(57)【要約】【課題】食品由来の異常プリオン分解酵素阻害物質を提供する。【解決手段】ニンニクから抽出され、異常プリオン分解酵素プリオナーゼによるタンパク質分解を阻害する活性を有し、１００℃で２０分間加熱しても当該活性を保持しているが、プロテイナーゼＫ処理により失活することを特徴とする異常プリオン分解酵素阻害物質；前記物質を含有する異常プリオン分解酵素阻害剤；及び前記物質及び異常プリオン分解酵素を用いる羊腸又は羊腸から製造される天然ケーシングの浄化方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニンニクから抽出され、異常プリオン分解酵素プリオナーゼによるタンパク質分解を阻害する活性を有し、１００℃で２０分間加熱しても当該活性を保持しているが、プロテイナーゼＫ処理により失活することを特徴とする異常プリオン分解酵素阻害物質。
【請求項２】
ニンニク水抽出液に８０％飽和になるように硫安を加え、遠心分離後、沈殿を水に再溶解し、一晩透析後、１００℃で２０分間加熱した後、再び遠心分離し、上清を回収後、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法で分離することにより得られる請求項１記載の異常プリオン分解酵素阻害物質。
【請求項３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて分子量約１２，０００を示す請求項１又は２記載の異常プリオン分解酵素阻害物質。
【請求項４】
次のアミノ酸配列：
ＧＮＩＬＭＮＤＥＧＬＹＡＧＱＳＬ
で示されるＮ末端アミノ酸配列を含むタンパク質である請求項１〜３のいずれか１項に記載の異常プリオン分解酵素阻害物質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の異常プリオン分解酵素阻害物質を含有する異常プリオン分解酵素阻害剤。
【請求項６】
ニンニク水抽出液、又はニンニク水抽出物の水溶液に７５〜８５％飽和になるように硫安を加え、遠心分離後、回収した沈殿を水に再溶解し、透析後、８０〜１００℃で加熱した後、再び遠心分離して得られる上清又はその処理物を含有する異常プリオン分解酵素阻害剤。
【請求項７】
請求項５又は６記載の異常プリオン分解酵素阻害剤及び異常プリオン分解酵素を用いる羊腸又は羊腸から製造される天然ケーシングの浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異常プリオン分解酵素阻害物質及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
わが国において海綿状脳症（ＢＳＥ）に罹患した牛が平成１９年２月までに３２頭確認され、プリオン病発症機序の解明及び治療・予防法の開発が緊急課題となっている。一方、本発明者らは、ラット肝臓から進化的に高度に保存された新規なタンパク質を世界に先駆けて発見し、これを過塩素酸可溶性タンパク質（ＰＳＰ）と名付けた（非特許文献１）。ＰＳＰの立体構造は、異常プリオンタンパク質と極めて類似した立体構造を示す（非特許文献２）。また、プロテイナーゼＫや熱に対する耐性も異常プリオンタンパク質と同様の性質を示したことから、ＰＳＰは異常プリオンタンパク質のモデルとなりうるとの着想に至った。ＰＳＰを基質として異常プリオンタンパク質を分解する酵素をスクリーニングした結果、ある種の放線菌（ストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６））が分泌する酵素（プリオナーゼＴＭ）が異常プリオンタンパク質を分解することを見出した（特許文献１及び非特許文献３）。
【０００３】
一方、ソーセージの皮は天然ケーシングとして羊腸から生成される。ＥＵではＢＳＥが羊へ感染することが実験的に確認されている（非特許文献４）。自然界でＢＳＥ罹患羊が確認された場合、食の安全に深刻な影響を与えることになる（非特許文献５）。本発明者らは、既にプリオナーゼの性質を明らかにするとともに、本酵素を天然ケーシング加工過程に導入し、天然ケーシングの浄化法について検討した（特許文献２）。スクレイピー由来の異常プリオンタンパク質を混在させたモデルケーシングをプリオナーゼで処理すると、わずか１５分で異常プリオンタンパク質が検出限界以下にまで浄化された。また、プリオナーゼは羊腸の異常プリオンタンパク質を浄化できるだけでなく、羊腸をコラーゲンのみの理想的なケーシングに仕上げる酵素であることが明らかにされた。
【０００４】
過去にオーストラリアで同様の酵素が見出され、ソーセージの製造過程に応用されたが、酵素の活性があまりに強力であったため、加工の過程でケーシングが破損したという経緯が報告されている。プリオナーゼは強力な酵素であることから、ソーセージ製造にプリオナーゼを応用した場合にもケーシングが破損することは十分に懸念される。従って、プリオナーゼを用いる際には、阻害剤を併せて使用することで、ソーセージの安全性及び品質を改善しつつ、ケーシングの破損を予防することが可能となる。プリオナーゼはセリン性プロテアーゼであり、既知の阻害剤としてフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）やフルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＦＰ）が知られているが、これらの阻害剤は毒性があり、食品に使用することは不可能である。そこで、本発明者らは、食品に由来するプリオナーゼ阻害物質のスクリーニングを行った。その結果、ニンニク抽出液にプリオナーゼ阻害効果があることを明らかにし、その活性本体は低分子の物質であると報告した（非特許文献６）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−３４１５２号公報
【特許文献２】特開２００６−１８０８２６号公報
【非特許文献１】Oka T, Tsuji H, Noda C, Sakai K, Hong YM, Suzuki I, Munoz S, Natori Y., Isolation and characterization of a novel perchloric acid-soluble protein inhibiting cell-free protein synthesis., J. Biol. Chem., 270, 30060-30067 (1995).
【非特許文献２】Carugo KD, Saraste M, Oka T., Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of perchloric acid soluble protein (PSP) from rat liver., Acta Cryst., D55, 667-668 (1999).
【非特許文献３】Hui Z, Doi H, Kanouchi H, Matsuura Y, Mohri S, Nonomura Y, Oka T., Alkaline serine protease produced by Streptomyces sp. degrades PrP(Sc)., Biochem. Biophys. Res. Commun., 321, 45-50 (2004).
【非特許文献４】Foster JD, Bruce M, McConnell I, Chree A, Fraser H., Detection of BSE infectivity in brain and spleen of experimentally infected sheep., Vet. Rec., 138, 546-548 (1996).
【非特許文献５】Declan Butler., A wolf in sheep's clothing., Nature, 414, 576-577 (2001).
【非特許文献６】平成１８年度日本栄養・食糧学会九州・沖縄支部および農芸化学会西日本支部合同大会講演要旨集第２９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、食品由来の異常プリオン分解酵素阻害物質を提供することである。
前記課題を解決するため、本発明者らが更に検討を重ねたところ、ニンニク抽出液のプリオナーゼ阻害効果の活性本体は先に予想していた低分子の物質ではなく、タンパク質であることを見出すとともに、当該物質を単離・精製することに成功し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（１）ニンニクから抽出され、異常プリオン分解酵素プリオナーゼによるタンパク質分解を阻害する活性を有し、１００℃で２０分間加熱しても当該活性を保持しているが、プロテイナーゼＫ処理により失活することを特徴とする異常プリオン分解酵素阻害物質。
（２）ニンニク水抽出液に８０％飽和になるように硫安を加え、遠心分離後、沈殿を水に再溶解し、一晩透析後、１００℃で２０分間加熱した後、再び遠心分離し、上清を回収後、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法で分離することにより得られる前記（１）に記載の異常プリオン分解酵素阻害物質。
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて分子量約１２，０００を示す前記（１）又は（２）に記載の異常プリオン分解酵素阻害物質。
（４）次のアミノ酸配列：
ＧＮＩＬＭＮＤＥＧＬＹＡＧＱＳＬ
で示されるＮ末端アミノ酸配列を含むタンパク質である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の異常プリオン分解酵素阻害物質。
（５）前記（１）〜（４）のいずれかに記載の異常プリオン分解酵素阻害物質を含有する異常プリオン分解酵素阻害剤。
（６）ニンニク水抽出液、又はニンニク水抽出物の水溶液に７５〜８５％飽和になるように硫安を加え、遠心分離後、回収した沈殿を水に再溶解し、透析後、８０〜１００℃で加熱した後、再び遠心分離して得られる上清又はその処理物を含有する異常プリオン分解酵素阻害剤。
（７）前記（５）又は（６）記載の異常プリオン分解酵素阻害剤及び異常プリオン分解酵素を用いる羊腸又は羊腸から製造される天然ケーシングの浄化方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の異常プリオン分解酵素阻害物質はニンニク由来であるので、これを用いることにより、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）やフルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＦＰ）のように毒性を有する阻害剤を用いることなく、羊腸又は羊腸から製造される天然ケーシングを浄化することができ、安全でかつ高品質のソーセージの製造が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の異常プリオン分解酵素阻害物質は、ニンニク抽出物から、異常プリオン分解酵素プリオナーゼによるタンパク質分解を阻害する活性を有し、１００℃で２０分間加熱しても当該活性を保持しているが、プロテイナーゼＫ処理により失活する物質を分離することにより得ることができる。
【００１０】
抽出溶媒としては、好ましくは水、リン酸緩衝液が用いられ、抽出温度は、通常４〜２０℃であり、抽出時間は、通常１０〜２０分である。本発明の物質は、１００℃で２０分間加熱しても、異常プリオン分解酵素プリオナーゼによるタンパク質分解を阻害する活性を保持しているので、抽出溶媒として、熱水を用いることもできる。
【００１１】
本発明の異常プリオン分解酵素阻害物質により酵素活性が阻害される異常プリオン分解酵素としては、例えば特開２００５−３４１５２号公報（特許文献１）に記載のストレプトミセス・エスピー９９−ＧＰ−２Ｄ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３６）が分泌する酵素（プリオナーゼＴＭ）が挙げられる。
【００１２】
本発明の物質を含有するニンニク水抽出液、ニンニク水抽出物の水溶液などの水溶液に７５〜８５％飽和になるように硫安を加え、遠心分離後、回収した沈殿を水に再溶解し、透析後、８０〜１００℃で１０〜６０分間、好ましくは２０分間加熱した後、再び遠心分離し、上清を回収後、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法で精製・分離することにより本発明の物質を得ることができる。
【００１３】
本発明の異常プリオン分解酵素阻害剤には、前記のようにして精製・分離した本発明の物質の他、前記上清又はこれをクロマトグラフィー等の各種精製手段で処理して得られる処理物を用いることもできる。
【００１４】
本発明の物質は、異常プリオン分解酵素阻害作用を有し、異常プリオン分解酵素を用いる羊腸又は羊腸から製造される天然ケーシングの浄化方法に用いることにより、ソーセージの安全性及び品質を改善しつつ、ケーシングの破損を予防することが可能となる。この際の使用方法としては、特開２００６−１８０８２６号公報（特許文献２）に記載されているように、異常プリオンを有し得る天然ケーシングに異常プリオン分解酵素を加え、該分解酵素の活動に有効な温度でインキュベートし、インキュベート終了後に本発明の異常プリオン分解酵素阻害物質を阻害剤として添加して反応を停止させる方法が挙げられる。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１６】
（実施例１）
（１）ニンニク抽出液の調製
ニンニク球根をその５倍重量の水でホモジナイズし、１４，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を得、サンプルとした。
【００１７】
（２）ニンニク抽出液のプリオナーゼ阻害活性
非特許文献１(J. Biol. Chem., 270, 30060-30067 (1995))記載の方法に準じて豚肝臓より抽出した過塩素酸可溶性タンパク質（ＰＳＰ）にプリオナーゼを添加し、各倍率に希釈したニンニク抽出液又はフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）存在下において６０℃で３０分間加熱した。その後、抗ＰＳＰ抗体（Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2003 Apr; 134(4): 571-8）を用いたウェスタンブロッティング法でＰＳＰの検出を行った。
ニンニク抽出液はＰＭＳＦと同様にプリオナーゼ阻害効果を示した。また、その阻害効果はニンニク抽出液の濃度依存的であった（図１）。
【００１８】
（３）プロテイナーゼＫ処理がニンニク抽出液のプリオナーゼ阻害活性に及ぼす効果
前記ＰＳＰにプリオナーゼを添加し、ニンニク抽出液及びタンパク質分解酵素であるプロテイナーゼＫの存在下、６０℃で３０分間加熱した。その後、前記抗ＰＳＰ抗体を用いたウェスタンブロッティング法でＰＳＰの検出を行った。
その結果、ニンニク抽出液からプリオナーゼ阻害活性が失われた（図２）。これらの結果は、ニンニク抽出液中の阻害物質がタンパク質であることを示唆している。
【００１９】
（４）ニンニク抽出液のプリオナーゼ阻害活性に及ぼす加熱の効果
ニンニク抽出液を１００℃で２０分間加熱した後、１４，０００×ｇで２０分間遠心分離し、沈殿を除去した。更に前記ＰＳＰにプリオナーゼを添加し、加熱又は非加熱のニンニク抽出液存在下で３０分間加熱した。最後に前記抗ＰＳＰ抗体を用いたウェスタンブロッティング法でＰＳＰの検出を行った。
ニンニク抽出液を１００℃で２０分間加熱してもニンニク抽出液はプリオナーゼに対する活性阻害効果を保持していた（図３）。これらの結果は、ニンニク抽出液中の阻害物質は耐熱性を有するタンパク質であることを示唆している。
【００２０】
（５）プリオナーゼ阻害物質の精製
以下のようにして、プリオナーゼ阻害物質を精製した。
先ず、ニンニク水抽出液に８０％飽和になるように硫安を加え、１時間静置した。次に１４，０００×ｇで２０分間遠心分離後、沈殿を回収して水に再溶解した。一晩透析後、１４，０００×ｇで２０分間遠心分離後、上清を回収した。最後に、１００℃で２０分間加熱した後、１４，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を回収後、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法で分離して精製標品とした。本精製標品は、濃度依存的にプリオナーゼを阻害した（図４）。
【００２１】
また、精製標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果、分子量約１２，０００のタンパク質が検出された（図５）。本タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を解析した結果、ＧＮＩＬＭＮＤＥＧＬＹＡＧＱＳＬ（配列番号１）であることが明らかにされた。更に、データベースによる解析を行った結果、同様のアミノ酸配列を有するタンパク質は見出されなかったことから本阻害物質は新規なタンパク質であることが明らかにされた。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明の異常プリオン分解酵素阻害物質は、安全でかつ高品質のソーセージの製造に利用される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】プリオナーゼ活性に及ぼすニンニク抽出液の効果を示す図である。
【図２】プロテイナーゼＫ処理がニンニク抽出液のプリオナーゼ阻害活性に及ぼす効果を示す図である。
【図３】ニンニク抽出液のプリオナーゼ阻害活性に及ぼす加熱の効果を示す図である。
【図４】ニンニク抽出液精製標品のプリオナーゼ阻害活性を示す図である。
【図５】ニンニク抽出液精製標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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