(57)【要約】【課題】動物の損傷した神経細胞を救助する。【解決手段】本発明は、患者の損傷した神経細胞を救助するためのデプレニル化合物の利用と、患者の損傷した神経細胞を救助するために有用なデプレニル化合物を含んだ器具とに関するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デプレニル化合物の容器と、損傷した神経細胞を持つ患者に対し、その患者において損傷した神経細胞の救助が行われるよう、治療上効果的な量のデプレニル化合物を投与する旨の指示書とを含む器具であって、デプレニル化合物が、下記化１の構造、
【化１】
2008260782.tif 000010
で表され、
ただし同式において、
Ｒ１は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、又はアリールオキシカルボニルであり、
Ｒ２は水素又はアルキルであり、
Ｒ３は一重結合、アルキレン、又は−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍであり、
ただしこのときＸはＯ、Ｓ又はＮ−メチル、ｍは１又は２、及びｎは０、１、又は２であり、
Ｒ４はアルキル、アルケニル、アルキニル、複素環、アリール、又はアラルキルであり、
Ｒ５はアルキレン、アルケニレン、アルキニレン及びアルコキシレンであり、
Ｒ６は
−Ｃ≡ＣＨであり、
あるいは、Ｒ２及びＲ４−Ｒ３は結合して、これらが結び付いたメチンと共に環
式又は多環式の基を形成しており、
及び薬学上容認可能なその塩であり、
但しその際、デプレニル化合物はデプレニル、パルジリン、ＡＧＮ−１１３３、又はＡＧＮ１１３５のいずれかから選択されるものではないことを条件とする、
器具。
【請求項２】
デプレニル化合物の容器と、損傷した神経細胞を持つ患者に対し、その患者において損傷した神経細胞の救助が行われるよう、治療上効果的な量のデプレニル化合物を投与する旨の指示書とを含む、
請求項１に記載の器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物の損傷した神経細胞を救助するためのプレニル化合物を利用した器具に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
デプレニル（ここではセレジリン又はＲ−（−）−Ｎ，α−ジメチル−Ｎ−２−プロピニルフェネチルアミンとも呼ぶ）が最初に用いられたのは、これが選択的モノアミン酸化酵素−Ｂ（ＭＡＯ−Ｂ）阻害物質として働くことで脳内ドーパミン量を高め、Ｌ−ＤＯＰＡから形成されたドーパミンの薬理作用を強めながらも、非選択的ＭＡＯ阻害物質で観察されるチラミン昇圧効果は防ぐであろうという根拠に基づき、１０年前にヨーロッパにおいてパーキンソン病（ＰＤ）の従来の薬物療法の補助剤（Ｌ−ジヒドロキシフェニールアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）及び末梢脱炭酸酵素阻害剤）として用いられたときである。報告では、この配合薬物療法によりＬ−ＤＯＰＡの抗無動作用が長くなるため、パーキンソン病患者のオン−オフ効果が消滅し、機能性障害が低下し、余命が長くなるとしている（Bernheimer,Ｈ.et al.,Ｊ.Neurolog.Sci.,1973.20:415-455,Birkmayer,Ｗ.,et al.,Ｊ.Neural Transm.,1975.36:303,336,Birkmayer.Ｗ.,et.al.Mod Prob.Pharmacopsychiatr.,1983.19:170-177,Birkmayer Ｗ.and P.Riederer,Hassler,Ｒ.Ｇ.and Ｊ.Ｆ Christ(Ed.)Advances,In Neurology，1984 40(Ｙ):p.0-89004,andBirkmayer,Ｗ.et.al.,Ｊ.Neural Transm.,1985.64(2):p.113-128）。
【０００３】
通常のＬ−ＤＯＰＡ療法の補助剤としてのデプレニルを調べた研究は、通常、その利点は１年又はそれ未満で消失してしまう短期間のものだと報告している。
デプレニルと共に摂取すればレボドーパ用量を減少させることができると報告する研究も、すべてではないがいくつかはある。（Elizan,Ｔ．Ｓ.,et.al.,Arch Neurol.1989.46(12):p1280-1283,Fischer,Ｐ.Ａ.and Ｈ.Baas,Ｊ.Neural Transm.(suppl.),1987.25:p.137-147,Golbe,Ｌ.I..,Neurology,1989.39:p.1109-1111,Lieberman,Ａ.Ｎ.et.al.,Ｎ.Ｙ.StateＪ.Med.,1987.87:p.646-649,Poewe,Ｗ.,F Gerstenbrand,and Ｇ.Ransomayr,Ｊ.Neural Transm.(suppl.),1987.25:p.137-147,Cedarbaum,Ｊ.Ｍ.,Ｍ．Hoey,and Ｆ.Ｈ.McDowell,Ｊ.Neurol.Neurosurg.Psychiatry,1989.52(2):p.207-212,and Golbe,Ｌ.I.,Ｊ,Ｗ．Langston,and I.Shoulson,Drugs,1990.39(5):p.646-651）。
デプレニルがパーキンソン病の進行を遅らせるという報告（Parklnson，Ｓ.Ｇ.Arch Neurol 46,1052-1060(1989)and Ｕ.Ｓ.Ａ.,Parkinson,Ｓ.Ｇ.Ｎ.Engl.Ｊ.Med.321,1364.1371(1989)）があってからは、デプレニルはますますパーキンソン患者に投与されるようになってきているが、その作用を説明するのに充分な仕組みはまだ解明されていない。
パーキンソン病（ＰＤ）に対してデプレニルを使用する裏付けは概ねＤＡＴＡＴＯＰプロジェクト（Parkinson,Ｓ.Ｇ．Arch Neurol 46,1052.1060（1989）andＵ.Ｓ.Ａ.,Ｐ.Ｓ.Ｇ.Ｎ.Engl.Ｊ．Med.321j 1364-1371(1989)）による発見に基づいている。この多中心性の研究は、デプレニルが、薬物療法をさらに必要とする障害症状の発症をほぼ１年遅らせると報告したものであるが、これらの発見は独立の、しかしより小規模な研究でも再現されている（Tetrud,Ｊ.Ｗ.＆Langston,Ｊ.Ｗ.Science 245,519-522(1989)）。残念ながら、ＤＡＴＡＴＯＰの研究の構成及びその結論には強い批判が集まっている(Landau,Ｗ,Ｍ.Neurology 40,1337-1339(1990)。さらにこれらのプロジェクトの著者はこのような結果はデプレニルがパーキンソン病の進行を遅らせるという仮説（Parkinson,Ｓ.Ｇ.Arch Neurol 46,1052-1060(1989),Ｕ.Ｓ.Ａ.,Ｐ.Ｓ.Ｇ.Ｎ.Engl.J.Med.321,1364-1371(1989)andTetrud,Ｊ.Ｗ．＆Langston.Ｊ.Ｗ．Science 249，303-304(1990)）と一致していると述べてはいるが、証明となるものでは決してない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
デプレニル、つまりＭＡＯ−Ｂ阻害物質がパーキンソン病の進行を遅らせるのは、フリーラジカルにより誘発される、生存中のドーパミン作動性黒質線条体（ＤＮＳ）ニューロンの死を抑えるためではないかということが主張されている（Parkinson's Desease and Movement Disorders(eds.Jankovic,Ｊ.＆Tolosa,Ｅ.)75-85のLangston,Ｊ.Ｗ.）(Urban and Schwarzenberg,Baltimore-Munich1988)）が、これは、デプレニルが霊長類のＭＰＴＰ誘発性神経毒性を遮断できたという観察（Langston,Ｊ.Ｎ.,Forno,Ｌ.Ｓ.Robert,Ｃ.Ｓ.＆IrWin,Ｉ.Brain Res 292,390-394(1984)）と、その他の環境毒素でＭＰＴＰに類似の作用の仕組みを持つものがパーキンソン病の病因に関連があるかも知れないという仮説（Tanner,Ｃ.Ｍ.TINS 12:49-54(1989)）に基づいている。しかしながら、ＭＡＯ−Ｂはドーパミン作動性ニューロンには存在しないこと（Vincent,Ｓ.Ｒ．Neuroscience 28,189-199(1989),Pintari,Ｊ.Ｅ.et.al.Brain Res276:127-140(1983),Westlund,Ｋ.Ｎ.,Denney,Ｒ.Ｍ.,Rochersperger,Ｌ.Ｍ.,Rose,R.M.＆Abell,Ｃ.Ｗ.Science(WashＤ.Ｃ.)230，181-183(1985)andWestlund,Ｋ.Ｎ.,Denney.,Ｒ.Ｍ.,Rose,Ｒ.Ｍ.＆Abell,Ｃ.Ｗ Neuroscience 25,439-459(1988)）から、それを阻害することでなぜＤＮＳニューロンが保護されるかは、毒性の高い化合物がドーパミン作動性ニューロン以外のニューロンで別に形成されて、それがＭＰＴＰと同じような方法でＤＮＳニューロンを傷つけるというのでない限り、不明である。驚くべきことに、中枢神経系からＭＰＴＰを除いた後では計測されているにもかかわらず、ＤNSニューロン数を計測してニューロン生存率に対してデプレニルが影響を与えるかどうかを調べることは、いずれの研究でも行われていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
請求項１に記載の発明は、デプレニル化合物の容器と、損傷した神経細胞を持つ患者に対し、その患者において損傷した神経細胞の救助が行われるよう、治療上効果的な量のデプレニル化合物を投与する旨の指示書とを含む器具であって、デプレニル化合物が、下記化１の構造で表され、
ただし同式において、
Ｒ１は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、又はアリールオキシカルボニルであり、
Ｒ２は水素又はアルキルであり、
Ｒ３は一重結合、アルキレン、又は−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍであり、
ただしこのときＸはＯ、Ｓ又はＮ−メチル、ｍは１又は２、及びｎは０、１、又は２であり、
Ｒ４はアルキル、アルケニル、アルキニル、複素環、アリール、又はアラルキルであり、
Ｒ５はアルキレン、アルケニレン、アルキニレン及びアルコキシレンであり、
Ｒ６は
−Ｃ≡ＣＨであり、
あるいは、Ｒ２及びＲ４−Ｒ３は結合して、これらが結び付いたメチンと共に環
式又は多環式の基を形成しており、
及び薬学上容認可能なその塩であり、
但しその際、デプレニル化合物はデプレニル、パルジリン、ＡＧＮ−１１３３、又はＡＧＮ１１３５のいずれかから選択されるものではないことを条件とする、器具である。
【０００６】
【化１】
2008260782.tif 000002
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、損傷した神経細胞を、デプレニル化合物を患者に投与することにより救助する方法を提供するものである。
ある態様では、本発明は、患者の損傷した神経細胞を救助する方法を提供するが、その方法は、損傷した神経細胞を持つ患者に対し、その患者において損傷した神経細胞の救助が行われるよう、ある量のデプレニル化合物を投与することを含み、但しその際、前記デプレニル化合物はデプレニル、パルジリン、ＡＧＮ−１１３３、又はＡＧＮ−１１３５のいずれかから選択されるものではないことを条件とする。
ここで用いられる「患者」又は「被験者」という用語は、損傷した神経細胞を持つ温血動物を言う。好適な実施例では、患者は、ヒト、及び、例えばイヌ、ネコ、ブタ、カウ、ヒツジ、ヤギ、ラット及びマウス等を含むヒト以外のほ乳類を含むほ乳類である。特に好適な実施例では、患者はヒトである。
ここで用いられる「損傷した神経細胞を救助する」又は「損傷した神経細胞を救助すること」という用語は、損傷から死に至る順番を（反転させなければ）致命傷である損傷を受けた神経細胞において反転させること、及び／又は、筋肉由来の栄養補給の消失を部分的に補うことを言う。
【０００８】
本発明の発明者は、神経毒１−メチル−４−フェニール−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）により誘発されるニューロンの死の時間経過を研究してきた。ＭＰＴＰは、Ｂ型モノアミン酸化酵素の働きにより酸化してジヒドトピリジウム中間体（ＭＰＤＰ＋）を経てその毒性の代謝産物１−メチル−４−フェニールーピリジウムイオン（ＭＰＰ＋）となる。ＭＰＴＰは非ドーパミン作動性細胞中でＭＰＰ＋に転換され、放出されてドーパミン作動性ニューロンに取り込まれ、そこで神経毒性作用を及ぼすと考えられている（VincentＳ.Ｒ.Neuroscience,1989,28 p.189-199,Pintari，Ｊ.Ｅ.et al．Brain Res,1983,276(1)p.127-140,Westlund,Ｒ.Ｎ,et al.Neuroscience,1988,25(2)p.439.456,Javitch,Ｊ.Ａ.et al.Ｐ.Ｎ.Ａ.Ｓ.ＵＳＡ 1985,82(7)p.2173.2177,Mayor,1986＃1763,及びSonsalla,Ｐ.Ｒ.et al,17thAnnual Meeting Of The Society For Neuroscience,New Orleans,Louisiana,ＵＳＡ，November,1987,13(2)を参照されたい）。
【０００９】
マウスではＭＰＴＰは急速に代謝されて消失する（Johannesen,Ｊ.Ｎ.et al．LifeSci.1985,36:p.219-224,Markey,Ｓ.Ｐet al.Nature,1984,311p.465467,Lau,Ｙ.Ｓ.et al.Life Sci.1988,43(18):p.1459-1464）。ＭＰＴＰの急速な代謝及び排出とは対照的に、本発明者たちはドーパミン作動性ニューロンの消失がＭＰＴＰ投与停止後２０日間に渡って進行することを立証している。ＭＰＴＰ（３０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）をマウスに連続５日間（総用量１５０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与して、緻密黒質（原語：substantia nigra compacta）（ＳＮｃ）及び腹側被蓋域（ＶＴＡ）のＴＨ−免疫陽性（ＴＨ＋）ニューロンの約５０％を消失させた（ＭＰＴＰ用量とカテコールアミン作動性ニューロンの消失との間の関係に関してここに参考文献として編入するSeniuk,Ｎ.Ａ.,Ｗ.Ｇ.Tatton,and Ｃ.Ｅ.Greenwood,BrainRes.,1990,527sp.7-20を参照されたい）。本発明者はまた、同様の時間経過後ＴＨ＋ＳＮｃニューロンの死が起きることを発見している。ＴＨ＋体細胞の２０から３０％がＭＰＴＰ投与終了後５日間の間に消失し、ＴＨ＋ニューロンの消失は更にその後１０日から１５日間続き、その後は検出可能な消失はなかった。このようなＴＨ＋ニューロンの継続的な消失は、上述の排出データに基づけば、ＭＰＰ＋の存在では説明できなかった。さらに、ＴＨ＋及びニッスル染色したＳＮｃ体細胞の計数を同時に表した表から、ＴＨ＋体細胞の消失はＴＨ免疫反応性の消失というよりはＳＮｃニューロンの死を意味するものであることが確認できた。
【００１０】
ＴＨ＋ＳＮｃ体細胞の消失と関連して、本発明者はさらに、ＳＮｃ及び腹側被蓋域（ＶＴＡ）におけるＴＨたんぱく質の免疫密度に変化があることを発見した。ＭＰＴＰを処置した動物において５日目で残存するＴＨ＋ＤＮＳニューロンの体細胞中の細胞形質のＴＨ免疫密度は、食塩水を処置した対照群と比較して４０％低かった。平均体細胞ＴＨ免疫密度は時間と共に増加し、ＭＰＴＰ後２０日で対照レベルに達した。線条体ＤＡ濃度の変化、及び移動などのドーパミン依存性行動の変化は、ＴＨ免疫化学の変化に平行していることが判明した。更に、本発明者たちは、ＤＯＰＡＣ／ＤＡ比で推測したときの線条体のＤＡ含有量及びＤＡ合成量の増加は、行動上の回復に平行していると考えられ、ＭＰＴＰへの暴露を生き抜いたＶＴＡ及びＳＮｃニューロン中のＤＡ含有量及び合成量の増加を示していることを発見した。
【００１１】
このように、注目すべきことに、ＭＰＴＰ誘発のニューロン性損傷後、ＴＨ＋ＳＮｃニューロンが効果的な修復及び回復を行なうか、又は死に至るかにとって重要な２０日間の期間があることを本発明者たちは発見した。
デプレニルを用いた大半の研究は、生体内でのＭＡＯ−Ｂ活性の阻害が、ＮＰＴＰのＭＰＰ＋への転換、ひいてはＭＰＴＰの神経毒性を遮断することを実証すべく構成されてきた。その結果、ＭＰＴＰへの暴露の期間中にＭＡＯ−Ｂ活性が確実に阻害されるよう、デプレニルは多くの場合、ＭＰＴＰ投与の前、そして投与の間を通じて数時間又は数日間与えられている（例えばCohen,Ｇ.,et al.,Eur.Ｊ.Pharmacol.,1984.106sp.209-210,Heikkila,Ｒ.Ｅ.,et al.,Eur.Ｊ.Pharmacol,1985.116(3):p.313-318,Heikkila,Ｒ.Ｅ.,et al,Nature,1984.311:p.467-469及びLangston,Ｊ.Ｗ,,et al.,Science(Wash.Ｄ.Ｃ.),1984,225(4669)p.1480-1482を参照されたい）。例えばＡＧＮ１１３３、ＡＧＮ−１１３５及びＭＤ２４０９２８等、その他のＭＡＯ−Ｂ選択的阻害物質を用いて比較可能な結果が得られており（Heikkila，Ｒ.Ｅ.，et al.,Eur.Ｊ．Pharmacol,1985.116(3)：p.313-318andFuller,Ｒ.Ｗ.andＬ.Ｓ.Ｋ.Hemrick,Life Sci,1985.37(12):p.1089-1096）、デプレニルの作用の仕組みはＭＡＯ−Ｂを遮断するその能力が媒介するものであり、それによりこの毒素が活性形態に転換するのを防ぐのだということを示唆している。
【００１２】
上述の研究とは対照的に、本発明者たちは、ＭＰＴＰのＭＰＰ＋への転換を遮断するその能力には依存していなかったその作用をデプレニルがＤＳＮニューロンに及ぼすことができるかを調べることに関心があった。ＭＰＴＰ処置したマウス（総用量は１５０ｍｇ／ｋｇ）に、ＭＰＴＰ投与後３日目から２０日目まで、デプレニルを投与した（０．０１、０．２５、１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射；１週間に３回）。デプレニル投与を３日目まで控えたのは、すべてのマウスが相当量のＭＰＰ＋に暴露し、すべてのＭＰＴＰ及びその代謝産物が中枢神経系から消失するのを確実にするためである。ＭＡＯ−Ｂ阻害物質であるクロルジリンもＭＰＴＰ処置したこのマウスに投与した。
本発明者たちは、食塩水処置したマウスでは、ドーパミン作動性緻密黒質（ＤＳＮ）ニューロンの約３８％がこの２０日間のうちに次第に死んでいったことを発見した。このＤＳＮニューロンの数はＭＰＴＰ−食塩水処置マウス及びＭＰＴＰクロルジリン処置マウスの場合と統計学的に同じであることが判明した。しかしながら、デプレニルにより、ＭＰＴＰ誘発性の損傷を生き延びるＤＳＮニューロンの数は増加しており（１６％消失−０．０１ｍｇ／ｋｇ、１６％消失−０．２５ｍｇ／ｋｇ）及び１４％消失１０ｍｇ／ｋｇ）、その効力はすべての用量において同じであった。このように、本発明者は、デプレニルは死につつあるニューロンを救助し、それらが効果的な修復を行うと共にドーパミンの合成に必要なチロシン水酸化酵素等の酵素の合成を再構築する確率を高めることができることを実証した。これは、死に至るはずのニューロンの損傷から死までの順序を反転させる、末梢又は経口投与治療に関する最初の報告であると考えられる。
【００１３】
発明者たちの研究は、デプレニルは、ＭＰＴＰが毒性代謝産物ＮＰＰ＋へ転換するのを阻害することを通じてその再生作用を媒介しているという可能性を見逃してきた。その結果は、デプレニルにはこれまで未知の作用メカニズムがあることを示唆するものである。ドーパミン作動性ニューロン自体におけるデプレニルの直接的作用を説明するのは、これらの細胞にＭＡＯ−Ｂがないため、難しいことであり、(Vincent,Ｓ,Ｒ.,Neuroscience28,189-199(1989);Pintari,Ｊ.Ｅ.,et al.Brain Res.276,127.140(1983);Westlund,Ｒ.Ｎ.et al.Science,(Wash.Ｄ.Ｃ.)230,181.183(1988)andWestlund,Ｋ.Ｎ.et al．Neuroscience25，439-156(1988)）、これらの結果を、ドーパミン作動性ニューロン自体の中でデプレニルがＭＡＯ−Ｂを阻害するという根拠に基づいて説明はできなくなっている。デプレニル（０．０１ｍｇ／ｋｇ）による処置の初期及び最後におけるＭＰＴＰ処置マウス中のＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂを測定した結果、この０．０１ｍｇ／ｋｇの用量では二つの時点でＭＡＯ−Ａ又はＭＡＯ−Ｂの阻害を大きくは阻害していないことが判明しており、このことから、デプレニルの再生作用を媒介するのはＭＡＯ−Ｂの阻害作用であるとはまず考えられない。更に、ＭＡＯ−Ａ阻害物質であるクロルジリンは、ＭＰＴＰで誘発されたニューロンの死後に生き延びるＤＳＮニューロンの数を増加させなかった。
【００１４】
他の研究結果からも、デプレニルによる損傷したニューロンの救助は、公知のＭＡＯ−Ｂ又はＭＡＯ−Ｂ阻害作用によるものではないことが裏付けられている。軸索切断した運動ニューロンのデプレニルによる救助は、デプレニル処置をその後止めた場合も、運動ニューロンが死なないため永久に続くことが実証されている（以下の議論を参照されたい）。更に、ＭＡＯ−Ｂ阻害物質Ｎ−（２−アミノエチル）−４−塩酸クロロベンズアミドは損傷した運動ニューロンを救助するには効果的でないことが実証されている。
さらに、生後１４日で軸索切断したラットの顔面運動ニューロンの生存率も調べられたが、その結果、デプレニルは軸索切断後２１日目の生存運動ニューロンの数を２．２倍増加させていたことが分かった（ここで述べる例３を参照されたい）。さらに、ＭＰＴＰモデルで用いた０．０１ｍｇ／ｋｇ用量の場合と同様、運動ニューロンを救助するのに、用量０．０１ｍｇ／ｋｇのデプレニルの効果は１０ｍｇ／ｋｇのデプレニルとまったく同じであった。パルジリンも運動ニューロンを救助することが判明した。このように、注目すべきことに、デプレニル及びパルジリンは、軸索切断により発生した栄養補給の消失を部分的に補うことができることが実証され、筋萎縮性側索硬化症等の状態における運動ニューロンの死の治療におけるデプレニル化合物の役割が示唆された。
１４日目で損傷を与え、続く２１日間１０ｍｇ／ｋｇのデプレニル（ｄ１４−３５）を与えた後、生後６５日まで未処置のまま放置した動物では、その後何ら運動ニューロンの死は見られなかった。さらに、この救助は軸索切断した運動ニューロンについては永久に続くことが実証された。つまり、運動ニューロンは、デプレニル処置を２１日目より後に中止した場合、死に始めることはなく、さらにその後３０日間も死ぬことはないのである。
【００１５】
デプレニルの再生作用は神経系の細胞のいずれかが媒介している可能性があり、その仕組みには、その細胞上のレセプタ（例えばニューロン栄養性因子のレセプタなど）の活性化が、ある構造を通じて関わっていると思われるが、この構造はＭＡＯ−Ｂを遮断する構造には関係がないものであろう。このことは、デプレニルは、ドーパミン作動性ニューロンのみに影響を与えるのではなく、グリア栄養性因子に反応する脳内のすべてのニューロンの死を防ぐのに役立つのではないかということを意味するものであろう。従って、パーキンソン病において治療上効果的であるだけでなく、その他の神経変性疾患及び神経筋疾患や、低酸素症、虚血、脳卒中又は外傷を原因とする脳の損傷にも効果的であると考えられ、さらに脳の老化に伴うニューロンの進行性の消失を遅延させられるかも知れない(Coleman,Ｐ.Ｄ.&FloodＤ.Ｇ.,Neurobiol.Aging8,521-845(1987);McGeer,P.L.et al.In Parkinsonlsm and Aging(eds.Ｄ.Ｂ.Calne,Ｄ,Ｃ,-Ｇ.Comi and Ｒ.Horowski)25.34(Plenum，New York，1989)。さらに、外傷性及び非外傷性の末梢神経の損傷において筋肉の神経再支配を刺激するのにも用途があるかも知れない。
【００１６】
本研究はまた、プロパルジルの末端が損傷したニューロンの救助に必要な因子かも知れないということを示す。上述したように、ＭＡＯ−Ａ阻害物質であるクロルジリンは、二日毎に用量２ｍｇ／ｋｇを与えた場合では、ＭＰＴＰ誘発した損傷後の生存ｄＳＮＣニューロン数を増加させることはなかった。Ｌ−デプレニル及びクロルジリンの公知の分子構造（図１を参照されたい）を比較すると、これらの化合物が、プロパルジル基を含んだ末端部分で同じ構造を有していることが分かる（図１の四角で囲った部分を参照されたい）。対照的に、フェノール環には二つの大きな塩素が含まれ、また酸素に結び付いた３つの炭素鎖は、この塩素置換フェノールを、アメチル側鎖をＬ−デプレニルに持った状態で２つの炭素を持つ窒素に結合させている。クロルジリンがＤＳＮニューロンを救助できないのは、プロパルジル基が結合部位に届かないようにしているこの塩素に関連があるかも知れないし、また、この重要な構造に、フェノール環を窒素に結合させている分子部分が含まれていることを示すものかも知れない。
ＭＡＯ−Ｂ阻害物質Ｎ−（２−アミノエチル）−４塩酸クロロベンズアミドは未成熟の軸索切断された運動ニューロンを救助しないことが分かった。この化合物は、デプレニル及びパルジリンの末端アルキン成分を持っていないため、ＭＡＯ−Ｂのフラビン部分の異なる箇所に結合又は相互反応するように思われる。
０．０１ｍｇ／ｋｇ用量のデプレニルの（＋）異性体は、未成熟の軸索切断された運動ニューロンを救助しないことが分かった。このように、この化合物の旋光度も救助に重要であるかも知れない。
【００１７】
上述したように、本発明は、損傷した神経細胞を救助するためのデプレニル化合物の利用と、このような使用に適合したデプレニル化合物を含む薬学的組成物と、損傷した神経細胞を救助することで神経系の疾患を治療する方法とに関するものである。
デプレニル化合物の投与は動物の損傷した神経細胞を救助するものでよく、従って、神経変性及び神経筋疾患の治療、及び、低酸素症、低血糖症、虚血性発作又は外傷を原因とする神経組織に対する急性の損傷に用いられよう。さらに、脳の老化に伴うニューロンの進行性消失を遅らせるのに用いることもできようが、デプレニルは、年齢に関係したマウスＤＳＮニューロンの死を防ぐことはできないことを本発明者たちは提示している。より具体的には、デプレニル化合物はパーキンソン病、ＡＬＳ、頭部外傷又は脊髄損傷の治療や、換気不良、溺水、長時間の痙攣、心拍停止、一酸化炭素への暴露、毒素への暴露、又はウィルス感染を原因とする虚血性発作、低酸素症直後の患者の治療に用いることができよう。デプレニル化合物は更に、外傷性及び非外傷性の末梢神経の損傷において筋肉の神経再支配を剌激するのにも用いることができよう。
【００１８】
デプレニル化合物
ここで用いられる「デプレニル化合物」という用語には、デプレニル（Ｎ，α−ジメチル−Ｎ−２−プロピニルフエネチルアミン）、デプレニルに構造上類似の化合物、例えば構造類似体、又はその誘導体など、が含まれる。このように、ある実施例では、デプレニル化合物は以下の式（化Ｉ）で表すことができる。
【００１９】
【化１】
2008260782.tif 000003
【００２０】
ただし同式において、
Ｒ１は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、又はアリールオキシカルボニルであり、
Ｒ２は水素又はアルキルであり、
Ｒ３は一重結合、アルキレン、又は−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍであり、ただしこのＸはＯ，Ｓ又はＮ−メチル、このｍは１又は２、そしてこのｎは０、１、又は２であり、  Ｒ４はアルキル、アルケニル、アルキニル、複素環、アリール、又はアラルキルであり、  Ｒ５はアルキレン、アルケニレン、アルキニレン及びアルコキシレンであり、
Ｒ６はＣ３−Ｃ６シクロアルキル又は −Ｃ≡ＣＨであり、
あるいは、Ｒ２及びＲ４−Ｒ３は結合して、これらが結び付いたメチンと共に環式又は多環式の基を形成しており、
及び薬学上容認可能なその塩である。
【００２１】
ある好適な実施例においては、デプレニル化合物は、デプレニル、パルジリン、ＡＧＮ−１１３３、ＡＧＮ−１１３５、又はＭＤ２４０９２８のいずれかから選択されるものではない。
【００２２】
いくつかの好適な実施例では、Ｒ１は生体内で分離可能な基である。いくつかの実施例では、Ｒ１は水素である。別の好適な実施例では、Ｒ１はメチルである。いくつかの好適な実施例では、Ｒ２は水素である。いくつかの好適な実施例では、Ｒ２はメチルである。いくつかの好適な実施例では、Ｒ３はアルキレン、より好ましくはメチレンである。別の好適な実施例では、Ｒ３は−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍである。好適な実施例では、Ｒ４はアリールである。いくつかの好適な実施例では、Ｒ４はフェニルである。別の好適な実施例では、Ｒ４はアラルキルである。さらに別の好適な実施例では、Ｒ４はアルキルである。さらに別の実施例では、Ｒ５はアルキレン、より好ましくはメチレンである。いくつかの好適な実施例では、Ｒ６は−Ｃ≡ＣＨである。また別の好適な実施例では、Ｒ６はシクロペンチルである。
【００２３】
さらに別の好適な実施例では、デプレニル化合物の構造は、以下の式（化２）である。
【００２４】
【化２】
2008260782.tif 000004
【００２５】
このときのＲ１は上述した通りである。好適なデプレニル化合物には（−）−デスメチルデプレニルと、下記化３とが含まれる。
【００２６】
【化３】
2008260782.tif 000005
【００２７】
別の実施例では、デプレニル化合物は以下の式（化４）で表すことができる。
【００２８】
【化４】
2008260782.tif 000006
【００２９】
ただし同式において、
Ｒ１は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、又はアリールオキシカルボニルであり、
Ｒ２は水素又はアルキルであり、
Ｒ３は化学結合又はメチレンであり、
Ｒ４はアリール又はアラルキルであり、
あるいは、Ｒ２及びＲ４−Ｒ３が結合して、これらが結び付いたメチンと共に環式又は多環式の基を形成しており、及び薬学上容認可能なその塩である。
【００３０】
別の実施例では、デプレニル化合物は以下の式（化５）で表すことができる。
【００３１】
【化５】
2008260782.tif 000007
【００３２】
ただし同式において、
Ｒ２は水素又はアルキルであり、
Ｒ３は化学結合又はメチレンであり、
Ｒ４はアリール又はアラルキルであり、
あるいは、Ｒ２及びＲ４−Ｒ３が結合して、これらが結び付いたメチンと共に環式又は多環式の基を形成しており、
そしてＲ５はアルキレン、アルケニレン、アルキニレン及びアルコキシレンであり、 及び薬学上容認可能なその塩である。
【００３３】
さらに別の実施例では、デプレニル化合物は以下の式（化６）で表すことができる。
【００３４】
【化６】
2008260782.tif 000008
【００３５】
ただし同式において、
Ｒ１は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、又はアリールオキシカルボニルであり、
Ａは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシル、−ＣＦ３、又はアジドのいずれかよりそれぞれ個別に選択される置換基であり、
ｎは０又は１から５までの整数であり、 及び薬学上容認可能なその塩である。
【００３６】
本発明のいくつかの実施例では、デプレニル化合物はデプレニル（（−）−デプレニルを含む）ではない。
「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、及びシクロアルキル置換アルキル基を含む、飽和脂肪族のラジカルを言う。好適な実施例では、直鎖又は分枝鎖アルキルは２０以下、より好ましくは１０以下の炭素原子をその主鎖（例えば直鎖ではＣ１−Ｃ２０、分枝鎖ではＣ３−Ｃ２０）の炭素原子に有する。同様に、好適なシクロアルキルは４−１０の炭素原子をその環構造に、より好ましくは５、６又は７の炭素をその環構造に有する。炭素数を特に明示していない限り、ここで言う「低アルキル」とは、上述のようにアルキル基を意味するが１から６個の炭素原子をその主鎖構造に有するものを言う。同様に、「低アルケニル」及び「低アルキニル」は同様の鎖長を有するものである。好適なアルキル基は低アルキルである。好適な実施例では、アルキルとしてここで指定された置換基は低アルキルのことである。
【００３７】
さらに、明細書及び請求の範囲を通じて用いられている「アルキル」（又は「低アルキル」）という用語は、「未置換アルキル」及び「置換アルキル」の両方を含むものとして意図されており、この後者は、炭化水素の主鎖の一つ又は複数の炭素に水素を置換する置換基を有するアルキル成分を言う。このような置換基には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル、（例えばカルボキシル、ケトン（アルキルカルボニル及びアリールカルボニル基を含む）、及びエステル（アルキルオキシカルボニル及びアリールオキシカルボニル基を含む）、チオカルボニル、アシルオキシ、アルコキシル、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アシルアミノ、アミド、アミジン、イミノ、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキチオ、スルフェート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、複素環、アラルキル、あるいは芳香族又はヘテロ芳香族成分が含まれよう。当業者であれば、炭化水素の鎖で置換を行った成分は、該当する場合には、それ自体が置換されることも理解されよう。例えば置換アルキルの置換基には、置換又は未置換の形のアミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネート及びホスフィネートを含む）、スルホニル（スルフェート、スルホンアミド、スルファモイル及びスルホナートを含む）、及びシリル基、並びにエーテル、アルキチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート、及びエステルを含む）、−ＣＦ３、−ＣＮ等々があろう。代表的な置換アルキルは以下に述べる通りである。シクロアルキルはさらにアルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキチオ、アミノアルキル、カルボニル置換体のアルキル、−ＣＦ３、−ＣＮ等々で置換することができる。
【００３８】
「アルケニル」及び「アルキニル」という用語は、上述のアルキルに長さ及び置換可能性という点で類似の不飽和脂肪族であるが、それぞれ少なくとも一つの二重又は三重結合を含んだものを言う。
ここで言う「アラルキル」とは、少なくとも一つのアリール基（例えば芳香族又はヘテロ芳香族）で置換したアルキル又はアルキレニル基を言う。代表的なアラルキルとしては、ベンジル（即ちフェニールメチル）、２−ナフチレチル、２−（２−ピリジル）プロピル、５−ジベンゾスベリル等々がある。
ここで言う「アルキルカルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）−アルキルを言う。同様に、「アリールカルボニル」とは−Ｃ（Ｏ）−アリールを言う。ここで言う「アルキルオキシカルボニル」とは−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキルの基を言い、「アリールオキシカルボニル」という用語は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリールを言う。「アシルオキシ」とは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ７を言うが、ただしこのＲ７はアルキル、あるケニル、アルキニル、アリール、アラルキル又は複素環である。
【００３９】
ここで言う「アミノ」とは−Ｎ（Ｒ８）（Ｒ９）を言い、このＲ８及びＲ９はそれぞれ、個別に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アリールであるか、あるいは、Ｒ８及びＲ９は、これらが結び付いた窒素原子と共に４−８の原子を有する環を形成するものである。このように、ここで言う「アミノ」とは、未置換体、一置換体（例えばモノアルキルアミノ又はモノアリールアミノ）、及び二置換体（例えばジアルキルアミノ又はアルキルアリールアミノ）のアミノ基を含む。「アミド」とは、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ８）（Ｒ９）を言い、このＲ８及びＲ９は上述の通りである。「アシルアミノ」とは、−Ｎ（Ｒ’８）Ｃ（Ｏ）−Ｒ７を言い、このＲ７は上述の通りであり、Ｒ’８はアルキルである。
ここで用いられる「ニトロ」とは−ＮＯ２を意味し、「ハロゲン」とは−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉを指し、「スルフヒドリル」とは−ＳＨを意味し、「ヒドロキシル」とは−ＯＨを意味する。
【００４０】
ここで言う「アリール」には５、６及び７員環の芳香族が含まれ、この芳香族は０個から４個のヘテロ原子を環内に含んでいてもよい。例えばフェニル、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾール、チアゾリル、トリアゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル及びピリミジニル、等々である。環構造にヘテロ原子を含むこのようなアリール基はまた、「アリール複素環」又は「ヘテロ芳香族」とも言及されているかも知れない。芳香族の環は一つ又は複数の環位置において、アルキルについて上述した置換基、例えばハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、複素環、芳香族又はヘテロ芳香族の成分、−ＣＦ３、−ＣＮ等々で置換することができる。アリール基はまた多環式の基の一部分となることができる。例えば、アリール基には、ナフチル、アントラセニル、キノリル、インドリル、等々といった融着した芳香族成分が含まれる。
【００４１】
「複素環」又は「複素環基」とは、４乃至１０員環の環構造、より好ましくは４乃至７員環であって、この環構造が１個乃至４個のヘテロ原子を含むものを言う。複素環基には、例えば、ピロリジン、オキソラン、チオラン、イミダゾール、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノン及びピロリジノン等のラクタム、スルタム、スルトン、等々が含まれる。複素環は、一つ又はそれ以上の位置において、上述のような置換基、例えばハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、複素環、芳香族又はヘテロ芳香族の成分、−ＣＦ３、−ＣＮ、等々で置換することができる。
【００４２】
「ポリシクリル」又は「多環式の基」とは、二つ以上の環（例えばシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、及び／又は複素環）であって、それらの環の二つ以上の炭素が隣り合う二つの環の間で共有されている、例えば環同士が「融合」している、ようなものを言う。隣り合っていない原子によって結合した環は「架橋された環」と呼ばれる。多環式の基の環は各々、上述のような置換基、例えばハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、複素環、芳香族又はヘテロ芳香族の成分、−ＣＦ３、−ＣＮ、等々で置換することができる。
ここで言う「ヘテロ原子」とは、炭素又は水素を除いたいかなる元素の原子をも意味する。好適なヘテロ原子は窒素、酸素、サルファ及びリンである。
【００４３】
本発明のいくつかの化合物構造は非対称の炭素原子を含むことが理解されよう。従って、このような非対称性から生じる異性体が本発明の範囲に含まれることは理解されねばならない。このような異性体は、伝統的な分離枝術及び立体調整された合成によってほぼ純粋な形で得られる。
ここで言う「生体内において分離可能」とは、生体内で酵素的又は非酵素的のどちらかによって開裂することのできる基を言う。例えば、アミノはアミダーゼにより開裂させることができ、またＮ−メチルアミンは酵素的酸化により開裂させることができる。例えば、デプレニルを被験者に投与すると、後で述べるように、メチル基が生体内で分離して有効化合物を生じると考えられる。さらなる例としては、化学式Ｉに見るように、Ｒ１がアルキルカルボニルの場合、できあがるアミド基は、生体内で加水分解により酵素的又は非酵素的に開裂して、第二アミンを含むデプレニル化合物を生じることができる（例えば、Ｒ１が生体内で水素に転換される）。生体内で分離可能な他の基も公知であり（例えばＲ.Ｂ．Silverman(1992)"The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action",Academic Pres,San Diegoを参照のこと）、本発明で用いる化合物に利用することができる。
【００４４】
製薬上の組成
ここで用いられる「薬学上容認可能な」という表現は、健全な医学的判断という見地から、過度の毒性、過敏症状、アレルギー反応、又はその他の問題あるいは合併症を引き起こすことなく、ヒト及び動物の組織に接触させることのできる適した化合物、材料組成物及び／又は剤形のものであって、妥当な利益／危険性の比に見合ったものを言う。
ここで言う「薬学上容認可能な基剤」とは、薬学上容認可能な材料、組成物又はビヒクル、例えば液体又は固形の充填剤、希釈液、付形剤、溶剤又は封入材料であって、一組織、又は身体の一部分から別の組織又は身体の一部分へと問題のデプレニル化合物を運ぶ又は移動させることに携わるものを意味する。各基剤は、調合物中の他の成分と適合性があり、かつ被験者に対して害がないという意味で「容認可能」でなければならない。薬学上容認可能な基剤として用いることのできる材料の例には、（１）ラクトース、グルコース及びシヨ糖等の糖類、（２）コーンスターチ及びイモの澱粉等の澱粉類、（３）セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及びアセチルセルロース等、（４）粉状トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）ココアバターや座薬ろう等の付形剤、（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油等の油類、（１０）プロピレングリコール等のグリコール類、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール等のポリオール、（１２）オレイン酸エチル及びラウレートエチル等のエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）無発熱因子水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液、及び、（２１）薬剤調合に用いられるその他の非毒性適合物質が含まれる。
【００４５】
デプレニルの安定度はデプレニルを調合する媒質のペーハーによって左右され得る。例えば、デプレニルは、約７のペーハーより約３乃至５の範囲のペーハーにおいて、より安定している。従ってデプレニル化合物を薬剤調合する場合、そのデプレニル化合物を適したペーハーに維持しておくことが好ましい。好適な実施例では、本発明の薬剤調合は約３乃至５の範囲のペーハー、より好ましくは約３から約４の範囲のペーハーを有するものである。さらに、エチルアルコールはデプレニルの安定度を高めるには好適な溶剤である。このように、いくつかの実施例では、アルコール性又は水性アルコールの媒質が本発明の薬剤調合には好ましい。
【００４６】
上述のように、本デプレニル化合物のあるいくつかの実施例には、アミノ又はアルキルアミノのような基本的な官能基を含めてもよく、そのため、薬学上容認可能な酸を用いて薬学上容認可能な塩を形成することができる。この意味で「薬学上容認可能な塩」とは、本発明の化合物のうち、比較的に非毒性の、無機及び有機酸添加塩を言う。このような塩は、本発明の化合物の最終的な分離及び精製の間に原位置で調製したり、あるいは、本発明の精製化合物を遊離した基質の形のまま適した有機又は無機酸と別個に反応させて、その結果形成された塩を分離することで調製することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、アセテート、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシレート、グルコヘプトネート、ラクトビオネート及びラウリルスルホネート、等々が含まれる（例えば、Berge et al．(1977)“PharmaceuticalSalts",Ｊ.Pharm.Sci.66:1-19を参照のこと）。
【００４７】
その他の場合として、本発明のデプレニル化合物には一つ又はそれ以上の酸性の官能基を含めてもよく、そのため、薬学上容認可能な塩を薬学上容認可能な塩基を用いて形成することができる。この場合の「薬学上容認可能な塩」とは、本発明の化合物のうち比較的に非毒性の、無機又は有機塩基添加塩を言う。このような塩も、同様に、化合物の最終的な分離及び精製の間に原位置で調製したり、あるいは、精製化合物を遊離酸の形のまま、例えば薬学上容認可能な金属カチオンの水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩のような適した塩基や、アンモニア、あるいは薬学上容認可能な有機質の第一、第二、又は第三アミンと個別に反応させることで調製することができる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びアルミニウム塩、等々がある。塩基添加塩の調合に用いることのできる、代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、等々がある（例えば、バージ他著による上述の文献を参照のこと）。
湿潤剤、乳化剤、潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、放出剤、被覆剤、スイートニング、調味料及び芳香剤、保存薬及び抗酸化剤もまた、組成中に存在していてもよい。
【００４８】
薬学上容認可能な抗酸化剤の例には、（１）水溶性の抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、二硫酸塩ナトリウム、異性重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、等々、（２）油溶性の抗酸化剤、例えばアスコルビルパルミチン酸塩、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファートコフエロール、等々、及び、（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸、等々、が含まれる。
本発明の調合物には、口、鼻腔、局所（頬及び舌下を含む）、直胴、膣及び／又は腸管外投与に適したものが含まれる。調合物は便利なように用量単位で提供してもよく、また、調剤技術において公知のいかなる方法を用いて調剤してもよい。一回分の用量を調剤するときに基剤材料と組み合わせることのできる有効成分の量は、治療を受ける主体、投与のその特定の形態に応じて異なるであろう。一回分の用量を調剤するときに基剤材料と組み合わせることのできる有効成分の量は一般的には、治療効果を生じるデプレニル化合物量となるであろう。多くの場合、１００％のうち、この量は約０．０１％から約９９％が有効成分、好ましくは約０．１％から約７０％、最も好ましくは約１％から約３０％の範囲となるであろう。
【００４９】
これらの調合物又は組成物を調剤する方法は、本発明による少なくとも一つのデプレニル化合物を、基剤、そして選択に応じて一つ又はそれ以上の付属成分とに会合させるステップを含む。一般的には、この調合物を、本発明のデプレニル化合物を、液体基剤、又は細密に分割された固形基剤、あるいはその両方に、均一かつ密接に会合させ、さらに必要な場合には製品を付形することで調剤する。
経口投与に適した本発明の調合物は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（調味基礎材料、多くの場合ショ糖、アラビアゴム又はトラガカントを用いて）、粉末剤、顆粒剤、又は、水性又は非水性の溶液又は懸濁液の形を採っても、あるいは、水中油形又は油中水形の乳剤として、又はエリキシル剤又はシロップ剤として、あるいは香錠（例えばゼラチン及びグリセリンなどの不活性の基質や、ショ糖及びアラビアゴムなど）及び／又は含そう剤、等々の形を採用してもよく、このとき各々は本発明による化合物を所定量、有効成分として含有するものである。本発明のデプレニル化合物はまた、巨丸剤、舐剤又はペースト剤として投与してもよい。
【００５０】
経口投与用の本発明品の固形剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末剤、顆粒剤、等々）においては、有効成分を一種又はそれ以上の薬学上容認可能な基剤と混合するが、この基剤は例えば、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、及び／又は（１）充填剤又は増量剤、例えば澱粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸など、（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルキン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアラビアゴムなど、（３）湿潤剤、例えばグリセロールなど、（４）分解剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、イモ又はタピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウムなど、（５）消散遅延剤、例えばパラフィン、（６）吸収加速剤、例えば第四アンモニウム化合物、（７）浸潤剤、例えばセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール、（８）吸収剤、例えばカオリン及びベントナイトクレイ、（９）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物、そして（１０）着色剤、のうちのいずれかである。カプセル、錠剤及び丸剤の場合、薬剤の組成にはさらに緩衝剤を含めてもよい。同様の種類の固形組成物はまた、高分子重量ポリエチレングリコール等々と同様、ラクトース又は乳糖等の付形剤を用いることで軟質又は硬質の充填ゼラチンカプセルの充填剤として利用してもよい。
【００５１】
錠剤は圧縮法又は成形法により製造することができ、選択に応じて一種又はそれ以上の付属成分を加えてもよい。圧縮された錠剤は、結合剤（例えばゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性の希釈剤、保存料、分解剤（例えばデンプングリコレートナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤又は拡散剤を用いて調製してもよい。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤させた粉末デプレニル化合物の混合物を、適した機械を用いて成形することで製造してもよい。
糖衣錠、カプセル、丸剤及び顆粒剤等、本発明の薬剤組成物の錠剤及びその他の固形剤形は、選択に応じて、筋目を付けたり、あるいは、例えば腸溶剤のコーティングや、薬剤調製技術で公知のその他のコーティング等のコーティング及び殻を施してもよい。これらはまた、所望の放出形等のポリマーマトリックス、リポソーム、及び／又は微小球が得られるよう、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な割合で用いることで、有効成分が放出するのを遅延又は調整しながら調剤してもよい。これらは、例えばバクテリア保持フィルタを通じてフィルタ濾過したり、無菌水で溶解可能な滅菌固形組成物の形状をした滅菌剤を加えたり、あるいはその他の無菌の注入可能な媒体を使用直前に加えたりして滅菌してもよい。これらの組成物には、選択に応じてさらに乳白剤を含めてもよく、また、その有効成分が、胃腸管の特定部位でのみ、あるいは特定部位で特に放出するような組成物としたり、さらに選択に応じて、遅れて放出するような組成物としてもよい。使用可能な埋封組成物の例としては高分子物質及びろうが含まれる。適切な場合には、有効成分に、上述の付形剤を一種又はそれ以上用いてミクロ被包形としてもよい。
【００５２】
本発明のデプレニル化合物の経口投与用の液体剤形には、薬学上容認可能なエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシル剤が含まれる。有効成分に加えて、液体剤形では当分野で通常用いられる不活性の希釈剤を含めてもよく、この希釈剤には、例えば水等の溶媒や、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油脂（特に綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物等の可溶化剤及び乳化剤がある。
不活性の希釈剤の他にも、経口用の本組成物には、例えば湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、スイートニング、調味料、着色剤、芳香剤及び保存剤等の補助剤を含めてもよい。
【００５３】
懸濁液は、有効なデプレニル化合物に加えて、例えばエトキシル基イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンのエステル、微晶質セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント、並びにこれらの混合物等の懸濁剤を含んでいてもよい。
直腸又は膣投与用の本発明の薬剤調合物を座薬として提供してもよく、この座薬は一種又はそれ以上の本発明のデプレニル化合物を、一種又はそれ以上の適した非炎症性の付形剤又は基剤と混合させることで調製することができるが、この付形剤又は基剤は、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、座薬用ろう又はサリチレートを含み、また、室温では固形であるが、体温では液体となるため直腸又は膣腔で溶けてデプレニル化合物を放出するものであろう。
経膣投与に適した本発明の調合物はまた、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡又は噴霧状の調合物であって、当分野で適切であると公知の基剤を含んだ調合物を含む。
本発明のデプレニル化合物の局所用又は経皮用投与に向けた剤形は、粉末、噴霧、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤を含む。有効化合物は滅菌状態で薬学上容認可能な基剤、そして必要であればいかなる保存料、緩衝剤、又は推進剤と混合してもよい。
軟膏、ペースト、クリーム、及びゲルは、本発明のデプレニル化合物に加えて、例えば動物性及び植物性脂肪、油脂、ろう、パラフィン、でんぷん、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物などの付形剤を含んでいてもよい。
【００５４】
粉末及び噴霧は、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミドの粉末、又はこれらの物質の混合物等の付形剤を含んでいてもよい。さらに噴霧は、例えばクロロフルオロ炭化水素のような通常の推進剤や、例えばブタン及びプロパンのような揮発性の未置換炭化水素を含んでいてもよい。
経皮用パッチは、本発明の化合物の身体への供与量を調整できるという点で有利である。このような剤形は、本デプレニル化合物を適した媒質中で溶解又は拡散させることで製造することができる。吸収促進剤をさらに用いれば、デプレニル化合物の皮膚の通過量を増加させることができる。このような通過率は、率調整膜を提供するか、あるいはデプレニル化合物をポリマーマトリックス状又はゲルとして拡散させることで調整可能である。本発明においては、さらに、パッチを含む器具を用いることでイオン導入又はその他の電気的方法によりデプレニル化合物を経皮的に供与できるが、このような器具は例えば、米国特許第４，７０８，７１６号及び第５，３７２，５７９号に述べられている。
【００５５】
眼用調合物、眼用軟膏、粉末、溶液、点眼薬、噴霧、等々もまた、本発明の範囲内にあるものとして考えられている。
腸管外投与に適した本発明の薬剤組成物は、一種又はそれ以上の本発明のデプレニル化合物を、一種又はそれ以上の薬学上容認可能な無菌等張性の水性又は非水性溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョンや、無菌粉末と組み合わせたものを含むが、この無菌粉末は使用直前に無菌の注入可能な溶液又は分散液に再構成してもよく、さらにこの無菌粉末に抗酸化剤、緩衝剤や静菌剤を含めても、あるいはこの調合物を被験者の血液と等張性にする溶質又は懸濁剤あるいは増粘剤を含めてもよい。
【００５６】
本発明の薬剤組成物に用いることのできる、適した水性及び非水性の基剤の例には、水、エタノール、ポリオル（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、等々）、及びこれらの適した混合物、オリーブ油などの植物性油脂、並びにオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが含まれる。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材を用いたり、分散液の場合には粒子の大きさを所定値に維持したり、サーファクタントを用いることで維持することができる。
これらの組成物にはまた、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの補助剤を含めてもよい。微生物の活動を防止するには、様々な抗菌物質及び抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール、等々を含めるとより確実となろう。さらに、例えば糖類、塩化ナトリウム、等々の等張作用因子を組成物に含めることが望ましいであろう。さらに、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅らせる物質を含めることで、注入薬物の吸収時間を長くすることが可能であろう。
場合によっては、薬品の作用を長引かせるために、皮下又は筋肉注射から薬品の吸収を遅らせることが好ましい。これは、水溶性の乏しい、結晶質又は非晶質の物質の液体懸濁液を用いることで達成することができる。これにより、薬品の吸収率はその溶解率に左右されることとなるが、この溶解率は結晶の大きさ及び結晶の形状で左右されるものとしてよい。あるいは、腸管外投与した薬品の吸収を遅らせるには、薬品を油性のビヒクル中で溶解又は懸濁させても達成できる。
【００５７】
注入可能な蓄積成形品は、本デプレニル化合物のマイクロカプセルのマトリックスを、ポリラクチドーポリグリコリドのような生分解性ポリマーに形成することで製造される。また、薬品対ポリマーの比に応じて、そして使用したその特定のポリマーの性質に応じて、薬品の放出率を調整することができる。その他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）がある。蓄積注入調合物はまた、薬品を、生体組織に適合性のあるリポソーム又はミクロエマルジョン内に閉じ込めることで調製される。
【００５８】
本発明の化合物をヒト及び動物に対して薬剤として投与する場合には、単体で与えたり、あるいは、例えば０．０１％から９９．５％（より好ましくは０．１から９０％）の有効成分を薬学上容認可能な基剤と組み合わせて含有した薬剤組成物として与えることができる。
本発明の調剤は、経口、腸管外、局所的、又は直腸を通じて与えてよい。また各投与経路に適した形態で与えてもよいことはもちろんである。例えば錠剤又はカプセルの形態でも、注射、吸入、目薬、軟膏、座薬等々の形態で投与される。
注射、輸注又は吸入による投与や、目薬又は軟膏による局所的投与、座薬による直腸投与である。注射（皮下又は腹腔内）あるいは局所的な眼への投与が好ましい。
ここで用いる「腸管外投与」及び「脳管外で投与する」という表現は、腸内及び局所的投与以外の、多くの場合注射による投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節、被膜下、クモ膜下、脊髄及び胸骨内注射及び輸注を意味するが、これらに限定されるものではない。
ここで用いる「全身投与」、「全身的に投与する」、「末梢投与」及び「末梢に投与する」という表現は、化合物、薬品又はその他の物質を、被験者の全身に進入するように静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節、被膜下、クモ膜下、脊髄及び胸骨内注射及び輸注を意味するが、これらに限定されるものではない。
ここで用いる「全身投与」、「全身的に投与する」、「末梢投与」及び「末梢に投与する」という表現は、化合物、薬品又はその他の物質を、中枢神経に直接投与する以外の方法により、被験者の全身に進入するように投与することを意味し、代謝及びその他の同様なプロセス、例えば皮下投与に準ずるものである。
【００５９】
これらの化合物は、治療目的のためにヒト及びその他の動物に投与してもよいが、それには、例えば噴霧による口腔、鼻腔投与、直脳、経膣、腸管外、槽内投与、及び、粉末、軟膏、点眼薬等による頬及び舌下を含む局所的投与を含むいかなる投与経路を経てもよい。
選択した投与経路に関係なく、適した水化物形態で用いてもよい本発明の化台物、及び／又は、本発明による薬剤組成物は、当業者に公知の通常の方法を用いて薬学上容認可能な剤形に調製されるものである。
【００６０】
本発明による薬剤組成物中の有効成分の実際の適用レベルは、被験者に害を与えることなく、特定の被験者、組成、及び投与の形態から見て所望の治療上の反応をもたらすのに効果的な量の有効成分を得るよう、変更してもよい。
選択する適用レベルは様々な因子によって左右されるが、この因子には、使用した本発明による特定のデプレニル化合物の活性、又はエステルの活性、塩あるいはそのアミドの活性、投与の経路、投与時間、使用中の特定の化合物の排出率、治療期間、その特定のデプレニル化合物と組み合わせて用いた他の薬品、化合物及び／又は物質、被験者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態及び以前の治療歴、等々、医療分野で公知の因子が含まれる。
当分野における通常の技術を有する医師又は獣医であれば、必要な薬剤組成物の効果的な量を容易に決定し、処方することができる。例えば、このような医師又は獣医は、薬剤組成中に使用される本発明による化合物の用量を、所望の効果を上げるのに必要な量よりも抑えて開始し、この用量を、所望の効果が得られるまで次第に増やすことも可能であろう。
【００６１】
多くの場合、本発明のデプレニル化合物の適した一日当りの用量は、治療効果を上げるのに最も低い用量の化合物量であろう。このような効果的な用量は、通常、上述の因子により異なるであろう。一般的には、一被験者に対する本発明の化合物の腹腔内及び皮下用量は、提示の神経細胞救助作用に向けて用いる場合、一日当り、体重１キログラムに対して約０．０００１ミリグラム乃至約１０ミリグラム、より好ましくは一日当り約０．００１ミリグラム乃至約１ミリグラム／１キログラムの範囲内であろう。
所望の場合、デプレニル化合物の効果的な一日当りの用量を、２、３、４、５、６又はそれ以上に小分けした単位剤形として、適した間隔を置きながら終日かけて分けて投与することが好ましいこともあろう。
本発明の化合物を単体で投与することも可能であるが、薬剤調合物（組成物）として本化合物を投与することが好ましい。二種又はそれ以上のデプレニル化合物を単一の治療用組成物として投与可能であることは理解されよう。
【００６２】
治療用の組成物は当分野で公知の医療用器具を用いて投与することができる。
例えば、ある好適な実施例では、本発明の治療用組成物を、例えば米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号又は第４，５９６，５５６号に開示された器具などのニードルレス皮下注射用器具を用いて投与することができる。本発明において使用可能な公知のインプラント及びモジュールの例の中には、速度を調節しながら小分け投薬するためのインプラントの可能なマイクロ輸注ポンプを開示した米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を通じて薬剤を投与するための治療用器具を開示した米国特許第４，４８６，１９４号、精確な輸注速度で投薬を行うための医療用輸注ポンプを開示した米国特許第４，４４７，２３３号、継続的な投薬を行うためのインプラントの可能な可変フロー輸注装置を開示した米国特許第４，４４７，２２４号、複数の分割チャンバを有する浸透的投薬システムを開示した米国特許第４，４３９，１９６号、そして浸透的投薬システムを開示した米国特許第４，４７５，１９６号がある。これらの特許を参考文献としてここに編入する。このようなインプラント、投薬システム、及びモジュールは他にも数多く、当業者には公知である。
【００６３】
ある特定のデプレニル化合物は、被験者に対する投与後、少なくとも部分的に生体内で代謝されると考えられる。例えば、（−）−デプレニルは経口投与後、肝臓で代謝されて（−）−デスメチルデプレニル、並びに（−）−メタンフェタミン及び（−）−アンフェタミンに変化する。（−）−デプレニルの肝臓代謝は、プロアジフェン等のＰ４５０阻害薬の投与で阻害することができる。動物及び細胞培養研究では、プロアジフェンの投与により、細胞死を防ぐ（−）−デプレニルの能力が落ちることになるが、（−）−デスメチルデプレニルの細胞救護作用を遮断することはない。このように、少なくとも（−）−デプレニルの少なくとも一つの代謝産物、多くの場合（−）−デスメチルデプレニルのことであるが、これが有効な化合物であると考えられる。現在では、（−）−メタンフエタミン及び（−）−アンフェタミンが、デプレニル化合物の細胞救護作用の阻害物質であると考えられている。また、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂの両方を含むＭＡＯ）阻害作用が神経細胞救助作用に必要ではないとも考えられる。ＭＡＯ阻害作用がないことは、実際には、副作用の小さい薬品の提供につながるであろう。このように、いくつかの実施例では、デプレニル化合物の持つＭＡＯ阻害作用が低いか、あるいは、（例えば適したプロドラッグ又は調合物を用いて）ＭＡＯ阻害作用を最小限にするよう投与することが好ましい。
【００６４】
上述の事項を鑑み、（−）−メタンフェタミン及び（−）−アンフェタミン等の阻害因子化合物への代謝を最小限に抑えながらも、（−）−デスメチルデプレニル等の有効化合物への代謝は可能であるという経路でデプレニル化合物を投与することが好ましい。有効化合物への代謝を、例えば目的の器官又は領域、例えば脳など、所望の作用域で行わせることができる。このように、有効化合物へと代謝されるプロドラッグは、本発明による方法では有用である。
特定のデプレニル化合物は、「ファーストパス効果」を減じる又は防ぐよう投与するとより大きな治療上の効験がある（例えばより少量の用量で効果が出るなど）ことが判明している。従って、腹腔内又は特に皮下注射が好適な投与経路ということになる。好適な実施例ではデプレニル化合物は用量を分割して投与されている。例えばデプレニル化合物を頻回（例えば律動的に）注射したり、調整を加えながらの輸注として投与することができ、またこれらは上述のように一定でも計画的に変更してもよい。デプレニル化合物を経口投与する好適な実施例では、経口投与後の肝臓代謝量を減らすようデプレニル化合物を調製することができ、それにより治療効果を向上させている。
いくつかの実施例では、生体内で確実に適宜分散されるよう本発明のデプレニル化合物を調合することができる。例えば血液脳関門（ＢＢＢ）は吸水性の高い化合物を数多く除外してしまう。本発明の治療用化合物がこの血液脳関門を確実に通過する（それが好ましい場合）よう、これらを例えばリポソームに調合することができる。リポソーム製造方法としては、例えば米国特許第４，５２２，８１１号、第５，３７４，５４８号、及び第５，３９９，３３１号を参照されたい。このリポソームに、特定の細胞又は器官に選択的に運ばれる一種又はそれ以上の成分（目標成分）を含めることで、目標の薬品配給を行ってもよい（例えばブイ．ブイ．ラネード著（１９８９）臨床ジャーナル、薬理学、２９：６８５を参照のこと）。代表的な目標成分には、葉酸塩又はビオチン（例えばロウ他による米国特許第５，４１６，０１６号を参照のこと）、マンノシド（ウメザワ他著、（１９８８）生化学及び生物物理学研究諭文、１５３：１０３８）、抗体（ピー．ジー．ブロウマン他著、（１９９５）ＦＥＢＳ書、３５７：１４０：エム．オワイス他著、（１９９５）抗菌物質化学療法、３９：１８０）、サーファクタントプロテインＡレセプタ（ブリスコウ他著、（１９９５）米国生理学ジャーナル、１２３３：１３４）、ｇｐ１２０（シュライア他著、（１９９４）生物化学ジャーナル、２６９：９０９０）があるが、さらにケー．カイナネン及びエム．エル．ローカネン著、（１９９４）ＦＥＢＳ書、３４６：１２３、ジェー．ジェー．キリオン；アイ．ジェー．フィドラー著、（１９９４）免疫法、４：２７３も参照されたい。ある好適な実施例では、本発明の治療用化合物はリポソームに調合され、より好適な実施例ではそのリポソームは目標成分を含んでいる。
【００６５】
以下の発明はさらに以下の例で説明されるが、これらの例からさらに限定的に捉えられてはならない。本出願で引用されているすべての参考文献、係属中の特許出願及び公開特許出願の内容は参考としてここに編入されたものである。例で用いられた神経細胞救助に関する動物モデルは容認されており、またこれらのモデルにおける効験の実証はヒトの場合の効験を予測するものであることは理解されたい。
【００６６】
以下の非限定的例は本発明を描写するものである。
例１
この例は、ＮＰＴＰ投与後に緻密黒質（原語：substantia nigra compacta）（ＳＮｃ）からチロシン水酸化酵素免疫陽性（ＴＨ＋）ニューロンが消失し、それらがデプレニルにより救助されたことを実証するものである。
研究の一番目の部分として、ＭＰＴＰで誘発されるニューロンの死の時間経過を以下のように作り出した。ＭＰＴＰ（３０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を生後８週の同質遺伝子型のＣ５７ＢＬマウス（米国、ジャクソン・ラボラトリーズのナショナル・インスティテューツ・オブ・エージング・コロニーから入手）（Ｃ５７ＢＬ／ＮＮｉａ））；（ｎ＝６／期間）に連続５日間腹腔内投与した（合計用量１５０ｍｇ／ｋｇ）。マウスは、過量の麻酔剤（ペントバルビタール）で死なせ、これらに最後のＭＰＴＰ注射をしてから、５日、１０日、１５日、２０日、３７日及び６０日目に、等張食塩水（５％のレオマクロデックス及び０．００８％のキシロケーンを含む）及び４％のパラホルムアルデヒドで潅流した。解剖した脳を０．１ｍのリン酸緩衝液中４％のパラホルムアルデヒドに一晩浸して２０％のショ糖液中に置いた。
この研究の二番目の部分として、ＴＨ＋ＳＮｃニューロンがＭＰＴＰで誘発される消失からデプレニルにより救助されることを以下のように実証した。ＭＰＴＰ（３０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を生後８週のＣ５７ＢＬマウス（ｎ＝６−８／処置群）に連続５日間腹腔内投与した（−５日目から０日目まで；合計用量１５０ｍｇ／ｋｇ）。ＭＰＴＰ投与中止から３日後、マウスに食塩水、デプレニル（カナダ、デプレニル社製）（０．０１、０．２５又は１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）又はクロルジリン（米国、シグマ・ケミカル・カンパニー社製）（２ｍｇ／ｋｇ）を１週間当り３回施した。デプレニルの投与は３日目まで控えたが、それはすべてのマウスが相当量のＭＰＰ＋に暴露し、かつすべてのＭＰＴＰ及びその代謝産物が中枢神経系から除かれてしまうことを確実にするためである。デプレニルの用量の選択に当たっては、デプレニルがラットの寿命を長くし、ＭＡＯ−Ｂの活性を約７５％阻害するがＭＡＯ−Ｂ活性に影響を与えない（０．２５ｍｇ／ｋｇ）か、あるいはＭＡＯ−Ｂ及びＭＡＯ−Ａの両方を阻害することができる（１０ｍｇ／ｋｇ）ことを実証した研究で用いられた用量を考慮した(Knoll,Ｊ.Mt.Sinai Ｊ.Med.55,67-74(1988)and Knoll,Ｊ.Mech.AgeingDev.46,237-262(1988),Demarest,Ｒ.Ｔ．and Azzarg Ａ.Ｊ.In：Monoamine Oxidase：Structure，function and AlteredFunction(Ｔ.ＰSinger,Ｒ.Ｗ.Von Korff,D.L.Murphy(Eds)),Academic Press,New York(1979)p.423-430)。０．０１ｍｇ／ｋｇデプレニル用量も選択された。
この用量では１０−７Ｍ未満が脳組織に達するであろう。さらなる対照群として、マウスをデプレニルのみで処置し、ＭＰＴＰは投与しなかった。マウスは過量の麻酔剤（ペントバルビタール）で殺し、最後のＭＰＴＰ注射から２０日目にパラホルムアルデヒドで潅流した。
【００６７】
研究の両方の部分において、脳は正中線に沿って縦方向に二等分し、二分の一の脳を、表面の標識構造がロンギテューディナル・レジスター（原語:longitudinalregister）にくるよう、ティシューテックを用いて互いに接着した。接着した脳を−７０℃のメチルブタン中で凍結させた後、１０μｍの連続断片を各ＳＮｃの全縦方向長に沿って切り取った。
断片は、一つ置きに、ここに文献として編入することとするSenluk,Ｎ.Ａ.et al.Brain Res.527,7-20(1990)and Tatton,Ｗ.Ｇ.etal.Brain Res.527,21-32(1990)に概ね述べられているように、一次抗体として多クローンＴＨ抗体、及び、視覚化のための色素原としてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使った標準的アビジン−ビオチン反応（ＡＢＣキット、ベクター・ラブズ社製）を用いてＴＨ免疫細胞化学に向けて処理し、以下のように改質した。スライドに載せた断片を０．２％のトリトン／０．１Ｍのリン酸緩衝液中、標識を付けていない一次ＴＨ抗血清（ユージーン・テック社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。組織をリン酸緩衝液で洗浄した後、ビオチニレーテッド（原語：biotinylated）ヒツジ抗ウサギＩｇＧ二次抗体と共に１時間インキュベートし、アビジン−ＨＲＰでインキュベートした。０．０１％の過酸化水素中０．０５％のＤＡＢ溶液を用いて免疫反応性体細胞を視覚化した。相対的光学密度測定には、検定手続きにおけるスライド間のばらつきの作用を減らすために対照群及びＭＰＴＰ処置した脳から採った断片を同じスライドに載せ、免疫細胞化学のために処理した。
ＴＨ＋ＳＮｃニューロンの数は、各全核を通じて番号を付された一つ置きの連続断片の数により得た。断片は、観察者の偏見を避けるために複数の盲検観察者により再度計数をしてもらった。その値は断片の厚さ分を補正した（Konigsmark,Ｂ.Ｗ.In:Nauta,Ｗ.Ｈ.,Ebesson Ｓ,Ｏ.Ｅ.ed.,Contemporary Research Methods inNeuroanatomy,New York,Springer Verlag,p.315-380,1970）。中間値プラスマイナス中数の標準偏差を、食塩水を注射された対照群マウスについて計算した。次のデータはこうしてこの中間数のパーセンテージとして図２に示すように表された。
【００６８】
間にある断片はニッスル染色して核の輪郭を規定した（ここに参考文献として編入することとするSeniuk et al.Brain Res.527:7,1990:Tatton et al.Brain Res.527:21.1990を参照されたい）。接着された二分の一の脳について対になる二分の一断片は、実験群及び対照群中のニューロン数の差が、貫通路が異なっていたり、抗体又は試薬への暴露が異なったことが原因で生まれないようにするためである。
各動物のそれぞれの核の長さ方向に渡る２０の無作為に選択された二分の一断片上で、ＴＨ＋体細胞を含む領域を顕微鏡につけたカメラルシダを用いてたどり、その輪郭を、標識構造の局部的組織的特徴を利用してすぐ隣のニッスル断片に転位させた（それぞれの核は通常、約９０対の断片を含んでいた）。核小体を輪郭内に含むニッスル体細胞の数を三つの大きさのグループに分けて計数した（小型−１４０から２８０μｍ２、中型−３００から５４０μｍ２、及び大型−５４０から８４０μｍ２）が、グリアの輪郭（４０から１００μｍ２）は、ラットのＳＮｃに用いた基準と同様な基準を用いて除外した（Poirier et al.1983 Brain Res.Bull.11:371）。ＴＨ＋体細胞の数を、２０個のすぐ隣り合う断片の対応する区域にあるニッスル体細胞の数に対して表にした。ニッスル数／ＴＨ＋数を同じ表にすることで、ＴＨ＋ＳＮｃ対細胞の数の減少が、ニューロンの破壊によるものか、それとも生き延びたニューロンによるＴＨ免疫反応性の消失によるものかを判定する手段が提供される（この手続きの根拠について詳しくは上述のSeniuk et al.1990を参照されたい）。
【００６９】
図３は、ＭＰＴＰ後０日目から２０日目までにかけてＴＨ＋体細胞がＳＮｃから消失しており、その後は減少していないことを示すものである。ＴＨ＋体細胞のうち２０から３０％が、注射計画の終了後５日間で消失しており、ＴＨ＋ニューロンの消失はさらにその後１０日から１５日間に渡って続くがその後は消失していない。このようなＴＨ＋ニューロンの継続的な消失は、ＭＰＴＰの存在又はその毒性代謝産物ＭＰＰ＋の存在によっても説明できないであろうが、なぜなら、これは体内からは迅速に排出されるためである(Johannessen,Ｊ.Ｎ．et al.,LifeScie,36,219.224(1985);Markey,S.Ｐ et al.,Nature,311,465-467(1984);andLau et al.,Life Sci,431459-1464(1988)）。いくつかのニューロンは、ＭＰＴＰでも見られるように、軸索の損傷後に修復を開始する能力を持ち合わせており、その修復は、成長しつつあるニューロンがその軸索又は神経突起を伸ばしていくときに利用されるのと同様なＤＮＡの転写「プログラム」を再活性化させることで行われる（Barron,Ｋ.Ｖ．in Nerve,Organ and Tissue Regeneration:ResearchPerspectives(ed.Seil,J.),3-38(Academic Press,New York,1986)を参照されたい）ＴＨ＋ＳＮｃニューロンの場合、これらのニューロンがＭＰＴＰ誘発性の損傷後に効果的な修復及び回復を行えるか、あるいは死んでしまうかを決めるのに重要な２０日間の期間があるように思われる。
【００７０】
食塩水のみを処置したマウスのすぐ隣り合う断片の対応する区域で調べたＴＨ＋ＳＮｃ体細胞及びニッスル染色したＳＮｃ体細胞の数を同時に表した表を見ると（図３Ａ１乃至Ａ３では数値を三匹の動物についてプールした）、ＴＨ＋体細胞の数はニッスル体細胞の数に線形に関連しており、中型ＳＮｃ体細胞（図３Ａ２）及び大型ＳＮｃ体細胞（図３Ａ３）の等値の対角線の周りに近いところに散らばっている。図３の各表では、二分の一断片毎の体細胞のニッスル計数及びＴＨ＋計数の中間＋／−１．０標準偏差は、それぞれ各Ｙ軸の上端と各Ｘ軸の上端とに見られる。中型及び大型の体細胞については、ニッスル体細胞の中間数はＴＨ＋体細胞の対応する中間数を５から１０％越えており、これは、ＴＨ＋でない黒質線条体ニューロンのパーセンテージに対応するように思われる（Van der Kooyet al.Neuroscience28:189,1981）。
食塩水処置した動物の小型ＳＮｃ体細胞の同時に表した表から、小型ニューロンのごく一部分のみがＴＨ免疫反応性であり、従ってドーパミン作動性であることが分かる（図３Ａ１）。これらの結果は、大型及び中型の体細胞はドーパミン作動性の黒質線条体ニューロンのものであり、小型の体細胞は多くの場合、局部的に分枝した介在ニューロンのものであることを提示した、げっ歯類における以前の発見と一致している（上述のVan der Kooy et al.,1981;Poirier et al.BrainRes.Bull.11:371,1983）。ＭＰＴＰのみを処置した動物又はＭＰＴＰで処置した後に食塩水で処置した動物（図３Ｂ１、３Ｂ２及び３Ｂ３ではＭＰＴＰ−食塩水処置した三匹の動物の数値をプールした）のニッスル体細胞数／ＴＨ＋体細胞数を同時に表した表から、ＭＰＴＰ処置終了後２０日間でＴＨ＋体細胞が消失したことは、生き延びたニューロンにおいてＴＨ免疫反応性が消失している事ではなく、ＳＮｃニューロンの死を示すものであることが裏付けられた。図３Ｂ２及び３Ｂ３は、中型及び大型体細胞において、それぞれニッスル及びＴＨ＋体細胞の数が、断片当り２１．６＋／−１５．５及び２０．６＋／−１５．５から１２．４＋／−８．０及び１１．４＋／−７．２へと減少した（数値は中間＋／−１．０標準偏差）にも関わらず、これらの計数の間にほとんど等しい数値関係が維持されていることを示している。もしＳＮｃニューロンがＴＨ免疫反応性を失っているにもかかわらず死んでいかないのであれば、この表の散らばりは等値対角線の上方の位置にずれていたであろうと予測される（Seniuk et al.Brain Res.527:7,1990）。さらに、図３Ｂ１から、小型のニッスル染色体細胞数は、小型のＳＮｃ体細胞のＴＨ＋成分の減少（断片当り４．１＋／−２．８から２．３＋／−１．６へ）に伴って僅かに減って（断片当り２６．２＋／−１８．３から２２．４＋／−１２．５へ）いることが分かる。もし中型及び大型のＳＮｃ体細胞の消失のうちいくらかは萎縮が原因であり、その結果これらの横断面領域が、ＭＰＴＰ処置に反応する中型及び大型領域にもはや該当しないということであれば、小型のニッスル染色する体細胞の数の増加が予測されるであろう。
【００７１】
ＭＰＴＰ処置終了後０日、３日、５日１０日１５日及び２０日目と食塩水による対照群のニッスル／ＴＨ＋を同時に表したものを図４及び５に示す。
図４は、食塩水による対照群動物のげっ歯類における、ＳＮｃ体細胞の三つの主要な大きさグループ（小型横断面体細胞面積、１４０−２８０μｍ２、中型横断面体細胞面積、３００−５４０μｍ２、及び大型横断面体細胞面積、５４０−８４０μｍ２）のニッスル／ＴＨ表である。データはＭＰＴＰへの暴露終了後０日、３日、５日、１０日、１５日及び２０日の時点で殺した食塩水対照群についてプールした。前述したように、小型ＳＮｃ体細胞のニッスル／ＴＨ＋を共に示した表は概ね等値対角線の上方に来ている（ニッスル計数の断片当りの中間値は３１．９＋／−１９．２であり、ＴＨ＋計数の中間値は３．５＋／−２．６）が、これは、小型の体細胞のほとんどは非ドーパミン作動性ニューロンのものだからである。対照的に、概ねドーパミン作動性であることが知られている中型及び大型の体細胞は、等値対角線に近いところに集まっている（中型体細胞ではニッスル中間値／断片は１５．８＋／−１２．８、ＴＨ＋中間値／断片は１４．７＋／−１２．３であり、大型体細胞ではニッスル中間値／断片は３．２＋／−３．５、ＴＨ＋中間値／断片は２．９＋／−２．４）。従って食塩水対照群では、中型及び大型のニッスル染色可能な体細胞の大部分は、ＴＨ免疫反応性でもある。
【００７２】
図５からは、０日目の時点（ＭＰＴＰ暴露の最終日）では、中型体細胞（中型体細胞はｄＳＮｃニューロンの９０％を越える割合を占める）の表の大部分が当地対角線の上方に来ており、食塩水処置した動物で設定した点の領域の上方にあることが分かる。このことは、中型ｄＳＮｃニューロンの大きな部分が、検出可能なＴＨ免疫反応性を失ってはいるが、０日目の時点では死んではいないことを示すものである（プールされた食塩水対照群の中間ニッスル数／断片１５．８＋／−１２．８をＭＰＴＰに暴露した０日目の１４．８＋／−９．７に比較されたい。中型体細胞の１４．８／１５．８が０日目の時点ではまだ存在することが分かる）。点の位置は５日目から２０日目にかけて次第に食塩水対照群で設定された帯域内に戻るが、一方、等値対角線に沿った点の広がりは表の始点に向かって縮んでいる。ニッスル／ＴＨ＋を共に示した表中の点位置が次第に変化していることは、ニューロンが２０日という期間をかけて次第に死んでいくため、２０日目までには、生存する中型ニューロンのすべてが検出可能なＴＨ免疫反応性を有することとなることを示している。
【００７３】
図６は、０日目から６０日目の間の食塩水対照群の中間値に対する、ニッスル染色した体細胞のパーセンテージと、ＴＨ免疫反応性体細胞のパーセンテージとを重ね合わせて示した表である。ＴＨ免疫反応性のパーセンテージと、ニッスル染色したパーセンテージとの差は、毒素のためにＴＨ合成ができなくなるまで損傷を受けながらも死には至っていないｄＳＮｃニューロンのパーセンテージを示すものである。従って、デプレニル処置を開始した３日目の時点では、ｄＳＮｃ体細胞の平均３７％が検出可能なＴＨ免疫反応性を失ってはいるが、死んだのは僅かに４％であった。この二つの表は、ＴＨ免疫反応性体細胞のパーセンテージがニッスル染色可能なＳＮｃ体細胞の数と変わらなくなっている１５日から２０日の間で収束している。二つの表の差から、ＭＰＴＰへの暴露後の各時点で、重度の損傷を受けながらも救助可能と考えられるｄＳＮｃニューロンのパーセンテージを推測することができる。
図６の重ね合わせた表によれば、１５日から２０日目までに死んだｄＳＮｃニューロンの８４％が３日目の時点であれば救助可能であったと考えられる。従って、この８４％のうち６６％をデプレニルが救助、実際にはデプレニル処置が、治療を開始する前に死んでいないニューロンの７９％を救助したと判明した。
【００７４】
図７は、それぞれの核の全頭−尾長に渡って１０ミクロンずつ一つ置きに採取した連続断片の個々のＳＮｃ核のＴＨ＋ＳＮｃ体細胞の生の計数を、累積度数分布図に示した図である。各処置について４回の代表的試験を図７に示してある。
食塩水のみで処置したマウス、ＭＰＴＰ（１５０ｍｇ／ｋｇ）及び食塩水で処置したマウス、並びにＭＰＴＰ及びデプレニル（０．２５ｍｇ／ｋｇ、１週間当り３回）で処置したマウスから採ったニューロン計数の数値は、図８の柱状図表で示されたものにも用いられている。図８に示すように、すべてのＳＮｃ核（ｎ＝４／処置群）に関する累積度数分布曲線が示す同じようなパターンから、ＭＰＴＰ後にＴＨ＋体細胞が消失し、それらがデプレニルにより救助されるという事象は核のすべての部分で起きているが、毒素に対して相対的により抵抗力のあるニューロンを含んだ核の頭部分（断片１０−４０）で最も大きいことが分かる。さらに図８からは、三つの動物群の間で個々の度数分布曲線に重複がないことも見ることができる。
【００７５】
図９は、核の頭−尾長に沿ったｄＳＮｃニューロンのＴＨ＋体細胞計数を示す。６匹の動物の頭−尾計数は各表に重ね合わせてある。それぞれの下側の部分は免疫反応性ｄＳＮｃニューロンの合計数を示し、またデプレニルによる救助を示す。
図８に示したデータは、全実験の平均計数（ｎ＝６−８マウス／処置群、つまり１２−１６ＳＮｃ核）にＴＨ＋体細胞／ＳＮｃ核のＳ．Ｅ．Ｍを±したものを示す。これらの数値を得るために、ＴＨ＋体細胞の生の計数を、Contemporary Research Methods in Neuroanatomy（eds.Nauta,Ｗ.Ｈ.and Ebesson ＳＯＥ）の３１５−３８０（Springer Verlag,New York,1970）でKonigsmark,Ｂ.Ｗ.氏が述べた通りに、補正係数２．１５を用いてニューロン数に変換した。図８は、ＭＰＴＰのみを投与された動物に比較して、デプレニル処置されたマウスのＴＨ＋ＳＮｃ体細胞数が増加していることを示し、デプレニルがＭＰＴＰで誘発された毒性に伴うニューロンの死の一部分を防いだことを示唆している。低用量及び高用量のデプレニルは両方とも、ＴＨ＋ＳＮｃニューロンの消失を防ぐ意味では等効果であった。
具体的には、図８は、食塩水のみで処置した動物で判明したＴＨ＋体細胞の中間補正計数３０１４＋／−３０４（中間＋／−ＳＥＭ）が、ＭＰＴＰのみを処置した動物（１７５６＋／−１６１）及びＭＰＴＰ−食塩水群（１８７２＋／−１８７、１９０４＋／−３０８及び１８０５＋／−１８５）では著しく減少している（マン−ホイットニー・テスト、ｐ＜０．００１）ことを示す。従って、ＭＰＴＰは、これら三つのＭＰＴＰ前処置群のＴＨ＋体細胞の平均的消失３６％、３８％及び４２％を引き起こしたことになる（図８の黒い柱）。ＮＰＴＰ食塩水対照群はすべて、統計学的に同じである（ｐ＞０．０５）。図８ではまたＭＡＯ−Ａ阻害物質であるクロルジリンがニューロンを救助しないことを示しているが、それは、ＭＰＴＰ−食塩水（１７０６＋／−１５５）及びＭＰＴＰ−クロルジリン（１７２５＋／−２１３．６）の数値は統計学的には同じだからである。
【００７６】
デプレニルは、１０、０．２５及び０．０１ｍｇ／ｋｇ用量与えたときにそれぞれ２５８６＋／−１６１（１４％の消失）、２５３５＋／−１６９（１６％の消失）及び２７４７＋／−１４５と、ＭＰＴＰ後のＴＨ＋ＳＮｃ体細胞数を著しく増加させていた（ｐ＜０．００５）。従って、デプレニルはすべての用量で、ＭＰＴＰによるＴＨ＋体細胞の消失を、ＭＰＴＰの後に食塩水を与えたときに見られた消失の５０％未満まで減少させており、この三つのデプレニルはすべて、食塩水で処置した動物に比較して、同様な、そして統計学的に大きな（ｐ＜０．００１）増加をニューロン数にもたらすと言える。
【００７７】
図１０は、食塩水のみ、ＭＰＴＰのみ、ＭＰＴＰ−食塩水、ＭＰＴＰ−クロルジリン、ＭＰＴＰ−デプレニルで処置した動物で判明したＴＨ＋体細胞の中間補正数を示し、表はこの種々の処置のタイミングを示すものである。さらにこの図は、デプレニルのみを処置した動物の体細胞数も示す。デプレニルだけでは、ＭＰＴＰに予め暴露していない動物のＴＨ＋体細胞数には変化はない。
上述したＭＰＴＰ誘発性のＴＨ＋ＳＮｃニューロンの消失の時間経過を考えると、図７及び８の示す結果はより驚くべきものがある。２０日目までに死ぬＴＨ＋ＳＮｃニューロンの７５％が、５日目までに既にそれらのＴＨ免疫反応性を失っており、死ぬことになるＴＨ＋ＳＮｃニューロンの僅かに２５％のみが、５日目から２０日目の間にＴＨ免疫反応性を失い続けていた。ニューロン消失の時間経過は本研究の一番目の部分及び二番目の部分の間で同一だと想定すると、ＴＨ＋ＳＮｃ体細胞の数は、中間値の３０１４体細胞／核から３日目の２１６９まで減少し、さらに減少を続けて２０日目までに平均の１８７２体細胞／核になっていたはずである。デプレニル処置したマウス（０．２５ｍｇ／ｋｇ）は平均２５３５体細胞／核を有していたため、投与の１７日間で死んでしまったはずのＴＨ＋ＳＮｃニューロンをデプレニルがすべて救助したこと、さらにＴＨ＋免疫細胞化学ではもはや検出不能ないくつかのＴＨ＋ＳＮｃニューロンまで救助していた可能性があることを示している。
ニッスル／ＴＨ＋計数を一緒に表した図３Ｃ１−Ｃ３の表は、０．２５ｍｇ／ｋｇ用量のデプレニルに続きＭＰＴＰを処置した３匹の動物からプールしたデータを表にしたものである。図３Ｃ２は、ニッスル及びＴＨ＋中型ＳＮｃ体細胞の消失の減少を、ＭＰＴＰ−食塩水動物（図３Ｂ２）での消失に比較しつつ、共に示す。ＭＰＴＰ−食塩水動物（図３Ｂ３）の場合と比較すると、ＭＰＴＰ−デプレニル動物（図３Ｃ３）の大型体細胞の消失の減少の方が小さい。ニッスル／ＴＨ＋を同時に示した表により、ＭＰＴＰ−デプレニル処置したマウスにおけるＴＨ＋ＳＮｃ体細胞の消失が減少したことは、ＴＨ免疫反応性でないニューロンの数が減少したのではなく、ニューロンの死が減少したことが原因であることが裏付けられる。
【００７８】
例２
例１で示した手続き後、ＭＰＴＰマウスにデプレニル（０．０１ｍｇ／ｋｇ又は０．２５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。初回の０．２５ｍｇ／ｋｇ又は０．０１ｍｇ／ｋｇのデプレニル投与から24時間後、そして１８日後（２１日目に該当するが、これは２０日目に免疫化学法に先立って動物を殺した直後に当たる）に、以下に述べる方法に基づき、ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂ測定を行った。
ＭＡＯ活性は、Wurtman,Ｒ.Ｊ.氏及びAxelrod,Ｊ.氏の方法(Biochem Pharmacol1963;12:1439-1444)により新鮮な組織ホモジネートで検定したが、ＭＡＯ−ＡとＭＡＯ−Ｂとを区別するために基質は変更した。この方法は、トルエン／酢酸エチル中の（１４−Ｃ）−セロトニン（ＭＡＯ−Ａに向けて）又は（１４−Ｃ）フェニールエチルアミン（ＭＡＯ−Ｂに向けて）の酸性代謝産物の抽出に依拠するものである。組織ホモジネートを、放射性の標識を付けたセロトニン（１００マイクロモル）又はフェニールエチルアミン（１２．５マイクロモル）のいずれかを含んだリン酸カリウム緩衝液中で３７℃で３０分間インキュベートした。ＨＣ1を加えてこの反応を停止させ、酸性の代謝産物をトルエン／酢酸エチル中に抽出した。トルエン／酢酸エチル層中の放射活性を液体シンチレーション・スペクトロメトリで判定する。沸騰させた組織ホモジネート又は５つの酵素を含んだ反応混合液のいずれかからブランクを得る（Crane,Ｓ.Ｂ.and Greenwood,Ｃ.Ｅ.DietaryFat Source Influences Mitochondrial Monoamine Oxidase Activity andMacronutrlent Selection in Rats.Pharmacol Biochem Behav 1987:27:1-6）。
【００７９】
図１１は、初回の０．２５ｍｇ／ｋｇ又は０．０１ｍｇ／ｋｇから２４時間後、及び１８日後（２１日目に該当するが、これは２０日目に免疫細胞化学法に先立って動物を殺した直後に当たる）に行ったＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂ測定を示す。従って、ＭＡＯ−Ｂ阻害作用（１００％−ＭＡＯ−Ｂ活性）がこの１７日間の処置期間の間に次第に増加すると考えられるため、二つの測定値（図２に対応させてｄ４及びｄ２２のラベルをした）は処置期間の開始時及び終了時のＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂ活性を描き出す。
各対（食塩水及びデプレニル処置）の上方の括弧内に示したＫＳ確率は、デプレニル−食塩水の対が同じ集団から抽出されたかを調べるためのコルモゴロフースミルノフの二試料非媒介変数的統計学的検定を表す（Siegel,Ｓ.Non ParametrIcStatistics for the BehavIoral ScIences,McGrawhill Book Company,New York,1956,pp.127-136）。この確率の数値は、データが同じ集団を由来とするものかの確率を示すものである。大きな差を検出するにはｐ＜０．５の数値が必要であり、ｐ＜０．０１であることが好ましい。従って、０．２５ｍｇ／ｋｇのデプレニル用量のｄ４において弱くはあるが検出可能なＭＡＯ−Ａ阻害作用があるが、ＭＡＯ−Ｂ阻害物質はより高い用量のときに弱いＭＡＯ−Ａ阻害作用を起こすと考えられるため、これは現実的である。０．２５ｍｇ用量は、ｄ４（７２％活性、２８％阻害）及びｄ２２（３１％活性、６９％阻害）の両方で強いＭＡＯ−Ｂ阻害作用を起こす。抗抑制作用のためには９０パーセント以上のＭＡＯ−阻害作用が必要であるが、おそらくは、２８から６９％のＭＡＯ−Ｂ阻害作用があれば、０．２５ｍｇ／ｋｇのデプレニル用量で救助を媒介するであろう。
最も重要なことは、０．０１ｍｇ／ｋｇ用量はｄ４及びｄ２２で大きなＭＡＯ−Ａ又はＭＡＯ−Ｂ阻害作用を生じなかったことである。従って、０．０１ｍｇ／ｋｇで見受けられた著しい救助は０．２５ｍｇ／ｋｇの救助と効果は等しかったが、ＭＡＯ−Ｂ阻害作用によるものではないはずである。従って、デプレニルは、ＭＡＯ−Ｂを遮断する構造とは関係のない３Ｄ構造を通じてレセプタを活性化すると考えられる。
【００８０】
例３
ジャクソン・ラブズ（メーン州、バー・ハーバー）から入手した生後５週のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを別々の籠に入れて、適宜エサ及び水を与えた。マウスには最初の２週間、２１℃に保たれた隔離した部屋で１２：１２時間の明：暗（ＬＤ）サイクルに馴れる順化期間を与えた。実験上の「昼間」は８時に開始し、実験上の「夜間」は２０時に開始した。実験上の昼間の間、光量は２００ルクスに保った。移動運動をストーリング・エレクトロニック・アクティビテイ・モニタを用いて選択的に数量化したが、この際個々のセンサ・ボックスは各籠の下に配置した。食餌や毛づくろいなど、高周波信号障害は記録しなかった。個々のマウスの移動運動を、連続的暗状態（ＤＤ）又はＬＤ状態で９０から１２０日間継続して観察した。約２０日後にマウスに一日二回、（総用量３７．５、７５、１５０及び３００ｍｇ／ｋｇとなるように）食塩水又はＭＰＴＰの注射を５日間（注射前の日は−５から０日）行った。注射は必ず実験上の昼間に行い、最初の注射は「点灯」から４時間後に行い、二回目の注射は「消灯」より４時間前の時点で行った。
【００８１】
移動運動のスペクトル分析(Bloomfield,Ｐ.Fourier Analysis of Time Seriess AnIntroduction;John Wylie and Sons:New York,1976,Brigham,Ｅ.Ｏ．The FastFourier Transform;Prentice-Hall,New, York, 1974, Marmarelis, Ｐ.Ｚ.;Marmarelis,Ｖ.Ｚ.Analysis of Physiological SystemsThe White-Noise Approach;Plenum Press:New York and London，1978）を高速フーリエ変換を用いたＳＹＳＴＡＴ統計ソフトウェア・プログラムで行った。２４０時間（約１０日間）又は１２０時間（約５日間）をちょうど経過した期間の活動計数を用いた。試料の数は、２のべき乗の法則を満たすように１２８、又は２５６をちょうど越えるように選択した。フーリエ分解の前に、活動値にスプリット・コサイン・ベル（原語：split-cosine-bell ）漸減を行って強い成分からその他の成分への漏れを減らした。次に、これらの数値にゼロを付けて５１２試料にふくらませた。次に、時間／周期値が５．１２から５１２までの間の１００点についてフーリエ変換を行った。大きさを二乗して各成分の強さを求め、各時間／周期値のパワーをは、全パワーの合計値に対する割合で表した。
【００８２】
最後のＭＰＴＰ注射から５日、１０日、１５日及び２０日目の時点で神経化学検定を行った。マウスを頸部脱臼で殺し、脳を取り出した。側坐核及び尾状核をを含むよう、線条体組織を切り取った。この組織を、そのカテコールアミン濃度を逆相イオン対高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により電気化学検出するまで、２−メチルブタン（コダック社製）中で−７０℃に凍結させた。組織試料の重量を計測した後、内部基準としてジヒドロキシルベンジルアミンを含んだ０．２Ｎの過塩素酸中で均質化し、アルミナ上に抽出した（Mefford,Ｉ.Ｎ.Ｊ.Neuroscl.Neth.1981,３,207-224）。カテコールアミンは０．１Ｎのリン酸中に脱着させ、濾過し、ウルトラスフィアＯＤＳ５ミクロンカラムに注入した。その移動相は７．１ｇ／１のＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍｇ／ｌのＥＤＴＡ、１００ｍｇ／ｌの硫酸オクチルナトリウム及び１０％のメタノールを含んでいた。検出器の電位は＋０．７２対Ａｇ−ＡｇＣｌ基準電極であった。運転間の変動性は約５％だった。図１２は、９２日間の典型的な記録であり、黒い棒はＭＰＴＰ注射の間隔を示す（合計１５０ｍｇ／ｋｇ、毎日３０ｍｇ／ｋｇを５日間）。活動の追跡の上にある各々の縦の棒は１時間中の活動の合計を表す。１００から２００時間の期間に、早い（約２４時間）概日リズムに、より遅いリズムが重なっており、これにより活動のピークの振幅に周期的なばらつきが出ていることに注目されたい。これらのパターンの規則性は活動の振幅と共に、ＭＰＴＰ注射期間（６７５時間目から８４２時間目）の間に大きく影響を受けているが、１２００時間までに、つまり注射後１５から２０日目で「回復」しているように見える。
【００８３】
時間領域中の移動運動の分析は、複数の内因性活動サイクルが重なり合っているために複雑になっているため、フーリエ分析を用いてデータを定量化した。食塩水を注射したマウスのＬＤ及びＤＤ注射前対照期間に関する高分解能パワースペクトルを図１３に示す。このスペクトルは２５６の活動計数について計算し、４０９６数値まで０でふくらませてからフーリエ変換を行った。図１３Ａでは、両ＬＤ及びＤＤスペクトルは、約２４時間／周期の時点に大きなピークがあり、全パワーの７５％を越えるパワーを含んでいる。ＤＤピークの重心が僅かにずれて、ＬＤピークよりも約９分短い周期長になっていることに注目されたい。図１３Ｂでは、二次ピークが１００から２５０時間／周期の間にあり、このことは図１２の未処理データから得た考察とも一致している。このピークは、ＬＤスペクトルに比較すると、ＤＤスペクトル側に約５０時間／周期ずれている。それより長い時間／周期値ではその他のピークはなかった。ＬＤエンターテインメント（原語：entertainment）の間でのみ起きる三番目のより小さなピークは６０から９０時間／周期に渡ってあることに注目されたい。遅い方のピークから概日ピークがはっきりと分かれていることで、ＭＰＴＰ処置後に優位な２４時間成分のパワーの変化を個別に評価することが可能であった。従って移動活動は、２２−２６時間／周期ピークのところでパワーのパーセンテージとして測定された。
【００８４】
図１４では、パネルＡから、食塩水を注射するという、動物の内因性活動にとっての妨げが、注射前及び注射後の日に対するＰ２２−２６のパワーのパーセンテージを減少させるのに充分であったことが分かる。従って、パネルＢで示すような活動の変化はＭＰＴＰ注射期間によるものとして説明できない可能性がある。食塩水の注射では、注射後期間のＰ２２−２６の変化は生じていない（一例はパネルＣ）。対照的に、１５０及び３００ｍｇ／ｋｇ用量の結果（図１５を参照されたい）、Ｐ２２−２６の抑制が著しく見られたが、これも１２日目から２０日目の間に回復している（パネルＢ及びＤ）。
図１５から、食塩水及び３７．５又は７５ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰ注射では、対照となる注射前期間のそれからはＰ２２−２６の移動活動は大きくは変化しなかったことが分かる（誤差棒はプールした対照活動の＋／−１標準偏差を示す）。
対照的に、Ｐ２２−２６のピーク時パワーは、１５０又は３００ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰ処置後５日間で中間対照値の２０から６０％に減少しており、中間日２０日目までには正常に戻っていた。
１５０ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰ又は食塩水を処置した第二群の動物をＴＨ免疫細胞化学に向けて殺し、ＭＰＴＰ注射後５日、１０日、１５日、２０日及び６０日目の時点でアビジン共役カラシペルオキシダーゼ及びジアミノベンジジンで断片を視覚化した。パラホルムアルデヒドで潅流した脳を正中線に沿って二分割し、食塩水を注射した動物及びＭＰＴＰを注射した動物から採った二分の一部分を、表面標識構造がロンギテューディナル・レジスター（原語：longitudinal register）にくるよう、ティシュ・テックを用いて互いに接着した。両方の動物のＳＮｃを調べられるよう、連続する１０μｍの断片を脳幹を通って採取し、食塩水動物及びＭＰＴＰ動物のＳＮｃニューロンがすぐ隣に来て同じような濃度の抗体及び試薬に暴露するようにした。パネルＡ及びパネルＢ（図１６）は５日目及び２０日目における接着された脳のＳＮｃ断片を表す。
【００８５】
図１７のパネルＡは、全核にわたって採取された、ＮＰＴＰ処置後のＴＨ＋ＳＮｃ及びＶＴＡニューロン体細胞の計数を、対応する食塩水注射動物の中間計数のパーセンテージで表したものである（誤差棒は標準偏差）。５日目から２０日目にかけて検出可能なＴＨ免疫反応性を持つＳＮｃ体細胞数が次第に減少しているが、２０日目後は、ＴＨ＋体細胞数は明らかに維持されていることに注目されたい。パネルＢ、Ｃ及びＤは食塩水注射した動物及びＭＰＴＰ注射した動物の線条体ＤＡ及びＤＯＰＡＣの濃度を表す。線条体ＤＡ濃度が正常レベルに回復する時間経過と、図１５の移動活動の回復の時間経過との類似性を注目されたい。ＤＯＰＡＣ／ＤＡ比は、ＭＰＴＰ注射した動物では５から１０日目に渡って著しく増加し急速に減少した後、食塩水注射した動物の約２倍の一定レベルで維持されることを示している。
コンピュータ光学密度（ＯＤ）システムを用いて、接着した脳断片から無作為に選び出したＳＮｃ及びＶＴＡ体細胞のすぐ隣り合う組織における、体細胞の細胞質ＴＨ免疫反応性及びバックグラウンド免疫反応性を測定した（Tatton,Ｗ.Ｇ.et al.Brain Res.1990,527,21.32）。各細胞ごとに、単位面積当りのバックグラウンドＯＤを単位面積当りの体細胞ＯＤから減算して、単位面積当りの細胞質のＴＨ免疫密度を試算した。各接着断片の食塩水を注射した二分の一部分の中間バックグラウンドＯＤを用いて、ＭＰＴＰバックグラウンドＯＤ、食塩水ＯＤ及びＭＰＴＰ細胞質ＯＤの数値を正規化した。図１７は、この正規化したバックグラウンドと、食塩水又は１５０ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰを注射後５日目から２０日目のＴＨ＋ＳＮｃ体細胞の細胞質測定値との分布を表す。接着した脳を用いたこの研究及びその他の研究において、食塩水注射した二分の一片とＭＰＴＰ注射した二分の一片とでバックグラウンド値に大きな違いはなかった（ｐ＜０．０５）ため、細胞質値について有効な比較を行うことができた。食塩水注射した動物の対照分布は、しばしば、ＳＮｃ体細胞について二峰性分布するＴＨ免疫密度を呈しており、バックグラウンドレベルは０．５から６倍、最頻値はバックグラウンドレベルが約２及び４倍のところにある。
【００８６】
５日間の間に、ＭＰＴＰ処置したＳＮｃ及びＶＴＡ体細胞の細胞質ＴＨ免疫密度が著しく減少しており、その後、注射後２０日で食塩水対照群の分布にほぼ近い分布にまで次第に回復している（図１７及び１８）。ＭＰＴＰ処置後のＳＮｃ及びＶＴＡニューロンのＴＨ免疫密度の回復は、線条体ＤＡ濃度及び移動活動の回復に平行している。
本発明者たちは、高速フーリエ変換を用いたスペクトル分析技術を、ＭＰＴＰ処置したマウスの長期間移動活動の分析に適合させた。これにより、最近の取り扱い又は観察者がいることで生じてきた動物の主観的評価に頼らない、感受性が高く、しかも再現可能なデータを提供することができる。そもそも、ラット及びマウスのＳＮｃニューロンは毒素に対して抵抗性があるという見解を理由に、ＭＰＴＰはげっ歯類において運動欠陥を生じないと言われていた。これは、ＭＰＴＰ語の線条体ドーパミンの過渡的変化のみを報告した神経化学データに概ね基づいていた（Ricuarte,Ｇ.Ａ.et al.Brain Res.1986,376,117-124,and Walters,Ａ.et al.,Biogenic Amines 1984,1,297-302）。他の研究者は、高用量の毒素を処置されたマウスにおいて四肢の運動の遅滞、異常歩行及び移動活動の慢性的減少を報告しているが、これは、線条体ＤＡ濃度の変化が維持されたことと相関関係にあるように思われる（Duvoisin,Ｒ.Ｃ.et al.In Recent Development in Parkinson'sDiseases;S.Fahn et al.Raven Press:New York,1986:p.147-154,Heikkila,Ｒ.Ｅ.,et al.Science 1984,224,1451-1453,Heikkila,Ｒ.Ｅ.et al.Life Sci.1985,36,231-236）。ＭＰＴＰ後のげっ歯類移動活動の変化を測定した以前のものは、残念ながら、短期間（Saghal Ａ.,et al.Neuroscl.Lett.1985,48,179-184）であるか、又は短期隔離されただけの測定（Willis,Ｇ.Ｌ.,et al.Brain Res Bull 1987,19,57-62）である。今日までのところ、ネコ（Schneider,Ｊ.Ｓ.,et al.Exp Neurol 1986,91,293-307）、マーモセット（Waters,Ｃ.Ｍ.,et al.Neuroscience 1987,23,1025-1039）又はげっ歯類(Chiueh,C.C.,etal.Psychopharmacol.Bull.1984,20,548-553,andJohannessen,Ｊ.Ｍ..et al.Life Sci．1985,36,219-224)を含め、様々なＭＰＴＰモデルで観察されてきた行動の回復に対して満足な説明はなされていない。
【００８７】
Ｐ２２−２６ピーク下でのパワーで測定される移動活動、ＳＮｃ及びＶＴＡ体細胞中の線条体ＤＡ濃度及びＴＨ免疫密度は、ＭＰＴＰ処置後にこれらが正常へ回復するという点で相関関係にある。検出可能なＴＨ免疫反応性を持つＳＮｃ及びＶＴＡ体細胞数はＭＰＴＰ処置後、最初の２０日間かけて安定状態レベルまで減少する。従って、線条中のドーパミン含有量は、検出可能なＴＨ含有量を持つＳＮｃニューロン及びＶＴＡニューロンが減少している間に増加している。ＤＯＰＡＣ／ＤＡ比の急速な上下は、おそらくは線条中のＤＡ末端が死んでＤＡが細胞外空間へと消失していくことに関係があるであろう。しかしながら、この比は１５日目以降は増加レベルで維持されるため、ＤＡ合成は、ＭＰＴＰへの暴露から生き延びたＳＮｃニューロン中で増加すると示唆した先の発見が裏付けられている。
ＳＮｃ及びＶＴＡニューロンの体細胞中のＴＨ免疫密度の測定値は、おそらく、ＴＨ濃度の線形推定値とはならない。ペルオキシダーゼ反応の利用により、細胞質中の二次抗体−アビジン錯体の数を線形に推定することはできよう(Reis,Ｄ.Ｊ.et al.In Cytochemical Methods in Neuroanatomy Alan Ｒ.Liss,Inc.:New York,198;p.205-228）が、本発明者の多クローン性抗体の、そして一次及び二次抗体間の免疫反応の親和定数からは、エピトープの濃度とアビジン分子の濃度との間に線形関係があるとはならないであろう。それでも尚、この結果はおそらくは、ＭＰＴＰへの暴露を生き抜いたＶＴＡ及びＳＮｃの体細胞中のＴＨ濃度に回復があることを示すであろう。ＴＨ免疫密度の回復は線条体ＤＡ含有量の増加に平行するが、これは、ＴＨ合成の回復が、ＤＡ含有量の回復の、そしておそらくは個々の生存ニューロンにより増加したＤＡ合成のファクタであることを示唆している。
【００８８】
げっ歯類における新線条体ドーパミン作動性及びその他のカテコールアミン作動性系が、移動活動の生成に関係づけられてきた（Tabar Ｊ.,et al.Pharmacol Biochem Behav 1989,33,139-146,Oberlander,Ｃ.,et al.Neurosci.Lett.1986,67,113-118,Melnick,Ｍ.Ｅ.et al.17thAnnual Meeting Of The Society For Neuroscience,New Orleans,Lousiana,ＵＳＡ,November 1987,13,Marek,Ｇ.Ｊ.,et al.Brain Res 1990,517，1-7,Rostowski,Ｗ.,et al.Acta Physiol.Pol.1982,33,385-388,Fink,Ｊ.Ｓ.Smith,Ｇ.Ｐ.Ｊ.Comp.Physiol.Psych.1979,93,24-65）。しかし今尚、ＳＮｃ又はＶＴＡニューロンの特定の役割は不明である。従って、移動活動に対して、ＳＮｃの回復及び線条体パラメータの回復が相関付けられたとしても、必ずしも因果関係を意味するものではない。しかしながら、ＭＰＴＰは多種のカテコールアミン作動系において同じようなＴＨ＋ニューロンの消失を引き起こす（Seniuk,Ｎ.Ａ.et al.Brain Res.1990,527sp.7-20）ことから見て、これらの系の伝達物質関連機能が、ＳＮｃ及びＶＴＡドーパミン作動性ニューロンについて我々が示してきたのと同じような回復を行うことが、行動上の回復の根底になっているのではないかと本発明者たちは示唆してきた。ＤＡ合成の回復は、ＭＰＴＰへの暴露を生き抜いたＳＮｃニューロンが彼らの仲間の埋め合わせをしようとすることを意味するものかも知れないが、それはなぜなら、この埋め合わせの成分は回復に関係し、さらにＭＰＴＰへの暴露から生き延びたニューロン中のチロシン水酸化酵素の合成の増加に関係しているからである。
【００８９】
例４
デプレニルが、例えばラットの運動ニューロン等、その他の軸索損傷ニューロン表現型の死を減少させることができるかを調べるべく、実験を行った。軸索切断後に死ぬラットの運動ニューロンの比率は生後４日間の間が最高であり（８９から９０％が消失）、その後３から４週間で成体レベル（２０から３０％の消失）に減少する（Sendtner et al.Nature,345,440-441,1990,Snider Ｗ.Ｄ．and Thanedar,Ｓ.Ｊ．Compl.Neuro 1,270,489,1989）。生後１４日のラツトの二つの群（ｎ＝６）にその片側顔面神経にトランスジェクション（損傷）を与え、一方、二つの群には損傷を与えなかった（損傷なし）。対になった損傷あり及び損傷なし群に食塩水、デプレニル（０．０１及び１０ｍｇ／ｋｇ）、パルジリン（１０ｍｇ／ｋｇ）を一日おきに処置した。このラットを軸索切断から２１日目に殺し、顔面核の高さにある脳幹の冠状組織断片を、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ＣｈＡＴ)免疫細胞化学(ここに参考文献として編入することとするTatton et al,Brain Res.527:21,1990)及びニッスル染色（ここに参考文献として編入することとするSeniuk et al.,Brain Res.527;７,1990:Tatton et al.Brain Res.527:21,1990）に向けて処理した。
【００９０】
具体的には、二つの群の生後１４日のスプラーグ・ドーリーラットにハロタン−笑気麻酔をかけて右側顔而神経を茎乳突孔への出口で離断し、別の二つのグループは未施術のままとした（各群はｎ＝６）。施術の日より、損傷あり及び損傷なし群に１０ｍｇ／ｋｇのデプレニル腹腔内投与を死亡させるまで一日おきに行った。他方の損傷有り及び損傷なし群には食塩水で同一の注射を行った。離断から２１日後にラットを過量の麻酔剤で殺した後、等張食塩水及びリン酸緩衝液中４％のパラホルムアルデヒドで潅流した。損傷なし群から採った脳を正中線に沿って縦方向に二分割し、食塩水処置した動物及びデプレニル処置した動物から採った二分の一の脳を、表面標識構造が合致するようにティシュ−テックを用いて互いに接着した。損傷なしの動物の接着した脳、及び、損傷有りの動物のそのままの脳を−７０℃のメチルブタン中で凍結させ、１０μｍの連続断片を、顔面神経核を含む髄質部分を通って切断した。三つ目毎の断片をＣｈＡＴに対する多クローン性抗体に反応させた後、ビオチニレーテッド（原語：biotinylated）二次抗体と共にインキュベートし、その後ＨＲＰ共役アビジンと共にインキュベートして最終的にはジアミノベンジジン及び過酸化水素と反応させた（Tatton et al,BrainRes.527:21,1990）。接着した二分の一片の脳の対になる断片は、デプレニルと食塩水処置した損傷なし対照群の間で、抗体又は試薬の浸透又は暴露が異なることを原因とする免疫反応性の差が生じないようにするためであった。
【００９１】
さらに、上述の手続きを用いて以下の実験も行った。
生後１４日のラットの一群にその片側顔面神経に離断（損傷）を与え、一方、いくつかの群には損傷を与えなかった（損傷なし）。対になった損傷あり及び損傷なし群に食塩水又はデプレニル（１０ｍｇ／ｋｇ）を一日おきに処置した。このラットを殺し、ここで説明する方法でＣｈＡＴ免疫化学法を行った。
生後１４日のラットの一群にその片側顔面神経に離断を与え、１０ｍｇ／ｋｇのデプレニルを一日おきに２１日間処置した。動物を生後３５日及び６５日で殺し、ここで述べる方法でＣｈＡＴ免疫化学法を行った。
生後１日のラットの一群にその片側顔面神経に離断を与え、食塩水又はデプレニル（１０ｍｇ／ｋｇ）で一日おきにデプレニルを処置した。動物を生後８日で殺し、ここで述べる方法でＣｈＡＴ免疫化学法を行った。
図１９は、顔面神経の離断と同側にある顔面神経核を通って切断した、隣接するＣｈＡＴ免疫反応性（Ａ１及びＢ１）断片及びニッスル染色（Ａ２及びＢ２）
断片の顕微鏡写真を示す。Ａ１及びＡ２は食塩水処置した動物のもの、そしてＢ１及びＢ２はデプレニル処置した動物のものである。
【００９２】
図２０は、異なる損傷及び処置群の顔面神経のＣｈＡＴ＋体細胞の計数を示す棒グラフである（棒−中間値、誤差棒−標準偏差）。核の輪郭を含んだＣｈＡＴ免疫反応性体細胞を、全顔面神経核から連続して採取した断片の三つ目毎に計数した。各棒の一番上に記載した数値は中間値である。同側損傷及び反対側損傷とは、それぞれ顔面神経の離断があった側に同じ側及び反対側に核があったことを示すものである。計数は顔面神経核中のＣｈＡＴ＋体細胞数の合計を推定すべく調節してはいないため、損傷なし群の数はニッスル染色した体細胞数について報告された数値の約３分の１である。これら数値は、マン・ホイットニーＵテストを用いて対を考える方法で統計学的に比較した。
図２０に示すように、顔面神経核の全長に渡って三番目毎にある連続断片のＣｈＡＴ免疫陽性（ＣｈＡＴ＋）体細胞の数は、損傷なし−食塩水群及び損傷なし−デプレニル群と統計学的に同じ（ｐ＝０．５２０）であった。対照的に、このＣｈＡＴ＋体細胞数は、顔面神経離断があった側に同じ側（２３．８％損傷なし−食塩水、ｐ＝０．００３）及び反対側（８２．２％、損傷なし−食塩水、ｐ＝０．０２４）にある顔面神経核の損傷あり−食塩水群では著しく減少していた。デプレニル処置により、同側損傷顔面神経核（５２．７％損傷なし−食塩水ｐ＝０．００４）のＣｈＡＴ＋体細胞数は二倍以上に増加しており、反対側神経核のＣｈＡＴ＋数の減少を防止しており、これらは損傷なし群と統計学的には同じであった（ｐ＝０．８７３）。
【００９３】
図２１は、隣接断片のニッスル／ＣｈＡＴ＋計数を同時に示した表である。ＣｈＡＴに対して免疫反応性である断片の間にある断片の各対の一方はニッスル染色していた。カメラ・ルシダを用い、ＣｈＡＴ＋体細胞数、及びニッスル染色した核小体を含む（基準はOppenheim,Ｒ.Ｗ.Ｊ.Comp.Neurol.246:281,1986に基づく）体細胞数を、各動物のそれぞれの核の長さを通じて無作為に選択された２０の断片の隣接する断片の適合する区域で計数した。次に、プールされた各損傷あり−処置群のうち三匹の動物から採った隣接断片の数値について、ニッスル計数をＣｈＡＴ＋計数に対して作表した。ニッスル及びＣｈＡＴ体細胞数の比較を行って、免疫反応性体細胞の数の減少が、運動ニュ−ロンの死又は免疫反応性の消失のいずれを反映しているかを調べた。
損傷なし群のニッスル体細胞／ＣｈＡＴ体細胞数を同時に示した表（図２１）では、食塩水（ニッスル２７．６＋／−１２．０４、ＣｈＡＴ＋２７．３＋／−１３．８０、ｐ＝０．５２６、同じ群のニッスル及びＣｈＡＴ計数は対ｔテストを用いて比較した）及びデプレニル群（ニッスル２８．９＋／−１３．２、ＣｈＡＴ２８．５＋／−１３．８、ｐ＝０．６４１）で、同じような中間値及び標準偏差があり、等値対角線の周りに線対称に分布していることが分かる。同側損傷有り−食塩水動物（図２１）では、両方の計数はより低く、等値対角線に対して非線対称に分布しており（ニッスル値がより高い数値にずれていることを矢印で示した）、ＣｈＡＴ＋数（９．７＋／−４．０、ｐ＝０．００１）に比較してニッスル数（１２．６＋／−４．１８）の中間値がより高いことにも反映されている。損傷有り−デプレニル点（図２１Ｂ）は食塩水の点よりも減少が小さく、等値対角線の周りに線対称に分布していた（ニッスル１７．６＋／−６．５、ＣｈＡＴ＋１７．５＋／−６．１、ｐ＝０．６１６）。最後に、反対側損傷動物（図２１Ｃ）の表では、食塩水群（ニッスル２４．６＋／−１０．１、ＣｈＡＴ＋２４．８＋／−１０．７、ｐ＝０．１５９）及びデプレニル群（ニッスル２８．９＋／１２．１、２８．５＋／−１２．０、ｐ＝０．７４１）の両方の点とも、等値対角線に対して線対称に分布している。
【００９４】
このように、等値対角線の上方にニッスル／ＣｈＡＴ＋合同表が分布しており、同側損傷あり−食塩水動物（図２１）のニッスル及びＣｈＡＴ＋計数を同時に表した表の間に大きな違いがあることは、図２０に示したＣｈＡＴ＋体細胞数の減少のうち約８４％が運動ニューロンの死を原因とするものであり、一方ＣｈＡＴ免疫反応性の消失のみで引き起こされたのは、ＣｈＡＴ＋運動ニューロンの減少のうち約１６％であったことを示していた。この同時に表された計数から、さらに、反対側の核から失われたＣｈＡＴ＋体細胞の消失はすべて、運動ニューロンの死を原因とするものであることが分かる。最も重要なことは、この合同計数により、デプレニル処置が、運動ニューロンの死を大きく減少させると共に同側の核の生存運動ニューロンのＣｈＡＴ免疫反応性の消失を反転又は防止したことが実証されることである。さらにそれは反対側の核の運動ニューロンの死も防止したのである。
【００９５】
図２２は、生後１４日で片側軸索切断を行ったラットの生後３５日の時点の顔面運動ニューロンのＣｈＡＴ＋計数を示す。この図から、軸索が離断された運動ニューロン（ＩＰＳＩ離断）の救助があったこと、そして脳幹の反対側で死ぬ顔面運動ニューロン（反対側離断）のうち少数が同時に救助されたことが分かる。
図２３は、図２０に示したデータを表にしており（棒グラフの一番左の二つのグループ）、いくつか別の動物（群の大きさは６から８以上に増加した）から採取したデータも含む。さらにこの図は、パルジリンが運動ニューロンを救助することも示す（斜線を施した棒、群がｐ＜０．０５では異なるためにおそらくはデプレニルより弱い）。さらに、ＭＰＴＰモデルで用いられた０．０１ｍｇ／ｋｇ用量と同様、０．０１ｍｇ／ｋｇ用量のデプレニルは運動ニューロンを救助する際に１０ｍｇ／ｋｇのデプレニルと効果が等しいことが判明した。
１４日目で損傷を与え、その後２１日間１０ｍｇ／ｋｇのデプレニルを処置し（ｄ１４−３５）た後、生後６５日まで未処置のままにした動物ではさらなる運動ニューロンの死は見られない（左から三番目の群の棒グラフを、デプレニル処置を続行中のまま生後３５日で殺した第二群の対応する棒グラフに比較されたい）。これにより、軸索切断した運動ニューロンでは救助は永久であること、つまり、デプレニル処置を２１日目以降取りやめても運動ニューロンの死が開始せず、その３０日間の間にもさらなる死がないことが分かる。
【００９６】
図２３はさらに、生後１日の時点で軸索を離断したラットの運動ニューロンは１４日の運動ニューロンよりも死ぬ量が多く、デプレニルで救助できないことを示す。従って、デプレニルが効果を持つにはその前に何らかのファクターが神経系で成熟せねばならず、そのファクターは生後１日から１４日の間に現れると考えられる。
これは、デプレニルが運動ニューロンの死を防ぐことができるという最初の証拠であり、デプレニルが軸索切断により損傷したニューロンの死を減少させられることを示した研究と一致するものである。未成熟のラットにおいて軸索切断した運動ニューロンの死は、運動ニューロンが自らの剌激する筋肉からの栄養補給に依存している状態を反映していると考えられる（Crews,Ｌ.and Wigston,Ｄ.Ｊ.;Ｊ.Neurosci 10,1643,1990;上述のSnider,Ｗ.Ｄ.and Thanedar,Ｓ.）。この考えを裏付けるように、最近の研究では、いくつかのニューロン栄養ファクターにより運動ニューロンの消失を防ぐことができることを示している（Sendtner,Ｍ.et al.,Nature 345:440,1990)。この研究は、デプレニルには、目標由来の栄養物質の消失を補う何らかのメカニズムを活性化する能力があることを示している。神経変性疾患におけるデプレニルの働きの一部には、栄養補給の減少のための同様の補償作用を反映したものかも知れない。
【００９７】
顔面神経離断の反対側にある顔面神経核における運動ニューロンの死が少量であるという発見は、運動神経の離断とは反対側にある無損傷の神経中の軸索の数が減少するという以前の報告（Tamaki,Ｋ..Anat.Rec.56,219,1933）や、反対側の核におけるその他様々な変化に関する報告（Pearson,Ｃ.Ａ.et al.Brain Res.463,1988）と一致する。デプレニルは反対側の運動ニューロンの死を完全に防止するのである。
軸索切断により、顔面運動ニューロン中のたんぱく質合成に過渡的な変化が起きる（Tetzlaf,Ｗ.et al.Neuro Sci.8,3191(1988)）が、その変化の中にはコリンアセチルトランスフェラーゼの減少がある（Hoever,Ｄ．R.＆Hancock,Ｊ.Ｃ.Neuroscience 15,481,1985）。ＣｈＡＴ免疫反応性を失った同側の核（16％）中の食塩水処置した運動ニューロンの比率が小さいことは、おそらく、免疫化学的に検出可能になるまで充分にＣｈＡＴ濃度を回復できなかった生存運動ニューロンを反映するものであろう。デプレニルは、生存運動ニューロン中のＣｈＡＴ免疫反応性の消失を防止又は反転させていた。
【００９８】
デプレニル用量（１０ｍｇ／ｋｇ）はＭＡＯ−Ｂ活性の大半、そしてＭＡＯ−Ａ活性のいくらかを遮断するには充分であった（Demarest,Ｒ.Ｔ.,Aazzaro,Ａ.Ｊ.in Monoamine Oxidase:Structure,Function and Altered Functions（eds.Singer,Ｔ.Ｐ.,Korff,Ｒ.Ｗ.and Murphy,D.L.）423-340,Academic Press,New York,1979）ため、運動ニューロンの死の減少は、ＭＡＯ−Ｂ又はＭＡＯ−Ａの阻害作用が原因かも知れないし、両酵素からは独立のものかも知れない。しかしながら、０．０１ｍｇ／ｋｇのデプレニル用量は、１０ｍｇ／ｋｇ用量で得られるのと同様な運動ニューロンの死の減少をもたらすと期待される。０．０１ｍｇ／ｋｇ用量では著しいＭＡＯ−Ａ又はＭＡＯ−Ｂ阻害作用は生じないことから、０．０１ｍｇ／ｄｇのデプレニルによる救助はＭＡＯ−Ａ又はＭＡＯ−Ｂ阻害作用が原因ではないことが分かる。（例２を参照されたい）。このように、運動ニューロンの死の減少はＭＡＯ−Ｂ又はＭＡＯ−Ａからは独立したものである公算が大きい。
【００９９】
最近の研究では、ＭＡＯ−阻害物質は後線条体ニューロンへの動脈による血液供給が一時的に遮断された後にこのニューロンに起きる壊死を減少させるにはデプレニルよりも効果的であろうと示されている（Matsui,Ｙ and Kamagae,Ｙ.,Neurosci.Lett.126,175-178,1991）。しかしながら、マウスにおいて、ＭＡＯ−Ａ阻害作用を生じるには低すぎるがＭＡＯ−Ｂの２０−７５％の阻害作用を生じるには充分であるデプレニル用量（０．２５ｍｇ／ｋｇ）は、ＳＮｃニューロンの死を防ぐには１０ｍｇ／ｋｇ用量と同じ効果がある。ＭＡＯ−Ｂは、いくつかのセロトニン作動性ニューロン及びヒスタミン作動性ニューロンに存在するのはたしかだが、グリア細胞中に概ね集中している（Vincent,Ｓ.Ｒ.Neurosci 28,189-199(1989):Pintnri,Ｊ.Ｅ.et al.Brain Res.276,127-140，1983）。近くの運動ニューロンに関わる軸索切断に対し、小神経膠細胞は増殖反応を示し、大グリア細胞はたんぱく質合成の増加により反応するため、デプレニルで誘発するニューロン死の防止にはグリア細胞が関係しているのかも知れない。
【０１００】
例５
マウスＳＮＣニューロンの年齢に関係した死
Tatton Ｗ.Ｇ.et al Neurobiol.Aging 1991;12:5,543に記載の手続きを用いて、マウスのｄＳＮｃニューロンの年齢に関係した死をデプレニルが防ぐかどうかを調べるべく、研究を行った。結果を図２４に示す。
図２４に示すように、デプレニルはマウスｄＳＮｃニューロンの年齢に関係した死を防止しない。
【０１０１】
例６
以下の式（化７）を有するＮ−（２−アミノエチル）−４−塩酸クロロベンズアミドを、米国マサチューセッツ州ナティック、のリサーチ・バイオケミカルズ・インコーポレイテッド（Ｃａｔ番号Ｒ−１０６、番号Ｒ０１６−６４９１）から入手し、これが末成熟の軸索切断した運動ニューロンを救助するかを調べた。生後１４日のラットの一群に片側顔面神経離断を行い、１０．５ｍｇ／ＫｇＣのＮ−（２−アミノエチル）−４−クロロベンズアミドを一日おきに２１日間処置した。このラットを生後３５日の時点で殺し、例４で説明したようにＣＨＡＴ＋免疫化学法を行った。
【０１０２】
【化７】
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【０１０３】
図２５は、図２３に示したデータを含むと共に、Ｎ−（２−アミノエチル)−４−クロロベンズアミドを処置した動物から得たデータも含む。
図２５に示すように、この化合物は未成熟の軸索切断した運動ニューロンを救助しなかった（図２５）。この化合物はデプレニル及びパルジリンのアルキニル末端を持たないため、ＭＡＯ−Ｂのフラビン部分の異なる部分に結合又は結び付くのではないかと考えられることに留意されたい。プロパルジル基の結合は永久である（ＭＡＯ−Ｂ阻害作用は反転不能）が、一方、Ｎ−（２−アミノエチル）−４−クロロベンズアミドの結合は反転可能であり、短命である。
【０１０４】
例７
デプレニルの（＋）異性体及び（−）異性体を調べて、未成熟な軸索切断した運動ニューロンの救助が立体特異的かどうかを判定した。生後１４日のラットの一群に片側顔面神経離断を行い、デプレニルの（−）異性体又は（＋）異性体を０．１ｍｇ／ｋｇ、一日おきに２１日間処置した。このラットを生後３５日の時点で殺し、例４で説明したようにＣＨＡＴ＋免疫化学法を行った。図２５に示すように０．１ｍｇ／ｋｇ用量の（＋）デプレニルは運動ニューロンを救助しない。救助は（−）異性体に対して立体特異的であると見られる。このように、（＋）デプレニルはプロパルジル成分を持つにも関わらず、分子のキラル中心の形状が、救助を開始する分子部位への結合に影響があるのかも知れない。
【０１０５】
例８
動物の拍動モデルにおけるデプレニルの影響を調べるべく研究を行った。ラットに一酸化炭素を処置し、グルコースを静脈投与した。次に頸動脈をクランプしてデプレニルをこの動物に投与した。次にクランプを解除して動物の拍動を起こさせた。クランプの解除から３０分後に、未処置の動物の一群にもデプレニルを投与した。上述したように脳の連続断面で陽性ニューロンを調べた。デプレニルは、特に海馬において、ニューロンの死を減少させ、損傷区域を小さくすることが判明した。
【０１０６】
均等物
当業者であれば、ごく通常の実験を行うことにより、ここに説明した本発明の特定の実施例の均等物を数多く認識又は確認できるであろう。このような均等物は以下の請求の範囲の包含するところとして意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】Ｌ−デプレニル、クロルジリン及びパルジリンの公知の分子構造の比較図である。
【図２】ＭＰＴＰ投与後の緻密黒質（原語：substantia nigra compacta）（ＳＮｃ）中のチロシン水酸化酵素免疫陽性（ＴＨ＋）ニューロンの数を示すグラフである。
【図３】食塩水のみを処置した動物（Ａ１，Ａ２，Ａ３）、ＭＰＴＰ−食塩水を処置した動物（Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３）及びＭＰＴＰ−デプレニルを処置した動物（Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３）のすぐ隣り合う断片の対応する区域にあるＴＨ＋及びニッスル染色した体細胞の数を、ＭＰＴＰ処置後20日の時点で各群のうち３匹の動物からデータをプールして同じ表に示したものである。
【図４】プールしておいた食塩水対照群の０日、３日、５日、１０日、１５日及び２０日の時点のニッスル／ＴＨ＋を同じ表に示したものである。
【図５】ＭＰＴＰ処置完了後０日、５日、１０日、１５日及び２０日の時点で食塩水対照群について累計をとったニッスル／ＴＨ＋を同じ表に示したものである。
【図６】１日目から６０日目に渡る間の、食塩水による中間値に対するニッスル染色した体細胞のパーセンテージとＴＨ＋免疫反応性体細胞のパーセンテージとのグラフを重ね合わせて表したものである。
【図７】核全体を通じて連続して一つ置きに１０ミクロンずつ採った断片から得た個々の代表的ＳＮｃ核についてＴＨ＋ＳＮＣニューロンの累計対断片数を示すグラフである。
【図８】ＭＰＴＰ処置マウス、ＭＰＴＰ−食塩水処置マウス及びＭＰＴＰ−デプレニル処置マウスについて、中間値及びＳＥＭ値を示すグラフである。
【図９】核の頭から尾までの長さに沿ったＳＮＣニューロンのＴＨ＋体細胞数を示すグラフである。
【図１０】食塩水処置動物、ＭＰＴＰ処置動物、ＭＰＴＰ−食塩水処置動物、ＭＰＴＰ−クロルジリン処置動物及びＭＰＴＰ−デプレニル処置動物のＴＨ＋体細胞の中間補正値を、これら多種の処置を施した時点を表す表と共に示したグラフである。
【図１１】デプレニル（０．２５ｍｇ／ｋｇ又は０．０１ｍｇ／ｋｇ）の一回目の投与後２４時間（ｄ４）と１８日後（ｄ２２）との時点におけるＭＡＯ−Ａ測定値及びＭＡＯ−Ｂ測定値を示す棒グラフである。
【図１２】ＭＰＴＰを注射したマウスの移動活動のスペクトル分析を示す。
【図１３】食塩水を注射したマウスから得たＬＤ及びＤＤ注射前対照期間からの高解像度スペクトルを示す。
【図１４】対照マウス及びＭＰＴＰマウスの高解像度パワー・スペクトルを示す。
【図１５】正規化した合計％ピーク・パワー対中間日を示すグラフである。
【図１６】ＭＰＴＰ又は食塩水を処置した動物から採った脳を接合したもののＳＮｃ断片を示す。
【図１７】Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、食塩水を注射したマウス及びＭＰＴＰを注射したマウスについて、すべての核から得たＭＰＴＰ処置後のＴＨ＋、ＳＮｃ及びＶＴＡニューロン体細胞の数を、（Ａ）対応する食塩水注射動物に対するその中間値のパーセンテージ、（Ｂ）線条体ＤＡの濃度、（Ｄ）線条体ＤＯＰＡＣの濃度及びＤＯＰＡＣ／ＤＡ比で表したグラフである。
【図１８】食塩水のバックグラウンドに対する中間ＯＤ／中間Ｏ．Ｄ．対ＭＰＴＰ注射後日数を示すグラフである。
【図１９】同側顔面神経核を通って顔面神経の横断面に至る隣り合うＣｈＡＴ免疫反応（Ａ１及びＢ１）断片及びニッスル染色（Ａ２及びＢ２）断片の顕微鏡写真を示す。
【図２０】異なる損傷及び処置群の顔而神経核のＣｈＡＴ＋体細胞の計数を示す棒グラフである（棒−中間値、誤差棒−標準偏差）。
【図２１】損傷なし群（図１４Ａ）、同側損傷−食塩水動物（図１４Ｂ）、損傷あリ−デプレニル動物（図１４Ｂ）、及び反対側損傷あり動物（図１４Ｃ）のニッスル／ＣｈＡＴ＋計数を同じ表に示したグラフである。
【図２２】生後１４日で片側軸索切断を行なった生後３５日のラットの顔面運動ニューロンのＣｈＡＴ＋計数を示す。
【図２３】図２０に示したデータを示すと共に、更に別の動物に関するデータを含む。
【図２４】デプレニル処置後のＴＨ＋ＳＮｃ体細胞の計数を示す。
【図２５】図２３に示したデータを示すと共に、Ｎ−（２−アミノエチル）−４−クロロベンズアミドを処置した動物から得たデータを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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