(57)【要約】【課題】組織内部の蛍光染色性が良好な内視鏡用組織蛍光染色剤の提供。【解決手段】式（１）2008069107.tif 000004（式中、Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって炭素数１〜５のアルキル基を示し、Ｘ-はアニオン残基を示す）で表される化合物を含有する内視鏡用組織蛍光染色剤組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
2008069107.tif 000003
（式中、Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって炭素数１〜５のアルキル基を示し、Ｘ-はアニオン残基を示す）
で表される化合物を含有する内視鏡用組織蛍光染色剤組成物。
【請求項２】
Ｒ1及びＲ2がエチル基である請求項１記載の組織蛍光染色剤組成物。
【請求項３】
Ｘ-がＨＯＳＯ3-である請求項１又は２記載の組織蛍光染色剤組成物。
【請求項４】
内視鏡が、共焦点内視鏡である請求項１〜３のいずれか１項記載の組織蛍光染色剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内視鏡による診断に用いる組織蛍光染色剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
内視鏡を用いた診断技術は、上部消化管及び下部消化管における消化管内視鏡検査を中心に、特に癌、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎等の疾患の診断に広く応用されている。これら内視鏡検査における組織の異常（病変部）の検出は、染色剤を用いることなく１０〜５００倍程度の可視光内視鏡による観察が一般的である。他方、組織表面に色素を含む溶液を撒布した状態で内視鏡観察する色素内視鏡法と呼ばれる方法がある。この色素内視鏡法は消化器内腔表面の形状を明確に観察することができるため、色調の変化によって微細な病変部であっても容易に発見することができる。色素内視鏡法に用いられる内視鏡としては可視光内視鏡及び蛍光内視鏡がある。
【０００３】
色素内視鏡法に用いられる色素としては、例えば可視光下での消化管内腔の染色にはコントラスト法により観察するインジゴカルミン（非特許文献１）、蛍光染色にはアクリフラビン及びフルオレセイン（非特許文献２）などが主に用いられている。
【０００４】
がんなどの診断においては、生体の組織表面だけでなく、生体組織内部の観察も重要である。生体組織内部を観察する方法としては、バイオプシーなどで採取した組織の微小部を実験室で薄切し、染色の後に観察する方法が一般的である。生体組織の内部をその場で観察する方法では、例えば、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＣＴ、軟Ｘ線法などが全身の観察のために適用されている。消化管内視鏡に関しては、生体組織の自家蛍光反応を応用した内視鏡が商業化されている。生体組織に特定波長の光を照射することで組織の内因性蛍光物質により自家蛍光が発生するので、その強度差及びスペクトラムにより正常部位と病変部位を視覚的に観察することができる。
【０００５】
通常の内視鏡を用いて、例えば、消化管がんを診断するためには、観察により病変部を経験的に判断し、組織片を切り取って、別途実験室内で組織染色等の手法により診断せざるを得なかった。しかし、近年開発された、共焦点内視鏡を用いることで、組織を切り取ることなく、組織内部を観察することができる。
一般に、共焦点撮像システムとは、検出器の前にピンホールを置くことにより、組織内の焦点面のみの反射光を検出し、機械切削なしに組織内部の明確な画像を得ることができる技術である。通常、共焦点撮像システムは蛍光物質により染色された組織にレーザー光を走査してその蛍光像を観察する。一般に共焦点撮像システムでは、蛍光染色剤が必要である。
共焦点撮像システムを採用した共焦点内視鏡は、通常観察光学系と共焦点観察光学系の両者を有しているため、病変部のスクリーニングが可能であり、細胞を切り取らずに光学的な組織薄切による細胞の観察が低浸襲且つその場で可能となる点で有用である。
【０００６】
現在市販されている共焦点内視鏡は、波長４８８nmの青色レーザー光を色素励起光源として用いている。医療用の共焦点内視鏡に使用される蛍光色素は、生体に対して毒性や変異原性を示さないことが重要な性質として求められる。従って現在のところ、医療用共焦点内視鏡に使用可能な蛍光色素は、眼底造影のための静脈注射用フルオレセイン及び抗生物質として用いられているアクリフラビンに限定される。(非特許文献３)
【０００７】
共焦点内視鏡に利用される光源に関しては、将来的にその波長が多様化することが予想される。例えば、赤色〜赤外領域の光は青色光に比較して生体組織の透過性が高いため、生体組織の表面よりも深い位置での共焦点像を得ることができると考えられている。人体への投与が認可されている診断用赤外蛍光化合物にインドシアニングリーン(Icg : IndoCyanine Green)があり、主として肝臓機能検査や眼底血管造影に用いられている。共焦点内視鏡用染色剤としてインドシアニングリーンを用いると、例えば、非特許文献２に記載されているフルオレセインよりも組織を明確に造影することができない。さらにはインドシアニングリーンを内視鏡用蛍光染色剤として用いるには、フルオレセインと比較して毒性が高いという問題があった。
【非特許文献１】多田正大、磯  彰格  他（臨消内科、vol.7、no.2、1992）
【非特許文献２】Gastroenterology 2004, vol.127, No.3, p.706-713
【非特許文献３】Gastrointestinal Endoscopy Clin of N Am, 2005, vol.12, p.715-731
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、１）生物学的な毒性が低く、２）白色光源下でも組織の凹凸を強調するコントラストを付与し、３）蛍光を発し、４）組織内部の蛍光染色性が良好であり、組織内部の病変の診断に有用な内視鏡用組織蛍光染色剤組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、安全性の高い色素に着目して種々検討した結果、ブリリアントグリーンに代表される後記式（１）で表される化合物が、前記条件を満たし、特に水溶液中では蛍光を発しないにもかかわらず、組織、特にアルブミンに適用した場合にのみ蛍光を生じ、組織内部の鮮明な蛍光像を量し、組織内部の選択的な蛍光染色剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は式（１）
【００１１】
【化１】
2008069107.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって炭素数１〜５のアルキル基を示し、Ｘ-はアニオン残基を示す）
で表される化合物を含有する内視鏡用組織蛍光染色剤組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
（１）白色光源を用いる通常内視鏡下での消化管の観察において、フルオレセインなどの赤色系色素と比較して、本発明の組織蛍光染色剤は青色系色素のためコントラストが強い。
（２）白色光内視鏡と共焦点内視鏡を併せ持つ内視鏡による観察において、白色光に対しては、青色のコントラストを組織に付与し、赤色の励起光に対しては組織特異的な蛍光を示す。このため上記の内視鏡の使用時に病変部の発見とその共焦点画像の取得が一つの色素で提供できる。
（３）式（１）の化合物は、水溶液中では蛍光を示さず、組織、特にアルブミンに適用した場合に限って蛍光を示す。従って、細胞間隙は染色せず、組織内部が特異的に染色できる。
（４）従って、本発明の組織蛍光染色剤を用いれば、可視光及び蛍光、共焦点内視鏡観察下において、すなわち組織を採取することなく、病変組織内部の可視化を同時に行うことができ、その染色像が鮮明であることから、消化管疾患等の診断に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の内視鏡には、消化管内視鏡、呼吸器内視鏡、血管内視鏡、腹腔内視鏡などの医療用内視鏡が挙げられる。このうち消化管内視鏡が特に好ましい。本発明において、可視光内視鏡には、可視光で観察する内視鏡が全て含まれ、通常の内視鏡、拡大内視鏡、及び可視光を観察する色素内視鏡が含まれる。一方、蛍光内視鏡には、励起光を照射して生じる蛍光を測定する内視鏡が含まれ、これには拡大蛍光内視鏡が含まれる。また、共焦点内視鏡は、共焦点撮像システムを搭載した内視鏡をいう。なお、共焦点内視鏡は通常観察光学系と共焦点観察光学系の両者を有している。
【００１５】
本発明の組織蛍光染色剤組成物は、前記式（１）で表される化合物を含有する。式（１）中、Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって炭素数１〜５のアルキル基を示す。当該アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基等が挙げられるが、このうちメチル基、エチル基が好ましい。さらに、Ｒ1及びＲ2の両者がエチル基である場合が特に好ましい。
【００１６】
Ｘ-はアニオン残基を示すが、ＨＯＳＯ3-（硫酸イオン）、ハロゲンイオン等が挙げられる。このうちＨＯＳＯ3-が特に好ましい。
【００１７】
式（１）の化合物の好ましい具体例としては、ブリリアントグリーン（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｃ2Ｈ5、Ｘ-＝ＨＯＳＯ3-）が挙げられる。
【００１８】
ブリリアントグリーンは化粧品の着色剤として広く使用されている。化粧品に使用することのできる法定色素である。この成分の安全性は確立されている。しかし、この化合物がアルブミン等のタンパクと結合した場合にのみ、蛍光を発することは全く知られておらず、また組織に適用した場合にのみ組織内部において鮮明な蛍光像を呈することはまったく知られていない。
【００１９】
ブリリアントグリーンの市販品としては、例えばシグマのブリリアントグリーン（Ｂ４０１４−２５Ｇ）が挙げられる。また、異名には Pigment Green1、Basic Greenがあり、Ｃ．Ｉ．（カラーインデックスナンバー）で４２０４０と表される。
【００２０】
本発明の組織染色剤中の式（１）の化合物の含有量は、染色性及び染色像の鮮明さの点から０．０１〜７０質量％、さらに０．０１〜５０質量％、特に０．０１〜２０質量％が好ましい。
【００２１】
本発明の組織染色剤は、液体、顆粒、錠剤等の形態で使用することができる。消化管内で撒布する場合又は粘膜下投与する場合は液体が好ましく、経口投与する場合は液体、顆粒、錠剤等が好ましい。
【００２２】
本発明の組織染色剤には、その形態(剤型)に応じて種々の成分を配合できる。例えば粘稠剤、増粘剤、界面活性剤、甘味剤、防腐剤、香料、pH調整剤、水等を配合できる。
【００２３】
pH調整剤としては、pHを５〜９にするもの、例えば、塩酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、酢酸及びこれらの塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、ピロリン酸四ナトリウムなどが挙げられる。また溶剤としてエタノール、水などを配合し得る。錠剤の場合は、結合剤、崩壊剤などの公知の錠剤用成分を用いることができる。
【００２４】
本発明の組織染色剤は、組織を青色系に染色することができるので、通常の白色光内視鏡観察時における組織染色剤として有用である。ここで用いられる内視鏡は通常の内視鏡及び拡大内視鏡であり、１０〜５００倍の倍率を有する内視鏡観察に有用である。
【００２５】
組織への染色性に関しては、通常組織と前がん状態や腫瘍の存在下で染色性が異なる。通常組織を染色した場合、小腸や大腸などでは上皮細胞の細胞膜及び細胞質を染色する。一方、腫瘍等の観察においては細胞個々の特徴として、核容積が増大、核のクロマチンの増量と過染性、核小体が増大、染色体の数や形態に異常を見ること、胞体が好塩基的に染まり、細胞の増殖性に関係すること、などが挙げられる。また、腫瘍細胞では多くの核クロマチンが核膜に接して集合し、小胞体が単純化してくる。さらにミトコンドリアは不ぞろいで大きさも不均一となり、細胞内にフィラメント様の構造物が多くなる。
【００２６】
本発明の組織染色剤組成物は、まず、上皮細胞及び細胞質が良好に染色され、細胞間隙はほぼ不染であることが観察により明らかにされている。そのため、組織内の細胞の形状や配列の特徴が見てとれる。当該染色剤組成物に適合した波長範囲に該当する内視鏡であれば、組織及び細胞の異常等が共焦点撮像システムによる観察により適しているため、非常に有用性が高い。また、細胞核が染色されないため、前述した前がん状態等にある場合に判別がより容易になる。
【００２７】
また、本発明の組織染色剤組成物は、結合した組織においてのみ蛍光を発するという性質を有するため、溶液漏れによる洗浄をせずとも必要な情報が得られる。この点に関しても本発明の染色剤から得られる情報の意義が高いと言える。
【００２８】
後述の実施例で示すように、式（１）の化合物は、他の色素に比べて、溶液状態では蛍光を発せず、体内腔に撒布したときに蛍光を発し、さらに組織内部の蛍光染色像が鮮明であるという特性を有する。従って、本発明の染色剤は、内視鏡用組織蛍光染色剤として非常に有用である。
【００２９】
なお、共焦点光学システムを採用した内視鏡が、通常観察光学系と共焦点観察光学系との両者を有しているものであれば、通常光下での観察により病変部を肉眼観察し、次いで疑問になった病変部について、共焦点内視鏡により組織内部(例えば、２５０μmまで)の蛍光染色断層像を観察することにより、病変部組織を切除することなく組織表面及び組織内部の診断が可能となる。すなわち、生体組織の細胞や核の形状を生きた状態のまま観察することができる。この結果、前癌状態、癌、潰瘍、潰瘍性大腸炎等の消化管の疾患の診断が安全、迅速、低浸襲で可能となり、且つ精度が飛躍的に向上する。
【００３０】
これらの内視鏡観察においては、本発明の組織染色剤は、消化管内腔に直接撒布又は粘膜下投与してもよく、経口的、経静脈的に投与してもよい。
【実施例】
【００３１】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されるものではない。
【００３２】
実施例１
ブリリアントグリーン（ＳＩＧＭＡ製、Ｂ４０１４−２５Ｇ）を蒸留水で０．００１mg／mLに濃度調整し、分光光度計(島津製作所製、ＢｉｏＳｐｅｃ−１６００)により波長２００〜７５０nmまでの吸光度を連続的に測定し、吸収極大となる波長を決定した。得られた吸収極大波長６２５nmを励起波長として照射し、その励起光の光軸に対して垂直方向に検出される散乱光の波長を分光蛍光光度計(島津製作所製、ＲＦ−１５００)により測定、蛍光極大波長は６２５nmであった。この分光蛍光光度計を用いて励起極大波長を測定すると６２７nmであった。図１に蛍光光度計にて測定した励起極大波長及び蛍光極大波長を示す。
【００３３】
結果、溶液を調製した染色剤からは蛍光が検出されなかった。同様の試験を行った結果、食用色素の青色１号として広く利用されているブリリアントブルーＦＣＦは、吸収極大波長が６２９nmであり、励起極大波長６１９nm、蛍光極大波長６５０nmであり同じ波長領域での蛍光強度に明確な差異が見られた。ブリリアントグリーンは赤色波長領域の光源に蛍光を発しないことが示された。
【００３４】
ブリリアントグリーンは蛍光光度計で測定すると、図１に示すように吸収極大波長と蛍光極大波長に差がなく、これは照射光によって励起され蛍光を発しているのではないと言える。
しかし、大腸等の生体組織をブリリアントグリーンで染色し、一定のレーザをあてて励起させると、強い蛍光による観察ができる。
ブリリアントグリーンに対する比較として、大腸等の内腔をブリリアントグリーン同様に細胞内部染色させる、ローダミンＢの波長パターンを測定した。ローダミンＢは、図２のように溶液のみでも強い蛍光を示すことを確認することができた。
【００３５】
実施例２
ブリリアントグリーン（SIGMA製、Ｂ４０１４―２５Ｇ）を蒸留水で０．１mg/mLに調製し、アルブミン（from Bovine Serum, Globulin Free；Wako，０１３−１５１０４）を生理食塩水で２．０mg/mLに調製した。０．１Ｍリン酸緩衝溶液（pH５）と調製した２．０mg/mLアルブミンを用いて、０．０１mg/mLブリリアントグリーン・アルブミン混合液を調製した。ブリリアントグリーンの吸収極大波長６２５nmを励起波長として照射し、その励起光の光軸に対して垂直方向に検出される散乱光の波長を分光光度計（島津製作所、ＲＦ−１５００）により測定した。蛍光極大波長は６５１nmであった。図３に蛍光光度計にて測定した蛍光極大波長を示す。
ブリリアントグリーン・アルブミン混合液に対する比較として、励起波長６２５nmに対するアルブミン溶液の蛍光極大波長を図４に示した。これは励起波長と蛍光波長に差がないため、アルブミン自体は６２５nmの励起波長では蛍光を持たないことが示された。
これらのことから、ブリリアントグリーンは水溶液で蛍光を発さず、アルブミンと結合することにより、ブリリアントグリーンが赤色波長領域の光源に蛍光を発するということが示された。
【００３６】
実施例３
ブリリアントグリーン（ＳＩＧＭＡ製、Ｂ４０１４−２５Ｇ）を蒸留水で調製し、濃度を１．０mg/mLとした。
マウス（ddY、１３週齢、オス）に麻酔をかけた状態で開腹し、大腸を摘出した。摘出直後の大腸にブリリアントグリーンの調製溶液を塗布し、共焦点顕微鏡（ライカ社製、ＴＣＰＳＰ２）の共焦点撮像システムによる蛍光観察を行った。ここでブリリアントグリーンの染色性、浸透性、及び蛍光性の検証を行った。
【００３７】
摘出大腸の肉片の最表層から深さ方向へ５μmずつの断層の観察を行った。（図５）
図５からも見て取れるように３５μmの深さは充分に観察することができ、ゲイン値等を調節することにより深さ方向への観察も可能である。
図６は表層より１０μm深い地点、図７は表層より１５μm深さの地点での断層像である。細胞質が好染されており、細胞間隙は対照的に暗いため、細胞の形状や状態が非常に良く観察できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ブリリアントグリーンの励起(Abs.)及び蛍光(Emission)スペクトラムを示す図である。
【図２】ローダミンＢの励起(Abs.)及び蛍光(Emission)スペクトラムを示す図である。
【図３】ブリリアントグリーン・アルブミン混合液の蛍光スペクトラムを示す図である。
【図４】アルブミンの蛍光スペクトラムを示す図である。
【図５】ブリリアントグリーンで蛍光染色した大腸表層から３５μm付近の染色結果を示す図である。
【図６】ブリリアントグリーンで蛍光染色した大腸表層から１０μm付近の染色結果を示す図である。
【図７】ブリリアントグリーンで蛍光染色した大腸表層から１５μm付近の染色結果を示す図である。
【図１】
2008069107.tif 000005
【図３】
2008069107.tif 000006
【図４】
2008069107.tif 000007
【図２】
2008069107.tif 000008
【図５】
2008069107.tif 000009
【図６】
2008069107.tif 000010
【図７】
2008069107.tif 000011