(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸増幅によって液体サンプルを分析するための装置に使用されるマイクロ流体デバイス、核酸増幅によって液体サンプルを分析するための装置、液体サンプルを分析するための方法、及び液体中の核酸を増幅するための方法の提供。【解決手段】デバイスが複数の反応チャンバー１１を有するとともに、各反応チャンバーが入口チャネル１２及び出口を有してなり、各入口チャネルが更に、出口を有さない閉端ブランチ１４を含んでなる、少なくとも１のマイクロ流体バルブを含有し、当該閉端ブランチがガスを含有するとともに、少なくとも当該閉端ブランチが加熱された場合、当該ガスが膨張して当該閉端ブランチから当該入口チャネルに進入し、当該入口チャネルを可逆的に封止することが可能な拡散障壁を形成する際に、少なくとも当該入口チャネルを封止するのに十分な量のガスを含有するような寸法に形成された、マイクロ流体デバイス１。【選択図】図１
2008253261.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅によって液体サンプルを分析するための装置に使用されるマイクロ流体デバイス（micro-fluidic device）であって、
当該デバイスが、反応チャンバーを少なくとも含んでなり、当該反応チャンバーが、当該反応チャンバーに当該液体サンプルを充填するのに適した入口チャネルを有する反応チャンバーと、当該反応チャンバーからの流体の排出に適した出口とを少なくとも有し、前記反応チャンバーに当該液体サンプルが充填された後、当該出口を閉鎖することができるとともに、
当該入口チャネルが更に、出口を有さない閉端ブランチ（dead end branch）を含んでなる、少なくとも１つのマイクロ流体バルブ（microfluidic valve）を含有し、
当該閉端ブランチがガスを含有するとともに、少なくとも当該閉端ブランチが加熱された場合、当該ガスが膨張して当該閉端ブランチから当該入口チャネルに進入し、当該入口チャネルを可逆的に封止することが可能な拡散障壁を形成する際に、少なくとも当該入口チャネルを封止するのに十分な量のガスを含有するような寸法に形成された、デバイス。
【請求項２】
当該閉端ブランチが当該入口チャネルに対して実質的に垂直である、請求項１記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
当該入口チャネルの内壁が、少なくとも当該閉端ブランチと当該入口チャネルとの間の接合部において、疎水性被膜により被覆されている、請求項１又は請求項２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
当該デバイスが複数の反応チャンバーを有するとともに、各反応チャンバーが入口チャネル及び出口を有してなり、
各入口チャネルが更に、出口を有さない閉端ブランチを含んでなる、少なくとも１のマイクロ流体バルブを含有し、
当該閉端ブランチがガスを含有するとともに、少なくとも当該閉端ブランチが加熱された場合、当該ガスが膨張して当該閉端ブランチから当該入口チャネルに進入し、当該入口チャネルを可逆的に封止することが可能な拡散障壁を形成する際に、少なくとも当該入口チャネルを封止するのに十分な量のガスを含有するような寸法に形成された、請求項１から３の何れか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
各入口チャネルの一端が１つの反応チャンバーに連結され、他端が主チャネルに連結されるとともに、当該主チャネルが、当該複数の反応チャンバーの各々に当該液体サンプルを有効に充填し得る、請求項４記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
当該入口チャネルが、少なくとも２つの閉端ブランチを含んでなるマイクロ流体バルブを含むとともに、当該閉端ブランチの入口チャネルへの開口が、互いに隣接する位置、又は、実質的に互いに対向する位置に存在する、請求項１から５の何れか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
前記出口が、幾何的バルブ（geometric valve）、及び／又は少なくとも１の閉端ブランチ、及び／又は疎水性被膜を含んでなる、出口チャネルである、請求項１から６の何れか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
核酸増幅によって液体サンプルを分析するための装置であって、
請求項１から７の何れか一項に記載のマイクロ流体デバイス、
核酸増幅反応を監視するためのデバイス、及び、
当該マイクロ流体デバイスの当該少なくとも１の閉端ブランチを少なくとも覆ってなる加熱デバイスを少なくとも含んでなる装置。
【請求項９】
当該加熱デバイスが更に、当該マイクロ流体デバイスの当該反応チャンバーを覆ってなる、請求項８記載の装置。
【請求項１０】
熱制御部を更に含んでなる、請求項８又は請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
当該加熱デバイスが熱プロファイルを実施可能である、請求項８から１０の何れか一項に記載の装置。
【請求項１２】
核酸増幅によって液体サンプルを分析するための方法であって、
請求項１から７の何れか一項に記載のマイクロ流体デバイスの反応チャンバー内に、当該デバイスの入口チャネルを通じて液体サンプルを供給する工程、
少なくとも当該デバイスの閉端ブランチに、前記加熱デバイスによって熱を加えることにより、前記閉端ブランチ内の前記ガスが膨張して当該閉端ブランチから当該入口チャネル内に進入し、拡散障壁を形成するとともに、これにより当該デバイスの入口チャネルを可逆的に封止する工程、
当該液体サンプル中の核酸を増幅する工程、及び、
前記増幅反応を監視する工程を含んでなる方法。
【請求項１３】
液体サンプル中の核酸を増幅するための方法であって、
請求項１から７の何れか一項に記載のマイクロ流体デバイスの反応チャンバー内に、当該デバイスの入口チャネルを通じて液体サンプルを供給する工程、
少なくとも当該デバイスの閉端ブランチに、前記加熱デバイスによって熱を加えることにより、前記閉端ブランチ内の前記ガスが膨張して当該閉端ブランチから当該入口チャネル内に進入し、拡散障壁を形成するとともに、これにより当該デバイスの入口チャネルを可逆的に封止する工程、及び、
当該液体サンプル中の核酸を増幅する工程を含んでなる方法。
【請求項１４】
前記反応チャンバーに当該液体サンプルが充填された後、前記入口及び／又は前記出口チャネルを閉鎖する工程を更に含んでなる、請求項１２又は請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
核酸の増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、核酸配列に基づく増幅、ローリング・サークル（rolling circle）増幅、鎖置換（strand-displacement）増幅、等温増幅、タッチダウンポリメラーゼ連鎖反応、又は転写媒介増幅を用いて行なわれる、請求項１２から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
液体を含有するマイクロ流体チャネルを閉鎖するためのマイクロ流体バルブを形成するよう、所定量のガスを含有する閉端ブランチコンパートメントの使用であって、少なくとも当該閉端ブランチコンパートメントに熱を加えた場合に、当該ガスが膨張して当該閉端ブランチコンパートメントから当該チャネル内に進入し、当該チャネルを可逆的に封止可能な拡散障壁を形成するとともに、これにより当該液体を二分割して当該チャネルを閉鎖する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、核酸増幅によって液体サンプルを分析するための装置に使用されるマイクロ流体デバイス（micro-fluidic device）、核酸増幅によって液体サンプルを分析するための装置、液体サンプルを分析するための方法、及び、液体中の核酸を増幅するための方法である。
【背景技術】
【０００２】
本発明は特に、サンプルに含まれる成分の確実な分析が必要とされる、健康管理や、生命科学及び医学における研究、特に核酸分析、遺伝子定量及び遺伝子型決定の分野で有用である。核酸を増幅するための方法及びデバイスは、本技術分野では周知である。
【０００３】
変性及び増幅工程を含む反応サイクルを用いる方法の１つとして、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）がある。この手法は、特定の配列を有する核酸を、無視し得る量から検出し得る量へと増大させるツールを提供することにより、核酸処理の分野、特に核酸分析の分野に革命を起こした手法である。ＰＣＲについては、例えばＥＰ０２０１１８４及びＥＰ０２００３６２に記載されている。長尺の金属ブロックを加熱及び冷却することにより、チューブ内のサンプルに対して熱サイクル（thermocycles）を制御下で実施する機器が、例えばＥＰ０２３６０６９に開示されている。
【０００４】
より近年になって、改良されたより強力なＰＣＲ法が開発されている。定量リアルタイムＰＣＲは、所与のＤＮＡ分子の特定部位の定量及び増幅を同時に行なうために使用される、実験手法の一つである。本手法により、サンプル内に特定の配列が存在するか否かを決定することができ、存在する場合にはサンプル内のコピー数を定量することができる。一般的な定量法としては、二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光染料の使用と、相補的ＤＮＡとハイブリダイズすると蛍光を発する修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブの使用という二種の方法が挙げられる。かかる方法は、例えばＥＰ０５１２３３４に記載されている。
【０００５】
ポリメラーゼ連鎖反応は一般的に、特殊な反応容器内で実施される。安定で信頼性が高く、且つ高精度の核酸増幅結果を得るためには、反応領域の汚染を避けることが重要である。ＰＣＲは単一の分子を１０億倍超にも増幅し得る。従って、ごく僅かな量の汚染物質であっても、増幅されて偽陽性の結果を生じる可能性がある。かかる汚染物質の多くは以前のＰＣＲ増幅の産物であり、これらはキャリーオーバー汚染と呼ばれている。反応領域の充填時におけるキャリーオーバー汚染の予防に加えて、特に重要なのは、反応の実施時に反応領域を封止して汚染物質から遮断することである。これが特に困難となるのは、共通の流体チャネルを用いて２以上の反応領域を同時に充填する用途である。かかる用途では、反応体積を削減しながらより高いスループットを得るために、複数の反応領域を有する小型のデバイスを用いる場合が多く、これが汚染の危険性を低減するための技術的な要件をより厳しくする結果となっている。
【０００６】
マイクロ流体学（micro-fluidics）は、ナノリットル又はピコリットル範囲の体積の流体を扱うデバイスの設計、製造及び策定を行なう科学である。マイクロ流体学のハードウェアには、マクロスケールのハードウェアとは異なる構成及び設計が必要とされる。従来のデバイスを縮小すれば、マイクロ流体学の用途においてうまく動作するとの予想は、系の挙動が劇的に変化するため、一般的には成り立たない。マクロスケールチャネルの場合と比較すると、流体がマイクロスケール系のチューブを通過する様子は、毛管作用によって変化する。更に、関連する因子、特にマイクロスケールの熱移動及び物質移動に関する因子には、未知のものが存在する。マイクロ流体系は健康管理分野において、多様且つ広範な用途に利用できる可能性がある。例としては、赤血球分離、生化学アッセイ、化学合成、遺伝分析、薬剤スクリーニング、及び電気クロマトグラフィーが挙げられる。
【０００７】
汚染の課題に取り組むために、反応領域内に液体サンプルを充填し、維持することを可能とし、更には反応が生じる際の交差汚染の危険を低減する、特別なマイクロ流体バルブが開発されている。このバルブは、各反応チャンバーを個々に密封するものである。これが特に重要なのは、幾つかの独立したパラメーターについて１種又は２種以上のサンプルを試験する、アレイ形式の場合である。交差反応は偽陽性の結果を生む原因となり得ることから、かかる交差反応を避けることが主要な課題となる。従って、多くの用途では、アレイ型デバイスにおける反応チャンバー特有の試薬のキャリーオーバーを予防するため、バルブが使用される。
【０００８】
本技術分野では幾つかの種類のバルブが知られているが、主な種類としては、一般に単回閉鎖（once-close）バルブと呼ばれるものと、オン／オフ（On/Off）バルブと呼ばれるものの２種に大別される。単回閉鎖バルブは、初期状態では開放されており、一回だけ閉鎖可能である。閉鎖後はバルブは応答しない。オン／オフ型バルブは、通常は外部の駆動力を用いることにより、開放及び閉鎖を数回繰り返すことが可能である。
【０００９】
ＵＳ２００５／００７２９４６には、多層ソフトリソグラフィーを用いたマイクロ流体バルブが開示されている。かかるバルブの特徴は、均一な厚さのエラストマー膜部分にある。膜の厚さが均一であるため、膜の幅方向全体に圧力が加えられた場合、これにかかる抵抗力も同程度となる。かかる偏向可能な膜を用いて組み立てられたオン−オフ型バルブは、駆動圧を極めて低くすることが可能であり、集積マイクロ流体チップにおいて、ポンプやミキサー等の動的機能を実装するのに用いることができる。しかし、かかる一体化されたソフト膜を備えたデバイスは、二成分生産技術（two-component production techniques）により作製される。第１の成分は通常、ポリプロピレン（ＰＰ）やポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等の比較的硬質なポリマー材料であり、第２の成分は熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）等の軟質な材料である。こうした二成分技術は複雑で費用がかかり、１つのデバイスを作製するのにかかる時間は、一成分技術と比べて大幅に増加してしまう。加えて、エラストマー製バルブは三次元的に構造化する必要がある。デバイスを幾つかの層から構成し、各層に特定の機能を持たせなければならない（例えば、流体層、バルブ層等）。バルブの駆動のための層は、幾何的に流体層の上に設けられる。かかる多層プロセスによって、更に商品の価格が上がり、デバイスの複雑さも増してしまう。
【００１０】
更に、ペルチエ駆動マイクロバルブを用いて、反応領域への流体の流入及び反応領域からの流体の流出を阻止するためのバルブが、本技術分野では知られている（Richard P. Welle and Brian S. Hardy, 24th International Conference on Thermoelectrics (ICT), 2005, pages 343-346）。ペルチエ素子は流体チャネル網の近傍又は下方に配置される。反応チャンバーに流入し、又は反応チャンバーから流出するチャネル内の流体を、ペルチエ素子を用いて冷却すると、流体が凍結し、チャネル内にアイスプラグが形成される。このアイスプラグがチャネルを塞ぎ、拡散を防止する。ペルチエ素子の電源を切ると、アイスプラグが溶解してチャネルが再び開放される。すると、液体がチャネルを通じて流れ、拡散が再び生じる。この種のバルブは、冷凍及び解凍のサイクルを数回実施できるので、オン／オフ型バルブに分類される場合もある。しかし、かかるペルチエ駆動バルブには、難点も多数存在する。各バルブ毎に１つのペルチエ素子を、極めて近い位置に配置する必要がある。ペルチエ素子はサイズに制限があるため、反応チャンバー及びチャネルを高密度で有するマイクロ流体デバイスに、かかるバルブを適用することはできない。更に、各ペルチエ素子は電子的にアクセス及び制御しなければならないため、配線や複雑なコントローラのためのスペースが必要となる。その上、かかるバルブは以下の理由から、熱サイクリング用途には使用できない。チャネル内の液体を密閉状態で、反応チャンバーの近傍において冷凍させる必要があるが、この反応チャンバーには、５０から９０℃の温度の熱サイクリングが印加されている。バルブと反応チャンバーとの間の温度勾配は双方に影響を及ぼすため、冷凍プロセス及び加熱プロセスの何れにも、より多くのエネルギーが必要となってしまう。その影響により、高速熱サイクリングの速度及び効率に限界が生じてしまう。その上に、冷凍によって液体の体積が変化するため、デバイス及びその材料にストレスが誘発されてしまう。
【００１１】
毛管の湿潤性が、当該毛管から反応領域への開口部と比べて異なることを利用した、毛管現象に基づく受動バルブ（passive valves）は、毛管駆動停止バルブ（capillary-driven stop valves）又は毛管破裂バルブ（capillary burst valves）として知られており、Duffy et al, 1999, 71, 4669-4678, Analytical Chemistry に記載されている。かかる受動バルブは、湿潤エネルギー（wettability energies）に基づくものである。メニスカスを毛細管からより大きなチャンバーへと押し込むのに必要な力が、バルブとして使用されている。この圧力（単位面積当たりの力として定義される）は、密閉されたＰＣＲ反応チャンバー内で熱サイクリング時に生じる圧力である１．４ｂａｒと比べ、通常は遥かに低い。従って、受動バルブの強度では、ＰＣＲ反応の加熱により生じる圧力に耐えられない。この圧力によって大きなチャンバーが濡れてしまうと、バルブが閉鎖すべき時にも開放されてしまうことになる。
【００１２】
要約すると、これらの上述したバルブは何れも、共通の不利点を有していた。即ち、これらは巨視的なバルブを小型化してマイクロ流体用途に部分的に応用したものに過ぎないため、マイクロ流体用途に必要な条件や要請の全てを満たすものではない。かかるバルブは共通して、電流、空気圧又は温度等の外部駆動力を必要とする。しかし、外部駆動力を供給するのに必要な配管や配線等の上部構造部品（superstructural parts）は、概して非常に多くのスペースを必要とし、費用もかかる。特に集積チップの用途では、こうしたバルブに利用可能なスペースは極めて限られている。更に、とりわけマイクロ流体チップを用いた核酸分析の場合、バルブの駆動力を担う別の層を追加するのは不利である。特に増幅反応を行なう場合には、高速且つ高効率の熱伝達を可能とするために、マイクロ流体チップの熱質量を可能な限り小さくしなければならないからである。
【００１３】
一方、巨視的なバルブの小型化ではないマイクロ流体の概念も、特に費用の面で、より高いスループットのマイクロ流体用途の要件を全て満たすものではない。かかるバルブの例としては、Jing Wang et al, Biomedical Microdevices 7:4, 3 13 2005に記載されている、Lab-on-a-Chip applications の自己作動型熱応答性ヒドロゲルバルブ（self-actuated thermoresponsive hydrogel valve）が挙げられる。かかるバルブは、高分子Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが温度反応性の挙動を示すという事実を利用したものである。このポリマー材料は、細孔構造を有する網構造から構成される。細孔のサイズは温度に応じて変化する。かかる材料を用いてバルブとして機能させる場合、この材料をマイクロ流体ネットワークのチャンバー内部に充填し、温度に応じて流体流を許容又は遮断する。しかし、ヒドロゲルバルブを備えたデバイスの作製は、ヒドロゲルを原位置で重合させるか、ホイルに組み入れなければならないため、複雑であり、費用もかかる。ヒドロゲル材料はプロセス流体と直接に接するが、その細孔構造ゆえに体積当たりの表面積は極めて大きい。殆どの用途において、これは好ましいことではない。表面積が大きいと、タンパク質、ＤＮＡ、又は他の化学成分が吸着される空間も大きくなる。表面化学によっては、これらの物質が表面に結合する可能性がある。しかし、これらの物質は反応チャンバー内に存在する必要があり、ヒドロゲルに吸着されるのは好ましくない。従って、アッセイ／試験の性能が低下するおそれがある。
【００１４】
更には、他のバルブとして、ガスのコアの周囲に軟成分のシェルを配した膨張可能なマイクロスフェア（microspheres）を利用したものもある（P. Griss, H. Andersson and G. Stemme, Lab Chip, 2002, 2:117-120, "Expandable microspheres for the handling of liquids"）。温度が上昇すると、マイクロスフェアが膨張してチャネルを閉鎖する。ビーズのシェルは一定の高温下で軟化する。シェルが軟化した後、被包されたガスが膨張することにより、このマイクロ粒子はその原体積を数倍も上回る体積に膨張する。この膨張は不可逆であり、温度が低下してもマイクロスフェアが再び縮むことはない。よって、かかるバルブは単回閉鎖バルブに分類される。しかし、かかるマイクロスフェアを含んでなるデバイスの製造は、マイクロスフェアをマイクロ流体デバイス内の適切な位置に組み込んで配置しなければならないため、非常に困難である。デバイスの製造時の温度を、マイクロスフェアの膨張点未満の温度に維持しなければならないため、かかるマイクロスフェアバルブの製造は困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
要約すると、本技術分野で知られているバルブのうち、巨視的なバルブを小型化してマイクロ流体用途に応用したものは、バルブを閉鎖するために外部駆動力が必要となるため、マイクロ流体用途における要件のすべてを満たすものではない。また、マイクロ流体の概念の主な不利点は、複雑な材料を使用しなければならず、こうした複雑な材料が熱や液体との処理に不安定な場合には、製造プロセスが複雑化し、マイクロ流体デバイスのコストが嵩んでしまうという点である。従って、複雑な外部駆動力や複雑な製造プロセスを必要としない、安価なマイクロ流体デバイス用のマイクロ流体バルブの提供が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の主旨は、核酸増幅によって液体サンプルを分析するための装置に使用されるマイクロ流体デバイス（micro-fluidic device）であって、
当該デバイスが、反応チャンバーを少なくとも含んでなり、当該反応チャンバーが、当該反応チャンバーに当該液体サンプルを充填するのに適した入口チャネルを有する反応チャンバーと、当該反応チャンバーからの流体の排出に適した出口とを少なくとも有し、前記反応チャンバーに当該液体サンプルが充填された後、当該出口を閉鎖することができるとともに、
当該入口チャネルが更に、出口を有さない閉端ブランチ（dead end branch）を含んでなる、少なくとも１つのマイクロ流体バルブ（microfluidic valve）を含有し、
当該閉端ブランチがガスを含有するとともに、少なくとも当該閉端ブランチが加熱された場合、当該ガスが膨張して当該閉端ブランチから当該入口チャネルに進入し、当該入口チャネルを可逆的に封止することが可能な拡散障壁を形成する際に、少なくとも当該入口チャネルを封止するのに十分な量のガスを含有するような寸法に形成された、デバイスに存する。
【００１７】
本発明の第２の主旨は、核酸増幅により液体サンプルを分析するための装置であって、
本発明に係るマイクロ流体デバイス、
核酸増幅反応を監視するためのデバイス、及び、
当該マイクロ流体デバイスの当該少なくとも１の閉端ブランチを少なくとも覆ってなる加熱デバイスを少なくとも含んでなる装置に存する。
【００１８】
本発明の第３の主旨は、核酸増幅により液体サンプルを分析するための方法であって、
本発明に係るマイクロ流体デバイスの反応チャンバー内に、当該デバイスの入口チャネルを通じて液体サンプルを供給する工程、
少なくとも当該デバイスの閉端ブランチに、前記加熱デバイスによって熱を加えることにより、前記閉端ブランチ内の前記ガスが膨張して当該閉端ブランチから当該入口チャネル内に進入し、拡散障壁を形成するとともに、これにより当該デバイスの入口チャネルを可逆的に封止する工程、
当該液体サンプル中の核酸を増幅する工程、及び、
前記増幅反応を監視する工程を含んでなる方法に存する。
【００１９】
本発明の第４の主旨は、液体サンプル中の核酸を増幅するための方法であって、
本発明に係るマイクロ流体デバイスの反応チャンバー内に、当該デバイスの入口チャネルを通じて液体サンプルを供給する工程、
少なくとも当該デバイスの閉端ブランチに、前記加熱デバイスによって熱を加えることにより、前記閉端ブランチ内の前記ガスが膨張して当該閉端ブランチから当該入口チャネル内に進入し、拡散障壁を形成するとともに、これにより当該デバイスの入口チャネルを可逆的に封止する工程、及び、
当該液体サンプル中の核酸を増幅する工程を含んでなる方法に存する。
【００２０】
本発明の第５の主旨は、液体を含有するマイクロ流体チャネルを閉鎖するためのマイクロ流体バルブを形成するよう、所定量のガスを含有する閉端ブランチコンパートメントの使用であって、少なくとも当該閉端ブランチコンパートメントに熱を加えた場合に、当該ガスが膨張して当該閉端ブランチコンパートメントから当該チャネル内に進入し、当該チャネルを可逆的に封止可能な拡散障壁を形成するとともに、これにより当該液体を二分割して当該チャネルを閉鎖する、使用に存する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の好ましい実施形態について、例示のために、添付の図面を参照しながら以下に説明する。
【００２２】
本発明は、マイクロ流体デバイス又はマイクロ流体チップに実装することが可能な、温度駆動型マイクロ流体バルブに関する。かかるバルブをマイクロ流体デバイスに使用すれば、デバイスを複数の層から構成する必要が無く、また、一成分プロセスで製造可能であるので、コスト及び時間を削減できるという利点がある。かかるマイクロ流体デバイス又はマイクロ流体チップは、液体サンプルを分析するための装置に使用することができる。本明細書で使用されるマイクロ流体デバイスという語は、例えばチャネル、チャネル網、又は反応チャンバー等のマイクロ構造部品（micro-structured parts）を有するデバイスを指す。マイクロ流体デバイスは機器の一部（複数回使用）であってもよく、使い捨て（単回使用）であってもよい。
【００２３】
本発明の一実施形態によれば、核酸増幅によって液体サンプルを分析するための装置に使用されるマイクロ流体デバイスは、少なくとも反応チャンバーを含んでなり、この反応チャンバーは、反応チャンバーに液体サンプルを充填するのに適した入口チャネルと、反応チャンバーからの流体の排出に適した出口とを有する。反応チャンバーに液体サンプルを充填した後に、出口を閉鎖してもよい。入口チャネルは更に、少なくとも１の閉端ブランチを有する。閉端ブランチは出口を有しておらず、ガスを含有している。更に、閉端ブランチは、少なくともブランチが加熱された場合、ガスが膨張してブランチから入口チャネルに進入する際に、少なくとも入口チャネルを封止するのに十分な量のガスを少なくとも含有する寸法で形成される。液体が入口チャネル内に存在する状態で少なくとも閉端ブランチを加熱すると、ガスは膨張して閉端ブランチコンパートメントから入口チャネルへと進入する。続いて、気泡が閉端ブランチから入口チャネルへと広がって、入口チャネル内に存在する液体を独立の部分へと二分割する拡散障壁を形成し、入口チャネルを閉鎖する。閉端ブランチは、反応を実施する温度において、閉端ブランチから広がる気泡が十分に拡大して、入口チャネルを完全に封止できるような寸法に形成される。好ましい実施形態によれば、ガスが閉端ブランチから入口チャネル内へと広がって、気泡が入口チャネルの壁と物理接触することにより、完全な封止が可能となる。
【００２４】
反応チャンバーは、マイクロ流体デバイス上の領域であって、検体と試薬との間に所望の反応が生じる領域である。更に、特定の態様によれば、反応を監視する場合、反応チャンバーは反応を検出するための場所であってもよい。流体ネットワークの一部である入口チャネルを通じて、反応チャンバーに液体を充填する。特定の態様によれば、この液体は検体を含有していてもよい。特定の態様によれば、反応チャンバーに液体を充填した後、入口チャネルを可逆的又は不可逆的に閉鎖する。この閉鎖は、入口チャネルの種類や、デバイスが使用される用途の種類に応じ、プラグやバルブ（例えば、本発明に係る温度駆動型マイクロ流体バルブ）を使用して、接着、熱的力及び／又は機械力を用いて、或いは高沸点の非混和性の液体（例えば、鉱油、蝋、ハロゲン化炭化水素等）を用いて行なう。
【００２５】
出口も流体ネットワークの一部であり、反応チャンバーに液体を充填する際に、流体ネットワーク及び反応チャンバーから追い出されるガスの排気に使用される。出口はチャネルでも通気口でもよく、或いは透過性膜や半透膜であってもよい。特定の態様によれば、これらを疎水性化合物で被覆し、或いは疎水性化合物で形成してもよい。特定の態様によれば、反応チャンバーに液体を充填した後、出口を可逆的又は不可逆的に閉鎖する。この閉鎖は、出口の種類や、デバイスが使用される用途の種類に応じ、プラグやバルブ（例えば、本発明に係る温度駆動型マイクロ流体バルブ）を使用して、接着、熱的力及び／又は機械力を用いて、或いは高沸点の非混和性の液体（例えば、鉱油、蝋、ハロゲン化炭化水素等）を用いて行なう。
【００２６】
マイクロ流体バルブの主な特徴の一つである閉端ブランチも、流体ネットワークの一部である。閉端ブランチにはガス（空気、滅菌空気、或いは窒素やアルゴン等の不活性ガスなど）が充填され、チャネルから分岐している。閉端ブランチは別の出口を有さないため、マイクロ流体デバイスに液体を充填しても、閉端ブランチはガスが充填された状態で維持される。
【００２７】
閉端ブランチの取り得る幾何的形状は幾つかあるが、閉端ブランチとの連結部は、入口チャネルよりも狭い、狭チャネルであることが好ましい。狭チャネルの後方にガス空間が存在し、その容積は少なくとも、ガスが膨張してチャネル内に進入し、流体を二つの部分に分割するのに十分な量である。このより大きな空間は、円形、長方形、三角形、或いは高集積密度や製造に適した、他の任意の形状とすることができる。
【００２８】
マイクロ流体デバイスの特定の実施形態によれば、閉端ブランチは当該入口チャネルに対して実質的に垂直である。マイクロ流体デバイスの別の実施形態によれば、閉端ブランチの出口部分と入口チャネルとの角度は、反応チャンバーの充填時における液体サンプルの流通方向において、９０°未満である。かかる実施形態では、少なくとも閉端ブランチに熱を加えると、ガスが反応チャンバーに向かって膨張する。この実施形態によれば、閉端ブランチに含有されるガスが液体に追い出される可能性や、反応チャンバーの充填時に閉端ブランチにも液体が充填されてしまう可能性が低減されるので、有利である。
【００２９】
しかし、特定の態様によれば、閉端ブランチの出口部分と入口チャネルとの角度が、反応チャンバーの充填時における液体サンプルの流通方向において、９０°を超える角度であるのが有利な場合もある。この場合、少なくとも閉端ブランチに熱を加えると、ガスが膨張して反応チャンバーから流出するので、ガスが偶発的に反応チャンバー内に向かって膨張するのを防止することができる。これが特に有用なのは、反応チャンバーを高密度で有するデバイス、及び／又は、閉端ブランチに供給されるガス量に比べて入口チャネルが非常に短いデバイスの場合である。
【００３０】
更に、閉端ブランチを含んでなる温度駆動型マイクロ流体バルブを用いて出口チャネルを閉鎖する場合、特定の態様によれば、閉端ブランチが当該出口チャネルに対して実質的に垂直であるか、或いは、閉端ブランチの出口部分と出口チャネルとの角度が、反応チャンバーの充填時における液体サンプルの流通方向において、９０°未満であることが有利な場合がある。これらの実施形態によれば、少なくとも閉端ブランチに熱を加えた場合に、ガスが膨張すると確実に反応チャンバーから流出するので、ガスが偶発的に反応チャンバー内に向かって膨張するのを防止することができる。
【００３１】
実施形態の一例を図２（Ａ）に示す。本実施形態では、２つの閉端ブランチ（１４）の出口部分の径が、それぞれ入口チャネル（１２）及び出口チャネル（１３）の径よりも小さく形成されており、これによって閉端ブランチコンパートメントが意図に反して充填されてしまうのを防ぐことができる。反応チャンバーの充填時における液体サンプルの流通方向において、閉端ブランチ（１４）の出口部分と入口チャネル（１２）との角度は約１３０°であり、閉端ブランチ（１４）の出口部分と出口チャネル（１３）との間の角度は約５０°である。この構成によれば、少なくとも閉端ブランチ（１４）に熱を加えた場合に、双方の閉端ブランチ（１４）から膨張するガスが、確実に反応チャンバー（１１）から遠ざかって、対応するチャネル内へと広がっていくようにすることができる。これによって、反応チャンバー（１１）の内容物が封止されるとともに、ガスが意図に反して反応チャンバー（１１）内へと膨張していくのが防止される。
【００３２】
マイクロ流体デバイスの特定の実施形態によれば、入口チャネルの内壁は、少なくとも閉端ブランチと入口チャネルとの接合部において、疎水性被膜により被覆されている。これにより、エネルギー上の理由で疎水性表面上に空気が蓄積され、膨張したガスが膨張期の間及びその後に亘って安定化されるので、有利である。この挙動によって、空気がマイクロバルブから離れて反応チャンバーの方に移動し、バルブ機能の低下を生じるおそれを最小限に抑えることができる。疎水性被膜は、低表面張力の被膜であって、水を試験流体とした場合の接触角度が９０°を超えるものである。例としては、テフロン（登録商標）（ＰＴＦＥ）被膜、炭化水素、又はフッ化炭素、チタン被膜、パリレン、及びシラン化ガラス表面が挙げられる。
【００３３】
特定の実施形態によれば、マイクロ流体デバイスは、１つのデバイスで２以上の液体サンプルの並行分析を可能とするために、複数の反応チャンバーを含んでなる。特定の態様によれば、各入口チャネルの一端が１つの反応チャンバーに連結され、他端が主チャネルに連結される。主チャネルはサンプルを分配し、複数の反応チャンバーの各々に当該液体サンプルを充填するのに有用である。これによって、幾つかの反応チャンバーに同一の液体サンプルを、実質的に同時に充填することが可能となる。サンプルはデバイスの特定の充填位置に供給される。続いて液体サンプルは、好ましくは毛管力によって、主チャネルに沿って入口チャネルに、そして反応チャンバーに移送される。別の実施形態によれば、反応チャンバーの充填は、低圧又は高圧により、或いは遠心分離機を用いてデバイスを回転させることにより行なわれる。かかる実施形態では、全ての反応チャンバーに同一の増幅混合物を供給し、同一の実験について多重の結果を得るために、同一のサンプルを幾つかの反応チャンバーで並行に同一の増幅及び／又は検出反応に供してもよく、或いは、反応チャンバーに別々の増幅混合物を供給し、同一のサンプルを幾つかの反応チャンバーで様々な増幅及び／又は検出反応に供してもよい。かかる増幅及び／又は検出反応の例としては、例えばポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、核酸配列に基づく増幅、ローリング・サークル増幅、鎖置換増幅、又は転写媒介増幅が挙げられる。
【００３４】
図１（Ａ）に、マイクロ流体デバイス（１）の実施形態の一例を示す。このマイクロ流体デバイスは、主チャネル（１５）と、主チャネルから分岐する数本の入口チャネル（１２）とを含んでなり、各入口チャネルは反応チャンバー（１１）へと通じるとともに、閉端ブランチ（１４）を有する。閉端ブランチはガスを含有し、熱を加えることにより、このガスが入口チャネルを閉鎖しうるようになっている。デバイス（１）に供給されるサンプル（例えば血漿）は、サンプル入口ポート（１８）から導入され、マイクロ流体構造（例えば主チャネル（１５））を通じて反応チャンバー（１１）に移送される。サンプルの移送は、流体ネットワークへの圧力の印加、デバイスの遠心分離、或いは毛管力によって行なわれる。主チャネル（１５）は幾つかの接合部を含んでなり、液体サンプルはこれらの接合部から入口チャネル（１２）を通じて反応チャンバー（１１）へと誘導される。各入口チャネル（１２）は、マイクロ流体バルブとして機能する閉端ブランチ（１４）を含んでなる。閉端ブランチ（１４）には出口が存在しないので、閉端ブランチ（１４）を満たしている空気が、液体サンプルによって追い出されることはない。各反応チャンバー（１１）は出口チャネル（１３）を含んでなり、反応チャンバー（１１）内に存在する空気が液体サンプルによって追い出される際には、この出口チャネルを通じて空気が排出される。最後の入口チャネル（１２）が主チャネルから分岐した後、主チャネル（１５）は屈曲して、出口チャネル（１３）が主チャネル（１５）に流れ出るように案内される。主チャネルのこの部分は収集チャネル（１７）と呼ばれる。従って、反応チャンバー（１１）から出口チャネル（１３）を通じて排出されたガスは、収集チャネル（１７）を通じて誘導される。反応チャンバー（１１）の充填が終了した後、閉鎖手段を用いてデバイスを閉鎖する必要がある。閉鎖手段としては、例えばキャップ、軟プラグ、接着剤、又はテープ等が挙げられる。デバイスに熱サイクルが加えられると、閉端ブランチ（１４）内に捕捉されていたガスが、高温において入口チャネル（１２）に向かって膨張し、チャネルを二つの独立した部分に分割することにより、液体で満たされた二つの部分の間にガス塊が介在する状態となる。この膨張によって、一方の反応チャンバー（１１）から他方の反応チャンバー（１１）への拡散が防止される。熱サイクルプロセスの終了後、チップが冷却されるとガス塊が縮小し、その結果としてバルブが開放される。従って、検出手段の使用はバルブが閉鎖されている高温時に、又はリアルタイムで行なう必要がある。
【００３５】
別の好ましい実施形態によれば、図１（Ｂ）及び（Ｃ）、並びに図６（Ａ）に詳細に示すように、マイクロ流体デバイスの出口チャネル（１３）が各々、疎水修飾幾何的バルブ（geometrical valve）（１６）を含んでなる。図１（Ｃ）に詳細に示される幾何的バルブは、疎水性の小さな狭窄部分に空気を捕捉している。収集チャネル（１７）に液体が充填されると、幾何的バルブ（１６）は、内側からは反応チャンバー及び出口チャネル内の液体サンプルによって閉鎖され、外側からは収集チャネル（１７）内の液体サンプルによって閉鎖される。更に、この疎水修飾幾何的バルブ（１６）の小さな狭窄部分に捕捉されたガスが、反応チャンバー（１１）から収集チャネル（１７）への分子の拡散を防止している。
【００３６】
特定の態様によれば、プライマー、プローブ、及び／又は緩衝液を含んでなる異なる反応混合物を、異なる反応チャンバー（１１）に供給することにより、単一のサンプルを数種の独立した核酸の存在下で分析することが可能となる。別の態様によれば、異なる反応チャンバー（１１）に、プライマー、プローブ、及び／又は緩衝液を含んでなる同一の反応混合物を含有させることにより、単一のサンプルを数種の独立した反応の下、単一のパラメーターについて分析することが可能となる。
【００３７】
温度駆動型マイクロ流体バルブをマイクロ流体デバイスにおいて増幅及び／又は検出反応に使用することの主な利点は、反応時における加熱を駆動力として使用し、閉端ブランチ内に供給されたガスの膨張によってバルブを閉鎖することにより、入口チャネルを閉鎖し、１又は２以上の反応チャンバー内の液体サンプルを封止することができるという点である。従って、かかるマイクロ流体デバイスを増幅及び／又は検出反応に使用する場合、反応チャンバーを閉鎖するために別の駆動力（例えば、別のヒーター及び／又はクーラー、或いは反応チャンバーを機械的に閉鎖するデバイス）を供給する必要はない。更に、外部駆動力を供給するために必要な、配管や配線等の上部構造部品を別に設ける必要もない。かかる機構によって、デバイスの複雑化が低減されることになる。上部構造部品とチャネル及び反応チャンバーとを含んでなる複雑な多層構造の代わりに、温度駆動型マイクロ流体バルブを含有する本発明に係るマイクロ流体デバイスは、比較的単純な幾何形状を有する単一層として構成されるので、製造コストを低減することができる。
【００３８】
本発明に係る温度駆動型マイクロ流体バルブの詳細な機能を図３に示す。拡大部分は、反応チャンバー（１１）に繋がる入口チャネル（１２）と、液体の不在下においてガスで満たされている閉端ブランチ（１４）を示している（Ａ）。液体サンプルは、マイクロ流体デバイスの反応チャンバー（１１）に、入口チャネル（１２）を通じて供給される。入口チャネル（１２）は少なくとも１の閉端ブランチ（１４）を含んでなる。閉端ブランチ（１４）は別の出口を有さないため、サンプルが入口チャネル（１２）を通じて反応チャンバー（１１）へと流れる際にも、閉端ブランチ内に存在するガスが液体サンプルによって置き換えられることはない。よって、反応チャンバー（１１）及び入口チャネル（１２）に液体が充填されると、一定量のガスが閉端ブランチ（１４）内に包含されることになる。これを図３（Ｂ）に示す。閉端ブランチ（１４）のサイズ、ひいては包含されるガスの量は、閉鎖される入口チャネル（１２）の径、及び、閉端ブランチに加えられる熱量に応じて選択される。図３（Ｃ）から分かるように、少なくとも閉端ブランチ（１４）に熱を加えた場合、理想気体の法則に従って、また、ガスの熱容量に応じて、ガスは閉端ブランチ（１４）から、液体で満たされた入口チャネル（１２）の方に向かって膨張する。一方からガスが膨張するとともに、出口チャネル（１３）内に幾何的バルブ（１６）が存在し、幾何的バルブがガスのみを許容し、反応チャンバー（１１）から液体が流出するのを阻止することにより、液体の連通が遮断され、反応チャンバー（１１）内の液体が分断されることになる。従って、閉端ブランチ（１４）から膨張したガスが拡散障壁として機能し、反応チャンバー（１１）を入口チャネル（１２）から分離することによって、少なくとも閉端ブランチ（１４）に熱を加えた場合に、反応チャンバー（１１）と入口チャネル（１２）との間で物質の交換が行なわれることはない。
【００３９】
熱が加えられる間、液体サンプルの蒸散を防ぐために、マイクロ流体デバイスを閉鎖しなければならない。デバイスが開放されていると、熱サイクル後には空となってしまい、増幅を首尾よく行なうことはできない。この閉鎖は、例えばキャップ、テープ、軟プラグを用いて、或いは接着剤をＵＶや高速反応（２成分系）により、ポート内で瞬時に重合させて行なうことができる。
【００４０】
閉鎖系内において、上述したような閉端ブランチから入口チャネル内へのガスの膨張を可能とするためには、余剰空間（compensation volume）が存在していなければならない。この余剰空間によって、閉端ブランチからのガスの膨張が可能となる一方、余剰空間自体は縮小することになる。また、液体は殆ど圧縮不可能であるため、余剰空間はガスで満たされていなければならない。かかる余剰空間が存在しないと、閉鎖系内の圧力が上昇し、閉端ブランチから入口チャネルへのガスの膨張が生じない可能性がある。熱サイクルを加える際も、余剰空間は加熱されないことが理想的である。さもなくば、余剰空間及び閉端ブランチバルブの双方の圧力が同様に上昇してしまう。余剰空間が加熱される場合でも、余剰空間コンパートメントの厚さ及び／又は高さを、閉端ブランチコンパートメントの高さと比べて大きい値とすれば、閉端ブランチからのガスの膨張が可能となる。これによって、余剰空間に亘って温度勾配が形成され、閉端ブランチコンパートメントからのガスの膨張が可能となる。一例として、図１（Ａ）に示すように空の充填ポートを余剰空間（１９）として使用し、これをデバイスの充填後に閉鎖して、熱サイクルを加える際には加熱しないようにすればよい。
【００４１】
図２（Ｂ）に例を示すマイクロ流体デバイスの別の実施形態によれば、入口チャネル（１２）は少なくとも２つの閉端ブランチ（１４）を有し、当該閉端ブランチの入口チャネル（１２）への開口（１４）は、実質的に互いに対向する位置に設けられる。更に別の実施形態によれば、これらの閉端ブランチは互いに隣接して設けられる。かかる実施形態の第１の利点は重複性である。即ち、もし一方の閉端ブランチに誤って流体が充填されてしまった場合でも、第２のバルブによってチャネルが閉鎖される。かかる実施形態の第２の利点は集積密度である。ガス塊を２つに分割して、入口チャネルの各側に１箇所ずつ配置することにより、入口チャネルの片側に設けられた１つの閉端ブランチに全てのガス塊が配置される実施形態と比べて、バルブの形態をより小型化することができ、ひいてはデバイスをより小型化することができる。
【００４２】
温度駆動型マイクロ流体バルブを形成する閉端ブランチ（１４）については、様々な実施形態が考えられる。実施形態の例を図４（Ｂ）〜（Ｅ）に示す。閉端ブランチ（１４）は、互いに対向していてもよく（Ｂ）、対向して互い違いに位置してもよく（Ｃ）、互いに隣接していてもよく（Ｄ）、多数の閉端ブランチが存在していてもよい（Ｅ）。更には図５に示すように、出口チャネル（１３）にも１つ又は複数の閉端ブランチを設け、マイクロ流体デバイスが加熱された場合に出口チャネル（１３）が閉鎖されるようにしてもよい。閉端ブランチに供給されるガスの量は、各閉端ブランチ（１４）が、デバイスに熱を加えた場合に入口チャネル（１２）を閉鎖するのに十分なガスを含有するように選択してもよく、或いは、二つ又は多数の閉端ブランチ（１４）に含有されるガス量の合計が、デバイスに熱を加えた場合に入口チャネル（１２）を閉鎖するのに十分な量となるように選択してもよい。前者の実施形態は重複性の面で有利である。即ち、もし１つの閉端ブランチに誤って流体が充填されてしまっても、２つ目のバルブがチャネルを閉鎖し得る。後者の実施形態は、デバイス上で高集積密度を可能にするという点で有利である。
【００４３】
マイクロ流体デバイスの更に別の実施形態によれば、出口チャネル（１３）は、幾何的バルブ（１６）、及び／又は、少なくとも１の閉端ブランチ（１４）、及び／又は、疎水性被膜を含んでなる。かかる実施形態を図６及び７に示す。マイクロ流体デバイスの一実施形態として、液体を反応チャンバー（１１）に誘導する入口チャネル（１２）から分岐する閉端ブランチ（１４）を有するとともに、反応チャンバー（１１）に液体サンプルを充填した場合に反応チャンバー（１１）から追い出されたガスが収集チャネル（１７）内に進入するのを抑制することが可能な幾何的バルブ（１６）を、出口チャネル（１３）の端部に有するマイクロ流体デバイスを図６（Ａ）に示す。更に、別の実施形態の例として、入口チャネル（１２）から分岐する少なくとも２つの閉端ブランチ（１４）を有する例を図６（Ｂ）〜（Ｅ）に示す。ここで閉端ブランチ（１４）は、互いに対向していてもよく（Ｂ）、対向して互い違いに位置してもよく（Ｃ）、互いに隣接していてもよく（Ｄ）、或いは多数の閉端ブランチが設けられてもよい（Ｅ）。更に、出口チャネル（１３）が更に１つ又は複数の閉端ブランチを有し、マイクロ流体デバイスの加熱時に出口チャネル（１３）が閉鎖できるようにしてもよい。かかる実施形態を図７に示す。
【００４４】
幾何的バルブの一例を図１（Ｃ）に示す。幾何的バルブは、小さな径を有する小型のチャネル（例えば毛管）からなり、より大きな２つのチャンバー又はチャネルの間に配置される。小型チャネルは前記のより大きな２つのチャンバー又はチャネルの間に位置する壁の中央に設けられ、前記のチャンバー又はチャネルとは何れの側壁も共有しないことが好ましい。幾何的バルブを形成する小型チャネルの連続（continuance）は、各面において、前記のより大きなチャンバー又はチャネルと小型チャネルとの間の角度が９０°となるように構成すべきである。かかるバルブを作製するのは、製造上の理由から困難である。従って、通常はこれらの幾何的バルブを簡略化するために、壁の１つを前記チャンバー又はチャネルと共有させる（例えば、チャネルの側壁の１つを、９０°の角度を設けることなく、チャンバー又はチャネルへと直接連続させる）。加えて、図８に示すように、閉端ブランチ（１４）が幾何的バルブ（１６）を有していてもよい。これは好ましくは疎水性であり、チャネル（１２／１３）と閉端ブランチ（１４）の出口との交差部分に設けられる。かかる実施形態は、幾何的バルブ（１６）が、デバイスに液体を充填する際に閉端ブランチ（１４）に液体が誤って充填されるのを避けるための追加手段として機能するという点で有利である。
【００４５】
ある態様によれば、幾何的バルブは疎水処理されるか、本質的に疎水性の材料で形成される。かかる実施形態を図９に示す。疎水性表面を有する幾何的バルブの挙動が、親水性表面を有する幾何的バルブと異なるのは、マイクロ流体デバイスに水性の液体を充填する際に、充填（Ａ）がバルブの狭窄部の前で停止する（Ｂ）という点である。この挙動によって、一定量のガスが幾何的バルブ（１６）の狭窄部に捕捉される。収集チャネル（１７）と組合せれば、ガスは両側から捕捉され、両側から液体により包囲される（Ｃ）。２つの液体は、幾何的バルブの狭窄部に捕捉されたガスによって分断され、これら２つの液体の間に拡散は生じない。この種類のバルブには加熱は必須ではないが、幾何的バルブを加熱した場合には、機能性を損なうことなく、捕捉されたガスが膨張する。疎水修飾幾何的バルブ（１６）を収集チャネル（１７）と組み合わせて、本発明に係るデバイスにおける反応チャンバーの特定の出口として使用してもよい。出口におけるバルブが必要であると判断される用途では、出口（１３）を封止するために、幾何的バルブ（１６）を単独で、或いは収集チャネル（１７）との組合せで、バルブ（例えば閉端ブランチバルブ）の代わりに、或いはバルブに加えて使用することができる。
【００４６】
別の実施形態によれば、本発明は、核酸増幅によって液体サンプルを分析するための装置であって、本発明に係るマイクロ流体デバイスと、核酸増幅反応を監視するためのデバイスと、当該少なくとも１の閉端ブランチを少なくとも覆ってなる加熱デバイスとを少なくとも含んでなる装置を提供する。特定の実施形態によれば、加熱デバイスは更に当該反応チャンバーを覆ってなる。この実施形態は、核酸の増幅と同時に温度駆動型マイクロ流体バルブが閉鎖されるという点で有利である。特定の態様によれば、この装置は更に熱制御部を備えてなる。熱制御部によって、マイクロ流体バルブを制御下で閉鎖及び開放するための加熱、及び／又は、増幅反応を制御下で行なうための加熱若しくは熱サイクルの印加が可能となる。特定の用途（例えばＰＣＲ用途）においては、加熱デバイスが熱プロファイルを実行可能であると望ましい。特定の用途では、液体サンプルの蒸散を防ぐため、加熱時にマイクロ流体デバイスを閉鎖する必要がある。マイクロ流体デバイスの閉鎖は、例えばキャップ、テープ、軟プラグを用いて、或いは接着剤をＵＶや高速反応（２成分系）により、ポート内で瞬時に重合させて行なうことができる。
【００４７】
別の実施形態によれば、本発明は、核酸増幅によって液体サンプルを分析するための方法を提供する。この方法は、本発明に係るマイクロ流体デバイスの反応チャンバー内に、当該デバイスの入口チャネルを通じて液体サンプルを供給する工程を少なくとも含んでなる。次の工程では、デバイスの少なくとも閉端ブランチを、加熱デバイスによって加熱する。これによって、閉端ブランチ内のガスが膨張し、デバイスの入口チャネルを封止する。その後、液体サンプル中の核酸が増幅され、増幅反応が監視される。
【００４８】
更に別の実施形態によれば、本発明は、液体サンプル中の核酸を増幅するための方法であって、本発明に係るマイクロ流体デバイスの反応チャンバー内に、当該デバイスの入口チャネルを通じて液体サンプルを供給する工程と、デバイスの少なくとも閉端ブランチを加熱デバイスによって加熱することにより、閉端ブランチ内のガスを膨張させて当該デバイスの入口チャネルを封止する工程と、液体サンプル中の核酸を増幅する工程とを含んでなる方法を提供する。
【００４９】
これらの方法は何れも、特定の態様によれば、反応チャンバーに液体サンプルを充填した後に、入口及び／又は出口チャネルを閉鎖する工程を更に含んでなる。更に、これらの方法では、核酸の増幅を増幅反応により行なってもよい。増幅反応の例としては、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、核酸配列に基づく増幅、ローリング・サークル（rolling circle）増幅、鎖置換（strand-displacement）増幅、等温増幅、タッチダウンポリメラーゼ連鎖反応、又は転写媒介増幅等が挙げられる。
【実施例】
【００５０】
抗凝固ＥＤＴＡ内に採取したＨＢＶ陽性患者のヒト血漿を、COBASR AmpliPrep/COBASR TaqManR ＨＢＶ試験（Roche、PIN 03587819 190）を用いた、Ｂ型肝炎ウイルス（Hepatitis B Virus：ＨＢＶ）抗性試験に供する。サンプルの調製はマニュアルに従い、COBASR AmpliPrep 装置を用いて行なう。サンプル調製後、精製したサンプルを以下の試薬と混合する。
【００５１】
【表１】
2008253261.tif 000003
【００５２】
次に、得られた溶液を、図１（Ａ）に示す、６つの反応チャンバーを有するマイクロ流体デバイスのサンプルポート（１８）に、ピペットにより導入する。ポンプを用いてサンプルをチップに充填する。充填後、デバイスに取り付けられた一体型のキャップで、デバイスを閉鎖する。デバイスを保持するとともに、反応チャンバー内の反応をリアルタイムで検出するように構成された熱サイクル装置（thermal cycler）を用いて、以下のプロトコールに従ってデバイスに熱サイクルを印加する。
【００５３】
【表２】
2008253261.tif 000004
【００５４】
デバイスの初回加熱の際、温度駆動型バルブは閉端ブランチの幾何的設計に従って特定の温度に閉鎖し、ＰＣＲ反応が終了してデバイスが冷却されるまで閉鎖したまま維持される。
【００５５】
熱サイクリングの際に、ＰＣＲ性能をオンラインでリアルタイムに監視する。サンプル中に存在するＨＢＶ量の指標となるＣｔ値が、何れの反応チャンバーにおいても同様に検出可能である（図１０参照）。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】主チャネル（１５）と、主チャネルから分岐する数個の入口チャネル（１２）とを含んでなるマイクロ流体デバイス（１）を示す。各入口チャネルは反応チャンバー（１１）に通じるとともに、加熱時に入口チャネルを封止し得るガスを含有する閉端ブランチ（１４）を有する（図１（Ａ））。図１（Ｂ）は、疎水修飾幾何的バルブ（１６）を含んでなる出口チャネル（１３）を有する１つの反応チャンバー（１１）に通じる、閉端ブランチ（１４）を有する入口チャネル（１２）の特定の実施形態を詳細に示す図であり、図１（Ｃ）は、反応チャンバー（１１）からの流出を防止する幾何的バルブ（１６）を詳細に示す図である。
【図２】入口チャネル（１２）及び閉端ブランチ（１４）を有する、本発明に係る温度駆動型マイクロ流体バルブの特定の実施形態を示す図である。ここで、閉端ブランチと入口チャネルとの間の角度が、当該反応チャンバーの充填時における液体サンプルの流通方向において９０°未満であるか（図２（Ａ））、或いは、入口チャネルが２つの閉端ブランチを有するとともに、閉端ブランチの入口チャネルへの開口部が、実質的に互いに対向して設けられている（図２（Ｂ））。
【図３】本発明に係る温度駆動型マイクロ流体バルブの機能を表わす図である。拡大図は、液体不在時にガスで満たされた状態の、反応チャンバー（１１）に通じる入口チャネル（１２）及び閉端ブランチ（１４）（図３（Ａ））、入口チャネル及び反応チャンバーが液体で満たされた状態（図３（Ｂ））、並びに、反応チャンバー及び入口チャネルが液体で満たされた状態で、少なくとも閉端ブランチに熱を加えるとガスが膨張する様子（図３（Ｃ））を表わす。
【図４】マイクロ流体デバイスの拡大図であり、特に主チャネル（１５）の一部と、反応チャンバー（１１）に通じる入口チャネル（１２）の接合部を示す。入口チャネル（１２）における閉端ブランチ（１４）の実施形態及び配置を幾つか示している。
【図５】マイクロ流体デバイスの拡大図であり、特に主チャネル（１５）の一部と、反応チャンバー（１１）に通じる入口チャネル（１２）の接合部を示す。入口（１２）及び出口（１３）チャネルにおける閉端ブランチ（１４）の実施形態及び配置の例を幾つか示している。
【図６】マイクロ流体デバイスの拡大図であり、特に主チャネル（１５）の一部と、反応チャンバー（１１）に通じる入口チャネル（１２）の接合部を示す。出口チャネル（１３）は更に、幾何的バルブ（１６）を含んでなる。入口チャネル（１２）における閉端ブランチ（１４）の実施形態及び配置を幾つか示している。
【図７】マイクロ流体デバイスの拡大図であり、特に主チャネル（１５）の一部と、反応チャンバー（１１）に通じる入口チャネル（１２）の接合部を示す。出口チャネル（１３）は更に、幾何的バルブ（１６）を含んでなる。入口（１２）及び出口（１３）チャネルにおける閉端ブランチ（１４）の実施形態及び配置の例を幾つか示している。
【図８】幾何的バルブ（１６）を有する閉端ブランチ（１４）の特定の実施形態を表わす図である。
【図９】出口チャネル（１３）に幾何的バルブ（１６）を含んでなる実施形態における、反応チャンバー（１１）及び収集チャネル（１７）への充填を表わす図である。
【図１０】１つのＨＢＶ陽性患者のヒト血漿サンプルを、６つの並行反応において分析した場合における、サイクル数対蛍光グラフである。
【符号の説明】
【００５７】
１    マイクロ流体デバイス
１１    反応チャンバー
１２    入口チャネル
１３    出口チャネル
１４    閉端ブランチ
１５    主チャネル
１６    幾何的バルブ
１７    収集チャネル
１８    サンプル入口ポート
１９    余剰空間
【図１】
2008253261.tif 000005
【図４】
2008253261.tif 000006
【図５】
2008253261.tif 000007
【図６】
2008253261.tif 000008
【図７】
2008253261.tif 000009
【図１０】
2008253261.tif 000010
【図２】
2008253261.tif 000011
【図３】
2008253261.tif 000012
【図８】
2008253261.tif 000013
【図９】
2008253261.tif 000014
【外国語明細書】
2008253261000001.pdf