(57)【要約】【課題】  ヒトβ−アミロイドペプチドの沈着に起因する疾患に対処するためのツールの提供。【解決手段】  ヒトβ−アミロイドペプチドに結合する新規なタンパク質、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びこれらのタンパク質の製造方法が提供される。また、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを用いる診断、治療及びスクリーニング方法も提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｂ）受託番号ＡＴＣＣ  ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｃ）受託番号ＡＴＣＣ  ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）ヌクレオチド２０２からヌクレオチド８０７までの配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｅ）受託番号ＡＴＣＣ  ９８３９９で寄託されたクローンｐＥＫ１９６のβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｆ）受託番号ＡＴＣＣ  ９８３９９で寄託されたクローンｐＥＫ１９６のｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：２のアミノ酸６８からアミノ酸２６９までのアミノ酸配列を含んでなる、ヒトβ−アミロイドペプチド結合活性を有する配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）上記の（ａ）−（ｆ）のポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体であるポリヌクレオチド；
（ｋ）上記の（ｇ）−（ｈ）のタンパク質の種相同物をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｌ）（ａ）−（ｈ）において特定されたポリヌクレオチドのいずれかに厳しい条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド、
よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なポリヌクレオチド及びそのようなポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質並びにこれらのポリヌクレオチド及びタンパク質の治療、診断及び研究有用性に関する。特に、本発明はポリヌクレオチド及びそのようなポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質であって、それらのタンパク質がアルツハイマー病と関係するアミロイド沈着物の主要構成成分の一つのβ−アミロイドペプチドに結合するものに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は脳の一連の構造異常を特徴とする中高年層の進行性痴呆疾患である。中枢神経系（ＣＮＳ）の多数の領域のニューロンが機能障害になり、死滅し、シナプス入力の改変をもたらす。これらの傷つきやすいニューロンの細胞体及び近位樹状突起はペアードヘリカルフィラメントからなる神経原繊維変化を含み、それらの主要成分はリン酸化された微小管結合タンパク質、すなわちτである。疾病の特徴の一つは老人（または神経突起）斑と呼ばれる脳内の沈着物を含むアミロイドの蓄積である。アミロイド斑の主要成分はβ−アミロイドペプチド（以下「ＢＡＰ」、Ａβ、βＡＰ等とも文献において呼ばれる）であり、それはＡＤの進行中に密な集合体を形成する。
【０００３】
ＢＡＰはアミロイド前駆体タンパク質（以下「ＡＰＰ」）のタンパク質分解開裂により得られる３９−４３アミノ酸ペプチドであり、ＡＰＰの膜貫通ドメインの一部及び管腔／細胞外ドメインからなる。４２アミノ酸を含んでなるＢＡＰペプチド（ＢＡＰ４２）がおそらくヒトにおけるいっそう有毒な集合型であると考えられる。ＡＰＰはいくつかのＢＡＰ含有アイソフォームとして生じる。主要な型は６９５、７５１及び７７０アミノ酸からなり、後者の２つのＡＰＰはクニッツ型セリンプロテアーゼインヒビターと構造的及び機能的相同性を共有するドメインを含有する。正常個体では、ＢＡＰは蓄積せず、循環する体液から迅速に取り除かれる。しかしながら、ペプチドは異栄養性樹状突起及び軸索、ミクログリア並びに反応性アストロサイトの表面上に斑を形成することができる。神経突起斑におけるＢＡＰの集合及び沈着はＡＤの開始事象の一つとみなされている。ＢＡＰの発現及び結果をもたらす事象並びにＡＤにおけるそれらの個々の役割の研究は神経科学研究の主要な焦点である。特に、ＢＡＰに結合するタンパク質の発見は、疾病の病因の理解を進めるため及びおそらく新規な治療標的を導入するためにきわめて重要である。
【０００４】
本発明まで、ヒトＢＡＰと結合し、そしてＡＤにおけるＢＡＰの生物学的作用に関与する可能性があるタンパク質及びそれらのフラグメントは同定されていない。
【発明の開示】
【０００５】
本発明はヒトβ−アミロイドペプチド（ＢＡＰ）アミノ酸配列に選択的に結合する遺伝子産物をコードする新規な単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００６】
一つの態様として、本発明は：
（ａ）配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｂ）受託番号ＡＴＣＣ  ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｃ）受託番号ＡＴＣＣ  ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）ヌクレオチド２０２からヌクレオチド８０７までの配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｅ）受託番号ＡＴＣＣ  ９８３９９で寄託されたクローンｐＥＫ１９６のβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｆ）受託番号ＡＴＣＣ  ９８３９９で寄託されたクローンｐＥＫ１９６のｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：２のアミノ酸６８からアミノ酸２６９までのアミノ酸配列を含んでなる、ヒトβ−アミロイドペプチド結合活性を有する配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、；
（ｊ）上記の（ａ）−（ｆ）のポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体であるポリヌクレオチド；
（ｋ）上記の（ｇ）−（ｉ）のタンパク質の種相同物をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｌ）（ａ）−（ｈ）において特定されたポリヌクレオチドのいずれかに厳しい条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド、
よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチドを含んでなる組成物を提供する。
【０００７】
好ましくは、そのようなポリヌクレオチドは配列番号：１のヌクレオチド配列；受託番号ＡＴＣＣ  ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列；または受託番号ＡＴＣＣ  ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコードするポリヌクレオチドを含んでなる。別の態様は配列番号：１のｃＤＮＡ配列に対応する遺伝子を提供する。
【０００８】
他の態様として、本発明はタンパク質を含んでなる組成物を提供し、その場合、該タンパク質は：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列：
（ｂ）アミノ酸６８からアミノ酸２６９までの配列番号：２のアミノ酸配列；
（ｃ）受託番号ＡＴＣＣ  ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのｃＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸１８５からアミノ酸２１７までのアミノ酸配列を含んでなる配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメント、
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【０００９】
好ましくは、そのようなタンパク質は配列番号：２のアミノ酸配列またはアミノ酸６８からアミノ酸２６９までの配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなる。また、融合タンパク質も本発明において請求される。  ある好ましい態様として、ポリヌクレオチドを発現制御配列に機能的に連結する。また、本発明はそのようなポリヌクレオチド組成物で形質転換された、バクテリア、酵母、昆虫及び哺乳類細胞を初めとする、宿主細胞も提供する。
【００１０】
また、（ａ）適当な培養培地中で下記の態様３の宿主細胞の培養物を増殖させ；そして（ｂ）培養培地からタンパク質を精製することを含んでなるＢＢＰの製造方法も提供する。
【００１１】
また、そのようなＢＢＰと特異的に反応する抗体を含んでなる組成物も本発明により提
供される。
【００１２】
ヒトＢＡＰの異常な発現を特徴とする疾病状態を検出するための方法及び診断プロセス並びにＢＢＰの活性を調節する化合物を同定するための方法が提供される。
【００１３】
本発明の別の態様は発現制御配列に機能的に連結されたＢＢＰをコードするポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック動物を含む。
【００１４】
後述する図面は本発明のある一定の態様を示す。それらは具体的に説明するためのものにすぎず、他の本明細書に開示される本発明を限定しない。
【００１５】
図１は、酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）スクリーニング設計のスキームを示す概略図である。記載されているように、ＢＡＰ４２に融合したＧａｌ４  ＤＮＡ  結合ドメイン（ＢＡＰＢＤ；ＴＲＰ１マーカーを含有するプラスミド）及び非融合ＢＡＰ４２（ＢＡＰ；ＵＲＡ３マーカーを含有するプラスミド）を発現するＹ２Ｈ宿主株を、Ｇａｌ４活性化ドメイン融合タンパク質（未知ＡＤ）を発現するＹ２Ｈヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（ＬＥＵ２マーカーを含有するプラスミド）で形質転換した。従って、株は示したタンパク質を発現する円で表される３個のエピソームプラスミドを含有した。陽性のタンパク質−タンパク質相互作用は上流活性化配列（ＧＡＬＵＡＳ）でＧａｌ４活性を再構成し、それによりレポーター遺伝子ＨＩＳ３の転写を誘導した。
【００１６】
図２は、ＢＢＰ１／ＢＡＰ結合の証明をする、酵母ツーハイブリッドアッセイの結果を示す図に代わる写真である。記載されているように、１０倍連続希釈を作製し、トリプトファン、ロイシン、ヒスチジンを欠き、２５ｍＭ  ３−アミノ−トリアゾールを含有する合成寒天培地上に５μｌを置くことによりヒスチジン原栄養に関してＹ２Ｈ株をアッセイした。ラベルＢＡＰで示されるように、全ての株はＢＡＰ融合タンパク質発現プラスミドｐＥＫ１６２を含有する。最初の列（ベクター）はｐＥＫ１６２及び関係のない融合タンパク質を発現するベクターｐＡＣＴ２を保有する独立して得られた株を含む。標的タンパク質を発現する株との比較のバックグラウンドの基準としてこれらを用いる。本文中に記述するように、ＢＢＰ１Δｔｍで示したカラムはｐＥＫ１９８から短くしたＢＢＰ１を発現する。ＢＡＰとＢＢＰ１Δｔｍ融合タンパク質の相互作用はＧａｌ４活性を再構成し、コントロール株に比較して増大した原栄養増殖として見られる、ＨＩＳ３レポーター遺伝子の誘導をもたらす（図１参照）。
【００１７】
図３は、Ｇαタンパク質とＢＢＰ１の相互作用を示すバイオアッセイの結果を示す図に代わる写真である。Ｇａｌ４活性化ドメイン融合タンパク質として発現されるラットＧαｓ、ＧαｏまたはＧαｉ２の部分と共にＢＢＰ１の予測される細胞内ドメインをＧａｌ４
ＤＮＡ結合ドメインとして発現させた。各株の２つの独立して得られたクローンのＹ２Ｈ反応を、Ｇタンパク質成分を欠いている細胞の反応（ベクター）と比較した。プロトコルは図２に対する本文の説明文において記述するとおりである。
【００１８】
図４は、ＢＢＰ１とＢＡＰの相互作用の部位を明らかにするためのアッセイ結果を示す図に代わる写真である。本文に記述するようにＢＢＰ１Δｔｍを２つの重複するセグメントに分けた。これらのタンパク質、ＢＢＰ１ΔＣまたはＢＢＰ１ΔＮをＢＡＰとの相互作用に関してアッセイした。アッセイ方法及びベクターまたはＢＢＰ１Δｔｍで示される株は図２に対する説明文において記述したとおりである。ＢＢＰ１ΔＣまたはＢＢＰ１ΔＮで示される株は、示したＢＢＰ１セグメントを融合タンパク質として発現する。
【００１９】
図５は、ヒト組織（Ａ）及び脳領域（Ｂ）におけるＢＢＰ１  ｍＲＮＡの発現の結果を示す図面に代わる写真である。示した組織から単離した２μｇのサイズ分画したポリ−Ａ
ＲＮＡをブロットしたナイロン膜をＣＬＯＮＴＥＣＨから入手した。これらに放射性標識したＢＢＰ１  ｃＤＮＡプローブを記述したようにハイブリダイズさせた。１．２５ｋｂ（分子量マーカー（示されない）から決定した）に相当する顕著なバンドが全てのレーンにおいて見られた。より高分子量のバンドはおそらくヘテロ核ＲＮＡに相当し；ＢＢＰ１遺伝子はいくつかのイントロンを含む。ブロットをはがし、積載及びＲＮＡ保全性コントロールとしてβ−アクチンで再検出し；全てのレーンは同等なシグナルを示した（データは示されない）。
【００２０】
図６は、海馬の細胞におけるＢＢＰ１及びＡＰＰの発現の結果を示す図に代わる写真である。ヒト海馬及び嗅内皮質におけるＢＢＰ１（Ａ）及びＡＰＰ（Ｂ）発現のパターンを示すインサイチューハイブリダイゼーションオートラジオグラムの像。これらの像を生成するために用いた切片を２人の異なる患者から得られた死後標本から作った。略語：ＤＧ＝歯状回；ＣＡ１＝海馬部分体（ｓｕｂｆｉｅｌｄ）；ＥＣ＝嗅内皮質。
【００２１】
図７は、ヒトまたは齧歯類ＢＡＰとのＢＢＰ１相互作用の比較を示すためのアッセイ結果を示す図に代わる写真である。本文中に記述するように齧歯類ＢＡＰを作製し、融合タンパク質として発現させた。ヒトＢＡＰで示す株は図２において示したものと同一である。齧歯類ＢＡＰで示す株はＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメイン融合物として齧歯類ＢＡＰを発現する。ベクターはＢＡＰ融合タンパク質に対比させるベクターのみを含有するコントロール株を示し；ＢＢＰ１はＢＢＰ１Δｔｍ融合タンパク質を発現する株を示す。
【００２２】
＜発明の詳細な説明＞
本発明はヒトβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ１）の単離及びクローニングに関する。酵母２ハイブリッドアッセイにおいて融合タンパク質としてＢＢＰ１はＢＡＰの４２アミノ酸フラグメント（ＢＡＰ４２）に結合すると特性化された。ＢＢＰ１の発現はヒト組織及び特定の脳領域において示された（図５）。重要なことに、ＢＢＰ１は齧歯類ＢＡＰに比較した場合に酵母２ハイブリッド系においてヒトＢＡＰ１を選択的に結合することが示された。これらの結果は、アルツハイマー病の診断及び処置に、そして脳におけるアミロイド含有斑の蓄積を調節するための薬剤の評価及びスクリーニングのために本発明のＢＢＰ１を用いることができるという前提を裏付ける。
【００２３】
ＢＢＰ１コーディング配列
ＢＡＰのおそらくより有毒な型のヒトＢＡＰ４２と相互作用するタンパク質を同定するために開発された酵母２−ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）遺伝子スクリーニングを用いることにより、最初のヒトＢＢＰ１クローン（クローン１４と称した）を得た。ＢＡＰ４２を酵母Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合して発現させ、また遊離ペプチドとしても発現させた（図１）。この株をヒト胎児脳ｃＤＮＡ  Ｙ２Ｈライブラリーで形質転換した。約１０６の別個の形質転換体から、＃１４で示される単一クローンが一貫したレポーター遺伝子活性化を示し、ＧＡＬ４ドメインのものと連続した実質的なオープンリーディングフレームを含有した。ｃＤＮＡインサートはポリ−Ａ領域で終わる９８４塩基対を含んでなった。この配列は細胞膜を横切るために十分な長さ及び疎水性の２つの領域を有する２０２アミノ酸（配列番号：２のアミノ酸６８ないしアミノ酸２６９）をコードした。また、可能性のあるアルパラギン連結グリコシル化部位もある。クローン１４をクローンｐＥＫ１９６と称し、ＡＴＣＣ  ９８３９９として寄託した。
【００２４】
ライブラリー由来のプラスミドをクローン１４から単離し、Ｙ２Ｈアッセイ株を再構築するために用いた。これらの株の試験から、反応は弱いが、ＢＡＰ融合タンパク質がクローン１４タンパク質と特異的に相互作用することが示された。膜貫通領域のような強い疎水性のタンパク質ドメインはＹ２Ｈ反応を妨げるので（Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ、未発表データ）、最も強い疎水性の領域を除くためにクローン１４インサートを短くし（ＢＢＰ１
Δｔｍ；さらなる説明は以下の表２を参照）、ＢＡＰとの相互作用に関して再試験した。ＢＢＰ１Δｔｍでかなりより強いＹ２Ｈ反応が見られ、削除した配列が可能性のある膜貫通（「ｔｍ」）アンカーをコードするという考えを裏付けた。クローン１４は融合タンパク質の形態で新規なＢＡＰ結合タンパク質を同定する。
【００２５】
可能性がある開始メチオニンコドンが存在しなかったので、クローン１４中に含まれるＢＢＰ１  ｃＤＮＡ配列はタンパク質コーディング領域の５’末端を欠いていると同定された。標準的な逆転写酵素を利用する通常の５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）の多数の試みは２７ヌクレオチドの付加をもたらしただけであった。従って、以下の実施例２において記述したようなゲノムクローニング法を用いて５’末端を単離した。
【００２６】
５’コーディング配列末端はゲノムライブラリーから得られたので、この領域がイントロンを含有する可能性が存在した。この可能性を以下の実施例２において記述したような２つの方法により調べた。得られたデータから、上流配列（ゲノム及びｃＤＮＡ起源からの両方）並びにこの領域中にイントロンがないことが確かめられた。全長ＢＢＰ１タンパク質コーディング領域をコードするｃＤＮＡインサートを含有するプラスミドＢＢＰ１−ｆｌをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号９８６１７で寄託した。全コーディング領域及び推定されるタンパク質配列を配列番号：１及び２に示す。３’非翻訳ヌクレオチド配列は元のクローン１４（ｐＥＫ１９６）中に含まれる。
【００２７】
本発明により、適切な宿主細胞においてＢＢＰ１または機能的に活性のあるペプチドの発現を導く組み換えＤＮＡ分子を作製するためにＢＢＰ１、そのフラグメント、融合タンパク質または機能的同等物をコードするヌクレオチド配列を用いることができる。あるいはまた、ＢＢＰ１配列の一部にハイブリダイズするヌクレオチド配列を核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、サザン及びノーザンブロットアッセイ等に用いることができる。
【００２８】
また、本発明は本明細書に開示されるポリヌクレオチドのものに相補的な配列を有するポリヌクレオチドも含む。
【００２９】
また、本発明は引き下げられたストリンジェンシー条件、より好ましくは厳しい条件、最も好ましくは非常に厳しい条件下で本明細書に記述されるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドも含む。ストリンジェンシー条件の例を以下の表に示し：非常に厳しい条件は例えば条件Ａ−Ｆと少なくとも同じくらい厳しいものであり；厳しい条件は例えば条件Ｇ−Ｌと少なくとも同じくらい厳しく；そして引き下げられたストリンジェンシー条件は例えば条件Ｍ−Ｒと少なくとも同じくらい厳しい。
【００３０】
【表１】
2008253275.tif 000002
１：ハイブリッドの長さはハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリダイズした領域に対して予想されるものである。未知の配列の標的ポリヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズするポリヌクレオチドのものであると考えられる。既知の配列のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる場合、ポリヌクレオチドの配列を整列させ、最適の配列相補性の領域または複数の領域を同定することによりハイブリッドの長さを決定することができる。
Ｈ：ハイブリダイゼーション及び洗浄バッファー中のＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）の代わりにＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４及び１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４である）を用いることができ；ハイブリダイゼーションが完了した後に洗浄を１５分間実施する。
＊ＴＢ−ＴＲ：５０塩基対未満の長さであると予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度はハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−１０ＥＣ低くなるべきであり、
その場合、Ｔｍは以下の式により決定される。１８塩基対未満の長さのハイブリッドでは、Ｔｍ（ＥＣ）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８ないし４９塩基対の間の長さのハイブリッドでは、Ｔｍ（ＥＣ）＝８１．５＋１６．６｛ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］｝＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、そして［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオンの濃度である（１ｘＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。
【００３１】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件のさらなる例は、引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、第９及び１１章並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、節２．１０及び６．３−６．４中に与えられる。
【００３２】
好ましくは、各々のそのようなハイブリダイズするポリヌクレオチドは、それがハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドの長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％）である長さを有し、そしてそれがハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドと少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７５％の同一性；最も好ましくは少なくとも９０％または９５％の同一性）を有し、その場合、配列同一性は、配列のギャップを最小限にしながら重複及び同一性を最大にするように整列した場合にハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列を比較することにより決定される。
【００３３】
ＢＢＰ１の発現
タンパク質を組み換え的に生産するために、Ｋａｕｆｍａｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９、４４８５−４４９０（１９９１）中に開示されたｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターのような発現制御配列に本発明の単離されたポリヌクレオチドを機能的に連結することができる。多数の適当な発現制御配列が当該技術分野において知られている。また、組み換えタンパク質を発現させる一般法も知られており、Ｒ．Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、５３７−５６６（１９９０）中に例示されている。本明細書に定義される場合「機能的に連結された」は、連結されたポリヌクレオチド／発現制御配列で形質転換（トランスフェクト）されている宿主細胞によりタンパク質が発現されるように本発明の単離されたポリヌクレオチドと発現制御配列がベクターまたは細胞内に位置していることを意味する。
【００３４】
ＢＢＰ１の発現系
多数の型の細胞がタンパク質発現のための適当な宿主細胞の役割を果たすことができる。哺乳類宿主細胞は、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養から得られた細胞系、一次移植片、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞を含む。
【００３５】
あるいはまた、酵母のような下等真核生物またはバクテリアのような原核生物においてタンパク質を生産することが可能である。潜在的に適当な酵母株はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）または異種起源のタンパ
ク質を発現することができるあらゆる酵母株を含む。潜在的に適当なバクテリア株はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）または異種起源のタンパク質を発現することができるあらゆるバクテリア株を含む。タンパク質が酵母またはバクテリアで作られる場合、機能的タンパク質を得るために、例えば適切な部位のリン酸化またはグリコシル化により、その中で生産されたタンパク質を修飾することが必要である可能性がある。既知の化学的または酵素的方法を用いてそのような共有結合連結を成し遂げることができる。
【００３６】
また、１つまたはそれ以上の昆虫発現ベクター中の適当な制御配列に本発明の単離されたポリヌクレオチドを機能的に連結し、そして昆虫発現系を用いることによりタンパク質を生産してもよい。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料及び方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．からキットの形態（ＭａｘＢａｃ７キット）で市販されており、そのような方法は引用することにより本明細書に組み込まれるＳｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）中に記述されたように当該技術分野において周知である。本明細書に用いられる場合、本発明のポリヌクレオチドを発現することができる昆虫細胞は「形質転換」されている。
【００３７】
組み換えタンパク質を発現させるために適当な培養条件下で形質転換された宿主細胞を培養することにより本発明のタンパク質を製造することができる。次に、ゲル濾過及びイオン交換クロマトグラフィーのような既知の精製方法を用いてそのような培養物から（すなわち、培養培地または細胞抽出物から）得られた発現タンパク質を精製することができる。また、タンパク質の精製はタンパク質に結合する薬剤を含有するアフィニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−トヨパール７またはシバクロムブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｍ  ｂｌｕｅ）３ＧＡセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）７のようなアフィニティー樹脂での１つもしくはそれ以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテルもしくはプロピルエーテルのような樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む１つもしくはそれ以上の工程；または免疫アフィニティークロマトグラフィーを含んでもよい。
【００３８】
あるいはまた、精製を容易にする形態で本発明のタンパク質を発現させてもよい。例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）のもののような融合タンパク質としてそれを発現させることができる。そのような融合タンパク質の発現及び精製のためのキットは、それぞれ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）及びＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。また、タンパク質にエピトープをつけ、続いて、そのようなエピトープに対する特異的抗体を用いることにより精製することもできる。一つのそのようなエピトープ（「フラッグ（Ｆｌａｇ）」）はＫｏｄａｋ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）から市販されている。
【００３９】
最後に、タンパク質をさらに精製するために疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒質、例えば、メチルまたは他の脂肪族側基を有するシリカゲルを用いる１つまたはそれ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いることができる。また、実質的に均質な単離された組み換えタンパク質を与えるために前記の精製工程のいくつかまたは全てを様々な組み合わせで用いることもできる。従って、タンパク質は他の哺乳類タンパク質を実質的に含まず、本発明により「単離されたタンパク質」と定義される。
【００４０】
また、本発明のタンパク質をトランスジェニック動物の生成物として、例えば、タンパ
ク質をコードするヌクレオチド配列を含有する体細胞または生殖細胞を特徴とするトランスジェニックウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジのミルクの成分として発現させることもできる。
【００４１】
また、タンパク質を既知の通常の化学合成により製造してもよい。合成手段により本発明のタンパク質を構築するための方法は当業者に知られている。合成的に構築されたタンパク質配列は、タンパク質と共有する一次、二次もしくは三次構造及び／または配座特性のために、タンパク質活性を初めとする生物学的特性をそれらと同様に保有することができる。従って、治療用化合物のスクリーニング及び抗体の開発のための免疫学的工程において天然の精製されたタンパク質の生物学的に活性のあるまたは免疫学的代用品としてそれらを用いることができる。
【００４２】
また、本明細書に与えられるタンパク質は、精製されたタンパク質のものに類似したアミノ酸配列を特徴とするタンパク質も含むが、それらに改変が自然に与えられるかまたは故意に作製される。例えば、既知の技術を用いて当業者はペプチドまたはＤＮＡ配列における改変を実施することができる。タンパク質配列中の目的の改変はコーディング配列中の選択したアミノ酸残基の変更、置換、交換、挿入または欠失を含むことができる。例えば、分子の配座を変えるために１個またはそれ以上のシステイン残基を欠失させるかまたは他のアミノ酸と交換することができる。そのような変更、置換、交換、挿入または欠失のための技術は当業者に周知である（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号を参照）。好ましくは、そのような変更、置換、交換、挿入または欠失はタンパク質の適切な活性を保持する。
【００４３】
本明細書の開示が与えられれば、当業者は、タンパク質活性を全部または一部保持すると予想され、従って、スクリーニングまたは他の免疫学的方法論に有用な可能性があるタンパク質の配列の他のフラグメント及び誘導体を容易に作製することもできる。そのような改変は本発明により包含されると考えられる。
【００４４】
酵母ツーハイブリッドアッセイ
Ｙ２Ｈアッセイにより、ＢＢＰ１融合タンパク質とＢＡＰの結合が特異的であることが示された。ＢＡＰとＢＢＰ１の結合は、ＢＢＰ１活性がアルツハイマー病の病因において特定の役割を有する可能性があることを示唆する。
【００４５】
基本的な局所整列検索手段（ＢＬＡＳＴ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９０）を用いてＢＢＰ１配列をジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）に比較した。ＢＢＰ１タンパク質及び利用できる発現配列標識の翻訳を整列させ、保存されたセグメントを検索し、ＭｏＳＴ（Ｔａｔｕｓｏｖ等、１９９４）タンパク質モチーフ検索アルゴリズムにより評価した。これらの分析により、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーに対する可能性のある進化的関係が示された。具体的には、これらの分析から、ＢＢＰ１がＧタンパク質共役受容体のｔｍドメイン３及び４に同等な２つの可能性のある膜貫通（ｔｍ）ドメインを含むことが示された。介在する親水性ループは十分に特性化された３個のアミノ酸モチーフ、アスパルテート（Ｄ）またはグルタメート及びそれに続くアルギニン（Ｒ）及び芳香族残基（ＹまたはＦ）（一般にＤＲＹ配列と呼ばれる）を含み、それはこの受容体ファミリーのほとんど全てのメンバーにおいて保存され、そしてＧタンパク質活性化のための分子引き金として働くことが示されている（Ａｃｈａｒｙａ及びＫａｒｎｉｋ、１９９６）。
【００４６】
Ｙ２Ｈアッセイからのデータ（図２−４を参照）は、ＢＢＰ１がＧタンパク質共役受容体スーパーファミリーのメンバーと共有する機能モジュールをおそらく含有する新規なタンパク質であることを示す。具体的には、ＢＢＰ１は２つの予測されるｔｍドメイン間に重要なＤＲＦ配列（配列番号：２のアミノ酸１９９ないしアミノ酸２０１）を保持し、そ
してＧタンパク質調節シグナリング経路に共役する可能性を有すると思われる。
【００４７】
ＡＰＰはＧαＯと機能的に結合することが示されており（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ等、１９９３；Ｙａｍａｔｓｕｊｉ等、１９９６）、そしてＢＢＰ１は関係のあるＧタンパク質共役受容体中のＧαタンパク質活性化配列であることが知られている構造モチーフを含有する。さらに、ＢＢＰ１  ｔｍドメインの予測される位置及び方向に基づいた仮説から、ＢＡＰと相互作用するタンパク質の領域がＡＰＰ中のＢＡＰと同じ位置に構造関係的に拘束されることが示唆される。
【００４８】
Ｇαタンパク質とＢＢＰ１細胞内領域の結合を評価するためにＹ２Ｈアッセイ株を作製した。ＢＢＰ１の予測される細胞内配列を融合タンパク質として発現させ、３つのＧαタンパク質のＣ末端領域との相互作用に関してアッセイした。これらの実験に用いたタンパク質セグメントを以下の表２に挙げる。ＢＢＰ１細胞内ループは３つ全てのＧαタンパク質と相互作用し（図３）、ＢＢＰ１がＧタンパク質活性のモジュレーターとして機能する可能性があるという前提を裏付けた。これらの様々なＹ２Ｈアッセイにより、ヘテロ三量体Ｇタンパク質に共役した最低限で内在性膜タンパク質ＢＢＰ１及びＡＰＰからなる複数のタンパク質複合体の魅力的なモデルが示唆される。
【００４９】
【表２】
2008253275.tif 000003
【００５０】
ＢＢＰ１のさらなる分析をＹ２Ｈアッセイを用いて得た。ＢＢＰ１Δｔｍクローン中に含まれるＢＢＰ１配列の２つの重複する部分を増幅し、Ｙ２ＨベクターｐＡＣＴ２中にクローン化した（発現プラスミドｐＥＫ２１６及びｐＥＫ２１９、表２並びに対応するタンパク質ＢＢＰ１ΔＮ及びＢＢＰ１ΔＣ（図４））。ΔＣ構築物は両方のｔｍドメインを欠き；ΔＮ構築物は１番目のｔｍドメインとその前の５２アミノ酸をコードした。これらの融合タンパク質をＢＡＰ融合タンパク質とアッセイし、より大きいＢＢＰ１Δｔｍタンパク質を発現する株のものに反応を比較した。ＢＢＰ１ΔＣタンパク質は弱いＹ２Ｈ反応を誘導したが（ベクターにＢＢＰ１ΔＣを比較、図４）、１番目のｔｍドメインと隣接するアミノ近位配列を含有するＢＢＰ１ΔＮタンパク質はＢＢＰ１Δｔｍで見られたものよりほんのわずかに弱い反応を生じた（図４）。これらの結果は、ＢＡＰとの結合のための主要な決定基が野生型ＡＰＰタンパク質中のＢＡＰに構造関係に類似していると予測されるＢＢＰ１領域内に含まれることを示唆する。
【００５１】
齧歯類ＢＡＰに比較した場合にヒトＢＡＰへのＢＢＰ１結合の選択性及び特異性を示すためにＹ２Ｈ系を利用した。ヒト配列に比較して齧歯類ＢＡＰ配列には３個のアミノ酸置換がある（Ｇ５Ｒ、Ｆ１０Ｙ及びＲ１３Ｈ）。実施例６において記述したＹ２Ｈアッセイ
において、齧歯類ペプチドは減少した神経毒性及びヒト脳ホモジェネートへの結合の欠如を示す（Ｍａｇｇｉｏ等、１９９２）。それ故、Ｙ２Ｈ系においてＢＢＰ１と齧歯類ＢＡＰの結合を評価することは興味深かった。ＰＣＲによるオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発によりｐＥＫ１６２中のヒトＢＡＰの配列を齧歯類ペプチドをコードするように変えた。得られたプラスミドｐＥＫ２４０は、齧歯類ペプチド配列のアミノ酸置換を生じる３つのコドンを除いて、この報告を通して利用されるヒトＢＡＰ融合タンパク質発現プラスミドと同一である。ＢＢＰ１融合タンパク質と齧歯類及びヒトＢＡＰ融合タンパク質の相互作用をＹ２Ｈバイオアッセイにより比較した。ＢＢＰ１と齧歯類ＢＡＰを発現する株は増殖反応を生じることができなかった（図７）。この結果はＢＢＰ１がＢＡＰの神経毒性作用の特異的メディエーターとして働く可能性があるという前提を裏付け、そして齧歯類ＢＡＰの減少した神経毒性を説明するための機構を与える。重要なことに、３個のアミノ酸の置換は結合を完全に妨げるために十分であったので、これらのデータはＹ２ＨアッセイにおけるＢＢＰ１／ＢＡＰ相互作用の高度の特異性を示すためにも役立つ。
【００５２】
単離されたＢＢＰ１ポリペプチド
本発明のタンパク質及びタンパク質フラグメントは、開示されたタンパク質の長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％）であるアミノ酸配列の長さを有し且つ開示されたタンパク質と少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７５％の同一性；最も好ましくは少なくとも９０％または９５％の同一性）を有するタンパク質を含み、その場合、配列同一性は配列のギャップを最小限にしながら重複及び同一性を最大にするように整列した場合にタンパク質のアミノ酸配列を比較することにより決定される。また、本発明に含まれるものは、開示されたタンパク質のいずれかのそのようないずれかのセグメントと少なくとも７５％の配列同一性（より好ましくは少なくとも約８５％の同一性；最も好ましくは少なくとも９５％の同一性）を共有する好ましくは８個またはそれ以上（より好ましくは２０個またはそれ以上、最も好ましくは３０個またはそれ以上）の連続したアミノ酸を含んでなるセグメントを含むタンパク質及びタンパク質フラグメントである。
【００５３】
また、開示されたポリヌクレオチド及びタンパク質の種相同物も本発明により提供される。本明細書に用いられる場合、種相同物は既定のタンパク質またはポリヌクレオチドのものと異なる種の起源を有するが、既定のタンパク質またはポリペプチドに著しい配列類似性を有するタンパク質またはポリヌクレオチドである。好ましくはポリヌクレオチド種相同物は既定のポリヌクレオチドと少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７５％の同一性；最も好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有し、タンパク質種相同物は既定のタンパク質と少なくとも３０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも４５％の同一性；最も好ましくは少なくとも６０％の同一性）を有し、その場合、配列同一性は配列のギャップを最小限にしながら重複及び同一性を最大にするように整列した場合にポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはタンパク質のアミノ酸配列を比較することにより決定される。本明細書に与えられる配列から適当なプローブまたはプライマーを作製し、適切な種からの適当な核酸源をスクリーニングすることにより種相同物を単離し、同定することができる。好ましくは、種相同物は哺乳類種から単離されたものである。最も好ましくは、種相同物は、例えば、パン・トログロディテス（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、ゴリラ・ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ）、ポンゴ・ピグミウス（Ｐｏｎｇｏ  ｐｙｇｍａｅｕｓ）、ヒロバテス・コンカラー（Ｈｙｌｏｂａｔｅｓ
ｃｏｎｃｏｌｏｒ）、マカカ・ムラータ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、パピオ・パピオ（Ｐａｐｉｏ  ｐａｐｉｏ）、パピオ・ハマドリアス（Ｐａｐｉｏ  ｈａｍａｄｒｙａｓ）、セルコピテカス・エチオプス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）、セブス・カプシナス（Ｃｅｂｕｓ  ｃａｐｕｃｉｎｕｓ）、アオタス・トリビルガタス（Ａｏｔｕｓ  ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）、サングイナス・オイディプス（Ｓａｎｇｕｉｎｕｓ  ｏｅｄｉｐｕｓ）、ミクロセバス・ムリナス（Ｍｉｃｒｏｃｅｂｕｓ  ｍｕ
ｒｉｎｕｓ）、ムス・ムスクラス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ラタス・ノルベギカス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、クリセツラス・グリセウス（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、フェリス・カトゥス（Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ）、ムステラ・ビソン（Ｍｕｓｔｅｌａ  ｖｉｓｏｎ）、カニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、オリクトラガス・クニクラス（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）、ボス・タウラス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、オビス・アリエス（Ｏｖｉｓ
ａｒｉｅｓ）、サス・スクロファ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）及びエクウス・カバラス（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）のようなある哺乳類種から単離されたものであり、それらには遺伝子地図が作製されており、ある種の遺伝子のゲノム構成と別の種の関係のある遺伝子のゲノム構成の間のシンテニィ関係を同定できる（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ及びＳｅｕａｎｅｚ、１９８８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：３２３−３５１；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ等、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：１０３−１１２；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ等、１９９５、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２５：６８２−６９０；Ｌｙｏｎｓ等、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：４７−５６；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ等、１９９７、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３（１０）：３９３−３９９；Ｃａｒｖｅｒ及びＳｔｕｂｂｓ、１９９７、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：１１２３−１１３７；それらの全ては引用することにより本明細書に取り込まれる）。
【００５４】
また、本発明は開示されたポリヌクレオチドまたはタンパク質の対立遺伝子変異体；すなわち、開示されたポリヌクレオチドによりコードされるものに同一であるかまたは著しく類似した配列を有するタンパク質を同様にコードする単離されたポリヌクレオチドの天然に存在する代替形も包含する。好ましくは、対立遺伝子変異体は既定のポリヌクレオチドと少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７５％の同一性；最も好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有し、その場合、配列同一性は配列のギャップを最小限にしながら重複及び同一性を最大にするように整列した場合にポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を比較することにより決定される。本明細書に与えられた配列から適当なプローブまたはプライマーを作製し、適切な種の個体からの適当な核酸源をスクリーニングすることにより対立遺伝子変異体を単離し、同定することができる。
【００５５】
また、本発明は本明細書に開示されたポリヌクレオチドのものに相補的な配列を有するポリヌクレオチドも含む。
【００５６】
用途
本開示に基づいて当業者に慣例の様々な用途に本発明のＢＢＰ１タンパク質を用いることができる。具体的には、クローン化されたポリペプチドに対して特異的な抗体を作製するための免疫原としてＢＢＰを用いることができる。ＢＢＰ１タンパク質に対する抗体の製造のために当該技術分野で知られている様々な方法を用いることができる。そのような抗体はポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリーを含むがそれらに限定されない。抗体の製造のために、ウサギ、マウス及びラットを初めとするがそれらに限定されない様々な宿主動物にＢＢＰを注入する。一つの態様として、特異的免疫活性能力があるポリペプチドまたはポリペプチドのフラグメントを免疫原性担体に結合させる。また、宿主動物の免疫学的応答を上げるためにアジュバントをポリペプチドと共に投与してもよい。用いることができるアジュバントの例は完全及び不完全フロイント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、スカシガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン及びジニトロフェノールを含むがそれらに限定されない。
【００５７】
培養における連続細胞系による抗体の生産を規定するあらゆる技術を用いて本発明のＢＢＰ１タンパク質に対するモノクローナル抗体を調製することができる。そのような技術
は当業者に周知であり、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  １９７５、２５６、４２０２−４９７）により最初に記述されたハイブリドーマ技術、Ｋｏｓｂｏｒ等（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １９８３、４、７２）により記述されたヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術並びにＣｏｌｅ等（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ７７−９６）により記述されたＥＢＶ−ハイブリドーマ技術を含むがそれらに限定されない。
【００５８】
次に、生物学的サンプルにおける類似したポリペプチドの存在及び細胞以下分布に関してスクリーニングするために本発明のポリペプチドに免疫反応する抗体を用いることができる。さらに、本発明のＢＢＰ１タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を治療法として用いることができる。
【００５９】
また、請求したペプチドと免疫反応する抗体の存在を測定する固相アッセイに有用な抗原としてもＢＢＰ１タンパク質を用いることができる。生物学的サンプルにおけるクローン１４に関連した抗原の免疫学的量を測定するために固相競合アッセイを用いることができる。この測定は本発明のポリペプチドの細胞機能または複数の機能の完全な特性化を容易にすることに有用なだけでなく、これらのタンパク質の異常な量を有する患者を同定するためにも用いることができる。
【００６０】
また、ＡＤのマーカーとしてのＢＡＰ及びＢＡＰ集合体の検出のためのアフィニティークロマトグラフィーにおける捕捉試薬としても本発明のＢＢＰ１タンパク質を用いることができる。
【００６１】
さらに、これらのＢＢＰ１はＢＡＰとクローン化されたタンパク質の相互作用に影響を与える候補分子を同定するためのアッセイにおける試薬として有用である。この結合を特異的に妨げる化合物はＡＤの処置または予防に有用である可能性がある。
【００６２】
また、これらのＢＢＰ１は、ＢＡＰまたはＢＡＰ集合体へのこれらのβ−アミロイドペプチド結合タンパク質の結合の化合物による改変を測定する非細胞インビトロ結合アッセイにも有用である。非細胞アッセイは生細胞を用いるアッセイより費用効果的であり、実施するのが容易であるのでこれらのアッセイはかなり多数の化合物をスクリーニングすることに非常に有用である。本発明のポリペプチドの開示により、これらのアッセイの開発は当業者にとって慣例的である。そのようなアッセイでは、ＢＢＰ１またはＢＡＰのいずれかが標識される。そのような標識は放射性標識、抗体及び蛍光または紫外線標識を含むがそれらに限定されない。まず、ＢＡＰまたはＢＡＰ集合体へのＢＢＰ１の結合をあらゆる試験化合物なしで測定する。次に、試験される化合物をアッセイに添加してそのような化合物がこの相互作用を改変するかどうかを測定する。
【００６３】
実施例
本発明は以下の実施例によりさらに説明される。それらの実施例は特定の態様に関して本発明を具体的に示すためにのみ与えられる。これらの例示は、本発明のある特定の態様を具体的に示すが、限定を表さず、または本発明の範囲を制限しない。
【００６４】
酵母ツーハイブリッド系（以下、「Ｙ２Ｈ」）
Ｙ２Ｈ発現プラスミドを（ＷａｄｅＨａｒｐｅｒ等、１９９３中に記述された）ベクターｐＡＳ２及びｐＡＣＴ２並びに（Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ及びＹｏｕｎｇ、１９９５中に記述された）ｐＣＵＰにおいて構築した。酵母株ＣＹ７７０（Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ及びＹｏｕｎｇ、１９９５）を全ての２Ｈアッセイの宿主として用いた。
【００６５】
遺伝子スクリーニング：ＢＡＰをコードする配列を増幅及び改変するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いた。鋳型として、改変されたヒトＡＰＰクローンのｐＣＬＬ６２１（Ｊａｃｏｂｓｅｎ等、１９９４）を用いてＢＡＰを増幅するためにオリゴヌクレオチド＃１（５’−ＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＧＡ  Ｃ）及び＃３（５’−ＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣ  ＴＴＡ  ＣＧＣ  ＴＡＴＧＡＣ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＧＣ）を用いた。増幅されたＤＮＡは以下の改変を含むＡＰＰ前駆体タンパク質の（ＢＡＰ４２をコードする）コドン３８９ないし４３０からなる。センス鎖プライマーはｐＡＳ２中のＮｃｏＩ部位と同じ翻訳読み枠で５’ＮｃｏＩ制限部位を付加した。アンチセンス鎖プライマーは終止コドン並びにクローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩ部位を付加した。この増幅からの産物をＴＡクローニング系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に連結し、続いて、ＮｃｏＩ及びＳａｌＩでの消化により取り出した。このフラグメントをＮｃｏＩとＳａｌＩで切断したｐＡＳ２中にクローン化した。得られたプラスミド、ｐＥＫ１６２をＧＡＬ４／ＢＡＰ連結点を通ってＤＮＡシークエンシングにより確かめた。ｐＥＫ１６２から発現されるタンパク質（ＢＡＰＢＤ；図１）はカルボキシ末端にＢＡＰの４２アミノ酸を付加した（機能活性化配列を欠いている）酵母転写活性化タンパク質Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインを含有する融合タンパク質を含んでなった。未改変のＢＡＰ４２の発現をもたらす発現プラスミドを開発した。上記のようなＰＣＲにおいてオリゴ＃２（５’−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧ  ＡＴＧ  ＧＡＴ
ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＧＡ  Ｃ）をオリゴ＃３と対にした。この増幅の産物は５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位及びサッカロミセス・セレビシエにおける発現のために最適化された翻訳開始シグナルを含む。
【００６６】
再び、ＤＮＡフラグメントをＴＡ系にクローン化した。次に、それをＨｉｎｄＩＩＩフラグメント上で単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＣＵＰ中にクローン化した。得られたプラスミド、ｐＥＫ１４９（ＢＡＰ；図１）中のＢＡＰ遺伝子の方向をＤＮＡシークエンシングにより確かめた。ＢＡＰ発現プラスミドｐＥＫ１４９（選択マーカーとしてＵＲＡ３を用いた）及びｐＥＫ１６２（選択マーカーとしてＴＲＰ１を用いた）を酵母宿主ＣＹ７７０（Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ及びＹｏｕｎｇ、１９９５）中に形質転換した。両方のプラスミドを含有する株をＣＹ２０９１と称した。酵母２−ハイブリッド発現ベクターｐＡＣＴ２（選択マーカーとしてＬＥＵ２を用いた）中にクローン化されたヒト胎児脳から単離されたｃＤＮＡフラグメントからなるプラスミドライブラリーをＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から購入した。ライブラリー由来のタンパク質を図１において未知ＡＤとして示す。このライブラリーを用いてＣＹ２０９１を形質転換した。３つ全てのプラスミドを含有する細胞を選択するためにウラシル、トリプトファン及びロイシンを欠いている合成完全（ＳＣ）酵母増殖培地上にサンプルを広げた。また、培地はヒスチジンも欠き、そして酵母ＨＩＳ３遺伝子の産物のインヒビターの３−アミノ−トリアゾールを２５ｍＭの濃度で含有した。ＨＩＳ３レポーター遺伝子の低レベルの構成的発現からの活性を減らすために３−アミノ−トリアゾールを利用した。プレートを３０℃で１２日間インキュベートした。増加したヒスチジン原栄養を示す２４個のコロニーを単離した。形質転換コントロールにより、スクリーニングが１０６の別個のクローンをアッセイしたことが示された。陽性クローンの中身を素早く決定するためにＰＣＲ法を利用した。標準法により各陽性株から全ＤＮＡを単離した。ライブラリーベクターｐＡＣＴ２のクローニング領域に隣接するオリゴ＃４（５’−ＴＴＴＡＡＴＡＣＣＡ  ＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡ  Ｔ）と＃５（５’−ＴＴＴＴＣＡＧＴＡＴ  ＣＴＡＣＧＡＴＴＣＡ  Ｔ）を用いるＰＣＲの鋳型としてこの材料を用いた。ＤＮＡフラグメントをＴＡ系に連結し、ＤＮＡシークエンシングにより調べた。（上記のような）クローン＃１４中に含まれるライブラリープラスミドをエシェリキア・コリ中に往復させることにより単離した。ヒトｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を決定し、最初のＰＣＲ産物の配列を確認した。
【００６７】
バイオアッセイ
ロイシン及びトリプトファンを欠いている２ｍｌのＳＣ培地中で株を約７ｘ１０７細胞／ｍｌの密度まで一晩増殖させた。細胞を数え、滅菌水中で１０４から１０８細胞／ｍｌまで１０倍連続希釈物を作製した。ロイシン、トリプトファン及びヒスチジンを欠き、２５ｍＭ  ３−アミノ−トリアゾールを含有するＳＣ培地上にこれらのサンプルを５μｌアリコートで置いた。プレートを３０℃で２ないし３日間インキュベートした。Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質と関係のない転写活性化ドメイン融合タンパク質を発現する（または単に挿入された配列のないｐＡＣＴベクターを含有する）コントロール株に比較して増加した原栄養増殖により陽性のタンパク質／タンパク質相互作用を同定した。これらのコントロール株を上記の図においてラベル「ベクター」として示した。このアッセイ法は非常に再現性があり、標的タンパク質間の特異的相互作用によりもたらされる増殖の微妙な誘導の検出を与えた。ＢＢＰ１Δｔｍを発現するようにタンパク質産物を短くするためのＰＣＲ鋳型として、ｐＥＫ１９６と称し、ＡＴＣＣ  ９８３９９として寄託した元のＢＢＰ１クローン（本明細書においてクローン１４と呼ばれる）を用いた。センスプライマー＃６（５’−ＴＴＴＡＡＴＡＣＣＡ  ＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡ  Ｔ）はｐＡＣＴ２中のＧＡＬ４配列にアニーリングした。アンチセンスプライマー＃７（５’−ＣＴＣＧＡＧ  ＴＴＡ  ＡＡＡ  ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣＣ  ＣＡＡ  ＣＣ）はＢＢＰ１のＤＲＦモチーフをコードする配列のすぐ３’に３’終止コドン及びＸｈｏＩ部位を含んだ。ＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターに連結し、続いて、ＥｃｏＲＩ＋ＸｈｏＩで消化し、ｐＡＣＴ２中にクローン化した。このプラスミド（ｐＥＫ１９８）から発現されるハイブリッド産物をＢＢＰ１Δｔｍで示した。同様に、ＢＢＰ１ΔＮ発現プラスミドｐＥＫ２１６を作製するためにプライマー＃７をプライマー＃８（５’−ＧＡＡＴＴ  ＣＣＡ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＡＣＧ）と対にした。再び、ＰＣＲ産物をＴＡ系に連結し、ＢＢＰ１フラグメント（コドン１２３−２０２）を含む得られたプラスミドをＥｃｏＲＩ＋ＸｈｏＩで消化し、最後に同じ酵素で消化したｐＡＣＴ２に連結した。ｐＡＣＴ２特異的オリゴ＃６をアンチセンスオリゴ＃９（５’−ＣＴＣＧＡＧ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＴＡＴ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＡＣ）と共に用いることによりＢＢＰ１ΔＣを作製した。ＴＡクローニング、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントの単離及びｐＡＣＴ２中へのクローニング後に、得られたプラスミド、ｐＥＫ２１９は残基６８から１７５までのＢＢＰ１を発現した。オリゴヌクレオチド＃１０（５’−ＣＣＴＴＣＣ
ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＧＣＡ  ＴＴＧ  ＴＣＴ）と＃１１（５’−ＡＡＣＡＣＴＣＧＡＧ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＡＡＡ  Ｃ）を用いてＢＢＰ１細胞内ループをコードする配列を増幅した。ＢＢＰ１コドン１８５ないし２１７を含有するこの産物をＮｃｏＩ＋ＸｈｏＩで消化し、ＮｃｏＩ＋ＳａｌＩで切断したｐＡＳ２中にクローン化してｐＯＺ３３９を作製した。全てのＧαタンパク質発現プラスミドの構築はｐＡＣＴ２における融合の部位として各ラットｃＤＮＡ配列（Ｋａｎｇ等、１９９０）の中心近くのＢａｍＨＩ部位を利用した。センスプライマーはＢａｍＨＩ部位の５’の配列にアニーリングし；アンチセンスプライマーは終止コドンの３’の配列にアニーリングし、ＳａｌＩ制限部位を含んだ。プライマーは：Ｇαｏ、センス（＃１７）＝５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣ  ＴＧＣＴＴＣＧＡＧＧ  ＡＴ、アンチセンス（＃１８）＝５’−ＧＴＣＧＡＣＧＧＴＴ  ＧＣＴＡＴＡＣＡＧＧ  ＡＣＡＡＧＡＧＧ；Ｇａｓ、センス（＃１９）＝５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧ  ＴＧＣＴＴＣＡＡＴＧ  ＡＴ、アンチセンス（＃２０）＝５’−ＧＴＣＧＡＣＴＡＡＡ  ＴＴＴＧＧＧＣＧＴＴ  ＣＣＣＴＴＣＴＴ；Ｇａｉ２、センス（＃２１）＝５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣ  ＴＧＣＴＴＴＧＡＧＧ  ＧＴ、アンチセンス（＃２２）＝５’−ＧＴＣＧＡＣＧＧＴＣ  ＴＴＣＴＴＧＣＣＣＣ  ＣＡＴＣＴＴＣＣであった。ＰＣＲ産物をＴＡベクター中にクローン化した。Ｇα配列をＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントとして単離し、ＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩで消化したｐＡＣＴ２中にクローン化した。プラスミド名称は表２を参照。最後に、ヒトＢＡＰの齧歯類配列への転化のためにオリゴヌクレオチド＃２３を合成した。このプライマーは配列５’−ＡＴＡＴＧＧＣＣＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＧＡ  ＣＡＴ
ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＣＧＴを有する。トリプレットはＢＡＰの最初の１３コドンを表し；齧歯類配列を生じるように変えた３個のヌクレオチドに下線を引く。鋳型としてｐＥＫ１６２を用いるＰＣＲにおいてクローニング部位の３’であるＹ２Ｈベクターの領域にアニーリングする＃２４（５’−ＴＧＡＣＣＴＡＣＡＧ  ＧＡＡＡＧＡＧＴＴＡ）とオリゴ＃２３を対にした。産物をＮｃｏＩ＋ＳａｌＩで切断し、ｐＡＳ２に連結してｐＥＫ２４０を作製した。齧歯類ＢＡＰをコードするセグメントのヌクレオチド配列を確認した。
【００６８】
ゲノムクローニング；ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）
ヌクレオチド１８７−６００（図２）に相当するランダムにプライミングされたＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩフラグメントプローブで、ａ２．０ｘ１０６ｐｆｕに相当するヒトゲノムラムダライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングした。製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のプロトコルに従ってＴ７ＱｕｉｃｋＰｒｉｍｅｒキットを用いてプローブを［３２Ｐ］−ＣＴＰで標識した。高ストリンジェンシー下：５０％ホルムアミド、０．１２Ｍ  ＮａＨＰＯ４、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、７％  ＳＤＳ及び２５ｍｇ／ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ中４０℃でフィルターをハイブリダイズさせ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する０．１  ｘ  ＳＳＣ中６５℃で洗浄し、Ｋｏｄａｋ  ＢｉｏＭａｘ  ＭＳフィルムに露出させた。プローブにハイブリダイズするラムダファージクローンを連続平板培養及び再スクリーニングによりプラーク精製した。１０個の陽性クローンを精製し、元のｃＤＮＡクローンから既知の最も５’の配列に対する４５ｎｔオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションによるさらなる分析に供した。このオリゴヌクレオチドはヌクレオチド１５７−２０１（図２）の逆相補物であり、配列５’−ＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣ  ＧＣＣＡＴＣＴＴＧＧ  ＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣ  ＴＴＴＣＴＣＧＣＣＡ  ＣＴＴＣＣを有する。標準的な分子生物学技術によりラムダファージＤＮＡを単離し、ＡＢＩ３７３シーケンサーで蛍光ジデオキシサイクルシークエンシングを用いた直接シークエンシングに供した。
【００６９】
ＲＡＣＥ：第一鎖ＤＮＡ合成を、ｒＴｔｈ熱安定性ポリメラーゼ系（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて実施した。以下の試薬：１Ｘ  逆転写バッファー、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１．６ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、２．５Ｕ  ｒＴｔｈポリメラーゼ、１００ｎｇヒト海馬ポリＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、１０ｍＭオリゴヌクレオチド（ｎｔ４２９−４５２、図２；５’−ＧＴＴＡＴＧＴＴＧＧ  ＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡ  ＡＣＡＧ）を、１０μｌ容量を与えるように１．５ｍＬチューブ中で合わせた。反応を７０℃で１５分間インキュベートし、すぐに氷上に置いた。第二鎖ｃＤＮＡ生成のためにＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。第一鎖反応からの全１０μｌを以下の試薬：１Ｘ  第二鎖バッファー、０．８ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、４Ｘ  第二鎖カクテル（エシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼＩ、エシェリキア・コリＤＮＡリガーゼ、エシェリキア・コリＲＮａｓｅＨ）及び８０μｌの容量までのｄＨ２Ｏと合わせた。チューブを１６℃で１．５時間インキュベートし、その後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ）を添加し、１６℃でさらに４５分間インキュベートした。反応を停止するために、４μｌの２０Ｘ  ＥＤＴＡ／グリコーゲン（０．２Ｍ  ＥＤＴＡ／２ｍｇ／ｍｌグリコーゲン）を反応混合物に添加し、続いて、酵素及び他の不純物を除くためにフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出した。０．１Ｘ  容量の３Ｍ酢酸Ｎａ  ｐＨ  ５．２及び２．５Ｘ  容量の試薬等級ＥｔＯＨを添加し、−７０℃に置くことによりＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを７０％  ＥｔＯＨで１回洗浄し、乾燥させ、１０μｌのｄＨ２Ｏ中に再懸濁した。以下のようにＣｌｏｎｔｅｃｈプロトコルに従って次のＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応に用いるためにＤＮＡの半分をＭａｒａｔｈｏｎアダプターライゲーションに用いた：５μｌのｃＤＮＡを２μｌ（１０ｍＭ）Ｍａｒａｔｈｏｎ（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣ  ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ  ＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧ  ＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣ  ＡＧＧＴ）、１Ｘ  ＤＮＡライゲーションバッファー及び１μｌ（１Ｕ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼに添
加した。反応混合物を１６℃で一晩インキュベートした。混合物を最初のＲＡＣＥ反応のために１：５０希釈し、以下のもの：４０μｌ  ｄＨ２Ｏ、１μｌ  １０Ｘ  Ｋｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、１μｌ（１０ｍＭ）ＡＰ１プライマー（５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴ  ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ  ＡＴＡＧＧＧＣ）、１μｌ（１０ｍＭ）ＢＢＰ１特異的プライマー（ｎｔｓ．１８７−２０９に相当する、図２；５’−ＣＣＡＧＡＣＧＧＣＣＡ  ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣ  ＡＴ）、５μｌ  １０Ｘ  Ｋｌｅｎｔａｑポリメラーゼバッファー、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、１μｌの上記の反応からの希釈したｃＤＮＡと共に０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブ中で合わせた。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム２４００サーモサイクラーを用いて以下のサイクリング条件：９４℃で１分間の変性サイクル、続いて、９４℃で３０秒、７２℃で３分を５サイクル、９４℃で３０秒、７０℃で３分を５サイクル、続いて、９４℃で３０秒、６８℃で３分を２５サイクル、７２℃で７分の最後の伸長を実施した。これに以下のようなネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応を続けた：４０μｌ  ｄＨ２Ｏ、１μｌ（１Ｕ）１０Ｘ  ＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、１μｌ（１０ｍＭ）ＡＰ２プライマー（５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣ  ＧＧＣ）、１μｌ（１０ｍＭ）ＢＢＰ１特異的プライマー（ｎｔｓ．１７２−１９４に相当する、図２；５’−ＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴ  ＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡ  ＣＡＣ）、５μｌ  １０Ｘ  Ａｍｐｌｉｔａｑポリメラーゼバッファー、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、１μｌの一次ＲＡＣＥ産物。ＰＣＲサイクリング条件は９４℃で９分の初期変性サイクル、９４℃で３０秒、６８℃で３０秒、７２℃で２分を２５サイクル、続いて７分間の７２℃伸長であった。ＰＣＲ産物を１Ｘ  ＴＢＥバッファー中で１％アガロースゲルで泳動した。得られた３５０塩基対の産物をゲル精製し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて直接クローン化した。ライゲーション混合物をＯｎｅＳｈｏｔ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換し、Ｘ−ｇａｌを含有するＬＢ−アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）寒天プレート上で平板培養した。ミニプレップＤＮＡを得、ＡＢＩ  ３７３シーケンサーで蛍光ジデオキシサイクルシークエンシングにより調べた。
【００７０】
ノーザン分析．
ヒトの複数の組織及び複数の脳組織のｍＲＮＡノーザンブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手した。元の融合連結点からポリ−Ａ領域までに及ぶＢＢＰ１配列をｐＥＫ１９６から得られたＴＡクローンからＥｃｏＲＩフラグメント上で単離した。β−アクチンＤＮＡは製造業者により供給された。３２Ｐ−ｄＣＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を取り込むためにランダムプライミング法を用いてこれらのＤＮＡから放射性標識されたプローブを生成した。ハイブリダイゼーションをＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂ溶液中、６８℃で製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の説明書に従って実施した。ブロットを２ｘＳＳＣ（１ＸＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）、０．０５％  ＳＤＳ中で室温で洗浄し、続いて、０．１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、５０℃で２回洗浄した。Ｋｏｄａｋ  ＢｉｏＭａｘフィルムへの露出によりハイブリダイゼーションシグナルを視覚化した。
【００７１】
インサイチューハイブリダイゼーション
全長ヒトＢＢＰ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドクローンを用いてＰＣＲによりリボプローブ合成のためのＤＮＡ鋳型を調製した。ｃＤＮＡの３’ＵＴＲを標的とする単一リボプローブを用いた。プローブ配列をジーンバンクデータベースに対して照合してそれらが全ての寄託配列の中で適切な標的のみを認識することを確実にした。ＢＢＰ１のリボプローブを生成するために、ＢＢＰ１  ｃＤＮＡの３’ＵＴＲからの２７５塩基対領域を増幅し、さらに、Ｔ７（センス）及びＴ３（アンチセンス）ポリメラーゼのプロモーター配列を付加するように１組のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。これらのプライマー
は以下の配列：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ  ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ  ＴＴＡＧＡＡＧＡＡＡ  ＣＡＧＡＴＴＴＧＡＧ（フォワード）；５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣ  ＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ  ＣＡＡＧＴＧＧＣＡＡ  ＣＴＴＧＣＣＴＴＴＧ（リバース）を含んだ。ＰＣＲ産物を１．５％低融点アガロースゲルでゲル精製し、産物を含有するバンドを切り出し、フェノール及びフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。ペレットを乾燥させ、１Ｘ  ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４）中に再懸濁した。ＡＰＰリボプローブ鋳型はＪａｃｏｂｓｅｎ等（１９９１）により記述されたように、タンパク質コーディング領域からのＤｄｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントからなった。（３５Ｓ）−ＣＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）及びリボプローブＧｅｍｉｎｉＴＭ（商標）システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いた転写反応のために５０ｎｇのＤＮＡ鋳型を用いた。  死後ヒト海馬の切片を用いたインサイチューハイブリダイゼーション組織化学を以前に記述されたように実施した（Ｒｈｏｄｅｓ、１９９６）。Ｈａｃｋｅｒ−Ｂｒｉｇｈｔｓクリオスタットで１０μｍで切片を切断し、Ｖｅｃｔａｂｏｎｄ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）で被覆した冷却（−２０℃）スライド上に融解固定した。全ての溶液を０．１％（ｖ／ｖ）ジエチルピロカーボネートで処理したｄＨ２Ｏ中に調製し、オートクレーブした。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中４％のパラホルムアルデヒド中に浸すことにより切片を固定し、次に、連続して２ｘＳＳＣ、ｄＨ２Ｏ及び０．１Ｍトリエタノールアミン、ｐＨ  ８．０中に浸した。次に、０．２５％（ｖ／ｖ）無水酢酸を含有する０．１Ｍトリエタノールアミン中に浸すことにより切片をアセチル化し、０．２ｘＳＳＣ中で洗浄し、５０、７０及び９０％エタノール中で脱水し、迅速に乾燥させる。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．６）中に０．９Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｘデンハルト、０．２５ｍｇ／ｍｌ一本鎖ニシン精子ＤＮＡ（ＧＩＢＣＯ／ＢＬＲ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）、５０％脱イオンホルムアミド（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）を含有する１ｍｌのプレハイブリダイゼーション溶液を各スライド上にピペットで移し、スライドを給湿箱中で５０℃で３時間インキュベートした。次に、５０、７０及び９０％エタノール中に浸すことにより切片を脱水し、風乾させた。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．６）中に０．９Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｘデンハルト、０．１ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌ一本鎖サケ精子ＤＮＡ、デキストラン硫酸（１０％）、０．０８％  ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）及び５０％脱イオンホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション溶液に標識したリボプローブを５０，０００ｃｐｍ／μｌの最終濃度で添加した。次に、プローブを９５℃で変性させ（１分）、氷上に置き（５分）、切片上にピペットで移し、給湿室中で５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。続いて、切片を１０ｍＭ  ＤＴＴを含有する２ｘＳＳＣ中、３７℃で１ｘ４５分、続いて、５０％ホルムアミドを含有する１ｘＳＳＣ中、３７℃で１ｘ３０分、そして２ｘＳＳＣ中、３７℃で１ｘ３０分洗浄した。ウシ膵臓ＲＮＡｓｅＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ；４０ｍｇ／ｍｌ）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中に浸すことにより一本鎖及び非特異的にハイブリダイズしたリボプローブを消化した。切片を２ｘＳＳＣ中、６０℃で１時間、続いて０．５％（ｗ／ｖ）チオ硫酸ナトリウムを含有する０．１ｘＳＳＣ中、６０℃で２時間洗浄した。次に、０．３Ｍ酢酸アンモニウムを含有する５０、７０、９０％エタノール中で切片を脱水し、乾燥させた。スライドをＸ線カセット中に置き、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ｂ−Ｍａｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に１４−３０日間対置した。いったん十分な露出が得られると、核トラック感光乳剤（ＮＴＢ−２；Ｋｏｄａｋ）でスライドを覆い、４℃で７−２１日間露出させた。乳剤オートラジオグラムを現像し、製造業者の説明書に従って固定し、下にある組織切片をヘマトキシリンで染色した。非特異的標識化を評価するために、リボプローブＧｅｍｉｎｉＴＭシステムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に供給される鋳型からコントロールプローブを作製した。ＳｃａＩを用いてこのベクターを直鎖状にし、Ｔ３ポリメラーゼを用いて転写した。得られた転写反応はベクター配列のみを含有する２つの産物
、２５０塩基及び１，５２５塩基のリボプローブを生成する。このコントロールプローブ混合物を上記のように標識し、５０，０００ｃｐｍ／μｌの最終濃度でハイブリダイゼーション溶液に添加した。コントロール切片では特異的ハイブリダイゼーションは見られず、すなわち、これらの切片は神経解剖学的標識構造に従わない非常に弱い均一なハイブリダイゼーションシグナルを与えた（データは示されない）。
【実施例１】
【００７２】
ＢＡＰ結合タンパク質（ＢＢＰ１）のクローニング及び単離
おそらくＢＡＰのいっそう有毒な集合型であると考えられるＡＰＰの４２アミノ酸のタンパク質分解フラグメント、ヒトＢＡＰ４２と相互作用するタンパク質を同定するために酵母２−ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）遺伝子スクリーニングを開発した。ＢＡＰ４２を酵母Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合して発現させ、また、遊離ペプチドとしても発現させた（図１）。この株をヒト胎児脳ｃＤＮＡ  Ｙ２Ｈライブラリーで形質転換した。約１０６の別個の形質転換体から、上に特定したクローン１４と称した単一クローンが一貫したレポーター遺伝子活性化を示し、Ｇａｌ４ドメインのものと連続した実質的なオープンリーディングフレームを含有した。ｃＤＮＡインサートはポリ−Ａ領域で終わる９８４塩基対を含んでなった。この配列は細胞膜を横切るために十分な長さ及び疎水性の２つの領域を有する２０１アミノ酸（配列番号：２；アミノ酸残基６８ないし２６９）をコードした。
【００７３】
ライブラリー由来のプラスミドをクローン１４から単離し、Ｙ２Ｈアッセイ株を再構築するために用いた。これらの株の試験から、反応は弱いが、ＢＡＰ融合タンパク質がクローン１４タンパク質と特異的に相互作用することが示された。膜貫通領域のような強い疎水性のタンパク質ドメインはＹ２Ｈ反応を妨げるので（Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ、未発表データ）、最も強い疎水性の領域を除くためにクローン１４インサートを短くし（以下、ＢＢＰ１Δｔｍ）、ＢＡＰとの相互作用に関して再試験した。ＢＢＰ１Δｔｍでかなりより強いＹ２Ｈ反応が見られ（図２）、削除した配列が可能性のある膜貫通（「ｔｍ」）アンカーをコードするという考えを裏付けた。クローン１４のヌクレオチド配列をジーンバンクに対して検索し；このようにしてＢＡＰ結合タンパク質（ＢＢＰ１）は新規であるようであると同定された。
【実施例２】
【００７４】
ＢＢＰ１の５’末端の単離及び確認
上記の実施例１に記述したクローン１４中に含まれるＢＢＰ１  ｃＤＮＡ配列は、可能性のある開始メチオニンコドンが存在しなかったのでタンパク質コーディング領域の５’末端を欠いていた。標準的な逆転写酵素を利用する通常の５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）の多数の試みは２７ヌクレオチドの付加をもたらしただけであった。これらの配列はＡＴＧを含んだが、これが開始コドンであるという確信を与えるための同じ翻訳読み枠の上流終止コドンを含まなかった。ＢＢＰ１遺伝子の５’末端を単離するためにゲノムクローニング法を開始した。
【００７５】
クローン１４の５’配列の４００塩基対（ｂｐｓ）に相当するランダムにプライミングされたプローブでのヒトゲノムラムダライブラリーのハイブリダイゼーションは１０個の陽性クローンの同定をもたらした。クローン１４の最も上流のＢＢＰ１配列に対する（そして、４００塩基対プローブの５’上流配列に相当する）４５塩基オリゴヌクレオチドプローブを用いるこれらのクローンのさらなる特性化により、１０個のうち６個のクローンが先に同定されたものの中に含まれる末端の５’配列を含むことが示された。他の４個のラムダクローンは元の４００塩基対のランダムにプライミングされたｃＤＮＡ由来のプローブ内に含まれる他のエキソンに相当することが決定された（データは示されない）。ＢＢＰ１の５’末端に相当する代表的なクローンからのラムダファージＤＮＡの直接サイク
ルシークエンシングにより、クローン１４で既知の配列の上流でそれと重複するａ５００ヌクレオチドが示された。おそらくこの付加配列はイン−フレームの終止コドンが前にあるＭＥＴに到達する前に先に特性化されたＭＥＴの上流に６２個のさらなるアミノ酸をコードする。最も遠い上流のＭＥＴから下流に２個のＭＥＴ残基が存在するが、標準的慣例により、イン−フレームの終止コドンに続く最初の５’ＭＥＴを含むようにヒトＢＢＰ１遺伝子のアミノ末端の配列を仮に特定した。全コーディング領域及び推定されるタンパク質配列を配列番号：１及び２に示す。このアミノ酸配列を含有する（ＢＢＰ１−ｆｌで示される）プラスミドを受託番号９８６１７でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した。
【００７６】
５’コーディング配列はゲノムライブラリーから得られたので、この領域がイントロンを含む可能性が存在した。この可能性を２つの方法により調べた。第一に、５’ＭＥＴの領域に対するフォワードプライマー及び元のクローン１４内のリバースプライマーを利用して脳ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから配列を増幅させた。両方のサンプルから同じ大きさの産物が生成され、この領域内にイントロンがないことが示され、そして元の配列と上流配列の連結が確かめられた。第二に、改変された５’ＲＡＣＥ実験において（上記の材料及び方法を参照）ゲノムクローンから得られたものに同一であるｃＤＮＡ配列が単離された。これらの結果から、（ゲノム及びｃＤＮＡ起源からの両方の）上流配列及びこの領域中にイントロンがないことが確認された。
【実施例３】
【００７７】
ＢＢＰ１の特性化
基本的な局所整列検索手段（ＢＬＡＳＴ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９０）を用いてＢＢＰ１配列をジーンバンクに比較した。２つのセノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）及び１つのドロソフィラ・メラノガスタ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ゲノム配列並びに多数のヒト、マウス及び他の哺乳類の発現配列標識が同定された。しかしながら、完全なｃＤＮＡ配列も遺伝子に起因すると考えられるいかなる機能データも入手できなかった。ＢＢＰ１タンパク質及び利用できる発現配列標識の翻訳を整列させ、保存されたセグメントを検索し、ＭｏＳＴ（Ｔａｔｕｓｏｖ等、１９９４）タンパク質モチーフ検索アルゴリズムにより評価した。これらの分析により、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーに対する可能性のある進化関係が示された。具体的には、これらの分析から、ＢＢＰ１がＧタンパク質共役受容体のｔｍドメイン３及び４に同等な２つの可能性のある膜貫通（ｔｍ）ドメインを含むことが示された。介在する親水性ループは十分に特性化された３個のアミノ酸モチーフ、アスパルテート（Ｄ）またはグルタメート及びそれに続くアルギニン（Ｒ）及び芳香族残基（ＹまたはＦ）（一般にＤＲＹ配列と呼ばれる）を含有し、それはこの受容体ファミリーのほとんど全てのメンバーにおいて保存され、そしてＧタンパク質活性化のための分子引き金として働くことが示されている（Ａｃｈａｒｙａ及びＫａｒｎｉｋ、１９９６）。これらのデータは、ＢＢＰ１がＧタンパク質共役受容体スーパーファミリーのメンバーと共有する機能モジュールをおそらく含有する新規なタンパク質であることを示す。具体的には、ＢＢＰ１は２つの予測されるｔｍドメイン間に重要なＤＲＦ配列を保持し、それ故、Ｇタンパク質調節シグナリング経路に共役する可能性を有するようである。
【００７８】
ＢＢＰ１の構造分析により、それが関係のあるＧタンパク質共役受容体中のＧαタンパク質活性化配列であることが知られている構造モチーフを含有することが示された。Ｇタンパク質共役受容体の様々なメンバーとＢＢＰ１の相互作用を示すＹ２Ｈアッセイを図３に示す。構造予測に基づいて、ＢＢＰ１は両末端を管腔区画に有して膜を２回横切るように表される。他の配置を完全に除外することはできない。上に記述した可能性のあるタンパク質相互作用をＹ２Ｈアッセイにおいて調べた。ＢＢＰ１Δｔｍクローン中に含まれるＢＢＰ１配列の２つの重複する部分を増幅し、Ｙ２ＨベクターｐＡＣＴ２中にクローン化
した（発現プラスミドｐＥＫ２１６及びｐＥＫ２１９、表２並びに対応するタンパク質ＢＢＰ１ΔＮ及びＢＢＰ１ΔＣ、図４）。ΔＣ構築物は両方のｔｍドメインを欠いており；ΔＮ構築物は１番目のｔｍドメインとその前の５２アミノ酸をコードする。これらの融合タンパク質をＢＡＰ融合タンパク質と共にアッセイし、より大きいＢＢＰ１Δｔｍタンパク質を発現する株のものに反応を比較した。これらの結果は、ＢＡＰとの結合のための主要な決定基が、野生型ＡＰＰタンパク質中のＢＡＰに構造関係的に類似していると予測されるＢＢＰ１領域内に含まれることを示唆する。
【実施例４】
【００７９】
ヒトＢＢＰ１発現の組織分布
ＢＢＰ１  ｍＲＮＡの発現を遺伝子及びその産物の活性を解明することにおける最初の段階として評価した。全ての組織で１．２５ｋｂの主要な転写産物が見られた（図５Ａ）。心臓において高レベルの発現があった。全脳は中間レベルの発現を示した。別の脳領域から得られたサンプルは全てＢＢＰ１発現を示した（図５Ｂ）。興味深いことに、大脳辺縁領域は比較的多量のＢＢＰ１  ｍＲＮＡを含有した。これらはＢＡＰ集合及び関連する神経毒性が最初に起こる脳の領域である。ＢＢＰ１特異的リボプローブを用いて得られたインサイチューハイブリダイゼーションオートラジオグラムの分析から、ヒト海馬及び嗅内皮質において、ＢＢＰ１  ｍＲＮＡがグリア細胞とは対照的にニューロンにおける発現と一致したパターンで中間ないし大きい細胞で発現されることが示された（図６）。さらに、ＢＢＰ１  ｍＲＮＡは実質的に全ての海馬及び嗅内ニューロンで発現され、すなわち、ハイブリダイゼーションシグナルの強さのいかなる実質的または薄片（ｌａｍｉｎａｒ）差もないようである。興味深いことに、ＢＢＰ１発現のパターンはアミロイド前駆体タンパク質ＡＰＰのｍＲＮＡに対するリボプローブを用いて見られたパターンに顕著に類似した（図６）。要約すると、ＢＢＰ１  ｍＲＮＡは調べられた全ての組織及び全ての脳領域において見られた。また、ＢＢＰ１  ｍＲＮＡ発現のインサイチュー分析も海馬領域における多量の発現を示した。
【実施例５】
【００８０】
ＢＢＰ１発現の細胞系分布
ＢＢＰ１発現を多数の細胞系においても調べ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎからの発現配列標識の収集、ｄｂＥＳＴからデータを抽出した。組み換えタンパク質発現のために一般に利用される細胞系及び様々な癌細胞系におけるＢＢＰ１  ｍＲＮＡ発現を定性的に評価するために逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を利用した。ＢＢＰ１はハムスターＣＨＯ及びヒトＨＥＫ２９３細胞において見られた。シグナルは胚幹細胞系Ｎｔｅｒａ−２並びに神経芽細胞腫系ＩＭＲ３２及びＳＫ−Ｎ−ＳＨにおいて見られた。ＢＢＰ１発現は以下の組織起源に相当する癌細胞系において見られた：結腸（Ｃｘ−１、Ｃｏｌｏ２０５、ＭＩＰ１０１、ＳＷ９４８、ＣａＣｏ、ＳＷ６２０、ＬＳ１７４Ｔ）、卵巣（Ａ２７８０Ｓ、Ａ２７８０ＤＤＰ）、胸（ＭＣＦ−７、ＳＫＢｒ−３、Ｔ４７−Ｄ、Ｂ７４７４）、肺（Ｌｘ−１、Ａ５４３９）、黒色腫（Ｌｏｘ、Ｓｋｍｅｌ３０）、白血病（ＨＬ６０、ＣＥＭ）、前立腺（ＬＮＣＡＰ、Ｄｕ１４５、ＰＣ−３）。以下の癌細胞系から単離されたｍＲＮＡを検出するノーザンブロットは全てのサンプルにおいてＢＢＰ１発現を示した：前骨髄性白血病（ＨＬ−６０）、癌腫（ＨｅＬａ  Ｓ３）、慢性骨髄性白血病（Ｋ−５６２）、リンパ芽球性白血病（ＭＯＬＴ−４）、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、結腸腺癌（ＳＷ４８０）、肺癌（Ａ５４９）及び黒色腫（Ｇ３６１）。
【実施例６】
【００８１】
齧歯類ＢＡＰに対してヒトＢＡＰとＢＢＰ１の選択的相互作用
ヒト配列に比較して齧歯類ＢＡＰ配列には３個のアミノ酸置換がある（Ｇ５Ｒ、Ｆ１０Ｙ及びＲ１３Ｈ）。齧歯類ペプチドは減少した神経毒性及びヒト脳ホモジェネートへの結
合の欠如を示す（Ｍａｇｇｉｏ等、１９９２）。それ故、Ｙ２Ｈ系においてＢＢＰ１と齧歯類ＢＡＰの結合を評価することは興味深かった。上記のＰＣＲによるオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発によりｐＥＫ１６２中のヒトＢＡＰの配列を齧歯類ペプチドをコードするように変えた。得られたプラスミドｐＥＫ２４０は、齧歯類ペプチド配列のアミノ酸置換を生じる３つのコドンを除いて、本発明を通して利用されるヒトＢＡＰ融合タンパク質発現プラスミドに同一であった。ＢＢＰ１融合タンパク質と齧歯類及びヒトＢＡＰ融合タンパク質の相互作用をＹ２Ｈバイオアッセイにより比較した。ＢＢＰ１と齧歯類ＢＡＰを発現する株は増殖反応を示すことができなかった（図７）。この結果はＢＢＰ１がＢＡＰの神経毒性作用の特異的メディエーターとして働く可能性があるという前提を裏付け、そして齧歯類ＢＡＰの減少した神経毒性を説明するための機構を与える。重要なことに、３個のアミノ酸の置換は結合を完全に妨げるために十分であった（図７）ので、これらのデータはＹ２ＨアッセイにおけるＢＢＰ１／ＢＡＰ相互作用の高度の特異性を示すためにも役立つ。
【００８２】
【表３】
2008253275.tif 000004
【００８３】
【表４】
2008253275.tif 000005
【００８４】
【表５】
2008253275.tif 000006
【００８５】
【表６】
2008253275.tif 000007
【００８６】
以下、本発明の主要な態様または特徴について列挙する：
１．（ａ）配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｂ）受託番号ＡＴＣＣ  ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｃ）受託番号ＡＴＣＣ  ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）ヌクレオチド２０２からヌクレオチド８０７までの配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｅ）受託番号ＡＴＣＣ  ９８３９９で寄託されたクローンｐＥＫ１９６のβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｆ）受託番号ＡＴＣＣ  ９８３９９で寄託されたクローンｐＥＫ１９６のｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：２のアミノ酸６８からアミノ酸２６９までのアミノ酸配列を含んでなる、ヒトβ−アミロイドペプチド結合活性を有する配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）上記の（ａ）−（ｆ）のポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体であるポリヌクレオチド；
（ｋ）上記の（ｇ）−（ｈ）のタンパク質の種相同物をコードすポリヌクレオチド；及び（ｌ）（ａ）−（ｈ）において特定されたポリヌクレオチドのいずれかに厳しい条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド、
よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド。
【００８７】
２．該ポリヌクレオチドが少なくとも１つの発現制御配列に機能的に連結されている態
様１のポリヌクレオチド。
【００８８】
３．態様２のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞。
【００８９】
４．該細胞が原核または真核細胞である態様３の宿主細胞。
【００９０】
５．態様２のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の製造方法であって、（ａ）適当な培養培地中で態様３の宿主細胞の培養物を増殖させ；そして（ｂ）培養培地からタンパク質を精製することを含んでなる方法。
【００９１】
６．態様５の方法により製造されるタンパク質。
【００９２】
７．（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列：
（ｂ）アミノ酸６８からアミノ酸２６９までの配列番号：２のアミノ酸配列；
（ｃ）受託番号ＡＴＣＣ  ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのｃＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸１８５からアミノ酸２１７までのアミノ酸配列を含んでなる配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメント、
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質。
【００９３】
８．該タンパク質が配列番号：２のアミノ酸配列含んでなる態様７のタンパク質。
【００９４】
９．異種起源のタンパク質またはペプチド配列に連結されたＢＢＰ１を含んでなる融合タンパク質。
【００９５】
１０．ＢＢＰ１が配列番号：２のアミノ酸配列を有する態様９の融合タンパク質。
【００９６】
１１．配列番号：１のＢＢＰ１配列の一部に相補的なアンチセンス配列をコ−ドし、ＢＢＰ１遺伝子の発現を妨げるオリゴヌクレオチド。
【００９７】
１２．  サンプル中のβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコ−ドするポリヌクレオチドの確認方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドに特異的なプローブを、該プローブが該ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするために有効な条件下でサンプルにハイブリダイズさせ；そして（ｂ）サンプル中のポリヌクレオチドへの該プローブのハイブリダイゼーションを確認する工程を含んでなり、その場合、該プローブが配列番号：１のポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一の２０またはそれ以上の塩基対の領域を有する核酸配列を含んでなる方法。
【００９８】
１３．サンプル中のβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコ−ドするポリヌクレオチドの確認方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドに特異的なプローブを、該プローブが該ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするために有効な条件下でサンプルにハイブリダイズさせ；そして（ｂ）サンプル中のポリヌクレオチドへの該プローブのハイブリダイゼーションを確認する工程を含んでなり、その場合、該プローブがＡＴＣＣ  ９８６１７またはＡＴＣＣ  ９８３９９のｃＤＮＡインサートのポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一の２０またはそれ以上の塩基対の領域を有する核酸配列を含んでなる方法。
【００９９】
１４．配列番号：２のアミノ酸配列に配列が少なくとも９０％同一の領域を含んでなるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【０１００】
１５．ＡＴＣＣ  ９８６１７のｃＤＮＡインサートによりコ−ドされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質のアミノ酸配列に配列が少なくとも９０％同一の領域を含んでなるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【０１０１】
１６．配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一の領域を含んでなるポリペプチドをサンプルにおいて検出するための方法であって、（ａ）特異的結合のために有効な条件下で該ポリペプチドに特異的に結合する試薬をサンプルとインキュベートし；そして（ｂ）サンプル中の該ポリペプチドへの該試薬の結合を確認することを含んでなる方法。
【０１０２】
１７．ＡＴＣＣ  ９８６１７のｃＤＮＡインサートによりコ−ドされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質のアミノ酸配列に配列が少なくとも９０％同一の領域を含んでなるポリペプチドをサンプルにおいて検出するための方法であって、（ａ）特異的結合のために有効な条件下で該ポリペプチドに特異的に結合する試薬をサンプルとインキュベートし；そして（ｂ）サンプル中の該ポリペプチドへの該試薬の結合を確認することを含んでなる方法。
【０１０３】
１８．（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一の領域を含んでなるポリペプチドを含んでなる試薬とヒトβ−アミロイドペプチドの異常な発現を示すサンプルを該ヒトβ−アミロイドペプチドへの該試薬の特異的結合のために有効な条件下でインキュベートし；そして（ｂ）サンプル中の該ペプチドへの該試薬の結合を確認することを含んでなる、ヒトβ−アミロイドペプチド（ＢＡＰ）の異常な発現を特徴とする疾病の診断方法。
【０１０４】
１９．（ａ）ＡＴＣＣ  ９８６１７のｃＤＮＡインサートによりコ−ドされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一の領域を含んでなるポリペプチドを含んでなる試薬とヒトβ−アミロイドペプチドの異常な発現を示すサンプルを該ヒトβ−アミロイドペプチドへの該試薬の特異的結合のために有効な条件下でインキュベートし；そして（ｂ）サンプル中の該ペプチドへの該試薬の結合を確認することを含んでなる、ヒトβ−アミロイドペプチドの異常な発現を特徴とする疾病の診断方法。
【０１０５】
２０．宿主から得られたサンプル中の態様１のポリヌクレオチドの存在を分析することを含んでなる診断方法。
【０１０６】
２１．β−アミロイドペプチド結合タンパク質の活性を調節する化合物の同定方法であって、（ａ）該試験化合物を含有する試験媒質中にヒトβ−アミロイドペプチドを含んでなるサンプルと配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一の領域を含んでなるポリペプチドを含んでなる試薬を該ヒトβ−アミロイドペプチドへの該試薬の特異的結合のために有効な条件下でインキュベートし；（ｂ）該試験化合物の有無でサンプル中の該ペプチドへの該試薬の結合を比較し；そして（ｃ）工程（ｂ）における結合の差をβ−アミロイドペプチド結合タンパク質の活性を調節する試験化合物に結び付けることを含んでなる方法。
【０１０７】
２２．β−アミロイドペプチド結合タンパク質の活性を調節する化合物の同定方法であって、（ａ）該試験化合物を含有する試験媒質中にヒトβ−アミロイドペプチドを含んでなるサンプルとＡＴＣＣ  ９８６１７のｃＤＮＡインサートによりコ−ドされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一の領域を含んでなるポリペプチドを含んでなる試薬を該ヒトβ−アミロイドペプチドへの該試薬の特異的結合のために有効な条件下でインキュベートし；（ｂ）該試験化合物の有無でサンプル中の該ペプチドへの該試薬の結合を比較し；そして（ｃ）工程（ｂ）における結合の差をβ−
アミロイドペプチド結合タンパク質の活性を調節する試験化合物に結び付けることを含んでなる方法。
【０１０８】
２３．  態様７のポリペプチドの治療的に有効な量を患者に投与することを含んでなる、脳におけるβ−アミロイドペプチド蓄積を妨げる必要がある患者の処置方法。
【０１０９】
２４．  態様２のポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニックまたはキメラ動物。
【０１１０】
【表７】
2008253275.tif 000008
【０１１１】
【表８】
2008253275.tif 000009
【０１１２】
【表９】
2008253275.tif 000010
【０１１３】
【表１０】
2008253275.tif 000011
【０１１４】
【表１１】
2008253275.tif 000012
【０１１５】
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）スクリーニング設計のスキームを示す概略図である。
【図２】ＢＢＰ１／ＢＡＰ結合の証明をする、酵母ツーハイブリッドアッセイの結果を示す図に代わる写真である。
【図３】Ｇαタンパク質とＢＢＰ１の相互作用を示すバイオアッセイの結果を示す図に代わる写真である。
【図４】ＢＢＰ１とＢＡＰの相互作用の部位を明らかにするためのアッセイ結果を示す図に代わる写真である。
【図５】ヒト組織（Ａ）及び脳領域（Ｂ）におけるＢＢＰ１  ｍＲＮＡの発現の結果を示す図面に代わる写真である。
【図６Ａ】海馬の細胞におけるＢＢＰ１の発現の結果を示す図に代わる写真である。略語：ＤＧ＝歯状回；ＣＡ１＝海馬部分体（ｓｕｂｆｉｅｌｄ）；ＥＣ＝嗅内皮質。
【図６Ｂ】海馬の細胞におけるＡＰＰの発現の結果を示す図に代わる写真である。略語：ＤＧ＝歯状回；ＣＡ１＝海馬部分体（ｓｕｂｆｉｅｌｄ）；ＥＣ＝嗅内皮質。
【図７】ヒトまたは齧歯類ＢＡＰとのＢＢＰ１相互作用の比較を示すためのアッセイ結果を示す図に代わる写真である。
【図１】
2008253275.tif 000013
【図２】
2008253275.tif 000014
【図３】
2008253275.tif 000015
【図４】
2008253275.tif 000016
【図５】
2008253275.tif 000017
【図６Ａ】
2008253275.tif 000018
【図６Ｂ】
2008253275.tif 000019
【図７】
2008253275.tif 000020