(57)【要約】【課題】アグロバクテリウムを介して簡便に日本国内ダイズ品種の形質転換体を作出する手法を提供すると共に、短期間で形質転換体当代及び後代の種子を獲得する技術を提供する。【解決手段】国内品種のカリユタカを利用して、ダイズの形質転換体を作出する方法であって、ダイズの外植片として吸水させた種子に由来する１／２の子葉部分を用いること、当該外植片にアグロバクテリウムを感染させること、不定芽誘導培地で培養して不定芽を誘導すること、シュート形成培地で培養してシュート形成を行うこと、シュートから発根・成長・苗化させる、の培養工程により所定の特性を有する形質転換体を作出する、あるいは、得られた形質転換体を用いて、任意の品種と交配し、その後代から優れた形質を引き継いだ品種を作出すること、で特徴付けられるダイズ形質転換体の作出方法、及び該方法により作出した形質転換体並びにその形質転換体に由来する生産物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
国内品種のカリユタカを利用して、ダイズの形質転換体を作出する方法であって、（１）ダイズの外植片の植物部位として吸水させた種子の子葉部分を用いる、（２）当該子葉にアグロバクテリウムを感染させる、（３）不定芽誘導培地で培養して不定芽を誘導する、（４）シュート形成培地で培養してシュート形成を行う、（５）シュートから発根、成長、苗化させる、の培養工程により所定の特性を有する形質転換体を作出する、あるいは、得られた形質転換体を用いて、任意の品種と交配し、その後代から優れた形質を引き継いだ品種を作出する、ことを特徴とするダイズ形質転換体の作出方法。
【請求項２】
得られた形質転換体を用いて、アグロバクテリウム感染性、不定芽誘導能、及びシュート形成能に優れた北米品種と、あるいはシュートからの発根能に優れた国内品種と交配し、その後代から優れた形質を引き継いだ品種を作出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
北米品種として、Ｊａｃｋ、又はＴｈｏｒｎｅを使用する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
感染させるアグロバクテリウムの濃度が、ＯＤ０．３〜０．５である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
国内品種のカリユタカを利用して、ダイズの形質転換体を作出する方法であって、請求項１に記載の（１）〜（５）の培養工程により、培養時に着蕾する特性を有する形質転換体を作出することを特徴とするダイズ形質転換体の作出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により作出した、培養時に着蕾する特性を有するカリユタカの形質転換体。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載の方法により作出した形質転換体に由来する生産物。
【請求項８】
請求項１から５のいずれかに記載の方法により作出した形質転換体を利用することにより、通常の手法と比べて短期間で形質転換体当代及び／又は世代更新された後代の種子を獲得する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイズ形質転換体の作出方法及び形質転換体に関するものであり、更に詳しくは、国内品種のカリユタカを利用して、アグロバクテリウム法を用いてダイズ形質転換体を作出する方法、当該方法により作出した、従来法による通常品種と比べて極短期間の培養時に着蕾する特性を有する形質転換体、及び当該形質転換体を用いて任意の品種と交配し、その後代から優れた形質を引き継いだ品種を作出する方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ダイズの形質転換体は、例えば、パーティクルガン法、並びにアグロバクテリウム法により作出されている。しかしながら、従来、報告されている方法は、一般的な手法として利用するには、未だ多くの改良の余地がある。従来の方法は、通常の培養設備を持つ研究室で容易に利用可能な簡便な形質転換体の作出方法を確立するには至っていない。
【０００３】
本発明者らは、これまでに、「発芽種子における子葉を用いた方法」（非特許文献１参照）と「胚軸を用いた方法」（非特許文献２参照）の２種の方法で、ダイズ形質転換体の作出を試みたが、残念ながら、形質転換体を得るまでには至っていない。
【０００４】
一般に、アグロバクテリウム法は、パーティクルガン法に比較して、導入コピー数が少なく、ジーンサイレンシングが起こりにくいこと、また、安価で研究が進められること、等の利点がある。アグロバクテリウム法で効率良くダイズ形質転換体を得る方法があれば、新たなダイズ種子の開発が格段に進歩すると考えられる。しかし、ダイズ形質転換体作出については、未だに安定した系は確立されていないのが実情である。
【０００５】
また、形質転換体の作出には、多大な労力と時間を要する。更に、ダイズの形質転換体は、形質転換体当代で利用することは極めて少なく、通常は、自殖を繰り返し、導入遺伝子の固定化を図る必要がある。特に、形質転換体当代から種子を得るためには、多大な時間を要する。したがって、短期間で形質転換体当代及び世代更新された後代の種子を得る手法を確立することが必要となる。
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｌａｎｔａ  ２１６：７２３−７３５（２００３）
【非特許文献２】Ｐｌａｎｔａ  ２１９：１０４２−１０４９（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、国内品種を用いてアグロバクテリウム法で効率良くダイズ形質転換体を作出する方法を開発することを目標として鋭意研究開発を積み重ねた結果、植物部位として吸水させた種子の子葉部分を用いることでアグロバクテリウムの感染程度が高く、不定芽誘導能とシュート形成能が高く、シュートからの発根能が高く、しかも着蕾の時期が極端に早まる特性を有する形質転換体を作出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、国内品種のカリユタカを用いて、ダイズ形質転換体を作出する方法、及び当該方法により作出した、短期間の培養時に着蕾する特性を持つダイズ形質転換体を提供すること、できる限り短期間で形質転換体当代及び世代更新された後代の種子を得るための省力技術を提供すること、を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）国内品種のカリユタカを利用して、ダイズの形質転換体を作出する方法であって、１）ダイズの外植片の植物部位として吸水させた種子の子葉部分を用いる、２）当該子葉にアグロバクテリウムを感染させる、３）不定芽誘導培地で培養して不定芽を誘導する、４）シュート形成培地で培養してシュート形成を行う、５）シュートから発根、成長、苗化させる、の培養工程により所定の特性を有する形質転換体を作出する、あるいは、得られた形質転換体を用いて、任意の品種と交配し、その後代から優れた形質を引き継いだ品種を作出する、ことを特徴とするダイズ形質転換体の作出方法。
（２）得られた形質転換体を用いて、アグロバクテリウム感染性、不定芽誘導能、及びシュート形成能に優れた北米品種と、あるいはシュートからの発根能に優れた国内品種と交配し、その後代から優れた形質を引き継いだ品種を作出する、前記（１）に記載の方法。
（３）北米品種として、Ｊａｃｋ、又はＴｈｏｒｎｅを使用する、前記（２）に記載の方法。
（４）感染させるアグロバクテリウムの濃度が、ＯＤ０．３〜０．５である、前記（１）に記載の方法。
（５）国内品種のカリユタカを利用して、ダイズの形質転換体を作出する方法であって、前記（１）に記載の１）〜５）の培養工程により、培養時に着蕾する特性を有する形質転換体を作出することを特徴とするダイズ形質転換体の作出方法。
（６）前記（５）に記載の方法により作出した、培養時に着蕾する特性を有するカリユタカの形質転換体。
（７）前記（１）から（５）のいずれかに記載の方法により作出した形質転換体に由来する生産物。
（８）前記（１）から（５）のいずれかに記載の方法により作出した形質転換体を利用することにより、通常の手法と比べて短期間で形質転換体当代及び／又は世代更新された後代の種子を獲得する方法。
【００１０】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、ダイズの形質転換体を作出する方法であって、ダイズの外植片の植物部位として吸水させた種子の子葉部分を用いること、当該子葉にアグロバクテリウムを感染させること、不定芽誘導培地で培養して不定芽を誘導すること、シュート形成培地で培養してシュート形成を行うこと、シュートから発根、成長、苗化させること、により形質転換体を作出すること、また、得られた形質転換体を用いて、任意の品種と交配し、その後代から優れた形質を引き継いだ品種を作出すること、を特徴とするものである。
【００１１】
本発明では、得られた形質転換体を用いて、例えば、アグロバクテリウム感染性、不定芽誘導能、及びシュート形成能に優れた北米品種と、あるいはシュートからの発根能に優れた国内品種と交配し、その後代から優れた形質を引き継いだ品種を作出すること、を好ましい実施の態様としている。また、本発明では、上記北米品種として、Ｊａｃｋ、又はＴｈｏｒｎｅを用いること、を好ましい実施の態様としている。また、本発明は、上記方法により作出した形質転換体を利用することにより、通常の手法と比べて短期間で形質転換体当代及び／又は世代更新された後代の種子を獲得する方法の点に特徴を有するものである。
【００１２】
次に、本発明の方法について具体的に説明する。本発明では、ダイズの外植片として、吸水させた種子の子葉を使用することが重要である。従来、外植片として、発芽種子における子葉を用いる方法や、胚軸を用いる方法について、種々試験を試みた事例があったが、本発明者らが検討したところ、発芽種子における子葉を用いる方法は、外植片の準備（特に、メスの入れ方）が極めて煩雑であり、研究室で行える実験レベルの範囲を越えるものと考えられた。また、胚軸を用いる方法は、アグロバクテリウムの感染効率は極めて高いものであったが、胚軸からの不定芽誘導は、上記の発芽種子における子葉を用いる方法に比べ、低いものであることが分かった。
【００１３】
本発明では、外植片として吸水させた種子の子葉を用いることにより、外植片の準備が比較的容易であるという大きな利点がある。また、このことに加え、従来、国内品種では、アグロバクテリウムの感染程度、及び不定芽誘導能とシュート形成能は低く、また、シュートからの発根能の高い品種はない、とされていたものが、これらの全てにおいて高い能力の品種が得られる、という利点があることが分かった。
【００１４】
従来、アグロバクテリウムの感染程度、不定芽誘導能とシュート形成能が高いとされていた北米品種のＪａｃｋ、Ｔｈｏｒｎｅでも、シュートからの発根能は、高い品種はなかった。このことを考慮すると、国内品種で、シュートからの発根能が高い品種を確立できる系が見出されたことは、国内品種の利用を図る上で非常に重要であると考えられる。
【００１５】
次に、本発明における、アグロバクテリウムの感染、不定芽誘導、シュート形成、シュートからの発根、成長、苗化の過程について具体的に説明する。まず、吸水させた種子の子葉を外植片として切り出す。次いで、これにアグロバクテリウムを感染させ、共存培地（ＣＣＭ）で５日間程度培養した後、シュートを誘導するために、不定芽誘導培地（ＳＩＭ）で１４日間程度培養する。その間に、抗生物質、除草剤による選抜を行い、シュートを誘導させる。
【００１６】
次に、シュートを伸長させるために、抗生物質、除草剤で選抜しながら、シュートが３〜４ｃｍになるまで約１４日毎にシュート形成培地（ＳＥＭ）で継代培養を行う。次いで、シュートを発根させるために、Ｒｏｏｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍｕ（ＲＭ）で培養し、シュートの発根を行い、発根したシュートを無菌資材で培養して成長させ、これを園芸培土に移植して苗化させる。上述のような植物体の形成過程において、上記ＣＣＭ、ＳＩＭ、ＳＥＭ、及びＲＭとしては、市販の培地を入手し、用いることが可能である。
【００１７】
本発明の方法において、上述の培地、培養条件等は、シュートの誘導、伸長、シュートの発根、成長の程度に応じて任意に調節することができる。本発明では、外植片として、吸水させた種子の子葉を使用し、アグロバクテリウムの感染程度の品種間差異を試験して調べたところ、北米品種のＪａｃｋ、Ｔｈｏｒｎｅの感染程度が高いが、国内品種のカリユタカでも、上記Ｊａｃｋ、Ｔｈｏｒｎｅと同程度の高い感染程度の品種を確立できることが分かった。
【００１８】
次に、シュートからの発根能の品種間差異を試験して調べたところ、アグロバクテリウムを感染させない場合は、北米品種では、シュートからの発根能が高い品種を確立することはできなかったが、国内品種のカリユタカでは、北米品種よりシュートからの発根能が高い品種を確立することができることが分かった。また、アグロバクテリウムを感染させた場合（実際に遺伝子を導入した場合）は、国内品種から、シュート形成能が高いダイズ形質転換体の作出が可能である。
【００１９】
このことは、アグロバクテリウムの感染程度、不定芽誘導能とシュート形成能が高く、シュートからの発根能が低い北米品種（Ｊａｃｋ、Ｔｈｏｒｎｅ等）と、シュート発根能が高い国内品種を交配した、交配後代から両品種の優れた形質を引き継いだ品種を作出、育成することで、優れた形質を引き継いだダイズの形質転換体の作出が可能であることを示唆している。
【００２０】
アグロバクテリウム法は、例えば、パーティクルガン法に比較して、導入コピー数が少なく、ジーンサイレンシングが起こりにくい利点があり、また、低コストで安価に実施できる利点がある。ダイズについては、各種外植片を用いたダイズ形質転換方法が種々試みられているが、未だに安定した系は確立されていないのが実情であり、例えば、外植片として、発芽種子における子葉を用いる方法、胚軸を用いる方法では、現在までのところ、形質転換体を得ることができていない。
【００２１】
これに対して、本発明では、外植片として吸水させた種子の子葉を用いることで、優れた形質を有する形質転換体を得ることができる。また、それと、アグロバクテリクム感染程度、不定芽誘導能をシュート形成能の高い北米品種（Ｊａｃｋ、Ｔｈｏｒｎｅ等）と、あるいはシュートからの発根能の高い国内品種（カリユタカ、トヨスズ等）と交配して、その交配後代から両品種の優れた形質を引き継いだ品種を作出、育成すること、それにより、国内品種を利用した大豆形質転換体を作出する手法を確立し、提供することを可能とするものである。
【００２２】
ダイズのアグロバクテリウムを介した形質転換方法は、非常に煩雑な操作を必要とするだけでなく、形質転換体を作出するまでに多くの時間と労力を伴う。更に、形質転換体当代において導入遺伝子の評価をすることは少なく、通常、導入遺伝子を固定した後に、解析を行うことが多い。そのため、短期間で形質転換体当代から種子を得ることができれば、固定化を図るために必要な時間を大幅に短縮することが可能となる。本発明者らは、国内品種のカリユタカの形質転換体が、極めて特徴的な培養特性を具備することを発見した。
【００２３】
カリユタカの形質転換体は、１６時間日長の２６℃一定の培養条件下において、サイトカイニンを含む培地上で子葉から誘導した不定芽が培養１ヶ月後くらいから花芽を形成するようになる。この着蕾した不定芽を発根させた後、土に移植すると１ヶ月くらいで着莢するようになる。通常品種であれば、土に移植後２〜３ヶ月くらいから着蕾を始める。また、吸水させた種子の子葉を用いたアグロバクテリウムによる形質転換方法がカリユタカに適していることも明らかとなった。カリユタカを用いた本方法は、極めて短期間に形質転換体当代の種子を得ることができるため、ダイズにおける遺伝子機能解析のツールとして好適に利用できるものと考えられる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）国内品種のカリユタカの吸水した種子の子葉を用いることで、煩雑な操作を省略して、ダイズ形質転換体を作出することを可能とするダイズ形質転換体の作出方法を提供することができる。
（２）米国品種ＴｈｏｒｎｅやＪａｃｋと同程度の優れた培養特性を持つ国内品種を提供することができる。
（３）ダイズ国内品種のアグロバクテリウム法による新規形質転換体の作出方法を確立し、提供することができる。
（４）本発明による国内品種カリユタカは、培養時に花をつけ、収穫までの期間を３ヶ月程度短縮することができる。
（５）上記形質転換体と北米品種又は国内品種を交配して、その後代の形質転換体を作出する新しい形質転換体系の作出方法を提供することができる。
（６）結果的に、形質転換体の次世代（Ｔ２世代）以降の世代更新された後代の種子を短期間で得ることが実施可能となる。
（７）国内品種（カリユタカ）を利用して、培養時に着蕾する特性を有する形質転換体を作出することができる。
（８）上記形質転換体を利用することにより、北米品種（Ｔｈｏｒｎｅ）と比べて、種子の収穫を約３ヶ月早く行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
本実施例では、ダイズのアグロバクテリウム法による形質転換系の確立を試みた。
【００２７】
１）方法
培養実験には、米国の栽培品種であるＪａｃｋとＴｈｏｒｎｅの２品種を用いた。形質転換の方法は、従来の方法〔Ｐｌａｎｔａ（２００３）２１６：７２３−７３５〕をもとに改良を試みた。アグロバクテリウムの３ｓｔｒａｉｎｓである、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５を用いて、２品種に対する感染実験を行った。発現プラスミドＤＮＡには、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流にレポーター遺伝子の一つであるＧＵＳ遺伝子を持つｐＩＧ１２１−Ｈｍ（ハイグロマイシン選択マーカー遺伝子を保有する）を用いた。感染程度は、組織片のＧＵＳ染色の度合いで判断した。
【００２８】
２）アグロバクテリウムを接種する外植片の準備
無菌発芽５日目の芽生えを外植片として用いた。種子を縦に二つの切り分け、伸長しつつある上胚軸の付け根部分をメスで切り落とした。上胚軸を取り除いた部分（再分化能力が高いと考えられる部分）に集中して、深さ０．５ｍｍほどの傷を７、８本つけた。
【００２９】
３）アグロバクテリウム接種と共存培養
子葉の先から１／２（半分）を切り落としたところ、共存培地に接地しやすくなり、結果的に、アグロバクテリウムの感染程度が上がった。感染実験の結果、共存培養直後のＧＵＳ染色程度は、ＥＨＡ１００が最も良く染まった。ＥＨＡ１０５を用いて感染実験を行ったところ、ＪａｃｋとＴｈｏｒｎｅの２品種の間で差は認められなかった。共存培養中に外植片が反り返り、培地に接地していないことから、共存培養３日目に一度だけ、ピンセットを使って外植片を培地に押しつけたところ、染色程度が格段に良くなった。
【００３０】
４）シュート誘導と選抜
どの程度の選抜圧を加える必要があるかを確認するために、感染処理をしていないＪａｃｋの外植片のハイグロマイシンを含む培地上で、シュート誘導培養の最初から選抜試験を行った。培養初期に太いシュートが出てくることもあるが、これらのシュートが形質転換されているものはなかった。おそらく、形質転換は、傷を付けた場所から誘導される多芽体から出てくるシュートの中に含まれていると考えられた。このようなシュートの出方の違いは、外植片を準備する時につける傷のつけ方によると考えられる。
【００３１】
培養初期に見られるシュートは、その後の多芽体形成に悪影響を及ばすと考えられ、上胚軸を取り除いた跡に的確に傷をつけ、その辺りの組織を分割することができれば、太いシュートが再生されることをある程度防ぐことができる。ＪａｃｋとＴｈｏｒｎｅ間のシュート再生率に大きな差はなかった。また、シュート伸長培養時における選抜試験も、シュート誘導培養と同様に行った結果、ｈｙｇ：１０ｍｇ／ｌ程度の選抜が適切と考えられた。
【００３２】
以上により、外植片の傷のつけ方が多芽体形成頻度に大きな影響を及ぼすこと、共存培養中に外植片を培地に密着させることで形質転換頻度は格段に上がる（そのためには、子葉の一部切断が必要である）こと、ＪａｃｋとＴｈｏｒｎｅでは、アグロバクテリウムのｓｔｒａｉｎはＥＡＡ１０５が最も感染の頻度が良いこと、Ｊａｃｋでは、上胚軸を取り除いた部分へのアグロバクテリウムの感染が難しいとされているが、少し改良することで、Ｔｈｏｒｎｅと同等の感染程度を持たせることができたこと、選抜時期を早めることで、効果的な選抜ができる可能性が示唆されたこと、が分かった。
【実施例２】
【００３３】
本実施例では、アグロバクテリウム感染方法の確立、形質転換体選択条件の確立、培養条件の検討（チジアズロン（ＴＤＺ）をＢＡＰの代わりに使用）を試みた。
【００３４】
１）アグロバクテリウム感染方法の検討
上記実施例１の方法と同様にして、アグロバクテリウムの感染方法を検討した。その結果、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５の３ｓｔｒａｉｎｓの内、最も感染程度が良かったものは、ＥＨＡ１０５であった。実験に供した植物材料である２品種のＪａｃｋ：Ｔｈｏｒｎｅの間において、感染程度に違いは認められなかった。アグロバクテリウムの感染程度にばらつきが認められた。感染実験に用いるアグロバクテリウムの培養時間を極端に短くすると共に、感染時の誘導剤であるアセトシリンゴン（４ｍｇ／Ｌ）を加えて培養することで、ばらつきを著しく改良することができた。以上により、感染時における条件を確立した。
【００３５】
２）形質転換体選抜条件の検討
従来の方法について、ａ）選抜時期を早め、培養段階に応じて選抜剤であるハイグロマイシンの濃度を変更したこと、ｂ）アグロバクテリウム自身の増殖を抑える薬剤にメロペネム（メロペン）を２５ｍｇ／Ｌ加えたこと、により、改変を試みた。
【００３６】
アグロバクテリウム感染直後から、５ｍｇ／Ｌハイグロマイシンで選抜を行い、２週間後に１０ｍｇ／Ｌの培地に移植した。以後、２週間毎に１０ｍｇ／Ｌの培地で継代選抜を行った（なお、全ての培地に２５ｍｇ／Ｌメロペンが含まれている）。ＧＵＳ染色することで感染後５３日目の外植片においても、遺伝子導入された細胞の存在を確認した。更に、感染後６５日目の培養物において、ハイグロマイシン耐性と考えられるシュートが認められた。これらの結果は、遺伝子導入された細胞を選択的に培養できることを示唆している。ハイグロマイシン耐性と思われるシュートの出現率は１．９％であった。
【００３７】
３）培養条件の検討
従来、アグロバクテリウム感染後のシュート誘導のためにＢＡＰを用いているが、より多くのシュートを誘導する効果があると云われるチジアズロン（ＴＤＺ）を用いた。ＴＤＺは、ＢＡＰと同じサイトカイニンに分類される植物ホルモンである。シュート誘導培地に、ＢＡＰの代わりに、ＴＤＺ（２μＭ、４μＭ、１０μＭ、２０μＭ）を添加し、シュートの誘導率を調べた。ただし、この実験では、アグロバクテリウムの感染を行わず、培養だけを行った。
【００３８】
その結果、ＴＤＺは、ＢＡＰに比べて、小さなシュートを数多く誘導することが分かった。ＴＤＺによって誘導された小シュートの数を数えることはできなかったが、観察の結果、小シュートの誘導率は、２μＭ＜４μＭ＞４μＭ＞１０μＭ＞２０μＭであった。小シュートが誘導された外植片をシュート伸長培地に置床したところ、シュートの伸長が見られたので、ＢＡＰの代わりにＴＤＺを使用することは、可能であると考えられた。
【００３９】
ハイグロマイシン耐性と考えられるシュートの出現率は、外植片５０に対して１本程度であるが、シュートの形成率を上げるために、チジアズロン（サイトカイニン様物質）を用い、獲得シュート数を高めることを試みた。ハイグロマイシン耐性と考えるシュートは、随時、ＧＵＳ染色と共に、ＰＣＲによるＨＰＴ遺伝子（ハイグロマイシン耐性遺伝子）の導入を確認する必要がある。
【実施例３】
【００４０】
本実施例では、ダイズのアグロバクテリウム法による形質転換系を確立するために、アグロバクテリウム感染条件の検討、不定芽誘導条件の検討、及び形質転換方法の検討、を試みた。
【００４１】
１）アグロバクテリウム感染条件の検討
実施例１と同様の方法により、アグロバクテリウム感染条件を検討した。その結果、感染させるアグロバクテリウムの濃度は、ＯＤ０．３〜０．５が最も好適であった。２０時間アグロバクテリウムを感染させた後、５日間共存培養をすることで、感染効率を著しく上げることができた。過去に報告例（Ｐｌａｎｔａ  ２００４，２１９：１０４２−１０４９）のある共存培地よりも、発芽種子における子葉を外植片に用いる場合の共存培地での培養の方が良好な結果が得られた。共存培養の場合、外植片は、縦向けに培地に貫通する状態に床置することで、感染効率を上昇させることができた。
【００４２】
２）不定芽誘導条件の検討
アグロバクテリウムを感染させた子葉を、強光（１４０〜１８０μｍｏｌｅｓ／ｓ／ｍ２）条件下で培養することにより、不定芽誘導能を著しく向上させることができた。なお、その不定芽誘導率は、強光の場合が７５％であるのに対し、弱光条件下（５０〜８０μｍｏｌｅｓ／ｓ／ｍ２）では、１２．５％であった。アグロバクテリウムの感染後、発芽種子における子葉を用いた方法による形質転換方法で用いるシュート誘導培地で培養することにより、不定芽誘導性を高めることが可能になった。
【００４３】
尚、ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｔｉｐ用培地での不定芽形成率は２８．０％、子葉節用培地での不定芽形成率は４０．０％である。サイトカイニンの効果を調査したところ、ＴＤＺ（チジアズロン）よりもＢＡＰ（ベンジルアデノプリン）の効果の方が有効であった。ＪａｃｋとＴｈｏｒｎｅでは、明らかに品種間差異が認められ、Ｊａｃｋの方が当該培養方法では、不定芽誘導能が高いことが明らかとなった〔ＢＡＰ（１μＭ）・・・Ｊａｃｋ：６２．５％、Ｔｈｏｒｎｅ：２８．５％〕。
【００４４】
３）形質転換方法の検討（子葉：本発明、胚軸：参考例）
ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｔｉｐを培養すると、その伸長に伴い、外植片が大きく湾曲し、その後の扱いが極めて困難となることが分かった。ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｔｉｐは、外植片として扱うには極めて小さいため、ピンセットでの操作に注意が必要になる。これらの問題を解決するために、播種５日後ぐらいの胚軸を外植片に利用することを検討したところ、感染時間は、ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｔｉｐと異なり、３０分感染後に５日間共存培養することで、感染程度が良好であった。共存培養での外植片の置床方法は、ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｔｉｐと同様に、縦向けに培地に貫通する状態に置床することで、感染効率を上昇させることができた。以上の方法を用いることで、ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｔｉｐと同等に不定芽の誘導も可能であった。
【００４５】
以上の結果から、ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｔｉｐを用いた形質転換方法を一部改良し、外植片に胚軸部分を用いることで、従来の方法に比べ、簡便な方法として利用できることが示唆された。
【実施例４】
【００４６】
本実施例では、アグロバクテリウム感染程度の品種間差異、不定芽誘導能とシュート形成能の品種間差異、及びシュートからの発根能の品種間差異の検討、並びにＪａｃｋ並びにＴｈｏｒｎｅを用いた形質転換実験を行った。
【００４７】
（１）アグロバクテリウムの感染とシュートからの発根
種子を滅菌水に一晩浸し、子葉を切り出し、アグロバクテリウムを感染させ、共存培地（ＣＣＭ）で５日間培養した。次に、シュートを誘導するために、アグロバクテリウムを感染させた子葉を不定芽誘導培地（ＳＩＭ）で１４日間培養し、抗生物質、除草剤による選択を行い、シュートの誘導を行った。次に、シュートが３〜４ｃｍになるまで伸長させるために、１４日毎にＳＩＭ培地で継代培養を行った。次に、シュートを、発根させるために、Ｒｏｏｔ  ｍｅｄｉｕｍ（ＲＭ）で培養し、次いで、無菌資材にて培養を行い、成長させて苗化し、園芸培土に移植した。
【００４８】
（２）品種間差の検討
１）ＧＵＳ染色による各品種のアグロバクテリウムの感染程度を比較した。表１に、その結果を示す。アグロバクテリウムの感染程度は、次の基準、０＊：全く染色が認められなかった外植片、１＊：一部にのみ染色が認められた外植片、２＊：全体的に染色されているがその色が薄い外植片、３＊：全体的に染色されていて、その色が濃い外植片、により評価した。
【００４９】
【表１】
2008259497.tif 000003
【００５０】
２）また、不定芽誘導能とシュート形成能の品種間差異を比べるために、不定芽誘導能とシュート形成率の比較を行った。表２に、その結果を示す。各品種における不定芽誘導能とシュート形成能は、次の基準、０＊：全く不定芽の誘導が認められなかった外植片、１＊：一部にのみ不定芽の誘導が認められた外植片、２＊：全体的に不定芽の誘導が認められるがその量が少ない外植片、３＊：全体的に不定芽の誘導が認められ、その量が多い外植片、により評価した。誘導率は、誘導率＝１＊〜３＊の外植片の数／全外植片の数×１００で算出した。
【００５１】
【表２】
2008259497.tif 000004
【００５２】
３）また、シュートからの発根能の品種間差異を比べるために、各品種におけるシュートからの発根能の比較を行った。表３に、その結果を示す。尚、タチユタカに関しては、伸長したシュートが少なかったため、発根能力の比較は行わなかった。発根率は、発根率＝発根したシュート数／発根培地に移したシュート数×１００により算出した。
【００５３】
【表３】
2008259497.tif 000005
【００５４】
（３）形質転換実験
ＧＵＳレポーター遺伝子は、その組織染色により、極めて明瞭に感染部位を特定することができる。しかしながら、染色した組織片は死滅するために、その後の培養を続けることが不可能である。そこで、ある程度感染が可能であると確認できたことから、レポーター遺伝子をｓＧＦＰ（オワンクラゲ由来の緑色発光タンパク質）に変更して行うことにした。
【００５５】
発現ベクターとして、ｐＭｐＣ１２３由来のＣａＭＶ３５５Ｓ  ｐｒｏ−ｓＧＦＰ−ＮｏｓＴ領域を含む発現ベクターを用い、グリホシネート（６ｍｇ／Ｌ）選抜による形質転換実験を行い、Ｊａｃｋにおいて、５０外植片から１つの形質転換不定芽を得ることができた。文献（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，２５：２０６−２１３，２００６）によると、品種Ｔｈｏｒｎｅでの形質転換率が、（４／７０＝５．７％）と報告されている。そこで、Ｔｈｏｒｎｅ（外植片数約１５０）を中心とした形質転換実験を行ったところ、吸水した種子の子葉を用いた方法が最も有効であることが分かった。
【実施例５】
【００５６】
本実施例では、本発明者らの研究室で系が確立している、子葉を外植片に用いたアグロバクテリウム形質転換方法を、カリユタカに対して適用した。なお、導入遺伝子として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子を形質転換実験に用い、図１の発現ベクターを構築した（図１）。カリユタカからＧＦＰ蛍光を持つ、形質転換体を作出することに成功した。なお、カリユタカのＧＦＰ蛍光を持つシュート出現頻度がＴｈｏｒｎｅと比べ格段に高いことが分かった。しかしながら、発根を伴う形質転換シュート数は、比較的少なく、結果的に、Ｔｈｏｒｎｅの形質転換効率が０．８５％であるのに対して、カリユタカ形質転換効率は０．７７％であった。
【００５７】
また、形質転換実験でも、同様に、シュート伸長培地での培養中に着蕾が見られた。更に、形質転換シュートを発根後、鉢上げを行うと、２ヶ月後には着莢が見られた。また、形質転換体当代から得られた種子数は数粒程度であるが、ＧＦＰ蛍光が認められることから、導入遺伝子は、次世代に遺伝していると考えられた。
【００５８】
図２のように、カリユタカは、米国品種Ｔｈｏｒｎｅの培養特性と比べ、培養中に着蕾する特性が見られ、着蕾の時期が極端に早まることが分かった。これは、１６時間日長（２６℃一定）でサイトカイニンがある条件下で見られる現象である。結果的に、カリユタカは、Ｔｈｏｒｎｅに比べ、収穫までに要する期間を約３ヶ月程度短縮することが可能となることが明らかとなった。
【００５９】
以下に、本実施例において実施した試験方法の詳細を説明する。
【００６０】
バイナリーベクターｐＭＤＣ（Ｃｕｒｔｉｓ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ  ２００３）をベースに、本試験用に改良した。また、アグロバクテリウムｓｔｒａｉｎは、ＥＨＡ１０５（Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）を用いた。
【００６１】
ｐＭＤＣ１２３には、植物形質転換体の選抜マーカー遺伝子として、Ｂａｒ（除草剤グルフォシネート耐性遺伝子）が含まれている。また、本試験のために、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ部位からＥｃｏＲＩ部位までを削除した。
【００６２】
ｐＭＤＣ１２３をベースに、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ（Ａｋａｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）に由来するカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼのターミネーター並びにｓＧＦＰ遺伝子（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）を挿入したｐＭＤＣ１２３ＧＦＰを構築した（図１）。
【００６３】
（２）アグロバクテリウムの培養及び感染培地
ｐＭＤＣ１２３ＧＦＰを持つＥＨＡ１０５株を５０ｍｇ／ｌカナマイシン（和光純薬）を含むＹＥＰ培地（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）で２８℃で２日間培養した。アグロバクテリウムの単一クローンを、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含む液体ＹＥＰ培地に植菌し、２８℃で一晩、１６０ｒｐｍで培養した。次いで、その一部を２００ｍｌびＹＥＰ培地に移し、２８℃で一晩培養し、ＯＤ６５０＝０．３−０．５にした。
【００６４】
感染の日に一晩培養した菌液を３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して集菌を行い、７．５μＭ  ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．７μＭのジベレリン酸（ＧＡ  ３）、２０ｍＭのＭＥＳ［２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォン酸］、３％ショ糖及び２００μＭアセトシリンゴンを含んだ１／１０のＢ５培地に再懸濁させた。菌液濃度を分光光度計を用いて、ＯＤ６５０＝０．７−０．８に調整した。
【００６５】
（３）外植変の調整及び感染
殺菌処理した完熟種子を滅菌した純水に約１６時間浸した。種子の臍に沿ってメスで切断し子葉を切り分けた。更に、水平方向にメスを入れ１／２子葉を得た。胚軸を部分を含む約５０外植片を、アグロバクテリウム懸濁を入れた１００ｍｍ×２０ｍｍシャーレに移した。これらの外植片は、１０分間おきに軽くかき混ぜ、３０分間感染処理を行った。感染後、ろ紙を敷いた共存培地上に外植片を平らな面を培地に向けてシャーレあたり５つずつ置床した。
【００６６】
共存培地は、Ｂ５塩、Ｂ５ビタミン類、７．５μＭ  ＢＡＰ、０．７μＭ  ＧＡ３、２０ｍＭ  ＭＥＳ、３％ショ糖、２００μＭアセトシリンゴン、４００ｍｇ／ｌシステイン、１５４ｍｇ／ｌジチオスレイトール、ｐＨ  ５．４、０．４２５％寒天を含む。共存培養は、１６時間日長（１４０−１８０μｍｏｌｅｓ／ｓ／ｍ２）で２６℃で５日間行った。
【００６７】
（４）培養条件及び植物体再分化
共存培養後、外植片を不定芽誘導（ＳＩ）培地［Ｂ５塩、Ｂ５ビタミン類、３％ショ糖、３ｍＭ  ＭＥＳ、５．０μＭ  ＢＡＰ、２５ｍｇ／ｌメロペン（大日本住友製薬）、ｐＨ  ５．７〕で洗浄を行った。
【００６８】
更に、０．７％の寒天を含むＳＩ培地（ＳＩＭ）上に、外植片を平らな面を培地に向けて、シャーレあたり５つずつ置床した。この外植片を、１６時間日長（１４０−１８０μｍｏｌｅｓ／ｓ／ｍ２）で２６℃で２週間培養した。
【００６９】
選抜のため、外植片を６ｍｇ／ｌグルフォシネートを含むＳＩＭ培地に移植し、２週間培養した。更に、もう２週間、同様に、培養を行った。その後、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、３％ショ糖、３ｍＭ  ＭＥＳ、１ｍｇ／ｌゼアチンリボサイド、０．５ｍｇ／ｌ  ＧＡ３、０．１ｍｇ／ｌ  ＩＡＡ、１００ｍｇ／ｌ  ＤＬ−ピログルタミン酸、５０ｍｇ／ｌ  Ｌ−アスパラギン、２５ｍｇ／ｌメロペン（大日本住友製薬）、６ｍｇ／ｌ  グルフォシネート、ｐＨ  ５．７、０．７％寒天を含むシュート形成培地（ＳＥＭ）に移した。
【００７０】
２週間毎にＳＥＭ培地で移植を繰り返すと、シュートの伸長が見られるようになる。特に、カリユタカは、他の品種と比べ、シュートの伸長段階で着蕾が認められ、開花に至る場合がある。中でも、２．５ｃｍ以上に伸長したシュートに関しては、メスで切り取った後に、無菌的に１ｍｇ／ｌインドール酪酸溶液に１分間程度浸した。これらのシュートは、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、２％ショ糖、３ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ  ５．６、０．７％寒天を含んだ発根用培地（ＲＭ）へ移植した。発根処理２−３週間後、幼植物体を培地から取り出し水で洗浄した後に鉢上げを行った。１週間、順化処理を行った後、１６時間日長条件の閉鎖系温室へ移動し、養成した。
【００７１】
（３）形質転換体の導入遺伝子の確認
鉢上げした幼植物体の葉の一部から全ＤＮＡを抽出を行い、導入遺伝子をＰＣＲによって確認した。また、カリユタカ由来の形質転換体は、鉢上げ後、２−３ヶ月で完熟した種子を得ることができた。これは、他の品種（例：Ｔｈｏｒｎｅ）と比べ、約３ヶ月程度早く収穫が可能であったことを示す。
【実施例６】
【００７２】
本実施例では、カリユタカを用いた形質転換体の世代更新された後代の作出試験を行った。上記実施例５と同様の方法で作出したカリユタカ由来の形質転換体の幼植物体を培地から取り出し、水で洗浄した後に鉢上げを行い、１週間順化処理を行った後、１６時間日長の２６℃一定の培養条件下の閉鎖系温室の土へ移植し、養成した。鉢上げ後、約２−３ヶ月で完熟した種子（Ｔ１種子）を収穫することができた。
【００７３】
次に、カリユタカの形質転換体から収穫した種子（Ｔ１種子）を１６時間日長の２６℃一定の培養条件下の閉鎖系温室の土に播種して養成し、約２ヶ月半で完熟した種子（Ｔ２種子）を同条件下の閉鎖系温室の土に播種して養成し、約２ヶ月で完熟した種子（Ｔ３種子）を収穫することができた。同様に、完熟したＴ３種子を上記条件下の閉鎖系温室の土に播種して養成し、約３ヶ月で完熟したＴ４種子を収穫することができた。それらの結果を表４にまとめて示す。本実施例によって、本発明の方法で作出したダイズ形質転換体は、通常の品種と比べて、約２−３ヶ月の極めて短期間に形質転換体当代の種子並びに同様の期間で世代更新された後代の種子を得ることができることが実証された。
【００７４】
【表４】
2008259497.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００７５】
以上詳述したように、本発明は、アグロバクテリウムを介したダイズ国内品種の形質転換体の作出方法及び形質転換体の種子を短期間で獲得する方法に係るものであり、本発明により、簡便にダイズ形質転換体を作出できる新しいダイズ形質転換体の作出方法を提供することができる。特に、通常の品種を用いると形質転換体当代の種子を得るまでに約９ヶ月程度の期間を要するのに対して、カリユタカを用いることで３ヶ月程度短縮することが可能となり、結果的に、導入した遺伝子の固定化に要する時間を大幅に短縮することが可能となる。本発明により、培養時に着蕾する特性を有するダイズ形質転換体を作出し、提供することができる。本発明は、通常品種と比べて、極めて短期期間に形質転換体当代並び世代更新された後代の種子を得ることができる画期的な手法を提供するものとして高い技術的意義を有する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】実施例５で用いたＧＦＰレポーター遺伝子をもつ発現ベクターの構成を示す。
【図２】Ｔｈｏｒｎｅとカリユタカの着蕾及び収穫までの期間の比較を示す。
【図１】
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【図２】
2008259497.tif 000008