(57)【要約】【課題】土壌に施用することにより、土壌の疎水化を抑制する効果並びに疎水化した土壌への水の浸透性を改善する効果に優れるとともに、安全性も高い、土壌処理剤及び土壌処理方法を提供する。【解決手段】ゴルドニア（Gordonia）属に属する微生物の培養物又はその処理物を含む土壌処理剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴルドニア（Gordonia）属に属する微生物の培養物又はその処理物を含む土壌処理剤。
【請求項２】
前記培養物又はその処理物が前記微生物により生産される複合脂質を含む請求項１記載の土壌処理剤。
【請求項３】
前記複合脂質が中性糖及び脂肪酸を主な構成成分とする請求項２記載の土壌処理剤。
【請求項４】
前記微生物がGordonia sp. JE1058 (FERM BP-7406)である請求項１〜３のいずれか１項に記載の土壌処理剤。
【請求項５】
芝草用である請求項１〜４のいずれか１項に記載の土壌処理剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の土壌処理剤を土壌に施用することを含む土壌処理方法。
【請求項７】
土壌が芝草面の土壌である請求項６記載の土壌処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌処理剤及び土壌処理方法に関し、更に詳しくは特定の微生物の培養物又はその処理物を含む土壌処理剤、及び該土壌処理剤を土壌に施用する土壌処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゴルフ場のグリーンなどの芝草、特にベントグラスに発生するトラブルとして、ドライスポットがある。これは、芝草面に生育阻害などが斑点状に発生し、進行すると芝草が枯死に至るもので、芝草管理において重要な事項の一つとなっている。
【０００３】
ドライスポットは、砂質土壌に芝草を生育させた場合に特に発生しやすいが、芝草面の土壌が疎水化されることにより、土壌が芝草の生育に必要な水分を保持できなくなり、この結果芝草が枯死に至る。土壌疎水化の原因としては、芝刈り後の葉くずなどが堆積したサッチ層やピートモス又はその他の有機物が、微生物などの作用により分解される過程で疎水性の物質が生成され、この物質が土壌粒子の表面を被覆してしまうため土壌が疎水化されることにある。疎水化した土壌では水の浸透性がきわめて悪くなるため、土壌中に水分を殆ど保持しなくなっているだけでなく、散水を行っても水が浸透せず乾燥した状態のままである。
【０００４】
ドライスポットへの対応としては、サッチ層を丹念に取り除いたり適切な散水管理を行うなどのほか、一般には疎水化してしまった土壌の水の浸透性を改善することを目的として、土壌浸透剤を芝草面の土壌に施用する方法が広く行われている。これら土壌浸透剤の多くは、例えば、非イオン性の界面活性剤を主体としたものである（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−６０４３７号公報
【特許文献２】特開平１１−２５６１６０号公報
【特許文献３】特開２００２−２０７４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、芝刈り後の葉くずの除去や十分な散水管理は、多大の労力が必要であるが、それだけでドライスポットの発生を完全に抑えることは困難である。また、土壌浸透剤を散布する対処方法では、必ずしも十分な効果が得られていないのが現状である。一方、近年では化学物資を自然環境に放出することに対して社会的に関心が高まっており、法的な規制も強まりつつある。
【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、土壌に施用することにより、土壌の疎水化を抑制する効果並びに疎水化した土壌への水の浸透性を改善する効果に優れるとともに、安全性も高い、土壌処理剤及び土壌処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、微生物の生産物の土壌に対する水の浸透性改善作用について鋭意検討を加えた結果、特定の微生物の生産物が、土壌の疎水化を抑制する作用、並びに疎水化された土壌に対して優れた水浸透性の改善作用を持つことを見いだし、本発明を完成させた。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］ゴルドニア（Gordonia）属に属する微生物の培養物又はその処理物を含む土壌処理剤。
［２］前記培養物又はその処理物が前記微生物により生産される複合脂質を含む前記［１］に記載の土壌処理剤。
［３］前記複合脂質が中性糖及び脂肪酸を主な構成成分とする前記［２］に記載の土壌処理剤。
［４］前記微生物がGordonia sp. JE1058 (FERM BP-7406)である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の土壌処理剤。
［５］芝草用である前記［１］〜［４］のいずれかに記載の土壌処理剤。
［６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の土壌処理剤を土壌に施用することを含む土壌処理方法。
［７］土壌が芝草面の土壌である前記［６］に記載の土壌処理方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、土壌の疎水化を有効に抑制するとともに、疎水化し水浸透性の劣化した土壌の水浸透性を有効に改善する土壌処理剤及び土壌処理方法を提供できる。また本発明の土壌処理剤は微生物の生産物又はその処理物を用いているので、生分解性及び安全性が高く、環境に及ぼす影響が少ない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の土壌処理剤は、ゴルドニア属に属する微生物の培養物又はその処理物を含むものである。本発明に用いる微生物としては、ゴルドニア属に属する微生物で、中性糖及び脂肪酸を主な構成成分とする複合脂質を生産する能力を有するものであれば、特に制限はなく、例えば、Gordonia sp. JE1058 (FERM BP-7406)、Gordonia polyisoprenivorans（例えば、DSM 44266、DSM 44302、NCIMB 13616）が挙げられる。
【００１１】
Gordonia sp. JE1058 (FERM BP-7406)は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番１号つくばセンター中央第６）に寄託されている。Gordonia polyisoprenivorans DSM 44266及びGordonia polyisoprenivorans DSM 44302は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）に寄託されている。Gordonia polyisoprenivorans NCIMB 13616は、ＮＣＩＭＢ（National Collections of Industrial Food and Marine Bacteria (incorporating the NCFB), NCIMB Ltd.）に寄託されている。
【００１２】
本発明に用いる微生物は、ゴルドニア属に属する微生物を培養し、中性糖及び脂肪酸を主な構成成分とする複合脂質を生産する能力を有することを確認することにより容易に選択することができる。
【００１３】
本発明に用いる前記微生物の培養物又はその処理物は、前記微生物により生産される複合脂質（例えば、糖脂質類）を含むものが好ましく、更には中性糖及び脂肪酸を主な構成成分とする複合脂質（例えば、糖脂質類）を含むものが好ましい。
【００１４】
本発明に用いる培養物は、ゴルドニア属に属する微生物を、例えばノルマルパラフィンを原料炭素源として含む培地で好気的に培養することにより生産することができる。
【００１５】
本発明においては、前記の微生物を変異誘発した変異株を用いて培養物又はその処理物を生産することもできる。変異誘発処理の方法は、突然変異を誘発するものであれば特に制限されない。例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネートなどの変異剤による化学的方法、紫外線照射、Ｘ線照射などの物理的方法、遺伝子組換え、トランスポゾンなどによる生物学的方法などを用いることができる。この変異誘発処理は１回でもよいし、また、この変異誘発処理により得られた変異体を更に変異誘発処理するというように２回以上の変異処理を行ってもよい。
【００１６】
培地としては、ゴルドニア属に属する微生物が生育可能なものであれば特に限定されない。原料炭素源としては、生産性の面から炭素数１０〜１８のノルマルパラフィン、オレフィンなどの鎖状炭化水素、炭素数１０〜１８の脂肪酸、炭素数１０〜１８の脂肪酸エステル、炭素数１０〜１８の脂肪酸からなる油脂などが好ましく、その中でノルマルパラフィンがより好ましい。そのようなノルマルパラフィンとしては、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン及びオクタデカンを例示できる。
【００１７】
その他の培地成分として、窒素源、無機塩など、通常微生物の培養に使用されるものを用いることができる。また必要により、各種エキス類、ビタミン類などを用いることもできる。
【００１８】
培養時のｐＨ、温度は、ゴルドニア属に属する微生物が生育し、土壌の水浸透性を改善する作用を有する生産物を生産する範囲であれば特に限定されないが、通常、ｐＨは５〜１０、温度は２０〜３５℃である。また、培養時間は、土壌の水浸透性を改善する作用を有する生産物の生産が最適となるように選定すればよく、特に限定されないが、通常は２〜１０日間好気的に培養を行う。
【００１９】
本発明においては、通常、前記のようにして得られた培養液から、例えば遠心分離やろ過などの公知の方法により微生物菌体を除去した後、上澄み液を限外ろ過により濃縮し、この濃縮液を、例えば凍結乾燥などの公知の方法で乾燥したものを土壌処理剤として用いる。また、前記のようにして得られた培養液を、微生物を含んだまま公知の方法で乾燥したものや、培養液から微生物菌体を除去した液を土壌処理剤として用いることもできる。
【００２０】
必要であれば、前記の操作に加えて、例えばペンタン、ヘキサンなどの有機溶媒を用いて、培養液から持ち越した原料のノルマルパラフィンなどを除去する等の操作を行ってもよい。
【００２１】
本発明においては、目的に応じて、培養液、その乾燥物などの培養物、又は培養液から微生物菌体を除去した後、乾燥したもの、培養液から微生物菌体を除去した液などの処理物を適宜用いることができる。
【００２２】
本発明の培養物又はその処理物は、中性糖及び脂肪酸を主な構成成分として含む。これら中性糖及び脂肪酸の組成は、培養条件等により変化するが、通常、次のような組成を示す。
【００２３】
培養物の処理物（菌体除去後の固形分）中の中性糖の含有量は、通常、２０〜４５重量％であり、構成糖としては、グルコース、ガラクトース及びマンノースが主な成分として認められる。通常、グルコースを１５〜２８重量％、ガラクトースを３〜１０重量％、マンノースを０．２〜３重量％の範囲で含んでいる。この他に、更にラムノースを含む場合もある。なお、中性糖の含有量はオルシノール−硫酸法により、また中性糖の組成及び含有量は酸で加水分解した後にＨＰＬＣにより分析することにより、それぞれ容易に求めることができる。
【００２４】
培養物の処理物（菌体除去後の固形分）中の脂肪酸の含有量は、通常、２０〜５０重量％である。脂肪酸の構成成分の種類や炭素数は、微生物を培養する際の原料炭素源の種類により異なるが、例えば、炭素数１４のノルマルパラフィンであるテトラデカンを原料炭素源として用いた場合、オクタン酸、デカン酸、３−ヒドロキシデカン酸及び３−ヒドロキシドデカン酸が主な構成脂肪酸として認められる。これら脂肪酸の含有量の一例を示せば、オクタン酸が６〜１２重量％、デカン酸が３〜１１重量％、３−ヒドロキシデカン酸が１〜５重量％、３−ヒドロキシドデカン酸が１〜７重量％である。なお、培養物の処理物中の脂肪酸の含有量は、培養物の処理物をアルカリ加水分解した水溶液をエーテルで抽出してエーテル可溶物を除去後、水溶液を酸性化した後、エーテルで抽出して抽出された脂肪酸の重量を測定することにより、また構成脂肪酸組成は前記のようにして酸性条件下エーテル抽出して得られた脂肪酸を常法によりメチルエステル化してガスクロマトグラフにより分析することにより、それぞれ容易に求めることができる。
【００２５】
本発明の培養物の処理物（菌体除去後の固形分）はアルカリ加水分解により脂肪酸が遊離することや酸分解により糖が遊離すること、また赤外スペクトル（ＦＴ−ＩＲ）でエステル結合に特有の１７３５ｃｍ−１に吸収が認められることから、中性糖及び脂肪酸を主な構成成分とする複合脂質（例えば、糖脂質）が主成分と推定できる。
【００２６】
更にこの複合脂質（例えば、糖脂質類）の主成分は、例えば、前記培養物の処理物をメタノールで抽出した抽出物から、メタノールを留去し乾燥させたものを、薄層クロマトグラフにおいて固定相をシリカゲル、移動相をクロロホルム：メタノール：水（例えば、６０：３０：２）として展開したとき、原点より上に展開されるスポットとして確認することができる。
【００２７】
本発明の培養物又はその処理物は、土壌の疎水化を抑制し、土壌の水浸透性を改善する性能に優れているので、土壌処理剤として好適に用いることができる。
【００２８】
ゴルフ場のグリーンなどにおけるドライスポットの発生原因となる土壌の疎水化は、芝刈り後の葉くず、芝草の枯葉、或いは根圏土壌であるピートモスなどの種々の有機物が、微生物の作用などにより腐朽化、分解などされることにより生成した疎水性の有機物が、土壌粒子を被覆することにより起こる。疎水化された土壌は、水の浸透性が著しく悪化し、水をはじくようになり、土壌の保水性は著しく失われ乾燥した状態の土壌層となる。土壌がこのような状態になると、もはや雨水や散水などでもその部分は乾いた状態のままであるので、芝草は根から十分な水を吸収することができなくなり、生育が阻害され、状態が進行すると芝草は枯死に至る。このような疎水化された土壌は、多くの場合、表面から地表下５ｃｍ程度までの範囲で発生し、例えば地表下７〜８ｃｍ以上の深さになるとあまり疎水化は受けない。
【００２９】
また、土壌の種類によっても疎水化され易さは異なり、土壌に含まれる砂の割合が高いほどドライスポットが発生する危険性は高いことが知られており、砂をベースとしたサンドグリーンなどでドライスポットの発生が特に問題となる。なお、本発明においては、芝草を生育させている土壌が、砂のみである場合或いは砂を含んでいる場合も含めて、土壌ということがある。
【００３０】
芝草の種類としては、バミューダグラス、センチピートグラスなどの暖地型、ブルーグラス、ライグラス、トールフェスク、ファインフェスク、ベントグラスなどの寒地型がある。これら種類のうち、ベントグラス、バミューダグラスにおいてドライスポットが発生しやすいといわれている。
【００３１】
前記のようにして得られた培養物又はその処理物は、通常、水に溶解して、ドライスポットが発生した及び／又は発生の恐れがある土壌に対して、土壌処理剤として施用する。例えば、前記のような芝草面の土壌に、この水溶液を散布する。
【００３２】
本発明の土壌処理剤は、前記の培養物の処理物である場合０．０１ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌの濃度範囲で用いることが好ましく、更には０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌが好ましい。この土壌処理剤溶液を、噴霧器、散水器等を用いて、土壌に散布する。散布量は、０．５〜５Ｌ／ｍ２が好ましく、更には１〜３Ｌ／ｍ２が好ましい。必要であれば、疎水化している土壌層が存在する深さまで土壌処理剤が届くように、更に散水を施してもよい。
【００３３】
本発明の土壌処理剤がドライスポットなど土壌の疎水化による土壌の浸透性、保水性の劣化による悪影響を防止又は改善できる理由としては、本発明の土壌処理剤が疎水化された土壌粒子の表面を覆うことにより土壌粒子と水との親和性を向上させて、土壌粒子間の空隙へ水が浸透しやすくなるためと考えられる。更に、土壌粒子と水との親和性が高まるため、土壌中に浸透した水分が土壌粒子間の間隙中に保持されるものと考えられる。
【００３４】
本発明の土壌処理剤には、必要に応じて、更に非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、殺菌剤、無機塩などを、本発明の効果を損なわない程度に適宜配合してもよい。
【００３５】
芝草面としては、ゴルフ場のグリーン、フェアウェー、ティーグラウンドなどの芝草面に好適に使用できるが、これに限らず、公園、庭園、遊技場、サッカーコート、アスレチックフィールド等の芝草面にも使用できる。
【００３６】
本発明の土壌処理剤は、主に芝草用に用いられるが、土壌の疎水化抑制効果並びに土壌の水浸透性改善効果が望まれる土壌に適用すれば優れた効果を発揮することができ、例えば、野菜、果樹、花卉などの栽培に用いられる苗床や培土、雨水による土壌の流出が問題となる法面等にも適用することができる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例により説明する。
【００３８】
［分析方法］
以下において、中性糖及び脂肪酸の分析は次のようにして行った。
（１）中性糖の分析
中性糖の含有量は、オルシノール−硫酸法により分析を行った。また、中性糖組成の定性・定量分析は、サンプルを２Ｎトリフルオロ酢酸中、１００℃で６時間加水分解した後、減圧乾固し、乾固物を蒸留水に溶解後、ポストラベル蛍光検出法によるＨＰＬＣ分析により、各種中性糖の検量線から測定した。
カラム：TSK-gel sugerAXG 15cm×4.6mmI.D.、カラム温度：70℃
移動相：0.5M ホウ酸カリウム緩衝液（pH8.7）、流速：0.4ml/min
ポストカラム標識：１％アルギニン／３％ホウ酸、反応温度：150℃
検出波長：EX320nm、EM430nm
【００３９】
（２）脂肪酸の分析
脂肪酸の含有量は、次のようにして測定した。サンプルを１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中で加水分解した後、エーテルにて抽出し、エーテル抽出物を除去した。このエーテル抽出後の水層を塩酸にて酸性とし（ｐＨ２〜３）、再度エーテルにて抽出した。このエーテル層を、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、エーテルを蒸発除去し、残留物の重量を測定した。残留物の重量から、サンプル中の脂肪酸含有量を計算した。また、この残留物を更にジアゾメタンでメチル化後、ガスクロマトグラフィーで分析し脂肪酸組成を分析した。
【００４０】
［調製例］
（土壌処理剤の調製）
Gordonia sp. JE1058株を用い、グルタミン酸１ナトリウム２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ｎ−テトラデカン１５容積％を含む培地５０ｍｌに一白金耳接種し、５００ｍｌ坂口フラスコ中、３０℃、１２０ｒｐｍの条件で２日間培養を行った。
【００４１】
次に、前記と同じ組成の培地２．５Ｌを５Ｌのジャーファーメンターに入れたものに、前記の培養液を接種し、通気条件下、温度３０℃、撹拌速度１０００ｒｐｍに制御し、７日間培養を行った。
【００４２】
培養終了後、培養液を水で２倍に希釈し、ｐＨ１０に調整後、遠心分離により菌体を除去した。更にｐＨを８に再調整し、限外ろ過により濃縮後、凍結乾燥した。この乾燥した粉体をヘキサンで洗浄し、減圧乾燥することにより培養物の処理物１０７ｇを得た。
【００４３】
得られた培養液の処理物の分析結果を、表１に示す。
【００４４】
【表１】
2008045066.tif 000002
【００４５】
［実施例１〜２、比較例１］
前記のようにして得た培養物の処理物を、２ｇ／Ｌ及び５ｇ／Ｌの濃度で蒸留水に溶解し、土壌処理剤を調製した。この土壌処理剤をゴルフ場のグリーンに１Ｌ／ｍ２の散布量で散布し、土壌処理剤の散布３日後に、ソイルサンプラーを用いて土壌コアを採取した。地表面から１ｃｍ刻みに５ｃｍまでの深さの部分に、蒸留水をスポイトにて１滴落とし、蒸留水が土壌コアにしみ込むまでの時間を測定した。それぞれの浸透時間（秒）を、表２に示す。なお、浸透時間が短いほど、土壌への水の浸透が良好であることを示している。
【００４６】
【表２】
2008045066.tif 000003
【００４７】
［実施例３〜４、比較例２］
同様にして、土壌処理剤の散布２０日後の土壌コアについての蒸留水の浸透時間を測定した。それぞれの浸透時間（秒）を表３に示す。
【００４８】
【表３】
2008045066.tif 000004
【００４９】
［比較例３］
市販のドライスポット用土壌改良剤（非イオン系合成界面活性剤含有）３ｍｌを水で１Ｌに希釈し、この水溶液をゴルフ場のグリーンに１Ｌ／ｍ２の散布量で散布した。散布２０日後の土壌コアを採取し、同様にして蒸留水の浸透時間を測定した。結果を表４に示す。
【００５０】
【表４】
2008045066.tif 000005