(57)【要約】      （修正有）【課題】エクソンアレイから得られたエクソン発現データの解析システム及び解析方法を用いた、疾患特異的選択的スプライシング同定法を提供する。【解決手段】ｍＲＮＡをエクソン・アレイに入力し（５０１）、エクソン・アレイがｍＲＮＡに含まれるエクソンを検出し（５０２）、エクソン・アレイにより検出された観測データをコンピュータに入力し（５０３）、ＣＰＵによる観測データの統計処理からエクソン発現プロファイルを算出し（５０４）、算出されたエクソン発現プロファイルを記憶装置に記憶し（５０５）、記憶されている複数のサンプルに関するエクソン発現プロファイルをＣＰＵで比較し（５０６）、比較結果を出力する（５０７）。【選択図】図５
2008027244.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンピュータを用いエクソン発現データから疾患特異的な選択的スプライシングを同定するデータ解析システムであって、
（１）ｍＲＮＡから観測されたエクソン発現データを入力する入力手段と、
（２）前記入力手段を介して入力されたエクソン発現データの統計処理を行い、当該ｍＲＮＡに含まれるエクソン全体に関する情報を表すエクソン発現プロファイルを算出する演算手段と、
（３）前記演算手段によって算出されたエクソン発現プロファイルを記憶する記憶手段と、
（４）複数のｍＲＮＡに関して前記入力手段と前記演算手段とを介して算出され前記記憶手段に記憶されている複数のエクソン発現プロファイルを読み出し、読み出された複数のエクソン発現プロファイルを比較する比較手段であって、正常細胞から得られた第１のｍＲＮＡに関して算出され前記記憶手段に記憶されている第１のエクソン発現プロファイルと、異常細胞から得られた第２のｍＲＮＡに関して算出され前記記憶手段に記憶されている第２のエクソン発現プロファイルとを比較することにより正常細胞と異常細胞とにおけるエクソン発現プロファイルの差異を同定し、同定された差異に基づき、正常細胞においては生じず異常細胞において生じる疾患特異的な選択的スプライシングを同定する比較手段と、
を備えていることを特徴とするデータ解析システム。
【請求項２】
コンピュータを用いｍＲＮＡにおける疾患特異的な選択的スプライシングを同定するデータ解析システムであって、
（０）ｍＲＮＡを入力する入力手段と前記入力手段を介して入力されたｍＲＮＡに含まれる特定のエクソンの有無を個別的に検出し、当該ｍＲＮＡに含まれるエクソン全体に関するエクソン発現データを出力する検出手段と、
（１）前記検出手段によってｍＲＮＡから観測されたエクソン発現データを入力する入力手段と、
（２）前記入力手段を介して入力されたエクソン発現データの統計処理を行い、当該ｍＲＮＡに含まれるエクソン全体に関する情報を表すエクソン発現プロファイルを算出する演算手段と、
（３）前記演算手段によって算出されたエクソン発現プロファイルを記憶する記憶手段と、
（４）複数のｍＲＮＡに関して前記入力手段と前記演算手段とを介して算出され前記記憶手段に記憶されている複数のエクソン発現プロファイルを読み出し、読み出された複数のエクソン発現プロファイルを比較する比較手段であって、正常細胞から得られた第１のｍＲＮＡに関して算出され前記記憶手段に記憶されている第１のエクソン発現プロファイルと、異常細胞から得られた第２のｍＲＮＡに関して算出され前記記憶手段に記憶されている第２のエクソン発現プロファイルとを比較することにより正常細胞と異常細胞とにおけるエクソン発現プロファイルの差異を同定し、同定された差異に基づき、正常細胞においては生じず異常細胞において生じる疾患特異的な選択的スプライシングを同定する比較手段と、
を備えていることを特徴とするデータ解析システム。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のデータ解析システムにおいて、前記演算手段は、
前記エクソン発現データに含まれる観測バイアスを除去するバックグラウンド修正を行う前処理手段と、
前記前処理手段により観測バイアスが除去されたデータに対して統計処理を行う統計処理手段と、
前記統計処理手段によって行われた統計処理の結果として得られるデータから個体差を含む原因に由来する交絡因子を除去する後処理手段と、
を更に備えており、前記前処理手段と前記統計処理手段と前記後処理手段とによるデータ処理を介してエクソン発現プロファイルを算出することを特徴とするデータ解析システム。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載のデータ解析システムにおいて、
前記検出手段は前記入力手段を介して入力されたｍＲＮＡに含まれるエクソンの有無を表す生化学的情報を発光強度として出力する多数のプローブから構成された光学アレイであることを特徴とするデータ解析システム。
【請求項５】
請求項４記載のデータ解析システムにおいて、
前記前処理手段によって除去される観測バイアスは、前記入力手段を介して入力されたｍＲＮＡに含まれるＧＣ含有量が多い場合に生じるプローブの発光強度の上方バイアスを含むことを特徴とするデータ解析システム。
【請求項６】
請求項４又は請求項５に記載のデータ解析システムにおいて、前記統計処理手段は、
正常細胞ｊ＝１及び異常細胞ｊ＝２のそれぞれに対し、ｉ番目のエクソン（ｉ＝１，・・・，ｍ）とｋ番目のプローブ（ｋ＝１，・・・，ｎｉ）とに対応するバックグラウンド修正済のプローブ強度をｘｉｊｋで表し、このプローブ強度ｘｉｊｋを、ｍ個のエクソン領域に対するベースライン強度の変化に対する応答であり正常及び異常の両方の細胞に共通するスプライシングによる変動の存在に応答して１又は複数の異なる値をとりうるパラメータαｉ（ｉ＝１，・・・，ｍ）と、正常細胞と異常細胞との間の全体平均の差に対応し正常及び異常の両方の細胞タイプにおける遺伝子発現レベルの変化に応答して異なる値を取りうるパラメータβｊと、ｍ個のエクソンと正常及び異常の２つの細胞との組合せに対する相互作用効果を表しスプライシングが一方の細胞に存在し他方の細胞に存在しない場合には少なくとも１つの値が相互に異なる可能性が高いパラメータγｉｊとを含む和ｘｉｊｋ＝μ＋αｉ＋βｊ＋γｉｊ＋εｉｊｋとして表現することにより、発光強度としてプローブによって生じる応答を、エクソン効果αｉと、全体的な遺伝子レベルでのエクソン発現差の効果βｉと、特定のスプライシング事象の効果γｉｊとの３つの相互に独立な効果に分解し、それぞれの効果について統計的検定を行うことにより、疾患特異的な選択的スプライシングを同定する分散分析手段を更に含むことを特徴とするデータ解析システム。
【請求項７】
請求項６記載のデータ解析システムにおいて、前記分散分析手段によって行われる統計的検定では、第１に、エクソン効果に関する検定では、帰無仮説（Ｈ０）として、任意のｉ≠ｊに対してαｉ＝αｊと仮定し、対立仮説（Ｈ１）として、少なくとも１対の｛ｉ≠ｊ｝に対してαｉ≠αｊと仮定し、第２に、全体的な遺伝子効果に関する検定では、Ｈ０として、β１＝β２と仮定し、Ｈ１として、β１≠β２と仮定し、第３に、疾患特異的な選択的スプライシングの効果に関する検定では、Ｈ０として、任意の｛ｉ，ｊ｝≠｛ｈ，ｋ｝に対してγｉｊ＝γｈｋと仮定し、Ｈ１として、少なくとも１対の｛ｉ，ｊ｝及び｛ｈ，ｋ｝に対してγｉｊ≠γｈｋと仮定して統計的検定が実行されることを特徴とするデータ解析システム。
【請求項８】
請求項６又は請求項７に記載のデータ解析システムにおいて、前記後処理手段は、
フィッシャーのノーマル・インバーション法を用いて、同定された疾患特異的なスプライシングのリストから小さなｐ値を有するスプライス変異を見出すことにより交絡因子を除去する手段であって、Ｇ人の個体に対して前記分散分析を適用した結果得られる相互作用項γｉｊに対してｐ値ｐ１，・・・，ｐＧを計算し、これらのｐ値を、下記の数式で表される正規化された累積的な分布関数の逆数を用いて併合されたｚ得点（merged z score）に変換し、
【数１】
2008027244.tif 000031
ただし、この数式においては、分母の平方根の中は１に等しく、ｗｉ≧０であり、Φ−１（ｘ）は、標準正規変動の累積的分布関数の逆数を意味し、この併合されたｚ得点の累積標準正規分布関数を計算することによって、併合されたｐ値を導いて遺伝子を得た１又は複数の個体が比較的大きなｐ値を示す遺伝子のｐ値を自動的にマイナス評価する、手段を更に備えていることを特徴とするデータ解析システム。
【請求項９】
コンピュータを用いエクソン発現データから疾患特異的な選択的スプライシングを同定するデータ解析方法であって、
（１）ｍＲＮＡから観測されたエクソン発現データを入力する入力ステップと、
（２）前記入力ステップを介して入力されたエクソン発現データの統計処理を行い、当該ｍＲＮＡに含まれるエクソン全体に関する情報を表すエクソン発現プロファイルを算出する演算ステップと、
（３）前記演算ステップによって算出されたエクソン発現プロファイルを記憶する記憶ステップと、
（４）複数のｍＲＮＡに関して前記入力ステップと前記演算ステップとを介して算出され前記記憶ステップによって記憶されている複数のエクソン発現プロファイルを読み出し、読み出された複数のエクソン発現プロファイルを比較する比較ステップであって、正常細胞から得られた第１のｍＲＮＡに関して算出され前記記憶ステップによって記憶されている第１のエクソン発現プロファイルと、異常細胞から得られた第２のｍＲＮＡに関して算出され前記記憶ステップよってに記憶されている第２のエクソン発現プロファイルとを比較することにより正常細胞と異常細胞とにおけるエクソン発現プロファイルの差異を同定し、同定された差異に基づき、正常細胞においては生じず異常細胞において生じる疾患特異的な選択的スプライシングを同定する比較ステップと、
を備えていることを特徴とするデータ解析方法。
【請求項１０】
コンピュータを用いｍＲＮＡにおける疾患特異的な選択的スプライシングを同定するデータ解析方法であって、
（０）ｍＲＮＡを入力する入力ステップと前記入力ステップを介して入力されたｍＲＮＡに含まれる特定のエクソンの有無を個別的に検出し、当該ｍＲＮＡに含まれるエクソン全体に関するエクソン発現データを出力する検出ステップと、
（１）前記検出ステップによってｍＲＮＡから観測されたエクソン発現データを入力する入力ステップと、
（２）前記入力ステップを介して入力されたエクソン発現データの統計処理を行い、当該ｍＲＮＡに含まれるエクソン全体に関する情報を表すエクソン発現プロファイルを算出する演算ステップと、
（３）前記演算ステップによって算出されたエクソン発現プロファイルを記憶する記憶ステップと、
（４）複数のｍＲＮＡに関して前記入力ステップと前記演算ステップとを介して算出され前記記憶ステップによって記憶されている複数のエクソン発現プロファイルを読み出し、読み出された複数のエクソン発現プロファイルを比較する比較ステップであって、正常細胞から得られた第１のｍＲＮＡに関して算出され前記記憶ステップによって記憶されている第１のエクソン発現プロファイルと、異常細胞から得られた第２のｍＲＮＡに関して算出され前記記憶ステップによって記憶されている第２のエクソン発現プロファイルとを比較することにより正常細胞と異常細胞とにおけるエクソン発現プロファイルの差異を同定し、同定された差異に基づき、正常細胞においては生じず異常細胞において生じる疾患特異的な選択的スプライシングを同定する比較ステップと、
を備えていることを特徴とするデータ解析方法。
【請求項１１】
請求項９又は請求項１０に記載のデータ解析方法において、前記演算ステップは、
前記エクソン発現データに含まれる観測バイアスを除去するバックグラウンド修正を行う前処理ステップと、
前記前処理ステップにより観測バイアスが除去されたデータに対して統計処理を行う統計処理ステップと、
前記統計処理ステップによって行われた統計処理の結果として得られるデータから個体差を含む原因に由来する交絡因子を除去する後処理ステップと、
を更に備えており、前記前処理ステップと前記統計処理ステップと前記後処理ステップとによるデータ処理を介してエクソン発現プロファイルを算出することを特徴とするデータ解析方法。
【請求項１２】
請求項１０又は請求項１１に記載のデータ解析方法において、
前記検出ステップは、前記入力ステップを介して入力されたｍＲＮＡに含まれるエクソンの有無を表す生化学的情報を発光強度として出力する多数のプローブから構成された光学アレイを用いて行われることを特徴とするデータ解析方法。
【請求項１３】
請求項１２記載のデータ解析方法において、
前記前処理ステップによって除去される観測バイアスは、前記入力ステップを介して入力されたｍＲＮＡに含まれるＧＣ含有量が多い場合に生じるプローブの発光強度の上方バイアスを含むことを特徴とするデータ解析方法。
【請求項１４】
請求項１２又は請求項１３に記載のデータ解析方法において、前記統計処理ステップは、
正常細胞ｊ＝１及び異常細胞ｊ＝２のそれぞれに対し、ｉ番目のエクソン（ｉ＝１，・・・，ｍ）とｋ番目のプローブ（ｋ＝１，・・・，ｎｉ）とに対応するバックグラウンド修正済のプローブ強度をｘｉｊｋで表し、このプローブ強度ｘｉｊｋを、ｍ個のエクソン領域に対するベースライン強度の変化に対する応答であり正常及び異常の両方の細胞に共通するスプライシングによる変動の存在に応答して１又は複数の異なる値をとりうるパラメータαｉ（ｉ＝１，・・・，ｍ）と、正常細胞と異常細胞との間の全体平均の差に対応し正常及び異常の両方の細胞タイプにおける遺伝子発現レベルの変化に応答して異なる値を取りうるパラメータβｊと、ｍ個のエクソンと正常及び異常の２つの細胞との組合せに対する相互作用効果を表しスプライシングが一方の細胞に存在し他方の細胞に存在しない場合には少なくとも１つの値が相互に異なる可能性が高いパラメータγｉｊとを含む和ｘｉｊｋ＝μ＋αｉ＋βｊ＋γｉｊ＋εｉｊｋとして表現することにより、発光強度としてプローブによって生じる応答を、エクソン効果αｉと、全体的な遺伝子レベルでのエクソン発現差の効果βｉと、特定のスプライシング事象の効果γｉｊとの３つの相互に独立な効果に分解し、それぞれの効果について統計的検定を行うことにより、疾患特異的な選択的スプライシングを同定する分散分析ステップを更に含むことを特徴とするデータ解析方法。
【請求項１５】
請求項１４記載のデータ解析方法において、前記分散分析ステップによって行われる統計的検定では、第１に、エクソン効果に関する検定では、帰無仮説（Ｈ０）として、任意のｉ≠ｊに対してαｉ＝αｊと仮定し、対立仮説（Ｈ１）として、少なくとも１対の｛ｉ≠ｊ｝に対してαｉ≠αｊと仮定し、第２に、全体的な遺伝子効果に関する検定では、Ｈ０として、β１＝β２と仮定し、Ｈ１として、β１≠β２と仮定し、第３に、疾患特異的な選択的スプライシングの効果に関する検定では、Ｈ０として、任意の｛ｉ，ｊ｝≠｛ｈ，ｋ｝に対してγｉｊ＝γｈｋと仮定し、Ｈ１として、少なくとも１対の｛ｉ，ｊ｝及び｛ｈ，ｋ｝に対してγｉｊ≠γｈｋと仮定して統計的検定が実行されることを特徴とするデータ解析方法。
【請求項１６】
請求項１４又は請求項１５に記載のデータ解析方法において、前記後処理ステップは、
フィッシャーのノーマル・インバーション法を用いて、同定された疾患特異的なスプライシングのリストから小さなｐ値を有するスプライス変異を見出すことにより交絡因子を除去するステップであって、Ｇ人の個体に対して前記分散分析を適用した結果得られる相互作用項γｉｊに対してｐ値ｐ１，・・・，ｐＧを計算し、これらのｐ値を、下記の数式で表される正規化された累積的な分布関数の逆数を用いて併合されたｚ得点（merged z score）に変換し、
【数２】
2008027244.tif 000032
ただし、この数式においては、分母の平方根の中は１に等しく、ｗｉ≧０であり、Φ−１（ｘ）は、標準正規変動の累積的分布関数の逆数を意味し、この併合されたｚ得点の累積標準正規分布関数を計算することによって、併合されたｐ値を導いて遺伝子を得た１又は複数の個体が比較的大きなｐ値を示す遺伝子のｐ値を自動的にマイナス評価する、ステップを更に備えていることを特徴とするデータ解析方法。
【請求項１７】
請求項９ないし請求項１６のいずれかの請求項に記載の方法をコンピュータに実行させるプログラムが記憶されたコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項１８】
請求項９ないし請求項１６のいずれかの請求項に記載の方法をコンピュータに実行させるプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くは、データ解析システムに関し、更に詳しくは、エクソンアレイから得られたエクソン発現データの解析システム及び解析方法に関する。本発明はまた、当該解析システムおよび解析方法を用いた、疾患特異的選択的スプライシング同定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
選択的スプライシングは、多様なｍＲＮＡ転写物を単一の遺伝子から生成するための重要な転写調節機構として知られている。最新の研究は、真核生物遺伝子の３０〜６０％が多様なスプライスバリアントを有することを示唆している。Cline, M. S., et al., Bioinformatics, Vol.21, i107-i115, 2005及びLe, K., et al., Nucleic Acids Research, Vol. 32, No.22, e180, 2004を参照のこと。選択的スプライシングでは、一旦遺伝子の完全複製であるｍＲＮＡ前駆体が生成された後、非翻訳部位であるイントロンが除去され、エクソン領域のみが結合することで成熟ｍＲＮＡ転写産物を形成する。この反応の間に、ある特定のエクソンのセットが、ある成熟ｍＲＮＡ転写産物に含まれるが、別のｍＲＮＡ転写産物では欠落していて含まれないことがありうる。このような画一的でない現象を生じさせることが、選択的なスプライシングと称される理由である。スプライシングによる転写産物の変異は、癌および他の遺伝性疾患に関与するタンパク質を変化させることができる。例えば、スプライシング変異による異常型の転写物は、遺伝性疾患の１５％において、その原因となることが、次の論文で発表されている。Xiao, Y., et al., PLOS Computational Biology, Volume 1, Issue 4, e39, 0276-0288, 2005を参照のこと。従って、選択的スプライシングの調節機構を理解することは、ヒト疾患のいくつかの種類についての潜在的なバイオマーカーを同定するための、興味深い課題の一つである。
【０００３】
２００５年１２月に、ヒトエクソンマイクロアレイ技術の応用例であるＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙが登場したことにより、１００万を超えるヒトエクソンのゲノムワイドな発現データを収集することが可能になった。そのような技術革新により、機能性遺伝子調節の解析は、全体としての遺伝子発現値の変化のみならず、異なる細胞クラスにまたがるスプライシング変異の変化を検出することになる。エクソン発現プロファイルによる全転写物解析は、機能的スプライシング調節の機構を明らかにすることにおいて重要な役割を果たすであろう。同時に、全エクソンマイクロアレイ発現データを解析するための統計技術の開発が、バイオインフォマティクスにおいて取り組むべき最重要課題の１つである。
【０００４】
カスタムメイドのエクソンマイクロアレイデータを解析するために、種々の計算手法が提案されてきている。例えば、Ｗａｎｇら（Wang, H., et al., Bioinformatics, Vol.19, i315-i322, 2005）は、既知のスプライスバリアントの相対的発現量を推定するための構造モデリングの手法を考案し、２１のよく知られた遺伝子に対してカスタムメイドのエクソンアレイを設計して、その性能を示した。しかしながら、この手法を適用するためには、ユーザーは転写産物の形をあらかじめ指定する必要があり、これが未知の場合その有効性は限定的である。
【０００５】
【非特許文献１】Cline, M. S., et al., Bioinformatics, Vol.21, i107-i115, 2005
【非特許文献２】Le, K., et al., Nucleic Acids Research, Vol. 32, No.22, e180, 2004
【非特許文献３】Xiao, Y., et al., PLOS Computational Biology, Volume 1, Issue 4, e39, 0276-0288, 2005
【非特許文献４】Wang, H., et al., Bioinformatics, Vol.19, i315-i322, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、広くは、データ解析システムに関し、更に詳しくは、エクソンアレイから得られたエクソン発現データの解析システム及び解析方法を提供することを目的とする。本発明はまた、当該解析システムおよび解析方法を用いた、疾患特異的選択的スプライシング同定法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明によると、コンピュータを用いエクソン発現データから疾患特異的な選択的スプライシングを同定するデータ解析システムであって、（１）ｍＲＮＡから観測されたエクソン発現データを入力する入力手段と、（２）前記入力手段を介して入力されたエクソン発現データの統計処理を行い、当該ｍＲＮＡに含まれるエクソン全体に関する情報を表すエクソン発現プロファイルを算出する演算手段と、（３）前記演算手段によって算出されたエクソン発現プロファイルを記憶する記憶手段と、（４）複数のｍＲＮＡに関して前記入力手段と前記演算手段とを介して算出され前記記憶手段に記憶されている複数のエクソン発現プロファイルを読み出し、読み出された複数のエクソン発現プロファイルを比較する比較手段であって、正常細胞から得られた第１のｍＲＮＡに関して算出され前記記憶手段に記憶されている第１のエクソン発現プロファイルと、異常細胞から得られた第２のｍＲＮＡに関して算出され前記記憶手段に記憶されている第２のエクソン発現プロファイルとを比較することにより正常細胞と異常細胞とにおけるエクソン発現プロファイルの差異を同定し、同定された差異に基づき、正常細胞においては生じず異常細胞において生じる疾患特異的な選択的スプライシングを同定する比較手段と、を備えているデータ解析システムが提供される。
【０００８】
また、本発明によると、コンピュータを用いｍＲＮＡにおける疾患特異的な選択的スプライシングを同定するデータ解析システムであって、（０）ｍＲＮＡを入力する入力手段と前記入力手段を介して入力されたｍＲＮＡに含まれる特定のエクソンの有無を個別的に検出し、当該ｍＲＮＡに含まれるエクソン全体に関するエクソン発現データを出力する検出手段と、（１）前記検出手段によってｍＲＮＡから観測されたエクソン発現データを入力する入力手段と、（２）前記入力手段を介して入力されたエクソン発現データの統計処理を行い、当該ｍＲＮＡに含まれるエクソン全体に関する情報を表すエクソン発現プロファイルを算出する演算手段と、（３）前記演算手段によって算出されたエクソン発現プロファイルを記憶する記憶手段と、（４）複数のｍＲＮＡに関して前記入力手段と前記演算手段とを介して算出され前記記憶手段に記憶されている複数のエクソン発現プロファイルを読み出し、読み出された複数のエクソン発現プロファイルを比較する比較手段であって、正常細胞から得られた第１のｍＲＮＡに関して算出され前記記憶手段に記憶されている第１のエクソン発現プロファイルと、異常細胞から得られた第２のｍＲＮＡに関して算出され前記記憶手段に記憶されている第２のエクソン発現プロファイルとを比較することにより正常細胞と異常細胞とにおけるエクソン発現プロファイルの差異を同定し、同定された差異に基づき、正常細胞においては生じず異常細胞において生じる疾患特異的な選択的スプライシングを同定する比較手段と、を備えているデータ解析システムが提供される。ここで言う検出手段は、例えば、エクソン発現データを観測するエクソン・アレイである。
【０００９】
また、本発明によるデータ解析システムの前記演算手段は、前記エクソン発現データに含まれる観測バイアスを除去するバックグラウンド修正を行う前処理手段と、前記前処理手段により観測バイアスが除去されたデータに対して統計処理を行う統計処理手段と、前記統計処理手段によって行われた統計処理の結果として得られるデータから個体差を含む原因に由来する交絡因子を除去する後処理手段と、を更に備えており、前記前処理手段と前記統計処理手段と前記後処理手段とによるデータ処理を介してエクソン発現プロファイルを算出する。
【００１０】
更に、本発明によるデータ解析システムにおいて、前記検出手段は前記入力手段を介して入力されたｍＲＮＡに含まれるエクソンの有無を表す生化学的情報を発光強度として出力する多数のプローブから構成された光学アレイである。
【００１１】
更に、本発明によるデータ解析システムにおいて、前記前処理手段によって除去される観測バイアスは、前記入力手段を介して入力されたｍＲＮＡに含まれるＧＣ含有量が多い場合に生じるプローブの発光強度の上方バイアスを含むことを特徴とするデータ解析システム。
【００１２】
更に、本発明によるデータ解析システムにおいて、前記統計処理手段は、正常細胞ｊ＝１及び異常細胞ｊ＝２のそれぞれに対し、ｉ番目のエクソン（ｉ＝１，・・・，ｍ）とｋ番目のプローブ（ｋ＝１，・・・，ｎｉ）とに対応するバックグラウンド修正済のプローブ強度をｘｉｊｋで表し、このプローブ強度ｘｉｊｋを、ｍ個のエクソン領域に対するベースライン強度の変化に対する応答であり正常及び異常の両方の細胞に共通するスプライシングによる変動の存在に応答して１又は複数の異なる値をとりうるパラメータαｉ（ｉ＝１，・・・，ｍ）と、正常細胞と異常細胞との間の全体平均の差に対応し正常及び異常の両方の細胞タイプにおける遺伝子発現レベルの変化に応答して異なる値を取りうるパラメータβｊと、ｍ個のエクソンと正常及び異常の２つの細胞との組合せに対する相互作用効果を表しスプライシングが一方の細胞に存在し他方の細胞に存在しない場合には少なくとも１つの値が相互に異なる可能性が高いパラメータγｉｊとを含む和ｘｉｊｋ＝μ＋αｉ＋βｊ＋γｉｊ＋εｉｊｋとして表現することにより、発光強度としてプローブによって生じる応答を、エクソン効果αｉと、全体的な遺伝子レベルでのエクソン発現差の効果βｉと、特定のスプライシング事象の効果γｉｊとの３つの相互に独立な効果に分解し、それぞれの効果について統計的検定を行うことにより、疾患特異的な選択的スプライシングを同定する分散分析手段を更に含む。
【００１３】
更に、本発明によるデータ解析システムにおいて、前記分散分析手段によって行われる統計的検定では、第１に、エクソン効果に関する検定では、帰無仮説（Ｈ０）として、任意のｉ≠ｊに対してαｉ＝αｊと仮定し、対立仮説（Ｈ１）として、少なくとも１対の｛ｉ≠ｊ｝に対してαｉ≠αｊと仮定し、第２に、全体的な遺伝子効果に関する検定では、Ｈ０として、β１＝β２と仮定し、Ｈ１として、β１≠β２と仮定し、第３に、疾患特異的な選択的スプライシングの効果に関する検定では、Ｈ０として、任意の｛ｉ，ｊ｝≠｛ｈ，ｋ｝に対してγｉｊ＝γｈｋと仮定し、Ｈ１として、少なくとも１対の｛ｉ，ｊ｝及び｛ｈ，ｋ｝に対してγｉｊ≠γｈｋと仮定して統計的検定が実行される。
【００１４】
更に、本発明によるデータ解析システムにおいて、前記後処理手段は、フィッシャーのノーマル・インバーション法を用いて、同定された疾患特異的なスプライシングのリストから小さなｐ値を有するスプライス変異を見出すことにより交絡因子を除去する手段であって、Ｇ人の個体に対して前記分散分析を適用した結果得られる相互作用項γｉｊに対してｐ値ｐ１，・・・，ｐＧを計算し、これらのｐ値を、下記の数式で表される正規化された累積的な分布関数の逆数を用いて併合されたｚ得点（merged z score）に変換し、
【００１５】
【数１】
2008027244.tif 000003
【００１６】
ただし、この数式においては、分母の平方根の中は１に等しく、ｗｉ≧０であり、Φ−１（ｘ）は、標準正規変動の累積的分布関数の逆数を意味し、この併合されたｚ得点の累積標準正規分布関数を計算することによって、併合されたｐ値を導いて遺伝子を得た１又は複数の個体が比較的大きなｐ値を示す遺伝子のｐ値を自動的にマイナス評価する、手段を更に備えている。
【００１７】
更に、本発明によるデータ解析システムにおいて、前記後処理手段は、ＡＮＯＶＡモデルのミクスチャーに基づく統計的技法を用いた、ヒト細胞の不均一性をコントロールする手段をさらに備えている。
【００１８】
本発明は、コンピュータを用いて疾病特異的な選択的スプライシングを同定するデータ解析方法として定義することも可能である。
また、本発明は、疾病特異的な選択的スプライシングを同定するデータ解析方法をコンピュータに実行させるプログラムが記憶されたコンピュータ読み取り可能な記憶媒体として定義することも可能である。
【００１９】
また、本発明は、疾病特異的な選択的スプライシングを同定するデータ解析方法をコンピュータに実行させるプログラムとして定義することも可能である。
【００２０】
詳細な説明
本発明者らは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙを用いて、疾患に関与するミススプライシングされた遺伝子座を同定することを目的とした（図１）。これは、選択的スプライシングによる転写調節機構を理解する上で、そしてまた、エクソンレベルでの潜在的なバイオマーカーをゲノムワイドに発見する上で、重要な役割を果たす。提案する方法は、以下の過程によって構成される：（１−１）データの正規化（前処理）；ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）エクソンマイクロアレイによって収集した発現データにおいては、観察された発現値には様々な観測バイアスが含まれている。特に、ＧＣ含有量によるプローブ強度のバイアスは、データ解析において重大な問題を引き起こすため、その後の転写産物解析においてこれを除くことが必要不可欠である。（１−２）異常観測値の検出；このマイクロアレイシステムでは、エクソンごとの発現量を推定するために、各エクソン領域に少数のプローブが割り付けられている。通常、１つのエクソン領域あたりのプローブ数は、４〜２０の範囲である。そのような少数のプローブのセットに基づいてエクソン特異的シグナルを推定する場合、シグナル推定の性能劣化の原因となり、その結果転写物解析において擬陽性率上昇をもたらすことになる。（２）分散分析（ＡＮＯＶＡ）による全転写物解析；この過程において、特定の細胞において存在するが、正常コントロール細胞には存在していない、特異的なスプライス変異のセットを同定する。この過程において、本発明の方法は、標的疾患に対するプローブ強度の応答を、３つの効果、すなわち、正常細胞および腫瘍細胞が共有する選択的スプライシングの効果、異なる細胞のタイプの間の総遺伝子発現レベルの違い、および特異的スプライス変異の効果、に自動的に分解する。（３）メタアナリシス；（２）のＡＮＯＶＡにより得られた疾患特異的なスプライス変異の候補のうち、当該疾患を有するほとんどの個体によって共有される、すなわち、個体差に依存しない普遍的な疾患特異的スプライス変異を同定する。
【００２１】
なお、本明細書において、エクソンマイクロアレイによって収集した発現データ、または、エクソン発現データ、とは、エクソンマイクロアレイによって収集した、補正処理等を行っていない生のデータを意味する。また、本明細書において、エクソン発現プロファイルとは、エクソン発現データを補正および／または統計解析等の処理を加えた後に得られたデータを意味する。
【００２２】
（１）データの正規化および異常観測値の検出
エクソン発現データの統計解析手法を検討していく上で最も重要な事項の一つは、ＧＣ含有量に起因するバイアスをいかに扱うかである。本発明者らは、補正を行っていない未処理のプローブ強度から、以下の事実を観測した：（１）プローブ発光強度はＧＣ含有量が大きくなるに従って指数的に増大する。（２）ＧＣ含有量が大きくなるにつれ、二つの四分位点の範囲が大きくなる。そのようなＧＣ含有量に起因する観測バイアスは、ＧＣ含有量の高いプローブはＡＴ含有量の高いプローブと比較して高い親和性を有するために生じるのであり、観測バイアスの事前除去は転写産物解析における擬陽性率低下のために必要不可欠である。
【００２３】
アフィメトリクス社のテクニカルノート（Exon array background correction v1.0, http://www.affymetrix.com/support/technical/whitepapers/exon_background_correction_whitepaper.pdf）は、同じＧＣ含有量を有するバックグラウンドプローブ（ＢＧＰ）の発光強度の対数平均（ｌｏｇ（ＢＧＰ））を用いて、ｌｏｇ（未処理の強度）−ｌｏｇ（ＢＧＰ）に基づく観測バイアス補正を推奨している。この方針に従い、ＢＧＰを用いたバックグラウンド補正を適用して、ＧＣ含有量由来のバックグラウンド強度を推定した。図２（ｂ）はＧＣ含有量に対するＢＧＰの上方傾向を示し、図２（ｃ）はこれに基づきバックグラウンド補正を行った結果を示す。ＧＣ含有量の高いプローブ、例えば、２５ｍｅｒのプローブ中にＧまたはＣヌクレオチドを２０以上含むもの、については、バックグラウンド補正プローブ強度には依然として上方バイアスが含まれていた（図２（ｃ））。ＢＧＰの中央値について、例えば２５ｍｅｒのプローブ中にＧまたはＣヌクレオチドを２３以上含む、ＧＣ含有量の高いプローブについては上方傾向は明確ではない点に着目した。このことは、高いＧＣ含有量を有するＢＧＰ発光強度は、ＧＣ含有量依存的バイアスの推定およびバックグラウンド強度の推定に対して十分な情報を有していないことを示している。そのような不正確な推定は、高いＧＣ含有量を有するアレイ情報のＢＧＰのサンプルサイズが小さいことや、大量のクロスハイブリダイゼーションを生じるであろうＧＣ含有量の高いプローブの非常に高い親和性に起因することが考えられる。例えば、ＧＣ含有量が２４（２５ｍｅｒのプローブ中にＧまたはＣヌクレオチドを２４個含む）の非ゲノム性ＢＧＰの数は２６８であり、これは、ＧＣ含有量が１４（２５ｍｅｒのプローブ中にＧまたはＣヌクレオチドを１４個含む）のもののわずか２７％にすぎない。
【００２４】
エクソンアレイにおいて、ＧＣ含有量が高いプローブの発光強度は、少数のエクソン領域で構成される遺伝子座を解析するときには特に、以後のデータ解析に大きく影響し、多数の擬陽性を生じさせることになる。すなわち、このマイクロアレイではエクソン領域を調べるためのプローブ数が比較的少数であるため、評価されたエクソン発現値は、マイクロアレイに含まれる信頼性の低いプローブに起因する外れ値の存在によりバイアスを含むのが通常である。従って、本発明の方法においては、保守的な特異的スプライシング検出方式を設計するために、転写産物解析から２２以上のＧＣ含有量を有するプローブデータを排除する。
【００２５】
（２）分散分析（ＡＮＯＶＡ）
同一の個体から採取された１対の正常細胞と腫瘍細胞に対するマイクロアレイ実験を通じて、プロファイリングがなされたとする。ターゲットとなる遺伝子座は、ｍ個のエクソンから構成されると仮定する。そして、正常細胞ｊ＝１及び腫瘍細胞ｊ＝２のそれぞれに対し、ｉ番目のエクソン（ｉ＝１，・・・，ｍ）とｋ番目のプローブ（ｋ＝１，・・・，ｎｉ）とに対応するバックグラウンド修正済のプローブ強度を、ｘｉｊｋで表す。この場合に、観測されたプローブ強度ｘｉｊｋから、エクソンアレイ上のある位置においてスプライシング過程がどのように作用するのかを導きたい。
【００２６】
スプライシングされた腫瘍細胞特異的な遺伝子座の検出に関する問題は、両方の細胞のタイプにおいて異なる発現を生じているエクソン領域を示す遺伝子座の集合を見出すことである。この目的のために、次のような単純な固定効果モデル：
ｘｉｊｋ＝μ＋αｉ＋βｊ＋γｉｊ＋εｉｊｋ
に基づいて、古典的な分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行う。この数式において、μは、全プローブに共通のプローブ強度の全体の平均を表す。パラメータαｉ（ｉ＝１，・・・，ｍ）は、ｍ個のエクソン領域に対するベースライン強度の変化に対する応答である。評価されたαｉは、両方の細胞タイプの間で共有されるスプライシングによる変動の存在に対して、１又は複数の異なる値をとることが予想される。パラメータβｊは、正常細胞と腫瘍細胞との間の全体平均の差に対応する。評価されたβｊは、両方の細胞タイプにおける遺伝子発現レベルの変化に応答して、異なる値を取りうる。パラメータγｉｊは、ｍ個のエクソンと２つの細胞カテゴリとのそれぞれの組合せに対する相互作用効果を表す。選択的スプライシングが一方の細胞に存在し他方の細胞に存在しない場合には、評価されたγｉｊの少なくとも１つの値が相互に異なる可能性が高い。相互作用パラメータの評価により、腫瘍特異的な選択的スプライシングの効果を捕捉することができる。混合線形モデルのメカニズムは、図３にその概要が示されている。
【００２７】
このように、αｉ、βｊ、γｉｊを評価することにより、結果的に、プローブの応答を、エクソン効果と、全体的な遺伝子効果と特定のスプライシング事象の効果との３つの相互に独立な（orthogonal）効果に分解することになる。それぞれの効果の有意性を観測強度を用いて評価するため、発明者らは、以下のような統計的検定を行った。
【００２８】
第１に、エクソン効果に関する検定では、帰無仮説（Ｈ０）として、任意のｉ≠ｊに対してαｉ＝αｊと仮定し、対立仮説（Ｈ１）として、少なくとも１対の｛ｉ≠ｊ｝に対してαｉ≠αｊと仮定した。
【００２９】
第２に、全体的な遺伝子効果に関する検定では、Ｈ０として、β１＝β２と仮定し、Ｈ１として、β１≠β２と仮定した。
第３に、腫瘍特異的な選択的スプライシングの効果に関する検定では、Ｈ０として、任意の｛ｉ，ｊ｝≠｛ｈ，ｋ｝に対してγｉｊ＝γｈｋと仮定し、Ｈ１として、少なくとも１対の｛ｉ，ｊ｝及び｛ｈ，ｋ｝に対してγｉｊ≠γｈｋと仮定した。
【００３０】
すべての相互作用項が等しいという帰無仮説が棄却されると、腫瘍形成と何らかの意味で関連がある遺伝子座である可能性が高いことが示唆される。ヒト・エクソン・マイクロアレイによって得られる遺伝子座全体に対してＡＮＯＶＡを反復的に適用することにより、全ヒトゲノム上の遺伝子座に対して疾患特異的なスプライシングの有無を評価し、第３の検定における帰無仮説のｐ値をそれぞれの遺伝子座に割り当てることができる。
【００３１】
上述した転写産物の解析をすべての個体に応用することにより、腫瘍の形成と関連する可能性がある腫瘍特異的なスプライシング部位の集合を自動的に得ることができる。
【００３２】
（３）メタアナリシス
同定されたスプライシングの一部は、収集された患者の個体差、例えば、性別、年齢、疾患の重篤度、など、によって生じている可能性がある。特定の疾患を有するほとんどの個体によって共有される腫瘍特異的なスプライシング変異を示す普遍的なバイオマーカーを発見するためには、ほとんどすべての個体にわたって小さなｐ値を有する遺伝子の群を同定する必要がある。
【００３３】
そのためには、フィッシャーのノーマル・インバーション法に含まれる統計的技法を用いてよい。例えば、Ｇ人の個体に対して上記分散分析を適用した結果得られる相互作用項γｉｊに対してｐ値ｐ１，・・・，ｐＧを計算する。本発明の方法では、まず、これらのｐ値を、下記の数式で表される正規化された累積的な分布関数の逆数を用いて併合されたｚ得点（merged z score）に変換する。
【００３４】
【数２】
2008027244.tif 000004
【００３５】
ここで、分母の平方根の中は１に等しく、ｗ＞＝０であり、Φ−１（ｘ）は、標準正規変動の累積的分布関数の逆数を意味する。統計理論によると、帰無仮説が成立する、すなわち、相互作用の効果がない場合に、かつ、その場合に限り、ｚｉ＝Φ−１（１−ｐｉ）は標準正規分布に従う。従って、ｚｉの任意の重み付き平均もまた、上記の数式の分母の平方根の中が１に等しく、ｗ≧０であるときには常に、標準正規分布に従った分布となる。計算されたｐ値がすべての個体に対して小さい場合には、併合されたｚ得点は、ゼロから離れた正の領域に存在する。併合されたｐ値は、併合されたｚ得点の累積標準正規分布関数を計算することによって、導かれる。このプロセスは、遺伝子を得た１又は複数の個体が比較的大きなｐ値を示す遺伝子のｐ値を自動的にマイナス評価する。
【００３６】
あるいは、ＡＮＯＶＡモデルのミクスチャーに基づく統計的技法を用いてよい。エクソンアレイデータの解析において、ヒト細胞の不均一性をコントロールするための第２方策として、混合効果モデルのミクスチャーを用いる。ここで、ｘｉｊｋｌはｉ番目のエクソン発現シグナルを検出するために用意されたｋ番目のプローブ発光強度を表すことにする。ただし、添え字ｌはｌ番目の個体を表し、添え字ｊは個体ｌから採取した正常細胞（ｊ＝１）及び疾患細胞（ｊ＝２）を表す。このプローブ発光強度に対して次のようなＧ要素和からなる線形モデルのミクスチャーを用いる（ｇ＝１，・・・，Ｇ）。
【００３７】
【数３】
2008027244.tif 000005
【００３８】
個体ｌのＧ個の部分母集団Ｃ１・・・ＣＧからなり、個体ｌが集団Ｃｇに属する確率をｗｇによって与える。また、εｉｊｇｌは観測ノイズで平均０、分散τの正規分布に従うものと仮定する。解析対象の総個体数およびエクソン数はそれぞれＬ（ｌ＝１，・・・，Ｌ）およびｍ（ｉ＝１，・・・，ｍ）と仮定する。
【００３９】
この基本モデルの下で、仮説Ｈ０：γｉｊｇ＝０の検定方式を適切に設計することで、疾患特異的スプライス変異の有意性を統計的に評価することが可能になる。より詳細にいえば，正常細胞と疾患細胞に共通のスプラシングの有無Ｈ０：αｉｇ＝０、遺伝子全体での発現差の有無Ｈ０：βｊｇ＝０、部分母集団の個数Ｇのテストをモデル（１）の下で統一的にかつ自動的に行うことが可能になる。検定方式設計のための便宜上、モデル（１）を次のように書き換えることにする。
【００４０】
【数４】
2008027244.tif 000006
【００４１】
δ（  ）は定義関数で、もしモデルＭがαｉｇ≠０、βｊｇ≠０、γｉｊｇ≠０を許せば、それぞれδ（ｉｇ）＝１、δ（ｊｇ）＝１、δ（ｉｊｇ）＝１、そうでなければ、δ（ｉｇ）＝０、δ（ｊｇ）＝０、δ（ｉｊｇ）＝０の値をとるものである．
これらの定義関数とパラメータセットαｉｇ、βｊｇ、γｉｊｇは観測データに基づき推定される。本発明で考案した推定アルゴリズムは情報量基準最小化原理に基づく。すなわち、次の目的関数、
【００４２】
【数５】
2008027244.tif 000007
【００４３】
を最小化するようにパラメータと定義関数の同時推定を実行する。
ここで、上式の第一項はモデルの対数尤度、
【００４４】
【数６】
2008027244.tif 000008
【００４５】
であり、第２項のｄはモデルの自由パラメータ数を表す。ただし、φ（ｘ；ａ，ｂ）は平均ａ、分散ｂの正規分布の確率密度関数である。例えば、情報量規準としてＡＩＣ（赤池情報量規準）を用いる場合は
【００４６】
【数７】
2008027244.tif 000009
【００４７】
また、ＢＩＣ（ベイズ情報量規準）を用いる場合は
【００４８】
【数８】
2008027244.tif 000010
【００４９】
とおけばよい．
Ｉ（δ，α，β，γ，ｗ）の最適解をえるためには、まず定義関数δ（ｉｇ）、δ（ｊｇ）、δ（ｉｊｇ）を適当に与え、ＥＭアルゴリズムによって最尤推定値を計算すればよい。しかしながら、解の全探索をするためには、定義関数δ（ｉｇ）、δ（ｊｇ）、δ（ｉｊｇ）の（０，１）の全組み合わせに対してパラメータの最尤推定値を計算する必要があることから、Ｏ（２ｄＧ）の計算量を要することになる（ここでｄ＝３ｍ＋２）。これに対して、本発明では，計算量Ｏ（ｄＧ）で実行可能なＩ（δ，α，β，γ，ｗ）に対する次の最適化アルゴリズムを考案した。
【００５０】
・ステップ［Ａ０］．  以下の手順をＧ∈｛Ｇｍｉｎ，・・・，Ｇｍａｘ｝に対して繰り返す。ただし、Ｇｍｉｎ、Ｇｍａｘは部分母集団の個数の下限および上限を表す：
−ステップ［Ｂ０］．  パラメータに対して適当な初期値を設定し、
【００５１】
【数９】
2008027244.tif 000011
【００５２】
更新されるパラメータが収束条件を満たすまで、以下の手順をｈ＝０，１，２，・・・，に対して繰り返す：
＊ステップ［Ｓ１］．  現ステップのパラメータを用いて、ｌ＝１，・・・，Ｌ、ｇ＝１，・・・，Ｇ  に対して、個体ｌの部分母集団ｇへの所属確率を次式に従い評価する。
【００５３】
【数１０】
2008027244.tif 000012
【００５４】
＊ステップ［Ｓ２］．  モデルの十分統計量を次式に従い計算する（ｇ＝１，・・・，Ｇ）。
【００５５】
【数１１】
2008027244.tif 000013
【００５６】
＊ステップ［Ｓ３］．  観測ノイズをτ＝τ（ｈ）とおいて、以下の目的関数Ｉｃ（ＭｕＧ，Θ）のパラメータ  μｇ、αｉｇ、βｉｇ、γｉｊｇ、δ（  ）に関する最小化を実行する。
【００５７】
【数１２】
2008027244.tif 000014
【００５８】
パラメータ  μｇ、αｉｇ、βｉｇ、γｉｊｇ、δ（  ）に関する最小化は次式によって達成される。
・（全体平均の推定）  ｇ＝１，・・・，Ｇ  につき、次式を計算する。
【００５９】
【数１３】
2008027244.tif 000015
【００６０】
・（エクソン効果）  Ｓ（ｉ），ｉ＝１，・・・，ｍ  は次のように定義されるエクソンインデックスの集合とする。
【００６１】
【数１４】
2008027244.tif 000016
【００６２】
いま、｜Ｓ（ｉ）｜は集合Ｓ（ｉ）の要素数を表す。まず、エクソン効果の有意性を表す指示パラメータを次の手順に従い更新する：
【００６３】
【数１５】
2008027244.tif 000017
【００６４】
次にエクソン効果を表すパラメータを次式に従い更新する：
【００６５】
【数１６】
2008027244.tif 000018
【００６６】
・（遺伝子効果）  Ｓ（ｊ），ｊ＝１，２  は次のように定義される細胞種インデックスの集合とする。
【００６７】
【数１７】
2008027244.tif 000019
【００６８】
いま、｜Ｓ（ｊ）｜は集合Ｓ（ｊ）の要素数を表す。まず、遺伝子効果の有意性を表す指示パラメータを次の手順に従い更新する：
【００６９】
【数１８】
2008027244.tif 000020
【００７０】
次に遺伝子効果を表すパラメータを次式に従い更新する：
【００７１】
【数１９】
2008027244.tif 000021
【００７２】
・（疾患特異的スプライシング効果）  Ｓ（ｉ，ｊ），ｉ＝１，・・・，ｍ、ｊ＝１，２  は次のように定義されるエクソンインデックスと細胞種インデックスの集合とする。
【００７３】
【数２０】
2008027244.tif 000022
【００７４】
いま、｜Ｓ（ｉ，ｊ）｜は集合Ｓ（ｉ，ｊ）の要素数を表す。まず、特異的スプライシング効果の有意性を表す指示パラメータを次の手順に従い更新する：
【００７５】
【数２１】
2008027244.tif 000023
【００７６】
次に、特異的スプライシング効果を表すパラメータを次式に従い更新する：
【００７７】
【数２２】
2008027244.tif 000024
【００７８】
＊ステップ［Ｓ４］．  観測ノイズの分散を次式に従い更新する：
【００７９】
【数２３】
2008027244.tif 000025
【００８０】
＊ステップ［Ｓ５］．  前ステップ（ｈ）のパラメータと上記ステップにおいて更新されたパラメータの差異が十分小さければ、ステップ［Ａ２］へ進む。そうでなければ、ｈ＝ｈ＋１として、ステップ［Ｓ１］に戻る。
・ステップ［Ａ１］．  情報量規準の計算：  次式に従い、Ｇに対する情報量規準を評価する。
【００８１】
【数２４】
2008027244.tif 000026
【００８２】
・ステップ［Ａ２］．  ステップ［Ａ０］に戻る。
【００８３】
本発明によるデータ解析システムは、エクソン・アレイから得られた発光強度データを、所定のデータ処理手順を定めコンピュータ・ハードウェア上で動作するコンピュータ・プログラムが処理することによって実現される。以下では、図４を参照しながら、本発明によるデータ解析システムがどのようなハードウェア資源を用いて具体的に実現されているかの概略を説明する。
【００８４】
図４には、一般的なコンピュータ４００の内部構成が図解されている。本発明によるデータ解析システムが解析の対象とするのは、エクソン・アレイ４０１を用いて観測されたデータである。エクソン・アレイ４０１から出力された観測データは、コンピュータ４００に入力される。この観測データには、ｍＲＮＡに含まれるエクソン全体に関するエクソン発現プロファイルが反映されている。コンピュータ４００においては、入力装置４０２を介してエクソン・アレイ４０１から入力された観測データに対し、ＣＰＵ４０３において、統計処理が行われる。この統計処理の際には、必要に応じて、エクソン・アレイ４０１から得られたデータに含まれる観測バイアスを除去するバックグラウンドの修正を行う前処理がなされ、観測バイアスが除去されたデータに対して統計処理が実行され、更に、統計処理の結果として得られるデータから個体差などの原因に由来する交絡因子を除去する後処理がなされる。これら一連のデータ処理は、記憶装置４０４に記憶されているコンピュータ・プログラムを構成する一連の命令に従い、ＣＰＵ４０３によって実行される。統計処理の結果は、記憶装置４０４に記憶される。以上の手順を複数のサンプルについて実行し、その結果は、記憶装置４０４の中に累積される。ＣＰＵ４０３は、複数のサンプルに関する処理結果を記憶装置４０４から読み出して比較する。複数のエクソン発現プロファイルを比較した結果は、ディスプレイなどの出力装置４０５から出力され、疾患特異的な選択的スプライシングの同定に利用される。また、外部のデータベース４０６に蓄積されているデータとの比較も可能である。
【００８５】
図５には、以上のようにコンピュータ・ハードウェアとコンピュータ・プログラムとの協働により実現される一連のデータ解析が、フローチャート形式で図解されている。最初に、ステップ５０１では、サンプルであるｍＲＮＡがエクソン・アレイ４０１に入力される。ステップ５０２では、エクソン・アレイ４０１は、入力されたｍＲＮＡに含まれるエクソンを検出する。ステップ５０３では、エクソン・アレイによって検出された観測データが、入力装置４０１を介してコンピュータ４００の入力される。ステップ５０４では、ＣＰＵ４０３によって所定の統計処理が行われ、エクソン発現プロファイルが得られる。ステップ５０５では、統計処理によって得られたエクソン発現プロファイルが記憶装置４０４に記憶される。ステップ５０６では、記憶装置４０４に記憶されている複数のサンプルに関するエクソン発現プロファイルが、ＣＰＵ４０３において比較される。比較された結果は、ステップ５０７において、ディスプレイなどの出力装置４０５に出力される。
【００８６】
以下の実施例においては、本発明者らは本発明の方法を、結腸直腸癌のエクソン発現データに適用し、本発明の方法が有効であることを確認した。データセットは、アフィメトリクス社が、エクソンアレイデータ解析技術の開発を行う第三者に配布したものである。本発明の方法は、広範な種類の腫瘍特異的な転写によるアイソフォームを検出することが可能であった。そのうちのいくつかは、たとえば、いくつかの公知の結腸癌のバイオマーカー、およびＡｌｔＳｐｌｉｃｅデータベース（http://www.ebi.ac.uk/asd/）のような公的に利用可能な選択的スプライシングのデータベース、などの現在までに得られている生物学的知見に関連することが確かめられた。パイオニア的発明として、本発明は、全エクソンマイクロアレイデータの統計学的解析の潜在的な役割を強調し、そして、選択的スプライシングの全ゲノム研究に対してのいくつかの有望な方針を示すものである。本発明は、より進歩した統計学的技術の開発についての重要な第一歩である。
【実施例】
【００８７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８８】
１．材料と方法
１−１.  プローブデザイン
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙ上には、５５０万を超える大量のプローブが保持されており、１００万を超えるエクソンの発現プロファイルをモニターする。この新技術に伴って、本発明者らはエクソンレベルでの細胞の遺伝子発現プログラム、具体的には、選択的スプライシング（例えば、エクソンスキッピング、イントロン保持、相互に排他的なエクソン使用、選択的プロモーター使用、選択的ポリアデニル化、など）の調節機構、を明らかにすることを目的とした。
【００８９】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙは、包括的なプローブ設計戦略を採用しており、十分にアノテーションされたヒト遺伝子および豊富な新規転写物の双方についてのほとんどのエクソン領域をサポートする。このマイクロアレイシステムに、全部で１００万を超えるエクソン領域が登録されている。プローブ配列は２種のゲノム源、すなわち、ヒトＲｅｆＳｅｑ  ｍＲＮＡｓ、ＧｅｎＢａｎｋ、およびｄｂＥＳＴからのＥＳＴｓを含むｃＤＮＡに基づくコンテンツ、ならびに、ＧＥＮＳＣＡＮ、ＴＷＩＮＳＣＡＮ、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ等により予測された遺伝子構造配列、に基づいて設計されている。大多数のプローブセットは、４つの長さ２５ｂｐの完全マッチ（ＰＭ）プローブで構成される一方、約１０％のエクソンプローブセットについてのプローブ数は、プローブ選択領域の長さおよび配列の制約のため、４未満に制限されている。このマイクロアレイプラットフォームにおいては、データの標準化、例えばモニターされたプローブ強度のバックグラウンド補正を行うのに、ミスマッチのない（ＭＭ）プローブは利用可能ではない。ＭＭプローブの代わりに、アフィメトリクス社によってデザインされたバックグラウンドプローブ（ＢＧＰ）について観察された強度に基づく、観測量のバイアスを推測して除去することができる。ＢＧＰはゲノム性および非ゲノム性のプローブで構成される。ゲノム性ＢＧＰは、ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３１に基づくヒトエクソンアレイデザインの研究プロトタイプから選択された。非ゲノム性バックグラウンドプローブ配列は、ヒト（ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３４）、マウス（ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３２）、またはラット（ＨＧＳＣ  ｂｕｉｌｄ  ３．１）ゲノムにおいて見られなかった参照配列に基づく。ＢＧＰデザインについての詳細は、アフィメトリクス社のデータシートを参照のこと（http://www.affymetrix.com/suppprt/technical/datasheets/exon_arraydesign_datasheet.pdf）。
【００９０】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙにおいては、転写物クラスターＩＤが全ヒトゲノム上の各遺伝子座に割り当てられている。さらに、エクソン特異的シグナル強度を定量するために、各エクソンは、プローブセットのそれぞれが約４のプローブを含む、いくつかのプローブセットに渡っている。標的細胞についてのハイブリダイゼーションの後、各エクソンの発現値を、対応するプローブ強度に基づいて予測する。特定の位置におけるプローブ強度の観測されたパターンに基づいて、スプライシングアイソフォームを予測することができる（図６）。
【００９１】
１−２．  組織試料
本発明者は、http://www.affymetrix.com/support/technical/sample_data/exon_array_data.affxより現在公衆に利用可能な、アーリーアクセス一本鎖全転写物アッセイ（ＷＴＡ）結腸癌データセット、の解析を通じて、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  ＳＴ  １．０  Ａｒｒａｙの潜在的な適用可能性について検討した。このデータセットは元来、第三者のソフトウェア開発者のために作られたものである。結腸癌腫瘍から得られた全ＲＮＡを、それらの対応する近接した正常組織のものに対して比較した。１０の異なる個体から単離された、１０の結腸癌腫瘍／正常組織の対について検討した。従って、全部で２０の、技術的に複製されていない試料が調製された。試料情報のより詳細を表１に示す。
【００９２】
【表１】
2008027244.tif 000027
【００９３】
２.  データの正規化および異常観測値の検出：
エクソンアレイ上のプローブの高いＧＣ含有量に起因するバイアスを事前に除去することは、以降の転写物解析における擬陽性率低下のために必要不可欠である。
【００９４】
アフィメトリクス社のテクニカルノート（Exon array background correction v1.0, http://www.affymetrix.com/support/technical/whitepapers/exon_background_correction_whitepaper.pdf）に従って、非ゲノム性ＢＧＰを用い、同じＧＣ含有量を有するバックグラウンドプローブ（ＢＧＰ）の発光強度の対数平均（ｌｏｇ（ＢＧＰ））を用い、ｌｏｇ（未処理の強度）−ｌｏｇ（ＢＧＰ）に基づくバックグラウンド補正を適用して、ＧＣ含有量依存性バックグラウンド強度を推定した（図２）。このバックグラウンド強度推定によってもＧＣ含有量の高い部分については値の正確性が期待できなかったため、以下の転写産物解析から２２以上のＧＣ含有量を有するプローブデータを排除した。
【００９５】
３．  分散分析を用いた全転写産物解析
３−１．分散分析（ＡＮＯＶＡ）
観測されたプローブ強度ｘｉｊｋから、スプライシング過程が、エクソンアレイ上のある位置においてどのように作用するのかを分散分析（ＡＮＯＶＡ）により導いた。ｘｉｊｋは、バックグラウンド修正済のプローブ強度であり、ｉはターゲットとなる遺伝子座のエクソン番号（ｉ＝１，・・・，ｍ）に対応し、ｊは正常細胞ｊ＝１及び腫瘍細胞ｊ＝２のそれぞれに対応し、そしてｋはプローブの番号（ｋ＝１，・・・，ｎｉ）に対応する。
【００９６】
スプライシングされた腫瘍細胞特異的な遺伝子座の検出に関する問題は、両方の細胞のタイプにおいて異なる発現を生じているエクソン領域を示す、エクソンアレイ上の位置の集合を見出すことである。この目的のために、次のような単純な固定効果モデル：
ｘｉｊｋ＝μ＋αｉ＋βｊ＋γｉｊ＋εｉｊｋ
に基づいて、古典的な分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。
【００９７】
この数式において、μは、全プローブに共通のプローブ強度の全体の平均を表す。パラメータαｉ（ｉ＝１，・・・，ｍ）は、ｍ個のエクソン領域に対するベースライン強度の変化に対する応答である。評価されたαｉは、両方の細胞タイプの間で共有されるスプライシングによる変動の存在に対して、１又は複数の異なる値をとることが予想される。パラメータβｊは、正常細胞と腫瘍細胞との間の全体平均の差に対応する。評価されたβｊは、両方の細胞タイプにおける遺伝子発現レベルの変化に応答して、異なる値を取りうる。パラメータγｉｊは、ｍ個のエクソンと２つの細胞カテゴリとのそれぞれの組合せに対する相互作用効果を表す。
【００９８】
このように、αｉ、βｊ、γｉｊを評価することにより、結果的に、プローブの応答を、エクソン効果と、全体的な遺伝子効果と特定のスプライシング事象の効果との３つの相互に独立な（orthogonal）効果に分解した。選択的スプライシングが一方の細胞に存在し他方の細胞に存在しない場合には、評価されたγｉｊの少なくとも１つの値が相互に異なる。相互作用パラメータγｉｊの評価により、腫瘍特異的な選択的スプライシングの効果を捕捉することができる（図３）。
【００９９】
それぞれの効果の有意性を観測強度を用いて評価するため、発明者らは、以下のような統計的検定を行った。
第１に、エクソン効果に関する検定では、帰無仮説（Ｈ０）として、任意のｉ≠ｊに対してαｉ＝αｊと仮定し、対立仮説（Ｈ１）として、少なくとも１対の｛ｉ≠ｊ｝に対してαｉ≠αｊと仮定した。
【０１００】
第２に、全体的な遺伝子効果に関する検定では、Ｈ０として、β１＝β２と仮定し、Ｈ１として、β１≠β２と仮定した。
第３に、腫瘍特異的な選択的スプライシングの効果に関する検定では、Ｈ０として、任意の｛ｉ，ｊ｝≠｛ｈ，ｋ｝に対してγｉｊ＝γｈｋと仮定し、Ｈ１として、少なくとも１対の｛ｉ，ｊ｝及び｛ｈ，ｋ｝に対してγｉｊ≠γｈｋと仮定した。
【０１０１】
すべての相互作用項が等しいという帰無仮説が棄却されると、腫瘍形成と何らかの意味で関連がある遺伝子座である可能性が高いことが示唆される。ヒト・エクソン・マイクロアレイによって得られる遺伝子座全体に対してＡＮＯＶＡを反復的に適用することにより、全ヒトゲノム上の遺伝子座に対して腫瘍特異的なスプライシングの有無を評価し、第３の検定における帰無仮説のｐ値をそれぞれの遺伝子座に割り当てることができた。
【０１０２】
３−２．結果
（１）  直腸癌特異的スプライス変異の検出
正常細胞および腫瘍細胞の間で共有される選択的スプライシング、遺伝子発現レベルの全体の差、および、腫瘍特異的スプライス変異、の有意性について分散分析（ＡＮＯＶＡ）でｐ値を計算した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙ上に保持されたプローブ全部（５００万を超える）を、この分析に用いた。全体で３００，０００の転写物クラスターの中で、それぞれ５％または１％有意性レベルを選択することにより、３０１６および１４７０遺伝子座が腫瘍特異的スプライス変異を生じると同定された。転写物クラスターについて繰り返しＦ−テストを行ったので、本発明の方法は多様な比較を伴っており、そして、ｐ値はそのように解釈されるべきである。バイアスした擬陽性率を補正するために、ややより厳しいｐ値の閾値を選んだ。よって、規準として、同定した有意性のある座における擬陽性発見率を評価するｑ値（Storey, J. D., Journal of the Royal Statistical Society, Series B, Vol. 64: 479-498, 2002）を計算した。結果を表２に示した。
【０１０３】
【表２】
2008027244.tif 000028
【０１０４】
表２は、相互作用パラメータγｉｊについて、有意性のある遺伝子の一部であって、得られたｐ値が、最も小さい方から２０番目までの遺伝子を示す。最も小さいｐ値を得た遺伝子は、ホモ・サピエンス  ラミニン  アルファ３をコードするＬＡＭＡ３（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ１９８１２９）であった。ラミニンは、他の細胞外マトリクス成分との相互作用により、真核生物の発生の際、細胞の組織への付着、遊走および組織化を仲介する基底膜成分である。この遺伝子にコードされるタンパク質は、ラミニン５のα−３鎖である。ラミニン５は、３つのサブユニット（アルファ、ベータ、およびガンマ）で構成される複合糖タンパク質である。ラミニン５は、細胞接着、シグナル伝達、およびケラチノサイトの分化に関与すると考えられている。
【０１０５】
多様なアイソフォームをコードする選択的スプライシングされた転写による変異体が同定された。例えば、ＡｌｔＳｐｌｉｃｅデータベース（http://www.ebi.ac.uk/asd/ ; European Bioinformatics Institute)には、ＬＡＭＡ３の５個のスプライスバリアントが登録されている（AltSplice-Human: Entry ENSG00000053747）。これらのスプライスバリアント、すなわちｓｐ１、ｓｐ２、ｓｐ３、ｓｐ４、およびｓｐ５は、図７の左パネルに、右パネルの正常細胞および腫瘍細胞についてのプローブ強度の観察されたパターンと共に示されている。観察されたプローブ強度のパターンは、スプライス変異は腫瘍細胞特異的であったことを示す。具体的には、腫瘍細胞において、ｃｈｒ１８：１９７０５０２９−１９７８６８９０（＋）周辺のエクソン領域が、正常の対照細胞よりも高度に発現していた。図７の左パネルにおいて、腫瘍細胞に特異的なスプライス型の予測を示す。ここで、有意に発現したエクソン領域は、エクソン領域におけるプローブ強度の平均値は０に等しいという帰無仮説についてのｔ検定を繰り返し適用することにより同定された。この観察結果は、腫瘍細胞におけるＬＡＭＡ３の観察された発現パターンは、公知の転写変異体ｓｐ３またはｓｐ４におおよそ対応することを示している。
【０１０６】
次に、ロイシンリッチリピートを含むＧタンパク質共役型受容体５をコードするＬＧＲ５（ＧＰＲ４９）に着目した。図８はＡｌｔＳｐｒｉｃｅデータベースに登録された３つのスプライスバリアント、および、腫瘍細胞に特異的なスプライス変異および左パネルに示されているようなスプライスバリアントの型を予測する、観察されたプローブ強度を示す。ＬＧＲ５は、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、および黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）を含む、糖タンパク質ホルモン受容体サブファミリーの一員である。Ｙａｍａｍｏｔｏらの文献（Yamamoto, Y., et al., HEPATOLOGY, Vol.37, 528-533, 2003）によると、ＬＧＲ５の過剰発現は、β−カテニン  エクソン３の変異とともに、ＨＣＣ（肝臓癌）においてしばしば観察された（１６症例中１４例、８７．５％）。さらに、変異型β−カテニンを培養中のマウス肝細胞に導入すると、ＬＧＲ５マウスホモログのアップレギュレーションが引き起こされた。観察された事実からＹａｍａｍｏｔｏらは，ＬＧＲ５はＷｎｔ−シグナリングにより活性化される標的遺伝子であると結論づけた。Ｗｎｔシグナリングは、遊離の細胞質β−カテニンの不安定化の引き金となることが知られている。加えて、β−カテニンは、カドヘリンに仲介される細胞−細胞接着にも関与する。最近、β−カテニンの異常な活性化は、種々の腫瘍、特に直腸結腸癌の始まりに寄与することが確立された（Bienz, M. and Clecers, H., Cell, Vol.103, 311-320, 2000；Polakis, P., Genes Dev., Vol.14, 1837-1851, 2000を参照）。
【０１０７】
続いて、有意に特異的なスプライス変異を伴う同定された遺伝子について、Ｗｎｔシグナリングとの関連において、議論する。Ｗｎｔシグナリングおよび結腸癌についてのいくつかの優れた総説がある（Bienz, M. and Clevers, H., Cell, Vol.103, 311-320, 2000; Polakis, P., Genes Dev., Vol.14, 1837-1851, 2000）。腺腫性結腸ポリープ症（ＡＰＣ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ  ＧＳＫ−３β、および転写性コファクター  β−カテニンは、この経路において中心的な役割を果たす。β−カテニンは、カドヘリン関連タンパク質，ベータ１（ＣＴＮＮＢ１）をコードすることが知られており、そして、安定化し、核へと移行して、Ｔ細胞因子（Ｔｃｆ）／リンパ系促進因子（ＬＥＦ）ファミリーの転写因子のメンバーに結合して標的遺伝子発現を誘導する。標準的なＷｎｔシグナリング経路の下流標的は、細胞増殖に重要ないくつかの遺伝子を含み、癌の発達におけるＷｎｔシグナリングの重要性を強調する。例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＣＬＤＮ１、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）、ＭＭＰ３、などである。図９はＷｎｔシグナリング経路のまとめを示す。特異的なスプライス変異の証拠と共に同定された遺伝子を赤で示した。例えば、ＴＲＡＮＳＰＡＴＨ（http://www.transpath.com/）は、Ｗｎｔシグナリング標的遺伝子であるｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓは、ＭＥＴ（ここでＭＥＴは、有意なｐ値  １．３４×１０−６を有する特異的スプライス変異を有し、かつ、ｍｅｔ  プロト−オンコジーン（肝細胞増殖因子受容体）をコードする）を調節することが知られていることを示唆している。有意な遺伝子ＣＤＬＮ１およびＣＤＨ１１（カドヘリン）のいずれかは、膜貫通タンパク質をコードし、細胞接着分子を生じる。この経路において、例えば、ｃ−ｍｙｃ、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１２、ＣＤＣＡ７、ＭＡＴ２Ａ、ＥＴＳ２について、ずっと有意なスプライス変異が観察された。さらに、遺伝子レベルにおいて、ＡＰＣ（腺腫性結腸ポリープ症）およびβ−カテニンは、正常細胞および腫瘍細胞の間で差次的に発現すると判断された（全体としての遺伝子効果βｊのｐ値は、それぞれ、３．０３×１０−４６および５．７２×１０−２０であった）。Ｗｎｔ経路において、ＡＰＣタンパク質は通常β−カテニンに細胞質で結合する。この結合は、遊離のβ−カテニンの迅速な分解へと導く。他方、ＡＰＣ遺伝子の不活性化はβ−カテニンの減少した分解の引き金となる。このことは、β−カテニンの核における異常な蓄積、および蓄積したβ−カテニンは、Ｗｎｔ標的遺伝子として働く転写因子ＴＣＦ／ＬＥＦに結合するという結果を招く。この実験において、我々は正常細胞におけるＡＰＣの発現の存在を観察したが、腫瘍細胞においては存在しなかった。逆に、β−カテニンは腫瘍細胞において特異的に高発現していた。この観察結果は、上記の遺伝子制御機構と矛盾がない。
【０１０８】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  ＳＴ  Ａｒｒａｙの登場は、選択的スプライシングの機能的制御についての全ゲノム解析に道を開くものである。本発明者は、本発明の統計学的解析を伴うマイクロアレイプラットフォームについての、結腸癌の出現を引き起こすかも知れない、または結腸癌の出現により引き起こされる、スプライシング変異を発見することについての可能性を議論した。本発明の方法は、エクソン発現プロファイルの全ゲノム統計学的解析について新規データを生み出した、最初のものである。ＡＮＯＶＡ法は、腫瘍関連スプライス変異の証拠を、３０００を超える遺伝子座について自動的に同定した。次いで、いくつかの同定されたスプライス変異と既に存在する生物学的知見の関連を解明した。本発明の方法により得られた、観察されたスプライシングパターンのいくつかは、ＡｌｔＳｐｌｉｃｅデータベースに登録されている転写によるアイソフォームと高度に一致した。さらに、スプライシング変異を、結腸直腸癌の現れに関与することが知られているＷｎｔシグナリング経路における、遊離のβ−カテニンの異常な蓄積と関連づけるために、経路レベル解析を行った。これらの結果は、エクソン発現データの統計学的解析の潜在的な力を強調するのに十分である。
【０１０９】
４．メタアナリシス
ヒトの疾患の解析においては、選択的スプライシングの制御機構にいくらかの影響がある個体特異性、例えば、性別、年齢、ＳＮＰｓ等の問題を扱う必要があることは強調すべきである。例えば、現在の腫瘍形成研究が報告していることによると、結腸腫瘍は女性優位的であり、遺伝子のある集合は、男性から得られた試料において、女性の結腸癌患者と比較して、有意差をもって過剰に発現することが知られている（Issa, J-P. J., et al., Cancer Research, Vol.61, 3573-3577, 2001）。更に、年齢や腫瘍差の程度など別の非特異的な因子も、ヒトの結腸癌における遺伝子制御機構に影響する可能性がある。
【０１１０】
最終的な目標は、「ユニバーサルバイオマーカー」すなわち、特定の疾患についてすべての個体において共通してミススプライスされる遺伝子座、を発見することである。ユニバーサルバイオマーカー発見に向けての１つの直感的な方針は、全患者にわたって十分に小さいｐ値が割り当てられる座を同定することである。例えば、上記３．のＡＮＯＶＡの方法を、１０の直腸癌患者のそれぞれについてのＬＧＲ５（ＴＣＩＤ：３４２２１４４）およびＴＤＧＦ１（ＴＣＩＤ：２６２０９３７）に適用した。１０個体の特異的スプライシング変異についてのｐ値を計算したところ、ＬＧＲ５について：２．９０４ｘ１０−２；３．７５１ｘ１０−２９；３．０４４ｘ１０−７；１．１６１ｘ１０−３；０．９９５７；４．０９５ｘ１０−２２；１．０２４２ｘ１０−２３；１．３４４ｘ１０−１７；１．８７４ｘ１０−１１；０．９９９；および、ＴＤＧＨ１について：０．９８７３；０．９３２６；５．４１９ｘ１０−４；１．６５６ｘ１０−５；０．６６２２；８．０２８６ｘ１０−６；０．９８３６；２．２９２１ｘ１０−３；３．５９１９ｘ１０−３；０．８４５７２；であった。ＬＧＲ５について割り当てられたｐ値はほとんどの個体において小さかったが、ＴＤＧＨ１は、個体によって変化し、特に、５０％異常のスコアが患者Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７、およびＮｏ．１０にそれぞれ割り当てられた。実際に、観察されたスプライスパターンは、ＬＧＲ５についての全実験を通じてほぼ同じであったが、ＴＤＧＨのそれぞれにおいては異なっていた。後者のプローブ強度のパターンは、非特異的スプライシング因子によって影響を受けていたのであろう。そのような非特異的スプライシング因子の除去が、ヒト疾患のいくつかの型のためのバイオマーカーのセットの選択を成功させるための鍵となる。そのような問題を解決するための１つの直感的な方針は、データを集めた患者すべてに渡って小さなｐ値を有する遺伝子の群を同定することである。このような直感に従って、フィッシャーのノーマル・インバーション法に含まれる統計的技法を用いた。
【０１１１】
Ｇ人の個体に対して上記分散分析の手法を適用した結果得られる相互作用項γｉｊに対してｐ値ｐ１，・・・，ｐＧを計算した。まず、これらのｐ値を、下記の数式で表される正規化された累積的な分布関数の逆数を用いて併合されたｚ得点（merged z score）に変換した。
【０１１２】
【数２５】
2008027244.tif 000029
【０１１３】
ここで、分母の平方根の中は１に等しく、ｗ＞＝０であり、Φ−１（ｘ）は、標準正規変動の累積的分布関数の逆数を意味する。統計理論によると、帰無仮説が成立する、すなわち、相互作用の効果がない場合に、かつ、その場合に限り、ｚｉ＝Φ−１（１−ｐｉ）は標準正規分布に従う。従って、ｚｉの任意の重み付き平均もまた、上記の数式の分母の平方根の中が１に等しく、ｗ≧０であるときには常に、標準正規分布に従った分布となる。計算されたｐ値がすべての個体に対して小さい場合には、併合されたｚ得点は、ゼロから離れた正の領域に存在する。併合されたｐ値は、併合されたｚ得点の累積標準正規分布関数を計算することによって、導かれた。このプロセスは、遺伝子を得た１又は複数の個体が比較的大きなｐ値を示す遺伝子のｐ値を自動的にマイナス評価した。
【０１１４】
結果
上述のようにフィッシャーのノーマル・インバーション法を行ったところ、１０個体のエクソン発現プロファイルから結腸癌特異的な選択的スプライシングが生じる候補遺伝子として、以下の表３に示される遺伝子を同定することができた。
【０１１５】
【表３】
2008027244.tif 000030
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、１の個体から単離された正常細胞および腫瘍細胞のエクソン発現プロファイルからの、腫瘍特異的バイオマーカー・スプライスバリアントの同定の概要の図解である。保持されたプローブの観察された強度から、全ヒトエクソンの発現値を見積もることができる。特定の座におけるエクソンの発現パターンに基づいて、選択的スプライシングの間に生じた転写によるアイソフォームを予測した。腫瘍特異的スプライシング事象を検出する際の問題は、正常細胞および腫瘍細胞の間で差次的に発現するエクソンを示すエクソンアレイ上の位置を探し出すことにある。
【図２】図２は、エクソンマイクロアレイのバックグラウンド補正に関する図である。（ａ）プローブのＧＣ含量と分布を示すヒストグラムである。（ｂ）ＧＣ含量に対する非ゲノム性ＢＧＰ強度を示すボックスプロットである。（ｃ）同じＧＣ含量について補正していない未処理のプローブ強度から非ゲノム性ＢＧＰ強度の平均を差し引くことにより算出したバックグラウンド補正プローブ強度を示すプロットである（ＧＣ含量の高い部分のバイアスの除去は行っていない）。
【図３】図３は、混合線形モデルの機構を示す図である。モデル・パラメータであるαｉ、βｊ及びγｉｊは、正常及び腫瘍細胞に共通の選択的スプライシング、遺伝子発現レベルにおける全体的な差異及び腫瘍特異的なスプライシングに対応する。例えば、αｉ（１＜ｉ＜ｍ）又はβｊ（ｊ＝１，２）の中の少なくとも１つのパラメータは残りのパラメータとは異なる値を取り、正常及び腫瘍細胞の両方に共通の選択的スプライシング又は遺伝子発現レベルにおける全体的差異にそれぞれ対応する。更に、スプライス変異が一方の細胞に存在し他方の細胞には存在しない場合には、少なくとも１つのγｉｊ（１＜ｉ＜ｍ；ｊ＝１，２）は他とは異なっている。
【図４】図４は、本発明によるデータ解析システムを構成するハードウェアのブロック図である。
【図５】図５は、本発明によるデータ解析システムの動作の概略を表すフローチャートである。
【図６】図６は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴ  マイクロアレイシステムの概略を示す図である。このマイクロアレイにおいては、転写物クラスターＩＤという位置ＩＤが、ヒトゲノム上の各遺伝子座に割り当てられている。エクソン特異的発現値を見積もるために、各エクソンはいくつかのプローブセットに渡っており、各プローブセットは典型的には４のプローブを含有する。エクソンクラスターＩＤおよびプローブセットＩＤもまた、それぞれのエクソン領域およびプローブセットに割り当てられている。標的細胞についてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの後、各エクソンの発現値を、観察されたプローブ強度から見積もる。特定の位置におけるプローブ強度の観察されたパターンに基づいて、当該細胞においてどのスプライス変異が生じているのかを予測することができる。
【図７】図７は、ＬＡＭＡ３のスプライス変異（左）、ならびに、正常細胞および腫瘍細胞にわたる観察されたプローブ強度のパターン（右）を示す図である。左のパネルに、現在のＡｌｔＳｐｌｉｃｅデータベースに登録されている５つのスプライスバリアント、すなわち、ｓｐ１、ｓｐ２、ｓｐ３、ｓｐ４およびｓｐ５を示す。これらに加えて、観察されたプローブ強度から予測されたスプライス型およびこのエクソンアレイシステムに割り当てられたエクソン領域を左パネルに示す。
【図８】図８は、ＬＧＲ５のスプライス変異（左）ならびに、正常細胞および異常細胞に渡る観察されたプローブ強度のパターン（右）を示す図である。左のパネルに、現在のＡｌｔＳｐｌｉｃｅデータベースに登録されている３つのスプライスバリアント、すなわち、ｓｐ１、ｓｐ２、およびｓｐ３、を示す。これらに加えて、観察されたプローブ強度により予測されたスプライス型およびこのエクソンアレイシステムに割り当てられたエクソン領域を左パネルに示す。
【図９】図９は、Ｗｎｔシグナリング経路における特異的スプライス変異のまとめ。標準的Ｗｎｔシグナリング経路の下流標的は、例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＣＤＬＮ１、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）、ＭＭＰ３等、癌の発達におけるＷｎｔシグナリングの重要性を強調する、細胞増殖に重要ないくつかの遺伝子を含む。特異的なスプライス変異の証拠を伴う、同定された遺伝子は濃い灰色で示した。
【図１】
2008027244.tif 000033
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【図６】
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【図９】
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