(57)【要約】【課題】  ヘルペスウイルスに対して感染感受性が高く、安定であり、しかも子孫ウイルスを分離可能な細胞株を提供すること。また、組換えウイルスや免疫学的手法を用いることなく、へルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を高感度で迅速かつ簡便に定量解析し、ヘルペスウイルス感染を検出するための方法を提供すること。【解決手段】  ヘルペスウイルスに対して、感染感受性だけでなく、感染許容性も有する細胞を親株として用いることにより、簡便かつ高感度にヘルペスウイルス感染を検出でき、かつウイルス分離も可能である。また、本発明の細胞を用いることにより、ヘルペスウイルス感染のモニタリングを行うこともできる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
へルペスウイルスに対して感染感受性及び感染許容性を有し、かつ
標識されたＰＭＬボディ構成タンパク質を発現する細胞株。
【請求項２】
標識されたＰＭＬボディ構成タンパク質が刺激により発現する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
標識が蛍光標識である、請求項１又は２に記載の細胞株。
【請求項４】
ＰＭＬボディ構成タンパク質がＰＭＬタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項５】
ウイルス分離が可能である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項６】
寄託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９５３で表される細胞株。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞株にヘルペスウイルスを感染させ、ＰＭＬボディの特異的形態変化を示す細胞を解析することを含む、ヘルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を検出する方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞株にヘルペスウイルスを含む可能性のある生体試料を接種し、ＰＭＬボディの特異的形態変化を示す細胞を解析することを含む、ヘルペスウイルス感染モニタリング方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞株にヘルペスウイルスを含む可能性のある生体試料を接種し、接種した細胞を培養し、培養細胞から子孫ウイルスを回収することを含む、ウイルス分離方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞株に、ヘルペスウイルスと試料を接種し、ＰＭＬボディの特異的形態変化を示す細胞を解析することを含む、感染阻害物質のスクリーニング方法または薬剤感受性検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、へルペスウイルスに対して感染感受性及び感染許容性を有し、かつ
標識されたＰＭＬボディ構成タンパク質を発現する細胞株に関する。また、本発明は、前記細胞株を用いたヘルペスウイルスの検出・モニタリング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘルペスウイルスは、α、βおよびγヘルペスウイルスの３つの亜科からなるＤＮＡウイルスである。αヘルペスウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、並びに帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）が、βヘルペスウイルスとしては、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、並びにヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）およびヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）が、γヘルペスウイルスとしては、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）が知られている。現在までにこれら８種のウイルスがヒトに感染するヒトヘルペスウイルスとして報告されている。
【０００３】
ヒトヘルペスウイルスは様々な病態の原因ウイルスであるが、その多くは日和見感染症である。多くのヒトヘルペスウイルスでは、初感染時の不顕性感染を経て、一生涯体内に滞まる潜伏感染状態へ移行する。その後、様々な刺激によって再活性化された際、免疫能が低下している場合に重篤な日和見感染症を引き起こす。例えばＣＭＶの場合、成人になるまでに８０〜９０％の人が感染するが、初感染時は通常不顕性に経過し、疾患にはいたらない。しかし、免疫の未熟な胎児や、免疫の低下したエイズ患者、臓器移植患者、および癌患者などの易感染性者では、ＣＭＶ脳炎、ＣＭＶ網膜炎、肺炎など重篤な病態を引き起こし、多臓器不全となる場合もある。ＨＳＶ−１は三叉神経節に潜伏感染し、後に再活性化され、角膜炎や口唇ヘルペスを引き起こす。ＨＳＶ−２は、通常、性的接触によって獲得され、生殖器ヘルペスを引き起こす。ＨＨＶ−８はエイズに頻発するカポジ肉腫の原因ウイルスである。ＶＺＶは、水痘、帯状疱疹およびヘルペス後神経痛を引き起こし、再活性化により症状を繰り返す傾向が強い。ヘルペスウイルスの治療薬（抗ヘルペスウイルス剤）としては、ウイルス遺伝子複製過程の選択的な阻害作用を利用する核酸系抗ウイルス剤（例えばガンシクロビル、アシクロビル）が用いられている。
【０００４】
臓器移植患者やエイズ患者のように免疫不全の状態にある患者では、ＨＣＭＶに起因するＨＣＭＶ感染症がしばしば重篤、致死的となり、最も警戒すべき感染症の一つである。これらの患者群においてはウイルスの再活性化がおこりやすい状態となっており、早期発見の為には血液等を試料とした感染モニタリングが非常に重要である。特に、臓器移植、骨髄移植の術後段階では、ＨＣＭＶ感染症は一度発症すると予後不良であり、移植自体を左右する場合も多くあるため、その発症予防、管理は最重要課題の一つである。即ち、これらの患者群において、ＨＣＭＶ感染症の管理のための継続的ウイルスモニタリングが必須となっている。
【０００５】
ＨＣＭＶ感染症の診断に用いられる検査法としては、血液中抗体価（特異的ＩｇＭ抗体）、尿からのウイルス分離などの古典的方法が確立されている。さらに、血液中ウイルス抗原を検出するアンチゲネミア法、培養後に抗原検出するシェルバイアル法、ゲノムＤＮＡ検出のためのＰＣＲ法などが用いられている。ＨＣＭＶ感染モニタリングに必要な条件としては、定量性、感度、迅速性、病態との相関性があげられる。血液中抗体価は過去に於ける感染履歴を反映しており、活動中のウイルスの指標としては有用ではない。尿からのウイルス分離は操作完了までに数週間要するため、臨床現場における感染モニタリングという観点からは有用な情報は得られない。ゲノムＤＮＡ検出は感度が高く、迅速に結果が得られるが、病態に連動しない事が知られている。アンチゲネミア法は、末梢血多形核白血球細胞中のウイルス抗原陽性細胞数が分かるため定量的結果がえられ、病態との関連も示されているが、感度が十分とはいえず、ゲノムＤＮＡ検出などと組み合わせる必要がある。病態を的確に把握するための感染モニタリングには、複数の検査方法を組み合わせて総合的に判断する必要があり、定量性、感度、迅速性、病態との相関性などを備えた新しい検出法の開発が望まれている。更に、移植患者等でのＨＣＭＶ感染をモニタリングするには、血液等の生体試料から直接ウイルスを定量する方法が必要である。更に、活発に活動中のウイルスを高感度で検出できれば、病態との相関性の高い指標となると予想される。
【０００６】
本発明者らは、ヘルペスウイルスの中和抗体価、感染阻害率などを定量的に算出する新規な検出方法について報告している（特開２００５−３１２４０９号公報を参照されたい）。この方法は、標識したＰＭＬボディ構成タンパク質を発現する細胞（例えばＳＥ／１５細胞）を用いることにより、簡便かつ高感度にヘルペスウイルス感染細胞を検出できる。ＰＭＬボディは、ＰＭＬタンパク質を含む数十種類のタンパク質から構成されている。ＣＭＶの場合、非感染細胞のＰＭＬタンパク質は小さなドット状のＰＭＬボディとして存在しているが、感染により前初期遺伝子産物ＩＥ１が発現すると、ＰＭＬボディが壊れてＰＭＬタンパク質が核内全体へ拡散し、ドットが大きくなる。両者の大きさは著しく異なっているため、容易に区別することができる。さらに、ＰＭＬボディ構成タンパク質は標識されているため、抗体等による免疫染色の操作を必要とせず、例えば蛍光顕微鏡による観察だけでウイルス感染細胞を検出する事が可能である。しかし、ＳＥ／１５細胞は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣由来）細胞株を親株とした細胞であり、子孫ウイルスが増殖しないため、被検試料からのウイルス分離はできなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヘルペスウイルスに対して感染感受性が高く、安定であり、しかも子孫ウイルスを分離可能な細胞株を提供することを目的とする。また、本発明は、組換えウイルスや免疫学的手法を用いることなく、へルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を高感度で迅速かつ簡便に定量解析し、ヘルペスウイルス感染を検出するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヘルペスウイルスに対して、感染感受性だけでなく、感染許容性も有する細胞を親株として用いることにより、簡便かつ高感度にヘルペスウイルス感染を検出でき、かつウイルス分離も可能である、ヘルペスウイルスの新規検出系を確立した。
【０００９】
即ち、本発明は、へルペスウイルスに対して感染感受性及び感染許容性を有し、かつ
標識されたＰＭＬボディ構成タンパク質を発現する細胞株を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９５３で表される細胞株を提供するものである。
【００１１】
さらに、本発明は、上記細胞株にヘルペスウイルスを感染させ、ＰＭＬボディの特異的形態変化を示す細胞を解析することを含む、ヘルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を検出する方法を提供するものである。
【００１２】
さらに、本発明は、上記細胞株にヘルペスウイルスを含む可能性のある生体試料を接種し、ＰＭＬボディの特異的形態変化を示す細胞を解析することを含む、ヘルペスウイルス感染モニタリング方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、上記細胞株にヘルペスウイルスを含む可能性のある生体試料を接種し、接種した細胞を培養し、培養細胞から子孫ウイルスを回収することを含む、ウイルス分離方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、上記細胞株に、ヘルペスウイルスと試料を接種し、ＰＭＬボディの特異的形態変化を示す細胞を解析することを含む、感染阻害物質のスクリーニング方法または薬剤感受性検査方法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明について、詳細に説明する。
【００１６】
本発明はヘルペスウイルス、例えばＨＳＶ−１またはＨＣＭＶ、好ましくはＨＣＭＶの感染を検出するための細胞および方法に関するものである。
【００１７】
本発明の細胞株はＰＭＬボディを構成するタンパク質を発現する。構成タンパク質の例としては、ＰＭＬ、ＳＰ１００、ＮＤＰ５２、ＮＤＰ５５、ＤＡＸＸ、Ｓｋｉ／Ｓｎｏ、ＣＢＰ、ＨＳＦ２、Ｓｐ１、ｐＲｂ、ＨＰ１、ｅＩＦ−４などを挙げることができるが、ＰＭＬを用いることが好ましい。本発明の細胞株に導入する構成タンパク質遺伝子は、これらと同等の機能を有するタンパク質を発現する限り、１〜１５０塩基、好ましくは１〜１００塩基、より好ましくは１〜５０塩基（例えば１〜数塩基）が欠失、置換、および／または付加されたものでもよい。同等の機能とは、ＤＮＡウイルスの感染によりＰＭＬボディから核内に拡散し、非イオン性界面活性剤処理により可溶化されることをいう。
【００１８】
これら構成タンパク質は、ＰＭＬボディ中でタグ標識された状態で発現する。標識には通常蛍光タンパク質、例えばグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）やＥＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＢＦＰ２、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰなどが用いられるが、本発明の検出方法に用いることができれば、蛍光標識以外の標識方法を用いることもできる。蛍光以外の標識方法の例としては、β−ガラクトシダーゼ、ＣＡＴ、ルシフェラーゼなどによる化学発光を用いた方法が挙げられる。
【００１９】
本発明の細胞株は、ヘルペスウイルスに対して感染感受性を有し、かつ子孫ウイルスの複製が可能な感染許容性を有する細胞株である。「感染感受性を有する」とは、ウイルス粒子の細胞への吸着から前初期遺伝子産物の翻訳までに求められる宿主細胞の様々な機能が欠如していない細胞を意味する。「感染許容性を有する」とは、子孫ウイルスが増殖するまでの全てのウイルス感染複製過程が滞りなく終了するために求められる宿主細胞の様々な機能が欠如していない細胞を意味する。したがって、本発明の細胞株にヘルペスウイルスを接種すると、前初期遺伝子抗原が十分発現するとともに、試料由来の子孫ウイルスを得る事が可能である。本発明の細胞株の例として、ヒト急性単球性白血病由来のＴＨＰ／３３（実施例１参照）を挙げることができる（受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９５３、受託日：２００６年７月７日）。
【００２０】
本発明の細胞株の調製方法を以下に説明する。
【００２１】
細胞中で発現させる遺伝子のクローニングおよび発現細胞の作製は、常法に従って行うことができ、例えば、Katano, H. et al., Virology, 286, 2001, 446-445に記載の方法を用いることができる。
【００２２】
まず所望の遺伝子をＰＣＲで増幅後、適当な発現ベクターに組み込む。その際、所望の遺伝子をタグ標識するために連結する遺伝子を、所望の遺伝子産物との融合タンパク質として発現可能なように組み込むことができるが、すでにベクター中に組み込まれたものを用いることが好ましい。発現ベクターとしては、ｐＥＧＦＰ  Ｃ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、Ｖｉｔａｌｉｔｙ  ｈｒＧＦＰレポーターベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）、ＧＦＰ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＴｒａｃｅｒベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを用いることができる。
【００２３】
組換え発現ベクターは、例えばリポフェクチン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法などの方法により、へルペスウイルスが感染可能な細胞へトランスフェクションする。ヘルペスウイルスが感染可能な細胞としてはＭＲＣ−５、ＨＥＬ、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３、２９３Ｔ、ＨｅＬａ、Ｒａｍｏｓ３、ＨＳＢ−２、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、Ｖｅｒｏ、Ｃａｃｏ−２、Ｋ−１０３４などを挙げることができる。特に、ＨＣＭＶ感染許容細胞としてはＭＲＣ−５、ＨＥＬ、ＴＨＰ−１、Ｃａｃｏ−２、Ｋ−１０３４、Ｕ３７３−ＭＧ細胞などが知られている。発現ベクターには薬剤耐性遺伝子が組み込まれていることが好ましく、この場合、発現ベクターを導入後、薬剤存在下で選択し、耐性細胞株をクローニングすることができる。
【００２４】
本発明者らは、ＨＣＭＶ感染許容細胞として最も汎用されているＭＲＣ−５、ＨＥＬ細胞などを親株として、ＰＭＬタンパク質などを長期間にわたり強制発現する細胞株の樹立を試みてきたが、このような細胞株を安定的に樹立する事は困難であった。この理由の１つとして、ＨＣＭＶ感染許容性の必要条件の１つは内在的なＰＭＬボディが十分に発達していることであるが、そのような性質を備えた細胞に外来性ＰＭＬタンパク質を持続的に強制発現させると細胞に悪影響をもたらすことが考えられた。したがって、本発明では、ＨＣＭＶ感染許容性を備えた細胞ではなく、ＨＣＭＶ感染許容性が刺激によって誘導されるような細胞を親株として、ＰＭＬタンパク質の強制発現細胞株の作製を試みた。ＴＨＰ−１細胞の感染許容性は、ＴＰＡなどのホルボールエステル刺激後に誘導されることが報告されている（Weinshenker, B.G., Wilton, S.及びRice, G.P., 1988, J. Immunol., 140: 1625-1631）。そこで、ＴＨＰ−１細胞を使用して研究を重ねた結果、持続的にＧＦＰ−ＰＭＬタンパク質を発現する細胞株の樹立に成功した。
【００２５】
ＴＨＰ−１細胞の他に、刺激によって感染許容性が誘導される細胞株の例としては、Ｕ９３７、ＴＥＲＡ−２、ＴＦ１、Ｕ１３８−ＭＧなどが挙げられる。また刺激の例として、Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ、ＢＵｄＲ、ＩＵｄＲ、ＨＭＢＡ、ＤＭＡ、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（ＨＣ）などが知られている。
【００２６】
次に、本発明の細胞株を用いてヘルペスウイルス感染を検出する方法について説明する。
【００２７】
本発明の細胞株にウイルスサンプルを接種した後、前初期遺伝子産物の発現によりＰＭＬボディの特異変化を誘導させる。この特異変化の例としては、ＨＣＭＶ前初期遺伝子産物ＩＥ１の場合はＰＭＬタンパク質の核内への拡散、ＨＳＶ−１の前初期遺伝子産物の場合はＰＭＬタンパク質の消失などが挙げられる。例えばＣＭＶの場合、非感染細胞のＰＭＬタンパク質は小さなドット状のＰＭＬボディとして存在しているが、感染によりＩＥ１が発現するとＰＭＬボディが壊れてＰＭＬタンパク質が核内全体へ拡散し、ドットが大きくなる。両者の大きさは著しく異なっているため、容易に区別することができる。
【００２８】
核内へ拡散したＰＭＬタンパク質は、ＮＰ−４０、オクチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、ＭＥＧＡ−１０（デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、Ｂｒｉｊ−３５、Ｂｒｉｊ−５６、Ｂｒｉｊ−５８、Ｂｒｉｊ−７６、Ｂｒｉｊ−９６、Ｂｒｉｊ−９８、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１６５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１、Ｓｐａｎ２０、Ｓｔｅｒｏｘ  ６７−Ｋ、Ｌｕｂｒｏｌ  ＷＸ、スクロースモノヘキサン酸エステル、スクロースモノラウリン酸エステル、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、Ｔｗｅｅｎ  ８０などの非イオン性界面活性剤を含む溶出バッファーで可溶化処理し、その後、可溶化したＰＭＬタンパク質量を蛍光光度計で測定する。測定値を比較することで前初期遺伝子産物の発現の有無を迅速に検出することができる。この方法を用いることにより、ＨＣＭＶ感染を検出することができる。または細胞内に存在する非可溶性ＰＭＬタンパク質の残存量を測定することにより、同様にしてＨＣＭＶ感染を検出することもできる。
【００２９】
ＰＭＬタンパク質の核内からの消失は、例えば蛍光標識したＰＭＬタンパク質を直接測定することでモニターできる。この方法を用いることにより、ＨＳＶ−１感染を検出することが可能である。
【００３０】
さらに、ウイルスサンプルの代わりに、ウイルスと試料との混合液を接種するかまたはあらかじめ試料で処理した細胞にウイルスを接種した後、非イオン性界面活性剤で可溶化処理し、可溶性ＰＭＬタンパク質量または細胞内に存在する非可溶性ＰＭＬタンパク質の残存量を測定することで、試料の感染阻害率を算出することができる。ここで、試料とはヘルペスウイルス感染阻害候補物質または感染阻害薬等を意味する。試料の例としては、抗ウイルス剤、中和抗体、ウイルスの細胞への吸着阻害剤、ウイルスの核移行阻害剤を挙げることができる。この方法を用いることにより、感染阻害候補物質のスクリーニングや感染阻害薬の感受性検査が可能となる。また、可溶化処理をせずに直接ＰＭＬボディの特異的形態変化を確認することにより、感染阻害候補物質のスクリーニングや感染阻害薬の感受性検査をすることも可能である。
【００３１】
感染用ウイルスサンプルは実験室用分離株でも臨床分離株でもよく、目的及び検出方法により適宜選択される。また、尿、血液、血液由来細胞、生検材料など、ウイルスが含まれる可能性のある生体由来材料を用いることもできる。また、本発明の検出方法は、組換えウイルスを必要としないという特徴から、ヒトへルペスウイルスの臨床分離株だけでなく、ヒト以外を宿主とするヘルペスウイルスにも応用可能である。
【００３２】
以下、ＧＦＰ−ＰＭＬ融合タンパク質を発現する細胞にＨＣＭＶを感染させた場合についてさらに具体的に説明する。
【００３３】
本発明の細胞株をプレートに蒔き、ＨＣＭＶサンプルを接種させる。一定時間培養後、ＩＥ１タンパク質の発現によりＰＭＬボディの形態学的変化を生じさせる。細胞数（細胞／ウェル）は５×１０３〜４×１０５、好ましくは１×１０４〜２×１０５、より好ましくは５×１０４〜１×１０５で行う。培養時間は２〜９６時間、好ましくは１０〜２４時間である。
【００３４】
その後、定量的解析（以下、「Ｓｕｐ法」という。）を行う場合には、例えばＮＰ−４０溶出バッファー（ＮＥＢ）を加え、ＩＥ１タンパク質の発現により核内に拡散したＧＦＰ−ＰＭＬを可溶化する。ＮＰ−４０の濃度は０．５〜０．０３％、好ましくは０．２〜０．０５％、より好ましくは０．１〜０．１５％で行う。ＮＥＢのｐＨは７．０〜８．０、好ましくは７．５である。塩濃度は１０〜１５０ｍＭ、好ましくは１５０ｍＭで使用する。また、溶出温度は４〜３７℃、好ましくは４〜２０℃、より好ましくは４℃である。溶出時間は１〜２５分、好ましくは５〜２０分、より好ましくは１０〜１５分で行う。次にＮＥＢを回収し、可溶化したＧＦＰ−ＰＭＬ量を蛍光光度計で測定する。この方法を用いることにより、非イオン性界面活性剤で感染細胞に対し可溶化処理する工程のみでヘルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を簡便に、精度よく定量的に検出することができる。
【００３５】
またもう１つの定量的解析法としてＤｉｓｈ法が挙げられる。Ｄｉｓｈ法を行う場合は、ＩＥ１タンパク質の発現により核内に拡散したＧＦＰ−ＰＭＬをＮＥＢで溶出・除去し、プレート上の細胞中に残存した非可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量を蛍光光度計で測定する。ＧＦＰ−ＰＭＬの溶出条件はＳｕｐ法と同様である。この方法は、免疫学的手法を必要とすることなく、感染細胞を蛍光顕微鏡で観察するのみで経時的にヘルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を追跡可能である。したがって、免疫学的手法に伴う非特異的反応を除外することができ、確実な判定をすることができる。
【００３６】
Ｓｕｐ法およびＤｉｓｈ法は共に優れた定量的解析法として、同様の用途で使用することができる。Ｓｕｐ法およびＤｉｓｈ法の実験室レベルにおける用途の具体例として以下の例が挙げられる。種々の抗体で前処理したＴＨ／３３細胞にＨＣＭＶを感染させ、ＮＥＢ処理を行い、溶出した可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量、あるいは非可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量をそれぞれ測定し、得られた測定値から感染効率を算出する。これらの方法を用いてＨＣＭＶ感染を阻害する抗体をスクリーニングすることにより、ＨＣＭＶ感染における新規受容体が迅速かつ簡便に検索できる。また臨床レベルの用途の具体例としては、次の例が挙げられる。治療に用いる薬剤あるいは治療の候補となる薬剤でＴＨ／３３細胞を処理し、臨床分離株を感染させる。あるいは臨床分離株を同様の薬剤で処理し、ＴＨ／３３細胞に感染させる。そしてＳｕｐ法またはＤｉｓｈ法を用いて各薬剤の阻害作用を定量的に検出することで、臨床分離株の各々の薬剤に対する感受性を定量的に比較することが可能となる。
【００３７】
また、上述のようにＰＭＬボディの形態は感染前後で明らかに異なるため、ＮＥＢで溶出操作を行うことなく画像解析により定量解析することも可能である。前述の感染細胞及び非感染細胞を蛍光顕微鏡で観察し、蛍光顕微鏡画像解析システム等を用いて観察した画像を記録する。画像の記録方法は特に限定されるものではない。記録した画像を画像解析ソフトを用いて解析する。画像解析ソフトの例としては、ＮＩＨ ｉｍａｇｅ、Ｗｉｎ  Ｒｏｏｆ（三谷商事）、Ｌｕｍｉｎａ  Ｖｉｓｉｏｎ（三谷商事）、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、Ｍａｃ Ｓｃｏｐｅ（三谷商事）、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ、ＩｍａｇｅＪなどが挙げられるが、ある一定以上あるいは以下の大きさのドットのみの面積またはドット数を測定できるものであればいかなるソフトを用いてもよい。例えばＮＩＨ ｉｍａｇｅを用いる場合は、閾値（threshold）を設定して一定面積に存在する感染細胞数あるいは非感染細胞数を定量的に検出することが可能である。界面活性剤で溶出操作を行うことなく感染あるいは非感染細胞数をカウントできるため、非常に簡便かつ精度よく定量的に検出することができる。従ってＳｕｐ法、Ｄｉｓｈ法と同様に、画像解析法も感染細胞の検出や、新規抗ウイルス剤開発におけるスクリーニング法、臨床分離株の薬剤感受性検査に非常に有用である。
【００３８】
本発明の細胞株は持続的にＧＦＰ−ＰＭＬタンパク質を発現するため、上記方法によりウイルス感染細胞数を定量的に解析することができ、ヘルペスウイルス感染モニタリング、特にＨＣＭＶ感染モニタリングに有用な検査法を提供することができる。
【００３９】
ＴＨＰ−１細胞においてＨＣＭＶを効率的に感染させるには、ＴＰＡなどのホルボールエステル刺激が有効である事が報告されている（Weinshenker, B.G., Wilton, S.及びRice, G.P., 1988, J. Immunol., 140: 1625-1631）。したがって、ＴＨＰ−１細胞にＨＣＭＶサンプルを接種させる場合は、細胞をＴＰＡなどのホルボールエステルで刺激した後、ＴＳＡを添加した培地で培養し、被検試料を接種する。
【００４０】
本発明の細胞株は、ヘルペスウイルスに対して感染感受性を有するだけでなく、感染許容性も有する細胞株であるため、子孫ウイルスの複製が可能である。したがって、ヘルペスウイルスを含む可能性のある尿、血液等の生体試料を細胞に接種した後、さらに培養を継続すれば、生体試料に含まれるウイルスを分離する事が可能である。分離したウイルスは、薬剤感受性試験その他に使用可能である。
【００４１】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４２】
ＧＦＰ−ＰＭＬタンパク質を発現したＴＨＰ−１細胞株（ＴＨ／３３細胞）の樹立
ＴＹ１細胞由来の１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりＰＭＬ遺伝子を増幅し、ｐＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に挿入連結してプラスミドｐＥＧＦＰ−ＰＭＬを得た（特開２００５−３１２４０９号公報を参照）。ＧＦＰ−ＰＭＬ融合タンパク質をＴＨＰ−１細胞中で産生させるため、以下のようしてＴＨＰ−１細胞へ遺伝子を導入した。ＴＨＰ−１細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地中、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養し、遠心して５×１０６個の細胞を集め、ＰＢＳで洗浄後、１ｍｌのＰＢＳ中に懸濁させた。１０μｇのｐＥＧＦＰ−ＰＭＬを２０μｌ  ＰＢＳに溶解し、細胞懸濁液に加えてよく混和した。細胞懸濁液をエレクトロポレーション用０．４ｃｍキュベットに移し、氷上で１０分間静置した後、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、９８０μＦ  ｃａｐａｃｉｔｏｒ、ｖｏｌｔａｇｅ  ｆｉｅｌｄ  ３００Ｖ／ｃｍ、ｐｕｌｓｅ  ｔｉｍｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  １０ｍｓｅｃの条件でエレクトロポレーションを行った。処理後の細胞に１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地１０ｍｌを添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で３０時間培養した。その後、４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８存在下で２日ごとに培地を交換し、１０日間培養後に、Ｇ４１８耐性細胞株を限外希釈法によりクローニングし、ＧＦＰ−ＰＭＬを安定に発現する細胞株ＴＨ／３３細胞を樹立した（受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９５３、受託日：２００６年７月７日）。
【００４３】
ＴＨ／３３細胞の核内でＧＦＰ−ＰＭＬがＰＭＬボディを形成するかどうかを、共焦点レーザー顕微鏡を用いて調べたところ、図１（ａ）に示すとおり、ＰＭＬボディを形成することを確認した。
【実施例２】
【００４４】
ＴＨ／３３細胞へのＨＣＭＶ感染とＰＭＬボディの変化
ＴＨＰ−１細胞においてＨＣＭＶを効率的に感染させるにはＴＰＡなどのホルボールエステル刺激が有効である事が報告されている（Weinshenker, B.G., Wilton, S.及びRice, G.P., 1988, J. Immunol., 140: 1625-1631）。ＴＰＡ刺激のあとにＴＳＡ（Ｔｒｉｃｏｓｔａｔｉｎ  Ａ）処理を続けて行うと更に感度よく感染を検出できる事が判明したので以下のような手順で感染実験を行った。
【００４５】
実施例１で樹立したＴＨ／３３細胞（１．０×１０５個）に対してＴＰＡを終濃度５０ｎｇ／ｍｌとなるように加え、１２ウェルプレート中で培養した。プレートは、刺激後の細胞が培養プレート表面に接着しやすくするために、ファイブロネクチン溶液（５μｇ／ｍｌ  ｉｎ  ＰＢＳ）で予め処理した。１６時間培養後に培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、ＴＳＡ（終濃度５μＭ）を添加した１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４時間培養した。ＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−９７７）をｍ．ｏ．ｉ．１になるように各ウェルに加え、３７℃で６０分間インキュベーションした。その後１００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む５％ＦＢＳ−Ｆ１２／ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）５００μｌを加え、３７℃で１８時間インキュベーションした。
【００４６】
蛍光顕微鏡を用いて細胞の観察を行ったところ、図１（ｂ）に示すとおり、感染によりＰＭＬボディが破壊されてＰＭＬタンパク質が核内全体へ拡散し、ドットが大きくなる様子が観察され、ＨＣＭＶ感染細胞が容易に判定された。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の方法を用いることにより、簡便で迅速かつ定量的にヘルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を検出し、ウイルス感染価、中和抗体価、感染阻害率を算出することができる。さらに、本発明の検出方法は組換えウイルスを必要としないため、ヒトへルペスウイルスの臨床分離株、ヒト以外を宿主とするヘルペスウイルスにも応用可能であり、感染阻害物質のスクリーニングや感受性検査にも用いることができる。さらに、本発明の方法は、活発に活動中のウイルスのみを検出するため、病態との相関性の高い指標となり、臓器移植、骨髄移植などの易感染性者のヘルペスウイルス感染モニタリングに有用な検査法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】（ａ）はＴＨ／３３細胞におけるＰＭＬボディの形成を示す。（ｂ）はＴＨ／３３細胞にＨＣＭＶを感染させた後のＰＭＬボディの形態変化を示す。
【図１】
2008017811.tif 000002
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月11日(2006.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
へルペスウイルスに対して感染感受性及び感染許容性を有し、かつ
標識されたＰＭＬボディ構成タンパク質を発現する細胞株。
【請求項２】
標識されたＰＭＬボディ構成タンパク質が刺激により発現する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
標識が蛍光標識である、請求項１又は２に記載の細胞株。
【請求項４】
ＰＭＬボディ構成タンパク質がＰＭＬタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項５】
ウイルス分離が可能である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項６】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５３で表される細胞株。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞株にヘルペスウイルスを感染させ、ＰＭＬボディの特異的形態変化を示す細胞を解析することを含む、ヘルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を検出する方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞株にヘルペスウイルスを含む可能性のある生体試料を接種し、ＰＭＬボディの特異的形態変化を示す細胞を解析することを含む、ヘルペスウイルス感染モニタリング方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞株にヘルペスウイルスを含む可能性のある生体試料を接種し、接種した細胞を培養し、培養細胞から子孫ウイルスを回収することを含む、ウイルス分離方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞株に、ヘルペスウイルスと試料を接種し、ＰＭＬボディの特異的形態変化を示す細胞を解析することを含む、感染阻害物質のスクリーニング方法または薬剤感受性検査方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
また、本発明は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５３で表される細胞株を提供するものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明の細胞株は、ヘルペスウイルスに対して感染感受性を有し、かつ子孫ウイルスの複製が可能な感染許容性を有する細胞株である。「感染感受性を有する」とは、ウイルス粒子の細胞への吸着から前初期遺伝子産物の翻訳までに求められる宿主細胞の様々な機能が欠如していない細胞を意味する。「感染許容性を有する」とは、子孫ウイルスが増殖するまでの全てのウイルス感染複製過程が滞りなく終了するために求められる宿主細胞の様々な機能が欠如していない細胞を意味する。したがって、本発明の細胞株にヘルペスウイルスを接種すると、前初期遺伝子抗原が十分発現するとともに、試料由来の子孫ウイルスを得る事が可能である。本発明の細胞株の例として、ヒト急性単球性白血病由来のＴＨＰ／３３（実施例１参照）を挙げることができる（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５３、寄託日：２００６年７月７日）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
ＧＦＰ−ＰＭＬタンパク質を発現したＴＨＰ−１細胞株（ＴＨ／３３細胞）の樹立
ＴＹ１細胞由来の１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりＰＭＬ遺伝子を増幅し、ｐＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に挿入連結してプラスミドｐＥＧＦＰ−ＰＭＬを得た（特開２００５−３１２４０９号公報を参照）。ＧＦＰ−ＰＭＬ融合タンパク質をＴＨＰ−１細胞中で産生させるため、以下のようしてＴＨＰ−１細胞へ遺伝子を導入した。ＴＨＰ−１細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地中、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養し、遠心して５×１０６個の細胞を集め、ＰＢＳで洗浄後、１ｍｌのＰＢＳ中に懸濁させた。１０μｇのｐＥＧＦＰ−ＰＭＬを２０μｌ  ＰＢＳに溶解し、細胞懸濁液に加えてよく混和した。細胞懸濁液をエレクトロポレーション用０．４ｃｍキュベットに移し、氷上で１０分間静置した後、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、９８０μＦ  ｃａｐａｃｉｔｏｒ、ｖｏｌｔａｇｅ  ｆｉｅｌｄ  ３００Ｖ／ｃｍ、ｐｕｌｓｅ  ｔｉｍｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  １０ｍｓｅｃの条件でエレクトロポレーションを行った。処理後の細胞に１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地１０ｍｌを添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で３０時間培養した。その後、４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８存在下で２日ごとに培地を交換し、１０日間培養後に、Ｇ４１８耐性細胞株を限外希釈法によりクローニングし、ＧＦＰ−ＰＭＬを安定に発現する細胞株ＴＨ／３３細胞を樹立した（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５３、寄託日：２００６年７月７日）。