(57)【要約】      （修正有）【課題】化学的または微生物的個体単位についてその捕捉、認識、検出、同定または定量化に使用する核酸類縁体の提供。【解決手段】（ａ）主鎖に沿ったそれぞれ空間を置いた異なる位置において複数のリガンドを有するポリアミド主鎖から構成されるＰＮＡにおいて、前記リガンドは各々前記主鎖の窒素原子に直接または間接に結合され、かつ前記リガンドが４つから８つまでの介在する原子によって前記主鎖のなかで相互に分離された窒素原子を有するものである、ＰＮＡ、（ｂ）相補的配列の核酸とハイブリッド形成して、公知のデオキシリボヌクレオチドと前記核酸との間で形成されたハイブリッドよりも熱による変性に対する安定性がより高いハイブリッドを形成する能力を有する核酸類縁体；または（ｃ）一本鎖が前記類縁体に相補的である配列を有する二重鎖核酸とハイブリッド形成し一本鎖からもう一方の鎖を置換せしめる能力を有する核酸類縁体。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断薬の分野において、例えば一つまたはそれ以上の化学的または微生物学的個体単位についてその捕捉、認識、検出、同定または定量化などを行うために幾つかの核酸類縁体を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴジオキシリボヌクレオチド（オリゴ−ＤＮＡ類）は、診断薬の手法においてますます頻繁に用いられおり、例えば、特異的な微生物の確認を行う試験、例えば疾病など一般的な素因を確認するための試験、法医学分野および微生物学全般などにおいて用いられている。このような分野におけるオリゴ−ＤＮＡ類の用途は、当然のことながら、かかるオリゴ−ＤＮＡ類が相補的核酸の塩基配列とハイブリドを形成することができる能力に依拠している。例として挙げれば、標識したオリゴ−ＤＮＡプロ−ブは、固定化した標的ＤＮＡ類を探索して特異的な塩基配列の存在を確認するためのハイブリダイゼ−ション測定法に用いられている。増幅操作法においては、オリゴ−ＤＮＡ類の有するこのようなハイブリダイゼ−ション特性を利用して、増幅するべき鋳型分子にオリゴ−ＤＮＡプライマ−をハイブリッドさせているのである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
長さが１００塩基対に達するオリゴ−ＤＮＡ類は現在、固体支持体法を用いて合成されており、完全自動合成装置が幾つか市販されている。しかしながら、これまで注目が払われてきたのは、塩基配列に特異的に天然ＤＮＡとハイブリド形成しながら、なおＤＮＡそれ自体とは有利に異なる化学的特性を有する能力がある合成ＤＮＡ類縁体を構築・構成することが出来るか否かということであった。このような研究は大半は、”アンチセンス”治療薬にこのような化合物が用いる可能性があるのではないかという動機の基づいているのであるが、この場合従来のオリゴ−ＤＮＡ類を使用すると幾つかの困難が伴うのである。その理由は、このような非修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレア−ゼが天然に存在するため生体内（インビボ）で半減期が短く、また量の多少を問わず製造コストが高くしかも細胞膜透過性能が劣るからである。
【０００４】
例えば、国際特許出願（ＰＣＴ）ＷＯ８６／０５１８号において、おそらくは天然の核酸と塩基配列に特異的にハイブリダイゼ−ションする能力を有するリガンドの、典型的にはヌクレオチド塩基の配列を有する主鎖を持ったＤＮＡ類縁体が開示されており、また主鎖として、異なったものが数多く開示されている。このような化合物を提供する方法について、具体的な例示は一切示されておらず、請求されている化合物のＤＮＡに対する親和性を示すデ−タも一切ない。国際特許出願（ＰＣＴ）ＷＯ８６／０５５１９号は、同種のＤＮＡ類縁体から成る診断薬試薬および診断薬システムを特許請求しているが、やはりここでも具体的な例示は全くない。
【０００５】
国際特許出願（ＰＣＴ）ＷＯ８９／１２０６０号においては、合成の原料たる種々の構成単位に基づいたオリゴヌクレオチド類縁体が記載されている。このような構成単位の例示はなされているが、これら構成単位からオリゴヌクレオチド類縁体を現実に製造する実施例は全くなく、従ってこのような類縁体の有する性能について明示も一切されていない。
【０００６】
更には、ヌクレア−ゼに対する抵抗性を高めかつアンチセンセンス治療方法に用いるＤＮＡの安定性を全般的に改良する目的で、ＤＮＡ主鎖を修飾することが知られている。またＤＮＡ類縁体を設計する別の試みも幾つか、上記したＷＯ８６／０５５１８の導入部において議論されている。
【０００７】
一般的な経験としては、天然ＤＮＡの主鎖を修飾すると、修飾されたオリゴヌクレオチドとその相補的である通常のオリゴヌクレオチドとの間において形成されるハイブリッドの安定性は、Ｔｍ値の測定によって求めた場合低下する、ということであった。従って、この領域における従来の知恵は、主鎖を種々に修飾すると、必ずハイブリッドが不安定になる、即ちＴｍ値が低下することになるということであり、従って、実現可能な最良の結果としてＴｍ値を若干低下させたハイブリッドを得るために、このような修飾は出来るだけ少なくするべきであるということである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、好ましくは、相補的配列の従来公知の核酸とハイブリッドを形成し、而もそのハイブリッドのＴｍ値における安定性を相当する配列を持つ従来公知の核酸が形成するハイブリッドよりも高くするような特性および／または相当する配列を持つ前記従来公知の相当する核酸よりも不適合の程度に関与する配列と比較した相補的配列に対する選択性をより大きくする特性といった、従来知られていない特性を有する新規な構造の核酸類縁体及びを診断薬または分析にかかる核酸類縁体を使用する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、一つまたはそれ以上の化学的または微生物学的個体単位についてその捕捉、認識、検出、同定または定量化を行うために使用する核酸類縁体であって、かかる類縁体が以下であるものを提供する：即ち、（ａ）主鎖に沿ったそれぞれ空間を置いた異なる位置において複数のリガンドを有するポリアミド主鎖から構成されるペプチド核酸（ＰＮＡ）において、前記リガンドがそれぞれ独立して天然の核酸塩基、非天然の核酸塩基または核酸塩基結合基であり、前記リガンドは各々前記主鎖の窒素原子に直接または間接に結合せしめられ、かつ前記リガンドが４つから８つまでの介在する原子によって前記主鎖のなかで相互に分離された窒素原子を有するものである、前記ペプチド核酸（ＰＮＡ）、（ｂ）核酸類縁体であって、相補的配列の核酸とハイブリッド形成して、前記類縁体に相当する従来公知のデオキシリボヌクレオチドと前記核酸との間で形成されたハイブリッドよりも熱による変性に対する安定性がより高いハイブリッドを形成する能力を有する前記核酸類縁体；または（ｃ）核酸類縁体であって、一本鎖が前記類縁体に相補的である配列を有する二重鎖核酸とハイブリッド形成して、かくして前記一本鎖からもう一方の鎖を置換せしめる能力を有する前記核酸類縁体。
【００１０】
上記第（ａ）項において定義された核酸類縁体（ＰＮＡ類）の主鎖に原子を有する該窒素の分離は、好ましくは五つの原子によって行われるのが好ましい。式（Ｉ）（下記）を有する核酸類縁体において、かかる分離によって、ＤＮＡに対する親和性が最も強くなることが見出されたのである。しかしながら、一つまたはそれ以上のリガンドを最適以下の間隔で間に入れることによって、即ち５つ以上の原子の間隔、例えば１４個までの原子おいて間に入れることによって、該ＰＮＡ類とＤＮＡとの間の結合力を減少させるのが所望される場合もある。リガンド間の間隔の２５％以下が６個の原子またはそれ以上であるのが好ましい。更に好ましくは、リガンド間の間隔の１０ないし１５％以下が、６個の原子またはそれ以上である。該リガンドを有する（直接または結合基を介して）アザ窒素原子はそれ自体は、上記した間隔においてカウントしない。
【００１１】
ＤＮＡ結合力を減少させる別の方法またはもう一つの方法は、このようなリガンドの内幾つかを除外し、その代わりに例えば水素のようなＤＮＡの結合に殆どまたは全く寄与しない原子部を導入することである。好ましくは、このようなリガンド位置の２５％以下は、例えば１０から２５％以下が非結合性原子部によって占められる。
【００１２】
典型的なリガンドとしては、四つの主要天然ＤＮＡ塩基（即ち、チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン）またはその他の天然の核酸塩基（例えば、イノシン、ウラシル、５−メチルシトシンまたはチオウラシル）または適当な結合基を介してペプチド主鎖に結合された人工の塩基類（例えば、ブロモウラシル、アザアデニン類またはアザグアニン類など）が挙げられる。
【００１３】
好ましい実施態様において、本発明において使用される核酸類縁体は、以下の一般式（Ｉ）を有する：
【００１４】
（化Ｉ）
【化１】
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【００１５】
なお上式において：ｎは、少なくとも２である、Ｌ1−Ｌnのそれぞれは独立して、水素、ヒドロキシ、（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル、天然の核酸塩基類、非天然の核酸塩基類、芳香族原子残基、ＤＮＡ挿入基、核酸塩基結合基およびリポ−タリガンドから構成される群から選択されるが、Ｌ1−Ｌnの内の少なくとも一つは、天然の核酸塩基、非天然の核酸塩基、ＤＮＡ挿入基または核酸塩基結合基である；Ａ1−Ａnのそれぞれは、一重結合、メチレン基または下記式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される基である：
【００１６】
（化ＩＩａ）
【化２ａ】
2008253251.tif 000004
又は
【００１７】
（化ＩＩｂ）
【化２ｂ】
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【００１８】
なお本式において；Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ3、ＣＨ2またはＣ（ＣＨ3）2である；Ｙは、一重結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ4である；ｐおよびｑのそれぞれは、１から５までの整数であり、ｐ＋ｑの和は、１０以下である；ｒおよびｓのそれぞれは、ゼロまたは１から５までの整数であり、ｒ＋ｓの和は、１０以下である；Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシもしくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンから構成される群から選択される；またＲ3およびＲ4のそれぞれは独立して、水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、ヒドロキシもしくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換された（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよびアミノから構成される群から選択される；Ｂ1−Ｂnのそれぞれは、ＮまたはＲ3Ｎ+であり、ここにおいてＲ3は上記において定義された通りである；Ｃ1−Ｃnのそれぞれは、ＣＲ6Ｒ7、ＣＨＲ6ＣＨＲ7またはＣＲ6Ｒ7ＣＨ2であり、ここにおいてＲ6は、水素でありまたＲ7は、天然のアルファアミノ酸の側鎖から構成される群から選択され、またはＲ6およびＲ7は独立して、水素、（Ｃ2−Ｃ6）アルキル、アリ−ル、アラルキル、ヘテロアリ−ル、ヒドロキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ＮＲ3Ｒ4およびＳＲ5から構成される群から選択されるが、ここにおいてＲ3およびＲ4は、上記において定義された通りであり、Ｒ5は、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ヒドロキシもしくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換された（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり、またはＲ6およびＲ7とは一緒になって、脂環系または異項環系を形成する；Ｄ1−Ｄnのそれぞれは、ＣＲ6Ｒ7、ＣＨ2ＣＲ6Ｒ7またはＣＨＲ6ＣＨＲ7であり、ここにおいてＲ6およびＲ7は、上記において定義された通りである；Ｇ1−Ｇn-1のそれぞれは、いずれかの方向での−ＣＯＮＲ3−、ＣＳＮＲ3−、−ＳＯＮＲ3−または−ＳＯ2ＮＲ3−であって、なおここにおいてＲ3は、上記において定義した通りである；Ｑは、−ＣＯ2Ｈ、−ＣＯＮＲ'Ｒ"、−ＳＯ3Ｈもしくは−ＳＯ2ＮＲ'Ｒ"または−ＣＯ2Ｈもしくは−ＳＯ3Ｈの活性化誘導体である；またＩは、−ＮＨＲ"'Ｒ""または−ＮＲ"'Ｃ（Ｏ）Ｒ""であり、ここにおいてＲ'、Ｒ"、Ｒ'"およびＲ""は独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、リポ−タリガンド、挿入基、キレ−ト化剤、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌクレオチドならびに可溶および不溶のポリマ−から構成される群から選択されるものであって、何れも一つの検出可能な標識を含んで成るか又は該標識に共役複合せしめられたものであるＬ1
【００１９】
好ましいペプチド核酸は、以下の一般式（ＩＩＩ）を有する：
【００２０】
（化ＩＩＩ）
【化３】
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【００２１】
なお本式において：Ｌはそれぞれ独立して、水素、フェニル、天然の核酸塩基および非天然の核酸塩基から構成される群から選択される；Ｒ7'は、水素および天然のアルファアミノ酸の側鎖から構成される群から選択される；ｎは、１から６０までの整数である；ｋおよびｍのそれぞれは独立して、ゼロまたは１である；またｌは独立して、ゼロから５である；Ｒhは、ＯＨ、ＮＨ2または−ＮＨＬｙｓＮＨ2である；およびＲiは、ＨまたはＣＯＣＨ3であって、何れも一つの検出可能な標識を含んで成るか又は該標識に共役複合せしめられたものである．
【００２２】
特に好ましいのは、式（ＩＩＩ）においてＬが独立して、核酸塩基であるチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）とから成る群から選択され、特にチミンであり、またｎが１から３０までの整数であり、特に４から２０までの整数である化合物である。このような化合物の一例は第１図に示してあるが、この図によれば、かかる化合物と一本鎖ＤＮＡとの間の構造上の類似性が明らかである。
【００２３】
本発明のペプチド核酸類は、溶液中または固相上の何れかで標準ペプチド合成方法を採用して合成してもよい。用いたこれらのシントンは、特別に設計したモノマ−アミノ酸またはそれらの活性化誘導体であって、標準的な保護基で保護されたものであればよい。このようなオリゴヌクレオチド類縁体はまた、相当する二酸とジアミンを用いることによって合成することもできる。
【００２４】
即ち、本発明に使用する化合物を得るために用いたモノマ−シントンは、以下の一般式（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）でそれぞれ表されるアミノ酸、二酸およびジアミンから成る群から選択されてもよい。
【００２５】
（化（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ））
【化４】
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【００２６】
なお本式においてＬ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、上記のいて定義した通りである。但し、本式におけるアミノ基は全て、アミノ保護基によって保護されていてもよい；Ｅは、ＣＯＯＨ、ＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ2ＯＨまたはこれらの活性化された誘導体であればよい；およびＦは、ＮＨＲ3またはＮＰｇＲ3であり、ここにおいてＲ3は上記において定義された通りであり、Ｐｇはアミノ保護基である。
【００２７】
好ましいモノマ−シントンは、以下の式（ＶＩＩ）を有するアミノ酸である：
【００２８】
（化ＶＩＩ）
【化７】
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【００２９】
またはアミノ−保護酸および／またはこれらの末端活性化誘導体であるが、ここにおいてＬは、水素、フェニル、異項環、天然の核酸塩基、非天然の核酸塩基およびこれらの保護された誘導体から成る群から選択される；およびＲ7は独立して、水素および天然のアルファアミノ酸の側鎖から成る群から選択される。特に好ましいのは、式（４）においてＲ7'が水素でありかつＬは核酸塩基であるチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）ならびにこれらの保護された誘導体から成る群から選択されるシントンである。
【００３０】
本発明に従えば、一つまたはそれ以上の化学的または微生物学的個体単位についてその捕捉、認識、検出、同定または定量化などを行うために上記において定義された核酸類縁体を使用することが包含される。検出されるかかる個体単位としては先ず第一に、核酸でありかつ前記固体単位はハイブリダイゼ−ションによってその特異的な核酸塩基配列を経由して検出されることが、通常は意図される。
【００３１】
前記において定義された核酸類縁体は、固体支持体に固定化された本発明において用いられる核酸類縁体にハイブリッド形成条件下で核酸に接触せしめることから成る核酸を捕捉する方法において、該固定化核酸類縁体が、補足されるべき前記核酸または核酸類縁体とハイブリッド形成に適したリガンドの配列を有している前記核酸捕捉方法に使用してもよい。
【００３２】
該固体支持体は、親和性捕捉に使用する従来公知のオリゴヌクレオチドを固定化することに関連して公知である種々の形態を取ってもよい。固体支持体は例えば、プレ−ト、フィルタ−、マルチウェルプレ−トまたはディップスティックであればよく、またビ−ズのような個別の粒子の形状を取ってもよく、かかる粒子はカラムに保持し、次いで核酸を含有する溶液をこのカラムに流して所望の種を溶液から捕捉させればよい。
【００３３】
捕捉された核酸は、極めて多くの方法によって認識され、検出され、同定されまたは定量化されることが出来る。洗浄後はかかる捕捉された核酸は系内に残留する唯一の核酸であり得るので、捕捉された配列に特異的か否かを問わず、核酸の存在を証明するのに適した試薬系であれば如何なるものによっても検出され得る。即ち、例として挙げれば、捕捉された核酸がＤＮＡでありかつ比較的短いＰＮＡによって一本鎖の形態で捕捉された場合、懸垂状態の一重鎖ＤＮＡは、ヌクレア−ゼによって消化してもよく、かつこのような消化物は通常の方法に依って検出すればよい。このＤＮＡが二本鎖でありかつ該ＰＮＡが再び比較的短い場合は、該ＤＮＡのうち当初の二本鎖の形態で残留している（即ち、ＰＮＡによって変位・置換されていない）部分は、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重らせんには結合しない通常のＤＮＡ挿入基によって検出することが出来る。核酸を認識する抗体を、固定化した核酸類縁体に結合せしめた核酸（ＲＮＡ、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ）を検出するために使用してもよい。
【００３４】
固体支持体に固定化した通常のオリゴヌクレオチドを用いて核酸種のアフィニティ−（親和性）捕捉を行うに際しては、標的核酸を生成することが通常は必要である。試料中に含まれてもよいヌクレア−ゼは、固定化した核酸を攻撃する傾向がある。実際においては、非特異性が極めて高い結合を用いると、特定な結合は殆ど得られない。更には、当該捕捉が生起しないうちに、かかるＤＮＡを一本鎖にまで編変性せることが必要である。
【００３５】
上記式Ｉの核酸類縁体は、ヌクレア−ゼの攻撃を受けにくく、典型的には相補的配列の核酸に対する親和性が高いため、固定化した種として通常のオリゴヌクレオチドを用いて得た場合よりもより高度の特異的結合を与えるのである。更には、本発明に従って使用された核酸類縁体は定型的には、相補的配列の核酸とハイブリッドを形成する能力を有しているが、かかる核酸を先ず一本鎖に変性せしめることはない。一旦標的核酸が捕捉されると、固定化された核酸類縁体および捕捉された核酸を例えば加熱とジメチルホルムアミドなどのような脱ハイブリダイゼ−ションの条件に供することによって、固定化された核酸類縁体から開放・放出させればよい。
【００３６】
例として挙げれば、かかる固定化した核酸類縁体は、ｍＲＮＡのポリＡ尾部とハイブリッド形成可能であってかくして当該ｍＲＮＡを捕捉する、例えばチミンなど連続リガンドから構成されていればよい。
【００３７】
本発明は、上記したような固定化した核酸類縁体から構成される親和性捕捉カラムを包含する。
【００３８】
すなわち、本発明はまた、固相生化学（例えば、”Ｓｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ− Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ”、 Ｗ．Ｈ． Ｓｃｏｕｔｅｎ編著、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３を参照）、特に固相バイオシステム、特にバイオアッセイまたは種々の固相技法であって、診断的検出／定量化または相補的核酸の親和性生成に関するもの（例えば、”ＡｆｆｎｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ− Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”、Ｐ．Ｄ．Ｇ． Ｄｅａｎ、Ｗ．Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｆ．Ａ．Ｍｉｄｄｌｅ編著、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ１９８６；”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ − Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”、Ｂ．Ｄ． Ｈａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、ＩＲＬＰｒｅｓｓ Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ １９８７を参照）に係ることが、理解可能であろう。かかるバイオアッセイまたは精製法を実行する今日的方法は、セルロ−ス、気孔率をコントロ−ルしたものを含むガラスビ−ズ（Ｍｉｚｕｔａｎｉ、ｅｔａｌ．。Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１９８６、３５６、２０２）ビ−ドにした固体支持体、”Ｓｅｐｈａｄｅｘ”、”Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ”、アガロ−ス、ポリアクリルアミド、多孔性粒状アルミナ、メタアクリル酸ヒドロキシアルキルエステルのゲル、ジオ−ル結合シリカ、多孔性セラミック、またはナイロンやニトロセルロ−スのフィルタ−ディスクなどの連続材料に物理的に吸着させたかまたは実質的に永久的な共有結合によるアンカリング結合を介して結合させた”通常の”または若干修飾したオリゴヌクレオチドを用いるのが殆ど専らである。一つの例において、ｍＲＮＡを含むポリＡテイルを親和性単離するためのセルロ−スビ−ズ上でオリゴ−ｄＴを化学的に合成することを用いている（”Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”におけるＧｉｌｈａｍ、Ｌ． ＧｒｏｓｓｍａｎｎおよびＫ． Ｍｏｌｄａｖｅ編著、２１巻、ｐａｒｔ Ｄ、ペ−ジ１９１、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ、１９７１）。上記した方法は全て、本発明の文脈において適用可能である。しかしながら、可能ならば、共有結合の方が、該当する分子の物理的吸着よりも好ましいのである。その理由は、後者の方法には、固定化した分子の内のいくつかがハイブリダイゼ−ションまたは親和性過程において洗い流され得る（脱着される）という欠点があるからである。すなわち、支持体材料の表面に吸着された種は、支持体が当該バイオアッセイ／精製方法の過程において供される種々の処理の間において失われるのであるが、そのような逸失の程度を制御することが殆ど出来ない。このような問題の重大さは勿論ことながら、吸着された種と”遊離状態の”種との間における平衡が確立する差異の速度に大幅に依存して変わるであろう。場合によっては、許容可能な精度および／または再現性をもって定量的なバイオアッセイを実施することは、実際上不可能であるかもしれない。このような支持体を体液、水性試薬または洗浄媒体で処理する過程において吸着された種が逸失することは、一般的にいえ��分子量が比較的低い種について最も深刻となることが期待されるであろう。オリゴヌクレオチドと比較して、ＰＮＡ分子は、強度に求核性および／または親電子性の中心を包含しているために固体支持体により付着し易いのである。更には、固体支持体の上においてオリゴヌクレオチドを直接的に組み立て・構築することは、固定化した分子をロ−ドするに際して極めてわずかしかロ−ド出来ないという欠点が生じるのである。その理由は主として、オリゴヌクレオチドを構築するためにの最高技術水準であるホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学の利用を可能ならしめる種々の物質・材料の表面性能・能力が低くなるためである（Ｂｅａｕｃａｇｅａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９８１、２２、１８５９；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５、２３２、２８１）。またこのようなことには、表面／ロ−ディング性能が高い固体支持体に適している別のフォスファイトトリエステル法を用いることによって（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒａｎｄ Ｍａｈａｄｅｖａｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９７６、９８、３６５５）、比較的短いオリゴヌクレオチドしか得ることが出来ないという事実が伴う。しかしながら、通常の固相ペプチド合成に関しては、後者の支持体は、固定化したＰＮＡ分子を構築するうえで優れた材料である（側鎖保護基は、このような鎖を固体支持体に保持するアンカ−リング結合を開裂させることなく、合成されたＰＮＡから除去することが可能である）。すなわち、ＰＮＡ種は、相補的核酸に対する結合親和性が極めて高いことに関して、上記した固相技法から利点を受け、また二重鎖構造で存在する核酸をさらにユニ−クに配列特異的に認識すること（およびかかる核酸に強力な結合すること）をからも利点を受けるのである。このようなＰＮＡ種はまた、大量に固体支持体にロ−ドすることが可能であり、かくして当該固相法の感度／能力を増大せしめることになる。更には、固相生化学でのＰＮＡの使用に関するいくつかの種類の研究が、最近報告された”光−指示された、空間的に取組可能な、平衡化学的合成”技術、すなわち固相化学と写真石版術とを組み合わせて実質的に同時に極めて多種の、但し同定可能で、永久的に固定化された化合物（例えばペプチド）を精製せしめる技法を利用することによって着手され、容易にされまたは大いに加速されることが可能である。
【００３９】
式ＩのＰＮＡ類は、以前では認められたことがなかった特性を示すことが見出されたのである。すなわち、かかる核酸類縁体が二本鎖の形態で存在する通常の核酸とハイブリッドを形成する能力を有しておりまたこのような条件下において、当該類縁体に相補的な配列を有する鎖とハイブリッドを形成しかつ当初の核酸二重らせんからもう一方の鎖を置換せしめる能力を有しているということである。このような認識は、塩基対として５−６０対の長さであるｄｓＤＮＡ配列に対して行い得るのである。塩基が１０と２０との間にある配列は、原核細胞および真核細胞のＤＮＡの独自配列が認められる範囲に相当するので、興味深いのである。１７−１８の塩基を認識する試薬は、ヒトゲノムにおける独自配列の長さに相当するので、特に興味の対象となる。
【００４０】
このようなハイブリダイゼ−ション反応を溶液中で行うと、該核酸類縁体の最初の鎖配と同じ配列を有する二番目の鎖もやはり、相補的配列を有する核酸鎖とハイブリッドを形成し、その結果ＰＮＡの二つの鎖が通常の核酸の単一鎖とハイブリッドせしめられている三重らせん構造を形成することが見出されたのである。この最初のＰＮＡ鎖が通常の型式の塩基間水素結合によってハイブリダイゼ−ションを行い、他方ではＰＮＡの二番目の鎖がＨｏｏｇｓｔｅｅｎの対合によって当初の二重らせんの主要な溝の中で受容されることが観察されている。ＰＮＡが固体支持体に固定化された場合、二本鎖核酸とのハイブリダイゼ−ションが、一本鎖がそれから置換・変位さするのを伴って観察されるが、三重らせん構造の形成は、該ＰＮＡの固定化によって阻止され得るのである。
【００４１】
本発明は、検出可能な標識を包含するかまたはこれと接合した上記において定義された核酸類縁体を包含する。目下のところ公知であるペプチド、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを標識化する方法は、一般的にＰＮＡ類にも適用され得る。すなわち、標識化の方法は、放射性同位元素標識、酵素標識、ビオチン、スピン標識、発蛍光団、化学発光標識、抗原標識または抗体標識を使用することからなるであろう。
【００４２】
上記した標識ＰＮＡ類は、標的核酸を認識し、検出しまたは定量化する方法において、充分相補的配列を有する上記において定義した標識核酸類縁体に前記標的をハイブリダイゼ−ションさせて、かくしてハイブリッドする条件においてハイブリダイゼ−ションを起こさせ、次いでこうして前記標的にハイブリッドさせた該核酸類縁体の前記標識を検出するかまたは定量化することから成る前記認識、検出または定量化方法に使用してもよい。
【００４３】
好ましくは、該標的は、該ハイブリダイゼ−ションを行う前に基質に固定化させてもよい。
【００４４】
このような方法において、このような標的は、該標的の第一の領域を前記第一の領域に充分相補的である配列を有しかつそれ自体前記基質に固定化されている捕捉核酸または核酸類縁体にハイブリダイゼ−ションさせて、かくしてハイブリッドさせることによって基質に固定化させてもよく、次いで標識核酸類縁体を該標的の第二の領域にハイブリッドさせればよい。
【００４５】
本発明に従った少なくとも好ましい核酸類縁体が、二本鎖標的核酸とハイブリッドしかつその一本の鎖を置換させることが出来る能力については、上記において記載した通りである。本発明は、核酸の二重らせんから一本鎖を置換する方法において、前記二重ラセンから一本鎖を置換することができる程充分な、前記二重らせんの内のもう一方の鎖に対する親和性を有する上記において定義した核酸類縁体を前記二重らせんにハイブリッドさせることから成る前記置換方法を包含する。
【００４６】
本発明は、前記において定義した置換核酸類縁体に相補的な配列を一方の鎖が有する二本鎖標的から他の一本鎖を置換する能力がある前記核酸類縁体を二本鎖標的にハイブリッドさせるに際して、前記置換核酸類縁体が、ハイブリダイゼ−ションさせるに充分な、前記二本鎖標的の内の前記もう一方の鎖に対する相補的配列を有しており、その結果一本鎖の形態における前記標的の前記一本鎖を置換するものであり、次いで前記二本鎖標的からの置換後に前記一本鎖の存在を検出しまたはこれを定量化することから成る、二本鎖標的核酸を検出し、同定しまたは定量化する方法を包含する。
【００４７】
このように置換された一本鎖を断片に破断し、次いで前記斑だの存在を検出してもよい。置換された一本鎖は好ましくは、ヌクレア−ゼによる作用によって破断させてもよい。すなわち、特異的な二本鎖標的核酸配列の存在の検出を、該標的核酸配列に相補的ＰＮＡをハイブリッドさせて鎖置換を行わしめ、かくして該反応混合物中において一本鎖ＤＮＡを生成せしめ、次いでヌクレア−ゼを用いて一本鎖ＤＮＡを消化させてヌクレオチド類を生成させることによって行うことが出来るが、この際かかるヌクレオチドの存在を、当該標的二本鎖ＤＮＡが当初に存在していたという指標・標識として検出することが可能である。
【００４８】
本発明は更には、上記において定義した核酸類縁体を少なくとも一種組み込んで成り、かつ好ましくはかかる核酸類縁体を標識化したものを少なくとも一種、例えば一つの標識ＰＮＡおよび前記標識を検出するのに使用する検出試薬を少なくとも一種とを含んで成る診断薬に使用出来るキットを包含する。
【００４９】
一般的にいって、かかる核酸類縁体は、ハイブリダイゼ−ション緩衝液として溶液状で提供される。このようなキットは通常は、洗浄緩衝溶液を少なくとも一種包含する。
【００５０】
該核酸類縁体を例えばビオチンで間接的に標識化した場合、当該キットは、酵素標識と該核酸類縁体の標識と結合する能力がある物質、例えばアビジンとの間の抱合体を含有して成るものであってもよい。
【００５１】
該核酸類縁体を直接的または間接的に酵素で標識化した場合は、該キットは、該酵素によって仲介されるモニタ−可能な反応を行うに適している該酵素の基質を包含して成るものであってもよい。
【００５２】
式Ｉで表されるＰＮＡ類およびその製造に用いたモノマ−シントンにおいて、リガンドＬは主として、自然界において見出される位置、すなわちアデニンまたはグアニンについては９位の位置またチミンまたはシトシンについては１位の位置に結合させた天然の核酸塩基である。その代わりに、これらリガンドＬの内のいくつかはそれぞれ、非天然の核酸塩基（核酸塩基類縁体）、他の塩基結合性原子部、芳香族原子部、（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル、ヒドロキシまたは水素であってもよい。いくつかの典型的な核酸塩基リガンドおよび具体的な合成リガンドは、第２図に示してある。更には、Ｌは、ＤＮＡ挿入基、例えば発蛍光団、ラジオ標識、スピン標識、ハプテンなどのリポ−タ−リガンド、またはビオチンなどのタンパク質認識リガンドであり得る。
【００５３】
モノマ−シントンにおいては、Ｌには、保護基を設けていてもよい。このことは、第４図に図示してあるが、本図においてＰｇ１は、酸、塩基または例えばｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−ニトロベンジル（２Ｎｂ）などの水素分解性もしくは光化学的に開裂可能な保護基である。
【００５４】
結合基Ａは、例えば−ＣＲ1Ｒ2ＣＯ−、−ＣＲ1Ｒ2ＣＳ、ＣＲ1Ｒ2Ｃｓｅ−、−ＣＲ1Ｒ2ＣＮＨＲ3−、−ＣＲ1Ｒ2Ｃ＝ＣＨや−ＣＲ1Ｒ2Ｃ＝Ｃ（ＣＨ3）2−、−なおＲ1 、Ｒ2およびＲ3は上記において定義した通りである−などの種々の基であり得る。Ａは、メチレンカルボニル（−ＣＨ2ＣＯ−）である。また、Ａは、プロパノイル、ブタノイルまたはペンタノイルなどのより長鎖の原子部またはそれに相当する誘導体であって、その酸素原子がその他のＸで表される原子で置換されるかまたはその原子鎖がＲ1Ｒ2で置換されるかＹを含む不均一であるものであってもよい。さらに、Ａは、（Ｃ2−Ｃ6）アルキレン鎖、Ｒ1Ｒ2で置換された（Ｃ2−Ｃ6）アルキレン鎖であってもよく、またはＹを含む不均一なものであってもよい。場合によっては、Ａは単に一重結合であればよい。
【００５５】
本発明の好ましい形態においては、Ｂは窒素原子であり、かくしてアキラル主鎖の可能性が生じる。ＢはまたＲ3Ｎ＋−本式においてＲ３は上記において定義した通りである−であってもよい。
【００５６】
本発明の好ましい形態においては、Ｃは−ＣＲ6Ｒ7−であるが、また二つの炭素単位、すなわち−ＣＨＲ6ＣＨＲ7−または−ＣＲ6ＣＲ7ＣＨ2−−本式において、Ｒ6およびＲ7は上記において定義された通りである−であってもよい。Ｒ6およびＲ7はまた、例えばピロ−ロリル、フリル、チオニル、イミダゾリル、ピリジル、ピリミジニル、インドリルなどのヘテロアリ−ル基であってもよく、または両者は共同して例えば１、２−シクロブタンジイル、１、２−シクロペンタンジイルまたは１、２−シクロヘキサンヂイルなどの脂環系を形成してもよい。
【００５７】
本発明の好ましい形態においては、モノマ−シントンにおけるＥはＣＯＯＨまたはその活性化された誘導体であり、またオリゴマ−におけるＧは、−ＣＯＮＲ3−である。（好ましくは、式Ｉにおける−Ｒ3ＮＯＣの方向において）。上記において定義したように、Ｅはまた、ＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ2ＯＨ、またはそれらの活性化された誘導体であってもよく、またこの時オリゴマ−におけるＧは、−ＣＳＮＲ3−、−ＳＯＮＲ3−および−ＳＯ2ＮＲ3−となる。かかる活性化は、例えば酸無水物または活性エステル誘導体を用いて行えばよく、この際Ｅで表される基における水素は、成長する主鎖を精製させるために適した解離する基によって置換されている。
【００５８】
かかる主鎖を形成するアミノ酸は、同じでもまたは異なっていてもよい。本発明者らは、２−アミノエチルグリシンに基づいたものが本発明の目的に特に適していることを見出したのである。
【００５９】
場合によっては、何れかの端末（Ｑ、Ｉ）においてリガンドを結合させて、ＰＮＡ類の結合特性を変調させることは興味深いことであり得る。代表的なリガンドとしては、ｄｓＤＮＡの結合を改善するＤＮＡ挿入基または例えばリシンまたはポリリシンなどの、静電的相互作用によってＰＮＡの結合を強化する塩基性基が挙げられる。カルボキシやスルフォ基などのマイナスに荷電した基を減少させる基を使用することも可能であろう。シントンの設計によって更には、その他の原子部を端末でない位置に移動させることもできる。
【００６０】
ＰＮＡオリゴマ−は、例えばヌクレア−ゼ活性またはアルキル化活性を有するリガンドまたはリポ−タ−リガンドなどの（発蛍光団、スピン標識、放射性物質、タンパク質認識リガンド、たとえばビオチンまたはハプテン）低分子量の作動リガンドに共軛・接合させてもよい。本発明のまた別の局面においては、このようなＰＮＡ類は、ペプチドまたはタンパク質に共軛・接合させるのであるが、かかるペプチドは信号発信活性を有しかつかかるタンパク質はたとえば酵素、転写因子または抗体である。また、ＰＮＡ類は、水溶性または非水溶性のポリマ−に結合させることもできる。本発明の別の局面において、これらのＰＮＡ類は、オリゴヌクレオチドまたは炭水化物に共軛・接合させられる。保証された場合は、ＰＮＡオリゴマ−は、固体支持体に結合された何らかの原子部（たとえば、ペプチド鎖、リポ−タ−、挿入基またはその他の種類のリガンド含有基）の上において合成することも出来る。
【００６１】
本発明に使用されるこれらのＰＮＡ類の合成は、以下において詳細に議論されるが、ここにおいて第１図は好ましいＰＮＡの例の一つを表し、その構造を相補的ＤＮＡの構造になぞらえている。
【００６２】
ＰＮＡオリゴマ−およびポリマ−の合成分子を固体マトリックスにアンカ−止めする原理は、化学変化の過程において中間生成物を解明するうえで役に立つのであるが、固相合成またはメリフィ−ルド合成として知られている（たとえば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６３、８５、２１４９およびＳＣＩＥＮＣＥ、１９８６、２３２、３４１を参照のこと）。アミノ酸を段階的にまたは断片的に組み立ててペプチドにする方法として確立されているのは通常は、若干架橋処理されたスチレン−ジビニルベンゼンコポリマ−から成るビ−ズにしたマトリックスを用いるが、このような架橋処理したコポリマ−は、ジビニルベンゼン類の混合物を添加したスチレンをパ−ル重合させることによって形成させられたものである。架橋密度・程度として１−２％が通常は用いられ、かかるマトリックスも、本発明に従って固相ＰＮＡ合成に使用することが出来る（第１図）。
【００６３】
このような固相を当初において機能化させることに関して、五十以上の方法が、従来の固相ペプチド合成に関連して記載されている（たとえば、”ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ” Ｖｏｌ．２におけるＢａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｄ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７９、ｐｐ．１−２８４、およびＳｔｅｗａｒｔａｎｄ Ｙｏｕｎｇ、”Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、２ｎｄ Ｅｄ．、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、１９８４）。クロロメチル官能性（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｄｒｅｓｉｎ；クロロメチルメチルエ−テル／ＳｎＣｌ４反応を経由），アミノメチル官能性（Ｎ−ヒドロキシメチルフタルイミド反応を経由して；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．、１９７６、３７９５）およびベンゾヒドリルアミノ官能性（Ｐｉｅｔｔａら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９７０、６５０）を導入する反応が、最も広く用いられている。その本質如何に拘らず、このような官能性の目的は、通常はかかるコポリマ−の固体支持体とその固体支持体にカップリング結合させるべき第一のアミノ酸のＣ−末端との間にアンカ−止め結合を形成させることである。官能基の”濃度”をグラム当たりミリモル（ｍｍｏｌｅ／ｇ）で表すことが一般的には好都合である。当初に導入した他の反応性官能性としては、４−メチルベンゾヒドリルアミノおよび４−メトキシベンゾヒドリルアミノが挙げられる。これらの確立された方法は全て、原則として本発明の文脈の範囲内において有用である。ＰＮＡ合成の好ましい方法は、当初官能性としてアミノメチルを使用するが、それは、アミノメチルが、スペ−サ−形成試薬の一端においてカルボキシル酸へのアミド結合を本質的に定量的に形成させることに関連してアミノメチル官能性のアミノ基が持つ反応性が高いために”スペ−サ−”または”ハンドル（ｈａｎｄｌｅ）”基を導入することに関して有利であるから。該当するスペ−サ−またはハンドル形成性二官能性基について膨大な数の基が記載されている（Ｂａｒｒａｎｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、１９８７、３０、７０５を参照）が、特にたとえばアミノメチル官能において見出されているようなアミノ基に対する反応性の高い試薬が記載されている。代表的な二官能性試薬としては、たとえば４−（ブロモメチル）フェニル酢酸などの４−（ハロアルキル）アリ−ル−低級アルカン酸、たとえばＢｏｃ−アミノアシル−４−（オキシメチル）フェニル酢酸などのＢｏｃ−アミノアシル−４−（オキシメチル）アリ−ル−低級アルカノン酸、たとえばＮ−Ｂｏｃ−ｐ−グルタロイルベンゾヒドリルアミンなどのＮ−Ｂｏｃ−ｐ−アシルベンゾヒドリルアミン、たとえばＮ−Ｂｏｃ−４’−メチル−ｐ−グルタロイルベンゾヒドリルアミンなどのＮ−Ｂｏｃ−４’−低級アルキル−ｐ−アシルベンゾヒドリルアミン、たとえばＮ−Ｂｏｃ−４’−メトキシ−ｐ−グルタロイル−ベンゾヒドリリルアミンなどのＮ−Ｂｏｃ−４’−低級アルコキシ−ｐ−アシルベンゾヒドリルアミン、および４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸が挙げられる。本発明の文脈の範囲内において特に該当するスペ−サ−基の一種類は、フェニルアセトアミドメチル（Ｐａｍ）ハンドル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９７６、４１、２０１５）であり、これは４−フェニルアセトアミドメチル基の電子吸引効果から派生して、Ｂｏｃ−アミノ脱保護試薬であるトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に対する古典的なベンジルエステル結合よりもほぼ１００倍安定である。
【００６４】
ＰＮＡ鎖のＣ−末端がアミドの形態となるように合成したＰＮＡ鎖を固体支持体から開裂させる目的のために導入させてもよいいくつかの官能性（たとえば、ベンゾヒドリルアミノ、４−メチルベンゾヒドリルアミノおよび４−メトキシベンゾヒドリルアミノ）は、スペ−サ−基の導入を一切必要としない。このような官能性は何れも、有利には本発明の文脈において使用することが出来る。
【００６５】
スペ−サ−またはハンドル基の導入に関するもう一つの戦略は、所謂”予備形成したハンドル”戦略（Ｔａｍら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９７９、９５５−９５７を参照）であって、これは、第一のアミノ酸をカップリング結合させることを完璧に制御することが出来またペプチドまたはＰＮＡ合成に関係しない所望しない官能基が存在することから起因する複雑な状況が生ずる可能性を排除するものである。この戦略においては、スペ−サ−またはハンドル基は、前記したものと同様の種類の基であるがこれらを固体支持体に結合させたいと希望する第一のアミノ酸と反応させるが、該アミノ酸はＮ−保護されておりかつ随意には所望のＰＮＡ鎖の伸張について該当しないその他の側鎖において保護される。すなわち、スペ−サ−またはキハンドル基が望ましい場合においては、固体支持体にカップリングさせるべき第一のアミノ酸は、当初に導入した官能性（たとえば、アミノメチル基）に導入させておいたスペ−サ−基の遊離の反応性末端にカップリング・結合させることが出来るかまたはスペ−サ−形成試薬と反応させることが出来る。スペ−サ−形成性試薬は、次いで当初に導入した官能性と反応させる。他の有用なアンカ−止めスキ−ムとしては、”多重脱離可能な（ｍｕｌｔｉ−ｄｅｔａｃｈａｂｌｅ）”樹脂（Ｔａｍら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．、１９７９、４９３５およびＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８０、１０２、６１１；Ｔａｍ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９８５、５０５２９１））であり、この樹脂は、一つ以上の放出・解離型式が可能であり、かくして合成デザインにおいて一層の柔軟性をもたらすものである。
【００６６】
Ｎ−保護のための適当な選択策としては、通常は側鎖の保護のためのベンジルに関連した基と組合せて用いる第三級−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基（Ｃａｒｐｉｎｏ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９５７、７９、４４２７；ＭｃＫａｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９５７、７９、４６８６；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９５７、７９、６１８０）および如何なる側鎖をも保護するための第三級ブチル（ｔＢｕ）と組合せて用いる９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基（Ｃａｒｐｉｎｏら、Ｊ．Ａｍ．ＣＨｅｍ．Ｓｏｃ．、１９７０、９２、５７４８およびＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９７２、３７、３４０４）である。尤も、通常の固相ペプチド合成において公知であるその他の多くの可能性がある。すなわち、種々のその他のアミノ保護基が存在するのであり、その内のいくつかは、Ａｄｏｃ（Ｈａｓｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６６、８８、１９８８）。Ｂｐｏｃ（Ｓｉｅｂｅｒ、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ．、１９６８、５１、６１４）、Ｍｃｂ（Ｂｒａｄｙら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９７７、４２、１４３），Ｂｉｃ（Ｋｅｐｍら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９７５、４６２４），ｏ−ニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ）（Ｚｅｒｖｅｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６３、８５、３６６０）およびジチアスクシノイル（Ｄｔｓ）（Ｂａｒａｎｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，、１９７７、９９、７３６３）である。これらのアミノ保護基は、特にウレタン官能性に基づく保護基は、大半のアルファ−アミノ酸のカップリングの過程においてラセミ化（容易に生成するオキサゾリノン（アスラクトン）中間体の互変異性化によって仲介される）を成功裏に抑止する。このようなアミノ保護基以外に、それ以外では”無用の”非ウレタン型式のアミノ保護基の全体は、ＰＮＡ分子、特にアキラル単位から構築したＰＮＡ分子を構築するに際しては適用可能である。すなわち、上記したアミノ保護基（またはこれらの基から誘導されたもの）は、本発明の文脈の範囲内において有用であるばかりでなく、以下の要件をほぼ満たすアミノ保護基の実際上全てのものが有用である：（１）温和な酸に対する安定性（カルボキシル基によって有意に攻撃されない）；（２）温和な酸または求核試薬に対する安定性（問題となるアミノ基によって有意に攻撃されない）；（３）アセチル化に対する抵抗性（活性化されたアミノ基によって有意に攻撃されない）；さらに（４）該保護基は、重大な副反応を伴うことなく定量的な除去可能性に近いものでなくてはならない；および（５）導入されるアミノ酸の光学的完全さが、好ましくはカップリングに際して高度に保存されるべきである。最後に、側鎖保護基の選択は一般的に、側鎖官能性の保護は繰り返されるアミノ脱保護サイクルの条件に耐えるものでなくてはならないので、アミノ保護基の選択に依存して異なる。ＰＮＡを化学的に構築する全般的な戦略が、たとえばアミノと側鎖保護基の特異的な酸安定性に依拠しようとも（たとえば上記した”Ｂｏｃ−ベンジル”の手法）、または直交的な、すなわち化学選択的な保護スキ−ムを用いようとも（たとえば、上記した”Ｆｍｏｃ−ｔＢｕ”手法の当てはまる）、このことは真実である。
【００６７】
第一のアミノ酸をカップリングさせた後、固相合成の次ぎの工程は、所望するＰＮＡ鎖を系統的に合成することである。このような合成は、繰り返し行う脱保護／カップリングサイクルを包含する。たとえばＢｏｃやＦｍｏｃ基などの、最後にカップリングしたアミノ酸の暫定的な保護基は、たとえばＢｏｃの場合はトリフルオロ酢酸を用いた酸分解、Ｆｍｏｃの場合はピペリジンを用いた塩基処理などの適当な処理に依って定量的に除去し、かくしてＮ−末端アミノ機能を遊離せしめるのである。
【００６８】
所望一歩前のＮ−保護されたアミノ酸は次いで、最後にカップリングさせたアミノ酸のＮ−末端にカップリングさせる。アミノ酸のＣ−末端に最後にカップリングさせたアミノ酸のＮ−末端をこのようにカップリングさせることは、いくつかの方法で行い得る。たとえば、２、４、５−トリクロロフェニルエステル（Ｐｌｅｓｓら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９６３、４６、１６０９）、フタルイミドエステル（Ｎｅｆｋｅｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｏ．、１９６１、８３、１２６３）、ペンタクロロフェニルエステル（Ｋｕｐｒｙｓｚｅｗｓｋｉ、Ｒｏｃｚ．Ｃｈｅｍ．、１９６１、３５、５９５）、ペンタフロロフェニルエステル（Ｋｏｖａｃｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６３、８５、１８３）、ｏ−ニトロフェニルエステル（Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ、Ｎａｔｕｒｅ、１９５５、１７５、６８５）、イミダゾ−ルエステル（Ｌｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９７０、９２、７６０８）および３−ヒドロキシ−４−オキソ−３、４−ジヒドロキナゾリン（Ｄｈｂｔ−ＯＨ）エステル（Ｋｏｎｉｇら、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．、１９７３、１０３、２０２４および２０３４）などの活性エステル誘導体を当初に形成させること、またはたとえば対称無水物などの無水物を当初に形成させることを含む、いくつかの方法の何れを用いてある形態の導入アミノ酸にカルボキシル基を付与する事によって結合させることが出来る。その代わりに、導入するアミノ酸のカルボキシル基には直接的に、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｓｅｅｈａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９５５、７７、１０７６）またはその誘導体などの縮合試薬を用いて最後にカップリングしたアミノ酸のＮ−端末と反応させることが出来る。ベンゾトリアゾリルＮ−オキシトリス−ジメチルアミノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェ−ト（ＢＯＰ）、すなわち”カストロの試薬”（たとえば、Ｒｉｖａｉｌｌｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９８０、３６、３４１３）が、第二級アミノ基を含むＰＮＡ分子を構築する場合勧められる。最後に、最近報告されたアミノ酸弗化物（Ｃａｒｐｉｎｏ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９０、１１２、９６５１）ｎｉｒｕｉｊｉｓｉｔａ活性化ＰＮＡモノマ−も、ＰＮＡ合成においても使用できる相当な見込みがある。
【００６９】
保護基を含む所望のＰＮＡ鎖を構築した後、次ぎの工程は、通常はＰＮＡ鎖のアミノ酸部位の脱保護と合成したＰＮＡを固体支持体から開裂させることであろう。これらのプロセスは、実質的に同時に生起させて、その結果所望の形状で遊離のＰＮＡ分子を得ることが可能である。その代わりに、これら二つの別々に合成されたＰＮＡ鎖を縮合させねばならない場合は、合成のスタ−ト時に適当なスペ−サ−基を選択して、かくして所望のＰＮＡ鎖をそれぞれの固体支持体から開裂させ（両方のペプチド鎖ともなおそれぞれ側鎖保護基を含んでいる）、次いで最後に、たとえば二つの側鎖保護されたペプチド鎖をカップリングさせた後側鎖保護基を除去して、かくしてより長いＰＮＡ鎖を形成せしめることによって、このような反応は可能である。
【００７０】
上記した”Ｂｏｃ−ベンジル”保護スキ−ムにおいて、側鎖の最終的な脱保護およびＰＮＡ分子の固体支持体からの開放は、たとえば無水ＨＦ（Ｓａｋａｋｉｂａｒａら、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．、１９６５、３８、４９２１）、トリス（トリフルオロ酢酸）ホウ素（Ｐｌｅｓｓら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９７３、４６、１６０９）およびトリフルオロメタンスルホン酸やメタンスルホン酸（Ｙａｊｉｍａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．、１９７４、１０７）などのスルホン酸類などの強酸を使用することに依って実施されるのがもっとも多い。このような通常の強酸（たとえば、無水ＨＦ）による脱保護方法は、極めて反応性の強いカルボカチオンを生成し、それによってＰＮＡ鎖の中における敏感な残基のアルキル化やアシル化が起きる可能性がある。このような副反応は、アニソ−ル、フェノ−ル、ジメチルサルファイドやメルカプトエタノ−ルなどのスカベンジャ−（捕捉剤）を存在させることによっては部分的にしか回避出来ないので、従ってサルファイドを用いた酸加水分解的ＳＮ2脱保護法（Ｔａｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８３、１０５、６４４２およびＪ．Ａｍ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８６、１０８、５２４２），所謂”低い”方法は、有害なカルボカチオンの前駆体を除いて、不活性なスルフォニウム塩を形成させるのであるが、ペプチドやＰＮＡ合成においては単独でまたは”高い”方法と組合せて頻繁に用いられる。それ程頻繁ではないが、特別の場合には、脱保護することおよび／またはＰＮＡ−固体支持体との結合を最終的に開裂させるために用いられる方法としては、たとえば、塩基接触アルコ−ル分解（Ｂａｒｔｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．ｓｏｃ．、１９７３、９５、４５０１）やアンモニア分解ならびにヒドラジン分解（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．、１９６４、１４２３）、水素分解（Ｊｏｎｅｓ、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．、１９７７、２８５３およびＳｃｈｌａｔｔｅｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９７７、２８６１）および光分解（Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｇｕｒｗａｒａ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｏ．、１９７５、９７、１５７５）などの方法が挙げられる。
【００７１】
最後に、”通常の”ペプチドの化学的合成と異なって、たとえばアミノエチルグリシル主鎖単位に基づいたＰＮＡ類などのアキラルＰＮＡ類の段階的鎖構築は、かかるカップリング反応はラセミ化を伴わないので、Ｎ−端末またはＣ−端末の何れかから出発することが出来る。
【００７２】
大半の走査は、固相ペプチド合成の合成サイクルにおけるのと同一である（固相ＰＮＡ合成についても当てはまるように）事実を認識することに基づいて、新規のマトリックス、すなわちＰＥＰＳが多数のペプチド類の合成を容易にするために最近導入された（Ｂｅｒｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８９、１１１、８０２４および国際特許出願ＷＯ ９０／０２７４９号）。このようなマトリックスは、長鎖のポリスチレン（ＰＳ）グラフト（１０6のオ−ダ−の分子量）をぶら下げたポリエチレン（ＰＥ）フィルムから構成される。このフィルムのロ−ディングの能力は、ビ−ズマトリックスと同じ程度に高いが、ＰＥＰＳには、多段合成に同時に適合させる別の柔軟性がある。すなわち、新規な固相ペプチド合成方法においては、かかるＰＥＰＳフィルムは、不連続の標識されたシ−トに加工されるが、それぞれのシ−トは、個別の分画部として機能する。このような合成サイクルの同一の工程の全てにおいて、これらのシ−トは、単一の反応容器の中において一体に保持され、かくして通常の方法による単一ペプチドの合成と近似した速度で複数のペプチド合成を同時に実施せしめることが可能である。
【００７３】
このＰＥＰＳフィルム支持体は、該当する特殊化学に適合せしめられた結合基またはスペ−サ−基を含んで成り、複数のＰＮＡ分子の合成において特に有用で貴重であるはずと推定された。それというのも、四つの”プソイド−ヌクレオチド”単位のそれぞれに対して一つずつ、僅かに四つの異なる反応分画部しか通常は必要とされないので、概念上合成が簡単であるからである。すなわち、ＰＥＰＳフィルム支持体は、平行したかつ実質的に同時の態様でかす多くのＰＮＡ合成において試験されて、何れも成功している。ＰＥＰＳから得られた製品の収率と品質は、伝統的なポリスチレンビ−ズ支持体を使用することによって得られた収率と品質に比肩し得るものであった。また、たとえば不織フェルト、編みネット、スティックまたはマイクロウエルプレ−トなどその他の外観形状のＰＥＰＳポリマ−を用いた実験の意結果では、合成効率に何等の制限もないことが判っている。多数のペプチドを同時に合成するために提案された他の二つの方法もやはり、多数の異なるＰＮＡ分子を調製製造するために適用され得る。これらの方法の最初の方法は（Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｏｒｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ、１９８４、８４、３９９８）、アクリル酸グラフトポリエチレン製ロッドおよび９６個のマイクロリットルウエルを用いて、成長するペプチド鎖を固定化しかつ分画化した合成を実施するものである。この方法は、極めて効率がよいものの、マイクログラムのスケ−ルでのみ適用可能であるに過ぎない。第二の方法は（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８５、８２、５１３１）、伝統的に使用されてきたポリマ−ビ−ズを用いるものである。その他多重ペプチドまたはＰＮＡ合成のために提案された方法で、本発明の文脈の範囲内に入る方法には、密度の異なる二つの相異なる支持体を同時に用いる方法（Ｔｒｅｇａｅｒ、”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓ”、Ｊ．Ｍｅｉｅｒｈｏｆｅｒ編著、Ａｎｎ ＡｒｂｏｒＳｃｉ，Ｐｕｂｌ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、１９７２ ｐｐ．１７５−１７８）、マニホルドを介して異なる反応容器を組み合わせる方法（Ｇｏｒｍａｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８４、１３６、３９７）、マルチカラム固相合成法（たとえば、Ｋｒｓｃｎａｋら、Ｉｎｔ．Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、１９８９、３３、２０９およびＨｏｌｍ ａｎｄ Ｍｅｌｄａｌ、”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ２０ｔｈ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｍｐｏｄｉｕｍ”、Ｇ．ＪｕｎｇおよびＥ．Ｂａｙｅｒ編著、Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ ＆ Ｃｏ．、Ｂｅｒｌｉｎ、１９８９ｐｐ２０８−２１０）およびセルロ−スペ−パ−を使用する方法（Ｅｉｃｈｌｅｒら、Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９８９、５４、１７４６）がある。従来からある架橋スチレン／ジビニルベンゼンコポリマ−マトリックスおよびＰＥＰＳ支持体が目下とのところ固相ＰＮＡ合成の文脈において好ましいのであるが、該当し得る固体支持体の例として、これに限定されないリストには以下のものが含まれる：すなわち（１）既知量のＮ−第三級−ブトキシカルボニル−ベ−タ���アラニル−Ｎ’−ヘキサメチレンジアミンを含むＮ、Ｎ’−ビサクリロイルエチレンジアミンで架橋されたジメチルアクリルアミドのコポリマ−を用いた粒子。いくつかのスペ−サ−分子は、典型的にはベ−タアラニル基を介して、次いでアミノ酸残基によって付加される。また、このベ−タアラニル含有モノマ−は、重合過程においてアクロイルサルコシンモノマ−で置換して、樹脂ビ−ズを形成するのである。かかる重合を行ったあとで、ビ−ズにエチレジアミンを反応させて、共有結合で結合させた官能基として一級アミンを含有する樹脂粒子を形成する。このポリアクリルアミドを用いた支持体は、相対的にポリスチレンを用いた支持体よりも親水性が高く、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどを含む極性の高い、非水性の溶媒とともに通常は使用される（Ａｔｈｅｒｔｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９７５、９７、６５８４、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９７９、８、３５１およびＪ．Ｃ．Ｓ．、ＰｅｒｋｉｎＩ、５３８（１９８１）を参照）；（２）第二の固体支持体のグル−プは、たとえば、多孔質のガラスビ−ズやシリカゲルなどのシリカ含有粒子を用いるものである。一つの例は、ＷａｔｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡが”ＰＯＲＡＳＩＬ”なる商標で市販されているトリクロロ−［３−（−クロロメチル）−フェニル］プロピルシランおよび多孔質のガラスビ−ズとの反応生成物（Ｐａｒｒａｎｄ Ｇｒｏｈｍａｎｎ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ．Ｅｄ．、１９７２、１１、３１４を参照）である。同様に、１，４−ジヒドロキシメチルベンゼンとシリカとのモノエステル（ＷａｔｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓによって”ＢＩＯＰＡＫ”なる商標で販売されている）が、有用であると報告されている（Ｂａｙｅｒ ａｎｄ Ｊｕｎｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９７０、４５０３）；（３）有用な固体支持体の三番目の種類は、二種の主要成分を含有しているという意味で複合物と称することが出来る：すなわち、樹脂および使用した有機合成反応条件に対して実質的にに不活性であるたの材料である。一つの複合物の例は（Ｓｃｏｔｔら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｓｃｉ、１９７１、９、５７７を参照）、疎水性の架橋処理したクロロメチル基を含むスチレンポリマ−で被覆したガラス粒子を用いたものであり、Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ、ＵＳＡのＮｏｒｔｈｇａｔｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．によって製造販売されていたものである。もう一つの複合物の例は、ポリスチレンがグラフトされているフッ素化エチレンポリマ−のコア−を含有するものである（Ｋｅｎｔａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｉｓｒａｅｌ Ｊ．Ｃｈｅｍ．、１９７８、１７、２４３およびｖａｎＲｉｅｔｓｃｈｏｔｅｎ，”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １９７４”、Ｙ．Ｗｏｌｍａｎ編著、Ｗｉｌｅｙａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７５、ｐｐ．１１３−１１６を参照）；（４）たとえばコトンシ−トなどのＰＥＰＳ以外の同一種に属する固体支持体（Ｌｅｂｌ ａｎｄＥｉｃｈｌｅｒ、ＰｅｐｔｉｄｅＲｅｓ．、１９８９、２、２３２）およびヒドロキシプロピルアクリレ−トでコ−トされたポリプロピレン膜（Ｄａｎｉｅｌｓら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．、１９８９、４３４５）もＰＮＡ合成に適している。
【００７４】
操作が手動または自動であれ、本発明の文脈における固相ＰＮＡ合成は、通常はバッチ法で行われる。しかしながら、このような合成の大半は、支持体をカラムに充填して（Ｂａｙｅｒら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．、１９７０、４５０３およびＳｃｏｔｔら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．、１９７１、９、５７７）連続フロ−の型式で同様に実施してもよい。連続フロ−固相合成に関して、硬質のポリ（ジメチルアクリルアミド）−珪藻土（Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ）支持体（Ａｔｈｅｒｔｏｎら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕ．、１９８１、１１５１）が、特に成功しているように見えるが、もう一つの有用で貴重な方法は、標準的なコポリ（スチレン−１％−ジビニルベンゼン）支持体のために工夫されたものに関するものである（Ｋｒｃｈｎａｋら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．、１９８７、４４６９）。
【００７５】
固相方法は目下のところＰＮＡ合成の文脈において好ましいのであるが、その他の方法論またはたとえばそれらとこのような固相法との組合せも適用される：すなわち、（１）ペプチドの古典的な溶液相法（たとえば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８４）であって段階的な構築法によるかまたはセグメント／フラグメント縮合法によるものが、ＰＮＡ化合物の特に大規模な製造（グラム。キログラムまたはトンまでも）を考慮する場合に特別に該当する；（２）所謂”液相”戦略であって、たとえば線状ポリスチレンなどの溶解性ポリマ−支持体（Ｓｈｅｍｙａｋｉｎら、ＴｅｔｒａｈｄｒｏｎＬｅｔｔ．、１９６５、２３２３）やポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）（Ｍｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｙｅｒ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．、Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、１９７４、１３、８８）を用いるものが有用である；（３）種々の分子量の（”ｐｏｌｙ−ｄｉｓｐｅｒｓｅ”）ペプチドまたはＰＮＡ分子を生成するランダム重合（たとえば、Ｏｉｄａｎ、”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”、 ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７０）を参照）抗ウイルス効果のスクリ−ニングの目的のために特に該当する；（４）ポリマ−に支持されたアミノ酸の活性エステル（Ｆｒｉｄｋｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６５、８７、４６４６）を使用した方法であって、”逆Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ合成法”または”ポリメリック試薬合成法”とも称される方法には、中間物の単離および精製ができるという利点があり、従って、中間の大きさの任意に保護されたＰＮＡ分子で、後刻引き続いてフラグメント縮合してより大きいサイズのＰＮＡ分子に変換することが出来るＰＮＡｂｕｎｓｉを合成するための特に適した方法を提供し得るものである；（５）ＰＮＡ分子をたとえばプロテア−ゼまたは新規な特異性を有するその誘導体（たとえばタンパク質工学などの人工的手段によって得られる）を用いて酵素的に構築することが見込まれる。また、数多くのＰＮＡフラグメントを縮合して極めて大きなＰＮＡ分子に変えるための”ＰＮＡリガ−ゼ”を開発することも見込むことが出来る；（６）抗体は、興味の対象とする実質的に如何なる分子としても生成させることが出来るので、Ｌｅｒｎｅｒ（Ｔｒａｍａｎｔａｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８６、２３４、１５６６）とＳｃｈｕｌｔｚ（Ｐｏｌｌａｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８６、２３４、１５７０））のグル−プによって同時に発見された、最近開発された接触抗体（ａｂｚｙｍｅｓ）も、ＰＮＡ分子を構築するための潜在的な候補として考慮されるべきであろう。すなわち、アシル−トランスファ−反応を接触・触媒するａｂｚｙｍｅｓを産生させるのに顕著な成功が成されている（たとえば、Ｓｈｏｋａｔら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８９、３３８、２６９およびそれに引用されている文献を参照）．ｓａｉｇｏｎｉ、対細菌Ｓｔｅｗａｒｔのグル−プ（Ｈａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９０、２４８、１５４４）によって開拓された完全に人工的な酵素を、ＰＮＡ合成に適するように開発することも出来るであろう。
【００７６】
一般的に適用可能な酵素、リガ−ゼおよび接触抗体など、特異的なカップリング反応を仲介することが可能なものの設計は、”通常の”ペプチド合成よりもＰＮＡ合成のための方がより容易に実施されるはずである。その理由は、ＰＮＡ分子は、ペプチドを構成する二十個の天然の（タンパク質生成性−ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ−）アミノ酸と比較して、僅か四つの異なるアミノ酸（四つの天然の塩基のそれぞれの一つに対応するもの）から構成されている場合が多いからである。結論として、特異的なＰＮＡ分子を合成するためには単一の戦略では如何なるものも適合することはなく、従って時にはいくつかの方法の組合せが最善に機能することがあり得るであろう。
【００７７】
（ａ）モノマ−構成単位の合成実験これらのモノマ−は好ましくは、第８図において概略を示した一般的スキ−ムによって合成される。この合成は、実施例２１−２３において記載した保護／脱保護方法を用いて（Ｂｏｃアミノエチル）グリシンのメチルまたはエチルエステルの何れかの製造を包含して成る。チミンモノマ−の合成は、実施例２４−２５において記載されており、また保護されたシトシンモノマ−の合成は実施例２６において記載されている。
【００７８】
保護されたアデニンモノマ−の合成（第１４図）は、臭化酢酸エチルによるアルキル化（実施例２７）およびＸ線結晶学を用いた置換位置の確認−所望とする９位−を包含して成るものであった。次いでＮ６−アミノ基をＮ−エチル−ベンジルオキシカルボニルイミダゾ−ルテトラフルオロ硼酸エステル試薬を用いてベンジルオキシカルボニル基で保護した（実施例２８）。このエステル生成物を単に加水分解すると、Ｎ６−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルアデニンが得られ、これを次ぎに標準方法に用いた（実施例１０−１１、第８図）。このアデニンモノマ−を構築して、二つの異なるＰＮＡ−オリゴマ−とした（実施例３０および３１）。
【００７９】
保護されたＧ−モノマ−の合成を、第１５図において概略を示してある。この出発物質である２−アミノ−６−クロロプリンを臭化酢酸でアルキル化し（実施例３２）、次いでこの塩素原子をベンジルオキシ基で置換した（実施例３６）。得られた酸を試薬ＰｙＢｒｏｐｔｍを用いて（Ｂｏｃアミノエチル）グリシンメチルエステル（実施例３６）とカップリングさせ、次いで得られれたエステルを加水分解した（実施例２３）。このＯ６−ベンジル基をＰＮＡ−オリゴマ−の合成において最終のＨＦ−開裂工程で除去した。開裂は、縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミドを用いてＰＮＡ−オリゴマ−に組み込んだ場合、最終のＰＮＡ−オリゴマ−の予期した量を測定することによって確認した（実施例５２）。以下に記載する略記号を実験実施例において使用する：ＤＭＦ、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＣＣ、Ｎ、Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＤＣＵ、Ｎ、Ｎ−ジシクロヘキシル尿素；ＴＨＦ、テトラヒドロフラン；ａｅｇ、Ｎ−アセチル（２’−アミノエチル）グリシン；ｐｆｐ、ペンタフルオロフェニル；Ｂｏｃ、第三級−ブトキシカルボニル；Ｚ、ベンジルオキシカルボニル；ＮＭＲ、核磁気共鳴；ｓ、一重項；ｄ、二重項；ｔ、三重項；ｑ、四重項；ｍ、多重項；ｂ、ブロ−ド；δ、化学シフト。
【００８０】
ＮＭＲスペクトルは、テトラメチルシランを内部標準として用いてＪＥＯＬＦＸ９０Ｑ 分光計またはＢｒｕｋｅｒ ２５０ＭＨｚで記録した。質量分光測定は、ＶＧ ＦＡＢ源およびプロ−ブを備えたＭａｓｓＬａｂ ＶＧ １２−２５０四極子装置で行った。融点は、Ｂｕｃｈｉ融点測定装置で記録し、補正は行わなかった。Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドは、４Åモレキュラ−シ−ブで乾燥し、蒸留し次いで４Åモレキュラ−シ−ブ上で保存した。ピリジン（ＨＰＬＣグレ−ド）は、４Åモレキュラ−シ−ブ上で乾燥し、保存した。その他の溶媒は、入手可能な最高級品質のものかまたは使用前に蒸留した。ジオキサンは、使用前に塩基性アルミナを通した。Ｂｏｃ無水物、４−ニトロフェノ−ル、臭化酢酸メチル、塩化ベンジルオキシカルボニル、ペンタフルオロフェノ−ルは全て、ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙを介して入手した。チミン、シトシン、アデニンは全て、Ｓｉｇｍａ を介して入手した。
【００８１】
薄層クロマトグラフィ−（Ｔｌｃ）は、以下の溶媒系を用いて行った：（１）クロロホルム：トリエチルアミン：メタノ−ル、７：１：２；（２）塩化メチレン：メタノ−ル、９：１；（３）クロロホルム：メタノ−ル：酢酸８５：１０：５。スポットは、ＵＶ（２５４ｎｍ）によってまたは／および１２０℃において５分間加熱後ニンヒドリン溶液（１００ｍｌの１−ブタノ−ルおよび３０ｍｌ酢酸中に３ｇニンヒドリン）を噴霧し次いで噴霧後再度加熱することによって可視化させた。
【００８２】
鎖延長した主鎖グル−プＡ、ＣおよびＤ（第１６図）の変化は、モノマ−構成単位を合成し、ＰＮＡ−オリゴマ−に組み入れることによって証明される。一つの例において、グル−プＣはＣＨ（ＣＨ3）基である。相応するモノマ−の合成は、第１７図において概略を示すが、Ｂｏｃ−保護された１−アミノ−２、３−プロパンジオ−ル（実施例３５）の製造を包含して成り、このものは、過ヨウ素酸塩で開裂してｂｏｃアミノアセトアルデヒドとし、このものを直接次の反応に用いる。このｂｏｃアミノアセトアルデヒドを種々のアミンと縮合させることが出来る；実施例３６において、アラニンエチルエステルを使用した。実施例１７−１９において、相当するチミンモノマ−類を調製した。このようなモノマ−は、ＤＣＣ−カップリングプロトコ−ルによって８−量体に組み入れた（実施例３０および３１）。
【００８３】
別の例において、第−グル−プは（ＣＨ2）3である。相当するモノマ−の合成は、第１８ａ図において概略を示し、かつ実施例４０および４６において記載してある。
【００８４】
また別の例において、Ｃグル−プは、（ＣＨ2）2ＣＯ基である。チミンおよび保護されたシトシンモノマ−の合成は、第１９図および実施例４６から５１にまでにおいて概略を示してある。一つのユニットを包含するＰＮＡ−オリゴマ−を用いたハイブリダイゼ−ション実験は、実施例６１に記載しており、これによれば、親和性が著しく低下しているが特異性は保持されていることが示される。
【実施例】
【００８５】
実施例１
４−ニトロフェニル炭酸第三級−ブチルエステル炭酸ナトリウム（２９．１４ｇ；０．２７５ｍｏｌ）および４−ニトロフェノ−ル（１２．７５ｇ；９１．６ｍｏｌ）をジオキサン（２５０ｍｌ）と混合した。Ｂｏｃ−無水物（２０．０ｇ：９１．６ｍｏｌ）をジオキサン（５０ｍｌ）ｔとともにこの混合物に移した。この混合物を１時間還流し、０℃にまで冷却し、ろ過し、１／３にまで濃縮し、次いで０℃において水（３５０ｍｌ）に注いだ。１／２時間攪拌した後、この生成物を濾取し、水で洗浄し、次いで真空下でｓｉｃａｐｅｎｔ上で乾燥した。収率、２１．３ｇ（９７％）。ｍ．ｐ．７３．０−７４．５℃（ｌｉｔｔ．７８．５−７９．５℃）。元素分析、Ｃ11Ｈ13ＮＯ5、実験値（理論値） Ｃ：５５．２０（５５．２３） Ｈ：５．６１（５．４８）Ｎ：５．８２（５．８５）
【００８６】
実施例２
（Ｎ’−Ｂｏｃ−２’−アミノエチル）グリシン（２）
表題化合物をＨｅｉｍｅｒらによる方法の変法によって調製した。Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン（１、３．００ｇ；２５．４ｍｏｌ）を水（５０ｍｌ）に溶解し、ジオキサン（５０ｍｌ）を加え、次いでｐＨを２Ｎ水酸化ナトリウムで１１．２に調節した。第三級−ブチル−４−ニトロフェノ−ル炭酸エステル（７．２９ｇ；３０．５ｍｍｏｌ）をジオキサン（４０ｍｌ）に溶解し、２時間かけて滴下したが、この間においてｐＨは２Ｎ水酸化ナトリウムで１１．２に維持した。ｐＨは、３時間以上定期的に１１．２に調節し、次いで溶液を一夜放置した。溶液を０℃にまで冷却し、ｐＨを注意深く０．５Ｍ塩酸で３．５に調節した。この水溶液を０．５Ｍクロロホルム（３ｘ ２００ｍｌ）で洗浄し、ｐＨを２Ｎ水酸化ナトリウムで９．５に調節し、この溶液を真空下で（１４ｍｍＨｇ）蒸発乾凅した。残渣をＤＭＦ（２５＋２ｘ１０ｍｌ）で抽出し、抽出液をろ過して、過剰の塩を除去した。こうすることによって、表題化合物の溶液が収率約６０％でかつｔｌｃ（溶媒系１、ニンヒドリンで可視化した、Ｒｆ＝０．３）による純度が９５％以上で得られる。この溶液をこれ以上精製することなく以後のＢｏｃ−ａｅｇの製造に使用した。
【００８７】
実施例３
Ｎ−１−カルボキシメチルチミン（４）
この方法は、文献奇さの方法とは異なるが、より容易簡単であり、高い収率が得られ、製品中に未反応のチミンが残留しない。ＤＭＦ（９００ｍｌ）中にチミン（３、４０．０ｇ；０．３１７ｍｏｌ）および炭酸カリウム（８７．７ｇ；０．６３４ｍｍｏｌ）を分散させた分散液に、臭化酢酸メチルエステル（３０．００ｍｌ；０．３１７ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を窒素雰囲気下で一夜激しく攪拌した。この混合物をろ過し、真空下で蒸発乾凅した。固形の残渣を水（３００ｍｌ）および４Ｎ塩酸（１２ｍｌ）で処理し、０℃において１５分間攪拌し、ろ過し、水（２ｘ７５ｍｌ）で洗浄した。沈殿物を水（１２０ｍｌ）および２Ｎ水酸化ナトリウム（６０ｍｌ）で処理し、１０分間沸騰させた。この混合物を０℃に冷却し、ろ過し、次いで純粋の表題化合物を４Ｎ塩酸（７０ｍｌ）を添加することによって沈殿させた。ｓｉｃａｐｅｎｔ上で真空下乾燥させた後での収率、３７．１ｇ（６４％）。１Ｈ−ＮＭＲ（９０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ６）：１１．３３ ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．４９（ｄ，Ｊ＝０．９２Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ）；４．３８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2；１．７６（ｄ，Ｊ＝０．９２Ｈｚ，Ｔ−ＣＨ3）。
【００８８】
実施例４
Ｎ−１−カルボキシメチルチミン ペンタフルオロフェニルエステル（５）
Ｎ−１−カルボキシメチルチミン（４、１０．０ｇ；５４．３ｍｍｏｌ）およびペンタフルオロフェノ−ル（１０．０ｇ；５４．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍｌ）中に溶解し、氷水で０℃にまで冷却した。ＤＣＣ（１３．４５ｇ；６５．２ｍｍｏｌ）を次ぎに添加した。温度が５℃以下になったとき、氷浴を取り除き、混合物を常温で３時間攪拌した。沈殿したＤＣＵをろ過して除去し、ＤＭＦ（２ｘ １０ｍｌ）で二度洗浄した。濾液を合わせてエ−テル（１４００ｍｌ）に注ぎ、０℃にまで冷却した。石油エ−テル（１４００ｍｌ）を添加し、混合物を一夜放置した。表題化合物をろ過して単離し、石油エ−テルで完全に洗浄した。収率：１４．８ｇ（７８％）。この製品は、次ぎの反応を実施する出来るほど純粋であったが、分析用サンプルを２−プロパノ−ルから再結晶して得た。ｍ．ｐ．２００．５−２０６℃。元素分析、Ｃ13Ｈ7Ｆ5Ｎ2Ｏ4、実験値（理論値）Ｃ：４４．７９（４４．５９） Ｈ：２．１４（２．０１）Ｎ：８．１３（８．００）。ＦＡＢ−ＭＳ：４４３（Ｍ＋１＋グリセリン）、３５１（Ｍ＋１）。1Ｈ−ＮＭＲ（９０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ６）：１１．５２ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．６４（ｓ，１Ｈ，ＡｒＨ）；４．９９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2）；１．７６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）。
【００８９】
実施例５
１−（Ｂｏｃ−ｓｅｇ）チミン（６）
ＤＭＦ−溶液に上から、トリエチルアミン（７／０８ｍｌ；５０．８ｍｍｏｌ）を加え、次いでＮ−１−カルボキシメチルチミンペンタフルオロフェニルエステル（５、４．４５ｇ；１２．７ｍｍｏｌ）を加えた。生じた溶液は、１時間攪拌し、０℃に冷却しカチオン交換物質（”Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ−８”、４０ｇ）で２０分間処理した。このカチオン交換物質をろ過して除去し、ジクロロメタン（２ｘ １５ｍｌ）で洗浄し、ジクロロメタン（１５０ｍｌ）を加えた。生じた溶液を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、真空下で蒸発乾凅したが、先ず水アスピレ−タで、次いでオイルポンプで行った。残渣を水（５０ｍｌ）で振盪し、蒸発乾凅した。この方法をもう一度繰り返した。残渣を次いでメタノ−ル（７５ｍｌ）に溶解し、エ−テル（６００ｍ）と石油エ−テル（１．４Ｌ）に注いだ。一夜攪拌した後で、白色固体をろ過して単離し、石油エ−テルで洗浄した。真空下でｓｉｃａｐｅｎｔ上で乾燥して、３．５０ｇ（７１．７％）が得られた。ｍ．ｐ．１４２−１４７℃。元素分析、Ｃ16Ｈ24Ｎ4Ｏ7、実験値（理論値） Ｃ：４９．５９（５０．００）Ｈ：６．４３（６．２９） Ｎ：１４．５８（１４．５８）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）。二級アミド結合の周囲の回転が限定されているため、シグナルのいくつかが、２：１の比率で二重化した（リストにおいて大きい方はｍｊでまた小さい方はｍｉで示してある）。１２．７３ｐｐｍ（ｂ，１Ｈ，−ＣＯＯＨ）；１１．２７ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ．，イミド）；１１．２５ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ．，イミド）；７．３０ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ．，ＡｒＨ）；７．２６ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ．，ＡｒＨ）；６．９２ｐｐｍ（ｕｎｒｅｓ．ｔ，ｍｊ．，ＢｏｃＮＨ）；６．７３ｐｐｍ（ｕｒｅｓ．ｔ；ｍｉ．，ＢｏｃＮＨ）４．６４ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ．，Ｔ−ＣＨ2−ＣＯ−）；４．４７ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ．，Ｔ−ＣＨ2−ＣＯ−）；４．１９ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ．，ＣＯＮＲＣＨ2ＣＯ2Ｈ）；３．９７ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ．，ＣＯＮＲＣＨ2ＣＯ2Ｈ）；３．４１−２．８９ｐｐｍ（ｕｒｅｓ．ｍ，−ＣＨ2ＣＨ2−および水）；１．７５ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ，Ｔ−ＣＨ3）；１．３８ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）；13Ｃ−ＮＭＲ：１７０．６８ｐｐｍ（ＣＯ）；１７０．３４（ＣＯ）；１６７．４７（ＣＯ；１６７．０８（ＣＯ）；１６４．２９（ＣＯ）；１５０．９（Ｃ５”）；１４１．９２（Ｃ６”）；１０８．０４（Ｃ２’）；７７．９５および７７．６８（Ｔｈｙ−ＣＨ2ＣＯ）；４８．９６、４７．４５および４６．７０（−ＣＨ2ＣＨ2−およびＮＣＨ2ＣＯ2）；３７．９８（Ｔｈｙ−ＣＨ3）；２８．０７（ｔ−Ｂｕ）。ＦＡＢ−ＭＳ：４０７（Ｍ＋Ｎａ+）；３８５（Ｍ＋Ｈ+）。
【００９０】
実施例６
１−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）チミンペンタフルオロフェニルエステル（７、Ｂｏｃ−Ｔａｅｇ．０Ｐｆｐ）
１−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）チミン（６）（２．００ｇ；５．２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、次いで塩化メチレン（１５ｍｌ）を加えた。ペンタフルオロフェノ−ル（１．０５ｇ；５，７２ｍｍｏｌ）を炭化し、溶液を氷浴中で０℃にまで冷却した。次いでＤＤＣを加え（１．２９ｇ；６．２４ｍｍｏｌ）、次いで２分後に氷浴を取りはずした。常温で攪拌しつつ３時間経過後、沈殿したＤＣＵをろ過して除去し、塩化メチレンで洗浄した。濾液を合わせて、重炭酸ナトリウム溶液で二度洗浄しまた飽和塩化ナトリウム溶液で一度洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空化で蒸発乾凅した。固体の残渣をジオキサン（１５０ｍｌ）に溶解し、０℃で水（２００ｍ）に注いだ。表題化合物をろ過して単離し、水で洗浄し真空化でｓｉｃａｐｅｎｔ上で乾燥した。収率：２．２０ｇ（７７％）。分析用試料を２−プロパノ−ルから再結晶化して得た。ｍ．ｐ．１７４−１７５．５℃。元素分析、Ｃ22Ｈ23Ｎ4Ｏ7Ｆ5、実験値（理論値） Ｃ：４８．２２（５０．００） Ｈ：４．６４（４．２１） Ｎ：９．６７（１０．１８）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：二級アミド結合の周囲の回転が限定されているため、シグナルのいくつかが、６：１の比率で二重化した（リストにおいて大きい方はｍｊでまた小さい方はｍｉで示してある）。７．０１ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ．，ＡｒＨ）；６．９９ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ．，ＡｒＨ）；５．２７ｐｐｍ（ｕｎｒｅｓ．ｔ，ＢｏｃＮＨ）；４．６７ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ．，Ｔ−ＣＨ2−ＣＯ−）；４．６０ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ．，Ｔ−ＣＨ2−ＣＯ−）；４．４５（ｓ，ｍｊ．，ＣＯＮＲＣＨ2ＣＯ2Ｐｆｐ）；４．４２ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ．，ＣＯＮＲＣＨ2ＣＯ2Ｐｆｐ）；３．６４ｐｐｍ（ｔ，２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ2ＣＨ2−）；３．８７ｐｐｍ（”ｑ”，２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ2ＣＨ2−）；１．４４（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）。ＦＡＢ−ＭＳ：５５１（１０；Ｍ＋１）；４９５（１０；Ｍ＋１−ｔＢｕ）；４５１（８０；−Ｂｏｃ）．
【００９１】
実施例７
Ｎ4−ベンジルオキシカルボニルシトシン（９）
ほぼ１時間かけて、塩化ベンジルオキシカルボニル（５２ｍｌ；０．３６ｍｏｌ）を、乾燥ピリジン（１０００ｍｌ）にシトシン（８、２０．０ｇ；０．１８ｍｏｌ）を分散させた分散液に０℃において、オ−ブンで乾燥させた装置の中で窒素雰囲気中にて滴下した。この溶液を一夜攪拌し、その後このピリジン分散液を真空下で蒸発乾凅させた。水（２００ｍｌ）と４Ｎ塩酸を添加して、ｐＨ〜１にした。生じた白色沈殿をろ過して除き、水で洗浄し、空気をサクションして部分的に乾燥した。まだ湿潤している沈殿を無水アルコ−ル（５００ｍｌ）と一緒に１０分間沸騰させ、０℃にまで冷却し、ろ過し、エ−テルデで完全に洗浄し、真空下で乾燥した。収率、２４．７ｇ（５４％）。ｍ．ｐ．＞２５０℃。元素分析、Ｃ14Ｈ11Ｎ3Ｏ3、実験値（理論値） Ｃ：５８．５９（５８．７７） Ｈ：４．５５（４．５２） Ｎ：１７．１７（１７．１３）。ＮＭＲスペクトルは、本製品を溶解出来なかったため一切記録しなかった。
【００９２】
実施例８
Ｎ4−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ１−カルボキシメチルシトシン（１０）
メカニカル攪拌装置と窒素封入装置を備えた三口丸底フラスコに臭化酢酸メチルエステル（７．８２ｍｌ；８２．６ｍｍｏｌ）およびＮ４−ベンジルオキシカルボニルシトシン（９、２１．０ｇ；８２．６ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（１１．４ｇ；８２．６ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（９００ｍｌ）中に分散させた分散液を入れた。この混合物を一夜激しく攪拌し、ろ過し、真空下で蒸発乾凅した。水（３００ｍｌ）と４Ｎ塩酸（１０ｍｌ）とを加え、混合物を０℃で１５分間攪拌し、ろ過し、水（２ｘ ７５ｍｌ）で洗浄した。単離した沈殿を水（１２０ｍｌ）、２Ｎ水酸化ナトリウム（６０ｍｌ）処理し、３０分間攪拌し、ろ過し、０℃に冷却し４Ｎ塩酸（３５ｍｌ）を加えた。表題化合物をろ過して単離し、よく水で洗浄し、メタノ−ル（１０００ｍｌ）から再結晶し、よくエ−テルで洗浄した。こうして、７．７０ｇ（３１％）の純品を得た。再結晶母液を２００ｍｌの容積にまで濃縮し、０℃に冷却した。こうすることによって、さらに２．３０ｇの物質を得たが、このものは、ｔｌｃで純品でありことが判り、淡赤色を呈していた。ｍ．ｐ．２６６−２７４℃。元素分析、Ｃ14Ｈ13Ｎ3Ｏ5、実験値（理論値） Ｃ：５５．４１（５５．４５）Ｈ：４．２３（４．５３２） Ｎ：１４．０４（１３．８６）。 1Ｈ− ＮＭＲ（９０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．０２ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．３９（ｓ，５Ｈ，Ｐｈ）；７．０１（ｄ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；５．１９（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ2−）；４．５２（ｓ，２Ｈ）。
【００９３】
実施例９
Ｎ４−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ１−カルボキシメチルシトシンペンタフルオロフェノ−ルエステル（１１）
Ｎ4−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−カルボキシメチルシトシン（１０、４．００ｇ；１３．２ｍｍｏｌ）およびペンタフルオロフェノ−ル（２．６７ｇ；１４．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７０ｍ）と混合し、氷浴で０℃にまで冷却し、ＤＣＣ（３．２７ｇ；１５．８ｍｍｏｌ）を添加した。この氷浴を３分後に取りはずし、混合物を室温で３時間攪拌した。沈殿したＤＣＵをろ過して除去し、ＤＭＦで洗浄し、次いで濾液を真空下で（０．２ｍｍＨｇ）蒸発乾凅した。固体の残渣を塩化メチレン（２５０ｍｌ）で処理し、１５分間激しく攪拌し、溶かし、希重炭酸ナトリウム溶液で二度また飽和塩化ナトリウム液で一度洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で蒸発乾凅した。固体の残渣を２−プロパノ−ル（１５０ｍｌ）で再結晶し、結晶をよくエ−テルで洗浄した。収率、３．４０ｇ（５５％）。ｍ．ｐ．２４１−２４５℃。元素分析、Ｃ20Ｈ12Ｎ3Ｆ5Ｏ5、実験値（理論値） Ｃ：５１．５６（５１．１８） Ｈ：２．７７（２．５８） Ｎ：９．２４（８．９５）。 1Ｈ− ＮＭＲ（９０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3）：７．６６ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝７．６３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．３７（ｓ，５Ｈ，Ｐｈ）；７．３１（ｄ，Ｊ＝７．６３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；５．２１（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ2−）；４．９７（ｓ，２Ｈ，ＮＣＨ2）。ＦＡＢ−ＭＳ：４７０（Ｍ＋１）。
【００９４】
実施例１０
Ｎ4−ベンジルオキシカルボニル−１−Ｂｏｃ−ａｅｇ−シトシン（１２）
上記において調製した（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）グリシン（２）をＤＭＦに溶かした溶液に、トリエチルアミン（７．００ｍｌ；５０．８ｍｍｏｌ）およびＮ４−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ１−カルボキシメチルシトシンペンタフルオロフェノ−ルエステル（１１、２，７０ｇ；５，７５ｍｍｏｌ））を加えた。この溶液を室温で１時間攪拌した後、塩化メチレン（１５０ｍｌ）、飽和塩化ナトリウム液（２５０ｍｌ）、およびｐＨ〜１までの４Ｎ塩酸を加えた。有機層を分離し、飽和塩化ナトリウム液で二度洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で蒸発乾凅したが、先ず最初は水アスピレ−タ−、次ぎにオイルポンプを用いて蒸発乾凅した。油状の残渣を水（２５ｍｌ）で処理し、再度、真空下で蒸発乾凅した。この方法を繰り返した。油状残渣（２．８０ｇ）を次ぎに塩化メチレン（１００ｍｌ）に溶解し、石油エ−テル（２５０ｍｌ）を加え、この混合物を一夜攪拌した。表題化合物をろ過して単離し、石油エ−テルで洗浄した。Ｔｌｃ（溶媒系１）の結果、実際量のペンタフルオロフェノ−ルが存在することが判ったが、これを除去しようとする試みは行わなかった。収率：１，７２ｇ（５９％）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）。二級アミド結合の周囲の回転が限定されているため、シグナルのいくつかが、２：１の比率で二重化した（リストにおいて大きい方はｍｊでまた小さい方はｍｉで示してある）。７．８８ｐｐｍ（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．３９（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；７．００（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５）；６．９２（ｂ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨ）；６．７４（ｂ，１Ｈ，ＺＮＨ）−？；５．１９（ｓ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ3）；４．８１ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ．，Ｃｙｔ−ＣＨ2−ＣＯ−）；４．６２ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ．，Ｃｙｔ−ＣＨ−ＣＯ＝）；４．２３（ｓ，ｍｉ．，ＣＯＮＲＣＨ2ＣＯ2Ｈ）；３．９８ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ．，ＣＯＮＲＣＨ2ＣＯ2Ｈ）；３．４２−３．０２（ｕｎｒｅｓ．ｍ，−ＣＨ2ＣＨ2−および水）；１．３７（ｓ，９Ｈ，ｔＢｕ）。ＦＡＢ−ＭＳ：５０４（Ｍ＋１）；４４８（Ｍ＋１−ｔＢｕ）。
【００９５】
実施例１１
Ｎ4−ベンジルオキシカルボニル−１−Ｂｏｃ−ａｅｇ−シトシンペンタフルオロフェノ−ルエステル（１３）
Ｎ4−ベンジルオキシカルボニル−１−Ｂｏｃ−ａｅｇ−シトシン（１２、１．５０ｇ；２．９８ｍｍｏｌ））およびペンタフルオロフェノ−ル（５４８ｍｇ；２．９８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍ）に溶解し、塩化メチレン（１０ｍｌ）を添加し、反応混合物を氷浴中で０℃にまで冷却し、ＤＤＣ（６７６ｍｇ；３．２８ｍｍｏｌ）を添加した。この氷浴を３分後に取り除き、混合物を常温で３時間攪拌した。沈殿をろ過して単離し、塩化メチレンで一度洗浄した。この沈殿を、沸騰ジオキサン（１５０ｍｌ）に溶解し、生じた溶液を１５℃にまで冷却したが、この際ＤＣＵが沈殿した。このＤＣＵをろ過して除去し、生じた濾液を０℃において水（２５０ｍｌ）に注いだ。表題化合物をろ過して単離し、水で洗浄し真空下においてｓｉｃａｐｅｎｔ上で乾燥した。収率：１．３０ｇ（６５％）。元素分析、Ｃ29Ｈ28Ｎ5Ｏ8Ｆ5、実験値（理論値） Ｃ：５２．６３（５２．０２） Ｈ：４．４１（４．２２） Ｎ：１０．５５（１０．４６）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：本質的の上記酸のスペクトルを示したが、該エステルが加水分解したことに起因するのが最も可能性が高い。ＦＡＢ−ＭＳ：６７０（Ｍ＋１）；６１４（Ｍ＋１−ｔＢｕ）．
【００９６】
実施例１２
４−クロロカルボキシ−９−クロロアクリジン４−カルボキシアクリジン（６．２５ｇ；２６．１ｍｍｏｌ）、塩化チオニル（２５ｍｌ）および４滴のＤＭＦを、固体の物質が全て溶解するまで窒素を流しながら緩やかに加熱した。次いでこの溶液を４０分間還流し、過剰の塩化チオニルを真空下で除去した。塩化チオニルの最後の痕跡量を乾燥ベンゼン（Ｎａ−Ｐｂで乾燥）と一緒に二度蒸発させて除去した。残留する黄色の粉末を直接次ぎの反応にそまま用いた。
【００９７】
実施例１３
４−（５−メトキシカルボニルペンチルアミドカルボニル）−９−クロロアクリジン６−アミノヘキサノン酸メチル塩酸塩（４．７０ｇ；２５．９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（９０ｍｌ）に溶解し、０℃にまで冷却し、トリエチルアミン（１５ｍｌ）を加え、生じた溶液を直ちに酸の塩化物に上から加えた。この酸塩化物を入れた丸底のフラスコを氷浴中で０℃にまで冷却した。この混合物を０℃で３０分間また室温で３時間激しく攪拌し、この混合物をろ過して残留する固形物除去したが、この固形物を塩化メチレン（２０ｍｌ）で洗浄した。この赤−茶色の塩化メチレンろ液を飽和重炭酸ナトリウムで二度洗浄しまた飽和塩化ナトリウムで一度洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で蒸発乾凅した。得られた油状の物質に、乾燥ベンゼン（３５ｍｌ）およびリグロイン（６０−８０℃、Ｎａ−Ｐｂで乾燥）を加えた。この混合物を還流するまで加熱した。活性炭およびセライトを加えて、この混合物を３分間還流した。ろ過した後で、表題化合物は、磁気攪拌下で冷却すると結晶化した。この藻をろ過して単離し、石油エ−テルで洗浄した。本品は、固形の水酸化カリウム上で保存した。収率：５．０ｇ（５０％）。
【００９８】
実施例１４
４−（５−メトキシカルボニルペンチル）アミドカルボニル）−９−［６’−（４”−ニトロベンズアミド）ヘキシルアミノ］−アミノアクリジン４−（５−メトキシカルボニルペンチルアミドカルボニル）−９−クロロアクリジン（１．３０ｇ；３．３８ｍｍｏｌ）およびフェノ−ル（５ｇ）を、窒素気流下で３０分間で８０℃にまで加熱し、その後６−（４’−ニトロベンズアミド）−１−ヘキシルアミン（８９７ｍｇ；３，３８ｍｍｏｌ）を加えた。温度は２時間で１２０℃まで上昇した。反応混合物を冷却し、塩化メチレン（８０ｍｌ）を加えた。生じた溶液は２Ｎ水酸化ナトリウム（６０ｍｌ）で三度また水で一度洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で蒸発乾凅した。得た赤色オイル（１．８ｇ）を塩化メチレン（４０ｍｌ）に溶解し、０℃にまで冷却した。エ−テル（１２０ｍｌ）を加え、出た溶液を一夜攪拌した。こうすることによって、固形物質とオイルの混合物が得られた。この固形ブツヲろ過して単離した。固形物とオイルとを塩化メチレン（８０ｍｌ）に再度溶解し、冷エ−テル（１５０ｍｌ）に滴下した。２０分間攪拌したあと、表題化合物をろ過してオレンジ色の結晶として単離した。本品をエ−テル出洗浄し、水酸化カリウム上で真空にて乾燥した。収率：１．６０ｇ（７７％）。ｍ．ｐ．１４５−１４７℃。
【００９９】
実施例１５
４−（５−カルボキシペンチル）アミドカルボニル）−９−［６’−（４”−ニトロベンズアミド）ヘキシルアミノ］−アミノアクリジン４−（５−メトキシカルボニルペンチル）アミドカルボニル）−９−［６’−（４”−ニトロベンズアミド）ヘキシルアミノ］−アミノアクリジン（５０３ｍｇ；０．８２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ｍｌ）に溶解し、２Ｎ水酸化ナトリウム（３０ｍｌ）を添加した。１５分間攪拌した後、２Ｎ塩酸（３５ｍｌ）および水（５０ｍｌ）を０℃で加えた。３０分間攪拌したあとで、溶液をデカントしたところ、オイル状の物質が得られ、これを沸騰メタノ−ル（１５０ｍｌ）に溶解し、ろ過し、１／３の容積にまで濃縮した。このメタノ−ル溶液に、エ−テル（１２５ｍｌ）およびエタノ−ルに溶かした塩酸５−６滴を加えた。この溶液を０℃において１時間攪拌した後でデカントした。オイル状の物質を再びメタノ−ル（２５ｍｌ）に溶解し、エ−テル（１５０ｍｌ）で沈殿させた。一夜攪拌した後で表題化合物が黄色結晶として単離された。収率：４１７ｍｇ（８０％）。ｍ．ｐ．１７３℃（分解）。
【０１００】
実施例１６
（ａ）４−（５−ペンタフルオロフェニルメオシカルボニルペンチル）アミドカルボニル）−９−［６’−（４”−ニトロベンズアミド）ヘキシルアミノ］−アミノアクリジン（Ａｃｒ１Ｏｐｆｐ）
上記の酸（３００ｍｇ；０．，４８０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）と塩化メチレン（８ｍｌ）に溶解し、ペンタフルオロフェノ−ル（９７ｍｇ；０．５３ｍｍｏｌ）を２ｘ ２ｍｌの塩化メチレンと共に移して添加した。生じた溶液を０℃まで冷却し、この後ＤＣＣ（１２４ｍｇ；０．６０ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を５分後に取り除き、混合物を一夜攪拌しつつ放置した。沈殿したＤＣＵを遠心分離して除去し、遠心分離液を真空下で蒸発乾凅したが、先ず水アスピレ−タで次いでオイルポンプで蒸発乾凅した。残渣を塩化メチレン（２０ｍｌ）中に溶解し、ろ過し、真空にて蒸発乾凅した。残渣を再び塩化メチレンと石油エ−テル（１５０ｍｌ）に溶解した。エ−テル中の５Ｎ塩酸１ｍｌを添加し、０℃で３０分間攪拌した後、溶媒をデカンテ−ションで除去した。残留するオイル状物質を塩化メチレン（１００ｍｌ）に溶解し、石油エ−テルを加え、混合物を一夜攪拌しつつ放置した。翌日、黄色の沈殿結晶物をろ過して単離し、大量の石油エ−テルで洗浄した。収率：３００ｍｇ（７８％）、乾燥後。ｍ．ｐ．９７，５℃（分解）。全ての試料は、帰属するべき元素分析結果、1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲおよび質量スペクトルを示した。
【０１０１】
（ｂ）ＰＮＡ化合物の合成実験、第８図を参照。
材料：Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）、ベンゾヒドリルアミン−コポリ（スチレン−１％−ジビニルベンゼン）樹脂（ＢＨＡ樹脂）およびｐ−メチルベンゾヒドリルアミン−コポリ（スチレン−１％−ジビニルベンゼン）樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）をＰｎｅｉｎｓｕｌａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。その他の試薬および溶媒は、それぞれ以下から購入した：即ち、Ｂｉｏｇｒａｄｅのトリフルオロ酢酸は、Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社から；ジイソプロピルエチルアミン（９９％；これ以上蒸留しなかった）およびＮ−アセチルイミダゾ−ル（９８％）は、Ａｌｄｒｉｃｈ社から；Ｈ２Ｏは、二度蒸留した；無水ＨＦは、ＵｎｉｏｎＣａｒｂｉｄｅ社から；合成グレ−ドのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび分析グレ−ドの塩化メチレン（これ以上蒸留しなかった）は、Ｍｅｒｃｋ社から；ＨＰＬＣグレ−ドのアセトニトリルは、Ｌａｂ−Ｓｃａｎ社から；ｐｕｒｕｍグレ−ドのアニソ−ル、Ｎ、Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびｐｕｒｉｓｓ．グレ−ドの２、２、２−トリフルオロエタノ−ルは、Ｆｌｕｋａ社から購入した。
【０１０２】
（ｂ）一般的方法および注記別段に特記しない限り、以下を適用する。ＰＮＡ化合物は、”一時的な”Ｎ−保護のためにＴＦＡ−反応活性な第三級−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を用い（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｏ，、１９６４、８６、３０４）また”永久的な”側鎖保護のためにもっと酸に安定なベンジルオキシカルボニル（Ｚ）および２−クロロベンジルオキシカルボニル（ＣｌＺ）を用いて段階的固相方法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６３、８５、２１４９）によって合成した。Ｃ−末端アミドを得るために、ＰＮＡ類は、ＨＦ−反応活性なＢＨＡまたはＭＢＨＡ樹脂（このＭＢＨＡ樹脂は、未置換ＢＨＡ樹脂を基準として最終ＨＦ開裂を受け易い（Ｍａｔｓｕｅｄａら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、１９８１、２、４５））の上において構築した。全ての反応は（ＨＦ反応を除いて）、粗いガラスフリットを備えた、手動操作する標準固相反応容器において行った（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８２、２１、５０２０）。元来”通常の”アミノ酸を包含するペプチドのためにＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄおよびその共同研究者（Ｓａｒｉｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８１、１１７、１４７）によって開発された定量的なニンヒドリン反応が、全ての樹脂に対して”通常”用いられてきた有効吸光係数ε＝１５０００Ｍ-1ｃｍ-1を用いると、うまく適用され、個別のカップリングの完結度ならびに成長するペプチド鎖の数を測定出来た。カップリング時の残留基ｎの理論的置換度Ｓｎ−１は（合成サイクルの過程において脱保護とカップリングが完璧でありかつＰＮＡの鎖終了もその逸失も一切ないことを前提とする）、以下の式から算定される：
【０１０３】
Ｓｎ＝Ｓｎ−１ ｘ （１ ＋ （Ｓｎ−１ ｘΔＭＷｘ １０-3 ｍｍｏｌ／ｍｏｌ））-1
【０１０４】
なお本式において、ΔＭＷは、分子量の増大分（［ΔＭＷ］＝ｇ／ｍｏｌ）であり、またＳｎ−１は、先行する残留基ｎ−１のカップリング時の理論的置換度である（［Ｓ］＝ｍｍｏｌ／ｇ）。個別のカップリングの程度の推定値（％）は、測定した置換度を基準として算出され（Ｓが決定されない限り）かつ先立つサイクルのあとの残留する遊離アミノ酸基の数について補正はしていない。ＨＦ反応は、ＴｏｈｏＫａｓｅｉ（Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）製のＤｉａｆｌｏｎＨＦ装置で実施した。Ｖｙｄａｃ Ｃ１８（５ミクロン、０．４６ ｘ ２５ｃｍおよび５ミクロン。１ ｘ ２５ｃｍ）逆相カラムは、それぞれＳＰ８０００計器において分析用および半−合成用ＨＰＬＣに用いた。緩衝液液Ａは、１リットル当たり４４５マイクロリットルのトリフルオロ酢酸を含む６０容量％のアセトニトリル／水溶液であり、また緩衝液Ｂは、１リットル当たり３９０マイクロリットルのトリフルオロ酢酸を含む６０容量％のアセトニトリル／水溶液である。直線勾配は、３０分で０−１００％の緩衝液Ｂで、流速は１．２ｍｌ／分（分析用）と５ｍｌ／分（半製造用）であった。溶出液は２１５ｎｍ（分析用）と２３０ｎｍ（半製造用）においてモニタ−した。ＰＮＡ類の分子量は、最も多い同位元素の平均値から252Ｃｆプラズマ脱着の飛行時間質量分光測定法によって決定した。
【０１０５】
実施例１７
Ａｃｒ１−［Ｔａｅｇ］15−ＮＨ2およびより短い誘導体の固相合成（ａ）Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂の段階的合成この合成は、事前膨潤させ、中和したＢＨＡ樹脂１００ｍｇの上で（定量的ニンヒドリン反応によって０．５７ｍｍｏｌ／ＮＨ2／ｇ含有する旨決定された）、３．２等量のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐをほぼ３３％のＤＭＦ／ＣＨ２Ｃｌ２中で用いて開始した。個別のカップリング反応は、手動操作する、６ｍｌの標準固相反応容器内で少なくとも１２時間振盪することによって実施し、未反応のアミノ基は、合成の選択された段階でアセチル化することによってブロックした。鎖延長の過程は、定量的ニンヒドリン反応によっていくつかの段階でモニタ−した（第Ｉ表を参照）。保護されたＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−ＢＨＡ、Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−ＢＨＡおよびＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡの一部を、それぞれ５、１０および１５の残基を構築した後で取り出した。
【０１０６】
【表１】
2008253251.tif 000009
【０１０７】
（ｂ）Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂の合成残留Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂（推定乾燥重量はほぼ３０ｍｇ；０．００２ｍｍｏｌ成長鎖）の脱保護を行ったあと、３ｍｌの固相反応容器において、Ｈ−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂を６６％ほぼＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2１ｍｌ中ほぼ５０当量（８０ｍｇ；０．１１ｍｍｏｌ）のＡｃｒ１−ＯＰｆｐ（即ち、ペンタフルオロフェノ−ル０．１１Ｍ溶液）に反応させた。定量的ニンヒドリン反応によって判定されたように、アクリジン部のカップリングはほぼ定量的に近似していた。
【０１０８】
（ｃ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］15−ＮＨ2の開裂、精製および同定保護されたＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−ＢＨＡ樹脂の一部を、塩化メチレン中５０％のトリフルオロ酢酸と反応させて、ＨＦ開裂に先だってＮ−末端Ｂｏｃ（これは、潜在的に有害な三級−ブチルの前駆体である）を除去した。中和しかつ洗浄し（”合成実験記録”工程２−４の方法と同様の方法で）次いで真空で２時間乾燥した後、生じた６７．１ｍｇ（乾燥重量）のＨ−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂を０℃において６０分間攪拌しつつ５ｍｌのＨＦ：アニソ−ルで開裂させた。ＨＦを除去した後、残渣を乾燥ジエチルエ−テル（４ｘ １５ｍｌ、それぞれ１５分間）とともに攪拌して、アニソ−ルを除去し、フリット処理したガラス漏とで重力ろ過し、乾燥させた。ＰＮＡを次ぎに６０ｍｌ（４ ｘ １５ｍｌ、それぞれ１５分間攪拌）の酢酸水溶液に抽出した。この溶液のいくつかのアリコ−トを分析用逆相ＨＰＬＣによって分析して、この粗製ＰＮＡの純度を測定した。１３．０分における主ピ−クは、前吸光率のほぼ９３％を占めていた。残りの溶液は、凍らせ、次いで凍結乾燥すると、粗製物がほぼ２２．９ｍｇが得られた。最後に、１９．０ｍｇのこの粗製物をそれぞれ１ｍｌの水に３．８ｍｇを含む五つのバッチから精製した。この主ピ−クは、半合成用逆相カラムを用いて集めた。アセトニトリルをスピ−ドｖａｃで除き、残留溶液を凍結し（ドライアイス）、その後凍結乾燥させると、９９％以上の純度のＨ−［Ｔａｅｇ］5−ＮＨ2が１３．１ｍｇ得られた。このＰＮＡ分子は、直ちに水に溶解し、質量分光分析による測定に基づいて正確な分子量を有していた。（Ｍ＋Ｈ）+について、計算したｍ／ｚ値は１３４９．３でありまた測定したｍ／ｚ値は１３４７．８であった。
【０１０９】
（ｄ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−ＮＨ2の開裂、精製および同定保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−ＢＨＡの一部を上記（ｃ）項において記載したように処理し、１８．９ｍｇの乾燥Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−ＢＨＡ樹脂をＨＦ開裂すると１１．０ｍｇの粗製物が得られた。１５．５分における主ピ−クは、全吸光度のほぼ５３％を占めていた。ほぼ１ｍｇのこの粗製物を繰り返して（下記する理由によって）、少なくとも８０％の、恐らくは９９％以上の純度のＨ−［Ｔａｅｇ］10−ＮＨ2がほぼ１ｍｇ得られた。標的ピ−クの後で溶出しかつ全吸光度のほぼ２０％を占めるもう少しブロ−ドのテイル部は、繰り返し精製しても除去出来なかった（若干減少しただけ）。質量スペクトルは正確な分子量のＨ−［Ｔａｅｇ］10−ＮＨ2の存在を確認するものであったが、そのスペクトルから判定して、このようなテイル現象は、多少とも充分に定義された、いくつかの凝集／配座状態にある標的分子によるものである。従って、この粗製物は、標的分子を上記した５３％以上は含有している可能性がある。Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−ＮＨ2は、水に容易に溶解する。（Ｍ＋Ｈ）+については、計算ｍ／ｚ値は２６７９．６でありかつ測定ｍ／ｚ値は２６８１．５であった。
【０１１０】
（ｅ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］15−ＮＨ2の開裂、精製および同定保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−ＢＨＡ樹脂の一部を（ｃ）項において記載したと同様に処理して、１３．９ｍｇの乾燥Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂をＨＦ開裂して３．２ｍｇの粗製物を得た。２２．６分における主ピ−クは、ブロ−ドな膨れ部に位置し、全吸光度のほぼ６０％を占めていた（第１２ａ図）。再び（前項を参照）、この膨れ部は、質量スペクトルによってこの集積した”膨れ部”を分析したところ、他の分子の存在がないことが判ったので、いくつかの凝集／配座状態の標的分子Ｈ−［Ｔａｅｇ］15−ＮＨ2によるものである。この粗製物を全て”膨れ部”を集めて精製したところ、ほぼ２．８ｍｇの物質を得た。（Ｍ＋Ｈ）＋については、計算ｍ／ｚ値は４０３３．９でありかつ測定ｍ／ｚ値は４０３２．９であった。
【０１１１】
（ｆ）Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−ＮＨ2の開裂、精製および同定保護されたＡｃｒ１−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂の一部を（ｂ）項において記載したように処理して２９．７ｍｇの乾燥Ａｃｒ１−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂をＨＦ開裂して１４．３ｍｇの粗製物を得た。全て合わせると、２３．７に分における主ピ−クおよび２９．２分における”ダイマ−”（下記を参照）は、全吸光度のほぼ４０％を占めていた（第１２ｂ図）。この粗製物を繰り返し精製して、恐らくは９９％以上の純度のＡｃｒ１−［Ｔａｅｇ］15−ＮＨ2 −２７．４分、２９．２分および最後に１００％緩衝液Ｂで溶出する大きく、ブロ−ドな膨れ部として溶出する自己凝集分子で”汚染された”−がほぼ１ｍｇ得られた（第１２ｃ図）。このような解釈は、これらのピ−クが酢酸水溶液中において放置すると（数時間）成長し、最後に定量的に下降するという観察結果と一致する。（Ｍ＋Ｈ）＋については、計算ｍ／ｚ値は４５９３．６でありかつ測定ｍ／ｚ値は４５８８．７であった。
【０１１２】
（ｇ）合成実験記録１（１）ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、ｖ／ｖ）によるＢｏｃ−脱保護、３ｍｌ、３ｘ１分および１ｘ３０分；（２）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、３ｍｌ、６ｘ１分；（３）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、３ｍｌ、３ｘ２分；（４）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、３ｍｌ、６ｘ１分、および１分間のドレ−ン；（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試料を取り出し、完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して置換度を測定する；（６）１ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した３．２当量の（０．１８ｍｍｏｌ；１００ｍｇ）ＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを添加し、次いで０．５ｍｌのＤＭＦ（最終のペンタフルオロフェノ−ル濃度＾０．１２Ｍ））を添加する；（７）ＤＭＦによる洗浄、３ｍｌ、１ｘ２分；（８）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、３ｍｌ、４ｘ１分；（９）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、３ｍｌ、２ｘ２分；（１０）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、３ｍｌ、６ｘ１分；（１１）２−５ｍｇの保護ＰＮＡ樹脂試料を取り出し、迅速ニンヒドリン定量試験に供し、さらに２−５ｍｇをよく乾燥してニンヒドリン定量分析に供して、カップリング度を測定する（サイクル７、１０および１５の後で、未反応アミノ基を塩化メチレン中でＮ−アセチルイミダゾ−ルによるアセチル化を行いブロックした）。
【０１１３】
実施例１８
Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ−ＮＨ2および短鎖誘導体の固相合成
【０１１４】
（ａ）Ａｃｒ１−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の段階的構築この合成は、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）を予め膨潤させ、中和したＢＨＡ樹脂（０．５７ｍｍｏｌＮＨ2／ｇ）１００ｍｇに定量的にロ−ディング（純ＣＨ２Ｃｌ２中での標準的ＤＣＣによるｉｎ−ｓｉｔｕカップリング）することによって開始した。この保護したＰＮＡ樹脂鎖をさらに延長するために、ほぼ３３％ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2中３．２当量のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを用いて、サイクル１から５までおよび１０から１５までについて単一カップリング（”合成実験記録２”）を用いた。サイクル５から１０までは、ほぼ３３％ＳＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2中遊離の酸ＢｏｃＴａｅｇ−ＯＨをまた別のストレ−トＤＣＣ（即ち、ｉｎｓｉｔｕ）カップリングさせる方法を用いた。全てのアカップリング反応を手動操作式の６ｍｌ標準固相反応容器中において少なくとも１２時間振盪することによって実施した。未反応のアミノ基を、実施例１７において行ったと同様に、この合成の同じ段階においてアエチル化することによってブロックした。保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂およびＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂を一部ずつ、５および１０ＰＮＡ残基を組み立てた後で取り出した。Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の分析用ＨＰＬＣクロマトグラムから判定して（（ｅ）項を参照）、ＰＮＡ残基５から１０までにさらに”遊離酸”カップリングさせても、実施例１７における完全単一カップリングした残基と比較して、合成収率は改善されることはなかった。
【０１１５】
（ｂ）Ａｃｒ１−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の合成Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の一部を脱保護した後で（推定乾燥重量はほぼ９０ｍｇ；＾０．０１ｍｍｏｌの成長鎖）、このＨ−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂に３ｍｌの固相反応容器のおいてほぼ６６％ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2中ほぼ２０当量の（１４１ｍｇ；０．１９ｍｍｏｌ）のＡｃｒ１−ＯＰｆｐを反応させた。定量的ニンヒドリン反応から判定して、アクリジン部のカップリングは、定量的に近かった。
【０１１６】
（ｃ）Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の合成残留Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂（推定乾燥重量はほぼ７０ｍｇ；０．００５ｍｍｏｌ成長鎖）を脱保護したあとで、このＨ−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂に３ｍｌの固相反応容器のおいてほぼ６６％ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2中ほぼ２５当量の（９１ｍｇ；０．１２ｍｍｏｌ）のＡｃｒ１−ＯＰｆｐを反応させた。定量的ニンヒドリン反応から判定して、アクリジン部のカップリングは、定量的に近かった。
【０１１７】
（ｄ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］5−ＮＨ2の開裂、精製および同定保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の一部を実施例１７ｃにおいて記載したように処理し、１９．０ｍｇの乾燥Ｈ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂をＨＦ開裂すると８．９ｍｇの粗製物が得られた。１２．２分における主ピ−クは（１０％酢酸溶液の代わりに水溶液から注入すると１４．２分において溶出）、全吸光度のほぼ９０％を占めていた。ほぼ２．２ｍｇの粗製物を精製すると、９９％純度のＨ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ−ＮＨ２がほぼ１．５ｍｇ得られた。
【０１１８】
（ｅ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2の開裂、精製および同定保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の一部を実施例１７ｃにおいて記載したように処理し、７．０ｍｇの乾燥Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂をＨＦ開裂すると１．７ｍｇの粗製物が得られた。１５．１分における主ピ−クは（１０％酢酸溶液の代わりに水溶液から注入すると１７．０分において溶出）、全吸光度のほぼ５０％を占めていた。ほぼ１．２ｍｇの粗製物を精製すると、９５％以上の純度のＨ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2がほぼ０．２ｍｇ得られた。（Ｍ＋Ｈ）+については、計算ｍ／ｚ値は２８０７．８でありかつ測定ｍ／ｚ値は２８０８．２であった。
【０１１９】
（ｆ）Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2の開裂、精製および同定保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の９９．１ｍｇ（乾燥重量）を実施例１７ｃにおいて記載したように処理し、４２．２ｍｇの粗製物を得た。２５．３分における主ピ−クは（１０％酢酸溶液の代わりに水溶液から注入する２３．５分において溶出）、全吸光度のほぼ４５％を占めていた。８．８７ｍｇの粗製物を精製すると、９７％以上の純度のＨ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2がほぼ５．３ｍｇ得られた。（Ｍ＋Ｈ）+については、計算ｍ／ｚ値は２８５０．８でありかつ測定ｍ／ｚ値は２８４９．８であった。
【０１２０】
（ｇ）Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ−ＮＨ2の開裂、精製および同定保護したＡｃｒ１−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の７８．７ｍｇ（乾燥重量）を実施例１（ｃ）項において記載したように開裂させ、３４．８ｍｇの粗製物を得た。２３．５分における主ピ−ク（１０％酢酸溶液の代わりに水溶液から注入しても同じ溶出時刻において溶出）および２８．２分における”ダイマ−”は、全吸光度のほぼ３５％を占めていた。ほぼ４．５ｍｇの粗製物を精製すると、９５％以上の純度のＨ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2がほぼ１．６ｍｇ得られた。この化合物は、”ダイマ−”ピ−クを無くすことは出来ず、酢酸水溶液中に放置すると増大した。
【０１２１】
（ｈ）合成実験記録２（１）ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、ｖ／ｖ）によるＢｏｃ−脱保護、３ｍｌ、３ｘ１分および１ｘ３０分；（２）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、３ｍｌ、６ｘ１分；（３）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、３ｍｌ、３ｘ２分；（４）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、３ｍｌ、６ｘ１分、および１分間のドレ−ン；（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試料を取り出し、完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供する；（６）サイクル１から５までおよびサイクる１０から１５までに就いては、カップリング反応は、１ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した３．２当量の（０．１８ｍｍｏｌ；１００ｍｇ）ＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを添加し、次いで０．５ｍｌのＤＭＦ（最終のペンタフルオロフェノ−ル濃度＾０．１２Ｍ））を添加することによって実施した；このカップリング反応は、振盪しつつ全体として１２−２４時間進行させた；サイクル５から１０までは、１．５ｍｌのＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：２、ｖ／ｖ）中で０．１２ＭＢｏｃＴａｅｇ−ＯＨをさらに０．１２ＭＤＣＣでカップリングさせた；（７）ＤＭＦによる洗浄、３ｍｌ、１ｘ２分；（８）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、３ｍｌ、４ｘ１分；（９）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、３ｍｌ、２ｘ２分；（１０）ＣＨ２Ｃｌ２による洗浄、３ｍｌ、６ｘ１分；（１１）２−５ｍｇの保護ＰＮＡ樹脂試料を取り出し、迅速ニンヒドリン定量試験に供し、さらに２−５ｍｇをよく乾燥してニンヒドリン定量分析に供してる（サイクル７、１０および１５の後で、未反応アミノ基を塩化メチレン中でＮ−アセチルイミダゾ−ルによるアセチル化を行いブロックした）。
【０１２２】
実施例１９
Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2の改善された固相合成保護されたＰＮＡをＭＢＨＡ樹脂の上で、前記実施例において使用したＢＨＡ樹脂のロ−ディングのほぼ半分を用いて構築した。更には、一つのサイクルを除いて全てのサイクルは、カップリングしないアミノ基をアセチル化することによってこれに従った。以下にこの合成法を詳細に記述する：
【０１２３】
（ａ）当初置換度が０．３ｍｍｏｌ／ｇのＢｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＮＨ−ＣＨ（ｐ−ＣＨ3−Ｃ6Ｈ4）−Ｃ６Ｈ４樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）の製造Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の所望の置換度は０．２５−０．３０ｍｍｏｌ／ｇであった。この数値を得るために、１．５ｍｍｏｌのＢｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）を、６０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中にて単一ｉｎ−ｓｉｔｕカップリング（１．５ｍｍｏｌのＤＣＣ）剤を用いて、中和し、事前に膨潤させたＭＢＨＡ樹脂（定量ニンヒドリン反応によって０．６４ｍｍｏｌＮＨ２／ｇを含有することが測定された）５．０ｇにカップリングさせた。この反応は、手動操作式の２２５ｍｌ標準固相反応容器の中において３時間振盪することによって実施した。未反応のアミノ基を無水酢酸．ピリジン／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１：２、ｖ／ｖ／ｖ）の混合物を用いて１８時間アセチル化してブロックした。中和した樹脂の上での定量的ニンヒドリン反応を行ったところ、僅か０．０００９３ｍｍｏｌ／ｇの遊離アミンが残留すること（第Ｉ表を参照）、即ち原初のアミノ基の０．１５が残留していることが判った。置換度は、脱保護しニンヒドリン分析して決定したが、中和したＨ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂について０．３２ｍｍｏｌ／ｇであることが判った。０．３０ｍｍｏｌＢｏｃ０Ｌｙｓ（ＣＩＺ）／ｇ樹脂なる定量的カップリングに対する最大値０．２８ｍｍｏｌ／ｇと充分に比肩できるものである（第ＩＩ表を参照）。
【０１２４】
（ｂ）Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］3−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の段階的構築（ａ）項で製造したＨ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の全バッチをそのまま（同じ反応容器中において）用いて、２．５当量のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを純ＣＨ2Ｃｌ2中において用いて単一カップリング（”合成実験記録３”）によってＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］3−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂を構築した。定量的ニンヒドリン反応を、この合成全体にわたって適用した（第ＩＩ表を参照）。
【０１２５】
（ｃ）Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の段階的合成湿潤Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］3−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂ほぼ４．５ｇ（＾０．３６ｍｍｏｌの成長鎖；（ｂ）項において製造した全部で１９ｇの湿潤樹脂から取り出した）を、５５ｍｌのＳＰＰＳ反応容器のなかに入れた。Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂を、ほぼ３０％ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2中において２．５当量のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを用いて単一カップリング（”合成実験記録４”）で構築した。合成の進行は、全ての段階において定量的ニンヒドリン反応によってモニタ−した（第ＩＩ表を参照）。
【０１２６】
（ｄ）Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の段階的構築湿潤Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］3−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂ほぼ１ｇ（０．０９ｍｍｏｌｏの成長鎖；（ｃ）項におい手製造した全部で４ｇの湿潤樹脂から取り出した）を、２０ｍｌのＳＰＰＳ反応容器のなかに入れた。Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂を、ほぼ３０％ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2中において２．５当量のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを用いて前記した項において使用した単一カップリング合成実験記録によって構築した。反応容量は３ｍｌであった（激しく振盪）。合成は、定量的ニンヒドリン反応によってモニタ−した（第ＩＩ表を参照）。
【０１２７】
【表２】
2008253251.tif 000010
【０１２８】
（ｅ）Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の合成Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の一部を（推定乾燥重量はほぼ４５ｍｇ）脱保護した後、この樹脂を３ｍｌの固相反応容器の中において無水酢酸／ピリジン／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１：１、ｖ／ｖ／ｖ）の混合液２ｍｌを用いて２時間定量的にアセチル化した。
【０１２９】
（ｆ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2の開裂、精製および同定保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の一部を実施例１７ｃにおいて記載したように処理して、７６ｍｇの乾燥Ｈ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂をＨＦ開裂すると２４ｍｇの粗製物が得られた。１５．２分における主ピ−クは（欠失ペプチドや種々の副生物などの不純物を含む）、全吸光度のほぼ７８％を占めていた。このピ−クはまた、”主ピ−クおよび欠失ピ−ク”吸光度のほぼ８８％を占めていたが、このことは、第ＩＩ表における個別のカップリング収率をまとめて得た全推定カップリング収率としての９０．１％と用く合致している。７．２ｍｇの粗製物を二つのバッチから半合成用逆相カラムを用いて精製した（主ピ−クをドライアイス／２−イソプロパノ−ルで冷却したビ−カ−に集める）。それぞれは、Ｈ2Ｏ１ｍｌ中に３．６ｍｇを含有していた。凍結した溶液をそのまま凍結乾燥して（ｓｐｅｅｄ ｖａｃにおいてアセトニトリルを予め除去することなく）８２％純度のＨ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2がほぼ４．２ｍｇ得られた。
【０１３０】
（ｇ）Ａｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2の開裂、精製および同定保護したＡｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の４００．０ｍｇ（乾燥重量）を実施例１７ｃにおいて記載したように開裂させたが、ＴＦＡ処理を行うことはせずに、１１．９ｍｇの粗製物を得た。１５．８分における主ピ−クは、全吸光度のほぼ７５％を占めていた。４．８ｍｇの粗製物を精製すると、９５％以上の純度のＨ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2がほぼ３．５ｍｇ得られた。（Ｍ＋Ｈ）+については、計算ｍ／ｚ値は２８４９．８でありかつ測定ｍ／ｚ値は２８４８．８であった。
【０１３１】
（ｈ）合成実験記録３（１）ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、ｖ／ｖ）によるＢｏｃ−脱保護、３ｍｌ、３ｘ１分および１ｘ３０分；（２）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、１００ｍｌ、６ｘ１分；（３）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、１００ｍｌ、３ｘ２分；（４）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、１００ｍｌ、６ｘ１分、および１分間のドレ−ン；（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試料を取り出し、完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して、置換度を測定する；（６）３５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した２．５当量の（３．７５ｍｍｏｌ；２．０６４ｇ）ＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを添加（最終ペンタフルオロフェノ−ルの濃度は〜０．１Ｍ）；カップリング反応は、振盪しつつ合わせて２０−２４時間進行させた；（７）ＤＭＦによる洗浄、１００ｍｌ、１ｘ２分（ＢｏｃＴａｅｇ−ＯＨの沈殿を除去するため）；（８）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、１００ｍｌ、４ｘ１分；（９）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、１００ｍｌ、２ｘ２分；（１０）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、１００ｍｌ、６ｘ１分；（１１）２−５ｍｇの保護ＰＮＡ樹脂試料を取り出し、迅速ニンヒドリン定量試験に供し、さらに２−５ｍｇをよく乾燥してニンヒドリン定量分析に供してカップリング度を測定；（１２）無水酢酸／ピリジン／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１：１、ｖ／ｖ／ｖ）の混合液１００ｍｌを用いて２時間アセチル化を行って未反応アミノ基をブロックする；（１３）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、１００ｍｌ、６ｘ１分；（１４）２ｘ ２−５ｍｇの保護ＰＮＡ樹脂試料を取り出し、ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）で中和し次いでＣＨ2Ｃｌ2で洗浄してニンヒドリン定性および定量分析に供する。
【０１３２】
（ｉ）合成実験記録４（１）ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、ｖ／ｖ）によるＢｏｃ−脱保護、２５ｍｌ、３ｘ１分および１ｘ３０分；（２）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２５ｍｌ、６ｘ１分；（３）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、２５ｍｌ、３ｘ２分；（４）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２５ｍｌ、６ｘ１分、および１分間のドレ−ン；（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試料を取り出し、完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して、置換度を測定する；（６）６ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した２．５当量の（０．９２ｍｍｏｌ；０．５０６ｇ）ＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを添加ｓｉ，次いで３ｍｌのＤＭＦを添加（最終ペンタフルオロフェノ−ルの濃度は〜０．１Ｍ）；カップリング反応は、振盪しつつ合わせて２０−２４時間進行させた；（７）ＤＭＦによる洗浄、２５ｍｌ、１ｘ２分；（８）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２５ｍｌ、４ｘ１分；（９）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、１００ｍｌ、２ｘ２分；（１０）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２５ｍｌ、６ｘ１分；（１１）２−５ｍｇの保護ＰＮＡ樹脂試料を取り出し、迅速ニンヒドリン定量試験に供し、さらに２−５ｍｇをよく乾燥してニンヒドリン定量分析に供してカップリング度を測定；（１２）無水酢酸／ピリジン／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１：２、ｖ／ｖ／ｖ）の混合液２５ｍｌを用いて２時間アセチル化を行って未反応アミノ基をブロックする（最初のサイクルの後は除く）；（１３）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、１００ｍｌ、６ｘ１分；（１４）２ｘ ２−５ｍｇの保護ＰＮＡ樹脂試料を取り出し、ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）で中和し次いでＣＨ2Ｃｌ2で洗浄してニンヒドリン定量分析に供する。
【０１３３】
実施例２０Ｈ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ−ＮＨ2の固相合成      
【０１３４】
（ａ）Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の段階的合成湿潤Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］3−Ｃａｅｇ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂をほぼ２．５ｇ（残留するほぼ１６ｇの全湿潤樹脂の〜１／６；〜０．７５ｇ乾燥樹脂〜０．１５ｍｍｏｌの成長鎖）６ｍｌのＳＰＰＳ反応容器に入れた。Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−［Ｔａｅｇ］4−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂を、ほぼ３０％のＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2２．５ｍｌの中において通常の２．５当量のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを用いて全てのＴａｅｇ残基を二重カップリングさせて構築した。但し、最初の残基は単一カップルさせた。Ｃ（Ｚ）ａｅｇ−残基の導入は、ＴＨＦ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：２、ｖ／ｖ）中においてＢｏｃＣ（Ｚ）ａｅｇ−ＯＰｆｐの２当量でカップリングさせて行った。この合成の進行は、定量的ニンヒドリン反応によって全ての段階でモニタ−した（表ＩＩＩ）。
【０１３５】
【表３】
2008253251.tif 000011
【０１３６】
（ｂ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−［Ｔａｅｇ］4−Ｌｙｓ−ＮＨ2の開裂、精製および同定保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−［Ｔａｅｇ］4−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の一部を実施例１の第ｃ項において記載したように処理し、６６．９ｍｇの乾燥したＨ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−［Ｔａｅｇ］4−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂をＨＦで開裂させて１４．４ｍｇの粗製物を得た。１４．５分における主ピ−クは、全吸光度のほぼ５０％を占めていた。１００ｍｇの粗製物を精製すると（８バッチ；それぞれ１ｍｌのＨ2Ｏに溶解）、９６％の純度のＨ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−［Ｔａｅｇ］4−Ｌｙｓ−ＮＨ2がほぼ９．１ｍｇ得られた。（Ｍ＋Ｈ）＋については、計算ｍ／ｚ値は２７９３．８でありかつ測定ｍ／ｚ値は２７９０．６であった。
【０１３７】
実施例２１
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−（ｂｏｃアミノエチル）グリシンアミノエチルグリシン（５２．８６ｇ；０．４４７ｍｏｌ）を水（９００ｍｌ）に溶解し、ジオキサン（９００ｍｌ）を加えた。このｐＨを２Ｎ−ＮａＯＨで１１．２に調節した。ｐＨを１１．２に保持しつつ、三級−ブチル−ｐ−ニトロフェニル炭酸エステル（１２８．４ｇ；０．５３７ｍｏｌ）をジオキサン（７２０ｍｌ）に溶解し、２時間かけて滴下した。このｐＨを少なくともさらに３時間保持し、次いで攪拌しつつ一夜放置した。黄色の溶液を０℃に冷却し、次いでｐＨを２Ｎ−ＨＣｌで３．５に調節した。混合物をクロロホルム（４ｘ １００ｍｌ）で洗浄し、水相のｐＨを０℃で２Ｎ−ＮａＯＨで再び９．５に調節した。塩化ベンジルオキシカルボニル（７３．５ｍｌ； ０．５１５ｍｌ）を、ｐＨを２Ｎ−ＮａＯＨで９．５に保持しつつ半時間かけて添加した。このｐＨをこの後４時間頻繁に調節し、この溶液を攪拌しつつ一夜放置した。翌日、この溶液をエ−テル（３ｘ ６００ｍｌ）で洗浄し、そのｐＨを０℃において２Ｎ−ＨＣｌで１．５に調節した。表題化合物を酢酸エチル（５ ｘ １０００ｍｌ）で抽出して単離した。この酢酸エチル溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空において蒸発乾凅した。こうして１３８ｇが得られたが、こののもをエ−テル（３００ｍｌ）に溶解し、石油エ−テル（１８００ｍｌ）を加えて沈殿させた。収率：１２４．７ｇ（７９％）。ｍ．ｐ．６４．５−８５℃。Ｃ17Ｈ24Ｎ2Ｏ6の元素分析、測定値（理論値） Ｃ：５８．４０（５７．９４）；Ｈ：７．０２（６．８６）；Ｎ：７．９４（７．９５）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）７．３３ ＆ ７．３２（５Ｈ，Ｐｈ）；５．１５ ＆ ５．１２（２Ｈ，ＰｈＣＨ2）；４．０３＆ ４．０１（２Ｈ．ＮＣＨ2ＣＯＨ）；３．４６（ｂ，２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ2ＣＨ2）；３．２８（ｂ，２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ2ＣＨ2）；１．４３ ＆ １．４０（９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）。ＨＰＬＣ（２６０ｎｍ）２０．７１ｍｉｎ．（８０．２％）および２１．５７ｍｉｎ．（１９．８％）。ＵＶ−スペクトル（２００ｎｍ−３００ｎｍ）は同一であり、小さいピ−クはＢｉｓ−Ｚ−ＡＥＧから成ることが明かとなっている。
【０１３８】
実施例２２
Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシネチルエ−テルＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ’−（ｂｏｃアミノエチル）グリシン（６０．０ｇ；０．１７０ｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（６．００ｇ）を無水エタノ−ル（５００ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却して、その後にＤＣＣ（４２．２ｇ；０．２０４ｍｏｌ）を添加した。５分後に氷浴を取り除いて、攪拌をさらに２時間継続した。沈殿したＤＣＵ（乾燥して３２．５ｇ）をろ過して除去し、エ−テル（３ｘ １００ｍｌ）で洗浄した。濾液を併せて、希硫酸水素ナトリウム液（２ ｘ ４００ｍｌ）、希炭酸水素ナトリウム液（２ ｘ ４００ｍｌ）および飽和塩化ナトリウム液（１ｘ ４００ｍｌ）で次々に洗浄した。有機相をろ過し、次いで硫酸マグネシウムで乾燥し、真空において蒸発乾凅し、その結果ＤＣＵを含有するオイル状物質６６．１ｇが得られた。この油状物を無水エタノ−ル（６００ｍｌ）に溶解し、パラジムカ−ボン（６．６ｇ）を加えた。この溶液を大気圧で水素添加したが、この際保存容器は２Ｎ−水酸化ナトリウムで満たした。４時間後、４．２Ｌの理論値に比較して、３．３Ｌが費消された。この反応混合物をセライトでろ過し、真空において蒸発乾凅したところ、油状物質が３９．５ｇ（９４％）が得られた。この油状物質１３ｇをシリカゲル（６００ｇＳｉＯ2）クロマトグラフィ−で精製した。塩化メチレン中２０％の石油エ−テル３００ｍｌで溶出した後で、表題化合物を塩化メチレン中５％メタノ−ル１７００ｍｌで溶出させた。溶媒を満足するべき純度のフラクションから真空において揮散させた。収率は８．４９ｇであった。その代わりに、粗製物１０ｇをＫｕｇｅｌＲｏｈｒ蒸留で精製した。１Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ）４．７７（ｂ，ｓＮＨ）；４．１８（ｑ，２Ｈ，ＭｅＣＨ2−）；３．３８（ｓ，２Ｈ，ＮＣＨ2ＣＯ2Ｅｔ）；３．１６（ｔ，２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ2ＣＨ2）；２．６８（ｔ，２Ｈ．ＢｏｃＮＨＣＨ2ＣＨ2）；１．４３（ｓ，９Ｈ，ｔＢｕ）および１．２６（ｔ，３Ｈ，ＣＨ3）。13Ｃ−ＮＭＲ１７１．４（ＣＯＥｔ）；１５６．６（ＣＯ）；７８．３（（ＣＨ3）Ｃ）；５９．９（ＣＨ2）；４９．０（ＣＨ2）；３９．０（ＣＨ2）；２６．９（ＣＨ2）および１２．６（ＣＨ3）。
【０１３９】
実施例２３
Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエ−テルメタノ−ルをエタノ−ルの代わりに変えて、上記した方法を用いた。最終製品は、カラム精製法で精製した。
【０１４０】
実施例２４
１−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）チミンエチルエステルＮ’−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエ−テル（１３．５ｇ；５４．８ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ（９．８４ｇ；６０．３ｍｍｏｌ）および１−カルボキシメチルチミン（１１．１ｇ；６０，３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２１０ｍｌ）に溶解した。塩化メチレン（２１０ｍｌ）を次に加えた。この溶液をエタノ−ル／氷浴で０℃にまで冷却し、ＤＣＣ（１３．６ｇ；６５．８ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を１時間後に取り除き、攪拌をさらに常温で２時間続行した。沈殿したＤＣＵをろ過して除き、塩化メチレン（２ｘ ７５ｍｌ）で二度洗浄した。濾液を合わせて、これにさらに塩化メチレン（６５０ｍｌ）を加えた。この溶液を稀重炭酸ナトリウム液（３ ｘ ５００ｍｌ）、希硫酸水素ナトリウム液（２ｘ５００ｍｌ）および飽和塩化ナトリウム液（１ ｘ ５００ｍｌ）で連続して洗浄した。若干の沈殿をろ過して有機相から除去し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空において蒸発乾凅した。オイル状の残渣を塩化メチレン（１５０ｍｌ）に溶解し、ろ過し、表題化合物を０℃において石油エ−テル（３００ｍｌ）を加えて沈殿させた。この塩化メチレン／石油エ−テルの方法をもう一度繰り返し、これによって物質１６．０ｇ（７１％）が得られたが、これは、ＨＰＬＣによって９９％以上の純度であった。
【０１４１】
実施例２５
１−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）チミン上記で得た物質をＴＨＦ（１９４ｍｌ．０．２Ｍ溶液が得られる）中に溶解し、１Ｍの水酸化リチウム水溶液（１１６ｍｌ）を加えた。この混合物を常温で４５分間攪拌し、次いでろ過して残留ＤＣＵを除去した。水（４０ｍｌ）をこの溶液に加え、次に塩化メチレン（３００ｍｌ）で洗浄した。さらに追加の水（３０ｍｌ）を加え、このアルカリ性の溶液をさらにもう一度塩化メチレン（１５０ｍｌ）で洗浄した。この水溶液を０℃にまで冷却し、ｐＨを１Ｎ−ＨＣｌ（ほぼ１１０ｍｌ）を滴下して２に調節した。表題化合物を酢酸エチル（９ｘ ２００ｍｌ）で抽出し、抽出液を併せて、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中において蒸発乾凅した。残渣をもう一度メタノ−ルから蒸発させて、一夜乾燥させると、無色のガラス様の固体が得られた。収率：９．５７ｇ（６４％）。ＨＰＬＣ＞９８％ＲT ＝ １４．８ｍｉｎ。元素分析、Ｃ16Ｈ24Ｎ4Ｏ7Ｃ・０．２５Ｈ2Ｏ、実験値（理論値）Ｃ：４９．２９（４９．４２） Ｈ：６．５２（６．３５）； Ｎ：１４．１１（１４．４１）。二級アミド結合の周囲の回転が限定されているため、シグナルのいくつかが２：１の比率で二重化した（リストにおいて大きい方はｍｊでまた小さい方はｍｉで示してある）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：１２．７５（ｂ．ｓ，１Ｈ，ＣＯ2Ｈ）；１１．２８（ｓ，”１Ｈ”，ｍｊ．，ｉｍｉｄｅＮＨ）；１１．２６（ｂ．ｓ．．１Ｈ，ＣＯ2Ｈ）；７．３０（ｓ，”１Ｈ”，ｍｊ．，ＴＨ−６）；７．２６（ｓ，”１Ｈ”，ｍｉ．，Ｔ Ｈ−６）；６．９２（ｂ．ｔ．，”１Ｈ”，ｍｊ．，ＢｏｃＮＨ））；６．７３（ｂ．ｔ．，”１Ｈ”，ｍｉ．，ＢｃｏＮＨ））；４．６４（ｓ，”２Ｈ”，ｍｊ．，ＣＨ2ＣＯＮ）；４．４６（ｓ，”２Ｈ”，ｍｊ．，ＣＨ2ＣＯＮ）；４．１９（ｓ，”２Ｈ”，ｍｉ．，ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）；３．９７（ｓ，”２Ｈ”，ｍｊ．，ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）；３．６３−３．０１（分解されないｍ，水を含む，ＣＨ2ＣＨ2）；１．７５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）および（ｓ，９Ｈ，ｔＢｕ）。
【０１４２】
実施例２６
Ｎ4−ベンジルオキシカルボニル−１−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）シトシンＮ’−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエステル（５．００ｇ；２０．３ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ（３．６４ｇ；２２．３ｍｍｏｌ）およびＮ4−ベンジルオキシカルボニル−１−カルボキシメチルシトシン（６．７７ｇ；２２．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍｌ）に分散させた。塩化メチレン（１００ｍｌ）を次に加え、この溶液を０℃にまで冷却し、ＤＣＣ（５．０３ｇ；２４．４ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後に氷浴を取り除き、攪拌を常温でさらに１時間継続した。この反応混合物を真空において蒸発乾凅し、残渣をエ−テル（１００ｍｌ）中に分散させ、３０分間激しく攪拌した。固形物をろ過して単離し、エ−テル洗浄処理方法を二度繰り返した。希重炭酸ナトリウム液（ほぼ４％溶液、１００ｍｌ）とともに１５分間激しく攪拌し、ろ過して、水で洗浄した。この方法をもう一度繰り返し、乾燥後、放置すると淡黄色の固体物質が１７．９ｇ得られた。この固体をジオキサン（２００ｍｌ）とともに煮沸し、熱時ろ過した。冷却後、水（２００ｍｌ）を加えた。沈殿した物質をろ過して単離し、水で洗浄して、乾燥した。ＨＰＬＣ（２６０ｎｍにおいて観察）によれば、この物質は、ＤＣＵの他に純度として９９％であった。このエステルをＴＨＦ（１００ｍｌ）中に分散させ、０℃にまで冷却して、１Ｎ−ＬｉＯＨ（６１ｍｌ）を加えた。１５分間攪拌した後で、混合物をろ過し、濾液を塩化メチレン（２ｘ １５０ｍｌ）で洗浄した。このアルカリ性の溶液を０℃にまで冷却し、ｐＨを１Ｎ−ＨＣｌで２．０に調節した。表題化合物をろ過して単離して、水で一度洗浄すると、乾燥後に白色の粉体が１１．３ｇが得られた。この物質を塩化メチレン（３００ｍｌ）中に懸濁させ、石油エ−テル（３００ｍｌ）を加えた。ろ過し、次いで洗浄すると、乾燥後で７．１ｇ（６９％）が得られた。ＨＰＬＣの結果、ＲＴ＝１９．５分で純度が９９％でありまた１２．６分において、恐らくはＺ−で保護されたモノマ−である不純物（ほぼ１％）があることが判った。元素分析、Ｃ23Ｈ29Ｎ5Ｏ8、実験値（理論値） Ｃ：５４．１６（５４．８７）Ｈ：５．７６（５．８１）； Ｎ：１３．６５（１３．９１）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：１０．７８（ｂ．ｓ，１Ｈ，ＣＯ2Ｈ）；７．８８（二つのオ−バ−ラップする二重線，”１Ｈ”，ＣｙｔＨ−５）；７．４１−７．３２（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；７．０１（二つのオ−バ−ラップする二重線，”１Ｈ”，ＣｙｔＨ−５）；６．９４＆ ６．７８（ｕｎｒｅｓ．三重線、１Ｈ，ＢｏｃＮＨ）；５．１９（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ2））；４．８１＆ ４．６２（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯＮ）；４．１７＆ ３．９８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）；３．４２−３．０３（ｍ，水を含有，ＣＨ2ＣＨ2）および１．３８ ＆１．３７（ｓ，９Ｈ，ｔＢｕ）。13Ｃ−ＮＭＲ、１５０．８８；１２８．５２；１２８．１８；１２７．９６；９３．９０；６６．５３；４９．５８および２８．２２。ＩＲ：周波数、ｃｍ−１（強度）。３４２３（２６．４，３０３５（５３．２）、２９７８（４１．４））、１７３６（１７．３）、１６５８（３．８）、１５６３（２３．０）、１５０１（６。８）および１４５���（２６．２）
【０１４３】
実施例２７
９−カルボキシメチルアデニンエチルエステルアデニン（１０．０ｇ；７４ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１０．２９ｇ；７４．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦに懸濁させ、臭化酢酸エチル（８．２４ｍｌ；７４ｍｍｏｌ）を加えた。この懸濁液を室温で窒素雰囲気下で２．５時間攪拌し、次いでろ過した。固形の残渣をＤＭＦ（１０ｍｌ）三酸度洗浄した。濾液を併せて、真空において蒸発乾凅し、黄−オレンジ色の固形物質を水（２００ｍｌ）に注ぎ、４Ｎ−ＨＣｌをｐＨ〜６になるように加えた。０℃で１０分間攪拌した後で、固形物をろ過して除き、水で洗浄し、９６％エタノ−ルから再結晶した。表題化合物をろ過して単離し、エ−テルでよく洗浄した．収率：３。４ｇ（２０％）。ｍ．ｐ．２１５．−２２０℃。元素分析、Ｃ9Ｈ11Ｎ5Ｏ2、実験値（理論値） Ｃ：４８．８６（４８．６５）Ｈ：５．０１（４．９１）； Ｎ：３１．６６（３１．４２）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：（ｓ，２Ｈ，Ｈ−２ ＆ Ｈ−８）；７．２５（ｂ．ｓ．，２Ｈ，ＮＨ2）；５．０６（ｓ，２Ｈ，ＮＣＨ2））；４．１７（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１１Ｈｚ，ＯＣＨ2）および１．２１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１３Ｈｚ，ＮＣＨ2）。13Ｃ−ＮＭＲ。１５２．７０、１４１．３０、６１．４１、４３．９７および１４．０７。ＦＡＢ−ＭＳ．２２２（ＭＨ＋）。ＩＲ：周波数、ｃｍ−１（強度）。３８５５（５４．３），３２７４（１０．４）、３２４６（１４．０））、３１１７（５．３）、２９８９（２２．３）、２９４０（３３．９）、２８７６（４３．４），２７５３（４９．０），２３４６（５６．１），２１０６（５７．１），１８９９（５５．７），１７６２（１４．２），１７４２（１４．２），１７４２（１．０），１６７１（１．８），１６４４（１０．９），１６０６（０．６），１５８２（７．１），１５２２（４３．８），１４７７（７．２），１４４５（３５．８）および１４２２（８．６）。アルキル化の位置は、９６％エタノ−ルから再結晶して得た結晶についてのＸ−線結晶学によって確認した。
【０１４４】
実施例２８
Ｎ6−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル（３．４０ｇ；１５．４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（５０ｍｌ）に緩やかに加熱して溶解させて、２０℃にまで冷却し塩化メチレン（５０ｍｌ）にＮ−エチルベンジルオキシカルボニルイミダゾ−ルＮ−エチル テトラフルオロ硼酸エステル（６２ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に氷で冷却しながら１５分かけて加えた。若干の沈殿が認められた。氷浴を取り除いて、溶液を一夜攪拌した。この反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム液（１００ｍｌ）で処理し、１０分間攪拌した後、二相を分離し、有機相を当量の水、希流酸水素ナトリウム液（二度）で、および飽和塩化ナトリウム液で連続して洗浄した。この溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空において蒸発乾凅したところ、油状物１１ｇが得られた。この物質を塩化メチレン（２５ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却し、石油エ−テル（５０ｍｌ）で沈殿させた。この方法をもう一度繰り返して、表題化合物３．４５ｇ（６３％）が得られた。ｍ．ｐ．１３２−３５℃。元素分析、Ｃ17Ｈ17Ｎ5Ｏ4、実験値（理論値） Ｃ：５６．９５（５７．４６）Ｈ：４．７１（４．８２）； Ｎ：１９．３５（１９．７１）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：８．７７（ｓ，１Ｈ，Ｈ−２ ＆ Ｈ−８）；７．９９（ｓ．，１Ｈ，Ｈ−２またはＨ−８）；７．４５−７．２６（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；５．３１（ｓ，２Ｈ，ＮＣＨ2））；４．９６（ｓ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ2）；４．２７（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ，ＣＨ2ＣＨ2）および１．３０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ，ＣＨ2ＣＨ3）。13Ｃ−ＮＭＲ。１５３．０９；１４３．１１；６７．８４；６２．５１；４４．２４および１４．０９。ＦＡＢ−ＭＳ：３５６（ＭＨ＋）および３１２（ＭＨ＋−ＣＯ2）。ＩＲ：周波数、ｃｍ−１（強度）。３４２３（５２．１）；３１８２（５２．８）；３１１５（５２．４））；３０３１（４７．９）；２９８１（３８．６）；１７４７（１．１）；１６１７（４．８），１５８７（８．４）；１５５２（２５．２）；１５１１（４５．２）；１４９２（３７．９）；１６４５（１４．０）および１４１３（３７．３）。
【０１４５】
実施例２９
Ｎ6−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルアデニンＮ6−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル（３．２０ｇ；９．０１ｍｍｏｌ）をメタノ−ル（５０ｍｌ）と混合し、０℃に冷却した。水酸化ナトリウム溶液（５０ｍｌ；２Ｎ）を加えたところ、この物質が急速に溶解した。０℃において３０分経過して、このアルカリ性溶液を塩化メチレン（２ｘ ５０ｍｌ）で洗浄し、０℃において４Ｎ−ＪＣｌでｐＨ１．０に調節したところ、表題化合物が沈殿した。ろ過し、水で洗浄しかつ乾燥後の収率は、３．０８ｇ（１０４％）であった。この製品は塩を含有しており、元素分析にこのことが反映されていた。元素分析、Ｃ15Ｈ13Ｎ5Ｏ4、実験値（理論値） Ｃ：４６．３２（５５．０５）Ｈ：４．２４（４．００）； Ｎ：１８．１０（２１．４０）およびＣ／Ｎ：２．５７（２．５６）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．７０（ｓ，１Ｈ，Ｈ−２＆ Ｈ−８）；７．５０−７．３５（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；５．２７（ｓ，２Ｈ，ＮＣＨ2）および５．１５（ｓ，２Ｈ，ｐＨ−ＣＨ2）。13Ｃ−ＮＭＲ。１６８．７７；１５２．５４；１５１．３６；１４８．７５；１４５．１３；１２８．５１；１２８．１７；１２７．９８；６６．６７および４４．６７。ＩＲ：周波数、（ＫＢｒ）。３４８４（１８．３）；３１０９（１５．９）；３０８７（１５．０））；２９６６（１７．１）；２９２７（１９．９）；２３８３（５３．８）；１９６０（６２．７），１７３９（２．５）；１６８８（５．２）；１６５５（０．９）；１５９４（１１．７）；１５６０（１２．３）；１５３０（２６．３）；１４９９（３０．５）；１４７５（１０．４）；１４５５（１４．０）；１４２９（２４．５）および１４１１（２３．６）。ＦＡＢ−ＭＳ：３２８（ＭＨ＋）および２８４（ＭＨ＋−ＣＯ2）。ＨＰＬＣ（２１５ｎｍ、２６０ｎｍ）、溶媒系１：１５．１８分、マイナ−な不純物は全てで２％以下。
【０１４６】
実施例３０
Ｎ6−ベンジルオキシカルボニル−１−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）アデニンエチルエステルＮ’−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエステル（２．００ｇ；８．１２ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ（１．４６ｇ；８．９３ｍｍｏｌ）およびＮ6−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルアデニン８２．９２ｇ；８．９３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解した。塩化メチレン（１５ｍｌ）を加え、この溶液をエタノ−ル／氷浴で０℃にまで冷却した。ＤＣＣ（２．０１ｇ；９．７４ｍｍｏｌ）を加え、２．５時間後に氷浴を取り除いて常温で１．５時間攪拌を継続した。沈殿したＤＣＵを濾して除去し、ＤＭＦ（１５ｍｌ）で一度、塩化メチレン（２ｘ １５ｍｌ）で二度洗浄した。濾液を併せ、これにさらに塩化メチレン（１００ｍｌ）を添加した。この溶液を希重炭酸ナトリウム液（２ｘ １００ｍｌ）、希流酸水素カリウム液（２ｘ １００ｍｌ）および飽和塩化ナトリウム液（１ Ｘ １００ ｍｌ）で連続して洗浄した。有機層を真空において蒸発乾凅し、こうして淡黄色の油状物質３．２８ｇ（７３％）が得られた。この粗製物のＨＰＬＣの結果、純度は僅かに６６％に過ぎず、主ピ−クよりも極性が高いかまたは低い不純物がいくつか含まれていることが判った。油状物を無視エタノ−ル（５０ｍｌ）に溶解し、活性炭を加えた。５分間攪拌した後で、溶液をろ過し、濾液を水（３０ｍｌ）と混合し一夜攪拌しつつ放置した。翌日、白色の沈殿をろ過して除去して、水で洗浄し、乾燥したところ、ＨＰＬＣによる純度が９８％以上である物質１．１６ｇ（２６％）が得られた。母液に水を加えたところ、純度がほぼ９５％である物質がさらに０．５３ｇ得られた。元素分析、Ｃ26Ｈ33Ｎ7Ｏ7・Ｈ2Ｏ、実験値（理論値） Ｃ：５５．０１（５４．４４）；Ｈ：６．８５（６．１５）およびＮ：１６．４７（１７．０９）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：８．７４（ｓ，１Ｈ，ＡｄｅＨ−２）；８．１８（ｂ．ｓ，１Ｈ，ＺＮＨ）；８．１０＆ ８．０４（ｓ，１Ｈ，Ｈ−８）；７．４６−７．３４（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；５．６３（ｕｎｒｅｓ．ｔ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨ）；５．３０（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ2）；５．１６＆ ５．００（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯＮ）；４．２９＆ ４．０６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）；４．２０（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ2ＣＨ３）；３．６７−３．２９（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2）；１．４２（ｓ，９Ｈ，ｔＢｕ）および１．２７（ｔ，３Ｈ，ＯＣＨ2ＣＨ3）。スペクトルの結果、痕跡量のエタノ−ルおよびＤＣＵの存在が明となった。
【０１４７】
実施例３１
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）アデニンＮ6−ベンジルオキシカルボニル−１−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）アデニンエチルエステル（１．４８ｇ；２．６６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１３ｍｌ）中に懸濁させ、混合物を０℃に冷却した。水酸化リチウム（８ｍｌ；１Ｎ）を添加し、１５分間攪拌した後で反応混合物をろ過し、さらに水（２５ｍｌ）を添加し、この溶液を塩化メチレン（２ｘ ２５ｍｌ）で洗浄した。この水溶液のｐＨを１Ｎ−ＨＣｌでｐＨ２．０に調節した。沈殿をろ過して単離して、水で洗浄し、乾燥して、０．８２ｇ（５８％）が得られた。本品を塩化メチレン／石油エ−テルで二度再度沈殿させ、乾燥後０．７７ｇ（５５％）が得られた。ｍ．ｐ．１１９℃（分解）。元素分析、Ｃ24Ｈ29Ｎ7Ｏ7・Ｈ2Ｏ、実験値（理論値） Ｃ：５６．３２（５２．８４） Ｈ：５．７１（５．７３）； Ｎ：１７．６８（１７．９７）。ＦＡＢ−ＭＳ。５２８．５（ＭＨ＋）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：１２．７５（ｖｅｒｙｂ，１Ｈ，ＣＯ2Ｈ）；１０．６５（ｂ．ｓ，１Ｈ，ＺＮＨ）；８．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１４Ｈｚ，ＡｄｅＨ−２）；８．３１（ｓ，１Ｈ，Ａｄｅ Ｈ−８）；７．４９−７．３１（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；７．０３＆６．７５（ｕｎｒｅｓｏｌｖ．ｔ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨ）；５．３３ ＆５．１６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯＮ）；５．２２（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ2））；４．３４−３．９９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）；３．５４−３．０３（ｍ’ｓ、水を含有、ＣＨ2ＣＨ2）および１．３９ ＆ １．３７（ｓ，９Ｈ，ｔＢｕ）。13Ｃ−ＮＭＲ。１７０．４；１６６．６；１５２．３；１５１．５；１４９．５；１４５．２；１２８．５；１２８．０；１２７．９；６６．３２；４７．６３；４７．０３；４３．８７および２８．２４。
【０１４８】
実施例３２
２−アミノ−６−クロロ−９−カルボキシメチルプリン２−アミノ−６−クロロプリン（５．０２ｇ；２９．６ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（１２．９１ｇ；９３．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶かした溶液に、臭化酢酸（４．７０ｇ；２２．８ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を２０時間窒素雰囲気下で激しく攪拌し、水（１５０ｍｌ）を添加し、溶液をセライトを通してろ過したところ、透明な黄色溶液が得られた。この溶液を４Ｎ−塩酸でｐＨ３に酸性化し、沈殿物をろ過し、ｓｉｃａｐｅｎｔ上で真空下で乾燥した。収率８３．０２ｇ；４４．８％）。1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：ｄ＝４．８８ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ）；６．９５（ｓ，２Ｈ）；８．１０（ｓ，１Ｈ）。
【０１４９】
実施例３３
２−アミノ−６−ベンジルオキシ−９−カルボキシメチルプリンナトリム（２．０ｇ；８７．０ｍｍｏｌ）をベンジルアルコ−ル（２０ｍｌ）に溶解し、１３０℃で２時間加熱した。０℃にまで冷却したあとで、２−アミノ−６−クロロ−９−カルボキシメチルプリン（４．０５ｇ；１８．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（８５ｍｌ）中に溶かした溶液をゆっくりと添加し、生じた懸濁液を２０℃において一夜攪拌した。水酸化ナトリウム溶液（１Ｎ、１００ｍ）を加え、、透明な溶液を酢酸エチル（３ｘ １００ｍｌ）で洗浄した。水相を４Ｎ塩酸でｐＨ３に酸性化した。沈殿物を酢酸エチル（２００ｍｌ）にとり、水相を酢酸エチル（２ ｘ １００ｍｌ）で抽出した。有機層を併せて、飽和塩化ナトリウム液（２ｘ ７５ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で蒸発乾凅させた。残渣をエタノ−ルから再結晶化させた。真空下でのｓｉｃａｐｅｎｔ上での乾燥後の収率：２，７６ｇ（５２％）。ｍ．ｐ．１５９−６５℃。元素分析、実験値（理論値）Ｃ：（５６．１８；５５．９７） Ｈ（４．３８；４．３２）、 Ｎ（２３．４；２３．１０）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：４．８２ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ）；５．５１（ｓ，２Ｈ）；６．４５（２，２Ｈ）；７．４５（ｍ，５Ｈ）；７．８２（ｓ，１Ｈ）。
【０１５０】
実施例３４
Ｎ−（［２−アミノ−６−ベンジルオキシ−プリン−９イル］−アセチル）−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−グリシン［ＢｏｃＧａｅｇ−ＯＨモノマ−］
２−アミノ−６−ベンジルオキシ−９−カルボキシメチルプリン（０．０５０ｇ；１．６７ｍｍｏｌ）、メチル−Ｎ（２−［第三級−ブトキシカルボニルアミノ］エチル）−グリシンエステル（０．６５ｇ；２．８０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５４ｇ；４．１９ｍｍｏｌ）およびブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム−ヘキサフロロホスフェ−ト（ＰｙＢｒｏＰ(R)）（０．７９８ｇ；１．７１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）中で４時間攪拌した。透明な溶液を重炭酸ナトリウムの氷冷液（３ｘ ４０ ｍｌ）に注ぎ、酢酸エチル（３ ｘ ４０ｍｌ）で抽出した。有機相を硫酸水素カリウム溶液（１Ｎ；２ ｘ ４０ ｍｌ）、重炭酸ナトリウム溶液（１Ｎ；１ ｘ４０ｍｌ）および飽和塩化ナトリウム溶液（６０ｍｌ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で蒸発したあとで、固形残渣を酢酸エチル／ヘキサン（２０ｍｌ（２：１））から再結晶化して、収率６３％でメチルエステルを得た（ＭＳ−ＦＡＢ５１４（Ｍ＋１）。このエステルを濃水酸化ナトリウム液（１ｍｌ）を含むエタノ−ル／水（３０ｍｌ（１：２））に溶解することによって加水分解を行った。２時間攪拌した後で、この溶液をろ過し、４Ｎ−塩酸を酸化してｐＨ３に酸性化した。表題化合物を、ろ過して得た。収率：３７０ｍｇ（加水分解に対して７２％）。ＨＰＬＣによる純度は、９９％以上であった。二級アミドの回転が制限されていたために、シグナルのいくつかは、２：１の比率で二重化した（リストにおいては、主要ピ−クについてｍｊ．でまた小さいピ−クはｍｉ．で表してある）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：ｄ＝１．４ｐｐｍ．（ｓ，９Ｈ）；３．２（ｍ，２Ｈ）；３．６（ｍ，２Ｈ）；４．１（ｓ，ｍｊ．，ＣＯＮＲＣＨ2ＣＯＯＨ）；４．４（ｓ，ｍｉ．，ＣＯＮＲＣＨ2ＣＯＯＨ）；５．０（ｓ，ｍｊ．，Ｇｕａ−ＣＨ2ＣＯ−）；５．２（ｓ，ｍｊ．，Ｇｕａ−ＣＨ2ＣＯ）；５．６（ｓ，２Ｈ）；６．５（ｓ，２Ｈ）；６．９（ｍ，ｍｉ．，ＢｏｃＮＨ）；７．１（ｍ．ｍｊ．，ＢｏｃＮＨ）；７．５（ｍ．，３Ｈ）；７．８（ｓ，１Ｈ）；１２．８（ｓ，１Ｈ）。13Ｃ−ＮＭＲ。１７０．９５；１７０．５２；１６７．２９；１６６．８５；１６０．０３；１５９．７８；１５５．８４；１５４．８７；１４０．６３；１３６．７６；１２８．４９；１２８．１０；１１３．０４；７８．１９；７７．８６；６６．９５；４９．２２；４７．７０；４６．９４；４５．９６；４３．６２；４３．３１および２８．２５。
【０１５１】
実施例３５
３−Ｂｏｃ−アミノ−１、２−プロパンジオ−ル
３−アミノ−１、２−プロパンジオ−ル（４０．００ｇ；０．４４０ｍｏｌ、１、０ｅｑ．）を水（１０００ｍｌ）に溶解し、０℃にまで冷却した。ジ−三級−ブチル炭酸エステル（１１５．０ｇ、０．５２６ｍｏｌ、１，２ｅｑ．）を一度に加えた。この反応混合物を攪拌しつつ水浴上で室温にまで加温した。ｐＨを水（１２０ｍｌ）に溶かした水酸化ナトリウム（１７．５６ｇ、０．４４０ｍｏｌ，１．０ｅｑ．）で１０．５に維持した。水酸化ナトリウム溶液を添加し終えたとき、反応混合物を室温で一夜攪拌した。その後、酢酸エチル（７５０ｍｌ）を反応混合物に加え、次に０℃に冷却した。ｐＨを激しく攪拌しつつ４Ｎ−硫酸で２．５に調節した。二つの相を分離し、水相を別の酢酸エチル（６ｘ ３５０ｍｌ）で洗浄した。有機相の容量を減圧下で蒸発させて９００ｍｌにまで減少させた。有機相を飽和硫酸水素カリウム溶液を二倍量に希釈したもの（１ ｘ１０００ｍｌ）および飽和塩化ナトリウム溶液（１ｘ ５００ｍｌ）で洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、減圧下で蒸発させて、表題化合物を５０．１２ｇ（６０％）を得た。このものは、塩化メチレンから蒸発させ次いで凍結させて、固化させることが出来た。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3／ＴＭＳ）：ｄ＝１．４３（ｓ，９Ｈ，Ｍｅ3Ｃ）、３．２５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）、３．５７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）、３．７３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3／ＴＭＳ）：ｄ＝２８．２（Ｍｅ3Ｃ）、４２．６（ＣＨ2）、６３．５、７１．１（ＣＨ2ＯＨ，ＣＨＯＨ）、７９．５（Ｍｅ3Ｃ）、１５７（Ｃ＝Ｏ）。
【０１５２】
実施例３６
２−（Ｂｏｃ−アミノ）エチル−Ｌ−アラニンメチルエステル
３−Ｂｏｃ−アミノ−１、２−プロパンジオ−ル（２０．７６ｇ；０．１０９０ｍｏｌ。１ｅｑ．）を水（１５０ｍｌ）に溶解した。ｍ−過ヨウ素酸カリウム（２４．９７ｇ；０．１９０ｍｏｌ、１ｅｑ．）を加え、反応混合物を窒素雰囲気中で室温で２時間攪拌した。反応混合物をろ過し、水相をクロロホルム（６ｘ２５０ｍｌ）で抽出した。有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ2）、蒸発させると無色の油状物としてＢｏｃ−アミノアセトアルデヒドが殆ど定量的な収率で得られ、このものを精製することなく次の処理法に用いた。パラジウム−カ−ボン（１０％、０．８ｇ）を窒素雰囲気中で冷却し（０℃）かつ激しく攪拌しつつＭｅＯＨ（２５０ｍｌ）に加え、無水酢酸ナトリウム（４．４９ｇ；５４．７ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）およびＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（３．８２ｇ；２７．４ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を加えた。Ｂｏｃ−アミノアセトアルデヒド（４．７９ｇ；３０．１ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）をＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）に溶かし、反応混合物に加えた。反応混合物を常圧、常温で、水素吸収が止むまで水素添加した。反応混合物をセライトを通してろ過させたが、セライトをさらにＭｅＯＨで洗浄した。このＭｅＯＨを減圧下で除去し、残渣を水（１５０ｍｌ）に溶解し、ｐＨを激しく攪拌しつつ０．５Ｎ−ＮａＯＨを滴下することによって８．０に調節した。水相を塩化メチレン（４ｘ ２５０ｍｌ）で抽出し、有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ）、セライトでろ過し、減圧下で蒸発させて透明で、若干黄色の油状物として表題化合物が６．３６ｇ（９４％）得られた。ＭＳ（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ（％）＝２４７（１００，Ｍ＋１，１９１（９０），１４７（１８）。１Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：１．１８（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ，Ｍｅ）、１．３６（ｓ，９Ｈ，Ｍｅ3Ｃ）、１．８９（ｂ，１Ｈ，ＮＨ）、２．５１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ2）、２．６６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ2）、３．１０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）、３．２７（、Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）、３．６４（ｓ，３Ｈ，ＯＭｅ）、５．０６（ｂ，１Ｈ，カルバメ−トＮＨ）。13Ｃ−ＮＭＲ ｄ＝１８．８（Ｍｅ）、２８．２（Ｍｅ3Ｃ）、４０．１、４７．０（ＣＨ2）、５１．６（ＭｅＯ），５６．０（ＣＨ），１５５．８（カルバメ−トＣ＝Ｏ）、１７５．８（エステルＣ＝Ｏ）。
【０１５３】
実施例３７
Ｎ−（Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（１−チミニルアセチル）−Ｌ−アラニンメチルエステル
Ｂｏｃ−アミノエチル−（Ｌ）−アラニンメチルエステル（１．２３ｇ，５．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶かした溶液に、Ｄｈｂｔ−ＯＨ（０．／９０ｇ，５．５２ｍｍｏｌ）および１−チミニル酢酸（１．０１ｇ，５．４８ｍｍｏｌ）を添加した。１−チミニル酢酸が溶解した時に、クロロメタン（１０ｍｌ）を加え、溶液を氷浴で冷却した。この反応混合物が０に達した時に、ＤＣＣ（１．２４ｇ，６０１ｍｍｏｌ）を加え、添加後５分でＤＣＵの沈殿が認められた。二時間後に、ＴＬＣ分析の結果、反応が完結したのを確認した。この混合物をろ過し、沈殿をジクロロメタン（１９９ｍｌ）で洗浄した。得た溶液を５％重炭酸ナトリウム（１５０ｍｌ）で二度、また飽和硫酸水素カリウム液（２５ｍｌ）を水（１００ｍ）に溶かした液で二度洗浄した。飽和塩化ナトリウム液で最終的に抽出した後、溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させると、白色発泡物を得た。この発泡物を、メタノ−ル傾斜のジクロロメタンを溶出溶媒として用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィ−によって精製した。これによって、純品を得た（ＨＰＬＣで９９％以上）（１．０８ｇ，５２．８％）。ＦＡＢ−ＭＳ＊４１３（Ｍ＋１）および４３１（Ｍ＋１＋水）。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：４．５２（ｓ，２Ｈ，ＣＨ’２）；３．７３（ｓ，３Ｈ，ＯＭｅ）；３．２−３．６（ｍ，４Ｈ，エチルＣＨ2‘ｓ）、１．９０（ｓ，３Ｈ，ＴにおけるＭｅ）；１．４９（ｄ，３Ｈ，ＡｌａにおけるＭｅ）；１．４４（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ）。
【０１５４】
実施例３８
Ｎ−（Ｂｏｃ−アミノエチル）０Ｎ−（１−チミニルアセチル）−Ｌ−アラニン
表題化合物のメチルエステル（２．０７ｇ，５．０２ｍｍｏｌ）をメタノ−ル（１００ｍｌ）に溶解し、氷浴で冷却し、２Ｎ水酸化ナトリウム（１００ｍｌ）を加えた。１０分間攪拌した後で、混合物のｐＨを４Ｍ−塩化水素で３に調節した。その後この溶液を酢酸エチル（３ｘ １００ｍｌ）で抽出し、有機抽出液を併せて、硫酸マグネシウムで乾燥した。蒸発後、得た発泡物を酢酸エチル（４００ｍｌ）と数ｍｌのメタノ−ルに溶かして、この固形物を溶解した。石油エ−テルを沈殿物が生成し始めるまで加え、−２０℃で一夜放置した後、沈殿物をろ過して除いた。こうすることによって、純品を１．０１ｇ（５０．５％）得た（ＨＰＬＣで９９％以上）。この化合物を２−プロパノ−ルから再結晶した。ＦＡＢ−ＭＳ：３９９（Ｍ＋１）。1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：１１．３５（ｓ，１Ｈ，ＣＯＯ）；７．４２（ｓ，１Ｈ，Ｈ’6）；４．６９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ’2）；１．８３（ｓ，３Ｈ，ＴにおけるＭｅ）；１．５０−１．４０（Ｍ、１２Ｈ、Ａｌａ＋ ＢｏｃにおけるＭｅ）。
【０１５５】
実施例３９
【０１５６】
（ａ）Ｎ−（Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（１−チミニルアセチル）−Ｄ−アラニンメチルエステル
Ｂｏｃ−アミノエチルアラニンメチルエステル（２．４８ｇ；１０．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍｌ）に溶かした溶液にＤｈｈｂｔ−ＯＨ（１．８０ｇ；１１．０ｍｍｏｌ）およびチミニル酢酸（２．１４ｇ；１１．６ｍｍｏｌ）を添加した。１−チミニル酢酸が溶解した後で、塩化メチレン（２０ｍ）を加え、この溶液を氷浴で冷却した。反応混合物が０℃に達した時に、ＤＣＣ（２．８８ｇ；１４．０ｍｍｏｌ）を加えた。添加後５分でＤＣＵの沈殿が認められた。３５分後に、氷浴を取り除き、３．５時間後に反応混合物をろ過し、沈殿を塩化メチレン（２００ｍｌ）で洗浄した。得た溶液を５％重炭酸ナトリウム液（２００ｍｌ）で二度、また飽和流酸水素カリウム水溶液（１００ｍｌ）で二度抽出し、飽和塩化ナトリウム液（２５０ｍｌ）で最終的に抽出した後で、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させると油状物を得た。この油状物をメタノ−ル傾斜の塩化メチレンを溶出溶媒として用いて、短いカラムシリカゲルクロマトグラフィ−で精製した。こうすることによって、石油エ−テルで沈殿させた後でＨＰＬＣによる純度が９６％の化合物が得られた（１．０５ｇ；２５．３％）。ＦＡＢ−ＭＳ：４１３（Ｍ＋１）。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：５．６４（ｔ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨ，Ｊ＝５．８９Ｈｚ）；４．５６（ｄ，２Ｈ，ＣＨ’2）；４．３５（ｑ，１，Ｈ，ＡｌａにおけるＣＨ，Ｊ＝７．２５）；３．７４（ｓ，３Ｈ，ＯＭｅ）；３．６４−３．２７（ｍ，４Ｈ，エチルのＨ’）；１．９０（ｓ，３Ｈ，ＴにおけるＭｅ）；１．５２−１．４４（ｔ，１２Ｈ，ＡｌａにけるＢｏｃ＋Ｍｅ）。
【０１５７】
（ｂ）Ｎ−（Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（１−チミニルアセチル）−Ｄ−アラニン
表題化合物のメチルエステル（１．５７ｇ，３．８１ｍｍｏｌ）をメタノ−ル（１００ｍｌ）に溶解し、氷浴で冷却し、水酸化ナトリウム（１００ｍｌ；２Ｍ）を加えた。１０分間攪拌した後で、混合物のｐＨを４Ｍ−塩化水素で３に調節した。その後この溶液を酢酸エチル（３ｘ １００ｍｌ）で抽出し、有機抽出液を併せて、硫酸マグネシウムで乾燥した。蒸発後、得た油状物を酢酸エチル（２００ｍｌ）に溶かし、石油エ−テルを沈殿物が生成し始めるまで加え、−２０℃で一夜放置した後、沈殿物をろ過して除いた。こうすることによって、表題化合物を１．０２ｇ（６７．３％）得たが、純度はＨＰＬＣで９９％以上であった。ＦＡＢ−ＭＳ：３９９（Ｍ＋１）。1Ｈ−ＮＭＲ：１１．３４（ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ）；７．４２（ｓ，１Ｈ，Ｈ’6）；４．６９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ’2）；４．４０（ｑ，１Ｈ，ＡｌａにおけるＣＨ、Ｊ＝７。２０Ｈｚ）；１．８３（ｓ，３Ｈ，ＴにおけるＭｅ）；１．５２−１．４０（ｍ、１２Ｈ、ＡｌａにおけるＢｏｃ＋Ｍｅ）。
【０１５８】
実施例４０
Ｎ−（Ｎ’−Ｂｏｃ−３’−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グリシンメチルエステル
Ｎ（Ｎ’−Ｂｏｃ−３’−アミノプロピル）グリシンメチルエステル（２．８４ｇ；０．０１１５ｍｏｌ）をＤＭＦ（３５ｍｌ）に溶解し、その後ＤｈｂｔＯＨ（２．０７ｇ；０．０１２７ｍｏｌ）と１−チミニル酢酸（２．３４ｇ；０．０１２７ｍｏｌ）を加えた。塩化メチレン（３５ｍｌ）を加えて、混合物を氷浴で０℃に冷却した。ＤＣＣ（２．８５ｇ；０．０１３８ｍｏｌ）を加えた後、混合物を２時間０℃で攪拌し、その後室温で１時間攪拌した。沈殿したＤＣＵをろ過して除去し、塩化メチレン（２５ｍｌ）で洗浄し、更に追加量の塩化メチレン（１５０ｍｌ）を濾液に加えた。有機相を重炭酸ナトリウム（飽和液を当量の水で希釈、６ｘ ２５０ｍｌ）で抽出し、硫酸カリウム（飽和液を４倍量の水で希釈、３ ｘ ２５０ｍｌ）次いで飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し真空下で蒸発乾凅した。固体の残渣を塩化メチレン（３５ｍｌ）に懸濁させて、１時間攪拌した。沈殿したＤＣＵは、ろ過して除去し、塩化メチレン（２５ｍｌ）で洗浄した。濾液を真空下で蒸発乾凅して、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−で、メタノ−ルと塩化メチレン（塩化メチレン中３−７％メタノ−ルの傾斜）の混合物で溶出して精製した。こうすることによって、表題化合物を白色固体として得た（３．０５ｇ、６４％）。ｍ．ｐ．７６−７９℃（分解）。元素分析、Ｃ18Ｈ28Ｎ4Ｏ7、実験値（理論値） Ｃ：５２．０３（５２．４２）Ｈ：６．９０（６．８４）； Ｎ：１３．２１（１３．５８）。この化合物は、満足すべき1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した。
【０１５９】
実施例４１
Ｎ−（Ｎ’−Ｂｏｃ−３’−アミノプロピル）−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グリシン
Ｎ−（Ｎ’−Ｂｏｃ−３’−アミノプロピル）−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グリシンメチルエステルをメタノ−ル（２５ｍｌ）に溶解し、２Ｍ−水酸化ナトリウム（２５ｍｌ）と共に１．５時間攪拌した。メタノ−ルを真空下で蒸発させて除去し、ｐＨを４Ｍ−塩酸で０℃において２に調節した。本製品をろ過して白色結晶として単離し、水（３ｘ １０ｍｌ）で洗浄し、真空下でｓｉｃａｐｅｎｔで乾燥した。収率：２．１９（７５％）。元素分析、Ｃ17Ｈ26Ｎ4Ｏ7・Ｈ2Ｏ、実験値（理論値） Ｃ：４９．９５（４９．０３）Ｈ：６．４７（６．２９）； Ｎ：１３．４３（１３．４５）。この化合物は、満足すべき1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した。
【０１６０】
実施例４２
３−（１−チミニル）−プロパン酸メチルエステル
チミン（１４．０ｇ；０．１１ｍｏｌ）をメタノ−ルに懸濁させ、メタアクリル酸メチル（３９．６ｍｌ；０．４４ｍｏｌ）を触媒量の水酸化ナトリウムとともに加えた。この溶液を４５時間暗所で還流させ、真空下において蒸発乾凅させ、残渣を加熱しつつメタノ−ル（８ｍｌ）に溶解させた。氷浴で冷却した後、生成物をエ−テル（２０ｍｌ）を加えて沈殿させ、ろ過して単離し、エ−テル（２０ｍｌ）で洗浄し、真空下でｓｉｃａｐｅｎｔ上で乾燥させた。収率；１１．２３ｇ（４８％）。ｍ．ｐ．１１２−１１９℃。元素分析、Ｃ9Ｈ12Ｎ2Ｏ4、実験値（理論値） Ｃ：５１．１４（５０．９４）Ｈ：５．７８（５．７０）；Ｎ：１１．５２（１３．２０）。この化合物は、満足すべき1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した。
【０１６１】
実施例４３
３−（１−チミニル）−プロパン酸
３（１−チミニル）−プロパン酸メチル（１．０ｇ；０．００４７ｍｏｌ）を２Ｍ−水酸化ナトリウム（１５ｍｌ）に溶解し、１０分間煮沸させた。ｐＨを濃塩酸を用いて０．３に調節した。この溶液を酢酸エチル（１０ｘ ２５ｍｌ）で抽出し、有機層を飽和塩化ナトリウム液で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で蒸発乾凅させると、表題化合物が白色固体として得られた（０．６６ｇ；７１％）。ｍ．ｐ．１１８−１２１℃。元素分析、Ｃ8Ｈ10Ｎ2Ｏ4、実験値（理論値） Ｃ：４８．３８（４８．４９）Ｈ：５．０９（５．０９）； Ｎ：１３．９８（１４．１４）。この化合物は、満足すべき1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した。
【０１６２】
実施例４４
Ｎ−（Ｎ’−Ｂｏｃ−３’−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）プロパノイル］グリシンエチルエステル
Ｎ（Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチル）グリシンエチルエステル（１．０ｇ；０．００４１ｍｏｌ）をＤＭＦ（１２ｍｌ）に溶解し、その後ＤｈｂｔＯＨ（０．７３ｇ；０．００４５ｍｏｌ）と１−チミニルプロパン酸（０．８９ｇ；０．００４５ｍｏｌ）を加えた。塩化メチレン（１２ｍｌ）を加えて、混合物を氷浴で０℃に冷却した。ＤＣＣ（１．０１ｇ；０．００４９ｍｏｌ）を加えた後、混合物を２時間０℃で攪拌し、その後室温で１時間攪拌した。沈殿したＤＣＵをろ過して除去し、塩化メチレン（２５ｍｌ）で洗浄し、更に追加量の塩化メチレン（５０ｍｌ）を濾液に加えた。有機相を重炭酸ナトリウム（飽和液を当量の水で希釈、６ｘ １００ｍｌ）で抽出し、硫酸カリウム（飽和液を４倍量の水で希釈、３ ｘ １００ｍｌ）次いで飽和塩化ナトリウム（１ ｘ １００ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し真空下で蒸発乾凅した。固体の残渣を塩化メチレン（１５ｍｌ）に懸濁させて、１時間攪拌した。沈殿したＤＣＵは、ろ過して除去し、塩化メチレン（２５ｍｌ）で洗浄した。濾液を真空下で蒸発乾凅して、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−で、メタノ−ルと塩化メチレン（塩化メチレン中３−７％メタノ−ルの傾斜）の混合物で溶出して精製した。こうすることによって、表題化合物を白色固体として得た（１．０２ｇ、５９％）。元素分析Ｃ19Ｈ30Ｎ4Ｏ7、実験値（理論値） Ｃ：５３．１５（５３．５１）Ｈ：６．９０（７．０９）； Ｎ：１２．７６（１３．１３）。この化合物は、満足すべき1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した。
【０１６３】
実施例４５
Ｎ−（Ｎ’−Ｂｏｃ−３’−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）プロパノイル］グリシン
Ｎ−（Ｎ’−Ｂｏｃ−３’−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）プロパノイル］グリシンエチルエステル（０．８３ｇ；０．００１９５ｍｏｌ）をメタノ−ル（２５ｍｌ）に溶解した。水酸化ナトリウム（２５ｍｌ；２Ｍ）を加え、この溶液を１時間攪拌した。メタノ−ルを真空下で蒸発させて除き、ｐＨを４Ｍ−塩酸で０℃において２に調節した。本品をろ過して単離し、エ−テル（３ｘ１５ｍｌ）で抽出し、真空下でｓｉｃａｐｅｎｔの上で乾燥させた。収率：０．７６９ｇ（９９％）。ｍ．ｐ．２１３℃（分解）
【０１６４】
実施例４６
モノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（２）
第三級−ブチル−４−ニトロフェニル炭酸エステル（１）（１０．０ｇ；０．０４１８ｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解し溶液を、３０分かけてエチレンジアミン（２７．９ｍｌ；０．４１８ｍｏｌ）およびＤＭＦ（５０ｍｌ）の溶液に加え、一夜攪拌した。この混合物を真空下で蒸発乾凅させて、得られた油状物を水（２５０ｍｌ）に溶解した。０℃に冷却した後、ｐＨを ４Ｍ−塩酸で３．５に調節した。この溶液をろ過し、クロロホルム（３ ｘ ２５０ｍｌ）で抽出した。このｐＨを２Ｍ−水酸化ナトリウムで０℃において１２に調節し、水溶液を塩化メチレン（３ｘ ３００ｍｌ）で抽出した。飽和塩化ナトリウム水溶液で（２５０ｍｌ）処理した後で、塩化メチレン溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過して、生じた溶液を真空下で蒸発乾凅して、本品（油状物）９４．２２ｇが得られた。1Ｈ−ＮＭＲ（９０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3）：δ１．４４（ｓ，９Ｈ）；２．８７（ｔ，２Ｈ）；３．１（ｑ，２Ｈ）；５．６２（ｓ，ｂｒｏａｄ）。
【０１６５】
実施例４７
（Ｎ−Ｂｏｃ−３’−アミノエチル）−β−アラニンメチルエステル塩酸塩
モノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（２）（１６．２８ｇ；０．１０２ｍｏｌ）をアセトニトリル（４４０ｍｌ）に溶解し、アクリル酸メチル（９１．５０ｍｌ；１．０２ｍｏｌ）をアセトニトリル（２００ｍｌ）と一緒にこの混合物に移した。この溶液を暗所で窒素雰囲気下で一夜還流して、アクリル酸メチルの重合を回避した。真空下で蒸発乾凅した後で、水とエ−テルの混合物（２００＋ ２００ｍｌ）を加え、生じた溶液をろ過して、激しく攪拌した。水相をもう一度エ−テルで抽出し、次いで凍結乾燥して、黄色の固体を得た。酢酸エチルから再結晶して、表題化合物を１３．０９ｇを得た。ｍ．ｐ．１３８−１４０℃。元素分析Ｃ11Ｈ23Ｎ2Ｏ4Ｃｌ、実験値（理論値） Ｃ：４６．４９（４６．７２）Ｈ：８．３８（８．２０）； Ｎ：９．８３（９．９１）；Ｃｌ：１２．４５（１２．５４）。1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．３９ｓ，９Ｈ）；２．９（ｍ．８Ｈ）；３．６４（ｓ，３Ｈ）．
【０１６６】
実施例４８
Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］−Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチル−β−アラニンメチルエステル
（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ−エチル）−β−アラニンメチルエステル・塩酸塩（３）（２．０ｇ；０．００７１ｍｏｌ））および１−チミニル酢酸ペンタフルオロフェニルエステル（５）（２．８２８ｇ；０．００８１２ｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解した。トリエチルアミン（１．１２ｍｌ；０．００８１２ｍｏｌ）を加え、混合物を一夜攪拌した。塩化メチレン（２００ｍｌ）を添加後、有機層を重炭酸ナトリウム水溶液（３ｘ ２５０ｍｌ）、半飽和流酸水素カリウム水溶液（３ ｘ ２５０ｍｌ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（２５０ｍｌ）で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過し、次いで真空下で蒸発乾凅すると、２．９ｇ（９９％）の収量で生成物が得られた（油状物）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3：二級アミドの周囲の回転が制限されるため、信号のいくつかが二重化した。δ１．４３（ｓ，９Ｈ）；１．８８（ｓ，３Ｈ）；２．６３（ｔ，１Ｈ）；２．７４（ｔ，１Ｈ）；３．２５−３．５５（４ｘｔ，８Ｈ）；３．６５（２ｘｔ，２Ｈ）；３．６６（ｓ，１．５）；３．７２（ｓ，１．５）；４．６１（ｓ，１Ｈ）；５．７２（ｓ，２Ｈ）；５．５９（ｓ，０．５Ｈ）；５．９６（ｓ，０．５Ｈ）；７．１１（ｓ，１Ｈ）；１０．３３（ｓ，１Ｈ）。
【０１６７】
実施例４９
Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］−Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチル−β−アラニン
Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］−Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチル−β−アラニンメチルエステル（３．０ｇ；０．００７３ｍｏｌ）を２Ｍ−水酸化ナトリウム（３０ｍｌ）に溶解し、ｐＨを４Ｍ−塩酸で０℃において２に調節し、溶液を２時間攪拌した。沈殿をろ過して単離し、冷水で三度洗浄し、真空下においてｓｉｃａｐｅｎｔ上で乾燥した。収率、２．２３ｇ（７７％）。ｍ．ｐ．１７０−１７６℃。元素分析Ｃ17Ｈ26Ｎ4Ｏ7・Ｈ2Ｏ、実験値（理論値） Ｃ：４９．４９（４９．０３） Ｈ：６．３１（６．７８）； Ｎ：１３．８４（１３．４５）；1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．３８（ｓ，９Ｈ）；１．７６（ｓ，３Ｈ）；２．４４および３．２９（ｍ，８Ｈ）；４．５５（ｓ，２Ｈ）；７．３（ｓ，１Ｈ）；１１．２３（ｓ，１Ｈ）。ＦＡＢ−ＭＳ：３９９（Ｍ＋１）
【０１６８】
実施例５０
Ｎ−［（１−（Ｎ４−Ｚ）−シトシル）アセチル］−Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチル−β−アラニンメチルエステル
（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ−エチル）−β−アラニンメチルエステル・塩酸塩（３）（２．０ｇ；０．００７１ｍｏｌ）および１−（Ｎ−４−Ｚ）−シトシル酢酸ペンタフルオロフェニルエステル（５）（３．３１９ｇ；０．００７１ｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解した。トリエチルアミン（０．９９ｍｌ；０．００７１ｍｏｌ）ｗｏ加え、混合物を一夜攪拌した。塩化メチレン（２００，ｌ）を添加した後で、有機層を重炭酸ナトリウム水溶液（３ｘ ２５０ｍｌ）、半飽和硫酸水素カリウム水溶液（３ ｘ ２５０ｍｌ）および飽和塩化ナトリウム水溶液で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過して、真空下で蒸発乾凅して、３．３６ｇの固体の化合物が得られたが、このものをメタノ−ルから再結晶した。収率：２．４２ｇ（６４％）。ｍ．ｐ．１５８−１６１℃。元素分析Ｃ25Ｈ33Ｎ5Ｏ8、実験値（理論値） Ｃ：５５．１９（５６．４９）Ｈ：６．１９（６．２６）； Ｎ：１２．８６（１３．１８）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3）：二級アミドの周囲の回転が制限されるため、信号のいくつかが二重化した；δ１．４３（ｓ，９Ｈ）；２．５７（ｔ，１Ｈ）；３．６０−３．２３（ｍ’ｓ，６Ｈ）；３．６０（ｓ，１．５Ｈ）；３．６６（ｓ，１．５Ｈ）；４．８０（ｓ，１Ｈ）；４．８８（ｓ，１Ｈ）；５．２０（ｓ，２Ｈ）；７．８０−７．２５（ｍ’ｓ，７Ｈ）。ＦＡＢ−ＭＳ：５３２（Ｍ＋１）
【０１６９】
実施例５１
Ｎ−［（１−（Ｎ４−Ｚ）−シトシル）アセチル］−Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチル−β−アラニン
Ｎ−［（１−（Ｎ４−Ｚ）−シトシル）アセチル］−Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチル−β−アラニンメチルエステル（０．６２１ｇ；０．００１２ｍｏｌ）を２Ｍ−水酸化ナトリウム（８．５ｍｌ）に溶解して２時間攪拌した。その後に、ｐＨを４Ｍ−塩酸で０℃において２に調節し、この溶液を２時間攪拌した。沈殿をろ過して単離して、冷水で三度洗浄し、真空下でｓｉｃａｐｅｎｔ上で乾燥した。収率：０．３２６ｇ（５４％）。この白色固体を２−プロパノ−ルから再結晶し、石油エ−テルで洗浄した。ｍ．ｐ．１６３第（分解）。元素分析Ｃ24Ｈ31Ｎ5Ｏ8、実験値（理論値） Ｃ：４９．４９（４９．０３）Ｈ：６．３１（６．７８）； Ｎ：１３．８４（１３．４５）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3）：二級アミドの周囲の回転が制限されるため、信号のいくつかが二重化した；δ１．４０（ｓ，９Ｈ）；２．５７（ｔ，１Ｈ）；２．６５（ｔ，１Ｈ）；３．６０−３．３２（ｍ’ｓ，６Ｈ）；４．８５（ｓ，１Ｈ）；４．９８（ｓ，１Ｈ）；５．２１（ｓ，２Ｈ）；５．７１（ｓ，１Ｈ，ｂｒｏａｄ）；７．９９−７．２５（ｍ’ｓ，７Ｈ）。ＦＡＢ−ＭＳ：５１８（Ｍ＋１）
【０１７０】
実施例５２
グアニン残基を有するＰＮＡ−オリゴマ−の例
【０１７１】
（ａ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］５−［Ｇａｅｇ］−［Ｔａｅｇ］4−Ｌｙｓ−ＮＨ２の固相合成保護されたＰＮＡを、置換度がほぼ０．１５であるＢｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）で修飾したＭＢＨＡ樹脂の上で構築した（定量的ニンヒドリン反応で測定）。カップルしていないアミノ基のキャッピングは、ＢｏｃＢａｅｇ−ＯＨモノマ−を導入する前に初めて行った。
【０１７２】
（ｂ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］5−［Ｇａｅｇ］−［Ｔａｅｇ］4−Ｌｙｓ−ＮＨ2の段階的合成（合成実験記録）
合成は、予備膨潤（ＤＣＭ中で一夜）させかつ中和したＢｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂１０２ｍｇ（乾燥重量）において開始した。実施した工程は以下の通りである：（１）ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、ｖ／ｖ）によるＢｏｃ−脱保護、１ｘ２分および１ｘ１／２時間、３ｍｌ；（２）ＤＣＭによる洗浄、４ｘ２０秒、３ｍｌ；ＤＭＦによる洗浄、２ｘ２０秒、３ｍｌ；ＤＣＭによる洗浄、２ｘ２０秒、３ｍｌ、および３０秒間のドレ−ン；（３）ＤＩＥＡ／ＤＣＭ（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、２ｘ３分、３ｍｌ；（４）ＤＣＭによる洗浄、４ｘ２０秒、３ｍｌおよび１分間のドレ−ン；（５）４当量のジイソプロピルカルボジイミド（０．０６ｍｍｏｌ；９．７μｌ）および４当量（０．０６ｍｍｏｌ；２４ｍｇ）のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＨまたは（０．０６ｍｍｏｌ；３０ｍｇ）のＢｏｃＧａｅｇ−ＯＨを０．６ｍｌのＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１、ｖ／ｖ）に溶解して添加、このカップリング反応は、室温で振盪させながら１／２時間進行させた；（６）サクションを２０秒間適用した；（７）ＤＭＦによる洗浄、２ｘ２０秒及び１ｘ２分、３ｍｌ；（８）ＤＩＥＡ／ＤＣＭ（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、２ｘ３分、３ｍｌ；（９）ＤＣＭによる洗浄、４ｘ２０秒、３ｍｌおよび１分間のドレ−ン；（１０）定性的Ｋａｉｓｅｒ試験；（１１）未反応アミノ基をＡｃ2Ｏ／ピリジン／ＤＣＭ（１：１：２、ｖ／ｖ）。１ｘ１／２時間、３ｍｌ；および（１２）ＤＣＭによる洗浄、４ｘ２０秒、２ｘ２分；２ｘ２０秒。工程１−１２は、所望の配列が得られるまで繰り返した。定性的Ｋａｉｓｅｒ試験は全て、マイナスであり（わら様の黄色、ビ−ズには一切着色しない）、カップリング収率はほぼ１００％であることを示していた。ＰＮＡ−オリゴマ−を開裂させ、通常の方法で精製した。ＦＡＢ−ＭＳ：２８３２．１１［Ｍ＋１］（計算値２８３２．１５）。
【０１７３】
実施例５３
Ｈ−Ｔａｅｇ−Ａａｅｇ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ−ＮＨ２の固相合成
【０１７４】
（ａ）Ｂｏｃ−Ｔａｅｇ−Ａ（Ｚ）ａｅｇ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡの固相合成
湿潤Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨ樹脂ほぼ０．３ｇを３ｍｌのＳＰＰＳ反応容器に入れた。Ｂｏｃ−Ｔａｅｇ−Ａ（Ｚ）ａｅｇ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂を、２．５ｍｌの５０％ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2中０．１５Ｍ−ＤＣＣと共に０．１９ＭのＢｏｃ（Ａ）（Ｚ）ａｅｇ−ＯＨを用いたｉｎｓｉｔｕＤＣＣカップリング（単一）および純ＣＨ２Ｃｌ２中において０．１５ＭのＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐとの単一カップリングによって組み立て・構築した（”合成実験記録５”）。この合成は、定量的ニンヒドリン反応によってモニタ−したが、これによってＡ（Ｚ）ａｅｇの導入率はほぼ５０％でありまたＴａｅｇの導入率はほぼ９６％であることが明らかになった。
【０１７５】
（ｂ）Ｈ−Ｔａｅｇ−Ａｅｇ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ−ＮＨ2の開裂、精製および同定
保護されたＢｏｃ−Ｔａｅｇ−Ａ（Ｚ）ａｅｇ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂を実施例４０ｃにおいて記載したように処理して、乾燥Ｈ−Ｔａｅｇ−Ａ（Ｚ）ａｅｇ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂５３．１ｍｇをＨＦ開裂すると粗製物質がほぼ１５．６ｍｇが得られた。１４．４分における主ピ−クは、全吸光度の５０％以下を占めていた。この粗製物０．５ｍｇを精製して、Ｈ−Ｔａｅｇ−Ａａｅｇ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ−ＮＨ2が０．１ｍｇ得られた。（ＭＨ＋）＋について、計算ｍ／ｚ値は、２８１６．１６でありかつ測定ｍ／ｚ値は２８１６．２８。
【０１７６】
（ｃ）合成実験記録５
（１）ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、ｖ／ｖ）によるＢｏｃ−脱保護、２．５ｍｌ、３ｘ１分および１ｘ３０分；（２）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２．５ｍｌ、６ｘ１分；（３）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、２．５ｍｌ、３ｘ２分；（４）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２．５ｍｌ、６ｘ１分、および１分間のドレ−ン；（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試料を取り出し、完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して置換度を測定する；（６）１．２５ｍｌのＤＭＦに溶解した０．４７ｍｍｏｌ（０．２５ｇ）のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＨを添加し、次いで１．２５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶かした０．４７ｍｍｏｌ（１ｇ）のＤＣＣまたは２．５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶かした０．３６ｍｍｏｌ（０．２０ｇ）のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを添加する；カップリング反応は、振盪しつつ全部で２０−２４時間進行させた；（７）ＤＭＦによる洗浄、２．５ｍｌ、１ｘ２分；（８）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２．５ｍｌ、４ｘ１分；（９）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、２．５ｍｌ、２ｘ２分；（１０）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２．５ｍｌ、６ｘ１分；（１１）２−５ｍｇの保護ＰＮＡ樹脂試料を取り出し、よく乾燥してニンヒドリン定量分析に供して、カップリング度を測定する；（１２）未反応アミノ基を無水酢酸／ピリジン／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１：２、ｖ／ｖ／ｖ）の混合物２５ｍｌ用いて２時間アセチル化することによってブロックする（最後のサイクルを除く）；および（１３）ＣＨ２Ｃｌ２による洗浄、２．５ｍｌ、６ｘ１分；（１４）保護されたＰＮＡ−樹脂の２ｘ２−５ｍｇ試料を取り出し、ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄してニンヒドリン分析を行った。
【０１７７】
実施例５４
Ｈ−［Ｔａｅｇ］2−Ａａｅｇ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ−ＮＨ2の固相合成
【０１７８】
（ａ）Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］2−Ａ（Ｚ）ａｅｇ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の段階的合成
湿潤Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂ほぼ０．５ｇを５ｍｌのＳＰＰＳ反応容器に入れた。Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］2−Ａ（Ｚ）ａｅｇ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂を、２ｍｌの／ＣＨ2Ｃｌ2中の当量のＤＣＣと共に０．１５Ｍから０．２０Ｍの保護されたＰＮＡモノマ−（遊離酸）を用いたＡ（Ｚ）ａｅｇとＴａｅｇ残基とのｉｎｓｉｔｕＤＣＣカップリングを行うことによって組み立て・構築した（”合成実験記録６”）。この合成は、定量的ニンヒドリン反応によってモニタ−したが、これによって三回のカップリングを行った後でＡ（Ｚ）ａｅｇの導入率はほぼ８２％であり（一回目のカップリングでは、導入率はほぼ５０％であった；５０％ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2中での四回目のＨＯＢｔ仲介カップリングでは、全カップリング収率は有意には増大しなかった）またＴａｅｇ残基の導入率は定量的であることが明らかになった。
【０１７９】
（ｂ）Ｈ−Ｔａｅｇ−Ａｅｇ−［Ｔａｅｇ］2−Ｌｙｓ−ＮＨ2の開裂、精製および同定
保護されたＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］2−Ａ（Ｚ）ａｅｇ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂を実施例４０ｃにおいて記載したように処理して、乾燥Ｈ−［Ｔａｅｇ］2−Ａ（Ｚ）ａｅｇ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂１０２．５ｍｇをＨＦ開裂すると粗製物質がほぼ１６．２ｍｇが得られた。この粗製物の一部を精製した。（ＭＨ＋）+について、計算ｍ／ｚ値は、２０５０．８５でありかつ測定ｍ／ｚ値は２０５０．９０であった。
【０１８０】
（ｃ）合成実験記録６
（１）ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、ｖ／ｖ）によるＢｏｃ−脱保護，２ｍｌ，３ｘ１分および１ｘ３０分；（２）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２ｍｌ、６ｘ１分；（３）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、２ｍｌ、３ｘ２分；（４）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２．５ｍｌ、６ｘ１分、および１分間のドレ−ン；（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試料を取り出し、完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して置換度を測定する；（６）１．５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した０．４４ｍｍｏｌ（０．２３ｇ）のＢｏｃＡ（Ｚ）ａｅｇ−ＯＨを添加し、次いで０．５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶かした０．４７ｍｍｏｌ（１ｇ）のＤＣＣまたは１．５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶かした０．３３ｍｍｏｌ（０．１３ｇ）のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＨを添加する；カップリング反応は、振盪しつつ全部で２０−２４時間進行させた；（７）ＤＭＦによる洗浄、２ｍｌ、１ｘ２分；（８）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２ｍｌ、４ｘ１分；（９）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、２ｍｌ、２ｘ２分；（１０）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２ｍｌ、６ｘ１分；（１１）２−５ｍｇの保護ＰＮＡ樹脂試料を取り出し、よく乾燥してニンヒドリン定量分析に供して、カップリング度を測定する；（１２）未反応アミノ基を無水酢酸／ピリジン／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１：２、ｖ／ｖ／ｖ）の混合物２５ｍｌ用いて２時間アセチル化することによってブロックする（最後のサイクルを除く）；（１３）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２ｍｌ、６ｘ１分；および（１４）保護されたＰＮＡ−樹脂の２ｘ２−５ｍｇ試料を取り出し、ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄してニンヒドリン分析を行った。
【０１８１】
実施例５５
”ゼロ塩基”置換の例。
【０１８２】
（化ＶＩＩ−１）
【化７Ａ】
2008253251.tif 000012
【０１８３】
【表４】
2008253251.tif 000013
【０１８４】
即ち、Ｈ−Ｔ10−ＬｙｓＮＨ2と比べて、一つのチミンリガンドをＨで置換すると、Ｔｍが７３℃から４８℃まで低下することが判る。また単一塩基ミスマッチを導入する効果も示してある。
【０１８５】
ＰＮＡオリゴマ−のいくつかの生化学的／生物学的性質を、以下の実験によって説明する。
【０１８６】
１．ｄｓＤＮＡレベルの配列識別（実施例６３、第２０図）
Ｓ１−ヌクレア−ゼプロ−ビング技法を用いて、プラスミドｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ、ＳａｌＩまたはＰＳＴＩにクロ−ンした認識配列Ａ10、Ａ5ＧＡ4（Ａ9Ｇ）＆Ａ2ＧＡ2ＧＡ4（Ａ8Ｇ2）に対するＴ10、Ｔ5ＣＴ4（Ｔ9Ｃ）＆Ｔ2ＣＴ2ＣＴ4（Ｔ8Ｃ2）ＰＮＡの結合の識別を解析した。この結果（第２０図）、三つのＰＮＡは、以下の相対的な効率でそれぞれの認識配列に結合することが判った：ＰＮＡ−Ｔ10：Ａ10＞Ａ9Ｇ≫Ａ8Ｇ2、ＰＮＡ−Ｔ9Ｃ：Ａ9Ｇ＞Ａ10≫Ａ8Ｇ2、ＰＮＡ−Ｔ8Ｃ2：Ａ8Ｇ2≧Ａ9Ｇ≫Ａ10。即ち、３７℃において、１０につき１のミスマッチがあると、効率が減少し（５−１０倍と推定）、他方では二つのミスマッチは受け入れられない。
【０１８７】
２．ＰＮＡｓＴ10／Ｔ9Ｃ／Ｔ8Ｃ2のハイブリダイゼ−ションによるｄｓ−ＤＮＡからの単一鎖ＤＮＡの置換（第２０図）−実施例６３。
【０１８８】
３．ＰＮＡ−Ｔ10−ｄｓＤＮＡの鎖置換複合体形成の速度論（実施例６４、第２１図）
複合体形成は、ＰＮＡと３２Ｐ−ｅｎｄ標識ｄｓＤＮＡフラグメントを混合した後異なる時点でＳ１−ヌクレア−ゼによってプロ−ブした（第２１図）。
【０１８９】
４．ＰＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体の安定性ＰＮＡ−Ｔnと32Ｐ−ＤＳＤＮＡ（Ａ10／Ｔ10）標識との複合体を形成させた（６０分、３７℃）。これらの複合体は、過剰のオリゴ−ｄＡ10の存在下所望の温度において培養し、室温に冷却しＫＭｎＯ4でプロ−ブした。その結果（第２２図）、ＰＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体の熱安定性はＰＮＡオリゴヌクレオチド複合体の熱安定性を”Ｔｍ”とういう点で反映していることが判る。
【０１９０】
５．ＰＮＡによる制限酵素開列の抑制（実施例６４、第２３図）
プラスミド構成、ｐＴ１０は、ｐＵＣ１９中のＢａｍＨＩ部位にクロ−ンしたｄＡ10／ｄＴ10 ｔｒａｃｔを含有している。即ち、ＢａｍＨＩおよびＰｖｕＩＩによるＰＴ１０の開裂を行うと、２１１と１１１ｂｐなる二つの小さいＤＮＡフラグメントが生じる。ＰＮＡ−Ｔ10の存在下では、３３６ｂｐフラグメントが得られるが、これはＰｖｕＩＩのみに因る開裂に相当する（第２３図）。即ち、ＢあＭＩＩによる開裂は、制限酵素部位に近接して結合したＰＮＡによって抑制される。このような結果も、ＰＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体を１００％収率で形成させることが出来ることを示している。
【０１９１】
６．125Ｉ−標識したＰＮＡのオリゴヌクレチドへの結合（実施例６３、第２４図）
Ｔｙｒ−ＰＮＡ−Ｔ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2をＮａ125Ｉおよびクロラミン−Ｔを用いて125Ｉで標識し、ＨＰＬＣで精製した。この125Ｉ−ＰＮＡ−Ｔ10は、ＰＡＧＥおよびオ−トラジオグラフィ−によってオリゴ−ｄＡ１０に結合することが判った。このような結合は、過剰の変成した子牛胸腺ＤＮＡによって拮抗させることが出来た。
【０１９２】
上記（１）項に戻って論じると、ｄｓＤＮＡの配列特異的認識は、１０のチミン置換２−アミノエチルグリシル単位から成るＰＮＡ−そのＣ−終末はリシンアミドでありまたＮ−終末は複合９−アミノアクリジンリガンド（９−Ａｃｒ１−（ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2、第１１ａおよび１１ｂ図）である−がｄＡ10／ｄＴ10標的配列に結合することよって説明される。この標的は、２４８ｂｐ32Ｐ−ｅｎｄ（末端）−標識ＤＮＡ−フラグメントに含まれる。
１）この９−Ａｃｒ1は（第５図）、照射時のＤＮＡの開裂を確実にするため４−ニトロベンズアミドを付しており、その結合部位に極めて近接してＤＮＡを開裂させることが予期されるに過ぎない。上記２４８ｂｐ ＤＮＡフラグメントとともにＰＮＡを照射すると、ｄＡ10／ｄＴ10配列における選択的開裂が認められる（第３ａ図）。
【０１９３】
２）所謂ホトフットプリンティング検定において、合成ジアゾ結合アクリジンは紫外線照射下において、ＤＮＡと相互作用した場合にＤＮＡを開裂させる（但し、ＤＮＡが前記結合性物質で保護されている場合は除く）。このような実験は、上記した２４８ｂｐｄｓＤＮＡを用いて行ったが、その結果ＰＮＡ結合部位の光開裂に対する保護が明らかとなった（第３ｂ図）。
【０１９４】
３）様様な種類の実験において、ＤＮＡ−開裂性酵素であるＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓヌクレア−ゼは、矢張り大抵のＤＮＡ−結合性試薬によってその作用が阻害されるが、Ｔ10−標識における開裂を増大させた（第３ｃ図）。
【０１９５】
４）また別の種類の実験において、一本鎖チミンリガンドは（二本鎖チミンリガンドとは異なって）過マンガン酸カリウムによる酸化を極めて受け易いのであるが、この性質を利用した。この試薬の存在下で２４８ｂｐを酸化したところ、標的のＴ10−鎖の酸化のみが起こることが判った（第３ｂ図）。
【０１９６】
５）同種の証明実験において、Ｓ１ヌクレア−ゼが持つ一本鎖特異性によって、標的のＴ10−鎖のみが攻撃されたことが判った（第３ｄ図）。
【０１９７】
（Ｔａｅｇ）10、（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2およびＡｃｒ1−（ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2（第５図）が相当するｄＡ10に極めて効率よく結合することは、以下の二つの方法で説明・証明された：
【０１９８】
１．以下の実施例５６ におい手示す様に、ＰＮＡ−オリゴヌクレオチッド複合体は、ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動を行うと一本鎖オリゴヌクレオチッドよりも泳動速度が遅いはずである。従って、このような実験は、Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2および32Ｐ−ｅｎｄで標識したｄＴ10について行った。この結果、通常のｄＡ10／ｄＴ10二重らせんが安定である条件においてはまたこのような二重らせんが不安定である（変成性ゲル）条件下においても泳動が遅延することが判った。対照実験を、Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2と32Ｐ−ｅｎｄで標識したｄＴ10との混合物で行ったが、その結果上記した条件下では全く遅延しないことが判った。
【０１９９】
２．一本鎖ＤＮＡからＤＮＡ二重らせん（ｄｓＤＮＡ）を形成させると、吸光度係数は減少する（淡色効果）。即ち、ＤＮＡの変性は、吸光率の変化をたとえば、二重らせんの５０％が消失して一本鎖を生じる温度であるＴｍを函数として測定することによって追跡することができる。二重らせんは、一本鎖オリゴデオキシリブヌクレオチドと以下に列挙するＰＮＡ類とから形成した。典型的には、Ｔ−リッチ鎖の０．３ＯＤ260を１当量の他の鎖と、９０℃において５分間加熱し、次いで室温にまで冷却することによハイブリダイゼ−ションさせ、次いで３０分間保持し、最後に５℃の冷蔵庫に少なくとも３０分間保存した。使用した緩衝液は全て、りん酸が１０ｍＭかつＥＤＴＡが１ｍＫであった。低塩緩衝液は塩化ナトリウムを一切含有しておらず、一方中塩緩衝液は、１４０ｍＭのＮａＣｌを含有しまた高塩緩衝液は５００ｍＭのＮａＣｌを含有していた。これら緩衝液の全ては、ｐＨが７．２であった。ハイブリッドの融点は、ＧｉｌｆｏｒｄＲｅｓｐｏｎｓｅ装置で測定した。以下に記載する吸光度係数を用いた：通常のオリゴヌクレオチッドおよびＰＮＡの双方とも、Ａ：１５．４ｍｌ／μｍｏｌ・ｃｍ；Ｔ：８，８；Ｇ：１１．７およびＣ：７．３とした。融解曲線を０．５℃／分刻みで記録した。Ｔｍは、Ａ260と温度との曲線の一次微分係数も最大値から求めた。
【０２００】
オリゴデオキシリボヌクレオチッドのリスト：
１．５’−ＡＡＡ−ＡＡＡ−ＡＡ
２．５’−ＡＡＡ−ＡＡＡ−ＡＡＡ−Ａ
３．５’−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−Ｔ
４．５’−ＡＡＡ−ＡＡＧ−ＡＡＡ−Ａ
５．５’−ＡＡＧ−ＡＡＧ−ＡＡＡ−Ａ
６．５’−ＡＡＡ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−Ａ
７．５’−ＡＡＡ−ＡＧＡ−ＡＧＡ−Ａ
８．５’−ＴＴＴ−ＴＣＴ−ＴＴＴ−Ｔ
９．５’−ＴＴＴ−ＴＣＴ−ＴＣＴ−Ｔ
１０．５’−ＴＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−Ｔ
１１．５’−ＴＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＣ−Ｔ
１２．５’−ＴＴＣ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−Ｔ
１３．５’−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ
１４．５’−ＡＡＡ−ＡＡＡ−ＡＡＡ−ＡＡＡ−ＡＡＡ
【０２０１】
ＰＮＡ類のリストａ．ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ2ｂ．ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ2ｃ．ＴＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ2ｄ．ＴＴＣ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ2ｅ．Ａｃｒ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ2ｆ．Ａｃ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ2
【０２０２】
【表５】
2008253251.tif 000014
【０２０３】
ＲＮＡ−Ａ（ポリｒＡ）とＰＮＡ−Ｔ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2との間のハイブリッドは、測定出来ないほどの高温で融解する（＞９０℃）。しかし、特異的なハイブリダイゼ−ションは、ＲＮＡ−Ａ−但しＧ、ＣおよびＵではない−と混合した時のＡ260が大幅に低下することによって証明される。実験は、ＰＮＡ溶液１ｍｌとＲＮＡ溶液１ｍｌ−何れもＡ260＝０．６−とを混合し、次いで２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって行う。その後、試料を９０℃に５分間加熱し、室温にまで冷却し、この温度に３０分間保持子、最後に５℃において３０分間保存する。
【０２０４】
【表６】
2008253251.tif 000015
【０２０５】
上記の測定値から、以下の結論を下すことが出来る。融解曲線が認められるので、塩基スタッキングがある。ＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの方が、通常のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりも安定性が高く、而もＰＮＡ−ＲＮＡはさらにこれよりも安定である。ミスマッチによって、誤対合した塩基がＤＮＡ鎖にあるかまたはＰＮＡ鎖にあるかに拘らず、Ｔｍが大幅に低下する。このＴｍ値は、通常のオリゴヌクレオチドとは異なりイオン強度にわずかしか依存していない。
【０２０６】
実施例５６
Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2 のｄＡ10への結合（第１１ａ図）
Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ（１００ｎｇ）を２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中において５０ｃｐｓの５’−［32Ｐ］−ｅｎｄ−で標識したオリゴヌクレオチッドと一緒に室温で１５分間培養した。試料を氷で冷却し（１５分間）、ポリアクリルアミド中でのゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）で分析した。試料の１０μｌに、２μｌの５０％のグリセリン、５μｌのＴＢＥ（ＴＢＥ＝９０ｍＭトリス硼酸塩、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）を加え、試料を４℃においてＴＢＥ緩衝液中でのＰＡＧＥ（１５％アクリルアミド、０．５％ビスアクリルアミド）によって分析した。この試料１０μｌを凍結乾燥して、１０μｌの８０％ホルムアミド、１ＴＢＥに再度溶解し、９０℃に加熱（５分間）し、尿素／ＴＢＥ緩衝液中でのＰＡＧＥ（１５％アクリルアミド、０．５％ビスアクリルアミド）によって分析した。［32Ｐ］−含有ＤＮＡバンドを増幅スクリ−ンおよび−８０℃において２時間露光したアグファクリックス（Ａｇｆａ Ｃｕｒｉｘ）ＲＰＩＸ−線フィルムを用いて、オ−トラジオグラフィ−で可視化した。
【０２０７】
オリゴヌクレオチドを、γ［32Ｐ］−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とポリヌクレオチドキナ−ゼで標識したＢｉｏｓｅｒａｃｈ７５００ＤＮＡ合成装置で合成し、標準技法を用いてＰＡＧＥで精製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８５）：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。第１１ａ図および第１１ｂ図において、５’−32Ｐで標識したオリゴヌクレオチド１は、５’−ＧＡＳＴＣＣＡ10Ｇであり、Ａｃｒ−Ｔ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2の不存在下（レ−ン１および４）または存在下（レ−ン２および５、２５ｐｍｏｌ；レ−ン３および６、７５ｐｍｏｌ））で培養し、また５’−ＧＡＴＣＣＴ10Ｇである”オリゴ−２”の不存在化（レ−ン１から３まで）または存在化（レ−ン４から６まで）で培養した。５’−32Ｐで標識したオリゴ２は、同じＰＮＡの不存在下（レ−ン７） または存在下（レ−ン８、２５ｐｍｏｌ；レ−ン９、７５ｐｍｏｌ）で培養し、上記において詳細に記載したようなＰＡＧＥで分析した。第１１ａ図に示した結果によれば、ＰＮＡでハイブリダイゼ−ションしたと同様に（レ−ン１から３まで）ｓｓＤＮＡの遅延化が明らかであり、ＰＮＡが、標識した相補オリゴヌクレオチド（レ−ン４から６まで）に対してＤＮＡオリゴヌクレオチドと競合・拮抗する能力を有していることが判る。ｄｓＤＮＡに起因するバンドの強度は、ＰＮＡ濃度を上げるに応じてより急速に増大し、泳動速度が遅いＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを表すバンドで置換される。レ−ン７から９までは、このＰＮＡは、相補的でないＴ10オリゴＤＮＡには影響を及ぼさないことを示す。第１１ｂ図においては、ＤＮＡ変成条件で行ったものであるが、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重らせんが未変成のままである。
【０２０８】
実施例５７
鎖置換複合体の生成プラスミドＤＮＡに含有されるｄＡ10−ｄＴ10標的配列を、標準的方法に従い（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８６）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＪＭ１０１株を用いて二つのオリゴヌクレオチド（ｄ（ＧＡＴＣＣＡ10Ｇ）＋ｄ（ＧＡＴＣＣＴ10Ｇ）））をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ制限酵素部位にクロ−ンすることによって構成した。所望のプラスミド（ｐＴ１０と称する）を得られたクロ−ンの一つから単離し、アルカリ性抽出法およびＣｓＣｌ遠心分離法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８６）によって精製した。ｄＡ10／ｄＴ10標的配列を含む２４８ｂｐの３’−［32Ｐ］−ｅｎｄ（末端）で標識したＤＮＡフラグメントを、このｐＴ１０ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩで開裂し、次にＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラ−ゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）のＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いてこの開裂したＤＮＡをα［32Ｐ］−ｄＡＴＰ（４０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）で標識し、２４８ｂｐＤＮＡフラグメントをＰＡＥＧ（１５％アクリルアミド、０．５％ビスアクリルアミド、ＴＢＥ緩衝液）によって精製して得た。このＤＮＡフラグメントは、ＥｃｏＲＩで開裂したｐＴ１０プラスミドをバクテリア性アルカリ性ホスファタ−ゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で処理し、このプラスミドＤＮＡを低融点アガロ−スでのゲル電気泳動法で精製し、次いでγ［32Ｐ］ＡＴＰとポリヌクレオチドキナ−ゼで標識することによって、５’−ｅｎｄにおける［32Ｐ］標識を付して得た。ＰｖｕＩＩで処理した後、２４８ｐｂＤＮＡを上記のように精製した。Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2と２４８ｂｐＤＮＡフラグメントとの複合体を、Ａｃｒ１−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2５０ｎｇを５００ｃｐｓのＰ−標識した２４８ｂｐフラグメントと０．５μーｇの子牛胸腺ＤＮＡとともに、下記においてさらに詳細に述べるように、１００μｌの２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．１ｍＭＣａＣｌ2、ｐＨ７．４中において３７℃において６０分間培養することによって形成させた。
【０２０９】
実施例５８
以下を用いた鎖置換複合体のプロ−ビング
【０２１０】
（ａ）スタフィロコッカスヌクレア−ゼ（第１２ｂ図レ−ン８から１０）。鎖置換複合体を上記したように生成させた。この複合体を２０℃において５分間７５０Ｕ／ｍｌのスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ヌクレア−ゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理し、この反応をＥＤＴＡを２５ｍＭまで添加することによって停止させた。このＤＮＡを２容量のエタノ−ル−２％酢酸カリウム−で沈殿させ、８０％ホルムアミド、ＴＢＥに再溶解させ、９０℃に加熱し（５分間）、高分解ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド、０．３％ビスアクリルアミド、７Ｍ尿素）とオ−トラジオグラフィ−によって分析した。レ−ン８は、ＰＮＡを含有せず、レ−ン９は４０ｐｍｏｌまたレ−ン１０は１２０ｐｍｏｌのＰＮＡを含有している。ＰＮＡが含有されているので、フットプリントの生成が認められ、この結果スタフィロコッカスヌクレア−ゼによって消化を受け易くなることおよび従ってｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡの置換が増大することが判る。
【０２１１】
（ｂ）アフィニティ−光開裂（第１２図＋第１２ｂ図；何れの場合もレ−ン１から３まで）
複合体をＴＥ緩衝液中で生成させた。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に入れた試料に３００ｎｍにおいて（ＰｈｉｌｉｐｓＴＬ）２０Ｗ／１２蛍光灯、２４３Ｊｍ-2／ｓ）３０分間ＵＶ照射した。ＤＮＡは、上記したように沈殿させ、１Ｍピペリジンに取り、９０℃にまで２０分間加熱した。凍結乾燥した後で、ＤＮＡは、上記したＰＡＧＥによって分析した。もう一度、それぞれの場合において、レ−ン１は、ＰＮＡは一切含有せず、レ−ン２および３は、それぞれ４０ｐｍｏｌと１２０ｐｍｏｌのＰＮＡを含有する。ＰＮＡに結合したＤＮＡ鎖（Ａ１０鎖）は、アクリジンエステルの位置において（第１２ａ図のレ−ン１から３まで）開裂して、新しいバンドを与えるが、またＰＮＡによって置換された鎖は（Ｔ１０鎖）ランダムに開裂子、フットプリントを与える。
【０２１２】
（ｃ）過マンガン酸カリウム（第１２Ｂ図レ−ン４から６まで）
複合体を１００μｌのＴＥ中で生成させ、２０ｍＭＫＭｎＯ4を５μｌ添加した。２０℃において１５秒経過後、１．５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１Ｍ２−メルカプトエタノ−ルを添加して反応を停止させた。ＤＮＡを沈殿させ、ピペリジンで処理して、上記した様に分析した。レ−ン４から６までにおいては、レ−ン１から３までと同様のＰＮＡ濃度を用いた。かくして再び、過マンガン酸塩により置換されたｓｓＤＮＡの開裂を示すフットプリントの生成を認める。
【０２１３】
（ｄ）光フットプリンティング（第１２ａ図レ−ン５から６まで）
複合体を１００μｌＴＥにおいて生成させ、ジアゾ−結合アクリジン（０．１μｇ／μｌ）（ＤＨＡ、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９８８）、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６、３８７７−８８）を添加した。試料を３６５ｎｍ（ＰｈｉｌｉｐｓＴＬ ２０Ｗ／０９Ｎ、２２Ｊｍ-2／ｓ）で３０分間照射し、上記した様に処理して、”アフィニティ−光開裂”に供した。ＰＮＡの存在下において、（レ−ン６）このＤＮＡは、保護されておりかつ保護された領域において開裂に相当するバンドは消滅する。
【０２１４】
（ｅ）Ｓ１−ヌクレア−ゼ（第１２ｃ図レ−ン１から３）
複合体を５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０ｍＭＮａｃｌ、０．５％グリセリン、１ｍＭＺｎＣｌ2、ｐＨ４．５において生成させ、０．５Ｕ／ｍｌにおいてヌクレア−ゼＳ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で２０℃において５分間処理した。反応を停止させ、さらに上記”スタフィロコッカスヌクレア−ゼ”項において記載した様に処理した。使用したＰＮＡの量は、ゼロ（レ−ン１から３まで）または１２０ｐｍｏｌ（レ−ン４から６まで）であり、レ−ン７がサイズの標準を示す。かくして再び、ＰＮＡで置換されたＴ１０ＤＮＡ鎖の開裂が認められる。
【０２１５】
実施例５９（１）配向、（２）ｐＨおよび（３）配列ミスマッチに対するハイブリダイゼ−ションの感度ＰＮＡオリゴマ−Ｈ−Ｔ4Ｃ2ＴＣＴＣ−ＬｙｓＮＨ2を合成実験記録６によって製造し、逆相ＨＰＬＣによって精製し、ＦＡＢ−ｍａｓｓ分光分析法によって同定した；実験値（理論値）：２７４６．８（２４４７．１５）。この配列を用いたハイブリダイゼ−ション実験によって、実際のところ非対照であるので、配向の問題が解決される。このような実験によって、Ｔｍの温度依存性や生成した複合体の化学量論の問題も解決される。ＰＮＡ−オリゴマ−Ｈ−Ｔ4Ｃ2ＴＣＴＣ−ＬｙｓＮＨ2を用いたハイブリダイゼ−ション実験を以下のように行った：
【０２１６】
【表７】
2008253251.tif 000016
【０２１７】
これらの結果から、真に混合された配列が明確な輪郭の融解曲線をもたらしたことが明らかとなった。ＰＮＡ−オリゴマ−は実際に両方の配向において結合することが可能である（第１列と第４列を比較のこと）。尤もＮ−末端／５’−配向に対する優先性が認められる。ＴまたはＣに対向する単一ミスマッチを導入した結果、ｐＨ７．２において１６℃以上もＴｍが低下することになった；ｐＨ５．０においては、このＴｍ値は、２７℃以上も低下した。このことは、極めて高度の配列選択性があることを示している。
【０２１８】
上記したように、Ｔｍ 値には極めて強度のｐＨ依存性が認められ、Ｈｏｏｇｓｔｅｎの塩基対合がハイブリッドを形成する上で重要であることを示している。従って、化学量論が２：１であることが判明したことは、驚くに当たらない。配列に対称性がないことおよびミスマッチが存在した場合Ｔｍが極めて大きく低下することは、相補的ＤＮＡに結合した場合Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ鎖およびＨｏｏｇｓｔｅｎ鎖が平行することを示している。このことは、双方の配向・方向、即ち５’／Ｎ−末端および３’／Ｎ−末端についても当てはまるのである。
【０２１９】
実施例６０
ハイブリダイゼ−ションにおける配列識別Ｈ−Ｔ5ＧＴ4−ＬｙｓＮＨ2を用いたデオキシオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼ−ション実験結果を以下に示す：
【０２２０】
【表８】
2008253251.tif 000017
【０２２１】
第１、３および６列を第２、４、５および７列を比較すると明らかなように、Ｇは、このような態様においてＤＮＡ−鎖におけるＣ／ＡとＧ／Ｔとを識別することが可能であり、即ち配列識別が認められる。第３列における複合体は更には、ＵＶ−混合曲線から２ＰＮＡ：１ＤＮＡ複合体であることが決定された。
【０２２２】
実施例６１
修飾された主鎖を用いたハイブリダイゼ−ションにおける配列特異性延長された主鎖（β−アラニン修飾）を有する単一ユニットのＰＮＡ−オリゴマ−に対するハイブリダイゼ−ションデ−タは、以下の通りである：
【０２２３】
【表９】
2008253251.tif 000018
【０２２４】
融点が低下するにつれて、これらのデ−タから、塩基特異的認識が保持されていることが明らかである。
【０２２５】
実施例６２
ヨウ素化方法−放射能標識Ｔｙｒ−ＰＮＡ−Ｔ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2の５μｇを１００ｍＭりん酸ナトリウム、ｐＨ７．０の４０μｌ中に溶解し、１ｍＣｉのＮａ125Ｉと２μｌのクラミン−Ｔ（ＣＨ3ＣＮ中５０ｍＭ）を添加する。この溶液を２０℃に１０分間放置し、次いで０．５＋５ｃｍのセファデックスＧ１０カラムに通す。放射能を含む最初の二つのフラクション（それぞれ１００μｌ）を集め、ＨＰＬＣで精製する：即ち、１％のＣ3ＦＣＯＯＨ水溶液中０−６０％ＣＨ3ＣＮ勾配を用いた逆相Ｃ−１８である。125Ｉ−ＰＮＡは、ＰＮＡピ−クの直後に溶出する。溶媒は減圧下で除去する。
【０２２６】
実施例６３
二本鎖ＤＮＡ標的Ａ10／Ａ9Ｇ／Ａ8Ｇ2に対するＰＮＡｓ−Ｔ10／Ｔ9Ｃ／Ｔ8Ｃ2の結合（第２０図）
表示したプラスミドの二本鎖、32Ｐで標識したＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩフラグメント（ＥｃｏＲＩ部位の３’−末端で標識した大きいフラグメント）２００ｃｐｓ、キャリア−子牛胸腺ＤＮＡ０．５μｇおよび１００μｌ緩衝液（２００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、１ｍＭＺｎＳＯ4）中の表示したＰＮＡ３００ｎｇから成る混合物を３７℃において１２０分間培養した。ヌクレア−ゼＳ１を５０単位を加え、２０℃において５分間培養した。０．５ＭＥＤＴＡ３μｌを添加することによって反応を停止させ、エタノ−ル中２％の酢酸カリウム液２５０μｌを加えることによってＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡを１０％ポリアクリルアミド配列決定ゲルにおける電気泳動法によって分析し、放射能標識したＤＮＡバンドをオ−トラジオグラフィ−で可視化した。得られた完全なバンドパタ−ンから、鎖置換によって一本鎖ＤＮＡが生成していることが明らかとなっているが、このものは、ヌクレア−ゼによって攻撃され、より短鎖のオリゴヌルレオチドの混合物が得られる。それぞれの場合に使用した三種のＰＮＡについて得られた結果を比較した結果、得られるそれぞれの標的に対する選択性があることが明らかとなっている。ｐＵＣ１９に適当なオリゴヌクレオチドをクロ−ンすることによって標的プラスミドを調製した。標的Ａ10：ＢａｍＨＩ部位（ｐＴ10と称するプラスミド）にクロ−ンしたオリゴヌクレオチドＧＡＴＣＣＡ10Ｇ＆ＧＡＴＣＣＴ10Ｇ。標的Ａ5ＧＡ4：ＳａｌＩ部位（プラスミドｐＴ９Ｃ）にクロ−ンしたオリゴヌクレオチドＴＣＧＡＣＴ4ＣＴ5Ｇ＆ＴＣＧＡＣＡ5ＧＡ4Ｇ。標的Ａ2ＧＡ2ＧＡ4：ＰｓｔＩ部位（プラスミドｐＴ2Ｃ2）にクロ−ンしたオリゴヌクレオチドＧＡ2ＧＡ2ＧＡ4ＴＧＣＡ＆ＧＴ4ＣＴ2ＣＴ2ＣＴＧＣＡ。ゲル中におけるこれらの標的の位置は、左方へのバ−によって示される。Ａ／Ｇは、標的Ｐ１０のＡ＋Ｇ配列ラダ−である。
【０２２７】
実施例６４
制限酵素開裂のＰＮＡによる抑制・阻害（第２３図）
プラスミドｐＴＴ１０の２μｇを２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中のｐＮＡ−Ｔ10の表示量と混合し、３７℃において１２０分間培養した。２μｌ ｘ濃縮緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ、ＭｇＣｌ2、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ）およびＰｖｕＩＩ（２単位）とＢａｍＨＩ（２単位）を添加し、培養を６０分間継続した。このＤＮＡを５％ポリアクリルアミド中でのゲル電気泳動法によって分析し、このＤＮＡを臭化エチジウム染色法によって可視化した。有意比率のＰＮＡの存在下では（０．２、０．６）、酵素ＢａｍＨＩの開裂パタ−ンは、変化せず、この酵素は開裂部位に添ってＰＮＡの存在によって抑制阻害されることが判る。
【０２２８】
実施例６５
ＰＮＡ−Ｔ10−ｄｓＤＮＡ鎖置換複合体形成の速度論（第２１図）
ｐＴ１０の二本鎖、32Ｐで標識したＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩフラグメント（ＥｃｏＲＩ部位の３’−末端で標識した大きいフラグメント）２００ｃｐｓ、キャリア−子牛胸腺ＤＮＡ０．５μｇおよび１００μｌ緩衝液（２００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、１ｍＭＺｎＳＯ4）中の表示したＰＮＡ−Ｔ10−ＬｙｓＮＨ2３００ｎｇから成る混合物を３７℃において１２０分間培養した。表示した時間において、ヌクレア−ゼＳ１を５０単位を７つの試料のそれぞれに加え、２０℃において５分間培養した。鎖置換によって生成した一本鎖ＤＮＡをこのヌクレア−ゼによって消化した。エタノ−ル中２％の酢酸カリウム液２５０μｌを加えることによってＤＮＡを沈殿させ、１０％ポリアクリルアミド配列決定ゲルにおける電気泳動法によって分析した。鎖置換複合体の量を、標的配列におけるＳ１−開列の強度をオ−トラジオグラフをデンシトメ−タ−で走査して測定し、これに基づいて任意の単位で算定した。時間の経過とともにこの複合体の生成が認められる。
【０２２９】
実施例６６
ＰＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体の安定性（第２２）
２００ｃｐｓの32Ｐ−ｐＴ１０フラグメント（実施例６５ｎｉおけると同様のもの）、子牛胸腺ＤＮＡ０．５μｇおよび３００ｎｇの所望のＰＮＡ（Ｔ10−ＬｙｓＮＨ2、Ｔ8−ＬＹＳＮＨ2またはＴ6−ＬＹＳＮＨ2）とから成る混合物を、１００μの２００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、１ｍＭＺｎＳＯ4中３７℃において６０分間培養した。オリゴヌクレオチドＧＡＴＣＣＡ10Ｇを２μｇを加え、標識オリゴヌクレオチドに対するＰＮＡと拮抗させ、各試料を表示した温度において１０分間加熱し、氷で１０分間冷却し、次いで２０℃に加温した。Ｓ１ヌクレア−ゼを５０単位加え、単一ヌクレオチドとして放出遊離された放射能の量を測定した。Ｔ10ＤＮＡ二重らせんに対する予期Ｔｍ値は、２０℃であり、またＴ8については１６℃であり、Ｔ6については１２℃であった。相当するＰＮＡ／ＤＮＡ値は、Ｔ10＞７０℃であり、Ｔ8については６０℃であり、またＴ6については３７℃であった。
【０２３０】
実施例６７
ＰＮＡの固定化ＰＮＡ−セファロ−スを製造するために、臭化ジシアンで活性化したセファロ−ス（Ｓｉｇｍａ）１０ｍｇを１０μｇのＰＮＡとともに５０ｍＭりん酸ナトリウム、ｐＨ７．５において３７℃で６０分間培養した。このセファロ−スは、遠心分離によって単離し、５０ｍＭりん酸ナトリウム、ｐＨ７．５の２５０μｌで三回洗浄した。
【０２３１】
実施例６８ＰＮＡ−セファロ−スへの５’−３２Ｐ−末端標識オリゴヌクレオチドの結合１００μのＴＥ中１ｍｇのＰＮＡ−セファロ−ス（実施例６７）を32Ｐで標識したオリゴヌクレオチドの５０ｃｐｓ（１００ｎｇ）と共に２０℃において１６時間培養した。このセファロ−スを遠心分離して単離し、５００μｌのＴＥで二回洗浄した。結合したオリゴヌルレオチドを、”Ｃｅｒｅｎｋｏｖ”方法を用いて液体シンチレ−ションカウンティングによって求めた。三種の異なるＰＮＡ−セファロ−スと４種のオリゴ−ＤＮＡについて、得られた結果を下記の表に示す。この固定化したＰＮＡによる捕捉の特異性が明確に求められるが、なお塩基対ミスマッチは一つだけ許容される。
【０２３２】
【表１０】
2008253251.tif 000019
【０２３３】
この表において、Ａ１０は、５’−ＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧであり、Ａ９Ｇは、５’−ＴＣＧＡＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧであり、Ａ８Ｇ２は、５’−ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＣであり、またｍｉｘは、５’−ＧＡＴＣＡＣＧＣＧＴＡＴＡＣＧＣＧＴある。ＰＮＡ類は、以下の通り：Ｔ１０：Ｈ−Ｔ10ＬｙｓＮＨ2、Ｔ９Ｃ：Ｈ−Ｔ5ＣＴ4−ＬｙｓＮＨ2、Ｔ８Ｃ２：Ｈ−Ｔ2ＣＴ2ＣＴ4−ＬｙｓＮＨ2、なし：エタノ−ルアミン。
【０２３４】
実施例６９（第２５ａ、ｂおよびｃ図）
ＰＮＡ−セファロ−スへの32Ｐ−オリゴヌクレオチドの結合安定性の温度依存性オリゴヌクレオチド類を実施例６７および６８において記載したようにｐＮＡ−セファロ−ズに結合した。何れの場合においても、得られたＰ−オリゴヌクレオチド−ＰＮＡ−セファロ−スを高温で洗浄し、セファロ−スを遠心分離して単離し、放射能を”Ｃｅｒｅｎｋｏｖ”カウンティングによって測定し、セファロ−スを再び５００μｌにとり、以下に記載する温度において培養し、遠心分離した。この図には、当初結合に正規化した結果を示す。オリゴヌクレオチドおよびセファロ−スは、実施例６８の表に記載した通りであった。これら曲線間における変位は、ミスマッチが一つ生じた場合オリゴヌクレオチド結合安定性が低下したことを示す。
【０２３５】
実施例７０
ＰＮＡによる転写の抑制・阻害（第２６図）
１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（制限酵素ＰｖｕＩＩ（以下を参照）で開裂した）と１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の１５μｌ中での１００ｎｇのＰＮＡとを３７℃において６０分間培養した。次いで、４μｌ５ｘ濃縮緩衝液（０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭＭｇＣｌ2、１０ｍＭスペルミジン、１２５ｍＭＮａＣｌ）を１μｌのＮＴＰ−ｍｉｘ（１０ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ ＣＴＰ、１０ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、０．１μＣｉ／μｌ ３２Ｐ−ＵＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、２μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、１μＧ／ｍｌへパリン）および３単位のＲＮＡポリメラ−ゼと混合した。培養を３７℃において１０分間継続した。このＲＮＡを−２０℃において９６％エタノ−ル中の２％酢酸カリウム液６０μｌを添加して沈殿させ、８％ポリアクリルアミド配列決定ゲルにおける電気泳動法によって分析した。ＲＮＡ転写物をオ−トラジオグラフィ−で可視化した。使用したプラスミドは以下の通りであった：レ−ン１から５まで；ｐＡ１０ＫＳ（Ａ１０標的は、転写された鎖の上に位置する）。レ−ン６から１０まで：ｐＴ１０ＫＳ（Ａ１０標的は、転写されていない鎖の上に位置する）。このプラスミドは、実験に先だって以下の制限酵素で処理した：レ−ン１，４，６および９：ＰｖｕＩＩ；レ−ン２、５、７および１０：ＸｈａＩ；レ−ン３および８：ＢａｍＩＩ。レ−ン４、５、９および１０の試料は、ＰＮＡを含有していたが、その他は、含有していなかった。ＰＮＡＴ10をプラスミドの転写された鎖に結合した場合、ＲＮＡの転写は、ＰＮＡ結合部位において阻止されることが、ゲルから認めることが出来る。このＰＮＡをプラスミドの転写されていない鎖に結合すると、転写は阻止されないのである。
【０２３６】
実施例７１
アフィニティＰＮＡ−セファロ−ス（第２７図）
１００μｌのＴＥ中のＰＮＡ−Ｔ10セファロ−ス（実施例６７を参照）１ｍｇを以下の32Ｐ−５’−末端標識したオリゴヌクレオチドの５０ｃｐｓと共に２０℃において１６時間培養した：１：５’−ＧＡＴＣＣＧ ＧＣＡ ＡＡＴ ＣＧＧ ＣＡＡ ＴＡＣ ＧＧＣＡＴＡ ＡＣＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＣＧＴ ＣＴＴ ＴＡＣ ＧＧＣＴＴＡ ＴＣＧ ＧＣＴ ＡＴＴ ＣＧＧ ＣＡＴＴＴＣ ＧＧＣＡＡＴ ＴＣＧ、２：５’−ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＣＴ ＴＡＡ ＣＧＧ ＣＡＡ ＴＴＣ ＧＣＴＴＡＴ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＡＴ ＣＧＧ ＣＴＡ ＡＴＣ ＧＧＣＡＴＴＡＣＧ ＧＣＴ ＴＴＴ ＣＧＧ Ｇ、３：５’−ＧＡＣ ＡＡＡ ＣＡＴ ＡＣＡ ＡＴＴ ＴＣＡ ＡＣＡ ＧＡＡＣＣＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ Ａ、４：５’−ＡＣＴＧＡＣ ＴＡＣ ＣＴＡ ＧＧＴ ＴＴＡ ＣＣＧ ＴＧＣＣＡＧ ＴＣＡ５：５’−ＧＡＡ ＡＣＧ ＧＡＴ ＡＧＣ ＴＧＣ Ａこのセファロ−スを遠心分離して単離し、ＴＥで三回洗浄した。オリゴヌクレオチドを次に温度を上げつつ５００μｌのＴＥで洗浄して、除去し、１ｍｌのエタノ−ル、２％酢酸カリウムで沈殿させ、ＴＢＥ緩衝液中２０％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素ゲルにおける電気泳動法で分析し、オ−トラジオグラフィ−（−７０℃、１６時間、増幅スクリ−ン）で検出した。結果を第２６図に示す。
【０２３７】
レ−ン１：セファアデックスに結合していないオリゴヌクレオチドレ−ン２：４０℃で洗浄除去したオリゴヌクレオチドレ−ン３：６０℃で洗浄除去したオリゴヌクレオチドレ−ン４：８０℃で洗浄除去したオリゴヌクレオチド
【０２３８】
プラスミド３のみが、このＰＮＡに相補的である。８０℃までの温度において洗浄すると、相補的プラスミドのみがＰＮＡ−セファロ−ズ上に保持されることが、理解することできる。この実施例によって、ＰＮＡを用いたアフィニティ捕捉法によって混合物から一つのオリゴヌクレオチドを抽出出来ることが証明される。
【０２３９】
実施例７２
ｐＮＡ−鎖置換によるｄｓプラスミド中のＤＮＡ配列についての定量的検定５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の１０μｌ中で以下に示したそれぞれの制限酵素によって消化した３μｇのプラスミドＤＮＡを125Ｉ−ＰＮＡ−Ｔ10−Ｔｙｒ５０００ｃｐｍ（１０ｎｇ）と以下において全ＰＮＡ量として表示した量の冷ＰＮＡＴ10Ｔｙｒと共に３７℃において培養した。ＤＮＡを２５μｌのエタノ−ル、２％酢酸ナトリウムで沈殿させ、ＴＢＥ緩衝液中６％ポリアクリルアミドにおける電気泳動法によって分析した。このゲルを臭化エチジウムで染色し、その後オ−トラジオグラフィ−に供した（−７０℃、１６時間、増幅スクリ−ン）。得られた結果を第２８図に示す。”Ａ”は、エチジウム染色ゲルであり、”ｂ”は、相当するオ−トラジオグラムである。使用したプラスミドは、以下の通りであった：レ−ン１から３まで：ｐＴ１０＋ ＨａｅＩＩＩレ−ン４から６まで：ｐＴ１０ ＋ Ｈｉｎｆｌレ−ン７から９まで：ｐＴ１０ ＋ ＰｖｕＩＩ。
それぞれの試料中のＰＮＡ−Ｔ10−Ｔｙｒの全量は、以下の通りであった：レ−ン１、４および７： １０ｎｇ；
レ−ン２、５および８： ２５ｎｇ；
レ−ン３、６および９： ２５０ｎｇ；
臭化エチジウムゲル（ａ）は、生成したＤＮＡフラグメント（ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドを含む）の大きさを示す。オ−トラジオグラフ（ｂ）は、ゲル（ａ）中の何れのバンドがＰＮＡを含有しているかを示す。鎖置換複合体の存在は、レ−ン１において認めることが出来るが、レ−ン２および３において冷ＰＮＡの比率を増大させることによってこのバンドの強度に及ぼす影響を認めることが出来る。同様の結果がレ−ン４から６までおよびレ−ン７から９までにおいて他の二つのプラスミドのそれぞれについて認められる。それぞれの場合におけるＰＮＡ−ＤＮＡバンドの位置は、プラスミドを同定するために用いられ、またその強度は、存在するプラスミドの量を定量化するために用いることが出来る。当業者は、本発明の好ましい実施態様について多くの変更および修正を行い得ることおよびかかる変更および修正は、本発明の精神から逸脱することなく行い得ることを理解するであろう。従って、添付する請求の範囲は、本発明の真の精神および範囲に含まれる全ての等価の変更を包含することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２４０】
【図１Ａ】天然のデオキシリボヌクレオチド（Ａ）および本発明のペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｂ）を示す。
【図１Ｂ】天然のデオキシリボヌクレオチド（Ａ）および本発明のペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｂ）を示す。
【図２Ａ】ＤＮＡ認識のための天然および非天然の核酸塩基およびリポ−タ−基を示す。
【図２Ｂ】ＤＮＡ認識のための天然および非天然の核酸塩基およびリポ−タ−基を示す。
【図３】以下の概略図を示したものである：すなわち、（ａ）Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2（ＡｃｒＴ10Ｌｙｓ−ＮＨ2）による光開裂；Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2のジアゾ−結合アクリジンによるフォトフットプリントおよび好ましいＫＭｎＯ4−開裂；および（ｃ）Ｓ1−ヌクレア−ゼで増進せしめられた開裂と（ｄ）Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2結合部位のミクロコッカスヌクレア−ゼによる開裂。
【図４】ＰＮＡモノマ−シントンのいくつかの例を示す。
【図５】Ａｃｒ1リガンドおよび一つのＰＮＡであるＡｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2を示す。
【図６】モノマ−シントンを調製する一般的な概略図である。
【図７】Ａｃｒ1リガンドを調製する一般的概略図である。
【図８】線状の未保護ＰＮＡアミドの調製を図示する固相ＰＮＡ合成の一般的概略図である。
【図９】以下の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示すものである：（Ａ）ＨＦ−開列後の粗製Ｈ−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ−ＮＨ2（凍結乾燥前）；（Ｂ）ＨＦ開裂後の粗製Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ−ＮＨ2（凍結乾燥前）；および（Ｃ）精製Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ−ＮＨ2・緩衝液Ａ、５％ＣＨ3ＣＮ／９５％  Ｈ2Ｏ／０．０４４５％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ、６０％ＣＨ3ＣＮ／４０％Ｈ2Ｏ／０．０３９０％ＴＦＡ；直線勾配、３０分でＢが０−１００％；流量、  １．２ｍｌ／分；カラム、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８  （５μｍ、０．４６  ｘ  ２５ｃｍ）。
【図１０】以下の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す：すなわち、（Ａ）精製Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2および（Ｂ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−［Ｔａｅｇ］4−Ｌｙｓ−ＮＨ2−第９図におけると同一条件を使用。
【図１１Ａ】第１１ａ図および第１１ｂ図は、ＡｃｒＴ10−ＬｙｓのｄＡ10・５’−32Ｐで標識したオリゴヌクレオチドへの結合を示す；（１）（５’−ＧＡＴＣＣＡ10Ｇ）をＡｃｒＴ10−Ｌｙｓの存在下または不存在下およびオリゴヌクレオチドの存在下または不存在下で培養した。（２）（５’−ＧＡＴＣＣＡ10Ｇ）および試料を”自然の条件”下（第１１ａ図）または”変性条件”下（第１１ｂ図）でポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）およびオ−トラジオグラフィ−によって分析した。
【図１１Ｂ】第１１ａ図および第１１ｂ図は、ＡｃｒＴ10−ＬｙｓのｄＡ10・５’−32Ｐで標識したオリゴヌクレオチドへの結合を示す；（１）（５’−ＧＡＴＣＣＡ10Ｇ）をＡｃｒＴ10−Ｌｙｓの存在下または不存在下およびオリゴヌクレオチドの存在下または不存在下で培養した。（２）（５’−ＧＡＴＣＣＡ10Ｇ）および試料を”自然の条件”下（第１１ａ図）または”変性条件”下（第１１ｂ図）でポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）およびオ−トラジオグラフィ−によって分析した。
【図１２Ａ】第１２ａ−ｃ図は、ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2錯体についての化学的、光化学的および酵素的プロ−ビングを示す。ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2とｄＡ10／ｄＴ10標識配列を含む32Ｐ−ｅｎｄ標識化ＤＮＡフラグメントとの間の錯体を、アフィニティ−光開裂（第１２ａ図、レ−ン１−３；第１２ｂ図、レ−ン１−３）、過マンガン酸塩プロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン４−６）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓヌクレア−ゼによるプロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン８−１０）もしくはヌクレア−ゼＳ１によるプロ−ビング（第１２ｃ図）によってプロ−ブした。Ａ鎖（第１２ａ図）またはＴ鎖（第１２ｂ図、第１２ｃ図）をプロ−ブした。（ＰＡＧＥ）およびオ−トラジオグラフィ−によって分析した。
【図１２Ｂ】第１２ａ−ｃ図は、ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2錯体についての化学的、光化学的および酵素的プロ−ビングを示す。ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2とｄＡ10／ｄＴ10標識配列を含む32Ｐ−ｅｎｄ標識化ＤＮＡフラグメントとの間の錯体を、アフィニティ−光開裂（第１２ａ図、レ−ン１−３；第１２ｂ図、レ−ン１−３）、過マンガン酸塩プロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン４−６）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓヌクレア−ゼによるプロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン８−１０）もしくはヌクレア−ゼＳ１によるプロ−ビング（第１２ｃ図）によってプロ−ブした。Ａ鎖（第１２ａ図）またはＴ鎖（第１２ｂ図、第１２ｃ図）をプロ−ブした。（ＰＡＧＥ）およびオ−トラジオグラフィ−によって分析した。
【図１２Ｃ】第１２ａ−ｃ図は、ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2錯体についての化学的、光化学的および酵素的プロ−ビングを示す。ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2とｄＡ10／ｄＴ10標識配列を含む32Ｐ−ｅｎｄ標識化ＤＮＡフラグメントとの間の錯体を、アフィニティ−光開裂（第１２ａ図、レ−ン１−３；第１２ｂ図、レ−ン１−３）、過マンガン酸塩プロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン４−６）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓヌクレア−ゼによるプロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン８−１０）もしくはヌクレア−ゼＳ１によるプロ−ビング（第１２ｃ図）によってプロ−ブした。Ａ鎖（第１２ａ図）またはＴ鎖（第１２ｂ図、第１２ｃ図）をプロ−ブした。
【図１３】保護ＰＮＡシントンを合成する手法を示す。
【図１４】保護アデニンモノマ−シントンを合成する手法を示す。
【図１５】保護グアニンモノマ−シントンを合成する手法を示す。
【図１６】ＰＮＡ主鎖改変のいくつかの例を示す。
【図１７】通常のアミノ酸に相当する側鎖を有するチミンモノマ−シントンを合成する手法を示す。
【図１８Ａ】第１８ａ図および第１８図ｂはそれぞれ、チミンモノマ−シントンのアミノプロピル類縁体およびプロピオニル類縁体を合成する手法を示す。
【図１８Ｂ】第１８ａ図および第１８図ｂはそれぞれ、チミンモノマ−シントンのアミノプロピル類縁体およびプロピオニル類縁体を合成する手法を示す。
【図１９】チミンモノマ−シントンのアミノエチル−β−アラニン類縁体を合成する手法を示す。
【図２０】ＰＮＡｓ−Ｔ10、−Ｔ9Ｃおよび−Ｔ8Ｃ2が、高い配列特異性をもって二本鎖ＤＮＡに結合することを実証するＰＡＧＥラジオオ−トグラフを示す。
【図２１】Ａ10／Ｔ10二本鎖ＤＮＡ標的に結合した長さの異なるＰＮＡ類の熱安定性を示すＰＡＧＥオ−トラジオグラフのデンシトメ−タ−走査に基づくグラフである。
【図２２】Ａ１０／Ｔ１０二重鎖ＤＮＡ標的に結合させた、長さの異なるＰＮＡの熱安定性を示す、ＰＡＧＥオートラジオグラフのデンシトメトリ走査に基くグラフである。
【図２３】ＤＮＡに対する制限酵素活性が、ＰＮＡを制限酵素認識部位の近位に結合させた場合抑制されることを実証する電気泳動ゲル染色を示す。
【図２４】125Ｉで標識したＰＮＡ−Ｔ10が相補的ｄＡ10オリゴヌクレオチドに結合することを実証するＰＡＧＥオ−トラジオグラフを示す。
【図２５】第２５ａ図から第２５ｃ図は、固定化したＰＮＡとマッチするまたは塩基一つがミスマッチしたオリゴ−ＤＮＡ類との間で異なる温度において実現される結合の百分率を示す。
【図２６】第２６図は、転写された鎖へのＴ10によるＲＮＡポリメラ−ゼ転写抑制を示すオ−トラジオグラフである。
【図２７】標識化プラスミドｄｓＤＮＡ類の一つに相補的である固定化されたＤＮＡに捕捉されかつ異なる温度において洗浄された標識化プラスミドｄｓＤＮＡ類の混合物のオ−トラジオグラフである。
【図２８】第２８図は、ＰＮＡによる鎖置換を用いたプラスミドｄｓＤＮＡの定量を実証する臭化エチジウムゲルとそのオ−トラジオグラフとを組合せたものである。
【図１Ａ】
2008253251.tif 000020
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2008253251.tif 000031
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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