(57)【要約】【課題】  クリングル構造を有するタンパク質の新規生産方法を提供する。【解決手段】  鳥類の胚に形成される初期の心臓内又は血管内へ、クリングル構造を有するタンパクのコード遺伝子を含む外来性遺伝子を含む複製能欠損型レトロウイルスベクターを、マイクロインジェクションにより感染させ、その胚を孵化させることを特徴とする方法によって得られるトランスジェニック鳥類により、クリングル構造を有するタンパク質をその活性を保持したまま生産する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリングル構造を有するタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類。
【請求項２】
４つのクリングル構造を有するタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を有する請求項１に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項３】
配列表の配列番号１の３０〜７２８番目のアミノ酸配列で示されるネコ肝細胞増殖因子及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質とアミノ酸配列において配列同一性が９０％以上であるタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含む請求項２に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４】
配列表の配列番号２の３２〜７２３番目のアミノ酸配列で示される変異型ヒト肝細胞増殖因子及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質とアミノ酸配列において配列同一性が９０％以上であるタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含む請求項２に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項５】
配列表の配列番号３の３２〜４７３番目のアミノ酸配列で示されるＮＫ４及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質とアミノ酸配列において配列同一性が９０％以上であるタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含む請求項２に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項６】
複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いて作製した、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項７】
複製能欠損型レトロウイルスベクターがモロニーマウス白血病ウイルス及び／又はモロニーマウス肉腫ウイルス由来の配列を含む請求項６に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項８】
複製能欠損型レトロウイルスベクターがマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来の配列を含む請求項７に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項９】
複製能欠損型レトロウイルスベクターがＶＳＶ−Ｇエンベロープを含む請求項６〜８のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１０】
組織非特異的なプロモーター遺伝子を含む複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いて作製した請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１１】
組織非特異的なプロモーター遺伝子がニワトリβアクチンプロモーター遺伝子の一部（配列番号４の２２４４〜２７４６番目のＤＮＡ配列）を含む請求項１０に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１２】
組織特異的なプロモーター遺伝子を含む複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いて作製した請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１３】
卵管特異的なプロモーター遺伝子を含む組織特異的なプロモーター遺伝子を有する複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いて作製した請求項１２に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１４】
オボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボムチン、リゾチーム、Ｇ２  グロブリン、Ｇ３  グロブリン、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、オボフラボプロテイン、オボマクログロブリン、シスタチン、アビジンのプロモーター遺伝子及びその組み合わせを含む卵管特異的なプロモーター遺伝子を有する複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いて作製した請求項１３に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１５】
転写エンハンサー及び／又は調節エレメントを含む複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いて作製した請求項６に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１６】
調節エレメントがｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ配列を含む請求項１５に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１７】
鳥類の胚へ外来性遺伝子を含む複製能欠損型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることからなる方法によって得られる請求項６に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１８】
鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始後２４時間以後の胚へ外来性遺伝子を含む複製能欠損型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることからなる方法によって得られる請求項１７に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１９】
胚が孵卵開始後３２時間以後７２時間以前に形成されたものである請求項１８に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項２０】
胚が孵卵開始後４８時間以後６４時間以前に形成されたものである請求項１９に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項２１】
胚に形成される心臓内又は血管内へのマイクロインジェクションにより複製能欠損型レトロウイルスベクターを感染させる請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項２２】
鳥類が家禽である請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項２３】
鳥類がニワトリである請求項２２に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類、その子孫、その卵及びその精子。
【請求項２５】
外来性遺伝子を含む複製能欠損型レトロウイルスベクターを鳥類の胚へ感染させ、その胚を孵化させることからなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類の作製方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類の血液、その体細胞及び／又はその卵より、抽出、精製、活性化、修飾することのいずれか、又はその組み合わせを含む外来性遺伝子由来のタンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来性遺伝子を含むトランスジェニック鳥類の作製法に関し、トランスジェニック鳥類によるクリングル構造を含むタンパク質の発現に関する。更に詳しくは、トランスジェニック鳥類による、ヒト肝細胞増殖因子活性、ネコ肝細胞増殖因子活性、ＮＫ４活性を有するタンパク質の生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年数多くの医薬用タンパク質が利用されるようになってきた。微生物や哺乳類動物細胞に目的タンパク質の遺伝子を導入する遺伝子組換え技術が開発・応用され、これらの遺伝子組換え体を培養することでタンパク質を工業生産できるようになったためである。
【０００３】
医薬用タンパク質が本来持っている生理活性を示す為には、タンパク質が天然に存在するのと同様に折り畳まれる必要や、糖鎖付加・ジスルフィド結合等の翻訳後修飾を受ける必要がある。
【０００４】
微生物培養によりタンパク質を生産する方法は、微生物の増殖速度が早いことや、培地組成が単純であることから、低コストでタンパク質を生産することが可能である。しかし、微生物では目的タンパク質の翻訳後修飾が正しくおこわれないことが多い。よって、天然型と同様の生理活性を有するタンパク質を十分量得ることが難しく、工業生産の実用化が限られているのが現状である。
【０００５】
そこで、今日では、哺乳類動物細胞に目的タンパク質の遺伝子を導入し、その細胞を培養することによって生産する方法が主流となっている。造血因子や抗体医薬といった医薬用タンパク質が、遺伝子組換え哺乳類動物細胞を用いて生産され、販売、使用されている。しかし、哺乳類動物細胞を用いた方法は、専用の培養タンクや培地が必要であり生産コストが高いという問題がある。
【０００６】
これらの問題を克服する為に、動物工場が注目されてきた。遺伝子導入（トランスジェニック）動物を用いて目的タンパク質を生産する技術である。ヤギやヒツジやウシ等を用いてトランスジェニック哺乳類を作製し、その乳汁中に目的タンパク質を生産させる方法が試みられてきた。目的タンパク質にもよるが、抗体が乳汁中に１０ｍｇ／ｍｌ発現したという報告もある（非特許文献１参照）。しかし、この方法にも、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）の問題や利用可能な哺乳類は個体が大きく生産、飼育、管理が大変であること、性成熟の期間がヤギやヒツジで８ヶ月、ウシで１５ヶ月と長いこと等の問題がある。
【０００７】
そこで、トランスジェニック鳥類を用いて卵中に目的タンパク質を発現させる方法が検討されている。この方法は、卵の生産性の高さや、ＢＳＥの問題が存在しないこと、性成熟の期間がニワトリで５ヶ月と短いこと、個体が小さいため大量の個体の飼育が可能であること、人工授精法を検討すればより大規模のトランスジェニック群を急速に育成可能であること、一般に卵の中が自然に無菌であること等の利点があげられる。
【０００８】
トランスジェニック鳥類を作製する手法は、レトロウイルスベクターを用いる方法、胚性幹細胞を用いる方法、始原生殖細胞を用いる方法、精子に目的遺伝子を付着させ導入する方法等が研究中であり、この中でレトロウイルスベクターを用いる方法が最も一般的である。
【０００９】
これまでに、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）の複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いた研究が報告されている（特許文献１参照）。目的タンパク質としてβラクタマーゼを用い、プロモーター遺伝子としてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター遺伝子を用いている。放卵直後のステージＸの胚盤葉にレトロウイルスベクターを導入し、トランスジェニック鳥類の作製に成功している。発現量は、ウエスタンブロットを用いた分析法では０．３３ｍｇ／ｍｌ（卵白を４０ｍｌとする）であり、βラクタマーゼ活性からの換算では０．００３〜０．０３３ｍｇ／ｍｌであると報告されている。また、その際のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の出現頻度は２０％である。生殖細胞への導入効率を調べた結果、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類のオスのうち５％程度が精子中に導入遺伝子を有していた。
【００１０】
他の報告として、同様の実験で、全身に遺伝子が導入されたＧ２において、多いもので卵白中に１．２μｇ／ｍｌ程度の発現であったという報告もなされている（非特許文献２参照）。またその際のＧ０からＧ１の出現頻度は３／４２２（０．７１％）であった。
【００１１】
別の報告では、ＭＳＣＶベクターをＶＳＶ−Ｇエンベロープを用い、高いウイルス力価や感染性、発現量を得た報告がなされている（特許文献２〜４参照）。さらに、その報告では、レトロウイルスベクターを導入する時期を調節することによっても高発現を実現しており、目的タンパク質として抗プリオン１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を用い、卵白、卵黄中に０．５〜１ｍｇ／ｍｌの発現を実現している。
【００１２】
肝細胞増殖因子は成熟肝細胞に対する増殖促進因子として発見されたサイトカインであり、４６３アミノ酸残基のα鎖（６９ｋＤ）と２３４アミノ酸残基のβ鎖（３４ｋＤ）からなるヘテロダイマーである。肝細胞増殖因子は７２８アミノ酸残基からなる１本鎖の前駆体として合成され、Ｎ末端にある３１アミノ酸残基のシグナルペプチドを除去される。その後、セリンプロテアーゼによってＡｒｇ４９４−Ｖａｌ４９５部位でα鎖とβ鎖に切断され、初めて活性型二本鎖の成熟肝細胞増殖因子となる。α鎖には１つのヘアピンループ構造と、４個のクリングル構造を有し、β鎖にはセリンプロテアーゼ活性領域に類似した領域を持つ。
【００１３】
その後の研究で、肝細胞増殖因子は肝細胞のみならず様々な細胞に対して、細胞増殖促進、細胞運動促進、抗アポトーシス、形態形成誘導、血管新生など組織・臓器の再生と保護を担う多彩な生理活性を有することが分かってきた。そして、医薬品として種々の応用が検討されてきている。肝臓、腎臓、肺などの臓器において再生を促進する治療剤となることが確認されているのを初めとして、腎の近位尿細管細胞の増殖を促進するため腎疾患治療剤となること（特許文献５参照）や、メラノサイト、ケラチノサイトなど正常上皮細胞の増殖を促進することから上皮細胞促進剤、創傷治療剤、皮膚潰瘍治療剤、毛根細胞の増殖剤などへも応用可能であること（特許文献６参照）が明らかとなってきている。また、肝細胞増殖因子の重要な特性として、肝細胞増殖因子がＧ１期、すなわち増殖期に入った細胞のみを増殖促進し、Ｇ０期、すなわち静止期にある細胞には作用しないことが挙げられる。このことは、傷害のある組織の増殖再生は促進するが、傷害を受けていない組織に対しては全く作用を及ぼさないということを意味する。したがって、過剰に肝細胞増殖因子を投与しても、あるいは血液などを介して非患部に肝細胞増殖因子が到達しても、正常組織にガン化を誘導したり、過剰な増殖を起こしたりすることがないと考えられている。
【００１４】
肝細胞増殖因子はガン化を誘導はしないが、ガン細胞を取り巻く間質細胞との相互作用（ｔｕｍｏｒ−ｓｔｒｏｍａ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）により、腫瘍の浸潤、転移を誘発することが知られている（非特許文献３〜４参照）。具体的には、細胞表面上のｃ−Ｍｅｔ受容体に結合し、チロシンリン酸化により腫瘍の浸潤、転移を誘発する（非特許文献６参照）。ｃ−Ｍｅｔ受容体はガン遺伝子産物であり、ガン細胞においてしばしば過剰に発現していることが知られている（非特許文献５〜７参照）。そこから、ｃ−Ｍｅｔ受容体に対するアンタゴニストをみつければガンの浸潤を阻害し、ガン転移を阻止する新しい制癌剤になるだろうと推測される。肝細胞増殖因子の作用を水際でブロックする訳である。肝細胞増殖因子において、ｃ−Ｍｅｔ受容体への結合に関与する分子内領域は、Ｎ末端のヘアピン構造とそれに続く第一クリングル構造であることが明らかになっており、肝細胞増殖因子の部分領域がアンタゴニストとして利用可能であるとの推測がなされた。実際のアンタゴニストとして注目され、研究が進められたのは、ＮＫ４と呼ばれるタンパク質である。ＮＫ４は肝細胞増殖因子のＮ末端のヘアピン構造と４個のクリングル構造を持つタンパク質で制癌効果が確認されてきている（非特許文献８〜９参照）。
【００１５】
ＮＫ４は肝細胞増殖因子のアンタゴニストとして制癌効果を示す以外にも、癌抑制効果を示すことも明らかになってきた。ガン転移において、血管新生は重要なプロセスである。血管新生とは、既存の血管から新しい血管の芽が突出・伸長し、やがて伸長した血管の末端がつながって新しい血管網ができることをさす。ガン組織は活発な血管新生を促す腫瘍血管新生因子を分泌し、腫瘍組織内に血管網を作る。この血管を介して、ガン細胞に酸素と栄養分が供給され、ガンは急速に増大する。そこで、血管新生を抑制することができれば、ガンの増殖を防ぐことができると考えられる。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子といった増殖因子が腫瘍血管新生因子の実態であることが分かっている。ＮＫ４は少なくとも肝細胞増殖因子によって促進される血管新生を阻害することが期待されたが、その期待に加え更にＶＥＧＦやｂＦＧＦによって促進される血管内皮細胞の増殖を強力に阻害した。これらの結果は、ＮＫ４は肝細胞増殖因子のアンタゴニスト活性とは別に、血管新生阻害活性を併せ持つことを意味している（非特許文献１０参照）。
【００１６】
肝細胞増殖因子はヒトの治療薬としてだけでなく、動物の治療薬としても開発可能である。近年ペットの高齢化傾向により、ネコの萎縮性、退行性をはじめとする各種加齢に伴う疾患の増加が問題となっている。なかでも、ネコ慢性腎不全は年々増加する傾向にあり、１５歳以上のネコの８０％以上はこの病気でなくなるという報告もなされている。腎臓は４分の３以上が傷害を受けない限り症状が出ず、症状があらわれて診察を受けた時には、腎機能に重篤な障害を受けている場合が多い。現在では、１０歳以上のネコの死亡原因の第１位であるにも関わらず、有効な治療法がなく、毒素吸着剤、輸液治療、腹膜透析など対処治療による延命治療が施されているのが実情である。慢性疾患に対する治療では、長期にわたって薬剤を投与する必要があるため、種を超えて組換え肝細胞増殖因子タンパク質を投与することによって抗原性の問題から長期の投与ができない可能性が考えられる。したがって、ネコのこれら慢性疾患の治療薬として抗原性の問題がなく長期間投与可能な組換えネコ肝細胞増殖因子の必要性が存在する。
【００１７】
以上のことから、組織傷害治癒促進剤としてヒト肝細胞増殖因子及びネコ肝細胞増殖因子が必要とされ、ガン抑制剤としてＮＫ４が必要とされている。しかしこれらを医薬製剤として用いるためには、大量に生産しなければならないという課題が残っている。
【００１８】
これまで、ヒト肝細胞増殖因子はＣＯＳ細胞やチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養細胞での生産が開示されている（特許文献７参照）。また、ＮＫ４はＣＨＯ細胞等の動物細胞を用いた生産法（特許文献８参照）、原核生物での生産法（非特許文献１１参照）が知られているが、上記で述べたように原核生物を用いた生産、哺乳類動物細胞を用いた生産には、それぞれデメリットがあるため、より安価で大量に生理活性を持ったタンパク質を生産する方法が必要とされている。また、ネコ肝細胞増殖因子はカイコで生産される系が開示されている（特許文献９参照）がヒト肝細胞増殖因子同様、より大量に生産させる系が必要とされている。
【特許文献１】特表２００１−５２０００９号公報
【特許文献２】特開２００２−１７６８８０号公報
【特許文献３】特開２００４−２３６６２６号公報
【特許文献４】国際公開第ＷＯ０４／０１６０８１号パンフレット
【特許文献５】特開平４−４９２４６号公報
【特許文献６】特開平７−１７９３５６号公報
【特許文献７】特開平５−１１１３８３号公報
【特許文献８】特開２００３−２５０５４９号公報
【特許文献９】国際公開第ＷＯ０１／０９２３３２号パンフレット
【非特許文献１】Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９  Ｓｅｐ；１７（９）：３６７−７４
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２  Ａｐｒ；２０（４）：３９６−９
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９７  Ａｕｇ  １；５７（１５)：３３０５−１３
【非特許文献４】Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  １９９９  Ｆｅｂ；２９（３)：２０９−４８.
【非特許文献５】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １９９１  Ｎｏｖ；６（１１)：１９９７−２００３.
【非特許文献６】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９５  Ｍａｒ  １；５５（５)：１１２９−３８.
【非特許文献７】Ｃａｎｃｅｒ．  １９９９  Ｍａｙ  １；８５（９)：１８９４−９０２.
【非特許文献８】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １９９７  Ｄｅｃ  ２２；４２０（１)：１−６.
【非特許文献９】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １９９８  Ｄｅｃ  １０；１７（２３)：３０４５−５４.
【非特許文献１０】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０００  Ｄｅｃ  １；６０（２３)：６７３７−４３.
【非特許文献１１】Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００１  Ａｐｒ；１２（２)：１９５−２０１.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
これまでに、肝細胞増殖因子及びＮＫ４は、哺乳類動物細胞や昆虫細胞により発現検討がなされてきたが、トランスジェニックニワトリを用いて発現検討がなされたことはない。このようなタンパク質は、４つのクリングル構造といった高度な構造を取るため、動物種を変えると簡単には発現しそうにない。ましてや、活性を保持したまま生産することは困難を要する。本発明では、肝細胞増殖因子及びＮＫ４といった４つのクリングル構造を有する複雑な構造を持つタンパク質をトランスジェニックニワトリによって活性を保持したまま生産することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、トランスジェニック鳥類によりクリングル構造を含むタンパク質の発現させることを目指した。更に詳しくは、トランスジェニック鳥類により肝細胞増殖因子及びＮＫ４をトランスジェニックニワトリによって生産することを目指した。鋭意研究を重ねた結果、ウイルスベクターを用い該遺伝子を鳥類胚に挿入し、孵化させ、その血中及び／又はその卵中に該タンパク質を生産することを成功させた。すなわち、本発明は、クリングル構造を含むタンパク質のコード配列を含む外来遺伝子を有するトランスジェニック鳥類に関する。
【００２１】
よって、本発明が提供するのは以下のとおりである。
【００２２】
（１）クリングル構造を有するタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類。
【００２３】
（２）４つのクリングル構造を有するタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を有する（１）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００２４】
（３）配列表の配列番号１の３０〜７２８番目のアミノ酸配列で示されるネコ肝細胞増殖因子及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質とアミノ酸配列において配列同一性が９０％以上であるタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含む（２）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００２５】
（４）配列表の配列番号２の３２〜７２３番目のアミノ酸配列で示される変異型ヒト肝細胞増殖因子及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質とアミノ酸配列において配列同一性が９０％以上であるタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含む（２）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００２６】
（５）配列表の配列番号３の３２〜４７３番目のアミノ酸配列で示されるＮＫ４及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質とアミノ酸配列において配列同一性が９０％以上であるタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含む（２）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００２７】
（６）複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いて作製した、（１）〜（５）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
【００２８】
（７）複製能欠損型レトロウイルスベクターがモロニーマウス白血病ウイルス及び／又はモロニーマウス肉腫ウイルス由来の配列を含む（６）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００２９】
（８）複製能欠損型レトロウイルスベクターがマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来の配列を含む（７）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００３０】
（９）複製能欠損型レトロウイルスベクターがＶＳＶ−Ｇエンベロープを含む（６）〜（８）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
【００３１】
（１０）組織非特異的なプロモーター遺伝子を含む複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いて作製した（１）〜（５）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
【００３２】
（１１）組織非特異的なプロモーター遺伝子がニワトリβアクチンプロモーター遺伝子の一部（配列番号４の２２４４〜２７４６番目のＤＮＡ配列）を含む（１０）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００３３】
（１２）組織特異的なプロモーター遺伝子を含む複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いて作製した（１）〜（５）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
【００３４】
（１３）卵管特異的なプロモーター遺伝子を含む組織特異的なプロモーター遺伝子を有する複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いて作製した（１２）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００３５】
（１４）オボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボムチン、リゾチーム、Ｇ２  グロブリン、Ｇ３  グロブリン、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、オボフラボプロテイン、オボマクログロブリン、シスタチン、アビジンのプロモーター遺伝子及びその組み合わせを含む卵管特異的なプロモーター遺伝子を有する複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いて作製した（１３）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００３６】
（１５）転写エンハンサー及び／又は調節エレメントを含む複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いて作製した（６）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００３７】
（１６）調節エレメントがｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ配列を含む（１５）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００３８】
（１７）鳥類の胚へ外来性遺伝子を含む複製能欠損型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることからなる方法によって得られる（６）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００３９】
（１８）鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始後２４時間以後の胚へ外来性遺伝子を含む複製能欠損型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることからなる方法によって得られる（１７）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００４０】
（１９）胚が孵卵開始後３２時間以後７２時間以前に形成されたものである（１８）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００４１】
（２０）胚が孵卵開始後４８時間以後６４時間以前に形成されたものである（１９）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００４２】
（２１）胚に形成される心臓内又は血管内へのマイクロインジェクションにより複製能欠損型レトロウイルスベクターを感染させる（１７）〜（２０）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
【００４３】
（２２）鳥類が家禽である（１）〜（５）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
【００４４】
（２３）鳥類がニワトリである（２２）に記載のトランスジェニック鳥類。
【００４５】
（２４）（１）〜（２３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類、その子孫、その卵及びその精子。
【００４６】
（２５）外来性遺伝子を含む複製能欠損型レトロウイルスベクターを鳥類の胚へ感染させ、その胚を孵化させることからなる、（１）〜（５）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類の作製方法。
【００４７】
（２６）（１）〜（２５）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類の血液、その体細胞及び／又はその卵より、抽出、精製、活性化、修飾することのいずれか、又はその組み合わせを含む外来性遺伝子由来のタンパク質の生産方法。
【００４８】
本発明で用いるクリングル構造を有するタンパク質はアミノ酸に修飾を受けていても良い。タンパク質の分泌のためにはタンパク質のコード配列に分泌シグナル配列が備わっていることが好ましい。また、分泌シグナルは自己の配列に限定されるものではない。例えば、ニワトリ由来の分泌シグナル配列、詳しくはリゾチームやオボアルブミンの分泌シグナル配列を用いても良い。
【００４９】
クリングル構造とはジスルフィド結合を含むアミノ酸配列約１００残基からなる構造ドメインのことであり、クリングル構造を持つタンパク質としてはプロトロンビン（２個）、プラスミノーゲン（５個）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（２個）、ウロキナーゼ型アクチベーター（１個）、ハーゲマン因子（１個）、アポリポタンパク質ａ（３７個）、肝細胞増殖因子（４個）、ヒアルロン酸結合タンパク質２（１個）などに見出されている（括弧内はクリングル構造の数）。クリングル構造はタンパク質−タンパク質およびタンパク質−細胞間の分子認識に重要なドメインであると推定されている。
【００５０】
肝細胞増殖因子は受容体型チロシンキナーゼの一つであるｃ−Ｍｅｔ受容体に結合し、細胞内の様々なシグナル伝達に関与する。肝細胞増殖因子は肝細胞のみならず様々な細胞に対して、細胞増殖促進、細胞運動促進、抗アポトーシス、形態形成誘導、血管新生など組織・臓器の再生と保護を担う多様な生理活性を有する。ＮＫ４もクリングル構造を含むタンパク質の一つであり、ＮＫ４は肝細胞増殖因子のアンタゴニストとして制癌効果を示すため有用なタンパク質である。プロトロンビンやハーゲマン因子は血液凝固にとって重要なタンパク質であり、プラスミノーゲンや組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ型アクチベーターは血栓溶解に利用可能なタンパク質である。このようにクリングル構造を含むタンパク質は生体内で重要な役割を担っており産業上の利用が期待されている。
【００５１】
配列番号１の３０〜７２８番目にネコ肝細胞増殖因子（ｆＨＧＦ）のアミノ酸配列を例示する。配列番号１の１２４〜２０５番目のアミノ酸配列、２０６〜２８７番目のアミノ酸配列、３００〜３８２番目のアミノ酸配列、および、３８６〜４６８番目のアミノ酸配列がそれぞれクリングルドメインである。配列番号２の３２〜７２３番目に記載の変異型ヒト肝細胞増殖因子（ｄｈＨＧＦ）は野生型ヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）の１６１〜１６５番目の５アミノ酸（第１クリングル構造内のＳＦＬＰＳの配列）を欠失した変異体（クリングル構造は維持している）であり、野生型ヒト肝細胞増殖因子に比べて上皮系細胞に対する増殖活性が２〜３倍高いことがわかっている。配列番号２の１２６〜２０２番目のアミノ酸配列、２０３〜２８４番目のアミノ酸配列、２９７〜３７９番目のアミノ酸配列、および、３８３〜４６５番目のアミノ酸配列がそれぞれクリングルドメインである。配列番号３の３２〜４７３番目にＮＫ４のアミノ酸配列を例示する。配列番号３の１２６〜２０２番目のアミノ酸配列、２０３〜２８４番目のアミノ酸配列、２９７〜３７９番目のアミノ酸配列、および、３８３〜４６５番目のアミノ酸配列がそれぞれクリングルドメインである。「それらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質」とは、上記アミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、付加、又は、置換されたアミノ酸配列であって、生理作用の変わらないものを示し、生理作用が同じであれば活性の大小に関係なくこれに含まれる。欠失、挿入、付加、又は、置換可能なアミノ酸残基の数は、タンパクの生物学的活性が変わらない限りにおいて限定されないが、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、更に好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、１個である。このようにして得られた変異タンパク質は、配列表の配列番号１の３０〜７２８番目のアミノ酸配列、配列番号２の３２〜７２３番目のアミノ酸配列、または、配列番号３の３２〜４７３番目のアミノ酸配列のいずれかの配列と高い配列同一性を示すことが望ましく、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であることが望ましい。
【００５２】
外来性遺伝子としては特に限定されず、鳥類以外の遺伝子はもちろん、鳥類のものを含んでも良い。トランスジェニック鳥類の作製に用いる個体が有する配列であっても、その個体が本来有する全遺伝子にあらたに遺伝子を導入するので外来性遺伝子と呼ぶ。
【００５３】
本発明において、外来性遺伝子はタンパク質のコード配列を含んでおり、コード配列の境界は開始コドン、及び開始コドンに対応する終止コドンにより決定される。開始コドン近傍はコザックのコンセンサス配列を含むことが好ましい。コード配列の上流にはリボソーム結合部位が存在していることが好ましい。
【００５４】
外来性遺伝子は、鳥類細胞内で発現するために適当なプロモーター遺伝子を含んでいることが好ましい。プロモーター遺伝子とは遺伝子の転写開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節する、ＤＮＡ上の領域のことである。外来性遺伝子は上記以外の非翻訳領域を含んでもよい。
【００５５】
本発明の複製能欠損型レトロウイルスベクターは、鳥類で動作可能な組織非特異的なプロモーター遺伝子、又は、組織特異的なプロモーター遺伝子を含むものが好ましい。
【００５６】
本発明の組織特異的なプロモーター遺伝子とは、鳥類の特定の組織・細胞で特別に活性の強いプロモーター遺伝子のことである。組織特異的なプロモーター遺伝子を用いることにより、目的タンパク質の発現が鳥類の発生や生存に悪影響を与える可能性が減少又は排除できる利点がある。
【００５７】
本発明の組織特異的なプロモーター遺伝子としては特に限定されないが、卵管特異的なプロモーター遺伝子をあげることができる。卵管組織は性成熟後に活発に活動することから性成熟後に強く誘導されることが多い。
【００５８】
卵管特異的なプロモーター遺伝子としては、鳥類由来のオボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボムチン、リゾチーム、Ｇ２グロブリン、Ｇ３グロブリン、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、オボフラボプロテイン、オボマクログロブリン、シスタチン、アビジンのプロモーター遺伝子等をあげることができる。これらの卵管特異的なプロモーター遺伝子を用いた場合、目的タンパク質を卵白中に高発現させることができ、特に好ましい。
【００５９】
本発明の組織非特異的なプロモーター遺伝子とは、組織特異的なプロモーター遺伝子でない鳥類で動作可能なプロモーター遺伝子のことである。組織非特異的なプロモーター遺伝子としては特に限定されないが、鳥類のほぼすべての体細胞で活性のあるものをいう。その場合、目的タンパク質が血中にも発現するため、雛の段階で発現の可否を検出できるという利点がある。
【００６０】
本発明の組織非特異的なプロモーター遺伝子としては特に限定されないが、βアクチンプロモーター遺伝子、ＥＦ１αプロモーター遺伝子、チミジンキナーゼプロモーター遺伝子やシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター遺伝子、ラウスザルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター遺伝子等のウイルス由来プロモーター遺伝子が挙げられる。他に、テトラサイクリン誘導型プロモーター遺伝子のような、組織非特異的な誘導型プロモーター遺伝子を用いてもよい。上記βアクチンプロモーター遺伝子としては、ニワトリβアクチンプロモーター遺伝子等が挙げられ、上記組織非特異的なプロモーター遺伝子としては、ニワトリβアクチンプロモーター遺伝子を含むことが好ましい。
【００６１】
本発明の複製能欠損型レトロウイルスベクターは、転写エンハンサー及び／又は調節エレメントを含んでいてもよい。転写エンハンサーは、プロモーター遺伝子からの転写を促進する配列であるが、単独では転写を起こせないＤＮＡまたはＲＮＡ上の領域のことである。本来機能しているものとは異なるプロモーター遺伝子に連結した場合にも機能することが多いので、プロモーター遺伝子との組み合わせについては特に限定しない。転写エンハンサーとしては、特に限定されないが、ＳＶ４０、ＣＭＶ、チミジンキナーゼエンハンサー、ステロイド応答エレメントやリゾチームエンハンサー等が挙げられる。調節エレメントは転写調節や、転写後のＲＮＡの安定化に寄与する、単独では転写を起こせないＤＮＡまたはＲＮＡ上の領域のことである。調節エレメントとしては特に限定されないが、ウッドチャック肝炎ウイルス由来調節エレメント（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ：ＷＰＲＥ、米国特許６１３６５９７号）等が挙げられる。
【００６２】
本発明のトランスジェニック鳥類の作製には、レトロウイルスベクターを用いることが好ましい。レトロウイルスベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、パッケージング細胞の異なる形態を含む。パッケージング細胞とはウイルス粒子の複製に必要なタンパク質の少なくとも一つをコードする遺伝子を導入した細胞である。
【００６３】
本発明で使用するレトロウイルスベクターは、安全性を考慮して、複製能を欠損していることが好ましい。複製能の欠失方法としては、ウイルス粒子の複製に必要な内部コアに含まれるタンパク質ｇａｇ（ｇｒｏｕｐ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）、逆転写酵素ｐｏｌ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、及びエンベロープ糖タンパク質ｅｎｖ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）のうちいずれか又はその組み合わせが発現しないように、コード配列又は発現に必要な配列の少なくとも一部又は全部を欠損するか、それらが発現不能なように置換、挿入変異を含むことが好ましい。レトロウイルスベクターは、ウイルス毎に挿入可能な遺伝子の長さが制限を受けるため、欠失変異が好ましく、安全性や挿入断片の長さを増やす観点から、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの複製を欠失させることが好ましい。
【００６４】
レトロウイルスベクターは、ウイルス粒子にパッケージされる目印として機能するウイルスパッケージングシグナル（ｐｈｉ）を含んでいることが好ましい。ｇａｇのコード配列の一部はウイルスパッケージングシグナルとして機能することもあるため、ウイルス力価向上の観点からは、ウイルスベクターがｇａｇのコード配列の少なくとも一部を含んでいることが好ましい。詳しくは、配列表の配列番号４の５１６〜１４０５番目のＤＮＡ配列（ｐｈｉ＋）のようにｐｈｉにｇａｇの一部を連結していることが好ましい。（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  １９８７  Ｍａｙ；６１（５）：１６３９−４６．）。
【００６５】
本発明に用いるレトロウイルスベクターとしては特に限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）等が挙げられる。モロニーマウス白血病ウイルス及び／又はモロニーマウス肉腫ウイルスが好ましいが、鳥類の胚へ感染させるため、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）やマウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）等、胚細胞や幹細胞への感染性の高いウイルスを用いることが好ましい。本発明の複製能欠損型レトロウイルスベクターは、これらのウイルスに由来する配列を含むものが好ましい。本発明においては、鳥類細胞にこのウイルスベクターを効率的に感染させるため、外皮タンパク質を人為的にウシ水疱性口内炎ウイルス由来のＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質とすることが好ましいが、このウイルスタイプに限定されるものではない。
【００６６】
本発明に用いるレトロウイルスベクターには、マーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は正しく遺伝子導入された細胞の同定及び単離の目印となるタンパク質をコードする遺伝子である。マーカー遺伝子としては特に限定されないが、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）やエンハンスドＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、シアン・フルオレッセント・プロテイン（ＣＦＰ）、ルシフェラーゼ等の蛍光タンパク質の遺伝子；ネオマイシン耐性（Ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン耐性（Ｐｕｒｏｒ）等の薬剤耐性遺伝子；他にチミジンキナーゼ、ジヒドロフォレート・レダクターゼ、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、β―ラクタマーゼ、β―ガラクトシダーゼ等の遺伝子とその派生遺伝子が挙げられる。マーカー遺伝子は、プロモーター遺伝子や発現に必要な要素を伴っていることが好ましい。
【００６７】
レトロウイルスベクターは、５’末端、３’末端に長い反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ，ＬＴＲ）の少なくとも一部を含む。ＬＴＲは転写プロモーター遺伝子やｐｏｌｙ−Ａ付加シグナルを持つことから、プロモーター遺伝子やターミネーター遺伝子として利用可能である。レトロウイルスベクターにおいて、目的タンパク質のコード配列、プロモーター遺伝子、転写エンハンサー及び／又は調節エレメントは、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に含まれる。この際、プロモーター遺伝子の下流に目的タンパク質のコード配列が位置することが好ましい。ＬＴＲ以外のプロモーターを用いる際は、プロモーターの下流に目的タンパク質のコード配列を接続した構造を有することが好ましい。レトロウイルスベクターが転写され、ウイルス粒子が作製されるためには、５’ＬＴＲから３’ＬＴＲの間にターミネーターやｐｏｌｙ−Ａシグナルを含まないことが好ましい。
【００６８】
次に、本発明で好適に用いられる複製能欠損型レトロウイルスベクターの調製法について、好ましい一態様を説明する。
【００６９】
本発明で用いられる複製能欠損型レトロウイルスベクターは複製に必要とされるｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を欠失している。ｇａｇ、ｐｏｌ遺伝子を保有するパッケージング細胞に目的タンパク質を発現可能な複製能欠損型レトロウイルスプラスミドとＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを共導入し、培養上清をウイルス液とする。あるいは、望ましくは、上記ウイルス液を感染させたパッケージング細胞にＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを導入し、培養上清をウイルス液とする。ウイルス液は、必要に応じて濃縮することが好ましい。複製能欠損型レトロウイルスベクターの調製は、このような方法に限定されるものではない。
【００７０】
上記ウイルス液において、複製能欠損型レトロウイルスベクターの力価（タイター）は、１×１０８〜１×１０１４ｃｆｕ／ｍｌが好ましく、１×１０９〜１×１０１４ｃｆｕ／ｍｌがより好ましい。
【００７１】
上記ウイルス液の力価は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）にウイルス液を添加したとき、感染した細胞の数によって定義する。具体的には、６ウェル培養プレートの各ウェル（底面積９．４ｃｍ２）に存在する５×１０４のＮＩＨ３Ｔ３細胞に、１０２から１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、マーカーであるネオマイシン耐性遺伝子を発現している細胞の割合を、Ｇ４１８（ネオマイシン）に対する耐性を調べることによりウイルス液の力価を測定する。
【００７２】
次に、複製能欠損型レトロウイルスベクターの鳥類胚への感染について説明する。
【００７３】
胚とは、多細胞動物の個体発生初期のものであり、卵膜または卵殻に包まれているか、母体内にあって、独立して食物をとる以前のものである。孵化とは、胚が卵膜または卵殻から出ることである。
【００７４】
複製能欠損型レトロウイルスベクターを感染させる胚は、孵卵開始から２４時間以上経過していることが好ましい。より好ましくは、孵卵開始から３２時間以後７２時間以前の胚である。更に好ましくは、孵卵開始から４８時間以後６４時間以前の胚である。レトロウイルスベクターを感染させる、つまりレトロウイルスベクターを導入する場所としては、心臓内あるいは血管内が好ましい。本発明においては、遺伝子導入効率の高いＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製する上で、心臓の拍動を観察することができる初期の段階（心臓が拍動を開始してから６時間以内）に遺伝子導入することが好ましい。それは、血流に乗せて全身に遺伝子を運ぶという観点と、細胞数が少ないという観点による。また、上述の時間帯に生殖系列細胞の前駆細胞である始原生殖細胞（ＰＧＣ）が血液と共に胚体内を循環している（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ  Ｖ．  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｈ．Ｌ．のステージ１４〜１５にかけて血中のＰＧＣ濃度がもっとも高い（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．１９９９  ２８４；７５９−７６４））ため、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類からＧ１トランスジェニック鳥類を高い確率で得ることを可能とする。
【００７５】
マイクロインジェクションは、顕微鏡下で先端を細くした微小ガラス管等を用い、特定の場所に直接ウイルス液を導入する方法である。本発明では、心臓や血管という特定の場所にウイルス液を導入するため、リポフェクション法やエレクトロポレーション法といった他の遺伝子導入法より、マイクロインジェクションが好ましい。
【００７６】
孵卵の条件としては特に限定されず、例えばニワトリならば温度が立体孵卵器で３７．２〜３７．８℃（平面孵卵器等では卵の上端で３８．９〜３９．４℃）、湿度が４０〜７０％程度の条件が発生に最適な環境であるが、この環境に限定されない。また、孵卵の際には転卵を行う。転卵は、角度３０度以上で１日２回以上行うことが好ましいが、その限りではない。
【００７７】
本発明で使用する鳥類としては特に限定されないが、家畜として利用可能な家禽であることが好ましい。家禽としては、ニワトリ、七面鳥、カモ、ダチョウ、ウズラ、アヒル等を挙げることができる。なかでもニワトリは入手が容易で、産卵種としても多産であり、卵も大きく大量飼育方法が確立している点で特に好ましい。
【００７８】
生殖細胞に外来性遺伝子を保有するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を野生型鳥類、又はＧ０トランスジェニックキメラ鳥類と交配させ、孵化したヒナを選別することによりＧ１トランスジェニック鳥類を得ることができる。Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類は全ての細胞に外来性遺伝子が導入される確率は低く、ほとんどの場合、外来性遺伝子が導入された細胞と野生型の細胞との異なる遺伝子型の細胞が共存しているキメラ状態である。一方で、上記の方法で得られたＧ１トランスジェニック鳥類は、ほぼ全ての体細胞に均一に導入遺伝子を保有している。体細胞や生殖細胞への遺伝子導入の確認は、血液や体細胞、精子、卵由来のＤＮＡやＲＮＡをＰＣＲ法等によって行うことができる。また、目的タンパク質の発現からも判断できる。目的タンパク質の発現は、ＥＬＩＳＡ法や電気泳動法、目的タンパク質の活性測定等によって調べることができる。
【００７９】
Ｇ２以降の世代のトランスジェニック鳥類は、Ｇ１トランスジェニック鳥類を交配させることにより作製される。交配型は、Ｇ１トランスジェニックオスと野生型メス、Ｇ１トランスジェニックメスと野生型オス、Ｇ１トランスジェニックのオスとメス等が考えられ、さらに子孫とその親による戻し交配も可能である。なかでもＧ１トランスジェニックオスと野生型メスの交配型は、１羽のＧ１トランスジェニックオスに対し複数の野生型メスを交配させることができるため、効率の点から好ましい。
【００８０】
本発明の目的タンパク質の生産方法は、前述のトランスジェニック鳥類から目的タンパク質を回収することを特徴とする。より詳細には、作製されたトランスジェニック鳥類の血液、その体細胞及び／又はその卵から目的タンパク質を抽出、精製、活性化することのいずれか又はその組み合わせにより回収することを特徴とする。抽出、精製に用いる方法としては特に限定されず、例えば、分別沈殿、遠心法、二相分離、限外濾過、膜分離、クロマトグラフィー、免疫化学的方法、結晶化することのいずれか及び／又はその組み合わせを含む方法などが挙げられる。修飾としては、ＰＥＧ化や糖鎖や糖鎖構成単位の付加を含む。このような修飾によりタンパク質の半減期を伸ばし、目的タンパク質の薬効を高めることができる。
【発明の効果】
【００８１】
本発明によれば、クリングル構造を有するタンパク質を生産するトランスジェニック鳥類、及びその作製方法が提供される。その結果として、肝細胞増殖因子及びＮＫ４を生産するトランスジェニック鳥類、及びその作製方法が提供される。細胞や臓器の再生物質である肝細胞増殖因子は難治性臓器疾患や血管、心臓の動脈硬化性疾患に対して、ＮＫ４はガンの原発腫瘍に対して有効な治療薬として期待されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
以下、実施例により本発明を記述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるのもではない。遺伝子操作について特に記述のないものに関しては、代表的な方法に従った（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。細胞培養について特に記述のないものに関しては代表的な方法に従った（小山秀機編集「細胞培養ラボマニュアル」シュプリンガー・フェアラーク東京、第１版）。商品名を記載している場合は、特に記述のない限り添付の説明書の指示に従った。
【００８３】
（実施例１）
ネコ肝細胞増殖因子（ｆＨＧＦ）遺伝子発現用ウイルスベクター調製用プラスミド、変異型ヒト肝細胞増殖因子（ｄｈＨＧＦ）遺伝子発現用ウイルスベクター調製用プラスミド、ＮＫ４遺伝子発現用ウイルスベクター調製用プラスミドの構築
ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ（配列表配列番号４）は、公知文献（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９４  ＭＡＲ；１（２）：１３６−８．）とインターネットの情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ＮＩＨ．ｇｏｖ／他）を元に配列表配列番号４の５６３９〜５７９８番目のＤＮＡ配列と、１〜３３４５番目のＤＮＡ配列が、それらの５７９８番目と１番目の配列の間で繋がった全長３５０５ｂｐからなるＤＮＡ配列を全合成し、ｐＵＣ１９（東洋紡社製、ジェンバンク  アクセッション番号Ｘ０２５１４）のＥｈｅＩ（２３５）〜ＰｖｕＩＩ（６２８）間に挿入して作製した。これをＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （ＢＡＰ）（タカラバイオ社製）処理後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製し、ＤＮＡ断片を回収した。これを１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製、回収した（実施例１ベクター断片）。
【００８４】
ｐＢＳ−ｆＨＧＦはｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）のＥｃｏＲＶ断片にｌａｃプロモーターに対して正の方向にｆＨＧＦのコード配列（ストップコドンを含む）を挿入して作製した（配列表配列番号５）。ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用い、ｐＢＳ−ｆＨＧＦを鋳型として、２つの合成ＤＮＡ、ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｆＨＧＦプライマー（配列表配列番号６）、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｆＨＧＦプライマー（配列表配列番号７）をプライマーとしてＰＣＲにより目的断片の増幅をおこなった。増幅した断片はＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製、回収し、ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で切断した。これを１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより精製、回収した（実施例１ｆＨＧＦインサート断片）。
【００８５】
配列表配列番号８の合成ＤＮＡを鋳型として、２つの合成ＤＮＡ、ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｄｈＨＧＦプライマー（配列表配列番号９）、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｄｈＨＧＦプライマー（配列表配列番号１０）をプライマーとして、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、ＰＣＲにより目的断片の増幅をおこなった。増幅した断片はＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製、回収し、ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で切断した。これを１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片を先述の方法を用いて精製、回収した（実施例１ｄｈＨＧＦインサート断片）。
【００８６】
配列表配列番号１１の合成ＤＮＡを鋳型として、２つの合成ＤＮＡ、ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｄｈＨＧＦプライマー（配列表配列番号９）、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ＮＫ４プライマー（配列表配列番号１２）をプライマーとしてＰＣＲにより目的断片の増幅をおこなった。増幅した断片はＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製、回収し、ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で切断した。これを１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片を先述の方法を用いて精製、回収した（実施例１ＮＫ４インサート断片）。
【００８７】
実施例１ベクター断片と、実施例１ｆＨＧＦインサート断片、実施例１ｄｈＨＧＦインサート断片、又は、実施例１ＮＫ４インサート断片のそれぞれを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用いて連結し、これをＥ． ｃｏｌｉＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）に形質転換した。形質転換した大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ寒天培地に塗布し、３７℃で１２〜１５時間培養した。生えてきたコロニーを５ｍｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地で、３７℃で６〜１２時間培養した後、プラスミドを抽出した。図１、図２、図３の構造を持つプラスミドを選択しそれぞれｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｆＨＧＦ、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｄｈＨＧＦ、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ＮＫ４とした。
【００８８】
なお、図１〜３中のマーカー遺伝子ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ、ウイルスパッケージングシグナル配列ｐｈｉ＋、マーカー遺伝子Ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ、組織非特異的なプロモーター遺伝子ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、並びに、長い反復配列５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはすべて、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔに由来するものである。
【００８９】
（実施例２）
ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｆＨＧＦ、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｄｈＨＧＦ、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ＮＫ４それぞれとｐＶＳＶ−Ｇを用いたレトロウイルスベクターの調製
以後特に記述のない限り、培地は１０％の牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ、ギブコ社製）を用いた。培養は３７℃、ＣＯ２５％でおこなった。レトロウイルスベクターに用いるプラスミドＤＮＡはＥｎｄｏｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。
【００９０】
まず、実施例１で構築したプラスミドｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｆＨＧＦよりレトロウイルスベクターを調製するため、ｇａｇ、ｐｏｌ遺伝子を持つパッケージング細胞ＧＰ２９３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を直径１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養ディッシュ（旭テクノグラス社製）に細胞を５×１０６個（７０％コンフルエント）となるように播種した（翌日９０％コンフルエントになるようにする）。次の日、培地を取り除き、７．２ｍｌの培地と１０μｌの２５ｍＭクロロキン（シグマ社製）を加えて、更に１時間培養した。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００（インビトロジェン社製）を１．４ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地（ギブコ社製）に懸濁し、室温で５分おいた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とする）。１２μｇのｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｆＨＧＦと１２μｇのｐＶＳＶ−Ｇを１．４ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地に懸濁した（プラスミドＤＮＡ溶液とする）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とプラスミドＤＮＡ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを、培養ディッシュに全量加え、６時間培養した。６時間後、培地を取り除き９ｍｌの培地と２００μｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）を加え、更に２４時間培養した。
【００９１】
培養上清をフィルターユニット“ＤＩＳＭＩＣ”０．４５μｍ、セルロースアセテート（アドバンテック社製）に通し、遠心管に集めた。超遠心機ＣＳ１００ＧＸＬ（日立工機社製）を用い、２８０００ｒｐｍ（５００００×ｇ）で１．５時間遠心分離した。沈殿に２０μｌのＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８），１３０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、４℃で一晩放置後、よく懸濁して小型高速遠心機を用いて１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を０．４５μｍのデュラポアウルトラフリーフィルター（アドバンテック社製）に通し、ウイルス液とした。ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｄｈＨＧＦ及びｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ＮＫ４からも同様にウイルス液を調製した。
【００９２】
（実施例３）
ｆＨＧＦ遺伝子安定パッケージング細胞、ｄｈＨＧＦ遺伝子安定パッケージング細胞、ＮＫ４遺伝子安定パッケージング細胞の選択
ウイルス感染の前日に２４ウェル培養プレートにＧＰ２９３細胞を１．５×１０４個／ウェルとなるよう播種し培養した。ウイルス感染の当日、１０μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ社製）を含有する培地１ｍｌと交換した。これに、実施例２で調製したウイルス液を感染させた。以後、細胞を限界希釈法によりクローニングした。具体的には、次の日、細胞を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に懸濁し、同じ培地に１０個／ｍｌとなるように希釈した。希釈した細胞を９６ウェル培養プレートに１００μｌずつ播種し、細胞増殖速度が速い細胞を選択し、ｆＨＧＦ遺伝子安定パッケージング細胞クローン、ｄｈＨＧＦ遺伝子安定パッケージング細胞クローン、ＮＫ４遺伝子安定パッケージング細胞クローンを得た。
【００９３】
（実施例４）
ｆＨＧＦ遺伝子安定パッケージング細胞、ｄｈＨＧＦ遺伝子安定パッケージング細胞、ＮＫ４遺伝子安定パッケージング細胞それぞれとｐＶＳＶ−Ｇを用いたレトロウイルスベクターの調製
まず、ｆＨＧＦ遺伝子安定パッケージング細胞を用いたレトロウイルスベクターの調製について述べる。直径１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養ディッシュに実施例３で得られたｆＨＧＦ遺伝子安定パッケージング細胞を５×１０６個（７０％コンフルエント）となるように播種した（翌日、９０％コンフルエントとなるようにする）。次の日、培地を取り除き、７．２ｍｌの培地と１０μｌの２５ｍＭクロロキンを加えて、更に１時間培養した。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００を１．４ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地（ギブコ社製）に懸濁し、室温で５分おいた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とする）。１２μｇのｐＶＳＶ−Ｇを１．４ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地に懸濁し室温で２０分おいた。（ｐＶＳＶ−Ｇ溶液とする）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とｐＶＳＶ−Ｇ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを培養ディッシュに加え、６時間培養した。培地を取り除き、９ｍｌの培地と２００μｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）を加え、２４時間培養した。培養上清をフィルターユニット“ＤＩＳＭＩＣ”０．４５μｍ、セルロースアセテート（アドバンテック社製）に通し、遠心管に集めた。超遠心機を用い、２８０００ｒｐｍ（５００００×ｇ）で１．５時間遠心分離した。沈殿に２０μｌのＴＮＥ緩衝液を加え、４℃で一晩放置後、よく懸濁して小型高速遠心機を用いて１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を０．４５μｍのデュラポアウルトラフリーフィルターに通しｆＨＧＦウイルス液とした。ｄｈＨＧＦ遺伝子安定パッケージング細胞及びＮＫ４遺伝子安定パッケージング細胞からも同様にウイルス液を調製し、それぞれｄｈＨＧＦウイルス液、ＮＫ４ウイルス液とした。
【００９４】
（実施例５）
ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｆＨＧＦｗｐｒｅ、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｄｈＨＧＦｗｐｒｅ、および、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ＮＫ４ｗｐｒｅの構築とレトロウイルスベクターの調製
ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｄｈＨＧＦ、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｆＨＧＦ、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ＮＫ４をそれぞれＣｌａＩ（タカラバイオ社製）で切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （ＢＡＰ）で処理後、精製、回収した。精製、回収には、実施例１に記載の製品を用いた。これを１％アガロースゲルで電気泳動し、目的断片を精製、回収した。（それぞれ実施例５ｄｈＨＧＦインサート断片、実施例５ｆＨＧＦインサート断片、実施例５ＮＫ４インサート断片）
また、ｐＷＨＶ８（ＡＴＣＣ  ４５０９７）を鋳型とし、２つの合成ＤＮＡ、ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｗｐｒｅプライマー（配列表配列番号１３）、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｗｐｒｅプライマー（配列表配列番号１４）をプライマーとして、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、ＰＣＲによりＷＰＲＥ配列の増幅をおこなった。
【００９５】
増幅した断片はＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製、回収し、ＣｌａＩで切断した。これを１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片を先述の方法を用いて精製、回収した（実施例５インサート断片）。
【００９６】
３種類の実施例５ｄｈＨＧＦインサート断片、実施例５ｆＨＧＦインサート断片、または、実施例５ＮＫ４インサート断片それぞれと実施例５インサート断片を実施例１記載のライゲーション方法により連結し、これをＥ． ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓを形質転換した。形質転換株より図４、図５、図６の構造を持つプラスミドを選択しそれぞれｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｆＨＧＦｗｐｒｅ、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｄｈＨＧＦｗｐｒｅ、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ＮＫ４ｗｐｒｅとした。実施例３、４と同様にして遺伝子安定パッケージング細胞やレトロウイルスベクターを調製した。ここで得られたレトロウイルスベクターは、それぞれｆＨＧＦｗｐｒｅウイルス液、ｄｈＨＧＦｗｐｒｅウイルス液、ＮＫ４ｗｐｒｅウイルス液とした。ＷＰＲＥ配列を用いると高力価の遺伝子安定パッケージング細胞を得られやすかった。ＷＰＲＥ配列により転写活性が増強されているためやＲＮＡが安定化されているためだと考えた。
【００９７】
（実施例６）
ネオマイシン耐性遺伝子を含むウイルスの力価測定
ウイルス液の力価は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）にウイルス液を添加したとき、ネオマイシン耐性を獲得した細胞の数によって定義した。６ウェル培養プレートの各ウェル（底面積９．４ｃｍ２）に存在する５×１０４のＮＩＨ３Ｔ３細胞に、１０２から１０６倍の希釈率で希釈した実施例５のウイルス溶液を１ｍｌ加え、マーカーであるネオマイシン耐性遺伝子を発現している細胞の割合を、Ｇ４１８に対する耐性から調べることによりウイルス液の力価を測定した。１０６倍希釈でｎコロニー現れた場合、ウイルス力価は、ｎ×１０６ｃｆｕ／ｍｌとした。
【００９８】
具体的には、力価測定開始の前日にＮＩＨ３Ｔ３細胞を組織培養用マイクロプレート（６ウェル）（旭テクノグラス社製）に５×１０４個／ウェルとなるよう播種し培養した。翌日、培地を約８．８８μｇ／ｍｌのポリブレンを含有する培地９００μｌと交換し、ウイルス液をポリブレンを含まない培地で１０１〜１０５に希釈し、それぞれ１００μｌをウェルに添加して感染させた（ポリブレン終濃度８μｇ／ｍｌ）。４〜６時間培養後、１ｍｌの培地を更に加えた。次の日、培地を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地と交換し、以後３〜４日おきに２ｍｌのＧ４１８含有培地と交換した。感染から約２週間後プレートをメチレンブルー液で染色し、得られたコロニー数を測定し力価を求めた。後述の実施例７でインジェクションに用いたｆＨＧＦｗｐｒｅウイルス液の力価は２×１０６〜３×１０８ｃｆｕ／ｍｌ、ｄｈＨＧＦｗｐｒｅウイルス液の力価は１×１０５ｃｆｕ／ｍｌ、ＮＫ４ｗｐｒｅウイルス液の力価は４×１０５〜１×１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００９９】
（実施例７）
ニワトリ胚へのレトロウイルスベクターのマイクロインジェクションと人工孵化
マイクロインジェクションと人工孵化は無菌条件下で行った。ニワトリ受精卵（城山種鶏場社製）の外側を消毒液（昭和フランキ社製）及びエタノールで除菌した。孵卵器Ｐ−００８（Ｂ）型（昭和フランキ社製）を３８℃、湿度５０〜６０％の環境になるようにセットし、電源を入れた時刻を孵卵開始時刻（０時間）とし、以後１５分毎に９０度転卵しながら孵卵を行った。
【０１００】
孵卵開始から約５５時間経過後、孵卵器から卵を取り出し、その鋭端部を直径３．５ｃｍの円形にダイヤモンド刃（刃先径２０ｍｍ、シャフト径２．３５ｍｍ）を付けたミニルーター（プロクソン社製）で切り取った。ニワトリ二黄卵（城山種鶏場社製）の鈍端部を直径４．５ｃｍに切り取り、中身を捨てた卵殻に受精卵の中身を移し、注射器の中筒で胚を上方へ移動させた。実体顕微鏡システムＳＺＸ１２（オリンパス社製）下で、フェムトチップＩＩ（エッペンドルフ社製）にウイルス液を注入し、フェムトジェット（エッペンドルフ社製）を用い、実施例５で調製したＷＰＲＥ配列を含む３種類のウイルス、ｆＨＧＦｗｐｒｅウイルス液、ｄｈＨＧＦｗｐｒｅウイルス液、ＮＫ４ｗｐｒｅウイルス液の約２μｌを胚にマイクロインジェクションした。
【０１０１】
卵白を糊として、約８×８ｃｍに切ったサランラップ（旭化成社製）で胚にレトロウイルスベクターをマイクロインジェクションした受精卵を移したニワトリ二黄卵の卵殻の鈍端部の穴を塞ぎ、孵卵器に戻し孵卵を続けた。孵卵器の転卵を３０分毎に３０度転卵に変更した。孵卵開始から２０日目にサランラップに２０Ｇの注射針で２０個程度穴をあけ、孵卵器に６０ｃｃ／ｍｉｎで酸素を供給し孵卵を行った。雛がハシ打ちを始めたら、卵殻を割って孵化させた。この人工孵化に関する結果を表１に示した。表１で「回目」はまとめて孵卵を行った回数を示した。「卵数」はマイクロインジェクションを行った卵の数を示し、「孵卵数」は卵から孵化した数を示した。
【表１】
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【０１０２】
（実施例８）
ｆＨＧＦ発現トランスジェニックニワトリ、ｄｈＨＧＦ発現トランスジェニックニワトリ、ＮＫ４発現トランスジェニックニワトリにおける血中及び卵中のＨＧＦ発現の確認
実施例７で作製し誕生した雛を飼育して成長させた。飼料として、幼雛ＳＸセーフティー及びネオセーフティー１７（いずれも豊橋飼料社製）を用いた。発育途中で死亡した個体がいたため検査個体数と孵化数は一致しなかった。血中の発現分析には血清を用いた。トランスジェニックニワトリからの採血は翼下静脈より行った。採血後、３０分間室温で放置した後小型高速遠心機で４℃、３０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を血清サンプルとした。卵中の発現分析の際には、卵白と卵黄を分離し、卵白を超音波や物理的手法により全体を一様となるように調製し、卵白サンプルとした。調製した血清、卵白サンプルはアッセイ時まで−８０℃で凍結保存した。
【０１０３】
ｆＨＧＦの発現量は卵白サンプルを用いて測定した。０．１μｌの卵白サンプルと段階希釈した標準ｆＨＧＦをｅ・パジェル１２．５％（アトー社製）を用いて電気泳動した。泳動は、還元、及び非還元条件でおこなった。ＰＶＤＦ膜に転写後、１０％スキムミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでブロッキングし、一次抗体としてｍｏｕｓｅ抗ｆＨＧＦ抗体を用い、二次抗体としてｇｏａｔ抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。検出には、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍとＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（いずれもＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社社製）を用いた。非還元条件のウエスタンブロットの結果から発現量は４〜８μｇ／ｍｌであった。還元条件の結果から発現量は約１６μｇ／ｍｌであった。還元条件ではα鎖とβ鎖が解離することから定量性が低いと考えた。ウエスタンブロットの結果を図７、８に示した。図７より卵白中でｆＨＧＦの多くは切断を受けて、活性型になっていると考えられた。
【０１０４】
ｄｈＨＧＦの発現量は血清サンプル、卵白サンプルを用いて測定した。測定にはＨＧＦ「オーツカ」ＥＬＩＳＡキット（大塚製薬社製）を用いた。発現量は血中で最大４３ｎｇ／ｍｌ、卵白中で最大５４０ｎｇ／ｍｌであった。結果は図９、１０のようになった。
【０１０５】
ＮＫ４の発現量は血清サンプル、卵白サンプルを用いて測定した。測定にはイムニス  ＨＧＦ  ＥＩＡキット（特殊免疫研究所製）を用いた。Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９８４  Ａｕｇ  １６；１２２（３）：１４５０−９．、および、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００１  Ｏｃｔ  １５；６１（２０）：７５１８−２４．を参考にＮＫ４を純度９５％に精製し、標準試料とした。発現量は血中で最大２０ｎｇ／ｍｌであった。１個体について卵白中の発現を調べたところ、１．７ｎｇ／ｍｌ発現していた。結果は図１１のようになった。
【０１０６】
（実施例９）
ｆＨＧＦ卵白サンプルを用いた生理活性測定
実施例７で孵化し、実施例８で調製したｆＨＧＦ卵白サンプルを用いて、そのｆＨＧＦの生理活性測定をマウス肝細胞由来細胞ＢＮＬ  ＣＬ．２細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−７３）による増殖活性測定を行った。ＢＮＬ  ＣＬ．２細胞は１０％ＦＢＳを含むイーグルＭＥＭ（Ｅ−ＭＥＭ；日水社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ２存在下で継代を行った。飽和細胞密度まで増殖させたＢＮＬ  ＣＬ．２細胞をプレートから剥離し、１×１０５個／ｍｌになるように細胞数を調整した。これを、９６ウェル培養プレートに１００μｌずつ分注し、一晩培養した。翌日、１％ＦＢＳを含むＥ−ＭＥＭ培地１００μｌと交換した。検量線用に精製ｆＨＧＦ（入手方法を記してください。）を１６０、２５０、４００、６４０、１０００ｎｇ／ｍｌとなるように１％ＦＢＳを含むＥ−ＭＥＭ培地で希釈し１０μｌをウェルに加えた。実施例８で調製した卵白サンプル３−２４を１、３、１０、３０、１００、３００倍希釈となるよう１％ＦＢＳを含むＥ−ＭＥＭ培地で希釈し１０μｌをウェルに加えた。７２時間後、各ウェルに１０μｌのＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（同仁化学社製）を加え、更に２〜３時間培養し、分光光度計を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。野生型卵白サンプルの添加でも細胞増殖率があがったが、ｆＨＧＦ発現卵白サンプルはそれよりも有為に細胞増殖率が高かった。図１２の検量線より、卵白サンプルの発現量を定量した結果、図１３のようになった。卵白サンプルの発現量は検量線から換算し、野生型卵白との差を取った結果、６．５ｎｇ／ｍｌであった。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】実施例１で得られたネコ肝細胞増殖因子発現ベクターｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｆＨＧＦの構築を示す。ｐｈｉ＋はウイルスペッケージングシグナル配列を示す。モロニーマウス白血病ウイルスのパッケージングシグナル配列にｇａｇの開始コドン（ＡＴＧ）をＴＡＧに変更したｇａｇの一部が付随している。ｆＨＧＦはネコ肝細胞増殖因子遺伝子を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはＭＳＣＶのＬＴＲ配列を示す。
【図２】実施例１で得られた変異型ヒト肝細胞増殖因子発現ベクターｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｄｈＨＧＦの構築を示す。ｐｈｉ＋はウイルスペッケージングシグナル配列を示す。モロニーマウス白血病ウイルスのパッケージングシグナル配列にｇａｇの開始コドン（ＡＴＧ）をＴＡＧに変更したｇａｇの一部が付随している。ｄｈＨＧＦはヒト肝細胞増殖因子遺伝子を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはＭＳＣＶのＬＴＲ配列を示す。
【図３】実施例１で得られたＮＫ４発現ベクターｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ＮＫ４の構築を示す。ｐｈｉ＋はウイルスペッケージングシグナル配列を示す。モロニーマウス白血病ウイルスのパッケージングシグナル配列にｇａｇの開始コドン（ＡＴＧ）をＴＡＧに変更したｇａｇの一部が付随している。ＮＫ４はＮＫ４遺伝子を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはＭＳＣＶのＬＴＲ配列を示す。
【図４】実施例５で得られたネコ肝細胞増殖因子発現ベクターｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｆＨＧＦｗｐｒｅの構築を示す。ｐｈｉ＋はウイルスペッケージングシグナル配列を示す。モロニーマウス白血病ウイルスのパッケージングシグナル配列にｇａｇの開始コドン（ＡＴＧ）をＴＡＧに変更したｇａｇの一部が付随している。ｆＨＧＦはネコ肝細胞増殖因子遺伝子を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはＭＳＣＶのＬＴＲ配列を示す。ｗｐｒｅはウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節因子である。
【図５】実施例５で得られたヒト肝細胞増殖因子発現ベクターｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ｄｈＨＧＦｗｐｒｅの構築を示す。ｐｈｉ＋はウイルスペッケージングシグナル配列を示す。モロニーマウス白血病ウイルスのパッケージングシグナル配列にｇａｇの開始コドン（ＡＴＧ）をＴＡＧに変更したｇａｇの一部が付随している。ｄｈＨＧＦはヒト肝細胞増殖因子遺伝子を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはＭＳＣＶのＬＴＲ配列を示す。ｗｐｒｅはウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節因子である。
【図６】実施例５で得られたＮＫ４発現ベクターｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ−ＮＫ４ｗｐｒｅの構築を示す。ｐｈｉ＋はウイルスペッケージングシグナル配列を示す。モロニーマウス白血病ウイルスのパッケージングシグナル配列にｇａｇの開始コドン（ＡＴＧ）をＴＡＧに変更したｇａｇの一部が付随している。ＮＫ４はＮＫ４遺伝子を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはＭＳＣＶのＬＴＲ配列を示す。ｗｐｒｅはウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節因子である。
【図７】ｆＨＧＦ発現トランスジェニックニワトリ由来卵白サンプルの還元条件におけるウエスタンブロット分析の結果を示す。マーカーは分子量マーカーである。「３−１」〜「３−２４」はサンプル番号に相当する。０．１μｌの卵白サンプルを泳動した。ｆＨＧＦ（αβ鎖）は切断を受けていない前駆体、ｆＨＧＦ（β鎖）は活性型であると考えられる。β鎖に特異的な一次抗体を用いた為α鎖は検出されない。精製ｆＨＧＦを標準品としてｆＨＧＦ（α鎖＋β鎖）のバンドの濃さから発現量を換算すると、３−２４と精製ｆＨＧＦ１．６ｎｇのバンドの濃さが同程度であることから、発現量は約１６μｇ／ｍｌであると考えられる。
【図８】ｆＨＧＦ発現トランスジェニックニワトリ由来卵白サンプルの非還元条件におけるウエスタンブロット分析の結果を示す。マーカーは分子量マーカーである。「３−１」〜「３−２４」はサンプル番号に相当する。０．１μｌの卵白サンプルを泳動した。切断を受けていない前駆体ｆＨＧＦ（αβ鎖）と活性型ｆＨＧＦ（α鎖＋β鎖）が同じ位置に検出されていると考えられる。精製ｆＨＧＦを標準品としてｆＨＧＦ（α鎖＋β鎖）のバンドの濃さから発現量を換算すると、３−２４は精製ｆＨＧＦ０．４と０．８ｎｇの間のバンドの濃さであることから、発現量は４〜８μｇ／ｍｌであると考えられる。
【図９】ｈＨＧＦ発現トランスジェニックニワトリ由来血清サンプルのＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。測定にはＨＧＦ「オーツカ」ＥＬＩＳＡキット（大塚製薬社製）を用いた。野生型は野生型ニワトリの血清サンプルをあらわす。野生型血清サンプルでは検出限界以下であった。横軸の「１−８」〜「１−２３」はサンプル番号に相当する。標準ｈＨＧＦの検量線を元に濃度に換算した結果、発現量は最大で４３ｎｇ／ｍｌであった。
【図１０】ｈＨＧＦ発現トランスジェニックニワトリ由来卵白サンプルのＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。測定にはＨＧＦ「オーツカ」ＥＬＩＳＡキットを用いた。野生型は野生型ニワトリの卵白サンプルをあらわす。野生型卵白サンプルでは検出限界以下であった。横軸の「１」〜「６」はサンプル番号に相当する。標準ｈＨＧＦの検量線を元に濃度に換算した結果、発現量は最大で５４０ｎｇ／ｍｌであった。
【図１１】ＮＫ４発現トランスジェニックニワトリ由来血清及び卵白サンプルのＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。測定にはイムニス  ＨＧＦ  ＥＩＡキットを用いた。野生型は野生型ニワトリの血清サンプル及び卵白サンプルをあらわす。野生型血清サンプル及び卵白サンプルでは検出限界以下であった。横軸の「１−３」〜「３−９」はサンプル番号に相当する。標準ＮＫ４の検量線を元に濃度に換算した結果、発現量は血中で最大２０ｎｇ／ｍｌであった。１個体について卵白中の発現を調べたところ、１．７ｎｇ／ｍｌ発現していた。
【図１２】標準ｆＨＧＦ濃度とＢＮＬ  ＣＬ．２細胞の増殖との関係の検量線の結果を示す。ｆＨＧＦ濃度と吸光度４５０ｎｍの関係は、ｆＨＧＦ濃度をｘ、吸光度４５０ｎｍをｙとするとｙ＝０．０００３ｘ＋０．６１８２と一次近似できる。
【図１３】野生型卵白サンプルとｈＨＧＦ発現トランスジェニックニワトリ３−２４由来卵白サンプルの、ＢＮＬ  ＣＬ．２細胞に及ぼす増殖活性の効果を調べた。野生型卵白サンプルの添加でも細胞増殖率が上がったが、３−２４由来卵白サンプルの添加により細胞増殖率がより上がった。３−２４由来卵白サンプルの細胞増殖率から卵白サンプルの細胞増殖率を差し引いて図１２の検量線から換算した結果、６．５ｎｇ／ｍｌであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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