(57)【要約】      （修正有）【課題】関節リウマチ治療用薬物の新規植物抽出物の提供。【解決手段】プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ（ＰＡ）の粗抽出物または抽出物を含む関節リウマチに対する治療用薬物を提供する。該ＰＡ粗抽出物が、ＰＡを直接搾汁することにより得られる粗抽出物、また、ＰＡ抽出物が、ＰＡを極性溶媒に浸漬し、濃縮した後、カラム分離により得られる抽出物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のプレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇの粗抽出物または抽出物と、薬学上許容可能な担体とを含む、関節リウマチの治療用薬剤組成物。
【請求項２】
カプセル、錠剤、散剤、軟膏、水薬、またはスプレーの形態を有する、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
前記プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ粗抽出物が、プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇを直接搾汁することにより得られる粗抽出物である、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ抽出物が、プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇを極性溶媒に浸漬し、濃縮した後、カラム分離により得られる抽出物である、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇを極性溶媒に浸漬することにより得られる前記抽出物が、下表の保持時間を有するＨＰＬＣピークを有し、
【表１】
2008069143.tif 000008
前記ＨＰＬＣが下記の条件：
流量：１．０ｍｌ／分  圧力限界：２５０ｋｇｆ／ｃｍ２
試料注入：１０μｌ
ＰＤＡ条件：
サンプリング：０．６４秒
波長領域：１９０〜３７０ｎｍ
ｕｖ波長：２５４ｎｍ
溶出パターン：
【表２】
2008069143.tif 000009
の下で行われる、
請求項４に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
前記抽出物が、
高極性溶媒で洗浄し、溶出緩衝液を回収することと、
乾燥材料容量の約５〜１０倍の容量の準高極性溶媒で洗浄し、溶出緩衝液を回収することと、
乾燥材料容量の約５〜１０倍の容量の中極性溶媒で洗浄し、溶出緩衝液を回収するステップことと、
乾燥材料容量の約５〜１０倍の容量の低極性溶媒で洗浄し、溶出緩衝液を回収すること
によってカラム分離を受ける、請求項４に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
乾燥材料容量の約５〜１０倍の容量の準高極性溶媒で洗浄される前記プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ抽出物が、下表の保持時間のＨＰＬＣピークを有し、
【表３】
2008069143.tif 000010
ＨＰＬＣが下記の条件：
流量：１．０ｍｌ／分  圧力限界：２５０ｋｇｆ／ｃｍ２
試料注入：１０μｌ
ＰＤＡ条件：
サンプリング：０．６４秒
ｕｖ波長：２５４ｎｍ
溶出パターン：
【表４】
2008069143.tif 000011
の下で行われる、
請求項６に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
関節リウマチ治療用薬物の製造における、プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇの粗抽出物または抽出物の使用。
【請求項９】
前記薬物が、カプセル、錠剤、散剤、軟膏、水薬、またはスプレーの形態を有する、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ粗抽出物が、プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇを直接搾汁することにより得られる粗抽出物である、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
前記プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ抽出物が、プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇを極性溶媒に浸漬し、濃縮した後、カラム分離により得られる抽出物である、請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、漢方薬抽出物に関する。特に、本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）治療用のプレクトランサスアンボイニクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ  Ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ（ＰＡ）の粗抽出物または抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種対症薬および免疫抑制剤を使用の結果、関節リウマチの治療は、大きく進歩してきた。ほとんどの研究で、対症薬または免疫抑制剤は、初期発現直後に使用されると、骨の破壊速度が有効に低減できることが明らかになっている。現在、関節リウマチ治療用薬物は、以下の３類に分類される。
１．非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）：例えば、有効に炎症を抑制し、痛みの作用を軽減することができるアスピリン、インドメタシン、またはナプロキセン。
２．抗リウマチ薬（ＡＲＤ）：疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）と称され、例えば、状態を抑制し、免疫異常を改善することができる金製剤、ヒドロキシクロロキン、メトトレキセート（ＭＴＸ）、またはペニシラミン。
３．ステロイド薬：副腎皮質ステロイドと称され、抗炎症性であって、免疫抑制剤として使用することができる。
【０００３】
加えて、臨床的上一般的な対症薬にはスルファサラジンが挙げられ、免疫抑制剤にはシクロスポリン、アザチオプリン、またはシクロホスファミドが挙げられる。さらに、ミノサイクリンなど一部の抗生物質は、酵素を抑制し、骨吸収を抑制し、炎症性物質の生成を抑制することができるので、関節リウマチの治療にも使用できる。薬物の使用および治療のタイミングに関して、鋸歯状療法、ステップダウンブリッジ療法、段階療法、および標的療法など多くの治療モデルが提案されてきた。これら治療モデルの趣旨は明らかに、初期の段階で、各種対症薬または免疫抑制剤を単独で、または組み合わせて使用することである。
【０００４】
しかし、これら薬物の欠点は、薬物、特にステロイド薬は効き目があるほど、副作用を引き起こす恐れがあることである。抗炎症性薬物は、例えば出血などの異常を腸管内に頻繁に引き起こす。
【０００５】
ＴＮＦ−αなどのタンパク質アンタゴニストは、迅速に状態を緩和するために、臨床的に使用することもできるが、観血的に使用する必要があり、不便である。さらに、薬草の雷公藤（Ｒａｄｉｘ  Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｉ  Ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）には、抗炎症、殺菌、ならびに発熱および痛みの軽減作用があるので、現在関節リウマチの治療に使用されているが、その有毒な副作用のために安全性に対する配慮がなされる可能性がある。
【０００６】
統計によると、世界中で人口の１％が関節リウマチを患っている。したがって、便利で、安全で、効果のある関節リウマチ治療用薬物を開発することは、非常に重要である。
【０００７】
プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ（ＰＡ）は、マレーシアおよびインドが原産であり、鑑賞用薬草として普通の家庭によって頻繁に植えられている。一般的薬草ＰＡは、プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ植物の地上部分であり、別名は、リシマキア  カピリペス  ヘムシル（ｌｙｓｉｍａｃｈｉａ  ｃａｐｉｌｌｉｐｅｓ  Ｈｅｍｓｌ）、スペアミント、カッコウ（ａｇａｓｔａｃｈｅ  ｒａｇｏｓｕｓ）、パチョリ、インドペパーミント、またはポゴステモン・キャブリン（ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ  ｃａｂｌｉｎ）である。東インド人はこれを布地用香料として用い、イギリス人は１８２０年にインドからショール用布地を持ち込んだ後、ＰＡの魅力的な芳香を発見した。ＰＡの葉を衣服に直接入れると、衣服に芳香が染み付いただけでなく、その衣類の虫食いを防止した。東南アジアでＰＡは、殺菌性、興奮性、または虫よけの機能を有すると考えられている。さらに、ＰＡは、毒ヘビまたは蚊および昆虫からの咬傷を治癒し、頭痛、膨満、嘔吐、下痢、および発熱を軽減することなどもできる。プレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇの芳香油は、アジアで最も人気のある香料である。芳香療法では、ＰＡは上皮細胞の再生、ならびに、ざ瘡、湿疹、水虫、および皮膚の乾燥性ひび割れの治療を促進するのに使用される。さらにまた、ＰＡは不安を軽減し、性欲を増強する働きをする、優れた抗うつおよび性欲促進剤である。
【０００８】
本発明では、予期せぬことに、ＰＡの粗抽出物または抽出物は、ＲＡ治療の有効性を有しているということが見出されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一目的は、治療有効量のプレクトランサスアンボイニクス（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ（ＰＡ）の粗抽出物または抽出物を含む、関節リウマチ治療用薬剤組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、関節リウマチ治療用薬物の製造における、ＰＡの粗抽出物または抽出物の使用を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、ＰＡの粗抽出物または抽出物を製造する方法を提供することである。
【００１２】
以下、本発明を詳細に例示することとする。本発明の他の特徴、目的、および利点は、本明細書および特許請求の範囲から明らかになろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本明細書で使用する「治療」または「治療する」という用語は、状態を改善することを示す。
【００１４】
本明細書で使用する「患者」という用語は、動物、特に哺乳動物を示す。好ましい実施形態では、患者はヒトである。
【００１５】
本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、単独の、または治療において治療上の利点をもたらすことができる他の薬物と組み合わせた本発明の薬剤組成物の成分量を示す。
【００１６】
本明細書で使用する「担体」または「薬学上許容可能な担体」という用語は、当分野の技術者に周知で、薬剤組成物の調製に使用することができる希釈剤、賦形剤、または許容できる作用物質などを示す。
【００１７】
本明細書で使用する「ＰＡ粗抽出物」または「ＰＡ抽出物」という用語は、直接搾汁法またはＰＡ植物の地上部分に使用される抽出法により得られるものを示す。
【００１８】
本明細書で使用する「高極性溶媒」という用語は、調製工程で使用される溶媒の中で最大極性を有する溶媒を示す。高極性溶媒は、以下のものに限定されないが、水、メタノール、エタノール、または前記溶媒２種以上の混合物が挙げられる。
【００１９】
本明細書で使用する「低極性溶媒」という用語は、調製工程で使用される溶媒の中で最低の極性を有する溶媒を示す。低極性溶媒は、以下のものに限定されないが、クロロホルム、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、前記溶媒の２種以上の混合物、あるいは約７０：３０〜約５０：５０の比（ｖ：ｖ）で、前記溶媒の１種または複数と極性がより高い１種または複数の溶媒との混合物が挙げられる。
【００２０】
本明細書で使用する「準高極性溶媒」という用語は、調製工程で使用される高極性溶媒より低いが、調製工程で使用される中極性溶媒より高い極性を有する溶媒を示す。準高極性溶媒は、約７０：３０〜約３０：７０、好ましくは約６０：４０〜約４０：６０の比（ｖ：ｖ）で、高極性溶媒とより低い極性を有する溶媒とを混合することにより得ることができる。
【００２１】
本明細書で使用する「中極性溶媒」という用語は、調製工程で使用される準高極性溶媒の極性より低いが、調製工程で使用される低極性溶媒の極性より高い溶媒を示す。中極性溶媒は、約３０：７０〜約５：９５、好ましくは約１５：８５〜約５：９５の比（ｖ：ｖ）で、高極性溶媒とより低い極性を有する溶媒とを混合することにより得ることができる。
【００２２】
本発明は、ＲＡを治療するために、ＰＡ粗抽出物またはＰＡ抽出物を使用することを特徴とする。それにより本発明は、ＰＡ粗抽出物またはＰＡ抽出物の治療有効量を含む、ＲＡの治療用薬剤組成物を提供する。
【００２３】
治療に最も適する方法および投与量は、当分野の技術者により容易に決定されることであろう。本発明によると、好ましい方法は経口投与であり、例えば、それだけに限らないが、カプセル、錠剤、散剤、軟膏、水薬、またはスプレーなどがある。投与量は、治療する症状の性質および状態、治療する患者の年齢および全般的な体調、投与方法、ならびにこれまで実施された任意の治療法によって決まることとなる。投与量が、年齢、サイズ、健康状態、および関連因子に応じ、患者によって異なることを、当分野の技術者には理解されるはずである。さらに、所望により、該組成物は滅菌するか、あるいは薬学上許容可能な任意の担体または賦形剤と混合することができよう。本発明の薬剤組成物の調製は、従来の方法に従って、当分野の技術者により行うことができる。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態で、ＰＡ粗抽出物およびＰＡ抽出物の調製を下記に示す。
【００２５】
［ＰＡ粗抽出物の調製］
採りたてのＰＡ植物を採取し、清浄水で洗浄した後、汁抽出器で圧搾して搾り汁を得た。次にＰＡ搾り汁を凍結乾燥し、乾燥粉末を得、それをクロロホルムまたはメタノールなどの適当な溶媒に溶かし、ＰＡ粗抽出物を得た。
【００２６】
［ＰＡ抽出物の調製］
一定量の乾燥ＰＡを適量の高極性溶媒に浸漬、ろ過した後、適量の高極性溶媒に再度浸漬した。この後、ＰＡ抽出液を、減圧下で回転濃縮機により元の容量の２〜３％まで濃縮し、溶媒中に希釈した後、カラム中で分離した。場合によっては、高極性から低極性まで異なる溶媒の４区分（高極性溶媒、準高極性溶媒、中極性溶媒、および低極性溶媒とする）を使用し、連続的に溶出することができた。高極性溶媒、準高極性溶媒、中極性溶媒、および低極性溶媒は、上記に定義した通りである。カラム分離法では、メタノールによりすでに処理されているＤＩＡＩＯＮカラムを使用するのが好ましい。例えば、乾燥ＰＡと同量のＤＩＡＩＯＮを秤量し、メタノールに浸漬した後、カラムに充填した。充填後、該ＤＩＡＩＯＮを、１〜２倍の容量のメタノールで、次に５〜６倍の容量の脱イオン蒸留水で洗浄した。洗浄を終了し、充填が完了した。
【００２７】
［ＰＡ医薬材料抽出物の成分分析］
機器および器具：
高速液体クロマトグラフ
ポンプ：Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｐ４０００
検出器：ＵＶ／ＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＵＶ６００ＯＬＰ
オートサンプラー：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｕｄｕｃｔｓ  ＡＳ３５００
ソフトウェア：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｕｄｕｃｔｓ  Ｃｈｒｏｍ  Ｑｕｅｓｔ
システム制御：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｕｄｕｃｔｓ  ＳＮ４０００
【００２８】
液体クロマトグラフィー条件：
クロマトグラフカラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ、４．６×２５０ｍｍ、５Ｃ１８−ＭＳ
流量：１．０ｍｌ／分  圧力限界：２５０ｋｇｆ／ｃｍ２
試料注入：１０μｌ
ＰＤＡ条件：
サンプリング：０．６４秒
波長範囲：１９０〜３７０ｎｍ
ｕｖ波長：２５４ｎｍ
【００２９】
溶出条件（１）：
2008069143.tif 000002
【００３０】
溶出条件（２）：
2008069143.tif 000003
【００３１】
下記の非限定的な実施例を参照して、本発明を詳細に記述する。下記手順を実施することにより、ＲＡの治療における、ＰＡ粗抽出物または抽出物の効果を確認できよう。当分野の技術者により容易に達成できる、いかなる改変および変更も、本明細書および添付の請求項の開示の範囲に含まれる。
【実施例】
【００３２】
実施例１：直接搾汁法を使用して得られるＰＡ粗抽出物
採りたてのＰＡ１．２５ｋｇを秤量、清浄水で洗浄した後、汁抽出器により圧搾して搾り汁を得た。容量シリンダーを使用し、搾り汁の容量を測定し、そこから１０５０ｍｌを取り出して凍結乾燥し、乾燥粉末１９ｇを得た（収率１．５％）。ＨＰＬＣパターンを図１に示す。
【００３３】
実施例２：ＰＡ粗抽出物による動物のＲＡ治療に関する動物試験
［試験動物］
生後８週、および体重約１５５〜１６５ｇの試験動物Ｌｅｗｉｓラットは全て、国立実験動物センターから購入した。１２時間明所／１２時間暗所のサイクル、室温２３±１℃、適度な湿度、および良好な空気調節の動物小屋で、該動物を飼育し、水および飼料は無制限に与えた。さらに、実施中は、全ての試験動物が、国際実験動物機構の標準規制の基準に従った。
【００３４】
［薬物］
１．コラーゲンＩＩ型（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−１１８８）：ウシの気管軟骨から得た
２．完全フロイントアジュバント：ＣＦＡ（ＢＤ  ＢＢＬ（登録商標）２３１１３１）
３．不完全フロイントアジュバント：ＩＦＡ（ＢＤ  ＢＢＬ（登録商標）２６３９１０）
４．ラットの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、およびインターロイキン１β（ＩＬ−１β）（Ｒ＆Ｄ、Ｄｕｏｓｅｔ）のＥＬＩＳＡキット
５．ラットのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）：ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ（登録商標）Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ５５７８２５）
６．インドメタシン（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎｃｈｕｎｇ  Ｃｉｔｙ、Ｔａｉｐｅｉ  Ｃｏｕｎｔｙから市販）
７．採りたての中国薬草ＰＡを直接圧搾して搾汁を得、減圧下で濃縮してＰＡの濃縮溶液を形成した後、それぞれ希釈して、高濃度の生薬２２．５ｇ／ｋｇ（ＰＡ−Ｈ）および低濃度の生薬４．５ｇ／ｋｇ（ＰＡ−Ｌ）とした。最後に、該溶液を、それぞれの実体重に基づいてラットに経口で直接投与した。
【００３５】
［器具］
１．シリンジ：１ｍｌ、３ｍｌ、および５ｍｌ（Ｔｅｒｕｍｏ）
２．天秤
３．ノギス（Ｖｅｒｎｉｅｒ  Ｃａｌｉｐｅｒ）（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
４．３方向ピストン管
５．発振器（Ｖｏｒｔｅｘ）
６．ＥＬＩＳＡ読取機（Ｄｙｎｅｘ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）
【００３６】
［手順］
１．抗原処方および免疫注射
【００３７】
動物試験計画を図２に示す。ウシコラーゲンＩＩ型（Ｂｏｖｉｎｅ  ＣＩＩ）を０．１Ｍ酢酸溶液に溶解し、完全に溶解するまで攪拌し、濃度１．５および３ｍｇ／ｍｌの溶液に処方し、後で使用するために４℃で保存した。一次免疫注射として、ＣＩＩ溶液１００μｌを等量のＣＦＡで乳化し、乳化が完了した後、ラットの尾根部に皮下注射（２００μｌ／ラット）した。一次免疫化後、ラットの体重を３日毎に記録し、四肢に腫脹が起こるか否かを見つけるためにラットを観察した。約１５日後、二次免疫化を行った。  ＣＩＩ溶液１００μｌを等量のＩＦＡで乳化し、乳化が完了した後、ラットの尾根部に皮下注射（２００μｌ／ラット）した。およそ２０日目から、関節炎の症状が観察され（ＣＩＡラット）、ＰＡおよびインドメタシンを４５日目まで投与した。
【００３８】
２．動物の群分けおよび治療
2008069143.tif 000004
【００３９】
［試験項目および指標］
１．体重の観察：３日毎の計量により表示
２．ＲＡ試験の評価：最大関節炎指数（ＭＡＩ）で評価
３．関節腫脹速度：ノギスにより測定（１５〜２８日目に関節炎発現）
４．リウマチ因子（ＲＦ）
５．急性炎症Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）
６．サイトカイン：ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６（炎症性サイトカイン）
−ＲＡ試験の評価
【００４０】
免疫化後、ラットを週３回観察した。四肢における赤みおよび腫脹の変化等を記録し、比較用として写真を撮り保管した。試験の採点は、以下の５段階に基づいた：
０：関節炎の症状が起こらない。
１：足裏および足根部が赤みを示し、僅かに腫脹している。
２：足根および足関節部が赤く、中程度に腫脹している。
３：足根および足関節部が赤く、激しく腫脹している。
４：関節が硬く、骨が変形している。
【００４１】
最大関節炎指数、各群の平均ＭＡＩを以下の通りに計算した。
平均ＭＡＩ＝各ラットの四肢において記録されたＭＡＩの合計（０：ＣＩＡが起こらない、１６：最高点）／４／各群のラット総数
【００４２】
（関節炎腫脹度の測定）
ラット足裏部の厚さの変化をノギス（週２回）により測定したが、各ラットにつき、それぞれ２本の前足の各足裏中央に１部位、およびそれぞれ２本の各後ろ足に３部位（足関節部、足裏部、および趾根部）を含む、合計８種の測定部位があった。
【００４３】
（血清ＲＦ分析）
１．コラーゲンを、濃度４０μｇ／ｍｌまでコーティング緩衝液に配合、そのうち０．１ｍｌを９６ウェルマイクロプレートにそれぞれ添加し、終夜４℃で保管した。
２．トリス緩衝液で３回洗浄後、１％のＢＳＡを含むブロッキング緩衝液０．２ｍｌを各ウェルに添加した。反応が室温で２時間続いた後、再度トリス緩衝液で３回洗浄した。
３．血清試料を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（１／２０または１／４０）を含むトリス緩衝液で適当に希釈し、血清試料０．１ｍｌを９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに添加した。反応が室温で２時間続いた後、再度トリス緩衝液で３回洗浄した。
４．コーティングした抗ラット免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）をセイヨウワサビ過酸化酵素（ＨＲＰ）と合わせ、適度に希釈（１／１２０００）した後、９６ウェルマイクロプレートに添加した。反応が室温で２時間続いた後、再度トリス緩衝液で３回洗浄した。
５．テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）０．１ｍｌを呈色反応用の各ウェルに直接添加後、停止溶液を添加して反応を停止させた。最後に、吸収（Ｏ．Ｄ）値を波長４５０ｎｍで読み取った。
【００４４】
（血清Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）分析）
１．ＣＲＰ  ＥＬＩＳＡキットは事前にコーティングしたマイクロプレートであったので、適当に希釈した血清試料０．１ｍｌを直接添加することができた。室温で１時間反応させた後、洗浄緩衝液で４回洗浄した。
２．ウサギ抗ラットＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）をＨＲＰ  Ａｂと合わせ、洗浄緩衝液で１００倍に希釈後、０．１ｍｌを各ウェルに添加した。室温で１時間反応させた後、洗浄緩衝液で４回洗浄した。
３．ＴＭＢ０．１ｍｌを呈色反応用の各ウェルに添加し、約５〜１０分後、停止溶液を添加して反応を停止させた。最後に、Ｏ．Ｄ値を波長４５０ｎｍで読み取った。
【００４５】
（上記分析方法は、全て該キットに添付の試験規則に従って実施した）
（腹腔細胞の培養およびサイトカインの分析）
１．二酸化炭素で安楽死させた後、ラット腹腔の外皮を剪刀で切り取り、腹腔全体を露出させた。
２．ＨＢＳＳ緩衝液を、１０ｍｌシリンジによりバッチ式で腹腔に注入し、全容量を約２０ｍｌ／ラットにした。
３．腹部をそっと揉んだ後、ラットの腹腔を開いた。剪刀を使用して、約２ｃｍの切込みを腹腔に入れた。腹腔浸出細胞（ＰＥＣ）液（細胞液約１０〜１５ｍｌを回収することができた）をシリンジで引き出し、５０ｍｌ遠心管に入れた。
４．該液を５分間１５００ｒｐｍで遠心した後、上澄みを除去した。ＨＢＳＳ緩衝液１０ｍｌを添加して洗浄し、次に遠心した後で、上澄みを除去した。
５．細胞密度を、（抗生物質を含む）新鮮な培養液で２×１０６細胞／ｍｌに調整した。
６．細胞懸濁液を、０．５ｍｌ／ウェルで４８ウェルプレートに分けた。
７．さらにリポ多糖類（ＬＰＳ）０．５ｍｌ（２０μｇ／ｍｌ）を別途添加して、最終密度を１０μｇ／ｍｌにした。
８．最後に、３７℃のインキュベーターの中に２４時間置いた。上澄みを回収し、−２０℃で保存した。サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−１βの濃度を、ＥＬＩＳＡキットを使用して分析した。
【００４６】
［結果および考察］
Ｉ．ラットの体重変化
動物試験では、薬物の投与および他の外力の適用が共に、直接または間接的に体重の変化に影響する。したがって、体重を直接観察することは、外見上の最も重要な指標である。体重の測定結果によると、およそ２０日目後、コラーゲンにより誘発された関節炎の症状が生じ、正常のラットと比較して、体重は図３に示すように有意に減少することが示されるが、ＰＡ−Ｈおよびインドメタシンを投与したラットの群では、体重の減少が効果的に避けられ、正常の群と同様の成長曲線である。さらに、体重減少の現象は、ＰＡ−Ｌを投与した群では効果的に阻止できなかった。
【００４７】
ＩＩ．最大関節炎指数
材料および方法の項で記述したように、最大関節炎指数（ＭＡＩ）は、試験採点法の基準として５段階差があり、外観指標の１つである。図４に示すように、コラーゲンにより誘発されたラットの関節炎は、およそ３５日目でピークに達するが、ＰＡおよびインドメタシンを投与したラットの群では、関節炎指数が効果的に減少することができた。その中で、ＰＡ−Ｈおよびインドメタシンの結果が最も好ましい。
【００４８】
ＩＩＩ．関節腫脹度
関節炎の症状は、ラットに２回目の二次抗原注入後およそ２０日目で連続的に生じ、四肢の関節部位をノギスで実際に測定した。関節腫脹率（８つの測定部位から得られた平均）は、３９日目に２０％から最高６１％まで増加し、図５に示すように、正常の群（Ｐ＜０．０１）と比較して有意な差がある。ＰＡおよびインドメタシンを投与している点から、ＰＡ−ＨおよびＰＡ−Ｌは共に関節腫脹を有効に抑制でき、ＰＡ−Ｈおよびインドメタシンの効果も依然として非常に好ましく、ＰＡ−Ｈがインドメタシンと同様の抗炎症効果がある可能性を示唆している。
【００４９】
ＩＶ．血清ＲＦに対する、ＰＡの連続投与の効果
ＲＡが発現する間、現れる自己抗体がいくつかある。しかし、臨床診断では、患者の血清に自己抗体が存在しているか否かは、ＲＡか否かを決定する際の主な基準であり、ＲＦの自己抗体が最も重要である。したがって、本試験におけるＣＩＡの動物モデルもＲＦを重要な生化学指標としている。過去の研究では、ヒトまたはラットの血清中のＲＦは、ＥＬＩＳＡ法（Ｖｉｔｔｅｃｏｑら、２００１；Ｊｏｎｓｓｏｎら、１９８６）を使用して分析をすることができると指摘していた。本研究では、過去の分析法に基づいて一部改善をし、ラット血清ＲＦ分析のための科学技術の基盤を再構築した。分析結果により、図６に示すように、２回の抗原注入後２０日目で、ラットの血清ＲＦの力価は全てピークに達することが示されているが、２０日目と比較して、ＰＡおよびインドメタシンを投与した群の血清ＲＦ値は、３５日目にそれぞれ３３％および４７％減少し、４５日目には、それぞれ３９％および５１％さらに減少した。そのうえ、本研究の知見では、陰性対照群の血清ＲＦ値は、２０日目から徐々に減少する傾向があり、したがって関節炎の症状がラットにおいてコラーゲンにより誘発された後、症状は軽減し、時間と共に回復する傾向さえもあることが示唆され、その結果、疾患発現の「最盛期」は２０日目〜４５日目であると考えられる。
【００５０】
Ｖ．血清ＣＲＰに対する、ＰＡ連続投与の効果
血清ＣＲＰは主に肝臓によって作られ、全身性炎症反応を起こす指標であり、急性炎症中、血清に現れる最も重要な反応物である。ＲＡ患者血清中のＣＲＰ濃度、ならびにＩＬ−１およびＴＮＦ−αの生成は、関節炎障害の発現に密接に関係していることが、一部の文献で言及されている（Ｎａｋａｍｕ、関節リウマチ、２０００）。本研究の結果によると、２回の抗原免疫注射後、ラット血清中のＣＲＰ濃度は、図７に示すように有意に増加し、３５日目でピークに達し、正常の群（Ｐ＜０．０１）と比較して有意差を有することが示されている。さらに、３５日目にＰＡ−Ｈおよびインドメタシンを連続的に投与した後、ＣＩＡラットでは血清ＣＲＰ濃度を効果的に抑制できることが判明したが、４５日目でもまだ同様の効果があるため、ＰＡ−Ｈを投与すると、インドメタシンと同様の臨床的抗炎症剤投与の治療効果があることを示唆している。ＰＡ−Ｌを投与しても、有意な炎症抑制効果は全くない。
【００５１】
ＶＩ．ＰＥＣサイトカインの変化
ＰＡ抗腫脹または抗炎症効果があるか否かを評価する、上記のいくつかの重要な生化学指標の他に、ＲＡ症状が生じる前後のラットの状態変化をさらに容易に理解するために、本研究は炎症反応におけるサイトカイン分泌の効果もさらに調査するが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−１βなどの炎症性サイトカインは最も重要な指標である。即ち体内のこれらサイトカインの量が炎症反応に密接に関係している。本研究の結果により、ＣＩＡラットにＰＡ−Ｈを与えることで、ＰＥＣがＴＮＦ−αおよびＩＬ−１β（図８に示すように）、ならびにＩＬ−６（図９に示すように）を分泌するのを有意に抑制できることが実証されている。そのうえ、インドメタシンを投与すると、ＰＥＣが炎症性サイトカインを分泌するのを抑制する効果がなかったので、インドメタシン効果のメカニズムはこれを対象としていなかったと考えられ、したがって、抗腫脹または抗炎症剤の使用におけるＰＡの適用価値がさらに重視される。
【００５２】
上記により、本発明の薬剤と対照群のインドメタシンとの比較で、高濃縮ＰＡ粗抽出物の薬効性が、インドメタシン２．５ｍｇ／ｋｇと同等であることがわかる。さらに、インドメタシンはＣＯＸの抑制剤であり、その医薬的効果は、現れたサイトカインの抑制現象に対し、ＰＡの効果とは異なると思われる。
【００５３】
実施例３：カラム分離精製を使用して得られるＰＡ抽出物（ＰＡ−ＥｔＯＨ、ＰＡ−Ｆｌ、ＰＡ−Ｆ２、ＰＡ−Ｆ３、およびＰＡ−Ｆ４）
ＰＡの乾燥材料を２ｋｇ取り、１０倍の高濃度エタノールに２４時間浸漬し、ろ過した後、再度１０倍の高濃度エタノールに２４時間浸漬した。この後、ＰＡ抽出液を、回転濃縮機による減圧下、元の容量の２〜３％まで濃縮、乾燥して粉末にし、ＰＡ−ＥｔＯＨと命名する。重量は３０ｇ、収率は１．５％であった。
【００５４】
溶媒で希釈後、予備処理したＤＩＡＩＯＮカラムに注入した。乾燥薬草の約１０倍の容量の高極性溶媒で洗浄後、溶出物を回収し、ＰＡ−Ｆｌと命名した。重量は８．５ｇ、収率は０．４３％であった。
【００５５】
該カラムを、乾燥薬草の約５〜１０倍の容量の準高極性溶媒で洗浄後、溶出物を回収し、ＰＡ−Ｆ２と命名した。重量は１２ｇ、収率は０．６％であった。ＨＰＬＣパターンを図１０に示す。
【００５６】
該カラムを、乾燥薬草の約５〜１０倍の容量の中極性溶媒で再度洗浄後、溶出物を回収し、ＰＡ−Ｆ３と命名した。重量は１５ｇ、収率は０．７５％であった。
【００５７】
該カラムを、乾燥薬草の約５〜１０倍の容量の低極性溶媒で再度洗浄後、溶出物を回収し、ＰＡ−Ｆ４と命名した。重量は１２ｇ、収率は０．６％であった。
【００５８】
実施例４：ＲＡ動物の治療用ＰＡ抽出物の動物試験
本動物試験において、使用した試験動物および器具は、実施例２で開示したものと同じである。
【００５９】
［薬物］
１．コラーゲンＩＩ型（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−１１８８）：ウシの気管軟骨から得た
２．完全フロイントアジュバント：ＣＦＡ（ＢＤ  ＢＢＬ（登録商標）２３１１３１）
３．不完全フロイントアジュバント：ＩＦＡ（ＢＤ  ＢＢＬ（登録商標）２６３９１０）
４．インターロイキン６（ＩＬ−６）およびインターロイキン１β（ＩＬ−１β）（Ｒ＆Ｄ、Ｄｕｏｓｅｔ）のＥＬＩＳＡキット
５．Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（ＣＢＸ）
６．実施例３のＰＡ抽出物（ＰＡ−ＥｔＯＨ、ＰＡ−Ｆｌ、ＰＡ−Ｆ、ＰＡ−Ｆ３、およびＰＡ−Ｆ４）を、それぞれ実際の体重に基づき、ラットに直接経口投与した。
【００６０】
［手順］
１．抗原処方および免疫注射
動物試験計画を図１１に示す。ウシコラーゲンＩＩ型を、０．１Ｍ酢酸溶液に溶解し、完全に溶解するまで攪拌し、濃度１．５および３ｍｇ／ｍｌの溶液に処方し、後で使用するために４℃で保存した。一次免疫注射として、ＣＩＩ溶液１００μｌを等量のＣＦＡで乳化し、乳化が完了した後、ラットの尾根部に皮下注射（２００μｌ／ラット）した。一次免疫化後、ラットの体重を３日毎に記録し、四肢に腫脹が起こるか否かを見つけるためにラットを観察した。約１５日後、二次免疫化を行った。ＣＩＩ溶液１００μｌを等量のＩＦＡで乳化し、乳化が完了した後、ラットの尾根部に皮下注射（２００μｌ／ラット）した。およそ１８日目から、関節炎の症状が観察され（ＣＩＡラット）、ＰＡおよびＣＢＸを１９日目から３８日目まで投与した。
【００６１】
２．動物の群分けおよび治療
2008069143.tif 000005
【００６２】
［結果および考察］
Ｉ．ラットの体重変化
図１２に示すように、各群における正常のラットおよびＣＩＡラットの体重間に、明確な差はなかった。蒸留水を投与した対照群と比較して、ＰＡ−ＥｔＯＨ、ＰＡ−Ｆ２、およびＰＡ−Ｆ４を投与したラットの方が、体重が重い。
【００６３】
ＩＩ．最大関節炎指数
図１３に示すように、コラーゲンにより誘発されたラットの関節炎指数は、およそ３１日目でピークに達するが、ＰＡ−ＥｔＯＨ、ＰＡ−Ｆ１、ＰＡ−Ｆ２、ＰＡ−Ｆ３、ＰＡ−Ｆ４、およびＣＢＸを投与したラット群では、関節炎指数を効果的に減少することができた。その中で、ＰＡ−Ｆ１およびＣＢＸの結果が最も好ましい。
【００６４】
ＩＩＩ．関節腫脹度
関節炎の症状は、ラットの二次免疫注射後およそ２０日目で連続的に生じ、四肢の関節部位をノギスで実際に測定した。関節腫脹率は引き続き増加し、２７日目に最高６４％に達した。図１４に示すように、正常の群と比較して有意な差がある。しかし、ＰＡ−ＥｔＯＨ、ＰＡ−Ｆ１、ＰＡ−Ｆ２、ＰＡ−Ｆ３、ＰＡ−Ｆ４、およびＣＢＸを投与したラットは全て、関節腫脹の抑制効果を示した。その中でＰＡ−Ｆ１およびＣＢＸの効果は依然として最も好ましく、ＰＡ−Ｆ１がＣＢＸと同様の抗炎症効果を有し得ることを示している。
【００６５】
ＩＶ．血清ＲＦに対する、ＰＡの連続投与の影響
分析結果により、図１５に示すように、２回の免疫注射後１８日目で、ラットの血清ＲＦの力価は全て、ピークに達することが示されている。しかし、ＰＡ−Ｆ２およびＣＢＸを投与した群では、ＰＡ−Ｆ２によりＲＦ値が３０日目に約３４％、３７日目に約４４％減少する一方、ＣＢＸ治療により、ＲＦ値が３０日目に約５２％、３７日目に約６６％減少し、１８日目と比較して、血清ＲＦ値はそれぞれ有意に減少した。
【００６６】
Ｖ．ＰＥＣサイトカインの変化
本研究結果により、ＰＡ−Ｆ２、ＰＡ−Ｆ３、およびＰＡ−Ｆ４をＣＩＡラットに与えることで、ＰＥＣがＩＬ−６を分泌するのを（図１６に示すように）有意に抑制し、ＰＡ−Ｆ１、ＰＡ−Ｆ２、およびＣＢＸをＣＩＡラットに与えることで、ＰＥＣがＩＬ−１βを分泌するのを（図１７に示すように）有意に抑制することが実証されている。
【００６７】
［結論］
上記動物の作用度の分析結果を、表Ｉにまとめる。
2008069143.tif 000006
【００６８】
実施例５：ラットマクロファージのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞モデルの分析
Ｉ．ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの濃度決定方法
［目的］
ラットのマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞培養におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの濃度を測定し、それにより、ＬＰＳ誘発α合成を抑制できる活性成分を選別した。
【００６９】
［器具および材料］
１．機器
（１）ＥＬＩＳＡ読取機
（２）遠心分離機
【００７０】
２．アッセイキットＤＹ４１０：ラットＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ（ＥＬＩＳＡキット）（Ｒ＆Ｄ、Ｄｕｏｓｅｔ）
（１）担体タンパク質非含有のヤギ抗ラットＴＮＦ−αまたはＩＬ−１β抗体：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．８μｇ／ｍｌ
（２）ビオチン化ヤギ抗ラットＴＮＦ−αまたはＩＬ−１β抗体：希釈剤中１５０ｎｇ／ｍｌ
（３）希釈剤中の組換ラットＴＮＦ−αまたはＩＬ−１β：２０００ｐｇ／ｍｌ
（４）ストレプトアビジンＨＲＰ
【００７１】
３．必要な溶液
（１）ＰＢＳ：塩化ナトリウム１３７ｍＭ、塩化カリウム２．７ｍＭ、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）８．１ｍＭ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）１．５ｍＭ、ｐＨ７．２〜７．４
（２）洗浄緩衝液：ＰＢＳ中、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
（３）ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ、５％ショ糖、０．０５％アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）
（４）希釈剤：ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ
（５）基質溶液：１：１の発色試薬Ａと発色試薬Ｂ（Ｒ＆Ｄ  系統＃ＤＹ９９９）との混合物
（６）停止溶液：２Ｎ硫酸
【００７２】
４．薬物
（１）グリース試薬：５％リン酸中の１％スルファニルアミドおよび０．１％Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアミン
（２）標準液：亜硝酸ナトリウム
（３）免疫促進剤：リポ多糖類（ＬＰＳ）
（４）活性調節剤：ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）、インドメタシン
（５）培養液：ＤＭＥＭ中１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）
（６）ＰＢＳ
（７）トリプシン
５．細胞：ＲＡＷ２６４．７
【００７３】
［方法］
１．細胞培養およびプレーティング：
（１）Ｔ−７５中の古い培養液を取り出し、ＰＢＳで１〜２回洗浄、トリプシン３ｍｌを添加し、３７℃で３分間反応させた後、培地７ｍｌ（１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ）を添加してトリプシン作用を中止させた。
（２）１０００ｒｐｍで遠心分離機を使用し、４℃で１０分間遠心分離して、トリプシン含有培地を除去した。培地１０ｍｌを添加し、完全に混合して、細胞を数えた。
（３）ＲＡＷ２６４．７細胞を、細胞密度５×１０５細胞／ウェルで、２４ウェルプレートに播種し、５％二酸化炭素中、３７℃でインキュベートした。
【００７４】
２．ＬＰＳ促進剤および薬物療法
（１）Ｌ−ＮＡＭＥおよびインドメタシン（活性調節剤）、ならびに試料を、ＬＰＳ１μｇ／ｍｌを含むフェノールを含有しない培養液に添加した。
（２）古い培養液を取り出し、ＬＰＳおよび活性調節剤を含む新鮮培地または試料に変えた。これを３回繰り返した。５％二酸化炭素中、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。
【００７５】
３．サンドイッチＥＬＩＳＡの処方
（１）捕獲抗体１００λ（ＰＢＳ中０．８μｇ／ｍｌまで希釈）を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、室温でシールして、終夜インキュベートした。
（２）遊離している捕獲抗体を除去した後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。ブロッキング緩衝液３００λを添加、室温で少なくとも１時間インキュベートし、非特異的結合を減少させた。
（３）細胞懸濁液を回収、遠心分離機を使用し、４℃で１０分間、１０ｋｒｐｍで遠心分離した後、−２０℃で保存した。
【００７６】
４．ＥＬＩＳＡ分析
（１）ブロッキング緩衝液を除去した後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。適当に希釈した細胞培養または標準液１００λ（最高濃度は２０００ｐｇ／ｍｌであった）を添加し、室温で２時間インキュベートした。
（２）細胞培養または標準液を除去した後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。検出抗体１００λ（溶媒に１００ｎｇ／ｍｌまで希釈）を添加し、室温で２時間インキュベートした。
（３）遊離している検出抗体を除去した後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。ストレプトアビジンＨＲＰの希釈作用溶液１００λを添加し、室温で２０分間、遮光してインキュベートした。
（４）遊離しているストレプトアビジンＨＲＰを除去した後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。基質溶液１００λを添加し、室温で２０分間、遮光してインキュベートした。
（５）停止溶液１００λを添加し、穏やかに振盪して完全に混合した。
（６）Ｏ．Ｄ値を波長４５０ｎｍで読み取った後、５４０ｎｍまたは５７０ｎｍの較正が推奨された、あるいは５７０ｎｍ（または５４０ｎｍ）での読み取り値を、４５０ｎｍでの読み取り値から直接減じた。
【００７７】
ＩＩ．ＮＯの決定
［目的］
ラットのマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞培養における亜硝酸（ＮＯ）の濃度を測定し、それによりＬＰＳ誘発ＮＯ合成を抑制することができる活性成分を選別した。
【００７８】
［器具および材料］
１．機器
（１）ＥＬＩＳＡ読取機
（２）遠心分離機
２．薬物
（１）グリース試薬：５％リン酸中１％スルファニルアミドおよび０．１％Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアミン
（２）標準液：亜硝酸ナトリウム
（３）免疫促進剤：リポ多糖類（ＬＰＳ）
（４）活性調節剤：ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）、インドメタシン
（５）培養液：ＤＭＥＭ中１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）
（６）ＰＢＳ
（７）トリプシン
３．細胞：ＲＡＷ２６４．７
【００７９】
［方法］
１．細胞培養およびプレーティング：
（１）Ｔ−７５中の古い培養液を取り出し、ＰＢＳで１〜２回洗浄、トリプシン３ｍｌを添加し、３７℃で３分間反応させた後、培地７ｍｌ（１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ）を添加して、トリプシンの作用を中止させた。
（２）１０００ｒｐｍで遠心分離機を使用し、４℃で１０分間遠心分離して、トリプシン含有培地を除去した。培地１０ｍｌを添加し、完全に混合して、細胞を数えた。
（３）ＲＡＷ２６４．７細胞を、細胞密度５×１０５細胞／ウェルで、２４ウェルプレートに播種し、５％二酸化炭素中、３７℃でインキュベートした。
【００８０】
２．ＬＰＳ促進剤および薬物療法
（１）Ｌ−ＮＡＭＥおよびインドメタシン（活性調節剤）、ならびに試料を、ＬＰＳ１μｇ／ｍｌを含むフェノールを含有しない培養液に添加した。
（２）古い培養液を取り出し、ＬＰＳおよび活性調節剤を含む新鮮培地または試料に変えた。これを３回繰り返した。５％二酸化炭素中、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。
（３）細胞懸濁液を回収、遠心分離機を使用し、４℃で１０分間、１０ｋｒｐｍで遠心分離した後、−２０℃で保存した。
【００８１】
３．ＮＯ濃度の測定
（１）標準液の処方：亜硝酸ナトリウム１００μＭ／ｍＬ（培養液に溶解）を配合し、２倍ずつに希釈して、それぞれ濃度が５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、および１．５６μＭ／ｍＬの標準液を合計７種得た。
（２）該標準液または細胞培養の上澄みを、グリース試薬と１：１で混合し、室温で１５分間、遮光してインキュベートした。
（３）Ｏ．Ｄ値を波長５５０ｎｍで読み取った。
【００８２】
ＩＩＩ．プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の決定
ＲＡＷ２６４．７細胞を、細胞密度１０５細胞／ウェルで、２４ウェルプレートに播種し、終夜（１６〜２４時間）インキュベートした。活性調節剤および試験試料は、ＬＰＳ１μｇ／ｍｌを含むフェノールを含有しない培養液にそれぞれ添加した。古い培地を除去した後、試験試料およびＬＰＳを含む新鮮培地１ｍｌを添加して、同時インキュベーションした。２４時間後、遠心分離機を使用し、１０００ｒｐｍで１０分間それらを遠心分離した。上澄みを吸出し、−２０℃で保存するか、または上澄みの中のＰＧＥ２含有量を、ＰＧＥ２Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ−ＥＩＡキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＲＰＮ２２２）を使用して直接定量化した。
【００８３】
［結論］
上記細胞モデルの分析結果を、表ＩＩにまとめる。
2008069143.tif 000007
【００８４】
ＰＡ抽出物は、ＬＰＳにより誘発されるラットのマクロファージ炎症を阻止することができる。ＰＡ−Ｆ１は、ＬＰＳから誘発された赤みを帯び腫脹した炎症細胞により生じたＴＮＦ−αを有意に抑制することができ、ＰＡ−Ｆ２は、ＩＬ−１βにより起こる作用を抑制することができるのに対して、ＰＡ−Ｆ３は、ＣＯＸの生成物であるＰＧＥ２を抑制することができる。
【００８５】
上記のように、本発明で使用したＰＡ粗抽出物または抽出物は、直接搾汁またはカラム分離により得られ、外用または経口使用し得る非常に安全な薬草である。さらに、経口で投与する場合、ＰＡ粗抽出物または抽出物は、免疫アジュバントと共に、コラーゲンを原因とする自己免疫疾患および関連した生化学の動物障害を、効果的に抑制することができ、それにより、ＰＡ粗抽出物または抽出物は、潜在的な抗腫脹または抗炎症効率を有し、ＲＡ治療に有効に使用できることが、ＲＡラットモデルにより本発明で実証されている。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】実施例１におけるＰＡ粗抽出物のＨＰＬＣパターン図である。
【図２】実施例２における動物試験の計画を例証する表である。
【図３】ＣＩＡラットの体重に対する、ＰＡ粗抽出物を投与する効果を例証するグラフである。
【図４】ＣＩＡラットの関節炎指数に対する、ＰＡ粗抽出物を投与する効果を例証するグラフである。
【図５】ＣＩＡラットの関節炎膨張度に対する、ＰＡ粗抽出物を投与する効果を例証するグラフである。
【図６】ＣＩＡラットの血清ＲＦに対する、ＰＡ粗抽出物を投与する効果を例証するグラフである。
【図７】ＣＩＡラットの血清ＣＲＰに対する、ＰＡ粗抽出物を投与する効果を例証するグラフである。
【図８】ＣＩＡラット腹腔中のサイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βに対する、ＰＡ粗抽出物を投与する効果を例証するグラフである。
【図９】ＣＩＡラット腹腔中のサイトカインＩＬ−６に対する、ＰＡ粗抽出物を投与する効果を例証するグラフである。
【図１０】実施例３におけるＰＡ抽出物ＰＡ−Ｆ２のＨＰＬＣパターン図である。
【図１１】実施例４における動物試験の計画を例証する表である。
【図１２】ＣＩＡラットの体重に対する、ＰＡ抽出物を投与する効果を例証するグラフである。
【図１３】ＣＩＡラットの関節炎指数に対する、ＰＡ抽出物を投与する効果を例証するグラフである。
【図１４】ＣＩＡラットの関節炎膨張度に対する、ＰＡ抽出物を投与する効果を例証するグラフである。
【図１５】ＣＩＡラットの血清ＲＦに対する、ＰＡ抽出物を投与する効果を例証するグラフである。
【図１６】ＣＩＡラット腹腔中のサイトカインＩＬ−６に対する、ＰＡ抽出物を投与する効果を例証するグラフである。
【図１７】ＣＩＡラット腹腔中のサイトカインＩＬ−１βに対する、ＰＡ抽出物を投与する効果を例証するグラフである。
【図１】
2008069143.tif 000012
【図２】
2008069143.tif 000013
【図３】
2008069143.tif 000014
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2008069143.tif 000022
【図１２】
2008069143.tif 000023
【図１３】
2008069143.tif 000024
【図１４】
2008069143.tif 000025
【図１５】
2008069143.tif 000026
【図１６】
2008069143.tif 000027
【図１７】
2008069143.tif 000028
【外国語明細書】
2008069143000001.pdf