(57)【要約】 【課題】従来の方法に較べて、比較的に簡単に多種類のヒト型オリゴ糖鎖を有する複合糖質類を合成するためのグリコシル化剤と、グリコシル化方法の提供。【解決手段】式（Ｉ）：Ｇ−Ｘ−Ｙ［式中、Ｇは、水酸基やカルボキシル基を保護したヒト型オリゴ糖鎖であり；Ｘは、硫黄あるいはセレンであり；Ｙは、炭素数８〜２０である直鎖アルキル基である。］で表されるグリコシル化剤；その製造方法；及び該グリコシル化剤を用いて複合糖質類を合成するためのグリコシル化方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：Ｇ−Ｘ−Ｙ［式中、Ｇは、水酸基やカルボキシル基を保護したヒト型オリゴ糖鎖であり；Ｘは、硫黄あるいはセレンであり；Ｙは、炭素数８〜２０である直鎖アルキル基である。］で表されるグリコシル化剤。
【請求項２】
Ｇが、水酸基をベンジル基で保護したグロボトリオースである請求項１記載のグリコシル化剤。
【請求項３】
Ｇが、水酸基をアセチル基またはベンジル基で保護したＧａｌβ１−６Ｇｌｃである請求項１記載のグリコシル化剤。
【請求項４】
Ｘが、硫黄である請求項１から３のいずれか１項に記載のグリコシル化剤。
【請求項５】
Ｙが、−（ＣＨ2）11ＣＨ3である請求項１から４のいずれか１項に記載のグリコシル化剤。
【請求項６】
Ｙが、−（ＣＦ2）7ＣＦ3である請求項１から４のいずれか１項に記載のグリコシル化剤。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載のグリコシル化剤を用いるグリコシル化法。
【請求項８】
Ｎ−ヨウ化コハク酸イミドとトリメチルシリルトリフラートの存在下に反応させる請求項７に記載のグリコシル化法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト型オリゴ糖鎖を有するグリコシル化剤に関するものであって、生化学研究や医薬などに用いられる複合糖質類の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
複合糖質（糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカンなど）は、細胞間の接着や認識、そして細胞間情報伝達など、ヒト生体内の生命現象に深く関与している。このような生命現象の解明や医薬品の開発を目的として、ヒト型オリゴ糖鎖を有する複合糖質類が設計、合成されている（例えば、非特許文献１参照）。複合糖質類の合成において重要な工程は、タンパク質や脂質などに糖鎖を導入するグリコシル化の工程と、グリコシル化反応に用いるグリコシル化剤を調製する工程である。従来のグリコシル化法としては、化学的なグリコシル化法（例えば、非特許文献２参照）、糖加水分解酵素を用いるグリコシル化法（例えば、非特許文献３参照）、そして糖転移酵素を用いるグリコシル化法（例えば、非特許文献４参照）などが報告されている。これらのグリコシル化法に用いられるグリコシル化剤としては、化学的に調製した糖誘導体、天然糖鎖、天然糖鎖から調製した糖誘導体、そして糖ヌクレオチドなどが挙げられる。
【０００３】
一方、複合糖質類の糖鎖部分の簡便な合成法として、細胞を用いた糖鎖の合成法が報告されている（例えば、特許文献１、非特許文献５参照）。これらの方法では、簡単な構造の糖鎖プライマーを培養細胞に投与すると、糖鎖伸長した複数のオリゴ糖鎖が培養細胞から放出される。また、培養細胞の種類を変えることによって異なった構造のオリゴ糖鎖を合成することができる。
【０００４】
【非特許文献１】Ｙ．Ｃ．Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｔ．Ｌｅｅ，（ｅｄｓ）（１９９４）「Ｎｅｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ」（米国）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、５３−３２１．
【非特許文献２】Ｎ．Ｏｔｓｕｂｏ，Ｈ．Ｉｓｈｉｄａ，Ｒ．Ｋａｎｎａｇｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｋｉｓｏ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｓｙｍｍｅｔｒｙ，１６，１３２１−１３２７（２００５）．
【非特許文献３】Ｔ．Ｗ．Ｄ．Ｆ．Ｒｉｓｉｎｇ，Ｔ．Ｄ．Ｗ．Ｃｌａｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｗ．Ｂ．Ｍｏｉｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｊ．Ｆａｉｒｂａｎｋｓ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，７，１１７７−１１８０（２００６）．
【非特許文献４】Ｓ．Ｊａｃｑｕｅｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｉｃｈ，Ｃ．−Ｃ．Ｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｂｕｎｄｌｅ，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４，１４２−１５４（２００６）．
【非特許文献５】Ｈ．Ｎａｋａｊｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１２４，１４８−１５６（１９９８）．
【特許文献１】特開２０００−２４７９９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記のグリコシル化剤の調製において化学的にグリコシル化剤を調製する場合には、還元末端の単糖残基の１位に保護基を導入する必要がある。すなわち、１位を保護した単糖残基の非還元末端に糖鎖伸長を行うことでオリゴ糖を合成し、引き続き１位の脱保護、脱離基の導入を行うことでグリコシル化剤が調製される。このようなグリコシル化剤の調製法では、１位の保護基とオリゴ糖への変換法との組み合わせが重要であり、適切な組み合わせが選択されなかった場合にはグリコシル化剤が低収率でしか生成しない（例えば、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ａ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３３６，１３−４６，２００１．）。このように化学的グリコシル化剤の調製では、反応工程数が長く合成工程の設計が難しいことが問題となっている。また、天然糖鎖や、天然糖鎖から調製した糖誘導体をグリコシル化剤として用いる場合には、入手できる糖鎖の種類や量が限られてしまうという欠点があり、糖ヌクレオチドをグリコシル化剤として用いる場合には、糖ヌクレオチドが高価であるという欠点がある。また、前述の細胞を用いた糖鎖の合成法では多種類の糖鎖の調製が達成されているが、合成した糖鎖のグリコシル化剤への変換については検討されていない。以上のことから、簡便に多種類のヒト型オリゴ糖鎖を有するグリコシル化剤と、このグリコシル化剤を用いるグリコシル化法の開発が強く求められている。
【０００６】
そこで、発明者らは鋭意研究を重ね、ラウリルチオグリコシドなどの直鎖アルキル基をアグリコンに有するチオグリコシドを利用したグリコシル化剤の調製法と、そのグリコシル化剤を用いるグリコシル化法を開発した。すなわち、前述の化学的なグリコシル化剤の調製において還元末端の単糖にラウリルチオグリコシドを用いると、ラウリルチオ基がオリゴ糖へ変換する際には保護基として作用し、グリコシル化の工程では脱離基として作用することを見いだした。この方法を従来の化学的なオリゴ糖鎖の調製法に適用することで、ヒト型オリゴ糖鎖を有するグリコシル化剤の簡便な調製が可能になった。また、ラウリルチオグリコシドなどの直鎖アルキル基をアグリコンに有するチオグリコシドは、前述の特許文献１記載の細胞を用いた糖鎖合成法の基質になることが知られている。そこで、ラウリルチオグリコシドを基質に用いてヒト型オリゴ糖鎖を生産する細胞を利用した糖鎖合成を行うことによって糖鎖伸長したチオグリコシドを合成し、このチオグリコシドに保護基を導入することでヒト型オリゴ糖鎖を有するグリコシル化剤が調製できることを見いだした。また、このグリコシル化剤は、グリコシル化反応によって複合糖質類へ誘導されることを見いだした。以上のように、発明者らは上記課題を解決し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、式（Ｉ）：Ｇ−Ｘ−Ｙ［式中、Ｇは、水酸基やカルボキシル基を保護したヒト型オリゴ糖鎖であり；Ｘは、硫黄あるいはセレンであり；Ｙは、炭素数８〜２０である直鎖アルキル基である。］で表されるグリコシル化剤であり、このグリコシル化剤を用いるグリコシル化法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明を用いることにより、ヒト型オリゴ糖鎖を有するグリコシル化剤を簡便に調製することができる。また、このグリコシル化剤を用いることで複合糖質類の合成が容易になり、ヒト型オリゴ糖鎖を有する複合糖質の機能解明や、薬理活性を有する糖鎖誘導体の開発などに大きく貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の式（Ｉ）のグリコシル化剤において、Ｇは、水酸基やカルボキシル基を保護したヒト型オリゴ糖鎖である。ヒト型オリゴ糖鎖とは、ヒト生体内に存在するオリゴ糖鎖であり糖脂質糖鎖や糖タンパク質糖鎖などが挙げられ、例えば、Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌα１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃなどのグロボ系列の糖脂質糖鎖が挙げられる（Ｇａｌとはガラクトースであり、Ｇｌｃとはグルコースであり、ＧａｌＮＡｃとは、Ｎ−アセチルガラクトサミンである）。
【００１０】
水酸基の保護基としては、アセチル基やベンゾイル基などのアシル系保護基、ベンジル基やアリル基などのエーテル系保護基、ｔ−ブチルジメチルシリル基やｔ−ブチルジフェニルシリル基などのシリルエーテル系保護基、イソプロピリデン基やベンジリデン基などの環状アセタール系保護基などが使用できる。また、カルボキシル基の保護基としては、メチル基、ベンジル基などの保護基が使用できる。
【００１１】
本発明の式（Ｉ）のグリコシル化剤において、Ｘは、硫黄あるいはセレンを用いることができ、好ましくは硫黄である。
【００１２】
本発明の式（Ｉ）のグリコシル化剤において、Ｙは、炭素数８から２０である直鎖アルキル基であればよく、フッ素化されていてもよい。好ましくは炭素数１２または８の直鎖アルキル基である。
【００１３】
本発明はまた、上記式（Ｉ）で表されるグリコシル化剤の調製方法であって、このグリコシル化剤は、ラウリルチオグリコシドのような直鎖アルキル基をアグリコンに有するチオグリコシドを還元末端単糖として出発物質に用い、化学的なヒト型オリゴ糖鎖の合成法（例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｋ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２０２，１７７−１９１，１９９０）にしたがって調製することで得ることができる。ただし、出発物質に用いるチオグリコシドの水酸基には、アシル系の保護基を導入することが好ましい。また、上記式（Ｉ）で表されるグリコシル化剤は、前述の細胞を用いる糖鎖合成法によってラウリルチオグリコシドから得られる糖鎖に対して、その水酸基やカルボキシル基に保護基を導入することによって調製できる。式（Ｉ）で表されるグリコシル化剤のＧがヒト型オリゴ糖鎖であるグリコシル化剤は、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞、ラットＰＣ１２細胞、ヒト−ＨＬ６０細胞などを用いることにより調製できる。たとえば、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を用いた場合にはＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃが得られ、ラットＰＣ１２細胞を用いた場合にはＧａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃが得られる（Ｇａｌとはガラクトースであり、Ｇｌｃとはグルコースであり、ＮｅｕＡｃとはＮ−アセチルノイラミン酸である）。このように細胞から調製された糖鎖の水酸基やカルボキシル基への保護基の導入は、公知の保護基導入法に比べて過剰量の試薬を用いることによって達成される。たとえば、水酸基のベンジル基による保護は、糖鎖の１つの水酸基に対して５当量の水素化ナトリウムと５当量のベンジルブロミドとを反応させることによって達成される。
【００１４】
上記の方法で得られた本発明の式（Ｉ）のグリコシル化剤は、チオグリコシドやセレノグリコシドの活性化剤の存在下に、糖受容体とカップリングさせることによって複合糖質類へ導くことができる。活性化剤としては、例えばメチルトリフラート、臭化銅（ＩＩ）−臭化テトラブチルアンモニウム、Ｎ−ヨウ化コハク酸イミド−トリフルオロメタンスルホン酸、ヨードニウムジコリシン過塩素酸塩、ジメチルメチルチオスルホニウムトリフラートなどが利用できるが、好ましくは、Ｎ−ヨウ化コハク酸イミド−トリメチルシリルトリフラートが収率良く目的物を与える。糖受容体としては、エタノール、オクタノール、ドデカノールなどのアルコール類、３−Ｎ−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ、ｅｔｈｙｌ  ９−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎａｎｏａｔｅ、６−ａｚｉｄｏ−ｈｅｘａｎｏｌなどのタンパク質の導入に利用できるリンカー、２−（ｔｅｔｒａｄｅｃｙｌ）ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｌ、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−ａｚｉｄｏ−３−Ｏ−ｂｅｎｚｏｙｌ−４−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｅ−１，３−ｄｉｏｌなどの脂質を模した化合物などが挙げられる。
【実施例】
【００１５】
以下に記載する実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
［実施例１］グロボトリオースを有するグリコシル化剤の調製と、これを用いるグリコシル化。
【００１６】
１．  化学的手法によるグロボトリオースを有するグリコシル化剤の調製
１，２，３，６―テトラ―Ｏ―アセチル−４―Ｏ−（２，３，４，６―テトラ―Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノース、１．５０ｇ（２．２１ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下にジクロロメタン（１１ｍｌ）に溶解した。この反応液に氷冷下、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体０．６ｍｌ（４．７ｍｍｏｌ）を加え、室温に昇温して撹拌した。２時間３０分後、氷冷下にトリエチルアミン０．９２ｍｌ（６．６ｍｍｏｌ）を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を水洗したのち、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。抽出液をろ過、濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）にて精製し、式１に示すチオグリコシド誘導体（１）１．４８ｇ（収率８１％）を得た。
【化１】
2008260763.tif 000002
【００１７】
チオグリコシド誘導体（１）の物性値を示す。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：５．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），５．２１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２，１０．３Ｈｚ），４．９５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４，１０．４Ｈｚ）４．９３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），４．５０−４．４４（ｍ，２Ｈ），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），４．１５−４．０５（ｍ，３Ｈ），３．８９−３．８５（ｍ，１Ｈ），３．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），３．６３−３．５８（ｍ，１Ｈ），２．６７−２．５５（ｍ，２Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，６Ｈ），１．９７（ｓ，３Ｈ），１．４０−１．１９（ｍ，２０Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）．
【００１８】
チオグリコシド誘導体（１）１．４７ｇ（１．７９ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍｌ）に溶解し、氷冷下に２８％ナトリウムメトキシド（０．１ｍｌ）を加え、室温にて撹拌した。７時間後、析出した結晶をろ別し、減圧下に乾燥させた。この結晶７５２．５ｍｇをアルゴン雰囲気下にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５ｍｌ）に溶解し、ジメトキシプロパン０．３８ｍｌ（３．１ｍｍｏｌ）とＤｒｉｅｒｉｔｅ１．１４ｇを加えた。１時間３０分後、カンファ−スルホン酸１５０．３ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）を加え、８０度で撹拌した。６時間後、反応液をセライト（Ｎｏ．５４５）を用いてろ過し、ろ液を減圧下に濃縮した。残渣をアルゴン雰囲気下にピリジン（１４ｍｌ）に溶解し、氷冷下に塩化ベンゾイル２ｍｌ（１７ｍｍｏｌ）を加え、室温にて撹拌した。２０時間後、反応液に氷冷下メタノールを加え、溶媒を減圧下に除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製し、式２に示すチオグリコシド誘導体（２）を１．２４ｇ（収率８０％）得た。
【化２】
2008260763.tif 000003
【００１９】
チオグリコシド誘導体（２）の物性値を示す。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：８．１５−７．９０（ｍ，１０Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．６５−７．２４（ｍ．１５Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．７３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．１２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），４．６２−４．５７（ｍ，２Ｈ），４．４６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，１１．７Ｈｚ），４．２６−４．２１（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），４．０７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，５．５Ｈｚ），４．８６−４．７８（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６，１１．７Ｈｚ），２．６６−２．５４（ｍ，２Ｈ），１．６５−１．４１（ｍ，２Ｈ），１．３３−１．０７（ｍ，１８Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）．
【００２０】
チオグリコシド誘導体（２）１．２３ｇ（１．１４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２３ｍｌ）に溶解し、氷冷下に５０％トリフルオロ酢酸水溶液（４ｍｌ）を加え、室温で撹拌した。９時間後、氷冷下に炭酸水素ナトリウムを用いて反応液を中和し、クロロホルムで抽出した。有機層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。減圧下に溶媒を除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製した。得られた結晶をアルゴン雰囲気下にピリジン（１６ｍｌ）に溶解し−２０度に冷却した。この反応液に塩化ベンゾイル０．１２ｍｌ（１．０ｍｍｏｌ）を加え、０度で撹拌した。２０時間後、反応液にメタノールを加え、減圧下に溶媒を除去した。残渣をクロロホルムで抽出し、有機層を水洗したのち無水硫酸マグネシウムで乾燥した。抽出液をろ過、濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）にて精製し、式３に示すチオグリコシド誘導体（３）を７９６ｍｇ（収率６２％）得た。
【化３】
2008260763.tif 000004
【００２１】
チオグリコシド誘導体（３）の物性値を示す。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：８．０６−７．８８（ｍ，１２Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．６３−７．２３（ｍ，１８Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．７７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．６９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６，１０．３Ｈｚ），５．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４，１０．３Ｈｚ），４．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），４．６０−４．５５（ｍ，１Ｈ），４．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１２．４Ｈｚ），４．１８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），４．１１−４．０２（ｍ，２Ｈ），３．８６−３．８３（ｍ，１Ｈ），３．６８−３．６１（ｍ，２Ｈ），２．６９−２．５４（ｍ，２Ｈ），１．５９−１．４１（ｍ，２Ｈ），１．３３−１．０７（ｍ，１８Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）．
【００２２】
チオグリコシド誘導体（３）１３５ｍｇ（０．１１７ｍｍｏｌ）と２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルトリクロロイミデート１６０ｍｇ（０．２３３ｍｍｏｌ）とをアルゴン雰囲気下にジクロロメタン（３ｍｌ）とエーテル（６ｍｌ）に溶解した。この溶液にモレキュラーシーブ４Ａ１．０２ｇを加え、−５度で３時間撹拌した。この溶液にトリメチルシリルトリフラート０．０１４ｍｌ（０．０７７ｍｍｏｌ）を加え撹拌した。２時間後、トリエチルアミン０．２ｍｌ（１．４ｍｍｏｌ）を加え、反応液をセライト（Ｎｏ．５４５）にてろ過し、ろ液をクロロホルムで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥した。ろ過濃縮後、残渣を薄層シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）にて精製し、式４に示すグリコシル化剤（４）を８１．７ｍｇ（収率４２％）得た。
【化４】
2008260763.tif 000005
【００２３】
グリコシル化剤（４）の物性値を示す。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：８．０６−７．７７（ｍ，１２Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．６１−７．０３（ｍ，３８Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．８０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．７３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２，１１．０Ｈｚ），５．３８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．０２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，１１．０Ｈｚ），４．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），４．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），４．７３−４．６２（ｍ，４Ｈ），４．５８−４．５１（ｍ，３Ｈ），４．４７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１１．７Ｈｚ），４．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），４．２６−４．１３（ｍ，５Ｈ），４．０７−４．０４（ｍ，１Ｈ），３．９５−３．８２（ｍ，３Ｈ），３．９０−３．８５（ｍ，１Ｈ），３．３３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），２．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，８．９Ｈｚ），２．６５−２．５３（ｍ，２Ｈ），１．４３−１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３４−１．０６（ｍ，１８Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）．
【００２４】
２．細胞を用いたグロボトリオースを有するグリコシル化剤の調製
式５に示すグロボトリオース誘導体（５）２５．６ｍｇ（０．０３７２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）に溶解し、水素化ナトリウム７５．４ｍｇ（１．８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。この混合液にベンジルブロミド０．２ｍｌ（１．６８ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で２４時間撹拌した。反応混合物に氷冷下、メタノール（２ｍｌ）を加えた後、室温にて１時間撹拌した。減圧下に溶媒を除去し、薄層シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）にて精製し、式６に示すグロボトリオースを有するグリコシル化剤（６）１９．１ｍｇ（収率３２％）を得た。
【化５】
2008260763.tif 000006
【化６】
2008260763.tif 000007
【００２５】
以下に得られたグリコシル化剤（６）の物性値を示す。
ＨＲ  ＲＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（ｍ／ｚ）：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ100Ｈ116ＫＯ15Ｓ（Ｍ＋Ｋ）１６２７．７７，ｆｏｕｎｄ１６２８．１９．
【００２６】
３．グロボトリオースを有するグリコシル化剤を用いたグリコシル化
【００２７】
グロボトリオースを有するグリコシル化剤（６）１９．３ｍｇ（０．０１２１ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下においてジクロロメタン（１．５ｍｌ）に溶解し、この反応液にエタノール０．００７ｍｌ（０．１２ｍｍｏｌ）とモレキュラージーブス４Ａ（１５０ｍｇ）を加え、室温にて１時間撹拌した。この反応液に氷冷下、Ｎ−ヨウ化コハク酸イミド１５．８ｍｇ（０．０７０２ｍｍｏｌ）と６０ｍＭトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナート／ジクロロメタン溶液０．２ｍｌ（０．０１２１ｍｍｏｌ）を加えた。室温にて１時間撹拌した後、反応液にピリジン（０．１ｍｌ）と飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液（１ｍｌ）を加えた。セライト（Ｎｏ．５４５）を用いてろ過した後、クロロホルムにて抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。抽出液に無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥した後、減圧下に溶媒を除去し、薄層シリカゲルクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１２：１）にて精製し、式７に示すグロボトリオース誘導体（７）５．５ｍｇ（収率３２％）を得た。
【００２８】
【化７】
2008260763.tif 000008
【００２９】
以下に得られたグロボトリオース誘導体（７）の物性値を示す。
ＨＲ  ＲＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（ｍ／ｚ）：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ90Ｈ96ＮａＯ16（Ｍ＋Ｎａ）１４５５．６６，ｆｏｕｎｄ１４５５．３５．
【００３０】
［実施例２］  Ｇａｌβ１−６Ｇｌｃ骨格を有するグリコシル化剤の調製と、これを用いるグリコシル化。
１．  化学的手法によるＧａｌβ１−６Ｇｌｃ骨格を有するグリコシル化剤の調製
１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノース５４４ｍｇ（１．３９ｍｍｏｌ）と３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１０−ヘプタデカフルオロ−１−デカンチオール１．０ｇ（２．０８ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下にジクロロメタン（１４ｍｌ）に溶解した。この反応液に氷冷下、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体０．５４ｍｌ（４．２６ｍｍｏｌ）を加え、室温に昇温して攪拌した。８時間後、氷冷下にトリエチルアミン１．２ｍｌ（８．６ｍｍｏｌ）を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。抽出液をろ過、濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）にて精製し、式８に示すチオグリコシド誘導体（８）９４３ｍｇ（収率８４％）を得た。
【化８】
2008260763.tif 000009
【００３１】
チオグリコシド誘導体（８）の物性値を示す
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：５．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．０８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．０６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），４．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），４．２２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，１２．４Ｈｚ），４．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，１２．４Ｈｚ），３．７６−３．７１（ｍ，１Ｈ），３．０１−２．９４（ｍ，１Ｈ），２．８６−２．７８（ｍ，１Ｈ），２．５４−２．４３（ｍ，２Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ）．
【００３２】
チオグリコシド誘導体（８）２．０４ｇ（２．５１ｍｍｏｌ）をメタノール（３０ｍｌ）とテトラヒドロフラン（３０ｍｌ）に溶解した。この反応液に２８％ナトリウムメトキシド０．２ｍｌを加え、室温にて攪拌した。４．５時間後、反応液に陽イオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ−ＩＲ１２０（Ｈ+））を加えて中和し、ろ過、濃縮し、アモルファス状物質を１．５４ｇ得た。このアモルファス状物質をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２４ｍｌ）に溶解しクロロトリフェニルメタン７８１ｍｇ（２．８０ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン３３．４ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン０．５ｍｌ（３．５９ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。４８時間後、氷冷下にメタノールを加えた後、減圧下にて濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝６：１）にて精製し、アモルファス状物質２．５１ｇを得た。アルゴン雰囲気下、このアモルファス状物質にピリジン（２０ｍｌ）と塩化ベンゾイル２．５ｍｌ（２１．５ｍｍｏｌ）を加え室温にて攪拌した。１９時間後、氷冷下に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、０．５Ｎ塩酸水溶液、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液の順で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加え乾燥した。抽出液をろ過、濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１５：１）にて精製し、式９に示すチオグリコシド誘導体（９）２．０３ｇ（収率７１％）を得た。
【化９】
2008260763.tif 000010
【００３３】
チオグリコシド誘導体（９）の物性値を示す
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：８．１２−７．６６（ｍ，６Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．５８−７．１４（ｍ，２４Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．８２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．６４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．５６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），４．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），３．９３−３．８７（ｍ，１Ｈ），３．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，１１．０Ｈｚ），３．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１１．０Ｈｚ），３．１５−３．０６（ｍ，１Ｈ），３．０４−２．９６（ｍ，１Ｈ），２．５７−２．４４（ｍ，２Ｈ）．
【００３４】
チオグリコシド誘導体（９）２．０３ｇ（１．７０ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１２ｍｌ）とメタノール（６ｍｌ）に溶解した。この反応液にカンファースルホン酸３．９４ｇ（１７．０ｍｍｏｌ）と塩化リチウム３６０ｍｇ（８．５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。２５時間後、反応液をクロロホルムで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥した。抽出液をろ過、濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝８：１）にて精製し、式１０に示すチオグリコシド誘導体（１０）１．４８ｇ（収率９１％）を得た。
【化１０】
2008260763.tif 000011
【００３５】
チオグリコシド誘導体（１０）の物性値を示す
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：８．０２−７．２２（ｍ，１５Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．９８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．５５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．５１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），４．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），３．９０−３．８１（ｍ，２Ｈ），３．７６−３．７２（ｍ，１Ｈ），３．０９−３．０２（ｍ，１Ｈ），２．９９−２．９１（ｍ，１Ｈ），２．５７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，８．２），２．５５−２．４２（ｍ，２Ｈ）．
【００３６】
チオグリコシド誘導体（１０）７２．７ｍｇ（０．０７６２ｍｍｏｌ）と２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチルガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート４５．９ｍｇ（０．０９３２ｍｍｏｌ）にアルゴン雰囲気下、ジクロロメタン（３ｍｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ（４１４ｍｇ）を加えマイナス４０度に冷却した。この反応液にトリメチルシリルトリフラート３μｌを加え攪拌した。１．５時間後、トリエチルアミン０．０５ｍｌ（０．３５９ｍｍｏｌ）を加え、反応液をセライトにてろ過し、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。抽出液をろ過、濃縮後、残渣を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２．５：１）にて精製し、式１１に示すＧａｌβ１−６Ｇｌｃ骨格を有するグリコシル化剤（１１）７５．２ｍｇ（収率７７％）を得た。
【化１１】
2008260763.tif 000012
【００３７】
Ｇａｌβ１−６Ｇｌｃ骨格を有するグリコシル化剤（１１）の物性値を示す
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：８．００−７．２２（ｍ，１５Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．８８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．５１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．４１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．３８−５．３５（ｍ，１Ｈ），５．２１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２，１０．６Ｈｚ），４．９９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４，１０．６Ｈｚ），４．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），４．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），４．１１−４．０１（ｍ，３Ｈ），４．８８−４．８４（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１１．０Ｈｚ），３．１０−２．９２（ｍ，２Ｈ），２．５５−２．４０（ｍ，２Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），１．９８（ｓ，３Ｈ），１．９７（ｓ，３Ｈ）．
【００３８】
２．  Ｇａｌβ１−６Ｇｌｃ骨格を有するグリコシル化剤を用いたグリコシル化
Ｇａｌβ１−６Ｇｌｃ骨格を有するグリコシル化剤（１１）６１ｍｇ（０．０４７５ｍｍｏｌ）とメチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−グルコピラノシド２９．１ｍｇ（０．０５７５ｍｍｏｌ）にアルゴン雰囲気下、１，２−ジクロロエタン（３ｍｌ）とモレキュラーシーブス４Ａ（４２０ｍｇ）を加えた。反応液をマイナス２０度に冷却し、ブロモコハク酸イミド１９．４ｍｇ（０．１０９ｍｍｏｌ）とトリメチルシリルトリフラート２μｌ（０．０１１ｍｍｏｌ）を加え、攪拌した。反応温度を室温まで徐々に昇温し、２２時間後、セライトにてろ過し、ろ液をクロロホルムで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。抽出液をろ過、濃縮後、残渣を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：３）にて精製し、式１２に示すオリゴ糖誘導体（１１）５１．７ｍｇ（収率９２％）を得た。
【化１２】
2008260763.tif 000013
【００３９】
オリゴ糖誘導体（１２）の物性値を示す
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：８．１７−７．１３（ｍ，３０Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．０８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．８５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．４５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２，９．６Ｈｚ），５．４２−５．３５（ｍ，２Ｈ），５．３２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．２１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２，１０．３Ｈｚ），５．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，９．６Ｈｚ），５．０８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４，１０．３Ｈｚ），４．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），４．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），４．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），４．２３−４．１７（ｍ，１Ｈ），４．１６−４．１２（ｍ，１Ｈ），４．０７−４．０３（ｍ，２Ｈ），４．０２−３．９５（ｍ，２Ｈ），５．９１−５．８６（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６，１１．７Ｈｚ），３．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１１．７Ｈｚ），３．０８（ｓ，３Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），１．９８（ｓ，３Ｈ），１．９７（ｓ，３Ｈ）．
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明である、ヒト型オリゴ糖鎖を有するグリコシル化剤が、医薬品や食品添加物、化粧品、高分子モノマー機能性材料、医療材料などの製造を容易にすることは確実である。とりわけ、従来は困難であったヒト型オリゴ糖を有する複合糖質類の調製を簡便にすることから、産業的価値やその波及効果は極めて大きい。