(57)【要約】【課題】炎症性腸疾患に対する治療又は予防効果に優れ、かつ副作用の少ない医薬組成物を提供すること。【解決手段】炎症性腸疾患の治療又は予防のための医薬組成物であって、下記一般式（１）で表される化合物及びその医薬的に許容され得る塩の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬組成物である。【化７】2008056591.tif 000010ただし、前記一般式（１）中、Ｒは、水素原子及び水溶性基のいずれかを表す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性腸疾患の治療又は予防のための医薬組成物であって、下記一般式（１）で表される化合物及びその医薬的に許容され得る塩の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬組成物。
【化１】
2008056591.tif 000009
ただし、前記一般式（１）中、Ｒは、水素原子及び水溶性基のいずれかを表す。
【請求項２】
一般式（１）中、Ｒが水溶性基を表す請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
水溶性基が、プロリン及びその医薬的に許容され得る塩の少なくともいずれかを含有する請求項２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患の治療又は予防のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ：ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、大腸や小腸の粘膜に慢性の炎症又は潰瘍を引き起こす原因不明の疾患の総称であり、主に潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管ベーチェット病に代表される。
炎症性腸疾患の発症の原因は未だ不明であるが、特定の抗原に対する免疫機構の異常な活性化が原因の一つではないかと推測されている。特定の抗原にさらされることにより、インターロイキン（ＩＬ）−１β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインや、ロイコトリエン（ＬＴ）Ｂ４、トロンボキサン（ＴＸ）Ａ２、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２等の化学メディエーターなどが放出され、これらの一連の反応の結果、腸粘膜に炎症が引き起こされる。更にこのような腸粘膜の炎症が持続し、腸の組織障害が起こるものと考えられている。
潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病はいずれも厚生労働省の特定疾患に指定されており、患者数は増加する傾向にあるが、これらの炎症性腸疾患を根本的に治すことのできる治療法は未だ見出されていない。このため、炎症性腸疾患に対する有効な治療法の開発は、大きな課題となっている。
【０００３】
炎症性腸疾患に対する現在の内科的治療法としては、栄養療法や薬物療法を組み合わせることが多く、中でも、薬物療法には、５−アミノサリチル酸製剤、ステロイド剤、免疫抑制剤などが用いられている（例えば、非特許文献１参照）。
前記５−アミノサリチル酸製剤としては、サラゾスルファピリジン（製品名サラゾピリン）やメサラジン（製品名ペンタサ）などが挙げられ、中でもメサラジンは、サラゾスルファピリジンからスルファピリジンを取り除き、有効成分５−アミノサリチル酸を取り出したもので、比較的副作用が少ないとされている。しかしながら、前記５−アミノサリチル酸製剤は、炎症を一時的に抑制することができるものの、積極的に炎症性腸疾患の治癒を促進できるものではなく、使用を止めると再び発症してしまう恐れがあるという問題がある。また、前記ステロイド剤や前記免疫抑制剤にも、炎症活性を効果的に抑制することができる一方で、長期的使用による副作用の問題がある（例えば、非特許文献２〜４参照）。
したがって、炎症性腸疾患に対する治療又は予防効果に優れ、かつ副作用の少ない医薬組成物の開発が強く望まれている。
【０００４】
【非特許文献１】ＳＡＮＤＳ，Ｂ．Ｅ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０００；１１８  Ｓ６８−Ｓ８２．
【非特許文献２】Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｏ，Ｓｔｅｉｎ  Ｊ．Ｌｏｗ  ｄｏｓｅ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００３；９８：５３０−３７．
【非特許文献３】Ｈｏｌｔｍａｎｎ  ＭＨ，Ｇａｌｌｅ  ＰＲ，Ｎｅｕｒａｔｈ  ＭＦ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００１；１：４５５−６６．
【非特許文献４】Ｒａｍｐｔｏｎ  ＤＳ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｗｈｅｒｅ  ａｒｅ  ｗｅ  ｎｏｗ？  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０００；６：３１５−２３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、炎症性腸疾患に対する治療又は予防効果に優れた医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、後述する一般式（１）で表される化合物及びその医薬的に許容され得る塩の少なくともいずれかを含有する医薬組成物が、炎症性腸疾患モデルマウスに対する優れた治療又は予防効果を奏するという知見である。
従来から、一般式（１）で表される化合物の一種であり、前記一般式（１）中のＲが水素原子である化合物、ＥＧ−６２６（フタラジノール）は、動脈硬化予防作用、血小板凝集抑制作用等を有することが知られており、動脈硬化性疾患、血栓性疾患等の治療又は予防への利用が期待されていた（例えば、特開昭５０−７０３７８号公報、特開昭５０−７０３８０号公報参照）。
しかしながら、前記一般式（１）で表される化合物及びその医薬的に許容され得る塩の少なくともいずれかが、炎症性腸疾患に対する治療又は予防効果に優れ、そのため、優れた炎症性腸疾患用医薬組成物として利用できることは従来全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。
【０００７】
したがって、本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  炎症性腸疾患の治療又は予防のための医薬組成物であって、下記一般式（１）で表される化合物及びその医薬的に許容され得る塩の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬組成物である。
【化２】
2008056591.tif 000002
ただし、前記一般式（１）中、Ｒは、水素原子及び水溶性基のいずれかを表す。
＜２＞  一般式（１）中、Ｒが水溶性基を表す前記＜１＞に記載の医薬組成物である。
＜３＞  水溶性基が、プロリン及びその医薬的に許容され得る塩の少なくともいずれかを含有する前記＜２＞に記載の医薬組成物である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、炎症性腸疾患に対する治療又は予防効果に優れた医薬組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（医薬組成物）
本発明の医薬組成物は、炎症性腸疾患の治療又は予防のための医薬組成物であり、下記一般式（１）で表される化合物及びその医薬的に許容され得る塩の少なくともいずれか（一般式（１）で表される化合物及び／又はその医薬的に許容され得る塩）を含有しており、更に必要に応じて適宜その他の成分を含有している。
【００１０】
【化３】
2008056591.tif 000003
【００１１】
＜化合物＞
前記一般式（１）中、Ｒは、水素原子及び水溶性基のいずれかを表す。中でも、Ｒは水溶性基であることが好ましい。Ｒが水溶性基であると、前記化合物の水に対する溶解度が改善され、生体に投与した場合に血中濃度を容易に上昇させることができることから、経口吸収が良好となり、更に、注射剤や坐剤としても好適に使用することができる点で、有利である。
前記水溶性基としては、前記化合物に水溶性を付与できるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プロリン、リジン、グリシン、アラニン等のアミノ酸や、糖類などが挙げられる。中でも、水溶液中での安定性に優れる点で、前記水溶性基としては、プロリン、リジンが好ましく、プロリンが特に好ましい。また、前記水溶性基としては、前記した各種水溶性基の医薬的に許容され得る塩であってもよい。
【００１２】
＜塩＞
前記医薬的に許容され得る塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、無機塩及び有機塩のいずれかが挙げられ、より具体的には、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩などが挙げられる。
【００１３】
＜具体例＞
また、前記一般式（１）で表される化合物及び／又はその医薬的に許容され得る塩の具体例としては、下記構造式（２）で表される化合物（Ｒ：プロリン、塩酸塩）が、特に好ましい。
【００１４】
【化４】
2008056591.tif 000004
【００１５】
前記構造式（２）で表される化合物は、ＳＨＩ−２１９とも称される。前記ＳＨＩ−２１９は、水に対する溶解度が高く、生体に投与した場合に血中濃度が容易に上昇することから、経口吸収が良好であり、更に、注射剤や坐剤としても好適に使用することができる点で、優れている。また、前記ＳＨＩ−２１９は、水溶液中での安定性にも優れる。
なお、前記ＳＨＩ−２１９は、生体内で、下記構造式（３）で表される化合物（ＥＧ−６２６：フタラジノール）に変換されることにより、炎症性腸疾患の治療又は予防効果を奏していると考えられる。即ち、前記ＳＨＩ−２１９は、下記構造式（３）で表される化合物（ＥＧ−６２６：フタラジノール）のプロドラッグであるということができる。
【００１６】
【化５】
2008056591.tif 000005
【００１７】
前記構造式（３）で表される化合物は、前記一般式（１）中のＲが水素原子である化合物であり、該化合物は、ＥＧ−６２６（フタラジノール）とも称される。前記ＥＧ−６２６の構造が、前記医薬組成物の有効成分であると考えられる。
【００１８】
＜製造＞
前記一般式（１）で表される化合物及び／又はその医薬的に許容され得る塩の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜製造することができ、例えば、特開昭５０−７０３７８号公報、特開昭５０−７０３８０号公報、特開昭５８−１１６４７１号公報の記載を参照し、製造することができる。
より具体的には、例えば、前記構造式（２）で表される化合物（ＳＨＩ−２１９）は、前記構造式（３）で表される化合物（ＥＧ−６２６）を、触媒量のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）存在下、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）でＮ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−プロリンと縮合させ、次いで保護基を除去することにより得ることができる。
【００１９】
前記医薬組成物中、前記一般式（１）で表される化合物及び／又はその医薬的に許容され得る塩の含有量としては、特に制限はなく、例えば、後述する前記医薬組成物の剤型や、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
また、前記医薬組成物は、前記一般式（１）で表される化合物及び／又はその医薬的に許容され得る塩そのものであってもよい。
【００２０】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、後述する前記医薬組成物の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬組成物中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２１】
＜剤型＞
前記医薬組成物の剤型としては、特に制限はなく、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、坐剤などが挙げられる。
【００２２】
前記経口固形剤としては、例えば、前記一般式（１）で表される化合物及び／又はその医薬的に許容され得る塩に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００２３】
前記経口液剤としては、例えば、前記一般式（１）で表される化合物及び／又はその医薬的に許容され得る塩に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００２４】
前記注射剤としては、例えば、前記一般式（１）で表される化合物及び／又はその医薬的に許容され得る塩に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００２５】
前記坐剤としては、例えば、前記一般式（１）で表される化合物及び／又はその医薬的に許容され得る塩に、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリド等の公知の坐剤製剤用担体と、必要に応じてツイーン（ＴＷＥＥＮ：登録商標）等の界面活性剤などを加えた後、常法により製造することができる。
【００２６】
＜対象疾患＞
前記医薬組成物の治療又は予防対象となる炎症性腸疾患としては、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管ベーチェット病などが挙げられる。中でも、前記医薬組成物は、潰瘍性大腸炎、クローン病に特に好適である。
【００２７】
＜投与＞
前記医薬組成物は、例えば、前記炎症性腸疾患の患者に投与することにより使用することができる。
前記医薬組成物の投与対象動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サルなどが挙げられる。
また、前記医薬組成物の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬組成物の剤型等に応じ、適宜選択することができ、経口投与、注射による投与、直腸投与などが挙げられる。
また、前記医薬組成物の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、ヒト成人への１日の投与あたり、前記一般式（１）で表される化合物及び／又はその医薬的に許容され得る塩の量として、１０〜５００ｍｇ／ｋｇ体重が好ましく、２０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重がより好ましい。
また、前記医薬組成物の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２８】
＜効果＞
前記医薬組成物は、炎症性腸疾患の治療又は予防効果に優れるので、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管ベーチェット病等の各種炎症性腸疾患の患者への適用に好適であり、中でも、潰瘍性大腸炎、クローン病の患者への適用に特に好適である。また、前記ＥＧ−６２６の他疾患用途（動脈硬化性疾患、血栓性疾患用途）に関する既存の基礎研究及び臨床治験結果等から、前記一般式（１）で表される化合物は副作用の可能性が低いことが推測され、したがって、前記医薬組成物は、安全性の高い点でも有利であると考えられる。
なお、前記医薬組成物が炎症性腸疾患の治療又は予防効果に優れることは、例えば、炎症性腸疾患マウスモデル等を利用し、前記医薬組成物の投与による各症状の緩和度合いを組織学的、生化学的に検討することにより確認することができる。
【実施例】
【００２９】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１：ＳＨＩ−２１９投与による炎症性腸疾患モデルマウスの症状改善）
−炎症性腸疾患モデルマウスの作製と薬物投与−
平均体重２０ｇの６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本エスエルシー株式会社）を各群５匹ずつ用い、自由摂食下で、正常群には蒸留水を７日間自由飲水させ、対照群とＳＨＩ−２１９投与群には５質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）水溶液を７日間自由飲水させた。更にＳＨＩ−２１９投与群には、ＳＨＩ−２１９（２ｍｇ若しくは０．５ｍｇ／０．３ｍｌの蒸留水／マウス）を７日間連続で１日１回腹腔内に注入した。各マウスについて、以下の各項目を評価した。
【００３１】
［血液学的検査］
投与開始後７日目に、屠殺直前に麻酔下で心臓から血液を採取し、血液学的検査の定法に従って白血球数とヘモグロビン濃度を測定した。
【００３２】
［症状活性度指数（ＤＡＩ：Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ）］
症状活性度指数は、投与開始後７日目のマウスの状態を、以下に示す基準に従って各スコアに分類し、各群のマウスの平均値を求めた。結果を表１に示す。
［スコア分類基準］
スコア  ０：体重減少は無く、便の状態は正常（ペレット状）で、潜血や出血が無い。
スコア  １：１〜５質量％の体重減少があり、便の状態は正常（ペレット状）で、潜血や出血が無い。
スコア  ２：５〜１０質量％の体重減少があり、便は緩くペースト状だが肛門には付着していない状態。
スコア  ３：１１〜１５質量％の体重減少があり、便は緩くペースト状だが肛門には付着していない状態。
スコア  ４：１５質量％を超える体重減少があり、便の状態は下痢状態であり、肉眼で確認できる出血がある。
【００３３】
［病理学的検査：大腸の長さと組織学的障害スコア］
投与開始後７日目に麻酔下で屠殺後、直ちに摘出した大腸の長さを定規で計測した。摘出した大腸は、縦軸にそって切開し、半分（残り半分は、後述する実施例２以降で使用）を、組織学的な障害度評価のために１０％のホルマリン中性緩衝液で固定し、４ｍｍ角の切片をヘマトキシリンとエオジンで染色し、１００倍の顕微鏡下で検定した。切片ごとに１５視野を選択し、各視野について、以下の基準に従い、第３者によるグレード分類を実施し、その平均値を求めた。結果を表１に示す。
［グレード分類基準］
グレード  ０：正常な腸管粘膜。
グレード  １：およそ１／３程度の陰窩（ｃｒｙｐｔ）が消失。
グレード  ２：およそ２／３程度の陰窩（ｃｒｙｐｔ）が消失。
グレード  ３：粘膜固有層が一層の上皮に覆われ、わずかな炎症性細胞の浸潤がある。
グレード  ４：糜爛（びらん）と顕著な炎症性細胞の浸潤がある。
【００３４】
【表１】
2008056591.tif 000006
【００３５】
表１の結果から、ＳＨＩ−２１９投与群の各症状は、対照群（ＤＳＳ投与群）に比べ、顕著に改善されていることがわかる。
具体的には、生活状態の指標である症状活性度指数（ＤＡＩ）では、対照群の全てに鮮血の混じった下痢便、体重減少、貧血が見られたのに対して、ＳＨＩ−２１９投与群には鮮血便は見られず、便形成も改善され、体重減少も軽度であった。また、血液学的な指標として、白血球数と貧血状態を調べた。炎症が起きると白血球数が増加することが予想されるが、対照群に比べてＳＨＩ−２１９投与群の白血球数は少なかった。下痢により出血すると貧血を引き起こすため、対照群のヘモグロビン濃度は正常群の約６５％濃度まで低下していたが、ＳＨＩ−２１９投与群は正常群の約７３％濃度で、対照群よりも高かった。また、病理学的には炎症時の大腸の長さは短縮傾向がみられる。対照群では大腸の長さは著しく短縮していたが、ＳＨＩ−２１９投与群の大腸の長さは正常群よりは短いものの対照群と比べて有意に長いことがわかる。また、組織学的障害スコアについても、ＳＨＩ−２１９投与群では、対照群に比べ顕著に低いことがわかる。
以上の結果から、ＳＨＩ−２１９が、マウスの炎症性腸疾患の症状改善に有効であることが示された。
【００３６】
（実施例２：ＳＨＩ−２１９投与による結腸粘膜内のミエロ過酸化酵素（ＭＰＯ）活性の変化）
実施例１における投与開始後７日目の各群５匹のマウスから採取した大腸近位部の組織を、ホモジナイズ後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）と過酸化水素水を加えて室温で１５分間インキュベートし、６３０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、組織ホモジネートの蛋白質含有量を、市販の蛋白質アッセーキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で測定し、得られた６３０ｎｍの吸光度（Ａ）を、蛋白質含有量に基づいて定量化した。
最初の測定時に、ヒトのＭＰＯをグアイアコール法により調べ、標準値とした。標準値に基づいて、測定した吸光度（Ａ）を、以下の式によりＭＰＯ活性（ｍＵ／ｍｇ蛋白）に換算した。結果を図１に示す。
［式］
ＭＰＯ活性＝［Ａ／蛋白質濃度（ｍｇ／ｍｌ）］×１．６
【００３７】
図１の結果から、対照群（ＤＳＳ投与群）では、明らかにＭＰＯ活性（０．６７１±０．０８９ｍＵ／ｍｇ）が正常群の２倍近くまで上昇したのに対し、ＳＨＩ−２１９投与群（２ｍｇ或いは０．５ｍｇ）では、ＭＰＯ活性は上昇しなかったことがわかる。したがって、この結果から、ＳＨＩ−２１９が、白血球に起因する炎症を有意に抑制する作用を有していることが示された。
【００３８】
（実施例３：ＳＨＩ−２１９投与による結腸粘膜内の炎症性サイトカイン量の変化）
実施例１における投与開始後７日目の各群のマウスから採取し、ホモジナイズした直腸組織のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αの濃度を、製造物取り扱い手順（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ’ｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）に従って、ＥＬＩＳＡ法により測定した。簡潔に記すと、ビオチン処理した抗体試薬を９６穴プレートに分注し、そこにホモジナイズした直腸組織の上澄み液を加えて、５％の炭酸ガス雰囲気下、３７℃で２時間インキュベートした。ウシ血清で洗った後、ストレプトアビジン過酸化酵素（ＨＲＰ）溶液を加え、室温で更に３０分インキュベートした後、５９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。総蛋白濃度はＬｏｗｒｙ法により決定し、吸光度を蛋白質のｍｇ単位量に換算した。結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
2008056591.tif 000007
【００４０】
表２の結果から、対照群（ＤＳＳ投与群）は、正常群（非投与群）に比べて著しく粘膜内の炎症性サイトカイン濃度が上昇したのに対し、ＳＨＩ−２１９投与（２ｍｇ或いは０．５ｍｇ）により、局所的なサイトカイン濃度の上昇が有意に抑制されたことがわかる。したがって、この結果から、ＳＨＩ−２１９が抗炎症作用を有していることが示された。
【００４１】
（実施例４：ＳＨＩ−２１９投与による結腸粘膜内のアラキドン酸代謝物レベルの変化）
実施例１における投与開始後７日目の各群５匹のマウスの大腸近位部の組織を採取し、酢酸エチル中でホモジナイズ後に上澄み液を集め、市販の特異的ＥＬＩＳＡキットを用いて、ＴＸＢ２（ＴＸＡ２の安定代謝物）、ＬＴＢ４、ＰＧＥ２レベルを前記製造物取り扱い手順に従って測定し、組織のｍｇ単位量に換算した。結果を図２Ａ〜Ｃに示す。
【００４２】
図２Ａ〜Ｃの結果から、対照群（ＤＳＳ投与群）では、アラキドン酸に由来する炎症因子であるＰＧＥ２、ＬＴＢ４、ＴＸＡ２の安定代謝物であるＴＸＢ２のレベルは正常群の約２倍に上昇するが、ＳＨＩ−２１９投与により、ＰＧＥ２のレベル上昇は緩やかに、ＬＴＢ４やＴＸＢ２のレベル上昇は顕著に抑制されることが確認された。
【００４３】
（実施例５：ＳＨＩ−２１９投与による結腸粘膜内のＣＯＸ−２発現確認）
実施例１における投与開始後７日目のマウスを屠殺し、直腸組織の標本を抗マウスＣＯＸ−２多クロナール抗体で染色した。簡潔に記すと、４℃の３．３％のホルマリン牛血清溶液中に切片を一夜浸して固定し、ＯＣＴ化合物に埋没した。埋没した試料を液体窒素で急速凍結し、４ミクロンの連続切片を作成した。空気中で乾燥した試料をアセトンで１５分間固定し、内因性の過酸化酵素を阻害するために５０％メタノール中の０．３％過酸化水素で１５分室温処理した。非特異的な結合は２％の牛血清アルブミン処理により防ぎ、組織を４℃の２０ｍｇ／ｍｌのビオチン処理した抗マウスＣＯＸ−２単クロナール抗体と共に一夜インキュベートした後、室温で２０分間アビジン−ビオチン過酸化酵素複合体をインキュベートした。牛血清で洗った後、組織を、０．００３％過酸化水素を含んだ０．３％の３，３−ジアミノベンジジン四塩酸塩中でインキュベートした。全ての切片をＭａｙｅｒのヘマトキシリンで逆染色した。顕微鏡下４００倍拡大の結果を図３に示す。
【００４４】
図３の結果から、正常群では全くＣＯＸ−２が発現しなかったが（図３ａ）、対照群（ＤＳＳ投与群）（図３ｂ）とＳＨＩ−２１９投与群（図３ｃ）では、炎症が見られた細胞の周りにＣＯＸ−２が発現していることが確認された。このことから、ＳＨＩ−２１９はＣＯＸ−２の発現を阻害しないことが確認され、ＳＨＩ−２１９は、ステロイドやＣＯＸ阻害薬とは異なる抗炎症の作用機序を持つことが示唆された。
【００４５】
（参考例１：ＳＨＩ−２１９及びＥＧ−６２６投与後の、ＥＧ−６２６の血中濃度確認）
本参考例１では、前記一般式（１）で表される化合物である、ＳＨＩ−２１９或いはＥＧ−６２６を十二指腸内に投与後に、血中に出現するＥＧ−６２６の血中濃度の違いを確認した。
麻酔下の体重３．７〜４．３ｋｇの家兎に、ＳＨＩ−２１９の生理食塩水溶液を７４．６ｍｇ／ｋｇ／５ｍｌ（３匹）又は１４．９ｍｇ／ｋｇ／５ｍｌ（３匹）の用量で、或いは、体重２．３〜３．５ｋｇの家兎（４匹）にＥＧ−６２６のカルボキシメチルセルロース(ＣＭＣ)懸濁液を５０ｍｇ／ｋｇ／５ｍｌの用量で、十二指腸内に投与し、経時的に一側頚動脈より約２ｍｌの血液をヘパリン採血した。遠心分離後、血清を各０．５ｍｌずつの試料ＡとＢの２つに分割した。各々に、下記構造式（４）で示される定量用内部標準物質の酢酸エチル溶液を２μｇ／２０μｌずつ加えた。血清を酢酸エチル１ｍｌで３回抽出し、酢酸エチル層を集め、水０．５ｍｌで洗った後、酢酸エチル層を濃縮した。測定５分前にメタノールを２０μｌずつ加え、μＣ１８ボンダパックカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーにより６０％メタノール／水系の溶離液で分離した成分の２９４ｎｍの吸光度を求め、試料ＡとＢから得られた定量値を加えて、血清１ｍｌ中のＥＧ−６２６の含有量を定量した結果を図４に示す。
【００４６】
【化６】
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【００４７】
ＳＨＩ−２１９は、ＥＧ−６２６と天然型Ｌ−プロリンの縮合物であり、ＳＨＩ−２１９分子中のＥＧ−６２６の割合は６７質量％に相当する。ＥＧ−６２６の２０℃の水に対する溶解度は０．０２％だが、ＳＨＩ−２１９の２０℃の水に対する溶解度は５０％を超える。
図４の結果から、ＳＨＩ−２１９は７４．６ｍｇ／ｋｇの投与量で投与直後から血中濃度が飛躍的に増加したのに対して、ＥＧ−６２６は５０ｍｇ／ｋｇ（上記ＳＨＩ−２１９中のＥＧ−６２６の割合に相当する量）を投与しても血中濃度の上昇は低く、ＳＨＩ−２１９を１４．９ｍｇ／ｋｇ（ＥＧ−６２６の１／５当量に相当する量）投与した場合とほぼ同程度の血中濃度にしか達しないことが確認された。したがって、ＳＨＩ−２１９は消化管吸収が良好で、血中濃度が上昇し易いという点で優れており、しかも、水中では安定なＳＨＩ−２１９が血中では速やかにＥＧ−６２６へ変換されることが確認されたことで、例えば、経口剤や坐剤はもとより、注射剤としても、本発明の医薬組成物に、より好適な化合物であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の医薬組成物は、炎症性腸疾患の治療又は予防効果に優れるので、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管ベーチェット病等の各種炎症性腸疾患の患者への適用に好適であり、中でも、潰瘍性大腸炎、クローン病の患者への適用に特に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ＳＨＩ−２１９投与による、結腸粘膜内のミエロ過酸化酵素（ＭＰＯ）活性の変化を示したグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、ＳＨＩ−２１９投与による、結腸粘膜内のＴＸＢ２レベル（ｐｇ／ｍｇ）の変化を示したグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＳＨＩ−２１９投与による、結腸粘膜内のＬＴＢ４レベル（ｐｇ／ｍｇ）の変化を示したグラフである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＳＨＩ−２１９投与による、結腸粘膜内のＰＧＥ２レベル（ｐｇ／ｍｇ）の変化を示したグラフである。
【図３】図３は、ＳＨＩ−２１９投与による、結腸粘膜内のＣＯＸ−２発現の変化の有無を示した組織染色像である。
【図４】図４は、ＳＨＩ−２１９とＥＧ−６２６の血中濃度の違いを示したグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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