(57)【要約】      （修正有）【課題】糖新生関連遺伝子の転写因子のリン酸化阻害方法およびリン酸化阻害剤を提供する。【解決手段】転写因子であるヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）がＲＳＫＢによりリン酸化され、糖新生関連遺伝子のプロモーター領域への結合を促進させることを見出し、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化方法；リン酸化阻害方法；リン酸化阻害剤；ＨＮＦ−４αが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物産生阻害剤および産生阻害方法；ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化に起因する疾患の防止剤および／または治療剤並びに防止方法および／または治療方法；ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害する化合物の同定方法；該同定方法で得られた化合物；さらに、ＲＳＫＢ、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターを含んでなる試薬キットを提供した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）とヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）を相互作用を可能にする条件下で共存させることを特徴とする、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化方法。
【請求項２】
リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）の活性を阻害することを特徴とする、ＲＫＳＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）のリン酸化阻害方法。
【請求項３】
リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）とヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）との相互作用を阻害することを特徴とする、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害方法。
【請求項４】
少なくともリボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）とヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）とを発現している細胞を、ＲＳＫＢ活性の阻害剤で処理することを特徴とするＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害方法。
【請求項５】
リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）活性の阻害剤が、ＲＳＫＢを認識する抗体、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）を認識する抗体から選ばれる１つまたは２つ以上の抗体である請求項４に記載のＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害方法。
【請求項６】
リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）活性の阻害剤を有効量含むことを特徴とするＲＳＫＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）のリン酸化阻害剤。
【請求項７】
リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）とヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）との相互作用を阻害することを特徴とする、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤。
【請求項８】
リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）活性を阻害することを特徴とする、ＲＳＫＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）のリン酸化阻害剤。
【請求項９】
リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）活性の阻害剤が、ＲＳＫＢを認識する抗体、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）を認識する抗体から選ばれる１つまたは２つ以上の抗体である請求項８に記載のＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤。
【請求項１０】
ヘパトサイトヌクレアーファクター４αをリボソームＳ６キナーゼＢを用いてリン酸化することを特徴とする、糖新生関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法。
【請求項１１】
糖新生関連遺伝子がホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子である請求項１０に記載の糖新生関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法。
【請求項１２】
リボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化を阻害することを特徴とする、糖新生関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法。
【請求項１３】
リボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化を阻害することを特徴とする、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法。
【請求項１４】
請求項２から５のいずれか１項に記載のリン酸化阻害方法を用いることを特徴とする、糖新生関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法。
【請求項１５】
請求項２から５のいずれか１項に記載のリン酸化阻害方法を用いることを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４αが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法。
【請求項１６】
請求項２から５のいずれか１項に記載のリン酸化阻害方法を用いることを特徴とする、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法。
【請求項１７】
請求項２から５のいずれか１項に記載のリン酸化阻害方法を用いることを特徴とする、リボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項１８】
請求項２から５のいずれか１項に記載のリン酸化阻害方法を用いることを特徴とする、糖新生関連遺伝子の遺伝子産物の増加に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項１９】
請求項２から５のいずれか１項に記載のリン酸化阻害方法を用いることを特徴とする、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子の遺伝子産物の増加に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項２０】
請求項２から５のいずれか１項に記載のリボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化阻害方法を用いることを特徴とする、糖尿病の防止方法および／または治療方法。
【請求項２１】
請求項６から９のいずれか１項に記載のリボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化阻害剤および／またはＲＳＫＢ活性の阻害剤を用いることを特徴とする、糖尿病の防止方法および／または治療方法。
【請求項２２】
請求項６から９のいずれか１項に記載のリボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化阻害剤および／またはＲＳＫＢ活性の阻害剤を有効量含んでなる、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子の遺伝子産物の産生阻害剤。
【請求項２３】
請求項６から９のいずれか１項に記載のリボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化阻害剤および／またはＲＳＫＢ活性の阻害剤を有効量含んでなる医薬組成物。
【請求項２４】
請求項６から９のいずれか１項に記載のリボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化阻害剤および／またはＲＳＫＢ活性の阻害剤を有効量含んでなる、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子の遺伝子産物の増加に起因する疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項２５】
請求項６から９のいずれか１項に記載のリボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化阻害剤および／またはＲＳＫＢ活性の阻害剤を有効量含んでなる、糖尿病の防止剤および／または治療剤。
【請求項２６】
リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）とヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）の相互作用を阻害する化合物の同定方法であって、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を可能にする条件下、ＲＳＫＢおよび／またはＨＮＦ−４αと被検化合物を接触させ、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、被検化合物がＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を阻害するか否かを決定する同定方法。
【請求項２７】
リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）によるヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を可能にする条件下、ＲＳＫＢおよび／またはＨＮＦ−４αと被検化合物を接触させ、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、被検化合物がＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害するか否かを決定する同定方法。
【請求項２８】
リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）、ＲＳＫＢをコードするポリヌクレオチドおよびＲＳＫＢをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうち少なくともいずれか１つと、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）、ＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドおよび該ＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つを含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４α、以下ＨＮＦ−４αと略称する。）のリン酸化方法、リン酸化剤、リン酸化阻害方法およびリン酸化阻害剤に関する。より具体的にはリボソームＳ６キナーゼＢ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ、以下ＲＳＫＢと略称する。）を用いることを特徴とするＨＮＦ−４αのリン酸化方法およびリン酸化剤に関する。また、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害方法およびリン酸化阻害剤に関する。さらに、ＨＮＦ−４αが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生阻害方法および産生阻害剤に関する。また、ＨＮＦ−４αのリン酸化に起因する疾患、例えば糖尿病の防止方法および／または治療方法並びに防止剤および／または治療剤に関する。さらに、ＨＮＦ−４αのＲＳＫＢによるリン酸化を阻害する化合物の同定方法および該同定方法により同定された化合物に関する。また、ＲＳＫＢ、ＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターを含んでなる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓はグルコースの恒常性維持にとって重要な臓器であり、グルコースを産生する糖新生（ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）とグルコースからグリコーゲンを生成するグリコーゲン合成（ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓｉｓ）によって生体内のグルコース量のバランスを保っている。糖尿病患者では、肝臓での過剰なグルコース産生が起こっており、それが高血糖症の原因の一つとされている（非特許文献１）。
【０００３】
糖新生はピルビン酸からグルコースを合成する経路であり、そのほとんどが肝臓で行われる。糖新生を進める一連の酵素群の中で、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙ  ｋｉｎａｓｅ、以下ＰＥＰＣＫと略称する）は糖新生の律速酵素と考えられている（非特許文献２〜７）。肝臓中のＰＥＰＣＫの活性はＰＥＰＣＫ遺伝子からの転写量によって制御されている。この転写はホルモンで調節されており、グルココルチコイドはＰＥＰＣＫの転写を促進し（非特許文献８）、インスリンは抑制する（非特許文献４、６、８）。さらにＰＥＰＣＫ遺伝子のｍＲＮＡの半減期は４０分と短く、その転写量は数時間単位で劇的に増減する（非特許文献３）。これによりＰＥＰＣＫの酵素活性、糖新生、さらには血糖値が調節される（非特許文献３）。糖尿病病態時の肝臓では、グルココルチコイドによりＰＥＰＣＫ遺伝子の発現が増加しており、糖新生が亢進している（非特許文献８および９）。
【０００４】
糖尿病は１型糖尿病（インスリン依存性糖尿病、ＩＤＤＭ）と２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）に分類される。２型糖尿病はさらにインスリン分泌低下が主体の糖尿病、インスリンは分泌されているが標的細胞でのグルコースに対するインスリン感受性の低下が主体の糖尿病に分けられ、後者は特にインスリン抵抗性と言われている。インスリンの標的組織は肝臓、脂肪、筋肉であり、肝臓の糖新生と糖放出の抑制により血糖値が下がる。高血糖の持続により肝臓のインスリン感受性が低下し、インスリン依存性の糖新生抑制作用が期待できなくなる。しかしながら、高血糖持続による肝臓のインスリン感受性低下メカニズムは未だ明らかにされておらず、インスリンレセプターのダウンレギュレーションなどが想定されている。
【０００５】
ＨＮＦ−４αは核内レセプターの一つであり、肝臓、膵臓のβ細胞、腎臓および小腸で発現し、コレステロール、脂肪酸およびグルコースなどの代謝や肝臓の発生および分化に関与する蛋白質をコードする種々の遺伝子の転写因子であることが知られている。糖新生関連では、ＨＮＦ−４αはＰＥＰＣＫ遺伝子のプロモーターに存在するＡＦ−１領域に結合し、ＰＥＰＣＫ遺伝子の発現に関与している（非特許文献１６）。転写因子はリン酸化によりＤＮＡ結合能が変化することが分かっている（非特許文献１７）が、ＨＮＦ−４αは、ＰＫＡ（ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）によりリン酸化され、Ｌ型ピルビン酸キナーゼのプロモーターに対する結合能が低下するとの報告がある（非特許文献１０）。
【０００６】
ＲＳＫＢは、ストレス応答型ＭＡＰＫ（マイトージェン活性化キナーゼ、ｍｙｔｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）であるｐ３８キナーゼファミリーにより活性化されるキナーゼで、核に分布する（非特許文献１１）。ｐ３８キナーゼは色々な病態において活性化される（非特許文献１２）。糖尿病病態下、持続的に高血糖に曝されている細胞では、活性酸素による酸化ストレスからｐ３８キナーゼが活性化される（非特許文献１３および１４）。例えば、高血糖下（１６．５ｍＭ）で培養された血管平滑筋細胞（非特許文献１５）や糖尿病モデル動物のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓でｐ３８キナーゼの活性化が報告されている（非特許文献２９）。
【非特許文献１】「Ｎａｔｕｒｅ」２００１年，第 ４１３巻，第１３号，ｐ．１３１−１３８。
【非特許文献２】「日本臨床」２００２年、第６０巻、増刊７号、ｐ． １２１−１２８。
【非特許文献３】「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９８２年，第２５７巻，第１３号，ｐ．７６２９−７６３６。
【非特許文献４】「Ｎａｔｕｒｅ」１９８３年，第３０５巻，第５９３４号，ｐ．５４９−５５１。
【非特許文献５】「Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．」１９７４年，第１３８巻，ｐ．３８７−３９４。
【非特許文献６】「Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．」１９９３年，第７巻，第１１号，ｐ．１４５６−１４６２。
【非特許文献７】「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」１９９４年，第９１巻，ｐ．９１５１−９１５４。
【非特許文献８】「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９９３年，第２６８巻，第１７号，ｐ．１２９５２−１２９５７。
【非特許文献９】「Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．」１９９３年，第４２巻，ｐ．４７３−４７７。
【非特許文献１０】「Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．」１９９７年，第１７巻，第８号，ｐ．４２０８−４２１９。
【非特許文献１１】「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９９８年，第２７３巻，第４５号，ｐ．２９６６１−２９６７１。
【非特許文献１２】「Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ」２０００年，第２８巻，Ｎ６７−７７。
【非特許文献１３】「日本臨床」２００２年、第６０巻、増刊号７、ｐ．３９５−３９８。
【非特許文献１４】「Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ」２００２年、第２３巻、第５号、ｐ．５９９−６２２。
【非特許文献１５】「Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．」１９９９年，第１０３巻，ｐ．１８５−１９５。
【非特許文献１６】「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」１９９５年，第９２巻，ｐ．４１２− ４１６。
【非特許文献１７】「Ｃｅｌｌ」１９９２年，第７０巻，第３号，ｐ．３７５−３８７。
【非特許文献１８】「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」１９８８年，第８巻，ｐ．３４６７−３４７５。
【非特許文献１９】「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９９５年，第２７０巻，ｐ．８２２５−８２３２。
【非特許文献２０】「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」１９９４年， 第９１巻，ｐ．５６４７−５６５１。
【非特許文献２１】「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９９５年，第２６９巻，ｐ．１１０８−１１１２。
【非特許文献２２】「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９９７年，第２７２巻，ｐ．２６３０６−２６３１２。
【非特許文献２３】「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２０００年，第２７５巻，ｐ．５８０４−５８０９。
【非特許文献２４】「Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．」１９９９年，第１３巻，ｐ．６０４−６１８。
【非特許文献２５】「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９９９年，第２７４巻，第９号，ｐ．５８８０−５８８７。
【非特許文献２６】「Ｄｉａｂｅｔｅｓ」１９８９年，第３８巻，ｐ．５５０−５５７。
【非特許文献２７】「Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１９９７年，第６６巻，ｐ．５８１−６１１。
【非特許文献２８】「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２００２年，第２７７巻，第３５号，ｐ．３２２３４−３２２４２。
【非特許文献２９】「Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．」２００３年，第１７巻，第６号，ｐ．１１３１−１１４３。
【非特許文献３０】「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２００４年，[Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ  ｐｒｏｎｔ]。
【非特許文献３１】Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９８３年，第２１９巻，ｐ．６６６−６７１
【非特許文献３２】「ペプチド合成」（日本国）、丸善株式会社、１９７５年。
【非特許文献３３】「ペプチド合成（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（米国）、インターサイエンス、１９９６年。
【非特許文献３４】「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２０００年，第２７５巻，第３１号，ｐ．２３５４９−２３５５８。
【非特許文献３５】「Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．」１９９９年，第１３巻，ｐ．６０４−６１８。
【非特許文献３６】「ＤＮＡ」１９８９年，第８巻，ｐ．１２７−１３３。
【非特許文献３７】「Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．」１９９０年，第４巻，第９号，ｐ１３０２−１３１０。
【非特許文献３８】「Ｄｉａｂｅｔｅｓ」２００１年，第５０巻，ｐ．１３１−１３８。
【非特許文献３９】「Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．」１９９５年，第３２３巻，第２号，ｐ４７７−４８３。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＰＥＰＣＫ遺伝子の転写を調節するＨＮＦ−４αをリン酸化することにより、ＰＥＰＣＫプロモーター領域への結合能を促進させる物質を見出し、ＰＥＰＣＫ遺伝子の転写量増加により引起こされる疾患、例えば、糖尿病の防止手段および／または治療手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意努力し、ＲＳＫＢによってＨＮＦ−４αがリン酸化されることを見出した。さらに、ＨＮＦ−４αはＲＳＫＢによりリン酸化されることでＰＥＰＣＫプロモーター領域のＡＦ１部位への結合能が促進され、かかる促進によりＰＥＰＣＫ遺伝子の転写活性が亢進することを実証し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
１．リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）とヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）を相互作用を可能にする条件下で共存させることを特徴とする、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化方法、
２．リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）の活性を阻害することを特徴とする、ＲＫＳＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）のリン酸化阻害方法、
３．リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）とヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）との相互作用を阻害することを特徴とする、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害方法、
４．少なくともリボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）とヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）とを発現している細胞を、ＲＳＫＢ活性の阻害剤で処理することを特徴とするＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害方法、
５．リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）活性の阻害剤が、ＲＳＫＢを認識する抗体、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）を認識する抗体から選ばれる１つまたは２つ以上の抗体である前項４に記載のＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害方法、
６．リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）活性の阻害剤を有効量含むことを特徴とするＲＳＫＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）のリン酸化阻害剤、
７．リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）とヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）との相互作用を阻害することを特徴とする、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤、
８．リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）活性を阻害することを特徴とする、ＲＳＫＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）のリン酸化阻害剤、
９．リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）活性の阻害剤が、ＲＳＫＢを認識する抗体、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）を認識する抗体から選ばれる１つまたは２つ以上の抗体である前項８に記載のＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤、
１０．ヘパトサイトヌクレアーファクター４αをリボソームＳ６キナーゼＢを用いてリン酸化することを特徴とする、糖新生関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法、
１１．糖新生関連遺伝子がホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子である前項１０に記載の糖新生関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法、
１２．リボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化を阻害することを特徴とする、糖新生関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法、
１３．リボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化を阻害することを特徴とする、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法、
１４．前項２から５のいずれか１項に記載のリン酸化阻害方法を用いることを特徴とする、糖新生関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法、
１５．前項２から５のいずれか１項に記載のリン酸化阻害方法を用いることを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４αが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法、
１６．前項２から５のいずれか１項に記載のリン酸化阻害方法を用いることを特徴とする、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法、
１７．前項２から５のいずれか１項に記載のリン酸化阻害方法を用いることを特徴とする、リボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化に起因する疾患の防止方法および／または治療方法、
１８．前項２から５のいずれか１項に記載のリン酸化阻害方法を用いることを特徴とする、糖新生関連遺伝子の遺伝子産物の増加に起因する疾患の防止方法および／または治療方法、
１９．前項２から５のいずれか１項に記載のリン酸化阻害方法を用いることを特徴とする、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子の遺伝子産物の増加に起因する疾患の防止方法および／または治療方法、
２０．前項２から５のいずれか１項に記載のリボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化阻害方法を用いることを特徴とする、糖尿病の防止方法および／または治療方法、
２１．前項６から９のいずれか１項に記載のリボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化阻害剤および／またはＲＳＫＢ活性の阻害剤を用いることを特徴とする、糖尿病の防止方法および／または治療方法、
２２．前項６から９のいずれか１項に記載のリボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化阻害剤および／またはＲＳＫＢ活性の阻害剤を有効量含んでなる、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子の遺伝子産物の産生阻害剤、
２３．前項６から９のいずれか１項に記載のリボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化阻害剤および／またはＲＳＫＢ活性の阻害剤を有効量含んでなる医薬組成物、
２４．前項６から９のいずれか１項に記載のリボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化阻害剤および／またはＲＳＫＢ活性の阻害剤を有効量含んでなる、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子の遺伝子産物の増加に起因する疾患の防止剤および／または治療剤、
２５．前項６から９のいずれか１項に記載のリボソームＳ６キナーゼＢによるヘパトサイトヌクレアーファクター４αのリン酸化阻害剤および／またはＲＳＫＢ活性の阻害剤を有効量含んでなる、糖尿病の防止剤および／または治療剤、
２６．リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）とヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）の相互作用を阻害する化合物の同定方法であって、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を可能にする条件下、ＲＳＫＢおよび／またはＨＮＦ−４αと被検化合物を接触させ、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、被検化合物がＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を阻害するか否かを決定する同定方法、
２７．リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）によるヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を可能にする条件下、ＲＳＫＢおよび／またはＨＮＦ−４αと被検化合物を接触させ、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、被検化合物がＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害するか否かを決定する同定方法、
２８．リボソームＳ６キナーゼＢ（ＲＳＫＢ）、ＲＳＫＢをコードするポリヌクレオチドおよびＲＳＫＢをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうち少なくともいずれか１つと、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）、ＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドおよび該ＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つを含んでなるキット、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明において、ＲＳＫＢによりリン酸化されたＨＮＦ−４αがＰＥＰＣＫ遺伝子のプロモーター領域のＡＦ１に結合することを見出した。これよりＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化方法、リン酸化阻害方法およびリン酸化阻害剤が提供される。糖尿病病態時では、ＲＳＫＢにより活性化されたＨＮＦ−４αはＰＥＰＣＫ遺伝子の転写活性を促進することで、糖新生を亢進させ、高血糖を悪化させると考えている。したがって、本発明が提供するＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤および／またはリン酸化阻害方法により、ＨＮＦ−４αが作用する遺伝子の遺伝子産物の産生阻害、例えばＰＥＰＣＫ遺伝子の遺伝子産物の産生阻害が可能となる。また、ＨＮＦ−４αが作用する遺伝子の遺伝子産物の増加に起因する疾患の防止および／または治療が可能となる。具体的には、ＰＥＰＣＫ遺伝子産物の増加に起因する疾患、より具体的には糖尿病などの防止および／または治療が可能である。このように本発明は、糖新生関連遺伝子発現に関与するＨＮＦ−４αの過剰なリン酸化に起因する疾患の防止および／または治療のために非常に有用である。
【００１１】
さらに、本発明によるＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤および／またはリン酸化阻害方法により、インスリンの効果が期待できない２型糖尿病のインスリン抵抗性患者の肝臓における糖新生を抑制でき、高血糖を抑制させる作用を有すると考えている。近年、糖尿病治療薬としてインスリン抵抗性改善薬が開発されおり、その代表例として、チアゾリジンジオン誘導体が臨床の場で用いられている。チアゾリジンジオン誘導体は、脂肪組織におけるインスリン感受性の低い大型脂肪細胞をインスリン感受性の高い小型脂肪細胞に変化させる作用を有する。しかしながら、本発明のＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤とチアゾリジンジオン誘導体とは、標的臓器が異なっている。また、膵臓のβ細胞が崩壊し、血中インスリン量が低下している糖尿病の末期患者においては、インスリンによるＰＥＰＣＫ遺伝子の抑制効果は減少していると考えられる。したがって、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害し、ＰＥＰＣＫ遺伝子の遺伝子産物の産生を抑制することは、インスリン非依存的に血糖降下作用を奏する可能性があり非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解されている意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
【００１３】
本明細書においては、アミノ酸を１文字表記または３文字表記することがある。また、ペプチドとは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドを意味する。さらにペプチドは、オリゴマーと称する単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドなどの短鎖ペプチド、並びに単離された若しくは合成の完全長ポリペプチドや単離された若しくは合成の完全長蛋白質などの長鎖ペプチドをも意味する。
【００１４】
本発明では、ＲＳＫＢと相互作用する蛋白質を国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号公報に記載の方法に従って予測し、その結果、ＲＳＫＢがＨＮＦ−４αと相互作用することを見出した。また、ＲＳＫＢがＨＮＦ−４αをリン酸化すること、ＲＳＫＢによりリン酸化されたＨＮＦ−４αはＰＥＰＣＫ遺伝子プロモーター領域のＡＦ１へのその結合が促進する結果、ＰＥＰＣＫ遺伝子の転写が上昇することを初めて明らかにした。
【００１５】
ＰＥＰＣＫプロモーターにはＧＲＵ（グルココルチコイド応答ユニット、ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｎｉｔ）と呼ばれる領域が存在し、ＡＦ１（アクセサリー因子結合部位１、ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ１）、ＧＲ１，２（グルココルチコイドレセプター結合部位、ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）、ＡＦ２（アクセサリー因子結合部位２、ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ２）およびＣＲＥ（サイクリックＡＭＰ応答配列、ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）が存在する。ＰＥＰＣＫ遺伝子を効率よく発現させるために、これらの領域が必要と考えられている。  
【００１６】
ＲＳＫＢによりリン酸化されＰＥＰＣＫプロモーターに結合する転写因子としては、ＣＲＥＢ（サイクリックＡＭＰ応答配列結合蛋白質、ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）がある。ＣＲＥＢはＰＥＰＣＫプロモーターのＣＲＥに結合する転写因子である（非特許文献１９）。ＣＲＥはＰＥＰＣＫプロモーターに存在し、ＰＥＰＣＫ遺伝子発現を正に調節している領域である（非特許文献１８）。ＣＲＥに結合してＰＥＰＣＫ遺伝子を正に調節する遺伝子としては、ＣＲＥＢとＣ／ＥＢＰ（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合蛋白質、ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が報告されている（非特許文献１９）。
【００１７】
ＲＳＫＢはＣＲＥＢをリン酸化し、リン酸化されたＣＲＥＢはＣＲＥを有するプロモーターの転写活性を亢進する（非特許文献１１）。したがって、ＲＳＫＢが活性化された場合、ＨＮＦ−４αを介することなくＣＲＥＢがリン酸化され、ＰＥＰＣＫプロモーターのＣＲＥにＣＲＥＢが結合し、ＰＥＰＣＫ遺伝子の発現が促進される可能性がある。しかしながら、生体内で実際にＰＥＰＣＫプロモーターのＣＲＥを調節しているのはＣＲＥＢではなくＣ／ＥＢＰであり（非特許文献２０〜２３）、Ｃ／ＥＢＰがＲＳＫＢによりリン酸化されるという報告はない。
【００１８】
また、ＰＥＰＣＫプロモーター領域において、ＡＦ１の置換欠失によりＰＥＰＣＫプロモーターの転写活性はコントロール（野生型ＰＥＰＣＫプロモーター）の約４分の１以下に低下する（非特許文献２４）。これに対し、ＣＲＥの置換欠失によっては、ＰＥＰＣＫプロモーターの転写活性はコントロールの２分の１程度にまでしか低下しない（非特許文献２５）。このことから、ＨＮＦ−４αが結合するＡＦ１はＰＥＰＣＫ遺伝子の発現により影響を与える配列であり、他のＰＥＰＣＫプロモーター領域の配列であるＣＲＥ１よりもより影響を与える遺伝子発現調節の重要な因子であると考えた。さらに、本明細書の実施例の図１１で示されるように、ＨＮＦ−４αによる転写活性が影響しないＰＥＰＣＫΔＡＦ１プロモーターを用いて細胞内ＲＳＫＢを活性化させたが（ＭＡＰＫ１１とＲＳＫＢの共発現）、ＰＥＰＣＫ遺伝子の転写活性はほとんど促進されなかった。したがって、生体内においては、ＲＳＫＢによるＰＥＰＣＫ遺伝子の発現調節はＨＮＦ−４αを介していると考えている。  
【００１９】
インスリン非依存性糖尿病患者のＰＥＰＣＫによる糖新生能は、正常人より約３倍亢進しており、この糖新生能は患者の空腹時血漿中グルコース濃度と相関していることが報告されている（非特許文献２６）。ＰＥＰＣＫ遺伝子の転写はホルモンによって制御されており、グルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｌｔｉｃｏｉｄ）により亢進され、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）により抑制される（非特許文献８および２７）。インスリンはＰＥＰＣＫプロモーターにおいて転写調節因子であるＬＩＰ（肝特異的転写抑制蛋白質、ｌｉｖｅｒ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を介してＰＥＰＣＫ遺伝子の転写を抑制することで肝臓での糖新生をコントロールしている（非特許文献２８）。また、インスリン刺激がＰＥＰＣＫプロモーターに直接作用して転写活性を抑制するという報告もある（非特許文献６および３７）。したがって、正常の肝臓ではＰＥＰＣＫ遺伝子の発現はインスリンによって抑制的に支配されているが、何らかの理由でＰＥＰＣＫ遺伝子の過剰発現が持続すると、肝臓での糖新生が亢進し高血糖となり、インスリン耐性になると糖尿病となると考えられる。
【００２０】
ＲＳＫＢは上流のキナーゼであるｐ３８により活性化される。また、ＲＳＫＢはＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をリン酸化する。従って、ＲＳＫＢの活性化はｐ３８の活性化およびＣＲＥＢのリン酸化を指標にすることができる。糖尿病モデル動物の肝臓では、ｐ３８のリン酸化型（活性型ｐ３８）は正常個体のそれに比べ約２．５〜３倍増加しており、ＣＲＥＢのリン酸化型も約２倍増加するとの報告がある（非特許文献２９および３０）。これらのことから、発明者は糖尿病病態下の肝臓では、酸化ストレス等によりｐ３８キナーゼが活性化し、続いてＲＳＫＢが活性化すると考えた。
【００２１】
ＰＥＰＣＫの活性制御はｍＲＮＡレベルで調節されている。肝細胞を用いた実験から、ＰＥＰＣＫ遺伝子のｍＲＮＡ量が２倍増加すると酵素活性は２．８倍増加し、さらに糖新生能は２．１倍亢進することが報告されている（非特許文献６）。マウスでは肝臓での糖新生能が約２．５倍亢進すると、血糖値は２倍上昇し（非特許文献７）、ヒトでは血糖値が２．５倍高い糖尿病患者ではＰＥＰＣＫによる糖新生能が正常人より３倍亢進している（非特許文献２６）。すなわち、ＰＥＰＣＫのｍＲＮＡ量、酵素活性、糖新生能および血糖値上昇はそれぞれ良好な相関を示している。
【００２２】
発明者は、ＲＳＫＢの活性化による血糖値上昇の程度を次のように考えた。ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化がＣＲＥＢと同程度であると仮定すると、糖尿病病態時のＲＳＫＢによる肝臓中ＨＮＦ−４αのリン酸化は正常時よりも２倍程度亢進していると推定された。実施例の結果を示す図９、１０、１２から、ＨＮＦ−４αのＰＥＰＣＫ遺伝子プロモーター転写活性化能はＲＳＫＢによりリン酸化されることで約２〜３倍亢進する。ＰＥＰＣＫ遺伝子のプロモーター活性をｍＲＮＡ量に置き換えると、糖尿病病態時ではＲＳＫＢの活性化によりＰＥＰＣＫ遺伝子のｍＲＮＡ量は約２〜３倍増加していると考えた。ＰＥＰＣＫ遺伝子のｍＲＮＡ量の増加は上記で述べたようにそのまま酵素活性に反映され、糖新生能亢進、血糖値の上昇を招く。このことにより、糖尿病病態時において、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害すれば、肝臓中のＰＥＰＣＫ遺伝子のｍＲＮＡ量は２分の１〜３分の１程度に抑制されると考えた。これによりＰＥＰＣＫの酵素活性は３分の１程度、糖新生能は２分の１程度に減少すると推定され、その結果、血糖値は病態時の半分程度に減少することとなる。従って糖尿病病態時においてＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害し、ＰＥＰＣＫ遺伝子の遺伝子産物の産生を調節することにより、糖尿病の治療が可能となると考えた。
【００２３】
これら知見により達成した本発明の一態様は、ＲＳＫＢを用いることを特徴とするＨＮＦ−４αのリン酸化方法に関する。ＲＳＫＢによるリン酸化の検出は、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αを接触させた後にウェスタンブロッティング法などの公知方法により実施可能である。
【００２４】
本発明に係るＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化方法は、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αを共存させることを特徴とする。また、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αとを共存させることを特徴とするＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化系の構築およびその利用もできる。
【００２５】
ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化方法およびリン酸化系は、インビトロであってよく、インビボの系であってもよい。具体的には、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αを、例えば試験管やマルチウエルプレート内で共存させてリン酸化させるリン酸化方法およびリン酸化系が例示できる。あるいは、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αを共発現させた細胞を用いたリン酸化方法およびリン酸化系を例示できる。
【００２６】
発現に用いる細胞は蛋白質発現に使用されている細胞が使用可能である。具体例として、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞等が例示できる。これら蛋白質の発現は、公知の遺伝子工学的手法を用いて実施することができる。
【００２７】
本発明で使用するＲＫＳＢおよびＨＮＦ−４αは、これら１つまたは２つ以上を遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。また、これら蛋白質は、それらのＮ末端側やＣ末端側に別の蛋白質やペプチドなどを、直接的にまたはリンカーペプチドなどを介して間接的に、遺伝子工学的手法などを用いて付加することにより標識化したものであってもよい。標識化は、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αとの相互作用およびこれら蛋白質の機能、例えばＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの接触、ＲＳＫＢの酵素活性およびＨＮＦ−４αの機能などが阻害されない方法が望ましい。
【００２８】
標識物質としては、例えば酵素類（グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはβガラクトシダーゼなど）、タグペプチド類（Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇなど）、蛍光蛋白質類〔グリーン蛍光蛋白質、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）など〕、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンのＦｃ断片、またはビオチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは放射性同位元素による標識も可能である。標識化するとき、１種類の標識物質を付加してもよいし複数を組み合わせて付加することもできる。これら標識物質自体またはその機能を測定することにより、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を検出することが可能である。
【００２９】
遺伝子導入に用いるＲＳＫＢおよびＨＮＦ−４αをコードする遺伝子はヒトｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。これら遺伝子を適当な発現ベクターＤＮＡ、例えば細菌プラスミド由来のベクターなどに自体公知の遺伝子工学的手法で導入し、上記遺伝子を含有するベクターを得て、遺伝子の導入に利用することができる。遺伝子導入は、自体公知の遺伝子工学的手法を用いて実施可能である。
【００３０】
ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化剤、リン酸化方法、およびリン酸化系は、ＨＮＦ−４αの機能解明やＨＮＦ−４αが関与する転写因子ネットワークについての研究、およびＨＮＦ−４αのリン酸化に起因する疾患、例えば糖尿病におけるＨＮＦ−４αやＲＳＫＢの関与についての分子レベルでの研究などに有用である。また、当該リン酸化方法およびリン酸化系を用いて、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害する化合物の同定方法を構築することも可能である。
【００３１】
本発明の別の一態様は、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤および阻害方法に関する。当該阻害剤および阻害方法は、ＲＳＫＢ活性を阻害すること、またはＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害すること、あるいは、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を阻害することを特徴とする。
【００３２】
ＲＳＫＢ活性の阻害またはＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化の阻害は例えばＲＳＫＢの酵素活性を阻害することにより実施できる。本発明に係るＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤は、一態様においてＲＳＫＢ活性を阻害する効果を有する化合物（ＲＳＫＢ活性阻害剤）の少なくとも１つを合成することを特徴とする。本発明にかかる阻害剤および阻害方法を適用する対象物としては、少なくともＲＳＫＢとＨＮＦ−４αとを含む対象物、例えば少なくともこれらを含む生体外試料が挙げられる。また、少なくともＲＳＫＢとＨＮＦ−４αを発現している細胞、例えば肝臓細胞、並びにかかる細胞を担持している非ヒト哺乳動物なども当該対象物に含まれる。
【００３３】
ＲＳＫＢ活性の阻害剤としては、拮抗阻害効果を有するペプチド類、抗体、および低分子化合物などが例示できる。抗体としては、ＲＳＫＢまたはＨＮＦ−４αを認識して結合する抗体であって、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害する抗体が挙げられる。抗体はＲＳＫＢまたはＨＮＦ−４α自体、これら由来の部分ペプチド、あるいはこれらが相互作用する部位のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として自体公知の抗体作成法により得ることができる。低分子化合物としては、ＲＳＫＢの酵素活性を阻害する化合物、好ましくは該酵素活性を特異的に阻害する化合物が挙げられる。かかる化合物は、例えば、本発明に係るリン酸化方法またはリン酸化系を利用して、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害するか否かを同定することにより得ることができる。ＲＳＫＢの酵素活性を特異的に阻害するとは、ＲＳＫＢの酵素活性を強く阻害するが、他の酵素の活性は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。
【００３４】
ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化の阻害はまた、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αとの相互作用を阻害することによっても実施できる。ＲＳＫＢによりＨＮＦ−４αがリン酸化されるのは、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αが相互作用している一態様と考えられる理由による。相互作用とは、蛋白質間の非共有結合力による相互作用をいい、一時的な結合、可逆的結合、不可逆的結合などが挙げられる。
【００３５】
本発明に係るＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤は、一態様において、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αとの相互作用を阻害する化合物の少なくとも１つを活性成分として有効量含んでなる。
【００３６】
本発明に係るＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化の阻害方法は、一態様において、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αとの相互作用を阻害する化合物の少なくとも１つを用いることを特徴とする。
【００３７】
ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αとの相互作用の阻害は、例えば両蛋白質が相互作用する部位のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて実施可能である。かかるペプチドとして、ＨＮＦ−４αのアミノ酸配列においてＲＳＫＢによりリン酸化される部位のアミノ酸配列を含むペプチドが例示できる。かかるペプチドは、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を競合的に阻害すると考えられる。ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αとの相互作用の阻害はまた、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用部位のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて実施可能である。
【００３８】
上記ペプチドは、ＲＳＫＢまたはＨＮＦ−４αのアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成方法により合成したものから、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化および／またはＲＳＫＢと該転写因子の相互作用を阻害するものを選択することにより得ることができる。
【００３９】
このように特定されたペプチドに１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、または挿入などの変異を導入したものも、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を阻害する限りにおいて、本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したペプチドは、さらにはＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害するものが好ましい。
【００４０】
変異を有するペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加または挿入などの変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（非特許文献３１）を利用できる。このような変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性など）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸など）の間での相互置換は容易に想定される。
【００４１】
ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αとの相互作用を阻害し得るペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基などを、例えばアミド化修飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。特に、ペプチドと他の蛋白質との相互作用を安定化し、ペプチドを解離し難くするために通常よく使用される修飾、例えばＣ末端のアルデヒド化またはＮ末端のアセチル化などの修飾は、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を阻害するペプチドの有効性を高めるために有用である。      
【００４２】
上記ペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、公知文献に記載の方法（非特許文献３２および３３）が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用可能である。  
【００４３】
本発明に係るＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤は、その一態様において、ＨＮＦ−４αとＲＳＫＢとの相互作用阻害化合物、ＨＮＦ−４αのＲＳＫＢによるリン酸化阻害剤、およびＲＳＫＢ活性の阻害剤の少なくとも１つを活性成分として有効量含有してなる。このとき、ＨＮＦ−４αのリン酸化の阻害剤は、ＨＮＦ−４αとＲＳＫＢとの相互作用阻害化合物、ＨＮＦ−４αのＲＳＫＢによるリン酸化阻害剤、およびＲＳＫＢの活性阻害剤の少なくとも１つを活性成分として有効量含有してなる阻害剤であることができる。また、ＨＮＦ−４αに対するかかる阻害物質を複数組合せて含有する阻害剤であることもできる。より具体的には、例えばＨＮＦ−４αとＲＳＫＢとの相互作用阻害化合物、ＨＮＦ−４αのＲＳＫＢによるリン酸化阻害剤、ＲＳＫＢの活性阻害剤の少なくとも１つを活性成分として有効量含有してなることが好ましい。    
【００４４】
本発明に係るＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害方法は、その一態様において、ＨＮＦ−４αとＲＳＫＢとの相互作用阻害化合物、ＨＮＦ−４αのＲＳＫＢによるリン酸化阻害剤、およびＲＳＫＢの活性阻害剤の少なくとも１つを用いることを特徴とする。このとき、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化の阻害方法においては、ＨＮＦ−４αとＲＳＫＢとの相互作用阻害化合物、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤、およびＲＳＫＢ活性阻害剤の少なくとも１つを用いることができ、また、各転写因子に対するかかる阻害化合物を複数組合せて用いることもできる。より具体的には、例えばＨＮＦ−４αとＲＳＫＢとの相互作用阻害化合物、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤、ＲＳＫＢの活性阻害剤の少なくとも１つを用いることが好ましい。
【００４５】
ＨＮＦ−４αはその機能の一つにおいて、肝臓における転写因子として糖新生関連遺伝子発現に関与していることが知られている。糖新生関連遺伝子とは、生体において糖新生を調節している物質をコードする遺伝子のことであり、例えばＰＥＰＣＫ遺伝子が挙げられる。糖尿病病態時におけるＨＮＦ−４αの活性化は糖新生をさらに亢進し、高血糖を悪化させる原因になると考えられる。
【００４６】
本発明のまた別の一態様は、糖新生関連遺伝子の遺伝子産物の産生調節方法に関する。本発明に係る糖新生関連遺伝子の遺伝子産物の産生調節方法は、それらをコードする遺伝子の発現に係るＨＮＦ−４αのＲＳＫＢによるリン酸化を調節して、該遺伝子の遺伝子産物の産生を調節することを特徴とする。    
【００４７】
糖新生関連遺伝子の遺伝子産物産生調節方法の一態様は、糖新生関連遺伝子の遺伝子産物の産生阻害方法であり、該遺伝子発現に係るＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害することを特徴とする。当該産生阻害方法は具体的には、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤またはＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害方法を使用することにより達成できる。上記リン酸化阻害剤を含んでなる、糖新生関連遺伝子の遺伝子産物産生促進剤も本発明の範囲に包含される。  
【００４８】
糖新生関連遺伝子発現に係るＨＮＦ−４αが作用する遺伝子の遺伝子産物としては、例えば、ＨＮＦ−４αの結合部位をプロモーターまたはエンハンサー内に有する遺伝子の遺伝子産物が挙げられる。具体的には、ＨＮＦ−４αが作用する遺伝子として、ＲＳＫＢによりリン酸化されたＨＮＦ−４αの結合部位であるＡＦ１をプロモーターまたはエンハンサー内に有する遺伝子、例えばＰＥＰＣＫ遺伝子が挙げられる。
【００４９】
本発明のさらに別の一態様は、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化に起因する疾患の防止剤および／または治療剤、並びに当該疾患の防止方法および／または治療方法に関する。当該疾患の防止剤および／または治療剤は、上記リン酸化阻害剤を含んでいる。当該疾患の防止方法および／または治療方法は、上記リン酸化阻害剤または上記リン酸化阻害方法を使用することにより達成できる。
【００５０】
ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化に起因する疾患としては、例えばＨＮＦ−４αが作用する遺伝子の遺伝子産物の増加に起因する疾患が挙げられる。例えばＲＳＫＢによりリン酸化されたＨＮＦ−４αはＰＥＰＣＫ遺伝子上流の転写部位への結合を促進させ、該遺伝子の遺伝子産物産生に寄与している。
【００５１】
ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化に起因する疾患として具体的には、糖新生関連遺伝子の遺伝子産物の増加に起因する疾患、例えばＰＥＰＣＫ遺伝子の遺伝子産物の増加に起因する疾患などが例示できる。より具体的には、糖新生異常による疾患、例えば糖尿病などが挙げられる。
【００５２】
本発明のまた別の一態様は、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を阻害する化合物の同定方法に関する。該同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。また、本発明に係るリン酸化系またはリン酸化方法を利用して、該同定方法が実施可能である。
【００５３】
本発明の被検化合物としては、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはＲＳＫＢおよびＨＮＦ−４αの一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物などが挙げられる。あるいは、ＨＮＦ−４αとＲＳＫＢの相互作用部位および／またはＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化部位のペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物なども被検化合物として好適である。
【００５４】
具体的には、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を可能にする条件を選択し、当該条件下でＲＳＫＢおよび／またはＨＮＦ−４αと被検化合物を接触させ、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を阻害する化合物を同定できる。ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用の検出は、自体公知の検出方法、例えばウェスタンブロッティング法などを用いて実施できる。
【００５５】
ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を可能にする条件は、インビトロの系であってよく、インビボの系であってもよい。例えば、ＲＳＫＢと当該転写因子を共発現させた細胞を用いることもできる。ＲＳＫＢおよび／またはＨＮＦ−４αと被検化合物の接触は、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用反応の前に行なってもよいし、相互作用反応に共存させることにより行なってもよい。
【００５６】
本発明においてシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指し、マーカーとはそのものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。
【００５７】
シグナルとしてはルシフェラーゼ、グリーン蛍光蛋白質、および放射性同位体など、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子など、または検出用のエピトープタグ、例えば６×Ｈｉｓ−ｔａｇなど、一般的に化合物の同定方法に用いられている標識物質であれば、いずれも用いることができる。これらシグナルまたはマーカーは、単独で使用してもよく、２つ以上を組合せて用いてもよい。これらシグナルまたはマーカーの検出方法は当業者に周知のものである。
【００５８】
本発明の別の一態様は、ＲＳＫＢによる糖新生関連遺伝子発現に係るＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害する化合物の同定方法に関する。該同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。また、本発明に係るリン酸化系またはリン酸化方法を利用して、該同定方法が実施可能である。
【００５９】
具体的には、ＲＳＫＢによる糖新生関連遺伝子発現に係るＨＮＦ−４αのリン酸化を可能にする条件を選択し、当該条件下でＲＳＫＢおよび／またはＨＮＦ−４αと被検化合物を接触させ、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害する化合物を同定できる。
【００６０】
ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を可能にする条件は、インビトロであってよく、インビボの系であってもよい。例えば、ＲＳＫＢと当該転写因子を共発現させた細胞を用いることもできる。ＲＳＫＢおよび／またはＨＮＦ−４αと被検化合物の接触は、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化反応の前に行なってもよいし、リン酸化反応に共存させることにより行なってもよい。ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化は、簡便にはリン酸化型ＨＮＦ−４α量の存在若しくは不存在および／または変化の測定により検出できる。
【００６１】
リン酸化型ＨＮＦ−４α量の定量は、自体公知の蛋白質またはペプチドの検出方法、例えばウェスタンブロッティング法などを用いて実施できる。あるいは、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化の検出は、ＨＮＦ−４α活性の存在若しくは不存在および／または変化の測定により行なうことができる。具体的には、例えば、ＨＮＦ−４αがＰＥＰＣＫ遺伝子に作用するときには、ＨＮＦ−４αとＲＳＫＢとを発現している細胞に、ＰＥＰＣＫ遺伝子のプロモーター領域をその上流に組み込んだレポーター遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションし、被検化合物とこの細胞を接触させた場合のレポーター遺伝子の発現量を、当該被検化合物と接触させなかった場合のレポーター遺伝子の発現量と比較することにより、所望の化合物の同定を行なうことができる。
【００６２】
その他、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を可能にする条件を選択し、当該条件下でＲＳＫＢおよび／またはＨＮＦ−４αと被検化合物を接触させ、ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害する化合物を同定できる。ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用の検出は、自体公知の検出方法、例えばウェスタンブロッティング法などを用いて実施できる。
【００６３】
かかる同定方法で得られた化合物は、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤あるいはＨＮＦ−４αが作用する遺伝子の遺伝子産物産生阻害剤として利用可能である。ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤またはＨＮＦ−４αが作用する遺伝子の遺伝子産物産生阻害剤は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製可能である。医薬組成物の調製において、これら阻害剤は、単独で使用することもできるし、複数を組合せて使用することも可能である。
【００６４】
本発明に係る医薬組成物は、通常は１種または２種以上の医薬用担体を用いて製造することが好ましい。医薬用担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤などの希釈剤や賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。これらは、本発明に係る剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製することもできる。
【００６５】
本発明に係る医薬組成物は、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化に起因する疾患の防止剤および／または治療剤として使用することができる。また、当該疾患の防止方法および／または治療方法に使用することができる。具体例としては、糖尿病の防止方法および／または治療方法に使用することができ、より好ましくはインスリン非依存性糖尿病の防止方法および／または治療方法に使用することができる。
【００６６】
医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断などに応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いて用量を変更することができる。上記投与量は１日１〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
【００６７】
本発明に係る医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。
【００６８】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内などへの投与を挙げることができる。あるいは経口による投与も可能である。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。
【００６９】
投与形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリンなどの包接体、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
【００７０】
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトールなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。
【００７１】
懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトースなどの糖類、種々の分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのグリコール類、油類を使用して製造できる。
【００７２】
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
【００７３】
リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルムなど）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
【００７４】
脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油などの植物油、ＭＣＴなど）、乳化剤（リン脂質など）などを混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型など）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトール、果糖など）が例示される。
【００７５】
シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水などに加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。このとき、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
【００７６】
本発明のさらに別の一態様は、ＲＳＫＢ、ＲＳＫＢをコードするポリヌクレオチド、ＲＳＫＢをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つと、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キットに関する。当該試薬キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用可能である。
【００７７】
また、上記ペプチドおよび上記同定方法で得られた化合物からなる試薬およびこれらを含む試薬キットも本発明の範囲に包含される。試薬キットは、ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカー、これらの検出剤、反応希釈液、緩衝液、洗浄剤および反応停止液など、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤などの物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。これら試薬および試薬キットは、例えばＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化に起因する疾患、例えば糖尿病におけるＨＮＦ−４αやＲＳＫＢの関与についての分子レベルでの研究などに有用である。
【００７８】
ＨＮＦ−４αのリン酸化を阻害することによる糖尿病の予防および／または治療を行えることを確認するためには、以下のような実験を行えばよい。糖尿病モデル動物のＺＤＦラットは、肝臓中のＰＥＰＣＫの発現量が正常に比べ２．４倍増加していることが知られている（非特許文献３８）。このモデル動物のＲＳＫＢ活性化によるＨＮＦ−４αのリン酸化を、１）肝臓中ＨＮＦ−４αのリン酸化量と２）肝臓中ＲＳＫＢの活性化量をまず調べ、ＲＳＫＢ活性化を阻害するリン酸化阻害剤であるＨ−８９（Ｎ−[２−（（ｐ−ブロモシンナミル）アミノ）エチル]−５−イソキノリンスルホナマイド；Ｎ−[２−（（ｐ−Ｂｒｏｍｏｃｉｎｎａｍｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ]−５−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）（非特許文献３４）を用い、モデル動物個体群の血中グルコース濃度を判定すればよい。血中グルコース濃度は前述したように約半分に減少する。
【００７９】
上記、肝臓中の１）ＨＮＦ−４αのリン酸化量は、ＨＮＦ−４αを免疫沈降して抗リン酸化抗体を用いてリン酸化の程度を検出すればよく、２）ＲＳＫＢの活性化量は、抗活性化型ＲＳＫＢ抗体を作成し免疫沈降するか、抗ＲＳＫＢ抗体で免疫沈降し、インビトロのキナーゼ活性測定をすればよい。
【実施例】
【００８０】
実施例１
（ＲＳＫＢと相互作用する蛋白質のインシリコでの探索）
ＲＳＫＢと相互作用する蛋白質を、国際公開第Ｗ００１／６７２９９号公報に記載の予測方法に従ってインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で予測した。すなわち、ＲＫＳＢのアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とＲＳＫＢとの間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをＲＳＫＢと相互作用すると予測した。ここではローカルアライメントのスコアを国際公開第Ｗ００１／６７２９９号公報に記載の方法と同様に、２５．０以上とした。
この結果、ＲＳＫＢ由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチド[ＣＲＲＣＲＱ（配列番号１０）、ＶＳＲＲＩＬＫ（配列番号１３）]と相同性のあるオリゴペプチド[ＣＲＹＣＲＬ（配列番号１１）、ＣＲＦＳＲＱ（配列番号１２）、ＶＳＩＲＩＬＤ（配列番号１４）]がＨＮＦ−４αのアミノ酸配列中に存在することがわかった。図１に、ＲＳＫＢ（図中、上の配列）とＨＮＦ−４α（図中、下の配列）とのローカルアライメントの結果を示した。
【００８１】
実施例２
（ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化）
ヒトＨＮＦ−４αがＲＳＫＢによってリン酸化されるかを、哺乳類培養細胞にて一過性発現させたＨＮＦ−４αおよびＲＳＫＢ蛋白質を用いたインビトロのリン酸化試験で検討した。なお、ＲＳＫＢの活性はサイクリックＡＭＰ応答配列結合蛋白質１[ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１（ＣＲＥＢ１）]にて確認し、ＨＮＦ−４αをリン酸化することが知られているサイクリックＡＭＰ応答配列依存性プロテインキナーゼ[ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＰＫＡ）]をリン酸化酵素の陽性対照とした。
【００８２】
＜材料＞
ＲＳＫＢ発現プラスミド（ＲＳＫＢ／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２）を以下のように構築した。Ｈｕｍａｎ  ＲＳＫＢ  ｃＤＮＡをＨｅＬａ細胞由来ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ  ＨｅＬａ  Ｑｕｉｃｋ−ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ、クローンテック社）よりＰＣＲにより獲得し、シーケンスにより配列を確認した。その後、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを付加させる動物細胞用発現プラスミドｐＣＭＶ−Ｔａｇ２（ストラタジーン社）に組込み、ＲＳＫＢ発現プラスミド（ＲＳＫＢ／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２）を構築した。なお、クローニングしたＲＳＫＢ  ｃＤＮＡのアミノ酸配列はＮＣＢＩ  ｐｒｏｔｅｉｎデータベースのアクセション番号ＮＰ＿００３９３３（登録遺伝子名はＲＰＳ６ＫＡ４）と同一である。
【００８３】
ＨＮＦ−４α発現プラスミド（ＨＮＦ−４α／ｐｃＤＮＡ  ３．１／Ｈｉｓ）を以下のように構築した。ヒトＨＮＦ−４α ｃＤＮＡを、ヒト脳ｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲにより獲得した。その後Ｎ末端に（６×Ｈｉｓ）−Ｘｐｒｅｓｓタグを付加させる動物細胞用発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（インビトロジェン社）に組み込みＨＮＦ−４α発現プラスミド（ＨＮＦ−４α／ｐｃＤＮＡ  ３．１／Ｈｉｓ）を構築した。なお、クローニングしたＨＮＦ−４αｃＤＮＡのアミノ酸翻訳配列は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースのアクセッション番号Ｐ４１２３５（登録遺伝子名はＨＮＦ４Ａ）と同一である。
【００８４】
ヒトＣＲＥＢ１[Ｈｕｍａｎ  ｃＡＭＰ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＥＢ１）]発現プラスミドを以下のように構築した。ヒトＣＲＥＢ１  ｃＤＮＡをＨｅＬａ細胞由来ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ  ＨｅＬａ  Ｑｕｉｃｋ−ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ、クローンテック社）よりＰＣＲにより獲得し、シーケンスにより配列を確認した。その後、Ｎ末端に（６×Ｈｉｓ）−Ｘｐｒｅｓｓタグを付加させる動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（インビトロジェン社）に組み込み、ＣＲＥＢ１発現プラスミド（ＣＲＥＢ１／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ）を構築した。なお、クローニングしたＣＲＥＢ１  ｃＤＮＡのアミノ酸配列はＮＣＢＩ  ｐｒｏｔｅｉｎデータベースのアクセション番号ＮＰ＿００４３７０（登録遺伝子名はＣＲＥＢ１）と同一である。
【００８５】
ＲＳＫＢの活性化と精製は以下のように行った。細胞数１．２×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃にて５％ＣＯ２の存在下で一晩培養した後（直径１００ｍｍシャーレ、４枚）、１０μｇ／シャーレのＲＳＫＢ発現プラスミド（ＲＳＫＢ／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２）をＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて細胞にトランスフェクションした。２日間培養した後、終濃度５０ｍＭとなるようにメタ亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｒｓｅｎｉｔｅ）を培地中に添加し、３７℃で３０分処理して細胞を回収した。細胞を冷却したリン酸緩衝生理食塩水（−）〔以下、ＰＢＳ（−）と称する。〕で洗浄後、ＢｕｆｆｅｒＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１０％  グリセロール／５００μＭ  ＤＴＴ／  ５ｍＭ  ＮａＰＰｉ／１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／５０ｍＭ  ＮａＦ／１％  Ｔｒｉｔｏｎ−  Ｘ１００）を４ｍｌ加えてよくピペッティングし、４℃で３０分攪拌した。その後、終濃度１５０ｍＭとなるようＮａＣｌを加え、１００００ｇ×１０分（４℃）で遠心した。上清を回収し、ＢｕｆｆｅｒＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１０％  グリセロール／５００μＭ  ＤＴＴ／５ｍＭ  ＮａＰＰｉ／１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／５０ｍＭ  ＮａＦ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄したＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーゲル（シグマ社）を１００μｌ加え、４℃で１時間転倒混和した。混和後、１０倍容量のＢｕｆｆｅｒＢでゲルを２回洗浄し、１０倍容量のＢｕｆｆｅｒＣ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１０％  グリセロール／０．５μＭ  ＤＴＴ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で１回洗浄した。その後ゲルを４００μｌのＢｕｆｆｅｒＤ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１０％  グリセロール／０．５μＭ  ＤＴＴ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％  ＮＰ−４０／３００μｇ／ｍｌ  ＦＬＡＧペプチド）で３回溶出した。溶出した各画分はＣＢＢ染色を実施し、精製度を確認するとともにＢｕｆｆｅｒＣによる透析をおこない、活性体ＲＳＫＢとして使用まで−８０℃にて保存した。図１に活性型ＲＳＫＢ蛋白質をＣＢＢ染色した結果を示す。
【００８６】
ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）（ＰＫＡ）酵素はウシＰＫＡ（ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、触媒サブユニット、プロメガ社）を使用した。
【００８７】
＜方法＞
免疫沈降リン酸化試験は以下のように行った。細胞数７×１０５のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃にて５％ＣＯ２の存在下で一晩培養した後（直径６０ｍｍシャーレ）、５μｇのＨＮＦ−４α発現プラスミド（ＨＮＦ−４α／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ）またはＣＲＥＢ１発現プラスミド（ＣＲＥＢ１／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ）をＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて細胞にトランスフェクションした。２日間培養後、細胞を冷却したＰＢＳ（−）で洗浄し、ＲＩＰＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１％  ＮＰ−４０／０．５％  デオキシコール酸ナトリウム塩（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）／０．１％  ＳＤＳ）にプロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）を添加したものを５００μｌ加え、ピペッティングにて細胞を懸濁し、氷上で２０分間静置して細胞を溶解させた。その後、軽くボルテックスをして１４，０００ｒｐｍ×１０分間（４℃）で遠心し、上清を採取した。上清４８０μｌにマウスＩｇＧアガロース（シグマ社）を２０μｌ加え、４℃で１時間転倒混和した（ｐｒｅ−ｃｌｅａｎ）。その後、１４，０００ｒｐｍ×１分間（４℃）で遠心を行ない、採取した上清４５０μｌに抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（インビトロジェン社）１μｌを加え、４℃で１時間転倒混和した後、０．１％ＢＳＡ／ＴＢＳ（ｐＨ８．０）でブロッキングしたＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社）を１０μｌ加え、さらに４℃で１時間転倒混和を行なった。その後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅをＲＩＰＡで３回、ｋｉｎａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（セル・シグナリング社）で２回洗浄した。１０μｌの洗浄したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに５μｌの活性型ＲＳＫＢ蛋白質、３μｌの１０×ｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）／１２ｍＭ  ＥＤＴＡ／６００ｍＭ  ＫＣｌ／１０ｍＭ  ＤＴＴ／５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、２μｌの１００μＭ  ＡＴＰ  、０．５μｌのγ３２Ｐ−ＡＴＰ  （５μＣｉ）、８．５μｌの蒸留水を加え合計２９μｌとし、３０℃で３０分間反応させた。ＰＫＡを用いた試験では、上記と同様に調整した１０μｌのＨＮＦ−４α／ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、１．５μｌのＰＫＡ、３μｌの１０×Ｋｉｎａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、２μｌの１００μＭ  ＡＴＰ、０．５μｌのγ３２Ｐ−ＡＴＰ（５μＣｉ）、３．５μｌの１０×ｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ、８．５μｌの蒸留水を加え合計２９μｌとし、３０℃で３０分反応させた。反応は２０μｌの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え停止させ、１００℃で５分加熱しＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料とした。１０％ゲルにて蛋白を分離し、ハイブリパックに挟み、ＢＡＳ２０００（富士フィルム社）の画像処理により、リン酸化の有無を確認した。
【００８８】
＜結果＞
図３に示したように、精製されたＲＳＫＢによるＣＲＥＢ１蛋白のリン酸化が認められ、使用したＲＳＫＢ蛋白が活性を有することが確認された。この活性型ＲＳＫＢ蛋白を用いてＨＮＦ−４αに対するリン酸化反応を検討した結果、ＲＳＫＢ依存的なリン酸化が認められ、ＨＮＦ−４αはＲＳＫＢの基質であることが明らかとなった。
【００８９】
実施例３
（ＨＮＦ−４αのＡＦ１配列に対するＥＭＳＡ）
ＨＮＦ−４αのＡＦ１配列に対するＤＮＡ結合能に対するリン酸化の影響をｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ（ＥＭＳＡ）により検討した。また、ＲＳＫＢの特異性を検討するため、ＨＮＦ−４αをリン酸化することが知られているＰＫＡについても同様にＥＭＳＡを実施した。
【００９０】
＜材料＞
図４に示したように、ＡＦ１プローブの合成は、ヒトＰＥＰＣＫ遺伝子のプロモーター領域（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ３１５１９）よりＨＮＦ−４αの結合サイトであるＡＦ１相当配列から、ＡＦ１／Ｓ／ＨＮＦ４（５´−ＧＴＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＴＡ−３´）（配列番号７）及びＡＦ１／ＡＳ／ＨＮＦ４（５´−ＡＴＡＧＴＣＡＡＡＧＧＴＣＡ−３´）（配列番号８）の二本のプローブを合成した（シグマジェノシスジャパン社）。
【００９１】
ＨＮＦ−４α発現プラスミド（ＨＮＦ−４α／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２）は、先に構築したＨＮＦ−４α発現プラスミドＨＮＦ−４α／ｐｃＤＮＡ  ３．１／ＨｉｓからＥｃｏＲＩサイトで、ＨＮＦ−４αのｃＤＮＡ配列をＮ末端ＦＬＡＧタグの付いた動物細胞用発現プラスミドｐＣＭＶ−Ｔａｇ２（ストラタジーン社）に組換えをおこない、発現プラスミドＨＮＦ−４α／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２を構築した。
【００９２】
ＨＮＦ−４α蛋白の精製は以下のように行った。細胞数１．２×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃にて５％ＣＯ２の存在下で一晩培養した後（直径１００ｍｍシャーレ、４枚）、１０μｇ／シャーレのＨＮＦ−４α発現プラスミド（ＨＮＦ−４α／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２）をＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて細胞にトランスフェクションした。２日間培養後、細胞を冷却したＰＢＳ（−）で洗浄し、４ｍｌのＢｕｆｆｅｒＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／  １ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１０％  グリセロール／５００μＭ  ＤＴＴ／５ｍＭ  ＮａＰＰｉ／１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／５０ｍＭ  ＮａＦ／１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）を加えてよくピペッティングし、４℃で３０分攪拌した。その後、終濃度１５０ｍＭとなるようＮａＣｌを加え、１０，０００ｇ×１０分（４℃）で遠心した。上清を回収し、ＢｕｆｆｅｒＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１０％  グリセロール／５００μＭ  ＤＴＴ／５ｍＭ  ＮａＰＰｉ／１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／５０ｍＭ  ＮａＦ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄した１００μｌのＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（シグマ社）を加え、４℃で１時間転倒混和した。混和後、１０倍容量のＢｕｆｆｅｒＢでゲルを２回、ＢｕｆｆｅｒＣ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１０％  グリセロール／０．５μＭ  ＤＴＴ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で１回洗浄した。その後ゲルを４００μｌのＢｕｆｆｅｒＤ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ／０．５μＭ  ＤＴＴ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％  ＮＰ−４０／３００μｇ／ｍｌ  ＦＬＡＧペプチド）で２回溶出した。溶出した各画分はそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこない、ＢｕｆｆｅｒＣにて透析後、ＣＢＢ染色を行って精製度を確認した。図５にＦＬＡＧ−ＨＮＦ−４α蛋白質をＣＢＢ染色した結果を示す。
【００９３】
＜方法＞
プローブの放射性標識化および精製は以下のようにおこなった。合成したプローブを各々１００ｐｍｏｌ／μｌになるように蒸留水に溶解し、１００℃で２分、３８℃で１時間加熱後、自然冷却してＤＮＡをアニールさせた。これを１０倍希釈して０．５μｌを分取し、１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、６μｌのγ３２Ｐ−ＡＴＰ（６０μＣｉ）、２μｌの１０×Ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ  Ｅｎｄ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１００ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）、１０．５μｌの蒸留水を加え３７℃で１時間インキュベートした。Ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ  Ｅｎｄとは「突出末端」を意味し、Ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ  Ｅｎｄ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼが２本鎖ＤＮＡの突出末端の５´−末端にγＡＴＰのγ位のリン酸基を付加する際に用いるバッファーである。その後、５μｌの０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ、５μｌの２０ｍｇ／ｍｌイーストＲＮＡを加え、蒸留水で１００μｌとし、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、５０μｌのＳＴＥ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解した。その後、ＣＥＮＴＲＩ・ＳＰＩＮ  ２０（プリンストン・セパレーションズ社）でゲルろ過をおこない、放射性標識ＡＦ１プローブとした。
【００９４】
ＲＳＫＢＰおよびＰＫＡによるリン酸化処理とＥＭＳＡは以下のように行った。６．２５μｌのＦＬＡＧ−ＨＮＦ−４α蛋白質に、５μｌの段階的（１×、１／２、１／４）に希釈した活性型ＲＳＫＢ蛋白質、２μｌの１０×ｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）／１２ｍＭ  ＥＤＴＡ／６００ｍＭ  ＫＣｌ／１０ｍＭ  ＤＴＴ／５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、４μｌの１ｍＭ  ＡＴＰと２．７５μｌの蒸留水を加え計２０μｌとし、３０℃で３０分反応させた。ＰＫＡによるリン酸化ではＲＳＫＢ蛋白質の代わりに１．５μｌのＰＫＡを使用した。反応後、４μｌの反応液を分取し、２μｌの１０×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／５００ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＤＴＴ／５０％  グリセロール）、１μｌの１ｍｇ／ｍｌポリｄＩｄＣ、１１μｌの蒸留水を混合し計１８μｌとし、氷上で１０分反応させた。この時、一部のサンプルには抗ＨＮＦ−４α抗体（Ｃ−１９、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）１μｌを添加した。その後、放射性標識ＡＦ１プローブを２μｌ加え、室温で２０分反応させた。６％アクリルアミドゲルを０．２５×ＴＢＥ[０．２５×ＥＤＴＡ含有トリスホウ酸バッファー（１２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１２．１ｍＭ  ホウ酸）]で１時間、４℃でプレラン後、各試料を１５μｌずつアプライして１時間５０分、４℃で泳動した。その後６５℃、１時間でゲルを乾燥させ、ＢＡＳ２０００（富士フィルム社）での画像処理により、プローブへのＨＮＦ−４αの結合の有無を確認した。
【００９５】
＜結果＞
図６および７に示したように、ＲＳＫＢにてリン酸化処理されたＨＮＦ−４αは、非処理試料に比べＡＦ１配列に対するＤＮＡ結合能が亢進しており、またＲＳＫＢの用量依存性も確認された。一方、ＰＫＡにてリン酸化処理された試料では非処理試料と同程度の結合しかみられなかったことから、ＲＳＫＢ処理によるＨＮＦ−４αのＤＮＡ結合能の亢進作用は、特異的なものであることが示された。
【００９６】
実施例４
（ＰＥＰＣＫプロモーターを用いたレポーターアッセイ）
ＰＥＰＣＫプロモーターにおけるＨＮＦ−４αの転写活性能におよぼすＲＳＫＢの影響をルシフェラーゼレポーターアッセイにより、ＨｅＬａ細胞とＨｅｐＧ２細胞にて検討した。
【００９７】
＜材料＞
ＲＳＫＢ発現プラスミドは、先に実施した「ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化」のＲＳＫＢ／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２を使用した。
【００９８】
ドミナントネガティブＲＳＫＢ（Ｓ３４３Ａ）発現プラスミド（ＲＳＫＢ（Ｓ３４３Ａ）／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２）は、３４３番目のセリンをアラニンに置換するとＲＳＫＢのキナーゼ活性が消失することから（非特許文献３４）、ＲＳＫＢ／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２を鋳型としてＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ストラタジーン社）を用いて３４３番目のアミノ酸置換を実施して構築した。
【００９９】
ＨＮＦ−４α発現プラスミドは、先に実施した「ＨＮＦ−４αのＡＦ１配列に対するＥＭＳＡ」のＨＮＦ−４α／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２を使用した。
【０１００】
ＭＡＰＫ１１発現プラスミド（ＭＡＰＫ１１／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４）の構築は以下のように行った。ヒトＭＡＰＫ１１（ｐ３８−ｂｅｔａ２）ｃＤＮＡはヒト脳由来ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｗｈｏｌｅ  Ｑｕｉｃｋ−ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ、クローンテック社）よりＰＣＲにより獲得し、シーケンスにて配列を確認した。その後、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付加させる動物細胞用発現プラスミドｐＣＭＶ−Ｔａｇ４（ストラタジーン社）に組み込み、ＭＡＰＫ１１発現プラスミド（ｐ３８−ｂｅｔａ２／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４）を構築した。なお、クローニングしたＭＡＰＫ１１  ｃＤＮＡのアミノ酸配列はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースのアクセション番号Ｑ１５７５９（登録遺伝子名はＭＡＰＫ１１／ＳＡＰＫ２Ｂ）と同一である。
【０１０１】
ＰＥＰＣＫ  ＡＦ１プロモーター依存性ルシフェラーゼレポータープラスミド（ＰＥＰＣＫ  ＡＦ１プロモーター／ｐＧＬ３）の構築は以下のように行った。ヒトＰＥＰＣＫ（ＰＣＫ１）プロモーター領域のうちＨＮＦ−４αのシスエレメントであるＡＦ１を含む領域（ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｕ３１５１９の塩基配列８８２〜１４０６番目）をヒトゲノムＤＮＡ（クローンテック社）よりＰＣＲにより獲得し、シーケンスにて配列を確認した。この領域はＰＥＰＣＫ遺伝子のエキソン１の１番目の塩基位置を＋１とすると−４６９〜＋６３に相当する（非特許文献３５）。その後、この領域をレポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼを発現させるレポータープラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社）に挿入し、ＰＥＰＣＫ  ＡＦ１プロモーター／ｐＧＬ３を構築した。
【０１０２】
ＰＥＰＣＫ  ΔＡＦ１プロモーター依存性ルシフェラーゼレポータープラスミド（ＰＥＰＣＫ ΔＡＦ１プロモーター／ｐＧＬ３）は、先にクローニングしたヒトＰＥＰＣＫプロモーター領域から、ＡＦ１を含まない部分（Ｕ３１５１９の塩基配列９３４〜１４０６番目）をＰＣＲにより獲得した。シーケンスにて配列を確認後、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社）に挿入して構築した。
【０１０３】
グルココルチコイドレセプター（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）発現プラスミドには、ラットグルココルチコイドを発現させるｐＭＭＧＲを使用した（非特許文献３６）。
【０１０４】
遺伝子導入効率補正プラスミド（インターナルコントロール）には、レポーター遺伝子としてウミシイタケルシフェラーゼを発現させるｐｈＲＬ−ｎｕｌｌプラスミドまたはｐＲＬ−ＳＶ４０プラスミド（プロメガ社）を使用した。
【０１０５】
ＭＡＰＫ１１阻害剤には、ＳＢ２０３５８０をプロメガ社より購入して用いた。
【０１０６】
＜方法＞
ＨｅＬａ細胞におけるレポーターアッセイは以下のように行った。細胞数６×１０４／ウェルのＨｅＬａ細胞を３７℃にて５％ＣＯ２の存在下で一晩培養した後（２４ウェルプレート（２．０ｃｍ２／ウェル））、０．２５μｇのＰＥＰＣＫ  ＡＦ１プロモーター／ｐＧＬ３、０．０５〜０．２μｇのＨＮＦ−４α／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２、０．２５μｇのＲＳＫＢ／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２、０．０５μｇのＭＡＰＫ１１／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４および０．０２５μｇのインタナールコントロールｐｈＲＬ−ｎｕｌｌを予め設定した組み合わせでＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて細胞にトランスフェクションした。総ＤＮＡ量は各実験群で一定量となるように、空ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ２（ストラタジーン社）にて補正した。２日間培養後、細胞を冷却したＰＢＳ（−）で洗浄し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（プロメガ社）にて細胞溶解液中のホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。転写活性はホタルルシフェラーゼ活性値をウミシイタケルシフェラーゼ活性値で除した後、コントロール群（ＰＥＰＣＫ  ＡＦ１プロモーター／ｐＧＬ３のみ）に対する倍数で表示した。
【０１０７】
ＨｅｐＧ２細胞におけるレポーターアッセイは以下のように行った。細胞数１×１０４／ウェルのＨｅｐＧ２細胞を３７℃にて５％ＣＯ２の存在下で一晩培養した後（２４ウェルプレート（２．０ｃｍ２／ウェル）、０．５μｇのＰＥＰＣＫ  ＡＦ１プロモーター／ｐＧＬ３、０．５μｇのＨＮＦ−４α／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２、０．２５μｇおよび０．５μｇのＲＳＫＢ／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２、０．５μｇのＭＡＰＫ１１／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４、０．５μｇのｐＭＭＧＲおよび０．０５μｇのインターナルコントロールｐＲＬ−ＳＶ４０を予め設定した組み合わせでＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて細胞にトランスフェクションした。総ＤＮＡ量は各実験群で一定量となるように、空ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ２（ストラタジーン社）にて補正した。ＭＡＰＫ１１阻害剤ＳＢ２０３５８０を添加した群は、ＦｕＧＥＮＥ６によるトランスフェクション直前に終濃度１０μＭとなるようにＳＢ２０３５８０を培地に添加した。トランスフェクション後２０時間にデキサメサゾンを終濃度１μＭとなるように培地に添加し、さらに２４時間培養後、細胞を冷却したＰＢＳ（−）で洗浄し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（プロメガ社）にて細胞溶解液中のホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。転写活性はホタルルシフェラーゼ活性値をウミシイタケルシフェラーゼ活性値で除した後、ＲＳＫＢ非発現群（ＨＮＦ−４α０．５）に対する倍数で表示した。
【０１０８】
統計解析はバートレット検定によって分散を、多重比較検定によって平均値をそれぞれ検定した。
【０１０９】
＜結果＞
図８に示したようにＨｅＬａ細胞において、ＰＥＰＣＫ  ＡＦ１プロモーターに対してＨＮＦ−４αを発現させると用量依存的に転写活性の増加が認められ、ＨＮＦ−４αはＰＥＰＣＫ遺伝子の転写活性を正に制御することが確認された。次にＲＳＫＢをＨＮＦ−４αと共発現させＨＮＦ−４αの転写活性に対する影響を検討したが、図８に示したようにＲＳＫＢ非発現群と明瞭な差は認められなかった。これはＲＳＫＢ自身のキナーゼ活性が不十分であると考えられたことから、ＲＳＫＢを活性化させるために上流キナーゼであるＭＡＰＫ１１（ｐ３８−ｂｅｔａ２）をＲＳＫＢと共発現させ、転写活性への影響を検討した。その結果、図９に示したように、ＨＮＦ−４α発現群（ＨＮＦ−４α０．０５）に比べ、活性化ＲＳＫＢ発現群（ＨＮＦ−４α０．０５＋ＲＳＫＢ  ０．２５＋ＭＡＰＫ１１  ０．０５）では転写活性が３倍以上増加した。一方、ＲＳＫＢを除いたＭＡＰＫ１１発現群（ＨＮＦ−４α０．０５＋ＭＡＰＫ１１  ０．０５）ではＨＮＦ−４αの転写活性の促進は認められなかった。さらに、図１０に示したように、キナーゼ活性を持たないドミナントネガティブＲＳＫＢ（Ｓ３４３Ａ）では、ＭＡＰＫ１１と共発現させてもＨＮＦ−４αの転写活性の促進が見られなかった（図１０、ＨＮＦ−４α０．０５＋ＲＳＫＢ（Ｓ３４３Ａ）  ０．２５＋ＭＡＰＫ１１  ０．０５）。また、図１１に示したように、ＡＦ１を除いたＰＥＰＣＫΔＡＦ１プロモーターではＨＮＦ−４αの転写活性が認められず、今回のＨＮＦ−４αの転写活性はＡＦ１領域への結合を介して行われていることが確認された。以上の結果から、ＲＳＫＢによってリン酸化されたＨＮＦ−４αはＰＥＰＣＫプロモーターのＡＦ１への結合を介して転写活性を促進することが実証された。
【０１１０】
図１２に示したように、肝細胞由来のＨｅｐＧ２細胞において、ＭＡＰＫ１１をＲＳＫＢと共発現させると（ＨＮＦ−４α ０．５＋ＲＳＫＢ  ０．５＋ＭＡＰＫ１１  ０．５）、ＨＮＦ−４αのＰＥＰＣＫ  ＡＦ１プロモーターに対する転写活性はＲＳＫＢ非発現群（ＨＮＦ−４α０．５）よりも３倍以上増加した。さらにＭＡＰＫ１１阻害剤ＳＢ２０３５８０を添加し、ＭＡＰＫ１１によるＲＳＫＢの活性化を阻害するとＨＮＦ−４αの転写活性の増加が消失した（ＨＮＦ−４α０．５＋ＲＳＫＢ  ０．５＋ＭＡＰＫ１１  ０．５＋ＳＢ２０３５８０）。以上の結果より、ＨｅｐＧ２細胞においてもＲＳＫＢによってリン酸化されたＨＮＦ−４αはＡＦ１を含むＰＥＰＣＫプロモーターの転写活性を促進することが実証された。
【０１１１】
実施例５
実験例１．糖尿病モデル動物での肝臓中ＨＮＦ−４αのリン酸化の検出
糖尿病を発症するＺＤＦ−ｆａ／ｆａ雄性ラットおよび正常動物のＺＤＦ−ｌｅａｎ雄性ラットを日本チャールズリバー社より５週齢で購入し、飼育維持する。６、８、１９週齢に採血した後、ペントバルビタール麻酔下で屠殺し、肝臓を採取する（各週齢ｎ＝６）。採取した血液は血中グルコース濃度とインスリン濃度をそれぞれ測定し、ＺＤＦ−ｆａ／ｆａで糖尿病が発症していることを確認する。肝臓は氷冷下でセルリシスバッファー[ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１％  Ｔｒｉｔｏｎ／２．５ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ／１ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ／１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）]中でホモジナイズし、氷冷下で３０分静置後、１５０００ｒｐｍ×１０分遠心した上清を細胞ライセートとする。作製した細胞ライセートに抗ＨＮＦ−４α抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を添加し４℃で１時間転倒混和した後、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）／Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水[Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）]（ｐＨ８．０）でブロッキングしたｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を加え、さらに４℃で１時間転倒混和する。その後、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅをセルリシスバッファーで２回洗浄し、２×ＳＤＳサンプルバッファーを添加し、１００℃で５分間加熱したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料とする。５−２０％ゲルで蛋白質を分解し、抗リン酸化セリン抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）および抗リン酸化スレオニン抗体（Ｚｙｍｅｄ社）を用いたウェスタンブロット法により、リン酸化ＨＮＦ−４αを検出する。糖尿病発症動物（ＺＤＦ−ｆａ／ｆａ）が正常動物（ＺＤＦ−ｌｅａｎ）よりＨＮＦ−４αのセリン・スレオニン残基のリン酸化が増加することにより、ＨＮＦ−４αのリン酸化が糖尿病病態下で亢進することが証明できる。
【０１１２】
実験例２．糖尿病モデル動物での肝臓中ＲＳＫＢの活性化の検出
糖尿病発症動物（ＺＤＦ−ｆａ／ｆａ）および正常動物（ＺＤＦ−ｌｅａｎ）から上記実験例と同様に肝臓細胞ライセートを作製する。これに抗ＲＳＫＢ抗体とｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅを添加し、上記実験例と同様の免疫沈降法によりＲＳＫＢを回収する。回収したＲＳＫＢ蛋白のキナーゼ活性は、合成基質クレビタイド[ＣＲＥＢｔｉｄｅ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）]（配列番号９）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙにより検出する（非特許文献３４）。すなわち、ＲＳＫＢ結合レジンをキナーゼバッファー[Ｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１４０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＮａＰＰｉ／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）]中でＣＲＥＢｔｉｄｅ(３３μＭ)およびγ−３２Ｐ−ＡＴＰと混和し、２２℃、３０分インキュベートする。その後、反応液をｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｉｌｔｅｒ  ｐａｐｅｒ  Ｐ８１（Ｗｈａｔｍａｎ社）に吸着させ、洗浄後、液体シンチレーションカウンターにて放射能を検出する。糖尿病発症動物（ＺＤＦ−ｆａ／ｆａ）が正常動物（ＺＤＦ−ｌｅａｎ）よりＲＳＫＢキナーゼ活性が増加することにより、肝臓中ＲＳＫＢ活性が糖尿病病態下で亢進することが証明できる。
【０１１３】
実験例３．糖尿病モデル動物におけるＲＳＫＢ阻害剤の抗糖尿病効果
糖尿病を発症するＺＤＦ−ｆａ／ｆａ雄性ラットを日本チャールズリバー社より５週齢で購入し、飼育維持する。動物を２群に分け（各群ｎ＝５）、６週齢からＲＳＫＢ阻害剤のＨ８９（Ｎ−[２−（（ｐ−ブロモシンナミル）アミノ）エチル]−５−イソキノリンスルホナマイド；Ｎ−[２−（（ｐ−Ｂｒｏｍｏｃｉｎｎａｍｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ]−５−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）（非特許文献３４）を５ｍｇ／ｋｇ／日で１４日間連続皮下投与する。１４日間投与終了後に動物をペントバルビタール麻酔下で屠殺し、肝臓を採取する。また、Ｈ−８９投与開始前と投与終了後に血液を採取し、血中グルコース濃度とインスリン濃度（レビスインスリンキット、シバヤギ社）を測定する。採取した肝臓を用いてＨＮＦ−４αのリン酸化およびＲＳＫＢ活性を上記実験例１、２と同様に測定するとともに、ＰＥＰＣＫ蛋白質発現量をウェスタンブロット法により検出する。上記実験例１と同様に作製した肝臓細胞ライセートに２×ＳＤＳサンプルバッファーを等容量添加し１００℃で５分間加熱したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥの試料とする。５−２０％ゲルで蛋白質を分離し、抗ＰＥＰＣＫ抗体を用いたウェスタンブロット法によりＰＥＰＣＫを検出する。Ｈ−８９投与によりＲＳＫＢ活性、ＨＮＦ−４αのリン酸化およびＰＥＰＣＫ蛋白質発現のいずれも低下し、糖新生が抑制されることにより血中グルコース濃度の低下が起こる。
【０１１４】
上記実験例１、２により、糖尿病モデル動物の肝臓ではＲＳＫＢの活性化とそれに伴うＨＮＦ−４αのリン酸化が亢進していることが示される。実験例３により、ＲＳＫＢを阻害することでＰＥＰＣＫの発現が低下し、肝臓の糖新生が抑制されることが証明できる。なお、Ｈ−８９はＲＳＫＢ以外にＰＫＡ（ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）を阻害する作用がある。ＰＫＡはＣＲＥＢをリン酸化し、リン酸化されたＣＲＥＢはＣＲＥを有するプロモーターの転写活性を亢進する（非特許文献１１）。従って、ＰＫＡの抑制はＣＲＥＢを介するＰＥＰＣＫ遺伝子発現を低下させる可能性がある。しかし、糖尿病モデル動物の肝臓ではＣＲＥＢのリン酸化が増加するどころか逆に低下しており、ＰＫＡも活性化されておらず、ＰＫＡシグナルは糖尿病病態下の肝臓でのＰＥＰＣＫ発現増加に関与していないことが示されている（非特許文献３９）。また、ＰＫＡはＨＮＦ−４αをリン酸化するが、このリン酸化によってＨＮＦ−４αのＰＥＰＣＫプロモーターへの結合能が亢進することはない（実施例２、図５）。従ってＨ−８９がＰＥＰＣＫ発現を抑制した場合、それはＰＫＡではなくＲＳＫＢ阻害に起因すると考えることができる。上記の実験例により、生体内においてＲＳＫＢを阻害すれば肝臓でのＨＮＦ−４αのリン酸化が抑制され、ＰＥＰＣＫを介する糖新生能が低下し、抗糖尿病効果が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
上記のように、本発明において提供するＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化阻害剤および／またはリン酸化阻害方法により、ＨＮＦ−４αが作用する遺伝子の遺伝子産物の産生阻害、例えばＰＥＰＣＫ遺伝子の遺伝子産物の産生阻害が可能になる。また、ＨＮＦ−４αが作用する遺伝子の遺伝子産物の増加に起因する疾患の防止および／または治療が可能になる。具体的には、例えばＰＥＰＣＫ遺伝子産物の増加に起因する疾患、より具体的には糖尿病などの防止および／または治療が可能である。このように本発明は、糖新生関連遺伝子発現に関与するＨＮＦ−４αの過剰なリン酸化に起因する疾患の防止および／または治療のために非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αの相互作用をインシリコで予測した結果を示す。ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αのローカルアライメントを行い、高いスコアを示した領域を表示した。上の配列および下の配列はそれぞれ、ＲＫＳＢに存在する配列およびＨＮＦ−４αに存在する配列である。
【図２】Ｎ末端ＦＬＡＧタグ動物細胞用発現プラスミドにてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性発現させ、ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーゲルを用いて精製した活性型ＦＬＡＧ−ＲＳＫＢ蛋白質のＣＢＢ染色像を示す。１、２はそれぞれＦＬＡＧによる溶出画分１、溶出画分２を示す。実験には溶出画分１を使用した。矢頭は精製ＦＬＡＧ−ＲＳＫＢ蛋白質を示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカー（Ｍ）の分子量である。
【図３】ＨＮＦ−４αのインビトロ免疫沈降リン酸化試験の結果、ＨＮＦ−４αがＲＳＫＢによりリン酸化されることを示す。Ａは陽性対照のＰＫＡによるリン酸化試験、ＢはＲＳＫＢによるリン酸化試験の結果を示す。ＣＲＥＢ１のＲＳＫＢによるリン酸化は、精製されたＲＳＫＢ蛋白質が活性を有することを示す。図中の＋および−はそれぞれの蛋白質の有無を示している。矢頭はＨＮＦ−４αを、スターマーク（＊）はＣＲＥＢ１のリン酸化体を示す。図の左列に記載した数値は、分子量マーカーの分子量である。
【図４】ヒトホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ３１５１９）を示す。ゲルシフトアッセイで用いたＡＦ１配列を太字枠内に示す。ＰＥＰＣＫ  ＡＦ１プロモーター／ｐＧＬ３は図の矢印１，３で区切られた８８２〜１４０６番目の塩基配列（ボールド表示）を、ＰＥＰＣＫ  ΔＡＦ１プロモーター／ｐＧＬ３は矢印２，３で区切られた９３４〜１４０６番目の塩基配列をそれぞれ使用した。左列の数字はＵ３１５１９の塩基配列番号を示す。
【図５】Ｎ末端ＦＬＡＧタグ動物細胞用発現プラスミドにてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性発現させ、ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーゲルを用いて精製したＦＬＡＧ−ＨＮＦ−４α蛋白質のＣＢＢ染色像を示す。１、２はそれぞれＦＬＡＧによる溶出画分１、溶出画分２を示す。実験には溶出画分１を使用した。矢頭は精製ＦＬＡＧ−ＨＮＦ−４α蛋白質を示す。図の右列に記載した数値は分子量マーカー（Ｍ）の分子量である。
【図６】ＨＮＦ−４αのＰＥＰＣＫプロモーターのＡＦ１配列に対するＥＭＳＡの結果を示す。Ａは、ＨＮＦ−４αがＡＦ１配列に結合することを示す図である。抗ＨＮＦ−４α抗体の添加により、ＨＮＦ−４α・ＤＮＡ複合体の移動度が小さくなるスーパーシフトが見られる。Ｂは、ＡＦ１配列のＤＮＡ結合活性に対するＲＳＫＢによるリン酸化の影響を示す図面である。ＲＳＫＢによるリン酸化処理により、ＨＮＦ−４αのＡＦ１配列に対する結合活性は亢進したが、ＰＫＡではその作用は見られない。ＢにおけるＨＮＦ−４αの使用量はＡの約１０分の１である。図中の＋および−は抗ＨＮＦ−４α抗体の添加の有無を示している。
【図７】ＲＳＫＢによるＨＮＦ−４αのリン酸化が、ＡＦ１配列への結合を亢進させる作用の用量依存性を示す。ＨＮＦ−４αのリン酸化処理に使うＲＳＫＢ量を減少させるにつれ、ＨＮＦ−４αのＡＦ１結合活性が低下する。一方、ＰＫＡ処理（ＰＫＡ）では、ＨＮＦ−４αのＡＦ１結合の亢進は見られない。１×、１／２、１／４はそれぞれ原液、２倍および４倍希釈したＲＳＫＢによるリン酸化資料のＥＭＳＡを示す。スターマーク（＊）は、抗ＨＮＦ−４α抗体の添加を示す。
【図８】ＨｅＬａ細胞におけるＰＥＰＣＫ ＡＦ１プロモーターを用いたレポーターアッセイの結果を示す。ＨＮＦ−４αの導入量に依存して転写活性が亢進し、ＨＮＦ−４αがＰＥＰＣＫ遺伝子を正に制御することを示す図面である。また、ＲＳＫＢを発現させてもＨＮＦ−４αの転写活性には影響がないことも示している。縦軸はコントロール群（ＰＥＰＣＫＡＦ１プロモーター／ｐＧＬ３のみ導入）の転写活性を１．００とした時の倍数である。グラフの高さおよびグラフ上段の値は各群のｎ＝３の平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。各群の蛋白質の横の数字は導入ＤＮＡ量である（例：ＨＮＦ−４α０．０５は、０．０５μｇのＨＮＦ−４α発現プラスミドを導入した）。＊：コントロールに対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、＃：ＨＮＦ−４α０．０５に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、＄：ＨＮＦ−４α０．１に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、＋：ＨＮＦ−４α０．２に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、￥：ＲＳＫＢ０．２５に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）。
【図９】ＨｅＬａ細胞におけるＰＥＰＣＫ ＡＦ１プロモーターを用いたレポーターアッセイの結果を示す。ＨＮＦ−４αによる転写活性がＭＡＰＫ１１によって活性化されたＲＳＫＢによって促進されることを示す図面である。ＲＳＫＢを除いてＭＡＰＫ１１だけを発現させてもＨＮＦ−４αの転写活性に影響がないことから、この作用はＲＳＫＢによるものと判断できる。縦軸はコントロール群（ＰＥＰＣＫＡＦ１プロモーター／ｐＧＬ３のみ導入）の転写活性を１．００とした時の倍数である。グラフの高さおよびグラフ上段の値は各群のｎ＝３の平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。各群の蛋白質の横の数字は導入ＤＮＡ量である（例：ＨＮＦ−４α０．０５は、０．０５μｇのＨＮＦ−４α発現プラスミドを導入した）。＊：コントロールに対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、＃：ＨＮＦ−４α０．０５に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、＄：ＲＳＫＢ ０．２５＋ＭＡＰＫ１１ ０．０５に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、＋：ＨＮＦ−４α ０．０５＋ＲＳＫＢ ０．２５＋ＭＡＰＫ１１ ０．０５に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）。
【図１０】ＨｅＬａ細胞におけるＰＥＰＣＫ ＡＦ１プロモーターを用いたレポーターアッセイの結果を示す。ＨＮＦ−４αによる転写活性がＲＳＫＢによって促進されることを示す図である。ドミナントネガティブＲＳＫＢ（Ｓ３４３Ａ）ではＭＡＰＫ１１を共発現させてもＨＮＦ−４αの転写活性は促進されない。縦軸はコントロール群（ＰＥＰＣＫＡＦ１プロモーター／ｐＧＬ３のみ導入）の転写活性１．００とした時の倍数である。グラフの高さおよびグラフ上段の値は各群のｎ＝３の平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。各群の蛋白質の横の数字は導入ＤＮＡ量である（例：ＨＮＦ−４α０．０５は、０．０５μｇのＨＮＦ−４α発現プラスミドを導入した）。＊：コントロールに対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、＃：ＨＮＦ−４α０．０５に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、＄：ＨＮＦ−４α０．０５＋ＲＳＫＢ０．２５＋ＭＡＰＫ１１０．０５に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）。
【図１１】ＨｅＬａ細胞におけるＰＥＰＣＫ ΔＡＦ１プロモーターを用いたレポーターアッセイの結果を示す。ＨＮＦ−４αによる転写活性はＰＥＰＣＫプロモーター領域のＡＦ１に依存することを示す図である。ＡＦ１がないためにＨＮＦ−４αを共発現させても、転写活性の促進はみられない。縦軸はコントロール群（ＰＥＰＣＫΔＡＦ１プロモーター／ｐＧＬ３のみ導入）の転写活性を１．００とした時の倍数である。グラフの高さおよびグラフ上段の値は各群のｎ＝３の平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。各群の蛋白質の横の数字は導入ＤＮＡ量である（例：ＨＮＦ−４α０．０５は、０．０５μｇのＨＮＦ−４α発現プラスミドを導入した）。＊：コントロールに対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、＃：ＨＮＦ−４α０．０５に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、＄：ＨＮＦ−４α０．２に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）。
【図１２】ＨｅｐＧ２細胞におけるＰＥＰＣＫ ＡＦ１プロモーターを用いたレポーターアッセイの結果を示す。ＨＮＦ−４αによる転写活性がＭＡＰＫ１１で活性化されたＲＳＫＢによって促進することを示す図面である。ＭＡＰＫ１１阻害剤ＳＢ２０３５８０を添加すると、ＭＡＰＫ１１とＲＳＫＢを共発現させてもＨＮＦ−４αの転写活性の促進はみられないことから、ＲＳＫＢの活性化が重要であることが示された。縦軸はＨＮＦ−４α０．５処理群の転写活性を１．００とした時の倍数である。グラフの高さおよびグラフ上段の値は各群のｎ＝３の平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。各群の蛋白質の横の数字は導入ＤＮＡ量である（例：ＨＮＦ−４α０．５は、０．５μｇのＨＮＦ−４α発現プラスミドを導入した）。＊：ＨＮＦ−４α０．５に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、＃：ＨＮＦ−４α０．５＋ＲＳＫＢ０．２５に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、＄：ＨＮＦ−４α０．５＋ＲＳＫＢ０．５に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、＋：ＲＳＫＢ０．５に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、￥：ＨＮＦ−４α０．５＋ＲＳＫＢ０．５＋ＭＡＰＫ１１０．５に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）、＋＋：ＨＮＦ−４α０．５＋ＲＳＫＢ０．５＋ＭＡＰＫ１１０．５＋ＳＢ２０３５８０に対して有意差あり（ｐ＜０．０５）。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号１：ＲＳＫＢ  ｃＤＮＡの塩基配列。
配列番号２：ＲＳＫＢ蛋白質のアミノ酸配列。
配列番号３：ＨＮＦ−４α  ｃＤＮＡの塩基配列。
配列番号４：ＨＮＦ−４α蛋白質のアミノ酸配列。
配列番号５：ＣＲＥＢ１  ｃＤＮＡのアミノ酸配列。
配列番号６：ＣＲＥＢ１蛋白質のアミノ酸配列。
配列番号７：ＡＦ１プローブ作成用オリゴヌクレオチドの塩基配列。
配列番号８：ＡＦ１プローブ作成用オリゴヌクレオチドの塩基配列。
配列番号９：ＣＲＥＢｔｉｄｅのアミノ酸配列。
配列番号１０：ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＲＳＫＢの部分オリゴペプチド。
配列番号１１：ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＨＮＦ−４αの部分オリゴペプチド。
配列番号１２：ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＨＮＦ−４αの部分オリゴペプチド。
配列番号１３：ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＲＳＫＢの部分オリゴペプチド。
配列番号１４：ＲＳＫＢとＨＮＦ−４αとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＨＮＦ−４αの部分オリゴペプチド。
【図１】
2008017701.tif 000002
【図４】
2008017701.tif 000003
【図８】
2008017701.tif 000004
【図９】
2008017701.tif 000005
【図１０】
2008017701.tif 000006
【図１１】
2008017701.tif 000007
【図１２】
2008017701.tif 000008
【図２】
2008017701.tif 000009
【図３】
2008017701.tif 000010
【図５】
2008017701.tif 000011
【図６】
2008017701.tif 000012
【図７】
2008017701.tif 000013
【配列表】
2008017701000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年10月19日(2005.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008017701000001.app