(57)【要約】【課題】新規な抗癌剤を提供する。【解決手段】下記一般式（Ｉ）で表されるベンゾキノン誘導体またはその医薬的に許容し得る塩を含む抗癌剤。2008290956.tif 000011（一般式（Ｉ）中、Ｒ1〜Ｒ3はそれぞれ独立して、水素または炭素数１〜５のアルキル基であり、ｎは１〜５の整数である。）【選択図】図１
2008290956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表わされるベンゾキノン誘導体またはその医薬的に許容し得る塩を含む抗癌剤。
【化１】
2008290956.tif 000009
（一般式（Ｉ）中、Ｒ1〜Ｒ3はそれぞれ独立して、水素または炭素数１〜５のアルキル基であり、ｎは１〜５の整数である。）
【請求項２】
治療または予防の対象とする癌細胞が、肝癌細胞、乳癌細胞、大腸癌細胞および白血病細胞から選ばれる少なくともいずれかである、請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
ベンゾキノン誘導体が、下記式（ＩＩ）で表わされる５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕−ベンゾキノンであることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗癌剤。
【化２】
2008290956.tif 000010
【請求項４】
５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕−ベンゾキノンの濃度が３〜３０μＭの範囲内であることを特徴とする、請求項３に記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗癌剤に関し、詳しくは、細胞周期調節作用を有する新規ベンゾキノン誘導体を用いた抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療には、多くの場合、抗癌剤を用いた化学療法が用いられる。抗癌剤には、癌細胞に対し選択的に殺す、またはその増殖を妨げるように作用し、かつ、正常細胞に対しては悪影響を及ぼさないことが求められる。しかしながら、癌による死亡例は年々増加の一途をたどっており、有効な新しい抗癌剤の開発が切望されている。
【特許文献１】国際公開第９８／１７６２９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、新規な抗癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の抗癌剤は、下記一般式（Ｉ）で表わされるベンゾキノン誘導体またはその医薬的に許容し得る塩を含むことを特徴とする。
【０００５】
【化１】
2008290956.tif 000003
【０００６】
（一般式（Ｉ）中、Ｒ1〜Ｒ3はそれぞれ独立して、水素または炭素数１〜５のアルキル基であり、ｎは１〜５の整数である。）
本発明の抗癌剤が治療または予防の対象とする癌細胞としては、肝癌細胞、乳癌細胞、大腸癌細胞および白血病細胞から選ばれる少なくともいずれかであることが好ましい。
【０００７】
本発明の抗癌剤において、上記ベンゾキノン誘導体は、下記式（ＩＩ）で表わされる５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕−ベンゾキノンであることが好ましい。
【０００８】
【化２】
2008290956.tif 000004
【０００９】
また本発明の抗癌剤は、３〜３０μＭの範囲内の濃度で５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕−ベンゾキノンを含んでいることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の抗癌剤は、様々な癌細胞（好ましくは肝癌細胞、乳癌細胞、大腸癌細胞および白血病細胞から選ばれる少なくともいずれか）に対し、強力な抗癌作用を示すものであり、化学療法による癌治療に好適に用い得るものであることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の抗癌剤は、下記一般式（Ｉ）で表わされるベンゾキノン誘導体を含むことを特徴とする。
【００１２】
【化３】
2008290956.tif 000005
【００１３】
上記一般式（Ｉ）中、Ｒ1〜Ｒ3はそれぞれ独立して、水素または炭素数１〜５のアルキル基であり、中でもメチル基、エチル基またはイソプロピル基が好ましい。また、Ｒ1およびＲ2は共にメチル基であり、かつ、Ｒ3は水素であることが特に好ましい。また上記一般式（Ｉ）中、ｎは１〜５の整数である。
【００１４】
本発明の抗癌剤は、上記一般式（Ｉ）で表わされるベンゾキノン誘導体の中でも、下記式（ＩＩ）で表わされる５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕−ベンゾキノンであることが好ましい。
【００１５】
【化４】
2008290956.tif 000006
【００１６】
本発明の抗癌剤は、上述したベンゾキノン誘導体を、医薬的に許容し得る塩の形態で含んでいてもよい。ここで、医薬的に許容し得る塩としては、たとえば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ホスホン酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、乳酸塩、ピルビン酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、グルタル酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、ショウノウ酸塩などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
上述した一般式（Ｉ）で表わされるベンゾキノン誘導体またはその医薬的に許容し得る塩を含む本発明の抗癌剤は、後述する実験例にて実証されるように、様々な癌細胞に対し強力な抗癌作用を示すものであり、化学療法による癌の治療または予防に好適に適用し得ることが期待される。ここで、本発明の抗癌剤が治療または予防の対象とする癌細胞としては、特に制限されるものではなく、たとえば、肝癌細胞、乳癌細胞、大腸癌細胞、白血病細胞、膀胱癌細胞、腎臓癌細胞、肺癌細胞、食道癌細胞、胆癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、胃癌細胞、子宮頸癌細胞、甲状腺癌細胞、前立腺癌細胞、皮膚癌細胞などを挙げることができる。中でも、肝癌細胞、乳癌細胞、大腸癌細胞および白血病細胞から選ばれる少なくともいずれかに対し特に有効に作用し得る。
【００１８】
本発明の抗癌剤は、３〜３０μＭ（より好ましくは１０〜３０μＭ）の範囲内の濃度で上記一般式（Ｉ）で表わされるベンゾキノン誘導体（中でも特に、上記式（ＩＩ）で表わされる５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕−ベンゾキノン）またはその医薬上許容し得る塩を含むことが好ましい。上記範囲内の濃度でベンゾキノン誘導体またはその医薬上許容し得る塩を含む場合、実験例にて後述するように、癌細胞の細胞周期のうち、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期の細胞（特にＧ２／Ｍ期の細胞）を有意に増加させる細胞周期調節作用を示す。
【００１９】
ここで、図１は、細胞の一般的な細胞周期を関連する細胞周期調節タンパク質と共に模式的に示す図である。図１に示すように、細胞の体細胞分裂は、有糸分裂を起こす時期であるＭ期（M(mitosis) phase）と、Ｍ期とＭ期との間の間期とに大きく分けられる細胞周期を有しており、間期はさらに、Ｇ１期（G1(gap 1) phase）、Ｓ期（S(synthesis) phase）およびＧ２期（G2(gap2) phase）に分けられる。Ｓ期は核のＤＮＡの複製が起こる時期であり、Ｍ期とこのＳ期との間が第１のギャップ期であるＧ１期である。またＳ期を経た後、次のＭ期までの間が第２のギャップ期であるＧ２期である。なお、細胞分裂を続けない細胞は、Ｍ期からＳ期に入らず、細胞周期の外に出て、Ｇ１期と似た状態となる（Ｇ０期）。上記Ｇ２／Ｍ期は、この細胞周期のうちＧ２期、Ｍ期の状態の総称である。
【００２０】
図１に示した細胞周期は、種々の細胞周期調節タンパク質により制御されて進行することが知られている。この細胞周期の制御の中心となる細胞周期調節タンパク質がサイクリン（Cyclin）とサイクリン依存性タンパクキナーゼ（Cdk：Cyclin dependent kinase）である。細胞が増殖刺激を受けると、Ｇ０期からＧ１期に移り、細胞内でサイクリンＤが合成され、サイクリン依存性タンパクキナーゼ−４（Cdk-4）と複合体を形成する。このサイクリンＤとサイクリン依存性タンパクキナーゼ−４との複合体は、サイクリン依存性タンパクキナーゼアクチベーティングキナーゼ（CAK）によりリン酸化され、活性化されることで、サイクリンＥの発現が誘導され、このサイクリンＥがサイクリン依存性タンパクキナーゼ−２（Cdk-2）と複合体を形成することで、Ｓ期に移行する。Ｓ期に入ると、サイクリンＥは分解し、発現が誘導されたサイクリンＡがサイクリン依存性タンパクキナーゼ−２と複合体を形成し、Ｇ２期へ移行する。Ｇ２期では、まずサイクリンＡがサイクリン依存性タンパクキナーゼ−１（Cdk1）と複合体を形成する。その後、発現が誘導されたサイクリンＢがサイクリン依存性タンパクキナーゼ−１と複合体を形成する。このサイクリンＢがサイクリン依存性タンパクキナーゼ−１との複合体は、サイクリン依存性タンパクキナーゼアクチベーティングキナーゼ（ＣＡＫ）によりスレオニン（Threonine）１４位、チロシン（Tyrosine）１５位、スレオニン１６１位がリン酸化され（高リン酸化状態、不活性）、さらにタンパク質チロシンホスファターゼＣＤＣ２５によりスレオニン１４位、チロシン１５位が脱リン酸化される（低リン酸化状態、活性）ことで、Ｍ期が開始される。その後、サイクリン依存性タンパクキナーゼと複合体を形成していたサイクリンＡは分解される。このようにサイクリン量の周期的変換は、細胞周期を起動させる原動力となる。
【００２１】
本発明の抗癌剤を３〜３０μＭの濃度で作用させた場合には、サイクリンＡの発現が有意に減少され、不活性な高リン酸化状態のサイクリン依存性タンパクキナーゼ−２（Cdk-2）およびサイクリン依存性タンパクキナーゼ−４（Cdk-4）を有意に減少される（実験例にて後述）。すなわち、上記範囲内の濃度で上記一般式（Ｉ）で表わされるベンゾキノン誘導体（特に好ましくは上記式（ＩＩ）で表わされる５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕−ベンゾキノン）またはその医薬上許容し得る塩を含む本発明の好ましい抗癌剤を投与することで、サイクリンＡとサイクリン依存性タンパクキナーゼ−２（Cdk-2）との複合体においてサイクリン依存性タンパクキナーゼ−２を脱リン酸化して活性化させるタンパク質チロシンホスファターセＣＤＣ２５の作用を阻害することで、細胞周期をＧ２／Ｍ期で有意に停滞させ、癌細胞周期を遅延させることにより抗癌作用を示すものと考えられる。
【００２２】
本発明の抗癌剤は、上述した一般式（Ｉ）で表わされるベンゾキノン誘導体またはその医薬上許容し得る塩をそのまま、または各種の医薬組成物として経口的または非経口的に投与され得る。医薬組成物とする場合の剤形としては特に制限されるものではなく、たとえば錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤、点滴剤などが挙げられる。上述した各剤形への製剤化は、当分野において従来より広く知られている適宜の方法を用いて行なうことができ、本発明の効果を阻害しない範囲で従来公知の適宜の添加剤（たとえば賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、懸濁化剤、等張化剤、乳化剤、吸収促進剤など）が添加されていてもよい。本発明の抗癌剤はまた、医薬上許容し得る担体を含んでいてもよく、このような担体としては、たとえば水、注射用蒸留水、生理食塩水、グルコース、フラクトース、白糖、マンニット、ラクトース、澱粉、コーン・スターチ、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アルギン酸、タルク、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、尿素、シリコーン樹脂、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステルなどの従来公知の適宜の担体を、本発明の効果を阻害しない範囲で製剤の種類に応じて選択して用いるでき、特に制限されるものではない。
【００２３】
本発明の抗癌剤の投与量および投与回数は、治療または予防の対象とする癌細胞、投与経路、治療期間、患者の年齢、体重などに応じて適宜選択することができ、特に制限されるものではない。
【００２４】
また本発明の抗癌剤は、単独投与しても有効な癌の治療または予防の効果を発揮するものであるが、本発明の効果を阻害しない範囲で、従来公知の適宜の他の抗癌剤と併用するようにしても勿論よい。この場合、本発明の抗癌剤の投与は、他の抗癌剤の投与前、同時、または投与後のいずれの時期に投与してもよい。
【００２５】
以下、実験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
＜製造例＞
以下に示すスキームで、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを合成した。
【００２７】
【化５】
2008290956.tif 000007
【００２８】
（１）２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノンの合成
２，３−ジメチル−１，４−ヒドロキノン（１．３８ｇ、１０ｍｍｏｌ）をクロロホルム５０ｍｌに溶解し、氷冷下、攪拌した。そこへ、硝酸第二セリウムアンモニウム（ＣＡＮ：Ceric Ammonium Nitrate）（６ｇ、１１ｍｍｏｌ）を水５０ｍｌに溶かしたものをゆっくり滴下した。その後、室温で１時間攪拌し、有機層を分離した。有機層を分液ロートを用いて水洗し、乾燥、濃縮を経て、粗２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノンを得た。
【００２９】
（２）５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの合成
上記（１）で得られた粗２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン（１０ｍｍｏｌとして計算）をエタノール４０ｍｌに溶解し、アルゴン気流下、２−メルカプトエタノール（１．４ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）を滴下した。１８時間室温で攪拌し、反応終了を確認してエタノールを濃縮した。得られた油状物質をクロロホルム５０ｍｌに溶かして氷冷攪拌し、硝酸第二セリウムアンモニウム（６ｇ、１１ｍｍｏｌ）の水溶液（５０ｍｌ）をゆっくり滴下した。室温で反応後、有機層を分画し、水洗後乾燥、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール＝２０：１）により精製した。このようにして、得られた化合物（１．１４ｇ（５３％））は、融点が９２℃の赤褐色固体であり、ＥＣＰ−４００（日本電子社製）を用いた1H−NMRの結果、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンが得られたことが確認された。
1H−NMR（400MHz、CDCl3）δ1.90（t, 1H, J=6Hz, -OH), 2.04(s, 6H, CH3×2), 3.0(t, 2H, J=6Hz, -SCH2-), 3.91(q, 2H, J=6Hz, -CH2OH), 6.43(s, 1H, -C(O)-CH=C-), 13C-NMR(100MHz, CDCl3)δ12.3(-CH3), 12.4(-CH3), 33.1(-CH2S-), 59.7(-CH2OH), 125.2(C=C-H), 140.8(-C(CH3)=C-), 151.3(C(O)-C(SCH2CH2OH), 184.0(O=C-), 184.1(O=C-).
＜実験例１＞
上述のようにして得られた５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを用い、培養癌細胞に対する抗癌活性強度の評価を行なった。培養癌細胞としては、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７（大日本製薬株式会社より入手）、ヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９（大日本製薬株式会社より入手）、ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ−Ｇ２（大日本製薬株式会社より入手）、急性骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０（大日本製薬株式会社より入手）、ヒトリンパ芽細胞ＩＭ−９（大日本製薬株式会社より入手）を用いた。
【００３０】
５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを上記各癌細胞１×１０4cells／wellに添加し、２４時間後、ＰＢＳ（−）で洗浄後、ＣＣＫ−Ｆ（同仁化学研究所製）によりＣａｌｃｅｉｎ／ＡＭ溶液を３７℃、３０分間反応させた。細胞内エステラーゼのＣａｌｃｅｉｎ／ＡＭ分解による蛍光発光をＣｙｔｏＦｌｕｏｒｏ蛍光光度計（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定し、各癌細胞の生存率が５０％となる（ＩＣ50）濃度（μＭ）を求めた。なお、測定波長は、励起フィルター４９０ｎｍ、測定フィルター５１５ｎｍとした。また、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７およびヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９については、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを添加して４８時間経過後の場合についても同様に行なった。図２は、実験例１の結果を示すグラフであり、縦軸は癌細胞の生存率（％）、横軸は５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの濃度（μＭ）である。また、実験例１でそれぞれ求められた５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンのＩＣ50濃度（μＭ）をｈｉｌｌ係数と共に表１に示す。
【００３１】
【表１】
2008290956.tif 000008
【００３２】
図２および表１に示す結果から、すべての癌細胞に関し、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンのＩＣ50濃度は３〜１９μＭの範囲内であり、癌細胞に対し十分な毒性作用を示すことが示唆された。中でも、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンは、白血病細胞（急性骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０およびヒトリンパ芽細胞ＩＭ−９）に対して３〜７μＭという非常に強力な抗癌活性を示し、白血病治療薬としての効果が示唆された。一方、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンは、乳癌細胞（ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７）、大腸癌細胞（ヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９）および肝癌細胞（ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ−Ｇ２）に対しても強い抗癌活性を示し、これらの癌細胞に対しても有効な抗癌剤として作用することを示唆する結果が得られた。
【００３３】
＜実験例２＞
上述のようにして得られた５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを用い、ヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９の細胞周期に対する影響について検討した。０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭおよび１００μＭの各濃度の５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを1.3×106cells/wellのヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９にそれぞれ添加し、５−ブロモ−２’−デオキシウリジンを１０ｇ／Ｌになるように添加し、Ｓ期細胞に取り込ませた。この細胞を回収し、マウス抗−ＢｒｄＵ抗体で標識して、ヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９が細胞周期のうちＧ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期のいずれの状態にあるかを観察し、割合を求めた。なお、ヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９が細胞周期のうちＧ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期のいずれの状態にあるかは、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を用いて、フローサイトメトリーにより定量することで確認した。
【００３４】
図３は、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの各濃度とヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９の細胞周期との関係を示すグラフであり、図３（ａ）はＧ１期、図３（ｂ）はＳ期、図３（ｃ）はＧ２／Ｍ期についての割合（％）を示している。図３（ａ）〜（ｃ）において、縦軸は実験例２に用いたヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９全体に占める各時期（図３（ａ）はＧ１期、図３（ｂ）はＳ期、図３（ｃ）はＧ２／Ｍ期）の割合（％）であり、横軸は５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの濃度（μＭ）である。
【００３５】
図３（ｃ）から分かるように、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを添加することで、Ｇ２／Ｍ期のヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９の割合の有意な増加が観察された（特に、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの濃度が１０μＭ、５０μＭ、１００μＭの場合）。一方、Ｓ期のヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９は、１０μＭの濃度の５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを添加した場合のみ有意な増加が観察されたが、その他の濃度の場合には変化が認められなかった（図３（ｂ））。また、Ｇ１期のヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９については、すべての濃度において変化が認められなかった（図３（ａ））。以上のことから、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンは、ヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９の細胞周期中、主にＧ２／Ｍ期の細胞を特異的に増加させる可能性が示唆された。
【００３６】
＜実験例３＞
実験例２の結果から、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンは、細胞周期においてＳ期およびＧ２／Ｍ期にあるヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９を特異的に増加させる可能性が示唆された。本実験例では、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期の増加機序に関連する細胞周期制御タンパク質と５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンとの関係について検討した。なお、細胞を血清飢餓状態とし、細胞周期を一度Ｇ１期で停滞させた後、０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭおよび１００μＭの各濃度の５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを1.3×106cells/wellのヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９にそれぞれ添加した後、回収し、各細胞周期制御タンパク質に対する抗体を用いて、細胞周期制御タンパク質としてサイクリンＡ、サイクリン依存性タンパクキナーゼ−２（Cdk-2）およびサイクリン依存性タンパクキナーゼ−４（Cdk-4）を抽出・精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて発現量をみた。なお、サイクリン依存性タンパクキナーゼ−２およびサイクリン依存性タンパクキナーゼ−４については、ＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎＧ（ＳＩＧＭＡ製）を１０μＬ添加することで免疫沈降を行ない、高リン酸化状態（不活性）の細胞周期の停滞を検出した。
【００３７】
図４は、実験例３についての結果を示す写真であり、０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭおよび１００μＭの各濃度の５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを添加した場合について、サイクリンＡ、サイクリン依存性タンパクキナーゼ−２およびサイクリン依存性タンパクキナーゼ−４の発現を示している。図４に示すように、サイクリンＡの発現は、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの濃度が１０μＭである場合に最も低下し、濃度が増加するに伴い増加した。また高リン酸化状態のサイクリン依存性タンパクキナーゼ−２については、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの濃度が２０μＭである場合に減少が認められた。また、高リン酸化状態のサイクリン依存性タンパクキナーゼ−４についても、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの濃度が２０μＭである場合に減少が認められた。これらの結果から、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを低濃度で作用させた場合には、サイクリンＡとサイクリン依存性タンパクキナーゼ１（Cdk-1）との複合体でのサイクリンＡの発現抑制を介してＧ２期で細胞周期停滞を引き起こしている可能性が示唆された。このサイクリンＡの発現抑制は、サイクリンＡとサイクリン依存性タンパクキナーゼ１との複合体を不活性の高リン酸化状態から活性な低リン酸化状態とするタンパク質チロシンホスファターゼＣＤＣ２５の作用を阻害することに起因するものと考えられた。なお、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを高濃度で作用させた場合には、上述した低濃度で作用させた場合とは異なる細胞周期調節作用を示すのではないかと考えられた。
【００３８】
＜実験例４＞
実験例２と同様にして、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを用い、ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ−Ｇ２についても細胞周期に対する影響について検討した。０μＭ、３μＭ、１０μＭ、２０μＭおよび３０μＭの各濃度の５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを1.5×106cells/wellのヒト肝癌細胞Ｈｅｐ−Ｇ２にそれぞれ添加し、５−ブロモ−２’−デオキシウリジンを１０μｇ／Ｌとなるよう添加し、Ｓ期細胞に取り込ませた。この細胞を回収し、マウス抗−ＢｒｄＵ抗体で標識し、ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ−Ｇ２が細胞周期のうちＧ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期のいずれの状態にあるかを観察し、割合を求めた。なお、ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ−Ｇ２が細胞周期のうちＧ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期のいずれの状態にあるかは、実験例２と同様の手法にて確認した。
【００３９】
図５は、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの各濃度とヒト肝癌細胞Ｈｅｐ−Ｇ２の細胞周期との関係を示すグラフであり、図５（ａ）はＧ１期、図５（ｂ）はＳ期、図５（ｃ）はＧ２／Ｍ期についての割合（％）を示している。図５（ａ）〜（ｃ）において、縦軸は実験例４に用いたヒト肝癌細胞Ｈｅｐ−Ｇ２全体に占める各時期（図５（ａ）はＧ１期、図５（ｂ）はＳ期、図５（ｃ）はＧ２／Ｍ期）の割合（％）であり、横軸は５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの濃度（μＭ）である。
【００４０】
図５（ｃ）から分かるように、ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ−Ｇ２の場合にも、５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを添加することで、Ｇ２／Ｍ期の割合が有意に増加することが認められた。一方、ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ−Ｇ２の場合、Ｇ１期およびＳ期の割合は減少する傾向が認められた（図５（ａ）、（ｂ））。
【００４１】
今回開示された実施の形態および実験例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】細胞の一般的な細胞周期を関連する細胞周期調節タンパク質と共に模式的に示す図である。
【図２】実験例１の結果を示すグラフであり、縦軸は癌細胞の生存率（％）、横軸は５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの濃度（μＭ）である。
【図３】５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの各濃度とヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９の細胞周期との関係を示すグラフであり、図３（ａ）はＧ１期、図３（ｂ）はＳ期、図３（ｃ）はＧ２／Ｍ期についての割合（％）を示している。図３（ａ）〜（ｃ）において、縦軸は実験例２に用いたヒト結腸上皮細胞ＨＴ−２９全体に占める各時期（図３（ａ）はＧ１期、図３（ｂ）はＳ期、図３（ｃ）はＧ２／Ｍ期）の割合（％）であり、横軸は５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの濃度（μＭ）である。
【図４】実験例３についての結果を示す写真であり、０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭおよび１００μＭの各濃度の５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンを添加した場合について、サイクリンＡ、サイクリン依存性タンパクキナーゼ−２およびサイクリン依存性タンパクキナーゼ−４の発現を示している。
【図５】５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの各濃度とヒト肝癌細胞Ｈｅｐ−Ｇ２の細胞周期との関係を示すグラフであり、図５（ａ）はＧ１期、図５（ｂ）はＳ期、図５（ｃ）はＧ２／Ｍ期についての割合（％）を示している。図５（ａ）〜（ｃ）において、縦軸は実験例４に用いたヒト肝癌細胞Ｈｅｐ−Ｇ２全体に占める各時期（図５（ａ）はＧ１期、図５（ｂ）はＳ期、図５（ｃ）はＧ２／Ｍ期）の割合（％）であり、横軸は５−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−２，３−ジメチル−〔１，４〕ベンゾキノンの濃度（μＭ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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