(57)【要約】      （修正有）【課題】天然型よりも更にサイズが小さく、しかも天然型よりも高い分泌生産効率を示すシグナル配列の提供。【解決手段】好アルカリ性バチルス属細菌のアルカリセルラーゼ遺伝子由来の２９アミノ酸残基から成る天然型シグナル配列のカルボキシ末端側を欠失させ、メチオニンをアミノ末端とし、４位アルギニンから14位イソロイシンまでのいずれかのアミノ酸をカルボキシル末端とするシグナル配列。本配列をシグナル配列とした場合には、天然型シグナル配列の約２倍に達する高い生産性が得られる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の１位メチオニンをアミノ末端とし、４位アルギニンから14位イソロイシンまでのいずれかのアミノ酸をカルボキシル末端とするシグナル配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え微生物によるタンパク質の製造に有用なシグナル配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え微生物を用いた有用タンパク質の製造方法において、バチルス（Bacillus）属細菌は、適当な分泌用シグナル配列が目的とするタンパク質のアミノ末端側に結合している場合、目的タンパク質を菌体外に分泌生産する性質を有しており、広く利用されている。このバチルス属細菌を宿主とした異種タンパク質の分泌生産のために用いられるシグナル配列としては、バチルス属細菌の菌体外タンパク質、例えばα-アミラーゼ、β-ラクタマーゼ等に由来するものが利用されている〔非特許文献１〕。このようなバチルス属細菌を宿主とするタンパク質の効果的な分泌生産においては、通常、シグナル配列のサイズは約30アミノ酸残基必要であるとされており、これよりも短いシグナル配列の場合、例えば、31残基から成るバチルス由来α-アミラーゼのシグナル配列のカルボキシル末端側６残基を欠失させた場合には、目的異種タンパク質の分泌生産量が大幅に減少したことが報告されている〔非特許文献２〕。
【非特許文献１】Microbiol. Rev., 57, 109(1993)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 5582(1982)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記のように、バチルス属由来のシグナル配列は、天然型由来で最も多く認められる約30アミノ酸残基のものが最も有効であるとされており、より高いタンパク分泌生産を目指す場合において、そのサイズをさらに改良する余地はないものと思われていた。そこで本発明は、天然型よりも更にサイズが小さく、しかも天然型よりも高い分泌生産効率を示すシグナル配列を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、種々の天然型シグナル配列の一部が様々なサイズで欠失した不完全なシグナル配列をコードする遺伝子断片を構築し、これらを用いて微生物宿主による異種タンパク質の分泌生産能を比較した。この結果、好アルカリ性バチルス属細菌のアルカリセルラーゼ遺伝子の29アミノ酸残基から成る天然型のシグナル配列のカルボキシル末端側を欠失させた４〜14アミノ酸残基をシグナル配列として用いた場合、天然型シグナル配列の約２倍に達する高い分泌生産性が得られることを見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１位メチオニンをアミノ末端とし、４位アルギニンから14位イソロイシンまでのいずれかのアミノ酸をカルボキシル末端とするシグナル配列を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の４〜14アミノ酸残基から成る配列をシグナル配列として用いることにより、天然型のシグナル配列を用いた場合に比べて、微生物によるタンパク質の分泌生産性が向上し、有用タンパク質の工業的生産に極めて有利である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の製造法は、シグナル配列として上記の４〜14アミノ酸残基からなる配列を用いる以外は、宿主を微生物とする通常の組換えDNA技術に従って行うことができる。具体的には、上記シグナル配列をコードするDNA断片の上流に遺伝子発現制御のためのDNA断片を、下流に目的とするタンパク質の構造遺伝子を結合させた組換えDNAを用いて、微生物を形質転換し、得られた形質転換微生物を培養することにより行われる。
【０００８】
本発明で用いる前記の不完全なシグナル配列をコードする遺伝子断片は、本発明者らが自然界から分離したバチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-64（FERM P-10482）株のアルカリセルラーゼ遺伝子に含まれている。この遺伝子断片を得るには、特開平4-190793号公報に示されるように、同株の染色体DNAから、ショットガンクローニングによって単離することも可能であるが、好適には、配列番号２に示したKSM-64株アルカリセルラーゼ遺伝子の配列を基にして、適当なプライマーDNAを用い、ポリメラーゼ  チェーン  リアクション（Polymerase Chain Reaction, PCR）法によって、４〜14アミノ酸残基の任意のサイズのシグナル配列をコードする遺伝子断片を増幅すればよい。また、化学合成による取得も可能である。
【０００９】
次いで、上記シグナル配列をコードするDNA断片と、その上流に遺伝子発現制御のためのDNA断片、すなわち適当なプロモーター及びSD配列を含むDNA断片を、常法に従って適当なベクターDNAに挿入することにより、本発明のタンパク質製造法に用いる高分泌発現ベクターを得ることができる。
【００１０】
ここで、遺伝子発現制御のためのDNA断片を取得する方法として、上記の不完全なシグナル配列のほか、その上流に存在するアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域やSD配列の全てを含む遺伝子断片を調製することもでき、異種タンパク質を生産する際に好適である。一方、他の遺伝子由来のプロモーター領域やSD配列を用いることも可能である。
【００１１】
また、ベクターDNAとしては特に限定されないが、バチルス属細菌で複製可能なものが好ましく、例えばエンテロコッカス、フェーカリス（Enterococcus faecalis）由来のプラスミドpAMα1や、スタフィロコッカス  アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のプラスミドpUB110、更には、大腸菌でも複製可能なシャトルベクターpHY300PLK等が挙げられる。また、上記のようなベクターDNA分子の一部のみを利用することも可能である。
【００１２】
上記の高分泌発現ベクターにおける不完全なシグナル配列をコードするDNA領域の下流に、生産させたいタンパク質の構造遺伝子を挿入することにより、目的のタンパク質を大量に生産させ得る組換えDNAを構築できる。この場合、シグナル配列領域と構造遺伝子の読み枠を一致させる必要があり、また、本発明で用いる不完全なシグナル配列にはシグナルペプチダーゼによる認識部位が欠失しているため、結合される目的タンパク質の構造遺伝子の５′末端に、シグナルペプチダーゼ認識配列、例えば、Ala-Xaa-Ala配列がコードされていることが望ましい。更に、両DNA断片の結合のために適当なリンカーDNA、例えば、Sal I等の適当な制限酵素の認識配列を含むリンカーDNAを用いることができる。
【００１３】
かくして得られる組換えDNAを用いて適当な微生物、好ましくはバチルス属細菌を形質転換し、得られた組換え微生物を適当な培地を用いて、適当な条件下で培養することによって、目的とするタンパク質を大量かつ安定に生産させることができる。用いる培地の種類や培養条件等は特に限定されない。
【実施例】
【００１４】
実施例１
特開平4-190793号公報に記載された方法によって抽出された、アルカリセルラーゼ生産菌バチルス  エスピー  KSM-64（FERM P-10482）株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号２に示されるオリゴヌクレオチドプライマーＡと、配列番号３〜15に示されるオリゴヌクレオチドプライマーB1〜B13のいずれかとを用いて、Pwo DNAポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）によるPCR反応をそれぞれ行うことによって、KSM-64株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開平4-190793号公報の第４図）のプロモーター及びSD配列と、その下流に種々のサイズを有するシグナル領域を含むDNA断片を取得した（図１）。なお、プライマーB1〜B13は、シグナル領域と異種タンパク質の構造遺伝子を効率的に結合するために、制限酵素Sal Iによる認識配列を有していることから、この結果得られた各DNA断片の下流側末端部は、Sal I切断部位となっている。
【００１５】
次いで、各DNA断片をSal Iで切断した後、Sal IとSma Iで切断したシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト本社製）との結合反応をT4DNAリガーゼによって行った。結合反応産物によって、大腸菌（Escherichia coli）HB101株（宝酒造社製コンピテントセル）の形質転換を行い、得られた形質転換体の中から、各DNA断片がpHY300PLKに挿入された組換えプラスミドベクターpHLS1〜13を得た（図１）。
【００１６】
実施例２
特開平8-336392号公報の実施例１に示される方法で抽出されたバチルス  エスピー  KSM-AP1378（FERM BP-3048）株の染色体DNAを鋳型として、配列番号16及び17に示されるオリゴヌクレオチドプライマーＣ（Sal I認識配列含有）及びＤ（Hind III認識配列含有）を用いて、Pwo DNAポリメラーゼによるPCR反応によって、KSM-AP1378株由来のアルカリアミラーゼ遺伝子（特開平8-336392号公報の配列番号２）のうち、シグナルペプチダーゼ認識配列と推定されるAla-Gln-Ala配列（アミノ酸番号29〜31）からカルボキシル末端のGln（アミノ酸番号516）をコードする約1.5kbのDNA断片を取得した（図１）。本DNA断片をSal IとHind IIIで切断した後、同制限酵素で切断した組換えプラスミドベクターpHLS1〜13（実施例１）との結合反応を行い（図１）、各反応産物による大腸菌HB101株の形質転換を行った。着色澱粉スターチアズレ（シグマ社製）とテトラサイクリンを含む寒天培地を用いて、スターチアズレの分解による透明帯の形成を指標として得られた形質転換体の組換えプラスミドを抽出し、塩基配列の確認を行って、各種のサイズを有するシグナル配列と、シグナル認識配列を持つアミラーゼの構造遺伝子が、Sal Iリンカーを介して計画通り結合していることを確認し、これらの組換えプラスミドを、それぞれpHLSLA1〜13と命名した（図２）。
【００１７】
実施例３
実施例２で得られた各組換えプラスミドpHLSLA1〜13による枯草菌（Bacillus subtilis）の形質転換をプロトプラスト法（Mol. Gen. Genet., 168, 111(1978)）によって行い、得られた各組換え枯草菌を種培養培地に接種して、30℃で１日間振盪培養を行った後、種培養培地に植え継いで、30℃で４日間の振盪培養を行った。培養３日目、４日目に培養液の一部を拭き取り、遠心分離によって菌体を除去して得られた上清液のアミラーゼ活性を、可溶性澱粉（シグマ社製）を基質としてジニトロサリチル酸法〔Anal. Chem., 31, 426(1959)〕により測定した。
【００１８】
この結果、図３に示したように、KSM-64株のアルカリセルラーゼ遺伝子のシグナル配列のサイズが、組換え枯草菌による液化型アルカリα-アミラーゼの生産性に大きな影響を与えることが明らかになり、特に、４〜14残基から成るシグナル配列を用いた場合（pHLSLA2〜8）に、完全なシグナル配列であると考えられる29残基のシグナル配列を用いた場合（pHLSLA13）の２倍以上の生産性が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】バチルス  エスピー  KSM-64株由来のシグナル配列とバチルス  エスピー  KSM-AP1378株由来の液化型アルカリアミラーゼ遺伝子のサブクローニングの手順を示す図である。
【図２】組換えプラスミドベクターpHLS1〜13とKSM-AP1378株由来のアルカリアミラーゼ遺伝子をコードするDNA断片を用いて得られた組換えプラスミドの構造を示す図である。
【図３】各シグナル配列を用いた場合の、枯草菌による液化型アルカリアミラーゼの生産性を示す図である。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【配列表】
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