(57)【要約】      （修正有）【課題】歯周軟組織を構成するコラーゲンの分解を阻害し、歯周組織破壊を抑制することにより歯周疾患の予防・改善を目的とするＭＭＰ阻害剤を提供する。【解決手段】リポソームにラクトフェリンを内包することにより、ＭＭＰ阻害作用を発揮する。さらに、経口で適用することにより歯周組織の破壊、とりわけ歯周軟組織の破壊を抑制することができる。ＭＭＰ阻害剤を剤型化することにより経口組成物ができる。経口組成物の中でも食品組成物又は医薬組成物としての利用が特に好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリンを含んだリポソームを含有するＭＭＰ阻害剤。
【請求項２】
歯周組織の破壊を抑制するものである請求項１に記載のＭＭＰ阻害剤。
【請求項３】
歯周組織が歯周軟組織である請求項２に記載のＭＭＰ阻害剤。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の阻害剤を含有する経口組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＭＰ阻害剤に関する分野、さらには、歯周組織の破壊を抑制する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病の炎症性組織破壊には歯周辺部細胞による組織破壊が必須のプロセスである。その中でも、歯周結合組織の合成系の低下と分解活性の亢進は歯周組織破壊に大きく関与している。ＭＭＰ（Matrix metalloproteinase）は酵素活性中心に金属であるＺｎを必要とする細胞外結合組織を分解する酵素群の総称であり、ＭＭＰファミリーは分解する細胞外結合組織の基質特異性から、コラゲナーゼ型、ストロメライシン型、ゼラチナーゼ型、およびその他の型の４種類に分類されている。Ｉ型コラーゲンは歯肉を構成する代表的なコラーゲンであり、Ｉ型コラーゲンを分解するＭＭＰとしては、繊維芽細胞やマクロファージから産生される組織コラゲナーゼであるＭＭＰ−１、好中球コラゲナーゼであるＭＭＰ−８、及び軟骨細胞から産生されるＭＭＰ−１３などが知られている。すなわち、これらのＭＭＰの働きを阻害することにより歯周軟組織を構成するコラーゲンの分解を抑制することができる。
【０００３】
ところで、ラクトフェリンはヒトを始めとする哺乳動物の乳汁、唾液、涙液などの外分泌液、粘液、好中球に存在する分子量約83,000の鉄結合性タンパク質である。これまで、ラクトフェリンをリポソームに内包させることにより、急性肝障害抑制作用、ＴＮＦ−α産生抑制作用が増強することや免疫機能を増強することを出願人は明らかにしている（特許文献１、２）。
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−３５９６４７号  公報
【特許文献２】特開２００４−３５９６４８号  公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のとおり、ＭＭＰは組織破壊における重要な酵素であり、その阻害作用を有する物質の開発が望まれている。また、ラクトフェリンを内包したリポソームは各種の有用性が確認されつつも、緩和に人に作用しつつ効果の高い素材として、さらに新たな有用性のある用途開発が期待されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者は、ラクトフェリンを内包したリポソームがすぐれたＭＭＰ阻害作用があることを見出し、さらにすぐれた歯周組織破壊の抑制作用を示すことを発見し、本発明を完成させた。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ラクトフェリンがリポソームに内包されるので、すぐれたＭＭＰ阻害作用を発揮することができる。さらに、経口で適用することにより歯周組織の破壊を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において、リポソームはリン脂質を主体とした脂質を十分量の水で水和することにより形成される二分子膜を有する脂質小胞体である。リポソームは水溶性薬物をその内水層に、脂溶性薬物を脂質二重層へ取り込むことができ、薬物のターゲティング、徐放化、副作用の軽減などを目的にDDS製剤の薬物運搬体としてその応用が試みられている。また、リポソームは生体膜の成分から構成されているため安全性が高いことも知られている。
【０００９】
一般的に、リポソームは脂質二重層の数に基づいて分類され、多重膜リポソーム（MLV）と一枚膜リポソームに分類される。一枚膜リポソームは、そのサイズに応じて、更にSUV（small unilamella vesicle）、LUV（large unilamella
vesicle）、GUV（giant unilamella vesicle）などに分類される。本発明のリポソームは、これらのいずれであってもよい。好ましいのはMLVである。本発明では、リポソームの大きさは、平均粒子系として通常30〜1000nm、好ましくは30〜600nm、より好ましくは50〜300nmである。
【００１０】
本発明において使用されるラクトフェリンを含んだリポソームにおいて、ラクトフェリンはリポソーム膜に囲まれる空間に封入されていることが好ましいが、ラクトフェリンがリポソーム膜構成成分として含まれていても良いし、多重膜リポソームを構成する多重膜の間に含まれていても良いし、リポソーム膜のうちの最も外側の膜にラクトフェリンが付着又は結合する形態で含まれていても良い。
【００１１】
ラクトフェリンを含んだリポソームは、従来の方法により製造することができる。例えば、所望量のレシチンをエタノールなどの適当な有機溶媒で可溶化し、減圧下に溶媒を除去し、膜脂質を作成後、これにラクトフェリンや任意の生理活性物質を含む水溶液を添加して、例えば、1000〜3000rpm程度で2〜5分間程度撹拌して、リポソーム懸濁液を調製することにより、ラクトフェリンを封入したリポソームを得ることができる。なお、レシチンの可溶化の際に所望量のステロールを加えてもよい。
【００１２】
また、この方法とは別に、所望量のレシチン及び必要に応じて所望量ステロールを少量のエタノールに溶解後、水溶液又は緩衝液に分散して予備乳化を行った後、高圧で分散させて脂質二重層を形成させてリポソーム懸濁液を調製することによってもラクトフェリンを封入したリポソームを得ることができる。
【００１３】
得られた懸濁液に対しては、必要に応じて、リポソーム外液中のラクトフェリンを除去する操作、例えば懸濁液を濾過後、得られた濾液を透析する操作を行ってもよい。
【００１４】
リポソームの懸濁液は、液状のままでも使用できるが、凍結乾燥やスプレードライした乾燥物として使用することもできる。リポソームは、その乾燥物を錠剤やカプセル化したものをはじめ、様々な経口摂取に適した形態とすることが可能である。
【００１５】
本発明に用いるラクトフェリンはその由来は限定されないが、例えば哺乳動物（ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等）から得られるラクトフェリンを使用することができる。このうちウシ又はヒト由来のラクトフェリンが好ましい。ラクトフェリンはこれら動物の乳又は乳処理物（脱脂乳、ホエー等）から常法により分離されることにより得られる。また、それらを塩酸、クエン酸等により脱鉄したアポラクトフェリン
、それらを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせた金属飽和ラクトフェリン 、各種飽和度で金属を飽和したラクトフェリン又はそれらの２種以上の任意の混合物などを使用できる。その他に、遺伝子操作により、微生物、動物細胞、動植物等で生産した各種ラクトフェリンを使用してもよい。また、本発明においては加水分解処理したラクトフェリンを用いることもできる。これらのラクトフェリン又はラクトフェリン誘導体は市販のものを用いてもよい。
【００１６】
ラクトフェリンの好ましい分子量は1000〜200000程度である。また、リポソームに含まれるラクトフェリンには、ラクトフェリンの加水分解物も包含され、この加水分解物は好ましい態様の一つである。ラクトフェリンを含んだリポソーム中におけるラクトフェリンの含有量は通常、10〜99重量％程度、好ましくは20〜95重量％程度、より好ましくは30〜90重量％程度である。
【００１７】
レシチンとしては、例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン、ナタネレシチン、コーンレシチン、ひまわりレシチン、ピーナッツレシチンなどを１種単独で又は２種以上組み合わせて使用することができるがこれらに限定されない。本発明では、これらの水素添加物を用いることもできる。レシチンはホスファチジルコリン又は１，２−ジアシルグリセロール
３−ホスホコリンとも称され、一般的に、グリセロールの１位及び２位に脂肪酸が結合している。本発明では、上記例示のレシチンに加えて、１位及び２位の両方又は片方に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することが好ましく、１位に炭素数１２〜２４の飽和脂肪酸、２位に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することが特に好ましい。ここで、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸は直鎖状及び分枝状のいずれでもよい。好ましい不飽和脂肪酸としては、炭素数１６〜１８の不飽和脂肪酸を使用できる。特に２位にオレイン酸、リノール酸が多く結合したレシチンが好ましい。具体的には、卵黄レシチン、大豆レシチンが好ましい。
【００１８】
ステロールとしては、コレステロール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロールなどの動物由来のステロール；β−シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、エルゴスタディエノール、シトステロール、ブラシカステロールなどの植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロールなどの微生物由来のステロール等が挙げられ、１種単独で又は２種以上組み合わせて使用できる。これらの中でも、コレステロール又はフィトステロールが好ましく用いられる。
【００１９】
リポソームにおけるレシチンとステロールのモル比は、55：45〜95：5程度が好ましく、60：40〜90：10程度がより好ましく、75：25〜85：15程度が最も好ましい。モル比がこれらの範囲にあるとリポソーム膜の安定性が向上する。
【００２０】
ラクトフェリンを含んだリポソームにおけるレシチンの含有量は、通常1〜80重量％程度、好ましくは3〜65重量％程度、より好ましくは5〜50重量％程度である。
ラクトフェリンを含んだリポソームにおけるステロールの含有量は、通常0〜40重量％程度、好ましくは0.1〜30重量％程度、より好ましくは1〜20重量％程度である。
レシチン又はステロールの含有量は既知の方法で測定できる。例えば、レシチンの含有量はFiske-Subbarow法など、ステロールの含有量はHPLC、比色法などによって定量できる。
【００２１】
さらに、ラクトフェリンを含んだリポソームの表面をコーティングすることができ、このコーティング物も有効成分として利用できる。好ましいコーティングとしては、硫酸基を含有する多糖類によるコーティングがあげられる。硫酸基含有多糖類としては、フコイダン、カラギーナン、寒天、ヘパリンなどが挙げられる。また、該硫酸基含有多糖類としては、硫酸基を含まない多糖を硫酸化したものも包含され、例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などであってもよい。
【００２２】
硫酸基含有多糖類としては、分子量が5000〜300000程度のものが好ましく用いられる。これらの硫酸基含有多糖類の中でもフコイダン及びカラギーナンを好ましく用いることができ、特にフコイダンが好ましい。
硫酸基含有多糖類の使用量は、例えば、リポソームに含有されるレシチン100重量部に対して、10〜500重量部程度が好ましく、20〜200重量部程度がより好ましい。
コーティングは、例えば、ラクトフェリンを含んだリポソームを含む懸濁液に、硫酸基含有多糖類を加え、1000〜3000rpm程度で2〜5分間程度撹拌することにより行うことができる。なお、１つのコーティング膜の中に複数のリポソームが含まれていてもよい。
リポソームが硫酸基含有多糖類でコーティングされていることは、例えば、リポソーム溶液のゼータ電位が、硫酸基含有多糖類を添加して撹拌することにより変化することにより確認できる。
【００２３】
ラクトフェリンを含んだリポソームにはレシチン、フィトステロール以外にも必要に応じて、トコフェロール、アスコルビン酸などの抗酸化剤、乳酸、クエン酸などの有機酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミンなどの脂質、キトサン、フコイダン、ヒアルロン酸などの天然高分子、ポリエチレングリコール、カルボキシビニルポリマーなどの合成高分子、トレハロース、ラクチュロース、マルチトールなどの糖質、グリセリンなどのポリオール等を加えることができる。
【００２４】
また、ラクトフェリンを含んだリポソームには、必要に応じて、ラクトフェリンに加えて、様々な物質を内容物として封入することができる。例えば、クロラムフェニコール、硫酸フラジオマイシン、エデト酸ナトリウム・セトリミド、エピジヒドロコレステリン、塩化亜鉛、塩化デカリニウム、塩化ベンゼトニウム、デキサメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、フッ化ナトリウム、非ステロイド性抗炎症薬、副腎皮質ステロイド薬、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィン、ペニシラミン、ブシラミン、ロベンザリット二ナトリウム、サラゾスルファピリジン、アクタリット、メトトレキサート、ミゾリビン、抗TNF抗体、可溶性TNFレセプター、抗インターロイキン1抗体、抗インターロイキン6抗体、エストラジオール、エストリオール等のエストロゲン製剤、塩酸ラロキシフェン、アレンドロネート、エチドロネート、リセドロネート等のビスホスホネート製剤、エルカトニン、カルシトニン、イプリフラボンなどである。
【００２５】
本発明のＭＭＰ阻害剤におけるラクトフェリンを含んだリポソームの含有量は、剤型等に応じて適宜設定されるが、通常0.5〜95重量％程度、好ましくは0.8〜80重量％程度、より好ましくは1〜50重量％程度である。
【００２６】
本発明のＭＭＰ阻害剤を剤型化することにより本発明の経口組成物ができる。経口組成物の中でも食品組成物又は医薬組成物としての利用が特に好ましい。
【００２７】
本発明のＭＭＰ阻害剤または経口組成物を食品組成物として利用する場合には、リポソームを必要に応じてその食品の形態に応じた可食性担体、食品素材、食品添加物などと組み合わせて、通常の方法により調製することができる。食品の形態としては、飲料などの液状の食品、錠剤、顆粒、チュアブルタブレットなどの固形の食品等として利用することができる。また、ヨーグルトなどの半固形の食品としても利用することができる。具体的な食品の形態としては、ジュース、清涼飲料水、ティー等の液体飲料；粉末ジュース、粉末スープ等の粉末飲料；チョコレート、キャンディー、チューインガム、アイスクリーム、ゼリー、クッキー、ビスケット、コーンフレーク、チュアブルタブレット、フィルムシート、ウエハース、グミ、煎餅、饅頭等の菓子類；ドレッシング、ソース等の調味料；パン類、麺類、こんにゃく、練り製品（かまぼこ等）、ふりかけ、口腔用スプレー、トローチ等が挙げられる。また、添加物として、乳酸菌などの生菌又は死菌、その他のプロバイオティクス素材、ビタミン、生薬、ハーブ等の植物そのものまたは抽出物を配合しても良い。
【００２８】
本発明の経口食品組成物は、歯周組織破壊を伴う歯周病の予防又は治療のため、歯周病の予防又は治療のため、加齢にともなう歯周病の予防又は治療のため、健全な歯を保つため、歯の損失を防ぐため、健全な歯周組織を保つため等の健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、病者用食品等の用途に用いることができる。特に、歯周軟組織の破壊に対して効果が期待できる。
【００２９】
また、本発明の経口組成物を医薬組成物として利用する場合には、リポソームに必要に応じて薬学的に許容される担体を配合し、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤などの固形剤或いは当該液剤又は固形剤を封入したカプセル剤等の経口投与可能な形態の医薬組成物として使用できる。薬学的に許容される担体としては、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。また、経口医薬組成物は香料等の各種添加剤を含むこともできる。このような医薬組成物は歯周組織破壊の予防又は治療剤として用いることができる。
【００３０】
本発明の経口組成物において経口組成物全量に対するラクトフェリンを含んだリポソーム含有量は組成物の剤型等に応じて適宜設定されるが、通常0.5〜95重量％程度、好ましくは0.8〜80重量％程度、より好ましくは1〜50重量％程度である。上記のように経口組成物には食品または医薬品として許容される担体を適宜配合することができる。
【００３１】
本発明の経口組成物に添加される担体として例えば、マルチトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコール類、結晶セルロース、乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸塩類、リン酸塩類等の賦形剤、ゼラチン、アルギン酸、キサンタンガム、セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、カラギーナン、プルラン、ペクチン等の粘結剤、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、酵素処理レシチン、酵素分解レシチン、サポニン等の乳化剤、アスコルビン酸、トコフェロール等の抗酸化剤、乳酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸等の酸味料、ビタミン類、アミノ酸類、乳酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩などの強化剤、二酸化ケイ素等の流動化剤、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸塩類等の滑沢剤、ラクチュロース、ラフィノース、フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、大豆オリゴ糖等のオリゴ糖、難消化性デキストリン、サイリウム、ビートファイバー等の食物繊維、スクラロース、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、グリシルリチン等の甘味料、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、タルク、リン酸一水素カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、硫酸カルシウム、乳酸カルシウム、カカオ脂等の賦形剤、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、クロスポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、粉末セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、リン酸カリウム、アラビアゴム末、プルラン、デキストリン、トウモロコシデンプン、アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、ゼラチン、キサンタンガム、トラガント、トラガント末、マクロゴール等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤、ハッカ油、ユーカリ油、ケイヒ油、ウイキョウ油、チョウジ油、オレンジ油、レモン油、ローズ油、フルーツフレーバー、ミントフレーバー、ペパーミントパウダー、ｄｌ−メントール、ｌ−メントール等の香料等を使用することができる。
【００３２】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フイルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。カプセル剤は有効成分を上記で例示した各種の担体と混合し、硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。液体製剤は水性又は油性の懸濁液、溶液、シロップ、エリキシル剤であってもよく、通常の添加剤を用いて常法に従い、調製される。
【００３３】
本発明のＭＭＰ阻害剤及び経口組成物の摂取量（投与量）は、成人一人１日あたり、ラクトフェリンを含んだリポソームの摂取重量が、通常10mg〜10000mg程度、好ましくは50mg〜2000mg程度となる量である。
【００３４】
本発明のＭＭＰ阻害剤及び経口組成物は有効成分であるラクトフェリンを含んだリポソームのＭＭＰ阻害作用を利用する分野において利用でき、例えば、歯周組織破壊の予防又は治療に有用である。特に、本発明のＭＭＰ阻害剤が歯周組織破壊抑制作用を示すことから、歯周組織の破壊を伴う疾患に有用である。すなわち、歯周組織破壊をともなう歯周疾患（歯肉炎、歯周炎など）、不正咬合、歯牙物理的損傷、根幹治療に伴う歯周組織の破壊、口腔内の膿胞や腫瘍による歯周組織の破壊などに有用である。特に歯周軟組織の破壊に対して有用である。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３６】
［実施例１］ラクトフェリンを含んだリポソームの調製
卵黄レシチンとフィトステロールをモル比が84:16となるように、卵黄レシチン 1g、フィトステロール 0.12gを量り、エタノール5mlを加えて溶解した。この溶液に3重量%のラクトフェリン水溶液 95mlを加えて予備乳化を行った後、高圧ホモジネーションによりラクトフェリン封入リポソームを得た。ラクトフェリンはウシ由来のものを使用した。なお、このリポソームを1重量%リンタングステン酸処理によりネガティブ染色し、乾燥後、これを電子顕微鏡で観察して、多重層リポソームが形成されていることを確認した。
【００３７】
［実施例２］ラクトフェリンを含んだリポソームの調製
実施例１により得られたラクトフェリンリポソーム懸濁液 6 mLに36 mgのフコイダンを加え、ボルテックスミキサーにより強く撹拌し、フコイダンでコーティングしたラクトフェリン封入リポソームを得た。
【００３８】
［試験例１］
7週齢Wistar系雄性ラットを、ラクトフェリン水溶液（LF）群（18匹）、ラクトフェリンを封入したリポソーム分散液（LLF）群（18匹）及びコントロール群（18匹）に分け、それぞれの被検試料を７日間経口投与した。ラット１匹あたりのラクトフェリン投与量は500mg/kg/日である。なお、コントロール群には飲料水のみを摂取させた。なお、ラクトフェリンはウシ由来のものを使用し、ラクトフェリンを封入したリポソームは実施例１を使用した。
〔被検試料〕
コントロール：飲料水
LF：ラクトフェリン含有量0.2125重量％
LLF：ラクトフェリン含有量0.2125重量％、レシチン含有量0.071重量％、フィトステロール含有量0.0085重量％
【００３９】
その後、5mg/mlのLPS（リポポリサッカライド（細胞増加因子））溶液を浸潤させた綿栓をラット上顎臼歯口蓋側辺縁歯周組織に1時間静置して、歯肉溝からLPSの浸透投与を行った。LPS接触後もそれぞれの検体試料は経口投与を続けた。投与0日（LPS投与直前）、およびLPS投与1、3日後に各6匹のラットを解剖し、１ラットあたり２個所の辺縁歯周組織を摘出した。摘出組織は液体窒素にて急速冷却し、MMP活性の測定まで -80℃で保管した。
【００４０】
凍結保存した組織をセルストレイナー上に採取し、氷冷した0.15M NaCl を含むpH
7.4の0.05M トリス塩酸bufferで洗浄した。組織1mgあたり、100μLの氷冷した0.2M NaCl、5mM CaCl2、0.1% TritonX-100を含むpH 7.4の0.05M トリス塩酸bufferを添加後、氷冷下でホモジネーションを行い、遠心分離（4℃、15,000rpm、15min）後、上清を採取し粗タンパク抽出液とした。この粗タンパク抽出液100μlに50μlの蛍光標識Ｉ型コラーゲン溶液と50μlのNaCl、CaCl2、NaN3を含むpH7.5の0.1Mトリス塩酸bufferを添加し37℃で2時間加温した。2時間後、200μlのNaCl、0-フェナントロリン含有0.05Mトリス塩酸buffer、pH9.5/エタノールを添加し、直ちに攪拌した。30分間、室温で放置した後、遠心分離(4℃、15,000rpm、15min)を行い、上清を水で2倍希釈し蛍光強度(Ex495nm、Em520nm)を測定した。
【００４１】
一方、コラゲナーゼ活性既知のType Ｉ コラゲナーゼ(MMP-1)を0.2M NaCl、5mM CaCl2、0.1% TritonX-100を含むpH7.4の0.05Mトリス塩酸bufferにて希釈し0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 unit/mlの希釈系列を作成し検体と同様の反応を行った。粗タンパク抽出液の総タンパク濃度(μg/ml)をタンパク定量キットにより定量し、Ｉ型コラゲナーゼ活性標準曲線より算出されるＩ型コラゲナーゼ活性(U/ml)より粗タンパク抽出液のタンパク量あたりのＩ型コラゲナーゼ活性(U/mg)を求め、それを歯周組織のＩ型コラゲナーゼ活性とした。
【００４２】
LPS投与前、投与1、3日後の辺縁歯周組織のＩ型コラゲナーゼ活性を図1に示す。コントロール群のＩ型コラゲナーゼ活性はLPS投与後上昇した（1日後は有意）。LF投与群では、LPS投与1日後においてコントロール群と比較して抑制傾向(p=0.073)を示した。一方、LLF投与群では、LPS投与1日後にコントロール群と比較して抑制傾向(p=0.066)を、投与3日後にコントロール群、及びLF群と比較して有意な抑制(p=0.0499, p=0.014)を示した。
【００４３】
［試験例２］
試験例１と同一の方法により、ラットへのLPSの接触および被検試料の投与を行った。LPS投与前、投与1、2、3日後に摘出した辺縁歯周組織にTRIzol (インビトロジェン) を添加しホモジナイズを行った後、定法に従いtotal RNAを抽出した。その後、1μgのtotal RNAよりcDNAへの逆転写反応を行った後、PCR反応によりDNAを増幅し、アガロースゲルによる電気泳動を行い、臭化エチジウムによる可視化を行った。なお、実験はn=4で行った。 
【００４４】
LPS投与前、投与1日後、2日後、3日後におけるコントロール、LF、LLF投与群（各４検体）の辺縁歯周組織のMMP-1及び内在性コントロールとしてGAPDHのmRNA発現の電気泳動の結果を図２から図５に示す。これらから、LLFがLFおよびコントールと比較してMMP-1の遺伝子発現を抑制していることが確認された。
【００４５】
具体的には、MMP-1のmRNA発現は、LPS投与前、および投与3日後には3群間で差は認められないが、LPS投与1日後および2日後にLLF投与群がコントロール群と比較して抑制を示した。特に、LLF投与群では強い抑制を示した。
【００４６】
以下、本発明を経口組成物に応用した例を示す。
【００４７】
製造例１：錠剤
下記のレシチン、ステロール及びラクトフェリンを用いてラクトフェリンを含んだリポソームを調製し、このリポソームと下記の他の成分を用いて常法により、下記の組成の錠剤を製造した。
卵黄レシチン          4.0重量％
植物性ステロール      1.0重量％
ラクトフェリン       15.0重量％
マルチトール         42.0重量％
乳糖                 20.0重量％
ラクチュロース       15.0重量％
ショ糖脂肪酸エステル  3.0重量％
合計                100  重量％
【００４８】
製造例２：顆粒剤
下記のレシチン及びラクトフェリンを用いてラクトフェリンを含んだリポソームを調製し、このリポソームと下記の他の成分を用いて常法により、下記の組成の顆粒剤を製造した。
卵黄レシチン          5.0重量％
ラクトフェリン       20.0重量％
乳糖                 33.3重量％
デンプン             40.0重量％
キサンタンガム        1.0重量％
トコフェロール        0.1重量％
グルコン酸            0.1重量％
香料                  0.5重量％
合計                100  重量％
【００４９】
製造例３：飲料
下記のレシチン、ステロール及びラクトフェリンを用いてラクトフェリンを含んだリポソームを調製し、このリポソームと下記の他の成分を用いて常法により、下記の組成の飲料を製造した。
卵黄レシチン          0.5重量％
植物性ステロール      0.1重量％
ラクトフェリン        2.0重量％
クエン酸              0.5重量％
クエン酸ナトリウム    0.05重量％
果糖・ブドウ糖液糖   10.0重量％
ビタミンC             0.5重量％
香料                  0.15重量％
精製水                  残部
合計                100  重量％
【００５０】
製造例４：チュアブル
下記のレシチン、ステロール及びラクトフェリンを用いてラクトフェリンを含んだリポソームを調製し、このリポソームをフコイダンでコーティングし、このコーティングリポソームと下記の他の成分を用いて常法により、下記の組成のチュアブルを製造した。
大豆レシチン          4.0重量％
植物性ステロール      0.8重量％
ラクトフェリン       40.0重量％
フコイダン            1.4重量％
マルチトール         30.0重量％
キシリトール         20.0重量％
ショ糖脂肪酸エステル  3.0重量％
香料                  0.8重量％
合計                100  重量％
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のＭＭＰ阻害剤及び経口組成物は有効成分であるラクトフェリンを含んだリポソームの歯周組織破壊の抑制作用を利用する分野において利用でき、例えば、歯周組織破壊による歯周疾患の予防又は治療に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】試験例１におけるＩ型コラゲナーゼ活性を表すグラフである。３種類の棒グラフは左からコントロール、ラクトフェリン、リポソーム化ラクトフェリンを表す。なお、０日目は投与前の値である。
【図２】試験例２における電気泳動（LPS投与前）についての写真である。
【図３】試験例２における電気泳動（LPS１日後）についての写真である。
【図４】試験例２における電気泳動（LPS２日後）についての写真である。
【図５】試験例２における電気泳動（LPS３日後）についての写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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