(57)【要約】【課題】優れたＮＱＯ１発現増強効果によって、抗酸化作用・解毒効果（アンチエージング・デトックス効果）、神経保護・神経機能維持効果や代謝正常化作用のある新規の物質を見出し、当該物質を食品や化粧品、さらには医薬品あるいは医薬部外品等に添加するための素材として利用する。【解決手段】リン脂質を有効成分として含むことを特徴とするＮＱＯ１発現増強剤、及び、上記ＮＱＯ１発現増強剤を含むことを特徴とする飲食物、化粧品、医薬品及び医薬部外品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質を有効成分として含むことを特徴とするＮＱＯ１発現増強剤。
【請求項２】
リン脂質がホスファチジルセリンであることを特徴とする請求項１記載のＮＱＯ１発現増強剤。
【請求項３】
リン脂質がホスファチジルイノシトールであることを特徴とする請求項１記載のＮＱＯ１発現増強剤。
【請求項４】
リン脂質がホスファチジルセリンとホスファチジルイノシトールを含む混合物であることを特徴とする請求項１記載のＮＱＯ１発現増強剤。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のＮＱＯ１発現増強剤を含むことを特徴とする飲食物。
【請求項６】
請求項１〜４の何れか１項に記載のＮＱＯ１発現増強剤を含むことを特徴とする化粧品。
【請求項７】
請求項１〜４の何れか１項に記載のＮＱＯ１発現増強剤を含むことを特徴とする医薬品及び医薬部外品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＱＯ１発現増強剤に関する。より詳しくは、リン脂質を有効成分として含むＮＱＯ１発現増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
キノンは自然界に広く分布しており、ヒトがこれに暴露される頻度は非常に高い。多環式芳香族のキノン類は、あらゆる燃焼有機物、例えば車の排ガス、タバコの煙、都会の大気中微粒子などに豊富に含まれている。
【０００３】
キノンは高反応分子であり、容易に１電子あるいは２電子還元を受ける。キノンやその誘導体の２電子還元は、キノン酸化還元酵素ＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ｑｕｉｎｏｎｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  １、別名：ＤＴ−ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）で触媒され、キノン類に基づくフリーラジカルによる毒性に対して、この２電子還元で細胞保護作用を誘導する。
ＮＱＯ１活性は全ての組織において普遍的に検出されるが、発現量は組織によって異なっており、腎臓、骨格筋や肺で発現量が高く、膵臓では発現量が低い。
【０００４】
ＮＱＯ１の効果として、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ、ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ、ｅｐｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅなどの抗酸化／解毒関連遺伝子と協調的に発現して、フリーラジカル損傷、酸化ストレスなどに対して細胞を保護すること（非特許文献１参照）、膜結合型ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ｑを還元型に維持し、膜脂質の過酸化を阻害することが知られている（非特許文献２参照）。
更に、ＮＱＯ１は、α−ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌの誘導体であるα−ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｑｕｉｎｏｎｅをα−ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅに還元することによって抗酸化作用を得ることが報告されている（非特許文献３参照）。
【０００５】
ＮＱＯ１の発現には転写因子Ｎｒｆ２が関与しており、ＮＱＯ１遺伝子上流に位置するＡＲＥ（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）にＮｒｆ２が結合することによってＮＱＯ１の発現が誘導される（非特許文献１参照）。一般にＮｒｆ２は抗酸化・解毒関連酵素の遺伝子を誘導することが知られているが、老齢ラットの核内におけるＮｒｆ２量は低下しており、その結果としてｇｃｌ（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｌｉｇａｓｅ）産生量が減少するという報告がある（非特許文献４参照）。両報告から考え、ＮＱＯ１の産生量は老化（加齢）に伴って低下する可能性が考えられる。従って、ＮＱＯ１の発現を増強する素材は、老化に伴うＮＱＯ１量低下をサポートすることに有用であり、アンチエージング／デトックス効果が期待できる。
なお、非特許文献７では、Ｎｒｆ２欠損動物（−／−）に環境汚染物質ペンタクロロフェノールを投与した際にＮＱＯ１蛋白質の発現が顕著に抑制され、過酸化脂質評価に用いられるチオバルビツール酸反応生成物（ＴＢＡＲＳ）の増大が認められたことが報告されている。
【０００６】
また、ＮＱＯ１のノックアウトマウスの神経では、正常マウスに比べミエリン非形成の神経が高頻度に認められ、また平均アクソン径の低下も認められた（非特許文献５参照）。このことから、ＮＱＯ１は神経細胞間におけるシグナル伝達機能に関して重要な役割を担っていることが考えられる。
【０００７】
また、ＮＱＯ１ノックアウトマウスは、アディポサイトレベルが顕著に低下し、インスリン耐性を示すことが知られている（非特許文献６参照）。このマウスは、レドックス系反応の異常をきたし、その結果としてピリジンヌクレオチド、グルコース、脂肪酸の代謝異常が生じることが報告されている。
【非特許文献１】Ａ．Ｋ．Ｊａｉｓｗａｌ（２０００）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２９：２５４−２６２
【非特許文献２】Ｒ．Ｅ．Ｂｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：２５２８−２５３２
【非特許文献３】Ｄ．Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２：３００−３０５
【非特許文献４】Ｊ．Ｈ．Ｓｕｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：３３８１−３３８６
【非特許文献５】Ｊ．Ｌ．Ｓｔｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．４７１：２８９−２９７
【非特許文献６】Ａ．Ｇａｉｋｗａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２２５５９−２２６５４
【非特許文献７】Ｔ．Ｕｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ．  ９０：１１１−１１９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、優れたＮＱＯ１発現増強効果によって、抗酸化作用・解毒効果（アンチエージング・デトックス効果）、神経保護・神経機能維持効果や代謝正常化作用のある新規の物質を見出し、当該物質を食品や化粧品、さらには医薬品あるいは医薬部外品等に添加するための素材として利用することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意研究を行った結果、リン脂質、なかでもホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールに優れたＮＱＯ１発現増強効果があることを見出し、本発明に至った。
すなわち本発明は、リン脂質を有効成分として含むことを特徴とするＮＱＯ１発現増強剤である。
また、本発明は、上記ＮＱＯ１発現増強剤を含むことを特徴とする飲食物、化粧品、医薬品及び医薬部外品である。
【００１０】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のＮＱＯ１発現増強剤は、リン脂質を含むものである。
本発明で用いるリン脂質としては特に限定されず、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、これらのリゾ体等が挙げられる。上記リン脂質は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらのなかでも、ＰＳ、ＰＩ及びこれらの混合物が好ましい。ＰＳとＰＩを混合して用いる場合、その比率は特に限定されないが、通常、ＰＳ／ＰＩが０．０５〜８０の範囲であり、０．１〜１０の範囲であると、ＮＱＯ１発現増強効果に優れたものとなり、好ましい。より好ましくは０．５〜８である。
【００１１】
本発明で用いられるリン脂質は、いかなる起源のものでもよい。リン脂質を含む天然物、天然物からの抽出物、当該抽出物を精製したもの、合成リン脂質等が好適に用いられる。
【００１２】
本発明のＮＱＯ１発現増強剤は、ＮＱＯ１遺伝子の発現を増強するものであるので、アンチエージングに効果のある抗酸化剤、デトックス効果を有する解毒剤や、神経の保護・機能維持に効果のある神経保護剤、脂肪酸、糖や核酸の代謝正常化作用のある代謝改善剤等としての効果が期待できる。
本明細書において、「神経の保護」「神経の機能維持」とは、ミエリンと呼ばれるリポタンパク質により神経繊維が包まれて髄鞘が形成されること、又は形成されていることを意味する。この髄鞘が絶縁体の役割をすることで、電気信号が神経繊維に沿って速く正確に伝わるので、髄鞘が破損すると神経の信号が正しく伝わらなくなる。髄鞘は、脳卒中、炎症、免疫異常、代謝異常、ビタミンＢ１２欠乏などの栄養素の欠損症等によって破壊されるが、本発明のＮＱＯ１発現増強剤を日常的に摂取することにより、髄鞘の破壊を予防する効果も期待できる。
【００１３】
本発明のＮＱＯ１発現増強剤は、飲食物、化粧品、医薬品、医薬部外品に使用することができる。上記食品としては例えば機能性食品等が挙げられ、ここでいう機能性食品とは、サプリメント、特定保健用食品、健康食品、栄養補助食品、栄養機能食品など医薬品以外で経口的に摂取することにより、健康の維持あるいは改善を目的とする製品を意味している。
【００１４】
本発明のＮＱＯ１発現増強剤は、経口的あるいは非経口的に投与することができる。経口投与剤としては散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤が挙げられる。また、非経口投与剤としては、点眼剤、坐剤、注射剤などが挙げられる。本発明のＮＱＯ１発現増強剤を注射剤で用いる場合、懸濁液、乳化液、リポソーム製剤のいずれであってもよい。
【００１５】
本発明のＮＱＯ１発現増強剤には、更に、上記リン脂質の他に薬剤学的および食品衛生学的に許容される他の素材を常法により適宜添加混合してもよい。このようなものとしては特に限定されず、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、コーティング剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤、健康食品素材、栄養補助食品素材、ビタミン、漢方薬（生薬エキス）を含む薬剤ならびにこれらの組み合わせなどが挙げられる。
【００１６】
本発明のＮＱＯ１発現増強剤におけるリン脂質の含有量は特に限定されず、好ましくは１重量％以上、より好ましくは１０重量％以上である。
本発明のリン脂質を含有するＮＱＯ１発現増強剤を作製する際のリン脂質の含有量、剤型、保存方法および保存形態は、医薬品、医薬部外品、飲食物、化粧品などの用途に応じて適宜決定できる。
【００１７】
本発明のＮＱＯ１発現増強剤の投与量としては特に制限されず、疾患の種類や程度によって適宜調整すればよく、例えばリン脂質の量に換算して成人一人当たり１日に５０〜２０００ｍｇ程度を投与すればよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＮＱＯ１発現増強剤は、優れたＮＱＯ１発現増強効果によって、抗酸化作用・解毒効果（アンチエージング・デトックス効果）、神経保護・神経機能維持効果や代謝正常化作用が期待される。また、当該発現増強剤は、継続的に摂取しても副作用の心配がないリン脂質からなるので、食品、化粧品、さらには医薬品あるいは医薬部外品等に添加するための素材として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
製造例１  ＰＩ・ＰＳ含有リン脂質
レシチンとしてＳＬＰ−ＰＩパウダー（辻製油株式会社製）７ｇをヘプタン及びアセトンの混合液７０ｍＬと共に混合して溶解させ、レシチン溶液を得た。これとは別に、セリン２０ｇ及びホスホリパーゼＤ（ナガセケムテックス株式会社製）５００Ｕを１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）６７ｍＬ中に含む酵素含有セリン溶液を調製した。
このレシチン溶液に酵素含有セリン溶液を加え、３０℃にて５時間攪拌した。次いで、ヘプタン及びアセトンの混合液７５ｍＬ及び塩化ナトリウム２０ｇを加え、１時間攪拌し、これを静置して分離した後、有機層を回収し、ＰＩ・ＰＳ含有有機溶媒溶液を得た。この有機溶媒溶液は固形分８ｇを含有していた。その組成を調べたところ、次の通りであった。ホスファチジルセリン２０％、ホスファチジルイノシトール２０％、ホスファチジルコリン９％、ホスファチジルエタノールアミン１４％、ホスファチジン酸１４％、リゾホスファチジルコリン５％、リゾホスファチジルエタノールアミン１％。
【００２０】
製造例２  ＰＳ含有リン脂質
レシチンとしてＳＬＰ−ＰＳ７０（辻製油株式会社製）を使用したこと以外は製造例１と同様に反応を行い、ＰＳを主として含有するリン脂質を固形分として７ｇ得た。その組成を調べたところ、次の通りであった。ホスファチジルセリン８０％、ホスファチジルイノシトール１％、ホスファチジン酸１０％、ホスファチジルエタノールアミン３％、リゾホスファチジルコリン２％、リゾホスファチジルエタノールアミン１％。
【００２１】
製造例３  ＰｕｒｅＰＩ
ＢＩＯＭＯＬ社のＬ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  Ｎａをクロロホルム／メタノール（９／１）混液で溶解し、エバポレートした。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で分散液を調製し、氷水中で超音波処理を行い、リポソームを調製した。
【００２２】
製造例４  ＰｕｒｅＰＳ
ＳＩＧＭＡ社のＬ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅをクロロホルムで溶解し、エバポレートした。ＰＢＳ（−）で分散液を調製し、氷水中で超音波処理を行い、リポソームを調製した。
【００２３】
製造例５  ＰｕｒｅＰＩ＋ＰｕｒｅＰＳ
製造例３及び４で得られたリポソームを細胞添加濃度に合うように必要量ずつ混合し、サンプルとした。配合割合は、図２〜４、図６及び図７に記載の濃度となるように混合した。
【００２４】
製造例６  ＰｕｒｅＰＩＰＳ
ＢＩＯＭＯＬ社のＬ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ＮａとＳＩＧＭＡ社のＬ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅとを１：１で混合し、クロロホルムで溶解し、エバポレートした。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で分散液を調製し、氷水中で超音波処理を行い、リポソームを調製した。
【００２５】
実施例１
ＰＣ１２ｈ（ＰＣ１２をクローニングすることによって得られた細胞）を２×１０６／ｗｅｌｌとなるように６ｗｅｌｌコラーゲンタイプＩコートのプレートに播種し、前培養した。製造例１〜４で得られたリン脂質を、図１、２に記載の濃度で添加し、３２時間培養した後、培養上清を廃棄し、各ウェルにＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）１ｍＬを添加し、細胞抽出物を得た。以下、ＩＳＯＧＥＮ添付の操作方法に準じてｍＲＮＡを分取した。
ｃＤＮＡの分取には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を使用し、本キットに添付の操作手順に準じて行った。以下使用したプライマーを示す。
ＮＱＯ１  Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：ＧＴＧＴＡＣＡＧＣＡＴＴＧＧＣＣＡＣＡＣ（配列番号１）
ＮＱＯ１  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：ＣＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＧＣ（配列番号２）
β−ａｃｔｉｎ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣ（配列番号３）
β−ａｃｔｉｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：ＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＧＡＴＡＧＴＧＡＴ（配列番号４）
９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１分間の条件でＮＱＯ１プライマーセットを用いて２８サイクル（配列番号１、２）、β−ａｃｔｉｎプライマーセットを用いて２２サイクル（配列番号３、４）でＰＣＲを行った。ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＧｏＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。ＰＣＲ終了後のサンプルを１．５％アガロースゲルにて電気泳動を行い、ＰＣＲ産物の解析を行った。
それぞれのバンド強度についてデンシトメトリー解析を行い、ＮＱＯ１／β−ａｃｔｉｎ比を取ることによってコントロールに対するＮＱＯ１発現増強量について半定量的に解析した。結果を図１及び図２に示す。
【００２６】
解析の結果、製造例１で得られたＰＩ・ＰＳ含有リン脂質、及び、製造例２で得られたＰＳ含有リン脂質によって、濃度依存的に顕著なＮＱＯ１発現増強効果が認められた（図１）。また、ホスファチジルセリンを添加した細胞においてＮＱＯ１の顕著な発現増強効果が認められたが、さらに同濃度のホスファチジルイノシトールが共存する場合、ホスファチジルセリン単独よりも強いＮＱＯ１発現増強効果が認められた（図２）。
【００２７】
実施例２
Ｎｅｕｒｏ  ２ａ（大日本製薬社製）を５×１０５／ｗｅｌｌとなるように６ｗｅｌｌコラーゲンタイプＩコートのプレートに播種し、前培養した。製造例１〜６で得られたリン脂質を、図３〜図５に記載の濃度で添加し、２４時間培養した後、培養上清を廃棄し、各ウェルにＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）１ｍＬを添加し、細胞抽出物を得た。以下、ＩＳＯＧＥＮ添付の操作方法に準じてｍＲＮＡを分取した。
ｃＤＮＡの分取にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を使用し、本キットに添付の操作手順に準じて行った。以下使用したプライマーを示す。
ＮＱＯ１  Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＧ（配列番号５）
ＮＱＯ１  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＡＧＴＴＡＧＴＣＣＣＴＣＧＧＣＣＡＴＴ（配列番号６）
β−ａｃｔｉｎ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧ（配列番号７）
β−ａｃｔｉｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：ＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧ（配列番号８）
９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１分間の条件でＮＱＯ１プライマーセットを用いて２８サイクル（配列番号５、６）、β−ａｃｔｉｎプライマーセットを用いて２５サイクル（配列番号７、８）でＰＣＲを行った。ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＧｏＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。ＰＣＲ終了後のサンプルを１．５％アガロースゲルにて電気泳動を行い、ＰＣＲ産物の解析を行った。
それぞれのバンド強度についてデンシトメトリー解析を行い、ＮＱＯ１／β−ａｃｔｉｎ比を取ることによってコントロールに対するＮＱＯ１発現増強量について半定量的に解析した。結果を図３〜図５に示す。
【００２８】
実施例１で使用した細胞ＰＣ１２ｈと別の細胞であるＮｅｕｒｏ２ａを用いて同様の検討を行った結果、ＰＣ１２ｈと同様に、ＰＩ・ＰＳ含有リン脂質及びＰＳ含有リン脂質による顕著なＮＱＯ１発現増強効果が認められ、それぞれコントロールに比し、約２倍発現が増大した（図３）。ホスファチジルセリン単独でもＮＱＯ１発現増強が認められたが、ホスファチジルイノシトールを併用した方が、発現量が増大する傾向が認められ、この結果は図２と同様であった。
また、ホスファチジルイノシトールのみを添加した細胞においても、ホスファチジルセリンのみを添加した場合と同程度のＮＱＯ１発現増強効果が認められた（図４）。
また、ホスファチジルセリンとホスファチジルイノシトールを混合して添加すると、添加の合計量に大きな違いがない場合、ＰＳ／ＰＩが０．５〜８の範囲であれば同程度のＮＱＯ１発現増強効果が認められた（図４、図５）。
【００２９】
実施例３  ＮＱＯ１活性測定方法
Ｐ．Ｔｓｖｅｔｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：５５３５−５５４０の方法を一部変更して行った。
（１）細胞の播種とリン脂質の添加
Ｎｅｕｒｏ  ２ａを５×１０５／ｗｅｌｌとなるように６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種し、２４時間培養した。培地を除去し、製造例１、２、５のリン脂質を図６に記載の濃度で添加し、２４時間培養した。
（２）細胞抽出液の調製
（１）で培養したＮｅｕｒｏ  ２ａをＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．１ｍＭ  ＤＴＴ）５００μＬでサスペンドし、細胞懸濁液を得た。これを氷水中で約２０秒間超音波処理した後、１５０００ｒｐｍで１５分間、４℃の条件で遠心を行い、得られた上清を細胞抽出液とした。
（３）タンパク定量（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）
ＢＳＡ（スタンダード、ＳＩＧＭＡ社製）及び細胞抽出液をそれぞれ１０μＬずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに添加した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（ＢＩＯＲＡＤ社製）をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で５倍希釈し、各ｗｅｌｌに２００μＬずつ添加した。室温で２０分間静置した後、５９５ｎｍの波長で吸光度測定を行った。ＢＳＡスタンダードから、細胞抽出液のタンパク濃度を算出した。
（４）活性測定
細胞抽出液１００μＬに対して、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０  １０μＬ、４０μＭ  ｍｅｎａｄｉｏｎｅ  １０μＬ、５μＭ  ＦＡＤ  １０μＬ及び２００μＭ  ＮＡＤＨ  １０μＬを添加した反応系に対し、ＮＱＯ１阻害剤として１０μＭ  ｄｉｃｕｍａｒｏｌ  １０μＬを添加あるいは非添加の反応系を作製し、３７℃で３０分間、ＮＡＤＨの減少量を３４０ｎｍの波長で吸光度を測定することより算出した。なお、反応系の容量は２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて２００μＬとした。
ＮＱＯ１活性（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）は以下の式で算出した。
（ＮＱＯ１活性）＝（（Ｄｉｃ（−）ｓ−Ｄｉｃ（＋）ｓ）／（Ｄｉｃ（−）ｃ−Ｄｉｃ（＋）ｃ））×１００
Ｄｉｃ（−）ｓ：ｄｉｃｕｍａｒｏｌ非添加サンプル吸光度
Ｄｉｃ（＋）ｓ：ｄｉｃｕｍａｒｏｌ添加サンプル吸光度
Ｄｉｃ（−）ｃ：ｄｉｃｕｍａｒｏｌ非添加コントロール吸光度
Ｄｉｃ（＋）ｃ：ｄｉｃｕｍａｒｏｌ添加コントロール吸光度
結果を図６示す。
【００３０】
測定の結果、製造例１で得られたＰＩ・ＰＳ含有リン脂質、製造例２で得られたＰＳ含有リン脂質、製造例３、４で得られたＰｕｒｅＰＩとＰｕｒｅＰＳとを混合して添加した場合において、ＮＱＯ１のタンパク質としての活性促進が認められた。
【００３１】
実施例４  過酸化水素傷害に対する細胞保護効果とこの保護効果におけるＮＱＯ１の関与
（１）細胞の播種とリン脂質ならびに一般抗酸化剤の添加
Ｎｅｕｒｏ  ２ａを１×１０４／ｗｅｌｌとなるように９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種し、２４時間培養した。培地を除去し、製造例３、４、５のリン脂質を図７に記載の濃度で添加し、２４時間培養した。
（２）Ｄｉｃｕｍａｒｏｌ（ＮＱＯ１阻害剤）および過酸化水素の添加
（１）で培養したＮｅｕｒｏ  ２ａに図７に記載の濃度に調製したＤｉｃｕｍａｒｏｌおよび過酸化水素を添加し、さらに２４時間培養した。
（３）細胞保護効果の解析
（２）で培養したＮｅｕｒｏ  ２ａにＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社同仁化学研究所）を１０μＬずつ添加し、３７℃で２時間反応した。その後、プレートリーダーで各ｗｅｌｌの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（細胞生存率）％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）＝（（Ｓ−ＢＬ）／（Ｃ−ＢＬ））×１００
サンプル添加吸光度：Ｓ
コントロール吸光度：Ｃ
ブランク吸光度：ＢＬ
結果を図７に示す。
【００３２】
測定の結果、Ｄｉｃｕｍａｒｏｌ  ｆｒｅｅにおける過酸化水素傷害に対して、製造例３、４、５で得られたＰｕｒｅＰＩとＰｕｒｅＰＳならびにその混合物で顕著な細胞保護効果が認められた。一方、ＮＱＯ１阻害剤であるＤｉｃｕｍａｒｏｌを２５μＭ又は５０μＭ添加することによって、この細胞保護効果は顕著に阻害された。
従って、ＰｕｒｅＰＩとＰｕｒｅＰＳならびにその混合物によって認められた過酸化水素傷害に対する細胞保護効果にはＮＱＯ１が関与していることが考えられた。
【００３３】
実施例５  過酸化水素傷害に対するＰＩ・ＰＳ含有リン脂質による細胞保護効果
（１）細胞の播種と製造例１の添加
Ｎｅｕｒｏ  ２ａを１×１０４／ｗｅｌｌとなるように９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種し、２４時間培養した。培地を除去し、製造例１で得られたＰＩ・ＰＳ含有リン脂質を図８に記載の濃度で添加し、２４時間培養した。
（２）過酸化水素の添加
（１）で培養したＮｅｕｒｏ  ２ａに図８に記載の濃度に調製した過酸化水素を添加し、さらに２４時間培養した。
（３）細胞保護効果の解析
（２）で培養したＮｅｕｒｏ  ２ａにＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社同仁化学研究所）を１０μＬずつ添加し、３７℃で２時間反応した。その後、プレートリーダーで各ｗｅｌｌの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（細胞生存率）％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）＝（（Ｓ−ＢＬ）／（Ｃ−ＢＬ））×１００
サンプル添加吸光度：Ｓ
コントロール吸光度：Ｃ
ブランク吸光度：ＢＬ
結果を図８に示す。
【００３４】
測定の結果、製造例１で得られたＰＩ・ＰＳ含有リン脂質において、過酸化水素傷害に対して顕著な細胞保護効果が認められた。
【００３５】
実施例６  ＰＩ・ＰＳ含有リン脂質によるＴＢＡＲＳ抑制効果
製造例１のＰＩ・ＰＳ含有リン脂質を肥満モデルのＺｕｃｋｅｒラットに与えた。
食餌組成および飼育方法
６週齢の雄性Ｚｕｃｋｅｒラットを２群に分け（１群６匹）、対照群（ＴＧ群、ｃｏｎｔｒｏｌ）と、ＰＩ・ＰＳ含有リン脂質を２％添加したＰＩＰＳ群を設けた。以上の２群を４週間飼育し、９時間絶食後、エーテル麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺を行い、肝臓を摘出した。
食餌組成を表１に示す。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
過酸化脂質ＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応生成物）の測定
上記ラットの肝臓をＰＢＳ（−）を用いて５０ｍｇ／ｍＬのホモジネートを調製した。ＴＢＡＲＳ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社製）の添付文書に参考にして、チオバルビツール酸反応生成物の測定を行った。結果はチオバルビツール酸と反応する過酸化脂質由来のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）量で示した。
測定結果を図９に示す。
【００３８】
図９の結果から、ＰＩ・ＰＳ含有リン脂質投与でＺｕｃｋｅｒラット肝臓のＴＢＡＲＳ抑制効果が認められた。
また、ＰＩ・ＰＳ含有リン脂質によるＴＢＡＲＳ抑制効果には、少なからずＮＱＯ１が関与していることが推測される。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明のＮＱＯ１発現増強剤は、優れたＮＱＯ１発現増強効果によって、抗酸化作用・解毒効果（アンチエージング・デトックス効果）、神経保護・神経機能維持効果や代謝正常化作用が期待される。また、当該発現増強剤は、継続的に摂取しても副作用の心配がないリン脂質からなるので、食品、化粧品、さらには医薬品あるいは医薬部外品等に添加するための素材として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】実施例１において、ＰＩ・ＰＳ含有リン脂質及びＰＳ含有リン脂質を用いた場合の、ＮＱＯ１の遺伝子発現の相対値を表すグラフである。
【図２】実施例１において、ＰｕｒｅＰＩ及びＰｕｒｅＰＳを用いた場合の、ＮＱＯ１の遺伝子発現の相対値を表すグラフである。
【図３】実施例２での、ＮＱＯ１の遺伝子発現の相対値を表すグラフである。
【図４】実施例２での、ＮＱＯ１の遺伝子発現の相対値を表すグラフである。
【図５】実施例２での、ＮＱＯ１の遺伝子発現の相対値を表すグラフである。
【図６】実施例３での、ＮＱＯ１のタンパク質活性の相対値を表すグラフである。
【図７】実施例４での、Ｄｉｃｕｍａｒｏｌ添加における過酸化水素傷害に対する製造例３のＰｕｒｅＰＩ、製造例４のＰｕｒｅＰＳ、製造例５のＰｕｒｅＰＩ＋ＰｕｒｅＰＳの細胞保護効果を表すグラフである。
【図８】実施例５での、過酸化水素傷害に対する製造例１で得られたＰＩ・ＰＳ含有リン脂質の細胞保護効果を表すグラフである。
【図９】実施例６での、製造例１で得られたＰＩ・ＰＳ含有リン脂質のＴＢＡＲＳ抑制効果を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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