(57)【要約】【課題】異なるゲノム配列を有する少なくとも２つ以上の相同組換え体を調製する方法を改善し、異なるゲノム配列を有する少なくとも２つ以上のトランスジェニック生物の調製に現在要している時間、労力およびコストを削減すること。【解決手段】本発明により、植物において、異なるゲノム配列を有する少なくとも２つ以上の相同組換え体を調製する方法であって、（ａ）植物細胞内に相同組換え用核酸を導入する工程、および（ｂ）その相同組換え用核酸が導入された植物細胞を培養する工程、を包含する方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において、異なるゲノム配列を有する少なくとも２つ以上の相同組換え体を調製する方法であって、以下：
（ａ）植物細胞内に相同組換え用核酸を導入する工程、および
（ｂ）該相同組換え用核酸が導入された該植物細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記異なるゲノム配列は、少なくとも２つの前記相同組換え用核酸由来のゲノム領域、および該少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの前記植物細胞のゲノム領域からなるゲノム領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記相同組換え用核酸が、アグロバクテリウム菌によって前記植物細胞に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
植物において、再生能のある植物細胞から、異なるゲノム配列を有する少なくとも２つ以上のトランスジェニック植物を調製する方法であって、以下：
（ａ）植物細胞内に相同組換え用核酸を導入する工程、
（ｂ）該相同組換え用核酸が導入された植物細胞を培養する工程、および
（ｃ）該培養された細胞より、トランスジェニック植物を調製する工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
前記異なるゲノム配列は、少なくとも２つの前記相同組換え用核酸由来のゲノム領域、および該少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの前記植物細胞のゲノム領域からなるゲノム領域を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記相同組換え用核酸が、アグロバクテリウム菌によって前記植物細胞に導入される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記相同組換え用核酸が、以下：
（１）第一のゲノム領域またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、第一の相同組換え領域、
（２）第二のゲノム領域またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、第二の相同組換え領域、および
（３）該第一の領域と該第二の領域との間に挟まれた、ポジティブ選択マーカー、
を含有し、ここで、該第一の領域および該第二の領域が、該第一のゲノム領域またはその相補鎖および該第二のゲノム領域またはその相補鎖に対して、少なくとも２つ以上の変異を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記相同組換え用核酸が、以下：
（４）第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子；および
（５）第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子、
をさらに含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子と前記第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子が同一の遺伝子である、方法。
【請求項１０】
前記相同組換え用核酸が、前記ポジティブ選抜マーカー遺伝子の上流および下流に（６）部位特異的組換え酵素（リコンビナーゼ）認識配列をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記相同組換え用核酸が、（７）発現誘導可能な部位特異的組換え酵素（リコンビナーゼ）遺伝子をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポジティブ選抜マーカー遺伝子が、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子および薬剤耐性遺伝子からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記ネガティブ選抜マーカー遺伝子が、ジフテリア毒素タンパク質Ａ鎖遺伝子（ＤＴ−Ａ）、ｃｏｄＡ遺伝子、シトクロムＰ−４５０遺伝子およびｂａｒｎａｓｅ遺伝子からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記部位特異的組換え酵素を発現させて、前記ポジティブ選抜マーカー遺伝子を前記植物細胞から除去する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
植物において、異なるゲノム配列を有する少なくとも２つ以上の相同組換え体を調製するための組成物であって、相同組換え用核酸を含有する、組成物。
【請求項１６】
前記異なるゲノム配列は、少なくとも２つの前記相同組換え用核酸由来のゲノム領域、および該少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの前記植物の細胞のゲノム領域からなるゲノム領域を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記相同組換え用核酸が、アグロバクテリウム菌によって前記植物に導入される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記相同組換え用核酸が、以下：
（１）第一のゲノム領域またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、第一の相同組換え領域、
（２）第二のゲノム領域またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、第二の相同組換え領域、および
（３）該第一の領域と該第二の領域との間に挟まれた、ポジティブ選択マーカー、
を含有し、ここで、該第一の領域および該第二の領域が、該第一のゲノム領域またはその相補鎖および該第二のゲノム領域またはその相補鎖に対して、少なくとも２つ以上の変異を有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記相同組換え用核酸が、以下：
（４）第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子；および
（５）第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子、
をさらに含有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組成物であって、前記第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子と前記第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子が同一の遺伝子である、組成物。
【請求項２１】
前記相同組換え用核酸が、前記ポジティブ選抜マーカー遺伝子の上流および下流に（６）部位特異的組換え酵素（リコンビナーゼ）認識配列をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記相同組換え用核酸が、（７）発現誘導可能な部位特異的組換え酵素（リコンビナーゼ）遺伝子をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ポジティブ選抜マーカー遺伝子が、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子および薬剤耐性遺伝子からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ネガティブ選抜マーカー遺伝子が、ジフテリア毒素タンパク質Ａ鎖遺伝子（ＤＴ−Ａ）、ｃｏｄＡ遺伝子、シトクロムＰ−４５０遺伝子およびｂａｒｎａｓｅ遺伝子からなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック生物の調製法に関する。より具体的には、本発明は、相同組換えを利用した、２つ以上のトランスジェニック生物を調製する方法およびその組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
相同組換えとは、相同的な塩基配列を有する分子間の遺伝的交換をいい、これは大腸菌、酵母、植物および動物を含む全ての生物において見られる現象である。生体内では染色体乗り換えなどの形式で見られるが、人工的にゲノム上の特定遺伝子を変化させる遺伝子ターゲティングの手段としても利用されている。
【０００３】
特定の染色体上の遺伝子においてこの相同組換えを起こさせることによって、特定の内在性遺伝子領域を欠失させる遺伝子ノックアウト系が、酵母において最初に確立された。遺伝子ノックアウト系は高等生物では非常に効率が低く、目的とする組換え体を得ることは困難であったが、ポジティブ・ネガティブ選抜等を適用することにより、ある程度は組換え体を効率よく選別することができるようになった。
【０００４】
近年、単純に遺伝子を破壊するノックアウト系だけではなく、点変異を導入してアミノ酸置換を起こさせて所望の変異を導入すること、または新規遺伝子を染色体上に導入すること等を可能にする、ノックイン系が開発された。このノックイン系では、ゲノム上で特定の遺伝子の両脇に位置するＤＮＡと相同的な塩基配列を有するＤＮＡフラグメントを改変体の両脇につなげて細胞内に導入し、両脇の相同（組換え）領域で相同組換えを起こし、特定の遺伝子を除去して、代わりに外来の遺伝子を挿入する。このノックイン系により、遺伝子変換を起こさせて、より詳細な解析を行うことが可能となった。
【０００５】
相同組換えを利用したノックイン系は、より詳細な遺伝子解析を行うための強力かつ有用な実験ツールである。しかしながら、高等真核生物においては相同組換えイベントが起こる確率は非常に低く、ある所望される目的の核酸を導入するためには、膨大な数の試行を行い、その中から所望のトランスジェニック生物の単離する必要がある。これは、非常に労力およびコストを要する作業である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ノックイン系は強力な遺伝子の機能解析ツールであるが、特に高等真核生物においてはその発生確率が極めて低い。そのため、例えばたった１つ程度の変異を導入するために、膨大な数の試行を行い、その中から所望のトランスジェニック生物を単離するという、非常に時間、労力およびコストを要する作業が必要とされている。そのため、１種のみならず複数種の異なる変異を有するトランスジェニック生物を調製するためには、多大な労力が必要とされていた。複数種の異なる変異を有するトランスジェニック生物を調製するには、異なるゲノム配列を有する少なくとも２つ以上の相同組換え体を調製し、そこからトランスジェニック生物を調製する必要がある。そのため、異なるゲノム配列を有する少なくとも２つ以上の相同組換え体を調製する方法を改善し、異なるゲノム配列を有する少なくとも２つ以上のトランスジェニック生物の調製に現在要している時間、労力およびコストを削減する大きな必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、植物において、複数の点変異を導入した相同組換え用核酸をアグロバクテリウムによって植物細胞に導入し、相同組換えを起こさせることによって、予想外に、単一の相同組換え用核酸と、１回の相同組換え用核酸導入作業から、入れ子状のゲノム領域を含む異なるゲノム配列を有する少なくとも２種類の相同組換え体を得ることができることを発見し、この発見に基づいて上記課題を解決した。本発明の方法は、アグロバクテリウム媒介性の１回のノックイン試行によって入れ子状のゲノム領域を含む異なるゲノム配列を有する少なくとも２種類の相同組換え体を得ることにより、相同組換えが起こる確率の低さに起因するノックインの効率の悪さを飛躍的に改善し得る。さらに、本発明の方法を用いた変異導入法は、相同組換え体取得効率自体も、従来公知である他の方法に比べて非常に高かった。また、従来の二本鎖ＤＮＡを介した変異導入メカニズム（図１Ｂを参照のこと；Ｆ．Ｐａｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｈａｂｅｒ（１９９９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：３４９−４０４（一部改変））では変異導入が困難であると理解されていた、相同組換え核酸内の５’上流側および３’下流側（すなわち、両末端の領域）への変異導入効率が、本発明の方法では上昇した。
【０００８】
本発明は、目的の遺伝子と染色体上の特定の遺伝子との間で、複数の箇所において入れ子状に相同組換えが起こるという、従来からは到底予想され得なかったモデルに基づくものであり、そして点変異のノックイン効率を飛躍的に改善するという、当業者が容易に想到し得ない顕著な効果を奏するものである。
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するために、例えば以下の項目を提供する：
（項目１）  植物において、異なるゲノム配列を有する少なくとも２つ以上の相同組換え体を調製する方法であって、以下：
（ａ）植物細胞内に相同組換え用核酸を導入する工程、および
（ｂ）その相同組換え用核酸が導入されたその植物細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【００１０】
（項目２）  上記異なるゲノム配列は、少なくとも２つの上記相同組換え用核酸由来のゲノム領域、およびその少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの上記植物細胞のゲノム領域からなるゲノム領域を含む、項目１に記載の方法。
【００１１】
（項目３）  上記相同組換え用核酸が、アグロバクテリウム菌によって上記植物細胞に導入される、項目１に記載の方法。
【００１２】
（項目４）  植物において、再生能のある植物細胞から、異なるゲノム配列を有する少なくとも２つ以上のトランスジェニック植物を調製する方法であって、以下：
（ａ）植物細胞内に相同組換え用核酸を導入する工程、
（ｂ）その相同組換え用核酸が導入された植物細胞を培養する工程、および
（ｃ）その培養された細胞より、トランスジェニック植物を調製する工程、
を包含する、方法。
【００１３】
（項目５）  上記異なるゲノム配列は、少なくとも２つの上記相同組換え用核酸由来のゲノム領域、およびその少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの上記植物細胞のゲノム領域からなるゲノム領域を含む、項目３に記載の方法。
【００１４】
（項目６）  上記相同組換え用核酸が、アグロバクテリウム菌によって上記植物細胞に導入される、項目３に記載の方法。
【００１５】
（項目７）  上記相同組換え用核酸が、以下：
（１）第一のゲノム領域またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、第一の相同組換え領域、
（２）第二のゲノム領域またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、第二の相同組換え領域、および
（３）その第一の領域とその第二の領域との間に挟まれた、ポジティブ選択マーカー、を含有し、ここで、その第一の領域およびその第二の領域が、その第一のゲノム領域またはその相補鎖およびその第二のゲノム領域またはその相補鎖に対して、少なくとも２つ以上の変異を有する、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【００１６】
（項目８）  上記相同組換え用核酸が、以下：
（４）第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子；および
（５）第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子、
をさらに含有する、項目７に記載の方法。
【００１７】
（項目９）  項目８に記載の方法であって、上記第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子と上記第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子が同一の遺伝子である、方法。
【００１８】
（項目１０）  上記相同組換え用核酸が、上記ポジティブ選抜マーカー遺伝子の上流および下流に（６）部位特異的組換え酵素（リコンビナーゼ）認識配列をさらに含む、項目７に記載の方法。
【００１９】
（項目１１）  上記相同組換え用核酸が、（７）発現誘導可能な部位特異的組換え酵素（リコンビナーゼ）遺伝子をさらに含む、項目１０に記載の方法。
【００２０】
（項目１２）  上記ポジティブ選抜マーカー遺伝子が、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子および薬剤耐性遺伝子からなる群から選択される、項目７に記載の方法。
【００２１】
（項目１３）  上記ネガティブ選抜マーカー遺伝子が、ジフテリア毒素タンパク質Ａ鎖遺伝子（ＤＴ−Ａ）、ｃｏｄＡ遺伝子、シトクロムＰ−４５０遺伝子およびｂａｒｎａｓｅ遺伝子からなる群から選択される、項目８に記載の方法。
【００２２】
（項目１４）
上記部位特異的組換え酵素を発現させて、上記ポジティブ選抜マーカー遺伝子を上記植物細胞から除去する工程をさらに包含する、項目１０に記載の方法。
【００２３】
（項目１５）  植物において、異なるゲノム配列を有する少なくとも２つ以上の相同組換え体を調製するための組成物であって、相同組換え用核酸を含有する、組成物。
【００２４】
（項目１６）  上記異なるゲノム配列は、少なくとも２つの上記相同組換え用核酸由来のゲノム領域、およびその少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの上記植物の細胞のゲノム領域からなるゲノム領域を含む、項目１５に記載の組成物。
【００２５】
（項目１７）  上記相同組換え用核酸が、アグロバクテリウム菌によって上記植物に導入される、項目１５に記載の方法。
【００２６】
（項目１８）  上記相同組換え用核酸が、以下：
（１）第一のゲノム領域またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、第一の相同組換え領域、
（２）第二のゲノム領域またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、第二の相同組換え領域、および
（３）その第一の領域とその第二の領域との間に挟まれた、ポジティブ選択マーカー、
を含有し、ここで、その第一の領域およびその第二の領域が、その第一のゲノム領域またはその相補鎖およびその第二のゲノム領域またはその相補鎖に対して、少なくとも２つ以上の変異を有する、項目１５に記載の組成物。
【００２７】
（項目１９）  上記相同組換え用核酸が、以下：
（４）第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子；および
（５）第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子、
をさらに含有する、項目１８に記載の組成物。
【００２８】
（項目２０）  項目１９に記載の組成物であって、上記第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子と上記第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子が同一の遺伝子である、組成物。
【００２９】
（項目２１）  上記相同組換え用核酸が、上記ポジティブ選抜マーカー遺伝子の上流および下流に（６）部位特異的組換え酵素（リコンビナーゼ）認識配列をさらに含む、項目１８に記載の組成物。
【００３０】
（項目２２）  上記相同組換え用核酸が、（７）発現誘導可能な部位特異的組換え酵素（リコンビナーゼ）遺伝子をさらに含む、項目２１に記載の組成物。
【００３１】
（項目２３）  上記ポジティブ選抜マーカー遺伝子が、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子および薬剤耐性遺伝子からなる群から選択される、項目１８に記載の組成物。
【００３２】
（項目２４）  上記ネガティブ選抜マーカー遺伝子が、ジフテリア毒素タンパク質Ａ鎖遺伝子（ＤＴ−Ａ）、ｃｏｄＡ遺伝子、シトクロムＰ−４５０遺伝子およびｂａｒｎａｓｅ遺伝子からなる群から選択される、項目１９に記載の組成物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明者らは、植物細胞において遺伝子に複数の点変異を導入した相同組換え用核酸を、アグロバクテリウムによって植物細胞に導入し、相同組換えを起こさせることによって、予想外に、単一の相同組換え用核酸を用いた１回の相同組換え用核酸導入作業から、入れ子状のゲノム領域を含む異なるゲノム配列を有する少なくとも２種類のトランスジェニック植物を得ることができることを発見し、その発見に基づいて上記課題を解決した。本発明の方法は、アグロバクテリウム媒介性の１回のノックイン試行によって入れ子状のゲノム領域を含む異なるゲノム配列を有する少なくとも２種類のトランスジェニック植物を得る（図１Ａを参照のこと）ことにより、相同組換えが起こる確率の低さに起因するノックインの効率の悪さを飛躍的に改善する。図１Ａにおいて示されるように、アグロバクテリウムによって植物細胞内に導入された、本発明の一本鎖ＤＮＡの相同組換え用核酸によって、（ｉ）および（ｉｉ）のような複数のタイプの相同組換えが生じ、その結果、入れ子状のゲノム領域を含む異なるゲノム配列を有する少なくとも２種類のトランスジェニック植物を得ることができる。本発明は、目的の遺伝子と染色体上の特定の遺伝子との間で、複数の箇所において入れ子状に相同組換えが起こるという、従来からは到底予想され得なかったモデルに基づくものであり、そして点変異のノックイン効率を飛躍的に改善するという、当業者が容易に想到し得ない顕著な効果を奏するものである。さらに、本発明の方法を用いた変異導入法は、相同組換え体取得効率自体も、従来公知である他の方法に比べて非常に高い。
【００３４】
現在、ゲノム上の特定の遺伝子の両脇に位置するＤＮＡと相同的な塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡフラグメントを改変体の両脇につなげて細胞内に導入することにより、両脇の相同（組換え）領域で相同組換えが起こり、特定の遺伝子が除去されて、代わりに外来の遺伝子が挿入されると考えられている（図１Ｂを参照のこと）。したがって、単一の核酸構築物によって１回のノックインを行うことにより、１種類のトランスジェニック植物を調製するという方法が、慣習的に実施されている（図１Ｂおよび図２Ｂを参照のこと）。それに対して、本研究者らは、植物細胞において遺伝子に複数の点変異を導入した相同組換え用核酸を、アグロバクテリウムによって植物細胞に導入し、相同組換えを起こさせることによって、この相同組換え用核酸由来の遺伝子と染色体上の特定の遺伝子との間で少なくとも１つの入れ子状の相同組換えが起こり、その結果、複数のパターンで入れ子状に目的の核酸が導入されている異なるゲノムを有する２つ以上の相同組換え体が生じる（図２Ａを参照のこと）ことを、予想外に発見した。
【００３５】
本発明の相同組換え用核酸は、以下：
（１）第一のゲノム領域またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、第一の相同組換え領域、
（２）第二のゲノム領域またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、第二の相同組換え領域、および
（３）該第一の領域と該第二の領域との間に挟まれた、ポジティブ選択マーカー、
を含有し、ここで、該第一の領域および該第二の領域において、少なくとも２つ以上の変異を有する。この第一の領域および第二の領域における２つ以上の変異の上流および下流においてそれぞれ、入れ子状に相同組換えが起こり、この２つ以上の変異が入れ子状に異なるパターンで相同組換え体に導入されることにより、入れ子状の異なるゲノム配列を有する２つ以上の相同組換え体が調製できる。
【００３６】
この一本鎖ＤＮＡを介した入れ子状の相同組換えモデル（図１Ａを参照のこと）は、相同組換えを利用したノックイン系において当該分野で現在周知である二本鎖ＤＮＡを介したモデル（図１Ｂを参照のこと）とは全く異なる新規のモデルである。図１Ａは、本発明の高効率変異導入法における相同組換えのモデル図を示し、（ｉ）のＳＤＳＡ（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｔｒａｎｄ−ａｎｎｅａｌｉｎｇ：合成依存型１本鎖ＤＮＡ会合）とは、太い矢印で示された新たに合成されたＤＮＡ鎖同士がハイブリダイズ（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）し、さらにＤＮＡ合成とライゲーションにより組換え体が生じる過程をさす。植物の核に導入された相同組換え用の一本鎖Ｔ−ＤＮＡは相同組換えの中間体として働き、１本鎖Ｔ−ＤＮＡの３’末端が植物の標的遺伝子領域ゲノムＤＮＡの相同領域に侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）し、（ｉ）又は（ｉｉ）に示すような相同組換え過程が進行する。（ｉ）は分枝点移動（ｂｒａｎｃｈ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）によってベクター由来の１本鎖Ｔ−ＤＮＡの相同領域のゲノムＤＮＡがヘテロ２重鎖ＤＮＡ（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ）を形成する。この分枝点移動は、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の非相同領域のはじまる所で停止するが、１本鎖Ｔ−ＤＮＡに切断が起り、その３’末端がゲノムＤＮＡに再侵入して再び分枝点移動によりヘテロ２重鎖ＤＮＡを形成され、新たに合成された１本鎖ＤＮＡ断片同士が会合するＳＤＳＡ過程を経て相同組換えが起る経路（ｐａｔｈｗａｙ）である。この場合は、生じたヘテロ２重鎖ＤＮＡの修復過程で種々の（２つ以上の）組合せの組換え体が生成され、高頻度で入れ子状の配列をもつ組換え体も生じる。一方、（ｉｉ）の場合は、Ｔ−ＤＮＡ上の１本鎖相同領域を鋳型としてＤＮＡが合成されるので、数塩基の変異（置換、挿入、および欠失）ばかりでなく、１〜２ｋｂ程度の比較的大きな置換、挿入、および欠失も効率よくベクターからゲノムへ移すことができる。それ故、従来の相同組換えでは困難な非相同領域をもつベクター上の配列とも高効率で組換えが起って相同組換え体を得ることが出来るので、この点もＴ−ＤＮＡを介した本組換え機構の特徴である。図１Ｂは、従来のノックイン法における相同組換えのモデル図を示す。この場合も末端で、ヘテロ２重鎖ＤＮＡを生じる可能性はあり、修復機構によって末端がベクター由来の配列か植物ゲノム由来に配列になり得るが、配列が入れ子状にはならない。
【００３７】
本発明者らは、上述の新規のモデルの発見に基づいて本発明を完成した。本発明は、植物において、アグロバクテリウムによって相同組換え用核酸を植物細胞に導入し、相同組換えを起こさせることによって、１回のノックイン試行で入れ子状のゲノム領域を含む少なくとも２種類の相同組み換え体を得ることにより、相同組換えが起こる確率の低さに起因するノックインの効率の悪さを飛躍的に改善する。さらに、本発明の方法を用いた変異導入法は、相同組換え体取得効率自体も、従来公知である他の方法に比べて非常に高かった。また、従来の二本鎖ＤＮＡを介した変異導入メカニズム（図１Ｂを参照のこと；Ｆ．Ｐａｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｈａｂｅｒ（１９９９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：３４９−４０４（一部改変））では変異導入が困難であると理解されていた、相同組換え核酸内の５’上流側および３’下流側（すなわち、端の領域）への変異導入効率が、本発明の方法では上昇した。これらは、当業者が容易に想到し得ない顕著な効果である。
【００３８】
以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により記載する。本発明を以下に説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００３９】
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきではない。本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは、当業者に明らかである。
【００４０】
（定義）
任意の植物細胞由来の再生能を有する細胞を用いることが可能である。
【００４１】
本明細書において用いられる「植物」とは、植物界に属する生物の総称であり、葉緑体、硬い細胞壁、豊富な永続性の胚的組織の存在、および運動する能力がない生物により特徴付けられる。植物の種類は、例えば、「原色牧野植物大図鑑」（北隆館（１９８２））などにおいて広範に分類されており、そこに記載されるすべての種類の植物が、本発明において使用され得る。代表的には、植物は、細胞壁の形成・葉緑体による同化作用をもつ顕花植物をいう。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。単子葉植物としては、イネ科植物が挙げられる。好ましい単子葉植物としては、トウモロコシ、コムギ、イネ、エンバク、オオムギ、ソルガム、ライムギ及びアワが挙げられ、さらに好ましくは、トウモロコシ、コムギ、イネが挙げられるが、これらに限定されない。コムギには、従来法では形質転換体を得ることが困難であったコムギ品種農林６１号も含まれる。双子葉植物としては、アブラナ科植物、マメ科植物、ナス科植物、ウリ科植物、ヒルガオ科植物が挙げられるが、これらに限定されない。アブラナ科植物としては、ハクサイ、ナタネ、キャベツ、カリフラワーが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいアブラナ科植物は、ハクサイおよびナタネである。特に好ましいアブラナ科植物は、ナタネである。マメ科植物としては、ダイズ、アヅキ、インゲンマメ、ササゲが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいマメ科植物は、ダイズである。ナス科植物としては、トマト、ナス、バレイショが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいナス科植物は、トマトである。ウリ科植物としては、マクワウリ、キュウリ、メロン、スイカが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいウリ科植物は、マクワウリである。ヒルガオ科植物としては、アサガオ、カンショ、ヒルガオが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいヒルガオ科植物は、アサガオである。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。特定の実施形態では、植物は、植物体を意味し得る。
【００４２】
別の実施形態において、本発明において使用され得る植物種の例としては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科、ヒルガオ科、キク科などの植物が挙げられる。さらに、本発明において使用され得る植物種の例としては、任意の樹木種、任意の果樹種、クワ科植物（例えば、ゴム）、およびアオイ科植物（例えば、綿花）が挙げられる。
【００４３】
アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
【００４４】
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、またはＺｅａに属する植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、サトウキビ、ソルガム、トウモロコシなどを含む。
【００４５】
本発明の方法は、植物細胞（カルスおよび懸濁培養細胞を含む）または植物組織（休眠組織（完熟種子、未熟種子、冬芽、および塊茎を含む）、生殖質、生長点、および花芽を含む）に対して、アグロバクテリウム菌を用いてＴ−ＤＮＡを介した形質転換を行うことによって実施される。本発明の方法は、好ましくは植物を対象に実施されるが、これに限定されず、Ｔ−ＤＮＡを介した形質転換を行うことが出来る動物細胞（Ｋｕｎｉｋ  Ｔら、（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１８７１−１８７６；Ｐｅｌｃｚａｒ  Ｐら、（２００４）ＥＭＢＯ  ＲＥＰ  ５：６３２−６３７）および個体動物にも適用され得る。
【００４６】
本明細書において用いられる「動物」とは、動物界に属する生物の総称であり、酸素と有機性食物を必要とし，植物や鉱物と違って任意的に動くことができる生物により特徴付けられる。動物は、大きく脊椎動物と無脊椎動物とに分類される。脊椎動物としては、例えば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物などが用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）が用いられる。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞または器官などが用いられる。無脊椎動物としては、例えば、甲殻綱、ヤスデ綱、エダヒゲムシ綱、ムカデ綱、コムカデ綱、昆虫綱などが用いられる。より好ましくは、昆虫（例えば、チョウ目（カイコなどを含む））が用いられる。
【００４７】
本発明において使用する場合、用語「形質転換」、「形質導入」および「トランスフェクション」は、特に言及しない限り互換可能に使用され、宿主細胞への核酸の導入を意味する。本発明においては、アグロバクテリウム菌を用いたＴ−ＤＮＡを介した形質転換法が使用される。
【００４８】
「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞等が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。
【００４９】
本明細書において、「トランスジェニック」とは、特定の遺伝子をある生物に組み込むことまたはそのような遺伝子が組み込まれた生物（例えば、植物または動物（マウスなど）を含む）をいう。トランスジェニック生物のうち、ある遺伝子が欠失または抑制されているものをノックアウト生物といい、ある遺伝子の配列または変異が挿入されているものをノックイン生物という。
【００５０】
本明細書において、「トランスジェニック生物」とは、特定の遺伝子が組み込まれた生物をいい、トランスジェニック植物およびトランスジェニック動物などを含む。「トランスジェニック植物」とは、特定の遺伝子が組み込まれた植物をいい、同様に「トランスジェニック動物」とは、特定の遺伝子が組み込まれた動物をいう。本発明において、トランスジェニック生物は、好ましくはトランスジェニック植物である。本発明において、トランスジェニック生物は、より好ましくは、トランスジェニックイネである。
【００５１】
本明細書において「再分化する」とは、個体の一部分から個体全体が復元される現象を意味する。例えば、再分化により、カルスやプロトプラストなどの細胞および葉または根などの組織片から植物体が形成される。
【００５２】
形質転換体を植物体へと再分化する方法は当該分野において周知である。そのような方法としては、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１８：  ６２７−６４０（１９８６）；Ｔａｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８：７３−８２（１９８７）；Ｓｈａｗ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：  ２７４（１９８９）；Ｍａｌｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５：２０５（１９９７）；Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４７：９６９  （２００６）などが挙げられる。従って、当業者は、上記周知方法を目的とするトランスジェニック植物に応じて適宜使用して、再分化させることができる。
【００５３】
本発明の方法により核酸導入／形質転換された細胞および組織は、当該分野において公知の任意の方法によって、分化、成長および／または増殖され得る。植物種の場合、細胞または組織を分化、成長および／または増殖させる工程は、例えば、その植物細胞もしくは植物組織またはそれらを含む植物体を栽培することによって達成され得る。本明細書では、植物の栽培は当該分野において公知の任意の方法により行うことができる。植物の栽培方法は、例えば、監修  島本功および岡田清，「モデル植物の実験プロトコール−イネ・シロイヌナズナ編−」：細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ４；イネの栽培法（奥野員敏）ｐｐ．２８−３２、ならびに、丹羽康夫著，シロイヌナズナの栽培法，ｐｐ．３３−４０に例示されており、当業者であれば容易に実施することができることから本明細書では詳述する必要はない。例えば、シロイヌナズナの栽培は土耕、ロックウール耕、水耕いずれでも行うことができる。白色蛍光灯（６０００ルクス程度）の下、恒明条件で栽培すれば播種後４週間程度で最初の花が咲き、開花後１６日程度で種子が完熟する。１さやで約４０〜５０粒の種子が得られ、播種後２〜３ケ月で枯死するまでの間に１００００粒程度の種子が得られる。また、例えば、コムギの栽培においては、播種後に一定期間の低温短日条件にさらされなければ、出穂および開花しないことが周知である。従って、例えば、人工環境下（例えば、温室やグロスチャンバー）においてコムギを栽培する場合には、生育初期段階で、コムギ幼植物に低温短日処理（例えば、２０℃  明期８時間（約２０００ルクス）および８℃  暗期１６時間での処理など）を行う必要がある。この処理は春化処理（ｖｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）と呼ばれる。このような各植物種ごとに必要とされる栽培条件は、当該分野において一般に広く知られており、従って、本明細書中で詳述する必要はない。
【００５４】
植物以外の種（例えば、動物種）の場合においても、Ｔ−ＤＮＡを介して核酸導入／形質転換された細胞および組織は、当該分野において公知の任意の方法によって、分化、成長および／または増殖され得る（例えば、泉美治ら編，生物化学実験のてびき  ４．動物・組織実験法，化学同人，１９８７年などを参照のこと）。
【００５５】
本明細書において使用される用語「相同組換え体」とは、外来遺伝子（本発明においては、相同組換え用核酸）由来の核酸が相同組換えによってゲノムに組み込まれている、任意の細胞および個体をいう。
【００５６】
本明細書において使用される句「少なくとも２つの前記相同組換え用核酸由来のゲノム領域、および該少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの前記植物細胞のゲノム領域からなるゲノム領域」とは、本発明の相同組換え用核酸由来のゲノム領域が入れ子状に植物細胞の植物ゲノム領域に組み込まれたゲノム領域をいう。「少なくとも２つの前記相同組換え用核酸由来のゲノム領域、および該少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの前記植物細胞のゲノム領域からなるゲノム領域」と「入れ子状のゲノム領域」とは同義であり、交換可能に使用され得る。
【００５７】
本発明の方法では、植物細胞の特定のゲノム領域と、相同組換え用核酸由来のゲノム領域との間の相同組換えによって、相同組換え用核酸由来のゲノム領域がその植物細胞に導入される。ここで、この導入された相同組換え用核酸由来のゲノム領域と、相同組換えによって置換された領域とは、同じ配列を有していてもよいし、異なる配列を有していてもよい。好ましくは、導入された相同組換え用核酸由来のゲノム領域と、相同組換えによって置換された領域とは、異なる配列を有している。本発明の一実施形態において、植物細胞に導入された相同組換え用核酸由来のゲノム領域は、少なくとも１つの変異を含む。
【００５８】
本発明の一実施形態において、上記「少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの前記植物細胞のゲノム領域からなるゲノム領域」は、本発明の方法の実施後に、少なくとも１つ以上存在する。本発明の別の実施形態において、この「少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの前記植物細胞のゲノム領域からなるゲノム領域」は、本発明の方法の実施後に、少なくとも２つ以上存在する。本発明の別の実施形態において、この「少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの前記植物細胞のゲノム領域からなるゲノム領域」は、本発明の方法の実施後に、少なくとも３つ以上存在する。本発明の別の実施形態において、この「少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの前記植物細胞のゲノム領域からなるゲノム領域」は、本発明の方法の実施後に、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つ以上存在する。より好ましくは、この「少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの前記植物細胞のゲノム領域からなるゲノム領域」は、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個または１００個以上存在する。
【００５９】
本発明の一実施形態において、上記「少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの前記植物細胞のゲノム領域」は、１０ｂｐ以上のサイズである。本発明の別の実施形態において、上記「少なくとも２つの相同組換え用核酸由来のゲノム領域に挟まれた少なくとも１つの前記植物細胞のゲノム領域」は、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、８５０ｂｐ、９００ｂｐ、９５０ｂｐまたは１，０００ｂｐ以上のサイズである。
【００６０】
本明細書において使用される用語「アグロバクテリウム」とは、グラム染色陰性の土壌細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓをいい、植物に感染してクラウンゴール腫瘍を誘発する植物病原菌の一種である。このアグロバクテリウムが有する約２００，０００塩基対のＴｉプラスミドがクラウンゴール腫瘍の原因因子である。このＴｉプラスミドは、同一方向を向いた一対の２５塩基対からなる境界配列に囲まれたＴ−ＤＮＡ領域が存在する。このＴ−ＤＮＡ領域は、特定のＶｉｒタンパク質により境界配列の中で一本鎖切断を受け、一本鎖ＤＮＡとして切り出される。この一本鎖ＤＮＡが植物へ移動し、染色体に組み込まれると考えられている。本発明のノックインモデルは、この一本鎖Ｔ−ＤＮＡ領域を利用することによって可能になった。
【００６１】
アグロバクテリウムを用いた形質転換は、植物だけでなく、哺乳動物由来の細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）にも適用され得ることが報告されている（Ｐａｗｅｌ  Ｐｅｌｃｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔ，ＶＯＬ５，ＮＯ．６，２００４；Ｔａｌｙａ  Ｋｕｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９８；１８７１−１８７６；２００１などを参照のこと、これらの参考文献は、本明細書中に参考として援用される）。したがって、本発明は植物のみならず、哺乳動物への変異導入にも使用され得ることが理解される。
【００６２】
理論に束縛されることは意図しないが、本発明の方法は、相同組換え用核酸として一本鎖ＤＮＡを使用する点にあり得る。したがって、本発明の方法では、アグロバクテリウム由来のＴ−ＤＮＡを相同組換え用核酸として使用しているが、相同組換え用核酸は必ずしもアグロバクテリウム由来のＴ−ＤＮＡには限定されず、一本鎖ＤＮＡならば全て、本発明の相同組換え用核酸として使用され得る。
【００６３】
本明細書中において使用される「再生能」とは、個体または器官の一部（例えば、細胞）から、元の個体または器官を再生する能力をいう。本発明において「再生能を有する細胞」とは、カルスまたは不定胚などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本明細書において使用される用語「細胞」とは、任意の植物または動物由来であって、自己複製能と分化能とを有する、未分化で幼若な任意の細胞を指し、カルスも含まれる。
【００６５】
本明細書において使用される用語「２つ以上の相同組換え体」とは、２種類以上の外来遺伝子（本発明においては、相同組換え用核酸）由来の核酸の組み込みパターンを有する相同組換え体をいう。一実施形態では、本発明の方法によって、異なるゲノム配列を有する２つ以上の形質転換細胞が調製される。別の実施形態では、本発明の方法によって、異なるゲノム配列を有する３つ以上の形質転換細胞が調製される。別の実施形態では、本発明の方法によって、異なるゲノム配列を有する４つ以上の形質転換細胞が調製される。別の実施形態では、本発明の方法によって、異なるゲノム配列を有する５つ以上の形質転換細胞が調製される。別の実施形態では、本発明の方法によって、異なるゲノム配列を有する６つ以上の形質転換細胞が調製される。別の実施形態では、本発明の方法によって、異なるゲノム配列を有する７つ以上の形質転換細胞が調製される。別の実施形態では、本発明の方法によって、異なるゲノム配列を有する８つ以上の形質転換細胞が調製される。別の実施形態では、本発明の方法によって、異なるゲノム配列を有する９つ以上の形質転換細胞が調製される。別の実施形態では、本発明の方法によって、異なるゲノム配列を有する１０種以上の形質転換細胞が調製される。さらに別の実施形態では、本発明の方法によって、異なるゲノム配列を有する１５種以上の形質転換細胞が調製される。さらに別の実施形態では、本発明の方法によって、異なるゲノム配列を有する２０種以上の形質転換細胞が調製される。
【００６６】
本明細書において「相同組換え」とは、相同的な塩基配列を有する分子間の遺伝的交換をいう。生体内では染色体乗り換えなどの形式で見られるが、人工的にゲノム上の特定遺伝子を変化させる遺伝子ターゲティングの手段でもある。ゲノム上の特定遺伝子と相同的な部分を有するＤＮＡを細胞中に導入した場合、この相同部分で組換えを起こし、外来のＤＮＡがゲノムに取り込まれる。これを利用して改変体（例えば、特定の遺伝子に点変異が導入された改変体）を産生することが可能になる。相同組換えは、転写活性遺伝子における変異を誘導または矯正するために遺伝子をターゲティングするためにもともと開発された技術である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｐｒｏｇ．ｉｎ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３６：３０１，１９８９）。基本的な技術は、哺乳動物ゲノムの特定の領域に特定の変異を導入するための方法として開発された（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４４：４１９−４２８，１９８６；Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３−５１２，１９８７；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：８５８３−８５８７，１９８８）か、または欠損遺伝子内の特定の変異を矯正するための方法として開発された（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６−５７８，１９８７）。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１（ＥＰ  ９１９３０５１，ＥＰ公開Ｎｏ．５０５５００；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、国際公開ＷＯ９１／０９９５５）に記載されている。当該分野において、相同組換えは周知であり、慣習的に実施されている。
【００６７】
本明細書において「遺伝子ターゲティング」（ジーンターゲティング、標的遺伝子組換えともいわれる）とは、細胞および個体レベルで、特定遺伝子座のみに目的とした変異を導入することをいう。遺伝子ターゲティングのためには、相同遺伝子組換えを細胞レベルで起こさせ、その後植物遺伝子組換え体を選別する。
【００６８】
本明細書において、「相同組換え用核酸」とは、導入ベクターまたは相同組換え用ベクターともいわれ、本発明の相同組換え用核酸は、以下：
（１）第一のゲノム領域またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、第一の相同組換え領域、
（２）第二のゲノム領域またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、第二の相同組換え領域、および
（３）該第一の領域と該第二の領域との間に挟まれた、ポジティブ選択マーカー、
を含有し、ここで、該第一の領域および該第二の領域において、少なくとも２つ以上の変異を有する。この第一の領域および第二の領域における２つ以上の変異の上流および下流においてそれぞれ、入れ子状に相同組換えが起こり、この２つ以上の変異が異なるパターンで植物に導入されることにより、異なるゲノム配列を有する２つ以上の相同組換え体を調製する。本発明の相同組換え用核酸は、必要に応じて、ネガティブ選抜のためのネガティブ選抜マーカーを含む。本発明の「相同組換え用核酸」はさらに、必要に応じて、ポジティブ選抜マーカーの前後に配置される２つのリコンビナーゼ（部位特異的酵素）認識配列を含む。このリコンビナーゼ認識配列は、好ましくは、ｌｏｘＰ配列である。本発明の「相同組換え用核酸」はなおさらに、必要に応じて、部位特異的組換え酵素であるＣｒｅ遺伝子を含む。本発明の相同組換え用核酸の概略については、図２Ａを参照のこと。この相同組換え用核酸は、必要に応じて他の調節エレメントと組み合わせて使用することもでき、そのような相同組換え用核酸もまた本発明の範囲に含まれる。
【００６９】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。
【００７０】
本明細書において「相同組換え領域」とは、幹細胞の特定のゲノム領域との間で相同組換えが起こり得る、相同組換え用核酸における部位をいう。相同組換え領域は、実際にその部位で相同組換えが起こるか否かに関わらず、相同組換えが起こり得る領域をいう。したがって、相同組換え領域において必ずしも相同組換えが起こる訳ではないことを、当業者は容易に認識する。
【００７１】
本明細書において使用する場合、「選抜マーカー」とは、核酸構築物、ベクターを含む宿主細胞を選択する指標として機能する遺伝子をいう。選抜マーカーとしては、蛍光マーカー、発光マーカー、および薬剤耐性選抜マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。「蛍光マーカー」としては、緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）、青色蛍光プロテイン（ＣＦＰ）、黄色蛍光プロテイン（ＹＦＰ）および赤色蛍光プロテイン（ｄｓＲｅｄ）のような蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。「発光マーカー」としては、ルシフェラーゼのような発光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。「薬剤耐性選抜マーカー」としてはヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、メタロチオネイン（ＭＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＭＰＤ１，２）、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＵＭＰシンターゼ、Ｐ−グリコプロテイン、アスパラギンシンテターゼ、およびオルニチンデカルボキシラーゼ。これら薬剤選抜マーカーと使用される薬剤との組み合わせは、例えば、以下のとおりである：ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）とメソトレキセート（ＭＴＸ）との組み合わせ、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）遺伝子とメチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）との組み合わせ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）遺伝子とＮ−ホスホンアセチル−Ｌ−アスパラギン酸（Ｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｎａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）（ＰＡＬＡ）との組み合わせ、ＭＴ遺伝子とカドミウム（Ｃｄ２＋）との組み合わせ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子とアデノシン、アラノシン、２’−デオキシコホルマイシンとの組み合わせ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＭＰＤ１，２）遺伝子とアデニン、アザセリン、コホルマイシンとの組み合わせ、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子と、マイコフェノール酸との組み合わせ、ＵＭＰシンターゼ遺伝子と６−アザウリジン、ピラゾフラン（ｐｙｒａｚｏｆｕｒａｎ）との組み合わせ、Ｐ−グリコプロテイン（Ｐ−ｇｐ，ＭＤＲ）遺伝子と多剤薬剤との組み合わせ、アスパラギンシンテターゼ（ＡＳ）遺伝子とβ−アスパルチルヒドロキサム酸またはアルビジイン（ａｌｂｉｚｚｉｉｎｎ）との組み合わせ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子とα−ジフルオロメチル−オルニチン（ＤＦＭＯ）などのタンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
本明細書中、相同組換えの文脈において使用する場合、用語「ネガティブ選抜マーカー」とは、改変核酸が植物領域以外のゲノム領域に挿入された細胞の増殖を阻害および／または抑制することによって、改変核酸が標的領域に挿入された細胞の選択を容易にする配列である。代表的には、「ネガティブ選抜マーカー」は、改変核酸の付加配列として存在し、２つの相同領域での相同組換えによらずに改変核酸がゲノム中に挿入された場合、２つの相同領域および挿入配列とともに、ゲノム中に挿入され、その結果、ネガティブ選択配列から、宿主細胞の増殖を阻害および／または促成する遺伝子産物（ＲＮＡおよび／またはタンパク質）が発現されて、その結果、改変核酸が標的領域以外のゲノム領域に挿入された細胞の増殖が阻害および／または抑制される。これに対して、改変核酸が相同組換えによって標的領域に挿入される場合は、２つの相同領域の外にある付加配列としての「ネガティブ選択配列」は、ゲノム中に挿入されることがなく、そのため、改変核酸を挿入した宿主細胞の増殖が、阻害・抑制されない。本明細書において使用する場合、「ネガティブ選抜マーカー」による選択を「ネガティブ選抜」という。「ネガティブ選抜マーカー」としては、ジフテリア毒素タンパク質Ａ鎖遺伝子（ＤＴ−Ａ）、Ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ遺伝子、Ｒｉｃｉｎ  ｔｏｘｉｎ  Ａ遺伝子、ｃｏｄＡ遺伝子、シトクロムＰ−４５０遺伝子、ＲＮａｓｅ  Ｔ１遺伝子およびｂａｒｎａｓｅ遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
本明細書中、相同組換えの文脈において使用する場合、用語「ポジティブ選抜マーカー」とは、改変核酸がゲノム領域に挿入された細胞の増殖の増殖に必須であるか、および／または増殖を促進する配列である。本明細書において使用する場合、「ポジティブ選抜マーカー」による選択を「ポジティブ選択」という。「ポジティブ選抜マーカー」としては、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子のような薬剤耐性遺伝子、ＡＬＳ（ＡＨＡＳ）遺伝子やＰＰＯ遺伝子のような除草剤耐性遺伝子など（Ｉｉｄａ，Ｓ  ａｎｄ  Ｔｅｒａｄａ  Ｒ（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．５９：２０５−２１９）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において用いられる、Ｃｒｅ酵素のような部位特異的組換え酵素の一過的発現、染色体上でのＤＮＡマッピングなどは、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズ「ＦＩＳＨ実験プロトコール  ヒト・ゲノム解析から染色体・遺伝子診断まで」松原謙一、吉川  寛  監修  秀潤社（東京）などに記載されるように、当該分野において周知である。
【００７５】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００７６】
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子である、細胞中に存在する核酸の一定の長さの配列をいう。本発明において遺伝子は、遺伝形質を規定するものであっても規定しないものであってもよい。本明細書において、遺伝子は、通常ゲノムに存在するものをさすが、それに限定されず、染色体外の配列、ミトコンドリアの配列なども包含することが理解される。多くの遺伝子は、通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。本明細書において遺伝子の「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、遺伝子の塩基配列を３塩基ずつに区切った時の３通りの枠組の１つであって、開始コドンを有し、そして途中に終止コドンが出現せずある程度の長さを持ち、実際にタンパク質をコードする可能性のある読み枠をいう。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子というときは、通常、ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子ならびにＤＮＡポリメラーゼのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含する。本発明では、構造遺伝子のほか、転写および／または翻訳などの調節配列もまた、本発明が対象とする遺伝子として有用であることが理解される。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
【００７７】
本明細書において「単離された」物質（例えば、核酸またはタンパク質などのような生物学的因子）とは、その物質が天然に存在する環境（例えば、生物体の細胞内）の他の物質（好ましくは、生物学的因子）（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００７８】
本明細書において「精製された」物質（例えば、核酸またはタンパク質などのような生物学的因子）とは、その物質に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された物質におけるその物質の純度は、その物質が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００７９】
本明細書において「精製された」および「単離された」とは、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の物質が存在することを意味する。
【００８０】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００８１】
本明細書において「ストリンジェントなハイブリダイズ条件」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００８２】
本明細書では塩基配列の同一性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００８３】
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用されるプロモーターとしては、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応する配列も含まれるべきであることが意図される。
【００８４】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００８５】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
【００８６】
その文字コードは以下のとおりである。
アミノ酸
３文字記号  １文字記号  意味
Ａｌａ      Ａ          アラニン
Ｃｙｓ      Ｃ          システイン
Ａｓｐ      Ｄ          アスパラギン酸
Ｇｌｕ      Ｅ          グルタミン酸
Ｐｈｅ      Ｆ          フェニルアラニン
Ｇｌｙ      Ｇ          グリシン
Ｈｉｓ      Ｈ          ヒスチジン
Ｉｌｅ      Ｉ          イソロイシン
Ｌｙｓ      Ｋ          リジン
Ｌｅｕ      Ｌ          ロイシン
Ｍｅｔ      Ｍ          メチオニン
Ａｓｎ      Ｎ          アスパラギン
Ｐｒｏ      Ｐ          プロリン
Ｇｌｎ      Ｑ          グルタミン
Ａｒｇ      Ｒ          アルギニン
Ｓｅｒ      Ｓ          セリン
Ｔｈｒ      Ｔ          トレオニン
Ｖａｌ      Ｖ          バリン
Ｔｒｐ      Ｗ          トリプトファン
Ｔｙｒ      Ｙ          チロシン
Ａｓｘ                  アスパラギンまたはアスパラギン酸
Ｇｌｘ                  グルタミンまたはグルタミン酸
Ｘａａ                  不明または他のアミノ酸。
【００８７】
塩基
記号  意味  
ａ    アデニン
ｇ    グアニン
ｃ    シトシン
ｔ    チミン
ｕ    ウラシル
ｒ    グアニンまたはアデニンプリン
ｙ    チミン／ウラシルまたはシトシンピリミジン
ｍ    アデニンまたはシトシンアミノ基
ｋ    グアニンまたはチミン／ウラシルケト基
ｓ    グアニンまたはシトシン
ｗ    アデニンまたはチミン／ウラシル
ｂ    グアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｄ    アデニンまたはグアニンまたはチミン／ウラシル
ｈ    アデニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｖ    アデニンまたはグアニンまたはシトシン
ｎ    アデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。
【００８８】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、６００、７００、８００、９００、１０００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００８９】
本発明において使用されるポリペプチドは、天然型のポリペプチドと実質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の１以上（例えば、１または数個）のアミノ酸が置換、付加および／または欠失していてもよく、糖鎖が置換、付加および／または欠失していてもよい。
【００９０】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。親水性指標もまた、改変体作製において考慮される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００９１】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９２】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００９３】
本明細書において「機能的改変体」とは、基準となる配列が担う生物学的活性を保持する改変体をいう。
【００９４】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。核酸においては、保存的置換は、例えば、プロモーター活性を測定しながら確認することができる。
【００９５】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドをコードする遺伝子を作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００９６】
本明細書において発現されるべきポリペプチドの核酸形態は、そのポリペプチドのタンパク質形態を発現し得る核酸分子をいう。この核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
【００９７】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変異誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【００９８】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００９９】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、原核生物細胞、酵母、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物個体および動物個体等の宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書では、例えば、ＢＡＣベクターを用いることができる。ＢＡＣベクターとは、大腸菌のＦプラスミドをもとにして作製されたプラスミドで、約３００ｋｂ以上の巨大なサイズのＤＮＡ断片をも大腸菌などの細菌内で安定に保持し増殖させることが可能なベクターである。ＢＡＣベクターは、少なくともＢＡＣベクターの複製に必須の領域を含む。その複製に必須の領域としては、例えば、Ｆプラスミドの複製開始点であるｏｒｉＳまたはその改変体が挙げられる。
【０１００】
本明細書において「プロモーター」（またはプロモーター配列）とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することができる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
【０１０１】
本明細書において「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。動物細胞において使用する場合、エンハンサーとしては、ＳＶ４０プロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好ましい。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。プロモーター中のプロモーター活性を強める領域もまたエンハンサーと呼ばれることがある。
【０１０２】
本明細書において使用する場合、「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０１０３】
本明細書において使用する場合、「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など）のような選抜マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０１０４】
本明細書において使用する場合、「導入ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物個体および動物個体等の宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
【０１０５】
本明細書において「上流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端に向かう位置を示す。
【０１０６】
本明細書において「下流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの３’末端に向かう位置を示す。
【０１０７】
ベクターの導入方法としては、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）が好ましい。
【０１０８】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
【０１０９】
本明細書中で使用される「部位特異的リコンビナーゼ」とは、多くの生物（例えば、ウイルスおよび細菌）において存在するタンパク質であり、そしてエンドヌクレアーゼおよびリガーゼの両方の特性を有すると特徴づけられる。これらのリコンビナーゼは、（いくつかの場合において関連タンパク質とともに）ＤＮＡにおける塩基の特異的な配列を認識し、そしてこれらのセグメントに隣接するＤＮＡセグメントを置換する。このリコンビナーゼおよび関連タンパク質は、総称して、「組換えタンパク質」と呼ぶ（例えば、以下を参照のこと：Ｌａｎｄｙ，Ａ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｖ  ３：６９９−７０７（１９９３））。
【０１１０】
種々の生物由来の多くの組換え系が記載されている。例えば、以下を参照のこと：Ｈｏｅｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４（６）：２２８７（１９８６）；Ａｂｒｅｍｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（１）：３９１（１９８６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（２３）：７４９５（１９９２）；Ｑｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１１）：７７９４（１９９２）；Ａｒａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５（１）：２５（１９９２）；Ｍａｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｈｎｍａｎｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０：１７０−１７６）（１９９１）；Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１８）：３６０５（１９９７）。これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（Ａｒｇｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：４３３−４４０（１９８６）；Ｖｏｚｉｙａｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：９３０（１９９９））。おそらく、これらのうち最もよく研究されているのは、バクテリオファージＰＩ由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（Ｈｏｅｓｓ  ａｎｄ  Ａｂｒｅｍｓｋｉ（１９９０）Ｉｎ  ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  ａｎｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４．Ｅｄｓ．：Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｙ，ＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；ｐｐ．９０−１０９）、バクテリオファージＸ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系（Ｌａｎｄｙ，Ａ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：６９９−７０７（１９９３））、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ２μ環状プラスミド由来のＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｂｒｏａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２９：２２７−２３４（１９８２））である。
【０１１１】
Ｃｒｅリコンビナーゼの細胞種特異的発現とＣｒｅ−ｌｏｘＰの部位特異的組換えとを併用するＣｒｅ−ｌｏｘＰ系を使用することにより、相同組換えによっていったんはゲノム中に挿入された核酸領域を削除することができる。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いる変異導入法では、標的遺伝子の発現を阻害しない位置に選抜マーカー（例えば、ハイグロマイシン遺伝子など）などの核酸配列を導入し、後に削除する配列をはさむようにしてｌｏｘＰ配列を挿入したターゲティングベクターを細胞に導入し、その後相同組換え体を単離する。次に、大腸菌のＰ１ファージ由来の部位特異的組換え酵素Ｃｒｅを特定条件下で特異的に発現させると、Ｃｒｅを発現する細胞中でのみ遺伝子が削除される（ここでは、Ｃｒｅは、ｌｏｘＰ配列（約３４ｂｐ）を特異的に認識して、２つのｌｏｘＰ配列間で組換えを起こさせ、その間の核酸配列が削除される）。この組換え系は、代表的には、部位特異的組換え酵素としてＣｒｅリコンビナーゼ、部位特異的組換え酵素認識配列としてｌｏｘＰを使用するＣｒｅ／ｌｏｘＰ系であるが、これに限定はされず、上述のように種々の生物由来の組換え系が使用され得る。この部位特異的組換え酵素は、本発明の相同組換え用核酸中に含まれてもよいし、相同組換え用核酸中には含まれなくてもよい（例えば、プラスミドによって供給されてもよい）。
【０１１２】
本明細書において、「リコンビナーゼ」とは、部位特異的組換え酵素ともいい、ＤＮＡ上の特定配列（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの場合、ｌｏｘＰという配列）を認識し、その部分の組換えを促進させる酵素をいう。リコンビナーゼとしては、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼなどを挙げることができる。このほかに、使用され得るリコンビナーゼとしては、例えば、Ｆ１ｐ組換え酵素やＲ組換え酵素（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｖ  ａｎｄ  Ｏｗ，Ｄ  （２００４）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：６２７−６２９）、φＣ３１（アクセッション番号ＮＣ＿００１９７８；ＧＩ：４０８０７２８５）を挙げることができるがこれらに限定されない。
【０１１３】
本明細書において「リコンビナーゼ認識配列」とは、少なくとも１つのリコンビナーゼによって認識される配列をいい、そのような配列は、リコンビナーゼに通常特異的である。そのような認識配列は、以下のようにして決定することができる：サザンハイブリダイゼーション解析、ＰＣＲ産物のＤＮＡ塩基配列などが挙げられる。そのような認識配列としては、例えば、ｌｏｘＰ配列、ＦＲＴ部位、ＲＳ部位、ａｔｔＢ配列，ａｔｔＰ配列およびｒｅｓ部位配列を挙げることができるがそれらに限定されない。そのような認識配列の具体的配列は以下の通りである：
ＬｏｘＰ配列
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号４）。
【０１１４】
このようなリコンビナーゼ認識配列は、上記配列のすべてを含んでいてもよく、リコンビナーゼに認識される限り、これらの配列に対して、１または複数の置換、付加および／または欠失を含んでいても良い。あるいは、リコンビナーゼと一定の条件下で任意の配列のライブラリーを用いてスクリーニングすることによって別のリコンビナーゼ認識配列を作製することも可能である。
【０１１５】
本明細書において「逆方向」とは、リコンビナーゼ認識配列について用いられるとき、あるリコンビナーゼ認識配列が二本鎖ＤＮＡの一方に配置されているとき、他方の鎖にリコンビナーゼ認識配列が配置されていることをいう。好ましくは、実質的に相同な配列が、一方の鎖に５’から３’向きに、他方の鎖に５’から３’向きに配置されている。より好ましくは、同一の配列が一方の鎖に５’から３’向きに、他方の鎖に５’から３’向きに配置されている。
【０１１６】
本明細書において「発現誘導可能なリコンビナーゼ遺伝子」とは、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，  Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ，  Ｅｃｄｙｓｏｎｅ，  Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ，  Ｅｔｈａｎｏｌ，  Ｃｏｐｐｅｒなどの種々の化学的誘導系で発現制御できるＣｒｅなどの部位特異的組換酵素遺伝子をいう。化学的誘導系プロモーター（Ｐａｄｉｄａｍ，  Ｍ  （２００３）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ６：１６９−１７７）の代りに、ヒートショックプロモーターなどをつないで、熱ショックにより部位特異的組換え酵素遺伝子を発現誘導させることも可能である。
【０１１７】
本明細書における点変異の導入は、従来からのｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４４８−４９２；Ｋｅ，Ｓ．−Ｈ．ａｎｄ  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｅ．Ｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７１−３３７２）であっても、目的とする点変異の両側に各々約５０塩基の相同塩基配列を有する２本鎖のオリゴヌクレオチドを合成してλＲｅｄシステムを用いた方法で組換えを行なわせて導入する方法（Ｍｕｙｒｅｒｓ，Ｊ．Ｐ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｔｒｅｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：３２５−３３１）であってもよい。
【０１１８】
（一般生化学・分子生物学）
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ
ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ  ＥＳ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１１９】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１２０】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１２１】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１２２】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
【０１２３】
（一般的実施例）
以下の記載は、Ａｄｈ２遺伝子を標的とした場合について記載しているが、本発明の方法はＡｄｈ２遺伝子のみに標的が限定されるものではない。他の遺伝子を標的とする場合には、当業者は以下に記載される各条件を適宜改変し、本発明の方法を容易に実施することができる。
【０１２４】
（核酸の調製）
プラスミド調製、植物ＤＮＡおよびＲＮＡ調製、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ増幅、ならびにサザンブロットおよびＤＮＡ配列決定分析を含む一般的な核酸調製法は、Ｔｅｒａｄａ  Ｒら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：１０３０−１０３４；Ｔｅｒａｄａ  Ｒら（２００４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２２：６５３−６５９；ならびにＭｏｒｉｔａ  Ｙら（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４２：３５３−３６３に記載されるように実施した。完全なコード領域を保持している約１．５ｋｂのＡｄｈ遺伝子転写物を検出するために、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して第一のｃＤＮＡ鎖を合成し、ＲＴ２−Ｆ／ＲＴ２−Ｒ（それぞれ、配列番号１６および１７）を使用して、Ａｄｈ２を、Ｅｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）によってＰＣＲ増幅した。構成的に発現される遺伝子であるユビキチン（Ｄ１２６２９）を、Ｕｂｉｑ−Ｆ／Ｕｂｉｑ−Ｒと共に、ＲＴ−ＰＣＲについての内部コントロールとして使用した。ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲのために使用されたプライマーを、以下の表１に示す。
【０１２５】
【表１】
2008253254.tif 000002
Ａｄｈ２をターゲティングするためのｐＪＨＹＡｄ２ベクターを構築するために、Ａｄｈ２プロモーターを含む６．２ｋｂのフラグメントを、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用して、プライマーＦ１およびＲ１を用いるＰＣＲ増幅によって、品種日本晴（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）ゲノムから調製した（Ｍｏｒｉｔａ  Ｙら、（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４２：３５３−３６３；Ｔｅｒａｄａ  Ｒら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：１０３０−１０３４）。ＰＣＲ条件は、以下の通りであった：
初回変性（９４℃で１分間）；
変性（９８℃で１０秒間）、アニーリングおよび伸長（５８℃で１５分間）を、１６サイクル；次いで
変性（９８℃で１０秒間）、アニーリングおよび伸長（５８℃で１５分間、１サイクル当たり１５秒を自動的に追加する）を、１９サイクル；
最終伸長（７２℃で１０分間）。
同様に、Ａｄｈ２のコード領域を含む６．０ｋｂのフラグメントもまた、プライマーＦ２およびＲ２を使用するＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ条件は、以下の通りであった：
初回変性（９４℃で１分間）；
変性（９８℃で１０秒間）、アニーリングおよび伸長（６２℃で１５分間）を、１６サイクル；次いで
変性（９８℃で１０秒間）、アニーリングおよび伸長（６２℃で１５分間、１サイクル当たり１５秒を自動的に追加する）を、１９サイクル；
最終伸長（７２℃で１０分間）。
得られたフラグメントを、まず、ベクターｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に個々にクローニングし、次いでターゲティング骨格ベクターであるｐＩＮＡ１３４（Ｔｅｒａｄａ  Ｒら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：１０３０−１０３４）に再びクローニングし、ｐＪＨＹＡｄ２を得た。Ａｄｈ２プロモーターを含む７．０ｋｂのフラグメントもまた、プライマーＦ３およびＲ１を使用して、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼで増幅した。ＰＣＲ条件は、以下の通りであった：
初回変性（９４℃で１分間）；
変性（９８℃で１０秒間）、アニーリングおよび伸長（６８．１℃で１５分間）を、１６サイクル；次いで
変性（９８℃で１０秒間）、アニーリングおよび伸長（６８．１℃で１５分間、１サイクル当たり１５秒を自動的に追加する）を、１９サイクル；  最終伸長（７２℃で１０分間）。
このフラグメントをｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯにクローニングし、次いでｐＩＮＡ１３４に再びクローニングし、ｐＪＨＹＡｄ２Ｃｔ５を生成した。これを、プライマーＦ４およびＲ４と一緒に、ＰＣＲスクリーニングにおける信頼できる５’連結フラグメントを生成するために使用した。
【０１２６】
（植物の形質転換）
アグロバクテリウム媒介性イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）形質転換法は、以前に記載された方法（Ｔｅｒａｄａ  Ｒら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
２０：１０３０−１０３４）に、以下の改変を加えて行った。形質転換のための胚形成カルスを、イネ、Ｏｒｉｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．亜種、ｊａｐｏｎｉｃａ  ｃｖ．日本晴の約１０００〜２０００個の成熟した種子から調製した。アグロバクテリウムとの共培養の後、バンコマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）をアグロバクテリウムを除去するための洗浄用に使用した（Ｓａｌｌａｕｄ  Ｃら、（２００３）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  １０６：１３９６−１４０８）。Ｃｅｐｈａｔｏｘｉｍ（４００ｍｇ／Ｌ）およびバンコマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）を、ハイグロマイシンＢ含有（５０ｍｇ／Ｌ）２Ｎ６−ＣＨ培地選択において継続的に使用した（Ｔｅｒａｄａ  Ｒら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：１０３０−１０３４）。
【０１２７】
Ａｄｈ２プロモーターを含む６．４ｋｂの５’連結フラグメントを検出するために、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼを使用して、プライマーＦ４およびＲ４でＰＣＲ増幅を実施し、ヘテロ接合状態を模倣している等モルのｐＪＨＹＡｄ２Ｃｔ５と日本晴ＤＮＡとを、コントロールＤＮＡサンプルとして使用した。このＰＣＲ反応のサイクルは、以下の通りであった：
初回変性（９４℃で１分間）；
変性（９８℃で１０秒間）、アニーリングおよび伸長（６３．５℃で１５分間）を、１５サイクル；次いで
変性（９８℃で１０秒間）、アニーリングおよび伸長（６３．５℃で１５分間、１サイクル当たり１５秒を自動的に追加する）を、１９サイクル；
最終伸長（７２℃で１０分間）。
Ａｄｈ２コード領域を含む６．８ｋｂの３’連結フラグメントの検出のために、プライマーＦ５およびＲ５を用いてＰＣＲ分析を行った。このＰＣＲ条件は、以下の通りであった：
初回変性（９４℃で１分間）；
変性（９８℃で１０秒間）、アニーリングおよび伸長（６６．５℃で１５分間）を、１６サイクル；次いで
変性（９８℃で１０秒間）、アニーリングおよび伸長（６６．５℃で１５分間、１サイクル当たり１５秒を自動的に追加する）を、１９サイクル；
最終伸長（７２℃で１０分間）。
これら６．４ｋｂフラグメントおよび６．８ｋｂフラグメントが、予想された５’および３’連結フラグメントにそれぞれ対応することを確認するために、これらのＰＣＲ増幅されたフラグメントの両端を、直接配列決定した。
【０１２８】
ＭＳ培地の塩基性塩およびビタミン、スクロース（３０ｇ／Ｌ）、ソルビトール（３０ｇ／Ｌ）、ＮＡＡ（１ｍｇ／Ｌ）、ＢＡＰ（２ｍｇ／Ｌ）、および０．８％アガロースタイプＩ（Ｓｉｇｍａ）を含むＭＳＲＥ培地を、カルスから多数の苗条を再生するのに、慣習的に使用した（Ｔｅｒａｄａ  Ｒら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：１０３０−１０３４）。カルスを緩やかに再生させるためには、少ない量（通常のＭＳＲＥ培地の１／４）の無機塩およびビタミンと、さらにＩＡＡ（１ｍｇ／Ｌ）およびＺｅａｔｉｎ（０．５ｍｇ／Ｌ）を含む改変ＭＳＲＥ培地を使用した。標的とされたカルスから、２０を超えるトランスジェニック植物が多数の苗条から慣習的に再生し（Ｔｅｒａｄａ  Ｒら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：１０３０−１０３４）、この再生体がａｄｈ２：：ｈｐｔアレルを含むことを確認するために、５’および３’連結フラグメントを検出するためのＰＣＲ分析に供した。予想された通り、ほとんどの再生体が、ａｄｈ２：：ｈｐｔアレルを保持しており、その中から活発に成長するトランスジェニック植物をさらなる分析のために選択した。Ｔ１分離個体におけるＡｄｈ２の遺伝型を試験するために、それぞれＡｄｈ２およびａｄｈ２：：ｈｐｔアレルに対する１．３ｋｂおよび５．０ｋｂのフラグメントを、プライマーＦ６およびＲ６を用いたＰＣＲ増幅によって確認した。
【０１２９】
（実施例１：相同組換え用核酸の設計）
本発明の相同組換え用核酸の概略が、図２Ａに示される。本発明者らは、本研究において変異を導入する標的遺伝子として、イネのＡｄｈ２遺伝子を選択した。ａｄｈ２変異については、これまでに報告されていない。Ａｄｈ２の１．０ｋｂ下流には、高度に反復しているコピア様配列が存在する。Ａｄｈ２遺伝子は、ゲノムにおいてＡｄｈ１遺伝子とＡｄｈ３遺伝子との間に位置し、全てのＡｄｈ遺伝子は、イネのカルスにおいて顕著に発現する。本実施例では、本発明の方法をイネのＡｄｈ２遺伝子に適用したが、標的とされる遺伝子はイネのＡｄｈ２遺伝子には限定されず、任意の生物の任意の遺伝子が標的とされ得ることを、当業者は容易に認識する。本実施例で使用した核酸は、上述のように調製した。
【０１３０】
複数の点変異が導入されたＡｄｈ２遺伝子は、ＰＣＲ増幅によって作製した。ＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅する際には、使用するＴａｑポリメレースが、しばしば（１ｋｂ毎に数ヶ所）の塩基配列の増幅エラー（以下ＰＣＲエラー）を引き起こすことが知られている。上記Ａｄｈ２プロモーターを含む６．２ｋｂのフラグメントおよびＡｄｈ２のコード領域を含む６．０ｋｂのフラグメントは各々、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅しているため、各フラグメント内にはＰＣＲエラーが存在し得る。各増幅フラグメントをｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯにクローニングした、次いでその塩基配列を決定した。その結果、Ａｄｈ２プロモーターを含む６．２ｋｂのフラグメントには１２個所の、Ａｄｈ２のコード領域を含む６．０ｋｂのフラグメントには７個所の塩基置換が導入されていることが明らかとなった。これらのフラグメントを使用して、以下のように標的ベクターｐＪＨＹＡｄ２（相同組換え用核酸）を作製した。
【０１３１】
ハイグロマイシンＢ耐性（Ｈｍｒ）のためのポジティブ選抜マーカー遺伝子ｈｐｔを０．１ｋｂの５’非翻訳領域を含む６．２ｋｂのＡｄｈ２プロモーターと、隣接するコピア様配列の２．０ｋｂの３’部分を含む４．０ｋｂのＡｄｈ２遺伝子との間に配置した。ネガティブ選抜マーカーであるジフテリア毒素タンパク質Ａ鎖遺伝子（ＤＴ−Ａ）を、境界でのランダム挿入を効率的に排除する（ネガティブ選抜する）ために、Ｔ−ＤＮＡの両端の境界配列の横に配置した。この相同組換え用核酸については、図２Ａを参照のこと。
【０１３２】
（実施例２  相同組換え体の作出および単離）
実施例１において作製した相同組換え用核酸ｐＪＨＹＡｄ２を使用して、上記（植物の形質転換）において記載したように、イネの形質転換を実施した。ｐＪＨＹＡｄ２を用いて、ポジティブ−ネガティブ選抜によって９個の生存カルスを得ることができた。
【０１３３】
最初に、相同組換えによってＡｄｈ２が改変されていない相同組換えカルスをスクリーニングするために、まずＡｄｈ２プロモーターを含む６．４ｋｂの５’連結フラグメントが検出され得るか否かを、プライマーＦ４およびＲ４を用いるＰＣＲ分析によって試験し、次いでその５’連結フラグメントの存在が確認されたカルスにおいて、Ａｄｈ２コード領域を含む６．８ｋｂの３’連結フラグメントも存在するか否かを、プライマーＦ５およびＲ５を用いるＰＣＲ分析によって試験した（図３を参照のこと）。５’連結フラグメントが検出された９個のカルスは全て、３’連結フラグメントを含んでいることを確認した。これらの６．４ｋｂフラグメントおよび６．８ｋｂフラグメントが各々予測される５’連結フラグメントおよび３’連結フラグメントに対応することを確認するために、これらＰＣＲ増幅されたフラグメントの両端を配列決定した。配列決定したＰＣＲ増幅フラグメントは全て予測された連結フラグメントであることが示され、このことによって期待された相同組換えが９個のカルス全てにおいて起こったことを確認した。本発明者らはさらに、残りの４５９個の生存カルスにおいて３’連結フラグメントが検出され得るか否かをＰＣＲによってさらに分析し、それらは全て６．８ｋｂのフラグメントを生成しないことを確認した。以上のことから、目的とする相同組換えが起こった９個のカルスを単離した。
【０１３４】
（実施例３  相同組換えによって導入された塩基置換の同定）
実施例２において単離した各カルスから、上記の条件にて、Ａｄｈ２プロモーターを含む６．４ｋｂの５’連結フラグメントおよびＡｄｈ２コード領域を含む６．８ｋｂの３’連結フラグメントをＰＣＲ増幅し、得られたフラグメントの全塩基配列を決定した。
【０１３５】
この結果を、図４に示す。図４に示されるように、９個のカルスでは、３つのグループ：Ｓ１〜Ｓ１９の全ての点変異が導入されている、グループＡの相同組換え体；Ｓ１５から下流には野生型の配列が残っている（Ｓ１５から下流には塩基置換が導入されていない）、グループＢの相同組換え体；およびＳ１〜Ｓ１９において野生型の配列と塩基置換とを入れ子状に有している（Ｓ１〜Ｓ１９の種々の点において塩基置換が導入されている）、グループＣの相同組換え体、が観察された。ここで、図４におけるグループＡ、ＢおよびＣにおいて、Ｖは変異が挿入されていることを示し、Ｇは変異が挿入されず、植物細胞のゲノム領域が残存していることを示す。図４の結果から明らかなように、単一の相同組換え用核酸ｐＪＨＹＡｄ２を用いて、本発明の方法によって８種類の相同組換え体を得た。
【０１３６】
（実施例４  誘導型Ｃｒｅ遺伝子を組み込んだ相同組換え用核酸の構築）
リコンビナーゼＣｒｅを発現させてポジティブ選抜マーカーを除去する工程を省くことができる、より高効率の変異導入を可能にする、誘導型Ｃｒｅ遺伝子を組み込んだ相同組換え用核酸（図５を参照のこと）の構築を行った。
【０１３７】
具体的には、誘導型Ｃｒｅ遺伝子を組み込んだ相同組換え用核酸（以下ｐＫＩＮ７）を、以下のように作製した。基となるベクターはｐＩＮＡ１３４である。ｐＫＩＮ７は、ｐＩＮＡ１３４にｐＢＩＭＦＮ由来のＥｓｔｒａｄｉｏｌを用いてＣｒｅ遺伝子を化学的に誘導するためのＤＮＡ断片（ｐＡｃｔ−ＸＶＥ−ｔＥ９）およびＸＶＥにより誘導されるプロモーターと、Ｃｒｅ遺伝子とからなるＤＮＡ断片（ＯＬｅｘＡ−Ｃｒｅ−ｔＮｏｓ）を組み込んだものである。構築方法はλＲｅｄシステム（Ｍ．−Ｋ．Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｉｄｕｌａｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：ｅ９７；Ｊ．Ｐ．Ｐ．Ｍｕｙｒｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｒｅｃｏｍｎｉｎｏｇｅｎｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−ｎｅｗ  ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ．Ｔｒｅｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２６：３２５−３３１を参照のこと）を用いた。
【０１３８】
（Ｓｔｅｐ１）
ｐＢＩＭＦＮから、不要な部分（ｐＮＯＳ−ｈｐｔ−ｔＮｏｓ）をλＲｅｄシステムを用いて取り除いた。ゼオシン耐性遺伝子（ＺｅｏｃｉｎＲ）を持つｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型とし、ｐＢＩＭＦＮ上のｔＥ９及びＯＬｅｘＡとそれぞれ５０ｂｐの相同性をもつプライマーＺｅｏＦ（ｔＥ９と相同性を有する）とＺｅｏＲ（ＯＬｅｘＡと相同性を持つ）とを用いてＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子の両側にｔＥ９およびＯＬｅｘＡと５０ｂｐの相同性を有するＤＮＡ断片を作製した。図６において、斜線部分は５０ｂｐの相同領域を示す。λＲｅｄシステムを用い、この断片とｐＢＩＭＦＮとの間で大腸菌内で組換えをおこさせ、不要な部分（ｐＮＯＳ−ｈｐｔ−ｔＮｏｓ）をゼオシン耐性遺伝子によって置き換え、削除しｐＢＩＭＦＮ／ｈｐｔ  ｄｅｌｅｔｅｄプラスミドを作製した。
【０１３９】
（Ｓｔｅｐ２）
ｐＢＩＭＦＮから必要な部分のみ（ｐＡｃｔからｔＮｏｓまで）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へクローニングした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩを鋳型とし、プライマーｐＢｌ−ＦとｐＢｌ−Ｒとを用いてＰＣＲを実施した。ｐＢｌ−ＦにはｐＢＩＭＦＮ上のｐＡｃｔと相同性を有する６０ｂｐの領域（図６においては灰色の四角で表示される）と、後述のｐＩＮＡ１３４のｌｏｘ領域と相同性を有する４０ｂｐの領域（図６においては斜線と三角形で表示される）とを有する。またｐＢｌ−Ｒは、ｐＢＩＭＦＮ上のｔＮｏｓと相同性を有する６０ｂｐの領域（図６においては灰色の四角で表示される）と、後述のｐＩＮＡ１３４のｐＡｃｔと相同性を有する４０ｂｐの領域（図６においては斜線とｐＡで表示される）を有する。このＰＣＲによって作製したＤＮＡフラグメントには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩの配列の両側に、まずｐＢＩＭＦＮと相同性を有する領域（図６における灰色の領域）が存在し、さらに外側にｐＩＮＡ１３４と相同性を有する領域（図６における斜線部分）が存在する。このＤＮＡフラグメントおよびＳｔｅｐ１で作成したｐＢＩＭＦＮ／ｈｐｔ  ｄｅｌｅｔｅｄプラスミドを用いて、λＲｅｄシステムにより大腸菌内で組換えを起こさせ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ／ｈｐｔ  ｄｅｌｅｔｅｄプラスミドを作製した。
【０１４０】
（Ｓｔｅｐ３）
ｐＩＮＡ１３４への誘導型Ｃｒｅの導入を行った。Ｓｔｅｐ２で得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ／ｈｐｔ  ｄｅｌｅｔｅｄプラスミドを、制限酵素ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで切断し、図６に示すＤＮＡ断片を得た。この断片およびｐＩＮＡ１３４を用いて、λＲｅｄシステムにより大腸菌内で組換えを起こさせ、ｐＫＩＮ６プラスミドを作製した。
【０１４１】
（Ｓｔｅｐ４）
ｐＫＩＮ６より不要なゼオシン耐性遺伝子を除去した。用いたＤＮＡフラグメントは、１２０ｍｅｒの人工的に合成したオリゴヌクレオチドであり、ｔＥ９とＯＬｅｘＡが連続的につながるように設計したオリゴヌクレオチドを、センス鎖及びアンチセンス鎖の２本作成した。この２種のオリゴヌクレオチドをアニールさせて２本鎖ＤＮＡとし（図６においては斜線部分で表示される）、ｐＫＩＮ６と合わせてλＲｅｄシステムにより大腸菌内で組換えを起こさせ、ｐＫＩＮ７を作製した。以下は、ｐＫＩＮ７作製の過程で使用したプライマーの配列である：
ＺｅｏＦ  ５‘ＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＧＡＣＡＡＴＣＴＧＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＴＴＡＡＧＧＡＴＴＡＴＴＡＡＣＧＣＴＴＡＣＡＡＴＴＴ  ３’（配列番号２０）
ＺｅｏＲ  ５‘ＴＧＴＡＣＡＧＴＡＣＧＴＣＧＡＧＧＧＧＡＴＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＴＴＡＧＣＣＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴ  ３’（配列番号２１）
ｐＢｌ−Ｆ  ５‘ＧＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＧＡＣＴＡＴＣＣＣＧＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＡＣＣＴＣＧＡＴＣＧＡＧＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＧ  ３’（配列番号２２）
ｐＢｌ−Ｒ  ５‘ＧＣＧＣＧＣＡＡＡＣＴＡＧＧＡＴＡＡＡＴＴＡＴＣＧＣＧＣＧＣＧＧＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＡＣＴＡＧＡＴＣＣＧＴＡＣＡＡＴＴＧＧＴＣＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＧＴＡＴＡＡＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧ  ３’（配列番号２３）
センス鎖オリゴヌクレオチド  ５‘ＣＡＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＧＡＣＡＡＴＣＴＧＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＴＴＡＡＧＧＧＴＣＧＡＧＧＣＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＴＣＧＣＡＴＴＡＴＣＡＴＣＣＣＣＴＣＧＡＣＧＴＡＣＴＧＴＡＣＡＴＡＴＡＡＣＣＡＣＴ  ３’（配列番号２４）
アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド  ５‘ＡＧＴＧＧＴＴＡＴＡＴＧＴＡＣＡＧＴＡＣＧＴＣＧＡＧＧＧＧＡＴＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＴＴＡＧＣＣＴＣＧＡＣＣＣＴＴＡＡＴＴＣＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＴＧ  ３’（配列番号２５）。
【０１４２】
（ｐＫＩＮ７を用いた相同組換え体の作出）
標的遺伝子と相同性を有する第一の相同領域および第二の相同領域をｐＫＩＮ７に導入する。続いて、第一の相同領域および第二の相同領域内に複数の任意の点変異を導入し、本発明における相同組換え用核酸である変異導入ベクター（ｐＫＩＮ８）を完成させる。ｐＫＩＮ８を用いて遺伝子ターゲティングを行い、異なるゲノム配列を有する少なくとも２つ以上の相同組換え体を得る。その後組換え体から個体を再生させる工程においてエストラジオールによりＣｒｅ遺伝子の発現を誘導し、２つのＬｏｘ部位で部位特異的組換えを起こさせ、変異のみをゲノム中に有する個体を作出する。
【０１４３】
（実施例５  点変異を導入した相同組換え体からのＣｒｅ酵素によるポジティブマーカーの除去
リコンビナーゼであるＣｒｅの発現を誘導して、実施例３で得られたＡｄｈ２遺伝子に塩基置換が導入された植物から、ポジティブ選抜マーカーを除去するためのベクターｐＣｒｅ−Ｋｍを以下のように構築した。図７に示されるように、ｐＢＩＭＦＮベクターのＨＰＴ遺伝子のＯＲＦ部分を、λＲｅｄシステムを用いて（実施例４を参照のこと）、ＮＰＴＩＩ遺伝子に置き換えた。
【０１４４】
実施例３で得られたＡｄｈ２遺伝子に塩基置換が導入された植物の自殖後代から、Ａｄｈ２遺伝子がホモで改変されている次世代を得た。このうち、＃６系統をさらに自殖した種子からカルスを誘導し、培地中にエストラジオールを添加することによって、その発現を誘導することができる誘導型Ｃｒｅ遺伝子を発現させるためのｐＣｒｅ−Ｋｍベクターをアグロバクテリウムによって導入した。ｐＣｒｅ−Ｋｍベクターの構造は図７及び図８に示す。形質転換カルスを分離するために、パロモマイシン（４０ｍｇ／ｌ）を加えた選抜培地にて約１ヶ月選抜し、パロモマイシン耐性を示す形質転換カルスを分離した。さらに得られたカルスを２．０μＭ及び４．０μＭのエストラジオールを含む植物再生培地に１４日間置いてＣｒｅ遺伝子の発現を誘導し、その後エストラジオールを含まない再生培地にカルスを移し、再生した植物体をＰＣＲにて解析した。エストラジオール添加により誘導されたＣｒｅ酵素により、Ａｄｈ２遺伝子領域内のｌｏｘ配列に挟まれたポジティブ選抜マーカー（ＨＰＴ遺伝子）および、ゲノム中に導入されたｐＣｒｅ−Ｋｍ領域のｌｏｘ配列に挟まれた配列（誘導型Ｃｒｅ遺伝子とＮＰＴＩＩ遺伝子）がゲノム中より削除されるはずである。二つの領域の除去が起きた形質転換植物は、以下のようなＰＣＲにて選抜した。
【０１４５】
Ａｄｈ２領域からのＨＰＴ遺伝子の除去（ＰＣＲ−Ａｄｈ２）
初回変性（９４℃で１分間）；
変性（９４℃で３０秒間）、アニーリング（６１．４℃で３０秒間）、伸長（７２℃で２分間）を３０サイクル；
最終伸長（７２℃で１０分間）。
プライマー；Ａｄｈ２Ｆ：５’−ＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡＴＣＣ−３’（配列番号２６）
Ａｄｈ２Ｒ：５’−ＴＧＣＡＣＡＡＴＴＧＧＡＣＡＣＴＴＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＴＴＴ−３’（配列番号２７）
ｐＣｒｅ−Ｋｍ領域からのＮＰＴＩＩ遺伝子および誘導型Ｃｒｅ遺伝子の除去（ＰＣＲ−Ｃｒｅ）
初回変性（９４℃で１分間）；
変性（９４℃で３０秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒間）、伸長（７２℃で１分間）を３０サイクル；
最終伸長（７２℃で１０分間）。
プライマー；Ｃｒｅ−Ｆ：５’−ＡＡＣＴＧＡＣＡＡＣＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＡＡＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号２８）
Ｃｒｅ−Ｒ：５’−ＴＡＡＣＡＣＡＴＴＧＣＧＧＡＣＧＴＴＴＴＴＡＡＴＧＴＡＣＴＧ−３’（配列番号２９）
【０１４６】
上記の２種のＰＣＲにてどちらの領域からもｌｏｘ配列に挟まれた配列が除去されたことが明らかとなった植物からゲノムＤＮＡを抽出し、サザン法によってＡｄｈ２遺伝子領域の構造を解析したところ、２つの染色体の両方のＡｄｈ２領域からＨＰＴ遺伝子の除去が起きていることが確認された（図９）。またこれらの植物のＡｄｈ２領域の塩基配列を決定したところ、図８および図４の様な点変異が導入されていることも明らかとなった。すなわち、本実施例にて、本発明者らは、相同組換え体を選抜する際のポジティブマーカー（ＨＰＴ遺伝子）をＣｒｅ遺伝子の発現を誘導することで除去し、相同組換えによって効率良く導入した点変異を植物ゲノムに残すことができたことを示した。さらに、この結果から、従来のように複数回の相同組換えを必要としないだけでなく、実施例３または実施例６のように２回の形質転換を行なわなくとも、本実施例で構築したベクターを用いることにより、１回の形質転換によって、より簡便に当初の目的を達することができることが明らかである。
【０１４７】
（実施例６  品種金南風を用いた変異の導入）
品種日本晴以外のイネの品種においても、同様の結果が得られるか否かを、品種金南風（きんまぜ）を用いて検討した。図４で示す塩基置換のパターンは、詳細なゲノム配列が解析された品種日本晴に相同組換え用核酸ｐＪＨＹＡｄ２を導入して得られた結果である。品種日本晴の代りに品種金南風を用いて、実施例２と実施例３に記載の手順を繰返し、図１０の結果を得た。この結果から、本願発明は、種を超えて普遍性があることが明らかである。
【０１４８】
（実施例７  導入したｐＣｒｅ−Ｋｍベクターを分離した、マーカーフリーイネの作出）
実施例５で得られた、Ａｄｈ２遺伝子領域内に点変異が導入され、遺伝子ターゲティングの際のポジティブマーカーであるハイグロマイシン耐性遺伝子を、Ｃｒｅ／ｌｏｘ部位特異的組換えにより除去した植物には、ゲノム中に後から導入したｐＣｒｅ−ＫｍベクターのＴ−ＤＮＡ断片やＴ−ＤＮＡ領域の配列が残存している可能性がある（図１１）。残存しているランダムにゲノムに挿入したＴ−ＤＮＡ配列は実施例６のＰＣＲ断片が示す２つのボーダー配列とｌｏｘ配列（図１１Ｂ）だけでなく、部位特異的組換えが起こらなかったために、ＮＰＴＩＩ遺伝子領域等を持つＴ−ＤＮＡ領域（図１１Ｃ）があると考えられる。それ故、Ａｄｈ２遺伝子領域内からポジティブマーカーを除去した植物の次世代を得て、分離により導入したｐＣｒｅ−Ｋｍの全てのＴ−ＤＮＡ断片の配列が全く残っていない植物を得ることを試みた（図１１）。図１２に示すように、ｐＣｒｅ−ＫｍのＴ−ＤＮＡ領域内の選抜マーカーであるＮＰＴＩＩ遺伝子および、Ｔ−ＤＮＡのボーダー配列付近のＭＣＳ部位付近をプローブとしたサザン法により、得られた次世代（Ｔ１世代）のゲノムを解析した。図１２の＃１や＃１４では、ＮＰＴＩＩとＭＣＳのどちらのプローブを用いてもサザン法のシグナルが得られないので、余計なＴ−ＤＮＡ断片は全く含まれないことは明らかである。さらにこれら個体のゲノム中には、図１１で示したようにＡｄｈ２遺伝子内には点変異が導入されていることは、塩基配列を決定して確認した。即ち、Ａｄｈ２遺伝子内の点変異とｌｏｘ配列以外のゲノム領域は野生型と同様で、Ｔ−ＤＮＡ由来の配列や選抜マーカー遺伝子配列を全く含まない、完全なマーカーフリーイネを作出できた。これにより、任意のゲノム中に目的の点変異を非常に効率良く導入し、かつ余分なマーカー遺伝子等の除去も可能であり、結果として目的の点変異のみを任意の遺伝子に導入することができたことを示した。
【０１４９】
（実施例８  マーカーフリー植物における、点変異を導入したＡｄｈ２遺伝子の発現解析）
実施例７で得られた、完全マーカーフリー植物を用いて、点変異を導入したＡｄｈ２遺伝子の発現解析を行った。播種後２週間の植物の根および葉よりＲＮＡを抽出し、Ａｄｈ２転写産物特異的に増幅するプライマー（Ａｄｈ２ｃｄ−ＦおよびＡｄｈ２ｃｄ−Ｒ）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりＡｄｈ２遺伝子の発現を解析した。図１３で示したように、点変異を導入した個体でも、根において野生型とほぼ同等のＡｄｈ２遺伝子の発現を確認できた。また、変異を導入した個体では野生型よりも若干長い転写産物が得られた。得られた転写産物の塩基配列を決定したところ、この違いは１つのｌｏｘ配列がＡｄｈ２遺伝子領域内に残り、ｌｏｘ配列も転写されているためであり、その他の領域は野生型と差異がないことが判明した。さらに葉においてはＡｄｈ２転写産物は野生型と同様にほとんど検出されず、たとえｌｏｘ配列が挿入していたとしても、Ａｄｈ２遺伝子の組織特異的な発現にはあまり影響していないことも分かった。したがって、遺伝子ターゲティングにより点変異を導入した時は、標的遺伝子の発現は全く見られないノックアウト変異であった植物から、部位特異的組換えによりポジティブマーカー遺伝子を除去した後、たとえｌｏｘ配列が転写領域内に残っていたとしても、野生型と同等の転写を回復でき、導入した点変異の利用や、機能解析が可能であることが示された。
【０１５０】
Ａｄｈ２転写産物の検出（ＲＴ−ＰＣＲ）
初回変性（９４℃で１分間）；
変性（９４℃で３０秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒間）、伸長（７２℃で２分間）を３２サイクル；
最終伸長（７２℃で１０分間）
プライマー；Ａｄｈ２ｃｄ−Ｆ：５’−ＧＣＡＡＣＧＡＡＣＴＧＣＧＡＧＴＧＡＴＴＣ−３’（配列番号３０）
Ａｄｈ２ｃｄ−Ｒ：５’−ＴＣＴＣＡＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡ−３’（配列番号３１）
ユビキチン遺伝子転写産物の検出（コントロール実験）
初回変性（９４℃で１分間）；
変性（９４℃で３０秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒間）、伸長（７２℃で２分間）を２７サイクル；
最終伸長（７２℃で１０分間）
プライマー；Ｕｂｉ−Ｆ：５’−ＣＣＡＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＧＣＣ−３’（配列番号３２）
Ｕｂｉ−Ｒ：５’−ＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣ−３’（配列番号３３）
【０１５１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の高効率変異導入法における相同組換えのモデル図を示し、（ｉ）のＳＤＳＡ（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｔｒａｎｄ−ａｎｎｅａｌｉｎｇ：合成依存型１本鎖ＤＮＡ会合）とは、太い矢印で示された新たに合成されたＤＮＡ鎖同士がハイブリダイズ（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）し、さらにＤＮＡ合成とライゲーションにより組換え体が生じる過程をさす。植物の核に導入された相同組換え用の一本鎖Ｔ−ＤＮＡは相同組換えの中間体として働き、１本鎖Ｔ−ＤＮＡの３’末端が植物の標的遺伝子領域ゲノムＤＮＡの相同領域に侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）し、（ｉ）又は（ｉｉ）に示すような相同組換え過程が進行する。（ｉ）は分枝点移動（ｂｒａｎｃｈ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）によってベクター由来の１本鎖Ｔ−ＤＮＡの相同領域のゲノムＤＮＡがヘテロ２重鎖ＤＮＡ  （ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ）  を形成する。この分枝点移動は、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の非相同領域のはじまる所で停止するが、１本鎖Ｔ−ＤＮＡに切断が起り、その３’末端がゲノムＤＮＡに再侵入して再び分枝点移動によりヘテロ２重鎖ＤＮＡを形成され、新たに合成された１本鎖ＤＮＡ断片同士が会合するＳＤＳＡ過程を経て相同組換えが起る経路（ｐａｔｈｗａｙ）である。この場合は、生じたヘテロ２重鎖ＤＮＡの修復過程で種々の（２つ以上の）組合せの組換え体が生成され、高頻度で入れ子状の配列をもつ組換え体も生じる。一方、（ｉｉ）の場合は、Ｔ−ＤＮＡ上の１本鎖相同領域を鋳型としてＤＮＡ  が合成されるので、数塩基の変異（置換、挿入、および欠失）ばかりでなく、１〜２ｋｂ程度の比較的大きな置換、挿入、および欠失も効率よくベクターからゲノムへ移すことができる。それ故、従来の相同組換えでは困難な非相同領域をもつベクター上の配列とも高効率で組換えが起って相同組換え体を得ることが出来るので、この点もＴ−ＤＮＡを介した本組換え機構の特徴である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、従来のノックイン法における相同組換えのモデル図を示す。この場合も末端で、ヘテロ２重鎖ＤＮＡを生じる可能性はあり、修復機構によって末端がベクター由来の配列か植物ゲノム由来に配列になり得るが、配列が入れ子状にはならない。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の高効率変異導入法の概略を示す。各部位の説明は、図の下部に記載されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、従来のノックイン法の概略を示す。各部位の説明は、図の下部に記載されている。
【図３】図３Ａは、Ａｄｈ遺伝子座のゲノム構造を示す。図３Ｂは、本発明の一実施形態において使用される相同組換え用核酸ｐＪＨＹＡｄ２の構造を示す。図３Ｃは、本発明の方法によって改変されたＡｄｈ２遺伝子の構造を示す。マップの下の水平線およびそれに隣接している小さな矢印は、それぞれＰＣＲフラグメントおよびプライマーを示す。Ｃｏｐｉａ−ｌｉｋｅは、コピア様配列を示す。
【図４】図４は、実施例２において単離した各カルスにおいて、導入された塩基置換のパターンを示す。グループＡ、ＢおよびＣにおいて、Ｖは変異が挿入されていることを示し、Ｇは変異が挿入されず、植物細胞のゲノム領域が残存していることを示す。
【図５】図５は、誘導型Ｃｒｅを組み込んだ相同組換え用核酸の概略を示す。この相同組換え用核酸を用いて本発明の方法を実施し、その後Ｃｒｅ遺伝子の発現を誘導して、塩基置換を導入する。相同組換え用核酸における各部位の説明は、図の下部に記載されている。
【図６】図６は、誘導型Ｃｒｅを組み込んだ相同組換え用核酸であるｐＫＩＮ７の構築およびその構造を示す。
【図７】図７はＣｒｅ酵素をトランスに供給するためのｐＣｒｅ−Ｋｍベクターの構築及びその構造を示す。
【図８】図８は実施例５の概略を示す。下向き矢印の右側にはｐＣｒｅ−Ｋｍベクターの構造を示す。また左側には、各ｌｏｘ配列で挟まれ、Ｃｒｅ遺伝子の作用で除去され得る領域を模式的に示す。Ａｄｈ２遺伝子領域のマップ内の黒丸はベクター由来の塩基置換が起きたことを示し、白丸は植物ゲノムの配列が保持されていることを示す。マップの下の水平線およびそれに隣接している矢印は、それぞれＰＣＲフラグメントおよびプライマーを示す。
【図９】図９はサザン法の結果を示す（Ａ）。用いた植物は、独立に得られたカルスより再生した２個体であり、それぞれ１，２で示した。ＷＴは非形質転換体の日本晴個体をまた、ＧＴはｐＣｒｅ−Ｋｍを形質転換していない、Ａｄｈ２遺伝子領域がホモで相同組換え（ターゲティング）によって改変された個体を示す。全てのゲノムはＫｐｎＩにて制限酵素処理をした。用いたプローブはＡｄｈ２遺伝子の下流領域の３’Ｕ（図９Ｂ参照）である。サザン法で得られるバンドの大きさをＢに示した。Ｔｙｐｅアは野生型のアレルを示し、１５ｋｂのバンドが得られる。Ｔｙｐｅイはターゲット型アレルを示し、７．６  ｋｂのバンドが得られる。Ｔｙｐｅウは目的のＨＰＴ遺伝子が削除されたアレルを示し、１１ｋｂのバンドが得られる。また、Ｋ＊は相同組換えにより導入された点変異により、作出された新たなＫｐｎＩ部位を示す。
【図１０】図１０は、品種金南風を用いて単離したカルスにおいて、導入された塩基置換のパターンを示す。ベクター由来の点変異を黒丸（●）、ゲノムの配列を白丸（○）で示す。なお、品種金南風は品種日本晴に比べて、Ａｄｈ２遺伝子領域内に、さらにもう１つ多型（ＰＫ）が見出された。
【図１１】完全なマーカーフリー個体を得るための策を模式的に示す。部位特異的組換えにより得られた個体のゲノムには、点変異を有するＡｄｈ２遺伝子（Ａ）だけでなく、Ｔ−ＤＮＡ内で部位特異的組換えが起きた断片（Ｂ）以外にも組換えが起きなかった断片（Ｃ）が存在する可能性がある。後から導入したｐＣｒｅ-ＫｍのＴ−ＤＮＡ断片を含まない個体を得るために、得られた組換え体を自殖して、Ｔ１次世代を得た。分離すると考えられるゲノム構造のうち、３例を示す。中央に示した個体が、目的の完全なマーカーフリー個体である。
【図１２】マーカーフリー個体をサザン法により検出した。ＮＰＴＩＩとＭＣＳプローブのハイブリダイズしうる領域をそれぞれ「ＮＰＴＩＩ  ｐｒｏｂｅ」、「ＭＣＳ  ｐｒｏｂｅ」として示した。ＭＣＳプローブは図１１-Ｂの様な断片と図１１Ｃの様な断片のどちらも検出し得る。野生型は野生型日本晴（非形質転換体）を用いた。＃１と＃１４の個体は、どちらのプローブを用いてもシグナルが得られないため、完全なマーカーフリー個体であると判明した。
【図１３】図１２で示した＃１と＃１４個体を用いて、Ａｄｈ２遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにて検出した。ＲＮＡは播種後2週間の植物の根と葉から抽出した。完全マーカーフリー個体のＡｄｈ２遺伝子の発現は、野生型日本晴（野生型）と同じ組織で転写産物が観察されたので、部位特異的組換えにより、ＨＰＴ遺伝子を除去することで、Ａｄｈ２遺伝子の発現が回復したことを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１５３】
配列番号１＝Ａｄｈ２の核酸配列
配列番号２＝Ａｄｈ２のアミノ酸配列
配列番号３＝プラスミドｐＩＮＡ１３４
配列番号４＝ｌｏｘＰ
配列番号５＝Ｆ１プライマー
配列番号６＝Ｒ１プライマー
配列番号７＝Ｆ２プライマー
配列番号８＝Ｒ２プライマー
配列番号９＝Ｆ３プライマー
配列番号１０＝Ｆ４プライマー
配列番号１１＝Ｒ４プライマー
配列番号１２＝Ｆ５プライマー
配列番号１３＝Ｒ５プライマー
配列番号１４＝Ｆ６プライマー
配列番号１５＝Ｒ６プライマー
配列番号１６＝ＲＴ２−Ｆプライマー
配列番号１７＝ＲＴ２−Ｒプライマー
配列番号１８＝Ｕｂｉｑ−Ｆプライマー
配列番号１９＝Ｕｂｉｑ−Ｒプライマー
配列番号２０＝ＺｅｏＦプライマー
配列番号２１＝ＺｅｏＲプライマー
配列番号２２＝ｐＢｌ−Ｆプライマー
配列番号２３＝ｐＢｌ−Ｒプライマー
配列番号２４＝センス鎖オリゴヌクレオチド
配列番号２５＝アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド
配列番号２６＝Ａｄｈ２Ｆプライマー
配列番号２７＝Ａｄｈ２Ｒプライマー
配列番号２８＝Ｃｒｅ−Ｆプライマー
配列番号２９＝Ｃｒｅ−Ｒプライマー
配列番号３０＝Ａｄｈ２ｃｄ−Ｆプライマー
配列番号３１＝Ａｄｈ２ｃｄ−Ｒプライマー
配列番号３２＝Ｕｂｉ−Ｆプライマー
配列番号３３＝Ｕｂｉ−Ｒプライマー
【図８】
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【図１０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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