(57)【要約】      （修正有）【課題】エンハンサーとして活性であり、かつ緑色組織において発現されるプロモーターの発現を増大させるＤＮＡ配列及び１以上の遺伝子プロモーターに対するエンハンサーを提供する。【解決手段】エンハンサーはＡ及びＴ塩基に富むヌクレオチド配列であり、その含有するＡ及びＴ塩基の総量はこのヌクレオチド配列の５０％を上回る。特定の配列はエンドウマメ・プラストシアニンプロモーターから同定され、該配列はＡ／Ｔのみのヌクレオチド配列と同様にエンハンサーとして活性であり、該配列が得られた植物以外の植物における遺伝子の発現を高める方法。【選択図】図１
2008253266.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子プロモーターの発現を増大させるエンハンサーであって、該エンハンサーはＡ及びＴ塩基に富むヌクレオチド配列であり、その含有するＡ及びＴ塩基の総量は該ヌクレオチド配列の50％を上回り、該エンハンサーは本明細書の図面の図６の配列番号1、本明細書の図面の図７の配列番号2、配列番号１からのヌクレオチド塩基対配列である−444〜389、−388〜284、−283〜179、−444〜284、−388〜179、本明細書の図面の図8の配列番号3又は上記配列のいずれか１つのエンハンサーとして作用可能となる類似性を有する任意の類似の配列からなる群の１以上から選択される単離された配列であり、さらに該エンハンサーは、自然発生するエンドウマメ・プラストシアニン遺伝子の５’非翻訳領域の該エンハンサーの隣に位置するヌクレオチド配列に結合していないエンハンサー。
【請求項２】
前記配列がＡ及びＴ塩基をそれぞれ少なくとも35％有する、請求項１に記載のエンハンサー。
【請求項３】
Ａ又はＴ塩基の一方が前記配列の40、45％もしくは50％、又はそれ以上存在する、請求項１又は２に記載のエンハンサー。
【請求項４】
前記配列がＡ及びＴ塩基のみを含む、請求項１に記載のエンハンサー。
【請求項５】
エンハンサーが配列番号３の精製されたサブ配列又はそれらに類似する配列であり、該サブ配列がエンハンサーとして活性である、請求項１に記載のエンハンサー。
【請求項６】
遺伝子プロモータ一の発現を増大させる方法であって、エンハンサーを用いて１以上の遺伝子のプロモーターの活性を高めることにより植物の１以上の器官における１以上の遺伝子の発現を増大させる方法であり、該エンハンサーはＡ及びＴ塩基に富むヌクレオチド配列であり、その含有するＡ及びＴ塩基の総量は該ヌクレオチド配列の50％を上回り、該エンハンサーは本明細書の図面の図６の配列番号1、本明細書の図面の図７の配列番号2、配列番号１からのヌクレオチド塩基対配列である−444〜389、−388〜284、−283〜179、−444〜284、−388〜179、本明細書の図面の図8の配列番号3又は上記配列のいずれか１つのエンハンサーとして作用可能となる類似性を有する任意の類似の配列からなる群の１以上から選択される単離された配列であり、さらに該エンハンサーは、自然発生するエンドウマメ・プラストシアニン遺伝子の５’非翻訳領域の該エンハンサーの隣に位置するヌクレオチド配列に結合していないエンハンサーである方法。
【請求項７】
前記配列がＡ及びＴ塩基をそれぞれ少なくとも35％有する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
Ａ又はＴ塩基の一方が前記配列の40、45％もしくは50％、又はそれ以上存在する、請求項6又は7に記載の方法。
【請求項９】
前記配列がＡ及びＴ塩基のみを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
エンハンサーが配列番号３の精製されたサブ配列又はそれらに類似する配列であり、該サブ配列がエンハンサーとして活性である、請求項6に記載の方法。
【請求項１１】
前記エンハンサーが植物遺伝子から得られるか、又は合成により生成される、請求項６に記載の遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
【請求項１２】
前記エンハンサーが植物遺伝子の相同体であるか、又は合成により生成した配列である、請求項11に記載の遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
【請求項１３】
前記遺伝子プロモーターが植物における遺伝子プロモーターである、請求項6〜12のいずれか１項に記載の遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
【請求項１４】
エンハンサーの配列又はサブ配列が植物の緑色又は非緑色組織における遺伝子の発現を増大させる、請求項6〜13のいずれか１項に記載の遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
【請求項１５】
増大した発現が前記植物の根、塊茎、種子、茎、花又は葉で生じる請求項14に記載の遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
【請求項１６】
エンハンサーが複数のエンハンサーを含む、請求項6〜15のいずれか１項に記載の遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
【請求項１７】
エンハンサーが正常方向及び逆方向の両者で作動する、請求項6〜16のいずれか１項に記載の遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
【請求項１８】
エンハンサーが、発現させようとする遺伝子のプロモーター又はターミネーターのいずれかに結合する、請求項6〜17のいずれか１項に記載の遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
【請求項１９】
エンハンサーが請求項1〜5のいずれか１項に記載のエンハンサーである、請求項6〜18のいずれか１項に記載の遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
【請求項２０】
請求項1〜5のいずれか１項に記載のエンハンサー、異種遺伝子プロモーター、コード配列もしくは非コード配列及びターミネーター配列を含むキメラ遺伝子。
【請求項２１】
前記キメラ遺伝子が１を上回る前記エンハンサー及び１を上回るプロモーターを含む、請求項20に記載のキメラ遺伝子。
【請求項２２】
エンハンサーが複数のエンハンサーを含む、請求項20に記載のキメラ遺伝子。
【請求項２３】
前記エンハンサーが前記プロモーターに作動的に結合し、該エンハンサーは、正常の方向または逆方向である請求項19〜21のいずれか１項に記載のキメラ遺伝子。
【請求項２４】
請求項1〜5のいずれか１項に記載のエンハンサーの１以上を用いることにより、１以上の遺伝子の発現が高められた植物。
【請求項２５】
形質転換された植物が双子葉植物種又は単子葉植物種である請求項24に記載の植物。
【請求項２６】
前記植物がジャガイモ、タバコ、綿、レタス、メロン、カボチャ、キュウリ、エンドウマメ、セイヨウアブラナ、大豆、甜菜、ヒマワリ、コムギ、オオムギ、ライムギ、コメもしくはトウモロコシである、請求項25に記載の植物。
【請求項２７】
請求項1〜5のいずれか１項に記載のエンハンサーを用いて形質転換された植物の珠芽。
【請求項２８】
請求項6〜19のいずれか１項の方法の結果として発現が高められた遺伝子を有する細胞。
【請求項２９】
請求項１〜5のいずれか１項のエンハンサーを有する細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の発現の増大に関し、特には、遺伝子のプロモーター活性の改変に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子操作は植物へのキメラ遺伝子の導入に依存し、導入された遺伝子の発現はそのプロモーターに依存する。これらの遺伝子におけるプロモーターの有効性を改善する方法を得ることが有利であるという多くの理由が存在する。異なるプロモーターは異なる組織において異なる効率で作動する。異なるプロモーターは同じ組織において異なる効率で作動し、カリフラワーモザイクウイルス35Ｓプロモーター（35Ｓ ＣａＭＶ）のような幾つかのものは一般にnos遺伝子に由来するプロモーターよりも強力なプロモーターであると考えられる。プロモーターは通常1000bpを上回るものからなり、短くした場合には作動の効率が低下する。しかしながら、ＤＮＡの長い区画は組換えＤＮＡ技術における技術的な困難をもたらす。したがって、改善された発現が必要となり得る多くの場合が存在する。アンチセンスに関与する実験においては、商業上の成果を達成するためには可能な限り最も高い発現が必要となることがある。したがって、適切な条件下において所定の遺伝子の発現を高める利用可能なＤＮＡ構築体を得ることは有利である。
【０００３】
転写を活性化する配列はエンハンサーと呼ばれ（Simpsonら、Nature（1986）323,551-554）、エンハンサーとして活性である配列がＣａＭＶの35Ｓプロモーターから得られている（米国特許第5,164,316号）。このエンハンサー領域を有する35Ｓプロモーターは多くの植物において活性であり、このプロモーターは構成的で、多くの組織において作用するものとして説明されている。しかしながら、植物遺伝子についてエンハンサー領域が示唆されているものの、植物プロモーターの一部が幾つかの異なる器官及び異なる種においてエンハンサー活性を有し得ることは従来認識されていない。例えば、エンドウマメ(pea)ＲｂｃＳ遺伝子の−352〜2領域を細菌のnosプロモーターに接合すると、光合成組織において強い光誘発性発現が得られた。この要素をコード配列の下流に配置する類似の実験では、タバコでの発現を引き出さなかった（Fluhrら、，Science（1986）232，1106-1111）。
【０００４】
エンドウマメＰｅｔＥ遺伝子がLast，D.I.及びGray，J.C.によって単離された［Plant Molecular Biology（1989）12，655-666］。この遺伝子は、光合成電子伝達に関与する10ｋＤａの銅タンパク質であるプラストシアニンをコードする。したがって、この遺伝子の発現は葉及び茎のような器官、葉緑体を有する細胞において必要である。この遺伝子のプロモーター領域を用いる欠失研究により、このプロモーターが葉、茎及び花では活性であるが根では活性ではなく、−784〜992の上流の要素が葉における発現を抑制することが示唆された。この領域を除去することにより非常に‘強力な’プロモーターがもたらされた（Pwee，K-H．and Gray，J.C．The Plant Journal（1993）3 437-449）。
【０００５】
本発明は、エンドウマメの緑色光合成組織において発現する遺伝子が、非光合成組織を含む他の種及び他の組織において活性のエンハンサー領域を有するという驚くべき発見に基づくものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、エンハンサーとして活性であり、かつ緑色組織において発現されるプロモーターの発現を増大させるＤＮＡ配列を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、エンハンサーとして活性であり、かつ植物の根、塊茎、茎、葉、花又は種子の１以上において発現する任意のプロモーターの発現を増大させるＤＮＡ配列を提供することにある。
また、該配列が得られた植物以外の植物における遺伝子の発現を高める方法を提供することも本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法であって、エンハンサーを用いて１以上の遺伝子のプロモーターの活性を高めることにより植物の１以上の器官における１以上の遺伝子の発現を増大させ、該エンハンサーはＡ及びＴ塩基に富むヌクレオチド配列であり、その含有するＡ及びＴ塩基の総量は該ヌクレオチド配列の50％を上回るエンハンサーである方法を提供する。
【０００８】
本明細書中で用いられる場合、発現の増大とは、本発明のエンハンサーと共に用いた場合の遺伝子の発現が、本発明のエンハンサーを用いずにその遺伝子の発現において見られるであろうものよりも大きいことを意味する。
【０００９】
都合の良いことには、エンハンサーは植物の遺伝子から得られるか、又は合成により産生される。エンハンサーは植物遺伝子の相同体であっても、合成により産生された配列の相同体であってもよい。
【００１０】
都合の良いことには、エンハンサーはエンドウマメにおいて発現する遺伝子から得られる。より都合の良いことには、この遺伝子はエンドウマメの緑色光合成組織、特にはエンドウマメ植物体の葉において発現する。
【００１１】
好ましくは、植物の１以上の器官に組み込まれる遺伝子の高められた発現は、そのエンハンサーが得られた植物とは異なる植物におけるものである。この相違は植物の型、すなわち系統群(family)の相違であっても、又は同じ植物系統群の別の植物であってもよい。
【００１２】
本発明は、遺伝子プロモーターのためのエンハンサーであって、該エンハンサーはＡ及びＴ塩基に富むヌクレオチド配列であり、その含有するＡ及びＴ塩基の総量がこのヌクレオチド配列の50％を上回るエンハンサーを提供する。
【００１３】
このエンハンサー配列は単離及び／又は精製されたされた配列が適切であり得る。
【００１４】
好ましくは、この配列は少なくとも20％のＡ塩基及び少なくとも20％のＴ塩基を含む。好ましくは、この配列は少なくとも25％、より好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも35％のＡ及びＴ塩基をそれぞれ含む。Ａ又はＴ塩基の一方は、この配列の40、45％もしくは50％、又はそれを上回って存在していてもよい。この配列はＡ及びＴ塩基のみを含んでいてもよい。
【００１５】
このエンハンサーは、本明細書の図面の図１の単離及び／又は精製された配列、配列番号1、又はそれらに類似する配列であることが有利である。
【００１６】
このエンハンサーは、配列番号１の単離及び／又は精製されたサブ配列又はそれらに類似する配列であって、そのサブ配列がエンハンサーとして活性であることがより有利である。
【００１７】
好ましくは、このエンハンサーのサブ配列は本明細書において配列番号２として記述され、かつ知られる配列番号１の31bp領域、又はそれらに類似する任意の配列である。また、このエンハンサーは、好ましくは、以下の塩基対配列：−444〜389、−388〜284、−283〜179、−444〜284、−388〜179又は必要とされるエンハンサー活性を有する類似の任意の配列のいずれか１つもしくはそれ以上であってもよい。
【００１８】
このエンハンサーは、本明細書の図面の図８の単離及び／又は精製された配列、配列番号3、又はそれらに類似する配列であることが有利である。
【００１９】
類似配列は相同体としても知られ得る。本明細書中で用いられる場合、相同体という用語は、別のヌクレオチド配列と同一であるか又はそれに類似するヌクレオチド配列を有する核酸を意味する。その類似性は、そのヌクレオチド配列が本発明によるエンハンサーとして作用可能となるのに十分なものでなければならない。
【００２０】
このエンハンサーは、配列番号３の精製されたサブ配列又はそれらに類似する配列であって、そのサブ配列がエンハンサーとして活性であることがより有利である。
【００２１】
好ましくは、遺伝子プロモーターは植物における遺伝子プロモーターである。好ましくは、このエンハンサーの配列又はサブ配列は、植物の緑色又は非緑色組織、特にはそのような植物の根、塊茎、種子、茎、花又は葉において遺伝子の発現を増大させる。
【００２２】
都合の良いことには、このエンハンサーは、そのエンハンサーが得られる植物以外の植物における遺伝子の発現を増大させる。
【００２３】
都合の良いことには、このエンハンサーは複数のエンハンサーを含んでいてもよい。このエンハンサーは、正常又は逆方向の両者において適切に作動し得る。また、このエンハンサーは、発現させようとする遺伝子のプロモーター又はターミネーターのいずれかに作動可能に結合させ得ることが適切である。
【００２４】
また、本発明は、本発明によるエンハンサー、遺伝子プロモーター、コード配列もしくは非コード配列及びターミネーター配列を含むキメラ遺伝子も提供する。
【００２５】
ここで用いられる場合、キメラ遺伝子という用語は、１種を上回る生物からの配列を有する組換えＤＮＡ分子を意味する。
【００２６】
前記キメラ遺伝子は１種を上回るエンハンサー及び１種を上回るプロモーターを有していてもよい。
【００２７】
エンハンサーは、このキメラ遺伝子に含まれる場合、正常の方向であっても逆方向であってもよい。
【００２８】
キメラ遺伝子は、レポーター配列又は識別可能な特徴を形質転換された植物に付与する他の任意の配列を含むことが可能である。
【００２９】
さらに、本発明は、形質転換された植物であって、本発明の方法によって形質転換されていてもよく、本発明による１以上のエンハンサーを用いることによりその形質転換された植物中の１以上の遺伝子の発現が増大している形質転換された植物を提供する。
【００３０】
この形質転換された植物は、双子葉植物種、例えばジャガイモ、タバコ、綿、レタス、メロン、カボチャ、キュウリ、エンドウマメ、セイヨウアブラナ、大豆、甜菜もしくはヒマワリ、又は単子葉植物種、例えばコムギ、オオムギ、ライムギ、コメもしくはトウモロコシであり得る。このような穀物に適切な代替形質転換系は熟練した読者には公知であり、ここで説明する必要はないであろう。
【００３１】
また、本発明は、本発明によるエンハンサーを用いて形質転換された植物の珠芽も提供する。
【００３２】
また、本発明は、本明細書の方法又はそのエンハンサーの結果として発現が増大している遺伝子を有する細胞も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明を容易に理解し、かつ容易に実施することができるように、例として、本明細書の図面を参照する。
【実施例】
【００３４】
実施例１ 
本明細書において配列番号１（図６を参照）として認められる配列を、エンドウマメの葉から、Last，D.I.及びGray，J.C.によって記載される方法［Plant Molecular Biology（1989）12，655-666］で単離した。この配列を、図１に示すように、ＧＵＳレポーターコード配列及びnosターミネーターに融合させたＰｅｔＥプロモーターの−175〜＋4の区画に正常方向又は逆方向のいずれかで接合した。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ベクターｐＢＩＮ19（Jefferson，R.A．ら、ＥＭＢＯ J，6，3901-3907）中で得られたキメラ遺伝子をタバコ植物体（ニコチアナ・タバクム cv.サムスン（Nicotiana tobacum cv.Samsun））の形質転換に用いた。図１は４種類の異なる構築体についての結果を図的に示す。各々の構築体について、幾つかの独立した形質転換系を分析した。表１は各系について得られたＧＵＳの比活性の実際の値を示す。予想通り、ＰｅｔＥプロモーターは葉においてのみ発現し、根においては発現しない。それにも関わらず、活性の数値は、このプロモーターの−179〜444の上流領域がいずれの方向でも、すなわち正常方向又は逆方向でも発現を高めるという驚くべき結果を示す。
これらの植物の生産方法を以下に詳述するが、当業者によって認識されるように、これらの、又は他の植物の他の生産及びアッセイも等しく適切である。
【００３５】
トランスジェニック植物 
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターに結合するエンハンサー及びＰｅｔＥプロモーターを有する組換え融合構築体を、Shen，W.J.及びForde，B.J.による電気穿孔法［Nucleic acid research（1989）17，8385］を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ4404（Ooms，G;Hooykaas，P.J.J;Van Veen R.J.M;Van Beelen，P;Regensburg，T.J.G;Schilpoort R.A.（1982a）Octopine Ti-plasmid deletion mutants of Agrobacterium tumefaciens with emphasis on the right side of the T region．Plasmid7，15-29）に集め、形質転換したアグロバクテリウム細胞を用いて、Horsch，R.B.、Fry，J.E.、Hoffman，N.L.、Eichholtz，D.、Rogers，S.G.及びFraley，R.T．1985［A simple and general method for transferring genes into plants．Science，22，1229-1231］に従ってタバコの葉のディスクに感染させた。個々のカナマイシン耐性再生苗条(shoots)をカルス形成葉ディスクから切り離し、成長調節因子を含まない培地に根付かせた。根付いたトランスジェニック植物を100μｇ ｍｌ-1カナマイシン及び200μｇ ｍｌ-1カルベニシリンを含む培地における組織培養で維持し、7−8週間毎に継代培養した。ＧＵＳアッセイにおいて用いる材料を、苗条の尖端にかなり近い幼若健常増殖葉（25−35ｍｍ長）から収穫した。根は使用前に蒸留水で丁寧に洗浄した。
【００３６】
蛍光測定ＧＵＳアッセイ 
ＧＵＳ酵素アッセイを、本質的にJeffersonら、1987，EMBO J，6，3901-3907に従って行った。500μｌのＧＵＳ溶解バッファー（50ｍＭ ＮａＰi、ｐＨ7.0、10ＭＭ ＥＤＴＡ、0.1％トリトンＸ−100、0.1％ラウリルサルコシンナトリウム、10ｍＭ 2−メルカプトエタノール）中の10−40ｍｇの植物組織から抽出物を作製し、5−50μｌの抽出物を１ｍＭの4−メチルウンベリフェリルグルクロニドを含むアッセイの各々において用いた。ＬＳ50蛍光分光光度計（Perkin Elmer、Connecticut、ＵＳＡ）を用いて蛍光を測定した。Bradford（1976）のミクロアッセイを用いてタンパク質を決定した。
【００３７】
〔表１〕
配列番号１をＰｅｔＥ最小−175／＋4プロモーター、ＧＵＳレポーター、nosターミネーターの上流に両方向で有する構築体で形質転換した組織培養タバコ植物体の葉及び根抽出物に由来するＧＵＳの比活性。
ＧＵＳの比活性 
（ピコモルＭＵ／分／タンパク質μｇ）
構築体40
対照としてのＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター、nosターミネーター
2008253266.tif 000003
構築体38正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター、nosターミネーターの上流の配列番号１
2008253266.tif 000004
構築体39
逆方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター、nosターミネーターの上流の配列番号１
2008253266.tif 000005
ＭＵ＝4メチルウンベリフェロン
【００３８】
実施例２ 
さらなる実験において、配列番号１全体を用いる代わりに、配列番号１の31bp(−289〜259)領域を用いた。この配列を、図７に示される配列番号２をもたらすように修飾した。
構築体110においては、１コピーの配列番号２をＰｅｔＥ−175／＋4プロモーターの上流に結合させた。このプロモーターは、図２に示されるように、ＧＵＳレポーターコード配列及びnosターミネーターに結合している。構築体108においては、３コピーの配列番号２を−175〜＋4のＰｅｔＥプロモーターに結合させた。図２の集団についてタバコ植物体の形質転換及び再生の後に得られた結果を示す。これらは、１を上回るコピー数の配列番号２の領域がプロモーターの発現を増大させることを示す。表２は各系について得られたＧＵＳ比活性の実際の値を示す。実施例１において用いられ、図２に示されるものと同じ対照を用いた。  
【００３９】
〔表２〕
タンパク質結合について高い親和性を示すエンドウマメ・プラストシアニンプロモーターからの１コピーの31bp断片及び３コピーの31bp断片を有する構築体で形質転換したトランスジェニックタバコ植物体の葉の抽出物からのＧＵＳの比活性。
ＧＵＳの比活性
（ピコモルＭＵ／分／タンパク質μｇ）
構築体110
正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosプロモーターの上流の
31bpオリゴヌクレオチド
2008253266.tif 000006
構築体108
正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の
３コピーの31bpオリゴヌクレオチド
2008253266.tif 000007
【００４０】
実施例３ 
エンハンサー領域配列番号１が他のプロモーターに対して類似の効果を有しているかどうかを確かめるため、配列番号１を「最小」35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーターに正常方向及び逆方向に結合させ、この最小ＣａＭＶプロモーターを用いて調製したキメラ遺伝子のターミネーター領域にも正常方向及び逆方向に結合させた。実施例１に記載されるようにしてタバコを形質転換し、アッセイを行なった。図３は、これらの構築体で得られた集団の平均値を示す。表３は、各系についての、（図３に示される）葉及び根両方についての値を示す。ＰｅｔＥ遺伝子のエンハンサーとして識別される領域は異種ＣａＭＶプロモーターに対するエンハンサーとして作用し、該領域がそのプロモーターの上流に存在しようと、下流に存在しようと、両方向で活性である。このエンハンサーは根及び葉において発現するプロモーターに関して活性であり、したがって、組織特異的ではない。
【００４１】
〔表３〕
最小35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーター、ＧＵＳレポーター、nosターミネーター及びエンハンサー配列を有する構築体で形質転換したトランスジェニックタバコ植物体の根及び葉の抽出物に由来するＧＵＳの比活性。
ＧＵＳの比活性 
（ピコモルＭＵ／分／タンパク質μｇ）
構築体33
対照としての35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーター
2008253266.tif 000008
構築体34
正常方向の、35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の配列番号１
2008253266.tif 000009
構築体35
逆方向の、35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の配列番号１
2008253266.tif 000010
構築体36
正常方向の、35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの下流の配列番号１
2008253266.tif 000011
構築体37
逆方向の、35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの下流の配列番号１
2008253266.tif 000012
【００４２】
実施例４ 
配列番号１の、配列番号２以外の領域がエンハンサー様の活性を有しているかどうかを確かめるため、図４に示されるように５種類のさらなるキメラ遺伝子を構築した。これらの構築体は、配列番号２の上流及び下流の両者に存在する配列番号１の領域を用いた。実施例１に記載されるようにしてトランスジェニックタバコ植物体を得た。これらの構築体を有するトランスジェニック植物の分析は、選択された配列番号１のサブ領域の全てがエンハンサー様の活性を有することを示し、表４は配列番号１によって示される活性の全てが配列番号２によってもたらされるわけではないことを示す。
【００４３】
〔表４〕
配列番号１の断片を含む構築体で形質転換したトランスジェニックタバコ植物体の葉の抽出物に由来するＧＵＳの比活性。
ＧＵＳの比活性 
（ピコモルＭＵ／分／タンパク質μｇ）
構築体74
正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の、
エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターからの
−444〜389の断片
2008253266.tif 000013
構築体83
正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の、
エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターか
らの−388〜284の断片
2008253266.tif 000014
構築体90
正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の、
エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターか
らの−283〜179の断片
2008253266.tif 000015
構築体105
正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の、
エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターか
らの−444〜284の断片
2008253266.tif 000016
構築体111
正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の、
エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターか
らの−388〜179の断片
2008253266.tif 000017
【００４４】
実施例５ 
エンハンサー領域が他の種において活性であるかどうかを確かめるため、−179〜444の領域を、Mignery，G.A.；Pikaard，C.S．and Park，W.D．1988［Molecular characterisation of the patatin multigene family of potato．Gene，62，27-44］に記述されるパタチンプロモーターPS20の−330〜＋１の領域に結合した。生成したキメラ遺伝子を形質転換によりジャガイモに導入した。  
【００４５】
植物材料 
ジャガイモ苗条培養物を、in vitroにおいて、ムラシゲ及びスクーグ（Murashige and Skoog）（ＭＳ）培地で、マジェンタ（Magenta）ＧＡ−7容器中、22oCで維持した（16時間／8時間 明／暗）。これらを３週間毎に節ごとに継代培養した。
2−3インチ（5−7.5ｃｍ）の高さのin vitro苗条をレビントンズ（Levingtons）Ｆ1コンボストの2.5インチ（6.4ｃｍ）の鉢に植えた。これらを、増殖器（propagator）中で１週間、成長室において18oCで引き離した（16時間／8時間 明／暗）。増殖器を取り除き、３週間で植物を５インチ（12.7ｃｍ）の鉢に再度植えた。5−7週間で、これらの植物を形質転換に用いた。
【００４６】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス 
適切な株、例えば、ＬＢＡ4404、Ｃ58＃3の液体一晩培養物を、28oCで、Ｌ−ブロスにおいて、0.8のＯＤ600（ファルマシア（Pharmacia）ＬＫＢ ＵＬＴＲＡＳＰＥＣ II）まで成長させた（下記参照）。
【００４７】
同時培養 
最も若い、４枚の最も広がった葉を採取し、表面を10％市販漂白剤（ドメストス（Domestos）ＲＴＭ）で15分間滅菌した。葉を無菌水でよくすすいだ後、7ｍｍコルクボーダーを用いてディスク状に切断した。これらのディスクをアグロバクテリウムと1−5分間混合し、濾紙（ワットマン（Whatman）Ｎｏ.1）で水気をとって乾燥させた後、90ｍｍの三穴ペトリ皿（triple vented petri dish）内のカルス形成培地（下記参照）上に下表皮を下にして置いた。これらの90ｍｍ三穴ペトリ皿をテープで密封し、切断して気体の交換を可能にした後、22oCでインキュベートした（16時間／8時間 明／暗）。48時間後、500μｇ ｍｌ-1のクラホラン及び30μｇ ｍｌ-1のカナマイシンを加えたカルス形成培地にディスクを植え継いだ(transfer)。これにより細菌が取り除かれ、形質転換細胞が選択される。
【００４８】
形質転換苗条の再生 
１週間後、同じ抗生物質を含む苗条形成培地にディスクを植え継いだ。
2008253266.tif 000018
【００４９】
苗条を採取できるまで（通常、約４週間）同じ培地上でさらに植え継ぎを行った。カルスを伴う苗条を、十分に換気された容器、例えばマジェンタ内のクラホラン（500μｇ／ｍｌ）を含むＭＳ培地に植え継いだ。セホタキシムと共に数世代継代して細菌を除去した後、形質転換体をＭＳ培地に維持した。これらをin vitroから取り除き、引き離して、植物材料について上述される成熟度まで成長させた。このプロセスにより、同時培養したディスクの30％までの頻度で形質転換ジャガイモ植物体を得た。
【００５０】
アンシミドール（180μｇ／ｍｌ）の存在下においてこれらの植物体から生じた微小塊茎を、実施例１に説明されるようにＧＵＳの活性についてアッセイを行なった。図５はその結果を示すもので、いずれの方向のエンハンサー配列もパタチンプロモーターの活性を高めることを示しており、表５は遺伝子が微小塊茎では発現するが、葉では発現しないことを示す。
【００５１】
〔表５〕
最小パタチンプロモーター及び完全長ＰＳ20パタチンプロモーターと比較した、−330〜＋１のパタチンクラス１プロモーターの上流の配列番号１を有するトランスジェニックジャガイモ植物体に誘発された微小塊茎に由来するＧＵＳの比活性。
比ＧＵＳ活性 
（ピコモルＭＵ／分／タンパク質μｇ）
構築体p250
2562bpパタチンプロモーター、ＧＵＳレポーター
及びnosターミネーター
2008253266.tif 000019
構築体116
330／＋1bp最小パタチンプロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーター
2008253266.tif 000020
構築体112
正常方向の、最小パタチン−330／＋1プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の、
エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターからの
−444〜179の断片
2008253266.tif 000021
構築体114
逆方向の、最小パタチン−330／＋1プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の、
エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターの
−444〜179の断片
2008253266.tif 000022
【００５２】
実施例６ 
ここで配列番号３として認められる配列（図８を参照）は硬貨を投げて(coin flipping)設計し、いかなるＧ／Ｃ bpの介在もなく多量体化できるように5’末端にＥｃｏＲＩ突出部を有する２つの相補的オリゴヌクレオチド（5’AAT TAT AAT ATA ATT TTA ATT TAA AA3’）及び（5’AAT TTT TTA AAT TAA AAT TAT ATT AT 3’）から構築した。オリゴヌクレオチドをアニールしてリン酸化し、鎖状体をｐＩＣ19Ｈ（Marshら、1984）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。配列決定により、それぞれこのオリゴヌクレオチドの4、２及び１コピーのインサートを含む３種類のプラスミドを同定した。インサートをHindIII-SalI断片として切り出し、ここでｐＪＳＳ22として認められるｐＫＨｄ7（Pwee，K-H and Gray，J.C.（1993）The Plant Journal）に挿入して、それぞれ2、１及び４コピーを含むｐＪＳＳ139、ｐＪＳＳ140及びｐＪＳＳ141を得た。
【００５３】
得られたキメラ遺伝子をアグロバクテリウム・ツメファシエンスベクターｐＢＩＮ19中で用いて、上述の方法に従ってタバコ植物体（ニコチアナ・タバクム cv．サムスン）を形質転換した。図９は、５種類の異なる構築体についての結果を図示する。各々の構築体について、幾つかの独立した形質転換系統を分析した。表６は、各系列について得られたＧＵＳの比活性の実際の値を示す。予想通り、ＰｅｔＥプロモーターは葉において発現したが、複数の配列番号３が用量に関連して発現を高めるという驚くべき結果も示される。
【００５４】
〔表６〕
ｐｅｔＥ最小−175／＋4プロモーター、ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流にあるＥｃｏＲＩ部位に１コピーの26merオリゴヌクレオチドを有する構築体で形質転換されたトランスジェニックタバコ植物体の葉の抽出物に由来する比ＧＵＳ活性。
2008253266.tif 000023
【００５５】
実施例７ 
配列番号１が他のプロモーターに関して活性であることをさらに確かめるため、本明細書においてＰｓＭＴA(Marta Evans，I.，ら、ＦＥＢＳ 262（1）29-32)として認められるエンドウマメメタロチオネインプロモーターを得た。このプロモーターの−806〜１の領域を、イントロン（Vancanneyt，G．ら、(1990)Mol.Gen.Genet 220 245-250）及びnosターミネーターを有するＧＵＳコード領域にライゲートし、それにより構築体ｐＫＳ 21040を得た（図10を参照）。配列番号１をこのキメラ遺伝子の5’末端に、正常方向又は逆方向のいずれかで結合した。このエンハンサー−プロモーター−ＧＵＳ−nosターミネーター融合体を図10に示されるバイナリーベクターｐＡＴＣ（改変制限部位を有するｐＢＩＮ19誘導体）に導入した。これにより構築体ｐＡＴＣ25040及びｐＡＴＣ26040がそれぞれ得られ（図11を参照）、これらを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスＲ1000でニコチアナ・タバクム cv ヘビー・ウェスタン（Nicotiana tabacum cv Heavy Western）タバコを形質転換して毛状根を生成させた。
【００５６】
毛状根の形質転換： 
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＲ1000（McAfee，Bら、Plant Cell Tissue and Organ Culture（1993）34，53.62）を電気穿孔法（Shen，W.J．and Forde，B.J．Nucleic acid research（1989）17，8385）を形質転換し、得られた細菌を葉ディスク法（Horsch，R.B.;Fry，E.J.;Hoffinan，N.L.;Eichholtz，D;Rogers，S.G:Fraley，R.T．Science（1985）22，1229-1231）によるニコチアナ・タバクムの形質転換に用いた。カナマイシンに対して耐性である根をディスクから切り離し、100μｇ／ｍｌカナマイシン及び500μｇ／ｍｌクラホランを含む組織培養培地に移した。根をこの培地に維持し、３週間毎に継代培養した。その後、根を100μｇ／ｍｌカナマイシン及び200μｇ／ｍｌクラホランを含む培地に植え継いだ。さらに７日後、これらの根をクラホラン(claforan)を含まない培地に植え継ぎ、毎週継代培養した。
【００５７】
実施例８ 
合成オリゴマー（配列番号３）のモノマー、ダイマー及びテトラマーを、ｐＩＣ19Ｈ（Marshら、(1984)Gene 32，481-485）のＥｃｏＲＩ部位にライゲートすることができるようにＥｃｏＲＩ突出部を含めて合成した。得られたプラスミドからXhoI-SalI断片を切り出し、ｐＫＳ21040の対応部位にライゲートした。この合成オリゴマープロモーター−ＧＵＳ−nosターミネーター融合体をバイナリーベクターｐＡＴＣに導入した。得られた構築体ｐＡＴＣ27040、ｐＡＴＣ28040及びｐＡＴＣ29040（図11を参照）をニコチアナ・タバクム cv ヘビー・ウェスタンの形質転換に用いて毛状根を生成させた。
【００５８】
参考文献
Bradford，M.M.、（1976）タンパク質二結合(di−binding)の原理を用いる、マイクログラム量のタンパク質を定量するための迅速かつ高感度の方法。Analytical Biochemistry 72、248。
Fluhr，R.、Kuhlmeier，C.、Nagy，F．及びChua，N.H.（1986）植物遺伝子の器官特異的及び光誘発性発現。Science 232、1106−1111。
Horsh，R.B.、Fly，J.E.、Hoffmann，N.L.、Eichholtz，D.、Rogers，S.G及びFraley，R.T.（1985）植物に遺伝子を導入するための簡潔かつ一般的な方法。Science、22、1229−1231。
Jefferson，R.A.、Kavanagh，T.A.、及びBevan，M.W.（1987）［ＧＵＳ融合体：高等植物における高感度かつ可変性(versatile)の遺伝子融合マーカーとしてのβ−グルクロニダーゼ。European Molecular Biology Organisation J.6、3901−3907］Last，D.I．及びGray，J.C.（1989）エンドウマメハプロイドにおいて、プラストシアニンは１コピーの遺伝子によってコードされる。Plant Molecular Biology 12、655−666。
Marsh，J.L.、Erfle，M.、Wykes，E.J.（1984）挿入性不活性化(insertional inactivation)による組換え体選別のための可変性クローン化部位を有するｐＩＣプラスミド及びファージベクター。Gene 32、482−485。
Marta Evans，I.、Gatehouse，L.N.、Gatehouse，J.A.、Robinson，N.J及びCroy，R.R.D.（1990）メタロチオネイン遺伝子に対する相同性を有する、エンドウマメ（ピスム・サチブムＬ（Pisum sativum L））からの遺伝子。Federation of European Biochemical Sciences、262(1)29−32
McAfee，B.、White，E.、Pelcher，L.及びLapp，M.（1993）アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いるマツ(pine)（ピヌス（Pinus））及びカラマツ(larch)（ラリックス（Larix））種における根の誘導。Plant Cell Tissue and Organ Culture 34、53−62。
Mignery，G.A.;Pikaard，C.S及びPark，W.D.（1988）ジャガイモのパタチン多重遺伝子族の分子的特徴付け。Gene、62、27−44。
Ooms，G；Hooykaas，R.J.J.;Van Veen R.J.M；Van Beelen，P；Regensburg，T.J.G；Schilpoort R.A.（1982a）Ｔ領域の右側が強調された、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトパイン(Octopine)Ｔｉ−プラスミド欠失変異体。Plasmid 7、15−29。
Pwee，K-H.及びGray，J.C.（1993）エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターは、トランスジェニックタバコ植物体において細胞特異性は誘発するが、完全な光調節発現は誘発しない。The Plant Journal 3、437−449
Shen，W.J.及びForde，B.J.（1989）高電圧によるアグロバクテリウム種の効率的な形質転換。Nucleic acid research 17、8385。
Simpson，J.、Schell，J.、Van Montagu，M.及びHerrera-Estrella，L.（1986）光誘発性及び組織特異的エンドウマメlhcp遺伝子の発現はエンハンサー及びサイレンサー様の特性を併せ持つ上流要素に関与する。Nature 323、551−554。
Vancanneyt，G.、Schmidt，R.、O'Connor-Sanchez，A.、Willmitzer，L.及びRochsa-Sosa，M.（1990）イントロン含有マーカー遺伝子の構築：トランスジェニック植物におけるイントロンのスプライシング及びアグロバクテリウム媒介植物形質転換における初期現象のモニタリングでのそれらの使用。Mol．Gen．Genet．220、245−250。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】最小ＰｅｔＥプロモーター、ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターに対して正常方向及び逆方向で融合させた場合の、トランスジェニックタバコ植物体の葉においてエンハンサーとして挙動する、配列番号１の棒グラフの形態にあるＧＵＳの比活性を示す。
【図２】最小ＰｅｔＥプロモーター、ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターに融合させた場合の、トランスジェニックタバコ植物体の葉においてエンハンサーとして挙動する、単一及び複数コピーの、配列番号２の棒グラフの形態にあるＧＵＳの比活性を示す。
【図３】最小35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーター、ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流又は下流に正常方向及び逆方向で融合させた場合の、トランスジェニックタバコ植物体の根においてエンハンサーとして挙動する、配列番号１の棒グラフの形態にあるＧＵＳの比活性を示す。
【図４】最小ＰｅｔＥプロモーター、ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターに融合させた場合の、トランスジェニックタバコ植物体の葉においてエンハンサーとして挙動する、正常方向の配列番号１のサブ配列の棒グラフの形態にあるＧＵＳの比活性を示す。
【図５】最小もしくは完全長パタチン(patatin)プロモーター、ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターに対して正常方向及び逆方向で融合させた場合の、トランスジェニックジャガイモ植物体の微小塊茎においてエンハンサーとして挙動する、配列番号１の棒グラフの形態にあるＧＵＳの比活性を示す。
【図６】本明細書において配列番号１としても認められる、エンドウマメ・プラストシアニンプロモーター（−444〜179）配列のコード配列を示す。
【図７】配列番号２としても認められる、図６のエンドウマメ・プラストシアニンプロモーターのサブ配列のコード配列を示す。
【図８】エンハンサーとして活性であり、かつ本明細書において配列番号３として認められるヌクレオチド配列を示す。
【図９】最小ＰｅｔＥプロモーター、ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターに融合させた場合の、トランスジェニックタバコ植物体の葉においてエンハンサーとして挙動する、配列番号３の棒グラフの形態にあるＧＵＳの比活性を示す。
【図１０】構築体ｐＡＴＣを示す。
【図１１】構築体ｐＫＳ 21040、ｐＡＴＣ 25040、ｐＡＴＣ 26040、ｐＡＴＣ 27040、ｐＡＴＣ28040及びｐＡＴＣ 29040を示す。
【図１】
2008253266.tif 000024
【図２】
2008253266.tif 000025
【図３】
2008253266.tif 000026
【図４】
2008253266.tif 000027
【図５】
2008253266.tif 000028
【図６】
2008253266.tif 000029
【図７】
2008253266.tif 000030
【図８】
2008253266.tif 000031
【図９】
2008253266.tif 000032
【図１０】
2008253266.tif 000033
【図１１】
2008253266.tif 000034
【配列表】
2008253266000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月16日(2008.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
遺伝子プロモーターの発現を増大させるエンハンサーであって、該エンハンサーはＡ及びＴ塩基に富むヌクレオチド配列であり、その含有するＡ及びＴ塩基の総量は該ヌクレオチド配列の50％を上回り、該エンハンサーは本明細書の図面の図６の配列番号１からのヌクレオチド塩基対配列である−444〜389、−388〜284、−283〜179、−444〜284、本明細書の図面の図８の配列番号３又は上記配列のいずれか１つのエンハンサーとして作用可能となる類似性を有する任意の類似の配列からなる群の１以上から選択される単離された配列であり、さらに該エンハンサーは、自然発生するエンドウマメ・プラストシアニン遺伝子の５’非翻訳領域の該エンハンサーの隣に位置するヌクレオチド配列に結合していないエンハンサー。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
遺伝子プロモータ一の発現を増大させる方法であって、エンハンサーを用いて１以上の遺伝子のプロモーターの活性を高めることにより植物の１以上の器官における１以上の遺伝子の発現を増大させる方法であり、該エンハンサーはＡ及びＴ塩基に富むヌクレオチド配列であり、その含有するＡ及びＴ塩基の総量は該ヌクレオチド配列の50％を上回り、該エンハンサーは本明細書の図面の図６の配列番号１からのヌクレオチド塩基対配列である−444〜389、−388〜284、−283〜179、−444〜284、本明細書の図面の図８の配列番号３又は上記配列のいずれか１つのエンハンサーとして作用可能となる類似性を有する任意の類似の配列からなる群の１以上から選択される単離された配列であり、さらに該エンハンサーは、自然発生するエンドウマメ・プラストシアニン遺伝子の５’非翻訳領域の該エンハンサーの隣に位置するヌクレオチド配列に結合していないエンハンサーである方法。