(57)【要約】【課題】ガンのようなBcl-2関連疾患の処置に、詳細には、嚢胞性リンパ腫（FL）の処置における使用のための新規組成物および方法を提供すること。リポソームアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによるBcl-2タンパク質発現を阻害すること。【解決手段】細胞内条件下で第２のＢｃｌ−２をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチド、および該第１のポリヌクレオチドと会合される中性脂質を含む、組成物であって、ここで該組成物がカチオン性脂質を含まない、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載されるリポソームアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによるBcl-2タンパク質発現の阻害のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ａ．発明の分野
本発明は、ガン治療、特に、Ｂｃｌ−２疾患の処置の分野に関する。より詳細には、これらの処置は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドおよびそのリポソーム処方物の使用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｂ．関連技術
Ｂｃｌ−２は、白血病およびリンパ腫の両方の血液学的悪性疾患（嚢胞性および非嚢胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病、および形質細胞異形成を含む）（Ｃａｍｐｏｓら，Ｂｌｏｏｄ，  ８４：５９５，１９９４）；固体腫瘍（例えば、乳ガン、前立腺ガン、および結腸ガンと関連する腫瘍）；ならびに免疫障害のような種々の疾患に関連している。１つの特定のＢｃｌ−２関連疾患は、嚢胞性非ホジキンリンパ腫（ＦＬ）である。ＦＬは、ヨーロッパおよび米国で最も一般的なリンパ様悪性疾患である。代表的には、小さな休止Ｂ細胞の蓄積からなる無痛性の低級疾患（ｌｏｗ  ｇｒａｄｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）である。化学療法に対する応答は最初は良好であるが、再発は、より攻撃的な組織学的タイプへの形質転換および薬物耐性の発生のため避けられない（Ａｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１３：２６５６，１９９５；Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１３：１４０，１９９５）。９０％以上のＦＬ患者では、染色体１８ｑ２１からのｂｃｌ−２遺伝子の、染色体１４ｑ３２３における免疫グロブリンＨ鎖遺伝子座との並列を生じる、ｔ（１４；１８）転座が見られる（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１３９０，１９８５；Ｇｒａｎｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８０：１５１２，１９８７）。結果として、ｂｃｌ−２遺伝子は免疫グロブリンＨ鎖エンハンサーの影響下にあり、そしてＢｃｌ−２タンパク質は過剰発現される（Ｂａｋｈｓｈｉら，Ｃｅｌｌ，４１：８９９，１９８５；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２：３，１９８７）。Ｂｃｌ−２腫瘍形成可能性は、生理学的死応答を妨害する能力に関連し、それによって細胞の寿命を増やす（Ｎｕｎｅｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：３６０２，１９９０）。Ｂｃｌ−２タンパク質は、増殖因子欠損、放射、熱ショック、ウイルス、およびほとんどの化学療法剤のようなアポトーシス刺激をブロックする（Ｒｅｅｄ，Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．，９：４５１，１９９５；Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：３３４，１９９０）。ｂｃｌ−２−Ｉｇ−トランスジェニックマウスでは、成熟Ｂリンパ球の拡張からなるポリクローナル嚢胞性リンパ増殖が、最初に観察される（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら，Ｃｅｌｌ，５７：７９，１９８９）。次に、モノクローナルの高程度の巨大免疫芽細胞タイプリンパ腫は、Ｃ−ＭＹＣの再編成を提示するその５０％が発生する。これは、第２の遺伝子改変が、悪性リンパ腫の発生および進行に必要であることを示唆する（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌおよびＫｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２５４，１９９１）。
【０００３】
近年、Ｂｃｌ−２関連タンパク質の拡張したファミリーが同定された。これには、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ＸＳ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｍｃｌ−１、Ａ−１、およびＤＮＡウイルス中のいくつかのオープンリーディングフレームが挙げられる（Ｏｌｔｖａｉら，Ｃｅｌｌ，７４：６０９，１９９３；Ｂｏｉｓｅら，Ｃｅｌｌ，７４：５９７，１９９３；Ｙａｎｇら，Ｃｅｌｌ，８０：２８５，１９９５；Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３７４：７３３，１９９５；Ｋｉｅｆｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３７４：７３６，１９９５；Ｋｏｚｏｐａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：３５１６，１９９３；Ｌｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：１９７９，１９９３；Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１６０：１５１，１９８７；Ｎｅｉｌａｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４３９１，１９９３）。タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーにおけるメンバーシップは、主として、メンバー間のダイマー化を調節することを助けるＢＨ１およびＢＨ２ドメイン内の相同性によって定義される（Ｓａｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９２３８，１９９４）。Ｂｃｌ−２と２１％アミノ酸同一性を共有するＢａｘは、Ｂｃｌ−２タンパク質に結合し、そして細胞死をブロックする能力を中和し得る。したがって、Ｂｃｌ−２対Ｂａｘの比は、アポトーシス刺激後の細胞の死への感受性を決定すると考えられる（Ｏｌｔｖａｉら，１９９３；Ｙｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：３２１，１９９４）。
【０００４】
Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの翻訳開始部位の特異的配列に相補的なホスホジエステルアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、Ｂｃｌ−２タンパク質の産生およびｔ（１４；１８）転座保有細胞の増殖を阻害し得る（Ｋｉｔａｄａら，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．，３：１５７，１９９３）。しかし、アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療的使用は、その低い細胞取り込みならびにヌクレアーゼおよび他の血清または細胞成分によるその迅速な分解によって妨げられている。ヌクレアーゼ分解に耐性であるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドよりも１０倍低い濃度でＦＬ細胞増殖を阻害することが見いだされた（Ｒｅｅｄら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５０：６５６５，１９９０ａ；Ｃｏｔｔｅｒら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９：３０４９，１９９４）。しかし、このアプローチは、オリゴヌクレオチドの低い細胞取り込みを被る。例えば、Ｒｅｅｄらは、６９７およびＳｕ−Ｄｈｌ−４細胞のようなＢ細胞リンパ腫に由来する細胞株の５０％増殖阻害を達成するために、ホスホロチオエートの２５μＭ以上の濃度を使用しなければならなかった。リポソーム組込みは、オリゴヌクレオチドの白血病細胞への取り込みを増強させた（Ａｋｈｔａｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：５５５１，１９９１；Ｔａｒｉら，Ｂｌｏｏｄ，８４：６０１，１９９４）。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達するためのＲｅｅｄらによるカチオン性脂質の使用は、０．０７５〜０．３μＭにオリゴヌクレオチド濃度を低下させ、そしてさらにＳｕ−Ｄｈｌ−４細胞における増殖阻害を誘導することを可能にした。
【０００５】
しかし、まだ、嚢胞性および非嚢胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、および形質細胞異形成を含む、白血病およびリンパ腫の両方の血液学的悪性疾患；固体腫瘍（例えば、乳ガン、前立腺ガン、および結腸ガンに関連する腫瘍）；ならびに免疫障害のようなＢｃｌ−２関連疾患の処置のための方法および組成物の大きな必要性がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、患者の細胞において特定の核酸を標的するために新規アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、嚢胞性および非嚢胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、および形質細胞異形成を含む、白血病およびリンパ腫の両方の血液学的悪性疾患；固体腫瘍（例えば、乳ガン、前立腺ガン、および結腸ガンに関連する腫瘍）；ならびに免疫障害のようなＢｃｌ−２関連疾患の処置のための改良された組成物および方法を提供することによって、先行技術の欠点を克服するように設計される。
【０００７】
したがって、１つの実施態様では、細胞内条件下でＢｃｌ−２をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。本明細書で定義されるような細胞内条件には、約１６０ｍＭの濃度の一価カチオン（１０ｍＭ  Ｎａ＋；１５０ｍＭ  Ｋ＋）および約２０ｍＭの二価カチオンの濃度（１８ｍＭ  Ｍｇ＋＋；２ｍＭ  Ｃａ＋＋）を含む。細胞内条件はまた、ハイブリダイゼーションの容量を減少させ、したがって核酸種の有効濃度を上昇させるために役立つ、約１５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を含み得る。
【０００８】
本発明のポリヌクレオチドは、約８〜５０塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチドは、天然で見られるようなホスホジエステルポリヌクレオチドであり得るか、あるいは好ましくは、誘導体化されたポリヌクレオチドまたはさらにポリヌクレオチドアナログであり得る。例示的ポリマーは、ｐ−エトキシまたはメチルホスホネートポリヌクレオチドである。使用され得る他のアナログとしては、Ｃ−５プロピンピリミジンポリヌクレオチド（Ｗａｇｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１５１０−１５１３，１９９３）、あるいは米国特許第５，１３８，０４５号またはヨーロッパ特許出願ＥＰ  ４３１，５２３に記載されるようなポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない（それぞれ参考として本明細書に援用される）。好ましいアナログは、ヌクレアーゼ耐性であり、高い融点を有し、（ＲＮＡに堅く結合し、）そして特定の実施態様では、好ましいポリヌクレオチドは、リポソームのような脂質組成物とのより効率的な会合に対して疎水性である。
【０００９】
さらなる実施態様では、ポリヌクレオチドは、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡに、および好ましくはＢｃｌ−２  ｍＲＮＡの翻訳開始部位にハイブリダイズする。しかし、本発明のアンチセンス分子が、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現をダウンレギュレートするために有効なｂｃｌ−２転写物の任意の領域にハイブリダイズし得ることが理解される。第１のオープンリーディングフレームを標的することに特定の利点があり、そして上述のように、転写開始部位が特に好ましい。ある特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列５’ＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴＣＣＴＴＣ３’（配列番号１）を有するオリゴヌクレオチドであり得る。
【００１０】
本発明のポリヌクレオチド調製物は、好ましくは、脂質と会合される。脂質と会合したポリヌクレオチドは、リポソームの水性内部にカプセル化され、リポソームの脂質二重層内に散在され、リポソームおよびポリヌクレオチドの両方と会合される連結分子を介してリポソームに付着され、脂質と複合体化され、脂質を含む溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質と合わされ、脂質中で懸濁液として含まれ、ミセルとともに含まれもしくは複合体化されるか、あるいは他の様式で脂質と会合されると記載される。
【００１１】
本明細書および請求の範囲で使用される場合、用語「脂質」とは、天然に存在するおよび合成の脂質またはリポソームの両方のいずれかの形態をいう。脂質は脂肪物質であり、そして当業者に周知である。本発明の脂質は、溶液中の任意の特定の構造に限定されない。例えば、これらは、ミセルのような二重層構造で、または「折り畳まれた（ｃｏｌｌａｐｓｅｄ）」構造を有して存在し得る。これらはまた、単に溶液中で散在され得、おそらくサイズまたは形状のいずれかにおいて均一でない凝集物を形成する。脂質は、好ましくは、正味の電荷で中性であり、そして有利には、脂質ジオレオイルホスファチジルコリンから構成され得るが、他のホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルエタノールアミンのような他の脂質も用いられ得る。
【００１２】
さらに他の実施態様では、Ｂｃｌ−２をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。
【００１３】
なおさらに別の実施態様では、Ｂｃｌ−２をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードする発現構築物を含む組成物が提供され、ここで、この第１のポリヌクレオチドは、真核生物細胞において活性であるプロモーターの制御下にある。
【００１４】
本発明はまた、Ｂｃｌ−２をコードする核酸にハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物とガン細胞とを接触させる工程を包含する、ガン細胞の増殖を阻害する方法を包含する。この方法は、以下で実施例に示すように、種々のガン細胞に対して有利に適用され得る。本発明の方法は、高レベルのｂｃｌ−２を過剰発現または発現しそしてまたＢａｘタンパク質を発現するガン細胞で、ならびに遺伝毒性傷害の際の核へのｐ５３の転座がｂｃｌ−２によって阻害される細胞で、有効であることが示される。このような細胞としては、嚢胞性および非嚢胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、および形質細胞異形成を含む、白血病およびリンパ腫の両方の血液学的悪性疾患；固体腫瘍（例えば、乳ガン、前立腺ガン、および結腸ガンに関連する腫瘍）；ならびに免疫障害が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、リポソーム中にカプセル化されたポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチドと会合される中性脂質を含み得る。特定の実施態様では、接触させる工程は、患者で、および特定の実施態様ではヒト患者で起こる。組成物は、有利には、用量当たり０．５０〜１０．０ｍｌの用量でまたはｍ２当たり５〜３０ｍｇポリヌクレオチドの量でヒト患者に送達され得る。特定の治療法では、組成物は、８週間にわたり１週当たり３回投与される。しかし、種々の投与量が、患者の特定の疾患、年齢、および状態、ならびに医師の決定に影響を及ぼし得る他の因子に基づいて、担当医によって決定されるように使用され得る。
【００１５】
本発明は、Ｂｃｌ−２関連疾患を処置するために用いられ得るアンチセンス技法に関する。１つの実施態様では、Ｂｃｌ−２をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと会合される中性脂質、そして好ましくはカチオン性脂質を排除するものを含む組成物を包含する。ポリヌクレオチドは、約８と約５０塩基との間の長さを有するオリゴヌクレオチドであり得る。しかし、他の長さのオリゴヌクレオチオも有用であり得る。ポリヌクレオチドはまた、Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの翻訳開始部位にハイブリダイズし得る。有用なポリヌクレオチドの例は、配列ＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴＣＣＴＴＣ（配列番号１）を有するオリゴヌクレオチドである。
【００１６】
本発明の組成物はまた、リポソームが脂質から形成される組成物を包含する。いくつかの場合では、ポリヌクレオチドがリポソーム中にカプセル化される組成物を有することが有用であり得る。本発明で特に有用である脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルエタノールアミンが挙げられ、１つの例は、脂質ジオレイルホスファチジルコリンであるが、任意の受容可能な中性脂質が使用され得る。
【００１７】
本発明の実施態様は、Ｂｃｌ−２をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードする発現構築物を含む組成物であり、ここでこのポリヌクレオチドは真核生物細胞で活性であるプロモーターの制御下にある。
【００１８】
他の実施態様は、Ｂｃｌ−２をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを得る工程、ポリヌクレオチド／脂質会合を形成するためにポリヌクレオチドを中性脂質と混合する工程、およびこの会合を細胞に投与する工程を包含する、Ｂｃｌ−２関連疾患を阻害する方法を包含する。細胞は、嚢胞性リンパ腫細胞のようなガン細胞であり得る。この方法は、約８と約５０塩基との間の長さを有するオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを用い得る。脂質は、リポソームを含み得る。そうであれば、リポソームはポリヌクレオチドをさらにカプセル化し得る。
【００１９】
この実施態様はまた、接触させる工程がヒトのような動物において起こる方法を包含する。例えば、組成物は、用量当たり０．５０〜１０．０ｍｌの容量でまたはｍ２当たり約５〜約３０ｍｇポリヌクレオチドの量で上記のヒトに送達され得る。これはまた、１週間当たり３回、８週間投与され得る。
【００２０】
本発明の他の目的、特徴、および有利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、本発明の意図および範囲内の種々の変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および特定の実施例が、本発明の好ましい実施態様を示すが、例示のみによって与えられることが理解されるべきである。
【００２１】
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
項目１．細胞内条件下で第２のＢｃｌ−２をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチド、および該第１のポリヌクレオチドと会合される中性脂質を含む、組成物であって、ここで該組成物がカチオン性脂質を含まない、組成物。
【００２２】
項目２．前記第１のポリヌクレオチドが、約８と約５０との間の塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドである、項目１に記載の組成物。
【００２３】
項目３．前記第１のポリヌクレオチドが、Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの翻訳開始部位に相補的である、項目１に記載の組成物。
【００２４】
項目４．前記ポリヌクレオチドが、配列ＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴＣＣＴＴＣ（配列番号１）を含むオリゴヌクレオチドである、項目３に記載の組成物。
【００２５】
項目５．前記脂質から形成されるリポソームを含む、項目１に記載の組成物。
【００２６】
項目６．前記第１のポリヌクレオチドが、リポソームにカプセル化される、項目５に記載の組成物。
【００２７】
項目７．前記脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、またはホスファチジルエタノールアミンである、項目１に記載の組成物。
【００２８】
項目８．前記脂質が、ジオレオイルホスファチジルコリンである、項目７に記載の組成物。
【００２９】
項目９．細胞内条件下で、第２のＢｃｌ−２をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドをコードする発現構築物を含む組成物であって、ここで、該第１のポリヌクレオチドは、真核生物細胞で活性であるプロモーターの制御下にあり、そして該構築物は、中性脂質と会合し、そしてさらに、該組成物がカチオン性脂質を含まない、組成物。
【００３０】
項目１０．Bcl-2関連疾患を阻害する方法であって、細胞内条件下で、第２のＢｃｌ−２をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドを得る工程、ポリヌクレオチド／脂質会合を形成するために該第１のポリヌクレオチドを中性脂質と混合する工程、および該会合を細胞に投与する工程、を包含し、ここで該細胞がBcl-2およびＢａｘの両方を発現する、方法。
【００３１】
項目１１．前記細胞がガン細胞である、項目１０に記載の方法。
【００３２】
項目１２．前記ガン細胞が嚢胞性リンパ腫細胞である、項目１１に記載の方法。
【００３３】
項目１３．前記第１のポリヌクレオチドが、約８と約５０との間の塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドである、項目１０に記載の方法。
【００３４】
項目１４．前記脂質から形成されるリポソームを含む、項目１０に記載の方法。
【００３５】
項目１５．前記リポソームが、前記第１のポリヌクレオチドをカプセル化する、項目１４に記載の方法。
【００３６】
項目１６．前記接触させる工程が動物で行われる、項目１０に記載の方法。
【００３７】
項目１７．前記動物がヒトである、項目１６に記載の方法。
【００３８】
項目１８．前記組成物が、０．５０〜１０．０ｍｌ／用量の容量で前記ヒトに送達される、項目１７に記載の方法。
【００３９】
項目１９．前記組成物が、約５〜約３０ｍｇポリヌクレオチド／m２の量で前記ヒトに送達される、項目１７に記載の方法。
【００４０】
項目２０．前記組成物が、１週間当たり３回、８週間投与される、項目１９に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
好ましい実施態様の詳細な説明
ｂｃｌ−２は、プログラムされた細胞死をブロックする能力による腫瘍形成可能性を有するガン遺伝子である。本発明は、腫瘍細胞がプログラムされた細胞死に入る能力を回復し得るようにＢｃｌ−２の産生を阻害するために、リポソームアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを用いる。本発明はまた、嚢胞性および非嚢胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、およびプラズマ細胞疾患を含む、白血病およびリンパ腫の両方の血液学的悪性疾患；固体腫瘍（例えば、乳ガン、前立腺ガン、および結腸ガンに関連する腫瘍）；およびＢｃｌ−２発現に関連する免疫疾患を処置するために使用され得る。このような疾患は、Ｂｃｌ−２を過剰発現または高レベルを発現し、そしてＢａｘも発現する細胞に関連する疾患を含む。
【００４２】
本発明は、ｂｃｌ−２遺伝子の部分に関するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、およびＢｃｌ−２関連疾患の処置におけるそれらの使用に関する。本発明の方法によって処置され得るガンの特定のタイプはＦＬである。９０％以上の嚢胞性リンパ腫患者は、第１８染色体におけるその正常位置から第１４染色体上の免疫グロブリン重鎖遺伝子座へのｂｃｌ−２遺伝子の転座を生じるｔ（１４；１８）転座を有する。結果として、ｂｃｌ−２遺伝子は、免疫グロブリン重鎖エンハンサーの影響下にあり、そしてＢｃｌ−２タンパク質が過剰発現される。ｂｃｌ−２は、プログラムされた細胞死をブロックするその能力による腫瘍化の可能性を有するガン遺伝子であるので、これらの嚢胞性リンパ腫についての可能性のある治療は、Ｂｃｌ−２タンパク質の産生を阻害することである。本発明は、他のアプローチが、Ｂｃｌ−２タンパク質の産生を阻害するために、第１のオープンリーディングフレームに、およびより詳細には、Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの翻訳開始部位に特異的な安定なヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞へ送達するための中性リポソームへ組み込むことによって失敗した場合に、成功することを望む。
【００４３】
特に、これらのアンチセンス分子を単独または他のアンチセンス分子と組み合わせのいずれかで使用することによって、ＦＬ、およびおそらく他のＢｃｌ−２ガンを効果的に処置することができることを意図する。例えば、本明細書に示すように、リポソームｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｌ−ｂｃｌ−２）は、ＦＬ細胞およびＢｃｌ−２タンパク質を過剰発現する他の細胞の増殖を阻害する。本発明の実施において、オリゴ−またはポリヌクレオチド自体、あるいはそれをコードする発現ベクターが用いられ得る。これらの核酸を送達する好ましい方法は、リポソーム、および特に中性脂質から作成されるリポソームによってである。本発明は、種々の実施態様において、以下により詳細に説明される。
【００４４】
（Ａ．ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド）
用語「アンチセンス」とは、Ｂｃｌ−２  ＲＮＡの一部に相補的なポリヌクレオチド分子、またはそれに対応するＤＮＡをいうことを意図する。「相補的な」ポリヌクレオチドは、標準的ワトソン・クリック相補性ルールに従って塩基対合し得るポリヌクレオチドである。すなわち、より大きなプリンは、シトシンと対になったグアニン（Ｇ：Ｃ）とＤＮＡの場合はチミン（Ａ：Ｔ）と、またはＲＮＡの場合はウラシル（Ａ：Ｕ）と対になったアデニンとの組み合わせを形成するために、より小さなピリミジンと塩基対合する。イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチン、および配列をハイブリダイズする他のもののような普通にはない塩基の包含は、いくつかの場合に特定の利点を提供し得、そして対合を妨害しない。
【００４５】
ポリヌクレオチドとの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを標的することは、三重らせん形成を導き；ＲＮＡを標的化することは、二重らせん形成を導く。標的細胞に導入される場合、アンチセンスポリヌクレオチドは、その標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、そして転写、ＲＮＡプロセシング、輸送、翻訳、および／または安定性を妨害する。アンチセンスＲＮＡ構築物、またはこのようなアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡは、ヒト被験体を含む宿主動物内のようなインビトロまたはインビボのいずれかで、宿主細胞内で遺伝子転写または翻訳あるいは両方を阻害するために用いられ得る。
【００４６】
一価カチオンの細胞内濃度は約１６０ｍＭである（１０ｍＭ  Ｎａ＋；１５０ｍＭ  Ｋ＋）。二価カチオンの細胞内濃度は約２０ｍＭである（１８ｍＭ  Ｍｇ＋＋；２ｍＭ  Ｃａ＋＋）。ハイブリダイゼーションの用量を減少させ、したがって核酸種の有効濃度を増加させるために用いる細胞内タンパク質濃度は、１５０ｍｇ／ｍｌである。構築物は、これらのインビボ条件を模倣する条件下でインビトロで試験され得る。
【００４７】
アンチセンス構築物は、プロモーターおよび他の制御領域、エクソン、イントロン、またはさらに遺伝子のエクソン−イントロン境界に結合するように設計され得る。本発明についてのほとんどの有効なアンチセンス構築物は、ｍＲＮＡ開始部位に相補的な領域を含むことが意図される。当業者は、どのレベルの標的タンパク質が影響を及ぼされるかを決定するために、単にインビトロで構築物を試験することによって、このような構築物を容易に試験し得る。このような試験は、当該分野で公知の種々の技術により裸のポリ核酸分子を細胞に移入することによって、あるいは核酸分子を１つ以上の脂質と会合することによって行われ得る。同様に、タンパク質合成の有害な非特異的阻害はまた、インビトロで標的細胞生存度を決定することによって測定され得る。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」または「アンチセンス」とは、その完全な長さにわたって実質的に相補的でありそして非常にわずかの塩基のミスマッチを有するポリヌクレオチドを意味する。例えば、１５塩基長の配列は、それらが１５のうちの１３または１４の位置について相補的なヌクレオチドを有する場合に相補的と呼ばれ得る。天然には、「完全に相補的」または「全長相補物」である配列は、その全体の長さを通して完全に相補的であり、そして塩基ミスマッチを有さない配列である。
【００４９】
より低い程度の相同性を有する他の配列も意図される。例えば、高い相同性の限定された領域を有するが、非相同領域（例えば、リボザイム）も含むアンチセンス構築物が設計され得る。これらの分子は、５０％以下の相同性を有するが、適切な条件下で標的配列に結合する。
【００５０】
本発明によるポリヌクレオチドは、ｂｃｌ−２遺伝子またはタンパク質発現のアンチセンス阻害をもたらすために十分な遺伝子の一部をコードし得る。ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに由来し得、すなわち、特定の生物のゲノムから直接クローン化され得る。しかし、他の実施態様では、ポリヌクレオチドは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であり得る。ｃＤＮＡは、テンプレートとしてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使用して調製されるＤＮＡである。したがって、ｃＤＮＡは、任意の中断されたコード配列を含まず、そして通常は対応するタンパク質のコード領域（単数または複数）をほとんど独占的に含む。他の実施態様では、アンチセンスポリヌクレオチドは、合成的に生成され得る。
【００５１】
特定の構築物を生成するために、ゲノムＤＮＡの一部をｃＤＮＡまたは合成配列と合わせることは有利であり得る。例えば、イントロンが最終的構築物で所望される場合、ゲノムクローンが使用される必要がある。ｃＤＮＡまたは合成されたポリヌクレオチドは、構築物の残りの部分についてのより都合の良い制限部位を提供し得、したがって配列の残りに使用される。
【００５２】
Ｂｃｌ−２についてのＤＮＡおよびタンパク質配列は、ＴｓｕｊｉｍｏｔｏおよびＣｒｏｃｅ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：５２１４，１９８６）（配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７）によって文献で公開される（これは、参考として本明細書に援用される）。本明細書中に開示されたものとは異なる配列を有するＢｃｌ−２の天然の改変体が存在することが意図される。したがって、本発明は、Ｂｃｌ−２について提供されたポリヌクレオチド配列の使用に限定されないが、任意の天然に存在する改変体の使用を包含する。このような改変体の特定の配列に依存して、これらは標的選択性に関してさらなる利点を提供し得、すなわち、関連の転写物の望ましくないアンチセンス阻害を避ける。本発明はまた、これらの配列の化学的に合成された変異体を包含する。
【００５３】
上述のように、アンチセンス配列は、全長ゲノムもしくはｃＤＮＡコピーまたはそれらの大きなフラグメントであり得るが、これらはまた、より短いフラグメント、または５０塩基以下のポリヌクレオチドとして本明細書中に定義される「オリゴヌクレオチド」であり得る。より短いオリゴマー（８〜２０）はインビボ接近性を得て増加させることがより容易であるが、多くの他の因子が塩基対合の特異性を決定することに関連する。例えば、オリゴヌクレオチドのその相補的標的への結合親和性および配列特異性の両方は、長さの増加とともに増加する。８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０塩基対、あるいはそれより大きいオリゴヌクレオチドが使用され得ることが意図される。遺伝子配列のすべてまたは一部が、アンチセンス構築物の状況において用いられ得るが、統計学的には、１７塩基長の任意の配列は、ヒトゲノムにおいて一度のみ生じるべきであり、したがって、独特の標的配列を特定するために十分である。
【００５４】
特定の実施態様では、他のエレメントを含むアンチセンス構築物、例えば、Ｃ−５プロピンピリミジンを含む構築物を用いることが望まれ得る。ウリジンおよびシチジンのＣ−５プロピンアナログを含むオリゴヌクレオチドは、高い親和性でＲＮＡを結合し、そして遺伝子発現の強力なアンチセンスインヒビターであることが示されている（Ｗａｇｎｅｒら，１９９３）。本発明の実施において、ｐ−エトキシまたはメチルホスホネートオリゴヌクレオチドのような誘導体化されたポリヌクレオチドまたはホスホジエステルアナログが使用され得る。このようなポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性のような特定の利点を提供し得る。疎水性であるｐ−エトキシオリゴヌクレオチドがまた、リポソームにより有効に組み込まれる点で有利であることが本発明者らの発見である。
【００５５】
標的されたアンチセンス送達の代わりとして、標的されたリボザイムが使用され得る。用語「リボザイム」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方において特定の塩基配列を標的化し、そして切断し得るＲＮＡに基づく酵素をいう。リボザイムは、リボザイム配列を組み込むＲＮＡオリゴヌクレオチドの形態で、細胞に直接標的され得るか、あるいは所望のリボザイムＲＮＡをコードする発現ベクターとして細胞に導入され得るかのいずれかであり得る。リボザイムは、アンチセンスポリヌクレオチドについて記載されたのとほとんど同じように使用および適用され得る。リボザイム配列もまた、アンチセンスポリヌクレオチドについて記載されたのとほとんど同じように改変され得る、例えば、非ワトソン・クリック塩基を導入し得るか、もしくは混合したＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを作製し得るか、またはホスホジエステル中心を改変し得る。
【００５６】
あるいは、本発明のアンチセンスオリゴおよびポリヌクレオチドは、オリゴ−またはポリヌクレオチドをコードする核酸を有する発現構築物からの転写によって、ｍＲＮＡとして提供され得る。本明細書全体を通して、用語「発現構築物」とは、核酸配列の一部またはすべてが転写され得るアンチセンス産物をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物の任意のタイプを含むことを意味する。代表的な発現ベクターには、ｐＵＣまたはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＴＭプラスミドシリーズのいずれかのような細菌プラスミドまたはファージ、あるいはさらに以下に議論されるような真核生物細胞での使用に適合されたウイルスベクターが挙げられる。
【００５７】
好ましい実施態様では、核酸は、プロモーターの転写制御下でアンチセンスオリゴ−またはポリヌクレオチドをコードする。「プロモーター」とは、細胞の合成機構によって認識されるＤＮＡ配列、または遺伝子の特異的転写を開始するために必要とされる合成機構を導入したＤＮＡ配列をいう。句「転写制御下」とは、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼ開始を制御するために核酸に関して正確な位置および配向にあることを意味する。
【００５８】
用語プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩについての開始部位の周囲にクラスター形成された転写制御モジュールの群をいうために本明細書で使用される。プロモーターがどのように組織されるかについての考察の多くは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写ユニットについてのプロモーターを含む、いくつかのウイルスプロモーターの分析に由来する。より近年の研究によって増大されたこれらの研究は、プロモーターが、それぞれ約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、そして転写アクチベーターまたはリプレッサータンパク質についての１つ以上の認識部位を含む、個々の機能的モジュールから構成されることを示している。
【００５９】
各プロモーターにおける少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成についての開始部位を配置するために機能する。これの最良の公知の例は、ＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子についてのプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子についてのプロモーターのようなＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーターでは、開始部位自体の上に横たわる別々のエレメントは、開始の場所を固定することを助ける。
【００６０】
追加のプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。代表的には、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多くのプロモーターは、さらに開始部位の下流の機能的エレメントを含むことが近年示された。プロモーターエレメント間の間隔は、しばしば融通性であり、そのためエレメントがもう１つのプロモーターに対して逆転または移動される場合、プロモーター機能は保存される。ｔｋプロモーターにおいては、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が減少し始める前に、５０ｂｐ離れるまで増加され得る。プロモーターに依存して、個々のエレメントが、転写を活性化するために協力してまたは独立してのいずれかで機能し得る。
【００６１】
阻害ペプチドをコードする核酸の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、標的された細胞においてペプチドを発現し得る限り、重要であるとは考えられない。したがって、ヒト細胞が標的される場合、ヒト細胞において活性であるプロモーターに隣接し、そしてその制御下にある阻害ペプチドをコードする核酸を配置することが好ましい。一般的にいえば、このようなプロモーターは、ヒトまたはウイルスプロモーターのいずれかを含み得る。
【００６２】
種々の実施態様では、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、およびＲｏｕｓ肉腫ウイルス長末端反復配列は、種々のタンパク質の高レベル発現を得るために使用され得る。発現のレベルが所定の目的に十分であるならば、本発明によるペプチドの発現を達成するための当該技術分野で周知である他のウイルスまたは哺乳動物細胞または細菌ファージプロモーターの使用がさらに意図される。
【００６３】
周知の特性を有するプロモーターを用いることによって、アンチセンスオリゴ−またはポリヌクレオチドの発現のレベルおよびパターンは最適化され得る。さらに、特異的な生理学的シグナルに応じて調節されるプロモーターの選択は、阻害タンパク質の誘導性発現を可能にし得る。例えば、ヒトＰＡＩ−１プロモーターの制御下の核酸は、腫瘍壊死因子によって誘導可能な発現を生じる。表１および２は、本発明の文脈において、アンチセンス構築物の発現を調節するために用いられ得るいくつかのエレメント／プロモーターを列挙している。このリストは、発現の促進に関連するすべての可能性のあるエレメントの完全ではなく、単にそれらの例示であることが意図される。
【００６４】
エンハンサーは、元来、ＤＮＡの同じ分子上の離れた位置に位置するプロモーターからの転写を増加させる遺伝エレメントとして検出された。大きな距離にわたって作用するこの能力は、原核生物転写調節の古典的研究においてほとんど先例がなかった。その後の研究は、エンハンサー活性を有するＤＮＡの領域が非常に類似のプロモーターに組み立てられることを示した。すなわち、これらは、多くの個々のエレメントから構成され、そのそれぞれは１つ以上の転写タンパク質に結合する。
【００６５】
エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な差異は、操作上のものである。エンハンサー領域は全体として、少し離れて転写を刺激できなければならない；これはプロモーター領域またはその成分エレメントに当てはまる必要はない。他方では、プロモーターは、特定の部位でおよび特定の配向でＲＮＡ合成の開始を支持する１つ以上のエレメントを有さなければならないが、エンハンサーはこれらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複しそして連続し、しばしば非常に類似のモジュラー機構を有すると思われる。
【００６６】
以下は、発現構築物においてＮＦ−ＩＬ６阻害ペプチドをコードする核酸と組み合わせて使用され得るウイルスプロモーター、細胞性プロモーター／エンハンサー、および誘導性プロモーター／エンハンサーのリストである（表１および表２）。さらに、任意のプロモーター／エンハンサー組み合わせ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢについて）も、本発明による核酸の発現を誘導するために使用され得る。Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６細胞質発現系の使用は、他の可能な実施態様である。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝発現構築物としてのいずれかで提供されるならば、真核生物細胞は、ある細菌プロモーターからの細胞質転写を支持し得る。
【００６７】
【表１】
2008069161.tif 000002
【００６８】
【表２】
2008069161.tif 000003
本発明のある実施態様では、細胞における核酸の送達は、発現構築物においてマーカーを含むことによってインビトロまたはインビボで同定され得る。マーカーは、発現の容易な同定を可能にするトランスフェクトされた細胞への同定可能な変化を生じる。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）（真核生物性）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）（原核生物性）のような酵素が用いられ得る。
【００６９】
これはまた、転写物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の成功した実施に重要とは考えられず、そしてこのような配列が用いられ得る。例としては、ＳＶ４０、グロビン、またはアデノウイルスポリアデニル化シグナルが挙げられる。発現カセットのエレメントがターミネーターであることも意図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強しそしてカセットから他の配列へのリードスルーを最小にするために役立ち得る。
【００７０】
（Ｂ．脂質処方物）
本発明の好ましい実施態様では、アンチセンスオリゴ−またはポリヌクレオチドおよび発現ベクターは、脂質と会合され得る。脂質と会合したポリヌクレオチドは、リポソームの水性内部にカプセル化され得るか、リポソームの脂質二重層内に散在し得るか、リポソームとポリヌクレオチドとの両方と会合される連結分子を介してリポソームに付着され得るか、リポソームに捕らえられ得るか、リポソームと複合体化され得るか、脂質を含む溶液に分散され得るか、脂質と混合され得るか、脂質と合わされ得るか、脂質中に懸濁液として含まれ得るか、ミセルに含まれるかもしくは複合体化され得るか、あるいは他に脂質と会合され得る。本発明の脂質または脂質／オリゴヌクレオチド会合組成物は、溶液中で任意の特定の構造に限定されない。例えば、これらは、ミセルとして二重層構造で、または「折り畳まれた（ｃｏｌｌａｐｓｅｄ）」構造で存在し得る。これらはまた、単に溶液中に散在され得、おそらくサイズまたは形状のいずれかが均一でない凝集体を形成する。脂質は、多重層状小胞、小さなまたは大きな単層小胞、あるいは当該技術分野で公知の他のタイプの小胞として、当該技術分野で公知のリポソームの形態であり得る。
【００７１】
脂質は、天然に存在するまたは合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質としては、細胞質に天然に存在する脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体（例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒド）を含む当業者に周知の化合物のクラスが挙げられる。例は、脂質のジオレオイルホスファチジルコリンである。
【００７２】
「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成された種々の単または多重層状脂質小胞を包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を有する小胞構造を有するものとして特徴づけられ得る。多重層状リポソームは、水性媒体によって分離された多重脂質層を有する。これらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁される場合に自然に形成される。脂質成分は、閉じた構造の形成の前に自己再配置を受け、そして脂質二重層間に水および溶解した溶質を捕らえる（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ，  Ｗｕ  Ｇ．  Ｗｕ  Ｃ編，Ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉａｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，８７−１０４頁，１９９１）。しかし、本発明はまた、正常な小胞構造とは溶液中で異なる構造を有する組成物を包含する。例えば、脂質は、ミセル構造を仮定し得るか、あるいは単に脂質分子の非均一凝集体として存在し得る。リポフェクタミン−核酸複合体も意図される。
【００７３】
インビトロでの外来ＤＮＡのリポソーム媒介されたポリヌクレオチド送達および発現は、非常に成功している。Ｗｏｎｇら（Ｇｅｎｅ，１０：８７−９４，１９８０）は、培養されたニワトリ胚ＨｅＬａおよび肝臓ガン細胞中での外来ＤＮＡのリポソーム媒介された送達および発現の可能性を証明した。Ｎｉｃｏｌａｕら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６，１９８７）は、静脈内注射後のラットにおける成功したリポソーム媒介された遺伝子導入を達成した。
【００７４】
本発明の所定の実施態様では、脂質は、赤血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と会合され得る。これは、細胞膜との融合を容易にしそしてリポソームカプセル化ＤＮＡの細胞侵入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５−３７８，１９８９）。他の実施態様では、脂質は、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）とともに複合体化されるかまたは用いられ得る（Ｋａｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨｅｍ．，２６６：３３６１−３３６４，１９９１）。よりさらなる実施態様では、脂質は、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方とともに複合体化されるかまたは用いられ得る。このような発現ベクターがインビトロおよびインビボでのポリヌクレオチドの導入および発現にうまく用いられている場合、これらは本発明に適用可能である。細菌プロモーターがＤＮＡ構築物中で用いられる場合、リポソーム内に適切な細菌ポリメラーゼを含むことも望まれる。
【００７５】
リン脂質は、本発明によるリポソームを調製するために使用され、そして正味の正電荷、正味の負電荷を有し得るか、あるいは中性であり、中性リン脂質が最も好ましい。ジアセチルホスフェートは、しばしば、リポソームに負電荷を与えるために用いられ、そしてステアリルアミンは、リポソームに正電荷を与えるために用いられる。
【００７６】
本発明による使用に適切な脂質は、市販の供給源から得られ得る。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｃａｌ  Ｃｏ．から得られ得、ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）は、Ｋ  ＆  Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から得られ；コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから得られ；ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ）から得られ得る。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約−２０℃で保存され得る。好ましくは、メタノールよりも容易にエバポレートされるので、クロロホルムが使用される。
【００７７】
卵または大豆ホスファチジルコリン、脳ホスファチジン酸、脳または植物ホスファチジルイノシトール、心臓カルジオリピン、および植物または細菌ホスファチジルエタノールアミンのような、天然の供給源からのリン脂質は、好ましくは、主要ホスファチドとして、すなわち、得られるリポソームの不安定性および漏出性のため、総ホスファチド組成の５０％以上を構成するホスファチドとして使用されない。
【００７８】
本発明によって使用されるリポソームは、種々の方法によって作成され得る。リポソームのサイズは、合成方法に依存して変化する。水溶液に懸濁されたリポソームは、一般的に、球状小胞の形状であり、脂質二重層分子の１つ以上の同心円層を有する。各層は、式ＸＹによって表される分子の並行整列からなり、ここでＸは、親水性部分であり、そしてＹは、疎水性部分である。水性懸濁液中では、同心円層は、親水性部分が水相と接触したままの傾向があり、そして疎水性領域が自己会合する傾向があるように整列される。例えば、水相がリポソーム内および外の両方に存在する場合、脂質分子は、配列ＸＹ−ＹＸの、ラメラとして公知の二重層を形成し得る。１つより多くの脂質分子の親水性および疎水性部分が互いに会合する場合、脂質の凝集体が形成され得る。これらの凝集体のサイズおよび形状は、溶媒の性質および溶液中の他の化合物の存在のような、多くの種々の変数に依存する。
【００７９】
本発明の範囲内のリポソームは、公知の実験室技法に従って調製され得る。１つの好ましい実施態様では、リポソームは、容器（例えば、ガラス、ナス型フラスコ）中の溶媒中で、リポソーム脂質を混合することによって調製される。容器は、リポソームの予測された懸濁液の容量よりも１０倍大きい容量を有するべきである。ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒を減圧下で約４０℃で除去した。溶媒は、正常には、リポソームの所望の容量に依存して、約５分から２時間以内で除去される。組成物は、真空下でデシケーター中でさらに乾燥され得る。乾燥した脂質は、一般的に、時間とともに悪化する傾向のため、約１週間後に捨てられる。
【００８０】
乾燥した脂質は、すべての脂質フィルムが再懸濁されるまで浸透することによって、滅菌した発熱物質を含まない水中の約２５〜５０ｍＭのリン脂質で水和され得る。次いで、水性リポソームは、アリコートに分離され、それぞれバイアルに入れ、凍結乾燥し、そして真空下で密封され得る。
【００８１】
あるいは、リポソームは、他の公知の実験室手順に従って調製され得る：Ｂａｎｇｈａｍら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３：２３８，１９６５）の方法、その内容は参考として本明細書に援用される；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓの方法、ＤＲＵＧ  ＣＡＲＲＩＥＲＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，  Ｇ．Ｇｒｅｒｏｒｉａｄｉｓ編（１９７９）２８７−３４１頁に記載される、その内容は参考として本明細書に援用される；ＤｅａｍｅｒおよびＵｓｔｅｒ（ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ，Ｍ．Ｏｓｔｒｏ編，１９８３）の方法、その内容は参考として本明細書に援用される；およびＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：４１９４−９８  １９７８）によって記載される逆相エバポレーション方法。上記の方法は、水性物質を捕らえるためのそれぞれの能力およびそれぞれの水性空隙対脂質比で異なる。
【００８２】
上記のように調製した乾燥した脂質または凍結乾燥したリポソームを、脱水し、そして阻害ペプチドの溶液中で再構成し、そして適切な溶媒、例えば、ＤＰＢＳで適切な濃度に希釈し得る。次いで、混合物を、ボルテックスミキサーで激しく浸透する。カプセル化されていない核酸を、２９，０００×ｇでの遠心分離によって除去し、そしてリポソームペレットを洗浄する。洗浄したリポソームを、適切な総リン脂質濃度、例えば、約５０〜２００ｍＭで再懸濁する。カプセル化された核酸の量を、標準的方法に従って決定し得る。リポソーム調製物にカプセル化される核酸の量の決定後、リポソームを、適切な濃度に希釈し、そして使用まで４℃で貯蔵し得る。
【００８３】
ホスホジエステルのヌクレアーゼ耐性アナログであるｐ−エトキシオリゴヌクレオチドは、血清中で安定でありそして細胞質中へ効果的に輸送されるので、好ましい。好ましい実施態様では、脂質ジオレオイルホスファチジルコリンが用いられる。しかし、他のホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルエタノールアミンのような他の脂質もまた有用であり得る。ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、過剰のｔ−ブタノールの存在下で脂質と混合される。混合物は、アセトン／ドライアイス浴中で凍結される前にボルテックスされる。凍結した混合物は凍結乾燥され、そしてＨｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（１ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５）で水和され、次いで、リポソームは１０〜１５分間、浴タイプのソニケーター中で超音波処理される。リポソームオリゴヌクレオチドのサイズは、代表的には、サブミクロン粒子サイザー自動希釈モデル３７０（Ｎｉｃｏｍｐ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）によって決定される場合の２００〜３００ｎｍの直径の範囲である。
【００８４】
（Ｃ．代わりの送達系）
レトロウイルス。レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染した細胞中でそのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する能力によって特徴づけられる一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓら（編），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１４３７−１５００，１９９０）。次いで、得られるＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込まれ、そしてウイルスタンパク質の合成を導く。組込みは、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列の保持を生じる。レトロウイルスゲノムは、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をコードする３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含む。ｇａｇ遺伝子から上流に見られる配列は、Ψと呼ばれ、ビリオンへのゲノムのパッケージングのためのシグナルとして機能する。２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、そしてまた宿主細胞ゲノムにおける組込みに必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。
【００８５】
レトロウイルスベクターを構築するために、Ｂｃｌ−２アンチセンス構築物をコードする核酸が、複製欠損であるウイルスを産生するために、特定のウイルス配列の代わりに、ウイルスゲノムに挿入される。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲおよびΨ成分を含まないパッケージング細胞株が、構築される（Ｍａｎｎら，Ｃｅｌｌ，３３：１５３−１５９，１９８３）。レトロウイルスＬＴＲおよびΨ配列とともに、挿入されたＤＮＡを含む組換えプラスミドは、（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）この細胞株に導入される場合、Ψ配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写がウイルス粒子にパッケージングされることを可能にし、次いでこれは培養培地に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ，（編），Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４９４−５１３頁，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（編），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１４９−１８８頁，１９８６；Ｍａｎｎら，１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含む培地を集め、必要に応じて濃縮し、そして遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、広範な種々の細胞タイプを感染させ得る。しかし、組込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７：２４２−２４８，１９７５）。
【００８６】
アデノウイルス：ヒトアデノウイルスは、約３６ｋＢのゲノムサイズを有する二本鎖ＤＮＡ腫瘍ウイルスである。真核生物遺伝子発現についてのモデル系として、アデノウイルスは、広く研究されそして十分に特徴づけされ、これは遺伝子導入系としてのアデノウイルスの開発のための魅力的な系になる。このウイルスの群は、増殖および操作が容易であり、そしてこれらはインビトロおよびインビボで広い宿主範囲を示す。溶菌的に感染した細胞において、アデノウイルスは、宿主タンパク質合成を遮断し、大量のウイルスタンパク質を合成するために細胞機構を導き、そして大量のウイルスを産生し得る。
【００８７】
ゲノムのＥ１領域は、ウイルスゲノムの転写調節にを担うタンパク質をコードするＥ１ＡおよびＥ１Ｂ、ならびに少数の細胞性遺伝子を含む。Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂを含むＥ２発現は、ウイルス複製機能物、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、および複製をプライムする末端タンパク質の合成を可能にする。Ｅ３遺伝子産物は、細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を抑制し、そしてウイルス増殖に重要であるようである。Ｅ４タンパク質と関連する機能には、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞遮断が挙げられる。後期遺伝子産物には、ほとんどのビリオンキャプシドタンパク質が挙げられ、そしてこれらは、主要後期プロモーターからの単一の初期転写物のプロセシングのほとんどが生じた後にのみ、発現される。主要後期プロモーター（ＭＬＰ）は、感染の後期の間、高い効率を示す（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，５１−６１頁，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，  Ｏ．Ｃｏｈｅｎ−ＨａｇｕｅｎａｕｅｒおよびＭ．Ｂｏｉｒｏｎ編  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ  Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  Ｅｘｒｏｔｅｘｔ，Ｆｒａｎｃｅ，１９９１）。
【００８８】
ウイルスゲノムの小部分のみがシスで必要とされるようであるので、アデノウイルス由来ベクターは、２９３細胞のような細胞株とともに使用される場合、大きなＤＮＡフラグメントの置換にすぐれた可能性を提供する。Ａｄ５形質転換されたヒト胚腎臓細胞株（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９−７２，１９７７）は、トランスで必須のウイルスタンパク質を提供するために開発されている。
【００８９】
外来タンパク質を細胞に送達するためのアデノウイルス系の特に利点としては、（ｉ）外来ＤＮＡによるウイルスＤＮＡの比較的大きな部分を置換する能力；（ｉｉ）組換えアデノウイルスの構造安定性；（ｉｉｉ）アデノウイルス投与のヒトへの安全性；および（ｉｖ）ガンまたは悪性腫瘍でのアデノウイルス感染の任意の公知の関連の欠如；（ｖ）組換えウイルスの高い力価を得るための能力；および（ｖｉ）アデノウイルスの高い感染性が挙げられる。
【００９０】
アデノウイルスベクターのレトロウイルスに対するさらなる利点は、遺伝子発現のより高いレベルを包含する。さらに、アデノウイルス複製は、宿主遺伝子複製とは独立しており、レトロウイルス配列とは異なる。Ｅ１領域中のアデノウイルストランスフォーミング遺伝子は、容易に欠失されそしてさらに効果的な発現ベクターを提供するので、アデノウイルスベクターからのガン遺伝子危険性は、無視できると考えられる（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ，Ｓｅｍｉｎａｒ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３：２３７−２５２，１９９２）。
【００９１】
一般に、アデノウイルス遺伝子導入系は、組換えの操作されたアデノウイルスに基づき、これはＥ１のようなそのゲノムの一部の欠失によって複製非能になり、そしてさらに感染についてのその能力を保持する。比較的大きな外来タンパク質をコードする配列は、追加の欠失がアデノウイルスゲノムで作製される場合、発現され得る。例えば、Ｅ１およびＥ３領域の両方で欠失したアデノウイルスは、１０ｋＢまでの外来ＤＮＡを有し得、そして２９３細胞において高い力価まで増殖され得る（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９１）。驚くべきことに、アデノウイルス感染後の導入遺伝子の持続した発現も報告されている。
【００９２】
発現構築物としての他のウイルスベクター。他のウイルスベクターは、本発明における発現構築物として用いられ得る。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４６７−４９２頁，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ，（編）  Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１１７−１４８頁，１９８６；Ｃｏｕｐａｒら，Ｇｅｎｅ，６８：１−１０，１９８８）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６−６４７０，１９８４）、ならびにヘルペスウイルスのようなウイルスに由来するベクターが用いられ得る。これらは、種々の哺乳動物細胞についてのいくつかの魅力的特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ．３：１３１４，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒら，１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：６４２−６５０，１９９０）。
【００９３】
欠損Ｂ型肝炎ウイルスの最近の認識により、種々のウイルス配列の構造−機能関連に新しい洞察を得た。インビトロ研究は、ウイルスが、その８０％までのゲノムの欠失にもかかわらず、ヘルパー依存性パッケージングおよび逆転写についての能力を保持し得ることを示した（Ｈｏｒｗｉｃｈら，１９９０）。これは、ゲノムの大部分が外来遺伝物質と置換され得ることを示唆した。肝臓親和性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｓｍ）および存続（組込み）は、特に、肝臓指向性遺伝子導入にとっての魅力的な特性であった。Ｃｈａｎｇら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１４：１３４Ａ，１９９１）は、近年、ポリメラーゼコード配列、表面コード配列、およびプレ表面コード配列の代わりに、カモＢ型肝炎ウイルスゲノムにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を導入した。鳥類肝ガン腫細胞株に野生型ウイルスを同時トランスフェクトした。高い力価の組換えウイルスを含む培養培地を使用して、初代子ガモ肝細胞に感染させた。安定なＣＡＴ遺伝子発現を、トランスフェクション後の少なくとも２４日間にわたり検出した（Ｃｈａｎｇら，１９９１）。
【００９４】
非ウイルス方法。培養した哺乳動物細胞への発現ベクターの導入のためのいくつかの非ウイルス方法もまた、本発明によって意図される。これらには、リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７，１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７：２７４５−２７５２，１９８７；Ｒｉｐｐｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０，１９８５）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１−７１６５，１９８４）、直接マイクロインジェクション（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０１：１０９４−１０９９，１９８５）、ＤＮＡ装填リポソーム（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０，１９８２；Ｆｒａｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８−３３５２，１９７９）およびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理（Ｆｅｃｈｅｉｍｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８−５２，１９７９）、高速マイクロプロジェクタイル（Ｙａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：９５６８−９５７２，１９９０）を使用する遺伝子ボンバードメント、ポリカチオンおよびレセプター媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２，１９８７；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：８８７−８９２，１９８８）が挙げられる。これらの技法のいくつかは、インビボまたはエクスビボ使用にうまく適合され得る。
【００９５】
本発明の１つの実施態様では、発現構築物は、単に裸の組換えベクターからなり得る。構築物の導入は、物理学的または化学的に細胞膜を透過可能にする上記の方法のいずれかによって行われ得る。例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７５２９−７５３３，１９８４）は、成熟および新生マウスの肝臓および脾臓にＣａＰＯ４沈殿物の形態でポリオーマウイルスＤＮＡをうまく注射し、活性なウイルス複製および急性感染を示した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＮｅｓｈｉｆ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：９５５１，１９８６）はまた、ＣａＰＯ４沈殿させたプラスミドの直接腹腔内注射が、トランスフェクトされた遺伝子の発現を生じることを示した。Ｂｃｌ−２構築物をコードするＤＮＡもまた、インビボで類似の方法でトランスフェクトされ得ると考えられる。
【００９６】
裸のＤＮＡ発現ベクターを細胞に導入するための本発明の他の実施態様は、粒子ボンバードメントを包含し得る。この方法は、ＤＮＡコートしたマイクロプロジェクタイルを、細胞膜を貫通させそして細胞を殺傷することなく細胞に侵入させる高速まで促進する能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７０−７３，１９８７）。小さい粒子を促進するためのいくつかのデバイスが開発されている。このような１つのデバイスは、電流を発生するために高電圧放出を頼り、次に動力を提供する（Ｙａｎｇら，１９９０）。使用されるマイクロプロジェクタイルは、タングステンまたは金ビーズのような生物学的に不活性な物質からなっている。
【００９７】
ラットおよびマウスの肝臓、皮膚、および筋肉組織を含む選択された器官が、インビボでボンバードされた（Ｙａｎｇら，１９９０；Ｚｅｌｅｎｉｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２８０：９４−９６，１９９１）。これは、銃と標的器官との間の任意の間に入っている組織を排除するために、組織または細胞の外科的曝露を必要とし得る。Ｂｃｌ−２構築物をコードするＤＮＡは、この方法によって送達され得る。
【００９８】
（Ｄ．薬学的組成物および投与経路）
アンチセンスオリゴ−またはポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含むリポソームの臨床的適用を受ける場合、目的の適用に適切な薬学的組成物としてリポソーム複合体を調製する必要がある。一般的に、これは、発熱物質、ならびにヒトまたは動物に有害であり得る任意の他の不純物を本質的に含まない薬学的組成物を調製することを含む。一般的に、複合体を安定にしそして標的細胞による取り込みを可能にするために適切な緩衝液を用いることも所望される。
【００９９】
本発明の水性組成物は、上記のようなリポソームにカプセル化され、さらに薬学的に受容可能なキャリアまたは水性倍体に分散された、有効量のアンチセンス発現ベクターを含む。このような組成物は、接種物ともいう。用語「薬学的に」または「生理学的に受容可能」とは、動物またはヒトに適切に投与される場合、有害な、アレルギー性の、または他の都合の悪い反応を生じない組成物をいう。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」としては、任意およびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合であるかぎり以外は、治療組成物における使用が意図される。追加の活性成分はまた、組成物に組み込まれ得る。
【０１０１】
治療組成物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合した水中で調製され得る。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、それらの混合物中で、および油中で調製され得る。貯蔵および使用の普通の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【０１０２】
本発明の治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能な組成物の形態で有利に投与され；注射前に液体中での溶液または懸濁液に適切な固体形態も調製され得る。これらの調製物はまた乳化され得る。このような目的のための代表的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む。例えば、組成物は、リン酸緩衝化生理食塩水の１ミリリットル当たり、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、または約１００ｍｇまでのヒト血清アルブミンを含み得る。他の薬学的に受容可能なキャリアには、水溶液、非毒性賦形剤（塩、保存剤、緩衝剤を含む）などが挙げられる。
【０１０３】
非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性キャリアには、水、アルコール性／水性溶液、生理食塩溶液、塩化ナトリウム、リンゲルブドウ糖のような非経口ビヒクルなどが挙げられる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補充物が挙げられる。保存剤には、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスが挙げられる。薬学的組成物の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータに従って調節される。
【０１０４】
追加の処方物は、経口投与に適切である。経口処方物には、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような代表的賦形剤が挙げられる。組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出処方物、または粉剤の形態をとる。経路が局所的である場合、形態はクリーム、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、またはスプレーであり得る。
【０１０５】
本発明の治療組成物は、古典的薬学的調製物を含み得る。本発明による治療組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の普通の経路を介する。これには、経口、経鼻、経頬内、経直腸、経膣、または局所が含まれる。局所投与は、化学療法で誘導された脱毛症または他の皮膚過剰増殖障害を防ぐために、皮膚ガンの処置に特に有利である。あるいは、投与は、眼局所（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射によってであり得る。このような組成物は、正常には、生理学的に受容可能なキャリア、緩衝剤、または他の賦形剤を含む薬学的に受容可能な組成物として投与される。肺の症状の処置については、好ましい経路は肺へのエアロゾル送達である。エアロゾルの容量は、約０．０１ｍｌと０．５ｍｌとの間である。同様に、結腸関連疾患の処置のために好ましい方法は、浣腸によってである。浣腸の容量は、約１ｍｌと１００ｍｌとの間である。
【０１０６】
治療組成物の有効量は、意図される目的に基づいて決定される。用語「単位用量」または「投与量」とは、被験体における使用に適切な物理的に別個の単位をいい、各単位は、その投与、すなわち適切な経路および処置方法と関連して、上記の所望の応答を生じるために計算された治療組成物の所定の量を含む。処置の数および単位用量の両方に従って投与されるべき量は、所望の防御に依存する。
【０１０７】
治療組成物の正確な量はまた、主治医の判断に依存し、そして各個体に固有である。用量に影響を及ぼす因子には、患者の物理的および臨床的状態、投与経路、処置（徴候対治癒の軽減）および効能の意図された目的、特定の治療物質の安定性および毒性が挙げられる。本発明については、単位用量に含まれる治療ペプチドの量は、約５〜３０ｍｇのポリヌクレオチドの範囲であると考えられる。
【実施例】
【０１０８】
（Ｅ．実施例）
実施例１：オリゴヌクレオチドの合成。
【０１０９】
ヌクレアーゼ耐性ｐ−エトキシオリゴヌクレオチド、非イオン性ホスホジエステルアナログを、Ｏｌｉｇｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｗｉｌｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ）から購入した。ヒトＢｃｌ−２  ｍＲＮＡの翻訳開始部位に特異的なオリゴヌクレオチド：配列５’ＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴＣＣＴＴＣ３’（配列番号１）を、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用した。２つの異なるコントロールオリゴヌクレオチドを使用した：５’ＡＣＧＧＴＣＣＧＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＣＣ３’（配列番号２）（Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドのスクランブル型）およびランダム配列５’ＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣ３’（配列番号３）。
【０１１０】
実施例２：リポソームオリゴヌクレオチド（Ｌ−ＯＳ）の調製
蒸留水に溶解したｐ−エトキシ−オリゴヌクレオチドを、過剰のｔｅｒｔ−ブタノール（≧９５容量％）の存在下でリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）に添加した。混合物を、ドライアイス／アセトン浴中で凍結し、一晩凍結乾燥させ、そして最終的に０．１ｍｍｏｌ／Ｌの最終オリゴヌクレオチド濃度でＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈｅｐｅｓおよび１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）で水和した。リポソームオリゴヌクレオチド（Ｌ−ＯＳ）を、浴槽タイプの超音波処理器中で１２分間超音波処理した。粒子の平均直径は、ＮＩＣＯＭＰ粒子測定システム（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）で決定した場合、１００ｎｍ±５０ｎｍであった。
【０１１１】
実施例３：タンパク質発現のオリゴヌクレオチド阻害
細胞株
Ｂｃｌ−２タンパク質を過剰発現するｔ（１４；１８）転座を有するヒト形質転換ＦＬ細胞株である、Ｊｏｈｎｓｏｎ細胞を使用した。それぞれヒトＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株およびヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株である、ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞も使用した。両方の株ともＢｃｌ−２タンパク質を発現するが、ｔ（１４；１８）転座がない。Ｂｃｌ−２タンパク質を発現しないヒトＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株であるＤａｕｄｉ細胞を、ネガティブコントロール細胞株として使用した。Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｒａｊｉ、およびＪｕｒｋａｔ細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（ＧＩＢＣＯ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）中で増殖した。Ｄａｕｄｉ細胞を、２０％熱不活性化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で増殖した。
【０１１２】
Ｌ−ＯＳの細胞への送達
１０，０００細胞／ウェルを、０．１ｍＬのそれぞれの培地中の９６ウェルプレートに播種した。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて２〜８μｍｏｌ／Ｌの最終濃度でＬ−ＯＳとともにインキュベートした。各研究を３連で行い、そして少なくとも３回繰り返した。
【０１１３】
細胞生存度アッセイ
新生物細胞の生存度を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ色素（Ａｌａｍａｒ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）によって測定した。Ｌ−ＯＳとのインキュベーションの５日後、４０μＬの細胞／ウェルをアリコートにし、そして１４０μＬの新鮮な培地に添加した。２０μＬのａｌａｍａｒＢｌｕｅ色素を各ウェルに添加した。３７℃にて１２時間のインキュベーション後、プレートを、５７０および５９５ｎｍにてマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）で直接読んだ。５７０と５９５ｎｍとの間の吸光度の差を、細胞の全体の吸光度値とみなした。すべての実験を、ｔ−検定によって分析し、ここでは、Ｌ−ＯＳで処理した細胞の生存度は、未処理のコントロールの生存度と比較した。
【０１１４】
Ｂｃｌ−２およびＢａｘタンパク質についてのウエスタンブロット
１００，０００細胞／ウェルを、３ｍＬのそれぞれの培地中の６ウェルプレートに播種し、２、３、および４μｍｏｌ／ＬのＬ−ＯＳで処理し、そして３７℃にてインキュベートした。未処理細胞も、培養物中で維持した。試料を、Ｌ−ＯＳの添加後３日目に取り出し、そして０℃にて３０分間１００μＬの溶解緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、および２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．４）中で溶解した。１２，０００×ｇにて１０分間の遠心分離後、上清を回収し、そして総タンパク質含量について標準化した（Ｂｃｌ−２分析については５μｇ／レーンのＪｏｈｎｓｏｎ細胞ライセートおよび２０μｇ／レーンのＪｕｒｋａｔ細胞ライセート、ならびにＢａｘ分析については２５μｇ／レーンのＪｏｈｎｓｏｎ細胞）。ライセートを、１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１％の２−β−メルカプトエタノールを含む試料緩衝液と混合し、そして５分間煮沸した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを１０％ポリアクリルアミドゲルに流し、電気泳動でニトロセルロースメンブレンに移し、そして１０％脱脂乾燥乳でブロックした。フィルターを２つの部分に切断した：下の部分を、６Ｃ８ハムスター抗ヒトＢｃｌ−２モノクローナル抗体またはウサギ抗ヒトＢａｘポリクローナル抗体（Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：３３４，１９９０）とインキュベートし、そして上の部分を、室温にて２時間、マウス抗アクチンモノクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とインキュベートした。洗浄、ならびにペルオキシダーゼ標識した抗ハムスター（ＫｉｒｋｅｇａａｒおよびＰｅｒｒｙ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗ウサギ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、または抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）二次抗体とのインキュベーション後、ブロットを、増強した化学発光系（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって顕色した。Ｂｃｌ−２タンパク質の阻害およびＢｃｌ−２／Ｂａｘタンパク質の比を評価するために、濃度測定スキャンを、Ｇｉｌｆｏｒｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｇｅｌ  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＣＩＢＡ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｅｄｆｉｅｌｄ，ＭＡ）でのウエスタンブロットで行った。５００ｎｍでの吸光度ピークの面積積分を使用して、Ｂｃｌ−２：アクチンおよびＢｃｌ−２：Ｂａｘタンパク質の比を決定した。
【０１１５】
アポトーシスの分析
アポトーシスに関連したヌクレオソーム間のＤＮＡ切断を定性的に決定するために、アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡフラグメント化分析を行った（Ｄｕｋｅら，Ｃｏｌｉｇａｎら（編）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１巻，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  ｓｏｎｓ，ｐ３．１７．１，１９９１）。簡単にいえば、１×１０６Ｊｏｈｎｓｏｎ細胞を、７５ｓｑ．ｃｍ組織培養フラスコ中１０ｍＬの培地中で培養し、４μｍｏｌ／ＬのＬ−ＯＳで処理し、そして３７℃にてインキュベートした。未処理細胞も、培養物中で維持した。試料を処理後３日目に取り出し、ＰＢＳで洗浄し、そして２００×ｇにて１０分間遠心分離することによってペレットにした。ペレットを、０．５ｍＬの溶解緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．４、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０、および０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で溶解し、そしてフラグメントにしたＤＮＡを、１３，０００×ｇにて１０分間マイクロ遠心分離することによってインタクトなクロマチンから分離した。上清のＤＮＡを、−２０℃にて一晩０．７ｍＬの氷冷イソプロパノールで沈殿させ、３０μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．４、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０）に再懸濁し、そして１０μＬのＲＮａｓｅ（１０μｇ／ｍＬ溶液）中で６０℃にて１時間インキュベートした。ウェル当たり２０μＬの試料を、２％アガロースゲルで電気泳動し、そしてエチジウムブロミド染色によって可視化した。
【０１１６】
アポトーシスの程度を定量的に決定するために、蛍光ＤＮＡ結合色素のアクリジンオレンジ（Ｄｕｋｅら，１９９１）を使用した。簡単にいえば、５μｍｏｌ／Ｌの最終濃度のＬ−ＯＳを、１ｍＬの培地中２４ウェルプレートにプレートした１×１０５細胞／ウェルに添加した。３７℃でのインキュベーションの３日後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。２５μｌの細胞懸濁液を、１μＬのアクリジンオレンジ色素（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と混合し、そして蛍光顕微鏡で観察した。アポトーシス細胞の割合（アポトーシスインデックス）を、血球計数器を使用して得た。アポトーシスインデックス＝（アポトーシス核を有する細胞の総数／計数された細胞の総数）×１００％。
【０１１７】
リンパ腫細胞増殖におけるＬ−ｂｃｌ−２−アンチセンスオリゴヌクレオチド（「Ｌ−ｂｃｌ−２」）の効果
Ｌ−ｂｃｌ−２の細胞への添加後５日目に、腫瘍細胞の生存度を評価した。細胞増殖を、ｔ（１４；１８）転座を有しそして非常に高レベルのＢｃｌ−２を発現するＪｏｈｎｓｏｎ細胞においては濃度依存的様式で阻害した。６μｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−ｂｃｌ−２の濃縮物は、５日以内のＪｏｈｎｓｏｎ細胞の生存性の完全喪失を生じた（図１）。細胞生存度の同様の用量依存的減少は、３つの別の研究においてみられ得た。逆に、６μｍｏｌ／Ｌ（  ）Ｌ−ｂｃｌ−２での処理後、Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、およびＤａｕｄｉ細胞の生存度は、それぞれ２３％、０％、および３５％のみ減少した（図１）。
【０１１８】
リンパ腫細胞増殖におけるリポソームコントロールオリゴヌクレオチド（Ｌ−コントロールオリゴ）の効果
２つのコントロールオリゴヌクレオチドを使用して、観察された阻害の特異性を決定した。Ｌ−コントロールオリゴまたは空のリポソームをＪｏｈｎｓｏｎ細胞に添加した場合、細胞増殖阻害は観察されなかった。Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、およびＤａｕｄｉ細胞も、Ｌ−コントロールオリゴおよび空のリポソームで処理した。非特異的毒性は、６μｍｏｌ／Ｌより多いＬ−ＯＳを使用した場合に観察し得たが、空のリポソームでは観察されなかった（図２）。
【０１１９】
Ｌ−ｂｃｌ−２−アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＢｃｌ−２タンパク質の選択的阻害
Ｊｏｈｎｓｏｎ細胞におけるＬ−ｂｃｌ−２の細胞傷害効果がＢｃｌ−２タンパク質の減少によって引き起こされたかどうかを決定するために、Ｌ−ｂｃｌ−２での処理後のこれらの細胞におけるＢｃｌ−２タンパク質発現ならびにＢｃｌ−２タンパク質を過剰発現する他の細胞株におけるＬ−ｂｃｌ−２の効果（図３）も決定した。
【０１２０】
Ｊｏｈｎｓｏｎ細胞を、２、３、および４ｍｍｏｌ／ＬのＬ−ｂｃｌ−２で処理した場合、Ｂｃｌ−２／アクチンタンパク質の比は、それぞれ２８、５７、および６４％阻害された。Ｂｃｌ−２タンパク質発現は、同じ用量のＬ−コントロールオリゴで処理した細胞で阻害されなかった。
【０１２１】
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、３および４ｍｍｏｌ／ＬのＬ−ｂｃｌ−２で処理した場合、Ｂｃｌ−２／アクチンタンパク質の比は、それぞれ４４％および５０％阻害された。Ｂｃｌ−２タンパク質は、同じ用量のＬ−コントロールオリゴを使用した場合、有意に阻害されなかった（図４）。
【０１２２】
Ｌ−ｂｃｌ−２およびＬ−コントロールオリゴでの処理の前後のＪｏｈｎｓｏｎおよびＪｕｒｋａｔ細胞におけるＢｃｌ−２／Ｂａｘタンパク質の比も決定した。Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｒａｊｉ、およびＤａｕｄｉ細胞はＢａｘタンパク質を発現したが、Ｊｕｒｋａｔ細胞は発現しなかった（図５）。Ｊｏｈｎｓｏｎ細胞を、２、３、および４ｍｍｏｌ／ＬのＬ−ｂｃｌ−２で処理した場合、Ｂａｘ／アクチンの比は改変されなかったが、Ｂｃｌ−２／Ｂａｘの比はそれぞれ１０％、４０％、および５０％減少した。これらのタンパク質比は、同じ用量のＬ−コントロールオリゴでの処理後に改変されなかった（図６）。
【０１２３】
Ｂｃｌ−２タンパク質の阻害はＦＬ細胞におけるアポトーシスを導く
Ｊｏｈｎｓｏｎ細胞で見られる増殖阻害効果がアポトーシスの誘導に関連し得るかどうかも研究した。Ｌ−ｂｃｌ−２とのインキュベーションの３日後、代表的なヌクレオソーム間ＤＮＡ分解パターンが観察されたが、Ｌ−コントロールオリゴとインキュベートした細胞は、ヌクレオソーム間ＤＮＡパターンを示さなかった（図７）。その後、アクリジンオレンジによるアポトーシスの定量を評価した。４および５μｍｏｌ／ＬのＬ−ｂｃｌ−２への曝露の３日後、アポトーシス細胞が明らかであった。未処理のＪｏｈｎｓｏｎ細胞のアポトーシスインデックスは３％であったが、４および５μｍｏｌ／ＬのＬ−ｂｃｌ−２で処理したＪｏｈｎｓｏｎ細胞のインデックスは、それぞれ４３％および６１％であった。アポトーシスインデックスの有意な増加は、リポソームコントロールオリゴヌクレオチドまたは空のリポソームで処理した細胞では見られなかった（図８）。
【０１２４】
Ｌ−ｂｃｌ−２は用量依存的様式でＢｃｌ−２タンパク質の発現および細胞増殖をダウンレギュレートする
細胞増殖の阻害は、ｔ（１４；１８）転座を有するＦＬ細胞株でのみ見られたが、細胞増殖阻害は、Ｂｃｌ−２発現（Ｄａｕｄｉ細胞）またはｔ（１４；１８）転座（ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞）のない細胞株では見られなかった。２つの異なるコントロールオリゴヌクレオチドへ曝露したＪｏｈｎｓｏｎ細胞において、非特異的毒性はなかった。増殖阻害効果は、３μｍｏｌ／ＬのＬ−ｂｃｌ−２の濃度で始まることが観察され得、そして阻害効果は６μｍｏｌ／Ｌ濃度で最大であった。処理した細胞は、代表的ＤＮＡヌクレオソーム間分解パターン、およびアクリジンオレンジによって測定した場合に増加したアポトーシスインデックスを示したので、Ｌ−ｂｃｌ−２がＪｏｈｎｓｏｎ細胞において増殖阻害を及ぼすメカニズムの１つは、アポトーシスの誘導を介するものであり得た。３日目までに、５μｍｏｌ／ＬのＬ−ｂｃｌ−２で処理したＪｏｈｎｓｏｎ細胞の６１％が、Ｌ−コントロールオリゴで処理した細胞では１５％であったのと比較してアポトーシスであった。アポトーシスは、他の細胞タイプで観察されなかった。
【０１２５】
したがって、Ｂｃｌ−２タンパク質の阻害は、生存性を維持するためのＢｃｌ−２タンパク質の存在に依存する細胞において、細胞増殖阻害を導く。遺伝子導入実験は、Ｂｃｌ−２が、インビトロでリンパ様細胞生存性を維持することに重要な役割を果たすという証拠を提供したが、他の自己分泌増殖因子もまた関連し得る（Ｖａｕｘら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３５５：４４０，１９８８；Ｒｅｅｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：３６６０，１９９０ｂ；ＢｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙおよびＮｅｃｋｅｒｓ，Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ，６：２１，１９９５）。ホスホロチオネートアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、Ｃｏｔｔｅｒおよび共同研究者らは、ｔ（１４；１８）転座を有しそしてＢｃｌ−２タンパク質を過剰発現するＤｏＨＨ２細胞株の増殖阻害を観察したが、ｔ（１４；１８）転座なしにＢｃｌ−２タンパク質を過剰発現するＦＣ１１細胞株では観察されなかった（Ｃｏｔｔｅｒら、１９９４）。Ｂｃｌ−２を過剰発現しそしてｔ（１４；１８）転座のない細胞は、アポトーシスおよび増殖阻止に駆動する、増殖因子喪失または化学療法薬物での処理のような、アポトーシス刺激を必要とし得る（Ｒｅｅｄ，１９９５）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｔ（１４；１８）転座なしに高レベルのＢｃｌ−２もまた過剰発現する細胞の化学療法剤耐性を逆転させるために使用され得る（Ｋｉｔａｄａら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，４：７１，１９９４）。アポトーシス刺激と本発明の開示のＬ−Ｂｃｌ−２とのこのような組み合わせが、添付の請求の範囲の精神および範囲に包含されることが理解される。
【０１２６】
アポトーシス細胞死のプロモーターであるＢａｘは、他のＢｃｌ−２ファミリーメンバー機能のヘテロダイマー化および調節に関連する共通のパートナーであり得る（Ｓｅｄｌａｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７８３４，１９９５）。Ｂｃｌ−２：ＢａｘヘテロダイマーおよびＢａｘ：Ｂａｘホモダイマーの形成における平衡が、アポトーシスの分子調節における中心のようであることが示唆されている（Ｙｉｎら，１９９４）。さらに、近年の研究では、Ｂｃｌ−２：Ｂａｘの比は、ＩＬ−３依存的ＦＬ５．１２細胞における細胞死と相関した。約半分以上のＢａｘがＢｃｌ−２とヘテロダイマー化された場合、アポトーシスは阻害された（Ｙａｎｇら，１９９５）。Ｌ−ｂｃｌ−２とのインキュベーション後にＪｏｈｎｓｏｎ細胞で観察されたアポトーシス死は、Ｂｃｌ−２：Ｂａｘ比の減少およびより多くのＢａｘ：Ｂａｘホモダイマーの形成に起因し得た。
【０１２７】
別の説明は、Ｃ−ＭＹＣおよびｐ５３のような他のガン遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子が、他の細胞株の生存に関連し得るということである。例えば、Ｃ−ＭＹＣは、代表的には、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫でおよびいくつかの形質転換されたＦＬで発現される（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌおよびＫｏｒｓｍｅｙｅｒ，１９９１）。多くのヒト腫瘍に関連するサプレッサー遺伝子であるｐ５３遺伝子の変異はまた、これらの細胞株に関連し得；ｐ５３遺伝子は、Ｂａｘのアップレギュレーションによって細胞周期阻止およびアポトーシスを誘導するために、少なくとも一部は転写因子として機能する、ＤＮＡ結合タンパク質をコードする（ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ，Ｃｅｌｌ，７０：５２３，１９９２；Ｍｉｙａｓｈｉｔａら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９：１７９９，１９９４；ＭｉｙａｓｈｉｔａおよびＲｅｅｄ，Ｃｅｌｌ，８０：２９３，１９９５）。おそらく、Ｂｃｌ−２発現の阻害単独では、ｔ（１４；１８）転座を有するような高い発現レベルのＢｃｌ−２を有する細胞以外の細胞におけるアポトーシスおよび増殖阻害を誘導するために十分ではない。しかし、本明細書に記載のように、Ｌ−ｂｃｌ−２によるＢｃｌ−２／Ｂａｘの比の減少は、嚢胞性リンパ腫治療ならびにＢａｘが発現される細胞における他のＢｃｌ−２疾患への分子アプローチのための基礎を形成する。
【０１２８】
実施例４：ｐ５３核移入のＢｃｌ−２調節
野生型ｐ５３遺伝子を有する、ヒト前立腺ガン腫細胞株、ＬＮＣａＰ（Ｃａｒｒｏｌｌら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，２３：１２３−１３４，１９９３）を選択して、ｂｃｌ−２によるｐ５３依存的性のプログラムされた細胞死の阻害を研究した。安定なｂｃｌ−２発現ＬＮＣａＰ前立腺ガン腫細胞株を生成し、そしてウエスタンブロットによって確認した。ｂｃｌ−２の発現は、形態学的およびフローサイトメトリー分析によって評価される場合にコントロールクローンと比較して、γ−照射後のアポトーシス誘導に対して顕著な耐性を与えた（図９Ａおよび９Ｂ）。照射後４８時間まで、ｂｃｌ−２発現ＬＮＣａＰ細胞において、顕著な細胞死誘導は観察されなかった。さらに、照射前のＬＮＣａＰとＬＮＣａＰ−ｂｃｌ−２細胞との間の細胞周期分布の差、および細胞周期内の細胞の分布が照射後に変更される証拠はなかった。約６０％の非照射コントロール細胞は、Ｇ０／Ｇ１にあり、１８％がＳ期、および２２％がＧ２／Ｍにあり、これと比較して５９％の非照射ＬＮＣａＰ−ｂｃｌ−２細胞がＧ０／Ｇ１、２１％がＳ期、および２０％がＧ２／Ｍにある。これらの値は、照射後３０分、１時間、２時間、４時間、および８時間で観察された値と著しく異ならなかった。
【０１２９】
遺伝毒性傷害に応じて誘導されたアポトーシスは、ｐ５３依存的であると考えられる。ＬＮＣａＰ細胞では、総細胞性ｐ５３タンパク質は、２０Ｇｙγ−照射後４時間以内に、ｂｃｌ−２発現クローンおよびコントロールトランスフェクタントのほぼ等価なレベルまで誘導された（図１０Ａ）。単離された核を使用するウエスタンブロット分析は、核中のｐ５３タンパク質のレベルがコントロールＬＮＣａＰにおいて照射の２時間以内に増加するが、ｂｃｌ−２発現ＬＮＣａＰ細胞では増加しないことを明らかにした（図１０Ａ）。この観察は、ＤＮＡ傷害後のｐ５３の核移入が、高レベルのｂｃｌ−２タンパク質に関連して損傷され得ることを示唆する。
【０１３０】
スキャンニング共焦点レーザー顕微鏡を使用して、照射後のｐ５３核移入をさらに特徴づけた。ｂｃｌ−２細胞における核ｐ５３移入の阻害は、ｐ５３タンパク質を認識する抗体を使用して共焦点顕微鏡によって確認された（図１０Ｂ）。したがって、２つの独立した技法によって、ｐ５３核移入は、電離放射線による細胞死誘導後のｂｃｌ−２発現細胞において著しく阻害されることを証明した。
【０１３１】
ｐ５３のトランス活性化能力がｂｃｌ−２タンパク質に関連した影響を及ぼすかどうかを決定するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、機能的ｐ５３結合部位を有するｍｄｍ−２プロモータールシフェラーゼリポーター構築物で、一過性でトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、野生型ｐ５３発現プラスミドでの同時トランスフェクション後に約８倍増加したが、変異体ｐ５３発現プラスミドでは増加しなかった（図１０Ｃ）。ｂｃｌ−２および野生型ｐ５３発現プラスミドの同時トランスフェクションは、野生型ｐ５３単独と比較してルシフェラーゼ活性の２〜４倍の減少を生じた（ｐ≦０．０２）。
【０１３２】
野生型ｐ５３の核輸移入を阻害するｂｃｌ−２の能力がＬＮＣａＰ前立腺ガン細胞株に特異的であるかどうかを評価するために、ＲＫＯ結腸ガン腫細胞株を使用して、さらなる研究を行った。ＲＫＯ細胞は、野生型ｐ５３遺伝子を有し（Ｎａｇａｓａｗａら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５５，１８４２−１８４６，１９９５）、そしてまたｂｃｌ−２タンパク質を発現する。ＲＫＯ細胞におけるｂｃｌ−２発現をダウンレギュレートするために、ｂｃｌ−２特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを、リポソームによって送達した。Ｂｃｌ−２タンパク質レベルは、空のリポソームまたはコントロールオリゴヌクレオチドを含むリポソームで処理したＲＫＯ細胞と比較して、３倍減少した（図１１Ａ）。共焦点顕微鏡を使用して、アンチセンスｂｃｌ−２オリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチドを含むリポソームで処理したＲＫＯ細胞において、１０Ｇｙのγ−照射後４時間のｐ５３タンパク質をイメージングした。コントロールオリゴヌクレオチドで処理したＲＫＯ細胞は、ほとんどのｐ５３タンパク質がサイトゾルに局在したままであることを示した（図１１Ｂ）。逆に、ｂｃｌ−２がアンチセンスオリゴヌクレオチドによってダウンレギュレートされているＲＫＯ細胞は、コントロールオリゴヌクレオチドで処理したＲＫＯ細胞と比較して、核内で高レベルのｐ５３タンパク質および有意な（ｐ≦０．００５）細胞死誘導を示した（図１１Ｃ）。これらの所見は、ＤＮＡ傷害に応じて野生型ｐ５３タンパク質の移入を調節するためのｂｃｌ−２の能力が細胞タイプ特異的ではないことを示唆する。
【０１３３】
照射およびカルセイン−ＡＭ染色
細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で２０分間１ｍｇ／ｍｌでカルセイン−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）をプレロード（ｐｒｅｌｏａｄｅｄ）した。細胞を、１３７Ｃｓγ源を使用して２０Ｇｙの放射を与え、そしてカルセイン生成した蛍光を、エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）光学およびＦＩＴＣフィルター（５３０ｎｍ発光）を使用して可視化した。ＬＮＣａＰ細胞においてアポトーシスの最大レベルを誘導するために必要な最少用量として、２０Ｇｙ用量の放射を選択した。
【０１３４】
フローサイトメトリー分析
ＬＮＣａＰ細胞における細胞周期および細胞死誘導のフローサイトメトリー分析。単一細胞懸濁液を７０％エタノールで固定し、そして５０ｍｇ／ｍｌプロピジウムヨード（ＰＩ）および２０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮＡｓｅとともに３７℃にて１５分間インキュベートした。フロー分析を、４８８ｎｍ励起でＥＰＩＣＳ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｉで行い、そしてＥｌｉｔｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ４．０（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）およびＭｕｌｔｉ  Ｃｙｃｌｅ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓプログラムソフトウエア（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、ＰＩ蛍光について収集した。
【０１３５】
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
ＬＮＣａＰ細胞を、既述のように（Ｍａｒｉｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１２，２２５９−６６，１９９６；Ｔｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，９３，１４７−１５５，１９９５）ｂｃｌ−２  ｃＤＮＡインサートを有するまたは有さない（コントロール）脾臓フォーカス形成ウイルス発現プラスミドでトランスフェクトした。エフェクタープラスミドＬＴＲＸＡおよびＬＴＲＫＨ発現プラスミドはこれまでに記載されており（Ｄｅｆｉｌｅら，１９９３）、そしてそれぞれ野生型および変異体ｐ５３を表す。リポータープラスミドＰ２ｍｄｍ２−Ｌｕｃを、マウスｍｄｍ２遺伝子からのｐ５３応答性エレメントを含む１Ｋｂ  Ｘｈｏｌ−フラグメントをｐＡ３−ルシフェラーゼプラスミドのＳｍａｌ部位にクローニングすることによって作製した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、トランスフェクションの２４時間前にプレート当たり０．５×１０６細胞の密度でプレートした。エフェクター野生型または変異体ｐ５３プラスミド（１０μｇ）、リポータープラスミドＰ２ｍｄｍ２−Ｌｕｃ（４μｇ）、およびβ−ガラクトシダーゼ（βｇａｌ）発現プラスミド（３μｇ）を、リン酸カルシウム法後にｂｃｌ−２ベクター（２０μｇ）とともにまたはなしで同時トランスフェクトした。トランスフェクトしたＤＮＡの総量を、すべてのトランスフェクションについて、ｐ−ＧＥＭプラスミドを３７μｇの総ＤＮＡまで添加することによって標準化した。トランスフェクション後４８時間に、細胞を採取した。抽出物を作製し、そしてルシフェラーゼ活性についてアッセイした。
【０１３６】
免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡分析
ＬＮＣａＰコントロールおよびＬＮＣａＰ−ｂｃｌ−２細胞を、ラミニンでコートしたカバースライド上で増殖させ、そして２０Ｇｙで照射した。４時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、そしてＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞をＰＢＳ中１０％ヤギ血清でブロックし、１０％ヤギ血清中でｐ５３（ＡＢ−２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）抗体（７５：１）とともにインキュベートし、２回洗浄し、そして１０％ヤギ血清中でフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識二次抗体（２００：１）とともにインキュベートした。イメージングを、Ｚｅｉｓｓ走査型共焦点レーザー顕微鏡を使用して行った。
【０１３７】
ＲＫＯ細胞を、ラミニンでコートしたカバースライド上で増殖させ、そして５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃にて３日間、１０μＭの最終濃度でリポソームオリゴヌクレオチド処方物とともにインキュベートした。１０Ｇｙでの照射後４時間で、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、そしてＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞をＰＢＳ中１０％ヤギ血清でブロックし、１０％ヤギ血清中でｐ５３（ＡＢ−２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）抗体（７５：１）とともにインキュベートし、２回洗浄し、そして１０％ヤギ血清中でフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識二次抗体（２００：１）とともにインキュベートした。共焦点顕微鏡分検査を、Ｚｅｉｓｓ走査型共焦点レーザー顕微鏡を使用して行った。
【０１３８】
アンチセンスおよびＤＮＡ方法
ｐ−エトキシ−オリゴヌクレオチド、非イオン性およびヌクレアーゼ耐性ホスホジエステルアナログを、Ｏｌｉｇｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （Ｗｉｌｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ）から購入した。ヒトｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの翻訳開始部位に特異的なオリゴヌクレオチド：５’ＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴＣＣＴＴＣ３’（配列番号１）を、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用した。使用したコントロールオリゴヌクレオチドは、スクランブル型のＢｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド５’ＡＣＧＧＴＣＣＧＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＣＣ３’（配列番号２）であった。ＤＭＳＯに溶解したｐ−エトキシ−オリゴヌクレオチドを、過剰のｔｅｒｔ−ブタノールの存在下でリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）に添加した。混合物を、ドライアイス／アセトン浴中で凍結し、一晩凍結乾燥し、そして０．１ｍｍｏｌ／Ｌの最終オリゴヌクレオチド濃度で０．９％生理食塩水で水和した。空のリポソームを、オリゴヌクレオチドが調製物中に含まれないこと以外は、上記と同様に調製した。０．２５×１０５細胞／ｍＬを、２４ウェルプレート中のそれぞれ０．５ｍＬの培地中に播種した。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃にて３日間、１０μＭの最終濃度で、アンチセンス、コントロールオリゴヌクレオチドおよび空のリポソームとインキュベートした。コントロールおよびｂｃｌ−２でトランスフェクトしたクローンの全細胞抽出物（４０μｇ）のウエスタンブロッティングを、抗ｂｃｌ−２モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を使用するｂｃｌ−２タンパク質についての免疫ブロッティングによって分析した。
【０１３９】
細胞および核抽出物におけるタンパク質発現の分析
γ−照射後のｐ５３タンパク質誘導および核への輸送のウエスタンブロット分析。コントロールＬＮＣａＰおよびＬＮＣａＰ−ｂｃｌ−２細胞のサブコンフルエント培養物に、２０Ｇｙを照射した。核の抽出物を、低張溶解緩衝液（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ  ７．４、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭβ−メルカプトエタノール、および５ｎｇ／ｍｌロイペプチン）中に細胞単層を掻き落とすことによって調製した。氷上で１０分後、ＮＰ−４０を０．６２５％まで添加し、そして粗核ペレットを、２０００×ｇで５分間の遠心分離によって回収した。核ペレットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料ローディング緩衝液に溶解した。核および全細胞の抽出物を、照射後２および４時間に調製した。ライセートの等量を、ｐ５３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）での免疫ブロッティングによって分析した。  
【０１４０】
核の抽出物を、低張溶解緩衝液（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ  ７．４、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭβ−メルカプトエタノール、および５ｎｇ／ｍｌロイペプチン）中に細胞単層を掻き落とすことによって調製した。氷上で１０分後、ＮＰ−４０を０．６２５％まで添加し、そして粗核ペレットを、２０００×ｇで５分間の遠心分離によって回収した。核ペレットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料ローディング緩衝液に溶解した。
【０１４１】
実施例５：インビボ試験
インビボ試験の最初のラウンドでは、約５〜６週齢の３０匹のヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスに、それぞれ３，０００，０００のＪｏｈｎｓｏｎ細胞、ｔ（１４；１８）転座を有する濾胞性リンパ腫細胞を腹腔内注射した。それぞれ１０匹のマウスの３群を使用した：未処理マウス（Ｉ群）、リポソームｐ−エトキシＢｃｌ−２アンチセンス処理マウス（ＩＩ群）、およびリポソームＢｃｌ−２コントロール処理マウス（ＩＩＩ群）。腫瘍移植後１週に、ＩＩおよびＩＩＩ群のマウスに、リポソームＢｃｌ−２アンチセンスオリゴ、またはリポソームＢｃｌ−２コントロールオリゴの隔週の静脈内注射を投与した。オリゴ用量は、１５ｍｇ／ｋｇマウス体重である。
【０１４２】
５０日目までに瀕死の状態（１．５ｃｍ３を越える腫瘍サイズと定義される）に達した数匹のマウスが観察された。移植後７０日目（処理の６３日目）に、ＩおよびＩＩＩ群では６匹のマウス（６０％）が瀕死の状態に達しそしてこれらを屠殺し、一方、ＩＩ群では２匹のみのマウス（２０％）が瀕死の状態に達しそしてこれらを屠殺した。１匹の他のマウスは、７７日目（処理の７０日目）までに瀕死の状態に達した。研究を７８日目に終了した。肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺、胃、小腸、および骨髄からの組織を、組織病理研究のために収集した。したがって、予備的インビボ結果は、中性リポソーム中の送達されたアンチセンスＢｃｌ−２が、マウスにおいて濾胞性リンパ腫を阻害することに効果的であることを示す。
【０１４３】
実施例６：臨床試験
この実施例は、脂質に会合したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド組成物を使用するヒト処置プロトコルの開発に関する。これらの脂質処方物は、形質転換されたまたはガン細胞がある役割を果たす種々のｂｃｌ−２過剰発現ガンおよび疾患の臨床処置における使用のものである。このような処置は、抗腫瘍治療、例えば、ＦＬの患者を処置することに、特に有用なツールである。この処置はまた、濾胞性および非濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病、ならびに形質細胞異形成を含む、白血病およびリンパ腫の両方の血液学的悪性疾患；乳ガン、前立腺ガン、および結腸ガンに付随するような固形腫瘍；ならびに免疫障害のような、ｂｃｌ−２過剰発現によって媒介されそして従来の養生法および処置に耐性である他の状態を処置することに有用である。
【０１４４】
患者の処置およびモニタリングを含む臨床試験を行うことの種々のエレメントは、本開示を考慮に入れれば当業者に公知である。以下の情報を、臨床試験において、単独かまたは抗ガン薬物と組み合わせた、脂質に会合したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド組成物を確立することにおける使用のための一般的指針として提示する。
【０１４５】
第１相臨床試験のための候補は、すべての従来の治療が失敗した患者である。リポソームＢｃｌ−２アンチセンスオリゴが、試験的な週１回の基準で患者に静脈内投与される。疾患の経過をモニターしそして抗腫瘍応答を評価するために、患者が毎月適切な腫瘍マーカーについて検査されるべきであることが意図される。薬物の有効性を評価するために、以下のパラメーターをモニターする：腫瘍サイズおよびガン細胞の骨髄浸潤。患者の経過および処置の有効性をモニターするために使用される試験には、以下が含まれる：理学的検査、Ｘ線、血液研究、および他の臨床実験室的方法論。さらに、末梢血および骨髄試料を採取して、標的タンパク質発現の変化を評価する。第１相研究で与えられる用量は、標準的第１相臨床試験で行われるように段階的に増加され、すなわち、用量は、最大許容範囲が達成されるまで段階的に増加される。
【０１４６】
臨床応答は、許容可能な測定によって定義され得る。例えば、完全な応答は、少なくとも２ヶ月間のガン細胞の証拠の完全な消失によって定義され得る。それに対して、部分応答は、少なくとも２ヶ月間のガン細胞の５０％減少によって定義され得る。
【０１４７】
実施例７：ヒト処置および臨床プロトコル
この実施例は、脂質に会合したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの組成物を、単独でまたは抗ガン薬物と組み合わせて使用して、ｂｃｌ−２媒介された疾患の処置を容易にするためのプロトコルを記載する。
【０１４８】
代表的には、処置のための候補である患者はＦＬの患者であるが、白血病およびリンパ腫の両方の血液学的悪性疾患；乳ガン、前立腺ガン、および結腸ガンに関連するもののような固形腫瘍；および免疫障害の患者もまた、本発明の方法で処置され得る。処置の代表的経過は、個々の患者および当業者に公知の方法で処置される疾患に依存して変化する。例えば、ＦＬの患者は、８週間のサイクルで処置され得るが、患者に有害な効果が観察されないならばより長い期間が使用され得、そして患者が見込まれたほどには処置に寛容でないならばより短い処置期間となり得る。各サイクルは、等しく間隔をあけた２０と３５との間の用量からなるが、これも臨床状況に依存して変化され得る。
【０１４９】
ＦＬのようなｂｃｌ−２媒介状態を示す患者は、以下のプロトコルを使用して処置され得る。患者は、それまでに化学療法、放射線治療、または遺伝子治療処置を受けていてもよいが、その必要はない。最適には、患者は、適切な骨髄機能（＞２，０００／ｍｍ３の末梢絶対顆粒球数および１００，０００／ｍｍ３の血小板数として定義される）、適切な肝機能（ビリルビン１．５ｍｇ／ｄｌ）、ならびに適切な腎臓機能（クレアチニン１．５ｍｇ／ｄｌ）を示す。
【０１５０】
ｂｃｌ−２の過剰発現は、代表的には、治療の前、最中、および後にモニターされる。本発明の組成物は、代表的には、所望のように標準的な周知の非毒性の生理学的に受容可能なキャリア、アジュバント、およびビヒクルを含む投与単位処方物で、経口または非経口投与される。本明細書で使用される場合、用語、非経口には、皮下注射、静脈内、筋肉内、動脈内注射、または注入技術が挙げられる。脂質に会合したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組成物は、他の抗ガン剤の前、後、または同時に患者に送達され得る。
【０１５１】
代表的な処置経過は、７〜２１日の期間にわたって送達される約６用量を含み得る。臨床医による選択の際、養生法は、３週毎に６用量またはより少ない頻度（毎月、隔月、年に４回など）の基準で続けられ得る。もちろん、これらは、単に例示的な処置時間であり、そして当業者は多くの他の時間経過が可能であることを容易に認識する。
【０１５２】
本発明に記載の方法および組成物を使用してｂｃｌ−２過剰発現ガン細胞を殺すために、一般的には、標的細胞を既述の脂質に会合した処方物と接触させる。これらの組成物は、細胞を殺すまたは細胞の増殖を阻害するための有効量で提供される。
【０１５３】
脂質に会合した処方物の局所送達は、臨床疾患を妨げるための治療有効用量を送達するための効率的方法である。あるいは、全身送達が適切であり得る。本発明の治療組成物は、腫瘍の部位で患者に直接投与され得る。これは、本質的に、ガンの表面の局所的処置である。組成物の容量は、通常、腫瘍の全体の表面が、脂質に会合したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組成物によって接触することを確実にするために十分であるべきである。
【０１５４】
１つの実施態様では、投与は、単に、治療組成物の腫瘍への注射を伴う。別の実施態様では、カテーテルが、腫瘍の部位に挿入され、そしてその腔は、所望の期間にわたり連続的に灌流され得る。
【０１５５】
もちろん、上記の処置養生法は、実施例５に記載の臨床試験のような臨床試験から得られた知見に従って変更され得る。当業者は、本明細書に開示された情報を得、そして本明細書に記載された臨床試験に基づいて処置養生法を最適化し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに証明するために含まれる。本発明は、本明細書に示される特定の実施態様の詳細な説明と組み合わせて１つ以上のこれらの図面を参照してよりよく理解され得る。
【図１】リポソーム−ｂｃｌ−２−アンチセンスオリゴヌクレオチド（「Ｌ−ｂｃｌ−２」）によるリンパ様細胞の増殖阻害。３μｍｏｌ／Ｌ（点）、４μｍｏｌ／Ｌ（横線）、５μｍｏｌ／Ｌ（縦線）、および６μｍｏｌ／Ｌ（斜線）の最終濃度のＬ−ｂｃｌ−２を、Ｊｏｈｎｓｏｎ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｒａｊｉ細胞、およびＤａｕｄｉ細胞に添加した。５日後、腫瘍細胞の生存度を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ染料によって測定した。生存度を、未処理細胞のパーセントとして表した。
【図２】リポソームオリゴヌクレオチドの６μｍｏｌ／Ｌでのリンパ様細胞における非特異的毒性。空のリポソーム（斜線）および２つの異なるリポソームコントロールオリゴヌクレオチド（「Ｌ−コントロールオリゴ」）（灰色、黒色）を、６μｍｏｌ／Ｌ最終濃度で、Ｊｏｈｎｓｏｎ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｒａｊｉ細胞、およびＤａｕｄｉ細胞に添加した。５日後、腫瘍細胞の生存度を、ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ染料によって測定した。生存度を、未処理細胞のパーセントとして表した。
【図３】４つの細胞株におけるＢｃｌ−２タンパク質のウエスタンブロット分析。Ｊｏｈｎｓｏｎ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、およびＲａｊｉ細胞を、試料緩衝液に溶解し、そして総タンパク質含量について標準化した。２５グラムの総タンパク質を各レーンにロードした。メンブレンをハムスター抗ヒトｂｃｌ−２モノクローナル抗体とともにインキュベートした。ｔ（１４；１８）転座を有する細胞株であるＪｏｈｎｓｏｎ細胞では、Ｂｃｌ−２タンパク質の過剰発現が観察される。ｔ（１４；１８）転座のないＪｕｒｋａｔおよびＲａｊｉ細胞では、Ｂｃｌ−２の発現は低い。Ｄａｕｄｉ細胞では、Ｂｃｌ−２発現は観察されない。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂ：Ｌ−ｂｃｌ−２によるＪｏｈｎｓｏｎおよびＪｕｒｋａｔ細胞におけるＢｃｌ−２タンパク質の特異的阻害。図４Ａ：３ｍＬ中１×１０５Ｊｏｈｎｓｏｎ細胞／ｍＬを、３および４μｍｏｌ／ＬのＬ−ｂｃｌ−２またはＬ−コントロールオリゴで処理した。培養の３日後、タンパク質含有ライセートを調製し、そして５μｇの総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてニトロセルロースメンブレンに移した。ブロットを切片に切断し、そしてＢｃｌ−２またはアクチンのいずれかに特異的な抗体とともにインキュベートした（左）。ｂｃｌ−２タンパク質の阻害を推定するために、データを、スキャンニングデンシトメトリーによって定量し、そしてＢｃｌ−２：アクチンの比として表した（右）。Ｌ−ｂｃｌ−２：（黒四角）；Ｌ−コントロール：（白丸）。図４Ｂ：３ｍＬ中の１×１０５Ｊｕｒｋａｔ細胞／ｍＬを３および４μｍｏｌ／ＬのＬ−ｂｃｌ−２またはＬ−コントロールオリゴヌクレオチドで処理した。培養の３日後、タンパク質含有ライセートを調製し、そして２０μｇの総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてニトロセルロースメンブレンに移した。ブロットを切片に切断し、そしてＢｃｌ−２またはアクチンのいずれかに特異的な抗体とともにインキュベートした（左）。ｂｃｌ−２タンパク質の阻害を推定するために、データを、スキャンニングデンシトメトリーによって定量し、そしてＢｃｌ−２：アクチンの比として表した（右）。Ｌ−ｂｃｌ−２：（黒四角）；Ｌ−コントロール：（白丸）。
【図５】４つの細胞株におけるＢａｘタンパク質のウエスタンブロット分析。Ｊｏｈｎｓｏｎ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、およびＲａｊｉ細胞を、試料緩衝液に溶解し、そして総タンパク質含量について標準化した。５０μｇの総タンパク質を各レーンにロードした。メンブレンを、ウサギ抗ヒトＢａｘポリクローナル抗体とともにインキュベートした。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂ：Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ比は、Ｌ−ｂｃｌ−２によるＪｏｈｎｓｏｎ細胞における減少する。図６Ａ：３ｍＬにおいて１×１０５Ｊｏｈｎｓｏｎ細胞／ｍＬを、２、３、および４μｍｏｌ／ＬのＬ−ｂｃｌ−２またはＬ−コントロールオリゴで処理した。培養の３日後、タンパク質含有溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そしてニトロセルロースメンブレンに転写した。ブロットを切片に切断し、そしてＢａｘまたはアクチンのいずれかに特異的な抗体とともにインキュベートした。この実験を、図４Ａおよび４Ｂに示される実験で得られる同じ溶解物を使用して行った。図６Ｂ：データを、スキャンニングデンシトメトリーによって定量し、そしてＢｃｌ−２：Ｂａｘの比として表した。Ｌ−ｂｃｌ−２：（黒四角）；Ｌ−コントロールオリゴ：（白丸）。
【図７】Ｌ−Ｂｃｌ−２とインキュベートしたＪｏｈｎｓｏｎ細胞におけるＤＮＡフラグメント化。Ｊｏｈｎｓｏｎ細胞を、４μｍｏｌ／ＬのＬ−ｂｃｌ−２および２つのＬ−コントロールオリゴとインキュベートした。インキュベーションの３日後、ＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲルによって電気泳動し、そしてエチジウムブロミドで染色した。レーン１、未処理細胞；レーン２、Ｌ−コントロール（スクランブルした）オリゴで処理した細胞；レーン３、Ｌ−コントロール（ランダム）オリゴで処理した細胞；レーン４、Ｌ−ｂｃｌ−２で処理した細胞。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂ：Ｌ−ｂｃｌ−２でインキュベートしたアポトーシスＪｏｈｎｓｏｎ細胞。図８Ａ：５μｍｏｌ／ＬのＬ−ｂｃｌ−２（右）とのまたはリポソームオリゴヌクレオチド（「Ｌ−ＯＳ」）（左）なしでのインキュベーションの３日後、ＤＮＡ結合染料のアクリジンオレンジで染色したＪｏｈｎｓｏｎ細胞の蛍光写真。図８Ｂ：４および５μＭのＬ−ｂｃｌ−２（点）、Ｌ−コントロールオリゴ（横線）、または空のリポソーム（黒塗り）で処理したＪｏｈｎｓｏｎ細胞のアポトーシスインデックス。アポトーシスインデックス＝（アポトーシス核を有する細胞の総数／係数した細胞の総数）×１００％。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂ：ＬＮＣａＰコントロールおよびｂｃｌ−２トランスフェクトした細胞の照射後の細胞死の評価。図９Ａ：ＬＮＣａＰコントロールおよびｂｃｌ−２でトランスフェクトした細胞（ＬＮＣａＰ−ｂｃｌ−２）の照射後の細胞死誘導の蛍光顕微鏡評価。未処理コントロール（左上）、未処理のＬＮＣａＰ−ｂｃｌ−２細胞（左下）、２０Ｇｙγ−照射の２４時間後のコントロール細胞（右上）、および照射の２４時間後のＬＮＣａＰ−ｂｃｌ−２細胞（右下）。アポトーシスの特徴的特徴を示した細胞は、コントロールで普通に観察されるが、照射後のＬＮＣａＰ−ｂｃｌ−２細胞では観察されない。図９Ｂ：ＬＮＣａＰ細胞における２０Ｇｙのγ−照射後の細胞死誘導のフローサイトメトリー分析。アポトーシス細胞は、照射の８時間後にＬＮＣａＰベクターコントロール細胞集団の約３０％を含み、そして照射したＬＮＣａＰ−ｂｃｌ−２細胞では＜５％を含む。
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂおよび図１０Ｃ：ｐ５３誘導、細胞下の局在化、および転写制御。図１０Ａ：ＬＮＣａＰコントロールおよびＬＮＣａＰ−ｂｃｌ−２細胞におけるγ−照射後のｐ５３タンパク質誘導および核移入のウエスタンブロット分析。コントロールＬＮＣａＰおよびＬＮＣａＰ−ｂｃｌ−２細胞のサブコンフルエント培養物を、２０Ｇｙで照射した。細胞全体または細胞全体から単離した核の抽出物を、照射後２および４時間に調製した。溶解物の等価のマウントを、ｐ５３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）での免疫ブロッティングによって分析した。対応するデンシトメトリースキャンは、照射後に誘導したｐ５３タンパク質のマウントが、ＬＮＣａＰコントロールおよびＬＮＣａＰ−ｂｃｌ−２細胞からの細胞全体抽出物においてほぼ等価であることを示す。しかし、ｐ５３タンパク質の核蓄積は、照射したＬＮＣａＰコントロール細胞から単離された核でのみ観察される。図１０Ｂ：照射後のｐ５３細胞下局在化の共焦点顕微鏡分析。ＬＮＣａＰコントロール（左）およびＬＮＣａＰ−ｂｃｌ−２（右）細胞を、２０Ｇｙで照射し、４時間後に固定し、そしてｐ５３タンパク質を共焦点レーザー顕微鏡をスキャンすることによってイメージングした。ｐ５３タンパク質の核局在化は、ＬＮＣａＰコントロール細胞でのみ観察される。図１０Ｃ：ｗｔ−ｐ５３による転写活性化のＢｃｌ−２阻害。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、リン酸カルシウム法を使用して、ｂｃｌ−２発現ベクター（ＢＣＬ−２）（２０μｇ）を含むかまたは含まない、エフェクター野生型（Ｐ５３  ＷＴ）または変異体ｐ５３（Ｐ５３  ＭＵＴ）プラスミド（１０μｇ）、リポータープラスミドＰ２ｍｄｍ２−Ｌｕｃ（４μｇ）、およびβ−ガラクトシダーゼ（βｇａｌ）発現プラスミド（３μｇ）でトランスフェクトした。空のエフェクターベクター（ＶＥＣＴＯＲ）での同時トランスフェクションを、ネガティブコントロールとして用いた。データは、ルシフェラーゼ活性の増加倍数を表す。Ｂｃｌ−２は、野生型ｐ５３タンパク質がｍｄｍ２プロモーターをトランス活性化する能力を有意に阻害した（＊ｐ≦０．０２）。
【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂ：アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＲＫＯ結腸ガン細胞におけるｂｃｌ−２のダウンレギュレーションおよびｐ５３の局在化。図１１Ａ：ＲＫＯ結腸ガン細胞におけるｂｃｌ−２タンパク質の選択的ダウンレギュレーション。細胞全体抽出物（４０μｇ）のウエスタンブロッティングを、ｂｃｌ−２タンパク質についての免疫ブロッティングによって分析した。タンパク質ローディングの基準化後のｂｃｌ−２タンパク質の相対マウントのグラフ表示を示す。アンチセンスｂｃｌ−２オリゴヌクレオチドでの処理は、ｂｃｌ−２タンパク質の量の減少を生じたが、コントロールオリゴヌクレオチドまたは空のリポソームでは減少しなかった。図１１Ｂ：コントロールオリゴヌクレオチド（上）またはアンチセンス−ｂｃｌ−２オリゴヌクレオチド（下）で処理した照射したＲＫＯ細胞におけるｐ５３タンパク質の共焦点顕微鏡。照射後のｐ５３タンパク質の顕著な核局在化は、アンチセンス−ｂｃｌ−２処理したＲＫＯ細胞でのみ観察される。
【０１５７】
（配列表）
SEQUENCE LISTING 
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT: Board of Regents, The University of Texas System
(ii) TITLE OF INVENTION: INHIBITION OF Bcl-2 PROTEIN EXPRESSION
BY LIPOSOMAL ANTISENSE OLIGODEOXYNUCLEOTIDES
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 7  
(iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:
(A) ADDRESSEE: Arnold, White & Durkee
(B) STREET: P.O. Box 4433
(C) CITY: Houston
(D) STATE: Texas
(E) COUNTRY: United States of America
(F) ZIP: 77210
(v) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(vi) CURRENT APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: pct/us97/18348
(B) FILING DATE:  1997-10-03
(C) CLASSIFICATION: Unknown
(viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:
(A) NAME: Wilson, Mark B.
(B) REGISTRATION NUMBER: 37,259
(C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: UTFC:550-JP
(ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:
(A) TELEPHONE: (512) 418-3000
(B) TELEFAX: (512) 474-7577
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ACGGTCCGCC ACTCCTTCCC                                                  20
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 16 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
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CTGAAGGGCT TCTTCC                                                      16
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(A) LENGTH: 5086 base pairs
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(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
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GCGCCCGCCC CTCCGCGCCG CCTGCCCGCC CGCCCGCCGC GCTCCCGCCC GCCGCTCTCC      60
GTGGCCCCGC CGCGCTGCCG CCGCCGCCGC TGCCAGCGAA GGTGCCGGGG CTCCGGGCCC     120
TCCCTGCCGG CGGCCGTCAG CGCTCGGAGC GAACTGCGCG ACGGGAGGTC CGGGAGGCGA     180
CCGTAGTCGC GCCGCCGCGC AGGACCAGGA GGAGGAGAAA GGGTGCGCAG CCCGGAGGCG     240
GGGTGCGCCG GTGGGGTGCA GCGGAAGAGG GGGTCCAGGG GGGAGAACTT CGTAGCAGTC     300
ATCCTTTTTA GGAAAAGAGG GAAAAAATAA AACCCTCCCC CACCACCTCC TTCTCCCCAC     360
CCCTCGCCGC ACCACACACA GCGCGGGCTT CTAGCGCTCG GCACCGGCGG GCCAGGCGCG     420
TCCTGCCTTC ATTTATCCAG CAGCTTTTCG GAAAATGCAT TTGCTGTTCG GAGTTTAATC     480
AGAAGACGAT TCCTGCCTCC GTCCCCGGCT CCTTCATCGT CCCATCTCCC CTGTCTCTCT     540
CCTGGGGAGG CGTGAAGCGG TCCCGTGGAT AGAGATTCAT GCCTGTGTCC GCGCGTGTGT     600
GCGCGCGTAT AAATTGCCGA GAAGGGGAAA ACATCACAGG ACTTCTGCGA ATACCGGACT     660
GAAAATTGTA ATTCATCTGC CGCCGCCGCT GCCAAAAAAA AACTCGAGCT CTTGAGATCT     720
CCGGTTGGGA TTCCTGCGGA TTGACATTTC TGTGAAGCAG AAGTCTGGGA ATCGATCTGG     780
AAATCCTCCT AATTTTTACT CCCTCTCCCC CCGACTCCTG ATTCATTGGG AAGTTTCAAA     840
TCAGCTATAA CTGGAGAGTG CTGAAGATTG ATGGGATCGT TGCCTTATGC ATTTGTTTTG     900
GTTTTACAAA AAGGAAACTT GACAGAGGAT CATGCTGTAC TTAAAAAATA CAAGTAAGTC     960
TCGCACAGGA AATTGGTTTA ATGTAACTTT CAATGGAAAC CTTTGAGATT TTTTACTTAA    1020
AGTGCATTCG AGTAAATTTA ATTTCCAGGC AGCTTAATAC ATTGTTTTTA GCCGTGTTAC    1080
TTGTAGTGTG TATGCCCTGC TTTCACTCAG TGTGTACAGG GAAACGCACC TGATTTTTTA    1140
CTTATTAGTT TGTTTTTTCT TTAACCTTTC AGCATCACAG AGGAAGTAGA CTGATATTAA    1200
CAATACTTAC TAATAATAAC GTGCCTCATG AAATAAAGAT CCGAAAGGAA TTGGAATAAA    1260
AATTTCCTGC GTCTCATGCC AAGAGGGAAA CACCAGAATC AAGTGTTCCG CGTGATTGAA    1320
GACACCCCCT CGTCCAAGAA TGCAAAGCAC ATCCAATAAA ATAGCTGGAT TATAACTCCT    1380
CTTCTTTCTC TGGGGGCCGT GGGGTGGGAG CTGGGGCGAG AGGTGCCGTT GGCCCCCGTT    1440
GCTTTTCCTC TGGGAAGG ATG GCG CAC GCT GGG AGA ACG GGG TAC GAC AAC      1491
Met Ala His Ala Gly ArgThr Gly TyrAsp Asn  
1               5                  10      
CGG GAG ATA GTG ATG AAG TAC ATC CAT TAT AAG CTG TCG CAG AGG GGC      1539
Arg Glu IleVal Met Lys Tyr Ile His Tyr LysLeu Ser Gln Arg Gly  
15                  20                  25          
TAC GAG TGG GAT GCG GGA GAT GTG GGC GCC GCG CCC CCG GGG GCC GCC      1587
Tyr Glu TrpAsp Ala Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala  
30                  35                  40              
CCC GCA CCG GGC ATC TTC TCC TCCCAG CCC GGG CAC ACG CCC CAT CCA      1635
Pro Ala Pro Gly Ile Phe Ser SerGln Pro Gly His Thr Pro His Pro  
45                  50                  55                  
GCC GCA TCC CGC GAC CCG GTC GCC AGG ACC TCG CCG CTG CAG ACC CCG      1683
Ala Ala Ser ArgAsp Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro  
60                  65                  70                  75  
GCT GCC CCC GGC GCC GCC GCG GGG CCT GCG CTC AGC CCG GTG CCA CCT      1731
Ala Ala Pro GlyAla Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro  
80                  85                  90      
GTG GTC CAC CTG GCC CTC CGC CAA GCC GGC GAC GAC TTC TCC CGC CGC      1779
Val Val His LeuAla Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser ArgArg  
95                 100                 105          
TAC CGC GGC GAC TTC GCC GAG ATG TCC AGC CAG CTG CAC CTG ACG CCC      1827
Tyr Arg GlyAsp Phe Ala Glu Met Ser Ser Gln LeuHis Leu Thr Pro  
110                 115                 120              
TTC ACC GCG CGG GGA CGC TTT GCC ACG GTG GTG GAG GAG CTC TTC AGG      1875
Phe Thr Ala Arg Gly ArgPhe Ala Thr Val Val Glu GluLeu Phe Arg 
125                 130                 135                  
GAC GGG GTG AAC TGG GGG AGG ATT GTG GCC TTC TTT GAG TTC GGT GGG      1923
Asp Gly Val AsnTrp Gly ArgIle Val Ala Phe Phe Glu PheGly Gly  
140                 145                 150                 155  
GTC ATG TGT GTG GAG AGC GTC AAC CGG GAG ATG TCG CCC CTG GTG GAC      1971
Val Met Cys Val Glu Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp  
160                 165                 170      
AAC ATC GCC CTG TGG ATG ACT GAG TAC CTG AAC CGG CAC CTG CAC ACC      2019
Asn Ile Ala Leu Trp Met ThrGlu Tyr LeuAsn Arg His Leu His Thr  
175                 180                 185          
TGG ATC CAG GAT AAC GGA GGC TGG GAT GCC TTT GTG GAA CTG TAC GGC      2067
Trp Ile GlnAsp Asn Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu LeuTyr Gly  
190                 195                 200              
CCC AGC ATG CGG CCT CTG TTT GAT TTC TCC TGG CTG TCT CTG AAG ACT      2115
Pro Ser Met Arg Pro Leu Phe Asp PheSer Trp Leu Ser Leu Lys Thr  
205                 210                 215                  
CTG CTC AGT TTG GCC CTG GTG GGA GCT TGC ATC ACC CTG GGT GCC TAT      2163
Leu Leu Ser Leu Ala Leu Val Gly Ala Cys IleThr Leu GlyAla Tyr  
220                 225                 230                 235  
CTG AGC CAC AAG TGAAGTCAAC ATGCCTGCCC CAAACAAATA TGCAAAAGGT          2215
Leu Ser His Lys                                             
TCACTAAAGC AGTAGAAATA ATATGCATTG TCAGTGATGT ACCATGAAAC AAAGCTGCAG    2275
GCTGTTTAAG AAAAAATAAC ACACATATAA ACATCACACA CACAGACAGA CACACACACA    2335
CACAACAATT AACAGTCTTC AGGCAAAACG TCGAATCAGC TATTTACTGC CAAAGGGAAA    2395
TATCATTTAT TTTTTACATT ATTAAGAAAA AAGATTTATT TATTTAAGAC AGTCCCATCA    2455
AAACTCCGTC TTTGGAAATC CGACCACTAA TTGCCAAACA CCGCTTCGTG TGGCTCCACC    2515
TGGATGTTCT GTGCCTGTAA ACATAGATTC GCTTTCCATG TTGTTGGCCG GATCACCATC    2575
TGAAGAGCAG ACGGATGGAA AAAGGACCTG ATCATTGGGG AAGCTGGCTT TCTGGCTGCT    2635
GGAGGCTGGG GAGAAGGTGT TCATTCACTT GCATTTCTTT GCCCTGGGGG CGTGATATTA    2695
ACAGAGGGAG GGTTCCCGTG GGGGGAAGTC CATGCCTCCC TGGCCTGAAG AAGAGACTCT    2755
TTGCATATGA CTCACATGAT GCATACCTGG TGGGAGGAAA AGAGTTGGGA ACTTCAGATG    2815
GACCTAGTAC CCACTGAGAT TTCCACGCCG AAGGACAGCG ATGGGAAAAA TGCCCTTAAA    2875
TCATAGGAAA GTATTTTTTT AAGCTACCAA TTGTGCCGAG AAAAGCATTT TAGCAATTTA    2935
TACAATATCA TCCAGTACCT TAAACCCTGA TTGTGTATAT TCATATATTT TGGATACGCA    2995
CCCCCCAACT CCCAATACTG GCTCTGTCTG AGTAAGAAAC AGAATCCTCT GGAACTTGAG    3055
GAAGTGAACA TTTCGGTGAC TTCCGATCAG GAAGGCTAGA GTTACCCAGA GCATCAGGCC    3115
GCCACAAGTG CCTGCTTTTA GGAGACCGAA GTCCGCAGAA CCTACCTGTG TCCCAGCTTG    3175
GAGGCCTGGT CCTGGAACTG AGCCGGGCCC TCACTGGCCT CCTCCAGGGA TGATCAACAG    3235
GGTAGTGTGG TCTCCGAATG TCTGGAAGCT GATGGATGGA GCTCAGAATT CCACTGTCAA    3295
GAAAGAGCAG TAGAGGGGTG TGGCTGGGCC TGTCACCCTG GGGCCCTCCA GGTAGGCCCG    3355
TTTTCACGTG GAGCATAGGA GCCACGACCC TTCTTAAGAC ATGTATCACT GTAGAGGGAA    3415
GGAACAGAGG CCCTGGGCCT TCCTATCAGA AGGACATGGT GAAGGCTGGG AACGTGAGGA    3475
GAGGCAATGG CCACGGCCCA TTTTGGCTGT AGCACATGGC ACGTTGGCTG TGTGGCCTTG    3535
GCCACCTGTG AGTTTAAAGC AAGGCTTTAA ATGACTTTGG AGAGGGTCAC AAATCCTAAA    3595
AGAAGCATTG AAGTGAGGTG TCATGGATTA ATTGACCCCT GTCTATGGAA TTACATGTAA    3655
AACATTATCT TGTCACTGTA GTTTGGTTTT ATTTGAAAAC CTGACAAAAA AAAAGTTCCA    3715
GGTGTGGAAT ATGGGGGTTA TCTGTACATC CTGGGGCATT AAAAAAAAAT CAATGGTGGG    3775
GAACTATAAA GAAGTAACAA AAGAAGTGAC ATCTTCAGCA AATAAACTAG GAAATTTTTT    3835
TTTCTTCCAG TTTAGAATCA GCCTTGAAAC ATTGATGGAA TAACTCTGTG GCATTATTGC    3895
ATTATATACC ATTTATCTGT ATTAACTTTG GAATGTACTC TGTTCAATGT TTAATGCTGT    3955
GGTTGATATT TCGAAAGCTG CTTTAAAAAA ATACATGCAT CTCAGCGTTT TTTTGTTTTT    4015
AATTGTATTT AGTTATGGCC TATACACTAT TTGTGAGCAA AGGTGATCGT TTTCTGTTTG    4075
AGATTTTTAT CTCTTGATTC TTCAAAAGCA TTCTGAGAAG GTGAGATAAG CCCTGAGTCT    4135
CAGCTACCTA AGAAAAACCT GGATGTCACT GGCCACTGAG GAGCTTTGTT TCAACCAAGT    4195
CATGTGCATT TCCACGTCAA CAGAATTGTT TATTGTGACA GTTATATCTG TTGTCCCTTT    4255
GACCTTGTTT CTTGAAGGTT TCCTCGTCCC TGGGCAATTC CGCATTTAAT TCATGGTATT    4315
CAGGATTACA TGCATGTTTG GTTAAACCCA TGAGATTCAT TCAGTTAAAA ATCCAGATGG    4375
CGAATGACCA GCAGATTCAA ATCTATGGTG GTTTGACCTT TAGAGAGTTG CTTTACGTGG    4435
CCTGTTTCAA CACAGACCCA CCCAGAGCCC TCCTGCCCTC CTTCCGCGGG GGCTTTCTCA    4495
TGGCTGTCCT TCAGGGTCTT CCTGAAATGC AGTGGTCGTT ACGCTCCACC AAGAAAGCAG    4555
GAAACCTGTG GTATGAAGCC AGACCTCCCC GGCGGGCCTC AGGGAACAGA ATGATCAGAC    4615
CTTTGAATGA TTCTAATTTT TAAGCAAAAT ATTATTTTAT GAAAGGTTTA CATTGTCAAA    4675
GTGATGAATA TGGAATATCC AATCCTGTGC TGCTATCCTG CCAAAATCAT TTTAATGGAG    4735
TCAGTTTGCA GTATGCTCCA CGTGGTAAGA TCCTCCAAGC TGCTTTAGAA GTAACAATGA    4795
AGAACGTGGA CGTTTTTAAT ATAAAGCCTG TTTTGTCTTT TGTTGTTGTT CAAACGGGAT    4855
TCACAGAGTA TTTGAAAAAT GTATATATAT TAAGAGGTCA CGGGGGCTAA TTGCTAGCTG    4915
GCTGCCTTTT GCTGTGGGGT TTTGTTACCT GGTTTTAATA ACAGTAAATG TGCCCAGCCT    4975
CTTGGCCCCA GAACTGTACA GTATTGTGGC TGCACTTGCT CTAAGAGTAG TTGATGTTGC    5035
ATTTTCCTTA TTGTTAAAAA CATGTTAGAA GCAATGAATG TATATAAAAG C             5086
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 239 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:
Met Ala His Ala Gly Arg Thr GlyTyr Asp Asn Arg Glu IleVal Met 
1               5                  10                  15     
Lys Tyr IleHis Tyr Lys Leu Ser Gln ArgGly Tyr GluTrp Asp Ala 
20                  25                  30         
Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro GlyAla Ala Pro Ala Pro Gly Ile 
35                  40                  45             
Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp 
50                  55                  60                 
Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala 
65                  70                  75                  80 
Ala Ala GlyPro Ala Leu Ser Pro Val Pro ProVal Val His Leu Ala 
85                  90                  95     
Leu Arg GlnAla Gly Asp Asp Phe Ser Arg ArgTyr Arg GlyAsp Phe 
100                 105                 110         
Ala Glu Met Ser Ser Gln LeuHis Leu Thr Pro Phe Thr Ala ArgGly 
115                 120                 125             
Arg Phe Ala Thr Val Val GluGlu Leu PheArg Asp Gly Val Asn Trp 
130                 135                 140                 
Gly Arg IleVal Ala Phe Phe Glu Phe GlyGly Val Met Cys Val Glu 
145                 150                 155                 160 
Ser Val Asn ArgGlu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp 
165                 170                 175     
Met Thr GluTyr Leu AsnArg His Leu His Thr Trp IleGln Asp Asn 
180                 185                 190         
Gly Gly TrpAsp Ala Phe Val Glu Leu Tyr GlyPro Ser Met Arg Pro 
195                 200                 205             
Leu Phe Asp Phe Ser Trp LeuSer Leu Lys Thr Leu LeuSer Leu Ala 
210                 215                 220                 
Leu Val Gly Ala Cys Ile ThrLeu Gly Ala Tyr Leu Ser His Lys 
225                 230                 235                 
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 911 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 147..761
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:
TGATTGAAGA CACCCCCTCG TCCAAGAATG CAAAGCACAT CCAATAAAAT AGCTGGATTA      60
TAACTCCTCT TCTTTCTCTG GGGGCCGTGG GGTGGGAGCT GGGGCGAGAG GTGCCGTTGG     120
CCCCCGTTGC TTTTCCTCTG GGAAGG ATG GCG CAC GCT GGG AGA ACG GGG TAC      173
Met Ala His Ala Gly ArgThr Gly Tyr  
1               5                  
GAC AAC CGG GAG ATA GTG ATG AAG TAC ATC CAT TAT AAG CTG TCG CAG       221
Asp Asn ArgGlu Ile Val Met Lys Tyr IleHis Tyr Lys Leu Ser Gln  
10                  15                  20                  25  
AGG GGC TAC GAG TGG GAT GCG GGA GAT GTG GGC GCC GCG CCC CCG GGG       269
Arg Gly TyrGlu Trp Asp Ala Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly  
30                  35                  40      
GCC GCC CCC GCA CCG GGC ATC TTC TCC TCC CAG CCC GGG CAC ACG CCC       317
Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile PheSer Ser Gln Pro Gly His Thr Pro  
45                  50                  55          
CAT CCA GCC GCA TCC CGC GAC CCG GTC GCC AGG ACC TCG CCG CTG CAG       365
His Pro Ala Ala Ser Arg Asp Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln  
60                  65                  70              
ACC CCG GCT GCC CCC GGC GCC GCCGCG GGG CCT GCG CTC AGC CCG GTG       413
Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala Ala AlaGly Pro Ala Leu Ser Pro Val  
75                  80                  85                  
CCA CCT GTG GTC CAC CTG GCC CTC CGC CAA GCC GGC GAC GAC TTC TCC       461
Pro Pro Val ValHis Leu Ala Leu Arg Gln Ala GlyAsp Asp Phe Ser  
90                  95                 100                 105  
CGC CGC TAC CGC GGC GAC TTC GCC GAG ATG TCC AGC CAG CTG CAC CTG       509
Arg Arg TyrArg Gly Asp Phe Ala Glu Met Ser Ser Gln LeuHis Leu  
110                 115                 120      
ACG CCC TTC ACC GCG CGG GGA CGC TTT GCC ACG GTG GTG GAG GAG CTC       557
Thr Pro Phe Thr Ala Arg GlyArg Phe Ala Thr Val Val GluGlu Leu  
125                 130                 135          
TTC AGG GAC GGG GTG AAC TGG GGG AGG ATT GTG GCC TTC TTT GAG TTC       605
Phe Arg Asp Gly Val Asn TrpGly Arg IleVal Ala Phe Phe Glu Phe  
140                 145                 150              
GGT GGG GTC ATG TGT GTG GAG AGC GTC AAC CGG GAG ATG TCG CCC CTG       653
Gly Gly Val Met Cys Val Glu Ser Val Asn Arg GluMet Ser Pro Leu  
155                 160                 165                  
GTG GAC AAC ATC GCC CTG TGG ATG ACT GAG TAC CTG AAC CGG CAC CTG       701
Val Asp Asn IleAla Leu Trp Met Thr Glu TyrLeu Asn ArgHis Leu  
170                 175                 180                 185  
CAC ACC TGG ATC CAG GAT AAC GGA GGC TGG GTA GGT GCA TCT GGT GAT       749
His Thr TrpIle Gln Asp Asn Gly GlyTrp Val Gly Ala Ser Gly Asp  
190                 195                 200      
GTG AGT CTG GGC TGAGGCCACA GGTCCGAGAT CGGGGGTTGG AGTGCGGGTG           801
Val Ser Leu Gly                                             
205                                             
GGCTCCTGGG CAATGGGAGG CTGTGGAGCC GGCGAAATAA AATCAGAGTT GTTGCTTCCC     861
GGCGTGTCCC TACCTCCTCC TCTGGACAAA GCGTTCACTC CCAACCTGAC                911
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 205 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:
Met Ala His Ala Gly Arg Thr GlyTyr Asp Asn Arg Glu IleVal Met 
1               5                  10                  15     
Lys Tyr IleHis Tyr Lys Leu Ser Gln ArgGly Tyr GluTrp Asp Ala 
20                  25                  30         
Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro GlyAla Ala Pro Ala Pro Gly Ile 
35                  40                  45             
Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp 
50                  55                  60                 
Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala 
65                  70                  75                  80 
Ala Ala GlyPro Ala Leu Ser Pro Val Pro ProVal Val His Leu Ala 
85                  90                  95     
Leu Arg GlnAla Gly Asp Asp Phe Ser Arg ArgTyr Arg GlyAsp Phe 
100                 105                 110         
Ala Glu Met Ser Ser Gln LeuHis Leu Thr Pro Phe Thr Ala ArgGly 
115                 120                 125             
Arg Phe Ala Thr Val Val GluGlu Leu PheArg Asp Gly Val Asn Trp 
130                 135                 140                 
Gly Arg IleVal Ala Phe Phe Glu Phe GlyGly Val Met Cys Val Glu 
145                 150                 155                 160 
Ser Val Asn ArgGlu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp 
165                 170                 175     
Met Thr GluTyr Leu AsnArg His Leu His Thr Trp IleGln Asp Asn 
180                 185                 190         
Gly Gly TrpVal Gly Ala Ser Gly Asp Val Ser Leu Gly 
195                 200                 205 
【図１】
2008069161.tif 000004
【図２】
2008069161.tif 000005
【図３】
2008069161.tif 000006
【図４】
2008069161.tif 000007
【図５】
2008069161.tif 000008
【図６】
2008069161.tif 000009
【図７】
2008069161.tif 000010
【図８】
2008069161.tif 000011
【図９】
2008069161.tif 000012
【図１０】
2008069161.tif 000013
【図１１】
2008069161.tif 000014