(57)【要約】【目的】免疫調節剤、抗再狭窄剤または抗腫瘍剤の同定、設計および合成のための新規な哺乳動物起源のラパマイシン-ＦＫＢＰ１２結合タンパクを提供すること。【構成】免疫調節剤、抗再狭窄剤または抗腫瘍剤の同定、設計および合成のための新規な哺乳動物起源のラパマイシン-ＦＫＢＰ１２結合タンパクおよびそれらの断片、ならびに、これらタンパクに対応するＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡセグメント。さらに、これらタンパクを単離する方法、ならびに、これらタンパクに関連する治療上の使用。【効果】免疫調節剤、抗再狭窄剤または抗腫瘍剤の同定、設計および合成のための新規な哺乳動物起源のラパマイシン-ＦＫＢＰ１２結合タンパクなどが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に分子量が約２１０ｋＤａである単離されたタンパクであって、ヒトから得ることができ、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン複合体に結合し、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン複合体の免疫抑制活性を媒介する、タンパク。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパクをコードする単離されたＤＮＡであって、
ａ）請求項１に記載の単離されたタンパクをプロテアーゼで消化し、少なくとも一つのタンパクの断片を得；
ｂ）少なくとも一つのタンパクの断片を単離してその断片を配列決定し；および
ｃ）そのタンパクの断片の配列からオリゴヌクレオチドプローブを得、そのプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、該タンパクをコードするＤＮＡを同定する
ことで得られるＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１のタンパクに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体。
【請求項４】
免疫抑制薬を服用している個体から得られる生物学的試料中の親化合物および／または代謝産物を測定するための請求項３に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用。
【請求項５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に分子量が約２１０ｋＤａであり、ヒト細胞由来のＦＫＢＰ１２−ラパマイシン複合体に結合する、タンパクを単離する方法であって、
ａ）緩衝剤、キレート剤、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、および低濃度の塩の存在下、タンパク分解を最小限に抑える温度で、哺乳動物細胞を溶解し、未破壊細胞、細胞核、および、細胞膜画分と細胞破砕物を含む溶解物を生成させ、
ｂ）タンパク分解を最小限に抑える温度で、該溶解物から未破壊細胞および細胞核を前除去し、前清澄化溶解物を調製し、
ｃ）該前清澄化溶解物に由来する、膜タンパクを含有する哺乳動物細胞の細胞膜画分を濃縮し、
ｄ）タンパク分解を最小限に抑える温度で、タンパクの有害な変性を引き起こすことなく、タンパクを可溶化する界面活性剤を含有する緩衝液中に該膜タンパクを可溶化し、可溶化タンパクおよび哺乳動物細胞破砕物を得て、
ｅ）哺乳動物細胞破砕物から可溶化タンパクを分離し、
ｆ）緩衝剤、還元剤、１種またはそれ以上のプロテアーゼ阻害剤、二価カチオン、および塩を含有する緩衝液中に可溶化タンパクを含有する溶液を、アフィニティーマトリックスと共にインキュベートすることにより、該アフィニティーマトリックスへの結合を可能にし、かつ、タンパク分解を最小限に抑える温度で、該アフィニティーマトリックスに対する結合親和性を有するタンパクを該アフィニティーマトリックスに吸着させ、
ｇ）タンパク分解を最小限に抑える温度で、工程（ｆ）の溶液からアフィニティーマトリックスを分離することにより、工程（ｆ）のアフィニティーマトリックスには結合しない可溶化タンパクを含有する溶液（ｇ）を得て、
ｈ）溶液（ｇ）を、分子量約２１０ｋＤａの所望のタンパクの単離を促進するＦＫＢＰ１２のＧＳＴ融合タンパクと複合体を形成したラパマイシンまたはラパマイシン類似物（ＬＡＦとの関係においてＩＣ５０＜５００ｎＭ）と共にインキュベートすることにより、融合ＦＫＢＰタンパク：ラパマイシン複合体または融合ＦＫＢＰ１２タンパク：ラパマイシン類似物複合体に結合した分子量約２１０ｋＤａの所望のタンパクを含有する混合物（ｈ）を得て、
ｉ）融合ＦＫＢＰ１２タンパク：ラパマイシン複合体または融合ＦＫＢＰ１２タンパク：ラパマイシン類似物複合体に結合した分子量約２１０ｋＤａの所望のタンパクを含有する混合物（ｈ）を、該融合タンパクに結合するアフィニティーマトリックスと共に、アフィニティーマトリックスへの結合を可能にし、かつ、タンパク分解を最小限に抑える温度および時間でインキュベートすることにより、融合ＦＫＢＰ１２タンパク：ラパマイシン複合体または融合ＦＫＢＰ１２タンパク：ラパマイシン類似物複合体に結合させ、
ｊ）結合した複合体を含むアフィニティーマトリックス（ｉ）を、分子量約２１０ｋＤａの所望タンパク以外のタンパクの結合を解離する緩衝液ですすぎ、
ｋ）緩衝液を用いて、アフィニティーマトリックス（ｊ）から、分子量約２１０ｋＤａのタンパク：融合ＦＫＢＰ１２タンパク：ラパマイシンの複合体、あるいは、分子量約２１０ｋＤａのタンパク：ＦＫＢＰ１２タンパク：ラパマイシン類似物複合体を溶出させ、
ｌ）工程（ｋ）で溶出したタンパクをサイズによって分離する、
ことを含む、単離方法。
【請求項６】
ＦＫＢＰ１２と複合体を形成した場合に、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン複合体に結合する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量約２１０ｋＤａの哺乳動物タンパクに結合する、生物学的試料中の、ラパマイシンまたはラパマイシン類似物を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料をＦＫＢＰ１２と組み合わせ、ラパマイシンまたはラパマイシン類似物が該生物学的試料中に存在すれば、ラパマイシン：ＦＫＢＰ１２複合体またはラパマイシン類似物：ＦＫＢＰ１２複合体を含有する第１の混合物を形成させる工程；
ｂ）その第１の混合物を、請求項１に記載のＧＳＴ−ＦＫＢＰ１２-ラパマイシン複合体に結合するタンパクに、固形担体に結合しているタンパクに添加することにより、第２の混合物を調製する工程；
ｃ）工程（ｂ）の第２の混合物を、ラパマイシン：ＦＫＢＰ１２複合体またはラパマイシン類似物：ＦＫＢＰ１２複合体が、それらが存在するならば、ＧＳＴ-ＦＫＢＰ１２-ラパマイシン複合体に結合するタンパクに結合するのに適当な条件下で維持する工程；および
ｄ）ラパマイシン：ＦＫＢＰ１２複合体、またはラパマイシン類似物：ＦＫＢＰ１２複合体と、該タンパクとの結合が工程（ｃ）で発生したかどうかを決定する工程、
を含む、同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラパマイシンのエフェクタータンパクに関する。さらに詳しくは、本発明は、免疫調節剤、抗再狭窄剤または抗腫瘍剤の同定、設計および合成のための哺乳動物起源の新規なラパマイシン-ＦＫＢＰ１２結合タンパクに関する。
【背景技術】
【０００２】
ラパマイシンは、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）によって生産されるマクロライド系抗生物質であり、最初は、抗真菌剤としてのその性質によって特徴付けられた。カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）やミクロスポラム・ジプセウム（Microsporum gypseum）などのカビの増殖に悪影響を及ぼす。ラパマイシン、その製造およびその抗生物質活性については、特許文献１（スレンドラ・セーガル（Surendra Sehgal）ら、1975年12月30日付で発行）に記載されている。1977年には、マーテル，アール・アール（Martel，R.R.）らにより、非特許文献１に、実験的なアレルギー脳炎およびアジュバント関節炎に対するラパマイシンの免疫抑制性が報告された。1989年には、非特許文献２ならびに非特許文献３が、別々に、同種異系移植手術におけるインビボでの拒絶反応を阻害する際のラパマイシンの有効性について報告した。続いて、ラパマイシンの免疫抑制性および拒絶反応阻害性について記載する数多くの論文が発表されたが、臨床研究については、ヒトにおける移植手術の際の拒絶反応を阻害するのにラパマイシンを使用することから始まった。
【０００３】
ラパマイシンは、単独（特許文献２）で、あるいは、ピシバニルと組み合わせて（特許文献３）、抗腫瘍活性を有することが示されている。非特許文献４は、ラパマイシンが、実験的なアレルギー脳脊髄炎モデル、多発性硬化症のモデル、アジュバント関節炎モデル、慢性関節リウマチのモデルに有効であり、ＩｇＥ様抗体の形成を効果的に阻害したことを開示した。
【０００４】
ラパマイシンの免疫抑制効果は、非特許文献５に開示されている。シクロスポリンＡやＦＫ-５０６などのマクロ環状分子もまた、免疫抑制剤として有効であることが示されており、それゆえ、移植組織の拒絶反応を予防するのに有用である（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；および特許文献４）。
【０００５】
ラパマイシンは、全身性エリテマトーデス（特許文献５）、肺炎（特許文献６）、インシュリン依存性糖尿病（非特許文献８）、ならびに血管損傷後の平滑筋細胞増殖および内膜肥大化（非特許文献９）を防止したり、治療したりするのに有用であることが示されている。
【０００６】
ラパマイシンのモノおよびジアシル化誘導体（２８位および４３位でエステル化）は、抗真菌剤として有用であることが示されており（特許文献７）、ラパマイシンの水溶性プロドラッグを製造するのに用いられている（特許文献８）。最近、ラパマイシンの番号付けの規約が変更された；それゆえ、ケミカル・アブストラクツの命名法に従えば、上記のエステルは、３１位および４２位におけるものになる。特許文献９は、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗真菌剤、および抗腫瘍剤として有用な、ラパマイシンのカーバメートを開示している。特許文献１０は、ラパマイシンのフッ素化エステルを開示している。特許文献１１は、ラパマイシンのアミドエステルを開示している。特許文献１２は、ラパマイシンのアミノエステルを開示している。特許文献１３は、ラパマイシンのスルホネートおよびスルファメートを開示している。特許文献１４は、ラパマイシンのスルホニルカーバメートを開示している。
【０００７】
特許文献４（カルネ（Calne））は、ラパマイシンならびにその誘導体およびプロドラッグを用いて哺乳動物における移植組織の拒絶反応を阻害する方法を開示している。ラパマイシンと共に用いるために挙げられている他の化学療法剤は、アザチオプリン、コルチコステロイド、シクロスポリン（およびシクロスポリンＡ）、およびＦＫ-５０６、あるいはその組合せである。
【０００８】
ラパマイシンは、細胞内のシグナルトランスダクションを遮断することによって、免疫抑制効果を生じる。ラパマイシンは、Ｔ細胞およびマスト細胞におけるカルシウム依存性シグナルカスケードを干渉するようである（非特許文献１０）。ラパマイシンは、ＦＫ-５０６結合タンパク（ＦＫＢＰ）系統群のメンバーである幾つかのイムノフィリン（immunophilin）に結合することが知られている。特に、ラパマイシンは、結合タンパクＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１３、ＦＫＢＰ２５（非特許文献１１および非特許文献１２；非特許文献１３）、およびＦＫＢＰ５２（特許文献１５）に結合することが知られている。
【０００９】
ラパマイシンは、マイトジェン誘発のＴ細胞およびＢ細胞の増殖、ならびに、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４およびＩＬ-６を含む数種のサイトカインによって誘発される増殖を阻害することができる（非特許文献１４）。それはまた、抗体産生を阻害することができる。ラパマイシンは、細胞周期の進行に伴うタンパク合成を減少させるラパマイシンの能力と互いに関係があると思われるｐ７０Ｓ６キナーゼのサイトカイン誘発活性化を遮断することが示されている（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。それはまた、ｃｄｋ２/サイクリンＥ複合体の活性化を阻害する（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）。ラパマイシンの効果は、ｐ７０ｓ６キナーゼやｃｄｋ２/サイクリンＥへの直接結合によって媒介されるのではなく、これらキナーゼの活性化状態を調節する上流成分へのラパマイシン-ＦＫＢＰ複合体の作用による。
【００１０】
一般に、ラパマイシン、シクロスポリンおよびＦＫ５０６などの免疫抑制剤の作用が、それらの各々の細胞内受容体タンパク（イムノフィリンと呼ばれる）との複合体の形成に依存することは受け入れられている。これらの免疫抑制剤がそれらの各々のイムノフィリンと結合することは、イムノフィリンのシス-トランスペプチジルプロリルイソメラーゼ（ＰＰＩase）活性を阻害するが、ＰＰＩase阻害は、免疫抑制活性を媒介するほど充分ではない（非特許文献２２）。ディールス-アルダー付加物である２種のラパマイシン類似物（一方は４-フェニル-１,２,４-トリアゾリン-３,５-ジオンとの付加物であり、他方は４-メチル-１,２,４-トリアゾリン-３,５-ジオンとの付加物）は、ＦＫＢＰに結合し、そのＰＰＩase活性を阻害したが、検出可能な免疫抑制活性を示さなかった。モル大過剰のフェニル-トリアゾリンジオン・ディールス-アルダー付加物は、マイトジェン誘発のマウス胸腺細胞増殖におけるＤＮＡ合成へのラパマイシンの効果を競合的に阻害することが示されている（非特許文献２３）。最近の証拠は、シクロフィリン-シクロスポリンＡやＦＫＢＰ-ＦＫ５０６などのバイナリーイムノフィリン-薬物複合体が、特定の標的タンパクに作用することによってシグナルトランスダクションを遮断することを可能にする新しい機能を獲得していることを示唆している。シクロフィリン-シクロスポリンＡおよびＦＫＢＰ-ＦＫ５０６複合体の両方の分子標的は、Ｃａ＋２/カルモデュリン（calmodulin）依存性セリン/スレオニンホスファターゼカルシネウリン（calcineurin）として同定されている（非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８）。
【００１１】
ラパマイシンの抗菌活性および免疫抑制活性は、ラパマイシンと、ＦＫ５０６結合タンパク（ＦＫＢＰ）系統群のあるメンバーと、少なくとも１種の付加的な第３のタンパク（ラパマイシンの標的（ＴＯＲ）と呼ばれる）とからなる複合体によって媒介される。ＦＫＢＰの系統群については、アーミステッド（Armistead）およびハーディング（Harding）によって総説が与えられている（非特許文献２９）。ラパマイシンの抗菌活性における関連ＦＫＢＰ分子は、ＦＫＢＰ１２であることが示されている（非特許文献３０）。哺乳動物細胞について、関連ＦＫＢＰは研究中である。２種のＴＯＲタンパク（ＴＯＲ１およびＴＯＲ２）は酵母において同定されているが（非特許文献３１）、ヒト細胞中におけるラパマイシンの標的は、不明のままである。酵母ＴＯＲ２のカルボキシ末端は、２種のタンパク（すなわち、ホスファチジルイノシトール３-キナーゼのｐ１１０サブユニットおよびＶＰＳ３４）と、２０％の同一性を有することが示され、また、酵母液胞選別タンパクはＰＩ ３Ｋ活性を有することが示されている。しかし、ジェイ・ブレニス（J. Blenis）らは、ラパマイシン-ＦＫＢＰ１２複合体が、ｐ１１０，ｐ８５ ＰＩ ３Ｋ複合体によって、ＰＤＧＦ刺激された細胞に対するその効果を直接媒介しないことを報告している。
【特許文献１】米国特許第3,929,992号
【特許文献２】米国特許第4,885,171号
【特許文献３】米国特許第4,401,653号
【特許文献４】米国特許第5,100,899号
【特許文献５】米国特許第5,078,999号
【特許文献６】米国特許第5,080,899号
【特許文献７】米国特許第4,316,885号
【特許文献８】米国特許第4,650,803号
【特許文献９】米国特許第5,118,678号
【特許文献１０】米国特許第5,100,883号
【特許文献１１】米国特許第5,118,677号
【特許文献１２】米国特許第5,130,307号
【特許文献１３】米国特許第5,117,203号
【特許文献１４】米国特許第5,194,447号
【特許文献１５】WO 93/07269
【非特許文献１】カナディアン・ジャーナル・オブ・フィジオロジカル・ファーマコロジー（Canadian Journal of Physiological Pharmacology）55,48-51(1977)
【非特許文献２】カルネ、アール・ワイ（Calne，R.Y.）ら、ランセット（Lancet）1989,no.2,p.227
【非特許文献３】モリス、アール・イー（Morris，R.E.）およびメイザー、ビー・エム（Meiser，B.M.）、メディカル・サイエンス・リサーチ（Medical Science Research）1989,No.17,p.609-10
【非特許文献４】アール・アール・マーテル（R.R. Martel）ら、カナディアン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー・アンド・ファーマコロジー（Can. J. Physiol. Pharmacol.）55,48(1977)
【非特許文献５】FASEB 3,3411(1989)
【非特許文献６】FASEB 3,5256(1989)
【非特許文献７】アール・ワイ・カルネ（R.Y. Calne）ら、ランセット（Lancet）1183(1978)
【非特許文献８】フィフス・イント・コンフ・インフラム・レス・アソク（Fifth Int. Conf. Inflamm. Res. Assoc.）121(要約),(1990)
【非特許文献９】モリス、アール（Morris，R.）ジャーナル・オブ・ハート・アンド・ラング・トランスプラント（J. Heart Lung Transplant）11(pt.2)：197(1992)
【非特許文献１０】シュライバー（Schreiber）ら、(1992)テトラヘドロン（Tetrahedron）48：2545-2558
【非特許文献１１】ガラト・エイ（Galat A.）ら、(1992)バイオケミストリー（Biochemistry）31(8)；2427-2437
【非特許文献１２】フェレラ・エイ（Ferrera A）ら、(1992)ジーン（Gene）113(1)：125-127
【非特許文献１３】アーミステッド（Armistead）およびハーディング（Harding）、アニュアル・リポーツ・イン・メディカル・ケミストリー（Ann. Reports in Med. Chem.）28：207-215,1993
【非特許文献１４】セーガル（Sehgal）らによる総説；メディカル・リサーチ・レビュー（Med. Research Rev.）14：1-22,1994
【非特許文献１５】カルボ（Calvo）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ユー・エス・エイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）89：7571-7575,1992
【非特許文献１６】チュング（Chung）ら、セル（Cell）69：1227-1236,1992
【非特許文献１７】クオ（Kuo）ら、ネイチャー（Nature）358：70-73,1992
【非特許文献１８】プライス（Price）ら、サイエンス（Science）257：973-977,1992
【非特許文献１９】フラナガン（Flanagan）ら、アナルズ・オブ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ann. N.Y. Acad. Sci.）印刷中
【非特許文献２０】フラナガン（Flanagan）ら、モレキュラー・アンド・セルーラー・バイオロジー（Mol. Cell Biol.）印刷中
【非特許文献２１】フラナガン（Flanagan）ら、ジャーナル・オブ・セル・バイオケミストリー（J. Cell Biochem.）17A：292,1993
【非特許文献２２】アーミステッド（Armistead）およびハーディング（Harding）、アニュアル・リポーツ・イン・メディカル・ケミストリー（Annual Reports in Med. Chem.）28：207-215：1993
【非特許文献２３】オケイン（Ocain）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）192：1340,1993
【非特許文献２４】ジェイ・リウ（J. Liu）ら、セル（Cell）66,807,1991
【非特許文献２５】ジェイ・リウ（J. Liu）ら、バイオケミストリー（Biochemistry）31,3896,1992
【非特許文献２６】ダブリュー・エム・フラナガン（W.M. Flanagan）ら、ネイチャー（Nature）352,803,1992
【非特許文献２７】マッキャフリー（McCaffrey）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）268,3747,1993
【非特許文献２８】マッキャフリー（McCaffrey）ら、サイエンス（Science）262：750,1993
【非特許文献２９】アニュアル・リポーツ・イン・メディカル・ケミストリー（Annual Reports in Med. Chem.）28：207-215：1993
【非特許文献３０】ハイトマン（Heitman）ら、サイエンス（Science）253：905-909：1993
【非特許文献３１】クンツ（Kunz）ら、セル（Cell）73：585-596：1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
免疫調節剤、抗再狭窄剤または抗腫瘍剤の同定、設計および合成のための新規な哺乳動物起源のラパマイシン-ＦＫＢＰ１２結合タンパクの提供が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＧＳＴ-ＦＫＢＰ１２-ラパマイシンの複合体に結合する単離され、クローン化され、かつ、発現されたタンパクに関する。これらタンパクは、モルト（Molt）４Ｔ細胞白血病の膜調製物から単離される。４種の新規なタンパクのサイズは、ＰＡＧＥ移動法によって、１２５±１２キロダルトン（ｋＤａ）、１４８±１４ｋＤａ、２０８±１５ｋＤａおよび２１０±２０ｋＤａであると推定され、それぞれ、１２５ｋＤａ、１４８ｋＤａ、２０８ｋＤａ、および２１０ｋＤａとして表されている。これら４種のタンパクは、エフェクタータンパクとも呼ばれる。
【００１４】
本発明のタンパクは、酵素阻害剤アッセイや結合アッセイなどのスクリーニングアッセイに用いて、内因性の複合体およびリガンド、ならびに、それらの機能を調節する新規な外因性の化合物（ラパマイシン様）を同定することができる。それらは、再狭窄や免疫調節に対して、また、抗腫瘍剤として、治療上の利点を有する化合物を同定するアッセイに用いることもできる。本発明のタンパクをクローニングすることは、これらタンパクを大量に生産することを可能にするだけでなく、関連のアンチセンス療法を開発する基礎をも提供する。免疫調節活性（移植手術の拒絶反応、対宿主性移植片病、狼瘡などの自己免疫疾患、重症筋無力症、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、I型糖尿病、ならびに、乾癬、皮膚炎、湿疹、脂漏症、炎症性腸疾患、肺炎、喘息、および眼のブドウ膜炎などの炎症疾患に対する使用）、抗再狭窄活性および抗腫瘍活性を用いてアンチセンス療法を実施するためのｃＤＮＡクローンの使用は、本発明の範囲内に含まれる。
【００１５】
本発明のタンパクは、Ｔ細胞白血病細胞系モルト４の細胞（ATCC1582、アメリカン・タイプ・セル・カルチャー（American Type Cell Culture）、12301パークローン・ドライブ（Parklawn Drive）、ロックビル（Rockville）、MD、USA、20852）、Ｂ細胞リンパ腫、ＢＪＡＢ、または正常なヒトＴ細胞などの哺乳動物細胞から単離することができる。これらの哺乳動物細胞は、低張圧緩衝液Ａ（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、pＨ７.５、２０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.４ｍＭ ＰＭＳＦおよび２ｍＭ β-メルカプトエタノール（２-ＭＥ））などの、プロテアーゼ阻害剤および還元剤（２-ＭＥ）を含有する緩衝液中で溶解させることができる。細胞核および未破壊細胞は、タンパク分解を最小限に抑える温度で遠心分離によって取り除かれる。次いで、これら細胞の膜画分は、１００,０００ｇの超遠心分離によって濃縮またはペレット化することができる。膜ペレットの界面活性剤による可溶化は、ＣＨＡＰＳＯ（３-[(３-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-１-プロパンスルホネート；１２ｍＭ）またはトリトンＸ１００（ポリエチレングリコール４-イソオクチルフェニルエーテル）を含む緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＣｌ、０.２ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ２-ＭＥ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５μｇ/ｍｌアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチンＡおよびアンチペイン）などの界面活性剤含有緩衝液中で実施する。次いで、可溶化された膜タンパクは、タンパク分解を最小限に抑える温度で１００,０００ｇの超遠心分離によって、破砕物から分離することができる。次いで、可溶化された膜タンパクを含有する上清を、タンパク分解を最小限に抑える温度で、プロテアーゼ阻害剤の存在下、グルタチオン樹脂などのアフィニティー樹脂に前吸着させる。上清から樹脂を除去するために遠心分離した後、この上清を、次いで、タンパク分解を最小限に抑える温度で、ＦＫＢＰに複合体化したラパマイシンまたはラパマイシン類似体、例えば、ＧＳＴ-ＦＫＢＰ１２--ラパマイシンと共にインキュベートする。次いで、ＦＫＢＰに複合体化したラパマイシンまたはラパマイシン類似物、例えば、ＧＳＴ-ＦＫＢＰ１２--ラパマイシンと共にインキュベートした可溶化膜タンパクの混合物は、タンパク分解を最小限に抑える温度で、アフィニティー樹脂とインキュベートして、ラパマイシンまたはラパマイシン類似物、ＦＫＢＰ融合タンパクおよび結合タンパクの複合体を結合させることができる。最も非特異的なタンパクを、界面活性剤含有緩衝液、例えば、緩衝液Ｃ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＣｌ、０.２ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ２-ＭＥまたは１０ｍＭ ジチオスレイトール、０〜５ｍＭ ＣａＣｌ２、０〜５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５μｇ/ｍｌアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチンＡおよびアンチペイン、ならびに０.１％トリトンＸ１００（ポリエチレングリコール４-イソオクチルフェニルエーテル））を用いて、すすいだ後、これらタンパクを、樹脂から解離させるのに充分な界面活性剤を含有する緩衝液（例えば、ラエムリ（Laemli）、ネイチャー（Nature）227：680,1970に記載の、必要に応じてグリセロールまたは色素を含むラエムリ緩衝液）などの変性��件下で、または、５ｍＭグルタチオンなどのアフィニティーカラムに適当な溶出化合物を含有する緩衝液などの非変性条件下で、樹脂から溶出させる。次いで、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）を用いて、これらタンパクをサイズによって分離することができる。
【００１６】
本発明はまた、上記タンパクのゲノムＤＮＡ配列、ならびに、上記タンパクの遺伝子に対応するｃＤＮＡおよびアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ配列を含む。本発明はさらに、上記タンパクと少なくとも機能的に相同または等価である他の哺乳動物種のタンパク、ならびに、かかる相同または等価タンパクのＤＮＡ遺伝子配列、およびかかる相同または等価タンパクの遺伝子に対応するｃＤＮＡおよびアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ配列を含む。
【００１７】
本発明の目的に対して、本発明のタンパクの等価物は、上記タンパクに対して実質的に類似しているが、同一ではないアミノ酸配列を有する、タンパク、タンパク断片および／または切断された形態であると見なされ、かかる等価物は上記タンパクに類似したラパマイシン-ＦＫＢＰ複合体に結合する特性および機能を示す。それゆえ、本明細書では、本発明の１２５ｋＤａ、１４８ｋＤａ、２０８ｋＤａ、および２１０ｋＤａタンパクに言及することは、上記の１２５ｋＤａ、１４８ｋＤａ、２０８ｋＤａ、および２１０ｋＤａタンパクと実質的に類似しているが、同一ではないアミノ酸配列を有する、相同または等価タンパク、ならびに、断片化および／または切断された形態を示し、含むものと理解すべきである。
【００１８】
これらタンパクあるいは相同または等価タンパクは、様々な細胞タイプから同様の方法によって、および／または、組換えＤＮＡ法によって、生成させることができ、また、部位特異的変異誘発処理を含む手法によって改変してもよい。例えば、本発明の遺伝子は、これらタンパクの１つまたは全部を、単離に有利な融合相手（例えば、ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦｃ、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧなど）との融合タンパクとして発現するように構築することができる。可溶形になる変異や切断を部位特異的変異誘発処理によって導入することができ、これにより単離が有利になりうる。
【００１９】
本発明はさらに、結合親和性を保持しているが、活性タンパクのアミノ酸配列より少ないアミノ酸配列を有する、オリゴペプチド断片、切断形およびタンパク断片を含む。本発明はまた、これらタンパクに特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体と、それらの使用とを含む。このような使用には、免疫調節および／または抗腫瘍活性のための新規な薬剤をスクリーニングする方法や、免疫抑制薬を服用している個体から得た生物学的試料中の親化合物および／または代謝物を測定する方法が含まれる。免疫調節活性（移植手術の拒絶反応、対宿主性移植片病、狼瘡などの自己免疫疾患、重症筋無力症、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、I型糖尿病、ならびに、乾癬、皮膚炎、湿疹、脂漏症、炎症性腸疾患、肺炎、喘息、および眼のブドウ膜炎などの炎症疾患に対する使用）、および抗腫瘍活性を用いてアンチセンス療法（ミリガン（Milligan）ら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）36：1923-1936,1993）を実施するためのｃＤＮＡクローンの使用も、本発明の範囲内に含まれる。
【００２０】
本発明のタンパクは、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術によって製造することもできる。つまり、課題のタンパクの遺伝子は、このタンパクを、リシンＣなどのプロテアーゼで切断することによって部分的なアミノ酸配列を得て、得られたタンパク断片を微孔ＨＰＬＣによって単離した後、断片の配列決定（マツダイラ（Matsudaira）、ア・プラクティカル・ガイド・トゥー・プロテイン・アンド・ペプチド・ピュリフィケーション・フォア・マイクロシークエンシング（A Practical Guide To Protein and Peptide Purification for Microsequencing）中、アカデミック・プレス（Academic Press）(サンディエゴ,CA,1989)）を行うことによってクローン化することができる。次いで、決定された配列は、ヒトｃＤＮＡライブラリーを直接スクリーニングしたり、ポリメラーゼ連鎖反応によってプローブを生成させたりするのに用いることができるオリゴヌクレオチドプローブを製造するのに用いることができる。ライブラリーはヒトＴ細胞または細胞系モルト（Molt）４、ジュルカット（Jurkat）、あるいはその他のものなどから作成して、クローンを得ることができる。これらのクローンを用いて、タンパクの全長遺伝子、つまり完全オープンリーディングフレームがクローン化されるまで、付加的な配列を含む付加的なクローンを同定することができる。
【００２１】
ある種のタンパクが、タンパクのサイズから当初予想されたものより長いオープンリーディングフレームによってコードされ得ることは当該分野でよく知られている。これらタンパクは、完全なオープンリーディングフレームから翻訳された前駆体タンパク（例えば、ＩＬ-１β）や、下流の開始コドンを用いて翻訳されたタンパク（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原）の切断産物を表す場合がある。この知見を考慮して、ここで用いる「ｃＤＮＡ」なる用語は、上で考察したように、本発明のタンパクまたはタンパク断片を、同時にまたは別々に、あるいは切断された形でコードする遺伝子の完全なオープンリーディングフレームに対するｃＤＮＡまたはその任意の部分を意味するものと理解される。
【００２２】
相補的な方策では、本発明のタンパクに対する遺伝子は、ＦＫＢＰ１２：ＲＡＰＡをクローニング用トラップとして用いたインタラクティブ酵母クローニング（interactive yeast cloning）技術によって同定してもよい。これらの方策を組み合わせて、クローンの同定を早めることもできる。
【００２３】
４つのタンパクのいずれかの遺伝子をコードする関連ｃＤＮＡクローンは、当該技術分野で標準的な発現ベクターを用いて、イー・コリ（E. coli）、酵母、またはバキュロウイルス感染細胞あるいは哺乳動物細胞で発現させることができる。単離は、上記のように実施することができ、ｃＤＮＡは、単離に有利な融合相手（例えば、ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦｃ、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼなど）との融合タンパクを発現するように製造することができる。可溶形になる変異を部位特異的変異誘発処理によって導入することができ、これにより単離が有利になりうる。
【００２４】
このようなｃＤＮＡクローンの使用には、組換えタンパクの製造が含まれる。さらに、このような組換えタンパク、または哺乳動物細胞から単離された対応の天然タンパク、あるいはその断片（ペプチドオリゴマーを含む）は、これらタンパクに対する抗体の生成に有用である。簡単に言えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、当該技術分野で標準的な技術を用いて、組換えタンパク、または哺乳動物細胞から単離された対応の天然タンパク、あるいはその断片（担体タンパク（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンまたはウシ血清アルブミン）に結合したペプチドオリゴマーを含む）で動物を免疫することによって誘発される。これらの抗体は、哺乳動物細胞から単離された天然タンパク、あるいは、イー・コリ（E. coli）、酵母、またはバキュロウイルス感染細胞あるいは哺乳動物細胞、あるいは細胞産物に由来する組換えタンパクの精製法に用いることができる。
【００２５】
このようなｃＤＮＡクローンの使用には、組換えタンパクの製造が含まれる。さらに、このような組換えタンパク、または哺乳動物細胞から単離された対応の天然タンパクは、免疫調節および／または抗腫瘍活性のための合成化合物、天然物、外因性または内因性の物質などの新規な薬剤をスクリーニングする方法に有用である。スクリーニングしうる天然物には、細胞溶解物、細胞上清、植物抽出物、および真菌や最近の天然ブロスが含まれるが、これらには限定されない。競合結合アッセイの一例としては、マトリックスに（共有結合的にまたは非共有結合的に）結合させたこれらタンパクの１つを、上記の化合物、天然物、細胞溶解物または細胞上清、および標識したラパマイシン：ＦＫＢＰ複合体を含有する緩衝液と共にインキュベートすることができる。これら化合物、天然物、外因性または内因性の物質が、この複合体または特異的抗体の結合を競合的に阻害する能力を評価することができる。複合体を標識する方法の例には、放射標識、蛍光または化学ルミネセンス標識、ルシフェラーゼなどのＦＫＢＰとの融合タンパク、および、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣＨＥ）などの酵素への結合が含まれる。酵素アッセイの一例としては、上記タンパクは、合成化合物、天然物、外因性または内因性の物質などの新規な薬剤の存在下または非存在下で、基質と共にインキュベートされ、タンパクの酵素活性が評価することができる。免疫抑制薬を服用している個体から得た生物学的試料中の親化合物および／または代謝物を測定する方法は、これらタンパクを用いて評価することができる。
【００２６】
本発明は、免疫抑制剤または抗腫瘍剤として有用でありうる物質を同定する方法を含む。かかる方法は、以下の工程を利用している：
ａ）試験物質を、本発明の４つの哺乳動物タンパク（約１２５ｋＤａ、約１４８ｋＤａ、約２０８ｋＤａ、または約２１０ｋＤａ；固形担体に結合されている）の１つと組み合わせる工程、
ｂ）該試験物質と、工程（ａ）の固形担体に結合させたタンパクとを、該試験物質が該タンパクに結合するのに適当な条件下で維持する工程、および
ｃ）該試験物質の結合が工程（ｂ）で発生したかどうかを決定する工程。
【００２７】
本発明はまた、以下の工程を伴う、免疫抑制剤または抗腫瘍剤として有用でありうる物質を同定する方法を含む。
ａ）試験物質を、本発明の哺乳動物タンパク（固形担体に結合されている）の１つと組み合わせる工程、
ｂ）該試験物質と、工程（ａ）の固形担体に結合させたタンパクとを、該試験物質が該タンパクに結合するのに適当な条件下で維持する工程、および
ｃ）該試験物質の存在が、哺乳動物タンパクの活性を調節したかどうかを決定する工程。
【００２８】
本発明はさらに、ＦＫＢＰと複合体を形成した場合に、本発明の４つの上記タンパクの１つと結合するラパマイシン、ラパマイシン類似物またはラパマイシン代謝物を、生物学的試料中に検出する方法を含む。かかる方法は、以下の工程からなる：
ａ）生物学的試料をＦＫＢＰと組み合わせ、ラパマイシン、ラパマイシン類似物またはラパマイシン代謝物が該生物学的試料中に存在すれば、ラパマイシン：ＦＫＢＰ複合体、ラパマイシン類似物：ＦＫＢＰ複合体、またはラパマイシン代謝物：ＦＫＢＰ複合体を含有する第１の混合物を得る工程、
ｂ）第１の混合物を本発明のタンパク（固形担体に結合されている）の１つに添加することにより、第２の混合物を調製する工程、
ｃ）工程（ｂ）の第２の混合物を、ラパマイシン：ＦＫＢＰ複合体、ラパマイシン類似物：ＦＫＢＰ複合体、またはラパマイシン代謝物：ＦＫＢＰ複合体が、存在するならば、本発明のタンパクに結合するのに適当な条件下で維持する工程、および
ｄ）ラパマイシン：ＦＫＢＰ複合体、ラパマイシン類似物：ＦＫＢＰ複合体、またはラパマイシン代謝物：ＦＫＢＰ複合体と、該タンパクとの結合が工程（ｃ）で発生したかどうかを決定する工程。
【００２９】
また、アンチセンス治療剤を生成するためにcＤＮＡクローンを使用することも本発明に包含される。これは、ミリガン（Milligan）ら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）36:14:1924-1936に記載されているような当該分野の技術を用いることにより達成することができる。この開示および特許請求の範囲の目的のために、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは、天然のバックボーンを有するまたは修飾されたバックボーンを利用する本発明の４つのタンパク（１２５ｋＤａ、１４８ｋＤａ、２０８ｋＤａまたは２１０ｋＤａ）のうちの１つをコードするcＤＮＡクローン由来のＲＮＡおよびＤＮＡ鎖を包含すると理解される。ＲＮＡおよびＤＮＡバックボーンのかかる修飾は、ミリガン（Milligan）ら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）36:14:1924-1936に記載されている。最近開示された（ミリガン（Milligan）ら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）36:14:1924-1936）当該分野の技術により創製されるアンチセンス化合物は、免疫応答を調節するのに有用であり、従って腎臓、心臓、肝臓、肺、骨髄、膵臓（島細胞）、角膜、小腸および皮膚同種移植および心臓弁異種移植のような移植拒絶の治療または抑制に；狼瘡、慢性関節リウマチ、糖尿病、重症筋無力症および多発性硬化症のような自己免疫疾患および乾癬、皮膚炎、湿疹、脂漏症、炎症性腸疾患および眼ブドウ膜炎のような炎症性疾患の治療または抑制に有用であり得る。本発明のアンチセンス分子は、抗腫瘍、抗真菌活性および抗増殖活性を有し得る。したがって、本発明の化合物は固形腫瘍、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、真菌感染症および再発狭窄症およびアテローム性動脈硬化症のような過増殖血管疾患の治療にも有用であり得る。したがって、本発明はまた、哺乳動物、好ましくはヒトにおける上記疾患および症状の治療法よりなる。該方法は、本発明の関連するアンチセンス治療剤の有効量を、投与の必要な哺乳動物に投与することよりなる。
【００３０】
上記疾患状態の治療または抑制のために投与する場合には、本発明のアンチセンス分子は、哺乳動物に経口的、非経口的、鼻内、気管支内、経皮的、局所的、膣内、または直腸内に投与することができる。
【００３１】
本発明のアンチセンス分子を免疫抑制剤または抗炎症剤として用いる場合、それらは１またはそれ以上の他の免疫調節剤と組み合わせて投与することができると考えられる。かかる他の免疫調節剤には、アゼチオプリン、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾンのようなコルチコステロイド、シクロホスファミド、ラパマイシン、シクロスポリンＡ、ＦＫ-５０６、ＯＫＴ-３およびＡＴＧが含まれるがこれらに限定されるものではない。本発明の複合体を、免疫抑制を誘導するまたは炎症症状を治療するためのかかる他の薬または剤と組み合わせることにより、所望の効果を得るために必要な該剤のそれぞれの量はより少量ですむ。かかる併用療法の基礎はステプコウスキー（Stepkowski）により確立されており、彼の結果が示すところによると、下治療用量（subtherapeutic dose）のラパマイシンおよびシクロスポリンＡの併用により、心臓同種移植生存時間を著しく延長した（トランスプランテーション・プロシーディングズ（Transplantation Proc.）23:507(1991)）。
【００３２】
一般にこれらのアンチセンス化合物での治療は、該化合物の最適用量未満の少用量で開始する。その後、該条件下で最適効果に到達するまで投与量を増やす。正確な投与量は、治療される個々の対象についての経験に基づき、投与する医師が決定する。一般に、本発明のアンチセンス化合物は、有害な副作用を全く起こさずに有効な結果を与える濃度にて最も望ましく投与される。
【００３３】
また、上記アンチセンス化合物の治療価値に鑑みれば、本発明は、本発明の１２５ｋＤａ、１４８ｋＤａ、２０８ｋＤａおよび２１０ｋＤａのタンパクをコードするcＤＮＡクローン由来のアンチセンスＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡ化合物を含有する医薬組成物をも包含する。
【００３４】
また、本発明は、本発明のタンパクを単離するための以下の方法並びにそれから単離されるタンパクよりなる。
哺乳動物細胞からタンパクを単離する方法は以下の工程からなる。
１．関心のある哺乳動物細胞を増殖させ収穫する。上記のとおり、該細胞はＴ細胞由来（例えば、Ｔ細胞リンパ腫、白血病、正常ヒトＴ細胞）、Ｂ細胞由来（例えば、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞、正常ヒトＢ細胞）、肥満細胞、またはラパマイシンに感受性の他の細胞源であってもよい。該細胞は、収穫後直ちに加工しても、または加工前に例えばペレットにて凍結保存してもよい。凍結保存した細胞は、−７０〜８０℃で凍結保存されるドライアイスおよびエタノール浴中で使用するまで保存してもよい。関心の細胞を増殖させ収穫するこの工程は、本方法の第１工程または本方法のための単なる予備工程と考えてもよい。
【００３５】
２．タンパク分解を最小限に抑える温度（例えば、４℃）で緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ、トリス，ｐＨ７.５）、低塩（例えば、１０〜５０ｍＭ ＮａＣｌまたはＫＣｌ）、キレート剤（例えば、１〜２ｍＭ ＥＤＴＡ）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、０.４ｍＭ ＰＭＳＦ）および還元剤（例えば、２ｍＭ ２-ＭＥまたは１〜２０ｍＭジチオスレイトール）を含有する緩衝液中で細胞を溶解する。哺乳動物細胞は、音波溶解、ダウンシング（douncing）などの細胞溶解を起こすことのできるいずれの方法で処理してもよいと理解されるべきである。
【００３６】
３．タンパク分解を最小限に抑える温度（例えば、４℃）にて遠心分離することにより、ライゼートから破壊されていない細胞または細胞核を前除去する。例えば１６００ｇ、１０分間の遠心分離が、破壊されていない細胞および細胞核をライゼートから前除去するのに十分であることが判明した。この工程は強制的なものではないが、後続する工程のためのより清澄な調製物を与える。
【００３７】
４．ついで、前清澄化ライゼート中の膜画分を、例えば超遠心分離により濃縮する。この濃縮の一例として、１００,０００ｇで１〜1.５時間の超遠心分離が挙げられる。
【００３８】
５．ついで膜タンパク（例えば、貫膜、内因性および膜結合タンパク）を可溶化する。これは、タンパク分解を最小限に抑える温度（例えば、４℃）にて、タンパクを有害に変性することなくこれを可溶化する界面活性剤、緩衝剤（例えば、２０〜５０ｍＭトリスまたはＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.２）、塩（例えば、１００〜２００ｍＭ ＮａＣｌ＋２０ｍＭ ＫＣｌ）、還元剤（例えば、１〜２ｍＭ ２-ＭＥまたは１〜２０ｍＭジチオスレイトール）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、０.２ｍＭ ＰＭＳＦ、５μｇ/ｍｌアプロチニン、リューペプチン、ペプスタチンＡおよびアンチパイン）、二価カチオン（例、０〜５ｍＭ ＣａＣｌ２、０〜５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を含有する緩衝液中、工程４のペレットをインキュベートすることにより行ってもよい。この工程で有用な界面活性剤としては、例えば、ＣＨＡＰＳＯ（３-[(３-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-１-プロパンスルホナート）またはトリトンＸ１００（ポリエチレングリコール４-イソオクチルフェニルエーテル）が挙げられる。この工程の後、該混合物は可溶化膜タンパクおよび非可溶化細胞破片を含有する。
【００３９】
６．該可溶化膜タンパクを、タンパク分解を最小にする温度（例えば、４℃）にて、例えば超遠心分離（例えば、１００,０００ｇ、１〜１.５時間）により非可溶化細胞破片から分離する。
【００４０】
７．アフィニティー樹脂に直接結合するタンパクの吸収を許容し、タンパク分解を最小限に抑える温度（例えば、４℃）および時間にて、緩衝剤（例えば、２０〜５０ｍＭトリスまたはＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.２）、塩（例えば、１００〜２００ｍＭ ＮａＣｌ＋２０ｍＭ ＫＣｌ）、還元剤（例えば、１〜２ｍＭ ２-ＭＥまたは１０〜２０ｍＭジチオスレイトール）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、０.２ｍＭ ＰＭＳＦ、５μｇ/ｍｌアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチンＡおよびアンチペイン）、二価カチオン（例えば、０〜５ｍＭ ＣａＣｌ２、０〜５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を含有する緩衝液中、可溶化膜タンパクを含有する上清をアフィニティー樹脂と共にインキュベートする。
【００４１】
８．ついで、タンパク分解を最小限に抑える温度（例えば、４℃）で、遠心分離により上清から該樹脂を除去する。
【００４２】
９．ついで、エフェクタータンパクの融合ＦＫＢＰタンパク：ラパマイシンまたは類似物複合体に対する結合を許容し、タンパク分解を最小限に抑える温度および時間（例えば、４℃および１〜２時間）にて、緩衝剤（例えば、２０〜５０ｍＭトリスまたはＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.２）、塩（例えば、１００〜２００ｍＭ ＮａＣｌ＋２０ｍＭ ＫＣｌ）、還元剤（例えば、１〜２ｍＭ ２-ＭＥまたは１〜２０ｍＭジチオスレイトール）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、０.２ｍＭ ＰＭＳＦ、５μｇ/ｍｌアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチンＡおよびアンチペイン）、二価カチオン（例えば、０〜５ｍＭ ＣａＣｌ２、０〜５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を含有する緩衝液中、ＦＫＢＰ１２＋タンパク[これは所望のエフェクタータンパクの単離を促進し、また、これにより融合タンパクがアフィニティー樹脂またはアフィニティーカラム（例えば、ＧＳＴ-ＦＫＢＰ１２、ヒスチジノリゴマー-ＦＫＢＰ１２、ビオチン-ＦＫＢＰ１２など）に結合する]の融合タンパクに複合体化させたラパマイシンまたはラパマイシン類似物（ＬＡＦにおいてＩＣ５０＜５００ｎＭ）と共に該上清をインキュベートする。
【００４３】
１０．エフェクタータンパクおよび融合ＦＫＢＰタンパク：ラパマイシンまたはアナログの複合体のアフィニティー樹脂に対する結合を許容し、タンパク分解を最小にする温度および時間（例えば、４℃および０.５〜２時間）にて、エフェクタータンパクおよび融合ＦＫＢＰタンパク：ラパマイシン複合体を含有する工程９の混合物を、アフィニティー樹脂と共にインキュベートする。
【００４４】
１１．非特異的タンパクの結合を解離するが所望のタンパクおよびＲＡＰＡ−ＦＫＢＰ間の複合化を解離しない緩衝液、例えば緩衝剤（例えば、２０〜５０ｍＭトリスまたはＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.２）、塩（例えば、１００〜１０００ｍＭ ＮａＣｌ、ＫＣｌ）、還元剤（例えば、１〜２ｍＭ ２-ＭＥまたは１０〜２０ｍＭジチオスレイトール）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、０.２ｍＭ ＰＭＳＦ、５μｇ/ｍｌアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチンＡおよびアンチペイン）、二価カチオン（例えば、０〜５ｍＭ ＣａＣｌ２、０〜５ｍＭ ＭｇＣｌ２）および非特異的タンパクの結合を解離するが該４つのタンパクおよびＲＡＰＡ-融合ＦＫＢＰタンパク間の複合化を解離しない界面活性剤（例えば、トリトンＸ１００（ポリエチレングリコール４-イソオクチルフェニルエーテル））を含有する緩衝液を用いて、ほとんどの非特異的タンパクを該樹脂から洗い流す。
【００４５】
１２．該樹脂から該エフェクタータンパクおよび融合ＦＫＢＰタンパク：ラパマイシン複合体を、それを樹脂から解離するのに十分な界面活性剤を含有する緩衝液（例えば、グリセロールまたは染料を含むまたは含まないラエムリ（Laemli）緩衝液、ラエムリ（Laemli）、ネーチャー（Nature）227:680,1970）のような適当な緩衝液、またはグルタチオン、ヒスチジンのようなアフィニティーカラム用の適当な溶出化合物を用いて溶出させる。
【００４６】
１３．ついで、該エフェクタータンパクをサイズにより分離する。これは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびサイズ排除カラムクロマトグラフィーを包含する（しかし、これに限定されるわけではない）、該タンパクをサイズにより分離するいずれの方法で行ってもよい。
【００４７】
また、工程８において、ＬＡＦにおいてＩＣ５０＜５００ｎＭであるラパマイシンまたはラパマイシンアナログを緩衝液に置換する方法である対照法により単離されたタンパクを比較することも有用であり得、ラパマイシン：ＦＫＢＰ複合体に結合するタンパクをより容易に識別するために使用することができる。
【００４８】
また、本発明のタンパクは、当業者によく知られている組換えＤＮＡ技術により製造することができる。すなわち、タンパクを適当なエンドペプチダーゼ（例えば、リシンＣ）で消化することにより部分アミノ酸配列を得、得られたタンパク断片を小口径ＨＰＬＣにより単離し、ついで断片を配列決定することにより、問題のタンパクの遺伝子をクローニングすることができる（マツダイラ（Matsudaira）、ア・プラクティカル・ガイド・ツー・プロテイン・アンド・ペプチド・ピュリフィケーション・フォー・ミクロシークエンシング（A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing）、アカデミック・プレス（Academic Press）、サンジエゴ（San Diego）CA，1989）。ついで、決定された配列を用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（例えば、ヒトＴ細胞、モルト（Molt）４、ジュルカト（Jurkat）などについてのもの）をスクリーニングするために使用することができるオリゴヌクレオチドプローブを作製しクローンを得ることができる（サムブルック（Sambrook）、フリッチュ（Fritsch）およびマニアタス（Maniatas）、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）1989）。タンパクの全遺伝子をクローニングするまで、これらのクローンを用いて追加的配列を含有する追加的クローンを同定することができる（サムブルック（Sambrook）、フリッチュ（Fritsch）およびマニアタス（Maniatas）、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）1989）。補足的な戦略においては、クローニングのためのトラップとしてＦＫＢＰ１２：ＲＡＰＡを用いて、相互作用する酵母クローニング技術により遺伝子を同定してもよい（チエン（Chien）ら、プロシーディングズ・オブ・ナチュラル・アカデミック・サイエンシーズ（Proc. Natl. Acad. Sci.）88:9578-9582,1991）。また、これらの戦略を組み合わせて該クローンの同定を速めてもよい。
【００４９】
また、大腸菌、酵母またはバクロウイルス感染細胞または哺乳動物細胞中、当該分野における発現ベクターを用いて、関連するcＤＮＡクローンを発現させることもできる。単離は上記のとおりに行うことができ、あるいは該cＤＮＡは単離において利点を与える融合相手（例えば、ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦc、グルタチオン Ｓ-トランスフェラーゼなど）との融合タンパクとして作製することができる。また、可溶形態を生じさせる突然変異は、特定部位の突然変異誘発により起こすことができ、単離における利点を与えるであろう。
【００５０】
同様の手法を用いて、マウス、ラット、サル、イヌおよび他の哺乳動物種における相同体を得ることができる。さらに、該タンパクのヒトクローンの単離の際には、該クローンを用いて他の哺乳動物種における相同体についてスクリーニングすることができる。また、これらの相同体を用いて、免疫調節活性を有する化合物、内因性リガンド、外因性リガンドについて結合測定法を進め、ハイスループットスクリーニングアッセイ（high through put screening assay）を行うことができる。
【００５１】
かかる免疫調節活性を有する化合物、内因性リガンドおよび外因性リガンドは、免疫応答を調節するのに有用であり、従って腎臓、心臓、肝臓、肺、骨髄、膵臓（島細胞）、角膜、小腸および皮膚同種移植および心臓弁異種移植のような移植拒絶の治療または抑制に；狼瘡、慢性関節リウマチ、糖尿病、重症筋無力症および多発性硬化症のような自己免疫疾患および乾癬、皮膚炎、湿疹、脂漏症、炎症性腸疾患および眼ブドウ膜炎のような炎症性疾患の治療または抑制に有用であり得る。
【００５２】
また、上記の化合物、内因性リガンドおよび外因性リガンドは、抗腫瘍、抗真菌活性および抗増殖活性を有する。従って、本発明の化合物は固形腫瘍、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、真菌感染症および再発狭窄症およびアテローム性動脈硬化症のような過増殖血管疾患の治療にも有用であり得る。
【発明の効果】
【００５３】
本発明によれば、免疫調節剤、抗再狭窄剤または抗腫瘍剤の同定、設計および合成のための新規な哺乳動物起源のラパマイシン-ＦＫＢＰ１２結合タンパクなどが提供される。
【実施例】
【００５４】
実施例１
本発明のタンパクは、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ-ＦＫ５０６結合タンパク１２（ＧＳＴ-ＦＫＢＰ）の融合タンパクを利用して単離した。ＧＳＴ-ＦＫＢＰは、プラスミド、ｐＧＥＸ-ＦＫＢＰを含有する組換え大腸菌により生産される。該細胞を増殖させ、ＩＰＴＧで誘導し、ディー・ビー・スミス（D.B. Smith）およびケイ・エス・ジョンソン（K.S. Johnson）、ジーン（Gene）67,31,1988およびケイ・エル・グアン（K.L. Guan）およびジェイ・イー・ディクソン（J.E. Dixon）、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.）192,262,1991に記載の標準的な技術を用いて該融合タンパクを単離した。セントリコン１０フィルトレーションユニット（Centricon 10 filtration unit)(アミコン（Amicon））を用いてグルタチオンおよびＧＳＴ-ＦＫＢＰ１２を含有する溶液を５回交換してグルタチオンを除去し緩衝液を交換した。
【００５５】
標準培地（１００Ｕ/ｍｌペニシリン、１００ｕｇ/ｍｌ Ｌ-グルタミン、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０）中でモルト４細胞（１×１０９）を増殖させた。該細胞を収穫し、ＰＢＳ（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７.０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で３回洗浄し、ドライアイス-エタノール浴中でフラッシュ凍結し、−８０℃で保存した。氷上、該細胞を解かし、Ｂ乳棒の付きダウンス（dounce）ホモジナイザーを用いて５ｍｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭヘペス，ｐＨ７.５、２０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.４ｍＭ ＰＭＳＦおよび２ｍＭ ２-ＭＥ）中で溶解した。１６００ｇで１０分間遠心分離することにより破片を清澄化し、１００,０００ｇ遠心分離（１時間）により膜画分を濃縮した後、１２ｍＭ ＣＨＡＰＳＯを含有する３ｍｌの緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリス，ｐＨ７.２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＣｌ、０.２ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ２-ＭＥ、２ｍＭ ＣaＣl２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５μｇ/ｍｌアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチンＡおよびアンチペイン）中、４℃で２時間、１００,０００ｇペレットをインキュベートした。該可溶化膜タンパクを１００,０００ｇ遠心分離により該破片から分離した。緩衝液Ｂ中で膨潤させた０.４ｍｌグルタチオンセファロース樹脂に上清を３〜１８時間前吸収させた後、４℃で２時間、複合化ラパマイシン-ＧＳＴ-ＦＫＢＰ１２（緩衝液Ｂ中４℃にて１〜２時間、６６０ｕｇ ＧＳＴ-ＦＫＢＰ＋６０ｕｇ ＲＡＰＡをインキュベートすることにより行った）と共に上清をインキュベートした。ついで、該上清を１００ｕｌグルタチオン樹脂（１：１緩衝液Ｂ）と共に４℃で２時間インキュベートした。非特異的タンパクを緩衝液Ｃ（緩衝液Ｂ＋０.１％トリトン×１００）で５回洗浄し、９５℃で３分間インキュベートしミクロ遠心分離することにより、ラエムリ（Laemli）緩衝液中樹脂から該タンパクを溶出した。該タンパクは、７％ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、ついで銀染色を用いてサイズにより分離した。２１０ｋＤａ、２０８ｋＤａ、１４８ｋＤａおよび１２５ｋＤａの分子量のタンパクに相当する４つの帯が、ＲＡＰＡ＋ＧＳＴ-ＦＫＢＰ１２（対ＧＳＴ-ＦＫＢＰ単独）を含有する試料中、より高濃度で存在した。
【００５６】
ＬＡＦと称されるマイトジェン刺激胸腺細胞増殖検定は、ラパマイシンまたはデメトキシラパマイシンのようなアナログにより抑制され、免疫抑制におけるラパマイシンアナログの相対活性を示す。免疫抑制アナログであるデメトキシラパマイシン（表１）と複合体化させたＧＳＴ-ＦＫＢＰを用いて同一のタンパクを単離した。ディールスアルダー付加体はＦＫＢＰ１２に結合しＦＫＢＰ１２のＰＰＩアーゼ活性を阻害したが、検出可能な免疫抑制活性を示さず、従ってラパマイシンの標的に結合しない。類似の単離方法（すなわちラパマイシン：ＧＳＴ-ＦＫＢＰ１２を置換する）においてＧＳＴ-ＦＫＢＰ１２と複合体化しているこれらの２個の化合物を用いることにより、２１０ｋＤａタンパクのバックグラウンド値が得られた（ラパマイシン無し)(表１）。ＦＫ５０６は、ＦＫＢＰに結合しＦＫ５０６-ＦＫＢＰ複合体のカルシニューリンとの結合によりその作用の少なくともいくつかを仲介する免疫抑制化合物である。ＦＫ５０６は、類似の方法においてＧＳＴ-ＦＫＢＰと複合体化させた場合、２１０ｋＤａタンパクのバックグランド値を与えたに過ぎなかった（表１）。
【００５７】
【表１】
2008253264.tif 000002
【００５８】
ラパマイシンがその効果を媒介するためには多種のＦＫＢＰと結合しなければならないことが知られている。本発明のタンパクがＲＡＰＡ-ＧＳＴ-ＦＫＢＰ複合体に結合し、ラパマイシンまたはＦＫＢＰ１２の個々に結合しないことを実証するために、単離修飾操作を用いた。その修飾操作は、（１）ラパマイシンの代わりにラパマイシン-４２-ビオチングリシナートエステル（両方共、ＬＡＦ検定にて等しい免疫抑制活性を示す）、（２）非外因性ＦＫＢＰおよび（３）グルタチオン-樹脂の代わりにストレパタビジン−複合樹脂を用いることからなる。バックグラウンドレベルの２１０ｋＤａタンパクだけをこの修飾単離操作を用いて単離した。
【００５９】
２１０ｋＤａタンパクを、ＧＳＴ--ＦＫＢＰ１２--ラパマイシン複合体を用い、ＢＪＡＢ細胞（Ｂ細胞リンパ腫）ならびにフィコール・ハイパック（Ficoll-Hypaque）およびＴ細胞カラムを介して精製された正常なヒトＴリンパ球から単離した。
【００６０】
部分アミノ酸組成物の分析結果を以下の表２に示す。塩基性アミノ酸の割合は測定しなかった。
【００６１】
【表２】
2008253264.tif 000003
【００６２】
実施例２
本発明の２１０ｋＤａ（２１０±２０ｋＤａ）タンパクを、前記のように、アフィニティーマトリックス操作を用い、４×１０１１個のモルト（Molt）４細胞から単離した。結合タンパクをグリセロールおよび色素不含の１×ラエムリ（Ｌaemli）緩衝液（０.０６２５Ｍ トリス-ＨＣｌ、ｐＨ６.８、２％ＳＤＳ、０.３７Ｍ β-メルカプトエタノール）でアフィニティーマトリックスから溶出し、セントリコン（centricon）１００（マサチューセッツ州、ビバリー、アミコン（Amicon））を用いる遠心分離操作により３回連続して、最初の２回は４℃で、３回目は１８℃で濃縮した。濃縮試料は、最初の２回はグリセロールおよび色素不含の等容量の２×ラエムリ緩衝液で、３回目は等容量の２×ラエムリ緩衝液で、室温で２時間インキュベートすることにより、セントリコン１００フィルターより溶出した。試料中のタンパクを１.５ｍｍ厚の７％ポリアクリルアミドゲル（３８：１）のＰＡＧＥにより分離した。該タンパクを、４℃で一夜、５０ｍＡで０.０３７％ＳＤＳ含有の１０×トリス／グリシン緩衝液（カリフォルニア州、ハーキュレス、バイオラッド（Biorad））中のポリビニリジン ジフルオリド、ＰＶＤＦ（バイオラッド）に移動させた。ＰＶＤＦ上のタンパクを、１０％エタノール、２％酢酸中、アミドブラック（バイオラッド）で染色し、適当なバンドを取り出し、ＰＢＳおよび水でリンスし、凍結貯蔵した。
【００６３】
配列決定操作
ＰＶＤＦ膜上のタンパク（約３μｇ）を、ジェイ・フェルナンデス（J.Fernandez）らがアナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.）201:255-64,1992に記載する変法を用い、トリプシンでその場で消化した。簡単には、湿らす前に、ＰＶＤＦを１ｍｍ２の断片に切断し、該タンパクを３７℃で６時間、０.２μｇトリプシンを含む１０％アセトニトリル、および１％還元トリトン（カルバイオケム（CalBiochem））含有の１００ｍＭ トリス-ＨＣｌ，ｐＨ緩衝液中に消化し、つづいて０.２μｇのトリプシンを加え、一夜インキュベートした。フラグメントを音波処理で該膜より溶出し、該フラグメント含有の緩衝液をミクロフュージ遠心分離操作により分離した。該膜を２×逆抽出した（すなわち、５０μｌの緩衝液を膜に加え、音波処理し、ミクロフュージにて遠心分離に付し、溶液を溶出フラグメント含有の原緩衝液と一緒にプールした）。試料（１４０-１４５μｌ）を、ダブリュ・レーン（W. Lane）らがジャーナル・オブ・プロテイン・ケミストリー（J. Protein Chem.），10(2):151-60,1991にて前記するように、４０ダイオードアレイ検出器を備えたフューレット・パッカード（Hewlett Packard）ＨＰＬＣ１０９０上のバイダック（Vydac）Ｃ１８ ２.１ｍｍ×１５０ｍｍ逆相カラムを用いる細孔高性能液体クロマトグラフィーにより分離した。複数のフラクションを収集し、複数の波長（２１０、２７７および２９２ｎｍ）で吸収について測定した。分解、シンメトリーおよび紫外線吸収およびスペクトル（２１０ｎｍ、２７７ｎｍおよび２９２ｎｍ）に基づき、配列決定についての最適フラクションを選択した。最適フラクションのアリコート（５％）を、フィニガン・レーザーマット（Finnigan lasermat）上の、マトリックス・アシステッド・レーザー・デソープション・タイム・オブ・フライト・マス・スペクトロメトリー、ＭＡＬＤＥ-ＴＯＦ-ＭＳにより、フラグメントの均一性および長さについて分析した。選択した最適フラクションを、マイクロカートリッジおよび製造者が推奨するケミストリーサイクルを用い、アプライド・バイオシステム４７７Ａタンパクシーケンサー上の自動エドマン（Edman）デグラデーションにより配列決定した。
【００６４】
配列比較
インテリジェネティックス・スーツ（カリフォルニア州、インテリジェネティックス）を用いて比較した。
【００６５】
配列
前記方法を用い、本発明の２１０ｋＤａ（２１０±２０ｋＤａ）タンパクがペプチドフラグメントを含有し、そのうちの４個が以下に示すアミノ酸配列を有すると決定した：
ａ）ＩＬＬＮＩＥＨＲ；
ｂ）ＬＩＲＰＹＭＥＰＩＬＫ；
ｃ）ＤＸＭＥＡＱＥ；および
ｄ）ＱＬＤＨＰＬＰＴＶＨＰＱＶＴＹＡＹＭ（Ｋ）
【００６６】
当業者であれば、当該アミノ酸についての一文字記号が解るであろう（その定義はまた、ラバート・ストライヤー（Lubert Stryer）によるダブリュ・エッチ・フリーマン・アンド・カンパニー（W.H. Freeman and Company）１９８８、ザ・テキスト・バイオケミストリー（the text Biochemistry）第３版の２１頁に記載されている）。当業者であればさらに、配列ｃ）におけるＸが今だ未同定アミノ酸を示唆し、配列ｄ）中の括弧はその位置にあるアミノ酸がおそらくリジンであることを示唆することがわかるであろう。
【００６７】
前記したように、本発明は本明細書に記載のタンパクの断片形または切形を包含する。これは、前記ａ）〜ｄ）に挙げた４個のうち１またはそれ以上の配列をそのアミノ酸配列の一部または全部として有するタンパクを包含する。後に示す請求の範囲のために、１またはそれ以上の「内部アミノ酸配列」を包含すると称されるタンパクは、該タンパクが全体として１またはそれ以上の配列ａ）〜ｄ）からなるとしても、または前記した１またはそれ以上の配列が該タンパクのいずれかの部分を形成するとしても、前記した配列の一つを含有するいずれかのタンパクであると理解される。これは、限定されるものではないが、タンパクのアミノ酸連鎖を開始および停止するタンパクのセクションを包含するタンパクのアミノ酸配列上のすべての位置を包含すると解される。
【００６８】
これらの部分アミノ酸配列を遺伝子銀行のデータベースにおける配列と比較した。受入番号Ｌ３４０７５（ブラウン（Brown）ら、ネイチャー（Nature）３６９，７５６−７５８（１９９４））と配列が同じであった。ＳＥＰ遺伝子のｃＤＮＡを以下のようにクローンした：１単位のＴaq ポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Perkin Elmer）を有する１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ トリス-ＨＣl、ｐＨ８.３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＴＴＰ、２００μＭ ｄＣＴＰ、２００μＭ ｄＧＴＰ；パーキン・エルマー）中、２μｇのモルト（Molt）４ｃＤＮＡ（カリフォルニア州、パロ アルト、クロンテク（Clontech））を、次のオリゴマー対の１つを含有する３つの別々の反応により、９４℃で３０秒間、３０サイクルについて６６℃で４分間、７２℃で１０分間、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した：
【００６９】
【化１】
2008253264.tif 000004
【００７０】
オリゴヌクレオチドを以前に記載されている方法であって、当該分野における公知方法により合成し、単離した（ケミカル・アンド・エンザイマティック・シンセシス・オブ・ジン・フラグメント（Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments）、エッチ・ジー・ガッシンおよびアン・ラング（H.G.GassinおよびAnne Lang），ベルラグ・ケミー（Verlag Chemie），FLA，1982）。各々、ＳＥＰ３、ＳＥＰ４およびＳＥＰ５と命名したＰＣＲ生成物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（１単位）およびＰＣＲ生成物を効果的に連結するように修飾された５０ｎｇのｐｃII（カリフォルニア州、サンディエゴ、インビトロゲン、ＴＡクローニングキット）含有の緩衝液中、１５℃で一夜インキュベートし、ＰＣＲ-ｐｃII生成物を得た。ＰＣＲ-ｐｃII生成物をインビトロゲンから入手可能なコンピテント・イー・コリ・ＩＮＶαＦ細胞に形質転換した。ミニプレプ（miniprep）ＤＮＡをキアゲン・ミニプレプ・キット（カリフォルニア州、チャトスワース、キアゲン（Quiagen））を用いて調製し、適当な大きさの生成物含有のクローンを、市販されているＨｉｎｄIIIまたはＳａｌＩでの制限酵素消化、電気泳動、および標品との比較により同定した。Ｓｅｐ１およびＳｅｐ１のｃＤＮＡを、オリゴｄＴ（０.１３μｇ）および、各々、２５０ピコモルの
【化２】
2008253264.tif 000005
を含有する第一の鎖合成反応で、タイム・セイバー・ｃＤＮＡ・シンセシス・キット（Time Saver cDNA synthesis kit）（ニュージャージー州、ピスカタウェイ、ファーマシア（Pharmacia））を用いて製造した。Ｓｅｐ２およびＳｅｐ１の第二の鎖合成は、各々、２５０ピコモルの
【化３】
2008253264.tif 000006
を添加してタイム・セイバー・ｃＤＮＡ・シンセシス・キットを用いて行った。ついで、そのＳｅｐ２およびＳｅｐ１ ｃＤＮＡを、前記したように、各々、
【化４】
2008253264.tif 000007
を用いるＰＣＲにより増幅した。Ｓｅｐ２ ＰＣＲ生成物をＴＡクローニングキット（インビトロゲン）を用いてｐｃIIにクローンした。Ｓｅｐ１ ＰＣＲ生成物をＨindIIIおよびＳalＩで消化し、アガロース電気泳動によりｐｃIIベクターより分離した。Ｓｅｐ１（ＨindIII-ＳalＩ）フラグメントをファーマシア市販のセファグラス（Sephaglas）バンドプロプ・キットを用いて単離し、記載されているように、ｐＵＣ１９のＨindIIIおよびＳalＩ部位にクローンした（サムブロック（Sambrook）ら、モレキュラー・クローニング・コールド・スプリング・ハーバー（Molecular Cloning Cold Spring Harbor），1989）。単離したＳｅｐ２（ＨindIII、ＡspＩ）とＳｅｐ３（ＡspＩ、ＳalＩ）フラグメントまたはＳｅｐ４（ＨindII、ＡccII/ＭroＩ）とＳｅｐ５（ＡccIII/ＭroＩ、ＳalＩ）フラグメントのｐＵＣ１８（ＨindIII、ＳalＩ）ベクターへの連結およびコンピテント・イー・コリ・ＩＮＶα細胞（インビトロゲン）の形質転換を、当業者に公知の技術（サムブロックら、モレキュラー・クローニング・コールド・スプリング・ハーバー，1989）を介して行い、ｐＵＣ１８-Ｓｅｐ２３およびｐＵＣ１８-Ｓｅｐ４５を得た。それは、各々、添付した配列番号１に示される全長クローンのヌクレオチド１４６８-５３２６および４９６４-７６５３を含有する。ｐＵＣ１９-Ｓｅｐ１（ＥcoＲＶ、ＳalＩ）、Ｓｅｐ２３（ＥcoＲＶ、ＢstＥII）およびＳｅｐ４５（ＢstＥII、Ｓal１）フラグメントの連結およびコンピテント・イー・コリ・ＩＮＶαＦ細胞（インビトロゲン）の形質転換は、当該分野における当業者に公知の方法（サムブロックら、モレキュラー・クローニング・コールド・スプリング・ハーバー，1989）により行い、全長クローンを得ることができる。このタンパクをコードする核酸配列を配列番号１に示す。
【００７１】
グルタチオンＳトランスフェラーゼ−シロリマスエフェクタータンパク、ＧＳＴ-ＳＥＰ、と称される縮合タンパクは、以下に示すように、Ｓｅｐ４およびＳｅｐ５フラグメントをプラスミド、ｐＧＥＸ-ＫＧ（グアン・ケイおよびジキソン・ジェイ・イー（Guan, K.およびDixon, J.E.）（1991）アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.）192,262-267）にサブクローンすることにより操作した。簡単には、Ｓｅｐ４を市販のＨindIII制限酵素で消化し、その制限部位をＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント（ギブコ（Gibco））で満たし、ＤＮＡをフェノール-クロロホルムおよびエタノールで抽出し、当該分野における当業者に公知の技法を用いて沈降させた（サムブロックら、モレキュラー・クローニング・コールド・スプリング・ハーバー，1989）。ＳＥＰ４（ＨindIII-クレノー）をさらにＭroＩ制限酵素で消化し、アガロース電気泳動によりｐｃIIベクターより単離し、ＳＥＰ４-ＨindIII-クレノー-ＭroＩフラグメントとして単離した。Ｓｅｐ５フラグメントをＳalＩおよびＭroＩで消化し、アガロース電気泳動によりｐｃIIベクターから単離し、ＳＥＰ５-ＳalＩ-ＭroＩとして単離することにより製造した。ｐＧＥＸ-ＫＧ（グアン・ケイおよびジキソン・ジェイ・イー（Guan, KおよびDixon, J.E.）（1991）アナリティカル・バイオケミストリー192,262-2679）をＮcoＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントで満たし、ＤＮＡをフェノール-クロロホルムおよびエタノールで抽出し、当該分野における公知技術を用いて沈降させた（サムブロックら、モレキュラー・クローニング・コールド・スプリング・ハーバー，1989）。ｐＧＥＸ-ＫＧ（ＮcoＩ、クレノー）をさらにＳalＩで消化し、アガロース電気泳動により未消化ベクターより分離し、当該分野における公知操作を用いて、ベクターｐＧＥＸ-ＫＧ-ＮcoＩ-クレノー-ＳalＩとして単離した。当該分野における公知操作を用いて、該ベクター、ｐＧＥＸ-ＫＧ-ＮcoＩ-クレノー-ＳalＩとＳｅｐ４（ＨindIII、ＭroＩ）およびＳｅｐ５（ＭroＩ、ＳalＩ）フラグメントの連結ならびにイー・コリ株ＩＮＶαＦ細胞（インビトロゲン）への形質転換によりプラスミド、ｐＧＥＸ-Ｓｅｐ４５を得た。この縮合タンパクのＤＮＡおよびタンパク配列を配列番号２に示す。
【００７２】
フラグ（flag）配列を、Ａsp Ｔyr Ｌys Ａsp Ａsp Ａsp Ａsp Ｌysについてのコーディング配列からなるオリゴヌクレオチドを用い、ＳＥＰ範囲内のアミノ酸末端で、またはＳＥＰ、ＳＥＰ４、５もしくは他のフラグメントのカルボキシ末端で加えることができる。縮合タンパクは、コネチカット州、ニューヘーブンのＩＢＩから市販されているキットを用い、抗-フラグ特異的抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより単離できる。
【００７３】
配列番号１に示すような、ｐＵＣ１９-Ｓｅｐ１（ＥcoＲＶ、ＳalＩ）、Ｓｅｐ２３（ＥcoＲＶ、ＢstＥII）およびＳｅｐ４５（ＢstＥII、ＳalＩ）フラグメントを含有する形質転換宿主細胞はまた、アメリカ合衆国、メリーランド２０８５２、ロックビル、パークラウン・ドライブ・１２３０１番のジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、すでにＡＴＣＣ名称が与えられている。
【００７４】
実施例３
本発明の２１０ｋＤａタンパクはまた、次のラパマイシンアナログを用い、実施例１に記載の操作により単離できる：
ａ）４２-デオキシ-４２-[１-(１,１-ジメチルエトキシ)-２-オキソエトキシ]ラパマイシン（米国特許第5,233,036号に記載）；
ｂ）４２-[Ｏ-(１,１-ジメチルエチル)ジメチルシリル]ラパマイシン（米国特許第5,120,842号に記載）；
ｃ）Ｎ-[１,１-ジメチルエトキシ)カルボニル]-Ｎ-メチルグリシンとのラパマイシン４２-エステル（米国特許第5,130,307号に記載）；
ｄ）５-[１,１-ジメチルエトキシ)-２-[[(１,１-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-５Ｎ-オキソペンタン酸酢酸エチル溶媒和物３/４水和物とのラパマイシン４２-エステル（米国特許第5,130,307号参照）；
ｅ）Ｎ-[１,１-ジメチルエトキシ)カルボニル]グリシルグリシンとのラパマイシン４２-エステル（米国特許第5,130,307号参照）；
ｆ）Ｎ２,Ｎ６-ビス[(１,１-ジメチルエトキシ)カルボニル]-Ｌ-リジンとのラパマイシン４２-エステル（米国特許第5,130,307号参照）；
【００７５】
［配列表］
配列番号：１
配列の長さ：７６５３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：モルト４ヒトＴ細胞白血病細胞
株名：ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８２株
配列：
AAG ATG CTT GGA ACC GGA CCT GCC GCC GCC ACC ACC GCT GCC ACC ACA      48
Met Leu Gly Thr Gly Pro Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr
1               5                  10                  15
TCT AGC AAT GTG AGC GTC CTG CAG CAG TTT GCC AGT GGC CTA AAG AGC      96
Ser Ser Asn Val Ser Val Leu Gln Gln Phe Ala Ser Gly Leu Lys Ser
20                  25                  30
CGG AAT GAG GAA ACC AGG GCC AAA GCC GCC AAG GAG CTC CAG CAC TAT     144
Arg Asn Glu Glu Thr Arg Ala Lys Ala Ala Lys Glu Leu Gln His Tyr
35                  40                  45
GTC ACC ATG GAA CTC CGA GAG ATG AGT CAA GAG GAG TCT ACT CGC TTC     192
Val Thr MET Glu Leu Arg Glu MET Ser Gln Glu Glu Ser Thr Arg Phe
50                  55                  60
TAT GAC CAA CTG AAC CAT CAC ATT TTT GAA TTG GTT TCC AGC TCA GAT     240
Tyr Asp Gln Leu Asn His His Ile Phe Glu Leu Val Ser Ser Ser Asp
65                  70                  75
GCC AAT GAG AGG AAA GGT GGC ATC TTG GCC ATA GCT AGC CTC ATA GGA     288
Ala Asn Glu Arg Lys Gly Gly Ile Leu Ala Ile Ala Ser Leu Ile Gly
80                  85                  90                  95
GTG GAA GGT GGG AAT GCC ACC CGA ATT GGC AGA TTT GCC AAC TAT CTT     336
Val Glu Gly Gly Asn Ala Thr Arg Ile Gly Arg Phe Ala Asn Tyr Leu
100                 105                 110
CGG AAC CTC CTC CCC TCC AAT GAC CCA GTT GTC ATG GAA ATG GCA TCC     384
Arg Asn Leu Leu Pro Ser Asn Asp Pro Val Val MET Glu MET Ala Ser
115                 120                 125
AAG GCC ATT GGC CGT CTT GCC ATG GCA GGG GAC ACT TTT ACC GCT GAG     432
Lys Ala Ile Gly Arg Leu Ala MET Ala Gly Asp Thr Phe Thr Ala Glu
130                 135                 140
TAC GTG GAA TTT GAG GTG AAG CGA GCC CTG GAA TGG CTG GGT GCT GAC     480
Tyr Val Glu Phe Glu Val Lys Arg Ala Leu Glu Trp Leu Gly Ala Asp
145                 150                 155
CGC AAT GAG GGC CGG AGA CAT GCA GCT GTC CTG GTT CTC CGT GAG CTG     528
Arg Asn Glu Gly Arg Arg His Ala Ala Val Leu Val Leu Arg Glu Leu
160                 165                 170                 175
GCC ATC AGC GTC CCT ACC TTC TTC TTC CAG CAA GTG CAA CCC TTC TTT     576
Ala Ile Ser Val Pro Thr Phe Phe Phe Gln Gln Val Gln Pro Phe Phe
180                 185                 190
GAC AAC ATT TTT GTG GCC GTG TGG GAC CCC AAA CAG GCC ATC CGT GAG     624
Asp Asn Ile Phe Val Ala Val Trp Asp Pro Lys Gln Ala Ile Arg Glu
195                 200                 205
GGA GCT GTA GCC GCC CTT CGT GCC TGT CTG ATT CTC ACA ACC CAG CGT     672
Gly Ala Val Ala Ala Leu Arg Ala Cys Leu Ile Leu Thr Thr Gln Arg
210                 215                 220
GAG CCG AAG GAG ATG CAG AAG CCT CAG TGG TAC AGG CAC ACA TTT GAA     720
Glu Pro Lys Glu MET Gln Lys Pro Gln Trp Tyr Arg His Thr Phe Glu
225                 230                 235
GAA GCA GAG AAG GGA TTT GAT GAG ACC TTG GCC AAA GAG AAG GGC ATG     768
Glu Ala Glu Lys Gly Phe Asp Glu Thr Leu Ala Lys Glu Lys Gly MET
240                 245                 250                 255
AAT CGG GAT GAT CGG ATC CAT GGA GCC TTG TTG ATC CTT AAC GAG CTG     816
Asn Arg Asp Asp Arg Ile His Gly Ala Leu Leu Ile Leu Asn Glu Leu
260                 265                 270
GTC CGA ATC AGC AGC ATG GAG GGA GAG CGT CTG AGA GAA GAA ATG GAA     864
Val Arg Ile Ser Ser MET Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Glu MET Glu
275                 280                 285
GAA ATC ACA CAG CAG CAG CTG GTA CAC GAC AAG TAC TGC AAA GAT CTC     912
Glu Ile Thr Gln Gln Gln Leu Val His Asp Lys Tyr Cys Lys Asp Leu
290                 295                 300
ATG GGC TTC GGA ACA AAA CCT CGT CAC ATT ACC CCC TTC ACC AGT TTC     960
MET Gly Phe Gly Thr Lys Pro Arg His Ile Thr Pro Phe Thr Ser Phe
305                 310                 315
CAG GCT GTA CAG CCC CAG CAG TCA AAT GCC TTG GTG GGG CTG CTG GGG    1008
Gln Ala Val Gln Pro Gln Gln Ser Asn Ala Leu Val Gly Leu Leu Gly
320                 325                 330                 335
TAC AGC TCT CAC CAA GGC CTC ATG GGA TTT GGG ACC TCC CCC AGT CCA    1056
Tyr Ser Ser His Gln Gly Leu MET Gly Phe Gly Thr Ser Pro Ser Pro
340                 345                 350
GCT AAG TCC ACC CTG GTG GAG AGC CGG TGT TGC AGA GAC TTG ATG GAG    1104
Ala Lys Ser Thr Leu Val Glu Ser Arg Cys Cys Arg Asp Leu MET Glu
355                 360                 365
GAG AAA TTT GAT CAG GTG TGC CAG TGG GTG CTG AAA TGC AGG AAT AGC    1152
Glu Lys Phe Asp Gln Val Cys Gln Trp Val Leu Lys Cys Arg Asn Ser
370                 375                 380
AAG AAC TCG CTG ATC CAA ATG ACA ATC CTT AAT TTG TTG CCC CGC TTG    1200
Lys Asn Ser Leu Ile Gln MET Thr Ile Leu Asn Leu Leu Pro Ara Leu
385                 390                 395
GCT GCA TTC CGA CCT TCT GCC TTC ACA GAT ACC CAG TAT CTC CAA GAT    1248
Ala Ala Phe Arg Pro Ser Ala Phe Thr Asp Thr Gln Tyr Leu Gln Asp
400                 405                 410                 415
ACC ATG AAC CAT GCC CTA AGC TGT GTC AAG AAG GAG AAG GAA CGT ACA    1296
Thr MET Asn His Ala Leu Ser Cys Val Lys Lys Glu Lys Glu Arg Thr
420                 425                 430
GCG GCC TTC CAA GCC CTG GGG CTA CTT TCT GTG GCT GTG AGG TCT GAG    1344
Ala Ala Phe Gln Ala Leu Gly Leu Leu Ser Val Ala Val Arg Ser Glu
435                 440                 445
TTT AAG GTC TAT TTG CCT CGC GTG CTG GAC ATC ATC CGA GCG GCC CTG    1392
Phe Lys Val Tyr Leu Pro Arg Val Leu Asp Ile Ile Arg Ala Ala Leu
450                 455                 460
CCC CCA AAG GAC TTC GCC CAT AAG AGG CAG AAG GCA ATG CAG GTG GAC    1440
Pro Pro Lys Asp Phe Ala His Lys Arg Gln Lys Ala MET Gln Val Asp
465                 470                 475
GCC ACA GTC TTC ACT TGC ATC AGC ATG CTG GCT CGA GCA ATG GGG CCA    1488
Ala Thr Val Phe Thr Cys Ile Ser MET Leu Ala Arg Ala MET Gly Pro
480                 485                 490                 495
GGC ATC CAG CAG GAT ATC AAG GAG CTG CTG GAG CCC ATG CTG GCA GTG    1536
Gly Ile Gln Gln Asp Ile Lys Glu Leu Leu Glu Pro MET Leu Ala Val
500                 505                 510
GGA CTA AGC CCT GCC CTC ACT GCA GTG CTC TAC GAC CTG AGC CGT CAG    1584
Gly Leu Ser Pro Ala Leu Thr Ala Val Leu Tyr Asp Leu Ser Arg Gln
515                 520                 525
ATT CCA CAG CTA AAG AAG GAC ATT CAA GAT GGG CTA CTG AAA ATG CTG    1632
Ile Pro Gln Leu Lys Lys Asp Ile Gln Asp Gly Leu Leu Lys MET Leu
530                 535                 540
TCC CTG GTC CTT ATG CAC AAA CCC CTT CGC CAC CCA GGC ATG CCC AAG    1680
Ser Leu Val Leu MET His Lys Pro Leu Arg His Pro Gly MET Pro Lys
545                 550                 555
GGC CTG GCC CAT CAG CTG GCC TCT CCT GGC CTC ACG ACC CTC CCT GAG    1728
Gly Leu Ala His Gln Leu Ala Ser Pro Gly Leu Thr Thr Leu Pro Glu
560                 565                 570                 575
GCC AGC GAT GTG GGC AGC ATC ACT CTT GCC CTC CGA ACG CTT GGC AGC    1776
Ala Ser Asp Val Gly Ser Ile Thr Leu Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser
580                 585                 590
TTT GAA TTT GAA GGC CAC TCT CTG ACC CAA TTT GTT CGC CAC TGT GCG    1824
Phe Glu Phe Glu Gly His Ser Leu Thr Gln Phe Val Arg His Cys Ala
595                 600                 605
GAT CAT TTC CTG AAC AGT GAG CAC AAG GAG ATC CGC ATG GAG GCT GCC    1872
Asp His Phe Leu Asn Ser Glu His Lys Glu Ile Arg MET Glu Ala Ala
610                 615                 620
CGC ACC TGC TCC CGC CTG CTC ACA CCC TCC ATC CAC CTC ATC AGT GGC    1920
Arg Thr Cys Ser Arg Leu Leu Thr Pro Ser Ile His Leu Ile Ser Gly
625                 630                 635
CAT GCT CAT GTG GTT AGC CAG ACC GCA GTG CAA GTG GTG GCA GAT GTG    1968
His Ala His Val Val Ser Gln Thr Ala Val Gln Val Val Ala Asp Val
640                 645                 650                 655
CTT AGC AAA CTG CTC GTA GTT GGG ATA ACA GAT CCT GAC CCT GAC ATT    2016
Leu Ser Lys Leu Leu Val Val Gly Ile Thr Asp Pro Asp Pro Asp Ile
660                 665                 670
CGC TAC TGT GTC TTG GCG TCC CTG GAC GAG CGC TTT GAT GCA CAC CTG    2064
Arg Tyr Cys Val Leu Ala Ser Leu Asp Glu Arg Phe Asp Ala His Leu
675                 680                 685
GCC CAG GCG GAG AAC TTG CAG GCC TTG TTT GTG GCT CTG AAT GAC CAG    2112
Ala Gln Ala Glu Asn Leu Gln Ala Leu Phe Val Ala Leu Asn Asp Gln
690                 695                 700
GTG TTT GAG ATC CGG GAG CTG GCC ATC TGC ACT GTG GGC CGA CTC AGT    2160
Val Phe Glu Ile Arg Glu Leu Ala Ile Cys Thr Val Gly Arg Leu Ser
705                 710                 715
AGC ATG AAC CCT GCC TTT GTC ATG CCT TTC CTG CGC AAG ATG CTC ATC    2208
Ser MET Asn Pro Ala Phe Val MET Pro Phe Leu Arg Lys MET Leu Ile
720                 725                 730                 735
CAG ATT TTG ACA GAG TTG GAG CAC AGT GGG ATT GGA AGA ATC AAA GAG    2256
Gln Ile Leu Thr Glu Leu Glu His Ser Gly Ile Gly Arg Ile Lys Glu
740                 745                 750
CAG AGT GCC CGC ATG CTG GGG CAC CTG GTC TCC AAT GCC CCC CGA CTC    2304
Gln Ser Ala Arg MET Leu Gly His Leu Val Ser Asn Ala Pro Arg Leu
755                 760                 765
ATC CGC CCC TAC ATG GAG CCT ATT CTG AAG GCA TTA ATT TTG AAA CTG    2352
Ile Arg Pro Tyr MET Glu Pro Ile Leu Lys Ala Leu Ile Leu Lys Leu
770                 775                 780
AAA GAT CCA GAC CCT GAT CCA AAC CCA GGT GTG ATC AAT AAT GTC CTG    2400
Lys Asp Pro Asp Pro Asp Pro Asn Pro Gly Val Ile Asn Asn Val Leu
785                 790                 795
GCA ACA ATA GGA GAA TTG GCA CAG GTT AGT GGC CTG GAA ATG AGG AAA    2448
Ala Thr Ile Gly Glu Leu Ala Gln Val Ser Gly Leu Glu MET Arg Lys
800                 805                 810                 815
TGG GTT GAT GAA CTT TTT ATT ATC ATC ATG GAC ATG CTC CAG GAT TCC    2496
Trp Val Asp Glu Leu Phe Ile Ile Ile MET Asp MET Leu Gln Asp Ser
820                 825                 830
TCT TTG TTG GCC AAA AGG CAG GTG GCT CTG TGG ACC CTG GGA CAG TTG    2544
Ser Leu Leu Ala Lys Arg Gln Val Ala Leu Trp Thr Leu Gly Gln Leu
835                 840                 845
GTG GCC AGC ACT GGC TAT GTA GTA GAG CCC TAC AGG AAG TAC CCT ACT    2592
Val Ala Ser Thr Gly Tyr Val Val Glu Pro Tyr Arg Lys Tyr Pro Thr
850                 855                 860
TTG CTT GAG GTG CTA CTG AAT TTT CTG AAG ACT GAG CAG AAC CAG GGT    2640
Leu Leu Glu Val Leu Leu Asn Phe Leu Lys Thr Glu Gln Asn Gln Gly
865                 870                 875
ACA CGC AGA GAG GCC ATC CGT GTG TTA GGG CTT TTA GGG GCT TTG GAT    2688
Thr Arg Arg Glu Ala Ile Arg Val Leu Gly Leu Leu Gly Ala Leu Asp
880                 885                 890                 895
CCT TAC AAG CAC AAA GTG AAC ATT GGC ATG ATA GAC CAG TCC CGG GAT    2736
Pro Tyr Lys His Lys Val Asn Ile Gly MET Ile Asp Gln Ser Arg Asp
900                 905                 910
GCC TCT GCT GTC AGC CTG TCA GAA TCC AAG TCA AGT CAG GAT TCC TCT    2784
Ala Ser Ala Val Ser Leu Ser Glu Ser Lys Ser Ser Gln Asp Ser Ser
915                 920                 925
GAC TAT AGC ACT AGT GAA ATG CTG GTC AAC ATG GGA AAC TTG CCT CTG    2832
Asp Tyr Ser Thr Ser Glu MET Leu Val Asn MET Gly Asn Leu Pro Leu
930                 935                 940
GAT GAG TTC TAC CCA GCT GTG TCC ATG GTG GCC CTG ATG CGG ATC TTC    2880
Asp Glu Phe Tyr Pro Ala Val Ser MET Val Ala Leu MET Arg Ile Phe
945                 950                 955
CGA GAC CAG TCA CTC TCT CAT CAT CAC ACC ATG GTT GTC CAG GCC ATC    2928
Arg Asp Gln Ser Leu Ser His His His Thr MET Val Val Gln Ala Ile
960                 965                 970                 975
ACC TTC ATC TTC AAG TCC CTG GGA CTC AAA TGT GTG CAG TTC CTG CCC    2976
Thr Phe Ile Phe Lys Ser Leu Gly Leu Lys Cys Val Gln Phe Leu Pro
980                 985                 990
CAG GTC ATG CCC ACG TTC CTT AAT GTC ATT CGA GTC TGT GAT GGG GCC    3024
Gln Val MET Pro Thr Phe Leu Asn Val Ile Arg Val Cys Asp Gly Ala
995                 100O                1005
ATC CGG GAA TTT TTG TTC CAG CAG CTG GGA ATG TTG GTG TCC TTT GTG    3072
Ile Arg Glu Phe Leu Phe Gln Gln Leu Gly MET Leu Val Ser Phe Val
10lO                1015                1020
AAG AGC CAC ATC AGA CCT TAT ATG GAT GAA ATA GTC ACC CTC ATG AGA    3120
Lys Ser His Ile Arg Pro Tyr MET Asp Glu Ile Val Thr Leu MET Arg
1025                1030                1035
GAA TTC TGG GTC ATG AAC ACC TCA ATT CAG AGC ACG ATC ATT CTT CTC    3168
Glu Phe Trp Val MET Asn Thr Ser Ile Gln Ser Thr Ile Ile Leu Leu
1040                1045                1050                1055
ATT GAG CAA ATT GTG GTA GCT CTT GGG GGT GAA TTT AAG CTC TAC CTG    3216
Ile Glu Gln Ile Val Val Ala Leu Gly Gly Glu Phe Lys Leu Tyr Leu
1060                1065                1070
CCC CAG CTG ATC CCA CAC ATG CTG CGT GTC TTC ATG CAT GAC AAC AGC    3264
Pro Gln Leu Ile Pro His MET Leu Arg Val Phe MET His Asp Asn Ser
1075                1080                1085
CCA GGC CGC ATT GTC TCT ATC AAG TTA CTG GCT GCA ATC CAG CTG TTT    3312
Pro Gly Arg Ile Val Ser Ile Lys Leu Leu Ala Ala Ile Gln Leu Phe
1090                1095                1100
GGC GCC AAC CTG GAT GAC TAC CTG CAT TTA CTG CTG CCT CCT ATT GTT    3360
Gly Ala Asn Leu Asp Asp Tyr Leu His Leu Leu Leu Pro Pro Ile Val
1105                1110                1115
AAG TTG TTT GAT GCC CCT GAA GCT CCA CTG CCA TCT CGA AAG GCA GCG    3408
Lys Leu Phe Asp Ala Pro Glu Ala Pro Leu Pro Ser Arg Lys Ala Ala
1120                1125                1130                1135
CTA GAG ACT GTG GAC CGC CTG ACG GAG TCC CTG GAT TTC ACT GAC TAT    3456
Leu Glu Thr Val Asp Arg Leu Thr Glu Ser Leu Asp Phe Thr Asp Tyr
1140                1145                1150
GCC TCC CGG ATC ATT CAC CCT ATT GTT CGA ACA CTG GAC CAG AGC CCA    3504
Ala Ser Arg Ile Ile His Pro Ile Val Arg Thr Leu Asp Gln Ser Pro
1155                1160                1165
GAA CTG CGC TCC ACA GCC ATG GAC ACG CTG TCT TCA CTT GTT TTT CAG    3552
Glu Leu Arg Ser Thr Ala MET Asp Thr Leu Ser Ser Leu Val Phe Gln
1170                1175                1180
CTG GGG AAG AAG TAC CAA ATT TTC ATT CCA ATG GTG AAT AAA GTT CTG    3600
Leu Gly Lys Lys Tyr Gln Ile Phe Ile Pro MET Val Asn Lys Val Leu
1185                1190                1195
GTG CGA CAC CGA ATC AAT CAT CAG CGC TAT GAT GTG CTC ATC TGC AGA    3648
Val Arg His Arg Ile Asn His Gln Arg Tyr Asp Val Leu Ile Cys Arg
1200                1205                1210                1215
ATT GTC AAG GGA TAC ACA CTT GCT GAT GAA GAG GAG GAT CCT TTG ATT    3696
Ile Val Lys Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Glu Glu Glu Asp Pro Leu Ile
1220                1225                1230
TAC CAG CAT CGG ATG CTT AGG AGT GGC CAA GGG GAT GCA TTG GCT AGT    3744
Tyr Gln His Arg MET Leu Arg Ser Gly Gln Gly Asp Ala Leu Ala Ser
1235                1240                1245
GGA CCA GTG GAA ACA GGA CCC ATG AAG AAA CTG CAC GTC AGC ACC ATC    3792
Gly Pro Val Glu Thr Gly Pro MET Lys Lys Leu His Val Ser Thr Ile
1250                1255                1260
AAC CTC CAA AAG GCC TGG GGC GCT GCC AGG AGG GTC TCC AAA GAT GAC    3840
Asn Leu Gln Lys Ala Trp Gly Ala Ala Arg Arg Val Ser Lys Asp Asp
1265                1270                1275
TGG CTG GAA TGG CTG AGA CGG CTG AGC CTG GAG CTG CTG AAG GAC TCA    3888
Trp Leu Glu Trp Leu Arg Arg Leu Ser Leu Glu Leu Leu Lys Asp Ser
1280                1285                1290                1295
TCA TCG CCC TCC CTG CGC TCC TGC TGG GCC CTG GCA CAG GCC TAC AAC    3936
Ser Ser Pro Ser Leu Arg Ser Cys Trp Ala Leu Ala Gln Ala Tyr Asn
1300                1305                1310
CCG ATG GCC AGG GAT CTC TTC AAT GCT GCA TTT GTG TCC TGC TGG TCT    3984
Pro MET Ala Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ala Phe Val Ser Cys Trp Ser
1315                1320                1325
GAA CTG AAT GAA GAT CAA CAG GAT GAG CTC ATC AGA AGC ATC GAG TTG    4032
Glu Leu Asn Glu Asp Gln Gln Asp Glu Leu Ile Arg Ser Ile Glu Leu 
1330                1335                1340            
GCC CTC ACC TCA CAA GAC ATC GCT GAA GTC ACA CAG ACC CTC TTA AAC    4080
Ala Leu Thr Ser Gln Asp Ile Ala Glu Val Thr Gln Thr Leu Leu Asn
1345                1350                1355                
TTG GCT GAA TTC ATG GAA CAC AGT GAC AAG GGC CCC CTG CCA CTG AGA    4128
Leu Ala Glu Phe MET Glu His Ser Asp Lys Gly Pro Leu Pro Leu Arg
1360                1365                1370                1375
GAT GAC AAT GGC ATT GTT CTG CTG GGT GAG AGA GCT GCC AAG TGC CGA    4176
Asp Asp Asn Gly Ile Val Leu Leu Gly Glu Arg Ala Ala Lys Cys Arg
1380                1385                1390
GCA TAT GCC AAA GCA CTA CAC TAC AAA GAA CTG GAG TTC CAG AAA GGC    4224
Ala Tyr Ala Lys Ala Leu His Tyr Lys Glu Leu Glu Phe Gln Lys Gly
1395                1400                1405
CCC ACC CCT GCC ATT CTA GAA TCT CTC ATC AGC ATT AAT AAT AAG CTA    4272
Pro Thr Pro Ala Ile Leu Glu Ser Leu Ile Ser Ile Asn Asn Lys Leu
1410                1415                1420
CAG CAG CCG GAG GCA GCG GCC GGA GTG TTA GAA TAT GCC ATG AAA CAC    4320
Gln Gln Pro Glu Ala Ala Ala Gly Val Leu Glu Tyr Ala MET Lys His
1425                1430                1435
TTT GGA GAG CTG GAG ATC CAG GCT ACC TGG TAT GAG AAA CTG CAC GAG    4368
Phe Gly Glu Leu Glu Ile Gln Ala Thr Trp Tyr Glu Lys Leu His Glu 
1440                1445                1450                1455
TGG GAG GAT GCC CTT GTG GCC TAT GAC AAG AAA ATG GAC ACC AAC AAG    4416
Trp Glu Asp Ala Leu Val Ala Tyr Asp Lys Lys MET Asp Thr Asn Lys
1460                1465                1470
GAC GAC CCA GAG CTG ATG CTG GGC CGC ATG CGC TGC CTC GAG GCC TTG    4464
Asp Asp Pro Glu Leu MET Leu Gly Arg MET Arg Cys Leu Glu Ala Leu
1475                1480                1485
GGG GAA TGG GGT CAA CTC CAC CAG CAG TGC TGT GAA AAG TGG ACC CTG    4512
Gly Glu Trp Gly Gln Leu His Gln Gln Cys Cys Glu Lys Trp Thr Leu
1490                1495                1500
GTT AAT GAT GAG ACC CAA GCC AAG ATG GCC CGG ATG GCT GCT GCA GCT    4560
Val Asn Asp Glu Thr Gln Ala Lys MET Ala Arg MET Ala Ala Ala Ala
1505                1510                1515
GCA TGG GGT TTA GGT CAG TGG GAC AGC ATG GAA GAA TAC ACC TGT ATG    4608
Ala Trp Gly Leu Gly Gln Trp Asp Ser MET Glu Glu Tyr Thr Cys MET
1520                1525                1530                1535
ATC CCT CGG GAC ACC CAT GAT GGG GCA TTT TAT AGA GCT GTG CTG GCA    4656
Ile Pro Arg Asp Thr His Asp Gly Ala Phe Tyr Arg Ala Val Leu Ala
1540                1545                1550
CTG CAT CAG GAC CTC TTC TCC TTG GCA CAA CAG TGC ATT GAC AAG GCC    4704
Leu His Gln Asp Leu Phe Ser Leu Ala Gln Gln Cys Ile Asp Lys Ala
1555                1560                1565
AGG GAC CTG CTG GAT GCT GAA TTA ACT GCA ATG GCA GGA GAG AGT TAC    4752
Arg Asp Leu Leu Asp Ala Glu Leu Thr Ala MET Ala Gly Glu Ser Tyr
1570                1575                1580
AGT CGG GCA TAT GGG GCC ATG GTT TCT TGC CAC ATG CTG TCC GAG CTG    4800
Ser Arg Ala Tyr Gly Ala MET Val Ser Cys His MET Leu Ser Glu Leu 
1585                1590                1595
GAG GAG GTT ATC CAG TAC AAA CTT GTC CCC GAG CGA CGA GAG ATC ATC    4848
Glu Glu Val Ile Gln Tyr Lys Leu Val Pro Glu Arg Arg Glu Ile Ile
1600                1605                1610                1615
CGC CAG ATC TGG TGG GAG AGA CTG CAG GGC TGC CAG CGT ATC GTA GAG    4896
Arg Gln Ile Trp Trp Glu Arg Leu Gln Gly Cys Gln Arg Ile Val Glu
1620                1625                1630
GAC TGG CAG AAA ATC CTT ATG GTG CGG TCC CTT GTG GTC AGC CCT CAT    4944
Asp Trp Gln Lys Ile Leu MET Val Arg Ser Leu Val Val Ser Pro His
1635                1640                1645
GAA GAC ATG AGA ACC TGG CTC AAG TAT GCA AGC CTG TGC GGC AAG AGT    4992
Glu Asp MET Arg Thr Trp Leu Lys Tyr Ala Ser Leu Cys Gly Lys Ser
1650                1655                1660
GGC AGG CTG GCT CTT GCT CAT AAA ACT TTA GTG TTG CTC CTG GGA GTT    5040
Gly Arg Leu Ala Leu Ala His Lys Thr Leu Val Leu Leu Leu Gly Val
1665                1670                1675          
GAT CCG TCT CGG CAA CTT GAC CAT CCT CTG CCA ACA GTT CAC CCT CAG    5088
Asp Pro Ser Arg Gln Leu Asp His Pro Leu Pro Thr Val His Pro Gln
1680                1685                1690                1695
GTG ACC TAT GCC TAC ATG AAA AAC ATG TGG AAG AGT GCC CGC AAG ATC    5136
Val Thr Tyr Ala Tyr MET Lys Asn MET Trp Lys Ser Ala Arg Lys Ile
1700                1705                1710
GAT GCC TTC CAG CAC ATG CAG CAT TTT GTC CAG ACC ATG CAG CAA CAG    5184
Asp Ala Phe Gln His MET Gln His Phe Val Gln Thr MET Gln Gln Gln
1715                1720                1725
GCC CAG CAT GCC ATC GCT ACT GAG GAC CAG CAG CAT AAG CAG GAA CTG    5232
Ala Gln His Ala Ile Ala Thr Glu Asp Gln Gln His Lys Gln Glu Leu
1730                1735                1740
CAC AAG CTC ATG GCC CGA TGC TTC CTG AAA CTT GGA GAG TGG CAG CTG    5280
His Lys Leu MET Ala Arg Cys Phe Leu Lys Leu Gly Glu Trp Gln Leu
1745                1750                1755
AAT CTA CAG GGC ATC AAT GAG AGC ACA ATC CCC AAA GTG CTG CAG TAC    5328
Asn Leu Gln Gly Ile Asn Glu Ser Thr Ile Pro Lys Val Leu Gln Tyr
1760                1765                1770                1775
TAC AGC GCC GCC ACA GAG CAC GAC CGC AGC TGG TAC AAG GCC TGG CAT    5376
Tyr Ser Ala Ala Thr Glu His Asp Arg Ser Trp Tyr Lys Ala Trp His
1780                1785                1790
GCG TGG GCA GTG ATG AAC TTC GAA GCT GTG CTA CAC TAC AAA CAT CAG    5424
Ala Trp Ala Val MET Asn Phe Glu Ala Val Leu His Tyr Lys His Gln
1795                1800                1805
AAC CAA GCC CGC GAT GAG AAG AAG AAA CTG CGT CAT GCC AGC GGG GCC    5472
Asn Gln Ala Arg Asp Glu Lys Lys Lys Leu Arg His Ala Ser Gly Ala
1810                1815                1820
AAC ATC ACC AAC GCC ACC ACT GCC GCC ACC ACG GCC GCC ACT GCC ACC    5520
Asn Ile Thr Asn Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Ala Thr
1825                1830                1835
ACC ACT GCC AGC ACC GAG GGC AGC AAC AGT GAG AGC GAG GCC GAG AGC    5568
Thr Thr Ala Ser Thr Glu Gly Ser Asn Ser Glu Ser Glu Ala Glu Ser
1840                1845                1850                1855
ACC GAG AAC AGC CCC ACC CCA TCG CCG CTG CAG AAG AAG GTC ACT GAG    5616
Thr Glu Asn Ser Pro Thr Pro Ser Pro Leu Gln Lys Lys Val Thr Glu
1860                1865                1870
GAT CTG TCC AAA ACC CTC CTG ATG TAC ACG GTG CCT GCC GTC CAG GGC    5664
Asp Leu Ser Lys Thr Leu Leu MET Tyr Thr Val Pro Ala Val Gln Gly 
1875                1880                1885
TTC TTC CGT TCC ATC TCC TTG TCA CGA GGC AAC AAC CTC CAG GAT ACA    5712
Phe Phe Arg Ser Ile Ser Leu Ser Arg Gly Asn Asn Leu Gln Asp Thr
1890                1895                1900
CTC AGA GTT CTC ACC TTA TGG TTT GAT TAT GGT CAC TGG CCA GAT GTC    5760
Leu Arg Val Leu Thr Leu Trp Phe Asp Tyr Gly His Trp Pro Asp Val
1905                1910                1915
AAT GAG GCC TTA GTG GAG GGG GTG AAA GCC ATC CAG ATT GAT ACC TGG    5808
Asn Glu Ala Leu Val Glu Gly Val Lys Ala Ile Gln Ile Asp Thr Trp
1920                1925                1930                1935
CTA CAG GTT ATA CCT CAG CTC ATT GCA AGA ATT GAT ACG CCC AGA CCC    5856
Leu Gln Val Ile Pro Gln Leu Ile Ala Arg Ile Asp Thr Pro Arg Pro
1940                1945                1950
TTG GTG GGA CGT CTC ATT CAC CAG CTT CTC ACA GAC ATT GGT CGG TAC    5904
Leu Val Gly Arg Leu Ile His Gln Leu Leu Thr Asp Ile Gly Arg Tyr
1955                1960                1965
CAC CCC CAG GCC CTC ATC TAC CCA CTG ACA GTG GCT TCT AAG TCT ACC    5952
His Pro Gln Ala Leu Ile Tyr Pro Leu Thr Val Ala Ser Lys Ser Thr
1970                1975                1980
ACG ACA GCC CGG CAC AAT GCA GCC AAC AAG ATT CTG AAG AAC ATG TGT    6000
Thr Thr Ala Arg His Asn Ala Ala Asn Lys Ile Leu Lys Asn MET Cys
1985                1990                1995
GAG CAC AGC AAC ACC CTG GTC CAG CAG GCC ATG ATG GTG AGC GAG GAG    6048
Glu His Ser Asn Thr Leu Val Gln Gln Ala MET MET Val Ser Glu Glu
2000                2005                2010                2015
CTG ATC CGA GTG GCC ATC CTC TGG CAT GAG ATG TGG CAT GAA GGC CTG    6096
Leu Ile Arg Val Ala Ile Leu Trp His Glu MET Trp His Glu Gly Leu
2020                2025                2030
GAA GAG GCA TCT CGT TTG TAC TTT GGG GAA AGG AAC GTG AAA GGC ATG    6144
Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly MET
2035                2040                2045
TTT GAG GTG CTG GAG CCC TTG CAT GCT ATG ATG GAA CGG GGC CCC CAG    6192
Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala MET MET Glu Arg Gly Pro Gln
2050                2055                2060
ACT CTG AAG GAA ACA TCC TTT AAT CAG GCC TAT GGT CGA GAT TTA ATG    6240
Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu MET
2065                2070                2075
GAG GCC CAA GAG TGG TGC AGG AAG TAC ATG AAA TCA GGG AAT GTC AAG    6288
Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr MET Lys Ser Gly Asn Val Lys
2080                2085                2090                2095
GAC CTC ACC CAA GCC TGG GAC CTC TAT TAT CAT GTG TTC CGA CGA ATC    6336
Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile
2100                2105                2010
TCA AAG CAG CTG CCT CAG CTC ACA TCC TTA GAG CTG CAA TAT GTT TCC    6384
Ser Lys Gln Leu Pro Gln Leu Thr Ser Leu Glu Leu Gln Tyr Val Ser
2115                2120                2125
CCA AAA CTT CTG ATG TGC CGG GAC CTT GAA TTG GCT GTG CCA GGA ACA    6432
Pro Lys Leu Leu MET Cys Arg Asp Leu Glu Leu Ala Val Pro Gly Thr
2130                2135                2140
TAT GAC CCC AAC CAG CCA ATC ATT CGC ATT CAG TCC ATA GCA CCG TCT    6480
Tyr Asp Pro Asn Gln Pro Ile Ile Arg Ile Gln Ser Ile Ala Pro Ser
2145                2150                2155
TTG CAA GTC ATC ACA TCC AAG CAG AGG CCC CGG AAA TTG ACA CTT ATG    6528
Leu Gln Val Ile Thr Ser Lys Gln Arg Pro Arg Lys Leu Thr Leu MET 
2160                2165                2170                2175
GGC AGC AAC GGA CAT GAG TTT GTT TTC CTT CTA AAA GGC CAT GAA GAT    6576
Gly Ser Asn Gly His Glu Phe Val Phe Leu Leu Lys Gly His Glu Asp
2180                2185                2190
CTG CGC CAG GAT GAG CGT GTG ATG CAG CTC TTC GGC CTG GTT AAC ACC    6624
Leu Arg Gln Asp Glu Arg Val MET Gln Leu Phe Gly Leu Val Asn Thr
2195                2200                2205
CTT CTG GCC AAT GAC CCA ACA TCT CTT CGG AAA AAC CTC AGC ATC CAG    6672
Leu Leu Ala Asn Asp Pro Thr Ser Leu Arg Lys Asn Leu Ser Ile Gln
2210                2215                2220
AGA TAC GCT GTC ATC CCT TTA TCG ACC AAC TCG GGC CTC ATT GGC TGG    6720
Arg Tyr Ala Val Ile Pro Leu Ser Thr Asn Ser Gly Leu Ile Gly Trp
2225                2230                2235
GTT CCC CAC TGT GAC ACA CTG CAC GCC CTC ATC CGG GAC TAC AGG GAG    6768
Val Pro His Cys Asp Thr Leu His Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Arg Glu
2240                2245                2250                2255
AAG AAG AAG ATC CTT CTC AAC ATC GAG CAT CGC ATC ATG TTG CGG ATG    6816
Lys Lys Lys Ile Leu Leu Asn Ile Glu His Arg Ile MET Leu Arg MET
2260                2265                2270
GCT CCG GAC TAT GAC CAC TTG ACT CTG ATG CAG AAG GTG GAG GTG TTT    6864
Ala Pro Asp Tyr Asp His Leu Thr Leu MET Gln Lys Val Glu Val Phe
2275                2280                2285
GAG CAT GCC GTC AAT AAT ACA GCT GGG GAC GAC CTG GCC AAG CTG CTG    6912
Glu His Ala Val Asn Asn Thr Ala Gly Asp Asp Leu Ala Lys Leu Leu
2290                2295                2300
TGG CTG AAA AGC CCC AGC TCC GAG GTG TGG TTT GAC CGA AGA ACC AAT    6960
Trp Leu Lys Ser Pro Ser Ser Glu Val Trp Phe Asp Arg Arg Thr Asn
2305                2310                2315
TAT ACC CGT TCT TTA GCG GTC ATG TCA ATG GTT GGG TAT ATT TTA GGC    7008
Tyr Thr Arg Ser Leu Ala Val MET Ser MET Val Gly Tyr Ile Leu Gly
2320                2325                2330                2335
CTG GGA GAT AGA CAC CCA TCC AAC CTG ATG CTG GAC CGT CTG AGT GGG    7056
Leu Gly Asp Arg His Pro Ser Asn Leu MET Leu Asp Arg Leu Ser Gly
2340                2345                2350
AAG ATC CTG CAC ATT GAC TTT GGG GAC TGC TTT GAG GTT GCT ATG ACC    7104
Lys Ile Leu His Ile Asp Phe Gly Asp Cys Phe Glu Val Ala MET Thr
2355                2360                2365
CGA GAG AAG TTT CCA GAG AAG ATT CCA TTT AGA CTA ACA AGA ATG TTG    7152
Arg Glu Lys Phe Pro Glu Lys Ile Pro Phe Arg Leu Thr Arg MET Leu
2370                2375                2380
ACC AAT GCT ATG GAG GTT ACA GGC CTG GAT GGC AAC TAC AGA ATC ACA    7200
Thr Asn Ala MET Glu Val Thr Gly Leu Asp Gly Asn Tyr Arg Ile Thr
2385                2390                2395
TGC CAC ACA GTG ATG GAG GTG CTG CGA GAG CAC AAG GAC AGT GTC ATG    7248
Cys His Thr Val MET Glu Val Leu Arg Glu His Lys Asp Ser Val MET
2400                2405                2410                2415
GCC GTG CTG GAA GCC TTT GTC TAT GAC CCC TTG CTG AAC TGG AGG CTG    7296
Ala Val Leu Glu Ala Phe Val Tyr Asp Pro Leu Leu Asn Trp Arg Leu
2420                2425                2430
ATG GAC ACA AAT ACC AAA GGC AAC AAG CGA TCC CGA ACG AGG ACG GAT    7344
MET Asp Thr Asn Thr Lys Gly Asn Lys Arg Ser Arg Thr Arg Thr Asp
2435                2440                2445
TCC TAC TCT GCT GGC CAG TCA GTC GAA ATT TTG GAC GGT GTG GAA CTT    7392
Ser Tyr Ser Ala Gly Gln Ser Val Glu Ile Leu Asp Gly Val Glu Leu
2450                2455                2460
GGA GAG CCA GCC CAT AAG AAA ACG GGG ACC ACA GTG CCA GAA TCT ATT    7440
Gly Glu Pro Ala His Lys Lys Thr Gly Thr Thr Val Pro Glu Ser Ile
2465                2470                2475
CAT TCT TTC ATT GGA GAC GGT TTG GTG AAA CCA GAG GCC CTA AAT AAG    7488
His Ser Phe Ile Gly Asp Gly Leu Val Lys Pro Glu Ala Leu Asn Lys
2480                2485                2490                2495
AAA GCT ATC CAG ATT ATT AAC AGG GTT CGA GAT AAG CTC ACT GGT CGG    7536
Lys Ala Ile Gln Ile Ile Asn Arg Val Arg Asp Lys Leu Thr Gly Arg
2500                2505                2510
GAC TTC TCT CAT GAT GAC ACT TTG GAT GTT CCA ACG CAA GTT GAG CTG    7584
Asp Phe Ser His Asp Asp Thr Leu Asp Val Pro Thr Gln Val Glu Leu
2515                2520                2525
CTC ATC AAA CAA GCG ACA TCC CAT GAA AAC CTC TGC CAG TGC TAT ATT    7632
Leu Ile Lys Gln Ala Thr Ser His Glu Asn Leu Cys Gln Cys Tyr Ile
2530                2535                2540
GGC TGG TAC CCT TTC TGG TAA
Gly Trp Tyr Pro Phe Trp
2545
【００７６】
配列番号：２
配列の長さ：３４２３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
ハイポセチカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：モルト４ヒトＴ細胞白血病細胞
株名：ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８２株
配列：
ATG TCC CCT ATA CTA GGT TAT TGG AAA ATT AAG GGC CTT GTG CAA CCC      48
MET Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1               5                  10                  15
ACT CGA CTT CTT TTG GAA TAT CTT GAA GAA AAA TAT GAA GAG CAT TTG      96
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20                  25                  30
TAT GAG CGC GAT GAA GGT GAT AAA TGG CGA AAC AAA AAG TTT GAA TTG     144
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35                  40                  45
GGT TTG GAG TTT CCC AAT CTT CCT TAT TAT ATT GAT GGT GAT GTT AAA     192
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50                  55                  60
TTA ACA CAG TCT ATG GCC ATC ATA CGT TAT ATA GCT GAC AAG CAC AAC     240
Leu Thr Gln Ser MET Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65                  70                  75                  80
ATG TTG GGT GGT TGT CCA AAA GAG CGT GCA GAG ATT TCA ATG CTT GAA     288
MET Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser MET Leu Glu
85                  90                  95
GGA GCG GTT TTG GAT ATT AGA TAC GGT GTT TCG AGA ATT GCA TAT AGT     336
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100                 105                 110
AAA GAC TTT GAA ACT CTC AAA GTT GAT TTT CTT AGC AAG CTA CCT GAA     384
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115                 120                 125
ATG CTG AAA ATG TTC GAA GAT CGT TTA TGT CAT AAA ACA TAT TTA AAT     432
MET Leu Lys MET Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130                 135                 140
GGT GAT CAT GTA ACC CAT CCT GAC TTC ATG TTG TAT GAC GCT CTT GAT     480
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe MET Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145                 150                 155                 160
GTT GTT TTA TAC ATG GAC CCA ATG TGC CTG GAT GCG TTC CCA AAA TTA     528
Val Val Leu Tyr MET Asp Pro MET Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165                 170                 175
GTT TGT TTT AAA AAA CGT ATT GAA GCT ATC CCA CAA ATT GAT AAG TAC     576
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180                 185                 190
TTG AAA TCC AGC AAG TAT ATA GCA TGG CCT TTG CAG GGC TGG CAA GCC     624
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195                 200                 205
ACG TTT GGT GGT GGC GAC CAT CCT CCA AAA TCG GAT CTG GTT CCG CGT     672
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
210                 215                 220
GGT GGA TCC CCG GGA ATT TCC GGT GGT GGT GGT GGT GGA ATT CTA GAC     720
Gly Gly Ser Pro Gly Ile Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Leu Asp
225                 230                 235                 240
GAC TCC ATG AGC TTC AAG TAT GCA AGC CTG TGC GGC AAG AGT GGC AGG     768
Asp Ser MET Ser Phe Lys Tyr Ala Ser Leu Cys Gly Lys Ser Gly Arg
245                 250                 255
CTG GCT CTT GCT CAT AAA ACT TTA GTG TTG CTC CTG GGA GTT GAT CCG     816
Leu Ala Leu Ala His Lys Thr Leu Val Leu Leu Leu Gly Val Asp Pro
260                 265                 270
TCT CGG CAA CTT GAC CAT CCT CTG CCA ACA GTT CAC CCT CAG GTG ACC     864
Ser Arg Gln Leu Asp His Pro Leu Pro Thr Val His Pro Gln Val Thr
275                 280                 285
TAT GCC TAC ATG AAA AAC ATG TGG AAG AGT GCC CGC AAG ATC GAT GCC     912
Tyr Ala Tyr MET Lys Asn MET Trp Lys Ser Ala Arg Lys Ile Asp Ala
290                 295                 300
TTC CAG CAC ATG CAG CAT TTT GTC CAG ACC ATG CAG CAA CAG GCC CAG     960
Phe Gln His MET Gln His Phe Val Gln Thr MET Gln Gln Gln Ala Gln
305                 310                 315                 320
CAT GCC ATC GCT ACT GAG GAC CAG CAG CAT AAG CAG GAA CTG CAC AAG    1008
His Ala Ile Ala Thr Glu Asp Gln Gln His Lys Gln Glu Leu His Lys
325                 330                 335
CTC ATG GCC CGA TGC TTC CTG AAA CTT GGA GAG TGG CAG CTG AAT CTA    1056
Leu MET Ala Arg Cys Phe Leu Lys Leu Gly Glu Trp Gln Leu Asn Leu
340                 345                 350
CAG GGC ATC AAT GAG AGC ACA ATC CCC AAA GTG CTG CAG TAC TAC AGC    1104
Gln Gly Ile Asn Glu Ser Thr Ile Pro Lys Val Leu Gln Tyr Tyr Ser
355                 360                 365
GCC GCC ACA GAG CAC GAC CGC AGC TGG TAC AAG GCC TGG CAT GCG TGG    1152
Ala Ala Thr Glu His Asp Arg Ser Trp Tyr Lys Ala Trp His Ala Trp
370                 375                 380
GCA GTG ATG AAC TTC GAA GCT GTG CTA CAC TAC AAA CAT CAG AAC CAA    1200
Ala Val MET Asn Phe Glu Ala Val Leu His Tyr Lys His Gln Asn Gln
385                 390                 395                 400
GCC CGC GAT GAG AAG AAG AAA CTG CGT CAT GCC AGC GGG GCC AAC ATC    1248
Ala Arg Asp Glu Lys Lys Lys Leu Arg His Ala Ser Gly Ala Asn Ile
405                 410                 415
ACC AAC GCC ACC ACT GCC GCC ACC ACG GCC GCC ACT GCC ACC ACC ACT    1296
Thr Asn Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr
420                 425                 430
GCC AGC ACC GAG GGC AGC AAC AGT GAG AGC GAG GCC GAG AGC ACC GAG    1344
Ala Ser Thr Glu Gly Ser Asn Ser Glu Ser Glu Ala Glu Ser Thr Glu
435                 440                 445
AAC AGC CCC ACC CCA TCG CCG CTG CAG AAG AAG GTC ACT GAG GAT CTG    1392
Asn Ser Pro Thr Pro Ser Pro Leu Gln Lys Lys Val Thr Glu Asp Leu
450                 455                 460
TCC AAA ACC CTC CTG ATG TAC ACG GTG CCT GCC GTC CAG GGC TTC TTC    1440
Ser Lys Thr Leu Leu MET Tyr Thr Val Pro Ala Val Gln Gly Phe Phe
465                 470                 475                 480
CGT TCC ATC TCC TTG TCA CGA GGC AAC AAC CTC CAG GAT ACA CTC AGA    1488
Arg Ser Ile Ser Leu Ser Arg Gly Asn Asn Leu Gln Asp Thr Leu Arg
485                 490                 495
GTT CTC ACC TTA TGG TTT GAT TAT GGT CAC TGG CCA GAT GTC AAT GAG    1536
Val Leu Thr Leu Trp Phe Asp Tyr Gly His Trp Pro Asp Val Asn Glu
500                 505                 510
GCC TTA GTG GAG GGG GTG AAA GCC ATC CAG ATT GAT ACC TGG CTA CAG    1584
Ala Leu Val Glu Gly Val Lys Ala Ile Gln Ile Asp Thr Trp Leu Gln
515                 520                 525
GTT ATA CCT CAG CTC ATT GCA AGA ATT GAT ACG CCC AGA CCC TTG GTG    1632
Val Ile Pro Gln Leu Ile Ala Arg Ile Asp Thr Pro Arg Pro Leu Val
530                 535                 540
GGA CGT CTC ATT CAC CAG CTT CTC ACA GAC ATT GGT CGG TAC CAC CCC    1680
Gly Arg Leu Ile His Gln Leu Leu Thr Asp Ile Gly Arg Tyr His Pro
545                 550                 555                 560
CAG GCC CTC ATC TAC CCA CTG ACA GTG GCT TCT AAG TCT ACC ACG ACA    1728
Gln Ala Leu Ile Tyr Pro Leu Thr Val Ala Ser Lys Ser Thr Thr Thr
565                 570                 575
GCC CGG CAC AAT GCA GCC AAC AAG ATT CTG AAG AAC ATG TGT GAG CAC    1776
Ala Arg His Asn Ala Ala Asn Lys Ile Leu Lys Asn MET Cys Glu His
580                 585                 590
AGC AAC ACC CTG GTC CAG CAG GCC ATG ATG GTG AGC GAG GAG CTG ATC    1824
Ser Asn Thr Leu Val Gln Gln Ala MET MET Val Ser Glu Glu Leu Ile
595                 600                 605
CGA GTG GCC ATC CTC TGG CAT GAG ATG TGG CAT GAA GGC CTG GAA GAG    1872
Arg Val Ala Ile Leu Trp His Glu MET Trp His Glu Gly Leu Glu Glu
610                 615                 620
GCA TCT CGT TTG TAC TTT GGG GAA AGG AAC GTG AAA GGC ATG TTT GAG    1920
Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly MET Phe Glu
625                 630                 635                 640
GTG CTG GAG CCC TTG CAT GCT ATG ATG GAA CGG GGC CCC CAG ACT CTG    1968
Val Leu Glu Pro Leu His Ala MET MET Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu
645                 650                 655
AAG GAA ACA TCC TTT AAT CAG GCC TAT GGT CGA GAT TTA ATG GAG GCC    2016
Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu MET Glu Ala
660                 665                 670
CAA GAG TGG TGC AGG AAG TAC ATG AAA TCA GGG AAT GTC AAG GAC CTC    2064
Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr MET Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu
675                 680                 685
ACC CAA GCC TGG GAC CTC TAT TAT CAT GTG TTC CGA CGA ATC TCA AAG    2112
Thr Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys
690                 695                 700
CAG CTG CCT CAG CTC ACA TCC TTA GAG CTG CAA TAT GTT TCC CCA AAA    2160
Gln Leu Pro Gln Leu Thr Ser Leu Glu Leu Gln Tyr Val Ser Pro Lys
705                 710                 715                 720
CTT CTG ATG TGC CGG GAC CTT GAA TTG GCT GTG CCA GGA ACA TAT GAC    2208
Leu Leu MET Cys Arg Asp Leu Glu Leu Ala Val Pro Gly Thr Tyr Asp
725                 730                 735
CCC AAC CAG CCA ATC ATT CGC ATT CAG TCC ATA GCA CCG TCT TTG CAA    2256
Pro Asn Gln Pro Ile Ile Arg Ile Gln Ser Ile Ala Pro Ser Leu Gln
740                 745                 750
GTC ATC ACA TCC AAG CAG AGG CCC CGG AAA TTG ACA CTT ATG GGC AGC    2304
Val Ile Thr Ser Lys Gln Arg Pro Arg Lys Leu Thr Leu MET Gly Ser
755                 760                 765
AAC GGA CAT GAG TTT GTT TTC CTT CTA AAA GGC CAT GAA GAT CTG CGC    2352
Asn Gly His Glu Phe Val Phe Leu Leu Lys Gly His Glu Asp Leu Arg
770                 775                 780
CAG GAT GAG CGT GTG ATG CAG CTC TTC GGC CTG GTT AAC ACC CTT CTG    2400
Gln Asp Glu Arg Val MET Gln Leu Phe Gly Leu Val Asn Thr Leu Leu
785                 790                 795                 800
GCC AAT GAC CCA ACA TCT CTT CGG AAA AAC CTC AGC ATC CAG AGA TAC    2448
Ala Asn Asp Pro Thr Ser Leu Arg Lys Asn Leu Ser Ile Gln Arg Tyr
805                 810                 815
GCT GTC ATC CCT TTA TCG ACC AAC TCG GGC CTC ATT GGC TGG GTT CCC    2496
Ala Val Ile Pro Leu Ser Thr Asn Ser Gly Leu Ile Gly Trp Val Pro
820                 825                 830
CAC TGT GAC ACA CTG CAC GCC CTC ATC CGG GAC TAC AGG GAG AAG AAG    2544
His Cys Asp Thr Leu His Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Arg Glu Lys Lys
835                 840                 845
AAG ATC CTT CTC AAC ATC GAG CAT CGC ATC ATG TTG CGG ATG GCT CCG    2592
Lys Ile Leu Leu Asn Ile Glu His Arg Ile MET Leu Arg MET Ala Pro
850                 855                 860
GAC TAT GAC CAC TTG ACT CTG ATG CAG AAG GTG GAG GTG TTT GAG CAT    2640
Asp Tyr Asp His Leu Thr Leu MET Gln Lys Val Glu Val Phe Glu His
865                 870                 875                 880
GCC GTC AAT AAT ACA GCT GGG GAC GAC CTG GCC AAG CTG CTG TGG CTG    2688
Ala Val Asn Asn Thr Ala Gly Asp Asp Leu Ala Lys Leu Leu Trp Leu
885                 890                 895
AAA AGC CCC AGC TCC GAG GTG TGG TTT GAC CGA AGA ACC AAT TAT ACC    2736
Lys Ser Pro Ser Ser Glu Val Trp Phe Asp Arg Arg Thr Asn Tyr Thr
900                 905                 910
CGT TCT TTA GCG GTC ATG TCA ATG GTT GGG TAT ATT TTA GGC CTG GGA    2784
Arg Ser Leu Ala Val MET Ser MET Val Gly Tyr Ile Leu Gly Leu Gly
915                 920                 925
GAT AGA CAC CCA TCC AAC CTG ATG CTG GAC CGT CTG AGT GGG AAG ATC    2832
Asp Arg His Pro Ser Asn Leu MET Leu Asp Arg Leu Ser Gly Lys Ile
930                 935                 940
CTG CAC ATT GAC TTT GGG GAC TGC TTT GAG GTT GCT ATG ACC CGA GAG    2880
Leu His Ile Asp Phe Gly Asp Cys Phe Glu Val Ala MET Thr Arg Glu
945                 950                 955                 960
AAG TTT CCA GAG AAG ATT CCA TTT AGA CTA ACA AGA ATG TTG ACC AAT    2928
Lys Phe Pro Glu Lys Ile Pro Phe Arg Leu Thr Arg MET Leu Thr Asn
965                 970                 975
GCT ATG GAG GTT ACA GGC CTG GAT GGC AAC TAC AGA ATC ACA TGC CAC    2976
Ala MET Glu Val Thr Gly Leu Asp Gly Asn Tyr Arg Ile Thr Cys His
980                 985                 990
ACA GTG ATG GAG GTG CTG CGA GAG CAC AAG GAC AGT GTC ATG GCC GTG    3024
Thr Val MET Glu Val Leu Arg Glu His Lys Asp Ser Val MET Ala Val
995                 1000                1005
CTG GAA GCC TTT GTC TAT GAC CCC TTG CTG AAC TGG AGG CTG ATG GAC    3072
Leu Glu Ala Phe Val Tyr Asp Pro Leu Leu Asn Trp Arg Leu MET Asp
1010                1015                1020
ACA AAT ACC AAA GGC AAC AAG CGA TCC CGA ACG AGG ACG GAT TCC TAC    3120
Thr Asn Thr Lys Gly Asn Lys Arg Ser Arg Thr Arg Thr Asp Ser Tyr
1025                1030                1035                1040
TCT GCT GGC CAG TCA GTC GAA ATT TTG GAC GGT GTG GAA CTT GGA GAG    3168
Ser Ala Gly Gln Ser Val Glu Ile Leu Asp Gly Val Glu Leu Gly Glu
1045                1050                1055
CCA GCC CAT AAG AAA ACG GGG ACC ACA GTG CCA GAA TCT ATT CAT TCT    3216
Pro Ala His Lys Lys Thr Gly Thr Thr Val Pro Glu Ser Ile His Ser
1060                1065                1070
TTC ATT GGA GAC GGT TTG GTG AAA CCA GAG GCC CTA AAT AAG AAA GCT    3264
Phe Ile Gly Asp Gly Leu Val Lys Pro Glu Ala Leu Asn Lys Lys Ala
1075                1080                1085
ATC CAG ATT ATT AAC AGG GTT CGA GAT AAG CTC ACT GGT CGG GAC TTC    3312
Ile Gln Ile Ile Asn Arg Val Arg Asp Lys Leu Thr Gly Arg Asp Phe
1090                1095                1100
TCT CAT GAT GAC ACT TTG GAT GTT CCA ACG CAA GTT GAG CTG CTC ATC    3360
Ser His Asp Asp Thr Leu Asp Val Pro Thr Gln Val Glu Leu Leu Ile
1105                1110                1115                1120
AAA CAA GCG ACA TCC CAT GAA AAC CTC TGC CAG TGC TAT ATT GGC TGG    3408
Lys Gln Ala Thr Ser His Glu Asn Leu Cys Gln Cys Tyr Ile Gly Trp
1125                1130                1135
TAC CCT TTC TGG TAA
Tyr Pro Phe Trp
1140
【配列表】
2008253264000001.app