(57)【要約】【課題】劇症肝炎などの肝炎の病態を予測・診断することは、適切な治療を行う上で最も重要である一方、特定タンパク質の発現量や肝機能を指標とした従来の診断技術で肝炎の病態を予測することは困難であり、肝炎に対する新規の診断技術の開発が望まれていた。【解決手段】本発明によれば、血液を含む組織試料中のＴＧＦ―αのｍＲＮＡの発現量をワンステップＲＴ−ＰＣＲなどで定量的に検出することで、肝炎の、予後を含めた病態を的確に診断することを可能とする、病態と相関性の高く精度の優れた診断キット及び診断マーカーが提供される。【選択図】    図１
2008017777.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における肝炎を診断するための診断キットであって、
前記哺乳動物から得られた組織試料において、ＴＧＦ−αをコードするｍＲＮＡを定量的に検出するための検出試薬を有し、前記ｍＲＮＡの発現量が肝炎の診断の指標となる診断キット。
【請求項２】
前記肝炎が劇症肝炎である、請求項１に記載の診断キット。
【請求項３】
前記指標が肝炎の予後の指標である、請求項１又は２に記載の診断キット。
【請求項４】
前記組織試料が血液である、請求項１ないし３の何れか１項に記載の診断キット。
【請求項５】
前記検出試薬が、ＲＴ−ＰＣＲに用いるための１組のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項１ないし４の何れか１項に記載の診断キット。
【請求項６】
前記ＲＴ−ＰＣＲが、蛍光色素を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲであることを特徴とする請求項５に記載の診断キット。
【請求項７】
前記１組のオリゴヌクレオチドプライマーが、それぞれＳＥＱ  ＩＤ：１及びＳＥＱ  ＩＤ：２と少なくとも８０％の同一性を有する１組のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項５又は６に記載の診断キット。
【請求項８】
前記検出試薬がマイクロアレイ解析に用いるためのオリゴヌクレオチドプローブを含み、該プローブが備え付けられたマイクロアレイ用チップを更に含む、請求項１ないし４の何れか１項に記載の診断キット。
【請求項９】
前記検出試薬が、インサイツハイブリダイゼーションに用いるためのオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項１ないし４の何れか１項に記載の診断キット。
【請求項１０】
前記検出試薬が、ノーザンブロット解析に用いるためのオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項１ないし４の何れか１項に記載の診断キット。
【請求項１１】
ＴＧＦ−αをコードするｍＲＮＡを含む、肝炎を診断するための診断マーカー。
【請求項１２】
前記肝炎が劇症肝炎である、請求項１１に記載の診断マーカー。
【請求項１３】
前記診断が肝炎の予後の診断である、請求項１１又は１２に記載の診断マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝疾患を診断するための診断キット及び診断マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は多種多様な機能を有し、生体の恒常性維持の上で重要な役割を担っている臓器であり、肝臓の主な機能として多種の血漿タンパク質の合成分泌、糖新生やグリコーゲン代謝による血糖調節、尿素合成、胆汁分泌、各種薬物や栄養素（タンパク質、脂質、ビタミン、ホルモン等）に対する代謝などが挙げられる。これらの機能の何れかが障害を受けると、過労感、倦怠感、食欲不振、黄胆や微熱を始めとする肝機能障害特有の諸症状があらわれることとなる。肝機能障害の原因としては、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、肝硬変、肝癌等の肝疾患が挙げられる。
【０００３】
肝疾患として最も一般的なものが各種肝炎である。肝炎の原因としては、肝炎ウイルス及び化学物質が最もよく知られているが、日本では特に、肝炎の大部分は肝炎ウイルスによるものである。予後は一般に若年層ほど良好であるが、３％−６％が劇症肝炎に移行すること、また、数十％近くが肝硬変、更には肝癌に進行することが知られている。
【０００４】
主な肝炎ウイルスとしては、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス及びＥ型肝炎ウイルスが知られており、更にその何れにも属さない未知の肝炎ウイルスの存在も示唆されている。劇症肝炎へと進行するのは、Ｃ型、Ｂ型の順に多く、Ａ型は極めて少ない。また、妊婦がＥ型肝炎ウイルスに感染した場合は、劇症肝炎の頻度が高いことも知られている。
【０００５】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によるＢ型肝炎は、特に熱帯アフリカ、東南アジアおよび極東において多発するウイルス性疾患であり、急性の自己限定性感染、生命を脅かす危険性のある劇症肝炎 、並びに肝硬変や原発性肝癌に進行し肝不全をもたらす可能性のある慢性肝炎が含まれる。慢性感染のＨＢＶキャリアーの人数は、世界中に２億人いると見積もられており、そのうちの１５％ほどが肝臓癌へと進行すると考えられている。急性又は慢性のＢ型肝炎の治療法は、現在のところ不充分であり、主に患者の体力を保たせるための対症療法が用いられている他、抗ウイルス剤であるインターフェロン（ＩＦＮ）−βの投与なども行われている。
【０００６】
他方、日本では肝炎発症の大部分を占める、Ｃ型肝炎ウイルスによるＣ型肝炎は、時には無症状のまま進行することも多く、その半数以上が慢性化し、高い確率で肝硬変及び肝癌のような悪性の疾患へ進行することが知られている。慢性Ｃ型肝炎のうち、門脈域の炎症が実質域にまで及んだ状態である慢性活動性肝炎については、ＩＦＮを投与してＣ型肝炎ウイルスを減少させることにより症状を緩和させられることが明らかとなったため、１９９２年よりＩＦＮ療法が盛んに行われるようになった。このＩＦＮ療法は慢性活動性肝炎についてのみ保険適用が認められており、ＩＦＮ療法を行う前には確認のための肝生検が行われることとなっている。更に、ＩＦＮ療法後の効果の判定には、ＧＰＴ（Glutamic-pyruvic transaminase：グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）の低下とウイルスの有無が基準となっているが、肝組織側からその組織像の回復を調べるには、肝生検を行うしか方法がない。しかしながら、肝生検には熟練した技術が必要であり、患者を拘束するとともに苦痛を伴う。またサンプリングエラーなどの危険性も含んでいる。そのため、現在ではＩＦＮ療法後の効果の判定の多くで肝生検を行っておらず、ＩＦＮ療法後の予後判定を精確に行うことは困難な状況にある。
【０００７】
劇症肝炎は、急性肝炎の中で、経過中に肝細胞が広汎かつ急速に壊死をきたすものを指し、重篤な肝機能障害を起こす死亡率の高い疾患として知られている。その診断基準によれば、劇症肝炎とは、「肝炎の症状が発現後、約８週間以内に高度の肝機能障害に基づく肝性昏睡をきたし、プロトロンビン時間４０％以下を示すもの」をいう。原因については、９０％以上が肝炎ウイルスといわれているが、複雑で未知の点も多く、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型肝炎ウイルスに加えて、Ｅ型肝炎ウイルスや未知の肝炎ウイルスの影響も示唆されている。予後に関しては、Ｃ型肝炎ウイルスによるものが最も悪いことが知られている。劇症肝炎には、肝炎の症状発現後１０日以内に発現する急性型と、１１日以後に発現する亜急性型とがあり、劇症肝炎の３０％以上が急性型である。亜急性型は急性型よりも死亡率が高いが、臨床症状、諸検査所見により早期に予測することは困難である。従来の劇症肝炎の治療法としては、肝不全のために生じた中毒物質の除去・失われた必須物質の補給のための、血漿交換、交換輸血、グルカゴンとインスリンの併用投与などが行われてきたが、これら通常の内科的治療法を行った場合、生存率は２０％−４０％であり、その改善はなかなか見られていない。
【０００８】
これらの肝炎の診断に関しては、例えば、ビリルビン量、ＧＯＴ（Glutamic-oxaloacetic transaminase：グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ）、ＧＰＴ、血清コリンエステラーゼ、総コレステロール、血清アルブミン、アンモニアなどの肝機能の指標・臨床マーカーが一般的に用いられている。
【０００９】
肝機能の指標に加えて、ウイルス性肝炎においては、急性・慢性の判別、治療効果の予測、予後などの診断において、肝炎ウイルスタンパク質などの肝炎ウイルスマーカーが用いられている。また、劇症肝炎においては、白血球の増加や血小板の減少などの血液所見、プロトロビン時間などの血液凝固試験、血清電解質、血漿遊離アミノ酸なども診断に用いられている。また、劇症肝炎の病態では肝細胞の増殖に関与する増殖因子受容体とそのリガンドが重要であるため、肝細胞に存在する増殖因子受容体であるＥＧＦＲ（Epidermal Growth Factor Receptor）、ｃ−ｍｅｔ、及びそれら受容体のリガンドであるＴＧＦ−α（Transforming Growth Factor-α）、ＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）、ＶＥＧＦ（Vascular Endothelial Growth Factor）、更に細胞寿命に重要な機能をもつｈＴＥＲＴ（human Telomerase Reverse Transcriptase）などの様々なタンパク質について、肝炎との関連が示唆されており、例えば、非特許文献１にはＴＧＦ−αの血中タンパク質濃度を用いた肝炎の急性／慢性の判断法が記載されている。
【００１０】
一方、特許文献１には、腫瘍の診断において、血液中のｍＲＮＡを用いることが記載されている。
【００１１】
【非特許文献１】T. TOMIYA et al., “Liver Regeneration in Fulminant Hepatitis as Evaluated by Serum Transforming Growth Factor α Levels”, Hepatology, 1996; 23: 253-257
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０４９８６４公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
劇症肝炎に対する従来の内科的治療法では生存率は２０％−４０％である一方、肝移植を施行した場合、生存率は９０％以上に向上するため、劇症肝炎の予後を早い段階で診断することが可能となれば、無効な治療を継続することなく、肝移植などへ治療法を転換することが可能となり、患者の生存の可能性を高めることができる。しかし、肝炎の病態を予測することは従来困難であった。なぜなら、従来の肝機能やマーカーのタンパク質濃度を指標とした診断技術は、感度や相関性の点で問題を有していたからである。
【００１３】
一方、疾患によっては、タンパク質よりもｍＲＮＡの方が病状と相関性の高い診断マーカーとして知られていたが、ｍＲＮＡはＲＮａｓｅにより分解され不安定であるため、特定のｍＲＮＡしか安定に計測できることが知られていなかった。
【００１４】
斯かる状況に鑑み、予後を含めた病態の診断のための新たな診断キット及び診断マーカーの開発が望まれた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば、哺乳動物における肝炎を診断するための診断キットであって、この哺乳動物から得られた組織試料において、ＴＧＦ−αをコードするｍＲＮＡを定量的に検出するための検出試薬を有し、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡの発現量が肝炎の診断の指標となる診断キットが提供される。この診断キットは、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡを指標とすることにより、肝炎の病態と相関性の高い診断を行うことができる。
【００１６】
また、本発明によれば、ＴＧＦ−αをコードするｍＲＮＡを含む、肝炎を診断するための診断マーカーが提供される。この診断マーカーは、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡを指標として用いることが可能なため、肝炎の病態と相関性の高いマーカーとして用いることができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、肝炎の病態と相関性の高い診断を行うことを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１はプライマーの配列を説明するための図である。
【図２】図２はＴＧＦ−αの配列を説明するための図である。
【図３】図２はＴＧＦ−αの配列を説明するための図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本実施形態に係る「哺乳動物」とは、任意の哺乳動物をいい、ヒト、家畜用動物、ペット用動物、動物園用動物、又はスポーツ用動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウサギなどを含む。哺乳動物は、好ましくはヒトである。
【００２０】
本実施形態に係る「ＴＧＦ−α」（Transforming Growth Factor−α）とは、図２及び図３、あるいはＳＥＱ  ＩＤ：４で示される塩基配列がｃＤＮＡとしてコードするポリペプチドのことをいい、そのポリペプチドの遺伝子多型体、遺伝子変異体あるいはスプライシングバリアントも含む。ＴＧＦ−α は、上皮細胞等の増殖作用を示すサイトカインであり、同時に、肝癌などの幾つかの癌において血管新生等に関与する癌の増悪因子として重要な役割を担っている。また、その受容体としてＥｒｂＢレセプターファミリーが同定され、そのレセプターもやはり癌において重要なシグナルに関わることが明らかにされつつある。
【００２１】
本実施形態に係る「肝炎の診断の指標」とは、例えば、肝炎の発症、急性肝炎・慢性肝炎・劇症肝炎・肝硬変への移行、治療結果の観察・評価、予後、早期診断・早期予知、病態把握、肝不全などの肝障害程度の推定などの、肝炎の様々な診断に用いられる指標のことをいう。疾患における成功裏の治療及び改善を評価することに関する上記の症状及びその症状を表すパラメーター等に関しては、この技術分野の医師にとってよく知られている日常的手法によって容易に測定が可能である。
【００２２】
ここで、「予後」とは、疾病に対しての治療を施した後の、患者の生死を含めた見通しのことをいう。
【００２３】
本実施形態に係る「劇症肝炎」とは、その診断基準によれば、「肝炎の症状が発現後、約８週間以内に高度の肝機能障害に基づく肝性昏睡をきたし、プロトロンビン時間４０％以下を示すもの」をいう。劇症肝炎は、急性肝炎の中で、経過中に肝細胞が広汎かつ急速に壊死をきたすものを指し、重篤な肝機能障害を起こす死亡率の高い疾患として知られている。劇症肝炎は、急性肝炎の約１％の頻度にあたり、年間約４０００例が発生し、男女比はほぼ同数でどの年代にも見られるが、２０歳台と５０歳台に特に多いことがその特徴である。原因については、９０％以上が肝炎ウイルスといわれているが、複雑で未知の点も多く、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型肝炎ウイルスに加えて、Ｅ型肝炎ウイルスや未知の肝炎ウイルスの影響も示唆されている。予後に関しては、Ｃ型肝炎ウイルスによるものが悪いことが知られている。劇症肝炎の機序については、詳細は不明であるが、過剰な抗体産生による肝細胞壊死及びＴ細胞による肝細胞への細胞性免疫などの、肝臓でおこる激しい炎症と、その後のＳｈｗａｒｔｚｍａｎ反応、肝細胞のアポトーシスや、その結果としての肝細胞再生の不全として理解されている。
【００２４】
劇症肝炎には、肝炎の症状発現後１０日以内に発現する急性型と、１１日以後に発現する亜急性型とがあり、劇症肝炎の３０％以上が急性型である。亜急性型は急性型よりも死亡率が高いが、臨床症状、諸検査所見により早期に予測することは困難である。症状としては、肝性昏睡がほとんどの症例で見られ、他に、進行性の黄疸、強い全身倦怠と食欲不振、悪心、嘔吐、肝性口臭、発熱、出血傾向、浮腫、腹水、乏尿、肝濁音界の縮小、羽ばたき振せん、及び播種性血管内凝固症候群、消化管出血、感染症、腎不全、脳浮腫などの合併症が主要な臨床所見である。
【００２５】
従来の劇症肝炎の治療法としては、肝不全のために生じた中毒物質の除去、失われた必須物質の補給のための、血漿交換、交換輸血、グルカゴンとインスリンの併用投与などが知られているが、これら通常の内科的治療法を行った場合、生存率は２０％−４０％であり、その改善はなかなか見られていない。しかし、肝移植を施行した場合、生存率は９０％以上に向上するため、劇症肝炎の予後を早い段階で診断することが可能となれば、無効な治療を継続することなく、肝移植などへ治療法を転換することが可能となり、患者の生存の可能性を高めることができる。そのため、予後の診断を含めた、より有効な診断法の開発が求められている。
【００２６】
本実施形態に係る「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在する塩基、糖及び糖間結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシドモノマーのオリゴマー又はポリマーのことをいう。本実施形態に係るオリゴヌクレオチドは、同様に機能する天然に存在しないモノマー、蛍光分子等や放射性同位体で標識されたモノマー、又はその部分を含むオリゴマー又はポリマーも含む。
【００２７】
本実施形態に係る「同一性」とは、配列を比較することにより決定される、２以上のポリヌクレオチドの間の関係をいい、本実施形態で「同一性」とは、ポリヌクレオチド配列間の適合によって決定されるようなポリヌクレオチド配列間の配列一致性の程度を意味する。「同一性」に関するパラメーターは、既知の方法により容易に計算可能である。同一性に関するパラメーターを計算するための方法は、公に利用可能なプログラムにコードされている。そのようなプログラムとして、例えば、AltschulらによるＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool)プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997)）を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いるのが好ましいが、これに限定されない。
【００２８】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００２９】
本発明のある実施形態は、哺乳動物における肝炎を診断するための診断キットであって、哺乳動物から組織試料を得、その得られた組織試料において、検出試薬を用いてＴＧＦ−αのｍＲＮＡを定量的に検出し、そのｍＲＮＡの発現量を以って、肝炎の診断の指標とする診断キットであり、この診断キットによると肝炎の病態を把握することが可能となる。従来、肝炎が急性、自己限定性もしくは慢性の何れであるかの診断、劇症肝炎などへの進行についての診断、ＩＦＮ療法への応答性の診断、そして各種肝炎の治療効果の診断や予後の予測は困難であったが、この診断キットにより治療効果を予測又は監視することも可能となり、より有効な治療法を提供することが可能となる。
【００３０】
この診断キットで診断に用いられるｍＲＮＡは、タンパク質より量的に高感度であり、微量でも感度よく検出可能である。また、肝炎の診断において従来のタンパク質濃度を用いる診断技術は病態との相関性が高くないことに加え、更に、タンパク質量の変化はｍＲＮＡ量の変化よりも遅いため、タンパク質量による診断は急激な症状の変化やその予測に対しては相関性が高くなく、実際にＴＧＦ−αのタンパク質を指標とした場合にも肝炎の病態との相関性は高くない。
【００３１】
上記のとおり、従来型のタンパク質を用いた診断よりもｍＲＮＡを用いた診断の方が精度も高く有利であるが、ＲＮＡはＲＮａｓｅにより分解されるため、安定に定量的検出ができるのは特定のＲＮＡに限られ、全てのＲＮＡでｍＲＮＡを用いた診断ができるわけではない。本発明のある実施形態においては、安定に定量的検出ができるｍＲＮＡとしてＴＧＦ−αを見出し、そのＴＧＦ−αのｍＲＮＡ量を用いて診断することにより、この実施形態に係る診断キットは肝炎の病態と高い相関性を示すという顕著な効果を奏する。更に、本実施形態に係る診断キットを用いて肝炎の病態を把握することにより、肝炎同士の様々な病態を識別することが可能となり、適切な治療法計画の設計に有用である。
【００３２】
更なる実施形態は、劇症肝炎についての診断キットであり、この診断キットにより、例えば、劇症肝炎への移行、劇症肝炎の治療結果の観察、予後、肝障害程度の推定などに関する指標を得ることが可能となる。本実施形態に係る診断キットは、変化の即時性の高いｍＲＮＡを指標とするため、劇症肝炎などの急性の症状の診断に対して好適である。
【００３３】
また、他の実施形態は、肝炎の予後の指標としてＴＧＦ−αのｍＲＮＡを用いた診断キットであり、肝炎の予後と高い相関性を有するこの診断キットを用いることにより、各種肝炎の治療後の、治療結果の観察や、移植例、死亡例及び生存例の予測が容易となる。この診断キットにおいては、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡの発現量が高い場合が、予後が良好であると診断される。従来、劇症肝炎の予後を的確に診断する指標は知られておらず、本実施形態に係る診断キットは、劇症肝炎患者の予後の改善には特に効果を奏する。
【００３４】
また、他の更なる実施形態は、組織試料として血液を用いることのできる診断キットである。肝炎においては、その炎症反応のため、血液中にＴＧＦ−αのｍＲＮＡが流出しており、またそのｍＲＮＡは血液中では多くの場合２４時間以上安定であるため、血液を組織試料として用いることが可能となる。血液を用いることで、肝生検によらない非侵襲的な検査が可能となり、迅速・簡便かつ患者に利便性の高い方法での診断が可能となる。血液を試料として用いる場合、例えば、血液に適切な遠心分離操作を行うことで、リンパ球の存在を無視できる量になるまで減少させた血清を得、その血清に対してｍＲＮＡの検出試薬を反応させることで実施できるが、これに限られない。
【００３５】
更なる実施形態では、血液から得られた血清に対し、更なる処理操作を追加してもよい。このような処理操作としては、例えば、デオキシヌクレーゼ処理等によるＤＮＡの除去、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）、オリゴｄＴラテックス法、ファスト・トラック・ｍＲＮＡ単離キット（インビトロジェン社）、クイック・プレップ・ｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア社）等によるｍＲＮＡの調製などが挙げられるが、これに限られない。
【００３６】
また、上記実施の形態での試料は血液であるが、他の実施形態では、肝細胞・肝臓組織などをもとに、例えば、ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）などの、固体試料からのＲＮＡ抽出試薬を用いて試料を調整し、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡを検出することも、当業者にとっては容易に達成可能である。
【００３７】
また、更なる実施形態は、検出試薬として１組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによりＴＧＦ−αのｍＲＮＡを検出する診断キットである。増幅反応であるＰＣＲ反応を検出手段として用いることで、更に感度の良い検出が可能となり、タンパク質や肝機能を指標とした場合より微量の検出や精度の高い診断が可能となる。
【００３８】
このＲＴ−ＰＣＲに用いられるプライマーは、図２及び図３、あるいはＳＥＱ  ＩＤ：４に示すｃＤＮＡあるいはそのコードするポリペプチドに対応するＤＮＡ、あるいはそれらの相補鎖を基に、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡとハイブリダイズし、ＰＣＲ反応を行えるように、好ましくはＴＧＦ−α特異的なＰＣＲ生成物（鎖長あるいは配列において）を生成するように、より好ましくはプライマー自身がＴＧＦ−α特異的な配列を含むように、設計される。このようなプライマーは、ＢＬＡＳＴ等のプログラム及びデータベースを用いることにより、当業者には容易に設計可能である。その際、プライマーの３’側の領域はＴＧＦ−αのｍＲＮＡに対し相補的であることが好ましいが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することも可能である。また、そのプライマーは、通常、１５ｂｐ−１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ−３５ｂｐの鎖長を有するように設計される。
【００３９】
上述のように設計されたプライマーを用い、ｍＲＮＡを含む試料から逆転写酵素によりｃＤＮＡを生成する工程と、そのｃＤＮＡよりＰＣＲにてＰＣＲ生成物を増幅する工程と、そのＰＣＲ生成物を検出する工程により、ＲＴ−ＰＣＲを用いた診断を行うことができる。当業者であれば、公知の手法により、プローブ長などの因子に適合させて、温度、イオン強度等の諸条件を調節し適する条件で行うことは容易に可能である。
【００４０】
また、更なる実施形態は、図１又はＳＥＱ  ＩＤ：１及びＳＥＱ  ＩＤ：２で表される１組のオリゴヌクレチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによりＴＧＦ−αのｍＲＮＡの発現量を定量的に検出する診断キットである。本実施形態に係る診断キットは、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡと特異性をもって反応するこれらのオリゴヌクレチドプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、確実にＴＧＦ−αのｍＲＮＡを検出可能にするという効果を奏する。
【００４１】
また、更なる実施形態は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲでＴＧＦ−αのｍＲＮＡを検出する診断キットである。リアルタイムＰＣＲを用いることで、ワンステップあるいは短いステップ数の工程で、簡便に、リアルタイムで、かつ定量的にｍＲＮＡの検出を行うことが可能となる。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲとしては、例えば、各種蛍光ＰＣＲベースの技術を用いることが可能である。蛍光ＰＣＲベースの技術としては、例えば、ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉなどの各種の蛍光性核酸標識剤を用いるインターカレーター法（例えば、ライトサイクラー（登録商標：ロシュ社）、ABI Prizm 7700 Sequence Detection System（登録商標）（パーキン・エルマー、アプライド・バイオシステムズ社)を用いる）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を利用して増幅をリアルタイムでモニターするＴａｑＭａｎプローブ法、ＲＮａｓｅＨ酵素のＲＮａｓｅ活性及び専用のキメラＲＮＡプローブを利用するサイクリングプローブ法などが挙げられるが、これに限られない。
【００４２】
また、他の更なる実施形態は、検出試薬としてオリゴヌクレオチドプローブと、更にチップを用いたマイクロアレイ解析によりＴＧＦ―αのｍＲＮＡを検出する診断キットである。マイクロアレイ解析を用いることで、他の病態遺伝子など多くの因子を含めた多面的な同時解析、及び簡便な解析が可能となる。本実施形態に係るマイクロアレイは、オリゴヌクレオチドプローブをチップに固定する工程を含む方法で提供することができる。
【００４３】
マイクロアレイ解析で用いられるプローブは、図２及び図３、あるいはＳＥＱ  ＩＤ：４に示すＴＧＦ−αのｃＤＮＡの部分配列、対応するｍＲＮＡの部分配列、それらと相補的な配列あるいはそれらとハイブリダイズする配列を含む任意のオリゴマーから設計される。また、プローブは少なくとも１５ｂｐの鎖長のオリゴヌクレオチドとなるように設計される。設計されたプローブは、ＰＣＲや核酸化学合成の技術などを用いて合成され、提供される。そのマイクロアレイは１つのスポット当り１種または２種以上の任意のプローブを含み、何れかのスポットに１種又は２種以上のＴＧＦ−αのｍＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドプローブが含まれているものとする。このプローブはマイクロアレイ用チップに物理的結合または化学的結合によって固定されていてもよい。
【００４４】
マイクロアレイ用チップの素材は公知の全ての種類の物質であってもよく、好ましくは通常のマイクロアレイで使用される物質であり、チップ表面にオリゴヌクレオチドを固定することができる反応基やニトロセルロースまたは３次構造形成物が更に含まれていてもよい。例えば、シリコンウエハー、ガラス、ポリカーボネート、膜、ポリスチレンまたはポリウレタンのような高分子フィルム及び多孔性物質が用いられる。プローブの固定は、通常のマイクロアレイ製造方法で使用する方法を用いることができ、例えば、フォトリソグラフィ法、圧電印刷法、マイクロピペッティングまたはスポッティングなどの方法を用いることができる。
【００４５】
上述のプローブは、マイクロアレイ上の一つのスポット当り２ｐｇ〜１００ｐｇ固定することができる。また、マイクロアレイ上のスポットは１倍数以上であってもよく、好ましくは２ないし３倍数で構成可能である。この時、スポットは、例えば、直径５０μｍ〜５００μｍ、スポットの間隔は１０μｍ〜５００μｍであってもよいが、スポットの大きさ及び稠密度はマイクロアレイ分析システムの解像度によって適切に調節することが好ましい。本実施形態に係るマイクロアレイは、マイクロウェルプレート、例えば９６ウェルプレートのウェルに設置し、既存の９６ウェルプレートを利用した自動装備（Biomek、Genetix roboなど）を用いて、試料分子、標識、混成化及び洗浄過程を機械的に処理することも可能である。
【００４６】
また、他の更なる実施形態は、検出試薬としてオリゴヌクレオチドプローブを用い、例えば、肝臓組織、肝臓細胞又は血液細胞などの試料に対しインサイツハイブリダイゼーションを行うことでＴＧＦ−αのｍＲＮＡを検出する診断キットである。治療前後あるいは治療時の肝生検と併用することにより、肝炎のより詳細で多面的な診断・解析が可能となる。インサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織での核酸配列の検出及び局在化の検出に効果的である。
【００４７】
インサイツハイブリダイゼーションは、例えば、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)のプロトコールなどに従うか、あるいは、例えば、ＩＮＦＯＲＭ（登録商標）(ベンタナ)又はＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）(ビシス)のようなキットを用いて実施することができるが、これに限られない。
【００４８】
その方法の一例を簡潔に以下に述べる。組織をホルマリン固定後、パラフィン包埋組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）を用い１５分間３７℃で脱タンパクし、更に上掲のLu及びGillettの文献に記載されたようにしてインサイツハイブリダイゼーションのためにプロセシングする。最後に、各種標識ヌクレオチドプローブを、５５℃で終夜、組織にハイブリダイズさせ、スライドをＫｏｄａｋ ＮＴＢ２核トラックエマルジョンに浸漬して４週間さらすことにより解析像を得る。上記の記述は例示であり、当業者であれば、必要に応じて各種条件（温度、時間、濃度など）を調節し、適切な工程（固定法（凍結切片法、メタノール固定法など）、現像法など）を選択して適切なインサイツハイブリダイゼーションを行うことが可能である。
【００４９】
プローブの標識に関しては、例えば、α―３３Ｐなどの放射性標識、各種蛍光標識（ＦＩＳＨ法：１９９８年１０月に公開の国際公開９８／４５４７９を参照。）あるいは色素標識（「hydroxy peroxidase（ＨＲＰ）等の酵素＋ジアミノベンジジン等の発色基質」であってもよい）を用いることができる。プローブの標識に関しては、当業者であれば、各種標識試薬・キットの使用法又は定法に従い、任意の標識を行うことが可能である。また、対比染色として、例えば、ヘマトキシリン等の核染色や抗体による染色を更に追加してもよい。
【００５０】
プローブは、図２及び図３、あるいはＳＥＱ  ＩＤ：４に示すＴＧＦ−αのｃＤＮＡの部分配列、対応するｍＲＮＡの部分配列、それらと相補的な配列あるいはそれらとハイブリダイズする配列を含む任意のオリゴマーから設計される。設計されたプローブは、ＰＣＲや核酸化学合成の技術などを用いて合成され、提供される。
【００５１】
一般に、プローブの鎖長が長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブの鎖長が短くなるとそれに必要な温度は低くなる。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。（ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについては、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience Publishers, 1995）を参照。）
【００５２】
また、他の更なる実施形態は、検出試薬としてオリゴヌクレオチドプローブを用い、ノーザンブロット解析によりＴＧＦ−αのｍＲＮＡを検出する診断キットである。ノーザンブロット解析を用いることにより、特殊な装置・試薬を必要とすることなく、ｍＲＮＡの解析が可能となる。ノーザンブロット法は、例えば、Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)のプロトコールに従い実施することができるが、当業者であれば、必要に応じて各種条件（温度、時間、濃度など）を調節し、適切な工程を選択・追加して行うことも可能である。ノーザンブロット法で用いるプローブ及びその標識等に関しては、マイクロアレイに用いるプローブについての上述の記載と同様にして実施することができる。
【００５３】
なお、上記実施の形態とは別に、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡの検出手段として種々のインビボアッセイも利用可能である。例えば、患者の体内にある細胞あるいは体液を、放射性同位元素のような検出可能な標識を付したオリゴヌクレオチドプローブに曝し、その細胞又は体液へのオリゴクレオチドプローブの結合を、例えば、放射性の外部スキャンニングや生検によって評価することも可能である。
【００５４】
上記の任意の実施形態において、あるいは、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡや、そのｍＲＮＡを含むＲＮＡ二本鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＲＮＡ-タンパク二本鎖を認識することができる抗体や、ＲＮＡを認識可能な他の化合物を用いて、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡを検出することも可能であり、本発明の技術的範囲に含まれる。
【００５５】
本発明に係る他の実施形態は、本発明に係る診断キットを含む製造品である。この製造品は容器及び容器に備え付けられるラベル又はパッケージ挿入物を含む。容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含み、ガラス又はプラスチックなどの適切な素材から選択される。容器は、本発明に係る診断キットを含む組成物を収容し、場合によっては無菌のアクセスポートを有し得る形態も可能である（例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バイアルであってよい）。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が肝炎の診断のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、診断に用いる際の注意書きを更に含む。製造品はさらに、コントロール試料、各種緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ及び注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)等を含む付加的な容器を具備してもよい。
【００５６】
本発明の他の実施形態は、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡ量を指標とする肝炎の新たな診断マーカーであり、この診断マーカーにより肝炎の病態を把握することが可能となる。従来、肝炎が急性、自己限定性もしくは慢性の何れであるかの診断、劇症肝炎などへの進行についての診断、ＩＦＮ療法への応答性の診断、そして各種肝炎の治療効果の診断や予後の予測は困難であったが、この診断マーカーにより治療効果を予測又は監視することも可能となり、より有効な治療法を提供することも可能となる。
【００５７】
この診断マーカーで用いられるｍＲＮＡは、タンパク質より量的に高感度である。また、タンパク質量の変化はｍＲＮＡ量の変化よりも遅いため、タンパク質量による診断は急激な症状の変化やその予測に対しては相関性が高くなく、実際にＴＧＦ−αのタンパク質を指標とした場合にも肝炎の病態との相関性は高くない。
【００５８】
上記のとおり、従来型のタンパク質を用いた診断マーカーよりもｍＲＮＡを用いた診断マーカーの方が有利であるが、安定に定量的検出ができるのは特定のＲＮＡに限られ、全てのＲＮＡでｍＲＮＡを診断マーカーとして用いられるわけではない。本実施形態においては、安定に定量的検出ができるｍＲＮＡとしてＴＧＦ−αを見出した。このＴＧＦ−αのｍＲＮＡ量を診断マーカーとすることにより、この実施形態に係る診断マーカーは肝炎の病態と高い相関性を示すという顕著な効果を奏する。更に、本実施形態に係る診断マーカーを用いて肝炎の病態を把握することにより、肝炎同士の様々な病態を識別することが可能となり、適切な治療法計画の設計に有用である。
【００５９】
また、他の更なる実施形態は、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡ量を指標とする劇症肝炎の新たな診断マーカーであり、この診断マーカーにより、例えば、劇症肝炎への移行、劇症肝炎の治療結果の観察、予後、肝障害程度の推定などに関する診断を行うことが可能となる。また、本実施形態に係る診断マーカーは、変化の即時性の高いｍＲＮＡを指標とするため、劇症肝炎などの急性の症状の診断に対して好適である。
【００６０】
また、他の更なる実施形態は、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡ量を予後の診断指標とする劇症肝炎の新たな診断マーカーであり、肝炎の予後と高い相関性を有するこの診断マーカーを用いることにより、各種肝炎の治療後の、治療結果の観察や、移植例、死亡例及び生存例の予測が容易となる。この診断マーカーにおいては、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡの発現量が高い場合が、予後が良好であると診断される。従来、劇症肝炎の予後を的確に診断する診断マーカーは知られておらず、本実施形態に係る診断マーカーは、劇症肝炎患者の予後の改善には特に効果を奏する。
【００６１】
なお、上記実施の形態により説明される診断キット及び診断マーカーは、本願発明を限定するものではなく、例示することを意図して開示されているものである。本願発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められるものであり、当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の技術的範囲において種々の設計的変更が可能である。例えば、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡの検出を、ドットブロット法や各種改変ＰＣＲ法により達成してもよく、このような態様の診断キット及び診断マーカーが本願発明の技術的範囲に含まれることはいうまでもない。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これは一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。
【００６３】
実施例
２０００−２００５年の期間、鳥取大学医学部附属病院、岩手医科大学附属病院、埼玉医科大学附属病院に許可された、急性肝炎（ＡＨ）９人、重症肝炎（ＳＨ）５人、劇症肝炎（ＦＨ）２８人を対象に試験を行った。患者の平均年齢は５３歳（１８歳〜８９歳）であった。
【００６４】
この試験を行うに際し、患者からインフォームドコンセントを得て、且つ、研究プロトコール（計画案）は、１９７５年のヘルシンキ宣言の倫理的ガイドラインに従ったものとし、鳥取大学の倫理委員会の承認の下、試験を行った。
【００６５】
本実施例では、最初に被験者（患者）の血液を採取し、次に血液中からＲＮＡを含む試料を得た。
【００６６】
より具体的に説明すると、患者から採取した血液（約１〜２ｍＬ）について、１０℃で１０分間、３段階（８００ｘｇ、１０００ｘｇ、１５００ｘｇ）の遠心分離操作を行うことにより、リンパ球を減少させた血清を得、それを試験試料として用いた。リンパ球が効果的に取り除かれていることは、β２−マイクログロブリンを対照として、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２及びＣＤ６８の発現量を調べることにより確認した。次いで、従来公知の方法で、血清からデオキシリボヌクレアーゼ処理を用いてＲＮＡを抽出した。血清２００μＬ中から抽出したＲＮＡを２００μＬのヌクレアーゼフリーの水に溶解した。
【００６７】
次に、１μＬの試料に対し、２μＬのＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（ロシュ社）を蛍光剤として用い、ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（キアゲン社）を使用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲのコントロール試料としては、β２−マイクログロブリンＲＮＡを用いた。
【００６８】
この実験に使用したプライマー及び標的のＴＧＦ−αのｃＤＮＡの塩基配列を、それぞれ、図１、図２、図３又はＳＥＱ  ＩＤ：１、ＳＥＱ  ＩＤ：２及びＳＥＱ  ＩＤ：４に示す。
【００６９】
ＴＧＦ−αを検出するためのプライマーセットとして、上流側プライマー（CCTGTTCGCTCTGGGTATTG、ＳＥＱ  ＩＤ：１）及び下流側プライマー（GTTGCATGGAAGCAGAACTG、ＳＥＱ  ＩＤ：２）を用いた。図１に示すとおり、上流側プライマーは、標的塩基配列の順方向（５’→３’）に設定し、下流側プライマーは、標的塩基配列の逆方向（３’→５’）で相補的な塩基配列で設定したものである。
【００７０】
比較例とするため、ＥＧＦＲ、ＨＧＦ、ｃ−ｍｅｔ、ｈＴＥＲＴについても、ＴＧＦ−αの場合と同様にプライマーセットを設計した。
【００７１】
リアルタイムＰＣＲの条件は、最初の逆転写反応を、５０℃で３０分間行い、その後、反応活性化段階として、９５℃に１２分間保ち、その後、ＰＣＲ反応を５０サイクル（９５℃（０秒）、５５℃（１０秒）、７２℃（１５秒））行い、そして、４０℃で２０秒間、熱変性させた。
【００７２】
このＲＴ−ＰＣＲ分析は２回繰り返し、定量化についてはライトサイクラー（登録商標：ロシュ社）を用いて行い、繰り返し再現性があることを確認した。
【００７３】
ＲＴ−ＰＣＲで得られたｍＲＮＡ発現量の数値データを基に、ＳＰＳＳＩＩ（ＳＰＳＳ社）を使用して、各種統計的解析を行った。各々の臨床因子における層別分類は、論理学的回帰分析モデルを使用して、各々のｍＲＮＡ発現量の数値データについて、多変量解析法によって評価した。ＲＮＡコントロールを用いた解析からは、この実施例の条件では、コピー数とＰＣＲサイクルとの強い直線関係が示された。（r２＞０．９９）
【００７４】
また、病態として、予後及び臨床パラメーターを用いた。予後は、劇症肝炎から回復した例を予後良好（１）とし、劇症肝炎で死亡した例を予後不良（２）とした。臨床パラメーターとしては、ＰＴ（Prothorombin Time、プロトロンビン時間）、ＴＢ（Total Bilirubin、総ビリルビン）、ＤＢ（Direct Bilirubin、直接ビリルビン）、ＡＳＴ（Asparate aminotransferase、ＧＯＴ）、ＡＬＴ（Alanine aminotransferase、ＧＰＴ）、ＡＦＰ（α-FetoProtein、α―フェトプロテイン）、ＮＨ３（アンモニア）、ＷＢＣ（White Blood Cell count、白血球数）、ＰＬＴ（Platelet count、血小板数）を用いた。また、ＲＮＡを用いていないタンパク質の発現量型の診断マーカー（比較例）として、ＨＧＦのタンパク質発現量をＥＬＩＳＡで検出した。
【００７５】
劇症肝炎例のうち、欠測値の無いものを対象とし、各ｍＲＮＡ量と予後との相関を調べるために、各検定でのＰ値を計算した。Ｐ値が０．０５以下である時、統計上の有意差があるとみなすことができる。Ｐ値の計算には、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定又はｔ検定を用いた。Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定は、対応のない２群間の差を検定する方法で、データを順位に置き換え、その和を比較するｔ検定のパラメトリック版である。ｔ検定は、２つの母集団の平均に関する検定で、標本平均がどのくらい離れているかを、母集団の分布が正規分布しているとみなして行う検定である。Ｕ検定に用いた順位情報を表１、Ｕ検定の検定結果を表２、ｔ検定に用いた群情報を表３、ｔ検定の検定結果を表４、にそれぞれ示した。
【００７６】
【表１】
2008017777.tif 000003
【００７７】
【表２】
2008017777.tif 000004
【００７８】
【表３】
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【００７９】
【表４】
2008017777.tif 000006
【００８０】
Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を行ったところ、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡにおいて、生存例と死亡例で有意差のある相関関係が認められた。（Ｐ＝０．０４５５）この時、生存例の方がＴＧＦ−αのｍＲＮＡ量が高かった。一方、ＥＧＦＲのｍＲＮＡ、ＨＧＦのｍＲＮＡ、ｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡ、ｈＴＥＲＴのｍＲＮＡでは、予後との間に有意差のある相関関係が認められなかった。（それぞれ、Ｐ＝０．３６７０、０．１００９、０．８８５５、０．９４４９）
【００８１】
次に、ｔ検定を行ったところ、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡにおいて、生存例と死亡例の間に相関関係が認められた。（Ｐ＝０．０４２８）この時、生存例は死亡例に対しＴＧＦ−αのｍＲＮＡ量が約６×１０２３倍高かった。一方、ＥＧＦＲのｍＲＮＡ、ＨＧＦのｍＲＮＡ、ｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡ、ｈＴＥＲＴのｍＲＮＡでは、予後との間に有意差のある相関関係が認められなかった。（それぞれ、Ｐ＝０．４３５６、０．３６７０、０．５９０１、０．６２７１）
【００８２】
次に、全試験例に対して、一部の臨床パラメーターと各ｍＲＮＡ量との相関を調べるために、各検定でのＰ値を計算した。Ｐ値が０．０５以下である時、統計上の有意差があるとみなすことができる。Ｐ値の計算には、病変間ではＦｉｒｅｄｍａｎ検定を行い、臨床パラメーターや予後との相関に関してはＳｐｅａｒｍａｎ検定を用いた。Ｆｒｉｅｄｍａｎ検定は、繰り返しのない二元配置分散分析法（two-way ANOVA without repetition）のノンパラメトリック版である。Ｓｐｅａｒｍａｎ検定は、正規分布に従わない群間を検定する方法で、データを順位に置き換えて検定するノンパラメトリック検定である。結果を以下に説明する。
【００８３】
Ｆｒｉｅｄｍａｎ検定によるＡＨ、ＳＨ、ＦＨの群間比較では、それぞれ、ＴＧＦ−α、ＥＧＦＲ、ｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡ発現量について、有意差が認められた。（それぞれ、Ｐ＝０．０３３、０．０４６、０．００４）
【００８４】
Ｓｐｅａｒｍａｎ検定による各パラメーター間の比較では、それぞれ、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡとＡＳＴ及びＡＦＰ（それぞれ、Ｐ＝０．０１９、Ｐ＝０．０３３）、ＥＧＦＲのｍＲＮＡとｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡ及びＰＴ（それぞれ、Ｐ＝０．０１３、０．０２６）、ＨＧＦのｍＲＮＡとｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡ及びアンモニア（それぞれ、Ｐ＝０．０１１、＜０．００１）、ｈＴＥＲＴのｍＲＮＡとＰＬＴ（Ｐ＝０．００１）の間に有意な相関関係が認められた。予後と関連するパラメーターは、アンモニア、ＰＴ、ＴＢで（それぞれ、Ｐ＝０．００１、０．００７、０．０２８）、ｍＲＮＡ量では、ＴＧＦ−α高値例でのみ有意に予後が良好（生存している）であった。（Ｐ＝０．００１）
【００８５】
以上の結果から、従来、そのタンパク質機能やタンパク質濃度と肝炎との関係が示唆されていたＴＧＦ−α、ＥＧＦＲ、ＨＧＦ、ｃ−ｍｅｔ、ｈＴＥＲＴの５つの血清遺伝子のうち、ｍＲＮＡ量と予後が相関するのはＴＧＦ−αのみであることが明らかとなった。すなわち、病態と相関性の高いＴＧＦ−αのｍＲＮＡを測定することにより、劇症肝炎の予後をワンポイントで診断できる技術を開発した。
【００８６】
また、別の検定では、ＴＧＦ−αのｍＲＮＡ量は、急性肝炎、重症肝炎、劇症肝炎の間で有意差があり、予後の生存例と死亡例でも有意差のあることが明らかとなった。この結果から、血中のＴＧＦ−αのｍＲＮＡを用いたバイオマーカーにより、死亡例や生存例の判別、肝炎の各種病態の判別が可能となり、予後を含めた病態把握に有益であることが明らかとなった。
【００８７】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
以上のように、本発明に係る診断キット及び診断マーカーは、肝炎の病態と相関性の高い指標を与えることの可能な診断キット及び診断マーカーとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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