(57)【要約】【課題】雑菌に汚染された場合、速やかに雑菌を除去し、汚染状態から短期間で回復するアルコールの生産方法を提供すること。【解決手段】サッカロマイセス属セレビシエＡＭ１２菌株からなる酵母を用いて、発酵槽２内に連続的にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行い、得られたアルコール液を前記発酵槽２から引き抜き、次いで引き抜いたアルコール液中のＡＭ１２菌の菌体を沈降分離槽３で沈殿させて分離回収して前記発酵槽２に返送する菌体リサイクルを行うアルコール生産方法において、前記沈降分離槽３で分離された上澄み液を除去し、沈殿して残ったＡＭ１２菌の菌体３ａにエタノール濃度が１４％〜２０％、ｐＨが６〜８である洗浄液を添加混合し、次いで一定時間静置してＡＭ１２菌の菌体３ａを沈殿させ、上澄み液３ｂを除去することにより、ＡＭ１２菌の雑菌汚染を回復することを特徴とする。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株からなる酵母を用いて、発酵槽内に連続的にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行い、得られたアルコール液を前記発酵槽から引き抜き、次いで引き抜いたアルコール液中のＡＭ１２菌の菌体を沈降分離槽で沈殿させて分離回収して前記発酵槽に返送する菌体リサイクルを行うアルコール生産方法において、
前記沈降分離槽で分離された上澄み液を除去し、沈殿して残ったＡＭ１２菌の菌体にエタノール濃度が１４％〜２０％、ｐＨが６〜８である洗浄液を添加混合し、次いで一定時間静置してＡＭ１２菌の菌体を沈殿させ、上澄み液を除去することにより、ＡＭ１２菌の雑菌汚染を回復することを特徴とするアルコール生産方法。
【請求項２】
前記洗浄液を前記ＡＭ１２菌の菌体に添加混合する際に、前記沈降分離槽から発酵槽へのＡＭ１２菌の菌体の返送と、前記発酵槽から沈降分離槽へのアルコール液の送液を停止することを特徴とする請求項１記載のアルコール生産方法。
【請求項３】
前記沈降分離槽内で前記ＡＭ１２菌の菌体に洗浄液を添加混合した際に、５分以上４０分以内静置し、その後上澄み液を沈降分離槽から抜き取ることを特徴とする請求項１又は２記載のアルコール生産方法。
【請求項４】
雑菌を排除する洗浄を、汚染の程度に応じて１または２回以上繰り返すことを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のアルコール生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアルコール生産方法に関し、詳しくは菌体酵母をリサイクルするアルコールの連続生産する際に、雑菌に汚染されても、迅速に回復可能なアルコール生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
連続してエタノールを生産する連続エタノール生産方法は、エタノール生産性が高い反面、酵母のエタノール耐性、酸素条件などの環境要因により、エタノール生産効率が大きく変動するため、安定かつ高効率なエタノール生産が困難であった。
【０００３】
特に、発酵槽内に連続的にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行い、得られたアルコール液を前記発酵槽から引き抜いて、引き抜いたアルコール液中の酵母菌体を沈降分離槽で沈殿させて分離回収して前記発酵槽に返送する菌体リサイクルを行うアルコール連続生産方法は、生産過程が複雑になるため、酵母以外の微生物（雑菌）が混入する可能性が高い。
【０００４】
アルコール生産では、生成物であるエタノールが、生物に対して阻害作用があるため、アルコールに耐性のない微生物が混入しても、アルコール液中では増殖できないので汚染されることは少ない。しかし、通称「火落菌」と呼ばれる乳酸菌に属する一部の菌は、一般に１５％のエタノールに対して耐性を持ち増殖が可能であり、中には２５％のエタノールでも増殖が可能な、アルコール生産における主要な汚染菌として知られている（非特許文献１）。
【０００５】
従来、雑菌に汚染された場合は、生産を停止し、アルコール液と酵母菌体を全て廃棄して装置を洗浄し、滅菌して再設置し、新たな酵母種菌を接種して立ち上げ直すことが一般的である。元の状態に回復するまで長い期間が必要となれば、それだけ工業的生産量が減少する。
【非特許文献１】田村學造・野白喜久雄・秋山裕一・小泉武夫編著、「酵母からのチャレンジ〜応用酵母学〜」、技報堂出版、１９９７年、ｐ．８７−９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、菌体リサイクルを行うアルコール生産において、雑菌の汚染による損失は、雑菌に汚染された状態から短期間で回復する方法があれば軽減されるのではないかと考え、鋭意研究を継続した結果、本発明に至った。
【０００７】
そこで、本発明の課題は、雑菌に汚染された場合、速やかに雑菌を除去し、汚染状態から短期間で回復するアルコールの生産方法を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の課題は以下の記載によって明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題は以下の発明によって解決される。
【００１０】
（請求項１)
サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株からなる酵母を用いて、発酵槽内に連続的にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行い、得られたアルコール液を前記発酵槽から引き抜き、次いで引き抜いたアルコール液中のＡＭ１２菌の菌体を沈降分離槽で沈殿させて分離回収して前記発酵槽に返送する菌体リサイクルを行うアルコール生産方法において、
前記沈降分離槽で分離された上澄み液を除去し、沈殿して残ったＡＭ１２菌の菌体にエタノール濃度が１４％〜２０％、ｐＨが６〜８である洗浄液を添加混合し、次いで一定時間静置してＡＭ１２菌の菌体を沈殿させ、上澄み液を除去することにより、ＡＭ１２菌の雑菌汚染を回復することを特徴とするアルコール生産方法。
【００１１】
（請求項２）
前記洗浄液を前記ＡＭ１２菌の菌体に添加混合する際に、前記沈降分離槽から発酵槽へのＡＭ１２菌の菌体の返送と、前記発酵槽から沈降分離槽へのアルコール液の送液を停止することを特徴とする請求項１記載のアルコール生産方法。
【００１２】
（請求項３）
前記沈降分離槽内で前記ＡＭ１２菌の菌体に洗浄液を添加混合した際に、５分以上４０分以内静置し、その後上澄み液を沈降分離槽から抜き取ることを特徴とする請求項１又は２記載のアルコール生産方法。
【００１３】
（請求項４）
雑菌を排除する洗浄を、汚染の程度に応じて１または２回以上繰り返すことを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のアルコール生産方法。  
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、雑菌に汚染された場合、速やかに雑菌を除去し、汚染状態から短期間で回復するアルコールの生産方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００１６】
本発明のアルコール生産方法は、凝集沈降性を持つ酵母、好ましくはサッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株（以下、ＡＭ１２菌と称する）からなる酵母を用いて、発酵槽内に連続的にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行い、得られたアルコール液を前記発酵槽から引き抜いて、かつ前記引き抜いたアルコール液中の酵母菌体を沈降分離槽で沈殿させて分離回収して前記発酵槽に返送する菌体リサイクルを行うアルコール連続生産方法において、雑菌に汚染された場合に、汚染状態から短期間で回復するための方法である。
【００１７】
本発明において、アルコールの生産は、発酵槽に糖液を連続的に供給しながら、一方で生成物を連続的に取り出すもので、エタノールと酵母の混ざった培養液が連続的に取り出されるものを指す。
【００１８】
また、本発明における「菌体リサイクルを行う」とは、発酵槽から取り出したエタノールと酵母の混ざった培養液を静置して酵母菌体を沈殿させて分離し、再培養の有無に関わらず分離した菌体の一部を発酵槽に戻してアルコール発酵を行うことと定義される。
【００１９】
アルコール生産系は糖液供給タンク、発酵槽、沈降分離槽、それらをつなぐ各ラインを含め、外部から微生物が容易には混入しにくい構造となっている。
【００２０】
本発明において、「雑菌」とは、アルコール生産系に何らかの原因で混入し、存在する酵母以外の微生物のことを指し、「雑菌に汚染される」とは、前記アルコール液中で酵母以外の微生物が増殖し、検出される状態のことであり、「雑菌汚染を回復する」とは、アルコール生産系から酵母以外の微生物を除去し、アルコール連続生産が汚染以前の状態と同様に行われるようにすることである。
【００２１】
本発明に用いられる凝集沈降性酵母ＡＭ１２菌は工業技術微生物工業技術研究所に、微工研受託番号第６７４９号として寄託されている。詳しくは特開昭５９−１３５８９６号公報を参照できる。
【００２２】
図１に基づいて、本発明のアルコール生産方法を説明する。
【００２３】
図１において、１は糖液供給タンクであり、２は発酵槽であり、３はアルコール液から菌体を分離する沈降分離槽である。
【００２４】
糖液供給タンク１から発酵槽２への原料の供給は供給ポンプ１１、供給ライン１２を通して行われる。供給ライン１２からは、原料となる糖液のほかペプトンや微量金属塩溶液等の菌体増殖に必要な栄養液も加えることができる。
【００２５】
発酵槽２は内部に菌体と供給された原料とを十分に混合するための攪拌装置２１を備えている。攪拌装置としては、発酵槽内の混合が十分に行われるものであれば良いが、プロペラ等の攪拌翼を備えたものが好ましく、攪拌回転数は酵母にとって最適値となるように調節される。また、発酵槽には図示しないがｐＨ、温度、溶存酸素濃度を維持するために特に限定されないシステムを備えることができる。
【００２６】
発酵槽２では酵母によってアルコール発酵が行われ、原料糖液はアルコールと酵母菌体を含む液体（培養液）となり、取液ポンプ２２、取液ライン２３から沈降分離槽３へ送られる。また、アルコール発酵に伴って生じるガスはライン２４から排出される。
【００２７】
沈降分離槽３では静置による沈降分離が行われ、凝集沈降性酵母は沈降し、アルコール液と分離される。図１において、３ａは沈降したＡＭ１２菌（酵母）の菌体であり、３ｂは酵母菌体が除かれた上澄み液であり、通常のアルコール生産が行われている場合にはアルコール液を指す。アルコール液３ｂはアルコールポンプ３１によって引き抜かれ、アルコールライン３２を通して次の精製過程へ送られる。
【００２８】
沈降し濃縮された菌体３ａの一部は取り出され、規定量の菌体がリサイクルポンプ３３、供給ライン１２へとつながるリサイクルライン３４を通して、供給ライン１２から原料と共に発酵槽１へ返送される。また、余分な菌体（沈殿物）は排出ライン３５より排出される。
【００２９】
図１において、４は雑菌に汚染された場合に沈降分離槽３を洗浄する洗浄液を入れる洗浄液タンクであり、４１は洗浄液送液ポンプ、４２は洗浄液送液ラインである。
【００３０】
図１では、洗浄液送液ライン４２は沈降分離槽３の下部に接続されているが、リサイクルライン３４に接続し、リサイクルライン３４から通常の流路と逆流させるように沈降分離槽３へ洗浄液を注入することもできる。５は、アルコール連続生産系のポンプを制御する制御部である。
【００３１】
以下に、本発明における雑菌汚染を回復する雑菌の除去方法を説明する。
【００３２】
雑菌による汚染を監視するため、定期的に取液ライン２３から沈降分離槽３へ送られた培養液をサンプリングして検査する。
【００３３】
検査には、迅速な判断が求められることから、培養等による検査法よりは分子生物学的な検査法が好ましく、具体的にはＤＮＡを抽出してＰＣＲを用いて増幅し、増幅後のＤＮＡ断片を電気泳動して、例えば、バンドの有無などによって、遺伝子を検出する手法が挙げられ、火落菌など主要な汚染菌に対しては、市販の検査キットを用いることができる。
【００３４】
雑菌の検出は、サンプリングしたアルコール液から雑菌の遺伝子を検出するか否かで判定する。
【００３５】
遺伝子が検出され、雑菌による汚染があると判明した場合、制御部５は供給ポンプ１１と、取液ポンプ２２とリサイクルポンプ３３を停止して、発酵槽への糖液の供給と、発酵槽２から沈降分離槽３の培養液の供給と、沈降分離槽３から発酵槽２への酵母菌体の供給を停止する。
【００３６】
沈降分離槽３内の液体の流入が停止すると、ＡＭ１２菌は凝集沈降性が高いので速やかに沈降する。混入した微生物は、ＡＭ１２菌ほど速やかに沈降しないので上澄み液３ｂ中に存在する。この状態にあるとき、制御部５はアルコールポンプ３１を稼動させて沈降分離槽３から上澄み液３ｂを抜き取り、廃棄する。
【００３７】
即ち、ＡＭ１２菌の強い凝集沈降性を利用して、遠心分離機を利用することなく、ＡＭ１２菌と、沈降速度の異なる雑菌とを分離することができる。
【００３８】
このため、沈降分離槽３への液体の流入（による攪拌）が停止してから、ＡＭ１２菌を沈降させる時間は５分以上４０分以下、好ましくは１０分以上３０分以下とし、その後、速やかに上澄み液３ｂを引き抜くことが必要となる。
【００３９】
上澄み液のアルコール培養液をぬきとり廃棄した後、制御部５は洗浄液送液ポンプ４１を稼動させ、洗浄液タンク４内の洗浄液を沈降分離槽３下部より注入する。
【００４０】
洗浄液の組成は、エタノール濃度が１４％〜２０％、好ましくは１４．５％〜１７％、ｐＨを６〜８、好ましくは６．５〜７．５に調整し、オートクレーブまたはフィルター等で滅菌をしたものが好ましい。
【００４１】
ＡＭ１２菌は、エタノール濃度２０％においても阻害を受けない耐エタノール性を持つが、大抵の他の微生物はエタノール２０％の液体中では生存または増殖することができない。
【００４２】
火落菌の中でも特に高いエタノール耐性を持つ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｏｍｏｈｉｏｃｈｉｉや、Ｌ．ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓといった真性火落菌といわれる細菌は、本発明の洗浄液の好ましいエタノール濃度では増殖の抑制効果は低いが、これらの菌は生育最適ｐＨが４．５〜５．０であり、ｐＨ５．５以上では生育できないので、本発明の、エタノール濃度が１４％〜２０％、好ましくは１４．５％〜１７％、ｐＨが６〜８、好ましくは６．５〜７．５である洗浄液は火落菌に対しても効果がある。
【００４３】
洗浄液ポンプ４１は、沈降分離槽３内に沈殿するＡＭ１２菌の菌体３ａを浮遊させ、沈降分離槽３内でＡＭ１２菌の菌体が洗浄液と十分に接触し攪拌することができるような流速で注入可能な出力を持つことが好ましく、１回の洗浄で沈降分離槽容量の５０〜８０％程度の洗浄液を注入する。沈殿した酵母菌体を浮遊させることで、雑菌の洗浄効果が高くなるためである。
【００４４】
洗浄液注入が終了し、攪拌されなくなると速やかにＡＭ１２菌は沈降するので、同様に、ＡＭ１２菌を沈降させる時間は５分以上４０分以下、好ましくは１０分以上３０分以下とし、その後速やかにアルコールポンプ３１を稼動させて上澄み液３ｂを抜き取る。
【００４５】
引き抜いた上澄み液３ｂの洗浄液をサンプリングし、雑菌の遺伝子を検出するか検査する。雑菌の遺伝子が検出されなかった場合は雑菌の除去が完了（雑菌汚染から回復）したとして、通常のアルコール連続生産を開始する。検出した場合は再び洗浄液を注入し、洗浄の工程を雑菌の検出がなくなるまで行う。
【００４６】
以上の洗浄の工程について、制御部５が行う制御処理を図２に示す。
【００４７】
サンプリングした培養液を検査し、検査データを入力する（Ｓ１）。検査データ（例えば、バンドの検出の有無）から、雑菌の混入があるかどうか判断する（Ｓ２）。雑菌の混入がないと判断された場合は終了する。
【００４８】
雑菌の混入があると判断された場合、供給ポンプ１１と、取液ポンプ２２とリサイクルポンプ３３を停止して、ＡＭ１２菌を沈殿させた後、アルコールポンプ３１を稼動させて沈降分離槽３から上澄みのアルコール液３ｂを抜き取る（Ｓ３）。
【００４９】
アルコール液を抜き取った後、洗浄液送液ポンプ４１を稼動させ、洗浄液タンク４内の洗浄液を沈降分離槽３下部より注入し、沈殿するＡＭ１２菌の菌体３ａを浮遊させる（Ｓ４）。
【００５０】
ＡＭ１２菌を沈殿させた後、アルコールポンプ３１を稼動させて沈降分離槽３から上澄みの洗浄液３ｂを抜き取る（Ｓ５）。
【００５１】
洗浄液３ｂをサンプリングして検査し、検査データを入力する（Ｓ６）。検査データ（例えば、バンドの検出の有無）から雑菌が存在するかどうか判断する（Ｓ７）。雑菌が存在した場合は、Ｓ４に戻る。  
【００５２】
雑菌の存在が認められなかった場合、供給ポンプ１１、取液ポンプ２２と、リサイクルポンプ３３、アルコールポンプ３１を順次稼動させて発酵槽への糖液の供給と、通常のアルコール連続生産を再開する（Ｓ８）。
【００５３】
本発明の方法では、酵母の菌体をほとんど損失せずに雑菌を除去することができるので、アルコール生産において、雑菌の汚染を排除してから通常の運転までの期間を短くすることができる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はかかる実施例によって限定されない。
【００５５】
加熱滅菌処理をした発酵槽に、単糖濃度（グルコース換算）２０重量％、コーンスティープリカー０．１重量％を含む培地を入れ、ＡＭ１２菌の種菌を接種しエタノール発酵を開始した。
【００５６】
エタノール発酵開始から約４０時間後に、発酵槽に糖液を連続的に供給しながら、一方で生成物を連続的に取り出す連続エタノール生産を開始し、最終的に希釈率を０．１８ｈ-1とし、発酵槽内の酵母菌体、エタノール、グルコースの各成分の濃度が一定状態（定常状態）となり、連続アルコール生産が立ちあがったことを確認した。
【００５７】
そのアルコール生産系に、意図的に雑菌に汚染された状態を作り出すため、火落菌（Ｌ．ｈｏｍｏｈｉｏｃｈｉｉ  ＲＩＢ−９１３４  理研バイオリソースセンター番号  ＪＣＭ７５２４）を発酵槽に混入させ、７２時間連続生産を行った。
【００５８】
７２時間経過後、発酵槽からアルコール培養液をサンプリングし、遠心分離して菌体を集菌した後ＤＮＡを抽出し、Ｔａｋａｒａ  ＰＣＲ火落菌検出キット（タカラバイオ（株））を用いて検査したところ、濃いバンドが確認され、火落菌が検出された。
【００５９】
この雑菌に汚染された状態のアルコール生産系に対して、本発明を用いて雑菌汚染からの回復を試みた。
【００６０】
雑菌が検出されたので、供給ポンプ１１と、取液ポンプ２２とリサイクルポンプ３３を停止して、３０分静置し、ＡＭ１２菌を沈殿させた。
【００６１】
その後、アルコールポンプ３１を稼動させて沈降分離槽３から上澄みのアルコール液３ｂを速やかに抜き取った。
【００６２】
アルコール液を抜き取った後、洗浄液送液ポンプ４１を稼動させ、洗浄液タンク４内の洗浄液を沈降分離槽３下部より注入し、沈殿するＡＭ１２菌の菌体３ａを浮遊させた。
【００６３】
洗浄液は、ｐＨ７、エタノール濃度１５％に調整したものを用いた。
【００６４】
３０分静置してＡＭ１２菌を沈殿させた後、アルコールポンプ３１を稼動させて沈降分離槽３から上澄みの洗浄液３ｂを抜き取った。
【００６５】
洗浄液をサンプリングし、火落菌検査をしたところ、薄いバンドが確認され、火落菌が少量検出された。洗浄によって、検出される火落菌量が少なくなった。
【００６６】
再び洗浄液を注入し、洗浄操作を行った。洗浄液をサンプリングし、火落菌検査をしたところ、バンドは確認されなかった。従って、火落菌を除去することができた。
【００６７】
雑菌の存在が認められなかったので、供給ポンプ１１、取液ポンプ２２と、リサイクルポンプ３３、アルコールポンプ３１を順次稼動させて、通常のアルコール連続生産を開始した。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の連続アルコール生産の概略図
【図２】制御部が行う制御処理を示す図
【符号の説明】
【００６９】
１：糖液供給タンク
１１：供給ポンプ
１２：供給ライン
２：発酵槽
２１：攪拌装置
２２：取液ポンプ
２３：取液ライン
２４：ライン
３：沈降分離槽
３ａ：ＡＭ１２菌の菌体
３ｂ：上澄み液（アルコール液、洗浄液）
３１：アルコールポンプ
３２：アルコールライン
３３：リサイクルポンプ
３４：リサイクルライン
３５：排出ライン
４：洗浄液タンク
４１：洗浄液送液ポンプ
４２：洗浄液送液ライン
５：制御部
【図１】
2008253154.tif 000003
【図２】
2008253154.tif 000004