(57)【要約】      （修正有）【課題】ウイルス変異体の抗癌剤としての使用、および該ウイルスを含有する癌治療用医薬組成物の提供。【解決手段】長い繰り返し領域（ＲL）中のγ３４．５遺伝子中で該γ３４．５遺伝子が非機能的となるように修飾されており、機能的リボヌクレオチド還元酵素遺伝子を有する単純ヘルペスウイルス突然変異体の抗癌剤としての使用、およびウイルスを含有する癌治療用医薬組成物。該医薬組成物は、転移性腫瘍、特に、転移性黒色腫、転移性脳内腫瘍に有用である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における腫瘍の治療に使用するための医薬の製造における、各長い繰り返し領域（ＲL）中のγ３４．５遺伝子中に修飾を有し、その結果、各γ３４．５遺伝子が機能的産物を発現しない単純ヘルペスウイルス突然変異体の使用。
【請求項２】
単純ヘルペスウイルス突然変異体が、機能的リボヌクレオチド還元酵素遺伝子を有する、請求項１記載の使用。
【請求項３】
腫瘍が、哺乳動物の中枢神経系を起源としない、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
医薬が癌治療用である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
癌が黒色腫である、請求項４記載の使用。
【請求項６】
哺乳動物がヒトである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
腫瘍が転移性腫瘍である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
転移性腫瘍が脳内で生じる、請求項７記載の使用。
【請求項９】
腫瘍が転移性黒色腫である、請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
単純ヘルペスウイルス突然変異体が単純ヘルペスウイルスタイプ１である、請求項１〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
単純ヘルペスウイルス突然変異体が１７株単純ヘルペスウイルスである、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
各ＲLリピートのBamHIs制限断片内に、０．１〜３ｋｂの欠失を生じている、請求項１０または１１記載の使用。
【請求項１３】
欠失が０．７〜２．５ｋｂである、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
欠失が、γ３４．５遺伝子中の７５９ｂｐの欠失である、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
単純ヘルペスウイルス突然変異体が１７１６株である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
各長い繰り返し領域（ＲL）中のγ３４．５遺伝子中に修飾を有し、その結果、各γ３４．５遺伝子が機能的産物を発現しない単純ヘルペスウイルス突然変異体を含有する、哺乳動物における腫瘍の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項１７】
単純ヘルペスウイルス突然変異体が、機能的リボヌクレオチド還元酵素遺伝子を有する、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
腫瘍が、哺乳動物の中枢神経系を起源としない、請求項１６または１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
癌治療用である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
癌が黒色腫である、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
哺乳動物がヒトである、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
腫瘍が転移性腫瘍である、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
転移性腫瘍が脳内で生じる、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】
腫瘍が転移性黒色腫である、請求項１６〜２３のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２５】
単純ヘルペスウイルス突然変異体が単純ヘルペスウイルスタイプ１である、請求項１６〜２４のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２６】
単純ヘルペスウイルス突然変異体が１７株単純ヘルペスウイルスである、請求項２５記載の医薬組成物。
【請求項２７】
各ＲLリピートのBamHIs制限断片内に、０．１〜３ｋｂの欠失を生じている、請求項２５または２６記載の医薬組成物。
【請求項２８】
欠失が０．７〜２．５ｋｂである、請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項２９】
欠失が、γ３４．５遺伝子中の７５９ｂｐの欠失である、請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３０】
単純ヘルペスウイルス突然変異体が１７１６株である、請求項１６〜２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌腫瘍、特に転移性か原発性腫瘍かを問わず脳又は神経系の癌腫瘍の治療に単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）突然変異体を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
単純ヘルペスタイプ１（ＨＳＶ−１）のＤＮＡ配列が知られており（非特許文献１３および２４を参照）、約１５２ｋ残基の長さを持つ直鎖状である。これは長鎖（Ｌ）と短鎖（Ｓ）と呼ばれる２つの共有結合したセグメントからなる。各セグメントは、１対の逆行する末端繰り返し配列と隣接するユニークな配列を含む。長い繰り返し（ＲL）と短い繰り返し（ＲS）が区別されている。ユニークな長い（ＵL）領域には遺伝子ＵＬ１からＵＬ５６までを含み，ＵS領域には遺伝子ＵＳ１からＵＳ１２までを含む。
【０００３】
進行した癌を持つ患者の比較的多数が脳及び脊髄に転移病変を生じる。その結果、頭痛、麻痺、発作や認知の衰退を含む重症で衰弱させる神経系の余病をもたらすことが多い。中枢神経系（ＣＮＳ）への転移病変のために米国で毎年７万人の癌死が起きていると推定されている。現在のところ、放射線照射とステロイドが主な治療であるが、これらは症状を軽減するだけで、また神経生理学的及び内分泌的な深刻な病気を引き起こすことが多い。離れた部位の転移は一般に手術で除去するが、これも治癒とならないことが多い（非特許文献１を参照）。
【０００４】
癌の破壊にウイルス治療を用いるのは新しい概念ではない。パルボウイルスＨ−１、ニューカッスル病ウイルス、薬剤感受性遺伝子を含むレトロウイルス、及び単純ヘルペスウイルスタイプ１（ＨＳＶ−１）を用いる各種の実験的腫瘍系の効果が示されている（非特許文献２−７を参照）。実験的腫瘍系での結果をウイルスが改良するメカニズムは複雑でよくわかっていない。脳腫瘍は、支持細胞の本質的に非分裂性の細胞集団中、及び末端で分化するニューロン中で起きる分裂性の細胞集団である。従って脳腫瘍治療の関連では、分裂細胞のみで、又は分裂細胞で優先的に複製するウイルスを選択することが合理的方法の１つである。このようなウイルスはＣＮＳ内の腫瘍細胞内のみで溶解感染することができ、究極的には周囲の脳に感染することなく、また宿主に有害な効果を与えることなく、腫瘍を破壊することができる。
【０００５】
ＨＳＶを用いるパイオニア的実験では、突然変異体ＨＳＶ−１ ｄｌｓｐＴＫで腫瘍内治療をした結果、頭蓋内ヒト神経膠腫をもつヌードマウスの生存率が用量依存的に改良されたことを示す（非特許文献３を参照）。このウイルスはウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を欠失し（非特許文献８を参照）、マウスに比較的神経減衰した（neuro-attenuated）表現型を示す（非特許文献９を参照）。しかしながら、ｄｌｓｐＴＫで腫瘍をもつマウスを感染すると組織学的に明らかな脳炎を引き起こす（非特許文献３を参照）。ＨＳＶ−１のＴＨ-突然変異体をウイルス治療に用いると、これらのウイルスが臨床的に有効な抗ウイルス剤であるアシクロビル（acyclovir）及びガンシクロビル（ganciclovir）に耐性であるという点において固有の欠点ももっている（非特許文献１０を参照）。
【０００６】
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２ゲノムの長い繰り返し領域（ＲL）の末端の１ｋｂは神経毒性を与える遺伝子を含む（非特許文献１１―１３を参照）。この遺伝子（γ３４．５）の欠失又は突然変異は、多くの樹立されたセルラインの分裂細胞上で野生型ウイルスと同様に成長するが、非分裂細胞上では複製できない変異体をもたらす（非特許文献１２−１４を参照）。マウスでは、γ３４．５のない（null）突然変異体は中枢神経系で複製できず、脳炎を引き起こさない（非特許文献１２、１５−１６を参照）。
【０００７】
γ３４．５中の１０００塩基対（ｂｐ）を欠失し、これが由来する野生型Ｆ株よりも少なくとも３ｘ１０3倍大きいＬＤ50（感染動物の５０％を殺す最少用量）をもつ（非特許文献１２を参照）Ｒ３６１６と呼ばれる突然変異体ＨＳＶ−１は、頭蓋内のヒト神経膠腫をもつヌードマウスの結果を改良することが報告されている（非特許文献１７を参照）。
【０００８】
本明細書で示す発明において、我々は１７１６と呼ばれるＨＳＶ−１株１７突然変異体ウイルスを用いたが、これはγ３４．５の７５９ｂｐを欠失する（非特許文献１６を参照）。
【０００９】
突然変異体ウイルス１７１６の構築については公開特許公報ＷＯ９２／１３９４３（特許文献１を参照）に記載されており、その内容をここに参照として包含する。しかしながら、この公開特許は突然変異体１７１６をそれ自体ワクチンとして、あるいは抗原をコードする異種遺伝子を含むベクターワクチンとして使用することのみに関する。
【００１０】
黒色腫はよくある悪性腫瘍である。黒色腫をもつ患者の７５％で大脳への転移が起きており、最も多い死因の１つである（非特許文献１１８−２２を参照）。現在のところ，ＣＮＳ黒色腫をもつ患者の余命は２〜７ヶ月と短い（非特許文献２３を参照）。
【特許文献１】ＷＯ９２／１３９４３
【非特許文献１】Feun, L.G.ら、Cancer, 50: 1656-1663, 1982.
【非特許文献２】Markert, J.M.ら、J. Neurosurg, 77: 590-594, 1992.
【非特許文献３】Martuza, R.L.ら、Science, 252:854-856, 1991.
【非特許文献４】Ram, Z.ら、Cancer Res, 53:83-88, 1993.
【非特許文献５】Takamiya, Y.ら、J. Neurosurg, 79: 104-110, 1993.
【非特許文献６】Reichard, K.W.ら、J. Surg. Res., 52:448-453, 1992.
【非特許文献７】Dupressori, T.ら、Cancer Res, 49: 3203-3208, 1989.
【非特許文献８】Coen, D.M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:4736-4740, 1989.
【非特許文献９】Tenser, R.B.ら、Intervirology, 32: 76-92, 1991.
【非特許文献１０】Coen, D.M.ら、J. Virol, 53: 477-488, 1985.
【非特許文献１１】Ackermann, M.ら、Virology, 150: 207-220, 1986.
【非特許文献１２】Chou, J.ら、Science, 250:1262−1266, 1990.
【非特許文献１３】McGeoch, D.J.ら、J. Gen. Virol, 69: 1531-1574, 1991.
【非特許文献１４】Bolovan, C.A.ら、J. Virol, 68:48, 1994.
【非特許文献１５】Javier, R.T.ら、J. Virol, 61: 1978-1984, 1987.
【非特許文献１６】MacLean, A.R.ら、J. Gen. Virol, 72: 631-639, 1991.
【非特許文献１７】Markert, J.M.ら、J. Neurosurgery, 32: 597-603, 1993.
【非特許文献１８】Einhorn, L.H.ら、Cancer Res, 34: 1995-2011, 1974.
【非特許文献１９】Amer, M.H.ら、Cancer, 42: 660-668, 1978.
【非特許文献２０】Budman, D.R.ら、Eur. J. Cancer, 14: 327-330, 1978.
【非特許文献２１】Patel, J.K.ら、Am. J. Surg, 135:807-810, 1978.
【非特許文献２２】delaMonte, S.M.ら、Cancer Res, 43: 3427-3433, 1983.
【非特許文献２３】Balch, C.M.ら、J. Clin. Oncol, 1:126-132, 1983.
【非特許文献２４】McGeoch, D.J.ら、J. Gen. Virol, 69: 1531-1574, 1988.
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、癌腫瘍の治療のためのＨＳＶ−に基づく改良されたウイルス治療を提供することである。
【００１２】
本発明はある面において、長い繰り返し領域（ＲL）のγ３４．５遺伝子中で該遺伝子が非機能的となるように修飾された単純ヘルペスウイルス突然変異体を抗癌剤として使用することを提供する。
【００１３】
本発明はまた、抗癌的有効量の単純ヘルペスウイルス突然変異体を哺乳動物（ヒト又は動物）に投与することによる哺乳動物中の癌を治療する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は以下の特徴を有する。
［１］  長い繰り返し領域（ＲL）中のγ３４．５遺伝子中で、該γ３４．５遺伝子が非機能的となるように修飾されている単純ヘルペスウイルス突然変異体の抗癌剤としての使用。
［２］  ウイルスが実質的に非神経毒性である［１］の単純ヘルペスウイルス突然変異体の使用。
［３］  ウイルス突然変異体がＨＳＶ−１突然変異体、ＨＳＶ−２突然変異体又はその誘導体から選択される［１］又は［２］の単純ヘルペスウイルス突然変異体の使用。
［４］  ウイルスに対する修飾が、ＲL末端繰り返しのＢａｍＨＩ ｓ制限酵素断片内で行われる［１］〜［３］のいずれかの単純ヘルペスウイルス突然変異体の使用。
［５］  修飾が０．１〜３ｋｂ、特に０．７〜２．５ｋｂの欠失である［４］の単純ヘルペスウイルス突然変異体の使用。
［６］  欠失がγ３４．５遺伝子中における７５９ｂｐの欠失である［５］の単純ヘルペスウイルス突然変異体の使用。
［７］  抗−脳腫瘍剤としての［１］〜［６］のいずれかの単純ヘルペスウイルス突然変異体の使用。
［８］  脳及び神経系内で発生した原発性腫瘍に対する［７］の単純ヘルペスウイルス突然変異体の使用。
［９］  転移性腫瘍、特に黒色腫の転移に対する［７］の単純ヘルペスウイルス突然変異体の使用。
［１０］  哺乳動物、特にヒトに使用する［１］〜［９］のいずれかの単純ヘルペスウイルス突然変異体の使用。
［１１］  単純ヘルペスウイルス突然変異体が１７１６突然変異体である［１］〜［１０］のいずれかの使用。
［１２］  哺乳動物、特にヒトの癌の治療用薬剤の製造における、［１］〜［１１］のいずれかの単純ヘルペスウイルス突然変異体の使用。
［１３］  哺乳動物、特にヒトの脳腫瘍の治療用薬剤の製造における、［１２］の単純ヘルペスウイルス突然変異体の使用。
［１４］  脳及び／又は神経系内で発生した原発性腫瘍の治療用薬剤の製造における、［１２］又は［１３］の単純ヘルペスウイルス突然変異体の使用。
［１５］  転移性腫瘍、特に黒色腫の転移に対する治療用薬剤の製造における、［１２］〜［１４］のいずれかの単純ヘルペスウイルス突然変異体の使用。
［１６］  長い繰り返し領域（ＲL）中のγ３４．５遺伝子中で、該γ３４．５遺伝子が非機能的となるように修飾されている単純ヘルペスウイルス突然変異体を含む医薬製剤を投与することによって、哺乳動物、特にヒトの癌を治療する方法。
［１７］  医薬製剤を腫瘍に直接投与することによる、［１６］の哺乳動物、特にヒトの癌を治療する方法。
［１８］  医薬製剤を血流に非経口的に投与して腫瘍に送る、［１６］の哺乳動物、特にヒトの癌を治療する方法。
【００１５】
本発明の目的にとって、“非機能的”の語は、遺伝子を欠失、付加又は置換（あるいは転位などのＤＮＡ中のその他の変更）することによって修飾して、遺伝子が正常な産物又は機能的に均等な産物を発現しないようにすることを意味する。遺伝子が非機能的になる効果は、ウイルスの患者に対する神経毒性が実質的になくなることである。
【００１６】
従って、本発明は、γ３４．５遺伝子を非機能的にすることが、分裂性腫瘍細胞を破壊するのに特に有効なＨＳＶ突然変異体を提供し、同時にこのＨＳＶ突然変異体は正常な非腫瘍細胞中で複製しないという発見に基づく。従って、本発明は安全な抗癌治療を提供する。
【００１７】
ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２の２つの型の単純ヘルペスウイルスが知られており、これらのいずれも本発明のＨＳＶ突然変異体を作成するのに使用できる。両方の型由来のＤＮＡを含むインタータイプの組換え体も使用できる。
【００１８】
修飾はγ３４．５遺伝子中のあらゆる便宜的な点で行うことができ、このような点は一般に制限酵素部位に対応する。修飾部位はＲL末端繰り返し（０−０．０２及び０．８１−０．８３ｍｕに対応する）のＢａｍＨＩ ｓ制限断片内であってよい。修飾は典型的には０．１−３ｋｂ、特に０．７−２．５ｋｂの欠失である。本研究では、ＨＳＶ−１突然変異体でγ３４．５内の７５９ｂｐを欠失させ、これを１７１６と命名した。
【００１９】
ＨＳＶゲノムにはウイルスの正常な培養に本質的でない多数の他の遺伝子も含む。もちろん、突然変異体が自己複製でき突然変異体のストックを組織培養で増殖できるように、ＨＳＶ突然変異体内に突然変異体を培養する能力を維持することが必要である。ＨＳＶ突然変異体を培養する能力を除去するようなゲノムの致死的修飾は受け入れられない。
【００２０】
しかしながら、ＲL領域のγ３４．５遺伝子に対する一次的修飾に加えて、非本質的遺伝子内において１以上の二次的な非致死的修飾をＨＳＶ突然変異体に含めることも有利である。
【００２１】
本発明はまた、一次的修飾に加えて二次的な非致死的修飾（例えばＶｍｗ６５内で）を含むＨＳＶ突然変異体を新規生産物として含む。突然変異体はＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２から誘導できる。
【００２２】
同様にして、その他の二次的修飾には、潜伏関連転写物（latency associated transcript：ＬＡＴ）プロモーターを非機能的にしてその転写を妨げるように該プロモーターを修飾することを含む。
【００２３】
単純ヘルペスウイルスは脳及び神経系に感染する。このＨＳＶ突然変異体は脳及び神経系で発生した原発性腫瘍に対して有効であるが、別の場所で発生した癌細胞が脳又は神経系（特に中枢神経系（ＣＮＳ））に居着いた転移性腫瘍に対して特に有効である。脳への転移は種々のヒト癌（例えば黒色腫）でよく生じることであり、現在のところそのような場合には致死的となることが避けられない。
【００２４】
ＨＳＶ突然変異体を用いる本発明の治療の有効性は、治療を開始する腫瘍発生後の期間によるであろうが、例えば１から３０日といった初期治療では有効性が改善される。
【００２５】
マウスについての１７１６突然変異体のＬＤ50（感染動物の５０％を殺すウイルスの最少投与量）は、この突然変異体が由来する野生型１７＋ウイルスのＬＤ50よりも１０6倍大きい。従って、野生型と比較して１７１６の神経毒性は実質的に除去されている。
【００２６】
ＨＳＶ突然変異体の有効な非毒性的投与量は当業者が日常的実験によって定めることができ、動物の種及び腫瘍の進行度を含む多数の要因に依存する。本明細書中の実施例からその指針は得られる。
【００２７】
本発明は別の面では、ＨＳＶ突然変異体を含む医薬製剤を哺乳動物、特にヒトに投与することからなる哺乳動物、特にヒトの癌を治療する方法を提供する。従って、治療方法は、ＨＳＶ突然変異体を含む医薬製剤を腫瘍に直接注射するか、あるいは非経口的に血流に投与して腫瘍に送ることができる。
【００２８】
通常は担体又は賦形剤、例えば生理的食塩水や蒸留水などの注射可能な担体を含む医薬製剤として用いる。製剤は慣用法を用いて調製できる。
【００２９】
本発明の態様を実施例によって説明する。
【実施例】
【００３０】
実施例−第１節材料及び方法
動物：
雌Ｃ５７Ｂ１／６マウス（４〜６週齢、体重約２０ｇ）はThe Jackson Laboratory(BarHarbor，ME)から入手した。
腫瘍細胞：
Ｓ９１クラウドマン（Cloudman）黒色腫細胞はＡＴＣＣ（Rockville，MD）から入手した。Ｂ１６、及びハーディング−パッセイ（Harding-Passey）黒色腫細胞はDorothee Herlyn（Wistar Institute，Phila，PA）から恵与された。細胞をペニシリン、ストレプトマイシン、及び５％ウシ血清を含むＡＵＴＯ−ＰＡＷ培地中、プラスティックフラスコで増殖した。入手した全てのセルラインが増殖したときに、９５％ウシ血清／５％ＤＭＳＯ中で凍結し、全ての実験を同じ継代数の細胞で開始できるようにした。頭蓋内注入の日に、サブコンフルエント単層に培養した細胞をＥＤＴＡ中の０．２５％トリプシン溶液に通し、細胞培養培地で１回洗浄し、血清不含培地に適当な濃度で再懸濁し、氷上に保持した。
頭蓋内腫瘍産物：
マウスをＩ．Ｍ．ケタミン／キシラジン（８７ｍｇ／ｋｇケタミン／１３ｍｇ／ｋｇキシラジン）で麻酔した。頭部を７０％ＥｔＯＨで消毒した。頭部皮膚に小さな中央線切開を行って頭蓋を露出した。小さい動物用のステレオタクティック装置（Kopf Instruments，Tujunga，CA）を用いて腫瘍細胞懸濁液をステレオタクティックに（三次元的に正確に）注入した。注入はハミルトンシリンジで使い捨て用２８ゲージの針を用いて行った。針を前頂の２ｍｍ尾側で中央線の１ｍｍ左に配置した。針の露出部分の長さを０．５ｍｍに限定するシールドをつけた別の２７ゲージの針を用いて、頭蓋を適当な大きさに割いた。注入針を穴から頭蓋に頭蓋表面から２ｍｍ深さに挿入し、次いで０．５ｍｍ深さに戻して十分な空間を作った。１分かけて２μＬの全容量中の１ｘ１０5の細胞を注入した。注入後、針をそのまま３分おいておき、それからゆっくり引き抜いた。皮膚を縫合して閉じた。
ウイルス：
ウイルスストックを作製するために、ベビーハムスター腎臓２１クローン１３（ＢＨＫ）細胞のサブコンフルエント単層をｉｎ１８１４、１７１６、ｄｌｓｐＴＫ又は野生型１７＋中のＨＳＶ株で感染した。ウイルスを培養物から濃縮し、文献（２８）記載の方法でプラークアッセイにより滴定した。全てのウイルスストックをウイルス培養培地（ペニシリン及びストレプトマイシン含有ＡＵＴＯ−ＰＯＷ培地）中、−７０℃で冷凍して保存し、使用直前に急速解凍した。
ウイルス接種：
マウスをＩ．Ｍ．ケタミン／キシラジンで麻酔し、頭部を７０％ＥｔＯＨで消毒した。３０ゲージの使い捨て用針を付けたハミルトンシリンジで適当量のウイルス（２μＬ中の１０4−１０6ＰＦＵ）を、腫瘍細胞注入で用いたのと同じステレオタクティックな位置に中央線切開部を通して注入した。１分かけて注入を行い、注入後、針をそのまま３分おいておき、それからゆっくり引き抜いた。
磁気共鳴画像：
ペンシルバニア大学ＭＲＩ施設の病院にある内径３０ｃｍ、１．９テスラの動物用ＭＲＩシステムでマウスの画像を撮った。動物用をＩ．Ｍ．ケタミン／キシラジン（８７ｍｇ／ｋｇケタミン／１３ｍｇ／ｋｇキシラジン）で麻酔した。次いで各動物にＧｄ（ＤＴＰＡ）１０ユニットを尾静脈から注入した。動物をプレクシグラスグラジエントコイル内に固定して画像を撮った。
免疫組織化学：
ＨＳＶ−感染した細胞を、間接アビジン−ビオチン免疫パーオキシダーゼ法（Vectastain ABC Kit，Vector Labs，Burlingam，CA）によって、製造者の指示に従いこれを少し修飾して検出した。簡単に述べると、組織セクションを脱パラフィン化し、再水和し、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）中で抑え（quench）、３．５％ヤギ血清（Sigma Chem．Co.，St．Louis，MO）でブロックした。組織セクションを４℃で、１：１０００の希釈で用いる一次抗体であるＨＳＶ−１に対するウサギ抗血清（Dako Corp.，Carpinteria，CA）とともに一晩インキュベートした。次いで、組織を室温でビオチン化ヤギ抗−ウサギＩｇＧ、アビジン−ビオチンホースラディッシュパーオキシダーゼ複合体及び最後にＡＥＣ基質とともにインキュベートした。セクションをヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡で調べた。
【００３１】
免疫染色の特異性の対照として、一次ＨＳＶ−１抗血清に代えて非免疫ウサギ血清を用いる以外は上述のようにして組織を処理した。
腫瘍及び脳からのウイルスの滴定：
麻酔薬を致死注射することによりマウスを殺した。in situの腫瘍をもつ脳又はもたない脳を無菌的に切除し、液体窒素中で瞬間冷凍し、−７０℃で保存した。各組織を３７℃の水浴中で急速解凍し、組織をPyrex Ten Broeck組織グラインダーを用いて１０％ｗ／ｖで、ウイルス培養培地中でホモジェナイズした。ホモジェネートを３０００ｘｇで４℃、１０分遠心した。各組織ホモジェネートの上清を培地中で対数的に希釈し、それぞれのウイルスカ価をＢＨＫ細胞上のプラークアッセイ（２８）によって決定した。
統計：
標準偏差、ｔ−検定（２サンプル間の分散が等しくないと仮定して）は、Apple Maclntoshコンピューター（Cupertino，CA）でMicrosoft Excel（Redmond，WA）を用いて計算した。
実施例１：黒色腫細胞の溶解
我々の当初の研究では、ＨＳＶ−１野生型と突然変異体ウイルスの各種ネズミ黒色腫細胞を溶解する相対的能力をin vitroで直接決定することを目指した。また、ＨＳＶ−１の増殖と力価測定に用いられる標準的セルラインであるベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞と比較して、これらの黒色腫細胞が如何に効率よくＨＳＶ−１によって溶解されるかを比較することを目指した。細胞を５ｘ１０4細胞／ウエルの密度で２４ウエルの組織培養プレート中に接種した。ウイルスを対数的に希釈し、細胞単層を三重試験で感染した。培養７２時間後に、単層の完全な破壊がまだ起きる最高のウイルス希釈を各ウイルス−細胞の組み合わせのために記録した。データは各ウイルス−細胞の組み合わせから得られたウイルスのＰＦＵ数で表す。
【００３２】
表１に示すように、種々の突然変異体ウイルスが黒色腫細胞及びＢＨＫを野生型１７＋と同様の効率で溶解する。クラウドマンＳ−９１、及びＨ−Ｐ黒色腫細胞はＢＨＫと比較して効率よく溶解された。
実施例２：腫瘍の作製
次に各黒色腫セルラインが頭蓋内腫瘍を産生する能力を評価した。各セルライン用に、１０匹のＣ５７Ｂ１／６マウスの右大脳半球に５ｘ１０4の細胞をステレオタクティックに（三次元的に正確に）注入した。マウスを毎日観察し、瀕死に見えた時点で、又は無症状なままならば６週後に殺した。各脳を固定し、セクションにして、染色し、腫瘍を組織学的に試験した。Ｈ−Ｐ及びＢ−１６はいずれも１０匹のＣ５７Ｂ１／６マウスのうちの１０匹に頭蓋内腫瘍を形成したが、クラウドマンＳ−９１は１０匹のマウスのうちの１匹のみに腫瘍を形成した。
【００３３】
Ｈ−Ｐ細胞は関連のあるＨＳＶ−１突然変異体による溶解に感受性であり、脳腫瘍を効率よく形成するので、Ｈ−Ｐモデルを採用することに決定した。
【００３４】
続く実験によって、Ｈ−Ｐ細胞をＣ５７Ｂ１／６マウス脳にステレオタクティックに注入すると動物の１００％に腫瘍を樹立することを確認した。このシステムの技術的に有利な点は、脳腫瘍の存在を治療前に磁気共鳴画像（ＭＲＩ）で、あるいは一般に細胞注入の５日後に腫瘍部位の上の頭蓋に着色領域を観察するだけで確認できることである。約２週間で神経症状からマウスが瀕死になるようなサイズまで腫瘍は大きくなった。
実施例３：ＨＳＶ−１突然変異体１７１６による脳腫瘍の治療
Ｃ５７Ｂ１／６マウスの右大脳半球に５ｘ１０4のハーディングパッセイ黒色腫細胞をステレオタクティックに注入した。１０日後（図１ａ）又は５日後（図１ｂ）に、５ｘ１０5ＰＦＵのＨＳＶ１７１６を同じステレオタクティックな位置で注入した。腫瘍細胞の注入とマウスが瀕死になった時点との間に経過した日数をＸ軸に示す。対照マウスには適当な時点で等量のウイルス培養培地を注入した。
【００３５】
図１ａに示すように、樹立１０日後の脳腫瘍にＨＳＶ−１突然変異体１７１６をステレオタクティックに注入すると、マウスが瀕死になるまでの期間の長さに統計的に有意な増加が得られた（Ｐ（Ｔ＜＝ｔ）１テイル：１．０１６ｘ１０-4）。しかしながら、長期間生存マウスは観察されなかった。腫瘍樹立の５日後に実施したウイルス治療（図１ｂ）では、再び治療群で有意な結果の改善が見られ（Ｐ（Ｔ＜＝ｔ）１テイル：７．７０７ｘ１０-3）、治療マウスの２／１０が治癒した。ウイルス感染の３９日後に１匹の長期間生存マウスを殺した。脳の連続セクションを顕微鏡観察したところ、腫瘍は全く残っていなかった（データ示さず）。２匹目のマウスは生存し続け。治療後１５０日以上無症状であった。瀕死になった治療したマウスを組織セクションで観察したところ、脳腫瘍の進行を示した。
実施例４：腫瘍細胞及び非腫瘍細胞における１７１６の複製
免疫組織化学的観察によると、１７１６の複製は実際腫瘍細胞に限定されており、周囲の脳では起こらない。有意な数の腫瘍内の黒色腫細胞が、感染の３日後及び６日後にＨＳＶ−１に対するポリクローナル抗血清で染色された。また、１７１６で治療した腫瘍保持マウスでは、試験した全てのセクションで、腫瘍に隣接する脳組織又はその他の領域でＨＳＶ−１抗原染色が観察されなかった。さらに、どの時点でも１７１６治療したマウスのいずれにも脳炎を示す組織学的証拠が観察されなかった。これとは対照的に、野生型１７＋ウイルスで感染した腫瘍保持マウスは、腫瘍内及び周囲や離れた脳でもＨＳＶ−１の免疫組織化学染色によって複数の病巣領域を示した。多型核白血球、核ダスト（dust）、及び赤血球細胞の溢血によって特徴付けられる深刻な脳炎が試験したあちこちのセクションで観察された。対照実験では、ウイルスを受け取らなかったマウスの腫瘍又は脳、あるいは一次抗−ＨＳＶ−１抗体に代えて正常ウサギ血清を用いる免疫組織化学プロトコルに付したウイルスで感染した脳腫瘍セクションでは抗−ＨＳＶ−１による免疫組織化学的染色が観察されなかった（データ示さず）。
実施例５：腫瘍細胞及び非腫瘍細胞における複製速度
免疫組織化学によって１７１６の複製が驚くほど腫瘍に限定されることを示したので、次に感染性ウイルスの滴定によって１７１６の腫瘍中における複製の速度と程度を定量し、これを１７１６又は１７＋で感染された非腫瘍保持マウス脳からの滴定データと比較することを試みた。
【００３６】
脳腫瘍中の１７１６複製の程度を調べるために、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにハーディングパッセイ黒色腫細胞を中央線の右側に注入した。７日後に各マウスに同様のステレオタクティックな位置に５ｘ１０5ＰＦＵの１７１６を注入した。図示する時点でマウスを殺し、脳を液体Ｎ2で冷凍し、−７０℃に保存した。標本を急速に解凍し、ホモジェナイズし、ＢＨＫ細胞上の三重試験でウイルス滴定を行った（黒四角）。これらのデータは各時点での４匹のマウスの平均を示す。
【００３７】
腫瘍のない脳中における１７１６及び野生型１７＋の増殖特徴を確認するために、マウスに５ｘ１０5ＰＦＵの１７１６（白四角）又は１ｘ１０3ＰＦＵの１７＋（黒三角）を頭蓋内注入した。マウスを図示する時点で殺し、上述したように処理した。各点は２匹のマウスの平均である。
【００３８】
図２に示すように、野生型１７＋ウイルスは非腫瘍保持マウス脳中で効率よく複製した。これとは対照的に、非腫瘍保持マウスの脳中で１７１６は全く複製しなかった。回収したウイルスの力価は時間とともに減衰し、感染性１７１６は接種後３日間だけ単離できた。しかしながら、１７１６を脳腫瘍に注入したところ、接種１日後に一定量の感染性１７１６の回収によって示されるように有意な複製が起こり、これは接種した量よりも実質的に多い。これらの条件下で、接種後５日間は腫瘍保持マウスから感染性１７１６が単離できたが、７日目には単離できなかった。これらの結果は、ＨＳＶ−１突然変異体１７１６が腫瘍細胞中で自由に複製する（そしてその破壊に至る）が、非腫瘍細胞中では複製しない（従って害を与えないままである）ことを明瞭に示す。
【００３９】
【表１】
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実施例−第２節
材料及び方法
ウイルスストック
ウイルスストックを調製するために、ベビーハムスター腎臓２１クローン１３（ＢＨＫ）細胞のサブコンフルエント単層をＨＳＶの１７１６、ｉｎ１８１４株又は親株である１７＋で感染した。ｉｎ１８１４株はＶＰ１６遺伝子（ＵL領域に位置する；図３Ａ）中に突然変異（挿入）をもち、１７１６株はγ３４．５遺伝子中に突然変異（欠失）をもつ（突然変異体；図３Ｃ）。培養物からウイルスを濃縮し、ＢＨＫ細胞上でプラークアッセイにより力価測定し、ウイルス培養培地（ペニシリン及びストレプトマイシン含有ＡＵＴＯ−ＰＯＷ培地）０．５ｍｌ中、−７０℃で保存し、使用直前に急速解凍した（３０、３４）。
腫瘍細胞の培養とＮＴ２の分化
文献（２８、２９）記載の方法でＮＴｅｒａ−２（クローンＤ１）細胞（ここではＮＴ２細胞と呼ぶ）を培養した。簡単に述べると、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含むＯｐｔｉＭＥＭ中に、１週間に２回、１：３で通した。髄芽細胞腫セルライン、Ｄ２８３ ＭＥＤ及びＤＡＯＹは、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ及び１％グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。ＢＨＫ細胞は５％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ及び１％グルタミンを含むＡＵＴＯ−ＰＯＷ中で培養した。ＮＴ２細胞はＴ７５フラスコ中に２．０ｘ１０6の密度で入れて、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ及び１０-5Ｍレチノイン酸を補充したＤＭＥＭ−ＨＧを１週間に２回、５週間添加した。分化したＮＴ２Ｎ細胞を文献（２９、３５）記載の方法で非ニューロン性細胞から分離した。頭蓋内注入の日に、サブコンフルエント単層培養のＮＴ２細胞を回収し、バッファーで３回洗浄し、ヌードマウスの脳に注入するまで氷上に保持した。
プラークアッセイ
ＮＴ２、ＢＨＫ、ＤＡＯＹ及びＤ２８３ ＭＥＤ細胞を２４ウエルの組織培養プレートに１０5細胞／ウエルの密度で入れた。関心のあるウイルスを対数的に希釈し、細胞単層を１０〜０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で三重試験で感染した。培養物を定期的に観察してウイルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）の程度を観察し、各ＭＯＩについて記録した。
細胞培養物由来のウイルスの滴定
細胞をＭＯＩ＝１で感染し、感染の４、２４及び４８時間後に回収し、−７０℃に保存した。サンプルを−７０℃から３７℃に２回凍結融解し、３０００ｘｇで４０℃、１０分遠心し、上清を培地中で対数的に希釈し、各サンプルのウイルス力価をＢＨＫ細胞上のプラークアッセイによって決定した（３４）。
腫瘍及び脳由来のウイルスの滴定
腫瘍及び脳におけるウイルス接種物を滴定するために、ヌードマウスに１ｘ１０6ＰＦＵの１７+株又は６．２５ｘ１０4ＰＦＵの１７１６株を頭蓋内に接種し、麻酔剤（ケタミン／キシラジン）を致死注射してマウスを殺した。ウイルス接種後の異なる日（０、１、３、５及び７日目）にマウスから脳と腫瘍を切除し、液体窒素中で急速冷凍し、−７０℃で保存した。異なる時点から得た脳及び腫瘍サンプルを３７℃の水浴中で急速に解凍し、Pyrex Ten Broeck組織グラインダーを用いて、１０％ｗ／ｖの割合でウイルス培養培地中でホモジェナイズした。ホモジェネートを３０００ｘｇで４℃、１０分遠心し、上清を培地中で対数的に希釈し、各サンプルのウイルスカ価をＢＨＫ細胞上のプラークアッセイで決定した（３４）。
大脳内移植片の移植
雌ホモ接合のヌードマウス（４〜６週齢）をHarlan Spraque Dawley(Indianapolis，IN)から入手し、マウスを筋肉内（ＩＭ）ケタミン／キシラジン（８７ｍｇ／ｋｇケタミン／１３ｍｇ／ｋｇ／キシラジン）で麻酔し、小さい動物用ステレオタクティック装置（Kopf Instruments，Tujunga，CA）、１０μＬのハミルトンシリンジ及び３０ゲージの使い捨て針を用いて文献（３５）記載の方法で腫瘍細胞懸濁液をステレオタクティックに注入した。皮質の腫瘍を作るために、シリンジ針を前頂の２ｍｍ吻側で中央線の１ｍｍ右に配置した。頭蓋を７０％エタノールで消毒し、２７ゲージの針で穿孔し、付属の針を付けたハミルトンシリンジを頭蓋の穴を通して硬膜から１．５ｍｍ深さに挿入し、５分かけて２μＬの全容量中の３ｘ１０4のＮＴ２細胞を注入した。移植前に、ＮＴ２細胞をＤＭＥＭ／ＨＧに懸濁し、氷浴中、４０℃で維持した。約５ｘ１０5の細胞を含むＮＴ２Ｎ細胞懸濁液を正確に５μＬとり、前記と同じ位置に注入した。注入後、針をそのままの場所に５分おいておき、それから２分かけてゆっくり引き抜き、表面の皮膚を縫合して閉じた。マウスを回復させ、病気の兆候がないか毎日観察した。
【００４０】
体重とカリパスによる頭蓋の測定を毎週行った。極度の（inextremis）疾患徴候を示したマウスは全て殺して脳を組織化学検査用に調製した。ケージ中で観察していないときに死亡した数匹のマウスの組織も回収して組織化学検査用に固定した。ヌードマウスを用いた実験を表２にまとめた。
ウイルス接種
対照マウス及び予め腫瘍細胞を接種しておいたマウスを上述の方法で麻酔し、頭部を７０％エタノールで消毒した。３０ゲージの使い捨て針を付けたハミルトンシリンジを用いて、以前に腫瘍細胞を注入したときと同じステレオタクティックな位置に中央線の切開部から適当量のウイルス（５μＬ中１０4−１０6ＰＦＵ）を注入した。注入後、針を３分おいておき、それから１分かけてゆっくり引き抜いた。対照マウスには等量のウイルス培地を接種した。
磁気共鳴画像
選択したマウスの脳を内径３０ｃｍ、１．９テスラの動物用磁気共鳴画像（ＭＲＩ）システム（General Electric）を用いて画像を撮った。これを行うには、腫瘍細胞の移植及び腫瘍部位にウイルスを接種した後の様々な時点で上述した方法でマウスを麻酔した。次いで各動物に１０ユニットの増強剤であるＤＴＰＡ担体（Magnevist）との錯体にしたガドリニウムを尾静脈から注入した。次いで動物をプレクシガラスＲＦコイルに固定して画像を撮った。
免疫組織化学的方法
マウスを経心臓潅流し、等張の生理食塩水(150 nM NaCl，pH 7.4)中の70％エタノールまたは4%パラホルムアルデヒド(0.1M PBS，pH 7.4）で固定し、脳並びに複数の他の組織（即ち、三叉神経節、心臓、近位空腸、肝臓、脾臓、左腎臓、大腿骨及び椎体）の試料を切断し、組織学的及び免疫組織化学的分析に供した。
【００４１】
組織加工及び光学顕微鏡免疫組織化学的分析の方法は、別の文献に記載されたものと同様のものであった(35,36)。ニューロン及び神経膠の細胞骨格タンパク質に対するモノクローナル及びポリクローナル抗体、並びにニューロン及び神経膠表現型の分子サインとなることが示されているその他のポリペプチドを、頭蓋内同種異系移植片の免疫組織化学的特徴づけのために使用した(35,37)。ウイルスエンベロープに存在する主要なグリコプロテイン及び少なくとも１つのコアタンパク質を検出する、HSV-1に対するウサギポリクローナル抗血清(Dako Corp.；Carpinteria，CA）を1:1000の希釈度で使用して、複製するウイルスを検出した(38)。ヒトNCAMに特異的な神経細胞接着分子(NCAM)に対するマウスモノクローナル抗体(MOC-1)を1:100の希釈度で使用してNT2とNT2N細胞を検出し、マウス脳細胞からそれらを区別した(35)。中間分子量神経フィラメント(NF-M)タンパク質の齧歯動物特異的エピトープを認識し、ヒトNF-Mと交差反応しないもう一つのモノクローナル抗体、RMO93(1:10)を使用して、NT2N移植片の同一性を確認した(35)。ヒト特異的NF-Mを認識するモノクローナル抗体のRMO301(1:100)を、NT2N移植片を確認するために使用した。ヒト微小管関連タンパク質-2(MAP2)を認識するマウスモノクローナル抗体、M13を1:500の希釈度で使用した。マウスミエリン塩基性タンパク質(MBP)に特異的なウサギポリクローナル抗体は1:1000の希釈度で使用した(A．McMorrisからの寄贈物）。M1B-1(細胞周期特異的抗原(Ki-67)を認識するマウスモノクローナル抗体、1:20の希釈度で使用、AMAC，West brook，ME)による染色のための組織切片は、以前に記載された(39)ようにして10 mMのクエン酸ナトリウム中での超音波処理により前処理した。屠殺に先立ち、何匹かの対照マウスには、５mg/g体重のブロモデオキシウリジン(BrdU)(150 mM NaCl、7 mM NaOH中）を腹腔内注射し、以前に記載されたようにして(37)、移植片中の細胞分裂しているNT2細胞を標識した。近位腸のセグメントを、細胞分裂サイクル中の細胞についての陽性対照として同じマウスから除去した。BrdU陽性の細胞はBrdU抗体BU-33(1:250)を使用して同定した。抗原を発現している細胞は、間接的なアビジン-ビオチン免疫ペルオキシダーゼ(Vectastain ABC kit，Vector Labs，Burlingam，CA)またはパーオキシダーゼ抗パーオキシダーゼ検出系システムによって、3,3-ジアミノベンズアジン(DAB)を発色源として検出した。すべての動物中の移植片及びウイルスの広まりは、脳全体を通して10個目毎の切片をMOC-1、MIB-1及びHSV抗体でスクリーニングすることによってモニターした。
HSV-1特異的遺伝子発現のためのin situハイブリダイゼーション
潅流及び固定された組織の切片をスライド上にマウントし、以前に記載されたようにしてin situハイブリダイゼーションを行い、ウイルスの遺伝子発現を検出した(26,33,40)。連続的な組織切片を、35S-標識HSV LAT特異的プローブ(BstEII-BstEII、図1E)、35S-標識HSV特異的チミジンキナーゼプローブ(tk ；初期遺伝子産物)、あるいはビオチン化HSV特異的gC（後期遺伝子産物）プローブとハイブリダイズさせた。
35S-標識ニックトランスレーションプローブの調製
BamHI Bの潜伏性関連転写産物(LAT)プローブBstEII-BstEIIサブ断片(0.9kb)を、制限消化物からゲル電気泳動により単離し、GeneClean（Bio 101 Inc.；LaJolla，CA、図3を参照）によって精製した(30)。tk遺伝子をコードしている3.4kb BamHI断片は以前に記載されたように単離した(41)。ＤＮＡプローブをニックトランスレーションし、セファデックスG-50スピンカラム(Pharamacia)を通すことにより、取り込まれていないヌクレオチドから分離した(33)。そのプローブの比活性は約1〜5 x 108c.p.m/μgＤＮＡであった。
35S−標識ポリ(dT)プローブの調製
ポリ(dT)の21-マーを合成し、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)による標識化の基質として使用した。反応混合物は、２μlのTdT、１μlのポリ(dT)(6μg/μl)、５μlの5X TdTバッファー、６μlのCoCl2(2.5 mM)、10μlの35S-dTTP(1μl)、１μlのddH2Oからなるものとした。混合物を30分間37℃でインキュベートし、セファデックスG-25スピンカラムを通すことにより、取り込まれていないヌクレオチドから分離した。in situハイブリダイゼーションを上記の通り行ったが、ハイブリダイゼーション及び洗浄は25 %のホルムアミド中37℃で行った(42)。露出時間工程を、非感染、擬似感染、野性型ウイルス感染及びＲＮアーゼ処理組織切片について行い、実験的組織切片についての陽性及び陰性対照として使用した(43を参照)。
活性なウイルス複製を検出するためのビオチン化gCプローブ
ビオチン化テイル[5'-(TAG)2-BBB-3']により3'末端に結合した21 bpアンチセンスgCプローブ(gC 転写産物の中の核酸199-219、CGGGGCGGGGGTGGCCGGGGG、K．Montoneからの寄贈物、図3F)を使用して、同位元素を使用しないin situハイブリダイゼーションを行った。プロトコルは、マウス脳組織についてわずかに変更を加えた以外はWang及びMontoneのものと本質的に同じものであった。
TUNEL法によるDNAニック末端標識化
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)dUTP-ビオチンニック末端標識(TUNEL)法を、以前に記載されたように行った(37)。簡単に以下に説明する。まず、パラフィンを除去し、再水和したスライドを、0.1M トリス(pH=8)中のプロテイナーゼＫの20μg/mlで室温において15分消化した。洗浄の後、その切片を、20 mM ビオチン化dUTP、0.3 U/μl ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、1.5 mM塩化コバルト、200 mMカコジル酸ナトリウム、25 mM トリス、0.25 mg/mlウシ血清アルブミンを含む混合物(pH=6.6)中で、37℃で45分インキュベートした。2x SSC中で15分洗浄することによって反応を停止し、結果物を、ストレプトアビジンを抱合するアルカリホスファターゼにより可視化し、ファストレッド(Fast Red)基質で現像した。出産後8日のラットの脳の冠状切片をこのTUNEL法の陽性対照としてとして使用した。これは、この時期がアポトーシス活性のピークが認められた発生段階であるからである(44)。
薄い切片の電子顕微鏡観察
潅流マウス脳からの腫瘍組織の部分を、0.1 M カコジル酸ナトリウム(pH=7.4)中の1%グルタルアルデヒド及び4%パラホルムアルデヒドで４℃で一晩固定し、カコジル酸ナトリウムバッファーで洗浄し、以前に記載されたようにしてＥＭ用に加工した(37)。
統計処理
BMDP統計ソフトウェア(ed．WJ Dixon;リリース7.0; 1993)を使用して生存及び体重についての統計処理を行った。対照及び処理群の生存数の差異を、一般化されたWilcoxon(Breslow)分析を使用して比較した。体重の相違は、ｔ検定とMann-Whitney検定を使用して比較した。統計的分析においては、瀕死の動物は屠殺してケージ中で死亡した動物と同様に処理した。
実施例６
HSV-1株1716はin vitroでヒト神経細胞系由来の腫瘍単層上で溶解し広まる
親株17+と比較して、HSV-1株1716がどれだけ効率的に迅速に分裂するNT2を溶解するかを測定するために、NT2細胞を24ウェルプレートにまき、1日後にこれらの2種の株を、10、1及び0.1の感染多重度(MOI)で感染させた。10のMOIでは、両方のウイルスがNT2細胞を1日以内に溶解し、これはHSV感染と関連する特徴のある形態上の変化（丸くなること、相の輝度、サイトメガロ的プラーク形成及び接着性の減少）も示した。in vitroにおける低MOI(0.1)でのウイルスの挙動により、in vivoで腫瘍内に広まるウイルスの能力が予測され得るので、MOI-0.1での感染について研究した。株1716は、広まってNT2細胞の単層を破壊する効率が17+よりも低かった（1716は単層を3日間で溶解したのに対し、17+は2日間で溶解した）。これらのウイルスの挙動は、2種の異なるヒト髄芽細胞腫細胞系(D283 MED 及びDAOY)におけるものと同様であり、株1716が多くの異なる脳腫瘍細胞系を溶解することができることを示唆している。
【００４２】
次に、NT2N細胞(NT2細胞のニューロン様レチノイン酸分化誘導体)にこれらのウイルスを感染させた。株1716は、これらの細胞における細胞毒性について株17+と比較して弱毒化されており、上記のウイルスに感染したNT2N細胞について行った細胞毒性に関する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)アッセイにより、両方のウイルスが感染後12時間以内に非特異的毒性を引き起こすことが示された（データは示していない）。興味深いことに、感染細胞培養物からのウイルスの力価測定により、株1716がNT2N細胞中での複製能を欠いていることが示された（データは示していない）。株1716は他の製造された株より激しくマウス中で神経的に弱毒化されたので(26,30)、in vitro誘導NT2N細胞の移植片を有するか有しないヌードマウス、あるいは移植NT2細胞から確立された腫瘍を有するヌードマウスのCNSに接種された株1716と17+ウイルスについてin vivo で調べた。表2を参照。
実施例７
脳内接種後のマウスCNS中にはHSV-1株1716の複製は検出されない
SCIDマウスを使用した以前の結果(26)と一致して、ヌードマウスに株1716の5×106プラーク形成単位(PFU)を脳内(IC)接種しても、接種後4か月にわたって臨床的症状を起こさず、これらのマウスの脳の組織学的分析でも脳炎は見出されず、主要な器官（例えば肝臓、脾臓、骨髄等）における複製も見られなかった（表2、研究I）。株1716とは異なり、株17+の100PFU未満のIC接種により5〜10日以内にヌードマウスは死亡し、組織病理学的分析によれば、これらのマウス中の大規模な細胞毒性傷害（例えば核内封入体、細胞死等）が明らかになった（示していない）。
【００４３】
株1716と株17+をIC接種した後の脳内におけるウイルスの複製をモニターするために、ウイルスの力価測定アッセイを行った(表2、研究II)。いずれのウイルスについても、０日の回収は注射された接種物中のウイルスよりも低かった。これは、おそらく脳ホモジネート中の膜へのウイルス粒子の吸着又は融合、及び回収の間のウイルスの失活によるものであろう。図4は、株17+の力価が経時的に指数関数的に増加し、接種されたマウスの罹患と死亡をもたらしたことを示す。これに対して、株1716の力価はヌードマウスの脳では急激に低下し、接種の3日後にはウイルスは検出されなくなった。さらに、株1716に感染したマウスにおいては免疫組織化学的に脳炎が確認されず、また肝臓、脾臓、腎臓、空腸及び骨髄の試料中に免疫組織化学的にウイルスが存在しないことが確認されたことにより、そしてHSV特異的転写産物についてのin situハイブリダイゼーションにより（データは示していない）確かめられたように、CNSの外部における株1716のウイルスの検出可能な広まりはなかった。同様に、株1716の肝臓又は静脈内注射による直接の接種は、ヌードマウスの罹患と死亡を引き起こさなかった。株1716とは異なり、株17+感染マウスは脳炎と腫瘍溶解の証拠を示した(図4を参照)。
実施例８
HSV-1 株1716はNT2腫瘍中で細胞溶解的に複製するが、マウスCNS中の移植NT2N細胞中ではしない
1716株をNT2腫瘍に注射すると、３日までに投与接種物よりもウイルスの力価が増加したことにより、7日間有意な複製が起こることが示された(図4)。これは、NT2腫瘍細胞中で、それらが存在してウイルス複製を支持している場合を除いて、これらのマウスの脳中に検出可能な1716株が存在しなかったことを示す免疫組織化学的データ及びin situハイブリダイゼーションデータと一致している(下記参照)。
【００４４】
マウスにおける力価測定アッセイによる定量により、NT2細胞腫瘍中で株1716が複製していることが示されたことから、これらの腫瘍の緩解を誘導する株1716の能力を試験した(表2、研究IV)。これを行うために、5 x 105 PFUを含む株1716の5 μlを、3 x 106のNT2細胞のIC移植の後に、ヌードマウスの脳中に形成した腫瘍に注射した。移植されたNT2細胞の運命をモニターするために、ウイルスの接種後、マウスを異なる時点で屠殺し、その脳及び器官を免疫組織化学及びin situハイブリダイゼーションによって分析した。100%のマウスで神経及び上皮組織でNT2細胞が腫瘍を形成し、これらの腫瘍は移植後5週間以内で致死的なものであった(図5A、5B)。BrdU標識化、細胞周期抗原の免疫組織化学的検出及びそれらの急速な増殖によって示されるように、これらの腫瘍は多量の増殖細胞を含んでいた(図5C、5D)。図5E、F、G及びHは、株1716によるNT2腫瘍の感染が感染後(pi)３日において均一でないことを示している。これは、注射の部位が局所的なものであることを反映しているか、株1716による感染と溶解に対する細胞の脆弱さにおける細胞タイプ特異的な差異によるものであろう。それでも、注射部位の近くの腫瘍細胞タイプは、ほとんどが５日までに免疫活性なウイルスを有していた。
【００４５】
感染後のその後においてはより多くの細胞が感染したが、おそらくは感染腫瘍細胞の溶解の後のウイルスの消失のために、腫瘍におけるウイルスに対する免疫反応性は弱まった(図５)。
【００４６】
図5Hに見られるように、ウイルスの抗原は腫瘍に限定されている。高い倍率では、感染腫瘍細胞はHSV-1感染の特徴、即ち核内封入体と多核巨細胞形成を示した(図5F)。ウイルス抗原の染色は、これらのマウスの周囲の脳中、あるいは対照非処理のマウスの脳中に見られなかった。これは、グリコプロテインC(gC)に対するビオチン化プローブを使用した同位体不使用のin situハイブリダイゼーションプロトコル及び放射性標識チミジンキナーゼ(TK)プローブ(急性感染においてのみ発現される後期及び初期遺伝子産物)により、活性なウイルスの複製を連続的な切片で検出することによって確認した(図5J)。このように、遺伝子発現によって立証されるようにウイルスの複製も腫瘍細胞に限定されている。これに対して、株17+を接種した腫瘍担持マウスは、腫瘍と脳の両方でウイルスの複製を示した(図5K、5L)。1716による腫瘍移植物のウイルス処理の18日後に回収したマウス脳は、腫瘍のサイズの著しい減少を示した。実際には、いくらかのマウスに残留する繊維形成痕跡が観られ、ウイルス抗原はその痕跡の残っている細胞に厳密に限定されていた(図5M、N、O）。
【００４７】
脳腫瘍の緩解を誘導する株1716の能力を調べるために、ヌードマウスの脳中のNT2腫瘍に、NT2細胞の移植後12日に株1716を定位注射した。処理マウスには腫瘍移植部位で株1716の5×105PFU(5μl中)を接種し、対照マウスには5μlの培地のみを投与した。MRI走査により、これらのマウスが移植後11日までに検出可能な腫瘍を発生させたことが判った。すべての擬似処理された腫瘍担持マウスでは、腫瘍が急速に大きさを増し、致死的なものであった(図6A〜D)。すべての処理されたマウスにおいて、株1716の感染により、当初の接種部位で腫瘍の検出可能な緩解が誘導された(図6E〜G)。
【００４８】
移植されたNT2N細胞がHSV複製を許容するかどうかを調べるため、2.5 x 105の細胞をヌードマウスの脳実質または脳室に移植した(表1、研究III)。これらの細胞は一体化されて1年以上生存し、充分に成熟した出産後ヒトCNSニューロン表現型を獲得した(27)。次に株1716を、移植6週後に同じ定位部位に接種した。その移植片は、神経細胞接着分子(MOC1)又は神経フィラメントタンパク質(RM0301、RM093)に対するヒト特異的(MOC1及びRMO301)及びマウス特異的(RM093)抗体を使用して同定し、マウス細胞から区別した。NT2腫瘍とは異なり、ウイルス接種後1、3、5、7、9、21及び50日後にウイルス抗原についての免疫組織化学的染色が見られなかったことにより示されるように、これらの長期的なNT2N移植片は株1716の複製を許容しなかった。
実施例９
HSV株1716はNT2腫瘍細胞に非アポトーシス死亡を起こす
株1716感染マウスの選択群と非感染腫瘍対照からの腫瘍切片を、NT2細胞腫瘍中の細胞死の型式を特性化するためのEM分析用に調製した。H&E染色において感染細胞は、HSV感染細胞に典型的な特徴を有していた(図5F)。ウイルスの組立ドメインは、感染細胞の核中に見られた。EMによっては、ウイルス感染腫瘍細胞中の細胞死のアポトーシス性メカニズムの証拠は得られなかった(図７)。ウイルス粒子を有する腫瘍細胞は、核とオルガネラ並びに縮合し及び縁のある(marginated)DNAの断片化及び溶解を示した。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)dUTP-ビオチンニック末端標識化(TUNEL)及びＤＮＡゲル電気泳動による分析では、アポトーシスを示すＤＮＡ断片化の証拠は得られなかった（データは示していない）。これらの所見を合わせると、in vitro及びin vivoにおいて、株1716がNT2細胞における特徴的な溶菌感染を誘導することを示している。
実施例10
HSV株1716で処理された腫瘍担持マウスの長期間生存
上記の研究の結果に基づいて、ウイルスで処理された腫瘍担持マウスと処理されない腫瘍担持マウスの同齢集団の生存について分析した(表2、研究V及びVI)。
【００４９】
これにより、株1716での処理の長期間の結果についても調べることができた（下記参照）。20匹のマウスに3 x 106 NT2細胞を接種し、数日後にマウスを2つの群に分けた。対照マウスには培養培地を投与し、処理されたマウスには株1716の5 x 106 PFUを投与した。第1の生存実験(表2、研究V)では腫瘍細胞接種の12日後にウイルス処理をした。この群においては1匹(10%)しか長期間生存動物が見られず、対照（研究VA）と処理動物（研究VB）との間に生存率の有意な差はなかった(p=.63、図8A)。何匹かの対照及び処理動物の組織学的検査により、ウイルスが腫瘍中で複製していたことが判った。処理動物においては、腫瘍が既に増殖して広がっており、一回のウイルス処理では腫瘍の緩解を誘導するのに十分でないようなサイズになっていたようである(データは示していない)。腫瘍細胞接種後7日にウイルス処理すると、マウスの44％が長期間生存し、対照マウスは10週間以内に100％死亡した(表2、研究VI、図6B)。これは、生存について統計学的に有意な差となった(p<.03 ；中央値生存期間(対照)=44.75+/-5.24：中央値生存期間(処理)= 101.78+/-22.69)。
【００５０】
生存実験中に、模擬処理された腫瘍担持マウス(表2、研究VIA)及び株1716で処理された腫瘍担持マウス(表2、研究VIB)の両方の下位個体群で有意な体重減少が観察された。これらの2つの群の平均体重には違いがなかったので(図8C)、処理群(研究VIB)を2つの下位群(高度応答(HR)-長期間生存マウス(4匹のマウス)及び死亡した低度応答(LR)マウス(5匹のマウス)図8C）に分けた。標準的ｔ検定を使用して、群HRとLRとの間、及び群LRと1716処理マウス(研究１)との間で、6週間における体重減少に有意な相違があることが判った(p<0.01)(図8D)。これらのデータは研究Vにおける体重減少の先の観察を確認するものであり、体重減少は腫瘍増殖、緩解又は溶解の有毒な生理的効果によるものであり得、脳のウイルス感染の直接の効果によるものではないことを示唆している。特に、死亡した処理マウスの何匹かは、移植部位から脳室と柔膜への腫瘍細胞の漏れを示した。これが脳脊髄液の流れの障害を起こすので、これらの処理マウスの何匹かが対照マウスに類似した生存カイネティックスを示すことは驚くにあたらない(図8A)。また、脳腫瘍を有する対照マウスの頭蓋内容積は25%を超える増加を示すが(腫瘍増殖を示す)、処理マウスの頭蓋内容積は有意に増加しなかった(図６を参照)。長期生存動物も同様に頭蓋内容積に有意な増加を示さなかった(データは示していない)。これらの解釈は、株1716のみを接種されたマウスが研究を通じて脳炎の臨床的または組織学的特徴を何ら示さなかったという事実により支持される。
【００５１】
研究V及びVI(表2)からの長期間生存動物は、臨床的症状、頭蓋内容積の通常のものではない増加、及び体重減少のいずれをも示さなかった(図8C)。これらのマウス及び株1716のみを接種されたマウスを屠殺し、免疫組織化学及びin situハイブリダイゼーションにより病理学とウイルス複製について分析した。生存動物においては、繊維形成痕跡組織及び異栄養性石灰化の証拠のみが見出され、残留生存腫瘍細胞の証拠は見られなかった(図9A、B、C)。細胞周期抗原についての免疫組織化学的染色(例えばMIB-1を使用する)も陰性であり、脳中に増殖サイクルにあるNT2細胞が欠如していることを示した。さらに、これらのマウスの脳はヘルペス抗原について陰性であり、複製ウイルスの欠如を示したが、何匹かのマウスでは、in situハイブリダイゼーションにより海馬における潜在的なHSVの存在が示された(図9D)。驚くべきことに、株1716（のみ）に感染しているマウスの海馬にも潜伏ウイルスが見出された。しかし、HSV及びヒトNT2細胞(MOC-1、RMO301)に特異的な抗体を使用した全ての生存動物の脳の代表的な頭側から尾部へのレベルの検査では、活性なウイルスの複製あるいは残留生存腫瘍細胞の証拠はいずれも示されなかった。脱髄のような、HSV-1株の他の可能性がある有毒な続発症の起こり得る発生を排除するために、ミエリン塩基性タンパク質に対する抗体を使用してマウスの脳からの切片をプロービングした。株1716のみを注射したマウス及び長期生存動物の検査では、脱髄の証拠は見られなかった(図9E)。最後に、放射性標識ポリ(dT)プローブを使用したin situハイブリダイゼーションによりポリ(A)+RNAのレベルをモニターしてニューロンの全体的な代謝健全性を調べたところ(31,32)、長期生存動物のLAT-陽性の細胞と、同じ動物及び非感染対照マウスの反対の非LAT陽性の細胞との間に、ポリ(A)+RNA のレベルの定量可能な相違は見られなかった(図9F)。
【００５２】
【表２】
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結論
HSVタイプI(HSV-1)株1716はγ34.5神経毒性遺伝子を欠失しており、これがそれをマウスCNSにおいて無毒にするものであり、我々は腫瘍細胞とニューロンの選択的な溶解を誘発するその能力についてin vitro及びin vivoで調べた。ヒトテラトカルシノーマ誘導胎児カルシノーマ細胞(NT2細胞)を使用して、親HSV-1株17+及び作成した株1716を調べた。これらの細胞はニューロン前駆体細胞に似ており、レチノイン酸によりニューロン(NT2N)細胞に分化するように誘導され得る。ヌードマウスの脳へのNT2細胞の脳内移植片は致死的な脳腫瘍を生じるが、NT2N細胞の移植片は新生物形成転換を起こすことなく一体化しNT2N細胞の成熟をもたらす。in vitroでの研究により、株1716がNT2細胞の単層中で複製し、その上に広がり、これらの細胞の溶解をもたらすことが示された。しかし、株1716はin vitroでNT2N細胞中で複製しなかった。in vivoにおいては、ウイルス抗原についての免疫組織化学的染色、HSV特異的転写物についてのin situハイブリダイゼーション、及びこれらのマウスにウイルスを頭蓋内注射した後の腫瘍による脳からのウイルスの力価測定により示されるように、株1716はNT2腫瘍中で優先的に複製した。NT2腫瘍細胞とは異なり、移植されたNT2N細胞は株1716複製を許容しなかった。磁気共鳴イメージングにより、株1716により処理されたマウスにおけるNT2腫瘍の一時的な緩解がin vivoで示された。電子顕微鏡観察及びＤＮＡ断片化試験により、株1716処理マウスにおけるNT2脳腫瘍の緩解は、主として、非アポトーシス性の、溶解形態の細胞死滅に依るものであったことが示唆された。株1716処理されたNT2腫瘍担持マウスは、擬似処理された腫瘍担持マウスの2倍長く生存し、生存におけるこれらの差異(25週対９週)は、統計学的に有意なものであった(p〈.03)。これらの研究から、株1716は、複製コンピテントであり、HSV-1の非神経毒性変異体であり、ヌードマウスの脳に形成されたヒト神経性腫瘍の緩解を誘導し、その結果マウスの延長された生存期間を生じるものと我々は結論する。これらの結果は、HSV-1γ34.5変異体がin vivoでのヒト脳腫瘍の治療の候補物であることを示している。
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【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、実施例３で詳細に記載する実験の結果を示す生存曲線の図である。 腫瘍注入後１０日（図１ｂ）及び５日（図１ｂ）にＨＳＶ−１突然変異体１７１６を注射した腫瘍をもつマウス。
【図２】図２は、実施例５で詳細に記載する実験の結果を示すＨＳＶ−１突然変異体の相対複製率を示す図である。脳腫瘍におけるＨＳＶ−１突然変異体１７１６の相対複製率（黒四角）；ならびに腫瘍のない脳における１７１６と野生型１７＋の相対複製率（それぞれ白四角及び黒三角）。
【図３】図３は、ＨＳＶ−１のゲノム地図を示す図である。γ３４．５、２ｋｂの潜伏関連転写物（ＬＡＴ）及び近辺遺伝子のおよその位置を示すＨＳＶ−１ゲノム。Ａ．１５２ｋｂのＨＳＶ−１の１７＋株ゲノムであって、内部繰り返し（ＩＲ）及び末端繰り返し（ＴＲ）領域（箱で示す）によって結合された、ゲノムのユニークな長短セグメント、ＵL及びＵS（線）を示す。線で示した個所はＶＰ１６、チミジンキナーゼ（ＴＫ）及び糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）遺伝子の位置を示す。Ｂ．ゲノムのＵL／ＵS領域の拡大図、γ３４．５、ＩＣＰＯ及びＩＣＰ４ ｍＲＮＡの位置、ならびに急性及び潜伏性感染で発現する２．０ｋｂのＬＡＴの位置。Ｃ．１７１６株中の７５９ｂｐの欠失位置。Ｄ．ＨＳＶ特異的遺伝子発現のin situ検出に用いたＬＡＴ特異的ＢｓｔＥＩＩ−ＢｓｔＥＩＩプローブの位置。ヌクレオチドの位置はPerry and McGeoch（４５）のＤＮＡ配列分析に基づいている。
【図４】図４は、ＩＣ接種後のヌードマウス脳中における感染ウイルスの定量結果を示す図である。脳腫瘍における１７１６株の複製度を知るために、ヌードマウスにＮＴ２細胞を注入した。１２日後に各マウスに同じステレオタクティックな（三次元的に正確な）位置で１７１６株を５ｘ１０5ＰＦＵ感染させた（白丸）。図に示す時期にマウスを殺し、脳を液体Ｎ2中で冷凍し、−７０℃で保存した。標本を急速に解凍し、ホモジェナイズし、ＢＨＫ細胞上で滴定を三重試験で行った。腫瘍のない脳での１７１６株及び親株である１７+の増殖特徴を確かめるために、マウスに１７１６株５ｘ１０4ＰＦＵ（黒丸）又は１７＋株１ｘ１０6ＰＦＵ（黒三角）のいずれかを頭蓋に注入した。図に示す時期にマウスを殺し、方法の項に記載したように処理した。各点は２匹のマウスの平均を標準偏差（ＳＥＭ）のバーとともに示す。
【図５】図５は、免疫組織化学及びin situハイブリダイゼーションによる複製ウイルスの検出結果を示す図である。ヌードマウスに３ｘ１０4のＮＴ２細胞をＩＣ注入した。１４日後に１７１６株５ｘ１０5ＰＦＵを接種した。Ａ．１４日後の腫瘍をもつ対照マウス。Ｂ．腫瘍は組織学的には極めて様々である。矢印：小管構造。Ｃ．ＭＯＣ−１抗体はＮＴ２腫瘍細胞を特異的に同定する。Ｄ．ＭＩＢ−１抗体は細胞周期を進行しつつある細胞（cycling cell）を同定する。小管構造に標識細胞の数は少ないことに注意されたい（星印）。Ｅ．１７１６株の注入３日後の１４日腫瘍。矢印は強度の腫瘍溶解と壊死の領域を示す。Ｆ．感染された細胞は核内封入体形成、巨大細胞及び壊死のようなヘルペスに感染された細胞の特徴を示す。Ｇ．ヘルペス抗原は腫瘍細胞に限定される。Ｈ．抗−ＨＳＶ抗体を用いて示した、腫瘍と宿主脳の境界面における腫瘍細胞でのウイルス複製。Ｉ．抗−ＨＳＶ抗体で示すように、周囲の非小管細胞と比較して小管構造では、ウイルス複製の速度は感染３日後に遅くなる。矢印は珍しいＨＳＶ抗原陽性の小管細胞を示す。これらの小管構造は感染後の遅い時期に溶解する。Ｊ．ヘルペス遺伝子の発現はin situハイブリダイゼーションにおいても腫瘍に限定されている(黒い粒子)。Ｋ及びＬ．野生型ウイルス（１７+）は脳と腫瘍で複製し、脳全体に広がる。Ｍ．１７１６株で感染１８日後における１４日目腫瘍のＨ＆Ｅ。腫瘍サイズの小さいことに注意されたい。Ｎ．ウイルス抗原及びＯ．ウイルス遺伝子発現は残っている腫瘍のかたまりに驚くほど限定されている。略記号：Ｔ＝腫瘍；Ｂ＝宿主脳。（スケールバー＝Ａでは１．２ｍｍ；＝Ｂ，Ｃ，Ｄでは６２．５μｍ；＝Ｅ及びＧでは２．０ｍｍ；＝Ｆでは１２μｍ；＝Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｏでは４５０μｍ；＝Ｉでは９０μｍ；＝Ｊでは２００μｍ；＝Ｋ及びＬでは９００μｍ）。
【図６】図６は、処理及び未処理ＮＴ２腫瘍のＭＲＩ分析結果を示す図である。ヌードマウスに３ｘ１０4のＮＴ２細胞をステレオタクティックに注入し、１１日後に（腫瘍細胞移植後１１日）Ｔ１で強調し、ガドリウムで増強したＭＲＩ（Ａ、Ｅ）を行った。腫瘍（Ｔ）の存在がマウスの上方右半球に白い増強病巣の画像によって確認できる。複数のセクションの観察から、横断面に最大の腫瘍のかたまりが見られた。翌日マウスに５ｘ１０5ＰＦＵの１７１６株又は培地のいずれかを接種した。対照マウスでは、時間とともに腫瘍は進行し、ＩＣ容積は劇的に増加した（Ｂ：腫瘍移植後３２日；Ｃ及びＤ：腫瘍移植後４１日）。１７１６株で処理したマウスでは、腫瘍は退行し、脳中に生きた腫瘍細胞又はウイルスが見られなかった（Ｆ及びＧ：腫瘍移植後３６日）。（スケールバー：＝Ｄ及びＧでは２．７７ｍｍ）。
【図７】図７は、電子顕微鏡による観察結果を示す図である。疑似接種又は１７１６株を接種したヌードマウス由来の腫瘍を回収し、電子顕微鏡用に処理した。Ａ：未感染の腫瘍細胞の電子顕微鏡写真。Ｂ：感染初期のＮＴ２腫瘍細胞の電子顕微鏡写真。ＤＮＡ縮合とウイルスドメインが見られる（白矢印）。Ｃ：感染後期のＮＴ２腫瘍細胞。縁のあるクロマチン（星印）とウイルス粒子（矢印）が観察される。Ｄ：感染された分裂細胞。矢印：核膜、ｃ：細胞質、ｎ：核（元の倍率２５００ｘ）。
【図８】図８は、１７１６株で処理したＮＴ２腫瘍保持マウスの生存延長の結果を示す図である。Ａ：生存性実験（表１、研究Ｖ）−２０匹のヌードマウスに３ｘ１０4のＮＴ２細胞をステレオタクティックに注入した。１２日後に、１０匹のマウスに５ｘ１０5ＰＦＵ／５μＬの１７１６株（処理、黒丸）を、１０匹のマウスに５μＬのウイルス培養培地（疑似、黒三角）をステレオタクティックに注入した。Ｂ：生存性実験（表１、研究ＶＩ）−１７匹のヌードマウスに３ｘ１０4のＮＴ２細胞をステレオタクティックに注入した。１０日後に、９匹のマウスに５ｘ１０5ＰＦＵ／５μＬの１７１６株（処理、黒丸）をステレオタクティックに注入し、８匹のマウスに５μＬのウイルス培養培地（疑似、黒三角）を疑似注入した。Ｃ：体重グラフ−研究ＶＩ（表１；図６Ｂ）からの対照マウス（黒三角）及び処理マウス（黒丸）の体重。Ｄ：１７１６株のみで処理したマウス（研究１、表１；黒三角）と比較した、長期間生存マウス（ＨＲ、黒丸）と死亡マウス（ＬＲ、黒四角）に分けた処理群の体重。標準偏差（ＳＥＭ）バーを含む。
【図９】図９は、免疫組織化学及びin situハイブリダイゼーションによる長期間生存マウスにおけるウイルスの検出結果を示す図である。長期間生存マウスを殺し脳とその他の器官を固定し、セクションにして、ＮＴ２細胞とＨＳＶの免疫組織化学的検出に、またＨＳＶのin situ検出に用いた。Ａ：矢印は腫瘍移植部位に残る瘢痕を示す。Ｂ：組織学的には脳には腫瘍細胞（矢印）又は複製ウイルスを示す証拠は何もないことを示す。Ｃ：残る瘢痕は異常成長した石灰化部分からなる。これはＢで矢印で示した領域を高倍率で見たものである。Ｄ：生存マウス（感染後４カ月）の海馬（星印）には潜伏ウイルスが観察され、挿入写真はＬＡＴ陽性細胞の核に局在するシグナルを示す。Ｅ：ＭＢＰ染色によると、これらのマウスの脳全体には脱髄の証拠が何も見られなかった。Ｆ：ＬＡＴ陽性細胞（星印）の代謝健常度の測定として全ポリ（Ａ）+ＲＮＡを検出するために、放射性標識したポリ（ｄＴ）プローブを用いて行ったin situハイブリダイゼーションの暗視野光学顕微鏡写真である。実験組織（７Ｄからの連続セクション）を未感染組織、疑似感染した組織、及びＲＮＡｓｅ処理した組織と比較した。ＬＡＴ陽性領域と近くの連続セクションとの間には検出しうるシグナルの差はなかった。（スケールバー：＝Ａ，Ｂ，Ｅでは１．２ｍｍ；＝Ｄでは１１３μｍで挿入写真では９０μｍ；＝Ｆでは１１３μｍ；＝Ｃでは４５μｍ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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