(57)【要約】【課題】  非特異的な核酸増幅断片を減少させ、目的遺伝子を含む核酸断片を特異的に選別する核酸クローニング法を提供する。【解決手段】  アダプターを核酸にライゲーションして、アダプターを付加した核酸断片を得る核酸断片生成工程と、上記核酸断片生成工程にて得られた上記アダプターを付加した核酸断片を３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって増殖して、ＰＣＲ産物を得るＰＣＲ産物生成工程と、上記ＰＣＲ産物を付着末端生成制限酵素及び平滑末端生成制限酵素で消化したベクターにライゲーションして、クローニングベクターを得るクローニングベクター生成工程と、上記クローニングベクターをコンピテントな細胞に導入して、目的遺伝子を含むクローンを増殖させるクローン増殖工程とを有する【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アダプターを用いたＰＣＲを利用する核酸のクローニング法において、
アダプターを核酸にライゲーションして、アダプターを付加した核酸断片を得る核酸断片生成工程と、
上記核酸断片生成工程にて得られた上記アダプターを付加した核酸断片を３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって増殖して、ＰＣＲ産物を得るＰＣＲ産物生成工程と、
上記ＰＣＲ産物を付着末端生成制限酵素及び平滑末端生成制限酵素で消化したベクターにライゲーションして、クローニングベクターを得るクローニングベクター生成工程と、
上記クローニングベクターをコンピテントな細胞に導入して、目的遺伝子を含むクローンを増殖させるクローン増殖工程と
を有することを特徴とする核酸クローニング法。
【請求項２】
上記核酸断片生成工程では、上記アダプターの付着末端と同じ末端を生じさせる制限酵素によって核酸を消化して、上記アダプターを付加した核酸断片を得ることを特徴とする請求項１記載の核酸クローニング法。
【請求項３】
上記アダプターは、その３'末端が脱リン酸化されていることを特徴とする請求項１記載の核酸クローニング法。
【請求項４】
上記ＰＣＲ産物生成工程では、第１のＰＣＲ産物でｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行うことを特徴とする請求項１記載の核酸クローニング法。
【請求項５】
上記ＰＣＲは、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いて行うことを特徴とする請求項１記載の核酸クローニング法。
【請求項６】
請求項１に記載の付着末端生成酵素及び平滑末端生成酵素で消化したベクターを含むことを特徴とする核酸クローニングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の特異的な増幅に好適なクローニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療分野における遺伝子診断やゲノム創薬において不可欠な遺伝子解析、農業分野における農植物に導入した遺伝子の特定、さらに分子生物学分野における遺伝子プロモーターの取得等に遺伝子クローニング法が重要な役割を果たしている。
【０００３】
遺伝子クローニングとは、遺伝子操作によって、目的とする遺伝子を含んだ組換え体を作成して細胞の中に導入し、その細胞を増やすことにより、初めに単離したものと全く同じ遺伝子を無限に供給するものである。
【０００４】
従来から使用されている方法としては、ゲノムＤＮＡを制限酵素消化後、ベクターにライゲーションし、宿主細胞に導入させ、該当するクローンを選別する方法がある。例えば、コスミドライブラリーや細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーを作成し、該当するクローンを選別する方法である。この方法は一度に長鎖をクローニングすることができる方法であるが、ライブラリーの作成には高度な技術が必要とされ、相当数のクローンの中からサザンハイブリダイゼーション法等によって目的遺伝子を含むクローンを探索しなければならず、多大な労力と費用が必要となり、簡素化と自動化が困難な方法である。
【０００５】
一方、別の方法として、制限酵素で消化した核酸にアダプターをライゲーションし、これを鋳型としてアダプター及び目的遺伝子に特異的に設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法で酵素的に増幅させるという方法がある。
【０００６】
ＰＣＲ法は、ＤＮＡを鋳型として、特定領域を挟むように短いプライマーＤＮＡを各相補鎖にハイブリット結合させ、基質である４種類のｄＮＴＰ存在下、ＤＮＡポリメラーゼを作用させることによって、このプライマーの３’末端の塩基配列に従ってヌクレオチドが添加され、鎖が伸長していく反応が繰り返されることで、数時間で目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を指数関数的に増幅させることができる増幅方法である。
【０００７】
このＰＣＲ法によるクローニング法は、ライブラリーを作成してクローンニングする上記方法と比較して、簡単に、しかも短時間で目的遺伝子を含む核酸断片を得ることができるという点でとても有用である。しかも、近年では種々のＤＮＡポリメラーゼが開発され、ＰＣＲの増幅効率が高まり、従来よりも長鎖の核酸を正確に増幅させることが可能となっている。その代表的なＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕＤＮＡポリメラーゼであり、このＤＮＡポリメラーゼは３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有することから、誤った塩基の取り込みに対して校正する機能を有しており、また熱安定性にも優れていることから、正確性の高いＰＣＲを行うことができる。
【０００８】
そして、この３'→５'エキソヌクレア−ゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用したクローニング法にＴＡクローニング法がある。このＴＡクローニング法は、まず該ＤＮＡポリメラーゼを用いて得られたＰＣＲ産物の平滑末端をＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等のpolＩ型酵素によって処理することによって、３'末端にアデニン又はチミンを付加させる。一方、ベクターにｄＴＴＰ又はｔａｑＤＮＡポリメラーゼを反応させることのよってＴＡベクターを作製する。そして、上記のように処理した核酸断片とベクターをライゲーションさせて宿主細胞に形質転換し、クローニングするというものである。このＴＡクローニング法は、ＰＣＲ産物をリン酸化する工程を省略でき、また平滑末端同士のライゲーションよりも付着末端化させることでライゲーション効率を高めることができるという利点がある（例えば、非特許文献１参照）。
【０００９】
【非特許文献１】編集田村隆明氏「改訂遺伝子工学実験ノート下巻（第２版）」羊土社出版、2006年5月15日、p.34−36
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のＴＡクローニング法のようなＰＣＲ法を用いたクローニング法は、短時間で効率的に目的遺伝子を増幅する方法である。しかし、目的とする遺伝子を含まない非特異的なクローンが出現してしまうという欠点を有している。ＰＣＲ法を利用したクローニング法は、このような特異性が十分ではないという問題があることから、より特異性のあるＤＮＡクローンを増幅する技術が求められていた。
【００１１】
本発明は、このような実情に鑑みて提案されたものであり、非特異的な増幅断片を減少させ、目的遺伝子を含むクローンを特異的に選別するクローニング法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本件発明者は、上述した目的を達成するために、様々な観点から鋭意研究を重ねてきた。その結果、制限酵素切断部位が末端に付加されたアダプターを用いたＰＣＲにおいて、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸断片を増幅させ、そのＰＣＲ断片を、付着末端生成制限酵素及び平滑末端生成制限酵素で消化したベクターにライゲーションさせることで、目的遺伝子を含む核酸断片を特異的に増幅させることができることを見出した。本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。
【００１３】
すなわち、本発明に係る核酸クローニング方法は、アダプターを核酸にライゲーションして、アダプターを付加した核酸断片を得る核酸断片生成工程と、上記工程にて得られた上記アダプターを付加した核酸断片を３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって増殖して、ＰＣＲ産物を得るＰＣＲ産物生成工程と、上記ＰＣＲ産物を付着末端生成制限酵素及び平滑末端生成制限酵素で消化したベクターにライゲーションして、クローニングベクターを得るクローニングベクター生成工程と、上記クローニングベクターをコンピテントな細胞に導入して、目的遺伝子を含むクローンを増殖させるクローン増殖工程とを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る核酸クローニング法によれば、目的遺伝子を含んだＰＣＲ産物（標的ＰＣＲ産物）は、付着末端と平滑末端よりなっていることから、同一の制限酵素及び任意の平滑末端生成制限酵素で消化したベクターとのライゲーションにおいては、両末端が一致した標的ＰＣＲ産物のみがライゲーションされる。従って，極めて効率的かつ正確に標的ＰＣＲ産物に特異性を生み出すことができ、その結果、目的遺伝子を含まない非特異的なクローンの増殖を抑えることが可能となる。
【００１５】
また、ＰＣＲ産物生成工程において、必要に応じて、第１のＰＣＲ産物でｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行うようにすることにより、ＰＣＲ増幅過程における非特異的なＰＣＲ産物の産出を減少させることができ、より特異性の向上を図ることが可能となる。
【００１６】
本発明のこのような効果によって、当該技術分野における研究の前進に貢献するばかりではなく、医療、法医学分野またはその他の分野において広く利用されることにより、効率的かつ正確なクローニング方法を実現することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施方法及び実施態様について説明する。図１に本発明に係るクローニング方法を用いた実施形態の概略図を示す。
【００１８】
本発明に係る核酸クローニング方法は、アダプターを核酸にライゲーションして、アダプターを付加した核酸断片を得る核酸断片生成工程と、上記工程にて得られた上記アダプターを付加した核酸断片を３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって増殖して、ＰＣＲ産物を得るＰＣＲ産物生成工程と、上記ＰＣＲ産物を付着末端生成制限酵素及び平滑末端生成制限酵素で消化したベクターにライゲーションして、クローニングベクターを得るクローニングベクター生成工程と、上記クローニングベクターをコンピテントな細胞に導入して、目的遺伝子を含むクローンを増殖させるクローン増殖工程とを含む。
【００１９】
先ず、アダプターを付加した核酸断片を得る核酸断片生成工程について説明する。
【００２０】
アダプターは、約２０〜４０塩基対からなるオリゴヌクレオチドであり、その末端には制限酵素切断部位が付加されている。その制限酵素は、例えばBamHＩや、HindＩＩＩ、EcoRＩ、ApaＩその他、種々のものを用いることができるが、その制限酵素切断末端が４塩基付着末端であることが好ましい。このことより、核酸とのライゲーション効率が上げることができる。図２に、アダプターの例を示す。
【００２１】
アダプターの３’末端は脱リン酸化されており、これによって、核酸とのライゲーション工程においてアダプター同士がライゲーションされることを防ぐことができる。
【００２２】
また、図２に示すように、アダプターにおける核酸とのライゲーション末端とは反対側のプライマー領域の塩基配列には、ＧＣ量を多めに設定し、プライマーのＴｍ値を上げるようにすることが好ましい。このことによって、ＰＣＲにおいて該末端側から正確にアニーリングすることができるようになる。例えば、アダプタープライマーのＴｍ値を６５℃、後述するｎｅｓｔｅｄＰＣＲも行う場合には、ｎｅｓｔｅｄプライマーのＴｍ値を５５℃となるようにアダプターを設計する。その結果、正確にアニーリングされる。
【００２３】
さらに、該アダプターにはＰＣＲ産物生成工程におけるプライマーと相補的な結合をなす領域があり、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲを伴わせる場合には、図２に示すような隣接する形でプライマー領域を形成し、または一部重なり合うようにプライマー領域を形成することも可能である。このようにアダプター上にプライマー領域を設けることによって、増幅されたＰＣＲ産物上に該アダプターと同一の制限酵素切断部位ができるので、後の工程において該制限酵素で切断することで、ＰＣＲ産物の一端又は両端を付着末端にすることが可能となる。詳しくは後述する。
【００２４】
一方、クローニングする核酸には、その遺伝子配列に塩基配列既知の目的遺伝子領域が存在している。ここで、上記核酸はＤＮＡに限定されず、ＤＮＡの転写によって得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて生成したｃＤＮＡでも当然良い。
【００２５】
そして、該核酸を、上記アダプターに付加されている制限酵素切断末端と同一の切断末端を形成する制限酵素で消化して核酸断片を作り、上記アダプターにライゲーションする。その結果、核酸断片の両端にアダプターが付加された形の核酸断片が生成されるが、この生成核酸断片には、目的遺伝子配列が両端のアダプターに挟まれた形で存在している断片（標的核酸断片）や目的遺伝子配列を含まず両端にアダプターを付加しているだけの断片（非標的核酸断片）とが存在している。
【００２６】
このように、核酸断片に制限酵素切断部位を有するアダプターを付加する結果、後述のＰＣＲで得られた増幅断片を、同一の制限酵素で消化することで、ＰＣＲ産物の末端に付着末端を形成させることが可能となる。そして、こうして得られたＰＣＲ産物は、極めて容易に脱リン酸化したベクターにライゲーションさせることができ、本実施形態の効果である特異性を与えることができる。
【００２７】
次に、上記生成核酸断片をＰＣＲにより増幅する工程について説明する。
【００２８】
ＰＣＲでは、ＤＮＡを鋳型として、特定領域を挟むように短いプライマーＤＮＡを各相補鎖にハイブリット結合させ、基質である４種類のｄＮＴＰ存在下、ＤＮＡポリメラーゼを作用させると、このプライマーの３’末端に、鋳型の塩基配列に従ってヌクレオチドが添加され、鎖が伸長していく反応が起きる。ＰＣＲはこの反応が繰り返されることで、数時間で目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を指数関数的に増幅させることができる増幅方法である。
【００２９】
本実施形態においては、２種類のプライマーと、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。なお、第１のＰＣＲ産物でｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行う場合には、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲプライマーを別に用意する。
【００３０】
本実施形態に用いられるプライマーの１つは、上記アダプターのプライマー領域と相補的に結合するように設計されたプライマーであり、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行う場合にはｎｅｓｔｅｄＰＣＲプライマー領域に相補的なプライマーを用意する。また、別のもう一種類のプライマーは核酸上の目的遺伝子配列に特異的に結合する様に設計したプライマーである。
【００３１】
ここで、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲについて説明する。ｎｅｓｔｅｄＰＣＲは、外側と内側のプライマーを使って２段階のＰＣＲを行う方法であり、目的とする領域からの最初のＰＣＲ産物を鋳型にして、最初に使用したプライマーの位置より、両側とも内側にプライマーを設定して行う方法である。ｎｅｓｔｅｄＰＣＲは一組のプライマー対で増幅される目的配列の内側に第２のプライマーをデザインし、最初のＰＣＲで増えた生成物を希釈して新たな鋳型とした第２のＰＣＲを行う。ＰＣＲは、２つのプライマー対が適当な間隔で向き合って存在することによる特異性に基づいて特定の断片を増幅する方法であるが、プライマーの類似配列によってミススプライミングが時々起こり、目的配列の増幅とともに非特異的な増幅も起こってしまう。この非特異的断片を含むＰＣＲ産物を鋳型にしてｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行うと、非特異的な断片の中にｎｅｓｔｅｄプライマーに類似した配列が存在する確率が極めて低くなるため、非特異的増幅のノイズの海から目的配列のみをうまく抽出することが可能となる。従って、バックグラウンドが出やすいＰＣＲの場合に有効な方法となる。
【００３２】
本実施形態においても、第１のＰＣＲによって無数の断片が生じた場合、該ＰＣＲ産物でｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行うことにより絞込みができると共に、非特異的な増幅をこの段階においても排除することができるので、最終的に、目的遺伝子を含んだ核酸をより一層特異的にクローニングすることができる。
【００３３】
さらに、本実施形態におけるＰＣＲでは、ＤＮＡポリメラーゼとして３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するものを用いて行う。該活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いることによって、ＰＣＲ増幅過程における誤った塩基の取り込みに対する校正機能を有するので、正確性の高いＰＣＲ増幅ができると共に、ＰＣＲ産物の３’末端にｄＡが付加されないので平滑末端を有するＰＣＲ産物を生成させることができる。
【００３４】
ここで一般的に、ＤＮＡポリメラーゼの種類は、polＩ型とα型、そして混合型に大別される。PolＩ型ＤＮＡポリメラーゼは比較的安価であり、伸長活性が高いという利点を持つが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないことより、誤った塩基の取り込みに対して校正ができず、正確性の高いＰＣＲ産物を生成することができない。また、３’末端にはｄＡが付加されるので付着末端を形成させることになる。それに対し、α型ＤＮＡポリメラーゼは、伸長活性は高くないが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有することから増幅過程において校正が可能となる。その結果、正確性に富んだ増幅ができ、また該活性により３’末端にｄＡが付加させないので平滑末端を有するＰＣＲ産物を生成させることができる。また、これら上記ポリメラーゼの各々の欠点を補ったのが混合型ＤＮＡポリメラーゼである。PolＩ型とα型の両者を一定割合で混合した混合型ＤＮＡポリメラーゼは、polＩ型の有する伸長活性とα型の有する３’→５’エキソヌクレアーゼ活性によって、比較的長い核酸を正確に増殖させ、さらにそのＰＣＲ産物の３’末端を平滑末端とすることができる。
【００３５】
本実施形態におけるＰＣＲでは、上記したアダプター上に相補的に結合するプライマーと、核酸上の目的遺伝子配列に特異的に結合するプライマーと、そして３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ産物を得ることにより、目的遺伝子を含むＰＣＲ産物（標的ＰＣＲ産物）の一方の末端のみを平滑末端とすることを可能とし、標的ＰＣＲ産物に特異性を与えることできる。
【００３６】
従って、本実施形態では、ＰＣＲ工程において３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するα型のＤＮＡポリメラーゼを選択する。α型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼやＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ等を用いることができる。なお、混合型ＤＮＡポリメラーゼも３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しているが、polＩ型酵素も一定の割合で含まれていることにより、α型を用いる方が好ましい。
【００３７】
次に、クローニングベクターを生成する工程について説明する。
【００３８】
上記ＰＣＲによって増幅された核酸には、一方の断片が平滑末端であり、他方の末端に制限酵素切断部位を有する目的遺伝子を含んだ核酸断片（標的核酸断片）だけでなく、両端に制限酵素切断部位を有するか、又は両端ともに制限酵素切断部位を有さない目的遺伝子非含有の核酸断片（非標的核酸断片）も含まれている。
【００３９】
本実施形態は、ＰＣＲで増幅した標的核酸断片の末端の特異性を利用して、上記制限酵素と同じ制限酵素又は上記制限酵素と同じ切断断片を生じさせる制限酵素及び平滑末端生成酵素で消化したベクターとＰＣＲ産物をライゲーションさせるという、二次的に標的核酸断片を選別する工程を含んでいる。
【００４０】
ＰＣＲで増幅した非標的核酸断片は、その末端がベクターの末端と完全に一致しない為、ライゲーションすることができない。一方で、標的核酸断片の末端はベクターの両末端と完全に一致する為、ライゲーションされる。
【００４１】
このようにＰＣＲ産物を付着末端及び平滑末端を有するベクターとライゲーションさせることにより、ベクターとのライゲーションが可能な標的核酸断片のみを二次的に選別することが可能となる。
【００４２】
なお、ベクターとしては、プラスミドベクターやλファージベクター等の種々のものが用いられ、特に限定されない。
【００４３】
最後に、上記クローニングベクターをコンピテントな細胞に導入して、目的遺伝子を含むクローンを増殖する工程について説明する。
【００４４】
上記説明のようにベクターにクローニングされたＰＣＲ産物は、ベクターとの特異的なライゲーションという二次的な選別工程より得られたものであることから、目的遺伝子を含むものである。このクローニングベクターを大腸菌等のコンピテントセルに導入することによって目的遺伝子を含んだクローンを生成させることが可能となる。
【００４５】
ここでコンピテントセルとしては、例えば大腸菌が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４６】
また、コンピテントセルへのベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法やヒートショック法等が挙げられる。
【００４７】
以上の実施形態のように、アダプターを利用したＰＣＲにおいて、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いることによって、一方が付着末端で他方が平滑末端を有するＰＣＲ産物を生成させることができ、そしてこのＰＣＲ産物を上記付着末端と同じ末端を生じさせる制限酵素及び平滑末端生成制限酵素で消化したベクターとライゲーションさせることによって、目的遺伝子を含有するＰＣＲ産物のみがライゲーションされるという選択性が付与され、目的遺伝子インサートクローンを特異的に増殖させることができる。
【実施例】
【００４８】
（ＤＮＡ抽出）
まず、Penicillium purpurogenum Stoll（IAM15392）由来のゲノム遺伝子を以下のように抽出した。
【００４９】
Penicillium purpurogenum Stoll（IAM15392）をＹＭＡ(Yeast Malt extract Agar)培地中で８０時間培養した。この培養液を遠心分離後、回収し、液体窒素で急冷し、凍結させた菌体を乳鉢、乳棒を用いて粉末状にした。
【００５０】
粉末の菌体重量に対して４倍量のＤＮＡ抽出液（0.3Ｍ NaCl、50ｍM Tris-HCl（pH.7.5）、20ｍM EDTA、0.5% SDS、5M UREA、10ｍM 2−mercaptoethanol、5%（v/v） phenol）を加えて転倒混和した。そして等量のＰＣＩ（25:24:1=phenol:chloroform:Isoamylalchol）を加えて、２０秒間激しく撹拌し、常温で１２０００×ｇ、１５分間遠心分離し、上層を回収した。そして、このＰＣＩを加えて遠心分離する操作を中間層が無くなるまで繰り返し行った。
【００５１】
その後、上層に２倍量のエタノールを加えて転倒混和後、１0分間室温放置し、これを４℃で１２０００×ｇ、２０分間遠心分離した後、上清を除去した。また、７０％エタノールを３倍量加え、４℃で１５０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。そして、７０％エタノールを2倍量加えて上清を除去する作業をもう一度繰り返した。
【００５２】
上清を除去した後、ＴＥ（10ｍM Tris-HCl(PH 7.5)、1ｍM EDTA、20μg/ｍL RNase A）１００μＬに溶解し、１６時間４℃で緩やかに撹拌した。そして、３７℃で１時間インキュベートし、１００μＬのＰＣＩを加えて、２０秒間激しく撹拌した。そして、常温で１２０００×ｇ、１５分間遠心分離し、上層を回収した。
【００５３】
上層８０μＬに３Ｍ酢酸ナトリウムを８μL（1/10）及び１００％エタノールを１６０μＬ（2vol.）加え、転倒混和後、室温で１分間放置した。放置後、４℃で１２０００×ｇ、２０分間遠心分離し、上清を除去した。また、７０％エタノールを１ｍＬ加え、４℃で１５０００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清を除去した。さらに、７０％エタノールを１ｍＬ加え、上清を除去する作業をもう一度繰り返した。
【００５４】
そして、１０分間常温で風乾させた後、滅菌水５０μＬで完全に溶解させ、ＤＮＡを抽出した。
【００５５】
（アダプターを用いたＰＣＲ）
次に、上記作業で抽出されたＤＮＡを、アダプターを用いたＰＣＲ（ＧＣＡ−ＰＣＲ）によって以下のように増幅させた。
【００５６】
上記抽出したＤＮＡ溶液を制限酵素BamHＩで３７℃、１６時間消化した。そして、制限酵素消化したＤＮＡをSpin Column PCR Product Purification Kit（Bio Basic社製）（以下、ＳＣと呼ぶ。）によって精製し、このＤＮＡにＧＣＡ−アダプター（BamHＩ）をLigaFastTM Rapid DNA Ligation System（Promega社製）を用いて１６℃で１６時間ライゲーションした。アダプターを下記に示す。
【００５７】
【化１】
2008253219.tif 000003
【００５８】
アダプターをライゲーションしたＤＮＡを鋳型にアダプタープライマー、目的遺伝子（polyketide synthase）の部分的な配列により設計したプライマー、及びＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲを行った。ここで、アダプタープライマーを下記に示す。
【００５９】
GCA-primer ＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＣ
まず、９５℃、２分間で鋳型ＤＮＡを熱変性させ、９５℃で１５秒間→６８℃で５分間のサイクルを１０回繰り返した。その後、第２サイクルとして、９５℃で１５秒間→６０℃で３０秒間→６８℃で５分間のサイクルを４０回繰り返し、ＤＮＡを増幅させた。
【００６０】
そして、増幅させたＤＮＡの一部を鋳型にして、ｎｅｓｔｅｄプライマー、目的遺伝子のアダプターに近い配列より設計したプライマー、及びＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、上記と同様の条件でＰＣＲを行った。すなわち９５℃、２分間で鋳型ＤＮＡを熱変性させ、９５℃で１５分間→６８℃で５０分間のサイクルを１０回繰り返し、その後、第２サイクルとして、９５℃で１５分間→６０℃で３０秒間→６８℃で５分間のサイクルを４０回繰り返し、ＰＣＲ産物を得た。ここで、ｎｅｓｔｅｄプライマーを下記に示す。
【００６１】
GCA-nested-primer ＧＴＣＧＡＧＣＴＣＴＡＣＧＴＡＣＡＡＴＴ
そして、ＰＣＲ産物のＤＮＡをＳＣによって精製した。
【００６２】
得られたＰＣＲ産物には、目的遺伝子を含む核酸断片だけではなく、目的遺伝子を含んでいない核酸断片も含有されている。図３が、その様子を示したものであり、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけた結果である。この図３からもわかる様に、明瞭な１本のバンドパターンと複数本のバンドパターンが確認された。
【００６３】
（ベクターへのライゲーション）
次に、上記アダプターを用いたＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物を、以下のようにベクターに組み込み、大腸菌に形質転換した。
【００６４】
上記精製されたＤＮＡを制限酵素BamHＩによって消化した。この制限酵素で消化したＤＮＡをＳＣで精製し、アダプターを除去した。
【００６５】
一方、pbluescriptＩＩSK＋ベクターを、制限酵素BamHＩ及び平滑末端生成酵素であるHincＩＩで消化し、このベクターをＳＣで精製した。その後、精製ベクターをＢＡＰ（Bacterial Alkaline Phosphatase）で処理して脱リン酸化し、ＳＣで精製した。
【００６６】
上記制限酵素消化し、アダプターを除去、精製したＤＮＡの一部を、上記精製ベクターにLigaFastTM Rapid DNA Ligation System（Promega社製）を用いて１６℃、１６時間ライゲーションした。
【００６７】
そして、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに、上記ＤＮＡをライゲートしたベクターを形質転換させ、抗生物質（アンピシリン）選択培地上で目的遺伝子断片を含むクローンを選別した。
【００６８】
比較例
上述と同様に、ＤＮＡを抽出後、アダプターを用いたＰＣＲを行った後、上記実施例とは異なり、そのＰＣＲ産物をＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼにて処理してカラムに回収後、Ｔ-ｅａｓｙベクター（Promega社製）にライゲーションする、いわゆるＴＡクローニングを行い、当該ベクターを大腸菌DH5αに形質転換するクローニング法を比較例として行った。
【００６９】
インサートクローン取得の特異性の効果
本実施例に係るクローニング法と上記比較例に係るＴＡクローニング法によってそれぞれ得られたコロニーをランダムに５０個選択し、コロニーＰＣＲ法を用いて目的の配列を含むクローンの選別を行った。ここで、コロニーＰＣＲ法とは、ＤＮＡを抽出することなく、直接コロニーをＰＣＲ反応液に懸濁し、ＰＣＲ反応を起こさせるものである。
【００７０】
そして、このコロニーＰＣＲによって得られた反応液をそのまま電気泳動ゲルにアプライし、インサートチェックを行った。図４が、その結果を示したグラフである。
【００７１】
図４のグラフに示すように、比較例のＴＡクローニングにより得たクローンのうち、目的遺伝子を含んでいたクローンが２６クローンであったのに対して、本実施例に係る方法により得られた目的遺伝子を含むクローンは４８クローンと大きな差が出た。
【００７２】
これは、比較例の場合には、目的遺伝子とは異なる遺伝子を含むＤＮＡ断片もベクターにライゲーションされるのに対して、本実施例に係るクローニング法では、ベクターに付着末端生成制限酵素及び平滑末端生成制限酵素による処理を加えているため選択性が増し、目的遺伝子を含むクローンが特異的に増加したものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本実施の形態のクローニング法の概略図である。
【図２】BamHＩ、HindＩＩＩ、EcoRＩ、ApaＩの制限酵素切断末端を有するアダプターの示した図である。
【図３】ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる電気泳動の結果を示した図である。
【図４】比較例であるＴＡクローニング法と本実施例に係るクローニング法のそれぞれによる目的遺伝子インサートクローン数の割合を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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