(57)【要約】【課題】ハプテン修飾された腫瘍細胞抽出物及び癌を治療又はスクリーニングするための方法を提供すること。【解決手段】癌細胞もしくは癌細胞膜、またはそのペプチドから調製したハプテン修飾した腫瘍細胞抽出物を含む新規組成物を開示する。本発明は、Ｔ細胞リンパ細胞を刺激し、癌治療に有用であるハプテン修飾された腫瘍細胞抽出物の治療効果量を含む組成物を提供する。さらに治療効果判定を目的とした癌のサイトカイン産生をスクリーニングする方法であって、患者組織サンプルから得たサイトカイン特異的核酸を増幅して検出可能な信号を得る方法も開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の、組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
【数１】
2008056704.tif 000002
【０００２】
【数２】
2008056704.tif 000003
【０００３】
【数３】
2008056704.tif 000004
【０００４】
【数４】
2008056704.tif 000005
【０００５】
【数５】
2008056704.tif 000006
【０００６】
【数６】
2008056704.tif 000007
【０００７】
【数７】
2008056704.tif 000008
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
【０００９】
【化１】
2008056704.tif 000009
【００１０】
【化２】
2008056704.tif 000010
【００１１】
【化３】
2008056704.tif 000011
【００１２】
【化４】
2008056704.tif 000012
【００１３】
【化５】
2008056704.tif 000013
【００１４】
【化６】
2008056704.tif 000014
【００１５】
【数８】
2008056704.tif 000015
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
【数１１】
2008056704.tif 000016
【００１７】
【数１２】
2008056704.tif 000017
【００１８】
【数１３】
2008056704.tif 000018
【００１９】
【数１４】
2008056704.tif 000019
【００２０】
【数１５】
2008056704.tif 000020
【００２１】
【数１６】
2008056704.tif 000021
【００２２】
【数１７】
2008056704.tif 000022
【００２３】
【数１８】
2008056704.tif 000023
【００２４】
【数１９】
2008056704.tif 000024
【００２５】
【数２０】
2008056704.tif 000025
【００２６】
【数２１】
2008056704.tif 000026
【００２７】
【数２２】
2008056704.tif 000027
【００２８】
【数２３】
2008056704.tif 000028
【００２９】
【数２４】
2008056704.tif 000029
【００３０】
【数２５】
2008056704.tif 000030
【００３１】
【数２６】
2008056704.tif 000031
【００３２】
【数２７】
2008056704.tif 000032
【００３３】
【数２８】
2008056704.tif 000033
【００３４】
【数２９】
2008056704.tif 000034
【００３５】
【数３０】
2008056704.tif 000035
【実施例】
【００３６】
実施例１
【００３７】
【数３１】
2008056704.tif 000036
【００３８】
【数３２】
2008056704.tif 000037
【００３９】
【数３３】
2008056704.tif 000038
【００４０】
【数３４】
2008056704.tif 000039
【００４１】
【数３５】
2008056704.tif 000040
【００４２】
【数３６】
2008056704.tif 000041
【００４３】
【数３７】
2008056704.tif 000042
【００４４】
【数３８】
2008056704.tif 000043
【００４５】
【数３９】
2008056704.tif 000044
【００４６】
【数４０】
2008056704.tif 000045
【００４７】
【数４１】
2008056704.tif 000046
【００４８】
【数４２】
2008056704.tif 000047
【００４９】
【数４３】
2008056704.tif 000048
【００５０】
【数４４】
2008056704.tif 000049
【００５１】
【数４５】
2008056704.tif 000050
【００５２】
【数４６】
2008056704.tif 000051
【００５３】
【数４７】
2008056704.tif 000052
【００５４】
【数４８】
2008056704.tif 000053
【００５５】
【数４９】
2008056704.tif 000054
【００５６】
【数５０】
2008056704.tif 000055
【００５７】
【数５１】
2008056704.tif 000056
【００５８】
【数５２】
2008056704.tif 000057
【００５９】
【数５３】
2008056704.tif 000058
【００６０】
【数５４】
2008056704.tif 000059
【００６１】
【数５５】
2008056704.tif 000060
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、ＤＮＰ修飾自己由来ＰＢＬおよび黒色腫細胞へのＤＴＨ発現の動態を示す図である。ＤＮＰワクチンで治療した転移性黒色腫患者を、ＤＮＰ修飾ＰＢＬ（ＬＹ）または転移性塊から分離したＤＮＰ修飾黒色腫細胞（ＭＥＬ）で連続的に皮膚試験した。それぞれのバーは、各時点での患者群の平均ＤＴＨ反応を示す。１１９日に、ＰＢＬに対する反応のみを測定した。サンプル規模：０日、１４日、６３日、Ｎ＝８４、１１９日、Ｎ＝５７、１７５日、Ｎ＝４２、２３１日、Ｎ＝３５。
【図２】図２は、ＤＮＰに対する抗体反応を示す図である。各時点で得られた血清を、ＥＬＩＳＡを用いたＤＮＰに対する抗体（総免疫グロブリン）について試験した。滴定は次のように規定した：（サンプルのピークＯＤ）Ｘ（陽性対照のピークＯＤの半分に等しいＯＤを示した希釈の逆数）。
【図３】図３は、ＤＮＰ修飾自己由来リンパ球に対するＰＢＬの増殖性反応を示す図である。ＰＢＬはそれぞれのＤＴＨ反応のピークでＤＮＰワクチンを投与した患者４例から得た。ＤＮＰ修飾自己由来ＰＢＬ（自己ＬＹ−ＤＮＰ）の増殖能について、非修飾自己由来ＰＢＬ（自己ＬＹ）を対照として細胞を試験した。６日目に１２５ＩＵＤＲで培養液をパルスした。
【図４】図４は、ＤＮＰ修飾リンパ球に対する増殖性反応の動態を示す図である。ＤＮＰワクチンを投与しながら患者ＤＭ２から連続的にＰＢＬを採集した。それらを凍結保存したのち、ＤＮＰ修飾自己由来ＰＢＬ（自己ＬＹ−ＤＮＰ）に対する増殖性反応について同時に全サンプルを試験した。６日目に１２５ＩＵＤＲで培養液をパルスした。
【図５】図５は、ＤＮＰ修飾細胞に対する増殖性反応の特異性を示す図である。非修飾（自己ＬＹ）、ＤＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＤＮＰ）、またはＴＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＴＮＰ）のいずれかの自己由来ＰＢＬ、および非修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）またはＤＮＰ修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）のいずれかの培養自己由来黒色腫細胞に対する増殖性反応について、患者２例からのＰＢＬを試験した。６日目に１２５ＩＵＤＲで培養液をパルスした。
【図６】図６は、増殖（ｅｘｐａｎｄｅｄ）Ｔ細胞の特異性分析を示す図である。患者ＤＭ２からのＰＢＬをIL2において増殖させ、自己由来ＤＮＰ修飾Bリンパ芽球細胞で繰り返し刺激した。それらを非修飾（自己ＬＹ）、ＤＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＤＮＰ）、またはＴＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＴＮＰ）のいずれかの自己由来ＰＢＬ、および非修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）またはＤＮＰ修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）のいずれかの培養自己由来黒色腫細胞、ならびに同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）ＰＢＬ（同種異系ＬＹ）に対する増殖性反応について試験した。６日目に１２５ＩＵＤＲで培養液をパルスした。
【図７】図７は、ＤＮＰ修飾自己由来細胞に対するＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の反応を示す図である。陽性パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）により増殖Ｔ細胞をＣＤ８濃縮群またはＣＤ４濃縮群に分離した。次にそれらを非修飾（自己ＬＹ）、ＤＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＤＮＰ）、またはＴＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＴＮＰ）のいずれかの自己由来ＰＢＬ、および非修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）またはＤＮＰ修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）のいずれかの培養自己由来黒色腫細胞に対する増殖性反応について試験した。６日目に１２５ＩＵＤＲで培養液をパルスした。
【図８】図８は、ＤＮＰ反応性Ｔ細胞によるサイトカイン産生を示す図である。ＤＮＰ反応性Ｔ細胞系（親）、および限界希釈での平板培養により得られた３つの継代培養（２Ｆ８、ＩＤ７、ＩＣ２）を自己由来ＤＮＰ修飾Ｂリンパ芽球細胞と共に１８時間保温した。上清を採集し、γインターフェロン（ＩＦＮ）およびＩＬ４について分析した。
【図９】図９は、抗ＭＨＣクラスＩモノクローナル抗体によるＴ細胞反応の遮断を示す図である。自己由来ＤＮＰ修飾Ｂリンパ芽球細胞で拡張ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激し、１８時間後にγインターフェロンについて培養液を分析した。次のうちのいずれか１つで刺激細胞をプレインキュベートした：抗体なし（なし）、非特異的マウスＩｇＧ（非特異的）、モノクローナル抗体Ｗ６／３２（クラスＩ）、またはモノクローナル抗体Ｌ２３４（クラスＩＩ）。
【図１０】図１０は、Ｔ細胞反応のＭＨＣ制限を示す図である。別の患者４例からのＤＮＰ修飾自己由来ＰＢＬおよびＤＮＰ修飾同種異系ＰＢＬに応じた増殖能について増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ｂ６、ＢＷ６）を試験した。同種異系刺激物質のうち３つを図に示したように１つまたはそれ以上のクラスＩ座で適合させ、第４の刺激物質は完全に不適合させた（Ａ２４、Ａ２６、Ｂ４４、Ｂ６３）。６日目に１２５ＩＵＤＲで培養液をパルスした。
【図１１Ａ】図１１は、ＤＮＰ反応性Ｔ細胞の細胞毒性を示す図である。自己由来（自己）または同種異系クラスＩ不適合（同種）のいずれかの黒色腫細胞を、６時間５２Ｃｒアッセイにおける標的として用いた。エフェクター細胞は拡張ＣＤ８＋、ＤＮＰ反応性Ｔ細胞であった。図１１Ａ−標的細胞を各濃度のＤＮＢＳまたはＴＮＢＳでハプテン化した。エフェクター：標的細胞比は２０：１であった。
【図１１Ｂ】図１１は、ＤＮＰ反応性Ｔ細胞の細胞毒性を示す図である。自己由来（自己）または同種異系クラスＩ不適合（同種）のいずれかの黒色腫細胞を、６時間５２Ｃｒアッセイにおける標的として用いた。エフェクター細胞は拡張ＣＤ８＋、ＤＮＰ反応性Ｔ細胞であった。図１１Ｂ−２．５ｍｇ／ｍｌのＤＮＢＳまたはＴＮＢＳでハプテン化した標的細胞を一連のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でエフェクターと混合した。
【図１２】図１２は、ＤＮＰワクチンおよび非ハプテン化対照ワクチンで治療した手術後数ヶ月において腫瘍が認められない患者の割合を示す図である。
【図１３】図１３は、それぞれ１０画分の５群にプールしたＨＰＬＣ画分を示す図である。ジニトロフェニル修飾黒色腫細胞（ＤＮＰ−ＭＥＬ）またはジニトロフェニル修飾Ｂ細胞（ＤＮＰ−ＬＹ）から誘導したペプチドはプール２において刺激性であった。
【図１４Ａ】図１４は、ＩＦＮγおよびＩＬ１０のｍＲＮＡを発現するＤＮＰワクチン免疫化患者からの炎症性皮下黒色腫結節を示す図である。図１４−１はＲＴ−ＰＣＲ（レーン１＝サイズマーカー、２＝β−アクチン、３＝ＩＦＮγ、４＝ＩＬ４、５＝ＩＬ１０）により決定されるサイトカインのｍＲＮＡを示し、図１４−２は皮下病変のＨ＆Ｅ染色切片を示す。
【図１４Ｂ】図１４は、ＩＦＮγおよびＩＬ１０のｍＲＮＡを発現するＤＮＰワクチン免疫化患者からの炎症性皮下黒色腫結節を示す図である。図１４−１はＲＴ−ＰＣＲ（レーン１＝サイズマーカー、２＝β−アクチン、３＝ＩＦＮγ、４＝ＩＬ４、５＝ＩＬ１０）により決定されるサイトカインのｍＲＮＡを示し、図１４−２は皮下病変のＨ＆Ｅ染色切片を示す。
【図１５Ａ】図１５は、ＩＦＮγではなくＩＬ１０のｍＲＮＡを発現する免疫化されていない患者からのリンパ節転移を示す図である。図１５−１は、ＲＴ−ＰＣＲ（レーン１＝サイズマーカー、２＝β−アクチン、３＝ＩＦＮγ、４＝ＩＬ４、５＝ＩＬ１０）により決定されるサイトカインのｍＲＮＡを示し、図１４−２はリンパ節転移のＨ＆Ｅ染色切片を示す（４０ＯＸ）。
【図１５Ｂ】図１５は、ＩＦＮγではなくＩＬ１０のｍＲＮＡを発現する免疫化されていない患者からのリンパ節転移を示す図である。図１５−１は、ＲＴ−ＰＣＲ（レーン１＝サイズマーカー、２＝β−アクチン、３＝ＩＦＮγ、４＝ＩＬ４、５＝ＩＬ１０）により決定されるサイトカインのｍＲＮＡを示し、図１４−２はリンパ節転移のＨ＆Ｅ染色切片を示す（４０ＯＸ）。
【図１６】図１６は、ヒト黒色腫転移において発現したＩＬ１０  ｍＲＮＡのゲルを示す図である。サイトカインのｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ（レーン１＝サイズマーカー、Ｃ＝ＩＬ１０  ｃＤＮＡ対照、１−７＝患者サンプル）により決定された。
【図１７】図１７は、黒色腫細胞により発現されたＩＬ１０  ｍＲＮＡのゲルを示す図である。図１７は、代表的腫瘍生検および誘導細胞系からのＲＴ−ＰＣＲにより発現されるＩＬ１０  ｍＲＮＡを示す（レーン１＝サイズマーカー、２＝ＩＬ１０  ｃＤＮＡ、３＝腫瘍生検、４＝腫瘍系）。
【図１８Ａ】図１８は、非炎症性黒色腫生検のパラフィン切片からのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲである（Ａ＝１００Ｘ、Ｂ＝４００Ｘ）。
【図１８Ｂ】図１８は、非炎症性黒色腫生検のパラフィン切片からのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲである（Ａ＝１００Ｘ、Ｂ＝４００Ｘ）。
【００６３】
（配列表）
【００６４】
【数５６】
2008056704.tif 000061
【００６５】
【数５７】
2008056704.tif 000062
【００６６】
【数５８】
2008056704.tif 000063
【００６７】
【数５９】
2008056704.tif 000064
【図１】
2008056704.tif 000065
【図２】
2008056704.tif 000066
【図３】
2008056704.tif 000067
【図４】
2008056704.tif 000068
【図５】
2008056704.tif 000069
【図６】
2008056704.tif 000070
【図７】
2008056704.tif 000071
【図８】
2008056704.tif 000072
【図９】
2008056704.tif 000073
【図１０】
2008056704.tif 000074
【図１１Ａ】
2008056704.tif 000075
【図１１Ｂ】
2008056704.tif 000076
【図１２】
2008056704.tif 000077
【図１３】
2008056704.tif 000078
【図１４Ａ】
2008056704.tif 000079
【図１４Ｂ】
2008056704.tif 000080
【図１５Ａ】
2008056704.tif 000081
【図１５Ｂ】
2008056704.tif 000082
【図１６】
2008056704.tif 000083
【図１７】
2008056704.tif 000084
【図１８Ａ】
2008056704.tif 000085
【図１８Ｂ】
2008056704.tif 000086