(57)【要約】【課題】納豆製造過程で副生する大豆煮汁又は、焼酎の製造過程で副生する焼酎粕を有効利用するため、大豆煮汁を原料にして製造した醸造酢や焼酎粕から抽出、分離したアポトーシスを誘導するトリプトフォール誘導体及びその精製法を提供する。【解決手段】アポトーシスを誘導するトリプトフォール誘導体の精製法は、大豆煮汁を原料にして米麹、酵母を添加してアルコール発酵させ、次いで酢酸菌で酢酸発酵させて得られた醸造酢及び、焼酎粕の酢酸エチル抽出物を５０％メタノール水溶液に溶解し、ＨＰＬＣによりアポトーシスを誘導するトリプトフォール誘導体を分離するアポトーシスを誘導するトリプトフォール誘導体の精製法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆煮汁、米麹、酵母を混合してアルコール発酵させ、次いで酢酸菌で酢酸発酵させて得られた醸造酢又は、焼酎粕から抽出・分離したアポトーシスを誘導するトリプトフォール誘導体。
【請求項２】
大豆煮汁、米麹、酵母を混合してアルコール発酵させ、次いで酢酸菌で酢酸発酵させて得られた醸造酢又は、焼酎粕に酢酸エチルを添加して得られる酢酸エチル抽出物を乾燥し、乾燥物を５０％超純水、５０％メタノール水溶液に溶解した後、ＨＰＬＣによりアポトーシスを誘導するトリプトフォール誘導体を分離することを特徴とする、アポトーシス誘導物質を誘導するトリプトフォール誘導体の精製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、納豆製造過程において副生する大豆煮汁から製造した醸造酢や、焼酎の製造過程で副生する焼酎粕から抽出・分離したアポトーシス誘導物質であるトリプトフォール誘導体及びその精製法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
納豆製造過程において副生する大豆煮汁は、通常、活性汚泥処理後、廃棄処分されている。また、焼酎の製造過程で副生する焼酎粕についても産業廃棄物として廃棄されているが、大豆煮汁や焼酎粕は大量に副生されるため、その処分が問題となっている。
【０００３】
大豆煮汁には、タンパク質、糖質、ミネラル、ポリフェノール類を豊富に含んでいることから、栄養機能性に優れており、特に、味噌や納豆の大豆煮汁は高い抗ラジカル活性、血圧上昇抑制活性を有し、その健康機能性が期待されている。このことから、味噌や納豆の製造工程において副生する大豆煮汁を有効活用することを目的として、味噌や納豆の製造工程において副生する大豆煮汁に麹と酵母を添加してエタノール発酵を行い、その後、酢酸菌を添加して酢酸発酵を行う醸造酢の製造法が知られている（特許文献１、非特許文献１参照）。
【０００４】
飲料用の健康酢（黒酢やもろみ酢）は、毎日気軽に摂取できることから有望な健康食品として注目されており、また、その健康機能性が明らかになってきている。例えば、黒酢はガン細胞の増殖抑制能、マウスの腫瘍抑制能など様々な効果がある（非特許文献２参照）。
【０００５】
一方で、医療の現場で用いられている抗ガン剤は、アポトーシス誘導活性により効果を発揮していることが分かっている。近年、アポトーシス誘導物質は薬剤としてのみならず、例えば、緑茶中に含まれるカテキンの一種であるエピガロカテキンガレートやキャベツから単離されたインドールカルビノールは、単球性白血球（Ｕ９３７）細胞に対してアポトーシス誘導作用を持ち、これらの成分を含む食材を食している地域ではガン発症率が少ないことが疫学的調査にて実証されている（非特許文献３参照）。  
【特許文献１】特開２００３−４７４５６号公報
【非特許文献１】日本食品科学工学会誌５２巻，１２号５７８−５８３ページ(２００５年)
【非特許文献２】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２２，ｐ５９１−５９７(２００３年)
【非特許文献３】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．５３，ｐ３９１−３９４(２０００年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来、食品産業廃棄物として処理されていた、大量の大豆煮汁又は、焼酎の製造過程で副生する焼酎粕を有効利用するため、大豆煮汁を原料にして製造した醸造酢又は、焼酎粕から抽出、分離したアポトーシスを誘導するトリプトフォール誘導体及びその精製法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、大豆煮汁を原料にして米麹、酵母を添加してアルコール発酵させ、次いで酢酸菌で酢酸発酵させて得られた醸造酢又は、焼酎粕から抽出・分離したアポトーシスを誘導するトリプトフォール誘導体であることを特徴とする。
【０００８】
本発明のアポトーシスを誘導するトリプトフォール誘導体の精製法は、大豆煮汁を原料にして米麹、酵母を添加してアルコール発酵させ、次いで酢酸菌で酢酸発酵させて得られた醸造酢又は、焼酎粕の酢酸エチル抽出物を５０％超純水、５０％メタノール水溶液に溶解し、ＨＰＬＣによりアポトーシスを誘導するトリプトフォール誘導体を分離することを特徴とする。
【０００９】
本発明は、従来は廃棄していた食品副産物である大豆煮汁あるいは焼酎粕を用いて製造した醸造酢からトリプトフォール誘導体を抽出し、Ｕ９３７細胞のＤＮＡを断片化させ、核の凝集、アポトーシス小体の形成を誘導するという特徴を確認するに至った。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、納豆製造過程で副生する大豆煮汁あるいは、焼酎粕を原料にして製造した醸造酢又は、焼酎粕からアポトーシスを誘導するトリプトフォール誘導体であり、天然由来のアポトーシス誘導物質として副作用の少ない抗ガン剤として利用可能となる。
【００１１】
また、本発明の原料である大豆煮汁あるいは焼酎粕は、製造時大量に副生し、従来は食品産業廃棄物として処理されていたものであるが、本発明により未利用資源を有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【実施例１】
【００１３】
大豆煮汁１．５Ｌに米麹２２４ｇ（麹歩合１３％）、協会酵母Ｋ７７（サッカロミセスセレビジェ）を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ容になるように添加し、二晩静置培養し、アルコール濃度５．７６％（ｖ／ｖ）の大豆煮汁を得た。発酵終了後、遠心分離して固形分を除いた後、上清１Ｌに酢酸菌（アセトバクター・アセチ）ＮＢＲＣ３２８３を５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ容となるように添加し、３Ｌジャーファーメンターシステムを用いて２２時間培養した。その後、不溶物を遠心分離により除き、酢酸度数約５％の大豆煮汁醸造酢とした。
【００１４】
製造した大豆煮汁醸造酢に等量の酢酸エチルを添加し、シェーカーにより振とうした。以下、同様の操作を２回繰り返し、酢酸エチル層の溶媒を減圧乾燥により除き、乾燥物を５０％超純水、５０％メタノール水溶液に溶解し、フィルターろ過後、ＨＰＬＣ用サンプルとした。
【００１５】
ＨＰＬＣは分取用ギルソンクロマトグラフィーシステムを用いて実施した。カラムはＬ−ＣｏｌｕｍｎＴＭを用いた。流速は１０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム保温温度は３０℃、検出波長はＵＶ（２２０，２８０ｎｍ）で実施した。移動層はＡが、容量比で、超純水：メタノール：５Ｎ塩酸＝８９．９：１０：０．１  、Ｂが、超純水：アセトニトリル：５Ｎ塩酸＝４９．９：５０：０．１となるように調製し、０−１０分：Ａ  １００％  Ｂ  ０％、１０−８０分：  Ａ  ６０％  Ｂ  ４０％、８０−１００分：Ａ  ０％  Ｂ１００％、  １００−１２０分：  Ａ  ０％  Ｂ  １００％、  １２０−１３５分：  Ａ  １００％  Ｂ  ０％になるように調整した。本条件を用いたＨＰＬＣで検出された１０フラクションを分取し、それぞれのアポトーシス誘導試験を行った。
【００１６】
ＤＮＡの断片化試験
アポトーシス誘導活性物質のスクリーニングはＵ９３７細胞のＤＮＡの断片化能を指標にして実施した。ＤＮＡの断片化試験は以下のとおりである。
【００１７】
Ｕ９３７細胞（単球性リンパ腫細胞）をＲＰＭＩ培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＵ９３７細胞にサンプルを添加して２４時間培養した。細胞を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，  １０ｍｉｎ）により集めた後、上記の細胞をＴＥ  ２００μＬに溶解し、ＲＮａｓｅ（１０μｇ／μＬ）  １０μＬ，  ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（１０μｇ／μＬ）  １０μＬ，１０％ＳＤＳ  １０μＬを添加後、３７℃で３０分間インキュベートした。さらにＮａＩ溶液３００μＬ添加して６０℃で１５分インキュベートした。次に５００μＬの１００％イソプロパノ−ル処理を行ない、続いて５０％イソプロパノ−ルで洗浄後、遠心分離（１６，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）によりＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡの沈殿を３７℃で乾燥させた後、４０μＬのＴＥに溶解した。ＤＮＡの断片化の確認はアガロースゲル電気泳動法を実施した。
【００１８】
図１に示すように、大豆煮汁醸造酢をＨＰＬＣで分画し、全ピーク画分を用いてアポトーシス誘導試験を行ったところ、全１０画分のうち画分Ｎｏ．６（７４分）にアポトーシス誘導活性を見出した。画分Ｎｏ．６は４０および８０μｇ／ｍＬの濃度でＤＮＡの断片化を起こした。その写真を模式的に図２に示した。なお、図２で示すＭは分子量マーカーである。
【００１９】
画分Ｎｏ．６の構造解析（ＮＭＲ，ＭＳおよびＦＡＢ−ＭＳ解析）を行ったところ、分子量４０２のトリプトフォールの誘導体であった。
【００２０】
細胞毒性試験
次に、正常白血球細胞およびＵ９３７細胞に対する細胞毒性試験を行い、細胞毒性の感受性の違いを調べた。正常白血球細胞は、発明者の血液を採血後、リンフォセパール溶液（免疫生物研究所）を等量添加後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ，  ３０ｍｉｎ）し、中間層に集まった白血球細胞をＲＰＭＩ培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
【００２１】
細胞毒性試験は、ＷＳＴ−８細胞数測定キット（キシダ化学）を用いて以下の手順で行った。９６穴マイクロプレートに、Ｕ９３７細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整した。サンプルを添加し、２４時間培養した後、ＷＳＴ−８溶液（５ｍｍｏｌ／μＬ）を１０μＬ添加した。さらに２時間培養した後、マイクロプレートリーダーを用いた吸光度法（Ａｂｓ４９０ｎｍ）により細胞数の測定を行った。
【００２２】
その結果、図３に示すように、トリプトフォール誘導体は正常白血球細胞に対するよりもＵ９３７細胞に対する方が有意に強い細胞毒性を発揮した。また、トリプトフォール誘導体は正常白血球細胞にアポトーシスを誘導しなかった。
【００２３】
これらの結果は、トリプトフォール誘導体がガン細胞に選択的に毒性を発揮することを示すものである。
【実施例２】
【００２４】
焼酎粕に等量の酢酸エチルを添加し、シェーカーにより振とうした。以下、同様の操作を２回繰り返し、酢酸エチル層の溶媒を減圧乾燥により除き、乾燥物を５０％メタノール水溶液に溶解し、フィルターろ過後、ＨＰＬＣ用サンプルとした。
【００２５】
ＨＰＬＣの条件はすべて実施例１に準ずる。検出された５画分を分取し、それぞれのアポトーシス誘導試験を行った。ＤＮＡ断片化試験および細胞毒性試験は実施例１に準ずる。図４に示すように、焼酎粕の酢酸エチル抽出物をＨＰＬＣで分離し、全ピーク画分を用いてアポトーシス誘導試験を行ったところ、全５画分のうち画分Ｎｏ．５（７４分）が４０および８０μｇ／ｍＬの濃度でＤＮＡの断片化を起こした（図２）。
【００２６】
画分Ｎｏ．５の構造解析（ＮＭＲ，ＭＳおよびＦＡＢ−ＭＳ解析）を行ったところ、分子量４０２のトリプトフォールの誘導体であった。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】大豆煮汁醸造酢をＨＰＬＣで分画した結果を示す図である。
【図２】単離したトリプトフォール誘導体のＤＮＡ断片化試験の結果を示す図である。
【図３】トリプトフォール誘導体の正常白血球細胞およびＵ９３７細胞に対する細胞毒性試験の結果を示す図である。
【図４】焼酎粕をＨＰＬＣで分画した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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