(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面のＰ−セレクチン糖タンパク質１（ＰＳＧＬ−１）に結合する化合物は、Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞の枯渇、アポプトシスを誘導する。本発明の化合物及び方法は、自己免疫疾患、移植拒絶、アレルギー疾患の制御を提供。【解決手段】過剰な若しくは望ましくないＴ細胞が介在する免疫応答の特徴を有する症状を有するまたはこのような症状になる危険性があると診断される個体を選択し；およびＴ細胞の表面上のＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）への化合物の結合はＴ細胞を死亡させるシグナル伝達経路を誘導するものである、Ｔ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１に結合する化合物を、該個体に投与することにより、該個体でＴ細胞が介在する免疫応答を防止または抑制することを有する、個体におけるＴ細胞が介在する免疫応答の防止または抑制方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
過剰な若しくは望ましくないＴ細胞が介在する免疫応答の特徴を有する症状を有するまたはこのような症状になる危険性があると診断される個体を選択し；および
Ｔ細胞の表面上のＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）への化合物の結合はＴ細胞を死亡させるシグナル伝達経路を誘導するものである、Ｔ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１に結合する化合物を、該個体に投与することにより、該個体でＴ細胞が介在する免疫応答を防止または抑制することを有する、個体におけるＴ細胞が介在する免疫応答の防止または抑制方法。
【請求項２】
該化合物は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合する抗体またはこの抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該化合物は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
モノクローナル抗体に結合し、Ｔ細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘導する物質を投与することをさらに有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該方法は、Ｔ細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘導することを有し、該架橋はＴ細胞を死亡させるシグナル伝達経路を誘導するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
自己免疫疾患を有すると診断される個体を選択することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
同種または異種移植を受けたまたは受けることが予想される個体を選択することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アレルギー疾患を有すると診断される個体を選択することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｔ細胞癌を有すると診断される個体を選択することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該Ｔ細胞は活性化Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該方法は、化合物の投与前に個体から採取した第１の生体試料におけるＴ細胞の数を検出し、化合物の投与後の該個体から採取した第２の生体試料におけるＴ細胞の数と結果を比較することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該方法は、化合物の投与前に個体から採取した第１の生体試料におけるＴ細胞の生物学的活性を検出し、化合物の投与後の該個体から採取した第２の生体試料におけるＴ細胞の生物学的活性と結果を比較することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
投与により、個体の末梢血のＣＤ３＋細胞の少なくとも２０％を減損する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
抗体またはその抗原結合断片は、抗体またはその抗原結合断片に暴露した後に個体の末梢血のＣＤ３＋細胞の少なくとも２０％の死亡を誘導するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
細胞表面上でＰＳＧＬ−１を発現するＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を提供し；および
Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１への化合物の結合はＴ細胞またはＮＫ細胞を死亡させるシグナル伝達経路を誘導するものである、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１に結合する化合物と、該Ｔ細胞またはＮＫ細胞を接触させることを有する、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の死亡の誘導方法。
【請求項１８】
該化合物は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合する抗体またはこの抗原結合断片である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該化合物は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
モノクローナル抗体に結合し、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘導する物質とモノクローナル抗体を接触させることをさらに有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該方法は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘導することを有し、該架橋はＴ細胞またはＮＫ細胞を死亡させるシグナル伝達経路を誘導するものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
該Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
該Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
該Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
該方法は、化合物との接触後にＴ細胞またはＮＫ細胞の生存率を評価することを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
該方法は、化合物との接触後にＴ細胞またはＮＫ細胞の生物学的活性を評価することを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
細胞表面上でＰＳＧＬ−１を発現する細胞を提供し；
該細胞を試験物質と接触させ；および
細胞を試験物質と接触させた後の細胞の生存率を測定することにより、該試験物質がＰＳＧＬ−１機能のモジュレーターであるかどうかを決定することを有する、ＰＳＧＬ−１機能のモジュレーターに関するスクリーニング方法。
【請求項２８】
該試験物質によって誘導される細胞の死を検出することにより、該試験物質がＰＳＧＬ−１機能のモジュレーターであることを決定することをさらに有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該試験物質は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合する抗体またはこの抗原結合断片である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該化合物は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
モノクローナル抗体を、該モノクローナル抗体に結合し、Ｔ細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘導する物質と接触させることをさらに有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該方法は、細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘導することを有し、該架橋はＴ細胞を死亡させるシグナル伝達経路を誘導するものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
該Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
該Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
該Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
大量の試験物質を製造し、該試験物質を製薬上許容できる担体中に配合することをさらに有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
Ｔ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１への化合物の結合はＴ細胞を死亡させるシグナル伝達経路を誘導するものである、Ｔ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１に結合する化合物；および
自己免疫性、移植拒絶、アレルギー症状、またはＴ細胞癌を処置するための化合物の使用に関するインストラクションを有するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００１年８月３日に提出された、米国仮出願第６０／３１０，１９６号の優先権を主張するものであり、この内容は参考によって本明細書中に引用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、免疫応答を制御するための組成物及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
望ましくない免疫応答の制御は、自己免疫疾患、移植拒絶、アレルギー疾患、及びある種の癌などの病気の処置において重要な問題である。過度に攻撃的なＴ細胞の活性は、免疫抑制によってまたは免疫トレランスの誘導によって制御されうる。トレランスは、免疫系が抗原に対して応答しなくなる状態として規定されるが、抗原に対する免疫応答を抑制する免疫抑制は、一般的に、薬剤の継続使用を必要とする。器官の移植では、Ｔ細胞は、アロ抗原に対する免疫応答において不可欠な役割を果たす。現在の免疫抑制レジメは、一般的に、Ｔ細胞の重要な増殖因子である、ＩＬ−２の転写を遮断する、またはＩＬ−２に依存する増殖を阻害する、コルチコステロイド、シクロスポリンまたはラパマイシン(rapamycin)の使用を含む。しかしながら、Ｔ細胞枯渇剤（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）として、またはサイトカインシグナル伝達(signaling)若しくはＴ細胞の共刺激(co-stimulatory)経路の阻害剤（例えば、ＣＤ２５、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ１５２、ＣＴＬＡ４）としてのいずれかで作用する多くのモノクローナル抗体は、副作用または毒性を制限して拒絶の発生を抑制するのに有効であることが示された。これらの薬剤によっては、自己免疫疾患を処置するのにおよび移植片生着を長期化するのにある程度成功していることが示された。
【０００４】
アポプトシスは、免疫系の適当な機能及び望ましくない細胞を除去する主要な機構を維持するのに極めて重要であると、広く考えられている(Kabelitz et al. Immunol. Today 14:338-340 (1993); Raff, Nature:356:397-399 (1992))。細胞の内側または外側から派生する様々なシグナルは、細胞の生存及び死に影響を与える。Ｆａｓ（またはＣＤ９５、ＭＷ＝４３ｋＤ）、ＴＮＦＲ２（ＭＷ＝７５ｋＤ）、ＣＤ２（ＭＷ＝４５ｋＤ）及びＣＴＬＡ−４（ＭＷ＝３３ｋＤ）等のＴ細胞表面分子に対する抗体は、Ｔ細胞のアポプトシスを誘導する(Osborne, Curr. Opin. Immunol. 8:245-248 (1996); Lin et al. J. Immunol. 158:598-603 (1997); Zhang et al. Nature:377:348-350 (1995); Lai et al. Eur. J. Immunol. 25:3243-3248 (1995); Mollereau et al. J. Immunol. 156:3184-3190 (1996); Gribben et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:811-815 (1995))。望ましくないＴ細胞を制御するためにＦａｓ及びＴＮＦＲ２分子を使用しようとする試みは、これら２分子が免疫細胞でのみならず、肝臓等の幾つかの他の重要な器官系でも発現するという事実によって妨げられた。この発現パターンは、潜在的に、これらの２抗体の治療用途を制限する(Ogasawara et al. Nature 364:806-809 (1993); Pfeffer et al. Cell:73:457-467 (1993); Engelmann et al. J. Biological Chemistry 265:14497-14504 (1990))。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
本発明は、Ｔ細胞がＴ細胞表面抗原であるＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）のエンゲージメントによって枯渇されうるおよび／またはアポプトシスを受けるのを誘導されうるという知見に基づくものである。Ｔ細胞の枯渇(depletion)は、過剰な若しくは望ましくないＴ細胞が介在する免疫応答または過剰な若しくは望ましくないＴ細胞の増殖に関連する症状の処置に特に有効でありうる。例えば、Ｔ細胞の枯渇は、自己免疫疾患、移植拒絶、アレルギー疾患、および／またはＴ細胞で誘導される癌(T cell-derived cancer)に関連する望ましくないＴ細胞の活性または増殖の抑制または排除を生じうる。本発明は、Ｔ細胞が介在する免疫応答を防止または抑制するためのＰＳＧＬ−１機能のモジュレーターの使用方法さらにはＰＳＧＬ−１機能のモジュレーターに関するスクリーニング方法を包含する。
【０００６】
一態様においては、本発明は、個体のＴ細胞が介在する免疫応答の防止または抑制方法を特徴とする。本方法は、以下の段階を含む：過剰な若しくは望ましくないＴ細胞が介在する免疫応答の特徴を有する症状を有するとまたはこのような症状になる危険性があると診断される個体を選択し；およびＴ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１への化合物の結合がＴ細胞を死亡させるシグナル伝達経路を誘導するものである、Ｔ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１に結合する化合物を、個体に投与することにより、個体におけるＴ細胞が介在する免疫応答を防止または抑制する。
【０００７】
このような方法に使用される化合物としては、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合する抗体またはこの抗原結合断片がありうる。一例では、化合物は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体である。一実施態様においては、本方法は、モノクローナル抗体に結合し、Ｔ細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘導する物質を投与するさらなる段階を含む。
【０００８】
一実施態様においては、本方法は、架橋がＴ細胞を死亡させるシグナル伝達経路を誘導する、Ｔ細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘導することを含む。
【０００９】
一例では、本方法は、自己免疫疾患を有すると診断される個体を選択する段階を含む。他の例では、本方法は、同種または異種移植を受けたまたは受けることが予想される個体を選択する段階を含む。他の例では、本方法は、アレルギー疾患を有すると診断される個体を選択する段階を含む。他の例では、本方法は、Ｔ細胞癌を有すると診断される個体を選択する段階を含む。
【００１０】
一実施態様においては、Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞である。一例では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞である。他の例では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【００１１】
一実施態様においては、本方法は、化合物の投与前に個体から採取した第１の生体試料におけるＴ細胞の数を検出し、化合物の投与後の個体から採取した第２の生体試料におけるＴ細胞の数と結果を比較する段階を有する。
【００１２】
他の実施態様においては、本方法は、化合物の投与前に個体から採取した第１の生体試料におけるＴ細胞の生物学的活性を検出し、化合物の投与後の個体から採取した第２の生体試料におけるＴ細胞の生物学的活性と結果を比較する段階を有する。
【００１３】
一実施態様においては、投与により、個体の末梢血のＣＤ３＋細胞の少なくとも２０％を減損する。実施態様によっては、投与により、個体の末梢血のＣＤ３＋細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、またはそれ以上を減損する。
【００１４】
一実施態様においては、抗体またはその抗原結合断片は、抗体またはその抗原結合断片に暴露した後に個体の末梢血のＣＤ３＋細胞の少なくとも２０％の死亡を誘導するものである。実施態様によっては、このような投与は、個体の末梢血のＣＤ３＋細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、またはそれ以上の死亡を誘導するものである。細胞の死は、抗体またはその抗原結合断片に暴露された後、いずれの時間、例えば、１、２、３、４、５、６、７日、またはそれ以上の日数で測定されてもよい。
【００１５】
他の態様においては、本発明は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の死の誘導方法を特徴とする。本方法は、以下の段階を含む：細胞表面上でＰＳＧＬ−１を発現するＴ細胞またはＮＫ細胞を提供し；およびＴ細胞またはＮＫ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１への化合物の結合がＴ細胞またはＮＫ細胞を死亡させるシグナル伝達経路を誘導するものである、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１に結合する化合物と、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を接触させる。
【００１６】
このような方法に使用される化合物としては、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合する抗体またはこの抗原結合断片がありうる。一例では、化合物は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体である。一実施態様においては、本方法は、モノクローナル抗体に結合し、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘導する物質とモノクローナル抗体を接触させる段階を含む。
【００１７】
一実施態様においては、本方法は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘導することを有し、該架橋はＴ細胞またはＮＫ細胞を死亡させるシグナル伝達経路を誘導する段階を包含する。
【００１８】
一実施態様においては、Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞である。一例では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞である。他の例では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【００１９】
一実施態様においては、本方法は、化合物との接触後にＴ細胞またはＮＫ細胞の生存率を評価する段階を包含する。
【００２０】
一実施態様においては、本方法は、化合物との接触後にＴ細胞またはＮＫ細胞の生物学的活性を評価する段階を包含する。
【００２１】
他の態様においては、本発明は、ＰＳＧＬ−１機能のモジュレーターに関するスクリーニング方法を特徴とする。本方法は、以下の段階を含む：細胞表面上でＰＳＧＬ−１を発現する細胞を提供し；細胞を試験物質と接触させ；および細胞を試験物質と接触させた後の細胞の生存率を測定することにより、試験物質がＰＳＧＬ−１機能のモジュレーターであるかどうかを決定する。
【００２２】
一実施態様においては、本方法は、試験物質によって誘導される細胞の死を検出することにより、試験物質がＰＳＧＬ−１機能のモジュレーターであることを決定する段階を包含する。
【００２３】
一実施態様においては、試験物質は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合する抗体またはこの抗原結合断片である。一例では、試験物質は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体である。一実施態様においては、本方法は、モノクローナル抗体を、モノクローナル抗体に結合し、細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘導する物質と接触させる段階を包含する。
【００２４】
一実施態様においては、本方法は、細胞の表面上の複数のＰＳＧＬ−１抗原の架橋を誘導することを有し、架橋はＴ細胞を死亡させるシグナル伝達経路を誘導する段階を包含する。
【００２５】
一実施態様においては、Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞である。一例では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞である。他の例では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【００２６】
一実施態様においては、本方法は、大量の試験物質を製造し、該試験物質を製薬上許容できる担体中に配合する段階を含む。
【００２７】
他の態様においては、本発明は、Ｔ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１への化合物の結合はＴ細胞を死亡させるシグナル伝達経路を誘導するものである、Ｔ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１に結合する化合物；および自己免疫性、移植拒絶、アレルギー症状、またはＴ細胞癌を処置するための化合物の使用に関するインストラクションを有するキットを特徴とする。他の実施態様においては、上記キットは、本明細書中に記載される病気または疾患を処置するための化合物の使用に関するインストラクションを有する。
【００２８】
本発明の利点としては、関連する望ましくないまたは有害な免疫応答を引き起こすことなくＴ細胞を枯渇および／またはＴ細胞のアポプトシスを誘導できることがある。例えば、個体への抗ＰＳＧＬ−１抗体の投与によって、ＩＬ−２またはＴＮＦ−Ｅ等の炎症性サイトカインのレベルの望ましくない上昇は起こらない。
【００２９】
本発明の他の利点としては、その発現が白血球、および特にＴ細胞及びＮＫ細胞にかなり限定される、細胞表面タンパク質、ＰＳＧＬ−１の標的化が可能であることがある。したがって、本明細書中に記載される化合物は、肝臓細胞等の他の細胞型の有意なレベルのアポプトシスを誘導しない。生存を脅かす全身性サイトカイン応答を有意に誘導したりまた他の器官系に損傷を与えたりすることなく、選択的な枯渇を目的としたＴ細胞及びＮＫ細胞（移植拒絶にかかわる重要なＣＤ３−細胞型）の標的化は、免疫抑制剤の望ましい特性である。
【００３０】
特記しない限り、本明細書中で使用される技術的及び科学用語はすべて、本発明が属する分野における通常の知識を有するものによって一般的に理解されるのと同様の意味を有する。本明細書中に記載されるのと同様のまたは等価の方法及び材料が本発明の実施または試験で使用できるが、適当な方法及び材料を以下に説明する。本明細書中に記載されるすべての公報、特許出願、及び他の参考文献は、参考によって完全に本明細書中に引用される。専門用語の不一致がある場合には、本明細書が制御するであろう。加えて、記載される材料及び方法は、詳細に説明するのみであり、本発明を制限するものではない。
【００３１】
本発明の他の態様及び利点は、下記詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【００３２】
図面の簡単な説明
図１は、いつ活性化Ｔ細胞がＴＡＢ４（抗ＴＡＩＰモノクローナル抗体）が介在するアポプトシスシグナルに対する感受性を得るかを調べた経時的な実験の代表的結果を示すものである。
【００３３】
図２は、ＴＡＢ４抗体によって認識される抗原の細胞表面のビオチン化及び免疫沈降の結果を示すものである。
【００３４】
図３は、脾臓ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞、及びＮＫ細胞でのＰＳＧＬ−１抗原の発現を示すものである。
【００３５】
図４は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＤ４＋８＋、及びＣＤ４−８−胸腺細胞でのＰＳＧＬ−１抗原の発現を示すものである。
【００３６】
図５は、レスポンダー(responder)としてのＴＡＢ４（またはハムスターＩｇ）で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスから単離された脾臓細胞およびスティミュレーター(stimulator)としてのＨ２ミスマッチＣ３Ｈ脾臓細胞を用いた混合リンパ球培養で生産されたＩＬ−２レベルを示すものである。
【００３７】
図６は、（Ａ）ＴＡＢ４抗体で免疫沈降したタンパク質が市販の抗ＰＳＧＬ−１抗体によって認識できることおよび（Ｂ）抗ＰＳＧＬ−１抗体でＴ細胞溶解産物を予め透徹(preclearing)することによって、ＴＡＢ４によって認識されたタンパク質を枯渇できることを示すウェスタンブロット分析を示すものである。
【００３８】
図７は、Ｂａｌｂ／ｃマウスから皮膚移植を受け、抗ＰＳＧＬ−１抗体（黒塗りのダイアモンド）またはコントロール抗体（白抜きの四角）で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスでの生存した移植片の割合（％）を示すものである。
【００３９】
図８は、活性化ヒト末梢血の単核細胞を抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体で処置した後のアポプトシスを受けたＴ細胞の割合（％）の経時変化を示すものである。
【００４０】
図９は、抗ＰＳＧＬ−１抗体（黒塗りの四角）またはコントロール抗体（白抜きの四角）で処置された自己免疫性肥満でない糖尿病(autoimmune non-obese diabetic)（ＮＯＤ）オスマウスの糖尿病の発症率を示すものである。
【００４１】
詳細な説明
本発明は、Ｔ細胞の表面上にあるＰＳＧＬ−１分子の機能を調節することによるＴ細胞活性の調節方法に関するものである。本明細書に記載される組成物でＰＳＧＬ−１をエンゲージメントすると、Ｔ細胞を枯渇するおよび／またはＴ細胞がアポプトシスを受けるのを誘導することができる。したがって、これらの化合物は、自己免疫疾患、移植拒絶、アレルギー症状、および／またはＴ細胞が誘導する癌等の免疫が関連する症状を制御するための治療剤として有用である。これらの組成物はまた、Ｔ細胞の存在または活性が望ましくない生体試料からＴ細胞を枯渇させるのにも有用である。
【００４２】
ＰＳＧＬ−１タンパク質
ＰＳＧＬ−１は、好中球、Ｔ及びＢリンパ球、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、及び原始ヒトＣＤ３４造血前駆細胞で発現する細胞表面付着分子である。セクレチンと相互作用できることにより、ＰＳＧＬ−１は、内皮での白血球の回転(rolling)及び炎症組織への白血球の溢出を仲介する。Ｔ細胞のＥ−及びＰ−セクレチンへのＰＳＧＬ−１が仲介する結合、または移動は、異なるように調節される。例えば、ＣＬＡ（皮膚リンパ球抗原）エピトープの出現は、記憶の移行(memory transition)に未経験である(naive)Ｔ細胞上で誘導されると考えられる。活性化ヘルパー１のみでなくヘルパー２Ｔ細胞も機能性ＰＳＧＬ−１を発現して、皮膚の炎症領域への移動が可能になる。
【００４３】
ＰＳＧＬ−１は、特異的にシアリル化され、フコシル化され、さらに硫酸化されてＰ−セレクチンに結合しなければならないシアロムチンである。ＰＳＧＬ−１分子は、そのＮ末端でのグリコシル化及び硫酸化部位の異なる度合いという特徴を有するイソ型で存在する。休止抹消血Ｔ及びＢ細胞、リンパ細胞系およびインビトロの活性化抹消血Ｔ細胞は、同様のレベルのＰＳＧＬ−１を発現する。しかし、活性化Ｔ細胞のみが機能性形態のＰＳＧＬ−１を示して、Ｐ−セレクチンに貪欲に結合する。このような活性化依存性結合活性は、活性化Ｔ細胞でのアルファ（１，３）フコシルトランスフェラーゼ活性レベルの上昇によって示唆されるように、異なる翻訳後修飾の結果であると考えられる。ＰＳＧＬ−１イソ型はまた、Ｌ−セクレチン及びＥ−セクレチンへの異なる親和性を示す。例えば、ＣＬＡ陽性イソ型を示すヒトＴ細胞はＥ−及びＰ−セクレチン双方でつないで(tether)回転できるが、ＣＬＡエピトープのないＰＳＧＬ−１を発現するＴ細胞はＰ−セレクチンにのみ結合する。さらに、Ｐ−セレクチンへのＰＳＧＬ−１の結合は、硫酸化のための３つのチロシン残基及びグリコシル化のための１つのトレオニン残基を含む末端デカペプチドの存在に左右される。
【００４４】
ＰＳＧＬ−１タンパク質は、組み換え方法によっておよび／または生体材料からの天然のＰＳＧＬ−１タンパク質を単離することによって調製できる。組み換えＰＳＧＬ−１タンパク質は、インビトロまたはインビボのいずれかで、原核または真核細胞で生産されうる。ＰＳＧＬ−１をコード化する核酸は、タンパク質の組み換え生産で使用できる（例えば、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドをコード化する核酸の一例としてＧｅｎＢａｎｋo 受託番号ＮＭ＿００３００６を参照）。ＰＳＧＬ−１に対する抗体はまた既知であり、抗原の精製に使用できる（例えば、Herron et al. (2000) Science Jun 2;288(5471):1653-56; WO 00/25808を参照）および／または本明細書に記載される方法に使用できる。ＰＳＧＬ−１はさらに、以下に制限されないがSako et al. (1993) Cell 75:1179; Vachino et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:21966; 及びVeldman et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:16470などの参考文献に記載される。
【００４５】
ＰＳＧＬ−１の組み換え生産では、ＰＳＧＬ−１及びその修飾アルファ−（１，３）フコシルトランスフェラーゼ、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ、双方の同時発現が、ＰＳＧＬ−１の機能発現には必要であるかもしれない。加えてまたはこれに代わり、ＰＳＧＬ−１の組み換え生産は、プロペプチドを除去するためのＰＡＣＥをコード化する核酸および／またはチロシンスルホトランスフェラーゼをコード化する核酸との同時トランスフェクション(co-transfection)を伴うかもしれない。
【００４６】
抗ＰＳＧＬ−１抗体は、生体材料からＰＳＧＬ−１抗原を単離、精製するのに使用できる。ＰＳＧＬ−１タンパク質を発現する細胞型、例えば、個体由来のＴ細胞またはＴ細胞系が、タンパク質源として使用されてもよい。精製されたら、タンパク質は、本明細書に記載される様々な方法に使用されうる。例えば、精製ＰＳＧＬ−１タンパク質は、Ｔ細胞でのＰＳＧＬ−１機能のモジュレーターのインビトロスクリーニングにまたはそのタンパク質に対する抗体を調製するための免疫原として使用できる。
【００４７】
加えて、ＰＳＧＬ−１抗原は、セクレチン−Ｆｃ融合、例えば、Ｐ−セクレチン−Ｆｃ融合を用いて精製できる。
【００４８】
抗ＰＳＧＬ−１抗体
ＰＳＧＬ−１ポリペプチド（またはその免疫原性断片または類似体）は、本発明の方法に有用な抗体を生じるのに使用できる。上記したように、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドまたはそのペプチド断片は、組み換え技術によって生産できるまたは固相合成方法を用いて合成できる。組み換えＰＳＧＬ−１ポリペプチドまたはそのペプチド断片は、抗ＰＳＧＬ−１抗体を生産するための免疫原として使用できる。加えて、ＴＡＢ４モノクローナル抗体等の、抗ＰＳＧＬ−１抗体は、ＰＳＧＬ−１ポリペプチド、例えば、天然の立体配置のＰＳＧＬ−１ポリペプチドを精製するのに使用でき、これは次にさらなる抗ＰＳＧＬ−１抗体を生産するための免疫原として使用できる。
【００４９】
本発明の抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、またはＰＳＧＬ−１ポリペプチドに特異的に結合する操作された抗体であってもよい。特定の抗原、例えば、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドに「特異的に結合する」抗体は、サンプル中の他の分子を実質的に認識または結合しないであろう。ゆえに、本発明はまた、ポリペプチドを試験化合物と接触させて、（結合の直接的な検出、ポリペプチドへの試験化合物の結合を阻害する競合分子の検出、および／またはアポプトシス誘導活性に関するアッセイを用いた結合の検出によって）ポリペプチドが試験化合物に結合するかどうかを決定することによって本発明のポリペプチドに結合する試験化合物（例えば、抗体）を同定する方法を特徴とするものである。
【００５０】
通常、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドは、ＫＬＨ等の、キャリアタンパク質にカップリングさせ、アジュバントと混合されて、宿主哺乳動物に注射されうる。次に、その動物中で生産された抗体は、ペプチド抗原アフィニティークロマトグラフィーによって精製されうる。
【００５１】
特に、様々な宿主動物が、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドまたはその抗原性断片の注射によって免疫処置されうる。一般的に使用される宿主動物としては、ウサギ、マウス、モルモット、及びラットがある。免疫学的な応答を上昇させるのに使用できる様々なアジュバントは、宿主の種によって異なるが、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウム等の無機質ゲル、リゾレシチン等の界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールが挙げられる。潜在的に有用であるヒトのアジュバントとしては、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム−パルヴムがある。ポリクローナル抗体は、免疫処置された動物の血清中に含まれる抗体分子の異種集団である。
【００５２】
したがって、本発明に包含される抗体は、ポリクローナル抗体、さらにはモノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及びＦａｂ発現ライブラリーを用いて生産された分子を包含する。
【００５３】
特定の抗原に対する抗体の同種集団である、モノクローナル抗体は、上記したＰＳＧＬ−１ポリペプチドおよび標準的なハイブリドーマ技術（例えば、Kohler et al., Nature 256:495 [1975]; Kohler et al., Eur J Immunol 6:511 [1976]; Kohler et al., Eur J Immunol 6:292 [1976]; Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y. [1981]を参照）を用いて調製できる。
【００５４】
特に、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)、及び米国特許第４，３７６，１１０号に記載されるなどの培養物での連続細胞系による抗体分子の生産を提供するいずれかの技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al., Immunology Today 4:72 [1983]; Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 [1983])、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 [1983])によって得られる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ等のいずれかの免疫グロブリンクラスおよびこれらのサブクラスなどを有していてもよい。本発明のｍＡｂを生産するハイブリドーマは、インビトロでまたはインビボで培養されてもよい。インビボで高力価のｍＡｂを生産できることは、特に有用な生産方法である。
【００５５】
生産されると、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、ウェスタンブロットまたは例えば、Ausubel et al、上記に記載されるような、標準的な方法による免疫沈降分析による特異的ＰＳＧＬ−１認識について試験される。ＰＳＧＬ−１を特異的に認識し、これに特異的に結合する抗体が本発明で有用である。Ｔ細胞、例えば、ＣＤ３＋細胞の表面のＰＳＧＬ−１抗原に結合し、個体でのＴ細胞の枯渇および／またはアポプトシスを誘導する抗ＰＳＧＬ−１抗体が特に有用である。
【００５６】
抗体は、例えば、（例えば、自己免疫疾患、移植拒絶、アレルギー疾患、及びＴ細胞で誘導される癌等の症状に関連した、Ｔ細胞が介在する免疫応答等の、望ましくない免疫応答を抑制するまたは排除するための）治療レジメの一部として、使用されうる。抗体はまた、候補化合物のＰＳＧＬ−１への結合能を測定するためのスクリーニングアッセイにも使用されうる。
【００５７】
加えて、適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と共に適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の生産を目的として開発された技術(Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 [1984]; Neuberger et al., Nature 312:604 [1984]; Takeda et al., Nature 314:452 [1984])が使用できる。キメラ抗体は、マウスのモノクローナル抗体由来の可変領域及びヒトの免疫グロブリン定常領域を有するものなどの、異なる部分が異なる動物種由来である分子である。
【００５８】
または、単鎖抗体の生産を目的として記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号、第４，９４６，７７８号、及び第４，７０４，６９２号）を用いて、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドに対する単鎖抗体、またはその断片を生産するのに適用してもよい。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重及び軽鎖を連結して、単鎖のポリペプチドを得ることによって形成される。
【００５９】
特定のエピトープを認識し、これに結合する抗体断片は、既知の技術によって得られる。例えば、このような断片としては、以下に制限されないが、抗体分子のペプシン消化によって生産されうるＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって得られるＦａｂ断片がある。または、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築してもよい(Huse et al., Science 246:1275 [1989])。
【００６０】
抗体は、当該分野において既知の方法によってヒト化されてもよい。例えば、所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体を商業的にヒト化してもよい(Scotgene, Scotland; Oxford Molecular, Palo Alto, Calif.)。形質転換動物で発現するものなどの、十分なヒト抗体もまた本発明の態様である（Green et al., Nature Genetics 7:13 [1994]; 及び米国特許第５，５４５，８０６号及び第５，５６９，８２５号）。
【００６１】
ＰＳＧＬ−１機能を調節する化合物に関するスクリーニングアッセイ
本発明はまた、以下に制限されないが、ＰＳＧＬ−１への結合する際にＴ細胞の枯渇および／またはＴ細胞のアポプトシスを誘導する化合物などの、ＰＳＧＬ−１（またはＰＳＧＬ−１のドメイン）と相互作用する化合物を同定する方法をも包含する。ＰＳＧＬ−１活性を調節する膜内外、細胞外、または細胞内タンパク質とのＰＳＧＬ−１の相互作用を調節する化合物およびＰＳＧＬ−１活性を調節する化合物もまた包含される。
【００６２】
本発明にしたがってスクリーニングされる化合物としては、以下に制限されないが、本明細書に記載されるように、ＰＳＧＬ−１に結合して、ＰＳＧＬ−１が介在する生物学的機能を調節するペプチド、抗体及びこれの断片、ならびに他の有機化合物が挙げられる。
【００６３】
このような化合物としては、以下に制限されないが、例えば、以下に制限されないが、ランダムペプチドライブラリーのもの；(Lam et al., Nature 354:82 [1991]; Houghten et al., Nature 354:84 [1991])等の、可溶性ペプチド、およびＤ−および／またはＬ−体のアミノ酸から作製されるコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリー、ホスホペプチド（以下に制限されないが、ランダムまたは部分的に変性した定方向ホスホペプチドライブラリー(random or partially degenerate, directed phosphopeptide libraries)を含む；Songyang et al., Cell 72:767 [1993]）などの、ペプチド、抗体（以下に制限されないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプの、キメラまたは単鎖抗体、ならびにＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦＡｂ発現ライブラリー断片、ならびにこれらのエピトープ結合断片を含む）、ならびに有機または無機小分子が挙げられる。
【００６４】
本発明にしたがってスクリーニングされうる他の分子としては、以下に制限されないが、本明細書に記載されるように、ＰＳＧＬ−１タンパク質の活性に影響を与える有機小分子がある。
【００６５】
コンピュータモデリング及び探索技術によって、ＰＳＧＬ−１発現または活性を調節できる、化合物を同定できる、または既に同定された化合物を改善できる。このような化合物または組成物が同定されたら、活性部位または領域が同定される。このような活性部位は、具体的には、活性の天然のモジュレーターに対する結合部位であってもよい。活性部位は、例えば、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、または関連する化合物または組成物のその天然のリガンドとの複合体の研究からなどの、当該分野において既知な方法を用いて同定できる。後者の場合では、化学的またはＸ線結晶方法が、その因子上のどこにモジュレーター（またはリガンド）が見出されるかを知得することによって活性部位を見出すのに使用できる。
【００６６】
結合を変更する化合物の設計及び生成を参照しながら上記してきたが、ＰＳＧＬ−１タンパク質に結合して、Ｔ細胞の枯渇を引き起こすおよび／またはＴ細胞のアポプトシスを誘導する化合物に関して、天然産物または合成化学物質、及びタンパク質等の生物学的に活性のある材料などの、既知の化合物のライブラリーをスクリーニングしてもよい。
【００６７】
インビトロ系が、ＰＳＧＬ−１（またはＰＳＧＬ−１のドメイン）と相互作用することができる化合物を同定するために設計されてもよい。同定される化合物は、例えば、本明細書に記載されるようにＴ細胞活性を調節するのに有用であり、ゆえに、自己免疫疾患、移植拒絶、アレルギー疾患、及びＴ細胞で誘導される癌等の症状の処置に有用である。
【００６８】
ＰＳＧＬ−１に結合する化合物を同定するのに使用されるアッセイの原則は、２成分が相互作用して結合するのに、ゆえに反応混合物中で除去および／または検出されうる複合体を形成するのに十分な条件下および時間、ＰＳＧＬ−１（またはＰＳＧＬ−１のドメイン）及び試験化合物の反応混合物を調製することを包含する。使用されるＰＳＧＬ−１種は、スクリーニングアッセイの目標によって異なる。場合によっては、アッセイ系（例えば、得られた複合体の標識、単離など）で利点が得られる異種タンパク質またはポリペプチドに融合するＰＳＧＬ−１のドメインに相当するペプチドを使用することが好ましく、利用できる。
【００６９】
スクリーニングアッセイは、様々なように行ないうる。例えば、このようなアッセイを行なう一つの方法としては、固相上にＰＳＧＬ−１タンパク質、ポリペプチド、ペプチド若しくは融合タンパク質または試験化合物を固着し、反応終了時に固相上に固着したＰＳＧＬ−１／試験化合物複合体を検出することがある。このような方法の一実施態様においては、ＰＳＧＬ−１反応物を、固体表面に固着させてもよく、固着しない、試験化合物を、直接的または間接的に、標識してもよい。
【００７０】
実際には、マイクロタイタープレートが、簡便に固相として使用されてもよい。固着した成分は、非共有または共有結合によって固定化されてもよい。非共有結合は、固体表面をタンパク質の溶液で簡単に被覆して、乾燥することによって達成されてもよい。または、固定化されるタンパク質に特異的な、固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いて、タンパク質を固体表面に固着させてもよい。表面は、予め調製され、貯蔵されていてもよい。
【００７１】
アッセイを行なうために、固定化されていない成分を、固着成分を含む被覆表面に添加する。反応が終了した後、未反応成分を、形成された複合体が固体表面で固定化され続けるような条件下で（例えば、洗浄によって）除去する。固体表面上に固着した複合体の検出は、数多くの方法で達成できる。前に固定化されていない成分が予め標識されている場合には、表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。前に固定化されていない成分が予め標識されていない場合には、間接的な標識を用いて；例えば、前に固定化されていない成分に特異的な標識抗体を用いて（さらに、この抗体は、直接標識されてもまたは標識された抗Ｉｇ抗体で間接的に標識されてもよい）、表面上に固着した複合体を検出できる。
【００７２】
または、反応を、液相で行なってもよく、反応産物を未反応成分から分離して、複合体を、例えば、溶液中に形成される複合体を固着するためにＰＳＧＬ−１タンパク質、ポリペプチド、ペプチド若しくは融合タンパク質または試験化合物に特異的な固定化抗体を、および固着した複合体を検出するために可能性のある複合体の他の成分に特異的な標識抗体を用いて、検出してもよい。
【００７３】
または、細胞によるアッセイを用いて、ＰＳＧＬ−１と相互作用する化合物を同定してもよい。この際には、ＰＳＧＬ−１を発現する細胞系、またはＰＳＧＬ−１を発現するように遺伝子操作された細胞系が使用できる。細胞によるアッセイは、本明細書に記載されるスクリーニングによって同定される化合物の機能的な効果を評価するのに特に有用である。例えば、化合物がＰＳＧＬ−１タンパク質への結合能に基づいて同定されたら、次にこの化合物について、例えば、インビトロ若しくはインビボのＴ細胞のアポプトシスの誘導能またはインビトロ若しくはインビボのＴ細胞の枯渇能を試験してもよい。
【００７４】
薬剤組成物
本発明の目的が個体の免疫応答を変更するものである場合には、例えば、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドに特異的に結合する抗体、小分子、または他の化合物を含む薬剤組成物がまた、本発明の態様である。好ましい例では、化合物がＰＳＧＬ−１のアゴニストとして機能する。
【００７５】
本発明にしたがって使用される薬剤組成物は、一以上の生理学的に許容できる担体または賦形剤を用いて公知の方法で配合されうる。ゆえに、化合物ならびにこれらの生理学上許容できる塩及び溶媒和化合物は、様々な投与経路による投与を目的として配合されてもよい。
【００７６】
化合物は、注射による、例えば、大量注射または連続輸注による、非経口投与を目的として配合されてもよい。注射用の配合物は、保存剤を添加して、単位服用形態(unit dosage form)で、例えば、アンプルでまたは複数投与用容器(multi-dose container)で提示されてもよい。組成物は、懸濁液、溶液または油性若しくは水性ベヒクルにおけるエマルジョン等の形態をとってもよく、懸濁、安定化および／または分散剤等の配合剤を含んでもよい。または、活性成分は、使用前に、適当なベヒクル、例えば、滅菌した発熱性物質なしの水で構成されるために粉末形態であってもよい。
【００７７】
Ｔ細胞が介在する免疫応答を制御するおよびＴ細胞集団を枯渇する方法
本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにおいて詳述されたものなどの化合物は、例えば、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドによって調節される生物学的な機能を調節するのにおよび／または過剰な若しくは望ましくない免疫応答、例えば、Ｔ細胞が介在する免疫応答に関連する疾患の処置に有用でありうる。これらの化合物としては、以下に制限されるものではないが、Ｔ細胞の表面上のＰＳＧＬ−１に結合し、Ｔ細胞の死を引き起こすシグナル伝達経路を誘導するペプチド、抗体及びこれの断片、ならびに他の有機化合物が挙げられる。本発明の方法は、必要であれば、細胞の表面のＰＳＧＬ−１の架橋を誘導する架橋剤を添加することを含む。本明細書に記載される化合物は、Ｔ細胞活性の枯渇または排除が望ましい場合に使用できる。本発明の化合物で処置されうる特に有用な症状としては、自己免疫疾患、移植拒絶、アレルギー疾患、及びＴ細胞で誘導される癌がある。
【００７８】
本明細書に記載される抗ＰＳＧＬ−１化合物で処置されうる症状としては、以下に制限されるものではないが、真性糖尿病、関節炎（リウマチ様関節炎、若年性関節リウマチ、骨関節炎、及び乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚性紅斑性狼瘡、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい反転反応(leprosy reversal reactions)、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感覚神経性聴力損失、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴェンズ−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、間質性肺線維症、移植片対宿主疾患、骨髄移植、肝臓移植またはいずれかの器官若しくは組織の移植等の移植の症例（同種または異種組織を用いた移植を含む）、アトピー性アレルギー等のアレルギー、ＡＩＤＳ、および白血病および／またはリンパ腫等のＴ細胞新生物が挙げられる。
【００７９】
本発明の方法は、インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞集団からＴ細胞を枯渇するのに使用できる。例えば、個体由来の生体試料から、このサンプルを、本明細書に記載される抗ＰＳＧＬ−１化合物と、さらに必要であれば架橋剤と共に、接触させることによって、インビトロでＴ細胞を枯渇することができる。本方法は、例えば、細胞集団中の非Ｔ細胞を強化させることによってさらには細胞集団からＴ細胞活性を減少するまたは排除することによって、有用でありうる。
【実施例】
【００８０】
下記は、本発明の実施例である。下記実施例は、本発明の概念を制限するものでないと解される。
【００８１】
実施例１：抗Ｔ細胞アポプトシス誘導タンパク質（「ＴＡＩＰ」）モノクローナル抗体の調製
ＴＡＩＰに特異的なモノクローナル抗体を、所望の抗体を分泌するハイブリドーマを生産するのにKohler and Milstein ((1976) European Journal of Immunology 6:511-519)の既知の細胞融合方法を適用することによって得た。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）活性化Ｂａｂ／ｃの脾臓Ｔ細胞を注射したハムスターからの抗体産生細胞を、ミエローマ細胞系と融合させて、抗体を分泌するハイブリドーマを形成した。これらの細胞の２集団は、ポリエチレングリコールで融合させ、得られた抗体産生細胞をクローニングして、標準的な組織培養方法によって増殖させた。これらの方法にしたがって得られた一つのハイブリドーマは、インビトロでＴ細胞のアポプトシスを誘導しかつインビボでＴ細胞を枯渇することができる、ＴＡＢ４と称する、モノクローナル抗体を分泌した。ＴＡＢ４によって認識されるタンパク質を、Ｔ細胞のアポプトシス誘導タンパク質（ＴＡＩＰ）と称した。
【００８２】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）及びＢＡＬＢ／ｃは、Jackson lab (Bar Harbor, ME)から購入した。シリアンハムスターは、Animal Core Facility, National Taiwan University Medical Collegeから購入した。
【００８３】
ＴＡＢ４ハイブリドーマの濃縮培養液上清を、２０，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を結合緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）で１：１の比で希釈した。プロテインＧカラム（約１ｍｌのベッドボリューム）を、３〜５ｍｌの結合緩衝液で３回洗浄した。透明な培養液上清をプロテインＧカラムにのせ、流動液を集め、カラムに再度のせた。カラムを６〜１０ｍｌの結合緩衝液で洗浄し、結合した抗体を５ｍｌの溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．８）でカラムから溶出させた。各画分は１ｍｌの溶出された抗体を含み、各１ｍｌの画分を５０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５と混合することによって、溶出画分を中性のｐＨに調節した。抗体を含む画分を溜め、各透析について３時間、２リットルのＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回透析した。抗体試料中のタンパク質濃度を、Bio-Rad Protein Assay (BIO-RAD, Hercules, CA)を用いてBradfordによって記載された方法で測定した。
【００８４】
実施例２：マウス脾臓細胞懸濁液の調製ならびにＴ細胞の活性化および強化
マウスの脾臓を、８ｍｌのハンクス液（ＨＢＳＳ）に浸漬し、滅菌したカバーガラスでゆるやかに細かく切り刻み、１５ｍｌの遠心管(Costar)に移し、さらに２００×ｇで５分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレットを、壁をゆるやかにたたくことによって残りの緩衝液に再懸濁した。混入した赤血球（ＲＢＣ）を、１ｍｌのＲＢＣ溶解緩衝液（０．６Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、０．１７Ｍ  Ｔｒｉｓ−ベース、ｐＨ  ７．６５）を添加することによって溶解した後、室温で２分間インキュベートし、９ｍｌのＨＢＳＳで迅速に急冷した。細胞を２００×ｇで５分間でペレット化し、２回洗浄して、ＲＰＩＭ培養液に再懸濁した。混合物中の細胞の濃度及び生存率を、血球計数器(Cambridge Scientific Inc.)及びトリパンブルー排除(Trypan blue exclusion）で測定した。
【００８５】
脾臓細胞を、ＲＰＩＭ培地で３×１０６／ｍｌの最終濃度になるように調節し、コンカナバリンＡを２μｇ／ｍｌの最終濃度になるように加えて、Ｔ細胞を活性化した。細胞懸濁液を、集める前に、６ウェルの培養プレート（５ｍｌ／ウェル）または１０ｃｍの培養皿（１０ｍｌ／皿）に移し、３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間インキュベートした。活性化Ｔ細胞を含む、活性化された脾臓細胞を、５ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁し、遠心管のパーコール溶液の５５％クッション５ｍｌの頂上に注意深くのせた。分離した層を乱さないように注意した。細胞を止めずに２５℃で１，９００×ｇで１３分間遠心した。強化された(enriched)Ｔ細胞を２層の界面から集め、ＨＢＳＳで２回洗浄し、実験用に用意した。
【００８６】
実施例３：活性化Ｔ細胞のアポプトシス
活性化Ｔ細胞（実施例２参照）を、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を含むＲＰＩＭ培地に５×１０５細胞／ｍｌの最終濃度になるように再懸濁し、表１に示される条件にしたがって、コントロールＩｇ、ＴＡＢ４、または抗ＣＤ３で処理した。
【００８７】
【表１】
2008260759.tif 000002
【００８８】
１８〜２４時間インキュベートした後、各培養物のアポプトシスの程度を７−ＡＡＤアポプトシスアッセイを用いて測定した。処理した細胞を、ＦＡＣＳ管(Falcon)に移し、氷冷したＦＡＣＳ溶液（ＰＢＳにおける１％ウシ胎児血清、０．０５％アジ化ナトリウム）で２回洗浄し、４℃で２００×ｇでペレット化した。細胞を、１〜２×１０７細胞／ｍｌの最終濃度になるように氷冷したＦＡＣＳ溶液に再懸濁した。染色するために、０．１ｍｌの再懸濁された細胞を、２μｇ／ｍｌの最終濃度で７−ＡＡＤと混合した後、暗所で４℃で２０分間インキュベートした。最後に、染色された細胞を氷冷したＦＡＣＳ溶液で２回洗浄し、０．５ｍｌのＦＡＣＳ溶液に再懸濁して、ＢＤ  ＬＳＲフローサイトメーター(Beckton Dickison)で分析した。
【００８９】
図１は、いつ活性化Ｔ細胞がＴＡＢ４（抗ＴＡＩＰ）が介在するアポプトシスシグナルに対する感受性を得るかを調べた経時的な実験の代表的結果を示すものである。マウスの脾細胞を、Ｃｏｎ−Ａで活性化し、ＩＬ−２含有培地に維持した。活性化Ｔ細胞を集め、再懸濁し、架橋体(cross-linker)としての抗ハムスターＩｇＧ抗体の存在下でＴＡＢ４モノクローナル抗体またはコントロールのハムスターＩｇＧで攻撃した。ＴＡＩＰ架橋が低レベル（６．５％）のアポプトシス細胞死を誘導できたことが１日目で明らかであった。しかしながら、ＴＡＢ４で誘導されたアポプトシスの程度は、２日目で１７％から増加し、４日で５２％でピークとなり、６日目には４４％にまで減少した。コントロールのハムスターＩｇＧは、ＩＬ−２のみを投与した培養物に比して、特異的なアポプトシスＴ細胞死を誘導しなかった。抗ＣＤ３（ポジティブコントロールとして）は、活性化してから４８時間後に３８％のＴ細胞のアポプトシスを誘導した（データ示さず）。
【００９０】
実施例４：異なる組織におけるＴＡＩＰ抗原の発現
細胞を氷冷したＦＡＣＳ溶液（ＰＢＳにおける１％ウシ胎児血清、０．０５％アジ化ナトリウム）で２回洗浄し、ＦＡＣＳ管(Falcon)で４℃で２００×ｇで遠心した。細胞を、１×１０７細胞／ｍｌの最終濃度になるように氷冷したＦＡＣＳ溶液に再懸濁し、ＦＡＣＳ管(Falcon)中の再懸濁した細胞の０．１ｍｌのアリコートを各アッセイに使用した。表面を染色するために、２μｇ／ｍｌの最終濃度でＴＡＢモノクローナル抗体またはコントロールのハムスターＩｇを細胞に添加し、混合物を暗所で４℃で３０分間インキュベートした。細胞を氷冷したＦＡＣＳ溶液で１回洗浄した後、（１）脾細胞では、１００μｌの氷冷したＦＡＣＳ溶液におけるサイクロム(cychrome)接合抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍｌ）、ＦＩＴＣ接合抗ハムスターＩｇ、及びＰＥ接合抗ＣＤ８／ＣＤ４／ＣＤ１９／ＣＤ１１ｂ／ｐａｎ−ＮＫ／Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ／Ｍａｃ−３抗体（２μｇ／ｍｌ）；ならびに（２）胸腺細胞では、１００μｌの氷冷したＦＡＣＳ溶液におけるＦＩＴＣ接合抗ハムスターＩｇ、ＰＥ接合抗ＣＤ８抗体、及びサイクロム接合抗ＣＤ４抗体（２μｇ／ｍｌ）で、染色した。反応は、暗所で４℃で３０分間、行なった。最後に、染色細胞を氷冷したＦＡＣＳ溶液で２回洗浄し、１ｍｌのＦＡＣＳ溶液に再懸濁して、ＢＤ  ＬＳＲフローサイトメーター(Beckton Dickison)で分析した。
【００９１】
図３及び４は、脾細胞及び胸腺細胞の様々なサブ集団でのＴＡＩＰ抗原の分布をＦＡＣＳ分析によって示すものである。図３に示されるように、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞は、表面で低いが検出可能な量のＴＡＩＰタンパク質を発現した。有意により高い量のＴＡＩＰタンパク質が、ＣＤ３＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞の画分で検出された。ほとんどのＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＤ４＋８＋  胸腺Ｔ細胞は、有意な量のＴＡＩＰタンパク質を発現した。これに対して、ＴＡＩＰタンパク質は、ＣＤ４−８−  胸腺Ｔ細胞の小集団でしか発現しなかった（図４）。
【００９２】
脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、胃、腎臓、脾臓、及び皮膚等の、Ｂ６及びＢａｌｂ／ｃマウスの組織を集め、室温で一晩、１０％ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンブロック中に包埋した。４μｍ厚の、組織切片を、Leica RM2135ミクロトームでパラフィンブロックから調製し、４５℃の水中に広げ、被覆スライドにのせた。スライドを３７℃で乾燥し、次の実験のために用意した。
【００９３】
組織パラフィン切片を含むスライドを脱ろうし、標準的なプロトコルにしたがってキシレン−１００％エタノールシリーズで乾燥し、最後に１００％エタノールに保持した。切片を、標準的なプロトコルにしたがって１００％エタノール−９０％エタノール−８５％エタノール−７０％エタノール−ＰＢＳの連続インキュベーションからさらに最後にＰＢＳ溶液にまでして再水和させた。以下の反応はすべて、給湿ボックスで行なった。非特異的な結合を、組織切片を遮断緩衝液（１％正常ヤギ血清）中で室温で１時間（または４℃で一晩）インキュベートすることによって遮断した。遮断緩衝液を除き、ＴＡＢ４または正常ハムスターＩｇ（１：２００希釈）を切片に加えて、インキュベーションをさらに室温で１時間（または４℃で一晩）続けた。切片を、各々５分間、ＰＢＳで２回洗浄して、一次抗体を除去し、１：２５０の希釈アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ハムスターＩｇと反応させ、室温で１時間インキュベートした。切片を、再度、各々５分間、ＰＢＳで２回洗浄して、抗体−酵素接合体を除去し、着色反応を、暗所でＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液で室温で３０分間発色させた。切片を再度ＰＢＳで洗浄し、過剰な酵素基質を除去し、ＰＢＳ−エタノール−キシレンシリーズで脱水し、顕微鏡検査にのせた。
【００９４】
結果から、ＴＡＩＰタンパク質の発現は骨髄由来組織でのみ検出され試験された残りの組織では検出されなかったことが示された。
【００９５】
実施例５：ＴＡＩＰ抗原の細胞表面ビオチン化および免疫沈降
５×１０７ＲＬオス１またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、氷上で３０分間０．５ｍｇ／ｍｌスルホ−ＮＨＳ−ビオチン(Sulfo-NHS-biotin)(Pierce)を含むＰＢＳ  １ｍｌ中で表面ビオチン化した。反応を、細胞を氷上で１０分間、０．５ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地(Life Technologies, Inc.)でインキュベートすることによって終了した。細胞を１ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地で１回及び１ｍｌのリン酸緩衝液で２回洗浄した。
【００９６】
標識された細胞を、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(complete protease inhibitor cocktail)(Roche)を含む冷却溶解緩衝液（１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１６０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で５．０×１０７細胞／ｍｌの密度で１５分間溶解し、不溶材料を１０，０００×ｇで１０分間ペレット化した；これら及びすべての次の段階は、４℃で行なわれた。免疫沈降では、溶解産物を、５０μｌの充填プロテインＧ−セファロース(Amersham Pharmacia Biotech)と共に３０分間予めインキュベートして、非特異的に結合するタンパク質を除去した。ビーズをペレット化し、上清のアリコート（定常的に５．０×１０７細胞に相当）を、１０μｇのｍＡｂ  ＴＡＢ４または正常なハムスター血清由来のＩｇＧが予めのせられた２０μｌのプロテインＧ−セファロースと共にインキュベートした。４℃で４時間インキュベートした後、樹脂を、洗浄緩衝液（０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  オボアルブミン）で４回、および４００ｍＭ  ＮａＣｌの代わりに２５０ｍＭを含む、同様の洗浄緩衝液で２回洗浄した。ＴＡＢ４に特異的に結合するタンパク質を、５０μｌの１×ＳＤＳサンプル緩衝液で溶出した。溶出したタンパク質を、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜(Millipore)に移した。フィルターについて、ペルオキシダーゼ接合アビジン(PharMingen)でビオチン化されたタンパク質を分析し、化学発光試薬(NENＴＭLife Science Products)で発色させた。
【００９７】
図２に示されるように、約１２０ｋＤの分子量を有するビオチン化された表面タンパク質が、ＲＬ□１細胞（ＴＡＩＰ＋  Ｔ細胞）によっては同定されたが、３Ｔ３細胞（ＴＡＩＰ−  Ｔ細胞）では同定されなかった。これに対して、ハムスターの正常血清で被覆したプロテインＧセファロースは、この１２０ｋＤのタンパク質を抽出できなかった。これらの結果から、この１２０ｋＤのタンパク質はＴ細胞の細胞表面でモノクローナル抗体ＴＡＢ４によって認識される抗原であることが示唆される。
【００９８】
実施例６：インビボでのＴ細胞の枯渇
インビボでのＴ細胞及び他の細胞の集団へのＴＡＢ４の効果を試験するために、マウスに、３００μｇのＴＡＢ４またはコントロールのハムスターＩｇを腹腔内に注射し、４日目に、脾細胞、胸腺細胞、及び末梢血の単核細胞を全細胞計測のために及びＦＡＣＳによる細胞表面マーカーの分析のために集めた。
【００９９】
ＦＡＣＳアッセイでは、細胞を、４℃で２０分間２％パラホルムアルデヒドで固定し、２回洗浄して、１×１０７細胞／ｍｌの最終濃度になるように氷冷したＦＡＣＳ溶液に再懸濁した。ＦＡＣＳ管(Falcon)中の再懸濁された細胞の１００μｌのアリコートを各アッセイに使用した。２μｇ／ｍｌの最終濃度のＴＡＢ４またはコントロールのハムスターＩｇを細胞に添加して、混合物を暗所で４℃で３０分間、インキュベートした。細胞を氷冷したＦＡＣＳで１回洗浄し、（１）脾細胞では、１００μｌの氷冷したＦＡＣＳ溶液におけるサイクロム(cychrome)接合抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍｌ）、ＦＩＴＣ接合抗ハムスターＩｇ及びＰＥ接合抗ＣＤ８／ＣＤ４／ＣＤ１９／ＣＤ１１ｂ／ｐａｎ−ＮＫ／Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ／Ｍａｃ−３抗体（２μｇ／ｍｌ）；ならびに（２）胸腺細胞では、１００μｌの氷冷したＦＡＣＳ溶液におけるＦＩＴＣ接合抗ハムスターＩｇ、ＰＥ接合抗ＣＤ８抗体、及びサイクロム接合抗ＣＤ４抗体（２μｇ／ｍｌ）と、反応させた。反応は、暗所で４℃で３０分間、行なった。最後に、染色した細胞を、氷冷したＦＡＣＳ溶液で２回洗浄し、１，０００μｌのＦＡＣＳ溶液中に再懸濁して、ＢＤ  ＬＳＲフローサイトメーター(Beckton Dickison)で分析した。
【０１００】
注射してから４日後に、末梢血の白血球（ＰＢＬ）におけるＣＤ３＋  Ｔ細胞のパーセントは、コントロールマウスの３６．７％からＴＡＢ４で処置したマウスの４．１％にまで減少した（表２）。ＴＡＢ４処置により、脾細胞の全数は若干減少した。しかしながら、ＴＡＢ４処置マウスでは、ＣＤ３＋  Ｔ細胞の数が６２％減少し、ＮＫ細胞の数が５０％減少し、さらにＣＤ１９＋  Ｂ細胞の全数が若干増加した。ＴＡＢ４処置マウスから回収した胸腺細胞の全数は、コントロールで見られたレベルのたった４８％であった（５２％減少）。さらに、ＣＤ４＋  Ｔ細胞以外では、すべての他のＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＣＤ８＋、及びＣＤ４−ＣＤ８−  Ｔ細胞は減少し、この際、ＣＤ４＋ＣＤ８＋  サブ集団は最も顕著に影響を受けた（６４．７％減少）。
【０１０１】
【表２】
2008260759.tif 000003
【０１０２】
実施例７：抗ＴＡＩＰ抗体は、ＩＬ−２またはＴＮＦ−αの分泌を誘導しない
Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）に、３００μｇのＴＡＢ４またはコントロールのハムスターＩｇを腹腔内に注射した。脾細胞を注射してから７日目に単離し、マイトマイシンＣ処置Ｃ３Ｈ（Ｈ−２ｋ）脾細胞（スティミュレーター(stimulator)として）を有する培養物におけるレスポンダー(responder)として使用した。３日後、培養物上清を集め、ＩＬ−２含量をＥＬＩＳＡセット(PharMingen)によって測定した。図５に示されるように、ＩＬ−２の生産は、コントロールマウスのものに比してＴＡＢ４処置マウス由来のレスポンダー細胞では抑制された。ＩＬ−２及びＴＮＦ−ａの血漿レベルもまた分析したところ、コントロール及びＴＡＢ４処置マウスの血清ではＩＬ−２（またはＴＮＦ−ａ）のレベルに有意な差は認められなかった。ＩＬ−２の生産はＴ細胞の活性には重要であるので、これらの結果から、ＴＡＢ４等の、ＴＡＩＰに特異的な抗体は、Ｔ細胞を操作し、自己免疫疾患及び移植拒絶に関連するもの等の望ましくないＴ細胞が介在する免疫応答を制御するのにインビボで使用できることが示される。
【０１０３】
実施例８：移植拒絶を防止するための抗ＴＡＩＰ抗体の使用
８〜１２週齢のマウス（Jackson Laboratoryから得た）に、アセプロマジンマレエート(Acepromazin maleate)(Fermenta Animal Health Co., Kansas City, MO)で麻酔をかけた。皮膚移植前に、胸腺摘除されていないレシピエントＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）に、皮膚移植外科手術する７日前に、５００μｇのＴＡＢ４またはイソ型のコントロール抗体を腹腔内注射した。７日後、十分同種のミスマッチした(fully allogeneic mismatched)Ｂａｌｂ／ｃｊマウス（Ｈ−２ｄ）の皮膚の側腹部を、抗体で予め処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に移植した。移植してから７日目に、マウスに再度５００μｇのＴＡＢ４またはイソ型のコントロール抗体を注射した。マウスを移植片の移植後毎日モニターした。移植片の生存率（％）を図７に示す（ｎ＝８）。データから、ＴＡＢ４抗体による処置は同種皮膚移植片の生存を延ばすことが示される。
【０１０４】
実施例９：ＰＳＧＬ−１としてのＴＡＩＰの同定
ＣＤ１６２とも称する、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）は、Ｔ細胞等の、白血球で発現する主要なＰ−セレクチンリガンドである(Sako et al. (1993) Cell 75:1179; Vachino et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:21966; Veldman et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:16470)。その分子量及び二量体のなりやすさ等の、ＴＡＩＰの生化学的な特性から、ＴＡＢ４はＰＳＧＬ−１に類似する可能性が示唆された。これら２種の抗原の関係を調べるために、以下のように試験した：１）ＴＡＢ４によって沈降する抗原が市販の抗ＰＳＧＬ−１抗体によって認識できるかどうか；および２）抗ＰＳＧＬ−１抗体が細胞溶解産物からＴＡＢ４を枯渇できるかどうか。
【０１０５】
ＲＬオス１  Ｔ細胞を、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(complete protease inhibitor cocktail)を含む溶解緩衝液（１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１６０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で１．０×１０８細胞/／ｍｌの密度で１時間溶解し、不溶材料を１０，０００×ｇで１０分間ペレット化した。これら及びすべての次の段階は、４℃で行なわれた。５．０×１０７細胞に相当する溶解産物を、１０μｇの抗ＰＳＧＬ−１  ｍＡｂ（クローン２ＰＨ１、PharMingen, San Diego, CA）、抗ＴＡＩＰ  ｍＡｂ、ＴＡＢ４、または正常ハムスター血清由来のＩｇＧが予めのせられた２０μｌのプロテインＧ−セファロースと共にインキュベートした。４℃で４時間インキュベートした後、ビーズを洗浄緩衝液（０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  オボアルブミン）で４回、および４００ｍＭ  ＮａＣｌの代わりに２５０ｍＭを含む、同様の洗浄緩衝液で２回洗浄した。結合タンパク質を、４０μｌの１×ＳＤＳサンプル緩衝液で溶出した。溶出したタンパク質を、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を、抗ＰＳＧＬ−１  ｍＡｂで免疫ブロットし、ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）によってさらには化学発光(Renaissance, NEN)によって出現させた。
【０１０６】
表面ビオチン化ＲＬオス１  Ｔ細胞を、溶解緩衝液中で１．０×１０８細胞／ｍｌの密度で溶解した。細胞抽出物を、４℃で一晩、４０μｌのプロテインＧ−セファロースに結合した抗体２０μｇと共にインキュベートした。枯渇を、抗ＰＳＧＬ−１  ｍＡｂ（２ＰＨ１）またはコントロールのラットＩｇＧを用いて、ＴＡＢ４またはコントロールの正常ハムスター血清を用いて行なった。枯渇した溶解産物について、さらにＴＡＢ４または抗ＰＳＧＬ−１  ｍＡｂで、それぞれ、免疫沈降を行なった。免疫沈降物を、６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、蛍光板間接撮影によって検出した。図６に示されるように、抗ＰＳＧＬ−１抗体はＴ細胞溶解産物からＴＡＩＰタンパク質を枯渇できる。加えて、抗ＴＡＩＰ抗体（ＴＡＢ４）で免疫沈降したタンパク質は、ウェスタン分析によって抗ＰＳＧＬ−１抗体によって認識されうる。
【０１０７】
実施例１０：抗ＰＳＧＬ−１抗体によるヒトＴ細胞におけるアポプトシスの誘導
ヒトＴ細胞のアポプトシスにおけるＰＳＧＬ−１によって果たされる役割を決定するために、経時的な実験を行ない、いつ活性化ヒトＴ細胞がＰＳＧＬ−１が介在するアポプトシスシグナルに対する感受性を得るかを調べた。ヒトＴ細胞を、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）マイトジェンで刺激し、さらにＩＬ−２含有培地中に展開させた。活性化Ｔ細胞を集めた後、ＩＬ−２及び架橋抗体の存在下で抗ＰＳＧＬ−１で攻撃した。
ヒトの末梢血を、健常な成人から採取し、へパリン化し、フィコールパックプラス(Ficoll-Paque Plus)(Pharmacia Biotech)を用いて異なる密度に基づいた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を強化した。ＰＢＭＣを、１％ＰＨＡ(Life Technologies, GibcoBRL)で４８時間活性化した後、アッセイ期間中組換えヒトＩＬ−２（５ｎｇ／ｍｌ）中に維持した。抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体のアポプトシス誘導能を評価するために、活性化細胞を：（１）１μｇ／ｍｌの抗ＰＳＧＬ−１抗体クローンＫＰＬ−１(BD PharMingen)に架橋体(cross-linker)ウサギ抗マウスＩｇ（０．５μｇ／ｍｌ）(Jackson ImmunoResearch Laboratories)を加えたもの；（２）イソ型のコントロール精製マウスＩｇに架橋体ウサギ抗マウスＩｇを加えたもの；または（３）架橋体ウサギ抗マウスＩｇ単独で、処置した。６時間処置した後、初期のアポプトシス細胞のパーセントをＦＡＣＳによって測定し、抗アネクシンＶ(anti-Annexin V)(BD PharMingen)及びＰＩ(Sigma)で染色した。
【０１０８】
図８に示されるように、抗ＰＳＧＬ−１抗体に架橋体を加えたものを用いてＰＳＧＬ−１によって引き起こされたシグナル伝達(signaling)は、ＰＨＡ活性化ヒトＰＢＭＣ（主にＴ細胞）において有意なレベルのアポプトシスを引き起こした。アポプトシス細胞のパーセントは、抗ＰＳＧＬ−１処置培養物において３日目の８．５％から８日目の２４％まで増加した。同位体マッチコントロール(isotopic-matched control)、または架橋抗体単独はいずれも、これらの細胞に効果がなかった。
【０１０９】
実施例１１：自己免疫疾患を処置するための抗ＰＳＧＬ−１アゴニスト抗体の使用
よく公認された自己免疫性糖尿病動物である、肥満でない糖尿病(non-obese diabetic)（ＮＯＤ）マウスを、標準的な条件下で飼育した。突発性糖尿病(spontaneous diabete)が約２０週齢のＮＯＤマウスで発症した。実験群では、マウスに、１４、１５及び１７週齢のマウス当たり、３００μｇの抗ＰＳＧＬ−１抗体（ＴＡＢ４）を３回腹腔内投与した。同じ投与量の注射を２４及び２６週齢でさらに２回与えた。コントロール群には、同じ投与量のハムスターＩｇを与えた。マウスを、１５週齢以降毎週２回メディ−テストグルコースストリップ(Medi-Test Glucose strip)(Macherey-Nagel, Germany)によって尿中グルコースをモニターした。２回の連続した測定で３００ｍｇ／ｄｌを超える非空腹時尿中グルコースレベルが糖尿病と考えた。
【０１１０】
図９に示されるように、ＴＡＢ４（抗ＰＳＧＬ−１）抗体処置によって、コントロールの抗体処置に比べて有意な保護が得られた。ゆえに、抗ＰＳＧＬ−１抗体による処置は、自己免疫Ｔ細胞の活性を抑制し、Ｉ型糖尿病の発症を遅延することができる。
【０１１１】
他の実施態様  本発明を詳細な説明と合わせて説明してきたが、前記説明は詳細に説明することを意図するものであり、本発明の概念を制限するものではないと解される。本発明の他の態様、利点、及び修飾は、下記特許請求の範囲の概念に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】いつ活性化Ｔ細胞がＴＡＢ４（抗ＴＡＩＰモノクローナル抗体）が介在するアポプトシスシグナルに対する感受性を得るかを調べた経時的な実験の代表的結果を示すものである。
【図２】ＴＡＢ４抗体によって認識される抗原の細胞表面のビオチン化及び免疫沈降の結果を示すものである。
【図３】脾臓ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞、及びＮＫ細胞でのＰＳＧＬ−１抗原の発現を示すものである。
【図４】ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＤ４＋８＋、及びＣＤ４−８−胸腺細胞でのＰＳＧＬ−１抗原の発現を示すものである。
【図５】レスポンダー(responder)としてのＴＡＢ４（またはハムスターＩｇ）で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスから単離された脾臓細胞およびスティミュレーター(stimulator)としてのＨ２ミスマッチＣ３Ｈ脾臓細胞を用いた混合リンパ球培養で生産されたＩＬ−２レベルを示すものである。
【図６】（Ａ）ＴＡＢ４抗体で免疫沈降したタンパク質が市販の抗ＰＳＧＬ−１抗体によって認識できることおよび（Ｂ）抗ＰＳＧＬ−１抗体でＴ細胞溶解産物を予め透徹(preclearing)することによって、ＴＡＢ４によって認識されたタンパク質を枯渇できることを示すウェスタンブロット分析を示すものである。
【図７】Ｂａｌｂ／ｃマウスから皮膚移植を受け、抗ＰＳＧＬ−１抗体（黒塗りのダイアモンド）またはコントロール抗体（白抜きの四角）で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスでの生存した移植片の割合（％）を示すものである。
【図８】活性化ヒト末梢血の単核細胞を抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体で処置した後のアポプトシスを受けたＴ細胞の割合（％）の経時変化を示すものである。
【図９】抗ＰＳＧＬ−１抗体（黒塗りの四角）またはコントロール抗体（白抜きの四角）で処置された自己免疫性肥満でない糖尿病(autoimmune non-obese diabetic)（ＮＯＤ）オスマウスの糖尿病の発症率を示すものである。
【図１】
2008260759.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008260759.tif 000010
【図８】
2008260759.tif 000011
【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月9日(2008.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）に特異的に結合して、細胞表面上でＰＳＧＬ−１を発現する活性化Ｔ細胞の死亡を誘導できる抗体またはこの抗原結合断片を含み、懸濁液、溶液または油性若しくは水性ベヒクルにおけるエマルジョンの形態を有する、薬剤組成物。
【請求項２】
該抗体またはこの抗原結合断片は、抗体である、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
該抗体は、モノクローナル抗体である、請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
該抗体は、ＫＰＬ−１抗体ではない、請求項２または３に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
該抗体は、キメラ抗体である、請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
乾癬の治療を目的として使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）に特異的に結合して、細胞表面上でＰＳＧＬ−１を発現する活性化Ｔ細胞の死亡を誘導できるヒト化抗体を含み、懸濁液、溶液または油性若しくは水性ベヒクルにおけるエマルジョンの形態を有する、薬剤組成物。
【請求項８】
乾癬の治療を目的として使用される、請求項７に記載の薬剤組成物。