(57)【要約】【課題】腹膜透析を受ける被験体の状況をより的確に判断し、その状況に応じて的確に治療を行うための情報を提供すること。【解決手段】上記課題は、本発明において、目的の有核細胞を特定するための方法であって、該有核細胞の核および非核部分を検出する工程；および該核および該非核部分がともに検出されたときに、該有核細胞が存在すると判定する工程を包含する、方法によって、例えば、中皮細胞の老化を的確に判定することができるようになったことによって解決された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の有核細胞を特定するための方法であって、
Ａ）該有核細胞の核および非核部分を検出する工程；および
Ｂ）該核および該非核部分がともに検出されたときに、該有核細胞が存在すると判定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
検出された前記有核細胞の形状パラメータを得、それにより前記有核細胞の状態を判断する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記形状パラメータは、前記有核細胞の面積が測定可能かどうかまたは面積測定が有意であるかどうかを判定するために用いられる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記形状パラメータは、前記有核細胞の面積測定に不適な状態の細胞を判定するために用いられる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記面積測定に不適な状態は、凝集、接着および崩壊からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記形状パラメータは、投影面積、細胞表面凹凸および細胞の長軸対短軸の比からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞表面凹凸は、前記有核細胞の細胞周の２乗÷前記有核細胞の細胞面積×４πという計算手順で計算される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞表面凹凸および細胞の長軸対短軸の比の少なくとも１つは、１．５未満に設定される請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞表面凹凸および細胞の長軸対短軸の比は、１．５未満に設定される請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記有核細胞は、中皮細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記有核細胞は、中皮細胞であり、該中皮細胞は、前記核の存在と、中皮マーカーの発現によって判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記非核部分の検出のために、ＨＢＭＥ−１、抗ＣＡ−１２５抗体、抗メソテリン抗体および抗カルレチニン抗体からなる群より選択される抗体が使用され、前記核の検出に、ＨＯＥＣＨＳＴ  ３３３４２が使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記非核部分は、細胞表面を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記形状パラメータを得て、ほぼ円形のものを選択する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、前記有核細胞のネガティブマーカーが検出されないことを指標として選択することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ネガティブマーカーは、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ４５およびＣＤ３からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、前記有核細胞の投影面積を取得する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記投影面積を前記有核細胞の老化の指標として用いることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
被験体の腹膜透析の適合性を診断するための方法であって、
Ａ）被験体由来のサンプルにおける中皮細胞を検出する工程であり、
Ａ−１）該サンプル中における中皮細胞の核および非核部分を検出することと
Ａ−２）該核および該非核部分がともに検出された細胞を、中皮細胞と判定することにより該検出が達成される、工程、および
Ｂ）該中皮細胞の投影面積を計算する工程であって、該中皮細胞の変動により、腹膜透析への適合性が判断される
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記Ａ）工程は、さらにＡ−３）該サンプル中における細胞の形状パラメータを得ることを包含し、前記検出は、該形状パラメータが面積測定に不適な状態であるかどうかを判定することによって判定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞の平均投影面積が２５０平方マイクロメートルに達する投影面積の増大は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルは、腹膜透析排液検体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記中皮細胞の細胞濃度を測定し、一定レベルを下回った場合に腹膜透析を中止するよう患者にサインを提示する工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記中皮細胞の細胞濃度減少は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記中皮細胞の平均投影面積の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記中皮細胞の投影面積の増加は、平均投影面積によって判定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記中皮細胞で、投影面積が増加した細胞の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記中皮細胞が全総細胞数の約５％未満となったとき、腹膜透析が不適切になっていると判断される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
被験体が腹膜透析継続に適合しているかどうか事前診断または診断するためのシステムであって、
Ａ）該被験体からのサンプル中の有核細胞の核を検出する核検出手段；
Ｂ）該被験体からのサンプル中の該有核細胞の非核部分を検出する非核検出手段；および
Ｃ）該被験体からのサンプル中の該有核細胞の形状パラメータを得る形状パラメータ取得手段
を備える、システム。
【請求項３０】
前記核検出手段および前記非核検出手段は、蛋白質、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
前記核検出手段は蛍光色素であり、および前記非核検出手段は、標識されているかされていない抗体である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３２】
前記非核検出手段は、細胞表面検出手段である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３３】
前記核検出手段および前記非核検出手段は、標識されるか、または標識可能である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３４】
前記形状パラメータ取得手段は、顕微鏡写真撮影装置である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３５】
さらに、前記サンプルを精製する手段を備える、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３６】
前記精製する手段は、遠心分離手段、濾取手段、接着手段および電気的手段からなる群より選択される、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記被験体は、哺乳動物を含む、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３８】
前記被験体は、ヒトを含む、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３９】
前記有核細胞の面積分布係数を計算する手段をさらに備える、請求項２９に記載のシステム。
【請求項４０】
前記面積分布係数は、投影面積ごとの細胞数を累積して、自然対数回帰計算をして得られる、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
前記面積分布係数は、３０が下限である、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
前記面積分布係数を測定する手段は、コンピュータを含む、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４３】
前記システムは、腹膜透析適合性診断装置である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項４４】
前記システムは、アレイスキャンを含む、請求項２９に記載のシステム。
【請求項４５】
前記システムは、アレイスキャンおよび血球計算板を備え、該血球計算板は、試料調製の際の細胞数の測定に用いられる、請求項２９に記載のシステム。
【請求項４６】
前記形状パラメータは、投影面積、前記有核細胞の細胞表面凹凸、前記有核細胞の長軸対短軸の比で示される、請求項２９に記載のシステム。
【請求項４７】
前記有核細胞は、中皮細胞である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項４８】
前記非核部分検出手段は、ＨＢＭＥ−１、抗ＣＡ−１２５、抗メソテリンおよび抗カルレチニンからなる群より選択される抗体であり、前記核検出手段は、ＨＯＥＣＨＳＴ  ３３３４２である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項４９】
前記形状パラメータにより、ほぼ円形のものが選択される、請求項２９に記載のシステム。
【請求項５０】
さらに、前記有核細胞のネガティブマーカーの検出手段を備える、請求項２９に記載のシステム。
【請求項５１】
前記ネガティブマーカーは、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ４５およびＣＤ３からなる群より選択される、請求項５０に記載のシステム。
【請求項５２】
前記投影面積を前記有核細胞の老化の指標として用いることを特徴とする、請求項４６に記載のシステム。
【請求項５３】
前記サンプルは、腹膜透析排液検体である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項５４】
前記中皮細胞の細胞濃度が、一定レベルとなったときに、腹膜透析を中止することを特徴とする、請求項４７に記載のシステム。
【請求項５５】
前記中皮細胞の細胞濃度の減少は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることを特徴とする、請求項４７に記載のシステム。
【請求項５６】
前記中皮細胞の投影面積の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることを特徴とする、請求項４７に記載のシステム。
【請求項５７】
前記投影面積の増加は、平均投影面積または面積分布係数により判定される、請求項５６に記載のシステム。
【請求項５８】
前記投影面積が増加した中皮細胞の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることを特徴とする、請求項４７に記載のシステム。
【請求項５９】
前記中皮細胞が全総細胞数の約５％未満となったとき、腹膜透析が不適切になっていると判断される、請求項４７に記載のシステム。
【請求項６０】
総細胞数をトリパンブルー染色液で、総有核細胞をヒンケルマン液で血球計算板を用いて測定し、アレイスキャンで測定する試料の調製条件を決定し、作業効率を向上させることを特徴とする、請求項２９に記載のシステム。
【請求項６１】
被験体が腹膜透析続行可能かどうかを診断するための、Ａ）該被験体からのサンプル中の有核細胞の核を検出する核検出手段；Ｂ）該被験体からのサンプル中の該有核細胞の非核部分を検出する非核検出手段；およびＣ）該被験体からのサンプル中の該有核細胞の形状パラメータを得る形状パラメータ取得手段の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腹膜透析に関する。より詳細には、本発明は、腹膜透析を受ける患者の状態を的確に判断し、腹膜透析について診断し、その後の治療についての有用な情報を与える技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
腹膜透析は、腹腔に腹膜透析液を注入し，４〜８時間腹腔内に滞留させ，腹膜の半透膜としての性質を用いて腹膜を循環している血液やリンパ液を透析、排液し、新しい液を注入し、これを反復する方法である。この方法は患者の活動上の制限がなく社会復帰が容易である上に残腎機能保持や小児療育の観点からも望ましい方法であるが、腹膜炎の併発等、副作用がないかどうか、腹膜透析を継続できるかどうかを常に監視している必要がある。特に問題となるのは長期間の腹膜透析療法後に発生する被嚢性腹膜硬化症（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＥＰＳ）である。ＥＰＳの死亡率はきわめて高く、その予防対策と治療法の確立は急務である。その病因として反復する中皮細胞の喪失および再生等により中皮細胞が分裂限界に到達（老化）し枯渇すること等が挙げられている。その検査法としてｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｅｓｔ（ＰＥＴ）を用いた透析液／血清クレアチニン比測定等のほか化学染色および肉眼での観察による腹膜透析排液中の中皮細胞の解析が行われている。本発明では客観性、定量性にすぐれ自動化の進んだ中皮細胞の老化モニタリング技術を提供し、腹膜透析療法およびその関連事業に資する技術を提供する。
【０００３】
現在までに腹膜透析排液中の中皮細胞の形態測定とその臨床的意義について非特許文献１〜３のような文献が報告されている。これら文献において被嚢性腹膜硬化症発症と中皮細胞の形態の関連を解析することについて有用な知見が得られており、特に大型の中皮細胞の出現状況をモニタリングする意義について多くの有用な知見を報告している。これらの文献において中皮細胞の形状測定は遠心塗抹染色した後、顕微鏡観察し、画像をコンピュータ画像処理、面積計算を行い、測定平均値および標準誤差を得てデータとしている。しかしながらこれらの操作は高度に訓練された技術者が必要であり、また多大な労力を要することが明らかである。
【非特許文献１】透析会誌  1997年30巻10号  P.1225〜1231、山本忠司ほか
【非特許文献２】腎と透析  Vol.53別冊  腹膜透析2002：334-337、2002、山本忠司ほか
【非特許文献３】腎と透析  Vol.53別冊  腹膜透析2002：338-341、山本忠司ほか
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明においては中皮細胞に特異性の高い染色法を用い、より自動化され客観性を高めた情報量の多い手法を提供し安全な腹膜透析に寄与する事を目的とする。
【０００５】
本発明はまた、腹膜透析を受ける被験体の状況をより的確に判断し、その状況に応じて的確に治療を行うための情報を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題は、本発明において、目的の有核細胞を特定するための方法であって、該有核細胞の核および非核部分を検出する工程；および該核および該非核部分がともに検出されたときに、該有核細胞が存在すると判定する工程を包含する、方法によって、例えば、中皮細胞の老化の状況を的確に判定することができるようになったことによって解決された。
【０００７】
これには、例えば、中皮細胞マーカーを識別するＨＢＭＥ−１という抗体による染色性が陽性の細胞の状況を観察することによって、その状況が、腹膜透析の被験体における適合性の指標となることを見出し、上記課題を解決した。
【０００８】
従って、本発明は以下を提供する。
（１）目的の有核細胞を特定するための方法であって、
Ａ）上記有核細胞の核および非核部分を検出する工程；および
Ｂ）上記核および上記非核部分がともに検出されたときに、上記有核細胞が存在すると判定する工程、
を包含する、方法。
（２）検出された上記有核細胞の形状パラメータを得、それにより上記有核細胞の状態を判断する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（３）上記形状パラメータは、上記有核細胞の面積が測定可能かどうかまたは面積測定が有意であるかどうかを判定するために用いられる、項目２に記載の方法。
（４）上記形状パラメータは、上記有核細胞の面積測定に不適な状態の細胞を判定するために用いられる、項目２に記載の方法。
（５）上記面積測定に不適な状態は、凝集、接着および崩壊からなる群より選択される、項目４に記載の方法。
（６）上記形状パラメータは、投影面積、細胞表面凹凸および細胞の長軸対短軸の比からなる群より選択される、項目２に記載の方法。
（７）上記細胞表面凹凸は、上記有核細胞の細胞周の２乗÷上記有核細胞の細胞面積×４πという計算手順で計算される、項目２に記載の方法。
（８）上記細胞表面凹凸および細胞の長軸対短軸の比の少なくとも１つは、１．５未満に設定される項目２に記載の方法。
（９）上記細胞表面凹凸および細胞の長軸対短軸の比は、１．５未満に設定される項目２に記載の方法。
（１０）上記有核細胞は、中皮細胞である、項目１に記載の方法。
（１１）上記有核細胞は、中皮細胞であり、上記中皮細胞は、上記核の存在と、中皮マーカーの発現によって判定される、項目１に記載の方法。
（１２）上記非核部分の検出のために、ＨＢＭＥ−１、抗ＣＡ−１２５抗体、抗メソテリン抗体および抗カルレチニン抗体からなる群より選択される抗体が使用され、上記核の検出に、HOECHST  ３３３４２が使用される、項目１に記載の方法。
（１３）上記非核部分は、細胞表面を含む、項目１に記載の方法。
（１４）上記形状パラメータを得る工程は、ほぼ円形のものの選択を含む、項目２に記載の方法。
（１５）さらに、上記有核細胞のネガティブマーカーが検出されないことを指標として選択することを包含する、項目１に記載の方法。
（１６）上記ネガティブマーカーは、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ４５およびＣＤ３からなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
（１７）さらに、上記有核細胞の投影面積を取得する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（１８）上記投影面積を上記有核細胞の老化の指標として用いることを特徴とする、項目１７に記載の方法。
（１９）被験体の腹膜透析の適合性を診断するための方法であって、
Ａ）被験体由来のサンプルにおける中皮細胞を検出する工程であり、
Ａ−１）上記サンプル中における中皮細胞の核および非核部分を検出することと
Ａ−２）上記核および上記非核部分がともに検出された細胞を、中皮細胞と判定することにより上記検出が達成される、工程、および
Ｂ）上記中皮細胞の投影面積を計算する工程であって、上記中皮細胞の変動により、腹膜透析への適合性が判断される
を包含する、方法。
（２０）  上記Ａ）工程は、さらにＡ−３）上記サンプル中における細胞の形状パラメータを得ることを包含し、上記検出は、上記形状パラメータが正常であるかどうかを判定することによって判定される、項目１９に記載の方法。
（２１）上記細胞の平均投影面積が２５０平方マイクロメートルに達する投影面積の増大は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることを特徴とする、項目１９に記載の方法。
（２２）上記サンプルは、腹膜透析排液検体である、項目１９に記載の方法。
（２３）上記中皮細胞の細胞濃度を測定し、一定レベルを下回った場合に腹膜透析を中止するよう患者にサインを提示する工程をさらに包含する、項目１９に記載の方法。
（２４）上記中皮細胞の細胞濃度減少は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることを特徴とする、項目１９に記載の方法。
（２５）上記中皮細胞の平均投影面積の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることを特徴とする、項目１９に記載の方法。
（２６）上記中皮細胞の投影面積の増加は、平均投影面積によって判定される、項目２５に記載の方法。
（２７）上記中皮細胞で、投影面積が増加した細胞の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることを特徴とする、項目１９に記載の方法。
（２８）上記中皮細胞が全総細胞数の約５％未満となったとき、腹膜透析が不適切になっていると判断される、項目１９に記載の方法。
（２９）被験体が腹膜透析継続に適合しているかどうか事前診断または診断するためのシステムであって、
Ａ）上記被験体からのサンプル中の有核細胞の核を検出する核検出手段；
Ｂ）上記被験体からのサンプル中の上記有核細胞の非核部分を検出する非核検出手段；および
Ｃ）上記被験体からのサンプル中の上記有核細胞の形状パラメータを得る形状パラメータ取得手段
を備える、システム。
（３０）上記核検出手段および上記非核検出手段は、蛋白質、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目２９に記載のシステム。
（３１）上記核検出手段は蛍光色素であり、および上記非核検出手段は、標識されているかされていない抗体である、項目２９に記載のシステム。
（３２）上記非核検出手段は、細胞表面検出手段である、項目２９に記載のシステム。
（３３）上記核検出手段および上記非核検出手段は、標識されるか、または標識可能である、項目２９に記載のシステム。
（３４）上記形状パラメータ取得手段は、顕微鏡写真撮影装置である、項目２９に記載のシステム。
（３５）さらに、上記サンプルを精製する手段を備える、項目２９に記載のシステム。
（３６）上記精製する手段は、遠心分離手段、濾取手段、接着手段および電気的手段からなる群より選択される、項目３５に記載のシステム。
（３７）上記被験体は、哺乳動物を含む、項目２９に記載のシステム。
（３８）上記被験体は、ヒトを含む、項目２９に記載のシステム。
（３９）上記有核細胞の面積分布係数を測定する手段をさらに備える、項目２９に記載のシステム。
（４０）上記面積分布係数は、投影面積ごとの細胞数を累積して、自然対数回帰計算をして得られる、項目３９に記載のシステム。
（４１）上記面積分布係数は、自然対数回帰計算で３０が下限である、項目４０に記載のシステム。
（４２）上記計算手段は、コンピュータである、項目４０に記載のシステム。
（４３）上記システムは、腹膜透析適合性診断装置である、項目２９に記載のシステム。
（４４）上記システムは、アレイスキャンを含む、項目２９に記載のシステム。
（４５）上記システムは、アレイスキャンおよび血球計算板を備え、上記血球計算板は、試料調製の際の細胞数の測定に用いられる、項目２９に記載のシステム。
（４６）上記形状パラメータは、投影面積、上記有核細胞の細胞表面凹凸、上記有核細胞の長軸対短軸の比で示される、項目２９に記載のシステム。
（４７）上記有核細胞は、中皮細胞である、項目２９に記載のシステム。
（４８）上記非核部分検出手段は、ＨＢＭＥ−１、抗ＣＡ−１２５抗体、抗メソテリンおよび抗カルレチニンからなる群より選択される抗体であり、上記核検出手段は、ＨＯＥＣＨＳＴ  ３３３４２である、項目２９に記載のシステム。
（４９）上記形状パラメータにより、ほぼ円形のものが選択される、項目２９に記載のシステム。
（５０）さらに、上記有核細胞のネガティブマーカーの検出手段を備える、項目２９に記載のシステム。
（５１）上記ネガティブマーカーは、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ４５およびＣＤ３からなる群より選択される、項目５０に記載のシステム。
（５２）上記投影面積を上記有核細胞の老化の指標として用いることを特徴とする、項目４６に記載のシステム。
（５３）上記サンプルは、腹膜透析排液検体である、項目２９に記載のシステム。
（５４）上記中皮細胞の細胞濃度が、一定レベルとなったときに、腹膜透析を中止することを特徴とする、項目４７に記載のシステム。
（５５）上記中皮細胞の細胞濃度の減少は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることを特徴とする、項目４７に記載のシステム。
（５６）上記中皮細胞の投影面積の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることを特徴とする、項目４７に記載のシステム。
（５７）上記投影面積の増加は、平均投影面積により判定される、項目５６に記載のシステム。
（５８）上記投影面積が増加した中皮細胞の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることを特徴とする、項目４７に記載のシステム。
（５９）上記中皮細胞が全総細胞数の約５％未満となったとき、腹膜透析が不適切になっていると判断される、項目４７に記載のシステム。
（６０）総細胞数をトリパンブルー染色液で、総有核細胞をヒンケルマン液で血球計算板を用いて測定し、アレイスキャンで測定する試料の調製条件を決定し、作業効率を向上させルことを特徴とする、項目２９に記載のシステム。
（６１）被験体が腹膜透析続行可能かどうかを診断するための、Ａ）上記被験体からのサンプル中の有核細胞の核を検出する核検出手段；Ｂ）上記被験体からのサンプル中の上記有核細胞の非核部分を検出する非核検出手段；およびＣ）上記被験体からのサンプル中の上記有核細胞の形状パラメータを得る形状パラメータ取得手段の使用。
【０００９】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、中皮細胞などの有核細胞を簡便に判定する方法を提供する。これにより、例えば、腹膜透析などにおける適合性を簡便に判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００１２】
（用語の説明）
以下に本明細書において使用される用語および一般技術を説明する。
【００１３】
（一般技術）
本明細書において用いられる腹膜透析に関する技術は、当該分野において周知であり慣用される。
【００１４】
透析とは、膜を介して分子量のサイズで篩をかけ、濃度勾配により所定の分子を除去することで、代謝活動によって体内に蓄積された各種溶質（尿毒素としての尿素（Ｕ）、クレアチニン（Ｃｒ）等）、および電解質（Ｃａ２＋、Ｃｌ−、Ｎａ＋、Ｋ＋）、過剰水分、等を体液中から前記透析液中に溶出させたのち、透析液を排液として廃棄することで、患者の低下した腎機能を補助するものである。血液を体外循環して機械的に血液を浄化する方法、あるいは腹腔内に透析液を入れ、腹膜を介して血液を浄化する方法の違いで、血液透析（ＨＤ；Ｈｅｍｏ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ）、腹膜透析（ＰＤ；Ｐｅｌｉｔｏｎｅａｌ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ）の区別がある。
【００１５】
腹膜透析は、患者自身の腹膜を半透膜として利用する。この腹膜は、身体の腹腔の膜状層である。この腹膜は、天然の半透膜として機能し得る。
【００１６】
腹膜透析は、腹腔に滅菌水溶液を、周期的に、注入する。この溶液は、腹膜透析溶液または透析液と呼ばれる。拡散および浸透圧交換は、天然の身体膜を横切って、溶液と血流の間で起こる。これらの交換は、腎臓が通常排出する老廃生成物を除去する。この老廃生成物は、代表的に、尿素およびクレアチニンのような溶質からなる。腎臓はまた、透析によって調節される必要のあるナトリウムおよび水のような他の物質のレベルを維持する。透析の間に腹膜を横切る水および溶質の拡散は、限外濾過と呼ばれる。
【００１７】
移動性の連続した腹膜透析において、透析溶液は、カテーテルを使用して腹腔に導入される。透析液と血液との間の溶質の交換は、拡散によって達成される。さらなる除去は、血液から透析液への適切な浸透圧勾配を提供して、水が血液から流出することを可能にすることによって達成される。このことは、適切な酸−塩基バランス、電解質バランスおよび流体バランスが、身体内で達成されることを可能にする。この透析溶液は、単に、カテーテルを通して体腔から排液される。
【００１８】
腹膜透析は種々の改良がなされている。１つのこのような改変は、自動腹膜透析（「ＡＰＤ」）である。ＡＰＤは、機器（サイクラーと呼ばれる）を使用して、患者の腹腔におよび腹腔から、腹膜透析溶液を、自動注入、休止、および排液する。ＡＰＤは、特に、腹膜透析患者に対して魅力的である。なぜなら、これは、患者が寝ている間の夜に実施され得るからである。このことは、患者を、起きている時間および仕事の時間の間の移動性の連続的な腹膜透析の日々の要求から自由にする。ＡＰＤ手順は、代表的に、数時間にわたる。これはしばしば、使用済み透析液を腹腔から空にするための初期排液サイクルで始まる。次いで、このＡＰＤ手順は、順番に続く充填、休止および排液の段階の連続を通して進行する。各充填／休止／排液手順は、サイクルと呼ばれる。ＡＰＤは、多くの異なる方法で実施され得、そして実施される。
【００１９】
腹膜透析では、患者は主に在宅で透析を行う。これは患者自らが透析液をカテーテルを用いて腹腔内に入れ、数時間貯留したのち、排液するステップを一日数回繰り返す。患者は毎回の排液時における体内からの過剰水分排出量（除水量という）を記録しておき、以後の診察時に医師に提示し、処方を仰ぐようにする。このような腹膜透析の方法をＣＡＰＤ（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ；連続携行式腹膜透析）と呼ぶ。医師は特に患者の除水量に着目し、その量の多少により、患者に適切な処方を選択する。
【００２０】
本明細書において「形状パラメータ」とは、細胞の形状を示す任意のパラメータをいう。形状パラメータとしては、例えば、表面積、体積、投影面積、細胞表面凹凸および細胞の長軸対短軸の比、真球度、真円度、断面積、断面形状等を挙げることができるがそれらに限定されない。形状パラメータを用いることによって、有核細胞等の細胞の状態を調査することができる。形状パラメータはまた、前記有核細胞の面積が測定可能かどうか（すなわち、面積測定に適した状態）または面積測定が有意であるかどうかを判定するために用いられる。その具体的な手順は、一例として単独で浮遊している中皮細胞がほぼ球形となることを利用し投影形状の周の２乗÷面積×４πおよび長軸対短軸の比などを参酌することによって実施することができる。
【００２１】
面積測定に不適な状態は、凝集、接着および崩壊などであり得る。
【００２２】
細胞表面凹凸は、前記有核細胞の細胞周の２乗÷前記有核細胞の細胞面積×４πという計算手順で計算される。この数値は、円では１になり、形がいびつになると１以上になる。細胞表面凹凸および細胞の長軸対短軸の比の少なくとも１つまたは両方は、１．５未満、たとえば、１．2未満に設定することができる。これらの値は存在しうる最小値の1に近ければ投影形状が円、すなわち細胞の形状が球に近いことを示し、好ましい。したがって、細胞表面凹凸および細胞の長軸対短軸の比の少なくとも１つまたは両方は、１〜１．５未満、好ましくは１〜１．２未満という範囲で記載することもできる。
【００２３】
形状パラメータを得る工程では、ほぼ円形のものの選択を行ってもよいがそれに限定されない。
【００２４】
本明細書において、細胞の「状態」とは、その細胞が「面積測定に適切な状態」を有しているかどうか、かどうかをいう。これは形状パラメータによって細胞の状態を判定し、本発明の測定に応用する。
【００２５】
形状パラメータは、下記計算手順によって計算することができる。
以下に例示的な計算手順を記載する。
1.当該分野において通常知られている任意の方法により細胞または細胞の投影形状の長径、短径、面積(投影面積)、周(投影形状の周)を取得する。
2.長軸対短軸の比すなわち長径と短径の比を算出する。
3.細胞の凹凸の指標として周の２乗÷面積×４πを算出する。
【００２６】
本明細書において用いられる場合、例としてアレイスキャン付属のTarget activationソフトウェアを使用する場合は、形状パラメータは1例として、長軸対短軸の比が１．５未満、たとえば、１．０〜１．２に設定される。また同様に周の２乗÷面積×４πも１．０〜１．２に設定される。これにより半自動的に面積測定に適した中皮細胞の選択を行う上で有用な情報を得られるがこれに限定されない。
【００２７】
細胞の「面積測定に不適切な状態」とは、その細胞の投影面積を測定する上で障害があると疑うにたる状態をいい、例えば、凝集、接着および崩壊等を挙げることができる。
【００２８】
上記ソフトウェアでは、具体的には、「面積測定に不適切な状態」の判断は、例えば、長径と短径の比および周の２乗÷面積×４πのいずれかが1.2以上の場合、面積測定対象から除外することにより達成される。
【００２９】
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、代表的には単細胞生物自体、または多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。本明細書において「細胞」は、有核細胞と非有核細胞とを総称する。
【００３０】
本明細書において「有核細胞」とは、核を有する任意の細胞を指し、例えば、幹細胞、分化細胞、中皮細胞などを挙げることができる。通常の細胞は核を有する。
【００３１】
本明細書において「非有核細胞」とは、核を有しない任意の細胞を指し、例えば、赤血球などを挙げることができる。このような非有核細胞は、例えば、核染色により検出されないことを指標として選択することができる。
【００３２】
本明細書において、有核細胞のネガティブマーカーは、種々個別のCDマーカーなどを挙げることができる。例えば、中皮細胞では、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ３４、ＣＤ４などを挙げることができる。
【００３３】
本明細書において「核」とは、細胞の核をいい、細胞核ともいい、真核細胞に通常１つ存在する球形または楕円形の構造であって、核膜に包まれる構造体をいう。核は、通常、ＤＮＡに代表される遺伝物質を収容する。
【００３４】
本明細書において、「非核部分」とは、細胞における核以外の部分をいい、例えば、細胞表面、細胞膜、細胞質などを含む。非核部分の検出のために、ＨＢＭＥ−１、抗ＣＡ−１２５抗体、抗メソテリン抗体および抗カルレチニン抗体からなる群より選択される抗体が使用され、前記核の検出に、ＨＯＥＣＨＳＴ  ３３３４２が使用され得る。
【００３５】
本発明において「細胞表面」とは、細胞の表面を指す。細胞表面には、種々の生体分子（糖、複合糖、レセプター、膜貫通タンパク質等）が存在し、細胞に独特なものが多いことから、本願発明において、特に非核部分を識別するために好ましく用いられる。
【００３６】
本明細書において「有核細胞の投影面積」とは、通常の光学手段を用いて投影させたときに、得られる面積をいう。本発明において投影面積は、有核細胞の老化の指標として用いることができる。有核細胞の投影面積の取得は、当該分野において通常知られている任意の方法を用いて実施することができる。
【００３７】
そのような中皮細胞の老化による腹膜透析適合性低下の指標としては、以下を挙げることができる。
【００３８】
例えば、細胞の平均投影面積が２５０平方マイクロメートルに達する投影面積の増大は、腹膜透析の適合性の減少の指標であり得る。このほかには、腹膜透析排液中の細胞における中皮細胞比率の低下（４％以下）を挙げることができる。さらに中皮細胞の投影面積順の累積分布を対数回帰計算して分布を評価する事も可能である。この評価により投影面積の分布を表す事が可能となり、より大きい投影面積を持つ中皮細胞の増加を把握し腹膜透析の適合性低下をより適切に評価する事が可能である。
【００３９】
本明細書において「中皮細胞」とは、中皮（真体腔の内壁をなす中胚葉性の上皮組織であり、脊椎動物では通常，側板に由来する腹腔上皮をいい，胸膜腔，心膜腔，腹膜腔，陰嚢腔等諸種の内臓の表面をおおい，単層扁平上皮であることが多い）に存在する細胞をいう。たとえば、中皮細胞は、前記核の存在と、中皮マーカーの発現によって判定することができる。中皮細胞の細胞濃度を測定し、一定レベルを下回った場合に腹膜透析を中止するよう患者にサインを提示することによって、腹膜透析の継続の指標として使用することもできる。一般に、中皮細胞の細胞濃度減少は、腹膜透析の適合性の減少の指標であることが知られているからである。また、中皮細胞の平均投影面積の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標であり得る。中皮細胞の投影面積の増加は、平均投影面積によって判定される。中皮細胞で、投影面積が増加した細胞の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標である。
【００４０】
中皮細胞は、腹膜透析が良好にされているかどうかの指標であり得る。中皮細胞が腹膜透析排液中総細胞数の約４％未満となったとき、腹膜透析が不適切になっていると判断される。
【００４１】
本明細書において「単離された」または「分離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。本明細書では、使用する細胞は、分離されていないものでも用いることはできるが、ある程度分離されているほうが好ましい。
【００４２】
本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる。本発明では、特に、中皮細胞の識別が好ましい実施形態において使用されることから、本発明で用いられる細胞は、中皮細胞を有する任意の生物に由来する細胞であり得、そのような生物は通常脊椎動物であることが理解される。
【００４３】
本明細書において「サンプル」とは、本発明を実施するために用いられる細胞を含む任意の材料をいう。例えば、腹膜透析排液検体を挙げることができる。
【００４４】
本明細書において「マーカー」とは、ある細胞の特徴となる物質または因子をいう。このようなマーカーとしては、遺伝子、遺伝子産物、代謝物質、酵素などを挙げることができる。中皮細胞を識別するマーカーであれば、「中皮（細胞）マーカー」と称することがある。中皮細胞の非核部分の検出のために、ＨＢＭＥ−１、抗メソテリン抗体および抗カルレチニン抗体からなる群より選択される抗体が使用され得る。
【００４５】
本明細書において「ＨＢＭＥ−１」とは、中皮系の細胞マーカーを認識するモノクローナル抗体の一種であり、中皮腫での陽性率が高いとされている。Arch Gynecol Obstet. 2001 Aug;265(3):151-4を参照。
【００４６】
本発明において、腹膜透析適合性の診断は、中皮マーカーに特異的な因子または手段を用いて実現することができる。
【００４７】
本明細書において「因子」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、化合物、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００４８】
したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
【００４９】
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。このような特異的相互作用は、診断に応用することができる。
【００５０】
本明細書において「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。
【００５１】
本明細書において「手段」とは、ある目的を達成する任意の道具となり得るものをいい、特に、本明細書では、「選択的に認識する手段」とは、ある対象を他のものとは異なって認識することができる手段をいう。このような手段は標識されていてもよく、標識されていなくてもよい。標識されていない場合は、このような手段は標識可能な処理がされていてもよい。本明細書において、ある標的（たとえば、細胞マーカー）を検出するための手段は、「検出手段」ともいう。
【００５２】
本明細書において「核検出手段」とは、被験体からのサンプル中の有核細胞の核を検出することができる任意の手段をいう。このような手段としては、たとえば、システム、装置、あるいはキットなどを挙げることができ、蛋白質、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、化合物、有機低分子およびそれらの複合分子（たとえば、色素、組成物、抗体、抗原など）などもその手段として適切であり得る。
【００５３】
本明細書において「非核検出手段」とは、被験体からのサンプル中の該有核細胞の非核部分を検出する任意の手段を言う。細胞表面を検出する場合は、細胞表面検出手段という。このような手段としては、たとえば、システム、装置、あるいはキットなどを挙げることができ、蛋白質、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、化合物、機低分子およびそれらの複合分子（たとえば、色素、組成物、抗体、抗原など）などもその手段として適切であり得る。
【００５４】
代表的には、核検出手段は蛍光色素であり、非核検出手段は、標識されているかされていない抗体であり得るがそれに限定されない。
【００５５】
本明細書において「形状パラメータ取得手段」とは、被験体からのサンプル中の該有核細胞の形状パラメータを得る任意の手段をいう。このような手段としては、たとえば、システム、装置、あるいはキットなどを挙げることができ、コンピュータなどを接続して計算可能とした構成などもその手段として適切であり得る。このような形状パラメータ取得手段は、顕微鏡写真撮影装置であり得る。
【００５６】
本明細書において「サンプルを精製する手段」とは、サンプルを精製することができる任意の手段であり得る。このような精製手段としては、たとえば、遠心分離手段、濾取手段、接着手段および電気的手段などであり得る。
【００５７】
本明細書において「有核細胞の面積分布係数を測定する手段」とは、有核細胞の面積分布係数を測定することができる任意の手段をいう。
【００５８】
本明細書において、有核細胞（たとえば、中皮細胞）の「面積分布係数」とは、有核細胞（たとえば、中皮細胞）の投影面積順にそれ以下の投影面積を持つ細胞数を累積して、対数回帰を行い、得られた回帰式の係数をいう。中皮細胞の場合、面積分布係数は、一般的に、自然対数回帰計算で３０が腹膜透析適合性の下限である。腹膜透析適合性の指標とする場合は、上限は特に限定されない。上限については本発明の目的とは関連しないため規定する意義はない。理論に束縛されることは望まないが、上限の規定は本発明の目的すなわち「中皮細胞の老化して大きくなった物が増えてサイズの分布が広まってくる状況を検出すること」から無意味であるからである。したがって、合理的根拠を持って上限を規定することは不能であると考えられるからである。
【００５９】
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。ＣＤ３、ＣＤ４などの細胞マーカーは、抗原であるので、これに対する抗体は、検出手段となる。
【００６０】
本明細書において使用される抗体は、擬陽性が減じられるかぎり、どのような特異性の抗体を用いても良いことが理解される。抗体は一定の特異性があることから、本発明において用いられる抗体は、ＨＢＭＥ−１に限定されることはない。中皮マーカーあるいは中皮ネガティブマーカーを認識する抗体であれば、どのような抗体でも有用であることが理解される。従って、本発明において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。
【００６１】
本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物であり得る。
【００６２】
本明細書において「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約１０００以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６３】
本明細書において「リガンド」とは、あるタンパク質に特異的に結合する物質をいう。例えば，細胞膜上に存在する種々のレセプタータンパク質分子と特異的に結合するレクチン、抗原、抗体、ホルモン、神経伝達物質などがリガンドとして挙げられる。
【００６４】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされた複合体をさし得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）などが挙げられる。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。特に言及する場合、本発明の「ポリペプチド」は、マーカーを指すことがある。
【００６５】
本明細書において「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。
【００６６】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体もしくはヌクレオチドアナログのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。
【００６７】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド型核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、配列番号２のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントであって、診断に関与する生物学的な活性性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合分子も使用することができる。
【００６９】
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４などのポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、ヒト以外の動物において、ヒトと同様の診断を行う場合、その動物におけるＣＤ３等に対応する遺伝子が同様の診断に用いられることが理解される。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物（例えば、マウス）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ＣＤ３等）は、の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００７０】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーとして機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーとしての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ることが理解される。たとえば、抗体のフラグメントもまた、対応する抗体とおなじ検出可能性を有する限り、そのフラグメントも本発明において使用することができる。
【００７１】
（診断方法）
本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、発症前に診断することを「事前診断」ともいう。
【００７２】
本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができる。医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「診断を支援」すると称することがある。
【００７３】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいう。
【００７４】
本明細書では、例えば、中皮細胞の数を測定し、一定レベルを下回った場合に腹膜透析を中止するよう患者にサインを提示することができる。このように、中皮細胞の減少は、腹膜透析の適合性の減少の指標であり得る。また、中皮細胞の平均投影面積の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標であり得る。中皮細胞の投影面積の増加はまた、平均投影面積によって判定され得る。
【００７５】
中皮細胞の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標であり得る。例示的な実施形態では、中皮細胞が全総細胞数の約５％未満となったとき、腹膜透析が不適切になっていると判断され得る。この数値は、検体によって変動し得る。
【００７６】
本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれ、代表的には、哺乳動物であり得る。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。
【００７７】
（システム）
本明細書において、「システム」とは、診断するための任意の系をいい、一般に、１または複数の構成要素からなり、複数の構成要素がある場合それらの要素は互いに作用・関連し合っており、全体として調和のとれた挙動・機能を示すという３条件を満足する系をいう。システムは、装置、組成物、診断薬など任意の形態であり得る。従って、システムは、例えば、測定装置を備える大掛かりなシステムから、クロマトグラフィーを備えるシステム、免疫反応を利用したキット、抗体を含む組成物（すなわち、マーカーのモノクローナル抗体を含む、体外医薬品である診断薬）などを包含することが理解される。本発明では、代表的には、システムは、腹膜透析適合性診断装置である。システムは、アレイスキャンなどを含んでいてもよい。本発明のシステムにおいて形状パラメータは、投影面積、有核細胞の細胞表面凹凸、有核細胞の長軸対短軸の比を含み得る。中皮細胞の細胞濃度が、一定レベルとなったときに、腹膜透析を中止することを指令することによって、腹膜透析適合性診断を実現する。
【００７８】
このようなシステムでは、投影面積を有核細胞の老化の指標として用いることができ、中皮細胞の細胞濃度の減少は、腹膜透析の適合性の減少の指標として用いたり、中皮細胞の投影面積の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標として用いることができる。投影面積の増加は、平均投影面積により判定されるがこれに限定されない。投影面積が増加した中皮細胞の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標として用いることができる。たとえば、中皮細胞が全総細胞数の約５％未満となったとき、腹膜透析が不適切になっていると判断され得るがこれに限定されない。
【００７９】
本発明のシステムは、血球計算板を備えていてもよく、この血球計算板は、試料調製の際の細胞数の測定に用いられる。総細胞数をトリパンブルー染色液で、総有核細胞をヒンケルマン液で血球計算板を用いて測定し、アレイスキャンで測定する試料の調製条件を決定し、作業効率を向上させることができる。
【００８０】
（キット）
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、抗体、標識など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、抗体の使い方などを記載した指示書などが含まれる。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００８１】
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【００８２】
（中皮細胞診の意義とデータの解析について）
山本忠司らは中皮細胞診の意義について透析会誌  1997年30巻10号  P.1225〜1231において患者49名、CAPD期間は3〜161ヶ月（平均63.9ヶ月）の腹膜透析排液中の中皮細胞を従来技術で解析した結果を報告している。その結論として腹膜排液中の中皮細胞の面積は腹膜透析患者の腹膜変性の指標として有用であり、現在の名称で表すと被嚢性腹膜硬化症の発症回避に有用であることを示している。
→（腹膜透析期間と腹膜透析排液中の中皮細胞の面積の相関）
山本らは中皮細胞診の意義について透析会誌  1997年30巻10号  P.1225〜1231において中皮面積とCAPD期間との間には有意の正相関を認め、大型の中皮細胞出現が腹膜変性の指標として有用であることを示している。
【００８３】
中皮細胞診については、以下の文献を参照することができる（これらの文献は、その関連する部分（全体であり得る）を参考として援用する）：（１）  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌｉｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＣＡＰＤ  ｅｆｆｌｕｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．  Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ３２：９４６−９５２，１９９８；（２）  山本忠司、他：ＣＡＰＤ排液中皮細胞の形態とその臨床的意義について．  透析会誌３０：１２２５−１２３１、１９９７；（３）Ｉｚｕｍｏｔａｎｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｅｃｔ  ｔｏ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｏｎｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｄｉａｌｙｓｉｓ．  Ｎｅｐｈｒｏｎ  ８９：４３−４９，２００１；（４）  山本忠司、他：排液中皮細胞よりみたＨＤ併用療法の有用性．  腹膜透析２００３：１０１−１０３、２００３。
【００８４】
（データの解析について）
上記論文によれば排液中皮細胞診のＰＤ期間と面積の相関は、ある程度の幅をもって示される。また、中皮細胞傷害の程度は一定の面積カットオフ値で示される。
【００８５】
（ＰＤの中止基準について）
中皮細胞診についての文献（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；山本忠司、他、１９９７；Ｉｚｕｍｏｔａｎｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；山本忠司、他２００３）を参考にして決定することができる。
【００８６】
例えば、代表的な例として、ＰＤ中の面積が４００μｍ２以上およびＰＤ期間が１２０ヶ月以上の場合は、中止後にＥＰＳ（もしくはイレウス）を発症する予測率は４００μｍ２以上で２９％、１２０ヶ月以上で２１％である。４００μｍ２以上の面積が３ヶ月以上継続する場合、ＰＤの中止が望ましい。ＰＤ中の面積が３５０μｍ２以上およびＰＤ期間が７２ヶ月以上の場合は、中止後にＥＰＳを発症する予測率は３５０μｍ２以上で２５％、７２ヶ月以上で１７％である。３５０μｍ２以上の面積が３ヶ月以上継続する場合、他の所見ともあわせてＰＤ中止も考慮することが望ましい。
【００８７】
（ＣＡＰＤ中止基準について）
中皮細胞診についての文献（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；山本忠司、他、１９９７；Ｉｚｕｍｏｔａｎｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；山本忠司、他２００３）を参考にして決定することができる。
【００８８】
例えば、代表的な例として、山本らが排液中皮細胞診を行った４６９例の内、ＣＡＰＤを中止した６３例（平均年齢：５０．７歳、平均ＣＡＰＤ期間：８１．６か月）について、中止後の腹部症状なし群４６例、イレウス、ＥＰＳも含めて何らかの腹水を認めた群（腹水群）１４例、ＥＰＳも含めてイレウス症状のあった群（イレウス群）１１例、ＥＰＳ群３例に分けて、ＥＢＭによる検討を行った。面積カットオフが４００μｍ２のときＥＰＳ群で感度１００％、特異度８１．７％、カットオフが３５０μｍ２のときイレウス群で感度９０．９％、特異度３６．５％、カットオフ３００μｍ２のとき腹水群で感度６４．７％、特異度６０．９％であった。次いで、面積カットオフを５０μｍ２ごとに区分した場合の陽性予測率および陰性予測率では、最も確立が高かったのは腹水群で３００μｍ２、イレウス群で３５０μｍ２、ＳＥＰ群で４００μｍ２であった。
【００８９】
ＥＰＳ予防のためのＣＡＰＤ中止基準は、面積４００μｍ２付近が基準であり、もし腹水貯留が前ＥＰＳ状態と考えるならば、面積３５０μｍ２付近が一応の目安であると考えられる。面積３５０μｍ２以上の症例では、ＣＡＰＤ中止後も注意深い観察が必要と思われる（山本忠司、他：排液中皮細胞診によるＣＡＰＤ中止基準．腹膜透析２００２：３３４−３３７、２００２参照）。
【００９０】
（腹腔内洗浄の中止基準について）
ＥＰＳ予防のための腹腔内洗浄中止基準は、もし腹水貯留が前ＥＰＳ状態と考えるならば、面積３００μｍ２付  近一応の目安であると考えられる。ＣＡＰＤ中止後、カテーテルを留置し、腹腔内洗浄を行うことが是か非かという論議はあるが、もし留置が可能であれば、洗浄液による中皮細胞診で面積低下を確認してのちの抜去も一つの方法ではないかと考える。ＥＰＳ予防のためのＣＡＰＤ中止後の腹腔内洗浄は、面積３００μｍ２以下を示すまで継続することが必要と思われる（山本忠司、他：排液中皮細胞診による腹腔内洗浄の中止基準．腹膜透析２００２：３３８−３４１、２００２）。
【００９１】
サンプルとしては、腹水でも中皮細胞診は可能である。原則的には排液でも腹水でも検査可能である。ただ、高度のフィブリンの析出や血性排液では測定不可能なことがあり得る。
【００９２】
本発明においては検体中の有核細胞計数工程があるので従来法と比較し、対応可能な検体中細胞濃度の範囲は広い。しかし総中皮細胞数等のデータを取得することを考えるとPET時の排液がもっとも好ましいと考えられる。
【００９３】
上記の理由より従来法で細胞数不足と指摘された場合でも、測定できる。
【００９４】
ＰＤ中止後、低下していた中皮細胞面積が上昇してきた場合は、中皮細胞診についての文献（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；山本忠司、他、１９９７；Ｉｚｕｍｏｔａｎｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；山本忠司、他２００３）を参考にして決定することができる。
【００９５】
例えば、代表的な例として、以下のように解釈することができる。腹膜中皮は非常に再生能力の強い細胞で、ＣＡＰＤによって障害されてもすぐに再生し、その障害と再生の程度が中皮細胞面積と相関すると考えられる。ＣＡＰＤ中止後というのは再生の方向に向かうのが普通で、そのために面積も低下してくるが、腹膜がかなり障害をうけている症例（腹膜硬化症など）では中皮は回復せず、よって面積は回復しないか回復してもかなり時間がかかると予想される。
【００９６】
中止後、中皮面積が低値安定している症例で、再度、面積が上昇してくるということあまりないが、ただ、まれに上昇してくる症例の場合、中皮細胞診についての文献（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；山本忠司、他、１９９７；Ｉｚｕｍｏｔａｎｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；山本忠司、他２００３）を参考にして決定することができる。
【００９７】
例えば、代表的な例として、上記症例は何らかの原因で腹膜が障害を受け、そのために面積が上昇していると推測される。３５０μｍ２未満での面積の多少の上下はあまり問題はないが、３５０μｍ２以上に上昇してきた場合は注意が必要と考えられる。ＥＰＳが中止後２、３年経過して、突然発症してくることもあり、面積上昇例は注意深い観察が必要であると思われる。
【００９８】
ＣＡＰＤ期間とともに中皮面積は上昇するとされているが、逆に低下してくる症例の場合も、中皮細胞診についての文献（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；山本忠司、他、１９９７；Ｉｚｕｍｏｔａｎｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；山本忠司、他２００３）を参考にして決定することができる。
【００９９】
例えば、代表的な例として、この症例は以下のように解釈される。これまでの研究では、ＰＤによって腹膜中皮は一方的に悪化するのではなく、回復している時期もあると推測される。この原因は今のところ不明であるが、中性透析液への変更や週１回程度のＨＤ併用療法によって面積が低下することを考えると、透析液ＧＤＰｓ濃度の変化（同じロットでもＧＤＰ濃度は違うことがある）やある種薬剤の影響、腹膜そのものの回復機能など種々条件によって面積は微妙に変化していると考えられる。
【０１００】
ＰＥＴはＬからＬＡのレベルであるのに中皮細胞面積は４００μｍ２をこえており要注意と指摘された場合、中皮細胞診についての文献（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；山本忠司、他、１９９７；Ｉｚｕｍｏｔａｎｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；山本忠司、他２００３）を参考にして決定することができる。
【０１０１】
例えば、代表的な例として、この症例の場合、以下のように判断する。山本らの考えでは、排液中皮細胞診は腹膜中皮の障害と再生の程度を反映すると解釈しており、ＰＥＴで表されるような腹膜機能、特に腹膜透過性とは相関しないと判断される。すなわち、腹膜中皮が障害されていても、中皮下結合組織、血管内皮の物質透過性が正常であれば、ＰＥＴは良好に維持されるであろうし、逆に、腹膜中皮が正常でも、中皮下結合組織、血管内皮が障害されていれば、ＰＥＴは高値を示すと考えられる。このようなことから、腹膜透過性と中皮細胞診の結果の間には矛盾したようなことが起こり、ＥＰＳが腹膜中皮の障害、消失、癒着が原因であるとする場合、ＰＥＴがＬｏｗであっても面積が高値であるときは、要注意の症例ということになる。実際に、ＰＥＴがＬｏｗ  ａｖｅｒａｇｅの症例でも病理組織検査で中皮の消失、中皮下組織硬化を経験している。ＰＤ継続可能かどうかは、細胞診、ＰＥＴできれば病理組織を含めた総合的な判断が必要と思われる。
【０１０２】
ＰＥＴがＨであり、除水不全もあるのに中皮細胞面積は２５０μｍ２以下で問題ないと指摘された場合もまた、中皮細胞診についての文献（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；山本忠司、他、１９９７；Ｉｚｕｍｏｔａｎｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；山本忠司、他２００３）を参考にして決定することができる。
【０１０３】
例えば、代表的な例として、この症例の場合、以下のように判断する。山本らの考えでは、排液中皮細胞診は腹膜中皮の傷害と再生の程度を反映すると解釈しており、ＰＥＴで表されるような腹膜機能、特に腹膜透過性とは相関しないと判断している。すなわち、腹膜中皮が障害されていても、中皮下結合組織、血管内皮が正常であれば、腹膜透過性は維持されるであろうし、逆に、腹膜中皮が正常でも、中皮下結合組織、血管内皮が障害されていれば、ＰＥＴは高値を示すと考えられる。このようなことから、腹膜透過性と中皮細胞診の結果の間には矛盾したようなことが起こり、もし、ＥＰＳが腹膜中皮の傷害、消失、癒着が原因であるとする場合、ＰＥＴがＨｉｇｈであっても面積が低値であれば、腹膜中皮は良好に保たれているということになる。ＰＤ継続可能かどうかは、細胞診、ＰＥＴできれば病理組織を含めた総合的な判断が必要と思われる。
【０１０４】
本発明の中皮細胞診を用いるとＥＰＳを予防することができる。ＥＰＳの成因はまだ不明であるが、ＥＰＳは腹膜中皮の消失による炎症、癒着が原因と考えられる。よって、前ＥＰＳの状態を早期に発見して対処することが、現状の最良の予防治療かと思われる。中皮細胞消失の前兆となる中皮細胞の老化を本発明ではよりよくモニタリングできる。
【０１０５】
（本発明の自動検出技術）
１つの局面において、本発明は、目的の有核細胞を特定するための方法を提供する。この方法は、Ａ）該有核細胞の核および非核部分を検出する工程；Ｂ）必要に応じて該有核細胞の形状パラメータを得る工程；およびＣ）該核および該非核部分がともに検出され、必要に応じて細胞の形状パラメータが該有核細胞の形状パラメータであると判定されたときに、該有核細胞が存在すると判定する工程、を包含する。ここで、形状パラメータは検出した中皮細胞が面積測定可能あるいは面積測定する意味のあるものであることを判定するために用いる。すなわち中皮細胞の中で凝集、接着、崩壊などを起こしていないものを拾い出すために用いる。中皮細胞の判断は核があることと中皮マーカーが発現していることの二つで判断する。中皮細胞等の検出については、従来の技術では、透析液などに含まれている中皮細胞の面積を測る目的にはそのまま使うことはできない。なぜならば腹膜から剥離してきて遊離状態にある中皮細胞の多くは凝集、接着、崩壊などを起こしており、面積を測るには適さないからである。そのため測定する技師は、化学染色＋訓練された技師の目できれいな中皮細胞を拾い、手作業でデジタル画像を取得し、画像処理ソフトで面積を測定し、集計する。この測定は、人間がやる場合訓練された技師でないと無理であるが、本発明では、機械にやらせる方法として蛍光染色＋画像解析による形状認識が始めての実用例となった
１つの実施形態において、形状パラメータ、細胞表面凹凸は、前記有核細胞の細胞周の２乗÷前記有核細胞の細胞面積×４πという計算手順で計算される。この数値は、円では１になり、形がいびつになると１以上になる。細胞表面凹凸および細胞の長軸対短軸の比の少なくとも１つまたは両方は、１．５未満に設定することができるが、細胞のサイズに応じて変動させることもできる。
【０１０６】
1つの好ましい実施形態では、本発明の方法は、有核細胞の投影面積を取得する工程を包含する。例えば、ＨＢＭＥ−１のラベルに用いている蛍光色素の蛍光波長と同じ光が検出されればアレイスキャンの付属ソフト(Targetactivation)は面積の計算と記録を行う。したがって面積測定をする意味のある、中皮細胞を検出する手段として形状認識機能を利用することができる。
【０１０７】
１つの実施形態では、具体的な認識機能の手順は以下の通りである。
1.当該分野において通常知られている任意の方法により細胞または細胞の投影形状の長径、短径、面積(投影面積)、周(投影形状の周)を取得する。
2.長軸対短軸の比すなわち長径と短径の比を算出する。
3.細胞の凹凸の指標として周の２乗÷面積×４πを算出する。                              
【０１０８】
本明細書において用いられる場合、例としてアレイスキャン付属のTarget activationソフトウェアを使用する場合は、形状パラメータは1例として、長軸対短軸の比が１．５未満、たとえば、１．０〜１．2に設定される。また同様に周の２乗÷面積×４πも１．０〜１．2に設定される。これにより半自動的に面積測定に適した中皮細胞の選択を行う上で有用な情報を得られる。細胞表面凹凸の指標となる細胞周の２乗÷前記有核細胞の細胞面積×４πは、円において１になり、形がいびつになると１以上になる。これらの値は存在しうる最小値の1に近ければ投影形状が円、すなわち細胞の形状が球に近いことを示し、好ましい。
【０１０９】
本発明の自動検出技術の１つの実施形態では、有核細胞は、中皮細胞であり得る。非核部分の検出のために、ＨＢＭＥ−１、抗ＣＡ−１２５、抗メソテリンおよび抗カルレチニンからなる群より選択される抗体が使用され、核の検出に、ＨＯＥＣＨＳＴ  ３３３４２が使用される。
【０１１０】
１つの実施形態では、形状パラメータを得る工程は、投影形状がほぼ円形のものの選択を含む。中皮細胞は、単独で浮遊状態にあるときは通常球形であるからである。
「ほぼ円形」は、以下のようにして判定する
1.当該分野において通常知られている任意の方法により細胞または細胞の投影形状の長径、短径、面積(投影面積)、周(投影形状の周)を取得する。
2.長軸対短軸の比すなわち長径と短径の比を算出する。
3.細胞の凹凸の指標として周の２乗÷面積×４πを算出する。
【０１１１】
本明細書において用いられる場合、例としてアレイスキャン付属のTarget activationソフトウェアを使用する場合は、形状パラメータは1例として、長軸対短軸の比が１．５未満、たとえば、１．０〜１．2に設定される。また同様に周の２乗÷面積×４πも１．０〜１．2に設定される。これにより半自動的に面積測定に適した中皮細胞の選択を行う上で有用な情報を得られる。細胞表面凹凸の指標となる細胞周の２乗÷前記有核細胞の細胞面積×４πは、円において１になり、形がいびつになると１以上になる。これらの値は存在しうる最小値の1に近ければ投影形状が円、すなわち細胞の形状が球に近いことを示し、好ましい。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明の方法は、前記有核細胞のネガティブマーカーにより検出されないことを指標として選択することをさらに包含する。ネガティブマーカーとしては、中皮細胞の場合、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ４５およびＣＤ３等を挙げることができる。ネガティブマーカーを使用することによって、中皮細胞をより確実に選択することができる。
【０１１３】
１つの実施形態では、本発明では、投影面積を有核細胞の老化の指標として用いることができる。
【０１１４】
別の局面において、本発明は、被験体の腹膜透析の適合性を診断するための方法を提供する。この方法は、Ａ）被験体由来のサンプルにおける中皮細胞を検出する工程であり、Ａ−１）サンプル中における中皮細胞の核および非核部分を検出することとＡ−２）核および非核部分がともに検出された細胞を、中皮細胞と判定することにより検出が達成される、工程、およびＢ）中皮細胞の投影面積を計算する工程であって、中皮細胞の変動により、腹膜透析への適合性が判断されるを包含する。
【０１１５】
１つの実施形態では、Ａ）工程は、さらにＡ−３）該サンプル中における細胞の形状パラメータを得ることを包含し、この検出は、該形状パラメータが面積測定に適した状態にあるかどうかによって判定され得る。
【０１１６】
１つの実施形態では、細胞の平均投影面積が２５０平方マイクロメートルに達する投影面積の増大が、腹膜透析の適合性の減少の指標である。この数値は、現在好ましい数値であり、今後測定される母集団が変動することなどにより変動し得る。このような変動は、当業者が理解できる範囲内のものであり、そのような変動は、当該分野において周知の技法を用いて決定することができる。
【０１１７】
１つの実施形態では、本発明において用いられるサンプルは、腹膜透析排液検体である。腹膜透析排液検体は、中皮細胞をよく含み、これの解析結果は腹膜透析適合性の指標とすることができるからである。
【０１１８】
別の実施形態では、中皮細胞の数が、有意に減少したときに、腹膜透析を中止することができる。その減少は適合性の低下を意味していると考えられているが、目安は当該分野において周知の技法を用いて決定することができる。したがって、中皮細胞の細胞濃度を測定し、一定レベルを下回った場合に腹膜透析を中止するよう患者にサインを提示することが好ましいがこれに限定されない。また、同一患者を長期追跡すればこのような測定が可能である。また、本発明により中皮細胞のサイズ分布を解析することで適合性低下を知ることが可能になる。無理に崩壊したり凝集したりしている中皮細胞を数える必要は無くなる。中皮細胞数を計数する必要がなくなることが顕著な効果であり得る。特に、患者内での評価を行うことができることに留意すべきである。適合性が低下してくると中皮細胞が減少してくる。本発明を用いれば、経時的測定により中皮細胞の減少を捕捉できる。これを実現する方法としては、例えば、蛍光染色して手作業で数えることのほか、自動計数をさせてもよい。アレイスキャンは撮影装置として用いることも可能である。従って、１つの実施形態では、前記中皮細胞の、特に、細胞濃度の減少は、腹膜透析の適合性の減少の指標であり得る。
【０１１９】
別の実施形態では、中皮細胞の（好ましくは、平均）投影面積の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標であり得る。また少数の大型中皮細胞は腹膜透析において臨床的に無意味との報告もあることから、このような細胞を除外して測定しても良い。特に問題となるのは、中皮細胞全体のサイズ分布パターンである。サイズの標準偏差も腹膜透析経験年数により増大しているようである。累積分布グラフを回帰計算により評価したのはサイズ分布パターンを表現するのに平均より適切ではないかと考えられる。また、理論に束縛されないが、この分布パターンは、ポアソン分布様になる。
【０１２０】
別の実施形態では、前記投影面積が増加した中皮細胞の増加は、腹膜透析の適合性の減少の指標であり得る。
【０１２１】
他の実施形態では、中皮細胞が全総細胞数の、例えば、約１０％未満、好ましくは約５％未満となったとき、腹膜透析が不適切になっていると判断される。中皮細胞数の個体差に浸潤細胞の個体差および患者体調などによる一過性の誤差を乗じることにより判定することができる。したがって多数例の測定によりデータベースを作れば可能である。
【０１２２】
別の局面では、本発明は、被験体が腹膜透析継続に適合しているかどうか事前診断または診断するためのシステムを提供する。このシステムは、Ａ）該被験体からのサンプル中の有核細胞の核を検出する核検出手段；Ｂ）該被験体からのサンプル中の該有核細胞の非核部分を検出する非核検出手段；およびＣ）該被験体からのサンプル中の該有核細胞の形状パラメータを得る形状パラメータ取得手段を備える。腹膜透析を始めていなければ腹膜透析排液は存在しないが、等価物を測定することにより事前診断が可能である。開始前に中皮細胞が老化しており、まれではあるが適合性が低下していることはありえる(腹膜炎罹患歴など)。
【０１２３】
好ましい実施形態では、核検出手段および非核検出手段は、独立して、蛋白質、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される。標的となる核および非核部分に特異的に結合する因子であって、好ましくは生体適合性である限り、どのような分子であっても良いことが理解される。
【０１２４】
１つの具体的な実施形態では、核検出手段は蛍光色素であり、非核検出手段は、標識されているかされていない抗体である。ここでは、検出手段として蛍光を利用した測定機器が使用される。従って、核検出手段および非核検出手段は、標識されるか、または標識可能であることが好ましい。
【０１２５】
１つの実施形態では、形状パラメータ取得手段は、顕微鏡写真撮影装置、等価物およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。要点としては、画像解析ソフトへの入力が主となる。こういった設定は一般に行うことができる。
【０１２６】
1つの実施形態では、本発明は、さらに、サンプルを精製する手段を備える。通常は、排液をそのままサンプルとして使用することが想定される。好ましくは、遠心分離して細胞を集める。遠心分離法としては、任意の方法を用いることができる。従って、通常の臨床検査(尿沈渣検査など)と同じ手法を用いることができる。ほとんどの場合、遠心分離は必須であり得る。なぜなら、腹膜透析排液は細胞の濃度が低く、実質上細胞を濃縮しなければ測定できないからである。遠心分離以外の方法では濾取、接着、電気的手段などが考えられる。特に濾取と接着は遠心分離法の次に好ましい実施形態であり得る。
【０１２７】
1つの実施形態では、本発明の方法が対象とする被験体は、哺乳動物を含み、より好ましくは、ヒトを含む。
【０１２８】
１つの実施形態では、本発明のシステムは、有核細胞の面積分布係数を測定する手段をさらに備えていてもよい。面積分布係数は、投影面積ごとの細胞数を累積して、自然対数回帰計算をして得られる。
【０１２９】
別の実施形態では、本発明のシステムは、有核細胞の核部分と非核部分の計数を行うための手段をさらに備える。定量手段は、測定結果が許容範囲内かどうかを判定する判定手段をさらに含み得る。許容範囲は適切に設定される限り、どのようなものでも良いが、例えば、許容下限は、自然対数回帰計算で係数４０程度である。面積分布係数は、自然対数回帰計算で３０が下限であり得る。上限については本発明の目的とは関連しないため規定する意義はない。本技術は腹膜透析の継続によって中皮細胞に惹起された変化が許容範囲かどうかを判定する事を目的とすることから、許容範囲の具体的な数値については母集団に応じて変動し得るが、当業者は容易に決定することができる。現在好ましい実施形態では、平均面積350、自然対数回帰計算では係数40程度であるようである。面積分布係数を測定する手段は、コンピュータを含むことが好ましい。
【０１３０】
１つの実施形態では、判定手段は、コンピュータである。本発明では、画像解析およびその後の処理ができる限り、どのような構成のコンピュータであっても使用することができることが理解される。
【０１３１】
好ましい実施形態では、本発明のシステムは、腹膜透析適合性診断装置として提供される。なお、本技術に機材依存性はないことから、どのような構成であっても良いことが理解される。一例として同一部分を複数波長で撮影できる蛍光顕微鏡と適当な画像解析ソフトがあればアレイスキャンが無くても実施可能である。
【０１３２】
1つの実施形態では、ハード面ではアレイスキャンを単体で使う。特に構成するようなことはない。この構成では、試料調製の際に血球計算板で細胞数の測定を行う。血球計算板もアレイスキャンと同様に腹膜透析排液のような混入物の多い試料に強い道具である。具体的操作としては総細胞数をトリパンブルー染色液で、総有核細胞をヒンケルマン液で血球計算板を用いて測定し、アレイスキャンで測定する試料の調製条件を決定し、作業効率を向上させる。実験としてはごく普通の操作で実施可能であることが理解され得る。
【０１３３】
１つの実施形態では、形状パラメータは、投影面積、前記有核細胞の細胞表面凹凸、前記有核細胞の長軸対短軸の比などで示され得る。
【０１３４】
別の実施形態では、有核細胞は、中皮細胞である。
【０１３５】
さらなる実施形態では、非核部分検出手段は、ＨＢＭＥ−１、抗ＣＡ−１２５、抗メソテリンおよび抗カルレチニンからなる群より選択される抗体であり、前記核検出手段は、HOECHST  ３３３４２である。ここでは、形状パラメータとして、ほぼ円形のものが選択される。
【０１３６】
１つの実施形態では、さらに、前記有核細胞のネガティブマーカーの検出手段を備える。ネガティブマーカーとしては、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ４５およびＣＤ３等を用いることができる。
【０１３７】
本発明のシステムでは、投影面積を前記有核細胞の老化の指標として用いることができる。
【０１３８】
本発明のシステムでは、サンプルとしては、腹膜透析排液検体を用いることができる。
【０１３９】
本発明のシステムでは、上記される本発明の方法において利用される任意の指標を用いることができることが理解される。
【０１４０】
別の局面では、本発明は、被験体が腹膜透析続行可能かどうかを診断するための、Ａ）該被験体からのサンプル中の有核細胞の核を検出する核検出手段；Ｂ）該被験体からのサンプル中の該有核細胞の非核部分を検出する非核検出手段；およびＣ）該被験体からのサンプル中の該有核細胞の形状パラメータを得る形状パラメータ取得手段の使用を提供する。
【０１４１】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１４２】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１４３】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１４４】
（実施例１）
本実施例において、Ｉｍａｇｅ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによる腹膜透析排液中の剥落中皮細胞半自動検出法を検討した。
【０１４５】
（材料及び方法）
(検体)
腹膜透析排液
入手先:***病院(透析部門)
患者名:本実施例専用仮称A  (腹膜透析経過年数約14年)  
本実施例専用仮検体識別記号MaT-A
（試薬）
名称：ＨＢＭＥ−１（一次抗体）：ロット番号：００１２Ｃ（入手先：Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）
名称：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５４６  Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＭ  μｃｈａｉｎ  （二次抗体）２ｍｇ／ｍＬ：ロット番号：９３Ｅ１−１（入手先：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）
名称：Ｂｉｚｂｅｎｚｉｍｉｄｅ  Ｈ  ３３３４２：ロット番号：１２２Ｋ４０２１（入手先：ＳＩＧＭＡ）
(総細胞数の計数)
検体2510mLを4℃で300g、5分間遠心分離し、その上清を廃棄して5mLとした。
ヒンケルマン液等容積と混合しノイバウエル血球計算板で0.8μL中の細胞数を計数したところ総数は58個であった。この結果より検体2510mL中の細胞数は7.3×105と計算された。
【０１４６】
(細胞染色)
細胞計数時に濃縮した検体685μL (105個)を4℃で300×g、5分間遠心分離し、その上清を廃棄して0.1%のBSAを含むPBSで細胞濃度を106/mLとした。これを撹拌してからＨＢＭＥ−１を2μL添加して氷上で30分間反応させた。これを0.1%のBSAを含むPBSで二回遠心分離洗浄後、二次抗体で蛍光抗体染色した。これを0.1%のBSAを含むPBSで二回遠心分離洗浄後、Hoechst33342(2mg/mL)を2μL/200μL加え核染色した。0.1%のBSAを含むPBSで二回遠心分離洗浄後、300μLのCellFixをくわえ細胞固定した。
【０１４７】
(中皮細胞の測定)
アレイスキャンを用いて測定を行った。透明底黒色96well plate(Coster) で染色済み細胞の浮遊液300μL/well(細胞数105) を測定対象とした。測定対象は下記の項目とした。
核染色陽性細胞数、ＨＢＭＥ−１陽性細胞の数および面積
またＨＢＭＥ−１陽性細胞について自動認識された画像を目視でチェックし、多核細胞を計数した。
凝集したＨＢＭＥ−１陽性細胞に関しては細胞数および多核細胞を計数した。
【０１４８】
(測定結果)
検体全量2510mLを5mLに濃縮しヒンケルマン液で2倍希釈して血球計算板で8視野計数した。
細胞数58個
(58個×2倍希釈×5000μL)/(0.8μL)より
総細胞数7.3×105個
画像解析で検出された細胞数: 6323個          
同中皮(ＨＢＭＥ−１陽性)細胞数: 405個  中皮細胞比率6.4%        
中皮細胞総数4.6×104個
投影面積測定中皮細胞84個中、多核細胞19個(23%)
投影積平均308±19μm2 (Mean±SEM)  (SD=175μm2)
面積分布係数46(y=46.465Ln(x)-207.42，R2=0.9889)
図１〜３に更なる結果を示す。
【０１４９】
図１は、MaT-Aの累積分布グラフによる面積分布計数算出を示す。  
【０１５０】
図２は、検体MaT-Aにおける投影面積の分布を示す。
【０１５１】
図３は、検体MaT-AのＨＢＭＥ−１(赤)およびHoechst33342(青)の蛍光撮影画像の擬似カラー合成写真を示す。
【０１５２】
（材料及び方法）
(検体) 本実施例専用仮検体識別記号MaT-B
腹膜透析排液
入手先: ***病院(透析部門)
患者名: 本実施例専用仮称B  (腹膜透析経過年数約5年)
（試薬）
名称：ＨＢＭＥ−１（一次抗体）：ロット番号：００１２Ｃ（入手先：Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）
名称：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５４６  Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＭ  μｃｈａｉｎ  （二次抗体）２ｍｇ／ｍＬ：ロット番号：９３Ｅ１−１（入手先：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）
名称：Ｂｉｚｂｅｎｚｉｍｉｄｅ  Ｈ  ３３３４２：ロット番号：１２２Ｋ４０２１（入手先：ＳＩＧＭＡ）
(総細胞数の計数)
検体総量2475mL中600mLを4℃で300g、5分間遠心分離し、その上清を廃棄して0.5mLとした。ヒンケルマン液3倍容積と混合しノイバウエル血球計算板で0.8μL中の細胞数を計数したところ総数は138個であった。この結果より濃縮した検体中の細胞濃度は690個/μLと計算された。(138個×4÷0.8μL=690個/μL)
またMaT-Bの総細胞数は(2475mL÷600mL)×0.5mL×690個/μLより 1.4×106と計算された。
【０１５３】
(細胞染色)
検体600mLを4℃で300g、5分間遠心分離し、その上清を廃棄して0.5mLとした。これを145μL(105個)採取し0.1%のBSAを含むPBS 5mLを加えて4℃で300×g、5分間遠心分離し、その上清を廃棄して0.1%のBSAを含むPBSで0.5mL/tubeとした。これを撹拌してからＨＢＭＥ−１を2μL添加して氷上で30分間反応させた。これを0.1%のBSAを含むPBS5mLで二回遠心分離洗浄後、0.1%のBSAを含むPBSで0.5mL/tubeとし二次抗体2μLを加えて氷上で30分間反応させ蛍光抗体染色した。これを0.1%のBSAを含むPBSで二回遠心分離洗浄後、Hoechst33342  (2mg/mL)を2μL加え核染色した。氷上で10分間反応させた後0.1%のBSAを含むPBS5mLで1回遠心分離洗浄後、300μLのCellFixをくわえ細胞固定した。
【０１５４】
(中皮細胞の測定)
Image Cytometryを用いて測定を行った。透明底黒色96well plate(Coster) で染色および固定済み細胞の浮遊液150μL/well を測定対象とした。測定対象は下記の項目とした。
【０１５５】
核染色陽性細胞数、ＨＢＭＥ−１陽性細胞の数および投影面積
また核染色およびＨＢＭＥ−１蛍光抗体染色両陽性細胞について自動認識された画像を目視でチェックし、多核細胞を計数した。また損傷、凝集等により、投影面積が正確に測定できない中皮細胞は細胞数および多核細胞数の測定対象とし投影面積の集計からは除外した。
【０１５６】
(測定結果)
検体全量2475mL  
血球計算板による測定:  総細胞数1.4×106 
Image Cytometryによる測定
ＨＢＭＥ−１陽性細胞数: 2282個中141個(6.2%)
投影面積測定可能なＨＢＭＥ−１陽性細胞54個
投影面積測定中皮細胞56個中、多核細胞13個(23%)
投影積平均352±35μm2 (Mean±SEM)  (SD=259μm2)
面積分布係数41(y=40.779Ln(x)-179.24，R2=0.9765)
図４〜６に更なる結果を示す。
【０１５７】
図４は、MaT-Bの累積分布グラフによる面積分布計数算出を示す。
【０１５８】
図５は、検体MaT-Bにおける投影面積の分布を示す。
【０１５９】
図６は、検体MaT-BのＨＢＭＥ−１(赤)およびHoechst33342(青)の蛍光撮影画像の擬似カラー合成写真を示す。
【０１６０】
（材料及び方法）
(検体) 本実施例専用仮検体識別記号MaT-C
腹膜透析排液
入手先: ***病院(透析部門)
患者名: 本実施例専用仮称C  (腹膜透析経過年数  1年未満)  
（試薬）
名称：ＨＢＭＥ−１（一次抗体）：ロット番号：００１２Ｃ（入手先：Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）
名称：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５４６  Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＭ  μｃｈａｉｎ  （二次抗体）２ｍｇ／ｍＬ：ロット番号：９３Ｅ１−１（入手先：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）
名称：Ｂｉｚｂｅｎｚｉｍｉｄｅ  Ｈ  ３３３４２：ロット番号：１２２Ｋ４０２１（入手先：ＳＩＧＭＡ）
(総細胞数の計数)
検体総量1720mL中600mLを4℃で300g、5分間遠心分離し、その上清を廃棄して0.5mLとした。ヒンケルマン液3倍容積と混合しノイバウエル血球計算板で0.8μL中の細胞数を計数したところ総数は189個であった。この結果より濃縮した検体中の細胞濃度は945個/μLと計算された。(189個×4÷0.8μL=945個/μL)
またMaT-Cの総細胞数は(1720mL÷600mL)×0.5mL×945個/μLより 1.4×106と計算された。
【０１６１】
(細胞染色)
検体600mLを4℃で300g、5分間遠心分離し、その上清を廃棄して0.5mLとした。これを106μL(105個)採取し0.1%のBSAを含むPBS 5mLを加えて4℃で300×g、5分間遠心分離し、その上清を廃棄して0.1%のBSAを含むPBSで0.5mL/tubeとした。これを撹拌してからＨＢＭＥ−１を2μL添加して氷上で30分間反応させた。これを0.1%のBSAを含むPBS5mLで二回遠心分離洗浄後、0.1%のBSAを含むPBSで0.5mL/tubeとし二次抗体2μLを加えて氷上で30分間反応させ蛍光抗体染色した。これを0.1%のBSAを含むPBSで二回遠心分離洗浄後、Hoechst33342  (2mg/mL)を2μL/200μL加え核染色した。氷上で10分間反応させた後0.1%のBSAを含むPBS5mLで1回遠心分離洗浄後、300μLのCellFixをくわえ細胞固定した。
【０１６２】
(中皮細胞の測定)
Image Cytometryを用いて測定を行った。透明底黒色96well plate(Coster) で染色および固定済み細胞の浮遊液300μL/well を測定対象とした。測定対象は下記の項目とした。
【０１６３】
核染色陽性細胞数、ＨＢＭＥ−１陽性細胞の数および投影面積
また核染色およびＨＢＭＥ−１蛍光抗体染色両陽性細胞について自動認識された画像を目視でチェックし、多核細胞を計数した。また損傷、凝集等により、投影面積が正確に測定できない中皮細胞は細胞数および多核細胞数の測定対象とし投影面積の集計からは除外した。
【０１６４】
(測定結果)
検体全量1720mL
血球計算板による測定:  総細胞数1.4×106
Image Cytometryによる測定
ＨＢＭＥ−１陽性細胞数: 5881個中375個(6.4%)          
投影面積測定中皮細胞160個中、多核細胞4個(3%)
投影積平均179±7.1μm2 (Mean±SEM)  (SD=90μm2)
面積分布計数61(y=61.225Ln(x)-260.47，R2=0.9791)
図７〜９にさらなる結果を示す。
【０１６５】
図７は、MaT-Cの累積分布グラフによる面積分布計数算出を示す。
【０１６６】
図８は、検体MaT-Cにおける投影面積の分布を示す。
【０１６７】
図９は、検体MaT-CのＨＢＭＥ−１(赤)およびHoechst33342(青)の蛍光撮影画像の擬似カラー合成写真を示す。
【０１６８】
（まとめと考察）
受領した腹膜透析排液は総量１５３０ｍＬであった。検体を濃縮しヒンケルマン液と改良ノイバウエル血球計算板を用いて細胞を計数した結果よりＭａ−＊＊＊＊＊の総細胞数は８．２×１０５と計算された。
【０１６９】
蛍光抗体染色とＩｍａｇｅ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いた測定では５４４３個中１１２６個（２１％）がＨＢＭＥ−１陽性細胞であり中皮細胞と判断された。ＨＢＭＥ−１陽性細胞の総数は１．７×１０５と計算された。このＨＢＭＥ−１陽性細胞の画像を解析したところ１１０個が投影面積の測定が可能であり平均面積は１７０±８．６μｍ２（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ＳＤ＝９０）であった。また一つの細胞中に二個以上の核を持つＨＢＭＥ−１陽性細胞は１１０個中１２個（１１％）であった。
【０１７０】
なお検体に肉眼的な白色綿状−繊維状の細胞凝集塊と思われる浮遊物を多数認めた。このため総細胞数等の誤差が大きいと推定された。
【０１７１】
Ｉｍａｇｅ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによる腹膜透析排液中の剥落中皮細胞検出を検討した。検体は総量１５３０ｍＬであり、総細胞数は８．２×１０５であった。検出された細胞のうち２１％は核染色とＨＢＭＥ−１蛍光抗体染色が陽性の細胞であり中皮細胞と判断された。ＨＢＭＥ−１陽性細胞の総数は１．７×１０５と計算された。Ｉｍａｇｅ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙにより検出された中皮細胞１１２６個のうち１１０個が画像解析可能であり、平均面積は１７０±８．６μｍ２（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で、一つの細胞中に二個以上の核を持つ細胞は１２個（１１％）であった。なお本検体は状態が悪く肉眼的にも綿状−繊維状の細胞凝集塊らしきものの浮遊を認めた。Ｉｍａｇｅ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙにおいても測定困難な大型で密集した細胞凝集塊を認めた。
【０１７２】
（実施例１〜３のまとめ）
本技術により中皮細胞の平均サイズのみならず総細胞数、総有核細胞数、総中皮細胞数、面積分布係数を明らかにできた。またサイズ分布をグラフ化することにより腹膜中皮細胞の状態を把握しやすくなった。
【０１７３】
（実施例４：ネガティブマーカーについての実施例）
次に、ネガティブマーカーについての確認実験を行った。
【０１７４】
（材料および方法）
(検体)本実施例専用仮検体識別記号MaT-D
腹膜透析排液
入手先: ***病院(透析部門)
患者名: 本実施例専用仮称D  
(試薬)
名称:ＨＢＭＥ−１(一次抗体)
入手先:Dako Cytomation
(試薬)
名称:Alexa Fluor546 Goat-anti mouse IgM μchain (二次抗体)
入手先:Molecular Probes
(試薬)
名称:FITC標識抗CD14モノクローナル抗体
入手先: BD
(試薬)
名称:Bizbenzimide Hoechst 33342
入手先:SIGMA。
【０１７５】
(細胞染色)
検体より4×104個の有核細胞を分取、0.1%のBSAを含むPBSを加え0.1mL/tubeとした。これにＨＢＭＥ−１を2μL添加して4℃で30分間反応させた。これを0.1%のBSAを含むPBS2mLで二回遠心分離洗浄後、各0.1%のBSAを含むPBSで0.1mL/tubeとし二次抗体(Alexa Fluor546 Goat-anti mouse IgM)およびFITC標識抗CD14各2μLを加えて4℃で遮光して20分間反応させ蛍光抗体染色した。これにBizbenzimide Hoechst33342 (2mg/mL)を2μLおよび0.1%のBSAを含むPBSを0.1mL/tube加え、4℃で遮光して20分間反応させ核染色した。反応後0.1%のBSAを含むPBS2mLで1回遠心分離洗浄後、150μLのCell Fixをくわえ細胞固定した。
【０１７６】
(中皮細胞の測定)
Image Cytometryを用いて測定を行った。透明底黒色96wellplate  (Coster) で染色および固定済み細胞の浮遊液150μL/well を測定対象とした。測定結果はAlexaFluor 546に赤、FITCに黄、Hoechst33342に青を割り当て、擬似カラー合成画像として出力させた。図１０にこの画像を示す。
【０１７７】
図１０は、ネガティブマーカーを利用した中皮細胞識別の実施例である。ＨＢＭＥ−１による中皮細胞マーカー染色に赤、抗CD14による単球マーカー染色に黄、Hoechst33342による核染色に青を割り当てた擬似カラー合成画像。適切な画像解析ソフトにより容易に識別解析できる。
【０１７８】
（結果およびまとめ）
赤で表示されている中皮細胞以外の細胞はほぼ黄色の発色を示している。黄色であらわされていることからCD14陽性であり腹腔マクロファージであることを強く示唆する。したがってCD14陰性の細胞を選択することによっても中皮細胞を検出しうることが推定される。
【０１７９】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本発明は、医薬品産業等において利用性を有する。特に、腹膜透析液および腹膜または中皮細胞関連疾患の治療薬、予防薬、診断薬の製造において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】実施例１の結果について、MaT-Aの累積分布グラフによる面積分布計数算出を示す。
【図２】実施例１の結果について、検体MaT-Aにおける投影面積の分布を示す。
【図３】実施例１の結果について、検体MaT-AのＨＢＭＥ−１(赤)およびHoechst33342(青)の蛍光撮影画像の擬似カラー合成写真を示す。
【図４】実施例２の結果について、MaT-Bの累積分布グラフによる面積分布計数算出を示す。
【図５】実施例２の結果について、検体MaT-Bにおける投影面積の分布を示す。
【図６】実施例２の結果について、検体MaT-BのＨＢＭＥ−１(赤)およびHoechst33342(青)の蛍光撮影画像の擬似カラー合成写真を示す。
【図７】実施例３の結果について、MaT-Cの累積分布グラフによる面積分布計数算出を示す。
【図８】実施例３の結果について、検体MaT-Cにおける投影面積の分布を示す。
【図９】実施例３の結果について、検体MaT-CのＨＢＭＥ−１(赤)およびHoechst33342(青)の蛍光撮影画像の擬似カラー合成写真を示す。
【図１０】図１０は、ネガティブマーカーを利用した中皮細胞識別の一例を示す。ＨＢＭＥ−１による中皮細胞マーカー染色に赤、抗CD14による単球マーカー染色に黄、Hoechst33342による核染色に青を割り当てた擬似カラー合成画像。適切な画像解析ソフトにより容易に識別解析できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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