(57)【要約】【課題】メラニン産生抑制剤並びに美白化粧料の開発【解決手段】ロリオライドを含有するメラニン産生抑制剤又は美白化粧料。【選択図】図１
2008056616.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロリオライドを含有することを特徴とするメラニン産生抑制剤。
【請求項２】
ロリオライドを含有することを特徴とするチロシナーゼ阻害剤。
【請求項３】
ロリオライドを含有することを特徴とする美白化粧料。
【請求項４】
ロリオライドを含有することを特徴とする化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン産生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
大気汚染やオゾン層の破壊などに起因して、人の表皮に届く紫外線量は年々増加する傾向にあり、それに伴い、紫外線による肌のシミ、ソバカス、色黒などの肌悩みが大きな問題となっている。紫外線が照射されることにより、皮膚内に存在するチロシンがチロシナーゼ酵素の働きにより酸化されてメラニン色素が産生され、これが過剰に産生されると、シミ、ソバカス、色黒などの肌悩みとなって表れる。このメラニン色素の産生を抑制し、シミ、ソバカス、色黒を予防する方法として、従来より、皮膚の美白を目的として、皮膚化粧料にL-アスコルビン酸及びその誘導体であるL-アスコルビン酸グルコース配糖体を配合することが行なわれており（例えば、特許文献１：特開平４−１８２４１２号公報参照）、さらにL-アスコルビン酸グルコース配糖体とアミノ酸又はその誘導体を組み合わせて配合した皮膚外用剤（例えば、特許文献２：特開平４−１８２４１３号公報参照）など多数提案されている。しかしながら、これらの美白剤は美白効果が必ずしも十分に認められないものであったり、美白効果を示す成分を、美白効果を認める濃度で配合すると安全性や安定性に問題を生じることがあった。
ロリオライド配糖体は葉たばこから単離され、たばこ用香喫味改良剤として使用できることが知られている（特許文献３：特開昭５７−２１２１９７号公報参照）。また、ロリオライドは医薬用免疫抑制剤（特許文献４：特開平７−１３８１５６号公報参照）、作物発芽抑制剤（特許文献５：特開２００２−２５５７０６号公報）、茶フレーバー組成物（特許文献６：特開２００５−１４３４６７号公報参照）、として利用されることが知られているが、ロリオライドに美白作用があることは知られていなかった。
【０００３】
【特許文献１】特開平４−１８２４１２号公報
【特許文献２】特開平４−１８２４１３号公報
【特許文献３】特開昭５７−２１２１９７号公報
【特許文献４】特開平７−１３８１５６号公報
【特許文献５】特開２００２−２５５７０６号公報
【特許文献６】特開２００５−１４３４６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、優れたメラニン産生抑制剤並びに美白化粧料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（１）ロリオライドを含有することを特徴とするメラニン産生抑制剤。
（２）ロリオライドを含有することを特徴とするチロシナーゼ阻害剤。
（３）ロリオライドを含有することを特徴とする美白化粧料。
（４）ロリオライドを含有することを特徴とする化粧料。
【発明の効果】
【０００６】
本発明で用いるロリオライドはメラニン産生抑制作用があり、美白効果を奏する。ロリオライドを含有した美白化粧料を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
ロリオライドは下記式（１）で表される化合物である。
【０００８】
【化１】
2008056616.tif 000003
（１）
【０００９】
ロリオライドは、カロテノイドの酸化代謝物であり、例えば、ケール、イネ籾殻、麦種子殻、褐藻、サルビア、ツユクサ、ジギタリスの抽出物から分離して入手することができる。ケールは、南ヨーロッパ原産のアブラナ科植物の野菜で、キャベツの原種と言われており、その学名は、Brassicca Oleracea L．var．acephala DC.である。このケールには、キッチンケール、マローケール、ブッシュケール、ツリーケール、コラード、緑藻カンランなどの種類がある。
ロリオライドは、ケールの葉、茎、花、根などを濃度５０〜９９．５質量％、好ましくは７０〜８０質量％のエタノールで抽出して得られた抽出物の脂溶性画分に多く含まれている。
具体的には、例えば、ケールの葉、茎、花や根などの乾燥物に濃度５０〜９９．５質量％、好ましくは７０〜８０質量％エタノールを加え、室温で数時間ないし数十時間の間浸漬・攪拌することによりその抽出液を得て、この抽出液をおよそ１０〜２０倍程度まで加熱蒸発等によって濃縮し、分液ロートなどによって水溶性画分と脂溶性画分とに分離して得られた脂溶性画分である。ここで得られた脂溶性画分は、さらにその濃度が５０質量％のエタノールを用いて再度抽出を行い、分液ロートによって２層に分離することができる。
【００１０】
これらのうちの水溶性画分は主に水溶性の高い糖類や食物繊維などから構成されている。一方、脂溶性画分のうちの５０質量％エタノールに溶解しない画分（脂溶性画分Ｉ）は主としてクロロフィルやフィトステロールなどである。また、５０質量％エタノールに溶解する画分（脂溶性画分Ｓ）は主としてポリフェノール類などから構成されている。ロリオライドはこの脂溶性画分Ｓに含まれているので、脂溶性画分Ｓから逆相ＨＰＬＣなどでロリオライドを分離精製することによって得ることができる。
ロリオライドは公知の方法（特開昭５８−１６４５３８）で合成することもできる。
本発明のメラニン産生抑制剤は、ロリオライドをそのまま使用してもよいし、上記のようにして得たロリオライドを含有するケールのエタノール抽出物の脂溶性画分をそのままの状態で含有する組成物として使用してもよい。
【００１１】
本発明のメラニン産生抑制剤を、直接化粧料成分として使用し、美白化粧料を製造することができる。このような美白化粧料には、植物油のような油脂類、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、防腐剤、糖類、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子のような高分子、増粘剤、粉体成分、紫外線吸収剤、紫外線遮断剤、ヒアルロン酸のような保湿剤、香料、ｐＨ調整剤などを含有させることができる。さらに、ビタミン類、皮膚賦活剤、血行促進剤、活性酸素消去剤、抗炎症剤、美白剤等のほかの薬効成分、生理活性成分を含有させることができる。
【００１２】
美白化粧料の種類としては、化粧水、乳液、クリーム、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップクリーム、乳液状又はクリーム状あるいは軟膏型のファンデーションといったメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション等の身体用化粧料等とすることができる。ロリオライドを含有するメラニン産生抑制剤を含有させた美白化粧料としては、その機能面からは、例えば乳液、化粧液、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ローション、エッセンスなどが好ましい。
このような本発明のメラニン産生抑制剤を含有する美白化粧料は、常法に従って製造することができる。美白化粧料におけるロリオライドの添加量は、特に限定されるものではないが、一例としてあげると、化粧料全重量の０．００１〜２０質量％、好ましくは０．０１〜１０質量％が適当である。
【実施例１】
【００１３】
次に、本発明を実施例によって更に詳しく説明する。以下の製造例、実施例、処方例は本発明の好ましい例を示すものであり、これに限定されるものではない。また、各例中の「％」は質量基準である。
【００１４】
１）ロリオライドの製造
乾燥させたケールの葉を粉砕し、ケール粉砕物１２ｋｇを２００Ｌドラムに入れ、７０％エタノール、９６Ｌ、７２Ｌ、７２Ｌで３回抽出し、この抽出液を合わせて（１６９Ｌ）、１２．０ｋｇまで減圧濃縮した。次いで、遠心分離し、上層と下層に分けた。下層を分離し、３．６Ｌの水で２回洗浄し、５０％エタノール４８Ｌに溶解した。このエタノール溶液を、さらに遠心分離し、上層を分離して、濃縮乾固させてケールエタノール抽出物の「脂溶性画分Ｓ」として９５ｇを得た。
【００１５】
２）脂溶性画分Ｓ中の成分の中圧液体クロマトグラフィーによる分取
得られた脂溶性画分Ｓの９５ｇのうちの５０ｇを用いて、以下の方法と条件によって分離精製した。
・機器構成：
中圧液体クロマトグラフィーシステム：Ｋｒｏｎｌａｂ  ＧｍｂＨ
逆相カラム：Ｐｏｌｙｇｏｐｒｅｐ  ６０−５０  ＲＰ−１８（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆
Ｎａｇｅｌ）
・溶離液：
精製水１００％、続いて、精製水１００％→メタノール１００％のグラジエント、続いて、イソプロパノール１００％
・分取物  
溶離液が精製水１００％で溶出した分画Ｐ（０．４２ｇ）を得た。
【００１６】
３）分画Ｐ脱塩物含まれる成分の高速液体クロマトグラフィーによる分離
得られた分画Ｐ０．４２ｇを用いて、以下の方法と条件によって分離精製した。
・機器構成：
全自動分画・精製・分取システム：ＳＥＰＢＯＸＬｉｇｈｔ
分取カラム：  
Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｌｅｃｔ Ｂ  ２５０×１６ｍｍ、１０μｍ
検出器：ＥＬＳＤ（Ｓｅｄｅｘ７５）
ＵＶ（Ｍｅｒｃｋ、２５４ｎｍ）
・溶離液：
流  速：
１５ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：Ａ・・・０．５ｍＭギ酸アンモニウム、０．１％ギ酸水溶液
：Ｂ・・・０．５ｍＭギ酸アンモニウム、０．１％ギ酸のアセトニトリル：メタノール＝１：１溶液
グラジエント：表１に示す。
【００１７】
【表１】
2008056616.tif 000004
【００１８】
・分取物
分取物をＳＰＥカラム（Ｌｉｃｈｒｏｌｕｔ  ＥＮ-Ｍｅｒｃｋ）で脱塩し、サンプル（ａ）０．８ｍｇを得た。
【００１９】
４）サンプル（ａ）の高速液体クロマトグラフィーによる純度確認、並びに保持時間の確認
・機器構成：
ＨＰＬＣシステム：Ｍｅｒｃｋ  Ｈｉｔａｃｈｉ
分析カラム：  Ｍｅｒｃｋ Ｓｕｐｅｒｓｐｈｅｒ６０  ＲＰ  ＳｅｌｅｃｔＢ  １２５×４ｍｍ
検出器：ＥＬＳＤ（Ｓｅｄｅｘ７５）、ＵＶ（Ｍｅｒｃｋ、２５４ｎｍ）
・溶離液：
流  速：１ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：Ａ・・・０．５ｍＭギ酸アンモニウム、０．１％ギ酸水溶液
Ｂ・・・０．５ｍＭギ酸アンモニウム、０．１％ギ酸のアセトニトリル：メタノール＝１：１溶液
グラジエント：表２に示す。
【００２０】
【表２】
2008056616.tif 000005
本分析条件により、サンプル（ａ）の純度を確認した。保持時間は１４．０１分であった。
【００２１】
５）サンプル（ａ）の構造決定
上記の３）で分取したサンプル(ａ)について、ＬＣ／ＭＳ分析装置及びＮＭＲ分析装置を用いて化合物の構造決定を行なった。
ＬＣ／ＭＳ分析の溶離液は４）と同じものを用い、グラジエント条件は適宜調整した。
ＭＳシステムはＰＥ-Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ１５０（+/(-)-ＥＳＩ、Ｆａｓｔ-Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ-Ｍｏｄｅ）を使用した。
１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＨＨ−ＣＯＳＹは共鳴周波数４００ＭＨｚあるいは５００ＭＨｚで測定した。１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルはＨＭＢＣ、ＨＳＱＣの手法を用いて帰属した。溶媒は重メタノールを用い、化学シフト基準に使用した（１Ｈ−ＮＭＲ３．３０ｐｐｍ、１３Ｃ−ＮＭＲ４９．０ｐｐｍ）。
以上のようにして抽出分離した各サンプルのＬＣ／ＭＳ分析、ＮＭＲ分析の結果を以下に示す。
ＬＣ／ＭＳ
（+)−ＥＳＩ：１９７[Ｍ＋Ｈ]＋
１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ
スペクトルの帰属と化学シフトを表３に示す。対応する原子の位置を化学式で示す。
【００２２】
【化２】
2008056616.tif 000006
【００２３】
【表３】
2008056616.tif 000007
【実施例２】
【００２４】
メラニン産生抑制作用の評価試験 
B16マウスメラノーマ細胞をグルコサミン0.1%(w/v)の入ったMEM培地で48wellプレートに3,000cells/well播種し、5日間培養した。その後、培地をテオフィリン0.03%(w/v)の入ったMEM培地にサンプルを入れたものに交換し、3日間培養した。サンプルは予め終濃度0.5%のエタノールで溶解後、添加した。細胞を洗浄後、0.1%SDS水溶液により可溶化して475nm、260nmの吸光度を測定し、S475、S260とした。メラニン量比はサンプルを添加しない培地で培養した細胞の475nm、260nmにおける吸光度をC475、C260として式１により計算した。
【００２５】
(数１)
メラニン量比(%)＝｛（S475／S260）／(C475／C260)｝×100      （式１）
【００２６】
陽性対照サンプルとして美白成分として広く使用されているアスコルビン酸、コウジ酸、アルブチンを用いた。
メラニン量比が５０％となるサンプル濃度をメラニン産生のＩＣ５０（５０％阻害濃度）とし、ロリオライドと陽性対照サンプルを比較した。結果を表４に示す。
【００２７】
【表４】
2008056616.tif 000008
【００２８】
ロリオライドのメラニン産生のＩＣ５０は、陽性対照サンプルのアスコルビン酸の約１／６、コウジ酸の約１／３であり、優れたメラニン産生抑制効果を示した。また、ロリオライドのメラニン産生のＩＣ５０は、アルブチンと同程度であった。
【実施例３】
【００２９】
チロシナーゼ阻害作用の評価試験
サンプルを溶解した100mM Sodium succinate buffer (pH5.5）溶液100μlにチロシナーゼ300U/ml(100mM Sodium succinate buffer pH5.5)を混合して30℃10分インキュベートし、予め30℃にインキュベートした6mM  L-DOPA/100mM  Sodium succinate buffer pH5.5 を40μl添加し、30℃40分間振とうしながらインキュベートした。その後、475nmにおける吸光度を測定した。サンプルをいれないものをコントロールとし、L-DOPAを入れないものをブランクとし、以下の計算式によりチロシナーゼ阻害率を算出した。
【００３０】
(数２)
チロシナーゼ阻害率＝｛１− (サンプル吸光度−サンプルブランク吸光度)／(コントロール吸光度−コントロールブランク吸光度)｝×１００（％）          （式２）
【００３１】
陽性対照サンプルとして美白成分として広く使用されているアスコルビン酸、コウジ酸、アルブチンを用いた。結果を表５、図１に示す。
【００３２】
【表５】
2008056616.tif 000009
【００３３】
陽性対照サンプルのアスコルビン酸、コウジ酸、アルブチンと比べて、ロリオライドのチロシナーゼ阻害率は高かった。ロリオライドのチロシナーゼ阻害率は、陽性対照サンプルの中でチロシナーゼ阻害率が最も高いコウジ酸と比べて２倍以上であった。
【００３４】
次に、本発明のメラニン産生抑制剤を含む美白化粧料の処方例を示す。
処方例１：美白化粧水
上記の実施例１で得られたロリオライドを用いて、常法により下記組成の美白化粧水を製造できる。
（組成）                            （質量％）
グリセリン                              ８．０
１，３−ブチレングリコール              ２．０
クエン酸                                ０．１
Ｌ−セリン                              ０．０５
ロリオライド                            ０．５
精製水                                  残余
【００３５】
処方例２：美白クリーム
上記の実施例１で得られたロリオライドを用いて、常法により下記組成の美白クリームを製造できる。
（組成）                            （質量％）
ステアリルアルコール                    ６．０
ステアリン酸                            ２．０
スクワラン                              ９．０
オクチルドデカノール                  １０．０
１，３−ブチレングリコール              ０．５
ホ゜リエチレンク゛リコール１５００      ４．０
POE(25)セチルアルコールエーテル         ３．０
モノステアリン酸ク゛リセリル            ２．０
ロリオライド                            １．０
精製水                                  残余
【００３６】
処方例３：美白パック
ロリオライドを用いて、常法により下記組成の美白パックを製造できる。
（組成）                            （質量％）
ポリビニルアルコール                  １５．０
カルホ゛キシメチルセルロース            ５．０ 
１，３−ブチレングリコール              ５．０
エタノール                            １２．０
POE(25)オレイルアルコールエーテル       ０．５
クエン酸                                ０．０２
クエン酸ナトリウム                      ０．０４
ロリオライド                            １．０
精製水                                  残余
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ロリオライドのチロシナーゼ阻害作用の評価試験の結果を示すグラフである。
【図１】
2008056616.tif 000010