(57)【要約】      （修正有）【課題】鋳型核酸からＤＮＡの生成及び更なるＤＮＡ増幅を行う際にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に有用な新規組成物及び方法の提供。【解決手段】ＤＮＡを合成する酵素反応においてＤＮＡ合成の促進に効果のある陰イオン物質を含有することを特徴とする反応液組成物。具体的には、ジカルボン酸塩からなる２価のカルボキシルイオン、中でも特にしゅう酸イオン，マロン酸イオン，マレイン酸イオンの少なくとも１種類を含有する反応液組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡを合成する酵素反応においてＤＮＡ合成の促進に効果のある陰イオン物質として、シュウ酸イオン、マロン酸イオン、マレイン酸イオンの少なくとも１種類          を含有することを特徴とする反応液組成物。
【請求項２】
請求項１においてシュウ酸イオン、マロン酸イオン、マレイン酸イオンが無機塩の形で添加されることを特徴とする反応液組成物。
【請求項３】
請求項２においてシュウ酸イオン、マロン酸イオン、マレイン酸イオンがアルカリ金属またはアルカリ土類金属またはアンモニウムとの塩の形で添加されることを特徴とする反応液組成物。
【請求項４】
請求項３においてシュウ酸イオン、マロン酸イオン、マレイン酸イオンがカリウム塩、あるいはナトリウム塩の形で少なくともどちらか１種を含む形態で添加されることを特徴とする反応液組成物。
【請求項５】
シュウ酸イオン、マロン酸イオン、マレイン酸イオンが、シュウ酸亜鉛、シュウ酸アンモニウム、シュウ酸カリウム、シュウ酸カルシウム、シュウ酸ジエチル、シュウ酸Ｎ，Ｎ'−ジスクシンイミジル、シュウ酸ジメチル、シュウ酸すず、シュウ酸セリウム、シュウ酸鉄、シュウ酸銅、シュウ酸ナトリウム、シュウ酸ニッケル、シュウ酸ビス、シュウ酸（２，４−ジニトロフェニル）、シュウ酸（２，４，６−トリクロロフェニル）、シュウ酸マンガン、シュウ酸メチル、シュウ酸ランタン、シュウ酸リチウム、または、マロン酸イソプロピリデン、マロン酸エチル、マロン酸ジエチル、マロン酸ジベンジル、マロン酸ジメチル、マロン酸タリウム、マロン酸二ナトリウム、または、マレイン酸一ナトリウム、マレイン酸ジエチル、マレイン酸クロルフェニラミン、マレイン酸ジ−ｎ−ブチル、マレイン酸モノ−ｎ−ブチルエステルからなる群のうち少なくとも１つから調製され添加されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の反応液組成物。
【請求項６】
ＤＮＡ合成を行う反応液成分として、鋳型となる核酸、ＤＮＡ合成酵素、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、１種以上のヌクレオチド又は、それらの誘導体、緩衝剤、塩から成る群のうち少なくとも１つを含有する請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
鋳型となる核酸がＲＮＡであることを特徴とする請求項６記載の組成物。
【請求項８】
鋳型となる核酸がＤＮＡであることを特徴とする請求項６記載の組成物。
【請求項９】
前記ＤＮＡ合成酵素が、逆転写酵素であることを特徴とする請求項６または７記載の組成物。
【請求項１０】
前記逆転写酵素が、ＡＭＶ−ＲＴ，Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ，ＨＩＶ−ＲＴ，ＥＩＡＶ−ＲＴ，ＲＡＶ２−ＲＴ，Ｃ．ヒドロゲノホルマンス（Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）Ｉ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩ、並びにそれらの突然変異体、変異体及び誘導体から成る群から選択される請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ合成酵素が、ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項６または８記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ合成酵素が、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ合成酵素が、耐熱性のα型ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１１記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ合成酵素が、耐熱性のＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１１記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ合成酵素が、耐熱性のα型ＤＮＡポリメラーゼと耐熱性のＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを混合した混合型酵素であることを特徴とする請求項１１記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ，ＥＸ−Ｔａｑ，ＬＡ−Ｔａｑ，Ｅｘｐａｎｄシリーズ，Ｐｌｕｔｉｎｕｍシリーズ，Ｔｂｒ，Ｔｆｌ，Ｔｒｕ，Ｔｔｈ，Ｔ１ｉ，Ｔａｃ，Ｔｎｅ，Ｔｍａ，Ｔｉｈ、Ｔｆｉ，Ｐｆｕ，Ｐｆｕｔｕｂｏ，Ｐｙｒｏｂｅｓｔ，Ｐｗｏ，ＫＯＤ，Ｂｓｔ，Ｓａｃ，Ｓｓｏ，Ｐｏｃ，Ｐａｂ，Ｍｔｈ，Ｐｈｏ，ＥＳ４，ＶＥＮＴ，ＤＥＥＰＶＥＮＴ、並びにそれらの突然変異体、変異体及び誘導体から成る群から選択される請求項１１記載の組成物。
【請求項１７】
前記緩衝剤が、トリス（ＴＲＩＳ）、トリジン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス−トリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）から成る群から選択される請求項６記載の組成物。
【請求項１８】
前記塩が、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、及び酢酸リチウムから成る群から選択される請求項６記載の組成物。
【請求項１９】
さらに、ＤＮＡ合成に有用な添加剤として、ＤＭＳＯ、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム、ＰＥＧ、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、ＮＰ４０、エクトイン、ポリオール類、大腸菌ＳＳＢタンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、ＢＳＡから成る群から選択される少なくとも１つを含む請求項６記載の組成物。
【請求項２０】
前記ヌクレオチドが、デオキシホスホヌクレオチド又はその誘導体である請求項６記載の組成物。
【請求項２１】
前記デオキシホスホヌクレオチドが、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＩＴＰ，ｄＵＴＰ、α−チオ−ｄＮＴＰ類、ビオチン−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、及びシゴキシゲニン−ｄＵＴＰから成る群から選択される請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物を用いたＤＮＡの合成方法。
【請求項２３】
ＤＮＡの合成方法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＣＲ増幅が、少なくとも２５回のＤＮＡ変性、アニーリング、ＤＮＡ重合過程を繰り返すことから成る請求項２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に属する。本発明は、鋳型核酸からＤＮＡの生成及び更なるＤＮＡ増幅を行う際に有用な新規組成物及び方法に関する。本発明は、具体的にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に有用な新規組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸類の検出、分析、転写及び増幅は、現代の分子生物学において最も重要な操作法である。ＤＮＡ分析のためにそのような操作法の適用は、遺伝子発現の研究、伝染性病原体（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔｓ）又は遺伝病の診断、ｃＤＮＡの生成及びレトロウイルス類の分析等においてとりわけ重要である。
【０００３】
ＤＮＡの増幅に用いられるＰＣＲは、当分野においては周知の技術である。具体的には、ＰＣＲ法に基づく遺伝子増幅方法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及びＤＮＡ合成酵素の存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である（Ｎａｔｕｒｅ，  ３２４  （６０９３），  １３−１９（１９８６））（非特許文献１）。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖標的核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖標的核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。
増幅のために好ましい反応条件は、熱循環（ｔｈｅｍｏｃｙｃ１ｉｎｇ）、即ちＰＣＲサイクルの各々のステップを達成させるために、反応混合物の温度を変化させることである。熱循環は、約２３℃〜約１００℃の間、好ましくは約３７℃〜約９５℃の間の温度範囲で行う。核酸変性は、約９０℃〜約１００℃の間、好ましくは約９４℃において通常行う。アニーリングは、約３７℃〜約７５℃の間、好ましくは約６０℃において通常行う。ＤＮＡの伸長は、約５５℃〜約８０℃の間、好ましくは約６８〜７２℃において通常行う。サイクリング数は、所望のＤＮＡ生成物の量により大きく異なる。ＰＣＲサイクルの数は、好ましくは約５〜約９９の範囲であり、より好ましくは約２０サイクルより多く、最も好ましくは約２５〜４０サイクルである。
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，  ３２４  （６０９３），  １３−１９（１９８６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＰＣＲ技術ははじめ、大腸菌などの常温菌由来のＤＮＡ合成酵素を用いて行われており、その成功率（実際に目的ＤＮＡが増幅する確率）は低いものであった。やがて、好熱菌由来の耐熱性ＤＮＡ合成酵素が利用されるようになり、自動的に温度サイクリングを行う機器も開発されＰＣＲ成功率が向上した。更に、ＰＣＲ成功率を向上させるため、使用するＤＮＡ合成酵素の改良、反応液組成の改良、サイクル温度条件の改良、温度サイクリング機器の性能向上、試薬の管理状態の改善など、多岐にわたり、ありとあらゆる改善がなされてきた。以上の結果、ＰＣＲ成功率は格段に向上したが、現在においても目的のＤＮＡが１００％獲得できるものではなく、ＰＣＲ成功率を向上させることはＰＣＲ技術を利用する者にとって永遠のテーマであった。
【０００５】
例えば、ＰＣＲ成功率を向上させるためのＤＮＡ合成酵素の改良として、バーンズが提案した２種類の耐熱性ＤＮＡ合成酵素を混合して利用する技術が上げられる（Ｂａｒｎｓ，  Ｗ．Ｍ．（１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，  ２２１６−２２２０）。ＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡ合成酵素は大きく２種類に分けられる。１つは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼに代表されるＰｏｌＩ型酵素であり、もうひとつは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼに代表されるα型酵素である。
一般的にＰｏｌＩ型酵素は、ＤＮＡ合成速度が速く、プロセッシビティ（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ；ＤＮＡポリメラーゼが基質ＤＮＡに結合してから離れるまでに合成されるヌクレオチドの数である）に優れる反面、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が無いことから誤った塩基を重合した場合、これを除去できず、その場で反応停止を行い、目的ＤＮＡを十分に増幅することができなかった。一方、α型酵素は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つことから誤った塩基を重合した場合でも、これを除去し、ＤＮＡ合成を継続することができるが、ＤＮＡ合成速度が遅く、プロセッシビティが低いため十分に目的ＤＮＡを増幅することができなかった。
そこで、この両者の長所を合わせる目的で２種類の酵素を混合した酵素（混合型酵素）が生まれた。この酵素は、ＰｏｌＩ型酵素を主成分としてＤＮＡ合成は主にＰｏｌＩ型酵素が行い、誤った塩基の校正のみα型酵素が行うものである。この技術を用いることによりＰＣＲ成功率を向上することができた。
また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に有用な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する研究も多数なされてきた。例えば、我々が発見したＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼは、単独酵素（α型酵素）でありながら上記２者の長所を併せ持つ酵素であり、ＤＮＡ合成速度が速く、プロセッシビティに優れ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を保有していた。該酵素のこれら長所はＰＣＲにおいても発揮され、優れたＰＣＲパフォーマンスを示していた。
更に、酵素の改良法としてＤＮＡ合成酵素の抗体を添加して常温下で酵素活性を完全に抑える方法（Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ法）が上げられる。常温で酵素反応によるプライマーダイマーなどの副産物の産生を抑えたり、ｐｒｉｍｅｒの分解を保護することによりＰＣＲ成功率を高めたものである。
【０００６】
ＰＣＲ反応液組成の改良としても様々な研究がなされたきた。緩衝剤には、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビスートリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、キャプス（ＣＡＰＳ）などが試された。塩溶液では、例えば塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸ンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン・塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、及び酢酸リチウムが試された。添加剤としては、例えばＤＭＳＯ、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム、ＰＥＧ、ツイン（Ｔｗｅｅｎ）２０，ＮＰ４０、エクトイン（ｅｃｔｏｉｎｅ）、ポリオール類、大腸菌（Ｅ．ｃｏ１ｉ）ＳＳＢタンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、ＢＳＡが試みられた。
上記試薬は全てのＤＮＡ合成酵素に有効というものではなく、それぞれの酵素で向き不向きがあり、それぞれの酵素に合わせて独自の反応液組成が検討され各種酵素には最適な反応緩衝液が添付されており、添付緩衝液よりも高性能化することは不可能と考えられていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記検討において、従来、塩溶液においては、核酸に作用するという観点から陽イオン物質（Ｋ＋，Ｎａ＋，ＮＨ４２＋など）に焦点が当てられてきた。しかしながら、我々は鋭意研究の結果、陰イオン物質もＰＣＲの成否を決めるために重要であることを見出した。具体的には、ＰＣＲ反応系へ、ジカルボン酸塩からなる２価のカルボキシルイオンを添加することによりＰＣＲの成功率が向上することを見出した。また、２価のカルボキシルイオンの中でも特にしゅう酸イオン，マロン酸イオン，マレイン酸イオンが効果的であることを発見した。
本発明においては、これらイオンが無機塩の形で添加されることを特徴とする。具体的には、しゅう酸亜鉛、しゅう酸アンモニウム、しゅう酸カリウム、しゅう酸カルシウム、しゅう酸ジエチル、しゅう酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル、しゅう酸ジメチル、しゅう酸すず、しゅう酸セリウム、しゅう酸鉄、しゅう酸銅、しゅう酸ナトリウム、しゅう酸ニッケル、しゅう酸ビス、しゅう酸（２，４−ジニトロフェニル）、しゅう酸（２，４，６−トリクロロフェニル）、しゅう酸マンガン、しゅう酸メチル、しゅう酸ランタン、しゅう酸リチウム、または、マロン酸イソプロピリデン、マロン酸エチル、マロン酸ジエチル、マロン酸ジベンジル、マロン酸ジメチル、マロン酸タリウム、マロン酸二ナトリウム、または、マレイン酸一ナトリウム、マレイン酸ジエチル、マレイン酸クロルフェニラミン、マレイン酸ジ−ｎ−ブチル、マレイン酸モノ−ｎ−ブチルエステルなどの試薬から調製され添加されることが可能である。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）ＤＮＡを合成する酵素反応においてＤＮＡ合成の促進に効果のある陰イオン物質を含有することを特徴とする反応液組成物。
（２）陰イオン物質がカルボキシル基であることを特徴とする（１）記載の反応液組成物。
（３）陰イオン物質が２価のカルボキシル基からなることを特徴とする（１）記載の反応液組成物。
（４）（３）において２価のカルボキシル基が無機塩の形で添加されることを特徴とする反応液組成物。
（５）（４）において２価のカルボキシル基がアルカリ金属またはアルカリ土類金属またはアンモニウムとの塩の形で添加されることを特徴とする（１）〜（４）に記載の反応液組成物。
（６）ＤＮＡを合成する酵素反応においてシュウ酸イオン、マロン酸イオン、マレイン酸イオンの少なくとも１種類を含有することを特徴とする（１）〜（５）に記載の反応液組成物。
（７）（６）においてシュウ酸イオン、マロン酸イオン、マレイン酸イオンが無機塩の形で添加されることを特徴とする反応液組成物。
（８）（７）においてシュウ酸イオン、マロン酸イオン、マレイン酸イオンがアルカリ金属またはアルカリ土類金属またはアンモニウムとの塩の形で添加されることを特徴とする（１）〜（７）に記載の反応液組成物。
（９）シュウ酸イオン、マロン酸イオン、マレイン酸イオンが、シュウ酸亜鉛、シュウ酸アンモニウム、シュウ酸カリウム、シュウ酸カルシウム、シュウ酸ジエチル、シュウ酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル、シュウ酸ジメチル、シュウ酸すず、シュウ酸セリウム、シュウ酸鉄、シュウ酸銅、シュウ酸ナトリウム、シュウ酸ニッケル、シュウ酸ビス、シュウ酸（２，４−ジニトロフェニル）、シュウ酸（２，４，６−トリクロロフェニル）、シュウ酸マンガン、シュウ酸メチル、シュウ酸ランタン、シュウ酸リチウム、または、マロン酸イソプロピリデン、マロン酸エチル、マロン酸ジエチル、マロン酸ジベンジル、マロン酸ジメチル、マロン酸タリウム、マロン酸二ナトリウム、または、マレイン酸一ナトリウム、マレイン酸ジエチル、マレイン酸クロルフェニラミン、マレイン酸ジ−ｎ−ブチル、マレイン酸モノ−ｎ−ブチルエステルからなる群のうち少なくとも１つから調製され添加されることを特徴とする（１）〜（８）に記載の反応液組成物。
（１０）（８）においてシュウ酸イオン、マロン酸イオン、マレイン酸イオンがカリウム塩、あるいはナトリウム塩の形で少なくともどちらか１種を含む形態で添加されることを特徴とする（１）〜（９）に記載反応液組成物。
（１１）ＤＮＡ合成を行う反応液成分として、鋳型となる核酸、ＤＮＡ合成酵素、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、１種以上のヌクレオチド又は、それらの誘導体、緩衝剤、塩、ＤＮＡ合成に有用な添加剤から成る群の少なくとも１つを含有する（１）〜（１０）に記載の組成物。
（１２）鋳型となる核酸がＲＮＡであることを特徴とする（１１）記載の組成物。
（１３）鋳型となる核酸がＤＮＡであることを特徴とする（１１）記載の組成物。
（１４）前記ＤＮＡ合成酵素が、逆転写酵素であることを特徴とする（９），（１０）記載の組成物。
（１５）前記逆転写酵素が、ＡＭＶ−ＲＴ，Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ，ＨＩＶ−ＲＴ，ＥＩＡＶ−ＲＴ，ＲＡＶ２−ＲＴ，Ｃ．ヒドロゲノホルマンス（Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）Ｉ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩ、並びにそれらの突然変異体、変異体及び誘導体から成る群から選択される（１１），（１２）記載の組成物。
（１６）前記ＤＮＡ合成酵素が、ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする（１１），（１３）記載の組成物。
（１７）前記ＤＮＡ合成酵素が、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする（１１），（１３）記載の組成物。
（１８）前記ＤＮＡ合成酵素が、耐熱性のα型ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする（１１），（１３）記載の組成物。
（１９）前記ＤＮＡ合成酵素が、耐熱性のＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする（１１），（１３）記載の組成物。
（２０）前記ＤＮＡ合成酵素が、耐熱性のα型ＤＮＡポリメラーゼと耐熱性のＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを混合した混合型酵素であることを特徴とする（１１），（１３）記載の組成物。
（２１）前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ，ＥＸ−Ｔａｑ，ＬＡ−Ｔａｑ，Ｅｘｐａｎｄシリーズ，Ｐｌｕｔｉｎｕｍシリーズ，Ｔｂｒ，Ｔｆｌ，Ｔｒｕ，Ｔｔｈ，Ｔ１ｉ，Ｔａｃ，Ｔｎｅ，Ｔｍａ，Ｔｉｈ、Ｔｆｉ，Ｐｆｕ，Ｐｆｕｔｕｂｏ，Ｐｙｒｏｂｅｓｔ，Ｐｗｏ，ＫＯＤ，Ｂｓｔ，Ｓａｃ，Ｓｓｏ，Ｐｏｃ，Ｐａｂ，Ｍｔｈ，Ｐｈｏ，ＥＳ４，ＶＥＮＴ，ＤＥＥＰＶＥＮＴ、並びにそれらの突然変異体、変異体及び誘導体から成る群から選択される（１１），（１３）記載の組成物。
（２２）前記緩衝剤が、トリス（ＴＲＩＳ）、トリジン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビスートリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）から成る群から選択される（１）〜（１３）記載の組成物。
（２３）前記塩が、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、及び酢酸リチウムから成る群から選択される（１１）記載の組成物。
（２４）  さらに、ＤＮＡ合成に有用な添加剤として、ＤＭＳＯ、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、塩化テトラメチノレアンモニウム、ＰＥＧ、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０，ＮＰ４０、エクトイン、ポリオール類、大腸菌ＳＳＢタンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、ＢＳＡから成る群から選択される少なくとも１つを含む（１１）記載の組成物。
（２５）前記ヌクレオチドが、デオキシポスホヌクレオチド又はその誘導体である（１１）記載の組成物。
（２６）前記デオキシホスホヌクレオチドが、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄ１ＴＰ，ｄＵＴＰ、α−チオ−ｄＮＴＰ類、ビオチンーｄＵＴＰ、フルオレセインーｄＵＴＰ、及びシゴキシゲニンーｄＵＴＰから成る群から選択される（２５）記載の組成物。
（２７）（１）〜（２６）のいずれかに記載の組成物を用いたＤＮＡの合成方法。
（２８）ＤＮＡの合成方法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む（２７）記載の方法。
（２９）前記ＰＣＲ増幅が、少なくとも２５回のＤＮＡ変性、アニーリング、ＤＮＡ重合過程を繰り返すことから成る（２８）記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
上述したように、本発明により、今まで不可能であった目的ＤＮＡに対してもＰＣＲが可能となり、ＰＣＲ成功率を高めることができた。また、２価のカルボン酸塩の添加効果は、全ての種類のＤＮＡ合成酵素で確認でき、単純なＤＮＡ合成反応だけでなく、ＰＣＲ法においても有効であった。
【実施例】
【００１０】
以下実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。
【００１１】
実施例１．
混合型酵素（ＥＸ−Ｔａｑ）におけるしゅう酸イオンの添加効果確認（図１）
ＥＸ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにて、しゅう酸イオンの添加効果を確認した。ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒはＥＸ−Ｔａｑ（宝酒造製）添付のものを用い、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、配列番号１、２記載のプライマー対０．３μＭ使用した。ＥＸ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ１．０Ｕを用い、鋳型にはヒト培養細胞Ｋ５６２由来のＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ２０ｎｇを使用し、しゅう酸イオンの添加濃度の違いによるＰＣＲ結果に及ぼす影響について調べた。９４℃，２分の前反応の後、９４℃，１５秒―６０℃，３０秒−６８℃，８．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＧｅｎｅＡｍｐ２４００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）にてＰＣＲを行った。
しゅう酸イオン無添加の場合には全く目的ＤＮＡの増幅が認められなかったが、１ｍＭしゅう酸イオンを添加した時に目的ＤＮＡの増幅が認められ、２〜３ｍＭ添加した場合に増幅量が最大であった。しゅう酸イオン１〜４ｍＭの範囲で目的ＤＮＡの増幅が確認できた。
以上の結果から、混合型酵素においてしゅう酸イオンの添加効果が確認できた。また、添加効果が見られる濃度範囲は４ｍＭ以下であったが、その至適濃度は、標的ＤＮＡの種類及び増幅サイズ、ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ組成等により異なることが予想された。
【００１２】
実施例２．
混合型酵素（ＥＸ−Ｔａｑ）を用いたＰＣＲで効果のある塩の種類確認（図２）
次に、実施例１と同じ条件にて、ＥＸ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲに効果のある塩の種類（塩化カリウム、酢酸カリウム、しゅう酸カリウム、しゅう酸ナトリウム、硫酸カリウム）を調査した。なお、各塩の使用量は実施例１で最も効果のあったイオン価４，６ｍＭとした。塩として、しゅう酸カリウム、しゅう酸ナトリウムを添加した場合のみ増幅が確認できた。現在よく汎用されている他のカリウム塩を添加した場合には増幅が見られなかった。以上の結果から陰イオンのしゅう酸イオンがＰＣＲに効果があることが示唆された。
【００１３】
実施例３．
混合型酵素（ＥＸ−Ｔａｑ）を用いたＰＣＲで効果のあるカルボン酸塩の種類確認（図３）
次に、実施例２と同じ条件にて、ＥＸ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲに効果のあるカルボン酸塩（しゅう酸カリウム、しゅう酸ナトリウム、コハク酸カリウム、ギ酸カリウム）の種類を調査した。実施例２と同様で、塩として、しゅう酸カリウム、しゅう酸ナトリウムを添加した場合のみ目的ＤＮＡの増幅が確認できた。
一価のカルボキシル基を持つギ酸、２価のカルボキシル基を持つコハク酸ではしゅう酸塩と同様の効果は確認できなかった。しかしながら、ギ酸カリウム、コハク酸カリウムは、しゅう酸塩と異なり、ＰＣＲ増幅に効果を及ぼす濃度範囲が異なる可能性があるので、完全な否定はできない。ある濃度域では、他のカルボン酸塩についてもＰＣＲに効果を及ぼすものと思われる。
【００１４】
実施例４．
ＰｏｌＩ型酵素（Ｔａｑ）におけるしゅう酸イオンの添加効果確認
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにて、しゅう酸イオンの添加効果を確認した。ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒはＴａｑ（東洋紡績製）添付（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），  ５０ｍＭ  ＫＣｌ，  １．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）のものを用い、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、各プライマー対０．３μＭ使用した。なお、β−ｇｌｏｂｉｎクラスター内の３．６ｋｂを増幅するＰＣＲ（図４）には配列番号３、４記載のプライマー対を、ｍｙｅｌｉｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ４．５ｋｂを増幅するＰＣＲ（図５）には配列番号５，６記載のプライマー対を使用した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕを用い、鋳型にはヒト培養細胞Ｋ５６２由来のＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ２０ｎｇを使用し、しゅう酸イオンの添加濃度の違いによるＰＣＲ結果に及ぼす影響について調べた。９４℃，２分の前反応の後、９４℃，１５秒―６０℃，３０秒−６８℃，８分を３０サイクル繰り返すスケジュールでＧｅｎｅＡｍｐ２４００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）にてＰＣＲを行った。
いずれのターゲットにおいても、しゅう酸イオン無添加の場合にはスメアしか認められなかった。しかしながら、β−ｇｌｏｂｉｎ  ３．６ｋｂのＰＣＲにおいては、２ｍＭしゅう酸イオンを添加した時にスメアの中にターゲットの増幅が認められ、４ｍＭ添加した場合には、スメアも見られなくなった。しゅう酸イオン４，５ｍＭの範囲できれいな増幅が確認できた。一方、ｍｙｅｌｉｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ４．５ｋｂのＰＣＲにおいては、１ｍＭしゅう酸イオン添加時にスメアの中にターゲットの増幅が認められ、２ｍＭ添加した場合には、スメアも見られなくなった。しゅう酸イオン２〜５ｍＭの範囲できれいな増幅が確認できた。
以上の結果から、ＰｏｌＩ型酵素においてもしゅう酸イオンの添加効果が確認できた。また、添加効果が見られる濃度範囲はおよそ５ｍＭ以下であるが、その至適濃度は、標的ＤＮＡの種類及び増幅サイズ、ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ組成等により異なるものと思われる。
【００１５】
実施例５．
α型酵素（ｎａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ）におけるしゅう酸イオンの添加効果確認（図６）
ｎＰｆｕポリメラーゼを用いたＰＣＲにて、しゅう酸イオンの添加効果を確認した。ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒはｎＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）添付（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５），  １０ｍＭ  ＫＣｌ，  １０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４，  ２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，  ０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，  １００ｕｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）のものを用い、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、配列番号５，６記載のプライマー対０．３μＭ使用した。ｎＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕを用い、鋳型にはヒト培養細胞Ｋ５６２由来のＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ２０ｎｇを使用し、しゅう酸イオンの添加濃度の違いによるＰＣＲ結果に及ぼす影響について調べた。９４℃，２分の前反応の後、９４℃，１５秒―６０℃，３０秒−６８℃，８分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＧｅｎｅＡｍｐ２４００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）にてＰＣＲを行った。
しゅう酸イオン無添加の場合にはスメアしか認められなかったが、しゅう酸イオン２〜５ｍＭの範囲で目的ＤＮＡの増幅が確認できた。
以上の結果から、α型酵素においてもしゅう酸イオンの添加効果が確認できた。また、添加効果が見られる濃度範囲はおよそ５ｍＭ以下であるが、その至適濃度は、標的ＤＮＡの種類及び増幅サイズ、ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ組成等により異なるものと思われる。
【００１６】
実施例６．
α型酵素（ｎａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ）を用いたＰＣＲで効果のある塩の種類確認（図７）
次に、実施例５と同じ条件にて、ｎＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲに効果のある塩の種類（塩化カリウム、酢酸カリウム、しゅう酸カリウム、硫酸カリウム）を調査した。なお、各塩の使用量は実施例５で最も効果のあったイオン価４，６ｍＭとした。現在よく汎用されているカリウム塩（塩化カリウム、酢酸カリウム、しゅう酸カリウム、硫酸カリウム）を添加した場合には目的ＤＮＡの増幅が見られず、しゅう酸カリウムを添加した場合のみ増幅が確認できた。以上の結果から陰イオンのしゅう酸イオンがＰＣＲに効果があることが明らかとなった。
【００１７】
実施例７．
Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ酵素（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ）におけるしゅう酸イオンの添加効果確認（図８）
Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ酵素におけるしゅう酸イオンの添加効果を確かめるため、ＫＯＤ（α型酵素）に２種類のＫＯＤ抗体が添加されたＨｏｔ  ｓｔａｒｔ酵素、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて検討した。ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡績製）添付のものを用い、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、配列番号１，２記載のプライマー対０．３μＭ使用した。ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕを用い、鋳型にはヒト培養細胞Ｋ５６２由来のＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ２０ｎｇを使用し、しゅう酸イオンの添加濃度の違いによるＰＣＲ結果に及ぼす影響について調べた。９４℃，２分の前反応の後、９４℃，１５秒―６０℃，３０秒−６８℃，８．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＧｅｎｅＡｍｐ２４００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）にてＰＣＲを行った。
しゅう酸イオン無添加の場合には多数のエキストラバンドが見られたが、しゅう酸カリウムの添加に伴い、エキストラバンドが解消し、目的ＤＮＡのみ増幅することができた。しゅう酸カリウムの至適濃度は３ｍＭ程度であり、５ｍＭ添加したときには目的ＤＮＡの増幅量の減少が見られた。
以上の結果から、Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ酵素においてもしゅう酸イオンの添加効果が確認できた。また、添加効果が見られる濃度範囲はおよそ５ｍＭ以下であるが、その至適濃度は、標的ＤＮＡの種類及び増幅サイズ、ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ組成等により異なるものと思われる。
【００１８】
実施例８．
Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ酵素（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ）を用いたＰＣＲで効果のある塩の種類確認（図９）
次に、実施例７と同じ条件にて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲに効果のある塩の種類（塩化カリウム、酢酸カリウム、ギ酸カリウム、しゅう酸カリウム、しゅう酸ナトリウム、コハク酸カリウム、硫酸カリウム）を調査した。なお、各塩の使用量は実施例７で最も効果のあったイオン価６ｍＭとした。現在よく汎用されているカリウム塩（塩化カリウム、酢酸カリウム、しゅう酸カリウム、硫酸カリウム）を添加した場合には目的ＤＮＡの増幅が見られず、しゅう酸カリウム、しゅう酸ナトリウムを添加した場合のみ目的ＤＮＡの増幅効果が確認できた。また、化学式から、比較的近縁であると思われたギ酸カリウム、コハク酸カリウムについても検討したが、しゅう酸塩と同様の効果は確認できなかった。ギ酸カリウム、コハク酸カリウムは、しゅう酸塩と異なり、ＰＣＲ増幅に効果を及ぼす濃度範囲が異なる可能性があるので、ＰＣＲへの添加効果について完全に否定することはできない。ある濃度域では、他のカルボン酸塩についてもＰＣＲに効果を及ぼす可能性があると思われる。
以上の結果から陰イオンのしゅう酸イオンがＨｏｔ  ｓｔａｒｔ酵素に対しても添加効果があることが明らかとなった。
【００１９】
実施例９．
Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ酵素（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ）におけるマロン酸イオン、マレイン酸イオンの添加効果確認（図１０）
次に、実施例７と同じ条件にて、しゅう酸塩以外にＰＣＲに効果のある塩の種類（マロン酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム）について調査した。マロン酸ナトリウムを添加した場合２ｍＭ添加時にエキストラバンドの減少傾向が見られ、６ｍＭ添加時にはエキストラバンドがほぼ消失し、目的ＤＮＡのみの増幅が確認できた。また、マレイン酸ナトリウムにおいては、４ｍＭ添加時にエキストラバンドの減少傾向が見られ、１０ｍＭ添加時にはエキストラバンドがほぼ消失し、目的ＤＮＡのみの増幅が確認できた。
以上の結果から、同じ２価のカルボン酸塩に属するマロン酸塩、マレイン酸塩においても添加効果が確認できた。また、添加効果が見られる濃度範囲はしゅう酸塩と比べ、いずれにおいても高い濃度であった。それぞれのジカルボン酸における至適濃度は、標的ＤＮＡの種類及び増幅サイズ、ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ組成等により異なるものと思われる。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明により、分子生物学の分野において有用な方法、殊に、鋳型核酸からＤＮＡの生成及び更なるＤＮＡ増幅を行う際に有用な新規組成物及び方法を提供する。更には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に有用な新規組成物及び方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】混合型酵素（ＥＸ−Ｔａｑ）を用いたＰＣＲにおいてしゅう酸イオンの添加効果を確認した電気泳動写真の代用図面である。
【図２】混合型酵素（ＥＸ−Ｔａｑ）を用いたＰＣＲで効果のある塩の種類を確認した電気泳動写真の代用図面である。
【図３】混合型酵素（ＥＸ−Ｔａｑ）を用いたＰＣＲで効果のあるカルボン酸塩の種類を確認した電気泳動写真の代用図面である。
【図４】ＰｏｌＩ型酵素（Ｔａｑ）におけるしゅう酸イオンの添加効果を確認した電気泳動写真の代用図面である。
【図５】ＰｏｌＩ型酵素（Ｔａｑ）におけるしゅう酸イオンの添加効果を確認した電気泳動写真の代用図面である。図４とは異なる標的ＤＮＡのＰＣＲにて評価している。
【図６】α型酵素（ｎａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ）におけるしゅう酸イオンの添加効果を確認した電気泳動写真の代用図面である。
【図７】α型酵素（ｎａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ）を用いたＰＣＲで効果のある塩の種類を確認した電気泳動写真の代用図面である。
【図８】Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ酵素（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ）におけるしゅう酸イオンの添加効果を確認した電気泳動写真の代用図面である。
【図９】Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ酵素（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ）を用いたＰＣＲで効果のある塩の種類を確認した電気泳動写真の代用図面である。
【図１０】Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ酵素（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ）  におけるマロン酸イオン、マレイン酸イオンの添加効果を確認した電気泳動写真の代用図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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