(57)【要約】      （修正有）【課題】未利用海洋資源としてのホタテ貝外套膜の有効な利用法を提供すること、および高血圧症の予防や改善に有用なアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤を安全性の高い食品より安価に提供すること。【解決手段】ホタテ貝外套膜またはその加工製品を蛋白質分解酵素により処理して得られる蛋白質分解物を含むアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤。この阻害剤を含有する食品素材および食品は血圧低下作用を有し、高血圧の予防、改善に利用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホタテ貝外套膜由来の蛋白質分解物を含むアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【請求項２】
ホタテ貝外套膜由来の蛋白質分解物が、ホタテ貝外套膜またはホタテ貝外套膜を原料とする加工製品を蛋白質分解酵素で処理して得られるものである、請求項１記載の阻害剤。
【請求項３】
蛋白質分解酵素がペプシン、トリプシン、キモトリプシンおよびサーモライシンからなる群より選ばれる１種または２種以上の酵素である、請求項２記載の阻害剤。
【請求項４】
蛋白質分解酵素がサーモライシンまたはサーモライシンを含む２種以上の酵素である、請求項２記載の阻害剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかの項記載のアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤を含む、血圧降下作用を有する食品素材。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかの項記載のアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤を含む、高血圧症の予防または改善用の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤、並びにこの酵素阻害剤を含有する食品素材および食品に関する。この食品素材および食品はアンギオテンシンＩ変換酵素阻害活性により血圧降下作用を有し、高血圧の予防や改善に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ホタテ貝柱加工の際には中腸腺、生殖巣などの内臓と共に多量の外套膜が副産物として得られる。一部は珍味として用いられるものの、そのほとんどが廃棄されているのが現状であり、未利用海洋資源の有効利用の観点からホタテ貝外套膜の有効利用開発が求められている。
【０００３】
一方、高血圧は我が国では三大生活習慣病に挙げられ、脳卒中、虚血性心疾患、動脈硬化のリスクファクターとして知られている。高血圧の発症にはレニン−アンギオテンシン系が関連しており、特にこの系中で、アンギノテンシンＩがアンギオテンシンＩ変換酵素により、強い昇圧作用を有するアンギオテンシンIIに変換されることが重要な役割を果たしている。そこでこの酵素活性を阻害することにより血圧の上昇を抑制して血圧降下作用を示すアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤の開発が行われている。食品中にもアンギオテンシンＩ変換酵素の阻害物質が各種見出されているが、これまでホタテ貝外套膜由来のタンパク質分解物については検討されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ホタテ貝貝柱製造時に廃棄されていたホタテ貝外套膜を有効利用することである。また、本発明の別の目的は、高血圧症の予防や改善に有効なアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤を安全性の確認された食品より安価に提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ホタテ貝外套膜を有用利用するための検討を行った結果、ホタテ貝外套膜の蛋白質分解物について優れたアンギオテンシンＩ変換酵素阻害活性があることを初めて見出し、本発明の完成に至ったものである。
【０００６】
即ち、本発明はホタテ貝外套膜由来の蛋白質分解物を含むアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤に関する。この阻害剤に用いるホタテ貝外套膜由来の蛋白質分解物は、ホタテ貝外套膜またはホタテ貝外套膜を原料とする加工製品を蛋白質分解酵素で処理して得られるものである。また、使用する蛋白質分解酵素はペプシン、トリプシン、キモトリプシンおよびサーモライシンからなる群より選ばれる１種または２種以上の酵素であるのが好ましい。
【０００７】
本発明はさらに、上記のアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤を含む、血圧降下作用を有する食品素材、および上記アンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤を含む、高血圧症の予防または改善用の食品も提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ホタテ貝外套膜から低価格で大量にアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤を提供できる。この阻害剤は食品由来であるため安全性が高く、副作用の問題はないので、そのままで、あるいは適宜添加剤や他の食品成分と混合したり、また通常の食品中に含有させて、血圧降下作用を有する食品素材や食品として利用できる。従って、高血圧症の予防、改善に有効な食品素材および食品を提供できる。また、本発明はこれまであまり利用されていなかったホタテ貝外套膜の有効な利用法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤は、ホタテ貝外套膜由来の蛋白質分解物を含む。この分解物は、ホタテ貝外套膜またはホタテ貝外套膜を原料とする加工製品を蛋白質分解酵素で処理して得られる。
【００１０】
原料となるホタテ貝外套膜としては、ホタテ貝または貝柱を取り除いた後のホタテ貝から得られる外套膜、ボイル加工品から得られる外套膜、外套膜乾燥品およびその粉末状のもの等、ホタテ貝外套膜由来の蛋白質が含まれているものが使用できる。
【００１１】
使用する蛋白質分解酵素は特に限定されないが、アンギオテンシンＩ変換酵素阻害活性の優れた蛋白質分解物が得られる点で、ペプシン、トリプシン、キモトリプシンおよびサーモライシンからなる群より選ばれる１種または２種以上の酵素であるのが好ましく、サーモライシンまたはサーモライシンを含む２種以上の酵素であるのが特に好ましい。蛋白質分解酵素としては市販の製品を使用することができる。
【００１２】
蛋白質分解酵素での処理は、水洗し脱水したホタテ貝外套膜に、脱イオン水などを加え、粉砕して得られた懸濁液に、蛋白質分解酵素を加え、使用する酵素の至適温度、至適pHに調整して反応を行わせる。例えば、ペプシンではpH1.2 、温度37℃、トリプシンではpH6.8 、温度37℃、キモトリプシンではpH6.8 、温度37℃、サーモライシンではpH7.5 温度70℃が適当である。酵素の添加量は、使用する酵素の力価などによっても異なるが、外套膜湿重量に対して0.5 〜３％、好ましくは0.5 ％程度である。反応時間は、使用する酵素の種類、添加量、反応温度、pHなどにより変動するが、通常18〜30時間、好ましくは18〜24時間である。
【００１３】
ホタテ貝外套膜を上記のような反応条件で、多少の残留物や砂は残るがほとんど外套膜由来の蛋白質が分解されて水に溶解するまで蛋白質分解処理する。酵素反応の停止は加熱により行うことができ、例えば98℃で15分間程度加熱する。サーモライシンではオートクレーブで110 ℃、15分間程度の加熱により酵素反応を停止するのが好ましい。
【００１４】
酵素反応液はそのままでもアンギオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するので、それを使用することもできるが、遠心分離、濾過などの分離手段によりにより固形分を除去して得られる上清を用いてもよい。さらに、この蛋白質分解物溶液を噴霧乾燥や凍結乾燥法などの乾燥法により粉末状とすることもできる。
【００１５】
上記のようにして得られるホタテ貝外套膜由来の蛋白質分解物は、以下の試験例で実証されるように、優れたアンギオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有する。さらに高血圧自然発症ラットを用いたin vivo 薬理効果試験において血圧降下作用が確認された。
【００１６】
本発明のアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤は、上記のようにして得られたホタテ貝外套膜由来の蛋白質分解物を単独で、または適宜担体や添加剤と混合したものからなる。このアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤は、そのままで、あるいは各種賦形剤、食品添加物などを添加するか、または通常の食品中に含有させて、血圧低下作用を有する食品素材や食品として利用できる。例えば、高血圧の改善または予防のための機能性食品や健康食品などとして摂取することができる。
【００１７】
本発明のアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤の投与量は、ホタテ貝外套膜由来の蛋白質分解物として５〜500 mg/kg/日、好ましくは10〜300 mg/kg/日である。
本発明のアンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤を配合する食品や食品素材としては、コーヒー、紅茶、ウーロン茶、緑茶などの嗜好飲料、ジュース、ミネラルウォーター、清涼飲料水などの飲料、ビスケット類、スナック菓子、米菓、チョコレート、ココア、チューインガム、キャンデー類、洋菓子類、和菓子類、中華饅頭、パン類、麺類、即席麺、水産練り製品、珍味、寒天、バター、チーズ、アイスクリーム、氷菓、マーガリン、ショートニング、ラード、惣菜、佃煮、スープ、冷凍食品、缶瓶食品、レトルト食品、マヨネーズ、ドレッシング、調味料などがある。
【００１８】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００１９】
水道水にて水洗し、脱水したホタテ貝外套膜100 ｇに脱イオン水1000mlを加え、次いでジューサーミキサーにて粉砕し懸濁液を得た。この懸濁液にペプシンを500mg 加え、37℃、pH1.2 に調整後18時間反応させた。98℃で10分間加熱することにより酵素反応を停止させた。酵素反応を停止した溶液を遠心分離（2700×g 、20分間）、濾過し上清を得た。この上清を、スプレードライヤーによる噴霧乾燥を行うことにより粉末状のホタテ貝外套膜蛋白質分解物を製造できる。
【実施例２】
【００２０】
使用する蛋白質分解酵素および反応条件を以下のようにする以外は実施例１と同様の操作を行い粉末状のホタテ貝外套膜蛋白質分解物を得た。ただし、蛋白質分解酵素としてサーモライシンを使用した場合は、オートクレーブで110 ℃、15分間の加熱により反応を停止させた。
実施例２：トリプシン (pH6.8 、37℃、18時間) 
実施例３：キモトリプシン (pH6.8 、37℃、18時間)   
実施例４：トリプシン＋キモトリプシン*  (pH6.8 、37℃、18時間) 
実施例５：サーモライシン (pH7.5 、70℃、18時間)   
実施例６：ペプシン(pH1.2、37℃、６時間) ─→トリプシン**(pH6.8、37℃、18時間) 
実施例７：ペプシン(pH1.2、37℃、６時間) ─→キモトリプシン**(pH6.8、37℃、18時間) 
実施例８：ペプシン(pH1.2、37℃、６時間) ─→トリプシン＋キモトリプシン**(pH6.8、37℃、18時間) 
実施例９：サーモライシン(pH7.5、70℃、18時間) ─→ペプシン(pH1.2、37℃、６時間) →トリプシン*** (pH6.8、37℃、６時間) 
*   トリプシンとキモトリプシンを混合して使用
**  ペプシン処理を施した後、ペプシンを失活させてから次の酵素を使用
*** サーモライシン処理を施した後、サーモライシンを失活させてからペプシン処理お      よびトリプシン処理を施す
【００２１】
（試験例１）
実施例１〜９で得られた上清（ホタテ貝外套膜蛋白質分解物溶液）について以下のようにしてアンギオテンシンＩ変換酵素阻害活性を測定した。
1.2 M NaCl 100μｌに試料100 μｌを添加した (対照としては脱イオン水100 μｌ添加) 。これに、10mUのアンギオテンシンＩ変換酵素を含む50mMホウ酸緩衝液 (pH8.3) 100μｌを加え、37℃で10分間インキュベートした。10mMヒプリル-His-Leuを含む350 mMホウ酸緩衝液 (pH8.3) 100μｌを加えて40分間反応させた。0.5N HCl 400μｌを加えて反応を停止し、５分後に酢酸エチルを加えて生成する馬尿酸を抽出し、得られた溶液を濃縮乾燥した。乾燥後、１mlの脱イオン水にて溶解し、226nm における吸光度  (A226)を測定し、次式を用いてアンギオテンシンＩ変換酵素阻害率 (％) を算出した。
【００２２】
阻害率 (％) ＝ [１− (Ａ−Ｂ) ／ (Ｃ−Ｄ)]×100 
Ａ：試料の吸光度
Ｂ：試料を先に酵素失活させた場合の吸光度
Ｃ：対照の吸光度
Ｄ：対照を予め酵素失活させた場合の吸光度
算出された阻害率から、50％のアンギオテンシンＩ変換酵素を阻害するときの検体の濃度 (IC50) を求めた。結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
2008037766.tif 000002
【００２４】
表１に示す結果より、ホタテ貝外套膜蛋白質分解物がアンギオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有することが確認された。
【００２５】
（試験例２）
in vivo における薬理薬効試験 (血圧降下試験) 
実施例５で得られたサーモライシンによるホタテ貝外套膜蛋白質分解物を用いて以下のin vivo 試験を行った。
【００２６】
９週齢の雄性高血圧自然発症ラット  (SHR/HOSラット) にペントバルビタールナトリウム (30 mg/kg) を腹腔内投与して麻酔し、気管内チューブを挿管後、人工呼吸器に接続する。左頸動脈を剥離し、血圧を測定するためにカテーテルを挿入した。血行動態のパラメーターはポリグラフ上に記録する。手術後、少なくとも30分以上安定させた後、生理食塩水 (後に投与する被験物質の液量と同等の液量) を左大腿動脈より投与し、血圧に変化が起こらないことを確認した。次いで被験物質 (溶媒：生理食塩水) を左大腿静脈より投与し、血圧の変化を５分毎に１時間観察した。なお、群構成は表２の通りとした。
【００２７】
【表２】
2008037766.tif 000003
【００２８】
結果を表３、表４および図１に示す。
【００２９】
【表３】
2008037766.tif 000004
【００３０】
【表４】
2008037766.tif 000005
【００３１】
表３、４および図１に示す結果から、ホタテ貝外套膜蛋白質分解物は用量依存的にラットの血圧を低下させることが分かった。100mg/kgの投与量では収縮期血圧を約50％程度低下させ、拡張期血圧については約70％程度低下させる。
【００３２】
このように本発明のホタテ貝外套膜蛋白質分解物は高血圧自然発症ラットの血圧を低下させることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】SHR/HOS ラットを用いたホタテ貝外套膜蛋白質分解物の血圧降下作用を示すグラフである。
【図１】
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