(57)【要約】【課題】水溶化ローヤルゼリー（低分子化して水に浮遊した状態で、一見溶けているようにみえる）のもつ効果に加えて、細胞に抗酸化性や抗老化性を与えることのできる新規なローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応反応により得られた抗酸化ペプチドおよびその製造方法の提供。【解決手段】酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応により得られた、分子量分布が１００〜１０００の範囲に納まる抗酸化ペプチドおよびその製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応により得られた、分子量分布が１００〜１０００の範囲に納まる抗酸化ペプチド。
【請求項２】
酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応により得られた抗酸化ペプチドであって、その分子量分布が
１００〜  ５００未満のもの７０〜９０％
５００〜１０００未満のもの３０〜１０％（ただし、％はピーク面積百分率である）
である請求項１記載の抗酸化ペプチド。
【請求項３】
酵素処理されたローヤルゼリー１００重量部に対してポリペプチド０．７重量部以上を反応させて得られた請求項１または２記載の抗酸化ペプチド。
【請求項４】
酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとをｐＨ４〜６のバッファー水溶液中において６０℃以下の温度条件下で反応させることを特徴とする請求項１〜３記載の抗酸化ペプチドを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応により得られた抗酸化ペプチドおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ローヤルゼリーは働き蜂の咽頭腺などから分泌される乳白色の粘性で酸味のある物質であり、生後数日間はすべての蜂の幼虫に与えられるが、その後は女王蜂になる幼虫にだけ与えられるものとしてよく知られており、この中には、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、アセチルコリン、１０−ヒドロキシデセン酸、ステロール、ホルモンなどの栄養成分をバランスよく含み、健康食品、医薬品、化粧品などの分野に利用されている。特許文献１では、このローヤルゼリーを水溶性とすることにより、その利用性を拡大することに成功している。しかし、これをもってしても抗酸化性や抗老化性の点では満足できるものではない。
【０００３】
【特許文献１】特許第２６２３０４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の第１の目的は、水溶化ローヤルゼリー（低分子化して水に浮遊した状態で、一見溶けているようにみえる）のもつ効果に加えて、細胞に抗酸化性や抗老化性を与えることのできる新規なローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応により得られた抗酸化ペプチドを提供する点にある。
本発明の第２の目的は、新規なローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応により得られた抗酸化ペプチドの製造方法を提供する点にある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１は、酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応により得られた、分子量分布が１００〜１０００の範囲に納まる抗酸化ペプチドに関する。
本発明の第２は、酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応により得られた抗酸化ペプチドであって、その分子量分布が
１００〜  ５００未満のもの７０〜９０％
５００〜１０００未満のもの３０〜１０％（ただし、％はピーク面積百分率である）
である請求項１記載の抗酸化ペプチドに関する。
本発明の第３は、酵素処理されたローヤルゼリー１００重量部に対してポリペプチド０．７重量部以上を反応させて得られた請求項１または２記載の抗酸化ペプチドに関する。
本発明の第４は、酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとをｐＨ４〜６のバッファー水溶液中において６０℃以下の温度条件下で反応させることを特徴とする請求項１〜３記載の抗酸化ペプチドを製造する方法に関する。
【０００６】
本発明における酵素処理されたローヤルゼリーは、特許文献１記載の方法によって得ることができる。すなわち、前記酵素処理されたローヤルゼリーは、「ローヤルゼリーの水懸濁液を調製し、これに基質に対する作用部位の異なる２種類以上のプロテアーゼを同時または逐次添加して室温以上の温度に保持し、酵素反応により不溶性物質を可溶化させた後、ｐＨ５．０〜６．０で、６０℃以上に加熱して酵素反応を停止させ、その後沈殿物を除去して透明なローヤルゼリー溶液の形で製造する」ことができる。
なお、このようにｐＨを調整するには、ＮａＯＨやＫＯＨなどのアルカリ、あるいはクエン酸、グルコン酸、リンゴ酸などの酸や二塩基アミノ酸（アルギニン、リシンなど）などの有機酸を使用するが、ローヤルゼリーの水懸濁液はかなり酸性が強い場合が多いので、ｐＨ調整にアルカリを使用する場合が多い。ＮａＯＨやＫＯＨなどのアルカリ金属水酸化物を用いると、どうしてもアルカリ金属が残留するので、腎臓病などのナトリウム制限者のことを配慮した場合にはＫＯＨの使用が好ましい。
このような酵素処理されたローヤルゼリーでなければ、ポリペプチドとの間に反応は起こらない。また、ポリペプチドと実質的に反応しているものは、酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質であり、他の成分は反応しておらず、そのままの形で反応生成物中に存在している。
【０００７】
本発明におけるポリペプチドは、生体酵素ポリペプチドであることが好ましい。ポリペプチドは、分子構造中にアミノ酸が１０〜１００個含まれるもので、その分子量が５００〜１５００のものが好適である。生体酵素には、代謝酵素と消化酵素があるが、生体酵素ポリペプチドは代謝酵素に属するものである。その具体例としては、ＳＯＤ（Ｓｕｐｅｒ  Ｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ）、ＤＮＡブリコシラーゼ、ＡＰエンドヌレアーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、Ｅ２型たんぱく質、Ｐ５３たんぱく質、Ｐ２１たんぱく質、テロメラーゼ、グリセログロヘプチット（α−Ｄ−グリコヘプチット）、Ｄ−グリセロ−Ｄ−イドヘプチット（β−Ｄ−グリコヘプチット）、Ｌ−グリセロ−Ｌ−イドヘプチット（β−Ｌ−グリコヘプチット）、Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラヘプチット（α−Ｄ−マンノヘプチット）、Ｌ−グリセロ−Ｌ−ガラヘプチット（α−Ｌ−マンノヘプチット）、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノヘプチット（β−Ｄ−マンノヘプチット）、Ｄ−グリセロ−Ｄ−グルコヘプチット（β−Ｄ−アルトロヘプチット）、Ｌ−グリセロ−Ｌ−グルコヘプチット（β−Ｌ−アルトロヘプチット）、Ｄ−グリセロ−Ｌ−グルコヘプチット（β−Ｄ−ガラヘプチット）、Ｌ−グリセロ−Ｄ−グルコヘプチット（β−Ｌ−ガラヘプチット）、グリセロイドヘプチット（β−イドヘプチット）、グリセロアロヘプチット（β−アロヘプチット）、Ｄ−グリセロ−Ｄ−アルトロヘプチット（α−Ｄ−アロヘプチット）などを挙げることができる。
【０００８】
前記酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応は、通常、ｐＨ５．０〜６．０および温度６０℃以下に調整しながら、両者を混合する第１工程、ｐＨ５．０〜６．０および温度６０℃以下に調整しながら、反応を進行させる第２工程、ｐＨ５．０〜６．０に調整しながら６０〜８０℃に加熱し、ついで２０℃以下に冷却した後、不溶物を除去する第３工程よりなる。これらの工程は通常１時間以内に終了する。前記ｐＨの調整は、たとえばｐＨ４〜６のリン酸バッファー液により行う。
【０００９】
前記反応工程により得られた反応生成物は水溶液の形であるから、これをそのまま目的とする用途に使用してもよいが、反応生成物をそのまま乾燥してあるいは反応生成物中の抗酸化ペプチドのみを分解、乾燥して固体とすることもできる。乾燥手段としては、粉体や糖などのキャリアを用いて、またはフリーズドライやスプレードライなどを用いて行うことができる。
【００１０】
前記酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドの量的関係は、酵素処理されたローヤルゼリー１００重量部に対してポリペプチド０．７重量部以上、好ましくは０．７〜２．０重量部、とくに好ましくは１．２〜１．４重量部である。０．７重量部未満の場合は抗酸化作用が不充分である。２．０重量部以上あっても活性効能に変化がない。
【００１１】
本発明の反応生成物あるいは本発明の製造方法においては、必要に応じてフラボノイド類や補酵素などの第３成分を存在させることができる。フラボノイド類としてはアントシアニン類、フラバン類、イソフラボノイド類などがある。一般名ではポリフェノール、カテキン、アスタキサンチンなどと呼ばれている。補酵素としてはビタミン補酵素、キノン補酵素などがある。具体的にはパントテン酸、ビタミンＢ１２、コエンザイムＱなどがある。
【００１２】
前記酵素処理されたローヤルゼリーを製造するための原料として用いるローヤルゼリーは、生のものに限らず、冷凍したものまたは凍結乾燥したもの等、必要に応じて任意のものを使用できる。
まずローヤルゼリーに水または温水を加えてローヤルゼリーの懸濁液を調製する。この場合、アルコール（例えばエタノール）等で前処理（ろ別精製）したり、またはアルコール溶液を用いて懸濁液を調製すると、ローヤルゼリー中の有用成分、とくにアルコールに不溶な蛋白質の回収率が低下するので、このようなアルコール溶液による前処理や可溶化処理は行うことは好ましくない。
【００１３】
ｐＨを調整したローヤルゼリー懸濁液は、プロテアーゼ（蛋白質分解酵素）を加えて蛋白質の分解を行う。使用するプロテアーゼには特に制限はなく、微生物や植物起源の酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼをはじめ、ペプシン、パンクレアチン等の哺乳動物由来の消化酵素など通常、食品加工に用いられているものを広く利用することが可能でこれらの中から基質に対する作用部位の異なる二種類以上を選択して用いればよい。具体的なプロテアーゼ（蛋白質分解酵素）としては、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、レンニン、パンクレアチン、パパイン、キモパパインなどを挙げることができる。
【００１４】
前記酵素反応（酵素処理）は、酵素の種類や添加量、反応温度や反応時間を変えることによって任意に設定することができるが、通常の処理はローヤルゼリー１ｋｇに対し２０〜５００ユニット／ｇの酵素を０．５〜２ｇ加え、２〜２４時間処理する。反応温度は２０〜６０℃で行うことができるが、褐変防止や分解効率の点から４０〜５０℃にするのが望ましい。
【００１５】
二種類以上のプロテアーゼで酵素処理を行う場合、それぞれの酵素の好ましいｐＨ条件や温度条件が比較的近接している場合には、複数種の酵素を同時に加えて処理することが可能である。操作も簡単で比較的高い分解率が得られるので便利である。なお、ここでいう分解率とは蛋白質が分解して低分子化する割合を指すものである。一方、それぞれの酵素の好ましいｐＨ条件や温度条件の異なる酵素を組合わせて酵素処理を行う場合には逐次反応を行う。この場合には処理条件をそれぞれの酵素の好ましい条件に設定でき、また、多種類のプロテアーゼを組合わせた酵素処理ローヤルゼリー溶液を得ることができる。酵素処理は蛋白質の分解率を経時的に測定し、分解率が最高に到達した時点で打切る。使用する酵素により最終分解率は異なるが、分解率が７５％以上、好ましくは８５％以上となった時点で反応を終え、６０〜１００℃の温度で５〜３０分間加熱して酵素を失活させる。酵素反応を停止させた後、遠心分離又は膜ろ過により不純物や不溶成分を除去して透明なローヤルゼリー溶液とする。
このように二種類以上の酵素を組合わせて酵素処理することによって、単一酵素処理に比べてローヤルゼリー中の蛋白質の分解率は飛躍的に高まり、またこのローヤルゼリーを酸性飲料に添加した場合の安定性もきわめて優れたものとなる。ローヤルゼリーをプロテアーゼで処理すると通常好ましい香味、旨味も付加される。味の面から良い酵素の組合わせを選ぶことは重要である。
ちなみに、実施例１ではローヤルゼリーにペプシン処理にひきつづいてパンクレアチン処理を行っており、実施例２ではペプシン処理にひきつづいて、中性プロテアーゼ処理を行っており、実施例３ではプロテアーゼ処理にひきつづいてペプシン処理を行っているが、この順序はとくに制限はない。これらの酵素処理により、蛋白質の分子量が細分化され、ペプチド化が促進される。
【００１６】
前記酵素処理の終わったローヤルゼリー懸濁液の加熱による酵素の失活処理は、ｐＨ５．０〜６．０で６０℃以上で行い、酵素反応を停止させた後、膜ろ過又は遠心分離等により沈殿物を除去して透明なローヤルゼリー溶液とする。このローヤルゼリーが本発明に用いる酵素処理されたローヤルゼリーである。
ｐＨをこの範囲で酵素反応を停止させることにより粗蛋白質、総脂質の回収率を高め、特にローヤルゼリー中の有効成分とされている１０−ヒドロキシデセン酸の回収率を著しく高めることができ、同時に各有用成分の溶解安定性を高めることができる。
【００１７】
本発明の酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応により得られた分子量分布が１００〜１０００の範囲にある抗酸化ペプチドは、
分子量が１００〜  ５００未満のもの７０〜９０％、好ましくは７５〜９０％、
分子量が５００〜１０００未満のもの３０〜１０％、好ましくは２５〜１０％、
（ただし、％はピーク面積百分率である）
であり、分子量１０００以上のものは、ほとんど含まれてない。
これに対して、酵素処理されたローヤルゼリー（後記比較例１にもの）中の蛋白質は、
分子量  １００００以上のもの          ２４％＊
分子量  ３０００〜１００００未満のもの２０％＊
分子量  １０００〜３０００未満のもの      微量
分子量  ５００〜１０００未満のもの        微量
分子量  １００〜５００未満のもの      ５６％＊
である。＊は分子量１０００〜３０００未満の微量成分の量に応じて、これらの含有量が多少変動することを示す。
なお、前記分子量分布は、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２６００ＰＷｘｌカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより求めたものである。
【００１８】
本発明の方法で得られたローヤルゼリー／ポリペプチド反応生成物溶液と特許文献１の方法で得られたローヤルゼリー溶液中のデセン酸、抗酸化ペプチド、ナトリウムの含有量は、おおむね下記表のとおりである。
【表１】
2008056645.tif 000002
前記表１から明らかなように、本発明方法により得られたローヤルゼリー／ポリペプチド反応生成物溶液は、特許文献１の製造方法により得られたローヤルゼリー溶液と比較して、抗酸化ペプチドの量が２〜３倍量であり、デセン酸は４〜８倍量であるのに対して、ナトリウム量が１／１０程度と少ない。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、酵素処理されたローヤルゼリーとポリペプチドとの単なる混合物ではなく、両者の反応生成物であり、主としてテトラマー（４量体）構造をもった抗酸化ペプチドであることにより、反応していない単なる混合物や、酵素処理されたローヤルゼリー単品、ポリペプチド単品に較べてペプチド活性（小腸での吸収性を高める）、酵素活性（分解能力や代謝能力を高める）が４〜１０倍に向上する（例えば図１）。
本発明の酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応により得られた抗酸化ペプチドは、老化防止作用や抗酸化作用を示すほか、人血球系単球細胞の増殖を促進し、悪玉コレステロール低減作用、中性脂肪低減作用、内臓脂肪量低減作用を有する。
細胞の死には、２通りあり、その１つはネクローシス（壊死）であり、他の１つはアポトーシスである。前者は細胞が膨潤して崩壊するので、発熱や炎症を伴う死であるが、後者は細胞が縮小し細胞膜に包まれたまま発熱や炎症を伴うことのない死である。本発明の酵素処理されたローヤルゼリーとポリペプチドとの反応生成物は、がん細胞をアポトーシスさせるが、正常細胞に対しては何の影響も与えない。むしろ、正常細胞に対しては増殖と成長を促す。
本発明の酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応により得られた抗酸化ペプチドは、免疫力を増強する。
本発明の酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応により得られた抗酸化ペプチドは、老化防止や抗ガン作用を意図した食品添加剤、スキンケア用化粧品などとして有用である。
【実施例】
【００２０】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
（１）酵素処理されたローヤルゼリーの製造
１０ｗｔ％ローヤルゼリー水懸濁液ｌｋｇを２０ｗｔ％水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを４に調整した。この溶液にペプシンを１ｇ添加し、４５℃で６時間酵素処理を行った（ペプシン処理液）。次にこの処理液を２０ｗｔ％水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを８に調整し、パンクレアチンを１ｇ添加し、４５℃で６時間酵素処理を行った。酵素処理の終了した溶液は６ｗｔ％以上のデセン酸溶液を用いてｐＨを５．５に調整し、８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、さらにろ過を行って異物や不溶性残渣を除き、透明なローヤルゼリー溶液を得た。このローヤルゼリー溶液を使用した生ローヤルゼリーの重量まで減圧濃縮した。
（２）酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応
前記（１）の工程で得られたデセン酸６ｗｔ％含有ローヤルゼリー濃縮液９重量部とＳＯＤポリペプチド１重量部を混合した原料の１０ｗｔ％水懸濁液１ｋｇを２０ｗｔ％水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを４に調整した。この溶液にペプシンを１ｇ添加し、４５℃で６時間酵素処理を行った（ペプシン処理液）。次にこの処理液を２０ｗｔ％水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを８に調整し、パンクレアチンを１ｇ添加し４５℃で６時間酵素処理を行った。酵素処理の終了した溶液は２０ｗｔ％水酸化カリウム溶液又は１０ｗｔ％クエン酸溶液を用いてｐＨを５．５に調整し８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ（酵素はその目的が終了したら失活させることが大切である）、さらにろ過を行って異物や不溶性残渣を除き、透明なローヤルゼリーポリペプチド反応生成物（抗酸化ペプチドを含む）の溶液を得た。このローヤルゼリーポリペプチド反応生成物（抗酸化ペプチドを含む）溶液を、使用した生ローヤルゼリーの重量まで減圧濃縮して製品とした。
【００２２】
実施例２
前記ペプシン処理液１ｋｇを２０ｗｔ％水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを７に調整した。この溶液に中性プロテアーゼを１ｇ添加し、４５℃で６時間酵素処理を行った。酵素処理の終了した溶液は２０ｗｔ％水酸化カリウム溶液又は１０ｗｔ％クエン酸溶液を用いてｐＨを５．５に調整し８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、さらにろ過を行って異物や不溶性残渣を除き、透明なローヤルゼリーポリペプチド反応生成物（抗酸化ペプチドを含む）溶液を得た。このローヤルゼリーポリペプチド反応生成物（抗酸化ペプチドを含む）溶液を、使用した生ローヤルゼリーの重量まで減圧濃縮して製品とした。
【００２３】
実施例３
実施例１の（１）の方法で得られたデセン酸９ｗｔ％含有ローヤルゼリー９重量部とＳＯＤポリペプチド１重量部を混合して得られた原料の１０ｗｔ％ローヤルゼリー水懸濁液１ｋｇを２０ｗｔ％水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを４に調整した。この溶液に酸性プロテアーゼを１ｇ添加し、４５℃で６時間酵素処理を行った（酸性プロテアーゼ処理液）。この処理液にペプシンを１ｇ添加し、４５℃で６時間酵素処理を行った。酵素処理の終了した溶液は２０ｗｔ％水酸化カリウム溶液又は１０ｗｔ％クエン酸溶液を用いてｐＨを５．５に調整し８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、さらにろ過を行って異物や不溶性残渣を除き、透明なローヤルゼリーポリペプチド反応生成物（抗酸化ペプチドを含む）溶液を得た。このローヤルゼリーポリペプチド反応生成物（抗酸化ペプチドを含む）溶液を、使用した生ローヤルゼリーの重量まで減圧濃縮して製品とした。
【００２４】
比較例１
１０ｗｔ％ローヤルゼリー水懸濁液ｌｋｇを２０ｗｔ％水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを４に調整した。この溶液にペプシンを１ｇ添加し、４５℃で６時間酵素処理を行った（ペプシン処理液）。次にこの処理液を２０ｗｔ％水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを８に調整し、パンクレアチンを１ｇ添加し、４５℃で６時間酵素処理を行った。酵素処理の終了した溶液は２０ｗｔ％水酸化カリウム溶液又は１０ｗｔ％クエン酸溶液を用いてｐＨを５．５に調整し、８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、さらにろ過を行って異物や不溶性残渣を除き、透明なローヤルゼリー溶液を得た。
【００２５】
（１）実施例１の抗酸化ペプチド（検体１）と比較例１の酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質（検体２）について、その分子量分布を測定した。
（２）試験方法
１）標準溶液の調整
下記表１に示した分子量標準品を水、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸の混液（５４．９：４５：０．１）に溶解して０．０５〜０．１Ｗ／Ｖ％溶液を調整した。
【表２】
2008056645.tif 000003
２）試験溶液の調製
それぞれ検体約０．０１ｇを採取し、水、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸の混液（５４．９：４５：０．１）１０ｍｌを加えた。室温で一晩放置し充分に溶解させた後、孔径０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過し、得られた液を試験溶液とした。
３）分子量分布の測定
標準溶液及び試験溶液について、サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２６００ＰＷｘｌカラム）を用いる高速液体クロマトグラフ装置に注入した。得られた結果を４８０IIデータステーションＧＰＣプログラム（システムインスツルメンツ株式会社）を用いて解析した。なお、各ピークの分子量の推定を分子量標準品の溶出時間及び分子量をもとに作成した検量線を用いて行った。
（３）試験結果
検体の分子量分布測定結果を表２に示した。
【表３】
2008056645.tif 000004
【００２６】
試験例１
実施例１に示したローヤルゼリーポリペプチド反応生成物溶液と比較例１の製造方法により得られたローヤルゼリー溶液をチトクロームＣ法により比較のために抗酸化ＳＯＤ活性を計測した。この測定方法はキサンチン・オキシターゼ系で生成したＯ−２（活性酸素）をチトクロームＣ還元（５５０ｎｍにおける吸収増加）で検出する反応中、添加されたＳＯＤサンプルによるＯ−２（活性酸素）の消去、チトクロームＣ還元の阻害率からサンプル中のＳＯＤ量を測定するものであり、公知のＭｃＣｏｒｄとＦｒｉｄｏｖｉｃｈの方法に従った（１９８９年１１月６日、株式会社  日本医学館発行、大柳善彦著「ＳＯＤと活性酸素調節剤−その薬理作用と臨床応用」の「活性酸素の測定法」の項参照）。
【００２７】
試験方法
サンプルＡ：実施例１に示したローヤルゼリーポリペプチド反応生成物溶液
サンプルＢ：実施例１の（１）記載の製造方法により得られたローヤルゼリー溶液
サンプルＣ：生のままのローヤルゼリー（未処理のローヤルゼリー）
３つの容器のそれぞれに０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）２．２ｍｌに、０．３ｍＭチトクロームＣ溶液０．１ｍｌ、１．５ｍＭキサンチン溶液０．２ｍｌを加え、さらにそれぞれの容器の１つにはサンプルＡを、他の容器にはサンプルＢを、もう１つの容器にはサンプルＣを各０．１ｍｌ加え反応を開始する。２５℃で５分間保温する。それぞれの容器にキサンチンオキシターゼ溶液０．１ｍｌづつを加え、反応を行う。２５℃にて５５０ｎｍにおける吸光度の変化を分光計にて約２分間測定する。
上記の酵素反応によるチトクロームＣの還元速度を５０％阻害するＳＯＤ量を１単位規定とした。
得られたサンプルＡ、Ｂ、Ｃのそれぞれの抗酸化ＳＯＤ活性は図１に示すとおりであり、本発明のものは生ローヤルゼリーや酵素処理されたローヤルゼリーと較べて４から１０倍の抗酸化ＳＯＤ活性を示している。
【００２８】
試験例２
実施例１に示したローヤルゼリーポリペプチド反応生成物溶液Ａと通常の特許文献１の実施例１の製造方法により得られたローヤルゼリー溶液Ｂを成分比較したものが、表４である。
【００２９】
【表４】
2008056645.tif 000005
【００３０】
試験例３
実施例１に示したローヤルゼリーポリペプチド反応生成物溶液を使用して、図２に示すようにアポートシス作用のあることを確認した。細胞の死には、２通りあり、その１つはネクローシス（壊死）であり、他の１つはアポトーシスである。前者は細胞が膨潤して崩壊するので、発熱や炎症を伴う死であるが、後者は細胞が縮小し細胞膜に包まれたまま発熱や炎症を伴うことのない死である。本発明の酵素処理されたローヤルゼリーとポリペプチドとの反応生成物は、がん細胞をアポトーシスさせるが、正常細胞に対しては何の影響も与えない。むしろ、正常細胞に対しては増殖と成長を促す。人の血球系単球細胞をシャーレの中で培養し実施例１に示したローヤルゼリーポリペプチド反応生成物溶液を添加した場合、特許文献１の実施例１で得られたローヤルゼリー溶液を添加した場合とで比較した。図２に示すとおり、細胞数をみると実施例１に示したローヤルゼリーポリペプチド反応生成物溶液を添加５日後で約７倍に増えており、特許文献１の実施例１で得られたローヤルゼリー溶液を添加した場合には４日後でも約３．５にしか増えていない。この結果から実施例１に示したローヤルゼリーポリペプチド反応生成物溶液には細胞増殖を促す作用があることがわかる。
次にネズミの肝臓細胞を同じように培養した図３のケースについて説明する。実施例１に示したローヤルゼリーポリペプチド反応生成物溶液を加えた方は１日後に２倍の細胞数に増え、２０日たっても約９割の細胞が生き続けている。一方特許文献１の実施例１で得られたローヤルゼリー溶液を添加した方は１日後に１．８倍に増加したが、その後急激に細胞が死にはじめ２０日後には培養開始前と同じくらいに減ってしまった。この結果から実施例１に示したローヤルゼリーポリペプチド反応生成物溶液は肝臓細胞に対する増殖促進作用はそれほど強くはないが、増えた細胞を長生きさせる作用があることが判明した。これは肝臓細胞がアポトーシスという仕組みで死んでいくのを防いでいると考えられる。
【００３１】
試験例４
実施例１に示したローヤルゼリーポリペプチド反応生成物溶液は、図４の（Ａ）に示すように、試験例３と同様な実験により、高脂肪食を食べたネズミの悪玉コレステロール（ＬＤＬ：低密度ポリ蛋白）を下げるが、図４の（Ｂ）に示すように、善玉コレステロール（ＨＤＬ：高密度ポリ蛋白）には何の影響も及ぼさないことが判明した。図４と同じ実験系で、ネズミの中性脂肪が下がる（図５）こと、さらに内臓周囲の脂肪量（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｆａｔｓ）を減少させる効果もある（図６）ことが判明した。また、図４〜６と同じ実験系により図１に示すとおり、優れた抗酸化作用を示した。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】（Ａ）実施例１のローヤルゼリーポリペプチド反応生成物を添加した場合、（Ｂ）実施例１の（１）の方法で得られた酵素処理されたローヤルゼリー溶液を添加した場合および（Ｃ）生ローヤルゼリーを添加した場合のそれぞれの抗酸化効果の持続時間を示す。
【図２】人の血球系単細胞をシャーレの中で培養し、そこに実施例１のローヤルゼリーポリペプチド反応生成物を添加した場合と添加しない場合の細胞増殖効果を示す。
【図３】ネズミ肝臓細胞をシャーレの中で培養し、そこに実施例１のローヤルゼリーポリペプチド反応生成物を添加した場合と添加しない場合の細胞増殖効果を示す。
【図４】（Ａ）高脂肪食を食べているネズミに、実施例１のローヤルゼリーポリペプチド反応生成物を与えた場合と、カゼインを与えた場合における悪玉コレステロール（ＬＤＬ）の濃度を調べた結果を示す。（Ｂ）同様にして善玉コレステロール（ＨＤＬ）の濃度を調べた結果である。
【図５】実施例１のローヤルゼリーポリペプチド反応生成物は、カゼインに較べて中性脂肪低下能力があることを示す。
【図６】実施例１のローヤルゼリーポリペプチド反応生成物は、カゼインに較べて内臓脂肪量を低下させる能力があることを示す。
【図１】
2008056645.tif 000006
【図２】
2008056645.tif 000007
【図３】
2008056645.tif 000008
【図４】
2008056645.tif 000009
【図５】
2008056645.tif 000010
【図６】
2008056645.tif 000011