(57)【要約】      （修正有）【課題】還元酵素遺伝子の効率的な発現ベクターを提供すること。【解決手段】Ｌｅｉｆｓｏｎｉａに由来する特定の塩基配列を持つポリヌクレオチドの上流に、遺伝子断片５’−GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT−３’を接続させてなるポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドに機能可能な形で接続されたプロモーターを含む発現ベクター。Ｌｅｉｆｓｏｎｉａに由来する特定の塩基配列を持つポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールに還元する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のポリヌクレオチドの上流に、遺伝子断片５’−GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT−３’を接続させてなるポリヌクレオチドと当該ポリヌクレオチドに機能可能な形で接続されたプロモーターを含む発現ベクター。
(a)配列番号２のポリヌクレオチド。
(b)配列番号２のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールに還元する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールに還元する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールに還元する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
プラスミドｐＫＥＬＡである請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
請求項１または２に記載の発現ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項４】
宿主細胞が微生物であることを特徴とする請求項３記載の形質転換体。
【請求項５】
宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、請求項３，４または５に記載の形質転換体又はそれらの処理物を作用させることを特徴とするアルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター及びそれらを含む形質転換体の利用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
医農薬等の各種用途の化合物の製造中間体として有用性な光学活性なアルコールの製造方法としては、種々の方法が知られており、特許文献１には、ライフソニア  エスピー（Leifsonia sp.）S-749（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９１）から還元酵素遺伝子をクローニングし、当該還元酵素を発現する形質転換体を用いて光学活性アルコールを製造する方法が開示されている。
【特許文献１】特開２００４−２６１０４２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本願発明は、還元酵素をより効率的に発現させ、有用な光学活性アルコールを工業的に有利に得るための発現ベクター、当該発現ベクターを用いて得られる形質転換体等を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
即ち、本発明は、
１．下記（ａ）（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のポリヌクレオチド（以下、本還元酵素遺伝子と称する。）の上流に、遺伝子断片５’−GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT−３’（以下、本発明遺伝子断片と称する。）を接続させてなるポリヌクレオチドと当該ポリヌクレオチドに機能可能な形で接続されたプロモーターを含む発現ベクター（以下、本発明発現ベクターと称する。）。
(a)配列番号２のポリヌクレオチド。
(b)配列番号２のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールに還元する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールに還元する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールに還元する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
２．プラスミドｐＫＥＬＡである１項に記載の発現ベクター。
３．  前項１または２に記載の発現ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と称する。）。
４．  宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項３に記載の形質転換体。
５．  宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項４に記載の形質転換体。
６．  ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、前項３，４または５に記載の形質転換体又はそれらの処理物を作用させることを特徴とするアルコールの製造方法、等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の発現ベクターを用いることにより、形質転換体微生物等から還元酵素をより効率的に発現させ、ケトン化合物又はアルデヒド化合物から有用な光学活性アルコールを工業的に有利に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、さらに詳細に本発明を説明する。
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ライフソニア  エスピー（Leifsonia  sp.）S-749（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９１）由来の還元酵素である。当該還元酵素および還元酵素活性（即ち、基質を還元する能力）は、これらの還元酵素を例えば２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、ＮＡＤＨと混合して３０℃で保温し、消費されるＮＡＤＨ量を反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を指標に定量することにより測定することができる。
【０００７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、例えば、配列番号２のポリヌクレオチドを取得するには、例えばJ.Ｓambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラー  クローニング  第２版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリング  ハーバー  ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、１９８９年、等に記載の通常の遺伝子工学的手法に準じてライフソニア  エスピー（Leifsonia  sp.）S-749（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９１）から取得することができる。即ち、ライフソニア  エスピー（Leifsonia  sp.）S-749（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９１）から「新  細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）に記載された方法に準じてＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本還元酵素遺伝子が調製される。
【０００８】
ここで、前記ＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅して還元酵素遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
【０００９】
該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μM、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるＤＮＡライブラリーを混合した反応液を94℃（5分間）に加熱した後、94℃(5分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃（0.5分間）のサイクルを３０回行い、さらに72℃で10分間保持する条件が挙げられる。
【００１０】
なお、該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
【００１１】
また、前記ＤＮＡライブラリーを鋳型として配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする５’末端側の約１４塩基程度以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）とＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列に相補的な塩基配列からなる約１４塩基程度以上のオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによっても、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡや、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して還元酵素遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
【００１２】
尚、ライフソニア  エスピー（Leifsonia  sp.）S-749株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９１の寄託番号が付与されている（原寄託日：平成１５年２月１２日）。菌学的性状は次のとおり。
１．コロニー形態（３０℃、４８時間）
（１）細胞形態：かん菌、０．６×１.０〜２．０μｍ
（２）グラム染色性：陽性
（３）胞子の有無：無
（４）運動性の有無：有
２．Nutrient Agar上でのコロニー形態
コロニーの色：黄色
コロニーの形状：円形
コロニーの周縁：全縁滑らか
コロニーの隆起：低凸状
３．生理学的性質
カタラーゼ：陽性
オキシダーゼ：陰性
ＯＦテスト：陽性/陰性
４．１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列
ライフソニア  エスピー（Leifsonia  sp.）S-749株からＰＣＲにより１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列約５００ｂｐを増幅し、塩基配列を解析した。得られた１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列を使って、ＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った結果、相同率９９．６％で、ライフソニア  アクアティカ（Leifsonia  aquatica）基準株の１６ＳリボゾームＤＮＡに対し、最も高い相同性を示した。更に、検索された上位５株のうち、４株がライフソニア（Leifsonia）で占められ、その相同率は９８％以上を示した。
以上の菌学的性質により、本菌はライフソニア  エスピー（Leifsonia  sp.）と同定された。
【００１３】
配列番号２のポリヌクレオチドは２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する還元反応を触媒する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有している。
【００１４】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて、前記（ｃ）にある「１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換された」や前記（ｄ）にある「９０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが細胞内で受けるプロセシング、該タンパク質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。かかるポリペプチドとしては、９０％以上の配列同一性を有するものが好ましく、９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドがより好ましい。
前記（ｃ）にある「１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換された」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には1若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を見出すことのできる範囲であれば良い。
また前記欠失、付加又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、(1)グリシン、アラニン；(2)バリン、イソロイシン、ロイシン；(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；(4)セリン、スレオニン；(5)リジン、アルギニン；(6)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYXや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、９０％以上であればよいが、好ましくは９５％以上である。
前記（ｂ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法（具体的には、サザンハイブリダイゼーション法等）に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、（１）高イオン濃度下（例えば、６×SSC（１．５M  NaCl、０．１５M  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする））、50％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させることにより配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成した後、低イオン濃度下（例えば、2×SSC）で５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）、（２）高イオン濃度下（例えば、６×SSC）、溶液中で６５℃にてハイブリッドを形成させることにより配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成した後、低イオン濃度下（例えば、0.1 X SSC）で65℃にて洗浄するような条件（「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度（例えば、温度を５０℃に設定した場合）は、２×SSCで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSCで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの温度から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。このような洗浄ステップ後でも上記ハイブリッドが維持されうるようなＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡという。
【００１５】
また、本還元酵素遺伝子のＤＮＡは、例えば、微生物またはファージ由来のベクターに挿入されたＤＮＡライブラリーに配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有する約１５塩基程度以上の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして後述する条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによっても取得することができる。
【００１６】
染色体ＤＮＡ又はＤＮＡライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択することができる。
【００１７】
使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて作製されている場合にはコロニーハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入することにより形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈した後、該希釈物を寒天培地上にまき、コロニーが現われるまで培養する。
【００１８】
使用されるライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合にはプラークハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、宿主微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合し、さらに軟寒天培地と混合した後、該混合物を寒天培地上にまき、プラークが現われるまで培養する。
【００１９】
次いで、いずれのハイブリダイゼーションの場合にも、前記の培養を行った寒天培地上にメンブレンを置き、形質転換体又はファージを該メンブレンに吸着・転写させる。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いでＤＮＡを該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的には、例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地上にニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレン（例えば、Hybond-N+（アマシャム社登録商標））を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着・転写させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（例えば１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させることによりファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（例えば、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝溶液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。次いで該メンブレンを洗浄液（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間加熱することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定する。
【００２０】
このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うことができる。
【００２１】
プローブに用いるＤＮＡは、放射性同位元素により標識されたものや、蛍光色素で標識されたものであってもよい。
プローブに用いるＤＮＡを放射性同位元素により標識する方法としては、例えば、Random Primer Labeling Kit（宝酒造社製）等を利用することにより、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−32Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う方法が挙げられる。
また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には、例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の通りに行うことができる。
４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍMの塩化ナトリウム、９０ｍMのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保温する。
次いで、例えば、４５０〜９００ｍMの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ2当たり１．０×１０4〜２．０×１０6cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該ハイブリダイゼーション溶液に浸し４２〜６５℃で１２〜２０時間保温する。
【００２３】
該ハイブリダイゼーション後、メンブレンを取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム１．５〜３０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１〜１．０重量％のＳＤＳ等を含む４２〜６５℃の洗浄液（好ましくは１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１．０重量％のＳＤＳを含む６５℃の洗浄液）等を用いて洗浄する。洗浄したメンブレンを２xSSC（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ後、乾燥する。このメンブレンを例えばオートラジオグラフィー等に供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置に相当するクローンを元の寒天培地上で特定し、これを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離する。
【００２４】
このようにして得られるクローンを培養して得られる培養菌体からも本還元酵素遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
【００２５】
また、前述のＤＮＡの塩基配列は、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著、Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。
【００２６】
上記のようにして調製されたＤＮＡを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして発現ベクターを得ることができる。また、発現量を向上させるために、SD配列と開始コドンの距離や、プロモーターと開始コドンの距離を工夫することもできる。例えば、SD配列と開始コドンの距離を5ヌクレオチド以上13ヌクレオチド以下にするなどがあげられる。SD配列をAGGAとし、開始コドンの上流に本発明遺伝子断片（遺伝子断片５’−GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT−３’）が接続し、プロモーターが機能可能な形で接続した発現ベクターが好ましい。開始コドンの上流に本発明遺伝子断片（遺伝子断片５’−GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT−３’）が接続し、tacプロモーターが機能可能な形で接続したプラスミドｐＫＥＬＡがより好ましい。
【００２７】
上述のようにして得られるＤＮＡが、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを優先して生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードしていることの確認は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００２８】
まず上述のようにして得られるＤＮＡを後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで該形質転換体の培養物をケトン化合物又はアルデヒド化合物に作用させる。反応生成物中の２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールの量を分析することにより、得られたＤＮＡがかかる能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードすることが確認できる。
【００２９】
本還元酵素遺伝子を宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと、本発明遺伝子断片を本還元酵素遺伝子の上流に接続してなるポリペプチドとが機能可能な形で接続されてなる遺伝子を宿主細胞に導入して行われる。
【００３０】
ここで、「機能可能な形で」とは、該遺伝子を宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本還元酵素遺伝子が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、例えば、tacプロモーターをあげることができる。
【００３１】
本発明発現ベクター等を導入する宿主細胞としては、例えば、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、に属する微生物等があげられる。上記宿主細胞としては大腸菌が好ましい。大腸菌としては、Ｋ−１２及びその由来株が好ましく、具体的にはＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１株、ＸＬ１ＢｌｕｅＭＲＦ’株、ＤＨ５α、ＨＢ１０１株、ＤＨ１株、ＭＶ１１８４株、ＪＭ１０５株、ＭＣ１０６１株、Ｃ６００株などが例示される。
【００３２】
本発明発現ベクター等を宿主細胞へ導入する方法は、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法等をあげることができる。
【００３３】
本発明発現ベクター等が導入された形質転換体を選抜するには、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
該形質転換体が本還元酵素遺伝子を保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【００３４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する還元酵素は、例えば、本還元酵素遺伝子を保有する形質転換体を培養することにより製造することができる。
該形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
【００３５】
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３６】
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３７】
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３８】
さらに、アロラクトースで誘導されるタイプのtacプロモーターと本還元酵素遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入されてなる形質転換体の場合には、還元酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。
【００３９】
本還元酵素遺伝子を保有する形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される方法に準じて行うことができ、例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養、タンク培養等の液体培養及び固体培養が挙げられる。
培養温度は、該形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１５〜４０℃である。培地のｐHは約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
【００４０】
本還元酵素遺伝子を保有する形質転換体の培養物から還元酵素を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用することができ、例えば、次のような方法を挙げることができる。
【００４１】
まず、形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、還元酵素を精製することができる。
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
尚、還元酵素を含む画分を選抜するには、例えば、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を指標にして選抜すればよい。
【００４２】
次に、本発明におけるアルコールの製造方法について説明する。
該製造方法はケトン化合物又はアルデヒド化合物に、還元酵素、それを産生する形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とする。
【００４３】
ケトン化合物又はアルデヒド化合物は、例えば、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、ｎ−ヘキシルアルデヒド、ｎ−ペプチルアルデヒド、ｎ−デシルアルデヒド、２−オキソプロピオンアルデヒド、トランス−シンナムアルデヒド、４−ブロモベンズアルデヒド、２−ニトロベンズアルデヒド、３−ニトロベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、４−クロロベンズアルデヒド、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、２−ノナノン、３−ペンタノン、３−クロロ−２−ブタノン、tert−ブチルアセトアセテート、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、クロロアセトン、ジヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、メチル  ３−オキソブタノエート、エチル  ３−オキサブタノネート、エチル  ４−クロロアセトアセテート、メチル  ４−ブロモー３−オキサブタノエート、エチル  ４−ブロモ−３−オキサブタノエート、Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−３−ピロリジノン、イソプロピル  ４−シアノ−３−オキソブタノエート、エチル  ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル  ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル  ３−オキソペンタノエート、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、アセトフェノン、２’−ブロモアセトフェノン、３’−ブロモアセトフェノン、４’−ブロモアセトフェノン、２−クロロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、４’−クロロアセトフェノン、ベンジルアセトン、１−フェニル−２−ブタノン、ｍ−メトキシアセトフェノン、３，４−ジメトキシアセトフェノン、４’−メトキシアセトフェノン、２，３’−ジクロロアセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトン、シクロペンタノン、４−アセチル安息香酸、D-(+)-グルコース等が挙げられる。
【００４４】
上記方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記す。）の存在下に行うとよい。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物が挙げられる。
【００４５】
上記方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、トルエン、ヘキサン、シクロへヘキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。
【００４６】
上記方法における反応は、例えば、水、ＮＡＤＨ、及びケトン化合物又はアルデヒド化合物を、還元酵素あるいはそれを産生する形質転換体又はその処理物とともに、必要によりさらに有機溶媒等を含有した状態で、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。
【００４７】
上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常０〜６０℃の範囲である。
【００４８】
反応の終点は、例えば、反応液中のケトン化合物又はアルデヒド化合物の量を液体クロマトグラフィー等により追跡することにより決めることができる。
反応時間は適宜選択することができるが、通常０．５時間から１０日間の範囲である。
【００４９】
反応液からのアルコールの回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法が挙げられる。
【００５０】
還元酵素、それを産生する形質転換体又はその処理物は種々の形態で上記方法に用いることができる。
【００５１】
具体的な形態としては、例えば、本還元酵素遺伝子を保有する形質転換体の培養物、かかる形質転換体の処理物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質等及びこれらの固定化物が挙げられる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物が挙げられる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に還元酵素等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に還元酵素等を閉じ込める方法）が挙げられる。
【００５２】
尚、本還元酵素遺伝子を保有する形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、生形質転換体を用いるよりも該形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法が製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）が挙げられる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ還元酵素の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染などの影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。
【００５３】
また、本発明のアルコールの製造方法はＮＡＤＨの存在下に行われ、ケトン化合物又はアルデヒド化合物の還元反応の進行に伴い、当該ＮＡＤＨは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+と記す）に変換される。本還元酵素は、変換により生じたＮＡＤ+を、例えば、２−プロパノールの酸化反応に伴って、還元型（ＮＡＤＨ）に変換する能力を有するので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換を可能にする基質として、２−プロパノールなどを共存させることもできる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００５５】
実施例１  （ライフソニア・エスピー（Leifsonia sp.）S−749株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９１）由来還元酵素および還元酵素遺伝子の調製）
（１）還元酵素の調製
５Lジャーファーメンターに、培地（水に（NH4）2SO4を３ｇ/L、K2HPO4を３ｇ/L、NaClを１ｇ/L、MgSO4・７H2Oを０．２ｇ/L、DL-Phenylethyl Alcoholを２ｇ/L、Antifoam  PE-H（和光純薬工業社製）を０．５ｇ/Lの割合で溶解した後、ｐHを７．０に調整したもの）３Ｌを入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。次いで、Bacto Peptoneを５ｇ/L、Yeast Extractを５ｇ/Lの割合で水に溶解した後、ｐＨを７．０に調整した培地中で培養（３０℃、１８時間、振盪培養）したライフソニア・エスピー（Leifsonia sp.）S−749株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９１）の培養液３０ｍｌを上記ジャーファーメンター内に加え、３０℃で４８時間、ジャーファーメンターを用いて培養した。その後、得られた培養液を遠心分離（８０００ｘｇ、１０分）することにより、沈殿として約５．０ｇの湿菌体を得た。
調製したライフソニア・エスピー（Leifsonia sp.）S−749株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９１）の湿菌体約１０．０ｇを、２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）８０ｍｌに懸濁し、ULTRASONIC  DISPUPTOR  UD-200(TOMY社製)を用いて、OUTPUT８で氷冷しながら、計3分間、超音波破砕を行った。得られた破砕液を遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）することにより、遠心分離上清液（約８５ｍｌ）を得た。
得られた遠心分離上清（約８５ｍｌ）に、硫酸アンモニウムをその濃度が１４４ｇ/L（２５％飽和）になるまで徐々に加えた後、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）することにより、遠心分離上清液（約９０ｍｌ）を得た。得られた遠心分離上清液（約９０ｍｌ）に硫酸アンモニウムを、その濃度が３９０ｇ/L（６０％飽和）になるまで徐々に加えた後、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）した。得られた沈殿を２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）２０ｍｌに溶解することにより、２２ｍｌの沈殿溶解液を得た。沈殿溶解液をDIALYSIS  MEMBRANE  SIZE８（WAKO製）に入れ、２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）に対して、4℃で一晩透析を行った。透析後液をDEAE-TOYOPEARL（東ソー社製）［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（塩化ナトリウム濃度０Ｍ〜１．０Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（１８ｍｌ）を得た。
【００５６】
この溶出画分（１８ｍｌ）に、１．３Mになるように硫酸アンモニウムを加え、氷中で３０分間攪拌した後、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）した。遠心分離上清液（２９ｍｌ）をBUTYL-TOYOPEARL（東ソー社製）］［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）＋１．３M硫酸アンモニウムで平衡化したもの］に展着し、硫酸アンモニウムを溶解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（硫酸アンモニウム濃度１．３Ｍ〜０Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（３１ｍｌ）を得た。得られた溶出画分（３１ｍｌ）に硫酸アンモニウムをその濃度が４７２ｇ/L（７０％飽和）になるまで徐々に加えた後、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）した。得られた沈殿を２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）１ｍｌに溶解することにより、約１ｍｌの沈殿溶解液を得た。この沈殿溶解液１ｍｌをDIALYSIS  MEMBRANE  SIZE８（WAKO製）に入れ、２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）に対して、４℃で一晩透析を行い、透析液（約３ｍｌ）を得た。この透析液（約３ｍｌ）をCellulofine  GCL-2000ｓｆ（生化学工業社製）］［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を０．３ｍｌ/分の流速で流することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（９．７ｍｌ）を得た。得られた溶出画分（９．７ｍｌ）をBioassistQ（東ソー社製）［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（塩化ナトリウム濃度０Ｍ〜０．８Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（１ｍｌ）を得た。得られた溶出画分（１ｍｌ）をゲル濾過［カラム：TSK-GEL  G3000SWXL（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［移動層：BIS-TRIS-PROPANEバッファー（20ｍＭ、ｐＨ7.0）］することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（１ｍｌ：分子量約１１０，０００ダルトンの部分に相当）を精製酵素液として得た。
【００５７】
尚、クロマトグラフィー等で得られた溶出画分について、以下の操作により還元酵素活性を測定した。
２，２，２−トリフルオロアセトフェノン（２ｍM）及びＮＡＤＨ（０．２７ｍM）を溶解したリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）にクロマトグラフィー等により得られた溶出画分を加えて全量を１．５ｍｌとし、２５℃で２０秒間保温した後、３４０ｎｍの吸光度を測定した。３４０ｎｍの吸光度からＮＡＤＨの消費量を計算して溶出画分の還元酵素活性を求めた。
【００５８】
（２）還元酵素由来の部分ペプチドが有するアミノ酸配列の解析
上記操作により得られた活性画分（Ａ）をLaemmli, U. K., Nature, (1970) 227, 680記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルーＧ２５０染色液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で染色し、染色された部分のゲルを切り取った。このゲルをジチオスレイトール及びヨウ化アセトアミドを用いて還元アルキル化し、トリプシンを処理した後、ゲルからペプチドを抽出した。抽出したペプチドをＨＰＬＣ（カラム：TSK gel ODS-80Ts QA、2.0mm×250mm（東ソー株式会社）、
溶媒A：0.1% TFA
溶媒B：0.09% TFA in 90% acetonitrile
流速：200μL/min
温度：室温
検出：210nm、280nm
グラジエント
0（min）―0（%）
2  ―  0
7  ―  10
82 ―  50
87 ―  100
92 ―  100
97 ―  0
分取：200μL/Fraction
分取した各画分をプロテインシークエンサー（Procise 494HT Protein Sequencing System）により決定した。
決定したアミノ酸配列のそれぞれを配列番号５（N末端アミノ酸配列（AQYDVADRSAIVTGG））、配列番号６（内部アミノ酸配列（IAVNNAGIGGEA））に示す。
【００５９】
（３）還元酵素遺伝子由来の部分塩基配列の解析
配列番号５で示されるアミノ酸配列を基に、配列番号７（TFAR-F（CARTAYGAYGTIGCNGAHMG）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを、配列番号６で示されるアミノ酸配列を基に配列番号８（TFAR-R（CCDATICCNGCRTTRTTNAC）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ここで、塩基としてのＲはＧ又はＡ、ＹはＴ又はＣ、Ｉはイノシン、ＮはＡ又はＣ又はＧ又はＴ、ＨはＡ又はＣ又はＴ、ＭはＡ又はＣ、ＤはＡ又はＧ又はＴを意味している。
【００６０】
配列番号７、８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーに、Lifsonia sp. DNAを鋳型にして、下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。
【００６１】
[反応液組成]
Lifsonia sp. DNA                  １μl
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ）      ２μｌ
プライマー（５０μＭ）              各２μｌ
１０×ＥＸ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ  ＭｇＣｌ２）      ２μｌ
ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）  ０．５μｌ
超純水                      １０．５μｌ
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN  ELMER−GeneAmp  PCR  System2400にセットし、94℃（5分間）に加熱した後、94℃(0.5分間)→55℃(0.5分間)→72℃（0.5分間）のサイクルを３０回行い、さらに72℃で10分間保持した。
【００６２】
その後、ＰＣＲ産物を、pGEM-T Easy Vector System I (PROMEGA社製)にてライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli XL-1 Blue MRF'株を形質転換した。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）培地に、得られた形質転換体を接種し培養した。培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。
【００６３】
プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、得られたＤＮＡの塩基配列をABI PRISM 310 Genetic Analyzer（ABI社製）で解析することにより行った。プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号９に示す。
【００６４】
（４）還元酵素遺伝子の塩基配列の解析
Sau3A Ｉで部分分解したライフソニアDNAとBamH Iで切断したコスミドベクターpWE15のライゲーションを行った。
Gigapack Gold III（STRATAGENE社製）を用いてインビトロパッケージングを行った。
ファージをE.coli XL1-Blue MRF'に感染させ、アンピシリン入りのLBプレートで培養した後、集菌しアルカリSDS法によりコスミド抽出を行った。
コスミドをE.coli XL1-Blue MRF'に導入し、アンピシリン入りのLBプレートで培養した後、ナイロンメンブレンにブロッティングした。
標識プローブの調整、コロニーハイブリダイゼーションは、Alkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムバイオサイエンス株式会社）のプロトコルに従って行った。コロニーハイブリダイゼーションにおける条件は、プレハイブリダイゼーション75℃、ハイブリダイゼーション75℃、1次洗浄バッファー75℃であった。プローブに用いたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１０に示す。
検出はCDP-Star Detection reagentを用いて、X線フィルムに感光させることで行った。
陽性クローン中からコスミドｐWELA6を取得した。
【００６５】
実施例２  （本発明発現ベクターの調製、本発明形質転換体の製造及び還元反応例（その１））
（１）Lifsonia sp. ＤＮＡの調製
ライフソニア  エスピー（Leifsonia sp.）S-749株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９１）を、滅菌したPY培地（ペプトン、酵母エキス各0.5％、pH7.0）１００ｍｌで３０℃、一晩培養した。この菌体からQiagen Genomic Tip (Qiagen社製)を用い、それに付属のマニュアルに記載の方法にしたがって染色体ＤＮＡを精製した。
【００６６】
（２）本発明発現ベクターの調製（その１）
配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【００６７】
配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、ｐWELA6を鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。
【００６８】
[反応液組成]
ｐWELA6            １μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ）      ２μｌ
プライマー（５０μＭ）              各２μｌ
１０×ＥＸ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ  ＭｇＣｌ２）      ２μｌ
ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）  ０．５μｌ
超純水                      １０．５μｌ
【００６９】
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN  ELMER−GeneAmp  PCR  System2400にセットし、94℃（5分間）に加熱した後、94℃(0.5分間)→55℃(0.5分間)→72℃（0.5分間）のサイクルを３０回行い、さらに72℃で10分間保持した。
【００７０】
その後、ＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（BamHI及びPstI）を加え、ＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐUC118（宝酒造社製）を２種類の制限酵素（BamHI及びPstI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐULAと記すこともある。）を取り出した。
【００７１】
（３）本発明発現ベクターの調製（その２）
配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【００７２】
配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、ｐWELA6を鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。
【００７３】
[反応液組成]
ｐWELA6            １μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ）      ２μｌ
プライマー（５０μＭ）              各２μｌ
１０×ＥＸ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ  ＭｇＣｌ２）      ２μｌ
ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）  ０．５μｌ
超純水                      １０．５μｌ
【００７４】
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN  ELMER−GeneAmp  PCR  System2400にセットし、94℃（5分間）に加熱した後、94℃(0.5分間)→55℃(0.5分間)→72℃（0.5分間）のサイクルを３０回行い、さらに72℃で10分間保持した。
【００７５】
その後、ＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（EcoRI及びPstI）を加え、ＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐKK223-3（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を２種類の制限酵素（EcoRI及びPstI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐKLAと記すこともある。）を取り出した。
【００７６】
（４）本発明発現ベクターの調製（その３）
配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【００７７】
配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、ｐWELA6を鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。
【００７８】
[反応液組成]
ｐWELA6            １μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ）      ２μｌ
プライマー（５０μＭ）              各２μｌ
１０×ＥＸ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ  ＭｇＣｌ２）      ２μｌ
ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）  ０．５μｌ
超純水                      １０．５μｌ
【００７９】
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN  ELMER−GeneAmp  PCR  System2400にセットし、94℃（5分間）に加熱した後、94℃(0.5分間)→55℃(0.5分間)→72℃（0.5分間）のサイクルを３０回行い、さらに72℃で10分間保持した。
【００８０】
その後、ＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（NcoI及びPstI）を加え、ＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐTrc99A（アマシャムファルマシアバイオテク社社製）を２種類の制限酵素（NcoI及びPstI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐTLAと記すこともある。）を取り出した。
【００８１】
（５）本発明発現ベクターの調製（その４）
配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【００８２】
配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、ｐWELA6を鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。
【００８３】
[反応液組成]
ｐWELA6            １μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ）      ２μｌ
プライマー（５０μＭ）              各２μｌ
１０×ＥＸ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ  ＭｇＣｌ２）      ２μｌ
ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）  ０．５μｌ
超純水                      １０．５μｌ
【００８４】
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN  ELMER−GeneAmp  PCR  System2400にセットし、94℃（5分間）に加熱した後、94℃(0.5分間)→55℃(0.5分間)→72℃（0.5分間）のサイクルを３０回行い、さらに72℃で10分間保持した。
【００８５】
その後、ＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（NdeI及びPstI）を加え、ＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐGEM5Zｆ（＋）（PROMEGA社製）を２種類の制限酵素（NdeI及びPstI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐG5-LAと記すこともある。）を取り出した。
【００８６】
その後、プラスミドｐG5-LA溶液に２種類の制限酵素（NdeI及びNotI）を加え、ＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐET21ｂ（Novagen社製）を２種類の制限酵素（NdeI及びNotI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli BL21株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐELAと記すこともある。）を取り出した。
【００８７】
（６）本発明発現ベクターの調製（その５）
【００８８】
プラスミドｐELA溶液に２種類の制限酵素（XbaI及びPstI）を加え、ＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐUC118（宝酒造社製）を２種類の制限酵素（XbaI及びPstI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐUELAと記すこともある。）を取り出した。
【００８９】
（７）本発明発現ベクターの調製（その６）
【００９０】
プラスミドｐUELA溶液に２種類の制限酵素（EcoRI及びPstI）を加え、ＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐKK223-3（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を２種類の制限酵素（EcoRI及びPstI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐKELAと記すこともある。）を取り出した。
【００９１】
（８）本発明形質転換体の調製
プラスミドｐULA、プラスミドｐKLA、プラスミドｐTLA、プラスミドｐＵＥＬＡ、または、プラスミドｐＫＥＬＡ溶液でE．coli JM109株を形質転換し、それぞれ形質転換体JM109（ｐULA）、JM109（ｐKLA）、JM109（ｐTLA）、JM109（ｐＵＥＬＡ）、JM109（ｐＫＥＬＡ）を得た。また、プラスミドｐELA溶液でE．coli BL21(DE3)株を形質転換し、形質転換体BL21(DE3)（ｐELA）を得た。また、プラスミドｐＫＥＬＡ溶液でE．coli XL1Blue  MRF'株、または、BL21株をそれぞれ形質転換し、それぞれ形質転換体XL1Blue  MRF'（ｐＫＥＬＡ）、形質転換体BL21（ｐＫＥＬＡ）を得た。
【００９２】
（９）本発明形質転換体の調製及び還元反応例（その１）
得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（４ｍｌ）にＩＰＴＧを０．４ｍＭの添加した培地、または無添加培地に接種し、振盪培養した（３７℃、２４時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体０．０４gを得た。上記湿菌体を０．９％生理的食塩水にて洗浄した後、０．１Ｍのカリウムリン酸緩衝液（KPB）（ｐＨ７．０）１ｍｌに懸濁した。懸濁液中にさらにガラスビーズ（０．１ｍｍ）を１ｇ添加し、菌体破砕を行なった。破砕液を遠心分離後、上清液約１ｍｌを酵素液として得た。酵素液１０μｌにＰＴＫを３．０μｍｏｌ、ＮＡＤＨを０．４μｍｏｌ、ＫＰＢ（ｐＨ７．０）を７５μｍｏｌ加えて全量を１．５ｍｌとし、２５℃で２０秒間保温した後、３４０ｎｍの吸光度を測定した。３４０ｎｍの吸光度からＮＡＤＨの消費量を計算して還元酵素活性を求めた。なお、１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ＋に変換した酵素量と定義した。結果を表１に示す。
【００９３】
表１
2008017773.tif 000002
【００９４】
実施例３  本発明形質転換体を用いた還元反応例（その２）
形質転換体E．coli BL21（ｐKELA）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（４ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３７℃、２４時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体０．０４gを得た。培養液１ｍｌ分の湿菌体（約５Ｕ）に各基質を１００ｍｇ、ＮＡＤ＋を１μｍｏｌ、ＫＰＢ（ｐＨ７．０）を１００μｍｏｌ、２−プロパノールを０．１ｍｌ加えて全量を１ｍｌとし、２５℃で２４時間振とうした。その後、反応液に１．０ｍｌの酢酸エチルを加えたのち、遠心分離し、有機層を得た。有機層を分取後、さらに１．０ｍｌの酢酸エチルを加え、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥後、下記条件でガスクロマトグラフィーによる含量分析を行った。また、生成物の絶対配置をガスクロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィーにて測定した。
【００９５】
表２
2008017773.tif 000003
【００９６】
（２−ヘプタノン、２−ヘプタノールの含量分析条件、および、光学純度分析条件）
（含量分析条件（ガスクロマトグラフィー条件））
カラム：ＤＢ−１ (０．２５ｍｍ×３０Ｍ)
カラム温度：４０℃（５分間）→５℃／分→１００℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：１ｍｌ／分）
スプリット比：４０
検出器：ＦＩＤ
溶出時間：２−ヘプタノン（６．３分）、２−ヘプタノール（７．０分）
（光学純度分析条件（液体クロマトグラフィー条件））
カラム：ＯＢ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
カラム温度：３０℃
キャリアー：ヘキサン／２−プロパノール＝４９／１
流速：０．５ｍｌ／分
検出波長：２５４ｎｍ
溶出時間：（Ｒ）−２−ヘプタノール（７．２分）、（Ｓ）−２−ヘプタノール（７．４分）
【００９７】
（ピルビン酸エチル、乳酸エチルの含量分析条件、および、光学純度分析条件）
（ガスクロマトグラフィー条件）
カラム：Cyclodextrine-β-236M-19 (０．２５ｍｍ×２５Ｍ, DF)
カラム温度：８０℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：０．５ｍｌ／分）
スプリット比：５０
検出器：ＦＩＤ
溶出時間：ピルビン酸エチル（３．１分）、（Ｒ）−乳酸エチル（４．０分）、（Ｓ）−乳酸エチル（４．２分）
【００９８】
（３−メチル-２-オキソ酪酸エチル、３−メチル-２-ヒドロキシ酪酸エチルの含量分析条件、および、光学純度分析条件）
（含量分析条件（ガスクロマトグラフィー条件））
カラム：ＤＢ−１ (０．２５ｍｍ×３０Ｍ)
カラム温度：４０℃（５分間）→５℃／分→１００℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：１ｍｌ／分）
スプリット比：４０
検出器：ＦＩＤ
溶出時間：３−メチル-２-オキソ酪酸エチル（１２．１分）、３−メチル-２-ヒドロキシ酪酸エチル（１２．９分）
（光学純度分析条件（液体クロマトグラフィー条件））
カラム：ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
カラム温度：３０℃
キャリアー：ヘキサン／２−プロパノール＝９／１
流速：０．５ｍｌ／分
検出波長：２２０ｎｍ
溶出時間：（Ｓ）−３−メチル-２-ヒドロキシ酪酸エチル（７．９分）、（Ｒ）−３−メチル-２-ヒドロキシ酪酸エチル（８．４分）
【００９９】
（３−オキソ酪酸エチル、３−ヒドロキシ酪酸エチルの含量分析条件、および、光学純度分析条件）
（含量分析条件（ガスクロマトグラフィー条件））
カラム：Ｔｈｅｒｍｏｎ１０００ （５％  ＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂＷ）(３ｍｍ×２Ｍ)（信和化工社製）
カラム温度：７０℃
キャリアーガス：窒素（流量：０．５ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
溶出時間：３−オキソ酪酸エチル（７．６分）、３−ヒドロキシ酪酸エチル（１０．１分）
（光学純度分析条件（液体クロマトグラフィー条件））
カラム：ＯＢ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
カラム温度：３０℃
キャリアー：ヘキサン／２−プロパノール＝９／１
流速：１ｍｌ／分
検出波長：２２０ｎｍ
溶出時間：（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸エチル（１１．６分）、（Ｒ）３−ヒドロキシ酪酸エチル（１２．６分）
【０１００】
（４−クロロ−３−オキソ酪酸エチル、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの含量分析条件、および、光学純度分析条件）
（含量分析条件（ガスクロマトグラフィー条件））
カラム：ＤＢ−１ (０．２５ｍｍ×３０Ｍ)
カラム温度：７０℃（５分間）→５℃／分→２５０℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：１ｍｌ／分）
スプリット比：４０
検出器：ＦＩＤ
溶出時間：４−クロロ−３−オキソ酪酸エチル（１１．１分）、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（１２．３分）
（光学純度分析条件（液体クロマトグラフィー条件））
カラム：ＯＢ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
カラム温度：３０℃
キャリアー：ヘキサン／２−プロパノール＝９／１
流速：０．５ｍｌ／分
検出波長：２２０ｎｍ
溶出時間：（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（７．４分）、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（７．９分）
【０１０１】
（２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールの含量分析条件、および、光学純度分析条件）
（ガスクロマトグラフィー条件）
カラム：Cyclodextrine-β-236M-19 (０．２５ｍｍ×２５Ｍ, DF)
カラム温度：１３０℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：０．５ｍｌ／分）
スプリット比：５０
検出器：ＦＩＤ
尚、生成物の絶対立体配置は（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールの標品と比較することにより決定した。
溶出時間：２，２，２−トリフルオロアセトフェノン(１．８分)、（Ｓ）−（＋）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノール（６．７分）、（Ｒ）−（−）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノール（７．３分）
【０１０２】
（２，３’−ジクロロアセトフェノン、２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタノールの含量分析条件、および、光学純度分析条件）
（ガスクロマトグラフィー条件）
カラム：Cyclodextrine-β-236M-19 (０．２５ｍｍ×２５Ｍ, DF)
カラム温度：１６０℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：１ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
溶出時間：２，３’−ジクロロアセトフェノン(８．５分)、（Ｓ）−２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタノール（１２．７分）、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタノール（１３．１分）
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本願発明の方法によれば、カルボニル化合物から光学活性アルコール化合物が効率よく得られる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】に、本発明発現ベクターの調製例を示す。
【０１０５】
「配列表フリーテキスト」
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【図１】
2008017773.tif 000004
【配列表】
2008017773000001.app