(57)【要約】【課題】ヒトの心臓肥大を予防および処置するための新たな薬理学的ストラテジーを提供すること。【解決手段】心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおける使用のために適切な物質をスクリーニングする方法であって、該方法は、  ａ）実質的に単離された酵素と、該物質とを接触させる工程であって、該酵素は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の活性産物のレベルの調節に関与する、工程；  ｂ）該物質の存在下での該酵素の活性を測定する工程；および  ｃ）該物質の非存在下での該酵素の活性を測定することによってコントロールを提供する工程、を包含し、ここで、該コントロールと比較して、該物質による該酵素の活性の調節は、該物質が該心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおける使用のために適切な物質をスクリーニングする方法であって、該方法は、
ａ）実質的に単離された酵素と、該物質とを接触させる工程であって、該酵素は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の活性産物のレベルの調節に関与する、工程；
ｂ）該物質の存在下での該酵素の活性を測定する工程；および
ｃ）該物質の非存在下での該酵素の活性を測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、該コントロールと比較して、該物質による該酵素の活性の調節は、該物質が該心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。
【請求項２】
前記実質的に単離された酵素が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＡおよびＢ）（ＣａＭＫＩＩα）、ＹＹ１、ｐ３８およびＭＫＫ６、またはそれらの誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される前記少なくとも１つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびｂ型ナトリウム利尿因子からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおいて使用するための物質をスクリーニングする方法であって、該方法は、
ａ）第１の実質的に単離された心筋細胞と、物質とを接触させる工程；
ｂ）該物質の存在下での第１の心筋細胞の肥大に関連する心筋細胞パラメーターを測定する工程；および
ｃ）該物質が接触していない第２の実質的に単離された心筋細胞における肥大に関連する該心筋細胞パラメーターを測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、該コントロールと比較して、該物質による該心筋細胞パラメーターの調節は、該物質が、該心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。
【請求項５】
前記第１および第２の心筋細胞が、初代心筋細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１および第２の心筋細胞がトランスジェニック非ヒト動物から実質的に単離され、かつ該トランスジェニック動物が、心筋細胞において発現されるトランスジーンを含み、かつ該トランスジーンの発現産物が、心筋シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の活性産物のレベルを調節する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トランスジーンの発現産物が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＡおよびＢ）（ＣａＭＫＩＩα）、ＹＹ１、ｐ３８およびＭＫＫ６、またはそれらの誘導体である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
測定される前記心筋細胞パラメーターが、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される前記少なくとも１つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびｂ型ナトリウム利尿因子からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
測定される前記心筋細胞パラメーターが細胞直径である、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
測定される前記心筋細胞パラメーターが細胞質量である、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
測定される前記心筋細胞パラメーターが、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の活性産物のレベルである、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される前記少なくとも１つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびｂ型ナトリウム利尿因子からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおける使用のための物質をスクリーニングする方法であって、該方法は、
ａ）非ヒトトランスジェニック動物またはそのインビトロ部分に物質を投与する工程であって、該非ヒトトランスジェニック動物またはそのインビトロ部分は、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＡおよびＢ）（ＣａＭＫＩＩα）、ＹＹ１、ｐ３８およびＭＫＫ６、またはそれらの誘導体をコードするコード領域と、心筋特異的転写調節エレメントとを含むトランスジーンを含むゲノムを有する、工程；
ｂ）該動物またはその一部の心臓パラメーターを、該物質の存在下で測定する工程；および
ｃ）該物質を投与しない対応する動物またはその一部における該心臓パラメーターを測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、該コントロールと比較して、該物質による心臓パラメーターの調節は、該物質が、心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。
【請求項１５】
測定される前記心臓パラメーターが、心室質量、拡張型心筋症、類線維沈着、心筋細胞組織化、カルシウムイオンフラックス、拍動の長さ、および心室拍出量、およびｄＰ／ｄＴからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
トランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト動物であって、該動物は、
ａ）少なくとも１つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域；および
ｂ）該コード領域に作動可能に連結された転写調節エレメント（ＴＲＥ）であって、該ＴＲＥは、心筋細胞特異的プロモーターを含み、
ここで、該トランスジェニック動物は、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に増加しているという点において、特徴付けられる、
トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの心臓肥大感受性遺伝子が、心房性ナトリウム利尿因子遺伝子、ｂ型ナトリウム利尿ペプチド遺伝子、β−ミオシン重鎖遺伝子、およびα−骨格筋アクチン遺伝子からなる群より選択される、請求項１６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１８】
前記心筋細胞特異的プロモーターが、α−ミオシン重鎖プロモーターである、請求項１６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１９】
前記ＴＲＥが誘導性プロモーターエレメントをさらに含む、請求項１６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２０】
前記誘導性プロモーターエレメントが、テトラサイクリントランスアクチベーターによって調節される、請求項１９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２１】
前記コード領域が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＡおよびＢ）（ＣａＭＫＩＩα）、ＹＹ１、ｐ３８およびＭＫＫ６、またはそれらの誘導体をコードする、請求項１６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２２】
前記カルシニューリンのホスファターゼ活性が、構成的に活性である、請求項２１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２３】
トランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト動物であって、該動物は、
ａ）少なくとも１つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域；および
ｂ）該コード領域に作動可能に連結された転写調節エレメント（ＴＲＥ）であって、該ＴＲＥは、心筋細胞特異的プロモーターを含み、
ここで、該トランスジェニック動物は、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に減少しているという点において、特徴付けられる、
トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２４】
前記コード領域が、カルシニューリンのドミナントネガティブ変異体をコードする、請求項２３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２５】
前記変異体が、ホスファターゼ活性を実質的に欠失しており、ここで、該変異体がカルモジュリン結合を保持している、請求項２４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２６】
心臓肥大のトランスジェニックマウス動物モデルを作製する方法であって、該方法は、
ａ）マウス胚に、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＡおよびＢ）（ＣａＭＫＩＩα）、ＹＹ１、ｐ３８およびＭＫＫ６からなる群より選択される遺伝子産物またはその酵素的に活性な改変体をコードするコード領域を含むポリヌクレオチドを導入する工程であって、該コード領域は、心筋細胞特異的プロモーターを含む転写調節エレメントに作動可能に連結されている、工程；および
ｂ）養育母マウスに該胚を移入する工程、
を包含し、
ここで、該トランスジェニックマウスは、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に増加しているという点において、特徴付けられる、
方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法に従って得られたマウスを交配することによって生産される、トランスジェニックマウス。
【請求項２８】
請求項２７に記載のマウスであって、該子孫は、前記遺伝子産物のうちの少なくとも２つを含む、マウス。
【請求項２９】
請求項１６に記載のトランスジェニック動物から得られた細胞。
【請求項３０】
前記細胞が心筋細胞である、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
請求項２３に記載のトランスジェニック動物から得られた細胞。
【請求項３２】
前記細胞が心筋細胞である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３３】
心臓肥大を減少または低減させる能力について物質をスクリーニングする方法であって、該方法は、
ａ）請求項１６に記載のトランスジェニック動物に該物質を投与する工程；および
ｂ）該動物における心臓パラメーターまたは心臓機能を測定して、該物質を投与していないトランスジェニック同腹仔と比較する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、１９９７年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／０６２，８６４号、１９９７年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／０６５，１７８号、１９９８年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／０８１，８５３号、および１９９８年４月１６日に出願された米国特許出願第０９／０６１，４１７号の優先権を主張する。
【０００２】
（資金援助された研究の下でなされた発明に対する権利の記載）
本発明についての資金援助は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号第８０５−３３５１号の下で、米国政府によって一部提供された。従って、米国政府は、本願発明に一定の権利を有し得る。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、心臓肥大についてのトランスジェニック動物モデルに関する。本発明はさらに、心臓肥大に対する治療活性を有する物質を検出するためのこのようなトランスジェニック動物の使用に関する。本発明はさらに、心臓肥大の処置に使用する物質を検出するアッセイに関する。本発明はさらに、心臓肥大を処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景技術）
（心臓肥大）
心臓肥大は、心臓疾患の実質的に全ての形態に対する心臓の適応応答であり、これらの心臓疾患には、高血圧、機械的負荷、心筋梗塞、不整脈、内分泌障害、および心筋収縮タンパク質遺伝子の遺伝的変異が挙げられる。肥大応答は、心臓拍出を増大する、最初の補償的機構であるが、継続した肥大は、拡張型心筋症、心不全、および突然死を導き得る。米国では、ほぼ５０万人が毎年心不全と診断されており、死亡率は、５０％に達する。
【０００５】
心臓肥大を導く多様な刺激にもかかわらず、細胞サイズおよびタンパク質合成の増加、増強された筋節組織化、胎児性心臓遺伝子のアップレギュレーション、および前初期遺伝子の誘導（例えば、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｍｙｃ）に関与する肥大シグナルに対する心筋細胞の基本的な最終分子応答が存在する。Ｃｈｉｅｎら（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５：７７−９５；およびＳａｄｏｓｈｉｍａおよびＩｚｕｍｏ（１９９７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５９：５５１−５７１を参照のこと。心臓肥大の因果は、広範に述べられているが、心筋細胞遺伝子発現の再プログラミングに対する細胞膜で開始される肥大シグナルを結びつける、根底にある分子的機構は、依然としてほとんど理解されていないままである。これらの機構の解明は、心臓血管生物学における中心的な論点であり、そして心臓肥大および心不全の予防または処置についての新たなストラテジーを設計するために重要である。
【０００６】
多くの研究は、心臓肥大についてのシグナルとして細胞内Ｃａ2+を関連付けた。心臓製剤を働かせている状態での筋細胞伸展または増加した負荷に対する応答において、細胞内Ｃａ2+濃度は、生理的応答と増強した心臓拍出とを協同させることにおいてＣａ2+の役割と一致して上昇する（Ｍａｒｂａｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６００５−６００９；Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅら（１９９１）Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７：Ｓ１１０−Ｓ１１３；およびＨｏｎｇｏら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６９：Ｃ６９０−Ｃ６９７）。アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）、フェニレフリン（ＰＥ）、およびエンドセリン−１（ＥＴ−１）を含む種々の体液性因子（これは、心筋細胞の肥大応答を誘導する）はまた、細胞内Ｃａ2+濃度を上昇させる能力を有する。Ｋａｒｌｉｎｅｒら（１９９０）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ４６：８１−８４；ＳａｄｏｓｈｉｍａおよびＩｚｕｍｏ（１９９３）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７３：４２４−４３８；Ｓａｄｏｓｈｉｍａら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：９７７−９８４；およびＬｅｉｔｅら（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：Ｈ２１９３−Ｈ２２０３。
【０００７】
肥大刺激は、β−ミオシン重鎖（ＭＨＣ）およびα−骨格筋アクチン様の胎児性タンパク質イソ形態をコードする遺伝子がアップレギュレートされるように、成体心筋層での遺伝子発現の再プログラミングを生じる。その一方で、対応する成体イソ形態（α−ＭＨＣおよびα−心筋アクチン）は、ダウンレギュレートされる。血管拡張およびナトリウム排泄増加によって血圧を低下させるナトリウム利尿ペプチド、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、およびｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）はまた、肥大シグナルに対する応答において、心臓で迅速にアップレギュレートされる。ＫｏｍｕｒｏおよびＹａｚａｋｉ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５：５５−７５．肥大の間にこれらの心臓遺伝子を協同して調節することに関与するこの機構は未知であるが、いくつかの転写調節因子（血清応答因子（ＳＲＦ）、ＴＥＦ−１、ＡＰ−１、およびＳｐ−１を含む）結合部位は、肥大に応答性の胎児性心臓遺伝子の活性化のために重要である。ＳａｄｏｓｈｉｍａおよびＩｚｕｍｏ（１９９３）；Ｓａｄｏｓｈｉｍａら（１９９３）；Ｋａｒｉｙａら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３７７５−３７８２；Ｋａｒｎｓら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：４１０−４１７；およびＫｏｖａｃｉｃ−Ｍｉｌｉｖｏｊｅｖｉｃら（１９９６）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３７：１１０８−１１１７。最も最近では、心臓制限ジンクフィンガー（ｃａｒｄｉａｃ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｚｉｎｃ
ｆｉｎｇｅｒ）転写因子、ＧＡＴＡ４は、肥大の間にＡｎｇＩＩ  １ａ型レセプターおよびβ−ＭＨＣについての遺伝子の転写活性化を必要とすることもまた示されている。Ｈｅｒｚｉｇら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：７５４３−７５４８；Ｈａｓｅｇａｗａら（１９９７）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９６：３９４３−３９５３；およびＭｏｌｋｅｎｔｉｎおよびＯｌｓｏｎ（１９９７）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９６：３８３３−３８３５。
【０００８】
多くの細胞内シグナル伝達経路は、肥大刺激の伝達に関与している。例えば、細胞表面レセプターの、ＡｎｇＩＩ、ＰＥ、およびＥＴ−１についての占有は、ホスホリパーゼＣの活性化を誘導し、ジアシルグリセロールおよびイノシトール三リン酸の生成を生じる。これは、次いで、細胞内Ｃａ2+の移動およびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化を生じる。ＳａｄｏｓｈｉｍａおよびＩｚｕｍｏ（１９９３）；Ｙａｍａｚａｋｉら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３２２１−３２２８；およびＺｏｕら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３３５９２−３３５９７。Ｒａｓおよびマイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼ経路が肥大シグナルのトランスデューサーであるという証拠もまた存在する。Ｔｈｏｒｂｕｒｎら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４４−２２４９；およびＦｏｒｃｅら（１９９６）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７８：９４７−９５３。これらのシグナル伝達経路が心臓肥大の間に協調される程度は、未知である。しかし、これらの経路の全ては、複数の肥大シグナル伝達経路の活性化を協調することにおけるＣａ2+の中心的な調節役割と一致して、細胞内Ｃａ2+の増加と関連する。
【０００９】
ＢおよびＴ細胞において、Ｃａ2+、カルモジュリン依存性ホスファターゼ、カルシニューリンは、細胞内シグナル伝達経路を関連することを示している。これは、免疫応答の活性化に伴って、細胞内Ｃａ2+の上昇を生じる。カルシニューリンは、ＮＦ−ＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）として知られる転写因子のファミリーの脱リン酸化によって免疫応答遺伝子を調節する。Ｒａｏら（１９９７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：７０７−７４７。一旦、カルシニューリンによって脱リン酸化されると、ＮＦ−ＡＴ転写因子は核へ移行し、そして免疫応答遺伝子を直接活性化する。Ｆｌａｎａｇａｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：８０３−８０７；Ｌｏｈら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：３９４５−３９５４；およびＬｏｈら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０８８４−１０８９１。免疫抑制薬物であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびＦＫ５０６は、ＮＦ−ＡＴ転写因子を活性化するカルシニューリンの能力を阻害することによって免疫応答を抑制する。Ｓｈａｗら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１２０５−１１２０９；Ｌｏｈら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０８８４−１０８９１。
【００１０】
心臓肥大に十分に類似する、実験モデルとして有用な自然発症変異マウスは存在しない。ヒト心房性ナトリウム利尿因子遺伝子の制御下でカルモジュリンを過剰発現するトランスジェニック齧歯類系統が生産された。Ｇｒｕｖｅｒら（１９９３）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３３：３７６−３８８。これらのマウスにおいて、マウス心筋のＣａＭの発生的過剰発現は顕著に誇張された心臓成長応答を生成し、ＣａＭを過剰発現することが実証された領域において心筋肥大の存在および初期の発生段階で明らかである心筋過形成によって特徴付けられる。しかし、これらの動物においてカルモジュリンの発現は構成性であるため、ヒトにおける生理学的条件の反映ではない。トランスジェニックマウスが作製され、ここで、レポーター遺伝子は、テトラサイクリンで制御されたトランスアクチベーター（ｔＴＡ）によって調節され、次いで、ラットα−ミオシン重鎖遺伝子からの配列に隣接する５’の２．９ｋｂの転写制御下である。Ｙｕら（１９９６）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９：６９１−６９７。
【００１１】
心臓肥大の現在の医学的対応としては、３つの型の薬物の使用が挙げられる：カルシウムチャネル遮断剤、β−アドレナリン遮断剤、およびジソピラミド。ＫｉｋｕｒａおよびＬｅｖｙ（１９９５）Ｉｎｔ．Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．３３：２１−３７。心不全のための治療剤としては、アンジオテンシンＩＩ変換酵素（ＡＣＥ）インヒビターおよび利尿薬が挙げられる。心臓肥大の処置が開示されている他の薬剤としては、アンジオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト（米国特許第５，６０４，２５１号）；および神経ペプチドＹアンタゴニスト（国際特許出願ＷＯ９８／３３７９１）が挙げられる。現在、薬学的化合物が利用可能であるにもかかわらず、心臓肥大およびこれに引き続く心不全の予防および処置は治療的な挑戦でありつづけている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、ヒトの心臓肥大を予防および処置するために新たな薬理学的ストラテジーの開発が必要である。このようなストラテジーを開発するために、この疾患の病理学的プロファイルを正確に反映する動物モデルが必要であり、この動物モデルによって、治療的介入の新規な標的の同定が可能になる。さらに、心臓肥大を処置するために、新たな強力な治療剤の同定を可能にする新規なアッセイが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、心臓肥大の非ヒト動物モデルを提供する。このようなモデルは、心臓肥大の処置のためのさらなる標的を同定するため、および心臓肥大の処置において有効な物質を試験するために有用である。１つの局面において、本発明は、トランスジーンとしてポリヌクレオチドを含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。このポリヌクレオチドは、哺乳動物非ヒト動物の受精卵または胚へ初期段階において導入した場合、それらのゲノムへ機能的に組み込まれ、それによってトランスジェニック動物を生産し得る。このトランスジェニック動物は、このポリヌクレオチドが制御配列（例えば、プロモーターを含む）と組み合わせて、心臓肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むという点で特徴付けられる。そしてこの制御配列は、トランスジェニック動物の体細胞、特に心筋細胞内の遺伝子の発現に指向し、かつ調節する。
【００１４】
本発明は、トランスジーンとして心臓肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物を含む。ここで、この動物は、肥大型心筋症または類似の心臓機能不全の症状を自発的に発症する可能性が実質的に増加されている。
【００１５】
本発明はさらに、トランスジーンとして心臓肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物を含む。ここで、この動物は、肥大型心筋症または類似の心臓機能不全の症状を自発的に発症する可能性が実質的に減少されている。
【００１６】
本発明のトランスジェニック動物は、心臓肥大および心臓肥大が誘導する機能不全の予防または処置するための新たな標的を同定することにおいて有用である。これらの動物はまた、調査目的のため、肥大シグナルに対する応答に関与するシグナル伝達経路を調べるために有用である。これらの動物はさらに、心臓肥大の処置および／または予防のための強力な治療剤をスクリーニングするために有用である。
【００１７】
好ましくは、本発明のトランスジェニック動物を生産するために使用されるポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ構築物である。ここで、プロモーターおよび少なくともいくつかの制御配列が作動可能に連結したコード配列の発現を指向する。いくつかの実施態様において、プロモーターおよび制御配列は、心筋細胞特異的様式で発現される。このコード配列は、転写を終結するため、およびコードされた遺伝子産物の発現の間に転写されたＲＮＡのプロセシングを制御するためのシグナルを提供するに効果的な真核生物遺伝子配列の少なくともフラグメントを含む下流セグメントに融合される。１つの実施態様において、プロモーターは、α−ミオシン重鎖遺伝子（α−ＭＨＣ）に由来する。他の実施態様において、転写制御配列は、作動可能に連結されたコード配列に対する誘導性の発現を付与するエレメントを含む。いくつかの実施態様において、トランスジェニック動物は、少なくとも１つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を調節するポリペプチドをコードするトランスジーンを含む。これらの実施態様において、このポリペプチドは、改変された機能（例えば、改変された酵素機能）を有するか、または改変された調節特性（例えば、優性のネガティブ変異体）を有するように、野生型アミノ酸配列または変異アミノ酸配列を含み得る。他の実施態様において、トランスジーンがコードした遺伝子産物は、アンチセンスポリヌクレオチドである。なお他の実施態様において、このトランスジーンがコードした遺伝子産物はリボザイムである。
【００１８】
この構築物は、マイクロインジェクションのような標準的技術を使用して動物胚または胚幹細胞へ導入される。細胞培養ベースのモデルもまた、種々の方法によって調製され得る。例えば、細胞をトランスジェニック動物から単離し得るか、または標準的な細胞トランスフェクション技術で同じ構築物を使用して樹立された細胞培養物から調製し得る。
【００１９】
本発明はさらに、肥大型心筋症または類似の心臓機能不全を自発的に発症する可能性が実質的に増加されたか、または肥大型心筋症または類似の心臓機能不全を自発的に発症する可能性が実質的に減少されたかのいずれかのトランスジェニック動物（例えば、マウスまたは他の齧歯類）を生産するための方法を提供する。この方法は、上記の特定化されたポリヌクレオチドが機能的にゲノムに組み込まれるように非ヒト動物のゲノムへ取り込む工程を包含する。少なくとも好ましい実施態様において、核酸は、組換えＤＮＡであり、これは、受精卵または動物の胚へ、それらのゲノムに機能的に組み込まれるように導入される。この組換えＤＮＡは、遺伝子産物をコードする遺伝子配列を含むセグメントを含むという点で特徴付けられ、この遺伝子産物は、肥大シグナルに応答して、またはこのような遺伝子産物の誘導体のために心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する。このセグメントは、上記コード配列の発現を指向かつ調節するために有効なプロモーターおよび少なくともいくつかの制御配列を含む上流セグメントに融合される。そしてまた、好ましくは、このセグメントは、転写の終結および転写されたＲＮＡのプロセシングを制御するためのシグナルを提供するために効果的な真核生物遺伝子配列またはフラグメントを含む下流セグメントに融合される。
【００２０】
トランスジェニック動物を生産することにおいて使用するための構築物は、トランスジーンの発現が構成性または誘導性であり得るように構築され得る。トランスジェニック動物を生産することにおいて使用するためのポリヌクレオチドは、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含み、この遺伝子産物は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する。１つの局面において、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするこのヌクレオチド配列は、構成的に発現される。別の局面において、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする遺伝子は、調節可能な様式で発現される。別の局面において、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする遺伝子は、ポリペプチドの優性なネガティブ変異体をコードする部分を含む。
【００２１】
本発明の１つの局面において、トランスジェニック動物は、トランスジーンとして少なくとも１つの遺伝子の転写を抑制する遺伝子産物をコードする遺伝子を含む。この少なくとも１つの遺伝子は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される。本発明の別の局面において、トランスジーンがコードした遺伝子産物は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を誘導する。例えば、転写因子ＹＹ１は、心臓肥大応答性遺伝子の全体的なリプレッサであるが、カルシニューリンは、一般的に、心臓肥大応答性遺伝子の転写を誘導する。
【００２２】
本発明の別の局面は、上記のトランスジェニック動物から単離された細胞に関する。好ましくは、このような細胞は、心臓組織に由来し、そして心筋細胞である。本発明のトランスジェニック動物から単離された心筋細胞は、細胞がインビトロで曝露された物質の心臓治療的特徴を試験するために使用され得る。従って、この細胞は、心臓肥大の処置および／または予防のための強力な治療剤をスクリーニングするために有用である。このような細胞はまた、心臓肥大または心臓肥大が誘導する機能不全の予防および治療のための新規な標的を同定するために使用され得る。これらの細胞はまた、調査目的で、肥大シグナルに対する応答に関与するシグナル伝達経路を調査するために有用である。
【００２３】
本発明はさらに、心臓肥大が誘導する疾患状態（機能不全）を処置することにおいて使用するための物質をスクリーニングするための方法を提供する。
【００２４】
いくつかの実施態様において、酵素ベースのスクリーニングアッセイが提供され、ここで、この使用される酵素は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の活性な産物のレベルを調節することに関与する。この方法は、一般的に、この酵素と試験される物質とを接触させる工程、および試験される物質の非存在下でこの酵素を含むコントロールサンプルと比較して、この酵素活性を測定する工程を包含する。
【００２５】
別の実施態様において、細胞ベースのスクリーニングアッセイが提供され、ここで、実質的に単離された心筋細胞を、試験される物質と接触させて、次いで、心筋細胞機能またはパラメーターを測定する。測定される心筋細胞機能における変化は、物質が添加されないコントロール細胞サンプルと比較した場合、物質が心臓肥大が誘導した機能不全の処置において使用されるために適切であることを示す。これらの実施態様のいくつかにおいて、心筋細胞は本発明のトランスジェニック動物に由来する。他の実施態様において、心筋細胞は非トランスジェニック動物に由来する。
【００２６】
なお他の実施態様において、動物そのものがベースのスクリーニングアッセイが提供される。これらの実施態様において、本発明は、上記の動物に投与した物質の心臓治療的特徴を試験するため、または肥大型心筋症の発症を制御もしくは阻害することにおいてこのような物質の活性を試験するための、本発明のトランスジェニック動物、およびその一部の使用を含む。従って、本発明の別の局面に従って、肥大型心筋症の発症に対してまたはこれの処置において活性な薬物もしくは他の物質をスクリーニングおよび同定または試験するための方法は、本発明のトランスジェニック動物、またはその一部を、上記の薬物または他の関係のある物質で処置する工程、ならびに肥大型心筋症の発症の発生数の任意の減少および死亡率の減少を、この薬物または物質で処置していない対応する動物と比較して、検出または記載する工程、あるいは心臓機能を維持、修復、または改善することにおける有効性を検出または記載する工程を包含する。
【００２７】
本発明はさらに、本発明の方法によって同定された物質、ならびに公知の物質を含む組成物の、心臓肥大および心不全を処置するための使用を提供する。このような組成物は、１つ以上の遺伝子産物の活性レベルを増加させる物質を含み、この遺伝子産物は、通常、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を抑制する。このことによって、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の発現を減少させる。このような組成物はまた、１つ以上の遺伝子産物の活性レベルを減少させる物質を含み、この遺伝子産物は、通常、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を増加させる。これにより肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の発現を減少させる。さらに、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される、少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物の公知のモジュレータである物質が、心臓肥大が誘導する機能不全を処置することにおける使用のために含まれる。カルシニューリンのホスファターゼ活性を阻害する、公知のカルシニューリンのインヒビター、およびこれらのインヒビターの誘導体が含まれる。
【００２８】
本発明はさらに、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物のモジュレーターを使用して心臓肥大を処置する方法を提供する。本発明の１つの局面において、カルシニューリンインヒビターを使用して、心臓肥大および心不全を制御する。本発明はさらに、心臓肥大または心臓肥大が誘導する機能不全を処置する方法を提供し、この方法は、機能不全を減退させるかまたは進行を逆転させる物質をその必要がある個体に投与する工程を包含する。いくつかの実施態様において、この物質は、遺伝子産物が肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子の発現を阻害する。他の実施態様において、この物質は、このような遺伝子産物の活性を阻害する。いくつかの実施態様において、この方法は、カルシニューリンのホスファターゼ活性を阻害する、カルシニューリンの公知のインヒビター、およびこれらのインヒビターの誘導体を含む組成物を投与する工程を包含する。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）  心臓肥大が誘導する機能不全を処置する方法であって、
上記機能不全の進行を減退または逆転させるために有効な量の組成物を、心臓肥大が誘導する機能不全を処置する必要がある被験体に投与する工程
を包含し、上記組成物は、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＡおよびＢ）（ＣａＭＫＩＩα）、ＹＹ１、ｐ３８およびＭＫＫ６、またはそれらの誘導体からなる群より選択されるタンパク質の活性を阻害する、方法。
・（項目２）  上記組成物が、上記タンパク質またはそれらの誘導体の活性を阻害する、シクロスポリン、ＦＫ５０６、およびそれらの誘導体からなる群より選択される物質を含む、項目１に記載の方法。
・（項目３）  上記組成物が、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の活性を調節する、項目１に記載の方法。
・（項目４）  肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される上記少なくとも１つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、およびｂ型ナトリウム利尿因子からなる群より選択される、項目３に記載の方法。
・（項目５）  上記組成物が、カルシニューリンの活性を低減させる、項目１に記載の方法。
・（項目６）  上記組成物が、カルシニューリンホスファターゼ活性のインヒビターを含む、項目５に記載の方法。
・（項目７）  上記物質がカルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）の活性を低減させる、項目１に記載の方法。
・（項目８）  上記物質がＣａＭＫＩＶキナーゼ活性のインヒビターである、項目７に記載の方法。
・（項目９）  上記物質が、ＣａＭＫＩＶをコードする遺伝子の発現レベルを低減させる、項目７に記載の方法。
・（項目１０）  上記物質が、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＣａＭＫＩＩα）の活性を増加させる、項目１に記載の方法。
・（項目１１）  上記物質が、ＣａＭＫＩＩαキナーゼ活性のアクチベータである、項目１０に記載の方法。
・（項目１２）  上記物質が、ＣａＭＫＩＩαをコードする遺伝子の発現レベルを増加させる、項目１１に記載の方法。
・（項目１３）  上記物質が、ＹＹ１の活性を増加させる、項目１に記載の方法。
・（項目１４）  上記物質がｐ３８の活性を低減させる、項目１３に記載の方法。
・（項目１５）  上記物質が、ｐ３８キナーゼ活性を阻害する、項目１に記載の方法。
・（項目１６）  上記物質が、ｐ３８をコードする遺伝子の発現レベルを低減させる、項目１５に記載の方法。
・（項目１７）  上記物質が、ＭＫＫ６の活性を低減させる、項目１に記載の方法。
・（項目１８）  上記物質が、ＭＫＫ６キナーゼ活性を阻害する、項目１７に記載の方法。
・（項目１９）  上記物質が、ＭＫＫ６をコードする遺伝子の発現レベルを低減させる、項目１８に記載の方法。
・（項目２０）  上記組成物が、心臓肥大に対する治療的活性を有する、項目１に記載の方法。
・（項目２１）  上記組成物が、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、項目１に記載の方法。
・（項目２２）  心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおける使用のために適切な物質をスクリーニングする方法であって、上記方法は、
ａ）実質的に単離された酵素と、上記物質とを接触させる工程であって、上記酵素は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の活性産物のレベルの調節に関与する、工程；
ｂ）上記物質の存在下での上記酵素の活性を測定する工程；および
ｃ）上記物質の非存在下での上記酵素の活性を測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、上記コントロールと比較して、上記物質による上記酵素の活性の調節は、上記物質が上記心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。
・（項目２３）  上記実質的に単離された酵素が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＡおよびＢ）（ＣａＭＫＩＩα）、ＹＹ１、ｐ３８およびＭＫＫ６、またはそれらの誘導体である、項目２２に記載の方法。
・（項目２４）  肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される上記少なくとも１つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびｂ型ナトリウム利尿因子からなる群より選択される、項目２２に記載の方法。
・（項目２５）  心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおいて使用するための物質をスクリーニングする方法であって、上記方法は、
ａ）第１の実質的に単離された心筋細胞と、物質とを接触させる工程；
ｂ）上記物質の存在下での第１の心筋細胞の肥大に関連する心筋細胞パラメーターを測定する工程；および
ｃ）上記物質が接触していない第２の実質的に単離された心筋細胞における肥大に関連する上記心筋細胞パラメーターを測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、上記コントロールと比較して、上記物質による上記心筋細胞パラメーターの調節は、上記物質が、上記心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。
・（項目２６）  上記第１および第２の心筋細胞が、初代心筋細胞である、項目２５に記載の方法。
・（項目２７）  上記第１および第２の心筋細胞がトランスジェニック非ヒト動物から実質的に単離され、かつ上記トランスジェニック動物が、心筋細胞において発現されるトランスジーンを含み、かつ上記トランスジーンの発現産物が、心筋シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の活性産物のレベルを調節する、項目２６に記載の方法。
・（項目２８）  上記トランスジーンの発現産物が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＡおよびＢ）（ＣａＭＫＩＩα）、ＹＹ１、ｐ３８およびＭＫＫ６、またはそれらの誘導体である、項目２６に記載の方法。
・（項目２９）  測定される上記心筋細胞パラメーターが、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルである、項目２６に記載の方法。
・（項目３０）  肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される上記少なくとも１つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびｂ型ナトリウム利尿因子からなる群より選択されるタンパク質をコードする、項目２９に記載の方法。
・（項目３１）  測定される上記心筋細胞パラメーターが細胞直径である、項目２５に記載の方法。
・（項目３２）  測定される上記心筋細胞パラメーターが細胞質量である、項目２５に記載の方法。
・（項目３３）  測定される上記心筋細胞パラメーターが、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の活性産物のレベルである、項目２５に記載の方法。
・（項目３４）  肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される上記少なくとも１つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびｂ型ナトリウム利尿因子からなる群より選択されるタンパク質をコードする、項目３３に記載の方法。
・（項目３５）  心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおける使用のための物質をスクリーニングする方法であって、上記方法は、
ａ）非ヒトトランスジェニック動物またはそのインビトロ部分に物質を投与する工程であって、上記非ヒトトランスジェニック動物またはそのインビトロ部分は、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＡおよびＢ）（ＣａＭＫＩＩα）、ＹＹ１、ｐ３８およびＭＫＫ６、またはそれらの誘導体をコードするコード領域と、心筋特異的転写調節エレメントとを含むトランスジーンを含むゲノムを有する、工程；
ｂ）上記動物またはその一部の心臓パラメーターを、上記物質の存在下で測定する工程；および
ｃ）上記物質を投与しない対応する動物またはその一部における上記心臓パラメーターを測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、上記コントロールと比較して、上記物質による心臓パラメーターの調節は、上記物質が、心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。
・（項目３６）  測定される上記心臓パラメーターが、心室質量、拡張型心筋症、類線維沈着、心筋細胞組織化、カルシウムイオンフラックス、拍動の長さ、および心室拍出量、およびｄＰ／ｄＴからなる群より選択される、項目３５に記載の方法。
・（項目３７）  トランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト動物であって、上記動物は、
ａ）少なくとも１つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域；および
ｂ）上記コード領域に作動可能に連結された転写調節エレメント（ＴＲＥ）であって、上記ＴＲＥは、心筋細胞特異的プロモーターを含み、
ここで、上記トランスジェニック動物は、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に増加しているという点において、特徴付けられる、
トランスジェニック非ヒト動物。
・（項目３８）  上記少なくとも１つの心臓肥大感受性遺伝子が、心房性ナトリウム利尿因子遺伝子、ｂ型ナトリウム利尿ペプチド遺伝子、β−ミオシン重鎖遺伝子、およびα−骨格筋アクチン遺伝子からなる群より選択される、項目３７に記載のトランスジェニック動物。
・（項目３９）  上記心筋細胞特異的プロモーターが、α−ミオシン重鎖プロモーターである、項目３７に記載のトランスジェニック動物。
・（項目４０）  上記ＴＲＥが誘導性プロモーターエレメントをさらに含む、項目３７に記載のトランスジェニック動物。
・（項目４１）  上記誘導性プロモーターエレメントが、テトラサイクリントランスアクチベーターによって調節される、項目４０に記載のトランスジェニック動物。
・（項目４２）  上記コード領域が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＡおよびＢ）（ＣａＭＫＩＩα）、ＹＹ１、ｐ３８およびＭＫＫ６、またはそれらの誘導体をコードする、項目３７に記載のトランスジェニック動物。
・（項目４３）  上記カルシニューリンのホスファターゼ活性が、構成的に活性である、項目４２に記載のトランスジェニック動物。
・（項目４４）  トランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト動物であって、上記動物は、
ａ）少なくとも１つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域；および
ｂ）上記コード領域に作動可能に連結された転写調節エレメント（ＴＲＥ）であって、上記ＴＲＥは、心筋細胞特異的プロモーターを含み、
ここで、上記トランスジェニック動物は、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に減少しているという点において、特徴付けられる、
トランスジェニック非ヒト動物。
・（項目４５）  上記コード領域が、カルシニューリンのドミナントネガティブ変異体をコードする、項目４４に記載のトランスジェニック動物。
・（項目４６）  上記変異体が、ホスファターゼ活性を実質的に欠失しており、ここで、上記変異体がカルモジュリン結合を保持している、項目４５に記載のトランスジェニック動物。
・（項目４７）  心臓肥大のトランスジェニックマウス動物モデルを作製する方法であって、上記方法は、
ａ）マウス胚に、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＡおよびＢ）（ＣａＭＫＩＩα）、ＹＹ１、ｐ３８およびＭＫＫ６からなる群より選択される遺伝子産物またはその酵素的に活性な改変体をコードするコード領域を含むポリヌクレオチドを導入する工程であって、上記コード領域は、心筋細胞特異的プロモーターを含む転写調節エレメントに作動可能に連結されている、工程；および
ｂ）養育母マウスに上記胚を移入する工程、
を包含し、
ここで、上記トランスジェニックマウスは、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に増加しているという点において、特徴付けられる、
方法。
・（項目４８）  項目４７に記載の方法に従って得られたマウスを交配することによって生産される、トランスジェニックマウス。
・（項目４９）  項目４８に記載のマウスであって、該子孫は、前記遺伝子産物のうちの少なくとも２つを含む、マウス。
・（項目５０）  項目３７に記載のトランスジェニック動物から得られた細胞。
・（項目５１）  上記細胞が心筋細胞である、項目５０に記載の細胞。
・（項目５２）  項目４４に記載のトランスジェニック動物から得られた細胞。
・（項目５３）  上記細胞が心筋細胞である、項目５１に記載の細胞。
・（項目５４）  心臓肥大を減少または低減させる能力について物質をスクリーニングする方法であって、上記方法は、
ａ）項目３７に記載のトランスジェニック動物に上記物質を投与する工程；および
ｂ）上記動物における心臓パラメーターまたは心臓機能を測定して、上記物質を投与していないトランスジェニック同腹仔と比較する工程、
を包含する、方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
（発明を実施するための形態）
本発明は、トランスジーンとして、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。このトランスジーンに依存して、本発明のトランスジェニック動物は、実質的に増大された、または実質的に減少された、心臓肥大を自発的に発症する可能性を有する。
【００３０】
心臓肥大のための可能な処置を試験するために組換えポリヌクレオチドを用いる、トランスジェニック動物モデルの構築が、記載される。本発明は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。この構築物は、マイクロインジェクションまたは胚幹細胞のような標準技術を用いて動物胚に導入される。
【００３１】
本発明は、トランスジェニック非ヒト動物、およびトランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞を提供する。ここでトランスジーンが、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードし、そしてここで単離された細胞は、トランスジーンを発現する。
【００３２】
本発明は、トランスジェニック動物またはそれから単離された細胞を包含する。これらは、種々のパラメーターによって測定されるように、心臓肥大を減少させ得る物質についてスクリーニングするために使用され得る。このパラメーターとしては、左心室重量／体重、心筋細胞の大きさおよび組織化の変化、心臓遺伝子発現の変化および心臓機能の変化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明は、トランスジェニック動物またはそれから単離された細胞のいずれかを使用する、心臓肥大に対する治療能を有する物質を検出するための方法を提供する。さらに、本発明は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子のレベルを調節することに関与する、実質的に単離された酵素を使用する、スクリーニングアッセイを提供する。このスクリーニングアッセイはまた、非トランスジェニック動物由来の細胞を用いても実施され得る。
【００３４】
本発明は、心臓肥大が誘導する機能不全を処置するための方法をさらに提供し、この方法は、このような処置を必要とする個体に、肥大シグナルに応答して発現される少なくとも１つの遺伝子産物の活性レベルを調節する物質を含む組成物を投与する工程を包含する。これらの組成物に含まれる物質には、本発明の方法によって検出される物質、ならびに既知の物質およびそれらの誘導体が含まれる。
【００３５】
（一般技術）
本発明の実施は、他に示されなければ、分子生物学（組換え技術を包含する）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を使用する。これらは当該技術の範囲内である。このような技術は、文献に十分に説明されている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）：Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）。
【００３６】
トランスジェニック動物の生産に関連した技術について、特に、Ｈｏｇａｎら（１９８６）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  １９８６）を参照のこと。
【００３７】
本明細書中で使用される用語「肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物」は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する任意の遺伝子産物（タンパク質またはＲＮＡのいずれか）をいう。これはまた、転写および／または翻訳のレベルを減少させる、あるいはタンパク質活性を減少させる（例えば、競合または非競合阻害によるか、もしくはタンパク質濃度を減少させることによる）ことなどにより、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の活性を減少させるかまたは調節する遺伝子産物である。「調節」は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される遺伝子のダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションのいずれかであり得る。
【００３８】
肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される遺伝子はまた、本明細書中で、「心臓肥大感受性遺伝子」または「心臓肥大応答性遺伝子」と称される。肥大シグナルに応答して発現される遺伝子の例としては、図１に図解的に示されるように、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、α骨格筋アクチン、ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、心臓アクチン、およびβ−ミオシン重鎖（β−ＭＨＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
用語「トランスジェニック動物」は、その生殖系列ＤＮＡに、動物に導入した１つ以上のＤＮＡ配列を組み込んだ非ヒト動物（好ましくは非ヒト哺乳動物）をいう。
【００４０】
本明細書中で使用される用語「肥大シグナル」は、心臓肥大の測定可能な症状を生じる任意の刺激（機械的または化学的）を示す。心臓肥大シグナルとしては、機械的伸展、β−アドレナリン作用アゴニスト、α1−アドレナリン作用レセプターアゴニスト、およびアンジオテンシンＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。心臓肥大の症状は、種々のパラメーターによって測定され得る。このパラメーターとしては、左心室重量：体重比；心筋細胞の大きさ、重量および組織化の変化；心臓遺伝子発現の変化；心臓機能の変化；フィブロイド沈着；ｄＰ／ｄＴの変化、すなわち、時間に対する心室圧の変化率；カルシウムイオン流動；脈拍長；および心室拍出量が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
用語「転写調節エレメント」（ＴＲＥ）および「転写制御領域」、「転写応答エレメント」、および「転写制御エレメント」（これらは、本明細書中で交換可能に使用される）は、宿主細胞において作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に活性化するポリヌクレオチド配列（好ましくは、ＤＮＡ配列）をいう。ＴＲＥは、通常、プロモーター領域を含み、そして、プロモーターに加えて、他の制御配列（例えば、エンハンサーおよびサイレンサー）を必要に応じて含み得る。
【００４２】
「異種」ＴＲＥ、プロモーター、またはエンハンサーは、遺伝子の５’隣接配列と細胞において通常関連していないものであるか、またはそれに由来しないものである。肥大感受性遺伝子の少なくとも１つの遺伝子産物の活性レベルを調節する産物をコードする遺伝子の文脈において、異種プロモーターまたはエンハンサーの例は、α−ミオシン重鎖遺伝子５’隣接領域を含む。
【００４３】
用語「作動可能に連結された」とは、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの向きに関連する。ＴＲＥは、そのＴＲＥがコード配列の転写を促進する場合、コードセグメントに作動可能に連結される。作動可能に連結されたとは、連結されるＤＮＡ配列が、ほぼ隣接しており、そして２つのタンパク質コード領域を結合させることが必要である場合、隣接し、かつ同じリーディングフレームにあることを意味する。しかし、エンハンサーは、数キロ塩基プロモーターから離れているときに一般に機能するので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結しているが、隣接していない。
【００４４】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」（本明細書中で交換可能に用いられる）は、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）のポリマー形態をいう。従って、この用語は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。当業者は、点変異および欠失が、本発明で使用されるプロモーター配列およびコード領域配列に対して、配列がその機能を実行する能力を変えることなく（その機能が転写を活性化させることであろうが、あるいは機能的タンパク質をコードすることであろうが）なされ得ることを認識する。好ましくは、そのポリヌクレオチドはＤＮＡである。本明細書中で使用される「ＤＮＡ」は、塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧだけでなく、それらのアナログまたはこれらの塩基の改変形態（例えば、メチル化ヌクレオチド、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電連結およびチオエート）、糖アナログの使用、ならびに改変および／または代替の骨格構造（例えば、ポリアミド））のいずれかもまた包含する。
【００４５】
「実質的に単離された」または「精製された」ポリヌクレオチドは、それが天然に関連している物質を実質的に含まないポリヌクレオチドである。実質的に含まないとは、それが天然に関連した物質の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９０％を含まないことを意味する。本明細書中で使用されるように、「実質的に単離された」ポリヌクレオチドはまた、起源または操作によって、（１）それが天然に関連しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と関連していないか、（２）それが天然に連結しているもの以外のポリヌクレオチドに連結されているか、または（３）天然に生じない組換えポリヌクレオチドを意味する。
【００４６】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、または特定の抗原に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子のフラグメントをいう。抗体は、免疫学の科学における当業者に周知である。本明細書中で使用される用語「抗体」は、インタクトな抗体分子だけでなく、抗原結合能力を保持する抗体分子のフラグメントもまた意味する。このようなフラグメントもまた、当該分野において周知であり、そしてインビトロおよびインビボの両方でしばしば使用される。特に、本明細書中で使用される用語「抗体」は、任意のイソタイプのインタクトな免疫グロブリン分子（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ）だけでなく、周知の活性フラグメントＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ＶH、およびＶLをも意味する。抗体フラグメントについては、例えば、「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」（ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＴｈｏｒｐｅ編、１９９６；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）６９頁を参照のこと。
【００４７】
本明細書中で使用されるように、「心臓肥大が誘導する機能不全」は、心臓肥大に関連した状態または疾患であり、心臓肥大、複合心臓肥大、拡張型心臓肥大、代償不全心臓肥大、および心不全を包含する。心臓肥大が誘導する機能不全は、１つ以上の以下の症状または事象によって特徴付けられる：同心肥大型心室塊；偏心拡大型心室塊；拡張型心筋障害への進行；広範囲のフィブロイド沈着；ｄＰ／ｄＴの変化；心筋細胞乱脈；カルシウムイオン放出および取り込み（すなわち、Ｃａ2+流動）；脈拍短縮；逓減心室拍出量；不整脈；頻拍；中枢要求量の変化；および心不全。
【００４８】
（トランスジェニック動物）
本発明のトランスジェニック動物は、非トランスジェニック同腹仔と比較されたとき、実質的に減少された、心臓肥大を自発的に発症する可能性を有する動物、および実質的に増大された、心臓肥大を自発的に発症する可能性を有する動物を含む。「実質的に増大された」または「実質的に減少された」心臓肥大を自発的に発症する可能性とは、トランスジェニック動物を非トランスジェニック動物と比較したとき、それぞれ、心臓肥大の測定可能な症状の統計学的に有意な増大または減少が観察されることを意味する。
【００４９】
本発明のトランスジェニック動物が、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域を含むトランスジーンを用いて生産される。本発明のトランスジーンを構築することにおいて使用するためのコード領域としては、ＭＥＦ−２、ｐ３８、カルシニューリン（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ）（ＣａＮ）、ＣａＭＫＩＩα、ＣａＭＫＩＶ、ＧＡＴＡ４、およびＹＹ１をコードする領域が挙げられるが、これらに限定されない。コード領域は、ポリペプチドの所望の機能が保持される限り、すなわち、ポリペプチドが、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節し得る限り、完全ポリペプチドまたはそれらのフラグメントをコードし得る。本発明のトランスジーンを構築することにおいて使用するためのコード領域は、変異を含む領域をさらに含み、これには、サイレント変異、アミノ酸配列の変化を導くが機能的変化を生じない変異、より活性なタンパク質を生じる変異、構成的に活性なタンパク質を生じる変異、減少した活性を有するタンパク質を生じる変異、およびドミナントネガティブ変異体が含まれる。コード領域は、ヒト、ラット、またはマウス配列に由来し得、それらのいくつかが開示されている。ヌクレオチド配列は、マウスＣａＮ触媒サブユニットｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ８１４７５およびＪ０５４７９）；ヒトｐ３８  ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０１５２５６）；ヒトＹＹ１  ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ１４０７７）；およびラットＣａＭＫＩＩα
ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０２９４２）について開示されている。上述のように、これらの配列またはそれらの改変または変異が用いられ得る。構成的に活性な変異体の例として、ＣａＮ、ＣａＭＫＩＩ、およびＣａＭＫＩＶの構成的に活性な形態が、記載されている。Ｓｕｎら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：２５２７−２５３９；ＣｒｕｚａｌｅｇｕｉおよびＭｅａｎｓ（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２６１７１−２６１７８；およびＯ’Ｋｅｅｆｅら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５７；６９２−６９４。
【００５０】
トランスジェニック動物の生産において使用するための、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域を含むトランスジーンは、少なくとも１つの肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物が、１）心筋細胞特異的プロモーターの制御下にあり；２）心筋細胞特異的プロモーターの制御下の心筋細胞において構成的に発現され；３）心筋細胞特異的プロモーターの制御下にあるが誘導様式で発現されるトランスジーンを含む。
【００５１】
（転写調節エレメント）
本発明のトランスジェニック動物は、トランスジーンとして、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の発現を調節する遺伝子産物をコードするコード領域を含む、ポリヌクレオチドを含む。コード領域の転写は、転写調節エレメント（ＴＲＥ）によって制御される。本発明の使用に適したＴＲＥは、心筋細胞において優先的に作動可能に連結されるコード領域の転写を方向付けるＴＲＥを包含する。「優先的に」とは、心筋細胞におけるトランスジーンの発現が少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約１０倍から約５０倍、さらにより好ましくは少なくとも約５０倍から１００倍、さらにより好ましくは１００倍を超えて、非心筋細胞におけるより大きいことを意味する。好ましくは、トランスジーンの発現は、レポーター遺伝子アッセイ（例えば、実施例に示されるアッセイ）により示されるように、心筋細胞以外の細胞では検出限界以下である。
【００５２】
種々の心筋細胞特異的ＴＲＥが文献に記載されており、本発明において使用され得る。これらとしては、以下の遺伝子由来のＴＲＥが挙げられるが、これらに限定されない：ミオシン軽鎖−２、α−ミオシン重鎖、ＡＥ３、心臓トロポニンＣ、および心筋αアクチン。Ｆｒａｎｚら（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６０−５６６；Ｒｏｂｂｉｎｓら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ，Ｙ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５２：４９２−５０５；Ｌｉｎｎら（１９９５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：５８４−５９１；Ｐａｒｍａｃｅｋら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１８７０−１８８５；Ｈｕｎｔｅｒら（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２２：６０８−６１７；およびＳａｒｔｏｒｅｌｌｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４０４７−４０５１。
【００５３】
１つの実施態様では、ＴＲＥは、α−ＭＨＣ遺伝子の５’隣接領域由来のプロモーター領域を含む。マウスα−ＭＨＣ遺伝子の５４４３ｂｐの５’隣接配列が、登録番号Ｕ７１４４１でＧｅｎＢａｎｋにおいて提供される。完全な５．４ｋｂ配列が本発明のトランスジーンにおいて使用され得るが、心筋細胞において優先的に作動可能に連結されたコード領域の転写を方向付けるそれらの一部もまた使用され得る。実施例*に記載のα−ＭＨＣ発現ベクターは、所望のコード領域を、このコード領域がα−ＭＨＣプロモーターに作動可能に連結されるように挿入するために使用され得る。Ｊｏｎｅｓら、（１９９４）Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２２：１７−１２８。
【００５４】
別の実施態様では、ＴＲＥは、ｂ型ナトリウム利尿ペプチド遺伝子（ＢＮＰ）の５’隣接領域由来のプロモーター領域を含む。ＴｈｕｅｒａｕｆおよびＧｌｅｍｂｏｔｓｋｉ（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７４６４−７４７２；およびＬａＰｏｉｎｔｅら、（１９９６）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２７：７１５−７２２。ヒトＢＮＰの５’隣接領域のヌクレオチド配列は開示されている（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ１６６４１）。
【００５５】
他の実施態様では、コード領域は、誘導性調節エレメントに作動可能に連結される。種々の誘導性プロモーター系が文献に記載されており、本発明において使用され得る。これらとしては、テトラサイクリン調節性系、（ＷＯ９４／２９４４２；ＷＯ９６／４０８９２；およびＷＯ９６／０１３１３）；ホルモン応答性系、インターフェロン誘導性系、金属誘導性系、および熱誘導性系（ＷＯ９３／２０２１８）；およびエクジソン誘導性系が挙げられるが、これらに限定されない。これらの系のいくつか（エクジソン誘導性系およびテトラサイクリン誘導性系を包含する）は、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からそれぞれ市販されている。
【００５６】
いくつかの実施態様では、誘導性（調節性）プロモーター系は、その産物が肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節するコード領域に作動可能に連結されたテトラサイクリン結合オペレーター、ｔｅｔＯ（動物の水または食餌にテトラサイクリン（またはそのアナログ）を添加することによって調節される）を含む。本発明の使用に適した系は、周知である。Ｙｕら（１９９６）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９：６９１−６９７；Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｂａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１；ならびにＨｉｌｌｅｎおよびＷｉｓｓｍａｎｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＳａｅｎｇｅｒおよびＨｅｉｎｅｍａｎｎ編、Ｍａｃｍｉｌｌｉａｎ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８９）、１４３〜１６２頁。一般には、この系は、ハイブリッド融合タンパク質であるテトラサイクリントランスアクチベーター（ｔＴＡ）を利用する。このタンパク質は、ウイルスタンパク質ＶＰ１６由来のような転写活性化ドメインに結合されたＥ．ｃｏｌｉ由来のｔｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）タンパク質のようなポリペプチドに由来のｔｅｔＯに結合し得るＤＮＡ結合ドメインを含む。これにより、ｔＴＡ１６がｔｅｔＯ配列を含有する最小プロモーターに結合する場合、標的遺伝子の転写が活性化される。ｔＴＡへのテトラサイクリン結合は、おそらくｔＴＡのｔｅｔＲ部分のコンホメーション変化を引き起こし、ｔＴＡのｔｅｔＯへの結合を阻止することによって、活性化を妨害する。遺伝子活性化は、テトラサイクリンを除去することによって生じる。
【００５７】
さらに、細胞型特異的ＴＲＥが用いられ得る。細胞型特異的ＴＲＥとしては、以下の例示の遺伝子（ＴＲＥが特異的に機能性である細胞型は括弧内である）に由来するＴＲＥが挙げられるが、これらに限定されない：血管内皮成長因子レセプター（内皮）、アルブミン（肝臓）、第ＶＩＩ因子（肝臓）、脂肪酸シンターゼ（肝臓）、フォン・ビルブラント因子（脳内皮）、α−アクチンおよびミオシン重鎖（ともに平滑筋）、シンテターゼＩ（小腸）、Ｎａ−Ｋ−Ｃｌ輸送因子（腎臓）、前立腺特異的抗原（前立腺）、および腺カリクレイン−１遺伝子（前立腺）。
【００５８】
別のクラスのＴＲＥは、低酸素条件に応答して作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を活性化するＴＲＥである。これらには、低酸素誘導性因子−１によって少なくとも部分的に調節されるＴＲＥが含まれる。ＢｕｎｎおよｇびＰｏｙｔｏｎ（１９９６）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７６：８３９−８８５；ＤａｃｈｓおよびＳｔｒａｔｆｏｒｄ（１９９６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７４：５１２６−５１３２；ＧｕｉｌｌｅｍｉｎおよびＫｒａｓｎｏｗ（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８９：９−１２。Ｆｉｒｔｈら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６４９６−６５００；およびＪｉａｎｇら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：５３２８−５３３５。
【００５９】
広範な種々のウイルスプロモーターが当該分野で公知であり、用いられ得る。このようなプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、およびＭＭＴＶ  ＬＴＲプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。それらの調節の性質に依存して、プロモーターは、構成的であり得るか、または実験条件によって調節可能であり得る。
【００６０】
トランスジーンに含まれ得る他の調節配列には、ポリアデニル化シグナルおよび終結シグナルが含まれ、後者は、メッセージレベルを増強し、そして他の配列への読み通しを最小化するように作用し得る。これらの調節配列は当該分野で公知である。
【００６１】
（トランスジェニック動物の作製において使用するためのポリヌクレオチド）
本発明のトランスジェニック動物の作製において使用するための実質的に単離されたポリヌクレオチドは、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域を含むポリヌクレオチドを含む。このような遺伝子産物には、ポリペプチド、アンチセンスポリヌクレオチド、およびリボザイムが含まれる。
【００６２】
肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節するポリペプチド遺伝子産物としては、カルシニューリン、ＹＹ１、ｐ３８／Ｈｏｇ１、ＣａＭＫＩＶ、およびＣａＭＫＩＩαが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
トランスジェニック動物を作製するための本発明における使用に適したいくつかのｃＤＮＡクローンは、記載されている：ｐ３８、Ｗａｎｇら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２３６６８−２３６７４（ヒト配列、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０１５２５６）；カルシニューリン触媒サブユニット（ＭｕｒａｍａｔｓｕおよびＫｉｎｃａｉｄ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８８：２６５−２７１（触媒サブユニットのヒト配列、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｓ４６６２２）、Ｋｉｎｃａｉｄら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１３１２−１１３１９（触媒サブユニットのマウス配列、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０５４７９およびＭ８１４７５）；およびＹＹ１、Ｓｈｉら（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６７：３７７−３８８（ヒト配列、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ１４０７７）。
【００６４】
トランスジェニックマウスを作製するための発現クローンはまた、コード領域が、コード化タンパク質の活性に影響する１つ以上の変異を有するように構築され得る。例えば、アミノ酸７５−８２を欠損するＣａＭ変異体は、野生型ＣａＭに類似した速度論特性でＣａ2+に結合するが、インビトロでいくつかのＣａＭ依存性標的酵素を活性化し得ない。Ｖａｎ  Ｂｅｒｋｕｍら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：３７５０−３７５６。
【００６５】
有用な変異は、コード化タンパク質の構成的に活性な形態を生じる変異を包含する。例えば、ＣａＭＫＩＶ、ＣａＭＫＩＩα、およびＣａＮの構成的に活性な変異形態をコードする遺伝子は、トランスジェニック動物を生産するために用いられ得る。例えば、ｐＳＲ−ＣａＭＫＩＩ（１−２９０）と称される構築物（これは、この野生型ＣａＭＫＩＩの構成的に活性な短縮型変異形態を有する）が記載されている。Ｓｅｉら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５９１０−１５９１６。
【００６６】
他の有用な変異には、ドミナントネガティブ変異体が含まれる。例えば、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼのドミナントネガティブ変異体は、短縮型であるか、またはそのカルシウムイオン感受性を喪失するがカルモジュリンに対する感受性は維持するように変異される変異体であり得る。それはまた、キナーゼ活性を喪失したが、なおカルモジュリンに結合する変異体であり得る。このような変異体は、ＣａＭに結合するが酵素活性を欠損するので、下流の事象は影響される。
【００６７】
有用であるポリヌクレオチド遺伝子産物には、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の産物の発現を調節するアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、および三重ヘリックスポリヌクレオチドが含まれる。アンチセンスポリヌクレオチドおよびリボザイムは、十分に記載される。Ｓ．Ｔ．ＣｒｏｏｋおよびＢ．Ｌｅｂｌｅｕ編、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；およびＡｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ（１９８８）Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的化されたｍＲＮＡに結合し、そしてタンパク質翻訳を妨害することにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接的に阻止するように作用する。アンチセンスポリヌクレオチドの例は、翻訳開始部位（例えば、関連ヌクレオチド配列の−１０領域と＋１０領域との間）由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドである。
【００６８】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒し得る酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的相互作用、続くヌクレオチド内部分解切断を包含する。本発明の範囲内には、タンパク質複合体成分をコードするＲＮＡ配列のヌクレオチド内部分解切断を特異的かつ効率的に触媒する遺伝子操作されたハンマーヘッドまたは他のモチーフのリボザイム分子がある。
【００６９】
任意の可能なＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、標的分子を、以下の配列（ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣ）を含むリボザイム切断部位について走査することによりまず同定される。いったん同定されると、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に相当する、１５リボヌクレオチドと２０リボヌクレオチドとの間の短いＲＮＡ配列が、オリゴヌクレオチド配列を不適切とし得る推定の構造特徴（例えば、二次構造）について評価され得る。候補標的の適合性もまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対するそれらの接近可能性を試験することにより評価され得る。Ｄｒａｐｅｒ  ＰＣＴ  ＷＯ９３／２３５６９；および米国特許第５，０９３，２４６号を参照のこと。
【００７０】
転写の阻害のための三重ヘリックス形成において用いられる核酸分子は、一般に、一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドから構成される。塩基組成は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合規則によって三重ヘリックス形成を促進するように設計されなければならない。これは、一般に、プリンまたはピリミジンのいずれかの相当な大きさのストレッチが二重鎖の１つの鎖に存在することを必要とする。ヌクレオチド配列は、ピリミジンベースであり得る。これは、得られる三重ヘリックスの３つの会合された鎖を越えてＴＡＴおよびＣＧＣ+トリプレットを生じる。ピリミジンリッチ分子は、その鎖に対して平行方向にある二重鎖の単鎖のプリンリッチ領域に対する塩基相補性を提供する。さらに、例えば、Ｇ残基のストレッチを含有する、プリンリッチである核酸分子が、選択され得る。これらの分子は、ＧＣ対が豊富なＤＮＡ二重鎖と三重ヘリックスを形成する。ここでは、プリン残基の大部分が標的化された二重鎖の単鎖に位置し、三重鎖における３つの鎖を越えてＧＧＣトリプレットを生じる。
【００７１】
あるいは、三重ヘリックス形成について標的化され得る可能な配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することにより増大され得る。スイッチバック分子は、交互の５’−３’，３’−５’様式で合成される。これにより、それらは、まず二重鎖の一方の鎖と、次いで他方と塩基対合し、プリンまたはピリミジンのいずれかの相当の大きさのストレッチが二重鎖の一方に存在する必要性を排除する。
【００７２】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子、リボザイム、および三重ヘリックス分子は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の合成について当該分野で公知の任意の方法によって調製され得る。Ｄｒａｐｅｒ、同上を参照のこと。これらは、当該分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学合成するための技術を包含する。このような技術としては、固相ホスホルアミダイト化学合成が挙げられるが、それらに限定されない。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボでの転写によって生成され得る。このようなＤＮＡ配列は、広範な種々のベクターに組み込まれ得る。このベクターは、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーター）を組み込む。あるいは、用いられるプロモーターに依存してアンチセンスＲＮＡを構成的または誘導可能に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物が、細胞に安定にまたは一過的に導入され得る。
【００７３】
ＤＮＡ分子に対する種々の周知の改変は、細胞内安定性および半減期を増大させる手段として導入され得る。可能な改変としては、分子の５’および／もしくは３’末端へのリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、またはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ連結よりむしろホスホロチオエートもしくは２’Ｏ−メチルの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物は、当該分野で公知の任意の手段によって同定され得、この手段には、酵母２ハイブリッド系、当該分野で公知でそしてより詳細には以下に記載される種々の手段を含むが、これに限定されない。酵母２ハイブリッド系のような転写活性アッセイは、タンパク質−タンパク質相互作用の同定および操作を可能にする。ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６。転写活性化アッセイのための概念的な基礎は、機能的に分離可能なＤＮＡ結合およびトランス活性化ドメインからなる転写因子のモジュラー特徴に対して予想される。別のタンパク質として発現された場合、これらの２つのドメインは、遺伝子転写を媒介することができない。しかし、ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインがタンパク質−タンパク質相互作用を介して一緒に架橋される場合、転写活性化の能力は、回復され得る。これらのドメインに付加されたタンパク質は互いに他と相互作用し得る場合、これらのドメインは架橋され得る（例えば、融合タンパク質（ハイブリッドとして）ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインを発現することにより）。ハイブリッドのタンパク質−タンパク質相互作用は、転写的にコンピテントな複合体を生成するためのＤＮＡ結合およびトランス活性化ドメインを一緒にもたらし得る。ＧＡＴＡ４のようなシグナル伝達経路の公知の成分は、「ベイト（ｂａｉｔ）」として作用し得、そしてＤＮＡ結合タンパク質に融合され得る。発現ｃＤＮＡライブラリーが作製され得、転写性のアクチベーターに融合したタンパク質を含む融合タンパク質の発現を可能にする。次いで、ＧＡＴＡ４に機能的に結合するタンパク質は、ｌａｃＺ遺伝子の転写を開始させる。次いで、ｌａｃＺ遺伝子の産物は、増殖基質へ色素生産性基質を添加することにより検出され得る。このようなアッセイを行うためのキットは市販されている。
【００７５】
（トランスジェニック動物作製のために用いた核酸構築物）
トランスジェニック動物生産における使用のための構築物は、動物細胞における構築物発現のためのＴＲＥおよび肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする領域を含む。
【００７６】
いくつかの実施態様では、トランスジェニック動物の生産における使用のための構築物は、心筋細胞において少なくとも１つの肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする領域を含む。ここで、遺伝子産物をコードする領域は、遺伝子産物が心筋細胞において過剰発現されるように、異種のプロモーターに作動可能に連結される。「過剰発現」は、この遺伝子産物が、野生型における遺伝子の発現と比較した場合、またはその異種プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現と比較した場合、少なくとも約２倍〜約５倍、好ましくは、少なくとも約５倍〜約５０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍〜約１００倍、さらにより好ましくは少なくとも約１００倍発現されることを示す。
【００７７】
他の実施態様では、トランスジェニック動物の生産に用いるための構築物は、心筋細胞において少なくとも１つの肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする領域を含む。ここで、遺伝子産物をコードする領域は、コードされた遺伝子産物が心筋細胞において恒常的に活性であるように、異種のＴＲＥに作動可能に連結され、そして遺伝子産物をコードする領域は変異される。
【００７８】
他の実施態様において、トランスジェニック動物生産における使用のための構築物は、トランスジェニック動物の生産に用いるための構築物は、心筋細胞において少なくとも１つの肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする領域を含む。ここで、遺伝子産物をコードする領域は、異種のＴＲＥに作動可能に連結され、そしてここで、遺伝子産物をコードする領域の転写は誘導性である。誘導性の系は当該分野で公知であり、本明細書において記載される。
【００７９】
他の実施態様において、トランスジェニック動物生産における使用のための構築物は、心筋細胞において少なくとも１つの肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする領域を含む。ここで、遺伝子産物はドミナントネガティブ変異体である。
【００８０】
マイクロインジェクションのためのＤＮＡクローンは、当該分野で公知の任意の手段により調製され得る。例えば、マイクロインジェクションのためのＤＮＡクローンは、細菌のプラスミド配列を除くために適切な酵素で切断され得、そしてこのＤＮＡフラグメントは、標準的技術を用いて電気泳動され得る。このＤＮＡバンドを、エチジウムブロマイドを用いた染色により可視化し、発現配列を含むバンドを切り出す。次いで、切り出したバンドは、０．３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含む透析バッグに入れる。ＤＮＡは、透析バッグ内で電気的に溶出し、１：１フェノール：クロロホルム溶液で抽出し、そして２容量のエタノールで沈殿する。このＤＮＡを、１ｍｌの低塩緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再溶解し、そしてＥｌｕｔｅ−ＤTMカラムで精製する。このカラムを、３ｍｌの高塩緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．４、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で初回プライムし、次いで、５ｍｌの低塩緩衝液で洗浄する。このＤＮＡ溶液を、カラムを３回通し、カラムの基質にＤＮＡを結合させる。３ｍｌの低塩緩衝液での１回洗浄後、このＤＮＡを、０．４ｍｌの高塩緩衝液で溶出し、２容量のエタノールにより沈殿する。ＤＮＡ濃度をＵＶ分光光度計において２６０ｎｍの吸光度で測定する。マイクロインジェクションのために、ＤＮＡ濃度を、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．４および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で３μｇ／ｍｌに調節する。
【００８１】
マイクロインジェクションのためのＤＮＡの精製の他の方法は、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８６）、Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３００：６１１（１９８２）；Ｔｈｅ  Ｑｉａｇｅｎｏｌｏｇｉｓｔ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第３版、Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ  ＣＡ．発行；および  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ，１９８９）に記載されている。
【００８２】
（細胞培養内におけるトランスジーン構築物試験）
トランスジーン構築物は、実施例に記載のように、インビトロ培養において活性について（所望ならば）試験され得る。ＴＲＥ活性は、例えば、培養された心筋細胞に対して、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する能力が試験されるべき遺伝子に作動可能に連結されるＴＲＥを含むポリヌクレオチド構築物を導入すること、および肥大性感受性の遺伝子の発現モニタリングによって試験され得る。あるいは、ＴＲＥ活性は、培養された心筋細胞に対して、検出可能な、望ましくは定量可能な、シグナルを提供するレポーター遺伝子に作動可能に連結されるＴＲＥを含むポリヌクレオチド構築物を導入することによって試験され得る。
【００８３】
試験されるべき配列は、レポータータンパク質をコードする適切なレポーター遺伝子に作動可能に連結されるように、ベクターに挿入され得る。これには、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子によりコードされている）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ遺伝子によりコードされている）、アルカリホスファターゼ、グリーン蛍光タンパク質、および西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられるがこれに限定されない。このようなベクターおよびアッセイは、（とりわけ）商業的供給源から、容易に入手可能である。このように構築されたプラスミドは、当該分野で公知のトランスフェクション方法（例えば、リン酸カルシウム沈降、エレクトロポレーション、リポゾーム（リポフェクション）、およびＤＥＡＥデキストラン）用いてＴＲＥによりコントロールされるように、レポーター遺伝子の発現について試験するために適切な宿主細胞にトランスフェクトされる。
【００８４】
構築物は、構築物のそれぞれの成分を、都合の良い制限部位、制限部位を含み得る、末端に特定の配列を導入するためのＰＣＲ、などを用いることによって、プラスミドに導入する、伝統的な方法に従って調製され得る。発現構築物が調製された後に、構築物は、任意の都合のよい手段により、細胞内に導入され得る。
【００８５】
細胞内に発現構築物を導入するための方法には、トランスフェクション、陽イオン化合物を用いる複合、リポフェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。発現構築物は、任意の送達ビヒクルとともに細胞に導入され得、これには下記のような、ウイルスおよび非ウイルス送達ビヒクルが挙げられる。細胞への発現構築物の導入後、レポーター遺伝子の発現は、伝統的手段によって決定され得る。レポーター遺伝子によりコードされたタンパク質を直接的に検出することによるか、またはレポーター遺伝子がコードする酵素の酵素産物を検出することによるかのいずれかによって、レポーター遺伝子の産物を検出する任意のアッセイは、本発明における試用に適している。アッセイとしては比色アッセイ、蛍光アッセイもしくは発光アッセイ、またはタンパク質タグの場合には、ラジオイムノアッセイもしくは他の免疫学的アッセイも挙げられる。トランスフェクション効率は、レポーター遺伝子に作動可能に連結した活性プロモーターを構成的に含む発現構築物を同時にトランスフェクトすることによってモニターされ得る。
【００８６】
ＴＲＥレポーター遺伝子構築物内のＴＲＥの活性は、一過性の発現後に評価され得、または安定な細胞株が作製され得る。安定な細胞株が作製される場合、構築物はまた、選択遺伝子（選択可能マーカーともいう）を含む。この遺伝子は、選択的培養培地において増殖する形質転換された宿主細胞の生存または増殖のために必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されない宿主細胞は、培養培地中で生存しない。代表的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン）に対する抵抗性、相補的栄養要求性欠乏を付与するか、または複合培地から利用不可な重要栄養を供給するタンパク質をコードする。あるいは、選択可能マーカーは、ＴＲＥレポーター遺伝子を含む構築物とは別々に構築物に含まれ得、そしてこの２つの構築物が宿主細胞に同時に導入される。
【００８７】
ＴＲＥの活性を調節するための１つ以上の遺伝子産物の能力を評価するために、試験されるべき産物をコードする遺伝子を含む発現構築物は、ＴＲＥレポーター遺伝子構築物に加えて、心筋細胞内に同時トランスフェクトされ得る。次いで、レポーター遺伝子の発現に対する遺伝子産物の影響は、上記のように評価され得る。
【００８８】
１つ以上の肥大感受性遺伝子の転写を調節するための１つ以上の遺伝子産物の能力を評価するために、肥大感受性遺伝子からのＴＲＥを含む発現構築物は、上記のように、レポーター遺伝子に作動可能に連結され得、そして上記の様に細胞内に導入され得る。１つ以上の肥大感受性遺伝子の転写を調節するための能力を試験される産物をコードする遺伝子を含む発現構築物は、細胞内に同時トランスフェクトされ得る。次いで、レポーター遺伝子の発現における遺伝子産物の影響は、上記のように評価され得る。
【００８９】
必要に応じて、さらなる因子が培養培地に添加され得る（例えば、アドレナリンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストを含むが、これに限定されない、レセプターアゴニストおよびアンタゴニスト）。肥大感受性遺伝子の転写に対する影響は（あるとすれば）、上記の様に測定され得る。
【００９０】
本発明における使用のために適切なアゴニストおよびアンタゴニストには、アルブテロール（ＡＬＢ）およびドブタミン（ＤＯＢ）のようなβ１特異的アゴニスト；メトプロロール（ＭＥＴ）のようなβ１−特異的アンタゴニスト；フェニレフリン（ＰＥ）のようなα１特異的アゴニスト；プラゾシンのようなα１特異的アンタゴニスト；イソプロテレノール（ＩＳＯ）のような混合βアゴニスト；プロパノロール（ＰＲＯＰ）のような混合βアンタゴニスト；およびアンジオテンシンＩＩが挙げられるが、これに限定されない。
【００９１】
（細胞へのポリヌクレオチド構築物の送達）
ポリヌクレオチド構築物は、種々の経路により細胞内に導入され得る。細胞内へのポリヌクレオチドの送達のために適する送達ビヒクル（インビボか、エクスビボか、またはインビトロにかかわらず）には、ウイルスおよび非ウイルス送達ビヒクルが挙げられる。通常、ポリヌクレオチド配列は、転写的調節エレメント（ＴＲＥ）および異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結される。肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコーディング領域を含むポリヌクレオチド、または肥大感受性遺伝子を含むポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を用いてクローニングまたは発現ベクター内に含まれ得る。次いで、これらのベクター（特に発現ベクター）は、細胞内に例えば、送達する、そして／または入ることを容易にし得る任意の多くの形態をとるために操作され得る。真核生物細胞への、詳しくは哺乳動物細胞への、より詳しくは心筋細胞への本発明のポリヌクレオチド構築物の送達は、任意の適切な分野の公知の方法により成し遂げられ得る。送達は、インビボ、エクスビボまたはインビトロで成し遂げられ得る。
【００９２】
宿主細胞内への導入のためのポリヌクレオチドの組み込みに適する送達ビヒクルは、非ウイルスビヒクルおよびウイルスベクターを含む。ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：２３９−２４２。
【００９３】
ポリヌクレオチドの送達のための広範な種々の非ウイルスビヒクルは、当該分野で公知であり、そして本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、細胞へ、裸のＤＮＡとして送達され得る（米国特許第５，６９２，６２２号；ＷＯ９７／４０１６３）。あるいは、ポリヌクレオチドは、広範な物質（送達の形態）を用いて、種々の経路で、関連の細胞に送達され得る。この物質は、以下を含むがこれに限定されない；陽イオン脂質；天然のポリマーおよび合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；ポリサッカライド；リポポリサッカライド；人工のウイルスエンベロープ；金属粒子；および細菌。送達ビヒクルは微細粒子であり得る。これらの種々の物質の混合物または結合体はまた、送達ビヒクルとして用いられ得る。ポリヌクレオチドは、送達のこれらの種々の形態と非共有結合的にまたは共有結合的に結合され得る。リポソームは、特別な細胞型へ、例えば心筋細胞へ標的化され得る。
【００９４】
ウイルスベクターには、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスのようなポックスウイルスおよびパルボウイルスに基づくベクターのようなＤＮＡウイルスベクター（アデノ随伴ウイルスを含む）；ならびにレトロウイルスベクターを含むがこれに限定されないＲＮＡウイルスベクターが挙げられるがこれに限定されない。レトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスのようなレンチウイルスが挙げられる。Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−２６７。
【００９５】
ポリヌクレオチドを含む非ウイルス送達ビヒクルは、例えば、リン酸カルシウム共沈殿技術によるトランスフェクション；エレクトロポレーション；電気浸透；リポソーム媒介トランスフェクション；衝撃トランスフェクション；微粒子ボンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、ジェット注入ならびに針およびシリンジ注入を含む微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）工程；またはマイクロインジェクションによる当該分野で公知の任意の方法によって宿主細胞および／または標的細胞に導入され得る。トランスフェクションの多数の方法は、当業者に公知である。
【００９６】
ウイルス送達ビヒクルは、感染により細胞に導入され得る。あるいは、ウイルスビヒクルは、細胞に送達するために、上記の任意の非ウイルス送達ビヒクルに組み込まれ得る。例えば、ウイルスベクターは、陽イオン脂質（ＨｏｄｇｓｏｎおよびＳｏｌａｉｍａｎ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３３９−３４２）と、またはラメラリポソーム（Ｗｉｌｓｏｎら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：３４７１；およびＦａｌｌｅｒら（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：２６９）と混合され得る。
【００９７】
インビボ送達のために、送達ビヒクルは、それぞれ当該分野で周知の任意の多くの方法により、個体に導入され得る。
【００９８】
（動物供給源）
本発明のトランスジェニック動物の生産のために適切な動物は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物であり、そしてマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシおよびヒツジが挙げられるがこれに限定されない。
【００９９】
トランスジェニック実験のために適切な動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）、およびＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）のような標準的な商業的供給源から得られ得る。例えば、トランスジェニック動物がマウスである場合、多くのマウス系統が適切であるが、Ｃ５７ＢＬ／６雌性マウスが胚回収および移入に好ましい。Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスは、交配のために使用され得、そして精管切除されたＣ５７ＢＬ／６繁殖用雄性マウスは、偽妊娠を刺激するために用いられ得る。精管切除されたマウスおよびラットは、供給業者から得られ得る。
【０１００】
（トランスジェニック動物）
トランスジェニック動物は、マイクロインジェクション法、および胚性幹細胞法を含む任意の公知の手順によって作製され得る。げっ歯類の胚の操作のためおよびＤＮＡのマイクロインジェクションのための手順は、その教示が一般に公知でありそして本明細書において援用されている、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８６）に詳細に記載されている。
【０１０１】
マイクロインジェクションの例として、６週齢の雌性マウスは、妊娠牝馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ；Ｓｉｇｍａ）の５ＩＵ注入（０．１ｃｃ腹腔内）、次いで、４８時間後のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ）の５ＩＵ注入（０．１ｃｃ、腹腔内）により、過剰排卵させるために導入される。ｈＣＧ注入直後にメスをオスと一緒におく。ｈＣＧ注入２１時間後、交配したメスを、ＣＯ2窒息または頚椎脱臼により屠殺し、そして取り出した卵管から胚を回収し、そして０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ）含有ダルベッコリン酸緩衝液化生理食塩水に入れる。周囲の丘細胞をヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で除去する。次いで、前核胚を洗浄し、０．５％ＢＳＡ含有Ｅａｒｌｅ‘ｓ平衡化塩溶液（ＥＢＳＳ）に入れて、注入時まで、５％ＣＯ2、９５％空気の湿潤環境で３７．５℃インキュベーターに入れる。胚は、２細胞期で移植され得る。
【０１０２】
性周期を一致させていない（ｒａｎｄｏｍｌｙ  ｃｙｃｌｉｎｇ）成体雌性マウスを、精管切除雄性マウスとつがいにする。Ｃ５７ＢＬ／６もしくはＳｗｉｓｓマウスまたは他の匹敵する系統がこの目的に用いられ得る。レシピエント雌性マウスをドナーマウスと同時につがいにする。胚移入の時に、レシピエント雌性マウスを体重１グラムあたり０．０１５ｍｌの２．５％アベリチンの腹腔内注入で麻酔する。卵管を一ヶ所の背面正中線切開により露出する。次いで、切開を、卵管を直接超えて体壁を介して行う。次いで、卵巣嚢を時計用のピンセットで裂く。移入する胚を、ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝液化生理食塩水）に入れ、そして移入ピペットのチップに入れる（約１０〜１２胚）。このピペットチップを卵管漏斗に挿入し、胚を移入する。移入後、切開を２つの縫合により閉じる。
【０１０３】
（トランスジェニック動物の同定と特徴づけ）
トランスジェニック動物は、それらのＤＮＡを分析することにより同定され得る。この目的のため、トランスジェニック動物がげっ歯類である場合、尾のサンプル（１〜２ｃｍ）は、３週齢の動物から切り取られ得る。次いで、これらまたは他のサンプルからのＤＮＡを調製し、サザーンブロット、ＰＣＲまたはスロットブロットにより分析して、トランスジェニック創始（Ｆ0）動物およびそれらの子孫（Ｆ1およびＦ2）を検出する。
【０１０４】
（１．病理学的研究）
トランスジーンを有する種々のＦ０、Ｆ１およびＦ２動物は、免疫組織学、電子顕微鏡、心電図ならびに心臓全体および心臓の一部分の重量の測定、心筋細胞の断面積測定および心筋細胞数の決定を含む、任意の種々の技術により分析され得る。適切な特異性の抗体を用いることによるトランスジーンの発現のための免疫組織学的な分析は、公知の方法を用いて実行され得る。部分重量、心筋細胞断面積および心筋細胞核数を決定するための形態測定的分析は、公知の方法を用いて実行され得る。心臓は、胎仔の心臓遺伝子の機能、組織学、および発現のために分析され得る。
【０１０５】
（２．ｍＲＮＡレベル測定によるトランスジーン発現の分析）
メッセンジャーＲＮＡは、当該分野で公知の任意の方法（グアニジニウム酸チオシアネート−フェノール：クロロホルム抽出法（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６〜１５９）が挙げられるが、これに限定されない）によりトランスジェニック動物の細胞株および組織から単離され；ノーザンブロット、ＲＮＡｓｅ、定量的ＰＣＲおよびヌクレアーゼ保護アッセイにより発現レベルを決定が決定され得る。
【０１０６】
（３．タンパク質レベル測定によるトランスジーン発現の分析）
タンパク質レベルは、当該分野で公知の任意の手段により測定され得る。この手段には、トランスジーンによってコードされたタンパク質に特異的な１つ以上の抗体を使用するウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡおよびラジオイムノアッセイが挙げられるが、これに限定されない。
【０１０７】
ウエスタンブロット分析のために、タンパク質画分は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８８）によって記載されたように、組織ホモジネートおよび細胞溶解物から単離され得、そしてウエスタンブロット分析に供され得る。
【０１０８】
例えば、タンパク質画分は、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で変性され得、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動され得る。次いで、タンパク質を、電気ブロッティングによりニトロセルロースフィルターに転写する。このフィルターをブロックし、一次抗体とともにインキュベートし、そして最後に酵素と結合した二次抗体と反応させる。適切な色素生産性基質との次のインキュベーションは、トランスジーンにコードされたタンパク質の位置を表す。
【０１０９】
（交雑トランスジェニック動物）
本発明は、さらに、本発明のトランスジェニック動物と第二の動物との間の交雑の子孫であるトランスジェニック非ヒト動物を、提供する。本発明のトランスジェニック動物は、肥大応答に影響し、そしてまた薬剤の標的としても働き得る他の因子を同定するために他の動物とともに飼育され得る。トランスジェニック動物は、ある遺伝子産物に対する別の遺伝子産物の効果を試験するため、または２つの遺伝子産物の組み合わせ効果を試験するために、他のトランスジェニック動物とともに飼育され得る（ここで、この２つのトランスジェニック動物は、異なるトランスジーンを用いて生み出されたている）。
【０１１０】
いくつかの実施態様において、第１のトランスジェニック動物は、異種の心筋細胞特異的ＴＲＥに作動可能に連結された少なくとも１つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を増加する遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドをトランスジーンとして含む（ここでトランスジーンの発現は胚致死的であるか、またはそうでなければ動物が分析に十分な期間、生存しないように有害である）。トランスジーンは、トランスジーンが所望されるまで実質的に発現されないように、誘導性プロモーター（例えば上記のｔｅｔ誘導性システム）の転写制御下におかれ得る。このような動物は、トランスジーンとして、テトラサイクリン制御下にｔＴＡを含むポリヌクレオチドを含むｔＴＡ構成的「創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）」トランスジェニック動物と交雑させられ得る。
【０１１１】
他の実施態様では、第１のトランスジェニック動物（第１の動物が心臓肥大の１つ以上の症状を示すように、異種の心筋細胞特異的ＴＲＥに作動可能に連結された少なくとも１つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を増加させる遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを、トランスジーンとして含む）は、少なくとも１つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を増加する遺伝子産物のドミナントネガティブ変異体をトランスジーンとして含む第２のトランスジェニック動物と交雑される。このような交雑の子孫は、心臓肥大に関する１つ以上の症状の軽減を示す。
【０１１２】
他の実施態様では、第１のトランスジェニック動物（第１の動物が心臓肥大の症状を示さず、そして心臓肥大の発症に対して実質的に抵抗性であるよう異種の心筋細胞特異的ＴＲＥに作動可能に連結された少なくとも１つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を減少または抑制する遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを、トランスジーンとして含む）は、少なくとも１つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を増加する遺伝子産物の構成的に活性な変異体をコードするポリヌクレオチドをトランスジーンとして含む第２のトランスジェニック動物と交雑される。
【０１１３】
他の実施態様では、少なくとも１つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物へ標的されるアンチセンスポリヌクレオチドであるポリヌクレオチドを、トランスジーンとして含む第１のトランスジェニック動物は、少なくとも１つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を増加する遺伝子産物の構成的に活性な変異体をコードするポリヌクレオチドをトランスジーンとして含む第２のトランスジェニック動物と交雑される。ここで、このアンチセンスポリヌクレオチドは、第２のトランスジェニック動物のトランスジーンの発現を阻害する。
【０１１４】
（心臓肥大の処置のための物質のスクリーニング）
トランスジェニック動物、トランスジェニック動物から単離された動物細胞、または単離された酵素は、心臓肥大の処置における潜在的な効果について物質をスクリーニングするために用いられ得る。
【０１１５】
（酵素ベースのスクリーニングアッセイ）
酵素ベースのスクリーニングアッセイにおいて、心筋細胞において肥大シグナルへの応答に関与する、実質的に単離された酵素を、試験する物質と接触させる。酵素の活性は、物質の存在下で、適切な時間後に測定される。酵素アゴニストまたはアンタゴニストの候補と酵素との相互作用のための十分な時間および条件は、酵素で変わる。しかし、通常、結合に適切な条件は、約４℃と約４０℃との間で、好ましくは４℃と３７℃の間で；適切なイオンを適切な濃度範囲（この条件は所定の酵素によって変化し得る；そしてｐＨ５から９の間のｐＨ範囲にある）に含む緩衝液中で生じる。結合と反応のために十分な時間は、通常、曝露後、約１ミリ秒と約２４次間の間である。
【０１１６】
試験される物質の存在下の酵素活性は、試験される物質の非存在下での活性と比較される。測定される活性の増加または減少は、物質が、心臓肥大が誘導する機能不全の軽減に用いるために適切であることの指標である。測定される活性が、試験される物質の非存在下で測定された酵素活性の活性と比べて、少なくとも約２倍、より好ましくは、少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍またはより多く増加されるかまたは減少される場合、物質は、酵素活性に対して効果を有すると考えられる。このような物質は、以下に記載のように、細胞ベースのアッセイおよび／または動物そのものがベースのアッセイでさらに試験され得る。
【０１１７】
心筋細胞における肥大シグナルへの応答に関与する酵素には、カルシニューリン、ＣａＭＫＩＶ、ＣａＭＫＩＩα、ｐ３８、ＹＹ１、ＣａＭＫキナーゼ、およびＭＫＫ６が挙げられるがこれに限定されない。酵素は、それらの天然形態で；変化した酵素活性および／またはインビトロ安定性または溶解性を有する変異した形態で；酵素の調節または他の成分を欠いている変異体形態で用いられ得る；しかし、（インビトロ安定性を付与するため、固体支持体への付着を容易にするため、抗原決定基を提供するためなどのために、別の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に会合した）酵素は、肥大シグナルへの応答に関する酵素活性を保持している。この酵素は、検出シグナルまたは他の機能的な部分の産生を可能にする標識と結合され得る。適切な標識には、放射性核種、他の酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光性色素、化学発光性色素、生物発光性化合物および磁気粒子が挙げられるがこれに限定されない。
【０１１８】
好ましくは、スクリーニングアッセイにおける使用について、酵素は実質的に精製される。「実質的に単離した」または「精製した」酵素は、自然状態で関連している物質（ｍａｔｅｒｉａｌ）、特に他のタンパク様の物質（ｍａｔｅｒｉａｌ）、または肥大シグナルに対する応答に関連した酵素的活性を阻害し得る物質が実質的にない酵素である。実質的にないとは、自然状態で関連する物質が、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、およびなおより好ましくは少なくとも９０％ないことを意味する。本明細書中に使用される「実質的に単離した」酵素はまた、以下の起源または操作による組換え体酵素を言う：（１）自然状態で関連する酵素の全てまたは一部と関連していない、（２）自然状態で連結しているポリペプチド以外のポリペプチドに連結されるか、または（３）自然状態で生じない。
【０１１９】
これらのアッセイにおける使用のための酵素は、当該分野において公知の任意の方法（天然の供給源、化学合成、または組換え技術を含むがこれらに限定されない）により得られ得る。本発明のスクリーニングアッセイにおける使用のための酵素は、任意の公知の方法で精製され得る。広範な種々の方法は当該分野において公知である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ編（１９８７）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照のこと。
【０１２０】
酵素活性は任意の公知の方法で測定され得る。例えば、ｐ３８のキナーゼ活性は、この酵素をタンパク質基質およびγ32ｐ−ＡＴＰとともにインキュベートして、そして例えばシンチレーション計数によるこの基質への32Ｐ取り込みを検出することにより測定され得る。ｐ３８キナーゼ活性についてのアッセイは記述された。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９８／２７０９８を参照のこと。
【０１２１】
（細胞ベースのスクリーニングアッセイ）
本発明の細胞ベースのスクリーニングアッセイにおいて、試験される化合物は、期間中、種々の用量で、細胞の培養培地中に導入され、次にこの細胞は１つ以上の機能（肥大感受性遺伝子の発現レベルにおける変化、肥大感受性遺伝子のポリペプチド産物のレベルにおける変化、および細胞サイズおよび／または形態における変化を含むがこれらに限定されない）について試験される。
【０１２２】
化合物の治療的潜在性を測定するためのスクリーニングアッセイは、細胞培養物中で開示した導入遺伝子構築物についてのトランスジェニック動物由来の、ならびにこの開示した構築物で安定的にまたは一過性にトランスフェクトした動物細胞を使用して行われ得る。細胞ベースのスクリーニングアッセイはまた、初代細胞（例えば、非トランスジェニック動物由来の心筋細胞）を使用して実施され得、この細胞は、ポリヌクレオチド構築物で安定にまたは一過性にトランスフェクトされるか、あるいはアンジオテンシンＩＩまたはα−アドレナリンアゴニストのような肥大シグナルで刺激される。
【０１２３】
肥大感受性遺伝子のポリペプチド産物のレベルにおける変化を検出するために、種々のアッセイ法が使用されるが、この各々は当該分野において公知である。例えば、肥大感受性遺伝子の１つ以上のポリペプチド産物について特異的な１つ以上の抗体を使用して、ＥＬＩＳＡのような免疫学的アッセイが使用され得る。
【０１２４】
肥大感受性遺伝子の発現レベルにおける変化を検出するために、以下を含むがこれらに限定されない任意の公知の方法が使用され得る：この遺伝子のＲＮＡ産物に相補的なポリヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーション；およびこの遺伝子のＲＮＡ産物のｃＤＮＡコピーの伸長をプライムするオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応。幾つかの肥大感受性遺伝子のヌクレオチド配列が開示された。そしてこの情報を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計し得る。
【０１２５】
あるいは、この細胞はＴＲＥ、特に肥大感受性遺伝子由来のＴＲＥに作動可能に連結したレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物でトランスフェクトされ得る。これらのアッセイにおいて、これらのアッセイからの読み出しは、活性レポーター遺伝子産物のレベルである。幾つかの肥大感受性遺伝子の５’隣接領域のヌクレオチド配列は開示された。そしてこれを使用し、レポーター遺伝子に作動可能に連結した心臓肥大感受性遺伝子ＴＲＥを含む構築物を産生し得る。例えばこのようなヌクレオチド配列には、ラットＡＮＦ５’隣接配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０３２６７）；およびマウスβ−ＭＨＣ５’隣接配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ８６０７６）が挙げられる。
【０１２６】
本明細書中に記載される細胞ベースのスクリーニングアッセイは一次スクリーニング用に使用され得るか、あるいは二次スクリーニング用に使用され、上述の酵素ベースのスクリーニングで活性である化合物をさらに試験し得る。
【０１２７】
これらのアッセイについて、適切な細胞には、以下があるがこれらに限定されない：トランスジェニックまたは非トランスジェニック動物のいずれかから単離した初代心筋細胞。細胞ベースのスクリーニングアッセイにおける使用に適切な他の細胞には、線維芽細胞のような非心筋細胞細胞型が挙げられる。
【０１２８】
幾つかの実施態様において、細胞は、レポーター遺伝子と作動可能に連結した肥大感受性遺伝子由来のＴＲＥを含有する構築物でトランスフェクトされる。レポーター遺伝子は、当該分野において公知であり、上述される。１つの例はグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその改変体がある。例えば、ＨｅｉｍおよびＴｓｉｅｎ（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２；Ｍｉｔｒａら（１９９６）Ｇｅｎｅ  １７３：１３−１７；およびＹａｎｇら（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：４５９２−４５９３を参照のこと。次にトランスフェクトした細胞を９６ウェル培養ディッシュに、適切な培養培地（例えば、ダルベッコ最小必須培地および１０％ウシ胎仔血清）中に、１ウェルあたり１．５〜２．５×１０4細胞で配置する。５％二酸化炭素で平衡化したインキュベーター中３７℃で一晩インキュベーション後、培地を除去して、試験される化合物を含む培地で置換し、そして適切な期間にわたってインキュベートする。本発明について、試験される物質を用いるインキュベーションについての適切な期間は、約０．５時間〜約２４時間であり得る。試験化合物に加えて、肥大誘導物質は培養培地に添加される。肥大誘導物質が試験物質の添加と同時、前または後に添加され得る。肥大誘導物質には、アンジオテンシンＩＩおよびＰＥが挙げられるがこれら限定されない。試験される化合物を含むストックは、まず適切な溶媒中に調製される。この試験化合物の幾つかの希釈液が試験される。適切なコントロールには、試験物質を含まない溶媒が添加される細胞、ならびに試験物質が添加されたが、肥大誘導物質は添加されない細胞が挙げられる。
【０１２９】
処理後、試験化合物の効果は、レポーター遺伝子産物についての適切なアッセイを使用して測定される。
【０１３０】
使用され得るレポーター遺伝子は周知であり、以下を含むがこれらに限定されない：ルシフェラーゼ；グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、例えば、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰ、または当該分野で公知の任意の種々のＧＦＰ；β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；ヒト成長ホルモンのような免疫学的に検出可能なタンパク質「タグ」など。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，編、１９８７）および定期的な改訂版を参照のこと。
【０１３１】
レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質を直接検出するか、またはレポーター遺伝子がコードする酵素の酵素的産物を検出するかのいずれかにより、レポーター遺伝子の産物を検出する任意のアッセイは、本発明の使用に適切である。アッセイには、比色定量的、蛍光定量的、または発光アッセイがあり、あるいはなおタンパク質タグの場合には、ラジオイムノアッセイまたは他の免疫学的アッセイがある。
【０１３２】
物質は、作動可能に連結したレポーター遺伝子の転写が細胞中、この物質を露出しなかったコントロール細胞と比較して、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍以上増加または減少する場合、効果を有すると考えられる。
【０１３３】
この物質の細胞傷害性効果は、当該分野において公知の任意の手段により測定され得る。例えば、この物質の細胞傷害性効果は、Ｈａｎｓｅｎら，（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ．１１９：２０３−２１０の方法の改変により測定され得る。組織培養ディッシュに残存する細胞に、２５μｌの３，（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）ストック溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を最終濃度の１ｍｇ／ｍｌまで添加する。細胞は３７℃で１時間インキュベートされ、そして細胞活性は等量のＭＴＴ溶解緩衝液（５０％ジメチルホルムアミド中２０％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ４．７）を添加することにより停止される。完全な抽出は室温で一晩振盪することにより達成される。ＯＤ562nmとＯＤ650nmとの差異は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＵＶmaxマイクロプレートリーダー、または細胞生存度のインジケーターのような等価物で測定される。細胞生存度についての他のアッセイとしてはトリパンブルー排除が挙げられる。
【０１３４】
（動物そのものがベースのスクリーニングアッセイ）
本発明の動物そのものがベースのスクリーニングアッセイにおいて、この化合物は、期間中、種々の用量で本発明のトランスジェニック動物に投与され、次いでこの動物は、以下を含むがこれらに限定されない種々のパラメーターにより測定されるように、心機能について試験される：左心室質量：体重比；心筋細胞サイズおよび組織化；心臓肥大感受性遺伝子発現；心機能；ｄＰ／ｄＴ；類線維沈着物；カルシウムイオン束密度；脈拍長；ならびに心室拍出量。動物そのものがベースのアッセイは、一次スクリーニングとして使用され得るか、または二次スクリーニングとしてとして使用され、酵素および／または細胞ベースのスクリーニングで同定された物質をさらに評価し得る。幾つかの実施態様において、本発明のトランスジェニック動物の一部は、インビトロスクリーニングアッセイに使用され得る。例えば、トランスジェニック動物から単離した心臓は、インビトロスクリーニングアッセイに使用され得る。測定され得るパラメータ−は、動物そのものでの薬物スクリーニングに関するパラメーターである。
【０１３５】
（肥大シグナルの応答に関する酵素と相互作用するタンパク質を検出するアッセイ）
上述の酵素ベースのスクリーニングアッセイに使用する酵素標的はまた、他の因子（この酵素標的と相互作用するポリペプチドであり得る）を同定するに有用である。次に、このような因子は、心臓肥大が誘導する機能不全の処置における治療標的としてそれらの有用性が評価され得る。このような因子はまた、この標的遺伝子産物の生物学的機能を調節する潜在的な役割について分析され得る。
【０１３６】
任意の公知の方法が使用され、酵素標的と相互作用するポリペプチドを同定し得る。適切なアッセイには、インビトロおよびインビボアッセイが挙げられる。インビトロアッセイには、共沈降、タンパク質相互作用トラップ、およびＥＬＩＳＡが挙げられるがこれらに限定されない。アッセイは、標的遺伝子産物と結合し、標的遺伝子産物と相互作用する他の細胞性または細胞外タンパク質と結合し、そして標的遺伝子産物の他の細胞性タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同定するように設計され得る。
【０１３７】
タンパク質相互作用トラップの実施例として、酵母ツーハイブリッドスクリーニングが、ベイトにマウスＧＡＴＡ４を使用して行われ、記述のとおり成体心筋層中の潜在的相互作用因子を同定し得る。Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９３：２１５−２２８。この実施例において、ＧＡＴＡ４ベイトは、インフレームでＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインと融合したアミノ酸１３０−４０９を含む。ＧＡＴＡ４のこの領域は、二つのジンクフィンガードメインを包囲し、ＰｓｔＩ−ＮｓｉＩフラグメント（ｐＡＳ酵母発現ベクター中でＰｓｔＩ部位にクローン化された）内にコードされる。ｐＡＳ−ＧＡＴＡ４は、ランダムｃＤＮＡと融合したＧＡＬ４活性化ドメインを含む成体マウス心臓ライブラリーを用いて酵母中に同時形質転換され、５百万を超える一次コロニーは、陽性の相互作用についてスクリーニングされた。約１００の陽性酵母コロニーは、最初に同定された。それぞれ個々のコロニーから、活性化プラスミドがレスキューされ、このｃＤＮＡ挿入物は配列決定された。アンチセンス配向で、またはアウトオブフレームでｃＤＮＡ挿入物を含むクローンは処分した。この残りのクローン（約２１）を酵母に形質転換し直し、特異性について試験した。
【０１３８】
結合特異性は、以下の判定基準を使用して決定され得る：１）この単離したクローンは、本来のベイトとの相互作用を再利用するはずである；２）この単離したクローンは、このＧＡＬ４−Ｅ１２融合の場合、非特異的ベイトと相互作用しないはずである。特異性のさらなる試験として、高程度のアミノ酸配列相同性を占める関連タンパク質との相互作用を試験し得る。
【０１３９】
（トランスジェニック動物またはこれに由来する細胞の使用）
本発明に従って生産したトランスジェニック動物は、ヒト医薬に適用できる改善された治療処置または診断方法を開発する目的で、肥大型心筋症の処置および／または肥大型心筋症に関連した調査用の物質または潜在薬物をスクリーニング、および同定または試験するために特に有用である。
【０１４０】
試験される物質には、天然の物質および合成物質が挙げられる。これらの物質には、種々のコア構造に基づく天然および合成の無機および有機化合物のみでなく、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドのようなオリゴマーが挙げられる。種々の天然の供給源は、ジャングルおよび海洋などに見出されるものを含む活性化合物についてスクリーニングされ得る。さらに化合物のコンビナトリアルライブラリーが、産生され、試験され得る。遺伝子産物、特に心臓肥大感受性遺伝子の転写の調節に関する遺伝子のポリペプチドに対する抗体はまた、試験用に含まれる。
【０１４１】
（心臓肥大または心不全の処置に有用な物質を含む組成物）
本発明は、心臓肥大が誘導する機能不全の処置に使用するための物質を含む組成物を提供する。本発明の目的のための、心臓肥大が誘導する機能不全の処置に使用するための物質は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の活性産物のレベルを調節する物質である。適切な物質には、以下の天然または合成の有機または無機の化合物が挙げられる：１）肥大感受性遺伝子の発現を調節する；２）遺伝子産物が肥大感受性遺伝子の発現を調節するこの遺伝子の発現を調節する；および／または３）肥大感受性遺伝子の発現を調節する遺伝子産物の活性を調節する。「物質」にはまた、以下のポリヌクレオチドが挙げられる：１）肥大感受性遺伝子の発現を調節する；２）遺伝子産物が肥大感受性遺伝子の発現を調節するこの遺伝子の発現を調節する；３）肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の活性産物のレベルを調節する。
【０１４２】
物質の「有効量」は、本発明の方法により処置される心臓肥大性または他の状態の改善または緩和を達成するために必要な物質の量である。
【０１４３】
本発明はまた、心臓肥大を処置する公知の物質の使用を包含する。このような物質には、カルシニューリンインヒビターＦＫ５０６およびシクロスポリンならびに関連薬物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの薬物は、移植患者において免疫抑制剤として慣用的に使用されるが、心臓肥大または心不全の処置にはまだ使用されていない。「シクロスポリン」はサイクリックウンデカペプチドである。ＣａＮのホスファターゼ活性を阻害する種々のシクロスポリンは記述されており、用語「シクロスポリン」中に包含される。これらは以下を含むがこれらに限定されない：シクロスポリンＡ；（Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ−ｓｅｒ）８および（３’−デスヒドロキシ（ｄｅｓｈｙｄｒｏｘｙ）−３’−ケト−ＭｅＢｍｔ）１−（Ｖａｌ）２誘導体（米国特許第５，２８４，８２６号および同第５，５２５，５９０号）を含むがこれらに限定されないシクロスポリンＡの誘導体；ならびにシクロスポリンＧ。本発明の処置方法の使用に適切であり得るシクロスポリンの薬学的処方物には、以下に記載の処方物が挙げられるがこれらに限定されない：英国特許出願第ＧＢ２，２５７，３５９号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９５／３４２８５およびＷＯ  ９７／０７７８７；ならびに米国特許第５，７３９，１０５号および同第５，６４１，７４５号。ＦＫ５９６は大環状ラクトンである。本明細書中に使用の用語「ＦＫ５０６」には、ＦＫ５０６、ならびに米国特許第５，５３０，１２０号および同第５，４９３，０１９号に開示された誘導体を含むがこれらに限定されないＣａＮのホスファターゼ活性を阻害する誘導体が挙げられる。ＣａＭＫＩＶのキナーゼ活性を阻害するＫＮ６２、ＫＮ９３および関連薬物を含むＣａＭＫＩＶのインヒビターである物質がまた含まれる。ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９８／２７０９８に記載されるようなｐ３８キナーゼのインヒビターもさらに含まれる。
【０１４４】
心臓肥大および心不全の処置について潜在性を有する物質には、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を通常抑制する１つ以上の遺伝子産物の発現を増大し、これにより肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の発現を減少する物質が挙げられる。例えば、転写因子ＹＹ１は心臓肥大応答性遺伝子の一般的なリプレッサーであることが発見された。培養心筋細胞中のＹＹ１の過剰発現は心臓肥大を予防し、全ての肥大感受性遺伝子発現を封じる。次にＹＹ１の調節因子である物質は、心臓肥大、心筋細胞増殖、および心機能を調節するに潜在的に使用され得る。さらなる例として、構成的な活性ＣａＭＫＩＩαは、心筋細胞培養中全ての肥大感受性遺伝子を封じる。ＣａＭＫＩＩαを活性化する物質は心臓肥大を調節する能力を有する。
【０１４５】
心臓肥大および心不全の処置の潜在能力を有する物質はまた、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の転写を通常増加させる１つ以上の遺伝子産物の発現を減少し、これにより肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも１つの遺伝子の発現を減少する物質を含む。
【０１４６】
本発明の範囲内の組成物には、活性成分が、処置される状態の症状を緩和するに効果的な量で含まれる。この有効量の決定は、経験的に当業者により容易に行われ得る。
【０１４７】
本発明の物質は、単独でまたは以下を含む他の薬物治療と共に投与され得る：β−アドレナリンレセプターアンタゴニスト、エンドセリンレセプターアンタゴニスト、およびＡＣＥインヒビターなど。ＡＣＥインヒビターには、商標Ａｃｃｕｐｒｉｌ（登録商標）、Ａｌｔａｃｅ（登録商標）、Ｃａｐｏｔｅｎ（登録商標）、Ｌｏｔｅｎｓｉｎ（登録商標）、Ｍｏｎｏｐｒｉｌ（登録商標）、Ｐｒｉｎｉｖｉｌ（登録商標）、Ｖａｓｏｔｅｃ（登録商標）およびＺｅｓｔｒｉｌ（登録商標）により命名された薬物が挙げられる。
【０１４８】
薬学的組成物は、物質を使用して、または物質を適切なキャリア（これ自体免疫学的アジュバントであり得る）と組み合せることにより調製される。これらの組成物は、意図した目的を達成する任意の方法により投与され得る。例えば、投与は、皮下、皮膚、静脈内、皮内、筋肉内、または腹腔内であり得る。
【０１４９】
投与される物質の量、ならびに投与の頻度は、年齢、性別、受容者の健康および体重、ならびに所望される効果の性質による。
【０１５０】
本発明のスクリーニング方法により同定される物質に加えて、これらの薬学的組成物は、この活性化合物の薬学的に使用され得る調製物への加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。好ましくは、この調製物、特に経口的に投与され得、かつ錠剤、糖剤、およびカプセル剤のような好ましい型の投与で使用され得る調製物、およびまた坐剤のような直腸に投与され得る調製物、ならびに注射によるまたは経口的な投与に適切な溶液は、賦形剤と共に、約０．１〜９９重量％、および好ましくは約２５〜８５重量％の活性成分を含む。
【０１５１】
本発明の薬学的調製物は、それ自体公知である方法で、例えば従来の混合、顆粒形成、糖剤生成、溶解、または凍結乾燥プロセスにより製造される。従って、経口使用のための薬学的調製物は、所望されるか必要であれば、適切な補助剤を添加後、この活性化合物を固体賦形剤と組み合せ、必要に応じて得られる混合物を粉砕し、そしてこの混合物の顆粒を加工し、錠剤または糖剤コアを得ることにより得られ得る。
【０１５２】
適切な賦形剤は特に、糖（例えば、ラクトース、ショ糖、マンニトール、またはソルビトール）のような充填剤、セルロース調製物および／またはリン酸カルシウム（例えばリン酸トリカルシウム、またはリン酸水素カルシウム）、ならびにスターチペースト（例えば、トウモロコシスターチ、コムギスターチ、コメスターチ、ジャガイモスターチ）、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドンのような結合剤である。所望であれば、崩壊剤（例えば、上述のスターチおよびその誘導体、ならびにカルボキシメチルスターチ、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩）が添加され得る。補助剤には、流量調節剤および滑沢剤（例えば、シリカ、滑石、ステアリン酸、またはステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウムのようなその塩、ならびに／あるいはポリエチレングリコール）が挙げられる。糖剤コアは、所望であれば胃液に耐性である適切なコーティングを伴って提供され得る。この目的について、濃縮糖溶液が使用され得るが、これは必要に応じて、アラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒もしくは溶媒混合物を含み得る。胃液に耐性なコーティングを産生するために、適切なセルロース調製物の溶液（例えば、アセチルセルロースフタレート、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）が使用される。例えば同定用、または活性化合物用量の異なる組み合せを特徴付けるために、染料または顔料が、この錠剤または糖剤コーティングに添加され得る。
【０１５３】
経口で使用され得る他の薬学的調製物には、ゼラチンから作製された押し込みばめカプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリセロールもしくはソルビトールのような可塑剤から作製された軟封着（ｓｅａｌｅｄ）カプセル剤がある。押込みばめカプセル剤は、ラクトースのような充填剤、スターチのような結合剤、および／または滑石もしくはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、ならびに必要に応じて安定剤と混合され得る顆粒の形態の活性化合物を含み得る。軟カプセル剤において、この活性化合物は好ましくは溶解されるか、または適切な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィン、または流動ポリエチレングリコール）中に懸濁される。さらに、安定剤が添加され得る。
【０１５４】
直腸に投与され得る薬学的調製物としては坐剤が含まれ、この坐剤は、この活性化合物の坐剤基剤との組み合せからなる坐剤がある。適切な坐剤基剤は、例えば、天然または合成トリグリセリド、パラフィン系炭化水素、ポリエチレングリコール、またはより高級なアルカノールである。さらに、この活性化合物と適切な基剤の組み合せからなるゼラチン直腸カプセル剤を使用することもまた可能である。適切な基剤物質には、例えば、流動トリグリセリド、ポリエチレングリコール、およびパラフィン系炭化水素が挙げられる。
【０１５５】
物質の組織への制御した送達を可能にする種々のデバイスは、公知である。持続性放出調製物の適切な例には、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、これらのマトリクスは成形品（例えば、フィルムまたはミクロカプセル）の形態である。
【０１５６】
非経口投与の適切な処方物には、水溶性形態の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、適切な油性注射懸濁液のような活性化合物の懸濁液は投与され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が挙げられる。水性注射懸濁液は、この懸濁液の粘度を増加させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストラン）を含み得る。必要に応じて、この懸濁液は安定剤を含み得る。
【０１５７】
薬学的な賦形剤は当該分野で周知であり、本明細書中には詳細に記載する必要はない。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版、１９９５），Ｇｅｎｎａｒｏ編を参照のこと。
【０１５８】
（心臓肥大が誘導する機能不全を処置する方法）
本発明は、心臓肥大が誘導する機能不全を処置する方法を提供し、この方法は、この機能不全の進行を減退するか、または覆すに有効な物質の量を、これを必要とする個体（「被験体」）に投与する工程を包含する。本明細書中に記載される方法に使用について、上述のような、「物質」には、１）肥大感受性遺伝子の発現を調節する；２）その産物が肥大感受性遺伝子の発現を調節する遺伝子の発現を調節；または３）肥大感受性遺伝子の発現を調節する遺伝子産物の活性を調節する、天然または合成の有機または無機化合物が挙げられる。
【０１５９】
本明細書中に使用される「処置」は、恩恵のあるまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的について、恩恵のあるまたは所望の臨床結果には、検出可能または検出不可能のいずれの場合においても、症状の緩和、疾患の程度の減退、疾患の安定状態（すなわち、悪化していない）、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の回復または緩和、ならびに寛解（部分的にまたは全体的にのいずれか）があるがこれらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することを意味し得る。本明細書中に使用する用語「処置」には、予防が含まれる。
【０１６０】
疾患を「緩和する」は、本発明の方法により検出した物質がない場合と比較して、疾患状態の程度および／または所望でない臨床的発現が減少されること、ならびに／あるいは、進行の時間経過が緩徐化または伸ばされることを意味する。
【０１６１】
本方法は、これを必要とする個体（「被験体」）に、この機能不全の進行を減退または覆すに有効な物質の量を投与する工程を包含する。予防法の状況において、「これを必要とする被験体」は以下を含むがこれらに限定されない：５５歳以上の一般の集団における個体；心臓肥大の発症に対する遺伝的素因を有する個体；拡張型心筋症患者；高血圧患者；腎不全および血管性高血圧を有する患者；圧力過剰負荷、溶積過剰負荷、または増加末梢床抵抗に起因する血管性高血圧を有する個体；気腫または嚢胞性線維症のような呼吸性の病気を有する個体；慢性の喘息；結核を有する個体；ならびに器官移植患者。
【０１６２】
幾つかの実施態様において、本方法は、特にＮＦＡＴ−３または他のＮＦＡＴファミリーメンバーのような心転写因子上での脱リン酸作用に関して、心カルシニューリン（ＣａＮ）の活性をブロックする工程を包含する。幾つかの実施態様において、本方法は、ＣａＮ媒介脱リン酸により活性化したＮＦＡＴまたは他の核転写因子の転写活性化をブロックするためのＣａＮのインヒビターの使用を含む。他の実施態様において、本方法は、心筋細胞の細胞質ゾルおよび／または核において、免疫抑制ファミリーのメンバーのシクロスポリンＡ誘導体を含む臨床上認可された特異的インヒビター薬物によりＣａＮを阻害し、ＣａＮの脱リン酸化活性を減少させる工程を包含する。ＣａＮを特異的に阻害する免疫抑制薬物によるＮＦＡＴ転写因子の脱リン酸のブロックは、これらの転写因子の心筋細胞核画分への移行を実質的に減少または予防し、それらをＧＡＴＡ４との活性へテロ二重鎖の形成について無能にする。活性化ＮＦＡＴメンバーとＧＡＴＡ転写因子との間のＮＦＡＴ−３／ＧＡＴＡ−４ヘテロ二重鎖または類似の複合体を形成する能力がないことは、このような複合体が多くの心臓肥大感受性プロモーターでその特異的エンハンサー部位に結合することを予防する。多くの心臓肥大感受性プロモーターは、このような結合部位を含み、ＮＦＡＴ−３／ＧＡＴＡ−４または類似の複合体に応答性であるので、それらの遺伝子産物は、ＣａＮ活性によりアップレギュレートされ得、そしてそれ故ＣａＮ特異的免疫抑制インヒビターにより阻害され得る。
【０１６３】
ＣａＮ−特異的免疫抑制インヒビターは、心血管系圧の過剰負荷で誘導される心臓肥大によるＣａＮを通して集中する大部分の核シグナル伝達をブロックし、そして慢性肥大に導き、次いで長期的に未処置の動物における拡大する心筋障害に導く転写誘導をブロックする。他の実施態様において、ＣａＮのインヒビターの使用は、心血管肥大の転写誘導のためのすべての圧負荷膜レセプター媒介核シグナル伝達をブロックする。昇圧剤（α−１−アドレナリン性レセプターを通したアンジオテンシンII（ＡｎｇＩＩ）、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、トロンビン（Ｔｈｒｂ））を通した心血管肥大のレセプター媒介転写誘導、およびαアドレナリン性シグナル伝達は、ＣａＮにおいて核転写活性化シグナルとして集中する。これらの経路がＣａＮに集中するので、肥大感受性の心臓の遺伝子の、昇圧剤およびα−１−アドレナリン性レセプター媒介転写誘導は、ＣａＮインヒビターによってブロックされ得る。
【０１６４】
他の実施態様において、この方法は遺伝子産物の発現を阻害し、これはＮＦＡＴ転写因子、すなわち肥大感受性遺伝子の遺伝子産物のＣａＮ脱リン酸化に応答して発現される。これらの実施態様のいくつかにおいて、１つ以上の肥大感受性遺伝子の発現を阻害する薬剤は、肥大感受性遺伝子を標的とするアンチセンスポリヌクレオチドである。
【０１６５】
ＣａＮを阻害する薬剤の投与を含む実施態様において、それによってＮＦＡＴ−３および／または１つ以上の関連するファミリーメンバーの脱リン酸化をブロックすることによってＣａＮをブロックする薬剤は、免疫抑制薬物のサイクロスポリンファミリーのメンバー（例えば、サイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはＦＫ５０６）である。１つ以上のＮＦＡＴ転写因子ファミリーメンバーの脱リン酸化をブロックするために心臓ＣａＮ活性を阻害する任意の薬剤が有用であると証明され得る。
【０１６６】
いくつかの実施態様において、その方法は心臓ＣａＮの発現を減少させる薬剤を投与する。このような薬剤は、ＣａＮのドミナントネガティブ形態（例えば、ＣａＮのαサブユニットのコーディング領域のネガティブ短縮形態）；ＣａＮ遺伝子を標的化するアンチセンス構築物；およびＣａＮのβサブユニットの短縮された、不活性形態を含むがこれらに限定されない。ＣａＮのβ−サブユニットの短縮された、不活性形態は、ＣａＮの活性なαサブユニットと隔絶し得、そして活性化のための能力を与えない。他の実施態様において、この方法はＣａＮ、またはそのαサブユニットもしくはβサブユニットについての特異的な抗体を投与する工程を含む。これらのいくつかの実施態様において、その抗体は単鎖抗体である。他の実施態様において、その抗体はＣａＮ活性をブロックするか、あるいはＮＦＡＴ−３および／またはＮＦＡＴファミリーメンバーを、心臓ＣａＮによって脱リン酸化されることから妨害する。
【０１６７】
このような化合物の毒性および治療的な有効性は、細胞培養中または実験動物中で、例えば、ＬＤ50（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ50(集団の５０％において治療的に有効な用量)を決定するために、標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性および治療効果との間の用量比が治療指標であり、そしてそれはＬＤ50およびＥＤ50の比として表現され得る。大きい治療指標を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用され得る一方、非標的細胞に対する潜在的な損害を最小化し、それによって副作用を減少するために、影響を受けた組織の部位にそのような化合物を標的化する送達系が設計され得る。
【０１６８】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための広範な用量の処方範囲において使用され得る。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんど有さないか、またはまったく有さないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、そこから使用される投薬形態および利用される投与の経路に依存するこの範囲内で変動し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療的な有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから見積もられ得る。用量は、動物モデルにおいて処方され、細胞培養において、および／または動物全体において決定されるような、ＩＣ50（すなわち、症状の１／２の最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成し得る。このような情報は、ヒトにおいてより正確に有用な用量を決定するために使用され得る。
【０１６９】
心臓肥大の処置における本発明の方法によって検出される基質の治療的有効性は、公知の診断および処置の原理を使用して、当業者によって達成され得る。
【実施例】
【０１７０】
以下の実施例は例示のために提供されるが、本発明を限定するものではない。
【０１７１】
（実施例１）
（初代心筋細胞におけるＣｓＡおよびＦＫ５０６によるＡｎｇＩＩおよびＰＥの肥大性効果の阻害）
（実験プロトコール）
初代心筋細胞およびそれらの肉腫組織を可視化するために、抗αアクチニンマウスモノクローナル抗体を使用した（Ｓｉｇｍａ）。この抗体は、心臓および骨格筋α−アクチンタンパク質に特異的である。細胞を、１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、３．７％  パラホルムアルデヒド中で５分間固定化し、１×ＰＢＳで３回洗浄し、次いで２％  ウシ血清、２％  ＢＳＡ、および０．１％  非イオン系界面活性剤ＮＰ−４０を含む１×ＰＢＳで３０分間プレブロッキングを行った。抗α−アクチニン抗体を、新鮮なプレブロック溶液中で１：８００の希釈で添加し、そしてさらに３０分間インキュベートした。続いて、細胞を０．１％  ＮＰ４０を含む１×ＰＢＳ中で３回洗浄した。次いで、抗マウスＴＲＩＴＣ結合体化二次抗体をプレブロック溶液中に３０分間、１：４００の希釈で添加し、そしてこの細胞を再び３回０．１％  ＮＰ４０を含む１×ＰＢＳ中で３回洗浄した。ＤＮＡについての核染色を、ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌのビスベンズイミドを用いて１５分間行い、その後ＰＢＳで３回リンスした。
【０１７２】
（結果）
初代心筋細胞のＡｎｇＩＩおよびＰＥへの曝露は、明白な肥大応答を生じ、これは細胞のサイズおよび肉腫の集合の増加、いくつかの胎児収縮性タンパク質遺伝子のアップレギュレーション、ならびに収縮性の増強によって特徴付けられる。これらの事象の前には、細胞内カルシウムの増加がある。これらのアゴニストに対する心筋細胞の肥大応答がカルシニューリンによって媒介されるかどうかを決定するために、新生仔ラット心筋細胞を、ＣｓＡまたはＦＫ５０６の存在下または非存在下で、ＡｎｇＩＩ（１０ｎＭ）またはＰＥ（１０μＭ）に曝露した。心筋細胞は、ＡｎｇＩＩまたはＰＥ（図２Ｂおよび２Ｅ）への７２時間の曝露後、サイズおよび肉腫の集合体の劇的な増加を実証した。ＣｓＡ（図２Ｃおよび２Ｆ）またはＦＫ５０６の存在下において、ＡｎｇＩＩへの応答は完全に消滅し、そしてＰＥへの応答は劇的に減少した。
【０１７３】
ＡｎｇＩＩに応答する心筋細胞遺伝子発現の変化がまた、カルシニューリン依存性シグナル伝達経路によって制御されているかどうかを決定するために、ＡｎｇＩＩで処理した心筋細胞におけるＡＮＦ  ｍＲＮＡの発現を、ドットブロットアッセイによってＣｓＡの存在下または非存在下で調べた。ＡｎｇＩＩへの曝露は、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）ｍＲＮＡの１５倍の増加を生じ、これはＣｓＡによって完全にブロックされた（図２３Ｇ）。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡをコントロールとして測定した。共に、これらの形態学的および分子的データは、ＡｎｇＩＩおよびＰＥシグナル伝達経路が、ＣｓＡ−／ＦＫ５０６感受性であることを実証する。カルシニューリンは、ＣｓＡおよびＦＫ５０６の両方による阻害についての唯一の公知の標的であるので、これらの結果は、カルシニューリン活性化が、心臓肥大のＡｎｇＩＩ−およびＰＥ−依存的誘導についてのシグナル伝達経路における必須の工程であることを示唆する。
【０１７４】
（実施例２）
（インビボにおける心臓肥大の誘導）
（実験プロトコール）
トランスジェニックマウス。心臓においてカルシニューリンを発現するトランスジェニックマウスを、以下のようにして作製した。カルシニューリンＡ触媒サブユニットの構成的な活性型（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：６９２−６９４）をコードするｃＤＮＡを、５’ＳａｌＩリンカーおよび３’ＨｉｎｄＩＩＩリンカーを用いるＰＣＲによって、α−ＭＨＣプロモーターを含む発現ベクターにクローニングした。この発現ベクターの発現パターンおよび特徴は、以前に記載されている（Ｊｏｎｅｓら（１９９４）Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２２：１１７−１２８）。カルシニューリン−α−ＭＨＣベクターを、ＮｏｔＩを用いて消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ骨格を遊離させ、そしてα−ＭＨＣ−融合ｃＤＮＡフラグメントの精製を可能にする。このフラグメントを、Ｑｉａｅｘ  ＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してアガロースゲル上で精製し、そして卵母細胞注入緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４および０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で溶出させた。精製したフラグメントを、受精して間もないＦＶＢマウス由来の卵母細胞に注入し、偽妊娠ＩＣＲマウスの卵管に移した。
【０１７５】
心臓でＣａＭＫＩＶを発現するトランスジェニックマウスを、以下のように作製した。ＣａＭＫＩＶの構成的な活性型をコードするｃＤＮＡ（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：６９２−６９４）を、カルシニューリンマウスについて上記のように、ＰＣＲによってクローニングし、そしてα−ＭＨＣプロモーターを含む発現ベクターに挿入した。ＤＮＡを卵母細胞に注入するために調製し、そしてトランスジェニックマウスを、上記のように生産した。
【０１７６】
ＲＮＡ分析。全ＲＮＡを、推奨されるようにＴｒｉａｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）を用いて収集および精製した。野生型およびトランスジェニック心臓由来の、ならびに培養された心筋細胞由来のＲＮＡを、以前に記載されたように（Ｊｏｎｅｓら、（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８、１９０６−１９１７）、オリゴヌクレオチドプローブのパネルに対する、ドットブロットハイブリダイゼーションに供した。
【０１７７】
組織学。野生型およびトランスジェニックマウス由来の心臓を、組織学的分析に供した。手短に言えば、心臓を収集し、ＰＢＳで緩衝化した１０％  ホルマリン中で一晩固定し、エタノール中で脱水し、キシレン、次いでパラフィンに移した。パラフィンに包埋された心臓を、４μｍに切片化し、次に、慣用的な組織学的試験についてはヘマトキシリンおよびエオシンで、またはコラーゲンについてはマッソン三色染料で染色した（ＷｏｏｄｓおよびＥｌｌｉｓ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（１９９４）Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ７．１−１３頁）。
【０１７８】
（結果）
活性化されたカルシニューリンによるインビボでの心臓肥大の誘導。上記の結果は、カルシニューリンが、培養された初代心筋細胞において心臓肥大の潜在的な調節因子であることを示した。このシグナル伝達経路が、心筋層でインビボでもまた作用し得るかどうかを決定するために、発現を駆動するためのα−ＭＨＣプロモーターを使用して心臓におけるカルシニューリン触媒サブユニットの構成的な活性型を発現するトランスジェニックマウスを生産した。以前の研究は、この心臓特異的プロモーターが、主に誕生後に心室において活性であることを示した（Ｊｏｎｅｓら  （１９９４）Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２２：１１７−１２８）。合計１０の独立した初代のトランスジェニックマウスを生産し、これらはα−ＭＨＣ−カルシニューリントランスジェニックの２〜６８の間のコピーを含んだ（表１）。
【０１７９】
【表１】
2008253274.tif 000002
心臓：体重（心臓重量：体重）比を、非トランスジェニックおよびトランスジェニックの同腹仔の心臓および身体を計量することによって計算した。値は非トランスジェニック同腹仔と比較したトランスジェニック心臓の相対的な重量として表現される。まだ生存していたマウスの齢は１９９８年２月１８日現在のものであり、括弧中に示される。３７および３９は初代のトランスジェニックであり、そして３７−および３９−と名付けられたマウスはこれらの子孫である。用語「Ｎ．Ｄ．」は、この値が決定されていないことを示す。
【０１８０】
分析されたあらゆるカルシニューリントランスジェニックマウスは、非トランスジェニック同腹仔に比較して、心臓のサイズにおいて劇的な増加を示した。心臓対体重比は、コントロールの同腹仔に比較して、出生後１８日という早い時期においてさえカルシニューリントランスジェニックにおいて平均で２〜３倍高かった（図３；表１）。オスおよびメスの心臓表現型において違いは見られなかった。組織学的分析は、同心性の肥大を示し、ここで心室壁の横断面の領域および心室内の隔壁が劇的に増加された（図３Ｃ）。左心室が最も影響を受けたが、右心室および心房室もまた、拡大した。よく組織化された正常な心室壁の横紋筋系とは対照的に、カルシニューリントランスジェニック心臓由来の心筋細胞は、組織破壊され、そして明らかに肥大していた（図３Ｄおよび３Ｅ）。この肥大性心筋細胞は、しばしば劇的な核肥大（ｋａｒｙｏｍｅｇａｌｙ）を有した。左心室壁内での筋細胞の横断面の領域の測定は、コントロールと比較して、カルシニューリントランスジェニックにおいて２倍以上の増加を示した。
【０１８１】
ヒトにおいて、心臓肥大は、しばしば心室拡張、心不全および突然死に進行する。同様に、カルシニューリントランスジェニックマウスにおいて、齢の増加に伴う心室の拡張が観察された（図３Ｆおよび３Ｇ）。カルシニューリントランスジェニックマウスはまた、突然死に対して高度に感受性である。これは、自発的に、ならびに操作または麻酔の間に起こる。突然死したマウスは、心不全の指標である右および左の心室の拡大を示した。肺の組織学もまた、広範な脈管周囲の水腫および赤血球細胞を含む肺胞内マクロファージを示し、知見は心不全と一致した。心不全の悪い特徴の１つは、心室壁の線維症である。カルシニューリントランスジェニックの心臓は、三色染色によって示されるように、広範な、主要な間質性のコラーゲンの沈着を含む（図３Ｈ）。顕著な線維症を有する病巣において、筋線維変性が明白である。
【０１８２】
同様に、ＣａＭＫＩＶの構成的な活性形態を発現するトランスジェニックマウスは、α−ＭＨＣプロモーターの制御下において、図５に示すように、非トランスジェニック同腹仔と比較して、心臓のサイズが劇的に増加することを示した。
【０１８３】
カルシニューリンによるインビボにおける肥大に応答する分子の活性化。活性化されたカルシニューリンが、肥大および心不全に特徴的な心臓の遺伝子発現の変化を誘導するかどうかを決定するために、定量的ドットブロットアッセイを使用して、カルシニューリントランスジェニックおよび非カルシニューリントランスジェニック同腹仔の心臓由来のＲＮＡを調べた。遺伝子発現の胎仔プログラムの再活性化と一致して、ＭＨＣ、α−骨格筋アクチン、およびＢＮＰ転写物が、トランスジェニック心臓において劇的にアップレギュレートされたが、一方α−ＭＨＣはダウンレギュレートされた。筋小胞体Ｃａ++−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）およびホスホランバン（ＰＬＢ）の転写物が、破損した心筋層がＣａ++の操作の欠損を示す場合、心不全の間にダウンレギュレートされることが以前に示された（Ｍｅｒｃａｄｉｅｒら、（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：３０５−３０９；Ｓｃｈｗｉｎｇｅｒら（１９９５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ
９２：３２２０−３２２８）；両方の転写物はカルシニューリントランスジェニックにおいて減少した。グルタルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現の有意な変化はなかった。
【０１８４】
ＣｓＡを有する心臓肥大の予防。インビボにおけるカルシニューリン活性の阻害が心臓肥大を予防する効果的な手段であるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＣｓＡの皮下注射がカルシニューリントランスジェニックマウスの心機能不全を予防し得るかどうかを試験した。これらの実験のために、トランスジェニックマウス＃３７（表１）の同腹仔からの８匹のトランスジェニック同腹仔を使用した。
【０１８５】
４匹のトランスジーン陽性子孫に、１日に２回、２５ｍｇ／ｍｌ  ＣｓＡを注射し、そして４匹にはビヒクルを単独で注射した。４匹の非トランスジェニック同腹仔をまた、ＣｓＡで処置し、ＣｓＡによって誘導される潜在的な毒性効果または任意の心臓異常について制御した。ＣｓＡ処置は９日齢で開始し、そしてその動物を１６日後に屠殺した。図４Ｃに示すように、ビヒクル処置動物の心臓は高度に肥大し、そして２５日までに拡張したが、ＣｓＡ処置同腹仔は非トランスジェニックコントロールとはサイズにおいて有意な差はなかった。カルシニューリントランスジェニックの心臓対身体重量比は、図４Ｂに示すように、ＣｓＡ−処置トランスジェニックおよび非トランスジェニックのそれらよりもおよそ３倍大きかった。ＣｓＡ処置はまた、カルシニューリントランスジェニックの心臓の線維症を予防した。
【０１８６】
細胞レベルにおいて、カルシニューリントランスジェニックの心筋細胞の肥大性応答は、大部分はＣｓＡによって阻害されるが、筋線維の乱れた配列および顕著な高色素性の核を有する散乱した細胞の単離された領域が存在する。ＣｓＡ処置は、インビボにおいて活性化されたカルシニューリンに応答する全体の心臓肥大および関連する病理学を予防した。
【０１８７】
（実施例３）
（培養された心筋細胞モデルにおける肥大感受性遺伝子の発現におけるＣａＭＫＩＩおよびＣａＮの効果の特徴付け）
（プロトコール）
初代心筋細胞培養。胎仔ラット心筋細胞の初代培養を、１〜４日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用して調製した。仔ラット（調製１回あたり平均１５仔ラット）を、断首し、そして心臓を胸腔から無菌的に取り除き、そしてＭｅｄｉｕｍ  １９９（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で洗浄して、残存する血液を除去した。心房を取り除き、そして心室を細かくミンチし、そして各１８分間の３つの連続的なＶｉｏｋａｓｅ（Ａ．Ｈ．Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）消化に供した。リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼならびに他の膵臓の酵素を含むＶｉｏｋａｓｅを、ＰＢＳ緩衝液中で１ｍｇ／ｍｌに作製し、そして心臓１５個あたり１２０ｍｌの割合で使用した。３つの消化物からプールした上清を、消化反応をクエンチするためにアイスバス上に置いた。次いで上清を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＪ−６ローター中で室温で８分間２０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを、１０％ウシ胎仔血清および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンで補充したＭｅｄｉｕｍ１９９中に再懸濁した。次いで細胞を１００ｍｍ組織培養ディッシュ中にプレートし、そして３７℃で細胞培養インキュベーター中でインキュベートした。「プレ−プレーティング」と呼ばれるこのプロセスは、選択的に，迅速に結合した、非心筋細胞（例えば、細胞集団からの線維芽細胞）を取り除き、それゆえに細胞集団を心筋細胞について富化させる。４５〜５０分間後、長期培養の開始のために、約１５０細胞／ｍｍ2の密度で非結合細胞を新鮮な６０ｍｍディッシュに移した。２０〜２４時間後、心筋細胞培養物を洗浄して、上記のように６０ｍｍディッシュ中で、１０％ウシ胎仔血清で補充した新鮮な培地中に維持した。心筋細胞の培養物を７日まで維持し得る。
【０１８８】
一過性トランスフェクション。血清応答エレメントを通して媒介される遺伝子発現への効果を除去するために、無血清培地中で単離された心筋細胞を培養することが必要であった。初代心筋細胞を、最初に無血清増殖培地で洗浄し、次いでヒト血清アルブミン、ウシインスリンおよびヒトトランスフェリンを含む、Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ  ＨＵ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で補充した無血清培地１９９中で維持した。トランスフェクションを、リポソームに基づくトランスフェクト剤、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて行った。一過性トランスフェクションのために使用される手順は、製造者の説明書に従った。ＤＮＡ濃度、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ濃度、およびトランスフェクションの時間の長さを含む最適値を、本研究において行う実験に先立って決定した。手短に言えば、各々のトランスフェクションについて、２μｇ  ＤＮＡおよび２０μｇ  ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを３００μｌの無血清ｎｕｔｒｉｄｏｍａ補充培地を含む別個のバイアル中に希釈した。次いで、２つの溶液を合わせて、室温で１５〜４５分間インキュベートして、ＤＮＡ−リポソーム複合体を形成させた。各々のトランスフェクションについて、２．４ｍｌの無血清ｎｕｔｒｉｄｏｍａ補充培地を、ＤＮＡ−リポソーム複合体を含むチューブに添加し、そしてその希釈混合物を、６０ｍｍ組織培養プレート中の２ｍｌの無血清培地で１回リンスした、付着した心筋細胞に重層した。細胞培養を、３７℃で、５％  ＣＯ2を含むＣＯ2インキュベーター中で２４時間インキュベートした。その時点で種々の試験化合物を添加した。細胞抽出物由来のプロモーター活性を、トランスフェクションの開始後４８時間以内にアッセイした。
【０１８９】
α１−アドレナリン作動性刺激については、１００μＭ  ＰＥ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を細胞に添加した。選択性β１−アドレナリン作動性アゴニストである、ＤＯＢ（Ｇｅｎｓｉａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｉｒｖｉｎｇ，ＣＡ）を、１０μＭの濃度で添加した。トランスフェクション効率における変動を修正するために、ｐβＧａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌを内部標準として使用した。化学発光性のβ−ガラクトシダーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイについて収集した同じ細胞溶解物のアリコートを使用することによってアッセイし、そして下記のように同じルミノメーター中で測定した。
【０１９０】
ホタルルシフェラーゼアッセイ。ホタルルシフェラーゼアッセイは、市販の生物ルミネッセンスアッセイの長時間「成長」型（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に基づく。手短に言えば、ルシフェリンの活性化が、酵素結合型ルシフェリルアデニル酸（ルシフェリル−ＡＭＰ）の形成を生じる。その酵素中間体、ルシフェリル−ＡＭＰは、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）の存在下で酸化され、そして励起された酵素結合生成物の形成に導き、これは続いて光および強く酵素結合した生成物を放出するために分解する。より好ましい全体の反応速度論を有するルシフェニル−ＣｏＡの代わりに、酸化はＣｏＡの存在下において生じる。ルシフェラーゼ活性についてアッセイされる細胞をＰＢＳ緩衝液で２回すすぎ、そしてＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  １×緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）に溶解し、次いでかきとることによって収集した。大きな細片を短い遠心分離によってペレット化し、そして上清を新しいチューブに移した。ルシフェラーゼアッセイについては、２０μｌの細胞抽出物を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ、１．０７ｍＭ  （ＭｇＣＯ3）4Ｍｇ（ＯＨ）2５Ｈ2Ｏ、２．６７ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ  ＤＴＴ、２７０μＭ  コエンザイムＡ、４７０μＭ
ルシフェリン、よび５３０μＭ  ＡＴＰを含む１００μｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。１０秒間〜５分間にわたる完全な光放射を、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ２０（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。すべてのアッセイを細胞溶解の１時間以内に、室温で行った。
【０１９１】
ノーザン分析。ＡＮＦメッセージ分析については、市販のＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉの方法に従って、全ＲＮＡを１〜３日齢新生仔ラット心筋細胞細胞培養から抽出した。ラット初代細胞培養物をＴＲＩｚｏｌ中でホモジナイズし、そしてこのＲＮＡをクロロホルムの添加によって抽出し、そしてイソプロパノ−ルの存在下で沈殿させた。単離した全ＲＮＡを、１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分画し、そしてキャピラリーブロッティングによってナイロンメンブレンに転写した。ブロットを５０％ホルムアミド溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で、３〜４時間、４２℃でプレハイブリダイズし、次いでランダムプライマー、ビオチン標識ＡＮＦ  ｃＤＮＡプローブを用いて一晩ハイブリダイズした。高ストリンジェンシー（０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）での洗浄後、ハイブリダイズしたビオチン化ｃＤＮＡを、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＲＯＰＩＸ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて検出し、次いでＸ線フィルムに曝露した。ＡＮＦバンドをＨｏｗｔｅｃｋゲルスキャナー（ＰＤＩ，Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＹ）を用いて定量し、そして２８Ｓ  ｒＲＮＡシグナルに対して標準化して、ローディングおよび／または転写効率に対して修正した。
【０１９２】
自律的なＣａＭキナーゼＩＩ活性の測定。ラット心臓組織ホモジネートにおけるＣａＭＩＩキナーゼの自律的な活性を、外因性基質として、合成ペプチド基質、ａｕｔｏｃａｍｔｉｄｅ−２（ＫＫＡＬＲＲＱＥＴＶＤＡＬ）（Ｍａｒら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４２７１−４２８３；およびＦａｒｒａｎｃｅら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７２３４−１７２４０）を使用して測定した。このペプチドは、ラット脳α−ＣａＭキナーゼＩＩのコアの自己リン酸化配列を模倣し、そしてＣａＭキナーゼＩＩに高度に選択性である。自律的なＣａＭキナーゼＩＩ活性を、Ｃａ2+／カルモジュリンの非存在下でのａｕｔｏｃａｍｔｉｄｅ−２のリン酸化によってアッセイし、そしてこれらのコファクターの存在下で得られる活性の割合として表現した。組織切片を、必要とされる時間、種々の薬物化合物の存在下または非存在下でインキュベートした。インキュベートの終了時に、組織切片を氷冷した緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．０ｍＭ  ジチオスレイトール、１０ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、０．４ｍＭ  モリブデン酸アンモニウム、１００ｍｇ／ｍｌ  ロイペプチン）中で超音波処理によりホモジナイズした。上清を遠心分離（１２，０００×ｇ、２分間）により清澄化し、次いで５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐＨ  ７．０）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン、１０ｍＭ  ａｕｔｏｃａｍｔｉｄｅ−２、２０ｍＭ  [γ−32Ｐ]ＡＴＰ、およびＣａ2+−刺激活性についての０．５ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍｇ／ｍｌ  カルモジュリン、または自律的な活性についての１ｍＭ  ＥＧＴＡのいずれかを含む反応混合液中でアッセイした。このアッセイを３０℃で３０秒間行い、そしてトリクロロ酢酸の最終濃度５％までの添加により停止させた。内因性タンパク質を遠心分離によって沈殿させ、そしてａｕｔｏｃａｍｔｉｄｅ−２を含む上清をｐ８１ホスホセルロースの小片にスポットし、５回洗浄し、乾燥させ、そして32Ｐ−ＰＯ4含量をチェレンコフ放射によって定量した。
【０１９３】
プラスミドの構築。種々のラット心臓ＡＮＦプロモーターフラグメントおよびラットＡＮＦ  ｃＤＮＡを含む一連のネスティングした欠失変異体を使用した。このプロモーター−レポーター構築物のシリーズを、ルシフェラーゼに基づくｐｘｐ２ベクターにサブクローニングした。適切な制限酵素部位を使用、またはＰＣＲ増幅によって、５’欠失を生成した。ＡＮＦ転写を調節すると考えられている、鍵となるエンハンサーエレメントの模式図を図８Ａに示す。トリ心臓骨格筋α−アクチン遺伝子（ホタルルシフェラーゼ遺伝子の構造部分に連結する増殖シグナル伝達に応答性のエンハンサードメインの大部分を含む）の骨格筋α−アクチンレポーター（約４００ｂｐの近位の上流プロモータードメイン（転写開始部位に対して−３９４ｂｐ〜＋２４）を含む）を使用した。別のルシフェラーゼに基づくプロモーター−レポーター構築物（トリ心筋α−アクチン遺伝子の４００ｂｐの近位の上流プロモータードメインを含む）もまた使用した。ｐＳＲα発現ベクターに含まれるδ−ＣａＭキナーゼ（δAおよびδB）の２つのイソ型を使用した。全長型（ＣａＭＫＩＶｗｔ）および変異型（ＣａＭＫＩＶ３１３）の両方を含むＣａＭキナーゼＩＶについての発現プラスミドを使用した。ニューロン起源のカルシニューリンの構成的に活性な形態を、ポリメラーゼ連鎖反応変異誘発技術によって生成し、これはカルシニューリンの自己阻害ドメインの欠失を生じた。次いで、変異フラグメントを、ｐＳＲα発現ベクターにサブクローニングした。変異体脳α−ＣａＭキナーゼＩＩについての発現プラスミドを、野生型ＣａＭキナーゼＩＩ酵素の短縮型（アミノ酸１〜２９０）をコードするｃＤＮＡをサブクローニングすることによって構築した。これは、ｐＣＭＶ５（複数のクローニング配列を、サイトメガロウイルスの強力なウイルスプロモーターからすぐ下流に含む哺乳動物発現プラスミド）のＥｃｏＲＩ部位中で構成的に活性である。この構築物は、心筋細胞培養物にトランスフェクトした場合、Ｃａ2+またはカルモジュリンに結合しないＣａＭキナーゼＩＩ酵素を構成的に産生する。
【０１９４】
（結果）
（ＡＮＦ、骨格筋α−アクチン、および心筋α−アクチン遺伝子に関するプロモーター−レポーター活性に対する外因性ＣａＭキナーゼＩＩおよびカルシニューリンの効果）
本研究において、本発明者らは、ＡＮＦ、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンの遺伝子の発現の調節において、カルシウム依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ））、およびカルシウム感受性ホスファターゼ（カルシニューリン（ＣａＮ））の潜在的な機能的役割を調査した。上記記載のようなほぼ完全長のＡＮＦ、骨格筋α−アクチンまたは心筋α−アクチンのプロモーター領域を含む、３つのルシフェラーゼに基いたプロモーター−レポーター構築物を、本研究に使用した。変異体である構成的に活性なＣａＭＫＩＩα−イソフォームまたはＣａＮの構成的に活性な変異形態を保持しているベクター構築物をＡＮＦ／ルシフェラーゼ、骨格筋α−アクチン／ルシフェラーゼまたは心筋α−アクチン／ルシフェラーゼ融合遺伝子とともに使用する同時トランスフェクションプロトコルを、１〜４日齢のラットの子から調製した新生仔心筋細胞培養物上で実行した。ルシフェラーゼレポーター活性を評価した。図６に示すように、外因性ＣａＭＫＩＩα−イソフォームの過剰発現は、ＡＮＦ、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンに対するプロモーターレポーター活性をコントロール培養物（空ベクターを用い同時トランスフェクションした）と比較して５０％沈黙した。対照的に、外因性の構成的に活性なＣａＮの過剰発現は、ＡＮＦ、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンプロモーター活性をコントロール細胞より３００％〜６００％増加した。本実験の結果は、異種のＣａＭＫＩＩα−イソフォームの過剰発現が、心臓胚遺伝子（ＡＮＦおよび骨格筋α−アクチン）と構成的な収縮性のタンパク質遺伝子（心筋α−アクチン）との両方に対してプロモーター活性の沈黙を導く。対照的に、外因性ＣａＮの活性化は、これらの３つの遺伝子に対するプロモーター活性の超誘導を生じる。
【０１９５】
（ＡＮＦプロモーター−レポーター活性に対するＣａＭキナーゼイソ酵素の効果）
ＣａＭキナーゼファミリーは、構造、分布、調節、および酵素活性の異なる少なくとも１０のメンバーを有する。図６に示した結果は、変異されたα−ＣａＭＫＩＩが、肥大感受性遺伝子のダウンレギュレーションを誘導したことを示唆する。他のＣａＭキナーゼファミリーのメンバーのどの効果が、原型の肥大感受性遺伝子ＡＮＦにおいて役割を果たすかを決定することが目的であった。野生型ＣａＭＫＩＩ（ＣａＭＫＩＩwt）、δ−ＣａＭＫＩＩ（δAおよびδB）、およびＣａＭＫＩＶ（野生型および改変形態）を含むＣａＭキナーゼファミリーのメンバーの選択を、上記記載のＡＮＦプロモーター−レポーター構築物での同時トランスフェクションのために使用した。ＡＮＦのＰＥ誘導もまた、それぞれの外因性のＣａＭキナーゼメンバーの存在下で評価した。図７に示すように、ＣａＭＫＩＩwtは、ＡＮＦプロモーター活性を約４００％減少した。対照的に、ＣａＭＫＩＶwtは、ＡＮＦプロモーター活性を２７０％増加したが、ＣａＭＫＩＶmutは、ＡＮＦプロモーター活性を約４００％増加した。δAおよびδBの両方を含むＣａＭＫＩＩδイソフォームは、事実上、ＡＮＦのプロモーター活性を変化させなかった。類似の結果が、図７Ｂに示すように、トランスフェクションされた心筋細胞においてＰＥ刺激の存在下で得られた。まとめると、これらのデータは、異なったＣａＭキナーゼファミリーのメンバーが、ＡＮＦの発現に対して差次的な効果を示すことを示す。
【０１９６】
（ＡＮＦプロモーター−レポーターのネスト化された欠失構築物に対する外因性のＣａＭＫＩＩまたはＣａＮの効果）
これらの研究において、ラット心臓ＡＮＦ遺伝子の５’プロモーター／エンハンサードメインから生成したネスト化された欠失構築物のシリーズを使用した。３つの異なった長さの元来のＡＮＦプロモーターフラグメントを、上記記載のように、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の構造的部分に連結した。ＡＮＦ遺伝子について同定された機能的エンハンサーエレメントの全ての図を、図８Ａに示す。ＰＥに曝露された心筋細胞培養物における、各ネスト化された欠失構築物に対するレポーター活性を、図８Ｂに示す。ＰＥＲＥ（ＰＥ応答エレメント）モチーフを含む（ＡＮＦ７００（ＮＰ３３７）およびＡＮＦ１３５（ＮＰ３２５））十分な上流配列を含むプロモーター−レポーター構築物は、ＰＥ曝露により活性化され、このモチーフを欠いたプロモーター配列ＡＮＦ５０（ＮＰ３３８）は、活性化されなかった。外因性ＣａＭＫＩＩ／ＣａＮの発現によるＡＮＦプロモーター−レポーター活性の沈黙／誘導が、ＡＮＦプロモータードメインの領域に局在し得るかどうか評価した。上記記載のＡＮＦプロモーター−レポーターのネスト化された欠失構築物を、それぞれ構成的に活性なＣａＭＫＩＩまたは構成的に活性なＣａＮで同時トランスフェクションした。図８Ｃに示すように、外因性のＣａＭＫＩＩの過剰発現は、コントロール培養物と比較して５０％、３つ全てのＡＮＦ５'−欠失プロモーター構築物の沈黙を生じたが、外因性のＣａＮの過剰発現は、コントロール培養物の２００〜６００％の範囲で３つのＡＮＦプロモーター構築物のそれぞれを増加した。これらのデータは、ＣａＭＫＩＩ／ＣａＮによるＡＮＦプロモーター−レポーター活性の阻害／誘導が、ＡＮＦプロモーターについての規定の領域またはドメインに制限され得なかったことを示す。
【０１９７】
（β−アドレナリン作動性レセプターのシグナル伝達および心臓ＣａＭキナーゼＩＩの活性化）
これらの実験は、β1−アドレナリン作動性レセプターサブタイプによるシグナル伝達が、心臓ＣａＭＫＩＩを活性化し得るかどうか決定した。１〜４日齢新生仔ラット由来の心組織切片を、新鮮に単離し、そしてβ１選択性アゴニスト（ドルブタミン（ｄｏｌｂｕｔａｍｉｎｅ：ＤＯＢ））、または混合β１（β１およびβ２）アゴニスト（イソプロテレノール（ＩＳＯ））のどちらかで処理した。類似の研究において、アゴニストを加える前に、β１アンタゴニスト（プロパノロール（ＰＲＯＰ））を、１５秒加えた。後で、ＣａＭＫＩＩの自律的な活性（カルシウム依存性活性の％）をアッセイした。このような実験の結果を図９に示す。ＣａＭＫＩＩの自律的な活性化は、ＤＯＢまたはＩＳＯによる処理の３０秒後、刺激していない心組織において観察した活性より約１７０％増加した。さらに、ＤＯＢまたはＩＳＯのどちらかの添加の前に添加した場合、β１アンタゴニスト（ＰＲＯＰ）は、ＣａＭＫＩＩの自律的活性の活性化を阻止した。これらの結果は、β1−アドレナリン作動性アゴニストへの曝露が、心臓の内因性ＣａＭＫＩＩの活性化を導くことを示す。ＣａＭＫＩＩ活性のこの活性化は、β1−レセプター媒介応答である。
【０１９８】
（ＡＮＦ、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチン遺伝子についてのプロモーター−レポーター活性に対するアドレナリン受容体アゴニストの効果）
上記に示した実験の結果は、ＣａＮが新生仔ラット心筋細胞におけるこれら３つの遺伝子の誘導を導くことを示唆した。ＡＮＦ、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンの発現について、α−およびβ−アドレナリン作動性刺激の効果を決定することが目的であった。上記記載のようなＡＮＦ、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンプロモータードメインを保持するルシフェラーゼに基いたプロモーター−レポーター構築物を、初代新生仔ラット心筋細胞培養物へトランスフェクトした。次に、トランスフェクトされた心筋細胞を、α1−アドレナリン作動性アゴニスト（フェニレフリン（ＰＥ））、β1−アドレナリン作動性アゴニスト（ＤＯＢ）、またはβ型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β１）に曝露した。図１０のパネルＡ、Ｂ、およびＣに示すように、これらの各プロモーター−レポーター活性は、ＤＯＢでの処理により約５０％減少した。ＡＮＦおよび骨格筋α−アクチンについてのレポーター活性は、図１０のパネルＡおよびＢに示すように、心筋細胞をＰＥに曝露した場合、コントロール細胞におけるレポーター活性より２００％トランス活性化された。心筋α−アクチンについてのプロモーター活性は、ＰＥ処理した心筋細胞において有意には刺激されなかったが、ＴＧＦ−β１での処理は、以前の研究と一致して、コントロール細胞より７００％の心筋α−アクチンプロモーター−レポーター活性を誘導した。これらのデータは、α−アドレナリン作動性刺激およびβ−アドレナリン作動性刺激の両方が、ＡＮＦ、骨格筋α−アクチンおよび心臓β−アクチンのような心臓肥大感受性遺伝子の発現を調節することを示す。β1−アドレナリン作動性刺激は、ＡＮＦ、骨格筋α−アクチンのような胚遺伝子、および心筋α−アクチンのような構成的な収縮性のタンパク質遺伝子の両方についてのプロモーター活性を阻害し得る。従って、上記の実験において観察されたＡＮＦレポーター活性の変化が、ＡＮＦメッセージプールの変化に応答するかどうか評価することが目的であった。
【０１９９】
新生仔心筋細胞の初代培養物を、無血清培地中で維持し、そしてβ１アゴニスト、ＤＯＢを、種々の時間で細胞に適用した。ＡＮＦメッセージＲＮＡを、上記記載のようにノザン分析プロトコルにより終わりに評価した。図１０Ｄに示すように、細胞培養物をＤＯＢに曝露した場合、ＡＮＦメッセージの量が、１６時間以内には低下し始め、コントロール培養物（非薬物添加）において観察された約半分でしかなかった。この傾向は続き、ＤＯＢ曝露２４時間後には、ＡＮＦ  ｍＲＮＡが、コントロールの値と比較して７５％減少した。これらの結果は、レポーター活性における変化の全てでないとしても一部は、遺伝子転写のレベルで起こったことを示唆する。
【０２００】
（実施例４）
（誘導可能カルシニューリン発現系による肥大感受性遺伝子の転写調節）
（プラスミド構築）
テトラサイクリンで調節されたトランスアクティベーター（ｔＴＡ）発現プラスミドｐＵＨＤ１５−１は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびエンハンサーの制御下にキメラタンパク質ｔＴＡをコードする。ｔＴＡは、ｔｅｔＲタンパク質由来のアミノ酸残基１〜２０７およびＶＰ１６由来の残基３６３〜４９０からなる（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７〜５５５１）。
【０２０１】
プラスミドｐＵＨＤ１０−３は、キメラのｔｅｔオペロン／ＣＭＶ最小プロモーターを多重クローニング部位の上流に含む（Ｂｕｊａｒｄ、１９９６）。ｐＵＨＣ１３−３は、キメラのｔｅｔオペロン／ＣＭＶ最小プロモーターにより駆動されるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子発現プラスミドである（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（１９９２））。
【０２０２】
カルシニューリンの構成的に活性な遺伝子形態（ΔＣａＭ−ＡＩ）は、ｐＳＲα発現ベクター内に自己阻害ドメイン欠失カルシニューリン遺伝子変異体をサブクローン化することにより生成したプラスミドｐＣＮ（α）ΔＣａＭ−ＡＩからもともと回収した（Ｐａｒｓｏｎら、１９９４）。ｔＴＡ誘導可能カルシニューリン構築物ｐ１０−３ＣａＮを生成するために、構成的に活性なカルシニューリンをコードしているｐＣＮ（α）ΔＣａＭ−ＡＩの１．２Ｋｂｐ  ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩクローニング部位の前にｔＴＡ依存性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最小プロモーターを含むプラスミドｐＵＨＤ１０−３の唯一のＥｃｏＲＩ開裂部位中にサブクローン化した（Ｂｕｊａｒｄ、１９９６）。
【０２０３】
ＡＮＦルシフェラーゼプロモーター−レポーター構築物であるＮＰ３３７を、以前に他で記載したように（ＭｃＢｒｉｄｅら、１９９３）、ルシフェラーゼに基いたｐＸＰ−２ベクター内に、約７００ｂｐヌクレオチドのＡＮＦ近位のプロモーターフラグメントをクローニングすることにより作製した。
【０２０４】
骨格筋α−アクチンレポーターであるＳｋＡ−Ｌｕｃを、ホタルルシフェラーゼ発現ベクターｐＸＰ１内に、トリの骨格筋α−アクチン遺伝子（ＭａｃＬｅｌｌａｎら、１９９４）の約４２０ｂｐの近位の上流プロモーター（−３９４ｂｐから＋２４ｈｐ）をサブクローン化することにより構築した。別のレポーター構築物である心筋α−アクチンプロモーター−ルシフェラーゼ（ＣａｒｄＡ−Ｌｕｃ）は、ｐＧＬ２ベーシックルシフェラーゼベクターのＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位内に、ニワトリ心筋α−アクチンプロモーターおよび中間の上流領域の３３０ｂｐフラグメント（−３１５から＋１５、転写開始点に対して）をサブクローン化することにより生成した（ＣｈｅｎおよびＳｃｈｗａｒｔｚ、１９９６）。
【０２０５】
（細胞培養物）
初代心筋細胞培養  初代心室心筋細胞を、実施例３に記載のように、１〜４日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから調製した。
【０２０６】
（結果）
（初代新生仔ラット心筋細胞におけるテトラサイクリン依存性トランスアクティベーター（ｔＴＡ）発現系による外因性標的遺伝子転写の調節）
レポーター遺伝子としてのホタルルシフェラーゼ遺伝子は、ｐＵＨＣ１３−３におけるキメラｔｅｔオペロン／ＣＭＶ最小プロモーターの制御下にあった。一過性のトランスフェクションを、実施例３に記載のように実行した。この構築物およびｔＴＡ発現プラスミドｐＵＨＤ１５−１を、エフェクター物質ドキシサイクリン（ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ）の非存在下または存在下において、細胞に同時トランスフェクションした場合、ルシフェラーゼ活性の変化は、標的遺伝子転写の転写を制御するためのｔＴＡ系の能力を示す。テトラサイクリン調節化遺伝子発現系が、初代ラット心筋細胞において機能するかどうかを試験するために、細胞培養物を、ｔＴＡ発現プラスミドｐＵＨＤ１５−１（０．２５μｇ）およびｔＴＡ刺激化ルシフェラーゼ遺伝子発現構築物ｐＵＨＣ１３−３（０．２５μｇ）で同時トランスフェクションした。コントロールとして、同量のレポータープラスミドｐＵＨＣ１３−３と空ベクターであるｐＵＨＤ１０−３を、同じ細胞調製由来の心筋細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞抽出物におけるルシフェラーゼ活性を、種々の時間点で、実施例３に記載したようなルシフェラーゼアッセイを用いて試験した。ｔＴＡの非存在下では、非常に低レベルのレポーター遺伝子活性のみが、トランスフェクション後４８時間の間に検出された。ｔＴＡ発現は、図１１Ａに示すように、この期間中レポーター活性の劇的な増加を生じ、そして標的遺伝子活性は、トランスフェクション後１２時間で最大に達した。トランスフェクション後１２時間で、ｔＴＡをトランスフェクションされた細胞におけるルシフェラーゼ活性は、ｔＴＡトランスフェクションのない細胞におけるルシフェラーゼ活性より３０倍以上高かった（図１１Ａおよび１１Ｂ）。細胞をトランスフェクション後１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）で処理した場合、標的遺伝子のトランス活性化は、顕著に抑圧された。しかし、ドキシサイクリン処理それ自体は、標的遺伝子の一過性の低レベルの発現（トランスフェクション後１２時間で約４倍増加）を引き起こした（図１１Ａおよび１１Ｂ）。このことは、初代心筋細胞における標的遺伝子のドキシサイクリン抑圧が完全でないことを示唆する一過性のトランスフェクションにおける外因性の遺伝子の発現は、これらの細胞において、元来の遺伝子調節機構のしっかりとした制御下にはない可能性がある。ドキシサイクリン処理は、この標的遺伝子の低レベルの発現を刺激するために弱いシグナルを生じさせ得る。従って、ドキシサイクリンは、この系において心臓遺伝子転写を調節するための最もよいエフェクターではないようである。
【０２０７】
（ｔＴＡ制御カルシニューリン発現系により誘導された肥大感受性遺伝子の転写は、カルシニューリン遺伝子用量に依存する）
構成的に発現した活性なカルシニューリンは、初代ラット心筋細胞においてＡＮＦレポーター遺伝子の転写を活性化する。さらに、心筋α−アクチンレポーター遺伝子の転写は、Ｐａｃ−１平滑筋細胞においてｔＴＡで刺激した活性カルシニューリン発現により誘導される。初代心筋細胞における心臓遺伝子転写に対する活性カルシニューリンの効果を検出するために、および心臓遺伝子発現を誘導するためのトランスフェクションにおけるカルシニューリン構築物の最適な濃度を決定するために、種々の量のｔＴＡ依存性活性化カルシニューリン発現構築物ｐ１０−３ＣａＮ、０．２５μｇのｔＴＡ発現プラスミドｐＵＨＤ１５−１および０．２５μｇの心筋α−アクチンプロモーター−レポータープラスミドＣａｒｄＡ−Ｌｕｃを、初代ラット心筋細胞内にトランスフェクションした。結果を図１２に示す。空ベクターであるｐＵＨＤ１０−３を、ｐ１０−３ＣａＮの代わりをするために、または０．７５μｇ／ウエルにまで全ＤＮＡを補うために、コントロールとして使用した。トランスフェクション後２４時間で、心筋α−アクチンレポーター遺伝子の発現レベルを、実施例３に記載したようにルシフェラーゼアッセイにより分析した。図１２に示すように、外因性の活性カルシニューリンの不在下で、レポーター遺伝子発現のレベルは極めて低かったが、心筋α−アクチンレポーター遺伝子の転写は、トランスフェクションしたｐ１０−３ＣａＮの用量の漸増により徐々に高められた。カルシニューリンＤＮＡの量が０．２５μｇまでの場合、レポーター遺伝子の発現は、ほぼ最大レベルに増加した。明らかに、心筋α−アクチン遺伝子の発現は、活性カルシニューリン遺伝子用量依存性である。０．２５μｇのｐ１０−３ＣａＮを、次の実験において最適用量として使用した。
【０２０８】
（カルシニューリンの活性形態の誘導された発現は、心筋細胞における３つの肥大感受性遺伝子の転写を迅速に活性化する）
心筋細胞において心臓遺伝子の発現を調節するカルシニューリンの能力をさらに評価するために、本発明者らは、活性カルシニューリン発現の誘導下の３つの肥大応答遺伝子の発現の経時変化を研究した。心筋α−アクチン、骨格筋α−アクチン、およびＡＮＦプロモーター−Ｌｕｃプラスミドを、レポーターとして使用した。初代新生仔ラット心筋細胞を、レポーターであるｐＵＨＤ１５−１およびｐ１０−３ＣａＮ、またはｐ１０−３ＣａＮの代わりに空ベクターｐＵＨＤ１０−３のどちらかと、ｐＵＨＤ１５−１およびレポータープラスミドと共に同時トランスフェクションした。各プラスミド量は０．２５μｇであった。トランスフェクションを、実施例３に記載のように実行した。トランスフェクション後種々の時間点で、細胞抽出物のルシフェラーゼ活性を、実施例３に記載のように測定した。各実験において、ルシフェラーゼ活性の最高レベルを、レポーター遺伝子の最大応答として使用し、全てのデータを、最大応答のパーセンテージに基準化した。外因性の活性カルシニューリンの発現の不在下では、３つの心臓遺伝子の転写レベルは、非常に低かった。しかし、活性カルシニューリンの発現は、図１３に示すように、３つの心臓遺伝子の転写を顕著に誘導した。心筋α−アクチン、骨格筋α−アクチン、およびＡＮＦ遺伝子の発現は全て、転写後４８時間でほぼ最大レベルにまで有意に増加した。このことは、活性カルシニューリンが、初代心筋細胞においてこれらの肥大応答遺伝子の転写を迅速に活性化することを示唆する。
【０２０９】
同じ心臓細胞調製物を、同量のレポーター、ｔＴＡ、およびカルシニューリンプラスミドＤＮＡを、図１４に示すように同時トランスフェクションした場合、３つの心臓遺伝子の発現レベルを、トランスフェクション後４８時間で検出した。カルシニューリンプラスミドの代わりに空ベクターｐＵＨＤ１０−３のみを、レポーターおよびｔＴＡプラスミドと共に、心筋細胞にトランスフェクションしたコントロールと比較して、カルシニューリンは、約８〜１０倍心筋α−アクチンの転写を強く活性化し、そして、図１４Ｂおよび１４Ｃに示すように、約６倍および約３倍中程度にＡＮＦおよび骨格筋α−アクチン発現を活性化した。
【０２１０】
これらの結果は、肥大感受性遺伝子の転写に対するカルシニューリンの刺激性の効果を示しただけでなく、誘導可能遺伝子発現系の有用性もまた示した。心筋細胞における肥大応答遺伝子の転写を誘導する活性化カルシニューリンの能力は、カルシニューリンの構成的に活性な形態を過剰発現するトランスジェニックマウスからの結果（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９９８）と一致する。例えば、カルシニューリントランスジェニックマウスの心臓における骨格筋α−アクチン遺伝子のｍＲＮＡレベルは、正常マウスの心臓におけるレベルよりも約５倍高かった。本発明者らの誘導可能発現系におけるカルシニューリンにより誘導されたＡＮＦ遺伝子発現の増加倍は、カルシニューリントランスジェニックマウスにおけるＢＮＰ遺伝子活性化の増加倍と類似している。しかし、本発明者らの系における心筋α−アクチン遺伝子の転写レベルの増加倍は、カルシニューリンを過剰発現するトランスジェニックマウスにおける増加倍よりも大きい。
【０２１１】
（シクロスポリンＡによる肥大応答遺伝子発現のカルシニューリン誘導の抑圧）
活性化されたカルシニューリンによる肥大感受性遺伝子の転写の活性化が、カルシニューリンの特異的インヒビターであるＣｓＡにより阻害され得るかどうかを評価するために、実施例３に記載されているように、ｐ１０−３ＣａＮ構築物または空ベクターｐＵＮＤ１０−３のどちらかと、ｔＴＡおよびｃａｒｄＡ−Ｌｕｃレポータープラスミドと共にトランスフェクションされた両方の心筋細胞培養物を、トランスフェクション後０時間から異なった濃度のＣｓＡ（Ｓａｎｄｏｚ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ）またはＣｓＡ処理なしで処理した。種々の時間点で、これらの細胞におけるルシフェラーゼ活性をアッセイし、そして比較した。カルシニューリントランスフェクションを有さないコントロール群において、ＣｓＡ処理のみが、図１５に示すように、処理なしと比較して、心筋α−アクチン遺伝子の転写レベルの少ない減少を生じた。しかし、活性化されたカルシニューリンにより刺激された心筋α−アクチン遺伝子の発現は、図１５に示すように、全ての異なった濃度のＣｓＡにより有意に抑圧された。このことは、さらにこれらの心臓肥大応答遺伝子の発現が、カルシニューリン依存性シグナル伝達経路により活性化されるという結論を支持する。トランスフェクション後７２時間で、カルシニューリンにより誘導された心筋α−アクチン遺伝子活性は、図１５に示すように、１００ｎＭまたは１５０ｎＭ  ＣｓＡ処理により８０％以上阻害された。このことは、非常に低濃度のＣｓＡが、カルシニューリンにより誘導された心筋α−アクチン遺伝子の転写の活性化を阻害し得ることを示す。従って、１００ｎＭを、以下の実験においてＣｓＡの最適濃度として選択した。
【０２１２】
カルシニューリンにより誘導された肥大感受性遺伝子の転写に対するＣｓＡの効果をさらに示すために、本研究者らは、活性カルシニューリン刺激下で心筋α−アクチンプロモーター−レポーター遺伝子の発現が、いかにＣｓＡに応答するかを分析した。初代心筋細胞を、ｔＴＡ，心筋α−アクチンレポーター構築物、およびカルシニューリン、またはｔＴＡ、心筋α−アクチンレポーター遺伝子、およびコントロールとしての空ベクターのどちらかで同時トランスフェクションした。ＣｓＡ処理（１００ｎＭ）を、トランスフェクション後０時間で開始した。心臓細胞培養物中の心筋α−アクチン遺伝子の活性を、ルシフェラーゼアッセイにより試験し、そして結果を、最大応答のパーセンテージに規準化した。空ベクターでトランスフェクションした細胞では、図１６に示すように、心筋α−アクチン遺伝子の発現は低く、そしてＣｓＡ処理細胞と未処理細胞の間の遺伝子活性において顕著な差異はなかった。しかし、ＣｓＡ処理は、活性なカルシニューリンをトランスフェクションされた細胞において心臓遺伝子の転写の劇的な減少を導く。ＣｓＡ処理後４８時間で、カルシニューリンにより活性化された心筋α−アクチン遺伝子の発現は、図１６に示すように、ほぼ基底のレベルに減少した。
【０２１３】
上記の結果に基づき、本発明者らは、ＡＮＦ、心筋α−アクチンおよび骨格筋α−アクチン遺伝子のカルシニューリンに媒介された転写の活性化に対するＣｓＡの効果を試験した。等量の各レポーター構築物を、ｔＴＡおよびｐ１０−３ＣａＮ  ＤＮＡと共に、同じ初代培養調製由来の細胞内に同時トランスフェクションした。ｐ１０−３ＣａＮの代わりの空ベクターｐＵＨＤ１０−３を、コントロールとして使用した。トランスフェクション後、活性カルシニューリンでトランスフェクションされた細胞を、１００ｎＭ  ＣｓＡ含有培地またはＣｓＡを欠いた培地のどちらかで４８時間培養した。空ベクターでトランスフェクションした細胞を、同じ時間、ＣｓＡを欠いた培地中で培養した。次に、これらの心筋細胞を、これらの心臓肥大応答遺伝子の活性を分析するために溶解した。結果を図１７に示す。活性カルシニューリンにより媒介されたＡＮＦおよび骨格筋α−アクチン遺伝子の転写の活性化は、初代ラット心筋細胞においてＣｓＡによりほとんど完全に阻止された：カルシニューリンの作用によりアップレギュレートされた心筋α−アクチン遺伝子の転写の活性の約８０％が、ＣｓＡにより阻害された。
【０２１４】
（ＣｓＡ処理による肥大感受性遺伝子の転写の抑圧は可逆的である）
複合的な研究における実際的な要求のために、外因性遺伝子の発現を双方向的に調節する能力は、遺伝子機能の研究ならびに遺伝子治療において多大な有意性を有する。本発明者らの系における外因性の肥大応答遺伝子の抑圧された発現が、ＣｓＡ処理を中止することにより可逆的に制御され得るかどうかを評価するために、同一調製由来の初代心筋細胞を、ｔＴＡ、カルシニューリン構築物、および心筋α−アクチンレポータープラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクション後、全細胞を、１００ｎＭ  ＣｓＡで処理した。２４時間後、細胞の一部を、ＣｓＡ含有培地中で連続的に培養したが、細胞の別の部分を、ＣｓＡを含まない培地に変えた。種々の時間点で、これらの心筋細胞におけるレポーター遺伝子の発現を、ルシフェラーゼアッセイにより調べた。図１８に示すように、７２時間の間、ＣｓＡ処理細胞におけるレポーター遺伝子の活性は低かった。しかし、心臓遺伝子の発現は、ＣｓＡ処理を中止した後急速に上昇した。培地からＣｓＡを除去した後４８時間で（７２時間点）、心筋α−アクチンレポーター遺伝子活性は、ＣｓＡで処理した細胞における活性と比較して約２．５倍増加した。データは、ＣｓＡによる心臓遺伝子の抑圧された発現が速やかに逆転し得ることを示した。従って、上記に示したこれらの結果に基くと、使用した実験条件下では、初代心筋細胞における外因性の肥大感受性遺伝子の発現は、ポジティブな経路またはネガティブな経路のどちらかで速やかに調節され得る。
【０２１５】
（実施例５）
（培養された心筋細胞モデルにおける肥大感受性遺伝子の発現に対するＣａＭＫＩＶおよびＹＹ１の効果の特徴付け）
心筋細胞培養、心筋細胞の一過性のトランスフェクション、およびルシフェラーゼ活性測定に関する実験手順を、実施例３に記載のように行なった。心臓肥大感受性プロモーター−レポーター構築物は、実施例３に記載の通りである。
【０２１６】
（結果）
構成的に活性なＣａＭＫＩＶは、新生仔心筋細胞において心臓肥大感受性遺伝子プロモーター−レポーター活性の転写を増加する。
【０２１７】
上記記載のように、ＣａＭＫＩＶの構成的に活性な形態をコードするｃＤＮＡを、α−ＭＨＣプロモーターを含む発現ベクターに挿入した。新生仔心筋細胞を、実施例３に記載した骨格筋α−アクチン−ルシフェラーゼプラスミド、および発現プラスミド中のＣａＭＫＩＶの構成的に活性な変異形態で同時トランスフェクションした。ｐＳＧ（空ベクター）は、ネガティブコントロールとして使用した。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクション後種々の時間で測定した。結果を図１９に示す。構成的に活性な外因性ＣａＭＫＩＶの過剰発現は、コントロールより３００％以上に骨格筋α−アクチンプロモーター活性を増加した。
【０２１８】
新生仔心筋細胞における心臓α−アクチンプロモーター−レポーター構築物に対する構成的に活性な外因性ＣａＭＫＩＶの過剰発現の効果を調査した。心筋細胞を、実施例３に記載のような心筋α−アクチンプロモーター−レポーター構築物、および構成的に活性なＣａＭＫＩＶをコードする種々の量の発現プラスミドで同時トランスフェクションした。図２０に示した結果は、構成的に活性なＣａＭＫＩＶの過剰発現が、心筋α−アクチンプロモーター活性において適度の増加を生じることを示す。ピークの誘導（コントロールより約７倍）は、０．０１μｇのＣａＭＫＩＶ発現プラスミドを使用して成し遂げられ、そして０．１０μｇのＣａＭＫＩＶ発現プラスミドを使用した場合、ほぼコントロールのレベルに低下した。
【０２１９】
対照的に、類似の用量依存性研究を、骨格筋α−アクチンプロモーター−レポータープラスミドを用いて行なった場合、構成的に活性なＣａＭＫＩＶの過剰発現は、図２１に示すように、骨格筋α−アクチンプロモーター活性における実質的な増加を生じた。類似の結果が、図２２に示すように、ＡＮＦプロモーター−レポーター構築物を用いて観察された。
【０２２０】
明細書中で言及した全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が詳細にそして個々に参考として援用されるかのように、同じ程度で本明細書中で参考として援用される。
【０２２１】
上記の発明は、理解を明確にする目的のために、説明および例示によっていくらか詳細に記載されているが、特定の変更および改変が実行されることは、当業者にとって明白である。従って、説明および例示は、本発明の範囲を限定するとして解釈されるべきでなく、発明の範囲は、添付の請求の範囲によって外延を定められる。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】図１は、肥大が誘導する胚性遺伝子発現の核シグナル伝達および転写制御のモデルを示す。使用される略語は、以下のとおりである：ＶＤＣＣは、電圧依存性カルシウムチャネル；ＰＬＣは、ホスホリパーゼＣ；ＡｎｇＩＩは、アンジオテンシンＩＩ；Ｅｔ−１は、エンドセリン−１；ＤＡＧは、ジアシルグリセロール；ＰＫＣは、プロテインキナーゼＣ；ＩＰ３は、イノシトール−三リン酸；ＣＡＭは、カルモジュリン。
【図２Ａ】図２Ａは、アンジオテンシンＩＩ誘導およびフェニレフリン誘導初代心筋細胞肥大の、ＣｓＡおよびＦＫ５０６による阻害を示す。Ａ：無血清培地中の初代ラット心筋細胞を、ＡｎｇＩＩ（１０ｎＭ）またはＰＥ（１０μＭ）で７２時間刺激した。次いで、細胞を固定し、そして筋節を明らかにするために抗α−アクチニン抗体で、および核を明らかにするためにＨｏｅｃｈｓｔ染料で染色した。ＣｓＡ（５００ｎｇ／ｍｌ）をＡｎｇＩＩ添加の時点で１セットの培養物に添加した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、アンジオテンシンＩＩ誘導およびフェニレフリン誘導初代心筋細胞肥大の、ＣｓＡおよびＦＫ５０６による阻害を示す。Ｂ：無血清培地中の初代ラット心筋細胞を、ＡｎｇＩＩ（１０ｎＭ）またはＰＥ（１０μＭ）で７２時間刺激した。次いで、細胞を固定し、そして筋節を明らかにするために抗α−アクチニン抗体で、および核を明らかにするためにＨｏｅｃｈｓｔ染料で染色した。ＣｓＡ（５００ｎｇ／ｍｌ）をＡｎｇＩＩ添加の時点で１セットの培養物に添加した。
【図２Ｃ】図２Ｃは、アンジオテンシンＩＩ誘導およびフェニレフリン誘導初代心筋細胞肥大の、ＣｓＡおよびＦＫ５０６による阻害を示す。Ｃ：無血清培地中の初代ラット心筋細胞を、ＡｎｇＩＩ（１０ｎＭ）またはＰＥ（１０μＭ）で７２時間刺激した。次いで、細胞を固定し、そして筋節を明らかにするために抗α−アクチニン抗体で、および核を明らかにするためにＨｏｅｃｈｓｔ染料で染色した。ＣｓＡ（５００ｎｇ／ｍｌ）をＡｎｇＩＩ添加の時点で１セットの培養物に添加した。
【図２Ｄ】図２Ｄは、アンジオテンシンＩＩ誘導およびフェニレフリン誘導初代心筋細胞肥大の、ＣｓＡおよびＦＫ５０６による阻害を示す。Ｄ：無血清培地中の初代ラット心筋細胞を、ＡｎｇＩＩ（１０ｎＭ）またはＰＥ（１０μＭ）で７２時間刺激した。次いで、細胞を固定し、そして筋節を明らかにするために抗α−アクチニン抗体で、および核を明らかにするためにＨｏｅｃｈｓｔ染料で染色した。ＣｓＡ（５００ｎｇ／ｍｌ）をＡｎｇＩＩ添加の時点で１セットの培養物に添加した。
【図２Ｅ】図２Ｅは、アンジオテンシンＩＩ誘導およびフェニレフリン誘導初代心筋細胞肥大の、ＣｓＡおよびＦＫ５０６による阻害を示す。Ｅ：無血清培地中の初代ラット心筋細胞を、ＡｎｇＩＩ（１０ｎＭ）またはＰＥ（１０μＭ）で７２時間刺激した。次いで、細胞を固定し、そして筋節を明らかにするために抗α−アクチニン抗体で、および核を明らかにするためにＨｏｅｃｈｓｔ染料で染色した。ＣｓＡ（５００ｎｇ／ｍｌ）をＡｎｇＩＩ添加の時点で１セットの培養物に添加した。
【図２Ｆ】図２Ｆは、アンジオテンシンＩＩ誘導およびフェニレフリン誘導初代心筋細胞肥大の、ＣｓＡおよびＦＫ５０６による阻害を示す。Ｆ：無血清培地中の初代ラット心筋細胞を、ＡｎｇＩＩ（１０ｎＭ）またはＰＥ（１０μＭ）で７２時間刺激した。次いで、細胞を固定し、そして筋節を明らかにするために抗α−アクチニン抗体で、および核を明らかにするためにＨｏｅｃｈｓｔ染料で染色した。ＣｓＡ（５００ｎｇ／ｍｌ）をＡｎｇＩＩ添加の時点で１セットの培養物に添加した。
【図２Ｇ】図２Ｇは、アンジオテンシンＩＩ誘導およびフェニレフリン誘導初代心筋細胞肥大の、ＣｓＡおよびＦＫ５０６による阻害を示す。Ｇ：Ａのように、ＣｓＡの存在下または非存在下においてＡｎｇＩＩで処理した初代心筋細胞培養物から、総ＲＮＡを単離し、そしてドットブロットによりＧＡＰＤＨおよびＡＮＦ転写物の発現について分析した。
【図２Ｈ】図２Ｈは、アンジオテンシンＩＩ誘導およびフェニレフリン誘導初代心筋細胞肥大の、ＣｓＡおよびＦＫ５０６による阻害を示す。Ｈ：初代ラット心筋細胞を、ＮＦ−ＡＴコンセンサス結合部位の３つのタンデムなコピーに連結したルシフェラーゼレポーター遺伝子で一過性にトランスフェクトした。次いで、細胞を上記のようにＣｓＡの存在下または非存在下においてＡｎｇＩＩまたはＰＥで処理した。４８時間後、細胞を回収して、そしてルシフェラーゼ活性を測定した。
【図３】図３は、α−ＭＨＣカルシニューリントランスジェニックマウスの心臓の写真を示す。Ａ：コントロールおよびα−ＭＨＣ−カルシニューリントランスジェニック同腹仔を１８日齢で屠殺し、そして心臓を取り出して撮影した。Ｂ，Ｃ：Ａに示す心臓を長軸方向に切開し、心室チャンバーおよび心室内中隔を露出した。Ｄ，Ｅ：ＢおよびＣにそれぞれ示される、左心室壁の拡大図。Ｆ，Ｇ：９週齢のコントロールおよびカルシニューリントランスジェニックの心臓の横断切片をヘマトキシリンおよびエオシン染色した。Ｈ：Ｇに示されるカルシニューリントランスジェニック心臓由来の切片を、コラーゲンを明らかにするために、Ｍａｓｓｏｎトリクロームで染色した。ｃａは、冠状動脈；ｌａは、左心房；ｌｖは、左心室；ｒａは、右心房；ｒｖは、右心室。Ｂ，Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｈのバー＝１ｍｍ。Ｄ，Ｅのバー＝５０μｍ。
【図４】図４は、ＣｓＡを用いた、α−ＭＨＣ−カルシニューリンマウスの処置の結果を示す。Ａ）ＣｓＡ処置についてのレジメンを示す。Ｂ）α−ＭＨＣ−カルシニューリントランスジェニックおよび非トランスジェニックマウスを、示したように、ＣｓＡ（２５ｍｇ／ｋｇ）で処置またはそれで処置しなかった。心臓：体重の比は、表示±標準偏差である。雄性カルシニューリントランスジェニック＃３７から得られたトランスジェニック同腹仔（表１）を、実施例２に記載されるように、ＣｓＡまたはビヒクル単独で９日齢で開始して処置した。２５日齢で動物を屠殺し、そして心臓を取り出して、長軸方向に切開した。Ｃ）ヘマトキシリンおよびエオシン染色した、ビヒクル（中央パネル）またはＣｓＡ（右パネル）で処置した非トランスジェニックマウス（コントロール）およびトランスジェニックマウスの心臓切片。ｌａは、左心房；ｌｖは、左心室；ｒａは、右心房；ｒｖは、右心室。右心房をコントロールから取りだし、両方の心房をＣｓＡで処置したトランスジェニックから取り出した。バー＝２ｍｍ。
【図５】図５は、α−ＭＨＣ  ＣａＭＫＩＶトランスジェニックマウスの心臓写真を示す。コントロールおよびα−ＭＨＣ−ＣａＭＫＩＶトランスジェニック同腹仔を３週齢で屠殺して、心臓を取り出し、長軸方向に切開し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ｌａは、左心房；ｌｖは、左心室；ｒａは、右心房；ｒｖは、右心室。
【図６】図６は、ルシフェラーゼ発現を駆動するＡＮＦ、骨格筋α−アクチン、および心筋α−アクチンのプロモーターを含むプロモーター−レポーター構築物に対する、変異したＣａＭＫＩＩおよびＣａＮの効果を示す棒グラフである。心室心筋細胞の２連のディッシュをレポータープラスミドおよびＣａＭＫＩＩ（１−２９０）またはＣａＮmut（それぞれ、ＣａＭＫＩＩおよびＣａＮの構成的に活性な形態）で同時トランスフェクトした。「コントロール」は、ｃＤＮＡインサートおよびプロモーター−レポータープラスミドなしの発現ベクターで同時トランスフェクトした細胞を表す。値を、トランスフェクション効率について補正し、そして少なくとも３つの実験からの平均±標準偏差（ＳＤ）として報告する。
【図７】図７は、ＡＮＦプロモーター−レポーター活性に対する外来性ＣａＭキナーゼイソ酵素の効果を示す棒グラフである。心室心筋細胞の２連のディッシュをＡＮＦプロモーター−レポーター構築物および種々のＣａＭＫイソ形態をコードする発現構築物で同時トランスフェクトした。「コントロール」は、ｃＤＮＡインサートおよびプロモーター−レポータープラスミドなしの発現ベクターで同時トランスフェクトした細胞を表す。値を、トランスフェクション効率について補正し、そして少なくとも３つの実験からの平均±標準偏差（ＳＤ）として報告する。
【図８】図８は、ＡＮＦネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）欠失プロモーター−レポーター構築物に対して、ＰＥ、外来性ＣａＭＫＩＩまたはＣａＮの効果を示す棒グラフである。値を、トランスフェクション効率について矯正し、そして少なくとも３つの実験からの平均±標準偏差（ＳＤ）として報告する。
【図９】図９は、新生仔ラット心臓組織においてβ１アドレナリン作動性レセプターによってＣａＭＫＩＩ活性の刺激を示す棒グラフである。新生仔（１〜４日齢）心臓組織切片を単離し、そしてイソプロテレノール（ＩＳＯ、１００μＭ）、ドルブタミン（ｄｏｌｂｕｔａｍｉｎｅ）（ＤＯＢ、１０μＭ）、またはビヒクル単独（コントロール）で処置した。プロパノール（ＰＲＯＰ、２０μＭ）をアゴニストを添加する２分前に、添加した。処置の３０秒後、自律性ＣａＭＫＩＩ活性をアッセイした。データを、カルシウム非依存性活性を全活性で除した比の割合として示し、そして少なくとも３つの実験からの平均±ＳＤとして表した。
【図１０】図１０は、ＡＮＦ、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンについてのプロモーター−レポーター活性に対するアドレナリンレセプターアゴニストの効果ならびにＤＯＢおよびＡＮＦメッセージレベルの経時的効果を示すデータを示す。図１０Ａ、Ｂ、およびＣは、それぞれ、ＡＮＦ、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンの、心室心筋細胞へのトランスフェクションならびにトランスフェクションの２４時間後のＰＥ（１００μＭ）、ＤＯＢ（１０μＭ）、またはＴＧＦ−β１（１ｎｇ／ｍｌ）での処置後のルシフェラーゼレポーターレベルを示す棒グラフである。値を、トランスフェクション効率について補正し、そして少なくとも３つの実験からの平均±標準偏差（ＳＤ）として報告する。図１０Ｄは、心室心筋細胞を無血清培地に変更した。ＤＯＢを、種々の時点で培地に添加した。「コントロール」は、ＤＯＢビヒクルで処置した細胞を表す。インキュベートして２４時間後、総ＲＮＡを抽出し、そしてノザンブロットで分析した。結果は、各時点についてｎ＝３以上の代表である。
【図１１】図１１は、初代ラット心筋細胞におけるｔＴＡ−依存性標的遺伝子発現の調節を示す。心筋細胞を、ｔＴＡ発現プラスミドｐＵＨＤ１５−１およびｔＴＡ−依存性ルシフェラーゼ構築物ｐＵＨＣ１３−３またはコントロールとして空ベクターのいずれかで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後、細胞をドキシサイクリン（ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ）（ＤＯＸ）なしの培地またはドキシサイクリン含有培地中のいずれかでインキュベートした。図１１Ａは、標的遺伝子転写の経時的変化を示す。白丸は、空ベクター、ＤＯＸなし；黒丸は、空ベクターおよびＤＯＸ；白三角は、ｐＵＨＣ１３−３、ＤＯＸなし；黒三角は、ｐＵＨＣ１３−３およびＤＯＸ。図１１Ｂは、ｔＴＡが標的遺伝子の転写を刺激する能力およびトランスフェクションの１２時間後のドキシサイクリンの阻害効果を示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、心筋細胞の心臓肥大感受性遺伝子の転写の用量依存性を示すグラフである。０．２５μｇのｔＴＡ発現構築物ｐＵＨＤ１５−１、０．２５μｇの心筋α−アクチンプロモーター−レポータープラスミドＣａｒｄＡ−Ｌｕｃ、および種々の量のｔＴＡ依存性ＣａＮ発現構築物ｐ１０−３ＣａＮを細胞に同時トランスフェクトした。データは、６つの独立した実験の代表である。値を平均±ＳＥ；ｎ＝３培養物として報告する。
【図１３】図１３は、心筋細胞において外来性活性ＣａＮによって誘導された心臓肥大応答遺伝子の転写の経時的変化を示すグラフを示す。データを正規化し、そして最大応答の割合として表す。データは、３つの独立した実験の代表である。値を平均±ＳＥ；ｎ＝３培養物として報告する。
【図１４】図１４は、心筋細胞における肥大感受性遺伝子の転写に対する活性化されたＣａＮの効果を示す棒グラフを示す。データは、３つの独立した実験の代表である。値を平均±ＳＥ；ｎ＝３培養物として報告する。
【図１５】図１５は、心臓肥大応答遺伝子転写のＣａＮ誘導の、ＣｓＡによる阻害を示すグラフである。心筋細胞をｐＵＨＤ１５−１、ＣａｒｄＡ−Ｌｕｃ、およびｐ１０−３ＣａＮまたは空ベクターのいずれかで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を５０ｎＭ、１００ｎＭ、または１５０ｎＭ  ＣｓＡで処理した。処理の２４時間、４８時間、および７２時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【図１６】図１６は、ＣｓＡが、心臓肥大感受性遺伝子の転写のＣａＮ誘導を阻害することを経時的に示すグラフである。値を平均±ＳＥ；ｎ＝３培養物として報告する。
【図１７】図１７は、心筋細胞におけるＣａＮによる心臓肥大感受性遺伝子の転写活性化に対するＣｓＡ処置の効果を示す棒グラフである。値を平均±ＳＥ；ｎ＝３培養物として報告する。
【図１８】図１８は、心臓肥大応答遺伝子発現のＣｓＡによる転写抑制の、可逆性調節を示すグラフである。値を平均±ＳＥ；ｎ＝３培養物として報告する。
【図１９】図１９は、ラット新生仔心筋細胞において骨格筋α−アクチンプロモーター−レポーター活性に対する、構成的に活性なＣａＭＫＩＶの時間依存性応答を示すグラフである。
【図２０】図２０は、ラット新生仔心筋細胞において心筋α−アクチンプロモーター−レポーター活性に対する、構成的に活性なＣａＭＫＩＶの用量依存性応答を示すグラフである。
【図２１】図２１は、ラット新生仔心筋細胞において骨格筋α−アクチンプロモーター−レポーター活性に対する、構成的に活性なＣａＭＫＩＶの用量依存性応答を示すグラフである。
【図２２】図２２は、ラット新生仔心筋細胞においてＡＮＦプロモーター−レポーター活性に対する、構成的に活性なＣａＭＫＩＶの用量依存性応答を示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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