(57)【要約】【課題】極めて高感度で蛍光検出可能な表面プラズモン増強蛍光センサを得る。【解決手段】所定波長の励起光８を発する光源７と、励起光８を透過させる材料から形成された誘電体ブロック１３と、この誘電体ブロック１３の一表面１３ａに形成された金属膜２０と、疎水性材料からなり前記金属膜２０の上に形成された、膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にある不撓性膜３１と、この不撓性膜３１に試料１が接するように該試料１を保持する試料保持部５と、励起光８を、誘電体ブロック１３と金属膜２０との界面に向けて、全反射条件を満たすように誘電体ブロック１３を通して入射させる入射光学系７と、前記界面に励起光８が入射したとき、該界面から染み出すエバネッセント波１１に励起されて、試料１中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段９とから蛍光センサを構成する。【選択図】図１
2008102117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定波長の励起光を発する光源と、
前記励起光を透過させる材料から形成された誘電体ブロックと、
この誘電体ブロックの一表面に形成された金属膜と、
疎水性材料からなり前記金属膜の上に形成された、膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にある不撓性膜と、
この不撓性膜に試料が接するように該試料を保持する試料保持部と、
前記励起光を、前記誘電体ブロックと金属膜との界面に向けて、全反射条件を満たすように誘電体ブロックを通して入射させる入射光学系と、
前記界面に前記励起光が入射したとき、該界面から染み出すエバネッセント波に励起されて、前記試料中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段とからなることを特徴とする表面プラズモン増強蛍光センサ。
【請求項２】
前記不撓性膜がポリマーからなるものであることを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン増強蛍光センサ。
【請求項３】
前記ポリマーからなる不撓性膜の上に、特定物質と結合する親水性リンカーが形成されていることを特徴とする請求項２記載の表面プラズモン増強蛍光センサ。
【請求項４】
前記不撓性膜の上に、特定物質と結合するキャプチャ分子が固定化されていることを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の表面プラズモン増強蛍光センサ。
【請求項５】
前記キャプチャ分子が、生体内のセカンドメッセンジャーと結合するものであることを特徴とする請求項４記載の表面プラズモン増強蛍光センサ。
【請求項６】
前記キャプチャ分子と直接結合する物質と前記エバネッセント波によって励起され得る蛍光成分とが、一体化されてなる標識化特定物質を、試料中に含ませるためのキットとして備えていることを特徴とする請求項４または５記載の表面プラズモン増強蛍光センサ。
【請求項７】
請求項４から６いずれか１項記載の表面プラズモン増強蛍光センサを用いる蛍光検出方法であって、前記キャプチャ分子と直接結合する物質と、前記エバネッセント波によって励起され得る蛍光成分とが一体化されてなる標識化特定物質を試料中に含ませた上で、前記蛍光の検出を行うことを特徴とする蛍光検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光法により試料中の特定物質を検出する蛍光センサ、特に詳細には表面プラズモン増強を行う蛍光センサに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光法が広く用いられている。この蛍光法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する検出対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって検出対象物質の存在を確認する方法である。また、検出対象物質が蛍光体ではない場合、蛍光体で標識されて検出対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００３】
図３は、上記の標識された物質を用いる蛍光法を実施するセンサの一例を概略表示するものである。本例の蛍光センサは一例として試料１に含まれる抗原２を検出するためのものであり、基板３には抗原２と特異的に結合する１次抗体４が塗布されている。そしてこの基板３上に設けられた試料保持部５の中において試料１が流され、次いで同様に蛍光体１０で標識されて抗原２と特異的に結合する２次抗体６が流される。その後、基板３の表面部分に向けて光源７から励起光８が照射され、また光検出器９により蛍光検出がなされる。このとき、光検出器９によって所定の蛍光が検出されたなら、上記２次抗体６と抗原２との結合、すなわち試料中における抗原２の存在を確認できることになる。
【０００４】
なお以上の例では、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは２次抗体６であるが、この２次抗体６は抗原２と結合しなければ流されてしまって基板３上に存在し得ないものであるから、この２次抗体６の存在を確認することにより、間接的に検出対象物質である抗原２の存在が確認されることとなる。
【０００５】
とりわけここ数年は、冷却ＣＣＤの発達など光検出器の高性能化が進んでいることもあって、以上述べた蛍光法はバイオ研究には欠かせない道具となっており、さらにバイオ以外の分野においても広範に利用されている。
【０００６】
しかしながら、図３に示したような従来の蛍光表面プラズモン増強蛍光センサでは、基板と試料との界面における励起光の反射／散乱光や、検出対象物質以外の不純物／浮遊物Ｍ等による散乱光がノイズとなるため、せっかく光検出器を高性能化しても蛍光検出におけるＳ／Ｎは向上しないのが実情であった。
【０００７】
これに対する解決法として、例えば非特許文献１に示されるようなエバネッセント蛍光法、つまりエバネッセント波を用いる蛍光法が提案されている。この蛍光法を実施する蛍光センサの一例を図４に概略的に示す。なおこの図４において、図３中の要素と同等の要素には同番号を付し、それらについての説明は特に必要のない限り省略する（以下、同様）。
【０００８】
この蛍光センサにおいては、前述の基板３に代わるものとしてプリズム（誘電体ブロック）１３が用いられ、そして光源７からの励起光８は、このプリズム１３と試料１との界面で全反射する条件で、プリズム１３を通して照射される。この構成においては、励起光８が上記界面で全反射するとき該界面近傍に染み出すエバネッセント波１１により２次抗体６が励起される。そして蛍光検出は、試料１に対してプリズム１３と反対側（図中では上方）に配された光検出器９によってなされる。
【０００９】
この蛍光センサにおいて、励起光８は図中の下方に全反射するので、上方からの蛍光検出において、励起光検出成分が蛍光検出信号に対するバック・グラウンドとなってしまうことがない。またエバネッセント波１１は上記界面から数百ｎｍの領域にしか到達しないので、試料中の不純物／浮遊物Ｍからの散乱を殆ど無くすことができる。そのため、このエバネッセント蛍光法は、従来の蛍光法と比べて（光）ノイズを大幅に低減でき、検出対象物質を１分子単位で蛍光測定できる方法として注目されている。
【００１０】
また、さらに高感度で蛍光測定できるセンサとして、図５に示すような表面プラズモン増強蛍光センサも知られている。この表面プラズモン増強蛍光センサは、例えば特許文献１に記載が有るもので、図４の蛍光センサと比べると基本的に、プリズム１３の上に金属膜２０が形成されている点が異なる。すなわち、このような金属膜２０が形成されていることにより、励起光８が照射されたとき該金属膜２０中に表面プラズモンが生じ、その電場増幅作用によって蛍光が増幅されるようになる。あるシミュレーションによると、その場合の蛍光強度は１０００倍程度まで増幅されることも判っている。
【００１１】
しかし、上述のような表面プラズモン増強蛍光センサにおいては、非特許文献２に示されているように、試料中の蛍光体と金属膜とが接近し過ぎていると、蛍光体内で励起されたエネルギーが蛍光を発生させる前に金属膜へ遷移してしまい、蛍光が生じないという現象（いわゆる金属消光）が起こり得る。
【００１２】
この金属消光に対処するために非特許文献２には、金属膜の上にＳＡＭ（自己組織化膜）を形成し、それにより試料中の蛍光体と金属膜とを該ＳＡＭの厚さ以上離間させることが提案されている。なお図５でも、このＳＡＭに番号２１を付けて示してある。また非特許文献３では、この金属消光に関連して、表面プラズモンにより増強された蛍光強度の、金属膜からの距離に対する依存性が検討されている。
【特許文献１】特許第３５６２９１２号公報
【非特許文献１】「バイオイメージングでここまで理解る」p.104-113  楠見明弘他著  羊土社
【非特許文献２】W.Knoll他、Analytical Chemistry（Anal.Chem.）75(2003)  p.2610
【非特許文献３】W.Knoll他、Colloids and Surfaces. A.（Colloids Surf.A）,171(2000) p.115
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、上記ＳＡＭを設けた表面プラズモン増強蛍光センサで実際に蛍光検出を行ってみると、蛍光検出の感度は、ＳＡＭを設けない場合と比較してさほど大きく改善され得ないことが判った。
【００１４】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、極めて高い感度で蛍光検出することができる表面プラズモン増強蛍光センサを提供することを目的とする。
【００１５】
また本発明は、上述のような表面プラズモン増強蛍光センサを用いて、極めて高い感度で蛍光を検出することができる蛍光検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明による表面プラズモン増強蛍光センサは、先に述べたＳＡＭに代えて不撓性膜を設けることにより所期の目的を達成可能としたものであり、より具体的には、
所定波長の励起光を発する光源と、
前記励起光を透過させる材料から形成された誘電体ブロックと、
この誘電体ブロックの一表面に形成された金属膜と、
疎水性材料からなり前記金属膜の上に形成された、膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にある不撓性膜と、
この不撓性膜に試料が接するように該試料を保持する試料保持部と、
前記励起光を、前記誘電体ブロックと金属膜との界面に向けて、全反射条件を満たすように誘電体ブロックを通して入射させる入射光学系と、
前記界面に前記励起光が入射したとき、該界面から染み出すエバネッセント波に励起されて、前記試料中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段とからなることを特徴とするものである。
【００１７】
なお上述の不撓性膜としては、ポリマーからなるものが好適に用いられる。また、このポリマーからなる不撓性膜が適用される場合は、その不撓性膜の上に、特定物質と結合する親水性リンカーが形成されることが望ましい。
【００１８】
また、本発明による表面プラズモン増強蛍光センサにおいては、前記不撓性膜の上に、特定物質と結合するキャプチャ分子が固定化されていることが望ましい。そしてそのようなキャプチャ分子は、生体内のセカンドメッセンジャーと結合するものであることが望ましい。セカンドメッセンジャーとは、レセプターにリガンド(アゴニスト)が結合することで細胞外からの刺激が細胞内情報伝達系を通して細胞内に伝わる際に、レセプターの近傍でリガンドの結合を感知し細胞内シグナルを伝達するきっかけとなる物質である。例えばｃＡＭＰ、イノシトールリン酸などを挙げることができ、より好ましくはｃＡＭＰが選択される。
【００１９】
また本発明による表面プラズモン増強蛍光センサは、前記キャプチャ分子と直接結合する物質（例えば上記セカンドメッセンジャー等）と、前記エバネッセント波によって励起され得る蛍光成分とが一体化されてなる標識化特定物質を、試料中に含ませるためのキットとして備えていることが好ましい。
【００２０】
他方、本発明による蛍光検出方法は、上述したように特定物質と結合するキャプチャ分子が不撓性膜の上に固定化されている表面プラズモン増強蛍光センサを用いる蛍光検出方法において、前記キャプチャ分子と直接結合する物質（例えば上記セカンドメッセンジャー等）と、前記エバネッセント波によって励起され得る蛍光成分とが一体化されてなる標識化特定物質を試料中に含ませた上で、蛍光検出を行うことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明者の研究によると、前述のＳＡＭを設けた従来の表面プラズモン増強蛍光センサにおいて、蛍光検出の感度がさほど改善されないのは、このＳＡＭがいわゆる「ふわふわ」したものであることからその厚さが容易に変動し、そこで試料液中の蛍光体が金属膜に対して、金属消光が起きる程度まで近接してしまうことが有るためであることが判明した。
【００２２】
さらに、このＳＡＭを設けた従来の表面プラズモン増強蛍光センサにおいて、蛍光検出の感度がさほど改善されないのは、このＳＡＭがいわゆる「すかすか」したものであることから、試料液中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる分子が該ＳＡＭの内部にまで入り込み、それらの分子が励起光の励起エネルギーを奪ってしまうことが有るためであることも判明した。
【００２３】
本発明による表面プラズモン増強蛍光センサでは、上記の新しい知見に鑑みて、金属膜の上に膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にある不撓性膜が設けられているので、試料液中の蛍光体が金属膜に対して、金属消光が起きる程度まで近接してしまうことが防止される。そこでこのセンサによれば、上述のような金属消光を招くことがなくなり、表面プラズモンによる電場増幅作用を確実に得て、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。
【００２４】
また本発明による表面プラズモン増強蛍光センサでは、上記の新しい知見に鑑みて、不撓性膜が疎水性材料から形成されているので、試料液中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる分子が該不撓性膜の内部にまで入り込むことが無く、よってそれらの分子が励起光の励起エネルギーを奪ってしまうことが防止される。そこで本発明による表面プラズモン増強蛍光センサによれば、極めて高い励起エネルギーが確保され、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。
【００２５】
なお、上記の「不撓性」とは、センサを普通に使用しているうちに膜厚が変わってしまうほどに変形することが無い程度の剛性を備えていることを意味するものとする。
【００２６】
また、上記膜厚の下限値および上限値をそれぞれ１０ｎｍ、１００ｎｍと規定したのは、以下の理由による。金属の近傍に存在する蛍光体分子は、金属へのエネルギー移動により消光を起こす。エネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。そして前述した非特許文献３にも述べられているように、金属膜の場合は、金属と蛍光分子との間の距離は少なくとも 数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。それにより、本発明では薄膜の下限値を１０ｎｍとする。
【００２７】
一方、蛍光体分子は、表面プラズモンによって増強された、金属膜表面に染み出したエバネッセント波によって励起される。エバネッセント波の到達範囲（金属膜表面からの距離）は高々波長程度であり、その電界強度は金属膜表面からの距離に応じて指数関数的に急激に減衰することが知られている。実際、波長６３５ｎｍの可視光について両者の関係を計算によって求めると、図６に示すようなものとなる。同図から判るように、エバネッセント波の染み出しが生じているのは、波長（６３５ｎｍ）程度であり、１００ｎｍを超えるとその電界強度が急激に減衰する。蛍光体分子を励起する電界強度は大きいほど望ましいので、効果的な励起を行なうためには、金属膜表面と蛍光体分子との距離を１００ｎｍより小さくすることが望ましい。それにより、本発明では薄膜の上限値を１００ｎｍとする。
【００２８】
ここで、上述のような特性を備える不撓性膜の好ましい材料としてはポリマーが挙げられるが、ポリマーには、多くの場合試料液中に含まれるタンパク等が容易に非特異吸着しやすくなっている。そうであると、例えば該不撓性膜の表面に塗布した抗体に特異吸着する抗原を蛍光法によって検出するような場合、この特異吸着が生じたのと同様の状態となるので、それが誤検出を招くことになる。
【００２９】
そこで、本発明の表面プラズモン増強蛍光センサにおいて特にポリマーからなる不撓性膜が適用される場合、その不撓性膜の上に親水性リンカーが形成されていれば、そのリンカーが上記タンパク等を遮断するので、該タンパク等が不撓性膜に非特異吸着することがなくなり、上述のような誤検出が防止される。他方、本来不撓性膜の表面部分に配置すべき抗体等は、そのリンカーと特異的に結合させて、不撓性膜の表面部分に捉えることができる。
【００３０】
また、不撓性膜の好ましい材料としてより詳しくは、疎水性高分子、無機酸化物を含む膜を挙げることができる。
【００３１】
本発明に使用可能な疎水性高分子は、水に対する溶解度が２０重量％以下であるモノマーを５０重量％以上含むことが好ましい。
【００３２】
疎水性高分子を形成するモノマーの２５℃の水に対する溶解度は、「新実験化学講座基本操作１」（丸善化学、１９７５）に記載されている方法で測定することができる。この方法で測定すると上記本発明におけるモノマーの２０℃の水に対する溶解度は、例えば２−エチルヘキシルメタクリレートで０．００重量％、スチレンで０．０３重量％、メチルメタクリレートで１．３５重量％、ブチルアクリレートで０．３２重量％、ブチルメタクリレートで０．０３重量％である。本発明における疎水性高分子膜の水に対する溶解度の指標としては、１０重量％以下であることがより好ましく、１重量％以下であることが更に好ましい。
【００３３】
本発明で用いられる水に対する溶解度が２０重量％以下であるモノマーの具体例としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができ、スチレン、メタクリル酸メチル、メタクリル酸ヘキサフルオロプロパン、酢酸ビニル、アクリロニトリルなどが好ましく用いられる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００３４】
本発明では、前述の水に対する溶解度が２０重量％以下であるモノマーと共に、水に対する溶解度が２０重量％以上であるモノマーを共重合した高分子化合物を併用してもよい。水に対する溶解度が２０重量％以上であるモノマーの具体例としては、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸、アクリル酸、アリルアルコール等が挙げられる。
【００３５】
本発明において疎水性高分子としては、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリエステル、ポリスチレンがより好ましい。そうすることによって、膜形成が容易になりかつ表面に生理活性物質を固定化するための官能基を露出させることも容易になる。例えばポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリエステルで形成された膜は表面を酸や塩基で加水分解することによって表面にカルボキシル基とヒドロキシル基を露出することが容易であり、またポリスチレンで形成された膜はUV／オゾン処理などの酸化処理施すことによってカルボキシル基を露出させることが容易である。
【００３６】
本発明に使用可能な無機酸化物としては、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、フェライト及びその複合材料や誘導体を選択することができる。成膜方法としては常法によって行うことができ、例えばゾルゲル法、スパッタ法、蒸着法、めっき法などの手法を採用することができる。
【００３７】
一方、本発明による表面プラズモン増強蛍光センサにおいて、特に不撓性膜の上に、生体内のセカンドメッセンジャー等の特定物質と結合するキャプチャ分子が固定化されている場合は、いわゆる「競合形式」の蛍光検出を好適に採用可能となる。この競合形式の蛍光検出を採用すれば、表面プラズモン増強により高感度で蛍光検出可能であることから、二種のキャプチャ分子を用いる「サンドイッチ形式」の蛍光検出では困難とされていたＢ／Ｆ分離（バウンド／フリー分離)の不要化と高感度化の両立を実現できるようになる。Ｂ／Ｆ分離を不要にできれば、競合形式の検出方法においてしばしば生じる洗浄ムラによる感度の低下を防止可能となる。
【００３８】
なお上記キャプチャ分子は、特定の物質に対して結合する分子であれば、特に限定されるものではない。例えば抗体やその断片、核酸からなるアダプター、包摂化合物やモリキュラーインプリンティングで構築される鋳型分子などを挙げることができる。キャプチャ分子の特定物質との結合性を示す指標として解離平衡定数（Ｋｄ）があるが、本発明においては、Ｋｄが好ましくは１０-5以下、さらに好ましくは１０-6以下、さらに好ましくは１０-7以下、さらに好ましくは１０-8以下のキャプチャ分子が選択される。また、特定分子には結合性を示すが他の物質に対しては結合性を示さない、特異性を有するキャプチャ分子を選択使用することが望ましい。
【００３９】
特にこのキャプチャ分子が、生体内のセカンドメッセンジャーと結合するものである場合には、セカンドメッセンジャー量を測定することでリガンドによるレセプターの活性化、または阻害を検出および/または定量することができる。この場合も、表面プラズモン増強により、セカンドメッセンジャーを高感度に検出および／または定量することが可能となる。
【００４０】
そして、本発明による表面プラズモン増強蛍光センサが、特にキャプチャ分子と直接結合する物質（例えば上記セカンドメッセンジャー等）と、エバネッセント波によって励起され得る蛍光成分とが一体化されてなる標識化特定物質を、試料中に含ませるためのキットとして備えている場合は、該キットを用いることにより試料中に簡便に標識化特定物質を存在させることができるので、上記競合形式の蛍光検出を極めて容易に行えるようになる。
【００４１】
一方、本発明による蛍光検出方法は、キャプチャ分子と直接結合する前記セカンドメッセンジャー等の物質と、エバネッセント波によって励起され得る蛍光成分とが一体化されてなる標識化特定物質を試料中に含ませた上で蛍光検出を行うようにしたので、検出対象の物質と標識化特定物質を競合的にキャプチャ分子と結合させてその標識化特定物質を検出する、競合形式の検出方法を実施することができる。その場合も表面プラズモン増強効果が得られるから、サンドイッチ形式の検出方法では通常行うことが非常に困難である低分子化合物の検出および/または定量も、容易に実施可能となる。
【００４２】
なお、上述のような標識化特定物質は予め試料中に存在させてもよく、あるいは試料をキャプチャ分子と接触させて所定時間経過してから試料中に混合させてもよく、さらには、標識化特定物質をキャプチャ分子と接触させて所定時間経過してからそれらと試料とを混合するようにしてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００４４】
図１は、本発明の第１の実施形態による表面プラズモン増強蛍光センサ（以下、単に蛍光センサという）を示す概略側面図である。図示の通りこの蛍光センサは、例えば波長６３５ｎｍ の励起光８を発する半導体レーザ等の光源７と、上記励起光８を透過させる材料からなり、この励起光８が一端面から入射する位置に配されたプリズム（誘電体ブロック）１３と、このプリズム１３の一表面１３ａに形成された金属膜２０と、この金属膜２０の上に形成されたポリマーからなる不撓性膜３１と、プリズム１３と反対側から不撓性膜３１に液体状試料１が接するように該試料１を保持する試料保持部５と、この試料保持部５の上方に配された光検出器（蛍光検出手段）９とを備えてなるものである。
【００４５】
なお本実施形態では光源７が、励起光８を、プリズム１３と金属膜２０との界面に向けて、全反射条件を満たすようにプリズム１３を通して入射させるように配置されている。つまりこの光源７自体が、プリズム１３に対して励起光８を上述のように入射させる入射光学系を構成している。しかしこのような構成に限らず、励起光８を上述のように入射させるレンズやミラーなどからなる入射光学系を、光源７とは別途設けるようにしても構わない。
【００４６】
上記プリズム１３は一例として、日本ゼオン株式会社製  ZEONEX（登録商標） 330Ｒ（屈折率1.50）からなるものである。一方金属膜２０は、プリズム１３の一表面１３ａ上に金をスパッタして形成されたものであり、膜厚は５０ｎｍとされている。また不撓性膜３１は、金属膜２０の上に屈折率1.59のポリスチレン系ポリマーをスピンコートして形成されたものであり、膜厚は２０ｎｍとされている。
【００４７】
なお、プリズム１３は上記材料の他、公知の樹脂や光学ガラスを用いて適宜形成することができる。コストの点からは、光学ガラスよりも樹脂の方がより好ましいと言える。樹脂から形成する場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネイト（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を好適に用いることができる。
【００４８】
光検出器９としては、例えば富士フイルム株式会社製  LAS-1000（商品名）が用いられている。
【００４９】
この蛍光センサが検出対象としているのは、一例としてCRP抗原２（分子量11万 Da）であり、それと特異的に結合する１次抗体（モノクロナール抗体）４が上記不撓性膜３１の上に固定されている。この１次抗体４は、例えば末端をカルボキシル基化したPEGを介して、アミンカップリング法により、上記ポリマーからなる不撓性膜３１に固定される。一方、２次抗体６としては、蛍光体（Cy5色素）１０で標識化したモノクロナール抗体（１次抗体４とはエピトープ ＜epitope;抗原決定基＞が異なる）が用いられる。
【００５０】
上記アミンカップリング法は一例として下記（１）〜（３）のステップからなるものである。なおこれは、30μｌ（マイクロ・リットル）のキュベット／セルを用いた場合の例である。
【００５１】
（１）リンカー先端（末端）の-COOH基を活性化
０.１Ｍ（モル）のNHSと０.４ＭのEDCとを等体積混合した溶液を30μｌ加え、３０分間室温静置
NHS：N-hydrooxysuccinimide
EDC：1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
である。
（２）1次抗体４の固定化
PBSバッフア（pH7.4）で5回洗浄後、1次抗体溶液（500μg/ｍｌ）を30μｌ加え、３０〜６０分間室温静置
（３）未反応の-COOH基をブロッキング
PBSバッフア（pH7.4）で5回洗浄後、１Ｍのエタノールアミン（pH8.5）を30μｌ加え、20分間室温静置。さらにPBSバッフア（pH7.4）で5回洗浄。
【００５２】
一方、光源７としては上記半導体レーザに限らず、その他の公知の光源を適宜選択使用可能である。また光検出器９も上述のものに限らず、CCD、PD（フォトダイオード）、光電子増倍管、c-MOS等の公知のものを適宜選択使用可能である。また励起波長を変えれば、Cy5以外の色素を標識として用いることもできる。
【００５３】
以下、この蛍光センサの作用について、一例として試料１に含まれるCRP抗原２を検出する場合について説明する。なおここで説明する方法は、CRP抗原２を２つの抗体の間に挟む形で検出する、いわゆる「サンドイッチ形式」の検出方法である。まず試料保持部５の中において液体状の試料１が流され、次いで同様に蛍光体１０で標識されてCRP抗原２と特異的に結合する２次抗体６が流される。なお上記Cy5色素は、波長６３５ｎｍの励起光８により励起されて、所定波長の蛍光を発するものである。
【００５４】
その後、プリズム１３に向けて光源７から励起光８が照射され、そして光検出器９により蛍光検出がなされる。このとき、プリズム１３と金属膜２０との界面からエバネッセント波１１が染み出すようになる。そこで、もし１次抗体４にCRP抗原２が結合していれば、さらに該抗原２に２次抗体６が結合し、その２次抗体６の標識である蛍光体１０がエバネッセント波１１によって励起されることとなる。励起された蛍光体１０は所定波長の蛍光を発し、その蛍光は光検出器９によって検出される。こうして、光検出器９が所定波長の蛍光を検出した場合は、それにより、CRP抗原２に２次抗体６が結合していること、すなわち試料１にCRP抗原２が含まれていることを確認可能となる。
【００５５】
なお上記エバネッセント波１１は、プリズム１３と金属膜２０との界面から数百ｎｍ程度の領域にしか到達しない。そこで、試料１中の不純物／浮遊物からの散乱を略皆無とすることができる。それに加えてこの蛍光センサにおいて、プリズム１３中の不純物Ｎ等で散乱した光（これは通常の伝搬光である）は金属膜２０で遮断され、光検出器９に到達することがない。以上によりこの蛍光センサにおいては、光ノイズを殆ど皆無までに低減することができ、極めて高Ｓ／Ｎの蛍光検出が可能となる。
【００５６】
そして本実施形態の蛍光センサにおいては、プリズム１３の一表面１３ａに金属膜２０が形成されているので、ここで表面プラズモンが励起される。そこでこの表面プラズモンの電場増幅作用によって上記蛍光が増幅されて、より一層高Ｓ／Ｎの蛍光検出が可能となる。
【００５７】
また本実施形態の蛍光センサにおいては、金属膜２０の上に膜厚が２０ｎｍの不撓性膜３１が設けられているので、試料１中の蛍光体１０が金属膜２０に対して、金属消光が起きる程度まで近接してしまうことが防止される。そこでこの蛍光センサによれば、上述のような金属消光を招くことがなくなり、表面プラズモンによる電場増幅作用を確実に得て、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。
【００５８】
そして上記不撓性膜３１は疎水性材料であるポリスチレン系ポリマーから形成されているので、液体状の試料１中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる分子が該不撓性膜３１の内部に入り込むことが無く、よってそれらの分子が励起光８の励起エネルギーを奪ってしまうことが防止される。そこでこの蛍光センサによれば、極めて高い励起エネルギーが確保され、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。
【００５９】
なお、この蛍光センサにおいて、CRP抗原２と結合しないで不撓性膜３１の表面から離れている２次抗体６は、そこまでエバネッセント波１１が届かないので蛍光を発することがない。そこで、試料１中でそのような２次抗体６が浮遊していても測定上問題が無いので、測定毎に洗浄つまりＢ／Ｆ分離（バウンド／フリー分離）を行う必要もない。
【００６０】
次に図２を参照して、本発明の第２の実施形態による蛍光センサについて説明する。本実施形態の蛍光センサは、図１に示したものと比較すると基本的に、不撓性膜３１の上に親水性リンカー３２が結合されている点が異なるものである。
【００６１】
前述のように作用するポリスチレン系ポリマーからなる不撓性膜３１には、２次抗体６や抗原２が容易に非特異吸着しやすくなっている。そうであると、抗体４および６と抗原２との間の特異吸着が生じたのと同様の状態となるので、それが抗原２の誤検出を招くことになる。
【００６２】
しかし本実施形態の蛍光センサにおいては、不撓性膜３１の上に、１次抗体４と結合する親水性リンカー３２が形成されて、そのリンカー３２が２次抗体６や抗原２を遮断するので、それらが不撓性膜３１に非特異吸着することがなくなり、上述のような誤検出が防止される。他方、本来不撓性膜３１の表面部分に配置すべき１次抗体４は、リンカー３２と特異吸着させて、不撓性膜３１の表面部分に捉えることができる。
【００６３】
下に示す表１は、上記第２実施形態の蛍光センサと、従来の蛍光センサの検出限界を比較して示すものである。そこにおけるＡ、Ｂ、ＣおよびＤの部分が、それぞれ図１の基本構成を有する従来装置、ELISA法による従来装置、図４の基本構成を有する従来装置、第２実施形態の蛍光センサの検出限界を示している。なおELISA法とは、酵素反応を利用して蛍光体数（色素数）を増やすことにより、蛍光検出信号を増幅するようにした従来公知の方法である。
【００６４】
また検出限界を求めるに当たっては、５０ｐＭ（ピコ・モル）、５ｐＭ、５００ｆＭ（フェムト・モル）、５０ｆＭ、５ｆＭ、５００ａＭ（アト・モル）、５０ａＭの各クラスについて前記CRP抗原２の検出を行い、検出できた最小のモル数を以て検出限界を表すようにした。ここに示される通り、本発明の表面プラズモン増強蛍光センサによれば、従来装置と比べて、２桁〜４桁程度も高感度の蛍光検出が可能となっている。
【表１】
2008102117.tif 000003
【００６５】
他方、環境、特に温度の変動に対する安定性を高める上では、不撓性膜３１とプリズム１３は互いに熱膨張係数が近い方が好ましい。つまり、それら両者の熱膨張係数が大きくかけ離れていると、温度変動が生じた際に両者の剥離や密着度の低下等の問題を招きやすい。具体的には、それら両者の線（熱）膨張係数の差が３５×１０-6以内の範囲にあることが望ましい。なお、不撓性膜３１とプリズム１３との間には金属膜２０が存在しているが、この金属膜２０は温度変動が有ったとき、上下の不撓性膜３１およびプリズム１３に追随して伸縮するので、結局、不撓性膜３１とプリズム１３の熱膨張係数が近い方が好ましいことに変わりは無い。以上の点を考慮すると、不撓性膜３１をポリマーから形成する場合、プリズム１３の材料として一般には、ガラスより樹脂を選択する方がより好ましいと言える。
【００６６】
下の表２は、プリズム１３および不撓性膜３１の材料として用いられ得る主要な物質、並びに比較のための水および金の線（熱）膨張係数を示すものである。これらの物質の中から、上述のように、線（熱）膨張係数の差が３５×１０-6以内の範囲にあるものどうしを選択して、プリズム１３および不撓性膜３１を形成することが望ましい。
【表２】
2008102117.tif 000004
【００６７】
次に図７を参照して、本発明の第３の実施形態による蛍光センサについて説明する。本実施形態の蛍光センサは、図１に示したものと比較すると基本的に、抗体などのキャプチャ分子と直接結合する物質と前記エバネッセント波によって励起され得る蛍光成分とが、一体化されてなる標識化特定物質（例えば蛍光物質結合抗原）を試料中に含んでいる点が異なるものである。
【００６８】
本実施形態の蛍光センサを用いて試料１に含まれる物質の検出および／または定量を行う場合は、いわゆる競合形式の蛍光検出がなされる。以下、その蛍光検出について説明する。本実施形態では一例として、生体内に存在するセカンドメッセンジャー４１が検出対象とされ、キャプチャ分子４０はそのセカンドメッセンジャー４１と直接結合するものが適用されている。
【００６９】
また蛍光検出に先行して試料１の中には、前述したような蛍光体１０とセカンドメッセンジャー４１とが一体化されてなる標識化特定物質が含ませられる。なお、このような標識化特定物質は予め試料１中に存在させてもよく、あるいは試料１をキャプチャ分子４０と接触させて所定時間経過してから試料１中に混合させてもよく、さらには、標識化特定物質をキャプチャ分子４０と接触させて所定時間経過してからそれらと試料１とを混合するようにしてもよい。また、そのような標識化特定物質は、蛍光センサと共に、あるいは蛍光センサ専用のキットとして販売されれば、センサユーザが容易に入手可能となって競合形式の蛍光検出を簡便に実施できるので好ましい。
【００７０】
この競合形式の蛍光検出においては、検出対象のセカンドメッセンジャー４１が試料１の中に多く存在するほど、キャプチャ分子４０と結合する標識化特定物質が（つまり蛍光体１０が）少なくなる。したがって、表面プラズモン増強検出される蛍光の強度が低いほど試料１中のセカンドメッセンジャー４１の量が多くなるので、この原理に基づいてセカンドメッセンジャー４１の検出および／または定量を行うことができる。
【００７１】
この場合も、前述した表面プラズモン増強効果が同様に得られるから、セカンドメッセンジャー４１を高感度で検出可能となり、そこで、サンドイッチ形式の検出方法では通常行うことが非常に困難である低分子化合物の検出および/または定量も容易に実施可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の第１実施形態による表面プラズモン増強蛍光センサを示す概略側面図
【図２】本発明の第２実施形態による表面プラズモン増強蛍光センサを示す概略側面図
【図３】従来の蛍光センサの一例を示す概略側面図
【図４】従来の蛍光センサの別の例を示す概略側面図
【図５】従来の蛍光センサのさらに別の例を示す概略側面図
【図６】エバネッセント波の電界強度と、金属膜表面からの距離との関係を示すグラフ
【図７】本発明の第３実施形態による表面プラズモン増強蛍光センサを示す概略側面図
【符号の説明】
【００７３】
１    試料
２    抗原
４    １次抗体
６    ２次抗体
７    光源
８    励起光
９    光検出器
１０    蛍光体
１３    プリズム（誘電体ブロック）
２０    金属膜
３１    不撓性膜
３２    親水性リンカー
４０    キャプチャ分子
４１    セカンドメッセンジャー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2008102117.tif 000010
【図７】
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