(57)【要約】【課題】単一増幅ストラテジを用いてサンプル中の標的タンパク質を検出する方法及びキットを提供する。【解決手段】フルオロフォア及びクエンチャを含む一重鎖ＲＮＡ（「Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ」）に相補的に結合する一重鎖ＤＮＡ（Ｇ−ＤＮＡ）の付随放出を利用した、アプタマー型の標的タンパク質分子識別のための単一増幅ストラテジが確立される。フルオロフォア及びクエンチャが取り付けられたＲＮＡは、その後、ＲＮａｓｅＨによって分解されて蛍光シグナルを発生し、損傷されなかったＧ−ＤＮＡはリサイクルされて、蛍光増幅が達成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的タンパク質を検出する方法であって、
（１）（ａ）標的結合に必要な配列及び前記標的結合配列の５’末端から延びた配列を含むＤＮＡアプタマー（５’−Ｅｘ＿ａｐｔａｍｅｒ）と（ｂ）前記ＤＮＡアプタマーの前記５’末端延長領域を含む部分に対して相補関係にある一重鎖ＤＮＡ（Ｇｕａｒｄ−ＤＮＡ又はＧ−ＤＮＡ）とからなるＤＮＡ二重鎖を生成する工程と、
（２）前記標的タンパク質を含むサンプルを前記工程（１）の前記ＤＮＡ二重鎖と混合する工程と、
（３）前記工程（２）で得られた混合物を、ＲＮａｓｅＨ及び前記Ｇ−ＤＮＡに対して相補関係にある一重鎖ＲＮＡ（Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ）と混合する工程であって、フルオロフォア(fluorophore)及びクエンチャがそれぞれ前記一重鎖ＲＮＡの５’末端及び３’末端を標識している、混合工程と、
（４）前記工程（３）で得られた混合物の蛍光強度を測定する工程と
を包含することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記一重鎖ＲＮＡの長さは、前記一重鎖ＤＮＡの長さ以下である
ことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記フルオロフォアは、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、Ｃｙ５、Ｃｙ３及びテキサスレッドからなる群より選択される
ことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
前記クエンチャは、ダブシル(dabsyl)、ダブサイル(dabcyl)及びブラッククエンチャからなる群より選択される
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、
前記クエンチャは、共鳴蛍光エネルギ移動（ＦＲＥＴ）機構において蛍光アクセプタとして作用するフルオロフォアである
ことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、
前記標的タンパク質は、抗体、リガンド、天然化合物、合成ペプチド、新規な薬物の候補化合物、又はタンパク質である
ことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、
前記蛍光強度は、蛍光測定器によって測定される
ことを特徴とする方法。
【請求項８】
サンプル中の標的タンパク質を検出するキットであって、
（１）（ａ）ＤＮＡアプタマーと（ｂ）前記ＤＮＡアプタマーの５’末端延長領域を含む部分に対して相補関係にある一重鎖ＤＮＡ（Ｇｕａｒｄ−ＤＮＡ又はＧ−ＤＮＡ）とからなるＤＮＡ二重鎖と、
（２）前記Ｇ−ＤＮＡに対して相補関係にあり且つフルオロフォア及びクエンチャで標識された一重鎖ＲＮＡと、
（３）ＲＮａｓｅＨと
を含むことを特徴とするキット。
【請求項９】
請求項８に記載のキットにおいて、
前記一重鎖ＲＮＡの長さは、前記一重鎖ＤＮＡの長さ以下である
ことを特徴とするキット。
【請求項１０】
請求項８に記載のキットにおいて、
前記フルオロフォアは、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、Ｃｙ５、Ｃｙ３及びテキサスレッドからなる群より選択される
ことを特徴とするキット。
【請求項１１】
請求項８に記載のキットにおいて、
前記クエンチャは、ダブシル(dabsyl)、ダブサイル(dabcyl)及びブラッククエンチャからなる群より選択される
ことを特徴とするキット。
【請求項１２】
請求項８に記載のキットにおいて、
前記クエンチャは、共鳴蛍光エネルギ移動（ＦＲＥＴ）機構において蛍光アクセプタとして作用するフルオロフォアである
ことを特徴とするキット。
【請求項１３】
請求項８に記載のキットにおいて、
前記標的タンパク質は、抗体、リガンド、天然化合物、合成ペプチド、新規な薬物の候補化合物、又はタンパク質である
ことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中に含まれる標的タンパク質を分析する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーとは、通常、ＳＥＬＥＸ（試験管内人工進化法）によってインビトロで選択される核酸種である。Ｇｏｌｄ及びＳｚｏｓｔａｋのグループによって導入されて以来（Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄのＳｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２４９，ｐｐ．５０５−５１０，（１９９０））、アプタマーは、小さな分子やタンパク質から細胞及び組織に至る範囲に亘って対象とする任意の標的を仮想的に検出するために、分子識別エレメントとして用いられてきた。アプタマーは、感度及び特異性の点で抗体に匹敵するが、化学合成によって低コストで容易に製造できる。アプタマーは、さらに、所望の貯蔵特性(storage properties)を有し且つ生物学的な意味で免疫原性をほとんど又は全く誘発しない。アプタマーはその利点のために、抗体と比較して、治療及び診断における有用性がかなり広い。近年、固有のシグナリング特性を持たないというアプタマーの性質がきっかけとなり、生物工学用途及び生物医学用途のために、標的結合イベント(target-binding events)を容易に測定可能なシグナルへとトランスデュースするさまざまな方法が盛んに開発されている（Ｎａｖａｎｉ及びＬｉのＣｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．２７２−２８１（２００６））。
【０００３】
蛍光レポーターを用いる方法がアプタマー型バイオセンサの生成に特に有用であることがわかっている。該方法は、モノクロモフォア(monochromophore)型アプローチ（ＪｈａｖｅｒｉらのＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２２，ｐｐ．２４６９−２４７３（２０００））、アプタマービーコン(aptamerbeacon)工学（ＨａｍａｇｕｃｈｉらのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２９４，ｐｐ．１２６−１３１（２００１））、構造切換シグナリング(structure-switching signaling)（Ｎｕｔｉｕ及びＬｉのＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２５，ｐｐ．４７７１−４７７８（２００３））、インサイチュラベリング(in situ labeling)（Ｍｅｒｉｎｏ及びＷｅｅｋｓのＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２５，ｐｐ．１２３７０−１２３７１（２００３））、アロステリックキメラ(allosteric chimeras)（Ｗｕ及びＣｕｒｒａｎのＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，ｖｏｌ．２７，ｐｐ．１５１２−１５１６（１９９９））、染色式アプローチ（ＬｉらのＣｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，ｐｐ．７３−７５（２００７））、高分子コンジュゲート型蛍光化学センサ(polymer-conjugate based fluorescent chemosensors)（Ｈｏ及びＬｅｃｌｅｒｃのＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２６，ｐｐ．１３８４−１３８７（２００４））を含んでいる。これらの系は、通常、化学量論的な様態でシグナルを生成するが、ＰＬＡ（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）法（ＦｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎらのＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．４７３−４７７（２００２））又はエキソヌクレアーゼ保護アッセイ(exo-nuclease-protection assay)（ＷａｎｇらのＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７６，ｐｐ．５６０５−５６１０（２００４））をアプタマー型検知法に組み込むことによってシグナルを増幅する試みがなされてきた。タンパク質の超高感度検出が実現されているが、前者のアッセイは、同質二量体タンパク質標的に限定され、後者のアッセイは、時間をかけて複工程手順を行うという欠点がある。ごく最近では、分子ビーコンと組み合わせたＤＮＡポリメラーゼアッセイを用いて、アプタマーと標的である小さな分子との識別シグナルの増幅検出が行われている（ＳｈｌｙａｈｏｖｓｋｙらのＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２９，ｐｐ．３８１４−３８１５（２００７））。正確且つ特異的な生物分析を容易にし得る単純且つ適用容易なアプタマー型の方法を開発するために、そのような技術が要求され続けている。
【発明の開示】
【０００４】
第１の局面において、本発明は、サンプル中において他の分子の存在下でＤＮＡアプタマーが標的タンパク質に結合する際に生成される蛍光シグナルを増幅することによって標的タンパク質を検出する方法である。該方法は、
（１）（ａ）標的結合に必要な配列及び前記標的結合配列の５’末端から延びた配列を含むＤＮＡアプタマー（５’−Ｅｘ＿ａｐｔａｍｅｒ）と（ｂ）前記ＤＮＡアプタマーの前記５’末端延長領域を含む部分に対して相補関係にある一重鎖ＤＮＡ（Ｇｕａｒｄ−ＤＮＡ又はＧ−ＤＮＡ）とからなるＤＮＡ二重鎖を生成する工程と、
（２）前記標的タンパク質を含むサンプルを前記工程（１）の前記ＤＮＡ二重鎖と混合する工程と、
（３）前記工程（２）で得られた混合物を、ＲＮａｓｅＨ及び前記Ｇ−ＤＮＡに対して相補関係にある一重鎖ＲＮＡ（Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ）と混合する工程であって、フルオロフォア(fluorophore)及びクエンチャがそれぞれ前記一重鎖ＲＮＡの５’末端及び３’末端を標識している、混合工程と、
（４）前記工程（３）で得られた混合物の蛍光強度を測定する工程と
を包含することを特徴とする。
【０００５】
第２の局面において、本発明は、サンプル中の標的タンパク質を検出する方法を提供するキットである。該キットは、（１）（ａ）ＤＮＡアプタマーと（ｂ）前記ＤＮＡアプタマーの５’末端延長領域を含む部分に対して相補関係にある一重鎖ＤＮＡ（Ｇｕａｒｄ−ＤＮＡ又はＧ−ＤＮＡ）とからなるＤＮＡ二重鎖と、（２）前記Ｇ−ＤＮＡに対して相補関係にあり且つフルオロフォア及びクエンチャで標識された一重鎖ＲＮＡと、（３）ＲＮａｓｅＨとを含む。
【０００６】
本発明の上記並びにその他の目的及び特徴は、以下の本発明の説明を、本明細書に添付の図面と関係付けて参酌することにより、より明確になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、サンプル中の標的タンパク質の測定に用いる蛍光強度アッセイに基づいたバイオセンサに関し、該アッセイは、
（１）（ａ）標的結合に必要な配列及び前記標的結合配列の５’末端から延びた配列を含むＤＮＡアプタマー（５’−Ｅｘ＿ａｐｔａｍｅｒ）と（ｂ）前記ＤＮＡアプタマーの前記５’末端延長領域を含む部分に対して相補関係にある一重鎖ＤＮＡ（Ｇｕａｒｄ−ＤＮＡ又はＧ−ＤＮＡ）とからなるＤＮＡ二重鎖を生成する工程と、
（２）前記標的タンパク質を含むサンプルを前記工程（１）の前記ＤＮＡ二重鎖と混合する工程と、
（３）前記工程（２）で得られた混合物を、ＲＮａｓｅＨ及び前記Ｇ−ＤＮＡに対して相補関係にある一重鎖ＲＮＡ（Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ）と混合する工程であって、フルオロフォア及びクエンチャがそれぞれ前記一重鎖ＲＮＡの５’末端及び３’末端を標識している、混合工程と、
（４）前記工程（３）で得られた混合物の蛍光強度を測定する工程と
を包含することを特徴とする。
【０００８】
工程（１）のＤＮＡアプタマーは、ある既定のアプタマー（５’Ｅｘ＿ａｐｔａｍｅｒ）の５’末端に延長配列を有する分子である。本実施形態のＧ−ＤＮＡは、ＤＮＡアプタマーの５’末端延長領域を含む部分に対して相補関係にある一重鎖ＤＮＡ分子である。該既定のアプタマーは、標的タンパク質に結合するアプタマーである。ＤＮＡアプタマー及びＧ−ＤＮＡからなるＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡアプタマー及びＧ−ＤＮＡを含む水溶液を加熱し、その後室温でゆっくりと冷却することにより生成され得る。
【０００９】
工程（２）で得られた標的タンパク質は、タンパク質であり得、例えば、抗体、リガンド、天然化合物、抽出物、合成ペプチド、新規な薬物の候補化合物、又はタンパク質であるが、これらの例に限定されない。
【００１０】
工程（３）のＦ−ＲＮＡ−Ｑは、５’末端にフルオロフォアが取り付けられ、３’末端にクエンチャが取り付けられたＲＮＡ配列である。好適な実施形態において、フルオロフォアは、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、Ｃｙ５、Ｃｙ３及びテキサスレッドなどの従来の蛍光材料である。好適な実施形態において、クエンチャは、ダブシル(dabsyl)、ダブサイル(dabcyl)及びブラッククエンチャなどの、従来のクエンチャであり得る。クエンチャは、共鳴蛍光エネルギ移動（ＦＲＥＴ）機構において蛍光アクセプタとして作用する別のフルオロフォアであってもよい。本発明において、関連技術の当業者に公知のさらなるフルオロフォア及び蛍光クエンチャのいずれかを用いてもよい。
【００１１】
本実施形態のＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を識別し且つ該二重鎖のＲＮＡ部分のみを分解し、一重鎖ＲＮＡを分解しない酵素である。本発明において、ＲＮａｓｅＨを用いて、Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ／Ｇ−ＤＮＡ二重鎖のＦ−ＲＮＡ−Ｑを分解する。
【００１２】
本発明で用いるＤＮＡアプタマー、Ｇ−ＤＮＡ、Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ及びＲＮａｓｅＨは、それぞれ市販のものであり得る。
【００１３】
工程（４）において、蛍光強度は、ＴＲＩＡＤマルチモード検出器、Ｗａｌｌａｃ／Ｖｉｃｔｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、及びパーキンエルマー社のＬＢ５０Ｂルミネセンス分光計(luminescence spectrometer)などの、関連技術の当業者に公知の蛍光測定器によって測定され得る。
【００１４】
以下に、本発明によるサンプル中の標的タンパク質を検出する方法をさらに詳細に説明する。
【００１５】
工程（２）において、標的タンパク質の存在下において、５’Ｅｘ＿ａｐｔａｍｅｒを含有する部分的に二重鎖構造の複合体は、タンパク質−５’Ｅｘ＿ａｐｔａｍｅｒ複合体を形成する傾向にある。この結果、一重鎖のＧ−ＤＮＡ分子が放出される。工程（３）において、本実施形態のバイオセンサシステムは、５’末端にフルオロフォア（Ｆ）が取り付けられた一重鎖ＤＮＡプローブ「Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ」を含む。このフルオロフォアの強度は、３’末端のクエンチャ（Ｑ）によって完全に消失される。Ｆ−ＲＮＡ−Ｑの配列は放出されたＧ−ＤＮＡに対して相補関係にあるので、その後、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖が形成される。蛍光が消失したＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖が、ＲＮａｓｅＨで分解される。この結果、フルオロフォア含有ＲＮＡフラグメントがクエンチャから分離され、蛍光シグナルを生成するのに用いられる（図１）。サンプル中に標的タンパク質が存在しない場合、ＤＮＡアプタマーはＧ−ＤＮＡに結合したままであり、Ｆ−ＲＮＡ−ＱとＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖を形成することができないので、蛍光シグナルは生成されない。ＲＮａｓｅＨによってＦ−ＲＮＡ−Ｑが分解された結果、損傷しなかったＧ−ＤＮＡが残り、この残ったＧ−ＤＮＡは、別のＦ−ＲＮＡ−Ｑ分子と共に二重鎖を再形成するのに利用可能であるので、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖形成の後にＲＮａｓｅＨによる分解が行われるというサイクルの結果、蛍光シグナル増幅のメカニズムが得られる。
【００１６】
さらに、本発明は、蛍光シグナルの強度が標的タンパク質の量に比例して増加する（図２）ので、標的タンパク質の定量分析に用い得る。一方、Ｆ−ＲＮＡ−ＱがＧ−ＤＮＡよりもかなり長い場合、Ｇ−ＤＮＡ及びＦ−ＲＮＡ−Ｑは二重鎖を形成し、その結果、標的タンパク質がサンプル中に存在しない場合であってもＲＮａｓｅＨの触媒作用が誘導され得、正の誤シグナルが生成される。したがって、一重鎖ＲＮＡの長さは、Ｇ−ＤＮＡの長さ以下である。Ｇ−ＤＮＡの量がＤＮＡアプタマーの量よりも多い場合、ＤＮＡアプタマーに結合した後に残った過剰分のＧ−ＤＮＡがＦ−ＲＮＡ−Ｑに結合し得、ＲＮａｓｅＨが活性化されて、正の誤シグナルが生成され得る。したがって、本発明では、ＤＮＡアプタマー及びＧ−ＤＮＡは、好適には同じ量で使用される。
【００１７】
本発明の方法は均質な溶液中にて実施されるので、追加の洗浄工程を行うＥＬＩＳＡ（酵素免疫検定法）と比較して簡便である。
【００１８】
本発明において、ＤＮＡアプタマーは標的タンパク質に対して高い感度を示すので（図３）、標的タンパク質がサンプル中に存在しない限りにおいて、蛍光シグナルの増幅は起こらない。従来の化学量論的検出方法において、標的タンパク質の検出可能な量は、標的タンパク質のアプタマーとの結合強度に応じて変化する。対照的に、本発明のシグナル増幅処理を用いることにより、標的タンパク質の濃度が標的タンパク質−アプタマー複合体の乖離定数よりも低い場合であっても、非常に少量の標的タンパク質を検出することができる。蛍光増幅は、ＲＮａｓｅＨによるＦ−ＲＮＡ−Ｑの分解サイクルによって得られるが、このことは、標的タンパク質への結合時にＤＮＡアプタマーから放出される少量のＧ−ＤＮＡによってトリガされる。例えば、アプタマー−トロンビン複合体の乖離定数（〜１００ｎＭ）よりもかなり小さな１０ｎＭの濃度のトロンビンは、本発明を用いることによって容易に検出され得る。本発明の方法を用いると、増幅されたシグナルの定量のためのゲル分離処理を必要とするシグナル増幅を行うＰＣＲを用いる前述のアプタマー型検出方法と比べて、標的タンパク質の検出が非常に素早く達成される。
【００１９】
本発明によって提供される、サンプル中の標的タンパク質を検出するキットは、（１）（ａ）ＤＮＡアプタマーと（ｂ）前記ＤＮＡアプタマーの５’末端延長領域を含む部分に対して相補関係にある一重鎖ＤＮＡ（Ｇｕａｒｄ−ＤＮＡ又はＧ−ＤＮＡ）とからなるＤＮＡ二重鎖と、（２）前記Ｇ−ＤＮＡに対して相補関係にあり且つフルオロフォア及びクエンチャで標識された一重鎖ＲＮＡと、（３）ＲＮａｓｅＨとを含むことを特徴とする。
【００２０】
標的タンパク質は、抗体、リガンド、天然化合物、合成ペプチド、新規な薬物の候補化合物、又はタンパク質であり得る。
【００２１】
以下の実施例及び試験例は、説明のみを目的としたものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。以下の実施例は、本発明の実施形態を例示するために含まれる。以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施において十分機能することが本発明者らによって確認された技術であり、よってその実施のための好適な様態を構成すると考え得るということが当業者に理解される。しかし、当業者は、本明細書の開示を鑑みて、開示された特定的な実施形態にさまざまな改変を行い得、本発明の趣旨及び範囲から逸れることなく同一又は同様の結果が得られるということを理解する。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）ＲＮａｓｅＨ及びαトロンビンアプタマーを用いたαトロンビンの検出シグナルの増幅  
配列番号１（SEQ ID NO: 1）のヌクレオチド配列を有するトロンビンアプタマー（５０μＬ，１μＭ）を配列番号２（SEQ ID NO: 2）のヌクレオチド配列を有するＧ−ＤＮＡ（５０μＬ，１μＭ）と混合し、その後、ＲＮａｓｅＨ反応バッファ（１０Ｘ；５０μＬ，５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，７５０ｍＭ  ＫＣｌ，３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，及び１００ｍＭ  ジチオスレイトール）並びにＲＮａｓｅを含まない水（２８５μＬ）を加えた。その後、得られたＤＮＡ混合物を７０℃で５分間加熱し、室温まで緩やかに冷却して、二重鎖を形成した。ヒトのαトロンビン（１０μＬ、最終濃度は０ｎＭ，２０ｎＭ，５０ｎＭ，１００ｎＭ，２００ｎＭと変化させた）をプレアニーリングした二重鎖に加え、得られた混合物を２５℃で３０分間培養した。５’末端及び３’末端にそれぞれフルオレセイン及びダブサイル(dabcyl)で標識された配列番号３（SEQ ID NO: 3）のヌクレオチド配列を有するＲＮＡを含むＦ−ＲＮＡ−Ｑ（５０μＬ，１μＭ；ＢＩＯＮＥＥＲ，Ｋｏｒｅａ）を加えた後、ＲＮａｓｅＨ（５μＬ，２．５単位，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）を加えて又は加えずに得られた溶液を所定時間に亘って培養した。異なる培養時間（０時間、５時間及び１６時間）を経た後、パーキンエルマー社のＬＢ５０Ｂルミネセンス分光計を用いて試験溶液の蛍光強度を測定した。αトロンビンの各濃度について上記手順を３回繰り返し、その結果の平均値を計算した（図２）。
【００２３】
図２に示すように、蛍光強度の増加はαトロンビンの濃度に比例していた。これにより、本発明が標的タンパク質を定量的に分析するのに有用であることが確認された。
【００２４】
（実施例２）ＲＮａｓｅＨ及びαトロンビンアプタマーを用いたαトロンビンの検出シグナルの増幅のための選択性  
特異性評価のために、実施例１の手順を繰り返した。プレアニーリングしたＤＮＡ二重鎖にＢＳＡ、ヒトα−、β−、又はγ−トロンビン（５０μＬ，１μＭ）を加えた。Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ（５０μＬ，１μＭ）を加えた後、ＲＮａｓｅＨ（５μＬ，２．５単位，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）を加えて又は加えずに得られた溶液を１６時間培養した。その後、各溶液の蛍光強度を、実施例１に記載の方法によって判定した。各データは、３つの別個の実験の平均値を示す（図３）。
【００２５】
図３に示すように、アプタマーは、標的タンパク質、すなわちαトロンビンに、他のタンパク質と比べて非常に高い親和性で選択的に結合する。この結果は、本発明は標的タンパク質の選択的検出に有用であることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明の根拠となる原理を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明による、バッファ中のαトロンビンを検出し定量するために測定された蛍光強度値を示すグラフを示す図である。なお、蛍光強度は、αトロンビンの濃度並びに／若しくはＲＮａｓｅＨ及びＦ−ＲＮＡ−Ｑを用いた処理の後の培養時間を変化させて測定した。
【図３】図３は、本発明によるトロンビンの検出におけるトロンビンアプタマーの特異性を示すグラフを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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