(57)【要約】      （修正有）【課題】明確かつ再現性よく核酸配列中の複数の多型を検出する方法及びそのための試薬を提供する。【解決手段】第一のリガンドが結合し、判定したい塩基部位に相同的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物（Ａ）と、第二のリガンドが結合し、該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせた複合体に、第一のリガンドと第二のリガンドが共存しているかどうかを検出し、さらにＡの伸長産物と、第三のリガンドが結合し、Ｘと特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせた複合体に、第一のリガンドと第三のリガンドが共存しているかどうかを検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液中に含まれる標的核酸配列上の塩基部位を判定する方法において、少なくとも以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする塩基判定方法。
（１）第一のリガンドが結合したオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)とを用いて、標的核酸配列から核酸増幅反応を行う第一工程であり、該プライマー（Ａ、Ｂ）が下記の(ａ)または(ｂ)のいずれかの組み合わせから選択される：（ａ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ａ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ｂ)との組合せ；（ｂ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ｂ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ａ)との組合せ
（２）第一工程で得られうるプライマー（Ａ）の伸長産物と、第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）とをハイブリダイズさせた複合体（Ｐｃ）、および、該第一工程で得られうるプライマー（Ａ）の伸長産物と、第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）とをハイブリダイズさせた複合体（Ｐｄ）、を形成せしめる第二工程
（３）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｃ）中に、第一のリガンドと第二のリガンドが共存しているかどうかを検出する第三工程
（４）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｄ）中に、第一のリガンドと第三のリガンドが共存しているかどうかを検出する第四工程
【請求項２】
第一工程において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）が存在していることを特徴とする請求項１に記載の塩基判定方法。
【請求項３】
第二工程において、複合体（Ｐｃ）を形成せしめる際にプライマー（Ａ）の伸長産物を鋳型としてオリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）の伸長反応を行い、複合体（Ｐｄ）を形成せしめる際にプライマー（Ａ）の伸長産物を鋳型としてオリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長反応を行うことを特徴とする請求項１または２に記載の塩基判定方法。
【請求項４】
第三工程と第四工程を同時に行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の塩基判定方法。
【請求項５】
第一のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の塩基判定方法。
【請求項６】
第二のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の塩基判定方法。
【請求項７】
第三のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の塩基判定方法。
【請求項８】
第三工程が、以下の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかの工程を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の塩基判定方法。
（ｉ）複合体（Ｐｃ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、第二のリガンドを検出する工程、
（ｉｉ）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐｃ）を介して、第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、該複合体（Ｐｃ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出する工程。
【請求項９】
第四工程が、以下の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかの工程を含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の塩基判定方法。
（ｉ）複合体（Ｐｄ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、第三のリガンドを検出する工程、
（ｉｉ）第三のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐｄ）を介して、第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、該複合体（Ｐｄ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出する工程。
【請求項１０】
第一のリガンドの捕捉剤が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質及びアビジンからなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項８又は９に記載の塩基判定方法。
【請求項１１】
生理活性物質が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質およびアビジンからなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項８又は９に記載の塩基判定方法。
【請求項１２】
生理活性物質に結合される標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体および導電性物質からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項８又は９に記載の塩基判定方法。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の３’末端の塩基が判定したい塩基部位（Ｘ）の予想される塩基と同じ、または相補的な塩基であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の塩基判定方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の３’末端より２番目の塩基が判定したい塩基部位（Ｘ）の予想される塩基と同じ、または相補的な塩基であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の塩基判定方法。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の３’末端より３から５番目の少なくとも１つの塩基が鋳型となる核酸配列と相補的または相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする請求項１３または１４に記載の塩基判定方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の３’末端から２番目以降の少なくとも一つのヌクレオチドがリガンドにより標識されていることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の塩基判定方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の５’末端がリガンドにより標識されていることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載の塩基判定方法。
【請求項１８】
少なくとも以下の（１）〜（３）を含むことを特徴とする塩基判定用キット。
（１）第一のリガンドが結合したオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)であり、該プライマー（Ａ、Ｂ）が下記の(ａ)または(ｂ)のいずれかの組み合わせから選択される：（ａ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ａ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ｂ)との組合せ；（ｂ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ｂ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ａ)との組合せ
（２）該プライマー（Ａ）の伸長産物と、第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）
（３）該プライマー（Ａ）の伸長産物と、第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）
【請求項１９】
さらに以下の（４）及び（５）を含むことを特徴とする請求項１３に記載の塩基判定用キット。
（４）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質および／または第三のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質
（５）第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相
【請求項２０】
第一のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項１８又は１９に記載の塩基判定用キット。
【請求項２１】
第二のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項１８又は１９に記載の塩基判定用キット。
【請求項２２】
第三のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項１８又は１９に記載の塩基判定用キット。
【請求項２３】
第一のリガンドの捕捉剤が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質及びアビジンからなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項１８又は１９に記載の塩基判定用キット。
【請求項２４】
生理活性物質が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質およびアビジンからなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項１８又は１９に記載の塩基判定用キット。
【請求項２５】
生理活性物質に結合される標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体および導電性物質からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項１８又は１９に記載の塩基判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー、および核酸の伸長反応が起こりうる形態のオリゴヌクレオチドプローブを用いた塩基多型の同定方法に関するものである。本発明は、遺伝病の診断、塩基多型解析等に際して特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
本発明において、塩基多型とは野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。遺伝子の塩基多型は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（非特許文献１、非特許文献２）。また、原因となる変異型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。
【０００３】
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。
【０００４】
一方、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。
【０００５】
このような予想される点突然変異を検出する方法として、従来より、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（例えば、特許文献１及び２参照）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の点突然変異の検出方法が知られている。増幅された遺伝子断片に対し、特定の核酸配列を切断する制限酵素により処理し、生じるフラグメントの大きさで判断する方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）法が用いられている。同じくＰＣＲ法を用いた検出方法としては、使用するプライマーの特異性を利用したAlelle specific amplification法が用いられる。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドのうちの一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオ チドとを用いる。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。
【０００６】
試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同定することができる。この時増幅が起きたか否かを調べる方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、ＵＶ照射して増幅核酸の有無を検出できる。
【０００７】
上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に多型の同定が行えるように思われるが、実際には、非特異的な核酸増幅が起こり試料遺伝子が野生型か変異型かを明確に判別できない場合もある。また上記の塩基多型同定方法では１箇所の塩基多型を同定するために通常１回または２回の核酸増幅を行う必要があり、特に遺伝病の原因となる点突然変異が遺伝子の複数の部位で起こっている場合には上記一連の操作を複数回行わなければならいため、遺伝子の塩基多型を同定するためにより大きな労力が必要となる。
【０００８】
試料中に存在する特定の核酸分子を検出するための他の代表的な技術としては、ハイブリダイゼーション法がある（例えば、非特許文献３参照）。核酸のハイブリダイゼーション分析は、多種類の核酸の中から非常に少数の標的核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）をプローブで検出する技術であるが、ハイブリダイゼーション法では、高感度なレポーター（酵素、蛍光色素、ラジオアイソトープ等）を用いても、低コピー数（１〜１０００個）の標的核酸分子を検出するのは困難である。さらに、ハイブリダイゼーション法には、非特異反応という大きな問題点が存在するため、特定の核酸分子を正確に検出する為には担体のブロッキング、非特異シグナルの除去等の操作が不可欠であり、多大な労力が必要となる。
【０００９】
また、過去において非特異反応の問題を解決するための方法として、標的核酸より調製した標識ＤＮＡに、同様に調製した非標識ＤＮＡを添加して非特異反応を抑制するコンペティティブハイブリダイゼーション法（例えば、特許文献３、非特許文献４参照）が開発された。しかしコンペティティブハイブリダイゼーション法は操作が煩雑であり、また検出感度の面でも十分とはいえないため、特に遺伝病の診断、塩基多型解析等には適用できない。
【特許文献１】特公平４−６７９６０号公報
【特許文献２】特公平４−６７９５７号公報
【特許文献３】特許第２９８２３０４号
【非特許文献１】GramおよびBrsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 第８７〜９６頁（１９９０年）
【非特許文献２】Balantら、Eur. J. Clin. Pharmacol. 第３６巻、第５５１〜５５４頁、（１９８９年）
【非特許文献３】Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition、第１０章、第１０．１〜１０．５２頁（２００１年）
【非特許文献４】Nicolasら、Anal. Biochem. 第２０５巻、第１９３頁、（１９９２年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、上記のような問題点を解決して、明確にかつ再現性よく核酸配列中の多型を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
１．試料溶液中に含まれる標的核酸配列上の塩基部位を判定する方法において、少なくとも以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする塩基判定方法。
（１）第一のリガンドが結合したオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)とを用いて、標的核酸配列から核酸増幅反応を行う第一工程であり、該プライマー（Ａ、Ｂ）が下記の(ａ)または(ｂ)のいずれかの組み合わせから選択される：（ａ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ａ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ｂ)との組合せ；（ｂ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ｂ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ａ)との組合せ
（２）第一工程で得られうるプライマー（Ａ）の伸長産物と、第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）とをハイブリダイズさせた複合体（Ｐｃ）、および、該第一工程で得られうるプライマー（Ａ）の伸長産物と、第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）とをハイブリダイズさせた複合体（Ｐｄ）、を形成せしめる第二工程
（３）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｃ）中に、第一のリガンドと第二のリガンドが共存しているかどうかを検出する第三工程
（４）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｄ）中に、第一のリガンドと第三のリガンドが共存しているかどうかを検出する第四工程
２．第一工程において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）が存在していることを特徴とする１の塩基判定方法。
３．第二工程において、複合体（Ｐｃ）を形成せしめる際にプライマー（Ａ）の伸長産物を鋳型としてオリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）の伸長反応を行い、複合体（Ｐｄ）を形成せしめる際にプライマー（Ａ）の伸長産物を鋳型としてオリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長反応を行うことを特徴とする１または２の塩基判定方法。
４．第三工程と第四工程を同時に行うことを特徴とする１〜３のいずれかの塩基判定方法。
５．第一のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１〜４のいずれかの塩基判定方法。
６．第二のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１〜４のいずれかの塩基判定方法。
７．第三のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１〜４のいずれかの塩基判定方法。
８．第三工程が、以下の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかの工程を含むことを特徴とする１〜７のいずれかの塩基判定方法。
（ｉ）複合体（Ｐｃ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、第二のリガンドを検出する工程
（ｉｉ）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐｃ）を介して、第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、該複合体（Ｐｃ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出する工程
９．第四工程が、以下の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかの工程を含むことを特徴とする１〜８のいずれかの塩基判定方法。
（ｉ）複合体（Ｐｄ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、第三のリガンドを検出する工程
（ｉｉ）第三のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐｄ）を介して、第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、該複合体（Ｐｄ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出する工程
１０．第一のリガンドの捕捉剤が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質及びアビジンからなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする８又は９の塩基判定方法。
１１．生理活性物質が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質およびアビジンからなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする８又は９の塩基判定方法。
１２．生理活性物質に結合される標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体および導電性物質からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする８又は９の塩基判定方法。
１３．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の３’末端の塩基が判定したい塩基部位（Ｘ）の予想される塩基と同じ、または相補的な塩基であることを特徴とする１〜１２のいずれかの塩基判定方法。
１４．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の３’末端より２番目の塩基が判定したい塩基部位（Ｘ）の予想される塩基と同じ、または相補的な塩基であることを特徴とする１〜１２のいずれかの塩基判定方法。
１５．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の３’末端より３から５番目の少なくとも１つの塩基が鋳型となる核酸配列と相補的または相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする１３または１４の塩基判定方法。
１６．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の３’末端から２番目以降の少なくとも一つのヌクレオチドがリガンドにより標識されていることを特徴とする１〜１５のいずれかの塩基判定方法。
１７．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の５’末端がリガンドにより標識されていることを特徴とする１〜１６のいずれかの塩基判定方法。
１８．少なくとも以下の（１）〜（３）を含むことを特徴とする塩基判定用キット。
（１）第一のリガンドが結合したオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)であり、該プライマー（Ａ、Ｂ）が下記の(ａ)または(ｂ)のいずれかの組み合わせから選択される：（ａ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ａ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ｂ)との組合せ；（ｂ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ｂ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ａ)との組合せ
（２）該プライマー（Ａ）の伸長産物と、第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）
（３）該プライマー（Ａ）の伸長産物と、第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）
１９．さらに以下の（４）及び（５）を含むことを特徴とする１３の塩基判定用キット。
（４）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質および／または第三のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質
（５）第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相。
２０．第一のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１８又は１９の塩基判定用キット。
２１．第二のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１８又は１９の塩基判定用キット。
２２．第三のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１８又は１９の塩基判定用キット。
２３．第一のリガンドの捕捉剤が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質及びアビジンからなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１８又は１９の塩基判定用キット。
２４．生理活性物質が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質およびアビジンからなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１８又は１９の塩基判定用キット。
２５．生理活性物質に結合される標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体および導電性物質からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１８又は１９の塩基判定用キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、試料核酸中の複数の塩基多型を明確にまた簡便に、再現性よく検出できる方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において「試料溶液」とは、標的核酸配列すなわち解析の対象となる塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有する核酸を含む溶液を指し、例えば、バクテリア、動物または植物組織、個体細胞由来の溶解物などのあらゆる材料から調製することができる。該試料溶液の調製法は特に限定されないが、例えば、患者の血液、組織から、既知の方法により調製してもよい。代表的なものとして、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ 第７２巻、第６１９〜６２９頁、１９６３年）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第７巻、第１５１３〜１５２３頁、１９７９年）等の液相で行う方法がある。また、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．  ＵＳＡ 第７６−２巻、第６１５〜６１９頁、１９７９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。その他の方法としてはシリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 第２８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特開平２−２８９５９６号公報）が挙げられる。
【００１５】
本発明において「標的核酸配列」とは、標的核酸すなわち解析の対象となる塩基多型部位を含む核酸の配列を指す。該標的核酸の例としては、Ａｌｕ配列、リボゾーム遺伝子、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、薬物代謝に関連する遺伝子としてＣＹＰ２Ｃ１９ （Cytochrome P450 2C19）遺伝子が挙げられる。
【００１６】
本発明において「塩基多型」とは、核酸が野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。野生型の塩基配列を有する野生型核酸のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、該野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸、すなわち変異型核酸について、どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明されてきている。また、このような塩基多型により体質等が異なっていることも解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有しているか否かを検査する方法であり、「塩基部位（Ｘ）」とは、該塩基多型のうち検査の対象として判定しようとする塩基部位を示す。
【００１７】
本発明において、第一のリガンドが結合したオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)とは、下記の(ａ)または(ｂ)のいずれかの組み合わせから選択される。
（ａ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ａ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ｂ)との組合せ。
（ｂ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ｂ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ａ)との組合せ。
（ａ）の設定方法を図１に、（ｂ）の設定方法を図２に示す。
以下、（ａ）の組み合わせを例として説明するがこれに限定されるものではない。
【００１８】
本発明において、第一のリガンドが結合しておりかつ判定したい塩基部位（Ｘ）上流領域に相同的なオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）とは、対象となる核酸配列を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、既知の増幅方法であるＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮおよびＵＣＡＮ法に使用でき、増幅された核酸断片が判定したい塩基部位（Ｘ）を含みうるものであれば特に限定されるものではなく、必要に応じて修飾されていても良い。プライマー鎖長は、９〜３５塩基であればよく、好ましくは、１１〜３０塩基である。該プライマーは検出したい核酸配列に応じて、複数混在していても良い。例えば、判定したい塩基部位（Ｘ）が複数箇所存在する場合、所望により、プライマー（Ａ）および／またはプライマー（Ｂ）を複数、混在させてもよい。複数のプライマーを使用し、一つの反応系で増幅反応を行うことができる。複数のプライマー（Ａ）を混合して用いる場合、第一のリガンドの種類を変えても良い。
【００１９】
本発明において、第一のリガンドが結合しておりかつ判定したい塩基部位（Ｘ）上流領域に相同的なオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）、第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）、第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼを共に、作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。
【００２０】
該伸長反応は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition （Sambrookら、第８章、第８．１〜８．１２６頁、２００１年）に記載の方法に従って行うことができる。また、標的核酸が検出するのに十分な量が含まれていない場合、予め前記判定したい塩基部位（Ｘ）を含む核酸断片を以下に示す増幅反応によって、増幅しておくことも可能である。
【００２１】
本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及びオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）および（Ｂ）を作用させることで、標的核酸を鋳型として用いたオリゴヌクレオチドプライマー間の配列が増幅される。
【００２２】
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-basedamplification method；Nature 第３５０巻、第９１頁（１９９１年））、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁（１９９２年））、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁（１９９３年））、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method：J Clin Microbiol. 第４２巻：第１，９５６頁（２００４年））、ＩＣＡＮ（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids：Kekkaku. 第７８巻、第５３３頁（２００３年））などが挙げられる。
【００２３】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドプライマーで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドプライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドプライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上、上記一対のオリゴヌクレオチドプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２のｎ乗倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
【００２４】
本発明に用いられる「第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）」および「第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）」は、好適には該プライマー（Ａ）の伸長産物のうち該塩基部位（Ｘ）を含む部分に相補的なオリゴヌクレオチドにリガンドが結合されたもの、より好適には、オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）および（Ｂ）を用いて増幅した核酸断片のうちの該プライマー（Ａ）の伸長産物のうち該塩基部位（Ｘ）を含む部分に相補的なオリゴヌクレオチドにリガンドが結合されたものを用いることができ、上記プローブ（Ｃ）および（Ｄ）の伸長反応を阻害しない位置にリガンドを結合させることが好ましい。該リガンドを結合させる位置としては、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および（Ｄ）の３’末端から２番目以降の少なくとも一つのヌクレオチドにリガンドを結合させることが好ましく、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および（Ｄ）の５’末端にリガンドを結合させることがより好ましい。
【００２５】
また、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および（Ｄ）は、３’末端より1番目または２番目の塩基が、判定したい塩基部位（Ｘ）の位置に相当するように設計するのがよい。好ましくは、２番目の塩基が、該塩基部位（Ｘ）の位置に相当するように設計するのがよい。また、本発明の効果を損なわないように、３’末端より３番目や３番目以降の塩基を該塩基部位（Ｘ）の位置に相当するように設計してもよい。さらに、３’末端より３から５番目の少なくとも1つの塩基が、鋳型となる核酸配列と相補的でない塩基に置換させることによって、該塩基部位（Ｘ）が存在した場合、より選択的に該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および（Ｄ）の伸長反応が起こりうるようにしてもよい。該オリゴヌクレオチドプローブの鎖長は、５〜２５塩基であればよく、好ましくは、１０〜２０塩基である。
【００２６】
また、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および（Ｄ）は、オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）および（Ｂ）を用いた増幅反応を阻害しないように設計するのがよい。その一例として、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および（Ｄ）のＴｍ値を該プライマー（Ａ，Ｂ）のＴｍ値より低くなるように設計すればよい。
【００２７】
オリゴヌクレオチドプライマーのＴｍ値は、ハイブリッドを形成した２本鎖ＤＮＡ分子の５０％が乖離する温度のことであり、その計算方法としては、既知の方法であれば特に限定されないが、Ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ、Ｗａｌｌａｃｅ法、ＧＣ％法のいずれかにより求められたもので、本発明の特性を満たしていることが必要である。なお、特に好ましいＴｍ値はＮｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｅｔｈｏｄで計算されたものである。該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）および該プライマー（Ａ，Ｂ）におけるＴｍ値の差は１℃以上であれば特に限定されるものではないが、好ましくは５℃以上である。なお、Ｔｍ値の差は５０℃以下であればよく、好ましくは４０℃以下がよい。プローブ鎖長は、５〜３０塩基であればよく、好ましくは、８〜２５塩基である。
【００２８】
本発明においては、第一のリガンドが結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）、および第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）は、別々、又は同時に作用させることが可能である。
【００２９】
別々に作用させる場合には、一例として、上記オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）および（Ｂ）を用いて増幅反応を行った後に該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および（Ｄ）を加え、９８℃、３分の熱変性を行ってから徐々に室温付近まで温度を下げることができる。
【００３０】
同時に作用させる場合には、一例として、上記オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）、（Ｂ）および該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）、（Ｄ）を混合した状態で増幅反応を行い、増幅反応に引き続いて９８℃、３分の熱変性を行ってから徐々に室温付近まで温度を下げることができる。
【００３１】
核酸増幅法から複合体（Ｐｃ）および／または（Ｐｄ）を形成せしめるまでは、ホモジニアスな系で実施しても良い。例えば、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、プライマー（Ａ）、プライマー（Ｂ）、検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）、検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返し、核酸増幅反応を行う。その後、９８℃、３分の熱変性を行ってから徐々に室温付近まで温度を下げ、検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）とプライマー（Ａ）の伸長産物をハイブリダイズせしめる。その後、反応系に存在する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにより、プライマー（Ａ）の伸長産物を鋳型として検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の伸長反応を行い、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の伸長産物とプライマー（Ａ）の伸長産物の複合体（Ｐｃ）および／または（Ｐｄ）を形成せしめる。その後、複合体（Ｐｃ）および／または（Ｐｄ）の検出を行えばよい。
【００３２】
使用される第一のリガンド、第二のリガンド、第三のリガンドは核酸配列の検出を妨げるものでないのであれば、特に限定されるものではないが、好適には抗原、抗体、蛍光物質、発光団、および酵素、アビジン、ビオチン、ジゴケシゲニン、ジニトロフェニルからなる群から選ぶことができる。好ましくは、抗原、蛍光物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルなどが良く、特に好ましくは抗原、蛍光物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルが良い。本発明を実施するにあたって、第一のリガンド、第二のリガンド、第三のリガンドは異なっていることが好ましい。例えば、第一リガンドにビオチン、第二のリガンドにＦＩＴＣ、第三のリガンドにジゴキシゲニンを用いてもよい。
【００３３】
本発明の重要な開示の一つは、第一工程で得られうるプライマー（Ａ）の伸長産物に、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）をハイブリダイズさせる場合に、プライマー（Ａ）の伸長産物を鋳型とする伸長反応を行ってオリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）の伸長産物とプライマー（Ａ）の伸長産物の複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）を形成せしめることによって、従来公知の伸長反応を行わないハイブリダイゼーション法と比較して複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）の生成量が大幅に向上し、塩基多型を明確にまた簡便に同定できるような顕著な効果を見出したことにある。
【００３４】
この原理は、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）と「プライマー（Ａ）の伸長産物」の複合体を（ｐ’ｃ，ｐ’ｄ）とすると、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）の伸長産物と「プライマー（Ａ）の伸長産物」の複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）の方が、複合体（ｐ’ｃ，ｐ’ｄ）より、はるかに安定であることに由来する。一般に、「第一工程で得られうるプライマー（Ａ）の伸長産物」を含む二本鎖核酸の方がオリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）よりはるかに長いため、該二本鎖核酸の変性により形成された一本鎖核酸同士がハイブリダイズして元の二本鎖核酸を形成する反応の方が、該一本鎖核酸の一方すなわち「プライマー（Ａ）の伸長産物」に該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）がハイブリダイズして複合体（ｐ’ｃ，ｐ’ｄ）を形成する反応よりはるかに優勢である。該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）を「プライマー（Ａ）の伸長産物」にハイブリダイズさせ、該伸長産物を鋳型として伸長させることによって形成された該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）の伸長産物の方が、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）よりはるかに長いため、複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）の方が複合体（ｐ’ｃ，ｐ’ｄ）よりはるかに大量に存在しうる。また、伸長反応とは、換言すれば一本鎖核酸を鋳型とした相補鎖の合成によって合成二本鎖核酸を形成せしめる反応であり、該合成反応は、二本鎖核酸の変性により形成された一本鎖核酸同士がハイブリダイズして元の二本鎖核酸を形成する反応よりはるかに優勢であることからも、プライマー（Ａ）の伸長産物を鋳型とするオリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）の伸長反応によって複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）の生成量が大幅に向上し、該複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）は複合体（ｐ’ｃ，ｐ’ｄ）よりはるかに大量に存在しうる。
【００３５】
従って標的核酸配列上の塩基部位（Ｘ）の有無は、複合体の検出シグナルとなって反映される。塩基部位（Ｘ）が存在すれば、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）の伸長産物がえられ、複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）の生成量が増えるため高いシグナルが得られる。逆に、塩基部位（Ｘ）が存在しなければ、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）の伸長産物が得られないため、複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）が生成されず、シグナルが得られないか、若しくはごく少数の複合体（ｐ’ｃ，ｐ’ｄ）に起因する極度に低いシグナルとなる。ごく少数の複合体（ｐ’ｃ，ｐ’ｄ）に起因する極度に低いシグナルが観察される場合には、カットオフ値を設定してもよい。カットオフ値は対象とする塩基部位（Ｘ）毎に設定してもよい。カットオフ値の設定は、当業者であれば、容易に設定できる。
【００３６】
本発明では、形成された複合体（Ｐｃ）中に第一のリガンドと第二のリガンドが共存しているかどうか、および、形成された複合体（Ｐｄ）中に第一のリガンドと第三のリガンドが共存しているかどうか、を確認できればよい。例えば、複合体（Ｐｃ）および（Ｐｄ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、第二のリガンドと第三のリガンドを検出しても良い。このとき、該リガンドを直接検出しても良いし、該リガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、該複合体を介して固相上に捕捉し、該生理活性物質の標識を検出しても良い。また、第二のリガンドと第三のリガンドは同時に検出しても良いし、別々に検出しても良い。
【００３７】
上記の一例として、図３に示すように、複合体（Ｐｃ）および（Ｐｄ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉し、第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐｃ）を介して第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、該複合体（Ｐｃ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出し、第三のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐｄ）を介して第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、該複合体（Ｐｄ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出することができる。また別の一例としては、図４に示すように、複合体（Ｐｃ）および（Ｐｄ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉し、第二のリガンドを直接検出した後、第三のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐｄ）を介して第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、該複合体（Ｐｄ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出することができる。
【００３８】
固相としては金属板、木片、プラスチック板、ガラス板、ゴム板、発泡スチロール、フィルム、膜、通液性フィルター、ゲル、アッセイプレートなどを使用してもよい。好ましくは、アッセイプレートがよい。
【００３９】
用いられる生理活性物質は第二または第三のリガンドに親和性を有するものであれば、特に限定されるものではないが、好適には抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質、アビジン、ビオチン、ジゴケシゲニンよりなる群より選ぶことができる。好ましくは抗体、アビジンがよく、特に好ましくは抗体がよい。例えば、該リガンドがＦＩＴＣの場合、生理活性物質は抗ＦＩＴＣ抗体であればよく、該リガンドがジゴキシゲニンの場合、生理活性物質は抗ジゴキシゲニン抗体であればよい。
【００４０】
第一のリガンド、第二のリガンド、第三のリガンド、第一のリガンドの捕捉剤及び第二または第三のリガンドに結合する生理活性物質を選択する場合、第二のリガンドと第二のリガンドに結合する生理活性物質は結合でき、第二のリガンドと第三のリガンドに結合する生理活性物質および第一のリガンドの捕捉剤は結合できないように選択するのがよい。また、第三のリガンドと第三のリガンドに結合する生理活性物質は結合でき、第三のリガンドと第二のリガンドに結合する生理活性物質および第一のリガンドの捕捉剤は結合できないように選択するのがよい。さらに、第一のリガンドと第一のリガンドの捕捉剤は結合でき、第一のリガンドと第二のリガンドに結合する生理活性物質および第三のリガンドに結合する生理活性物質は結合できないように選択するのがよい。
【００４１】
生理活性物質に結合される標識としては、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群より選ぶことができる。好ましくは蛍光化学物質、蛍光蛋白質、発光団、酵素、導電性物質がよく、さらに好ましくは蛍光化学物質、蛍光蛋白質、酵素がよく、特に好ましくは酵素がよい。この標識は、第一のリガンド、第二のリガンド、第三のリガンド、第一のリガンドの捕捉剤、第二のリガンドに結合する生理活性物質および第三のリガンドに結合する生理活性物質のいずれとも結合しない物質が好ましい。
【００４２】
標識の検出は既知の方法であれば特に限定されるものではないが、標識が蛍光化学物質または蛍光蛋白質の場合、特定波長の光を照射し蛍光化学物質または蛍光蛋白質を励起させ、基底状態に変換される際に生じる特定波長の蛍光量を測定することが可能である。これらに用いられる蛍光化学物質としては、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＶＩＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＨＥＸ等が挙げられ、蛍光蛋白質としては、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等を挙げることができる。標識が酵素である場合、酵素の基質を添加することによって生成される反応生成物を検出することによって測定が可能である。これらに用いられる酵素と基質の組み合わせとしては、アルカリフォスファターゼとパラニトロフェニルリン酸、ＣＤＰ−ｓｔａｒ、ＡＭＰＰＤ、ＤＤＡＯｐｈｏｓｐａｔｅ、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ等の組み合わせ、パーオキシダーゼとＴＭＢ、Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ（ロッシュ・ダイアグノスティックス）、ＳＡＴ−１（同仁化学）等の組み合わせ、ジアホラーゼとＮＴＢ等の組み合わせ、各種オキシダーゼと基質、各種デヒドロゲナーゼと基質の組み合わせ等、反応性生物が検出されるものであれば、これらに限定されることはなく用いることが可能である。標識が磁性体の場合、磁気を検出することによって測定が可能である。標識が導電性物質、電流値を検出することによって測定が可能である。
【００４３】
特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、これら方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、変異型のホモか、あるいは、両方のヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と変異型遺伝子が共に存在するから野生型と変異型の両方で検出される。
【００４４】
キット
本発明において、少なくとも以下の（１）〜（３）を含むことを特徴とする塩基判定用キットである。
（１）第一のリガンドが結合したオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)であり、該プライマー（Ａ、Ｂ）が下記の(ａ)または(ｂ)のいずれかの組み合わせから選択される：（ａ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ａ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ｂ)との組合せ；（ｂ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ｂ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ａ)との組合せ
（２）該プライマー（Ａ）の伸長産物と、第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）、
（３）該プライマー（Ａ）の伸長産物と、第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）。
【００４５】
さらに以下の（４）及び（５）を含むことを特徴とする塩基判定用キットである。
（４）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質および／または第三のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質
（５）第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４７】
実施例１
Cytochrome P450 2C19（ＣＹＰ２Ｃ１９）遺伝子の塩基多型 （６３６Ｇ→Ａ）の検出
（１）ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の６３６番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１〜４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１〜４と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）等）に依頼した。
オリゴ１がオリゴヌクレオチドプライマー(Ａ)、オリゴ２がオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)である。オリゴ３は野生型検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）であり、オリゴ４は変異型検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）である。オリゴ１は５’末端をビオチンにより標識され、オリゴ３は５’末端をＦＩＴＣにより標識され、オリゴ４は５’末端をジゴキシゲニンにより標識されている。オリゴ３および４の５’末端を標識することで、オリゴ３および４からの伸長反応を可能にしている。
【００４８】
（２）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子多型の解析
ＰＣＲ法による増幅反応ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の塩基多型 （６３６Ｇ→Ａ）を解析した。
【００４９】
試薬
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１（５’末端をビオチンにより標識） ５ｐｍｏｌ、
オリゴ２ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ３（５’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
オリゴ４（５’末端をジゴキシゲニンにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液 ２．５μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １．０μｌ、
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ ０．４Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００５０】
増幅条件
９４℃・２分
９４℃・１５秒、
６０℃・３０秒、
６８℃・３０秒（３５サイクル）
９８℃・３分、
６５℃・１分、
５５℃・１分、
４５℃・１分、
３５℃・１分、
２５℃・１５分。
【００５１】
（３）アッセイプレートを用いた検出
増幅反応液１５μｌをＰＯＤ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ製）の溶液３０μｌに加えて、室温にて５分間反応させた。これによって、増幅されたＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子断片に結合したジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドであるオリゴ４にＰＯＤ標識抗ジゴキシゲニン抗体が結合する。この反応液をアビジンの結合したアッセイプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）に添加するとプレートのウェル内に増幅されたＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子断片が捕捉される。洗浄液によるプレートの洗浄後、ウェルに洗浄液を添加して励起光を当て、オリゴ３の標識体であるＦＩＴＣによる蛍光を確認した。次に、洗浄液を廃棄し、ＰＯＤ基質液を添加後、オリゴ４の標識体であるジゴキシゲニンに結合したＰＯＤ標識抗ジゴキシゲニン抗体による溶液の発色を目視によって確認した。表１に、試料Ｎｏ．１〜７で示すサンプルおよび試料なしの場合について、ＦＩＴＣによる蛍光およびＰＯＤ標識抗ジゴキシゲニン抗体による溶液の発色について、明らかに確認できたものを「＋」、明らかに確認できなかったものを「−」として示す。
【００５２】
【表１】
2008017753.tif 000002
【００５３】
上記のように、容易にかつ迅速に遺伝子型を明確に判定することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明により、試料核酸中の複数の塩基多型を明確にまた簡便に検出が可能となり、これまでの方法のように煩雑な操作を必要とせず、迅速で容易に再現性の良い結果が得られることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的なプライマー（Ａ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的なプライマー(Ｂ)との組合せの一例
【図２】判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的なプライマー（Ｂ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的なプライマー(Ａ)との組合せの一例
【図３】複合体（Ｐｃ）および（Ｐｄ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉し、第二のリガンドまたは第三のリガンドを検出する一例
【図４】複合体（Ｐｃ）および（Ｐｄ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉し、第二のリガンドを直接検出した後、第三のリガンドを検出する一例
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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