(57)【要約】【課題】  抗アレルギー作用に十分優れ、しかも副作用が十分に抑制された人体や皮膚に緩和である物質を提供する。【解決手段】  下記一般式（１）で表されるフロロアシルフェノン配糖体。【化１】2008069072.tif 000006［式（１）中、Ｒ１はイソプロピル基、イソブチル基又はｓｅｃ−ブチル基を示す。］ 【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるフロロアシルフェノン配糖体。
【化１】
2008069072.tif 000005
［式（１）中、Ｒ１はイソプロピル基、イソブチル基又はｓｅｃ−ブチル基を示す。］
【請求項２】
植物組織の冷水抽出物から分離して得られる、請求項１記載のフロロアシルフェノン配糖体。
【請求項３】
前記植物組織がホップの組織である、請求項１又は２記載のフロロアシルフェノン配糖体。
【請求項４】
前記ホップの組織は茎、毬花又は葉である、請求項３記載のフロロアシルフェノン配糖体。
【請求項５】
抗アレルギー作用を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載のフロロアシルフェノン配糖体。
【請求項６】
抗酸化剤としての作用を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載のフロロアシルフェノン配糖体。
【請求項７】
チロシナーゼ活性阻害作用を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載のフロロアシルフェノン配糖体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のフロロアシルフェノン配糖体を含有する飲食品。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のフロロアシルフェノン配糖体を含有する化粧品。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のフロロアシルフェノン配糖体を含有する医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なフロロアシルフェノン配糖体、その製造方法、抗アレルギー剤及び抗酸化剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ホップはビールの爽快な苦味と香りを与える主要な原料であるが、このホップにおいて球果に含まれるルプリン腺毛内で二次代謝産物が多く分泌され、これら二次代謝産物がビールの苦味や香りに大きく寄与していることが明らかになってきた。更に近年では、これらの二次代謝産物が薬理作用を有していることが示されている。例えば、ビールの苦味物質の素の１つであるフムロンには骨粗鬆症に対して効果があることが示されている（非特許文献１参照）。また、ホップのプレニルフラボノイドであるキサントフモールや８−プレニルナリンゲニン等には、抗癌活性があることが示されている（例えば非特許文献２及び３参照）。
【０００３】
また、抗酸化剤として有効な成分が、ホップ苞の水溶性画分をゲル型合成吸着剤に吸着させることで得られることが報告されている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特許第３４７７６２８号公報
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（１），１５８，１９９７
【非特許文献２】Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ３７，２７１−２８５，１９９９
【非特許文献３】Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８０，５８０−５８５，２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、ヒトにおけるアレルギー反応の機構は、概して、体内に侵入した異物（細菌、花粉、ダニなど：抗原、アレルゲン）を排除するためにそれに対抗する生体成分（抗体、リンパ球など）を産生して体を守るように働く、というものであり、このように体を守る機構は一般に免疫機能とも呼ばれる。ところが、その免疫機能が異物に対して過敏に働くため、却って身体に有害となり、種々の病気の原因となってしまう場合がある。この免疫機能による身体への傷害的な過敏症状はアレルギーと呼ばれており、即時型アレルギー（またはＩ〜ＩＩＩ型アレルギー）と遅延型アレルギー（またはＩＶ型アレルギー）とに分類されている。
【０００５】
アレルギー反応の中で発症頻度がより高いのは即時型であり、その反応機構は主として以下のように考えられている。まず体内にアレルゲンが侵入すると、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体が産生する。このＩｇＥ抗体は肥満細胞及び好塩基球に対して強いエフェクター作用を有する。肥満細胞及び好塩基球は、ヒスタミンやセロトニンといった薬理的活性アミンを含む顆粒を有する細胞であり、前者は血管周辺や結合組織に存在し、後者は血液中に存在している。これらの細胞の細胞膜上にはＩｇＥ抗体を結合するレセプターが存在している。このレセプターはＩｇＥ抗体と強く結合する性質を有しているため、産生したＩｇＥ抗体の多くはレセプターに結合した状態で保持されている。そして、そのような状態にあるＩｇＥ抗体に対し再び同種のアレルゲンが結合すると、脱顆粒を伴い前述のヒスタミンやセロトニンなどの多数の活性物質がそれらの細胞から放出される。その結果、種々のアレルギー症状が発生する。
【０００６】
例えば、皮膚にかゆみを伴う発赤やふくれあがった発疹（蕁麻疹）ができる症状、鼻や目が炎症を起こしてかゆくなり鼻汁や涙の分泌が盛んになるといった症状、あるいは気管がつまったりして呼吸困難の発作を起こしたりする症状（気管支喘息）などは、この即時型のアレルギー疾患として分類されている。
【０００７】
従来使用されている抗アレルギー剤の多くは、作用点が比較的明らかな即時型アレルギー反応によって引き起こされる上述の疾患に対する薬剤である。そのような薬剤として、例えば平滑筋を弛緩させる鎮痙薬や毛細血管の透過性の亢進を抑制する交感神経興奮薬、さらには抗ヒスタミン薬などが挙げられる。しかしながら、これらはいずれも対症治療用の薬剤であり、しかも、そのほとんどが合成医薬品であるため、服用により眠気を催したり、血圧が高くなる等の副作用の点で問題がある。
【０００８】
そこで本発明は抗アレルギー作用に十分優れ、しかも副作用が十分に抑制された人体や皮膚に緩和である新規な物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、食品成分としてビール等の原料に用いられているホップなど植物の組織からの抽出成分が、肥満細胞及び好塩基球からのヒスタミン及びセロトニン等の薬理的活性アミンを含む顆粒の放出を抑制できれば、花粉症等の即時型アレルギー症状に対する予防及び治療に繋がると考えた。そして本発明者らは、植物の組織を種々スクリーニングする過程において、ホップを原料とする抽出処理を経て特定の新規な化合物を単離・精製することに成功し、その化合物の効用をアッセイ試験で確認したところ上記目的を達成し得る物質であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、下記一般式（１）で表されるフロロアシルフェノン配糖体を提供する。
【化１】
2008069072.tif 000002
ここで、式（１）中、Ｒ１はイソプロピル基、イソブチル基又はｓｅｃ−ブチル基を示す。
【００１１】
本発明のフロロアシルフェノン（Phloroacylphenone）配糖体は、植物組織由来のものであり、植物組織の冷水抽出物から分離して得られるものである。ここで「冷水」とは室温以下の水を意味する。
【００１２】
このフロロアシルフェノン配糖体を冷水抽出物から分離するには、冷水抽出物を高速液体クロマトグラフのカラムに通液すればよい。また、植物組織の冷水抽出物から合成吸着剤に吸着して得られる吸着成分をメタノール若しくはエタノールと水との混合溶媒中に溶出し、その混合溶媒を上述の高速液体クロマトグラフのカラムに通液すると好ましい。こうすると、より確実に本発明のフロロアシルフェノン配糖体を分離できる。
【００１３】
本発明において、植物組織としてホップの組織が挙げられる。ホップを原料として用いることにより、更に効率的かつ確実に本発明のフロロアシルフェノン配糖体を得ることができる。また、抽出に用いるホップの組織は、ホップの茎、毬花及び／又は葉であってもよく、濃縮ホップペレット加工時に得られるスペントホップ又は炭酸ガス抽出（超臨界抽出）した残渣も使用可能である。
【００１４】
本発明者らは、インビトロでのヒト好塩基球株化細胞（ＫＵ８１２）を用いたアッセイ試験により、上記フロロアシルフェノン配糖体の抗ヒスタミン作用の強さが、５０％抑制濃度（ＩＣ５０）の値で２９０μｇ／ｍＬであることを確認した。このことは、本発明のフロロアシルフェノン配糖体が抗アレルギー作用を有することを示唆している。また、このフロロアシルフェノン配糖体は、その構造から抗酸化作用及びチロシナーゼ活性阻害作用を示すことが期待される。以上のことから、このフロロアシルフェノン配糖体を飲食品、化粧品又は医薬品に含有させると有用である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、抗アレルギー作用に十分優れ、しかも副作用が十分に抑制された人体や皮膚に緩和である物質を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のフロロアシルフェノン配糖体は、上記一般式（１）で表される新規な化合物であり、配糖体の構造を有する。式（１）中、Ｒ１はイソプロピル基、イソブチル基又はｓｅｃ−ブチル基を示す。すなわち本発明の新規なフロロアシルフェノン配糖体は、下記式（２）、（３）又は（４）で表される３種の化合物（それぞれ、フロロイソブチロフェノン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フロロ−２−メチルブチロフェノン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フロロイソバレロフェノン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）である。
【化２】
2008069072.tif 000003
【００１７】
本発明のフロロアシルフェノン配糖体は、植物由来のものであり、植物組織の冷水抽出物から分離して得られるものである。
【００１８】
植物組織としては、上記フロロアシルフェノン配糖体を比較的多く含むホップの茎、毬花及び葉などの組織が好ましく、ルプリン腺等の腺組織が多く含まれるホップの毬花の部分の組織であるとより好適である。また、濃縮ホップペレットへの加工時に得られるスペントホップや炭酸ガス抽出によりホップエキス抽出した後の滓も有用である。
【００１９】
ビール醸造の副産物の有効利用の観点から、ホップがビール醸造用ホップであると好ましい。
【００２０】
植物組織の冷水抽出物は常法によって得ることが可能である。例えば、植物組織としてホップの組織を用いる場合、その組織からなるペレットと蒸留水とを容器に入れ、適宜撹拌しながら所定時間静置する。こうして静置後に得られた液は、そのまま植物組織の冷水抽出物として利用することも可能であるし、例えば、その液を遠心した後に生じる上清（以下、「遠心上清」という。）を採取したものを植物組織の冷水抽出物して利用することも可能である。さらには、静置後に得られた液又は遠心上清から水分を除去したものを冷水抽出物として利用することもできる。
【００２１】
植物組織の冷水抽出物を得る際の水の温度は室温以下であって水が凍らない温度であればよい。具体的には０〜５０℃であると好適であり、５〜５０℃であるとより好ましく、５〜３０℃であると更に好ましい。水の温度がこの温度範囲よりも低温だと、水が凍るために抽出効率が低下する傾向にあり、この温度範囲よりも高温だと、フロロアシルフェノン配糖体以外の成分が溶出するため、フロロアシルフェノン配糖体を分離する処理が煩雑になる傾向にある。
【００２２】
次に、本発明のフロロアシルフェノン配糖体の分離方法について、好適な実施形態を説明する。本実施形態のフロロアシルフェノン配糖体の分離方法は、植物組織の冷水抽出物をヘキサンに接触させて水側に第１の抽出物を得るステップ（以下、「第１ステップ」という。）、第１の抽出物を酢酸エチルに接触させて水側に第２の抽出物を得るステップ（以下、「第２ステップ」という。）、第２の抽出物をブタノールに接触させて、そのブタノール中に第３の抽出物を得るステップ（以下、「第３ステップ」）、合成吸着剤を充填したカラムに第３の抽出物を通液して合成吸着剤に吸着させるステップ（以下、「第４ステップ」という。）、合成吸着剤に吸着した成分を水及びメタノールの混合溶媒に溶出させるステップ（以下、「第５ステップ」という。）、並びに、溶出した吸着成分を含む混合溶媒を、所定の吸着剤を充填したカラムを備える高速液体クロマトグラフの当該カラムに通液して、所望のフロロアシルフェノン配糖体を単離するステップ（以下、「第６ステップ」という。）を備える。
【００２３】
（第１ステップ）
第１ステップでは、ホップなどの植物組織の冷水抽出物をヘキサンに接触させる。これにより、本発明のフロロアシルフェノン配糖体以外の植物組織の成分をヘキサン中に抽出して選択的に冷水抽出物から除去できるため、フロロアシルフェノン配糖体の含有割合を当初よりも更に高めた第１の抽出物を得ることができる。植物組織の冷水抽出物のヘキサンへの接触方法としては、例えば、上述の遠心上清及びヘキサンを分液ロートに入れた後、その分液ロートを振とうして冷水抽出物をヘキサンと接触させる方法が挙げられる。冷水抽出物をヘキサンと接触させた後に分液ロートを静置すると、分液ロート中の液が水とヘキサンとに分離するが、本発明のフロロアシルフェノン配糖体は水中に含まれることになる。
【００２４】
上記分液ロートから採取した水は、第１の抽出物としてそのまま第２ステップに用いてもよく、水の一部を蒸発等により除去して濃縮したものを第１の抽出物として用いてもよい。
【００２５】
（第２ステップ）
第２ステップでは、第１ステップにおいて得られる第１の抽出物を酢酸エチルに接触させる。これにより、本発明のフロロアシルフェノン配糖体以外の植物組織の成分を酢酸エチル中に抽出して、更に選択的に第１の抽出物から除去できるため、フロロアシルフェノン配糖体の含有割合を第１の抽出物よりも更に高めた第２の抽出物を得ることができる。第１の抽出物の酢酸エチルへの接触方法としては、例えば、第１の抽出物及び酢酸エチルを分液ロートに入れた後、その分液ロートを振とうして第１の抽出物を酢酸エチルと接触させる方法が挙げられる。第１の抽出物を酢酸エチルと接触させた後に分液ロートを静置すると、分液ロート中の液が水と酢酸エチルとに分離するが、本発明のフロロアシルフェノン配糖体は水中に含まれることになる。
【００２６】
上記分液ロートから採取した水は、第２の抽出物としてそのまま第３ステップに用いてもよく、水の一部を蒸発等により除去して濃縮したものを第２の抽出物として用いてもよい。
【００２７】
（第３ステップ）
第３ステップでは、第２ステップにおいて得られる第２の抽出物をブタノールに接触させる。これにより、本発明のフロロアシルフェノン配糖体を選択的にブタノール中に抽出した第３の抽出物を得ることができる。第２の抽出物のブタノールへの接触方法としては、例えば、第２の抽出物及びブタノールを分液ロートに入れた後、その分液ロートを振とうして第２の抽出物をブタノールと接触させる方法が挙げられる。第２の抽出物をブタノールと接触させた後に分液ロートを静置すると、分液ロート中の液が水とブタノールとに分離するが、本発明のフロロアシルフェノン配糖体はブタノール中に含まれることになる。
【００２８】
この第３ステップは、より多くのフロロアシルフェノン配糖体を得るために、複数回繰り返されてもよく、２〜４回程度繰り返されると好ましい。
【００２９】
上記分液ロートから採取したブタノールは、第３の抽出物としてそのまま第４ステップに用いてもよく、ブタノールの一部を蒸発等により除去して濃縮したものを第３の抽出物として用いてもよい。
【００３０】
（第４ステップ）
第４ステップでは、合成吸着剤を充填したカラムに、第３ステップで得られたフロロアシルフェノン配糖体を含む第３の抽出物を通液する。これにより、第３の抽出物中のフロロアシルフェノン配糖体を含む成分が吸着成分として選択的に合成吸着剤に吸着する。合成吸着剤としては、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−７及びＸＡＤ−１６（オルガノ社製、商品名）などが挙げられ、その他に、活性炭及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰＰ；ポリフェノール吸着剤）などの吸着剤を用いることができるが、この中でもＸＡＤ−４が好ましく用いられる。
【００３１】
（第５ステップ）
第５ステップでは、吸着成分の吸着した上記合成吸着剤を水及びメタノールの混合溶媒（メタノール水溶液）と接触させて、混合溶媒中にフロロアシルフェノン配糖体を含む吸着成分を溶出させる。混合溶媒中のメタノールの配合割合は特に限定されないが、混合溶媒中に高濃度でフロロアシルフェノン配糖体を含有させる観点から、混合溶媒の全量に対して４０〜６０質量％であると好ましい。なお、この第５ステップに先立って、吸着成分の吸着した合成吸着剤を、水あるいは吸着成分を溶出する際に用いる混合溶媒よりもメタノールの配合割合が少ない混合溶媒により洗浄すると好ましい。これにより、フロロアシルフェノン配糖体以外の吸着成分を合成吸着剤からある程度選択的に除去することができる。
【００３２】
（第６ステップ）
第６ステップでは、第５ステップにおいて溶出した吸着成分を含む上記混合溶媒を、所定の吸着剤を充填したカラムを備える高速液体クロマトグラフ（以下、「ＨＰＬＣ」という。）の当該カラムに通液して分離・精製を行い、所望のフロロアシルフェノン配糖体を単離する。単離したフロロアシルフェノン配糖体は、その保持時間に応じて適宜分取すればよい。また、本発明のフロロアシルフェノン配糖体を高純度で単離するためには、逆相カラムを用いることが好ましく、所定の吸着剤であるカラムの充填剤としてはシリカゲル等の多孔質担体の表面を炭化水素により被覆されたものが好適に用いられ、炭化水素の炭素数は８〜１８のものが好適に用いられる。第５ステップにおいて溶出した吸着成分を含む上記混合溶媒は、これらのカラムのいずれか１種のみを通過してもよく、２種以上のカラムを順次通過してもよい。
【００３３】
溶離液（移動相）としては水及びメタノールの混合液、並びに、水及びアセトニトリルの混合液などの水及び有機溶媒の混合液が挙げられる。溶離液である混合液中の各成分の配合割合は特に制限されないが、本発明のフロロアシルフェノン配糖体を高い純度で効率よく採取するためには、２液間の配合割合を一定の速度で変化させるリニアグラジェント溶出法に基づいて、水及び有機溶媒の配合割合を変化させることが好ましい。
【００３４】
本発明に係るフロロアシルフェノン配糖体を上述の吸着成分から分取する際には、ＨＰＬＣにより分離された各成分を紫外吸収スペクトル分析法などの分析法によりモニタリングしながら分取することが好ましい。
【００３５】
こうして、本発明の新規なフロロアシルフェノン配糖体を単離することが可能となる。
【００３６】
本発明のフロロアシルフェノン配糖体は、種々のアレルギー性疾患、例えば、上述した即時型のアレルギー疾患及び慢性アレルギー性炎症（例えば、アレルギー性鼻炎、花粉症、アトピー性皮膚炎など）の予防又は症状の緩和への使用が期待できる。すなわち、この新規なフロロアシルフェノン配糖体は抗アレルギー剤としての機能を発揮する。
【００３７】
本発明のフロロアシルフェノン配糖体は、抗アレルギー作用、特にヒスタミン遊離抑制作用を示すことから、特にアレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び花粉症の予防または症状の緩和の目的で、医薬品として特にアレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び花粉症の予防剤又は治療剤に製造することができる。
【００３８】
さらには、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び花粉症の予防や症状の緩和の目的で、食品添加物として、特定保健用飲食品、特殊栄養飲食品、栄養補助飲食品、健康飲食品、機能性飲食品や病者用飲食品などに配合することができる。
【００３９】
また、本発明のフロロアシルフェノン配糖体は、その構造から抗酸化作用、チロシナーゼ活性阻害作用を示すことが示唆され、化粧品として、スキンケア製品、ファンデーションやメイクアップ製品等に添加することも期待できる。
【００４０】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【００４１】
上記好適な実施形態では、第４ステップよりも前に第１ステップ、第２ステップ及び第３ステップ（以下、「第１〜第３ステップ」という。）をこの順で設けているが、例えば別の実施形態において、第１〜第５ステップの全てを省略しても、フロロアシルフェノン配糖体を単離することはできる。この場合、第６ステップにおいて、第５ステップで溶出した吸着成分を含む混合溶媒に代えて植物組織の冷水抽出物を、所定の吸着剤を充填したカラムを備えるＨＰＬＣの当該カラムに直接通液すればよい。あるいは、第６ステップの前に第４ステップ及び第５ステップを設けると、フロロアシルフェノン配糖体の単離が容易になるので好ましい。この場合、第４ステップにおいて、合成吸着剤を充填したカラムに植物組織の冷水抽出物を直接通液すればよい。
【００４２】
また、上記好適な実施形態では第３ステップよりも前に第１ステップ及び第２ステップをこの順で設けているが、例えば別の実施形態において、第１ステップ及び第２ステップのいずれか又は両方を省略してもよく、あるいはこれらのステップが逆に設けられてもよい。また、上記好適な実施形態又は別の実施形態において、第３ステップよりも前に、ヘキサン及び酢酸エチル以外の有機溶媒に植物組織の冷水抽出物を接触させてもよい。
【００４３】
また、第３ステップにおいて用いるブタノールに代えて、それ以外の炭素数４〜５のアルカノールを用いてもよいが、フロロアシルフェノン配糖体を一層高い選択性をもって含むには、ブタノールの方が好ましい。
【００４４】
また第５ステップにおいて用いる混合溶媒中のメタノールに代えて他のアルコール（例えばエタノール）を用いてもよく、第６ステップにおいて用いる混合溶媒中のメタノールに代えて他のアルコール（例えばエタノール）を用いてもよい。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、特に明記しない限り、「％」は「体積％」を表す。
【００４６】
（実施例１）
［ホップペレットからフロロアシルフェノン配糖体の単離］
ホップペレット（チェコ産ザーツ種、タイプ９０）１ｋｇを蒸留水１０Ｌに入れ、５℃にて時々攪拌しペレット状態を消失させながら一晩静置した。７０００ｒｐｍで１５分遠心分離した後、上清（遠心上清）を回収した。上清をさらに濃縮して１７０ｇの濃縮物（冷水抽出物）が得られた。濃縮物を分液ロートに移し、その分液ロートにヘキサンを加えた後、振とう及び静置して、その分液ロートからヘキサン相２．４ｇを除去した（第１ステップ）。さらに、水相が残存するその分液ロートに酢酸エチルを加えた後、振とう及び静置して、その分液ロートから酢酸エチル相２．９ｇを除去した（第２ステップ）。最後に水相が残存するその分液ロートにｎ−ブタノールを添加した後、振とう及び静置してｎ−ブタノール相を別の容器に移した（第３ステップ）。この第３ステップを３回繰り返した後、別の容器に移したｎ−ブタノールを全て収集して減圧濃縮し、最終的に１２．２ｇの抽出物を得た。この抽出物には、後述の構造決定により、上記式（２）、（３）及び（４）で表される新規なフロロアシルフェノン配糖体が含まれていることが確認できた。なお、分液ロート中に残存した水相は１１４．６ｇであった。
【００４７】
さらにフロロアシルフェノン配糖体を濃縮して純度を高めるために、まず、合成吸着剤としてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−４（オルガノ社製、商品名）を充填した内径４０ｍｍ×長さ４５０ｍｍのカラムの中に上記抽出物を通液した（第４ステップ）。次いで、抽出物を通液した後のカラムに、蒸留水、１０％メタノール水溶液（１０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）、２０％メタノール水溶液（２０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）を通液してカラムを洗浄した。次に、洗浄後のカラムに５０％メタノール水溶液（５０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）を通液して、抽出物を含むメタノール水溶液３．６ｇを得た（第５ステップ）。
【００４８】
第５ステップにおいて得られたメタノール水溶液中の各成分を分取可能な程度に単離するために、ポリフェノールが含まれるその水溶液をＨＰＬＣに備えられるカラムに通液し、その水溶液中に含まれる各成分を分離した（第６ステップ）。カラムは２種類のカラム（第１カラム、第２カラム）を用いた。第１カラムとして、Ｄ−ＯＤＳ−５（ワイエムシィ社製、内径２０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、商品名）を４０℃にて使用し、流速を６ｍＬ／分とした。溶離液（移動相）は、メタノール及び水の混合液を用い、まず１０％メタノールで１０分間維持した後、１０％メタノールから６０％メタノールまで１６０分間でメタノールの割合を変化させるリニアグラジェントとした。これにより水溶液中の各成分を粗分けした。ＵＶ検出器（波長２９０ｎｍ）でモニタリングしながら、フロロアシルフェノン配糖体を主に含む溶液を２４０ｍｇ採取した。
【００４９】
次に、採取した２４０ｍｇの溶液を第２カラムに通液して各成分を単離した。第２カラムとして、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製、内径１９ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、商品名）を４０℃にて使用し、流速を６ｍＬ／分とした。溶離液（移動相）は、アセトニトリル及び水の混合液を用い、まず１０％アセトニトリルで１０分間維持した後、１０％アセトニトリルから６０％アセトニトリルまで１６０分間でアセトニトリルの割合を変化させるリニアグラジェントとした。ＵＶ検出器（波長２９０ｎｍ）でモニタリングしながら、総量１４０ｍｇのフロロアシルフェノン配糖体を分取した。このうち式（２）で表される化合物は１１０ｍｇであった。
【００５０】
［フロロアシルフェノン配糖体の構造決定］
タイプ９０のホップペレット中の配糖体成分を同定・構造決定した。
【００５１】
タイプ９０のホップペレットの冷水抽出物を、まず、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣによる分析は、カラムとしてＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製、内径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、商品名）を４０℃にて使用し、流速を０．２ｍＬ／分とした。移動相は、０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏを１液とし、アセトニトリルを２液とし、０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏの割合を１０％〜５０％まで１６分間で変化させるリニアグラジェントとした。検出はＵＶ検出器（２９０ｎｍ）で行った。ＨＰＬＣの分析結果を図１に示す。図１から、タイプ９０のホップペレットの冷水抽出物中に配糖体成分として主に、ピークＡ〜Ｆに相当する６種の成分が存在することが分かった。これらのピークのうちＡ、Ｂ及びＤは、上述の第６ステップと同様の方法により分取し、更に同定した結果から、それぞれイソケルシトリン、ケルセチンマロニルグルコシド及びケンフェロールマロニルグルコシドであることが判明した。
【００５２】
次に上述の第６ステップと同様の方法により分取したピークＣに相当する成分を、重メタノールを用いた１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び１Ｈ−１Ｈ−ＣＯＳＹで分析した。１Ｈ−ＮＭＲの結果を図２及び３に、１３Ｃ−ＮＭＲの結果を図４に、１Ｈ−１Ｈ−ＣＯＳＹの結果を図５にそれぞれ示す。
【００５３】
次に、Ｗａｔｅｒｓ社のＬＣ／ＭＳ装置（ＭＳ検出器：ＺＱ検出器）を用いて、ピークＣに相当する成分の分析を行った。ＬＣのカラムとしてＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製、内径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、商品名）を４０℃にて使用し、流速を０．２ｍＬ／分とした。移動相は、０．１％ギ酸／Ｈ２Ｏを１液とし、アセトニトリルを２液とし、０．１％ギ酸／Ｈ２Ｏの割合を１０％〜５０％まで１６分間で変化させるリニアグラジェントとした。ＵＶ検出器（２９０ｎｍ）でモニタリングをしながら行った。ポジティブスキャン（ｍ／ｚ１２０〜ｍ／ｚ６５０、キャピラリー電圧：＋３．０ｋＶ、コーン電圧：＋２５Ｖ）での結果を図６の（ａ）に、ネガティブスキャン（ｍ／ｚ１２０〜ｍ／ｚ６５０、キャピラリー電圧：−３．０ｋＶ、コーン電圧：−２５Ｖ）での結果を図６の（ｂ）に示す。この結果より、分子イオンが解裂してｍ／ｚ１６２の少ないシグナルが検出されていることから、配糖体の構成糖がヘキソースであることが判明した。
【００５４】
次いで、ピークＣに相当する成分７．５ｍｇを２ＮのＨＣｌ３ｍＬに溶解し、１００℃で３０分間還流し加水分解を行った。その後、得られた反応液を、吸着剤としてＭＥＧＡＢＯＮＤ  ＥＬＵＴ  Ｃ１８（２ｇ、Ｖａｒｉａｎ社製、商品名）を充填したカラムに通液し、最初の１０ｍＬを廃棄した後、次の１０ｍＬを回収した。回収した反応液についてＮＨ２カラム（資生堂社製、商品名「ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＮＨ２  ＵＧ８０」、内径２．０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）を用いたＬＣ／ＭＳ分析を行った。分析条件は、カラム温度を８０℃、溶離液は８９％アセトニトリル／水を０．２５ｍＬ／分の流量とし、ネガティブＳＩＲ（ｍ／ｚ１７９、キャピラリー電圧：−３．２ｋＶ、コーン電圧：−２５Ｖ）とした。また参照用としてマンノース、ガラクトース及びグルコースについても同様の分析を行った。結果のマススペクトルを図７に示す。（ａ）がマンノース、（ｂ）がガラクトース、（ｃ）がグルコース、（ｄ）が回収した反応液のマススペクトルである。これにより配糖体の構成糖はグルコースであることが明らかとなり、ピークＣに相当する成分が式（２）で表される化合物であることが確認された。
【００５５】
次に、図１におけるＨＰＬＣクロマトグラムのピークＣ、ピークＥ及びピークＦに相当する成分のＵＶ吸収を測定した。結果のＵＶ吸収スペクトルを図８に示す。それぞれ（ａ）がピークＣ、（ｂ）がピークＥ、（ｃ）がピークＦに相当する成分のＵＶ吸収スペクトルである。これにより、３成分ともＵＶ吸収スペクトルのパターンが同様であることが分かった。
【００５６】
次いで、ピークＥ及びピークＦに相当する成分のＬＣ／ＭＳ分析を行った。図１４に図６の（ａ）のマススペクトルを得るための条件と同様の条件で行ったＬＣ／ＭＳ分析の結果、図１５に図６の（ｂ）のマススペクトルを得るための条件と同様の条件で行ったＬＣ／ＭＳ分析の結果をそれぞれ示す。図１４及び１５において、それぞれ（ａ）がピークＥ、（ｂ）がピークＦに相当する成分のマススペクトルである。この結果より、ピークＥ及びピークＦに相当する成分はいずれも分子イオンがピークＣに相当する成分よりも１４大きいことが判明した。この結果から、ピークＥ及びピークＦに相当する成分はピークＣに相当する成分と基本骨格が同じであり、側鎖の構造のみが異なることが示唆された。
【００５７】
最後に、ピークＥ及びピークＦに相当する成分を、重メタノールを用いた１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び１Ｈ−１Ｈ−ＣＯＳＹで分析した。ピークＦに相当する成分の１Ｈ−ＮＭＲの結果を図９、１３Ｃ−ＮＭＲの結果を図１０、１Ｈ−１Ｈ−ＣＯＳＹの結果を図１１にそれぞれ示す。ピークＥに相当する成分の１Ｈ−ＮＭＲの結果を図１２に、１Ｈ−１Ｈ−ＣＯＳＹの結果を図１３にそれぞれ示す。これらの結果から、ピークＥに相当する成分が式（４）で表される化合物であり、ピークＦに相当する成分が式（３）で表される化合物であることが確認された。
【００５８】
（実施例２）
［フロロアシルフェノン配糖体のヒスタミン遊離抑制作用を確認するインビトロでのアッセイ試験］
ヒト好塩基球株化細胞（ＫＵ８１２）を、１０％の５６℃にて３０分間不活性化した牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ）で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。細胞にＴｙｒｏｄｅ溶液を添加して遠心（１５００ｒｐｍ、５分、４℃）し、Ｔｙｒｏｄｅ溶液で２回の洗浄を繰り返した後、Ｔｙｒｏｄｅ溶液に懸濁し、１．５ｍＬ容のチューブに２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように分注した。細胞懸濁液にそれぞれ表１に示した量の緩衝液、１０ｍＭのＣａＣｌ２、５０μＭのＡ２３１８７及び／又は被検化合物（式（２）で表されるフロロアシルフェノン配糖体）を加え、３７℃にて２０分間ヒスタミン遊離反応をさせた後、氷中に５分間入れて反応を停止させた。
【００５９】
【表１】
2008069072.tif 000004
【００６０】
その後４℃にて１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を回収した。回収された上清から有機溶媒で遊離ヒスタミンを抽出し、ｏ−フタルアルデヒドと反応させ発生した蛍光を、波長３５０ｎｍの光で励起した後波長４５０ｎｍにおいて蛍光強度を測定することによって、遊離ヒスタミンを定量した。また、細胞内総ヒスタミンは、同量の細胞懸濁液を氷中で１分間超音波破砕した後、４℃にて１００００ｒｐｍで３分間遠心分離して得た上清中のヒスタミン含量を測定することによって得た。ヒスタミンの遊離抑制率は、ヒスタミン遊離抑制率（％）＝（各サンプルの上清中のヒスタミン含量−自然遊離量）×１００／（Ａ２３１８７刺激によるヒスタミン遊離量−自然遊離量）の式で求め、その結果に基づいて、式（２）で表されるフロロアシルフェノン配糖体のＩＣ５０値（５０％抑制濃度）を求めた。その結果、ＩＣ５０値は２９０μｇ／ｍＬであった。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明のフロロアシルフェノン配糖体を含むポリフェノールのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】本発明のフロロアシルフェノン配糖体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】本発明のフロロアシルフェノン配糖体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４】本発明のフロロアシルフェノン配糖体の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５】本発明のフロロアシルフェノン配糖体の１Ｈ−１Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルである。
【図６】本発明のフロロアシルフェノン配糖体のマススペクトルである。
【図７】本発明のフロロアシルフェノン配糖体から得られる糖及び既知の糖のマススペクトルである。
【図８】本発明のフロロアシルフェノン配糖体のＵＶ吸収スペクトルである。
【図９】本発明のフロロアシルフェノン配糖体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０】本発明のフロロアシルフェノン配糖体の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１１】本発明のフロロアシルフェノン配糖体の１Ｈ−１Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルである。
【図１２】本発明のフロロアシルフェノン配糖体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１３】本発明のフロロアシルフェノン配糖体の１Ｈ−１Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルである。
【図１４】本発明のフロロアシルフェノン配糖体のマススペクトルである。
【図１５】本発明のフロロアシルフェノン配糖体のマススペクトルである。
【図１】
2008069072.tif 000007
【図２】
2008069072.tif 000008
【図３】
2008069072.tif 000009
【図４】
2008069072.tif 000010
【図５】
2008069072.tif 000011
【図６】
2008069072.tif 000012
【図７】
2008069072.tif 000013
【図８】
2008069072.tif 000014
【図９】
2008069072.tif 000015
【図１０】
2008069072.tif 000016
【図１１】
2008069072.tif 000017
【図１２】
2008069072.tif 000018
【図１３】
2008069072.tif 000019
【図１４】
2008069072.tif 000020
【図１５】
2008069072.tif 000021