(57)【要約】      （修正有）【課題】活性メチオニンと呼ばれ、医薬品として使用されるＳ−アデノシルメチオニンの高生産を可能とする、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素（メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ：ＥＣ２．５．１．６）遺伝子を提供する。【解決手段】グルタチオン、核酸等の生産に広く用いられている酵母の一種、キャンディダ・ユティリス染色体遺伝子由来の、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする、特定の塩基配列を有する遺伝子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャンディダ・ユティリス由来のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする遺伝子。
【請求項２】
配列表の配列番号７に示される塩基配列からなる、キャンディダ・ユティリス由来のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニンを高生産するキャンディダ・ユティリスの分子育種に利用される、キャンディダ・ユティリス由来のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓ−アデノシルメチオニンは活性メチオニンとも呼ばれる生体成分で、メチル基のドナーとして生体内のさまざまな反応に関与している。欧州では古くから肝臓や関節炎、鬱などの医薬品として使用されて来た。生体内ではＳ−アデノシルメチオニン合成酵素により、ＡＴＰとＬ−メチオニンから合成される。Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする遺伝子は、大腸菌Escherichia  coli(J．Biol．Chem．259，14505-14507，1984)や酵母 Saccharomyces  cerevisiae (J．Biol．Chem．262，16704-16709，1987)で早くから単離され、詳細な解析が進められている。該酵素は、進化的に良く保存されており、 Arabidopsis  thaliana(Plant  Cell，1，81-93，1989)やラットの肝臓(Eur．J．Biochem．184，497-501，1989)からも該酵素遺伝子が単離されている。しかし、工業的に重要な食用酵母キャンディダ・ユティリス(Candida  utilis)ではまだ該酵素遺伝子は単離されていない。
【０００３】
微生物をＬ−メチオニン濃度の高い培地で培養すると菌体内にＳ−アデノシルメチオニンを蓄積することは古くから知られているが、それはキャンディダ・ユティリスで初めて見いだされた(J．Biol．Chem．229，1027-1050，1957)。その後の微生物検索により、清酒酵母（Saccharomyces  cerevisiae）がキャンディダ・ユティリスより数倍高い生産能力を有する事が明らかとなり、その後キャンディダ・ユティリスをＳ−アデノシルメチオニンの生産に用いる試みはなされていない。
【０００４】
キャンディダ・ユティリスは、グルタチオン、核酸等の生産株として広く工業的に利用されてきた。該酵母は、炭素資化域が広く、好気的条件下での培養でエタノールを生成せず、その増殖阻害も受けないことから、高濃度での連続培養による菌体製造が可能であり、有用物質の工業的生産に適した宿主である。
【０００５】
組み換えＤＮＡ技術の発展によって、遺伝子を自在に改変しあるいは加工し、これを細胞に導入して遺伝子を組み換え、例えばその発酵特性の改良、工業的有用性の増大、などが行われており、種々の酵母で可能となってきた。近年、キャンディダ・ユティリスにおいても宿主ベクター系が整備されてきている（特許文献１，２，３）。
【特許文献１】ＷＯ９５／３２２８９号公報
【特許文献２】特開２００６-０７５１２３号公報
【特許文献３】特開２００６-１０１８６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、炭素資化域が広く、好気的条件下での培養でエタノールを生成せず、高濃度での連続培養による菌体製造が可能であるという特徴を有することから、有用物質の工業的生産に適した宿主として知られているキャンディダ・ユティリスに、キャンディダ・ユティリス由来のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする遺伝子を導入することにより、Ｓ−アデノシルメチオニンを高生産するキャンディダ・ユティリスを造成することにある。
具体的には、キャンディダ・ユティリスに導入し発現させることで、Ｓ−アデノシルメチオニンを高生産するキャンディダ・ユティリスを造成することを可能にする、キャンディダ・ユティリス由来のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする遺伝子を取得する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、キャンディダ・ユティリス由来のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードした遺伝子をクローニングするため鋭意研究の結果、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡから該タンパク質をコードする遺伝子断片のクローニングに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
（１）キャンディダ・ユティリス由来のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする遺伝子、
（２）配列表の配列番号７に示される塩基配列からなる、キャンディダ・ユティリス由来のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする遺伝子、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明が提供するキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子は、キャンディダ・ユティリス細胞内において機能を持つＳ−アデノシルメチオニン合成酵素に翻訳される。強力なプロモーター制御下で該酵素遺伝子を高発現させることにより、特にキャンディダ・ユティリスにおいて、著量のＳ−アデノシルメチオニンを生産することができる。キャンディダ・ユティリスは、炭素資化域が広く、好気的条件下での培養でエタノールを生成せず、高濃度での連続培養による菌体製造が可能であるという特長を有する宿主であることから、これにより、たとえばSaccharomyces  cerevisiaeと異なり、安価な合成培地を用いることもでき、高密度連続培養によりＳ−アデノシルメチオニンを高生産することも可能となるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする遺伝子とは、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡからクローニングされた、該タンパク質をするコードするＤＮＡ断片、具体的には、配列番号７に示す塩基配列で示されるものである。
【００１０】
染色体遺伝子から目的のＤＮＡ断片をクローニングする手順について、以下、説明する。
１．ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ−ＰＣＲによるＳ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする部分ＤＮＡ断片の取得
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子クローニングのプローブとして用いるため、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ−ＰＣＲによりＳ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子の部分ＤＮＡ断片を取得した。
【００１１】
２．Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子のクローニング
キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、上記ＰＣＲで得たＳ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子に特異的な部分ＤＮＡ断片をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションに供した。プローブとハイブリダイズするサイズのＤＮＡを回収し、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。得られたアンピシリン耐性を示す形質転換体について、同様のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をクローニングした。
【００１２】
３．ＤＮＡ塩基配列の決定
ＤＮＡ塩基配列の決定は、適当な制限酵素を用いたＤＮＡ断片の細分化とプライマーウォーキング法を組み合わせて行った。
配列番号７に示される塩基配列から予測されるアミノ酸配列を解析した結果、S. cerevisiaeのＳ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子と高い相同性が認められ、取得したＤＮＡ断片がＳ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子を含んでいることを確認した。
【００１３】
４．機能の確認
配列から推定されるＳ−アデノシルメチオニン合成酵素の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を、キャンディダ・ユティリスで機能する自律複製型の高発現ベクターに挿入して、キャンディダ・ユティリスＡＨＵ３０５３に導入した。
Ｌ−メチオニンを含むＹＰＤ培地で生産性試験を行い、形質転換体は親株より著量のＳ−アデノシルメチオニンを蓄積することを確認した。
【００１４】
本発明において提供されるキャンディダ・ユティリス由来のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする遺伝子は、キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株から得られたものであるが、当該キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株から誘導される種々の変異株のみならず、キャンディダ・ユティリスに属する他の菌株においても、機能を持つタンパク質に翻訳される。
【００１５】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例１
１．ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ−ＰＣＲによるＳ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子の部分ＤＮＡ断片の取得
既に遺伝子配列が明らかとなっている、Saccharomyces  cerevisiae、Schizosaccharomyces  pombe、Escherichia  coli、Neurospora  crassa由来の各Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素のアミノ酸配列について相同性検索を行い、特に保存性の高い領域を基に縮重したプライマーを作成した。
【００１６】
基にしたアミノ酸配列を配列表の配列番号１、配列番号２に示す。
Ｆ：配列番号１
Ｒ：配列番号２
これらのアミノ酸配列に対応する塩基配列を持つように、配列表の配列番号３、配列番号４に示す塩基配列のプライマーを作成した。
（１）SAM-2F：配列番号３
（２）SAM-3R：配列番号４
全てのプライマーの末端にNotＩを付加してある。
【００１７】
ＰＣＲは、Ｅｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ製）を用い、９４℃、１分の後、９５℃、３０秒→５０℃、１分→７２℃、２．５分を３０サイクル、最後に７２℃、１０分の条件で行った。
キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマー（１）と（２）を用いてＰＣＲを行った結果、約０．６ｋｂｐの断片が強く増幅された。
このＤＮＡ断片をＮｏｔＩで消化した後、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＮｏｔＩサイトに挿入した。この断片の両端について部分塩基配列を解読したところＳ−アデノシルメチオニン合成酵素の内部配列とそれぞれ高い相同性を示し、この断片がＳ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子の特異的な部分配列であることを確認した。
【００１８】
２．Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子のクローニング
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子の特異的な部分配列をプローブとして、キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株のゲノムＤＮＡからＳ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子全長のクローニングを行った。
キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株のゲノムＤＮＡをさまざまな制限酵素で消化し、上記ＰＣＲで得たＳ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子特異的な部分ＤＮＡ断片をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションに供した。プローブの標識や検出にはジゴキシゲニンとその抗体を利用するＤＩＧシステム（Ｒｏｃｈｅ製）を用いた。その結果、ＰｓｔＩ消化したもので約６ｋｂｐにポジティブなシグナルを検出した。シグナルが検出された箇所のアガロースゲルを切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮキット（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてＤＮＡを回収して、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに連結し、ＤＮＡライブラリーとした。
このＤＮＡライブラリーを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られたアンピシリン耐性を示す形質転換体について、同様のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った。ＰｓｔＩ 断片を組み込んだ１６３５個の形質転換コロニーから２つのポジディブのシグナルを得た。
シグナルの得られたクローンについては、マスタープレートからシングルコロニーを分離した後、プラスミドを回収した。これらのプラスミドを組み込みに使用したＰｓｔＩでそれぞれ消化し、再度前記プローブを用いた、サザンハイブリダイゼーションに供した結果、ＰｓｔＩでは２つにポジディブのシグナルを得た。各種制限酵素で消化して得られるフラグメントパターンからこれらは同一のクローンであることを確認した。
陽性のシグナルを得た６ｋｂｐのＰｓｔＩ断片を適当な制限酵素で消化し、得られる細分化されたＤＮＡ断片について、同様のサザン解析を行い、約０．５ｋｂｐのＳａｃＩＤＮＡ断片を中心にＳ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子が含まれると推察された。
【００１９】
３．ＤＮＡ塩基配列の決定
得られたＰｓｔＩの６ｋｂｐのＤＮＡ断片について塩基配列の決定を行った。ＳａｃＩで切り出される約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片とその近傍を中心に解析を進めた。
ＤＮＡ塩基配列の決定は、ジデオキシ法によりキャピラリーシーケンサーＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ３１０を用いて行った。Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子全長の塩基配列は、適当な制限酵素を用いたＤＮＡ断片の細分化とプライマーウォーキング法を組み合わせて解読した。
その結果、ＰｓｔＩ断片中には３８５アミノ酸をコードする配列番号７で示される１１５８ｂｐのＤＮＡより構成されるオープンリーディングフレームが存在していた。このオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列は既知のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素と高い相同性を示した。Saccharomyces  cerevisiaeのＳ−アデノシルメチオニン合成酵素には二つのアイソザイムが存在する。キャンディダ・ユティリスのＳ−アデノシルメチオニン合成酵素はそれらのＳａｍ１、Ｓａｍ２とは ７８．５％、７８．２％のともに高い同一性を示し、配列からはどちらかを同定する事はできなかった。
以上から、キャンディダ・ユティリスのＳ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子は、３８５アミノ酸をコードする配列番号７で示される１１５８ｂｐのＤＮＡで構成されることが明らかとなった。
【００２０】
４．機能の確認
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子をキャンディダ・ユティリス細胞内で高発現させることでＳ−アデノシルメチオニンの生産性向上を試みた。
４−１．  発現ベクターの構築
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素の構造遺伝子は、アミノ酸配列から推定された開始コドンＡＴＧから、終止コドンＴＡＡまでを下記のプライマー（SAM-F：配列番号５、SAM-R：配列番号６）を使用してＰＣＲによりＢａｍＨＩ，ＳｐｅＩ断片として増幅した。
この構造遺伝子を、キャンディダ・ユティリスで機能する自律複製型ベクターＹＲｐＧＡＰ（特許文献２）のグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰ）プロモーター下流のＢａｍＨＩ，ＳｐｅＩ部位に連結した。このプラスミドのＮｏｔＩサイトにＧ４１８耐性カセット（ＬＥＵ２：：Ｐｇａｐ-ｋａｎＭＸ-Ｔｇａｐ）（特許文献３）を挿入して、高発現カセットｐＣｕＳＡＭ−ＫＡＮを作製した（図１）。コントロールにはＹＲｐＧＡＰに同様にＧ４１８耐性カセットを連結したｐＫＡＮを用いた。
【００２１】
プライマー
（３）SAM-F：配列番号５
（４）SAM-R：配列番号６
【００２２】
４−２．  Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素高発現ベクターによるキャンディダ・ユティリスの形質転換
供試菌には酢酸リチウム法でＤＮＡ導入効率の良いＡＨＵ３０５３株を用いた。定法である酢酸リチウム法（J.Bacteriol 1983 153 163）により、０．２μｇのｐＣｕＳＡＭ−ＫＡＮ、またはｐＫＡＮをキャンディダ・ユティリスに形質転換した。形質転換処理した細胞をＹＰＤ液体培地を用いて一時間振とう培養し、Ｇ４１８を４０μｇ／ｍｌになるように添加したＹＰＤ培地に塗沫して３０℃で２日間培養した。
【００２３】
４−３．  形質転換体のＳ−アデノシルメチオニン生産性の確認
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素高発現ベクターを導入したキャンディダ・ユティリスのＳ−アデノシルメチオニン生産性を確認した。
得られたキャンディダ・ユティリスのＧ４１８耐性コロニーをシングルコロニーアイソレーションした。コントロールには、空のベクターｐＫＡＮの形質転換体を用いた。
５０ｍｌのＹＰＤ培地にＬ−メチオニン（和光）  ０．２５％とＧ４１８  １００μｇ／ｍｌを添加した。坂口フラスコで３０  ℃条件で振盪し、ＳＡＭ生成量とＯＤ６００の推移を調べた。菌体からのＳＡＭの抽出は、１．５Ｎ  過塩素酸を用いて室温で１時間振盪して行った。この遠心分離した上清をＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｍｙｔｉｃｉｌ  ＲＰ１８（関東化学）、カラム温度：３０℃、溶離液：０．５Ｍ  蟻酸アンモニウムｐＨ４．０、流速：０．５  ｍｌ／ｍｉｎとし、ＵＶ２６０ｎｍで検出した。Ｓ−（５'-Ａｄｅｎｏｓｙｌ）−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｓａｌｔ（ＳＩＧＭＡ）を０．１Ｎ  の硫酸に適量溶解し、検量線を作成した。
形質転換体は対数増殖期中期で速やかにＳＡＭを蓄積した。親株に比べＳＡＭ生産性が１．６倍向上した（図２）。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
以上、述べてきた通り、本発明によれば、キャンディダ・ユティリス由来の、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする遺伝子が提供され、特に該遺伝子をキャンディダ・ユティリス内で高発現させることにより、Ｓ−アデノシルメチオニンを著量生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子高発現プラスミド。キャンディダ・ユティリスで機能する自律複製起点ＡＲＳ４．２とＧ４１８耐性カセットおよびＳ−アデノシルメチオニン合成酵素高発現カセットで構成される。
【図２】形質転換体のＳ−アデノシルメチオニン生成試験。左図が生育、右図はＳＡＭ生産性を示す。黒四角はＳ−アデノシルメチオニン合成酵素高発現プラスミドのキャンディダ・ユティリス形質転換体、白丸はコントロールプラスミドの形質転換体をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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