(57)【要約】      （修正有）【課題】胚性幹細胞をインビトロで成長させる方法、およびそのためのシステムを提供する。【解決手段】胚性幹細胞（ＥＳＣ）をインビトロで成長させる方法であって、ａ）多孔性膜の表面をＥＳＣと接触させること；ｂ）固体支持体の表面をフィーダー細胞と接触させること；ｃ）培養培地を前記ＥＳＣに供給すること；ｄ）培地を前記フィーダー細胞に供給することを含み、前記多孔性膜は、ｄ）の培地と流体連通している方法。また、マルチウェルプレートを用いる、ＥＳＣ成長用システム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞（ＥＳＣ）をインビトロで成長させる方法であって、ａ）多孔性膜の表面をＥＳＣと接触させること；ｂ）固体支持体の表面をフィーダー細胞と接触させること；ｃ）培養培地を前記ＥＳＣに供給すること；ｄ）培地を前記フィーダー細胞に供給することを含み、前記多孔性膜は、ｄ）の培地と流体連通している方法。
【請求項２】
前記ＥＳＣが、未分化状態で維持されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＳＣが、マウス胚性幹細胞およびヒト胚性幹細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記フィーダー細胞が、線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記線維芽細胞が、マウスおよびヒト線維芽細胞から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記線維芽細胞が、胚線維芽細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＳＣ培養培地が、血清を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＳＣ培養培地が、ＬＩＦを場合により含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記多孔性膜および固体支持体が、マルチウエルプレートに備え付けられている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記マルチウエルプレートが、６、１２、４８または９６ウエルから成るプレートから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記多孔性膜が、ポリマーから成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマーが、ポリエチレンテレフタレート、ポリマークラッドファイバー、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、アガロース、セルロース、多糖類、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエステル、フッ化ポリビニリデン、ポリプロピレン、フルオロカーボン[例えばポリ（テトラフルオロエチレン−ｃｏ−過フルオロ（アルキルビニルエーテル））]、ポリカーボネート、ポリエチレン、ガラス、セラミック、ナイロンおよび金属から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
固体支持体と、前記固体支持体と流体連通している多孔性膜とおよび、ＥＳＣを成長させるために適する培養培地とを含む、ＥＳＣをインビトロで成長させるためのシステム。
【請求項１４】
胚線維芽細胞をさらに含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記多孔性膜および固体支持体が、マルチウエルプレートに備え付けられている、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１６】
前記マルチウエルプレートが、６、１２、４８または９６ウエルから成るプレートから選択される、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
ＥＳＣをさらに含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１８】
前記ＥＳＣが、マウスＥＳＣおよびヒトＥＳＣから選択される、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
固体支持体と、前記固体支持体と流体連通している多孔性膜と、少なくとも１つの容器とおよびＥＳＣを成長させるための説明とを含む、ＥＳＣを成長させるためのキット。
【請求項２０】
前記多孔性膜および固体支持体が、マルチウエルプレートに備え付けられている、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
組織培養プレートにおいてＥＳＣを成長させる方法であって、前記プレートは１つまたはそれ以上のウエルを含み、これらのウエルの各々は、多孔性膜挿入体とおよび、前記多孔性膜挿入体と液体連通する位置に置かれた固体支持体とを含み、ａ）多孔性膜の表面をＥＳＣと接触させること；ｂ）前記多孔性膜挿入体の真下に位置する固体支持体の表面を胚線維芽細胞と接触させること；ｃ）培養培地を前記ＥＳＣに供給すること；ｄ）培養培地を前記胚線維芽細胞に供給することを含む方法。
【請求項２２】
前記培地が、無血清である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、細胞生物学の分野に関する。ある特定の実施形態において、本発明は、幹細胞の成長に関するシステム、キットおよび方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、受精後のあらゆる時点での前胚組織、胚組織または胎児組織に由来し得る。様々なタイプの幹細胞の単離および成長が、以前に記載されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７５：１７３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４；米国特許第５，１６６，０６５号、同第５，３３２，６７２号、同第５，４０５，７７２号、同第５，４５３，３５７号、同第５，６３９，６１８号、同第５，６７２，４９９号、同第５，８４３，７８０号、同第５，９１４，２６８号、同第５，９２２，５９７号、同第５，９６８，８２９号、同第６，０４０，１８０号、同第６，０９０，６２２号、同第６，８３３，２６９号、同第６，５０６，５７４号、同第６，４５８，５８９号、同第６，６６７，１７６号、同第７，０４１，４３８号；国際特許公開  ＷＯ  ９９／２０７４１参照。
【０００３】
適切な条件下で培養した場合、ＥＳＣは、インビトロで未分化状態で無限増殖することができ、正常な核型を保持し、ならびに３つすべての胚性胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の誘導体に分化する能力を保持する。
【０００４】
ＥＳＣは、広範な応用の可能性を有する。いくつか挙げてみると、創薬の分野および基礎科学研究においてこれらは有用であり得る。医薬品開発過程における早期発見には、ターゲットの同定および確認が必要である。ターゲット確認の１つの要素は、遺伝子修飾動物モデルの使用である。医薬品開発に加えて、発現経路および疾病状態の基本的な解明には、一定の機能喪失（「ノックアウト」）および機能獲得（「ノックイン」）動物モデルが必要である。
【０００５】
ヒト幹細胞は、自己免疫疾患、感染性疾患、臓器および組織移植ならびに外傷性損傷および加齢をはじめとする広範な疾病および状態の治療に特に有用であり得る。様々な供給源からのヒトＥＳＣの成長および維持は、その後のすべての応用の出発点となる。しかし、ヒト幹細胞を成長させるという課題は、気が遠くなるような課題である。ヒト幹細胞を成長させるための現行のプロトコルは、多くの場合、ヒトＥＳＣと直接接触している成長したフィーダー細胞（マウス胚線維芽細胞）の使用を含むか、またはマウス胚線維芽細胞によって馴致された培地の存在下、マトリックス、例えばコラーゲンまたはフィブロネクチンなどを用いてヒトＥＳＣを成長させることを含む。
【０００６】
ＥＳＣは、遺伝子修飾マウスモデルの開発において欠くことのできないツールである。ＥＳＣに適用された遺伝子改変が、工学処理されたマウスの遺伝子型に確実に維持されるためには、ＥＳＣが、培養操作、増殖およびその後の胚盤胞注入を通して完全な多能性を保持しなければならない。このＥＳＣが未分化状態で維持されるという要件は、クローンの単離および増殖中の一般的な課題である。一般に、現在の方法は、２つの細胞タイプが直接接触している共培養でＥＳＣとマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層とを共培養することにより、これを達成する。このプロセスは、９６ウエル組織培養処理プレートにおいて、現在行われている。
【０００７】
作業の流れは複雑であり、９６ウエルプレートでのＭＥＦの培養、γ線照射によるＭＥＦの有糸細胞分裂不活性化またはこれらの過剰成長を防止するためのマイトマイシンＣでの処理、およびその後、ＭＥＦを除去した後の胚盤胞注入のためのＥＳＣ使用を含む。必要とされる多数の段階に加えて、ＥＳＣ−ＭＥＦの共培養物は、非常に代謝活性であり、その結果、９６ウエル形式でのより少ない培地量のために培地を１日２回交換する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、任意の供給源からのＥＳＣをインビトロで成長および維持するための条件は、一般に複雑であり、時間がかかり、大きな労力を要し、困難であり、費用がかかる。従って、比較的単純であり、容易に使用でき、人材および財源の最小支出で一貫した結果をもたらす、ＥＳＣをインビトロで成長させるために適する方法、システムおよびキットに対する要求がある。本明細書に開示する本発明の一定の実施形態は、これらの要求を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一定の実施形態において、本発明は、ＥＳＣを多孔性膜の表面で成長させることができるという驚くべき発見に関する。この多孔性膜は、フィーダー細胞を含む細胞培養物と流体連通した状態であることができ、この結果、フィーダー細胞層と、もしくは細胞外基質タンパク質を含む基質と、またはこれら両方とＥＳＣ細胞を直接接触させる必要をなくすことができる。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明は、ＥＳＣをインビトロで成長させる方法を提供し、この方法は、ａ）多孔性膜の表面をＥＳＣと接触させること；ｂ）固体支持体の表面をフィーダー細胞、例えば胚線維芽細胞、胎児線維芽細胞、と接触させること；ｃ）培地を前記ＥＳＣに供給すること；ｄ）培地を前記フィーダー細胞に供給することを含み、前記多孔性膜は、ｄ）の培地と流体連通している。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、組織培養プレートにおいてＥＳＣを成長させる方法を提供し、このプレートは１つ以上のウエルを含み、これらのウエルの各々は、多孔性膜挿入体とおよびこの多孔性膜挿入体と液体連通する位置に置かれた固体支持体とを含み、この方法は、ａ）多孔性膜の表面をＥＳＣと接触させること；ｂ）前記多孔性膜挿入体の真下に位置する固体支持体の表面をフィーダー細胞と接触させること；ｃ）培地を前記ＥＳＣに供給すること；ｄ）培地を前記フィーダー細胞に供給することを含む。
【００１２】
さらに他の実施形態において、本発明は、ＥＳＣをインビトロで成長させるためのシステムを提供し、このシステムは、固体支持体と、この固体支持体と流体連通している多孔性膜とおよびＥＳＣを成長させるために適する培地とを含む。このシステムは、以下のうちの１つ以上をさらに含むことができる。フィーダー細胞（例えば、胚線維芽細胞、胎児線維芽細胞）、胚性幹細胞、培地添加物、哺乳動物血清、必須アミノ酸、抗生物質、ならびに一般に、形質転換株、成長因子および白血病抑制因子（ＬＩＦ）から遺伝学的に選択される物質。
【００１３】
さらに他の実施形態において、本発明は、ＥＳＣを成長させるためのシステムを提供し、このシステムは、組織培養プレートとＥＳＣを成長させるために適する培地とを含み、この培養プレートは、１つまたはそれ以上のウエルを含み、これらのウエルの各々は、多孔性膜挿入体と、この多孔性膜挿入体と液体連通する位置に置かれた固体支持体とを含む。このシステムは、線維芽細胞、例えば胚線維芽細胞、胎児線維芽細胞および／またはＥＳＣをはじめとするフィーダー細胞、培地添加物、哺乳動物血清、必須アミノ酸、抗生物質、形質転換株を遺伝的に選択する薬剤、成長因子および白血病抑制因子（ＬＩＦ）から選択される物質をさらに含むことができる。
【００１４】
さらなる実施形態において、本発明は、ＥＳＣを成長させるためのキットを提供し、このキットは、固体支持体と、この固体支持体と流体連通している多孔性膜と、少なくとも１つの容器とおよびＥＳＣを成長させるための説明とを含む。このキットは、以下のうちの１つ以上を場合により含むことができる。ＥＳＣの成長に適する培養培地；胚線維芽細胞の成長に適する培地；ＥＳＣ；フィーダー細胞、例えば胎児線維芽細胞、胚線維芽細胞；１つ以上のバッファまたは洗浄溶液および培地添加物。
【００１５】
胚性幹細胞を成長させる方法
一定の実施形態において、本発明は、単純化されており、信頼でき、比較的容易に実行することができる、インビトロでＥＳＣを成長させる方法を提供する。細胞を未分化状態で維持することができる。一部の実施形態において、この方法は、ＥＳＣとフィーダー細胞を共培養することを含み、フィーダー細胞層とＥＳＣ層との直接的な物理的接触の必要をなくする。従って、本発明は、フィーダー細胞により馴致された培地をＥＳＣが利用できるように、例えば多孔性膜により、ＥＳＣとフィーダー細胞層を物理的および空間的に分離することができる、インビトロでＥＳＣを成長させる方法を提供する。フィーダー細胞層とＥＳＣ層を物理的に分離することから、幾つかの潜在的な利点が得られる。フィーダー細胞層の成長を削減する必要がもはやないため、フィーダー細胞の有糸細胞分裂を不活性化する必要ももはやない。従って、マイトマイシンＣまたはγ線などの作用因子の使用をなくすることができる。これら両方の作用因子は、潜在的に毒性であり、それ故、フィーダー細胞それら自体のものであるウエルに関する懸念ばかりでなく、マイトマイシンＣの場合には、これらの条件下で発生するＥＳＣの潜在的下流使用に関する懸念も提起し得る。
【００１６】
ＥＳＣとフィーダー細胞層の物理的分離は、例えば顕微鏡による、ＥＳＣコロニーの観察を容易にし、従って、ＥＳＣの成長および状態をより良好にモニターする手段となる。加えて、これら二層の分離は、希釈クローニングまたは下流操作（例えば形質移入、動物もしくは胚盤胞への移植）のためのＥＳＣコロニーの単離およびまたは回収を容易にする。
【００１７】
他の実施形態において、本発明は、多孔性膜上でＥＳＣを成長させる方法を提供する。本発明者らは、多孔性膜の表面が、ＥＳＣを成長させるために特によく適しており、それ故、これにより、ヒトＥＳＣを成長させるために一般に使用される細胞外基質タンパク質から成る基質が必要なくなり、従って、試薬費用がなくなることで時間も金銭も節約できることを発見した。
【００１８】
ＥＳＣの接種密度は、培養皿またはウエルのサイズに従って調整することができる。当業者は、接種密度を容易に決定することができる。（例えば、系列希釈により）単個細胞分離株からのクローンを拡張するために、または細胞分割後の確立された株系統の拡張のために、幹細胞を成長させることができる。前のケースでは、分割培養物から通常のな希釈により細胞を拡張して、幹細胞の通常の細胞増殖密度（すなわち、集密度２０から８０％）を確保し、その後、例えば、所望の密度に依存して１：２、１：４に再び分割することができる。一部の実施形態において、例えばＥＳＣがヒト由来のものである場合、全体の培養集密度に関係なく、コロニーが安定なサイズに達するまで細胞を成長させ、その後、分割することができる。一例として、９６ウエル膜プレート（図１）に細胞を接種すべき場合、ＥＳＣは、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどをはじめとする供給源を起源とする接種幹細胞であり得る。１つの実施形態において、前記幹細胞、例えばＥＳＣは、マウスＥＳＣであってもよい。もう１つの実施形態において、前記幹細胞は、例えばヒトＥＳＣであってもよい。
【００１９】
幹細胞は、胚外膜、組織および胚自体を形成する能力を有する全能幹細胞であってよい。この幹細胞は、生物の大部分の組織、例えば内胚葉、中胚葉または外胚葉由来の組織を生じさせる能力を有する多能性幹細胞であってよい。前記幹細胞は、複能性幹細胞、例えば造血幹細胞であってよい。
【００２０】
幹細胞を培養胚盤胞から単離し、単一祖先に由来するコロニーを選択することができるように、培養で１回またはそれ以上継代させることができる。前記幹細胞を遺伝的に人工処理して、望ましい形質または遺伝子型を発現させることができる。当分野において知られている標準的な技法、例えば、荷電脂質を用いるまたはエレクトロポレーションを用いる形質移入を用いて、遺伝物質を細胞に移入することができる。移入される遺伝物質は、ヒグロマイシン耐性などの選択可能マーカーを含むことができる。
【００２１】
一定の実施形態において、ＥＳＣを未分化状態で維持することが望ましいであろう。ＥＳＣの分化をモニターするために、幾つかのマーカーを利用することができる。一例として、細胞表面タンパク質ＯＣＴ−３／４およびＳＳＥＡ−１の高発現レベルは、未分化ＥＳＣを示す。同様に、高レベルのアルカリホスファターゼ活性も、未分化ＥＳＣを示す。対照的に、ＥＳＣの分化は、Ｏｃｔ  ３／４、アルカリホスファターゼ発現、ＳＳＥＡ（ヒトもしくはマウス特異的）などのマーカーの喪失、および／または胚葉特異的マーカーの増加により、表される。
【００２２】
任意の適するフィーダー細胞を本発明において使用することができる。適するフィーダー細胞は、有意な細胞死または分化を伴わずにＥＳＣを成長および継代させることができる。いずれの特定の理論にも拘束されないが、フィーダー細胞が適切な細胞因子を分泌することにより培養中のＥＳＣを生きつづけさせ、未分化で保つように機能するということが示唆されており、一方、より最近、フィーダー細胞がスポンジとして機能し、ＥＳＣによって生産される成長因子を離隔するという示唆も出されている。ＥＳＣの分化を一般に生じさせる因子を離隔することにより、ＥＳＣは未分化状態で維持される。前記フィーダー細胞は、線維芽細胞、例えば、胚線維芽細胞、胎児線維芽細胞であり得る。前記線維芽細胞は、臍帯由来であり得る。前記線維芽細胞の起源は、哺乳動物、例えばヒト、マウスなどであり得る。
【００２３】
固体支持体および多孔性膜
固体支持体は、本発明の一定の実施形態において、フィーダー細胞を成長させるための基質として使用し得る。本発明の１つの実施形態の１つの例として、マルチウエルプレートをＥＳＣの培養に利用することができる。このプレートは、フィーダー細胞を培養するために使用することができるプラスチックなどの適する材料から成る、底トレーから成る。したがって、このトレーの上に位置する多孔性膜から成る挿入体上でＥＳＣを培養することができる。前記挿入体は、これらの挿入体を前記底トレーにしっかりと取り付けることができるような取り付けまたは固定手段から成ることができる。加えて、固体支持体は、下で説明するような、多孔性膜のための基礎として使用することができる。例えば、多孔性膜を固体支持体の上に位置づけてもよいし、固体支持体の中、例えば縁の周囲に、部分的に配置してもよい。この固体支持体は、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンなどのポリマーをはじめとする任意のプラスチック材料から成り、従って、平坦であり得る堅い非展性の表面として形成することができる。
【００２４】
一部の実施形態において、固体支持体は、一体的な構造、例えば単一組織培養ウエル、皿、プレート、フラスコなどから成ることができる。一例として、前記固体支持体は、フィーダー細胞を成長させるための単一ウエルを有する基礎と、この基礎の上またはこのウエルの中に位置する挿入体とから成る単一の組織培養皿として形作ることができ、この場合、挿入体は、固体支持体と、ＥＳＣを成長させるために適する多孔性膜とから成る。または、固体支持体は、複合装置として形作ることができる。この実施形態において、基礎は、フィーダー細胞を成長させるために適する１つ以上のウエルから成ることができ、一方、挿入体は、固体支持体とＥＳＣを成長させるために適する多孔性膜とを含むマルチウエルプレートとして形作ることができる。一般に、固体支持体は、フィーダー細胞がＥＳＣの基底外側に位置づけられ、ＥＳＣ頂端表面が多孔性膜の上面に向くように形作られる。
【００２５】
一部の実施形態において、固体支持体は、中空糸バイオリアクターにおいて使用されるセルロースまたは酢酸セルロースチューブのような展性ポリマーから成ることができる。前記チューブが多孔性である場合、これは、固体支持体としても多孔性膜としても役立つことができる。一例として、ＥＳＣを前記チューブの片側で成長させ、フィーダー細胞をこのチューブの反対側で成長させることができる。または、フィーダー細胞とＥＳＣの両方を、前記チューブの周囲の毛管外空間内の別のチューブで成長させることができる。
【００２６】
本発明において使用される多孔性膜は、当分野では公知のあらゆる多孔性材料から成ることができる。適する多孔性材料の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリマークラッドファイバー（例えば、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標））（マサチューセッツ州、ビレリカのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、例えばアガロース、セルロース、多糖類、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリフッ化ビニリデン、ポリプロピレン、フルオロカーボン、例えばポリ（テトラフルオロエチレン−ｃｏ−過フルオロ（アルキルビニルエーテル））、ポリカーボネート、ポリエチレン、ガラス、セラミック、ナイロンおよび金属が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
システム
本発明の一定の実施形態は、幹細胞をインビトロで成長させるためのシステムを提供する。このシステムは、固体支持体とおよびこの固体支持体と流体連通している多孔性膜とを含むことができる。この固体支持体は、フィーダー細胞（例えば胚線維芽細胞）を成長させるために適切であり得る。このシステムは、以下のうちの１つ以上を含むことができる。ＥＳＣを生長させるための培地；フィーダー細胞を成長させるために適する培地；フィーダー細胞、洗浄バッファおよびＥＳＣとフィーダー細胞を間接的に共培養するための追加の試薬（例えばＬＩＦ、フィブロネクチンまたは他の細胞外基質タンパク質）。
【００２８】
キット
本発明は、一部の実施形態において、ＥＳＣをインビトロで成長させるために使用することができるキットも提供する。このキットは、固体支持体；この固体支持体と流体連通した状態になるように適切に形作ることができる多孔性膜；少なくとも１つの容器；およびＥＳＣを成長させるための説明を含むことができる。場合により、このキットは、ＥＳＣおよびＭＥＦを成長させるための１つ以上の異なる細胞培養培地を含むことができる。これらの培地は、液体または粉末形態で提供することができる。このキットは、細胞培養試薬およびサプリメントを含み得、また例えばグルタミンおよび必須アミノ酸なども含むことができる。前記サプリメントも、液体または粉末形態で提供することができる。同様に、このキットは、１つ以上のバッファおよび／または洗浄溶液を含むことができる。前記バッファおよび洗浄溶液も、液体または粉末形態で提供することができる。このキットは、１つ以上の細胞サンプル、例えばＥＳＣ、フィーダー細胞（例えば、ＭＥＦ）も含むことができる。これら細胞は、下流の応用のための出発原料として役立つことがあり、または将来の実験のための対照として役立つことがある。これら細胞は、冷凍して、各々、別容器で提供することができる。固体支持体および多孔性膜は、包装された、いつでも使用できる状態の組立て済みの形態で提供することができ、またはまだ組立てられていない部品が場合により別に包装されている未組立て形態で提供することができる。説明は、１つ以上の言語、例えば英語、フランス語、ドイツ語、日本語などで提供することができる。
【実施例１】
【００２９】
フィブロネクチン被覆プロトコル
材料
フィブロネクチン  ０．１％溶液（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）
未処理の一次マウス胚線維芽細胞株  ＣＦ−１（ＭＥＦ）（カリフォルニア州、テメキュラのＣｈｅｍｉｃｏｎ）
ＭＥＦ培地：ＤＭＥＭ（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
１０％  ウシ胎仔血清（ユタ州、ローガンのＨｙｃｌｏｎｅ）
１％  Ｇｌｕｔａｍａｘ−１（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
１％  ＰｅｎＳｔｒｅｐ（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
１％  非必須アミノ酸（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）
ＤＰＢＳ（ユタ州、ローガンのＨｙｃｌｏｎｅ）
【００３０】
フィブロネクチン（０．１％溶液）（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）を滅菌し、ＤＰＢＳで２５μｇ／ｍＬに希釈した。十分な、ＤＰＢＳ中のフィブロネクチン（２５μｇ／ｍＬ）を添加して、単一ウエルトレーを被覆した（１トレーにつき約５から１０ｍＬ）。このトレーを室温で少なくとも４５分間インキュベートした。ＭＥＦを接種する前に、過剰なフィブロネクチンを除去した。−８０℃の冷凍器に保管されていたＭＥＦを解凍した。このＭＥＦバイアルを３７℃の水浴中で穏やかに振盪した。予め温めておいた１０ｍＬのＭＥＦ培地が入っている１５ｍＬ試験管にこのＭＥＦを移した。細胞を１０００ｒｐｍで４分間ペレット化した。上清を除去し、予め温めておいた新たなＭＥＦ培地に細胞を再懸濁させた。フィブロネクチン被覆単一ウエルフィーダートレーにＭＥＦフィーダー細胞懸濁液を接種した。１つの単一ウエルトレーにつき１．６７×１０６のＭＥＦ細胞を接種し、結果として、２４時間以内に集密度９５％になった。このプレートに蓋をかぶせ、３７℃で一晩インキュベートした。
【実施例２】
【００３１】
フィーダー細胞と胚性幹細胞の間接的共培養
使用した材料：
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＰｌａｔｅｓおよびＳｉｎｇｌｅ  Ｗｅｌｌ  Ｆｅｅｄｅｒ  Ｔｒａｙｓ  ２４ウエルと０．４μｍ  ＰＣＦ膜または１．０μｍ  ＰＥＴ膜。
【００３２】
９６ウエル  ０．４μｍ  ＰＣＦ膜（マサチューセッツ州、ビルリカのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）
ＥＳＣ培地：Ｋｎｏｃｋ  ｏｕｔ  ＤＭＥＭ（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２０％  ＥＳ  ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  Ｓｅｒｕｍ（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
１％  Ｇｌｕｔａｍａｘ−１（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
１％  ＰｅｎＳｔｒｅｐ（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
１％  非必須アミノ酸（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）
０．１％  ＥＳＧＲＯ（登録商標）（ＬＩＦ）（カリフォルニア州、テメキュラのＣｈｅｍｉｃｏｎ）
０．１％  ２−メルカプトエタノール（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＭＥＦ培地：
ＤＭＥＭ（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
１０％ウシ胎仔血清（ユタ州、ローガンのＨｙｃｌｏｎｅ）
１％  Ｇｌｕｔａｍａｘ−１（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
１％  ＰｅｎＳｔｒｅｐ（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
１％  非必須アミノ酸（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）
ゼラチン２％溶液（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）
未処理の一次マウス胚線維芽細胞株  ＣＦ−１（ＭＥＦ）（カリフォルニア州、テメキュラのＣｈｅｍｉｃｏｎ）
マイトマイシンＣ  パウダー（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）
１２９／Ｓ６  マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）（カリフォルニア州、テメキュラのＣｈｅｍｉｃｏｎ）
ＤＰＢＳ（ユタ州、ローガンのＨｙｃｌｏｎｅ）
ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（１Ｘ）、液体（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
アルカリホスファターゼ検出キット（カリフォルニア州、テメキュラのＣｈｅｍｉｃｏｎ）
フィブロネクチン０．１％溶液（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）
【００３３】
１日目、Ｔ７５フラスコをＤＰＢＳ中０．１％のゼラチン（１０ｍＬ）で被覆し、少なくとも３０分間３７℃でインキュベートした。−８０℃の冷凍器に保管されていたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を解凍し、このＭＥＦバイアルを３７℃の水浴中で穏やかに振盪した。予め温めておいた１０ｍＬのＭＥＦ培地が入っている１５ｍＬ試験管にこのＭＥＦを移した。細胞を１０００ｒｐｍで４分間ペレット化した。上清を除去し、予め温めておいた新たなＭＥＦ培地に細胞を懸濁させた。接種前にフラスコから過剰なゼラチンを除去した。このフラスコにこのＭＥＦフィーダー細胞懸濁液を接種した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。Ｔ７５フラスコ中、２５ｍＬのＭＥＦ培地当たり３．７５から５×１０６のＭＥＦ細胞を使用することにより、結果として、２４時間以内に集密度９５％になった。
【００３４】
２日目、ＭＥＦフィーダー細胞をマイトマイシンＣで処理して、これらの細胞を有糸細胞分裂不活性にした。このマイトマイシンＣは、２ｍｇであった粉末ストックを使用して調製した。この粉末を４ｍＬの滅菌Ｈ２Ｏに溶解して、５００μｇ／ｍＬ溶液を作った。用いた作業濃度は、ＭＥＦ培地中１０μｇ／ｍＬであった。これらの細胞を３７℃で２時間インキュベートした。マイトマイシンＣを伴うＭＥＦ培地を除去し、予め温めておいたＤＰＢＳで細胞を３回洗浄した（Ｔ７５フラスコ１つの洗浄につき１０ｍＬ）。新たな胚性幹細胞（ＥＳＣ）培地を添加し、ＥＳＣを接種する準備が整うまで細胞を３７℃でインキュベートした。液体窒素タンクの中に保管してあったマウスＥＳＣを解凍した。細胞が入っているバイアルを３７℃の水浴の中で穏やかに振盪した。予め温めておいた１０ｍＬのＥＳＣ培地が入っている１５ｍＬ試験管にＥＳＣを移した。細胞を１０００ｒｐｍで４分間ペレット化した。上清を除去し、予め温めておいた新たなＥＳＣ培地に細胞を再懸濁させた。有糸細胞分裂不活性化ＭＥＦフィーダー層とＥＳＣ培地が入っているフラスコにＥＳＣ懸濁液を接種し、これには、Ｔ７５フラスコ中の３０ｍＬのＥＳＣ培地当たり４．５×１０６のＥＳＣ細胞を用いた。これらの細胞を３７℃で一晩インキュベートした。
【００３５】
３日目、ＭＥＦフィーダー層上のＥＳＣにＥＳＣ培地を供給した。４日目、必要に応じて、比率１：２で、ＭＥＦフィーダー層上のＥＳＣにＥＳＣ培地を供給するか、ＭＥＦフィーダー層上のＥＳＣを継代させた。一般に、ＥＳＣを放置して、集密度２０から８０％の範囲の密度に成長させ、その後、分割した。５から８日目は、４日目の手順をたどった。ＥＳＣ解凍後、マルチウエル細胞培養フィルタープレートに接種する前に、一般には２から３継代させた。
【００３６】
９日目、ＭＥＦフィーダー層上のＥＳＣにＥＳＣ培地を供給した。単一ウエルフィーダートレーをＤＰＢＳ中のフィブロネクチンで被覆し、４５分間室温でインキュベートした。ストック溶液は、０．１％フィブロネクチン（１０００μｇ／ｍＬ）であった。用いた作業濃度は、滅菌ＤＰＢＳ中２５μｇ／ｍＬであった。十分な、ＤＰＢＳ中のフィブロネクチン（２５μｇ／ｍＬ）を添加して、単一ウエルトレーを被覆し、これには、１トレーあたり約５から１０ｍＬを用いた。過剰なフィブロネクチンを除去した。この単一ウエルトレーはすぐに使用できる。
【００３７】
−８０℃の冷凍器の中に保管されていたＭＥＦを解凍した。この細胞バイアルを３７℃の水浴の中で穏やかに振盪した。予め温めておいた１０ｍＬのＭＥＦ培地が入っている１５ｍＬ試験管にＭＥＦを移した。これらの細胞を１０００ｒｐｍで４分間ペレット化した。上清を除去し、予め温めておいた新たなＭＥＦ培地にこれらの細胞を懸濁させた。フィブロネクチン被覆単一ウエルフィーダートレーにＭＥＦフィーダー細胞懸濁液を接種した。一般に、単一ウエルトレー１つ当たり１．６７×１０６のＭＥＦ細胞を使用すると、結果として、２４時間以内に集密度９５％になった。このトレーに蓋をかぶせ、３７℃で一晩、インキュベートした。
【００３８】
１０日目、以下のプロトコルに従って、ＥＳＣおよびＭＥＦフィーダー細胞をＴ７５フラスコから除去した。予め温めておいたＤＰＢＳでフラスコを２回洗浄した（各洗浄につき１０ｍＬ）。フラスコを洗浄１回ごとに１から２分放置した。ＤＰＢＳを除去し、フラスコ１つ当たり３ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。このフラスコを室温で２から３分間インキュベートした。顕微鏡の下でこのフラスコを観察し、細胞が球形になりフラスコから剥がれたたら、ＥＳＣ培地を添加して、このＴｒｙｐＬＥ（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を失活させた。このフラスコを十分に混ぜ、洗浄して、フラスコからすべての細胞を除去した。ＥＳＣとＭＥＦフィーダー細胞を次のように分離した。ＥＳＣ／ＭＥＦ細胞懸濁液を新たなＴ７５フラスコに移し、３７℃で４５分間インキュベートした；非付着細胞を除去し、もう１つの新しいＴ７５フラスコに移し、３７℃で４５分間インキュベートした；非付着細胞を除去し、細胞培養フィルタープレートのウエルにＥＳＣ懸濁液を接種した。９６ウエル細胞培養フィルタープレートについては、１００μＬのＥＳＣ培地中、１ウエル当たり２００から５００の細胞を頂上のウエルに接種した。２４ウエル細胞培養フィルタープレートについては、４００μＬのＥＳＣ培地中、１ウエル当たり１０００から１５００の細胞を頂上のウエルに添加した。単一ウエルトレーからＭＥＦ培地を除去し、ＥＳＣ培地で置換した。これには、１トレー当たり３２ｍＬのＥＳＣ培地を使用した。このＥＳＣ接種細胞培養フィルタープレートをこの単一ウエルトレーに追加し、この組立品を３７℃で一晩、インキュベートした。
【００３９】
１２および１４日目、このＥＳＣとＭＥＦの間接的共培養物にＥＳＣ培地を供給した。１６日目、キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（ジョージア州、ノルクロスのＳｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をこの製造業者の説明に従って使用してＥＳＣをアルカリホスファターゼ活性について分析した。結果は、未分化のままであるフィーダー細胞からの培地と流体連通を有する多孔性膜上でＥＳＣが成長したことを実証した（図２および３）。ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ（登録商標））（ジョージア州、ノルクロスのＳｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が培地中に存在した実験では、これを、試験ＥＳＣの増殖を通して１０００単位／ｍＬの濃度で、および指示のある場合には（初期増殖後）実験的に同じ濃度で使用した。
【００４０】
本明細書および特許請求の範囲において用いている、成分の量を表示するすべての数および反応条件などは、すべての場合、用語「約」で修飾されていると理解しなければならない。従って、そうでないと示されていない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に依存して変わり得る近似値である。少なくとも、および本特許請求の範囲と均等説の適用を制限する試みとしてではなく、各々の数値パラメータは、有効桁数および通常の丸めアプローチに鑑みて解釈しなければならない。
【００４１】
当業者には明らかであるように、本発明の精神および範囲を逸脱することなく本発明の多くの変更および変形を行うことができる。本明細書において説明した特定の実施形態は、単に例として提供したものであり、如何様にも限定を意味しない。本明細および実施例は、単に例示的なものと考えられ、本発明の真の範囲および精神は、特許請求の範囲によって示されると解釈する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＥＳＣをインビトロで成長させるために適するマルチウエルプレートを含む、本発明の一定の実施形態における使用に適する組織培養プレートの一例を示す。
【図２ａ】９６ウエルプレートにおいてインビトロで成長させたＥＳＣ培養物の写真を示す。各ウエルは、フィーダー細胞を含む下方のプラスチックトレーに挿入された上方の０．４μｍ  ＰＣＦ膜を含む。図２ａは、６日後のアルカリホスファターゼ活性を染色した、様々な条件下で成長させたＥＳＣコロニーを示す。図２ｂは、アルカリホスファターゼ活性を染色した、クローン選択のために系列希釈した、様々な条件下で成長させたＥＳＣコロニーを示す。
【図２ｂ】９６ウエルプレートにおいてインビトロで成長させたＥＳＣ培養物の写真を示す。各ウエルは、フィーダー細胞を含む下方のプラスチックトレーに挿入された上方の０．４μｍ  ＰＣＦ膜を含む。図２ａは、６日後のアルカリホスファターゼ活性を染色した、様々な条件下で成長させたＥＳＣコロニーを示す。図２ｂは、アルカリホスファターゼ活性を染色した、クローン選択のために系列希釈した、様々な条件下で成長させたＥＳＣコロニーを示す。
【図３】９６ウエルプレートにおいてインビトロで成長させたＥＳＣ培養物の写真を示す。このプレートにおける各ウエルは、下方のプラスチックフィーダートレーに挿入された上方の１．０μｍ  ＰＥＴ膜を含む。これらの図は、マイトマイシンＣと白血病抑制因子（ＬＩＦ）またはマイトマイシンＣ単独で処理したフィーダー細胞層を比較する。
【図４】９６ウエルプレートにおいてインビトロで成長させたＥＳＣ培養物の写真を示す。ウエルは、下方のプラスチックフィーダートレーに挿入された上方の１．０μｍ  ＰＥＴ膜を含む。フィーダートレー内のフィーダーウエルは、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）；ＭＥＦとＬＩＦまたはＬＩＦ単独を含んでいたか；培地を除き何も含んでいなかった。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【外国語明細書】
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