(57)【要約】【課題】内視鏡生検サンプル等の少量のサンプルから、効率的に短時間で抗癌剤感受性を測定する。【解決手段】癌細胞を含む生体組織から癌細胞を抽出するステップＳ１と、３次元スキャフォールドに癌細胞を播種するステップＳ２と、播種された癌細胞を増殖させるステップＳ３と、癌細胞に薬剤を供給するステップＳ４と、癌細胞の生存パラメータを測定するステップＳ５とを含む抗癌剤感受性測定方法を提供する。【選択図】    図１
2008017704.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞を含む生体組織から癌細胞を抽出するステップと、
３次元スキャフォールドに癌細胞を播種するステップと、
播種された癌細胞を増殖させるステップと、
癌細胞に薬剤を供給するステップと、
癌細胞の生存パラメータを測定するステップとを含む抗癌剤感受性測定方法。
【請求項２】
前記癌細胞抽出ステップが、癌細胞を含む生体組織に周期性のエネルギを加え、癌細胞を他の細胞から分離する請求項１に記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項３】
前記周期性のエネルギが、電気的エネルギである請求項２に記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項４】
前記周期性のエネルギが、超音波エネルギである請求項２に記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項５】
前記癌細胞抽出ステップおよび癌細胞播種ステップが、
癌細胞を含む生体組織から細胞を分離し、
ハイドロゲルにより構成された３次元スキャフォールドの上面に、分離された細胞を播くことにより行われる請求項１から請求項４のいずれかに記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項６】
前記ハイドロゲルが、親水基と疎水基のアミノ酸を繰り返したポリペプチドからなる請求項５に記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項７】
前記ハイドロゲルが、コラーゲン由来ペプチドを含む請求項５に記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項８】
前記ハイドロゲルが、アルギン酸を含む請求項５に記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項９】
前記癌細胞播種ステップが、混合し、その後、スキャフォールドをゲル化させる請求項１から請求項４のいずれかに記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項１０】
前記癌細胞の生存パラメータが、癌特異性のある指標である請求項１から請求項９のいずれかに記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項１１】
前記癌細胞の生存パラメータが、細胞から発せられる蛍光量である請求項１０に記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項１２】
前記蛍光量が、細胞の保持する腫瘍マーカの量に相関するものである請求項１１に記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項１３】
前記蛍光量が、細胞内の癌特性の高い酵素量に相関するものである請求項１１に記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項１４】
前記癌細胞の生存パラメータが、細胞の活性を示す量である請求項１から請求項９のいずれかに記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項１５】
前記癌細胞の生存パラメータが、酸素消費量である請求項１４に記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項１６】
前記癌細胞の生存パラメータが、グルコース消費量である請求項１４に記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項１７】
癌細胞の生存パラメータを測定するステップが、薬剤投与の前後において行われ、
両ステップにおいて測定された生存パラメータを比較するステップを備える請求項１から請求項１６のいずれかに記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項１８】
癌細胞に薬剤を供給するステップが、投与量を異ならせて複数回行われ、
測定された生存パラメータを投与量ごとに比較するステップを備える請求項１から請求項１７のいずれかに記載の抗癌剤感受性測定方法。
【請求項１９】
癌細胞を含む生体組織から癌細胞を抽出する細胞分離手段と、
３次元スキャフォールドに癌細胞を播種する細胞播種手段と、
播種された癌細胞を増殖させる細胞培養手段と、
癌細胞に薬剤を供給し蛍光を検出する蛍光検出手段と、
検出された蛍光に基づいて癌細胞の生存パラメータを測定する分析手段とを備える抗癌剤感受性測定装置。
【請求項２０】
前記細胞播種手段が、ハイドロゲルにより構成された３次元スキャフォールドの内部または上面に癌細胞を播種する請求項１９に記載の抗癌剤感受性測定装置。
【請求項２１】
前記ハイドロゲルが、親水基のアミノ酸と疎水基のアミノ酸とを繰り返したポリペプチドからなる請求項２０に記載の抗癌剤感受性測定装置。
【請求項２２】
前記ハイドロゲルが、コラーゲン由来ペプチドを含む請求項２０に記載の抗癌剤感受性測定装置。
【請求項２３】
前記ハイドロゲルが、アルギン酸を含む請求項２０に記載の抗癌剤感受性測定装置。
【請求項２４】
前記細胞播種装置が、ハイドロゲル素材をプレート上に複数のスポットとして設けたものである請求項１９に記載の抗癌剤感受性測定装置。
【請求項２５】
前記細胞播種装置が、ハイドロゲル素材と癌細胞とを混合する混合手段と、該混合手段による混合物をプレートへスポッティングするスポッティング手段と、スポッティングされた混合物をゲル化させるゲル化手段とを備える請求項２４に記載の抗癌剤感受性測定装置。
【請求項２６】
前記細胞培養手段が、癌特異性のある指標を被検体に導入し、
前記蛍光検出手段が、被検体からの蛍光量を検出する請求項１９に記載の抗癌剤感受性測定装置。
【請求項２７】
前記指標の導入および蛍光量の検出が、被検体への薬剤投与の前後において行われる請求項２６に記載の抗癌剤感受性測定装置。
【請求項２８】
同一の薬剤投与条件が複数のスポットに対して適用される請求項２４に記載の抗癌剤感受性測定装置。
【請求項２９】
規定量の癌細胞数が存在しないスポットを検出し、検出されたスポットを評価から除外する請求項２４に記載の抗癌剤感受性測定装置。
【請求項３０】
前記分析手段が、被検体への薬剤投与の前後における蛍光量を統計的に解析することで、薬剤の感受性の優先順位付けを行う請求項１９に記載の抗癌剤感受性測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、抗癌剤感受性測定方法および抗癌剤感受性測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、癌の特定の分子的機序をターゲットとし、分子薬剤の発展により高い奏効率を有する抗癌剤が市販されてきている。一方、特定の分子機序をターゲットとすることは、その機序が有効でない患者に対しても抗癌剤を投与することにもなり、分子薬剤の副作用の問題が注目されている。
【０００３】
一方、患者から得られた細胞を３次元的培養により生体中の細胞と同じような薬剤に対する感受性を得る方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
また、親水基と疎水基のアミノ酸の繰り返しからなるポリペプチドによって、細胞親和性の高いハイドロゲル（ペプチドマトリックス）を製造する方法も開示されている（例えば、特許文献２参照。）。
また、細胞の有するＣＥＡなどの腫瘍マーカに対して蛍光を発する分子マーカも開示されている（例えば、特許文献３参照。）。
さらに、細胞中の酵素の活性度に応じて蛍光を発する分子色素も開示されている（例えば、特許文献４参照。）。
【特許文献１】特許第２８７９９７８号明細書
【特許文献２】米国特許第５９５５３４３号明細書
【特許文献３】特表２００５−５０７６５９号公報
【特許文献４】国際公開第２００４／０７９３７０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述した分子薬剤の副作用の問題を解決するために、患者個々のテーラーメイド医療を目指して、遺伝子多型（ＳＮＰｓ等）を用いた抗癌剤感受性予測の研究が行われている。しかしながら、この方法による場合には、抗癌剤の市販の後、多くの患者に使用され、その長期的予後の結果が出ることが必要で、恩恵を受けることができるまでに長時間を要するという問題がある。
【０００５】
また、患者から得られた組織サンプルには癌細胞以外に繊維芽細胞等の他の多くの細胞が混入しているため、正確な結果を得るのが困難であるという問題もある。また、内視鏡下で得られる生検サンプル等の細胞数の絶対数が少ないものでは検査が困難であるという問題もある。
【０００６】
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、内視鏡生検サンプル等の少量のサンプルから、効率的に短時間で抗癌剤感受性を測定することができる抗癌剤感受性測定方法および抗癌剤感受性測定装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、癌細胞を含む生体組織から癌細胞を抽出するステップと、３次元スキャフォールドに癌細胞を播種するステップと、播種された癌細胞を増殖させるステップと、癌細胞に薬剤を供給するステップと、癌細胞の生存パラメータを測定するステップとを含む抗癌剤感受性測定方法を提供する。
【０００８】
本発明によれば、癌細胞を含む生体組織から癌細胞を抽出するので、生体組織内に含まれている繊維芽細胞等の他の細胞の影響を受けることなく正しい結果を得ることができる。また、３次元スキャフォールドに播種した癌細胞を用いるので、生体中の癌組織と同様の感受性を示す状態で測定を行うことができる。さらに、癌細胞を増殖させた後に測定するので少量のサンプルから測定を行うことができる。
【０００９】
上記発明においては、前記癌細胞抽出ステップが、癌細胞を含む生体組織に周期性のエネルギを加え、癌細胞を他の細胞から分離することとしてもよい。
この場合において、前記周期性のエネルギが、電気的エネルギであることとしてもよく、また、前記周期性のエネルギが、超音波エネルギであることとしてもよい。
このようにすることで、周期性のエネルギにより、生体組織から癌細胞を容易に分離することができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記癌細胞抽出ステップおよび癌細胞播種ステップが、癌細胞を含む生体組織から細胞を分離し、親水基と疎水基のアミノ酸を繰り返したポリペプチドからなるハイドロゲルにより構成された３次元スキャフォールドの上面に、分離された細胞を播くことにより行われることとしてもよい。
【００１１】
癌細胞の浸食性と、他の正常細胞の浸食性の相違を利用して、癌細胞のみを選択的にハイドロゲルからなる３次元スキャフォールド内に浸食させることができ、これによって、癌細胞の抽出と癌細胞の３次元スキャフォールドへの播種とを同時に行うことができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記癌細胞播種ステップが、粉状あるいは液状のスキャフォールド原料と癌細胞とを混合し、その後、スキャフォールドをゲル化させることとしてもよい。
このようにすることで、癌細胞を３次元スキャフォールドの内部に容易に播種することができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記癌細胞の生存パラメータが、癌特異性のある指標であることが好ましい。この場合、前記癌細胞の生存パラメータが、細胞から発せられる蛍光量であることとしてもよく、前記蛍光量が、細胞内の癌特性の高い酵素量に相関するものであることとしてもよい。
このようにすることで、癌細胞と他の細胞とが混合されている状態であっても癌細胞を特異的に検出できる。したがって、癌細胞抽出ステップにおいて癌細胞のみを抽出しきれない場合であっても測定精度を向上することができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記癌細胞の生存パラメータが、細胞の活性を示す量であることとしてもよく、その場合、前記癌細胞の生存パラメータが、酸素消費量またはグルコース消費量であることとしてもよい。
このようにすることで、癌細胞の生存状態を簡易に測定することができる。この場合においては、癌細胞および他の細胞の生存状態が同時に測定されてしまうことになるので、癌細胞抽出ステップにおいて十分に他の細胞を排除しておくことが必要となる。
【００１５】
また、上記発明においては、癌細胞の生存パラメータを測定するステップが、薬剤投与の前後において行われ、両ステップにおいて測定された生存パラメータを比較するステップを備えることとしてもよい。
このようにすることで、比較ステップの結果に基づいて、抗癌剤の感受性をより効率的に測定することができる。
【００１６】
また、上記発明においては、癌細胞に薬剤を供給するステップが、投与量を異ならせて複数回行われ、測定された生存パラメータを投与量ごとに比較するステップを備えることとしてもよい。
このようにすることで、比較ステップの結果に基づいて、抗癌剤の投与量に対する感受性をより効率的に測定することができる。
【００１７】
また、本発明は、癌細胞を含む生体組織から癌細胞を抽出する細胞分離手段と、３次元スキャフォールドに癌細胞を播種する細胞播種手段と、播種された癌細胞を増殖させる細胞培養手段と、癌細胞に薬剤を供給し蛍光を検出する蛍光検出手段と、検出された蛍光に基づいて癌細胞の生存パラメータを測定する分析手段とを備える抗癌剤感受性測定装置を提供する。
【００１８】
上記発明においては、前記細胞播種手段が、ハイドロゲルにより構成された３次元スキャフォールドの内部または上面に癌細胞を播種することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記ハイドロゲルが、親水基のアミノ酸と疎水基のアミノ酸とを繰り返したポリペプチドからなることとしてもよい。
【００１９】
また、上記発明においては、前記ハイドロゲルが、コラーゲン由来ペプチドを含むこととしてもよい。
また、上記発明においては、前記ハイドロゲルが、アルギン酸を含むこととしてもよい。
【００２０】
また、上記発明においては、前記細胞播種装置が、ハイドロゲル素材をプレート上に複数のスポットとして設けたものであることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記細胞播種装置が、ハイドロゲル素材と癌細胞とを混合する混合手段と、該混合手段による混合物をプレートにスポッティングするスポッティング手段と、スポッティングされた混合物をゲル化するゲル化手段とを備えることとしてもよい。
【００２１】
また、上記発明においては、前記細胞培養手段が、癌特異性のある指標を被検体に導入し、前記蛍光検出手段が、被検体からの蛍光量を検出することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記指標の投与および蛍光の検出が、被検体への薬剤投与の前後において行われることとしてもよい。
【００２２】
また、上記発明においては、同一の薬剤投与条件が複数のスポットに対して適用されることとしてもよい。
また、上記発明においては、規定量の癌細胞数が存在しないスポットを検出し、検出されたスポットを評価から除外することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記分析手段が、被検体への薬剤投与の前後における蛍光量を統計的に解析することで、薬剤の感受性の優先順位付けを行うこととしてもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、内視鏡生検サンプル等の少量のサンプルから、効率的に短時間で抗癌剤感受性を測定することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明の第１の実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法および抗癌剤感受性測定装置について、図１〜図４を参照して説明する。
本実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法は、図１および図３に示されるように、癌細胞１を含む生体組織２から癌細胞１を抽出する抽出ステップＳ１と、３次元スキャフォールドに癌細胞１を播種する播種ステップＳ２と、播種された癌細胞１を増殖させる培養ステップＳ３と、癌細胞１に薬剤を供給する投与ステップＳ４と、癌細胞１の生存パラメータを測定する測定ステップＳ５とを含んでいる。
【００２５】
前記抽出ステップＳ１は、図２に示されるように、例えば、内視鏡の生検鉗子等により採取された生検サンプル等の生体組織２から癌細胞１や正常細胞３を単離するステップＳ６と、単離された細胞１，３から癌細胞１のみを分離するステップＳ７とを備えている。
【００２６】
細胞１，３を単離するステップＳ６は、図３に示されるように、例えば、コラゲナーゼ等の細胞外マトリクス分解酵素や、トリプシン等の細胞接着基の分解酵素を用いて行われる。生体組織２をこれらの分解酵素を含む溶液４中に浸漬して攪拌することにより、生体組織２から細胞１，３を単離することができる。
【００２７】
癌細胞１を分離するステップＳ７は、図４に示されるように、例えば、ＤＥＰ（Dielectrophoresis）技術を利用する（米国特許第６９３６１５１号明細書参照。）。すなわち、ＭＥＭＳ技術により作成したマイクロ電極５（図４（ａ）参照。）上に単離した細胞１，３を持つ細胞懸濁液を載せて（図４（ｂ）参照。）、周期的な電界エネルギを付与することにより、細胞１，３の電界に対する周波数応答性の違いを利用して癌細胞１のみを電極に付着させ、その他の細胞３を緩やかな緩衝液流で流すことで分離することができるようになっている。ＤＥＰ技術を用いることで、色素や磁気ビーズ等を細胞１，３に着脱する等の前処理が不要であり、一度に多量の細胞１，３を処理できるという利点がある。
【００２８】
細胞１，３の大きさ等に応じて分離するために必要とされる周波数が異なる。例えば、乳癌細胞１を分離するためには、２００ｋＨｚの周波数を電界を加えることが望ましい。
なお、ＤＥＰ技術に代えて、超音波エネルギにより癌細胞１を分離することとしてもよい。例えば、図５および図６に示されるようにピエゾ素子の間に、細胞１，３を持つ細胞懸濁液を載せ、例えば、１．２ＭＨｚ程度の超音波を発生させると、超音波の定常波に沿って細胞１，３が線状に分離して集合する。その細胞１，３を、例えば、MicroFluidicsで分取することにより、癌細胞１を分離できる。
【００２９】
前記播種ステップＳ２は、３次元スキャフォールドを構成するスキャフォールド原料と、抽出された癌細胞１とを混合した後に、スキャフォールド原料をゲル化させることにより行われる。スキャフォールド原料としては、粉状または液状のものを使用することで、癌細胞１との混合を容易にし、ゲル化させた状態で３次元スキャフォールドの内部に均一に癌細胞１を分散させることができる。
【００３０】
スキャフォールド原料としては、ペプチドマトリックス、コラーゲンまたはアルギン酸を挙げることができる。ペプチドマトリックスは、塩を含む培地を加えることにより、コラーゲンは昇温することにより、アルギン酸はカルシウムイオンを添加することによりそれぞれ容易にゲル化するので、癌細胞１を均一に含有する３次元スキャフォールドを容易に構成することができる。
【００３１】
前記培養ステップＳ３は、上記のようにして構成された癌細胞１を含む３次元スキャフォールドを所定の培養条件下に維持することにより、癌細胞１を増殖させるものである。これにより、内視鏡的に採取された生検サンプルのように細胞１，３の絶対数が少ないものであっても、増殖により必要細胞数まで増加させることができ、測定精度を向上することができる。
なお、培養ステップＳ３は、３次元スキャフォールドをマイクロウェルアレイに収容した状態で行うことが好ましい。
【００３２】
前記投与ステップＳ４は、マイクロウェルアレイの各ウェルに収容された３次元スキャフォールドに対して、異種／異用量の抗癌剤を添加することにより行われる。
前記測定ステップＳ５は、例えば、細胞培養培地に、癌のマーカであるＣＥＡに対する抗体に蛍光色素を結合したものを添加し、一定時間の後に色素のない培地で洗浄する。これにより、細胞表面のマーカと抗体とが結合して、癌細胞が特異的に蛍光を発するようになる。あるいは、癌細胞１内部に多く存在するプロテアゾーム等の酵素の活性量に応じた蛍光を発する分子プローブを培地に添加し、一定の時間で酵素による反応を起こすことができる。これらのような分子プローブの抗癌剤投与前の蛍光量と、抗癌剤投与後の蛍光量とを測定する。そして、抗癌剤投与前後の蛍光量を比較することにより、抗癌剤投与による癌細胞１の数の変化を確認することができ、これによって、抗癌剤の感受性を測定することができる。
【００３３】
このように、本実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法によれば、抽出ステップＳ１によって生体組織２中の癌細胞１を選択的に抽出するので、他の正常細胞３の影響を受けることなく抗癌剤の感受性を精度よく測定することができる。
また、本実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法によれば、播種ステップＳ２によって、３次元スキャフォールド内に癌細胞１を均一に混合した状態に播種するので、細胞培養プレートなど、平面に播種・培養した場合と異なり、癌細胞１を生体内と同様の状態に保持することができ、抗癌剤の感受性をより正しく評価することができる。
また、この方法は、浮遊細胞や、神経細胞や肝細胞など、平面培養での維持が難しい細胞に対しても、同様に適用することができる。
【００３４】
また、本実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法によれば、培養ステップＳ３によって、３次元スキャフォールド内において癌細胞１を増殖させた後に、抗癌剤を投与するので、内視鏡による生検サンプルのように少量の生体組織２によっても、抗癌剤の感受性を正しく評価することが可能となる。
【００３５】
さらに、本実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法によれば、測定ステップＳ５が、分子プローブのように、癌細胞１に特異的な指標を用いるので、抽出ステップＳ１によって分離しきれない正常細胞３が存在しても、精度よく抗癌剤の感受性を評価することができる。
したがって、本実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法によれば、少量のサンプルから、効率的に短時間で抗癌剤の感受性を測定することができるという効果がある。
【００３６】
なお、本実施形態においては、ＤＥＰ技術により、癌細胞１のみを分離抽出することとしたが、分子プローブによって抗癌剤の感受性を測定するので、抽出ステップＳ１を遠心分離による細胞分画の取得のような、さらに簡略な手法によって実施することとしてもよい。
【００３７】
また、測定ステップＳ５として分子プローブのように癌細胞１に特異的な指標を用いたが、これに代えて、細胞１，３の活性を示す量の測定により、抗癌剤の感受性を評価することにしてもよい。細胞１，３の活性を示す量としては、例えば、細胞培養環境内における酸素消費量、グルコース消費量等を挙げることができる。酸素消費量については、培養培地中の酸素濃度から演算で求めることができる。また、細胞１，３の活性度に応じてＤＥＰ技術における周波数特性が変化することを利用して細胞１，３の活性度を測定してもよい。また、単純に細胞数を計数することにより細胞１，３の活性を測定してもよい。
【００３８】
これらの場合には、癌細胞１のみならず正常細胞３の活性度も測定されてしまうので、抽出ステップＳ１において癌細胞１のみを抽出でき、他の正常細胞３等が含有されない状態で行うことが効果的である。
【００３９】
図７に、本実施形態に係る抗癌剤感受性測定装置１０を示す。
本実施形態に係る抗癌剤感受性測定装置１０は、細胞分離手段１１、細胞播種手段１２、培養手段１３、蛍光検出手段１４および分析手段１５を備えている。蛍光検出手段１４は、蛍光撮像装置１４ａと画像処理手段１４ｂとを備えている。
【００４０】
図８（ａ）〜（ｄ）に、本実施形態に係る抗癌剤感受性測定装置１０で用いられるマイクロアレイプレート１６の一例を示す。
図８（ａ）は、マイクロアレイプレート１６の平面図、図８（ｂ）は、図８（ａ）の矢印Ａ方向に見たＡ−Ａ断面図、図８（ｃ）は、図８（ａ）の矢印Ｂ方向に見たＢ−Ｂ断面図である。
【００４１】
マイクロアレイプレート１６には、培地、洗浄用の緩衝液、抗癌剤溶液、蛍光分子イメージング色素溶液などを導入するためのウェル１７が設けられている。
各ウェル１７には、前述のハイドロゲルを設置するためのスポットＳＰ１〜ＳＰ５が設けられている。スポットＳＰ１〜ＳＰ５は、図８（ｂ）のようにゲルＧをウェル１７に設けられた穴に埋入してもよい。
【００４２】
図８（ｃ）に示されるように、ウェル１７内の複数のスポットＳＰ１〜ＳＰ５に対して、同一の抗癌剤など同条件で培地・薬剤等の溶液Ｃを供給できる。
また、初期培養・蛍光分子イメージングマーカを含んだ培地での培養時、洗浄時など、全体を同一の条件で培地等の溶液Ｃを提供したい場合には、図８（ｄ）に示されるように、マイクロアレイプレート１６の上部に設けられた培地受けに供給することもできる。これにより、簡便に一度に溶液Ｃの提供・交換を行うことができる。
【００４３】
なお、図９（ａ）〜（ｃ）に示されるように、ウェル１７内に直接ゲルＧを配置してもよい。この場合にはゲルＧの配置部分のみにガスプラズマ処理などによりハイドロゲルの接着性を向上させる加工を行うと、スポットＳＰ１〜ＳＰ５を安定に保持できる。このように構成しても、図９（ｂ）に示されるように、ウェル１７内の複数のスポットＳＰ１〜ＳＰ５に対して、同一の抗癌剤など同条件で培地・薬剤等の溶液Ｃを供給できる。また、初期培養・蛍光分子イメージングマーカを含んだ培地での培養時、洗浄時など、全体を同一の条件で培地等の溶液Ｃを提供したい場合には、図９（ｃ）に示されるように、ウェル１７の上部に設けられた培地受けに供給することもでき、これにより、簡便に一度に溶液Ｃの提供・交換を行うことができる。
【００４４】
前記細胞分離手段１１は、図１０に示されるように、組織洗浄手段１８と、組織破砕手段１９と、分離手段２０と、細胞数検出手段２１とを備えている。
組織洗浄手段１８は、組織を緩衝液などで洗浄を行う。組織破砕手段１９は、組織にコラゲナーゼなどの細胞外マトリクス分解酵素液を加え、回転刃などで組織を細分する。酵素分解に適した温度に一定時間保持する。
【００４５】
分離手段２０は、図１１に示されるように、１０μｍ以上の穴を有するメッシュ２２ａを有するフィルタ２２と遠心チューブ２３と、図示しない遠心分離機とからなる。符号２４は蓋である。そして、図１２に示されるように、（ａ）フィルタ２２に組織分解液Ｄを導入し、（ｂ）組織繊維成分Ｅをフィルタ２２でろ過し、細胞成分を含む細胞濃縮液Ｆを遠心分離機で遠心チューブ２３に捉え、分離液Ｈを分離するようになっている。 
細胞数検出手段２１は、細胞濃縮液Ｆ中の生細胞数または癌細胞数に対応する量を、蛍光量等により検出する。生細胞数は、Calcein AMなどで蛍光染色することで計測できる。癌細胞数は、前述の分子イメージングマーカを用いることができる。
【００４６】
細胞播種手段１２は、図１３に示されるように、ハイドロゲル素材混合手段２５と、スポッティング手段２６と、ゲル化手段２７とを備えている。
ハイドロゲル素材混合手段２５は、細胞分離手段１１で得られた細胞濃縮液Ｆを、培地や、ショ糖等浸透圧溶液などの細胞保護液に再懸濁し、アルギン酸溶液、自己組織化ポリペプチド溶液などの高粘度ハイドロゲル素材と混合する。細胞濃度は、細胞分離手段の細胞数検出手段から得られた細胞数により一定の範囲に規格化される。
【００４７】
スポッティング手段２６は、ピエゾによるインクジェット機構などにより、ハイドロゲル素材細胞混合液をマイクロアレイプレート１６のウェル１７内の所定の位置にスポッティングする。
ゲル化手段２７は、ウェル１７に静かにゲル化溶液を導入し、スポットＳＰ１〜ＳＰ５をゲル化する。アルギン酸の場合カルシウムイオンの添加された培地を加える。自己組織化ポリペプチドの場合、塩を含む培地を加える。特に自己組織化ポリペプチドの場合、ペプチド溶液の酸性度が高いため、所定時間（例えば、３０分）後に、培地の交換を行うと、ゲルＧ自身のｐＨを早く中性に近づけることができる。
【００４８】
例えば、２ｍｍ程度の大きさの生検サンプルには、最大で２Ｘ１０７個程度の細胞が存在する。この内５％を癌細胞１として分離できるとすれば、１０６個程度の癌細胞１が得られる。検出方法によるが、各スポットＳＰ１〜ＳＰ５に１００個程度の癌細胞１を検出の下限とすれば、最大で１００００個のスポットＳＰ１〜ＳＰ５を作成することが可能である。
【００４９】
また、細胞をハイドロゲル素材に混合せず、ハイドロゲル素材のみでスポッティングし、ゲル化手段２７でゲル化した後、細胞縣濁液をウェル１７に導入して、細胞のゲルＧへ付着および進展させても良い。
【００５０】
図１４（ａ）に蛍光撮像装置１４ａの構成を示す。蛍光撮像装置１４ａは光源２８、光源２８の上方に設置されたマイクロアレイプレート１６からの蛍光を撮像する蛍光カメラ２９を備えている。光源２８は発光体２８ａと励起光の波長のみを通過させる励起光フィルタ２８ｂを備える。蛍光カメラ２９は、励起光の波長をカットする励起光カットフィルタ２９ａ、結像レンズ２９ｂ、蛍光波長に感度を持つＣＣＤなどの撮像素子２９ｃを備えている。
【００５１】
この蛍光撮像装置１４ａとしては、点光源および点蛍光検出装置を対向して設け、スポットＳＰ１〜ＳＰ５ごとに走査を行っても良い。また、ライン光源およびライン蛍光検出装置を設け、マイクロアレイプレート１６を一方向に走査しても良い。
【００５２】
図１４（ｂ）に撮像された蛍光画像例を示す。画像処理手段１４ｂにより、各スポット（ＳＰ１（Ａ）〜ＳＰ５（Ｅ））に対応する画素値を積算、平均して、各スポットＳＰ１（Ａ）〜ＳＰ５（Ｅ）の蛍光量を演算する。正確な蛍光分子イメージングマーカからの蛍光量を算出するために、蛍光分子イメージングマーカ投与前に蛍光画像を撮像し、バックグラウンドの蛍光量を測定しておくとより良い。
【００５３】
培養手段１３、蛍光検出手段１４および分析手段１５による評価方法のフローを図１５に示す。
まず、増殖培地をマイクロアレイプレート１６に導入し、規定時間培養を行う（Ｓ１１）。次いで、蛍光分子イメージングマーカを含む培地マイクロアレイプレートに導入し、規定時間培養する（Ｓ１２）。
【００５４】
そして、蛍光分子イメージングマーカを含まない緩衝液で洗浄し、分子イメージングマーカを含まない培地に変更する（Ｓ１３）。その後、蛍光検出手段でマイクロアレイプレートを観察する（Ｓ１４）。
【００５５】
蛍光により、規定以上の蛍光が得られたスポットが規定数以上になったかどうか確認し（Ｓ１５）、規定以上の蛍光が得られたスポットの番地（Ａ１等）を記録する（Ｓ１６）。その後、規定数以上のスポットに対して所定の抗癌剤を所定の濃度で添加した培地を添加する。このとき、同一の条件に対して、所定の複数のスポットを割り当てる。そして、番地と抗癌剤の種類・濃度の関係を記録する（Ｓ１７）。
【００５６】
このステップＳ１７は、図８（ｂ）に示されるマイクロアレイに対し、表１に示されるように各ウェルに所定の抗癌剤を所定の濃度で添加することで行う。この時、各ウェルに対応するスポットＳＰ１〜ＳＰ５（図８（ｂ）では５個）の内、所定数（例えば、３個）が規定の蛍光値（ここでは５０とする。）に達しない場合、そのウェルは使用しない。
【００５７】
【表１】
2008017704.tif 000003
【００５８】
次いで、所定時間抗癌剤を含む培地で培養した後、抗癌剤を含まない緩衝液で洗浄し、増殖培地で培養を行う（Ｓ１８）。
規定時間経過後、蛍光分子イメージングマーカを含む培地で規定時間培養する（Ｓ１９）。そして、蛍光分子イメージングマーカを含まない緩衝液で洗浄し、分子イメージングマーカを含まない培地に変更する（Ｓ２０）。
【００５９】
その後、蛍光でウェルを観察し、蛍光強度を記録する（Ｓ２１）。ステップＳ１７で記録された抗癌剤の種類・濃度の関係を基準としてステップＳ２１で記録された蛍光強度を評価する（Ｓ２２）。
【００６０】
ステップＳ１９〜Ｓ２２は、例えば、表２に示されるように実施される。
【００６１】
【表２】
2008017704.tif 000004
【００６２】
初期蛍光値が基準値５０以下の場合、そのデータは棄却され、同一条件の他のデータのみが統計的処理に用いられる。
【００６３】
そして、同一の条件に属するスポットのデータに対して、統計処理を行い、優先順位づけを行う（Ｓ１３）。
表３では、単純に蛍光値の比を増殖率とみなして、増殖率の小さいものを選択しているが、当然統計検定等を利用して、コントロールからの有意差を算出しても良い。
【００６４】
【表３】
2008017704.tif 000005
【００６５】
次に、本発明の第２の実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法について、図１６および図１７を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。
【００６６】
本実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法は、図１６に示されるように、第１の実施形態における抽出ステップＳ１、播種ステップＳ２および培養ステップＳ３に代えて、抽出・播種・培養ステップＳ３０を備えている点で第１の実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法と相違している。
この抽出・播種・培養ステップＳ３０は、生検サンプル等の生体組織２から第１の実施形態と同様にして細胞１，３を単離した後に、図１７（ａ）に示されるように親水基と疎水基のアミノ酸の繰り返しからなるポリペプチドを用いて構成したペプチドマトリックスゲルＧをマイクロアレイプレート１６の各ウェル１７内に収容しておき、該ペプチドマトリックスゲルＧの上面に、単離された細胞１，３を載置することにより行われる。
【００６７】
癌細胞１は、他の正常細胞３と比較して浸食性が高いため、図１７（ｂ）に示されるように、培養される間にペプチドマトリックスゲルＧ内に進展していく。一方、他の正常細胞３はペプチドマトリックスゲルＧの上面に残される。特に、ペプチドマトリックスゲルＧの場合、含水率が９９〜９９．５％と極めて高く柔らかいため、癌細胞１のペプチドマトリックスゲルＧ内部への進展が容易であり、十分に深部まで進展することができる。
その結果、癌細胞１のみがペプチドマトリックスゲルＧ内に進展して播種された状態の３次元スキャフォールドを構成することができ、他の細胞３を分離除去することができる。
【００６８】
このペプチドマトリックスゲル以外に、コラーゲンゲル、ゼラチンゲルやアルギン酸ゲルなどのゲルを用いても同様に実施できる。
また、第１の実施形態のように３次元的に播種した場合でも、ペプチドマトリックスゲル、ゼラチンゲルあるいはアルギン酸ゲルのような生物学的シグナルが少ないゲルを用いて培養した場合、マトリックスからの生物学的シグナルが必要な正常細胞に対して、癌細胞の増殖が相対的に高いために、同様な効果を得ることができる。
【００６９】
このように本実施形態によれば、第１の実施形態における抽出ステップＳ１、播種ステップＳ２および培養ステップＳ３を同時に行うことができ、さらに簡易に抗癌剤の感受性の測定を行うことができるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の抗癌剤感受性測定方法の抽出ステップを示すブロック図である。
【図３】図１の抗癌剤感受性測定方法の単離ステップを示す模式図である。
【図４】図１の抗癌剤感受性測定方法の分離ステップを示す模式図である。
【図５】図４の分離ステップに代えて、超音波を利用した分離ステップを示す斜視図である。
【図６】図５の分離ステップを示す平面図である。
【図７】本発明の一実施形態に係る抗癌剤感受性測定装置を示すブロック図である。
【図８】図７の抗癌剤感受性測定装置に用いられるマイクロアレイプレートを示す（ａ）平面図、（ｂ）Ａ−Ａ断面図、（ｃ）Ｂ−Ｂ断面図、（ｄ）溶液供給例である。
【図９】図８のマイクロアレイプレートの変形例を示す（ａ）Ａ−Ａ断面図、（ｂ）Ｂ−Ｂ断面図、（ｃ）溶液供給例である。
【図１０】図７の抗癌剤感受性測定装置の細胞分離手段を示すブロック図である。
【図１１】図１０の細胞分離手段を構成する分離手段の一例を模式的に示す縦断面図である。
【図１２】図１１の分離手段による細胞分離方法を示す説明図である。
【図１３】図７の抗癌剤感受性測定装置の細胞播種手段を示すブロック図である。
【図１４】図７の抗癌剤感受性測定装置の蛍光検出手段を構成する（ａ）蛍光撮像装置、（ｂ）画像処理手段による画像例を模式的に示す説明図である。
【図１５】図７の抗癌剤感受性測定装置の培養手段、蛍光検出手段および分析手段による評価方法を示すフローチャートである。
【図１６】本発明の第２の実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法を示すフローチャートである。
【図１７】図１６の抗癌剤感受性測定方法の抽出・播種・培養ステップを説明する模式図である。
【符号の説明】
【００７１】
Ｇ  ハイドロゲル
Ｓ１  抽出ステップ（癌細胞抽出ステップ）
Ｓ２  播種ステップ
Ｓ３  培養ステップ（増殖させるステップ）
Ｓ４  投与ステップ（供給するステップ）
Ｓ５  測定ステップ
ＳＰ１〜ＳＰ５  スポット
１  癌細胞
２  生体組織
３  正常細胞（他の細胞）
１１  細胞分離手段
１３  細胞培養手段
１４  蛍光検出手段
１５  分析手段
１０  抗癌剤感受性測定装置
１６  マイクロアレイプレート（プレート）
２１  細胞播種手段
２５  ハイドロゲル素材混合手段（混合手段）
２６  スポッティング手段
２７  ゲル化手段
【図１】
2008017704.tif 000006
【図２】
2008017704.tif 000007
【図３】
2008017704.tif 000008
【図４】
2008017704.tif 000009
【図５】
2008017704.tif 000010
【図６】
2008017704.tif 000011
【図７】
2008017704.tif 000012
【図８】
2008017704.tif 000013
【図９】
2008017704.tif 000014
【図１０】
2008017704.tif 000015
【図１１】
2008017704.tif 000016
【図１２】
2008017704.tif 000017
【図１３】
2008017704.tif 000018
【図１４】
2008017704.tif 000019
【図１５】
2008017704.tif 000020
【図１６】
2008017704.tif 000021
【図１７】
2008017704.tif 000022