(57)【要約】【課題】発現が相補細胞で機能性だが宿主細胞で機能性でないようにウイルス遺伝子の発現が調節された新規ウイルスベクターと、その新規ベクターを含んだウイルス粒子および宿主細胞を提供することである。また、ウイルス遺伝子発現リプレッサーを含んだ相補細胞と、感染性ウイルス粒子の作製方法を提供することである。【解決手段】インデューサーおよび／またはリプレッサーをコードするＤＮＡ断片を含んでなる、Ｅ１機能と少くとも１つの第二の後期または初期アデノウイルス機能とに欠陥があるアデノウイルスベクターの相補用の相補細胞であって、（ｉ）相補細胞で発現に必要な要素のコントロール下におかれた、アデノウイルスのＥ１領域の全部または一部の発現のための第一カセット、および（ii）相補細胞で発現に必要な要素のコントロール下におかれた、Ｅ１領域以外のアデノウイルスの後期または初期領域の全部または一部の発現のための第二カセットを含んでなる、相補細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インデューサーおよび／またはリプレッサーをコードするＤＮＡ断片を含んでなる、Ｅ１機能と少くとも１つの第二の後期または初期アデノウイルス機能とに欠陥があるアデノウイルスベクターの相補用の相補細胞であって、
（ｉ）相補細胞で発現に必要な要素のコントロール下におかれた、アデノウイルスのＥ１領域の全部または一部の発現のための第一カセット、および
（ii）相補細胞で発現に必要な要素のコントロール下におかれた、Ｅ１領域以外のアデノウイルスの後期または初期領域の全部または一部の発現のための第二カセット（ここで、上記要素が、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＧＲＥ、ＰＲＥ、ＥＲＥおよびＧａｌ４  ＵＡＳ配列、並びにメタロチオネイン遺伝子の調節配列、および細菌トリプトファンラクトースおよびテトラサイクリンオペロンの調節配列から選択される１以上の調節配列を含んでなる）
を含んでなる、相補細胞。
【請求項２】
１以上の調節配列が、テトラサイクリントランスアクチベーター（ｔＴＡ）タイプのインデューサーにより活性化され、かつテトラサイクリンにより抑制されるプロモーターを与えるために、プロモーターのＴＡＴＡボックスの上流におかれた、テトラサイクリンオペロンに由来する、請求項１に記載の相補細胞。
【請求項３】
１以上の調節配列が、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）により抑制されるプロモーターを与えるために、プロモーターのＴＡＴＡボックスの下流におかれた、テトラサイクリンオペロンに由来するを含んでなる、請求項１に記載の相補細胞。
【請求項４】
２９３系に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の相補細胞。
【請求項５】
第二発現カセットの要素が１〜２０のｔｅｔＯ配列を５′末端に伴う最小プロモーターを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の相補細胞。
【請求項６】
第二発現カセットの要素が７つのｔｅｔＯ配列を５′末端に伴うＣＭＶウイルス（サイトメガロウイルス）由来の最小プロモーターを含んでなる、請求項５に記載の相補細胞。
【請求項７】
Ｅ１およびＥ４機能に欠陥があるアデノウイルスベクターの相補細胞であって、第二発現カセットがアデノウイルスのＥ４領域の全部または一部の発現用カセットである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の相補細胞。
【請求項８】
第二発現カセットがアデノウイルスのＥ４領域のオープンリーディングフレーム６および７（ＯＲＦ６／７）をコードする配列の発現用カセットである、請求項７に記載の相補細胞。
【請求項９】
Ｅ１およびＥ２機能に欠陥があるアデノウイルスベクターの相補細胞であって、第二発現カセットがアデノウイルスのＥ２領域の全部または一部の発現用カセットである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の相補細胞。
【請求項１０】
第二発現カセットがアデノウイルスのＥ２領域のＤＢＰタンパク質（ＤＮＡ結合タンパク質）をコードする配列の発現用カセットである、請求項９に記載の相補細胞。
【請求項１１】
第二発現カセットがアデノウイルスのＥ２領域のＤＢＰタンパク質の温度感受性変異体をコードする配列の発現用カセットである、請求項９に記載の相補細胞。
【請求項１２】
Ｅ１機能と少くとも２つの他の後期または初期アデノウイルス機能に欠陥があるアデノウイルスベクターの相補細胞であって、相補細胞で発現に必要な要素のコントロール下におかれた、Ｅ１領域と第二発現カセットのアデノウイルス領域以外のアデノウイルスの後期または初期領域の全部または一部の発現のための第三カセットを更に含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の相補細胞。
【請求項１３】
Ｅ１領域と第二発現カセットのアデノウイルス領域以外のアデノウイルスの後期または初期領域の全部または一部の発現のための第三カセットが、請求項１、２または３に記載されたプロモーターのコントロール下におかれている、請求項１２に記載の相補細胞。
【請求項１４】
Ｅ１、Ｅ２およびＥ４機能に欠陥があるアデノウイルスベクターの相補用の請求項１２または１３に記載の相補細胞であって、
（ｉ）相補細胞で発現に必要な要素のコントロール下におかれた、アデノウイルスのＥ１領域の全部または一部の発現のための第一カセット、
（ii）相補細胞で発現に必要な要素のコントロール下におかれた、アデノウイルスのＥ４領域の全部または一部の発現のための第二カセット、および
(iii) 相補細胞で発現に必要な要素のコントロール下におかれた、アデノウイルスのＥ２領域の全部または一部の発現のための第三カセット
を含み、第二および／または第三発現カセットの上記要素が少くとも１つのｔｅｔＯ配列を伴うプロモーターを含んでなる、相補細胞。
【請求項１５】
第二および／または第三発現カセットの前記要素が、７つのｔｅｔＯ配列を５′末端に伴うＣＭＶウイルス（サイトメガロウイルス）由来の最小プロモーターを含んでなる、請求項１２に記載の相補細胞。
【請求項１６】
相補細胞により産生されるウイルス粒子の力価が５×１０８ｐｆｕ（プラーク形成単位）／ｍｌ以上である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の相補細胞。
【請求項１７】
相補細胞により産生されるウイルス粒子の力価が１×１０１０ｉｆｕ（感染単位）／ｍｌ以上である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の相補細胞。
【請求項１８】
（ｉ）アデノウイルスベクターが、感染相補細胞を得るために、請求項１〜１７のいずれか一項に記載された相補細胞中に導入され、
（ii）上記トランスフェクトされた相補細胞がウイルス遺伝子の発現と上記感染性ウイルス粒子の産生を行うために適切な条件下で培養され、および
(iii) 上記感染性ウイルス粒子が細胞培養物中で回収される
ことを含む、感染性アデノウイルス粒子の作製方法。
【請求項１９】
遺伝子治療によるヒトまたは動物体の治療用の治療または予防的医薬品の製造における、請求項１〜１７のいずれか一項に記載された相補細胞の使用。
【請求項２０】
リプレッサーと組み合わされた、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は宿主細胞または生体で対象遺伝子のトランスファーおよび発現を行わせる新規ウイルスベクターに関し、そのウイルス遺伝子の発現は相補細胞で機能性だが宿主細胞または生体で機能性でないように調節されている。本発明は、これらの新規ベクターを含んだ細胞と、治療用の感染性ウイルス粒子を作製するための方法にも関する。本発明は、特にヒトにおける遺伝子治療の見通しに関して、極めて重要である。
【０００２】
遺伝子治療によりヒト疾患を治療する可能性は、数年で理論的考察の段階から臨床適用の段階へと変わってきた。ヒトに適用された最初のプロトコールは、アデニンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコードする遺伝子に影響を与える変異の結果として遺伝的に免疫不全であった患者で、１９９０年９月に米国で開始された。この最初の実験で比較的うまくいったことが、様々な遺伝子または後天性疾患（感染疾患および特にエイズのようなウイルス疾患、またはがん）について新たな遺伝子治療プロトコールの開発を促した。これまでに記載された大多数のプロトコールでは、治療すべき細胞に治療遺伝子を移して、そこでそれを発現させるためにウイルスベクターを用いている。
【０００３】
現在までのところ、レトロウイルスベクターはそれらゲノムの単純さのために最も広く用いられているものの１つである。しかしながら、クローニングについてそれらの限定された能力とは別に、それらはそれらの系統的使用を制限する２つの大きな欠点を示す：一方でそれらは主として分裂細胞に感染し、他方で宿主細胞のゲノムでランダムなそれらの組込みの結果として、挿入変異誘発のリスクが無視できない。この理由から、多くの研究チームは他のタイプのベクターを開発する努力をしており、その中ではアデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、サイトメガロウイルス、ポックスウイルスおよびヘルペスウイルスに由来するものが挙げられる。一般的に言えば、それらの組織とそれらの感染サイクルは当業者に入手しうる文献で詳細に記載されている。
【０００４】
この関係において、アデノウイルスベクターの使用は有望な代替法であるとみられた。アデノウイルスは多くの動物種で証明され、広い宿主範囲を有し、ほとんど病原性を有さず、レトロウイルスに伴う欠点を示さないが、その理由はそれらが非組込み性であって、休止細胞でも複製されるからである。参考のために、それらのゲノムは約３０以上の遺伝子、ウイルス複製に必要な初期遺伝子と後期構造遺伝子の双方を保有した約３６ｋｂの直鎖二本鎖ＤＮＡ分子からなる（図１参照）。
【０００５】
初期遺伝子はアデノウイルスゲノムに広がる４つの領域に分けられる（Ｅ１‐Ｅ４；Ｅは初期を表す）。それらは６つの転写単位を含み、それら自体のプロモーターを有している。後期遺伝子（Ｌ１‐Ｌ５；Ｌは後期を表す）は初期転写単位と部分的に重複しており、ほとんどの部分について主要後期プロモーター（ＭＬＰ）から転写される。
【０００６】
現在、遺伝子治療プロトコールで用いられるすべてのアデノウイルスベクターは、環境および宿主体でそれらの拡散を避けるために、複製に不可欠なＥ１領域のほとんどを欠いている。それらの一部は、特にそれらのクローニング能力を増加させることができる非必須Ｅ３領域において、追加の欠失を含んでいる。対象遺伝子は、１つのまたは他の欠失領域に代わって、ウイルスＤＮＡ中に導入される。Ｅ１領域の欠失は、ウイルスゲノムを複製に欠陥のあるものにする。しかしながら、Ｅ１−ウイルスは、感染性ウイルス粒子を作るために、欠失ウイルス機能をin transで供給する相補細胞系で増殖される。Ｅ１機能を効果的に補うヒト胚腎臓細胞から作られた２９３系（Graham et al.,1977,J.Gen.Virol.,36,59-72）が常用されている。Ｅ３領域は必須でなく、補われる必要はない。
【０００７】
これら第一世代ベクターを用いた遺伝子トランスファーの実施可能性は現在ではうまく確立されているが、それらの安全性の問題は未解決のままである。安全面（ＲＣＡ、即ち複製コンピテント粒子を作るリスク）とは別に、それらの毒性の問題が生じる。事実、最初の臨床試験では宿主でウイルス遺伝子の発現に伴い炎症反応の誘導を現した。
【０００８】
第二世代アデノウイルスベクターが最近文献で発表された。それらは感染細胞でウイルスの複製に必要なin cis領域（ＩＴＲおよびエンキャプシデーション配列）を残していて、in vivo 発現が望まれないウイルス遺伝子の大部分をなくす目的で実質的な内部欠失を有している。しかしながら、先行技術のこれらベクターは産業レベルでそれらの活用を制限するいくつかの欠点を有している。実際に、包括的な欠失機能を補って、高力価でウイルス粒子を産生しうる新たな系統を思いどおりに有することが必要である。実際上、このような系統は、ウイルス粒子の増殖能力と収率に関して最良であるためには、アデノウイルス遺伝子の細胞毒性のために作るのが特に難しい。
【発明の概要】
【０００９】
本発明ではこれらの欠点を直すことができる。一方、慣用的第二世代アデノウイルスベクターの増幅のためにＥ１およびＥ２またはＥ４アデノウイルス機能を補う、２９３系に由来する新たな系統が構築されたが、その系統ではＥ２またはＥ４領域の発現がいわゆる細菌テトラサイクリンオペロンの“オペレーター”配列を５′末端に伴うプロモーターにより指示され、これらの配列は以下でｔｅｔＯと称される。対応発現産物の合成は、アデノウイルスベクターまたはその系統自体により産生されうるインデューサーの存在下だけで活性化される。同様に、リプレッサーは相補がもはや望まれないときに培地に加えられる。
【００１０】
他方、Ｅ１およびＥ３領域の大部分が失われた新規アデノウイルスベクターがここに作製され、そのベクターにおいて残存ウイルス領域（Ｅ２、Ｅ４および／またはＬ１‐Ｌ５）の転写単位は、感染性ウイルス粒子が作製されるときにはそれらの発現を行わせ、更にはそれを宿主細胞で阻害する目的で調節しうる。後の例において、調節はｔｅｔＯ配列により行われる。ＴＡＴＡボックスの５′側におけるそれらの挿入では、転写のベースラインレベルが最小であるが、上記インデューサーの存在下で強く刺激されるプロモーターを生じる。このため、ウイルスタンパク質の産生は、感染性ウイルス粒子を形成させうるインデューサーを発現する２９３系で活性化される。逆に、それは細菌源のインデューサーを天然で産生しない感染宿主細胞だと著しく減少する。ウイルス遺伝子の調節は、テトラサイクリンに応答しないプロモーターのコントロール下におかれた外来ヌクレオチド配列の発現に効果を有しない。
【００１１】
本発明のアデノウイルスベクターは先行技術のベクターの使用に固有の欠点に対して有利なアプローチを提供するが、その理由はそれらが使用の安全性と産生の容易さを合わせ持っているからである。一方、それらは産業上の要求に合致した高力価で慣用的な相補系により増殖され、他方それらは外来ヌクレオチド配列をin vivo で移して、有害作用（宿主での炎症反応）を制限しながら安定的に発現させることができる。それらはヒト遺伝子治療に特に最も適している。
【００１２】
したがって、本発明の主題は、１以上のウイルス遺伝子を有した発現単位を含んでいることで特徴付けられるウイルスベクターであり、上記発現単位は相補細胞で機能性だが、宿主細胞で機能性でない。
【発明の具体的説明】
【００１３】
本発明の目的のために、“ウイルスベクター”はゲノムが修飾された親ウイルスから得られる。これらの修飾は多様（１以上のヌクレオチドの欠失、変異および／または付加）であって、ウイルスゲノムのコード領域中またはこれらの領域外、例えばプロモーター領域中に位置する。参考のために、一部のウイルス配列は失わせるか、非機能性にさせるか、または他の配列、特に発現が宿主細胞で求められる外来ヌクレオチド配列と代えられる。
【００１４】
本発明によるウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス）およびポックスウイルス、特にワクシニア、トリポックスまたはカナリヤポックスウイルスのような様々なウイルスから誘導される。このようなベクターとそれらの作製技術は、当業者に知られている。
【００１５】
しかしながら、本発明にとり特に適したベクターはアデノウイルスベクターである。それはヒト、イヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタまたはサル起源のアデノウイルスから、あるいは異なる起源のアデノウイルスゲノム断片を含んだハイブリッドから誘導される。イヌ起源のアデノウイルスＣＡＶ‐１またはＣＡＶ‐２、トリ起源のＤＡＶまたは代わりにウシ起源のＢａｄタイプ３（Zakharchuk et al., 1993, Arch.Virol.,128,171-176；Spibey and Cavanagh,1989,J.Gen.Virol.,70,165-172；Jouvenne et al.,1987,Gene,60,21-28；Mittal et al.,1995,J.Gen.Virol.,76,93-102 ）が更に具体的に挙げられる。しかしながら、好ましくは血清型Ｃ、絶対的に好ましくは２または５型のヒトアデノウイルス由来のアデノウイルスベクター（ Graham and Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology,vol.7,p 109-128 ；Ed:E.J.Murey,The Human.Press Inc. ）が好ましい。
【００１６】
本発明の有利な態様は、複製に必要な１以上のウイルス遺伝子が失われているか、または非機能性にされている、複製に欠陥があるベクターからなる。自律複製できないこのようなベクターは相補細胞で増殖される。“相補細胞”という用語は、本発明によるベクターに欠陥がある機能をin transで供給できる細胞を表す。換言すれば、それは、自ら産生できないが、感染性ウイルス粒子の形成に必要である、上記ベクターの複製およびエンキャプシデーションに必要なタンパク質、初期および／または後期タンパク質を産生することができる。説明すると、本発明による好ましいアデノウイルスベクターはＥ１領域のほとんどを欠いているため、そのベクターが産生できないＥ１領域によりコードされた包括的タンパク質をin transで供給できる２９３系のような相補細胞が利用される。“感染性ウイルス粒子”とは、宿主細胞に感染してウイルスゲノムをそこに入れさせる能力を有したウイルス粒子を意味すると理解されている。
【００１７】
好ましい態様によれば、本発明によるウイルスベクターは組換え体である。このため、それは宿主細胞でその発現に必要な要素のコントロール下におかれた外来ヌクレオチド配列を含んでいる。“外来ヌクレオチド配列”とは、いずれかの起源であって、本発明で用いられる親ウイルスのゲノムに通常存在しないか、またはもし存在するならば異なるゲノム関係にある核酸に関する。本発明の関係において、外来ヌクレオチド配列は１以上の遺伝子、特に治療対象の遺伝子からおそらく構成されることになる。
【００１８】
一般的に言えば、外来ヌクレオチド配列は、後で対象のタンパク質に翻訳されるアンチセンスＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡをコードすることができる。それはゲノムタイプ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）タイプまたは混合タイプ（少くとも１つのイントロンが失われたミニ遺伝子）からなる。それは成熟タンパク質または成熟タンパク質の前駆体、特にシグナルペプチドを含んだ分泌を意図する前駆体をコードする。更に、コードされる産物は、天然でみられるタンパク質（天然または端部切取りタンパク質）、または代わりに別な起源の配列の融合から得られるキメラタンパク質、あるいは改善されたおよび／または改変された生物学的性質を示す変異タンパク質から全部または一部なっている。このようなタンパク質は分子生物学の慣用的技術により得られる。
【００１９】
本発明の関係では、下記ポリペプチドをコードする遺伝子を用いることが有利である：
‐サイトカインまたはリンホカイン（インターフェロンα、βおよびγ、インターロイキン、ＩＬ‐２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０またはＩＬ‐１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ、Ｃ‐ＣＳＦ、Ｍ‐ＣＳＦ等））；
‐細胞または核レセプター（病原生物（ウイルス、細菌または寄生虫）、好ましくはＨＩＶウイルス（ヒト免疫不全ウイルス）により認識されるレセプター、あるいはそれらのリガンド）；
‐遺伝子障害に関与するタンパク質（因子VII 、因子VIII、因子IX、ジストロフィンまたはミニジストロフィン、インシュリン、ＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症貫膜透過レギュレーター）タンパク質、成長ホルモン（ＨＧＦ））；
‐酵素（ウレアーゼ、レニン、トロンビン等）；
‐酵素阻害剤（α１‐抗トリプシン、抗トロンビンIII 、ウイルスプロテアーゼの阻害剤等）；
‐腫瘍またはがんの開始または進行を少くとも部分的に阻止できる抗腫瘍効果を有したポリペプチド（アンチセンスＲＮＡ、抗体、細胞分裂または形質導入シグナルで作用する阻害剤、腫瘍抑制遺伝子の発現産物、例えばｐ５３またはＲｂ、免疫系を刺激するタンパク質等）；
‐主要組織適合遺伝子複合体クラスＩまたはIIのタンパク質、あるいは対応遺伝子の発現で作用する調節タンパク質；
‐ウイルス、細菌または寄生虫感染および／またはその進行を阻止できるポリペプチド（免疫原性を有する抗原ポリペプチド、抗原エピトープ、抗体、競合により天然タンパク質の作用を阻害できるトランスドミナント変異体等）；
‐毒素（単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ‐１  ＴＫ）、リシン、コレラまたはジフテリア毒素等）または免疫毒素；および
‐マーカー（β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等）
このリストは限定的ではなく、他の遺伝子も用いてよいことが指摘されるべきである。
【００２０】
更に、本発明で用いられる外来ヌクレオチド配列は、トランスフェクトされた細胞を選択または同定できる選択遺伝子を追加的に含んでいてもよい。抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする）、ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、ｐａｃ（プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子または代わりにｇｐｔ（キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）遺伝子が挙げられる。一般的に言えば、選択遺伝子は当業者に知られている。
【００２１】
宿主細胞で外来ヌクレオチド配列の発現に必要な要素は、ＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡまたはｍＲＮＡ）への転写とｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を行える包括的な要素を意味すると理解される。これらの中では、プロモーターが特に重要である。それは真核またはウイルス起源の遺伝子から単離しても、構成性でもまたは調節性でもよい。一方、それは対象となっている遺伝子の天然プロモーターであってもよい。（以下で記載される）ウイルス遺伝子の発現のための単位中に含まれたものとは異なるプロモーターを用いることも好ましい。更に、プロモーター活性を改善する、転写を阻害する領域をなくする、構成的プロモーターを調節性にするかまたはその逆にする、制限部位を導入する等のように修飾してもよい。例えば、ＨＳＶ‐１  ＴＫ、ネズミまたはヒトＰＧＫ（ホスホグリセラーゼキナーゼ）、α１‐抗トリプシン（肝臓特異性）および免疫グロブリン（リンパ球特異性）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０ウイルス（サルウイルス４０）初期プロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、あるいは代わりに特にヒトアデノウイルスタイプ２のアデノウイルスＭＬＰプロモーターが挙げられる。
【００２２】
当然ながら、本発明で用いられる外来ヌクレオチド配列は、宿主細胞で発現に必要な要素（イントロン配列、シグナル配列、核局在化配列、転写終結配列、ＩＲＥＳまたは他のタイプの翻訳開始部位等）または代わりにその維持に必要な要素を更に追加的に含むことができる。このような要素は当業者に知られている。
上記のように、本発明によるウイルスベクターは、相補細胞で機能性だが宿主細胞で機能性でないという有利な特徴を有した、１以上のウイルス遺伝子を有する発現単位を含んでいる。“機能性”とは、感染性ウイルス粒子の形成を行うために十分な量で十分な時間にわたるウイルス遺伝子の発現を意味すると理解されている。“非機能性”とは、親ウイルスでの発現レベルと比較して（好ましくは少くとも１／１０またはゼロ発現まで）減少したウイルス遺伝子の発現を意味すると理解されている。機能特徴は発現単位に含まれるウイルス遺伝子の産物の産生に際して現れるが、分子生物学、免疫学、生化学または酵素学の標準技術によりこれらの産物について証明することができる。非機能特徴は、ウイルス産物の産生の不在下で、または代わりに産生に際して、減少したレベルで現れる。
【００２３】
有利なことに、上記発現単位は親ウイルスＤＮＡに存在しない１以上の異種調節配列を含んでいる。発現でネガティブに作用するリプレッサータイプのレギュレーター、または好ましくはポジティブな作用を発揮するインデューサータイプのレギュレーターに応答する配列を利用してもよい。本発明の関係で用いられる調節配列はウイルス、原核または代わりに真核のいかなる起源であってもよい。一般的に言えば、調節配列は当業者に入手しうる文献で記載されている。配列が天然配列に対して修飾されたが、類似したまたは改善された調節機能を発揮するホモログを用いることも可能である。これらの修飾は、１以上のヌクレオチドの付加、欠失および／または置換による。
【００２４】
本発明で求められる目的によれば、調節配列はウイルス遺伝子の発現を異なるレベル、即ち転写、伸長、輸送、ｍＲＮＡの安定性または代わりに翻訳のレベルで調節することができる。それは上記発現単位の様々な箇所に、例えば特にその効果が転写レベル（好ましくはＴＡＴＡボックスの上流、後者から数百塩基対以内）であるときにはプロモーター、またはその作用が後の転写工程で発揮されるときには転写（可能であれば非コード）配列に存在していてよい。１〜２５、有利には１〜２０、好ましくは１〜１０、絶対的に好ましくは１〜７の調節配列を用いることが可能である。
【００２５】
本発明の目的から、“インデューサー”という用語は、上記調節配列に結合することで直接に、あるいは他の細胞またはウイルス因子で間接的に、調節配列のコントロール下におかれたウイルス遺伝子の発現を開始または活性化する能力を有した分子を表す。それはリプレッサーの作用も妨げることができる。対照的に、“リプレッサー”はそれが作用する調節配列のコントロール下におかれたウイルス遺伝子の発現を阻害または阻止する能力を有しており、これは直接または間接的に生じる。
【００２６】
これらの定義はラクトース（ｌａｃ）オペロンの例により説明される。ｌａｃＩ遺伝子は、“オペレーター”と称される短い調節配列に結合して、それによりラクトースの代謝経路の酵素をコードする構造遺伝子の転写を妨げるリプレッサーをコードしている。インデューサーの存在下で、後者はリプレッサーと結合して、オペレーターにもはや結合できないために転写を起こすことができない不活性形にそれを変換する。
【００２７】
これらレギュレーターの部分またはアナログを用いることも、それらの効力を改善するかまたはそれらの特異性を変えるために考えることができる（例えば、テトラサイクリンオペロンから誘導された調節配列を含んだプロモーターからの転写を阻害する上でテトラサイクリンより１０倍有効なアンヒドロテトラサイクリン、あるいは最近Gossen et al.,1995,Science,268,1766-1769に記載された逆トランスアクチベーター）。更に、本発明で用いられるレギュレーターは、異なる起源のポリペプチドの融合から得られるハイブリッドタンパク質であってもよい。好ましい組合せは、本発明で用いられる調節配列を認識または結合できるポリペプチド（例えば、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）またはエストロゲンリプレッサーＥＲから誘導される）と、発現を活性化できるポリペプチド（例えば、転写因子と相互作用できるＧａｌ４またはＶＰ１６タンパク質の活性化ドメイン）からなる。
【００２８】
下記表１は、本発明の関係で使用できる調節配列とレギュレーターの一部について掲載している：
【表１】
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【００２９】
本発明の具体的態様によれば、文献で“オペレーター”と称される細菌テトラサイクリンオペロン（ｔｅｔＯ）から誘導された調節配列が用いられる。一般的に言えば、テトラサイクリン耐性オペロンはトランスポゾンＴｎ１０によりコードされている（Hillen et al.,1984,J.Mol.Biol.,172,185-201）。調節は、様々なレギュレーターのための結合部位を構築している、“オペレーター”（ｔｅｔＯ）と称される短いヌクレオチド配列により行われる。このため、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）または抗生物質テトラサイクリンの結合は、転写のレベルを著しく減少させる。逆に、活性化効果は、単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６タンパク質の活性化ドメインの１３０Ｃ末端アミノ酸とｔｅｔＲとの間の融合から生じる、文献で“テトラサイクリントランスアクチベーター（ｔＴＡ）”と称されたタンパク質を用いることにより得られる。Gossen and Boujard（1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,5547-5551）では、この調節系が真核細胞で機能性 であることを最近示した。基本的転写配列（ＴＡＴＡボックス、転写開始部位等）の上流にあるｔｅｔＯのいくつかのコピーのコントロール下におかれたリポーター遺伝子の発現は、ｔＴＡの同時発現により検出でき、テトラサイクリンの添加により阻害される。Kim のグループ（1995,J.Virol.,69,2565-2573）は、その面に関して、プロモーターのＴＡＴＡボックスの下流に位置するｔｅｔＯ配列を利用しており、この場合に転写はｔｅｔＲの作用により阻害される。
【００３０】
本発明の関係において、ベースライン転写レベルが天然で非常に低いが、インデューサーｔＴＡにより活性化できてテトラサイクリンにより抑制できるプロモーターを生させる組合せ“ｔｅｔＯ‐最小プロモーター”（５′→３′方向）が特に最も好ましい。しかしながら、ｔｅｔＯ配列がＴＡＴＡボックスの３′側か、または代わりに後者の各側におかれて、ｔｅｔＯを認識するｔｅｔＲの配列を含んだリプレッサーにより抑制されうるプロモーターを用いることも可能である。
好ましい変形例として、本発明によるアデノウイルスベクターはＥ１領域の全部または一部か、代わりにＥ３領域の全部または一部を欠いたアデノウイルスのゲノムからなることが好ましい。有利には、Ｅ３領域の部分、特にｇｐ１９ｋ（Gooding and Wold,1990,Critical Reviews of Immunology,10,53-71 ）をコードする遺伝子に対応した部分を留めていることが好ましく、上記部分は上記のような発現単位に含まれていないが、慣用的同種（Ｅ３）または異種プロモーターのコントロール下におかれている。特にＥ４またはＥ２領域でウイルスゲノムの他の修飾を行えることも自明である。変異または追加欠失を導入することも有利である。この点を説明すると、温度感受性変異がＥ２Ａ領域のＤＢＰ（ＤＮＡ結合タンパク質を表す）遺伝子に影響を与える(Ensinger and Ginsberg,1972,J.Virol.10,328-339）。
【００３１】
好ましい態様によれば、本発明によるアデノウイルスベクターはＥ２、Ｅ４またはＬ１‐Ｌ５領域の１以上のウイルス遺伝子を有した発現単位を含んでなる。有利な変形例では、ＯＲＦ３、６および／または７をコードする配列だけをＥ４領域から残している（Ｅ４領域のこれらの限定された欠失はＥ４機能の相補を要しない；Ketner et al.,1989,Nucleic Acids Res.,17,3037-3048）。
【００３２】
いくつかの発現単位を含んだアデノウイルスベクターを思いどおりに有することが有利であり、すべての組合せ（Ｅ２およびＥ４、Ｅ２およびＬ１‐Ｌ５、Ｅ４およびＬ１‐Ｌ５またはＥ２、Ｅ４およびＬ１‐Ｌ５）を考えることができる。同様に、好ましくはポジティブに作用する調節配列（例えばＴＡＲ、ＲＲＥ、ｔｅｔＯ等）が選択される。実施の簡単さの理由から、単一インデューサーを含んだ相補系でアデノウイルスベクターを増殖させることができる同一の調節配列をその単位が保有している場合が好ましい。
【００３３】
本発明は感染性ウイルス粒子と、本発明によるウイルスベクターを含んだ真核宿主細胞にも関する。上記宿主細胞は有利には哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞であり、ゲノムに組み込まれた形または非組込み形（エピソーム）で上記ベクターを含んでいる。それには造血（全能性幹細胞、白血球、リンパ球、単球またはマクロファージ等）、筋肉、肺臓、肝臓、上皮または繊維芽細胞起源の一次または腫瘍細胞がある。
【００３４】
本発明の主題には相補細胞が更にあり、それはインデューサーおよび／またはリプレッサー（レギュレーター）を含むことで特徴付けられる。要求に応じて、後者は培地に加えても、あるいは細胞自体により安定的にまたは一過性で産生させてもよい。好ましくは、本発明による相補細胞は上記レギュレーターをコードするＤＮＡ断片の導入により改変される。細胞中に核酸（合成、ウイルスまたはプラスミドベクター、裸のＤＮＡ等）を導入するためのすべての標準手段、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着およびプロトプラスト融合が本発明の関係で用いられる。本発明の関係では、単一のレギュレーター、特にインデューサーだけを産生する相補細胞を作ることが有利である。しかしながら、いくつかのインデューサーを産生する細胞を思いどおりに有することも有利である。
【００３５】
有利な態様によれば、本発明による相補細胞は本発明によるウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターをin transで補うことができる。この関係において、Ｅ１および／またはＥ４機能用の相補細胞が有利に選択される。したがって、本発明はＥ１機能およびもう１つのアデノウイルス機能（後期または初期）に欠陥がある第二世代アデノウイルスベクターの相補が意図された細胞にも関する。このような細胞は、発現がいずれかのプロモーターによりコントロールされるアデノウイルスのＥ１領域の全部または一部と、調節配列、例えばトランスアクチベーターｔＴＡにより活性化できる少くとも１つ、好ましくは１〜２０のｔｅｔＯ配列をその５′末端に伴うプロモーターのコントロール下におかれた、Ｅ１領域以外のアデノウイルス領域の全部または一部とを含んでいる。有利な変形例ではＣＭＶウイルス（サイトメガロウイルス）由来の最小プロモーターからなり、その上流にはヘッド−テイル方向に７つのｔｅｔＯ配列がある。インデューサーはｔｅｔＯ配列のコントロール下におかれたアデノウイルス配列の前に、それと同時にまたはその後で本発明による相補細胞中に導入されるか、あるいは前記のようにそれは培地に加えられる。相補細胞でインデューサー（例えば、ｔＴＡ）を発現させ、アデノウイルス遺伝子の発現がもはや望まれないときにはリプレッサー（例えば、テトラサイクリン）を培地に加えることも考えることができる。
【００３６】
好ましい例によれば、Ｅ１領域以外のアデノウイルス領域は：
（ｉ）Ｅ４領域、特に後者のオープンリーディングフレーム６および７（ＯＲＦ  ６／７）をコードする配列の全部または一部、あるいは代わりに
（ii）Ｅ２領域、特に後者のＤＢＰタンパク質（ＤＮＡ結合タンパク質）または温度感受性変異体をコードする配列の全部または一部
からなる。
【００３７】
当然ながら、本発明による相補細胞は、発現が適切な要素のコントロール下におかれた第三アデノウイルス領域を更に含むことができる。この関係において、好ましい細胞は複製に不可欠な包括的初期機能に欠陥があるアデノウイルスベクターの相補向けであって、Ｅ１、Ｅ２およびＥ４領域の全部または一部を含んでおり、後の２領域の一方、他方または双方は前記のような調節配列を伴うプロモーターのコントロール下におかれている。
【００３８】
本発明による相補細胞の利点の１つは、それが慣用的なウイルスベクターまたは本発明によるウイルスベクターから高力価の感染性ウイルス粒子を産生できることである。最終プレパレーション（精製後）のウイルス力価は、有利には５×１０８pfu/ml以上、好ましくは１×１０９pfu/ml以上、絶対的に好ましくは５×１０９pfu/ml以上、更に一層好ましくは５×１０１０pfu/ml以上である。ｐｆｕという用語は、許容細胞の感染によりプラークを形成しうる粒子に関すると理解されている。ｐｆｕの数を評価するための技術は慣習的であって、当業者に知られている。寒天技術（Graham and Prevec,1991, 前掲）が挙げられる。通常、ウイルス力価pfu/mlは遺伝子トランスファー機能を発揮できる感染性ウイルス粒子の実際数に等しいか、またはそれ以下である。実際には、あるパーセンテージは許容細胞で有効に増殖して溶解プラークを形成することができない。本発明による相補細胞で産生された感染性ウイルス粒子の力価は、有利には５×１０９ifu/ml以上、好ましくは１×１０１０ifu/ml以上、絶対的に好ましくは５×１０１０ifu/ml以上、更に一層好ましくは５×１０１１ifu/ml以上である。ｉｆｕという用語は、非許容標的細胞に感染し、そのゲノムをトランスファーして、後者により保有された遺伝子の発現を行うことができる感染性粒子に関すると理解されている。ｉｆｕの数は、対象の遺伝子またはウイルス遺伝子を発現する標的細胞の数により評価される。当業者はそれらの発現を検出する上で用いられる技術：免疫蛍光、ウエスタンブロッティングまたは代わりに染色等について知っている。例えば、対象の遺伝子がＬａｃＺ遺伝子からなるとき、タンパク質β‐ガラクトシダーゼはＸ‐Ｇａｌ（５‐ブロモ‐４‐クロロ‐３‐インドリル  β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド）で染色することにより視覚化され、青色細胞の数がカウントされる。ＣＦＴＲ療法遺伝子が用いられるとき、発現産物はウエスタンブロッティングにより視覚化される。特別な抗体を用いてアデノウイルスＤＢＰ、ペントンまたは繊維タンパク質を発現する細胞を捜すことも可能である。
【００３９】
本発明による相補細胞は、アデノウイルスゲノムの適切な部分とレギュレーターをコードするＤＮＡ断片のトランスフェクションにより、様々な細胞系から作ることができる。考えうる系統の中では、ＡＴＣＣ（Rockville,USA ）のようなコレクションで入手しうるＶｅｒｏ腎臓（サル）、ＢＨＫ（ハムスター）、ＭＤＣＫ（イヌ）およびＭＢＤＫ（ウシ）系、ＣＨＯ系（ハムスター）または代わりにヒト系（ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＭＲＣ５、Ｗ１３８等）が挙げられる。しかしながら、特に適切な細胞は２９３系である。一次ヒト網膜細胞のような一次系の使用も考えられる。
【００４０】
本発明による感染性ウイルス粒子は、当業界で慣用的な技術（ Graham and Prevect,1991, 前掲）に従い、例えば適切な細胞中へのベクターおよびアデノウイルス断片のコトランスフェクションによるか、または代わりに非機能性ウイルス機能をin transで供給するヘルパーウイルスにより作製される。連結または代わりに相同的組換えにより Escherichia coli （E.coli）でin vitroでウイルスベクターを作ることも考えることが可能である（例えば、French Application  ９４／１４４７０参照）。
【００４１】
本発明は：
（ｉ）ウイルスベクターが、トランスフェクトされた相補細胞を得るために、in transで上記ベクターを相補する相補細胞中に導入され、
（ii）上記トランスフェクトされた相補細胞がウイルス遺伝子の発現および上記感染性ウイルス粒子の産生を行うために適切な条件下で培養され、および
(iii) 上記感染性ウイルス粒子が細胞培養物中で回収される
ことからなる、本発明によるウイルスベクターを含んだ感染性ウイルス粒子の作製方法にも関する。
【００４２】
当然ながら、感染性ウイルス粒子は培養上澄から回収されるが、細胞からも回収される。有利な態様によれば、本発明によるアデノウイルスベクターおよび相補細胞が用いられる。もう１つの変形例によれば、慣用的な相補細胞が利用される。発現単位が活性化しうる調節配列を含んだ場合だと、インデューサーを培地に加えることが必要かもしれない。用いられる量は、インデューサーの実際の性質に依存する。当業者であれば具体的データに従い最良の濃度に明らかに調整することができる。
【００４３】
本発明は、本発明による相補細胞を用いた、慣用的なウイルスベクターを含む感染性ウイルス粒子の作製方法にも関する。例えば、（ｉ）７つのｔｅｔＯ配列を５′末端に伴う最小プロモーターのコントロール下にあるＥ４領域のＯＲＦ６／７と（ii）同一のプロモーターにより指図されるトランスアクチベーターｔＴＡを発現する２９３細胞中への、Ｅ１およびＥ４機能に欠陥があるウイルスベクター（Ｅ１−Ｅ４−）の導入によれば、複製に欠陥があるが宿主細胞に対しては感染性であるウイルス粒子を作製することができる。
【００４４】
本発明の主題は、治療または予防剤として本発明によるウイルスベクター、感染性ウイルス粒子、相補細胞あるいは真核宿主細胞を、薬学的観点から許容されるビヒクルと組合せて含んでなる、医薬組成物にも関する。本発明による組成物は、特に：
‐遺伝子障害（血友病、嚢胞性繊維症、糖尿病またはミオパシー、Duchene´s ミオパシーおよびBecker´sミオパシー等）
‐がん遺伝子またはウイルスにより誘導されるようながん
‐肝炎ＢまたはＣとエイズ（ＨＩＶ感染から起きる後天性免疫不全症候群）のようなウイルス疾患、および
‐ヘルペスウイルスに起因するウイルス感染のような再発ウイルス疾患
のような障害の予防または治癒処置向けである。
【００４５】
本発明による医薬組成物は常法で製造される。特に、治療または予防剤の治療有効量が希釈剤のようなビヒクルと組み合わされる。本発明による組成物は、局所、全身またはエアゾールで、特に胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、腹腔内、腫瘍内、肺内、鼻内または気管内経路により投与される。投与は１回分の用量で、あるいはある時間間隔後に１回または数回繰返される用量で行われる。適切な投与経路および投薬量は、様々なパラメーター、例えば治療される個体または障害、あるいは代わりにトランスフェクトされる対象遺伝子に応じて変わる。特に、本発明によるウイルス粒子は１０４〜１０１４ｐｆｕ（プラーク形成単位）、有利には１０５〜１０１３ｐｆｕ、好ましくは１０６〜１０１１ｐｆｕの用量で処方される。その処方では薬学的観点から許容されるアジュバントまたは賦形剤も含有することができる。
【００４６】
最後に、本発明は、好ましくは遺伝子治療によるヒトまたは動物体の治療向け医薬品の製造のための、本発明によるウイルスベクター、感染性ウイルス粒子、相補細胞または真核宿主細胞の治療または予防用途に関する。第一の可能性によれば、医薬品は（例えば、到達しうる腫瘍では静脈内注射により、肺臓ではエアゾールによる等）in vivo で直接投与される。患者から細胞（骨髄幹細胞、末梢血リンパ球、筋肉細胞等）を取出し、当業界の技術に従いin vitroでそれらをトランスフェクトまたは感染させ、患者にそれらを再投与することからなるex vivo アプローチを採択することも可能である。発現単位がリプレッサーに応答するレギュレーター配列を含んでいる場合には、ウイルス遺伝子の発現を阻止または制限するためにリプレッサーを投与することが考えられる（リプレッサーの事前、同時または事後投与、あるいは慣用的ベクターによる同時発現）。
【００４７】
本発明は治療方法にも及び、それによれば本発明によるウイルスベクター、ウイルス粒子、真核宿主細胞または相補細胞の治療有効量がこのような治療を要する患者に投与される。
【実施例】
【００４８】
下記例は本発明の一態様について説明している。
【００４９】
下記構築は Maniatis et al.（1989,Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY）で詳述された遺伝子工学および分子クローニングの一般的技術に従い、または市販キットが用いられるときには製造業者の説明に従い行う。細菌プラスミドを用いたクローニング工程は E.coli 株５Ｋ（Hubacek and Glover,1970,J.Mol.Biol.,50,111-127）またはＢＪ５１８３（Hanahan,1983,J.Mol.Biol.,166,557-580）で行う。後者の株が相同的組換え工程で優先的に用いられる。ＰＣＲ増幅技術は当業者に知られている（例えば、PCR Protocols-A guide to methods and applications,1990, Innis,Gelfand,Sninksy and White ed.,Academic Press Inc. 参照）。制限部位の修復に用いられる技術は、 E.coli ＤＮＡポリメラーゼＩ（Klenow）の大断片を用いて５′突出末端を満たすことからなる。
【００５０】
細胞生物学関係については、細胞は当業者に周知の標準技術に従いトランスフェクトさせる。リン酸カルシウム技術（Maniatis et al.,前掲）が挙げられるが、ＤＥＡＥ‐デキストラン技術、エレクトロポレーション、浸透圧ショックに基づく方法、マイクロインジェクションまたはリポソームの使用に基づく方法のようないずれか他のプロトコールも用いてよい。培養条件はそれらの面に関して慣用的である。
【００５１】
下記例では、下記細胞系が用いられる：
Ａｄ５ゲノム（５′ＩＴＲ、エンキャプシデーション配列およびＥ１領域）の５′末端の染色体への組込みから得られる、ヒト胚腎臓由来の２９３系（Graham et al.,1977, 前掲）（レファレンスＣＲＬ１５７３でＡＴＣＣから入手できる）Ａｄ５  Ｅ４領域（ｎｔ３２８００〜３５８２６）とｐａｃ選択遺伝子の発現用カセットを保有したプラスミドｐＴＧ１６５３で安定的に形質転換された２９３系に由来するＴＧ１６５３系（国際出願ＷＯ９４／２８１５２、実施例８に記載されている）
他の細胞系も用いてよいことが理解されるべきである。
【００５２】
更に、下記の異なる構築で用いられるアデノウイルスゲノム断片は、レファレンスＭ７３２６０でGenebankデータバンクに開示されているようなＡｄ５ゲノムのヌクレオチド配列でそれらの位置について正確に示されている。
【００５３】
例１：アデノウイルス遺伝子の発現を活性化しうるインデューサーを発現する相補系
この例では、（１）トランス活性化タンパク質ｔＴＡを構成的に発現できる２９３系由来の相補系と、（２）Ｅ４領域の一部ウイルス遺伝子がｔＴＡに応答するｔｅｔＯ配列のコントロール下におかれたアデノウイルスベクターの構築について記載している。その系中へのベクターのトランスフェクション後にウイルス粒子の形成を行うが、その理由はＥ１およびＥ４機能がアデノウイルスＥ１領域およびｔＴＡの発現産物の供給によりトランス相補されるからである。キメラｔＴＡタンパク質を天然で産生しない感染宿主細胞において、Ｅ４と結果的に後期タンパク質（Ｅ４依存性発現）の発現は著しく減少し、それにより細胞性免疫および炎症の問題を制限する。
【００５４】
１．トランスアクチベーターｔＴＡを発現する相補系の構築
プロマイシンで形質転換細胞の選択を行えるベクターｐＴＧ６５２９を最初に構築する。そのベクターは、ＳＶ４０プロモーターおよびｐａｃ遺伝子とその後にＳＶ４０ウイルスポリＡシグナルから構成される発現カセットのｐポリIII-Ｉ＊（Lathe et al.,1987,Gene 57,193-201 ）中へのクローニングから得る。このような構築は、文献に記載された対応配列からみて、当業者の能力内に属する（Morgenstern and Land,1990,Nucleic Acid Res.18,3587-3596 ；GenebankレファレンスＪＯ２４００）。
【００５５】
並行して、ベクターｐＵＨＤ１５‐１（Gossen and Bujard,1992, 前掲）を酵素ＳｓｐＩおよびＨｐａＩで切断する。ＣＭＶプロモーターにより先行されるｔＴＡをコードする配列を含んだ断片をｐＴＧ６５２９の同部位間にクローニングして、ｐＴＧ４６７３を得る（図２）。
【００５６】
ベクターｐＴＧ４６７３を常法で２９３細胞中にトランスフェクトする。当然ながら、ｔＴＡの発現用ベクターおよび選択ベクター（例えばｐＵＨＤ１５‐１およびｐＴＧ６５２９）をトランスフェクトさせることも可能であった。トランスフェクト後、細胞を選択培地（プロマイシン１μg/ml）で培養する。８０の耐性クローンを単離し、これらのうち３５について、発現がｔｅｔＯ配列によりコントロールされるマーカー遺伝子をトランス活性化するそれらの能力に関して試験した。実施の簡単さとアッセイの感度の理由から、ルシフェラーゼ遺伝子を選択した。
【００５７】
ルシフェラーゼをコードする配列がｔｅｔＯの７コピーにより先行されたＣＭＶ最小プロモーターのコントロール下におかれたリポーターベクターｐＵＨＣ１３‐３（Gossen and Bujard,1992, 前掲）を用いる。試験は、試験されるクローン中への一時的トランスフェクションにより行う。２日後、ルシフェラーゼ活性はPromega 市販のキット（“Luciferase Assay System ”）と、サンプルの測定のためにシンチレーションカウンター（ＬＳ５００００ＴＤ、Beckman ）を用いて、細胞抽出物で評価する。そのアッセイでは評価されたクローンのうち１０について陽性とわかり、それらがｔｅｔＯ配列を認識してそれらのコントロール下におかれた遺伝子の発現を活性化しうる機能性ｔＴＡ産物を産生することを示している。
【００５８】
２．Ｅ４遺伝子の発現がｔＴＡで誘導しうるアデノウイルスの構築
上記のように、Ｅ４領域のＯＲＦ６および７をコードする遺伝子の発現は、相補の必要性なしにウイルス複製を行う上で十分である。この例では、発現がｔｅｔＯのコントロール下におかれて結果的にｔＴＡの存在下で促進されるＯＲＦ６および７をコードする配列を除いて、Ｅ１およびＥ３領域とＥ４領域の一部が失われたアデノウイルスベクターの構築について記載している。
【００５９】
ベクターｐＵＨＤ１０‐３は、７つのｔｅｔＯコピーとＣＭＶ最小プロモーター（転写開始部位に対して−５３位；Gossen and Bujard,1992, 前掲）を保有したＸｈｏＩ‐ＥｃｏＲＩ断片のプラスミドｐＢＲ３２２中へのクローニングから得る。ＢａｍＨＩで切断後（プロモーター領域の下流に位置する部位）、ｐＴＧ１６５３から得られてＯＲＦ６および７をコードする配列を保有したＢｇｌII‐ＢａｍＨＩ断片を挿入して、ｐＴＧ４６５８を得る。
【００６０】
ベクターｐＴＧ４６６４は、ＢｇｌII部位が予め取り除かれたｐポリII（Lathe et al.,1987,前掲）のＫｐｎＩ‐ＳｍａＩ部位間へのＫｐｎＩ‐ＨｐａＩアデノウイルス断片（ヌクレオチド２５８３８‐３２００４）のクローニングから得る。次いでＥ３の大部分（ヌクレオチド２７８７１‐３０７４８）を酵素切断（ＨｐａＩ‐Ｈｉｎｄ III）により除く。
【００６１】
ＯＲＦ６および７の調節発現用カセットを保有したＸｈｏＩ‐ＨｐａＩ断片をｐＴＧ４６５８から単離し、ＢｇｌIIで切断されてKlenow断片で処理されたベクターｐＴＧ４６６４中にKlenow断片の作用後に挿入して、カセットの方向に従いｐＴＧ４６６８およびｐＴＧ４６６９を得る。後者は相同的組換えによりアデノウイルスベクター中に導入する。“ＭＬＰプロモーター‐ＬａｃＺ遺伝子ＳＶ４０ｐＡ”発現カセットがＥ１領域の代わりにクローニングされた第二世代ベクターに由来する（そこから複製に不可欠なＥ１およびＥ４領域と非必須Ｅ３領域が失われている（ヌクレオチド２７８７１‐３０７４８の欠失）；国際出願ＷＯ９４／２８１５２の実施例４に記載されている）組換えベクターｐＴＧ４６６３がこの目的のために用いられる。E.coli細胞をＨｉｎｄ IIIで開裂されたｐＴＧ４６６８またはｐＴＧ４６６９とＳｐｅＩで直鎖化されたウイルスベクターｐＴＧ４６６３で同時形質転換させて、ｐＴＧ４６９６（図３）およびｐＴＧ４６９７を得る。
【００６２】
類似タイプの他のアデノウイルスベクターも作製できる。例えば、ｔｅｔＯ配列のコントロール下にＥ２領域の遺伝子をおくことも考えることが可能である。当業者であれば、ベクターｐＵＨＤ１０‐３から単離されたもののような調節しうるプロモーターによりＥ２プロモーターを置き換えさせるか、あるいはＥ２プロモーターのＴＡＴＡボックスの上流にある配列を除去させて、ｔｅｔＯ配列の１以上（好ましくは７つ）のコピーをそれらの位置に導入させるという、分子生物学技術に精通している。例えばＥ２、Ｅ４および／またはＭＬＰのウイルス遺伝子の発現を指図するプロモーターのＴＡＴＡボックスの上流でｔｅｔＯの挿入により、いくつかのレベルで調節されるベクターを構築することも可能である。３．ウイルス粒子の作製
ウイルスベクターｐＴＧ４６９６またはｐＴＧ４６９７を、例１のｔＴＡを産生する１０のクローンのうち１つにトランスフェクトする。その細胞は、Ｅ１機能を相補して、しかもＯＲＦ６および７の発現を活性化してウイルス粒子の形成を行わせるｔＴＡを産生することができる。次いで０．１〜１００で様々に変わる特定のｍ．ｏ．ｉ．（感染多重度）で標的細胞を感染させることができるストックを作り出す。
【００６３】
例２：Ｅ１およびＥ４機能のための相補系４６７７の構築であって、Ｅ４の発現はｔＴＡで誘導しうる
この例では、ｔｅｔＯの７コピーにより先行された最小プロモーターのコントロール下におかれたＥ４のＯＲＦ６および７の発現のためのベクターによる２９３細胞のトランスフェクションから作製された相補系に関する。トランスフェクトされた細胞は、Ｅ１機能を構成的におよびＥ４機能をｔＴＡ誘導で相補することができる。後者は欠陥アデノウイルスベクターまたは慣用的発現ベクターに保有させてもよい。
【００６４】
１．相補系の構築
ｐＴＧ４６５８のＸｈｏＩ‐ＢａｍＨＩ断片（“ｔｅｔＯ‐ＣＭＶ最小プロモーター‐ＯＲＦ６および７”カセットを保有する）を選択ベクターｐＴＧ６５２９のＳａｌＩおよびＢｇｌII部位間に挿入して、ｐＴＧ４６７７を得る。６０の耐性クローンを２９３系へのトランスフェクションとプロマイシン選択後に得た。相補について最良の能力を示すクローンは異なる手法で調べてもよい。
【００６５】
第一の方法では、ｔＴＡを構成的に発現するプラスミドｐＵＨＤ１５‐１を一時的にトランスフェクトさせる。適切な抗体を用いた細胞抽出物のウエスタンブロット分析では、これらのクローン中で産生されるＯＲＦ６および／または７ポリペプチドの量と、ひいてはＥ４アデノウイルス機能をトランス相補するそれらの能力について評価することができる。もう１つの方法によれば、ｔＴＡを発現する欠陥アデノウイルスも用いてよい。この方法は以下で詳述されている。
【００６６】
２．ｔＴＡを構成的に発現する欠陥アデノウイルスの構築
２シリーズの構築を行った。Ｅ１およびＥ３領域の大部分が失われたアデノウイルスゲノムに相当して、Ｅ１領域の代わりにｔＴＡ（ＣＭＶプロモーター）の構成的発現用のカセットを含んだｐＴＧ４６８２。加えて、Ｅ４領域はｐＴＧ４６８３から欠失させる。
【００６７】
出発物質は、アデノウイルスゲノムの５′末端の部分、即ちヌクレオチド１‐４５８および３３２８‐５７８８にわたる配列のｐポリII（Lathe et al.,1987,前掲）中への挿入から得られるベクターｐＴＧ８３４３である（図４）。
【００６８】
ＢｇｌIIによるｐＴＧ８３４３の切断とKlenow断片での処理後に、ベクターをＣＭＶプロモーターとその後にｔＴＡ配列を保有したｐＵＨＤ１５‐１のＳｓｐＩ‐ＨｐａＩ断片と結合させる。相同的配列を保有したアデノウイルスベクターとの相同的組換えによるｔＴＡカセットの挿入を行うためのｐＴＧ４６７４を得る。この目的から、Ａｄ５の５′ＩＴＲおよびエンキャプシデーション配列（ｎｔ１‐４５８）、Ｅ１領域の代わりにＬａｃＺ遺伝子の発現用カセットと、Ｅ３領域が失われた残りのアデノウイルス配列（ヌクレオチド３３２９‐２７８７０および３０７４９‐３５９３５）を含んだベクターｐＴＧ４６６２（図５）を選択する。
【００６９】
E.coli株ＢＪをＣｌａＩで直鎖化されたベクターｐＴＧ４６６２と、ＳｇｒＡＩおよびＢｓｔＥIIで開裂されたｐＴＧ４６７４で同時形質転換させて、ｐＴＧ４６８２を得る（図６）。この相同的組換え現象では、ｐＴＧ４６６２のＬａｃＺカセットからｐＴＧ４６７４から得た断片により保有されるｔＴＡカセットへの交換を行う。
【００７０】
ベクターｐＴＧ４６８３（図７）は、ＣｌａＩで開裂されたｐＴＧ４６６３とＳｇｒＡＩおよびＢｓｔＥIIで切断されたｐＴＧ４６７４との間でin vitro相同的組換えにより、同様の技術に従い得る。ベクターｐＴＧ４６６３は、Ｅ４領域の大部分（ヌクレオチド３２９９４‐３４９９８）が失われているという事実を除いて、ｐＴＧ４６６２と同様である。
【００７１】
３．ｔＴＡを誘導的に発現する欠陥アデノウイルスの構築
ｔＴＡ配列の発現をモニターするために、系を自己誘導性にする、５′末端にｔｅｔＯ配列の７コピーを含んだＣＭＶ最小プロモーターを利用する。実際には、未誘導プロモーターからのいくつかのｔＴＡ分子の産生がその系を活性化させる。前記のように、Ｅ４領域が失われたかまたは失われていない２つのアデノウイルスベクターｐＴＧ４６８４およびｐＴＧ４６８５を作製する。
【００７２】
ｐＵＨＤ１５‐１のＣＭＶプロモーターをＸｈｏＩ‐ＥｃｏＲＩ断片の形でｐＵＨＤ１０‐３から単離されたその調製しうるホモログと交換する。ｐＴＧ４６５９が得られる。そのカセットをＳｓｐＩおよびＨｐａＩ切断により後者から単離し、ＢｇｌIIで直鎖化されたベクターｐＴＧ８３４３中にクローニングし、Klenow断片で処理して、ｐＴＧ４６７５を得る（図８）。次いでE.coli株ＢＪをＳｇｒＡＩおよびＢｓｔＥIIで処理された上記ベクターと酵素ＣｌａＩで直鎖化されたｐＴＧ４６６２またはｐＴＧ４６６３で同時形質転換させて、相同的組換えによりウイルスベクターｐＴＧ４６８４（図９）およびｐＴＧ４６８５（図１０）を得る。
【００７３】
ウイルス粒子は、テトラサイクリンの不在下で例２．１の場合のように適切な細胞系の簡単なトランスフェクションにより得てもよい（ｔｅｔＯ配列により調節しうるｔＴＲとＯＲＦ６および７の転写に阻害効果を有する培地への抗生物質の添加）。
【００７４】
４．マイクロインフェクションおよび微量滴定の機能性試験
実験は、Ｅ１機能を補う２９３細胞とＥ１およびＥ４機能を補う１６５３細胞で並行して行う。細胞を約５×１０４細胞／ウェルのベースで培養プレートに分配させる。次いでそれらを試験されるベクターｐＴＧ４６８２〜４６８５でトランスフェクトさせる。双方の細胞タイプでプラークを形成する（それらの出現率による）それらの能力とそれらのサイズを評価する。コントロールとして、第一世代アデノウイルスベクター（Ｅ１およびＥ３の欠失）と第二世代アデノウイルスベクター（Ｅ４の追加欠失）に各々相当するが、ｔＴＡを発現しない組換えベクターｐＴＧ４６６２およびｐＴＧ４６６３を用いる。
【００７５】
ｐＴＧ４６６２からウイルス粒子の生成は双方の細胞系で容易に検出しうる（大きなプラークの形成が急速に出現する）。ｐＴＧ４６６３はその面についてＥ１およびＥ４を補う１６５３細胞だけで増殖させることができ、後で出現する小さなプラークを与える。
【００７６】
ベクターｐＴＧ４６８２およびｐＴＧ４６８４に関しては、２９３および１６５３細胞中へのそれらのトランスフェクションと、その後の大きな容易に同定しうるプラークの形成は速やかである（ｐＴＧ４６６２コントロールと似た挙動）。Ｅ４領域が失われたベクターｐＴＧ４６８３およびｐＴＧ４６８５はｐＴＧ４６６３に匹敵した挙動を示し、１６５３系だとウイルス粒子はゆっくり出現して小さなサイズのプラークを形成するが、２９３系だとプラークは検出されない。これらのデータは、ｔＴＡの発現がウイルス増殖に不利でないか、または細胞増殖に有害でないことを示しているようである。
【００７７】
上記のように、この技術は例１の系（２９３／ｐＴＧ４６７３）とベクターｐＴＧ４６９６およびｐＴＧ４６９７に適用してもよい。
【００７８】
例３：Ｅ１およびＥ４機能に関する相補系５６０６の構築であって、Ｅ４の発現は系により産生されるｔＴＡで誘導しうる
この例では、７つの連続的ｔｅｔＯ配列を５′末端に伴うＣＭＶ最小プロモーター（転写開始部位に対して−５３位）に相当する、ｐＣＭＶ＊と以下で称されるプロモーターのコントロール下におかれたＯＲＦ６／７およびｔＴＡをコードする配列をｐａｃ選択遺伝子以外に保有したベクターｐＴＧ５６０６での２９３細胞のトランスフェクションにより得られる、Ｅ１−およびＥ４−欠陥アデノウイルスの増殖を行える相補細胞系について記載している。この自己誘導系では、ｔｅｔＯ配列でポジティブに作用して、欠陥ベクターの有効な相補のために十分な量でそれら自体の合成とＯＲＦ６／７産物の合成とを増幅させることができる、最小ＣＭＶプロモーターからのいくつかのｔＴＡ分子の産生をまず第一に可能とする。
【００７９】
１．プラスミドｐＴＧ５６０６の構築
第一工程ではベクターｐＴＧ４６８８を構築するが、これはＨｐａＩおよびＰｖｕＩで開裂されたｐＴＧ４６７３（例１．１）から精製されたカセット（ＣＭＶプロモーター／エンハンサー‐ｔＴＡ）の、これらの同酵素で切断されたベクターｐＴＧ４６７７（例２．１）中へのクローニングから得る。ベクターｐＴＧ５６０６は、調節しうるプロモーターｐＣＭＶ＊によるＣＭＶプロモーター／エンハンサーの置換により、上記ベクターから得る。このために、ｐＴＧ４６８８を酵素ＳｃａＩ‐ＸｂａＩで直鎖化してから、ｐＴＧ４６５９から単離されたｐＣＭＶ＊を保有するＳｃａＩ‐ＸｂａＩ断片を挿入する。こうして作製されたプラスミドｐＴＧ５６０６（図１１）は下記３つの発現カセットを含んでいる：
ｐＣＭＶ＊プロモーター、ｔＴＡトランスアクチベーターをコードする配列およびＳＶ４０ウイルスポリＡ配列から構成される第一カセット、
初期プロモーターのコントロール下にあるプロマイシン耐性遺伝子（ｐａｃ遺伝子）およびＳＶ４０ウイルスｐＡ配列から構成される第二カセット、および
ｐＣＭＶ＊プロモーターと、その後に自己のポリＡシグナルを伴うアデノウイルス５  ＯＲＦ６／７をコードする配列から構成される第三カセット。
【００８０】
２．相補系５６０６の作製
４×１０６２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）を１０％ＦＣＳの存在下でＤＭＥＭ培地（Dulbecco改変Eagle 培地）で培養する。約７０〜８０％集密率で、それらをいくつかの皿に分配し、その後１０μｇまたは２０μｇのプラスミドｐＴＧ５６０６でトランスフェクトする（Gibco-ＢＲＬトランスフェクションキット；レファレンス５３０‐８１２０ＳＡ）。４８時間後、細胞を選択培地  （第一週目はプロマイシン０．７μg/ml、その後１μg/ml）で培養する。耐性クローンを上記選択培地で、適宜にテトラサイクリンの存在下において増幅させる。後者はｔｅｔＯ配列でリプレッサー効果を発揮し、それを加える目的はＯＲＦ６／７の発現産物の合成を減少させることであり、それは細胞毒性があって細胞死を導くことがある。このため、３つのバッチを各々０μg/ml、１μg/mlおよび５μg/mlで培地中に含有されたテトラサイクリン濃度に従い作った。多数のクローンがトランスフェクトされたＤＮＡの量と培養条件にかかわらず出現する。
【００８１】
Ｅ１およびＥ４遺伝子を同時発現するクローンは、マイクロインフェクションおよび微量滴定技術によりスクリーニングした。約１００の５６０６クローンをＥ１‐Ｅ４欠陥アデノウイルスベクターにより低いｍｏｉ（感染多重度）で感染させる（例えば、国際出願ＷＯ９４／２８１５２参照）。細胞変性効果は、それらが得られたバッチに応じて、それらの１０〜１６％について感染から４８〜７２時間後に観察される。細胞変性効果は二重欠陥ウイルスの増殖の証拠であり、トランス相補に関するクローンの能力を反映している。感染性ウイルス粒子の力価は許容細胞でマイクロウェル滴定技術により評価する。このために、ウイルス粒子を３サイクルの凍結‐解凍により感染培養物から回収し、滴定されるウイルス上澄を１００μｌ／ウェルのベースで連続希釈して、４×１０４１６５３細胞と接触させておく。ウイルス力価は異なる希釈倍率で細胞変性効果の観察によりおおまかに評価する。最も生産的な５６０６クローン（高希釈倍率で細胞変性効果）をpfu/mlおよびifu/mlで収率の更に正確な研究のために選択する。
【００８２】
選択された５６０６クローン（５×１０５細胞）を培養し、Ｅ１‐Ｅ４アデノウイルスベクターで再び感染させる。例えば、Ｅ１、Ｅ３（ｎｔ２８５９２‐３０４７０）およびＥ４（ｎｔ３２９９４‐３４９９８）領域が失われて、Ｅ１の代わりに対象遺伝子の発現用カセット、ＭＬＰ‐ＬａｃＺプロモーターおよびＭＬＰ‐ＣＦＴＲ遺伝子プロモーターを各々含んだベクターＡｄＴＧ８５９５およびＡｄＴＧ４６５１を用いることが可能である。前記のように、ウイルス上澄を回収し、許容細胞（系１６５３または５６０６生産クローン）を適切な希釈倍率のウイルス上澄で感染させて、寒天中で溶解プラークをカウントすることにより力価pfu/mlを調べる。＃５‐１９／１および＃５‐３８と称される２つのクローンは１〜５×１０９pfu/mlの力価を示す（滴定はそれら自体で行う）。感染性粒子の収率（ifu/ml）は対象遺伝子を発現する感染細胞をカウントすることにより評価する。このため、ＡｄＴＧ８５９５で感染された５６０６クローンから得られるウイルス上澄をそれら自体で滴定し、感染から４８時間後に付着細胞を  （２％ホルムアルデヒドおよび０．２％グルタルアルデヒドを含有したＰＢＳ緩衝液）固定し、β‐ガラクトシダーゼの産生を色素Ｘ‐Ｇａｌ（５ｍＭフェリシアニドＫ、５ｍＭフェロシアニドＫおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ２が加えられたＰＢＳ緩衝液中１ mg/ml）で視覚化させる。得られた力価は１０１０および１０１１ifu/mlである。
【００８３】
最後に、後期ウイルス遺伝子の発現は損われないことが確認されるが、それはウイルス粒子のアセンブリーの欠陥を生じることがあるためである。ファイバーおよびペントンの産生は、凍結‐解凍のサイクル後に回収された感染細胞のペレットについてウエスタンブロッティングにより調べる。分析はファイバーに対する抗体（Henry et al.,1994,J.Virol.68,5239-5246）またはペントンベースに対する抗体（Boulanger et al.,1973,Eur.J.Biochem.39,37-42）とその後にペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体（Amersham、ＮＡ  ９３４）を用いて３μｇのタンパク質に相当する細胞抽出物の一部で標準技術に従い行う。視覚化はＥＣＬ検出キット（Amersham、ＲＰＮ  ２１０６）を用いて行う。そのデータでは、２つの５６０６クローンから得られるＥ１‐Ｅ４アデノウイルスがＥ１−ウイルスで感染された２９３細胞で得られる場合に近いレベルで後期タンパク質を産生することができることを示している。
【００８４】
結論として、５６０６クローン＃５‐１９／１および＃５‐３８は１×１０９pfu/mlを超える力価、大規模産生に匹敵する力価で二重欠陥ベクターを増幅させることができるＥ１およびＥ４相補系である。
【００８５】
例４：Ｅ１およびＥ２Ａ機能に関する相補系９５７９の構築であって、Ｅ２Ａの発現はｔＴＡにより誘導できて、後者はその系により産生される
この例では、前例と同様の原理に従いＤＢＰタンパク質の自己誘導性発現を行うベクターｐＴＧ９５７９での２９３細胞のトランスフェクションにより得られる、Ｅ１−およびＥ２Ａ−欠陥アデノウイルスの増殖を行える相補細胞系について記載している。
【００８６】
１．ベクターｐＴＧ９５７９の構築
ベクターｐＴＧ９５７９を下記のように構築する：
アデノウイルス５ゲノムの３′末端をＤｒａＩ‐ＢｓｍＢＩで切断されたゲノムＤＮＡの作製から単離する。対応する断片をベクターｐＵＣ１９（Gibco ＢＲＬ）のＳｍａＩ部位中にサブクローニングして、中間ベクターｐＴＧ９５６８を得る。ＤＢＰ配列の停止コドンはＤｒａＩ開裂で壊れていることがわかっている。それは、ゲノム鋳型と適切なプライマーからＰＣＲ増幅により得られた正しい配列を含む断片の、ｐＴＧ９５６８のＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩ部位間での導入により修復する。ｐＴＧ９５７１を得る。
【００８７】
別に、ベクターｐＵＨＤ１０‐３をＨｉｎｄ IIIで直鎖化し、Klenow断片で処理し、初期プロモーターにより指示されるｎｅｏ遺伝子（ Colbere-Garapin et al.,1981,J.Mol.Biol.,150,1-14 ）の発現用カセットとＳＶ４０  ｐＡシグナルを挿入する。こうして得られたベクターｐＴＧ９５５５をＸｂａＩで直鎖化し、その後Klenow断片の作用に付してから、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩでの開裂とKlenow断片での処理後にｐＴＧ９５７１から単離されたＤＢＰ配列を保有した断片をクローニングする。最後に、ｔＴＡ遺伝子の発現用カセットを保有したｐＴＧ４６５９から単離されたＨｐａＩ‐ＸｈｏＩ断片（Klenow）を、先の工程で作られたベクターｐＴＧ９５７７の、Klenow断片で処理されたＸｈｏＩ部位中に導入する。要約すれば、後者は：
ｐＣＭＶ＊プロモーターと、その後にｔＴＡトランスアクチベーターをコードする配列とＳＶ４０ウイルス  ポリＡ配列から構成される第一カセット、初期プロモーターのコントロール下にある抗生物質Ｇ４１８耐性ｎｅｏ遺伝子とＳＶ４０ウイルスｐＡ配列から構成される第二カセット、および
ｐＣＭＶ＊プロモーターのコントロール下にあるアデノウイルス５ＤＢＰタンパク質をコードする配列とＳＶ４０ウイルスｐＡ配列から構成される第三カセット
を含んでいる。
【００８８】
ｐＴＧ９５７９による機能性ＤＢＰタンパク質の産生は、２９３細胞中への一時的トランスフェクションにより確認してもよい。簡単に言えば、１×１０６細胞をリン酸カルシウム法により５μｇのベクターでトランスフェクトし、その後テトラサイクリンの存在下（１μg/ml）または不在下で培養する。トランスフェクトから４日後に細胞を回収し、細胞ペレットを１００μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  Tris‐ＨＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１％ Triton Ｘ‐１００）で処理して、タンパク質を溶解させる。タンパク質抽出物７μｌを５％β‐メルカプトエタノール含有Tris‐グリシン添加緩衝液に溶解させ、変性条件下で８〜１６％ＰＡＧＥ電気泳動に付す。ニトロセルロース膜へのトランスファー後に、ＤＢＰタンパク質をウエスタンブロッティングによりアデノウイルスＤＢＰタンパク質に特異的な抗体  （Reich et al.,1983,Virology,128,480-484；例えばマウスモノクローナル抗体α７２ＫＢ６‐８）およびペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウス免疫グロブリン抗体（Amersham；ＮＡ  ９３１）を用いて視覚化させる。視覚化はＥＣＬキット（Amersham、ＲＰＮ  ２１０６）で行う。図１２で示された結果は、発現がテトラサイクリンの存在下で減少されることから、調節しながら、ＤＢＰタンパク質がベクターｐＴＧ９５７９で一時的にトランスフェクトされた２９３細胞で産生されることを示している。
【００８９】
２．相補系９５７９の作製
２０μｇのプラスミドｐＴＧ９５７９を用いて３×１０６２９３細胞をトランスフェクトする（Gibco-ＢＲＬトランスフェクションキット；レファレンス５３０‐８１２０ＳＡ）。クローンをＧ４１８  ６００μg/mlおよびテトラサイクリン１μg/mlの存在下で選択し、上記ウエスタンブロッティング技術によりＤＢＰタンパク質を産生させるそれらの能力について試験する。それらのうち２０％はデキサメタゾンの存在下でｇｍＤＢＰ６系で得られる場合に近いレベルで検出可能な量のＤＢＰを発現し、そのうち２つは＃７‐４４および＃７‐３２と称される。後者の系はＥ２Ａ機能の相補のためのレファレンス系である（ Brough et al.,1992,Virol.190,624-634 ）。それは、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーターにより指図される、ＤＢＰをコードする配列を含んだ発現カセットでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞に由来している。
【００９０】
ＤＢＰ陽性クローンを培養し、Ｅ２Ａ機能に欠陥があるアデノウイルスＨ５ｄ１８０２によりｍｏｉ≧１で感染させる（Rice and Klessig,1985, J.Virol.56,767-778 ）。感染から２日後に、ウイルス上澄を凍結‐解凍の連続サイクルによる細胞の溶解後に集め、連続希釈して、許容系ｇｍＤＢＰ６で滴定する。ウイルス粒子の存在はクローン＃７‐４４および＃７‐３２から得られた上澄で観察され、Ｅ２Ａ機能を補うそれらの能力について示している。同タイプの実験をベクターｐＴＧ９５４２（Ｅ１−（ＬａｃＺ）、Ｅ２Ａ−およびＥ３−）で行う。感染性粒子が産生され、これら２つのクローンが二重欠陥ベクターを増殖および増幅させうることを示している。更に、これらの粒子は２９３系で増殖できないため、Ｅ２Ａ−表現型と復帰変異体の不在を確認できる。
【００９１】
ＡｄＴＧ９５４２ウイルスで感染されたクローン＃７‐４４で行われた増幅実験では、滴定が感染から４日後に行われたとき、約１２５倍の増幅率を示した。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
本発明は下記図面と下記例を参考にして更に詳しく記載されている。
【図１】（０〜１００の任意単位で表された）ヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムの概略図であり、異なる遺伝子の位置を示している。
【図２】ＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ）により指示されるｔＴＡと、ＳＶ４０プロモーターのコントロール下にあるｐａｃ（プロマイシン耐性）選択遺伝子の構成性発現を行える、ベクターｐＴＧ４６７３の概略図である。
【図３】ｔＴＡにより活性化しうるＥ４領域のＯＲＦ６および７の発現用カセットを含んだヒトアデノウイルスベクターｐＴＧ４６９６の概略図である。
【図４】アデノウイルス５ゲノムの５′末端の部分を含んだベクターｐＴＧ８３４３の概略図である。
【図５】Ｅ１およびＥ３領域の大部分が失われた第一世代組換えアデノウイルスベクター、ベクターｐＴＧ４６６２の概略図である。組換えカセットは、アデノウイルスＭＬＰプロモーター（Ａｄ２）と、その後にβ‐ガラクトシダーゼをコードする細菌ＬａｃＺ遺伝子およびＳＶ４０ウイルスポリアデニル化シグナル（ｐＡ）からなる。
【図６】Ｅ１およびＥ３領域の大部分が失われたアデノウイルスベクターであって、ｔＴＡの構成性発現用のカセットを含んだ、ベクターｐＴＧ４６８２の概略図である。
【図７】Ｅ１、Ｅ３およびＥ４領域の大部分が失われたアデノウイルスベクターであって、ｔＴＡの構成性発現用のカセットを含んだ、ベクターｐＴＧ４６８３の概略図である。
【図８】（図でｔｅｔＯ‐ＣＭＶｉと示されたｔｅｔＯ配列の７コピーにより先行されたＣＭＶ最小プロモーター（−５３〜＋１）のコントロール下で）ｔＴＡの誘導性発現を行える、ベクターｐＴＧ４６７５の概略図である。
【図９】Ｅ１およびＥ３領域の大部分が失われたアデノウイルスベクターであって、ｔＴＡの誘導性発現用のカセットを含んだ、ベクターｐＴＧ４６８４の概略図である。
【図１０】Ｅ１、Ｅ３およびＥ４領域の大部分が失われたアデノウイルスベクターであって、ｔＴＡの誘導性発現用のカセットを含んだ、ベクターｐＴＧ４６８５の概略図である。
【図１１】ｔｅｔＯ配列の７コピーにより先行されたＣＭＶ最小プロモーターのコントロール下にあるアデノウイルスＥ４領域のＯＲＦ６／７およびｔＴＡと、プロマイシン耐性を付与するｐａｃ選択遺伝子の発現を行える、ベクターｐＴＧ５６０６の概略図である。
【図１２】ベクターｐＴＧ９５７９で一時的にトランスフェクトされてテトラサイクリンの存在下（＋）および不在下（−）で培養された２９３細胞におけるＤＢＰタンパク質の発現のウエスタンブロット分析である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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