(57)【要約】【課題】連続レーザ光により刺激を与えながら、自家蛍光を含まない明るく鮮明な多光子蛍光画像を取得する。【解決手段】超短パルスレーザ光を発生する第１のレーザ光源２と、超短パルスレーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させる走査部７と、連続レーザ光を発生する第２のレーザ光源３と、連続レーザ光の標本Ａ上における２次元的な照射位置の調節を行う照射位置調節部８と、超短パルスレーザ光および連続レーザ光を標本Ａ上に集光する一方、標本Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ１０と、該対物レンズ１０と走査部７との間の光路から分岐された蛍光を検出する光検出器１２と、光検出器１２が第１のレーザ光源２からの超短パルスレーザ光に基づく標本Ａからの必要な蛍光を検出していないときに、第２のレーザ光源３からの連続レーザ光の照射を許容する連続レーザ光スイッチング手段５とを備える走査型レーザ顕微鏡１を提供する。【選択図】図１
2008216996.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超短パルスレーザ光を発生する第１のレーザ光源と、
該第１のレーザ光源から発せられた超短パルスレーザ光を標本上において２次元的に走査させる走査部と、
連続レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、
該第２のレーザ光源から発せられた連続レーザ光の標本上における２次元的な照射位置の調節を行う照射位置調節部と、
前記超短パルスレーザ光および前記連続レーザ光を標本上に集光する一方、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
該対物レンズと前記走査部との間の光路から分岐された蛍光を検出する光検出部と、
該光検出部が前記第１のレーザ光源からの超短パルスレーザ光に基づく標本からの必要な蛍光を検出していないときに、前記第２のレーザ光源からの連続レーザ光の照射を許容する連続レーザ光スイッチング手段とを備える走査型レーザ顕微鏡。
【請求項２】
前記光検出部は、前記走査部が超短パルスレーザ光を一方向に走査する間に必要な蛍光を検出し、帰線期間においては必要な蛍光を検出しない請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記光検出部は、前記走査部による走査位置が、標本上の観察対象領域を越えた位置に配置されている場合には必要な蛍光を検出しない請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記超短パルスレーザ光の照射と非照射とを切り替えるパルスレーザ光スイッチング手段を備え、
前記連続レーザ光スイッチング手段は、前記パルスレーザ光スイッチング手段により超短パルスレーザ光が標本に照射されていないときに、前記連続レーザ光の照射を許容する請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項５】
前記光検出部が、アナログ積算式の光検出器であり、
前記連続レーザ光スイッチング手段は、前記光検出部における放電期間に前記連続レーザ光の照射を許容する請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項６】
前記光検出部が光電子増倍管を備え、
前記対物レンズと前記光検出部との間に、前記連続レーザ光スイッチング手段が連続レーザ光の照射を許容しているときに、光検出部への光の入射を遮断する遮断機構を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項７】
前記光検出部が光電子増倍管と、該光電子増倍管の駆動電圧を制御する制御部とを備え、
該制御部は、前記連続レーザ光スイッチング手段が、連続レーザ光の照射を禁止しているときに光電子増倍管を駆動するよう駆動電圧を制御する請求項１から請求項５のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項８】
チャネルロドプシン２を遺伝子導入した標本を観察対象とし、請求項１の走査型レーザ顕微鏡を用いて、前記第2のレーザ光源から発せられた連続レーザ光をチャネルロドプシン２へ照射する観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型レーザ顕微鏡および観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、２つのスキャナを備え、一方のスキャナにより標本上において超短パルスレーザ光を走査し、標本において多光子励起効果により発生する多光子蛍光を観察するとともに、他方のスキャナにより標本上の特定の位置に超短パルスレーザ光を照射して光刺激を与える走査型レーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この特許文献１に開示されている走査型レーザ顕微鏡は、観察用および光刺激用のいずれにおいても超短パルスレーザ光による多光子励起効果を利用しているので、蛍光が発生するのは、超短パルスレーザ光の光子密度が高められる対物レンズの焦点面に限定される。したがって、共焦点ピンホールを配置することなく、発生した蛍光を光検出器により検出するだけで、鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−３５２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、超短パルスレーザ光源は連続レーザ光源に比較して非常に高価である。標本の深部への刺激がさほど必要ない場合には、安価な連続レーザ光源でも十分であり、かつ、刺激用アプリケーションへの汎用性も高いことから、蛍光観察は超短パルスレーザ光により行い、刺激用のレーザ光として連続レーザ光を使用することが考えられている。この場合には、連続レーザ光は通過する光路上に配置されている自家蛍光物質を励起して自家蛍光を発生させるので、観察用に取得される多光子蛍光画像に自家蛍光が混入してしまうという不都合がある。例えば、連続レーザ光が照射される標本の焦点面以外の位置からの自家蛍光のみならず、連続レーザ光が通過するレンズ等の光学部品の硝材からも自家蛍光が発生する。その結果、鮮明な多光子蛍光画像を取得することができないという問題がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、連続レーザ光により刺激を与えながら、自家蛍光を含まない明るく鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる走査型レーザ顕微鏡および観察方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、超短パルスレーザ光を発生する第１のレーザ光源と、該第１のレーザ光源から発せられた超短パルスレーザ光を標本上において２次元的に走査させる走査部と、連続レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、該第２のレーザ光源から発せられた連続レーザ光の標本上における２次元的な照射位置の調節を行う照射位置調節部と、前記超短パルスレーザ光および前記連続レーザ光を標本上に集光する一方、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズと前記走査部との間の光路から分岐された蛍光を検出する光検出部器と、該光検出部が前記第１のレーザ光源からの超短パルスレーザ光に基づく標本からの必要な蛍光を検出していないときに、前記第２のレーザ光源からの連続レーザ光の照射を許容する連続レーザ光スイッチング手段とを備える走査型レーザ顕微鏡を提供する。
【０００７】
本発明によれば、第１のレーザ光源から発せられた超短パルスレーザ光が、走査部の作動により２次元的に走査され、対物レンズを介して標本上に集光されることにより、標本上の２次元的な位置において多光子励起効果による多光子蛍光が発生する。発生した多光子蛍光は、対物レンズにより集光され、走査部に戻る前の光路において分岐されて光検出部により検出される。これにより、走査部による走査位置と、光検出部による多光子蛍光の強度情報とに基づいて、対物レンズの焦点面に沿う２次元的な多光子蛍光画像を取得することができる。
【０００８】
一方、第２のレーザ光源から発せられた連続レーザ光は、照射位置調節部の作動により、標本上における２次元的な照射位置を調節された状態で、対物レンズにより標本上の所望の位置に集光され、その位置に光刺激を与えることができる。すなわち、連続レーザ光による光刺激による標本の状態の変化を多光子蛍光画像により観察することができる。
【０００９】
この場合において、本発明によれば、連続レーザ光スイッチング手段の作動により、第２のレーザ光源からの連続レーザ光の照射が、超短パルスレーザ光に基づく標本からの必要な多光子蛍光を検出していないときに許容され、必要な多光子蛍光が検出されているときには禁止される。その結果、光検出部により多光子蛍光が検出されている期間には連続レーザ光が光学部品や標本に入射されることが禁止され、自家蛍光が発生しないので、鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。特に、対物レンズと走査部との間の光路から分岐された多光子蛍光を光検出部により検出することで、標本において発生した多光子蛍光をピンホール等により遮ることなく全て検出するように構成しても自家蛍光の影響を受けずに済むので、鮮明で明るい多光子蛍光画像を取得することができる。
【００１０】
上記発明においては、前記光検出部は、前記走査部が超短パルスレーザ光を一方向に走査する間に必要な蛍光を検出し、帰線期間においては必要な蛍光を検出しないこととしてもよい。
このようにすることで、走査部が超短パルスレーザ光を一方向に走査している期間に多光子蛍光画像を構築するための多光子蛍光の輝度情報が取得され、輝度情報を取得しない帰線期間において連続レーザ光による光刺激が行われる。その結果、連続レーザ光の照射による自家蛍光の発生時には多光子蛍光画像を構築するための多光子蛍光の輝度情報が取得されず、多光子蛍光画像に自家蛍光が混入して不鮮明になるという不都合の発生を回避することができる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記光検出部は、前記走査部による走査位置が、標本上の観察対象領域を越えた位置に配置されている場合には必要な蛍光を検出しないこととしてもよい。
走査型レーザ顕微鏡においては、観察対象領域におけるレーザ光の走査速度を均一にするために、観察対象領域を越えた範囲で走査部を作動させる。特に、走査部がガルバノミラーである場合には、ガルバノミラーが、観察対象領域を越える範囲まで揺動させられる。このような観察対象領域を越えるオーバスキャン領域においては、多光子蛍光を検出しないように超短パルスレーザ光が遮断されるか、光検出部による多光子蛍光の検出が停止されるので、このオーバスキャン領域において連続レーザ光による光刺激を行うことにより、多光子蛍光画像に自家蛍光が混入する不都合の発生を防止することができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記超短パルスレーザ光の照射と非照射とを切り替えるパルスレーザ光スイッチング手段を備え、前記連続レーザ光スイッチング手段は、前記パルスレーザ光スイッチング手段により超短パルスレーザ光が標本に照射されていないときに、前記連続レーザ光の照射を許容することとしてもよい。
このようにすることで、パルスレーザ光スイッチング手段の作動により、必要な蛍光の検出を行わないときには、パルスレーザ光の標本への照射が停止されるので、標本を保護することができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記光検出部が、アナログ積算式の光検出器であり、前記連続レーザ光スイッチング手段は、前記光検出部における放電期間に前記連続レーザ光の照射を許容することとしてもよい。
光検出部がアナログ積算式の場合、外部からの蛍光を積算する充電期間と、次の積算を行うための放電期間とが繰り返されるので、放電期間においては必要な多光子蛍光が検出されることがない。このようにすることで、このような放電期間に連続レーザ光の照射を許容することにより、多光子蛍光画像に自家蛍光が混入することを防止できるとともに、超短パルスレーザ光の照射による多光子蛍光の取得と、連続レーザ光の照射による光刺激とを近接させ、同時性を高めることができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記光検出部が光電子増倍管を備え、前記対物レンズと前記光検出部との間に、前記連続レーザ光スイッチング手段が、連続レーザ光の照射を許容しているときに、光検出部への光の入射を遮断する遮断機構を備えることとしてもよい。
このようにすることで、遮断機構の作動により、連続レーザ光が出射されているときの光検出部への光の入射が遮断される。
【００１５】
観察を行う多光子励起蛍光は非常に微弱であることから、刺激用連続レーザ光による自家蛍光および反射光の強度は相対的に非常に大きなものとなる場合がある。その結果、仮に、光電子増倍管からなる光検出部に、標本からの蛍光よりも非常に強い（数千倍〜数万倍以上の）自家蛍光の方が入射した場合には、多光子蛍光を検出したい期間においても、それ以外の期間に受光した自家蛍光に起因する光電子増倍管からのアフターパルス（ノイズ成分）が混在して、多光子蛍光とは異なる信号が検出されることになる。
【００１６】
本発明によれば、連続レーザ光が出射され、自家蛍光が発生しているときに、遮断機構の作動により光検出部への光の入射が遮断されるので、アフターパルスの発生が抑えられ、自家蛍光の混在しない鮮明な多光子蛍光画像を取得することが可能となる。
【００１７】
上記発明においては、前記光検出部が光電子増倍管と、該光電子増倍管の駆動電圧を制御する制御部とを備え、該制御部は、前記連続レーザ光スイッチング手段が、連続レーザ光の標本への照射を禁止しているときに光電子増倍管を駆動するよう駆動電圧を制御することとしてもよい。
このようにすることで、連続レーザ光が出射されることにより発生した非常に強い自家蛍光が光検出部に入射しても、その入射時点における光電子増倍管の駆動が制御部の作動により停止されるので、アフターパルスの発生が抑えられ、自家蛍光の混在しない鮮明な多光子蛍光画像を取得することが可能となる。
本発明は、チャネルロドプシン２を遺伝子導入した標本を観察対象とし、上記発明の走査型レーザ顕微鏡を用いて前記第２のレーザ光源から発せられた連続レーザ光をチャネルロドプシン２へ照射する観察方法を提供する。
これまで、生細胞、特に神経細胞への刺激方法としてはパッチクランプ法やケージドグルタミン酸での刺激が主流であった。しかし、近年、光センサとイオンチャネルの機能を兼ね備えた、チャネルロドプシン２が知られるようになった。チャネルロドプシン２（光感受性イオンチャネル）は光に反応してイオンを放出する機能を持つので、予めチャネルロドプシン２を遺伝子導入した標本の所望の位置に刺激光を照射することにより、所望の位置に電気的刺激を与えることができる。このチャネルロドプシン２を用いた刺激に使用する光は、超短パルスレーザ光よりも連続レーザ光が適している。ここで、上記発明の第２のレーザ光源からの連続レーザ光をチャネルロドプシン２を用いた刺激に使用することにより、自家蛍光の影響を排除して良好な観察画像を取得することが可能となる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、連続レーザ光により刺激を与えながら、自家蛍光を含まない明るく鮮明な多光子蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の一実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１について、図１〜図１０を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１は、図１に示されるように、超短パルスレーザ光を出射する第１のレーザ光源２と、連続レーザ光を出射する第２のレーザ光源３とを備えている。これらレーザ光源２，３の後段には、それぞれシャッタ４，５が設けられている。
【００２０】
第１のレーザ光源２は、例えば、８２０〜１０００ｎｍの波長帯域の赤外パルスレーザ光を選択的に出射可能に設けられている。
第２のレーザ光源３は、例えば、４０５ｎｍの波長を有する連続レーザ光を出射するようになっている。
【００２１】
前記シャッタ４，５は、ＡＯＭあるいはＡＯＴＦのような音響光学素子あるいは電気光学素子により構成されている。
シャッタ４，５は、制御装置６に接続されている。制御装置６は、第１，第２のレーザ光源２，３からの各レーザ光の標本Ａへの照射タイミングに同期させてシャッタ４，５をオンオフ制御するようになっている。
【００２２】
また、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１は、該第１のレーザ光源２から出射された超短パルスレーザ光を２次元的に走査する第１のスキャナ７と、該第２のレーザ光源３から出射された連続レーザ光の照射位置を２次元的に調節する第２のスキャナ８とを備えている。
これら第１，第２のスキャナ７，８は、例えば、それぞれ一対のガルバノミラー７ａ，７ｂ；８ａ，８ｂにより構成されている。
【００２３】
第１のスキャナ７はガルバノミラー７ａ，７ｂの揺動角度を変化させ、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。これにより、超短パルスレーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させることができるようになっている。
また、第２のスキャナ８はガルバノミラー８ａ，８ｂの揺動角度を変化させることにより、連続レーザ光の標本Ａ上における照射位置を２次元的に位置調節し、あるいは走査させることができるようになっている。
【００２４】
さらに、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１は、これら超短パルスレーザ光および連続レーザ光を同一の光路に合流させる第１のダイクロイックミラー９と、超短パルスレーザ光および連続レーザ光を標本Ａ上に集光する一方、標本Ａにおいて発生する蛍光を集光する対物レンズ１０と、該対物レンズ１０により集光された蛍光を光路から分岐する第２のダイクロイックミラー１１と、該第２のダイクロイックミラー１１により分岐された蛍光を検出する光検出器１２とを備えている。
【００２５】
第１のダイクロイックミラー９は、前記波長帯域の超短パルスレーザ光を透過し、前記波長の連続レーザ光を反射する透過率特性を有している。また、第２のダイクロイックミラー１１は、第１，第２のレーザ光源２，３からのレーザ光を反射する一方、標本Ａから発生する蛍光を透過する透過率特性を有している。
前記光検出器１２は、例えば、光電子増倍管により構成されている。図中、符号１３はミラーである。
制御装置６は、第１，第２のスキャナ７，８と光検出器１２と接続し、各々を制御するようになっている。
【００２６】
前記制御装置６は、図２〜図７に示されるように、４つのモードに従って、観察用の超短パルスレーザ光と光刺激用の連続レーザ光とを照射するようにシャッタ４，５をオンオフ制御するようになっている。
【００２７】
第１のモードは、図２および図３に示されるように、所望の観察対象領域を一方向に走査する間（図２に実線で示される矢印の期間）に超短パルスレーザ光を標本Ａに照射し、観察対象領域を越える領域（オーバスキャン期間）および逆方向に走査する帰線期間（図２に破線で示される期間）においては超短パルスレーザ光を標本Ａに照射しないようにシャッタ４をオンオフ制御するようになっている。
【００２８】
この第１のモードにおいては、シャッタ４をオフ状態にすることにより超短パルスレーザ光の標本Ａへの照射を遮断している期間（オーバスキャン期間および帰線期間）内のいずれかの時点で光刺激用の連続レーザ光を標本Ａに照射するように、シャッタ５をオンオフ制御するようになっている。
【００２９】
第２のモードは、図４および図５に示されるように、所望の観察対象領域を両方向に走査する間（図４に実線で示される矢印の期間）に超短パルスレーザ光を標本Ａに照射し、観察対象領域を越える領域（オーバスキャン期間：図４に破線で示される期間）においては超短パルスレーザ光を標本Ａに照射しないようにシャッタ４をオンオフ制御するようになっている。この第２のモードにおいては、シャッタ４をオフ状態にすることにより超短パルスレーザ光の標本Ａへの照射を遮断している期間（オーバスキャン期間）内のいずれかの時点で光刺激用の連続レーザ光を標本Ａに照射するように、シャッタ５をオンオフ制御するようになっている。
【００３０】
第３のモードは、第１のモードと同様にして所望の観察対象領域を一方向に走査させる。しかしながら、第３のモードでは、超短パルスレーザ光を標本Ａに照射する期間内に光刺激用の連続レーザ光を標本Ａに照射するようになっている。
具体的には、光検出器１２を構成する光電子増倍管は、図６に示されるように、蛍光による電荷を積算する充電期間と、次の積算のために電荷を放電する放電期間とを繰り返す。したがって、充電期間においてのみ標本Ａからの蛍光が検出され、超短パルスレーザ光が照射されて標本Ａにおいて多光子蛍光が発生していても、放電期間においてはその検出は行われていない。そこで、第３のモードにおいては、この放電期間において連続レーザ光を標本Ａに照射するようにシャッタ５をオンオフ制御するようになっている。
【００３１】
第４のモードは図７に示されるように、所望の注目領域（ＲＯＩ：実線）のみの多光子蛍光画像を取得する場合であって、それ以外の領域を第１のスキャナ７が走査している間（図７に破線で示す期間）に連続レーザ光を標本Ａに照射するようにシャッタ５をオンオフ制御するようになっている。注目領域以外の領域においては、シャッタ４がオフ状態に設定され、超短パルスレーザ光の標本Ａへの照射が禁止されている。
【００３２】
このように構成された本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１を用いて標本Ａの蛍光観察を行うには、第１のレーザ光源２を作動させて超短パルスレーザ光を出射させ、シャッタ４をオンオフ制御し、第１のスキャナ７を作動させて、超短パルスレーザ光を標本Ａ上において走査させる。すなわち、第１のレーザ光源２から出射された超短パルスレーザ光は第１のスキャナ７により２次元的に走査され、第１のダイクロイックミラー９を透過し、第２のダイクロイックミラー１１により反射された後、対物レンズ１０により標本Ａ上に集光される。
【００３３】
対物レンズ１０の焦点面においては、超短パルスレーザ光の光子密度が高くなり、多光子励起効果が発生して標本Ａ内の蛍光物質が励起され、多光子蛍光が発生する。発生した多光子蛍光は、対物レンズ１０により集められ、第２のダイクロイックミラー１１を透過して光検出器１２により蛍光強度情報として検出される。
【００３４】
したがって、第１のスキャナ７による超短パルスレーザ光の照射位置および光検出器１２により検出された多光子蛍光の強度情報は、対応づけて記憶されることにより、２次元的な多光子蛍光画像を構築することが可能となる。
【００３５】
一方、第２のレーザ光源３から出射された連続レーザ光は、第２のスキャナ８により２次元的な位置を調節された後に、第１のダイクロイックミラー９および第２のダイクロイックミラー１１により反射され、対物レンズ１０により標本Ａ上に集光される。
これにより、対物レンズ１０の焦点位置に連続レーザ光を照射して、標本Ａに光刺激を与えることができる。
【００３６】
この場合において、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１によれば、制御装置６の作動により、シャッタ４，５がオンオフ制御され、光検出器１２が第１のレーザ光源２からの超短パルスレーザ光に基づく標本Ａからの必要な蛍光を検出していないときに、第２のレーザ光源３からの連続レーザ光の照射を許容される。したがって、光刺激が行われる際に連続レーザ光が対物レンズ１０や標本Ａにおいて自家蛍光を発生している期間においては、超短パルスレーザ光に基づく多光子蛍光の検出が行われず、多光子蛍光の検出が行われているときには光刺激が禁止されるので、多光子蛍光に自家蛍光が混入することが防止され、鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。
【００３７】
具体的には、制御装置６の第１のモードにおいては、超短パルスレーザ光はラスタスキャン方式による走査経路中の観察対象領域を一方向に走査しているときにのみ標本Ａに照射され、それ以外のオーバスキャン期間および帰線期間においてはシャッタ４がオフ状態とされることにより照射されていないので、その期間に連続レーザ光を照射して光刺激を行い、かつ、鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。
【００３８】
また、本実施形態においては、蛍光検出のＳ／Ｎ比向上のため、標本から発生した蛍光をスキャナ７に戻すことなく光検出器１２に導くノンデスキャン検出を行っている。ノンデスキャン検出では共焦点ピンホールを用いることはできないが、多光子励起による蛍光はレーザ光の集光位置（ピント位置）のごく近傍でしか生じないので、共焦点ピンホールがなくても標本の光学的断面画像を取得することができる。
【００３９】
ただし、本実施形態では、刺激光として連続レーザ光を用いている。刺激光として多く用いられるのは、４５０ｎｍ以下の青〜紫の可視光または４００ｎｍ未満の紫外光というような短波長の光である。この波長帯域の光は、光学系（硝材）に自家蛍光を発生させやすい。発生した自家蛍光は多光子励起による蛍光と波長帯域が近似しているため蛍光検出用バリアフィルタでは遮断できず、また、検出系に共焦点ピンホールがないため、対策を講じなければ、検出光路中で発生した自家蛍光は検出器に入ってしまう。
本実施形態によれば、観察用の多光子励起蛍光の検出を行わない期間に刺激用レーザ光を照射するようにしたので、自家蛍光が発生しても多光子励起蛍光の検出に影響を与えることがない。
【００４０】
また、制御装置６の第２のモードにおいては、超短パルスレーザ光はラスタスキャン方式による走査経路中の観察対象領域を両方向に走査しているときに標本Ａに照射され、それ以外のオーバスキャン期間においてはシャッタ４がオフ状態とされることにより照射されていないので、その期間に連続レーザ光を照射して光刺激を行い、かつ、鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。この場合には、両方向に走査しているときに標本Ａからの多光子蛍光を検出するので、迅速に高分解能の多光子蛍光画像を取得することができるという利点がある。
【００４１】
また、制御装置６の第３のモードにおいては、超短パルスレーザ光はラスタスキャン方式による走査経路中の観察対象領域を一方向に走査しているときにのみ標本Ａに照射されているが、その期間内の放電期間のみにシャッタ５をオン状態とされて連続レーザ光が照射されることにより、標本Ａの光刺激を行い、かつ、鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。この場合には、超短パルスレーザ光の照射期間と、連続レーザ光の照射期間とを近接させることができ、観察用の多光子蛍光の検出と光刺激との同時性を向上することができるという利点がある。
【００４２】
また、制御装置６の第４のモードにおいては、注目領域においてのみ超短パルスレーザ光が標本Ａに照射され、それ以外の領域においてはシャッタがオフ状態とされて超短パルスレーザ光が照射されていないので、その期間に連続レーザ光を照射して光刺激を行い、かつ、鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。
【００４３】
なお、本実施形態においては、多光子蛍光の検出期間と光刺激用の連続レーザ光の照射期間とを異ならせることにより、連続レーザ光により発生する自家蛍光が観察用の多光子蛍光に混入する不都合を防止したが、さらに、図８に示されるように、光検出器１２の前段にオンオフ可能な遮断機構１４を設けることにしてもよい。このようにすることで、光検出器１２を構成する光電子増倍管においてアフターパルスが発生する不都合を回避することができる。遮断機構１４としては、マイクロ秒オーダで動作可能な音響光学素子や電気光学素子が好ましく、電磁シャッタでもよい。また、ＭＥＭＳのように高速でスイッチング可能なミラーを切り替えて光検出器１２への光路を切り替えることにしてもよい。
【００４４】
すなわち、検出すべき標本Ａからの多光子蛍光に比べて、自家蛍光の強度が非常に強い（数千倍から数万倍以上の）場合には、図９に比較例として示すように、刺激用の連続レーザ光を照射して自家蛍光が発生している期間を越えて多光子蛍光を検出したい期間においても、自家蛍光に起因するアフターパルスが混在し、検出したい多光子蛍光とは異なる信号が検出されてしまう場合がある。そこで、遮断機構１４を作動させて、連続レーザ光が出射されて自家蛍光が発生している期間には、光検出器１２への光の通過を遮断し、超短パルスレーザ光を照射して多光子蛍光を検出する期間においてのみ光検出器１２への光の通過を許容することにより、図９の最下段に示されるように、検出したい多光子蛍光のみを含む信号を検出することが可能となる。
【００４５】
また、遮断機構１４に代えて、光電子増倍管１５を電気的にスイッチングすることにより、必要な期間のみに、入力された光の光量に応じた電流信号を出力させる、いわゆるゲーティングを行うことにしてもよい。図１０は、光電子増倍管１５の内部構造を示した模式図である。
【００４６】
制御装置６から発生したゲートパルス信号に基づいて、スイッチ１７を制御することにより、光電子増倍管１５の駆動と非駆動とを切り替える。この方法には、光電子増倍管１５を常時ゲートオフ状態とし、ゲートパルス信号が入力されているときにゲートオン状態とする方法（ノーマリオフ）と、その逆に、常時ゲートオン状態とし、ゲートパルス信号が入力されているときにゲートオフ状態とする（ノーマリオン）とがある。
【００４７】
例えば、ノーマリオフのゲーティングでは、制御装置６からゲートパルス信号が入力され、光電子増倍管１５内のデバイダ回路１８に高圧電源１９からの高圧電圧が加えられている期間のみ、複数のダイノード２０の各段において光電子が増倍され２次電子が生成され、信号検出回路２１により検出される。しかし、このゲートパルス信号が加えられていない期間は、ダイノード２０間を走行する電子の軌道が乱されるため、光電子は増倍されず、光電子増倍管１５は動作していない状態となる。ノーマリオンのゲーティングの動作はその逆である。
【００４８】
このようにすることによっても、遮断機構１４を設けた場合と同様に、連続レーザ光が出射されて自家蛍光が発生している期間には、光電子増倍管１５を動作させず、超短パルスレーザ光を照射して多光子蛍光を検出する期間においてのみ光検出器１２による多光子蛍光の検出を可能とすることにより、図９の最下段に示されるように、検出したい多光子蛍光のみを含む信号を検出することが可能となる。
したがって、自家蛍光の影響を受けない鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。
【００４９】
また、標本Ａにチャネルロドプシン２を遺伝子導入し、第２のレーザ光源３から発せられた連続レーザ光によって刺激することにしてもよい。
これまで、生細胞、特に神経細胞への刺激方法としてはパッチクランプ法やケージドグルタミン酸での刺激が主流であった。しかし、近年、光センサとイオンチャネルの機能を兼ね備えた、チャネルロドプシン２が知られるようになった。チャネルロドプシン２（光感受性イオンチャネル）は光に反応してイオンを放出する機能を持つので、予めチャネルロドプシン２を遺伝子導入した標本Ａの所望の位置に刺激光を照射することにより、所望の位置に電気的刺激を与えることができる。したがって、第２のレーザ光源３からの連続レーザ光をチャネルロドプシン２を用いた刺激に使用することにより、自家蛍光の影響を排除して良好な観察画像を取得することができるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の一実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の全体構成を示すブロック図である。
【図２】図１の走査型レーザ顕微鏡の第１のモードによるレーザ光の走査パターンを示す図である。
【図３】図２の走査パターンを示すタイムチャートである。
【図４】図１の走査型レーザ顕微鏡の第２のモードによるレーザ光の走査パターンを示す図である。
【図５】図４の走査パターンを示すタイムチャートである。
【図６】図１の走査型レーザ顕微鏡の第３のモードによるレーザ光の走査パターンを示すタイムチャートである。
【図７】図１の走査型レーザ顕微鏡の第４のモードによるレーザ光の走査パターンを示す図である。
【図８】図１の走査型レーザ顕微鏡の変形例を示すブロック図である。
【図９】図８の走査型レーザ顕微鏡による観察のタイムチャートである。
【図１０】図１の走査型レーザ顕微鏡に用いる光検出器の変形例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００５１】
Ａ  標本
１  走査型レーザ顕微鏡
２  第１のレーザ光源
３  第２のレーザ光源
４  シャッタ（パルスレーザ光スイッチング手段）
５  シャッタ（連続レーザ光スイッチング手段）
７  第１のスキャナ（走査部）
８  第２のスキャナ（照射位置調節部）
１０  対物レンズ
１２  光検出器
１４  遮断機構
１５  光電子増倍管
１７  スイッチ（制御部）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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