(57)【要約】【課題】細胞が密集して存在する領域においても、精度良く染色陽性細胞数を定量解析する新たな方法の提供。【解決手段】染色された組織標本を撮像し、得られた画像をコンピュータにより処理して染色陽性細胞を検出する方法であって、（１）画像の最も輝度分布の多い濃度を背景濃度として検出して標準化を行う工程、（２）画像の最も高い濃度より低濃度側に閾値を設定し、該一定の閾値まで、高濃度側から低濃度側へ検出閾値を徐々に変動させて、各閾値で初めて検出される陽性細胞像のみを陽性細胞像として選択する工程を含み、前記工程（２）は、(a)検出閾値以上に染色された領域を検出する工程と、(b)検出された領域のうち、一定の大きさの細胞が染色された部分のみを陽性細胞像として選択する工程と、(c)検出された陽性細胞像の数及び重心の座標を記録する工程とを含むことを特徴とする染色された組織標本の陽性細胞の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色された組織標本を撮像し、得られた画像をコンピュータにより処理して染色陽性細胞を検出する方法であって、（１）画像の最も輝度分布の多い濃度を背景濃度として検出して標準化を行う工程、（２）画像の最も高い濃度より低濃度側に閾値を設定し、該一定の閾値まで、高濃度側から低濃度側へ検出閾値を徐々に変動させて、各閾値で初めて検出される陽性細胞像のみを陽性細胞像として選択する工程を含み、前記工程（２）は、(a)検出閾値以上に染色された領域を検出する工程と、(b)検出された領域のうち、一定の大きさの細胞が染色された部分のみを陽性細胞像として選択する工程と、(c)検出された陽性細胞像の数及び重心の座標を記録する工程とを含むことを特徴とする染色された組織標本の陽性細胞の検出方法。
【請求項２】
前記工程（２）により選択された各閾値における陽性細胞像の計数値を合計して、撮像した組織標本中における陽性細胞の計数値として採用する染色された組織標本の陽性細胞の計数方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法により検出された染色陽性細胞を可視化して解析する方法であって、（３）得られた画像を碁盤目状のピクセルに区切り、各ピクセル内の陽性細胞密度を測定する工程、（４）陽性細胞密度に応じた擬似カラーを付し、組織標本全体の着色像を得る工程、（５）組織標本全体の形状を既知の組織標本形状に合わせて標準化を行う工程、及び（６）複数の個体由来の組織標本について前記（１）〜（５）の操作を行い、複数の組織標本についての着色像の平均値マップを得る工程を含む、染色された組織標本の陽性細胞の可視化解析方法。
【請求項４】
さらに、（７）複数の条件の個体群について前記（１）〜（６）の操作を行い、群間の比較を行うことを特徴とする請求項３記載の染色された組織標本の陽性細胞の可視化解析方法。
【請求項５】
さらに、群間比較の結果を、統計的パラメータとして数値化し、各ピクセルに擬似カラーを付すことを特徴とする請求項４記載の染色された組織標本の陽性細胞の可視化解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織学、病理学の分野における染色された組織標本における陽性細胞を客観的に定量するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織学、病理学の分野において、組織標本を免疫学的手段やハイブリダイゼーション等により染色し、その陽性細胞を定量解析することは、これらの分野における研究手段として、また病理学的診断の手段として極めて重要であり、広く実施されている。陽性細胞数の定量については、画像から実験者自ら設定した領域について、計数するという方法が用いられている（非特許文献１、２）。
【非特許文献１】Ｐｅｒｒｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２４（４７）:１０５９４−１０６０２（２００５）
【非特許文献２】Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２５（４９）:１１２３９−１１２４７（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の定量方法では、実験者自らが設定した領域のみを定量するので、実験者が注目していない場所のデータを得ることができない、得られるデータは計数データのみであり設定した領域内の空間の情報が失われてしまうという問題があった。
そこで、本発明者は、染色された組織標本における陽性細胞数を定量解析するにあたり、画像処理工程において一定の閾値以上に染色された領域の検出に加えて、細胞の大きさによる検出を組み合せて染色陽性細胞を検出し、さらに陽性細胞像を擬似カラー化して陽性細胞密度として検出し、さらにその着色像を標準化するとともに、複数の標本を用いて平均値によるマップを作成することにより、領域設定が客観的になるとともに標準化と平均値マップの作成により空間情報を維持した上での定量データが可視化できることを見出し、先に出願した（特願２００６−１３４６５）。この方法により、標本の領域設定及び定量がコンピュータにより自動的にでき、かつ複数の標本のデータが同時に解析できるため一点だけのデータでなく空間情報を加味したデータの可視化が可能となった。
しかし、細胞密度が高い領域（＞８００／ｍｍ2）では、細胞の重なりが測定誤差の要因となり、正確に染色陽性細胞を検出できず、細胞密度が高い領域に関して云えば測定した染色陽性細胞の計数値は信頼性の低いものであった（Wada et al., Neuroscience Research, 56: 96-102 2006）。
【０００４】
したがって、本発明の目的は、細胞が密集して存在する領域においても、精度良く染色陽性細胞数を定量解析する新たな方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、染色された組織標本を撮像した画像における染色陽性細胞の検出方法について種々検討したところ、取り込んだ画像の最も高い濃度（低輝度）より低濃度（高輝度）側に閾値を設定し、該一定の閾値まで、高濃度側から低濃度側へ検出閾値を徐々に変動させて、各閾値で初めて検出される陽性細胞像のみを陽性細胞像として検出することにより、細胞同士の重なりの見られるような高密度の領域であっても、従来の方法に比較して極めて高感度で陽性細胞を検出できることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、染色された組織標本を撮像し、得られた画像をコンピュータにより処理して染色陽性細胞を検出する方法であって、（１）画像の最も輝度分布の多い濃度を背景濃度として検出して標準化を行う工程、（２）画像の最も高い濃度より低濃度側に閾値を設定し、該一定の閾値まで、高濃度側から低濃度側へ検出閾値を徐々に変動させて、各閾値で初めて検出される陽性細胞像のみを陽性細胞像として選択する工程を含み、前記工程（２）は、(a)検出閾値以上に染色された領域を検出する工程と、(b)検出された領域のうち、一定の大きさの細胞が染色された部分のみを陽性細胞像として選択する工程と、(c)検出された陽性細胞像の数及び重心の座標を記録する工程とを含むことを特徴とする染色された組織標本の陽性細胞の検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（２）により選択された各閾値における陽性細胞像の計数値を合計して、撮像した組織標本中における陽性細胞の計数値として採用する染色された組織標本の陽性細胞の計数方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、細胞が密集して存在する領域においても、精度良く染色陽性細胞を自動検出できる。また、本発明によれば、組織全体で陽性細胞数の計数を行うことや、複数グループ間の統計比較も容易にできるので、実験者の意図しない領域の組織変化等を明瞭にかつ客観的に観察できる。さらに、病理診断の現場においてもこの方法を適用することで、客観的な診断が可能になる。また、本発明方法は、stereologyを利用した細胞計数や核医学等における粒子解析での定量へ応用することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明においては、まず、染色された組織標本を撮像し、得られた画像をコンピュータに入力する。ここで、組織標本としては、ヒトを含む動物、植物等の生体組織から採取した組織標本が用いられる。例えば、臓器全体像の凍結切片、手術により摘出した組織の切片等が挙げられる。また、染色手段としては、細胞核や細胞体のみが濃染する対象に対する免疫染色、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎあるいは、核染色等が挙げられる。撮像には、顕微鏡と撮像装置を用いるのが好ましい。撮像装置としては、例えばカラーＣＣＤカメラ等のディジタル画像撮影が行えるカメラが用いられる。撮像装置により得られた画像は、ディジタル信号の画像データに変換されたコンピュータに送られる。
【０００９】
コンピュータによる画像処理は、入力装置、表示装置及びコンピュータにより行われる。
【００１０】
入力装置は、本発明方法の実施に関する指示入力の受付、各種文字及び記号を含むデータの入力等を行うための装置である。具体的には、前述した指示、データ等の入力に用いることができる、キーボード、マウス、タッチパネル、音声入力機器等の機器の組合せにより構成される。
【００１１】
表示装置は、メニュー画面、操作画面、指示画面等の他、取得した画像、計測結果、着色像等の表示を行うためのものである。具体的には、液晶、プラズマ等のフラットパネルディスプレイ、ＣＲＴ等の表示管により画像の表示が行える装置が用いられる。この他に、拡大投影表示するための、スライドプロジェクタ等を接続することもできる。
【００１２】
コンピュータは、中央処理ユニット（ＣＰＵ）と、メモリと、補助記憶装置とを有する。補助記憶装置には、ＣＰＵが実行するプログラム群、各種データ等が格納される。
【００１３】
以下の画像処理は、すべてコンピュータ上で行われる。
【００１４】
まず、染色された組織標本を撮像して得られた画像（図１）から、輝度分布を調べ、（１）最も輝度分布の多い濃度を背景濃度として検出してこれを最高値（例えば、８Ｂｉｔの場合は２５５）とする標準化を行う（図２）。この操作は、例えばＭＡＴＬＡＢソフトウェア上で画像を行列データとして表現し、演算処理を加える事により行うことができ、これにより、細胞の検出条件を合わせるが可能となる。
この際、画像にバックグラウンドの染めムラ等ノイズが認められるときには、予め公知の画像処理ソフトウェア（ＮＩＨ−ｉｍａｇｅ）等を用いて取り除いておくことが好ましい。
【００１５】
次に、（２）画像の最も高い濃度（輝度０／２５５）より低濃度側（高輝度側）に閾値を設定し、該一定の閾値まで、高濃度側から低濃度側へ検出閾値を徐々に変動させて、それぞれの閾値で陽性細胞を検出する。検出閾値は、一定の閾値までの間に１〜２０程度の間隔、すなわち「０，２０，４０，６０，８０，１００，１２０」（２０間隔）といった具合に設定されるが、その変動の割合や設定数は、切片の状況、コンピュータの処理速度と検出精度の兼ね合いによって適宜決めることが可能である。
ここで、一定の閾値（最終検出閾値）は、実験者の経験から通常判断される閾値でよいが、背景値を基準にその半分から２／３程度（背景値が２５５の場合は１２０〜１６０程度）の濃度とするのが好ましい。
各閾値における陽性細胞の検出は、次のように行われる。
【００１６】
画像から、(a)検出閾値以上に染色された領域を検出する。この操作は、例えばＭＡＴＬＡＢソフトウェア上で行列データとして表現された画像から一定の数値以上のデータを選び出してくる操作を行うことで実現可能である。
【００１７】
この際、標本中のゴミや切片の傷などのノイズのデータへの混入を防ぐために、陽性細胞としてふさわしい(b)サイズの一定の大きさの細胞が染色された部分のみを陽性細胞として選択する。この部分のみを陽性像と判定する。ここで、一定の大きさの細胞の選択は、細胞サイズの大きさ、又は細胞核の大きさで判定することができる。この操作は、例えばＭＡＴＬＡＢソフトウェアに付加することができるｉｍａｇｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｔｏｏｌｂｏｘに含まれる選択領域の面積を計算するライブラリ関数を利用することで実現できる。このようにして計算した各領域の面積のうち一定の範囲内のもののみを陽性細胞像として選び出すことが可能である。
【００１８】
次に、(c)検出された陽性細胞像の数及び重心の座標を記録する。この操作は、例えばＭＡＴＬＡＢソフトウェア上で画像と等しいサイズの空行列を用意し、重心の座標に一致した箇所にのみ数値を代入し変数として記録を行うことで実現可能である。
【００１９】
同様の操作を次の検出閾値においても行い、その閾値での陽性細胞を検出する。その際、既に検出され記録された陽性細胞像の重心座標を含む陽性領域を省いて、その閾値で初めて検出された陽性細胞像のみを陽性細胞像として選択する。これにより、細胞同士が重なりあう高密度の領域であっても、正確に陽性細胞を検出できる。
【００２０】
以上のようにして各閾値で検出された陽性細胞像の計数値の合計を計算して、その領域における計数値として採用する。
複数の濃度の閾値を元に分析を行うことで、従来の２値化による検出法と比較して、薄い像や細胞密度の高い領域であっても高精度に陽性細胞を自動検出できるので、組織全体で陽性細胞計数を行ったり、複数の個体のデータを合算してグループ比較を行ったりでき、細胞数の微妙な変化も検出可能である。また、本発明の検出法により検出した陽性細胞を特願２００６−１３４６５に記載の方法により可視化解析することや、本発明の方法をstereology等を利用した細胞計数、核医学等における粒子解析での定量等へ応用することも可能である。
【００２１】
本発明の方法を用いて検出された染色陽性細胞を、特願２００６−１３４６５に記載の方法により可視化解析する場合は、次のように行う。
すなわち、（３）画像を碁盤目状のピクセルに区切り、各ピクセル内の陽性細胞密度を測定する（図７（Ａ））。この陽性細胞密度の計数は、計数ソフトウェアにより自動的に行われる。各ピクセルの大きさは、例えば示した例の場合、２００μｍブロックによって９等分とすることができる。この操作は、例えば、ＭＡＴＬＡＢソフトウェアに付加することができるｉｍａｇｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｔｏｏｌｂｏｘに含まれるライブラリ関数群によって実現できる。選択領域の重心を計算する関数によって各領域を１点で表すように変換し、この変換データに対してブロックごとに任意の数値演算を行うことが可能な関数によってブロック内の平均値を求めることで陽性細胞密度を計算することができる。
【００２２】
（４）各ピクセルを、陽性細胞密度に応じた擬似カラーを付し（図７（Ｂ））、組織標本全体の着色像を得る（図８）。これにより、組織標本全体で陽性細胞密度の高い領域がスクリーニングでき、それを着色で可視化した画像が得られる。この操作は、例えば、ＭＡＴＬＡＢソフトウェアに含まれる画像データを任意のカラーマップによって表示する機能によって実現できる。
【００２３】
しかし、前記工程（４）で得られた画像は１個体１切片の結果である。全体の傾向をするには複数の切片、複数の個体から得られたデータを平均化する必要がある。しかし組織標本は、個体、条件によって形状が微妙に異なるので、そのままの形では複数の標本の画像と重ねあわせることができない。そこで、（５）組織標本全体の形状を既知の組織標本形状に合わせて標準化を行う工程が必要となる。この標準化は、既知の組織標本形状のデータ、例えば既知の脳地図のデータ（非特許文献２）をもとに、前記（４）の着色像を回転、拡大、縮小等を行って、データの標準化を行う（図９）。この標準化により、（４）で得られた着色画像を他の標本の画像と重ねあわせて平均値マップを作成可能なもととなる。この操作は、例えばＭＡＴＬＡＢソフトウェアに付加することができるｉｍａｇｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｔｏｏｌｂｏｘに含まれるライブラリ関数群によって実現できる。任意の領域を選択する関数により切片全体像を選び出し、これを楕円に近似して特徴抽出する関数により長軸と短軸、回転角度を算出する。この値に基づき画像操作を行う関数により変換することで標準化データを得ることができる。ＭＡＴＬＡＢソフトウェア上でこの情報は行列データとして表現されており、行列演算という形で各々のマップから平均値マップを計算することが可能である。
【００２４】
（６）複数の個体由来の組織標本について、前記（１）〜（５）の操作を行い、得られた複数の組織標本についての着色像の平均値マップを得る。これは、複数の個体由来の組織標本についての着色像を重ねあわせて、各ポイントごとの平均値を求め、それをマップ化すればよい（図１０（Ａ）及び（Ｂ））。
【００２５】
さらに、（７）複数の条件の個体群について、前記（１）〜（６）の操作を行い、群間の比較を行えば、群間の比較が可能である。図１０（Ａ）及び（Ｂ）は、異なる実験操作を行った群についての着色像である。図１０（Ａ）及び（Ｂ）では、陽性細胞密度が大きく異なる領域が腹側に存在することが判る。また、陽性細胞密度は、擬似カラー化されているが、定量化されており、定量解析もできる。ここで、組織標本の数は、統計学的有意差検定できる数、例えば５以上が好ましい。
【００２６】
さらに、群間比較の結果を、統計的パラメータとして数値化し、各ピクセルに擬似カラーを付せば、有意差検定で有意差があった部分のみを可視化することもできる。例えば、図１０（Ｂ）のデータをもとに有意差がある部分（ｔ検定）を擬似カラー化した図が図１１である。図１１によれば、右下の部分のみが、有意に陽性細胞が存在する部分であることがわかる。この操作は、例えばＭＡＴＬＡＢソフトウェアに含まれるｔ検定を行うための関数により実現できる。計算した統計量を対数値に変換する関数を利用し、前記工程（４）に記した方法で計算結果を可視的に表示することが可能である。
【実施例】
【００２７】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。なお、画像解析をプログラミング上で表現する手段としてＭＡＴＬＡＢソフトウェアを用いた。
【００２８】
実施例１
（１）図３−Ａに示すように、図の直線下（黄色）に４つの陽性細胞が目視可能である。しかしながら、従来の２値化による検出法では、この４つの細胞を分離検出することは極めて困難である。また、閾値を高濃度側（輝度０側）に設定すれば、グラフ左に示す比較的低濃度に染色された細胞像を検出できず、他方、閾値を低濃度側に設定すれば、グラフ右に示す密集する細胞像が一つに融合されてしまい、個々を検出できない。本発明は、高濃度側より複数設定した閾値においてそれぞれ陽性細胞を検出することで、検出精度の向上を実現している。
（２）神経細胞に特異的な標識蛋白ＮｅｕＮに対する免疫染色を行った組織標本（マウス脳）に対して本発明を適用し、神経細胞核の自動検出を行った。具体的には、取り込んだ画像から検出した背景値を最高輝度（２５５）として標準化し、最終検出閾値を１４０に設定し、閾値２０、４０、１２０及び１４０でそれぞれ陽性細胞を検出した（図３−Ｂ）。比較例１として、閾値１２０でのみ陽性細胞を検出した。
【００２９】
検出された陽性細胞像を計数したところ、比較例１では４１であり、目視による場合の５０％程度の計数値だったのに対し（図４左）、本発明の検出法によれば６６であり、目視による場合の８５％程度の検出が可能であった（図４右）。
【００３０】
実施例２
（１）実施例１と同様の組織標本（マウス脳）に対して本発明を適用し、神経細胞核の自動検出を行った。具体的には、標準化された背景値２５５に対して、最終検出閾値を１６０に設定し、閾値０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０でそれぞれ陽性細胞像を検出した。各閾値では面積２ピクセル以上の像を陽性細胞像と判定した。また、比較例２として、閾値１２０又は閾値１６０の各１点のみで陽性細胞像を検出した。
結果を図５Ａ、Ｂに示す。図中、赤い丸は本発明の検出法によって検出された陽性細胞像を示し、青い丸は従来の２値化（比較例２）によって検出された陽性細胞像を示す。図５から明らかなように、薄い像や細胞が融合して１つになってしまったりした領域においても本発明の検出法により細胞像を分離でき、正確な陽性細胞像のカウントが可能であった。
【００３１】
（２）また、切片像から任意に抽出した１００×１００μｍの領域で目視（×２０対物レンズ想到の解像度での計数）により陽性細胞像を計数し、前記自動検出法（閾値０〜１６０）及び従来の２値化（閾値１２０又は１６０）による検出法と比較した。その結果、図５Ｃに示すように、従来の２値化による検出法では細胞が２０個を超えた密集領域になると目視に比して精度が大幅に低下するのに対し、本発明の検出法では目視の結果と強く相関しており、回帰直線が示すとおり、細胞が密集した領域であっても平均して目視の９０％程度の値を確保していた。なお、実施例では比較的低解像度（対物×４に相当する１pixel＝２．５μｍ）による解析を行ったが、解析画像の解像度は任意に設定可能である。
【００３２】
（３）前記ＮｅｕＮ染色切片のうち細胞が密集している領域（図６（Ａ）中黒三角で示す領域；皮質ＩＶ層）の画像を取り込み（１pixel＝２．５μｍ）、前記自動検出法（閾値０〜１６０）と従来の２値化による検出法（閾値１２０）でそれぞれ染色陽性細胞を検出した。
特願２００６−１３４６５に記載の方法を適用して、取り込んだ画像を１００×１００μｍの領域（４０×４０ピクセル）に区切り、各領域内の陽性細胞密度を計測した。計測した結果は、陽性細胞密度の高い領域を赤〜黄とした擬似カラーとして陽性細胞密度マップとして表示した。
従来の２値化による検出法により検出され作成された陽性細胞密度マップを図６（Ｂ）に示し、本発明の検出法によって検出され作成された陽性細胞密度マップを図６（Ｃ）に示す。従来の２値化による検出法では、黒三角で示した領域は細胞密度が高いにもかかわらず、正しく認識できなかった（図６（Ｂ））。他方、本発明の検出法によれば、従来の方法ではうまく検出できなかった高密度の領域でも個々の細胞が検出できた（図６（Ｃ））。結果として、大脳皮質の層構造による神経細胞密度の違いを示す事が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】神経細胞に特異的な標識蛋白ＮｅｕＮに対する免疫染色を行った組織標本（ラット脳）の染色陽性細胞像を示す図である。グラフ中の矢印は、細胞密度の高い領域での測定誤差を示す。
【図２】染色された組織標本を撮像して得られた画像（左）と、画像のうち最も輝度分布の多い濃度を背景濃度として自動検出して標準化した画像（右）を示す図である。
【図３−Ａ】本発明の陽性細胞検出法の概念図を示す図である。
【図３−Ｂ】各検出閾値において神経細胞核（ＮｅｕＮ）を自動検出した図である。
【図４】従来の２値化による検出法により検出された陽性細胞像（左）と、本発明の検出法により検出された陽性細胞像（右）を計数した結果を示す図である。
【図５】（Ａ）閾値１２０で検出された陽性細胞像を計数した結果（青丸）と、本発明の検出法により検出された陽性細胞像を計数した結果（赤丸）を示す図である。（Ｂ）閾値１６０で検出された陽性細胞像を計数した結果（青丸）と、本発明の検出法により検出された陽性細胞像を計数した結果（赤丸）を示す図である。（Ｃ）従来の２値化による検出法により検出された陽性細胞像の計数値と、本発明の検出法により検出された陽性細胞像の計数値とを、それぞれ目視による計数値と比較したグラフである。
【図６】（Ａ）ＮｅｕＮ染色切片の画像を示す図である。（Ｂ）従来の２値化による検出法により検出され、作成された陽性細胞密度マップを示す図である。（Ｃ）本発明の検出法により検出され、作成された陽性細胞密度マップを示す図である。
【図７】（Ａ）画像をピクセルに区切り、ピクセル内の陽性細胞密度を計測した結果の一例を示す図である。（Ｂ）ｉｂａ−１陽性細胞密度に応じた擬似カラーを付した状態の一例を示す図である。
【図８】切片全体についてｉｂａ−１陽性細胞密度の高い領域が可視化された状態の一例を示す図である。
【図９】データの標準化を行った画像の一例を示す図である。
【図１０】（Ａ）複数の個体由来の組織標本の着色像の平均値マップの一例を示す図である（統制群）。（Ｂ）複数の個体由来の組織標本の着色像の平均値マップの一例を示す図である（薬物投与群）。
【図１１】ｔ−検定によりＰ値に基づいて擬似カラー化した画像の一例を示す図である（Ｐ＜０．０１）。
【図１】
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【図２】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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