(57)【要約】【課題】高濃度な４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを得る製造方法を提供する。【解決手段】１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応によって４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法において、反応開始後、反応系内の４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが０．３ｍｏｌ／ｋｇとなった以降、反応系内の１，３−ジハロ−２−プロパノールの濃度を０．８ｍｏｌ／ｋｇを超えないようにすることを特徴とする、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応によって４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法において、酵素反応を開始し、反応系内の４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度が、０．３ｍｏｌ／ｋｇとなった以降、反応系内の１，３−ジハロ−２−プロパノールの濃度を、０．８ｍｏｌ／ｋｇを超えないようにすることを特徴とする、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法。
【請求項２】
１，３−ジハロ−２−プロパノールが０．０１〜０．８ｍｏｌ／ｋｇとなるよう、１，３−ジハロ−２−プロパノールを添加する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
酵素反応中、シアニドドナーが０．０５ｍｏｌ／ｋｇ以上となるように維持する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
酵素反応中、シアニドドナーが０．０５〜１．５ｍｏｌ／ｋｇとなるように維持する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
１，３−ジハロ−２−プロパノールと酵素が接触する前に、シアニドドナーを反応系内に存在させておく、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
酵素が、ハロヒドリンエポキシダーゼである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ハロヒドリンエポキシダーゼが、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  ｓｐ．Ｎ−１０７４のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ｈｈｅＢ）由来するものである、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応により４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法に関する。４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、種々の医薬品や生理活性物質の合成原料として有用な物質であり、特にＬ−カルニチンの合成原料として有用である。
【背景技術】
【０００２】
１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応により４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造するに際し、使用される酵素として、ハロヒドリンエポキシダーゼが例示できる。
【０００３】
ハロヒドリンエポキシダーゼとしては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、オウレオバクテリウム（Aureobacterium）属に属する微生物が産生する酵素が知られている。
【０００４】
本出願人らは、先にコリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、オウレオバクテリウム属の脱ハロゲン化酵素の作用により、１，３−ジハロ−２−プロパノールから光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法（特許文献１、特許文献２参照）、及びエピハロヒドリンから光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法（特許文献３参照）を提案している。さらに遺伝子組換え技術を利用し、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属由来のハロヒドリンエポキシダーゼ酵素遺伝子ＤＮＡを有する組換えベクターを得、この組換えベクターを導入した形質転換体を使用し３−ヒドロキシブチロニトリルを製造することに成功している（特許文献４、特許文献５、非特許文献１参照）。
【０００５】
また、Janssenらはアグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）  ＡＤ１株、マイコバクテリウム（Mycobacterium）ｓｐ．ＧＰ１、アースロバクター（Arthrobacter）ｓｐ．ＡＤ２が産生するハロヒドリンエポキシダーゼを見出している。アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）  ＡＤ１株においては、その酵素の立体構造を明らかにしている。（非特許文献２，３）
【０００６】
しかしながら、上述の酵素を用いた４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法においては、得られる該ニトリルの蓄積濃度は０．１ｍｏｌ／ｋｇ程度と生産性が低く、工業的に好適な方法ではなかった。
【特許文献１】特許第２８４０７２２号公報
【特許文献２】特開第２００１−２５３９７号公報
【特許文献３】特許第２８４０７２３号公報
【特許文献４】特許第３０７３０３７号公報
【特許文献５】特許第３０２６３６７号公報
【非特許文献１】Biosci. Biotech. Biochem.,58(8), 1451-1457,1994
【非特許文献２】The EMBO Journal.,22(19), 4933-4944, 2003
【非特許文献３】J.Bacteriology 183(17), 5058-5066, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、生産性が高く、工業的に好適な４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、酵素法による４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法について検討した。その過程において、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを蓄積させようとした際、該ニトリルが反応系内に０．３ｍｏｌ／ｋｇ以上、蓄積した時点で反応が突然停止することが分かった。
【０００９】
この問題を解決するために鋭意検討を行った結果、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが０．３ｍｏｌ／ｋｇ生成した時点以降、１，３−ジハロ−２−プロパノールの濃度が０．８ｍｏｌ／ｋｇを超えないように制御することにより、反応が停止することなく、高濃度に４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを蓄積できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応によって４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法において、酵素反応を開始し、反応系内の４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度が、０．３ｍｏｌ／ｋｇとなった以降、反応系内の１，３−ジハロ−２−プロパノールの濃度を、０．８ｍｏｌ／ｋｇを超えないようにすることを特徴とする、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法。
（２）１，３−ジハロ−２−プロパノールが０．０１〜０．８ｍｏｌ／ｋｇとなるよう、１，３−ジハロ−２−プロパノールを添加する、前記（１）記載の方法。
（３）酵素反応中、シアニドドナーが０．０５ｍｏｌ／ｋｇ以上となるように維持する、前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）酵素反応中、シアニドドナーが０．０５〜１．５ｍｏｌ／ｋｇとなるように維持する、前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）１，３−ジハロ−２−プロパノールと酵素が接触する前に、シアニドドナーを反応系内に存在させておく、前記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）酵素が、ハロヒドリンエポキシダーゼである、前記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の方法。
（７）ハロヒドリンエポキシダーゼが、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  ｓｐ．Ｎ−１０７４のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ｈｈｅＢ）由来するものである、前記（６）に記載の方法。である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、反応系内に４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを高濃度で蓄積させることができるため、生産性が高く、工業的に好適な４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明に関して詳細に説明する。
本発明に係る４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法（以下、単に「本製造方法」と称す）とは、水及びハロヒドリンエポキシダーゼを含む反応溶媒中で、１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応により４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法である。
【００１３】
（１）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルとは、下記一般式（１）で表される化合物のことをいう。
【００１４】
【化１】
2008017838.tif 000002
（式中、Ｘ１はハロゲン原子を示す。具体的にはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、塩素原子、臭素原子が好ましく、塩素原子が最も好ましい。＊は不斉炭素を示し、その立体配置は（Ｒ）体、（Ｓ）体、ラセミ体のいずれでも構わないが、（Ｒ）体が好ましい。）
【００１５】
具体的には４−フルオロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ヨード−３−ヒドロキシブチロニトリルが挙げられ、好ましくは４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリルである。
【００１６】
また、光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルとは、一方の鏡像異性体（例えばＲ体）が他方の鏡像異性体（例えばＳ体）より多く含まれている４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのこと、または、いずれか一方の鏡像異性体のみからなる４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのことをいう。なお、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルがいずれか一方の鏡像異性体のみからなる場合、光学純度１００％という。
【００１７】
（２）ハロヒドリンエポキシダーゼ
本製造方法に際して使用される酵素としては、ハロヒドリンエポキシダーゼが挙げられる。ハロヒドリンエポキシダーゼとは、下記一般式（２）で表される１，３−ジハロ−２−プロパノールを脱ハロゲン化水素し、下記一般式（３）で表されるエピハロヒドリンを合成する活性、及びその逆反応を触媒する活性を有する酵素（EC number: 4.5.1.-）を意味する。
【００１８】
【化２】
2008017838.tif 000003
（式中、Ｘ１、Ｘ２はハロゲン原子を示す。フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には１，３−ジフルオロ−２−プロパノール、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノール、１，３−ジヨード−２−プロパノール等が挙げられ、好ましくは、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノールである。）
【００１９】
【化３】
2008017838.tif 000004
（式中、Ｘ１はハロゲン原子を示し、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的にはエピフルオロヒドリン、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、エピヨードヒドリン等が挙げられ、特に好ましくはエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンである。）
【００２０】
この酵素を産生する微生物としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）sp.N-1074（FERM BP-2643）、ミクロバクテリウム（Microbacterium）sp.N-4701（FERM BP-2644）、アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）  AD1、マイコバクテリウム（Mycobacterium）sp.GP1、アースロバクター（Arthrobacter）sp.AD2等が挙げられる。
【００２１】
特に好ましい微生物は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）sp.N-1074（FERM BP-2643）である。
【００２２】
ハロヒドリンエポキシダーゼは、例えば、GenBankに公表されており、コリネバクテリウム（Corynebacterium）sp.N-1074由来のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（hheB）のAccession番号はD90350である。
【００２３】
前記ハロヒドリンエポキシダーゼは、上記微生物からの抽出によって調製することができる。また、ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を組み込んで作製した遺伝子組換え微生物によっても生産することができる。さらに天然型のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を改変し、酵素機能を改変したハロヒドリンエポキシダーゼについても、本発明に用いることができる。
【００２４】
酵素の抽出は常法によって実施すればよく、調製物にはハロヒドリンエポキシダーゼ以外の成分が含まれていても反応に悪影響を与えなければ特に精製する必要はない。ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を組み込んで作成した遺伝子組換え微生物を培養して得られるハロヒドリンエポキシダーゼが、調製が容易なことから好ましく使用される。
また、形質転換に用いる宿主微生物としては大腸菌（Escherichia coli）あるいはロドコッカス（Rhodococcus）属細菌に属する微生物が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではなく、他の宿主微生物を用いることも出来る。
【００２５】
前記ハロヒドリンエポキシダーゼを生産する微生物を培養するための培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものであれば何れのものでも使用できる。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、マルトースやフルクトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸あるいはその塩、またはエタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、硫酸、塩酸、燐酸やホウ酸などの無機酸あるいはその塩、用いられる微生物が利用可能なナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシウムなどを含む無機塩、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル微量金属塩、微生物育成促進剤としてビタミンＢ１、Ｂ２、Ｃ、Ｋ等のビタミン等が必要に応じて適宜添加される。本発明の微生物の培養は、通常は液体培養で行われるが、固体培養によっても行うことができる。
【００２６】
培養は１０〜５０℃の温度で、ｐＨ  ２〜１１の範囲で行われる。微生物の生育を促進させるために通気攪拌を行ってもよい。培養により得られた微生物は、培養液そのまま若しくは該培養物から遠心分離等の集菌操作によって得られる微生物菌体、若しくは菌体処理物（例えば、菌体破砕物、粗酵素、精製酵素）あるいは常法により固定化した菌体または菌体処理物の形で、ハロヒドリンエポキシダーゼとして利用することができる。
【００２７】
（３）シアニドドナー
シアニドドナーとは、反応液中に添加した際にシアンイオン（ＣＮ−）又はシアン化水素を生じる化合物を意味し、特に制限されないが、シアン化水素（ＨＣＮ）、シアン化カリウム（ＫＣＮ）、シアン化ナトリウム（ＮａＣＮ）、アセトンシアンヒドリン（ＡＣＨ）が例示される。シアン化水素、シアン化カリウム、シアン化ナトリウムが好ましく使用される。
【００２８】
（４）酵素反応
本製造方法の酵素反応は、水または緩衝液へ、シアニドドナー、１，３−ジハロ−２−プロパノール及びハロヒドリンエポキシダーゼを反応系に添加することにより開始する。緩衝液としては、例えば、青酸、リン酸、ホウ酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸又は酢酸等の塩等によって構成される緩衝液、トリス緩衝液あるいはグッド緩衝液等が例示される。その内、青酸とその塩によって構成される緩衝液、トリス緩衝液が好ましい。緩衝剤由来の不純物が混入しない点で、青酸とその塩によってのみ構成される緩衝液が特に好ましい。
【００２９】
上記緩衝液への、シアニドドナー、１，３−ジハロ−２−プロパノール、ハロヒドリンエポキシダーゼの投入順序については、特に制限されないが、１，３−ジハロ−２−プロパノールとハロヒドリンエポキシダーゼが接触する前に、反応系内にシアニドドナーを存在させておくことが、反応開始時に高い反応速度を得られる点、及びエピハロヒドリンの副生を抑えることができる点で好ましい。存在させておくシアニドドナーの濃度は、反応開始時において、０．０１〜１．５ｍｏｌ／ｋｇが好ましく、０．８〜１．５ｍｏｌ／ｋｇがより好ましい。シアニドドナーの濃度は１．５ｍｏｌ／ｋｇを超えると酵素の安定性の観点から好ましくない。
【００３０】
１，３−ジハロ−２−プロパノールは、反応開始時において０．０１ｍｏｌ／ｋｇ以上となるように予め反応系内に存在させておくことが、反応開始時に高い反応速度を得られる点で好ましい。反応開始時から４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが０．３ｍｏｌ／ｋｇ蓄積するまでの間、１，３−ジハロ−２−プロパノールの濃度は特に制限されないが、酵素の安定性の観点から１ｍｏｌ／ｋｇ以下とするのが好ましい。
【００３１】
ここで、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが、反応系内に０．３ｍｏｌ／ｋｇ蓄積した時点で、１，３−ジハロ−２−プロパノールの濃度が０．８ｍｏｌ／ｋｇを超えている場合には、水やシアニドドナーなどを添加し、１，３−ジハロ−２−プロパノールの濃度が０．８ｍｏｌ／ｋｇ以下となるように調整する。それ以降、反応速度向上、高生産性の観点から１，３−ジハロ−２−プロパノールを０．８ｍｏｌ／ｋｇを超えないように追添加することがさらに好ましい。０．０１〜０．８ｍｏｌ／ｋｇとなるように追添加することがさらに好ましい。
【００３２】
また、シアニドドナーは反応進行により消費されるため、追添加することが好ましい。その場合、反応系内に０．０５ｍｏｌ／ｋｇ以上存在させておくよう、追添加することが好ましいが、酵素の安定性の観点から１．５ｍｏｌ／ｋｇを超えないようにすることが好ましい。
【００３３】
シアニドドナーの使用量は、最終的に使用する１，３−ジハロ−２−プロパノールの１〜２当量とすることが、反応速度の向上、及びシアニドドナーの効率的な利用の観点から好ましい。
【００３４】
ここで、最終的に使用する１，３−ジハロ−２−プロパノールの量とは、反応開始から反応終了までに使用した１，３−ジハロ−２−プロパノールの全量のことを意味する。
【００３５】
酵素反応時の温度は、０〜３０℃とすることが酵素の安定性が良く、円滑に反応が進行する点から好ましい。
【００３６】
反応が進行するに従い、反応液中にハロゲン化水素が生成するためｐＨが低下していく。よって、反応系内にアルカリを追添加することにより、系内のｐＨを酵素の活性が発揮される領域に調整、維持することが好ましい。そのｐＨは７．０以上とすることが反応の円滑な進行の点から好ましく、８．５以下とすることが副反応の抑制の点から好ましい。
【００３７】
使用するアルカリとしては、ハロゲン化水素と塩を形成し、その塩の水溶液が酵素の活性が発揮されるｐＨ領域にあるものであれば特に制限されず、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属またはアンモニアの、水酸化物あるいは弱酸との塩が例示される。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、シアン化ナトリウム、シアン化カリウムが好ましい。アルカリの使用形態としては、特に制限されないが、取り扱いの容易さから水溶液が好ましい。
【００３８】
ハロヒドリンエポキシダーゼの使用量は特に制限されず、反応が円滑に進行する量を使用すればよい。例えば、反応開始時において反応液１ｇあたり１Ｕ〜１０００Ｕ使用することができる。ここで、１Ｕ（ユニット）とは、２０℃、ｐＨ８．０の緩衝液中において、１，３−ジクロロ−２−プロパノールから１分間に１μｍｏｌのエピクロロヒドリンを生成することができる酵素量のことを意味する。
【００３９】
反応系内の１，３−ジハロ−２−プロパノール、及び４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度は、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって定量することができる。また、反応系内のシアニドドナーの濃度は、例えば滴定によって定量することができる。これらの定量結果を反応進行の指標として、追添加する１，３−ジハロ−２−プロパノール及びシアニドドナーの量を決定することができるが、以下に示す方法で１，３−ジハロ−２−プロパノール及びシアニドドナーの濃度をより容易に管理できる。
【００４０】
つまり、反応開始以降、ｐＨコントローラーを用いてｐＨを一定に維持すると、生成したハロゲン化水素と理論上、等モル、すなわち反応により消費された１，３−ジハロ−２−プロパノール及びシアニドドナーと理論上等モルのアルカリが投入される。このアルカリの投入量が反応進行の指標となるので、反応系に１，３−ジハロ−２−プロパノール及びシアニドドナーを追添加する際の目安とすることができる。
【００４１】
例えば、反応開始時に１，３−ジハロ−２−プロパノールを０．５ｍｏｌ／ｋｇ、シアニドドナーを１ｍｏｌ／ｋｇとした際に、反応開始時以降、ｐＨコントローラーを用いてｐＨを一定に維持することにより投入されるアルカリと等モルの１，３−ジハロ−２−プロパノール、及びシアニドドナーを追添加することで、１，３−ジハロ−２−プロパノールの濃度を０．５ｍｏｌ／ｋｇを超えないよう、シアニドドナーの濃度を１ｍｏｌ／ｋｇを超えないように維持できる。
【００４２】
反応時間は、基質等の濃度、菌体濃度、又はその他の反応条件等によって適時選択するが、１〜１２０時間で反応が終了するように条件を設定するのが好ましい。
【００４３】
上述の方法により、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを、途中で蓄積が停止することなく、反応系内に０．３ｍｏｌ／ｋｇを超えて蓄積させることができる。反応液中に生成、蓄積した４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは公知の方法を用いて採取及び精製することができる。例えば、反応液から遠心分離等の方法を用いて菌体を除いた後、酢酸エチルなどの溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することにより４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのシロップを得ることができる。また、これらのシロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。
【００４４】
５．基質の再利用
酵素反応終了後の反応液を蒸留することにより、未反応のシアニドドナー及び１，３−ジハロ−２−プロパノールを再度、本反応に利用することもできる。
【００４５】
具体的には下記工程（３）に示すように、未反応のシアニドドナー及び１，３−ジハロ−２−プロパノールを回収し、再利用することが好ましい。すなわち、以下の工程を含む、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法である。
（１）シアニドドナーを含む水溶液に、１，３−ジハロ−２−プロパノール及び酵素を添加し、反応系内のシアニドドナーが０．０５〜１．５ｍｏｌ／ｋｇ、１,３-ジハロ−２−プロパノールが０．０１〜１ｍｏｌ／ｋｇとなるように制御しながら、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを０．３ｍｏｌ／ｋｇまで蓄積させ、
（２）前記工程（１）で４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを０．３ｍｏｌ／ｋｇまで蓄積した以降、反応系内の１,３-ジハロ−２−プロパノールの濃度を０．０１〜０．８ｍｏｌ／ｋｇとなるように管理し、
（３）前記工程（２）で得られた反応液を蒸留し、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを主成分とする水溶液と、未反応のシアニドドナー及び１，３−ジハロ−２−プロパノールを含む水溶液をそれぞれ回収する。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、エピクロロヒドリン、及び４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの定量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて表１に示す分析条件で行った。  
【表１】
2008017838.tif 000005
【００４７】
［調製例１］
ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物の培養
ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ大腸菌（Escherichia coli）JM109/pST111を、ＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）１００ｍＬ×２０本植菌し、３７℃で２０時間振盪培養した。
【００４８】
培養菌体を５０ｍＭ  トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）で洗浄し、５０ｍＭ  トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）を２０ｇになるように加え、懸濁した。この菌体懸濁液０．２５ｇを５０ｍＭ  トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）１００ｍＬに加え、さらに５０ｍＭとなるように１，３−ジクロロ−２−プロパノールを加え、２０℃で１０分間反応した。
【００４９】
ＨＰＬＣにより反応液中のエピクロロヒドリンの量を測定したところ、１１ｍＭであった。すなわち、１０分当たり１１００μｍｏｌのエピクロロヒドリンが生成したことになり、この菌体懸濁液の活性は菌体懸濁液１ｇあたり４４０Ｕであることがわかった。
【００５０】
この菌体懸濁液を５０ｍＭ  トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）で菌体懸濁液１ｇあたり４００ｕｎｉｔになるように希釈した。
【００５１】
なお、ｐＳＴ１１１は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）sp.N-1074のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ｈｈｅＢ）を含むBamHI-PstI１．１Ｋｂ  断片をｐＵＣ１１８に結合させたプラスミドである（図１）。
【００５２】
また、ｐＳＴ１１１は、特開平５−３１７０６６公報に記載されており、JM109/pST111は、FERM P-12065として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に平成３年３月１日付け寄託されている。
【００５３】
＜実施例１〜４＞
以下の表２に示す条件で反応を行った。反応は、ｐＨ電極及びｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した３００ｍＬ容４つ口フラスコに、所定量の水、ＨＣＮを投入し、３０％  ＮａＯＨで所定のｐＨ（I）に調整後、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（ＤＣＰ）を加え、均一に溶解するまで攪拌した。
【００５４】
次いで、調整例１の菌体懸濁液２０．００ｇ（８．００ｋＵ）を加え、所定の温度、ｐＨ（II）で反応を開始した。反応開始後は、反応系内のｐＨを制御するために、ｐＨコントローラーを設定し、３０％ＮａＯＨにてｐＨのコントロールを行った。
【００５５】
ｐＨコントロールで使用したＮａＯＨとほぼ等モルの割合でＤＣＰ及びＨＣＮを追添加し、ＤＣＰ及びＨＣＮの濃度を所定値の範囲内に維持した。
【００５６】
なお、収率は以下の方法により算出した。
収率（％）＝DCP転化率×CHBN選択率
・DCP転化率（％）＝100−｛（系内全量×DCP濃度）/（DCP仕込量＋DCP累計追加量）｝
・CHBN選択率（％）＝｛（系内全量×CHBN濃度）/（DCP仕込量＋DCP累計追加量）｝×DCP転化率
【００５７】
その後、３５％ＨＣｌで所定のpH(III)を調整後、窒素ガスを毎分5mL吹き込みながら常圧蒸留し、２℃に冷却した冷却管を用いて留出液を得た。
【００５８】
各実施例の反応プロファイルについては、表３、表５、表７及び表９に示した。また、各実施例の留出液・釜残組成に関しては、表４、表６、表８及び表１０に示した。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【００５９】
上記の結果より、反応液内に残存していた1,3-ジクロロ-2-プロパノールおよびHCNを60〜80%の回収率で回収できた。生成物である4-クロロ-3-ヒドロキシブチロニトリルはほぼ全量釜残に残り、ロスは殆どないことがわかった。
＜実施例５＞
【００６０】
実施例１で得られた留出液の100.0gを使用し、それに水31.25g、HCN3.41gを加え、30%NaOH 0.65gで、pH7.5に調整し、1,3-ジクロロ-2-プロパノール7.3gを加えて、均一に溶解するまで攪拌した。次に調整例１の菌体懸濁液２０．００ｇ（８．００ｋＵ）を加え、実施例１と同様に反応を行った。
【００６１】
反応開始23時間後、30%NaOHは、22.0g投入されており、反応液の全量は200.78gであった。
その後、35%塩酸を0.8g添加し、pHを2.0とした後、窒素ガスを毎分5mL吹き込みながら、110Torr, 50℃で減圧蒸留し、２℃に冷却した冷却管を用いて129.92gの留出液を得た。反応終了液、留出液、釜残の組成を表１１に示した。
【表１１】
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【００６２】
上記の結果より、蒸留した水、未反応の1,3-ジクロロ-2-プロパノールおよびHCNをリサイクル使用しても、酵素反応にはまったく悪影響がなく、新しい水、HCNおよび1,3-ジクロロ-2-プロパノールを使用した場合となんら変わらない反応結果が得られた。
また、反応液内に残存していた1,3-ジクロロ-2-プロパノールを75%の回収率で回収できた。生成物である4-クロロ-3-ヒドロキシブチロニトリルはほぼ全量釜残に残り、ロスは殆どないことがわかった。また、4-クロロ-3-ヒドロキシブチロニトリルの光学純度は蒸留の前後において94.8%eeであり、蒸留による光学純度の低下はみられなかった。
＜比較例１＞
【００６３】
実施例１〜４の４つ口フラスコに、０．１ｍｏｌ／ｋｇリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５５．５２ｇを入れ、ＤＣＰ１０．００ｇ（０．０７７５ｍｏｌ）を入れ、均一に溶解するまで攪拌した。
【００６４】
調製例１の菌体懸濁液２０．００ｇ（８．００ｋＵ）を加え、２０℃で反応を開始した。系内のｐＨを７．５〜７．６に維持するようｐＨコントローラーを設定し、３０％ＮａＯＨにてｐＨのコントロールを行った。反応開始後、ＤＣＰを２０分間隔に１．０９ｇ、ＨＣＮを１０分間隔に０．５５ｇの割合で追添加した。反応結果を表１２に示す。
【表１２】
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【００６５】
上記の結果より、６０分後、ＣＨＢＮが０．３０２ｍｏｌ／ｋｇ蓄積した以降、ＤＣＰの濃度を０．８ｍｏｌ／ｋｇを超えて添加し続けた場合、１２０分（２時間）後以降、反応が急に停止した。
【００６６】
１８０分後には、ＣＨＢＮは０．２９８ｍｏｌ／ｋｇ、その光学純度は９２．０％ｅ．ｅ．のＲ体過剰であり、収率は２１．６％であった。
＜比較例２＞
【００６７】
実施例１〜４の４つ口フラスコに、０．１ｍｏｌ／ｋｇリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１２５．０９ｇ、ＤＣＰ１０．００ｇ（０．０７７５ｍｏｌ）を入れ、均一に溶解するまで攪拌した。
調製例１の菌体懸濁液２０．００ｇ  （８．００ｋＵ）を加えた後、ＨＣＮを０．２０ｇ（０．０３６９ｍｏｌ）加えて、２０℃で反応を開始した。系内のｐＨを７．５〜７．６に維持するよう、３０％ＮａＯＨを投入するようにｐＨコントローラーを設定し、投入されたＮａＯＨとほぼ等モルの割合でＤＣＰ、ＨＣＮを追加していくことで、系内のＤＣＰの濃度を０．５ｍｏｌ／ｋｇを超えないようにした。また、このとき、系内のシアンイオン濃度は０．０５ｍｏｌ／ｋｇを超えることはなかった。反応結果を表１３に示す。
【表１３】
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【００６８】
上記の結果より、反応開始から１８０分経過しても、ＣＨＢＮは０．１４５ｍｏｌ／ｋｇしか蓄積せず、反応が円滑に進行しなかった。光学純度は９２．０％ｅ．ｅ．のＲ体過剰であった。収率は２８．９％であった。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】プラスミドｐＳＴ１１１の構成図である。
【図１】
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