(57)【要約】【課題】  本発明は、カルシウム拮抗薬、抗てんかん薬および免疫抑制薬などの薬物による副作用によって生じた歯肉肥大を抑制及び治療する薬剤を提供することを目的とする。【解決手段】  歯肉肥大症に対して、柴胡を使用する新規な歯肉肥大症抑制剤および治療剤を提供することができる。また、柴胡を含有する医薬組成物も新規な歯肉肥大症抑制剤および治療剤として提供することができる。さらに歯肉肥大症を抑制および治療する有効な手段として、柴胡または柴胡を含有する医薬組成物を含んでなる歯磨き粉を提供することができる。これにより、歯肉肥大症患者は異なる種類の抗てんかん薬に変更することなく、通常の歯磨きのブラッシング時に本発明の歯磨き粉を使用するだけで、歯肉肥大を抑制および治療できる。【選択図】  図１
2008260690.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
柴胡を使用する歯肉肥大症抑制剤。
【請求項２】
柴胡を有効成分として含有する医薬組成物を使用する歯肉肥大症抑制剤。
【請求項３】
前記医薬組成物は柴苓湯であることを特徴とする請求項２に記載の歯肉肥大症抑制剤。
【請求項４】
柴胡を使用する歯肉肥大症治療剤。
【請求項５】
柴胡を有効成分として含有する医薬組成物を使用する歯肉肥大症治療剤。
【請求項６】
前記医薬組成物は柴苓湯であることを特徴とする請求項５に記載の歯肉肥大症治療剤。
【請求項７】
柴胡または柴胡を有効成分として含有する医薬組成物を含んでなる歯磨き粉。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、柴胡を使用する歯肉肥大症抑制剤に関し、より詳細には、カルシウム拮抗薬、抗てんかん薬及び免疫抑制薬などの薬物による副作用によって生じた歯肉肥大を抑制及び治療するために、柴胡または柴胡を有効成分として含有する医薬組成物を使用する薬剤の提供に関する。さらに、本発明は、柴胡または柴胡を有効成分として含有する医薬組成物を含んでなる歯磨き粉に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ニフェジピン等のカルシウム拮抗薬、フェニトイン等の抗てんかん薬およびシクロスポリンＡ等の免疫抑制薬など種々の薬物が副作用として歯肉肥大を起こすことが知られている。薬物による歯肉肥大のメカニズムに対する研究はなされてきており、相当の論文が発表され、そのメカニズムは数多く提唱されている（例えば、非特許文献１乃至３参照）。
【０００３】
しかしながら、歯肉肥大の原因療法についての報告は稀であり、ほとんどなされていない（例えば、非特許文献４）。
【０００４】
以前、本発明者らは、薬物による歯肉肥大は細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇、タイプＩコラーゲンの生成および線維芽細胞の増殖を起こす塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の遊離により起こることを提唱した（例えば、非特許文献５参照）。
【０００５】
その歯肉肥大のメカニズムを概略して説明すると、上記の全ての薬物で、まず最初に起こるのは、細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇である。次いで、そのカルシウムイオンがｂＦＧＦの遊離を促進し、その後、パラクライン・オートクラインにより受容体チロシンキナーゼに結合し、チロシンキナーゼの活性化、Ｒａｓタンパクの活性化、ＭＡＰキナーゼの活性化を導き、コラーゲン生成の促進につながり、歯肉肥大へと導かれる。また、ＭＡＰキナーゼの活性化は、ｃ−ｆｏｓ遺伝子の転写促進となり、これが細胞増殖を引き起こし、歯肉肥大へと導かれる。
【０００６】
一方で、我が国では漢方薬は治療薬として認められており、構成成分が規定されて国内生産されて、特に副作用の少ない治療薬として使用されている。漢方薬の中で柴苓湯はリウマチ関節炎（例えば、非特許文献６参照）、狼そう紅斑（例えば、非特許文献７参照）、糸球体腎炎や腎炎症候群（例えば、非特許文献８参照）および糖尿病性腎臓病症（例えば、非特許文献９参照）などの処置のための治療薬の１つである。これらの有効な作用を持つために柴苓湯は日本の内科医に広く使用されており、さらに、最近の研究では、細胞増殖を抑制する作用を有することが報告されている。例えば、柴苓湯がラット培養糸球体脈管膜細胞の増殖を抑制することが報告されており、（例えば、特許文献９参照）、柴苓湯が自然発生腹膜後線維症における線維芽細胞の増殖を抑制することが報告されている（例えば、特許文献１０参照）。
【０００７】
しかしながら、漢方薬も含め既存の薬剤が、上記の歯肉肥大のメカニズムにおける歯肉線維芽細胞の増殖に対する有効な抑制を示す報告はなく、ましてや歯肉肥大に対する新規の薬剤を開発したという報告もなかった。
【０００８】
したがって、抗てんかん薬などの副作用による歯肉肥大症の患者は、異なるタイプの抗てんかん薬を服用するか、歯磨きによりプラークや歯石などの局所因子を除去したり、増殖した歯肉を外科的手段によって切除するなど、症状を少しでも緩和するような一時的な対処療法しかなく、歯肉肥大症を抑制および治療するための有効な手段は存在していなかった。
【非特許文献１】Brown, R.S., Beave,. W.T. and Bottomley, W.K.: On the mechanism of drug-induced gingival hyperplasia. J. Oral Pathol. Med. 20: 201-209, 1991.
【非特許文献２】Kataoka, M., Shimizu, Y., Kunikiyo, K., Asahara, Y., Azuma, H., Sawa, T., Kido, J. and Nagata, T.: Nifedipine induces gingival overgrowth in rats through a reduction in collagen phagocytosis by gingival fibroblasts. J. Periodontol. 72: 1078-1083, 2001.
【非特許文献３】Spolidorio, L.C., Spolidorio, D.M., Neves, K.A., Gonzaga, H.F.S. and Almeida, O.P.: Morphological evaluation of combined effects of cyclosporin and nifedipine on gingival overgrowth in rats. J. Periodotol. Res. 37: 192-195, 2002.
【非特許文献４】Hattori, T. and Pao-Li, W.: Inhibition by tranilast of nifedipine-indued proliferation of cultured human gingival fibroblasts. Eur. J. Pharmacol. 498: 79-81, 2004.
【非特許文献５】Hattori, T., Hirai, K., Wang, P. and Fujimura, S.: Proliferation of cultured human gingival fibroblasts caused by isradipine, a dihydropyridine-derivative calcium antagonist. Eur. J. Med. Res. 9: 313-315, 2004.
【非特許文献６】Tanaka, H.: Remission-inducing effects of Sairei-to in rheumatoid arthritis. In:  Medicines of plant origin in modern therapy. pp. 44-45, Oxford Clinical Communications. Oxford, 1990
【非特許文献７】Suzuki, T., Ono, S. and Oshima, Y.: Effects of Sairei-to on lupus erythematosus. In:  Medicines of plant origin in modern therapy. pp. 46-47, Oxford Clinical Communications. Oxford, 1990.
【非特許文献８】Ito, T., Seo, N., Yagi, H., Ohtani, T., Tokura, Y., Takigawa, M. and Furukawa, F.: Unique therapeutic effets of Japanese-Chinese herbal medicine, Sairei-to, on Th1/Th2 cytokines balance of the autoimmunity of MRL/lpr mice. J. Dermatol. Sci. 28: 198-219, 2002.
【非特許文献９】Awazu, M., Fujita, H., Omori, S. and Hida, M.: The herbal medicine sairei-to inhibits proliferation of rat mesangial cells. Nephron 92: 652-659, 2002.
【非特許文献１０】松岡陽、小林剛、岡薫著、持発性後腹膜線維化症および尿路吻合部狭窄に対する柴苓湯の使用実験、臨泌５５巻８号：６４３−６４６、２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明は上述に鑑みてなされたものであり、カルシウム拮抗薬、抗てんかん薬および免疫抑制薬などの薬物による副作用によって生じた歯肉肥大を抑制及び治療する薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述したように、歯肉肥大の原因療法についての報告はほとんどなく、その原因療法により近い薬剤の開発が望まれていた。そこで、本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、柴苓湯の主要成分である柴胡がニフェジピンによるヒト培養歯肉線維芽細胞の増殖を抑制することを見出し、柴胡は歯肉線維芽細胞においてｂＦＧＦの遊離を抑制し、コラーゲン合成を抑えることにより増殖を抑制するという知見に基づき本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、上記目的は、請求項１に記載されるが如く、柴胡を使用する歯肉肥大症抑制剤によって達成される。
【００１２】
請求項１に記載の発明によれば、歯肉肥大症抑制剤として、柴胡を効果的に使用することができる。
【００１３】
請求項２にかかる発明は、柴胡を有効成分として含有する医薬組成物を使用する歯肉肥大症抑制剤によって達成される。
【００１４】
請求項２に記載の発明によれば、歯肉肥大症抑制剤として、柴胡を有効成分として含有する医薬組成物を効果的に使用することができる。
【００１５】
請求項３にかかる発明は、請求項２に記載の発明において、前記医薬組成物は柴苓湯であることを特徴とする。
【００１６】
請求項３に記載の発明によれば、歯肉肥大症抑制剤として、柴苓湯を有効に使用することができる。
【００１７】
請求項４にかかる発明は、柴胡を使用する歯肉肥大症治療剤によって達成される。
【００１８】
請求項４に記載の発明によれば、歯肉肥大症治療剤として、柴胡を効果的に使用することができる。
【００１９】
請求項５にかかる発明は、柴胡を有効成分として含有する医薬組成物を使用する歯肉肥大症治療剤によって達成される。
【００２０】
請求項５に記載の発明によれば、歯肉肥大症治療剤として、柴胡を有効成分として含有する医薬組成物を効果的に使用することができる。
【００２１】
請求項６にかかる発明は、請求項５に記載の発明において、前記医薬組成物は柴苓湯であることを特徴とする。
【００２２】
請求項６に記載の発明によれば、歯肉肥大症治療剤として、柴苓湯を有効に使用することができる。
【００２３】
請求項７にかかる発明は、柴胡または柴胡を有効成分として含有する医薬組成物を含んでなる歯磨き粉によって達成される。
【００２４】
請求項７に記載の発明によれば、歯肉肥大症に対して、柴胡または柴胡を有効成分として含有する医薬組成物を含んでなる歯磨き粉を効果的に使用することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、歯肉肥大症に対して、柴胡を使用する新規な歯肉肥大症抑制剤および治療剤を提供することができる。また、柴胡を含有する医薬組成物も新規な歯肉肥大症抑制剤および治療剤として提供することができる。さらに歯肉肥大症を抑制および治療する有効な手段として、柴胡または柴胡を含有する医薬組成物を含んでなる歯磨き粉を提供することができる。これにより、歯肉肥大症患者は、異なる種類の抗てんかん薬に変更することなく、通常の歯磨きのブラッシング時に本発明の歯磨き粉を使用するだけで、歯肉肥大を抑制および治療できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の一つの好ましい態様について詳述して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２７】
本発明における柴胡の使用は、歯肉肥大症に対する新規な用途であり、歯肉肥大に対する顕著な効果を有する。したがって、本発明は、歯肉肥大症抑制剤及び治療剤としての柴胡の新規な使用である。
【００２８】
ここでいう柴胡は従来から知られている生薬であり、セリ科のミシマサイコまたはその変種の根を掘り起こした根茎を水洗後、乾燥したものである。また、その調製法は公知であり、一般に市販されて容易に入手可能である。
【００２９】
柴胡の主成分としては、サポニンａ〜ｆ、ステロール、脂肪酸を含有しており、従来の薬理作用としては、主に中枢抑制作用、つまり、鎮静、鎮咳、鎮痛、解熱などが知られている。また、柴胡は、それ自体でも使用されるが、例えば、柴苓湯、小柴胡湯、柴胡桂枝湯など多数の漢方処方に配合されて使用されている。
【００３０】
したがって、本発明の歯肉肥大症抑制剤および治療剤は、柴胡自体を用いるか、または柴胡を有効成分として含有した医薬組成物を用いることができ、常法により得ることができる。例えば、本発明の好ましい柴胡を有効成分として含有した医薬組成物は、柴苓湯であり、一般に市販されており容易に入手可能である。
【００３１】
本発明の柴胡自体または柴胡を有効成分として含有した医薬組成物を使用する歯肉肥大症抑制剤および治療剤の使用形態は、従来の生薬を使用する際の投与形態と同様であり、特に限定されず、必要に応じて適宜選択することができる。例えば、生薬において一般的な形態である、顆粒剤、細粒剤、散剤のような経口剤が好ましい。この場合、歯肉肥大症患者の年齢、性別、体重または疾患の程度に依存しており、１日あたりの患者の許容可能な範囲の投与量を１日数回に分けて投与するのが好ましい。
【００３２】
また、本発明の実施態様における、柴胡を有効成分として含有した医薬組成物として、下記に限定しないが、例えば、柴苓湯が好ましい。柴苓湯は、通常に柴苓湯を使用する際の投与条件と同等に投与してもよい。
【００３３】
本発明はまた、柴胡または柴胡を有効成分として含有した医薬組成物を含んでなる歯磨き粉として歯肉肥大症に対して局所的な使用ができる。本発明の歯磨き粉は、製造時に柴胡または柴胡を有効成分として含有した医薬組成物を添加された形態でも、または、市販の歯磨き粉の使用直前に添加した形態でもよい。つまり、本発明の歯磨き粉は、柴胡または柴胡を有効成分として含有した医薬組成物の有効性が損なわれない限り、任意の公知の手法によって作製されてよい。
【００３４】
これにより、従来は歯肉肥大症の対処療法として、プラークや歯石などの局所因子を除去するだけのブラッシングであったが、柴胡を含んだ歯磨き粉を使用してブラッシングすることによって、患部に対して効果的に浸透し、歯肉肥大のメカニズムに対して有効に作用することができ、カルシウム拮抗薬や抗てんかん薬の種類を変えることなく、歯肉肥大を抑えることができ、治療に導くことができる。
【００３５】
以上説明したように、歯肉肥大抑制剤および治療剤としての本発明の柴胡の使用によって、歯肉肥大症をかつてないほど抑制することができ、従来困難であった歯肉肥大症の治療に導くことができる。また、本発明の別の実施態様として、有効成分として柴胡を含有する医薬組成物を歯肉肥大抑制剤および治療剤として活用することもできる。さらにまた、柴胡または柴胡を含有する医薬組成物は歯肉に対して直接的に作用する歯磨き粉として使用することも可能であり、歯肉肥大症に対して効果的に作用する本発明の好ましい実施態様の一つである。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明にしたがって実施した具体例を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本発明の趣旨及び範囲を逸脱しない限り、その細部については様々な態様が可能である。
（実施例１）
実施例１では、正常ヒト歯肉線維芽細胞を用いて、柴胡を使用する場合の歯肉肥大の抑制作用の確認試験を実施した。
【００３７】
まず、柴胡がニフェジピンによる歯肉線維芽細胞の増殖を抑制することを説明する。なお、ニフェジピンは代表的な抗てんかん薬である。
【００３８】
材料として大日本製薬より入手した正常ヒト歯肉線維芽細胞（Ｇｉｎ−１）を用いた。細胞はウシ胎児血清１０％を含むＤＭＥＭ（大日本製薬、日本）で培養し高湿度で３７℃の９５％空気＋５％二酸化炭素中でインキュベートした。培養液には抗生物質（５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ/ｍｌストレプトマイシン、Ｓｉｇｍａ、米国）を添加した。培養液は２、３日間隔で交換した。
【００３９】
ニフェジピンによる歯肉線維芽細胞の増殖に対する柴胡の作用は水溶性テトラゾリウム（ＷＳＴ）−１による分析キット（同仁化学、日本）を購入して行った。細胞は９６穴のマイクロプレートを使って培養した。対照群にはニフェジピン（１０μＭ）のみを、試験群には更に柴胡（０．０５、０．１および０．２ｗ/ｖ％）を添加した（Nie, L., Mogami, H., Kanzaki, M., Shibata, H. and Kojima, I.: Blockade of DNA synthesis induced by platelet-derived growth factor by tranilast, an inhibitor of calcium entry, in vascular smooth muscle cells. Mol. Pharmacol. 50: 763-769, 1996.を参照）。なお、図面１乃至３において、Ｎｏｒｍａｌ（通常）は薬物が何も含まれていない状態の細胞である。柴胡はジメチルサルフオキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して濾過（０．２μｍ）し、冷蔵庫内に一晩（１６時間）静置した。ニフェジピンも同様にＤＭＳＯに溶解して使用した。培養を始める時点での細胞数は１×１０４とした。実験期間は１４日とした。分析法の概要は分析日にＷＳＴ−１（１０μｌ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした（Daniels, T., Cambrey, A.D., Occleston, N.L., Garrett, Q., Tarnuzzer, R.W., Schultz, G.S. and Khaw, P.T.: Matrix metalloproteinase inhibition modulates fibroblast-mediated matrix contraction and collagen production in vitro. Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 44: 1104-1109, 2003.を参照）。吸光度はマイクロプレートリーダー（モデル５５０、ＢｉｏＲａｄ、米国）で測定した。試験波長として４５０ｎｍ、基準波長として６５５ｎｍを用い、マニュアルに沿って行った。分析は対照群も試験群も８ウェルで行った。
【００４０】
図１にニフェジピンによる歯肉線維芽細胞の増殖に対する柴胡の作用を示した。図１中、Ｎｏｒｍａｌに対する有意差＃＃＃＃Ｐ＜０．００１、ニフェジピンに対する有意差＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１、Ｎ＝４（全ての時点において）である。図１から分かるように、特に、柴胡（０．２ｗ/ｖ％）は培養開始後５日目以降、有意にニフェジピンによる歯肉線維芽細胞の増殖を抑制した。
【００４１】
さらに、増殖抑制のメカニズムを明らかにするために線維芽細胞からのｂＦＧＦ遊離に対する作用を調べた。
【００４２】
ｂＦＧＦ定量は細胞を３５ｍｍディッシュで５日間培養後に行った。試験群は柴胡（０．０５、０．１および０．２ｗ/ｖ％）で処理した。ディッシュには１．２ｍｌの培養液を入れ、１×１０５の細胞を播いた。各ディッシュの上精中のｂＦＧＦレベルはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国）社製のＥＬＩＳＡキットにより測定した（Carroll, L.A. and Koch, R.J.: Heparin stimulates production of bFGF and TGF-β1 by human normal, keloid, and fetal dermal fibroblasts. Med. Sci. Monit. 9: BR97-108, 2003.を参照）。キットの感度は３ｐｇ／ｍｌであった。分析はマイクロプレートリーダーで行い、試験波長として４５０ｎｍ、基準波長として５７０ｎｍを用いた。
【００４３】
図２に細胞からのｂＦＧＦ遊離に対する作用を示した。図２中、Ｎｏｒｍａｌに対する有意差＃Ｐ＜０．０５、ニフェジピンに対する有意差＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００５、Ｎ＝４（全てのコラムにおいて）である。図２から分かるように、柴胡は０．０５〜０．２ｗ/ｖ％の範囲で濃度依存的に培養液中のｂＦＧＦレベルを低下させ、０．１ｗ/ｖ％以上の濃度で有意であった。
【００４４】
さらにまた、歯肉肥大につながるコラーゲン合成に対する作用を調べた。
【００４５】
タイプＩコラーゲンの定量は細胞を３５ｍｍディッシュで５日間培養後に行った。試験群は柴胡（０．０５，０．１および０．２ｗ/ｖ％）で処理した。ディッシュには１．２ｍｌの培養液を入れ、１×１０５の細胞を播いた。タイプＩコラーゲンの定量はＥＬＩＳＡ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、米国）により、マニュアルに沿って行った（Martelli-Junior, H., Cotrim, P., Graner, E., Sauk, J.J. and Colleta, R.D.: Effect of transforming growth factor-β1, interleukin-6, and interferon-γ on the expression of type I collagen, heat shock protein 47, matrix metalloproteinase (MMP)-1 and MMP-2 by fibroblasts from normal gingival and hereditary gingival fibromatosis. J. Periodontol. 74: 296-306, 2003.を参照）。分析はマイクロプレートリーダーで行い、試験波長として４９０ｎｍで行った。
【００４６】
図３にタイプＩコラーゲン産生に対する柴胡の作用を示した。図３中、Ｎｏｒｍａｌに対する有意差＃Ｐ＜０．０５、ニフェジピンに対する有意差＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００５、Ｎ＝４（全てのコラムにおいて）である。図３から分かるように、０．２ｗ/ｖ％以上の柴胡は有意に抑制した。したがって、柴胡がコラーゲン合成を抑制することが分かった。
【００４７】
上記実施例に使用した柴胡は（株）ツムラ（日本）より提供された。ニフェジピンはＳｉｇｍａ（米国）より入手した。また、その他の薬品はナカライテスク（日本）より購入した。
【００４８】
これら各図のデータは平均値±標準誤差および観測数（Ｎ）を示した。統計解析はスチューデントの単純ｔ検定を用いた。誤差危険率（Ｐ）が０．０５以下の場合、平均値間に有意差があると判定した。
【００４９】
ここで行った実施例は、柴胡を直接的に歯肉肥大患部に摂取する形態であり、例えば、柴胡を含有する歯磨き粉が一例として挙げられるが、通常の生薬の投与形態である顆粒剤などの経口剤とすることもできる。
（実施例２）
実施例２では、正常ヒト歯肉線維芽細胞を用いて、柴胡を含有する医薬組成物を使用する場合の歯肉肥大の抑制作用の確認試験を実施した。
【００５０】
まず、有効成分として柴胡を含有する医薬組成物として柴苓湯を使用して、ニフェジピンによる歯肉線維芽細胞の増殖を抑制することを説明する。なお、柴苓湯における柴胡の含有率は、約４０％である。
【００５１】
上記の柴胡の実施例と同様に、材料として大日本製薬より入手した正常ヒト歯肉線維芽細胞（Ｇｉｎ−１）を用いた。細胞はウシ胎児血清１０％を含むＤＭＥＭ（大日本製薬、日本）で培養し高湿度で３７℃の９５％空気＋５％二酸化炭素中でインキュベートした。培養液には抗生物質（５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ/ｍｌストレプトマイシン、Ｓｉｇｍａ、米国）を添加した。培養液は２、３日間隔で交換した。
【００５２】
ニフェジピンによる歯肉線維芽細胞の増殖に対する柴苓湯の作用は水溶性テトラゾリウム（ＷＳＴ）−１による分析キット（同仁化学、日本）を購入して行った。細胞は９６穴のマイクロプレートを使って培養した。対照群にはニフェジピン（１０μＭ）のみを、試験群には更に柴苓湯（０．２ｗ/ｖ％）を添加した（Nie, L., Mogami, H., Kanzaki, M., Shibata, H. and Kojima, I.: Blockade of DNA synthesis induced by platelet-derived growth factor by tranilast, an inhibitor of calcium entry, in vascular smooth muscle cells. Mol. Pharmacol. 50: 763-769, 1996.を参照）。柴苓湯はジメチルサルフオキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して濾過（０．２μｍ）し、冷蔵庫内に一晩（１６時間）静置した。ニフェジピンも同様にＤＭＳＯに溶解して使用した。培養を始める時点での細胞数は１×１０４とした。実験期間は１４日とした。分析法の概要は分析日にＷＳＴ−１（１０μｌ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした（Daniels, T., Cambrey, A.D., Occleston, N.L., Garrett, Q., Tarnuzzer, R.W., Schultz, G.S. and Khaw, P.T.: Matrix metalloproteinase inhibition modulates fibroblast-mediated matrix contraction and collagen production in vitro. Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 44: 1104-1109, 2003.を参照）。吸光度はマイクロプレートリーダー（モデル５５０、ＢｉｏＲａｄ、米国）で測定した。試験波長として４５０ｎｍ、基準波長として６５５ｎｍを用い、装置のマニュアルにしたがって行った。分析は対照群も試験群も８ウェルで行った。
【００５３】
図４にニフェジピンによる歯肉線維芽細胞の増殖に対する柴苓湯の作用を示した。図４中、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１，Ｎ＝８（全ての時点において）である。図４から分かるように、柴苓湯（０．２％）は培養開始後９日目以降、有意にニフェジピンによる歯肉線維芽細胞の増殖を抑制した。
【００５４】
柴苓湯は前述したように培養糸球体脈管膜細胞や腹膜後線維症における線維芽細胞の増殖を抑制する（非特許文献９および１０を参照）。しかしこれまで柴苓湯は歯肉肥大に対して治療目的では使われなかった。今回、本発明者らは柴苓湯がニフェジピンによる歯肉線維芽細胞の増殖を抑制することを初めて見出した（図４参照）。
【００５５】
さらに、上記同様、線維芽細胞からのｂＦＧＦ遊離に対する柴苓湯の作用を調べた。
【００５６】
ｂＦＧＦ定量は細胞を３５ｍｍディッシュで５日間培養後に行った。試験群は柴苓湯（０．０５、０．１および０．２ｗ/ｖ％）で処理した。ディッシュには１．２ｍｌの培養液を入れ、１×１０５の細胞を播いた。各ディッシュの上精中のｂＦＧＦレベルはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国）社製のＥＬＩＳＡキットにより測定した（Carroll, L.A. and Koch, R.J.: Heparin stimulates production of bFGF and TGF-β1 by human normal, keloid, and fetal dermal fibroblasts. Med. Sci. Monit. 9: BR97-108, 2003.を参照）。キットの感度は３ｐｇ／ｍｌであった。分析はマイクロプレートリーダーで行い、試験波長として４５０ｎｍ、基準波長として５７０ｎｍを用いた。
【００５７】
図５に細胞からのｂＦＧＦ遊離に対する柴苓湯の作用を示した。図５中、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、Ｎ＝８（全てのコラムにおいて）である。図５から分かるように、柴苓湯は０．０５〜０．２ｗ/ｖ％の範囲で濃度依存的に培養液中のｂＦＧＦレベルを低下させ、０．１ｗ/ｖ％以上の濃度で有意であった。
【００５８】
さらにまた、柴胡の場合と同様に、歯肉肥大につながるコラーゲン合成に対する柴苓湯の作用を調べた。
【００５９】
タイプＩコラーゲンの定量は細胞を３５ｍｍディッシュで５日間培養後に行った。試験群は柴苓湯（０．０５，０．１および０．２ｗ/ｖ％）で処理した。ディッシュには１．２ｍｌの培養液を入れ、１×１０５の細胞を播いた。タイプＩコラーゲンの定量はＥＬＩＳＡ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、米国）により、装置のマニュアルにしたがって行った（Martelli-Junior, H., Cotrim, P., Graner, E., Sauk, J.J. and Colleta, R.D.: Effect of transforming growth factor-β1, interleukin-6, and interferon-γ on the expression of type I collagen, heat shock protein 47, matrix metalloproteinase (MMP)-1 and MMP-2 by fibroblasts from normal gingival and hereditary gingival fibromatosis. J. Periodontol. 74: 296-306, 2003.を参照。分析はマイクロプレートリーダーで行い、試験波長として４９０ｎｍで行った。
【００６０】
図６にタイプＩコラーゲン産生に対する柴苓湯の作用を示した。図６中、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、Ｎ＝８（全てのコラムにおいて）である。図６から分かるように、０．１ｗ/ｖ％以上の柴苓湯は有意に抑制した。ｂＦＧＦ遊離に対する作用と比較すると、若干弱かったが、０．２ｗ/ｖ％で対照に対して約８０ｎｇ／ｍｌ低かった。
【００６１】
柴胡同様、柴苓湯は（株）ツムラ（日本）より提供された。ニフェジピンはＳｉｇｍａ（米国）より入手した。その他の薬品はナカライテスク（日本）より購入した。
【００６２】
各図のデータは平均値±標準誤差および観測数（Ｎ）を示した。統計解析はスチューデントの単純ｔ検定を用いた。誤差危険率（Ｐ）が０．０５以下の場合、平均値間に有意差があると判定した。
【００６３】
ここで行った実施例は、柴胡を有効成分として含有する医薬組成物、例えば、柴苓湯を直接的に歯肉肥大患部に摂取する形態であり、例えば、柴苓湯を含有する歯磨き粉が一例として挙げられるが、通常の生薬の投与形態である顆粒剤などの経口剤とすることもできる。
【００６４】
したがって、実施例の結果、柴胡を使用することによって歯肉肥大を抑制することが示された。また、有効成分として柴胡を含有する医薬組成物、例えば、柴苓湯も同様に使用することによって、歯肉肥大症を抑制することが示された。
【００６５】
本発明において、柴胡や柴苓湯は、生薬において一般的である、顆粒剤、細粒剤、散剤のような経口剤の形態とすることもできるが、より好ましくは、本実施例のように歯肉肥大患部に対して局所的に直接作用する形態が有効に活用することができる。例えば、本発明の好ましい形態は、柴胡または柴胡を含有する医薬組成物を含んでなる歯磨き粉とすることができる。
【００６６】
以上本発明の好ましい実施例について詳述したが、本発明はかかる特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の趣旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、これまで有効な手段がなかった歯肉肥大の抑制および治療において、柴胡を使用する新規な歯肉肥大症抑制剤および治療剤を提供することができる。また、歯肉肥大症抑制剤および治療剤として、柴胡を含有する医薬組成物を活用することができる。さらに効果的に歯肉肥大を抑制および治療する手段として、柴胡または柴胡を含有する医薬組成物を含んでなる歯磨き粉とすることができる。これにより、抗てんかん薬の種類を変更することなく、通常の歯磨き時にブラッシングするだけで、歯肉肥大症を抑制および治療できる。したがって、本発明は、柴胡または柴胡を含有する医薬組成物の新規な手法により、産業上の利用価値は極めて高い。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ニフェジピンによる歯肉線維芽細胞の増殖に対する柴胡の作用を示す図である。
【図２】細胞からのｂＦＧＦ遊離に対する柴胡の作用を示す図である。
【図３】タイプＩコラーゲン産生に対する柴苓湯の作用を示す図である。
【図４】ニフェジピンによる歯肉線維芽細胞の増殖に対する柴苓湯の作用を示す図である。
【図５】細胞からのｂＦＧＦ遊離に対する柴苓湯の作用を示す図である。
【図６】タイプＩコラーゲン産生に対する柴苓湯の作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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