(57)【要約】【課題】迅速かつ正確に核酸を検出するための方法およびそのためのキットを提供すること。【解決手段】それぞれ目的の核酸配列に相補的な配列を有する第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含む核酸プローブセットを目的の核酸を含む試料と混合して非酵素的な結合反応を生じさせることを特徴とする核酸の検出方法およびそのためのキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの核酸プローブセットを目的の核酸を含む試料と混合する工程を包含する核酸の検出方法であって、
核酸プローブセットが、それぞれ目的の核酸の配列に相補的な配列を有する第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含み、目的の核酸にハイブリダイズした際に第一の核酸プローブの３’末端が第二の核酸プローブの５’末端に隣接するように第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブの配列が選択され、
第一の核酸プローブが３’末端または３’末端側に求核基を有し、第二の核酸プローブが５’末端または５’末端側に求核基と反応性の基を有し、第一の核酸プローブの３’末端と第二の核酸プローブの５’末端が互いに隣接して配置されると非酵素的な結合反応を生じ、
第一の核酸プローブが第一の標識を有し、第二の核酸プローブが第二の標識を有し、第一の標識および第二の標識が互いに近接して配置されると検出可能な信号を生じる、
方法。
【請求項２】
第一の標識および第二の標識が異なる蛍光体基である、請求項１記載の核酸の検出方法。
【請求項３】
蛍光体基がフルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ローダミンおよびその誘導体、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ類、Ａｌｅｘａ類ならびにＢＨＱ類からなる群より選択される、請求項２記載の核酸の検出方法。
【請求項４】
第一の標識としての蛍光体基と第二の標識としての蛍光体基が互いに近接して配置されると特有の蛍光を発する、請求項２または３記載の核酸の検出方法。
【請求項５】
第一の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第二の標識としての蛍光体基の励起波長である、請求項２〜４のいずれか１項記載の核酸の検出方法。
【請求項６】
第二の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第一の標識としての蛍光体基の励起波長である、請求項２〜４のいずれか１項記載の核酸の検出方法。
【請求項７】
求核基がホスホロチオエートまたはホスホロセレノエートである、請求項１〜６のいずれか１項記載の核酸の検出方法。
【請求項８】
求核基と反応性の基がヨードアセチル基である、請求項１〜７のいずれか１項記載の核酸の検出方法。
【請求項９】
第一の核酸プローブの５’末端及び／又は第二の核酸プローブの３’末端が修飾されている、請求項１〜８のいずれか１項記載の核酸の検出方法。
【請求項１０】
修飾がビオチン、ジゴキシン、ジゴキシゲニンおよびＤＮＰからなる群より選択される物質での修飾である、請求項９記載の核酸の検出方法。
【請求項１１】
第一の核酸プローブが５〜２０塩基長である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の核酸の検出方法。
【請求項１２】
第二の核酸プローブが５〜２０塩基長である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の核酸の検出方法。
【請求項１３】
目的の核酸が核酸増幅方法により増幅された増幅物である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の核酸の検出方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの核酸プローブセットを含む核酸検出用キットであって、
核酸プローブセットが、それぞれ目的の核酸の配列に相補的な配列を有する第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含み、目的の核酸にハイブリダイズした際に第一の核酸プローブの３’末端が第二の核酸プローブの５’末端に隣接するように第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブの配列が選択され、
第一の核酸プローブが３’末端または３’末端側に求核基を有し、第二の核酸プローブが５’末端または５’末端側に求核基と反応性の基を有し、第一の核酸プローブの３’末端と第二の核酸プローブの５’末端が互いに隣接して配置されると非酵素的な結合反応を生じ、
第一の核酸プローブが第一の標識を有し、第二の核酸プローブが第二の標識を有し、第一の標識および第二の標識が互いに近接して配置されると検出可能な信号を生じる、
キット。
【請求項１５】
第一の標識および第二の標識が異なる蛍光体基である、請求項１４記載の核酸検出用キット。
【請求項１６】
蛍光体基がフルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ローダミンおよびその誘導体、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ類、Ａｌｅｘａ類ならびにＢＨＱ類からなる群より選択される、請求項１５記載の核酸検出用キット。
【請求項１７】
第一の標識としての蛍光体基と第二の標識としての蛍光体基が互いに近接して配置されると特有の蛍光を発する、請求項１５または１６記載の核酸検出用キット。
【請求項１８】
第一の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第二の標識としての蛍光体基の励起波長である、請求項１５〜１７のいずれか１項記載の核酸検出用キット。
【請求項１９】
第二の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第一の標識としての蛍光体基の励起波長である、請求項１５〜１７のいずれか１項記載の核酸検出用キット。
【請求項２０】
求核基がホスホロチオエートまたはホスホロセレノエートである、請求項１４〜１９のいずれか１項記載の核酸検出用キット。
【請求項２１】
求核基と反応性の基がヨードアセチル基である、請求項１４〜２０のいずれか１項記載の核酸検出用キット。
【請求項２２】
第一の核酸プローブの５’末端及び／又は第二の核酸プローブの３’末端が修飾されている、請求項１４〜２１のいずれか１項記載の核酸検出用キット。
【請求項２３】
修飾がビオチン、ジゴキシン、ジゴキシゲニンおよびＤＮＰからなる群より選択される物質での修飾である、請求項２２記載の核酸検出用キット。
【請求項２４】
第一の核酸プローブが５〜２０塩基長である、請求項１４〜２３のいずれか１項記載の核酸検出用キット。
【請求項２５】
第二の核酸プローブが５〜２０塩基長である、請求項１４〜２４のいずれか１項記載の核酸検出用キット。
【請求項２６】
目的の核酸が核酸増幅方法により増幅された増幅物である、請求項１４〜２５のいずれか１項記載の核酸検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸の検出方法およびそのためのキットに関するものである。より詳細には高効率化学ライゲーション反応と蛍光エネルギー転移現象を利用して特定の核酸を検出する方法およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム解析により多数の遺伝子が疾病に関与していることが明らかになってきている。また、細菌、ウイルスなどに感染した場合、その診断には遺伝子検出が有効である。これらの状況より遺伝子配列を迅速かつ正確に検出する方法が望まれている。従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。
【０００３】
また別の方法として、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（特許文献１および特許文献２参照）などの遺伝子増幅法を利用し、増幅された遺伝子断片に対し、特定の核酸配列を切断する制限酵素により処理し、生じるフラグメントの大きさで判断する方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）法が用いられている。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法では、ＰＣＲ後制限酵素処理を行なった上、電気泳動を行なう必要がある。ＰＣＲ後、制限酵素処理及び電気泳動により検出する方法は時間がかかり、操作は煩雑であった。
【０００４】
同じくＰＣＲ法を用いた検出方法として、使用するプライマーの特異性を利用したＡｌｅｌｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（非特許文献１）ではＰＣＲ後の操作は簡略化できる。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドのうちの一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオチドとを用いる。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドを同時にあるいはそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。
【０００５】
試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同定することができる。この時増幅がおきたか否かを調べる方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、ＵＶ照射して増幅核酸の有無を検出できる。
【０００６】
またほかの様式として、ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロット法、個体担体上に固定した補足プローブで捕捉した後検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブリダイゼーション法などが開発されてきた。
【０００７】
しかし、この方法を用いると野生型検出および変異型検出を行なうため、別個に増幅した場合、変異の数に合わせて増幅コストも増大する。複数の増幅を一つの反応系で増幅し、ＤＮＡチップで検出する方法もあるが、ＤＮＡチップはいまだコストがかかり、医療の最前線では使用が難しい状況にある。
【０００８】
さらに電気泳動で検出する場合、野生型検出および変異型検出を別個に実施する必要があり、またサザンブロット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーションさせる条件の設定に労力を要し、検討するための時間を必要とする。大規模なラボオートメーションシステムを構築すれば労力は少なくて済むが多大なコストがかかってしまう。
【０００９】
酵素を用いる別の方法としてリガーゼ（Ｌｉｇａｓｅ）を使用する方法が挙げられる。リガーゼには、一般的な遺伝子操作で使用されるＴ４ＤＮＡリガーゼや、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法に使用される耐熱性ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ）がある（特許文献３および特許文献４）。ＬＣＲ法は、検出しようとするＤＮＡ鎖にそれぞれ相補的で間にニックを生じる２つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、耐熱性リガーゼでニックを埋めて２つのオリゴヌクレオチドを酵素的反応により結合させ、結合したオリゴヌクレオチドを加熱により遊離させる反応を反復する核酸増幅方法である。しかしながら、連結した後のオリゴヌクレオチドを検出する方法は、連結したオリゴヌクレオチドだけを特殊な装置で捕捉して、余分なオリゴヌクレオチドを洗浄によるＢ／Ｆ（ｂｏｕｎｄ／ｆｒｅｅ）分離操作で除去しなければ、遺伝子を検出することができなかった。
【００１０】
また、蛍光強度の変化を用いる核酸検出法が報告されている。その１つの方法としては、２種類の蛍光体で標識されたプローブとＤＮＡポリメラーゼの有する５’ヌクレアーゼ活性を利用するＴａｑｍａｎアッセイ法である。２種類の蛍光体が結合した状態のプローブは蛍光体基がお互いの蛍光を消光させ、蛍光を発しない、しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ作用により、プローブが分解されると蛍光体基が離れるため、蛍光が検出される。このことによって試料中の標的遺伝子配列の存在を検出することが可能となる（非特許文献４）。しかしこの方法においては、プローブ自身の分解などにより、自発的に蛍光を発するという問題点があった。
【００１１】
また別の方法としてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法が挙げられる。この方法は、蛍光体および消光体を伴うヘアピン構成ＤＮＡプローブを用いる。本プローブが標的配列にハイブリダイズすると消光体と蛍光体間に距離が生じるため蛍光を発するようになる（非特許文献５）。
【００１２】
上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に多型を同定が行えるように思われるが、実際には、操作は煩雑なことが問題であり、多大な時間を要する。迅速かつ大量の試料を解析するためには、多大な労力を要するか大規模なラボオートメーションシステムを構築する必要があった。
【００１３】
そこで上述の酵素を使用したＬＣＲ法のような方法に代わる非酵素的な方法として核酸を化学的に結合する反応、すなわち化学ライゲーション方法を利用することが考えられた。化学ライゲーション方法は、ヌクレオシドＳ−アルキルホスホロチオエートの調製が１９６９年に提供されることによって実施可能となった（非特許文献６）。ホスホロチオエート基は酸素アナログよりも高い求核性を有する。さらに種々のハロゲン化合物との反応が報告された。チミジン３’−ホスホロチオエートの分子間求核反応が１９７１年に示唆された（非特許文献７）。Ｐ−Ｓ−Ｃ  ５’結合を含むジヌクレオチドおよびトリヌクレオチドが得られたが、それらは核酸の検出に使用されるものでなかった。
【００１４】
特許文献５〜８には、特別なヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドの製造および使用が示唆されている。該オリゴヌクレオチドは慣用的なオリゴヌクレオチドと比較して改善されたハイブリダイゼーション特性を有すると記載されている。
【００１５】
５’−Ｏ−トシル基の３’−ホスホロチオエートによる置換を介するオリゴヌクレオチドのカップリングがＨｅｒｒｌｅｉｎら（非特許文献８）により示唆された。該アプローチは３つの異なる系：ニックトダンベルオリゴヌクレオチド（ｎｉｃｋｅｄ  ｄｕｍｂｂｅｌｌ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、接合部位において短いオリゴヌクレオチドオーバーラップを有する抱合体の環化、ならびに２本鎖末端におけるキャップの閉塞により説明された。Ｈｅｒｒｌｅｉｎらは、ヨーダイドまたは消光脱離基のごとき他の脱離基を企図しておらず、彼らは核酸配列を検出するためにカップリングを使用しなかった。
【００１６】
ホスホロチオエート基によるα−ハロアシル基の置換が、２つのオリゴヌクレオチドを結合させる非酵素的方法として特許文献９により示唆されている。標的ポリヌクレオチド上の隣接位置において結合させることにより２つのオリゴヌクレオチドが近接した位置に置かれる。この特許文献では反応には２時間を要し、ＨＰＬＣで検出していることが記載されている。
【００１７】
５’−ヨードヌクレオチドが１本鎖および２本鎖ＤＮＡｓの効率的な非酵素的ライゲーションを可能にすることが報告されている（非特許文献９）。ヨードチミジンホスホルアミダイトにより５’−ヨーダイドをオリゴヌクレオチド中に配置することが可能となった。
【００１８】
迅速かつ正確な核酸の検出のための単純な方法に対する必要性がやはり存在する。さらに、未結合プローブの洗い流しに依存しない方法が望ましく、特に、生きた細胞に使用でき、配列中１個のヌクレオチドの違いに対して特異的である方法がより望ましい。
【００１９】
最近、Ｓａｎｄｏ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌは、溶液中および固体支持体上の脱離基としての消光剤の使用についての記載をインターネット上で公表した（非特許文献１０）。しかしながら、この方法を用いた場合、化学ライゲーション反応には２時間以上要することが示されている（非特許文献１１）。さらに、化学ライゲーション反応が起こると脱離基としての消光剤が除去され、その結果蛍光共鳴エネルギー転移現象（ＦＲＥＴ）が生じる方法も開示されているが、この場合も同様に反応に長時間を要するという問題点を有していた（非特許文献１２）。また、化学ライゲーション方法を用いた場合、電気泳動や放射性物質による検出を使用するため操作が煩雑になることは避けられなかった。
【特許文献１】特公平４−６７９６０号公報
【特許文献２】特公平４−６７９５７号公報
【特許文献３】米国特許第５７９２６０７号明細書
【特許文献４】米国特許第５４９４８１０号明細書
【特許文献５】米国特許第５４７６９２５号明細書
【特許文献６】米国特許第５６４６２６０号明細書
【特許文献７】米国特許第５６４８４８０号明細書
【特許文献８】米国特許第５９３２７１８号明細書
【特許文献９】米国特許第５４７６９３０号明細書
【非特許文献１】Cynthia D.K.Bottema and Steves S.Sommer、Mutation Research、第２８８巻、第９３−１０２頁、（１９９３））
【非特許文献２】Gram and Brsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 1990,第87-96頁
【非特許文献３】Balantら、 Eur. J. Clin. Pharmacol. 第３６巻、第551-554頁、(1989)
【非特許文献４】Livak, K. J.et.al. PCR Methods Appl. 4:357-362.(1995)
【非特許文献５】Piatek A.S.et.al. Nature Biotechnol. 16:359-63.(1998)
【非特許文献６】A. F. Cook, J. Am. Chem. Soc. 92(1): 190-195, 1969
【非特許文献７】S. Chladek and J. Nagyvary, J. Am. Chem. Soc. 94(6): 2079-2085, 1971
【非特許文献８】Herrlein et al., J. Am. Chem. Soc. 117: 10151-10152, 1995
【非特許文献９】Y. Xu and E. T. Kool, Tetrahedron Lett. 38(32): 5595-5598, 1997
【非特許文献１０】S. Sando and E.T. Kool, J. Am. Chem. Soc. 124(10): 2096-2097, 2002
【非特許文献１１】H. Abe and E.T.Kool, J. Am. Chem. Soc. 126, 13980-13986 (2004)
【非特許文献１２】H. Abe abd E.T. Kool, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 263-268 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、迅速かつ正確に核酸を検出するための方法およびそのためのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは鋭意検討を行った結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２２】
すなわち本発明は、以下に関する：
［１］少なくとも１つの核酸プローブセットを目的の核酸を含む試料と混合する工程を包含する核酸の検出方法であって、
核酸プローブセットが、それぞれ目的の核酸の配列に相補的な配列を有する第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含み、目的の核酸にハイブリダイズした際に第一の核酸プローブの３’末端が第二の核酸プローブの５’末端に隣接するように第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブの配列が選択され、
第一の核酸プローブが３’末端または３’末端側に求核基を有し、第二の核酸プローブが５’末端または５’末端側に求核基と反応性の基を有し、第一の核酸プローブの３’末端と第二の核酸プローブの５’末端が互いに隣接して配置されると非酵素的な結合反応を生じ、
第一の核酸プローブが第一の標識を有し、第二の核酸プローブが第二の標識を有し、第一の標識および第二の標識が互いに近接して配置されると検出可能な信号を生じる、
方法；
［２］第一の標識および第二の標識が異なる蛍光体基である、［１］の核酸の検出方法；
［３］蛍光体基がフルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ローダミンおよびその誘導体、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ類、Ａｌｅｘａ類ならびにＢＨＱ類からなる群より選択される、［２］の核酸の検出方法；
［４］第一の標識としての蛍光体基と第二の標識としての蛍光体基が互いに近接して配置されると特有の蛍光を発する、［２］また［３］の核酸の検出方法；
［５］第一の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第二の標識としての蛍光体基の励起波長である、［２］〜［４］のいずれかの核酸の検出方法；
［６］第二の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第一の標識としての蛍光体基の励起波長である、［２］〜［４］のいずれかの核酸の検出方法；
［７］求核基がホスホロチオエートまたはホスホロセレノエートである、［１］〜［６］のいずれかの核酸の検出方法；
［８］求核基と反応性の基がヨードアセチル基である、［１］〜［７］のいずれかの核酸の検出方法；
［９］第一の核酸プローブの５’末端及び／又は第二の核酸プローブの３’末端が修飾されている、［１］〜［８］のいずれかの核酸の検出方法；
［１０］修飾がビオチン、ジゴキシン、ジゴキシゲニンおよびＤＮＰからなる群より選択される物質での修飾である、［９］の核酸の検出方法；
［１１］第一の核酸プローブが５〜２０塩基長である、［１］〜［１０］のいずれかの核酸の検出方法；
［１２］第二の核酸プローブが５〜２０塩基長である、［１］〜［１１］のいずれかの核酸の検出方法；
［１３］目的の核酸が核酸増幅方法により増幅された増幅物である、［１］〜［１２］のいずれかの核酸の検出方法；
［１４］少なくとも１つの核酸プローブセットを含む核酸検出用キットであって、
核酸プローブセットが、それぞれ目的の核酸の配列に相補的な配列を有する第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含み、目的の核酸にハイブリダイズした際に第一の核酸プローブの３’末端が第二の核酸プローブの５’末端に隣接するように第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブの配列が選択され、
第一の核酸プローブが３’末端または３’末端側に求核基を有し、第二の核酸プローブが５’末端または５’末端側に求核基と反応性の基を有し、第一の核酸プローブの３’末端と第二の核酸プローブの５’末端が互いに隣接して配置されると非酵素的な結合反応を生じ、
第一の核酸プローブが第一の標識を有し、第二の核酸プローブが第二の標識を有し、第一の標識および第二の標識が互いに近接して配置されると検出可能な信号を生じる、
キット；
［１５］第一の標識および第二の標識が異なる蛍光体基である、［１４］の核酸検出用キット；
［１６］蛍光体基がフルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ローダミンおよびその誘導体、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ類、Ａｌｅｘａ類ならびにＢＨＱ類からなる群より選択される、［１５］の核酸検出用キット；
［１７］第一の標識としての蛍光体基と第二の標識としての蛍光体基が互いに近接して配置されると特有の蛍光を発する、［１５］または［１６］の核酸検出用キット；
［１８］第一の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第二の標識としての蛍光体基の励起波長である、［１５］〜［１７］のいずれかの核酸検出用キット；
［１９］第二の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第一の標識としての蛍光体基の励起波長である、［１５］〜［１７］のいずれかの核酸検出用キット；
［２０］求核基がホスホロチオエートまたはホスホロセレノエートである、［１４］〜［１９］のいずれかの核酸検出用キット；
［２１］求核基と反応性の基がヨードアセチル基である、［１４］〜［２０］のいずれかの核酸検出用キット；
［２２］第一の核酸プローブの５’末端及び／又は第二の核酸プローブの３’末端が修飾されている、［１４］〜［２１］のいずれかの核酸検出用キット；
［２３］修飾がビオチン、ジゴキシン、ジゴキシゲニンおよびＤＮＰからなる群より選択される物質での修飾である、［２２］の核酸検出用キット；
［２４］第一の核酸プローブが５〜２０塩基長である、［１４］〜［２３］のいずれかの核酸検出用キット；
［２５］第二の核酸プローブが５〜２０塩基長である、［１４］〜［２４］のいずれかの核酸検出用キット；
［２６］目的の核酸が核酸増幅方法により増幅された増幅物である、［１４］〜［２５］のいずれかの核酸検出用キット。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によると、化学ライゲーション反応はこれまで消光脱離基を使用する従来法などに要した分単位より短い秒単位の時間で実施することが可能となり、検出までに必要な時間が従来の数十分の１程度という極めて高速な検出を実施することが可能となった。また検出に蛍光エネルギー転移現象を用いることによって、２本のプローブが隣り合い結合した時にのみ蛍光を検出することで、例えば上述のＴａｑｍａｎ法のように反応中あるいは保存中に、化学的、生物的、物理的にプローブが破壊された場合でもバックグラウンドの上昇を伴うことがない。さらに、反応によって生じる第三の核酸プローブ（第一の核酸プローブと第二の核酸プローブとの結合によって生じる核酸プローブ）は蛍光体基の距離を一定に保っているため蛍光シグナルが安定して供給されうる。そのためシグナルを蓄積することが可能であり、少量の目的核酸配列を検出することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下本発明を詳述する。
【００２５】
本発明において目的の核酸とは、定量若しくは半定量的検出、または単なる検出を目的とする核酸のことを云う。目的の核酸を含む試料の精製の有無を問わないが、化学ライゲーション反応に阻害的な作用を有する物質を含まないことが好ましい。また、検出可能な範囲であれば濃度の大小も問わない。目的の核酸の反応液中の濃度は、例えば１ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは１ｎＭ〜１０μＭ、より好ましくは５ｎＭ〜１μＭである。各種の核酸が混在していてもよい。例えば、複合系（複数微生物のＲＮＡ若しくはＤＮＡの混在系）又は共生系（複数の動植物及び／又は複数の微生物のＲＮＡ若しくはＤＮＡの混在系）における定量若しくは半定量的検出、または単なる検出を目的とする特定核酸である。尚、標的核酸の精製が必要な場合は従来公知の方法で行うことができる。例えば、市販されている精製キット等を使用して行うことができる。上記の核酸の具体例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、デオキシリボオリゴヌクレオチド（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、リボキシオリゴヌクレオチド（ｒｉｂｏｘｙ−ｏｒｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）等を挙げることができる。例えばＤＮＡの場合、二本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡでもよく、それぞれの混合物でもよい。また、第一の核酸プローブと第二の核酸プローブの目的核酸配列は同一のものである。
【００２６】
本発明の核酸プローブセットは、それぞれ目的の核酸の配列に相補的な配列を有する第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含み、目的の核酸にハイブリダイズした際に第一の核酸プローブの３’末端が第二の核酸プローブの５’末端に隣接するように第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブの配列が選択される。ここで、第一の核酸プローブは３’末端または３’末端側に求核基を有し、第二の核酸プローブは５’末端または５’末端側に求核基と反応性の基を有し、第一の核酸プローブの３’末端と第二の核酸プローブの５’末端が互いに隣接して配置されると非酵素的な結合反応を生じる。そして、第一の核酸プローブは第一の標識を有し、第二の核酸プローブは第二の標識を有し、第一の標識および第二の標識が互いに近接して配置されると検出可能な信号を生じる。
【００２７】
本発明における核酸プローブのオリゴヌクレオチドは、通常の一般的オリゴヌクレオチドの製造方法で製造できる。例えば、化学合成法、プラスミドベクター、ファージベクター等を使用する微生物法等で製造できる（Tetrahedron letters、 22巻、 1859〜1862頁、 1981年; Nucleic acids Research、 14巻、6227〜6245頁、1986年）。尚、現在、市販されている核酸合成機を使用するのが好適である（例えば、ＡＢＩ３９４（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製、ＵＳＡ）、ＤＮＡ合成機（ジーンワールド社製））。
【００２８】
第一の核酸プローブの求核基は、ホスホロチオエートまたはホスホロセレノエート、メトキシ（−ＯＣＨ３）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、およびチオメチル（−ＳＣＨ３）基を有することが好ましく、好適にはホスホロチオエート基が用いられる。これらの求核基は核酸プローブのいずれの塩基に結合させても良い。好ましくは末端または末端付近の塩基がよく、より好ましくは３’末端または３’末端側がよい。ここで３’末端側の塩基とは、３’末端の近くの塩基をいい、例えば、３’末端から４塩基、３塩基または２塩基以内の位置の塩基をいう。
【００２９】
第二の核酸プローブ内にある求核基と反応性の基としては、特に限定しないがハロゲン化アルキル基が好ましく、ヨードアセチル基がより好ましい。ハロゲン化アルキル基修飾の位置については核酸プローブの末端または末端付近の塩基が好ましく、５’末端または５’末端側がより好ましい。ここで５’末端側の塩基とは、５’末端の近くの塩基をいい、例えば、５’末端から４塩基、３塩基または２塩基以内の位置の塩基をいう。
【００３０】
非酵素的な結合反応とはＬＣＲのように酵素を用いて核酸プローブ同士を結合させるのではなく、特に限定はしないが一例として２つの核酸プローブが隣接した時に自動的にライゲーションが起こる反応が挙げられる。非酵素的な結合反応は溶液中で相補的核酸の存在下にて行うことができる。これにより２つの核酸プローブが相補的核酸とハイブリダイゼーションし、それぞれの核酸プローブの反応性末端が近くに置かれ、結合が起こる。
【００３１】
非酵素的な結合反応時の反応温度に関しては、核酸プローブの長さと塩基配列や、反応の種類によって規定される。詳細は実施例で述べるが、一般的には常温で反応させるのが好ましい。
【００３２】
本発明において核酸プローブを修飾する物質として、５’末端または３’末端を例えばビオチン、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ等でさらに修飾してもよく何ら制限されない。この中で好ましくはビオチン、ジゴキシゲニンが使用される。このような修飾物質は例えば、第一の核酸プローブと第二の核酸プローブとの結合によって生じる第三のプローブの捕捉に利用することができる。さらに例を挙げるとビオチンはストレプトアビジンまたは抗ビオチン抗体と、ジゴキシゲニンは抗ジゴキシゲニン抗体と反応し所定の場所に捕捉することが可能となる。捕捉方法に関しては一般に利用されている方法に準じる。ただし、本発明の方法はＬＣＲ法のように結合した核酸プローブを捕捉し、洗浄する必要がないという利点を有するので、このような修飾は必ずしも必要でない。
【００３３】
本発明によれば、互いに近接して配置されると検出可能な信号を生じる第一の標識および第二の標識が使用される。上記性質を有していれば任意の標識を使用することができる。本発明を限定するものではないが、例えば、核酸プローブの標識として蛍光体を使用することができる。本発明における蛍光体基は一般に核酸プローブに標識して、核酸の測定・検出に用いられるものが使用できるが、蛍光体基で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、プローブに標識した当該蛍光体基が検出に有利に働くものが好適に用いられる。例えば、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）又はその誘導体類｛例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（ＦＩＴＣ）若しくはその誘導体等｝、Ａｌｅｘａ類、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）６Ｇ（Ｒ６Ｇ）又はその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（ｔｅｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）（ＴＭＲ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、ボデピー（ＢＯＤＩＰＹ）類（商標名；モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社製、米国）、ＲＯＸ、Ｈｅｘ、ＪＯＥ、ＢＨＱ類からなる群より選ぶことができる。好適なものとしてフルオロセイン、ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッドが挙げられる。特に異なる蛍光体基を選択する場合、それぞれの蛍光を消光しない組み合わせが良く、さらに好ましくは蛍光エネルギー転移が起こる組み合わせが良い。蛍光体の組み合わせの選択方法は当該分野において公知である（例えば、C. Berney and G. Danuser, Biophysical Journal, 84, 3992-4010 (2003)参照）。
【００３４】
オリゴヌクレオチドに蛍光体基を結合するには、従来公知の標識法のうちの所望のものを利用することができる（Nature Biotechnology、 14巻、 303〜308頁、 1996年; Applied and Environmental Microbiology、 63巻、 1143〜 1147頁、 1997年; Nucleic Acids Research、 24巻、 4532〜4535頁、 1996年）。例えば、５´末端に蛍光体基を結合させる場合は、先ず常法に従って５´末端のリン酸基にスペーサーとして、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨを導入する。これらの導入体は市販されている製品を用いてもよい（グレンリサーチ社）。この場合、ｎは３〜８、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基反応性を有する蛍光色素又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。このようにして合成された蛍光体基で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明で使用する核酸プローブとすることができる。
【００３５】
また、オリゴヌクレオチドの３’末端に蛍光体基を結合させることもできる。この場合は、リボース又はデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基にスペーサーとして、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２を導入する。これらの導入体も前記と同様にして市販されている製品を用いてもよい（グレンリサーチ社）。また、リン酸基を導入して、リン酸基のＯＨ基にスペーサーとして、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨを導入する。これらの場合、ｎは３〜８、好ましくは４〜７である。このスペーサーにアミノ基、ＳＨ基に反応性を有する蛍光体基又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。このようにして合成された蛍光体基で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明で使用する核酸プローブとすることができる。
【００３６】
また、核酸プローブの鎖内に蛍光色素分子を導入することも可能である（Analytical Biochemistry 225, 32-38頁（1998年））。この場合、市販の蛍光体基が既に結合した状態のチミンアミダイト（グレンリサーチ社）を使用すると便利である。
【００３７】
以上のようにして本発明の核酸プローブが調製できるが、蛍光体基の核酸プローブ中の位置は末端でもよくまた、配列中の塩基に結合していても良い。蛍光体基を末端標識した場合、核酸プローブの塩基配列によってはＧ消光現象（シトシン残基に付した標識がグアニン残基とのアニーリングに際して消光する現象）が起こり、蛍光が減少することがある。そのため、好ましいプローブの形態は、核酸プローブの鎖内に蛍光体基を導入したものである。核酸プローブへの蛍光体基の好ましい導入位置に関しては、後述の蛍光体基間の距離を考慮して決めることができる。すなわち、非酵素的結合を引き起こす組み合わせの第一及び第二の核酸プローブの両方で調節し得る。
【００３８】
本発明における蛍光体基間の距離は蛍光共鳴エネルギー転移現象（ＦＲＥＴ）（例えばMergney et al.,Nucleic Acid Res., 22: 920-928,1994参照）を考慮して決定されうる。また、末端同士の標識では距離が離れすぎていることがあり、蛍光共鳴エネルギー転移現象が起こらないことがある。蛍光体基の種類によって蛍光共鳴エネルギー転移現象の距離は異なるため、蛍光体基間の距離を特に限定するわけではないが、１〜３０塩基が好ましく、１〜１７塩基がより好ましい。さらに４〜７塩基が好適であり、５または６塩基がさらに好適である。
【００３９】
第一の標識としての蛍光体基と第二の標識としての蛍光体基が互いに近接して配置された第三の核酸プローブから発せられる特有の蛍光とは、非酵素的結合反応により生じ、非酵素的結合反応と相関するものであれば限定されない。好ましくは蛍光共鳴エネルギー転移現象により生じた蛍光が挙げられる。
【００４０】
第三の核酸プローブ生成によって蛍光シグナルの蓄積が可能となる。第三の核酸プローブは第一及び第二の核酸プローブが結合して生成したプローブであり、ハイブリダイゼーションが第一または第二の核酸プローブ単体より安定して行われる。さらに、蛍光体基の距離を一定に保っているため蛍光シグナルが安定して供給されうる。そのため第三の核酸プローブが目的の核酸配列から解離しても蛍光シグナルは保持しうる。例えば、サーマルサイクラーなどを使用して反応温度の上下を繰り返すサイクル反応によって、蛍光シグナルを蓄積、増強することができる。
【００４１】
各核酸プローブの長さ及び塩基配列は、目的の核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションすることが可能であればよく、特に限定されない。重要となるのは目的の核酸へのハイブリダイゼーション能力であり、プローブ塩基の長さ及び配列によって決定される。ハイブリダイゼーション能力が高すぎる場合、例えば核酸プローブが５０ｍｅｒ以上の場合は結合反応の有無に関わらず目的核酸配列にハイブリダイゼーションし、バックグラウンドの上昇の原因となる。またハイブリダイゼーション能力が低すぎる場合、例えば核酸プローブが５ｍｅｒ未満の場合は第一の核酸プローブと第二の核酸プローブが隣接できず、非酵素的な結合反応が起きないため核酸の検出ができなくなる。さらに、結合反応の結果生じた第三の核酸プローブが安定にハイブリダイゼーションすることが好ましい。
【００４２】
各核酸プローブの長さは測定対象となる核酸配列によって適宜選択されるが、好適には５ｍｅｒから５０ｍｅｒ、特に好ましくは５ｍｅｒから２５ｍｅｒ、さらに好ましくは５ｍｅｒから２０ｍｅｒが用いられる。
【００４３】
本発明における核酸配列に特異的とは、単に核酸の存在の有無だけでなく、目的の核酸配列に遺伝子の多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及び／又は変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）が存在した時でも特異的に検出可能であるという意味も含まれている。すなわち一つの例として目的の核酸配列と目的の核酸配列と一塩基異なる配列を判別し、検出できる。具体的方法は、実施例に記した。なお、本発明に従って多型または変異を含む核酸を識別する際には、例えば、変異を有しない別の領域にハイブリダイズするさらなる核酸プローブセットを用いて得られる検出シグナルによって測定データを補正することにより、より精度の高い検出が可能となる。
【００４４】
目的の核酸配列は一般的に考えうる核酸増幅方法、例えばＰＣＲ法、ＬＣＲ法、ＬＡＭＰ法などのうちの一つの方法により増幅された増幅物でもよく、抽出されたものでもよい。それらの核酸は一般的な方法で濃縮した核酸や精製後の核酸でもよい。
【００４５】
一般的には、生じた蛍光の増加をいずれの方法により検出してもよい。例えば、蛍光顕微鏡、蛍光分光光度計、または蛍光マイクロプレートリーダーを用いて蛍光を視覚的に検出することができる。さらに、フローサイトメトリー的方法やリアルタイムＰＣＲ装置を用いて蛍光をモニターすることができる。好ましくはリアルタイムＰＣＲ装置での検出であり、この方法を使用するとリアルタイムに蛍光強度をモニタリングすることが可能となる。
【実施例】
【００４６】
以下に実施例を示して本発明を具体的に述べるが、本発明は実施例に限定されるものではない。本実施例に使用した核酸配列を表１に示す。
【００４７】
【表１】
2008259453.tif 000002
【００４８】
（実施例１）
ホスホロチオエートプローブの合成
表１に示される核酸配列の核酸合成は一般的なホスホロアミダイト法を使用して、０．２μＭスケールのカラムにより核酸合成機Ｈ−８−ＳＥ（ジーンワールド社製）を用いて行った。表１の核酸配列のうちＡ−１、Ｂ−１、Ｃ−１、Ｄ−１の３’末端のホスホロチオエート化は３’−ｐｈｏｓｈａｔｅ  ＣＰＧ  ５ｍｇをカラムに装填し、アミダイトモノマーをカップリングした後、アセトニトリスに溶解したＳｕｌｆｕｒｉｚｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（グレンリサーチ社製）を用いて行った。脱保護条件をＵｌｔｒａ  Ｍｉｌｄで行うことから専用のアミダイト（グレンリサーチ社製）を使用し核酸合成を行った。合成条件はグレンリサーチ社製品仕様書記載の方法を参考にした。５’末端へのＣｙ５の導入にはＣｙ５−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（グレンリサーチ社製）を用いて核酸合成機にて核酸に組み込んだ。脱保護反応は０．０５Ｍ炭酸カリウム（メタノール中）で行い、ＣＰＧから核酸の切り出しを行った。その後、ＨＰＬＣ精製を行った。ＨＰＬＣはＪＡＳＣＯ社製ＭＤ−２０１０・ＰＵ−２０８０・Ｃ１８逆相カラムを使用し、グラジェント条件０−８０％アセトニトリル／５０ｍＭ  Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅで行った。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙにより目的の核酸が合成できているかを確認した。
【００４９】
（実施例２）
ヨードアセチルプローブの合成
核酸合成は実施例１のとおり行った。脱保護反応は一般的な方法を使用するため通常のアミダイト（グレンリサーチ社製）を使用した。表１の核酸配列のうちＡ−２、Ｂ−２、Ｃ−２、Ｄ−２の鎖内へのＦＩＴＣの導入にはＦＩＴＣ−ｄＴ（グレンリサーチ社製）を用いて核酸合成機にて核酸に組み込んだ。５’末端は５’ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ（グレンリサーチ社製）を用いてアミノリンカーを付加した。脱保護反応はアンモニア水を用いて行った。ＭＭＴ脱離には８０％酢酸を使用した。得られた核酸を２００μＭ、８ｍＭのヨードスクシイミドと７５ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｔｅｔｒａｂｏｒａｔｅ緩衝液中で室温、１．５時間反応させた。その後実施例１記載のＨＰＬＣ精製（グラジェント条件０−５０％アセトニトリル／５０ｍＭ  Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）・ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ分析によりヨードアセチルプローブを得た。
【００５０】
（実施例３）
化学ライゲーション反応確認
化学ライゲーションの基本的な反応は、表２の組成で示す反応液を用いた。以下の実施例で具体的な記載がなければ表２の反応液組成を使用した。ヨードアセチルプローブについては、同様の塩基配列の核酸プローブでヨードアセチル化していないものをコントロールとして使用した。テンプレートＤＮＡには各核酸プローブ配列と相補的な配列を含む合成オリゴＤＮＡ４０ｍｅｒ（核酸プローブセットＡ（ホスホロチオエートプローブＡ−１（配列番号１）およびヨードアセチルプローブＡ−２（配列番号５））の場合は配列番号１２；核酸プローブセットＢ（ホスホロチオエートプローブＢ−１（配列番号２）およびヨードアセチルプローブＢ−２（配列番号６））の場合は配列番号１３）を使用した。それぞれの試薬を混合し、室温５分の反応を行った。その結果を図１に示す。図１において、「−Ｓ，Ｉ−」はヨードアセチルプローブを使用した場合の結果を、「−Ｓ，ｎｏｎ」はヨードアセチル化していないコントロールのプローブの場合の結果を示す。また「Ｈ２Ｏ」はテンプレートの代わりに水を用いたコントロールの場合を、「ｔｅｍｐｌａｔｅ」はテンプレートを用いた場合を示す。さらに、核酸プローブセットＡを使用した場合の結果を「Ａ」で示し、核酸プローブセットＢを使用した場合の結果を「Ｂ」で示す。検出は蛍光共鳴エネルギー転移現象による蛍光シグナル（以下蛍光シグナル）の測定で行い、その測定にはＨＩＴＡＣＨＩ社製蛍光分光光度計Ｆ−７０００を使用した。測定条件は波長スペクトル測定モードで励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長６６５ｎｍ、その他の条件は初期設定のまま使用した。以下実施例の測定は特に記載がない限りこの条件を用いる。
【００５１】
【表２】
2008259453.tif 000003
【００５２】
核酸プローブ１０ｍｅｒ配列の組み合わせ（Ａ、Ｂの核酸プローブセット）のとき、ネガティブコントロールとして用いた水では蛍光シグナルは見られず、ヨードアセチルプローブの存在下で強い蛍光シグナルが見られた。ヨードアセチル基の存在しない核酸プローブの場合はヨードアセチル基結合核酸プローブに対して弱い蛍光シグナルを示すか、または蛍光シグナルを示さなかった。この両者の差は化学ライゲーション反応が起こったことによる蛍光シグナルと核酸プローブがハイブリダイゼーションしたことにより生じた蛍光シグナルの差だと考えられる。核酸プローブセットＡのほうが、ハイブリダイゼーションによる蛍光シグナルが抑えられているため、核酸プローブセットＢよりも得られた蛍光シグナルが化学ライゲーション反応特有のシグナルであることを示している。
【００５３】
なお、反応液５μＬを２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２０％ＰＡＧＥ）し、エチジウムブロマイドで染色後、核酸検出を示すバンドを確認した。結果を図２に示す。図２において、パネルＡは核酸プローブセットＡについての結果を、パネルＢは核酸プローブセットＢについての結果を示す。また、レーンＭはマーカーを、レーン１はテンプレートを含まない場合を、レーン２はヨードアセチルプローブを使用した場合を、レーン３はヨードアセチル化していないプローブを使用した場合を示す。化学ライゲーション反応は化学ライゲーション反応で結合したプローブのハイブリダイゼーション産物と、テンプレートオリゴＤＮＡとの核酸検出バンドの差により確認した（図２）。ヨードアセチルプローブを使用して化学ラーゲーション反応をさせた場合（レーン２）のみに、ヨードアセチルプローブとホスホロチオエートプローブとの結合によって生じた新たなバンドが観察された。
【００５４】
（実施例４）
核酸プローブの長さ及び配列
実施例３に示された同じ条件で核酸プローブの長さのみをそれぞれ７ｍｅｒに変更し、化学ライゲーション反応を行った。詳細には、核酸プローブセットＣ（ホスホロチオエートプローブＣ−１（配列番号３）およびヨードアセチルプローブＣ−２（配列番号７））または核酸プローブセットＤ（ホスホロチオエートプローブＤ−１（配列番号４）およびヨードアセチルプローブＤ−２（配列番号８））をプローブとして使用し、テンプレートＤＮＡとしては核酸プローブセットＣの場合は配列番号１２の塩基配列を有するものを、核酸プローブセットＤの場合は配列番号１３の塩基配列を有するものを使用した。その結果を図１に示す。
【００５５】
７ｍｅｒの核酸プローブの組み合わせでは蛍光シグナルを検出できず（図１中ＣおよびＤ）、２０％ＰＡＧＥの結果（図３）にもプローブをヨードアセチル化した場合（レーン２）とヨードアセチル化していない場合（レーン３）との間で変化は見られなかった。これは室温の反応ではハイブリダイゼーションが起こりにくい核酸プローブであることを示している。図４には図１と同様の７ｍｅｒの核酸プローブを使用し、１０ｍｅｒと組み合わせることで化学ライゲーションが起こり、蛍光シグナルが得られた例を示した。図４において「７−１０」はホスホロチオエートプローブＣ−１（７ｍｅｒ）とヨードアセチルプローブＡ−２（１０ｍｅｒ）との組み合わせの場合を、「１０−７」はホスホロチオエートプローブＡ−１（１０ｍｅｒ）とヨードアセチルプローブＣ−２（７ｍｅｒ）との組み合わせの場合をそれぞれ示す。また、テンプレートＤＮＡとして配列番号１２の塩基配列を有するものを使用した場合を「ＤＮＡ」で、テンプレートを含まない場合を「Ｈ２Ｏ」で示す。この結果から化学ライゲーション反応は単に個々の核酸プローブの長さのみによるのではなく、核酸プローブの長さと配列、すなわちハイブリダイゼーションの効率によって影響されることがわかった。
【００５６】
（実施例５）
反応温度
実施例３に示された条件を用いて反応温度を１０℃から９０℃まで振って化学ライゲーション反応を行った。反応はアプライドバイオシステムズ社製サーマルサイクラーＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を使用し、温度制御を行った。結果を図５に示す。図５において、核酸プローブセットＡの場合の結果を「Ａ」で、核酸プローブセットＢの場合の結果を「Ｂ」で示す。
【００５７】
核酸プローブセットＡに関しては３０℃、核酸プローブセットＢに関しては４０℃が最適温度であることが示された。またそれぞれの反応温度で得られる蛍光シグナル値が各核酸プローブセットによって異なり、塩基配列によって最適温度が異なることを示している。常温では最適反応温度に近い蛍光シグナルを示していた。
【００５８】
（実施例６）
核酸プローブの特異性
実施例３に示された条件を用いて核酸プローブの特異性を確認した。常温で５分反応させた。核酸プローブセットとしては、ホスホロチオエートプローブＡ−１および８ｍｅｒの全体がテンプレートＤＮＡに完全に相補的なヨードアセチルプローブＥ−２（配列番号９）または８ｍｅｒ中の一塩基が目的の核酸配列と異なっているヨードアセチルプローブＦ−２（配列番号１０）を使用した。またテンプレートＤＮＡとしては配列番号１２の塩基配列を有するものを使用した。その結果を図６に示した。図中「Ｈ２Ｏ」はテンプレートＤＮＡを含まない場合を示す。
【００５９】
同一のテンプレートで完全に相補的な核酸プローブの場合は蛍光シグナルが得られていたのに対し、一塩基変異がある核酸プローブでは蛍光シグナルが全く認められなかった。これは核酸プローブ配列が特異的に目的の核酸配列を認識し、化学ライゲーション反応が起きていることを示す。
【００６０】
（実施例７）
一塩基変異検出（１）
実施例３に示された条件を用いて目的の核酸配列に一塩基変異がある核酸配列の検出を試みた。ホスホロチオエートプローブ１０ｍｅｒ（Ｂ−１）及びヨードアセチルプローブ７ｍｅｒ（Ｄ−２）の核酸プローブを使用し、７ｍｅｒ側に一塩基変異がくるように設計した。テンプレートとして用いた合成オリゴＤＮＡはすべて４０ｍｅｒの長さに合わせ、一塩基のみ異なる配列を持つ合成オリゴＤＮＡを使用した。すなわち、配列番号１３の塩基配列を有するテンプレートＤＮＡでは１５〜２１位がヨードアセチルプローブＤ−２の配列と相補的であるのに対して、配列番号１４の塩基配列を有するテンプレートＤＮＡではこの領域に１塩基の変異が導入されている。結果を図７に示す。
【００６１】
水（「ＮＣ」、テンプレートＤＮＡなし）、目的の核酸（「一塩基変異なし」）、一塩基変異のある核酸（「一塩基変異あり」）の三種類のテンプレートにおいていずれもハイブリダイゼーションによる蛍光シグナルは無視できる（図中「（−）」）。三種類の異なるテンプレートは段階的に蛍光シグナル値の差が示された。この差は核酸プローブのハイブリダイゼーション効率の差から生まれたものであり、すなわち、ハイブリダイゼーションの結果生じた化学ライゲーション反応によって蛍光シグナルが保持されたことで生じた差である。この結果から、配列中の一塩基の差を検出できることが示された。
【００６２】
（実施例８）
一塩基変異検出（２）
実施例７同様の条件でヨードアセチルプローブ１５ｍｅｒ（表１におけるＧ−２（配列番号１１））をヨードアセチルプローブＤ−２の代わりに使用した結果を図８に示す。
【００６３】
一塩基変異のある塩基配列のテンプレートと完全に塩基配列が一致しているテンプレートとの蛍光シグナルの差はなく、一塩基変異は検出できなかった。すなわち、プローブの長さが長すぎると変異の有無にかかわらずハイブリダイゼーションおよび化学ライゲーションが起こることが示唆された。
【００６４】
（実施例９）
蛍光シグナルの蓄積
実施例３に示された条件を基本に、核酸プローブセットＡを使用し、テンプレートは表２で示された量の１／１０の合成オリゴＤＮＡ（終濃度０．１μＭ）を使用した。シグナルを蓄積するために化学ライゲーション反応に、核酸プローブの解離ステップを加えたサイクルを繰り返した。核酸プローブセットＡに最適化されたサイクル、６０℃１０秒、４℃２分を１回のみ行うか（×１）、または２０回繰り返した（×２０）結果を図９に示す。このサイクル反応にはアプライドバイオシステムズ社製サーマルサイクラーＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を使用し、温度制御を行った。
ヨードアセチル基のない核酸プローブを使用した場合（ｎｏｎ−Ｉ）は全く蛍光シグナルが得られなかった。これに対し化学ライゲーション反応が可能な核酸プローブの組み合わせなら２０サイクル繰り返した場合で１回のみの場合の約１．５倍の蛍光シグナルの増加が確認できた。
この結果は、化学ライゲーション反応では本実施例におけるようなサイクル反応を行わずに常温５分という迅速な検出が可能であることに加えて、サイクル反応を行うことによって蛍光シグナルの蓄積が可能であることを示唆している。
【００６５】
（実施例１０）
リアルタイム検出
表２の反応条件から、表１の核酸プローブセットＢを使用し、プローブ濃度２倍（終濃度２μＭ）かつテンプレートは合成オリゴＤＮＡを濃度１／１００（終濃度１０ｎＭ）で使用し、サイクル反応によるシグナルの蓄積をリアルタイムにモニタリングした。リアルタイムＰＣＲ装置としてロシュ社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ｓｙｓｔｅｍを使用した。測定条件は６０℃５秒、３５℃２分を２０回繰り返したサイクル反応を行い、Ｆ３モードの検出シグナルにより測定した。その結果を図１０に示す。
【００６６】
相補的なテンプレートＤＮＡ（配列番号１３）が存在する場合、緩やかな曲線を示しながら蛍光シグナルの増加が見られた。一塩基変異のあるテンプレートＤＮＡ（配列番号１４）を用いた場合やテンプレートＤＮＡが存在しない場合（水）は蛍光シグナルの増加は見られなかった。
【００６７】
このように本発明では化学ライゲーション反応を利用し、特有の蛍光シグナルを検出することによって、煩雑な操作を必要とせず、従来技術の数十分の一という極めて短時間での核酸検出が可能になった。さらに、反応によって生じる第三の核酸プローブは蛍光体基の距離を一定に保っているため蛍光シグナルが安定して供給されうる。そのためシグナルを蓄積することが可能であり、より少量の目的核酸配列を検出することが可能になった。そして、核酸塩基配列に特異的に反応する特徴から、一塩基変異を特異的に検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により疾病に関与している多数の遺伝子の検出や細菌、ウイルスなどに感染した場合、その診断のための遺伝子検出が可能となり、より迅速な検出を可能にする。操作性関してもこれまでの酵素を用いた方法と異なり、混合すればよく、非常に容易であることからも産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ホスホロチオエートプローブとヨードアセチルプローブによるテンプレート依存的化学ライゲーション反応を示す図である。
【図２】化学ライゲーション反応による電気泳動バンドのシフト（泳動遅延）確認を示す図である。
【図３】７ｍｅｒの核酸プローブによる化学ライゲーション反応のバンドシフト確認を示す図である。
【図４】塩基数の異なる核酸プローブを用いた時の化学ライゲーション反応による蛍光シグナルの検出を示す図である。
【図５】反応温度の違いによる蛍光シグナル検出を示す図である。
【図６】核酸プローブに変異があるときの化学ライゲーション反応による蛍光シグナルの検出を示す図である。
【図７】ヨードアセチルプローブ７ｍｅｒを使用したときの化学ライゲーション反応あり・なしによる蛍光シグナルの検出を示す図である。
【図８】ヨードアセチルプローブ１５ｍｅｒを使用したときの化学ライゲーション反応あり・なしによる蛍光シグナルの検出を示す図である。
【図９】化学ライゲーション反応によって生じる蛍光シグナルの蓄積を示す図である。
【図１０】ライトサイクラーによる化学ライゲーション反応特異的蛍光の検出を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
SEQ ID NO:1: phosphorothioate group modified probe (A-1)
SEQ ID NO:2: phosphorothioate group modified probe (B-1)
SEQ ID NO:3: phosphorothioate group modified probe (C-1)
SEQ ID NO:4: phosphorothioate group modified probe (D-1)
SEQ ID NO:5: iodo-acetyl group modified probe (A-2)
SEQ ID NO:6: iodo-acetyl group modified probe (B-2)
SEQ ID NO:7: iodo-acetyl group modified probe (C-2)
SEQ ID NO:8: iodo-acetyl group modified probe (D-2)
SEQ ID NO:9: iodo-acetyl group modified probe (E-2)
SEQ ID NO:10: iodo-acetyl group modified probe (F-2)
SEQ ID NO:11: iodo-acetyl group modified probe (G-2)
SEQ ID NO:12: Synthetic template oligonucleotide having a complementary sequence
SEQ ID NO:13: Synthetic template oligonucleotide having a complementary sequence
SEQ ID NO:14: Synthetic template oligonucleotide having a mutation at position 19
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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