(57)【要約】【課題】抗原性を低減し、ペプシン耐性を付与し、体内寿命を延ばした、臨床的有用性の高い非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体、さらに、天然ラクトフェリンの生物活性を一定割合保持しており、臨床的有用性が天然ラクトフェリンよりも優れたラクトフェリン複合体を、短時間で簡便に大量に製造するための製造及び精製方法を提供する。【解決手段】分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の製造方法であって、ラクトフェリンと、分岐型非ペプチド性親水性高分子とを含む反応液を、pH８〜１０の条件下で反応させる工程を含むことを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式〔Ｉ〕：
【化１】
2008069073.tif 000017
（式中、ＬＦはラクトフェリン、Ｘは官能基の反応によって生じる結合、Ｌはリンカー、Ｒは少なくとも３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、Ｙはヘテロ原子結合、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｑは２〜１０の整数、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ表す）
又は式〔II〕：
【化２】
2008069073.tif 000018
（式中、ＬＦはラクトフェリン、Ｘは官能基の反応によって生じる結合、Ｌはリンカー、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ表す）
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の製造方法であって、
ラクトフェリンと、式〔III〕：
【化３】
2008069073.tif 000019
（式中、Ｘ’は官能基、Ｌはリンカー、Ｒは少なくとも３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、Ｙはヘテロ原子結合、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｑは２〜１０の整数をそれぞれ表す）
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とを含む反応液を、pH８〜１０の条件下で反応させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ＰＯＬＹが、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカリド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）及びそれらの修飾物、ならびにそれらのコポリマー類及び混合物からなる群から選択される、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ＰＯＬＹが、ポリエチレングリコール又はその修飾物である、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
式〔Ｉ〕：
【化４】
2008069073.tif 000020
（式中、ＬＦはラクトフェリン、Ｘは官能基の反応によって生じる結合、Ｌはリンカー、Ｒは少なくとも３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、Ｙはヘテロ原子結合、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｑは２〜１０の整数、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ表す）
又は式〔II〕：
【化５】
2008069073.tif 000021
（式中、ＬＦはラクトフェリン、Ｘは官能基の反応によって生じる結合、Ｌはリンカー、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ表す）
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の精製方法であって、
試料中に含有される前記複合体をヘパリンセファロース担体に吸着させる工程、及びこの担体から０．２５〜０．３５Mの塩濃度の溶液を用いて前記複合体を溶出させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
式〔Ｉ〕：
【化６】
2008069073.tif 000022
（式中、ＬＦはラクトフェリン、Ｘは官能基の反応によって生じる結合、Ｌはリンカー、Ｒは少なくとも３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、Ｙはヘテロ原子結合、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｑは２〜１０の整数、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ表す）
又は式〔II〕：
【化７】
2008069073.tif 000023
（式中、ＬＦはラクトフェリン、Ｘは官能基の反応によって生じる結合、Ｌはリンカー、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ表す）
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の精製方法であって、
試料中に含有される前記複合体を陽イオン交換体に吸着させる工程及びこの担体から溶出させる工程を含み、かつ、この溶出液の分子篩クロマトグラフィによる精製工程を含まないことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の方法によって製造された分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体。
【請求項７】
請求項４又は５記載の方法によって精製された分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体。
【請求項８】
請求項６又は７記載の分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体及び治療上不活性な基剤及び／又は添加物を含む医薬品組成物。
【請求項９】
疾患又は症状の治療又は予防用の医薬品の製造のための、請求項６又は７記載の分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的に活性なラクトフェリンとポリエチレングリコールなどの非ペプチド性親水性高分子との複合体、その製造方法及びその用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体高分子の性質の調節などの目的のため、生体高分子とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非ペプチド性親水性高分子とをコンジュゲート化すること（以下「複合体化」、ＰＥＧ又はその類似化合物を用いる場合については「ＰＥＧ化」ということがある）が行われている。より具体的には、複合体化は、一般に、非ペプチド性親水性高分子の末端に活性基を付けてタンパク質等の分子表面に存在する官能基と反応させることにより行われる。
【０００３】
特に、タンパク質及びペプチドの複合体化は重要であり、非ペプチド性親水性高分子鎖でタンパク質の分子表面を部分的に覆うことにより、エピトープをシールドすることによる抗原性・免疫原性の低減、細網内皮系等による取り込みの低減、及びタンパク分解酵素による認識及び分解の防止などが研究されている。また、複合体化された物質について、生体内でのクリアランスが遅延し、体内寿命が延びることが知られている。その一方で、複合体化されたタンパク質などでは、非ペプチド性親水性高分子の存在によって活性部位が影響を受け、生物活性が低減されることも頻繁に観察されている。
【０００４】
例えば、インターフェロンは、ＰＥＧ化することによって、体内寿命が約７０倍に延びる一方、抗ウイルス活性のような生物活性が約１／１０に低下する。しかし、総合的にはＰＥＧ化によって治療効果が大幅に改善されることが知られており、これはＣ型肝炎の治療に役立っている。
【０００５】
タンパク質の複合体化という概念自体は、白血病治療薬としてアスパラギナーゼのＰＥＧ化が成功して以来、古い歴史がある。現在までにＰＥＧなどの複合体化試薬自体の構造（活性基のタイプ、分子の大きさと分布、分岐型の開発など）の改良がなされ、技術的に進歩している。
【０００６】
分岐型のＰＥＧといくつかのタンパク質との複合体については、直鎖型ＰＥＧを用いた場合と比較して、プロテアーゼ耐性が高くなり、タンパク質によってはpH及び熱に対する安定性が増大することが知られている（非特許文献１：Monfardini et al., Bioconjug Chem. 1995 6(1):62-9）。また、インターフェロンについては、分岐型ＰＥＧとの複合体が他のＰＥＧとの複合体及びインターフェロン自体よりも高い抗増殖活性を有することが観察されている（特許文献１：特開平１０−６７８００）。
【０００７】
しかし、複合体化による個々のタンパク質の活性の変動は、タンパク質ごとに異なっている。さらに、例えばインターフェロンについてはＰＥＧ化によってインビトロの抗ウイルス活性が減少する一方、ヒト腫瘍細胞における抗増殖活性が増加するというように、ＰＥＧ化によって、あるタンパク質が有する複数の特性について一律ではない影響が生じうる。したがって、望ましい特性を備えた複合体を得るための最適な条件等については、各タンパク質ごとに充分に検討されなければならない。
【０００８】
また、タンパク質などの複合体化に関しては、非ペプチド性親水性高分子鎖の構造（直鎖型か分岐型か、分子の大きさと分布など）、反応部位及び反応分子数によって、抗原性、プロテアーゼ抵抗性、体内寿命及び熱安定性などの生化学的・薬剤学的性質、及び薬効に関わる生物活性への影響が大きく異なることが容易に予想される。したがって、このような複合体を医薬品として開発する場合、一定の品質を保証するため非ペプチド性親水性高分子鎖の付加が一定の部位であることが求められる。
【０００９】
ラクトフェリン（以下、「ＬＦ」と略すことがある）は、主に哺乳動物の乳汁中に存在し、好中球、涙、唾液、鼻汁、胆汁、精液などにも見出されている、分子量約８０，０００の糖タンパク質である。ラクトフェリンは、鉄を結合することから、トランスフェリンファミリーに属する。ラクトフェリンの生理活性としては、抗菌作用、鉄代謝調節作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎症作用、抗酸化作用、食作用亢進作用、抗ウイルス作用、ビフィズス菌生育促進作用、抗がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用などが知られている。さらに、最近、ラクトフェリンが脂質代謝改善作用、鎮痛・抗ストレス作用、アンチエイジング作用を有することも明らかにされている。このように、ラクトフェリンは、多様な機能を示す多機能生理活性タンパク質であり、健康の回復又は増進のため、医薬品や食品などの用途に使用されることが期待されており、ラクトフェリンを含む食品は既に市販されている。
【００１０】
ラクトフェリンは、経口的に摂取した場合、胃液中に存在する酸性プロテアーゼのペプシンにより加水分解を受け、ペプチドに分解されるため、ラクトフェリン分子としてはほとんど腸管まで到達することができない。しかし、ラクトフェリン受容体は消化管では小腸粘膜に存在することが知られており、最近、ラクトフェリンが腸管から体内に取り込まれて、生物活性を発現していることが明らかにされている。そのため、ラクトフェリンの持つ生物活性を発揮させるには、ラクトフェリンを胃液中でのペプシンによる加水分解を受けない状態で腸管まで到達させることが重要である。
【００１１】
ラクトフェリンに関しても、ＰＥＧ化された複合体についての報告がある（非特許文献２： C. O. Beauchamp et al. Anal. Biochem. 131: 25-33 (1983)）。しかし、この文献には、直鎖型のＰＥＧとＬＦとの複合体が５〜２０倍延長された体内寿命を有していたことが記載されているだけであり、ＰＥＧ化されたＬＦの生物活性、ＰＥＧ化の程度、均一性などについては何ら記載されていない。
【００１２】
【特許文献１】特開平１０−６７８００号公報
【非特許文献１】Monfardini et al., Bioconjug Chem. 1995 6(1):62-9
【非特許文献２】C. O. Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131: 25-33 (1983)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、抗原性を低減し、ペプシン耐性を付与し、体内寿命を延ばした、臨床的有用性の高い非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体及びその製造方法を提供することを目的とする。さらに、天然ラクトフェリンの生物活性を一定割合保持し、体内寿命が有意に延長されており、臨床的有用性が天然ラクトフェリンよりも優れたラクトフェリン複合体及びその製造方法等を提供することを目的とする。
特に、短時間で効率的に上記の特性を有するラクトフェリン複合体を大量調製するのに適した方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、ラクトフェリンを生物活性が保たれた状態で最も均一にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非ペプチド性親水性高分子と複合体化するための反応条件等を検討し、ラクトフェリン分子表面の限定された部位に特定の構造のこのような高分子を結合させることを可能にした。また、このような複合体の大量調製又は工業的生産に適した条件及び方法を見出した。さらに、そのようにして製造されたラクトフェリン複合体はペプシンやトリプシンなどのプロテアーゼに対する抵抗性を有し、最も重要な生物活性である鉄キレート能、さらには炎症性サイトカイン産生調節（抑制）能も保存されているという結果を得、本発明を完成した。
【００１５】
即ち、本発明は、
（１）  式〔Ｉ〕：
【００１６】
【化８】
2008069073.tif 000002
【００１７】
（式中、ＬＦはラクトフェリン、Ｘは官能基の反応によって生じる結合、Ｌはリンカー、Ｒは少なくとも３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、Ｙはヘテロ原子結合、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｑは２〜１０の整数、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ表す）
又は式〔II〕：
【００１８】
【化９】
2008069073.tif 000003
【００１９】
（式中、ＬＦはラクトフェリン、Ｘは官能基の反応によって生じる結合、Ｌはリンカー、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ表す）
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の製造方法であって、
ラクトフェリンと、式〔III〕：
【００２０】
【化１０】
2008069073.tif 000004
【００２１】
（式中、Ｘ’は官能基、Ｌはリンカー、Ｒは少なくとも３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、Ｙはヘテロ原子結合、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｑは２〜１０の整数をそれぞれ表す）
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とを含む反応液を、pH８〜１０の条件下で反応させる工程を含むことを特徴とする方法；
（２）  ＰＯＬＹが、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカリド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）及びそれらの修飾物、ならびにそれらのコポリマー類及び混合物からなる群から選択される、前記（１）記載の製造方法；
（３）  ＰＯＬＹが、ポリエチレングリコール又はその修飾物である、前記（２）記載の製造方法；
（４）  式〔Ｉ〕：
【００２２】
【化１１】
2008069073.tif 000005
【００２３】
（式中、ＬＦはラクトフェリン、Ｘは官能基の反応によって生じる結合、Ｌはリンカー、Ｒは少なくとも３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、Ｙはヘテロ原子結合、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｑは２〜１０の整数、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ表す）
又は式〔II〕：
【００２４】
【化１２】
2008069073.tif 000006
【００２５】
（式中、ＬＦはラクトフェリン、Ｘは官能基の反応によって生じる結合、Ｌはリンカー、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ表す）
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の精製方法であって、
試料中に含有される前記複合体をヘパリンセファロース担体に吸着させる工程、及びこの担体から０．２５〜０．３５Mの塩濃度の溶液を用いて前記複合体を溶出させる工程を含むことを特徴とする方法；
（５）  式〔Ｉ〕：
【００２６】
【化１３】
2008069073.tif 000007
【００２７】
（式中、ＬＦはラクトフェリン、Ｘは官能基の反応によって生じる結合、Ｌはリンカー、Ｒは少なくとも３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、Ｙはヘテロ原子結合、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｑは２〜１０の整数、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ表す）
又は式〔II〕：
【００２８】
【化１４】
2008069073.tif 000008
【００２９】
（式中、ＬＦはラクトフェリン、Ｘは官能基の反応によって生じる結合、Ｌはリンカー、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ表す）
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の精製方法であって、
試料中に含有される前記複合体を陽イオン交換体に吸着させる工程及びこの担体から溶出させる工程を含み、かつ、この溶出液の分子篩クロマトグラフィによる精製工程を含まないことを特徴とする方法；
（６）  前記（１）〜（３）のいずれか１項記載の方法によって製造された分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体；
（７）  前記（４）又は（５）記載の方法によって精製された分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体；
（８）  前記（６）又は（７）記載の分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体及び治療上不活性な基剤及び／又は添加物を含む医薬品組成物；
（９）  疾患又は症状の治療又は予防用の医薬品の製造のための、前記（６）又は（７）記載の分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の使用方法、
を提供する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のラクトフェリン複合体の製造方法は、短時間で容易に効率よく、均一にＰＥＧ化された目的のラクトフェリン複合体を製造することを可能にする。本発明の製造方法によれば、反応性の高い限定的な部位のみが均一に反応しているものと推定され、その結果、非常に均一な複合体が得られる。
また、本発明の精製方法は、単純な工程で短時間に高純度の複合体が得られるので、工業的な大量生産に非常に適している。
【００３１】
本発明の複合体は、ラクトフェリンが有する鉄の結合能が保持されており、したがって、少なくとも鉄結合能に基づくラクトフェリンの重要な生物活性が保持されている。また、分岐型非ペプチド性親水性高分子の結合によって、ペプシン、トリプシンなどのプロテアーゼに対する抵抗性を有しているため、体内寿命が長く、体内で長時間にわたって生物活性を発揮することができる。さらに、複合体化によって胃でのペプシンによる消化分解を受けにくくなっているため、さらなる腸溶化のための製剤的な処理を行わなくても、充分に腸内に到達しうる。本発明の複合体は、炎症性サイトカインの産生を調節する活性もまた、充分に保持している。
【００３２】
さらに、本発明の複合体は、特定の位置に一定の数の非ペプチド性親水性高分子が結合するため、品質が均一であり、製造管理・品質管理の点でも有利である。これらの利点によって、本発明の複合体は、医薬品成分としての使用に特に適している。即ち、本発明にしたがった複合体及び複合体製造方法により、ラクトフェリンを医薬品成分としてさらに有用性の高い形とすることができる。ラクトフェリンは、安全性が非常に高く、多様な生物活性を有するので、本発明により、有効な治療薬がない疾患又は症状の治療薬又は予防薬として、さらに有利に適用が可能となる。例えば、生活習慣病（動脈硬化、高コレステロール血症、高脂血症、高血圧、糖尿病、脂肪肝など）、がん（発がん予防、がんの二次予防、転移抑制、制癌剤の作用増強など）、自己免疫疾患（シェーグレン症候群によるドライアイ及びドライマウス、リウマチ性関節炎、悪性関節リウマチ、膠原病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、全身性紅斑性狼蒼など）、精神神経疾患（痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、テンカン、うつ病、ヒキコモリ、統合失調症、各種ストレス性疾患など）、疼痛緩和（モルヒネ等のオピオイド増強作用、がん性疼痛、神経因性疼痛、ヘルペス後疼痛、線維筋痛症、術後疼痛、舌痛症、生理痛、歯痛、関節痛など）、肝炎（各種ウィルス性肝炎、非アルコール性肝炎、肝硬変など）、炎症性腸疾患（大腸性潰瘍炎、クローン病など）、過敏性腸症候群、前立腺肥大、頻尿、不眠症、便秘などへ適応を拡大できる。さらに、本発明の複合体に含まれるラクトフェリンは、抗菌・抗ウィルス作用及び免疫能賦活作用があるので、本発明の複合体又はそれを含む医薬品組成物は、各種感染症及びそれに基づく炎症、例えば、ヘリコバクター・ピロリ菌の胃粘膜感染、歯周病、歯槽膿漏、口臭、口腔カンジダ症、口内炎、口角炎、鼻炎、食道炎、胆嚢炎、尿路感染症、膣感染症、水虫、ニキビ、ヘルペス属ウィルスの感染症、老人性肺炎、術後感染症などへの適用も可能であり、また、抗生物質の作用を増強する作用がある。一方、ラクトフェリンは免疫的な寛容をもたらす作用もあり、本発明の複合体又はそれを含む医薬品組成物は、花粉症、アトピー性皮膚炎、脂漏症、蕁麻疹等のアレルギー性疾患にも適用可能である。注目すべきことは、ラクトフェリンには鉄キレート作用に基づく強い抗酸化ストレス作用があり、本発明の複合体又はそれを含む医薬品組成物は、ウィルソン病、劇症肝炎などや、肌や眼の抗加齢・若返り作用、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、粘膜上皮細胞の角化抑制・若返り作用などへの適用も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の複合体は、分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体である。本発明の複合体においてラクトフェリンと結合される非ペプチド性親水性高分子は、一般に、一方の末端にラクトフェリンの官能基と反応して共有結合を形成しうる官能基を有し、分岐しており（即ち高分子鎖を２以上有しており)、生体に対して適合可能又は薬理学的に不活性であればよい。なお、「非ペプチド性」とは、ペプチド結合を含まないこと、又は実質的に含まない（高分子の性質に影響しない程度の低頻度（例えば高分子を構成する全モノマー単位数の１〜５％程度）で含みうる）ことを意味する。
【００３４】
本発明の複合体は、
式〔Ｉ〕：
【００３５】
【化１５】
2008069073.tif 000009
【００３６】
又は
式〔II〕：
【００３７】
【化１６】
2008069073.tif 000010
【００３８】
（式中、ＬＦはラクトフェリン、Ｘは官能基の反応によって生じる結合、Ｌはリンカー、Ｒは少なくとも３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、Ｙはヘテロ原子結合、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｑは２〜１０の整数、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ表す）
で示される。
【００３９】
好ましくは、式中のＰＯＬＹ部分は、ポリ（アルキレングリコール）（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカリド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）及びそれらの修飾物、ならびにそれらのコポリマー類（例えばＰＥＧとポリプロピレングリコールとのコポリマー；ターポリマーなどを含む）及び混合物からなる群から選択される。ＰＯＬＹ部分は、それぞれ直鎖状であってもよく、分岐及び／又はペンダント基などを有していてもよい。
【００４０】
入手の容易性などの点から、最も好ましくは、ＰＯＬＹ部分はＰＥＧ及びその修飾物（例えばメトキシ化物）であり、特に直鎖状のＰＥＧ又はメトキシＰＥＧであることが好ましい。
【００４１】
ＰＯＬＹ部分の数（式中のｑ）は、一般に２〜１０程度であることができるが、好ましくは２〜６程度である。
【００４２】
Ｘは、ラクトフェリンの官能基（例えばリジンのε−アミノ基）と分岐型非ペプチド性親水性高分子の官能基（下記の式〔III〕中のＸ’；例えばマレイミド基、アルデヒド基、アミノ基、ＮＨＳ基など）との反応によって生じる結合である。好ましくは、ラクトフェリンの官能基はアミノ基、分岐型非ペプチド性親水性高分子の官能基はＮＨＳ基である。
Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−のようなヘテロ原子結合である。
Ｌは、リンカーとして作用する基であって特に制限はないが、Ｙと同様、存在してもしなくてもよい。
【００４３】
本発明の複合体において使用される「ラクトフェリン」（ＬＦ）は、天然又は天然型のラクトフェリン分子そのもののほか、遺伝子組換え型（一部のアミノ酸が置換された改変型を含む）ラクトフェリン、及びラクトフェリンの活性フラグメントなどのラクトフェリンの機能的等価物であってもよく、鉄イオンの有無又はその含有量、由来する生物種などを問わない。
【００４４】
天然のラクトフェリンには、４４個（ヒト）〜５４個（ウシ）程度のリジン残基が存在するが、それらの反応性はその存在位置の局所的環境により異なる。本発明の方法によれば、複合体において、ラクトフェリンのリジン残基が有するような官能基のうち、１〜１０箇所、好ましくは１〜５箇所に、再現性よく非ペプチド性親水性高分子が共有結合される。したがって、上記の式〔Ｉ〕及び〔II〕において、ｎは、好ましくは１〜５である。
【００４５】
本発明の複合体に関して「生物学的に活性な」とは、ラクトフェリンの生理薬理活性が保持されていることを意味する。特に、本発明の複合体は、天然ラクトフェリンと同等の鉄キレート(結合)能及び／又は炎症性サイトカイン産生調節能を有している。
【００４６】
具体的には、後述する実施例の方法で測定して天然ラクトフェリンの鉄結合能を１００％とした場合に、本発明の複合体は、少なくとも３０％以上（例えば約３０％〜約１５０％又は約３０％〜約１２０％）の鉄結合能を保持しており、好ましい態様においては、本発明の複合体は、天然ラクトフェリンの約５０％〜約１００％又はそれ以上（例えば約５０％〜約１５０％又は約５０％〜約１２０％）に相当する鉄結合能を有する。なお、鉄結合能は、実施例に記載した方法又はそれと同等の方法によって測定する場合、±２０％程度の誤差がありうる。
【００４７】
また、後述する実施例の方法で測定して天然ラクトフェリンの炎症性サイトカイン産生調節能を１００％とした場合に、本発明の複合体は、少なくとも３０％以上（例えば約３０％〜約１５０％又は約３０％〜約１２０％）の炎症性サイトカイン産生調節能を保持しており、好ましい態様においては、本発明の複合体は、天然ラクトフェリンの約５０％〜約１００％又はそれ以上（例えば約５０％〜約１５０％又は約５０％〜約１２０％）に相当する炎症性サイトカイン産生調節能を有する。なお、サイトカイン産生調節能は、実施例に記載した方法又はそれと同等の方法によって測定する場合、±２０％程度の誤差がありうる。
【００４８】
また、本発明の複合体は、プロテアーゼ耐性を有する。即ち、本発明の複合体は、少なくともペプシン及び／又はトリプシン、キモトリプシンによる消化に対して天然ラクトフェリンと比較して有意に耐性である。好ましくは、本発明の複合体は、実施例に記載した条件でのペプシンによる２０分の消化後において、天然ラクトフェリンの約１．１倍〜約２倍又はそれ以上（例えば約２倍〜約５倍）が未消化で残存する程度のペプシン耐性を有する。
【００４９】
本発明の複合体は、分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとを、それぞれの官能基を反応させることによって共有結合させることにより製造することができる。例えば、分岐型非ペプチド性親水性高分子としては、
【００５０】
式〔III〕：
【００５１】
【化１７】
2008069073.tif 000011
【００５２】
又は
式〔IV〕：
【００５３】
【化１８】
2008069073.tif 000012
【００５４】
（式中、Ｘ’は官能基、Ｌはリンカー、Ｒは少なくとも３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、Ｙはヘテロ原子結合、ＰＯＬＹは非ペプチド性親水性高分子、ｐは０又は１、ｑは２〜１０の整数をそれぞれ表す）
で示されるものを使用することができる。
【００５５】
Ｘ’としては、マレイミド基、アルデヒド基、アミノ基、ＮＨＳ基などが挙げられる。好ましくは、Ｘ’はＮＨＳ基である。Ｌ、Ｙ、ＰＯＬＹについては複合体について上述したとおりである。このような分岐型非ペプチド性親水性高分子は、公知の方法で合成することもできるが、既に各種のものが市販されている。反応に使用される分岐型非ペプチド性親水性高分子の分子量（数平均分子量）としては、一般に約５００〜２００，０００、好ましくは２,０００〜１００，０００、特に好ましくは１０，０００〜６０，０００（Da）である。
【００５６】
好ましくは、ラクトフェリンと分岐型非ペプチド性親水性高分子とが、１：０．１〜１：１００のモル比で反応液中に添加される。ラクトフェリン：分岐型非ペプチド性親水性高分子の混合モル比は、さらに好ましくは１：０．１〜１：６０、最も好ましくは１：０．１〜１：５４の範囲内である。コストの観点からは、１：０．１〜１：５が好ましい。
【００５７】
また、反応工程は、一般的にpH４以上、温度０〜４０℃、時間１分〜２４時間、好ましくは、pH６以上、温度４〜４０℃、時間１０分〜２４時間の条件下で行われる。即ち、反応液のpHは、好ましくはpH６以上であり、短時間で反応を完了させる目的からは、特に好ましくはpH８〜１０、最も好ましくはpH９付近（即ちpH８．５〜９．５）である。
【００５８】
反応時間及び反応温度は相互に密接に関連して変化させることができるが、一般に反応温度が高い場合は時間を短く、温度が低い場合は時間を長くすることが好ましい。例えば、反応pHが７付近（即ちpH６．５〜７．５）の場合、ラクトフェリン：分岐型非ペプチド性親水性高分子のモル比が１：１０の条件下では、２５℃において約１時間、あるいは１６℃又は４℃において２４時間反応させることにより、特に良好な結果（均一な複合体化など）が得られる。また、ラクトフェリン：分岐型非ペプチド性親水性高分子のモル比が１：１でpH９での条件下では、２５℃において約１０分、１６℃においては約１０分〜約４０分以内、４℃においては約１時間〜約２時間以内の反応により、特に良好な結果が得られる。
【００５９】
別の例として、反応pHが８〜１０の場合、ラクトフェリン：分岐型非ペプチド性親水性高分子のモル比が１：０．１〜６０の条件下では、２５℃においてわずか１０分程度反応させることにより、特に良好な結果が得られる。このような条件下では、反応性の特に高い特定の部位のみのアミノ基（おそらく一箇所）が限定的にＰＥＧ化され、短時間に反応が完結するとともに、それ以上長時間の反応を継続しても、複合体形成において経時的な変化がほとんど起こらないものと考えられる。
【００６０】
上記のようにして製造された、試料中に含有される本発明の複合体は、まずヘパリンのような陽イオン交換担体（樹脂）に吸着させて濃縮し、続いて、得られた濃縮物を分子篩クロマトグラフィ担体（樹脂）に適用することによって容易に精製することができる。具体的には、例えば最初に複合体を含有する試料をヘパリンカラムに適用して複合体をカラムに吸着させ、高塩濃度の緩衝液で溶出して濃縮された複合体を含有する溶出液を集める。次に、この溶出液を分子篩クロマトグラフィカラムに適用し、脱塩及び所望の緩衝液への置換を行うことができる。必要に応じて、透析、限外ろ過などの公知の方法で溶出液を適宜さらに濃縮することができる。
【００６１】
さらには、本発明の複合体の精製方法は、上記の二段階のカラムクロマトグラフィの代わりに、陽イオン交換体カラムのみによる一段階の精製であってもよい。例えば、本発明の複合体を含む試料をヘパリンカラム（例えばヘパリンセファロースカラム）に適用し、複合体をカラムに吸着させた後、高塩濃度の緩衝液で溶出するのみでも、充分に未反応ラクトフェリンとの分離が可能である。
【００６２】
このような陽イオン交換体からの溶出において、ＰＥＧ化されたラクトフェリンは０．３M程度（０．２５〜０．３５M）の塩濃度で選択的に溶出されることが見出された。したがって、溶出は、直線的濃度勾配を用いてもステップワイズに溶出してもよいが、溶出液としては０．３Mの塩濃度を含むような濃度勾配又は溶液を用いる。ステップワイズ塩濃度溶出法は、直線的塩濃度勾配溶出法と比較して簡便であり、大量精製を行う際には極めて有用であると考えられる。したがって、工業的生産又は大量調製の場合は、ステップワイズ塩濃度溶出法によることが有利である。
【００６３】
本発明の精製法に用いることのできる陽イオン交換体の担体としては、シリカゲルが挙げられる。シリカゲルは、物理的な強度が高い点において工業的生産又は大量調製に好適である。
【００６４】
また、別の実施態様においては、市販されている陽イオン交換担体(樹脂)を使用することによって、上記陽イオン交換担体処理及び分子篩クロマトグラフィ担体処理による二段階の濃縮・精製工程を一段階で行うこともできる。
【００６５】
ラクトフェリンは、抗菌作用、鉄代謝調節作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎症作用、抗酸化作用、食作用亢進作用、抗ウイルス作用、ビフィズス菌生育促進作用、抗がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用、脂質代謝改善作用、鎮痛作用、抗ストレス作用などを含む広範な生理活性を有しており、これらの作用によって、生活習慣病（例えば、高コレステロール血症、高脂血症など）、疼痛管理（がん性疼痛、神経因性疼痛など）、膠原病（シェーグレン症候群によるドライアイ及びドライマウス、リウマチ性関節炎など）、歯周病、Ｃ型肝炎などを含む、多くの疾患又は症状の治療（改善を含む）及び予防が可能である。
【００６６】
本発明の複合体は、これらの作用をもたらす鉄結合能、炎症性サイトカイン産生調節能などのラクトフェリンの生物活性を充分に保持しているうえ、細胞毒性を示さないので、治療上不活性な基剤及び／又は添加物を配合することによって医薬品組成物とすることができる。便宜上、本発明に関して医薬品又は医薬品組成物というときは、投与対象が人の場合のほか、動物である場合（即ち、獣医薬等）も含む。このような医薬品組成物に含有させることができる各種成分及び剤型は当業者には充分に公知である。本発明の複合体を含む医薬品組成物の有効投与量は、治療又は予防すべき疾患又は症状の種類や程度、投与対象の状態、剤型などによって異なり、公知の有効ラクトフェリン量を目安に適宜選択することができる。一般に、公知の有効ラクトフェリン量と比較して有意に少ない用量（例えばラクトフェリン量換算で１／２〜１／２０量）とすることができ、同等の用量で用いるのであれば投与回数を減らすことが可能である。
【実施例１】
【００６７】
１．ＰＥＧ化ラクトフェリンの調製
種々のＰＥＧ誘導体を用いてラクトフェリンとの複合体を調製した。
ラクトフェリンとしては、ウシラクトフェリン（マレーゴルバン社製）を用いた。ＰＥＧ化のターゲットは、ラクトフェリンのリジンのε−アミノ基（ウシラクトフェリン１分子当たり５４個存在する）及びＮ末端のα−アミノ基とした。
ＰＥＧ誘導体としては、以下に示す４種類の分岐型ＰＥＧ誘導体（実施例）及び３種類の直鎖型ＰＥＧ誘導体（比較例）を用いた：
【００６８】
【表１】
2008069073.tif 000013
【００６９】
ＰＢＳ（pH７．４）中で、ウシラクトフェリン（ｂＬｆ）０．５mg（６．２５μM）に対し、所定の量のＰＥＧ誘導体を混合し、最終容量１mlで、２５℃で１時間カップリング反応を行った。ラクトフェリンの最終濃度は０．５mg／mlであった。ｂＬＦとＰＥＧ誘導体との比は、ＰＥＧ誘導体／リシル基のモル比で０．０２〜５、ｂＬｆ：ＰＥＧ誘導体モル比１：１〜１：２７０；（ＰＥＧ誘導体濃度として６．２５μM〜１．６９mMに相当）の範囲で変化させた。
【００７０】
カップリング反応の生成物について、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行うことにより評価した。結果を図１及び２に示す。図１及び２において、矢印で示したバンドは未修飾のウシラクトフェリンを示す。
【００７１】
図１は、分岐型ＰＥＧ誘導体を用いてウシラクトフェリンを修飾した結果を、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色で解析したゲルの写真である。パネルＡ〜Ｄは、それぞれ表１に示すＰＥＧ誘導体１〜４の反応生成物についての結果である。分岐型ＰＥＧ誘導体とのカップリング反応を行った場合、生成するＰＥＧ化ラクトフェリンはＰＥＧ誘導体のモル数依存的に増加する傾向が観察され、ｂＬｆ：ＰＥＧ誘導体のモル比が１：５〜１：５４（ＰＥＧ誘導体濃度３１．２５〜３３７．５μM）の混合比となる条件下において反応させた場合に、ＰＥＧ誘導体で特異的に修飾されたラクトフェリン複合体（シャープなバンド）が生成した（図１、パネルＡ〜Ｄ）。電気泳動上の分子量から換算すると、これらのＰＥＧ化ラクトフェリンは、ＰＥＧ誘導体の分子量に関わらずｂＬＦ１分子当り約１〜４分子のＰＥＧで均一に修飾されていると推定された。
【００７２】
図２は、同様に直鎖型ＰＥＧ誘導体を用いてウシラクトフェリンを修飾した結果を示す写真である。パネルＡ〜Ｃは、それぞれ表１に示すＰＥＧ誘導体５〜７の反応生成物についての結果である。直鎖型のＰＥＧ誘導体を用いてカップリング反応を行った場合、分岐型の場合と同様、ＰＥＧ誘導体のモル数依存的に反応が進み、ＰＥＧ誘導体５（パネルＡ）及び６（パネルＢ）の反応においては数個〜非常に多数のＰＥＧで修飾された不均一なラクトフェリン複合体（スメア状のブロードなバンド）が生成した。ＰＥＧ誘導体７（パネルＣ）は、反応性が悪く、ＣＢＢ染色ではＰＥＧ化ラクトフェリンは確認されなかった。直鎖型ＰＥＧ誘導体を用いた場合は、複合体が生成した場合であっても反応の特異性が低く、いずれの反応においても反応特異的なＰＥＧ化ラクトフェリンの生成は認められなかった。
【００７３】
２．反応pHの検討
上記と同様の実験において、ウシラクトフェリンとＰＥＧ誘導体２〜４を用い、ＰＥＧ化カップリング反応液のpHを４〜９の範囲で変化させてカップリング反応を行った。使用緩衝液は、pH４〜５については酢酸緩衝液、pH６〜８についてはリン酸緩衝液、pH９はホウ酸緩衝液とした。他の条件は、ウシラクトフェリンの最終濃度０．５mg／ml、反応温度２５℃、反応時間１時間とし、ウシラクトフェリン：ＰＥＧ誘導体のモル比は１：５４（ＰＥＧ誘導体濃度３３７．５μM）、及び１：１０（ＰＥＧ誘導体濃度６２．５μM）とした。反応後、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色によって反応生成物を解析した。
【００７４】
結果を図３に示す。ＰＥＧ誘導体２〜４（それぞれパネルＡ〜Ｃ）のいずれを用いた場合も、反応特異的なＰＥＧ化ラクトフェリン生成はpH６以上で確認された。カップリング反応は、反応液のpHが６〜９の条件下でよく進むことが確認され、特にアルカリ性では反応が亢進した。一方、pH５以下の酸性条件下の反応液ではＰＥＧ化反応はほとんど起こらなかった。
【００７５】
３．反応温度及び時間の検討
上記と同様の実験において、ウシラクトフェリンとＰＥＧ誘導体２、３、４を用いて、反応温度を２５℃、１６℃、又は４℃とし、また、反応時間を変化させてＰＥＧ化カップリング反応を行った。他の条件は、ウシラクトフェリンの最終濃度は０．５mg／ml、反応緩衝液はＰＢＳ（pH７．４）、ウシラクトフェリン：ＰＥＧ誘導体のモル比は１：５４（ＰＥＧ誘導体濃度３３７．５μM）、及び１：１０（ＰＥＧ誘導体濃度６２．５μM）とした。反応後、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色によって反応生成物を解析した。
【００７６】
結果を図４〜６に示す。ＰＥＧ誘導体２、３、４（それぞれ図４、５、６）のいずれを用いた場合も、ＰＥＧ化反応は、４℃〜２５℃のいずれの反応温度においても起こり、温度が高いほど反応が進み易く、さらに、反応時間を延長すると多数のＰＥＧ誘導体で修飾された高分子のＰＥＧ化ラクトフェリンの生成が増加することが明らかとなった。
【００７７】
具体的には、２５℃においてｂＬｆ：ＰＥＧ誘導体のモル比１：５４（ＰＥＧ誘導体濃度３３７．５μM）の条件で反応を行うと、２０kDa及び４０kDaのＰＥＧ誘導体ともに、反応時間１０分からＰＥＧ化ラクトフェリンが生成し、反応時間が長くなるに従って、１〜４分子のＰＥＧで修飾された反応特異的なラクトフェリンが減少し、さらに高分子のＰＥＧ化ラクトフェリンが生成する傾向が確認された。一方、ｂＬｆ：ＰＥＧ誘導体のモル比１：１０（ＰＥＧ誘導体濃度６２．５μM）の条件で反応を行うと、反応時間１０分からＰＥＧ化ラクトフェリンが生成し、２４時間まで反応特異的なＰＥＧ化ラクトフェリンが増加し、２時間以降、高分子ＰＥＧ化ラクトフェリンも増加した（図４）。
【００７８】
また、１６℃においてｂＬｆ：ＰＥＧ誘導体のモル比１：５４（ＰＥＧ誘導体濃度３３７．５μM）の条件で反応を行うと、２０kDa及び４０kDaのＰＥＧ誘導体ともに、反応時間１０分からＰＥＧ化ラクトフェリンが生成し、反応１時間をピークに１〜４分子のＰＥＧで修飾された反応特異的なラクトフェリンが生成し、反応時間が長くなるとさらにＰＥＧで修飾された高分子ＰＥＧ化ラクトフェリンが生成する傾向が認められた。一方、ｂＬｆ：ＰＥＧ誘導体のモル比１：１０（ＰＥＧ誘導体濃度６２．５μM）の条件で反応を行うと、４０分以降からＰＥＧ化ラクトフェリンが生成し、２４時間まで反応特異的なＰＥＧ化ラクトフェリンが増加する傾向が確認された（図５）。
【００７９】
そして、４℃においてｂＬｆ：ＰＥＧ誘導体のモル比１：５４（ＰＥＧ誘導体濃度３３７．５μM）の条件で反応を行うと、２０kDa及び４０kDａのＰＥＧ誘導体ともに、反応時間１０分からＰＥＧ化ラクトフェリンが生成し、反応４時間をピークに１〜４分子のＰＥＧで修飾された反応特異的なラクトフェリンが生成し、反応時間が長くなるとさらに多くのＰＥＧで修飾された高分子ＰＥＧ化ラクトフェリンが生成する傾向が認められた。一方、ｂＬｆ：ＰＥＧ誘導体のモル比１：１０（ＰＥＧ誘導体濃度６２．５μM）の条件で反応を行うと、２時間以降でＰＥＧ化ラクトフェリンが生成し、２４時間まで徐々に反応特異的なＰＥＧ化ラクトフェリンが増加する傾向が確認された（図６）。
【００８０】
したがって、４℃以上の反応温度で良好なカップリング反応が起こることが確認された。
【００８１】
４．ＰＥＧ化ヒトラクトフェリンの調製
ＰＥＧ化に使用したヒトラクトフェリン（ｈＬｆ）は、SIGMA社より購入した（SIGMA, L0520）。ＰＥＧ化のターゲットは、ラクトフェリンのリジンε−アミノ基（タンパク質１分子当たり４４個存在）及びＮ末端のα−アミノ基とした。使用したＰＥＧ誘導体は、３種類の分岐型ＰＥＧ誘導体（表１のＰＥＧ誘導体２〜４）であった。カップリング反応は、ラクトフェリンの最終濃度０．５mg／ml、２５℃、１時間、ＰＢＳ（pH７．４）中、最終容量１mlで行った。ヒトラクトフェリン（ｈＬｆ）０．５mg（６．２５μM）に対し、ＰＥＧ誘導体の混合比はＰＥＧ誘導体／リシル基のモル比で０．０２〜５、ｈＬｆ：ＰＥＧ誘導体のモル比で１：１〜１：２２０（ＰＥＧ誘導体濃度として６．２５μM〜１．３８mMに相当）の範囲で変化させた。反応生成物の評価は、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色により行った。
【００８２】
結果を図７に示す。矢印で示したバンドは未修飾のヒトラクトフェリンを示す。パネルＡ〜Ｃは、それぞれＰＥＧ誘導体２〜４を用いた場合の結果である。これらのカップリング反応は、ウシラクトフェリンを用いた場合と同じ傾向を示した。即ち、ＰＥＧ誘導体のモル数依存的に反応が進み、数個〜非常に多数のＰＥＧで修飾されたラクトフェリンが生成するが、ｈＬｆ：ＰＥＧ誘導体のモル比を１：１〜１：８８、特に１：１０を中心とする比として反応させた場合に特異的なＰＥＧ化ラクトフェリンが生成した。また、電気泳動上の分子量から換算すると、ＰＥＧ化ラクトフェリンは、ＰＥＧ誘導体の分子量に関わらず約１〜４分子のＰＥＧで修飾されていると推定された。
【００８３】
５．ＰＥＧ化ラクトフェリンの精製
ヘパリンカラム及びゲルろ過カラムの組み合わせにより、ＰＥＧ化ウシラクトフェリン反応液中の未カップリングＰＥＧ誘導体、未カップリングラクトフェリンを分離し、ＰＥＧ化ラクトフェリンを精製した。
【００８４】
表１のＰＥＧ誘導体３及び４を用い、ｂＬｆ（０．５mg／ml）：ＰＥＧ誘導体のモル比１：１０で混合した反応液１００mlを調製し、２５℃、pH７．４で１時間反応を行った。この反応液９６ml（タンパク質４８mg相当）を試料として用いて、まずHiTrap Heparin HPカラム（カラムサイズ５ml、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に反応生成物を吸着させた。ＰＥＧ化ラクトフェリンの溶出は、AKTA explorer 10S（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて行った。緩衝液として、１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．６）、及び溶出緩衝液として１Ｍ  ＮａＣｌを含む１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．６）を用い、流速１ml／minで、直線的濃度勾配（linear gradient）で２０カラム容量かけて塩濃度を上昇させることにより、吸着物を溶出し、ＰＥＧ化ラクトフェリン画分を回収した。このＰＥＧ化ラクトフェリン画分を、ＰＢＳに対し１０℃で一晩透析し、CENTRIPLUS YM-50（MILLIPORE社）を用いて約１mlに濃縮した。最終精製は、Superdex 200 10/300GL（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）カラムを用い、１．５カラム容量の１５０mM  ＮａＣｌを含む５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）で流速０．５ml／minで溶出し、ＰＥＧ化ラクトフェリン画分を回収した。得られた精製サンプル（ＰＥＧ誘導体３及び４を用いて得られたＰＥＧ化ラクトフェリンを、それぞれ２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆ及び４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆと呼ぶ）を、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色により確認した。
【００８５】
結果を図８に示す。図８において、レーン１はＰＥＧ化反応液、レーン２はヘパリンカラム精製タンパク質、レーン３は分子篩クロマトグラフィカラム精製タンパク質である。したがって、ヘパリンカラムとカラムを用い、カップリング反応液からＰＥＧ化ラクトフェリンのみが精製されたことが確認された。
【００８６】
６．精製ＰＥＧ化ラクトフェリンのヨウ化バリウム染色
ＰＥＧ化されたタンパク質は、ヨウ化バリウムによって特異的に染色される（Kurfurst MM, Anal Biochem, 200,244-248 (1992), Balion P. et al., Bioconjug Chem, 12, 195-202 (2001)）。上記５．の実験において製造・精製されたＰＥＧ化ｂＬｆが確かにＰＥＧで修飾されているかどうかを確認するため、ヨウ化バリウム染色を行った。
【００８７】
下記に示す各試料を７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲルを脱イオン水で１５分間水洗し、５％（w/v）塩化バリウム溶液で１０分間振盪後、脱イオン水で３分間の洗浄を３回行った。次いで、０．１Ｎ  Titrisol iodine溶液（MERCK, Germany）中で１０分間振盪し、ＰＥＧ化ラクトフェリンを染色した。さらに、Titrisol iodine溶液で染色されたゲルを水洗、完全に脱色した後、ＣＢＢで染色した。結果を図９に示す。
【００８８】
図９において、パネルＡはヨウ化バリウム染色、パネルＢはＣＢＢ染色、パネルＣはヨウ化バリウム染色とＣＢＢ染色を重ねた像をそれぞれ示す。各レーンについて、試料は、「ｂＬｆ」＝未修飾のウシラクトフェリン、「１」＝ＰＥＧ誘導体３を用いたカップリング反応液、「２」＝ＰＥＧ誘導体４を用いたカップリング反応液、「３」＝精製ＰＥＧ化ｂＬｆ（２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆ）、「４」＝精製ＰＥＧ化ｂＬｆ（４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆ）である。レーンＭはマーカーである。
【００８９】
ヨウ化バリウム染色（パネルＡ、Ｃ）において、レーン１（分子量約４５kDa）及び２（分子量約９０kDa）において濃く染色されているバンドは、それぞれ未反応のＰＥＧ誘導体のバンドである。即ち、数平均分子量約２０kDaのＰＥＧ誘導体試薬はＳＤＳ−ＰＡＧＥで見かけ上、約４５kDaの位置に泳動され、数平均分子量約４０kDaのＰＥＧ誘導体試薬はＳＤＳ−ＰＡＧＥで見かけ上、約９０kDaの位置に泳動されることが分かる。ＰＥＧ化されていないタンパク質は染色されていない（レーンｂＬｆ、１及び２；分子量約８０kDa）。一方、精製ＰＥＧ化ラクトフェリンは、ヨウ化バリウム染色及びＣＢＢ染色で染まることが確認された（レーン１、３は分子量約１４０kDa；レーン２、４は分子量約２４０kDa）。精製タンパク質がヨウ化バリウムで染色されたことから、精製タンパク質は確かにＰＥＧ修飾されていることが確認された。
【００９０】
７．ペプシン、トリプシン消化に対する耐性の評価
上記５．の実験で得られた精製ＰＥＧ化ｂＬｆ、２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆ及び４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆを、以下の条件でペプシン又はトリプシンで消化して、未修飾ｂＬｆの消化と比較検討した。
【００９１】
ペプシン消化に関しては、精製した１０μg分の未修飾ｂＬｆ、２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆ及び４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆの各々に、最終濃度１８．７５ng／mlになるようにペプシン（ブタ胃由来、code No.165-18713、和光純薬工業（株）製）を加えて、０．０１M  ＨＣｌ中、３７℃で反応させた。反応開始から２０、４０、６０、８０、１００分後に、各タンパク質１．２５μg分をピペットでサンプリングして、等量の氷冷した２Ｘサンプルバッファー（１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH６．８）、４％  ＳＤＳ、２０％  グリセロール、色素（ＢＰＢ））と混ぜて酵素反応を停止させた。
【００９２】
トリプシン消化に関しては、精製した１０μg分のｂＬｆ、２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆ及び４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆの各々に、最終濃度２０μg／mlになるようにトリプシン（ウシ脾臓由来、code No.204-13951、和光純薬工業（株）製）を加えて、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH６．８）、０．１M  ＮａＣｌ、２mM  ＣａＣｌ２中、３７℃で反応させた。反応開始から１０、２０、３０、４０、５０、６０分後に、各タンパク質１．２５μg分をピペットでサンプリングして、等量の氷冷した２Ｘサンプルバッファーと混ぜて酵素反応を停止させた。その結果を図１０〜１２に示す。
【００９３】
図１０は、各サンプルを１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）で泳動後、ＣＢＢで染色したゲルの写真である。図１０において、パネルＡはペプシン、パネルＢはトリプシンで各々消化した結果である。精製ＰＥＧ化ラクトフェリンのバンドを＊印、断片化したＰＥＧ化ラクトフェリンのバンドを矢印で示す。ペプシン（パネルＡ）又はトリプシン（パネルＢ）での消化に対して、未修飾ｂＬｆは速やかに低分子化されたのに対して、２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆ、４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆの消化は限定的であり、断片化した矢印で示したバンドが観察された。このことより、ＰＥＧ化されたＬＦは、未修飾のｂＬｆと比較して、ペプシン、トリプシンの作用を受けにくいことが分かる。
【００９４】
図１１は、トリプシン消化物を１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ヨウ化バリウム染色（パネルＡ）又はＣＢＢ染色（パネルＢ）により解析した結果である。パネルＢ及び図８で矢印で示したＣＢＢ染色されたバンドがヨウ化バリウム染色される（パネルＡ）ことから、この矢印のバンドはＰＥＧ化されたラクトフェリン断片であり、ＰＥＧ化によってトリプシン消化に対して耐性を示すようになったことが分かる。
【００９５】
図１２は、インタクトなＰＥＧ化ウシラクトフェリン(図８中、＊印で示した)の経時的な分解を半定量的に示すために、図８で示した泳動像をスキャナーで取り込み、バンドの濃さをNIH imageで解析した結果を示す図である。縦軸は、各時間におけるバンドの濃さを示しており、時間０分時の濃さを１００％とする相対値である。横軸は、各酵素での処理時間である。ペプシン（パネルＡ）及びトリプシン（パネルＢ）によるＰＥＧ化ウシラクトフェリンの分解は、２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆ、４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆともに未修飾ｂＬｆの分解と比較して緩やかな傾向を示した。具体的には、例えばペプシンについては、２０分の消化の後、ＰＥＧ化ｂＬｆの残存率は、未修飾のｂＬｆの約２倍であり、４０分の消化の後では、ＰＥＧ化ｂＬｆの残存率は、未修飾のｂＬｆの約５倍であった。
【００９６】
以上の結果から、ＰＥＧ化ｂＬｆは、未修飾のｂＬｆと比較して、有意にペプシン、トリプシンの作用を受けにくくなっていることが分かる。
【００９７】
８．ＰＥＧ化ラクトフェリンの鉄結合能の測定
ラクトフェリンは分子量８万の非ヘム性の鉄結合性糖タンパク質で、Ｎローブ、Ｃローブと呼ばれる二つの領域からなり、炭酸イオン（ＣＯ３２−）の存在下でタンパク質１分子当たり２個の鉄イオン（Ｆｅ３＋）を可逆的にキレート結合する能力を有する（Anderson, et al., Nature, 344, 784-78 (1990)）。ラクトフェリンの鉄結合能の測定を、以下のように行った。
【００９８】
ｈｏｌｏ型ラクトフェリンから鉄イオン（Ｆｅ３＋）を遊離させ、ａｐｏ型ラクトフェリンを調製した。次いで、炭酸イオン（ＣＯ３２−）存在下で鉄イオン（Ｆｅ３＋）を付加させた鉄再結合ラクトフェリンを調製した。ａｐｏ型及び鉄再結合ラクトフェリンの鉄含量及びタンパク質濃度を測定し、鉄結合量の測定を行った。詳細には、ａｐｏ型ラクトフェリンは、ｂＬｆ（未修飾ウシラクトフェリン）、上記５．の実験で得た２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆ及び４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆを０．１Ｍクエン酸緩衝液（pH２．１）で２４時間、さらに蒸留水で２４時間透析し、調製した。鉄再結合型ラクトフェリンの調製は、ａｐｏ型ラクトフェリンを０．００１％クエン酸鉄アンモニウム、５０mM  炭酸ナトリウム及び５０mM  塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（pH７．５）で２４時間透析を行った後、過剰の鉄イオンを除去するため、蒸留水、次いで５０mM  塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（pH７．５）に対して２４時間透析し、調製した。陰性コントロールであるＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）についても同様の操作を行った。タンパク質に結合している鉄イオンを比色法で測定するため、血清鉄測定キット「Ｆｅ  Ｃ−テストワコー」（和光純薬工業（株））を用いた。鉄の結合能は、Bradford法で定量したタンパク質１mg当たりに結合している鉄の結合量として算出した。その結果を表２に示す。
【００９９】
【表２】
2008069073.tif 000014
【０１００】
ａｐｏ型については、すべてのタンパク質において鉄の結合量は検出限界以下であった。一方、鉄再結合型については、陰性コントロールのＢＳＡ以外において鉄の結合が検出された。２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆ及び４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆ  については未修飾ｂＬｆと同等の鉄結合量が検出され、ＰＥＧ化によって鉄イオンの結合活性が失われていなかったことが明らかになった。
【０１０１】
９．ＰＢＳ（pH７．４）及びホウ酸緩衝液（pH９．０）における低モル比でのＬＦのＰＥＧ化反応の検討
ラクトフェリン：分岐型ＰＥＧ誘導体のモル比１：０．１〜１：５の範囲について、表1の分岐型ＰＥＧ誘導体３（日本油脂社製ＰＥＧ化試薬  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−２００ＧＳ２（２０kDa））を用いて、ＰＢＳ（pH７．４）及び５０mMホウ酸緩衝液（pH９．０）中でのＰＥＧ化ラクトフェリン（２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆ）の生成反応を検討した。
ウシラクトフェリン（ｂＬｆ）０．５〜２０mg/mlに対し、ｂＬｆ：ＰＥＧ誘導体のモル比が１：０．１〜１：５の混合比となる条件において２５℃で１時間カップリング反応を行い、反応液を７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ＣＢＢ染色により解析した。
【０１０２】
結果を図１３及び図１４に示す。ＰＢＳ（pH７．４）でのカップリング反応（図1３）において、ｂＬｆとＰＥＧ誘導体の混合モル比を一定にしてｂＬｆ濃度を増加させた場合、高分子ＰＥＧ化ラクトフェリン（バンド（ａ））が増加することが明らかとなった。一方、ｂＬｆ：ＰＥＧ誘導体の混合モル比を１：０．１まで減少させてカップリング反応を行った場合であっても、均一なＰＥＧ化ラクトフェリン（バンド（ｂ））が生成した。また、５０mMホウ酸緩衝液（pH９．０）でのカップリング反応を行った場合（図１４）においてもＰＢＳ（pH７．４）中での反応と同様に、ｂＬｆ濃度依存的に高分子ＰＥＧ化ラクトフェリン（バンド（ａ））が生成し、ｂＬｆとＰＥＧ誘導体の混合モル比を１：０．１まで減少させた場合においてもＰＥＧ化ラクトフェリン（バンド(b)）の生成が認められた。
【０１０３】
１０．ヘパリンセファロースを用いたステップワイズ塩濃度溶出によるＰＥＧ化ラクトフェリンの精製
表１の分岐型ＰＥＧ誘導体３（日本油脂社製ＰＥＧ化試薬  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−２００ＧＳ２（２０kDa））を用いて、ｂＬｆ（０．５mg/ml）：ＰＥＧ誘導体のモル比１：１０で２５℃、ＰＢＳ（pH７．４）で１時間のカップリング反応を行い、２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦを作製した。
【０１０４】
この反応液を試料として、ＰＥＧ化ラクトフェリンの精製を行った。Ｐｏｌｙ ｐｒｅｐカラム（BioRad 社製）に５mlのヘパリンセファロース（Heparin Sepharose）６  ＦＦ  (ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製) を充填した。この担体を、開始緩衝液である１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．６）で十分平衡化した後、上記で作製した２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦ反応液１００mlを、ペリスタポンプを用いて２ml/minの流速でカラムにアプライした。このときの分取画分を、ＦＴ：カラム非吸着画分とした。その後、１０mM  リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．６）１５mlでカラムを洗浄した。このときの分取画分をＷ:カラム洗浄画分（約１５ml）とした。
【０１０５】
その後、塩濃度のステップワイズ溶出を行って吸着画分を溶出した。使用した溶出液は、０．３M、０．４M、１．０M  ＮａＣlを含む開始緩衝液（pH７．６）である。溶出タンパク質の分取は、ＵＶ検出器の数値を確認しながら行った。分取した画分は、ＦＴ：非吸着画分（約１００ml）、Ｗ：カラム洗浄画分（約１５ml）、０．３M  ＮａＣｌ溶出画分としてＦ１、 Ｆ２、Ｆ３(約１０ml)、０．４M  ＮａＣｌ溶出画分としてＦ４、Ｆ５（約１０ml）、１．０M  ＮａＣｌ溶出画分としてＦ６、Ｆ７である。分取した画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ（クーマシー）染色でタンパク質の確認を行った。
【０１０６】
タンパク質の溶出パターン（クロマトチャート）と、対応する電気泳動結果を図１５に示す。図１５の上段（パネル（Ａ））に示したクロマトチャートでは、横軸にはタンパク質の溶出画分（ＦＴ：非吸着画分、Ｗ：カラム洗浄画分、０．３M  ＮａＣｌ溶出画分（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３）、０．４M  ＮａＣｌ溶出画分（Ｆ４、Ｆ５）、１M  ＮａＣｌ溶出画分（Ｆ６、Ｆ７）である。縦軸には、２８０nmの相対吸光度を示している。図１５の下段（パネル（Ｂ））に示した電気泳動図では、レーン「ＦＴ」、「Ｗ」、「Ｆ１」、「Ｆ２」、「Ｆ３」、「Ｆ４」、「Ｆ５」、「Ｆ６」、「Ｆ７」は、それぞれパネル（Ａ）のクロマトチャートの画分に対応する。レーン「ｂＬｆ」は、電気泳動のコントロールで、ウシラクトフェリンを１μg流した泳動像である。「Ｍ」は分子量マーカーを示す。
【０１０７】
０．３MのＮａＣｌで溶出した場合は、フラクションＦ１、Ｆ２、Ｆ３への未修飾ｂＬｆの混入はわずかであり、２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦが精製されていることがわかる。一方、０．４MのＮａＣｌで溶出した場合は、フラクションＦ４、Ｆ５には未修飾ｂＬｆの混入が認められ、２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬのみを精製することは出来なかった。
【０１０８】
以上より、ヘパリンセファロースカラムを用いた場合、ヘパリンセファロースに吸着される２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦは、０．３MのＮａＣｌで選択的に溶出され、良好に精製されることが示された。
【０１０９】
また、表１の分岐型ＰＥＧ誘導体４（日本油脂社製ＰＥＧ化試薬  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２（４０kDa））を用いて、ｂＬｆ（０．５mg/ml）：ＰＥＧ誘導体のモル比１：１０で２５℃、pH７．４で１時間のカップリング反応を行い、４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦを作製した。
この反応液を試料として用いたこと以外は、上記と同様にしてヘパリンセファロース（Heparin Sepharose）６  ＦＦに吸着させた後、塩濃度のステップワイズ溶出を行って吸着画分を溶出し、画分中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色によって確認した。
【０１１０】
結果を図１６に示す。０．３MのＮａＣｌで溶出した場合は、フラクションＦ１とＦ２への未修飾ｂＬｆの混入はわずかであり、４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦが精製されていることがわかる。一方、０．４MのＮａＣｌで溶出した場合は、フラクションＦ３とＦ４には未修飾ｂＬｆの混入が認められ、４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬのみを精製することは出来なかった。
【０１１１】
以上より、ヘパリンセファロースカラムを用いた場合、２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦ、４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦのいずれであっても、０．３MのＮａＣｌで選択的に溶出され、良好に精製されることが示された。
【０１１２】
１１．ホウ酸緩衝液（pH９．０）におけるＰＥＧ化反応時間の検討
表１の分岐型ＰＥＧ誘導体４（日本油脂社製ＰＥＧ化試薬  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−２００ＧＳ２（４０kDa））を用いて、５０mMホウ酸緩衝液（pH９．０）中での生成ＰＥＧ化ラクトフェリン（４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦ）の経時変化を検討した。ウシラクトフェリン（ｂＬｆ）０．５mgに対し、ｂＬｆ：ＰＥＧ誘導体のモル比が１：１０の混合比となる条件において２５℃でカップリング反応を行い、反応液を経時的にサンプリングして、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ＣＢＢ染色により解析した。比較のため、ＰＢＳ（pH７．４）中で同様の反応を行なった。
【０１１３】
結果を図１７に示す。ＰＢＳ（pH７．４）でのカップリング反応（パネル（Ａ））においては、未反応ラクトフェリン（バンド（ｃ））量が経時的に減少するとともに、ＰＥＧ化ラクトフェリン（バンド（ｂ））が増加し、さらにカップリング反応時間の延長に伴い、高分子ＰＥＧ化ラクトフェリン（バンド（ａ））が生成することが明らかとなった。一方、５０mMホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）でカップリング反応を行った場合（パネル（Ｂ））、ＰＥＧ化ラクトフェリン（バンド（ｂ））の生成量は１０分から２４時間までの反応時間において変化は認められなかった。
【０１１４】
さらに、分岐型ＰＥＧ誘導体３（日本油脂社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２‐２００ＧＳ２（２０kDa））を使用したこと以外は上記と同様にしてホウ酸緩衝液(pH９．０)中での生成ＰＥＧ化ラクトフェリン（２０ｋ‐ＰＥＧ‐ｂＬｆ）の経時変化を検討した。
【０１１５】
結果を図１８に示す。この場合も、５０mMホウ酸緩衝液(pH９．０)でカップリング反応を行った場合、ＰＥＧ化ラクトフェリン（バンド（ａ））の生成量は、１０分から２４時間までの反応時間において変化は認められなかった。
【０１１６】
以上より、分岐型ＰＥＧ誘導体３及び４のいずれについても、５０mMホウ酸緩衝液(pH９．０)中でカップリング反応を行った場合には、１０分間という極めて短時間で、均一な分子種（ＰＥＧ化ラクトフェリン）の生成が完了し、生成量がその後も減少しないことが示された。このように、短時間に均一な分子種（ＰＥＧ化ラクトフェリン）を作製でき、その後の時間経過に影響されない本反応条件は、ＰＥＧ化ラクトフェリンの大量調製（工業化）に極めて適している。
【０１１７】
１２．グッドバッファー（pH９．０）を用いたＰＥＧ化反応時間の検討
上記１１．の実験によって、ホウ酸ナトリウム緩衝液（pH９．０）中でのＰＥＧ化反応においては、１０分間という極めて短時間で、均一な分子種（ＰＥＧ化ラクトフェリン）を作製できることが示された。この結果がpH９．０であることに起因するのか、あるいはホウ酸ナトリウム緩衝液を使用したことに起因するのかを検討するため、グッドバッファー（pH９．０）を用いて検討を行なった。
Ｂｉｃｉｎｅ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ（同仁社製）の３種類のグッドバッファーを５０mM（pH９．０）で調製した。それぞれのバッファーを用いて上記９．と同様の実験を行なった。即ち、ウシラクトフェリン(ｂＬｆ)０．５mgに対し、ｂＬｆ：ＰＥＧ誘導体のモル比が１：１０になるように混合して、２５℃でカップリング反応を行い、生成ＰＥＧ‐ｂＬｆを含む反応液を１０分間、２０分間、４０分間、１時間反応後にサンプリングして７．５％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥの後、ＣＢＢ染色により解析した。
【０１１８】
結果を図１９に示す。パネル（Ａ）は分岐型ＰＥＧ誘導体４（日本油脂社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２‐４００ＧＳ２(４０kDa)）を使用した場合、パネル（Ｂ）は分岐型ＰＥＧ誘導体３（日本油脂社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−２００ＧＳ２（２０kDa））を使用した場合の結果である。どのグッドバッファー中においても、分岐型ＰＥＧ誘導体３及び４のどちらを用いても、１０分間という極めて短時間で、均一な分子種（ＰＥＧ化ラクトフェリン）が生成され、１時間経過しても生成されたＰＥＧ化ラクトフェリン量に変化は認められなかった。
【０１１９】
以上より、短時間で、均一な分子種（ＰＥＧ化ラクトフェリン）が作製されるための条件は、ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH９．０)の使用というよりも、pH９．０というバッファー条件であることが明らかになった。
【０１２０】
１３．陽イオン交換体によるＰＥＧ化ラクトフェリンの精製条件の検討
シリカを担体とした陽イオン交換カラムを用いてＰＥＧ化ラクトフェリン反応液中の未カップリングＰＥＧ誘導体及び未カップリングラクトフェリンを分離し、ＰＥＧ化ラクトフェリンを一段階で精製した。
分岐型ＰＥＧ誘導体３（日本油脂社製ＰＥＧ化試薬  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−２００ＧＳ２（２０kDa））及び同４（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２（４０kDa））を用いてｂＬｆ（０．５mg/ml）：ＰＥＧ誘導体のモル比１：１０で２５℃、pH７．４で１時間のカップリング反応を行い、それぞれ２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦ及び４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦを作製した。
この反応液を試料として、カルボキシメチル基（ＣＭ）を官能基に持つシリカを担体とした弱陽イオン交換カラム（ＣＭ−ＥＰ−ＤＦ−１０−５００Ａ、カラムサイズ  ２．５ml、旭硝子エスアイテック（株））を用いて反応生成物を吸着させた。ＰＥＧ化ラクトフェリンの溶出は「Ａｋｔａ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ」（商品名）（GE Healthcare社）を用いて行なった。緩衝液として、５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）、及び溶出緩衝液として１．５M  ＮａＣｌを含む５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）を用い、流速１．０ml/minで、直線的勾配（linear  gradient）で２０カラム容量かけて塩濃度を上昇させることでＰＥＧ化ラクトフェリンの分離を行った。得られた各溶出画分を７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色により溶出パターンを解析した。
【０１２１】
２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦ及び４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦについての結果を、それぞれ図２０及び図２１に示す。図２０及び図２１において、パネル（Ａ）は溶出プロフィール、パネル（Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。パネル（Ａ）における「Ｃｏｎｄ」は緩衝液の電気伝導度の変化（実際の塩濃度変化）、「Ｃｏｎｃ」は理論上の塩濃度変化を示している。パネル（Ａ）における横軸の「Ｆ」及び「Ａ１」〜「Ａ１２」はパネル（Ｂ）のレーン「Ｆ」及び「１」〜「１２」にそれぞれ対応する。パネル（Ｂ）のレーン「Ｍ」はマーカー、「ｓｔｄ」は電気泳動のコントロールで、ウシラクトフェリン（ｂＬＦ）１００ngを流したときの泳動像である。
分岐型ＰＥＧ誘導体３及び４のいずれを用いた場合も、ＰＥＧ化したラクトフェリン反応液から、弱陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて未修飾ラクトフェリンとＰＥＧ化ラクトフェリンを良好に分離・精製できることが明らかとなった。
【０１２２】
１４．ＰＥＧ化ラクトフェリンの抗炎症活性（ＩＬ−６産生抑制活性）及び細胞毒性
ラクトフェリン（ｂＬｆ）の生理活性の一つに抗炎症作用がある。ｂＬｆは、ヒト単球細胞（ＴＨＰ−１）培養系においてリポポリサッカライド（ＬＰＳ）のエンドトキシンショックにより産生されるＩＬ−６量を抑制することが報告されている（Mattsby-Baltzer I et al., Pediatr Res, 40, 257-262 (1996), Haversen L et al., Cell Immunol, 220, 83-95 (2002)）。そこで、上記１３．において作製、精製したＰＥＧ−ｂＬｆ（２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦ及び４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦ）も、ｂＬｆと同様のエンドトキシンショックの抑制活性を保持しているかどうかを検討した。
【０１２３】
ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％  ＦＢＳ、２mMグルタマックスを添加したもの；以下「培地」と記す）で継代培養を続けているＴＨＰ−１細胞を、５×１０４個/mlの細胞濃度で継代し、２４時間培養した後、ヒトＩＦＮ−γ（４０ng/ml）及びカルシトリオール（２０ng/ml）を添加し、その後さらに３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間培養した。培養後の細胞を遠心分離で集め、培地で洗浄後、細胞を新鮮な培地に懸濁して１×１０６細胞/mlの細胞濃度に調整し、細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を２４ウェルプレートに４００μl/wellで蒔き３７℃、５％  ＣＯ２で１時間静置後、各ウェルにＬＰＳのみ（１００ng/ml）、ＬＰＳ（１００ng/ml）＋ｂＬｆ又はＰＥＧ−ｂＬｆ（各１００μg/ml）、Ｌｆ又はＰＥＧ−ｂＬｆのみ（各１００μg/ml）、培地を添加し２４時間後に培養上清を回収した。
培養上清中のＩＬ−６量は、ヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ測定キット（鎌倉テクノサイエンス（株））を用いて測定した。ＩＬ−６の産生抑制活性は、ＬＰＳのみを添加した場合に産生抑制されるＩＬ−６量とＬＰＳとｂＬｆの共存下で産生されたＩＬ−６量を比較し、産生が抑制されたＩＬ−６量から算出した。ｂＬｆの抑制活性を１００％としてそれぞれのＰＥＧ−ｂＬｆの比活性を算出した。
【０１２４】
一方、ＰＥＧ−ｂＬｆが細胞毒性を示さないことを確認するため、ＴＨＰ−１細胞にｂＬｆ及びＰＥＧ−ｂＬｆを添加した後、細胞の生存度を「Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８」（商品名）（同仁化学（株））を用いて測定した。具体的には、上記バイオアッセイ用に調製したＴＨＰ−１細胞培養液中に、５００μg/ml（通常の５倍濃度）のｂＬｆ及びＰＥＧ−ｂＬｆを添加し、２４時間３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーター内で培養を行った。培養後、「Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８」を各ウェルに１００μｌずつ加え、ＣＯ２インキュベーター内で６０分間静置後４５０nmの吸光度を測定した。この試験では、加えたタンパク質が細胞に対して毒性を示せば生細胞数が減少し、「Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８」添加後の４５０nmにおける吸光度が低下する。
【０１２５】
ＰＥＧ−ｂＬｆのＩＬ−６産生抑制活性を図２２及び表３に、細胞毒性試験の結果を図２３及び表４に、それぞれ示す。
【０１２６】
【表３】
2008069073.tif 000015
【０１２７】
【表４】
2008069073.tif 000016
【０１２８】
図２２及び表３において、ｂＬｆをＬＰＳと共存させた場合のＩＬ−６減少量は約８３pg/ml、２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆにおいては約５２pg/ml、４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆにおいては約７７pg/mlであった。ｂＬｆのＩＬ−６産生抑制活性を１００％とした場合、２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆでは約６３％、４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆにおいては約９０％以上の活性が残存しており、ＰＥＧ化を行った場合においても、ｂＬｆの有する抗炎症活性は残存していることが明らかとなった。
図２３及び表４において、２０ｋ−及び４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬｆは細胞のみで培養した場合と同等の吸光度（細胞生存度）を示していた。したがって、ＰＥＧ化ラクトフェリンは細胞毒性を示さないことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、分岐型ＰＥＧ誘導体を用いてウシラクトフェリンを修飾した生成物を、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色で解析したゲルの写真を示す図である。
【図２】図２は、直鎖型ＰＥＧ誘導体を用いてウシラクトフェリンを修飾した生成物を、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色で解析したゲルの写真を示す図である。
【図３】図３は、異なるpH条件下での分岐型ＰＥＧ誘導体とウシラクトフェリンとの複合体の形成を解析したゲルの写真を示す図である。
【図４】図４は、２５℃で異なる反応時間条件下での分岐型ＰＥＧ誘導体とウシラクトフェリンとの複合体の形成を解析したゲルの写真を示す図である。
【図５】図５は、１６℃で異なる反応時間条件下での分岐型ＰＥＧ誘導体とウシラクトフェリンとの複合体の形成を解析したゲルの写真を示す図である。
【図６】図６は、４℃で異なる反応時間条件下での分岐型ＰＥＧ誘導体とウシラクトフェリンとの複合体の形成を解析したゲルの写真を示す図である。
【図７】図７は、分岐型ＰＥＧ誘導体を用いてヒトラクトフェリンを修飾した結果を、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したゲルの写真を示す図である。
【図８】図８は、ＰＥＧ化ウシラクトフェリンをヘパリンカラム、ゲルろ過カラムで精製した結果を、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したゲルの写真を示す図である。
【図９】図９は、精製されたＰＥＧ化ｂＬｆのＰＥＧ化をヨウ化バリウム染色で調べたゲルの写真を示す図である。
【図１０】図１０は、未修飾ラクトフェリン、精製ＰＥＧ化ラクトフェリンをペプシン（パネルＡ）又はトリプシン（パネルＢ）で消化後、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したゲルの写真を示す図である。
【図１１】図１１は、未修飾ラクトフェリン、精製ＰＥＧ化ラクトフェリンをトリプシンで消化後、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した図である。
【図１２】図１２は、ペプシン、トリプシンによるＰＥＧ化ｂＬｆの経時的な分解を、未修飾ｂＬｆの分解と比較した図である。
【図１３】図１３は、ｂＬＦ：ＰＥＧ誘導体のモル比が１：５〜１：０．１となる条件下での２０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦの生成を示すゲルの写真を示す図である。
【図１４】図１３は、ｂＬＦ：ＰＥＧ誘導体のモル比が１：５〜１：０．１となる条件下での４０ｋ−ＰＥＧ−ｂＬＦの生成を示すゲルの写真を示す図である。
【図１５】ステップワイズ塩濃度溶出法によるヘパリンセファロースを用いた２０ｋ-ＰＥＧ-Ｌｆの精製を示す図である。パネル（Ａ）：カラムの溶出プロフィールを示す図である。パネル（Ｂ）：精製された分岐型ＰＥＧ誘導体３とウシラクトフェリンとの複合体の形成を解析したゲルの写真を示す図である。
【図１６】ステップワイズ塩濃度溶出法によるヘパリンセファロースを用いた４０ｋ-ＰＥＧ-Ｌｆの精製を示す図である。パネル（Ａ）：カラムの溶出プロフィールを示す図である。パネル（Ｂ）：精製された分岐型ＰＥＧ誘導体４とウシラクトフェリンとの複合体の形成を解析したゲルの写真を示す図である。
【図１７】図１７は、ＰＢＳ（pH７．４）中（パネル（Ａ））及びホウ酸緩衝液（pH９．０）中（パネル（Ｂ））における分岐型ＰＥＧ誘導体４とウシラクトフェリンとの複合体の形成を解析したゲルの写真を示す図である。
【図１８】図１８は、ＰＢＳ（pH７．４）中（パネル（Ａ））及びホウ酸緩衝液（pH９．０）中（パネル（Ｂ））における分岐型ＰＥＧ誘導体３とウシラクトフェリンとの複合体の形成を解析したゲルの写真を示す図である。
【図１９】図１９は、３種のグッドバッファー（Ｂｉｃｉｎｅ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ）中及びホウ酸緩衝液中（いずれもpH９．０）における分岐型ＰＥＧ誘導体４とウシラクトフェリンとの複合体の形成を解析したゲルの写真を示す図である。パネル（Ａ）では分岐型ＰＥＧ誘導体４を、パネル（Ｂ）では分岐型ＰＥＧ誘導体３を、それぞれ使用した。
【図２０】図２０は、陽イオン交換体による分岐型ＰＥＧ誘導体３でＰＥＧ化されたラクトフェリンの精製を示す図である。パネル（Ａ）：カラムの溶出プロフィールを示す図である。パネル（Ｂ）：精製された分岐型ＰＥＧ誘導体３とウシラクトフェリンとの複合体の形成を解析したゲルの写真を示す図である。
【図２１】図２１は、陽イオン交換体による分岐型ＰＥＧ誘導体４でＰＥＧ化されたラクトフェリンの精製を示す図である。パネル（Ａ）：カラムの溶出プロフィールを示す図である。パネル（Ｂ）：精製された分岐型ＰＥＧ誘導体４とウシラクトフェリンとの複合体の形成を解析したゲルの写真を示す図である。
【図２２】図２２は、ＰＥＧ化ラクトフェリンによるＴＨＰ−１細胞のＩＬ−６産生の抑制を調べた結果を示す図である。
【図２３】図２３は、ＰＥＧ化ラクトフェリンによるＴＨＰ−１細胞に対する細胞毒性試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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