(57)【要約】      （修正有）【課題】低コンダクタンス及び中間コンダクタンスのカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質の提供。【解決手段】カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質、及びカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする核酸を製造し、そして検出するための組成物及び方法、並びにカルシウム−活性化されたカリウムチャネルを通してのカリウムイオン流を高め又は低める化合物をアッセイするための方法及び組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載されるようなカルシウム−活性化されたカリウムチャネルのモノマーをコードする単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低コンダクタンス（SK）及び中間コンダクタンス（IK）のカルシウム−活性化された（alcium-activated）カリウムチャネル に関する組成物及びその同定方法に関する。本発明はさらに、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルを通してカリウムイオン流（flux）を高め又は低める化合物についてのアッセイ方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウム−活性化されたカリウム流は、広範囲の種類の動物細胞、たとえば神経、筋肉、腺又は上皮組織において、及び免疫系から見出される。それらの流 れを調節するチャネルは、内部カルシウム濃度が上昇するにつれて、開口し、そしてカリウムの排出を可能にする。カリウムイオンの外部流は、細胞の内部をより陰性にし、細胞に適用される脱分極化電圧を妨害する。
【０００３】
２種の別個の種類のカルシウム−活性化されたＫ+ チャネル(Kcaチャネルが記載されている。高コンダクタンスのカルシウム−活性化されたＫ+チャネル（BKチャネル）は、内部カルシウムイオン及び膜電位の協調された作用により閉じられ、そして 100〜200pS の単位コンダクタンスを有する。低（SK）及び中間（IK）コンダクタンスのカルシウム−活性化されたＫ+チャネルは、内部カルシウムイオンにより単独で閉じられ、それぞれ２〜20及び20〜85pSの単位コンダクタンスを有し、そしてBKチャネルよりもカル シウムに対してより敏感である（総説として、Latorreなど., 1989, Ann Rev Phys, 51 : 385-399 を参照のこと）。さらに、個々のタイプのＫCBチャネルは異なった薬理学的プロフィールを示す。３種類すべてが広く発現され、そしてそれらの活性は膜電位を高分極化する。BK (Atkinsonなど.,1991, Science, 253 : 551-555 ; Adelman など.,1992 Neuron, 9 : 20
9-216 ; Butler,1993, Science, 261 : 221-224) 及びSK (Kohlerなど., 1996, Science
, 273 :1709-1714)サブファミリーのメンバーがクローニング化され、そして異種細胞型
において発現され、そこでそれらの生来の対応物の基本的性質を再現する。
【０００４】
脊椎動物のニューロンにおいては、活動電位に続いて、数秒間持続し、そしてニューロンの開始パターンのための絶大な因果関係を有する後高分極化 （afterhyperpolarization)(AHP)が存在する。AHPの変更は、発作活動（Algerなど., J. Physiol. 399 : 191-205
(1988））、並びに学習及び記憶（deJongeなど., Exp. Br. Res. 80 : 456-462 (1990)
) に関係している。AHP は、２つの顕著な成分、すなわちバースト(burst)の開始におい
てスパイク頻度(spike frequency) を仲介する早い成分（fAHP) 、及びそれに続く遅い成分（sAHP) であってスパイク−頻度の適合をつかさどるものから構成される（Nicoll,Sc
ience 241 :545-551 (1988)) 。
【０００５】
AHP の個々の成分は動能的に異なり、そして異なるカルシウム−活性化されたカリウムチャネルの活動によるものである。高コンダクタンス(100〜200 ピコジ−メンス（pS））の電圧−及びカルシウム−活性化されたカリウムチャネル（BKチャネル）の活性化はfAHPの基礎となり、これは急速に進行し（１〜２ミリ秒）、そして10ミリ秒内に崩壊する（Lancaster など., J.Physiol. 389 : 187-203 (1987) ; Viana など.,J. Neurophysiol. 
69 : 2150-2163(1993））。sAHPの基礎となるチャネルは、BKチャネルとは異なり、より
カルシウム感受性であり、電圧−閉鎖されず、そして低い単位コンダクタンスを有する、低コンダクタンスのカルシウム活性化されたカリウムチャネル（SK チャネル）である（Lancasterなど.,J.Neurosci. 11 : 23-30 (1991) ; San, J. Neurophysiol. 74 : 1772-1
776 (1995））。
【０００６】
fAHP及びsAHPは、それらの薬理学においても異なる。fAHPはBKチャネルの薬理学によれば、低濃度の外部テトラエチルアンモニウム(TEA) 及びカリブドトキシン(CTX）によりブロックされる（Lancasterなど.,J. Physiol. 389 : 187-203 (1987) ; Viana など., J
. Neurophysiol.69 : 2150-2163 (1993）; Butlerなど., Science 261 : 221-224 (1993
））。対照的に、sAHPはCTXに対して感受性ではないが、しかしハチ毒ペプチドトキシン
、アパミンに対する感度に関して２つの種類に分類される。たとえば、海馬錐体ニューロンにおいては、sAHPはアパミンに対して感受性ではないが（Lancasterなど.,J. Neurop
hysiol. 55 :1268-1282 (1986））、海馬ニューロン間及び迷走神経性ニューロンにおい
ては、それはナノモル濃度のトキシンによりブロックされる（Sah, J. Neurophysiol. 74
:1772-1776 (1995) ; Zhang など., J. Physiol. 488 : 661-672 (1995））。
【０００７】
ニューロン細胞におけるその役割の他に、マイクロモルより低濃度のカルシウムにより活性化され、電圧閉鎖されていないアパミン−感受性カリウムチャネル が、末梢細胞型、たとえば骨格筋（Blatzなど.,Nature 323 : 718-720 (1986)）、腺細胞（Tse など., S
cience 255 :462-464 (1992) ; Park, J. Physiol. 481 : 555-570 (1994)) 及びＴ−リ
ンパ球（Grissmerなど.,J. Gen. Physiol. 99 : 63-84 (1992））からも記載されている
。
【０００８】
たとえば、SKチャネルは、筋緊張性筋ジストロフィーを有する患者の筋膜に見出されるアパミン受容体を代表することが提案されている（Renaudな ど.,Nature 319 : 678-680 (1986)) 。また、Grissmerなど.,(J. Gen. Physiol. 99 : 63-84(1992)) は、CTX 非感
受性、アパミン感受性、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルがヒト白血病Ｔ細胞に同定されることを報じており、そしてカルシウム活性化されたカリウ ムチャネルがカルシウムシグナルの力学的パターンを維持することによってＴ−細胞活性化の間、支持の役割を演じることを示唆する。さらに、多くの細胞において、SKチャネルは、神経伝達物質又はホルモン作用の結果として活性化される（Haylett など., Potassium Channels :Structure,Classification, Function and Therapeutic Potential (Cook, N. S.,ed.), 
pp. 71-95, John Wiley and Sons, 1990) 。中間チャネルは赤血球細胞の生理学において役割を演じる。
【０００９】
中間コンダクタンスのカルシウム−活性化されたカリウムチャネルは、それらの電気生理学により文献にこれまで記載されて来た。Gardosチャネルは、 マイクロモルより低濃度の内部カルシウムにより開口され、そして−120mVでの50pS〜120mV での13pSの範囲の整流単位コンダクタンスを有する（対称120mM Ｋ+ ；Christophersen,1991, J. Membrane Biol., 119 :75-83) 。それはカリブドトキシン(CTX) によりブロックされるが、しかし
構造的に関連するペプチドイベリオトキシン(IBX) によってはブロックされず、それらの両者はBKチャネルをブロックする（Brugnaraなど.,1995a,J. Membr. Biol., 147 : 71-
82) 。
【００１０】
アパミン、ある生来の可能性あるブロッカー（Vincent など., 1975, J. Biochem., 14, 2521 ; BlatzandMayleby, 1986, Nature, 323 : 718-720)及びクローン化されたSKチ
ャネルは、IKチャネルをブロックしない（de-Allieなど.,1996, Br. J. Pharm., 177 : 
479-487)。Gardosチャネルはまた、イミダゾール化合物、たとえばクロトリマゾールによりブロックされるが、しかしケトコナゾールによっては ブロックされない（Bragnaraなど.,1993, J.Clin. Invest., 92 : 520-526)。Gardosチャネルの電気生理学的及び薬理学
的性質は、それが本発明のIKサブファミリーに属することを示す。
【００１１】
IKチャネルは、種々の他の細胞型において記載されている。ラット皮質収集管（cortical collecting duct）の成分細胞（principlecell）は、異なった種類のＫ+ チャネルを
管腔膜と基底外側(basolateral)膜とに分離する。IKチャネルは、それらがこの膜を通し
てのＫ+ の再循環を促進し、Na+ ＋Ｋ+ −ATP アーゼの活性を高め、そしてそれにより血液中へのNa+  再吸収を高める基底外側膜に存在する（HirschandSchlatter, 1995, Pfl
ugers Arch.−Eur.J.Physiol., 449 : 338-344)。
【００１２】
IKチャネルはまた、それらがブラジキニンの血管拡張効果を担当する腎臓の微小血管系に包含されている（Rapaconなど., 1996)。脳細管内皮細胞においては、IKチャネルは、
ニューロン及びグリアにより生成されるエンドセリンにより活性化され、過剰のＫ+ を血液の方に向ける（Renterghemなど.,1995,J. Neurochem., 65 : 1274-1281) 。微生物侵
入に対して防御する好中球性顆粒球、すなわち移動性ファゴサイト細胞は、アゴニスト刺激に続いて、大きな脱分極化を受け、そしてIKチャネルはその刺激さ れた顆粒球の再分極化に関連する（Varnaiなど.,1993,J.Physiol., 472 : 373-390)。IKチャネルはまた、
体止及び活性化されたヒトＴ−リンパ球においても同定されている。
【００１３】
Grissmerなど.(1993,J. Gen. Physiol. 102 : 601-630)は、IKチャネルが低ナノモル
濃度のカリブドトキシンによりブロックされ、少々の又はまったくの電圧依存性を示さず、そしてアパミンに対して非感受性であることを報告している。この チャネルはまた、それが細胞内容積ホメオスタシスにおいて（Joiner,C. H., 1993, Am. J. Physiol. 264 :
C251-270)及び平滑筋において（Van Rentergnem, C.など., 1996, J. Neurochemistry 65 :1274-1281)、重要な役割を演じるヒト赤血球細胞においても同定されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、SK及びIKチャネルは、多くの細胞型において鍵となる生理学的役割を演じるカルシウム−活性化されたカリウムチャネルのサブファミリーを含む ように思われる。従って、広範囲の種類の生理学的機能におけるSK及びIKチャネルの鍵となる役割を得る場合、当業界において必要とされることは、新規SK及びIKチャネルタンパク質及びそれをコードする核酸の同定である。従って、必要とされることは、学習及び記憶障害、発作、筋緊張性ジストロフィー、 免疫応答、及び神経伝達物質又はホルモン分泌の処理又は調節への使用のためにSK及びIKチャネル流を高め又は低める化合物を同定する方法である。本発明はそれらの及び他の利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第１の広い観点において、本発明は、カルシウム−活性化されたカリウムイオンチャネルの、モノマーとして定義される新規タンパク質類及びそれらの対応する核酸を供給する。前記モノマーは、40〜80kDaの分子量を有し、そして前記モノマーがキセノパス(Xenop
us) 卵母細胞において発現されるようなポリマー形で存在する場合、２〜80pSのコンダクタンスの単位を有する。さらに、前記モノマーは、配列番号30又は42に対して生成される抗体に対して特異的に結合する。
【００１６】
もう１つの観点において、本発明は、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質の少なくとも15個の隣接するアミノ酸をコードする単離された 核酸に関する。SKチャネルタンパク質は、配列番号１，２，３，４，19，20,32, 43及び47、並びに配列番号１，２，３，４，19，20,32, 43及び47の保存的に修飾された変異体から成る群から選択
された配列を有する。
【００１７】
いくつかの態様においては、単離された核酸は、キセノパス卵母細胞において発現される場合、少なくとも２pSのコンダクタンス、40〜100Kd の分子量を有し、そして緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、SK又はIKコード核酸、たとえばヒトゲノムライブラリーにおける配列番号13又はラットゲノムライブラリーにおける配列番号14と選択的にハイブリ
ダイズし、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする。他の態様においては、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質 をコードする単離された核酸は、配列番号１，２，３，４，19，20,32, 43及び47から成る群から選択された配列を有するタンパク質をコードする。好ましい態様においては、核酸は、配列番号13，14，15，16，21，22,31, 44及び48から成る群から選択された配列を有する。
【００１８】
もう１つの観点において、本発明は、配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43及び47，１，２，３，４，19，20,32, 43及び47の保存的に修飾された変異体から成る群から選
択された配列の少なくとも15個の隣接するアミノ酸を有する単離されたカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質に関し、ここで前記変異体は、 免疫学的に反応性の条件下で、配列番号１，２，３，４，19，20,30, 32, 43及び47から成る群から選択されたタンパク質に対して反応性の抗体と特異的に反応する。
【００１９】
広い態様において、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質は、少なくとも２pSのコンダクタンス及び40〜100Kdの分子量を有するものとして定義される。他の
態様においては、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質は、配列番号１，２，３，４，19，20,32, 43及び47から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する。
【００２０】
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43及び47から成る群から選択された配列を有する、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質に対して、免疫学的に反応性の条件下で特異的に反応する抗体に向けられる。好ましい態様においては、前記抗体はモノクローナル抗体に制限される。
【００２１】
さらにもう１つの観点においては、本発明は、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルのモノマーをコードする核酸を含んで成る発現ベクターに関し、こ こで前記モノマーは配列番号１，２，３，４，19，20,32, 43及び47、及び配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43又は47の保存的に修飾された変異体から成る群から選択された配列を有し、そして前記修飾された変異体は、キセノパス卵母細胞において発現される場合、少なくとも２pSのコンダクタンス、40〜100Kdの分子量を有し、そして免疫学的に反応性の条件下で
、配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43及び47から成る群から選択された十分な長さのタンパク質と反応性の抗体と特異的に反応するタンパク質である。
【００２２】
もう１つの観点において、本発明は、配列番号１，２，３，19，20, 32, 43及び47、及び配列番号１，２，３，19，20, 32, 43又は47の保存的に修飾された変異体から成る群から選択された配列を有する、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質のモノマーをコードする核酸を含んで成るベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞に関し、ここで前記修飾された変異体は、キセノパス卵母細胞において発現される場合、 少なくとも２pSのコンダクタンス、40〜100Kdの分子量を有し、そして免疫学的に反応性の
条件下で、配列番号１，２，３，19，20, 32, 43及び47から成る群から選択された十分の長さのタンパク質に対して反応性の抗体と特異的に反応するタンパク質である。典型的には、宿主細胞は、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする核酸の発現を可能にする条件下で培養される。
【００２３】
さらにもう１つの観点においては、本発明は、配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43及び47から成る群から選択された、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする核酸に対して、緊縮条件下で特異的にハイブリダイズする少なくとも15個の長さのヌクレオチドの単離された核酸配列に関する。
【００２４】
さらなる観点においては、本発明は、生物学的サンプルにおけるカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質の存在を検出するための方法に向けられる。この方法は
、配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43及び47から成る群から選択された配列を有するカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質に対して、免疫学的に反応性の条件下で特異的に反応する抗体と生物学的サンプルとを接触せしめ、そして免疫学的に反応性の条件下で前記タンパク質への前記抗体の結合を可能にすることを含んで成り、ここで 前記結合された抗体の検出がチャネルタンパク質の存在を示す。
【００２５】
さらにもう１つの観点においては、本発明は、少なくとも25個の長さのアミノ酸のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする核酸 配列の生物学的サンプルにおける存在を検出するための方法を提供する。この方法は、配列番号１，２，３，４，19，20,32,43及び47から成る群から選択された配列を有するチャネルタンパク質を
コードする核酸に対して選択的にハイブリダイズする核酸セグメントを含んで成る核酸プローブと生物学的サンプルとを緊縮ハイブリダイゼーション条件下で接 触せしめ；ハイブリダイゼーション複合体を形成するために前記プローブへの前記チャネルタンパク質をコードする核酸のハイブリダイゼーションを可能にすることを含んで成り、ここで前記ハイブリダイゼーション複合体の検出がサンプルにおける核酸配列の存在を示すものである。いくつかの態様において、ハイブリ ダイゼーション条件は、中位の緊縮ハイブリダイゼーション条件である。
【００２６】
他の態様においては、カルシウム−活性化されたチャネルタンパク質は、少なくとも 400個の長さのアミノ酸残基であり、そして卵母細胞において発現される場合、少なくとも２pSのコンダクタンスを有する。さらなる態様においては、核酸プローブは、小さな又は中位のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質コア領域内の副配列をコードする少なくとも250個の隣接したヌクレオ チドを含んで成る。
【００２７】
さらなる観点において、本発明は、 hSK１のために配列番号５、及び６； rSK２のために配列番号７及び８；内因性 rSK３のために配列番号９及び10；rSK１のために配列番号11及び12； hSK２のために配列番号23及び24；hSK３のために配列番号25及び26；及び h
IKのために、ヒトゲノム又はcDNAライブラリーからhIK１を同定するために選択的である
プローブを増幅するであろう次のプライマー対：約 270個の塩基のプローブを生成する 5'GCCGTGCGTGCAGGATTTAGG 3'（配列番号34）及び5' CCAGAGGCCAAGCGTGAGGCC 3'（配列番
号35）、又は約165個の塩基のブローブを生成する 5' TCCAAGATGCACATGATCCTG 3'（配列
番号36）及び5' GGACTGCTGGCTGGGTTCTGG 3'（配列番号37）から成る群から選択されたプ
ライマーと同じ核酸配列に、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、選択的にハイブリダイズするプライマーにより増幅される核酸によりコードされる、単離されたカルシウム−活性化されたカリウムチャネルに関する。
【００２８】
十分な長さのhIK１の増幅のためには、次の２種のプライマー対が作動するであろう：
5'ATGGGCGGGGATCTGGTGCTTG 3'（配列番号38）及び 5' CTACTTGGACTGCTGGCTGGGTTC 3' （
配列番号39）、又は5' ATGGGCGGGGATCTGGTGCTGG 3' （イニシエターメチオニンのコドン
を含む）（配列番号40）及び5' GGGTCCAGCTACTTGGACTGCTG 3'（翻訳の終結のための停止
コドンを含む）（配列番号41）。
【００２９】
さらにもう１つの観点においては、本発明は、低又は中間コンダクタンスのカルシウム−活性化されたカリウムチャネルを通してカリウムイオン束を高め又は 低める、クロトリミゾールではない化合物を同定する方法に関する。この方法は、配列番号１，２，３，４，19，20,32,43，47及びそれらの保存的に修飾された変異体から成る群から選択された
配列を有するカルシウム−活性化されたカリウムチャネルをコードする核酸を発現されている真核宿主細胞と前記化合物とを接触せしめ、ここで前記保存的に修 飾された変異体は、配列番号１，２，３，４，19，20,32, 43及び47から成る群から選択されたアミノ酸配列を有し、少なくとも２pSのコンダクタンス及び40〜100KD の分子量を有する抗原と特異
的に反応する抗体に対して特異的に結合し；そして前記チャネルを通しての高められた又は低められたカリウムイオン束を決定する段階を含んで成る。
【００３０】
好ましい態様においては、前記高められた又は低められたカリウムイオン流（flux）は、前記真核宿主細胞の細胞膜を通しての電流又はイオン束を測定 し、又は電流又はイオン束の変化により誘発される電圧の変化を直接的に測定することによって決定される。特に好ましい態様においては、前記チャネルタンパク質は、配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43及び47から成る群から選択された配列を有する。もう１つの好ましい態様においては、チャネルタンパク質は、組換え体である。
【００３１】
さらなる観点においては、本発明は、少なくとも 400個の長さのアミノ酸残基のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする単離された真核核酸に関し、ここで前記カルシウム−活性化されたチャネルタンパク質は、配列番号１，２，３，４，19，20,32, 43及び47から成る群から選択されたタンパク質のコア領域の長さに対して
少なくとも55〜60％の類似性を有するアミノ酸を含んで成り、そして少なくとも２pSのコンダクタンスを有する。いくつかの態様においては、本発明は前 記単離された真核核酸によりコードされるタンパク質に向けられる。他の態様においては、カルシウム−活性化されたチャネルタンパク質をコードする単離された核酸は、前記コア領域内の20個の隣接したアミノ酸残基の比較窓に対して少なくとも85％の配列類似性を有する。
【００３２】
さらなる観点においては、本発明は、配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43及び47から成る群から選択されたタンパク質のコア領域の長さに対して少なくとも55％の類似性を有するアミノ酸配列を含んで成り、そして少なくとも２pSのコンダクタンスを有する、少なくとも 400個の長さのアミノ酸残基のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする単離された真核核酸を含んで成るベクターに向けられる。典型的には、前記ベクターは、チャネルタンパク質をコードする単離された真核核酸の発現を可能にする条件下で培養される宿主細胞中にトランスフェクトされ る。
【００３３】
さらなる観点においては、本発明は、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルを通してのカリウムイオン束を高め又は低める化合物を同定するための方法 に向けられる。この方法は、少なくとも400個の長さのアミノ酸のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質を発現している真核宿主細胞と前記化合物とを接触せしめ、ここでチャネル タンパク質は、配列番号１，２，３，４，19，20,32, 43及び47から成る群から選択されたタンパク質のコア領域の長さに対して少なくとも55％の類似性を有するアミノ酸配列、及び少なくとも２pSのコンダ クタンスを有し；そしてチャネルタンパク質を通しての高められた又は低められたカリウムイオン束を決定する段階を含んで成る。いくつかの場合、前記高められた又は低められたカリウムイオン束は、真核宿主細胞の細胞膜を通しての電流を測定することによって決定される。
【００３４】
もう１つの観点においては、本発明は、SK及びIK遺伝子の突然変異のためのスクリーニング方法をコンピューターシステムに供給し、ここで前記方法は、（ｉ）配列番号１，２，３，４，19，20,32,43，47及び保存的に修飾されたそれらの変異体から選択された配
列を有するカルシウム−活性化されたチャネルタンパク質をコードする第１核酸配列を入力し：（ii）前記第１核酸配列に対して実質的な同一性を有する第２ 核酸配列と前記第１核酸配列とを比較し；そして（iii）前記第１及び第２核酸配列間のヌクレオチド差異を同定する段階を含んで成る。第１の態様においては、前記第２核酸配列は、疾病状態に関連している。
【００３５】
もう１つの観点においては、本発明はSK及びIKタンパク質の立体構造を同定するための方法のコンピューターシステムを提供し、ここで前記方法は、（ｉ）配列番号１，２，３
，４，19，20,32, 43，47及び保存的に修飾されたそれらの変異体から選択されたアミノ
酸配列を有するカルシウム−活性化されたチャネルタンパク質、又は前記タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を入力し；そして（ii）前記アミノ酸配列によりコードされるタンパク質の立体構造を生成する段階を含んで成る。
【００３６】
１つの態様においては、前記アミノ酸配列は、一次構造であり、そしてその生成段階は、前記一次構造によりコードされるエネルギー条件を用いて前記一次構 造から二次構造を形成し、そして前記二次構造によりコードされるエネルギー条件を用いて前記二次構造から三次構造を形成する段階を包含する。もう１つの態様においては、生成段階は、前記三次構造によりコードされる異方性条件を用いて前記三次構造から四次構造を形成する段階も包含する。もう１つの態様におい ては、前記方法はさらに、リガンドに結合するタンパク質の立体構造の領域を同定し、そして前記タンパク質に結合するリガンドを同定するために前記領域を用いる段階を含んで成る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明は、新規の単離された低コンダクタンスのカルシウム−活性化されたカリウム（SK）チャネル、中間コンダクタンスのカルシウム−活性化されたカリ ウム（IK）チャネル（集合的には、“カルシウム−活性化されたカリウムチャネル”）、及び単離された核酸コードSK及びIKチャネル（すなわち、SK及びIKチャネル核酸）を供給する。その分布、機能及び薬理学は、SK又はIKチャネルとしてのそれらの新規種類のチャネルを定義する。
【００３８】
宿主細胞における単離されたSK又はIKチャネルタンパク質コード核酸の発現は、それぞれ、低コンダクタンスのカルシウム−活性化されたカリウム （SK）チャネル又は中間コンダクタンスのカルシウム−活性化されたカリウム（IK）チャネルを通してのカリウムイオン束を高め又は低める化合物を同定するために使用され得る組成物を供給する。SKチャネルはニューロンの後高分極化（sAHP) の遅延成分に従がうので、ニューロンsAHPの変更はてんかん性発作を阻害し、又は学習又は記憶障害を調整するための手段を提供する。
【００３９】
カルシウム−活性化されたSKチャネルはまた、Ｔ−細胞活性化にも包含される。従って、上昇する又は低下するSKチャネル流は、免疫応答を阻害し又は強 化するための手段を提供する。さらに、SKチャネルは、ホルモン及び神経伝達物質分泌に関係している。従って、SKチャネル流の変更は、細胞又は腺分泌を調節し、そしてそれにより、その不均衡を処理するための手段を提供する。
カルシウム−活性化された中間チャネル（IK）はまた、特に末梢組織において重要な生理学的役割を演じると思われる。たとえば、中間チャネルは、赤血球細胞において報告されており、そして一部、細胞脱水、すなわち鎌状赤血球貧血において悪化される工程に寄与する。
【００４０】
本発明はまた、単離された低コンダクタンス及び中間コンダクタンスのカルシウム−活性化されたカリウムチャネルの、及びSK及びIKチャネルタンパク質 をコードする単離された核酸のための副配列にも関する。SK又はIKチャネルタンパク質をコードする単離された核酸は、異常型転写生成物、又はSK又はIKチャネルをコードする高められた又は低められた転写レベルの遺伝子の同定のためのプローブとしての利用性を提供する。高められた又は低められた転写に ついてのアッセイは、薬物スクリーニングプロトコールに使用され得る。同様にSK又はIKチャネルタンパク質は、薬物スクリーニングアッセイにおいて、高められた又は低められた、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルの発現の免疫診断アッセイへの使用のための抗体を生成するための免疫原として使用され 得る。
【００４１】
定  義
単位、接頭辞及び記号は、それらのSI許容された形で示され得る。特にことわらない限
り、核酸は、５’→３’配向で左から右に書かれ；アミノ酸配列はアミノ→カルボキシ配向で左から右に書かれる。核酸の範囲は、その範囲を定義する数字も包含する。下記に定義される用語は、全体として明細書により十分に定義される。
【００４２】
用語“核酸”“プローブ”、又は“プライマー”は、一本鎖又は二本鎖形でのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーに対する関係を包含 し、そして特にことわらない限り、天然に存在するヌクレオチドに類似する態様で核酸に対してハイブリダイズする天然のヌクレオチドの既知類似体を包含する。特にことわらない限り、特定の核酸配列は、その完全な相補的配列を包含する。真核核酸は、真核細胞、好ましくは多細胞真核生物の細胞からの核酸であ る。
【００４３】
用語“組換え”は、細胞、又はタンパク質、核酸、又はベクターに関して使用される場合、細胞に対して生来でない形に、異種核酸の導入又は生来の核酸の変 更により修飾されているか、又はそのように修飾された細胞に由来する、細胞、又はタンパク質、核酸又はベクターの言及を包含する。従って、たとえば組換え細胞は、生来（非組換え）形の細胞内に見出されない遺伝子及びタンパク質を発現し、又は発現されるか又はまったく発現されない条件下で、異常に発現される 生来の遺伝子を発現する。
【００４４】
参照される核酸配列に関しての用語“副配列”とは、参照される核酸よりも長さにおいて短いヌクレオチドを有する核酸からの隣接した配列に関する言及を包 含する。参照されるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド配列（集合的には、“タンパク質”）に関しては、“副配列”とは、参照されるタンパク質よりも少ないアミノ酸を有する参照されるタンパク質からの隣接した配列を言及する。
【００４５】
２種の核酸又はポリペプチド配列に関しての用語“同一の”又は“配列同一性”とは、特定された比較窓に対して最大の対応のために整列される場合、同じで ある２種の配列における残基の言及を包含する。配列同一性の百分率がタンパク質に関して使用される場合、アミノ酸残基が類似する化学性質（たとえば電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基により置換され、そして従って、分子の機能的性質を変えない、保存性アミノ酸置換によって、同一でない残基位置がしば しば異なることが理解される。
【００４６】
配列が保存性置換において異なる場合、％配列同一性は、置換の保存性質のためにより高い方に修正するよう調節され得る。この調節を行なうための手段は、 当業者に良く知られている。典型的には、これは、完全なミスマッチよりもむしろ部分としての保存性置換の評点を包含する。従って、たとえば、同一のアミノ酸が１の評点を与えられ、そして非保存性置換がゼロの評点を与えられる場合、保存性置換は、ゼロ〜１の間の評点を与えられる。保存性置換の評点は、たとえ ばプログラムPC/GENE(Intelligenetics, Mountain View,California, USA)に従って実施されるような、Meyers and Miller,Computer Appli
c. Biol. Sci.,4 : 11-17 (1988)のアルゴリズムに従って計算される。
【００４７】
“比較窓”とは、本明細書において使用される場合、配列が、２種の配列が最適に一直線状に配置された後、同じ番号の隣接する位置の参照配列に比較され得 る、20〜600、通常約50〜約200、より通常には約 100〜約 150個から成る群から選択された隣接する位置
の数のいづれか１つのセグメントの言及を包含する。
【００４８】
比較のための配列の一列整列方法は、当業界において良く知られている。比較のための配列の最適な一列整列は、Smith and Waterman (1981)Adv. Appl. Math. 2 : 482の局部相同アルゴリズムにより；Needleman and Wunsch (1970) J. Mol.Biol. 48 : 443の相同一列整列アルゴリズムにより；Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.USA
85 : 2444の類似性方法のための研究により；それらのアルゴリズムのコンピューター記
憶された実施により（Intelligenetics, Mountain View, CaliforniaによるPC/Gene プログラムでの（LUSTAL,WisconsinGenetics Software Package, Genetics Computer Group
(GCG),575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USAにおけるGAP, BESTFIT, BLAST, FAS
TA及びTFASTAを包含するが、但しそれらだけには限定されない）、実施され得；ここで前記（LUSTALプログラムは、Higginsand Sharp(1988) Gene, 73 : 237-244 及びHiggins 
and Sharp(1989) CABIOS 5 : 151-153 ; Corpet、など., (1988) Nucleic Acids Resear
ch 16 :10881-90 ; Huang, など., (1992) Computer Applications in the Biosciences
8 :155-65 ；及びPearson 、など., (1994) Methods in Molecular Biology 24 : 307-
31により十分に記載されている。一列配列はまた、検閲及び手動整合によってもしばしば実施される。
【００４９】
用語、ポリヌクレオチド配列の“実質的な同一性”又は“類似性”とは、ポリヌクレオチドが、標準のパラメーターを用いての上記のプログラム（好ましくは BLAST)を用いて対照配列に比較される場合、少なくとも60％の配列同一性、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％及び最も好ましくは少な くとも95％の配列同一性を有する配列を含んで成ることを意味する。２種の核酸配列が実質的に同一である１つの表示は、第１の核酸がコードするポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。
【００５０】
２種の核酸配列が実質的に同一であるもう１つの表示は、それらの２種の分子が“中位の緊縮ハイブリダイゼーション条件”（又は“中位の条件”）下でお互 いに対してハイブリダイズすることである。代表的な“中位の緊縮ハイブリダイゼーション条件”とは、40％のホルムアミド、１ＭのNaCl,１％のSDS の緩衝液における37℃でのハイブリダイゼーション、及び45℃での１×SSCによる洗浄を包含する。陽性ハイブリダイゼーションは、
少なくとも２倍のバックグラウンドである。当業者は、他のハイブリダイゼーション及び洗浄条件が類似する緊縮性の条件を付与するために利用され得ることを 容易に理解するであろう。中位の緊縮ハイブリダイゼーション条件下でお互いに対してハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、まだ実質的に同一である。これは、たとえば核酸のコピーが遺伝子コードにより可能にされる最大ゴドン縮重を用いて創造される場合に生じ る。
【００５１】
ペプチドに関しての用語“実質的な同一性”又は“類似性”とは、ペプチドが、特定された比較窓に対する対照配列に対して、少なくとも60％の配列同一 性、通常少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは85％、最とも好ましくは少なくとも90％又は95％の配列同一性を有する配列を含んで成ることを示す。好ましくは、最適な一列配列は、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 : 443の相同性一列配列アルゴリズムを用いて実施される。２種のペプチド配列が実質的に同一である表示は、１つのペプチドが第２ペプチドに対して生ぜしめられた抗体と免疫学的に反応することである。
【００５２】
従って、１つのペプチドは、第２ペプチドに対して、それらの２種のペプチドが保存性置換によってのみ異なる場合、実質的に同一である。一般的に、類似性 は、20の隣接した位置からのいづれかの番号から、十分な長さのコア領域配列（すなわちアミノ酸残基135〜462 までのrSK２との最適な一列配列の領域）における残基の番号までの長さを有する
、コア配列内にある比較窓を用いて決定される。
【００５３】
用語“オリゴヌクレオチド”又は“ポリヌクレオチド”プローブは、二本鎖及び一本鎖のDNA 又はRNAの両者の言及を包含する。それらの用語はまた、非核酸汚染を実質的に有
さない、合成的に又は組換え的に誘導された配列も言及する。
本明細書において使用される場合、“接触”又は“接触する”とは、直接的な物理的会合で配置することを意味する。
【００５４】
“生物学的サンプル”とは、本明細書において使用される場合、IK及び／又はSKチャネルタンパク質、又はその対応するIK及び／又はSKチャネルタン パク質をコードする核酸を含む生物学的組織又は流体のサンプルである。そのようなサンプルは、唾液、羊水、血液、血液細胞（たとえば白血球細胞）、又は組織を包含するが、但しそれらだけには限定されない。生物学的サンプルはまた、組織の断片、たとえば組織学的目的のために取られた凍結断片も包含する。生物 学的サンプルの例は、神経、筋肉、腺又は上皮組織からの、又は免疫系（たとえばＴ細胞）からの細胞サンプルを包含する。生物学的サンプルは典型的には、真核生物、好ましくは多細胞真核生物、たとえば昆虫、原生動物亜界、鳥、魚、ハ虫類、及び好ましくは哺乳類、たとえばラット、マウス、牛、犬、テンジクネズ ミ、又はウサギ、及び最とも好ましくは、霊長類、たとえばマカークザル、チンパンヂー又はヒトから得られる。
【００５５】
用語“抗体”はまた、抗原結合形の抗体（たとえば、 Fab, Ｆ(ab)2 ）も包含する。用語“抗体”とは、分析物（抗原）を特異的に結合し、そして認識する、免疫グロブリン遺伝子又は複数の免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされるポリペプチド、又はそのフラグメントを言及する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ，λ，α，γ，δ，ε及びμ不変領域遺伝子、及び種々 の免疫グロブリン可変領域遺伝子を包含する。Ｌ鎖は、κ又はλのいづれかとして分類される。Ｈ鎖は、それぞれ免疫グロブリン種類、IgG,IgM, IgA, IgD及びIgEを定義する、γ，μ，α，δ、又はεとして分類される。
【００５６】
代表的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含んで成る。個々のテトラマーは、同一の２対のポリペプチド鎖から成り、個々の対は１つの “Ｌ”鎖（約25KD)及び１つの“Ｈ”鎖（約50〜70KD) を有する。個々の鎖のＮ−末端は、抗原認識を主に担当する約 100〜110又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。用語可変Ｌ鎖（ＶL）
及び可変Ｈ鎖（ＶH ）は、それぞれ、それらのＬ及びＨ鎖を言及する。
【００５７】
抗体はたとえば、損なわれていない免疫グロブリンとして、又は種々のペプチダーゼによる消化により生成された多くの十分に特徴づけられたフラグメントとして存在する。従って、たとえば、ペプシンは、Ｆ(ab)'2、すなわちそれ自体、ジスルフィド結合によりＶH−ＣH １に連結されるＬ鎖であるFab のダイマーを生成するために、ヒンジ領域におけるジスルフィド連鎖以下に抗体を消化する。Ｆ(ab)'2は、ヒンジ領域におけるジスルフィド連鎖を破壊するために温和な条件下で還元され得、それによりＦ(ab)'2ダイマーをFab'モノマーに転換する。Fab'モノマーは実質的に、ヒンジ領域の一部を有するFab である(Fundamental Immunology,Third Edition, W. E. Paul, ed., Raven Press, N. Y. 1993を参照のこと）。
【００５８】
種々の抗体フラグメントは、損なわれていない抗体の消化により定義されるが、当業者は、そのようなフラグメントが化学的に又は組換えDNA 方法を用いることによって、新たに合成され得ることを認識するであろう。従って、用語抗体は、本明細書において使用される場合、また抗体フラグメント、たとえば一本鎖ＦV 、キメラ抗体（すなわち、異なった種からの不変及び可変領域を含んで成る）、ヒト適合された抗体（すなわち、非ヒト源からの相補性決定領域(CDR)を含んで成る）、及びヘテロ接合抗体（たとえば二元特異的抗体）も包含する。
【００５９】
アミノ酸は、それらの通常知られている３文字記号又はIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission により推薦される一文字記号のいづれかにより、本明細書において言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの通常許容される一文字コードにより言及され得る。
【００６０】
“保存的に修飾された変異体”は、アミノ酸及び核酸配列の両者に適用する。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾された変異体は、同一の又は実質的に 同一のアミノ酸配列をコードするか、又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードしないそれらの核酸を言及する。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸はいづれかの一定のタンパク質をコードする。たとえば、コドンGCA, GCC, GCG 及びGCU はすべて、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンにより特定されるあらゆる位置で、そのコドンは、コードされるポリペプチドの変更を伴わないで、記載されるその対応するコドンのいづれかに変更され得る。
【００６１】
そのような核酸変動は、保存的に修飾された変動の１つの種である“サイレント変動”である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるあらゆる核酸配列 はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変動を説明する。当業者は、核酸における個々のコドン（但し、通常、メチオニンのための唯一のコドンであるAUGを除く）が機能的に同一の分子を生成するために修飾され得ることを理解するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の個々のサイレント変動は、個 々の記載される配列に内在する。
【００６２】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列における単一のアミノ酸又は低％のアミノ酸を変更し、付加し、又は欠失する、核酸、ペプチド、ポリペ プチド又はタンパク質の配列への個々の置換、欠失又は付加は、変更が化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす“保存的に修飾された変異体”であることを認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存性置換表は、当業界において良く知られている。
【００６３】
次の６つのグループはそれぞれ、お互いのための保存性置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００６４】
また、Creighton(1984) Proteins W. H. Freeman and Companyも参照のこと。
用語“生物学的に純粋な”または“単離された”とは天然に存在する環境で発見される時に、通常伴うかまたは相互作用する構成成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。
【００６５】
核酸に関しての句“〜から成る群から選択された配列に対して中位の緊縮性ハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズする核酸によりコードさ れるタンパク質をコードする”とは、天然に存在するタンパク質又は天然タンパク質の誘導体をコードするが、しかし言及された条件下で、天然起源のタンパク質に対してもはやハイブリダイズしないように故意に修飾され、又は構築されるそれらの核酸を意味する。
【００６６】
“発現ベクター”は、宿主細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の特定された核酸要素により組換え的に又は合成的に生成された核酸構造体であ る。発現ベクターは、プラスミド、ウィルス、又は核酸フラグメントの一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、転写されるべき核酸、及びプロモーターを含む。
【００６７】
チャネルに影響を及ぼす化合物を試験するためのアッセイに関しての句“機能的効果”とは、チャネルの影響下で間接的に又は直接的に存在するいづれかのパラメーターの決定を包含する。それは、イオン束及び膜電位の変化を包含すると共に、また他の生理学的効
果、たとえば転写又はホルモン開放の増強又は低下も包含する。
【００６８】
“選択的にハイブリダイズする”又は“選択的ハイブリダイゼーション”とは、特定された核酸標的配列に対して、核酸配列が、緊縮ハイブリダイゼーション 条件下で、非−標的核酸配列へのそのハイブリダイゼーションよりも検出的に高い程度に、又は非−標的核酸の実質的な排除までハイブリダイズすることを意味する。選択的にハイブリダイズする配列は、お互い、少なくとも80％の配列同一性、好ましくは90％の配列同一性、及び最とも好ましくは100％の配列同 一性（すなわち、相補的な）を有する。
【００６９】
“配列同一性の％”は、比較窓に対して２つの最適に一列配列された配列を比較することによって決定され、ここで比較窓におけるポリヌクレオチド配列の一 部は、２つの配列の最適な一列配列のための対照配列（付加又は欠失を含まない）に比較される場合、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含むことができる。その％は、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が適合された位置の数を生成するために両配列において生じる位置の数を決定し、比較窓における位置の合計数によ り前記適合された位置の数を割り算し、そして配列同一性の％を生成するために100を前記結果に掛け算することによって計算される。
【００７０】
用語“緊縮条件”又は“緊縮ハイブリダイゼーション条件”とはプローブがその標的配列に対して、他の配列よりも検出的に高い程度にハイブリダイズするで あろう条件を言及する。緊縮条件は、配列−依存性であり、そして異なった環境において異なるであろう。長い配列ほど、高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びpHで、特定の配列のために熱溶融点（Ｔm）よりも約５℃低くあるよ
うに選択される。Ｔm は、相補的標的配列の50％が完全に適合されたプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びpH下で）である。
【００７１】
典型的には、緊縮条件は、塩濃度が pH7.0〜8.3 で、約 1.0Ｍ以下のNaイオン濃度、典型的には約0.01〜1.0ＭのNaイオン濃度（又は他の塩）であり、そして温度が短いプロー
ブ（たとえば10〜50個のヌクレオチド）のために少なくとも約30℃及び長いプローブ（たとえば50個以上の、ヌクレオチド）のために少なくとも約 60℃である条件であろう。緊縮条件はまた、不安定化剤、たとえばホルムアミドの添加によっても達成され得る。典型的な低緊縮条件は、30％のホルムアミド、１ＭのNaCl，１％のSDSの緩衝溶液（37℃）によ
るハイブリダイゼーション、及び２×SSC(50℃）での洗浄を包含する。典型的な高緊縮条件は、50％のホルムアミド、１ＭのNaCl，１％のSDS溶液（37℃）によるハイブリダイゼ
ーション及び0.1×SSC(60℃）での洗浄を包含する。
【００７２】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイ型における“緊縮ハイブリダイゼーション条件”又は“緊縮条件”は、配列依存性であり、そして異なった環境パラメー ター下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに関する多数のガイドが、Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -Hgbridization with Nucleic Acid
Probes Part 1, Chapter 2 “Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleicacid probe assays”，Elsevier, New Yorkに見出される。緊縮条件は、配列−依存性であり、そして異なった環境下で異なるであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。
【００７３】
“ハイブリダイゼーション複合体”とは、２つの一本鎖核酸配列のお互いとの選択的ハイブリダイゼーションにより形成される二本鎖核酸配列を意味する。
“宿主細胞”とは、発現ベクターを含み、そしてその発現ベクターの複製又は発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞、たとえばＥ．コリ、又は真核細胞、たとえば酵母、昆虫、両性類、又は哺乳類細胞であり得る。
【００７４】
“コンダクタンス”とは、電気的コンダクタンスを意味する。電気的コンダクタンスは、便利には、ジ−メンス（１／ohm ＝mho)で測定される。単位コンダクタンスは、120mMの対称カリウムイオン濃度を用いて例６（たとえば卵母細胞）に示される条件下でパッチクランププロトコールを用いて単一のチャネル流を測定する ことによって決定される。一般的には、Hille,B.,Ionic Channels of Excitable Membranes, 2nd ed., Sinauer Ass
oc.,Sunderland, MAを参照のこと。本発明においては、“コンダクタンス”とは、言及
されたSK又はIKチャネルタンパク質の単一のホモマータンパク質の単位電気的コンダクタンスを意味する。
【００７５】
“卵母細胞において発現される場合、SKチャネルの形成を導びく”とは、多くの言及されたSKタンパク質が、SKチャネルを形成するために、単独で又は 他の内因性キセノパス卵母細胞分子と共にアセンブリーされる言及されたSKタンパク質の発現を包含する。キセノパス卵母細胞内での発現は、本明細書に提供される例、たとえば例３に開示される。
【００７６】
“卵母細胞において発現される場合、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルの形成を導びく”とは、多くの言及されたIK及び／又はSKタンパク質 が、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルを形成するために、単独で又は他の内因性キセノパス卵母細胞分子と共にアセンブリーされる言及されたIK及び／又はSKタンパク質の発現を包含する。キセノパス卵母細胞内での発現は、本明細書に提供されるれい、たとえば例３に開示される。
【００７７】
“免疫学的に反応性の条件”とは、特定のエピトープに対して生成される抗体のそのエピトープへの結合を、その抗体が実質的にすべての他のエピトープに結 合するよりも検出的に高い程度まで可能にする条件を意味する。免疫学的に反応性の条件は、抗体結合反応の形式に依存し、そして典型的には、イムノアッセイプロトコールに利用される条件である。イムノアッセイ形式及び条件の記載については、Harlow and Lane (1988) Antibodies, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York を参照のこと。
“タンパク質に対して反応性の抗体”とは、タンパク質が“抗体と特異的に免疫反応する”ことを意味する。
【００７８】
タンパク質又はペプチドを言及する場合、用語“抗体と特異的に免疫反応する”、又は“抗体に対して特異的に結合する”とは、抗体と、その抗体の抗原結合 部位により認識されるエピトープを有するタンパク質との間の結合反応を言及する。この結合反応は、タンパク質及び他の生物学的物質の異種集団の存在間での認識されるエピトープを有するタンパク質の存在の決定因子である。従って、企画されたイムノアッセイ条件下で、特定された抗体は、認識されるエピトープを 有するタンパク質に結合し、そしてあったとしても、サンプルに存在する、エピトープを欠いている他のタンパク質に対して、検出的に低い程度、結合する。
【００７９】
そのような条件下での抗体に対する特異的結合は、特定タンパク質に対するその特異性のために選択される抗体を必要とする。たとえば、配列番号１，２， ３，４，19，20,32, 43及び47に示されるアミノ酸配列を有するカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質に対して生ぜしめられた抗体は、低及び／又は中間コンダ クタンスのカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質と特異的に免疫反応するが、しかし他のタンパク質とは免疫反応しない抗体を得るために選択され得る。免疫原として使用されるタンパク質は、線状エピトープを供給するために生来のコンホメーションで存在するか又は変性され得る。
【００８０】
種々のイムノアッセイ形式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために使用され得る。たとえば、固相ELISA イムノアッセイは、タンパク質と特異的に
免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために通常使用される。特定の免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイ形式及び条件の記載については、Harlowand
Lane(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, N
ew York を参照のこと。
【００８１】
“トランスフェクトされた”とは、真核細胞中への核酸の導入を意味し、ここで核酸が細胞のゲノム（すなわち、染色体、プラスミド、又はミトコンドリア DNA) 中に導入され、自己レプリコン中に転換され、又は過渡的に発現される（たとえば、トランスフェクトされたmRNA）。トランスフェクションは、インビボ又はエクスビボで存在する。“エクスビボとは、細胞又は複数細胞が得られ、又は細胞系が単離される生物の身体外を意味する。エクスビボトランスフェクション に続いて、好ましくは、生物中への細胞の再注入が伴う。対照的に、“インビボ”とは、細胞が得られ、又は細胞系が単離される生物の身体内を意味する。
【００８２】
“抗原”とは、抗体が生成され得、そして抗体が特異的に免疫反応する物質を意味する。特定抗原と免疫学的に反応する抗体は、インビボで、又は組換え方 法、たとえばファージ又は類似するベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択により生成され得る。たとえば、Huseなど.(1989)Science 246 : 1275-1281；及びWard, など. (1989) Natur
e 341 : 544-546; 及びVaughan など. (1996) Nature Biotechnology, 14 : 309-314 を
参照のこと。
【００８３】
特定された核酸に関しての“コードする”又は“コードされる”とは、その特定されたタンパク質中への翻訳のための情報を含んで成ることを意味する。その 情報は、コドンの使用により特定される。典型的には、アミノ酸配列が“普遍的”遺伝子コードを用いて核酸によりコードされる。しかしながら、いくつかの植物、動物及び菌類ミトコンドリア、細菌性マイコプラズマカプリコラム（Mycoplasma capricolum) (Proc. Natl. Acad.Sci., 82 :2306-2309 (1985））又は繊毛虫マクロヌクレウス（Macronucleus) に存在するよ
うな普遍的コードの変異体が、核酸がそれらの生物を用いて発現される場合、使用され得る。
【００８４】
特定された配列からの特定された数のアミノ酸残基に関しての、“〜からの隣接するアミノ酸”とは、対照配列におけるのと同じアミノ酸に直接的に隣接する個々のアミノ酸の同一の順序を有する特定された対照配列内からの特定された数のアミノ酸の配列を意味する。
【００８５】
“低コンダクタンスのカルシウム−活性化されたカリウムチャネル”、又は“SKチャネル”とは、電圧−閉鎖されておらず、約30nM〜10μＭのカルシ ウムにより活性化され、そして例６に特定される条件を用いて、120mMの対称カリウム濃度下で測定される場合、約２〜60pS、しばしば２〜25pSの単位コンダクタンスを有する膜チャネルを意味する。SKチャネ ルは、サブユニットとして複数のSKチャネルタンパク質、典型的には４個のSKチャネルタンパク質（たとえば十分な長さ又は実質的に十分な長さのSKチャネルタンパク質）を含んで成る。
【００８６】
“低コンダクタンスのカルシウム−活性化されたチャネルタンパク質”又は“SKチャネルタンパク質”とは、SKチャネルを製造するアミノ酸配列からの少 なくとも10個の長さの隣接するアミノ酸のペプチドを意味する。それらのタンパク質は、十分な長さである場合、SKチャネルのモノマーとして作用する。従って、SKチャネルタンパク質は、SKチャネルの機能的特徴を有するヘテロマー又はホモマータンパク質を形成する機能的特徴を有し、又はそのペプチドフ ラグメントであり得る。たとえば、Ｎ−末端延長されたrsk３（配列番号43）及び切断されたrSK３（配列番号３）の両者は、実質的に同一の機能的特徴を示
す。
【００８７】
“中間コンダクタンスのカルシウム−活性化されたカリウムチャネル”、又は“IKチャネル”とは、電圧−閉鎖されておらず、約30nM〜10μＭのカル シウムにより活性化され、そして例６に特定される条件を用いて、120mMの対称カリウム濃度下で測定される場合、約20〜80pS、より通常とは30〜70pS，40〜60pS又は最とも好ましくは35〜40pSの 単位内部コンダクタンスを有する膜チャネルを意味する。IKチャネルは、サブユニットとして複数のIKチャネルタンパク質、典型的には４個のIKチャネルタンパク質（たとえば十分な長さ又は実質的に十分な長さのIKチャネルタンパク質）を含んで成る。
【００８８】
“中間コンダクタンスのカルシウム−活性化されたチャネルタンパク質”又は“IKチャネルタンパク質”とは、IKチャネルを製造するアミノ酸配列からの 少なくとも10個の長さの隣接するアミノ酸のペプチドを意味する。それらのタンパク質は、十分な長さである場合、IKチャネルのモノマーとして作用する。従って、IKチャネルタンパク質は、IKチャネルの機能的特徴を有するヘテロマー又はホモマータンパク質を形成する機能的特徴を有し、又はそのペプチドフ ラグメントであり得る。
【００８９】
“カルシウム−活性化されたカリウムチャネル”とは、低コンダクタンスのカルシウム−活性化されたカリウム（SK）チャネル及び中間コンダクタンスのカルシウム−活性化されたカリウム（IK）チャネルを意味する。
用語“ポリペプチド”，“ペプチド”、及び“タンパク質”は、アミノ酸残基のポリマーを言及するために、本明細書においては、互換性的に使用される。そ れらの用語は、１又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、及び天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用する。
“特異的に反応する”又は“特異的反応性の”とは、抗体とその抗体と“特異的に結合する”タンパク質との間の反応により示される特異性の反応を意味する。
【００９０】
“ヒトゲノムライブラリー”とは、ヒトの完全なゲノムを実質的に表わす単離されたDNA 分子の収集を意味す。ゲノムライブラリーの構成は、次の標準の分子生物学文献に教授されている：BergerandKimmel, Gnide to Molecular Cloning Techniques, Methods in
Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger) ; Sambrookなど.(1989)Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3 ; 及びCurr
ent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel など., eds., Current Protocols,& joint venture between Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley& Sons, Inc., (1994 Sapplement) (Ausubel) 。
【００９１】
“増幅された”とは、鋳型として少なくとも１つの核酸配列を用いての核酸配列の複数コピー又は核酸配列に対して相補的な複数コピーの構成を意味する。増幅システムは、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)システム、リガーゼ鎖反応(LCR)システム、核酸配列に基づく増
幅（NASBA,Cangene, Mississauga, Ontario),Ｑ−Beta Replicaseシステム、転写に基づ
く増幅システム(TAS)及び鎖置換増幅(SDS)を包含する。たとえば、Diagnostic Molecula
r Microbiology; Principles and Applications, Ed. D. H. Persingなど., American S
ociety for Microbiology, Washington, D. C. を参照のこと。
【００９２】
用語“残基”又は“アミノ酸残基”又は“アミノ酸”とは、本明細書において使用される場合、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド（集合的には“ペプチ ド”）中に組込まれるアミノ酸を言及する。前記アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であり、そして特にことわらない限り、天然に存在するアミノ酸と類似する態様で機能することができる天然のアミノ酸の既知類似体を包含する。
“核酸のセグメント”とは、15〜約1500個の長さのヌクレオチド、又はヌクレオチド類
似体のいづれか１つの核酸配列、又はそのような配列のコンカテマーを意味する。
【００９３】
“機能的効果の決定”とは、細胞及び細胞膜機能により、細胞又は細胞膜に対するカリウムイオン流を高め又は低める化合物の効果を試験することを意味す る。好ましくは、前記用語は、SK及びIKチャネル活性に対する化合物の機能的効果、たとえばコンダクタンスの変更、電圧閉鎖、及び同様のことを言及する。
【００９４】
低及び中間コンダクタンスのカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質
本発明は、中間コンダクタンスのカルシウム−活性化された（IK）カリウムチャネルタンパク質、及び低コンダクタンスのカルシウム−活性化された （SK）チャネルタンパク質（集合的には、“カルシウム−活性化されたカリウムチャネル”）を提供する。本発明の単離された低コンダクタンスのカルシウム−活性化された（SK）チャネルタンパク質は、配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43及び47、及び保存的に修飾されたそれらの変異体から成る群から選択された配列のいづれか１つからの少なくともＮ個のアミノ酸を含んで成り、ここで前記Ｎは10〜600 から成る群から選択された整数のいづれか１つであり、そして前記配列は起源のタンパク質に対してユニークである。
【００９５】
同様に、本発明の単離された中間コンダクタンスのカルシウム−活性化された（IK）チャネルタンパク質は、配列番号32及び保存的に修飾されたその変異 体からの少なくともＮ個のアミノ酸を含んで成り、ここでＮは10〜600から成る群から選択された整数のいづれか１つであり、そして前記配列は、起源のタンパク質に対してユニークである。
【００９６】
典型的には、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質及び特異的ペプチドは、少なくとも15,25, 35又は50個の長さのアミノ酸、より好ましくは、少なくとも10
0, 200, 300,400又は 500個の長さのアミノ酸、及び最とも好ましくは、十分な長さの配
列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43又は47、又は保存的に修飾されたそれらの変異体である。従って、本発明は、配列番号１，２，３，４，19，20,32, 43及び47の十分な長さの配列及び副配列、及び配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43及び47の保存的に修飾された変異体の十分な長さの配列及び副配列を提供する。
【００９７】
配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43又は47の“十分な長さ”の配列とは、それぞれ、配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43又は47の配列を意味する。配列番号１，２，３，４，19，20,32,43又は47の保存的に修飾された変異体の“十分な長さ”の配列と
は、それぞれ、配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43又は47の保存的に修飾された変異体の配列を意味する。本発明のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質及びペプチドは、薬物スクリーニングアッセイにおいて、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルの高められた又は低められた発現を評価するための免疫診断プローブの調製のための免疫原 として使用され得る。
【００９８】
本発明のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質はまた、配列番号１，２，３，４，19，20,32, 43及び47、及び保存的に修飾されたそれらの変異体から成る群
から選択された配列のいづれか１つの配列からの少なくともＮ個のアミノ酸のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質に対しての実質的な同一性 （すなわち類似性）を有するタンパク質を包含し、ここで前記Ｎは10〜600から成る群から選択された整数のいづれか１つである。
【００９９】
一般的に、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質は、少なくとも50個、典型的には少なくとも 100個、好ましくは少なくとも 200個、より好ましくは少なくとも300個、及び最とも好ましくは少なくとも400個の長さのアミノ酸残基である。典型的
には、カルシウム−活性化されたカリウムSK又はIKチャネルタンパク質の実質的に類似す
る又は保存的に修飾された変異体は、好ましくは、多細胞真核生物、たとえば昆虫、原生動物、鳥、魚、両生類、ハ虫類又は哺乳類からの真核タンパク質である。
【０１００】
配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43及び47から選択された配列を有するSKチャネルタンパク質に対して実質的に同一であるか、又はその保存的に修飾された変異体であるSKチャネルタンパク質は、免疫学的に反応する条件下で、配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43及び47から成る群から選択されたSKチャネルタンパク質に対して反応性の免疫グロブリンと特異的に反応するであろう。
【０１０１】
同様に、配列番号32からの選択された配列を有するIKチャネルタンパク質に対して実質的に同一であるか、又はその保存的に修飾された変異体であるIK チャネルタンパク質は、免疫学的に反応性の条件下で、配列番号32のIKチャネルタンパク質に対して反応性の免疫グロブリンと特異的に反応するであろう。種々のイムノアッセイ形式が、そのような免疫学的に特異的な反応、たとえばELISA 、競争イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウェスターンブロット、間接的免疫螢光アッセイ及び同様のものを評価するために使用され得る。
【０１０２】
他方では、配列番号１，２，３，４，19，20, 43及び47から選択された配列を有するSKチャネルタンパク質に対して実質的に同一であるか、又はその保存的に修飾された変異体であるSKチャネルタンパク質は、配列番号１，２，３，４，19，20,43及び47から成る群
から選択されたSKチャネルタンパク質のコア配列（又は“コア領域”）内の比較窓に対して60％〜100 ％の類似性の値のいづれか１つを有するアミノ酸配列を含んで成るであろう。配列番号32の配列を有するIKチャネルタンパク質に対して実質的に同一であるか、又はその保存的に修飾された変異体であるIKチャネルタンパク質は、IKチャネルタンパク質 hIK１のコア配列（又は“コア領域”）内の比較窓に対して60％〜100％の類似性の値のい
づれか１つを有するアミノ酸配列を含んで成るであろう。
【０１０３】
従って、類似性は、コア領域又はその副配列への参照により決定される。 hSK１（配列番号１）のコア領域は、アミノ酸残基 124〜451(配列番号27）である。rSK２（配列番号２）のコア領域は、アミノ酸残基 135〜462 である。切断された rSK３（配列番号３）のコア領域は、アミノ酸残基 109〜436 である。Ｎ−末端延長されたrSK３（配列番号43）のコア領域は、288〜615 である。 rSK１（配列番号４）のコア領域は、前述の領域と整
合する領域により定義される。 hSK２（配列番号19）のコア領域は、アミノ酸残基 134〜461 である。
【０１０４】
切断されたhSK３（配列番号20）のコア領域は、アミノ酸残基 109〜436 である。Ｎ−
末端延長されたhSK３（配列番号47）のコア領域は 238〜465 である。従って、配列番号
１〜４，19，20,43及び47のコア領域は、アミノ近位端でアミノ酸残基副配列LSDYALIFGM
（配列番号17）及びカルボキシル近位端でQRKFLQAIHQ（配列番号18）を含み、そしてそれらにより定義される。 hIK１（配列番号32）のコア領域は、アミノ酸残基25〜351である。前記コア領域の副配列は、10〜配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43又は47のコア配列の長さまでの数のいづれか１つの長さを有する。好ましくは、SK又はIKチャネルタンパク質は、コア配列内からの20の隣接したアミノ酸の比較窓に対して少なくとも90％の類似性を有するアミノ酸配列を含んで成る。
【０１０５】
類似性はまた、カルシウム−活性化されたチャネルタンパク質の機能的特徴によっても決定される。たとえば、本発明は、発現される場合、実質的に同一の流れを有するいくつかのSK３アミノ酸配列を供給する。rSK３をコードするcDNAは、２種の異なった形で単離
されて来た。第１の配列番号43をコードする配列番号44は、内因性 rSK３又はＮ−末端延長された rSK３である。第２の配列番号３をコードする配列番号16は、そのＮ−末端で配
列番号43に対して切断される。
【０１０６】
切断されたrSK３タンパク質（配列番号３）はまた、異なったＣ−末端を有し、ここで
配列番号43の最後の９個のアミノ酸が５個の異なったアミノ酸により置換されている。それらの配列はＮ−及びＣ−末端の両者で異なるけれども、それらは実 質的に同一の流れを発現する。Ｎ−末端延長され、そして切断されたSK３はその同じ、流れを発現するので、それ自体チャネル機能に必須ではないが、しかしもっともらしいＮ−末端延長は、細胞における特定の位置へのタンパク質の標的化に関与した。
【０１０７】
同様に、 hSK３のための次の２種のcDNAが同定されている：Ｎ−末端延長されたhSK３
（配列番号47をコードする配列番号48）及び切断されたhSK３（配列番号20をコードする
配列番号22）。さらに、類似するＮ−末端延長がSK２に関して存在する。SK２及びSK３の両者に関するマウスからのゲノム配列は、両者が、機能的流れ の発現が示されているアミノ酸配列と隣接する延長された読み取り枠を有することを示す。従って、実質的に同一のSKチャネルタンパク質、又は保存的に修飾されたその変異体はまた、機能的特徴に基づいても同定される。
【０１０８】
本発明は、機能的SK及びIKチャネルタンパク質及びその副配列を提供する。本発明の機能的SKチャネルは、２〜60pS、より通常には５〜25pSの 単位コンダクタンス、及びSKチャネルを製造するSKチャネルタンパク質の個々に関して、40〜100Kd、より通常には50〜80
KDの分子量を有する。機能的IKチャネルは、20〜80pS、及びしばしば30〜60pSの単位コンダクタンスを有する。単位コンダクタンスは便利には、裏がえし（inside-out又はoutside-out)パッチクランプ形状を用いて決定され得る。
【０１０９】
それらの形状は、イオンチャネルの生物物理（運動学、導電率、選択性、透過及びブロックの機構）の研究のために特に示される。パッチクランプ方法は当業 界において良く知られている。たとえば、Franciolini,Patch Clamp technique and biophysical study of mambrane Channels, Experientia,42 (6) : 589-594 (1986) ；及びSakmann など., Patch clamb techniques for studyingionic channels in excitable membranes, Annual
Review of Physiology, 46 : 455-472 (1984)を参照のこと。
【０１１０】
本発明の範囲内の単離されたSK及びIKタンパク質は、十分な長さであり、そして通常系からの細胞において発現される場合、それぞれ、SKチャネル又は IKチャネルの徴候である機能性及び薬理学を定義するタンパク質を包含する。通常系は、その生来の状態において（たとえば、組換えSK又はIKチャネルを発現しない）、低いか又は興味ない電気活動を有する細胞系、たとえばCHO 細胞系である。
【０１１１】
たとえば、対照細胞（本発明の推定上のSKチャネルの発現を有さない）及び実験細胞（推定上のSKチャネルを発現する）が、本明細書に開示される実施例 に供給されるように、電気生理学的パラメーターの測定のための標準である条件下で維持される。個々の細胞が、カルシウムイオノフォアにより処理される。典型的なイオノフォアは、イオノマイシン（SigmaChemical Co.) 又はA23187 (Sigma Chemical Co.) のような標準の化合物を包含
するが、但しそれらだけには限定されない。細胞はしばしば、約１μＭの濃度でイオノフォアにより処理される。
【０１１２】
続いて、細胞の電気生理学測定が、カリウム流の誘発（たとえば、ラジオトレーサーにより）、又は細胞のコンダクタンスの変化（たとえばパッチクランプに より）、又は電圧の変化（たとえば、螢光色素により）を検出するために取られる。存在するなら、イオンチャネルは、カルシウム誘発された変化により示され、続いての試験が、本発明のSKチャネルとしてチャネルを特徴づけるために使用される。好ましくは、少なくとも２種の特徴
が決定され、より好ましくは少なくとも３又は４種の特徴が決定される。本発明のSKチャネルの特徴は、本明細書に十分に開示されている。
【０１１３】
たとえば、本発明のSKチャネルを発現する細胞は、２〜30pS、しばしば２〜25pSのコンダクタンスを有することができ、しかし必ずしも必要ではな いが、10pM〜約100nMの範囲でアパミンによるブロックを示すことができ、約40〜80KDのSKチャネルタンパク質を含んで成ることができ、本明細書に開示される典 型的なSKチャネルタンパク質のコア領域との一列配列において、少なくとも60％、及びより好ましくは少なくとも70％，80％，90％又は95％の配列類似性を示すことができ、そして本明細書に開示される典型的なSK又はIKチャネル（たとえば、配列番号１〜４，19，20, 32, 43及び47）に対して生ぜしめられた抗体と、免疫学的に反応する条件下で特異的に反応することができる。そのような標準の方法は、本発明のSKタンパク質の同定を助ける。IKチャネルを発現する細胞は、同じ機能的特徴を有するが、但しそれらはCTX によりブロックされるが、しかしIBX 又はアパミンによってはブロックされず、そして20〜80pS、しばしば35〜40pSの単位コンダクタンスを有する。
【０１１４】
約50個以下の長さのアミノ酸のSK又はIKチャネルタンパク質の固相合成は、不溶性支持体への配列のＣ−末端アミノ酸の結合、配列における残るアミノ 酸の続く連続的な付加により達成され得る。固相合成のための技法は、Buranyand Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides :Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 
2 : Special Methods in Peptids Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am.Chem. Soc., 85 : 2149-2156(1963)、及びStewart et al., Solid Phase Peptide Synthesi
s, 2nd ed.Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984)により記載されている。より長い
長さのSK又はIKチャネルタンパク質は、短いフラグメントのアミノ及びカルボキシ末端の縮合により合成され得る。カルボキシ末端の活性化によるペプチド 結合の形成方法（たとえば、カップリング試薬Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドの使用による）は、当業者に知られている。
【０１１５】
カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする核酸の獲得
本発明は、上記でより十分に論じられたように、カルシウム−活性化されたSKチャネルタンパク質（“SKチャネルタンパク質核酸”）又はカルシウム−活性化されたIKチャネルタンパク質（“IKチャネルタンパク質核酸”）をコードする、RNA,DNA又はそれらのキメ
ラの単離された核酸を供給する。本発明の核酸は、たとえばmRNAのレベルでの欠損の検出において、遺伝子における突然変異（たとえば、置換、欠失又は付 加）の検出において、薬物スクリーニングアッセイにおけるSK又はIKチャネルのアップレギュレーションのモニターのために、又は抗体の調製において免疫原として使用するためのSK又はIKチャネルタンパク質の組換え発現のために、プローブとして使用され得る。
【０１１６】
本発明のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする核酸は、標準の組換え又は合成技法を用いて製造され得る。本発明において供給 されるSK又はIKチャネルタンパク質のアミノ酸配列により、当業者は、機能的に等しい核酸、たとえば同じタンパク質をコードする核酸を含む種々のクローンを容易に構成することができる。それらの目的を達成するためのクローニング方法、及び核酸の配列を確かめるための配列決定方法は、当業界において良く知 られている。
【０１１７】
適切なクローニング及び配列決定技法の例、及び多くのクローニング実験を通して当業者を方向づけるのに十分な説明が、次の文献に見出される：Sambrook、など.,Molecular
Cloning :A Laboratory Manual (2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laborator
y (1989)),Methods in Enzymology, Vol. 152 : Guide to Molecular Cloning Techniqu
es (Berger and Kimmel(eds.), San Diego ; Academic Press, Inc. (1987))、又はCurre
nt Protocols in Molecular Biology, (Ausubel, など. (eds), Greene Publishing andWiley-Interscience,New York (1987)。
【０１１８】
生物学的試薬及び実験装置の製造業者からの製品情報はまた、既知の生物学的方法において有用な情報も提供する。そのような製造業者は次の通りである： SIGMAChemical Company (Saint Louis, MO), R & D Systems (Minneapolis, MN),Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (PaloAlto, CA), Chem Genes C
orp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRLLife Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG,Buchs, Switzer land), Invitrogen, San Diego, CA 、及びApplied Bi
osystems(Foster City, CA)、並びに、当業者に知られている多くの他の広告源。
【０１１９】
１．核酸ハイブリダイゼーションによるSK及びIKチャネルタンパク質の単離
本発明の単離された核酸組成物は、RNA 、cDNA、ゲノムDNA 、又は種々の組合せのハイブリッドのいづれにせよ、生物学的源から単離され、又はインビトロで合成される。デオキシヌクレオチドは、いづれかの適切な方法、たとえば適切な配列のクローニング及び制限方法、又は次の方法による直接的な化学合成により調製され得る：Narangなど., Meth.
Enzymol.68 : 90-99 (1979) のホスホトリエステル方法；Brown など., Meth. Enzymol
. 68 : 109-151(1979) のホスホジエステル方法；Beaucageなど., Tefra. Lett., 22 : 
1859-1862 (1981)のジエチルホスホラミジット方法；Needham-Van Devanterなど.(1984) NucleicAcidsRes., 12 : 6159-6168 に記載されるような自動合成機を用いての、Beauc
age and Caruthers (1981), Tetrabedron Letts., 22 (20) : 1859-1862により記載され
る固相ホスホラミジットトリエステル方法；及びアメリカ特許第 4,458,066号の固相支持方法。
【０１２０】
化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補的配列によるハイブリダイゼーションにより、又は鋳型として一本鎖を用いてのDNA ポリメラーゼによる重合により二本鎖に転換され得る。当業者は、DNAの化学合成は約 100個の塩基の配列に限定されるが、より長い配列が短い配列の連結により得られることを認識するであろう。
【０１２１】
配列番号１のSKチャネルタンパク質をコードする核酸は、次の配列：ATGCCGGGTCCCCGGGCGGCCTGC（配列番号５）及びTCACCCGCAGTCCGAGGGGGCCAC(配列番号６）を有する単離され
た核酸プライマーを用いてのヒト海馬cDNAライブラリーの増幅により得られる。配列番号２のSKチャネルタンパク質をコードする核酸は、次の配列：ATGAGCAGCTGCAGGTACAACGGG（配列番号７）及びCTAGCTACTCTCAGATGAAGTTGG(配列番号８）を有する単離され た核酸プラ
イマーを用いてのラット脳cDNAライブラリーの増幅により得られる。
【０１２２】
配列番号43のSKチャネルタンパク質をコードする核酸は、次の配列：ATGAGCTCCTGCAAATACAGCGGT（配列番号９）及びTTAGCAACTGCTTGAACTTG(配列番号10）を有する単離された核
酸プライマーを用いてのラット脳cDNAライブラリーの増幅により得られる。配列番号４のSKチャネルタンパク質をコードする核酸は、次の配列：TCAGGGAAGCCCCCGACCGTCAGT（配列番号11）及びTCACCCACAGTCTGATGCCGTGGT(配列番号12）を有する単離 された核酸プライマ
ーを用いてのラット脳cDNAライブラリーの増幅により得られる。配列番号19のSKチャネルタンパク質をコードする核酸は、次の配列：ATGAGCAGCTGCAGGTACAACG（配列番号23）及び
CTAGCTACTCTCTGATGAAGTTG（配列番号24）を有する単離された核酸プライマーを用いてのヒト海馬cDNAライブラリーの増幅により得られる。
【０１２３】
配列番号20(hSK３）のSKチャネルタンパク質をコードする核酸は、次の配列：ATGAGCTCCTGCAAGTATAGC(配列番号25）及びTTAGCAACTGCTTGAACTTGTG(配列番号26）を有する単離さ
れた核酸プライマーを用いてのヒト海馬cDNAライブラリーの増幅により得られる。配列番
号32のIKチャネルタンパク質をコードする核酸は、配列：（配列番号38及び39）及び（配列番号40及び41）を有する単離された核酸プライマー対を用いてのヒト膵臓cDNAライブラリーの増幅により得られる。
【０１２４】
本発明の単離された核酸は、クローン化され、又はインビトロ方法、たとえばポリメラーゼ鎖反応(PCR)、リガーゼ鎖反応(LCR) 、転写に基づく増幅システム(TAS）、自己維持
された配列複製システム(SSR) により増幅され得る。広範囲の種類のクローニング及びインビトロ増幅方法は、当業者に良く知られている。多くのクローニング試験を通して当業者を方向づけるのに十分なそれらの技法及び説明の例は、次のものに見出される：
【０１２５】
Berger and Kimmel. Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology152 Academic Press,inc., San Diego, CA (Berger) ; Sambrook など. (1989) Molec
ular Cloning -A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Labora
tory, ColdSpring Harbor Press, NY, (Sambrook et al.) ; Current Protocols in Mol
ecular Biology,F. M. Ausubel など., eds., Current Protocols, a joint venture be
tween Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1994Supptement)(Ausubel) ; Cashionなど.,アメリカ特許第 5,017,478号；及びCarr. ヨーロッ
パ特許第0,246,864号。
【０１２６】
インビトロ増幅方法を通して当業者を方向づけるのに十分な技法の例は、次のものに見出される：Berger,Sambrook, and Ausubel, aswell as Mullisなど., (1987) アメリカ
特許第4,683,202号、PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innisなど
. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990)(Innis) ; Amheim & Levinson(October 1, 1990) C& EN 36-47 ; The Journal Of NIH Research (1991) 3 :81-94 ; (Kwoh
など.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 1173 ; Guatelliなど. (1990) Proc. N
atl. Acad. Sci.USA 87 : 1874 ; Lomellなど. (1998) J. Clin. Chem., 35 : 1826 ; L
andegrenなど.,(1988) Science. 241 : 1077-1080 ; Van Brunt (1990) Biotechnology,
8 :291-294 ; Wu and Wallace, (1989) Gene, 4 : 560 ; 及びBarringer など. (1990)
Gene, 89: 117 。
【０１２７】
SKチャネルタンパク質をコードする単離された核酸は、配列番号１，２，３，４，19，20及びそれらの副配列から成る群から選択されたSKチャネルタ ンパク質をコードする核酸配列を含んで成る。好ましい態様においては、SKチャネルタンパク質をコードする単離された核酸は、配列番号13，14，15，16，21，22及びそれらの副配列から成る群から選択される。
【０１２８】
IKチャネルタンパク質をコードする単離された核酸は、IKチャネルタンパク質をコードする核酸配列、たとえば配列番号32及びその副配列を含んで成る。好ましい態様において、IKチャネルタンパク質をコードする単離された核酸は、配列番号31及びその副配列である。
【０１２９】
本明細書において同定される単離された核酸の他に、本発明はまた、配列番号１，２，３，４，19，20,32, 43、及び47及びそれらの副配列から成る群から選択されたタンパク
質をコードする核酸に対して、緊縮条件下で選択的にハイブリダイズする、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする他の単離された 核酸も包含する。一般的に、本発明のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする単離された核酸は、コア領域をコードする配列番号13，14，15，16，21，22, 31, 44又は48又はその副配列からの核酸配列に対して、少なくとも中位の緊縮ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするであろう。
【０１３０】
他方では、又はさらに、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする単離された核酸は、コア領域の長さに対して少なくとも60％， 70％，80％又は90％の類似性のアミノ酸配列をコードするであろう。便利には、コア領域の副配列をコードする核酸は、配列番号13，14，15，16，21，22,32, 44又は48から得られ、そして15〜 400
個の長さのヌクレオチド、及び一般的には少なくとも 250又は 300個の長さのヌクレオチドの少なくともいづれか１つであり；好ましくは核酸は完全なコア配列をコードするであろう。カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする核酸配列又はその副配列は、少なくともＮ’個の長さのヌクレオチドを含んで成り、ここでＮ’は18〜2000から成る群か ら選択された整数のいづれか１つである。従って、本発明の核酸は、ゲノムDNA、及びSK及びIKチャネルタンパク質をコードする核転写体を含んで成る。
【０１３１】
SK又はIKチャネルタンパク質をコードする核酸が核酸プローブとして使用される予定である場合、検出できるラベルにより核酸をラベルすることがしばし ば所望される。ラベルは、当業者に良く知られている多くの手段により組込まれ得る。しかしながら、好ましい態様においては、ラベルは、核酸の調製における増幅段階の間、同時に組込まれる。従って、たとえば、ラベルされたプライマー又はラベルされたヌクレオチドによるポリメラーゼ鎖反応(PCR)は、ラベル された増幅生成物を提供するであろう。もう１つの好ましい態
様においては、ラベルされたヌクレオチド（たとえばフルオレセイン−ラベルされたUTP 及び／又はCTP) を用いての転写増幅は、転写された核酸中にラベルを組込む。
【０１３２】
他方では、ラベルは、元の核酸サンプル（たとえば、mRNA、ポリＡ  mRNA，cDNA、等）に対して、又は増幅が完結された後、増幅生成物に対して 直接的に付加され得る。核酸にラベルを結合する手段は、当業者に良く知られており、そしてたとえば核酸のリン酸化、及びサンプル核酸をラベル（たとえば螢光団）に連結する核酸リンカーの続く結合（連結）によるニックトランスレーション又は末端−ラベリング（たとえば、ラベルされたRNA による）を包含する。
【０１３３】
本発明への使用のための適切な検出できるラベルは、分光、放射性同体、光化学、生化学、免疫化学、電気、光学又は化学的手段により検出できるいづれかの 組成物を包含する。本発明における有用なラベルは、ラベルされたストレプタビジン接合体により染色するためのビオチン、磁気ビーズ、螢光色素（たとえば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、グリーン螢光タンパク質、及び同様のもの）、放射性ラベル（たとえば、3
Ｈ， 125Ｉ，35Ｓ，14Ｃ、又は32Ｐ）、 酵素（たとえば、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びELISAに通常使用される他のもの）、及び比色ラベル、たとえばコロイド状金又は着色されたガラス又はプラスチック（たとえば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラ テックス、等）ビーズを包含する。そのようなラベルの使用を教授する特許は、アメリカ特許第3,817,837号；第 3,850,752号；第 3,939,350号；第 3,996,345号；第4,277,437号；第 4,275,149号及び第4,366,241号を包含する。
【０１３４】
そのようなラベルを検出するための手段は、当業者に良く知られている。従って、たとえば、放射性ラベルは、写真フィルム又はシンチレーションカウンター を用いて検出され得、螢光マーカーは放された光を検出するために光検出器を用いて検出され得る。酵素ラベルは典型的には、酵素に基質を供給し、そして基質に対する酵素の作用により生成される反応生成物を検出することによって検出され、そして比色ラベルは着色されたラベルを単純に可視化することによって検出 される。
【０１３５】
プローブは、特定の組織（たとえば、心臓、脳、膵臓）を包含する興味あるいづれかの源、及び動物源、たとえばラット、ヒト、鳥、等からゲノム又は cDNAライブラリーをスクリーンするために使用される。スクリーニング技法は、当業界において知られており、そして上記で引用された一般的テキスト、たとえばSambrook and Ausubelに記載されている
。
【０１３６】
２．イムノスクリーニングによるSK及びIKチャネルタンパク質の単離
本明細書において請求されるタンパク質の新規形を同定するために核酸プローブを用いる他に、発現ライブラリーをプローブするために抗体を使用することが 可能である。これは、良く知られている技法である（Youngand Davis, 1982 Efficient isolation of genes usingantibody probes Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 80 : 1194-1198 を参照のこ
と）。一般的に、cDNA発現ライブラリーは、市販のキットから、又は容易に入手できる成分を用いて調製され得る。ファージベクターは好ましいが、しかし種々の他のベクターがタンパク質の発現のために利用できる。
【０１３７】
そのようなベクターは、酵母、動物細胞及びキセノパス卵母細胞を包含するが、但しそれらだけには限定されない。標的タンパク質により富化された源から mRNAを選択し、そして次にベクター中に連結され、そしてイムノスクリーニングのためにライブラリー宿主細胞を形質転換するcDNAを創造する。スクリーニングは、細胞上の特定のタンパク質に結合され、又は固体支持体、たとえばニトロセルロース又はナイロン膜上に固定される抗体の結合及び可視化を包含 する。陽性クローンが、均質に精製するために選択され、そして単離されたcDNAが所望する宿主細胞における発現のために調製される。この技法の一般的な再考は、Methodsof Cell Biology Vol. 37, Antibodies in Cell Biology, Ed. DJ Asai
pp.369-382, 1993に見出され得る。
【０１３８】
カルシウム−活性化されたチャネルタンパク質を得るために選択する場合、完全なタンパク質又はその一部を選択するための抗体が使用され得る。適切なペプ チドは、GHRRALFEKRKRLSDY（配列番号28）、FTDASSRSIGAL（配列番号29）、ARKLELTKAEKHVHNFMMDTQLTKR(配列番号30）又はARKLELTKAEKHVHNFMMDTQLTK(配列番号42）を包含する が、但し、それらだ
けには限定されない。
【０１３９】
核酸アッセイ
本発明はまた、遺伝子転写物（たとえば核RNA, mRNA)についてアッセイすることによってSK又はIKチャネルタンパク質発現を検出し、そして／又は定量化するための方法も提供する。このアッセイは、正常な遺伝子又は遺伝子生成物の存在又は不在について、異常遺伝子又は遺伝子生成物の存在又は不在について、又は正常又は異常SK又はIKチャネルタ ンパク質遺伝子生成物の転写レベルの定量化のために存在することができる。
【０１４０】
好ましい態様において、核酸アッセイは、試験されるべき生物から単離された核酸のサンプルにより実施される。最とも単純な態様においては、そのような核 酸サンプルは、生物学的サンプルから単離された全mRNAである。核酸（たとえば、ゲノムDNA又はmRNAのいづれか）は、当業者に良く知られている多くの方法のいづれかに従って、サンプルから単離される。
【０１４１】
中でも核酸アッセイに使用するための全DNA 又はmRNAを単離するための方法は、当業者に良く知られている。たとえば、核酸の単離及び精製方法は、Chapter3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, HybridizationWith Nacleic Acid Probes, Part1, Theory and Nucleic Acid Preparation, P.Tijssen, ed. Elsevier,
N. Y.(1993) に詳細に記載される。当業者は、SK又はIKチャネルタンパク質をコードす
る遺伝子のコピー数の変更が検出される場合、ゲノムDNA が好ましくは、単離されることを認識するであろう。逆に言えば、遺伝子又は複数遺伝子の発現レベルが検出される場合、好ましくは、RNA(mRNA)が単離される。
【０１４２】
時おり、ハイブリダイゼーションの前、核酸サンプルを増幅することが所望される。当
業者は、どんな増幅方法が使用されても、定量結果が所望される場合、増幅された核酸の相対的頻度を維持し又は調節する方法を使用することに注意が払わられ るべきであることを認識するであろう。“定量”増幅の方法は当業者に良く知られている。たとえば、定量PCRは、同じプライマーを用いて、既知量の対照配列を同時に同時増幅することを包含する。これは、PCR反応を検量するために使用され得る内部標準を提供す る。次に、高密度
アレイは、増幅された核酸の定量化のために内部標準に対して特異的なプローブを包含する。定量PCR のための詳細なプロトコールは、PCR Protocols, AGuide to Methods and Applications,Innisなど., Academic Press, Inc. N. Y. (1990)に供給されている。
【０１４３】
SKチャネルタンパク質をコードする核酸配列の存在を検出するための方法は一般的に：（ａ）配列番号１，２，３，４，19，20, 43及び47から成る群から選択されたSKチャネルタンパク質をコードする核酸配列に対して選択的にハイブリダイズする核酸セグメントを含んで成る核酸プローブと生物学的サンプルとを、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で接触せしめ；（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を形成するために、SKチャネルタン パク質をコードする核酸への前記プローブの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることを含んで成り、ここで前記ハイブリダイゼーション複合体の検出がサンプルにおけるSK核酸配列の存在の徴候である。IKチャネルタンパク質の検出は、配列番号32のIKチャネルタンパク質をコードする核酸配列に対して 選択的にハイブリダイズする核酸セグメントを用いて類似する態様で達成される。
【０１４４】
プローブの核酸セグメントは、配列番号13，14，15，16，21，22, 44及び48、並びにそれらの相補的配列から成る群から選択されたSKチャネルをコードする核酸からの少なくともＮ''の長さの隣接するヌクレオチドの副配列である。前記Ｎ''は、15〜1500の個々の整数から成る群から選択された整数のいづれか１つである。IKチャネルタンパク質の存在を検出するため には、核酸セグメントは、配列番号31のIKチャネルをコードする核酸からの少なくともＮ''の長さの隣接するヌクレオチドの副配列である。参照核酸からの“隣接するヌクレオチド”とは、参照核酸におけるのと同じ順序を有し、且つ同じヌクレオチドに直接的に隣接する（すなわち、付加又は欠失を伴わない）ヌ クレオチドの配列を意味する。典型的には、核酸セグメントは、少なくとも18個の長さのヌクレオチドである。核酸プローブの好ましい長さは、24〜200個の長さのヌクレオチドである。
【０１４５】
特に好ましい態様においては、核酸セグメントは、配列番号１，２，３，４，19，20, 32, 43及び47から成る群から選択されたタンパク質からのコア領域をコードする核酸に由来する。便利には、コア領域をコードする核酸は、配列番号13，14，15，16，21，22, 31，44，48及びそれらの相補的配列から成る群から選択された核酸の副配列である。通常、及び特に、交差−種ハイブリダイゼーションに関しては、核酸セグメントは、コア領域内からのアミノ酸配列をコードし、そして少なくとも 250個の長さのヌクレオチドであり、最とも好ましくは、コア領域のすべてをコードし、そして／又は中位の緊縮ハイブリダイゼーション条件下で標的配列に対してハイブリダイズするであろう。
【０１４６】
当業者は、プローブの核酸配列が、標的物へのその核酸セグメントの選択的ハイブリダイゼーションを妨害しないように選択されるであろうことを認識するで あろう。従って、たとえば、核酸セグメントに結合されるいづれかの追加のヌクレオチドは一般的に、緊縮条件下で、核酸標的物（可能性ある誤った陰性）にも、SK又はIKチャネルタンパク質又はペプチドをコードしない核酸（可能性ある誤った陽性）にも、選択的にハイブリダイズしないように選択されるであろ う。選択性及び特異性を確かめるために負及び正の対照の使用は、当業者に知られている。一般的に、プローブの長さは、所望する結果を達成するために必要な最少の長さに維持されるべきである。SK又はIKチャネルタンパク質又はペプチドをコードする核酸（すなわち、それぞれ“SKチャネルタンパク質核酸”又 は“IKチャネルタンパク質核酸”）の長さは、前記で十分に論ぜられたが、しかし好ましくは、少なく
とも30個の長さのヌクレオチドである。
【０１４７】
種々の核酸ハイブリダイゼーション形式が当業者に知られている。たとえば、通常の形式は、サンドイッチアッセイ及び競争又は置換アッセイを包含する。ハ イブリダイゼーション技法は一般的に、Bergenand Kimmel, (1987) 、前記；“Nacleic Acid Hybridization, A Practical Approach”（Hames,B. D. and Higgins, S. J. (eds.), IRL Press, 1985 ; Gall and Pardue, (Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 63 : 378-383 (1969)) ; 及びJohn, Burnsteil and Jones(Nature, 223 : 582-587 (1969))に記載されている。
【０１４８】
サンドイッチアッセイは、核酸配列を検出し、又は単離するために商業的に有用なハイブリダイゼーションアッセイである。そのようなアッセイは、固体支持 体に共有固定される“捕獲”核酸、及び溶液における、ラベルされた“シグナル”核酸を用いる。生物学的サンプルは、標的核酸を供給するであろう。“捕獲”核酸プローブ及び“シグナル”核酸プローブは、標的核酸とハイブリダイズし、“サンドイッチ”ハイブリダイゼーション複合体を形成する。効果的であるため には、シグナル核酸は、捕獲核酸とハイブリダイズすることができない。
【０１４９】
現場ハイブリダイゼーションにおいては、標的核酸は、続く解釈及び分析のために細胞形態を保持しながら、細胞内でのハイブリダイゼーションのために利用 できるように、その細胞周囲から遊離される。次の文献が、現場ハイブリダイゼーションの技術の概観を提供する：Singerなど.,Biotechniques 4 (3) : 230-250 (1986) ; Haase など., Methods
in Virology, Vol. VII, pp. 189-226 (1984) ; Wilkinson, “The theory and practiceof in situ hybridization”In : In situ Hybridization, Ed. D. G. Wilkinson, IRL
Press,Oxford University Press, Oxford ; 及びNucleic Acid Hybridization : A Pra
ctical Approach, Ed. Hames, B. D. and Higgins, S. J., IRL. Press (1987) 。
【０１５０】
典型的には、ラベルされたシグナル核酸は、ハイブリダイゼーションを検出するために使用される。相補的核酸又はシグナル核酸は、ハイブリダイズされたオ リゴヌクレオチドの存在を検出するために典型的に使用されるいくらかの方法のいづれか１つによりラベルされ得る。最とも通常の検出方法は、3Ｈ， 125Ｉ，35Ｓ，14Ｃ又は32Ｐ−ラベルされたプローブ又は同様のものによるオートラジオグラフィーの使用である。他のラベルは、ラベルされた抗体に結合するリガンド、螢光団、化学発光剤、酵素、及びラベルされたリガンドのための特異的結合対メンバーとして作用することができる抗体を包含する。
【０１５１】
ラベルはまた、ハイブリダイゼーション複合体の間接的検出も可能にする。たとえば、ラベルがハプテン又は抗原である場合、サンプルは抗体を用いることに よって検出され得る。それらのシステムにおいては、シグナルは、抗体に螢光又は酵素分子を結合することによって、又は多くの場合、放射性ラベルへの結合により生成される。（Tijssen,“Practice and Theoryof Enzyme Immunoassays, “LaboratoryTechniques in Biochemistry 
and Molecular Biology ”（Burdon, van Knippenberg (eds.), Elsevier, pp. 9-20(1985))。
【０１５２】
本発明の核酸に使用される検出可能ラベルは、前記で論ぜられたように、当業者に知られている多くの手段のいづれかにより組込まれ得る。そのようなラベルを検出する手段は、当業者に良く知られている。
ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸を増幅する核酸増幅システムの使用により増強され得る。そのようなシステムの例は、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)システム及びリガーゼ鎖反応(LCR)システムを包含する。当業者において知られている
他の方法は、核酸配列に基づく増幅（NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario) 及びＱ−Beta Replicaseシステムである。
【０１５３】
当業者は、異常な発現レベル又は異常な発現生成物（たとえば、突然変異誘発された転写体、切断された又はナンセンスタンパク質）が、正常な発現レベル及 び正常な発現生成物への比較により同定されることを認識するであろう。正常な発現レベル又は正常な発現生成物は、当業者に知られている標準方法に従って、いづれか特定集団、副集団、又は生物グループに関して決定され得る。
【０１５４】
典型的には、これは、健康な生物（すなわち、コンダクタンス及びカルシウム感受性のような性質により示されるような機能的SK又はIKチャネルタンパク 質を有する生物）を同定し、そしてSK又はIKチャネルタンパク質遺伝子（本明細書に記載されるような）の発現レベルを測定し、又は典型的な（正常な）配列変動を得るために、遺伝子、mRNA又は逆転写されたcDNAを配列決定することを包含する。分子遺伝学に使用される標準の統計学的方法の適用は、発現 の基線レベル、及び正常な遺伝子生成物、並びにそのような基線レベルからの有意な偏差の決定を可能にする。
【０１５５】
核酸アッセイキット
本発明の核酸は、本発明のSK又はIKチャネルをコードする正常な遺伝子又は遺伝子生成物の存在又は不在を、SK又はIKチャネルをコードする異常な遺 伝子又は遺伝子生成物の存在又は不在について、又は正常又は異常なSK又はIKチャネルタンパク質遺伝子生成物の転写レベルの定量化を、生物学的サンプルにおいて決定するために使用され得るキットに含まれ得る。
【０１５６】
キットは典型的には、本発明のアッセイを実施するための核酸プローブの安定した調製物を含む。さらに、キットはまた、標的のカルシウム−活性化されたカ リウムチャネルタンパク質又はカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質核酸へのプローブのハイブリダイゼーションのための、乾燥形又は液体形のいづれかでのハイブリダイゼーション溶液、所望しない及びハイブリダイズされなかった核酸の洗浄及び除去のための溶液、ハイブリダイゼーションを検出す るための基質、及び／又はアッセイを実施し、そして解釈するための説明書を包含することができる。
【０１５７】
核酸の発現
本発明のSK又はIKチャネルタンパク質をコードする核酸が単離され、そしてクローン化されると、組換え的に構築された細胞、たとえば細菌、酵母、昆虫 （特に、バキュロウィルスベクターを用いる）、及び哺乳類細胞において所望するタンパク質を発現することができる。“組換えタンパク質”は、タンパク質を発現することができるDNA の内因性コピーを、それらの生来の形で有さない細胞を用いて生成されたタンパク質である。細胞は、それらが適切な単離された核酸配列（たとえば、SK又はIKチャネルタンパク質核酸を含んで成るベクター）の導入により遺伝的に変更されているので、組換えタンパク質を生成する。
【０１５８】
当業者は、SK又はIKチャネルタンパク質をコードするDNAの発現のために利用できる多
くの発現システムに知識があることが予測される。原核生物又は真核生物におけるタンパク質の発現について知られている種々の方法を詳細に記載する試みは行なわれないであろう。
【０１５９】
簡単に要約すると、本発明のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする天然又は合成核酸の発現は典型的には、プロモーター（構成的又は誘発性のいづれかである）にDNA又はcDNAを操作可能的に連結し、続いて発現ベクター中に組込むこ
とによって達成されるであろう。ベクターは、原核生物又は真核生物のいづれかにおける複製及び組込みのために適切である。典型的な発現ベクターは、転写及び翻訳ターミネー
ター、開始配列、及びSK又はIKチャネルタンパク質をコードするDNA の発現の調節のために有用なプロモーターを含む。クローン化された遺伝子の高いレベルの発現を得るためには、転写を方向づけるための強いプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写／翻訳ターミネーターを少なくとも含む発現ベクターを構成することが所望される。
【０１６０】
当業者は、修飾がその生物学的活性を低めないで、SK又はIKチャネルタンパク質に対して行なわれ得ることを認識するであろう。いくつかの修飾が、ク ローニング、発現、又は融合タンパク質中への標的分子の組込みを促進するために実施され得る。そのような修飾は、当業者に良く知られており、そしてたとえば、開始部位を供給するためにアミノ末端で付加されるメチオニン、又は便利に配置された制限部位、又は終結コドン、又は精製配列を創造するためにいづれか の末端上に配置される追加のアミノ酸（たとえばポリHis)
を含む。
【０１６１】
１．原核生物における発現
Ｅ．コリにおいてこの目的のために適切な調節領域の例は、Yanofsky, Bacteriol. 158
:1018-1024 (1984) により記載されるようなＥ．コリトリプトファン生合成路のプロモ
ーター及びオペレーター領域、及びHerskowitz and Hagen, Ann. Rev. Genet., 14 : 399-445 (1980) により記載されるようなファージλの左方向プロモーター（ＰL）である。
Ｅ．コリにおいてトランスフェクトされたDNA ベクターにおける選択マーカーの包含はまた有用である。そのようなマーカーの例は、アンピシリン、テトラサイクリン又はクロラムフェニコールに対する耐性を特定する遺伝子を包含する。Ｅ．コリにおいて使用するための選択マーカーに関する詳細については、Sambrook、など. を参照のこと。
【０１６２】
ベクターは、適切な宿主細胞中への導入を可能にするよう選択される。細菌ベクターは典型的には、プラスミド又はファージ起源のものである。適切な細菌細 胞は、ファージベクター粒子により感染され、又は裸のファージベクターDNAによりトランスフェクトされる。プラスミドベクターが使用される場合、細菌細胞はプラスミドベクターDNA によりトランスフェクトされる。SKチャネルタンパク質を発現するための発現システムは、Ｅ．コリ、バシラスsp.(Bacillussp.)及びサルモネラ（Salmonella) を用いて入手できる（Pa
lva 、など., Gene22 : 229-235 (1983) ; Mosbach 、など., Nature 302 : 543-545 (1
983)) 。
【０１６３】
Ｓ．チピムリウム（S. typhimarium) においてSK又はIKチャネルタンパク質を発現する場合、プラスミドベクターの固有の不安定性を気づくべきである。これを回避するためには、外来性遺伝子が、宿主染色体の非必須領域中に組込まれ得る。これは、まず、遺伝子をプラスミド中に、それがサルモネラ染色体において挿入部位に対して相同のDNA の領域を端に有するように、挿入することによって達成される。Ｓ．チピムリウム中へのプラスミドの導入の後、外来性遺伝子は、フランキング配列と染色体DNA との間での相同組換えにより染色体中に組込まれる。
【０１６４】
これがいかにして達成され得るかの例は、サルモネラのhis オペロンに基づかれている。２つの段階がこの工程に包含される。第１においては、his オペロンのセグメントがキャリヤーとして選択されるサルモネラ株において欠失されるべきである。第２においては、SK又はIKチャネルタンパク質をコードする遺伝子の下流に欠失されたhis領域を担持す
るプラスミドを用いて、his サルモネラ株がトランスフェクトされる。his 配列及びSK又はIKチャネルタンパク質をコードする遺伝子の両者の組込みが生じ、his+として選択さ
れ得る組換え株をもたらす。
【０１６５】
発現されたタンパク質の検出は、当業界において知られている方法により達成され、そ
してたとえば、ラジオイムノアッセイ、ウェスターンブロット技法又は免疫沈殿法を包含する。Ｅ．コリからの精製は、アメリカ特許第 4,511,503号に記載される方法に従って達成され得る。
【０１６６】
２．真核生物における発現
種々の真核発現システム、たとえば酵母、昆虫細胞系、鳥、魚、カエル、及び哺乳類細胞が当業者に知られている。下記に手短に説明されるように、本発明の SK又はIKチャネルタンパク質は、それらの真核システムにおいて発現され得る。真核生物におけるSK又はIKチャネルの発現は特に好ましい。
【０１６７】
酵母における異種タンパク質の合成は良く知られている。Methods in Yeast Genetics,
Sherman,F., など., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)は、酵母においてタンパ
ク質を生成するために利用できる種々の方法を記載する十分に認識された研究である。適切なベクターは通常、発現制御配列、たとえばプロモーター、たとえば ３’−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素、及び複製の起点、終結配列、及び同様のものを有する。たとえば、適切なベクターは、文献に記載されている（Botstein、など., 1979, Gene, 8 : 17-24 ;Broach 、など., 1979, Gene, 8 : 121-133) 。
【０１６８】
２種の方法が、酵母細胞のトランスフェクションに使用される。第１の場合、酵母細胞がまず、チモリアーゼ、リチカーゼ、又はグルスラーゼを用いてプロトプラスト中に転換され、続いて、DNA及びポリエチレングリコール(PEG)が添加される。次に、 PEG−処理
されたプロトプラストは、選択条件下で、３％寒天培地において再生される。この方法の詳細は、J. D.Beggs, 1978, Nature (London),275 : 104-109 ; 及びHinnen, A., など
., 1978, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 75 : 1929-1933 による文献に与えられている。
第２の方法は、細胞壁の除去を包含しない。代わりに、細胞は、塩化リチウム、又はアセテート及びPEG により処理され、そして選択プレート上に置かれる（Ito,H.,など.,198
3, J. Bact.,153 : 163-168) 。
【０１６９】
本発明のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質は、発現されると、細胞を溶解し、そしてその溶解物に標準のタンパク質単離技法を適用する ことによって、酵母から単離され得る。精製工程のモニターリングは、ウェスターンブロット技法、又は他の標準イムノアッセイ技法のラジオイムノアッセイを用いて達成され得る。
【０１７０】
カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質をコードする配列はまた、たとえば哺乳類、昆虫、鳥、両性類又は魚起源の細胞培養物をトランスフェ クトすることに使用するために種々の発現ベクターに連結され得る。ペプチドの生成のために有用な細胞培養物の実例は、哺乳類細胞である。哺乳類細胞システムはしばしば、細胞の単層の形で存在するが、但し、哺乳類細胞懸濁液もまた用いられ得る。損なわれていないタンパク質を発現できる多くの適切な宿主細胞系 は、当業界において開発されており、そしてHEK293,BHK21 、及びCHO 細胞系、並びに種々のヒト細胞、たとえばCOS細胞系、HeLa細胞、骨髄
細胞系、Jurkat細胞を包含する。いくつかの態様においては、キセノパス卵母細胞が使用される。
【０１７１】
当業者は、SK又はIKチャネルを発現するための好ましい細胞系は、本発明のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルにより供給される細胞系（すなわ ち、“静止系”）と競争するコンダクタンスを実質的に欠いている。それらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、たとえば複製の起点、プロモーター（たとえば、CMV プロモーター、HSV tkプロモーター又はpgk(ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター）、エンハンサー（Queen など.,(1986)Immunol. Rev. 89 : 49)、及び必要なプロセッシング情報部位、たと
えばリボソーム結合部位、RNA スプライス部位、ポリアデニル化部位（たとえばSV40大TA
g ポリＡ付加部位）、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。SKチャネルタンパク質の生成のために有用な他の動物細胞は、たとえば AmericanType Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (7th edition,1992) から入手できる。
【０１７２】
昆虫細胞においてSK又はIKチャネルタンパク質を発現するための適切なベクターは通常、SF９バキュロウィルスに由来する。適切な昆虫細胞系は、蚊幼 虫、蚕、アワヨトウの幼虫、蛾及びショウジョウバエ細胞系、たとえばSchneider細胞系を包含する（Schneider,
J.Embryol. Exp. Morphol. 27 : 353-365 (1987)を参照のこと）。
上記に示されるように、宿主細胞をトランスフェクトするために使用されるベクター、たとえばプラスミドは好ましくは、転写を開始するためのDNA 配列、及びタンパク質の翻訳を制御するための配列を含む。それらの配列は、発現制御配列として言及される。
【０１７３】
酵母に関して、高等動物宿主細胞が使用される場合、既知の哺乳類遺伝子からのポリアデニル化又は転写ターミネーター配列が、ベクター中に組込まれるため には必要である。ターミネーター配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列もまた含まれ得る。スプライシング配列の例は、SV40からのVP１イントロンである（Sprague,J. など., 1983, J. Virol. 45 : 773-
781)。
【０１７４】
さらに、宿主細胞における複製を制御するための遺伝子配列が、ベクター、たとえばウシ乳頭腫ウィルス型−ベクターに見出されるベクター中に組込まれ得 る。Saveria- Campo, M., 1985,“Bovine Papilloma virus DNA a Enkaryotic Cloning Vector”inDNA Cloning Vol. II a Practical Approach Ed. D. M. Glover, IRL Press, Arlington,Virginia pp. 213-238を参照のこと。
【０１７５】
宿主細胞は、コンピテントであり、又は種々の手段により、トランスフェクションのためにコンピテントにされる。動物細胞中にDNA を導入するためのいくつかの良く知られている方法が存在する。それらは次のものを包含する：リン酸カルシウム沈殿、DNAを含む細菌性プロトプラストと受容体細胞との融合、DNA を含むリポソームによる受容体細胞の処理、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション及び細胞中へのDNAの直接的なマイク
ロインジェクション。トランスフェクトされた細胞は、当業界において良く知られている手段により培養される。Biochemical Methods in CellCeltnre and Virology, Kuchler,
R. J.,Dowden, Hutchinson and Ross, Inc., (1977) を参照のこと。発現されたタンパ
ク質は、良く知られている機械的、化学的又は酵素的手段により回収される。
【０１７６】
発現されたペプチドの精製
組換えDNA 技法により生成される本発明のSK又はIKチャネルタンパク質は、当業者に良く知られている標準の技法により精製され得る。組換え的に生成されたSK又はIKチャネルタンパク質は、直接的に発現され、又は融合タンパク質として発現され得る。本発明の組換えカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク 質は、細胞溶解（たとえば、音波処理）及びアフィニティークロマトグラフィーの組合せにより精製される。融合生成物に関しては、適切なタンパク質分解酵素による融合タンパク質の続く消化は、所望する組換えカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質を開放する。
【０１７７】
本発明のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質（組換え又は合成）は、当業界において良く知られている標準技法、たとえば硫酸アンモニウ ムのような物質による選択沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法、及び他の方法により実質的な純粋性に精製され得る。たとえば、R.Scopes, Protein Purification : Principles and Practice,Springer - Verlag : NewYork (1982) ; Deutscher, Guide to Protein Purif
ication,Academic Press, 1990 を参照のこと。たとえば、本発明のタンパク質は、本明
細書に記載されるようなSK又はIKチャネルタンパク質に対して生ぜしめられた抗体を用いてイムノアフィニティーカラムにより精製され得る。
【０１７８】
カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質の対する抗体
抗体は、本発明のSK又はIKチャネルタンパク質、たとえば個々の対立遺伝子、株、又は種変異体、及びそれらのフラグメントに対して、それらの天然に存 在する（十分な長さ）形で及び組換え形で生ぜしめられる。さらに、抗体は、それらの生来の形状又は非生来の形状で、それらのタンパク質に対して生ぜしめられる。抗−イジオタイプ抗体がまた生成され得る。抗体を製造する多くの方法が当業者に知られている。次の議論が利用できる技法の一般的な概観として存在す るが、しかしながら、当業者は、次の方法に基づく多くの変法が知られていることを認識するであろう。
【０１７９】
Ａ．抗体生成
多くの免疫原が、SK又はIKチャネルタンパク質と特異的に反応する抗体を生成するために使用される。５個の長さ又はそれ以上の長さの、及び配列番号 １，２，３，４，19，20，32,43又は47の副配列から選択された、単離された組換え、合成又は生来のSK又はIKチャネルタンパク質が、モノクローナル又はポリクローナル抗体の生成 のための好ましい免疫原（抗原）である。当業者は、本発明のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質が典型的には、発現ライブラリーをスクリーニングするために、又は本発明の推定上のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質が非生来の二次、三次、又は四次構造で発現され又は変性 される他のアッセイのために、抗体の形成の前に変性されることを容易に理解するであろう。
【０１８０】
免疫原として使用するための典型的なタンパク質は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：GHRRALFEKRKRLSDY（配列番 号28）、FTDASSRSIGAL（配列番号29）、ARKLELTKAEKHVHNFMMDTQLTKR（配列番号30）、及びARKLELTKAEKHVHNFMMDTQLTK（配列
番号42）。１つの種類の好ましい態様においては、免疫原性タンパク質接合体がまた、免疫原とに包含される。天然に存在するSK又はIKチャネルタンパク質はまた、純粋な形又は不純な形のいづれかで使用される。
【０１８１】
次に、SK又はIKチャネルタンパク質が、抗体を生成できる動物中に注入される。モノクローナル又はポリクローナル抗体が、カルシウム−活性化されたカ リウムチャネルタンパク質の存在及び量を測定するためにイムノアッセイへの続く使用のために生成され得る。ポリクローナル抗体を生成するための方法は、当業者に知られている。手短には、免疫原（抗原）、好ましくは精製されたSK又はIKチャネルタンパク質、適切なキャリヤー（たとえば、GST 、キーホールリンペットヘマノシアニン、等）に結合されたSK又はIKチャネルタンパク質、免疫化ベクター、たとえば組換えワクシニアウィルス中に組込まれたSK又はIKチャネルタンパク質（アメリカ特許第4,722,848号を参照のこと）が、アジュバントと
共に混合され、そして動物がその混合物により免疫化される。
【０１８２】
免疫原調製物に対する動物の免疫応答が、試験採血を取り、そして興味あるカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質に対する反応性の力価を決 定することによってモニターされる。免疫原に対する適切に高い力価の抗体が得られる場合、血液が動物から採血されて、そして抗血清が調製される。SK又はIKチャネルタンパク質に対して反応性の抗体を富化するために抗血清のさらなる分別が、所望の場合、実施される（たとえば、Coligan (1991)CurrentProtocols in Immunology Wiley/Greene, NY ; 及びHarlow and
Lane(1989) Antibodies : A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NYを参照
のこと）。
【０１８３】
SK又はIKチャネルタンパク質の前もって決定されたフラグメントに対する抗体、たとえ
ばその結合フラグメント及び一本鎖組換え型は、上記のようなキャリヤータンパク質と前記フラグメントとの接合体により動物を免疫化することによって生ぜし められる。典型的には、興味ある免疫原は、少なくとも約５個のアミノ酸のSK又はIKチャネルタンパク質である。より典型的には、SK又はIKチャネルタンパク質は、10個の長さ、好ましくは15個の長さのアミノ酸であり、そしてより好ましくは、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質は、 20個又はそれ以上の長さのアミノ酸である。ペプチドは典型的には、キャリヤータンパク質（たとえば、融合タンパク質として）に結合され、又は免疫化ベクターに組換え的に発現される。抗体が結合するペプチドに基づく抗原決定基は、典型的には、３〜10個の長さのアミノ酸である。
【０１８４】
モノクローナル抗体は、所望する抗体を分泌する細胞から調製される。モノクローナル抗体は、免疫原が由来するSK又はIKチャネルタンパク質に対する結 合についてスクリーンされる。特異的モノクローナル及びポリクローナル抗体は通常、少なくとも約0.1mM、より通常には少なくとも約50μＭ、及び最とも好ましくは少なくとも約１μＭ又はそれ以上のＫD を伴って結合するであろう。
【０１８５】
多くの場合、種々の哺乳類宿主、たとえばマウス、ゲッ歯動物、霊長類、ヒト、等からモノクローナル抗体を調製することが所望される。そのようなモノク ローナル抗体を調製するための技法の記載は、たとえば次の文献に見出される：Stites  など.(eds.) Basic
and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA、及びそこに引用される文献；Harlowand Lane、前記；Goding (1986) Monoclonal Antibodies : Principle and Practice (2ded.) Academic Press, New York, NY ;及びKohler and Milstein (1975) Nature 256 :495-497 。
【０１８６】
手短に要約すると、この方法は、SK又はIKチャネルタンパク質を含んで成る免疫原を動物に注射することによって進行する。次に、動物が殺され、そして 細胞がその脾臓から取られ、ここで細胞は骨髄腫細胞により融合されている。その結果物は、インビトロで再生できるハイブリッド細胞又は“ハイブリドーマ”である。次に、ハイブリドーマの集団がスクリーンされ、個々のクローンが単離され、その個々のクローンが免疫原に対する単一の抗体種を分泌する。この態様 においては、得られる個々の抗体種は、免疫原性物質上に認識される特異的部位に応答して生成される免疫動物からの不滅化され、そしてクローン化された単一のＢ細胞の生成物である。
【０１８７】
不滅化の方法は、Epstein Barrウィルス、腫瘍遺伝子、又はレトロウィルスによるトランスフェクション、又は当業界において知られている他の方法を包含する。単一の不滅化された細胞から生じるコロニーが、抗原のための所望する特異性及び親和性の抗体の生成のためにスクリーンされ、そしてそのような細胞により生成されるモノクロー ナル抗体の収量は、種々の技法、たとえば脊椎動物（好ましくは哺乳類）宿主の腹膜腔中への注射により増強される。本発明のSK又はIKチャネルタンパク質及び抗体は、修飾なしに、又は修飾を伴って使用され、そしてキメラ抗体、たとえばヒト適合されたネズミ抗体を包含する。
【０１８８】
他の適切な技法は、ファージ又は類似するベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択を包含する（たとえば、Huseなど. (1989) Science246 : 1275-1281 ;及びWard, など.(1989) Nature 341 : 544-546 ; 及びVaughan など. (1996)Nature Biotechnolog
y 14 : 309-314を参照のこと）。他方では、高い結合活性のヒトモノクローナル抗体が、転位されていないヒトＨ鎖及びＬ鎖Ig遺伝子座のフラグメントを含んで成るトランスジェニックマウス（すなわち、ミニ遺伝子座トランスジェニックマウス）から得られる。Fishwildなど., Nature Biotech., 14: 845-851 (1996) 。
【０１８９】
時おり、SK又はIKチャネルタンパク質及び抗体は、検出できるシグナルを提供する物質を、共有又は非共有結合することによってラベルされるであろう。 広範囲の種類のラベル及び接合技法が知られており、そして科学及び特許文献の両者に広く報告されている。適切なラベルは、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補因子、インヒビター、螢光成分、化学発光成分、磁気粒子、及び同様のものを包含する。そのようなラベルの使用を教授する特許は、アメリカ特許第3,817,837号；第 3,850,752号；第 3,939,350号；第 3,996,345号；第4,277,437号；第 4,275,149号；及び第4,366,241号を包含する。また、組換え免
疫グロブリンが生成され得る。Cabilly 、アメリカ特許第 4,816,567号；及びQueen など. (1989) Proc.Nat'l Acad.Sci. USA 86 : 10029-10033を参照のこと。
【０１９０】
本発明の抗体はまた、SK又はIKチャネルタンパク質タンパク質を単離することにおいてアフィニティークロマトグラフィーのためにも使用される。カラム は、たとえば固体支持体、たとえば粒子、たとえばアガロース、Sephadex又は同様のものに連結される抗体により調製され、ここで細胞溶解物がカラムに通され、洗浄され、そして高まる濃度のマイルドな変性剤により処理され、それにより、精製されたSK又はIKチャネルタンパク質が放される。
【０１９１】
抗体は、特定の発現生成物、たとえば正常又は異常ヒトSK又はIKチャネルタンパク質のための発現ライブラリーをスクリーンするために使用され得る。通常、そのような方法における抗体は、抗体結合により抗原の存在の容易な検出を可能にする成分によりラベルされる。
SK又はIKチャネルタンパク質に対して生ぜしめられる抗体はまた、抗−イディオタイプの抗体を生ぜしめるためにも使用され得る。それらは、それぞれの抗原の存在に関連する種々の病理学的状態を検出し、又は診断するために有用である。
【０１９２】
Ｂ．ヒト又はヒト適合された（キメラ性）抗体生成
本発明の抗−SK又は抗−IKチャネルタンパク質抗体はまた、治療目的のために哺乳類（たとえばヒト患者）に投与され得る（たとえば、エフェクター分 子、たとえばラベル、細胞毒素、酵素、成長因子、薬物、等に接合され、又は融合される場合、標的化分子として）。抗体が生ぜしめられる種以外の生物に投与される抗体はしばしば、免疫原性である。従って、たとえば、ヒトに投与されるネズミ抗体はしばしば、複数回の投与に基づいて、抗体に対する免疫応答（たと えば、ヒト抗−マウス抗体（HAMA）応答）を誘発する。抗体の免疫原性質は、抗体の一部又はすべてを、特徴的なヒト配列に変更することによって低められ、それにより、それぞれ、キメラ又はヒト抗体が生成される。
【０１９３】
ｉ）ヒト適合された（キメラ性）抗体
ヒト適合された（キメラ性）抗体は、ヒト及び非ヒト部分を含んで成る免疫グロブリン分子である。より特定には、ヒト適合されたキメラ抗体の抗原組合せ領 域（又は可変領域）は、非ヒト源（たとえばネズミ）に由来し、そしてキメラ抗体の不変領域（免疫グロブリンに生物学的エフェクター機能を付与する）は、ヒト源に由来する。ヒト適合されたキメラ抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性、及びヒト抗体分子により付与されるエフェクター機能を有すべきである。
【０１９４】
キメラ抗体を生成するための多くの数の方法が当業者に良く知られている（たとえば、アメリカ特許第5,502,167号；第 5,500,362号；第5,491,088号；第 5,482,856号；第 5
,472,693号；第5,354,847号；第 5,292,867号；第 5,231,026号；第 5,204,244号；第 5
,202,238号；第5,169,939号；第 5,081,235号；第 5,075,431号及び第 4,975,369号を参
照のこと）。キメラ（ヒト適合された）抗体の調製のための詳細な方法は、アメリカ特許第5,482,856号に見出され得る。
【０１９５】
ii）ヒト抗体
もう１つの態様において、本発明は十分なヒト抗−SKチャネルタンパク質抗体を供給する。ヒト抗体は、特徴的なヒトポリペプチド配列から完全に成る。本 発明のヒト抗−SK又は抗−IKチャネルタンパク質抗体は、広範囲の種類の方法を用いて生成され得る（たとえば、Larrickなど.,アメリカ特許第5,001,065号を参照のこと）。
【０１９６】
好ましい態様においては、本発明のヒト抗−SKチャネルタンパク質抗体は通常、トリオーマ（trioma)細胞において始め生成される。次に、その抗体をコードする遺伝子が他の
細胞、特に非ヒト哺乳類細胞においてクローン化され、そして発現される。トリオーマ技法によりヒト抗体を生成するための一般的なアプローチは、 Ostberg など.(1983), Hybridoma 2 :361-367, Ostberg、アメリカ特許第 4,634,664号及びEngelmanなど.,アメリカ
特許第4,634,666号により記載されている。この方法により得られる抗体−産生細胞系は
、それらが３種の細胞、すなわち２種のヒト細胞及び１種のマウス細胞から由来するので、トリオーマと呼ばれる。トリオーマは、ヒト細胞から製造される通常のハイブリドーマよりもより安定して抗体を生成することが見出された。
【０１９７】
トリオーマ細胞系により分泌される免疫グロブリンのＨ及びＬ鎖をコードする遺伝子は、当業界において知られている、ポリメラーゼ鎖反応を包含する方法に 従って、クローン化される（たとえば、Sambrookなど.,Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, N. Y.,1989 ; Berger & Kimmel, Methods in Enzymology, Vol. 152 : Guideto MolecularCloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego
, Calif., 1987; Coなど., (1992) J. Immunol., 148 : 1149 を参照のこと）。たとえ
ば、Ｈ及びＬ鎖をコードする遺伝子は、トリオーマのRNA の逆転写により生成されるトリオーマDNA 又はcDNAからクローン化される。クローニングは、クローン化される遺伝子又は遺伝子のセグメントを端に有するか又はそれをオーバーラップする配列に対してハイブリダイズするPCRプライマーの使用を包含する従来の技法により達成される。
【０１９８】
カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質イムノアッセイ
SK及びIKチャネルタンパク質についてのイムノアッセイは、少なくとも２種の異なった目的のために使用され得る。それらは、免疫学的に交差反応できることによりタンパク質の関連性を決定するために、又はチャネルタンパク質の存在又は不在の検出のために使用され得る。
【０１９９】
未知のタンパク質が本発明のチャネルタンパク質に関連するかどうかを決定する場合、種々のアッセイが使用され得る。たとえば、交差−反応性について試験 するために競争イムノアッセイが好ましい。たとえば、配列番号２又は32のタンパク質が固体支持体に固定され得る。タンパク質又はペプチドが、前記固定された抗原に対する抗血清の結合と競争するアッセイに添加される。固定されたタンパク質への抗血清の結合と競争する上記タンパク質の能力が、試験タンパク質 に関連すると思われるタンパク質に比較される。
【０２００】
試験される抗血清が特定のタンパク質に対して特異的であるか又はそれに対して選択的に結合することを確かめるために、それが、他の密接に関連するタンパ ク質に対する交差反応性について試験されるであろう。これは、低、中間及び高いコンダクタンスのチャネル間を区別するであろう血清の生成を可能にする。上記タンパク質についての％交差反応性が、標準の計算を用いて計算され得る。上記に列挙される個々のタンパク質と10％以下の交差反応性を有する。それらの 抗血清が選択され、そしてプールされる。交差反応する抗体は、任意には、上記列挙されたタンパク質による免疫吸着によりプールされた抗血清から除去される。
【０２０１】
次に、免疫吸着され、そしてプールされた抗血清は、請求された又はプロトタイプの免
疫原タンパク質に第２タンパク質を比較するために、上記競争結合イムノアッセイに使用される。この比較を行なうために、２種のタンパク質が、広範囲の濃度 でそれぞれアッセイされ、そして固定されたタンパク質に対しての抗血清の結合の50％を阻害するために必要とされる個々のタンパク質の量が決定される。必要とされるタンパク質の量がプロトタイプタンパク質の量の２倍以下である場合、その第２タンパク質は、プロトタイプ免疫原に対して生成される抗体に特異的 に結合すると言われる。
【０２０２】
抗体が短いペプチドに対して生成される場合、試験タンパク質は任意には、選択結合について十分に試験するために変性される。標的ペプチドが、大きなペプ チドの一部であるので、抗体に容易に接近できない情況においては、類似するサイズのプロトタイプタンパク質に対する試験タンパク質の関連性を測定することが適切であり、たとえば抗血清がプロトタイプのモノマーのペプチドに対して生成されても、プロトタイプの十分な長さのモノマーに対する十分な長さのモノ マーを試験することができる。これは、試験結果の読み取りを単純にし、そして競争イムノアッセイから生成されるデータの決定におけるコンホメーション問題及び分子量／モル濃度の考慮を回避する。
【０２０３】
本発明のSK又はIKチャネルタンパク質を検出するための手段は、本発明の決定的観点ではない。好ましい態様において、SK又はIKチャネルタンパク質 は、多くの十分に認識される免疫学的結合アッセイのいづれかを用いて検出され、そして／又は定量化される（たとえば、アメリカ特許第4,366,241号；第 4,376,110号；第 4,517,288号；及び第 4,837,168号を参照のこと）。一般的なイムノアッセイの再考のためには、また、MethodsinCel
l BiologyVolume 37 : Antibodies in Cell Biology, Asai, ed. Academic Press, Inc.
New York(1993) ; Basic and Clinical Immunology 7th Edition, Sites & Terr,eds.
(1991) を参照のこと。
【０２０４】
免疫学的結合アッセイ（又はイムノアッセイ）は典型的には、分析物（この場合、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質）を特異的に結合 し、そしてしばしば固定するために“捕獲剤”を用いる。前記捕獲剤は、分析物を特異的に結合する成分である。好ましい態様においては、捕獲剤は、本発明のカルシウム−活性化されたカリウムチャネルタンパク質を特異的に結合する抗体である。前記抗体（抗−SK又は抗−IKチャネルタンパク質抗体）は、本明細 書に記載されるように当業者に知られている多くの手段のいづれかにより生成され得る。
【０２０５】
イムノアッセイはまたしばしば、捕獲剤及び分析物により形成される結合複合体に特異的に結合し、そしてそれをラベルするためのラベリング剤を利用する。 そのラベリング剤は、それ自体、抗体／分析物複合体を含んで成る成分の１つであり得る。従って、ラベリング剤は、ラベルされたSK又はIKチャネルタンパク質又はラベルされた抗−SK又は抗−IKチャネルタンパク質抗体であり得る。他方では、ラベリング剤は、第三成分、たとえば抗体／SK又は抗体／IK チャネルタンパク質複合体に対して特異的に結合するもう１つの抗体であり得る。
【０２０６】
好ましい態様においては、ラベリング剤は、ラベルを担持する第２のSK又はIKチャネルタンパク質抗体である。他方では、前記第２のSK又はIKチャネ ルタンパク質抗体は、ラベルを欠くことができるが、しかしそれは、第２抗体が由来する種の抗体に対して特異的なラベルされた第３抗体により結合され得る。前記第２抗体は、第３のラベルされた成分；たとえば酵素−ラベルされたストレプタビジンが特異的に結合し得る検出可能成分、たとえばビオチンにより修飾さ れ得る。
【０２０７】
免疫グロブリン不変領域を特異的に結合できる他のタンパク質、たとえばプロテインＡ又はプロテインＧはまた、ラベリング剤としても使用され得る。それらのタンパク質は、
ストレプトコーカル(Streptococcal)細菌の細胞壁の通常の構成成分である。それらは、
種々の種からの免疫グロブリン不変領域と強い非免疫原性反応性を示す（一般的に、Kronval 、など. (1973)J. Immunol., 111 :1401-1406 ; 及びAkerstrom 、など. (1985) J
. Immunol., 135: 2589-2542 を参照のこと）。
【０２０８】
アッセイを通して、インキュベーション及び／又は洗浄段階は、試薬の個々の組合せの後に必要とされる。インキュベーション段階は、約５秒〜数時間まで、 好ましくは約５分〜約24時間まで変化し得る。しかしながら、インキュベーション時間は、アッセイ形式、分析物、溶液の体積、濃度、及び同様のものに依存するであろう。通常、アッセイは周囲温度で実施されるが、但しそれらは、広範囲の温度、たとえば10℃〜40℃にわたって実施され得る。
【０２０９】
本発明のイムノアッセイの詳細は使用される特定の形式により変化し得るが、生物学的サンプルにおけるSK又はIKチャネルタンパク質を検出するための方 法は一般的に、生物学的サンプルと、SK又はIKチャネルタンパク質に対して特異的に反応する抗体とを、免疫学的に反応する条件下で接触せしめる段階を含んで成る。抗体は、免疫学的に反応する条件下でSK又はIKチャネルタンパク質への結合を可能にし、そして結合された抗体の存在が直接的に又は間接的に検 出される。
【０２１０】
Ａ．非競争アッセイ形式
本発明のSK又はIKチャネルタンパク質を検出するためのイムノアッセイは、競争及び非競争形式を包含する。非競争イムノアッセイは、捕獲された分析物 （この場合、SK又はIKチャネルタンパク質）の量が直接的に測定されるアッセイである。好ましい“サンドイッチ”アッセイにおいては、捕獲剤（抗−SK又は抗−IKチャネルタンパク質抗体）が、それらが固定される固体支持体に直接的に結合され得る。
【０２１１】
次に、それらの固定された抗体が、試験サンプルに存在するSK又はIKチャネルタンパク質を捕獲する。次に、このようにして固定されたSK又はIKチャ ネルタンパク質が、ラベリング剤、たとえばラベルを担持する第２のヒトSK又はIKチャネルタンパク質抗体により結合される。他方では、第２のSK又はIKチャネルタンパク質抗体は、ラベルを欠いているが、しかしそれは第２抗体が由来する種の抗体に対して特異的なラベルされた第３抗体により結合され得 る。前記第２抗体は、第３のラベルされた成分、たとえば酵素−ラベルされたストレプタビジンが特異的に結合する検出可能成分、たとえばビオチンにより修飾され得る。
【０２１２】
Ｂ．競争アッセイ形式
競争アッセイにおいては、サンプルに存在する分析物（SK又はIKチャネルタンパク質）の量は、サンプルに存在する分析物により捕獲剤（抗−SK又は抗 −IKチャネルタンパク質抗体）から置換される（又は競争される）添加された（外因性の）分析物（SK又はIKチャネルタンパク質）の量を測定することによって、間接的に測定される。１つの競争アッセイにおいては、この場合、既知量のSK又はIKチャネルタンパク質が、サンプルに添加され、そして次に、そ のサンプルが、捕獲剤、この場合、SK又はIKチャネルタンパク質を特異的に結合する抗体と接触される。抗体に結合されるSK又はIKチャネルタンパク質の量が、サンプルに存在するSK又はIKチャネルタンパク質の濃度に反比例する。
【０２１３】
特に好ましい態様においては、抗体は固体支持体上に固定される。抗体に結合されるSK又はIKチャネルタンパク質の量は、その対応するSK又はIKチャ ネルタンパク質／抗体複合体に存在するSK又はIKチャネルタンパク質の量を測定し、又は他方では、残る複合体化されていないSK又はIKチャネルタンパク質の量を測定することによって、決定され得る。SK又はIKチャネルタンパク質の量は、ラベルされたSK又はIKチャネルタンパク質分子を供給
することによって検出され得る。
【０２１４】
ハプテン阻害アッセイは、もう１つの好ましい競争アッセイである。このアッセイにおいては、既知の分析物、この場合、SK又はIKチャネルタンパク質 が、固体支持体上に固定される。それぞれ、既知量の抗−SK又は抗−IKチャネルタンパク質抗体がサンプルに添加され、そして次に、そのサンプルが固定されたSK又はIKチャネルタンパク質と接触せしめられる。この場合、固定されたSK又はIKチャネルタンパク質に結合される抗−SK又は抗−IKチャネル タンパク質抗体の量が、サンプルに存在するSK又はIKチャネルタンパク質の量に反比例する。再び、固定された抗体の量は、抗体の固定された画分、又は溶液に残る抗体の画分のいづれかを検出することによって検出され得る。検出は、抗体がラベルされる場合、直接的であり、又は上記のような抗体に特異的に結合 するラベルされた成分の続く添加によりラベルされる場合、間接的であり得る。
【０２１５】
Ｃ．他のアッセイ形式
特に好ましい態様においては、ウェスターンブロット（イムノブロット）分析は、サンプルにおけるSK又はIKチャネルタンパク質の存在を検出し、そして 定量化するために使用される。その技術は一般的に、分子量に基づいてゲル電気泳動によりサンプルタンパク質を単離し、適切な固体支持体（たとえば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター又は誘導体化されたナイロンフィルター）に前記調製されたタンパク質を移し、そして前記サンプルを、SKチャネ ルタンパク質を特異的に結合する抗体と共にインキュベートすることを含んで成る。抗−SK又は抗−IKチャネルタンパク質抗体は、それぞれ、固体支持体上のSK又はIKチャネルタンパク質に特異的に結合する。それらの抗体は間接的にラベルされ得、又は他方では、抗−SK又は抗−IKチャネルタンパク質に対 して特異的に結合するラベルされた抗体（たとえば、ラベルされた羊抗−マウス抗体）を用いて検出され得る。
【０２１６】
他のアッセイ形式は、特定分子（たとえば抗体）を結合し、そして封入された試薬又はマーカーを開放するよう企画されたリポソームを使用するリポソームイ ムノアッセイ(LIA）を包含する。次に、その開放された化学物質が標準の技法に従って検出される（Monroeなど.(1986)Amer. Clin. Prod. Rev. 5 : 34-41 を参照のこと）。
【０２１７】
Ｄ．ラベル
アッセイに使用される特定のラベル又は検出できるグループは、それがアッセイに使用される抗体の特異的結合を有意に妨害しない限り、本発明の決定的観点 ではない。検出できるグループは、検出できる物理的又は化学的性質を有するいづれかの材料であり得る。そのような検出できるラベルはイムノアッセイの分野においては十分に開発されており、そして一般的に、そのような方法において有用なほとんどのいづれかのラベルが本発明に適用され得る。従って、ラベルは、 分光、光化学、生化学、免疫化学、放射性同位体、電気、光学又は化学的手段により検出できるいづれかの組成物である。本発明における有用なラベルは、前記で論ぜられたような核酸のラベリングに使用されるものを包含する。
【０２１８】
ラベルは、当業界において良く知られている方法に従って、アッセイの所望する成分に直接的に又は間接的に結合され得る。上記のように、広範囲の種類のラ ベルが使用され得、そしてラベルの選択は、必要とされる感度、化合物との接合の容易性、安定性の必要条件、利用できる装置及び捨棄規定に依存する。
【０２１９】
非放射性ラベルはしばしば、間接的手段により結合される。一般的に、リガンド分子（たとえばビオチン）は分子に共有結合される。次に、リガンドが、本来 検出できるか、又はシグナルシステム、たとえば検出できる酵素、螢光化合物又は化学発光化合物に共有結合される抗−リガンド（たとえばストレプタビジン）分子に結合する。多くの数のリガン
ド及び抗−リガンドが使用され得る。リガンドが天然の抗−リガンド、たとえばビオチン、チロキシン及びコルチゾールを有する場合、それはラベルされた、天 然に存在する抗−リガンドと接合して使用され得る。他方では、いづれかのハプテン性又は抗原性化合物が、抗体と組合して使用され得る。
【０２２０】
分子はまた、たとえば酵素又は螢光団との接合により、シグナル生成化合物に直接的に接合され得る。ラベルとしての興味ある酵素は、主にヒドロラーゼ、特 にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、又はオキシレダクターゼ、特にペルオキシダーゼであろう。螢光化合物は、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、等を包含する。化学発光化合物は、ルシフェリン、及び２，３−ジヒドロフタルアジンジオン、 たとえばルミノールを包含する。使用され得る種々のラベリング又はシグナル生成システムの再考のためには、アメリカ特許第4,391,904号を参照のこと。
【０２２１】
ラベルを検出する手段は、当業者に良く知られている。従って、たとえば、ラベルが放射性ラベルである場合、検出のための手段は、シンチレーションカウン ター又はオートラジオグラフィーとしての写真フィルムを包含する。ラベルが螢光ラベルである場合、それは、光の適切な波長を有する螢光色素を励起せしめ、そしてその得られる螢光を検出することによって検出され得る。螢光は、可視的に、写真フィルムにより、電子検出機、たとえば電荷結合の装置(CCDS）又は光増幅機、及び同様のものにより検出され得る。
【０２２２】
同様に、酵素ラベルは、酵素のために適切な基質を供給し、そしてその得られる反応生成物を検出することによって検出され得る。最終的に、単純な比色ラベ ルは、ラベルに関連する色彩を観察することによって、単純に検出され得る。従って、種々のディプスティクアッセイにおいては、接合された金がしばしばピンク色に見え、そして種々の接合されたビーズがビーズの色を現わす。
【０２２３】
いくつかのアッセイ形式は、ラベルされた成分の使用を必要としない。たとえば、凝集アッセイは標的抗体の存在を検出するために使用され得る。この場合、 抗原−被覆された粒子が、標的抗体を含んで成るサンプルにより凝集される。この形式においては、どの成分もラベルする必要はなく、そして標的抗体の存在は、単純な眼での調査により検出される。
【０２２４】
イムノアッセイ検出キット
本発明はまた、発現されるSK又はIKチャネルタンパク質のレベルにおいて不完全な生物（たとえば患者）の診断のためのキットを提供する。キットは好ま しくは、動物におけるSK又はIKチャネルタンパク質の量を検出するための１又は複数の試薬を含む。好ましい試薬は、正常なSK又はIKチャネルタンパク質又はその副配列に対して特異的に結合する抗体を包含する。抗体は自由であるか、又は固体支持体、たとえば試験管、マイクロウェルプレート、ディプス ティック及び同様のもの上に固定され得る。キットはまた、SK又はIKチャネルタンパク質の検出のためのアッセイにおける抗体の使用を教授する説明材料を含むこともできる。キットは、ラベルの検出のための適切な試薬、正及び負の対照、洗浄溶液、希釈緩衝液及び同様のものを含むことができる。
【０２２５】
Ｋ+ 流を高めるか又は低める化合物についてのアッセイ
細胞において発現される本発明の単離されたSK又はIKチャネル核酸は、それぞれ、SK又はIKチャネルを通しこのカリウムの流れ（すなわち、流入又は 流出）を高めるか又は低める化合物を検出するために種々のアッセイに使用され得る。一般的に、カリウムイオン流を低める化合物は、少なくとも10％又は20％、より好ましくは少なくとも30％，40％又は50％、及び最も好ましくは少なくとも70％，80％，90％又は100％の低下を引き起こすで
あろう。カリウムイオン流を高める化合物は、SK又はIKチャネルの開口の可能性を高め、そしてカリウムイオンの通過を可能にすることによって、カリウムイオン流密度の検出できる上昇を引き起こすであろう。
【０２２６】
典型的には、その流れは、少なくとも20％，50％， 100％又は 200％、しばしば少なくとも 400％，600％， 1,000％， 5,000％、又は10,000％上昇するであろう。高められた
又は低められたカリウム流は、SK又はIKチャネルを発現する細胞の分極化（すなわち、電位）の変化を決定することによって評価され得る。細胞分極化の変 化を決定するための特に好ましい手段は、電圧−クランプ技法である。全細胞流は便利には、例３に示される条件を用いて決定される。他の既知のアッセイは、放射性ラベルされたルビジウム流アッセイ、及び電圧感受性色素を用いての螢光アッセイを包含する。
【０２２７】
たとえば、Vestergarrd- Bogindなど., J. Membrane Biol., 88 : 67-75 (1988) ; Da
nielなど., J.Pharmacol. Meth., 25 : 185-193 (1993) ; Holevinskyなど., J. Membra
ne Biology, 137: 59-70 (1994)を参照のこと。SKチャネルタンパク質を通してのカリウ
ム流を阻害し又は高めることができる化合物についてのアッセイは、本発明のSK又はIKチャネルを有する細胞と接触して存在し、そしてそれを含んで成る槽 溶液への前記化合物の適用により実施され得る。たとえば、Blatzなど., Nature, 323 : 718-720 (1986) ; Park, J.Physiol., 481 : 555-570 (1994) を参照のこと。一般的に、試験されるべき化合
物は、１pM〜100mMの範囲で存在する。チャネルの機能の変化は、電流又はイオン流で、
又は電流及びイオン流の変化の結果により測定され得る。
【０２２８】
チャネルの機能に対する試験化合物の効果は、電流又はイオン流の変化により、又は電流及びイオン流の変化の結果により測定され得る。電流又はイオン流の 変化は、カチオン、たとえばカリウム又はルビジウムイオンの流れの上昇又は低下により測定される。カチオンは種々の標準手段により測定され得る。それらは、イオンの濃度変化により直接的に、又は膜電位又はイオンの放射性ラベリングにより間接的に測定され得る。イオン流に対する試験化合物の結果は非常に多 様であり得る。
【０２２９】
従って、いづれかの適切な生理学的変化は、本発明のチャネルに対する試験化合物の影響を評価するために使用され得る。チャネル機能の変化は、リガンド置 換、たとえばCTX開放により測定され得る。機能結果が損なわれていない細胞又は動物を用いて決定される場合、種々の効果、たとえば伝達物質（たとえばドーパミン）開放、ホ ルモン（たとえばインシュリン）開放、既知の及び特徴づけられていない遺伝子マーカーに対する転写変化（たとえばノザンブロット）、細胞体積変化（たとえば赤血球細胞における）、免疫応答（たとえば、Ｔ細胞活性化）細胞代謝、たとえば細胞成長の変化又はpH変化を測定することができる。
【０２３０】
好ましくは、アッセイのSKチャネルは、配列番号１，２，３，４，19, 20, 43又は47又は保存的に修飾されたその変異体のチャネルタンパク質から選択されるであろう。アッセイのIKチャネルは、好ましくは配列番号32又は保存的に修飾されたその変異体に示されるような配列を有するであろう。他方では、アッセイのSKチャネルは、真核生物に由来し、そして配列番号１〜４，19, 20, 43及び／又は47のSKチャネルタンパク質のコア領域に対して配列類似性を有するアミノ酸副配列を含むであろう。
【０２３１】
IKは典型的には、真核生物に由来し、そして配列番号32のIKチャネルタンパク質のコア領域に対して配列類似性を有するアミノ酸副配列を含むであろ う。一般的に、機能的なSK又はIKチャネルタンパク質は、少なくとも400,450,500 又は 550個の長さのアミノ酸で
あろう。配列番号１，２，３，４, 19, 20, 32, 43及び47から成る群から選択されたタンパク質のコア領域との配列類似性の％は、60〜100 の間の整数のいづれか１つであろう。
一般的に、配列類似性は、少なくとも60％、典型的には少なくとも70％、一般的には少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、最も好ましくは少なくとも90％及びしばしば少なくとも95％であろう。
【０２３２】
従って、SKチャネル相同体は、中位のハイブリダイゼーション条件下で、配列番号13,
14, 15, 16, 21,22及びその相補的配列から成る群から選択された核酸のコア領域からの
少なくとも 300個の長さのヌクレオチドの核酸に対してハイブリダイズするであろう。IKチャネル相同体は、中位のハイブリダイゼーション条件下で、配列番号31の核酸のコア領域からの少なくとも300個の長さのヌクレオチドの核酸に対してハイブリダイズするであ
ろう。
【０２３３】
配列番号13〜16,21, 22, 44及び48の“コア領域”又は“コア配列”は、配列番号１，
２，３，４，19,20, 43及び47と rSK２（配列番号２）アミノ酸残基 135〜462 との間の
一列配列のコードされた領域に対応する。 hIK１のコア領域は、アミノ酸残基25〜351 である。好ましい態様においては、SKチャネルは、コア領域内の20個の隣接するアミノ酸残基のいづれか１つ〜300個の隣接するアミノ酸残基のいづれかの比較窓に対して、配列番
号１，２，３，４，19,20, 43又は47の配列からのコア配列に比較して、少なくとも90％
の配列類似性を有するであろう。好ましい態様においては、IKチャネルは、コア領域内の20個の隣接するアミノ酸残基のいづれか１つ〜300個の隣接するアミノ酸残基のいづれか
の比較窓に対して、配列番号32のコア配列に比較して、少なくとも90％の配列類似性を有するであろう。
【０２３４】
SKチャネル相同体は一般的に、実質的に類似するコンダクタンス特性（たとえば２〜60pS）及びカルシウム感受性（30nM〜10μＭ）を有するであ ろう。IKチャネル相同体は同様に、IKチャネルと類似するSKチャネルコンダクタンス特性（たとえば20〜80pS）及びカルシウム感受性（30nM〜10μＭ）を有するであろう。配列番号１，２，３，４，19，20、又は32の少なくとも２つの配列の発現により形成されるキメラがまた使用 され得る。好ましい態様においては、カリウム流を高め又は低めることについてアッセイされる化合物と接触して配置される細胞は、真核細胞、より好ましくはキセノパス（たとえば、キセノパスラエビス（Xenopus laevis））の卵母細胞である。
【０２３５】
カルシウム活性化されたカリウムチャネルにおいてカリウム流を高め又は低める化合物についてのもう１つのアッセイは、コンピューターシステムがアミノ酸 配列によりコードされる構造情報に基づいてSK及びIKタンパク質の立体構造を生成するために使用される“バーチャル遺伝学（virtualgenetics）”を包含する。アミノ酸配列は、タンパク質の二次、三次及び四次構造モデルを生成するためにコンピュータープログラムにおける予定され たアルゴリズムと直接的及び活性的に相互作用する。次に、タンパク質構造のモデルが、リガンドに結合する能力を有する構造の領域を同定するために試験される。
【０２３６】
タンパク質の立体構造モデルは、コンピューターシステム中に、チャネルタンパク質をコードするチャネルタンパク質アミノ酸又は核酸配列を入力することに よって生成される。チャネルタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１，２，３，４，19,20, 32, 43, 47及び保存的に修飾されたそれらの変異体から成る群から選択される。アミノ酸配列は、タンパク質の構造情報をコードする、タンパク質の一次配列を表わす。アミノ酸配列は、電子貯蔵媒体（たとえば、磁気ディスケット、テープ、カートリッジ、及びチップス）、光媒体（たとえば、CDROM、電話線）、イン ターネット部位へのアドレス及びRAMを包含す
る（但しそれらだけには限定されない）コンピューター読み取り媒体からのコンピューターシステム中に入力される。次にチャネルタンパク質の立体構造モデル がアミノ酸配列及びコンピューターシステムの相互作用により生成される。ソフトウェアは、市販のプログラム、たとえばBiopolymer,Quanta及びInsight である。
【０２３７】
アミノ酸配列は、タンパク質の二次、三次及び四次構造を形成するために必要な情報をコードする一次構造を表わす。ソフトウェアは、その構造モデルを生成 するために一次配列によりコードされる一定のパラメーター調べる。それらのパラメーターは、“エネルギー項”として言及され、そして主に、静電位、疎水性電位、溶媒接近性表面及び水素結合を包含する。第２のエネルギー項は、der Waals 電位を包含する。生物学的分子は、累積態様でエネルギー項を最少にする構造を形成する。従って、コンピュータープログラムは、二次構造モデルを創造するために、一次構造又はアミノ酸配列によりコードされるそれらの項を用いる。
【０２３８】
次に、二次構造によりコードされるタンパク質の三次構造は、二次構造のエネルギー項に基づいて形成される。この点での使用者は、タンパク質が膜結合され るか又は可溶性であるかの追加の変数、身体におけるその位置、及びそれが細胞質性、表面性又は核性のいづれかであるかの変数を入力することができる。二次構造のエネルギー項と共にそれらの変数は、三次構造のモデルを形成するために使用される。三次構造を形成する場合、コンピュータープログラムは、二次構造 の疎水性タンパク質面と同様のものとを、及び親水性二次構造と同様のものとを適合せしめる。
【０２３９】
最終的に、複数−サブユニットタンパク質の四次構造は、異方性項を用いて、類似する態様で調節される。それらの項は、サブユニットの相互作用をエネル ギー的に最少にするために異なったタンパク質サブユニットを調整する。チャネルタンパク質の場合、典型的には４つの同一のサブユニットがチャネルの四次構造を組立てる。
【０２４０】
構造が生成されると、可能性あるリガンド結合領域が、コンピューターシステムにより同定される。可能性あるリガンドのための立体構造は、上記のように、 化合物のアミノ酸及びヌクレオチド配列又は化学式を入力することによって生成される。次に、可能性あるリガンドの立体構造が、チャネルタンパク質に結合するリガンドを同定するためにチャネルタンパク質の立体構造と比較される。タンパク質とリガンドとの間の結合親和性が、リガンドがタンパク質の結合の増強さ れた可能性を有するかどうかを決定するために、エネルギー項を用いて決定される。
【０２４１】
コンピューターシステムはまた、SK及びIK遺伝子の突然変異についてスクリーンするためにも使用される。そのような突然変異は、疾病状態と関係してい る。突然変異が同定されると、診断アッセイが、疾病状態と関連するそのような突然変異誘発された遺伝子を有する患者を同定するために使用され得る。突然変異誘発されたSK及びIK遺伝子の同定は、配列番号１，２，３，４，20, 32, 43, 47及び保存的に修飾されたその変異体から成る群から選択されたアミノ酸配列を有するカルシウムチャネルタンパク質をコードする第１核酸配列の入力を受けることを包含する。
【０２４２】
前記配列は、上記のようなコンピューターシステム中に入力されている。次に、第１核酸配列が、第１核酸配列に対して実質的な同一性を有する第２核酸配列 に比較される。第２核酸配列は、上記態様でコンピューターシステム中に入力される。第１及び第２配列が比較されると、配列間のヌクレオチド差異が同定される。そのような配列は、SK及びIK遺伝子における対立遺伝子差異、及び疾病状態との突然変異の関連性を示すことができる。
【０２４３】
細胞トランスフェクション及び遺伝子療法
本発明は、インビトロ及びインビボでの細胞のトランスフェクションのためのパッケージ可能なSK及びIKチャネルタンパク質核酸（cDNA）を供給す る。それらのパッケージ可能な核酸は、下記に記載されるように、標的細胞及び生物のトランスフェクションのために多くの良く知られているベクターのいづれか中に挿入され得る。核酸は、ベクター及び標
的細胞の相互作用を通して、エクスビボ又はインビボで細胞中にトランスフェクトされる。次に、SK又はIKチャネルタンパク質核酸は、プロモーターの制御 下で、本発明のカルシウム−活性化されたチャネルタンパク質核酸を発現し、それにより、SK又はIKチャネルタンパク質遺伝子の不在の、一部不活性化の、又は異常な発現の効果を弱める。
【０２４４】
そのような遺伝子療法は、多くの状況において、獲得され、そして伝達された遺伝子欠損、癌及びウィルス感染を補正するために使用されて来た。ヒトにおけ る人工遺伝子を発現する能力は、多くの重要なヒト疾病、たとえば他の治療による処理に対して影響されない多くの疾病の予防及び／又は治癒を促進する。例として、コレステロール−調節遺伝子、HIV の複製を選択的に阻止する遺伝子及びヒト患者における腫瘍−抑制遺伝子のインビボ発現は、それぞれ心臓疾患、AIDS及び癌の処理を劇的に改良する。遺伝子療法の再考のためには、次の文献を参照のこと。
【０２４５】
：Anderson,Science (1992) 256 : 803-813 ; Nabel and Felgner (1993) TIBTECH 11
: 211-217; Mitani and Caskey (1993) TIBTECH 11 : 162-166 ; Mulligan (1993) Sci
encs 926-932 ; Dillon(1993) TIBTECH 11 : 167-175 ; Miller (1992) Nature 357 : 4
55-460 ; Van Brunt (1988) Biotechnology 6 (10) : 1149-1154 ; Vigne (1995)Restorative Neurology and Neurosciencs 8 : 35-36 ; Kremer and Perricaudet(1995) British Medical Bulletin 51 (1) 31-44 ; Haddadaなど. (1995) Current Topicsin Microbiology and Immunology Doerfler and Bohn (eds) Springer-Verlay,Heidelberg Germany；及びYnなど.,Gene Therapy (1994) 1 : 13-26。
【０２４６】
細胞中への遺伝子又は遺伝子材料の供給は、疾病の遺伝子療法処理において最初の決定的段階である。多くの供給方法が当業者に良く知られている。そのよう な方法は、たとえばリポソームに基づく遺伝子供給（Debsand Zhu (1993) WO 93/24640, Mannino and Gould - Fogerite(1988) Bio Techniques 6(7) : 682-691 ; Roseアメリカ特許第 5,279,8
33号 ; Brigham(1991) WO 91/06309 ; 及びFelgner など. (1987) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 84 :7413-7414) 、及びレトロウィルスゲノムの一部として治療ポリヌクレオチ
ド配列を有する複製欠損レトロウィルスベクター（たとえば、Millerなど. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 4239 (1990) ;Kolberg (1992) J. NIH Res. 4 : 43、及びCornettaな
ど. Hum.Gene Ther. 2 : 215 (1991)）を包含する。
【０２４７】
広く使用されるレトロウィルスベクターは、ネズミ白血病ウィルス（MuLV）、テナガザル白血病ウィルス（GaLV）、Simian免疫欠損ウィルス (SIV）、ヒト免疫欠損ウィルス(HIV）、及びそれらの組合せに基づくベクターを包含する。たとえば、Buchscherなど. (1992) J. Virol. 66(5) 2731-2739 ; Johannなど. (1992) J. Virol. 66 (5) :1635-1640 
(1992) ;Sommerfelt など., (1990) Virol. 176 : 58-59 ; Wilson など. (1989) J. Vi
rol. 63 :2374-2378 ; Millerなど., J. Virol. 65 : 2220-2224 (1991) ; Wong - Staa
l など.,PCT/US94/05700 、及びRosenburg and Fauci (1993) Fundamental Immunology,
ThirdEdition Paul (ed) Raven Press, Ltd., New York andそこに引用される引例、及
びYuなど.,Gene Therapy (1994)前記を参照のこと。
【０２４８】
AA.V−に基づくベクターはまた、核酸及びペプチドのインビトロ生成において、及びインビボ及びエクスビボ遺伝子療法において、標的核酸により細胞を トランスダクトするために使用される。AA.Vベクターの概観については、Westなど.(1987)Virology 160 : 38
-47 ; Carterなど.(1989)  アメリカ特許第 4,797,368号；Carterなど. WO 93/24641 (1
993) ; Kotin(1994) Human Gene Therapy 5 : 793-801 ; Muzyczka (1994) J. Clin. In
vst. 94 : 1351及びSamulski(前記）を参照のこと。
【０２４９】
組換えAA.Vベクターの構成は、次の多くの文献に記載されている：Lebkowski、アメリ
カ特許第5,173,414号 ; Tratschinなど. (1985) Mol. Cell. Biol. 5 (11) : 3251-3260
;Tratschin、など. (1984) Mol. Cell. Biol., 4 : 2072-2081 ; Hermonat and Muzycz
ka (1984) Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 81 : 6466-6470 ; McLaughlin など. (1985)及
びSamulskiなど.(1989) J. Virol., 63 : 03822-3828 。rAAVによりトランスフェクトさ
れ得る細胞系は、Lebkowskiなど. (1988) Mol. Cell. Biol., 8 : 3988-3996に記載され
る細胞系を包含する。
【０２５０】
Ａ．細胞のエクスビボトランスフェクション
診断、研究又は遺伝子療法のためのエクスビボ細胞トランスフェクション（たとえば、宿主生物中へのトランスフェクトされた細胞の再注入による）は、当業 者に良く知られている。好ましい態様においては、細胞が対象生物から単離され、SK又はIKチャネルタンパク質核酸（遺伝子又はcDNA）によりトランスフェクトされ、そして対象生物（たとえば患者から細胞をいかにして単離し、そして培養するかについては、患者）中に再注入される。エクスビボトランスフェ クションのために適切な種々の細胞型は、当業者に良く知られている（たとえば、Freshneyなど.,Cultureof Animal Cells, a Manual of Basic Tech
nique, third edition Wiley - Liss, New York (1994)及びそこに引用される引例を参照のこと）。
【０２５１】
上記のようにして、好ましい態様においては、SK又はIKチャネルタンパク質をコードするパッケージ可能核酸は、活性化された又は構成的プロモーターの 制御下にある。トランスフェクトされた細胞は、欠失する又は異常なSK又はIKチャネルタンパク質遺伝子発現の効果を弱める機能的SK又はIKチャネルを発現する。
【０２５２】
１つの特に好ましい態様においては、幹細胞が、細胞トランスフェクション及び遺伝子療法のためのエクスビボ方法に使用される。幹細胞を用いる利点は、そ れらが他の細胞型にインビトロで分化され得、又はそれらが骨髄に移植するであろう哺乳類（たとえば細胞のドナー）中に導入され得ることである。GM−CSF, IFN−γ及び TNF−αのようなサイトカインを用いて、臨床学的重要な免疫細胞型にインビトロでCD34- 細胞を分化するための方法は知られている（Inabaなど., (1992) J. Exp. Med. 176, 1693-1702 及びSzabolcsなど.(1995) 154 : 5851-5861を参照のこと）。
【０２５３】
幹細胞は、既知方法を用いて、トランスダクション及び分化のために単離される。たとえば、マウスにおいては、骨髄細胞が、マウスを殺害し、そして脚の骨を一対のハサミにより切断することによって分離される。幹細胞は、所望しない細胞、たとえばCD４+及びCD８+（Ｔ細胞）、CD45+ （pan Ｂ細胞）、GR−１（顆粒球）及びIad （分化された抗原
表示細胞）を結合する抗体により骨髄細胞をパンニングすることによって骨髄細胞から単離される。このプロトコールの例に関しては、Inaba など. (1992)J. Exp. Med. 176 : 1693-1702 を参照のこと。
【０２５４】
ヒトにおいては、腸骨付近の稜からの骨髄吸入が、たとえば手術室においての一般的な麻酔下で実施される。骨髄吸入は、約 1,000mlの量であり、そして後部腸骨及び稜から集められる。集められた細胞の合計数が約２×108／kg以下である場合、後部稜の他に、胸骨及び前方腸骨稜を用いての第２の吸入が行われる。手術の間、２単位の照射された、パックされた赤血球細胞が、吸 収により採取される骨髄の体積を置換するよう投与される。ヒト造血前駆体及び幹細胞が、CD34表面膜抗原の存在により特徴づけられる。この抗原は、精製、たとえばCD34を結合する親和性カラムに使用される。骨髄が収穫された後、単核細胞が他の成分からフィコールグラジエント遠心分離により分離され る。
【０２５５】
これは、細胞分離機（たとえば、Baxter Fenwal CS3000＋又はTerumo機械）を用いて半自動方法により実施される。ほとんど単核細胞から構成される低密度細胞が集められ、そ
してその細胞がプラスチックフラスコにおいて、37℃で 1.5時間インキュベートされる。付着細胞（単球、マクロファージ及びＢ−細胞）が捨てられる。次に、非付着細胞が集められ、そしてモノクローナル抗−CD34抗体（たとえばネズミ抗体９Ｃ５）と共に、軽く撹拌しながら、４℃で30分間インキュベートされる。抗−CD34抗体のための最終濃度は、 10μｇ／mlである。２回の洗浄の後、羊抗−マウスIgG(Fc)抗体により被覆された常磁性微
小球（Baxter Immunotherapy Group, Santa Ana, California により供給されるDyna Beads）が、２細胞／ビーズの割合で細胞懸濁液に添加される。
【０２５６】
４℃で30分間のさらなるインキュベーションの後、磁気ビーズによるロゼット形成された細胞が磁気により集められる。 200Ｕ／mlの最終濃度でのキモパパイン（BaxterImmunotherapy Group,Santa Ana, California により供給される）が、CD34+ 細胞からビーズ
を放すために添加される。他方では、及び好ましくは、CD34、又はCD34に結合される抗体に結合する親和性カラム単離方法が使用され得る（下記を参照のこと）。Hoなど.(1995)
Stem Cells13 (Suppl.3) : 100-105、及びまた、Brenner (1993) Journal of Hematoth
erapy 2 : 7-17を参照のこと。
【０２５７】
もう１つの態様においては、造血幹細胞は、胎児コード血液から単離される。Yuなど. (1995) Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 92: 699-703 は、レトロウィルスベクターを用い
てヒト胎児コード血液からCD34+ 細胞をトランスダクトするための好ましい方法を記載する。
【０２５８】
Ｂ．インビボトランスフェクション
治療核酸を含むベクター（たとえばレトロウィルス、アデノウィルス、リポソーム、等）が、インビボでの細胞のトランスフェクションのために生物に直接的 に投与され得る。投与は、血液又は組織細胞と究極的に接触して分子を導入するために通常使用される経路のいづれかによるものである。パッケージされた核酸は、好ましくは医薬的に許容できるキャリヤーと共に、いづれかの適切な態様で投与される。そのようなパッケージされた核酸を投与するための適切な方法は、 入手でき、そして当業者に良く知られており、そして１つ以上の経路が特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路はしばしば、他の経路よりもより早く且つより効果的な反応を提供することができる。
【０２５９】
医薬的に許容できるキャリヤーは、投与される特定の組成物により、及び組成物を投与するために使用される特定の方法により一部決定される。従って、本発明の医薬組成物の広範囲の種類の適切な配合物が存在する。
【０２６０】
経口投与のために適切な配合物は、（ａ）液体溶液、たとえば希釈剤、たとえば水、塩溶液又はPEG400に懸濁されるパッケージされた有効量の核酸； （ｂ）予定された量の活性成分を液体、固体、顆粒又はゼラチンとして含む、カプセル、サケット又は錠剤；（ｃ）適切な液体における懸濁液；及び（ｄ）適切なエマルジョンから成る。錠剤形は、１又は複数のラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスター チ、トラガカント、微結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化珪素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、風味剤、顔料、砕解剤、及び医薬的に適合できるキャリヤーを含む ことができる。トローチ形は、風味剤、通常スクロース及びアカシア又はトラガカントにおける活性成分を含んで成り、そしてパステルは不活性基材、たとえばゼラチン及びグリセリン又はスクロース、及びアカシアエマルジョン、ゲル、及び活性成分の他に、当業界において知られているキャリヤーに活性成分を含んで 成る。
【０２６１】
パッケージされた核酸は、単独で又は他の適切な成分と組合して、吸入により投与され
るエアゾール配合物（すなわち、それらは“噴霧され”得る）に製造され得る。エアゾール配合物は、加圧された許容できる推進剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素及び同様のものに配合され得る。
直腸投与のための適切な配合物は、たとえばパッケージされた核酸及び坐剤基材から成る坐剤を含む。適切な坐剤基剤は、天然又は合成のトリグリセリド又は パラフィン炭化水素を包含する。さらに、パッケージされた核酸と基材、たとえば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール及びパラフィン炭化水素との組合せから成るゼラチン性直腸カプセルを用いることもまた可能である。
【０２６２】
関節内（関節における）、静脈内、筋肉内、経皮内、腹腔内、及び皮下経路による非経口投与のために適切な配合物は、酸化防止剤、緩衝剤、制細菌剤、及び 意図された受容体の血液により配合物を等張性にする溶質を含むことができる、水性及び非水性、等張性滅菌注射用溶液、及び懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定剤及び保存剤を含むことができる、水性及び非水性滅菌懸濁液を包含する。本発明の実施においては、組成物は、たとえば静脈内注入、経口、局所、腹腔内、ノウ 胞内又は包膜内投与され得る。非経口投与及び静脈内投与が好ましい投与方法である。パッケージされた核酸の配合物は、単位−投与又は複数−投与の密封された容器、たとえばアンプル及びバイアルに供給され得る。
【０２６３】
注射溶液及び懸濁液は、前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。エクスビボ治療に関して上記のようにパッケージされた核酸によりトランスダクトされた細胞がまた、上記のように、静脈内又は非経口投与され得る。
【０２６４】
本発明に関して、患者に投与される用量は、時間にわたって患者における有益な治療応答をもたらすのに十分であるべきである。用量は、使用される特定のベ クターの効能、及び患者の状態、並びに処理される患者の体重又は表面積により決定されるであろう。用量のサイズはまた、特定の患者における特定のベクター又はトランスダクトされた細胞型の投与に伴ういづれかの悪い副作用の存在、性質及び程度により決定されるであろう。
【０２６５】
SK又はIKチャネルタンパク質の減じられた又は異常な発現による状態の処理又は予防において投与されるべきベクターの有効量を決定する場合、医者は、 ベクターの循環血漿レベル、ベクター毒性、疾病の進行、及び抗−ベクター抗体の生成を評価する。一般的に、ベクターからの裸の核酸の用量は、典型的な70kgの患者に対して約１μｇ〜 100μｇであり、そしてレトロウィルス粒子を含むベクターの用量は、治療核酸の等量を生成するよう計算される。
【０２６６】
投与に関しては、本発明のインヒビター及びトランスダクトされた細胞は、患者の集団及び全体の健康に適用される場合、インヒビター、ベクター又はトラン スダクトされた細胞型のLD−50、及びインヒビター、ベクター又は細胞型の種々の濃度での副作用により決定される割合で投与され得る。投与は、一回の用量又は分割された用量で投与され得る。
【０２６７】
好ましい態様においては、注入の前、血液サンプルが得られ、そして分析のために保存される。１×108〜１×1012個のトランスダクトされた細胞が、60〜200分にわたって静
脈内注入される。パルス酸素濃度計による生命徴候及び酸素飽和が密接してモニターされる。血液サンプルが、注入に続いて５分及び１時間後に得られ、そして続く分析のために保存される。リューコフェレーシス（leukopheresis）、トランスダクション、及び再注
入が２〜３ヵ月ごとにくり返えされる。最初の処理の後、注入が臨床医の自由に外来患者に対して実施され得る。再注入が外来患者として与えられる場合、関係者は、治療に続いて少なくとも４及び好ましくは８時間、モニターされる。
【０２６８】
トランスダクトされた細胞が、確立された方法に従って、再注入のために調製される。
Abrahamsenなど.,(1991) J. Clin. Apheresis, 6 : 48-53 ; Carterなど. (1988) J. Cl
in. Arpheresis,4 : 113-117 ; Aehersold など. (1988) J. Immunol. Meth., 112 ; 1-
7 ; Muulなど.(1987) J. Immunol. Methods, 101 : 171-181 及びCarterなど. (1987) T
ransfusion 27 :362-365 を参照のこと。培養での約２〜４週間後、細胞は１×108 〜１
×1012個の数になるべきである。これに関して、細胞の増殖特徴は、患者から患者に、及び細胞型から細胞型に異なる。トランスダクトされた細胞の再注入の約72時間前、アリコートが表現型の分析、及び治療剤を発現する細胞の百分率についての分析のために採取される。
本発明は、明確に理解するために例示的且つ例的にいくらか詳細に記載されて来たが、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で実施され得ることは明白である。
【０２６９】
例１
例１は、低及び中間コンダクタンスのカルシウム−依存性カリウムチャネルをコードするクローンの単離及び配列決定を記載する。
Ａ．低コンダクタンスのカリウムチャネル（但し、minkタンパク質（Takumiなど., Science, 242 :1042-1045 (1988)を除く）は、一価カチオンのための特徴的選択性配列を指
図する配列を包含するコア領域内の構造モチーフを共有する（Heginbotham など., Biophys. J., 66 :1061-1067 (1994））。
【０２７０】
ミスマッチを可能にする問題の配列FXSIPXXXWWAXVTMTTVGYGDMXP（配列番号45）を用い
てのEST データベースのBLAST研究は、既知のカリウムチャネル配列及びGenbank ＃Ｍ62
043 を再生した。＃Ｍ62043のヌクレオチド６−36（センス）及び 258−287(アンチセン
ス）に対応するオリゴヌクレオチドを合成し（Genosys, The Woodlands, TX）、ポリヌクレオチドキナーゼ(BRL）及び32Ｐ−ATP(NEN）を用いて放射性ラベルし、そしてヒト海馬
cDNAライブラリーからの約106個の組換えファージをスクリーンするために使用した（40
％ホルムアミド；１ＭのNaCl、１％ SDS, 37℃；１×SSC,  50℃での洗浄）。
【０２７１】
二重の陽性ハイブリダイズファージを、低められた密度で再スクリーンすることによって精製した。cDNA挿入体をＭ13中にサブクローン化し、そしてそ のヌクレオチド配列を、ジデオキシ鎖終結方法及びＴ７DNAポリメラーゼを用いて決定した（Sequenase, UBI）。ポア（pore）ドメイン（アミノ酸325−522)を含むクローンのフラグメントを、ランダム
プライマー(Boehringer）を用いて放射性ラベルし、そしてラット脳cDNAライブラリーを
スクリーンするために使用した（30％ホルムアミド、１ＭのNaCl、１％のSDS, 37℃；２
×SSC,  50℃での洗浄）。陽性のハイブリダイズするファージを精製し、そして挿入体のヌクレオチド配列を決定した。コンピューター分析を、GCG ソフトウェアスィート（GeneticsComputerGroup ; version 8.1)を用いて、実施した。
【０２７２】
既知のカリウムチャネルの他に、ヒト海馬からの検出された配列の１つは、それがコンセンサスモチーフを含むが、しかしいくつかのあいまい性を含むことを 示唆した（Genebank  ＃Ｍ62043)。この配列に基づいて、センス鎖のヌクレオチド６〜36及びアンチセンス鎖のヌクレオチド258〜287により示される配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した
。そのオリゴヌクレオチドを用いて、ヒト海馬cDNAライブラリーをプローブした。
【０２７３】
十分な長さのコード配列、 hSK１（配列番号13）を単離し、そして読み取り枠、Kozak コンセンス配列、可能性あるトランスメンブランドメイン及び予測されるタンパク質構造について分析した。推定上のコア領域を含むフラグメントを、ランダムプライミングにより放射性ラベルし、そして40％のホルムアミド、１ＭのNaCl、１％のSDS 、及び 100μｇ／mlの酵母RNAのハイブリダイゼーション溶液を用いて37℃でラット脳cDNAライブラリー
をプローブするために使用し、そして 0.5×SSC を用いて55℃で洗浄した。異なった十分の長さのコード配列を含む次の２種のクローンを単離し、そして分析した：rSK２（配列
番号15）及びrSK３（配列番号16）。さらに、 hSK１のラット相同体(rSK１（配列番号14
））を示す部分的クローンを同定した。
【０２７４】
前記配列は、推定上のコア領域における12個のアミノ酸配列は別として、他のクローン化されたカリウムチャネルとの相同性の範囲を含まない（すなわち、 低い緊縮条件下でバックグラウンド以上のシグナルを含まない）、hSK１のための 561個のアミノ酸（配列番号１）、 rSK２のための580個のアミノ酸（配列番号２）、及び rSK３のための 553個の
アミノ酸（配列番号３）のタンパク質を予測する。疎水性の分析は、細胞の内部に存在するＮ−及びＣ−末端を有する６個のトランスメンブランセグメントを予 測する。それらの配列は、それらのトランスメンブランコアを通して高く保存されるが（80〜90％の同一性）、しかしそれらのＮ−及びＣ−末端ドメイン内の配列及び長さで異なる。
【０２７５】
【表１】
2008092950.tif 000002
【０２７６】
【表２】
2008092950.tif 000003
【０２７７】
【表３】
2008092950.tif 000004
【０２７８】
４番目の予測されるメンブラン延長ドメインは、電圧−依存性カリウムチャネル（Durellなど., Biophys.J., 62 : 238-250(1992))におけるようにあらゆる第３位置を占める
とは限らないが、しかし６及び７個の残基により分離される３つの陽性電荷の残基を含む。種々のタンパク質キナーゼによるリン酸化のための複数のコンセンサ ン標的が存在する。それらの部位のいくつかは、すべてのクローンに見出される。しかしながら、個々のクローンは、すべてのメンバー間には保存されない可能性あるリン酸化部位を含む。予測される細胞外ドメインには保存されたＮ−結合グリコシル化部位（NXXS/T) （配列番号46）は存在せず、そしてコンセンサスヌクレオチド又はカルシウム結合ドメイン（Ｅ−Ｆバンド）にもそれらは存在しない。
【０２７９】
ラット脳及び骨格筋のノザンブロットは、それらの組織からの rSK３転写体が、 rSK３
クローン配列番号16に対してＮ−末端延長されたタンパク質をコードすることを示した。
rSK３  Ｎ−末端延長をコードする核酸をクローン化し、そして配列決定し、そしてＮ−末端延長されたrSK３をコードするcDNAを配列番号44により表わす。さらに、内因性rSK
３は、配列番号43の最後の９個のアミノ酸により置換された配列番号３の最後の５個のアミノ酸を有するＣ−末端を有するタンパク質をコードするヌクレオチ ド配列を有することが示された。同様に、hSK３は、Ｎ−末端延長を有することが示され、そしてこのＮ−末端延長をコードするcDNAが配列番号48により示される。
【０２８０】
Ｂ．中間コンダクタンスのカルシウム−活性化されたＫ+ タンパク質を単離するために、PCR を標準条件下で用いることができる。適切なプライマーは、約270個の塩基のプロ
ーブを生成する配列番号34及び35、及び約 165個の塩基のプローブを生成する配列番号36及び37である。それらのプライマーは、クローン化されたhIK１を含んで成るプラスミド
DNA を、又は hIK１を発現する組織からの逆転写されたRNA、たとえば膵臓からのcDNAラ
イブラリーに基づいて、増幅するために使用され得る。PCR 反応は、 hIK１及び関連する遺伝子に対して特異的な配列を含む、特定されたサイズのDNA フラグメントを生成するであろう。
【０２８１】
続いて、それらのDNAフラグメントを、標準のランダム−プライミングプロトコールに
よりハイブリダイゼーションプローブとして使用するためにラベルする。次に、そのラベルされたプローブを用いて、 hIK１配列のみを単離するために高い緊縮性で、又は推定上、関連する配列を単離するために適度に低い緊縮性（30〜40％のホルムアミド、37℃での
hyb／１×SSC，55℃での洗浄）で、ライブラリーをスクリーンする。他方では、PCRプ
ライマー対、配列番号38及び39又は40及び41を用いて、膵臓cDNAライブラリーからの損なわれていないhIK１遺伝子を増幅することができる。
【０２８２】
例２
例２は、ラットSKチャネルクローンの個々とは異なる配列を用いてのラット脳断片の現場ハイブリダイゼーション、及び種々の末梢組織からの転写物サイズの決定を記載する。
【０２８３】
雌の成熟したSprague- Dawleyの世話及び取扱いは、制度化されたガイドラインの最高
の基準に従って行なわれた。ラットを、ペントバルビタールにより深く麻酔をかけ、そして氷冷却された塩溶液、続いて氷冷却された 0.1Ｍの硼酸ナトリウム(pH9.5)中、４％パラホルムアルデヒドにより心臓を通して灌流した。脳をすばやく除去し、そして10％スクロースを含む硼酸塩緩衝液(pH9.5) 中、４％パラホルムアルデヒドに４℃で一晩、後固定した。
【０２８４】
低温ミクロトーム断片（25mm）を、ゼラチン−及びポリ−Ｌ−リシン−被覆されたガラススライド上に固定し、そして 0.1ＭのPBS 中、４％パラホルムアルデヒドにおいて15分間、インキュベートし、0.1ＭのPBS により２度洗浄し、そして 100mMのトリス中、10mg／mlのプロテイナーゼＫ、50mMのEDTA（pH８）の溶液において37℃で30分間、続いて、0
.1Ｍのトリエタノールアミン中、0.0025％無水酢酸において室温で処理した。次に、断片を、２×SSC により洗浄し、上昇する濃度のエタノールにより脱水し、そして室温で真空乾燥せしめた。
【０２８５】
プローブ合成のための鋳型は、個々のクローンに対してユニークなＣ−末端及び３’翻訳配列を表わし、そしてpKS 中にサブクローン化した。線状化された鋳型DNA を用いて、35Ｓ−ラベルされたアンチセンスcDNAプローブを65℃に５分間加熱し、そしてハイブリダイゼーション緩衝液：66％のホルムアミド、260mM の NaCl, 1.3×Denhardt溶液（13mMのトリス、pH8.0,1.3mMのEDTA，13％の硫酸デキストラン）により107cpm／mlに希釈した。
ハイブリダイゼーション混合物中の断片を、シリコン処理されたガラスカバースリプによ
り被覆し、そしてDPX封入剤を用いて密封した。
【０２８６】
58℃で20時間のインキュベーションの後、スライドを４×SSCによりソークし、カバー
スリップを除き、次に、４×SSC によりすすぎ（４度、それぞれ５分間）、続いて、リボヌクレアゼＡ処理した（37℃で30分間、20mg／mlで）。次にスライドを、１mMのDTTを含む、下降する濃度のSSC溶液から最終緊縮性の 0.1×SSC ，１mMのDTT 溶液までの溶液に
より65℃で30分間すすいだ。上昇する濃度のエタノールによる断片の脱水の後、それらを真空乾燥せしめ、そして DuPont Cronex−４  Ｘ−線フィルムに７日間暴露した。フィルムを、MicrotekScanMaker 1850Ｓにより 728ピクセル／cmの解像度で走査し、そして像
を、ImageV1.55 ソフトウェア(NIH) 及びPhotoshop (Adobe) を用いて分析した。
【０２８７】
その結果は、ラット配列に対するmRNAがCNS を通して、特徴的であるが、しかしオーバーラップするパターンで広く分布されることを示す。 rSK１は、海馬及び歯状回、小脳の顆粒層、及び前方嗅核に発現される。rSK１ mRNA はまた、支柱、嗅結節及び新皮質にも検出される。rSK２ mRNA は最とも広く発現され、そして海馬において最高の発現が生じ
、そしてより低いレベルでの発現が歯状回、嗅球及び前方嗅核に生じる。 rSK２ mRNA はまた、小脳の顆粒層、視床の網様核、及び橋核にも検出される。 rSK２mRNA のための現場ハイブリダイゼーションのパターンは、ラット脳における放射性ラベルされたアパミン結合のパターンと一致する（Gelhart, Neuroscience,52 : 191-205 (1993)) 。 rSK３ mRNA は、嗅結節及び嗅球、視床じゅう、外側中隔、復側被蓋部分、及び黒質細胞層に検出された。中位のレベルが海馬、尾状被殻、及び中隔側坐核じゅうに検出された。
【０２８８】
rSK１及びrSK２のための同じ明確な配列が、全体の脳及びいくつかの末梢組織から単
離されたmRNAにより調製されたノザンブロットをプローブするために使用された。全RNA
を、生後３週目のSprague- Dawleyラットの脳、副腎、胸腺、脾臓、骨格筋、心臓、腎臓
、肝臓、及び肺から抽出した（Chirgawin など., Biochem., 18 : 5294-5300 (1979)) 。ポリ（Ａ) +mRNAをオリゴｄ（Ｔ）セルロースクロマトグラフィー（CollaborativeRese
arch) により精製し、そして個々の組織からの３μｇを、１％アガロース−ホルムアルデヒドゲルを通しての電気泳動によりノザンブロットとして調製し、そしてGenescreen (NEN) ナイロン膜に移した。
【０２８９】
現場ハイブリダイゼーションのために使用されるのと同じ配列のアンチセンスリボプローブを、32Ｐ−UTP (NEN) を用いて、線状化されたDNA鋳型から合成した。ブロットを、50％ホルムアミド、５％SDS，400mM のNaPO4 ，１mMのEDTAにおいて60℃で12時間ハイブ
リダイズせしめ、続いて、0.05×SSC により65℃で洗浄し、そして15時間後、 Phosphorimager 445 Ｓ１（MolecularDynamlcs)を用いて可視化した。
【０２９０】
rSK１mRNA はラット脳及び心臓において検出されたが、ところが rSK２ mRNA は脳及
び副腎において検出された。その結果は、異なったサイズの rSK１ mRNA が脳(3.2kb) 及び心臓(4.4kb)に存在することを示す。 rSK２mRNA は、脳、及び副腎において 2.2及び
2.4kbの２つのバンドとして検出された。rSK１ mRNA も rSK２ mRNA も、肺、肝臓、腎
臓、胸腺、脾臓又は骨格骨には検出されなかった。
【０２９１】
例３
例３は、SK及びIKチャネルタンパク質のインビトロ発現を記載する。
３Ａ．例３Ａは、キセノパス卵母細胞における rSK２及び hSK１ mRNA のインビトロ発現、及び電気コンダクタンスの測定を記載する。
インビトロmRNA合成及び卵母細胞注入を、Adelman、など., Neuron, 9 : 209-216 (19
92) に記載のようにして行なった。キセノパスの世話及び取扱いは、制度化されたガイドラインの最高の基準に従って行なわれた。カエルはわずか２回の手術を受け、少なくとも
３週までに分離され、そして手術は十分に確立された技法を用いて行なわれた。カエルに、３−アミノ安息香酸エチルエステルの通気された溶液により麻酔をかけた。
【０２９２】
卵母細胞は、２ngのmRNAの注入の後２〜５日で研究された。全細胞流を、Macintosh Quadra 650コンピューターに接続されるCA−１増幅機により、２つの電極電圧クランプを用いて、mRNA注入の後に測定した。データを、500HzでのPulse (Heka, Germany) 及び10Hz
でのChart(AD Instrumants, Australia) を通して同時に得た。記録の間、卵母細胞は、
96mMのNaCl，２mMのKCl,1.8mMの CaCl2，１mMの MgCl2，５mMのHEPES (NaOHによりpH7.
5 にされる）を含むND−96溶液により室温で連続して洗い流された。
【０２９３】
Cl-流を最少にするために、いくつかの卵母細胞をソークし、そしてCl- −フリーのND
96溶液（96mMのグルコン酸ナトリウム、２mMのグルコン酸カリウム、2.7mMのグルコン酸
カルシウム、１mMのグルコン酸マグネシウム、５mMのHEPES,NaOH によりpH7.5 にされる
）において研究した。−80mVの保持電位からの電圧プロトコールは、対照卵母細胞とは異なる電流の発生に失敗した。
【０２９４】
rSK２の発現パターンは、mGluR1a、すなわち代謝向性グルタミン酸受容体の発現パタ
ーンに類似するので（Houamed など., Science, 252 : 1318-1321 (1991) ; Masu など.,
Nature,349 : 760-765 (1991))、mGlu R1a mRNA をSK mRNA と共に又はそれを伴わない
で注入した。mGluR1a mRNA のみにより注入された卵母細胞を含んで成る槽へのグルタミ
ン酸（１mM）の添加は、細胞内カルシウムの開放に続いての内因性カルシウム−活性化された塩化物チャネルの活性化のために過渡的な内部方向への流れを引 き起こした（Houamedなど., Science,252 : 1318-1321 (1991) ; Masu など., Nature, 349 : 760-765 (19
91))。
【０２９５】
類似する結果が、mGluR1aにより注入された６個の他の卵母細胞に得られた。内部方向
応答のピーク近くで適用された−120mV 〜60mVの電圧ランプは、Cl- 逆電位近くの−25mVで逆転された外部方向に整流する流れを引き起こした。mGluR1a及び rSK２ mRNA により同時注入された卵母細胞へのグルタミン酸（１mM）の添加は、mGlu R1a注入された卵母細胞に観察される過渡的なカルシウム−活性化された塩化物流を引き起こし、続いて、大きな過渡的な外部方向への流れを引き起こした。
【０２９６】
類似する結果が、mGluR1a及び rSK２により同時注入された14個の他の卵母細胞に観察
された。外部方向応答のピーク近くで適用される−120 〜60mVの電圧ランプは、Ｋ+ 逆電位に近い−95mV近くで逆転された大きな内部方向に整流する流れを引き起こした。この結果は、クローン化されたサブユニットの個々により得られ、そしてこれは、クローン化された配列がカリウムチャネルをコードすることを示唆した。
【０２９７】
２−電極電圧クランプの確立に続いて、卵母細胞を、KOH により7.2 のpHに調整された
200mMのEGTAを含む第３電極により突き刺した。入力耐性を、卵母細胞の生存性を確かめるために突き刺しの間モニターした。示された時間で、 50nlのEGTA溶液を卵母細胞中に注入した。１μｌの卵母細胞体積を仮定して、EGTAの予定された最終濃度は10mMであった。EGTAの細胞内注入は、グルタミン酸の続く適用により引き起こされる両流れ応答を完全に破壊し、このことは、両成分がカルシウム−活性化されたことを示唆する。
【０２９８】
mGlu R1a及びrSK２を同時注入した他の３つの卵母細胞から類似の結果が得られた。2.
6 又は20mMのＫ+を含むCl- −フリー外部溶液中、 rSK２ mRNA により注入された卵母細
胞に流れ−電圧関連性が存在した。流れは、約１mMの最終濃度までのCaCl2 の注入により活性化された（Adelmanなど.,Neuron, 9 : 209-216 (1992))。バックグラウンド流を、
100nM のアパミンの適用により決定した。アパミン−非感受性バックグラウンド流は、外
部Ｋ+ により変化しなかった。
【０２９９】
注入の２日後、卵母細胞を、Cl- 流を最少にするためにCl- フリーND96溶液に24時間以上ソークした。２−電極記録モードにおいては、チャネルを、第３電極を通して５nl〜200mMのCaCl2の注入により活性化し、約１mMのCa2+の最終細胞内濃度をもたらした。この
方法は、mGlu R1a及び rSK２により同時注入された卵母細胞においてグルタミン酸により活性化された流れよりもＫ+ 流のより長く持続する活性化をもたらした。それらの卵母細胞においては、逆電位が100nMのアパミンにおけるバックグラウンド流に対して決定された。〔Ｋ+ 〕o に対してプロットされた平均逆電位±S.D.は、55.4mV／〔Ｋ+〕oにおけ
る10倍の変化の傾斜及び１mMの〔Ｋ+〕o で−110mV のｙ−切片をもたらす。
【０３００】
肉眼で見える流れをまた、摘出されたパッチから記録した。流れは、 rSK２を発現する卵母細胞からの摘出された裏がえしパッチにおいて−100 〜100mV の2.5秒電圧ランプにより誘発された。適用されるカルシウム槽なしでは、流れは対照の卵母細胞と異ならなかった。卵母細胞を、２−電極電圧クランプ記録の ために記載のようにして注入した。
【０３０１】
注入の２〜９日後、裏がえしのマクロパッチを、CaCl2 及び／又はEGTAにより補充された、116mM のグルコン酸カリウム、４mMのKCl,10mMのHEPES (KOHにより調節されたpH7.
25) を含む槽溶液中に摘出した。公称Ca−フリー溶液を得るために、１mMのEGTAを添加した。他方では、CaCl2を前記槽溶液に添加し、１〜10μＭの遊離カルシウム濃度を付与し
た。この場合、グルコン酸に結合するカルシウムの割合を、15.9Ｍ-1の グルコン酸カルシウムの安定性定数を仮定して、コンピュータープログラム(CaBuf)により決定した（Dawsonなど., Data for Biochemical Research (Oxford University Press, NewYork, (1969))。
【０３０２】
１μＭ以下のCa2+濃度を得るために、５mMのEGTAを、前記槽溶液に添加し、そしてCaCl2 を、CaBuf プログラム及び公開された安定性定数を用いて計算して添加した（Fabiato
など., J.Physiol., 75 : 463-505 (1979))。Mg2+が槽溶液に添加される実験のために、
MgCl2を、テキストに言及された全濃度に添加した。それらの条件下で、グルコン酸への
Mg2+の結合は無視できる（安定性定数1.7Ｍ-1）。
【０３０３】
電極を薄い壁のフィラメント繊維の珪硼酸ガラス（World Precision Instruments)から製造し、そして116mMのグルコン酸カリウム、４mMのKCl, 10mMのHEPES (pH7.25)により
充填した。電極抵抗は典型的には２〜５ＭΩであった。膜パッチを、Axopatch 200Ａ増幅機（Axon Instruments) を用いて電圧クランプした。データは、２kHで低−通過Bessel濾過され、そしてPulseソフトウェア（HEKAElectronik)を用いて獲得した。分析は、Puls
e, Kaleidograph(Abelbeck)又は IGOR (Wavemetrics) ソフトウェアを用いて実施された
。すべての実験は−80mVの維持電位から、室温で実施された。−100〜100mV の 2.5秒電
圧ランプを、500Hzのサンプリング周波数で獲得した。他方では、流れ−電圧の関係を、
５kHz でサンプリングされた、20mVのインクレメントでの−100〜100mV 間の電圧に対し
ての 500msのコマンドの間の平均流から得た。
【０３０４】
細胞内（槽）溶液への５μＭのCa2+の添加は、実質的な流れを引き起こした。対称 120mMのＫ+及び内部Mg2+の不在における電圧ランプは、わずかな内部方向への整流の流れ−
電圧関係を示した。−80mVの維持電位からの−100 〜100mV 間の電圧段階は、時間−依存性流れを引き起こした。誘導されたＩ−Ｖ関係は、電圧ランプから明らかな内部方向整流に影響を及ぼす。流れは、rSK２を発現する卵母細胞から摘出された裏がえしのマクロパッチから電圧段階により引き起こされた。
【０３０５】
槽における５μＭのCa2+により、膜を−80mVの維持電位から−100 〜100mの間の試験電
位まで進め、そして次に、−50mVに再分極化した。流れは即時に活性化し、そして 500msの試験パルスの間、不活性化を示さなかった。類似する結果が、 hSK１に関して得られ、但し、内部方向整流は言明されなかった。それらの結果は、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルとしてこの新しいファミリーを同定する。
【０３０６】
３Ｂ．例３Ｂは、hIK１チャネルの電気生理学を記載する。すべての hIK１チャネルサ
ブユニットを、複数の制限部位を含むポリリンカーを端に有するキセノパスβ−グロビン遺伝子からの５’及び３’翻訳領域を供給する卵母細胞発現ベクターpBF(未公開、Dr.B.
Fakler により親切に供給される）中にサブクローン化した。インビトロmRNAをSP６ポリメラーゼ（GibcoBRL)を用いて生成し；合成に続いて、mRNAを分光学的に、及びアガロー
スゲル電気泳動の後の臭化エチジウム染色により評価した。
【０３０７】
上記のように、キセノパスの世話及び取扱いは、制度化されたガイドラインの最高の基準に従って行なわれた。カエルは、わずか２回の手術を受け、少なくと も３週までに分離され、そしてすべての手術は十分に確立された技法を用いて実施された。カエルに、３−アミノ安息香酸エチルエステルの通気された溶液により麻酔をかけた。卵母細胞は、 0.5〜５ngのmRNAの注入の２〜14日で研究された。
【０３０８】
裏がえしのマクロパッチを、５μＭの遊離カルシウム濃度を付与するためにCaCl2 により補充された、116mMのグルコン酸カリウム、４mMのKCl, 10mMのHEPES (pH7.2, KOH に
より調節された）を含む細胞内溶液中に摘出し；グルコン酸へのカルシウム結合の割合を、15.9Ｍ-1のCa2+グルコン酸のための安定性定数を仮定して、コンピュータープログラム(CaBuf)により決定した（Dawsonなど.,1969)。１μＭ以下のCa2+濃度を得るために、１
mMのEGTAを槽溶液に添加し、そしてCaCl2を、CaBuf プログラム及び公開された安定性定
数を用いて計算して、添加した（Fabiato and Fabiato, 1979)。
【０３０９】
電極を薄い壁のフィラメント繊維の珪硼酸ガラス（World Precision Instruments)から製造し、そして116mMのグルコン酸カリウム、４mMのKCl, 10mMのHEPES (pH7.2）により
充填した。電極抵抗は典型的には２〜５ＭΩであった。裏がえしのマクロパッチのためには、溶液を逆にした。膜パッチを、Axopatch 200Ａ増幅機（AxonInstruments) を用いて電圧クランプした。データは、１kHで低−通過Bessel濾過され、そしてPulse ソフトウェア（HEKAElectronik)を用いて獲得した。
【０３１０】
分析は、Pulse,Kaleidagraph (Abelbeck)又は IGOR (Wavemetrica) ソフトウェアを用
いて実施された。特にことわらない限り、すべての実験は０mVの維持電位から、室温で実施された。−100〜60又は 100mVの 2.5秒電圧ランプを、500Hzのサンプリング周波数で
獲得した。値は、平均±SDとして表わされた。統計学的差異は、無対のｔ−テストを用いて決定され；0.05以下のｐ値が有意として見なされた。
【０３１１】
単一チャネルの記録のためには、卵母細胞を、遊離Ca2+の報告された濃度を得るために、CaCl2により調整された、116mMのグルコン酸カリウム、４mMの KCl, 10mMの HEPES, 
５mMのEGTA，pH7.2の槽溶液に添加した。すべての記録は、116mM のグルコン酸カリウム
、４mMのKCl, 10mMのHEPES, pH7.2を含む、厚壁の石英電極（13〜15ＭΩ）を用いて、裏
がえしパッチ形状で実施された。膜パッチを、Axopatch 200増幅機（Axon Instruments) により電圧クランプした。
【０３１２】
連続した記録は、１kHz で低通過Bessel濾過され、Pulse ソフトウェア（Heka Electronik)を用いて10KHz で獲得し、そしてMacintoshQuadra650上に直接的に保存した。単一
チャネルの記録を、現象の振幅を評価するために“50％閾値”技法を用いて、Mac Tac (SKALAR Instruments)により分析し、そして個々の遷移を、許容される前、眼により調べた
。振幅ヒストグラムを、Mac Tacfit (SKALAR Instruments) を用いて構成した。少なくとも１ｍ秒続く現象のみが包含され、そして振幅ヒストグラムを単一のGaussian分布により適合せしめた。すべての実験は、室温で実施された。
【０３１３】
キセノパス卵母細胞における hIK１の発現は容易に検出できた。５μＭのCa2+中に摘出された裏がえしのパッチに付与される電圧ランプ命令は、注入されていない卵母細胞からのパッチ（示されていない）又はCa2+−フリーの媒体に浸された裏がえしのパッチに存在しない、強い内部方向整流の肉眼で見える流れ応答を引き起こした。電圧段階命令は、Ca2+が（槽）内部溶液に含まれる場合のみ、高い時間−無関係流れを引き起こす。外部Ｋ+濃度の変更（Naにより置換された）は、Ｋ+−選択性コンダクタンスについてのネルンス
ト予測に従って逆電位をシフトした（57mV／Ｋ+ における10倍の変化）。電圧ランプ命令により引き起こされた流れは、SK２チャネルに類似して、膜の内面に適用されるCa2+の濃度に依存した。
【０３１４】
例４
例４は、 rSK２及びhSK１チャネルのカルシウム感度を記載する。
上記のような裏がえしのミクロパッチを用いて、電圧ランプにより引き起こされた rSK２流れは、内部（槽）溶液におけるカルシウムの濃度に依存することが示された。逆電位での傾斜コンダクタンスを、カルシウム濃度の関数として、プロットし、そしてデータ点をHill等式により適合せしめる。８個のパッチからのカルシウムについての平均Kdは、0.63±0.23μＭである。そのプ ロットが見出されるカルシウムに対する急勾配の依存性は、4.81±1.46のHill係数により影響され、このことは、少なくとも２つのカルシウムがチャネルゲートに包含されることを示唆する。 hSK１により実施された類似する実験は、0.70±0.06μＭのKd及び3.90±0.45のHill係数を生成した。
【０３１５】
hIK１及びSK２を比較するために、標準化された流れを、Ca2+濃度の関数としてプロッ
トし、そしてそれらのデータ点をHill等式により適合せしめる。両チャネルは、同じＫ0.5 （最大の半分の活性化のための濃度、 hIK１に関しては0.32±0.03μＭ（ｎ＝７）及びSK２に関しては0.31±0.05μＭ（ｎ＝４）；ｐ＝0.68）を示したが、しかしCa2+−依存性の急勾配においては異なっており、すなわちSK２は3.5±0.4(ｎ＝４）のHill係数を有し、ところが hIK１は1.7±0.3(ｎ＝７，ｐ＜0.001)のHill係数を有した。それらの結果は
、 hIK１がまた、カルシウム−活性化されたカリウムチャネルであることを示す。
【０３１６】
例５
例５は、 rSK２チャネルについてのマグネシウム誘発された内部方向整流を記載する。
上記に記載されるrSK２についての内部方向整流を、カリウム及びカルシウム（５μＭ
）以外の内部カチオンの不在下で観察した。生来のSKチャネルは、内部Mg2+イオンにより誘発された内部方向整流を示す（Lancaster など.,J. Neurosci., 11 : 23-30 (1991)）。海馬において、SKチャネルは内部Mg2+の存在下で有意な内部方向整流を示す。流れは、種々の濃度の内部Mg2+及び10μＭのCa2+の存在下で、rSK２を発現する卵母細胞から摘出
された裏がえしのマクロパッチから誘導された。異なった濃度のMg2+(0.1〜３mM）が裏がえしのパッチを浸している溶液に添加される場合、外部方向流が有意に減じられた。
【０３１７】
Mg2+誘発された内部方向整流の濃度−及び電圧−依存性を試験した。高まるMg2+に従っての内部方向流のわずかな低下が観察された。従って、−100mVでの内部方向流に対する、20〜100mvの電位での外部方向流の比を、異なった濃度の内部Mg2+の関数としてプロッ
トした。複数の実験から、異なったMg2+濃度及び電圧で得られたデータをHill等式により適合せしめ、0.94±0.27（ｎ＝24）の平均Hill係数を生成した。続いて、そのHill係数を１で固定し、そして平均Kdを試験電位の関数としてプロットした。
【０３１８】
上昇する電圧と共に低下するKdは、Mg2+阻止が電圧−依存性であることを示す。Mg2+のためのKdを、20,40,60, 80及び 100mVでパネルＢにおいて示されるように５個のパッチ
から得た。個々の電位での値を平均し、電圧の関数としてプロットし、そしてWoodhull等式、すなわちKd（０mV）exp(δzFE/RT)により適合せしめ、ここで前記式中、Kd（０mV)
は６mMであり、δはMg2+により検知される電場率0.30であり、Ｚはこの原子価２であり、そしてＦ，Ｅ，Ｒ、及びＴはそれらの有用な意味を有する（Woodhull,J. Gen. Physiol., 61 : 687-708(1973))。Woodhull等式の適用は、Mg2+イオンが約0.30の膜電場を検知す
ることを示した。
【０３１９】
例６
例６は、卵母細胞からの単一チャネルの記録を記載する。
６Ａ．例６Ａは、単一チャネルが rSK２を発現する卵母細胞から摘出された裏がえしのパッチを用いて試験されることを記載する。μモル以下の濃度でのカルシウムの添加は、対照には見出されないチャネル活性を誘発した。代表的なパッチは、槽溶液に適用される
0.2μＭのカルシウムが複数の開口部を単一の開口に誘発したことを示した。チャネル活性は、カルシウム濃度が高められるにつれて、上昇し、その結果、 0.6μＭのカルシウムにおいて、単位開口部はもはや分解され得ない。カルシウムの洗い流しに基づいて、チャネル活性は消出した。0.4μＭのカルシウムの存在下でのチャネル活性を、いくつかの電圧で記録した。肉眼で見えるランプ記録に類似して、チャネル開口確立は、電圧に対して明 らかに依存しなかった。
【０３２０】
いくつかの電圧で測定された単位開口部を用いて、単一チャネルＩ−Ｖ関係を構成した。使用される溶液はマクロパッチ記録に関してと同じであった（例 ５）。電極をCorning7052ガラス（Garner)から製造し、そしてそれは９〜13ＭΩの抵抗を有した。データを１
kHz (Bessel)で濾過し、Pulse(HEKA Electronik) を用いて10kHzで獲得し、そしてMacin
tosh Quadra 650上に直接的に貯蔵した。単一チャネルを、MacTac (SKALAR Instruments
)を用いて分析した。“50％閾値”技法を用いて、現象の振幅を評価した。
【０３２１】
閾値を個々の開口のために調整し、そして個々の遷移を、許容される前、眼により調べた。振幅ヒストグラムを、Mac Tacfit (SKALARInstruments) を用いて構成し、そして単一Gaussian分布により最良に適合せしめる。チャネル開口確立をNP（０）；すなわちチャネルの数により掛け算された開口確立の生成物として評価した。NP（０）を、合計時間により割り算される（滞留時間×レベル数）の合計として計算した。Ｎは、 0.4μＭのカルシウムでの同時開口チャネルの数として評価された。rSK２又は hSK１のいづれかを発現する卵母細胞からの３個のパッチに対する線状回帰分析は、それぞれ 9.9±0.9pS及び 9.2±0.3pS の平均単一チャネルコンダクタンスを生成した。
【０３２２】
６Ｂ．例６Ｂは、hIK１の単一チャネルコンダクタンスを記載する。この方法は、例３
Ｂに記載されている。 0.2〜1.0 μＭの遊離カルシウムを含む槽溶液中に摘出された裏がえしのパッチからの定常記録は、カルシウムの不在下で見出されなかった短−持続期間の開口部を示した。代表的な痕跡は、−60mVで記録された。チャネル活性の程度は、内部カルシウムの濃度に依存した。細胞内カルシウムの低減はチャネル活性を低め、そ して内部カルシウムの除去は、チャネル活性を破壊し、これはCa2+の再適用の後、戻った。
【０３２３】
持効性チャネル活性が−100mV 〜＋100mV の範囲の膜電圧で見うけられ、そして開口確立は明らかに、電圧依存性ではなかった。選択パッチに関しては、開口部の振幅を測定し、ヒストグラム中にアセンブルし、そしてGaussian分布により適合せしめる。その得られる平均振幅を用いて、流れ−電圧の関係を構成した。単一チャネルの流れ−電圧関係は、 肉眼で見える流れ−電圧関係に類似する内部方向整流を示す。このパッチのための、内部方向流れ−電圧関係の線状回帰分析は、35pSの単一チャネルコンダクタンスを生成し；４
個のパッチからの結果は、38±４pSの単位コンダクタンスを付与した。外部方向コンダクタンスの測定はより変動的であり、５〜12pSの範囲である。
【０３２４】
例７
例７は、新規ラット及びヒトカリウムチャネルの薬理学を記載する。
７Ａ．肉眼で見える rSK２流が、例３に記載されるパッチ用ピペットにより０又は60pMのアパミン、又は０又は２μＭのｄ−ツボクレートを注入することにより裏がえしのマクロパッチからの５μＭのCa2+で記録された。クローン化されたチャネルの機能的特徴は、ニューロン（Lancaster and Adams, J. Neurophysiol., 55 :1268-1282 (1986) ; Lancasterなど., J. Neurosci.,11 : 23-30 (1991) ; Sahなど., J. Neurophysiol.,68 : 18
34-1841 (1992))、骨格筋（Blatz and Magleby, Nature, 323 : 718-720 (1986))、副腎
クロム親和性細胞（Park,J. Physiol., 481 : 555-570 (1994) ; Artalejoなど., Pflug
ers Archiv.,423 : 97-103 (1993)) 、及びＴ−リンパ球（Grissmerなど., J. Gen. Phy
siol., 99 :63-84 (1992)) に記載されるSK種類のカルシウム−活性化されたカリウムチ
ャネルを暗示する。
【０３２５】
生来のSKチャネルは、明確な薬理学を表わす。それらは、サソリペプチドカリブドトキシン(CTX）、すなわちBKカリウムチャネルの有能なブロッカー によりブロックされない（Millerなど.,Nature,313 : 361-318 (1985))。しかしながら、すべてではないが、多く
のSKチャネルは、ハチ毒物トキシン、アパミン及び植物アルキロイド、すなわちｄ−ツボクラレによりブロックされる（dTC ; Zhang and McBain,J. Physiol., 488 : 661-672 (1995) ; Park,J. Physiol., 481 : 555-570 (1994) ;Dun など., J. Physiol., 375 : 
499-511 (1986))。
【０３２６】
500nM のCTXの適用は、 rSK２又は hSK１をブロックしないが、しかし hSlo BK流の活
性を破壊した。rSK２流は、63pMのＫd を有するピコモル濃度のアパミンにより効果的に
ブロックされた。対照的に、100nM のアパミンの適用は hSK−１流に影響を及ぼさなかった（ｎ＝８）。dTCはまた、 2.4μＭのＫdにより rSK２流をブロックし、ところが hSK
１は、76.2μＭのＫdに対して、約30倍低い感度であった。
【０３２７】
７Ｂ． hIK１の薬理学的試験に関して、クロトリマゾールはSigmaからであり、ケトコ
ナゾール及びイベリオトキシンはRP１からであり、アパミンはCalbiochemからであり、カリブドトキシンはDr.Chris Millerの親切な贈与であった。hIK１の機能的特徴は、赤血
球細胞（The Gardas channel ; Gardos, 1958)及び他の組織から記載される中間コンダクタンスのカルシウム−活性化されたＫ+チャネルを暗示する。生来のIKチャネルは識別する薬理学を提供し、カリブドトキシン(CTX) によりブロックされるが、しかし高コンダクタンスの電圧−及びCa2+−活性化されたＫ+チャネル（BKチャネル）とは異なり、イベリ
オトキシンによってはブロックされない。
【０３２８】
また、IKチャネルは、ハチ毒物ペプチドトキシンアパミン、すなわち生来の及びクローン化されたSKチャネルのブロッカーに対して敏感ではない。さら に、いくつかのIKチャネル、著しくはGardosチャネルは、いくつかのイミダゾール誘導体、たとえばクロトリマゾールに対して敏感であるが、しかし他のもの、たとえばケトコナゾールに対して敏感ではない。 hIK１流は、2.5nMのＫ1 を有するCTX により効果的にブロックされ（ｎ＝４）、
そして50nMのIBXはわずか15±３％をブロックした。ヒトIK１は24.8nMのKiをもってクロ
トリマゾールに対して敏感であるが、しかしわずか24±６％が10μＭのケトコナゾールによりブロックされた。100nM のアパミンは、 hIK１流をわずか12±５％減じた。
【０３２９】
本明細書に言及されるすべての出版物及び特許は、個々の出版物又は特許が引用により本明細書に組込まれることを特異的且つ個々に示されるかのように同じ程度に明細書中に
引用により組込まれる。
【配列表】
2008092950000001.app