(57)【要約】【課題】高感度化と同時に、ＰＣＲを行う形態を実現する。【解決手段】本発明の遺伝子検出チップは、核酸プローブが固相される表面を、温度制御可能でかつ光の全反射面としている。よって、表面への入射光によってしみだしたエバネッセント光が蛍光物質を励起し、マイクロアレイ上で蛍光標識核酸を含む固相ＰＣＲをエバネッセント領域で行うことにより、高感度な遺伝子検出が可能となる。【選択図】図１
2008275333.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子を捕捉可能な表面を有する遺伝子検出チップであって、
前記表面は、検出すべき核酸配列と相補的な核酸プローブを複数有し、温度制御可能であり、かつ入射光を全反射する全反射面であることを特徴とする遺伝子検出チップ。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子検出チップにおいて、
前記表面に接触する液体を挟んで対向する位置に配置される透明電極を有することを特徴とする遺伝子検出チップ。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子検出チップにおいて、
前記表面が、前記検出すべき核酸配列を含む液体を搬送可能な流路に配置されたことを特徴とする遺伝子検出チップ。
【請求項４】
請求項２に記載の遺伝子検出チップにおいて、
前記表面が、前記検出すべき核酸配列を含む液体を収容する容器に配置されたことを特徴とする遺伝子検出チップ。
【請求項５】
請求項３に記載の遺伝子検出チップの表面に、前記検出すべき核酸配列を集積させるための核酸配列集積方法であって、
前記検出すべき核酸配列を含む液体を、前記透明電極を通過する液量若しくはそれ未満の液量だけ搬送する第１の工程と、
前記搬送された液体に対して電圧を印加する第２の工程と、
前記第２の工程によって前記表面へ泳動した、前記検出すべき核酸配列に対し、二本鎖が一本鎖に乖離するための加熱を行う第３の工程と、を有し、
前記第１から第３の工程を順次繰り返して、前記表面に前記検出すべき核酸配列を集積させることを特徴とする核酸配列集積方法。
【請求項６】
請求項４に記載の遺伝子検出チップの表面に、前記検出すべき核酸配列を集積させるための核酸配列集積方法であって、
前記検出すべき核酸配列を含む液体に対して電圧を印加する第１の工程と、
前記第１の工程によって前記表面へ泳動した、前記検出すべき核酸配列に対し、二本鎖が一本鎖に乖離するための加熱を行う第２の工程と、を有し、
前記第１から第２の工程を順次繰り返して、前記表面に前記検出すべき核酸配列を集積させることを特徴とする核酸配列集積方法。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか１項に記載の遺伝子検出チップを用いた遺伝子検出装置であって、
前記表面にエバネッセント場を形成するための光を照射する照明手段と、
前記照明手段による照射によって前記表面からしみ出した光を撮像する撮像手段と、
前記表面に移動した前記検出すべき核酸配列に対し、二本鎖が一本鎖に乖離するための加熱を行う加熱手段と、を有すること特徴とする遺伝子検出装置。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子検出装置において、
前記検出すべき核酸配列を含む液体を搬送するための送液手段と、
前記搬送された液体に対して電圧を印加し、前記検出すべき核酸配列を前記表面へ電気泳動させるための電圧印加手段と、を有すること特徴とする遺伝子検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイ上で遺伝子を迅速かつ高感度に検出するための遺伝子検出チップ、これを用いた核酸配列集積方法および遺伝子検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、基板上にＤＮＡ等の核酸配列をマイクロアレイ状に固定化したマイクロアレイを使用して、複数の遺伝子を一挙に検出する手法が広く用いられるようになっている。
【０００３】
これに伴い、マイクロアレイの技術には、より一層の迅速性、高感度検出、および低コスト化が要求されるようになっている。
【０００４】
こうした要求に対応する従来技術には、例えば、固相表面でＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行わせることにより、ハイブリダイゼーションの時間を削減したものがある（特許文献１）。一方で、固相表面で高感度に分子を検出する方法として、特許文献２に開示された方法がある。
【０００５】
特許文献１，２に開示された従来技術について説明する。
【０００６】
特許文献１の図１０には、一塩基多型または遺伝子多型の検出方法が例として挙げられている。鋳型となる二本鎖ＤＮＡを含むダイ・ターミネーター入りＰＣＲ反応ｍｉｘｔｕｒｅを用い、底面部に形成された核酸プローブを、底面部に形成されたヒーターで加熱して固相表面上でＰＣＲを行う。このとき、容器内で進行するＰＣＲに伴い、鋳型に相補的な核酸プローブにて鎖の伸長反応がおき、核酸プローブの３’末端側にダイ・ターミネーターが取り込まれる。所定回数のＰＣＲサイクルのあと、未反応のダイ・ターミネーターを洗い流し、マイクロアレイスキャナで蛍光画像を取得し、分析評価を行う。
【０００７】
また、特許文献２の図１には、固定化したタンパク質または核酸分子と標的分子との相互作用を、標識物質の検出によって迅速かつ定量的に測定する方法が示されている。ここでは、エバネッセント光を用いて、分子間相互作用の１分子イメージングを可能としている。
【特許文献１】特開２００５−３０４４４５号
【特許文献２】特開２００２−２５３２４０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１では、対象とするアプリケーションが一塩基多型の検出を目的としており、高感度を要求していないため、本発明が課題とする高感度なアプリケーションに対応することが難しい。
【０００９】
一方、特許文献２では、高感度化が図られ、分子レベルで分子間相互作用の検出を可能としている。しかし、反応様式が抗原抗体反応等、固相表面で単に複合体を形成するものであり、ＰＣＲに必要な、２本の乖離（９５℃）、プライマーアニール（〜６３℃）、酵素の伸長（７２℃）を繰り返し行う形態を求めていない。
【００１０】
例えば、感染初期で極微量のウイルス、細菌等の遺伝子検出を行うためには、一層の高感度化が望ましいと同時に、ＰＣＲを行う形態が必要とされる。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、一層の高感度化と同時に、ＰＣＲを行う形態を実現する遺伝子検出チップを提供することにある。また、高感度化に際しては、検体の液量に対して、検体中に含まれる検出物質が少ないといった問題が起こる。そのため、本発明の他の目的は、少ない試薬使用量でもＰＣＲが行えるような核酸配列集積方法および遺伝子検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために本発明の遺伝子検出チップは、遺伝子を捕捉可能な表面を有する遺伝子検出チップであって、前記表面は、検出すべき核酸配列と相補的な核酸プローブを複数有し、温度制御可能であり、かつ入射光を全反射する全反射面であることを特徴とする。
【００１３】
また、前記遺伝子検出チップは、前記表面に接触する液体を挟んで対向する位置に配置される透明電極を有することを特徴とする。
【００１４】
また、前記遺伝子検出チップは、前記表面が、前記検出すべき核酸配列を含む液体を搬送可能な流路に配置されたことを特徴とする。
【００１５】
また、前記遺伝子検出チップは、前記表面が、前記検出すべき核酸配列を含む液体を収容する容器に配置されたことを特徴とする。
【００１６】
上記目的を達成するために本発明の一態様の核酸配列集積方法は、前記遺伝子検出チップの表面に、前記検出すべき核酸配列を集積させるための核酸配列集積方法であって、前記検出すべき核酸配列を含む液体を、前記透明電極を通過する液量若しくはそれ未満の液量だけ搬送する第１の工程と、前記搬送された液体に対して電圧を印加する第２の工程と、前記第２の工程によって前記表面へ泳動した、前記検出すべき核酸配列に対し、二本鎖が一本鎖に乖離するための加熱を行う第３の工程と、を有し、前記第１から第３の工程を順次繰り返して、前記表面に前記検出すべき核酸配列を集積させることを特徴とする。
【００１７】
上記目的を達成するために本発明の他の態様の核酸配列集積方法は、前記遺伝子検出チップの表面に、前記検出すべき核酸配列を集積させるための核酸配列集積方法であって、前記検出すべき核酸配列を含む液体に対して電圧を印加する第１の工程と、前記第１の工程によって前記表面へ泳動した、前記検出すべき核酸配列に対し、二本鎖が一本鎖に乖離するための加熱を行う第２の工程と、を有し、前記第１から第２の工程を順次繰り返して、前記表面に前記検出すべき核酸配列を集積させることを特徴とする。
【００１８】
上記目的を達成するために本発明遺伝子検出装置は、前記遺伝子検出チップを用いた遺伝子検出装置であって、前記表面にエバネッセント場を形成するための光を照射する照明手段と、前記照明手段による照射によって前記表面からしみ出した光を撮像する撮像手段と、前記表面に移動した前記検出すべき核酸配列に対し、二本鎖が一本鎖に乖離するための加熱を行う加熱手段と、を有すること特徴とする。
【００１９】
また、前記遺伝子検出装置は、前記検出すべき核酸配列を含む液体を搬送するための送液手段と、前記搬送された液体に対して電圧を印加し、前記検出すべき核酸配列を前記表面へ電気泳動させるための電圧印加手段と、を有すること特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の遺伝子検出チップは、表面を温度制御可能でかつ光の全反射面とすることにより、蛍光標識核酸を含むＰＣＲをエバネッセント領域である拡散プローブを固相した表面で行えるようにした。
【００２１】
このため、固相表面のＰＣＲをより高感度に検出できる。同時に、表面がレーザーの全反射面を兼ねるので、部品点数および製造プロセス数を削減できる。また、高感度になったことで少量アッセイ化が行えるため、採血量が減り、患者の負担が低減し、ひいては試薬使用量が減り低コスト化に役立つ。また、検体中の検出すべき核酸配列が非常に微量であるが故に、検体液を莫大に必要とする場合においても、流路上の固相表面で検出すべき核酸配列を集積可能なため、少量アッセイ化、試薬使用量減、低コスト化に役立つ。また、レーザーエバネッセント照明によってＢ／Ｆ分離が不要になったことで、多量の洗浄液を排出する必要がなくなり、廃液処理問題、洗浄作業に伴う感染等の心配がなくなり検査の安全化に役立つ。同時に、蛍光物質の検出によってリアルタイムな観測ができるので、定量ＰＣＲ測定が実施できる。また、高感度になったことでＰＣＲサイクル数を減らすことができ、検査の高速化に役立つ。同時に、電気泳動によって核酸配列を集積することで、単純な拡散より早く集積可能となり、検査の高速化に役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本発明を実施するための最良の形態について図面を参照して説明する。
【００２３】
図１を参照すると、本実施形態の遺伝子検出チップにおいては、遺伝子を捕捉可能な表面１は、検出すべき核酸配列３と相補的な核酸配列５を複数有し、この核酸配列５が核酸プローブとして固相化されている。
【００２４】
表面１は、ＰＣＲを起すために必要とされる温度に加熱制御することができ、かつエバネッセント場を形成するための入射光を全反射させる全反射面である。このような全反射面は、レーザービーム６を入射可能な基板２、例えば、透明な基板２に形成することができる。表面１からしみ出したエバネッセント光は、反応液７に含まれる表面近傍の蛍光物質４を励起するため、蛍光物質４の存在を光検出器によって検出することができる。検体中に検出すべき核酸配列３が存在するとき、固相表面で蛍光標識核酸を含むＰＣＲが行われることによって、核酸配列３の存在を検出することができる。
【００２５】
以下、望ましい実施形態を説明する。
（表面１について−その１）
表面１は、光の全反射面を形成する薄膜を持つ。薄膜の膜厚は、固相する核酸プローブのプローブ長を含めて、エバネッセント光のしみだしを超えない範囲とすることができる。仮に、しみだしの深さを、光の強度が1/eとなる界面からの距離ｄ(nm)とすると、以下のようにまとめることができる。
【００２６】
ｄ＝λ／４π〔n12・sin2θ−n22〕1/2  ・・・（１）
λ(nm)：レーザービーム６の波長
n1    ：薄膜を付けた基板２の屈折率
n2    ：検体の屈折率
θ    ：入射角（臨界角よりも大きい値）
例えば、レーザービーム６を照射するレーザーとして、Ｈｅ-Ｎｅなど、一般的なグリーンレーザーを用いると、ｄの値は１５０ｎｍ程度と試算できる。１分子レベルの観察をする場合には、０．５μＷ/μｍ2程度の励起強度の光を照射するとすれば、照射面積をＳ（μｍ2）として０．５Ｓ・ｅ（ただし、ｅ＝２．７１）μＷのレーザー出力となる。この式によれば、照射面積1ｍｍ2で１．３５Ｗ、照射面積１０ｍｍ2で１３５Ｗとなる。この値は入手可能な市販のレーザーの出力に対応する。
【００２７】
なお、照射面積Ｓは、固相されているマイクロアレイ全面を照射しなければならないが、もしも固相面をスキャンできるならこの限りでない。
【００２８】
また、レーザーには、できるだけ均一な照射とするために、ビームエキスパンダーを介する、直線偏向を円偏向にする、などの光学素子を用いることができる。
【００２９】
レーザービーム６の波長は、蛍光色素がＣｙ３やローダミンであれば、ＳＨＧの５３２ｎｍを、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩやＦＩＴＣであれば、ＳＨＧの４７３ｎｍを、Ｃｙ５であればＬＤ励起の６３５ｎｍとすることができる。
（表面１について−その２）
表面１は、上述のように、温度制御可能である。電気的に加熱する場合はドライブ可能な抵抗値を持った面積、形状パターンの表面となる。
【００３０】
まず、表面１の面積について述べる。
【００３１】
ＰＣＲサイクルで考慮すべき０℃＜Ｔ＜９９℃の温度範囲において、０℃のときの抵抗値をＲ0、Ｔ℃のときの抵抗値をＲT、抵抗温度係数をαとして直線近似で表現すると、以下のようになる。
【００３２】
ＲT  ＝  Ｒ0[１＋αＴ]  ・・・（２）
代表的な金属のバルク抵抗値は、例えば、薄膜ハンドブック（日本学術振興会薄膜第１３１委員会／編、オーム社出版）で参照できる。また、バルク抵抗値は、いずれの物質でも抵抗率測定器で測定すればよい。バルク抵抗値をＲbulk（μΩcm）とすると、シート抵抗は、
Ｒsheet ＝  Ｒbulk／厚さ（μΩ）  ・・・（３）
と表現できる。したがって、長さＬ、幅Ｗのシートの抵抗値ＲSは、以下のようになる。
【００３３】
ＲS ＝  Ｒsheet・Ｌ／Ｗ  ・・・（４）
このときのＲSの値が、ＲT（Ｔ＝プライマーアニール温度からＴ＝テンプレートディネーチャー温度まで）を変化させるので、この抵抗値ＲSをドライブできる電流源、電圧源があればよい。一例として、抵抗値が低く、ドライブするのに負担が大きい金属Ａｕを例にとると、Ａｕはバルク抵抗値２．２μΩcmなので、厚み１０ｎｍ（＝１０-6ｃｍ）のとき、抵抗値ＲSは、
ＲS ＝  ２．２Ω・Ｌ／Ｗ  ・・・（５）
となる。Ａｕはα＝０．００４０／℃（室温）であるので、（２）式から１００℃のとき約１．４倍に抵抗値が上昇すると試算できるので、抵抗値ＲSは、以下のようになる。
【００３４】
ＲS ＝  ３．１Ω・Ｌ／Ｗ  ・・・（６）
ここで、Ｌ：Ｗ＝１０：１とすると、抵抗値ＲSは数十Ωの値をとることができ、オーディオ回路等、一般的な回路でドライブすることが可能である。一例として、Ｌ＝１０ｍｍ、Ｗ＝１ｍｍ、固相面積が１ｍｍ2とすると、マイクロアレイドットのピッチが１００μｍの場合、１０×１０＝１００個のマイクロアレイドットを構成できる。この個数は、一般的な細菌同定検査項目をほぼ包括しうる。
【００３５】
上記の説明では、長さＬ、幅Ｗの単純な長方形である表面１の面積について述べた。
【００３６】
次に、表面１の形状パターンについて述べる。
【００３７】
図２（ａ）は、基板２の上に単層の薄膜をパターニングした、Ｈ字状のヒーターパターン４９である。電圧を印加する両端を太く、固相領域５４を細くすることで、単層のパターニングで固相領域５４を加熱することができる。図２（ｂ）は、二層のパターニングである。導電性の良好な金属薄膜、ここでは例えば金電極１５ａ、１５ｂをヒーターパターン４９の両端にパターニングすることで、太い正方形のヒーターパターン４９を均一に加熱することができる。このとき、正方形のヒーターパターン４９は高い抵抗値を持つことが望ましい。また、固相スポット５５を同じく金でパターニングすることで、ＳＨ基を末端にもった核酸プローブを結合するのに適した形態となる。
（表面１について−その３）
表面１は、複数の核酸プローブを有する。表面１への核酸プローブの固相方法は一般的な方法を用いてよい。例えば、光応答性ポリマーにアビジンを添加してＵＶ照射し、予めアビジンの固定化を行った固相表面に対し、ビオチン化オリゴヌクレオチドプローブをスポットする方法を用いてよい。スポット作業は市販の装置を用いることができる。この方法の場合、表面の材質を問わず固相可能である。また、金に限らず、貴金属の薄膜に対してはＳＨ基を持ったオリゴヌクレオチドプローブを用いることができる。
（表面１の薄膜材料について）
表面１の薄膜の薄膜材料には、金、銀、白金などの貴金属、鉄、ニッケル、マンガン、クロム、亜鉛、アルミニウム、チタンなどの金属、およびこれらの酸化物、金属やその酸化物の固溶体を用いることができる。その他、導電性のポリマー、ポリマー樹脂にカーボンブラックや金属フィラーを配合したものを用いることができる。また、レーザー６を入射する基板２には、ガラス、透明樹脂を用いることができる。透明樹脂には、ガラス転移温度がＰＣＲサイクルに必要なディネーチャー温度と同程度である樹脂材料を用いることができる。例えば、Poly(vinyl alcohol)、Poly(vinyl chloride)、Poly(p-methoxy styrene)、Polystyrene、Cellulose Acetate、Poly(p-methyl styrene)を用いることができる。その他、過熱状態（９５℃以上）になると膨張によって電気的接触を絶ち、過熱防止に役立つような材質が含まれる。
（表面１の温度制御方法について）
表面１の温度は、図３に示すブリッジ回路で制御できる。ブリッジ１３を構成する４つの抵抗のうちＲSと表示してある抵抗が遺伝子検出チップの抵抗である。Ｒnは既知の抵抗である。破線四角で囲んだ抵抗１０は、Ｄ／Ａコンバータもしくはラダー抵抗である。抵抗１０は、マイクイロプロセッサのバスライン１１と接続され、任意の抵抗比率を選択することができる。制御すべき温度に相当するＲSの抵抗値が解っていれば、差動増幅器１２の出力が零となるように、電源電圧Ｖｃに接続されたトランジスタ９を流れる電流を制御することで、目的の温度を得ることができる。
【００３８】
その他の温度制御の例を図４に示す。表面１の薄膜１４は加熱可能であり、この薄膜１４の周囲の４箇所に電極１５ｃ〜１５ｆを設ける。電流ｉが電極１５ｃから電極１５ｄへ流れるとき、電極１５ｅ−電極１５ｆ間の両端電圧Ｖを１チップマイコンのＡ／Ｄコンバータに導き、温度に換算しても良い。さらに他の温度制御の例として、図１のレーザー６の一部を２分割ホトダイオードセンサに導き、基板２の屈折率が温度変化に伴って変化する場合、この屈折率の情報をもとに温度制御しても良い。
（検出すべき核酸配列の集積方法について−表面が流路に配置された場合）
図５は、表面１が、検体（液体）を搬送可能な流路２５に配置された場合の核酸配列の集積方法を説明する図である。流路２５の固相面には、ＤＮＡ２９に対して少なくとも相補的な核酸配列２８ａ、２８ｂ、２８ｃが、加熱できる薄膜１４の上に核酸プローブとして固相されている。また、薄膜１４に接触する検体を挟んで対向する位置には透明電極３０が配置されている。透明電極３０にはＩＴＯを用いることができる。ＤＮＡ２９を集積させる方法について説明する。
【００３９】
図５の（１）は、検体の搬送を示している（第１の工程）。このとき、検体は、透明電極３０を通過する液量若しくはそれ未満の液量だけ搬送される。
【００４０】
次に、搬送された検体に対して電圧を印加することで、ＤＮＡ２９は固相面へ向かって電気泳動される（図５の（２）、第２の工程）。固相面へＤＮＡ２９が十分に移動した後、固相面のヒーターを駆動し、ＤＮＡ２９が二本鎖から一本鎖に乖離するに十分な加熱を行う（第３の工程）。このとき、もしも固相側に相補的な核酸配列が存在すると、相補鎖が形成されるので、固相表面にＤＮＡ２９を捕捉し、集積させることができる。
【００４１】
図５の（３）にはＤＮＡ２９が存在していないが、同様に検体の搬送を行う。検体がすべて固相面を通過するまで、以上の工程を順次繰り返す。
【００４２】
以上の工程をフローチャートで表すと図６のようになり、本実施形態の遺伝子検出装置のソフトウエアで制御できる。検体搬送終了判定２７で終了と判定されるまで、検体トラップサブルーチン２６を繰り返す。検体トラップサブルーチン２６では、まず、ポンプの駆動によって検体の搬送が行われ、端子３２（+）−端子３４（-）間に電圧が印加される。一般に物質の泳動速度は、その物質の移動度を係数として電界強度に比例する。アニオンの移動度は１０-3（ｃｍ2／Ｖｓ）程度なので、端子間距離が１００μｍのとき、１０Ｖを印加したとして、速度は１ｃｍ／ｓと見積もることができる。したがって、印加電圧は１００Ｖ未満で、印加時間は１秒未満でよい。電圧印加後、スイッチ３１をヒーター加熱側に倒し、端子３３を通じてヒーター加熱電流を流す。
（検出すべき核酸配列の集積方法について−表面が容器に配置された場合）
図７は、表面１が、検体を収容する容器８に配置された場合の核酸配列の集積方法を説明する図である。図７は、単なる容器であるので、図５のように検体の搬送はできない。しかし、図５のように、上部の対向する位置に透明電極３０が配置されているので、ＤＮＡ２９を電気泳動させることができる（第１の工程）。また、電気泳動後、スイッチ３１をヒーター加熱側に倒し、端子３３を通じてヒーター加熱電流を流すことができる（第２の工程）。以上の二つの工程を順次繰り返して、ＤＮＡ２９を固相表面に補足し、集積させることができる。なお、ＤＮＰ（ＤＮＡ結合蛋白）以外の蛋白質等、極性の異なる物質は、透明電極３０の方向へ電気泳動されるので、反応に邪魔な不純物を遠ざけることができる。透明電極３０はグランド電位に接続しておくことが望ましいが、開放としても良い。
【００４３】
なお、検体を希釈する希釈溶液は、通常のＰＣＲバッファー、ＴＡＥ、ＴＢＥバッファー、ＰＢＳバッファーを用いることができる。
（遺伝子検出反応について）
遺伝子を検出するための反応は、鎖の伸長または修復を伴う酵素反応である。こうした酵素反応には、φ２９ポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、E.coliＤＮＡリガーゼ、Ｔ４リガーゼ、逆転写酵素、耐熱ポリメラーゼ等を用いることができる。特に、耐熱ポリメラーゼを用いることが適している。基質となる核酸には、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、Ｕ等のデオキシヌクレオチド三リン酸やその蛍光標識物、および伸長のターミネーションを起すジデオキシヌクレオチドやその標識物を用いることができる。核酸は、核酸アナログであっても良い。また、耐熱ポリメラーゼの反応において必要とされるプライマーを反応溶液に添加することについては、固相側に存在する核酸鎖がプライマーの役割を兼ねるので、非対称ＰＣＲの実行でよい場合には行う必要はない。ただし、反応に伴う増幅率を上げたい場合、溶液中に相補的配列となるプライマーを設け、対称ＰＣＲとすることが望ましい。また、本実施形態の遺伝子検出チップは、固相側の核酸鎖に蛍光標識が取り込まれるため、使い捨てチップの形態となる。ただし、検出すべき核酸鎖と固相側の核酸鎖の二本鎖形成を、サイバーグリーンなどのインターカレータによって蛍光検出する場合は、ディネーチャー操作によって検出すべき核酸鎖を取り除くことで、遺伝子検出チップの再使用が可能である。このとき、基板２となる材質は、色素吸着を少なくするために、ガラスを避けることが望ましい。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。
【００４５】
［実施例１］
図８（ａ）は、本発明の実施例１の遺伝子検出チップを示す斜視図である。この遺伝子検出チップの固相面は、容器に配置されている。容器は、図８（ｂ）および（ｃ）のように、顕微鏡用の無蛍光ガラス基板１７とアクリル樹脂１９の２枚を張り合わせて構成される。図８（ｂ）のように、無蛍光ガラス基板１７の上に金電極１５a、１５ｂとしてクロムをパターニングし、その間に固相面かつヒーター面となるＰｔヒーター薄膜１６としてチタンを製膜する。成型加工した透明のアクリル樹脂１９には、サンプル注入孔１８a、１８bがあり、このサンプル注入孔１８a、１８bをゴムキャップ２０で塞ぐことで反応中の蒸発を防ぐことができる。市販のスポッター装置で核酸プローブをスポットした後、接着剤で２枚を張り合わせる。
【００４６】
［実施例２］
図９は、本発明の実施例２の遺伝子検出チップを示す斜視図である。この遺伝子検出チップの固相面は、流路２５に配置されている。遺伝子検出チップには、検体注入孔２１、バッファー注入孔２２、ＰＣＲ反応液注入孔２３、および廃液孔２４があり、それぞれに液溜めを持っている。検体中の検出すべき核酸配列が非常に微量であるために、検体を莫大に必要とする場合がある。こうした場合を考慮して、検体液溜めを大きく取り、固相面だけに核酸配列を捕捉した後、バッファー液で洗い流し、流路高さ×固相面積だけのわずかな領域分のＰＣＲ反応液で、反応を進めることができるようになっている。また、流路２５上の固相面かつヒーター面と反対側の位置に不図示の透明電極を設け、電気泳動によって固相面に検出すべき核酸配列を捕捉することができる。
【００４７】
以下、図９の遺伝子検出チップの作成手順を、図１０をもとに述べる。
【００４８】
２５×７６ｍｍ厚さ１．２ｍｍの無蛍光ガラス基板５１に、レジストをスピンコートし、ヒーターパターン４９を露光、現像した後、製膜レートを参考にスパッタ法で、Ｔｉ膜を約５ｎｍ、続いてＰｔ膜を約５０ｎｍ堆積する。次に、リフトオフプロセスで、レジスト及び不要な膜を除去する。リフトオフプロセス後のヒーターパターン４９は、図１０のようになる。
【００４９】
また、検体注入孔２１、バッファー注入孔２２、ＰＣＲ反応液注入孔２３、および廃液孔２４を予め成型したＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）基板５２に、ＩＴＯを約１００ｎｍ製膜する。次に、透明電極パターン５０をレジストで保護し、ＩＴＯエッチング液で不要部分を除去する。
【００５０】
また、流路２５の型をくりぬいた２１×７２ｍｍ厚さ１００ｎｍのＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）シート５３を用意しておく。また、無蛍光ガラス基板５１は、７０℃の硫酸−過酸化水素水に約１時間浸すかまたはＵＶオゾン照射によって、表面を清浄にしておく。
【００５１】
次に、蛍光ガラス基板５１の上に、ＰＤＭＳシート５３を重ね合わせる。無蛍光ガラス基板５１のヒーターパターン４９と、ＰＤＭＳシート５３の流路２５の型部分が交差する固相領域５４には、市販のスポッター装置を用いて、核酸プローブを固定化する。
【００５２】
なお、本実施例では、透明電極パターン５０及びヒーターパターン４９を１ｍｍ×２５ｍｍ、固相領域５４の面積が１ｍｍ×１ｍｍとなるように流路幅を１ｍｍとしている。また、核酸プローブは、以下の１０菌種を検出するためのものであり、特開２００４−３１３１８１号公報に開示された核酸プローブを用いる。また、５‘末端にはＳＨ（チオール）基が結合されている。
１．  黄色ブドウ球菌                    gAACCgCATggTTCAAAAgTgAAAgA
２．  表皮ブドウ球菌                    TAgTgAAAgACggTTTTgCTgTCACT
３．  大腸菌                            ATACCTTTgCTCATTgACgTTACCCg
４．  肺炎桿菌                          ggTCTgTCAAgTCggATgTgAAATCC
５．  緑膿菌                            TCAgATgAgCCTAggTCggATTAgC
６．  セラチア菌                        AggTggTgAgCTTAATACgCTCATC
７．  肺炎連鎖球菌                      CTTgCATCACTACCAgATggACCTg
８．  インフルエンザ菌                  CTTgggAATgTACTgACgCTCATgTg
９．  エンテロバクター・クロアカエ菌    ggTgTTgTggTTAATAACCACAgCAA
１０．エンテロコッカス・フェカリス菌    AACACgTgggTAACCTACCCATCAg
その後、核酸プローブの固定化が終了すると、図１０に示すように、ＰＥＴ基板５２を重ね合わせて固定する。
【００５３】
［実施例３］
実施例２の遺伝子検出チップを用いた遺伝子検出装置について図１１を用いて説明する。
【００５４】
表面１にエバネッセント場を形成するためのレーザービームは、照明手段であるレーザー３５から照射され、レーザパワーコントローラ４８によってコントロールされる。レーザービームはビームエキスパンダー３６に導かれ、レンズ３７を通して、本発明の遺伝子検出チップ３８に入射される。遺伝子検出チップ３８の表面１からしみ出したエバネッセント光は、撮像手段である冷却ＣＣＤカメラ３９によって撮像される。一方、ダイアフラム式マイクロポンプ４１、４２、および４３は、チュービングを経由して、それぞれ検体注入孔２１、バッファー注入孔２２、ＰＣＲ反応液注入孔２３に接続される。ダイアフラム式マイクロポンプ４０は、廃液孔２４に接続され、流路２５を満たす空気を吸引することで液体の搬送を行う送液手段である。ダイアフラム式マイクロポンプ４０〜４３のコントロールは、Ｉ／Ｏ４４およびデータ／制御バス４５通してＰＣコントローラ４７で制御される。制御の状態は表示器４６で確認することができる。
【００５５】
［実施例４］
実施例２の遺伝子検出チップを用いて、病原体の遺伝子を検出する。
（検体の調整）
まず、ＥＤＴＡ入り真空採血管で採血した検体から病原体ＤＮＡを含む粗分画を得る。次に、血液１０μｌに純水１０μｌを加え、９５℃で１０分間インキュベートする。次に、これを８０００×ｇで１０分遠心し、上清を捨てる。次に、これに、N-acetylmuramidase（0.625mg/mｌ）とbeta-1,3-glucanase（Zymolyase）（0.25mg/mｌ）から成る酵素カクテルを１０μｌ加える。さらに、lysozyme（100mg/mｌ）とlysostaphin（10mg/mｌ）から成る酵素カクテルを１０μｌ加える。次に、これを３７℃で１０分間インキュベートする。次に、これを８０００×ｇで１０分遠心し、上清を捨て、ＰＣＲキット（インビトロジェン株式会社  プラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）に添付のＰＣＲバッファーを用いて約１０μｌにメスアップする（Ａ液）。同じく、ＰＣＲキット内のＰＣＲプレミックス溶液を酵素が３Ｕｎｉｔとなるよう希釈し、そこへＣｙ３−ｄＵＴＰが１０ｐｍｏｌ／μｌとなるよう、蛍光色素を添加する（Ｂ液）。
（遺伝子検出チップへの分注）
検体注入孔２１に先ほどのＡ液１０μｌを分注する。バッファー注入孔２２には、希釈済みＰＣＲバッファーを７μｌ分注する。ＰＣＲ反応液注入孔２３には、先ほどのＢ液を３μｌ分注する。これを、遺伝子検出チップ３８として実施例３の遺伝子検出装置に組み込み、チュービングを接続する。
（遺伝子の捕捉・集積）
ダイアフラム式マイクロポンプ４１に接続する調整積み検体（Ａ液）を０.１μｌ/secの速度で押し出す。他の溶液との流路交差点を通過後、ダイアフラム式マイクロポンプ４０を同速度で駆動し、送液を安定化させる。検体が固相領域５４に到達してから、透明電極パターン５０と固相面との間に、不図示の電圧印加手段により５Ｖの電圧を５０msec印加する。次に、加熱手段である固相面のヒーター両端に電圧を印加して固相表面の温度が９３℃になるように制御する。制御方法はブリッジ１３によってブリッジ両端の電圧差がなくなるようフィードバック制御する。温度との対応は、予めヒーターの抵抗値との関係をキャリブレーションしておく。加熱の時間は９３℃に到達してから１秒間とする。以上の工程を、０.１μｌづつ液を送り出してトータル１０μｌに達するまで繰り返す。
（ＰＣＲ）
ダイアフラム式マイクロポンプ４２に接続するＰＣＲバッファーを０.１μｌ/secの速度で押し出す。他の溶液との流路交差点を通過後、ダイアフラム式マイクロポンプ４０を同速度で駆動し、送液を安定化させる。溶液が固相領域５４に到達してからトータル７μｌに達するまで送液を続ける。次に、ダイアフラム式マイクロポンプ４３に接続するＰＣＲ反応液を０.１μｌ/secの速度で押し出す。溶液を固相領域５４に到達させ、ＰＣＲを開始させる。温度サイクルは、９３℃を１秒、６３℃を１秒、７２℃を０．５秒の保持時間とし、２５回に設定する。
（ＰＣＲによる遺伝子の検出）
レーザービームが遺伝子検出チップ３８の全反射面に導かれ、ＰＣＲの開始と同時に冷却ＣＣＤカメラ３９によって撮像が開始される。撮影された画像はＰＣコントローラ４７内で画像処理され、ＰＣＲが起こった場合の核酸プローブについては、その部分が、ＰＣＲの反応回数毎に、リアルタイムに相対蛍光輝度に換算される。検出されたスポットの情報から、病原体を同定する。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、上述のように高感度検出が必要な遺伝子診断に用いることができる。しかしそれ以外の産業にも利用できる可能性がある。本発明は、温度制御可能な光の全反射面となる表面を有しており、光がしみだす近傍の温度を制御しているために、その温度においてその近傍で起こりうるすべての化学反応等の反応場を提供していることになる。したがって、本発明は、しみだす光が化学物質と相互作用し、光検出器で検出できるなら、反応物質の検出や反応温度解析に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の一実施形態の遺伝子検出チップを示す図である。
【図２】図１に示した遺伝子検出チップのヒーターパターンの一例を示す図である。
【図３】図１に示した遺伝子検出チップの温度制御の一例に用いるブリッジ回路を示す図である。
【図４】図１に示した遺伝子検出チップの温度制御の他の例を示す図である。
【図５】図１に示した遺伝子検出チップに、検出すべき核酸配列を集積させる方法の一例（表面が流路に配置された場合）を説明する図である。
【図６】図５に示した核酸配列集積方法を説明するフローチャートである。
【図７】図１に示した遺伝子検出チップに、検出すべき核酸配列を集積させる方法の他の例（表面が容器に配置された場合）を説明する図である。
【図８】本発明の実施例１の遺伝子検出チップを示す図である。
【図９】本発明の実施例２の遺伝子検出チップを示す図である。
【図１０】図９に示した遺伝子検出チップの作製方法の一例を説明する図である。
【図１１】図９に示した遺伝子検出チップを用いた遺伝子検出装置の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００５８】
１    表面
２    基板
３    検出すべき核酸配列
４    蛍光物質
５    相補的な核酸配列
６    レーザー
７    反応液
８    容器
９    トランジスタ
１０    抵抗
１１    マイクイロプロセッサのバスライン
１２    差動増幅器
１３    ブリッジ
１４    加熱できる薄膜
１５ａ，１５ｂ    金電極
１５ｃ，１５ｄ，１５ｅ，１５ｆ    電極
１６    Ｐｔヒーター薄膜
１７    無蛍光ガラス基板
１８ａ，１８ｂ    サンプル注入孔
１９    アクリル樹脂
２０    ゴムキャップ
２１    検体注入孔
２２    バッファー注入孔
２３    ＰＣＲ反応液注入孔
２４    廃液孔
２５    流路
２６    検体トラップサブルーチン
２７    検体搬送終了判定
２８ａ，２８ｂ，２８ｃ    相補的な核酸配列
２９    ＤＮＡ
３０    透明電極
３１    スイッチ
３２，３３，３４    端子
３５    レーザー光源
３６    ビームエキスパンダー
３７    レンズ
３８    遺伝子検出チップ
３９    冷却ＣＣＤカメラ
４０，４１，４２，４３    ダイアフラム式マイクロポンプ
４４    Ｉ／Ｏ
４５    データ／制御バス
４６    表示器
４７    ＰＣコントローラ
４８    レーザパワーコントローラ
４９    ヒーターパターン
５０    透明電極パターン
５１    無蛍光ガラス基板
５２    ＰＥＴ基板
５３    ＰＤＭＳシート
５４    固相領域
５５    固相スポット
【図１】
2008275333.tif 000003
【図３】
2008275333.tif 000004
【図４】
2008275333.tif 000005
【図５】
2008275333.tif 000006
【図６】
2008275333.tif 000007
【図７】
2008275333.tif 000008
【図８】
2008275333.tif 000009
【図９】
2008275333.tif 000010
【図１０】
2008275333.tif 000011
【図１１】
2008275333.tif 000012
【図２】
2008275333.tif 000013