(57)【要約】【課題】  細胞回収率高くかつ被験者に影響されない大便から細胞を回収する方法、細胞回収キット、大腸がん検出方法、および大腸がん検出キットを提供する。【解決手段】  細胞回収率高く且つ、被験者に影響されない大便から細胞を回収する方法を鋭意検討した。そこで整腸作用を有する成分を含む物質を含む大腸細胞回収用投与剤を用いる。前記整腸作用を有する成分が食物繊維であり、より好ましくはペクチンとする。本発明の方法は大便採取を行う前に整腸作用を有する成分を含む物質を被験者が摂取する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
整腸作用を有する成分を含む物質を含む大腸細胞回収用投与剤。
【請求項２】
大腸がん検査に用いる請求項１に記載の大腸細胞回収用投与剤。
【請求項３】
前記整腸作用を有する成分が食物繊維であることを特徴とする請求項1又は２に記載の大腸細胞回収用投与剤。
【請求項４】
前記食物繊維がペクチンであることを特徴とする請求項1〜３のいずれかに記載の大腸細胞回収用投与剤。
【請求項５】
前記ペクチンがアップルペクチンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の大腸細胞回収用投与剤。
【請求項６】
前記整腸作用を有する成分を含む物質が果実類、サトウダイコン、ヒマワリ、及びその加工品であることを特徴とする請求項１又は２に記載の大腸細胞回収用投与剤。
【請求項７】
投与回数が１回で効力を発することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の大腸細胞回収用投与剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の大腸細胞回収用投与剤を用いることを特徴とする大腸細胞回収方法。
【請求項９】
前記大腸細胞が大腸がん細胞であることを特徴とする請求項８に記載の大腸細胞回収方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の大腸細胞回収用投与剤と、個体担体を用いることを特徴とする大腸細胞回収方法。
【請求項１１】
前記個体担体が磁気ビーズであることを特徴とする請求項１０に記載の大腸細胞回収方法。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする大腸がん検査方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれかに記載の大腸細胞回収用投与剤と、個体担体を含む大腸細胞回収用キット。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれかに記載の大腸細胞回収用投与剤と、個体担体と、試薬を含む大腸細胞回収用キット。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれかに記載の大腸細胞回収用投与剤と個体担体を含む大腸がん検査用キット。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれかに記載の大腸細胞回収用投与剤と個体担体と、試薬を含む大腸がん検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は大便から細胞を回収するための投与剤、細胞回収方法及び、大腸がん検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
医療診断分野では、例えば、病原体の検出や、疾病の早期発見などの目的で核酸を抽出し、解析する方法が用いられている。しかしながら、血液、生体組織、糞便、尿などから核酸を抽出する場合は、夾雑物の混入による擬陽性の結果を生じることを防ぐため、細胞や核酸の精製が必要である。そこで例えば、細胞を含む検体から、遺伝子検査の対象となる一種または、数種の細胞を特異的に回収することが行なわれる。このように回収した細胞から核酸を抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等で核酸を増幅し遺伝子変異を検出するなどして、遺伝子診断が行われている。
【０００３】
特に、大便に存在する細胞回収方法の一つに、検査対象の細胞と特異的に結合する磁気ビーズなどの固体担体に細胞を捕捉して、不純物を除き回収する方法（例えば、特許文献１）がある。また、細胞回収に用いる磁気ビーズとしては、Ｂｅｒ−ＥＰ４抗体を結合された磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈ、ダイナル社製）がある。
【０００４】
下記特許文献２には、大便から細胞の回収を行い、その細胞から分離されたＤＮＡの量、または大便のＤＮＡ指数（分離したＤＮＡのナノグラムの値を便の重さのグラムの値で割ったものである）により、その被験者が結腸直腸がんを有するか、結腸直腸が前がん性状態にあるか、あるいは健康であるかが判別できると報告されている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−４６０６５号公報
【特許文献２】特表平１１−５１１９８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来磁気ビーズなどの固体担体を用いての細胞回収では被験者により細胞回収率が低いという問題があった。
【０００７】
更に、大便から回収した細胞から分離したＤＮＡの量または、ＤＮＡ指数から結腸直腸がんを有するか判別する時、磁気ビーズなどの固体担体を用いて細胞を回収する細胞回収率が２０％〜１００％と大きなばらつきをもち正確な結腸直腸がん判定が行えないという問題があった。
【０００８】
そこで、本発明では、これらの問題に鑑み、細胞回収率が高くかつ被験者に影響されない大便を得るための投与剤と、細胞を回収する方法、及び大腸がん検出方法を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者等は、上記課題を解決すべく、細胞回収率が高くかつ被験者に影響されない大便を得るための投与剤、細胞を回収する方法、及び大腸がん検出方法を鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。本発明の大腸細胞回収用投与剤は整腸作用を有する成分を含む物質を含むことを特徴とすることを主な特徴とする。また、本発明の細胞回収方法は、大便採取を行う前に大腸細胞回収用投与剤を投与することを主な特徴とする。以下、本発明について具体的に説明する。
【００１０】
本発明の大腸細胞回収用投与剤は、整腸作用を有する成分を含む物質を含むことを特徴とする。整腸作用を有する成分を大便採取前に投与することにより細胞回収を阻害する成分の大便中の含有率を減少させることができるため、細胞回収率高く細胞回収を行うことができ、且つばらつきの少ない細胞回収を行うことができる。また、投与後４８時間投与剤の効果はより有効に発現する。
【００１１】
また、上記大腸細胞回収用投与剤において、大腸がん検査に用いることを特徴とする。細胞回収率高く、ばらつきが少なく細胞を回収出来るため擬陽性及び、擬陰性を抑制でき、大腸がん検査に好適に用いることができる。
【００１２】
さらに、上記大腸細胞回収用投与剤において、整腸作用を有する成分が食物繊維であることが好ましい。食物繊維は消化酵素では分解されないため大便とともに体外に排出されるため大便中の細胞回収を阻害する成分の含有率を減少させることができる。不溶性食物繊維であることがより好ましい。排便活動を促すことができる。
【００１３】
さらに、上記大腸細胞回収用投与剤において、食物繊維がペクチンであることがさらに好ましい。ペクチンは果物類に含まれており、多量に摂取することができる。アップルペクチンであることがより好ましい。他のペクチンに比べ細胞回収の阻害をする悪玉菌をより抑制することができる。
【００１４】
さらに、上記大腸細胞回収用投与剤において、整腸作用を有する成分を含む物質が果実類、サトウダイコン、ヒマワリ及び、その加工品であることが好ましい。整腸作用を有する成分を多く含み、整腸作用を有する成分を多量に経口投与できる。りんごであることがより好ましい。りんごは多量に経口投与しやすく、食物繊維をより多量に摂取することが可能である。また、りんごを５０ｇ以上経口投与することが好ましい。整腸作用を有する成分を多量に摂取できる。りんごを１００ｇ以上経口投与することがより好ましい。整腸作用を有する成分をより多量に摂取できる。
【００１５】
さらに、上記大腸細胞回収用投与剤において、投与回数が１回で効力を発することが好ましい。継続的もしくは、断続的に投与を行う投与剤に比較し、簡便に、容易に用いることができる。また、大腸がん検査などの検査に用いる時、投与回数が１回であり、継続的もしくは、断続的に投与を行うことと比較し検査コストを安価にすることができる。
【００１６】
本発明の大腸細胞回収方法は、上記細胞回収用投与剤を用いることを特徴とする。安定に高収率に細胞を回収できる。
【００１７】
また、上記細胞回収方法においては、回収対象とし大腸がん細胞であることが好ましい。大腸がん細胞は、正常な細胞に比べ大便中に多数存在すると考えられており、好適に用いることができる。
【００１８】
さらに、上記細胞回収方法において、細胞回収に個体担体を用いることが好ましい。容易に細胞を回収することができる。前記個体担体が磁気ビーズであることがより好ましい。磁石などが発生する磁界に応答し容易に回収することができる。
【００１９】
本発明の大腸がん検査方法は、上記細胞回収方法を用いることを特徴とする。
安定に高収率に細胞を回収でき、正確な大腸がん判定を行える。
【００２０】
本発明の大腸細胞回収用キットは、上記大腸細胞回収用投与剤と個体担体を含むことを特徴とする。大腸細胞回収用投与剤と個体担体を同時に用いることにより簡便に大腸細胞を回収することができる。また、さらに細胞回収に用いる試薬を含むキットが好ましい。より簡便に大腸細胞を回収することができる。
【００２１】
本発明の大腸がん検査キットは、上記大腸細胞回収用投与剤と個体担体を含むことを特徴とする。大腸細胞回収用投与剤と個体担体を同時に用いることにより簡便に大腸がん検査を行うことができる。また、さらに大腸がん検査に用いる試薬を含むキットが好ましい。より簡便に大腸がん検査を行うことができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、細胞回収率が高くかつ被験者に影響されされない大便を得るための投与剤と、細胞を回収する方法及びキット、個体差に影響されず正確な大腸がん検出する方法及びキットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（整腸作用を有する成分を含む物質を含む大腸細胞回収用投与剤）
本発明の大腸細胞回収用投与剤は、整腸作用を有する成分を含む物質を含む。大腸細胞回収用投与剤の形態は、固形、液体どちらでも構わない。
【００２４】
大腸細胞回収用投与剤は整腸作用を有する成分を大便採取前に投与し、整腸作用を有する成分を単独で投与してもよいが、他の成分と同時に投与してもよい。投与方法は、経口投与が望ましいが他の方法でも構わない。大腸細胞回収用投与剤の投与は、大便採取前に行い、投与回数は１回でよく被験者に負担を強いることなく大腸細胞の回収や、大腸がん検診を簡便に行うことができる。継続的もしくは断続的に大腸細胞回収用投与剤を投与することも出来ることは言うまでもない。
【００２５】
大腸細胞回収用投与剤は大便を採取する前４８時間以内に投与することが望ましい。大腸細胞回収用投与剤の投与は大便採取前３７時間以内が好ましく、より好ましくは大便採取を行う前日の夕食時に投与し、翌朝に大便を採取することが望ましい。
【００２６】
整腸作用を有する成分を含む物質を1ｇ以上投与することが望ましいが、およそ０．０１ｇ以上投与すれがよい。
【００２７】
整腸作用を有する成分を含む物質は食物繊維であることが望ましい。食物繊維は水溶性、不溶性のいずれでも用いることができる。また食物繊維の中でもペクチンは果物類に含まれており、多量に投与しやすく好ましい。また、アップルペクチンは他のペクチンに比べ細胞回収の阻害をすると考えられる悪玉菌をより抑制することができ好適に用いることができる。
【００２８】
整腸作用を有する成分を含む物質は果実類、サトウダイコン、ヒマワリなど及び、これらの加工品が望ましい。果実類とは一般的な果物類のことであり、例えば、「五訂増補日本食品標準成分表」に記載されている果実類などである。また、りんごは多量に経口投与しやすく、食物繊維を多く含むため望ましい。また、整腸作用を有する成分を含む物質として果物類、サトウダイコン、ヒマワリなどを経口投与する時は、１５０ｇ以上経口投与することが望ましいが、およそ２０ｇ以上経口投与すればよい。
【００２９】
（細胞回収）
本発明の細胞回収方法の標準的プロトコールである図１に示すように、大腸細胞回収用投与剤を投与する工程を有する。
【００３０】
細胞回収は大便をメディウムに懸濁させ、ろ過後に個体担体に吸着させることが望ましい。メディウムにはウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するとより安定に細胞を回収することができる。また個体担体には磁気ビーズを用いることが望ましく、磁石など磁界を発生する物質または装置により磁気ビーズに捕捉した細胞を回収することが望ましい。磁気ビーズは磁界に応答するものであればどのような構成の磁気ビーズでもかまわないが、大便を含む溶液は粘度が高いため、磁界応答性に富むＦｅ粒子を含有することが望ましい。さらに、耐食性を保障するためにはＴi、Ｓｉ、やその酸化物、窒化物、炭化物、及びカーボンのいずれかで被覆されている、もしくは前記物質のうち２種類以上で多層に被覆されていることがさら望ましい。また大便を冷凍後、大便表面を分取したのち細胞を回収しても構わない。
【００３１】
本発明の方法を用いることで大腸上皮細胞や、大腸上皮から剥離された細胞を回収することができる。細胞回収後の大腸がん検出などのためには対象とする細胞は大腸がん細胞であることが望ましいが、正常細胞の回収にも利用できることは言うまでもない。
【００３２】
本発明の方法で回収した細胞は大便に依存せず含有する細胞を高い収率かつ、細胞の回収率のばらつくが小さく回収できるため大腸がん検出、もしくは大腸がん判定に利用することが可能である。回収した細胞のＤＮＡやＲＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡ量もしくはＤＮＡ指数により、その被験者が結腸直腸がんを有するか、結腸直腸が前がん性状態にあるか、あるいは健康であるかが判別することや、遺伝子診断など様々な方法に利用できる。
【００３３】
整腸作用を有する成分を含む物質と個体担体とを大腸細胞回収用キットとし使用することが望ましい。また、前記キットにメディウムなど試薬類を含めることもできる。更に、大腸がん検出用のキットとして使用することも出来る。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明に係る実施例を詳細に説明する。ただし、これら実施例によって必ずしも本発明が限定されるわけではない。
【００３５】
本発明に用いられる実施例およびその比較例を以下に示す。なお、大便は健常者から採取し、全て同一の被験者より採取した。
（実施例１）
りんごを皮のついたまま２００ｇ経口投与し、１３時間後に大便を採取した。採取後の大便は室温で1時間、４℃で２時間保存後に用いた。前記採取した大便１ｇを５０ｍＬ遠沈管に分取して、１０％ＦＢＳ含有Ｌ−１５Ｍｅｄｉｕｍ（シグマ社）３０ｍＬを加え攪拌した。攪拌後、フィルタを用いて懸濁液をろ過した。ろ液に直腸ガン培養細胞株（ＨＴ−２９細胞）を１万細胞加えボルテックスで２秒間攪拌した。市販のＢｅｒ−Ｅｐ４抗体が固定された上皮系細胞回収用磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈ、ダイナル社）を８０μＬ加え、ミックスローターを用い３０分間室温で混和し、上皮系細胞回収用磁気ビーズにより大腸ガン細胞を捕捉させた。
【００３６】
前記遠沈管を磁気スタンド（ＭｕｌｔｉＳｅｐ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ、ポリサイエンス社）に設置して、シーソー型攪拌機を用い３０分間攪拌し、細胞を捕捉した磁気ビーズを磁気捕集し、上澄み液を除去した。１０％ＦＢＳ含有Ｌ−１５Ｍｅｄｉｕｍで洗浄後、遠沈管を磁気スタンドから外し１０００μＬ１０％ＦＢＳ含有Ｌ−１５Ｍｅｄｉｕｍに磁気ビーズを懸濁させ、１．５ｍＬエッペンチューブに前記磁気ビーズ懸濁液をうつした。１．５ｍＬエッペンチューブ用磁気スタンド（ＭＰＣ-Ｓ、ダイナル社）を用い上澄み液を除去し６００μＬのＰＢＳ（リン酸緩衝液）を加え懸濁した。
【００３７】
上記細胞を捕捉した磁気ビーズを懸濁させた溶液を細胞二重染色キット（Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ、同仁化学社）を用い染色を行い、プランクトン計算板（松浪ガラス社）を用い蛍光顕微鏡により観察し、生細胞数を数え回収された生細胞数を計算した。生細胞数を添加した細胞数（１００００細胞）で割り１００をかけることにより細胞回収率を求めた。その結果を表１及び図２に示す。
【００３８】
（実施例２）
りんごを皮のついたまま２００ｇ経口投与し、３７時間後に大便を採取した以外は実施例１と同様の方法で細胞回収を行った。その結果を表１に示す。
【００３９】
（実施例３）
細胞回収のために、鉄粒子にチタニア被覆を行い、更にシリカ被覆された磁性粒子にストレプトアビジン（和光純薬社）を添加し結合した磁気ビーズに、更にビオチン化されたＶＵ−１Ｄ９抗体（バイオメダ社）を結合した磁気ビーズを使用した以外は実施例１と同様の方法で細胞回収を行った。その結果を表１に示す。
【００４０】
（比較例１）
採取前３日間りんごを投与しなかった被験者から採取した大便を使用した以外は実施例１と同様の方法で細胞回収を行なった。その結果を表１及び図２に示す。
【００４１】
（比較例２）
採取前３日間りんごを投与しなかった被験者から採取した大便を使用した以外は実施例２と同様の方法で細胞回収を行なった。その結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
表１のＮｏ．１及びＮｏ．２は実験を行った期日の違いであり、３日間以上りんごを投与せずに採取した大便を比較例１もしくは比較例２に使用し、その日の夕食後にりんご２００ｇを投与し、翌朝採取した大便を実施例１もしくは実施例３に使用した。Ｎｏ．１については更に一日経過後に採取した大便を実施例２に使用した。なお、実験実施期日Ｎｏ．１とＮｏ．２の間に1月間期間をあけ、りんご投与の影響を取り除いた。
【００４４】
表１においてあきらかなように、比較例である採取前３日間にりんごを投与しなかった被験者から採取した大便では抗体、磁気ビーズに関わらず細胞回収率が６０％以下と低く、２４％と極端に低い細胞回収率を示すこともあった。そして、細胞回収率は２４％〜５８％と大便の採取期日の違い、つまり大便の違いにより細胞回収率に大きな影響が見られる。一方、実施例であるりんごを投与し１３時間後または３７時間後に採取した大便では抗体、磁気ビーズ、大便採取期日に関わらずいずれも６５％以上と高い細胞回収率を示し細胞回収率が増加している。また、細胞回収率は６５％〜８９％と細胞回収率のばらつきも減少しており、大便の違いによる細胞回収率への影響が小さくなっていることを示す。つまり、本発明の大腸細胞回収用投与剤が有効に作用していることが示され、また、本発明の細胞回収方法が大便中から細胞を回収する方法として有用であることが示された。
【００４５】
（実施例４）
りんごと磁気ビーズを同じ箱に梱包し、大腸がん検査用キットとした。
【００４６】
（実施例５）
りんごと磁気ビーズと１０％ＦＢＳ含有Ｌ−１５Ｍｅｄｉｕｍを同じ箱に梱包し、大腸がん検査用キットとした。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】整腸作用有する成分を含む物質を大便採取前に経口投与し、採取した大便から細胞を回収するプロトコールの概略を示すフローチャートである。
【図２】実施例１、比較例２の細胞回収率を比較したグラフである。
【図１】
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【図２】
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