(57)【要約】【課題】コーヒー酸誘導体を効率よく生産する方法を提供する。【解決手段】ムラサキ科植物の細胞を培養し培養物よりコーヒー酸誘導体を分離する。【効果】これまで報告されている植物や培養細胞において、微量化合物としてしか含まれていなかったコーヒー酸誘導体が飛躍的に大量に生産される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムラサキ科（Boraginaceae）に属し、コーヒー酸誘導体を生産する能力を有する植物の細胞または組織を培養して得られる培養物から、該コーヒー酸誘導体を分離することを特徴とするコーヒー酸誘導体の製造方法。
【請求項２】
ムラサキ科植物がLithospermum erythrorhizonである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コーヒー酸誘導体が、下記の一般式（１）
【化１】
2008092954.tif 000007
［式中Ｒは水素原子、又は炭素数１〜６のアルキル基を表す。］で示される化合物ある請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
コーヒー酸誘導体が、エピラブドシンである請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
光照射条件下で培養を行うことを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムラサキ科（Boraginaceae）に属し、コーヒー酸誘導体を生産する能力を有する植物の細胞または組織の培養物からのコーヒー酸誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コーヒー酸由来の化合物についての有用性については幾つかの報告がなされており、コーヒー酸のエステル、アミドを構造に含む化合物については局所適用に用いる脱色素用医薬または化粧用組成物としての利用、コーヒー酸の４量体であるリソスペルミン酸Ｂおよびその誘導体については血管拡張効果、抗エイズ作用、ラブドシンについてはＤＮＡトポイソメラーゼII阻害作用、活性酸素スカベンジャーとしての作用が知られている。
【０００３】
これら化合物の天然の植物体に含まれる含量は非常に低いものであり、その例としてはヘリオトープの葉部でリソスペルミン酸が１．０６％、リソスペルミン酸Ｂが０．３４％であり、根部でリソスペルミン酸が１．３９％、リソスペルミン酸Ｂが０．０４％、in vitro plantの葉部においてもリソスペルミン酸が０．５７％、リソスペルミン酸Ｂが０．４２％（いずれも乾燥重あたり）であることが報告されている（植物組織培養 (1996),13(1),73-74）。
【０００４】
また、コーヒー酸４量体リソスペルミン酸Ｂおよび２量体ロズマリン酸の植物組織培養法を利用した生産研究についてはシソ科（Lamiaceae）植物であるSalvia miltiorrhizaを材料とした研究がなされており、カルス培養ではリソスペルミン酸Ｂが０．１％およびロズマリン酸が１．２４％、カルスより再生した植物体の葉部ではリソスペルミン酸Bが６．０５％およびロズマリン酸が６．９６％であることが報告されている（J. Nat. Prod. (1994), 57(6), 817-823）。
【０００５】
これまで植物組織培養法を用いた有用物質生産検討は数多くの植物についてなされており、生産された有用物質は医薬品、色素などへの利用展開が検討されてきた。ムラサキ科植物においても古くからムラサキ（Lithospermum erythrorithon）培養細胞によるシコニン生産研究がなされており、細胞の生育に適したＭＧ−５培地とシコニン生産に適したＭ−９培地を組み合わせた二段培養法によりシコニンを高生産する技術が確立している（Fujita Y. et al, Plant Cell Rep., (1981), 1, 61-63）。しかし、ムラサキ科植物の培養細胞または組織を培養することでコーヒー酸誘導体の生産性が飛躍的に向上することは知られていなかった。
【非特許文献１】植物組織培養 (1996),13(1),73-74
【非特許文献２】J. Nat. Prod. (1994), 57(6), 817-823
【非特許文献３】Fujita Y. et al, Plant Cell Rep., (1981), 1, 61-63
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ムラサキ科（Boraginaceae）に属し、コーヒー酸誘導体を生産する能力を有する植物の細胞または組織を培養して得られる培養物から、該コーヒー酸誘導体を分離することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは英意研究を重ねた結果、ムラサキ科植物がコーヒー酸誘導体を生産することを見出し、本発明を成すに至った。
【０００８】
即ち、本発明はムラサキ科（Boraginaceae）に属し、コーヒー酸誘導体を生産する能力を有する植物の細胞または組織を培養して得られる培養物から、該コーヒー酸誘導体を分離することを特徴とするコーヒー酸誘導体の製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ムラサキ科（Boraginaceae）に属し、コーヒー酸誘導体を生産する能力を有する植物の細胞または組織を培養条件をコントロールして培養することにより、これまで報告されている植物種や培養細胞においては微量化合物としてしか含まれていなかったコーヒー酸誘導体の生産が飛躍的に促進されることから、興味深い薬理活性を有するコーヒー酸誘導体を効率よく生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において、コーヒー酸誘導体を生産に使用される植物としてはムラサキ科植物に属し、コーヒー酸誘導体を生産する植物であり、例えば、ムラサキ（Lithospermum erythrorhizon）、ホタルカズラ（Lithospermum zollingeri）、ミヤマホタルカズラ（Lithospermum diffusum）、イヌムラサキ（Lithospermum arvense L.）、ロヘンシソウ（Lithospermum ruderale）、テンザンシソウ（Lithospermum tschimganicum B. Fedtsch）、カシソウ（Arnebia guttata Bge.）、ナンシソウ（Arnebia euchroma (Royle) Johnst）、パミールカシソウ（Arnebia thomsonii Clarke）、シトウソウ（Arnebia saxatilis Benth. et Hook.）、テンシソウ（Onosma paniculatum Bur. et Franch）、チョウカテンシソウ（Onosmahookeri Clarke var. longiflorum Duthie）などをあげることができ、中でもムラサキが好ましい。
【００１１】
本発明におけるコーヒー酸誘導体としては下記の一般式（１）
【００１２】
【化１】
2008092954.tif 000002
【００１３】
［式中、Ｒは水素原子、又は炭素数１〜６のアルキル基を表す。]を有する化合物、または下記の式（化２）に示すエピラブドシン（epi-rabdosiin）である。
【００１４】
【化２】
2008092954.tif 000003
【００１５】
一般式１における炭素数１〜６のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等を挙げることができる。
【００１６】
一般式１に含まれる化合物の好適例としてはリソスペルミン酸Ｂ（ＬＡ−Ｂ）（化３）、リソスペルミン酸−２（ＬＡＢ−２）等を挙げることができる。
【００１７】
【化３】
2008092954.tif 000004
【００１８】
本発明で用いられる培地としては、次に示す（１）〜（１６）濃度条件のうち少なくとも１以上の条件を満たす培地であれば良い。
（１）  窒素源のうちアンモニウムイオンの割合が１０モル％以下、
（２）  銅イオン濃度が０．２μＭ以上、
（３）  サイトカイニン類の濃度：５μＭ以下、
（４）  イノシトール濃度：５０ｍｇ／ｌ以下、
（５）  チアミン濃度：０．０５ｍｇ／ｌ以下、
（６）  ピリドキシン濃度：０．２５ｍｇ／ｌ以下、
（７）  ニコチン酸濃度：０．５ｍｇ／ｌ以下、
（８）  アスコルビン酸濃度：１．０ｍｇ／ｌ以下、
（９）  グリシン濃度：１．０ｍｇ／ｌ以下、
（１０）  Ｌ−システイン濃度：５．０ｍｇ／ｌ以下、
（１１）  Ｌ−グルタミン濃度：５．０ｍｇ／ｌ以下、
（１２）  硫酸イオン濃度：０．１ｍＭ以下、
（１３）  マンガンイオン濃度：１０μＭ以下、
（１４）  モリブデンイオン濃度：０．００３μＭ以下、
（１５）  ヨウ素イオン濃度：２．０μＭ以下、
（１６）  流動パラフィンおよび／または油脂濃度：１０ｍｌ／ｌ以上。
その中でも、本発明で用いられる培地としては、Ｍ−９培地が特に好ましい。
【００１９】
ムラサキ科植物の培養細胞または組織を培養することにより得られる培養物からコーヒー酸誘導体を採取するための好ましい例としては、次の方法が挙げられる。尚、培養物とは培養を行う際の培養細胞、組織、培地を示す。
【００２０】
ムラサキ科植物の一部、例えば根、生長点、葉、茎、種子などから採取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたリンスマイヤー・スクーグ培地などの固体培地上に置床し、１０〜３５℃で１４〜６０日程度経過させて組織片の一部から、カルスを生成させる。このようにして得られたカルスを継代培養すると生育速度が漸次高まり安定化したカルスが得られる。ここで、安定化したカルスとは、培養中に目的外の器官分化が起こらない状態を保持する性質をもちカルスの生育速度が均質であるものをいう。
【００２１】
この安定化したカルスを増殖に適した液体培地、例えばリンスマイヤー・スクーグの液体培地に移して増殖させる。液体培地において更に生育速度が高められる。
【００２２】
本発明の培養のための温度としては、通常は約１０〜３５℃、特に２３〜２８℃が増殖速度が大きいので好適である。また、培養期間としては、７〜４２日間が好適である。
【００２３】
また、光照射条件下で培養を行うことにより、コーヒー酸誘導体の生産を抑制することなく、同時に生産されるシコニン系化合物の生産を抑制することが可能であり、光照射条件下での培養はコーヒー酸誘導体の分離精製を効率よく行うことに有利である。本発明の培養のための光照射培養における照度としては、通常は５００〜２００００ルクス、特に２０００〜１００００ルクスが好適である。
【００２４】
培養された細胞は、公知の方法で植物体に再分化させ、優良系統選抜などの育種用途に使用することができる。また、培養細胞および／または培地から目的とするコーヒー酸誘導体を有機溶媒による抽出等の方法によって分離することができる。
【００２５】
コーヒー酸誘導体の抽出に用いられる有機溶媒としては、コーヒー酸誘導体が溶解する有機溶媒であれば特に制限はなく、メチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、酢酸エチル、クロロホルム、アセトン、ヘキサンなどを挙げることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例、比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
リンスマイヤー・スクーグ（ＬＳ）の寒天固体培地に、前もって２％アンチホルミン溶液または７０％エタノール溶液等で滅菌処理したムラサキの子葉の組織片を置床し、２５℃、暗所にて静置培養してムラサキのカルスを得た。継代を繰り返すことにより、数多くのフラスコからｐ−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル安息香酸（ＰＨＢＯＧ）含量が高く維持されたＭ−１８ＴＯＭ株を取得した。また、継代の過程で細胞がシコニンを全く生産しないＣＯ株を取得した。次にＭ−１８ＴＯＭ株のカルス１ｇ（新鮮重）をＬＳの液体培地（ただし植物ホルモン類として１μＭインドール酢酸および１０μＭカイネチン、炭素源として３０ｇ／ｌシュークロースを含む）２０ｍｌ入りの三角フラスコに移し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅２５ｍｍ、１００ｒｐｍ）し、１４日毎に継代し、カルスの生育速度を速めた。液体培養による継代過程において試験的にＭ−９の液体培地で培養したところ、シコニンを生産する培養細胞の入ったフラスコと生産しない培養細胞が入ったフラスコがあり、生産する培養細胞をＭ−１８ＴＯＭ株、生産しない培養細胞をＷＭ１８株とした。
【００２７】
このようにして得られたＭ−１８ＴＯＭ株培養細胞を、Ｍ−９の液体培地で２０ｍｌ入りの三角フラスコに移し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅２５ｍｍ、１００ｒｐｍ）し、暗所下、２１日間培養した。得られた培養物を濾紙を用いて細胞と培地に分離した後、細胞１ｇ（新鮮重）に対して１０ｍｌのメタノールを加え、ソニケーターを用いて０℃、９０分間超音波処理することによりコーヒー酸誘導体の抽出を行った。得られた抽出液に対し、定量のための内部標準として１ｍｇ／ｍｌβ−ナフトール（ｎ−ブタノール溶液）を加え、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ｎ−ブタノール相を以下に示す条件により高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。また、培地２０ｍｌに対し、１ｍｇ／ｍｌβ−ナフトール（ｎ−ブタノール溶液）を加え、更に２０ｍｌのｎ−ブタノールを加えて１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ｎ−ブタノール相を以下に示す条件によりＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析結果のクロマトグラムを図２に、コーヒー酸誘導体を含むフェニルプロパノイドの含量を表１に示す。
【００２８】
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：Hikalisil C18 （４．６×２５０ｍｍ）
移動相：１％のアルコールを含むＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ（linear gradient condition）
流 量：１ｍｌ／ｍｉｎ．
オーブン温度：４０℃
検出波長：２５４ｎｍ
Gradient conditionは図１のとおり。
【００２９】
〔比較例１〕
実施例１に於いて、Ｍ−９の液体培地の代わりにＬＳの液体培地で培養した以外は該実施例と同様に操作した。その結果を図２および表１に示す。
【００３０】
〔実施例２〕
実施例１に於いて、Ｍ−１８ＴＯＭ株 の代わりにＣＯ株を用いたこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００３１】
〔比較例２〕
実施例２に於いて、Ｍ−９の液体培地の代わりにＬＳの液体培地で培養した以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００３２】
〔実施例３〕
実施例１に於いて、Ｍ−１８ＴＯＭ株 の代わりにＷＭ１８株を用いたこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００３３】
〔比較例３〕
実施例３に於いて、Ｍ−９の液体培地の代わりにＬＳの液体培地で培養した以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
2008092954.tif 000005
【００３５】
〔実施例４〕
インタクトのムラサキ植物の上、中、下部の葉、茎部、根部、側根部から実施例１に示した抽出方法によりコーヒー酸誘導体を含むフェニルプロパノイドの抽出を行い、更に該実施例に示したＨＰＬＣ条件により分析を行い、含量を求めた。その結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
2008092954.tif 000006
【００３７】
〔実施例５〕
実施例１に於いて、培養期間を０，２，４，７，１４，２１日と継時的に変化させた以外は該実施例と同様に操作した。その結果を図３に示す。
【００３８】
〔比較例４〕
実施例５に於いて、Ｍ−９の液体培地の代わりにＬＳの液体培地で培養した以外は該実施例と同様に操作した。その結果を図４に示す。
【００３９】
〔実施例６〕
ムラサキ培養細胞をＬＳの液体培地またはＭ−９の液体培地２０ｍｌ入りの三角フラスコに移し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅２５ｍｍ、１００ｒｐｍ）し、暗所下または光照射条件下で２１日間培養した。得られた培養物から実施例１に示した抽出方法によりコーヒー酸誘導体を含むフェニルプロパノイドの抽出を行い、更に該実施例に示したＨＰＬＣ条件により分析を行い、含量を求めた。その結果を図５に示す。
【００４０】
〔実施例７〕
実施例６に於いて、培養フラスコ内に３ｍｌ流動パラフィンを添加して培養した以外は該実施例と同様に操作した。その結果を図５に示す。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＨＰＬＣにおけるグラジエントコンディションを示すグラフである。
【図２】Ｍ−９培地で培養した細胞の抽出液をＨＰＬＣ分析したクロマトグラム（上部、実施例１）、またはＬＳ培地で培養した細胞の抽出液をＨＰＬＣ分析したクロマトグラム（下部、比較例１）を比較した図である。
【図３】Ｍ−９培地で培養した培養細胞の生育（白丸印）およびＰＨＢＯＧ含量（白三角印）およびコーヒー酸誘導体含量（エピラブドシン：黒丸印、リソスペルミン酸Ｂ−２：白四角印、ロズマリン酸：黒三角印、リソスペルミン酸Ｂ：黒四角印）の経時変化を示すグラフである。
【図４】ＬＳ培地で培養した培養細胞の生育（白丸印）およびＰＨＢＯＧ含量（白三角印）およびコーヒー酸誘導体含量（エピラブドシン：黒丸印、リソスペルミン酸Ｂ−２：白四角印、ロズマリン酸：黒三角印、リソスペルミン酸Ｂ：黒四角印）の経時変化を示すグラフである。
【図５】コーヒー酸誘導体生産に対する光の影響を示すグラフである。
【図１】
2008092954.tif 000008
【図２】
2008092954.tif 000009
【図３】
2008092954.tif 000010
【図４】
2008092954.tif 000011
【図５】
2008092954.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月28日(2007.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムラサキ科植物Lithospermum erythrorhizonの細胞をＭ−９培地で培養して得られる培養物から、リソスペルミン酸Ｂ又はエピラブドシンを分離することを特徴とするリソスペルミン酸Ｂ又はエピラブドシンの製造方法。
【請求項２】
光照射条件下で培養を行うことを特徴とする請求項１記載の方法。