(57)【要約】【課題】美白作用、皮膚老化の抑制、皮膚の炎症やアレルギー症状の予防などに好適に使用できる皮膚外用剤を提供する。【解決手段】ゴルドニア（Gordonia）属に属する微生物により菌体外に生産される培養物又はその処理物を含む皮膚外用剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴルドニア（Gordonia）属に属する微生物により菌体外に生産される培養物又はその処理物を含む皮膚外用剤。
【請求項２】
前記培養物又はその処理物が前記微生物により生産される複合脂質を含む請求項１記載の皮膚外用剤。
【請求項３】
前記複合脂質が中性糖及び脂肪酸を主な構成成分とする請求項２記載の皮膚外用剤。
【請求項４】
前記微生物がGordonia sp. JE1058（FERM BP-7406）である請求項１〜３のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
【請求項５】
前記培養物又はその処理物が細胞賦活作用、メラニン生産抑制作用、ヒアルロン酸合成促進作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用及びラジカル消去作用から選ばれる少なくとも１種の作用を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
【請求項６】
細胞賦活剤として用いられる請求項１〜５のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
【請求項７】
メラニン生産抑制剤として用いられる請求項１〜５のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
【請求項８】
ヒアルロン酸合成促進剤として用いられる請求項１〜５のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
【請求項９】
ヒアルロニダーゼ阻害剤として用いられる請求項１〜５のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
【請求項１０】
ラジカル消去剤として用いられる請求項１〜５のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料などの皮膚外用剤に関し、更には特定の微生物の培養物又はその処理物を含有することにより、美白作用、皮膚老化の抑制、皮膚の炎症やアレルギー症状の予防などに効果を有する皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚外用剤、特に化粧料の分野においては、顔などの皮膚を美しく装うという従来からの機能に加え、近年では、皮膚の老化、美白に代表される皮膚機能の維持・増進又は改善などの作用がより注目され、重要視されるようになって来ている。
【０００３】
また、化粧料はほぼ日常的に皮膚等に直接適用されることから、その原材料として天然物系の素材に対する一般消費者のニーズも高くなっている。
【０００４】
このような状況にあって、皮膚に対して様々な作用を有する天然物系素材の探索が盛んに行われており、例えばシソエキス、クワエキス、米発酵エキス、或いはシルク抽出物など種々の動植物抽出物が皮膚に対して有用な作用を有することが見出され、更にそれらの素材を配合した化粧料などの皮膚外用剤が提案されている。
【０００５】
しかしながら、天然物を原料として製造されるこれらの素材は、気候変動などにより生産量が影響を受けたり、大量に製造することが一般に困難であるなどの問題点も有している。
【０００６】
このため、近年のいわゆるバイオテクノロジーの進歩を利用して、各種の微生物を用いて化粧料などの皮膚外用剤の成分として有用な素材を製造する試みが行われている。例えば、スエヒロタケの菌子体培養物を含有する優れた美白作用と保湿作用を有する化粧料（特許文献１）、スフィンゴモナス属の微生物が生産するスフィンゴ糖脂質を配合した保湿効果と肌荒れ防止効果を有する皮膚外用剤（特許文献２）、クロラッパタケの菌糸体培養物などを用いる乾燥肌、肌荒れなどに有効な化粧料（特許文献３）などが知られている。
【０００７】
一方、ゴルドニア属の微生物については、Gordonia sp. JE1058（FERM BP-7406）等のゴルドニア属微生物により菌体外に生産される培養物の塩析処理物が界面活性剤としての作用を有し、海上流出油処理剤として有用であることが知られ（特許文献４）、また、Gordonia bronchialis sp.等のゴルドニア属微生物の全菌体を含む免疫モジュレーター組成物がワクチンとして有用であることが知られている（特許文献５）。
【０００８】
しかしながら、特許文献４及び５のいずれにもゴルドニア属微生物により菌体外に生産される培養物が皮膚外用剤として有用であること示唆する記載はない。
【０００９】
【特許文献１】特開平５−２８６８４３号公報
【特許文献２】特開平１１−４３４３７号公報
【特許文献３】特開２００５−８９３８９号公報
【特許文献４】特開２００２−２３９３６８号公報
【特許文献５】特表２００６−５０３０２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、美白作用、皮膚老化の抑制、皮膚の炎症やアレルギー症状の予防などに好適に使用できる皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、前記の目的を達成すべく鋭意検討した結果、ゴルドニア属に属する微生物により菌体外に生産される培養物又はその処理物が、美白作用、皮膚老化の抑制、皮膚の炎症やアレルギー症状の予防などに効果を有することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の発明を包含するものである。
［１］ゴルドニア（Gordonia）属に属する微生物により菌体外に生産される培養物又はその処理物を含む皮膚外用剤。
［２］前記培養物又はその処理物が前記微生物により生産される複合脂質を含む前記［１］に記載の皮膚外用剤。
［３］前記複合脂質が中性糖及び脂肪酸を主な構成成分とする前記［２］に記載の皮膚外用剤。
［４］前記微生物がGordonia sp. JE1058（FERM BP-7406）である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の皮膚外用剤。
［５］前記培養物又はその処理物が細胞賦活作用、メラニン生産抑制作用、ヒアルロン酸合成促進作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用及びラジカル消去作用から選ばれる少なくとも１種の作用を有する前記［１］〜［４］のいずれかに記載の皮膚外用剤。
［６］細胞賦活剤として用いられる前記［１］〜［５］のいずれかに記載の皮膚外用剤。
［７］メラニン生産抑制剤として用いられる前記［１］〜［５］のいずれかに記載の皮膚外用剤。
［８］ヒアルロン酸合成促進剤として用いられる前記［１］〜［５］のいずれかに記載の皮膚外用剤。
［９］ヒアルロニダーゼ阻害剤として用いられる前記［１］〜［５］のいずれかに記載の皮膚外用剤。
［１０］ラジカル消去剤として用いられる前記［１］〜［５］のいずれかに記載の皮膚外用剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の皮膚外用剤は、美白作用、皮膚老化の抑制作用並びに皮膚老化症状の予防及び改善作用、湿疹肌荒れ等の皮膚の炎症やアレルギー症状の予防などに好適に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の皮膚外用剤は、ゴルドニア属に属する微生物により菌体外に生産される培養物又はその処理物を含むものである。本発明に用いる微生物としては、ゴルドニア属に属する微生物で、中性糖及び脂肪酸を主な構成成分とする複合脂質を生産する能力を有するものであれば、特に制限はなく、例えば、Gordoniasp. JE1058 (FERM BP-7406)、Gordonia polyisoprenivorans（例えば、DSM 44266、DSM 44302、NCIMB 13616）が挙げられる。
【００１４】
Gordonia sp. JE1058 (FERM BP-7406)は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番１号つくばセンター中央第６）に寄託されている。Gordonia polyisoprenivorans DSM 44266及びGordonia polyisoprenivorans DSM 44302は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）に寄託されている。Gordonia polyisoprenivorans NCIMB 13616は、ＮＣＩＭＢ（National Collections of Industrial Food and Marine Bacteria (incorporating the NCFB), NCIMB Ltd.）に寄託されている。
【００１５】
本発明に用いる微生物は、ゴルドニア属に属する微生物を培養し、中性糖及び脂肪酸を主な構成成分とする複合脂質を生産する能力を有することを確認することにより容易に選択することができる。
【００１６】
本発明に用いる前記微生物により菌体外に生産される培養物又はその処理物は、前記微生物により生産される複合脂質（例えば、糖脂質類）を含むものが好ましく、更には中性糖及び脂肪酸を主な構成成分とする複合脂質（例えば、糖脂質類）を含むものが好ましい。
【００１７】
前記培養物又はその処理物としては、細胞賦活作用、メラニン生産抑制作用、ヒアルロン酸合成促進作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用及びラジカル消去作用から選ばれる少なくとも１種の作用を有するものが好ましく、これらの作用のすべてを有するものが更に好ましい。
【００１８】
本発明に用いる培養物は、ゴルドニア属に属する微生物を、例えばノルマルパラフィンを原料炭素源として含む培地で好気的に培養することにより生産することができる。
【００１９】
本発明においては、前記の微生物を変異誘発した変異株を用いて培養物又はその処理物を生産することもできる。変異誘発処理の方法は、突然変異を誘発するものであれば特に制限されない。例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネートなどの変異剤による化学的方法、紫外線照射、Ｘ線照射などの物理的方法、遺伝子組換え、トランスポゾンなどによる生物学的方法などを用いることができる。この変異誘発処理は１回でもよいし、また、この変異誘発処理により得られた変異体を更に変異誘発処理するというように２回以上の変異処理を行ってもよい。
【００２０】
培地としては、ゴルドニア属に属する微生物が生育可能なものであれば特に限定されない。原料炭素源としては、生産性の面から炭素数１０〜１８のノルマルパラフィン、オレフィンなどの鎖状炭化水素、炭素数１０〜１８の脂肪酸、炭素数１０〜１８の脂肪酸エステル、炭素数１０〜１８の脂肪酸からなる油脂などが好ましく、その中でノルマルパラフィンがより好ましい。そのようなノルマルパラフィンとしては、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン及びオクタデカンを例示できる。
【００２１】
その他の培地成分として、窒素源、無機塩など、通常微生物の培養に使用されるものを用いることができる。また必要により、各種エキス類、ビタミン類などを用いることもできる。
【００２２】
培養時のｐＨ、温度は、ゴルドニア属に属する微生物が生育し、後述する複合脂質（例えば、糖脂質類）を含有する培養物を生産する範囲であれば特に限定されないが、通常、ｐＨは５〜１０、温度は２０〜３５℃である。また、培養時間は、美白作用、皮膚老化の抑制作用、皮膚の炎症やアレルギー症状の予防などの作用を有する生産物の生産が最適となるように選定すればよく、特に限定されないが、通常は２〜１０日間好気的に培養を行う。
【００２３】
本発明においては、通常、前記のようにして得られた培養液から、例えば遠心分離やろ過などの公知の方法により微生物菌体を除去した後、上澄み液を限外ろ過により濃縮し、この濃縮液を例えば凍結乾燥や噴霧乾燥などの公知の方法で乾燥する。好ましくは、より純度を向上させるため、更にメタノール、酢酸エチル、イソプロパノールなど、前記微生物により生産される複合脂質（例えば、糖脂質類）を溶解する有機溶媒により抽出を行い、不溶物を除去した後に、溶媒を留去し乾燥したものを用いる。
【００２４】
また、前記のようにして得られた有機溶媒で抽出する前の乾燥物、前記において菌体を除去せず取得した乾燥物を、前記と同様にして、有機溶媒で抽出し、不溶物を除去後、溶媒留去して取得した乾燥物、又は培養液から微生物菌体を除去した液を用いることもできる。
【００２５】
必要であれば、前記の操作に加えて、例えばペンタン、ヘキサンなどの有機溶媒を用いて、培養液から持ち越した原料のノルマルパラフィンなどを除去する等の操作を行ってもよい。
【００２６】
本発明の培養物又はその処理物は、中性糖及び脂肪酸を主な構成成分として含む。これら中性糖及び脂肪酸の組成は、培養条件等により変化するが、通常、次のような組成を示す。
【００２７】
培養物の処理物（菌体除去後の乾燥物から、有機溶剤で抽出し回収した処理物）中の中性糖の含有量は、通常、２０〜６０重量％であり、構成糖としては、グルコースとガラクトースが主な成分として認められる。通常、グルコースを１０〜４５重量％、ガラクトースを３〜１５重量％の範囲で含んでいる。この他に、マンノースやラムノースを含む場合もある。なお、中性糖の含有量はオルシノール−硫酸法により、また中性糖の組成及び含有量は酸で加水分解した後にＨＰＬＣにより分析することにより、それぞれ容易に求めることができる。
【００２８】
培養物の処理物（菌体除去後の乾燥物から、有機溶剤で抽出し回収した処理物）中の脂肪酸の含有量は、通常、２０〜６０重量％である。脂肪酸の構成成分の種類や炭素数は、微生物を培養する際の原料炭素源の種類により異なるが、例えば、炭素数１４のノルマルパラフィンであるテトラデカンを原料炭素源として用いた場合、オクタン酸、デカン酸、３−ヒドロキシデカン酸及び３−ヒドロキシドデカン酸が主な構成脂肪酸として認められる。これら脂肪酸の含有量の一例を示せば、オクタン酸が２〜２０重量％、デカン酸が２〜２０重量％、３−ヒドロキシデカン酸が１〜１０重量％、３−ヒドロキシドデカン酸が１〜１０重量％である。なお、培養物の処理物中の脂肪酸の含有量は、培養物の処理物をアルカリ加水分解した水溶液をエーテルで抽出してエーテル可溶物を除去後、水溶液を酸性化した後、エーテルで抽出して抽出された脂肪酸の重量を測定することにより、また構成脂肪酸組成は前記のようにして酸性条件下エーテル抽出して得られた脂肪酸を常法によりメチルエステル化してガスクロマトグラフにより分析することにより、それぞれ容易に求めることができる。
【００２９】
本発明の培養物の処理物（菌体除去後の乾燥物から、有機溶剤で抽出し回収した処理物）はアルカリ加水分解により脂肪酸が遊離することや酸分解により糖が遊離すること、また赤外スペクトル（ＦＴ−ＩＲ）でエステル結合に特有の１７３５ｃｍ−１に吸収が認められることから、中性糖及び脂肪酸を主な構成成分とする複合脂質（例えば、糖脂質類）が主成分と推定できる。
【００３０】
更にこの複合脂質（例えば、糖脂質類）の主成分は、例えば、前記培養物の処理物を、薄層クロマトグラフにおいて固定相をシリカゲル、移動相をクロロホルム：メタノール：水（例えば、６０：３０：２）として展開したとき、原点より上に展開されるスポットとして確認することができる。
【００３１】
本発明の皮膚外用剤は、前記の培養物又はその処理物を、乾燥物として一般に０．００００１〜２０重量％、より好ましくは０．０００1〜１０重量％含有する。
【００３２】
本発明の培養物又はその処理物は、細胞賦活作用、メラニン生産抑制作用、ヒアルロン酸合成促進作用及び／又はヒアルロニダーゼ阻害作用が認められることに特徴を有する。このため、本発明の培養物又はその処理物を含有させた皮膚外用剤は、皮膚にしなやかさや滑らかさを与え、皮膚の老化によるしわ、シミ、たるみ、くすみなどを改善並びに予防し、皮膚の老化防止に有用である。また、皮膚のシミ、ソバカス等の発生を抑制し、皮膚の美白作用を奏する。更に、ヒアルロン酸の分解によって引き起こされる皮膚の水分保持能の低下、及び皮膚の弾力、張り、ツヤなどの低下、並びに湿疹、肌荒れ等の皮膚症状など、皮膚の老化防止並びに皮膚症状の改善及び予防にも有用である。
【００３３】
また、本発明の培養物又はその処理物は、ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl））ラジカル消去作用も認められる点にも、特徴を有している。
【００３４】
以上のことから、本発明の皮膚外用剤は、細胞賦活剤、メラニン生産抑制剤、ヒアルロン酸合成促進剤、ヒアルロニダーゼ阻害剤及び／又はラジカル消去剤として用いることができる。
【００３５】
なお、本発明の培養物又はその処理物が示すこれらの作用は、該培養物又はその処理物に含まれる前記の複合脂質（例えば、糖脂質類）に、主に基づいているものと考えられる。
【００３６】
本発明の皮膚外用剤の剤形としては、皮膚外用剤として通常許容されるものであれば特に限定されない。例えば、エアゾール剤、液剤、懸濁剤、乳剤、軟膏剤、ローション剤、リニメント剤、クリーム、ゾル、ゲル、スティック、ファンデーション、口紅、化粧液、パック、洗顔料、石鹸、シャンプー、リンス等、任意の形態とすることができる。
【００３７】
本発明の皮膚外用剤には、本発明の効果を損なわない範囲において、皮膚外用剤として通常許容される、公知の界面活性剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、アルコール類、シリコーン油、水溶性高分子、溶剤、色素、顔料、香料、抗酸化剤、保湿剤、ビタミン、ビタミン誘導体、動植物抽出物、無機塩類、ｐＨ調整剤、殺菌剤、紫外線吸収剤などの成分を、必要に応じて適宜配合することができる。
【００３８】
界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、高分子界面活性剤、シリコーン系界面活性剤、フッ素系界面活性剤などがあげられ、例えば、脂肪酸セッケン、アルキルエーテルカルボン酸塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩などのカルボン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、Ｎ−アシルメチルタウリン塩などのスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸塩、アルキルアリール硫酸塩、脂肪酸アルカノールアミド硫酸塩などの硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルアリールエーテルリン酸塩などのリン酸塩、脂肪酸アミドアミン塩、アルキルアミン塩などの脂肪族アミン塩及びその４級アンモニウム塩、ベンザルコニウム塩、ベンゼトニウム塩、ピリジニウム塩などの環式４級アンモニウム塩、エチレングリコールモノ脂肪酸エステル、グリセリンモノ脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン動植物油などの非イオン性界面活性剤などを例示できる。
【００３９】
油脂類、ロウ類、炭化水素類としては、例えば、オリーブ油、アボカド油、サフラワー油、パーシック油などの植物油、牛脂、ミンク油などの動物油、ホホバ油、ミツロウ、ラノリンなどのロウ類、流動パラフィン、パラフィン、流動イソパラフィン、イソパラフィン、ワセリン、スクワラン、スクワレンなどの炭化水素類が例示できる。
【００４０】
アルコール類としては、例えば、エタノール、２−プロパノール、ミリスチルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、グリセリン、ポリプロピレングリコールなどを例示できる。
【００４１】
水溶性高分子としては、カラギーナン、キサンタンガム、グアーガム、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリアクリル酸アミドなど、色素としては、赤色２号、赤色２０１号などのタール色素、ベニバナ色素、β−カロチン、クチナシ色素などの天然色素、顔料としてはベンガラ、酸化チタンなど、香料としては、ムスク、シベット、ローズオイルなど、抗酸化剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、没食子酸オクチル、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビルなど、保湿剤としては、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール、トレハロース、プルラン、カルボキシメチルデキストランなどの糖類、ヒアルロン酸ナトリウムなどのムコ糖類、グリシン、セリンなどのアミノ酸など、ビタミン及びビタミン誘導体としては、パントテン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、リン酸−アスコルビルマグネシウム、トコフェロール、酢酸トコフェロール、ユビデカノレンなど、動植物抽出物としては、キチン・キトサン、コラーゲン、プラセンタエキスなどの動物抽出物、シソエキス、クワエキス、米発酵エキスなどの植物抽出物、殺菌剤としては、トリクロロカルバニリド、レゾルシン、ソルビン酸、デヒドロ酢酸、ヘキサクロロフェンなど、紫外線吸収剤としては、パラアミノ安息香酸、４−ブチル−４’−メトキシベンゾイルメタンなど、をそれぞれ例示できる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例により説明する。
（分析方法）
以下において、中性糖及び脂肪酸の分析は次のようにして行った。
（１）中性糖の分析
中性糖の含有量は、オルシノール−硫酸法により分析を行った。また、中性糖組成の定性・定量分析は、サンプルを２Ｎトリフルオロ酢酸中、１００℃で６時間加水分解した後、減圧乾固し、乾固物を蒸留水に溶解後、ポストラベル蛍光検出法によるＨＰＬＣ分析により、各種中性糖の検量線から測定した。
カラム：TSK−gel Sugar AXG15cm×4.6mmI.D.、カラム温度：70℃
移動相：0.5Mホウ酸カリウム緩衝液（pH8.7）、流速：0.4ml/min
ポストカラム標識：1％アルギニン／3％ホウ酸、反応温度：150℃
検出波長：EX320nm、EM430nm
【００４３】
（２）脂肪酸の分析
脂肪酸の含有量は、次のようにして測定した。サンプルを１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中で加水分解した後、エーテルにて抽出し、エーテル抽出物を除去した。このエーテル抽出後の水層を塩酸にて酸性とし（ｐＨ２〜３）、再度エーテルにて抽出した。このエーテル層を、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、エーテルを蒸発除去し、残留物の重量を測定した。残留物の重量から、サンプル中の脂肪酸含有量を計算した。また、この残留物を更にジアゾメタンでメチル化後、ガスクロマトグラフィーで分析し脂肪酸組成を分析した。
【００４４】
［実施例１］
（培養物の処理物の調製）
Gordonia sp. JE1058株を用い、グルタミン酸１ナトリウム２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ｎ−テトラデカン１５容積％を含む培地５０ｍｌに一白金耳接種し、５００ｍｌ坂口フラスコ中、３０℃、１２０ｒｐｍの条件で２日間培養を行った。
次に、前記と同じ組成の培地２．５Ｌを５Ｌのジャーファーメンターに入れたものに、前記の培養液を接種し、通気条件下、温度３０℃、撹拌速度１０００ｒｐｍに制御し、７日間培養を行った。
【００４５】
培養終了後、培養液を水で２倍に希釈し、ｐＨ１０に調整後、遠心分離により菌体を除去した。更にｐＨを８に再調整し、限外ろ過により濃縮後、凍結乾燥した。この乾燥した粉体をヘキサンで洗浄し、減圧乾燥することにより乾燥物１０７ｇを得た。更に、この処理物５０ｇを５容量のメタノールに懸濁し、不溶物を遠心分離で除去後、メタノールを留去することにより培養物の処理物３５ｇを得た。
得られた培養物の処理物の分析結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
2008156295.tif 000002
【００４７】
［実施例２］
（細胞賦活作用）
正常ヒト繊維芽細胞を２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で９６穴マイクロプレートに播種した。２４時間１％ウシ血清含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養後、所定の濃度の試料を含有した１％ウシ血清含有ＤＭＥＭに交換した。更に４８時間培養後、０．４ｍｇ／ｍｌ臭化３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＴ）を含有する１％ウシ血清含有ＤＭＥＭに交換し、２時間培養した。細胞を洗浄後、２−プロパノールにて細胞内に生成したホルマザンを溶解し、マイクロプレートリーダーを用いて、５５０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度を測定し、両者の差を持って細胞内に生成したホルマザン量として評価した。ＭＴＴ還元量は試料を無添加培養細胞（コントロール）の吸光度を１００とした百分率、Ｉｎｄｅｘ（％）で示した。
【００４８】
結果を表２に示す。なお、５％ウシ血清含有ＤＭＥＭを用いた場合のＩｎｄｅｘ（％）は、１１８．０であった。
【００４９】
【表２】
2008156295.tif 000003
【００５０】
［実施例３］
（ヒアルロン酸合成促進作用）
正常ヒト繊維芽細胞のヒアルロン酸合成に対する作用を検討した。９６穴マイクロプレートを用い、正常ヒト繊維芽細胞を２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度となるように播種し、２４時間０．５％ウシ血清含有ＤＭＥＭで培養した後、所定濃度の試料を含有した０．５％ウシ血清含有ＤＭＥＭに交換した。更に４８時間培養した後、培養上清を回収して、培養上清中に分泌されたヒアルロン酸をＥＬＩＳＡにて定量した。
【００５１】
０．２ｍｇ／ｍｌヒアルロン酸溶液をＥＬＩＳＡプレートに添加し、３７℃にて１時間コーティングした。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を用いて３７℃にて１時間ブロッキングした。次にプロテオグリカンモノマー含有１％ＢＳＡ溶液、及びリン酸緩衝液（ＰＢＳ）にて１０倍希釈した培養上清を一晩静置した。その後、一次抗体（抗ケラタン硫酸（マウス））を３７℃にて１時間反応させ、更に二次抗体（ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ１）を３７℃にて１時間反応後、０．１ｍｇ／ｍｌ２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム（ＡＢＴＳＴＭ）含有リン酸−クエン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．０）を加えた。１０分後、マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。培養上清中のヒアルロン酸量は、同じマイクロプレートで測定した検量線から算出した。単位蛋白量あたりのヒアルロン酸量を算出し、これをヒアルロン酸産生量とした。結果を表３に示す。何れの濃度においても、ヒアルロン酸合成促進作用が認められた。
【００５２】
【表３】
2008156295.tif 000004
【００５３】
［実施例４］
（メラニン生産抑制試験）
３次元皮膚モデルを用いてメラニン生産抑制作用を評価した。
アジアドナー由来ＭＥＬ−３００皮膚モデル（販売元：倉敷紡績株式会社）を６穴プレートに移した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）にて試験期間中培養した。試料の添加方法は、実際の皮膚への塗布を想定し、角質層側に直接添加する方法を採用した。２週間継続培養後、アルカリ可溶化法によるメラニンの定量を行った。結果を表４に示す。何れも、メラニン生産抑制作用が認められた。陽性対象として、０．５％コウジ酸を用いた場合のメラニン含有量は、１３．９μｇであった。
【００５４】
【表４】
2008156295.tif 000005
【００５５】
［実施例５］
（ヒアルロニダーゼ阻害作用）
１．５ｍｌのチューブを用い、各種濃度の試料水溶液０．２ｍｌに４０００Ｕ／ｍｌのヒアルロニダーゼ溶液（０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４）０．１ｍｌを加え、次いで酵素活性化溶液として０．５ｍｇ／ｍｌのコンパウンド４８／８０溶液（０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４）０．２ｍｌを加えてよく撹拌して３７℃で２０分間加温した後、基質溶液として０．８ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸カリウム（０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４）を０．５ｍｌ加えてよく撹拌し３７℃で４０分反応させた。この後、０．４Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を０．２ｍｌ添加し氷冷後、０．８Ｍホウ酸水溶液（ｐＨ９．１）０．２ｍｌを加え、９５℃５分加熱して直ちに氷冷した。１５ｍｌのチューブに、ｐ−ＤＡＢ試薬６ｍｌと前記反応液１．３ｍｌを入れてよく撹拌し、３７℃で２０分間発色させ、５８５ｎｍの吸光度を測定した。測定した吸光度から、式（１）に示す計算式によりヒアルロニダーゼ活性阻害率を算出した。
【００５６】
【数１】
2008156295.tif 000006
【００５７】
サンプルの吸光度；供試試料、基質及びヒアルロニダーゼを添加して試験を行ったときの吸光度
コントロールの吸光度（対照溶液）；供試試料水溶液の代わりに水０．２ｍｌを用いて試験を行ったときの吸光度
サンプルブランクの吸光度（試験溶液ブランク）；ヒアルロニダーゼ溶液の代わりに緩衝液０．１ｍｌを用いて試験を行ったときの吸光度
コントロールブランクの吸光度（対照溶液ブランク）；供試試料水溶液の代わりに水０．２ｍｌ、ヒアルロニダーゼ溶液の代わりに緩衝液０．１ｍｌをそれぞれ用いて試験を行ったときの吸光度
その結果、前記培養物の処理物の５０％阻害濃度は９０ｍｇ／Ｌであり、ヒアルロニダーゼ阻害作用が認められた。なお、グリチルリチン酸二カリウム（濃度：３３ｍｇ／Ｌ）の阻害率は４２．４％であった。
【００５８】
［実施例６］
（ＤＰＰＨラジカル消去作用）
前記の調製操作により得られた培養物の処理物を用い、ラジカル消去作用を検討した。９６穴プレートを用い、終濃度０．２ｍＭの１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）及び所定濃度の試料溶液を、５０％エタノール／１００ｍＭトリス酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて等量混合し、常温にて１０分間インキュベーションした後の吸光度を測定した。試料未添加の場合の吸光度を１００とし、各試料を添加した場合の吸光度の相対値を表５に示す。なお、同様にして１００μＭのα−トコフェロールの吸光度の相対値は、６．８であった。表２の結果から、濃度依存的に有意な吸光度の低下が認められ、ＤＰＰＨラジカル消去作用が認められた。
【００５９】
【表５】
2008156295.tif 000007
【００６０】
以下に本発明の皮膚外用剤の処方例を示す。
［処方例１］
化粧水
＜組成＞                                        （重量％）
実施例１の培養物の処理物                          ０．０３
水酸化カリウム                                    ０．０３
モノオレイン酸ＰＯＥ（２０ＥＯ）ソルビタン        １．０
プロピレングリコール                            １０．０
エタノール                                      １５．０
防腐・殺菌剤                                      適量
色素                                              適量
香料                                              適量
精製水                                            残量
合計                                          １００．０
【００６１】
［処方例２］
クリーム
＜組成＞                                          （重量％）
実施例１の培養物の処理物                            ０．０３
ステアリン酸                                      １５．０
パルミチン酸イソプロピル                            １．０
モノステアリン酸ソルビタン                          ２．０
モノステアリン酸ポリオキシエチレン（20）ソルビタン  １．５
ソルビトール（７０％）                              ４．０
水酸化カリウム                                      適量
防腐剤                                              適量
香料                                                適量
精製水                                              残量
合計                                            １００．０
【００６２】
［処方例３］
乳液
＜組成＞                                          （重量％）
実施例１の培養物の処理物                            ０．０３
ステアリン酸                                        ０．５
セトステアリルアルコール                            ０．５
ラノリン                                            ０．８
トリイソオクタン酸グリセリン                        ４．０
アボカド油                                          ４．０
テトラオレイン酸ポリオキシエチレン（60）ソルビット  ０．５
ポリオキシエチレン（20）モノステアリン酸ソルビタン  ０．５
モノステアリン酸グリセリン                          ０．５
防腐・殺菌剤                                        適量
酸化防止剤                                          適量
１，３−ブチレングリコール                          ６．０
キサンタンガム（２％水溶液）                        ７．０
香料                                                適量
精製水                                              残量
合計                                            １００．０