(57)【要約】【課題】高い神経保護活性を有し、安全性に優れる新規な神経細胞保護剤の提供。【解決手段】ローズマリー抽出物を有効成分とする神経細胞保護剤を提供する。該神経細胞保護剤は、神経細胞に対する細胞突起伸長作用及びアセチルコリン放出促進作用を有し、加えて高い安全性を発揮し得るものである。さらに、該神経細胞保護剤を薬理学的に許容され得る添加剤と混成した医薬品組成物及び化粧料組成物、並びに食品原料と混成した食品を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ローズマリー抽出物を有効成分とする神経細胞保護剤。
【請求項２】
神経細胞に対する細胞突起伸長作用を有することを特徴とする請求項１記載の神経細胞保護剤。  
【請求項３】
神経細胞に対するアセチルコリン放出促進作用を有することを特徴とする請求項１または２記載の神経細胞保護剤。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の神経細胞保護剤と薬理学的に許容され得る添加剤とを含有する医薬品組成物。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一項に記載の神経細胞保護剤と薬理学的に許容され得る添加剤とを含有する化粧料組成物。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか一項に記載の神経細胞保護剤と食品原料とを含有する食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞保護剤に関する。より詳しくは、ローズマリーから抽出した神経細胞保護剤と、これを含有する医薬品組成物並びに食品などに関する。
【背景技術】
【０００２】
現代社会は数多くのストレスに満ちており、我々は、例えば、人間関係や満員電車での通勤、渋滞、暑さや寒さ、騒音といった社会、自然環境の全てから日々ストレスを受けている。
【０００３】
「ストレス」は、一般に、このような精神的・肉体的に負担となる刺激や状況をいうが、より広義には、生体が外部環境からの刺激に対して安定した状態（恒常性又はホメオスタシス）を維持しようとする反応、と定義することができる。これに対して、外部環境からの刺激を「ストレッサー」といい、緊張や心労といった精神的なものから、痛みや寒冷、感染といった物理的、化学的なものまでを広く含む。
【０００４】
生体はストレス状態になると、交感神経系を活性化して、副腎髄質からアドレナリンやノルアドレナリンを放出し、心拍及び血圧を上昇させてストレッサーに対する防御反応を示す。また、下垂体から副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）を放出し、副腎皮質からグルココルチコイド（副腎皮質ホルモン）を分泌して、全身の糖代謝や血流を増加させる。
【０００５】
このストレス状態に対して、我々は、音楽やスポーツ、マッサージ、アロマテラピー、入浴等、様々な方法によって、ストレスの軽減（リラックス）を図っている。特に、入浴は、副交感神経系を優位にすることで交感神経系の興奮を抑制し、高いリラックス効果を得られる方法として最も身近な方法である。
【０００６】
しかしながら、ストレス状態が長期にわたると、例えば、自律神経系が疲弊し、その機能低下を原因とするうつ病ないしうつ状態が引き起こされるように、神経機能に障害が現れることが知られている。このような長期のストレス状態によって引き起こされる神経機能の障害は、過剰に放出されたグルココルチコイドによって、神経細胞が代謝に異常をきたし、細胞内カルシウム濃度の異常や活性酸素の産生亢進を引き起こして死滅することが一因と考えられている。
【０００７】
このようなストレスによる神経細胞死は、特に脳内の神経細胞、さらには海馬領域の神経細胞で顕著とされている。脳神経の細胞死は、細胞が構築する神経ネットワークの破綻を招来し、例えば、情緒不安定や記憶機能の低下といった神経機能障害の要因となる他、様々な神経系疾患においてもその病態に関与していることが明らかとなっている。
【０００８】
例えば、代表的な神経変性疾患であるアルツハイマー病においては、小胞体ストレスと呼ばれるストレスの関与が想定されている。小胞体は、リボゾームで合成されたタンパク質の正常な折り畳み（フォールディング）、すなわち糖鎖修飾や立体構造を形成させる場である。このタンパク質のフォールディングに障害が生じ、折り畳みが不完全な蛋白質（unfoldedprotein）が小胞体に蓄積した状態が小胞体ストレスである。アルツハイマー病においては、この状態が長く持続することが、神経細胞死の引き金となっているものと考えられている。
【０００９】
また、心筋梗塞や脳卒中においては、虚血による低酸素状態がストレスとなって神経細胞死が引き起こされ、神経ネットワークの破綻、さらにはこれに続く運動神経機能障害や言語機能障害といった神経機能障害が引き起こされる。
【００１０】
このような細胞レベルにおける「ストレス」には、小胞体ストレス、低酸素ストレスの他、上述した活性酸素による酸化ストレス、栄養飢餓、熱ストレス等が含まれる。特に小胞体ストレス及び酸化ストレスは、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などの中枢神経変性疾患における神経細胞死に深く関与しているとされる。
【００１１】
以上に説明したような、ストレスを原因とする様々な神経機能障害、さらには神経細胞死を有効に防止し、うつ病や記憶機能低下、情緒不安定、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経系疾患を治療または予防するため、神経細胞保護機能を有する種々の薬剤が開発されている。
【００１２】
このような神経細胞保護機能を有する薬剤として、特許文献１には、塩酸ドネペジルを含有する中枢神経の神経細胞保護剤、並びに中枢神経系の神経細胞障害の予防剤及び／又は治療剤が開示されている。塩酸ドネペジルは、アセチルコリンを分解する酵素であるアセチルコリンエステラーゼを可逆的に阻害することにより脳内のアセチルコリンの量を増加させ、脳内コリン作動性神経系を賦活する物質である。この物質は、アルツハイマー病の治療薬として広く用いられている。
【００１３】
また、特許文献２には、フコキサンチンを有効成分として含有する神経細胞保護剤が開示されている。この神経細胞保護剤は、古来食材として利用されてきたわかめ等の褐藻類に含まれるフコキサンチンを有効成分とするため、高い安全性を有するものと考えられる。
【特許文献１】再表２００４−１１０４４４号公報
【特許文献２】特開２００１−３３５４８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述のように、神経機能障害及び神経系疾患の治療または予防を目的として、神経細胞保護剤の開発が盛んになされている状況に鑑み、本発明は、高い神経保護活性を有し、安全性に優れる新規な神経細胞保護剤を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、上記課題の解決のため、種々の天然物を探索し、シソ科植物に属する代表的な西洋ハーブであるローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆ  ｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の抽出物に神経細胞保護作用があることを見出し、本願発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は、ローズマリー抽出物を有効成分とする神経細胞保護剤を提供するものである。
【００１７】
この神経細胞保護剤は、神経細胞に対する細胞突起伸長作用及びアセチルコリン放出促進作用をも有する。
【００１８】
ローズマリー抽出物を有効成分とする神経細胞保護剤は、薬理学的に許容され得る添加剤と混成して医薬品組成物及び化粧料組成物を得ることができる。また、食品原料と混成して食品とすることも可能である。
【００１９】
これら医薬品組成物、化粧料組成物及び食品には、次のような有利性がある。
【００２０】
本発明に係る神経細胞保護剤は植物由来成分であるため、その医薬品組成物は長期にわたって連続的に適用できる可能性が高く、副作用も少ない可能性が高い。また、例えば、本発明に係る神経細胞保護剤を、健常者が化粧料、健康補助食品などとして長期間、連続的に適用することにより、アルツハイマー病等の神経系疾患の発症を予防できる可能性がある。また、既に神経系疾患を発症している場合にも、長期間、連続的に適用することにより、病状の進行を抑制できる可能性がある。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、高い神経機能保護活性を有する新規な神経細胞保護剤が提供される。また、該神経細胞保護剤は安全性に優れたものである可能性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
ローズマリーは、古来より西洋ハーブとして薬用、香料用、料理用など広範な用途に使用されてきた安全性の高い植物である。記憶力を改善する作用があるとされ、ローズマリー抽出成分の一つであるカルノシン酸には、神経細胞の維持に重要な役割を果たす神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）の産生を促進する効果があることが知られている。
【００２３】
本発明者は、ローズマリーからの抽出物が、神経細胞に対する細胞ストレスの抑制作用、細胞突起伸長作用及びアセチルコリン放出促進作用を有することを明らかにし、本発明に係る高い神経細胞保護作用を有する新規神経細胞保護剤を完成させた。
【００２４】
すなわち、本発明において神経保護作用とは、「神経細胞に対する細胞ストレスの抑制作用」、「細胞突起伸長作用」及び「アセチルコリン放出促進作用」からなる。以下にそれぞれについて説明する。
【００２５】
まず「細胞ストレスの抑制作用」とは、小胞体ストレス、酸化ストレス、低酸素ストレス、栄養飢餓、熱ストレス等の細胞ストレスを受けた細胞のストレス反応を抑制ないしは緩和する作用をいう。
【００２６】
細胞は、細胞ストレスを受けた場合、細胞内でストレスタンパクと総称されるタンパク質群を発現させる。一例として、熱ストレスに応答して発現誘導される「ヒートショックプロテイン（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：以下ＨＳＰという）がある。
【００２７】
ＨＳＰは、分子量数万から約１５万の一群のタンパク質を指し、分子量によりＨＳＰ４７（分子量  約４７０００）、ＨＳＰ７０（同  約７００００）などのファミリーに分類される。ＨＳＰは分子シャペロンと呼ばれる機能を有し、タンパク質のフォールディング、変性タンパク質のリフォールディング（再折り畳み）、細胞内小器官への輸送や分解を介助して、熱ストレスを受けた細胞内への異常タンパク質、変性タンパク質の蓄積を防止し、細胞内小器官の機能を保全する機能を果たす。従って、ＨＳＰの発現誘導は、細胞への熱ストレスの指標とみなすことができる。
【００２８】
細胞ストレスの抑制作用により、ストレスによる細胞死から神経細胞を保護することができ、神経細胞死による神経ネットワークの破綻を防止して、神経機能障害や神経変性疾患の発症を予防または治療することが可能と考えられる。
【００２９】
次に「細胞突起伸長作用」とは、神経細胞の可塑性を促進する作用ということができる。
【００３０】
神経細胞は互いに細胞突起を伸ばしあって神経ネットワークを構築している。細胞突起と細胞突起間の接合部をシナプスといい、神経細胞はシナプスにおいて神経伝達物質を介した情報の伝達を行っている。
【００３１】
神経細胞は、細胞突起を絶えず伸張させる（神経細胞の可塑性）ことにより、神経ネットワークを再構築し、情報の伝達を制御して、情動の発現や記憶といった神経機能を支配している。従って、神経突起の伸長を促進することができれば、神経細胞死によって破綻をきたした神経ネットワークの再構築を促進し、神経機能を改善、向上させることが可能となる。
【００３２】
また「アセチルコリン放出促進作用」とは、シナプスにおけるアセチルコリンの放出を促進する作用である。アセチルコリンは、グルタミン酸、アスパラギン酸、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、グリシン、セロトニン、ドーパミン、ノルアドレナリン等とならぶ神経伝達物質の１つである。アセチルコリンを放出する神経細胞は、コリン作動性神経と呼ばれ、中枢神経系では、前脳の基底部から大脳皮質や海馬への投射や、脳幹部の橋脚部並びに外背側被蓋部から大脳皮質への投射を担っている。また末梢神経系では、交感神経の１次神経、副交感神経の１次神経と２次神経、運動神経はいずれもその神経終末でアセチルコリンが分泌される。
【００３３】
アセチルコリンによる情報伝達は記憶学習の機能、運動神経、自律神経（交感及び副交感神経）機能に関わっており、アセチルコリンによる情報伝達に異常が生じると、これらの機能に障害が生じ、様々な疾病の原因となる。
【００３４】
例えば、シナプス間隙におけるアセチルコリン量の不足ないしは不均衡による疾患として、アルツハイマー病、痴呆、不安、自閉症、うつ病、ハンチントン病、パーキンソン病などがある。また、筋萎縮性側索硬化症は、アセチルコリンの神経細胞内への取り込み低下が原因となる。
【００３５】
このように、アセチルコリンの減少は神経機能の障害に直接関与することから、アセチルコリンの放出を促進する薬剤は、アルツハイマー病、痴呆、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症等の中枢神経機能低下の改善薬として用いられている。上述した塩酸ドネペジルは、脳内のアセチルコリンの量を増加させ、脳内コリン作動性神経系を賦活する物質であり、アルツハイマー病の治療薬として広く用いられている。また、アセチルコリンの放出促進する薬剤は、自律神経系での神経伝達障害を改善する薬剤としても用いることができ、交感神経系に対して副交感神経系を優位にすることでリラックス効果を得るための薬剤としても適用が可能である。
【００３６】
以下、その好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００３７】
本発明に係る神経細胞保護剤は、各種溶媒を用いてローズマリーの全草を抽出して得ることができる。ここで、ローズマリーの全草とは、葉、花、茎、根のいずれの部分も用いることができることを意味する。また、これらは生の状態で用いてもよく、あるいは乾燥物を用いてもよい。抽出溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、エーテル類、クロロホルム、及びジクロロメタンのような有機溶媒ならびに水を用いることができる。このうち、本発明においては、メタノール、エタノール、酢酸エチルまたはこれら溶媒と水との組合せが好ましく、毒性が低いという生体内における安全性を考慮すれば、エタノール、または水とエタノールとの混合溶媒がさらに好ましい。好適な抽出方法としては、乾燥したローズマリーの全草を、７０％エタノール中に１週間浸漬した後、孔径０．４５μｍのマイクロフィルターを用いて不溶物を除去することにより得ることができる。
【００３８】
本発明に係る神経細胞保護剤は、医薬品組成物や化粧料組成物、食品などの適切な形態に加工され得る。
【００３９】
医薬品組成物や化粧料組成物に加工される場合、神経細胞保護剤と薬理学的に許容され得る添加剤とが混合される。添加剤の例としては、界面活性剤、賦形剤、着色料、保存料、コーティング助剤ならびにこれらの組合せが挙げられる。これら添加剤は、通常の医薬品製造における添加剤であれば特に限定されず、より具体的な例としては、ラクトース、デキストリン、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ソルビトール、結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、香味料、甘味料及びこれらの組合せが挙げられる。また、油類、アルコール類、保湿剤、紫外線吸収、香料、抗酸化剤、顔料等、一般的な化粧料用原料をも含有させることができる。さらに、必要に応じて他の薬剤との合剤としてもよい。
【００４０】
神経細胞保護剤及び医薬品組成物は、経口投与または非経口投与のいずれに使用されてもよい。投与剤形も特に限定されず、日本薬局方に従って適切な剤形に製造される。具体的には、経口投与を目的とする場合は、カプセル剤、錠剤、粉剤、除放剤などの剤形に製造される。非経口投与を目的とする場合は、注射剤、輸液剤などの剤形に製造される。また、化粧料組成物は、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム、軟膏として、より詳細には、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、液状又はクリーム状又は軟膏型のファンデーション等の美白用メイクアップ化粧料、日焼け止めローション，日焼け止めクリーム等の日焼け止め化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション等の美白用身体用化粧料としても提供し得る。
【００４１】
食品に加工される場合、神経細胞保護剤と適切な食品原料とが混合される。この適切な食品原料は、一般に食品用材料として使用され得るものである。例としては、米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、昆布、ワカメ、テングサなどの粉類；水飴；乳糖；グルコース；果糖；スクロース；マンニトール；ならびにこれらの組合せが挙げられる。さらに、香辛料、着色料、甘味料、食用油、ビタミンなどを添加してもよい。これら適切な食品原料は単独または組合せて使用される。さらに、必要に応じて水を添加して所望の形状に加工してもよい。このようにして、保健機能食品（特定保健機能食品、栄養機能食品、飲料を含む）や、いわゆる健康食品（飲料を含む）、又は飼料を得ることができる。またこれらの食品は飼料として動物に給餌することも可能である。
【実施例１】
【００４２】
＜ローズマリーからのアセチルコリン放出促進剤の抽出＞
乾燥させたローズマリーの全草１００ｇを、７０％エタノール１０００ｍｌ中に常温で１週間浸漬した後、孔径０．４５μｍのマイクロフィルターを用いて不溶物を除去することにより、以下の実施例で用いる神経細胞保護剤（以下、ローズマリー抽出物とも表記する）を得た。このローズマリー抽出物をロータリーエバポレーターにより５０℃で減圧乾燥を行い、やや緑色がかった薄い褐色の粉末（以下、ローズマリー抽出乾燥物といも表記する）を得た。その収量は１．４％であった。
【実施例２】
【００４３】
＜ＰＣ１２細胞を用いた細胞ストレスの抑制作用の確認＞
ラット副腎髄質に由来するＰＣ１２細胞は、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）の処理により、神経突起状の細胞突起を伸長させ、神経細胞様の形態を示す細胞に分化することが知られている。この神経細胞様に分化した細胞は、伸長させた細胞突起でシナプス様の細胞間結合を形成し、さらに神経細胞に特異的な各種のマーカーを発現するため、モデルニューロン（神経様細胞）として種々の実験に用いられている。後述するアセチルコリネステラーゼ（ＡｃｈＥ）も、このようなＰＣ１２細胞の神経分化のマーカーとして知られている。
【００４４】
ＰＣ１２細胞を用い、本発明に係る神経細胞保護剤存在下及び非存在下において、熱ストレス負荷後のＨＳＰ４７遺伝子のプロモーター活性を測定した。上述した通り、ＨＳＰの発現誘導は、細胞への熱ストレスの指標とみなすことができるため、ＨＳＰ４７遺伝子プロモーターの活性化は細胞のストレス状態を意味する。
【００４５】
まず、ラットＨＳＰ４７遺伝子のプロモーター配列の下流に、ｌａｃＺ遺伝子配列をつないだ組み換え遺伝子を含むＤＮＡベクターを作製した。次に、このＤＮＡベクターを用いて、定法による形質転換（トランスフォーム）を行い、組み換え遺伝子を有するＰＣ１２細胞（以下、形質転換ＰＣ１２細胞という）を作製した。形質転換ＰＣ１２細胞に熱ストレスを負荷すると、ＨＳＰ４７遺伝子プロモーターの活性化により、ｌａｃＺ遺伝子及びその遺伝子産物であるβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、β−ガラクトシダーゼ活性は細胞のストレス状態の指標となる。
【００４６】
形質転換ＰＣ１２細胞を、５％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）中で３７ ℃、５％ＣＯ２下において培養し、ＮＧＦ（Ｓｉｇｍａ社）を処置して、神経様細胞に分化させた。この神経様細胞を４２℃で１．５時間培養して熱ストレスを負荷した後、実施例１で得た神経細胞保護剤を１００倍希釈または１０，０００倍希釈にて処置した（ＮＧＦ（＋）Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ群）。対照群には、神経細胞保護剤を溶解した溶媒のみを添加した神経様細胞（ＮＧＦ（＋）群）を用いた。さらに３７ ℃で３時間培養した後、リン酸バッファー（ＰＢＳ）にて細胞を洗浄し、細胞溶解液を回収して、β−ガラクトシダーゼの基質となる４−ＭＵＧを加え、蛍光強度を測定（励起波長３６５ｎｍ、発光波長４５０ｎｍ）してβ−ガラクトシダーゼの活性を測定した。
【００４７】
結果を図１に示す。β−ガラクトシダーゼ活性は、ＮＧＦ（＋）群における活性を１００％とした相対値で示した。
【００４８】
本発明に係る神経細胞保護剤を１０，０００倍希釈で処置した神経様細胞では、対照群に比べ、β−ガラクトシダーゼ活性が５０％程度に抑制された。β−ガラクトシダーゼ活性の抑制は、ＨＳＰ４７遺伝子プロモーターの活性の低下を意味し、神経様細胞の熱ストレスに対するストレス反応が緩和されたことを示している。なお、神経細胞保護剤を１００倍希釈で処置した神経様細胞では、対照群に対してストレス反応に有意な変化はみられなかった。
【００４９】
以上、実施例２の結果より、本発明に係る神経細胞保護剤は、適切な処置濃度において、神経細胞に対する細胞ストレス抑制作用を発揮することが示された。
【実施例３】
【００５０】
＜ＰＣ１２細胞を用いた細胞突起伸長作用の確認＞
ＰＣ１２細胞を、５％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）中で３７ ℃、５％ＣＯ２下において培養し、ＮＧＦ（Ｓｉｇｍａ社）を処置して、神経様細胞に分化させた。この際ＮＧＦ処置と同時に、実施例１で得た神経細胞保護剤を１，０００倍希釈で処置した（ＮＧＦ（＋）Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ群）。対照群には、ＮＧＦ処置のみを行った細胞（ＮＧＦ（＋）群）と、ＮＧＦと神経細胞保護剤を溶解した溶媒のみを添加した細胞（ＮＧＦ（−）群）を用いた。２４時間培養後、各実験群の細胞の形態を観察した。
【００５１】
結果を図２に示す。
【００５２】
ＮＧＦ（−）群では、神経様細胞への分化が誘導されないため、細胞形態に変化がなく、細胞は円形を保っている。これに対し、ＮＧＦ（＋）群では、細胞突起が伸長して紡錘形となり、神経細胞様の形態を示している。さらに、本発明に係る神経細胞保護剤の処置により、細胞突起の伸長はより顕著となった（ＮＧＦ（＋）Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ群参照）。
【００５３】
次に、発明に係る神経細胞保護剤のＥＲＫ1／２のリン酸化状態に与える影響について検討した。ＮＧＦ処理によるＰＣ１２細胞の細胞突起伸長には、ＭＡＰキナーゼカスケードが関与し、ＭＡＰキナーゼカスケードに属するＥＲＫ1／２のリン酸化が伴うことが知られている。
【００５４】
上記のＮＧＦ（＋）群及びＮＧＦ（−）群に加えて、本発明に係る神経細胞保護剤を単独で処置したＲｏｓｍａｒｉｎｕｓ群について、ＮＧＦ及び神経細胞保護剤（１，０００倍、３００倍、１００倍希釈）の処置８時間後の細胞から、定法によりタンパクを抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、メンブレンにブロットし、ＥＲＫ1／２及びリン酸化（ｐ−ＥＲＫ1／２）を認識する抗体（Ｓｉｇｍａ社）を用いてウェスタンブロットを行なった。
【００５５】
結果を図３に示す。
【００５６】
ＮＧＦ（＋）群、Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ群において、ｐ−ＥＲＫ1／２の顕著な増加が認められ、両群においてＭＡＰキナーゼカスケードの活性化が起きていることが確認された。また、Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ群におけるＥＲＫ1／２のリン酸化は、神経細胞保護剤の濃度依存的に増強された。
【００５７】
このことは、本発明に係る神経細胞保護剤が、単独でＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する作用を有していることを示している。さらに、本神経細胞保護剤は、このＭＡＰキナーゼカスケード活性化作用により、同カスケードの活性化を介して発現されるＮＧＦの細胞突起伸長作用を増強、促進するものと推定された。
【００５８】
以上、実施例３の結果より、本発明に係る神経細胞保護剤が、細胞突起伸長作用を有することが示された。
【実施例４】
【００５９】
＜ＰＣ１２細胞を用いたアセチルコリン放出促進作用の確認＞
実施例３のＮＧＦ（＋）Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ群、ＮＧＦ（＋）群、ＮＧＦ（−）群の各群の細胞において、アセチルコリンエステラーゼ活性の測定を行なった。アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）は、シナプスへ放出されるアセチルコリンの量が増加すると、活性化することが知られている。従って、アセチルコリンエステラーゼの活性上昇は、放出されたアセチルコリンの増加を意味する。アセチルコリンエステラーゼの活性上昇と放出されたアセチルコリンの増加との関係については、種々の文献（例えば、Ultrasound-induced enhancement of ACh, ADhE and GABA in fetal brain tissue of mouse. Suneetha,N., Kumar, RP, Ultrasound In Medicine & Biology. vol. 19:411-413 (1993)）に記載されている。
【００６０】
アセチルコリンエステラーゼ活性測定は以下の方法により行なった。5000 cells/wellのＰＣ１２細胞を９６穴プレートに播種し、上述の培養条件で２４時間培養した後、実施例１で得た神経細胞保護剤を〜倍希釈で処置した。さらに４８時間培養した後、ＮＧＦを処置し（ＮＧＦ（＋）Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ群）、２４時間培養の後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞溶解液を得た。対照群には、ＮＧＦ処置のみを行った細胞（ＮＧＦ（＋）群）と、ＮＧＦと神経細胞保護剤を溶解した溶媒のみを添加した細胞（ＮＧＦ（−）群）を用いた。細胞溶解液にＡｃｅｔｙｌｔｈｉｏｃｈｏｌｉｎｅ ｉｏｄｉｄｅ（５．６ ｍＭ）を２０μｌ、７−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−３(４`−ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌ−ｐｈｅｎｙｌ)−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ（０．４ｍＭ）を２０μｌ加え、蛍光強度を測定（励起波長３６５ｎｍ、発光波長４５０ｎｍ）してアセチルコリンエステラーゼの活性を測定した。結果を図４に示す。アセチルコリンエステラーゼ活性は、ＮＧＦ（＋）群における活性を１００％とした相対値で示した。
【００６１】
ＮＧＦ（＋）群に比して、ＮＧＦ（＋）Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ群におけるアセチルコリンエステラーゼ活性は１１８％となり、有意な上昇を示した。このことは、ＮＧＦ（＋）Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ群において、本発明に係る神経細胞保護剤の処理により、神経様細胞から放出されるアセチルコリンが有意に増加していることを示している。
【００６２】
従って、実施例４の結果より、本発明に係る神経細胞保護剤が、アセチルコリン放出促進作用を有することが示された。
【実施例５】
【００６３】
次に本発明の神経細胞保護剤を含む医薬品組成物の処方実施例を詳細に説明する。表１に示す配合組成にしたがって、ローズマリー抽出物を含有する医薬品組成物の一例として軟膏（処方実施例）を調製した。
【００６４】
【表１】
2008162927.tif 000002
【実施例６】
【００６５】
次に本発明の神経細胞保護剤を含む化粧料の処方実施例を詳細に説明する。表２に示す配合組成にしたがって、ローズマリー抽出物を含有する化粧水（処方実施例）を調製した。
【００６６】
【表２】
2008162927.tif 000003
また、表３に示す配合組成にしたがって、ローズマリー抽出物を含有する乳液（処方実施例）を調製した。
【００６７】
【表３】
2008162927.tif 000004
（注１）日本油脂株式会社製「Lipidure-PMB」
【実施例７】
【００６８】
次に本発明の神経細胞保護剤を含む食品の処方実施例を詳細に説明する。表４に示す配合組成にしたがって、ローズマリー抽出乾燥物を含有するチューンガム（処方実施例）を調製した。
【００６９】
【表４】
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また、表５及び６に示す配合組成にしたがって、それぞれローズマリー抽出乾燥物を含有するクッキー及び清涼飲料水（処方実施例）を調整した。
【００７０】
【表５】
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【００７１】
【表６】
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【実施例８】
【００７２】
次に本発明の神経細胞保護剤を含む浴用剤の処方実施例を詳細に説明する。表７に示す配合組成にしたがって、ローズマリー抽出物を含有する浴用剤（処方実施例）を調製した。
【００７３】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明に係るローズマリー抽出物を有効成分とする神経細胞保護剤は、うつ病や記憶機能低下、情緒不安定、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経系疾患を治療または予防するための医薬品組成物及び化粧料組成物、食品などとして好適に利用することが可能である。
【００７５】
また、これらの医薬品組成物及び化粧料組成物、食品は、交感神経系に対して副交感神経系を優位にし、リラックス効果を得るための利用も可能と考えられる。特に化粧料組成物については、植物抽出成分であるため、皮膚官能性に優れ、敏感肌に対しても広く適用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明に係る神経細胞保護剤の細胞ストレス抑制作用を説明する図である。
【図２】本発明に係る神経細胞保護剤の細胞突起伸長作用を説明する図である。
【図３】本発明に係る神経細胞保護剤によるＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を示す図である。
【図４】本発明に係る神経細胞保護剤のアセチルコリン放出促進作用を説明する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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