(57)【要約】【課題】従来の方法よりも速度および感受性が大いに増大した、核酸分子を配列決定するために利用し得る新規な組成物および方法を提供すること。【解決手段】核酸分子の配列を決定する方法であって、該方法が、以下の工程：  （ａ）選択された標的核酸分子に相補的なタグ化核酸フラグメントを生成する工程であって、ここでタグは、特定のヌクレオチドと相関し、そして非蛍光分光分析または電位差測定により検出可能である、工程；  （ｂ）該タグ化フラグメントを配列の長さにより分離する工程；  （ｃ）該タグを該タグ化フラグメントから切断する工程；および  （ｄ）非蛍光分光分析または電位差測定により該タグを検出し、それによって該核酸分子の配列を決定する工程を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載されるような、核酸分子の配列の決定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、核酸分子の配列を決定するための方法および組成物に関する。より詳細には、複数の核酸配列を同時に決定し得る方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列決定は、生物学の基礎技術の１つである。それは分子生物学の中心であり、そして残りの生物学において急速に拡張する役割を果たす。ヒトゲノムプロジェクトは、全ヒト遺伝コードを読むための多国家の運動である。それはかつて生物学において行われた最大のプロジェクトであり、そして医学において重大な影響力を有し始めている。より安くそしてより早い配列決定技術の開発は、このプロジェクトの成功を保証する。実際、実質的な運動は、ヒトゲノムプロジェクトのＮＩＨおよびＤＯＥ部門により資金援助されて配列決定技術が改良されている。しかし、現行法に実質的な影響はない（ＳｕｌｓｔｏｎおよびＷａｔｅｒｓｔｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：１７５，  １９９５）。
【０００３】
過去２０年において、核酸配列の決定および分析は、生物学調査の基本要素の１つを形成した。これは、新しい研究道具および方法論に加えて、これら遺伝子の機能をより理解するために、ならびに新しい治療および診断を開発するために、科学者が遺伝子および遺伝子産物を研究することを可能にする。
【０００４】
１９７７年に開発された２つの異なるＤＮＡ配列決定方法論は、未だ現在広範に使用されている。簡潔には、ジデオキシターミネーターを利用するＳａｎｇｅｒにより記載（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ７４：５４６３，  １９７７）された酵素法は、一本鎖テンプレートからのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の合成を含む。サンガーの配列決定方法は、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）が、通常のデオキシヌクレオチドと同様の様式で伸長する鎖中に組み込まれるという事実に依存する（より低い効率ではあるが）。しかし、ｄｄＮＴＰは、通常のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）とは、それらが鎖伸長に必要な３’−ＯＨ基を欠いている点で異なる。ｄｄＮＴＰがＤＮＡ鎖中に組み込まれる場合、３’ヒドロキシ基の欠如は、新しいホスホジエステル結合の形成を妨げ、そしてＤＮＡフラグメントがテンプレートＤＮＡの塩基に相補的なｄｄＮＴＰで終結される。マキサムギルバート法（ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ７４：５６０，  １９７７）は、元のＤＮＡの化学分解法を利用する（両方の場合において、ＤＮＡはクローニングされなければならない）。両方法は、特定の点から始まり、そして配列決定されるＤＮＡフラグメントにおいて見出される各塩基で終結するフラグメントの集団を生成する。各フラグメントの終結は、元のＤＮＡフラグメント内の特定の塩基の位置に依存する。ＤＮＡフラグメントはポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離され、そしてＤＮＡ塩基（アデニン、シトシン、チミン、グアニン；それぞれ、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇとしても知られる）の順序がゲルのオートラジオグラフから読まれる。
【０００５】
扱いにくいＤＮＡをプールする配列決定ストラテジー（ＣｈｕｒｃｈおよびＫｉｅｆｆｅｒ−Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４：１８５，  １９８８）が、ＤＮＡ配列決定のより最近のアプローチの１つである。プールする配列決定ストラテジーは、多くのＤＮＡテンプレートを（サンプル）をプールすることおよびプールとしてのサンプルを処理することからなる。処理の最後で配列情報を分けるために、目的のＤＮＡ分子は、セットのオリゴヌクレオチド「タグ」に最初に連結される。タグ化ＤＮＡ分子は、９６ウェルプレートにおいて、プールされ、増幅され、そして化学的に断片化される。プールされたサンプルの電気泳動後、ＤＮＡは固体支持体に移され、次いで一連の特定の標識されたオリゴヌクレオチドでハイブリダイズされる。次いで、これらの膜は、元のプール中に存在するタグと同じ数だけプローブされ、標準的なＤＮＡ配列決定法からのオートラジオグラフと同様のオートラジオグラフが各セットのプロービングにおいて生成する。従って、各反応およびゲルは、使用されるプローブの数だけ増加された通常の反応およびゲルから得られるデータと同じ量のデータを生じる。アルカリホスファターゼがレポーター酵素として使用される場合、１，２−ジオキセタン基質が使用され得る。これは化学ルミネセンスアッセイ形式で検出される。しかし、このプールするストラテジーの主な欠点は、配列が、配列決定ゲルをサザンブロットすることおよびこの膜をプール中の各クローンについて１回ハイブリダイズさせることによってのみ読まれ得ることである。
【０００６】
配列決定方法論の進歩に加えて、速度の進歩が自動ＤＮＡ配列決定装置の出現によりもたらされた。簡潔には、これらの方法は蛍光標識プライマーを使用する。これは放射性標識成分を利用する方法を置換する。蛍光色素は、配列決定プライマーまたはｄｄＮＴＰ−ターミネーターのいずれかに結合される。現在自動化成分は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を利用する。これは線状増幅ストラテジーの開発をもたらした。現在の商業的な配列決定法はすべて、４ジデオキシ−ターミネーター反応物を１つのレーンにおいて泳動させ得る。各ジデオキシ−ターミネーター反応物は独特の（ｕｎｉｑｕｅ）蛍光プライマーで表される（各塩基タイプ（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）について１つの発蛍光団）。１つのみのテンプレートＤＮＡ（すなわち、ＤＮＡサンプル）が１レーンあたりに示される。現在のゲルは、６４の異なるレーンにおいて６４サンプルまで同時に電気泳動し得る。異なるｄｄＮＴＰ終結フラグメントは、光によるゲルレーンの照射、続く発蛍光団からの発光の検出により検出される。各電気泳動工程は約４〜６時間長である。各電気泳動分離は、約４００〜６００ヌクレオチド（ｎｔ）を決定し、それゆえ、約６０００ｎｔが１時間、１配列決定装置あたり配列決定され得る。
【０００７】
核酸のモノマー組成の研究のための質量分析法の使用がまた記載されている（Ｈｉｇｎｉｔｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，  ＷａｌｌｅｒおよびＤｅｒｍｅｒ（編），  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  第１６章，  ５２７頁，  １９７２）。簡潔には、より長いオリゴマーについて、有意に早い成功を、１４塩基長までの保護合成オリゴヌクレオチドおよび４塩基長までの未保護オリゴのプラズマ脱着により得た。タンパク質について、ＥＳＩ−ＭＳのオリゴヌクレオチドへの適用性が示されている（Ｃｏｖｅｙら，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ．  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．  ２：２４９−２５６，  １９８８）。これらの種は、酸結合ホスホジエステル部分および／または末端リン酸部分に存在する電荷により溶液中でイオン化され、そしてナトリウム付加生成物に加えて、気相多価帯電分子アニオンを生じる。
【０００８】
１００塩基未満のＤＮＡを通常の酵素的ｄｄＮＴＰ技術により配列決定することは、より長いＤＮＡテンプレートについて行うことより複雑であるため、化学的分解がしばしば利用される。しかし、化学的分解法は、約５０ｐｍｏｌの放射性３２Ｐ末端標識物質、６つの化学的工程、電気泳動分離、およびフィルムへの露光を必要とする。小さなオリゴヌクレオチド（＜１４ｎｔ）については、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびフーリエ変換（ＦＴ）質量分析法（ＭＳ）の組み合わせが、はるかに速くかつより感受性である。高解析能（１０５）で測定される多価帯電イオンの解離産物は連続的な骨格開裂を表し、完全な配列を１分内にサブピコモル量のサンプルで提供する（Ｌｉｔｔｌｅら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１６：４８９３，  １９９４）。分子量測定について、ＥＳＩ／ＭＳがより長いフラグメントまで拡大されている（Ｐｏｔｉｅｒら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：３８９５，  １９９４）。ＥＳＩ／ＦＴＭＳは、従来の配列決定方法および１００マー程度のヌクレオチドの点変異のための有用な補足物であるようである。最近、３×１０−１３ｍｏｌの５０マーをローディングしたスペクトルデータが、より感受性のＥＳＩ供給源を使用して得られている（Ｖａｌａｓｋｏｖｉｃ，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６８：２５９，  １９９５）。
【０００９】
質量分析法によるＤＮＡ配列決定の他のアプローチは、ＤＮＡが個々のエレメントのアイソトープで標識され、そして質量分析が、様々なサイズのＤＮＡの混合物が電気泳動により分離された後でアイソトープを区別さえすればよいものである。（上記の他のアプローチは、異なる長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドの分離および検出の両方を行う質量分析器の解析能を利用する。どうみても困難な提案である）。下記の手順の全ては、配列決定プライマーを１つのヌクレオチドで長さが変化する一連のＤＮＡフラグメントに変換するためにサンガー手順を利用する。酵素的に合成したＤＮＡ分子のそれぞれは元のプライマー、目的のＤＮＡの一部の複製された配列、およびジデオキシターミネーターを含む。すなわち、セットのＤＮＡ分子が生成される。これはプライマーを含み、そして互いに１つのヌクレオチド残基だけ長さが異なる。
【００１０】
Ｂｒｅｎｎｅｎら（Ｂｉｏｌ．  Ｍａｓｓ．  Ｓｐｅｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  ２１９頁，  １９９０）は、キャピラリー電気泳動により分離されたＤＮＡフラグメントを検出可能にするＤＮＡ標識としての硫黄の４つの安定なアイソトープを使用する方法を記載した。ｄｄＮＴＰのαチオアナログを使用して、１つの硫黄アイソトープがＤＮＡフラグメントのそれぞれに組み込まれる。それゆえ、４つのタイプのＤＮＡフラグメント（ｄｄＴＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ終結）のそれぞれは、末端ヌクレオチドにより独特に（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）標識され得る；例えば、Ａで終わるフラグメントについては３２Ｓ、Ｇについては３３Ｓ、Ｃについては３４Ｓ、およびＴについては３６Ｓ、そして電気泳動カラムのために一緒に混合され、数ピコリットルの画分が改変インクジェットプリンターヘッドにより得られ、次いで、加熱炉における完全な燃焼に供される。このプロセスは、標識ＤＮＡのチオホスフェートをＳＯ２に酸化する。これは、四重極型または磁気セクター質量分析器における分析に供される。ＳＯ２質量単位表示は、Ａで終わるフラグメントについては６４、Ｇについては６５、Ｃについては６６、およびＴについては６８である。カラムから現れるＤＮＡフラグメントの解像度の維持は、十分に小さい画分を用いることに依存する。なぜなら質量分析器はキャピラリーゲルカラムに直接結合され、分析の速度は電気泳動の速度により決定されるからである。このプロセスは不幸にして高価であり、放射性ガスを遊離し、そして市販されていない。２つの他の基本的な制限もまた、このアプローチに影響を及ぼす：（ａ）質量６４、６５、６６、または６８（同重量の夾雑物）を有する他の成分は許容され得ない、および（ｂ）硫黄アイソトープの天然％量（３２Ｓは９５．０、３３Ｓは０．７５、３４Ｓは４．２、および３６Ｓは０．１１）は、感受性および費用を支配する。３２Ｓは９５％の天然量であるから、他のアイソトープは、夾雑する３２Ｓを排除するために、＞９９％まで濃縮されなければならない。＜１％量であるアイソトープは、９９％濃縮で得るために極めて高価である；たとえ３６Ｓを１００倍精製したとしても、それは３６Ｓを含む程度以上に３４Ｓを含む。
【００１１】
Ｇｉｌｂｅｒｔは、オリゴマー合成器、膜上のアレイ、ハイブリダイゼーションを検出する検出器、および中枢コンピューターを備える自動ＤＮＡ配列決定装置（ＥＰＡ，  ９２１０８６７８．２）を記載した。この合成器は、任意の予想される配列の複数のオリゴマーを合成しそして標識する。オリゴマーが使用されて膜上の固定されたＤＮＡをプローブする。検出器はハイブリダイゼーションパターンを同定し、次いでそのようなパターンを中枢コンピューターに送る。これは配列を構築し、次いでオリゴマーの合成の次のラウンドの配列を予測する。プロセスを反復することにより、ＤＮＡ配列は自動様式で得られ得る。
【００１２】
Ｂｒｅｎｎｅｎはオリゴマーの連結に基づく核酸の配列決定法を記載した（米国特許第５，４０３，７０８号）。核酸テンプレートにハイブリダイズされる連結産物を形成するための方法および組成物が記載される。プライマーがＤＮＡテンプレートにハイブリダイズされ、次いでランダム伸長オリゴヌクレオチドのプールがまた、リガーゼの存在下でプライムされたテンプレートにハイブリダイズされる。リガーゼ酵素は、ハイブリダイズしたオリゴマーをプライマーに共有結合的に連結する。改変により、Ｎヌクレオチドの間隔で区切られる、核酸テンプレート中の標的ヌクレオチド残基の第１のセットの１つ以上のメンバーのヌクレオチド配列が決定され得る。この方法において、標識された連結産物が形成される。ここで、連結産物中に組み込まれた標識の位置およびタイプが、標識ヌクレオチド残基が塩基対形成する、核酸テンプレート中のヌクレオチド残基に関する情報を提供する。
【００１３】
Ｋｏｓｔｅｒは、エキソヌクレアーゼによるＤＮＡの分解後に質量分析によってＤＮＡを配列決定する方法を記載した（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２９３８）。記載される方法は、ＤＮＡ配列が直接決定される点で簡単であった（サンガー反応は使用されない）。ＤＮＡが標準的なベクターにクローニングされ、５’末端が固定され、次いで鎖が３’末端でエキソヌクレアーゼにより連続的に分解され、そして酵素産物（ヌクレオチド）が質量分析により検出される。
【００１４】
Ｗｅｉｓｓらは、蛍光多重ＤＮＡ配列決定のための自動ハイブリダイゼーション／映像装置を記載した（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１９１８）。方法は、酵素結合プローブを、代表的なサンガー反応から生じるサイズ分離したＤＮＡフラグメントを含む膜にハイブリダイズさせる概念に基づく。
【００１５】
配列決定情報の要求は、現存する配列決定機（例えば、ＡＢＩ３７７およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＡＬＦ）により供給され得るものより大きい。現在の技術の主な制限のうちの１つは、現在のタグ化システムを使用して解決され得る少ない数のタグである。上記のＣｈｕｒｃｈのプールシステムはより多くのタグを使用するが、これらのタグの使用および検出は労力がかかる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、上記の方法より速度および感受性が大いに増大した、核酸分子を配列決定するために利用し得る新規な組成物および方法を開示し、そして他の関連する利点を提供する。
【００１７】
発明の要旨
簡潔に述べれば、本発明は、核酸分子の配列を決定するための方法、化合物、組成物、キット、およびシステムを提供する。本発明の１つの局面において、核酸分子の配列を決定するための方法が提供される。本方法は、以下の工程を包含する：（ａ）選択された標的核酸分子に相補的なタグ化核酸フラグメントを生成する工程、ここで、タグは特定のヌクレオチドと相関し、そして非蛍光分光分析または電位差測定により検出可能である；（ｂ）タグ化フラグメントを配列の長さにより分離する工程；（ｃ）タグをタグ化フラグメントから切断する工程；および（ｄ）非蛍光分光分析または電位差測定によりタグを検出し、そしてそれによって核酸分子の配列を決定する工程。好ましい実施態様において、タグは、質量分析、赤外分光分析、紫外線分析、または定電位電流測定（ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔｉｃ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）により検出される。
【００１８】
別の局面において、本発明は以下の式の化合物を提供する：
Ｔｍｓ−Ｌ−Ｘ
ここで、Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、炭素、少なくとも１つの水素およびフッ素、ならびに酸素、窒素、硫黄、リン、およびヨウ素から選択される任意の原子を含む；Ｌは、Ｔｍｓ−含有部分が化合物の残りの部分から切断されることを可能にする有機基であり、ここで、Ｔｍｓ−含有部分は、化合物が質量分析に供される場合、１つのイオン化された荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される官能基を含む；Ｘは、他の部分との結合に際して基の活性を活性化するかまたは阻害するかのいずれかである、ヒドロキシル、アミノ、チオール、カルボン酸、ハロアルキル、およびそれらの誘導体から選択される官能基であるか、あるいは核酸フラグメントの３’末端以外でＬに結合した核酸フラグメントである；ただし、化合物は、Ｘを介して固体支持体に結合されず、また２５０ダルトン未満の質量を有さない。
【００１９】
別の局面において、本発明は、式Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩを有する複数の化合物を含む組成物を提供する。ここで、Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、炭素、少なくとも１つの水素およびフッ素、ならびに酸素、窒素、硫黄、リン、およびヨウ素から選択される任意の原子を含む；Ｌは、Ｔｍｓ−含有部分が化合物の残りの部分から切断されることを可能にする有機基であり、ここで、Ｔｍｓ−含有部分は、化合物が質量分析に供される場合、１つのイオン化された荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される官能基を含む；ＭＯＩは、核酸フラグメントであり、ここで、Ｌは、ＭＯＩの３’末端以外の位置でＭＯＩに結合される；ならびに、ここで２つの化合物は、同じＴｍｓも同じＭＯＩも有さない。
【００２０】
別の局面において、本発明は、水および式Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩを有する化合物を含む組成物を提供する。ここで、Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、炭素、少なくとも１つの水素およびフッ素、ならびに酸素、窒素、硫黄、リン、およびヨウ素から選択される任意の原子を含む；Ｌは、Ｔｍｓ−含有部分が化合物の残りの部分から切断されることを可能にする有機基であり、ここで、Ｔｍｓ−含有部分は、化合物が質量分析に供される場合、１つのイオン化された荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される官能基を含む；ＭＯＩは、核酸フラグメントであり、ここで、Ｌは、ＭＯＩの３’末端以外の位置でＭＯＩに結合される。
【００２１】
別の局面において、本発明は、複数のセットの化合物を含む組成物を提供する。各セットの化合物は、式Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩを有する。ここで、Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、炭素、少なくとも１つの水素およびフッ素、ならびに酸素、窒素、硫黄、リン、およびヨウ素から選択される任意の原子を含む；Ｌは、Ｔｍｓ−含有部分が化合物の残りの部分から切断されることを可能にする有機基であり、ここで、Ｔｍｓ−含有部分は、化合物が質量分析に供される場合、１つのイオン化された荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される官能基を含む；ＭＯＩは、核酸フラグメントであり、ここで、Ｌは、ＭＯＩの３’末端以外の位置でＭＯＩに結合される；ここで、セット内において、全てのメンバーは同じＴｍｓ基を有し、そしてＭＯＩフラグメントは、ｄｄＡＭＰ、ｄｄＧＭＰ、ｄｄＣＭＰ、およびｄｄＴＭＰから選択される同じジデオキシヌクレオチドで終結する可変長を有する；ならびに、ここで、セット間において、Ｔｍｓ基は少なくとも２ａｍｕだけ異なる。
【００２２】
別の局面において、本発明は、前段落に記載される、第１の複数のセットの化合物を、式Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩを有する、第２の複数のセットの化合物と組み合わせて含む組成物を提供する。ここで、Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、炭素、少なくとも１つの水素およびフッ素、ならびに酸素、窒素、硫黄、リン、およびヨウ素から選択される任意の原子を含む；Ｌは、Ｔｍｓ−含有部分が化合物の残りの部分から切断されることを可能にする有機基であり、ここで、Ｔｍｓ−含有部分は、化合物が質量分析に供される場合、１つのイオン化された荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される官能基を含む；ＭＯＩは、核酸フラグメントであり、ここで、Ｌは、ＭＯＩの３’末端以外の位置でＭＯＩに結合される；ならびに、ここで、第２の複数内の全てのメンバーは、ｄｄＡＭＰ、ｄｄＧＭＰ、ｄｄＣＭＰ、およびｄｄＴＭＰから選択される同じジデオキシヌクレオチドで終結するＭＯＩ配列を有する；ただし、第１の複数の化合物に存在するジデオキシヌクレオチドは、第２の複数の化合物に存在するジデオキシヌクレオチドと同じではない。
【００２３】
別の局面において、本発明は、ＤＮＡ配列決定分析のためのキットを提供する。キットは、複数のコンテナセットを含む。各コンテナセットは、少なくとも５つのコンテナを含む。ここで、第１のコンテナはベクターを含み、第２、第３、第４および第５のコンテナは、式Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩを有する化合物を含む。ここで、Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、炭素、少なくとも１つの水素およびフッ素、ならびに酸素、窒素、硫黄、リン、およびヨウ素から選択される任意の原子を含む；Ｌは、Ｔｍｓ−含有部分が化合物の残りの部分から切断されることを可能にする有機基であり、ここで、Ｔｍｓ−含有部分は、化合物が質量分析に供される場合、１つのイオン化された荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される官能基を含む；ＭＯＩは、核酸フラグメントであり、ここで、Ｌは、ＭＯＩの３’末端以外の位置でＭＯＩに結合される；例えば、第２、第３、第４および第５のコンテナのＭＯＩは同一であり、そしてセットのコンテナ内のベクターの一部と相補的であり、そして各コンテナ内のＴｍｓ基はキット内の他のＴｍｓ基と異なる。
【００２４】
別の局面において、本発明は、核酸分子の配列を決定するためのシステムを提供する。本システムは、タグ化核酸フラグメントを分離する分離装置、タグ化核酸フラグメントから、特定のヌクレオチドと相関し、そして電気化学的な検出により検出可能であるタグを切断する装置、および定電位電流測定装置を備える。
【００２５】
本発明の他の実施態様において、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００を超える、異なりかつ独特（ｕｎｉｑｕｅ）のタグ化分子が、所定の同時の反応において利用され得る。ここで、各タグは、選択される核酸フラグメント、プローブ、または第１のもしくは第２のメンバーごとに独特（ｕｎｉｑｕｅ）であり、そして別々に同定され得る。
【００２６】
本発明はさらに、以下を提供する：
（項目１）  核酸分子の配列を決定する方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）選択された標的核酸分子に相補的なタグ化核酸フラグメントを生成する工程であって、ここでタグは、特定のヌクレオチドと相関し、そして非蛍光分光分析または電位差測定により検出可能である、工程；
（ｂ）該タグ化フラグメントを配列の長さにより分離する工程；
（ｃ）該タグを該タグ化フラグメントから切断する工程；および
（ｄ）非蛍光分光分析または電位差測定により該タグを検出し、それによって該核酸分子の配列を決定する工程
を含む、方法。
【００２７】
（項目２）  前記タグの検出が、質量分析、赤外分光分析、紫外分光分析、または定電位電流測定による、項目１に記載の方法。
【００２８】
（項目３）  前記タグ化フラグメントが、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、マイクロチャネル電気泳動、およびＨＰＬＣから選択される方法により、工程（ｂ）において分離される、項目１または２に記載の方法。
【００２９】
（項目４）  前記タグ化フラグメントが、酸化、還元、酸不安定化法、塩基不安定化法、酵素的方法、電気化学的方法、熱的方法、チオール交換法、および光不安定化法から選択される方法により、工程（ｃ）において切断される、項目１または２に記載の方法。
【００３０】
（項目５）  前記タグが、飛行時間型質量分析、四重極型質量分析、磁気セクター質量分析、または電気セクター質量分析により検出される、項目２に記載の方法。
【００３１】
（項目６）  前記タグが、電量測定検出器または電流測定検出器により検出される、項目２に記載の方法。
【００３２】
（項目７）  前記タグ化核酸フラグメントが、工程（ａ）において、５’末端から３’末端まで生成される、項目１または２に記載の方法。
【００３３】
（項目８）  工程（ａ）が、４個よりも多くの前記タグ化核酸フラグメントを生成し、各タグが核酸フラグメントごとに別々（ｕｎｉｑｕｅ）である、項目１または２に記載の方法。
【００３４】
（項目９）  工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）が、連続する様式で行われる、項目１または２に記載の方法。
【００３５】
（項目１０）  工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）が、システムにおいて連続する様式で行われる、項目１または２に記載の方法。
【００３６】
（項目１１）  前記工程のうちの１つ以上が自動化されている、項目１または２に記載の方法。
【００３７】
（項目１２）  前記タグ化フラグメントがオリゴヌクレオチドプライマーから生成され、該プライマーは該プライマーの３’末端以外でタグに結合されている、項目１または２に記載の方法。
【００３８】
（項目１３）  前記タグ化フラグメントが、タグ化ジデオキシヌクレオチドターミネーターから生成される、項目１または２に記載の方法。
【００３９】
（項目１４）  少なくとも１つのタグ化核酸フラグメントが、項目１５〜３３のうちのいずれか１項に記載の化合物である、項目１または２に記載の方法。
【００４０】
（項目１５）  式：
Ｔｍｓ−Ｌ−Ｘ
の化合物であって、
Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、該基は、炭素；水素およびフッ素のうちの少なくとも１つ；ならびに酸素、窒素、硫黄、リンおよびヨウ素から選択される必要に応じた原子を含有し；
Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を該化合物の残りから切断することを可能にする有機基であり、該Ｔｍｓ含有部分は、該化合物が質量分析に供された際に単一イオン化荷電状態を支持し、かつ三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される、官能基を含み：そして
Ｘは、他の部分とのカップリングに対する該基の活性を活性化もしくは阻害する、ヒドロキシル、アミノ、チオール、カルボン酸、ハロアルキル、およびそれらの誘導体から選択される官能基であるか、あるいはＸは、核酸フラグメントであり、該核酸フラグメントは該核酸フラグメントの３’末端以外でＬに結合しており；
ただし、該化合物は、Ｘを介して固体支持体に結合されず、２５０ダルトン未満の質量も有さない、
化合物。
【００４１】
（項目１６）  Ｔｍｓが、１５〜１０，０００ダルトンの質量、およびＣ１〜５００Ｎ０〜１００Ｏ０〜１００Ｓ０〜１０Ｐ０〜１０ＨαＦβＩδの分子式を有し、ここで、α、βおよびδの合計は、該Ｈ原子、Ｆ原子、Ｉ原子が満たさなければ満たされていない、該Ｃ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｐ原子およびＳ原子の原子価を満たすのに十分である、項目１５に記載の化合物。
【００４２】
（項目１７）  ＴｍｓおよびＬが官能基を介して互いに結合されており、該官能基が、アミド、エステル、エーテル、アミン、スルフィド、チオエステル、ジスルフィド、チオエーテル、ウレア、チオウレア、カルバメート、チオカルバメート、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、ホスホンアミド、スルホネート、スルホンアミドまたは炭素−炭素結合から選択される、項目１５に記載の化合物。
【００４３】
（項目１８）  前記官能基が、アミド、エステル、アミン、ウレアおよびカルバメートから選択される、項目１７に記載の化合物。
【００４４】
（項目１９）  Ｌが、Ｌｈυ、Ｌａｃｉｄ、Ｌｂａｓｅ、Ｌ［Ｏ］、Ｌ［Ｒ］、Ｌｅｎｚ、Ｌｅｌｃ、ＬΔ、およびＬｓｓから選択され、それぞれが、化学線、酸、塩基、酸化、還元、酵素、電気化学、熱、およびチオール交換により、前記Ｔｍｓ含有部分を前記分子の残りから切断させる、項目１５に記載の化合物。
【００４５】
（項目２０）  Ｌｈυが、式Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３を有し、ここで、Ｌ２は、化学線を吸収してＸからのＴｍｓの切断を促進する分子フラグメントであり、そしてＬ１およびＬ３は独立して、直接結合または有機部分であり、ここで、Ｌ１はＴｍｓからＬ２を分離し、Ｌ３はＬ２をＸから分離し、そしてＬ２が該化学線を吸収した場合にＬ１もＬ３も結合が切断されない、項目１９に記載の化合物。
【００４６】
（項目２１）  −Ｌ２−Ｌ３が以下の式：
【００４７】
【化１】
2008183012.tif 000002
を有する、項目２０に記載の化合物であって、
ａ、ｂ、ｃ、ｄまたはｅの位置の１個の炭素原子は、−Ｌ３−Ｘで置換されており、そして必要に応じて、ｂ、ｃ、ｄまたはｅのうちの１つ以上の位置は、アルキル、アルコキシ、フッ素、塩素、ヒドロキシル、カルボキシレート、またはアミドで置換されており、Ｒ１は、水素またはヒドロカルビルである、
化合物。
【００４８】
（項目２２）  Ｘが
【００４９】
【化２】
2008183012.tif 000003
であり、Ｒ２が、−ＯＨであるか、またはＲ２が、カルボン酸を別の部分とのカップリングに関して保護もしくは活性化する基である、項目２１に記載の化合物。
【００５０】
（項目２３）  Ｌ３が、直接結合、ヒドロカルビレン、−Ｏ−ヒドロカルビレン、およびヒドロカルビレン−（Ｏ−ヒドロカルビレン）ｎ−Ｈから選択され、そしてｎが、１〜１０の整数である、項目２０に記載の化合物。
【００５１】
（項目２４）  −Ｌ−Ｘが以下の式：
【００５２】
【化３】
2008183012.tif 000004
を有する、項目１５に記載の化合物であって、
ｂ、ｃ、ｄまたはｅのうちの１つ以上の位置は、水素、アルキル、アルコキシ、フッ素、塩素、ヒドロキシル、カルボキシレートまたはアミドで置換されており、Ｒ１は、水素またはヒドロカルビルである、
化合物。
【００５３】
（項目２５）  Ｔｍｓが以下の式：
Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−
を有する、項目１５に記載の化合物であって、
Ｔ２は、炭素と；水素、フッ素、ヨウ素、酸素、窒素、硫黄、およびリンのうちの１つ以上と；から形成される有機部分であり、該部分は、１５〜５００ダルトンの質量を有し；
Ｔ３は、炭素と；水素、フッ素、ヨウ素、酸素、窒素、硫黄、およびリンのうちの１つ以上と；から形成される有機部分であり、該部分は、５０〜１０００ダルトンの質量を有し；
Ｊは、直接結合または官能基であり、該官能基は、アミド、エステル、アミン、スルフィド、エーテル、チオエステル、ジスルフィド、チオエーテル、ウレア、チオウレア、カルバメート、チオカルバメート、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、ホスホンアミド、スルホネート、スルホンアミド、または炭素−炭素結合から選択され；そして
ｎは、１〜５０の整数であり、ｎが１より大きい場合、Ｔ３およびＪは各々独立して選択される、
化合物。
【００５４】
（項目２６）  項目２５に記載の化合物であって、Ｔ２が、ヒドロカルビル、ヒドロカルビル−Ｏ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−Ｓ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−ＮＨ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−アミド−ヒドロカルビレン、Ｎ−（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、Ｎ，Ｎ−ジ（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、ヒドロカルビルアシル−ヒドロカルビレン、ヘテロシクリルヒドロカルビル（ここで、ヘテロ原子（単数または複数）は、酸素、窒素、硫黄、およびリンから選択される）、置換ヘテロシクリルヒドロカルビル（ここで、ヘテロ原子（単数または複数）は、酸素、窒素、硫黄、およびリンから選択され、そして該置換基は、ヒドロカルビル、ヒドロカルビル−Ｏ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−ＮＨ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−Ｓ−ヒドロカルビレン、Ｎ−（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、Ｎ，Ｎ−ジ（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、およびヒドロカルビルアシル−ヒドロカルビレンから選択される）、ならびに上記のいずれかの誘導体（ここで、１個以上の水素が、等しい数のフッ素で置換されている）から選択される、化合物。
【００５５】
（項目２７）  項目２５に記載の化合物であって、Ｔ３が式−Ｇ（Ｒ２）−を有し、Ｇは１つのＲ２置換基を有するＣ１〜６アルキレンであり、そしてＲ２は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール縮合シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、アラルキル、アリール置換アルケニルまたはアリール置換アルキニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換シクロアルキル、ビアリール、アルコキシ、アルケノキシ、アルキノキシ、アラルコキシ、アリール置換アルケノキシまたはアリール置換アルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノまたはアルキニルアミノ、アリール置換アルキルアミノ、アリール置換アルケニルアミノまたはアリール置換アルキニルアミノ、アリールオキシ、アリールアミノ、Ｎ−アルキルウレア置換アルキル、Ｎ−アリールウレア置換アルキル、アルキルカルボニルアミノ置換アルキル、アミノカルボニル置換アルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリル置換アルキル、ヘテロシクリル置換アミノ、カルボキシアルキル置換アラルキル、オキソカルボシクリル縮合アリールおよびオキソカルボシクリル縮合ヘテロシクリルアルキル；シクロアルケニル、アリール置換アルキル、およびアリール置換アラルキル、ヒドロキシ置換アルキル、アルコキシ置換アルキル、アラルコキシ置換アルキル、アルコキシ置換アルキル、アラルコキシ置換アルキル、アミノ置換アルキル、（アリール置換アルキルオキシカルボニルアミノ）置換アルキル、チオール置換アルキル、アルキルスルホニル置換アルキル、（ヒドロキシ置換アルキルチオ）置換アルキル、チオアルコキシ置換アルキル、ヒドロカルビルアシルアミノ置換アルキル、ヘテロシクリルアシルアミノ置換アルキル、ヒドロカルビル置換ヘテロシクリルアシルアミノ置換アルキル、アルキルスルホニルアミノ置換アルキル、アリールスルホニルアミノ置換アルキル、モルホリノアルキル、チオモルホリノアルキル、モルホリノカルボニル置換アルキル、チオモルホリノカルボニル置換アルキル、Ｎ−（アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル）−またはＮ，Ｎ−［ジアルキル、ジアルケニル、ジアルキニルもしくは（アルキル、アルケニル）−アミノ］カルボニル置換アルキル、ヘテロシクリルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルキレンアミノカルボニル、ヘテロシクリルアミノカルボニル置換アルキル、ヘテロシクリルアルキレンアミノカルボニル置換アルキル、Ｎ，Ｎ−［ジアルキル］アルキレンアミノカルボニル、Ｎ，Ｎ−［ジアルキル］アルキレンアミノカルボニル置換アルキル、アルキル置換ヘテロシクリルカルボニル、アルキル置換ヘテロシクリルカルボニルアルキル、カルボキシル置換アルキル、ジアルキルアミノ置換アシルアミノアルキル、ならびにアミノ酸側鎖（アルギニン、アスパラギン、グルタミン、Ｓ−メチルシステイン、メチオニンならびに対応するそれらのスルホキシド誘導体およびスルホン誘導体、グリシン、ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、アラニン、オルニチン、ヒスチジン、グルタミン、バリン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、β−シ��ノアラニン、ならびにアロスレオニンから選択される）；アリーニル（ａｌｙｎｙｌ）およびヘテロシクリルカルボニル、アミノカルボニル、アミド、モノ−アルキルアミノカルボニルまたはジ−アルキルアミノカルボニル、モノ−アリールアミノカルボニルまたはジ−アリールアミノカルボニル、アルキルアリールアミノカルボニル、ジアリールアミノカルボニル、モノ−アシルアミノカルボニルまたはジ−アシルアミノカルボニル、芳香族アシルまたは脂肪族アシル、アルキル（これは、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、メルカプト、モノ−アルキルアミノまたはジ−アルキルアミノ、モノ−アリールアミノまたはジ−アリールアミノ、アルキルアリールアミノ、ジアリールアミノ、モノ−アシルアミノまたはジ−アシルアミノ、アルコキシ、アルケノキシ、アリールオキシ、チオアルコキシ、チオアルケノキシ、チオアルキノキシ、チオアリールオキシ、およびヘテロシクリルから選択される置換基で必要に応じて置換されている）から選択される、
化合物。
【００５６】
（項目２８）  以下の式：
【００５７】
【化４】
2008183012.tif 000005
を有する、項目２５に記載の化合物であって、
Ｇは、（ＣＨ２）１〜６であり、ここで、各ＧのＣＨ２基のうちのただ一つのＣＨ２基の水素は−（ＣＨ２）ｃ−アミド−Ｔ４で置換されており；
Ｔ２およびＴ４は、式Ｃ１〜２５Ｎ０〜９Ｏ０〜９Ｓ０〜３Ｐ０〜３ＨαＦβＩδの有機部分であり、ここで、α、βおよびδの合計は、該Ｈ原子、Ｆ原子、Ｉ原子が満たさなければ満たされない該Ｃ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子およびＰ原子の原子価を満たすのに十分であり；
アミドは、
【００５８】
【化５】
2008183012.tif 000006
であり；
Ｒ１は、水素またはＣ１〜１０アルキルであり；
ｃは、０〜４の整数であり；
Ｘは、項目１に従って定義され；
ｎは１〜５０の整数であり、ｎが１よりも大きい場合には、Ｇ、ｃ、アミド、Ｒ１およびＴ４は独立して選択される、
化合物。
【００５９】
（項目２９）  以下の式：
【００６０】
【化６】
2008183012.tif 000007
を有する、項目２８に記載の化合物であって、
Ｔ５は、式Ｃ１〜２５Ｎ０〜９Ｏ０〜９Ｓ０〜３Ｐ０〜３ＨαＦβＩδの有機部分であり、ここで、α、βおよびδの合計は、該Ｈ原子、Ｆ原子、Ｉ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子およびＰ原子の原子価を満たすのに十分であり；そしてＴ５は、三級アミンもしくは四級アミンまたは有機酸を含み；そしてｍは０〜４９の整数である、
化合物。
【００６１】
（項目３０）  以下の式：
【００６２】
【化７】
2008183012.tif 000008
を有する、項目２８に記載の化合物であって、
Ｔ５は、式Ｃ１〜２５Ｎ０〜９Ｏ０〜９Ｓ０〜３Ｐ０〜３ＨαＦβＩδの有機部分であり、ここで、α、βおよびδの合計は、該Ｈ原子、Ｆ原子、Ｉ原子が満たさなければ満たされない該Ｃ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子およびＰ原子の原子価を満たすのに十分であり；そしてＴ５は、三級アミンもしくは四級アミンまたは有機酸を含み；そしてｍは０〜４９の整数である、
化合物。
【００６３】
（項目３１）  −アミド−Ｔ５が
【００６４】
【化８】
2008183012.tif 000009
から選択される、項目２９および３０のうちのいずれか１項に記載の化合物。
【００６５】
（項目３２）  −アミド−Ｔ５が
【００６６】
【化９】
2008183012.tif 000010
から選択される、項目２９および３０のうちのいずれか１項に記載の化合物。
【００６７】
（項目３３）  項目２５〜２９のうちのいずれか１項に記載の化合物であって、
Ｔ２は、以下の有機酸：
ギ酸、酢酸、プロピオール酸、プロピオン酸、フルオロ酢酸、２−ブチン酸、シクロプロパンカルボン酸、酪酸、メトキシ酢酸、ジフルオロ酢酸、４−ペンチン酸、シクロブタンカルボン酸、３，３−ジメチルアクリル酸、吉草酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｎ−ホルミル−Ｇｌｙ−ＯＨ、エトキシ酢酸、（メチルチオ）酢酸、ピロール−２−カルボン酸、３−フル酸（ｆｕｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、イソキサゾール−５−カルボン酸、トランス−３−ヘキセン酸、トリフルオロ酢酸、ヘキサン酸、Ａｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−ヒドロキシ−２−メチル酪酸、安息香酸、ニコチン酸、２−ピラジンカルボン酸、１−メチル−２−ピロールカルボン酸、２−シクロペンテン−１−酢酸、シクロペンチル酢酸、（Ｓ）−（−）−２−ピロリドン−５−カルボン酸、Ｎ−メチル−Ｌ−プロリン、ヘプタン酸、Ａｃ−ｂ−Ａｌａ−ＯＨ、２−エチル−２−ヒドロキシ酪酸、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸、ｐ−トルイル酸、６−メチルニコチン酸、５−メチル−２−ピラジンカルボン酸、２，５−ジメチルピロール−３−カルボン酸、４−フルオロ安息香酸、３，５−ジメチルイソキサゾール−４−カルボン酸、３−シクロペンチルプロピオン酸、オクタン酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルスクシンアミド酸、フェニルプロピオール酸、ケイ皮酸、４−エチル安息香酸、ｐ−アニス酸、１，２，５−トリメチルピロール−３−カルボン酸、３−フルオロ−４−メチル安息香酸、Ａｃ−ＤＬ−プロパギルグリシン、３−（トリフルオロメチル）酪酸、１−ピペリジンプロピオン酸、Ｎ−アセチルプロリン、３，５−ジフルオロ安息香酸、Ａｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨ、インドール−２−カルボン酸、２−ベンゾフランカルボン酸、ベンゾトリアゾール−５−カルボン酸、４−ｎ−プロピル安息香酸、３−ジメチルアミノ安息香酸、４−エトキシ安息香酸、４−（メチルチオ）安息香酸、Ｎ−（２−フロイル）グリシン、２−（メチルチオ）ニコチン酸、３−フルオロ−４−メトキシ安息香酸、Ｔｆａ−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−ナフトエ酸、キナルジン酸、Ａｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、３−メチルインデン−２−カルボン酸、２−キノキサリンカルボン酸、１−メチルインドール−２−カルボン酸、２，３，６−トリフルオロ安息香酸、Ｎ−ホルミル−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ、２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］酢酸、４−ｎ−ブチル安息香酸、Ｎ−ベンゾイルグリシン、５−フルオロインドール−２−カルボン酸、４−ｎ−プロポキシ安息香酸、４−アセチル−３，５−ジメチル−２−ピロールカルボン酸、３，５−ジメトキシ安息香酸、２，６−ジメトキシニコチン酸、シクロヘキサンペンタン酸、２−ナフチル酢酸、４−（１Ｈ−ピロール−１−イル）安息香酸、インドール−３−プロピオン酸、ｍ−トリフルオロメチル安息香酸、５−メトキシインドール−２−カルボン酸、４−ペンチル安息香酸、Ｂｚ−ｂ−Ａｌａ−ＯＨ、４−ジエチルアミノ安息香酸、４−ｎ−ブトキシ安息香酸、３−メチル−５−ＣＦ３−イソオキサゾール−４−カルボン酸、（３，４−ジメトキシフェニル）酢酸、４−ビフェニルカルボン酸、ピバロイル−Ｐｒｏ−ＯＨ、オクタノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、（２−ナフトキシ）酢酸、インドール−３−酪酸、４−（トリフルオロ���チル）フェニル酢酸、５−メトキシインドール−３−酢酸、４−（トリフルオロメトキシ）安息香酸、Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−ペンチルオキシ安息香酸、Ｚ−Ｇｌｙ−ＯＨ、４−カルボキシ−Ｎ−（フル−２−イルメチル）ピロリジン−２−オン、３，４−ジエトキシ安息香酸、２，４−ジメチル−５−ＣＯ２Ｅｔ−ピロール−３−カルボン酸、Ｎ−（２−フルオロフェニル）スクシンアミド酸、３，４，５−トリメトキシ安息香酸、Ｎ−フェニルアントラニル酸、３−フェノキシ安息香酸、ノナノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−フェノキシピリジン−３−カルボン酸、２，５−ジメチル−１−フェニルピロール−３−カルボン酸、トランス−４−（トリフルオロメチル）ケイ皮酸、（５−メチル−２−フェニルオキサゾール−４−イル）酢酸、４−（２−シクロヘキセニルオキシ）安息香酸、５−メトキシ−２−メチルインドール−３−酢酸、トランス−４−コチニンカルボン酸、Ｂｚ−５−アミノ吉草酸、４−ヘキシルオキシ安息香酸、Ｎ−（３−メトキシフェニル）スクシンアミド酸、Ｚ−Ｓａｒ−ＯＨ、４−（３，４−ジメトキシフェニル）酪酸、Ａｃ−ｏ−フルオロ−ＤＬ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｎ−（４−フルオロフェニル）グルタミン酸、４’−エチル−４−ビフェニルカルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロアクリジンカルボン酸、３−フェノキシフェニル酢酸、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）スクシンアミド酸、Ｎ−デカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、（＋）−６−メトキシ−α−メチル−２−ナフタレン酢酸、３−（トリフルオロメトキシ）ケイ皮酸、Ｎ−ホルミル−ＤＬ−Ｔｒｐ−ＯＨ、（Ｒ）−（＋）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸、Ｂｚ−ＤＬ−Ｌｅｕ−ＯＨ、４−（トリフルオロメトキシ）フェノキシ酢酸、４−へプチルオキシ安息香酸、２，３，４−トリメトキシケイ皮酸、２，６−ジメトキシベンゾイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロピオン酸、２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェノキシ酢酸、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）グルタミン酸、Ｎ−ウンデカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−（４−フルオロベンゾイル）安息香酸、５−トリフルオロメトキシインドール−２−カルボン酸、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）ジグリコールアミド酸、Ａｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｔｆａ−Ｌ−フェニルグリシン−ＯＨ、３−ヨード安息香酸、３−（４−ｎ−ペンチルベンゾイル）プロピオン酸、２−フェニル−４−キノリンカルボン酸、４−オクチルオキシ安息香酸、Ｂｚ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ、３，４，５−トリエトキシ安息香酸、Ｎ−ラウロイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３，５−ビス（トリフルオロメチル）安息香酸、Ａｃ−５−メチル−ＤＬ−Ｔｒｐ−ＯＨ、２−ヨードフェニル酢酸、３−ヨード−４−メチル安息香酸、３−（４−ｎ−ヘキシルベンゾイル）プロピオン酸、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−ノニルオキシ安息香酸、４’−（トリフルオロメチル）−２−ビフェニルカルボン酸、Ｂｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｎ−トリデカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル酢酸、３−（４−ｎ−へプチルベンゾイル）プロピオン酸、Ｎ−ヘプタノイル−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−デシルオキ���安息香酸、Ｎ−（α，α，α−トリフルオロ−ｍ−トリル）アントラニル酸、ニフルム酸（Ｎｉｆｌｕｍｉｃ  ａｃｉｄ）、４−（２−ヒドロキシヘキサフルオロイソプロピル）安息香酸、Ｎ−ミリストイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３−（４−ｎ−オクチルベンゾイル）プロピオン酸、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−ウンデシルオキシ安息香酸、３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロピオニル−Ｇｌｙ−ＯＨ、８−ヨードナフトエ酸、Ｎ−ペンタデカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、４−ドデシルオキシ安息香酸、Ｎ−パルミトイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、およびＮ−ステアロイル−Ｇｌｙ−ＯＨ；
のうちの１つがアミン基と縮合した際にＴ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−を形成する構造を有する、
化合物。
【００６８】
（項目３４）  式：
Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩ
の化合物を複数含む、組成物であって、
Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、該基は、炭素；水素およびフッ素のうちの少なくとも１つ；ならびに酸素、窒素、硫黄、リンおよびヨウ素から選択される必要に応じた原子を含有し；
Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を該化合物の残りから切断することを可能にする有機基であり、該Ｔｍｓ含有部分は、該化合物が質量分析に供された際に単一イオン化荷電状態を支持し、かつ三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される、官能基を含み：そして
ＭＯＩは、核酸フラグメントであり、Ｌは、該ＭＯＩの３’末端以外の位置で該ＭＯＩに結合しており、
あらゆる２つの化合物が、同じＴｍｓも同じＸも有さない、
組成物。
【００６９】
（項目３５）  前記複数が２よりも大きい、項目３４に記載の組成物。
【００７０】
（項目３６）  前記複数が４よりも大きい、項目３４に記載の組成物。
【００７１】
（項目３７）  前記核酸フラグメントが、ベクターの一部と相補的な配列を有し、ここで該フラグメントがヌクレオチド合成を開始（ｐｒｉｍｅ）し得る、項目３４に記載の組成物。
【００７２】
（項目３８）  前記複数のメンバーのＴｍｓ基は少なくとも２ａｍｕだけ異なる、項目３４に記載の組成物。
【００７３】
（項目３９）  前記複数のメンバーのＴｍｓ基は少なくとも４ａｍｕだけ異なる、項目３４に記載の組成物。
【００７４】
（項目４０）  水と、式：
Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩ
の化合物とを含む、組成物であって、
Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、該基は、炭素；水素およびフッ素のうちの少なくとも１つ；ならびに酸素、窒素、硫黄、リンおよびヨウ素から選択される必要に応じた原子を含有し；
Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を該化合物の残りから切断することを可能にする有機基であり、該Ｔｍｓ含有部分は、該化合物が質量分析に供された際に単一イオン化荷電状態を支持し、かつ三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される、官能基を含み：そして
ＭＯＩは、核酸フラグメントであり、Ｌは、該ＭＯＩの３’末端以外の位置で該ＭＯＩに結合している、
組成物。
【００７５】
（項目４１）  約５から約９までのｐＨを有する緩衝液をさらに含む、項目４０に記載の組成物。
【００７６】
（項目４２）  酵素と、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰのうちの１つとをさらに含む、項目４０に記載の組成物。
【００７７】
（項目４３）  酵素と、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＴＴＰのうちの１つとをさらに含む、項目４０に記載の組成物。
【００７８】
（項目４４）  複数の化合物セットを含む組成物であって、各化合物セットは、式：
Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩ
の化合物を有し、
Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、該基は、炭素；水素およびフッ素のうちの少なくとも１つ；ならびに酸素、窒素、硫黄、リンおよびヨウ素から選択される必要に応じた原子を含有し；
Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を該化合物の残りから切断することを可能にする有機基であり、該Ｔｍｓ含有部分は、該化合物が質量分析に供された際に単一イオン化荷電状態を支持し、かつ三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される、官能基を含み：そして
ＭＯＩは、核酸フラグメントであり、Ｌは、該ＭＯＩの３’末端以外の位置で該ＭＯＩに結合しており、
ここでセット内において、全てのメンバーは同じＴｍｓ基を有し、そして該ＭＯＩフラグメントは、ｄｄＡＭＰ、ｄｄＧＭＰ、ｄｄＣＭＰおよびｄｄＴＭＰから選択される同じジデオキシヌクレオチドで終結する可変長を有し；
ここでセット間において、該Ｔｍｓ基は少なくとも２ａｍｕだけ異なる、
組成物。
【００７９】
（項目４５）  前記複数が少なくとも３である、項目４４に記載の組成物。
【００８０】
（項目４６）  前記複数が少なくとも５である、項目４４に記載の組成物。
【００８１】
（項目４７）  第１の項目４４に記載の複数の化合物セットと、第２の化合物セットとを含む、組成物であって、該第２の化合物セットの化合物は、式：
Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩ
を有し、
Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、該基は、炭素；水素およびフッ素のうちの少なくとも１つ；ならびに酸素、窒素、硫黄、リンおよびヨウ素から選択される必要に応じた原子を含有し；
Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を該化合物の残りから切断することを可能にする有機基であり、該Ｔｍｓ含有部分は、該化合物が質量分析に供された際に単一イオン化荷電状態を支持し、かつ三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される、官能基を含み：そして
ＭＯＩは、核酸フラグメントであり、Ｌは、該ＭＯＩの３’末端以外の位置で該ＭＯＩに結合しており、
該第２の複数内における全てのメンバーはＭＯＩ配列を有し、該ＭＯＩ配列は、ｄｄＡＭＰ、ｄｄＧＭＰ、ｄｄＣＭＰおよびｄｄＴＭＰから選択される同じジデオキシヌクレオチドで終結し、ただし、該第１の複数の化合物中に存在するジデオキシヌクレオチドは、該第２の複数の化合物中に存在するジデオキシヌクレオチドと同じではない、
組成物。
【００８２】
（項目４８）  ＤＮＡ配列決定分析のためのキットであって、該キットは複数のコンテナセットを含み、各コンテナセットは少なくとも５つのコンテナを含み、ここで第１のコンテナはベクターを含み、第２、第３、第４および第５のコンテナは、式：
Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩ
の化合物を含み、
Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、該基は、炭素；水素およびフッ素のうちの少なくとも１つ；ならびに酸素、窒素、硫黄、リンおよびヨウ素から選択される必要に応じた原子を含有し；
Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を該化合物の残りから切断することを可能にする有機基であり、該Ｔｍｓ含有部分は、該化合物が質量分析に供された際に単一イオン化荷電状態を支持し、かつ三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される、官能基を含み：そして
ＭＯＩは、核酸フラグメントであり、Ｌは、該ＭＯＩの３’末端以外の位置で該ＭＯＩに結合しており、その結果、
該第２、第３、第４および第５のコンテナについてのＭＯＩは、同一であり、かつ該ＭＯＩは、該コンテナセット内のベクターの一部と相補的であり、各コンテナ内のＴｍｓ基は該キット内の他のＴｍｓ基とは異なる、
キット。
【００８３】
（項目４９）  前記複数が少なくとも３である、項目４８に記載のキット。
【００８４】
（項目５０）  前記複数が少なくとも５である、項目４８に記載のキット。
【００８５】
（項目５１）  核酸分子の配列を決定するためのシステムであって、該システムは、
タグ化核酸フラグメントを分離する分離装置、
タグ化核酸フラグメントからタグを切断する装置であって、該タグは、特定のヌクレオチドと相関しかつ電気化学的な検出により検出可能である、装置、および
定電位電流測定のための装置
を含む、システム。
【００８６】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより明らかとなる。さらに、種々の文献が以下に記載される。これらは、特定の手順または組成物（例えば、プラスミド）をより詳細に記載し、そしてそれゆえそれら全体が参考として援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
発明の詳細な説明
簡潔に述べると、１つの局面において本発明は、目的の分子、またはその前駆体が不安定結合（単数または複数）を介してタグに連結されている化合物を提供する。従って、本発明の化合物は、一般式：
Ｔ−Ｌ−Ｘ
を有するとして概説され得る。ここで、Ｔはタグ成分であり、Ｌは不安定な結合であるか、または不安定な結合を含むかのいずれかの連結成分であり、そしてＸは目的の分子成分（ＭＯＩ）か、またはこれを介してＭＯＩがＴ−Ｌに結合し得る官能基成分（Ｌｈ）のいずれかである。従って、本発明の化合物は、より詳細な一般式：
Ｔ−Ｌ−ＭＯＩ  および  Ｔ−Ｌ−Ｌｈ
により表され得る。
【００８８】
以下に詳細に記載する理由として、Ｔ−Ｌ−ＭＯＩ化合物の組は、破壊されるべき不安定な結合（単数または複数）を生じる条件に目的をもって供され、従って、化合物の残りからのタグ部分を放出し得る。次いで、タグ部分は、１つ以上の分析技術により特徴付けられ、それによりタグ部分の構造に関する直接的情報、および（最も重要には）対応するＭＯＩのアイデンティティに関する間接的情報を提供する。
【００８９】
本発明の代表的化合物の単純な例示的な実施例（ここでＬは直接結合である）は、以下の構造（ｉ）が参照される：
【００９０】
【化１０】
2008183012.tif 000011
構造（ｉ）において、Ｔはカルボニル基に結合した窒素含有多環式芳香環部分であり、ＸはＭＯＩ（そして詳細にはアミン基において終結する核酸フラグメント）であり、ならびにＬは、アミド基を形成する結合である。アミド結合は、Ｔにおける結合に比較して不安定である。なぜなら、当該分野において理解されるように、アミド結合は、タグ成分中の結合は変化しないままの酸または塩基条件により化学的に切断（破壊）され得るからである。従って、タグ部分（すなわち、Ｔを含む切断産物）は、以下に示すように放出され得る：
【００９１】
【化１１】
2008183012.tif 000012
しかし、リンカーＬは、以下の例示的な実施例に示すように、直接結合ではあり得ず、以下に示す構造を有する本発明の別の代表的化合物が参照される：
【００９２】
【化１２】
2008183012.tif 000013
ο−ニトロベンジルアミン部分（構造（ｉｉ）中の四角で囲んだ原子を参照のこと）を有する化合物は、光分解的に不安定であり、このような化合物の特定波長の化学線照射への曝露は、ベンジルアミン結合（構造（ｉｉ）の太線で示した結合を参照のこと）の選択的切断を生じることは周知である。従って、構造（ｉｉ）は、構造（ｉ）と同じＴ基およびＭＯＩ基を有するが、リンカー基は複数の原子および結合を含み、この中には特定の不安定な結合が存在する。従って、構造（ｉｉ）の光分解は、以下に示すように、化合物の残りからタグ部分（Ｔを含む部分）を放出する。
【００９３】
【化１３】
2008183012.tif 000014
従って、本発明は、適切な切断条件への曝露に際して、切断反応を行いそれにより化合物の残りからタグ部分を放出する化合物を提供する。本発明の化合物は、タグ部分、ＭＯＩ（またはその前駆体、Ｌｈ）、および２つの基を一緒に結合する不安定結合（単数または複数）によって記載され得る。あるいは、本発明の化合物は、形成される成分によって記載され得る。従って、化合物は、以下のように、タグ反応体、リンカー反応体およびＭＯＩ反応体の反応産物として記載され得る。
【００９４】
タグ反応体は、化学ハンドル（Ｔｈ）および可変成分（Ｔｖｃ）をからなり、タグ反応体は一般構造：
Ｔｖｃ−Ｔｈ
を有するように理解される。
この命名法を例示するために、構造（ｉｉ）の化合物を調製するために用いられ得るタグ反応体を示す構造（ｉｉｉ）が参照され得る。構造（ｉｉｉ）を有するタグ反応体は、以下に示すように、タグ可変成分およびタグハンドルを含む：
【００９５】
【化１４】
2008183012.tif 000015
構造（ｉｉｉ）において、タグハンドル（−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ）は、Ｔ−Ｌ部分を形成するためにタグ反応体とリンカー反応体との反応のための接近手段を単純に提供する。構造（ｉｉｉ）における基「Ａ」は、カルボキシル基が化学的に活性な状態にあり、従って他のハンドルに結合し得ることを示す。「Ａ」は、例えば、種々の他の可能性の中でも、水酸基またはペンタフルオロフェノキシであり得る。本発明は、以下により詳細に議論するタグ可変成分に結合され得る多数の可能なタグハンドルを提供する。従って、タグ可変成分は、式Ｔ−Ｌ−Ｘにおける「Ｔ」の部分であり、そしてまたＬを切断する反応から形成されるタグ成分の部分であり得る。
【００９６】
以下にまた詳細に議論するように、タグ可変成分は、本発明による化合物の組の調製において、個々のメンバーが分析技術により別のメンバーから区別され得るように組のメンバーが独特（ｕｎｉｑｕｅ）の可変成分を有することが所望されるので、タグ可変成分と命名される。１つの例として、構造（ｉｉｉ）のタグ可変成分は、以下の組の１つのメンバーであり得る。ここで、組のメンバーは、そのＵＶまたは質量スペクトルにより区別され得る：
【００９７】
【化１５】
2008183012.tif 000016
同様に、リンカー反応体は、リンカー不安定成分に隣接するその化学ハンドル（これらは少なくとも２つ必要であり、その各々はＬｈとして示され得る）によって記載され得る。ここでリンカー不安定成分は、必要な不安定部分（Ｌ２）および任意の不安定部分（Ｌ１およびＬ３）を含み、ここで任意の不安定部分は、ハンドルＬｈからＬ２を分離するのに効果的に役立ち、そして必要な不安定部分は、リンカー不安定成分中で不安定結合を提供することに効果的に役立つ。従って、リンカー反応体は、一般式：
Ｌｈ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌｈ
を有するものとして理解され得る。
【００９８】
リンカー反応体を説明するために使用した命名法は、構造（ｉｖ）を考慮して例示され得、これは再度構造（ｉｉ）の化合物から得られる：
【００９９】
【化１６】
2008183012.tif 000017
構造（ｉｖ）が例示するように、原子は、ひとつより多くの機能的役割を果たし得る。従って、構造（ｉｖ）において、ベンジル窒素は、リンカー反応体をタグ反応体にアミド形成反応を介して結合させる化学ハンドルとして機能する。そして引き続いて、ベンジル炭素−窒素結合における光分解切断に特に感受性な不安定部分Ｌ２の構造の必要な部分としてもまた役立ち得る。構造（ｉｖ）はまた、リンカー反応体は、Ｌ１基を有さず、Ｌ３基（この場合、メチレン基）を有し得ることを例示する。同様に、リンカー反応体は、Ｌ３基ではなくＬ１基を有し得、またはＬ１基およびＬ３基を有し得、あるいはＬ１基およびＬ３基のどちらをも有し得ない。構造（ｉｖ）において、カルボニル基に隣接する基「Ｐ」の存在は、カルボニル基が反応から保護されていることを示す。この構造が与えられたことによって、タグ反応体（ｉｉｉ）の活性化されたカルボキシル基は、リンカー反応体（ｉｖ）のアミン基と完全に反応して、アミド結合を形成し、そして式Ｔ−Ｌ−Ｌｈの化合物を与える。
【０１００】
ＭＯＩ反応体は、目的の分子の適切に反応性形態である。目的の分子が核酸フラグメントである場合、適切なＭＯＩ反応体は、その５’水酸基を介してホスホジエステル基、次いでアミノ基で終結するアルキレン鎖に結合した核酸フラグメントである。次いで、このアミノ基は、それによりＭＯＩをリンカーに結合し得る。構造（ｉｖ）のカルボニル基と反応（もちろん、カルボニル基の脱保護の後、そして好ましくは引き続くカルボニル基のアミン基との反応の活性化の後）し得、それによりＭＯＩをリンカーに結合し得る。
【０１０１】
時系列で見た場合、本発明は、タグ反応体（化学タグハンドルおよびタグ可変成分を有する）、リンカー反応体（２つの化学的リンカーハンドルおよび必要な不安定部分および０〜２の任意の不安定部分を有する）、およびＭＯＩ反応体（目的成分の分子および目的ハンドルの化学的分子を有する）でＴ−Ｌ−ＭＯＩを形成するように理解される。従って、Ｔ−Ｌ−ＭＯＩを形成するために、タグ反応体およびリンカー反応体が一緒に反応して最初にＴ−Ｌ−Ｌｈを提供し、次いでＭＯＩ反応体はＴ−Ｌ−Ｌｈおよび反応してＴ−Ｌ−ＭＯＩを提供するか、または（より好ましくない）リンカー反応体およびＭＯＩ反応体が一緒に反応して最初にＬｈ−Ｌ−ＭＯＩを提供し、次いでＬｈ−Ｌ−ＭＯＩはタグ反応体と反応してＴ−Ｌ−ＭＯＩを提供するかのいずれかである。便宜の目的のために、式Ｔ−Ｌ−ＭＯＩを有する化合物は、このような化合物を形成するために使用され得るタグ反応体、リンカー反応体およびＭＯＩ反応体によって記載される。もちろん、式Ｔ−Ｌ−ＭＯＩの同じ化合物は、他の（代表的には、より面倒な）方法により調整され得、そしてこれは本発明のＴ−Ｌ−ＭＯＩ化合物の範囲内にある。
【０１０２】
任意の事象において、本発明は、タグ部分が化合物の残りから放出されるような切断条件に供されるべきＴ−Ｌ−ＭＯＩ化合物を提供する。タグ部分は、少なくともタグ可変成分を含み、そして代表的にはさらに、タグ反応体とリンカー反応体とを結合するために使用されたタグハンドルからのいくつかのまたは全ての原子、リンカーハンドルからのいくつかのまたは全ての原子、この基がＴ−Ｌ−ＭＯＩにおいて存在する場合不安定部分を必要に応じて含み、そしてＬ２の精密な構造および切断化学の性質に依存して必要な不安定部分Ｌ２のいくつかの部分をおそらくはさらに含む。便宜のために、タグ部分は、Ｔは代表的にはタグ部分の主要部分（質量において）を構成するので、Ｔ−含有部分として呼ばれ得る。
【０１０３】
本発明の１つの局面へこの導入が与えられるので、種々の成分（Ｔ、Ｌ、およびＸ）が詳細に説明される。この説明は、Ｔ、Ｌ、およびＸの説明において本明細書中に以下で使用される以下の特定の用語の定義から始まる。
【０１０４】
本明細書中に使用される場合、用語「核酸フラグメント」は、選択された標的核酸分子に相補的な（すなわち、その全部または部分に相補的な）分子であり、そして天然または合成由来あるいは組換え的に産生され（天然に存在しない分子を含む）、そして適切な場合２本鎖または１本鎖形態であり；そしてオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、プライマー、プローブ、核酸アナログ（例えば、ＰＮＡ）、ポリメラーゼにより３’から５’末端の方向に伸張されるオリゴヌクレオチド、化学的または酵素的に切断される核酸、ジデオキシターミネーターによって終結させられるか、または３’または５’での重合を阻害する化合物により３’または５’末端でキャップされる核酸、およびこれらの組合せを含むことを意味する。核酸フラグメントの選択された標的核酸分子への相補性は、一般的に、フラグメントの長さ全体にかけて少なくとも約７０％の特異的な塩基対形成を示すことを意味する。好ましくは、核酸フラグメントは、少なくとも約８０％；そして最も好ましくは、約９０％の特異的な塩基対形成を示す。ミスマッチ割合（従って、特異的な塩基対形成の割合）を決定するためのアッセイは、当該分野において周知であり、そして完全に塩基対形成したコントロールに参照される場合のＴｍの関数としてのミスマッチ割合に基づく。
【０１０５】
本明細書中で使用される用語「アルキル」は、単独または組み合わせて、１〜１０、好ましくは１個〜６個そしてより好ましくは１個〜４個の炭素原子を含む飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルをいう。このようなラジカルの例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、デシルなどを含むが、これらに限定されない。用語「アルキレン」は、１個〜１０個、好ましくは１個〜６個そしてより好ましくは１個〜４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素ジラジカルをいう。このようなジラジカルの例は、メチレン、エチレン、（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、プロピレンなどを含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
用語「アルケニル」は、単独または組み合わせて、２個〜１０個、好ましくは２個〜６個そしてより好ましくは２個〜４個の炭素原子全体において、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルをいう。このようなラジカルの例は、エテニル、Ｅ−およびＺ−プロペニル、イソプロペニル、Ｅ−およびＺ−ブテニル、Ｅ−およびＺ−イソブテニル、Ｅ−およびＺ−ペンテニル、デセニルなどを含むが、これらに限定されない。用語「アルケニレン」は、２個〜１０個、好ましくは２個〜６個そしてより好ましくは２個〜４個の炭素原子の全体において、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素ジラジカルをいう。このようなジラジカルの例は、メチリデン（＝ＣＨ２）、エチリデン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、プロピリデン（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）などを含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
用語「アルキニル」は、単独または組み合わせて、２個〜１０個、好ましくは２個〜６個そしてより好ましくは２個〜４個の炭素原子の全体において、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルをいう。このようなラジカルの例は、エチニル（アセチレニル）、プロピニル（プロパルジル）、ブチニル、ヘキシニル、デシニルなどを含むが、これらに限定されない。用語「アルキニレン」は、単独または組み合わせて、２個〜１０個、好ましくは２個〜６個そしてより好ましくは２個〜４個の炭素原子の全体において、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素ジラジカルをいう。このようなラジカルの例は、エチニレン（−Ｃ≡Ｃ−）、プロピニレン（−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−）などを含むが、これらに限定されない。
【０１０８】
用語「シクロアルキル」は、単独または組み合わせて、炭素原子の数が３個〜８個そしてより好ましくは３個〜６個の炭素原子の飽和環状配置をいう。このようなシクロアルキルラジカルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含むが、これらに限定されない。用語「シクロアルキレン」は、シクロアルキルのジラジカル形態をいう。
【０１０９】
用語「シクロアルケニル」は、単独または組み合わせて、４個〜８個、好ましくは５個または６個の炭素原子および１つ以上の二重結合を含む環状炭素環をいう。このようなシクロアルケニルラジカルの例は、シクロペンテニル、シクロヘキシニル、シクロペンタジエニルなどを含むが、これらに限定されない。用語「シクロアルケニレン」は、シクロアルケニルのジラジカル形態をいう。
【０１１０】
用語「アリール」は、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、アズレニル、フルオレニル、およびアントラセニルからなる群から選択される炭素環（炭素および水素の全体からなる）芳香族基；またはフリル、チエニル、ピリジル、ピロリル、オキサゾリル（ｏｘａｚｏｌｙｌｙ）、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、２−ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、１，３，５−トリアジニル、１，３，５−トリチアニル、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、インドリニル、ベンゾ［ｂ］フラニル、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル、１Ｈ−インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノオキサリニル、１，８−ナフチリジニル、プテリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、およびフェノキサジニルからなる群から選択されるヘテロ環芳香族基をいう。
【０１１１】
本明細書中に定義される「アリール」基は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シアノ、カルボキシ、カルボアルコキシ、１，２−ジオキシエチレン、アルコキシ、アルケノキシまたはアルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、脂肪族アシルまたは芳香族アシル、アルコキシ−カルボニルアミノ、アルキルスルホニルアミノ、モルホリノカルボニルアミノ、チオモルホリノカルボニルアミノ、Ｎ−アルキルグアニジノ、アラルキルアミノスルホニル；アラルコキシアルキル；Ｎ−アラルコキシウレア；Ｎ−ヒドルキシルウレア；Ｎ−アルケニルウレア；Ｎ，Ｎ−（アルキル、ヒドロキシル）ウレア；ヘテロシクリル；チオアリールオキシ−置換アリール；Ｎ，Ｎ−（アリール、アルキル）ヒドラジノ；Ａｒ’−置換スルホニルヘテロシクリル；アラルキル−置換ヘテロシクリル；シクロアルキルおよびシクロアケニル置換−ヘテロシクリル；シクロアルキル−縮合アリール；アリールオキシ−置換アルキル；ヘテロシクリルアミノ；脂肪族アシルアミノカルボニルまたは芳香族アシルアミノカルボニル；脂肪族アシル−置換アルケニルまたは芳香族アシル−置換アルケニル；Ａｒ’−置換アミノカルボニルオキシ；Ａｒ’，Ａｒ’−ジ置換アリール；脂肪族アシル−置換アシルまたは芳香族アシル−置換アシル；シクロアルキルカルボニルアルキル；シクロアルキル−置換アミノ；アリールオキシカルボニルアルキル；ホスホロジアミジル酸またはエステル；からなる群から独立して選択される１個〜４個の置換基を、独立して含み得る。
【０１１２】
「Ａｒ’」は、上記に定義されるように水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、１，２−ジオキシメチレン、１，２−ジオキシエチレン、アルコキシ、アルケノキシ、アルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノまたはアルキニルアミノ、アルキルカルボニルオキシ、脂肪族アシルまたは芳香族アシル、アルキルカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、アルキルスルホニルアミノ、Ｎ−アルキル、またはＮ，Ｎ−ジアルキルウレアからなる群から選択される１個〜３個の置換基を有する炭素環またはヘテロ環アリール基である。
【０１１３】
用語「アルコキシ」は、単独または組み合わせて、アルキルエーテルラジカルをいい、ここで、用語「アルキル」は上記のように定義される。適切なアルキルエーテルラジカルの例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどを含むが、これらに限定されない。
【０１１４】
用語「アルケノキシ」は、単独または組み合わせて、アルケニル−Ｏ−式のラジカルをいい、ここで用語「アルケニル」は上記のように定義され、但し、ラジカルはエノールエーテルではない。適切なアルケノキシラジカルの例は、アリルオキシ、Ｅ−３−メチル−２−プロペノキシおよびＺ−３−メチル−２−プロペノキシなどを含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
用語「アルキニルオキシ」は、単独または組み合わせて、アルキニル−Ｏ−式のラジカルをいい、ここで用語「アルキニル」は上記のように定義され、但し、ラジカルはイノールエーテルではない。適切なアルキノキシラジカルの例は、プロパルギルオキシ、２−ブチニルオキシなどを含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
用語「チオアルコキシ」は式アルキル−Ｓ−のチオエーテルラジカルをいい、ここでアルキルは上記のように定義される。
【０１１７】
用語「アルキルアミノ」は、単独または組み合わせて、モノ−またはジ−アルキル−置換アミノラジカル（すなわち、式アルキル−ＮＨ−または（アルキル）２−Ｎ−のラジカル）をいい、ここで、用語「アルキル」は上記のように定義される。適切なアルキルアミノラジカルの例は、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｔ−ブチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノなどを含むが、これらに限定されない。
【０１１８】
用語「アルケニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルケニル−ＮＨ−または（アルケニル）２Ｎ−のラジカルをいい、ここで用語「アルケニル」は上記のように定義され、但し、ラジカルはエナミンではない。このようなアルケニルアミノラジカルの例は、アリルアミノラジカルである。
【０１１９】
用語「アルキニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルキニル−ＮＨ−または（アルキニル）２Ｎ−のラジカルをいい、ここで用語「アルキニル」は上記のように定義され、但し、ラジカルはイナミンではない。このようなアルキニルアミノラジカルの例は、プロパルギルアミノラジカルである。
【０１２０】
用語「アミド」は、−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（＝Ｏ）−または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−のいずれかをいい、ここでＲ１は本明細書中で水素ならびに他の基を含むと定義される。用語「置換アミド」は、Ｒ１が水素ではない状況をいい、一方用語「非置換アミド」はＲ１が水素である状況をいう。
【０１２１】
用語「アリールオキシ」は、単独または組み合わせて、式アリール−Ｏ−のラジカルをいい、ここでアリールは上記のように定義される。アリールオキシラジカルの例は、フェノオキシ、ナフトキシ、ピリジルオキシなどを含むが、これらに限定されない。
【０１２２】
用語「アリールアミノ」は、単独または組み合わせて、式アリール−ＮＨ−のラジカルをいい、ここでアリールは上記のように定義される。アリールアミノラジカルの例は、フェニルアミノ（アニリド）、ナフチルアミノ、２−、３−、および４−ピリジルアミノなどを含むが、これらに限定されない。
【０１２３】
用語「アリール縮合シクロアルキル」は、単独または組み合わせて、アリールラジカルと隣接する２原子を共有するシクロアルキルラジカルをいい、ここで用語「シクロアルキル」および「アリール」は、上記のように定義される。アリール縮合シクロアルキルラジカルの例は、ベンゾ縮合シクロブチルラジカルである。
【０１２４】
用語「アルキルカルボニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルキル−ＣＯＮＨのラジカルをいい、ここで用語「アルキル」は上記のように定義される。
【０１２５】
用語「アルコキシカルボニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルキル−ＯＣＯＮＨ−のラジカルをいい、ここで用語「アルキル」は上記のように定義される。
【０１２６】
用語「アルキルスルホニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルキル−ＳＯ２ＮＨ−のラジカルをいい、ここで用語「アルキル」は上記のように定義される。
【０１２７】
用語「アリールスルホニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アリール−ＳＯ２ＮＨ−のラジカルをいい、ここで用語「アリール」は上記のように定義される。
【０１２８】
用語「Ｎ−アルキルウレア」は、単独または組み合わせて、式アルキル−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−のラジカルをいい、ここで用語「アルキル」は上記のように定義される。
【０１２９】
用語「Ｎ−アリールウレア」は、単独または組み合わせて、式アリール−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−のラジカルをいい、ここで用語「アリール」は上記のように定義される。
【０１３０】
用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素をいう。
【０１３１】
用語「炭化水素ラジカル」は、１つの水素原子のみが独立した安定な分子であることを必要とする炭素および水素原子の配置をいう。従って、炭化水素ラジカルは炭素原子上に１つの空の原子価部位を有し、これを通じて炭化水素ラジカルは他の原子（単数または複数）に結合され得る。アルキル、アルケニル、シクロアルキルなどが、炭化水素ラジカルの例である。
【０１３２】
用語「炭化水素ジラジカル」は、２つの水素原子が独立した安定な分子であることを必要とする炭素および水素原子の配置をいう。従って、炭化水素ラジカルは１つまたは２つの炭素原子上に２つの空の原子価部位を有し、これを通じて炭化水素ラジカルは他の原子（単数または複数）に結合され得る。アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレンなどが炭化水素ジラジカルの例である。
【０１３３】
用語「ヒドロカルビル」は、炭素および水素の全体が単一の原子価部位を有し、これを通じて別の部分に結合する任意の安定な配置をいう。従って、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール（アリール環の中へのヘテロ原子の組み込みを含まない）、アリールアルキル、アルキルアリールなどとして知られるラジカルを含む。炭化水素ラジカルは、ヒドロカルビルの別の名前である。
【０１３４】
用語「ヒドロカルビレン」は、炭素および水素の全体が２つの原子価部位を有し、これを通じて他の部分に結合する任意の安定な配置をいう。従って、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、アリーレン（アリーレン環の中へのヘテロ原子の組み込みを含まない）、アリールアルキレン、アルキルアリーレンなどを含む。炭化水素ジラジカルは、ヒドロカルビレンの別の名前である。
【０１３５】
用語「ヒドロカルビル−Ｏ−ヒドロカルビレン」は、酸素原子に結合したヒドロカルビル基をいい、ここで酸素原子は、同様にヒドロカルビレン基が他の部分に結合する２つの原子価部位の１つでヒドロカルビレン基に結合する。用語「ヒドロカルビル−Ｓ−ヒドロカルビレン」、「ヒドロカルビル−ＮＨ−ヒドロカルビレン」および「ヒドロカルビル−アミド−ヒドロカルビレン」は、等価の意味を有し、ここで酸素はイオウ、−ＮＨ−、またはアミド基でそれぞれ置換されている。
【０１３６】
用語Ｎ−（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレンは、ヒドロカルビレン基をいい、ここで２つの原子価部位の１つは窒素原子に結合し、そしてこの窒素原子は同時に水素およびヒドロカルビル基に結合する。用語Ｎ，Ｎ−ジ（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレンは、ヒドロカルビレン基をいい、ここで２つの原子価部位の１つは窒素原子に結合し、そしてこの窒素原子は同時に２つのヒドロカルビル基に結合する。
【０１３７】
用語「ヒドロカルビルアシル−ヒドロカルビレン」は、ヒドロカルビレン基の２つの原子価部位の１つにアシル（−Ｃ（＝Ｏ）−）基を介して結合したヒドロカルビル基をいう。
【０１３８】
用語「ヘテロシクリルヒドロカルビル」および「ヘテロシリル」は、炭素原子および酸素、窒素、リン、およびイオウから選択された４つまでの原子（ヘテロ原子という）を含む、安定な原子の環状配置をいう。環状配置は、３個〜７個の原子のモノ環状環または８個〜１１個の原子の２環状環の形態であり得る。環は、飽和または不飽和（芳香族環を含む）であり得、そして必要に応じてベンゾ縮合され得る。環中の窒素およびイオウ原子は、窒素の４級化形態を含む任意の酸化形態であり得る。ヘテロシクリルヒドロカルビルは、任意の環外炭素またはヘテロ原子で結合し得、安定な構造を作製する。好ましいヘテロシクリルヒドロカルビルは、１個または２個の窒素のヘテロ原子を含む５〜７員のモノ環状ヘテロ環を含む。
【０１３９】
置換ヘテロシクリルヒドロカルビルは、上記のように定義されるヘテロシクリルヒドロカルビルをいい、ここで少なくともその１つの環原子が環外に伸張する示された置換基に結合する。
【０１４０】
ヒドロカルビルおよびヒドロカルビレン基において、用語「１つ以上の水素が等しい数のフッ素に置換されている上記の任意の誘導体」は、炭素、水素およびフッ素原子を含み、それ以外の原子を含まない分子をいう。
【０１４１】
用語「活性エステル」は、容易に求核試薬（例えば、アミンおよびアルコールまたはチオール求核試薬）により置換可能な「脱離基」を含むエステルである。このような脱離基は周知であり、限定はしないがＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ハロゲン（ハライド）、テトラフルオロフェノレートを含むアルコキシ、チオアルコキシなどを含む。用語「保護エステル」は、マスクされたか、またはそうでなければ非反応性のエステル基をいう。例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」を参照のこと。
【０１４２】
上記の定義を考慮して、本明細書全体に使用される他の化学用語は当業者に容易に理解され得る。用語は、単独またはそれらの任意の組合せで使用され得る。好ましいおよびより好ましいラジカルの鎖長は、このような全ての組合わせに適用される。
【０１４３】
Ａ．タグ化核酸フラグメントの作製
上記のように、本発明の１つの局面は、各レーンで１６タグより多くの使用を可能にする、ＤＮＡ配列決定のための一般的なスキームを提供する；連続的な検出によってちょうど従来の蛍光ベース配列決定のようにタグが検出され得、そして配列はサイズ分離が生じるごとに読み取られる。このスキームは、タグ化分子のサイズ分離に基づく任意のＤＮＡ配列決定技術に適用し得る。本発明における使用のために適切なタグおよびリンカー、ならびに核酸配列決定のための方法は、以下により詳細に議論される。
【０１４４】
１．タグ
本明細書中に使用される「タグ」は、一般に「目的分子」を独特（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）に同定するために使用される化学部分をいい、そしてより詳細にはタグ可変成分ならびに任意のタグ反応物、タグ成分およびタグ部分において、それに最も密接に結合し得るものをいう。
【０１４５】
本発明において有用なタグは、いくつかの性質を有する：
１）他の全てのタグから区別され得る。他の化学部分からのこの区別は、タグ（特に、切断反応後）のクロマトグラフィーの挙動、その分光光度または電位差特性、またはこれらのいくつかの組合せに基づき得る。タグが有用に区別される分光光度法は、質量スペクトル分析法（ＭＳ）、赤外（ＩＲ）、紫外（ＵＶ）、および蛍光を含み、ここでＭＳ、ＩＲ、およびＵＶが好ましく、そしてＭＳが最も好ましい分光光度法である。定電位電流測定は、好ましい電位差法である。
【０１４６】
２）タグは、１０−２２〜１０−６モルで存在する場合に検出され得る。
【０１４７】
３）タグは、タグが独特（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）に同定されると意図される、ＭＯＩに結合し得る化学的ハンドルを有する。結合は、ＭＯＩに直接的に、または「リンカー」基を介して間接的に形成され得る。
【０１４８】
４）タグは、それが供される全ての操作（ＭＯＩへの結合および切断、およびタグが結合される間のＭＯＩの任意の操作を含む）に対して化学的に安定である。
【０１４９】
５）タグは、タグが結合している間のＭＯＩについて行われる操作を有意に阻害しない。例えば、タグがオリゴヌクレオチドに結合されている場合、タグはオリゴヌクレオチドに行われるいかなるハイブリダイゼーションまたは酵素反応（例えば、ＰＣＲ配列決定反応）を阻害してはならない。同様に、タグが抗体に結合される場合、抗体による抗原認識を有意に阻害してはならない。
【０１５０】
特定の分光光度または電位差法により検出されることを意図されるタグ部分は、その方法による検出の感度および特異性を増強する特性を有する。典型的には、タグ部分は、このような特性を有する。なぜなら、特性は、典型的にタグ部分の主要部分を構成するタグ可変成分の中に設計されているからである。以下の議論において、用語「タグ」の使用は、タグ部分（すなわち、タグ可変成分を含む切断産物）をいうが、タグ可変成分それ自体をいうこともまた考慮され得る。なぜなら、タグ可変性分は、典型的には独特（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）に検出され得る特性を提供することを担うタグ部分の一部であるからである。式Ｔ−Ｌ−Ｘの化合物において、「Ｔ」部分は、タグ可変成分を含む。タグ可変成分が例えば、質量スペクトル分析法により特徴付けされるように設計されている場合、Ｔ−Ｌ−Ｘの「Ｔ」部分はＴｍｓといわれ得る。同様に、Ｔ−Ｌ−ＸからのＴを含む切断産物は、Ｔｍｓ含有部分といわれ得る。以下の分光光度法および電位差法は、Ｔｍｓ含有部分を特徴付けるために使用され得る。
【０１５１】
ａ．ＭＳタグの特徴
タグが質量分析（すなわち、ＭＳ読み取り可能タグ、また本明細書中でＭＳタグ、または「Ｔｍｓ含有部分」といわれる）により分析され得る場合、タグの必須特性は、それがイオン化され得ることである。従って、ＭＳ読み取り可能タグの設計において、そこにＭＳのイオン化条件の下で正電荷または負電荷を有し得る化学官能性を取り込むことは、好ましい要素である。この特性は、特にエレクトロスプレーイオン化において、イオン形成の改善された効率およびより大きい検出の全体的な感度を与える。イオン化電位を維持する化学官能基は、ＴｍｓまたはＬあるいは両方に由来し得る。質量スペクトル分析により検出される分析物の相対的な感度を増加し得る因子は、例えば、Ｓｕｎｎｅｒ，  Ｊ．ら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６０：１３００−１３０７  （１９８８）に議論されている。
【０１５２】
負電荷を有することを容易にするために好ましい官能基は、有機酸（例えば、フェノール性水酸基、カルボン酸、リン酸、リン酸塩、テトラゾール、硫化尿素、パーフルオロアルコールおよびスルホン酸）である。
【０１５３】
イオン化条件下で正電荷を有することを容易にするために好ましい官能基は、脂肪族または芳香族アミンである。ＭＳタグの増強された検出可能性を与えるアミン官能基の例は、四級アミン（すなわち、各々が炭素原子に対する４つの結合を有するアミン。Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，  米国特許第５，２４０，８５９号を参照のこと）および三級アミン（すなわち各々が炭素原子に対する３つの結合を有するアミン。これは、ピリジンに存在するようなＣ＝Ｎ−Ｃ基を含む。Ｈｅｓｓら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２４：３７３，  １９９５；  Ｂｕｒｅｓら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２４：３６４，  １９９５を参照のこと）を含む。阻害された三級アミンが特に好ましい。３級および四級アミンは、アルキルまたはアリールであり得る。Ｔｍｓ含有部分は、少なくとも１つのイオン化可能種を有さなくてはならないが、１つより多くのイオン化可能種を有し得る。好ましい電荷状態は、１つのタグ当たり１つのイオン化種である。従って、各Ｔｍｓ含有部分（および各タグ可変成分）は、１つの阻害されたアミンまたは有機酸基のみを含むことが好ましい。
【０１５４】
Ｔｍｓ含有部分の一部を形成し得る適切なアミン含有ラジカルは、以下を含む：
【０１５５】
【化１７】
2008183012.tif 000018
質量スペクトル分析によるタグの同定は、好ましくは分子量対電荷比（ｍ／ｚ）に基づく。ＭＳタグの好ましい分子量範囲は約１００〜２，０００ダルトンであり、そして好ましくはＴｍｓ含有部分は少なくとも約２５０ダルトン、より好ましくは少なくとも約３００ダルトン、そしてさらにより好ましくは少なくとも約３５０ダルトンの質量を有する。一般に、２００〜２５０ダルトン未満の親イオンを有する部分を質量スペクトル分析で区別することは特に困難であり（精密な装置に依存する）、従って本発明のＴｍｓ含有部分がこの範囲を超える質量を有することが好ましい。
【０１５６】
上記に説明したように、Ｔｍｓ含有部分は、タグ可変成分に存在するもの以外、そして特にＴｍｓ自体に存在するもの以外の原子を含み得る。従って、Ｔｍｓ自体の質量は、Ｔｍｓ含有部分が少なくとも約２５０ダルトンの質量を有する限り、約２５０ダルトンより少なくあり得る。従って、Ｔｍｓの質量は、１５（すなわち、メチルラジカル）〜約１０，０００ダルトンの範囲、そして好ましくは１００〜約５，０００ダルトンの範囲、そしてより好ましくは約２００〜約１，０００ダルトンの範囲であり得る。
【０１５７】
これらのタグが有意な量で１つより多くの同位体を有する原子を取り込む場合、質量スペクトル分析によりタグを区別することは比較的困難である。従って、質量スペクトル分析同定に意図される好ましいＴ基（Ｔｍｓ基）は、炭素、少なくとも１つの水素およびフッ素、および酸素、窒素、イオウ、リンおよびヨウ素から選択される任意の原子を含む。他の原子はＴｍｓに存在し得るが、その存在は質量スペクトル分析データの分析を幾分より困難にし得る。好ましくは、Ｔｍｓ基は、水素原子および／またはフッ素原子に加えて、炭素、窒素および酸素のみを有する。
【０１５８】
フッ素は、Ｔｍｓ基において有することがなお好ましい任意の原子である。水素と比較して、フッ素はもちろんより重い。従って、フッ素原子の存在は、水素原子よりもより高い質量のＴｍｓ基を導き、それによりＴｍｓ基は上記の説明のように所望される２５０ダルトンの質量に達し得、そしてこれを超え得る。さらに、水素のフッ素での置換は、Ｔｍｓ含有部分により高い揮発性を与え、そして分析物のより高い揮発性は、質量スペクトル分析が検出方法として用いられる場合、感度を増強する。
【０１５９】
Ｔｍｓの分子式は、Ｃ１−５００Ｎ０−１００Ｏ０−１００Ｓ０−１０Ｐ０−１０ＨαＦβＩδの範疇にあり、ここでａ、βおよびδの計は、Ｈ原子、Ｆ原子、Ｉ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、およびＰ原子の原子価を満たすのに十分である。表示Ｃ１−５００Ｎ０−１００Ｏ０−１００Ｓ０−１０Ｐ０−１０ＨαＦβＩδは、Ｔｍｓが少なくとも１つを含み、そして１個〜５００個の任意の数の炭素原子、さらに必要に応じて１００個までの窒素原子（「Ｎ０−」は、Ｔｍｓが窒素原子を１つも含む必要がないことを意味する）、および１００個までの酸素原子、ならびに１０個までのイオウ原子および１０個までのリン原子をＴｍｓに含み得ることを意味する。符合α、β、およびδは、Ｔｍｓ中の水素、フッ素およびヨウ素の数を表し、ここで、これらの数の任意の２つは０であり得、そしてこれらの数の計はＨ原子、Ｆ原子、Ｉ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子およびＰ原子の原子価の総計と等しい。好ましくは、Ｔｍｓは、Ｃ１−５０Ｎ０−１０Ｏ０−１００ＨαＦβの範疇に入る分子式を有し、ここでαおよびβの計は部分に存在する水素およびフッ素原子の数にそれぞれ等しい。
【０１６０】
ｂ．ＩＲタグの特徴
有機化学基のＩＲ検出には、２つの主な形態：ラマン散乱ＩＲおよび吸収ＩＲが存在する。ラマン散乱ＩＲスペクトルと吸収ＩＲスペクトルとは、相補的な分光学的方法である。一般に、ラマン励起は結合極性の変化に依存するが、ＩＲ吸収は結合双極子モーメントの変化に依存する。弱いＩＲ吸収線は強いラマン吸収線となり、そしてその逆も成り立つ。波数は、ＩＲスペクトルの特徴的な単位である。ＩＲタグのための別々の適用を有する３つのスペクトル領域が存在する：１２５００〜４０００ｃｍ−１における近ＩＲ、４０００〜６００ｃｍ−１における中程度のＩＲ、６００〜３０ｃｍ−１における遠ＩＲ。本明細書中に記載される使用（ここで化合物は、ＭＯＩ、プローブ、またはプライマーを同定するためのタグとして機能する）のために、中程度のスペクトル領域が好ましい。例えば、カルボニル伸縮（１８５０〜１７５０ｃｍ−１）は、カルボン酸、カルボン酸エステルおよびカルボン酸アミド、ならびに炭酸アルキルおよび炭酸アリール、カルバメート、ならびにケトンについて測定される。Ｎ−Ｈ変角（１７５０〜１６０ｃｍ−１）は、アミン、アンモニウムイオン、およびアミドを同定するために使用される。１４００〜１２５０ｃｍ−１において、Ｒ−ＯＨ変角ならびにアミド中のＣ−Ｎ伸縮が検出される。芳香族置換パターンは、９００〜６９０ｃｍ−１（ＡｒＮＨ２についてのＣ−Ｈ変角、Ｎ−Ｈ変角）において検出される。飽和Ｃ−Ｈ、オレフィン、芳香環、二重結合および三重結合、エステル、アセタール、ケタール、アンモニウム塩、Ｎ−Ｏ化合物（例えば、オキシム、ニトロ、Ｎ−オキシド、および硝酸塩）、アゾ、ヒドラゾン、キノン、カルボン酸、アミド、ならびにラクタムは全て、振動赤外相関データを有する（Ｐｒｅｔｓｃｈら，  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄａｔａ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９を参照のこと）。好ましい化合物には、２２３０〜２２１０ｃｍ−１において非常に強いニトリル伸縮振動を示す芳香族ニトリルが含まれる。他の有用なタイプの化合物は、２１４０〜２１００ｃｍ−１の間に鋭い吸収バンドを引き起こす強い伸縮振動を有する芳香族アルキンである。第３のタイプの化合物は、２１６０〜２１２０ｃｍ−１領域において強い吸収バンドを示す芳香族アジドである。チオシアネートは、２２７５〜２２６３ｃｍ−１において強い吸収を有する代表的な化合物である。
【０１６１】
ｃ．ＵＶタグの特徴
有機発色団のタイプおよびそれら各々のＵＶ可視特性の編集が、Ｓｃｏｔｔ（Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＶ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｐｅｒｍａｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９６２）において与えられる。発色団は、特定の光吸収を担う原子、または原子もしくは電子の群である。共役系におけるπ→π＊の極大について、経験則が存在する（Ｐｒｅｔｓｃｈら，  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄａｔａ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，  Ｂ６５頁およびＢ７０頁，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９を参照のこと）。好ましい化合物（共役系を有する）は、ｎ→π＊およびπ→π＊遷移を有する。そのような化合物は、以下によって例示される：アシッドバイオレット７、アクリジンオレンジ、アクリジンイエローＧ、ブリリアントブルーＧ、コンゴーレッド、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーンオキサレート、メタニルイエロー、メチレンブルー、メチルオレンジ、メチルバイオレットＢ、ナフトールグリーンＢ、オイルブルーＮ、オイルレッドＯ、４−フェニルアゾフェノール、サフラニンＯ（Ｓａｆｒａｎｉｅ  Ｏ）、ソルベントグリーン３、およびスダンオレンジＧ；これらの全てが市販されている（Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ）。他の適切な化合物は、例えば、Ｊａｎｅ，Ｉ．ら，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍ．  ３２３：１９１−２２５（１９８５）において表記されている。
【０１６２】
ｄ．蛍光タグの特徴
蛍光プローブは、それらの吸収および蛍光放出の波長および強度によって、最も直接的に同定されそして定量される。放出スペクトル（蛍光およびりん光）は、吸収スペクトルよりも非常に感度が高く、そしてより特異的な測定を可能にする。励起状態の寿命および蛍光の異方性のような他の光物理的特性は、より広く使用されていない。最も一般的に有用な強度パラメータは、吸収についてのモル吸光係数（ε）および蛍光についての量子収量（ＱＹ）である。εの値は単一の波長において明示され（通常、プローブの極大吸収）、一方ＱＹは全蛍光スペクトルプロフィールにわたる全光子放出の測定である。狭い最適バンド幅（＜２０ｎｍ）が蛍光励起（吸収を介する）について通常使用され、一方蛍光検出バンド幅はより可変的であり、最大感度についての完全スペクトルから最大解像度についての狭いバンド（約２０ｎｍ）までの範囲にわたる。プローブ分子あたりの蛍光強度は、εとＱＹとの積に比例する。現在実用的に重要な、発蛍光団におけるこれらのパラメータの幅は、εについて約１０，０００〜１００，０００ｃｍ−１Ｍ−１であり、そしてＱＹについて０．１〜１．０である。蛍光タグとして機能し得る化合物は、以下の通りである：フルオロセイン、ローダミン、ラムダブルー４７０、ラムダグリーン、ラムダレッド６６４、ラムダレッド６６５、アクリジンオレンジ、およびヨウ化プロピジウム、これらはＬａｍｂｄａ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏ．（Ｐｌｅａｓａｎｔ  Ｇａｐ，  ＰＡ）から市販されている。蛍光化合物（例えば、ナイルレッド、テキサスレッド、ｌｉｓｓａｍｉｎｅTM、ＢＯＤＩＰＹTM）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）から市販されている。
【０１６３】
ｅ．電位差タグの特徴
電気化学的検出（ＥＣＤ）の原理は化合物の酸化および還元に基づいている。特定の印加された電位において、電子は供与されるかまたは受容されるかのいずれかであり、従って測定され得る電流を産生する。特定の化合物が電位差に供された場合、分子は作用電極の表面において、電子の喪失（酸化）または獲得（還元）による分子転位を受ける。そのような化合物は電子的であると言われ、そして電気化学的反応を受ける。ＥＣ検出器は、その上にＨＰＬＣ溶出液が流れる電極表面に電圧を与える。カラムから溶出する電気的に活性な化合物は、電子を供与（酸化）するかまたは獲得（還元）するかのいずれかであり、即時に電流ピークを生じる。重要なことに、生じる電流の量は、分析物（ａｎａｌｙｔｅ）の濃度および与えられた電圧の両方に依存し、各化合物は、そこにおいて酸化または還元が始まる特定の電圧を有する。現在最もポピュラーな電気化学的検出器は電流測定検出器であり、そこでは電位が一定に保たれており、そして電気化学的反応から生じる電流が次いで測定される。この種類の分光分析は現在「定電位電流測定」と呼ばれている。市販の電流測定器はＥＳＡ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｈｅｌｍｆｏｌｄ，  ＭＡから入手できる。
【０１６４】
検出の効率が１００％である場合、特殊化された検出器は「電量的」であると言われる。電量検出器は高感度であり、選択性および感度に関して多くの実用的な利点を有し、それによりこれらの種類の検出器はアレイにおいて有用となる。電量検出器において、分析物の所定の濃度についてのシグナル電流は、作用電極に対する印加された電位（電圧）の関数としてプロットされる。得られるＳ字型グラフは電流−電圧曲線または流体力学的ボルタマグラム（ＨＤＶ）と呼ばれる。ＨＤＶは、活性電極に印加される電位の最良の選択を可能にし、これは観察されるシグナルを最大化することを可能にする。ＥＣＤの主要な利点は、サブフェムトモルの範囲における検出の電流レベルを有する、その固有の感度である。
【０１６５】
多数の化学物質および化合物が電気化学的に活性であり、それには多くの生化学物質、薬剤、および殺虫剤が含まれる。クロマトグラフィー上で共溶出する化合物は、それらの半波位（最大シグナルの半分における電位）が３０〜６０ｍＶでしか相違しない場合でさえも、効果的に解析され得る。
【０１６６】
最近開発された電量センサーは、液体クロマトグラフィーに基づく分離における検出器として使用される場合、共溶出する化合物の選択性、同定、および解析を提供する。従って、これらのアレイされた検出器は、検出器自身において達成される別の組の分離を加える。現在の計器は１６チャンネルを有し、これらは原則として、データが獲得され得る速度によってのみ制限される。ＥＣアレイ上で解析され得る化合物の数は、クロマトグラフィーによって制限される（すなわち、プレートの総数が制限される）。しかし、クロマトグラフィー上で共溶出する２以上の化合物が半波位において３０〜６０ｍＶの相違を有する場合、アレイは化合物を区別可能である。電気化学的に活性である化合物の能力は、所有のＥＣ活性基（すなわち、−ＯＨ、−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ）に依存する。
【０１６７】
電量検出器を使用して首尾良く検出されている化合物には、以下が含まれる：５−ヒドロキシトリプタミン、３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル−グリコール、ホモゲンチジン酸、ドーパミン、メタネフリン、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ｈｙｄｒｏｘｙｋｙｎｕｒｅｎｉｎｒ）、アセトミノフェン、３−ヒドロキシトリプトホール（３−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈｏｌ）、５−ヒドロキシインドール酢酸、オクタンスルホン酸、フェノール、ｏ−クレゾール、ピロガロール、２−ニトロフェノール、４−ニトロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、４，６−ジニトロクレゾール、３−メチル−２−ニトロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、４−クロロ−３−メチルフェノール、５−メチルフェノール、４−メチル−２−ニトロフェノール、２−ヒドロキシアニリン、４−ヒドロキシアニリン、１，２−フェニレンジアミン、ベンゾカテキン、ブツロン、クロルトルロン、ジウロン、イソプロツロン、リニュロン、メトブロムロン、メトキスロン、モノリニュロン、モニュロン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、４−アミノ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシクマリン酸、７−メトキシクマリン、アピゲニン（ａｐｉｇｅｎｉｎ）バイカレイン、カフェイン酸、カテキン、センタウレイン、クロロゲン酸、ダイドゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ダチスセチン、ジオスメチン、没食子酸エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン、オイゲノール、オイパトリン（ｅｕｐａｔｏｒｉｎ）、フェルル酸、フィセチン、ガランギン（ｇａｌａｎｇｉｎ）、没食子酸、ガルデニン（ｇａｒｄｅｎｉｎ）、ゲニステイン、ゲンチジン酸、ヘスペリジン、イリゲニン、ケンフェロール（ｋａｅｍｆｅｒｏｌ）、ロイコヤニジン（ｌｅｕｃｏｙａｎｉｄｉｎ）、ルテオリン、マンゴスチン、モリン、ミリセチン、ナリンギン、ナリルチン（ｎａｒｉｒｕｔｉｎ）、ペラルゴンジン（ｐｅｌａｒｇｏｎｄｉｎ）、ペオニジン（ｐｅｏｎｉｄｉｎ）、フロレチン（ｐｈｌｏｒｅｔｉｎ）、プラテンセイン、プロトカテキン酸（ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕｉｃ  ａｃｉｄ）、ラムネチン（ｒｈａｍｎｅｔｉｎ）、ケルセチン、サクラネチン、スクテラレイン（ｓｃｕｔｅｌｌａｒｅｉｎ）、スコポレチン（ｓｃｏｐｏｌｅｔｉｎ）、シリングアルデヒド、シリンジン酸（ｓｙｒｉｎｇｉｃ  ａｃｉｄ）、タンゲリチン（ｔａｎｇｅｒｉｔｉｎ）、トロキセルチン（ｔｒｏｘｅｒｕｔｉｎ）、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、バニリン酸、１，３−ジメチルテトラヒドロイソキノリン、６−ヒドロキシドーパミン、γ−サルソリノール、Ｎ−メチル−γ−サルソリノール、テトラヒドロイソキノリン、アミトリプチリン、アポモルヒネ、カプサイシン、クロルジアゼポキシド、クロルプロマジン、ダウノルビシン、デシプラミン、ドキセピン、フルオキセチン、フルアゼパム、イミプラミン、イソプロテレノール、メトキサミン、モルヒネ、モルヒネ−３−グルクロニド、ノルトリプチリン、オキサゼパム、フェニレフリン、トリミプラミン、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルセロトニン、３，４−���ヒドロキシベンジルアミン、３，４−ジヒドロキシマンデル酸（ＤＯＭＡ）、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）、３，４−ジヒドロキシフェニルグリコール（ＤＨＰＧ）、３−ヒドロキシアントラニル酸、２−ヒドロキシフェニル酢酸（２ＨＰＡＣ）、４−ヒドロキシ安息香酸（４ＨＢＡＣ）、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５ＨＩＡＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシマンデル酸、３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニルエチルアミン、４−ヒドロキシフェニル酢酸（４ＨＰＡＣ）、４−ヒドロキシフェニル乳酸（４ＨＰＬＡ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５ＨＴＰ）、５−ヒドロキシトリプトホール（５ＨＴＯＬ）、５−ヒドロキシトリプタミン（５ＨＴ）、５−ヒドロキシトリプタミンスルフェート、３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニルグリコール（ＭＨＰＧ）、５−メトキシトリプタミン、５−メトキシトリプトファン、５−メトキシトリプトホール、３−メトキシチラミン（３ＭＴ）、３−メトキシチロシン（３−ＯＭ−ＤＯＰＡ）、５−メチルシステイン、３−メチルグアニン、ブホテニン、ドーパミン、ドーパミン−３−グルクロニド、ドーパミン−３−スルフェート、ドーパミン−４−スルフェート、エピネフリン、エピニン、葉酸、グルタチオン（還元型）、グアニン、グアノシン、ホモゲンチジン酸（ＨＧＡ）、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）、ホモバニリルアルコール（ＨＶＯＬ）、ホモベラチン酸（ｈｏｍｏｖｅｒａｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ホモバニリン酸スルフェート、ヒポキサンチン、インドール、インドール−３−酢酸、インドール−３−乳酸、キヌレニン、メラトニン、メタネフリン、Ｎ−メチルトリプタミン、Ｎ−メチルチラミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルチラミン、ノルエピネフリン、ノルメタネフリン、オクトパミン、ピリドキサール、ピリドキサールリン酸、ピリドキサミン、シネフリン（ｓｙｎｅｐｈｒｉｎｅ）、トリプトホール、トリプタミン、チラミン、尿酸、バニリルマンデル酸（ｖｍａ）、キサンチン、およびキサントシン。他の適切な化合物は、例えば、Ｊａｎｅ，  Ｉ．ら，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍ．  ３２３：１９１−２２５（１９８５）およびＭｕｓｃｈ，  Ｇ．ら，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍ．  ３４８：９７−１１０（１９８５）に記載される。これらの化合物は、当該分野で公知の方法によって式Ｔ−Ｌ−Ｘの化合物中に取り込まれ得る。例えば、カルボン酸基を有する化合物は、アミン、ヒドロキシルなどと反応し得、ＴとＬとの間にアミド、エステル、および他の結合を形成する。
【０１６８】
上記の特性に加え、そして意図される検出法に関係なく、タグはモジュール式化学構造を有することが好ましい。このことは、コンビナトリアルケミストリーの技術を使用する多数の構造的に関連するタグの構築において助けとなる。例えば、Ｔｍｓ基はいくつかの特性を有することが望ましい。それはＴｍｓ含有部分が質量分析に供された場合に単一のイオン化電荷状態を維持する官能基（より単純には、「質量分析感度エンハンサー」基、すなわちＭＳＳＥと呼ばれる）を含むことが望ましい。またそれは、Ｔｍｓ含有部分のファミリーにおける１つのメンバーとして機能し得ることが望ましく、ここでファミリーのメンバーは各々が異なる質量／電荷の比を有するが、質量分析器においてほぼ同一の感度を有する。従って、ファミリーのメンバーは同一のＭＳＳＥを有することが望ましい。化合物のファミリーの作製を可能にするために、モジュール式合成スキームを介してタグ反応部を生成することが好都合であると見出されており、その結果タグ成分自身はモジュールを含んでいると見なされる。
【０１６９】
Ｔｍｓ基の構造への好ましいモジュール式アプローチにおいて、Ｔｍｓは以下の式を有する：
Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−
ここで、Ｔ２は、１５〜５００ダルトンの質量幅を有する、炭素および１個以上の水素、フッ素、ヨウ素、酸素、窒素、硫黄、およびリンから形成される有機部分であり；Ｔ３は、５０〜１０００ダルトンの質量幅を有する、炭素および１個以上の水素、フッ素、ヨウ素、酸素、窒素、硫黄、およびリンから形成される有機部分であり；Ｊは、直接の結合であるか、または以下のような官能基である：アミド、エステル、アミン、スルフィド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオエーテル、尿素、チオ尿素、カルバメート、チオカルバメート、Ｓｃｈｉｆｆ塩基、還元型Ｓｃｈｉｆｆ塩基、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスホンアミド、スルホネート、スルホンアミド、または炭素−炭素結合；そしてｎは１〜５０の範囲の整数であり、これによって、ｎが１より大きい場合、各Ｔ３およびＪは独立して選択される。
【０１７０】
モジュラー構造Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−は、Ｔ−Ｌ−Ｘ化合物のファミリーへの好都合な入口を提供し、ここでファミリーの各メンバーは異なるＴ基を有する。例えば、ＴがＴｍｓであり、そして各ファミリーメンバーが望ましくは同一のＭＳＳＥを有する場合、Ｔ３基の１つはＭＳＳＥ構造を提供する。Ｔｍｓの質量に関してファミリーのメンバー間の変動性を提供するために、Ｔ２基はファミリーメンバーの間で変動し得る。例えば、１つのファミリーメンバーはＴ２＝メチルを有し得るが、別のものはＴ２＝エチルを有し得、そして別のものはＴ２＝プロピルを有し得る、などである。
【０１７１】
質量に「著しい」飛躍または大きな飛躍を提供するために、Ｔ３基はＴ−Ｌ−Ｘに有意の（例えば、百または数百の）質量単位を付加するように設計され得る。そのようなＴ３基は、分子量幅調節基（「ＷＲＡ」）と言われ得る。ＷＲＡは、限界幅を超えて広がる質量を有するＴ２の単一のセットと共に作用する場合、非常に有用である。単一のセットのＴ２基は、単に１以上のＷＲＡ  Ｔ３基をＴｍｓ中に取り込むことにより、幅広い質量を有するＴｍｓ基を作製するために使用され得る。従って、単純な例を使用すると、１セットのＴ２基がＴｍｓについて２５０〜３４０ダルトンの質量幅を与える場合、例示的な数である１００ダルトンをＴ３基として有する単一のＷＲＡの付加は、同一のセットのＴ２基を使用しながら、３５０〜４４０ダルトンの質量幅へのアクセスを提供する。同様に、２つの１００ダルトンＭＷＡ基の付加（各々がＴ３基として）は、４５０〜５４０ダルトンの質量幅へのアクセスを提供し、ここでこのＷＲＡ基の増加的な付加は継続され得、Ｔｍｓ基について非常に大きな質量幅へのアクセスを提供する。式Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−Ｌ−Ｘの好ましい化合物は、式ＲＶＭＣ−（ＲＷＲＡ）ｗ−ＲＭＳＳＥ−Ｌ−Ｘを有し、ここで、ＶＷＣは「Ｔ２」基であり、そしてＷＲＡおよびＭＳＳＥ基の各々は「Ｔ３」基である。この構造は図１２に図示されており、そしてＴｍｓの調製への１つのモジュール式アプローチを表す。
【０１７２】
式Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−において、Ｔ２およびＴ３は、好ましくは以下から選択される：ヒドロカルビル、ヒドロカルビル−Ｏ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−Ｓ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−ＮＨ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−アミド−ヒドロカルビレン、Ｎ−（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、Ｎ，Ｎ−ジ（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、ヒドロカルビルアシル−ヒドロカルビレン、ヘテロシクリルヒドロカルビル（ここで、ヘテロ原子は酸素、窒素、硫黄、およびリンから選択される）、置換ヘテロシクリルヒドロカルビル（ここで、ヘテロ原子は酸素、窒素、硫黄、およびリンから選択され、そして置換基は以下から選択される：ヒドロカルビル、ヒドロカルビル−Ｏ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−ＮＨ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−Ｓ−ヒドロカルビレン、Ｎ−（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、Ｎ，Ｎ−ジ（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、およびヒドロカルビルアシル−ヒドロカルビレン）。さらに、Ｔ２および／またはＴ３は、１個以上の水素がフッ素で置き換えられているような、以前に表記された任意の潜在的Ｔ２／Ｔ３基の誘導体であり得る。
【０１７３】
また、式Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−に関して、好ましいＴ３は式−Ｇ（Ｒ２）−を有し、ここでＧは単一のＲ２置換基を有するＣ１−６アルキレン鎖である。従って、Ｇがエチレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−）である場合、１個または２個のいずれかのエチレン炭素はＲ２置換基を有し、そしてＲ２は以下から選択される：アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール縮合シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、アラルキル、アリール置換アルケニルもしくはアルキニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換シクロアルキル、ビアリール、アルコキシ、アルケノキシ、アルキノキシ、アラルコキシ、アリール置換アルケノキシもしくはアルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノもしくはアルキニルアミノ、アリール置換アルキルアミノ、アリール置換アルケニルアミノもしくはアルキニルアミノ、アリールオキシ、アリールアミノ、Ｎ−アルキル尿素置換アルキル、Ｎ−アリール尿素置換アルキル、アルキルカルボニルアミノ置換アルキル、アミノカルボニル置換アルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリル置換アルキル、ヘテロシクリル置換アミノ、カルボキシアルキル置換アラルキル、オキソカルボシクリル縮合アリール、およびヘテロシクリルアルキル；シクロアルケニル、アリール置換アルキルおよびアラルキル、ヒドロキシ置換アルキル、アルコキシ置換アルキル、アラルコキシ置換アルキル、アルコキシ置換アルキル、アラルコキシ置換アルキル、アミノ置換アルキル、（アリール置換アルキルオキシカルボニルアミノ）置換アルキル、チオール置換アルキル、アルキルスルホニル置換アルキル、（ヒドロキシ置換アルキルチオ）置換アルキル、チオアルコキシ置換アルキル、ヒドロカルビルアシルアミノ置換アルキル、ヘテロシクリルアシルアミノ置換アルキル、ヒドロカルビル置換ヘテロシクリルアシルアミノ置換アルキル、アルキルスルホニルアミノ置換アルキル、アリールスルホニルアミノ置換アルキル、モルホリノアルキル、チオモルホリノアルキル、モルホリノカルボニル置換アルキル、チオモルホリノカルボニル置換アルキル、［Ｎ−（アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル）−  または  Ｎ，Ｎ−（ジアルキル、ジアルケニル、ジアルキニル、もしくは（アルキル、アルケニル）−アミノ］カルボニル置換アルキル、ヘテロシクリルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルケンアミノカルボニル、ヘテロシクリルアミノカルボニル置換アルキル、ヘテロシクリルアルケンアミノカルボニル置換アルキル、Ｎ，Ｎ−［ジアルキル］アルキレンアミノカルボニル、Ｎ，Ｎ−［ジアルキル］アルキレンアミノカルボニル置換アルキル、アルキル置換ヘテロシクリルカルボニル、アルキル置換ヘテロシクリルカルボニルアルキル、カルボキシル置換アルキル、ジルキルアミノ置換アシルアミノアルキル、および以下から選択されるアミノ酸側鎖：アルギニン、アルバラギン、グルタミン、Ｓ−メチルシステイン、メチオニン、ならびにそれらの対応するスルホキシドおよびスルホン誘導体、グリシン、ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、アラニン��オルニチン、ヒスチジン、グルタミン、バリン、トレオニン、セリン、アスパラギン酸、β−シアノアラニン、およびアロトレオニン；アリニルおよびヘテロシクリルカルボニル、アミノカルボニル、アミド、モノまたはジアルキルアミノカルボニル、モノまたはジアリールアミノカルボニル、アルキルアリールアミノカルボニル、ジアリールアミノカルボニル、モノまたはジアシルアミノカルボニル、芳香族または脂肪族アシル、必要に応じて以下から選択される置換基によって置換されたアルキル：アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、メルカプト、モノまたはジアルキルアミノ、モノまたはジアリールアミノ、アルキルアリールアミノ、ジアリールアミノ、モノまたはジアシルアミノ、アルコキシ、アルケノキシ、アリールオキシ、チオアルコキシ、チオアルケノキシ、チオアルキノキシ、チオアリールオキシ、およびヘテロシクリル。
【０１７４】
式Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−Ｌ−Ｘの好ましい化合物は、以下の構造を有する：
【０１７５】
【化１８】
2008183012.tif 000019
ここでＧは（ＣＨ２）１−６であり、それによって、単一の「Ｇ」で表される１つのかつ唯一のＣＨ２基上の水素が−（ＣＨ２）Ｃ−アミド−Ｔ４に置き換えられ；Ｔ２およびＴ４は、式Ｃ１−２５Ｎ０−９Ｏ０−９ＨαＦβの有機部分であり、それによって、αおよびβの合計は、Ｈ原子およびＦ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子、およびＯ原子の原子価を満たすのに十分であり；アミドは以下の式であり：
【０１７６】
【化１９】
2008183012.tif 000020
ここでＲ１は水素またはＣ１−１０アルキルであり；ｃは０〜４の範囲の整数であり；そしてｎは１〜５０の範囲の整数であり、これによって、ｎが１より大きい場合、Ｇ、ｃ、アミド、Ｒ１、およびＴ４は独立して選択される。
【０１７７】
さらに好ましい実施態様において、式Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−Ｌ−Ｘの化合物は以下の構造を有する：
【０１７８】
【化２０】
2008183012.tif 000021
ここでＴ５は、式Ｃ１−２５Ｎ０−９Ｏ０−９ＨαＦβの有機部分であり、それによって、αおよびβの合計は、Ｈ原子およびＦ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子、およびＯ原子の原子価を満たすのに十分であり；そしてＴ５は三級または第四級アミンまたは有機酸を含み；ｍは０〜４９の範囲の整数であり、そしてＴ２、Ｔ４、Ｒ１、Ｌ、およびＸは以前に定義されている。
【０１７９】
式Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−Ｌ−Ｘを有する別の好ましい化合物は、以下の特定の構造を有する：
【０１８０】
【化２１】
2008183012.tif 000022
ここでＴ５は、式Ｃ１−２５Ｎ０−９Ｏ０−９ＨαＦβの有機部分であり、それによって、αおよびβの合計は、Ｈ原子およびＦ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子、およびＯ原子の原子価を満たすのに十分であり；そしてＴ５は三級または第四級アミンまたは有機酸を含み；ｍは０〜４９の範囲の整数であり、そしてＴ２、Ｔ４、ｃ、Ｒ１、「アミド」、Ｌ、およびＸは以前に定義されている。
【０１８１】
Ｔ５基を有する上記の構造において、−アミド−Ｔ５は、好ましくは以下の１つであり、これらは有機酸を「Ｇ」から伸びる遊離のアミノ基と反応させることにより好都合に調製され得る：
【０１８２】
【化２２】
2008183012.tif 000023
上記の化合物がＴ５基を有し、そして「Ｇ」基が遊離のカルボキシル基（またはそれらの反応性等価体）を有する場合、以下が好ましい−アミド−Ｔ５基であり、これらは適切な有機アミンを「Ｇ」から伸びる遊離のカルボキシル基と反応させることにより好都合に調製され得る：
【０１８３】
【化２３】
2008183012.tif 000024
本発明の３つの好ましい実施態様において、Ｔ−Ｌ−ＭＯＩは以下の構造を有する：
【０１８４】
【化２４】
2008183012.tif 000025
あるいは以下の式を有する：
【０１８５】
【化２５】
2008183012.tif 000026
あるいは以下の式を有する：
【０１８６】
【化２６】
2008183012.tif 000027
ここでＴ２およびＴ４は、式Ｃ１−２５Ｎ０−９Ｏ０−９Ｓ０−３Ｐ０−３ＨαＦβＩδの有機部分であり、それによって、α、β、およびδの合計は、Ｈ原子、Ｆ原子、Ｉ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、およびＰ原子の原子価を満たすのに十分であり；Ｇは（ＣＨ２）１−６であり、ここで各Ｇで表されるＣＨ２基上の１つのそして唯一の水素は−（ＣＨ２）Ｃ−アミド−Ｔ４に置き換えられており；アミドは以下の式であり：
【０１８７】
【化２７】
2008183012.tif 000028
ここでＲ１は水素またはＣ１−１０アルキルであり；ｃは０〜４の範囲の整数であり；「Ｃ２−Ｃ１０」は２〜１０の炭素原子を有するヒドロカルビレン基を表し、「ＯＤＮ−３’−ＯＨ」は末端３’ヒドロキシル基を有する核酸フラグメント（すなわち、核酸フラグメントの３’末端以外において（Ｃ１−Ｃ１０）に結合した核酸フラグメント）を表し；そしてｎは１〜５０の範囲の整数であり、これによって、ｎが１より大きい場合、Ｇ、ｃ、アミド、Ｒ１、およびＴ４は独立して選択される。好ましくは、単一の炭素原子に結合した３個のヘテロ原子は存在しない。
ここでＴ２およびＴ４は、式Ｃ１−２５Ｎ０−９Ｏ０−９ＨαＦβの有機部分であり、それによって、αとβとの合計は、Ｈ原子およびＦ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子、およびＯ原子の原子価を満たすのに十分であり；Ｇは（ＣＨ２）１−６であり、ここで各Ｇで表されるＣＨ２基上の１つのそして唯一の水素は−（ＣＨ２）Ｃ−アミド−Ｔ４に置き換えられており；アミドは以下の式であり：
【０１８８】
【化２８】
2008183012.tif 000029
ここでＲ１は水素またはＣ１−１０アルキルであり；ｃは０〜４の範囲の整数であり；「ＯＤＮ−３’−ＯＨ」は末端３’ヒドロキシル基を有する核酸フラグメントを表し；そしてｎは１〜５０の範囲の整数であり、ｎが１より大きい場合、Ｇ、ｃ、アミド、Ｒ１、およびＴ４は独立して選択される。
【０１８９】
上記で示されたＴ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−基を含有する構造において、この基は式ＨＮ（Ｒ１）−のアミンを以下から選択される有機酸（これらは単に例示的であって、潜在的な有機酸の余すところのないリストを構成していない）と反応させることにより形成され得る：ギ酸、酢酸、プロピオール酸、プロピオン酸、フルオロ酢酸、２−ブチン酸、シクロプロパンカルボン酸、酪酸、メトキシ酢酸、ジフルオロ酢酸、４−ペンチン酸、シクロブタンカルボン酸、３，３−ジメチル酢酸、吉草酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｎ−ホルミル−Ｇｌｙ−ＯＨ、エトキシ酢酸、（メトキシチオ）酢酸、ピロール−２−カルボン酸、３−フル酸（ｆｕｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、イソオキサゾール−５−カルボン酸、ｔｒａｎｓ−３−ヘキセン酸、トリフルオロ酢酸、ヘキサン酸、Ａｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−ヒドロキシ−２−メチル酪酸、安息香酸、ニコチン酸、２−ピラジンカルボン酸、１−メチル−２−ピロールカルボン酸、２−シクロペンテン−１−酢酸、シクロペンチル酢酸、（Ｓ）−（−）−２−ピロリドン−５−カルボン酸、Ｎ−メチル−Ｌ−プロリン、ヘプタン酸、Ａｃ−ｂ−Ａｌａ−ＯＨ、２−エチル−２−ヒドロキシ酪酸、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸、ｐ−トルイン酸、６−メチルニコチン酸、５−メチル−２−ピラジンカルボン酸、２，５−ジメチルピロール−３−カルボン酸、４−フルオロ安息香酸、３，５−ジメチルイソオキサゾール−４−カルボン酸、３−シクロペンチルプロピオン酸、オクタン酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルスクシンアミド酸（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、フェニルプロピオン酸、ケイヒ酸、４−エチル安息香酸、ｐ−アニス酸、１，２，５−トリメトキシピロール−３−カルボン酸、３−フルオロ−４−メチル安息香酸、Ａｃ−ＤＬ−プロパルギルグリシン、３−（トリフルオロメチル）酪酸、１−ピペリジンプロピオン酸、Ｎ−アセチルプロリン、３，５−ジフルオロ安息香酸、Ａｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨ、インドール−２−カルボン酸、２−ベンゾフランカルボン酸、ベンゾトリアゾール−５−カルボン酸、４−ｎ−プロピル安息香酸、３−ジメチルアミノ安息香酸、４−エトキシ安息香酸、４−（メチルチオ）安息香酸、Ｎ−（２−フロイル）グリシン、２−（メチルチオ）ニコチン酸、３−フルオロ−４−メトキシ安息香酸、Ｔｆａ−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−ナフトエ酸、キナルジン酸、Ａｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、３−メチルリンデン−２−カルボン酸、２−キノキサリンカルボン酸、１−メチルインドール−２−カルボン酸、２，３，６−トリフルオロ安息香酸、Ｎ−ホルミル−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ、２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］酢酸、４−ｎ−ブチル安息香酸、Ｎ−ベンゾイルグリシン、５−フルオロインドール−２−カルボン酸、４−ｎ−プロポキシ安息香酸、４−アセチル−３，５−ジメチル−２−ピロール安息香酸、３，５−ジメトキシ安息香酸、２，６−ジメトキシニコチン酸、シクロヘキサンペンタン酸、２−ナフチル酢酸、４−（１Ｈ−ピロール−１−イル）安息香酸、インドール−３−プロピオン酸、ｍ−トリフルオロメチル安息香酸、５−メトキシインドール−２−カルボン酸、４−ペンチル安息香酸、Ｂｚ−ｂ−Ａｌａ−ＯＨ、４−ジ��チルアミノ安息香酸、４−ｎ−ブトキシ安息香酸、３−メチル−５−ＣＦ３−イソオキサゾール−４−カルボン酸、（３，４−ジメトキシフェニル）酢酸、４−ビフェニルカルボン酸、ピバロール−Ｐｒｏ−ＯＨ、オクタノール−Ｇｌｙ−ＯＨ、（２−ナフトキシ）酢酸、インドール−３−酪酸、４−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸、５−メトキシインドール−３−酢酸、４−（トリフルオロメトキシ）安息香酸、Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−ペンチルオキシ安息香酸、Ｚ−Ｇｌｙ−ＯＨ、４−カルボキシ−Ｎ−（フル−２−イルメチル）ピロリジン−２−オン、３，４−ジエトキシ安息香酸、２，４−ジメチル−５−ＣＯ２Ｅｔ−ピロール−３−カルボン酸、Ｎ−（２−フルオロフェニル）スクシンアミド酸（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、３，４，５−トリメトキシ安息香酸、Ｎ−フェニルアントラニル酸、３−フェノキシ安息香酸、ノナノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−フェノキシピリジン−３−カルボン酸、２，５−ジメチル−１−フェニルピロール−３−カルボン酸、ｔｒａｎｓ−４−（トリフルオロメチル）ケイヒ酸、（５−メチル−２−フェニルオキサゾール−４−イル）酢酸、４−（２−シクロヘキセニルオキシ）安息香酸、５−メトキシ−２−メチルインドール−３−酢酸、ｔｒａｎｓ−４−コチニンカルボン酸、Ｂｚ−５−アミノ吉草酸、４−ヘキシルオキシ安息香酸、Ｎ−（３−メトキシフェニル）スクシンアミド酸（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｚ−Ｓａｒ−ＯＨ、４−（３，４−ジメトキシフェニル）酪酸、Ａｃ−ｏ−フルオロ−ＤＬ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｎ−（４−フルオロフェニル）グルタミン酸、４’−エチル−４−ビフェニルカルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロアクリジンカルボン酸、３−フェノキシフェニル酢酸、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）スクシンアミド酸（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｎ−デカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、（＋）−６−メトキシ−ａ−メチル−２−ナフタレン酢酸、３−（トリフルオロメトキシ）ケイヒ酸、Ｎ−ホルミル−ＤＬ−Ｌｅｕ−ＯＨ、（Ｒ）−（＋）−ａ−メトキシ−ａ−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸、Ｂｚ−ＤＬ−Ｌｅｕ−ＯＨ、４−（トリフルオロメトキシ）フェノキシ酢酸、４−ヘプチルオキシ安息香酸、２，３，４−トリメトキシケイヒ酸、２，６−ジメトキシベンゾイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロピオン酸、２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェノキシ酢酸、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）グルタミン酸、Ｎ−ウンデカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−（４−フルオロベンジル）安息香酸、５−トリフルオロメトキシインドール−２−カルボン酸、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）ジグルコラミン酸、Ａｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｔｆａ−Ｌ−フェニルグリシン−ＯＨ、３−ヨード安息香酸、３−（４−ｎ−ペンチルベンゾイル）プロピオン酸、２−フェニル−４−キノリンカルボン酸、４−オクチルオキシ安息香酸、Ｂｚ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ、３，４，５−トリエトキシ安息香酸、Ｎ−ラウロイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３，５−ビス（トリフルオロメチル）安息香酸、Ａｃ−５−メチル−ＤＬ−Ｔｒｐ−ＯＨ、２−ヨードフェニル酢酸、３−ヨード−４−��チル安息香酸、３−（４−ｎ−ヘキシルベンゾイル）プロピオン酸、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−ノニルオキシ安息香酸、４’−（トリフルオロメチル）−２−ビフェニルカルボン酸、Ｂｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｎ−トリデカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル酢酸、３−（４−ｎ−ヘプチルベンゾイル）プロピオン酸、Ｎ−ヘプタノイル−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−デシルオキシ安息香酸、Ｎ−（α，α，α−トリフルオロ−ｍ−トリル）アントラニル酸、ニフルム酸（ｎｉｆｌｕｍｉｃ  ａｃｉｄ）、４−（２−ヒドロキシヘキサフルオロイソプロピル）安息香酸、Ｎ−ミリストイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３−（４−ｎ−オクチルベンゾイル）プロピオン酸、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−ウンデシルオキシ安息香酸、３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロピオニル−Ｇｌｙ−ＯＨ、８−ヨードナフトエ酸、Ｎ−ペンタデカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、４−ドデシルオキシ安息香酸、Ｎ−パルミトイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、およびＮ−ステアロイル−Ｇｌｙ−ＯＨ。これらの有機酸は、以下の１社以上から入手可能である：Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，  Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，  ＫＹ；Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｒｒａｎｃｅ，  ＣＡ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ；Ｆａｒｃｈａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ  ＦＬ；Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｗｉｎｄｈａｍ  ＮＨ；およびＭａｙＢｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （ｃ／ｏ  Ｒｙａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，  ＳＣ。これらの企業からのカタログは、酸を同定するために上記で使用されている省略形を使用する。
【０１９０】
ｆ．タグを調製するための手段としてのコンビナトリアルケミストリー
コンビナトリアルケミストリーは、大きな化学ライブラリの産生を導く一種の合成戦略である（例えば、ＰＣＴ出願公表第ＷＯ  ９４／０８０５１号を参照のこと）。これらのコンビナトリアルライブラリは、目的の分子（ＭＯＩ）の同定のためのタグとして使用され得る。コンビナトリアルケミストリーは、種々の実在分子の巨大なアレイを生じるための、変化する構造の１組の異なる「構築ブロック」の、互いへの体系的かつ反復的な共有結合として定義され得る。構築ブロックは、以下のような多くの天然に存在する形態および合成の形態をとり得る：求核体、求電子体、ジエン、アルキル化剤またはアシル化剤、ジアミン、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、脂質、有機モノマー、シントン、および上記形態の組合せ。構築ブロックを結合するために使用される化学反応は、アルキル化、アシル化、酸化、還元、加水分解、置換、脱離、付加、環化、縮合などである。このプロセスは化合物のライブラリを産生し得、それらはオリゴマーか、非オリゴマーか、またはそれらの組合せである。オリゴマーである場合、化合物は、分枝であるか、分枝でないか、または環状であり得る。組合せ方法によって調製され得るオリゴマー構造の例には、以下が含まれる：オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴサッカライド、ポリリピド、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリエーテル、ポリ（リン誘導体）（例えば、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスファイト、ホスフィンアミドなど）、およびポリ（硫黄誘導体）（例えば、スルホン、スルホネート、スルファイト、スルホンアミド、スルフェンアミドなど）。
【０１９１】
１つの共通のタイプのオリゴマーコンビナトリアルライブラリは、ペプチドコンビナトリアルライブラリである。ペプチド化学および分子生物学における最近の技術革新により、数千万〜数億の異なるペプチド配列からなるライブラリの調製および使用が可能になっている。そのようなライブラリは、３つの広いカテゴリーに分類され得る。ライブラリの１つのカテゴリーは、可溶性の非支持体結合ペプチドライブラリの化学合成に関する（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４，  １９９１）。第２のカテゴリーは、プラスチックピン、樹脂ビーズ、または綿のような支持体上に提示される、支持体結合ペプチドライブラリの化学合成に関する（Ｇｅｙｓｅｎら，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：７０９，  １９８６；Ｌａｍら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２，  １９９１；ＥｉｃｈｌｅｒおよびＨｏｕｇｈｔｅｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１１０３５，  １９９３）。これら最初２つのカテゴリーにおいて、構築ブロックは、典型的にはＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、非天然型アミノ酸、またはそれらのいくつかの混合物もしくは組合せである。第３のカテゴリーは、糸状ファージ粒子またはプラスミドの表面上のペプチドまたはタンパク質を調製するために、分子生物学アプローチを使用する（ＳｃｏｔｔおよびＣｒａｉｇ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ５：４０，  １９９４）。可溶性の非結合ペプチドライブラリは、タグとしての使用を含む、多くの適用に適切なようである。ペプチドライブラリにおける化学的多様性の利用可能なレパートリーは、過メチル化のような工程によって拡張され得る（Ｏｓｔｒｅｓｈら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ９１：１１１３８，  １９９４）。
【０１９２】
ペプチドコンビナトリアルライブラリの多数の改変体が、ペプチド骨格が修飾される場合、および／またはアミド結合が模倣基に置換されている場合に可能である。使用され得るアミド模倣基には、尿素、ウレタン、およびカルボニルメチレン基が含まれる。側鎖がα炭素よりもむしろ各アミノ酸のアミド窒素から生じるような骨格の再構築は、ペプトイドとして公知の化合物のライブラリを与える（Ｓｉｍｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：９３６７，  １９９２）。
【０１９３】
他の共通のタイプのオリゴマーコンビナトリアルケミストリーは、構築ブロックが天然に存在するかまたは非天然型のヌクレオチドまたは多糖誘導体のいくつかの形態である場合、オリゴヌクレオチドコンビナトリアルケミストリーである。これには種々の有機基および無機基がリン酸結合を置換し得る場合、ならびに窒素または硫黄がエーテル結合中の酸素を置換する場合が含まれる（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３４：９５９９，  １９９５；Ｆｒｅｉｅｒら，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３８：３４４，  １９９５；Ｆｒａｎｋ，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４１：２５９，  １９９５；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，  公表ＰＣＴ第ＷＯ  ９４２０５２号；Ｅｃｋｅｒら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１：１８５３，  １９９３）。
【０１９４】
より最近は、非オリゴマーの小分子化合物の集合体の組合せ生成が記載されている（ＤｅＷｉｔｔら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ９０：６９０，  １９９３；Ｂｕｎｉｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ９１：４７０８，  １９９４）。小分子ライブラリへの仕上げに適切な構造は、以下のような広い種類の有機分子を包含する：例えば、ヘテロ環状、芳香族、脂環式、脂肪族、ステロイド、抗生物質、酵素阻害剤、リガンド、ホルモン、薬剤、アルカロイド、オピオイド、テルペン、ポルフィリン、トキシン、触媒、ならびにそれらの組合せ。
【０１９５】
ｇ．タグのコンビナトリアル合成のための特異的方法
多様な組のアミン含有ＭＳタグの調製および使用のための２つの方法を以下に概説する。両方法において、コンビナトリアルケミストリーの技術を使用して多数のタグ化リンカーの同時並行合成を可能にするために、固相合成が使用される。第１の方法において、オリゴヌクレオチドからのタグの最終的な切断は、カルボキシルアミドの遊離を生じる。第２の方法において、タグの切断はカルボン酸を生成する。これらの方法において使用された化学的成分および結合要素を、以下のように略記する：
【０１９６】
【化２９】
2008183012.tif 000030
方法１における工程の順序は以下の通りである：
ＯＨ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓  ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣＯ２Ｈ；カップリング（例えば、ＨＢＴＵ）
ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓  ピペリジン（ＦＭＯＣを除去）
ＮＨ２−Ｒｉｎｋ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓  ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ａ−ＣＯＯＨ；カップリング（例えば、ＨＢＴＵ）
ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ａ−ＣＯＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓  ピペリジン（ＦＭＯＣを除去）
ＮＨ２−Ａ−ＣＯＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓  ｎ個のアリコートに分割
↓↓↓↓↓  ｎ個の異なる酸Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＯＨとカップリング
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓↓↓↓↓  １％ＴＦＡを用いて樹脂からタグ化リンカーを切断
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣＯ２Ｈ
↓↓↓↓↓  ｎ個のオリゴ（ｏｌｉｇｏ１…ｏｌｉｇｏ（ｎ））とカップリング
（例えば、Ｐｆｐエステルを介して）
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣＯＮＨ−ｏｌｉｇｏ１…ｏｌｉｇｏ（ｎ）
↓  タグ化オリゴをプール
↓  配列決定反応を実行
↓  配列決定反応由来の異なる長さのフラグメントを分離
（例えば、ＨＰＬＣまたはＣＥを介して）
↓  ２５％〜１００％ＴＦＡを用いてリンカーからタグを切断
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯＮＨ
↓
質量分析法により分析。
【０１９７】
方法２における工程の順序は以下の通りである：
ＯＨ−１ＭｅＯ−ＣＯ２−Ａｌｌ
↓  ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ａ−ＣＯ２Ｈ；カップリング（例えば、ＨＢＴＵ）
ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ａ−ＣＯＯ−１ＭｅＯ−ＣＯ２−Ａｌｌ
↓  パラジウム（アリールを除去）
ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ａ−ＣＯＯ−１ＭｅＯ−ＣＯ２Ｈ
↓  ＯＨ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ；カップリング（例えば、ＨＢＴＵ）
ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ａ−ＣＯＯ−１ＭｅＯ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓  ピペリジン（ＦＭＯＣを除去）
ＮＨ２−Ａ−ＣＯＯ−１ＭｅＯ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓  ｎ個のアリコートに分割
↓↓↓↓↓  ｎ個の異なる酸Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＯＨとカップリング
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯＯ−１ＭｅＯ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓↓↓↓↓  １％ＴＦＡを用いて樹脂からタグ化リンカーを切断
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯＯ−１ＭｅＯ−ＣＯ２Ｈ
↓↓↓↓↓  ｎ個のオリゴ（ｏｌｉｇｏ１…ｏｌｉｇｏ（ｎ））とカップリング
（例えば、Ｐｆｐエステルを介して）
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯＯ−１ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−ｏｌｉｇｏ１…ｏｌｉｇｏ（ｎ）
↓  タグ化オリゴをプール
↓  配列決定反応を実行
↓  配列決定反応由来の異なる長さのフラグメントを分離
（例えば、ＨＰＬＣまたはＣＥを介して）
↓  ２５％〜１００％ＴＦＡを用いてリンカーからタグを切断
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯ２Ｈ
↓
質量分析法により分析。
【０１９８】
２．リンカー
本明細書において使用される「リンカー」成分（またはＬ）は、「タグ」（またはＴ）を「目的の分子」（またはＭＯＩ）に共有結合性の化学的結合を介して連結するために使用される直接的な共有結合または有機的な化学基のいずれかを意味する。さらに、直接的な結合それ自身、またはリンカー成分内の一つ以上の結合は、Ｔ−Ｌ−Ｘ化合物（これはＭＯＩ成分を含む）の残りからＴが遊離される（言い換えれば、切断される）条件下で切断可能である。Ｔ内に存在するタグ可変成分は、切断条件に対して安定であるべきである。好ましくは、切断は、数分以内に、および好ましくは約１５秒以下の内に迅速に達成され得る。
【０１９９】
一般に、リンカーは、タグの大きなセットの各々をＭＯＩの類似の大きなセットの各々に連結するために使用される。代表的には、単一のタグ−リンカーの組合せは各ＭＯＩに結合される（種々のＴ−Ｌ−ＭＯＩを与えるために）が、いくつかの場合において、一つより多いタグ−リンカーの組合せは、各個々のＭＯＩに結合され得る（種々の（Ｔ−Ｌ）ｎ−ＭＯＩを与えるために）。本発明の別の実施態様において、二つ以上のタグが、リンカー上の複数の独立的な部位を介して単一のリンカーに結合され、次いでこの複数のタグ−リンカーの組合せは、個々のＭＯＩに結合される（種々の（Ｔ）ｎ−Ｌ−ＭＯＩを与えるために）。
【０２００】
タグ化ＭＯＩのセットの種々の操作の後で、特定の化学的および／または物理的条件が、リンカー中の一つ以上の共有結合を切断するために使用され、これは、ＭＯＩからのタグの遊離を生じる。切断可能な結合は、タグ、リンカー、およびＭＯＩが、共に連結される場合、形成される同一の結合のいくつかがあってもよいし、なくてもよい。リンカーの設計は、大部分において、切断が達成され得る条件を決定する。従って、リンカーは、それらも特に影響を受けやすい切断条件によって同定され得る。リンカーが光不安定性（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）である（すなわち、化学放射線への曝露によって切断される傾向がある）場合、リンカーはＬｈυと命名され得る。同様に、命名Ｌａｃｉｄ、Ｌｂａｓｅ、Ｌ［Ｏ］、Ｌ［Ｒ］、Ｌｅｎｚ、Ｌｅｌｃ、ＬΔ、およびＬＳＳが、酸、塩基、化学的酸化、化学的還元、酵素の触媒活性（より単純には「酵素」）、電気化学的酸化または還元、高温（「熱」）、およびチオール交換のそれぞれに特に影響を受けやすいリンカーに言及するために使用され得る。
【０２０１】
リンカーの特定の型は、単一の型の切断条件に対して不安定であるが、一方リンカーの他の型はいくつかの型の切断条件に対して不安定である。さらに、複数のタグ（（Ｔ）ｎ−Ｌ−ＭＯＩ型構造を与える）を結合し得るリンカーにおいて、タグ結合部位の各々は、異なる切断条件に不安定に成り得る。例えば、リンカーに結合される二つのタグを有するそのリンカーにおいて、タグの一方は塩基に対してのみ不安定に成り得、そして他方は、光分解に対してのみ不安定に成り得る。
【０２０２】
本発明において有用なリンカーは、いくつかの属性を有する：
１）リンカーは化学的ハンドル（Ｌｈ）を有し、それを介してリンカーはＭＯＩに結合され得る。
【０２０３】
２）リンカーは、第二の別の化学的ハンドル（Ｌｈ）を有し、それを介してタグはリンカーに結合する。もし複数のタグが単一のリンカーに結合されるならば（（Ｔ）ｎ−Ｌ−ＭＯＩ型構造）、次いで別のハンドルが各タグについて存在する。
【０２０４】
３）リンカーは、Ｔ含有部分が化合物の残り（これはＭＯＩを含む）から遊離されるように切断を可能にする条件を例外として、供される全ての操作に対して安定である。従って、リンカーは、タグのリンカーへの結合の間、リンカーのＭＯＩへの結合の間、そしてタグおよびリンカー（Ｔ−Ｌ）がＭＯＩに結合される間のＭＯＩの任意の操作の間安定である。
【０２０５】
４）リンカーは、Ｔ−ＬがＭＯＩに結合される間、ＭＯＩ上で行われる操作に有意に干渉しない。例えば、Ｔ−Ｌがオリゴヌクレオチドに結合される場合、Ｔ−Ｌは、オリゴヌクレオチド上で行われる全てのハイブリダイゼーションまたは酵素反応（例えばＰＣＲ）に有意に干渉してはならない。同様に、Ｔ−Ｌが抗体に結合される場合、それは抗体による抗原認識に有意に干渉してはならない。
【０２０６】
５）タグの検出可能性に悪影響を与えない物理的または化学的プロセスを使用して、化合物の残りからのタグの切断は、高度に制御された様式で生じる。
【０２０７】
任意の所定のリンカーについて、リンカーが広範な種々のＭＯＩに結合可能で、そして広範な種々のタグが、リンカーに結合可能であることが望ましい。このような柔軟性は、一旦調製されれば、いくつかの異なるセットのＭＯＩを用いて使用されるＴ−Ｌ結合物のライブラリーを可能にするので、利点に富む。
【０２０８】
上記に説明されたように、好ましいリンカーは以下の式を有する。
【０２０９】
Ｌｈ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌｈ
ここで、各Ｌｈは、リンカーをタグ反応物および目的の反応物の分子と連結するために使用され得る反応性ハンドルである。Ｌ２はリンカーに不安定性を与えるので、Ｌ２はリンカーの不可欠な部分である。Ｌ１およびＬ３は、ハンドルＬｈからＬ２を分離するのに効果的に役立つ任意の基である。
【０２１０】
Ｌ１（これは、定義によって、Ｌ３よりＴに近い）は、必要とされる不安定部分Ｌ２からＴを分離するために役立つ。この分離は、切断反応がＴ含有部分の構造においてランダムな変化を生じ得る特定の反応性種（例えば、フリーラジカル）を生じる場合、有用であり得る。切断部位が、Ｔ含有部分からさらに離れている場合、切断部位で形成された反応性種が、Ｔ含有部分の構造を破壊する減少した可能性がある。さらに、Ｌ１における原子は、代表的には、Ｔ含有部分に存在する場合、これらＬ１原子は、Ｔ含有部分に望ましい質で特性を付与し得る。例えば、Ｔ含有部分が、Ｔｍｓ含有部分であり、そして妨害された（ｈｉｎｄｅｒｅｄ）アミンがＴｍｓ含有部分の構造の部分として望ましく存在する（例えば、ＭＳＳＥとして作用する）場合、妨害されたアミンはＬ１不安定部分に存在し得る。
【０２１１】
他の例において、Ｌ１および／またはＬ３は、単にリンカー成分中に存在し得る。なぜならば、リンカーの商業的な供給業者は、そのようなＬ１および／またはＬ３基を有する形態でリンカーを販売するように選択しているからである。そのような例において、Ｌ１および／またはＬ３基は、それらを組み込む化合物に対して性能利点を何ら特に寄与し得ないが、Ｌ１および／またはＬ３基を有するリンカーを使用することに害はない（これらの基が、切断反応を阻害しない限り）。従って、本発明は、Ｌ１および／またはＬ３基がリンカー成分中に存在することを可能にする。
【０２１２】
Ｌ１および／またはＬ３基は、直接的な結合（この場合において、基は実際には存在しない）、ヒドロカルビレン基（例えば、アルキレン、アリーレン、シクロアルキレンなど）、−Ｏ−ヒドロカルビレン（例えば、−Ｏ−ＣＨ２−、Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−など）、またはヒドロカルビレン−（Ｏ−ヒドロカルビレン）Ｗ−（ここでＷは、１〜約１０の範囲にある整数である）（例えば、−ＣＨ２−Ｏ−Ａｒ−、ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）４−など）であり得る。
【０２１３】
固相合成法の出現があったので、特定の反応条件に不安定なリンカーに関する多くの文献が、展開されてきた。代表的な固相合成において、固体支持体は、反応性部位に不安定なリンカーを介して結合され、そして合成されるべき分子は、反応性部位で生成される。分子が完全に合成された場合、固体支持体−リンカー−分子構築物は、固体支持体から分子を遊離する切断条件に供される。この状況における使用のために、開発されてきた不安定なリンカー（またはこの状況において使用され得る）はまた、本発明におけるリンカー反応物として容易に使用され得る。
【０２１４】
Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｐら、「Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．  ３４７，  ４９（４８）：１１０６５−１１１３３（１９９３）は、化学放射線（すなわち、光分解）ならびに酸、塩基、および他の切断条件に不安定なリンカーの広範な議論を提供する。不安定なリンカーについての情報のさらなる供給源は当該分野で周知である。
【０２１５】
上記のように、異なるリンカー設計は、異なる特定の物理的または化学的条件下で切断可能性（「不安定性」）を与える。種々の設計のリンカーを切断するのに役立つ条件の例は、酸、塩基、酸化、還元、フッ素、チオール交換、光分解、および酵素的な条件を含む。
【０２１６】
上記のリンカーについての一般的な基準を満足する切断可能なリンカーの例は当業者に周知であり、そしてＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能なカタログにおいて見出されるリンカーを含む。例は、以下を含む：
・エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ヒドロキルシアミンによって切断可能である（３７℃にて３〜６時間で１Ｍ）アミン反応性架橋試薬；
・ジスクシンイミジル酒石酸（ＤＳＴ）およびスルホ−ＤＳＴである（これは０．０１５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムによって切断可能であるアミン反応性架橋試薬；
・ビス［２−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）およびスルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ（これらは塩基（ｐＨ１１．６）によって切断可能なアミン反応性架橋試薬である）；
・１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ（プロピオンアミド））ブタン（ＤＰＤＰＢ）（チオール交換または還元によって切断可能であるピリジルジチオール架橋剤）；
・Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）−ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）（チオール交換または還元によって切断可能であるピリジルジチオール架橋剤）；
・ビス−［β−４−（アジドサリチルアミド）エチル］−ジスルフィド（チオール交換または還元によって切断可能である光反応性架橋剤）；
・Ｎ−スクシンイミジル−（４−アジドフェニル）−１，３’ジチオプロピオネート（ＳＡＤＰ）（チオール交換または還元によって切断可能である光反応性の架橋剤）；
・スルホスクシンイミジル−２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＥＤ）（チオール交換または還元によって切断可能である光反応性架橋剤）；
・スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−Ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’ジチオプロピオネート（ＳＡＮＤ）（チオール交換または還元によって切断可能である光反応性架橋剤）。
【０２１７】
タグを放出するために使用され得る切断可能なリンカーおよび切断条件の他の例は、以下である。シリル結合基は、フッ素によってかまたは酸条件下で切断され得る。３−、４−、５−、または６−置換−２−ニトロベンジルオキシまたは２−、３−、５−、または６−置換−４−ニトロベンジルオキシ結合基は、光子源によって切断さ得る（光分解）。３−、４−、５、または６−置換−２−アルコキシフェノキシまたは２−、３−、５−、または６−置換−４−アルコキシフェノキシ結合基は、Ｃｅ（ＮＨ４）２（ＮＯ３）６（酸化）によって切断され得る。ＮＣＯ２（ウレタン）リンカーは、水酸化物（塩基）、酸、またはＬｉＡＬＨ４（還元）によって切断され得る。３−ペンテニル、２−ブテニル、または１−ブテニル結合基は、Ｏ３、ＯＳＯ４／ＩＯ４−またはＫＭｎＯ４（酸化）によって切断され得る。２−［３−、４−、または５−置換フリル］オキシ結合基は、Ｏ２、Ｂｒ２、ＭｅＯＨまたは酸によって切断され得る。
【０２１８】
他の不安定な結合基の切断のための条件は、以下を含む：ｔ−アルキルオキシ結合基は酸によって切断され得る；メチル（ジアルキル）メトキシまたは４−置換−２−アルキル−１，３−ジオキサレン（ｄｉｏｘｌａｎｅ）−２−イル結合基は、Ｈ３Ｏ＋によって切断され得る；２−シリルエトキシ結合基は、フッ素または酸によって切断され得る；２−（Ｘ）−エトキシ（ここでＸ＝ケト、エステル、アミド、シアノ、ＮＯ２、スルフィド、スルホキシド、スルホン）結合基は、アルカリ条件下で切断され得る；２−、３−、４−、５−、または６−置換−ベンジルオキシ結合基は、酸または還元条件により切断され得る；２−ブテニルオキシ基は、（Ｐｈ３Ｐ）３ＲｈＣｌ（Ｈ）によって切断され得る、３−、４−、５−、または６−置換−２−ブロモフェノキシ結合基は、Ｌｉ、Ｍｇ、またはＢｕＬｉによって切断され得る；メチルチオメトキシ結合基はＨｇ２＋によって切断され得る；２−（Ｘ）−エチルオキシ（ここでＸ＝ハロゲン）結合基はＺｎまたはＭｇによって切断され得る；２−ヒドロキシエチルオキシ結合基は、酸化（例えば、Ｐｂ（ＯＡｃ）４を用いて）切断され得る。
【０２１９】
好ましいリンカーは、酸または光分解によって切断されるリンカーである。固相ペプチド合成のために開発されてきたいくつかの酸不安定リンカーは、タグをＭＯＩに架橋するに有用である。これらのリンカーのいくつかは、Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：１１０６５−１１１３３，  １９９３）による最新の総説によって記載される。リンカーの一つの有用な型は、ｐ−アルコキシベンジルアルコールに基づき、その内の二つ、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸および４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）酪酸は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，  ＫＹ）から入手可能である。両方のリンカーが、ベンジルアルコールへのエステル結合を介してタグに結合され得、カルボン酸へのアミド結合を介してアミン含有ＭＯＩと結合され得る。これらの分子によって結合されたタグは、多様な濃度のトリフルオロ酢酸を用いてＭＯＩから遊離される。これらの分子の切断は、タグ上のカルボン酸の遊離を生じる。関連するリンカー（例えば、２，４−ジメトキシ−４’−（カルボキシメチルオキシ）−ベンズヒドリルアミン（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈからＦＭＯＣ保護形態で入手可能）を介して結合されたタグの酸切断は、遊離されたタグ上のカルボン酸アミドの遊離を生じる。
【０２２０】
本願にとって有用な光不安定性リンカーはまた、固相ペプチド合成のために最も開発された部分であった（Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ総説を参照のこと）。これらのリンカーは、通常、２−ニトロベンジルエステルまたは２−ニトロベンジルアミドに基づく。文献において最近報告されている光不安定性リンカーの二つの例は、４−（４−（１−Ｆｍｏｃ−アミノ）エチル）−２−メトキシ−５−ニトロフェノキシ）ブタン酸（ＨｏｌｍｅｓおよびＪｏｎｅｓ、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ６０：２３１８−２３１９，  １９９５）および３−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−３−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸（Ｂｒｏｗｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  １：４−１２，  １９９５）である。両リンカーは、ＭＯＩ上でカルボン酸を介してアミンに結合され得る。リンカーへのタグの結合は、タグ上のカルボン酸とリンカー上のアミンとの間でアミドを形成することによって作製される。光不安定性リンカーの切断は、通常、強度で３５０ｎｍ波長のＵＶ光および当業者に公知の時間を用いて行われる。リンカーの切断は、タグ上の一級アミドの遊離を生じる。感光性リンカーの例は、ニトロフェニルグリシンエステル、ｅｘｏ−およびｅｎｄｏ−２−ベンゾノルボルネリルクロライドおよびメタンスルホネート、および３−アミノ−３（２−ニトロフェニル）プロピオン酸を含む。酵素的切断の例には、エステル結合を切断するエステラーゼ、ホスホジエステル結合を切断するヌクレアーゼ、ペプチド結合を切断するプロテアーゼなどが挙げられる。
【０２２１】
好ましいリンカー成分は以下に示すようなオルト−ニトロベンジル構造を有する；
【０２２２】
【化３０】
2008183012.tif 000031
ここでａ、ｂ、ｃ、ｄ、またはｅ位の一つの炭素原子は、−Ｌ３−Ｘで置換され、そしてＬ１（好ましくは直接的な結合である）は、上記構造中のＮ（Ｒ１）の左に存在する。このようなリンカー成分は、「ａ」と標識された炭素とＮ（Ｒ１）間の結合の選択的な光誘導切断に感受性である。Ｒ１の同一性は、切断反応にとって代表的には重要ではないが、しかしＲ１は、好ましくは、水素およびヒドロカルビルより選択される。本発明は、上記の構造において、−Ｎ（Ｒ１）−が、−Ｏ−で置き換えられ得る。さらに上記構造において、ｂ、ｃ、ｄ、またはｅ位の一つ以上が、必要に応じて、アルキル、アルコキシ、フッ素、クロライド、ヒドロキシル、カルボキシレート、またはアミドで置換され得、ここでこれらの置換基は、各存在で独立して選択される。
【０２２３】
化学ハンドルＬｈを有するさらに好ましいリンカー成分は、以下の構造を有する；
【０２２４】
【化３１】
2008183012.tif 000032
ここで、ｂ、ｃ、ｄ、またはｅ位の一つ以上が、水素、アルキル、アルコキシ、フッ素、クロライド、ヒドロキシル、カルボキシレート、アミドで置換され、Ｒ１は水素またはヒドロカルビルであり、そしてＲ２は、−ＯＨまたは別の部分とのカップリングのためにカルボン酸を保護しているかまたは活性化する基である。フルオロカーボンおよびヒドロフルオロカーボンは、別の部分とのカップリングへ向けてカルボン酸を活性化する好適な基である。
【０２２５】
３．目的の分子（ＭＯＩ）
ＭＯＩの例には、核酸、または核酸アナログ（例えば、ＰＮＡ）、核酸のフラグメント（すなわち、核酸フラグメント）、合成核酸またはフラグメント、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド、抗体、または抗体フラグメント、レセプター、レセプターリガンド、リガンド対メンバー、サイトカイン、ホルモン、オリゴ糖、合成有機分子、薬物およびそれらの組合せが挙げられる。
【０２２６】
好ましいＭＯＩの例には、核酸フラグメントが挙げられる。好ましい核酸フラグメントは、ベクターが、塩基配列決定に使用される場合、ベクターに存在する配列に相補的なプライマー配列である。好ましくは、核酸フラグメントは、フラグメントの３’末端以外、そして最も好ましくはフラグメントの５’末端でタグに直接的または間接的に結合される。核酸フラグメントは、購入され得るかまたは遺伝子データベースに基づいて調製され得る（例えば、Ｄｉｂら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：１５２−１５４，  １９９６およびＣＥＰＨ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｐｈｂ．ｆｒ）および商業的なメーカー（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ））
本明細書中で使用されるＭＯＩは、ＭＯＩをＴ−Ｌ−Ｌｈ化合物へ結合するに有用な官能基を含む誘導体を含む。例えば、ホスホジエステルがまたアルキレンアミンに結合される場合、５’末端にホスホジエステルを有する核酸フラグメントは、ＭＯＩである。このようなＭＯＩは、例えば、米国特許第４，７６２，７７９号（本明細書に参考として援用される）に記載される。内部修飾を有する核酸フラグメントもまたＭＯＩである。核酸フラグメントの例示的な内部修飾は、塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル）が、反応性官能基を付加するように修飾された場合である。このような内部修飾核酸フラグメントは、例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｈｅｒｎｄｏｎ，  ＶＡから市販されている。核酸フラグメントの別の例示的な内部修飾は、核酸フラグメントの糖とホスフェート基の間に挿入される修飾ホスホジエステルを合成するために、塩基のホスホルアミデートが使用される場合である。塩基のホスホルアミデートは、このホスホルアミデート由来の部分を含む核酸フラグメントを別の部分（例えば、Ｔ−Ｌ−Ｌｈ化合物）に結合させる反応性基を含む。このような塩基性ホスホルアミデートは例えば、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡから市販されている。
【０２２７】
４．化学ハンドル（Ｌｈ）
化学ハンドルは、安定でしかし第１の分子の部分として存在する反応性原子配列であり、ここでハンドルは、第２の分子の部分として存在する相補的な化学的ハンドルと、２つの分子間で共有結合を形成するために化学反応を受け得る。例えば、これらの２つのハンドル間の反応が２つの分子を結合させる共有結合（特にエステル基）を形成するに際して、化学ハンドルは、水酸基であり得、そして相補的な化学ハンドルはカルボン酸基であり得る（またはその活性化誘導体（例えば、ヒドロフルオロアリールエステル））。
【０２２８】
化学ハンドルは、タグをリンカーに結合し、そしてリンカーをＭＯＩに結合するに適切な多くの共有結合反応に使用され得る。このような反応に、アルキル化（例えば、エーテル、チオエーテルを形成する）、アシル化（例えば、エステル、アミド、カルバメート、ウレア、チオウレアを形成する）、ホスホリル化（例えば、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスホンアミドを形成する）、スルホニル化（例えば、スルホネート、スルホンアミドを形成する）、縮合（イミン、オキシム、ヒドラゾンを形成する）、シリル化、ジスルフィド形成、および光分解による反応性中間体（例えば、ニトレン、またはカルベン）の生成を含む。一般に、タグをリンカーに結合するに適切なハンドルおよび結合形成反応はまた、リンカーをＭＯＩに結合するに適切であり、そしてその逆も同様である。いくつかの場合において、ＭＯＩは、先に修飾または誘導を受けて、リンカーを結合するに必要なハンドルを提供し得る。
【０２２９】
リンカーをＭＯＩに結合するに特に有用な結合の一つの型は、ジスルフィド結合である。その形成は、リンカー上のチオール基（ハンドル）およびＭＯＩ上の別のチオール基の存在を必要とする。従って、緩やかな酸化条件は、２つのチオールをジスルフィドとして結合するに十分である。ジスルフィド形成はまた、過剰な適切なジスフィド交換試薬（例えば、ピリジルジスルフィド）を使用することによって誘導され得る。ジスルフィド形成は、容易に可逆であるので、ジスルフィドは所望ならばタグを遊離するための切断可能な結合としてもまた使用され得る。代表的には、これは、過剰の適切なチオール交換試薬（例えば、ジチオスレイトール）を使用して、同様の穏やかな条件下で達成される。
【０２３０】
アミド結合の形成は、タグ（またはリンカーを有するタグ）をオリゴヌクレオチドに結合するために特に興味深い。一次脂肪族アミンハンドルは、ホスホルアミダイト（例えば、６−モノメトキシトリチルヘキシルシアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，  ＶＡから入手可能））を有する合成オリゴヌクレオチドに容易に導入され得る。導入された一次アミンと比較した場合、天然のヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびグアノシン）上で見出されるアミンは、実際に非反応性である。反応性におけるこの相違は、アミドおよび導入された一次アミン（ヌクレオチドアミンではなく）を有する関連する結合基（例えば、ウレア、チオウレア、スルホンアミド）を選択的に形成する能力の基礎を形成する。
【０２３１】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｃａｔａｌｏｇ（Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）に収載されるように、アミン反応性官能基には、活性化カルボン酸エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルハライド、およびジクロロトリアゼンが部分的に挙げられる。活性エステルは、形成されるアミド生成物は極めて安定であるので、アミン修飾に優れた試薬である。さらに、これらの試薬は、脂肪族アミンと良好な反応性を有し、そしてオリゴヌクレオチドのヌクレオチドアミンとの低い反応性を有する。活性エステルの例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、およびｐ−ニトロフェニルエステルが挙げられる。活性エステルは、実際にはカルボン酸を含む任意の分子から作製され得るので、活性エステルは有用である。活性エステルを作製する方法は、Ｂｏｄａｎｓｋｙ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （第２版），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９９３）に収載される。
【０２３２】
５．リンカー結合
代表的には、単一の型のリンカーが、特定のセットまたはファミリーのタグを特定のセットのまたはファミリーのＭＯＩに結合するために使用される。本発明の好ましい実施態様において、単一の一様な手順が全ての種々のＴ−Ｌ−ＭＯＩ構造を作製するために付随され得る。Ｔ−Ｌ−ＭＯＩ構造のセットが大きい場合、これは、とくに利点に富む。なぜならば、それによってセットをコンビナトリアルケミストリーの方法または他の平行プロセシング技術を使用して調製することが可能となるからである。類似の方法において、単一の型のリンカーの使用は、単一の一様な手順を全ての種々のＴ−Ｌ−ＭＯＩ構造を切断するために用いることを可能にする。さらに、これは、大きなセットのＴ−Ｌ−ＭＯＩ構造について利点に富む。なぜならば、セットは、平行、反復、および／または自動化方法でプロセスされ得るからである。
【０２３３】
しかし、本発明の他の実施態様では、リンカーの２つ以上が、異なるサブセットのタグを対応するサブセットのＭＯＩを結合するために使用される。この場合において、選択的な切断条件が、各リンカーを独立に、他のサブセットのＭＯＩ上に存在するリンカーを切断することなしに切断するために使用され得る。
【０２３４】
多くの共有結合形成反応は、タグをリンカーに、そしてリンカーをＭＯＩに接着するに適切である。このような反応は、アルキル化（例えば、エーテル、チオエーテルを形成する）、アシル化（エステル、アミド、カルバメート、ウレア、チオウレアを形成する）、リン酸化（例えば、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスホンアミドを形成する）、スルホニル化（例えば、スルホネート、スルホンアミドを形成する）、縮合（例えば、イミン、オキシム、ヒドラゾンを形成する）、シリル化、ジスルフィド形成、および光分解による反応性中間体（例えば、ニトレンまたはカルベン）の生成を含む。一般的に、タグをリンカーに結合するに適切なハンドルおよび結合形成反応はまた、リンカーをＭＯＩに結合するに適切であり、逆も同様である。いくつかの場合において、ＭＯＩは、先の改変または誘導を受け得、リンカーを結合するに必要なハンドルを提供する。
【０２３５】
リンカーをＭＯＩに結合するに特に有用な結合の一つの型は、ジスルフィド結合である。その形成は、リンカー上のチオール基（「ハンドル」）およびＭＯＩ上の別のチオール基の存在を必要とする。次いで、穏やかな酸化条件が、二つのチオール基をジスルフィドとして結合するに十分である。ジスルフィド形成はまた、過剰の適切なジスルフィド交換試薬（例えば、ピリジルジスルフィド）を使用することによって誘導され得る。ジスルフィド形成は、容易に可逆的であるので、ジスルフィドは所望ならばタグを遊離するための切断可能な結合として使用され得る。代表的には、これは、過剰の適切なチオール交換試薬（例えば、ジチオスレイトール）を使用して、同様に穏やかな条件下で達成される。
【０２３６】
アミド結合の形成は、タグをオリゴヌクレオチドに結合するために特に興味深い。一次脂肪族アミンハンドルは、ホスホルアミダイト（例えば、６−モノメトキシトリチルヘキシルシアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，  ＶＡから入手可能）を有する合成オリゴヌクレオチドに容易に導入され得る。導入された一次アミンと比較した場合、天然のヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびグアノシン）上で見出されるアミンは、実際に非反応性である。反応性におけるこの相違は、アミドおよび導入した一級アミン（ヌクレオチドアミンではなく）を有する関連結合基（例えば、ウレア、チオウレア、スルホアミド）を選択的に形成する能力の基礎を形成する。
【０２３７】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｃａｔａｌｏｇ（Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）に収載されるように、アミン反応性官能基には、活性化カルボン酸エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホンニルハライド、およびジクロロトリアゼンが部分的に挙げられる。活性エステルは、形成されるアミド生成物は極めて安定であるので、アミン修飾に優れた試薬である。さらに、これらの試薬は、脂肪族アミンと良好な反応性を有し、そしてオリゴヌクレオチドのヌクレオチドアミンとの低い反応性を有する。活性エステルの例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、およびｐ−ニトロフェニルエステルが挙げられる。活性エステルは、実際にはカルボン酸を含む任意の分子から作製され得るので、活性エステルは有用である。活性エステルを作製する方法は、Ｂｏｄａｎｓｋｙ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （第２版），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９９３）に収載される。
【０２３８】
リンカーとして機能し得る多くの市販の架橋試薬が存在する（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬを参照のこと）。これらの中に、ホモ二官能性イミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルによって例示されるホモ二官能性アミン反応性架橋試薬がある。連続的な反応を可能にする２つ以上の異なる反応性基を有するヘテロ二官能性架橋試薬が存在する。イミドエステルは、アルカリ性ＰＨでアミンと迅速に反応する。ＮＨＳ−エステルは、一級アミンまたは二級アミンと反応させた場合、安定な生成物を与える。マレイミド、アルキルおよびアリールハライド、α−ハロアシルおよびピリジルジスルフィドは、チオール反応性である。マレイミドは、６．５〜７．５のｐＨの範囲でチオール（スルフヒドリル）基に対して特異的である。そしてアルカリ性ｐＨは、アミン反応性になり得る。チオエーテル結合は、生理学的条件下で安定である。α−ハロアセチル架橋試薬は、ヨードアセチル基と反応し得るが、反応は非常に遅い。イミダゾールは、ヨードアセチル部分を含み、そしてスルフヒドリルに対して反応性である。ピリジルジスルフィドは、チオール基と反応して、ジスルフィド結合を形成し得る。カルボジイミドは、カルボキシルとヒドラジドの一級アミンをカップリングさせ、これはアシル−ヒドラジン結合の形成を生じる。アリールアジドは、ＵＶまたは可視光に曝露されるまで化学的に不活性な光親和性試薬である。このような化合物が、２５０ｎｍ〜４６０ｎｍで光分解される場合、活性アリールニトレンが形成される。反応性アリールニトレンは、比較的非特異的である。グリオキサールは、アルギニンのグアニジル部分に対して反応性である。
【０２３９】
本発明の一つの代表的な実施態様において、タグはまずリンカーに結合され、次いでタグとリンカーとの組合せは、ＭＯＩに結合され、構造Ｔ−Ｌ−ＭＯＩを生じる。あるいは、同一の構造が、リンカーをＭＯＩへまず結合させ、次いでリンカーとＭＯＩとの組合せをタグに結合させることによって形成される。例は、ＭＯＩがＤＮＡプライマーまたはオリゴヌクレオチドである場合である。この場合において、タグは、代表的には、まずリンカーに結合され、次いでＴ−Ｌが、ＤＮＡプライマーまたはオリゴヌクレオチドに結合される。これは、次いで、例えば、配列決定反応において使用される。
【０２４０】
タグが、ＭＯＩに可逆的にＭＯＩに結合し得る一つの有用な形態（例えば、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ配列決定プライマー）は、化学的に不安定なリンカーを介する。リンカーについての一つの好ましい設計によって、リンカーを揮発性の有機酸（例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））に曝露した場合切断することが可能になる。ＴＦＡは、特に、多くのＭＳイオン化の方法（これは電気スプレイを含む）に適合性である。
【０２４１】
以下に詳細に記載されるように、本発明は、核酸分子の配列を決定するための方法を提供する。本発明の方法によって形成され得る組成物は、以下の式の複数の化合物を含む：
Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩ
ここでＴｍｓは、質量分析によって検出可能な有機基である。Ｔｍｓは、炭素、水素およびフッ素の少なくとも一つ、ならびに酸素、窒素、イオウ、リン、およびヨウ素より選択される任意の原子を含み得る。式において、Ｌは、切断条件への化合物の曝露に際して、Ｔｍｓ含有部分を化合物の残りから切断させる有機基である。切断されたＴｍｓ含有成分は、複数の化合物の各々が質量分析に供される場合、単一イオン化荷電状態を維持する官能基を含む。官能基は、三級アミン、四級アミン、または有機酸であり得る。式において、ＭＯＩは、ＭＯＩの５’末端を介して結合される核酸フラグメントである。用語「結合された」は、ＬおよびＭＯＩの中間の化学基があり得ることを意味する（例えば、ホスホジエステル基および／またはアルキレン基）。核酸フラグメントはベクターの一部と相補的な配列を有し得、ここでそのフラグメントは核酸合成を開始し得る。
【０２４２】
組成物において、二つの化合物は、同一のＴｍｓも同一ＭＯＩも有しない。言い換えれば、組成物は、複数の化合物を含み、ここで各化合物は、独特（ｕｎｉｑｕｅ）のＴｍｓおよび独特（ｕｎｉｑｕｅ）の核酸フラグメントの両方を含む（それが、独特（ｕｎｉｑｕｅ）の塩基配列を有するという点で独特（ｕｎｉｑｕｅ））さらに、組成物は、複数の化合物（ここで各化合物は独特（ｕｎｉｑｕｅ）のＴｍｓを有するように定義され得、ここでＴｍｓは、他の化合物が、質量分析によって同一のシグナルを提供するＴｍｓを有さない点で独特（ｕｎｉｑｕｅ）である）。従って、組成物は、複数の化合物を含み、各々は、独特（ｕｎｉｑｕｅ）のマスを有するＴｍｓを有する。組成物はまた、各化合物が独特（ｕｎｉｑｕｅ）の核酸配列を有するように規定される複数の化合物を有するように規定され得る。これらの核酸配列は、組成物が核酸配列決定のためのベクターに組合せられる場合、各化合物が唯一つのベクターのためのプライマーとして機能するように、意図的に独特（ｕｎｉｑｕｅ）である。独特（ｕｎｉｑｕｅ）のＴｍｓ基を有する化合物のセットは、独特（ｕｎｉｑｕｅ）の核酸配列を有する同一のセットの化合物である。
【０２４３】
好ましくは、Ｔｍｓ基は、任意の二つの異なる化合物のＴｍｓ基の間で少なくとも２ａｍｕ、より好ましくは少なくとも３ａｍｕ、およびさらにより好ましくは少なくとも４ａｍｕ質量、分離している点で独特（ｕｎｉｑｕｅ）である。組成物において、少なくとも２つの異なる化合物が存在し、好ましくは２より多い異なる化合物が存在し、そしてより好ましくは４より多い異なる化合物が存在する。組成物は１００以上の異なる化合物を含み得、各化合物は独特（ｕｎｉｑｕｅ）のＴｍｓおよび独特（ｕｎｉｑｕｅ）の核酸配列を有する。
【０２４４】
例えば、核酸分子の配列を決定するのに有用である別の組成物は、水および式Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩの化合物を含み、ここでＴｍｓは質量分析によって検出可能な有機基である。Ｔｍｓは、炭素、水素およびフッ素の少なくとも一つ、ならびに酸素、窒素、イオウ、リン、およびヨウ素より選択される任意の原子を含み得る。式において、Ｌは、切断条件への化合物の曝露に際して、Ｔｍｓ含有部分を化合物の残りから切断させる有機基である。切断されたＴｍｓ含有成分は、複数の化合物の各々が質量分析に供される場合、単一イオン化荷電状態を維持する官能基を含む。官能基は、三級アミン、四級アミン、または有機酸であり得る。式において、ＭＯＩは、ＭＯＩの５’末端を介して結合される核酸フラグメントである。
【０２４５】
水に加えて、この組成物は、約５〜約９の間に水溶液のｐＨを維持するために、緩衝液を含み得る。さらに、組成物は、酵素、塩（例えば、ＭｇＣｌ２およびＮａＣｌ）、ならびにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰの一つを含み得る。好ましい組成物は水、Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩならびにｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、およびｄｄＴＴＰの一つ（一つのみ）を含む。このような組成物は、ジデオキシ配列決定法における使用に適切である。
【０２４６】
本発明はまた、複数のセットの化合物を含む組成物を提供し、ここで化合物の各セットは以下の式を有する：
Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩ
ここで、
Ｔｍｓは、質量分析によって検出可能な有機基であり、これは、炭素、水素およびフッ素の少なくとも一つ、ならびに酸素、窒素、イオウ、リン、およびヨウ素より選択される任意の原子を含む。式において、Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を化合物の残りから切断させる有機基であり、ここでＴｍｓ含有成分は、化合物が質量分析に供される場合、単一イオン化荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミン、および有機酸から選択される官能基を含む。ＭＯＩは、ＬがＭＯＩの５’末端でＭＯＩに結合される核酸フラグメントである。
【０２４７】
セットにおいて、全てのメンバーは、同一のＴｍｓを有し、そしてＭＯＩフラグメントは、ｄｄＡＭＰ、ｄｄＧＭＰ、ｄｄＣＭＰ、およびｄｄＴＭＰから選択される同一のジデオキシヌクレオチドで終結する可変性の長さを有し；そしてセットの間で、Ｔｍｓ基は、少なくとも２ａｍｕづつ、好ましくは少なくとも３ａｍｕづつ異なる。複数のセットは、好ましくは、少なくとも５であり、そして１００以上に番号付けし得る。
【０２４８】
上記のような第一の複数のセットを含む好ましい組成物において、さらに、以下の式を有する第二の複数のセットの化合物が存在する
Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩ
ここで、Ｔｍｓは、質量分析によって検出可能な有機基であり、これは、炭素、水素およびフッ素の少なくとも一つ、ならびに酸素、窒素、イオウ、リン、およびヨウ素より選択される任意の原子を含む。式において、Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を化合物の残りから切断させる有機基であり、ここでＴｍｓ含有成分は、化合物が質量分析に供される場合、単一イオン化荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミン、および有機酸から選択される官能基を含む。ＭＯＩは、ＬがＭＯＩの５’末端でＭＯＩに結合される核酸フラグメントである。第二の複数において全てのメンバーは、ｄｄＡＭＰ、ｄｄＧＭＰ、ｄｄＣＭＰ、およびｄｄＴＭＰから選択される同一のジデオキシヌクレオチドで終結するＭＯＩ配列を有する；ただし、第一の複数の化合物中に存在する同一のジデオキシヌクレオチドは、第二の複数の化合物に存在する同一のジデオキシヌクレオチドではない。
【０２４９】
本発明はまた、ＤＮＡ配列解析のためのキットを提供する。キットは、複数のコンテナセットを含み、ここで各コンテナセットは少なくとも５つのコンテナを含み。第一のコンテナはベクターを含む。第２、第３、第４、および第５のコンテナは、以下の式の化合物を含む：
Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩ
ここで、Ｔｍｓは、質量分析によって検出可能な有機基であり、これは、炭素、水素およびフッ素の少なくとも一つ、ならびに酸素、窒素、イオウ、リン、およびヨウ素より選択される任意の原子を含む。式において、Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を化合物の残りから切断させる有機基であり、ここでＴｍｓ含有成分は、化合物が質量分析に供される場合、単一イオン化荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミン、および有機酸から選択される官能基を含む。ＭＯＩは、ＬがＭＯＩの５’末端でＭＯＩに結合される核酸フラグメントである。第２、第３、第４、および第５のコンテナについてのＭＯＩは、セットのコンテナ内のベクターの一部と同一でありかつ相補的であり、各コンテナ内のＴｍｓ基は、キット中の他のＴｍｓ基と異なる。
【０２５０】
好ましくは、キットにおいて、複数は、少なくとも３である（すなわち、少なくとも３セットのコンテナである）。より好ましくは、少なくとも５セットのコンテナである。
【０２５１】
上記のように、本発明は、核酸分子の配列を決定するための組成物および方法を提供する。簡略には、このような方法は、一般的には（ａ）核酸分子の第１の末端から第２の末端まで選択された核酸分子（例えば、タグ化フラグメント）に相補的であるタグ化核酸フラグメントを生成する工程で、ここでタグは、特定のまたは選択されたヌクレオチドと相関性があり、そして任意の種々の方法によって検出され得る、工程と、（ｂ）連続的な長さでタグ化フラグメントを分離する工程と、（ｃ）タグ化フラグメントからタグを切断する工程と、（ｄ）タグを検出する工程と、を含み、そしてそれによって核酸分子の配列を決定する。この局面の各々は、以下でより詳細に議論される。
【０２５２】
Ｂ．配列決定方法および戦略
上述のように、本発明は、核酸分子の配列を決定する方法を提供する。簡単にいえば、タグ化核酸フラグメントが調製される。核酸フラグメントは選択された標的核酸分子に相補的である。好ましい実施態様において、核酸フラグメントは、核酸分子の第一の末端から第二の末端へ、より好ましくは、５’末端から３’末端へと生成される。他の好ましい実施態様では、タグ化フラグメントは、５’タグ化オリゴヌクレオチドプライマーまたはタグ化ジデオキシヌクレオチドターミネーターから生成される。タグ化核酸フラグメントのタグは、特定のヌクレオチドと相関的であり、そして分光分析（蛍光を含むが、好ましくは蛍光以外）または電位差測定により検出可能である。好ましい実施態様において、少なくとも５つのタグ化核酸フラグメントが生成され、各々のタグは核酸フラグメントごとに別々（ｕｎｉｑｕｅ）である。より詳細には、タグ化フラグメントの数は、一般的に５〜２０００の範囲である。タグ化核酸フラグメントは、上記に示された化合物を含む種々の化合物から生成される。本発明の方法が本明細書中に記載される代表化合物および組成物の使用のみに限定されないことは、当業者にとって明らかである。
【０２５３】
タグ化核酸フラグメントの生成に続いて、タグ化フラグメントは連続的長さにより分離される。このような分離は種々の技術により実施され得る。より好ましい実施態様では、分離は液体クロマトグラフィー（ＬＣ）により、特に好ましくはＨＰＬＣによる。次に、このタグはタグ化フラグメントから切断される。結合を破壊してタグを放出するための特定の方法は、結合の切断に対する感受性の特定のタイプに基づいて選択される。例えば、光感受性の結合（すなわち、光によって破壊する結合）は、光に曝露される。放出されたタグは、分光分析または電位差測定により検出される。好ましい検出手段は、質量分析、赤外分光分析、紫外線分光分析、および定電位電流測定（例えば、電流検出器または電量検出器）である。
【０２５４】
１つ以上の工程が自動化され得る（例えば、機器の使用により）ことは、当業者により理解される。さらに、分離、切断、および検出工程は連続的様式で実施され得る（例えば、分離〜切断〜タグ検出を通してのタグ化フラグメントの連続流／連続流路）。例えば、種々の工程が系に取り込まれ、その結果工程は連続的な様式で実施される。このような系は、代表的には、機器または機器の組み合わせのフォーマットである。例えば、分離された（例えば、ＨＰＬＣにより）タグ化核酸フラグメントは、切断のためのデバイス（例えば、光反応器（ｐｈｏｔｏ−ｒｅａｃｔｏｒ）に流され得、そして次いでタグ検出器（例えば、質量分析計または電量検出器、または電流測定器）に流され得る。好ましくは、切断のためのデバイスは調節可能であり、その結果切断反応のための最適な波長が選択され得る。
【０２５５】
核酸配列決定のための本発明の方法が種々の目的のために実施され得ることは当業者には明らかである。例えば、本発明のそのような使用は、ウイルス、細菌、原核生物、および真核生物（例えば、哺乳動物）核酸分子の一次配列決定；変異検出；診断；法医学：同一性；および多型性検出を含む。
【０２５６】
１．配列決定方法
上述のように、本発明の化合物を含む化合物は、酵素的分解方法および化学的分解方法の両方を含む種々の配列決定方法に利用され得る。簡潔にいうと、Ｓａｎｇｅｒ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ７４：５４６３，  １９７７）によって記載される酵素的方法（これはジデオキシターミネーターを利用する）は、ＤＮＡポリメラーゼによる一本鎖テンプレートからのＤＮＡ鎖の合成を含む。配列決定のＳａｎｇｅｒ方法は、そのジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）が、通常のデオキシヌクレオチドと同様に、成長する鎖に取り込まれる（より低効率であるが）という事実に依存する。しかし、ｄｄＮＴＰは通常のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）とは、それが鎖伸長に必要な３’−ＯＨ基を欠くという点で異なる。ｄｄＮＴＰがＤＮＡ鎖に取り込まれた場合、３’−水酸基の非存在は、新たなホスホジエステル結合の形成を妨げ、そしてＤＮＡフラグメントは、テンプレートＤＮＡ中の塩基に相補的なｄｄＮＴＰを有して終結する。ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの方法（ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ７４：５６０，  １９７７）は、元のＤＮＡの化学分解方法を使用する（両方の場合において、ＤＮＡはクローン性でなければならない）。両方の方法は、特定の点で開始し、そして配列決定されるべきＤＮＡフラグメントに見い出されるすべての塩基で終結するフラグメントの集団を生成する。各フラグメントの終結は元のＤＮＡフラグメント内の特定の塩基の位置に依存する。ＤＮＡフラグメントは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離され、そしてＤＮＡ塩基（Ａ、Ｃ，Ｔ，Ｇ）の順番がゲルのオートラジオグラフィーから読まれる。
【０２５７】
２．エキソヌクレアーゼＤＮＡ配列決定
ＤＮＡヌクレオチド配列を決定するための手順はＬａｂｅｉｔら（Ｓ．  Ｌａｂｅｉｔ．  Ｈ．  ＬｅｈｒａｃｈおよびＲ．  Ｓ．  Ｇｏｏｄｙ，  ＤＮＡ  ５：  １７３−７，  １９８６；デオキシヌクレオシドα−チオトリホスフェートを使用するＤＮＡ配列決定の新たな方法）により、報告された。この方法の第一の工程において、４つのＤＮＡ（それぞれ異なるデオキシヌクレオシドホスホロチオエートが相当するモノホスフェートの代わりに別々に置換されている）は、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒されるテンプレート指向性重合により調製される。第二の工程において、これらのＤＮＡが厳密なエキソヌクレアーゼＩＩＩ処理に供され、これはホスホロチオエート核酸間連結を有して終結するフラグメントのみを生成する。次いで、これらは、標準ゲル電気泳動技術により分離され得、そして配列が、現在使用される配列決定方法におけるように直接読まれ得る。Ｐｏｒｔｅｒら（Ｋ．  Ｗ．  Ｐｏｒｔｅｒ，  Ｊ．  Ｔｏｍａｓｚ，  Ｆ．  Ｈｕａｎｇ，  Ａ．  Ｓｏｏｄおよび  Ｂ．  Ｒ．  Ｓｈａｗ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：  １１９６３−１１９６９，  １９９５；  Ｎ７−シアノボラン−２’−デオキシグアノシン  ５’−３リン酸はＤＮＡポリメラーゼの良い基質である）は、エキソヌクレアーゼ耐性でもあり、そして多数のポリメラーゼの良い基質である、ホウ素置換核酸アナログの新しい組を記述した：これらの塩基はまた、エキソヌクレアーゼＤＮＡ配列決定にも適する。
【０２５８】
３．多数の全長ｃＤＮＡの配列決定のための簡略化した戦略
ｃＤＮＡ配列決定は、完全なヒトゲノム配列を生成することに代わる代替法として示唆されてきた。２つのアプローチが企てられた。第一のアプローチは、各々のｃＤＮＡクローンの一方の末端における単一ＤＮＡ配列通過（ｐａｓｓ）を通じての発現配列タグ（ＥＳＴ）の生成を含む。この方法は、発現配列の型の分布への新しい見地を与え、ゲノムフラグメントとの時折の有用な相同性を明らかにしたが、全体には我々の知識の土台に対してほとんどなにも追加しない。なぜなら、それぞれのクローンからのデータの提供が不充分だからである。第二のアプローチは、  ｃＤＮＡの潜在的機能を表し得る完全なｃＤＮＡ配列を生成することである。不幸にも、ほとんどのｃＤＮＡは１〜４キロベースの大きさの範囲であり、これは全長配列決定の自動化を妨げている。現在のところ、ラージスケールで高スループットの配列の生成のための最も効率的な方法は、ベクター／プライマー部位からの配列決定に由来し、これは、代表的にはそれぞれの側方（ｆｌａｎｋ）から５００塩基未満の配列を生じる。「プライマーウォーキング」のための１５〜１８塩基の長さの新たなオリゴヌクレオチドプライマーの合成は、各々の配列の閉合を可能にし得る。全長ｃＤＮＡ配列決定のための代替戦略は、ユニバーサルプライマーを用いた配列決定に適した改変したテンプレートを生成することであるが、これは分子の重複した網羅を提供する。
【０２５９】
ショットガン配列決定方法は、各々のｃＤＮＡクローンからの別々のライブラリーを調製することによりｃＤＮＡ配列決定研究に適用され得る。しかし、これらの方法は、１．５〜４．０キロベースフラグメントの解析のためには、特には使用されていない。なぜなら、それらは初期のクローニング段階の間に非常に労働集約的であるからである。そのかわりに、それらは、一般的に、標的配列が、λまたはコスミドインサートのような１５〜４０キロベースのオーダーである場合の計画に適用されている。
【０２６０】
４．ｃＤＮＡとゲノム配列決定とのアナロジー
ｃＤＮＡ配列決定において解析されるべき個々のクローンの代表的に異なるサイズにもかかわらず、ラージスケールのゲノムＤＮＡ配列決定のための必要事項との類似が存在する。１塩基当たりの低コストおよび高いスループットに加えて、全長ｃＤＮＡ配列決定のための理想的な戦略は、高い正確性を有する。ゲノムＤＮＡ配列決定のために現在好まれている方法は、コスミドからのショットガン配列決定ライブラリーの調製、それに続くＡＢＩ蛍光ＤＮＡ配列決定機器を使用したランダム配列決定、および指向される努力による閉合（終止）を含む。全体として、蛍光ショットガンアプローチは現在の代替法法よりも効率および正確性の点で優れているということで合意がある。初期のショットガンライブラリーの品質は、配列アセンブリーの簡便さおよび品質についての決定的な要素である。入手可能なショットガンライブラリー手順の高い品質は、より小さいｃＤＮＡクローンの混合物を含む複合ショットガンライブラリーの生成のための戦略を促している。ここで、配列決定されるべき個々のクローンは、ライブラリー構築の前に混合され、そして、次いでランダム配列決定の後に、コンピューター解析の工程で同定される。個々のクローン間の連接部は、ライブラリー生成の間に、ＰＣＲによるかまたはベクターアーム配列の同定によるかのいずれかで標識される。
【０２６１】
クローンは、微生物学的方法によるかまたはＰＣＲによるかの両方で調製され得る。ＰＣＲを使用した場合、間違いのリスクを最小化するために、３つの反応が各々のクローンについて使用される。
【０２６２】
一方通過配列決定（ｏｎｅ  ｐａｓｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、ゲノムＤＮＡの新しい領域内の重要な配列の同定を加速するために設計された新しい技術である。簡潔にいえば、高品質ショットガンライブラリーが調製され、そして次いで、配列がサンプリングされて、８０〜９５％の網羅が得られる。コスミドについては、これは、代表的には約２００試料である。本質的には、すべての遺伝子が、配列類似性（ＢＬＡＳＴ）またはエキソン構造（ＧＲＡＩＬ２）スクリーニングのいずれかを使用してこの試料中において検出される少なくとも一つのエキソンをおそらく有している。
【０２６３】
「スキミング（ｓｋｉｍｍｉｎｇ）」は、コスミドおよびＰ１へ成功して適用されている。一方通過配列決定は、潜在的に、ポジショナルクローニング計画において遺伝子を見出すための最も迅速でそして最も安価な方法である。出力は実質的に保証される。ほとんどの研究者は、現在、エキソントラッピングおよび関連技術のために、コスミドコンティグを開発している。コスミドは、配列決定スキミングに完全に適切である。Ｐ１および他のＢＡＣは、かなり、より安価である。なぜなら、ショットガンライブラリー構築および重複の最小化の両方において節約があるからである。
【０２６４】
５．ショットガン配列決定
ショットガンＤＮＡ配列決定は、標的ＤＮＡのランダム断片化で始まる。次いで、ランダム配列決定がデータの主要部分を生成するために使用される。次いで、指向相（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｈａｓｅ）がギャップを埋め合わせ、各々の鎖の両方向における網羅を確証する。ショットガン配列決定は、高正確性という利点を比較的低コストで提供する。この手順は比較的大きなフラグメントの解析に最も適しており、そしてラージスケールのゲノムＤＮＡ配列決定における方法の選択肢である。
【０２６５】
ショットガン配列決定を正確にそして費用効果的にするために重要な要素がいくつかある。主要な考慮すべき点は、生成されたショットガンライブラリーの品質である。なぜなら、インサートを有しないか、またはキメラインサートを有する任意のクローンが、続いて起こる配列決定を非効率的にするからである。別の考慮すべき点は、配列決定のランダムな相と指向相との慎重な平衡であり、その結果、不必要な配列決定による効率性の損失を最小限に抑え、高正確性が得られる。
【０２６６】
６．配列決定化学：タグ化ターミネーター化学
現在利用可能な蛍光配列決定化学には２つタイプがある：色素プライマー（ここで、プライマーは蛍光で標識される）、および色素ターミネーター（ここで、ジデオキシターミネーターが標識される）。これらの化合物のそれぞれは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＳｅｑｕｅｎａｓｅ酵素のいずれかとともに使用され得る。Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ酵素は、Ｇ−Ｃリッチ領域、パリンドローム、単純反復、および他の解読困難配列を通って簡単に読むようである。Ｓｅｑｕｅｎａｓｅはまた、混合物集合体の配列決定のためにも良い。Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ配列決定は、５μｇのテンプレート、一回の伸長、および多工程の洗浄プロセスを必要とする。タグ化プライマー配列決定は、Ａ、Ｃ，Ｇ，およびＴの各々についての４つの別々の反応、ならびに、労力を要する洗浄プロトコルを必要とする。Ｔａｑターミネーターサイクル配列決定化学は、最も強力な配列決定方法である。この方法においては、いかなる配列プライマーも使用され得る。テンプレートの必要量は比較的小さく、そして準備から洗浄までの全反応プロセスが、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅおよび色素プライマー化学に比較して充分簡単である。１．５μｇのＤＮＡテンプレート、および４  ｐｍのプライマーのみが必要である。これに、調製済反応混合物が添加される。この混合物は緩衝液、酵素、ｄＮＴＰおよび標識ジデオキシヌクレオチドから構成される。この反応は、一本のチューブで実施され得る。なぜなら、４つのジデオキシが異なった蛍光色素で標識されているからである。これらの標識ターミネーターはこの混合物中に過剰量存在している。なぜなら、それらは伸長の間の取り込みが困難だからである。未精製ＤＮＡでは、これらの高分子量ジデオキシの取り込みは阻害され得る。プレミックスは、バンド圧縮を最小化するためにｄＩＴＰを含む。ＤＮＡポリメラーゼとしてのＴａｑの使用は、反応が高温で行われて、２次構造の問題および非特異的プライマー結合を最小限にすることを可能にする。全カクテルは２５サイクルの変性、アニーリング、および伸長がサーマルサイクラー中で受け、そして完了した反応物はＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ．  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）カラムを通してスピンされ、真空デシケーター中での５分後に、ゲルロードの準備が出来る。
【０２６７】
７．プライマーの設計
プライマーを設計する場合は、ＰＣＲプライマーを設計するときと同じ基準を使用するべきである。特に、プライマーは、好ましくは１８から２０ヌクレオチド長であり、そして３’末端塩基はＧまたはＣであるべきである。プライマーはまた、好ましくは、５０℃より高いＴｍを有しているべきである。１８ヌクレオチドより短いプライマーも作用するが推薦されない。プライマーが短くなるに従って、テンプレートＤＮＡの１を超える部位に、それが結合する可能性が高くなり、そしてそのＴｍを低下させる。配列は、テンプレートとの１００％のマッチを有するべきである。いかなるミスマッチ（特に３’末端に向かうミスマッチ）も配列決定能を大いに低下させる。しかし、結合する３’における約１８塩基が存在する限り、５’テイルを有するプライマーが使用され得る。配列クロマトグラムからプライマーを設計する場合、高い信頼性を有する領域が使用されなければならない。標準クロマトグラムにおいて、３５０〜４００塩基を通過して移動すると、ピークは、より広がり、ベースコールはさほど正確でなくなる。本明細書中で記載のように、プライマーは、それを介してリンカーまたはリンカータグが付着され得る５’ハンドルを有し得る。
【０２６８】
８．核酸テンプレート調製
タグ化プライマーＤＮＡ配列決定で最も重要な因子は、テンプレートの品質である。簡潔にいえば、一つの一般的な間違った概念は、テンプレートが手動の配列決定の場合で機能する場合に、それが自動配列決定で機能するはずであるということである。実際に、反応が手動配列決定において機能する場合、それは自動配列決定において機能し得るが、しかし、自動配列決定ははるかにより感受性であり、そして蛍光配列決定法を利用した場合、品質の悪いテンプレートは、ほとんどデータを与えないか、全くデータを与えないかもしれない。高塩濃度、およびテンプレート調製の間に適切に抽出されなかった他の細胞物質（ＲＮＡを含む）は、同様に、正確な配列上方を得る能力を妨げる。多くのミニプレップおよびマキシプレッププロトコルは、手動の配列決定またはＰＣＲには充分良いが、自動（タグ化プライマー）配列決定には充分良くはないＤＮＡを生成する。さらに、フェノールの使用は、全く推奨されない。なぜなら、フェノールは螺旋構造中にインターカレートし得るからである。１００％クロロホルムの使用で充分である。本明細書中で提供されるタグ化プライマー配列決定方法に特に好ましい多数のＤＮＡ調製方法が存在する。特に、塩化セシウム調製物またはＱｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）マキシプレップカラム（オーバーロードしないように慎重にする）を利用したマキシプレップが好ましい。ミニプレップについては、ＰｒｏｍｅｇａのＭａｇｉｃ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）のようなカラムが利用され得る。ＰＣＲフラグメントまたは制限酵素切断フラグメントのようなＤＮＡフラグメントを配列決定する場合、一般的に、所望のフラグメントを低融点アガロースゲルから切り出し、次いで、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）のような製品で精製することが好ましい。ゲルから一本のバンドのみを切り出すことを確実にすることが重要である。ＰＣＲフラグメントについては、ＰＣＲプライマーまたは内部プライマーが、適切なフラグメントが配列決定されることを確証するために使用され得る。配列分析ソフトウェアからの最適の成績をあげるには、フラグメントは２００塩基より大きくあるべきである。二本鎖または一本鎖のＤＮＡがこの方法により配列決定され得る。
【０２６９】
配列決定の調製の場合、一般的に考慮するべきさらなる因子は、宿主株の選択である。ＡＢＩ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）およびＱｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  ＣＡ）のような配列決定のための機器および試薬を販売する会社は、代表的に好ましい宿主株を推薦しており、そして以前に、ＤＨ５  α、ＨＢ１０１、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＭＶ１１９０のような株を推薦してきている。ＤＮＡ調製物が非常にきれいだったとしても、配列を得ることを困難にし得る他の固有の因子がある。Ｇ−Ｃリッチなテンプレートは常に、通って配列決定するのが困難であり、そして二次構造もまた、問題を生じ得る。長い反復を通っての配列決定は、しばしば、困難であると判明する。例えば、ＴａｑがポリＴ伸展にそって移動するとき、この酵素はしばしばテンプレートを脱落して、そして、後方に跳ね戻り、Ｔをスキップする。これは、ポリＴ伸展中のＸ量のＴを有する伸長生成物およびポリＴ伸展中のＸ−１、Ｘ−２などの量のＴを有するフラグメントを生じる。正味の効果は、各々の位置において１塩基より多くが現れることであり、これは配列を読解不可能にする。
【０２７０】
９．分子的に異なるクローニングベクターの使用
配列決定はまた、ユニバーサルクローニングベクター（Ｍ１３）および相補的配列決定プライマーを利用して達成され得る。簡潔にいえば、既存のクローニングベクターについて、同じプライマー配列が使用され、そして４つのタグのみが使用され（各々のタグは異なるターミネーター（ｄｄＮＴＰ）を表す異なるフルオロホアである）、各々の増幅プロセスは異なるコンテナにおいて行われなければならない（１コンテナ当たり１つのＤＮＡサンプル）。すなわち、２つまたは異なるＤＮＡサンプルを同一の増幅プロセス中で混合することは不可能である。４つのタグのみが利用可能な場合、１ゲルレーン当たり１つのＤＮＡ試料のみが泳動され得る。４つのタグのみで１つより多いＤＮＡの配列を解明する（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）便利な手段はない（この意味で、当業者は、現在の技術を使用する場合、異なるＤＮＡ試料を混合したり汚染したりしないように非常に留意する）。
【０２７１】
１ゲルレーンまたはそれぞれの分離プロセス当たり複数の４つのタグが泳動される場合、実質的な利点が得られる。特に、本発明のタグを利用して、単一の増幅反応またはコンテナ中において１つ以上のＤＮＡ試料が処理され得る。複数の４つのタグが使用のために利用可能である場合、各々のタグの組は、増幅されるべき特定のＤＮＡ試料に対して割り当てられる。一つのタグの組は一連の４つの異なるタグから構成され、各々が独特（ｕｎｉｑｕｅ）な特性を有する。各々のタグは、異なるジデオキシターミネーター、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、またはｄｄＴＴＰを表すように割り当てられる。この利点を使用するため、独特（ｕｎｉｑｕｅ）なプライミング部位が挿入された一連のベクターが生成されなければならない。独特（ｕｎｉｑｕｅ）なプライミング部位は、単に１８ヌクレオチドの長さであり、これはベクターごとに異なる。残りのヌクレオチド配列は、ベクターごとに保存されている。各々の独特（ｕｎｉｑｕｅ）のベクターに対応する配列決定プライマーが調製（合成）される。各々の独特（ｕｎｉｑｕｅ）なプライマーは独特（ｕｎｉｑｕｅ）なタグの組を用いて誘導（または標識）される。
【０２７２】
これらのそれぞれの分子生物学の道具を有して、本発明において、単一のコンテナで複数の試料を処理することが可能である。第一に、配列決定されるべきＤＮＡ試料は複数のベクターにクローン化される。例えば、１００の独特（ｕｎｉｑｕｅ）なベクターが入手可能な場合、１００のライゲーション反応、プレート工程、およびプラークを拾う工程が実施される。第二に、各々のベクタータイプから１つの試料がプールされ、１００の独特（ｕｎｉｑｕｅ）なＤＮＡフラグメントまたは試料を含む１００の独特（ｕｎｉｑｕｅ）なベクターのプールを作製する。それにより、所定のＤＮＡ試料は同定され、そして自動的にタグの組を伴うプライマーの組が割り当てられる。それぞれのプライマー、緩衝液、ポリメラーゼ（単数または複数）、ｄｄＮＴＰ、ｄＮＴＰおよび補因子は反応コンテナに添加され、そして増殖プロセスが実行される。次いで、反応物は分離工程に供され、それぞれの配列がタグの時間的出現によって確立される。複数のＤＮＡ試料をプールする能力は実質的な利点を有する。代表的なＰＣＲ反応の試薬コストは１試料当たり約２．００米国ドルである。本明細書中で記載の方法では、１試料当たりに基づく増幅のコストは少なくとも１００倍低減され得る。試料作業が少なくとも１００倍低減され得、そして材料コストが低減され得る。ラージスケール増幅ロボットに対する必要性は除去される。
【０２７３】
１０．切断可能質量分析タグ化のための配列決定ベクター
本発明の切断可能質量分析タグ化（ＣＭＳＴ）を用いて、それぞれの個々の配列決定反応が、分離が進むに従うと同時に独立に読まれ得る。ＣＭＳＴ配列決定において、異なるプライマーが各々のクローニングベクターのために使用される：１プール当たり、２０クローンが使用される場合、各々の反応は、２０の異なるプライマーを有する。各々のプライマーはベクターの一つに対応し、そして各々のプライマーは独特（ｕｎｉｑｕｅ）のＣＭＳＴ分子でタグ化されている。４つの反応が、各々のプールされたＤＮＡ試料に対して実施され（各塩基につき一つ）、それゆえ、全てのベクターが４つのオリゴヌクレオチドプライマーを有し、各々が配列では同一であるが、異なるＣＭＳタグでタグ化されている。４つの分離した配列決定反応物はプールされ、そしていっしょに泳動される。２０試料がプールされる場合、８０のタグが使用され（１試料当たり４塩基×２０試料）、そして８０全てが、ゲルが流れると同時に検出される。
【０２７４】
ベクターの構築は、ランダムな２０マーを制限部位の両方の側にクローニングすることにより達成され得る。得られたクローンは、配列決定され、そしてベクターとして使用するための番号が選択される。２つのオリゴヌクレオチドが各々の選択されたベクターについて調製される。これは、制限部位の各々の側での配列に相同であり、そして各々が、３’末端が制限部位に向かうように配向されている物である。各々のプライマーの４つのタグ化調製物が調製され、配列決定反応における各塩基に一つであり、そして各々が独特（ｕｎｉｑｕｅ）のＣＭＳタグで標識されている。
【０２７５】
１１．可逆的タグの使用による配列決定の利点
配列決定および関連の技術において切断可能タグが使用される場合、実質的な利点がある。第一に、感度の増強が、測定の前の特定の時間にタグを集める能力と同様、より長い読み取り長さに貢献する。切断可能タグの使用は、ゲルの全範囲（例えば、１〜１５００ヌクレオチド（ｎｔ））にわたってバンド幅を均等化するシステムの開発を可能にする。これは、４５０ｎｔより長い読み取り長さを得る能力に多大なる影響を与える。
【０２７６】
切断可能な複数のタグ（ＭＷ同定因子）の使用はまた、複数のＤＮＡが、単一のゲルレーンまたは分離プロセス上で泳動され得るという利点を有する。例えば、本明細書中に開示された方法論を使用して、少なくとも９６のサンプルおよび４つの配列決定反応（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ）を単一のレーンまたはフラグメントサイジングプロセス上で組み合わせることが可能である。独特（ｕｎｉｑｕｅ）なプライミング部位を有する複数のベクターが使用される場合、少なくとも、１ゲルレーン当たり３８４の試料が組み合わせられ得る（異なるターミネーター反応はこのスキームではいっしょには増幅され得ない）。切断可能タグを使用する能力が複数のベクターを使う能力と組み合わされた場合、見かけ上約１０，０００倍のＤＮＡ配列決定スループットの増加が達成される。さらに、本明細書中に記載のスキームにおいて、試薬の使用が低減され、使い捨てのものが低減され、消費者に対して作業コストが低減する結果になる。
【０２７７】
さらなる利点が、本明細書中に記載の全方法論にわたって、内部コントロールを処理する能力から得られる。試料の任意の組について、内部コントロール核酸が試料（単数または複数）中に入れられ得る。これは現在の仕様では可能ではない。この利点は、増幅プロセス、分離プロセス、タグ検出システムおよび配列決定アセンブリの制御を可能にする。これは、コントロールが常に全ての工程において試料から分離されている現在のシステムに対して莫大な利点である。
【０２７８】
本明細書中に記載の組成物および方法はまた、それらが本来モジュールであり、そしてそれぞれの技術のいずれかのタイプにおいて改善がなされた場合、任意のタイプの分離プロセスまたは方法に適合され得、そして、さらに、任意のタイプの検出系に適合され得るという利点を有する。例えば、本明細書中に記載された方法論はＤＮＡフラグメントの分離を可能にする「束にされた（ｂｕｎｄｌｅｄ）」ＣＥアレー、または微小製造されたデバイスに結びつけられ得る。
Ｃ．  ＤＮＡの分離
分析を必要とするサンプルはしばしば、複合体マトリックス中の多数の成分の混合物である。未知の化合物を含むサンプルについては、成分は、それぞれ個々の成分が他の分析方法により同定され得るように互いに分離されなければならない。混合物中の成分の分離特性は一定の条件下で一定であり、従って一旦決定されると、これらは各成分を同定および定量するために使用され得る。このような手順は、クロマトグラフ的および電気泳動的な分析分離において代表的である。
【０２７９】
１．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、溶液中に溶解された化合物を分離するためのクロマトグラフ的分離技術である。ＨＰＬＣ機器は、移動相のリザーバー、ポンプ、インジェクター、分離カラム、および検出器からなる。化合物は、サンプル混合物のアリコートをカラムに注入することにより分離される。混合物中の異なる成分は、これらの移動液相と固定相との間の分配挙動の差異に起因して異なる速度でカラムを通過する。
【０２８０】
最近、化学的に結合したアルキル鎖を有する非多孔性ＰＳ／ＤＶＢ粒子でのＩＰ−ＲＯ−ＨＰＬＣは、一本鎖および二本鎖の両方の核酸の分析において類似の程度の分解能を提供するキャピラリー電気泳動に対して迅速な代案となることが示されている（Ｈｕｂｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：３５１，１９９３；Ｈｕｂｅｒら、１９９３，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：１０６１；Ｈｕｂｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６：８９８，１９９３）。二本鎖ＤＮＡを鎖長の関数として保持するとは限らない（ＡＴ塩基対は正に荷電した固定相と、ＧＣ塩基対よりも強力に相互作用するので）イオン交換クロマトグラフィーとは対照的に、ＩＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣは、厳密なサイズ依存性分離を可能にする。
【０２８１】
１００ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテートをイオン対試薬として使用する方法が開発され、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドが、高速液体クロマトグラフィー（Ｏｅｆｎｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３：３９，１９９４）の方法により、アルキル化された非多孔性２．３μＭポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）粒子上で首尾良く分離され得た。記載された技術は、５０〜２００ヌクレオチドのサイズの範囲内においてわずか４〜８塩基対の長さが異なるＰＣＲ産物の分離を可能にした。
【０２８２】
２．電気泳動
電気泳動は、電場内でのイオン（または本明細書中で記載される場合のようなＤＮＡ）の移動度に基づく分離技術である。負に荷電したＤＮＡは正極に向かって移動し、そして正に荷電したイオンは負極に向かって移動する。安全性の理由のために、一方の電極は通常は接地され、他方の電極は正または負にバイアスをかけられている。荷電した種は、これらの総電荷、サイズ、および形に依存する、異なる移動速度を有し、従って、分離され得る。電極装置は、高電圧電源、電極、緩衝液、および緩衝液のためのポリアクリルアミドゲルまたはキャピラリーチューブのような支持体からなる。オープンキャピラリーチューブが、多くのタイプのサンプルのために使用され、そして他のゲル支持体が、通常は、生物学的サンプル（例えば、タンパク質混合物またはＤＮＡフラグメント）のために使用される。
【０２８３】
３．キャピラリー電気泳動（ＣＥ）
その種々の出現（フリーソリューション（ｆｒｅｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、等速電気泳動、等電点電気泳動、ポリアクリルアミドゲル、ミセル動電の「クロマトグラフィー」）におけるキャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、非常にわずかなサンプル量である複雑な混合物の、迅速で高い分解能の分離のための方法として開発されている。ＭＳの本来の感度および選択性との併用において、ＣＥ−ＭＳは、生体分析のための潜在的に強力な技術である。本明細書中に開示される新規な適用において、これら２つの技術を調和させることは、配列決定法の現在の速度を数桁の規模で越える優れたＤＮＡ配列決定法に至る。
【０２８４】
ＣＥとエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）との間の流速の対応および両方が溶液中でイオン種により促進される（そして主にイオン種のために使用される）という事実は、非常に魅力的な組み合わせについての基礎を提供する。ＥＳＩに基づく、四重極（ｑｕａｄｒａｐｏｌｅ）質量分析計を有するキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）およびキャピラリー等速電気泳動の両方の組み合わせが記載されている（Ｏｌｉｖａｒｅｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５９：１２３０，１９８７；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：４３６，１９８８；Ｌｏｏら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：４０４，１９８９；Ｅｄｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ．４７４：２１，１９８９；Ｌｏｏら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎ  Ｓｅｐ．１：２２３，１９８９；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．４５８：３１３，１９８８；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．４８０：２１１，１９８９；Ｇｒｅｓｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２８３５，１９８９）。小さなペプチドは、良好な（フェントモル）感度でＣＺＥ分析で容易に分析できる。
【０２８５】
ＤＮＡフラグメントのための最も強力な分離方法は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）であり、一般にスラブゲルの型である。しかし、現代の技術の主な限界は、配列決定反応により生成されたＤＮＡフラグメントのゲル電気泳動を実施するために必要とされる比較的長い時間である。増大した規模（１０倍）が、超薄ゲルを利用するキャピラリー電気泳動の使用で達成され得る。第一の近似値に対するフリーソリューションにおいて、全てのＤＮＡは、塩基の追加が質量および電荷の代償を生じる移動度と同じ移動度で移動する。ポリアクリルアミドゲルにおいて、ＤＮＡフラグメントはふるいにかけられ、そして長さの関数として移動し、そしてこのアプローチは、現在、ＣＥに適用されている。１メーターあたりの著しいプレート数が、現在、架橋ポリアクリルアミドで達成されている（１メーターあたり１０＋７プレート、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：９６６０，１９８８）。記載されるようにこのようなＣＥカラムは、ＤＮＡ配列決定のために使用され得る。ＣＥの方法は、原則として、標準的なシークエンサーにおけるスラブゲル電気泳動よりも２５倍早い。例えば、１時間あたり約３００塩基が解読され得る。分離速度は、スラブゲル電気泳動において過剰の熱生成を伴わずにゲルに適用され得る電場の規模により制限される。従って、ＣＥのより大きな速度は、より高い電界強度の使用を介して達成され得る（ＣＥにおいて３００Ｖ／ｃｍ対スラブゲル電気泳動において１０Ｖ／ｃｍ）。キャピラリーの型はアンペア数を減らし、従って、電源および生じる熱生成を減少する。
【０２８６】
Ｓｍｉｔｈおよび他の者（Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１８：４４１７，１９９０）は、処理能力を増大するために複数のキャピラリーを平行に使用することを示唆している。同様に、ＭａｔｈｉｅｓおよびＨｕａｎｇ（ＭａｔｈｉｅｓおよびＨｕａｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：１６７，１９９２）は、分離がキャピラリーの平行のアレイ上で実施され、そして高い配列決定処理能力を示すキャピラリー電気泳動を導入した（Ｈｕａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４：９６７，１９９２，Ｈｕａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４：２１４９，１９９２）。キャピラリー電気泳動の主な不利は、キャピラリー上にロードされ得る限定されたサンプル量である。分離前に、キャピラリーの初めに大量のサンプルを濃縮することにより、負荷能力（ｌｏａｄａｂｉｌｉｔｙ）が増大し、そして検出レベルが数桁の規模で低くなり得る。ＣＥにおける予備濃縮の最もポピュラーな方法は、サンプルの積層である。サンプルの積層は、最近、総説されている（ＣｈｉｅｎおよびＢｕｒｇｉ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４：４８９Ａ，１９９２）。サンプルの積層は、サンプル緩衝液とキャピラリー緩衝液との間のマトリックスの差異（ｐＨ、イオン強度）に依存し、その結果、サンプルのゾーンを横切る電場は、キャピラリー領域より大きくなる。サンプルの積層において、低濃度緩衝液中の大量のサンプルは、キャピラリーカラムの上部での予備濃縮のために導入される。キャピラリーは、同一成分であるが高濃度の緩衝液で充填される。サンプルのイオンがキャピラリー緩衝液およびより低い電場に到達した場合、これらは濃縮ゾーンに積層される。サンプルの積層は、１〜３桁の規模で検出性を増大する。
【０２８７】
予備濃縮の別の方法が、分析物のフリーゾーンＣＥ分離の前に等速電気泳動（ＩＴＰ）に適用される。ＩＴＰは、ＣＥに代表的に関連する低いｎＬ注入容量と対照的に、μｌ容量のサンプルをキャピラリーにロードさせる電気泳動的技術である。この技術は、分析物よりもそれぞれ高い移動度および低い移動度の２つの緩衝液（リーディングおよびトレーリングの電解液）の間にサンプルを挿入することに依存する。この技術は、本質的に、分析物が同じ速度で移動する純粋なゾーンに集中する濃縮技術である。リーディングおよびトレーリングの電解液のいくつかの選択の必要性および分離プロセスの間のカチオン種またはアニオン種のみを分離する能力のために、この技術は、現在、上記の積層方法よりもポピュラーではない。
【０２８８】
ＤＮＡ配列決定プロセスの核心は、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドフラグメントの非常に選択的な電気泳動的分離である。これは、各フラグメントが解析され、そしてわずかなヌクレオチドが異なることから、著しい。１０００フラグメント（１０００ｂｐ）までの分離が得られている。切断可能（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）なタグを用いる配列決定のさらなる利点は、以下のようである。切断可能なタグが使用されて、ＤＮＡフラグメントがポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離される場合、スラブゲルの型を使用する必要性はない。多数のサンプル（４〜２０００）が併用されるので、現在の色素プライマーまたは色素ターミネーター方法（すなわち、ＡＢＩ３７３シーケンサー）の場合のように、平行にサンプルを流す必要はない。平行なレーンを流す理由がないので、スラブゲルを使用する理由がない。従って、電気泳動的分離方法のためにチューブゲルの型が使用され得る。Ｇｒｏｓｓｍａｎ（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：９，１９９２）は、スラブゲルの型の代わりにチューブゲルの型が使用される場合、かなりの利点が得られることを示している。これは、スラブゲルと比較してチューブの型においてジュール熱を散逸するより優れた能力に起因し、この能力はより早い運転時間（５０％まで）および高分子量のＤＮＡフラグメント（１０００ｎｔを超える）のかなり高い分解能を生じる。長い解読は、ゲノム配列決定において重要である。従って、配列決定における切断可能なタグの使用は、ユーザーに最も高い分解能を有する最も効率的かつ敏感なＤＮＡ分離方法の使用を可能にするさらなる利点を有する。
【０２８９】
４．マイクロ作製デバイス（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、ＤＮＡ配列決定、法医学的分析、ＰＣＲ産物分析、および制限フラグメントサイジングのための強力な方法である。ＣＥは、キャピラリーゲルにかなりより高い電場が適用され得るので、従来のスラブＰＡＧＥよりもかなり迅速である。しかし、ＣＥは、ただ１つのサンプルがゲルあたり処理される欠点を有する。この方法は、ＣＥのより迅速な分離時間と、並行して複数のサンプルを分析する能力とを組み合わせる。マイクロ作製デバイスの使用の後ろにある基本的な概念は、レーンの寸法を約１００μｍに縮小化することにより、電気泳動における情報密度を増加させる能力である。エレクトロニクス産業は、１ミクロン未満のサイズの特徴を有する回路を作製するようなマイクロ作製を日常的に使用する。キャピラリーアレイの電流密度は、キャピラリーチューブの外径で制限される。チャネルのマイクロ作製は、より密度の高いアレイを作製する。マイクロ作製はまた、ガラスファイバーを用いて可能でない物理的組立を可能にし、そしてチャネルをチップ上で他のデバイスに直接的に連結する。わずかなデバイスが、分離技術のためにマイクロチップ上で構築されている。ガスクロマトグラフ（Ｔｅｒｒｙら、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ，ＥＤ−２６：１８８０，１９７９）および液体クロマトグラフ（Ｍａｎｚら、Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ１：２４９，１９９０）が、シリコンチップ上で作製されているが、これらのデバイスは広く使用されていない。いくつかのグループが、マイクロ作製デバイスでの蛍光色素およびアミノ酸の分離を報告している（Ｍａｎｚら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ５９３：２５３，１９９２，Ｅｆｆｅｎｈａｕｓｅｒら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．  ６５：２６３７，１９９３）。最近、ＷｏｏｌｌｅｙおよびＭａｔｈｉｅｓ（ＷｏｏｌｌｅｙおよびＭａｔｈｉｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１１３４８，１９９４）は、ガラス基板上で多数の分離チャネルを作製するために使用され得るフォトリソグラフィーおよび化学的エッチングを示している。このチャネルは、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）分離マトリックスで充填される。これは、ＤＮＡ制限フラグメントが、わずか２分で分離され得たことを示した。
【０２９０】
Ｄ．タグの切断
上記のように、異なるリンカーの設計は、異なる特定の物理的または化学的条件下で切断性（ｃｌｅａｖａｂｉｌｉｔｙ）（「不安定性」）を与える。種々の設計のリンカーを切断するように作用する条件の例は、酸、塩基、酸化、還元、フッ化物、チオール交換、光分解、および酵素的条件を含む。
【０２９１】
上記リンカーの一般基準を満足する切断性リンカーの例は、当該分野で周知であり、そしてＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能なカタログ中に見出される切断性リンカーを含む。例は、以下を含む：
・エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ヒドロキシルアミンにより切断可能であるアミン反応性架橋試薬（１Ｍ、３７℃で３〜６時間）；
・ジスクシンイミジルタルタレート（ＤＳＴ）およびスルホ−ＤＳＴ、これらは、０．０１５Ｍの過ヨウ素酸ナトリウムにより切断可能なアミン反応性架橋試薬である；
・ビス［２−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）およびスルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ、これらは、塩基（ｐＨ  １１．６）により切断可能なアミン反応性架橋試薬である；
・１，４−ジ−｛３’−（２’−ピリジルジチオ（プロピオンアミド））ブタン（ＤＰＤＰＢ）、チオール交換または還元により切断可能であるピリジルジチオール架橋剤；
・Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）−ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、チオール交換または還元により切断可能であるピリジルジチオール架橋剤；
・ビス−［β−４−（アジドサリチルアミド）エチル］−ジスルフィド、チオール交換または還元により切断可能である光反応性架橋剤；
・Ｎ−スクシンイミジル−（４−アジドフェニル）−１，３’ジチオプロピオネート（ＳＡＤＰ）、チオール交換または還元により切断可能である光反応性架橋剤；
・スルホスクシンイミジル−２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＥＤ）、チオール交換または還元により切断可能である光反応性架橋剤；
・スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’ジチオプロピオネート（ＳＡＮＤ）、チオール交換または還元により切断可能である光反応性架橋剤。
【０２９２】
タグを放出するために使用され得る切断性リンカーおよび切断条件の他の例は、以下のようである。シリル結合基は、フッ化物または酸性条件下により切断され得る。３−，４−，５−，または６−置換−２−ニトロベンジルオキシまたは２−，３−，５−，または６−置換−４−ニトロベンジルオキシ結合基は、光子の供給（光分解）により切断され得る。３−，４−，５−，または６−置換−２−アルコキシフェノキシまたは２−，３−，５−，または６−置換−４−アルコキシフェノキシ結合基は、Ｃｅ（ＮＨ４）２（ＮＯ３）６（酸化）により切断され得る。ＮＣＯ２（ウレタン）リンカーは、水酸化物（塩基）、酸、またはＬｉＡｌＨ４（還元）により切断され得る。３−ペンテニル、２−ブテニル、または１−ブテニル結合基は、Ｏ３、ＯｓＯ４／ＩＯ４−、またはＫＭｎＯ４（酸化）により切断され得る。２−［３−，４−，または５−置換−フリル］オキシ結合基は、Ｏ２、Ｂｒ２、ＭｅＯＨ、または酸により切断され得る。
【０２９３】
他の不安定な結合基の切断のための条件は、以下を含む：ｔ−アルキルオキシ結合基は、酸により分解され得る；メチル（ジアルキル）メトキシまたは４−置換−２−アルキル−１，３，−ジオキシラン−２−イル結合基は、Ｈ３Ｏ＋により分解され得る；２−シリルエトキシ結合基は、フッ化物または酸により分解され得る；２−（Ｘ）−エトキシ（ここで、Ｘ＝ケト、エステルアミド、シアノ、ＮＯ２、スルフィド、スルホキシド、スルホン）結合基は、アルカリ条件下で切断され得る；２−，３−，４−，５−，または６−置換−ベンジルオキシ結合基は、酸によるかまたは還元的条件下で切断され得る；２−ブテニルオキシ結合基は、（Ｐｈ３Ｐ）３ＲｈＣｌ（Ｈ）により切断され得、３−，４−，５−，または６−置換−２−ブロモフェノキシ結合基は、Ｌｉ、Ｍｇ、またはＢｕＬｉにより切断され得る；メチルチオメトキシ結合基は、Ｈｇ２＋により切断され得る；２−（Ｘ）−エチルオキシ（ここで、Ｘ＝ハロゲン）結合基は、ＺｎまたはＭｇにより切断され得る；２−ヒドロキシエチルオキシ結合基は、酸化（例えば、Ｐｂ（ＯＡｃ）４）により切断され得る。
【０２９４】
好ましいリンカーは、酸または光分解により切断され得るリンカーである。固相ペプチド合成のために開発されたいくつかの酸不安定なリンカーは、ＭＯＩにタグを結合するために有用である。いくつかのこれらのリンカーは、Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：１１０６５−１１１３３，１９９３）により最近の総説に記載されている。一つの有用なタイプのリンカーは、ｐ−アルコキシベンジルアルコールであり、その２つである４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸および４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）酪酸がＡｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）より市販されている。両方のリンカーは、ベンジルアルコールへのエステル結合を介してタグに結合され得、そしてカルボン酸へのアミド結合を介してアミン含有ＭＯＩに結合され得る。これらの分子により結合されたタグは、種々のトリフルオロ酢酸の濃度を用いてＭＯＩから放出される。これらのリンカーの切断は、タグ上でのカルボン酸の遊離を生じる。関連するリンカー（例えば、２，４−ジメトキシ−４’−（カルボキシメチルオキシ）−ベンズヒドリルアミン（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈよりＦＭＯＣ保護化形態で入手可能））を介して結合したタグの酸切断は、放出されたタグ上でのカルボン酸アミドの遊離を生じる。
【０２９５】
この適用に有用な感光性リンカーはまた、大多数が、固相ペプチド合成のために開発されている（Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓの総説を参照のこと）。これらのリンカーは、通常は、２−ニトロベンジルエステルまたは２−ニトロベンジルアミドに基づく。文献に最近報告されている感光性リンカーの２つの例は、４−（４−（１−Ｆｍｏｃ−アミノ）エチル）−２−メトキシ−５−ニトロフェノキシ）酪酸（ＨｏｌｍｅｓおよびＪｏｎｅｓ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：２３１８−２３１９，１９９５）および３−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−３−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸（Ｂｒｏｗｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  １：４−１２，１９９５）である。両方のリンカーは、カルボン酸を介してＭＯＩ上のアミンに結合され得る。タグのリンカーへの結合は、タグ上のカルボン酸とリンカー上のアミンとの間にアミドを形成することにより作製される。感光性リンカーの切断は、通常は、当該分野で公知の強度および時間で３５０ｎｍ波長のＵＶ光を用いて実施される。光化学的切断のための装置の供給源の例は、Ａｕｒａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｓｔａｔｅｎ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）およびＡｇｒｅｎｅｔｉｃｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）である。リンカーの切断は、タグ上の１級アミドの遊離を生じる。光切断性リンカーの例は、ニトロフェニルグリシンエステル、エキソ−およびエンド−２−ベンゾノルボルネイル（ｂｅｎｚｏｎｏｒｂｏｒｎｅｙｌ）クロライドおよびメタンスルホネート、ならびに３−アミノ−３（２−ニトロフェニル）プロピオン酸を含む。酵素的切断の例は、エステル結合を切断するエステラーゼ、ホスホジエステル結合を切断するヌクレアーゼ、ペプチド結合を切断するプロテアーゼなどを含む。
【０２９６】
Ｅ．タグの検出
検出方法は、代表的には、いくつかのタイプのスペクトル領域における吸収および発光に依存する。原子または分子が光を吸収する場合、入射エネルギーは、量子化された構造をより高いエネルギーレベルへ励起する。励起のタイプは、光の波長に依存する。電子は、紫外光または可視光により、より高い軌道に活性化され、分子振動は、赤外光により励起され、そして回転は、マイクロ波により励起される。吸収スペクトルは、波長の関数としての光の吸収である。原子または分子のスペクトルは、そのエネルギーレベル構造に依存する。吸収スペクトルは、化合物の同定に有用である。比吸光分光光度的方法は、原子吸光分光法（ＡＡ）、赤外分光法（ＩＲ）、およびＵＶ−ｖｉｓ分光法（ｕｖ−ｖｉｓ）が含まれる。
【０２９７】
高エネルギーレベルに励起される原子または分子は、光線を放射することにより低いレベルに減衰し得る。光の発光は、遷移が同一スピン間の場合は蛍光と呼ばれ、遷移が異なるスピン間で生じる場合はリン光と呼ばれる。分析物の発光強度は、濃度（低濃度で）に直線的に比例し、そして発光種を定量するために有用である。比発光分光光度的方法は、原子発光分析（ＡＥＳ）、原子蛍光分析（ＡＦＳ）、分子レーザー誘起蛍光（ＬＩＦ）、およびＸ線蛍光（ＸＲＦ）を含む。
【０２９８】
電磁波が物質を通過する場合、大部分の光線が元の方向で存続するが、少量が他の方向に散乱する。入射光として同一の波長で散乱する光は、Ｒａｙｌｅｉｇｈ散乱と呼ばれる。振動のために透明な固体中で散乱する光（フォノン）は、Ｂｒｉｌｌｏｕｉｎ散乱と呼ばれる。Ｂｒｉｌｌｏｕｉｎ散乱は、代表的には、入射光から０．１〜１波数シフトする。分子中の振動または不透明な固体中の光学的フォノンにより散乱する光は、ラマン散乱と呼ばれる。ラマン散乱光は、入射光から４０００波数と同じ量シフトする。特定の散乱分光学的方法は、ラマン分光法を含む。
【０２９９】
ＩＲ分光法は、サンプルによる中間赤外光（ｍｉｄ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｌｉｇｈｔ）の吸収の波長および強度の測定である。中間赤外光（２．５〜５０μｍ、４０００〜２００ｃｍ−１）は、分子振動をより高いエネルギーレベルに励起するのに十分にエネルギー性である。ＩＲ吸収帯の波長は、化学結合の特定のタイプに特徴的であり、そしてＩＲ分光法は、一般に、有機および有機金属分子の同定に最も有用である。
【０３００】
近赤外光吸収分光法（ＮＩＲ）は、サンプルによる近赤外光の吸収の波長および強度の測定である。近赤外光は、８００ｎｍ〜２．５μｍ（１２，５００〜４０００ｃｍ−１）の範囲にわたり、そして分子振動の倍音および組み合わせをより高いエネルギーレベルに励起するのに十分にエネルギー性である。ＮＩＲ分光法は、代表的には、有機の官能基（特にＯ−Ｈ、Ｎ−Ｈ、およびＣ＝Ｏ）の定量的測定のために使用される。ＮＩＲの器械類の構成装置および設計は、ｕｖ−ｖｉｓ吸収分光計と同様である。光源は通常、タングステンランプであり、そして検出器は通常、ＰｂＳ固体検出器（ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）である。サンプルホルダーは、ガラスまたは石英であり得、そして代表的な溶媒は、ＣＣｌ４およびＣＳ２である。ＮＩＲ分光法の便利な器械類は、オンラインのモニタリングおよびプロセス制御に適している。
【０３０１】
紫外および可視吸収分光法（ｕｖ−ｖｉｓ）は、サンプルによる近紫外および可視光の吸収の波長および強度の測定である。真空ＵＶの吸収は１００〜２００ｎｍ（１０５〜５０，０００ｃｍ−１）、石英ＵＶの吸収は２００〜３５０ｎｍ（５０，０００〜２８，５７０ｃｍ−１）、および可視の吸収は３５０〜８００ｎｍ（２８，５７０〜１２，５００ｃｍ−１）で起こり、そしてＢｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｂｏｕｇｕｅｔの法則により述べられる。紫外および可視光は、外殻電子をより高いエネルギーレベルに促進するのに十分にエネルギー性である。ＵＶ−ｖｉｓ分光法は通常、溶液中の分子および無機イオンまたは錯体に適用され得る。ｕｖ−ｖｉｓスペクトルは、スペクトルの広範な特徴により限定される。光源は、通常、ＵＶ測定については水素または重水素ランプであり、そして可視測定についてはタングステンランプである。これらの連続する光源の波長は、波長分離器（例えば、プリズムまたは格子モノクロメーター）を用いて選択される。スペクトルは波長分離器を走査することにより得られ、そして定量測定がスペクトルからまたは単一の波長で行われ得る。
【０３０２】
質量分析計は、イオン化された原子または分子の質量対電荷比（ｍ／ｚ）の差異を使用して、それらをお互いに分離する。それ故、質量分析法は、原子または分子の定量のために、そしてまた、分子についての化学的および構造的情報を決定するために有用である。分子は、化合物を同定するための構造的情報を提供する特有の断片化パターンを有する。質量分析計の一般的な操作は、以下のようである。気相イオンが作製され、イオンがその質量対電荷比に基づいて空間または時間で分離され、そして各質量対電荷比のイオンの量が測定される。質量分析計のイオン分離力は、分解能により述べられ、これはＲ＝ｍ／Δｍとして定義される。ここで、ｍはイオン質量であり、そしてΔｍは質量スペクトルにおける２つの分離可能なピークの間の質量の差異である。例えば、１０００の分解能を有する質量分析計は、ｍ／ｚが１００．１のイオンからｍ／ｚが１００．０のイオンを分離し得る。
【０３０３】
一般に、質量分析計（ＭＳ）は、イオン源、質量選択的な分析器、およびイオン検出からなる。磁気セクター型、四重極型、および飛行時間型の設計もまた、イオンを供給源領域から質量分析器に移すために、イオン光学の抽出および加速を必要とする。いくつかの質量分析器の設計（磁気セクター型ＭＳ、四重極型ＭＳ、または飛行時間型ＭＳ）の詳細は、以下で議論される。磁気セクター型ＭＳのための一重集束型（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）分析器は、１８０、９０、または６０°の粒子ビーム経路を利用する。粒子に影響を与える種々の力は、異なる質量電荷比を有するイオンを分離する。二重集束型分析計では、静電気的分析器は、動力学的エネルギーの差異を有する粒子を分離するためにこのタイプの装置に加えられる。
【０３０４】
四重極型ＭＳのための四重極型質量フィルターは、平行に配列された４つの金属ロッドからなる。印加電圧は，４つのロッドの間の中心である飛行経路を進み下りてくるイオンの軌道に影響を与える。所定のＤＣおよびＡＣ電圧のために、特定の質量対電荷比のイオンのみが四重極型フィルターを通過し、そして全ての他のイオンはそれらの元の経路の外へ投げられる。質量スペクトルは、ロッド上の電圧が変化する際の四重極型フィルターを通過するイオンをモニターすることにより得られる。
【０３０５】
飛行時間型質量分析計は、異なる質量のイオンを分離するために、「ドリフト領域」を通過する移動時間の差異を使用する。これは、イオンがパルスで生成されるべきそして／またはパルスで抽出されるべきであるように、パルスモードで稼働する。パルスされた電場は、ｑＶの動力学的エネルギー（ここで、ｑはイオン電荷であり、そしてＶは、印加電圧である）で、全てのイオンを場のない（ｆｉｅｌｄ−ｆｒｅｅ）ドリフト領域へ向けて加速する。イオンの動力学的エネルギーは０．５ｍＶ２であるので、より軽いイオンはより重いイオンよりもより高い速度を有し、そしてより早くドリフト領域の末端の検出器に到達する。イオン検出器の出力は、時間の関数としてオシロスコープ上に示されて質量スペクトルを作成する。
【０３０６】
イオン形成手順は、質量分析の開始点である。化学イオン化は、分析分子（タグ）と反応する試薬イオンを使用して、プロトンまたはヒドリド移動によりイオンを形成する方法である。試薬イオンは、大過剰のメタン（タグに対して）を電子衝撃（ＥＩ）イオン源へ導入することにより生成される。電子衝突は、メタンとさらに反応してＣＨ５＋およびＣ２Ｈ５＋を形成するようなＣＨ４＋およびＣＨ３＋を生成する。タグをイオン化するような別の方法は、プラズマおよびグロー放電である。プラズマは、効率的に原子を励起しそしてイオン化する、熱く部分的にイオン化したガスである。グロー放電は、２つの電極間で維持された低圧のプラズマである。電子衝撃イオン化は、タングステンフィラメントから通常生成される電子ビームを使用して、気相の原子または分子をイオン化する。ビームからの電子は、電子を分析物の原子または分子から打ち落として、イオンを生成する。エレクトロスプレーイオン化は、非常に細い針および一組のスキマー（ｓｋｉｍｍｅｒ）を使用する。サンプル溶液は、原料チャンバにスプレーされ、液滴を形成する。液滴は、キャピラリーを抜け出る場合に電荷を有し、そして溶媒が気化するにつれて液滴は高い電荷を有する分析物分子を残して消失する。ＥＳＩは、気化またはイオン化が困難な大きな生物学的分子のために特に有用である。高速原子衝撃（ＦＡＢ）は、脱離およびイオン化を引き起こす固体サンプルに衝突する中性原子（代表的には、ＸｅまたはＡｒ）の高エネルギービームを使用する。これは、気相になることが困難な大きな生物学的分子のために使用される。ＦＡＢは、ほとんど断片化を生じず、そして通常は、大きな分子イオンピークを示し、分子量決定に有用である。原子ビームは、電荷交換セルを介したイオン源からのイオンを加速することにより生成される。イオンは、中性原子との衝突において電子を捕捉して、高エネルギーの原子のビームを形成する。レーザーイオン化（ＬＩＭＳ）は、レーザーパルスが、サンプルの表面から物質を除去しそしていくつかのサンプル成分をイオン化するマイクロプラズマを生成する方法である。マトリックス補助（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）は、大きな生物学的分子（例えば、タンパク質またはＤＮＡフラグメント）を気化し、そしてイオン化するＬＩＭＳ方法である。生物学的分子は、固体マトリックス（例えば、ニコチン酸）に分散される。ＵＶレーザーパルスは、それらが質量分析計へ抽出され得るように、いくつかの大きな分子をイオン化形態で気相に運ぶマトリックスを除去する。プラズマ脱離イオン化（ＰＤ）は、反対方向に移動する２つの分裂フラグメントを生成する２５２Ｃｆの崩壊を利用する。一方のフラグメントは、サンプルに衝突して１〜１０の分析物イオンをたたき出す。他方のフラグメントは、検出器に衝突し、そしてデータ取得の開始を引き起こす。このイオン化方法は、大きな生物学的分子に特に有用である。共鳴イオン化（ＲＩＭＳ）は、１つ以上のレーザービームが気相原子または分子の遷移に対して共鳴するように調和されて、これのイオン化電位を越えて段階的な様式でこれを促進してイオンを生成する方法である。二次イオン化（ＳＩＭＳ）は、イオンビーム（例えば、３Ｈｅ＋、１６Ｏ＋、または４０Ａｒ＋）を使用し、これはサンプルの表面上に焦点を合わせられ、そして物質を気相に飛ばす。スパーク源は、電流を２つの電極を横切ってパルスすることにより固体サンプルにおける分析物をイオン化する方法である。
【０３０７】
タグは、これが付着する分子からの切断の前、その間、その後に荷電され得る。イオン化方法はイオン「脱離」に基づき、固体または液体表面からのイオンの直接的な形成または発光は、不揮発性および熱に不安定な化合物への適用を増大することを可能にする。これらの方法は、イオン化前の中性分子の気化の必要性を排除し、そして一般に分子種の熱分解を最小化する。これらの方法は、電界脱離（Ｂｅｃｋｙ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｉｅｌｄ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７７）、プラズマ脱離（ＳｕｎｄｑｖｉｓｔおよびＭａｃｆａｒｌａｎｅ、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．４：４２１，１９８５）、レーザー脱離（ＫａｒａｓおよびＨｉｌｌｅｎｋａｍｐ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２２９９，１９８８；Ｋａｒａｓら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１０１：８０５，１９８９）、高速粒子衝撃（例えば、高速原子衝撃、ＦＡＢ、および二次イオン質量分析、ＳＩＭＳ、Ｂａｒｂｅｒら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５４：６４５Ａ，１９８２）、ならびに熱スプレー（ＴＳ）イオン化（Ｖｅｓｔａｌ、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．２：４４７，１９８３）を含む。熱スプレーは、液体クロマトグラフィーとのオンラインの組み合わせについて広範に適用される。連続流通（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｌｏｗ）ＦＡＢ法（Ｃａｐｒｉｏｌｉら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５８：２９４９，１９８６）はまた、顕著な可能性が示されている。イオン化／質量分析法の組み合わせのより完全なリストは、イオントラップ質量分析法、エレクトロスプレーイオン化質量分析法、イオンスプレー質量分析法、液体イオン化質量分析法、大気圧イオン化質量分析法、電子イオン化質量分析法、準安定原子衝撃イオン化質量分析法、高速原子衝撃イオン化質量分析法、ＭＡＬＤＩ質量分析法、光イオン化飛行時間型質量分析法、レーザー液滴質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法、ＡＰＣＩ質量分析法、ナノスプレー質量分析法、噴霧スプレーイオン化質量分析法、化学イオン化質量分析法、共鳴イオン化質量分析法、二次イオン化質量分析法、熱スプレー質量分析法である。
【０３０８】
不揮発性の生物学的化合物を分析できるイオン化方法は、適用性の重複する範囲を有する。イオン化効率は、マトリックス成分および化合物のタイプに非常に依存する。現在利用可能な結果は、ＴＳについて上限の分子量は約８０００ダルトンであることを示す（ＪｏｎｅｓおよびＫｒｏｌｉｋ、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１：６７，１９８７）。ＴＳは、主に四重極型質量分析計と共に実行される（感度は、代表的には、より高い質量対電荷比（ｍ／ｚ）で非部分的に（ｄｉｓｐｏｒｐｏｒｔｉｏｎａｔｅｌｙ）影響される）。飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計は市販され、そしてｍ／ｚ範囲が検出器の能力によってのみ限定されるという利点を有する。最近、２つのさらなるイオン化方法が導入されている。これら２つの方法は、現在、マトリックス補助レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ、ＫａｒａｓおよびＨｉｌｌｅｎｋａｍｐ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２２９９，１９８８；Ｋａｒａｓら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１０１：８０５，１９８９）およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）である。両方の方法論は、非常に高いイオン化効率を有する（すなわち、非常に高い［生成された分子イオン］／［消費された分子］）。技術の最終的な可能性を規定する感度は、サンプルのサイズ、イオンの量、流速、検出効率、および実際のイオン化効率に依存する。
【０３０９】
エレクトロスプレーＭＳは、１９６０年代に最初に提示されたアイデアに基づく（Ｄｏｌｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．４９：２２４０，１９６８）。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）は質量分析法による分析のための荷電した分子を生成する一つの手段である。簡単に述べると、エレクトロスプレーイオン化は、強い静電場に液体を噴霧することにより、高度に荷電した液滴を生成する。大気圧の乾燥バスのガス中で一般に形成される高度に荷電した液滴は、電荷の反発が凝集力を超えるまで、中性の溶媒のエバポレーションにより縮小し、「クーロン爆発（ｃｏｕｌｏｍｂｉｃ  ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ）」に至る。イオン化の正確な機構は議論の余地があり、そしていくつかのグループが仮説を出している（Ｂｌａｄｅｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２１０９−１４，１９９１；Ｋｅｂａｒｌｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５：Ａ９７２−８６，１９９３；Ｆｅｎｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．４：５２４−３５，１９９３）。イオン形成の最終的なプロセスに関わらず、ＥＳＩは、穏やかな条件化で溶液から荷電した分子を生成する。
【０３１０】
少量の有機分子での有用な質量スペクトルデータを得る能力は、イオンの効率的な生成に依存する。ＥＳＩのイオン化の効率は、分子に関する正電荷の程度に関連する。イオン化の実験的な改良は、通常、酸性条件を使用することに関している。イオン化を改良する別の方法は、可能な場合に、四級アミンを使用する方法である（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １：４９４−５０３，１９９２；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：４３６−４１，１９８８を参照のこと）。
【０３１１】
エレクトロスプレーイオン化は、以下により詳細に記載される。エレクトロスプレーイオン生成は、２つの工程を必要とする：大気圧付近での高度に荷電した液滴の分散、次いで蒸発を導く条件である。分析物分子の溶液は、高い電位に保たれた針に通される。針の末端では、溶液は分散して分析物分子を含む、高度に荷電した液滴の小さなミストになる。小さな液滴は速やかに蒸発し、そして電界脱離または残りの蒸発によりプロトン化されたタンパク質分子が気相へと放出される。エレクトロスプレーは、一般に、キャピラリチューブからの液体のわずかな流れ（一般に１〜１０μＬ／分）への高電場の適用により、生成される。３〜６ｋＶの電位差は、代表的に、０．２〜２ｃｍ離れて配置されたキャピラリーと対電極との間に適用される（ここで、脱溶媒和の程度に依存するイオン、荷電したクラスター、およびさらに荷電した液滴は小口を介してＭＳによりサンプリングされ得る）。電場は、キャピラリーの末端で液体表面での電荷の蓄積を生じる。従って、液体の流速、抵抗率、および表面張力は、液滴の生成において重要なファクターである。高電場は、液体表面の破壊および高度に荷電した液滴の形成を生じる。正にまたは負に荷電した液滴は、キャピラリーのバイアスに依存して生成され得る。負のイオン形態は、電気的な放電を阻止する酸素のような電子捕捉剤の存在を必要とする。
【０３１２】
広範囲の液体は、真空中へ静電的にまたは噴霧剤の助けをかりてスプレーされ得る。噴霧のための電場のみの使用は、液体の電導率および誘電率の範囲に対するいくつかの実際的な制限の原因となる。１０−４Ｍ未満の水性電解質溶液に対応する、１０−５オーム未満の溶液電導率は、有用な液体の流速での安定なエレクトロスプレーのために、室温で必要である。ＥＳＩ−ＭＳに最も有用であると見出された形態において、適切な液体の流速は、液体の微細なミストとしての分散を生じる。キャピラリーからの短い距離は、液滴の直径をしばしば全く均一にし、そしておよそ１μｍにする。全てのエレクトロスプレーのイオン電流がより高い液体の流速のためにほんのわずかに増加することが、特に重要である。加熱はエレクトロスプレーを操作するために有用であるという証拠が存在する。例えば、わずかな加熱は、水溶液が容易にエレクトロスプレー化されることを可能にし、これはおそらく、粘性および表面張力の減少のためである。熱補助（ｔｈｅｒｍａｌｌｙ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）およびガス噴霧補助（ｇａｓ−ｎｅｂｕｌｉｚａｔｉｏｎ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）エレクトロスプレーは両方とも、より高い液体の流速を使用することを可能にするが、液滴の荷電の程度を減少する。分子イオンの形成は、最初の液滴群の蒸発をもたらす条件を必要とする。これは、乾燥ガスの中程度の温度（６０℃未満）での流れにより、インターフェースを介した輸送の間の加熱により、および（特に、イオン捕獲方法の場合に）比較的低圧でのエネルギー性の衝突により、高圧で達成され得る。
【０３１３】
ＥＳＩの基礎にある詳細なプロセスは不明のままであるが、ＥＳＩにより生成される非常に小さな液滴は、溶液中で正味の電荷を有するほとんどの種が残りの溶媒の蒸発の後に気相に移ることを可能にするようである。次いで、質量分析検出は、脱溶媒和の後に扱いやすいｍ／ｚ範囲（四重極型装置については、４０００ダルトン未満）を有し、そして十分な効率で生成され、伝導されるイオンを必要とする。広範囲の溶質は、ＥＳＩ−ＭＳで分析可能であることが既に見出されており、そして分子量に対するイオン化効率の実質的な相関関係の欠如は、高度に識別力がなくそして広範に適用可能なイオン化プロセスを示唆する。
【０３１４】
エレクトロスプレーのイオン「源」は、大気圧付近で機能する。エレクトロスプレー「源」は、代表的に、対電極に対して水溶液に電気的にバイアスをかけるための方法を組み入れている金属またはガラスのキャピラリーである。溶液（代表的には、分析物およびしばしば酢酸のような他の添加物を含む水−エタノール混合物）は、キャピラリーの末端へと流れる。本質的に任意の溶媒系に適合し得るＥＳＩ源は、記載されている（Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６２：８８５，１９９０）。ＥＳＩについての代表的な流速は、１〜１０μＬ／分である。ＥＳＩ−ＭＳインターフェースの主な必要条件は、イオンをサンプリングし、そして可能な限り効率的にイオンを高圧領域からＭＳへ運ぶことである。
【０３１５】
ＥＳＩの効率は、非常に高く、極度に敏感な測定の原理を提供する。これは、本明細書中に記載される本発明に有用である。電流装置の性能は、１価に荷電した種について約２×１０−１２Ａまたは約１０７カウント／秒である検出器において総イオン電流を提供し得る。装置の性能に基づいて、１価に荷電した種の１０−１０Ｍまたは約１０−１８モル／秒ほどの低い濃度は、分析物が完全にイオン化される場合に、検出可能なイオン電流（約１０カウント／秒）を示す。例えば、低いアトモルの検出限界が、キャピラリーゾーン電気泳動を有するＥＳＩインターフェースを使用して４級アンモニウムイオンについて得られている（Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５９：１２３０，１９８８）。１０００の分子量の化合物については、電荷の平均数は１であり、荷電状態のおよその数は１であり、ピーク幅（ｍ／ｚ）は１であり、そして最大強度（イオン／秒）は１×１０１２である。
【０３１６】
非常にわずかなサンプルが、ＥＳＩ質量スペクトルを得ることにおいて、実際に消費される（Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：１９４８，１９８８）。実質的なゲインもまた、セクター装置を有するアレイ検出器の使用により得られ得、これは、スペクトルの一部分の同時検出を可能にする。現在では、ＥＳＩにより形成された全てのイオンのわずか約１０−５しか検出されないので、装置の性能を制限するファクターへの注意は、改良された感度についての原理を提供し得る。本発明が、イオン化および検出の方法論における改良について意図しそして適合することは、当業者には、明らかである。
【０３１７】
インターフェースは、好ましくは、分離器械類（例えば、ゲル）と検出器（例えば、質量分析計）との間に配置される。インターフェースは、好ましくは、以下の特性を有する：（１）わずかな（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）時間間隔でＤＮＡフラグメントを回収する能力、（２）ＤＮＡフラグメントの濃縮、（３）電気泳動の緩衝液および環境からのＤＮＡフラグメントの取り出し、（４）タグのＤＮＡフラグメントからの切断、（５）タグのＤＮＡフラグメントからの分離、（６）ＤＮＡフラグメントの処分、（７）タグの揮発性溶液中への配置、（８）タグの気化およびイオン化、（９）タグを質量分析計へ誘導するエレクトロスプレーデバイスへのタグの配置または移動。
【０３１８】
インターフェースはまた、ＤＮＡフラグメントがゲルの底面から溶出するとＤＮＡフラグメントを「回収する」能力を有する。ゲルは、スラブゲル、管状のゲル、キャピラリー等からなり得る。ＤＮＡフラグメントは、いくつかの方法により回収され得る。第一の方法は、ＤＮＡフラグメントが電極上でまたはその近辺で回収される電場の使用である。第二の方法は、ＤＮＡフラグメントが、液流をゲルの底面を通して流すことにより回収される方法である。両方法の局面は組み合わせられ、ここで、流れに回収されたＤＮＡフラグメントは、後に、電場の使用により濃縮され得る。最終結果は、ＤＮＡフラグメントが分離方法が実施された環境から取り出されることである。つまり、ＤＮＡフラグメントは、電場の使用により一方の溶液タイプからもう一方の溶液タイプへと「ドラッグ（ｄｒａｇ）」され得る。
【０３１９】
一旦、ＤＮＡフラグメントが適切な溶液（エレクトロスプレーおよび質量分析に適合する）中にあれば、タグはＤＮＡフラグメントから切断され得る。次いで、ＤＮＡフラグメント（またはその残存物）が、電場の適用によりタグから分離され得る（好ましくは、タグは、ＤＮＡタグのＤＮＡフラグメントの反対の電荷である）。次いで、タグは、電場または流れる液体の使用により、エレクトロスプレーデバイスに導かれる。
【０３２０】
蛍光タグは、それらの吸収および蛍光発光の波長および強度により最も直接的に同定され、そして定量され得る。
【０３２１】
連続する範囲の励起および発光波長（ｌＥＸ，ｌＳ１，ｌＳ２）を提供する従来の分光蛍光光度計は非常に順応性があるが、より特殊化された装置（例えば、フローサイトメーターおよびレーザー走査顕微鏡）は単一の固定された波長で励起可能なプローブを必要とする。最新の装置においては、これは、通常、アルゴンレーザーの４８８ｎｍ線である。
【０３２２】
１プローブ分子あたりの蛍光強度は、生成物のｅおよびＱＹに比例する。現在実用上重要である発蛍光団間のこれらのパラメーターの範囲は、εについては約１０，０００〜１００，０００ｃｍ−１Ｍ−１およびＱＹについては０．１〜１．０である。吸収が高強度の照明により飽和へとされる場合、励起された発蛍光団の不可逆的な破壊（光退色）が蛍光検出能を制限するファクターとなる。光退色の実際的な影響は、問題となる蛍光検出技術に依存する。
【０３２３】
デバイス（インターフェース）は、分離および検出工程の間に配置されて、サイズ分離およびタグ検出の連続する操作（リアルタイムで）を可能にし得ることは当業者に明らかである。これは、分離の方法論および器械類と検出の方法論および器械類とを一体にし、単一のデバイスを形成する。例えば、インターフェースは、分離技術と質量分析法または定電位電流測定による検出との間に配置される。
【０３２４】
インターフェースの機能は、主に、（例えば、質量分析の）タグの分析物からの放出である。インターフェースについてのいくつかの代表的な実行が存在する。インターフェースの設計は、切断性リンカーの選択に依存する。光（ｌｉｇｈｔ）または光（ｐｈｏｔｏ）切断性リンカーの場合、エネルギーまたは光子源が必要とされる。酸不安定リンカー、塩基不安定リンカー、またはジスルフィドリンカーの場合、試薬の添加がインターフェース内で必要とされる。熱不安定リンカーの場合、エネルギー熱源が必要とされる。酵素の添加が、酵素感受性リンカー（例えば、特異的なプロテアーゼとペプチドリンカー、ヌクレアーゼとＤＮＡもしくはＲＮＡリンカー、グリコシラーゼ、ＨＲＰ、またはホスファターゼ）と切断後に不安定である（例えば、化学発光基質に類似する）リンカーについて必要とされる。インターフェースの他の特性は、最小のバンドの広がり、ＤＮＡの質量分析計への注入前のタグからの分離を含む。分離技術は、電気泳動的方法および技術、アフィニティー技術、サイズ保持（透析）、濾過などに基づく方法を含む。
【０３２５】
タグ（または、核酸−リンカー−タグ構築物）を濃縮し、電気泳動的にこれを捕捉し、次いでこれを選択されたイオン化方法の特定のタイプに適合する、代替（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）試薬の流れに放出することがまた可能である。インターフェースはまた、マイクロビーズ上のタグ（または、核酸−リンカー−タグ構築物）を捕獲し、ビーズ（単数または複数）をチャンバに射出し、次いでレーザー脱離／気化を前もって形成し得る。流れにおいて代替緩衝液中へ抽出することもまた可能である（例えば、キャピラリー電気泳動緩衝液から透過性膜を越えて疎水性緩衝液へ）。いくつかの使用において、タグをインターフェースのさらなる機能を含む質量分析計へ断続的に送達することもまた望ましい。インターフェースの別の機能は、各カラムについての時間帯を交代しながら、タグを複数のカラムから質量分析計へと送達することである。タグを、時間で分離して単一のカラムから複数のＭＳ検出器へと送達すること、数ミリ秒間にタグの各セットを回収すること、次いで質量分析計に送達することもまた可能である。
【０３２６】
以下は、本発明において使用され得る分離および検出技術についての代表的な売手のリストである。Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）は、配列決定アプリケーションについて電気泳動装置（Ｔｗｏ  ＳｔｅｐＴＭ，Ｐｏｋｅｒ  ＦａｃｅＴＭ  ＩＩ）を製造する。Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）は、ＤＮＡ分離および配列決定のための電気泳動装置（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析のためのＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ、ＤＮＡ配列決定のためのＭａｃｒｏＰｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）を製造する。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、蛍光染料に基づく半自動シーケンサー（ＡＢＩ３７３およびＡＢＩ３７７）を製造する。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）は、ＵＶ分光器を製造する。Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）は、原子吸光分光器、蛍光分光器、ＬＣおよびＧＣ質量分析器、ＮＭＲ分光器、およびＵＶ−ＶＩＳ分光器を製造する。ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）は、質量分析器（ＶｏｙａｇｅｒＴＭ  Ｅｌｉｔｅ）を生産する。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．（Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｐａｒｋ，ＭＡ）は、ＦＴＩＲ分光器（Ｖｅｃｔｏｒ２２）、ＦＴ−ラマン分光器、飛行時間型質量分析器（Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＩＴＭ）、イオン捕捉質量分析器（ＥｓｑｕｉｒｅＴＭ）、およびＭａｌｄｉ質量分析器を製造する。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（ＡＴＩ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）は、キャピラリーゲル電気泳動ユニット、ＵＶ検出器、およびダイオードアレイ検出器を作製する。Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）は、イオン捕捉質量分析器（３ＤＱ  ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴＭおよび３ＤＱ  ＡｐｏｇｅｅＴＭ）を製造する。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、エレクトロスプレーに適合するＳｃｉｅｘ質量分析器（三重の四重極型ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＩ  １００／３００）を製造する。Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）は、質量選択的検出器（ＨＰ  ５９７２Ａ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（ＨＰ  Ｇ２０２５Ａ）、ダイオードアレイ検出器、ＣＥユニット、ＨＰＬＣユニット（ＨＰ  １０９０）、ならびにＵＶ分光器を生産する。Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）は、質量分析器（磁気セクター（ＭＡＴ  ９５  ＳＴＭ）、四重極型分光器（ＭＡＴ  ９５  ＳＱＴＭ）、および４つの他の関連する質量分析器）を作製する。Ｒａｉｎｉｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）は、ＨＰＬＣ装置を作製する。
【０３２７】
本明細書中に記載される方法および組成物は、特定のサンプルタイプおよびヌクレオチド同一性に対するマップとして作用する切断されるタグの使用を可能にする。各配列決定法の始めに、特定の（選択された）プライマーは、特定の独特（ｕｎｉｑｕｅ）のタグに割り当てられる。タグは、サンプルタイプ、ジデオキシターミネータータイプ（Ｓａｎｇｅｒ配列決定反応の場合）、または好ましくは両方のいずれかをマップする。特に、タグは、プライマータイプをマップし、次にはベクタータイプをマップし、次にはサンプルの同一性をマップする。タグはまた、タグ化プライマーが配置されるジデオキシヌクレオチド反応を参照してジデオキシターミネータータイプ（ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＡＴＰ）をマップし得る。次いで、配列決定反応が実施され、そして得られるフラグメントはちょうどよい時にサイズにより連続的に分離される。
【０３２８】
タグは、時間枠内にフラグメントから切断され、そして測定され、そして時間枠内で記録される。配列は、タグマップを時間枠と比較することにより構築される。つまり、全てのタグの同一性が、サイジング（ｓｉｚｉｎｇ）工程の後にちょうどよい時に記録され、そして時間枠内で互いに関連する。サイジング工程は、１つのヌクレオチドの増加により核酸フラグメントを分離し、それ故、関連するタグの同一性は、一つのヌクレオチドの増加により分離される。ジデオキシターミネーターまたはヌクレオチドマップおよびサンプルタイプの予知により、配列は、直線的様式で容易に推定される。
【０３２９】
以下の実施例は、制限の目的ではなく例証の目的により提供される。
【０３３０】
他で述べない限り、実施例において使用されるような化学物質は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから入手され得る。以下の略語は、示される意味を有して、本明細書中で使用される：
ＡＮＰ＝３−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−３−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸
ＮＢＡ＝４−（Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−３−ニトロ安息香酸
ＨＡＴＵ＝Ｏ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＤＩＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン
ＭＣＴ＝モノクロロトリアジン
ＮＭＭ＝４−メチルモルホリン
ＮＭＰ＝Ｎ−メチルピロリドン
ＡＣＴ３５７＝Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹからのＡＣＴ３５７ペプチド合成機
ＡＣＴ＝Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ
ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ＝ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ−ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
Ｔｆａ＝トリフルオロアセチル
ｉＮＩＰ＝Ｎ−メチルイソニペコ酸
Ｔｆｐ＝テトラフルオロフェニル
ＤＩＡＥＡ＝２−（ジイソプロピルアミノ）エチルアミン
ＭＣＴ＝モノクロロトリアゼン
５’−ＡＨ−ＯＤＮ＝５’−アミノヘキシル−末端化オリゴデオキシヌクレオチド。
【実施例】
【０３３１】
実施例１
切断可能なＭＷ同定因子配列決定における使用のための酸不安定性リンカーの調製
Ａ．カルボキシルアミド末端を有する遊離タグのための化学的に切断可能な質量分析タグのペンタフルオロフェニルエステルの合成
図１は反応図を示す。
【０３３２】
工程Ａ。ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ  ＡＣ樹脂（化合物ＩＩ；ＡＣＴより入手可能；１ｅｑ．）を、ＡＣＴ３５７ペプチド合成装置（ＡＣＴ）の回収コンテナ中でＤＭＦに懸濁する。ＤＭＦ中の化合物Ｉ（３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）、およびＤＩＥＡ（７．５  ｅｑ．）を添加し、そして回収コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。樹脂へのＩのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＩＩＩを得る。
【０３３３】
工程Ｂ。樹脂（化合物ＩＩＩ）を、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、そして５分間振盪する。樹脂を濾過し、次いでＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、そして１０分間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄し、そして工程Ｃに直接用いる。
【０３３４】
工程Ｃ。工程Ｂからの脱保護樹脂をＤＭＦに懸濁し、そしてＤＭＦ中の側鎖にアミン官能基を含むＦＭＯＣ保護アミノ酸（化合物ＩＶ（例えば、α−Ｎ−ＦＭＯＣ−３−（３−ピリジル）−アラニン）Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ，  Ａｌｂａｎｙ，  ＯＲより入手可能；３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）、およびＤＩＥＡ（７．５  ｅｑ．）を添加する。コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。樹脂へのＩＶのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物Ｖを得る。
【０３３５】
工程Ｄ。樹脂（化合物Ｖ）を工程Ｂに記載のようにピペリジンで処理し、ＦＭＯＣ基を除去する。次いで、脱保護樹脂を、ＡＣＴ３５７によって、回収コンテナから１６の反応コンテナへ均等に分配する。
【０３３６】
工程Ｅ。工程Ｄからの脱保護樹脂の１６のアリコートをＤＭＦ中に懸濁する。各反応コンテナに、ＤＭＦ中の適切なカルボン酸ＶＩ１−１６（Ｒ１−１６ＣＯ２Ｈ；３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）、およびＤＩＥＡ（７．５  ｅｑ．）を添加する。コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂のアリコートをＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。樹脂のアリコートへのＶＩ１−１６のカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＶＩＩ１−１６を得る。
【０３３７】
工程Ｆ。樹脂（化合物ＶＩＩ１−１６）のアリコートを、ＣＨ２Ｃｌ２（３×）で洗浄する。各反応コンテナに、ＣＨ２Ｃｌ２中の１％ＴＦＡを添加し、そしてコンテナを３０分間振盪する。溶媒を、反応コンテナから個々のチューブに濾過する。樹脂のアリコートをＣＨ２Ｃｌ２（２×）およびＭｅＯＨ（２×）で洗浄し、そして濾過物を個々のチューブと合わせる。個々のチューブを真空下で蒸発させ、化合物ＶＩＩＩ１−１６を得る。
【０３３８】
工程Ｇ。各遊離カルボン酸ＶＩＩＩ１−１６を、ＤＭＦに溶解する。各溶液にピリジン（１．０５  ｅｑ．）を加え、続いてペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（１．１  ｅｑ．）を加える。混合物を、室温で４５分間撹拌する。溶液をＥｔＯＡｃで希釈し、１Ｍ  ａｑ．のクエン酸（３×）および５％  ａｑ．のＮａＨＣＯ３（３×）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして真空下で蒸発させ、化合物ＩＸ１−１６を得る。
【０３３９】
Ｂ．  カルボキシル酸末端を有する遊離タグのための化学的に切断可能な質量分析タグのペンタフルオロフェニルエステルの合成
図２は反応図を示す
工程Ａ。４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ酪酸（化合物Ｉ；１ｅｑ．）を、ＣＨＣｌ３中のＤＩＥＡ（２．１  ｅｑ．）およびアリルブロマイド（２．１  ｅｑ．）と合わせ、そして２時間加熱還流する。混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、１Ｎ  ＨＣｌ（２×）、炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）（２×）、および塩水（１×）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして真空で蒸発させ、化合物Ｉのアリルエステルを得る。
【０３４０】
工程Ｂ。工程Ａからの化合物Ｉのアリルエステル（１．７５  ｅｑ．）を、ＣＨ２Ｃｌ２中で、側鎖にアミン官能基を含むＦＭＯＣ保護アミノ酸（化合物ＩＩ（例えば、α−Ｎ−ＦＭＯＣ−３−（３−ピリジル）−アラニン）Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ，  Ａｌｂａｎｙ，  ＯＲより入手可能；１ｅｑ．）、Ｎ−メチルモルフォリン（２．５  ｅｑ．）およびＨＡＴＵ（１．１  ｅｑ．）と合わせ、そして室温で４時間撹拌する。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、１Ｍ  ａｑ．のクエン酸（２×）、水（１×）、および５％  ａｑ．のＮａＨＣＯ３（２×）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして真空下で蒸発させる。化合物ＩＩＩをフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２−−＞ＥｔＯＡｃ）によって単離する。
【０３４１】
工程Ｃ。化合物ＩＩＩを、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（０．０７  ｅｑ．）およびＮ−メチルアニリン（２ｅｑ．）を添加し、そして混合物を室温で４時間撹拌する。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、１Ｍ  ａｑ．のクエン酸（２×）および水（１×）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして真空下で蒸発させる。化合物ＩＶをフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２−−＞ＥｔＯＡｃ＋ＨＯＡｃ）によって単離する。
【０３４２】
工程Ｄ。ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ  ＡＣ樹脂（化合物Ｖ；１ｅｑ．）を、ＡＣＴ３５７ペプチド合成装置（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．（ＡＣＴ），Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，  ＫＹ）の回収コンテナ中でＤＭＦに懸濁する。ＤＭＦ中の化合物ＩＶ（３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）、およびＤＩＥＡ（７．５  ｅｑ．）を添加し、そして回収コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。樹脂へのＩＶのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＶＩを得る。
【０３４３】
工程Ｅ。樹脂（化合物ＶＩ）を、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、そして５分間振盪する。樹脂を濾過し、次いでＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、そして１０分間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。次いで、脱保護樹脂を、ＡＣＴ３５７によって、回収コンテナから１６の反応コンテナへ均等に分配する。
【０３４４】
工程Ｆ。工程Ｅからの脱保護樹脂の１６のアリコートを、ＤＭＦに懸濁する。各反応コンテナに、ＤＭＦ中の適切なカルボン酸ＶＩＩ１−１６（Ｒ１−１６ＣＯ２Ｈ；３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）、およびＤＩＥＡ（７．５  ｅｑ．）を添加する。コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂のアリコートをＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。樹脂のアリコートへのＶＩＩ１−１６のカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＶＩＩＩ１−１６を得る。
【０３４５】
工程Ｇ。樹脂（化合物ＶＩＩＩ１−１６）のアリコートを、ＣＨ２Ｃｌ２（３×）で洗浄する。各反応コンテナに、ＣＨ２Ｃｌ２中の１％ＴＦＡを添加し、そしてコンテナを３０分間振盪する。溶媒を、反応コンテナから個々のチューブに濾過する。樹脂のアリコートをＣＨ２Ｃｌ２（２×）およびＭｅＯＨ（２×）で洗浄し、そして濾過物を個々のチューブに合わせた。個々のチューブを真空下で蒸発させ、化合物ＩＸ１−１６を得る。
【０３４６】
工程Ｈ。各遊離カルボン酸ＩＸ１−１６を、ＤＭＦに溶解する。各溶液にピリジン（１．０５  ｅｑ．）を加え、続いてペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（１．１  ｅｑ．）を加える。混合物を、室温で４５分間撹拌する。溶液をＥｔＯＡｃで希釈し、１Ｍ  ａｑ．のクエン酸（３×）および５％  ａｑ．のＮａＨＣＯ３（３×）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして真空下で蒸発させ、化合物Ｘ１−１６を得る。
【０３４７】
実施例２
Ｔ−Ｌ−Ｘの光分解性切断の実証
実施例１３で調製されたＴ−Ｌ−Ｘ化合物を、室温で７分間、近紫外光で照射した。発光ピーク３５０ｎｍを有するＲａｙｏｎｅｔｔ蛍光ＵＶランプ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｃｏ．，  Ｍｉｄｄｌｅｔｏｗｎ，  ＣＴ）を、ＵＶ光供給源として用いる。ランプを、試料を有するペトリ皿から１５ｃｍ離して置く。ＳＤＳゲル電気泳動は、結合の＞８５％がこれらの条件下で切断されることを示す。
【０３４８】
実施例３
蛍光標識化プライマーの調製および発蛍光団の切断の実証
オリゴヌクレオチドの合成および精製
オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）を、製造業者より供給される標準ホスホルアミダイト化学、またはＨ−ホスホネート化学（Ｇｌｅｎｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，  ＶＡ）を用いて自動ＤＮＡ合成装置で調製する。適切にブロックされたｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、およびＴホスホルアミダイトは、これらの形態で市販され、そして合成ヌクレオシドは、適切な形態に容易に変換され得る。オリゴヌクレオチドを、製造業者より供給される標準ホスホルアミダイト、またはＨ−ホスホネート化学を用いて調製する。オリゴヌクレオチドを、標準方法を適応することによって精製する。５’トリチル基を有するオリゴヌクレオチドを、１２μｍ、３００＃Ｒａｉｎｉｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＣＡ）Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ−８  ４．２×２５０ｍｍ逆相カラムを用いて、０．１Ｎ  Ｅｔ３ＮＨ＋ＯＡｃ−（ｐＨ７．０）中の１５％〜５５％ＭｅＣＮの勾配で２０分間、ＨＰＬＣでクロマトグラフする。脱トリチル化を行う場合、オリゴヌクレオチドを、ゲル排除クロマトグラフィーによってさらに精製する。オリゴヌクレオチドの質の分析的チェックを、アルカリｐＨでＰＲＰカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ，  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，  ＩＬ）、およびＰＡＧＥで行う。
【０３４９】
２，４，６−トリクロロトリアジン誘導オリゴヌクレオチドの調製：５’末端アミン連結オリゴヌクレオチドの１０〜１０００μｇを、１９℃〜２５℃で３０〜１２０分間、アルカリ（好ましくはｐＨ８．３〜８．５）緩衝液において１０％ｎ−メチルピロリドン中の過剰の再結晶化塩化シアヌル酸と反応させる。最終反応条件は、０．１５Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）、２ｍｇ／ｍｌの再結晶化塩化シアヌル酸、および５００μｇ／ｍｌのそれぞれのオリゴヌクレオチドからなる。未反応の塩化シアヌル酸を、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）カラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。
【０３５０】
次いで、活性化した精製オリゴヌクレオチドを、０．１５Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）中の１００倍モル過剰のシスタミンと室温で１時間反応させる。未反応のシスタミンを、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。次いで、得られたＯＤＮを、アミン反応性蛍光色素と反応させる。得られたＯＤＮ調製物を、３つの部分に分け、そして各部分を（ａ）２０倍モル過剰のＴｅｘａｓ  Ｒｅｄスルホニルクロライド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）、（ｂ）２０倍モル過剰のＬｉｓｓａｍｉｎｅスルホニルクロライド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）（ｃ）２０倍モル過剰のフルオレセインイソチオシアネートのいずれかと反応させる。最終反応条件は、室温で１時間の０．１５Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）からなる。未反応の蛍光色素を、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。
【０３５１】
オリゴヌクレオチドから蛍光色素を切断するために、ＯＤＮを、１×１０−５モル濃度に調整し、次いで希釈物を、ＴＥ（ＴＥは、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡである）中で作製する（１２，３倍希釈）。１００μｌ容量のＯＤＮに対して、２５μｌの０．０１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加する。コントロールの同一のセットに対しては、ＤＴＴを加えない。混合物を、室温で１５分間インキュベートする。蛍光を、黒マイクロタイタープレートにおいて測定する。溶液をインキュベーションチューブ（１５０μｌ）から取り出し、そして黒マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，  ＶＡ）に入れる。次いで、プレートを、フルオレセインについては４９５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍのモニター発光、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄについては５９１ｎｍの励起波長および６１２ｎｍのモニター発光、およびＬｉｓｓａｍｉｎｅについては５７０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍのモニター発光で、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ＩＩ蛍光光度計（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＭｃＬｅａｎ，  ＶＡ）を用いて直接読みとる。
【０３５２】
【化３２】
2008183012.tif 000033
データは、蛍光色素をＯＤＮから切断した場合、相対的な蛍光が約２００倍増加することを示す。
【０３５３】
実施例４
タグ化Ｍ１３配列プライマーの調製およびタグの切断の実証
２，４，６−トリクロロトリアジン誘導オリゴヌクレオチドの調製：１０００μｇの５’末端アミン連結オリゴヌクレオチド（５’ヘキシルアミン−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’）（配列番号１）を、１９℃〜２５℃で３０〜１２０分間、アルカリ（好ましくはｐＨ８．３〜８．５）緩衝液において１０％ｎ−メチルピロリドン中の過剰の再結晶化塩化シアヌル酸と反応させる。最終反応条件は、０．１５Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）、２ｍｇ／ｍｌの再結晶化塩化シアヌル酸、および５００μｇ／ｍｌのそれぞれのオリゴヌクレオチドからなる。未反応の塩化シアヌル酸を、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。
【０３５４】
次いで、活性化した精製オリゴヌクレオチドを、０．１５Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）中の１００倍モル過剰のシスタミンと室温で１時間反応させる。未反応のシスタミンを、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。次いで、得られたＯＤＮを、種々のアミドと反応させる。得られたＯＤＮ調製物を、１２の部分に分割し、そして各部分を、（１）４−メトキシ安息香酸、（２）４−フルオロ安息香酸、（３）トルイル酸、（４）安息香酸、（５）インドール−３−酢酸、（６）２，６−ジフルオロ安息香酸、（７）ニコチン酸Ｎ−オキシド、（８）２−ニトロ安息香酸、（９）５−アセチルサリチル酸、（１０）４−エトキシ安息香酸、（１１）桂皮酸、（１２）３−アミノニコチン酸のいずれかのペンタフルオロフェニルエステル（２５モル過剰）と反応させる。０．２Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）中で、３７℃で２時間反応させる。得られたＯＤＮを、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘで、ゲル排除クロマトグラフィーによって精製する。
【０３５５】
オリゴヌクレオチドからタグを切断するために、ＯＤＮを、１×１０−５モル濃度に調整し、次いで希釈物を、５０％ＥｔＯＨ（Ｖ／Ｖ）を含むＴＥ（ＴＥは、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）５ｍＭ  ＥＤＴＡである）中で希釈する（１２，３倍希釈）。１００μｌ容量のＯＤＮに対して、２５μｌの０．０１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加する。コントロールの同一のセットに対しては、ＤＴＴを加えない。インキュベーションは、室温で３０分間である。次いで、ＮａＣｌを０．１Ｍまで加え、そして２容量のＥｔＯＨを添加し、ＯＤＮを沈殿させる。ＯＤＮを、１４，０００×Ｇ、４℃で１５分間の遠心分離によって溶液から除去する。上清を保存し、完全に乾燥する。次いで、ペレットを、２５μｌのＭｅＯＨに溶解する。次いで、ペレットを、タグの存在について質量分析によって試験する。
【０３５６】
この研究に用いた質量分析計は、外部イオン供給源フーリエ変換質量分析計（ＦＴＭＳ）である。ＭＡＬＤＩ分析のために調製した試料を、直接プローブの先端部に沈積し、そしてイオン供給源に挿入する。試料をレーザーパルスで照射する場合、イオンを供給源から抽出し、そして超伝導磁石の口径内に位置するＦＴＭＳ分析装置のセルに焦点を合わせ、かつ輸送する長四重極イオンガイドに通過させる。
【０３５７】
スペクトルは、以下の情報をもたらす。以下の分子量での２５〜１００相対強度単位の強度において変化するピーク：（１）４−メトキシ安息香酸誘導体を示す２１２．１ａｍｕ、（２）４−フルオロ安息香酸誘導体を示す２００．１、（３）トルイル酸誘導体を示す１９６．１ａｍｕ、（４）安息香酸誘導体を示す１８２．１ａｍｕ、（５）インドール−３−酢酸誘導体を示す２３５．２ａｍｕ、（６）２，６−ジフルオロ安息香酸を示す２１８．１ａｍｕ、（７）ニコチン酸Ｎ−オキシド誘導体を示す１９９．１ａｍｕ、（８）２−ニトロベンズアミドを示す２２７．１ａｍｕ、（９）５−アセチルサリチル酸誘導体を示す１７９．１８ａｍｕ、（１０）４−エトキシ安息香酸誘導体を示す２２６．１ａｍｕ、（１１）桂皮酸誘導体を示す２０９．１ａｍｕ、（１２）３−アミノニコチン酸誘導体を示す１９８．１ａｍｕ。
【０３５８】
結果は、ＭＷ同定因子がプライマーから切断され、そして質量分析によって検出され得ることを示す。
【０３５９】
実施例５
ＨＰＬＣ分離法、画分収集、ＭＷ同定因子切断、ＭＷ同定因子の質量（従って同一性）の決定、次いで配列の推定を用いた配列決定の実証
以下のオリゴヌクレオチドは実施例４に記載のように調製される。
【０３６０】
【化３３】
2008183012.tif 000034
上記の１００μｇの各５’末端アミン連結オリゴヌクレオチドを、１９℃〜２５℃にて３０〜１２０分間１０％ｎ−メチル−ピロリドンアルカリ（好ましくはｐＨ  ８．３〜８．５）中の過剰の再結晶化塩化シアヌルと反応させる。最終的な反応条件は、０．１５Ｍ  ホウ酸ナトリウム、ｐＨ  ８．３、２ｍｇ／ｍｌの再結晶化塩化シアヌルおよび５００ｕｇ／ｍｌの各オリゴヌクレオチドからなる。未反応の塩化シアヌルを、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。
【０３６１】
次いで、活性化精製オリゴヌクレオチドを、０．１５Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ  ８．３で１時間室温にて１００倍モル過剰のシスタミンと反応させる。未反応のシスタミンを、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。次いで、誘導体化したＯＤＮを以下の特定のペンタフルオロフェニル−エステルと反応させる：（１）４−メトキシ安息香酸を有するＤＭＯ７６７、（２）４−フルオロ安息香酸を有するＤＭＯ７６８、（３）トルイル酸、（４）安息香酸を有するＤＭＯ７６９、（５）インドール−３−酢酸を有するＤＭＯ７７０、（６）２，６−ジフルオロ安息香酸を有するＤＭＯ７７１、（７）ニコチン酸Ｎ−オキシドを有するＤＭＯ７７２、（８）２−ニトロ安息香酸を有するＤＭＯ７７３。
【０３６２】
１０ｎｇのそれぞれの８つの誘導体化ＯＤＮを共に混合し、次いでＨＰＬＣによってサイズ分離する。混合物を２５μｌの蒸留水に入れる。完全なサンプルを以下のカラムに注入する。ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  ４０００  ＤＭＡＥ、５０〜１０ｍｍカラムを用いる（ＥＭ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，  Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，  ＲＩ）。溶出液Ａは２０％  ＡＣＮ中の２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ  ７．４であり；  溶出液Ｂは溶出液Ａ＋１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４である。流速は１ｍｌ／分であり、そして検出はＵＶ＠２８０ｎｍである。グラジエントは以下の通りである：０分＠１００％Ａおよび０％Ｂ、３分＠１００％Ａおよび０％Ｂ、１５分＠８０％Ａおよび２０％Ｂ、６０分＠０％Ａおよび１００％Ｂ、６３分＠０％Ａおよび１００％Ｂ、６５分＠１００％Ａおよび０％Ｂ、７０分＠１００％Ａおよび０％Ｂ。画分を０．５分間隔で収集する。
【０３６３】
オリゴヌクレオチドからタグを切断するために、１００μｌの０．０５Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を各画分に添加する。インキュベーションは室温で３０分間である。次いで、ＮａＣｌを０．１Ｍになるように添加し、そして２容量のＥｔＯＨを添加してＯＤＮを沈殿させる。ＯＤＮを、１４，０００×Ｇで４℃にて１５分間の遠心分離によって溶液から取り出す。上清を保存し、遠心分離しながら真空下で完全に乾燥させる。次いで、ペレットを２５μｌのＭｅＯＨ中に溶解させる。次いで、ペレットを、ＭＷ−同定因子の存在について質量分析によって試験する。同一のＭＡＬＤＩ技術を、実施例４に記載のように使用する。以下のＭＷ（タグ）を、時間の関数として質量スペクトル中で観察する。
【０３６４】
【化３４】
2008183012.tif 000035
【０３６５】
【化３５】
2008183012.tif 000036
従って、タグの時間的出現は、２１２．１，２００．１、１９６．１、１８２．１、２３５．２，２１８．１、１９９．１、２２７．１である。２１２．１  ａｍｕは４−メトキシ安息香酸誘導体を示し、２００．１は４−フルオロ安息香酸誘導体を示し、１９６．１  ａｍｕはトルイル酸誘導体を示し、１８２．１  ａｍｕは安息香酸誘導体を示し、２３５．２  ａｍｕはインドール−３−酢酸誘導体を示し、２１８．１  ａｍｕは２，６−ジフルオロベンゼン誘導体を示し、１９９．１  ａｍｕはニコチン酸Ｎ−オキシド誘導体を示し、２２７．１  ａｍｕは２−ニトロベンズアミドを示すので、配列は−５’−ＡＴＧＣＡＴＧ−３’−であると推定され得る。
【０３６６】
実施例６
単一ＨＰＬＣ分離法における２つのＤＮＡサンプルの配列決定の実証
本実施例において、２つのＤＮＡサンプルを単一の分離法において配列決定する。
【０３６７】
以下のオリゴヌクレオチドを、実施例１に記載のように調製する：
【０３６８】
【化３６】
2008183012.tif 000037
上記の１００μｇの各５’末端アミン連結オリゴヌクレオチドを、１９℃〜２５℃にて３０〜１２０分間１０％ｎ−メチル−ピロリドンアルカリ（好ましくはｐＨ  ８．３〜８．５）中の過剰の再結晶化塩化シアヌルと反応させる。最終的な反応条件は、０．１５Ｍ  ホウ酸ナトリウム、ｐＨ  ８．３、２ｍｇ／ｍｌの再結晶化塩化シアヌルおよび５００ｕｇ／ｍｌの各オリゴヌクレオチドからなる。未反応の塩化シアヌルを、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。
【０３６９】
次いで、活性化精製オリゴヌクレオチドを、０．１５Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ  ８．３中で１時間室温にて１００倍モル過剰のシスタミンと反応させる。未反応のシスタミンを、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。次いで、誘導体化ＯＤＮを以下の特定のペンタフルオロフェニル−エステルと反応させる：（１）４−メトキシ安息香酸を有するＤＭＯ７６７およびニコチン酸Ｎ−オキシドを有するＤＭＯ７７３、（２）４−フルオロ安息香酸を有するＤＭＯ７６８および２−ニトロ安息香酸を有するＤＭＯ７７４、（３）トルイル酸およびアセチルサリチル酸を有するＤＭＯ７７５、（４）安息香酸を有するＤＭＯ７６９および４−エトキシ安息香酸を有するＤＭＯ７７６、（５）インドール−３−酢酸を有するＤＭＯ７７０およびケイ皮酸を有するＤＭＯ７７７、（６）２，６−ジフルオロ安息香酸を有するＤＭＯ７７１および３−アミノニコチン酸を有するＤＭＯ７７８。それ故、ＯＤＮの各セットに対して１つのタグが存在する。
【０３７０】
１０ｎｇのそれぞれの１２の誘導体化ＯＤＮを共に混合し、次いでＨＰＬＣによってサイズ分離する。混合物を２５μｌの蒸留水に入れる。完全なサンプルを以下のカラムに注入する。ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  ４０００  ＤＭＡＥ、５０〜１０ｍｍカラムを用いる（ＥＭ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，  Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，  ＲＩ）。溶出液Ａは２０％  ＡＣＮ中の２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ  ７．４であり；  溶出液Ｂは溶出液Ａ＋１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４である。流速は１ｍｌ／分であり、そして検出はＵＶ＠２８０ｎｍである。グラジエントは以下の通りである：０分＠１００％Ａおよび０％Ｂ、３分＠１００％Ａおよび０％Ｂ、１５分＠８０％Ａおよび２０％Ｂ、６０分＠０％Ａおよび１００％Ｂ、６３分＠０％Ａおよび１００％Ｂ、６５分＠１００％Ａおよび０％Ｂ、７０分＠１００％Ａおよび０％Ｂ。画分を０．５分間隔で収集する。
【０３７１】
オリゴヌクレオチドからタグを切断するために、１００μｌの０．０５Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を各画分に添加する。インキュベーションは室温で３０分間である。次いで、ＮａＣｌを０．１Ｍになるように添加し、そして２容量のＥｔＯＨを添加してＯＤＮを沈殿させる。ＯＤＮを、１４，０００×Ｇで４℃にて１５分間の遠心分離によって溶液から取り出す。上清を保存し、遠心分離しながら真空下で完全に乾燥させる。次いで、ペレットを２５μｌのＭｅＯＨ中に溶解させる。次いで、ペレットを、タグの存在について質量分析によって試験する。同一のＭＡＬＤＩ技術を、実施例４に記載のように使用する。以下のＭＷ（タグ）を、時間の関数として質量スペクトル中で観察する。
【０３７２】
【化３７】
2008183012.tif 000038
【０３７３】
【化３８】
2008183012.tif 000039
セット＃１に対するタグの時間的出現は、２１２．１，２００．１、１９６．１、１８２．１、２３５．２，２１８．１、１９９．１、２２７．１であり、そしてセット＃２に対するタグの時間的出現は１９９．１、２２７．１、１７９．１、２２６．１、２０９．１、１９８．１である。２１２．１  ａｍｕは４−メトキシ安息香酸誘導体を示し、２００．１は４−フルオロ安息香酸誘導体を示し、１９６．１  ａｍｕはトルイル酸誘導体を示し、１８２．１  ａｍｕは安息香酸誘導体を示し、２３５．２  ａｍｕはインドール−３−酢酸誘導体を示し、２１８．１  ａｍｕは２，６−ジフルオロベンゼン誘導体を示し、１９９．１  ａｍｕはニコチン酸Ｎ−オキシド誘導体を示し、２２７．１  ａｍｕは２−ニトロベンズアミドを示し、１７９．１８  ａｍｕは５−アセチルサリチル酸誘導体を示し、２２６．１  ａｍｕは４−エトキシ安息香酸誘導体を示し、２０９．１  ａｍｕはケイ皮酸誘導体を示し、そして１９８．１  ａｍｕは３−アミノニコチン酸を示すので、最初の配列は−５’−ＴＡＴＧＣＡ−３’−であると推定され得、そして第２の配列は−５’−ＣＧＴＡＣＣ−３’−であると推定され得る。従って、分離工程あたりに１つより多いＤＮＡサンプルを配列決定し得る。
【０３７４】
実施例７
式Ｒ１−３６−ＬＹＳ（ε−ｌＮＩＰ）−ＡＮＰ−ＴＦＰを有する化合物のセットの調製
図３は、３６のＴ−Ｌ−Ｘ化合物（Ｘ＝Ｌｈ）のセットの平行合成を例示する。Ｌｈは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、Ｌ２は、ＬｈおよびＬ２を連結するメチレン基であるＬ３を有するο−ニトロベンジルアミン基であり、Ｔはモジュラー構造を有する。ここでリジンのカルボン酸基は、Ｌ２ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分Ｒ１−３６（これらのＲ基は本明細書中に記載のＴ２に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、リジンのα−アミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（Ｎ−メチルイソニペコ酸を介して導入される）は、リジンのε−アミノ基を介して結合される。
【０３７５】
図３について言及する：
工程Ａ。ＮｏｖａＳｙｎ  ＨＭＰ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍより入手可能；１ｅｑ．）を、ＡＣＴ３５７の回収コンテナ中のＤＭＦに懸濁する。ＤＭＦ中の化合物Ｉ（ＡＣＴより入手可能なＡＮＰ；３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）およびＮＭＭ（７．５ｅｑ．）を添加し、そして回収コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。樹脂へのＩのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＩＩを得る。
【０３７６】
工程Ｂ。樹脂（化合物ＩＩ）を、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、５分間振盪する。樹脂を濾過し、次いでＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、そして１０分間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄し、そして工程Ｃに直接用いる。
【０３７７】
工程Ｃ。工程Ｂからの脱保護樹脂を、ＤＭＦ中に懸濁し、ＤＭＦ中の、側鎖に保護アミン官能基を含むＦＭＯＣ保護アミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓｉｎｅ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより入手可能；３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）、およびＮＭＭ（７．５ｅｑ．）を添加する。コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨの樹脂へのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＩＶを得る。
【０３７８】
工程Ｄ。樹脂（化合物ＩＶ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２×）で洗浄し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２中の（ＰＰｈ３）４Ｐｄ（０）（０．３ｅｑ．）およびＰｈＳｉＨ３（１０ｅｑ．）の溶液に懸濁する。混合物を１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２×）で洗浄する。パラジウム工程を反復する。溶媒を除去し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２×）、ＤＭＦ中のＮ，Ｎ−ジイソピロピルエチルアンモニウムジエチルジチオカルバメート（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄し、化合物Ｖを得る。
【０３７９】
工程Ｅ。工程Ｄからの脱保護樹脂を、工程Ｃに記載のＮ−メチルイソニペコ酸とカップリングさせ、化合物ＶＩを得る。
【０３８０】
工程Ｆ。Ｆｍｏｃ保護樹脂ＶＩを、ＡＣＴ３５７によって、回収コンテナから３６反応コンテナに等しく分配し、化合物ＶＩ１−３６を得る。
【０３８１】
工程Ｇ。樹脂（化合物ＶＩ１−３６）を工程Ｂに記載のピペリジンで処理し、ＦＭＯＣ基を除去する。
【０３８２】
工程Ｈ。工程Ｇからの脱保護樹脂の３６アリコートを、ＤＭＦ中に懸濁する。各反応コンテナに、ＤＭＦ中の適切なカルボン酸（Ｒ１−３６ＣＯ２Ｈ；３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）、およびＮＭＭ（７．５ｅｑ．）を添加する。コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂のアリコートをＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。樹脂のアリコートへのＲ１−３６ＣＯ２Ｈのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＶＩＩＩ１−３６を得る。
【０３８３】
工程Ｉ。樹脂（化合物ＶＩＩＩ１−３６）のアリコートをＣＨ２Ｃｌ２（３×）で洗浄する。各反応コンテナに、９０：５：５  ＴＦＡ：Ｈ２０：ＣＨ２Ｃｌ２を添加し、コンテナを１２０分間振盪する。溶媒を反応コンテナから個々のチューブに濾過する。樹脂のアリコートをＣＨ２Ｃｌ２（２×）およびＭｅＯＨ（２×）で洗浄し濾過物を個々のチューブに合わせる。個々のチューブを真空下で蒸発させ、化合物ＩＸ１−３６を得る。
【０３８４】
工程Ｊ。各々の遊離カルボン酸ＩＸ１−３６を、ＤＭＦ中に溶解させる。各溶液に、ピリジン（１．０５ｅｑ．）を添加し、続いて、テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（１．１ｅｑ．）を添加する。混合物を、室温で４５分間撹拌する。溶液をＥｔＯＡｃで希釈し、５％ａｑ．のＮａＨＣＯ３（３×）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして真空下で蒸発させ、化合物Ｘ１−３６を得る。
【０３８５】
実施例８
式Ｒ１−３６−ＬＹＳ（ε−ｌＮＩＰ）−ＮＢＡ−ＴＦＰを有する化合物のセットの調製
図４は、３６のＴ−Ｌ−Ｘ化合物（Ｘ＝Ｌｈ）のセットの平行合成を例示する。Ｌｈは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、Ｌ２は、ＬｈとＬ２との間で直接結合されるＬ３を有するο−ニトロベンジルアミン基であり（ＬｈはＬ２基の芳香環に直接結合する）、Ｔはモジュラー構造を有する。ここでリジンのカルボン酸基は、Ｌ２ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分Ｒ１−３６（これらのＲ基は本明細書中に記載のＴ２に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、リジンのαアミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（Ｎ−メチルイソニペコ酸を介して導入される）は、リジンのε−アミノ基を介して結合される。
【０３８６】
図４について言及する：
工程Ａ。ＮｏｖａＳｙｎ  ＨＭＰ樹脂を、実施例７の工程Ａに記載の手順に従って、化合物Ｉ（Ｂｒｏｗｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，１，４（１９９５）の手順に従って調製されたＮＢＡ）とカップリングさせ、化合物ＩＩを得る。
工程Ｂ−Ｊ。樹脂（化合物ＩＩ）を、実施例７の工程Ｂ〜Ｊに記載のように処理し、化合物Ｘ１−３６を得る。
【０３８７】
実施例９
式ｌＮＩＰ−ＬＹＳ（ε−Ｒ１−３６）−ＡＮＰ−ＴＦＰを有する化合物のセットの調製
図５は、３６のＴ−Ｌ−Ｘ化合物（Ｘ＝Ｌｈ）のセットの平行合成を例示する。Ｌｈは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、Ｌ２は、ＬｈおよびＬ２を連結するメチレン基であるＬ３を有するο−ニトロベンジルアミン基であり、Ｔはモジュラー構造を有する。ここでリジンのカルボン酸基は、Ｌ２ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分Ｒ１−３６（これらのＲ基は本明細書中に記載のＴ２に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、リジンのεアミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（Ｎ−メチルイソニペコ酸を介して導入される）は、リジンのα−アミノ基を介して結合される。
【０３８８】
図５について言及する：
工程Ａ〜Ｃ。実施例７と同じ。
【０３８９】
工程Ｄ。樹脂（化合物ＩＶ）を、実施例５の工程Ｂに記載のピリジンで処理し、ＦＭＯＣ基を除去する。
【０３９０】
工程Ｅ。工程Ｄの樹脂上の脱保護αアミンを、実施例５の工程Ｃに記載のＮ−メチルイソニペコ酸とカップリングさせ、化合物Ｖを得る。
【０３９１】
工程Ｆ。実施例７と同じ。
【０３９２】
工程Ｇ。樹脂（化合物ＶＩ１−３６）を、実施例７の工程Ｄに記載のパラジウムで処理し、Ａｌｏｃ基を除去する。
【０３９３】
工程Ｈ〜Ｊ。化合物Ｘ１−３６を、実施例７と同様の様式で調製する。
【０３９４】
実施例１０
式Ｒ１−３６−ＧＬＵ（γ−ＤＩＡＥＡ）−ＡＮＰ−ＴＦＰを有する化合物のセットの調製
図６は、３６のＴ−Ｌ−Ｘ化合物（Ｘ＝Ｌｈ）のセットの平行合成を例示する。Ｌｈは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、Ｌ２は、ＬｈおよびＬ２を連結するメチレン基であるＬ３を有するο−ニトロベンジルアミン基であり、Ｔはモジュラー構造を有する。ここでグルタミン酸のαカルボン酸基は、Ｌ２ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分Ｒ１−３６（これらのＲ基は本明細書中に記載のＴ２に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、グルタミン酸のα−アミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（２−（ジイソプロピルアミノ）エチルアミンを介して導入される）は、グルタミン酸のγ−カルボン酸を介して結合される。
【０３９５】
図６について言及する：
工程Ａ〜Ｂ。実施例７と同じ。
【０３９６】
工程Ｃ。脱保護樹脂（化合物ＩＩＩ）を、実施例７の工程Ｃに記載のカップリング方法を用いて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−（ＯＡｌ）−ＯＨにカップリングさせ、化合物ＩＶを得る。
【０３９７】
工程Ｄ。樹脂（化合物ＩＶ）上のアリルエステルを、ＣＨ２Ｃｌ２（２×）で洗浄し、ＣＨ２Ｃｌ２中の（ＰＰｈ３）４Ｐｄ（０）（０．３ｅｑ．）およびＮ−メチルアニリン（３ｅｑ．）の溶液と混合する。混合物を１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２×）で洗浄する。パラジウム工程を反復する。溶媒を除去し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２×）、ＤＭＦ（２×）中のＮ，Ｎ−ジイソピロピルエチルアンモニウムジエチルジチオカルバメート、およびＤＭＦ（２×）で洗浄し、化合物Ｖを得る。
【０３９８】
工程Ｅ。工程Ｄからの脱保護樹脂を、ＤＭＦ中に懸濁し、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）およびＮＭＭ（７．５ｅｑ．）を混合することによって活性化する。コンテナを１５分間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＮＭＰ（１×）で洗浄する。樹脂を、２−（ジイソプロピルアミノ）エチルアミン（３ｅｑ．）およびＮＭＭ（７．５ｅｑ．）と混合する。コンテナを１時間振盪する。樹脂への２−（ジイソプロピルアミノ）エチルアミンのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＶＩを得る。
【０３９９】
工程Ｆ〜Ｊ。実施例７と同じ。
【０４００】
実施例１１
式Ｒ１−３６−ＬＹＳ（ε−ｌＮＩＰ）−ＡＮＰ−ＬＹＳ（ε−ＮＨ２）−ＮＨ２を有する化合物のセットの調製
図７は、３６のＴ−Ｌ−Ｘ化合物（Ｘ＝Ｌｈ）のセットの平行合成を例示する。Ｌｈはアミン（特に、リジン誘導部分のε−アミノ基）であり、Ｌ２は、ＬｈおよびＬ２を連結するカルボキサミド置換アルキレンアミノアシルアルキレン基であるＬ３を有するο−ニトロベンジルアミン基であり、Ｔはモジュラー構造を有する。ここでリジンのカルボン酸基は、Ｌ２ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分Ｒ１−３６（これらのＲ基は本明細書中に記載のＴ２に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、リジンのαアミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（Ｎ−メチルイソニペコ酸を介して誘導される）は、リジンのε−アミノ基を介して結合される。
【０４０１】
図７について言及する：
工程Ａ。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＳＲＡＭ樹脂（ＡＣＴより入手可能：化合物Ｉ）を、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、そして５分間振盪する。樹脂を濾過し、次いでＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、そして１０分間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄し、そして工程Ｂに直接用いる。
【０４０２】
工程Ｂ。ＤＭＦ中の樹脂（化合物ＩＩ）、ＡＮＰ（ＡＣＴより入手可能；３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）およびＮＭＭ（７．５ｅｑ．）を添加し、そして回収コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。Ｉの樹脂へのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＩＩＩを得る。
【０４０３】
工程Ｃ〜Ｊ。樹脂（化合物ＩＩＩ）を、実施例７の工程Ｂ〜Ｉのように処理し、化合物Ｘ１−３６を得る。
【０４０４】
実施例１２
式Ｒ１−３６−ＬＹＳ（ε−ＴＦＡ）−ＬＹＳ（ε−ｌＮＩＰ）−ＡＮＰ−ＴＦＰを有する化合物のセットの調製
図８は、３６のＴ−Ｌ−Ｘ化合物（Ｘ＝Ｌｈ）のセットの平行合成を例示する。Ｌｈは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、Ｌ２は、ＬｈおよびＬ２を連結するメチレン基であるＬ３を有するο−ニトロベンジルアミン基であり、Ｔはモジュラー構造を有する。ここで第１のリジンのカルボン酸基は、Ｌ２ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、質量分析感度エンハンサー基（Ｎ−メチルイソニペコ酸を介して誘導される）は、第１のリジンのε−アミノ基を介して結合され、第２のリジン分子は第１のリジンのα−アミノ基を介して第１のリジンに結合され、分子量調整基（トリフルオロアセチル構造を有する）は、第２のリジンのε−アミノ基を介して結合され、そして可変重量成分Ｒ１−３６（これらのＲ基は本明細書中に記載のＴ２に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して誘導され得る）は、第２のリジンのαアミノ基を介して結合される。
【０４０５】
図８について言及する：
工程Ａ〜Ｅ。これらの工程は、実施例７の工程Ａ〜Ｅと同一である。
【０４０６】
工程Ｆ。樹脂（化合物ＶＩ）を、実施例７の工程Ｂに記載のピペリジンで処理し、ＦＭＯＣ基を除去する。
【０４０７】
工程Ｇ。脱保護樹脂（化合物ＶＩＩ）を、実施例７の工程Ｃに記載のカップリング方法を用いて、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｔｆａ）−ＯＨにカップリングし、化合物ＶＩＩＩを得る。
【０４０８】
工程Ｈ〜Ｋ。樹脂（化合物ＶＩＩＩ）を、実施例７の工程Ｆ〜Ｊに記載のように処理し、化合物ＸＩ１−３６を得る。
【０４０９】
実施例１３
式Ｒ１−３６−ＬＹＳ（ε−ｌＮＩＰ）−ＡＮＰ−５’−ＡＨ−ＯＤＮを有する化合物のセットの調製
図９は、実施例７のエステル由来の３６のＴ−Ｌ−Ｘ（Ｘ＝ＭＯＩ、ここでＭＯＩは核酸フラグメントである、ＯＤＮ）のセットの平行合成を例示する（同じ手順が、他のＴ−Ｌ−Ｘ化合物で用いられ得る、ここでＸは活性化エステルである）。ＭＯＩを、Ｔ−Ｌに、ＭＯＩの５’末端を介して、ホスホジエステル−アルキレンアミン基により結合する。
【０４１０】
図９について言及する：
工程Ａ。化合物ＸＩＩ１−３６を、Ｖａｎ  Ｎｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９，  ３３４５  （１９９１）の改変したビオチン化手順に従って調製する。２００ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３、
２５０ｍＬ）中に５’−アミノヘキシルオリゴヌクレオチド（化合物ＸＩ１−３６、１ｍｇ）の１つを有する溶液に、テトラフルオロフェニルエステル（実施例Ａからの化合物ＸＩＩ１−３６、２５０ｍＬのＮＭＰ中に１００倍モル過剰）の１つを添加する。反応物を、周囲温度で一晩インキュベートする。未反応および加水分解したテトラフルオロフェニルエステルを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０クロマトグラフィーによって化合物ＸＩＩ１−３６から除去する。
【０４１１】
実施例１４
式Ｒ１−３６−ＬＹＳ（ε−ｌＮＩＰ）−ＡＮＰ−ＬＹＳ（ε−（ＭＣＴ−５’−ＡＨ−ＯＤＮ）−ＮＨ２を有する化合物のセットの調製
図１０は、実施例１１のアミン由来の３６のＴ−Ｌ−Ｘ（Ｘ＝ＭＯＩ、ここで、ＭＯＩは核酸フラグメントである、ＯＤＮ）のセットの平行合成を例示する（同じ手順が、他のＴ−Ｌ−Ｘ化合物で用いられ得、Ｘはアミンである）。ＭＯＩを、Ｔ−Ｌに、ＭＯＩの５’末端を介して、ホスホジエステル−アルキレンアミン基により結合する。
【０４１２】
図１０について言及する：
工程Ａ。５’−［６−（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ）ヘキシル］オリゴヌクレオチドＸＩＩ１−３６を、Ｖａｎ  Ｎｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９，  ３３４５  （１９９１）に記載のように調製する。
【０４１３】
工程Ｂ。１００ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）中の１ｍｇ／ｍｌの濃度の５’−［６−（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ）ヘキシル］オリゴヌクレオチド（化合物ＸＩＩ１−３６）の１つを有する溶液を、Ｒ１−３６−Ｌｙｓ  （ｅ−ｉＮＩＰ）−ＡＮＰ−Ｌｙｓ（ｅ−ＮＨ２）−ＮＨ２（実施例１１からの化合物Ｘ１−３６）より選択される、１００倍モル過剰の１級アミンに添加した。溶液を室温で１晩混合する。未反応のアミンを、洗浄溶液としてＨ２Ｏ（３×）を用いて、３０００ＭＷカットオフ膜（Ａｍｉｃｏｎ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）を通す限外濾過によって除去する。化合物ＸＩＩＩ１−３６を、１００ｍＬの用量に減少させることによって単離する。
【０４１４】
実施例１５
ＣＥ分離法、画分収集、タグ切断、タグの質量（従って同一性）の決定、次いで配列推定を用いた配列決定の実証
本実施例において、２つのＤＮＡサンプルを単一の分離法において配列決定する。
【０４１５】
ＣＥ器具使用
ＣＥ器具は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）から市販されている器具のブレッドボード版である。それは２つの緩衝チャンバーを囲むＰｌｅｘｉｇｌａｓボックスからなり、これは熱制御ユニットで一定温度に維持され得る。電気泳動に必要な電圧は、磁気安全インターロックおよび適用電位を変化させる制御ユニットを有する高電圧パワーサプライ（Ｇａｍｍａ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｏｒｍｏｎｄ  Ｂｅａｃｈ，  ＦＬ）によって提供される。オープンチューブ（ｏｐｅｎ  ｔｕｂｅ）キャピラリーに対するサンプル注入は、キャピラリーを横切る圧力差（真空注入）を生じさせるためにハンド真空ポンプの使用によって実施する。ゲル充填キャピラリーについては、サンプルを電場の適用によってチューブ中に電気泳動させる（電気運動的注入）。
【０４１６】
ゲル充填キャピラリーの調製
２５ｃｍに検出器窓を有する５０センチメートル石英ガラスキャピラリー（３７５ｍｍ  ｏ．ｄ．，  ５０ｍｍ  ｉ．ｄ．、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｐｈｏｅｎｉｘ，  ＡＺ）（ここでポリイミドコーティングはキャピラリーから除去されている）を分離に用いる。キャピラリーの内部表面は、キャピラリー壁へのゲルの共有結合を可能にするために（メチアクリロキシプロピル）トリメトキシシラン（（ｍｅｔｈｙａｃｒｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ：ＭＡＰＳ）（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で誘導体化する（Ｎａｓｈａｂｅｈら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６３：２１４８，  １９９４）。手短には、カラムにトリフルオロ酢酸、脱イオン水、およびアセトンを連続的に流動させることにより、キャピラリーを清掃する。アセトン洗浄の後、５０／５０  水／エタノール溶液中の０．２％ＭＡＰＳ溶液をキャピラリーに通し、そして室温で３０分間そのままにしておく。溶液をアスピレーションによって除去し、そしてチューブを赤外線熱ランプ下で３０分間乾燥させる。
【０４１７】
ゲル充填キャピラリーを、Ｈｕａｎｇら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ６００：２８９，  １９９２）に記載された手順の改変法によって高圧下で調製する。５％のクロスリンカーおよび８．３  尿素を有する４パーセントのポリ（アクリルアミド）ゲルを、本明細書中に報告した全ての研究に用いる。３．８ｇのアクリルアミド、０．２０ｇのＮ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）、および５０ｇの尿素を１００ｍＬのＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭ  Ｔｒｉｓホウ酸、ｐＨ  ８．３，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に溶解させることによって、原液を作製する。架橋を、１０ｍＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）および２５０ｍＬの１０％アンモニウムパーサルフェート溶液で開始する。重合溶液を誘導体化カラムに迅速に通す。次いで、充填キャピラリーを、水を充填したスチールチューブ１×ｍ×１／８  ｉｎ．  ｉ．ｄ．×１／４  ｉｎ．  ｏ．ｄ．中に配置し、ＨＰＬＣポンプを用いて４００バーまで圧力を上昇させ、そして一晩その圧力を維持させる。圧力を徐々に開放し、そしてキャピラリーを除去する。カラムの各末端からキャピラリーの短いセクションを使用する前に除去する。
【０４１８】
ＤＮＡフラグメントの分離および検出
従来の電気泳動によって分離されたＤＮＡ配列決定反応の分析を、ＡＢＩ  ３７０Ａ  ＤＮＡシーケンサーで実施する。この器具は、製造業者の指示に従って調製された、サンプルウェルから検出領域まで２６ｃｍの距離を有するスラブ変性尿素ポリ（アクリルアミド）ゲル０．４ｍｍ厚を使用する。ＤＮＡ配列決定反応物を、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を利用して製造業者によって記載されるように調製し、そして標準的手順によって調製されるＭ１３ｍｐ１９一本鎖ＤＮＡテンプレートにおいて実施する。配列決定反応物を、暗所で−２０℃にて保存し、そしてサンプルをロードする直前にホルムアミド中で９０℃にて３分間熱する。それらを、製造業者の指示に従ってピペットマンで３７０Ａに載せ、そして１０，０００Ｖで１０秒間の電気運動注入によってＣＥにロードする。底面電極の全ての液体を取り出し、そしてそれを新しい電解質と交換することにより１０μｌの画分を操業（ｒｕｎ）間に収集する。
【０４１９】
オリゴヌクレオチドからタグを切断するために、１００μｌの０．０５Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を各画分に添加する。インキュベーションは室温で３０分間である。次いで、ＮａＣｌを０．１Ｍになるように添加し、そして２容量のＥｔＯＨを添加してＯＤＮを沈殿させる。ＯＤＮを、１４，０００×Ｇで４℃にて１５分間の遠心分離によって溶液から取り出す。上清を保存し、遠心分離しながら真空下で完全に乾燥させる。次いで、ペレットを２５μｌのＭｅＯＨ中に溶解させる。次いで、ペレットを、タグの存在について質量分析によって試験する。同一のＭＡＬＤＩ技術を、実施例４に記載のように使用する。以下のＭＷ（タグ）を、時間の関数として質量スペクトル中で観察する。
【０４２０】
【化３９】
2008183012.tif 000040
セット＃１に対するタグの時間的出現は、２１２．１，２００．１、１９６．１、１８２．１、２３５．２，２１８．１、１９９．１、２２７．１であり、そしてセット＃２に対するタグの時間的出現は１９９．１、２２７．１、１７９．１、２２６．１、２０９．１、１９８．１である。２１２．１  ａｍｕは４−メトキシ安息香酸誘導体を示し、２００．１は４−フルオロ安息香酸誘導体を示し、１９６．１  ａｍｕはトルイル酸誘導体を示し、１８２．１  ａｍｕは安息香酸誘導体を示し、２３５．２  ａｍｕはインドール−３−酢酸誘導体を示し、２１８．１  ａｍｕは２，６−ジフルオロベンゼン誘導体を示し、１９９．１  ａｍｕはニコチン酸Ｎ−オキシド誘導体を示し、２２７．１  ａｍｕは２−ニトロベンズアミドを示し、１７９．１８  ａｍｕは５−アセチルサリチル酸誘導体を示し、２２６．１  ａｍｕは４−エトキシ安息香酸誘導体を示し、２０９．１  ａｍｕはケイ皮酸誘導体を示し、そして１９８．１  ａｍｕは３−アミノニコチン酸を示すので、最初の配列は−５’−ＴＡＴＧＣＡ−３’−であると推定され得、そして第２の配列は−５’−ＣＧＴＡＣＣ−３’−であると推定され得る。従って、分離工程あたりに１つより多いＤＮＡサンプルを配列決定し得る。
【０４２１】
実施例１６
質量分析による複数のタグの同時検出の実証
本実施例は、質量分析による複数の化合物（タグ）を同時に検出する能力を記載する。この特定の実施例において、３１の化合物をマトリクスと混合し、沈積し、そして固体支持体上で乾燥させ、次いで、レーザーで脱離させる。次いで、得られたイオンを、質量分析装置に導入した。
【０４２２】
以下の化合物（Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩより購入した）を、等モルベースでともに混合し、０．００２Ｍベース（化合物当たり）の最終濃度とする：ベンズアミド（１２１．１４）、ニコチンアミド（１２２．１３）、ピラジンアミド（１２３．１２）、３−アミノ−４−ピラゾールカルボン酸（１２７．１０）、２−チオフェンカルボキサミド（１２７．１７）、４−アミノベンズアミド（１３５．１５）、トルミド（１３５．１７）、６−メチルニコチンアミド（１３６．１５）、３−アミノニコチンアミド（１３７．１４）、ニコチンアミド  Ｎ−オキシド（１３８．１２）、３−ヒドロピコリンアミド（１３８．１３）、４−フルオロベンズアミド（１３９．１３）、桂皮酸アミド（１４７．１８）、４−メトキシベンズアミド（１５１．１７）、２，６−ジフルオロベンズアミド（１５７．１２）、４−アミノ−５−イミダゾール−カルボキシアミド（１６２．５８）、３，４−ピリジン−ジカルボキシアミド（１６５．１６）、４−エトキシベンズアミド（１６５．１９）、２，３−ピラジンジカルボキサミド（１６６．１４）、２−ニトロベンズアミド（１６６．１４）、３−フルオロ−４−メトキシ安息香酸（１７０．４）、インドール−３−アセトアミド（１７４．２）、５−アセチルサリチルアミド（１７９．１８）、３，５−ジメトキシベンズアミド（１８１．１９）、１−ナフタレンアセトアミド（１８５．２３）、８−クロロ−３，５−ジアミノ−２−ピラジンカルボキシアミド（１８７．５９）、４−トリフルオロメチル−ベンズアミド（１８９．００）、５−アミノ−５−フェニル−４−ピラゾール−カルボキサミド（２０２．２２）、１−メチル−２−ベンジル−マロナメート（２０７．３３）、４−アミノ−２，３，５，６−テトラフルオロベンズアミド（２０８．１１）、２，３−ナフタレンジカルボン酸（２１２．２２）。化合物を、上記の濃度でＤＭＳＯ中に入れる。次いで、１μｌの材料をα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸マトリクス（１：１０，０００希釈後）と混合し、そして固体ステンレス支持体に沈積させる。
【０４２３】
次いで、材料を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ，  Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｐａｒｋ，  ＭＡ）を用いて、レーザーによって脱離させ、得られるイオンを、操作の直線および反射モードの両方で測定する。以下のｍ／ｚ値を得る（図１１）：
【０４２４】
【化４０】
2008183012.tif 000041
【０４２５】
【化４１】
2008183012.tif 000042
【０４２６】
【化４２】
2008183012.tif 000043
データは、３１個の化合物の２２個が予想される質量のスペクトルを示し、３１個の化合物の９個が予想される質量を超える＋Ｈ質量（１原子質量単位、ａｍｕ）のスペクトルを示したことを示した。後者の現象はおそらく、化合物内のアミンのプロトン化による。従って、３１個の化合物の３１個が、ＭＡＬＤＩ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙによって検出される。より重要なことに、実施例は、複数のタグが分光学的方法によって同時に検出され得ることを実証する。
【０４２７】
α−シアノマトリクス単体（図１２）は、１４６．２、１６４．１、１７２．１、１７３．１、１８９．１、１９０．１、１９１．１、１９２．１、２１２．１、２２４．１、２２８．０、２３４．３のピークを示す。化合物をさらに精製しなかったので、スペクトルの他の同定された質量は、購入した化合物の夾雑物による。
【０４２８】
実施例１７
ＭＷ−同定因子−標識プライマー、放射標識プライマー、ＭＷ同定因子−標識−ジデオキシターミネーター、蛍光−プライマーおよび蛍光−ジデオキシターミネーターを用いた配列決定のための手順
Ａ．  配列決定用ゲルの調製および電気泳動
プロトコルは以下の通りである。４％、６％、または８％ポリアクリルアミドについて以下のレシピに従って、８Ｍ尿素、ポリアクリルアミドゲル（１００ｍｌ）を調製する。
【０４２９】
【化４３】
2008183012.tif 000044
尿素（５５０ＵＡ）をＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）から入手する。全ての他の材料をＦｉｓｈｅｒ（Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，  ＮＪ）から入手する。手短には、尿素、ＭＴＢＥ緩衝液および水を組み合わせて、５５℃で５分間インキュベートし、そして撹拌して尿素を溶解させる。この混合物を手短に冷却し、アクリルアミド／ビス−アクリルアミド溶液を添加および混合し、そして混合物全体を５分間減圧下で脱気する。ＡＰＳおよびＴＥＭＥＤ重合化薬剤を撹拌しながら添加する。完全なゲル混合物を、０．１５ｍｍのスペーサーを有するテープしたガラスプレートの間にただちに注いだ。プレートを、ＡＬＣＯＮＯＸＴＭ（Ｎｅｗ，  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）界面活性剤および熱水で最初に清掃することによって調製し、二重蒸留水でリンスし、そして乾燥する。代表的には、刻み目で固定した（ｎｏｔｃｈｅｄ）ガラスプレートをシラン処理薬剤で処理し、次いで二重蒸留水でリンスする。注いだ後、ゲルをただちに水平に置き、ウェル形成コームを挿入し、適所で（ｉｎｔｏ  ｐｌａｃｅ）クランプし、そして少なくとも３０分間ゲルを重合化させる。ローディングの前に、ゲルの底面の周りのテープおよびウェル形成コームを除去する。次いで、ゲルプレートに上部および下部緩衝液チャンバーをクランプし、そしてそれらのチャンバーに１×ＭＴＢＥ電気泳動緩衝液を添加することによって、垂直方向の電気泳動装置を構築する。サンプルウェルを、ランニング緩衝液を含有するシリンジでフラッシュし、そして各サンプルをロードする直前に、ゲルローディングチップを用いてランニング緩衝液でフラッシュし、尿素を除去する。１〜２μｌのサンプルを、ゲルローディングチップを有するＰｉｐｅｔｔｅｍａｎ（Ｒａｉｎｉｎ，  Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＣＡ）を用いてロードし、次いで以下のガイドラインに従って電気泳動する（電気泳動の間、ゲルをファンで冷却する）。
【０４３０】
【化４４】
2008183012.tif 000045
終結させた（ショートターミネーションで）各塩基特異的配列決定反応の混合物を、０．１５ｍｍ×５０ｃｍ×２０ｃｍ変性５％ポリアクリルアミドゲル上にロードする；ロングターミネーションで終結させた反応の混合物を、代表的には半分に分け、そして２つの０．１５ｍｍ×７０ｃｍ×２０ｃｍ変性４％ポリアクリルアミドゲル上にロードする。
【０４３１】
電気泳動の後、緩衝液をウェルから除去し、テープを除去し、そしてゲルプレートを分離する。ゲルを、４０ｃｍ×２０ｃｍシートの３ＭＭ  Ｗｈａｔｍａｎペーパーに移し、プラスチックラップで覆い、そしてＨｏｅｆｅｒ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）ゲルドライヤー上で２５分間８０℃にて乾燥させる。乾燥ゲルを、Ｋｏｄａｋ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，  ＣＴ）ＸＲＰ−１フィルムに露光する。シグナルの強度および放射標識が３２Ｐまたは３５Ｓのいずれであるかに応じて、露光時間は４時間から数日間に変化する。露光の後、フィルムを、現像液および定着液中で処理することによって現像し、水でリンスし、そして風乾する。次いでオートラジオグラムをライトボックスに入れ、配列を手作業で読み、そしてデータをコンピューターにタイプする。
【０４３２】
標識プライマーを用いたＴａｑポリメラーゼ触媒サイクル配列決定。各塩基特異的サイクル配列決定反応物は、それぞれＡおよびＣまたはＧおよびＴ反応のために約１００または２００ｎｇの単離された一本鎖ＤＮＡを日常的に含む。二本鎖サイクル配列決定反応物は、標準的アルカリ溶解または珪藻土改変アルカリ溶解手順のいずれかを用いて単離された２００または４００ｎｇのプラスミドＤＮＡを同様に含有していた。テンプレートＤＮＡを除く全ての試薬を、−２０℃で保存した以前に分割した原液のプレミックスから１つのピペッティング工程で添加した。反応プレミックスを、反応緩衝液と塩基特異的ヌクレオチド混合物とを組み合わせることにより調製する。使用する前に、塩基特異的反応プレミックスを解凍し、希釈したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび各末端標識ユニバーサルプライマーと組み合わせ、最終反応混合物を産生する。一旦上記混合物を調製すると、４つのアリコートの一本鎖または二本鎖ＤＮＡを、それぞれの０．２ｍｌの薄壁の反応チューブ（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの反応物に対応する）の底にピペットし、次いでそれぞれの反応混合物のアリコートを、各チューブの側面に添加する。これらのチューブは、マイクロタイタープレートフォーマット中の９６チューブ／保持器セットトレイの一部であり、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６００（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）に適合する。ストリップキャップで、チューブ／保持器セットトレイを封着し、プレートを手短に遠心分離する。次いでプレートを熱ブロックが９５℃に予熱されたサイクラーに配置し、そしてサイクルプログラムをただちに開始する。サイクルプロトコルは、１５〜３０サイクルの：９５℃変性；５５℃アニーリング；７２℃伸長；９５℃変性；７２℃伸長からなり；９５℃変性、および７２℃伸長、４℃最終浸漬ファイルにつながる。
【０４３３】
この段階で、反応物を凍結し、そして数日間まで−２０℃で保存し得る。プーリングおよび沈殿の前に、プレートを手短に遠心分離し、濃縮を再生する。プライマーおよび塩基特異的反応物をエタノール中にプールし、そして沈殿したＤＮＡを遠心分離により収集し、乾燥させる。これらの配列決定反応物は、−２０℃で数日間保存され得る。
【０４３４】
配列決定反応のプロトコルは以下の通りである。ＡおよびＣ反応については１μｌ、ＧおよびＴ反応については２μｌの各ＤＮＡサンプル（Ｍ１３テンプレートに対して１００ｎｇ／ｕｌ、ｐＵＣテンプレートに対して２００ｎｇ／ｕｌ）を、０．２ｍｌの薄壁反応チューブの底にピペットする。ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｎ８０１−００６０）は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）に由来する。
【０４３５】
２４のクローンに対して、３０μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（５Ｕ／μｌ）、３０μｌの５×Ｔａｑ反応緩衝液、１３０μｌｄｄＨ２Ｏ、および１９０μｌの希釈Ｔａｑの混合物を調製する。
【０４３６】
Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの塩基特異的混合物を、各塩基特異的ヌクレオチド／緩衝液プレミックスに塩基特異的プライマーおよび希釈Ｔａｑを添加することによって調製する：
Ａ、Ｃ／Ｇ、Ｔ
６０／１２０μｌ          ５×Ｔａｑサイクル配列決定混合物
３０／６０μｌ            希釈Ｔａｑポリメラーゼ
３０／６０μｌ            各蛍光末端標識プライマー
１２０／２４０μｌ。
【０４３７】
Ｂ．ＭＷ−同定因子−標識ターミネーター反応を用いるＴａｑポリメラーゼ触媒サイクル配列決定
ＤＮＡサイクル配列決定における１つの問題は、プライマーが用いられる場合、反応条件が、ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）フラグメントセット分布が反応混合物中のテンプレート濃度に高度に依存することである。標識ターミネーターを用いるＤＮＡサイクル配列決定反応のためのネスティッドフラグメントセット分布が、ＤＮＡ濃度に対して上記のような標識プライマー反応で得られるのより大いに感受性が低いことが最近観察されている。さらに、ターミネーター反応は、テンプレートあたりにただ１つの反応チューブを必要とするが、一方、標識プライマー反応は４つのターミネーターのそれぞれに対して１つの反応チューブが必要である。下記のプロトコルは、９６ウェルテンプレート単離に容易に調和し、そして９６ウェル反応一掃手順もまた本明細書中に記載される。
【０４３８】
０．５μｇの一本鎖または１μｇの二本鎖ＤＮＡを０．２ｍｌのＰＣＲチューブに入れる。１μｌ（一本鎖テンプレートに対して）または４μｌ（二本鎖テンプレートに対して）の０．８μＭプライマーおよび９．５μｌのＡＢＩ供給プレミックスを各チューブに添加し、そしてｄｄＨ２Ｏで最終容量を２０μｌにする。手短に遠心分離し、そして製造業者に記載されるようなターミネータープログラム（すなわち、９６℃の予熱、引き続いて９６℃１５秒間、５０℃１秒間、６０℃４分間の２５サイクルを行い、次いで４℃保持につながる）を用いて通常通りにサイクルを行う。Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐカラム（Ａｍｉｃｏｎ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）または以下に示されるＧ−５０マイクロタイタープレート手順のいずれかを用いてスピンカラム精製を続ける。
【０４３９】
Ｃ．  Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐカラムによるターミネーター反応一掃
穏やかにカラムを軽くたたき、ゲル物質をカラムの底に沈降させることによって、カラムを調製する。カラム栓を取り除き、そして０．７５ｍｌ  ｄＨ２Ｏを添加する。カラムに栓をし、それを数回反転させることによって混合する。ゲルを少なくとも３０分間室温で水和させる。カラムは４℃で数日間保存可能である。４℃で保存したカラムを使用前に室温に暖める。カラムを反転させ、そしてゲルを沈降させることによって全ての気泡を除去する。上部端キャップを最初に除去し、次いで下部端キャップを取り除く。重力によってカラムを完全にドレインする。（注意：流動がただちに始まらない場合にはピペットバルブでカラムに穏やかな圧を適用する。）カラムを提供される洗浄チューブに挿入する。１３００×ｇで２分間可変速度微小遠心分離器中でスピンして、液体を除去する。洗浄チューブからカラムを取り出し、そしてサンプル収集チューブにそれを挿入する。反応混合物（２０μｌ）を注意深く取り出し、そしてゲル物質の上部にそれをロードする。サンプルをオイルで上塗りすることを必要とするサイクル器具中でインキュベートする場合には、オイルの下から反応物を注意深く取り出す。サンプル中の少量のオイル（＜１μｌ）は結果に影響しないが、サンプルでオイルを拾い上げることを避ける。サンプルを含有するピペットチップの末端のオイルは、清潔な表面（例えば、反応チューブ）上にチップを注意深く接触させることにより除去し得る。各カラムを一回のみ使用する。固定された角度のローターを有する可変速微小遠心分離器中で回転させ、最初の回転の時と同じ方向でカラムを配置する。減圧遠心分離器でサンプルを乾燥させる。熱を与えたり、乾燥させすぎたりしない。所望であれば、反応物をエタノールで沈殿させ得る。
【０４４０】
Ｄ．  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０充填マイクロタイター形式フィルタープレートによるターミネーター反応一掃
Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）は沈殿する；それ故、プレートに添加する前、さらに８〜１０ウェル毎に充填した後にも再懸濁しなければならない。４００μｌの混合したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０をマイクロタイターフィルタープレートの各ウェルに添加する。水を収集するためにマイクロタイタープレートの上面にマイクロタイターフィルタープレートを置き、そして遠心分離の間にそれらが飛び上がって離れないように側面をテープする。１５００ｒｐｍで２分間回転させる。マイクロタイタープレート中に収集された水を廃棄する。水を収集するためにマイクロタイタープレートの上面にマイクロタイターフィルタープレートを置き、そして遠心分離の間にそれらが飛び上がって離れないように側面をテープする。さらに１００〜２００μｌのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を添加して、マイクロタイタープレートウェルを充填する。１５００ｒｐｍで２分間回転させる。マイクロタイタープレート中に収集された水を廃棄する。水を収集するためにチューブを有するマイクロタイタープレートの上面にマイクロタイターフィルタープレートを置き、そして遠心分離の間にそれらが飛び上がって離れないように側面をテープする。２０μｌのターミネーター反応物を各Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０含有ウェルに添加する。１５００ｒｐｍで２分間回転させる。収集した溶出物をＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ中に約１〜２時間入れる。
【０４４１】
標識ターミネーターを用いたＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ（ＵＢＳ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ＯＨ）触媒配列決定。一本鎖ターミネーター反応は、約２μｇのフェノール抽出したＭ１３基礎テンプレートＤＮＡを必要とする。このＤＮＡを変性させ、そしてＤＮＡ、プライマー、および緩衝液を６５℃でインキュベートすることによってプライマーをアニールさせる。反応を室温に冷却した後に、α−チオ−デオキシヌクレオチド、標識ターミネーター、および希釈したＳｅｑｕｅｎａｓｅ  ＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼを添加し、そしてこの混合物を３７℃でインキュベートする。酢酸アンモニウムおよびエタノールを添加することによって反応を停止させ、そしてＤＮＡフラグメントを沈殿させ、乾燥させる。取り込まれていないターミネーターの除去の援助のために、ＤＮＡペレットをエタノールで２回リンスする。乾燥した配列決定反応物は、数日間まで−２０℃で保存可能である。
【０４４２】
二本鎖ターミネーター反応は、約５μｇの珪藻土改変アルカリ溶解ミニプレップ精製プラスミドＤＮＡを必要とする。二本鎖ＤＮＡを、６５℃で水酸化ナトリウム中にそのＤＮＡをインキュベートすることによって変性させ、そしてインキュベーションの後、プライマーを添加し、そして酸−緩衝液を添加することによって反応物を中和する。次いで、反応緩衝液、α−チオ−デオキシヌクレオチド、標識色素−ターミネーター、および希釈Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼを添加し、そして反応を３７℃でインキュベートする。酢酸アンモニウムを添加し、反応を停止させ、そいてＤＮＡフラグメントを沈殿させ、リンスし、乾燥させ、そして保存する。
【０４４３】
一本鎖反応に関して：
１．５ｍｌ微小遠心チューブに以下のものを添加する：
４μｌ            ｓｓＤＮＡ（２μｇ）
４μｌ            ０．８μＭ  プライマー
２μｌ            １０×ＭＯＰＳ緩衝液
２μｌ            １０×Ｍｎ２＋／イソクエン酸緩衝液
１２μｌ。
【０４４４】
ＤＮＡを変性させ、そしてプライマーをアニールさせるために、反応物を６５℃〜７０℃で５分間インキュベートする。反応を１５分間室温に冷却し、次いで手短に遠心分離して濃縮を再生する。各反応物に、以下の試薬を添加し、１０分間３７℃でインキュベートする。
【０４４５】
７μｌ            ＡＢＩターミネーター混合物（カタログ番号４０１４８９）
２μｌ            希釈Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＴＭ（３．２５Ｕ／μｌ）
１μｌ            ２ｍＭ  α−Ｓ  ｄＮＴＰ
２２μｌ。
【０４４６】
未希釈のＳｅｑｅｎａｓｅ  ＴＭ（カタログ番号７０７７５、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）は１３Ｕ／μｌであり、使用する前にＵＳＢ希釈緩衝液で１：４に希釈する。２０μｌの９．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび１００μｌの９５％エタノールを添加して反応を停止させ、そして混合する。
【０４４７】
氷水浴中で１０分間ＤＮＡを沈殿させる。４℃にて微小遠心分離で１０，０００×ｇで１５分間遠心分離する。上清を注意深くデカントし、そして３００μｌの７０〜８０％エタノールを添加することによってペレットをリンスする。混合し、そして１５分間再び遠心分離し、上清を注意深くデカントする。
【０４４８】
リンス工程を繰り返して取り込まれていないターミネーターの効率的な除去を保証する。Ｓｐｅｅｄ−ＶａｃでＤＮＡを５〜１０分間（または乾燥するまで）乾燥させ、そして−２０℃で乾燥した反応物を保存する。
【０４４９】
二本鎖反応に関して：
１．５ｍｌ微小遠心チューブに以下のものを添加する：
５μｌ            ｄｓＤＮＡ（５μｇ）
４μｌ            １Ｎ  ＮａＯＨ
３μｌ            ｄｄＨ２Ｏ。
【０４５０】
６５℃〜７０℃で５分間反応をインキュベートし、次いで手短に遠心分離して濃縮を再生する。各反応物に以下の試薬を添加し、ボルテックスし、そして手短に遠心分離する：
３μｌ            ８μＭプライマー
９μｌ            ｄｄＨ２Ｏ
４μｌ            ＭＯＰＳ−酸緩衝液。
【０４５１】
各反応物に、以下の試薬を添加し、そして３７℃で１０分間インキュベートする。
【０４５２】
４μｌ            １０×Ｍｎ２＋／イソクエン酸緩衝液
６μｌ            ＡＢＩターミネーターｍｉ
２μｌ            希釈Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＴＭ（３．２５  Ｕ／μｌ）
１μｌ            ２ｍＭ  ［α］−Ｓ−ｄＮＴＰ
２２μｌ。
【０４５３】
Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ由来の未希釈のＳＥＱＵＥＮＡＳＥＴＭは１３Ｕ／μｌであり、使用する前にＵＳＢ希釈緩衝液で１：４に希釈するべきである。６０μｌの８Ｍ酢酸アンモニウムおよび３００μｌの９５％エタノールを添加して反応を停止させ、そしてボルテックスする。氷水浴中で１０分間ＤＮＡを沈殿させる。４℃にて微小遠心分離器中で１０，０００×ｇで１５分間遠心分離する。上清を注意深くデカントし、そして３００μｌの８０％エタノールを添加することによってペレットをリンスする。サンプルを混合し、そして１５分間再び遠心分離し、そして上清を注意深くデカントする。リンス工程を繰り返して取り込まれていないターミネーターの効率的な除去を保証する。Ｓｐｅｅｄ−ＶａｃでＤＮＡを５〜１０分間（または乾燥するまで）乾燥させる。
【０４５４】
Ｅ．配列決定ゲル調製、プレ電気泳動、サンプルローディング、電気泳動、データ収集、およびＡＢＩ３７３Ａ  ＤＮＡシーケンサーにおける分析
ＤＮＡ配列決定用のポリアクリルアミドゲルを、重合化の前にゲル混合物を濾過する以外は上記のように調製する。ガラスプレートを熱水、蒸留水、およびエタノールで注意深く清掃して、テープする前に潜在的な蛍光夾雑物を除去する。変性６％ポリアクリルアミドゲルを、０．３ｍｍ×８９ｃｍ×５２ｃｍのテープしたプレート中に注ぎ、３６ウェルコームを取り付ける。重合化の後、テープおよびコームをゲルから取り出し、そしてガラスプレートの外部表面を熱水で清掃し、そして蒸留水およびエタノールでリンスする。ゲルをＡＢＩシーケンサー中に組立て、そしてレーザー走査によりチェックする。ベースライン変化をＡＢＩ−結合Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピューターディスプレイで観察する場合、プレートを再清掃する。引き続いて、緩衝液ウェルを取り付け、電気泳動緩衝液を添加し、そしてゲルを３０Ｗで１０〜３０分間プレ電気泳動する。サンプルローディングの前に、プールし、そして乾燥させた反応産物を、ボルテックスし、次いで９０℃に熱することによってホルムアミド／ＥＤＴＡローディング緩衝液中に再懸濁する。ロードされたサンプルの数および蛍光標識移動度ファイルを示すサンプルシートを、配列データ処理のために用いるＭａｃｉｎｔｏｓｈコンピューター上のＡＢＩデータ収集ソフトウェア内に作製する。シリンジでサンプルウェルを清掃した後、奇数番号の配列決定反応物を、扁平先端のゲルローディングチップを備えたマイクロピペッターを用いて各ウェルにロードする。次いで、ゲルを５分間電気泳動し、その後にウェルを再び清掃し、偶数番号のサンプルをロードする。色素プライマーおよび色素ターミネーターのために用いられるフィルターホイールをＡＢＩ  ３７３Ａ  ＣＰＵ上で特定化する。代表的には、電気泳動およびデータ収集は、熱分配アルミニウムプレートを取り付けたＡＢＩ  ３７３Ａ上で３０Ｗで１０時間である。データ収集の後、検出された蛍光シグナルを対応するスキャン番号に関連付ける画像ファイルをＡＢＩソフトウェアによって作製する。次いで、ソフトウェアは、シグナル強度に基づいてサンプルレーン位置を決定する。レーンをトラックした（ｔｒａｃｋ）後、各レーンに対するデータの横断面を抽出し、そしてベースラインサブトラクション、移動度計算、スペクトル逆重畳積分、および時間補正によって処理する。処理の後、ＮＦＳ  Ｓｈａｒｅを用いて配列データファイルをＳＰＡＲＣｓｔａｉｏｎ  ２に移す。
【０４５５】
プロトコル：３６ウェルコームを用いて、上記のように、８Ｍ尿素、４．７５％ポリアクリルアミドゲルを調製する。ローディング前に、ゲルプレートの外部表面を清掃する。下部スキャン（通常青色）線が、コンピューターデータ収集ウィンドウ上にディスプレイされるような８００〜１０００の強度値に対応するように、ゲルプレートを３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）中に組立てる。４色スキャン線のベースラインが平らでない場合には、ガラスプレートを再清掃する。アルミニウム熱分配プレートを張り付ける。ゲルを１０〜３０分間プレ電気泳動する。ローディング用のサンプルを調製する。各チューブの底に３μｌのＦＥを添加し、ボルテックスし、９０℃に３分間熱し、そして遠心分離して濃縮を再生する。シリンジを用いて電気泳動緩衝液でサンプルウェルをフラッシュする（ｆｌｕｓｈ）。扁平先端のゲルローディングピペットチップを用いて、それぞれの奇数番号サンプルをロードする。少なくとも５分間ゲルをプレ電気泳動し、再びウェルをフラッシュし、次いでそれぞれの偶数番号のサンプルをロードする。電気泳動（３０Ｗ、１０時間）を開始する。データ収集の後、ＡＢＩソフトウェアはデータ分析ソフトウェアを自動的に開く。これは画像化ゲルファイルを作製し、各サンプルレーンに対するデータを抽出し、そしてデータを処理する。
【０４５６】
Ｆ．  アンカーポリ（ｄＴ）プライマーを用いたロングポリ（Ａ）テイルを含有するｃＤＮＡクローンの二本鎖配列決定
ポリ（Ａ）トラクト（ｔｒａｃｔ）を含有するｃＤＮＡの二本鎖テンプレートは、ポリ（Ａ）テイルの下流でアニールするベクタープライマーとアニールするベクタープライマーで配列決定することが困難である。これらのプライマーを用いた配列決定は、ロングポリ（Ｔ）ラダー、およびそれに続く読みとりが困難であり得る配列を生じる。この問題を回避するために、３’末端に（ｄＴ）１７および（ｄＡ）または（ｄＣ）または（ｄＧ）のいずれかを含有する３つのプライマーを設計し、プライマーを「アンカー（ａｎｃｈｏｒ）」し、そしてポリ（Ａ）領域のすぐ上流の領域の配列決定を可能にするように設計した。このプロトコルを用いて、３００ｂｐ以上の読みとり可能配列を入手し得る。これらのｃＤＮＡの反対側の鎖の配列を、ポリ（Ａ）領域の上流の挿入物特異的プライマーを用いて決定した。ｃＤＮＡのポリ（Ａ）テイルからすぐ上流の配列を直接取得する能力は、ｃＤＮＡから配列タグ化部位（ＳＴＳ）を産生する大規模な労力に対して特に重要であるはずである。
【０４５７】
プロトコルは以下の通りである。ＤＮＡ合成機において３’末端に（ｄＡ）または（ｄＣ）または（ｄＧ）のアンカーを有するアンカーポリ（ｄＴ）１７を合成し、そしてＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ａｍｉｃｏｎ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）上で精製した後に使用する。アンカープライマーを用いた配列決定のために、０．２Ｍ  水酸化ナトリウムおよび０．１６ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する５０μｌの総容量中で６５℃で１０分間のインキュベーションによって５〜１０μｇのプラスミドＤＮＡを変性させる。３つのポリ（ｄＴ）アンカープライマー（それぞれ２ｐｍｏｌ）を添加し、そして氷上に混合物をただちに配置する。５ｍｌの５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ  ７．０を添加することによって溶液を中和する。
【０４５８】
１５０μｌの冷９５％エタノールを添加することによってＤＮＡを沈殿させ、そして冷７０％エタノールで２回ペレットを洗浄する。５分間ペレットを乾燥させ、次いでＭＯＰＳ緩衝液に再懸濁する。６５℃で２分間溶液を加熱し、続いて１５〜３０分間室温にゆっくりと冷却することによってプライマーをアニールさせる。上記のプロトコルを用いる改変Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼおよびα−［３２Ｐ］ｄＡＴＰ（＞１０００  Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を用いて、配列決定反応を実行する。
【０４５９】
Ｇ．  ＰＣＲおよびランダムショットガンクローニングに基づくｃＤＮＡ配列決定
以下は、ＰＣＲ増幅、ランダムショットガンクローニング、および自動化蛍光配列決定に基づいてクローン化ｃＤＮＡを配列決定する方法である。このＰＣＲに基づくアプローチは、通常の「ユニバーサル」正方向および逆方向プライミング部位とＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのマルチクローニング部位との間のプライマー対を使用する。これらの２つのＰＣＲプライマー（正方向または−１６ｂｓプライマーとして配列５’−ＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧ−３’（配列番号１５）および逆方向または＋１９ｂｓプライマーとして５’−ＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧ  ＴＧ−３’（配列番号１６）を有する）は、下記のランダムショットガン配列決定アプローチが実行され得るような１．２〜３．４ｋｂサイズ範囲の十分な量のｃＤＮＡ挿入物を増幅するために使用され得る。
【０４６０】
以下はプロトコルである。４つの１００μｌ  ＰＣＲ反応物（それぞれは０．５ｍｌのスナップキャップチューブ中に約１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、１００ｐｍｏｌの各プライマー、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．５、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および５ユニットのＰＥ−Ｃｅｔｕｓ  Ａｍｐｌｉｔａｑ）を、ＰＥ−Ｃｅｔｕｓ４８チューブＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ中で９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の２５サイクルインキュベートする。４つの反応物をプールした後、ＰＣＲ産物を含有する水溶液を噴霧器中に入れ、約０．５〜１．０ｍｌのグリセロールを添加することによって２．０ｍｌにし、そしてイソプロピルアルコール／ドライアイスまたは飽和した水性ＮａＣｌ／ドライアイス浴のいずれかにそれを１０分間配置することにより−２０℃で平衡化する。２５〜３０ｐｓｉの窒素圧力を２．５分間適用することにより、そのサンプルを−２０℃で噴霧する。剪断されたＰＣＲ産物を濃縮するためのエタノール沈殿の後、以前に記載されたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとのインキュベーションによりフラグメントを平滑末端化およびリン酸化した。
０．４〜０．７ｋｂの範囲のフラグメントを、低融点アガロースゲルからの溶出によって取得した。
【０４６１】
前述から、本発明の特定の実施態様が説明の目的のために本明細書中に記載されているが、種々の改変が発明の精神および範囲を逸脱することなく作製され得ることが理解される。従って、本発明は、添付される請求の範囲による以外には限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０４６２】
【図１】図１は、化学的切断可能質量スペクトル分析タグのペンタフルオロフェニルエステルの合成のための、カルボキシルアミド末端を有するタグを遊離させるフローチャートを示す。
【図２】図２は、化学的切断可能質量スペクトル分析タグのペンタフルオロフェニルエステルの合成のための、カルボキシル酸末端を有するタグを遊離させるフローチャートを示す。
【図３】図３〜６および８は、３６の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグのテトラフルオロフェニルエステルの組の合成のためのフローチャートを示す。
【図４】図３〜６および８は、３６の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグのテトラフルオロフェニルエステルの組の合成のためのフローチャートを示す。
【図５】図３〜６および８は、３６の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグのテトラフルオロフェニルエステルの組の合成のためのフローチャートを示す。
【図６】図３〜６および８は、３６の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグのテトラフルオロフェニルエステルの組の合成のためのフローチャートを示す。
【図７】図７は、３６のアミンで終結する末端光化学的切断可能質量スペクトル分析タグの組の合成のためのフローチャートを示す。
【図８】図３〜６および８は、３６の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグのテトラフルオロフェニルエステルの組の合成のためのフローチャートを示す。
【図９】図９は、光化学的切断可能質量スペクトル分析タグ酸の３６のテトラフルオロフェニルエステルの対応する組から作製された３６の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグ化オリゴヌクレオチドの合成を示す。
【図１０】図１０は、３６のアミン末端光化学的切断可能質量スペクトル分析タグ酸の３６の対応する組から作製された３６の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグ化オリゴヌクレオチドの合成を示す。
【図１１】図１１は、質量スペクトル分析による複数タグの同時検出を示す。
【図１２】図１２は、α−シアノマトリックス単独の質量スペクトル図を示す。
【図１３】図１３は、モジュラーで構築されるタグ化核酸フラグメントを示す。
【０４６３】
（配列表）
【０４６４】
【化４５】
2008183012.tif 000046
【０４６５】
【化４６】
2008183012.tif 000047
【０４６６】
【化４７】
2008183012.tif 000048
【０４６７】
【化４８】
2008183012.tif 000049
【０４６８】
【化４９】
2008183012.tif 000050
【図１】
2008183012.tif 000051
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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