(57)【要約】【課題】高解像度でゲノムＤＮＡ配列のコピー数異常を信頼性よく同定できる技術を提供する。【解決手段】対照タグデータおよび解析対象タグデータに基づいて、対照タグデータおよび解析対象タグデータの対応データが生成される。そして、この対応データにより、ゲノム上の各領域に対応する解析対象タグの個数が判定され、その結果、ゲノム上の各領域における増幅、欠失などの染色体異常の存在が検出される。このようなゲノム上の各領域における増幅、欠失などの情報は、疾患遺伝子の同定などに活用される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照ゲノムＤＮＡ配列を制限酵素により切断して得られ、それぞれ前記対照ゲノムＤＮＡ配列に含まれる個数が所定数以下であり、かつそれぞれ所定の範囲の塩基数のＤＮＡ配列からなる複数の対照タグを、それぞれ前記対照ゲノムＤＮＡ配列中の対応箇所と関連づけてなる対照タグデータを取得する対照タグデータ取得部と、
解析対象ゲノムＤＮＡ配列を前記制限酵素により切断して得られ、かつそれぞれ所定の範囲の塩基数のＤＮＡ配列からなる複数の解析対象タグの集合である解析対象タグデータを取得する解析対象タグデータ取得部と、
前記対照タグデータと前記解析対象タグデータとを比較して、前記対照タグおよび前記解析対象タグのうち、それぞれ対応するタグ同士を関連づけてなる対応タグデータを生成する対応タグデータ生成部と、
前記対応タグデータを解析し、前記対照タグと対応する前記解析対象タグの個数を判定し、前記個数に基づいて、前記解析対象ゲノムＤＮＡ配列のうち前記対照タグに対応する箇所を含む領域の前記対照ゲノムＤＮＡ配列に対するコピー数の相違を判定するコピー数判定部と、
前記コピー数判定部による処理を経たデータを出力する出力部と、
を備えるＤＮＡ配列解析装置。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ配列解析装置において、
前記コピー数判定部は、前記解析対象ゲノムＤＮＡ配列の所定の領域における前記解析対象タグの総数を、前記対照ゲノムＤＮＡ配列の前記所定の領域に対応する領域における前記対照タグの総数で除してなるタグ密度を判定するタグ密度判定部を含むＤＮＡ配列解析装置。
【請求項３】
請求項１または２記載のＤＮＡ配列解析装置において、
前記対応タグデータ生成部は、前記解析対象タグが、前記対照タグのうち一個のタグとのみ対応する場合に、これらのタグ同士を所定の寄与度により関連づけ、前記解析対象タグが、前記対照タグのうち二個以上のタグと対応する場合に、これらのタグ同士を前記所定の寄与度と異なる寄与度により関連づけるように構成されているＤＮＡ配列解析装置。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれかに記載のＤＮＡ配列解析装置において、
前記対応タグデータ生成部は、前記対照タグおよび前記解析対象タグのうち、完全に一致するタグ同士を所定の寄与度により関連づけ、一部異なるタグ同士を前記所定の寄与度と異なる寄与度により関連づけるように構成されているＤＮＡ配列解析装置。
【請求項５】
請求項１乃至４いずれかに記載のＤＮＡ配列解析装置において、
前記コピー数判定部は、前記対応タグデータを解析し、前記対照タグと対応する前記解析対象タグの個数が所定数以上の場合には、前記解析対象ゲノムＤＮＡ配列のうち前記対照タグと対応する箇所を含む領域の重複が発生していると判定する重複判定部を含むＤＮＡ配列解析装置。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれかに記載のＤＮＡ配列解析装置において、
前記コピー数判定部は、前記対応タグデータを解析し、前記対照タグと対応する前記解析対象タグの個数が所定数以下の場合には、前記解析対象ゲノムＤＮＡ配列のうち前記対照タグと対応する箇所を含む領域の欠失が発生していると判定する欠失判定部を含むＤＮＡ配列解析装置。
【請求項７】
請求項１乃至６いずれかに記載のＤＮＡ配列解析装置において、
前記対照ゲノムＤＮＡ配列と異なる起源由来の別ゲノムＤＮＡ配列データに接続して前記別ゲノムＤＮＡ配列データを検索する別ゲノムＤＮＡ配列データ検索部と、
前記対応タグデータを解析し、前記解析対象タグと対応する前記対照タグが存在しない場合には、前記解析対象タグと前記別ゲノムＤＮＡ配列データとを比較して、前記解析対象タグの起源を判定する起源判定部と、
をさらに備えるＤＮＡ配列解析装置。
【請求項８】
請求項１乃至７いずれかに記載のＤＮＡ配列解析装置において、
前記対照ゲノムＤＮＡ配列から前記対照タグデータを生成する対照タグデータ生成部をさらに備え、
前記対照タグデータ生成部は、
前記対照ゲノムＤＮＡ配列を取得する対照ゲノムＤＮＡ配列取得部と、
前記対照ゲノムＤＮＡ配列中の前記制限酵素による切断部位を検索する切断部位検索部と、
前記対照ゲノムＤＮＡ配列を前記切断部位により切断してなる複数の対照タグのうち、所定の範囲の塩基数からなり、前記対照ゲノムＤＮＡ配列に含まれる個数が所定数以下であるＤＮＡ配列を含む対照タグを選択する対照タグ選択部と、
前記選択された対照タグを前記対照ゲノムＤＮＡ配列中の対応箇所と関連づけて前記対照タグデータを生成する関連付部と、
を含み、
前記対照タグデータ取得部は、前記対照タグデータ生成部から前記対照タグデータを取得するように構成されているＤＮＡ配列解析装置。
【請求項９】
請求項８記載のＤＮＡ配列解析装置において、
前記制限酵素は、ＧＡＴＣからなる４塩基配列を認識して切断する制限酵素であるＤＮＡ配列解析装置。
【請求項１０】
対照ゲノムＤＮＡ配列を制限酵素により切断して得られ、それぞれ前記対照ゲノムＤＮＡ配列に含まれる個数が所定数以下であり、かつそれぞれ所定の範囲の塩基数のＤＮＡ配列からなる複数の対照タグを、それぞれ前記対照ゲノムＤＮＡ配列中の対応箇所と関連づけてなる対照タグデータを取得するステップと、
解析対象ゲノムＤＮＡ配列を前記制限酵素により切断して得られ、かつそれぞれ所定の範囲の塩基数のＤＮＡ配列からなる複数の解析対象タグの集合である解析対象タグデータを取得するステップと、
前記対照タグデータと前記解析対象タグデータとを比較して、前記対照タグおよび前記解析対象タグのうち、それぞれ対応するタグ同士を関連づけてなる対応タグデータを生成するステップと、
前記対応タグデータを解析し、前記対照タグと対応する前記解析対象タグの個数を判定し、前記個数に基づいて、前記解析対象ゲノムＤＮＡ配列に含まれる領域のうち前記対照タグに対応する箇所を含む領域の前記対照ゲノムＤＮＡ配列に対するコピー数の相違を判定するステップと、
前記コピー数判定部による処理を経たデータを出力するステップと、
を含むＤＮＡ配列解析方法。
【請求項１１】
請求項１０記載のＤＮＡ配列解析方法において、
前記コピー数の相違を判定するステップは、前記解析対象ゲノムＤＮＡ配列の所定の領域における前記解析対象タグの総数を、前記対照ゲノムＤＮＡ配列の前記所定の領域に対応する領域における前記対照タグの総数で除してなるタグ密度を判定するステップを含むＤＮＡ配列解析方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１記載のＤＮＡ配列解析方法において、
前記対応タグデータを生成するステップは、前記解析対象タグが、前記対照タグのうち一個のタグとのみ対応する場合に、これらのタグ同士を所定の寄与度により関連づけ、前記解析対象タグが、前記対照タグのうち二個以上のタグと対応する場合に、これらのタグ同士を前記所定の寄与度と異なる寄与度により関連づけるステップを含むＤＮＡ配列解析方法。
【請求項１３】
請求項１０乃至１２いずれかに記載のＤＮＡ配列解析方法において、
前記対応タグデータを生成するステップは、前記対照タグおよび前記解析対象タグのうち、完全に一致するタグ同士を所定の寄与度により関連づけ、一部異なるタグ同士を前記所定の寄与度と異なる寄与度により関連づけるステップを含むＤＮＡ配列解析方法。
【請求項１４】
請求項１０乃至１３いずれかに記載のＤＮＡ配列解析方法において、
前記コピー数を判定するステップは、前記対応タグデータを解析し、前記対照タグと対応する前記解析対象タグの個数が所定数以上の場合には、前記解析対象ゲノムＤＮＡ配列のうち前記対照タグと対応する箇所を含む領域の重複が発生していると判定するステップを含むＤＮＡ配列解析方法。
【請求項１５】
請求項１０乃至１４いずれかに記載のＤＮＡ配列解析方法において、
前記コピー数を判定するステップは、前記対応タグデータを解析し、前記対照タグと対応する前記解析対象タグの個数が所定数以下の場合には、前記解析対象ゲノムＤＮＡ配列のうち前記対照タグと対応する箇所を含む領域の欠失が発生していると判定するステップを含むＤＮＡ配列解析方法。
【請求項１６】
請求項１０乃至１５いずれかに記載のＤＮＡ配列解析方法において、
前記対応タグデータを解析し、前記解析対象タグと対応する前記対照タグが存在しない場合には、前記対照ゲノムＤＮＡ配列とは異なる起源由来の別ゲノムＤＮＡ配列と前記解析対象タグとを比較して、前記解析対象タグの起源を判定するステップをさらに含むＤＮＡ配列解析方法。
【請求項１７】
請求項１０乃至１６いずれかに記載のＤＮＡ配列解析方法において、
前記対照ゲノムＤＮＡ配列から前記対照タグデータを生成するステップをさらに備え、
前記対照タグデータを生成するステップは、
前記対照ゲノムＤＮＡ配列を取得するステップと、
前記対照ゲノムＤＮＡ配列中の前記制限酵素による切断部位を検索するステップと、
前記対照ゲノムＤＮＡ配列を前記切断部位により切断してなる複数の対照タグのうち、所定の範囲の塩基数からなり、前記対照ゲノムＤＮＡ配列に含まれる個数が所定数以下であるＤＮＡ配列を含む対照タグを選択するステップと、
前記選択された対照タグを前記対照ゲノムＤＮＡ配列中の対応箇所と関連づけて前記対照タグデータを生成するステップと、
を含むＤＮＡ配列解析方法。
【請求項１８】
請求項１７記載のＤＮＡ配列解析方法において、
前記制限酵素は、ＧＡＴＣからなる４塩基配列を認識して切断する制限酵素であるＤＮＡ配列解析方法。
【請求項１９】
請求項１０乃至１８いずれかに記載のＤＮＡ配列解析方法において、
前記解析対象ＤＮＡ配列から前記解析対象タグデータを生成するステップをさらに含み、
前記解析対象タグデータを生成するステップは、
前記解析対象ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を前記制限酵素により切断するステップと、
前記ＤＮＡ分子を前記制限酵素により切断してなる複数のＤＮＡ断片のうち、所定の範囲の塩基数からなるＤＮＡ断片を抽出するステップと、
前記抽出を経たＤＮＡ断片のＤＮＡ配列をシークエンスして前記解析対象タグデータを生成するステップと、
を含むＤＮＡ配列解析方法。
【請求項２０】
請求項１９記載のＤＮＡ配列解析方法において、
前記解析対象タグデータを生成するステップは、前記抽出するステップを経た複数のＤＮＡ断片を連結してなるコンカテマーを生成するステップをさらに含み、
前記シークエンスするステップは、前記コンカテマーのＤＮＡ配列をシークエンスするステップを含むＤＮＡ配列解析方法。
【請求項２１】
請求項２０記載のＤＮＡ配列解析方法において、
前記コンカテマーを生成するステップは、
前記複数のＤＮＡ断片を連結してなるコンカテマーをベクターに連結してコンカテマー含有ベクターを生成するステップと、
前記コンカテマー含有ベクターを大腸菌に導入して形質転換し、前記大腸菌を培養することにより前記コンカテマー含有ベクターを増幅するステップと、
前記培養された大腸菌から前記コンカテマー含有ベクターを抽出するステップと、
を含むＤＮＡ配列解析方法。
【請求項２２】
請求項２０または２１記載のＤＮＡ配列解析方法において、
前記解析対象タグデータを生成するステップは、前記コンカテマーを複数連結してなる２次コンカテマーを生成するステップをさらに含み、
前記シークエンスするステップは、前記２次コンカテマーのＤＮＡ配列をシークエンスするステップを含むＤＮＡ配列解析方法。
【請求項２３】
請求項２２記載のＤＮＡ配列解析方法において、
前記２次コンカテマーを生成するステップは、
前記コンカテマー含有ベクターから前記コンカテマーを切出して抽出するステップと、
複数の種類の前記コンカテマーを連結してなる２次コンカテマーをベクターに連結して２次コンカテマー含有ベクターを生成するステップと、
前記２次コンカテマー含有ベクターを大腸菌に導入して形質転換し、前記大腸菌を培養することにより前記２次コンカテマー含有ベクターを増幅するステップと、
前記培養された大腸菌から前記２次コンカテマー含有ベクターを抽出するステップと、
を含むＤＮＡ配列解析方法。
【請求項２４】
対照ゲノムＤＮＡ配列を制限酵素により切断して得られ、それぞれ前記対照ゲノムＤＮＡ配列に含まれる個数が所定数以下であり、かつそれぞれ所定の範囲の塩基数のＤＮＡ配列からなる複数の対照タグを、それぞれ前記対照ゲノムＤＮＡ配列中の対応箇所と関連づけてなる対照タグデータを取得するステップと、
解析対象ゲノムＤＮＡ配列を前記制限酵素により切断して得られ、かつそれぞれ所定の範囲の塩基数のＤＮＡ配列からなる複数の解析対象タグの集合である解析対象タグデータを取得するステップと、
前記対照タグデータと前記解析対象タグデータとを比較して、前記対照タグおよび前記解析対象タグのうち、それぞれ対応するタグ同士を関連づけてなる対応タグデータを生成するステップと、
前記対応タグデータを解析し、前記対照タグと対応する前記解析対象タグの個数を判定し、前記個数に基づいて、前記解析対象ゲノムＤＮＡ配列のうち前記対照タグに対応する箇所を含む領域の前記対照ゲノムＤＮＡ配列に対するコピー数の相違を判定するステップと、
前記コピー数判定部による処理を経たデータを出力するステップと、
をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【請求項２５】
請求項２４記載のプログラムにおいて、
前記コピー数の相違を判定するステップは、前記解析対象ゲノムＤＮＡ配列の所定の領域における前記解析対象タグの総数を、前記対照ゲノムＤＮＡ配列の前記所定の領域に対応する領域における前記対照タグの総数で除してなるタグ密度を判定するステップを含むプログラム。
【請求項２６】
請求項２４または２５記載のプログラムにおいて、
前記対応タグデータを生成するステップは、前記解析対象タグが、前記対照タグのうち一個のタグとのみ対応する場合に、これらのタグ同士を所定の寄与度により関連づけ、前記解析対象タグが、前記対照タグのうち二個以上のタグと対応する場合に、これらのタグ同士を前記所定の寄与度と異なる寄与度により関連づけるステップを含むプログラム。
【請求項２７】
請求項２４乃至２６いずれかに記載のプログラムにおいて、
前記対応タグデータを生成するステップは、前記対照タグおよび前記解析対象タグのうち、完全に一致するタグ同士を所定の寄与度により関連づけ、一部異なるタグ同士を前記所定の寄与度と異なる寄与度により関連づけるステップを含むプログラム。
【請求項２８】
請求項２４乃至２７いずれかに記載のプログラムにおいて、
前記コピー数を判定するステップは、前記対応タグデータを解析し、前記対照タグと対応する前記解析対象タグの個数が所定数以上の場合には、前記解析対象ゲノムＤＮＡ配列のうち前記対照タグと対応する箇所を含む領域の重複が発生していると判定するステップを含むプログラム。
【請求項２９】
請求項２４乃至２８いずれかに記載のプログラムにおいて、
前記コピー数を判定するステップは、前記対応タグデータを解析し、前記対照タグと対応する前記解析対象タグの個数が所定数以下の場合には、前記解析対象ゲノムＤＮＡ配列のうち前記対照タグと対応する箇所を含む領域の欠失が発生していると判定するステップを含むプログラム。
【請求項３０】
請求項２４乃至２９いずれかに記載のプログラムにおいて、
前記対応タグデータを解析し、前記解析対象タグと対応する前記対照タグが存在しない場合には、前記対照ゲノムＤＮＡ配列とは異なる起源由来の別ゲノムＤＮＡ配列と前記解析対象タグとを比較して、前記解析対象タグの起源を判定するステップをさらに含むプログラム。
【請求項３１】
請求項２４乃至３０いずれかに記載のプログラムにおいて、
前記対照ゲノムＤＮＡ配列から前記対照タグデータを生成するステップをさらに備え、
前記対照タグデータを生成するステップは、
前記対照ゲノムＤＮＡ配列を取得するステップと、
前記対照ゲノムＤＮＡ配列中の前記制限酵素による切断部位を検索するステップと、
前記対照ゲノムＤＮＡ配列を前記切断部位により切断してなる複数の対照タグのうち、所定の範囲の塩基数からなり、前記対照ゲノムＤＮＡ配列に含まれる個数が所定数以下であるＤＮＡ配列を含む対照タグを選択するステップと、
前記選択された対照タグを前記対照ゲノムＤＮＡ配列中の対応箇所と関連づけて前記対照タグデータを生成するステップと、
を含むプログラム。
【請求項３２】
請求項３１記載のプログラムにおいて、
前記制限酵素は、ＧＡＴＣからなる４塩基配列を認識して切断する制限酵素であるプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ配列解析装置、ＤＮＡ配列解析方法およびプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
体細胞および生殖細胞における遺伝子コピー数の異常は、細胞および個体レベルでの深刻な異常をもたらす。ヒトにおいては癌抑制遺伝子の欠失や癌遺伝子の増幅をともなう染色体変化はがん細胞の特徴であると言える。また、特定の染色体や染色体の限定された領域のコピー数変化は、ダウン症候群など多くの発生分化に関わる疾患の原因となる。
【０００３】
一方、２００１年初頭、約３０億塩基対におよぶヒトゲノムの概要配列が公開され、生命情報科学の研究者はこの「宝の山」を自由に利用できるようになった。ヒトゲノム解読はヒトの医療、発生、生理そして進化に関するきわめて貴重な情報の宝庫であり、このヒトゲノム情報を利用する技術分野は、２１世紀の初頭から前半にかけて急速に発展する新規産業創造になることが大いに期待できる。
【０００４】
最近の細胞内遺伝情報の量的変動すなわち染色体およびその特定領域のコピー数の異常を解析する技術としては、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、代表差異分析（ＲＤＡ：ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）および古典的細胞遺伝学的手法がある。
【０００５】
また、従来の遺伝子コピー数の異常を解析する技術としては、例えば非特許文献１に記載されたものがある。同文献に記載された解析方法では、対照ゲノムＤＮＡ配列を制限酵素で切断して得られるヴァーチャルタグと、解析対象ゲノムＤＮＡ配列を制限酵素で切断して得られる生タグと、を比較して、対照ゲノムＤＮＡ配列に対する解析対象ゲノムＤＮＡ配列の変化を解析している。
【０００６】
【非特許文献１】Tian-Li Wang et. al, "Digital karyotyping ", Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, December 10, 2002, vol. 99, no. 25, pages 16156-16161
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
第一に、上述の細胞分裂中期の染色体を利用するＣＧＨ法、ＲＤＡ法、古典的細胞遺伝学的手法などでは、解像度の限界が２０Ｍｂ程度であり、それよりも小さな領域に限局されたコピー数変化の解析に利用することは困難である。また、最近のＣＧＨ法からマイクロアレイ法への移行によって解像力は増しているが、解析する配列の数に限界があり特殊な設備を必要とする。これらの問題を克服するためには、高解像度でゲノムＤＮＡ配列のコピー数異常を同定できる手法が望まれる。
【０００８】
第二に、またＣＧＨ法に代表されるＤＮＡハイブリダイゼーションに基づく解析法では、事前にｈＣｏｔ−１  ＤＮＡを使用し分子生物学的手法で反復配列をサンプルから除去している。また、非特許文献１に記載の解析方法でも、反復配列を解析対象タグから除去している。これは、ゲノムの約４５％を占める反復配列を含む領域の情報を捨てることを意味する。そのため、これらの解析方法には、解析結果の信頼性の面でさらなる改善の余地がある。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、高解像度でゲノムＤＮＡ配列のコピー数異常を信頼性よく同定できる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、対照ゲノムＤＮＡ配列を制限酵素により切断して得られ、それぞれこの対照ゲノムＤＮＡ配列に含まれる個数が所定数以下であり、かつそれぞれ所定の範囲の塩基数のＤＮＡ配列からなる複数の対照タグを、それぞれこの対照ゲノムＤＮＡ配列中の対応箇所と関連づけてなる対照タグデータを取得する対照タグデータ取得部と、解析対象ゲノムＤＮＡ配列をこの制限酵素により切断して得られ、かつそれぞれ所定の範囲の塩基数のＤＮＡ配列からなる複数の解析対象タグの集合である解析対象タグデータを取得する解析対象タグデータ取得部と、この対照タグデータとこの解析対象タグデータとを比較して、この対照タグおよびこの解析対象タグのうち、それぞれ対応するタグ同士を関連づけてなる対応タグデータを生成する対応タグデータ生成部と、この対応タグデータを解析し、この対照タグと対応するこの解析対象タグの個数を判定し、この個数に基づいて、この解析対象ゲノムＤＮＡ配列のうちこの対照タグに対応する箇所を含む領域のこの対照ゲノムＤＮＡ配列に対するコピー数の相違を判定するコピー数判定部と、このコピー数判定部による処理を経たデータを出力する出力部と、を備えるＤＮＡ配列解析装置が提供される。
【００１１】
この構成によれば、解析対象ゲノムＤＮＡ配列を制限酵素処理して得られる短い断片からなる解析対象タグをゲノムの代表としてカウントし、対照ゲノムＤＮＡ配列に由来するヴァーチャルタグである対照タグと比較することにより、ヒトゲノムの網羅的コピー数の定量を行うことができるため、それをもとに解析対象ゲノムＤＮＡ配列中におけるコピー数異常を呈する領域を高解像度で同定することができる。
【００１２】
この際、この構成によれば、それぞれ対照ゲノムＤＮＡ配列に含まれる個数が所定数以下である複数の対照タグを用いるため、反復配列を含むタグであっても、対照ゲノムＤＮＡ配列に含まれる個数が所定数以下であるユニーク度の高いタグであれば好適に用いることができる。そのため、この構成によれば、対照ゲノムＤＮＡ配列中の一定の割合を占める反復配列を含む領域の情報を活用でき、解析結果の信頼性を向上できる。
【００１３】
なお、上記のＤＮＡ配列解析装置は、本発明の一態様であり、本発明のＤＮＡ配列解析方法、ＤＮＡ配列解析システム、ＤＮＡ配列解析プログラム、そのプログラムを含む記録媒体、などもまた、同様の構成を有する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、高解像度でゲノムＤＮＡ配列のコピー数異常を信頼性よく同定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１６】
＜用語説明＞
ゲノムスキャニング：ｇｅｎｏｍｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇとは、ゲノム上の遺伝子情報を網羅的に解析する方法である。Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ法（ＡＰ−ＰＣＲ）や、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｌａｎｄｍａｒｋ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  （ＲＬＧＳ）法などの手法があり、がんにおける遺伝子増幅や、欠失の同定に有効な手法である。しかし、既存の手法では全ゲノムの０．１％−１％程度を解析するのが限界である。
【００１７】
比較ゲノムハイブリダイゼーション：ＣＧＨ（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）とは、主に腫瘍細胞の染色体内で増幅あるいは欠失している領域を検出するための、競合的蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法である。
【００１８】
ＳＡＧＥ（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）：遺伝子発現の連続解析とは、多数の転写産物ｍＲＮＡの発現を同時に検出するための方法である。
【００１９】
コンカテマー：ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒとは、ＤＮＡリガーゼ（連結酵素）などによって直列に連結したＤＮＡ断片群である。
【００２０】
＜発明の概略＞
図１は、デジタルゲノムスキャニングの原理とヴァーチャルタグによる染色体異常解析の概要について説明するための概念図である。なお、ここでは概略を示すにとどめ、詳しくは後述する。
【００２１】
まず、図右上に示すように、ヴァーチャルタグである対照タグデータを作成するために、ヒトなどの所定の生物種のゲノム情報からなる対照ゲノムＤＮＡ配列データを用意する。次いで、タグの抽出のためのアルゴリズムが作成され、このアルゴリズムにより、対照ゲノムＤＮＡ配列データは所定の制限酵素切断部位により切断され、ヴァーチャルタグである対照タグが作成され、データベース化される。
【００２２】
そして、このヴァーチャルタグである対照タグのデータベースと、ヒトなどの所定の生物種のゲノムのシークエンステキスト（対照ゲノムＤＮＡ配列のシークエンステキスト）とがリンクされる。さらに、このヴァーチャルタグである対照タグのデータベースを、シークエンステキストを介して、ヒトなどの所定の生物種のゲノム上の位置情報（対照ゲノムＤＮＡ配列の位置情報）にリンクすることにより対照タグデータが得られる。
【００２３】
一方では、図左上に示すように、ヒトなどの所定の生物種のゲノムＤＮＡ分子を含む細胞から、ＤＮＡ抽出により複数の染色体からなるゲノムＤＮＡ分子（解析対象ゲノムＤＮＡ分子）が用意される。次いで、これらの複数の染色体からなるゲノムＤＮＡ分子が所定の制限酵素により切断され、得られた複数の解析対象タグが連結されて複数のコンカテマーが作成される。
【００２４】
そして、これらのコンカテマーがベクターにライゲーションされた後、シークエンス反応により、複数のコンカテマーのＤＮＡ配列が解読される。さらに、解読した複数のコンカテマーのＤＮＡ配列は、それぞれ複数のタグのＤＮＡ配列に変換されて、解析対象タグデータが得られる。
【００２５】
続いて、図中央下部に示すように、上述のようにして得られた対照タグデータおよび解析対象タグデータに基づいて、対照タグデータおよび解析対象タグデータの対応データが生成される。そして、この対応データにより、ゲノム上の各領域に対応する解析対象タグの個数が判定され、その結果、ゲノム上の各領域における増幅、欠失などの染色体異常の存在が検出される。このようなゲノム上の各領域における増幅、欠失などの情報は、疾患遺伝子の同定などに活用される。
【００２６】
図２は、ＤＮＡ配列解析システム１０００の全体構成を示した機能ブロック図である。
ＤＮＡ配列解析システム１０００は、対照タグデータおよび解析対象タグデータを取得してゲノムＤＮＡ配列の変化を解析するＤＮＡ配列解析装置１００を備える。また、ＤＮＡ配列解析システム１０００は、対照タグデータを生成する対照タグデータ生成装置２００を備える。さらに、ＤＮＡ配列解析システム１０００は、解析対象データを生成する解析対象データ生成装置３００を備える。
【００２７】
ＤＮＡ配列解析システム１０００は、対照タグデータや解析対象タグデータとは異種の生物種のゲノムＤＮＡ配列データを格納する別ゲノムＤＮＡ配列データベース１２０を備える。ＤＮＡ配列解析システム１０００は、ＤＮＡ配列解析装置１００を操作するための操作部１０２を備える。
【００２８】
ＤＮＡ配列解析システム１０００は、ＤＮＡ配列解析装置１００から出力されるデータを画像表示する画像表示装置１０４を備える。また、ＤＮＡ配列解析システム１０００は、ＤＮＡ配列解析装置１００から出力されるデータを印刷するプリンタ１０６を備える。さらに、ＤＮＡ配列解析システム１０００は、ＤＮＡ配列解析装置１００から出力されるデータを受信するＰＣ（パーソナルコンピュータ）１０８を備える。
【００２９】
図３は、ＤＮＡ配列解析システム１０００の変形例であるＤＮＡ配列解析システム２０００の全体構成を示した機能ブロック図である。
【００３０】
ＤＮＡ配列解析システム２０００は、基本的に図１のＤＮＡ配列解析システム１０００と同様の構成をしているが、対照ゲノムＤＮＡ配列データ取得部２０２（図４）がＤＮＡ配列解析装置４００内部に設けられている点が異なる。また、ＤＮＡ配列解析装置４００が対照ゲノムＤＮＡ配列データベース５００に接続している点でも異なる。
【００３１】
以下、本実施の形態にについて、下記の順番で説明する。
１．対照タグデータおよび解析対象タグデータを用いたＤＮＡ配列解析
２．対照タグデータの生成
３．解析対象タグデータの生成
ここで、「１．」は、図１のＤＮＡ配列解析装置１００の説明である。
「２．」は、上記「１．」の基礎になるデータ（ＤＮＡ配列解析装置１００に入力されるべきデータ）を生成する図１の対照タグデータ生成装置２００の説明である。
「３．」は、上記「１．」の基礎になるデータ（ＤＮＡ配列解析装置１００に入力されるべきデータ）を生成する図１の解析対象タグデータ生成装置３００の説明である。
【００３２】
＜１．対照タグデータおよび解析対象タグデータを用いたＤＮＡ配列解析＞
図４は、ＤＮＡ配列解析装置１００の内部構成を示した機能ブロック図である。
ＤＮＡ配列解析装置１００は、対照タグデータ生成装置２００から入力される対照タグデータを取得する対照タグデータ取得部２０２を備える。対照タグデータは、対照ゲノムＤＮＡ配列を制限酵素により切断して得られる複数の対照タグをそれぞれ対照ゲノムＤＮＡ配列中の対応箇所と関連づけてなるデータである。また、これら複数の対照タグデータは、それぞれ対照ゲノムＤＮＡ配列に含まれる個数が所定数以下であり、かつそれぞれ所定の範囲の塩基数のＤＮＡ配列からなるデータである。また、ＤＮＡ配列解析装置１００は、対照タグデータ取得部２０２により取得された対照タグデータを格納する対象タグデータ記憶部２０６を備える。
【００３３】
一方、ＤＮＡ配列解析装置１００は、解析対象タグデータ生成装置３００から入力される解析対象タグデータ取得部２０４を備える。解析対象タグデータは、解析対象ゲノムＤＮＡ配列を制限酵素により切断して得られる複数の解析対象タグの集合のデータである。また、これらの複数の解析対象タグの集合のデータは、それぞれ所定の範囲の塩基数のＤＮＡ配列からなるデータである。また、ＤＮＡ配列解析装置１００は、解析対象タグデータ取得部２０４により取得された解析対象タグデータを格納する解析対象タグデータ記憶部２０８を備える。
【００３４】
ＤＮＡ配列解析装置１００は、対照タグデータと解析対象タグデータとを関連づけてなる対応タグデータを生成する対応タグデータ生成部２１０を備える。対応タグデータ生成部２１０は、対照タグデータ記憶部２０６から対照タグデータを取得し、解析対象タグデータ記憶部２０８から解析対象タグデータを取得し、対照タグデータと解析対象タグデータとを比較して、対照タグおよび解析対象タグのうち、それぞれ対応するタグ同士を関連づけることにより対応タグデータを生成する。また、ＤＮＡ配列解析装置１００は、対応タグデータ生成部２１０が生成した対応タグデータを格納する対応タグデータ記憶部２１２を備える。
【００３５】
ＤＮＡ配列解析装置１００は、対応タグデータを解析し、解析対象ゲノムＤＮＡ配列における対照ゲノムＤＮＡ配列とのコピー数の相違を判定するコピー数判定部２１４を備える。コピー数判定部２１４は、対応タグデータ記憶部２１２から取得した対応タグデータを解析して対照タグと対応する解析対象タグの個数を判定し、この個数に基づいて対照ゲノムＤＮＡ配列のうち対照タグを含む領域の解析対象ゲノムＤＮＡ配列における対照ゲノムＤＮＡ配列とのコピー数の相違を判定する。また、ＤＮＡ配列解析装置１００は、コピー数判定部２１４によるコピー数判定結果を記憶するコピー数判定結果記憶部２１６を備える。
【００３６】
ＤＮＡ配列解析装置１００は、対照タグデータや解析対象タグデータとは異種の生物種のゲノムＤＮＡ配列データを検索する別ゲノムＤＮＡデータ検索部２２４を備える。すなわち、ゲノムＤＮＡ配列データ検索部２２４は、対照ゲノムＤＮＡ配列と異なる起源由来の別ゲノムＤＮＡ配列データベース１２０（図１）に接続して別ゲノムＤＮＡ配列データを検索する。
【００３７】
ＤＮＡ配列解析装置１００は、対照タグに対応しない解析対象タグについて起源を判定する起源判定部２２６を備える。すなわち、起源判定部２２６は、対応タグデータ記憶部２１２から取得した対応タグデータを解析し、解析対象タグと対応する対照タグが存在するか判定する。その結果、起源判定部２２６は、解析対象タグと対応する対照タグが存在しない場合には、解析対象タグと別ゲノムＤＮＡデータ検索部２２４から取得した別ゲノムＤＮＡ配列データとを比較して、解析対象タグの起源を判定する。また、ＤＮＡ配列解析装置１００は、起源判定部２２６による判定結果を格納する起源判定結果記憶部２２８を備える。
【００３８】
ＤＮＡ配列解析装置１００は、コピー数判定結果または起源判定結果に基づいて画像データを生成する画像データ生成部２２０を備える。すなわち、画像データ生成部２２０は、コピー数判定結果記憶部２１６からコピー数判定結果を取得し、起源判定結果記憶部２２８から起源判定結果を取得し、これらの結果に基づいて、ゲノムＤＮＡ配列の各領域の対照ゲノムＤＮＡ配列とのコピー数の相違や異種由来のＤＮＡ配列などの存在を、ユーザにとって理解しやすい画像により表示するための画像データを生成する。また、ＤＮＡ配列解析装置１００は、画像データ生成部２２０の生成した画像データを格納する画像データ記憶部２２２を備える。
【００３９】
図５は、ＤＮＡ配列解析装置１００の変形例であるＤＮＡ配列解析装置４００の内部構成を示した機能ブロック図である。ＤＮＡ配列解析装置４００の構成は、基本的には図４のＤＮＡ配列解析装置１００の構成と同様であるが、対照タグデータ生成部４０２を内部に備える点が異なる。
【００４０】
対照タグデータ生成部４０２は、対照ゲノムＤＮＡ配列データベース５００（図３）から入力される対照ゲノムＤＮＡ配列データを取得し、対照タグデータを生成する。対照タグデータ生成部４０２が対照タグデータを生成する詳細な機構については、後述する。
【００４１】
また、ＤＮＡ配列解析装置４００の構成は、対照タグデータ生成部４０２の生成した対照タグデータを格納する対照タグデータ記憶部４０４を備える点でも異なる。そのため、ＤＮＡ配列解析装置４００では、対照タグデータ取得部２０２は、装置外部からではなく、装置内部の対照タグデータ記憶部４０４から対照タグデータを取得する。
【００４２】
図６は、ＤＮＡ配列解析システム１０００の動作について説明するためのフローチャートである。まず、一連のフローがスタートすると、図２に示した対照タグデータ生成部２００が、ヒトなどの所定の生物種の対照ゲノムＤＮＡ配列データを、制限酵素切断部位で切断することにより、対照タグデータを生成する（Ｓ１０２）。
【００４３】
このとき、後述するように、対照ゲノムＤＮＡ配列に含まれる個数が所定数以下（例えば１）であるユニーク度の高い対照タグを抽出して、ユニーク度の高い対照タグのみを含む対照タグデータを生成することもできる。また、所定の範囲の塩基数のＤＮＡ配列からなる対照タグのみを抽出し、所定の範囲の長さの対照タグのみを含む対照タグデータを生成することもできる。さらに、得られた対照タグデータは、対照ゲノムＤＮＡ配列中の対応箇所と関連づけられている構成とすることができる。
【００４４】
次いで、ＤＮＡ配列解析装置１００では、対照タグデータ取得部２０２が、対照タグデータ生成部２００から対照タグデータを取得する（Ｓ１０６）。また、対照タグデータ取得部２０２は、取得した対照タグデータを対照タグデータ記憶部２０６に格納する。
【００４５】
一方、図２に示した解析対象タグデータ生成装置３００は、ヒトなどの所定の生物種の解析対象ゲノムＤＮＡ分子を制限酵素で処理して得られる複数のＤＮＡ断片を連結して複数のコンカテマーを生成し、この複数のコンカテマーのシークエンスを行うことにより、複数の解析対象タグを含む解析対象タグデータを生成する（Ｓ１０４）。
【００４６】
このとき、後述するように、複数のＤＮＡ断片を連結して複数のコンカテマーを生成し、さらに複数のコンカテマーを連結して複数の２次コンカテマーを生成してもよい。このように、２次コンカテマーを生成することにより、シークエンスの効率を向上することができるためである。
【００４７】
次いで、ＤＮＡ配列解析装置１００では、解析対象タグデータ取得部２０４が、解析対象タグデータ生成部３００から解析対象タグデータを取得する（Ｓ１０８）。また、解析対象タグデータ取得部２０４は、取得した解析対象タグデータを解析対象タグデータ記憶部２０８に格納する。
【００４８】
そして、対応タグデータ生成部２１０は、対照タグデータ記憶部２０６から対照タグデータを取得し、解析対象タグデータ記憶部２０８から解析対象タグデータを取得し、対照タグデータと解析対象タグデータとを比較して、対照タグおよび解析対象タグのうち、それぞれ対応するタグ同士を関連づけてなる対応タグデータを生成する（Ｓ１１０）。また、対応タグデータ生成部２１０は、生成した対応タグデータを対応タグデータ記憶部２１２に格納する。
【００４９】
続いて、コピー数判定部２１４は、対応タグデータ記憶部２１２から取得した対応タグデータを解析し、対照タグと対応する解析対象タグの個数を判定し、この個数に基づいて、解析対象ゲノムＤＮＡ配列のうち対照タグに対応する箇所を含む領域の対照ゲノムＤＮＡ配列に対するコピー数の相違を判定する（Ｓ１１４）。また、コピー数判定部２１４は、コピー数判定結果をコピー数判定結果記憶部２１６に格納する。
【００５０】
一方、起源判定部２２６は、対応タグデータ記憶部２１２から取得した対応タグデータを解析し、解析対象タグと対応する対照タグが存在するか判定する。その結果、起源判定部２２６は、解析対象タグと対応する対照タグが存在しない場合には、別ゲノムＤＮＡデータ検索部２２４から取得した別ゲノムＤＮＡ配列データと解析対象タグとを比較して、解析対象タグの起源を判定する（Ｓ１１２）。また、起源判定部２２６は、起源判定結果を起源判定結果記憶部２２８に格納する。
【００５１】
そして、画像データ生成部２２０は、コピー数判定結果記憶部２１６からコピー数判定結果を取得し、起源判定結果記憶部２２８から起源判定結果を取得し、コピー数判定結果および起源判定結果に基づいて画像データを生成する（Ｓ１１６）。また、画像データ生成部２２０は、生成した画像データを画像データ記憶部２２２に格納する。
【００５２】
さらに、出力部２１８は、コピー数判定結果記憶部２１６からコピー数判定結果を取得し、起源判定結果記憶部２２８から起源判定結果を取得し、画像データ記憶部２２２から画像データを取得したうえで、これらを装置の外部の画像表示装置１０４（図２）などに出力し（Ｓ１１８）、一連のフローが終了する。
【００５３】
以下、本実施の形態に係るＤＮＡ配列解析システム１０００の利点について説明する。
ＤＮＡ配列解析システム１０００によれば、解析対象ゲノムＤＮＡ配列を制限酵素処理して得られる短い断片からなる解析対象タグをゲノムの代表としてカウントし、対応タグデータ生成部２１０により対照ゲノムＤＮＡ配列に由来するヴァーチャルタグである対照タグと比較することにより、コピー数判定部２１４においてヒトゲノムの網羅的コピー数の定量を行うことができる。このため、それをもとに、解析対象ゲノムＤＮＡ配列中におけるコピー数異常を呈する領域を高解像度で同定することができる。その結果、遺伝子コピー数の異常を示すゲノム領域を高解像度で検索同定し、その領域に存在する疾患の新たな原因遺伝子を明らかにし、発症のメカニズムを解明すると同時に分子レベルの疾患診断と治療への応用を図ることができる。
【００５４】
図７は、対応タグデータ生成部２１０の内部構成を示した機能ブロック図である。対応タグデータ生成部２１０は、対照タグデータ記憶部２０６（図４）および解析対象タグデータ記憶部２０８（図４）からそれぞれ対照タグデータおよび解析対象タグデータの入力を受け付ける受付部５０２を備える。
【００５５】
対応タグデータ生成部２１０は、対照タグデータおよび解析対象タグデータの対応関係を判定する対応関係判定部５０４を備える。対応関係判定部５０４は、受付部５０２から対照タグデータおよび解析対象タグデータを取得し、解析対象タグが対照タグのうち一個のタグとのみ対応する場合に、これらのタグ同士を所定の寄与度（例えば１）により関連づけ、解析対象タグが対照タグのうち二個以上のタグと対応する場合に、これらのタグ同士を所定の寄与度と異なる寄与度（例えば０）により関連づける。この際、対応関係判定部５０４における寄与度の設定は、対応タグデータ生成部２１０に設けられている寄与度設定部５０８により行われる。
【００５６】
対応タグデータ生成部２１０は、対照タグデータおよび解析対象タグデータの一致度を判定する一致度判定部５０６を備える。一致度判定部５０６は、対応関係判定部５０４から対応関係に関する寄与度の設定の済んだ対照タグデータおよび解析対象タグデータを取得し、対照タグおよび解析対象タグのうち、完全に一致するタグ同士を所定の寄与度（例えば１）により関連づけ、一部異なるタグ同士を前記所定の寄与度と異なる寄与度（例えば０）により関連づける。この際、一致度判定部５０６における寄与度の設定は、対応タグデータ生成部２１０に設けられている寄与度設定部５０８により行われる。なお、一部異なるタグとして、長さは一致しているがミスマッチがある解析タグばかりでなく、１塩基または２塩基の挿入または欠失がある解析タグを含めてもよい。
【００５７】
対応タグデータ生成部２１０は、解析対象タグデータに含まれる複数の解析対象タグのそれぞれの生成を再試行するか否かを判定する再試行判定部５１０を備える。例えば、再試行判定部５１０は、一致度判定部５０６における判定結果において、対照タグおよび解析対象タグの配列が一部異なるという結果が得られた場合には、異なる塩基数が所定数以下であれば、その解析対象タグを生成するためのシークエンスを再試行するという判定をするように構成することができる。このようにすれば、数塩基レベルのわずかなシークエンスエラーにより、貴重な解析対象タグの数を減らすことを抑制できるので、得られる解析結果の信頼性を向上できる。
【００５８】
対応タグデータ生成部２１０は、対応関係判定部５０４、一致度判定部５０６、再試行判定部５１０の処理を経たデータを対応タグデータ記憶部２１２（図４）に出力する出力部５１２を備える。
【００５９】
図８は、対応タグデータ生成部２１０の動作を説明するためのフローチャートである。一連のフローがスタートすると、まず、対応関係判定部５０２が対照タグデータおよび解析対象タグデータの対応関係を判定する（Ｓ２０２）。例えば、それぞれの解析対象タグに対応する対照タグの個数を判定し、対照タグの個数が１であれば寄与度設定部５０８により寄与度をａに設定し（Ｓ２０６）、対照タグの個数が２以上であれば寄与度設定部５０８により寄与度をｂに設定し（Ｓ２０８）、対照タグの個数が０であればステップ１１２へ進んで起源判定を行う（図６）。
【００６０】
次に、一致度判定部５０６が対照タグデータおよび解析対象タグデータの一致度を判定する（Ｓ２１０）。例えば、それぞれの解析対象タグと対応する対照タグとの一致度を判定し、完全一致であれば寄与度設定部５０８により寄与度をｃに設定し（Ｓ２１２）、不完全一致であれば寄与度設定部５０８により寄与度をｄに設定する（Ｓ２１４）。
【００６１】
そして、上記の対応関係および一致度の判定結果に基づいて、再試行判定部５１０により再試行の必要性の有無を判定し（Ｓ２１４）、一連のフローを終了する。
【００６２】
以下、本実施の形態における対応タグデータ生成部２１０の利点について説明する。
対応タグデータ生成部２１０によれば、対応関係判定部５０４、一致度判定部５０６および寄与度設定部５０８により、対照タグおよび解析対象タグの間の対応関係および一致度に応じて適切な寄与度を設定することができる。その結果、後述するコピー数判定部２１４において、ゲノムＤＮＡ配列中の領域ごとに、対照タグおよび解析対象タグの間の対応関係および一致度に応じた寄与度を積算することにより、解析対象ゲノムＤＮＡ配列のうち対照ゲノムＤＮＡ配列に対してコピー数の相違した領域を信頼性よく検出することができる。
【００６３】
また、対応タグデータ生成部２１０によれば、再試行判定部５１０を備えているため、シークエンスの際の読み取りミスまたはＳＮＰｓであることが疑われる解析対象タグに関しては、シークエンスなどの再試行を行うことができ、ＤＮＡ配列解析システム１０００により得られる結果の信頼性を向上することに役立っている。
【００６４】
図９は、コピー数判定部２１４の内部構成を示した機能ブロック図である。コピー数判定部２１４は、対応タグデータ記憶部２１２（図４）から対応タグデータの入力を受け付ける受付部６０２を備える。また、コピー数判定部２１４は、受付部６０２により受け付けた対応タグデータに設定された寄与度を集計する寄与度集計部６０４を備える。
【００６５】
さらに、コピー数判定部２１４は、寄与度集計部６０４により集計された寄与度に基づいて解析対象ゲノムＤＮＡ配列における重複の発生の有無を判定する重複判定部６０６を備える。重複判定部６０６は、寄与度集計部６０４により集計された寄与度に基づいて対照タグと対応する解析対象タグの個数を判定し、対照タグと対応する解析対象タグの個数が所定数以上（例えば３以上）の場合には、解析対象ゲノムＤＮＡ配列のうちこの対照タグに対応する箇所を含む領域における重複が発生していると判定する。
【００６６】
また、コピー数判定部２１４は、寄与度集計部６０４により集計された寄与度に基づいて解析対象ゲノムＤＮＡ配列における欠失の発生の有無を判定する欠失判定部６０８を備える。欠失判定部６０８は、寄与度集計部６０４により集計された寄与度に基づいて対照タグと対応する解析対象タグの個数を判定し、対照タグと対応する解析対象タグの個数が所定数以下（例えば０．５以下）の場合には、解析対象ゲノムＤＮＡ配列のうちこの対照タグに対応する箇所を含む領域における欠失が発生していると判定する。
【００６７】
さらに、コピー数判定部２１４は、寄与度集計部６０４、重複判定部６０６および欠失判定部６０８から得られるデータをコピー数判定結果記憶部２１６（図４）に出力する出力部６１０を備える。
【００６８】
図１０は、コピー数判定部２１４の動作を説明するためのフローチャートである。コピー数判定部２１４では、一連のフローがスタートすると、まず、受付部６０２が受け付けた対応タグデータを寄与度集計部６０４が解析し、対照ゲノムＤＮＡ配列の領域ごと（対照タグデータのそれぞれの対照タグごと）に設定された寄与度を集計する（Ｓ３０２）。
【００６９】
次いで、重複判定部６０６は、対照ゲノムＤＮＡ配列の領域ごとに、集計された寄与度が閾値以上（例えば３以上）であるか判定する（Ｓ３０４）。その結果、閾値以上であれば重複であると判定する（Ｓ３０６）。一方、閾値未満であれば次のステップ３０８に進む。
【００７０】
次のステップでは、欠失判定部６０８が、対照ゲノムＤＮＡ配列の領域ごとに、集計された寄与度が閾値以下（例えば０．５以下）であるか判定する（Ｓ３０８）。その結果、閾値以下であれば欠失であると判定する（Ｓ３１０）。一方、閾値より大きければ特に何も判定しない。
【００７１】
そして、以上の判定結果を取得して、出力部６１０は、判定結果をコピー数判定結果記憶部２１６に出力し（Ｓ３１２）、一連のフローを終了する。
【００７２】
以下、本実施の形態におけるコピー数判定部２１４の利点について説明する。
コピー数判定部２１４によれば、対応タグデータ生成部２１０により対応関係および一致度に応じて適切な寄与度を設定されたデータを取得して、ゲノムＤＮＡ配列中の領域ごとに、対照タグおよび解析対象タグの間の対応関係および一致度に応じた寄与度を積算することにより、解析対象ゲノムＤＮＡ配列中の対照ゲノムＤＮＡ配列とのコピー数の相違した領域を信頼性よく検出することができる。また、重複判定部６０６および欠失判定部６０８により積算した寄与度と上下の閾値との関係を判定することにより、ゲノムＤＮＡ配列中の重複および欠失が発生している箇所を信頼性よく検出することができる。
【００７３】
図１１は、対照タグごと（ヴァーチャルタグ単位）のデータ可視化イメージを説明するための概念図である。画像データ生成部２２０は、コピー数判定結果記憶部２１６からコピー数の判定結果に関するデータを取得して、このような画像データを生成する。この図では、それぞれの対照タグに相当する個々のマス目について、タグ濃度（寄与度の集計値に対応）を計算してタグ濃度に応じた色彩により、ユーザに理解しやすい形で表示している。また、表示ウインドウについても、必要に応じて拡大縮小でき、ユーザの利便性を考慮している。
【００７４】
この画像によれば、マス目の色彩により、それぞれのマス目の相当するゲノムＤＮＡ中の領域で重複または欠失が生じているか否か容易に目視で判断することができる。
【００７５】
図１２は、対照タグごと（ヴァーチャルタグ単位）のデータ可視化イメージを説明するための概念図である。画像データ生成部２２０は、コピー数判定結果記憶部２１６からコピー数の判定結果に関するデータを取得して、このような画像データを生成してもよい。この図では、それぞれの対照タグに相当する個々の染色体上の位置について、タグ濃度（寄与度の集計値に対応）を計算してタグ濃度に応じた塗りつぶされたマス目の高さにより、ユーザに理解しやすい形で表示している。また、表示ウインドウについても、必要に応じて拡大縮小でき、ユーザの利便性を考慮している。さらに、ヒトゲノムの個々の染色体について、切り替えることの可能なボタンも用意されている。
【００７６】
この画像によっても、塗りつぶされたマス目の高さにより、それぞれの染色体上の位置で重複または欠失が生じているか否か容易に目視で判断することができる。このような優れた画像生成機能を有するため、大量のデータ解析と結果の把握を容易にするためのユーザインターフェースが実現している。
【００７７】
＜２．対照タグデータの生成＞
図１３は、対照タグデータ生成装置２００の内部構成を説明するための機能ブロック図である。対照タグデータ生成装置２００（対照タグデータ生成部４０２（図５）も同様の構成である）は、対照ゲノムＤＮＡ配列データを取得する対照ゲノムＤＮＡ配列データ取得部７０６を備える。また、対照タグデータ生成装置２００は、対照ゲノムＤＮＡ配列データ取得部７０６の取得した対照ゲノムＤＮＡ配列データを格納する対照ゲノムＤＮＡ配列データ記憶部７０８を備える。
【００７８】
対照タグデータ生成装置２００は、対照ゲノムＤＮＡ配列データ記憶部７０８から対照ゲノムＤＮＡ配列データを取得し、所定の制限酵素による切断部位を検索し、検索された切断部位で対照ゲノムＤＮＡ配列データを切断する切断部位検索部７１０を備える。また、対照タグデータ生成装置２００は、切断部位検索部７１０により切断されて得られる複数のＤＮＡ配列（対照タグ）を格納する切断ＤＮＡ配列記憶部７１２を備える。
【００７９】
対照タグデータ生成装置２００は、切断ＤＮＡ配列記憶部７１２から対照ゲノムＤＮＡ配列を切断部位により切断してなる複数の対照タグを取得し、これらの対照タグのうち、所定の範囲の塩基数・所定の範囲のユニーク度からなる対照タグを選択する対照タグ選択部７１４を備える。また、対照タグデータ生成装置２００は、対照タグ選択部７１４が選択した対照タグを格納する選択タグ記憶部７１６を備える。
【００８０】
対照タグデータ生成装置２００は、選択された対照タグを対照ゲノムＤＮＡ配列中の対応箇所と関連づけて対照タグデータを生成する関連付部７１８を備える。また、対照タグデータ生成装置２００は、関連付部７１８が生成した対照タグデータを格納する対照タグデータ記憶部７２０を備える。
【００８１】
対照タグデータ生成装置２００は、対照タグデータ記憶部７２０から対照タグデータを取得してＤＮＡ配列解析装置１００に出力する出力部７２２を備える。
【００８２】
以下、上述の対照タグデータ生成装置２００によるヒトゲノム情報を用いたヴァーチャルタグ（対照タグ）の生成について詳細に説明する。
【００８３】
１．ヒトゲノムの塩基配列情報、ならびにリピート配列データ
本発明者らの考案したデジタルゲノムスキャニング（ＤＧＳ）の原理は、ヒトゲノムの網羅的コピー数の定量を行うために、ゲノムＤＮＡを制限酵素処理して得られる短い断片をゲノムの代表としてカウントし、それをもとにコピー数異常を呈する領域を同定しようするものである。本発明者らはこのＤＧＳ法の基盤の確立にむけて、解像度や実効性を検討する目的でｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおいて下記のシミュレーションを行った。
【００８４】
ヒトゲノムの塩基配列情報、ならびにリピート配列データについてはカリフォルニア大ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐが公開しているｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ａｒｃｈｉｖｅ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ．ｈｔｍｌよりＪｕｌ  ２００３  ｈｇ１６バージョンを入手した。
【００８５】
解析プログラムにはＣ言語、ソフトウェア開発環境はＲｅｄ  Ｈａｔサーバーを中心に構築したシステムを使用した。ヴァーチャルタグ解析には、制限酵素認識塩基配列情報でゲノムデータを検索した後、指定の領域外のデータを排除し残ったタグデータを蓄積しサイズ別に解析した。この際各タグの位置情報を保存し、リピート配列データベースと照合してリピートのクラスを判定しデータを記録した。
【００８６】
２．制限酵素別のヴァーチャルタグ数
図１４は、各制限酵素によってゲノムから生成されるタグ数を示す図である。ＤＧＳの開始にあたっては、まずどの制限酵素を用いてゲノムＤＮＡを断片化するかが問題となる。そこで、ヴァーチャルタグのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析のために、まず、制限酵素別のヴァーチャルタグ数について検討した。
【００８７】
より詳細には、ヒトの全ゲノムＤＮＡ情報を用いて、コンピュータ上で制限酵素処理を行い生成されるタグ（以下、これをヴァーチャルタグと称する）のサイズと数を集計した。代表的な４塩基認識、ならびに６塩基認識の制限酵素によって生じるヴァーチャルタグ数の結果を図１４に示す。
【００８８】
この結果、６塩基認識の制限酵素は認識条件が厳しいため、生成されるヴァーチャルタグ数が４塩基認識制限酵素と比較して明らかに少なく不十分であると考えられた。この４塩基認識酵素の中でＭｂｏＩはＤＮＡ配列ＧＡＴＣを認識し切断するため、コンカテマー（タグを数珠つなぎにライゲーションしたもの）のクローニングにはＢａｍＨＩ部位を使用可能である。また生成されるタグ数も２０〜４０塩基の長さのものに限定してみると他の酵素との比較において中間的な値を示したことから、以下のシミュレーションにおいてはＭｂｏＩによって生成されるヴァーチャルタグを中心に解析を進めた。
【００８９】
３．ＭｂｏＩヴァーチャルタグのサイズ別分布
次いで、ＭｂｏＩヴァーチャルタグのサイズ別分布について検討した。より利詳細には、全ゲノムのＭｂｏＩ処理によって生成されるＤＮＡ断片のうちわけをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで解析した。現在明らかになっているヒト全ゲノムの塩基配列を対象とした場合、ＭｂｏＩ断片は合計７、０５６、５６７個生成され、全ＭｂｏＩ断片のうち９５％が１３７７塩基以下であることが明らかとなった。
【００９０】
図１５は、ＭｂｏＩで生成されるサイズ別のタグ数を示すグラフである。図１５では、各ＭｂｏＩヴァーチャルタグの両端のＧＡＴＣを除いた断片サイズ（以下、これをギャップ長と称する）２０〜８０塩基において、１塩基ごとにタグ数を集計したヒストグラムを示す。これにより、２０〜８０塩基ギャップ長をもつＭｂｏＩヴァーチャルタグは、タグのサイズによらずほぼ１万〜１．５万個ずつ存在することが明らかとなった。
【００９１】
一方、３６塩基、３７塩基ギャップ長のタグに見られるように、突出してタグ数の多いものが散見された。また各染色体別にヴァーチャルタグ数を集計した所、図１５に見られるように各染色体からほぼ各染色体の長さに比例して偏り無くタグが生成されていることがわかった。これらの結果から、短いサイズのＭｂｏＩ制限酵素断片を収集してゲノムの代表とすることは妥当と考えられた。
【００９２】
図１６は、タグサイズに幅を与えた場合のタグ数を示す図である。一方ＤＧＳを行う際には多数のタグの解析が必要となるため、一つのベクターになるべく多くのタグを連結したもの（以下これをコンカテマーと称する）を導入することが作業効率をあげる上で、また作業経費節減のため重要となる。
【００９３】
しかしベクターに収載できるコンカテマーの長さ、ならびに一回のシークエンスで解読できる塩基数には限界があるため、コンカテマーを形成する各々のタグのサイズは可能な限り短い方が良いと考えられる。そこで分取するタグサイズを制限した場合のヴァーチャルタグ数を解析し、図１６に示した。この結果２０〜９９塩基ギャップ長のＭｂｏＩヴァーチャルタグは合計１０７８７６２個存在し、４０塩基幅で分取した場合には約５０万個、３０塩基幅で分取した場合には約３７万個のヴァーチャルタグが得られることが明らかとなった。
【００９４】
４．リピート由来のヴァーチャルタグについての解析
次いで、リピート由来のヴァーチャルタグについての解析を行った。より詳細には、ゲノム中にはリピート配列と呼ばれる酷似した塩基配列が多数散在していることが知られている。２００１年のゲノムプロジェクトの報告（Ｎａｔｕｒｅ  ２００１、４０９、８７１−）では、ヒトゲノムの約４５％がリピート配列で占められているとされている。
【００９５】
ＤＧＳを行うにあたっては、各タグがゲノム上の１箇所にユニークにマッピングされなければ、正確なコピー数を推定することができない。すなわち、ゲノム上の何箇所かに合致する配列をもつタグはＤＧＳではタグとして採用できず、リピート配列由来のタグはそのような無効なタグとなる可能性が高いと考えられる。
【００９６】
そこでヴァーチャルタグのうち、リピート配列由来と考えられるタグを集計しその比率を解析した。リピート配列としては散在性反復配列（ＬＩＮＥ、ＬＴＲエレメント、ＳＩＮＥ、ＤＮＡトランスポゾン）に加え、縦列反復配列（マイクロサテライト、シンプルリピート  ｅｔｃ．）、およびｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ（ｔＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ  ｅｔｃ．）を対象とした。
【００９７】
図１７は、ＭｂｏＩ（＾ＧＡＴＣ）タグ分布を示すグラフである。結果として、ＭｂｏＩヴァーチャルタグの約４０％が散在性反復配列に由来するタグであることが明らかとなった（図１７）。また３６塩基、３７塩基ギャップ長に見られるように、突出してタグ数の多いサイズはリピート由来のタグの比率が高く、それを除いた非リピートタグの数は他のサイズと同程度であることがわかった。
【００９８】
図１８は、ＭｂｏＩで生成される有効なヴァーチャルタグ数を示す図である。これらをタグサイズに幅を持たせて集計しなおした結果を図１８に示す。たとえば３０塩基の幅を持たせた３０〜５９ｂｐギャップ長の場合、総タグ数が４２万個であり、そのうちリピート配列由来のタグが２５万個を占め、非リピートタグの数は１６５、８４５個、比率は３９．８％であることがわかった。
【００９９】
同じ３０塩基の幅でもリピート率の高い３６塩基、３７塩基ギャップ長を外すと、例えば４０〜６９ｂｐギャップ長では非リピートタグの比率が４３％に増加する。以上は、ＤＧＳにおいてリピート由来のタグを除外するには、分取するタグサイズを考慮する必要があることを示している。
【０１００】
５．モンテカルロシミュレーションによるＤＧＳの解像度の予測
次に、モンテカルロシミュレーションによるＤＧＳの解像度の予測について説明する。上記の解析から、ヒトゲノム情報にもとづいたヴァーチャルタグの概要が把握できた。しかしそのタグを用いてＤＧＳを行った際に、十分な解像度と感度を得るためには一体どれくらいの規模のタグ解析が必要となるのかは不明である。これをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏシミュレーションによって推測することを試みた。
【０１０１】
６．ＤＧＳモンテカルロシミュレーション
図１９は、ＤＧＳモンテカルロシミュレーションのイメージを示す概念図である。このように、シミュレーションの原理としてモンテカルロシミュレーションという手法を用いた。これは問題の解決に擬似乱数を用いる手法である。
【０１０２】
図２０は、ＤＧＳモンテカルロシミュレーションの詳細を説明する図である。図２１Ａに示す原理で擬似乱数を発生させるアルゴリズムを独自に開発し、遺伝子増幅、遺伝子欠損、ヘテロ接合性喪失のシミュレートに用いた。図２１Ｂに示すように、ヴァーチャルタグ数、実際に解析するタグ数、異常なコピー数を示すタグ数（異常なコピー数を示す領域の距離に相当する）とその相対出現頻度、ならびに試行回数を変数として設定し、各ヴァーチャルタグの出現回数をシミュレートし記録した。
【０１０３】
得られた結果に対して、設定したタグウインドウサイズ、異常検出の閾値にもとづいてコピー数異常の陽性・陰性を判定し、陽性適中率、感度、特異性を解析した。変数の値をさまざまに設定し、異常検出可能な解像度とそれを実現するために必要となる解析タグ数をシミュレーションにより予測した。
【０１０４】
図２１は、ＤＧＳモンテカルロシミュレーションの際におけるユーザインターフェースを示す画面表示図である。このシミュレーションの作業効率を上げるため、上記の操作が可能なユーザインターフェースを持つｗｅｂツールを開発しシミュレーションに用いた（図４）。
【０１０５】
本実施の形態においては、ＤＧＳの解析対象となる遺伝子増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、遺伝子欠損（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、ヘテロ接合性の欠失（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ、ＬＯＨ）の検出感度と解像度について、あるヴァーチャルタグ数を設定したとき、何タグを実際に解析すればこれらのゲノムのコピー数異常を検出できるか、ということをシミュレーションによって予測した。
【０１０６】
図２２は、ＤＧＳシミュレーション結果を、ＭｂｏＩ非リピートヴァーチャルタグ１６５、８４５個の場合の異常検出解像度、及び必要となる解析タグ数の形でまとめた図である。このように、ＤＧＳモンテカルロシミュレーションは、上述のＭｂｏＩヴァーチャルタグ解析で明らかとなった、タグギャップ長３０〜５９塩基において存在すると考えられる非リピートタグ１６５、８４５個のみを有効なタグとして採用した場合を想定して行った。このとき、設定した解析タグ数の回数だけ乱数を発生させてどのタグが出現したかを記録する、これを１試行とし、それを１００回試行した平均のデータを採用した。
【０１０７】
一方、実際のＤＧＳにおいては、陽性判定の閾値やウインドウサイズなどタグデータ取得後において変動させ解析する変数も存在する。そのため、ＤＧＳの実効性を検証する目的において、陽性適中率と感度が９０％以上を示す場合の設定を採用し、その際に予測される異常検出の解像度を結果としてまとめた（図２２）。
【０１０８】
これにより、５倍の遺伝子増幅を１Ｍｂｐの解像度で検出するには１３８００タグ、遺伝子欠損を１Ｍｂｐの解像度で検出するには、４４０００タグ、ＬＯＨを１Ｍｂｐの解像度で検出するには４９５０００タグの解析が必要であることが示された。一方解析タグ数を１００００タグに設定した場合、５倍増幅は１．３４Ｍｂｐ、遺伝子欠損は３．７９Ｍｂｐの解像度で検出可能であることが示された。
【０１０９】
７．リピート配列由来のヴァーチャルタグ
次に、リピート配列由来のヴァーチャルタグ（対照タグ）のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析とＤＧＳ作業効率の予測について説明する。散在型反復配列のサイズは短いものでは１００ｂｐから、長いものでは１０Ｋｂｐ以上になることがある。
【０１１０】
図２３は、両端リピート由来のタグおよび片端リピート由来のタグの違いについて説明するための概念図である。このため一口にリピート配列由来のタグといっても、その断片が完全にリピート配列中に埋もれて存在している場合と、タグの一端だけがリピート配列中に存在している場合とが考えられる。その際に、タグがゲノム上に１箇所にマップされる確率は、タグ中のリピート配列由来の部分が少ないほど高くなると予想される。
【０１１１】
そこでリピート配列由来のＭｂｏＩヴァーチャルタグについて、それが両端ともリピート配列中に埋もれたもの（以下、両端リピート）か、片端だけがリピート配列中に存在しているもの（以下、片端リピート）かによって分類し、タグ数とサイズによる分布についてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで解析を行った。
【０１１２】
図２４は、ＭｂｏＩヴァーチャルタグの見直しについて説明するために、リピート領域に埋没しているタグ（ｒｅｐｅａｔ  ｂｏｔｈ）と、リピート領域および非リピート領域にまたがるタグ（ｒｅｐｅａｔ  ｅｉｔｈｅｒ）のサイズ分布を示すグラフである。図２４では、図１７に示したグラフに両端／片端リピートの分類情報を付加したグラフを示している。
【０１１３】
同じ種類のリピート配列でも両端（ｂｏｔｈ）と片端（ｅｉｔｈｅｒ）は色分けをして区別している。また散在型反復配列（ＬＩＮＥ、ＳＩＮＥ、ＬＴＲ、ＤＮＡトランスポゾン）の片端リピートタグは、グラフ上では意図的に非リピート側に寄せて表示させている。これを見ると、タグギャップ長２０〜８０塩基の範囲においては、タグサイズが長くなるにつれて、ＳＩＮＥを中心とした散在型反復配列由来の片端リピートタグの比率が高くなっていくことがわかる。
【０１１４】
図２５は、リピート領域と非リピート領域とにまたがるＭｂｏＩヴァーチャルタグ（片端リピート）を有効タグとみなした場合について説明するための図である。次に、図２４のヒストグラムをもとに、分取サイズの幅を決めてタグ数を集計した（図２５）。図２５に示されるように、片端リピートのヴァーチャルタグ数はタグサイズが長くなるほど増加していることがわかる。
【０１１５】
ここで、片端リピートのヴァーチャルタグを非リピート配列と同様にＤＧＳにおいて有効なタグであると仮定して、「有効タグ」候補として集計したのが図２５のＢ＋Ｃ列の結果である。同じ３０塩基幅でタグをゲルから切り出す場合でも、分取サイズを５０〜７９塩基と長めに設定すると、片端リピートタグの数が増加した分だけ「有効タグ」の比率が上昇することを示している。
【０１１６】
図２６は、タグ切り出しサイズを長めにシフトさせるべきか否かを検討するための図である。それならば、ゲルから切り出すタグのサイズを長めに設定した方がＤＧＳの作業効率は上がるのだろうか。上記の試算をもとに、ＤＧＳにおいて片端リピートタグを重視したタグ精製を行った場合の作業効率について検討した結果を図２６に示す。
【０１１７】
現時点では、コンカテマー作製のボトルネックとなるのがコンカテマーのサイズなのか、もしくはコンカテマーに含まれるタグの数なのかが判然としていないため、その両方のケースを想定して試算を行った。図２６において、常に５００ｂｐ以上のコンカテマーが得られる状態を想定した結果が上段の表に、一方常に５タグのコンカテマーを得られる状態を想定した結果が下段の表に示されている。
【０１１８】
これによると、常に５００ｂｐ以上のコンカテマーを作れる状況では、有効タグを利用する場合であっても非リピートタグのみを利用する場合であっても、短いタグを分取した方が目標タグ数に到達するのは早いことがわかる。一方、常に５タグのコンカテマーを作れる状況では、有効タグを重視する場合には長い分画を分取した方が早く目標タグ数に到達することがわかる。以上の解析からは、コンカテマーの形成が連結するタグ数によって制限される状況においては、分取するタグサイズを長めに設定した方が有効タグを効率的に取得できると考えられる。
【０１１９】
８．ヴァーチャルタグのユニーク度の検証
次に、リピート配列由来のヴァーチャルタグがゲノム上にユニークにマッピングできない無効なタグとなる確率が高いか否かをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで検証した。解析対象として、２２番染色体からリピート由来と分類されるＭｂｏＩヴァーチャルタグ８０個をランダムにピックアップした。
【０１２０】
内訳は両端および片端リピートタグをそれぞれ４０個（ＳＩＮＥ、ＬＩＮＥ、ＬＴＲ、ＤＮＡトランスポゾン由来を各１０個ずつ）とした。８０個のＭｂｏＩヴァーチャルタグの平均ギャップ長は６０．０ｂｐ、最長で９９ｂｐ、最短で２０ｂｐであった。これらをＢｌａｔ検索にかけてゲノム上へのマッピングを行い、候補としてリストアップされる染色体部位とその数、ミスマッチ塩基数などを記録した。
【０１２１】
図２７は、リピート領域と非リピート領域とにまたがるＭｂｏＩヴァーチャルタグ（片端リピート）を有効タグとみなした場合について説明するための図である。結果の判定においては、ゲノム上の候補部位が２２番染色体上の１箇所にのみ存在し、かつタグの全長が候補部位のゲノム塩基配列と１００％マッチするものを‘ｕｎｉｑｕｅ’と定義した。
【０１２２】
この結果、図２７Ａに示すように、８０個のリピート由来のＭｂｏＩヴァーチャルタグのうち８２．５％がｕｎｉｑｕｅであることがわかった。内訳は、両端リピートが３８．８％、片端リピートが４３．８％であり、片端リピートタグの方がややユニーク度が高い結果となった。
【０１２３】
しかし、Ｂｌａｔ検索においては、上記のｕｎｉｑｕｅの定義に該当するタグであっても１〜２塩基のミスマッチを許すと多数の候補部位が検出されるという現象がしばしば認められた（このようなタグを‘ｆｉｎｅ  ｕｎｉｑｕｅ’と定義する）。そこでｕｎｉｑｕｅ  タグのうち、ゲノム上の候補部位が当該部位の１候補しか検出されないタグを’ｓｕｐｅｒ  ｕｎｉｑｕｅ’と定義してさらに分類を行った。
【０１２４】
この結果、図２７Ｂに示すようにｓｕｐｅｒ  ｕｎｉｑｕｅなタグは、８０タグ中１４個存在し、内訳は片端リピートタグが１０個（１５．２％）、両端リピートタグが４個（６．１％）であり、片端リピートタグはユニーク度が高いことが示唆された。
【０１２５】
以上の結果はすでにゲノム上にマップされている配列情報を使用して行ったｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析ではあるが、リピート配列由来のタグであっても塩基配列解析の精度が十分高ければゲノム上の１箇所にマップすることが可能であることを示している。その一方で、やはり片端リピートタグの方がＤＧＳにおいてはより安全に解析を行えるユニーク度の高いタグであると考えられる。
【０１２６】
９．まとめ
本実施の形態のデジタルゲノムスキャニング（ＤＧＳ）法は、ヒトゲノム情報をバックグランドとしてゲノムのコピー数の定量し、異常なコピー数を呈する領域を高い解像度で同定することを目的としている。上述の説明では、ＤＧＳのシステムを確立する上での予備実験をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏの両面から行った。
【０１２７】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析では、制限酵素ＭｂｏＩを用いた場合のヴァーチャルタグの解析を出発点としてモンテカルロシミュレーションを行い、増幅や欠失といったコピー数異常の検出のために必要な解析タグ数を予測することができた。
【０１２８】
より詳細には、解析タグ数を増やせばＤＧＳの解像度があがることにくわえて、あるヴァーチャルタグ数が設定された状態でどの程度の規模で生のタグ解析をするべきかという問題に対して、エンドポイントを示すことができた。
【０１２９】
一方、約５割を占める反復配列に由来するタグの存在に着目し、実験レベルで排除可能であるか否かの検討を行った。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析の結果では、リピート由来の配列であってもゲノムにマッピングされるものが少なくなく、また片端リピートの有効性が示唆された。これをＤＧＳのどの操作ステップに反映し、効率よく有効なタグのデータを取得していけば、得られるデータの信頼性が向上する。
【０１３０】
よって、上述のデジタルゲノムスキャニング法の基盤を確立するための予備的検討によって、１）ヒトゲノム情報のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析によって、制限酵素ＭｂｏＩによって３０塩基幅のタグを分取すると１６．５万個の非リピート配列由来のヴァーチャルタグが得られること、２）モンテカルロシミュレーションにより、１万タグの解析によって５倍の遺伝子増幅は１．３４Ｍｂの解像度で検出が可能であること、３）リピート配列由来のタグであってもゲノム上にユニークにマップできるものがあること、が理解できる。
【０１３１】
図２８は、対照タグデータ生成装置２００の動作を説明するためのフローチャートである。対照タグデータ生成装置２００では、一連のフローがスタートすると、まず、対照ゲノムＤＮＡ配列データ取得部７０６が、対照ゲノムＤＮＡ配列データを取得し（Ｓ４０２）、対照ゲノムＤＮＡ配列データ記憶部７０８に格納する。
【０１３２】
次に、上述の予備的検討の結果に基づいて、切断部位検索部７１０は、制限酵素（例えばＭｂｏＩ）を選択する（Ｓ４０４）。そして、切断部位検索部７１０は、対照ゲノムＤＮＡ配列データ記憶部７０８から対照ゲノムＤＮＡ配列データを取得し、制限酵素（例えばＭｂｏＩ）の切断部位を検索して（Ｓ４０６）、切断部位で対照ゲノムＤＮＡ配列を切断する。また、切断部位検索部７１０は、切断して生成した複数のＤＮＡ配列を切断ＤＮＡ配列記憶部７１２に格納する。
【０１３３】
続いて、対照タグ選択部７１４は、切断ＤＮＡ配列記憶部７１２から複数のＤＮＡ配列を取得し、それぞれのＤＮＡ配列が所定の範囲内の塩基数のＤＮＡ配列からなるか判定する（Ｓ４０８）。そして、対照タグ選択部７１４は、これらのＤＮＡ配列の中から、所定の範囲内の塩基数・ユニーク度のＤＮＡ配列からなる対照タグを選択する（Ｓ４１０）。一方、対照タグ選択部７１４は、これらのＤＮＡ配列の中でも、所定の範囲外の塩基数・ユニーク度のＤＮＡ配列からなる対照タグは選択しない（Ｓ４１２）。
【０１３４】
さらに、このとき、それぞれ対照ゲノムＤＮＡ配列に含まれる個数が所定数以下（例えば１個以下）であるユニーク度の高いＤＮＡ配列からなる対照タグをユニーク度が所定の範囲内であるとして選択するように構成することもできる。また、対照タグ選択部７１４は、選択した複数の対照タグを選択タグ記憶部７１６に格納する。
【０１３５】
そして、関連付部７１８は、選択タグ記憶部７１６から所定の範囲内の塩基数のＤＮＡ配列からなる複数の対照タグを取得し、対照ゲノムＤＮＡ配列データの対応する位置と関連付けて（Ｓ４１４）、対照タグデータを生成する。また、関連付部７１８は、生成した対照タグデータを対照タグデータ記憶部７２０に格納する。
【０１３６】
さらに、出力部７２２は、対照タグデータ記憶部７２０から対照タグデータを取得し、ＤＮＡ配列解析装置１００に出力し（Ｓ４１６）、一連のフローを終了する。
【０１３７】
以下、本実施の形態の対照タグデータ生成装置２００の利点について説明する。
対照タグデータ生成装置２００によれば、リピート配列か非リピート配列かにより対照タグを選択せず、対照ゲノムＤＮＡ配列に含まれる個数が所定数以下（例えば１個以下）であるユニーク度の高い対照タグを選択し得るため、対照ゲノムＤＮＡ配列から得られる対照タグを有効に活用でき、得られるデータの信頼性を向上することができる。
【０１３８】
また、対照タグデータ生成装置２００によれば、ヒトゲノムＤＮＡの切断に利用する制限酵素と抽出するタグ配列のサイズの組み合わせによって、適した制限酵素を変更して用いることができる。すなわち、全ゲノムレベルのＤＮＡ量の変化を高解像度で検出する目標達成のため、「デジタルゲノムスキャニング法」の感度と特異性を高くするにはいくつかのパラメーターを最適にする必要がある。本発明者らはすでに、ヒトゲノムＤＮＡの切断に利用する制限酵素と抽出するタグ配列のサイズの組み合わせによって、検出できる変異の最小領域が決定されることを、全ゲノム情報を用いたコンピュータシミュレーションにより明らかにしている。
【０１３９】
例えば、制限酵素：ＥｃｏＲＩ（６塩基認識酵素）とタグ配列サイズ：２０−２５塩基対の組み合わせでは、タグ配列の間隔は２００ｋｂから２０Ｍｂの範囲で、平均２Ｍｂの間隔で存在する。また、制限酵素：ＭｂｏＩ（４塩基認識酵素）とタグ配列サイズ：２０−３０塩基対の組み合わせでは、タグ配列の間隔は１０ｂｐから４６０ｋｂの範囲で平均２０ｋｂの高密度の間隔で存在している。そのため、対照タグデータ生成装置２００によれば、目的とする解像度に応じて、多種多様な制限酵素のうちから最適の制限酵素を選択することが可能である。
【０１４０】
また、このタグ配列はその由来するヒトゲノム上の位置情報を有しており、データベース化した後は即座に染色体上にマップできる。それゆえ、各染色体のタグ配列数を積算することにより高精度なＤＮＡ量の定量化に利用できる。具体的には、対照タグデータ生成装置２００によれば、上述の説明にあるように、ヒトゲノムＤＮＡ配列から対照タグを得るのに適したＭｂｏＩ制限酵素を用いるため、解析対象タグデータとの対応に適した対照タグデータを生成することができ、ＤＮＡ配列解析の信頼性および効率が向上する。
【０１４１】
さらに、対照タグデータ生成装置２００によれば、対照タグデータを生成する際に、選択された複数の対照タグをそれぞれ対照ゲノムＤＮＡ配列中の対応する位置に関連付けるため、対照タグデータ中には、対照ゲノムＤＮＡ配列の位置情報と選択された対照タグデータのシークエンスデータとを含めておけば足りる。そのため、ヒトゲノムＤＮＡ配列全体のシークエンスを直接に解析対象タグデータと対応付けする場合に比べて、ＤＮＡ配列解析装置１００の処理負荷を軽減できる。
【０１４２】
ここで、タグ生成に実際に用いる”最適”な制限酵素を選択するためには、全ゲノムデータと多数の制限酵素を網羅した詳細なシミュレーションが必要あるため、大きなコンピュータ処理能力が要求される。これに対しては、対照タグデータ生成装置２００によれば、本発明者らが以前から取り組んできたパラレルコンピューティング技術を用いることで処理を高速化することが可能である。また、アルゴリズムにはニューラルネットワークを用いることで従来のコンピュータ処理や統計的手法より的確な結果を得うるシステムを構築し得る。
【０１４３】
また、解析したい目的の細胞のゲノムから抽出するタグ配列の数であるが、例えば、１００、０００タグ配列のシークエン解析から、１００ｋｂ以上の増幅領域（１０倍程度）、６００ｋｂ以上のホモ欠失領域、４Ｍｂ以上の染色体コピー数変化（ｎ＝１ｏｒ３）を検出できることが、モンテカルロシミレーションによって裏づけられている。
【０１４４】
＜３．解析対象タグデータの生成＞
図２９は、解析対象タグデータ生成装置３００の内部構成を説明するための機能ブロック図である。解析対象タグデータ生成装置３００は、ヒトなどの所定の生物種のゲノムＤＮＡ分子である解析対象ＤＮＡ分子をアプライするための解析対象ＤＮＡ分子アプライ部８０２を備える。一方、解析対象タグデータ生成装置３００は、解析対象ＤＮＡ分子を切断するための制限酵素（ＭｂｏＩなど）をアプライするための制限酵素アプライ部８０４を備える。
【０１４５】
また、解析対象タグデータ生成装置３００は、解析対象ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を制限酵素（ＭｂｏＩなど）により切断するための制限酵素処理部８０６を備える。さらに、解析対象タグデータ生成装置３００は、切断された複数のＤＮＡ断片を分離するための電気泳動部８０８を備える。そして、解析対象タグデータ生成装置３００は、ＤＮＡ分子を制限酵素により切断してなる複数のＤＮＡ断片のうち、所定の範囲の塩基数からなるＤＮＡ断片を抽出するためのＤＮＡ断片抽出部８１０を備える。
【０１４６】
また、解析対象タグデータ生成装置３００は、ＤＮＡ断片抽出部８１０により抽出された複数のＤＮＡ断片を連結してなるコンカテマーを生成するコンカテマー生成部８１２を備える。さらに、解析対象タグデータ生成装置３００は、コンカテマー生成部８１２により生成されるコンカテマーを複数連結してなる２次コンカテマーを生成する２次コンカテマー生成部８１４を備える。
【０１４７】
また、解析対象タグデータ生成装置３００は、２次コンカテマーのＤＮＡ配列をシークエンスするシークエンス部８１６を備える。さらに、解析対象タグデータ生成装置３００は、シークエンス部８１６によるシークエンス結果を格納するシークエンス結果記憶部８１８を備える。
【０１４８】
また、解析対象タグデータ生成装置３００は、シークエンス結果記憶部８１８から取得したシークエンス結果に基づいて複数の解析対象タグの集合である解析対象タグデータを生成する解析対象タグデータ生成部８２０を備える。さらに、解析対象タグデータ生成装置３００は、解析対象タグデータ生成部８２０が生成した解析対象タグデータを記憶する解析対象タグデータ記憶部８２２を備える。
【０１４９】
そして、解析対象タグデータ生成装置３００は、解析対象タグデータ記憶部８２２から解析対象タグデータを取得して、ＤＮＡ配列解析装置３００に出力する出力部８２４を備える。
【０１５０】
以下、上述の解析対象タグデータ生成装置３００による解析対象ゲノムＤＮＡ分子からの解析対象タグデータの生成について詳細に説明する。
【０１５１】
１．ＤＧＳタグの作製とタグデータの取得
まず、ＤＧＳタグの作製とタグデータの取得について説明する。まず、ヒトゲノムＤＮＡ分子として、胃癌細胞株ＨＳＣ４５よりゲノムＤＮＡを抽出した。次いで、２０〜４０ｕｇのゲノムＤＮＡを制限酵素ＭｂｏＩで３７℃、１６時間処理し、３％Ｎｕｓｉｅｖｅアガロース電気泳動を行った。そして、約３０〜６０塩基の範囲をゲルから切り出し、Ｇｅｌａｓｅ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）でゲルを溶解後にエタノール沈殿にてタグＤＮＡを精製した。
【０１５２】
このとき、コンカテマーのクローニングベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＢａｍＨＩ制限酵素処理後、アルカリフォスファターゼ処理をしてクローニングに用いた。なお、Ｔａｋａｒａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ２．１を用いてタグからコンカテマーを作製しベクターにクローニングした。
【０１５３】
そして、エレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ１０Ｂにベクターを導入し、Ｘ−ｇａｌを用いたカラーセレクション法により陽性コロニーを選択した。各コロニーはアンピシリン含有ＬＢ培地で培養後、自動核酸抽出器（ＫＵＲＡＢＯならびにＱＩＡＧＥＮ）にてベクターＤＮＡを精製し、ＲＮａｓｅ処理後に解析を行った。
【０１５４】
インサートの確認は、ＸｈｏＩおよびＳａｃＩの２重処理にて行った。コンカテマーを含むベクターに対してのシークエンス反応にはプライマーはＴ３、Ｔ７を使用し、ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔならびにＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。産物の塩基配列解析にはＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いた。
【０１５５】
２．胃癌細胞株のゲノムＤＮＡを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ予備実験
図３０は、タグＤＮＡの抽出とコンカテマーの作製を説明するための図である。より詳細には、タグＤＮＡの抽出とコンカテマー作製胃癌細胞株ＨＳＣ４５から抽出した実際のヒトゲノムＤＮＡを用いて、ＤＧＳの予備実験を行った。ＨＳＣ４５から抽出したゲノムＤＮＡをＭｂｏＩで制限酵素処理し、３％Ｎｕｓｉｅｖｅゲルにおいて電気泳動した結果を図３０Ａに示す。
【０１５６】
ＤＧＳに有用なタグＤＮＡが存在すると考えられる１００ｂｐ以下においてもスメアが確認されたが、４０ｂｐ付近に明瞭なバンドが存在することがわかった。これは上述のＭｂｏＩヴァーチャルタグ解析で判明した３６、３７塩基ギャップ長の、数が突出して多い（しかもリピート由来の比率が高い）タグ集団を反映したバンドであると推測された。１００ｂｐ以下におけるフラグメントサイズの正確な判断は難しいため、その４０ｂｐ付近のバンドを指標として、そのバンドより長いフラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＃３）、そのバンドを含むフラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＃４）、それより短いフラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＃５）に分けてゲルを切り出し、タグＤＮＡを精製した。
【０１５７】
次に、得られたタグをライゲーションにより連結してコンカテマーを作製し、それをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターに導入してクローニングを試みた。当初はベクターに導入されるタグはせいぜい１個であったのに対し、タグ濃度を濃くすることによってコンカテマーの延長効率が改善され、３〜５タグがつながったコンカテマーを得ることができるようになった（図３０Ｂ）。
【０１５８】
代表的なコンカテマーの塩基配列をもとに作製した制限酵素マップを図３０Ｃに示す。このコンカテマーは５個のタグから構成されている。コンカテマーはｆｒａｃｔｉｏｎ  ＃３由来のタグから作製されたもので、実際の各タグのサイズは４３〜５２ｂｐであった。それぞれのタグをＢｌａｔ検索により染色体上にマッピングしたところ、各タグは図３０Ｃに示すように１番、６番、１１番、Ｘ染色体というように異なる染色体から由来しているものであることが確認された。また、コンカテマーにはＳＩＮＥ由来のリピートタグが１個含まれていた。
【０１５９】
３．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ予備実験で得られたタグの解析
上述の実験で得られたコンカテマー配列はＭｂｏＩ部位でタグに切り分け、切り分けたタグの両端にＭｂｏＩ配列ＧＡＴＣを付加した後にＢｌａｔ検索を行いゲノム上へマッピングした。この際に配列のユニークさやリピート配列か否かの解析も行った。
【０１６０】
図３１は、予備実験で用いたタグの塩基配列を解析し集計した結果を示すグラフである。次に、予備実験として合計８１タグの塩基配列を解析し集計した（図３１）。全タグのサイズ別分布、ならびにリピート／非リピート由来の比は図３１Ａに示すとおりで、タグのギャップ長は２５〜５８ｂｐの間を示し、８１タグ中３８タグ（４６．９％）が非リピート配列由来のタグであった。
【０１６１】
電気泳動後にサイズで分取したタグ分画、すなわちｆｒａｃｔｉｏｎ  ＃３、４、５のサイズの内訳は図３１Ｂ示す結果となった。各フラクションのタグサイズのピークは電気泳動のゲル上のサイズ位置にほぼ一致しているが、それぞれのフラクションが必ずしも排他的にサイズで分画されているわけではないことがわかった。
【０１６２】
それぞれのフラクションにおける非リピート率も約４５％であり、ヴァーチャルタグ解析で事前に予測した結果とほぼ一致した（図３１Ｃ）。Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＃４はリピート率が高くなると事前に予想されたが、サイズ分画が完全でないためか突出して高いリピート率は認められなかった。
【０１６３】
４．タグの塩基配列解析とゲノムマッピング
コンカテマー塩基配列のアライメント、制限酵素部位の解析には、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ  ７．２．２とＡｓｓｅｍｂｌｙ  ＬＩＧＮ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）ならびにＣｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ  ７  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｓｕｉｔｅ（Ｓｃｉ  Ｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ）を用いた。
【０１６４】
コンカテマーは、Ｔ３、Ｔ７プライマーを用いて２方向から塩基配列を解析し２つのデータのアライメントを作成した後に、両データにおいて合致する部分をコンカテマー配列として抜きだした。ＭｂｏＩ部位でコンカテマーの塩基配列をタグに切り分け、切り分けたタグの両端にＭｂｏＩ配列ＧＡＴＣを付加した後にＢｌａｔ検索を行い、ゲノム上へマッピングすると同時に、配列のユニークさやリピート配列か否かの分類を行った。各タグのゲノムマッピングならびにリピートクラスの分類にはＨｕｍａｎ  ＢＬＡＴ  Ｓｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＢｌａｔ）およびｂｌａｓｔｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）を使用した。
【０１６５】
そして、次に、すでに前述したように、得られた非リピートタグからなる解析対象タグデータと対照タグデータとを対応付けし、コピー数の判定を行ってこれらの解析対象タグデータをゲノム上にマップし染色体中の各領域別に集計した。
【０１６６】
一方、得られたタグ数は染色体中の各領域の長さ、言い換えれば染色体中の各領域に存在するヴァーチャルタグ数に比例すると考えられるため、タグの実数を染色体中の各領域のヴァーチャルタグ数もしくは染色体中の各領域長で除してタグ密度として表した）。すると、染色体中の領域ごとにタグ密度のばらつきが見られた（不図示）。
【０１６７】
５．まとめ
図３２は、解析対象タグデータ生成装置３００の動作の流れについて説明するための概念図である。上述の説明をまとめると、解析対象タグデータ生成装置３００は、以下のステップを順に行う。
【０１６８】
まず。ゲノムＤＮＡを抽出し、４０〜８０ｕｇを制限酵素ＭｂｏＩで切断する。
次に、３％Ｎｕｓｉｅｖｅアガロース電気泳動にて３０〜６０ｂｐのＤＮＡ断片をタグとして回収する。
次に、タグの連結したコンカテマーを作製する（１ｓｔ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）。
次に、コンカテマーをＢａｍＨＩ処理ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋ベクターに導入する（２ｎｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）。
次に、大腸菌にベクターを導入し、クローンをまとめて回収し、ベクターＤＮＡを精製する（１次ライブラリー）。
次に、１次ライブラリーベクターをＳｐｅＩ、ＰｓｔＩ制限酵素で処理し、コンカテマー配列を抜き出す。
次に、コンカテマーの再延長：抜き出したコンカテマー同士をライゲーションする（３ｒｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）。
次に、再延長したコンカテマーをＰｓｔＩ  ａｎｄ／ｏｒ  ＳｐｅＩ処理ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋ベクターに導入する（４ｔｈ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）。
次に、大腸菌にベクターを導入し、クローンを個別に回収し、コンカテマーの塩基配列を解析する。
次に、タグデータを得て、ゲノム上にマッピングし、タグの個数を集計する。
次に、得られたタグの個数からタグ密度を解析し、ゲノム上のコピー数の増減を検索する。
【０１６９】
図３３は、コンカテマーの再延長について説明するための概念図である。実際の解析においては、解析対象タグデータ生成装置３００は、タグを連結しコンカテマーを作製し、それを塩基配列解析に用いる。ただし、通常のライゲーションでは長いコンカテマーを作製することは困難である。ＤＧＳにおいては、コンカテマーの再延長という２段階のステップを踏むプロトコールを開発し、長いコンカテマーの作製に成功している。そして、これにより、塩基配列解析の効率をあげている。
【０１７０】
また、これまでの類似するゲノム定量の手法においてはタグの作製過程でＰＣＲによる増幅を行っているが、解析対象タグデータ生成装置３００を用いるＤＧＳでは、ＰＣＲを一切用いずより正確な定量が可能である。そのため、得られるデータの信頼性が高いという利点がある。
【０１７１】
図３４は、コンカテマー構造の把握方法を説明するための制限酵素地図である。このように、上述の方法で解析されるコンカテマーの塩基配列に基づけば、コンカテマー構造の把握をするうえで、制限酵素部位の並びだけから判断して、図３４のような配列構造であると推定できる。
【０１７２】
図３５は、コンカテマー構造の把握方法を説明するためのＤＮＡ配列のシークエンス地図である。図３６は、図３５のシークエンス地図からベクター配列を除去した場合のシークエンス地図である。図３７は、図３６のシークエンス地図からタグを切り出す様子を説明するためのシークエンス地図である。このように、コンカテマーを含む領域全体をシークエンスし、さらにシークエンス地図からベクター配列を除去して、残ったシークエンス地図からタグの配列情報を切り出すため、一度のシークエンスで多数の解析対象タグのＤＮＡ配列を解析でき、解析対象タグのシークエンスの効率が向上する。
【０１７３】
図３８は、解析対象タグデータ生成装置３００の動作を説明するためのフローチャートである。解析対象タグデータ生成装置３００では、一連のフローがスタートすると、チューブなどのような解析対象ＤＮＡ分子アプライ部８０２に、ヒトなどの所定の生物種のゲノムＤＮＡ分子がアプライされる（Ｓ５０２）。一方、チューブなどのような制限酵素アプライ部８０４に、ＭｂｏＩなどの適当な制限酵素がアプライされる（Ｓ５０４）。そして、制限酵素キットなどのような制限酵素処理部８０６において、解析対象ＤＮＡ分子および制限酵素は接触し、適切な環境でインキュベートされることにより、制限酵素処理が行われる（Ｓ５０６）。
【０１７４】
制限酵素処理により制限酵素切断部位において切断されたゲノムＤＮＡ分子は、複数のＤＮＡ断片に分離する。これらの複数のＤＮＡ断片は、電気泳動槽などの電気泳動部８０８により電気泳動されることにより、塩基数の長さごとに分離される（Ｓ５０８）。電気泳動によりサイズごとに分離された複数のＤＮＡ断片のうち、所定の範囲内の塩基数のＤＮＡ断片が、ＤＮＡ抽出キットなどのようなＤＮＡ断片抽出部８１０により、電気泳動のアガロースゲルから切り出されてミニプレップ法などにより抽出される（Ｓ５１０）。
【０１７５】
次いで、ライゲーションキットなどのようなコンカテマー生成部８１２は、こうして得られた所定の範囲内の塩基数のＤＮＡ断片は、互いに連結されてコンカテマーを生成する（Ｓ５１２）。さらに、複数のＤＮＡ断片を連結してなるコンカテマーは、プラスミドなどのベクターのマルチクローニングサイトなどに連結されてコンカテマー含有ベクターを生成する。このコンカテマー含有ベクターは、大腸菌に導入して形質転換され、この大腸菌が培養されることによりコンカテマー含有ベクターが増幅される。そして、培養された大腸菌からコンカテマー含有ベクターがミニプレップ法などにより抽出される。
【０１７６】
こうして、ライゲーションキットなどのような２次コンカテマー生成部８１４は、一旦ベクターに連結してベクターの宿主を培養することにより増幅されたコンカテマーをさらに複数連結して、２次コンカテマーを生成する（Ｓ５１４）。そして、この２次コンカテマーのＤＮＡ配列について、ＤＮＡシークエンサーなどのシークエンス部８１６を用いてシークエンスする（Ｓ５１６）。また、シークエンス部８１６は、生成したシークエンス結果をシークエンス結果記憶部８２０に格納する。
【０１７７】
そして、解析対象タグデータ生成部８２０は、シークエンス結果記憶部８２０からシークエンス結果を取得し、これらのＤＮＡ断片のうち所定の範囲内の塩基数のＤＮＡ断片のシークエンス結果に基づいて、解析対象タグデータを生成する（Ｓ５１８）。さらに、解析対象タグデータ生成部８２０は、生成した解析対象タグデータを解析対象タグデータ記憶部８２２に格納する。
【０１７８】
そして、出力部８２４が、解析対象タグデータ記憶部８２２から解析対象タグデータを取得し、ＤＮＡ配列解析装置１００に出力して（Ｓ５２０）、一連のフローが終了する。
【０１７９】
以下、解析対象タグデータ生成装置３００の利点について説明する。
解析対象タグデータ生成装置３００を用いることにより、ＤＧＳでは、４塩基認識制限酵素ＭｂｏＩなどの目的に適した制限酵素によってゲノムを切断後、ＭｂｏＩの場合には約３０〜８０ｂｐの断片を集めてタグとしてカウントし、ゲノムのコピー数を解析することができる。そのため、得られるデータの信頼性およびデータの取得効率が向上する。
【０１８０】
また、ＣＧＨに代表されるＤＮＡハイブリダイゼーションに基づく解析法では、事前にｈＣｏｔ−１  ＤＮＡを使用し、分子生物学的手法で反復配列をサンプルから除去している。これは、ゲノムの約４５％を占める反復配列を含む領域の情報を捨てることを意味する。一方、解析対象タグデータ生成装置３００を用いるＤＧＳにおいては、所定の範囲内の塩基数であれば、すべての解析対象タグの配列データを取得するため、全ゲノム領域のうち反復配列を含む幅広い箇所のコピー数異常を解析できる。そのため、ヒトゲノムＤＮＡの短い断片の定量的解析に基づき網羅的にヒトゲノムＤＮＡ量を高解像度かつ高精度に調べる方法として、デジタルゲノムスキャニング法（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ、以下ＤＧＳ）を行う場合に、ＤＧＳによるコピー数異常の解析の精度が向上する。
【０１８１】
また、ＤＧＳの作業速度は、解析対象タグの塩基配列データをいかに高速に取得するかに依存している。シークエンス解析は、通常の分析機器を用いると、１９６サンプルの解析にほぼ２４時間を要する。この前提にたつと、本発明者らのシミュレーションでは、１．３Ｍｂｐの増幅領域を同定するのに１万タグの解析が必要という結果が出ている。すると、１万タグをゴールとした場合、１サンプルに１タグしか含まれなければ５１日間を要するが、１サンプルに１０タグ含まれていれば５日間で目標に到達することができ、現実のシステムとして活用できることが期待される。
【０１８２】
このとき、解析対象タグを連結したコンカテマーの作製については、ＤＮＡ濃度、温度設定、反応時間など様々な条件検討を行ったが、一度のライゲーションでつながるタグ数は平均すると２〜３タグであり、容易には長いコンカテマーを調整できなかった。コンカテマーの長さの分布を電気泳動で確認すると、１タグのみのコンカテマーとが最も多く、バンドとして目視で確認された。その一方、電気泳動上は確認できない量で長いコンカテマーも存在しているだろうと考えられる。
【０１８３】
そこで、本発明者らは、長いコンカテマーを集め、さらにコンカテマー同士を再度つなぎ合わせればより長いコンカテマーを得ることができると予測した（コンカテマーの再延長）。そして、これは上述したようなステップによる実験手法により可能であることが実験で確認できた。すなわち、一回のステップのコンカテマー生成ステップで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験によって、３〜５個の異なる染色体由来のタグがつらなったコンカテマーを形成できるということが明らかになった。そして、このコンカテマー生成ステップを２階繰り返せば、これまでの予備実験で平均約７タグのコンカテマーを得ることができることがわかり、ＤＧＳにおける解析対象タグデータの生成時間に関する課題を克服できた。
【０１８４】
すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析では、ＤＧＳの出発点となるタグの精製とコンカテマーの形成が最も重要でかつ困難なステップであることが明らかとなった。一つのコンカテマーに何個のタグをつなげるかはＤＧＳ終了までの作業時間と経費を大きく左右するため、今後最も力を注いで効率の改善を目指す必要がある課題と考えられる。また、得られたタグ配列の解析は単純な作業ではあるが、大量のデータを処理するには自動化が必須である。この点に関しては、タグデータベースの構築と並行して、タグデータの解析の自動化を行うことにより解決される。
【０１８５】
一方、ＳＡＧＥ法（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）の原理を微生物ゲノムＤＮＡに応用したＧＳＴ法（ｇｅｎｏｍｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｔａｇｓ）が報告されているが、実験プロセスが煩雑でＰＣＲに起因するバイアスが生じるので、複雑性の高いヒトゲノムでは高精度の定量性ある結果を得るのは困難であった。
【０１８６】
これに対して、解析対象タグデータ生成装置３００を用いれば、上述の説明のように、ＰＣＲを行うことなしに、２次コンカテマーを生成可能であるため、実験プロセスが容易でＰＣＲに起因するバイアスが生じにくいので、複雑性の高いヒトゲノムでも高精度の定量性ある結果を得ることができる。
【０１８７】
＜その他の変形例＞
以下、上記の実施形態の変形例について、上記の説明とは別の観点から説明する。
図３９は、タグ自動解析の流れについて説明するための概念図である。上述の図１で示したデジタルゲノムスキャニングにおいて、タグ自動解析を行った場合のデータの流れの変形例について詳しく説明する。
【０１８８】
まず、生データの処理：タグデータの切り出しのステップについて説明する。ここでは、コンカテマーのＤＮＡ配列をシークエンスする際に、２方向でシークエンスをした場合には、両方向から読み取った配列のアライメントを作成する。次いで、アライメントを作成したこれらのＤＮＡ配列中における制限酵素部位を洗い出す。そして、これらのＤＮＡ配列中におけるコンカテマー構造を把握する。そして、これらのＤＮＡ配列中からベクター配列を除去し、それぞれのタグ配列を切り出す。
【０１８９】
次いで、タグのマッピングと判定、結果の管理のステップについて説明する。まず、タグのマッピングと判定のステップにおいては、上述のようにして得られた生データ由来のタグ配列を、ヴァーチャルタグデータベースに照合する。
【０１９０】
続いて、結果の管理のステップでは、上述のタグのマッピングと判定のステップで得られた結果に基づいて、ベクター単位のデータを集計し、コンカテマーの状態、タグ数、エラー理由を解析し、再解析に利用できる、実験条件の検討に再利用できるようなデータを取得する。このようなデータを集計することにより、コンカテマーの重複をチェックすることもできる。
【０１９１】
また、結果の管理のステップでは、タグ単位のデータの集計も行う。すなわち、ヴァーチャルタグごとの得票数を集計する。そして、この集計結果に基づいて、タグ単位のデータの解析と可視化を行う。このとき、ウインドウサイズや閾値を振るダイナミックな解析可視化を行うことができる（例えばタグ密度ヒストグラムやグリッド表示など）。このような可視化されたタグ単位のデータを参照することにより、ゲノムＤＮＡ配列の各領域における重複・欠失などの染色体異常を容易に発見できる。
【０１９２】
例えば、タグ密度ヒストグラムを用いる場合には、解析対象ゲノムＤＮＡ配列の所定の領域における生タグ（解析対象タグ）の総数を、対照ゲノムＤＮＡ配列の対応する領域におけるヴァーチャルタグ（対照タグ）の総数で除してなるタグ密度を判定することができる。この場合には、ウインドウサイズとは、タグ密度を計算する際の分母のヴァーチャルタグの数（密度計算時のゲノム領域の広さに相当する）を意味する。
【０１９３】
図４０は、タグを分類していく流れについて説明するための概念図である。タグの分類とは、タグごとに所定の寄与度を設定する操作に相当する。なお、この図で示すタグの分類方法は、一変形例であり、他にも多様なタグの分類方法があり得る。
【０１９４】
この図の例では、まず、最初のステップで、生タグ（解析対象タグ）の全長が１種類のＶタグ（ヴァーチャルタグ：対照タグ）全長に１００％マッチするか判定する。１種類のＶタグ全長に１００％マッチするのであれば、その生タグに判定コード０（例えば、寄与度１）を振った上で、そのＶタグに一票を投票する。一方、１種類のＶタグ全長に１００％マッチしない場合には、次のステップに進む。
【０１９５】
次のステップでは、生タグの長さが、ＶＴ−ＤＢ（ヴァーチャルタグデータベース）中に収載しているタグ長の範囲を超えているか判定する。ＶＴ−ＤＢ中に収載しているタグ長の範囲を超えている場合には、生タグの切り出し方が悪い、もしくはＶＴ−ＤＢ収載タグサイズの設定に問題があると判定し、その生タグに判定コード１（例えば、寄与度０）を振り、投票はしない。一方、ＶＴ−ＤＢ中に収載しているタグ長の範囲を超えていない場合には、次のステップに進む。
【０１９６】
次のステップでは、生タグが２種類以上のＶタグに全長１００％マッチしてしまうか判定する。２種類以上のＶタグに全長１００％マッチする場合には、生タグはリピート由来であると判定し、その生タグに判定コード２（例えば、寄与度０）を振り、投票はしない。一方、２種類以上のＶタグに全長１００％マッチしない場合には、次のステップに進む。
【０１９７】
次のステップでは、生タグに対して、１〜３塩基（もしくは１０％未満）のミスマッチのＶタグが１種類だけ存在するか判定する。１〜３塩基（もしくは１０％未満）のミスマッチのＶタグが１種類だけ存在する場合には、生タグのシークエンスエラーまたはＳＮＰｓタグである可能性が高いと判定し、生タグを再投票へまわし、その生タグに判定コード３を振る。一方、１〜３塩基（もしくは１０％未満）のミスマッチのＶタグが１種類だけ存在しない場合には、次のステップに進む。
【０１９８】
次のステップでは、生タグに対して、１〜３塩基（もしくは１０％未満）のミスマッチのＶタグが２種類以上存在するか判定する。１〜３塩基（もしくは１０％未満）のミスマッチのＶタグが２種類だけ存在する場合には、リピート由来のタグであると判定し、その生タグに判定コード４（例えば、寄与度０）を振り、投票はしない。一方、１〜３塩基（もしくは１０％未満）のミスマッチのＶタグが２種類以上存在しない場合には、次のステップに進む。
【０１９９】
次のステップでは、生タグの一端もしくは両端がＳｐｅＩ（ＡＣＴＡＧＴ）もしくはＰｓｔＩ（ＣＴＧＣＡＧ）であるか判定する。一端もしくは両端がＳｐｅＩもしくはＰｓｔＩである場合には、生タグの全長が、１種類のＶタグの一部に１００％マッチするか判定するステップに進む。一方、一端もしくは両端がＳｐｅＩもしくはＰｓｔＩでない場合には、何由来のＤＮＡ配列か判定するステップに進む。
【０２００】
何由来のＤＮＡ配列か判定するステップでは、その生タグに判定コード１０（例えば、寄与度０）を振った上で、投票はせず、Ｂｌａｓｔという名のアルゴリズムを用いてヒトゲノム由来の配列とホモロジーが高いか否か判定する。この場合、４塩基（１０％）以上のミスマッチがある場合には、ヒトゲノム由来の配列ではないと判定し、大腸菌、ミトコンドリア、ベクター（事前に除去していればありえないが）、それ以外の多様な生物種のゲノムとのホモロジーをサーチして、ＤＮＡ配列の起源を判定する。
【０２０１】
生タグの全長が、１種類のＶタグの一部に１００％マッチするか判定するステップでは、１００％マッチする場合には、その生タグは、コンカテマー切り出しの過程で切れたタグであると判定され、再投票に回され、その生タグに判定コード５（例えば、寄与度０）を振る。一方、１種類のＶタグの一部に１００％マッチしない場合には、次のステップに進む。
【０２０２】
次のステップでは、生タグの全長が２種類以上のＶタグの一部に１００％マッチするか判定する。生タグの全長が２種類以上のＶタグの一部に１００％マッチする場合には、その生タグは、リピート配列であると判定して、その生タグに判定コード６（例えば、寄与度０）を振り、投票はしない。一方、生タグの全長が２種類以上のＶタグの一部に１００％マッチしない場合には、次のステップに進む。
【０２０３】
次のステップでは、生タグが１〜３塩基のミスマッチで１種類のＶタグの一部にマッチするか判定する。１〜３塩基のミスマッチで１種類のＶタグの一部にマッチする場合には、生タグのシークエンスの際にシークエンスエラーがおきているか、ＳＮＰｓタグであると判定し、再投票に回した上で、その生タグに判定コード７（例えば、寄与度０）を振る。一方、１〜３塩基のミスマッチで１種類のＶタグの一部にマッチしない場合には、次のステップに進む。
【０２０４】
次のステップでは、生タグが１〜３塩基のミスマッチで２種類以上のＶタグの一部にマッチするか判定する。１〜３塩基のミスマッチで２種類以上のＶタグの一部にマッチする場合には、その生タグはリピート配列であると判定し、その生タグに判定コード８（例えば、寄与度０）を振り、投票しない。一方、１〜３塩基のミスマッチで２種類以上のＶタグの一部にマッチしない場合には、次のステップに進む。
【０２０５】
次のステップに進むのは、以上のいずれのカテゴリーにも属さなかった生タグであり、これらの生タグには、判定コード９（例えば、寄与度０）を振り、投票しない。
【０２０６】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【０２０７】
例えば、上記実施の形態ではヒトゲノムＤＮＡ配列のコピー数の相違を検出する構成としたが、ヒト以外の多様な生物におけるゲノムＤＮＡ配列のコピー数の相違を検出するために用いてもよい。このようにすれば、医学にくわえて、食品、化学、農林水産業をはじめとする幅広い産業への応用が可能となるという利点が得られる。
【０２０８】
また、上記実施の形態ではヒトゲノムＤＮＡ配列全体を解析の対象としたが、ヒトゲノムＤＮＡ配列全体ではなく、ヒトゲノムＤＮＡ配列の一部である染色体ＤＮＡ配列や、染色体のさらに一部のＤＮＡ配列を解析の対象としてもよい。このようにすれば、ヒトゲノムのうち、領域を絞ってピンポイントで効率のよい研究が可能になる利点がある。
【０２０９】
また、上記実施の形態では、制限酵素としてＭｂｏＩを用いたが、他の制限酵素を用いてもよい。特に、４塩基配列を認識して切断する制限酵素は、得られるヴァーチャルタグの個数が多いため、本実施の形態において好適に用いられる。
【０２１０】
また、上記実施の形態では、一部異なるタグとして、対照タグと解析タグとの間で長さは一致しているがミスマッチがあるタグを想定したが、特に限定するものではない。例えば、実際に生タグを解析してみると、シークエンスエラーのせいで１塩基が抜け落ちていたり、逆に余計な１塩基が入っていたり、ということが起きる場合がある。このような場合に、解析タグの塩基配列中に１塩基または数塩基の挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）および欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）がある場合も、これらのギャップを考慮して一部異なるタグとして取り扱うことができる。こうすることにより、シークエンスエラーによるギャップを考慮することができるため、解析精度を向上させることができる。
【実施例】
【０２１１】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０２１２】
本実施例では、デジタル ゲノム スキャニング法の開発と疾患遺伝子研究への応用について説明する。デジタル ゲノム スキャニング法は、高精度・高解像度な網羅的ヒトゲノムＤＮＡの定量的解析を可能にする技術である。
【０２１３】
本発明者らの考案したデジタルゲノムスキャニング（ＤＧＳ）の原理は、ヒトゲノムの網羅的コピー数の定量を行うために、ゲノムＤＮＡを制限酵素処理して得られる短い断片（以下、これをタグと称する）をゲノムの代表としてカウントし、それをもとにコピー数異常を呈する領域を同定しようするものである。以下、ＤＧＳ法の基盤確立のためのシミュレーションと予備実験、ならびに胃癌細胞株に対するＤＧＳの運用について説明する。
【０２１４】
１．  ヴァーチャルタグのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析
１．１  制限酵素別のヴァーチャルタグ数
ＤＧＳの開始にあたっては、まず、どの制限酵素を用いてゲノムＤＮＡを断片化するかが問題となる。そこで、ヒトの全ゲノムＤＮＡ情報を用いて、コンピュータ上で制限酵素処理を行い生成されるタグ（以下、これをヴァーチャルタグもしくはＶ−ｔａｇと称する）のサイズと数を集計した（図１４）。この結果、６塩基認識の制限酵素では生成されるヴァーチャルタグ数が４塩基認識制限酵素と比較して明らかに少なく不十分であると考えられた。
【０２１５】
４塩基認識酵素のうち、ＭｂｏＩはＤＮＡ配列ＧＡＴＣを認識し切断するため、コンカテマー（タグを数珠つなぎにライゲーションしたもの）のクローニングにはＢａｍＨＩ部位を使用可能である。また、生成されるタグ数も他の酵素との比較において中間的な値を示したことから、以下のシミュレーションにおいてはＭｂｏＩによって生成されるヴァーチャルタグを中心に解析を進めた。
【０２１６】
１．２  ＭｂｏＩヴァーチャルタグのサイズ別分布
まず全ゲノムのＭｂｏＩ処理によって生成されるＤＮＡ断片の内訳をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで解析した。現在明らかになっているヒトゲノム（Ｂｕｉｌｄ３５，ｈｇ１７）の塩基配列を対象とした場合、ＭｂｏＩ断片は合計７，０５６，５６７個生成され、全ＭｂｏＩ断片のうち９５％が１３７７塩基以下であることが明らかとなった。
【０２１７】
このうち、タグギャップ長（ＭｂｏＩタグの両端ＧＡＴＣ，計８塩基を除いたタグの長さ）２０〜８０塩基において、１塩基ごとにほぼ１万〜１．５万個ずつタグが存在することが明らかとなった（図１５）。また各染色体の長さに比例して偏り無くタグが生成されていることがわかった。これらの結果から、短いサイズのＭｂｏＩ制限酵素断片を収集してゲノムの代表とすることは妥当と考えられた。
【０２１８】
分取するタグサイズを制限した場合のヴァーチャルタグ数を解析したところ、４０塩基幅で分取した場合には約５４万個、３０塩基幅で分取した場合には約４２万個のヴァーチャルタグが得られることが明らかとなった（図１８）。
【０２１９】
１．３  リピート配列由来のヴァーチャルタグについての解析
ゲノム上の複数個所に合致する配列をもつタグはゲノム上の存在部位を特定できないため、ＤＧＳではタグとして採用できない。そこで、本発明者らは、リピート配列由来のタグはそのような無効なタグとなる可能性が高いと予想した。そこでヴァーチャルタグのうち、リピート配列由来のタグを集計しその比率を解析した。
【０２２０】
リピート配列データベースに照合した結果、ＭｂｏＩヴァーチャルタグの約６０％が散在性反復配列（ＳＩＮＥ，ＬＩＮＥ，ＬＴＲ，ＤＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に由来するタグであることが明らかとなった（図１８）。タグサイズを制限して集計したところ、３０〜５９ｂｐギャップ長の場合、総タグ数が４２万個であり、そのうちリピート配列由来のタグが２５万個を占め、非リピートタグの数は１６５，８４５個（３９．８％）であることがわかった。
【０２２１】
２．  モンテカルロシミュレーションによるＤＧＳの解像度の予測
モンテカルロシミュレーションという乱数発生を用いた手法により、ＤＧＳで何タグを実際に解析すればどの程度のサイズのゲノムのコピー数異常を検出できるか、ということをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測した。ＤＧＳの解析対象となる遺伝子増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ），遺伝子欠損（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ），ヘテロ接合性の喪失（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ，ＬＯＨ）のシミュレーションをするための乱数発生アルゴリズムを図２０に示す。
【０２２２】
これにより、ヴァーチャルタグ数を前述の１６５，８４５個に設定した場合、５倍の遺伝子増幅を１Ｍｂｐの解像度で検出するには１３８００タグ、遺伝子欠損を１Ｍｂｐの解像度で検出するには４４０００タグ、ＬＯＨを１Ｍｂｐの解像度で検出するには４９５０００タグの解析が必要であることが示された（図２２）。一方解析タグ数を１００００タグに設定した場合、５倍増幅は１．３４Ｍｂｐ、遺伝子欠損は３．７９Ｍｂｐの解像度で検出可能であることが示された。
【０２２３】
３．  胃癌細胞株のゲノムＤＮＡを用いたＤＧＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
３．１  タグＤＮＡの抽出とコンカテマー作製
図４１は、ＨＳＣ４５ゲノムからのタグの精製とコンカテマーの作製とを説明するための電気泳動図である。次に、胃癌細胞株ＨＳＣ４５から抽出したヒトゲノムＤＮＡを用いて、ＤＧＳの予備実験を行った。ＨＳＣ４５のゲノムＤＮＡをＭｂｏＩ制限酵素処理し（図４１Ａ）、得られた短いタグを連結してコンカテマーを作製しクローニングを試みた。
【０２２４】
当初はベクターに導入されるタグはせいぜい１個であったのに対し、ライゲーションを２段階に分け、またタグ濃度を高くすることによってタグの延長効率が改善され、平均約３タグがつながったコンカテマーを得ることができた（図４１Ｂ）。
【０２２５】
ＤＧＳの実現にはさらに長いコンカテマーが必要と考えられたため、コンカテマーの再延長という手法を考案した（図３３）。手順を以下に示す。
【０２２６】
１．一度クローニングしたコンカテマーを含むベクターを１次ライブラリとして精製する。
２．一次ライブラリーベクターからコンカテマーをＰｓｔＩ／ＳｐｅＩで切り出し（図４１Ｃ）、長いコンカテマー同士を再度ライゲーションする（コンカテマーの再延長）。
３．これによって得た二次ライブラリーからクローンを得る、
という手法である。
【０２２７】
これによりコンカテマーの平均長が飛躍的に伸び、１ベクターあたり平均約７タグを得ることが可能となった（図４１Ｄ）。
【０２２８】
３．２  タグの大量解析
上記の二次ライブラリーのひとつ（図４１Ｄ，＃５Ａ）を選択し、８２３クローンを回収し塩基配列解析を行った。得られた配列情報を自動解析プログラムにかけ、ＭｂｏＩで挟まれるタグ配列を抜き出した（こうしてＨＳＣ４５のゲノムＤＮＡから得られたタグ配列を以下、生タグと称する）。
【０２２９】
図４２は、タグのサイズ分布とリピート・ユニーク分類とを示すグラフである。結果として、８２３クローンから５５９３個の生タグを得た。生タグのサイズ分布は図４２Ｃに示すとおりで、最長ギャップ長１１８ｂｐ，最短ギャップ長０ｂｐ，平均２３．８ｂｐであった。
【０２３０】
３．３  ＭｂｏＩヴァーチャルタグデータベースの作成
得られた生タグのゲノム上の位置を特定しタグ数を集積するため、ヴァーチャルタグデータベース（以下、ＶＴ−ＤＢ）の作製を行った。ＶＴ−ＤＢに収載するＭｂｏＩヴァーチャルタグのサイズは１２〜１２２ｂｐギャップ長に設定した。この結果、ＭｂｏＩヴァーチャルタグ（Ｃｈ１〜Ｃｈ２２，Ｘ，Ｙ）１，８５９，９４２個がＶＴ−ＤＢに収載された。
【０２３１】
ＶＴ−ＤＢには各Ｖ−ｔａｇのＩＤ，染色体番号、染色体上の位置、配列情報に加え、リピート由来か否か、さらにユニークか否かの情報も含めた。ユニークの定義は、ゲノム上の１箇所にのみ場所を特定できる、すなわち同じ配列を持つＶ−ｔａｇが他に存在しない、ということである。
【０２３２】
ＤＧＳにおいては、ゲノム上の複数個所にマッチする配列、すなわち非ユニークな生タグは場所の特定ができず無効票として捨てざるを得ない。このためＶＴ−ＤＢ中のすべてのＶ−ｔａｇについても、ユニーク、非ユニークの判別を行った（図４２Ｂ）。また、得られた生タグのサイズを考慮して、Ｖ−ｔａｇのリピート・非リピートについても２０ｂｐギャップ長未満にまで範囲を拡大して解析した（図４２Ａ）。
【０２３３】
図４３は、ヴァーチャルタグデータベースにおけるリピートタグとユニークタグとの対応を示す図である。この結果、ＶＴ−ＤＢ中のヴァーチャルタグのうちリピート配列は６３．４１％であるのに対し、ユニーク配列は８９．３７％と予想外に高い比率を示した（図４３Ａ）。この比率は、ゲノム情報上リピート配列と分類されていても８３．７１％がユニークであり、ほとんどのタグが無駄にならないことを示唆する。
【０２３４】
一方、１２ｂｐギャップ長のヴァーチャルタグが１２万個と異常に多く存在し、その９割がリピート（図４２Ａ）、８割が非ユニークであり（図４２Ｂ）、ほとんどが無効なタグであることが判明した（図４３Ｂ）。
【０２３５】
３．４  生タグの分類
図４４は、ＨＳＣ４５から取得した生タグの内訳を示す図である。完成したＶＴ−ＤＢに対して生タグ配列を照合し、完全マッチ（生タグ配列の全長が１００％Ｖ−ｔａｇにマッチ）するものを抽出した。この結果、全生タグ５５９３個のうち、ユニークＶ−ｔａｇにマッチしたものが３１３３個（５６．０２％）、非ユニークＶ−ｔａｇにマッチしたものが１５４０個（２７．５３％）であり、のこり９２０個は迷子タグ（ｓｔｒａｙ  ｔａｇ）＃１と分類した（図４４）。
【０２３６】
生タグをサイズ別にユニーク、非ユニーク、迷子に分類した結果は図４２Ｃに示すとおりである。シークエンスエラーを考慮して、ＶＴ−ＤＢへの照合の際にミスマッチを１ｂｐもしくは２ｂｐ許容したところ、迷子タグ＃１，９２０個のうち３１９個をＶ−ｔａｇに照合できた。残ったタグ６０１個については、迷子タグ＃３と名付けた。
【０２３７】
３．５  タグ密度の解析
図４５は、ウインドウサイズを設定して算出したタグ密度を示すグラフである。得られた完全マッチ生タグ３１３３個をＶＴ−ＤＢに照合し、各Ｖ−ｔａｇへの投票数の計算を行った。その後、当該領域のタグ密度（ｔａｇ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を算出した。なお、タグ密度＝当該領域のユニーク生タグの投票数／当該領域のユニークＶ−ｔａｇ数である。
【０２３８】
密度を計算する領域（以下、ウインドウ）のサイズは、ユニークＶ−ｔａｇ数によって規定した。概算で５５４  Ｖ−ｔａｇｓが１Ｍｂｐ  ｇｅｎｏｍｅ相当となる。これに従い、２Ｍｂｐ〜１０Ｍｂｐにウインドウサイズを設定してタグ密度を算出した（図６）。
【０２３９】
ウインドウサイズ５Ｍｂｐに関しては、隣接するウインドウがオーバーラップしない通常の算出法に加え、１／２ウインドウサイズずつオーバーラップさせる算出法による結果を示した。
【０２４０】
３．６  増幅領域の解析
図４６は、異常なタグ密度を示す領域を示すグラフおよび物理地図である。周辺と比較して明らかにタグ密度の高い部位を持つＣｈ８とＣｈ１８のグラフを示した（図４６Ａ）。Ｃｈ８の末尾、Ｃｈ１８の開始に増幅と思われる領域が認められた。
【０２４１】
Ｃｈ８に関して該当領域に対して、ウインドウサイズ１０Ｋｂｐのタグ密度を算出した（図７Ｂ）。対応する領域に存在する遺伝子をＲｅｆｓｅｑ  ｇｅｎｅｓとして表示させたところ、近傍に癌遺伝子ｍｙｃがマップされた。
【０２４２】
４．実施例のまとめ
本実施例では、デジタルゲノムスキャニング法の基盤の確立にむけて、１）ヒトゲノム情報のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析によって、ＭｂｏＩヴァーチャルタグのデータベースを作成し、タグの性状を完全に把握した。２）モンテカルロシミュレーションにより、ＤＧＳに必要な解析タグ数の目標設定ができた。３）コンカテマーの再延長という手法をとることによって、生タグ取得効率を大幅に改善できた。
【０２４３】
また、ＤＧＳを胃癌細胞株のゲノム解析に用いて、４）約３０００の有効生タグを取得した。５）タグ密度の解析において、異常増幅と思われる領域を同定できた。
【０２４４】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【０２４５】
たとえば、上記実施例では、ゲノムのコピー数の指標としてタグ密度を用いたが、所定のヴァーチャルタグに対応する生タグの個数などの他の指標を用いてもよい。この場合、ヴァーチャルタグに対応する生タグの個数が多いタグの組合せが連続する領域では、ゲノム領域の重複が生じている可能性が高いと判定し得る。一方、ヴァーチャルタグに対応する生タグの個数が少ないタグの組合せが連続する領域では、ゲノム領域の欠失が生じている可能性が高いと判定し得る。
【産業上の利用可能性】
【０２４６】
以上のように、本発明にかかるＤＮＡ配列解析装置は、高解像度でゲノムＤＮＡ配列のコピー数異常を信頼性よく同定できるという効果を有し、ＤＮＡ配列解析装置、ＤＮＡ配列解析方法およびプログラム等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２４７】
【図１】デジタルゲノムスキャニングの原理とヴァーチャルタグによる染色体異常解析の概要について説明するための概念図である。
【図２】ＤＮＡ配列解析システム１０００の全体構成を示した機能ブロック図である。
【図３】ＤＮＡ配列解析システム１０００の変形例であるＤＮＡ配列解析システム２０００の全体構成を示した機能ブロック図である。
【図４】ＤＮＡ配列解析装置１００の内部構成を示した機能ブロック図である。
【図５】ＤＮＡ配列解析装置１００の変形例であるＤＮＡ配列解析装置４００の内部構成を示した機能ブロック図である。
【図６】ＤＮＡ配列解析システム１０００の動作について説明するためのフローチャートである。
【図７】対応タグデータ生成部２１０の内部構成を示した機能ブロック図である。
【図８】対応タグデータ生成部２１０の動作を説明するためのフローチャートである。
【図９】コピー数判定部２１４の内部構成を示した機能ブロック図である。
【図１０】コピー数判定部２１４の動作を説明するためのフローチャートである。
【図１１】ヴァーチャルタグ単位のデータ可視化イメージを説明するための概念図である。
【図１２】ヴァーチャルタグ単位のデータ可視化イメージを説明するための概念図である。
【図１３】対照タグデータ生成装置２００の内部構成を説明するための機能ブロック図である。
【図１４】各制限酵素によってゲノムから生成されるタグ数を示す図である。
【図１５】ＭｂｏＩで生成されるサイズ別のタグ数を示すグラフである。
【図１６】タグサイズに幅を与えた場合のタグ数を示す図である。
【図１７】ＭｂｏＩ（＾ＧＡＴＣ）タグ分布を示すグラフである。
【図１８】ＭｂｏＩで生成される有効なヴァーチャルタグ数を示す図である。
【図１９】ＤＧＳモンテカルロシミュレーションのイメージを示す概念図である。
【図２０】ＤＧＳモンテカルロシミュレーションの詳細を説明する図である。
【図２１】ＤＧＳモンテカルロシミュレーションの際のユーザインターフェースを示す画面表示図である。
【図２２】ＤＧＳシミュレーション結果を、ＭｂｏＩ非リピートヴァーチャルタグ１６５、８４５個の場合の異常検出解像度、及び必要となる解析タグ数の形でまとめた図である。
【図２３】両端リピート由来のタグおよび片端リピート由来のタグの違いについて説明するための概念図である。
【図２４】ＭｂｏＩヴァーチャルタグの見直しについて説明するために、リピート領域に埋没しているタグ（ｘ  ｂｏｔｈ）と、リピート領域および非リピート領域にまたがるタグ（ｘ  ｅｉｔｈｅｒ）のサイズ分布を示すグラフである。
【図２５】リピート配列由来のヴァーチャルタグにおけるユニーク度の検証について説明するための図である。
【図２６】タグ切り出しサイズを長めにシフトさせるべきか否かを検討するための図である。
【図２７】リピート領域と非リピート領域とにまたがるＭｂｏＩヴァーチャルタグ（片端リピート）を有効タグとみなした場合について説明するための図である。
【図２８】対照タグデータ生成装置２００の動作を説明するためのフローチャートである。
【図２９】解析対象タグデータ生成装置３００の内部構成を説明するための機能ブロック図である。
【図３０】タグＤＮＡの抽出とコンカテマーの作製を説明するための図である。
【図３１】予備実験で用いたタグの塩基配列を解析し集計した結果を示すグラフである。
【図３２】解析対象タグデータ生成装置３００の動作の流れについて説明するための概念図である。
【図３３】コンカテマーの再延長について説明するための概念図である。
【図３４】コンカテマー構造の把握方法を説明するための制限酵素地図である。
【図３５】コンカテマー構造の把握方法を説明するためのＤＮＡ配列のシークエンス地図である。
【図３６】図３５のシークエンス地図からベクター配列を除去した場合のシークエンス地図である。
【図３７】図３６のシークエンス地図からタグを切り出す様子を説明するためのシークエンス地図である。
【図３８】解析対象タグデータ生成装置３００の動作を説明するためのフローチャートである。
【図３９】タグ自動解析の流れについて説明するための概念図である。
【図４０】タグを分類していく流れについて説明するための概念図である。
【図４１】ＨＳＣ４５ゲノムからのタグの精製とコンカテマーの作製とを説明するための電気泳動図である。
【図４２】タグのサイズ分布とリピート・ユニーク分類とを示すグラフである。
【図４３】ヴァーチャルタグデータベースにおけるリピートタグとユニークタグとの対応を示す図である。
【図４４】ＨＳＣ４５から取得した生タグの内訳を示す図である。
【図４５】ウインドウサイズを設定して算出したタグ密度を示すグラフである。
【図４６】異常なタグ密度を示す領域を示すグラフおよび物理地図である。
【符号の説明】
【０２４８】
１００  ＤＮＡ配列解析装置
１０２  操作部
１０４  画像表示装置
１０６  プリンタ
１０８  ＰＣ
１２０  別ゲノムＤＮＡ配列データベース
２００  対照タグデータ生成装置
２０２  対照ゲノムＤＮＡ配列データ取得部
２０４  解析対象タグデータ取得部
２０６  対象タグデータ記憶部
２０８  解析対象タグデータ記憶部
２１０  対応タグデータ生成部
２１２  対応タグデータ記憶部
２１４  コピー数判定部
２１６  コピー数判定結果記憶部
２２０  画像データ生成部
２２２  画像データ記憶部
２２４  別ゲノムＤＮＡデータ検索部
２２６  起源判定部
２２８  起源判定結果記憶部
３００  解析対象データ生成装置
４００  ＤＮＡ配列解析装置
４０２  対照タグデータ生成部
４０４  対照タグデータ記憶部
５００  対照ゲノムＤＮＡ配列データベース
５０２  受付部
５０４  対応関係判定部
５０６  一致度判定部
５０８  寄与度設定部
５１０  再試行判定部
５１２  出力部
６０２  受付部
６０４  寄与度集計部
６０６  重複判定部
６０８  欠失判定部
６１０  出力部
７０６  対照ゲノムＤＮＡ配列データ取得部
７０８  対照ゲノムＤＮＡ配列データ記憶部
７１０  切断部位検索部
７１２  切断ＤＮＡ配列記憶部
７１４  対照タグ選択部
７１６  選択タグ記憶部
７１８  関連付部
７２０  対照タグデータ記憶部
７２２  出力部
８０２  解析対象ＤＮＡ分子アプライ部
８０４  制限酵素アプライ部
８０６  制限酵素処理部
８０８  電気泳動部
８１０  ＤＮＡ断片抽出部
８１２  コンカテマー生成部
８１４  ２次コンカテマー生成部
８１６  シークエンス部
８１８  シークエンス結果記憶部
８２０  解析対象タグデータ生成部
８２２  解析対象タグデータ記憶部
８２４  出力部
１０００  ＤＮＡ配列解析システム
２０００  ＤＮＡ配列解析システム
【図１】
2008161056.tif 000003
【図２】
2008161056.tif 000004
【図３】
2008161056.tif 000005
【図４】
2008161056.tif 000006
【図５】
2008161056.tif 000007
【図６】
2008161056.tif 000008
【図７】
2008161056.tif 000009
【図８】
2008161056.tif 000010
【図９】
2008161056.tif 000011
【図１０】
2008161056.tif 000012
【図１１】
2008161056.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2008161056.tif 000018
【図１７】
2008161056.tif 000019
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2008161056.tif 000022
【図２１】
2008161056.tif 000023
【図２２】
2008161056.tif 000024
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2008161056.tif 000030
【図２９】
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【図３０】
2008161056.tif 000032
【図３１】
2008161056.tif 000033
【図３２】
2008161056.tif 000034
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2008161056.tif 000037
【図３６】
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【図３７】
2008161056.tif 000039
【図３８】
2008161056.tif 000040
【図３９】
2008161056.tif 000041
【図４０】
2008161056.tif 000042
【図４１】
2008161056.tif 000043
【図４２】
2008161056.tif 000044
【図４３】
2008161056.tif 000045
【図４４】
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【図４５】
2008161056.tif 000047
【図４６】
2008161056.tif 000048
【配列表】
2008161056000001.app