(57)【要約】  【課題】本発明の目的は、生理活性物質を固相基板表面に固定したアレイで、細胞抽出液を測定する際、アレイ表面に吸着する非特異的吸着物質を取り除く為のアレイ洗浄方法を検討し、感度や再現性に優れたアレイを提供することにある。【解決手段】生理活性物質を基板上に固定化したアレイと細胞抽出液とを反応させた後、非イオン性界面活性剤を含む洗浄液でアレイを超音波洗浄することにより、アレイ表面の非特異的吸着物質を取り除くことができる。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を複数個基板に固定したアレイを用い、細胞抽出液中のプロテインキナ−ゼ活性を測定するする方法であって、測定前に親水部に糖鎖を持つ非イオン界面活性剤を含有する洗浄液でアレイを洗浄する工程を有することを特徴とする細胞抽出液測定方法。
【請求項２】
親水部に糖鎖を持つ非イオン界面活性剤が、アルキルグルコシド系界面活性剤であることを特徴とする請求項１に記載の細胞抽出液測定方法。
【請求項３】
アルキルグリコシド系界面活性剤が、一般式（Ｉ）であることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞抽出液測定方法（ただし、一般式（Ｉ）において、Ｇは糖鎖から還元末端単糖の１位の炭素原子に結合したＯＨが外れた残基を示す。Ｘは酸素原子または硫黄原子を表す。Ｑは水素原子を示す。ｍは１〜３の整数を示し、ｎは１〜４の整数を示す）。
【化１】
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【請求項４】
親水部に糖鎖を持つ非イオン界面活性剤が、ｎ-オクチル-β-D-グルコサイド、ｎ-デシル-β-D-グルコサイド、ｎ-ドデシル-β-D-グルコサイド、ｎ-オクチル-β-D-マルトサイド、ｎ-デシル-β-D-マルトサイド、ｎ-ドデシル-β-D-マルトサイド、スクロースモノラウレート、ｎ-オクチル-β-D-チオグルコサイド、ｎ-ヘプチル-β-D-チオグルコサイド、ｎ-ノニル-β-D-チオマルトサイド、スクロースモノカプレ−ト及びスクロースモノコレートからなる群より選ばれた１種又は２種以上の界面活性剤であることを特徴とする請求項１に記載の細胞抽出液測定方法。
【請求項５】
アレイを洗浄する工程が、基板を洗浄液に浸漬後、超音波をかけて洗浄することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞抽出液測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質やペプチドなどの生理活性物質を基板上に複数個固定したアレイで、細胞抽出液中のプロテインキナ−ゼ活性を蛍光法やＳＰＲ法などで測定する際、高感度な定量検出ができるアレイ洗浄方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞内シグナル伝達に関する研究は飛躍的に進歩しており、様々な種類のプロテインキナ−ゼが複雑に関連しあいながら、シグナル伝達経路において重要な役割を果たしていることが知られている。これらプロテインキナ−ゼの活性を網羅的に解析し、その細胞内における動態を一度にプロファイリングすることができれば、細胞生物学、薬学の基礎的研究はもとより、創薬開発、臨床応用などの分野においても大きく寄与しうるものと期待されている。しかしながら、これまでには簡便で効率よく数々のプロテインキナ−ゼにおける動態を同時にプロファイリングできるような技術はまだ確立されていない。
【０００３】
このような背景から、細胞内のプロテインキナーゼによるシグナル伝達を、in vivoやin vitroで網羅的に解析する試みがなされている。in vitroで解析する場合、培養細胞から調製した細胞抽出液（ライセ−ト）を用い、タンパク質やペプチドのリン酸化シグナルを解析する試みもされている。ライセートの調製では、細胞の種類や抽出方法、薬剤刺激などによりプロテインキナーゼの組成やタンパク質のリン酸化状態は大きく変わる為、細胞の選択や抽出方法にノウハウが必要とされている。
【０００４】
一方、ＤＮＡチップに代表されるように、基板上に生理活性物質を複数個固定し、アレイ状にしたバイオチップ製作の試みが数多くなされている。測定対象は血清などの生体材料や環境物質、細胞から抽出した細胞抽出液（ライセ−ト）など多岐にわたる。バイオチップの多くは、基板上に官能基を修飾し、市販スポッタ−装置を用いて複数個の生理活性物質をスポットし官能基と反応させることで基板上に固定化する。固定化した生理活性物質を検出する方法としては、蛍光やラジオアイソトープなどのラベル物質を結合させ、ラベル物質を検出することで生体分子あるいは分子集合体の評価をする方法がある。特に蛍光は、ＤＮＡチップや抗体チップの分野で幅広く使われている。一方、ラベル操作は非常に煩雑であるとともに定量性に欠け、反応をリアルタイムで観察するのは非常に困難である。そこでラベルが不要でかつ定量性があり、リアルタイムで評価可能な分析方法として、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）が注目を集めている。ＳＰＲは生理活性物質を固定化した金属薄膜に光を照射して反射光をモニターし、サンプルとの相互作用を共鳴角もしくは反射光強度の変化で測定する方法である。一般的なＳＰＲチップは、薄く蒸着した金フィルム上にカルボキシル化デキストランマトリックスを含む基板上に核酸や、ペプチド、抗体などを固定して測定が始められる。また、近年、金属表面に複数の生理活性物質をアレイ状に作成し、２次元ＳＰＲ法で複数アゴニストとアンダコニストの相互作用解析を行う方法も開示されている（特許文献１参照）。
【０００５】
プロテインキナーゼ活性解析用アレイとして、タンパク質やペプチドなどを基板にアレイ状に固定し、培養細胞から調製したライセ−トと反応させた場合、基板上にタンパク質などの非特異的吸着が起こり、蛍光法やＳＰＲ法においてもバックグランドが高い、シグナル強度が低いなどの問題が生じてきた。解決策の１つとして基板上に非特異的吸着を抑えるブロッキング剤で処理する方法が採られている。
【０００６】
一方、ELISA法で核酸や抗体測定を実施する場合の洗浄方法については、これまで様々な方法が検討されてきた。核酸ハイブリダイゼ−ション測定法において、マイクロプレ−ト内での反応後の洗浄にオクチルグリコシド系界面活性剤洗浄液を使用した洗浄方法（特許文献２参照）がある。固相担体に抗体などを固定し、免疫学的に測定する際生体成分の非特異的吸着を抑制する方法として、アルキルグルコシド系界面活性剤やステロイド系界面活性剤を用いる方法（特許文献３参照）や、塩酸グアニジン又は尿素を含む洗浄液を使用する方法（特許文献３参照）、リン酸バッファに非イオン性界面活性剤であるTween20を含む洗浄液を使用する方法（特許文献４参照）、リン酸バッファに市販界面活性剤である三洋化成製ノニソフトを含む洗浄液を使用する方法（特許文献５参照）が示されている。
【特許文献１】米国特許６１２７１２９号明細書
【特許文献２】特許第３３９５２２７号公報
【特許文献３】特開平１０−３３２６９７号公報
【特許文献４】特開２０００−１２１６３７号公報
【特許文献５】特開平９−８００４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、タンパク質やペプチドをアレイ上に固定した基板で、培養細胞から調製したライセ−ト中のプロテインキナーゼ活性を蛍光法やＳＰＲ法などで検出する際、ライセ−ト中成分が基板表面に非特異的吸着し、正確な反応シグナルが得られないことを防ぐ為、検出前にアレイ基板を洗浄する洗浄液組成や洗浄方法を検討し、洗浄により非特異的吸着物質を除き、感度のよい定量検出ができるライセ−ト測定用アレイを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．生理活性物質を複数個基板に固定したアレイを用い、細胞抽出液中のプロテインキナ−ゼ活性を測定するする方法であって、測定前に親水部に糖鎖を持つ非イオン界面活性剤を含有する洗浄液でアレイを洗浄する工程を有することを特徴とする細胞抽出液測定方法。
２．親水部に糖鎖を持つ非イオン界面活性剤が、アルキルグルコシド系界面活性剤であることを特徴とする１の細胞抽出液測定方法。
３．アルキルグリコシド系界面活性剤が、一般式（Ｉ）であることを特徴とする１または２の細胞抽出液測定方法（ただし、一般式（Ｉ）において、Ｇは糖鎖から還元末端単糖の１位の炭素原子に結合したＯＨが外れた残基を示す。Ｘは酸素原子または硫黄原子を表す。Ｑは水素原子を示す。ｍは１〜３の整数を示し、ｎは１〜４の整数を示す）。
【化１】
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４．親水部に糖鎖を持つ非イオン界面活性剤が、ｎ-オクチル-β-D-グルコサイド、ｎ-デシル-β-D-グルコサイド、ｎ-ドデシル-β-D-グルコサイド、ｎ-オクチル-β-D-マルトサイド、ｎ-デシル-β-D-マルトサイド、ｎ-ドデシル-β-D-マルトサイド、スクロースモノラウレート、ｎ-オクチル-β-D-チオグルコサイド、ｎ-ヘプチル-β-D-チオグルコサイド、ｎ-ノニル-β-D-チオマルトサイド、スクロースモノカプレ−ト及びスクロースモノコレートからなる群より選ばれた１種又は２種以上の界面活性剤であることを特徴とする１に記載の細胞抽出液測定方法。
５．アレイを洗浄する工程が、基板を洗浄液に浸漬後、超音波をかけて洗浄することを特徴とする１〜４のいずれかの細胞抽出液測定方法。
【発明の効果】
【０００９】
基板表面に生理活性物質を複数個固定した蛍光アレイやＳＰＲチップにおいて、ライセ−トとの反応によるシグナル変化を再現性よく得る一方、感度も向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１１】
本発明の「生理活性物質」は特に限定されないが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、膜タンパク質、糖タンパク質、抗体など低分子物質から高分子物質まで種種の物質を用いることができる。好ましい生理活性物質は、タンパク質、ペプチド、抗体などが挙げられる。
【００１２】
「生理活性物質」には末端に官能基があってもよい。官能基により、基板への共有結合結合を可能とし、生理活性物質を基板上に効果的に固定化出来る。共有結合可能な官能基としては、例えばアミノ基、水酸基、チオ−ル基、カルボキシル基、マレイミド基、アルデヒド基などを挙げることができる。
【００１３】
本発明の「基板」については、スライドガラス、金蒸着ガラスやプラスチック基板でもよい。蛍光アレイでは、スライドガラス表面にアミノ基を固定し、グルタルアルデヒドを用いて、アルデヒド基と反応させた基板に生理活性物質を固定させる方法がしばしば用いられる。ＳＰＲアレイでは、アミノ基やカルボキシル基を修飾させた金基板に、アミド結合により生理活性物質を固定してもよい。
【００１４】
本発明のアレイ製造方法において、基板上に複数個の生理活性物質を固定する場合、市販スポッタ−装置を使用してもよい。
【００１５】
本発明の細胞抽出液による非特異的反応の原因物質とは、主に細胞抽出液に含まれるタンパク質や脂質などが挙げられる。
【００１６】
本発明に用いる細胞抽出液調製については、ＣＯＳ−１細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＰＣ−１２細胞、ＭＣＦ−７（乳ガン細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３などの細胞株を入手し、専用培地で継代し、十分な細胞が得られるまで植え継ぎを継続する。但し長く継代することは避け、継代数をそろえた細胞群を凍結保存して用いることが望ましい。細胞抽出液調製には、２５mm2フラスコに専用培地と細胞を混合した物を１０ｍｌ分注し、ＣＯ2インキュベ−タ中で培養する。培地は２〜３日毎に培養状態を確認しながら交換する。ＰＣ−１２細胞など浮遊性の細胞は、コラ−ゲン溶液であらかじめ処理したフラスコで培養する。培養は、８０％コンフルエントとなる所（約１０6〜１０7cell／ｍｌ）で終了し、細胞を取り出し細胞抽出液調製を始める。
【００１７】
薬剤刺激を与える場合は、培養した細胞のｍｅｄｉｕｍを捨て、各種最適濃度に調製した薬剤を含むmediumに交換する。各薬剤刺激に最適な時間（１５〜６０分程度である）ＣＯ２インキュベ−タ中に静置し、取り出して後mediumを捨てＰＢＳやトリスバッファなどで２回洗浄する。さらに１ｍｌのＰＢＳをトリスバッファなどで加えセルスクレ−パ−を使用して容器から細胞をはがし取る。前記細胞懸濁液をチュ−ブに移し遠心後、上済みを除去する。
【００１８】
本発明では、細胞抽出液中に含まれるプロテインキナーゼの状態を検討している為、プロテア−ゼ阻害剤と、フォスファタ−ゼ阻害剤をカクテルしたバッファを加える。プロテア−ゼ阻害剤としては、ＰＭＳＦ、ペプスタチンＡ、アプロチンをミックスした物を、フォスフォァタ−ゼ阻害剤は、フッ化ナトリウム、オルトバナジン（Ｖ）酸ナトリウムをミックスした物を用いた。市販プロテア−ゼ阻害剤や、フォスファタ−ゼ阻害剤カクテルを使用してもよい。細胞破砕用超音波処理により細胞抽出液を取り出し、遠心して上済みを回収する。回収液はできるだけ小分けしてすぐ使用しない場合は、−８０℃で保存する。但し薬剤刺激による細胞抽出液の検討では、キナ−ゼ活性変化が起こっていると考えるが保存安定性を確認していない為、細胞抽出液の準備ができた時点ですぐ検討する。
【００１９】
本発明で細胞に用いる薬剤刺激剤は、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ誘発細胞死を抑制する働き）、ＮＧＦ（神経突起進展を促進する働き）、ＴＰＡ（ＰＫＣを活性する働き）、ＥＧＦ（細胞増殖因子）などが用いられる。各薬剤の最適量や刺激時間は、ＣＲＥＢを介したルシフェラ−ゼ発現系でコントロ−ルと比較して確認した所、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎは１０μＭで１５分から３０分、ＮＧＦは１００ｎｇ／ｍｌで１５分以内、ＴＰＡは１０μＭで１５分から３０分、ＥＧＦは６０分が最適である。
【００２０】
本発明で用いる細胞抽出液は、タンパク濃度で調製してもよい。具体的には市販タンパク濃度測定キットを用い、抽出した細胞抽出液のタンパク濃度を求める。サンプルとして使用する場合、各サンプルはタンパク濃度が一定となるようトリスバッファなどで希釈して調製する。タンパン濃度としては最終濃度として１００〜５００μｇ／ｍｌ程度となるよう調製する。
【００２１】
本願発明の最も重要な開示の一つは、生理活性物質を複数個基板に固定したアレイを、測定前に界面活性剤を含有する洗浄液で洗浄することにある。一般に、界面活性剤は、親水性部分がイオン性（陰イオン性・陽イオン性・双性）のものと非イオン性（ノニオン性ともいう）のものに大別される。
【００２２】
一般に、陰イオン性界面活性剤は洗浄能力に優れているが、細胞抽出液内のタンパクや、アレイ上に固定したタンパク質やペプチドも変性してしまう可能性が高い為、本発明の目的には一致しない。又膜タンパク可溶化剤として、両性界面活性剤であるＣＨＡＰＳ（化学名：3-［（3-Cholamidopropyl）dimetHylammonio］propanesulfonic acid ）がしばしば用いられる。しかしカチオン基とアニオン基が分極している為、アレイ上のカチオン性タンパク質やアニオン性タンパク質と結合する可能性がある為、本発明の目的には一致しない。
【００２３】
本願発明では、非イオン性の界面活性剤を用いることができる。非イオン性界面活性剤は、イオン化しない親水性部分を持つ界面活性剤で、アルキルグリコシドのような低分子系と、ポリエチレングリコールやポリビニルアルコールのような高分子系に分類される。本願発明では、低分子系の非イオン性界面活性剤を好ましく用いることができる。さらに、非イオン性界面活性剤のなかでも、親水基に糖鎖を持つ非イオン界面活性剤がよい。
【００２４】
親水基に糖鎖を持つ非イオン界面活性剤は、市販品としてｎ-オクチル-β-D-グルコサイド、ｎ-デシル-β-D-グルコサイド、ｎ-ドデシル-β-D-グルコサイド、ｎ-オクチル-β-D-マルトサイド、ｎ-デシル-β-D-マルトサイド、ｎ-ドデシル-β-D-マルトサイド、スクロースモノラウレート、スクロ−スモノラウレ−トなどが挙げられる。細胞中に含まれるβ−グルコシタ−ゼによりオクチルグルコシドなどは分解されるが、チオエ−テル結合は分解されない。よってｎ-オクチル-β-D-チオグルコサイド、ｎ-ヘプチル-β-D-チオグルコサイド、ｎ-ノニル-β-D-チオマルトサイドの化合物を用いてもよい。又スクロ−スモノラウレ−トに対し、スクロ−スへの結合の仕方が違う異性体の混合物であるスクロ−スモノコレ−トなどを用いてもよい。
【００２５】
本発明に用いる「親水基に糖鎖を持つ非イオン界面活性剤」は、アルキルグリコシド系界面活性剤であってもよい。本発明に用いるアルキルグリコシド系界面活性剤は、糖を親水基、アルキル基を疎水基として両者がグリコシド結合で結ばれた「親水基に糖鎖を持つ非イオン界面活性剤」である。一般的に下記一般式（Ｉ）で表された化合物が挙げられる。
【００２６】
【化２】
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【００２７】
一般式（Ｉ）において、Ｇは糖鎖から還元末端単糖の１位の炭素原子に結合したＯＨが外れた残基を示す。Ｘは酸素原子または硫黄原子を表す。Ｑは水素原子を示す。ｍは１〜３の整数を示し、ｎは１〜４の整数を示す。またこれらの化合物はα-、β-もしくはそれらの混合物を含む。本発明で用いられる具体的な化合物としては、オクチルグルコシド、ノニルグルコシド、ドデシルグルコシド、オクチルチオグルコシドなどを示し、具体的な化学名で言えば、n-Octyｌ-β-D-glucoside、n-Heptyl-β-D-thioglucosideがある。アルキルグルコシド系界面活性剤のなかでも、チオグルコシド結合したアルキルグルコシド系界面活性剤は、細胞中に含まれるβ−グルコシタ−ゼにより分解されないという特徴を持つため、β−グルコシタ−ゼにより影響を受ける場合において用いてもよい。たとえば、ｎ-オクチル-β-D-チオグルコサイド、ｎ-ヘプチル-β-D-チオグルコサイド、ｎ-ノニル-β-D-チオマルトサイドなどが例示される。
【００２８】
上記界面活性剤は、単独で用いても、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。また上記界面活性剤は、好ましくは０．０１〜１０（W／Ｖ）％、特に好ましくは０．１〜５（W／Ｖ）％の濃度範囲で用いる。濃度が高すぎる場合ミセルを形成する場合があり、濃度が低すぎるとアレイ洗浄効果が見られなくなる。
【００２９】
本発明に用いる洗浄液には、上記界面活性剤のほかに、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液やグット緩衝液など、通常洗浄液成分として用いられる緩衝剤を含有していてもよい。また該洗浄液のｐＨは特に限定されないが、ｐＨ５〜９の範囲に入ることが望ましい。
【００３０】
本発明におけるアレイ洗浄方法とは、アレイを装置内に設置した状態で、洗浄液を流すことにより洗浄する。別途ガラス容器に洗浄液を入れ、ライセートと反応させたアレイ表面をミリＱ水で軽く洗浄した後、アレイを容器に付ける方法もある。アレイ表面を超音波洗浄する場合は、アレイを入れた洗浄液容器毎超音波洗浄器に入れ、超音波をかける。温度調整ができない超音波洗浄器を使用する場合、超音波洗浄器中に氷を入れ、液温を２５℃以下に保つようにする。洗浄後はアレイ表面を再度ミリＱ水で軽く洗浄し、チッソガス、又はエアーを吹き付けアレイ表面をすばやく乾燥させる。
【００３１】
本発明に用いる超音波洗浄器は、出力Ｗ数が３５Ｗの簡易型を用いても良い。２５０Ｗ以上の細胞破砕用も使用できるが、できれば１００Ｗ以下の機器を使用するのがよい。好ましくは、３５W以上１００W以下の超音波洗浄器を用いるのがよい。又、超音波洗浄器で洗浄する時間の目安は、Ｗ値にかかわらず、５〜３０分の範囲で、できれば１５分から２０分程度が好ましい。
【００３２】
本発明の細胞抽出液測定用アレイは、プロテインキナーゼによるタンパク質やペプチドのリン酸化や、リン酸化タンパクと抗体の結合などを検出する際に使用できる。例えば蛍光法やＳＰＲ法がある。本発明の検討としては、主にＳＰＲ法を用いたので、本発明の実施で使用しているＳＰＲ装置の構成を図１に示す。ＳＰＲは光学的な検出方法であるため、測定に用いる基板は透明である必要がある。また、表面プラズモン共鳴を励起するために、透明基板の片面には金属薄膜が形成されている。この金属薄膜は通常金が用いられている。金薄膜は蒸着法、又はスパッタリング法によってクロムを１ｎｍ、金を４５ｎｍ積層させたものが表面厚みのムラがなく、金薄膜が剥がれ落ちにくいため好ましい。金薄膜上にチオール化合物もしくはジスルフィド化合物を、金−硫黄の結合を利用して固定できる。複数の生理活性物質の相互作用を測定するために、金基板に固定する生理活性物質はアレイ状にするのが好ましい。金基板上にプロテインキナーゼ特異的抗体を固定化し、２次元ＳＰＲ法によってプロテインキナーゼによりリン酸化された蛋白質もしくはペプチド部位の抗体結合による反射光強度変化をリアルタイムで解析することにより、正確なＫｉｎｅｔｉｃｓを評価することもできる。
【００３３】
たとえば、本発明の細胞抽出液測定方法を用いて、プロテインキナ−ゼ活性測定をＳＰＲ法で行うことができる。以下にその方法を説明する。まず、金基板をアルカンチオ−ル溶液に浸漬して、パタ−ン化した基板表面にアミノ基を導入する。次にＳＳＭＣＣ（Sulfosuccinimidyl 4-［N-maleimidomethyl］cyclohexane-1-carboxylate）を、室温で１５分反応させ、アミノ基とＳＳＭＣＣのＮＨＳ基を反応させ、未反応のマレイミド基を表面に導入する。配列番号４に示すチロシンキナ−ゼ酵素であるｃＳｒｃの基質となるアミノ酸配列からなるペプチド（Src-Y）、配列番号６に示すＳｒｃのネガティブコントロ−ル（Src-F；チロシン残基がフェニルアラニン残基に置換）、配列番号５に示すＳｒｃのポジティブコントロ−ル（Src-pY；チロシン残基がリン酸化）を濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解して、スポットしアレイを作成する。ペプチドの固定化反応を行った後、未反応のマレイミド基をブロッキングする為、ＰＥＧチオ−ルをアレイ上に分注し、室温で反応させる。
【００３４】
測定対象となる細胞抽出液の調製は、ＰＣ−１２細胞を培養し、細胞懸濁液に、プロテア−ゼ阻害剤、及びフォスファタ−ゼ阻害剤を添加後、細胞破砕用超音波洗浄機を用いて超音波をかける。高速遠心器で遠心後、上澄みを回収する。市販蛋白定量キットを用い、タンパク濃度を測定し、タンパク濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるよう調製する。
細胞抽出液反応の場合、ｃＳｒｃ酵素１μｌ、及び細胞抽出液４０μｌを専用希釈液３６０μｌに溶かした後、アレイ表面に滴下し３０℃で２時間反応させる。その後、１Ｗ％オクチルグルコシド系界面活性剤（n-Octyl-β-D-glucoside）中にアレイを侵漬し、室温で１５分超音波洗浄する。洗浄後アレイをＳＰＲ装置（東洋紡製）に装着する。リン酸化シグナルは、リン酸化チロシン抗体ＰＴ−６６と反応させ検出する。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３６】
金属薄膜上に、プロテインキナ−ゼA（PKA）を認識するペプチドが固定化されてなるアレイを用い、ライセート中のPKAによるアレイ上のペプチド基質のリン酸化シグナルを２次元ＳＰＲ法により検出することで、ライセートと反応後のアレイ洗浄剤や洗浄方法を試みた。
【００３７】
実施例１
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。まず準備したアレイとＰＫＡ酵素添加系ライセートを反応させ、アレイ洗浄剤や洗浄方法が、正確なリン酸化シグナルを得るのにどの程度効果的があるかを検討した。
【００３８】
１−１．ＰＫＡアレイ作成
（スポットするペプチド溶液の調製）
ＰＫＡ酵素の基質となる配列番号１に示す基質ペプチド（ＰＫＡ−Ｓ）、配列番号３に示すＰＫＡのネガティブコントロ−ル（ＰＫＡ−Ａ；セリン残基がアラニン残基に置換）、配列番号２に示すＰＫＡのポジティブコントロ−ル（ＰＫＡ−Ｐ；セリン残基がリン酸化）の３種類を、専用溶解液で調製した。スポットするペプチド溶液は、基質ペプチド、ネガコントロール、ポジコントロール共、0（ブランク）、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/ml濃度溶液を準備した。
【００３９】
（ＰＫＡアレイ製作）
金基板を１mMの４armPEG-SH（日本油脂製）に２時間浸漬後、９６パタ−ンのフォトマスクでＵＶ照射を２時間行う。再度金基板を１ｍＭ ＭＯＡＭ（8-amino-1-octanethiol， hydrochloride； 同仁化学製）溶液中に１．５時間浸漬して、金表面にアミノ基を導入した。次に架橋剤であるSSMCCを金表面にドロップし、室温で１５分反応させる。
【００４０】
準備したスポット用ペプチド溶液を市販スポッタ−装置にセットし、ポジコントロ−ル、基質、ネガコントロ−ル共、各濃度のペプチド溶液を数点ずつスポットし、ＳＳＭＣＣのマレイミド基と、合成したペプチドのＮ末端のＳＨ基を反応させる。アレイ表面をミリＱ水で洗浄後、ブロッキング：１mM  ＰＥＧ−ＳＨ（日本油脂製）をアレイ表面上に４００μｌドロップし、使用で室温３０分反応させる。
【００４１】
１−２．界面活性剤含有洗浄液準備
両イオン性界面活性剤として、ＣＨＡＰＳ：3-［(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio］ propanesulfonic  acid（ナカライテスク製）を、
陰イオン性界面活性剤として、Sodium cholate（同仁化学製）、SOD：ラウリル硫酸ナトリウム（ナカライテスク製）を、
親水基に糖鎖を持たない非イオン性界面活性剤として、MEGA-10：n-Decanoyl-N-methylglucamide（同仁化学製）、Tween-20：poly (oxyethylene) sorbitan monolaulate（ナカライテスク製）を、親水基に糖鎖を持つ非イオン界面活性剤として、Sucrose-monolaurateを、親水基に糖鎖を持つ非イオン界面活性剤のなかでもとくにアルキルグリコシド系界面活性剤として、n-Octyl-β-D-glucosideを用意し、いずれもミリＱ水で１（W／Ｖ）％に調製した物を準備した。
【００４２】
１−３．細胞抽出液の調製
ＰＣ−１２細胞を培養した。培養した細胞のｍｅｄｉｕｍを捨てＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳを加えセルスクレイパ−で細胞をはがし取る。細胞懸濁液をチュ−ブに移し、遠心（1500ｒｐｍ  ５分）後上澄みを除去する。これにＰＢＳを加え、プロテア−ゼ阻害剤であるフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ペプスタチンＡ、アプロチンをそれぞれ１mM、３μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌとなるように加える（全量２００μｌ）。その後細胞破砕用超音波洗浄機を用いて超音波を５分かける。高速遠心器で遠心（15，000rpm 20分）後、上澄みを回収する。市販蛋白定量キットを用い、準備した細胞抽出液のタンパク濃度を測定し、タンパク濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるよう調製した。
【００４３】
１−４．ＰＫＡ酵素添加系細胞抽出液反応
ＰＫＡ酵素反応のみの場合、ＰＫＡ（プロメガ製）１μｌを専用希釈液４００μｌに溶かした後、アレイ表面に滴下し３０℃で２時間反応させる。酵素添加系細胞抽出液反応の場合、ＰＫＡ（プロメガ製）１μｌ、及びタンパク濃度で１ｍｇ／ｍｌに調製した細胞抽出液４０μｌを専用希釈液３６０μｌに溶かした後、アレイ表面に滴下し３０℃で２時間反応させた。細胞抽出液のタンパク濃度は最終１００μｇ／ｍｌとなった。
【００４４】
１−５．アレイ洗浄
１−５−１．界面活性剤によるアレイ洗浄方法の検討
準備した界面活性剤の内、１Ｗ％オクチルグルコシド系界面活性剤（n-Octyl-β-D-glucosideともいう）と１Ｗ％トリトンX-100を使用し、比較対象としてＰＫＡ酵素のみの反応アレイと、PKA酵素添加系細胞抽出液と反応後、洗浄液による洗浄有り／無しのアレイを準備し、ポジコントロール、基質リン酸化シグナルとネガコントロールの差で洗浄の効果を確認した。次に洗浄効果の認められた界面活性剤を用い洗浄方法の検討を行う。洗浄方法としては、室温１５分侵漬洗浄、３０℃１５分侵漬洗浄、室温１５分超音波洗浄したアレイを準備し、洗浄方法の違いによる洗浄効果を比較した。超音波洗浄は市販超音波洗浄器を使用する。超音波洗浄中に洗浄液の液温が２５℃以上にならないよう液温を調整した。
【００４５】
１−５−２．親水部に鎖鎖を持つ界面活性剤の洗浄効果
非イオン製界面活性剤、及び非イオン製界面活性剤の内でも親水部に糖鎖を持つ構造の洗浄効果の有効性を確認する為、両性、陰性、非イオン性併せて代表的な６種類の１Ｗ％界面活性剤含有洗浄液を準備し、PKA酵素添加系細胞抽出液と反応させたアレイを室温で１５分超音波洗浄した。アレイの洗浄効果は、ポジコントロール、基質リン酸化シグナルとネガコントロールの差で見た。
【００４６】
１−６．ＳＰＲ測定
上記洗浄により準備したアレイをＳＰＲ装置（東洋紡製）に装着した。PKA酵素によるリン酸化シグナルは、ペプチドを固定したアレイとビオチン付加亜鉛キレ−ト剤ＢＴＬ１０４（ナード製）と６０分反応させ、次にストレプトアビジン（Vector製）、抗ストレプトアビジン抗体（BMD製）と反応させ検出した。
【００４７】
１−７．ＳＰＲ測定結果
１−７−１．界面活性剤による洗浄方法の検討結果
ＰＫＡ酵素反応アレイ、及びPKA酵素添加系ライセ−ト反応アレイでライセ−ト反応後にオクチルグルコシド系界面活性剤、又はトリトンＸ−１００で洗浄したアレイのＳＰＲ測定結果を図２に示す。横軸はアレイにスポットしたペプチド濃度、縦軸はＳＰＲシグナルを示す。（菱印はポジコントロ−ルのリン酸化シグナル、丸印は基質のリン酸化シグナル、四角印はネガコントロ−ルのリン酸化シグナルを示す）
【００４８】
結果より、PKA酵素添加系ライセ−ト反応アレイでは、オクチルグリコシド系界面活性剤による洗浄効果が認められ、基質リン酸化シグナルとネガコントロ−ルシグナルの有意な差が認められる。但しライセートを含まないPKA酵素反応アレイと比較すると、基質リン酸化シグナルとネガコントロールシグナルのＳ／Ｎは小さい。
【００４９】
次に、オクチルグリコシド系界面活性剤を用いた洗浄方法の検討結果を図３に示す。結果より、洗浄液の液温が上がるとポジコントロ−ルも含めシグナル全体が下がる。アレイを超音波洗浄することで、基質リン酸化シグナルとネガコントロ−ルシグナルのＳ／Ｎはよくなり、PKA酵素反応アレイのＳ／Ｎと同程度となる。よってアレイ表面の非特異的吸着の洗浄が十分であったと言える。
【００５０】
１−７−２．親水部に鎖鎖を持つ界面活性剤の洗浄効果
市販界面活性剤の種類によるアレイ洗浄とリン酸化シグナルの結果を図４に示す。結果から、陰イオン性界面活性剤と両性界面活性剤では、ポジコントロールを含めたシグナル全体が低下したり、基質シグナルとネガコンシグナルとの有意差がないなど、洗浄効果より弊害の方が目立った。洗浄効果は非イオン性界面活性剤で大きかった。しかも基質リン酸化シグナルとネガコントロールシグナルのS/N比で見ると、新水基に糖鎖を持つ非イオン性界面活性剤の方が、持たない物よりS/N比はよかった。オクチルグリコシド系界面活性剤や親水基がスクロ−ス、親油基がラウリル酸で構成されたサクロースモノラウレートでの洗浄効果が高かった。
【００５１】
実施例２
次に薬剤であるＮＧＦ刺激を与えたライセートとアレイを反応させ、親水部に糖鎖を持つ非イオン製界面活性剤含有洗浄液や洗浄方法が、薬剤刺激による基質のリン酸化反応シグナルを得るのにどの程度効果があるかを確認した。
【００５２】
２−１．細胞抽出液調製
ＰＣ−１２細胞を培養した。培養した細胞のｍｅｄｉｕｍを捨て、薬剤（１００ｎｇ／ｍｌ  ＮＧＦ）を含むｍｅｄｉｕｍに交換する。１５分後ｍｅｄｉｕｍを捨てＰＢＳで２回洗浄する。以下実施例１で示した手順と同様に行った。
【００５３】
２−２．細胞抽出液反応
薬剤刺激を与えたライセート４０μｌを専用希釈液３６０μｌに溶かした後、アレイ表面に滴下し３０℃で２時間反応させた。比較対照として、薬剤刺激無しのライセートも同様な方で調製し、同一条件で反応させた。
【００５４】
２−３．アレイ洗浄
アレイをオクチルグルコシド系界面活性剤で、室温１５分超音波洗浄した後、ＳＰＲ測定した。超音波洗浄器は、ＢＲＡＮＳＯＮ製で型式Ｂ１５１０３−ＭＴ（９０Ｗ）のものを用いた。
【００５５】
２−４．ＳＰＲ測定結果
薬剤刺激を与えたライセ−ト、及び薬剤刺激無しのライセ−トでの、アレイ洗浄によるリン酸化シグナルの効果を図５に示す。これまでＮＧＦによる薬剤刺激により細胞抽出液中のPKA酵素が活性化され、文献などではELISA法による検出では基質のリン酸化シグナルが得られた。今回ＳＰＲ用アレイで同様な検討を実施し、アレイ洗浄により基質のリン酸化シグナルとネガコントロールの有意な差が認められ、薬剤刺激有り無しによるPKA酵素活性の差が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の方法により、薬剤刺激を与えたガン細胞からの抽出液と、コントロールとして与えないガン細胞抽出液からの様々なプロテインキナーゼによるリン酸化シグナルの網羅的解析により、薬剤効果のスクリーニングが可能となる。結果、創薬開発のツ−ルとして有用なバイオチップとして大きく寄与することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＳＰＲ装置の構成図を示す。
【図２】非イオン製界面活性剤で親水部に糖鎖を持つ化合物と糖鎖を持たない化合物でアレイ洗浄効果の違いを示す。
【図３】洗浄方法で超音波洗浄の有効性を示す。
【図４】界面活性剤の中で、両性、陰イオン性界面活性剤や糖鎖を持たない非イオン界面活性剤との比較で、糖鎖を持つ非イオン性界面活性剤のアレイ洗浄効果を示す。
【図５】薬物刺激を与えたライセートで、プロテインキナーゼAによるリン酸化シグナル検出において、糖鎖を持つ非イオン性界面活性剤を用いた超音波洗浄の有効性を示す。
【符号の説明】
【００５８】
１    ハロゲンランプ
２    平凸レンズ  
３    平凸レンズ  
４    ピンホール  
５    平凸レンズ
６    近赤外偏光フィルタ  
７    ６０°プリズム  
８    フローセル    
９    干渉フィルタ（８３０ｎｍ）  
１０  ＣＣＴＶレンズ
１１  ＣＣＤカメラ  
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【配列表】
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