(57)【要約】【課題】ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の複製能を抑制し、弱毒化ワクチンを提供する。【解決手段】ＭＩＥ遺伝子プロモーターのシス作用性エレメント（ｃｒｓ）配列の一部に突然変異を有し、これによってウイルス複製が不能ではないが抑制されていること、および野生型の表現型と同一または本質的に同一であることを特徴とする、弱毒化組換えヒトサイトメガロウイルス、このウイルスを含むワクチン、ならびに弱毒化組換えＨＣＭＶの製造方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＩＥ遺伝子プロモーターのシス作用性エレメント（ｃｒｓ）配列の一部に突然変異を有し、これによってウイルス複製が不能ではないが抑制されていること、および野生型の表現型と同一または本質的に同一であることを特徴とする、弱毒化組換えヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）。
【請求項２】
前記ｃｒｓ配列が、ＨＣＭＶの野生型ｃｒｓ配列との同一性が３０〜８０％である突然変異を有する、請求項１記載の組換えヒトサイトメガロウイルス。
【請求項３】
前記ｃｒｓの突然変異が、ＨＣＭＶ感染初期で、ＨＣＭＶのＩＥ８６タンパク質の発現の低下を引き起こす、請求項１または２記載の組換えヒトサイトメガロウイルス。
【請求項４】
前記ｃｒｓの突然変異が、ＨＣＭＶ感染初期で、ＨＣＭＶのＩＥ７２タンパク質の発現の低下をさらに引き起こす、請求項３記載の組換えヒトサイトメガロウイルス。
【請求項５】
前記ｃｒｓの突然変異が、マウスＣＭＶのｃｒｓ配列によるＨＣＭＶの野生型ｃｒｓ配列の置換に基づく、請求項１〜４のいずれか１項記載の組換えヒトサイトメガロウイルス。
【請求項６】
前記マウスＣＭＶのｃｒｓ配列が、５'−ｃｃｃａｇｃｇｔｃｇｇｔａｃｃｇ−３'（配列番号１）を含む、請求項５記載の組換えヒトサイトメガロウイルス。
【請求項７】
前記ウイルス複製が、ＨＣＭＶの野生型と比べて１／１０〜１／５０またはそれ以下に抑制されている、請求項１〜６のいずれか１項記載の組換えヒトサイトメガロウイルス。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の弱毒化組換えヒトサイトメガロウイルスを含むことを特徴とする、ＨＣＭＶ感染症を治療または予防するためのワクチン。
【請求項９】
賦形剤をさらに含む、請求項８記載のワクチン。
【請求項１０】
アジュバントをさらに含む、請求項８または９記載のワクチン。
【請求項１１】
ＨＣＭＶゲノムのＭＩＥ遺伝子プロモーターのシス作用性エレメント（ｃｒｓ）配列の一部に突然変異を導入すること、およびウイルス複製が不能ではないが抑制されている、かつ、野生型の表現型と同一または本質的に同一である突然変異ウイルスを選択し、該ウイルスを回収することを含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の弱毒化組換えヒトサイトメガロウイルスの作製方法。
【請求項１２】
前記突然変異が、突然変異誘発法によって導入される、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱毒化組換えヒトサイトメガロウイルス、該ウイルスの作製方法、ならびに該ウイルスを含むワクチンを提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、β−ヘルペスウイルス亜科に属するメンバーであり、多くのヒトに無症候的に感染し、健常人に対しては臨床障害をもたらす可能性は少ないが、ＡＩＤＳ患者、臓器移植患者などの免疫抑制患者、乳幼児、高齢者、重症患者などの抵抗性が低下したヒトに対し、肺炎、肝炎、網膜炎、胃腸炎などを含む広範な疾患を引き起こす。しかし、ＨＣＭＶ感染について、その潜伏期から発病へスイッチする機序は明らかになっていない（非特許文献１および２）。
【０００３】
ＨＣＭＶゲノムは、約２３０キロベース（ｋｂ）の二本鎖ＤＮＡからなり、エンベロープによってパッケージングされ、それによってＨＣＭＶの感染性粒子が形成される。ＨＣＭＶ遺伝子は、前初期（ＩＥ；ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子、初期（Ｅ；ｅａｒｌｙ）遺伝子および後期（Ｌ；ｌａｔｅ）遺伝子と称する３つの種類の遺伝子群に分類される。特に、ＩＥ遺伝子は、該ウイルスが宿主細胞に入った後で発現され、ＭＩＥ（主要前初期；ｍａｊｏｒ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）プロモーターを含むエンハンサー内に特異的シス（ｃｉｓ）作用性エレメントを必要とする（非特許文献３）が、このエレメントの働きは不明であった。ＩＥ遺伝子からは、ＩＥ１（ＵＬ１２３）およびＩＥ２（ＵＬ１２２）と称する２つのＩＥ転写体が転写される。ヒトＣＭＶのＩＥ１およびＩＥ２遺伝子はそれぞれＩＥ７２タンパク質およびＩＥ８６タンパク質をコードしており、これらのタンパク質は、後続のウイルス遺伝子発現の調節のために重要である。すなわち、ＩＥ７２タンパク質は、低い感染多重度（ＭＯＩ）で効率的なウイルス複製に寄与する（非特許文献４および５）。また、ＩＥ８６タンパク質は、初期のウイルス遺伝子発現に必須である（非特許文献６）。
【０００４】
ＭＩＥプロモーターは、転写開始部位を＋１とするとき、−２８から−２２の間にＴＡＴＡボックス、−１５（または−１３）から＋１の間にシス作用性エレメント配列、および＋１から＋７の間にイニシエーター様配列を含む（非特許文献７）。ＩＥ８６タンパク質は、ＤＮＡの配列および位置依存的な様式で上記シス作用性エレメントに結合することによって、ＭＩＥプロモーターを負に自己調節する（非特許文献８〜１０）。ＩＥ８６タンパク質はまた、ＤＮＡ鋳型のマイナーなグローブコンタクトを利用してダイマーとしてシス作用性エレメントに結合する（非特許文献１１および１２）。さらに、ＭＩＥプロモーターのシス作用性エレメント特異的抑制には、ＩＥ８６タンパク質のカルボキシル末端部分のみが必要であることも知られている（非特許文献１３）。
【０００５】
本発明者らは、今回、天然型と異なる配列によって置換されたシス作用性エレメントを含む組換えＨＣＭＶを構築し、シス作用性エレメントの機能を検討し、その結果、シス作用性エレメントが、ＴＢＰ−ＴＦＩＩＢ−ＤＮＡ複合体の安定化と、ＩＥプレｍＲＮＡの有効なスプライシングとによって、ヒトＣＭＶ感染の初期段階で、主要ＩＥ遺伝子の転写を容易にすることを見出した。シス作用性エレメントは感染初期で主要ＩＥ遺伝子発現を促進したのち、感染後期で、主要ＩＥ遺伝子転写の抑制のためにＩＥ８６タンパク質と結合するので、以下においては、このシス作用性エレメントをシス調節配列（ｃｒｓ；ｃｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と称する。
【０００６】
本発明者らはまた、今回、ＨＣＭＶを弱毒化したウイルス粒子がワクチンとして使用できることを見出したが、ＨＣＭＶ粒子のワクチンとしての使用については、従来、例えばＨＣＭＶ感染後に遊離されるウイルス粒子であって、ウイルス性ＤＮＡおよびカプシドを含有せず、かつウイルス性グリコプロテインの変異体を含む該ウイルス粒子をワクチンとして使用することが開示されている（特許文献１）。
【特許文献１】特表2002-537830号公報
【非特許文献１】Britt, W.J.およびAlford, C.A. (1996) In B.N. Fields, D.M. Knipe およびP.M. Howley(編), Fields Virology, 3版, Lippencott-Raven publishers, Philadelphia, Pa.:2493-2523, 1981-2010
【非特許文献２】Ho, M. (1991) Plenum Publishing Corp., New York
【非特許文献３】Isomura, H.ら(2005) J. Virol. 79:9597-9607
【非特許文献４】Gawn, J.M.およびGreaves, R.F. (2002) J. Virol. 76:4441-4455
【非特許文献５】Greaves, R.F.およびMocarski, E.S. (1998) J. Virol. 72:366-379
【非特許文献６】Marchini, A.ら(2001) J. Virol. 75:1870-1878
【非特許文献７】Macias, M.P.ら(1996) J. Virol. 70:3628-3635
【非特許文献８】Cherrington, J.ら(1991) J. Virol. 65:887-896
【非特許文献９】Liu, B.ら(1991) J. Virol. 65:897-903
【非特許文献１０】Pizzorno, M.C.およびHayward, G.S. (1990) J. Virol. 64:6154-6165
【非特許文献１１】Waheed, Iら(1998) Virology 252:235-257
【非特許文献１２】Lang, D.ら(1992) Nucleic Acids Res. 20:3287-3295
【非特許文献１３】Hernandez, N. (1993) Genes Dev. 7:1291-1308
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、複製能が抑制された組換えヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）を提供することである。この組換えＨＣＭＶは、ＨＣＭＶ感染症を治療または予防するためのワクチンとして利用可能である。
【０００８】
本発明の別の目的は、上記組換えＨＣＭＶを作製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＨＣＭＶゲノム上のＭＩＥ遺伝子プロモーターのシス作用性エレメント（ｃｒｓ）配列の一部に突然変異を導入したとき、野生型と同一の表現型を有する一方で、野生型と比べて複製能が完全には抑制されないが１／１０以下に抑制されるという特徴を有する、弱毒化ワクチンとして使用可能な組換えＨＣＭＶを見出した。
【００１０】
したがって、本発明は、以下の特徴を有する。
本発明は、第１の態様において、ＭＩＥ遺伝子プロモーターのシス作用性エレメント（ｃｒｓ）配列の一部に突然変異を有し、これによってウイルス複製が不能ではないが抑制されていることを特徴とする、弱毒化組換えヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）を提供する。
【００１１】
本発明の実施形態において、前記ｃｒｓ配列が、ＨＣＭＶの野生型ｃｒｓ配列との同一性が約３０〜約８０％である突然変異を有するものである。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、前記ｃｒｓの突然変異が、ＨＣＭＶ感染初期で、ＨＣＭＶのＩＥ８６タンパク質の発現の低下を引き起こすものである。
【００１３】
本発明の別の実施形態において、前記ｃｒｓの突然変異が、ＨＣＭＶ感染初期で、ＨＣＭＶのＩＥ７２タンパク質の発現の低下をさらに引き起こすものである。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、前記ｃｒｓの突然変異が、マウスＣＭＶのｃｒｓ配列によるＨＣＭＶの野生型ｃｒｓ配列の置換に基づくものである。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、前記マウスＣＭＶのｃｒｓ配列が、５'−ｃｃｃａｇｃｇｔｃｇｇｔａｃｃｇ−３'（配列番号１）を含む。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、前記ウイルス複製が、ＨＣＭＶの野生型と比べて１／１０〜１／５０またはそれ以下に抑制されている。
【００１７】
本発明はまた、第２の態様において、上記の弱毒化組換えヒトサイトメガロウイルスを含むことを特徴とする、ＨＣＭＶ感染症を治療または予防するためのワクチンを提供する。
【００１８】
本発明の実施形態において、前記ワクチンは賦形剤をさらに含む。
本発明の実施形態において、前記ワクチンはアジュバントをさらに含む。
【００１９】
本発明はまた、第３の態様において、ＨＣＭＶゲノムのＭＩＥ遺伝子プロモーターのシス作用性エレメント（ｃｒｓ）配列の一部に突然変異を導入すること、およびウイルス複製が不能ではないが抑制されている、かつ、野生型の表現型と同一または本質的に同一である突然変異ウイルスを選択し、該ウイルスを回収することを含む、弱毒化組換えヒトサイトメガロウイルスの作製方法。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、前記突然変異が突然変異誘発法によって導入される。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、ＨＣＭＶのＭＩＥ遺伝子プロモーターのシス作用性エレメント（ｃｒｓ）配列の一部に突然変異を導入することによって、ＨＣＭＶの複製能を著しく抑制できる。本発明の組換えＨＣＭＶは、野生型と比べて表現型が同一または本質的に同一である一方、ウイルス複製能が約１／１０以下に抑制されているため、感染性や病原性または再活性化のリスクが非常に低い弱毒化ＨＣＭＶである。また、ウイルス複製が完全に不能となっていないため、弱毒化ウイルスの産生も可能であることから、ワクチンとして使用したときに、免疫誘導が持続的となり、効率的な免疫化が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本明細書で使用する用語は、以下の定義を包含する。
「ヒトサイトメガロウイルス」または「ＨＣＭＶ」は、β−ヘルペスウイルス亜科に属するウイルスの１種であり、本発明ではすべての天然型およびそれらの変異型、ならびにそれらのすべての型（ｔｙｐｅ）およびそれらのすべての亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）を包含するものとする。ＨＣＭＶのゲノムは約２３０ｋｂの二本鎖ＤＮＡからなり、その全ゲノム配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ等の配列データベースから入手可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＣ＿００１３４７；ＡＹ３１５１９７；ＡＹ４４６８９４など）。さらに、本明細書で使用される「組換えＨＣＭＶ」は、ＭＩＥプロモーター内のシス作用性エレメントの一部に突然変異を誘発させ、これによってウイルスの遺伝子型が変化する一方で、表現型は野生型と同一または本質的に同一である、遺伝子工学的に組換えられたウイルスである。
【００２３】
「ＭＩＥ遺伝子」は、ＨＣＭＶが感染宿主細胞に入った後で転写、発現される遺伝子であり、この遺伝子からＩＥ１（ＵＬ１２３）およびＩＥ２（ＵＬ１２２）と称する２つのＩＥ転写体が形成される。ヒトＣＭＶのＩＥ１およびＩＥ２遺伝子はそれぞれＩＥ７２タンパク質およびＩＥ８６タンパク質をコードしており、これらのタンパク質は、後続のウイルス遺伝子発現の調節のために重要である。ＩＥ７２タンパク質は、低い感染多重度（ＭＯＩ）で効率的なウイルス複製に寄与する。また、ＩＥ８６タンパク質は、初期のウイルス遺伝子発現に必須である。このため、ＨＣＭＶのＭＩＥ遺伝子は、ウイルス複製の効率を決定する重要な役割を果たしていると考えられる（非特許文献４〜６）。
【００２４】
ＨＣＭＶの「ＭＩＥプロモーター」は、転写開始部位を＋１とするとき、−２８から−２２の間にＴＡＴＡボックス、−１５（または−１３）から＋１の間にシス作用性エレメント（ｃｒｓ）配列、および＋１から＋７の間にイニシエーター様配列を含む（非特許文献７）。野生型のＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株のｃｒｓ配列は、例えば５’−ｃｔｃｇｔｔｔａｇｔｇａａｃｃｇ−３’（配列番号２）である。
【００２５】
「突然変異」なる用語は、野生型のＨＣＭＶのｃｒｓ配列について、その配列に置換、欠失、挿入、付加、あるいはそれらの組み合わせなどの変異が導入されることを意味する。本発明では、この突然変異の導入によって、組換えＨＣＭＶの複製能が約１／１０以下に抑制される。
【００２６】
「ウイルス複製が不能ではないが抑制されている」なる用語は、完全に複製不能にならない程度に、ウイルス複製が抑制されていることを意味する。これによって、組換えＨＣＭＶは、感染および病原性のリスクを大きく減弱させる一方で、ウイルスの産生が可能であるため、ワクチンとして使用できる。
【００２７】
「弱毒化」なる用語は、ウイルスの毒性（すなわち、感染性および病原性）を減弱することを意味する。
【００２８】
本明細書で使用される「同一性」なる用語は、ＨＣＭＶの野生型と組換え型との間のｃｒｓ配列の同一性に関して使用される用語である。この用語は、野生型ｃｒｓ配列の全塩基数に対する、組換え型ｃｒｓ配列のうち野生型と同一の塩基数のパーセンテージである。
【００２９】
以下において、本発明をさらに詳細に説明する。
１．弱毒化組換えＨＣＭＶの特性
本発明の弱毒化組換えＨＣＭＶは、上述したとおり、ＭＩＥ遺伝子プロモーターのシス作用性エレメント（ｃｒｓ）配列の一部に突然変異を有し、これによってウイルス複製が不能ではないが抑制されていること、および野生型の表現型と同一または本質的に同一であることを特徴とする。
【００３０】
本発明におけるｃｒｓは、ＭＩＥ遺伝子プロモーター内に存在し、具体的には、ＭＩＥ遺伝子の転写開始部位（＋１位）と-１５位との間に位置する。野生型のヒトＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ）、サルＣＭＶおよびマウスＣＭＶの各ｃｒｓ配列は、それぞれ以下のとおりである(図１（ａ）参照)。
５’−ｃｔｃｇｔｔｔａｇｔｇａａｃｃｇ−３’（配列番号２）
５’−ｃｔｃｇｔｔｔａｇｇｇａａｃｃｇ−３’（配列番号３）
５'−ｃｃｃａｇｃｇｔｃｇｇｔａｃｃｇ−３'（配列番号１）
ヒトとサルのｃｒｓ配列は、-６位の１塩基に違いがあるだけであるが、ヒトとマウスのｃｒｓ配列間には、９塩基の違いが存在する。
【００３１】
後述の実施例で実証するように、野生型ｃｒｓ配列を突然変異すると、ＭＩＥ遺伝子転写体のレベルが約１／１０以下に顕著に減少することから、ｃｒｓは、ＣＭＶ感染の初期段階でＭＩＥプロモーターからのＭＩＥ遺伝子の転写を容易にする（または、促進する）はたらきを有することが今回判明した。
【００３２】
また、野生型ｃｒｓ配列を含むＨＣＭＶと、突然変異ｃｒｓ配列を含むＨＣＭＶを、初代ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）に感染し、該ｃｒｓ配列がプレｍＲＮＡのスプライシングに及ぼす影響を調べた結果、野生型ｃｒｓ配列を含むＨＣＭＶでは、ＭＩＥ遺伝子のエクソン２とエクソン３の間およびエクソン３とエクソン４の間のプレｍＲＮＡのスプライス形態が高い割合で形成されるのに対して、突然変異ｃｒｓ配列を含むＨＣＭＶでは、逆に非スプライス形態が高い割合で検出された。このことから、ＭＩＥ遺伝子の転写において、ｃｒｓがプレｍＲＮＡのスプライシングに何らかの影響を及ぼしていることが判った。
【００３３】
さらにまた、ＨＣＭＶの野生型ｃｒｓを含むＭＩＥプロモーターにＴＦＩＩＢタンパク質（すなわち、ＴＡＴＡエレメントのＴＢＰの結合を安定化するタンパク質）が配列特異的に結合してＭＩＥ遺伝子の転写を開始するが、このときＴＦＩＩＢは、ＴＡＴＡボックスを認識するＴＢＰ（ＴＡＴＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質と結合して複合体を形成するため、該転写を開始する時にはＴＢＰ−ＴＦＩＩＢ−ＤＮＡ複合体が形成される。今回、ｃｒｓを含むＴＡＴＡエレメントがＴＢＰ−ＴＦＩＩＢ−ＤＮＡ複合体の形成に対し２〜３倍高い親和性を示したことから、野生型ｃｒｓはＤＮＡ鋳型上で該複合体の形成を安定化することが判明した。
【００３４】
このように、ＨＣＭＶの野生型ｃｒｓは、感染の初期段階で、効率的なＭＩＥ遺伝子の転写とプレｍＲＮＡのスプライシングのための転写開始複合体の形成を容易にする機能をもつことが判った。
【００３５】
したがって、ＨＣＭＶの野生型ｃｒｓ配列に、その配列との同一性が約２５〜約９０％、好ましくは約３０〜約８０％、さらに好ましくは約３０〜約５０％、最も好ましくは約３０％〜約４５％となる範囲内で突然変異を導入するときには、ＨＣＭＶの複製が約１／１０以下、例えば約１／１０〜約１／２０またはそれ以下、あるいは約１／１０〜約１／３０またはそれ以下、あるいは約１／１０〜約１／４０またはそれ以下、あるいは約１／１０〜約１／５０またはそれ以下に抑制される。
【００３６】
本発明において、突然変異は、好ましくは、ＨＣＭＶの野生型ｃｒｓ配列（−１５位〜＋１位）の１６塩基のうち２〜９個の塩基の変異を含むことができる。突然変異は、塩基の置換、欠失または付加（もしくは挿入）からなる変異である。塩基置換による変異の場合、野生型ｃｒｓ配列において、例えば、＋１、−１、−２、−３、−５および−１３位の塩基を保存しながら、それ以外の塩基を、Ｃ、Ｔ、ＧおよびＡから選ばれる野生型と異なる塩基によって置換することができる。例えば、後述の実施例で例証するように、ＨＣＭＶの野生型ｃｒｓ配列を、マウスＣＭＶｃｒｓ配列（配列番号１）によって置換するときには、ウイルス複製が約１／１０〜約１／２０以下に低下した。これに対して、該野生型ＨＣＭＶｃｒｓ配列を、サルＣＭＶｃｒｓ配列（配列番号３；野生型ＨＣＭＶｃｒｓ配列と１塩基の違い）によって置換したときには、野生型と同等の複製を示し、実質的な複製の抑制が認められなかった。
【００３７】
本発明において、ウイルスの複製は、完全に不能になるように抑制されないが、感染後に非効率的なあるいはかなり遅い速度でのウイルス複製が起こる。これは、ウイルス複製に関与するＩＥ８６およびＩＥ７２タンパク質の発現レベルの対野生型の約１／２〜約１／５またはそれ以下の低下とも関係している。
【００３８】
本発明の組換えＨＣＭＶは、上記のとおり、その複製が野生型と比べて約１／１０以下、好ましくは約１／２０またはそれ以下に抑制されているため、結果として感染性および病原性からなる毒性が著しく減弱、すなわち弱毒化されているという特徴を有している。これに加えて、本発明の組換えＨＣＭＶは、野生型と同一のまたは本質的に同一の表現型を有している。ここで、「本質的に同一」とは、組換えＨＣＭＶをワクチンとして使用したときに、その効能に影響を及ぼさない程度のマイナーな表現型の変化を含んでもよいことを意味する。それゆえに、本発明の組換えＨＣＭＶは、後述するように、ＨＣＭＶに関連する疾患を予防または治療するために有効に使用可能である。
【００３９】
２．弱毒化組換えＨＣＭＶの作製
本発明の組換えＨＣＭＶは、ＨＣＭＶゲノムのＭＩＥ遺伝子プロモーターのｃｒｓ配列の一部に突然変異を導入すること、およびウイルス複製が不能ではないが抑制されている、かつ、野生型の表現型と同一または本質的に同一である突然変異ウイルスを選択し、該ウイルスを回収することを含む方法によって作製することができる。
【００４０】
ＨＣＭＶは、ヘルペスウイルス科βヘルペスウイルス亜科に属する、直径約１８０ｎｍ、約２３０ｋｂｐからなる二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＨＣＭＶの株には、ＡＤ１６９株，Ｔｏｗｎｅ株，Ｍａｊｏｒ株，ＢＴ１９４３株，Ｄａｖｉｓ株，Ｍｅｒｌｉｎ株，Ｔｏｌｅｄｏ株，３１５７株，６３９７株，３３０１株などが知られている（Ｄｏｌａｎ，Ａ．ら（２００４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８５：１３０１−１３１２；Ｃｈｅｅ，Ｍ．Ｓ．ら（１９９０）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１２５−１６９）。ＨＣＭＶは、ヒト線維芽細胞、例えばヒト包皮線維芽（ＨＦＦ）細胞、ヒト胎児線維芽細胞などに感染することができる。
【００４１】
本発明の組換えＨＣＭＶは、野生型ＨＣＭＶのＭＩＥ遺伝子プロモーターのｃｒｓ配列の一部に突然変異を導入したゲノムＤＮＡを、適当なベクターを利用して作製し、これを適当な宿主細胞に感染し、組換えウイルス粒子を回収することを含む手順によって作製することができる。
【００４２】
突然変異は、例えば突然変異誘発法、好ましくはＰＣＲを利用した部位特異的突然変異誘発法によって導入しうる。
【００４３】
部位特異的突然変異誘発法は、例えば、野生型ＨＣＭＶのＭＩＥ遺伝子プロモーターのｃｒｓ配列の一部に突然変異を導入し、それに隣接して野生型と同一の十分な長さの配列を配置したヌクレオチド配列を合成し、サブクローニングベクターに導入してサブクローニングすること、野生型ＨＣＭＶゲノムＤＮＡを含む人工染色体ベクター、例えば細菌人工染色体を作製すること、上記ヌクレオチド配列を人工染色体ベクターにアニーリングし、ＰＣＲを行ない、目的ＤＮＡを増幅することを含む（西郷薫および佐野弓子訳、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓコンパクト版  分子生物学実験プロトコールＩ、丸善、１９９７年）。
【００４４】
具体的な方法は以下のとおりである。
大腸菌内でバクテリオファージλ組換えタンパク質ｅｘｏ、ｂｅｔａおよびｇａｍを発現するための迅速相同組換え系（Ｅｌｌｉｓ，  Ｈ．Ｍ．ら（２００１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：６７４２−６７４６）、ならびにＨＣＭＶ  のＢＡＣ  (細菌人工染色体;ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ)ＤＮＡ（Ｄｕｎｎ，Ｗら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：１４２２３−１４２２８；Ｌｅｅ，  Ｅ−Ｃ．ら（２００１）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ７３：５６−６５；Ｂｏｒｓｔ，Ｅ−Ｍら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（１０）：８３２０−８３２９など）を使用して突然変異誘発を行うことができる。
【００４５】
組換えのためのＨＣＭＶの二本鎖ＤＮＡは、カナマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子と７０ｂｐ程度の相同ウイルスＤＮＡ配列を含み、この耐性遺伝子には、３４ｂｐの最小ＦＲＴ部位（配列番号４）をフランキングさせる。ｃｒｓ配列の突然変異体を作製するために、後述の実施例中の表１に記載のプライマー対として、ＢＡＣ  ｃｒｓ＋ＦＲＴＦ、ＢＡＣｓｉｍｉａｎ ｃｒｓ＋ＦＲＴＲ、ＢＡＣｍｕｒｉｎｅ ｃｒｓ＋ＦＲＴＲおよびＢＡＣｃｒｓｍｕｔ＋ＦＲＴＲを使用し、ＰＣＲによる増幅を行う。ＰＣＲ条件は、例えば、９４℃２分の変性の1サイクル、９４℃１５秒の変性、５５℃30秒のアニーリングおよび７２℃５分の伸長の４０サイクル、７２℃７分または９４℃２分の１サイクル、９４℃２分、５５℃２分および７２℃２分の３０サイクル、７２℃７分の１サイクルからなる。ＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出し、９５％エタノールで沈澱する。
【００４６】
残存する鋳型ＤＮＡを除くために、ＰＣＲ産物を、制限酵素（ＤｐｎＩ）を用いて消化したのち、得られたＤＮＡ断片を、ＨＣＭＶ-ＢＡＣ  ＤＮＡを含むコンピテント大腸菌(例えばＥ  ｃｏｌｉ  ＤＹ３８０)中へエレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム法などの手法、好ましくはエレクトロポレーションを用いて形質転換する。エレクトロポレーションは、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩＩ（２．５ｋＶ，２００Ωおよび２５μＦ）またはＢＴＸ  ＥＣＭ  ８３０  エレクトロポレーター（３ｋＶ，１００μｓ，１０パルス）を使用して行うことができる。
【００４７】
カナマイシン耐性遺伝子を欠失するために、組換えＨＣＭＶ-ＢＡＣ  ＤＮＡを大腸菌に形質転換する。また、リコンビナーゼを発現するプラスミドｐＣＰ２０（Ｈａｈｎ，Ｗ．ら（２００３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３０７：１６４−１７７）を、組換えＨＣＭＶ-ＢＡＣ  ＤＮＡを含む大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）に形質転換する。カナマイシン耐性遺伝子を含まないヒトＣＭＶ-ＢＡＣ  ＤＮＡを、アンピシリンおよびクロラムフェニコール含有のＬＢプレート上で選択する。
【００４８】
ＨＦＦ細胞を、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂのリン酸カルシウム沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６−４６７）によって、プラスミドｐＳＶｐｐ７１の存在中、上記の各組換えＢＡＣでトランスフェクションする。約１０日後に、ウイルスプラークが出現し、１００％細胞変性作用（ＣＰＥ）の７日後に、細胞外液を回収し、約１：１０に希釈したものと未希釈のものを調製し、ＨＦＦ細胞に感染し、組換えウイルスを回収する。
【００４９】
このとき、ウイルスの選択は、ｃｒｓ配列に目的の変異が導入されていることを配列分析によって確認すること、ＨＦＦ細胞に導入または感染させて複製が不能ではないが抑制されている、すなわち複製が野生型の約１／１０以下であることを確認すること、ならびに、野生型の表現型と同一または本質的に同一であることを確認することによって行うことができる。
【００５０】
３．弱毒化組換えＨＣＭＶを含むワクチン
本発明はさらに、上で説明した弱毒化組換えＨＣＭＶを含むことを特徴とする、ＨＣＭＶ感染症を治療または予防するためのワクチンを提供する。
本発明のワクチンは、ＡＩＤＳ患者、臓器移植患者などの免疫抑制患者、胎児、乳幼児、高齢者、重症患者などの抵抗性が低下したヒトに対し、肺炎、肝炎、網膜炎、胃腸炎などを含む広範な疾患を引き起こす可能性のあるＨＣＭＶ感染の予防および治療のために使用可能である。ＨＣＭＶは、血液、尿、唾液などを介して感染するウイルスであり、上記のヒトに感染すると、重症になる場合がある。そのような感染を抑制するために、本発明のワクチンは有効である。
【００５１】
ワクチンは、適当な賦形剤、特に希釈剤、例えば滅菌水、生理食塩水、リンゲル液、緩衝液などに処方されうる。希釈剤には、ブドウ糖、トレハロース、エタノール、グリセリンなどの添加剤を含有させることができる。また、免疫力を向上させるためのアジュバント、例えば水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）、ムラミルジペプチドなどを含有させてもよい。
【００５２】
投与方法は、例えば皮下、筋肉内または皮内注射、鼻腔内などの粘膜投与などを含む。鼻腔内投与の場合、噴霧器による投与が好ましい。
【００５３】
投与量は、例えば１０3〜１０11ＰＦＵウイルス／ｋｇ体重の用量であるが、この範囲に制限されない。ワクチンの投与量は、患者などの受容者の状態、例えば年齢、体重、性別、重症度などを考慮に入れて、医師の裁量で判断されるべきである。受容者は、１回又は２回以上の投薬を受容でき、複数回投与の場合、１週間〜１か月以上の間隔、例えば２，３，６，１２，１８又は２４か月間隔で投与しうる。
【００５４】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【００５５】
材料および方法
細胞およびウイルス：
初代ヒト包皮線維芽（ＨＦＦ）細胞を、従来記載のように維持した（Ｓｔｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｆ．（１９７８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２６：６８６−７０１）。野生型（ｗｔ）ヒトＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅおよび組換えウイルスのウイルス力価を、従来記載のように、ＨＦＦ細胞での標準プラークアッセイによって測定した（Ｍｅｉｅｒ，Ｊ．Ｌ．およびＳｔｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｆ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２４６−１２５５）。組換えウイルスの力価は、記載されるようにして、野生型ウイルスに対して標準化した（Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｈ．ら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１２７８８−１２７９９）。導入したウイルスＤＮＡの相対量は、従来記載のものと同様にした（Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｈ．ら（２００４），上記）。
【００５６】
プラスミド構築：
ｐＣＡＴｗｔ  ｃｒｓは、従来記載されたｐＣＡＴＴＡＴＡ＋Ｓｐｌ（−５５）＋Ｓｐｌ（−７５）と同じである（非特許文献３）。ｐＣＡＴｍｕｒｉｎｅ ｃｒｓのプラスミドは、ｐＣＡＴｗｔ  ｃｒｓのｃｒｓ配列を突然変異するために構築された。突然変異誘発は、製造者の使用説明書にしたがって、Ｑｕｉｋ  ＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）によって行った。突然変異誘発のプライマー対は、表１に記載のＩＥ１Ｅｍｕｒｉｎｅ ｃｒｓＦおよびＩＥ１ＥＭｍｕｒｉｎｅ ｃｒｓＲであった。小文字は変異塩基を示す。増幅および変異産物は、ＤＮＡ配列決定によって確認された（愛知県がんセンター中央研究所中央施設利用）。
【００５７】
【表１】
2008092854.tif 000003
【００５８】
ＣＡＴアッセイ：
トランスフェクションを、製造者の使用説明書にしたがって、リポフェクタミンとＰｌｕｓ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）を用いて、ＨＦＦ細胞の６０ｍｍ直径プレート上で三連で行った。各発現プラスミド２μｇでＨＦＦ細胞を感染させ、感染の７２時間後に細胞を回収した。ついで、細胞溶解物を調製し、従来記載のようにＣＡＴアッセイにかけた（Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｈ．ら（２００４），上記）。プラスミドｐＳＶ４０β−ｇａｌを、内部対照に使用した（非特許文献１２）。Ｓｔａｔｖｉｅｗ４．０２を使用するＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤによって統計解析を行った。
【００５９】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）：
ＴＢＰ結合アッセイのために、ｗｔ  ｃｒｓおよびマウスｃｒｓのＤＮＡ配列を上記表１に記載した。小文字は変異塩基を示す。等モル比の各対のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを混合し、９５℃で変性し、室温（ＲＴ）まで徐々に冷却することによってアニーリングした。３２Ｐ標識プローブは、従来記載のようにして調製された（非特許文献３）。
【００６０】
ＴＢＰおよびＴＦＩＩＢタンパク質は和光純薬工業（東京）およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からそれぞれ購入した。ＴＢＰを２ｎｇ、ＴＦＩＩＢを示したｎｇで、１７６ｆｍｏｌのＤＮＡプローブ（約５０，０００ｃｐｍ）と一緒に３０℃、３０分インキュベートした。反応混合物は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのジチオスレイトール、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、２ｍＭのスペルミジン、０．２％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１０％のグリセロールおよび１μｇのｐｏｌｙ  ｄＧ−ｄＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｔｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（全量２０μｌ、ＴＢＰ結合用）であった。ＤＮＡ−タンパク質複合体を、電気泳動により、０．５×ＴＢＥ中の６％非変性ポリアクリルアミドゲルにて室温で、遊離のプローブから分離した。ＤＮＡ−タンパク質複合体のシグナル強度を、Ｉｍａｇｅ  ｇｕｉｄｅｒ（ＢＡＳ  ２５００；富士フィルム、東京）を用いて定量した。値は、（ＴＢＰ−ＴＦＩＩＢ−ＤＮＡ）対（ＴＢＰ−ＤＮＡ複合体）の比として算出した。
【００６１】
比較アッセイのために（全量２０μｌ）、２ｎｇのＴＢＰを、反応混合物中過剰モル比の非放射性競合体二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡと一緒に、室温で３０分間プレインキュベートした。その後、反応混合物に１７６ｆｍｏｌの放射性プローブを加え、室温で３０分間インキュベートした。電気泳動とバンド強度の定量を上記と同様に行った。
【００６２】
ヒトＣＭＶ  ＢＡＣ  ＤＮＡの突然変異誘発：
大腸菌内でバクテリオファージλ組換えタンパク質ｅｘｏ、ｂｅｔａおよびｇａｍを発現するための迅速相同組換え系（Ｄ．Ｃｏｕｒｔ博士（ＮＩＨ，米国）から供与された）を従来記載のように使用した（Ｅｌｌｉｓ，Ｈ．Ｍ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：６７４２−６７４６）。ヒトＣＭＶ  ＴｏｗｎｅのＢＡＣ  ＤＮＡは、Ｆ．Ｌｉｕ博士（カリフォルニア大学、Ｂｅｒｋｌｅｙ，ＣＡ）から供与された（Ｄｕｎｎ，Ｗら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：１４２２３−１４２２８）。組換えのためのＨＣＭＶ二本鎖ＤＮＡは、カナマイシン耐性遺伝子と７０ｂｐの相同ウイルスＤＮＡ配列を含み、この耐性遺伝子には、３４ｂｐの最小ＦＲＴ部位（５'−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ−３'(配列番号４)）をフランキングした。ｃｒｓ配列の突然変異体を作製するために、プライマー対としてＢＡＣ  ｃｒｓ＋ＦＲＴＦ、ＢＡＣｓｉｍｉａｎｃｒｓ＋ＦＲＴＲ、ＢＡＣｍｕｒｉｎｅｃｒｓ＋ＦＲＴＲおよびＢＡＣｃｒｓｍｕｔ＋ＦＲＴＲを使用した（表１）。ＰＣＲによる増幅を、従来記載のように行った（Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｈら（２００４）、上記）。残存する鋳型ＤＮＡを除くために、ＰＣＲ産物を、ＤｐｎＩを用いて３７℃で１．５時間消化した。約１００ｎｇの各ＤＮＡ断片を、ヒトＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ−ＢＡＣ  ＤＮＡを含むコンピテントなＥ  ｃｏｌｉ  ＤＹ３８０中へのエレクトロポレーションにかけた。エレクトロポレーションは、従来記載のように行った（Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｈら（２００４）、上記）。
【００６３】
カナマイシン耐性遺伝子の切断：
カナマイシン耐性遺伝子を欠失するために、組換えヒトＣＭＶ  ＢＡＣ  ＤＮＡをＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した。リコンビナーゼを発現するプラスミドｐＣＰ２０（Ｈａｈｎ，Ｗ．ら（２００３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３０７：１６４−１７７）を、組換えヒトＣＭＶ  ＢＡＣ  ＤＮＡを含むＤＨ１０Ｂに形質転換した。カナマイシン耐性遺伝子を含まないヒトＣＭＶ  ＢＡＣ  ＤＮＡを、アンピシリンおよびクロラムフェニコール含有のＬＢプレート上で選択した。
【００６４】
組換えウイルス単離：
ＨＦＦ細胞を、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂのリン酸カルシウム沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６−４６７）によって、２μｇのプラスミドｐＳＶｐｐ７１（Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｈら（２００４）、上記）の存在中、５μｇまたは１０μｇの各組換えＢＡＣでトランスフェクションした。１０日後、ウイルスプラークが出現した。１００％細胞変性作用（ＣＰＥ）の７日後に、細胞外液を回収し、ＨＦＦ細胞の感染のために、１：１０に希釈したものと未希釈のものを調製した。１００％ＣＰＥの５〜７日後に、ウイルス含有の細胞外液を、使用まで５０％仔ウシ血清中−８０℃で保存した。
【００６５】
ＰＣＲ分析：
従来記載のようにしてＰＣＲ分析を行った（Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｈら（２００４）、上記）。ＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングべクター中にクローン化し、愛知県がんセンター中央研究所中央施設にて配列決定し、これによって組換えおよび切断を確認した。
【００６６】
サザンおよびノーザンブロット分析：
組換えＢＡＣ  ＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、制限エンドヌクレアーゼＢｌｐＩおよびＸｈｏＩで消化し、従来記載のようにして１．０％アガロースゲル電気泳動にかけた（Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｈら（２００４）、上記）。サザンおよびノーザンブロットは、従来記載のように行った（Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｈら（２００４）、上記）。プローブについては、ｐＫＳ−５８３／＋７８のＤＮＡ断片（ＥａｇＩ−ＳｐｅＩ）を従来記載のようにして標識した（Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｈ．およびＳｔｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｆ．（２００３）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７７：３６０２−３６１４）（図１ａ参照）。ＩＥ１  ＤＮＡを、プライマー対ｅｘ４Ｆおよびｅｘ４Ｒを用いるＰＣＲによって増幅し（上記の表１参照）、従来記載のようにしてＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した（Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｈら（２００４）、上記）。
【００６７】
ウエスタンブロット分析：
従来記載のようにしてウエスタンブロット分析を行った（Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｈら（２００４）、上記）。ＩＥ１およびＩＥ２によってそれぞれコードされるｐＩＥ７２およびｐＩＥ８６あるいはＵＬ４４によってコードされるｐ５２タンパク質を検出するために、モノクローナル抗体ＮＥＡ−９２２１（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）およびＭ０８５４（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａ）をそれぞれ使用した。製造者の使用説明書にしたがって、増強化学発光検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および第二西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａ）を使用した。
【００６８】
リアルタイムＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ分析：
ＭＩＥ  ＲＮＡの検出のために、全細胞ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、示した時間に精製し、ＤＮａｓｅで処理し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに変換した。逆転写酵素非含有の対照では、導入ウイルスＤＮＡが検出されず、ｍｏｃｋ対照と同様であった。ＲＴ反応は、従来記載のようにして行った（Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｈら（２００４）、上記）。ウイルスＤＮＡの検出のために、６０ｍｍプレート中の細胞を、感染の４時間後に、５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含有する３つのＰＣＲ溶解バッファー中のそれぞれに回収した。従来記載のようにして増幅を行った（Ｉｓｏｍｕｒａ，  ＨおよびＳｔｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｆ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３６０２−３６１４；Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．Ａ．ら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１８１７−１８３０；Ｍｅｉｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：３１３−３２６）。相対ＭＩＥ  ＲＮＡまたはｇＢ  ＤＮＡの定量は、従来記載されるような標準曲線解析にしたがって実施された（Ｉｓｏｍｕｒａ，ＨおよびＳｔｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｆ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３６０２−３６１４；Ｍｅｉｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：３１３−３２６）。
【００６９】
ＲＴ−ＰＣＲ分析：
ＲＴ−ＰＣＲは、最終容量１０μｌのＰＣＲ混合液（０．５μＭプライマー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．５Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ，Ｒｏｃｈｅ））中で行った。エクソン２と３、またはエクソン３と４の間のスプライスＲＮＡを検出するためのプライマーは、ｅｘ２−３Ｒ，ｅｘ２−３Ｒ，ｅｘ３−４Ｆおよびｅｘ３−４Ｒであった（上記の表１参照）。加熱サイクル条件は、最初に９５℃１５分加熱し、ついで９５℃１５分および６０℃１分の３５サイクルからなった。５μｇのＲＴ−ＰＣＲ産物を１２％ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動にかけた。ＲＴ−ＰＣＲ産物もまた、別個にＴＡクローニングベクターにクローン化し、配列決定された。
【００７０】
結果
１．ｃｒｓ変異を有する組換えヒトＣＭＶの単離
従来の報告により、ヒトＣＭＶのＭＩＥプロモーターが、ウイルスＩＥ８６タンパク質と結合するシス作用性エレメントをもつことが示された（非特許文献１１および１２）。ｃｒｓは部分的パリンドローム様構造を形成するが、この構造は、ＭＩＥプロモーターに、配向非依存的であるが位置依存的な様式でＩＥ８６タンパク質依存的抑制を付与する（非特許文献９）。マウスＣＭＶは、ＭＩＥプロモーターの転写開始部位からの同じ位置に配列相同体を有するが、しかし、一時的転写アッセイではＩＥ８６タンパク質による抑制に対し反応が乏しかった（非特許文献９）。ヒトＣＭＶ感染の初期段階でのｃｒｓの役割を決定するために、本発明者らは、野生型と異なる配列で置換されたｃｒｓを有する組換えヒトＣＭＶ  ＢＡＣ  ＤＮＡを構築した（図１ａ）。野生型ヒトＣＭＶｃｒｓとサルＣＭＶｃｒｓとの間には、わずかに１塩基対（ｂｐ）の相違があるが、野生型ヒトＣＭＶｃｒｓとマウスＣＭＶｃｒｓとの間には９ｂｐの相違がある。カナマイシン耐性遺伝子を切断するために、本発明者らはＦＬＰ仲介組換え法を使用したが、この方法では３４ｂｐのＦＲＴ配列が残った（図１ａ）。ＦＲＴがＭＩＥ転写およびウイルス複製に何らかの作用を持つ可能性を避けるために、本発明者らはまた、他の組換えウイルスと同じ位置に野生型（ｗｔ）ｃｒｓ配列とＦＲＴを有する組換えウイルスを構築した。ＢｌｐＩおよびＸｈｏＩによる組換えＢＡＣ  ＤＮＡの制限酵素消化によって、組換えの間にＨＣＭＶゲノムの大きな欠失または転座が全く生じなかったこと、ならびに、予想したサイズのＤＮＡ断片が生成したことが証明された（図１ｂ）。プライマー対であるＵＬ１２７ＲおよびＨＣＭＶＦを使用するＰＣＲ分析（図１ａ）を行い、増幅されたＤＮＡ断片を配列決定し、正しい組換えと切断を確認した（データを示さず）。組換えヒトＣＭＶ  ＢＡＣ  ＤＮＡでＨＦＦ細胞をトランスフェクトした。Ｒｗｔ  ｃｒｓ、Ｒｓｉｍｉａｎ ｃｒｓおよびＲｍｕｒｉｎｅ  ｃｒｓは培養細胞中で複製したが、Ｒｍｕｔ  ｃｒｓは複製しなかった。各変異に関する２つの独立の単離物を別々に作製し特性決定したが、これらの２つの独立の組換えウイルス単離物の間では、表現型に差はなかった。
【００７１】
２．ウイルス感染中のＭＩＥ転写の遮断に対するｃｒｓ置換の影響
組換えウイルスによる感染がＭＩＥ転写の遮断を示すかどうかを決定するために、ＨＦＦ細胞を、約５のＭＯＩでＲｗｔ  ｃｒｓ、Ｒｓｉｍｉａｎ  ｃｒｓまたはＲｍｕｒｉｎｅ  ｃｒｓに感染させ、感染後に種々の回数でＩＥ１  ＲＮＡのレベルを分析した。ＩＥ１  ＲＮＡの定常状態レベルは、Ｒｗｔ  ｃｒｓおよびＲｓｉｍｉａｎ  ｃｒｓについて、またＲｍｕｒｉｎｅ  ｃｒｓについても、６時間で最も高く（図２のレーン１、３および５）、感染の２４時間後にはそれより低かった（図２のレーン２、４および６）。これらの知見は、マウスｃｒｓもｉｎ  ｖｉｖｏでＭＩＥ遺伝子転写に対して遮断機能を有していることを示した。しかしながら、シス作用性エレメントが完全に突然変異を受けたときには、組換えウイルスは単離されなかった。このことと加えて、ＭＩＥ転写の遮断はｃｒｓに依存することが分かった。
【００７２】
３．感染初期段階でのＭＩＥ遺伝子転写に対するｃｒｓ置換の影響
ＭＩＥ遺伝子の転写に対するｃｒｓ置換の影響を調べるために、１のＭＯＩでＨＦＦ細胞に組換えウイルスを感染させ、感染後１、２、４、７および１１時間目に細胞を採取し、エクソン１とエクソン２との間に位置するプローブおよびプライマーを用いるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＭＩＥ遺伝子転写体の相対レベルについてアッセイした。図３ａに示されるように、Ｒｍｕｒｉｎｅ  ｃｒｓを感染させた細胞からのＭＩＥ  ＲＮＡの相対量は、感染後４、７および１１時間目のＲｗｔ  ｃｒｓと比べて、約１／１０〜１／２０に減少した。これらのデータは、ｃｒｓ置換がウイルス感染の初期段階でＭＩＥ転写に影響することを示している。ＭＩＥ遺伝子転写体のレベルを確認するために、ノーザンブロット分析も実施した。０．１のＭＯＩでＲｗｔ  ｃｒｓまたはＲｍｕｒｉｎｅ  ｃｒｓを感染したのち、感染後６時間目に細胞を採取した。図３ｂに示されるように、Ｒｗｔ  ｃｒｓ感染細胞から定常状態の細胞質ＩＥ１  ｍＲＮＡが検出されたが、Ｒｍｕｒｉｎｅ  ｃｒｓ感染細胞からは、オートラジオグラムの長時間露光ではじめて該ｍＲＮＡが検出された。この結果から、ｗｔ  ｃｒｓは感染の初期段階でＭＩＥプロモーターからの転写を容易にすることが結論された。
【００７３】
４．ｃｒｓ配列はＭＩＥ遺伝子転写体のスプライシング効率に影響する
ｍＲＮＡのプロセシング反応は、転写の間に、統制的に行われる（Proudfoot, N.J.ら(2002) Cell 108:501-512）。ｃｒｓがＭＩＥプロモーターからの転写を容易にするため、ｃｒｓ配列はプレｍＲＮＡのプロセシングに影響する。スプライスされたＲＮＡを検出するために、エクソン２とエクソン３の間およびエクソン３とエクソン４の間のプライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＨＦＦ細胞に、０．１のＭＯＩで感染させ、感染６時間後に、感染細胞からＲＮＡを精製した。エクソン２とエクソン３の間およびエクソン３とエクソン４の間の、プレｍＲＮＡ由来のスプライス形態の量が、Ｒｗｔ  ｃｒｓに感染させたＨＦＦ細胞における感染６時間後の相対量で２０倍高い値を示した。ＨＦＦ細胞にＲｍｕｒｉｎｅ  ｃｒｓを感染したときには、エクソン２とエクソン３の間およびエクソン３とエクソン４の間の非スプライス形態が９０倍多い量で検出された（図３ｃ）。これらのデータは、ｃｒｓが転写の間にプレｍＲＮＡのスプライシングにも影響することを示している。
【００７４】
５．マウスｃｒｓによる置換が他のウイルスタンパク質の非存在下でＭＩＥ遺伝子転写に影響する
ウイルスのテグメントタンパク質ｐｐ７１は、ＭＩＥプロモーターからの転写を活性化する（Liu, B.およびStinski, M.F. (1992) J. Virol. 66:4434-4444）。他のウイルスタンパク質の非存在下でｃｒｓがＭＩＥプロモーターからの転写に影響を及ぼすかどうかを決定するために、また、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えウイルス結果を実証するために、一過的トランスフェクションアッセイを、図４ａに示される２つのＳｐ−１部位を有するＭＩＥプロモーター下流のＣＡＴ遺伝子を用いて実施した。ＣＡＴ活性は、ＭＩＥプロモーターからの転写の累積的作用を示したが、これは、ＣＡＴが哺乳類細胞で非常に安定であるからである。ｗｔ  ｃｒｓをもつＣＡＴ活性は、マウスｃｒｓをもつＣＡＴ活性よりも統計的に高かった（ｐ＝０．００４１）。これらのデータから、ｗｔ  ｃｒｓは、他のウイルスタンパク質の非存在下でＭＩＥプロモーターからの転写を容易にすることが示唆された。
【００７５】
６．ＴＢＰ−ＴＦＩＩＢ−ＤＮＡ相互作用に対するｃｒｓ配列の影響
ｗｔ  ｃｒｓがＭＩＥプロモーターからの転写に正に影響を及ぼすかどうかを決定するために、また、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えウイルス結果を実証するために、ＥＭＳＡをＴＢＰおよびＴＦＩＩＢを用いて実施した。ＴＢＰ−ＤＮＡ複合体を、ｗｔ  ｃｒｓまたはマウスｃｒｓとＴＡＴＡエレメントを含むプローブを用いて形成した。ＴＢＰ−ＤＮＡ複合体はともに、１５、３０および６０倍モル過剰の非放射性マウスｃｒｓ競合体を用いたとき、同等に減少した（図４ｂ）。ｗｔ  ｃｒｓまたはマウスｃｒｓのいずれかを有するＴＡＴＡエレメントへのＴＢＰの結合効率に全く差がなかった。
【００７６】
結晶学的構造分析により、ＴＦＩＩＢがＴＢＰおよび鋳型ＤＮＡと相互作用することが示されている（Ｔｓａｉ，Ｆ．Ｔ．およびＳｉｇｌｅｒ，Ｐ．Ｂ．（２０００）Ｅｍｂｏ  Ｊ．１９：２５−３６）。ＴＦＩＩＢは、ＴＡＴＡエレメントのすぐ上流のＤＮＡ鋳型の主要グローブと相互作用するし、また、ＴＡＴＡエレメントのすぐ下流のマイナーなグローブと相互作用する。本発明者らは、ＴＢＰ−ＴＦＩＩＢ複合体形成におけるｗｔ  ｃｒｓの役割を決定した。ＥＭＳＡを、ｗｔ  ｃｒｓまたはｍｕｒｉｎｅ  ｃｒｓのいずれかを有するＴＡＴＡエレメントを含む３２Ｐ標識プローブを用いて実施した。７、１４または２１ｎｇのＴＦＩＩＢをＴＢＰ−ＤＮＡ複合体に加えたとき、ＴＢＰ−ＴＦＩＩＢ−ＤＮＡ複合体に相当する上のバンドが検出された。ｗｔ  ｃｒｓを有するＴＡＴＡエレメントは、ＴＢＰ−ＴＦＩＩＢ−ＤＮＡ複合体形成に対し２〜３倍高い親和性を有した（図４ｃ）。ｗｔ  ｃｒｓは、ＤＮＡ鋳型上でＴＢＰ−ＴＦＩＩＢ−ＤＮＡ複合体の形成を安定化した。
【００７７】
７．ウイルスのＤＮＡ合成および遺伝子発現に対するｃｒｓ置換の影響
組換えウイルスのウイルス複製を比較するために、ＨＦＦ細胞に、１のＭＯＩで野生型（ｗｔ）ウイルスまたは組換えウイルスを感染した。ｇＢプライマーを用いるリアルタイムＰＣＲを実施し、感染後２、３および４日目にウイルスＤＮＡレベルを測定した。１８Ｓプライマーおよびプローブを用いるリアルタイムＰＣＲアッセイを、等量の導入ＤＮＡについて対照に対して行った（図５ａ、下のパネル）。サルｃｒｓを有する組換えウイルスは、Ｒｗｔ  ｃｒｓと同じレベルに複製した。これに対して、マウスｃｒｓを有する組換えウイルスはほとんど非効率的な複製を行なった。Ｒｗｔ  ｃｒｓとＲｍｕｒｉｎｅ  ｃｒｓとの間で、ウイルスＤＮＡレベルに約２０倍の差があった（図５ａ、上のパネル）。したがって、Ｒｍｕｒｉｎｅ  ｃｒｓは、感染後、より遅い速度でウイルスＤＮＡ複製に入った。
【００７８】
Ｒｍｕｒｉｎｅ  ｃｒｓによるウイルスＤＮＡ複製の速度が遅い理由が低いレベルのウイルス遺伝子発現によるものであるかどうかを決定するために、ＨＦＦ細胞に、１のＭＯＩで組換えウイルスを感染し、ウイルスタンパク質ｐＩＥ７２（ＵＬ１２３）、ｐＩＥ８６（ＵＬ１２２）およびｐ５２（ＵＬ４４）に対するモノクローナル抗体、あるいは負荷対照としての細胞ｐ３６ＧＡＰＤＨに対するモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った。サルｃｒｓを有する組換えウイルスのｐＩＥ７２、ｐＩＥ８６およびｐ５２のタンパク質レベルは、感染全体を通して、Ｒｗｔ  ｃｒｓの該タンパク質レベルと類似していた（図５ｂ）。これに対して、Ｒｍｕｒｉｎｅ  ｃｒｓ感染細胞でのｐＩＥ７２のタンパク質レベルは、感染後１日目で、Ｒｗｔ  ｃｒｓの該タンパク質レベルより低く、その１／１．９４であった。さらに、ｐＩＥ８６およびｐ５２タンパク質のレベルは、感染後２日目および４日目でそれぞれ１／２．７６および１／３．２４、１／５．８５および１／３．６３の低さであった。したがって、ｃｒｓは、ヒトＣＭＶ感染の初期段階で、ＭＩＥ  ｍＲＮＡおよびタンパク質産生に対する正のシス作用性エレメントであると結論される。
【００７９】
考察
ヒトＣＭＶ  ＭＩＥ遺伝子の転写調節は、潜伏からの再活性化と生産的感染において中心的な役割を有している。ＴＢＰによるＴＡＴＡボックスの認識は、開始前の複合体形成に向かう最初のステップを構成する（非特許文献１３および，Ｏｒｐｈａｎｉｄｅｓ，  Ｇ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：２６５７−２６８３）。ＴＢＰの生成後、ＴＦＩＩＢが複合体に入いり、より安定な三元複合体を形成する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析により、ｗｔ  ｃｒｓがＴＢＰ−ＴＦＩＩＢ−ＤＮＡ複合体を安定化することが示された。ＴＦＩＩＢがＴＡＴＡボックスの上流と下流の両方でＤＮＡ鋳型と接触する。ＴＡＴＡボックスの上流で、ＴＦＩＩＢが配列特異的ＤＮＡ接触をすることができる（Ｌａｇｒａｎｇｅ，Ｔ．ら（１９９８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：３４−４４；Ｔｓａｉ，Ｆ．Ｔ．およびＳｉｇｌｅｒ，Ｐ．Ｂ．（２０００）、上記；Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｓ．Ａ．およびＪａｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ１：３８９−４００）。このＴＦＩＩＢ認識エレメント（ＢＲＥ）は、真核生物プロモーターのサブセット中に存在することが報告されている。例えば、アデノウイルス主要後期プロモーターは、ＴＦＩＩＢにより高親和性結合を付与するＢＲＥを含む（Ｌａｇｒａｎｇｅ，Ｔ．ら（１９９８）、上記）。ヒトＣＭＶ  ｗｔ  ｃｒｓは、ＢＲＥエレメントと相同な配列を共有しないけれども、本発明者らのデータから、ＴＦＩＩＢが、ｗｔ  ｃｒｓを含むＭＩＥプロモーターと効率的な配列特異的接触をすることが示された。ＴＢＰ−ＴＦＩＩＢ−ＤＮＡ複合体の結合は、ｗｔ  ｃｒｓが存在するとき、より安定であった。したがって、本発明者らは、ヒトＣＭＶ  ｗｔ  ｃｒｓが、感染の初期段階で、効率的なＭＩＥ転写とプレｍＲＮＡのスプライシングのための転写開始複合体の形成を容易にすることを提案する。
【００８０】
ＲＴ−ＰＣＲによって、エクソン２とエクソン３の間で、およびエクソン３とエクソン４の間でスプライスされたＭＩＥ  ｍＲＮＡ、ならびに、スプライスされないＭＩＥ  ｍＲＮＡを検出し、このことから、ｗｔ  ｃｒｓが、プレｍＲＮＡスプライシングの相対量に影響することが示された。キャッピング、スプライシングならびに３’末端プロセシングおよびポリアデニル化などのプレｍＲＮＡプロセシングを含む反応は、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ転写複合体と密接に結びついていると、互いにモジュレートする（Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｄ．Ｌ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７：２５１−２５６；Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＴおよびＲｅｅｄ，Ｒ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ４１６：４９９−５０６；Ｄｙｅ，Ｍ．Ｊ．およびＰｒｏｕｎｄｆｏｏｔ，Ｎ．Ｊ．（２００１）Ｃｅｌｌ１０５：６６９−６８１）。したがって、Ｐｏｌ  ＩＩホロ酵素と、ｃｒｓ含有のＭＩＥコアプロモーター領域との間の相互作用は、遺伝子転写の全３つの段階、すなわち開始、伸長および終結で、ｍＲＮＡプロセシング活性と直接関係している可能性がある。
【００８１】
本発明者らは、かなりの努力にも拘らず、ｍｕｔ  ｃｒｓを含む完全組換えウイルスを単離することができなかったが、これらの結果について、２つの説明ができる。１つは、ｃｒｓが、感染の初期で、ヒトＣＭＶ  ＩＥ７２およびＩＥ８６タンパク質の発現に重要である、ということである。２つ目は、感染の後期で、野生型ＩＥ８６タンパク質の連続発現が、宿主細胞にとって有害である、ということである。これらの知見は、ｗｔ  ｃｒｓが、ＭＩＥプロモーターおよび後続のウイルス感染に必須の制御エレメントであることを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の弱毒化組換えＨＣＭＶは、ワクチンとして、免疫抑制患者や弱抵抗性のヒトに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】組換えヒトＣＭＶ  ＢＡＣ  ＤＮＡの構造を示す。（ａ）Ｒｗｔ  ｃｒｓの組換えＢＡＣ  ＤＮＡの組換えの概略位置を示す。転写開始部位を＋１としたときの−４８と＋１との間のｃｒｓを含む領域を、置換配列およびカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）で置換し、その後、ＫａｎＲをＦＬＰ仲介組換えにより切断した。ここで、置換配列は、図示されるように、サルＣＭＶｃｒｓ（配列番号３）またはマウスＣＭＶｃｒｓ（配列番号１）、あるいは完全に変異されたｃｒｓ（ｍｕｔ  ｃｒｓ；配列番号５）であった。配列中の小文字は、変異塩基を示す。（ｂ）親の野生型ｃｒｓ、ｍｕｔ  ｃｒｓ、サルＣＭＶｃｒｓおよびマウスＣＭＶｃｒｓプラスＦＲＴ配列（ただし、ＫａｎＲ含有配列とＫａｎＲ非含有配列）のサザンブロット分析を示す。Ｂａｃ  ＤＮＡをＢｌｐＩおよびＸｈｏＩで消化した。標準分子サイズは塩基対（ｂｐ）で示した。また、ＢＡＣ  ＤＮＡは、ブロットの最上部に同定された。
【図２】ＭＩＥ遺伝子転写の遮断に対するｃｒｓ置換の影響を示す。ＨＦＦ細胞に、約５のＭＯＩで、図に示した組換えウイルスを感染させ、図に示した時間に細胞を採取した。材料および方法に記載したようにして、細胞質ＩＥ１  ＲＮＡを精製し、ノーザンブロット分析にかけた。
【図３】ＭＩＥ遺伝子転写およびＲＮＡスプライシングに対するｃｒｓ置換の影響を示す。（ａ）ＨＦＦ細胞に、１のＭＯＩで組換えウイルスを感染し、材料および方法に記載したリアルタイムＰＣＲによって、ＩＥ遺伝子転写体のレベルについて分析した。各ＲＴ−ＰＣＲを三連で行い、感染の７時間後に、Ｒｗｔ  ｃｒｓを感染させたＨＦＦ細胞から回収したＭＩＥ  ＲＮＡについて閾値サイクル値に標準化した。ＲＮＡは、細胞ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡに対して標準化された。（ｂ）ノーザンブロット分析を行い、細胞質ＩＥ１  ＲＮＡのレベルを比較した。ＨＦＦ細胞に、０．１のＭＯＩでウイルスを感染し、感染の６時間後に、全細胞ＲＮＡを回収した。（ｃ）ＭＩＥ遺伝子転写体のスプライシング効率の分析を示す。ＨＦＦ細胞に、０．１のＭＯＩでウイルスを感染し、感染の６時間後に細胞を回収した。細胞から全細胞ＲＮＡを精製し、ＭＩＥ  ＲＮＡを、エクソン２と３の間、あるいはエクソン３と４の間のｍＲＮＡに特異的なプライマー対を用いるＲＴ−ＰＣＲによって分析した（上記の表１参照）。矢印で示した上と下のバンドはそれぞれ、スプライスされていないＭＩＥ  ＲＮＡ、スプライスされたＭＩＥ  ＲＮＡを表す。
【図４】別のウイルスタンパク質の非存在下での、ＭＩＥ転写ならびにＴＢＰおよびＴＦＩＩＢの結合に対するｃｒｓの影響を示す。（ａ）ＣＡＴ遺伝子構築物の概略的構造を示す（上のパネル）。ＣＡＴ活性は三連で測定された。値は、非アセチル化クロラムフェニコール形態からアセチル化形態への転換率（％）を示す。ここで、＊＊は、Ｐ＜０．０１である。（ｂ）ＴＢＰとＴＡＴＡエレメントとの結合活性を示す。２ｎｇのＴＢＰを、反応混合液中、室温で３０分間、増加量の過剰モル比の非放射性競合体ｄｓＤＮＡ（Ｘ１５，  Ｘ３０およびＸ６０）と一緒にインキュベートした。その後、１７６ｆｍｏｌの放射性プローブを反応混合物に添加し、室温、３０分間さらにインキュベートした。（ｃ）ＴＦＩＩＢの存在下でのＴＢＰのＴＡＴＡエレメントへの結合活性の定量分析を示す。２ｎｇのＴＢＰと、増加量のＴＦＩＩＢ（７、１４および２１ｎｇ）を、反応中でインキュベートした。各バンドの強度は、材料および方法で記載したＢＡＳ２５００画像解析機（富士フィルム）を用いてアッセイされ、グラフ上にプロットされた。
【図５】ウイルスＤＮＡおよびタンパク質合成に対するｃｒｓ置換の影響を示す。（ａ）１のＭＯＩで、Ｒｗｔ、Ｒｓｉｍｉａｎ  ｃｒｓまたはＲｍｕｒｉｎｅ  ｃｒｓを感染し、感染の２日後（２ｄ．ｐ．ｉ．）、３日後（３ｄ．ｐ．ｉ．）および４日後（４ｄ．ｐ．ｉ．）に細胞を回収した。感染の４時間後のＲｗｔ  ｃｒｓ  ＤＮＡのレベルに対する各値が計算されプロットされた。データは、３回の独立の実験の平均である。１８Ｓプライマーとプローブを用いるリアルタイムＰＣＲを、等しい導入ＤＮＡを対照として行った（下のパネル）。（ｂ）ＩＥおよび初期遺伝子発現のウエスタンブロット分析を示す。ＨＦＦ細胞に、１のＭＯＩで組換えウイルスに感染させ、感染後の図示した日に採取した。モノクローナル抗体ＮＥＡ−９２２１が、ＩＥ７２およびＩＥ８６タンパク質を検出し、一方、Ｍ０８５４はｐ５２初期タンパク質を検出した。ｐＧＡＰＤＨ（ｐ３６）は、タンパク質負荷対照として使用された。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
配列番号５:  人工配列の説明：ｍｕｔ  ｃｒｓ
配列番号６〜２２：  人工配列の説明：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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