(57)【要約】【課題】形状維持性・熱安定性・生体内安定性に富み、医療用材料・美容整形材料として好適なコラーゲン組成物を提供することである。【解決手段】  架橋コラーゲンと、乳糖とを含有し、  前記架橋コラーゲン１００重量部に対して前記乳糖が１〜３０重量部であり、  前記コラーゲンが魚由来のコラーゲンである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋コラーゲンと、
乳糖
とを含有することを特徴とするコラーゲン組成物。
【請求項２】
架橋コラーゲンと、
乳糖とを含有し、
前記架橋コラーゲン１００重量部に対して前記乳糖が１〜３０重量部である
ことを特徴とするコラーゲン組成物。
【請求項３】
架橋コラーゲンは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩によって架橋されたコラーゲンである
ことを特徴とする請求項１又は請求項２のコラーゲン組成物。
【請求項４】
コラーゲンが魚由来コラーゲンである
ことを特徴とする請求項１〜請求項３いずれかのコラーゲン組成物。
【請求項５】
生体内に埋め込まれて使用される材料である
ことを特徴とする請求項１〜請求項４いずれかのコラーゲン組成物。
【請求項６】
生体内に埋め込まれて使用される美容整形材料である
ことを特徴とする請求項１〜請求項５いずれかのコラーゲン組成物。
【請求項７】
コラーゲン溶液に架橋剤を添加してゲル化させるゲル化工程と、
ゲル化コラーゲンに乳糖を添加する乳糖添加工程
とを有することを特徴とするコラーゲンゲル組成物の製造方法。
【請求項８】
乳糖添加工程で添加される乳糖は濃度が０．５〜１０％の乳糖水溶液である
ことを特徴とする請求項７のコラーゲン組成物の製造方法。
【請求項９】
架橋剤が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩である
ことを特徴とする請求項７又は請求項８のコラーゲン組成物の製造方法。
【請求項１０】
コラーゲンが魚由来コラーゲンである
ことを特徴とする請求項７〜請求項９いずれかのコラーゲン組成物の製造方法。
【請求項１１】
生体内に埋め込まれて使用される材料の製造方法であることを特徴とする請求項７〜請求項１０いずれかのコラーゲン組成物の製造方法。
【請求項１２】
生体内に埋め込まれて使用される美容整形材料の製造方法であることを特徴とする請求項７〜請求項１１いずれかのコラーゲン組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコラーゲン組成物、特に生体内に埋め込まれるコラーゲン組成物、中でも美容整形材料として生体内に埋め込まれるコラーゲン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、部分的に螺旋構造（コラーゲン螺旋）を有するタンパク質または糖タンパク質である。そして、コラーゲンは、無脊椎動物あるいは脊椎動物の組織、特に皮膚から多く抽出される。このようなコラーゲンには構造の違いによって１９種類の型の存在が報告されており、更に同じ型に分類されるコラーゲンにも数種類の異なる分子種が存在する。中でも、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ型及びＩＶ型コラーゲンが主にバイオマテリアルの原料として用いられている。Ｉ型は殆どの結合組織に存在し、生体内に最も多量に存在するコラーゲンである。特に、コラーゲンは、腱、真皮及び骨に多く、工業的には、これらの部位から抽出される場合が多い。ＩＩ型は軟骨を形成するコラーゲンである。ＩＩＩ型は少量ではあるがＩ型と同様の部位に存在することが多い。ＩＶ型は基底膜を形成するコラーゲンである。Ｉ，ＩＩ及びＩＩＩ型はコラーゲン線維として生体内に存在し、主に組織あるいは器官の強度を保つ役割を果たしている。ＩＶ型は線維形成能力を有しないが、４分子で構成される網目状会合体を形成し、基底膜における細胞分化に関与していると言われる。コラーゲン線維は上記コラーゲン分子の自己集合体であり、コラーゲン分子が直列かつ並列にパッキングされた特異的な線維構造を有する。工業的には酸、アルカリ、あるいはタンパク質分解酵素を用いて組織内コラーゲン線維から可溶化されたコラーゲンが作成される。可溶性コラーゲンは、コラーゲン分子が数分子以下の集合体にまで微細化されていて、水あるいは塩水溶液に溶解して均一な透明溶液を形成する。一度可溶化されたコラーゲン分子は条件次第では試験管内でコラーゲン線維を再形成することが知られている。この現象は線維化（fibril formationあるいはfibrillation）と呼ばれる。コラーゲンに熱を加えるとコラーゲンの三重螺旋構造がほぐれ、各々のポリペプチド鎖がランダムコイル状の熱変性物を与える。そのような構造変化を起こす温度は変性温度と呼ばれ、熱変性物はゼラチンと呼ばれる。ゼラチンはコラーゲンに比べ水溶性が高い他に、生体内プロテアーゼに対する感受性が高いことが知られている。溶媒の条件によってはゼラチンがコラーゲン螺旋構造を部分的に回復することが知られている。ゼラチンはコラーゲン線維形成能を失っているが、部分的にコラーゲン螺旋構造を回復させることでコラーゲン線維形成能を回復できることが知られている。コラーゲンの変性温度は溶液状態の時に最も低くなる。コラーゲンは一般に生物原料から得られるが、生物から得たコラーゲンの変性温度はその生物の生活環境温度と密接に関係していると言われる。水溶液でのコラーゲンの変性温度は、哺乳類では３８℃前後であるが、魚類はおおむね哺乳類よりも低く、特に鮭等の寒流系の魚類では２０℃を下回る場合もある。
【０００３】
コラーゲンは優れた保湿性を有し、ヒアルロン酸などの他の生体由来保湿剤に比べ収量が多く安価である為に、化粧品原料として有効に用いられる。又、細胞の接着や増殖を促す、抗原性が低い、生体親和性が高い、生分解性である等の多くの優れた性質から、細胞実験用材料および医療用材料など様々な用途に有効に使用される。これらの目的でコラーゲンが使用される場合、水溶液、綿状物、フィルム、スポンジ、ゲルなど用途に応じて種々の形態で使用される。特に、コラーゲンゲルは細胞担体、医療用材料、美容整形材料などに有効に用いられており、近年では再生医療における重要なマテリアルとして盛んに研究されている。
【０００４】
上記コラーゲンゲルの原料となるコラーゲンは、従来、その殆どが牛皮など家畜の組織から採取されている。ところで、近年、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）問題が顕在化し、牛皮由来を含む家畜由来の原料を用いたコラーゲンが人間に用いられた場合、上記病原体の感染の恐れが指摘されるに至った。そこで、安全性と資源量等の観点から、魚由来コラーゲンが化粧品材料や食品材料として脚光を浴びている。又、細胞担体や医療用材料・美容整形材料のコラーゲンゲルの原料としても、魚由来コラーゲンを用いることが重要になりつつある。
【０００５】
コラーゲンゲルを作製する方法としては大きく３種類に分けることが出来る。
（１）コラーゲン溶液に架橋剤を導入し、溶液をゲル化する方法。
（２）コラーゲン溶液に架橋を惹起する光線を照射し、溶液をゲル化する方法。
（３）コラーゲン溶液に中性緩衝液を加えてコラーゲンの線維化を惹起させ、コラーゲン線維ネットワークから構成されるゲルを得る方法。
【０００６】
上記（１）の方法については、例えばコラーゲン溶液に化学架橋剤を混合してゲル化させた眼科用コラーゲンゲル成形物、グリコサミノグリカンとコラーゲンの混合溶液を水溶性カルボジイミドで架橋した組織再生マトリックス用ゲルなどが知られている。（２）の方法については、例えば窒素で十分に置換したコラーゲン溶液に紫外線を照射すると、コラーゲン溶液がゲル化することが報告されている。（３）の方法については、例えばサメ由来コラーゲン溶液と中性緩衝液を混合してコラーゲンの線維化を惹起させることにより得られるコラーゲン線維ネットワークから構成されるゲルが知られている。
【０００７】
ところで、上記３種類のゲル化方法によって魚由来コラーゲンから作製したコラーゲンゲルは、ゲル強度、熱安定性や生体内安定性が不十分で、医療用材料・美容整形材料の用途においてはゲルの収縮や崩壊の恐れとか、生体内吸収性が高すぎる恐れが有った。
【０００８】
そこで、近年、魚由来コラーゲンゲルの強度および熱安定性を大幅に向上させる技術として、コラーゲンを線維化させる工程に架橋剤を共存させ、コラーゲン線維内に架橋結合を導入させる技術が提案されている。魚由来コラーゲンの変性温度は一般的に低く、工業的に生産されている魚由来コラーゲンの変性温度は３０℃以下であり、上記技術において用いられている魚由来コラーゲンの変性温度は１９℃程度である。これらの魚由来コラーゲンから上記方法でコラーゲンゲルを作製すると、生体内温度である３７℃において部分的に変性し、ゲルの収縮や崩壊を来たす恐れや、生体内で速やかに吸収される恐れが有り、魚由来コラーゲンから医療用材料・美容整形材料としてのコラーゲンゲルを作成する方法としては必ずしも十分ではなかった。
【０００９】
このような問題を解決する為、即ち、高い強度・熱安定性・生体内安定性を有するコラーゲンゲルを提供する為、変性温度が３０℃以上である魚鱗由来コラーゲンを含むコラーゲン溶液に対して架橋剤と線維化剤を添加しゲル化させることを特徴とするコラーゲンゲルの作成方法が提案（特開２００６−２５７０１３号公報）されている。
【特許文献１】特開２００６−２５７０１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ところで、従来のコラーゲンゲルは、耐久性が劣るものであった。例えば、従来のコラーゲンゲルをマウスに注入して経過を観察すると、注入部に形成された脹らみが長期間に亘っては維持されて無いことが判って来た。
【００１１】
従って、本発明が解決しようとする第１の課題は、耐久性に富むコラーゲン組成物を提供することである。特に、形状安定性・熱安定性・生体内安定性に富み、医療用材料・美容整形材料として好適なコラーゲン組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記の課題は、
架橋コラーゲンと、
乳糖
とを含有することを特徴とするコラーゲン組成物によって解決される。
【００１３】
特に、
架橋コラーゲンと、
乳糖とを含有し、
前記架橋コラーゲン１００重量部に対して前記乳糖が１〜３０重量部である
ことを特徴とするコラーゲン組成物によって解決される。
【００１４】
又、上記のコラーゲン組成物であって、架橋コラーゲンが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩によって架橋されたコラーゲンであることを特徴とするコラーゲン組成物によって解決される。
【００１５】
又、上記のコラーゲン組成物であって、コラーゲンが魚由来コラーゲンであることを特徴とするコラーゲン組成物によって解決される。
【００１６】
又、上記のコラーゲン組成物であって、生体内に埋め込まれて使用される材料であることを特徴とするコラーゲン組成物によって解決される。
【００１７】
又、上記のコラーゲン組成物であって、生体内に埋め込まれて使用される美容整形材料であることを特徴とするコラーゲン組成物によって解決される。
【００１８】
又、コラーゲン溶液に架橋剤を添加してゲル化させるゲル化工程と、
ゲル化コラーゲンに乳糖を添加する乳糖添加工程
とを有することを特徴とするコラーゲンゲル組成物の製造方法によって解決される。
【００１９】
又、上記のコラーゲンゲル組成物の製造方法であって、
コラーゲン溶液に架橋剤を添加してゲル化させるゲル化工程と、
ゲル化コラーゲンに乳糖を添加する乳糖添加工程
とを有することを特徴とするコラーゲンゲル組成物の製造方法によって解決される。
【００２０】
又、上記のコラーゲンゲル組成物の製造方法であって、乳糖添加工程で添加される乳糖は濃度が０．５〜１０％の乳糖水溶液であることを特徴とするコラーゲン組成物の製造方法によって解決される。
【発明の効果】
【００２１】
架橋コラーゲンと乳糖とを含有するコラーゲン組成物は、体内に埋め込まれた状態にても、長期間に亘って、その状態が保持されていた。すなわち、形状安定性・熱安定性・生体内安定性に富んだものであった。
【００２２】
尚、乳糖が用いられても、架橋されていないコラーゲンが用いられたに過ぎないコラーゲン組成物の場合、架橋コラーゲンが用いられても、乳糖が用いられてないコラーゲン組成物の場合には、形状安定性・熱安定性・生体内安定性に富むと言う本願発明の特長が奏せられてなかった。例えば、本発明のコラーゲン組成物は、３７℃（人間の体温）においても、所定の粘性を保っており、変化が無かったのに対して、乳糖の代わりにブドウ糖を用いた場合には、粘性を失ってしまい、本発明の特長が到底に得られないものであった。
【００２３】
尚、架橋コラーゲンと乳糖との割合は、架橋コラーゲン１００重量部に対して乳糖が１〜３０重量部である場合、形状安定性・熱安定性・生体内安定性が特に奏されるものであった。特に好ましい割合は、架橋コラーゲン１００重量部に対して乳糖が６〜２５重量部の場合であった。
【００２４】
架橋コラーゲンは、前述の通り、各種の手法で得られる。但し、架橋剤によって架橋させたコラーゲンが特に好ましいものであった。中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩によって架橋されたコラーゲンが最も好ましいものであった。例えば、グルタルアルデヒドによって架橋されたコラーゲンと乳糖とからなるコラーゲン組成物と、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩によって架橋されたコラーゲンと乳糖とからなるコラーゲン組成物とを対比すると、後者のコラーゲン組成物の方が形状安定性・熱安定性・生体内安定性に優れていた。
【００２５】
そして、コラーゲンとして魚由来のコラーゲンを用いた場合には、牛由来のコラーゲンを用いた場合のＢＳＥ問題の心配も無い。
【００２６】
すなわち、本発明になるコラーゲン組成物は、医療用材料・美容整形材料として安全性が高く非常に好適なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明はコラーゲン組成物である。特に、生体内に埋め込まれて使用される材料としてのコラーゲン組成物である。中でも、生体内に埋め込まれて使用される美容整形材料としてのコラーゲン組成物である。そして、架橋コラーゲンと乳糖とを含有する。架橋コラーゲンと乳糖との割合は、架橋コラーゲン１００重量部に対して、特に、乳糖が１〜３０重量部（中でも、６〜２５重量部）である。架橋コラーゲンは、特に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩によって架橋されたコラーゲンである。すなわち、架橋剤として、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系、或いはイミダゾール系の架橋剤が用いられるものの、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩や、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩などの水溶性カルボジイミド系のものが好ましかった。中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩が最も好ましいものであった。コラーゲンは、特に、魚由来コラーゲンである。
【００２８】
又、本発明はコラーゲンゲル組成物の製造方法である。特に、上記のコラーゲンゲル組成物の製造方法である。そして、コラーゲン溶液に架橋剤を添加してゲル化させるゲル化工程を有する。かつ、ゲル化工程でゲル化されたゲル化コラーゲンに乳糖を添加する乳糖添加工程を有する。乳糖添加工程では、乳糖の濃度が０．５〜１０％（特に、１％以上、更には２．５％以上。８％以下、更には７％以下。）の乳糖水溶液が用いられる。
【００２９】
以下、更に具体的に説明する。
【００３０】
［実施例１］
［魚由来のコラーゲンの作成］
（１）  ヒラメのリン酸緩衝液でのホモジナイズ処理
凍結されたヒラメの皮をピンセット・鋏で取り、細かく切った。このヒラメの皮の細片８５ｇに１０００ｍＬのリン酸緩衝液（リン酸一水素二ナトリウム２１．７ｇとリン酸二水素一カリウム０．７８ｇとを水に加えて１０００ｍＬとしたもの）を加え、ホモジナイズした。同リン酸緩衝液で１時間洗浄し、静置後、上澄み液をガーゼで濾過し、水で洗浄（１回の洗浄時間は１時間）を２回した。
（２）  ペプシン処理
上記のヒラメ溶液にペプシン０．２ｇを加え、更に０．５Ｍ酢酸溶液を加えて１０００ｍＬとし、そして５℃で２４時間攪拌した。
（３）  コラーゲンの精製
ペプシン処理を終えた溶液を１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離を行い、可溶性上清を分取した。この可溶性上清を０．７ＭのＮａＣｌ／０．５Ｍ酢酸溶液で５℃で２４時間掛けて透析した。
【００３１】
この透析液を１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿物を０．５Ｍ酢酸に２４時間掛けて溶解させ、この後で１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離した。そして、上清を０．０５Ｍとなるよう０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、そして緩衝能を持たせた上でｐＨメータで測定しながらｐＨが７．４となるように５ＭのＮａＯＨを加えて中和した。尚、この時、ゲル化が起きないようにする為、ｐＨが４．８〜５．０に長時間留まらないように注意する。
【００３２】
次に、４．４ＭのＮａＣｌを加え、１晩に亘る攪拌後に、１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離を行った。そして、沈殿物を２．４ＭのＮａＣｌ／０．０５Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で抽出（１晩×２回）後、１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離を行った。次いで、この沈殿物を１．０ＭのＮａＣｌ／０．０５Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で抽出（１晩×２回）後、１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離を行い、上清を得た。この上清液はコラーゲンを含むことから、分取して濃度を測定した処、１．３８％であった。
【００３３】
このコラーゲン含有溶液（ａ溶液）２．５ｍＬを、予め、１．０ＭのＮａＣｌ／０．０５Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を移動相として充填したゲル濾過カラムに添加した。そして、出て来た溶液を廃棄し、カラム上端に溶液が無くなってから、カラムの上端に移動相３ｍＬを加え、ゲル濾過し、濾過された液３ｍＬを採取し、更に０．２２μｍのメンブランフィルターを通過させた。
このようにしてコラーゲン溶液を得た。
【００３４】
［コラーゲンゲルの作成］
ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩）を１％の割合で上記のコラーゲン溶液に添加・溶解させ、５℃で４日間掛けて反応を行わせた。得られた反応物に水を加えて洗浄した後、１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離を行った。この操作を３回繰り返した。
【００３５】
得られた沈殿物２ｇに乳糖水溶液（１％，４．７％，１０％）を７０ｍＬ加え、室温で、一晩振とうし、得られた反応物に水を加えて洗浄した。この後、１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離を行った。そして、沈殿物を凍結乾燥し、水分を半分除去した。
【００３６】
［マウスへの注入］
上記のようにして得られた乳糖処理のＥＤＣ架橋魚由来コラーゲンをヌードマウスの背部皮下に０．３ｇ注入した。又、比較の為、乳糖処理していないＥＤＣ架橋魚由来コラーゲン（水分を凍結乾燥により半分除去）をヌードマウスの背部皮下に０．３ｇ注入した。そして、注入部の状況を目視で観察したので、その結果を表−１に示す。
【００３７】
表−１
観察結果
１％乳糖溶液処理ＥＤＣ架橋魚由来コラーゲン      ２２日間皮下に膨れ保持
４．７％乳糖溶液処理ＥＤＣ架橋魚由来コラーゲン  ９０日以上皮下に膨れ保持
１０％乳糖溶液処理ＥＤＣ架橋魚由来コラーゲン    ６日間皮下に膨れ保持
乳糖溶液未処理ＥＤＣ架橋魚由来コラーゲン        ４日間皮下に膨れ保持  
表−１から判る通り、本発明になる乳糖処理された架橋コラーゲンは、体内において、長期間に亘って維持されるものである。
【００３８】
［実施例２］
実施例１におけるコラーゲン含有溶液（ａ溶液）２．５ｍＬを、予め、注射用水を移動相として充填したゲル濾過カラムに添加した。そして、出て来た溶液を廃棄し、カラム上端に溶液が無くなってから、カラムの上端に注射用水の移動相３ｍＬを加え、ゲル濾過し、濾過された液３ｍＬを採取し、更に０．２２μｍのメンブランフィルターを通過させた。このようにしてコラーゲン溶液を得た。
【００３９】
上記のようにして得られたコラーゲン溶液を基にして実施例１と同様に行った処、実施例１と同様な結果が得られた。すなわち、本発明になる乳糖処理された架橋コラーゲンは、体内において、長期間に亘って維持されるものであった。
【００４０】
［実施例３］
実施例１において、架橋剤として用いたＥＤＣの代わりに、グルタルアルデヒドを用いて同様に行った。
【００４１】
その結果は、ＥＤＣを用いた場合よりも劣るものであった。例えば、粘性が僅かで、淡黄色を呈するものであった、但し、乳糖水溶液による処理がなされていないものに比べると、良好なものであった。
代  理  人  宇  高    克  己