(57)【要約】【課題】性分化時期以前にヒラメ類の遺伝的性を確実に判別すること。【解決手段】ヒラメ類のＤＮＡに、Ｐｏｌｉ１８５ＴＵＦに係る５’−ＧＴＧＧＡＣＡＴＴＴ  ＧＴＡＣＴＣＣＡＣＡ  ＧＡＣＣＡ−３’及び５’−ＧＴＧＡＧＣＧＧＧＴ  ＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴ  ＧＡＧ−３’、又はＰｏｌｉ１０９ＴＵＦに係る５’−ＣＣＴＣＡＣＡＡＡＧ  ＡＴＡＴＴＴＧＴＡＣ  ＡＧＧＴＧＣＡ−３’及び５’−ＣＡＴＣＴＴＴＡＧＧ  ＴＣＡＣＡＴＴＧＴＣ  ＡＣＴＧＣＴＧ−３’ の塩基から成るオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ法を行い、得られたＰＣＲ産物にゲル電気泳動法を施し、Ｐｏｌｉ１８５ＴＵＦに関しては２１２ｂｐのバンドを持つものを雄とし、Ｐｏｌｉ１０９ＴＵＦに関しては１４４ｂｐのバンドを持つものを雄とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’−ＧＴＧＧＡＣＡＴＴＴ  ＧＴＡＣＴＣＣＡＣＡ  ＧＡＣＣＡ−３’（配列番号１）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、５’−ＧＴＧＡＧＣＧＧＧＴ  ＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴ  ＧＡＧ−３’（配列番号２）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分をプライマーとして、ヒラメのゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を行い、得られた産物にゲル電気泳動法を施して２１２ｂｐのバンドを持つものを雄とする、ヒラメ類の遺伝的性判別法。
【請求項２】
５’−ＣＣＴＣＡＣＡＡＡＧ  ＡＴＡＴＴＴＧＴＡＣ  ＡＧＧＴＧＣＡ−３’（配列番号３）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、５’−ＣＡＴＣＴＴＴＡＧＧ  ＴＣＡＣＡＴＴＧＴＣ  ＡＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号４）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分をプライマーとして、ヒラメのゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を行い、得られた産物にゲル電気泳動法を施して１４４ｂｐのバンドを持つものを雄とする、ヒラメ類の遺伝的性判別法。
【請求項３】
以下の（１）又は（２）に記載されたオリゴヌクレオチド部分から成る、ヒラメ類の遺伝的性判別方法に用いるポリメラーゼ連鎖反応用プライマー。
（１）５’−ＧＴＧＧＡＣＡＴＴＴ  ＧＴＡＣＴＣＣＡＣＡ  ＧＡＣＣＡ−３’（配列番号１）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、５’−ＧＴＧＡＧＣＧＧＧＴ  ＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴ  ＧＡＧ−３’（配列番号２）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分。
（２）５’−ＣＣＴＣＡＣＡＡＡＧ  ＡＴＡＴＴＴＧＴＡＣ  ＡＧＧＴＧＣＡ−３’（配列番号３）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、５’−ＣＡＴＣＴＴＴＡＧＧ  ＴＣＡＣＡＴＴＧＴＣ  ＡＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号４）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒラメ類の遺伝的性判別方法並びに遺伝的性判別方法に用いるプライマーに関する。本発明において、「ヒラメ類」という用語は、カレイ目魚類を総称する名称として使用している。
【背景技術】
【０００２】
魚類の一部では、ストレス、温度等の環境によって性が変わる（性転換）現象が確認されている。ヒラメ類も初期発生温度によってこのような性転換を起こす魚として知られている。
例えば、遺伝的に雄のヒラメは初期発生温度に関係なく表現型も雄であるが、遺伝的に雌のヒラメは、初期発生温度が２０℃であれば表現型が雌となり、１５℃或いは２７℃であれば、表現型が雄となる。
【０００３】
ところで、ヒラメ類は、食用魚として価値が高く、栽培漁業、養殖対象種として日本、韓国、中国、台湾などのアジア諸国の水産業で重要な魚種である。
近年、大量のヒラメ稚魚が海に放流されており、平成１６年度には全国で２４００万尾にも達する。
しかし、性転換した雄と雌とを交配して得られた稚魚は、全て遺伝的に雌であり、このように性比が雌雄いずれかに大きく偏った稚魚を放流すると、自然界における雌雄のバランスが崩れかねない。
実際、種苗の性比が雄や雌に偏る例が多数確認され、放流用種苗を生産するために継代した雄親の中に性転換雄が検定交配で同定された例があり、種苗生産中における遺伝的雌稚魚の雄への性転換や、性転換雄を親魚としてまちがって使用した結果、種苗の遺伝的性が撹乱されていることが指摘されている。つまり、種苗放流がヒラメ類の天然集団の雌雄比ばかりか、遺伝的性の構成に悪影響を及ぼしていることが危惧されている。それゆえ、その解決のために性の管理技術の開発が急がれている。
【０００４】
一方、ヒラメ類は雌の方が雄よりも成長が早くて体も大型に達し、商品価値が高いので、養殖では全雌生産が主になされている。ところが、遺伝的な雄と雌とを交配して得られたヒラメ類は、当然雌雄が混在することになり、全雌生産を行うためには、雄の個体が無駄になり、雄を排除する必要がある。
そのため、全雌生産では、遺伝的に雌でありながらも性転換の結果機能的な雄である個体（＝性転換雄）を作出して雄親とし、これを通常の雌親と交配させることによって遺伝的全雌群を得ている。しかしながら、従来、全雌生産に用いる雄親が確実に性転換雄であることをあらかじめ証明するには、雌性発生の利用や、検定交配を実施するなどの大変な努力や年月を要した。
即ち、養殖漁業・栽培漁業のいずれにおいても、性について転換魚と正常魚とを生きたままで判別できることが重要課題であり、どの成長段階においても、とりわけ遺伝的性を迅速に判別する技術を開発することが必要である。
【０００５】
そこで、従来、ヒラメの生体試料における、発現に性差のある遺伝子のｍＲＮＡの発現パターンを調べることにより、魚の性を判別する方法が開発されている（特許文献１参照）。
しかし、この方法は、性分化以降の雌雄間で発現を異にする遺伝子を調べるので、性分化時期である約６０日を過ぎないと性を判別することができず、２ヶ月もの長期間に亘って無駄な飼育を行うことになりかねない。また、判別をするためには、ある程度のＲＮＡを抽出する必要があり、成魚でない場合は、判別魚全体からの抽出というように、魚を殺してしまう必要があり、増養殖における実用性は必ずしも高くない。
さらに、この方法では機能的性（生理的性）を知ることができるのみであり、個体の遺伝的な性を断定することはできない。
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−６０５６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、性分化時期以前又は／及び以降に、好ましくはヒラメ類を殺すことなく、ヒラメ類の遺伝的性を確実に判別する遺伝的性判別方法並びに遺伝的性判別方法に用いるプライマーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
雌性発生により得たヘテロクローン雌と、野生個体の中から選抜して継代飼育してきた雄とを交配し、Ｆ１集団を作出した。
作出したＦ１集団及びその両親に対してＤＮＡマーカーを用いたＱＴＬ解析を行った結果、発明者らが既に見出していたヒラメ類の遺伝子連鎖地図｛Ｍ．Ｍ．Ｃｏｉｍｂｒａ、東京水産大学博士学位論文（２００１）；Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ（２００３）｝と照らし合わせると、このヒラメ遺伝子連鎖地図における遺伝子連鎖群（ＬＧ）９のマーカー座Ｐｏｌｉ１８５ＴＵＦ及びＰｏｌｉ１０９ＴＵＦに性決定遺伝子があることがわかった。
【０００９】
そして、ＬＧ９のマーカー座Ｐｏｌｉ１８５ＴＵＦ及びＰｏｌｉ１０９ＴＵＦにそれぞれ関連する特定のプライマーを用いて、ヒラメ類のゲノムＤＮＡにＰＣＲ法を行い、得られたＰＣＲ産物にゲル電気泳動法を施すことにより、個体の遺伝的性を判別することができる。
本発明のヒラメ類の遺伝的性判別方法は、５’−ＧＴＧＧＡＣＡＴＴＴ  ＧＴＡＣＴＣＣＡＣＡ  ＧＡＣＣＡ−３’（配列番号１）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、５’−ＧＴＧＡＧＣＧＧＧＴ  ＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴ  ＧＡＧ−３’（配列番号２）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分をプライマーとして、ヒラメ類のゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を行い、得られた産物にゲル電気泳動法を施して２１２ｂｐのバンドを持つものを雄とする。
【００１０】
或いは、５’−ＣＣＴＣＡＣＡＡＡＧ  ＡＴＡＴＴＴＧＴＡＣ  ＡＧＧＴＧＣＡ−３’（配列番号３）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、５’−ＣＡＴＣＴＴＴＡＧＧ  ＴＣＡＣＡＴＴＧＴＣ  ＡＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号４）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分をプライマーとして、ヒラメ類のゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を行い、得られた産物にゲル電気泳動法を施して１４４ｂｐのバンドを持つものを雄とする。
【００１１】
本発明のヒラメ類の遺伝的性判別方法に用いるポリメラーゼ連鎖反応用プライマーは、以下の（１）又は（２）に記載されたオリゴヌクレオチド部分から成る。
（１）５’−ＧＴＧＧＡＣＡＴＴＴ  ＧＴＡＣＴＣＣＡＣＡ  ＧＡＣＣＡ−３’（配列番号１）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、５’−ＧＴＧＡＧＣＧＧＧＴ  ＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴ  ＧＡＧ−３’（配列番号２）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分。
（２）５’−ＣＣＴＣＡＣＡＡＡＧ  ＡＴＡＴＴＴＧＴＡＣ  ＡＧＧＴＧＣＡ−３’（配列番号３）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、５’−ＣＡＴＣＴＴＴＡＧＧ  ＴＣＡＣＡＴＴＧＴＣ  ＡＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号４）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分。
少なくとも１０塩基で構成されるオリゴヌクレオチド部分を含有する配列番号１．２．３．４のプライマーとしては、１０〜５０塩基のオリゴヌクレオチド部分、より好ましくは２０塩基前後のオリゴヌクレオチド部分を含有するプライマーが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、性分化時期以前及び／又は以降にヒラメ類の遺伝的性を判別できるので、放流時にも稚魚の性比が雌雄いずれかに偏るのを防ぐことが可能であり、ヒラメ類の全雌養殖を効率良く行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
遺伝子連鎖群ＬＧ９上のマーカー座Ｐｏｌｉ１８５ＴＵＦ及びＰｏｌｉ１０９ＴＵＦの性決定遺伝子マーカーを用いて、ヒラメ類の遺伝的性を判別する。
以下、本発明の実施例について詳細に説明する。
本実施例で用いたのは、標準和名「ヒラメ」であり、学名はＰａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓ（Ｔｅｍｍｉｎｃｋ  ｅｔ  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，1765）である。ヒラメ属（Ｇｅｎｕｓ  Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ）には、世界中で約１９種があり、多くが産業重要種である。
【００１４】
（解析家系）
雌性発生により得たヘテロクローン雌と、鳥取県栽培漁業センターにおいて継代飼育されてきた雄とを交配し、７８匹のＦ１集団を得た。
得られたＦ１集団の受精卵を１００Ｌ水槽に収容し、７０Ｌの海水で水温２０℃に維持して止水飼育した。受精３日後、５００Ｌ水槽に移し、２０℃で流水飼育した。孵化後２５日目までは、餌料としてワムシを与え、１５日目から６０日目までは、アルテミアを加え、３０日以降は市販の配合飼料を与えた。
【００１５】
また、日齢４６から日齢９０までの間、飼料に雌性ホルモン（エスタジオール−１７β：Ｅ２）を０．３ｐｐｍ加えて、温度やストレスの影響により遺伝的に雌である個体が雄に性転換するのを最小限に抑えた。
飼育開始１年後に、Ｆ１集団７８個体を開腹し、生殖腺を確認することで雌雄の判別を行った。
７８個体の性比は、雄が３６個体、雌が４２個体であった。
【実施例１】
【００１６】
７８匹全てのヒラメに対し、次のようにしてＰｏｌｉ１８５ＴＵＦに関するＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ法を行い、得られたＰＣＲ産物にゲル電気泳動法を施し、その遺伝子型を確認した。
【００１７】
まず、全てのヒラメからのＤＮＡ抽出は、以下の手順で行った。
尾鰭を１ｃｍ角の大きさで採取し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔris−ＨＣｌ（pH８．０）、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ Proteinase Ｋを含む消化溶液を６００μＬ加え、３７℃で一晩静置した。
さらに、フェノール／クロロホルム（１：１）抽出を１回行った後、エタノール沈殿にて染色体ＤＮＡを析出させた。回収したＤＮＡは７０％エタノールで洗浄、乾燥後、ＴＥ溶液（０．０１Ｍ Ｔris−ＨＣｌ pH７．４、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ pH８．０）５０μＬに溶解した。
【００１８】
次に、
５’−ＧＴＧＧＡＣＡＴＴＴ  ＧＴＡＣＴＣＣＡＣＡ  ＧＡＣＣＡ−３’（配列番号１）
５’−ＧＴＧＡＧＣＧＧＧＴ  ＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴ  ＧＡＧ−３’（配列番号２）
の一組のプライマーを合成し、２．５ｐｍｏｌ Ｆプライマーと［γ-33Ｐ］ＡＴＰ、Ｔ４ polynucleotide kinaseによって標識した０．１７ｐｍｏｌ Ｒプライマー、０．１７５ｍＭ each ｄＮＴＰ、２０ｍＭ Ｔris−ＨＣｌ（pH８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１％ＢＳＡ、０．２５ Ｕ Ｔaq ＤＮＡ polymerase（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）、５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを含む１１μｌの溶液で、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９６００  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）にて、ＰＣＲ法を行った。
【００１９】
なお、このプライマーを用いたＰＣＲ反応組成（１サンプル分）を表１に示し、ＲプライマーのＲＩ標識用液組成（４９サンプル分）を表２に示す。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
【表２】
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【００２２】
ＰＣＲ条件は、９５℃、２分−（９５℃、３０秒−６０℃、１分−７２℃、１分）×３５サイクル−（９５℃、３０秒−６０℃、１分−７２℃、３分）×１サイクルとした。
反応後、等量のLoading dye（９５％ formamide,１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０５％ bromophenol blue and xylene cyanol）とよく攪拌し、ＰＣＲ産物を熱変性によって１本鎖にし、６％アクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。
その後、１時間乾燥させたゲルを、Imaging Plate(ＩＰ)に３〜１２時間感光させ、放射線の感光像が記憶されたＩＰをBio-imaging Analyzer（ＢＡＳ１０００，Fuji Photo Films）で読み取り、コンピュータで映像化した。
その結果を図１及び図２に示す。
【００２３】
図１及び図２からわかるように、雄は全ての個体が２１２ｂｐのバンドを持っていた。即ち、２１２ｂｐのバンドを持っているか否かを調べることで、雌雄を判別することができる。
性決定形質（雄性）とこのバンドとの連鎖関係の確かさはＬｏｄ Ｓｃｏｒｅ（Lathropet al １９８４）で示される。
２１２ｂｐのバンドと性決定形質（雄性）との矛盾は全く無く、Ｌｏｄ  Ｓｃｏｒｅ＝７８×ｌｏｇ０．５＝２３．４８となり、この連鎖関係は、１／１０23.48の危険率で確実である。
従って、実施例１において、ＰＣＲ産物に２１２ｂｐのバンドがあるヒラメは雄のヒラメであるといえる。
【実施例２】
【００２４】
実施例１と同様に抽出したヒラメのＤＮＡに対し、Ｐｏｌｉ１０９ＴＵＦに関するＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ法を行い、得られたＰＣＲ産物にゲル電気泳動法を施して、その遺伝子型を確認した。
５’−ＣＣＴＣＡＣＡＡＡＧ  ＡＴＡＴＴＴＧＴＡＣ  ＡＧＧＴＧＣＡ−３’（配列番号３）
５’−ＣＡＴＣＴＴＴＡＧＧ  ＴＣＡＣＡＴＴＧＴＣ  ＡＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号４）
の一組のプライマーを合成してＰＣＲ法を行った。
ＰＣＲ条件、電気泳動等の条件は実施例１とほぼ同様であるが、アニーリング温度のみを４６℃に変更した。
実施例２におけるＰＣＲ産物のゲル電気泳動像を図３及び図４に示す。
【００２５】
図３及び図４から、雄は全ての個体が１４４ｂｐのバンドを持っていることがわかった。即ち、１４４ｂｐのバンドを持っているか否かを調べることで、雌雄の判別が可能となる。
性決定形質（雄性）とこのバンドとの連鎖関係の確かさはＬｏｄ Ｓｃｏｒｅ（Lathropet al １９８４）で示される。
１４４ｂｐのバンドと性決定形質（雄性）との矛盾は全く無く、Ｌｏｄ  Ｓｃｏｒｅ＝７８×ｌｏｇ０．５＝２３．４８となり、この連鎖関係は、１／１０23.48の危険率で確実である。
従って、実施例２において、ＰＣＲ産物に１４４ｂｐのバンドがあるヒラメは雄のヒラメであるといえる。
【００２６】
なお、上記実施例では、性決定形質（雄性）と連鎖するバンドとして２１２ｂｐ，１４４ｂｐを示した。しかし、配列番号１と配列番号２のプライマー、及び、配列番号３と配列番号４のプライマーは、ＣＡ繰り返し配列（マイクロサテライト）を含む形でＰＣＲプライマーが設計されている。
マイクロサテライトを含むＰＣＲプライマーは、１つの遺伝子座を位置付けることができると共に、同種内のその多型性により各個体間では多くのバンドを検出する（ＤＮＡＭａｋｅｒｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，ＧＵＳＴＡＶＯ  ＣＡＥＴＡＮＯ−ＡＮＯＬＬＥＳ  ＰＥＴＥＲ  Ｍ．ＧＲＥＳＳＨＯＦＦ）。
よって、この実施例で示されるバンドのサイズは、これに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１のプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル電気泳動像を示す。
【図２】実施例１のプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル電気泳動の模式図を示す。
【図３】実施例２のプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル電気泳動像を示す。
【図４】実施例２のプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル電気泳動の模式図を示す。
【図２】
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【図４】
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【図１】
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【図３】
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【配列表】
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