(57)【要約】 【課題】エステルの分解、交換及び合成反応に高い活性を有するリパーゼ、該高活性リパーゼを細胞表層に発現及び固定化させたアーミング酵母及びその製造方法を提供する。【解決手段】アミノ末端から４６番目のアミノ酸がグリシン、８９番目のアミノ酸がトレオニン、９７番目のアミノ酸がアルギニン、２８６番目のアミノ酸がイソロイシンのいずれか１以上を充足することを特徴とするリパーゼＢ；係る要件を充足する塩基配列を有するキャンディダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢ遺伝子をサッカロミセス属酵母に導入して該酵母を培養することを特徴とする高活性アーミング酵母の製造方法；係るリパーゼＢを細胞表層に有する高活性アーミング酵母。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端から４６番目のアミノ酸がグリシン、８９番目のアミノ酸がトレオニン、９７番目のアミノ酸がアルギニン、２８６番目のアミノ酸がイソロイシンのいずれか１以上を充足することを特徴とするリパーゼＢ。
【請求項２】
アミノ末端から４６番目のアミノ酸がグリシン、８９番目のアミノ酸がトレオニン、９７番目のアミノ酸がアルギニン、２８６番目のアミノ酸がイソロイシンである請求項１に記載のリパーゼＢ。
【請求項３】
アミノ末端から８９番目のアミノ酸がトレオニン、９７番目のアミノ酸がアルギニン、２８６番目のアミノ酸がイソロイシンである請求項１に記載のリパーゼＢ。
【請求項４】
キャンディダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来である請求項１〜３のいずれか一項に記載のリパーゼＢ。
【請求項５】
前記キャンディダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）がＣＢＳ６６７８株である請求項４に記載のリパーゼＢ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のリパーゼＢを細胞表層に有する高活性アーミング酵母の製造方法であって、
アミノ末端から４６番目のアミノ酸がグリシン、８９番目のアミノ酸がトレオニン、９７番目のアミノ酸がアルギニン、２８６番目のアミノ酸がイソロイシンのいずれか１以上を充足する塩基配列を有するキャンディダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼＢ遺伝子をサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母に導入して該酵母を培養することを特徴とする高活性アーミング酵母の製造方法。
【請求項７】
前記リパーゼＢが、分泌シグナル配列、リパーゼＢの構造遺伝子配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、ＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡによって細胞表層に発現されるものである請求項６に記載の高活性アーミング酵母の製造方法。
【請求項８】
前記リパーゼＢが、分泌シグナル配列、リパーゼＢの構造遺伝子配列、糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列をこの順で、あるいは分泌シグナル配列、糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列、リパーゼＢの構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡによって細胞表層に発現されるものである請求項６に記載の高活性アーミング酵母の製造方法。
【請求項９】
前記糖鎖結合タンパク質ドメインが、少なくとも細胞表層局在タンパク質の凝集機能ドメインを含む部分である請求項８に記載の高活性アーミング酵母の製造方法。
【請求項１０】
前記リパーゼＢが、分泌シグナル配列、リパーゼＢの構造遺伝子配列、ＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡによって細胞表層に発現されるものである請求項６に記載の高活性アーミング酵母の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のリパーゼＢを細胞表層に有することを特徴とする高活性アーミング酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高活性リパーゼＢを発現させて細胞表層に固定化させた高活性アーミング酵母及びその製造方法並びに高活性リパーゼＢに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表層に酵素を固定化させたアーミング酵母の創製技術により、本来酵母が有していない分泌型酵素、例えば、アミラーゼ、セルラーゼなどを細胞表層に固定化することが可能となり、これまで酵母が分解、利用できなかった炭素源等の基質が利用できるようになった。例えば、細胞表層にアミラーゼを発現及び固定化させた、アミラーゼ・アーミング酵母を用いることで、酵母が利用できないデンプンから、直接アルコールを生産することができるようになっている（特許文献１及び２、非特許文献１参照）。
【０００３】
また、アーミング酵母は、アルコール発酵母体としてだけでなく、固定化酵素としても注目されている。発現された酵素が、酵母細胞表層に自発的に固定化され、酵母自体が酵素固定化担体としての役割を果たすため、通常の固定化酵素の製造過程で行われる酵素の分離、精製及び固定化のプロセスを経ることなく、目的の酵素を担体に固定化した状態（固定化酵素剤）で得ることが可能である。アーミング酵母を固定化酵素として利用した例としては、例えば、バイオディーゼル燃料の製造（特許文献３参照）が知られている。すなわち、細胞表層にリパーゼを発現及び固定化させたリパーゼ・アーミング酵母を用いて、廃油とメタノールのエステル交換反応を行うことで、脂肪酸メチルエステルを得るという技術である。あるいは、リパーゼ・アーミング酵母を用いてエステル交換反応を行うことで、光学活性エステルを製造する方法も知られている（特許文献４参照）。このように、アーミング酵母は発酵母体あるいは固定化酵素として様々な利用価値を秘めている。
【特許文献１】国際公開第２００２／０４２４８３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００３／０１６６５２５号パンフレット
【特許文献３】特開平１１−２９００７８号公報
【特許文献４】特開２００４−４９０１４号公報
【非特許文献１】Ｕｅｄａ  ｅｔ．ａｌ．  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３（１９９７），１３３２−１３３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述のように、細胞表層にリパーゼを発現及び固定化させたリパーゼ・アーミング酵母をエステル交換反応に利用した例は知られているが、エステル合成反応に利用した例はこれまで知られていない。エステル合成反応は吸熱反応であるため、高温条件下で反応を行うことが好ましい。しかしながら、通常の酵素は、至適温度以上の高温に長時間晒されると、酵素活性が著しく低下してしまう。そのため、エステル合成反応に適したリパーゼの創製と、このようなリパーゼを細胞表層に発現及び固定化させたアーミング酵母の創製が強く望まれている。
【０００５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、エステルの分解及び交換反応だけでなく、エステル合成反応にも高い活性を有するリパーゼを提供すると共に、このような高活性リパーゼを細胞表層に発現及び固定化させたアーミング酵母及びその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、エステル合成反応に適したアーミング酵母の創製を目指し、エステル分解及び合成反応に適した酵素の選抜、酵素の活性発現にとって望ましい酵母の細胞表層の立体構造、酵素の生産性や活性発現について鋭意検討した。そして、宿主となる酵母として、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母に着目し、酵素として、キャンディダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼＢに着目した。係るリパーゼＢを細胞表層に発現及び固定化させたサッカロミセス属アーミング酵母の創製研究、並びにエステル合成反応に対する活性の向上を目的としたリパーゼＢの改変研究において、当初の予想とは異なり、意外にもエステル合成反応に対して高い活性を示すリパーゼＢを見出し、本リパーゼをサッカロミセス属アーミング酵母の細胞表層に発現及び固定化させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、アミノ末端から４６番目のアミノ酸がグリシン、８９番目のアミノ酸がトレオニン、９７番目のアミノ酸がアルギニン、２８６番目のアミノ酸がイソロイシンのいずれか１以上を充足することを特徴とするリパーゼＢを提供する。
また、本発明は、係るリパーゼＢを細胞表層に有する高活性アーミング酵母の製造方法であって、アミノ末端から４６番目のアミノ酸がグリシン、８９番目のアミノ酸がトレオニン、９７番目のアミノ酸がアルギニン、２８６番目のアミノ酸がイソロイシンのいずれか１以上を充足する塩基配列を有するキャンディダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼＢ遺伝子をサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母に導入して該酵母を培養することを特徴とする高活性アーミング酵母の製造方法を提供する。
また、本発明は、係るリパーゼＢを細胞表層に有することを特徴とする高活性アーミング酵母を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の製造方法で得られたアーミング酵母は、その細胞表層に高活性なリパーゼＢを有し、従来のアーミング酵母細胞表層のリパーゼ、例えば、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｉｚａｅ）由来のリパーゼなどに比べ、エステル合成、分解及び交換反応を触媒する活性が高く、これら反応により適したリパーゼである。さらに、本発明のリパーゼＢは、従来のアーミング酵母細胞表層のリパーゼよりも耐熱性が高く、高温でも触媒活性を有するため、エステル合成反応のような吸熱反応を効率よく触媒することができる。したがって、本発明は、固定化酵素として優れた特性を有するアーミング酵母の利用機会をさらに拡大できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について詳しく説明する。なお、本発明においては、特に断りの無い限り、エステル反応とは、エステル合成、分解及び交換反応を指し、単位「％」は「ｗ／ｖ％」を示すものとする。また、単位「ｍＭ」は「ｍｍｏｌ／Ｌ」を、単位「μＭ」は「μｍｏｌ／Ｌ」をそれぞれ示す。
【００１０】
（アーミング酵母）
本発明において、アーミング酵母とは細胞表層局在タンパク質と種々の機能性タンパク質（酵素・抗原・抗体・レポータータンパク質など）やペプチドを融合させ、細胞表層にディスプレイさせることにより、通常の酵母では有していない新しい機能を有する、あるいは元来有している機能を増強した酵母細胞のことをいう。また、細胞表層とは細胞膜・細胞壁ならびにその間の空間であるペリプラズムのことであり、これらの層を利用し上記の様な要件を満たす酵母細胞をアーミング酵母という。
【００１１】
本発明におけるアーミング酵母の創製は、特許文献；特開平１１−２９００７８号公報、及び国際公開第２００２／０８５９３５号パンフレットを基に行われた。
本発明におけるリパーゼＢ及び該リパーゼＢのアミノ酸配列に関しては次に説明する通りである。
【００１２】
（分泌型酵素）
リパーゼとは、油脂から脂肪酸を遊離させ得る活性を有する酵素であり、その起源については特に限定されないが、通常、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｉｚａｅ、以下、リゾプス・オリザエと略記する）などのカビ由来のリパーゼや、キャンディダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、以下、キャンディダ・アンタルクチカと略記する）などの酵母由来のリパーゼが好適に用いられている。吸熱反応であるエステル合成反応に利用する場合には、高温で反応を触媒できる方が有利であり、様々なリパーゼの中でも反応至適温度が高いリパーゼが好ましい。
そこで、本発明においては、キャンディダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢを用いることが好ましい。
【００１３】
本発明のリパーゼＢは、アミノ末端から４６番目のアミノ酸がグリシン、８９番目のアミノ酸がトレオニン、９７番目のアミノ酸がアルギニン、２８６番目のアミノ酸がイソロイシンのいずれか１以上を充足することを特徴とする。
なかでも、３以上を充足するものが好ましく、アミノ末端から４６番目のアミノ酸がグリシン、８９番目のアミノ酸がトレオニン、９７番目のアミノ酸がアルギニン、２８６番目のアミノ酸がイソロイシンであるリパーゼＢ、並びにアミノ末端から８９番目のアミノ酸がトレオニン、９７番目のアミノ酸がアルギニン、２８６番目のアミノ酸がイソロイシンであるリパーゼＢが特に好ましい。
【００１４】
このように、前記のアミノ酸配置の条件のうち、３以上を充足するリパーゼＢの活性が向上する理由については、明らかではない。しかし、前記の四つのアミノ酸は、リパーゼＢの活性中心を形成すると考えられているアミノ末端から１０５番目のセリン、１８７番目のアスパラギン酸、２２４番目のヒスチジンとは異なるので、活性に直接影響するのではなく、基質の認識や基質との結合に関与しているのではないかと推定される。
【００１５】
本発明においては、リパーゼＢは、キャンディダ・アンタルクチカ由来ものが好ましい。
キャンディダ・アンタルクチカには、例えば、ＣＢＳ６６７８、ＣＢＳ５９５５、ＣＢＳ６８２１、ＮＢＲＣ１０２６０、ＮＢＲＣ１０７３６、ＤＳＭ３８５５、ＤＳＭ３９０８、ＤＳＭ３９０９、ＬＦ０５８などの株が知られており、一般的にいずれの株由来のリパーゼＢもエステル反応の触媒として利用することができ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、以下、サッカロミセスと略記）属の酵母の細胞表層に発現及び固定化させることができる。また、これらのリパーゼＢを発現及び固定化させたアーミング酵母は、エステル反応に利用することができる。
本発明者らは、キャンディダ・アンタルクチカＣＢＳ６６７８株から採取したリパーゼＢのアミノ酸配列を検討したところ、上記要件を充足していることが明らかとなった。なお、上記要件を充足しないリパーゼＢについては、後記するポイントミューテーション法などを用いて、アミノ酸配列を改変することによって、本発明のリパーゼＢを得ることが可能である。
【００１６】
キャンディダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢの構造遺伝子は、タンパク質の立体構造を形成するために必要とされるプロ配列をコードする遺伝子と、実際に触媒反応機能をもつ成熟タンパク質配列をコードする遺伝子からなる。リパーゼＢは、成熟タンパク質配列のみでも、サッカロミセス属酵母の細胞表層に発現させた場合、エステル反応を触媒することができる。
【００１７】
（細胞表層局在タンパク質）
本発明において、細胞表層局在タンパク質とは、酵母の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタンパク質をいう。例えば、凝集性タンパク質であるα―またはａ−アグルチニン、ＦＬＯタンパク質、大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＡなどが挙げられる。一般に細胞表層局在タンパク質は、Ｎ末端側に分泌シグナル配列及びＣ末端側にＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列を有している。分泌シグナル配列を有する点では分泌性タンパク質と共通しているが、細胞表層局在タンパク質は、ＧＰＩアンカーを介して細胞膜に固定されて輸送される点が分泌性タンパク質と異なる。細胞表層局在タンパク質は細胞膜通過の際、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が選択的に切断され、新たに突出したＣ末端部分でＧＰＩアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣ（以下、ＰＩ−ＰＬＣと略記する）によりＧＰＩアンカーの根元部分が切断される。次いで、細胞膜から切り離されたタンパク質は、細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に局在する。
【００１８】
（分泌シグナル配列）
本発明において、分泌シグナル配列とは、一般に細胞外に分泌されるタンパク質のＮ−末端に結合している、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むアミノ酸配列であり、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通して細胞外（ペリプラズムも含む）へ分泌される際に除去される。分泌シグナル配列であれば、どのような分泌シグナル配列でも用いることができ、その起源は限定されない。例えば、グルコアミラーゼの分泌シグナル配列、酵母のα―またはａ―アグルチニンの分泌シグナル配列、リパーゼの分泌シグナル配列などが好適に用いられている。また、リパーゼの活性に影響を与えないのであれば、分泌シグナル配列の一部または全部が酵素のＮ−末端側に残っても良い（特開平１１−２９００７８号公報、国際公開第２００２／０８５９３５号パンフレット参照）。
【００１９】
（ＧＰＩアンカー及びＧＰＩアンカリングドメイン）
ＧＰＩアンカーとは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と呼ばれる、エタノールアミンリン酸―６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質をいう。
ＧＰＩアンカリングドメインは、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端あるいはその近傍に位置する。例えば、α―アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列がこれに相当し、この配列には、ＧＰＩアンカーが細胞表層局在タンパク質と結合する際に認識される配列であるＧＰＩアンカー認識付着シグナル配列の他に、４カ所の糖鎖結合部位がある。ＧＰＩアンカーの根元部分がＰＩ−ＰＬＣにより切断された後、これらの糖鎖結合部位に結合した糖鎖と細胞壁を構成する多糖類とが共有結合することで、α―アグルチニンのＣ末端配列部分が細胞壁と結合し、α―アグルチニンは細胞表層に保持される。
【００２０】
（糖鎖結合タンパク質ドメイン）
本発明において、糖鎖結合タンパク質ドメインとは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が、細胞壁中の糖鎖と相互作用または絡み合うことによって、細胞表層に留まることのできるドメインをいう。例えば、レクチンなどの糖鎖結合部位や、α―アグルチニン、ａ―アグルチニン、ＦＬＯタンパク質などの凝集タンパク質の凝集機能ドメインなどが挙げられる。
【００２１】
（凝集機能ドメイン）
細胞表層局在タンパク質の凝集機能ドメインとはＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
【００２２】
本発明において、リパーゼＢを細胞表層に発現させるＤＮＡは、以下の配列を有するＤＮＡであることが好ましい。
（１）分泌シグナル配列、リパーゼＢの構造遺伝子配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列及びＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡ
（２）分泌シグナル配列、リパーゼＢの構造遺伝子配列、糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡ
（３）分泌シグナル配列、糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列、リパーゼＢの構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡ
（４）分泌シグナル配列、リパーゼＢの構造遺伝子配列、ＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡ
【００２３】
上記（２）、（３）の場合は、糖鎖結合タンパク質ドメインが、少なくとも細胞表層局在タンパク質の凝集機能ドメインを含む部分であることが好ましい。
【００２４】
また、上記（１）〜（４）の場合、リパーゼＢの構造遺伝子配列と、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列もしくは糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列またはＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列との間には、適当な長さのリンカー配列が挟みこまれてもよく、アミノ酸の種類は限定されないが、アミノ酸８個〜２１個をコードするＤＮＡ配列が好ましい。
【００２５】
前記（１）〜（４）のＤＮＡは、従来公知の手法を用いて合成することができる。例えば、（１）のＤＮＡの場合、分泌シグナル配列とリパーゼＢの構造遺伝子配列との結合は、部位特異的突然変異法を用いて行うことができ、正確な分泌シグナル配列の切断と高活性なリパーゼＢの発現が可能である。さらに、このようにして得られた配列と、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列とを結合すればよい。結合は、適切な制限酵素、リンカー等を用いて行うことができる。
また、係るＤＮＡは、プラスミドの形態でも、宿主となるサッカロミセス属酵母の遺伝子に組み込まれた形態でも、いずれでもよい。
アーミング酵母は、係るＤＮＡをサッカロミセス属酵母に導入することにより得ることができる。
【００２６】
本発明者らは、キャンディダ・アンタルクチカＬＦ０５８株から採取したリパーゼＢのアミノ酸配列を解析したところ、アミノ末端から４６番目、８９番目、９７番目、２８６番目のアミノ酸のいずれもが、本発明の構成を充足しないことが判った。このような場合、以下に示すような、ポイントミューテーション法などの従来公知の方法を用いて、該当アミノ酸の改変を行うことができる。
【００２７】
キャンディダ・アンタルクチカのいずれかの株のゲノムをテンプレートとして、適当なプライマーを用いてＰＣＲ等により増幅を行う。得られた増幅産物を適当な制限酵素で切断して、キャンディダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢ遺伝子を取得する。取得したリパーゼＢ遺伝子をＰＣＲ等により増幅させる過程で、ポイントミューテーションを起こさせることができる。例えば、取得したリパーゼＢ遺伝子を、一度サイズの小さいプラスミドに導入して、該プラスミドをテンプレートとして特定のプライマーを用いてＰＣＲ等により増幅を行うと、ポイントミューテーションを効率よく生じさせることができる。得られた増幅産物のプラスミドに対して、さらに異なる種類の特定のプライマーを用いてＰＣＲ等により増幅を行うと、異なる部位にポイントミューテーションを生じさせることができる。この過程を繰り返すことで、キャンディダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢ遺伝子の特定の箇所に変異を生じさせることができる。
【００２８】
得られた改変リパーゼＢ遺伝子を導入したプラスミドは、プライマーを用いてＰＣＲ等により、ポイントミューテーションを生じさせることなく増幅を行う。そして、得られた増幅産物を適当な制限酵素を用いて切断すると、リパーゼＢのプロ配列、成熟タンパク質配列、リンカー配列等をコードする遺伝子のいずれか一種以上を有する改変リパーゼＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得できる。この時用いる制限酵素は、取得したい配列のＤＮＡ断片の種類に応じて適宜選択すれば良い。
【００２９】
上記で得られた目的の配列を有するＤＮＡ断片は、例えば、Ｓｈｏｒｔ型ＦＬＯ１遺伝子と接続することにより、目的のリパーゼＢ遺伝子を含むプラスミドとすることができる。そして、該プラスミドをサッカロミセス属酵母に導入し、該酵母を培養すれば、ＦＬＯ１誘導体とリパーゼＢとの融合タンパク質が細胞表層に発現及び固定化されたアーミング酵母が得られる。酵母へのプラスミドの導入あるいは酵母の培養は、従来公知の方法で行えば良く、特に限定されない。
なお先にも述べた通り、本発明においては、遺伝子の改変あるいはアミノ酸配列の改変の手法は、ここに示した例に限定されるものではない。
【００３０】
このようにして、例えば、アミノ末端から４６番目のアミノ酸がグリシン、８９番目のアミノ酸がトレオニン、９７番目のアミノ酸がアルギニン、２８６番目のアミノ酸がイソロイシンのいずれか１以上を充足する塩基配列を有するキャンディダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢ遺伝子をサッカロミセス属酵母に導入して該酵母を培養すれば、本発明のリパーゼＢを細胞表層に有する高活性アーミング酵母が得られる。
【００３１】
このようにして得られるアーミング酵母の細胞表層のリパーゼＢは、従来のアーミング酵母細胞表層のリパーゼ、例えば、リゾプス・オリザエ由来のリパーゼなどに比べ、エステル反応を触媒する活性が高く、エステル反応により適したリパーゼである。さらに、従来のリパーゼよりも耐熱性が高く、高温でエステル反応を触媒できるため、エステル合成反応のような吸熱反応を効率よく触媒することが可能である。
以上のように、本発明のアーミング酵母は、従来のアーミング酵母よりも固定化酵素として優れたものである。
【実施例】
【００３２】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００３３】
（製造例１）
（Ａ．キャンディダ・アンタルクチカ由来リパーゼＢ遺伝子の取得）
次のようにしてキャンディダ・アンタルクチカ由来リパーゼＢ（ＣＡＬＢ）遺伝子を取得した。
すなわち、キャンディダ・アンタルクチカＣＢＳ６６７８株ゲノムをテンプレートとし、従来公知の方法でＤＮＡ合成装置にて合成した、配列番号１及び２に示す塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで切断して、約１０００ｂｐの長さのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片（ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＰｒｏＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８断片）を得た。このＣＡＬＢは、Ｕｐｐｅｎｂｅｒｇらの文献（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２：２９３（１９９４））に記載され、もっとも広く知られているキャンディダ・アンタルクチカ ＬＦ０５８株由来リパーゼＢのアミノ酸配列（ＣＡＬＢ  ＷＴ）と比較して７アミノ酸が変異している。すなわち２５番目のアラニンがトレオニンに、２８番目のセリンがトレオニンに、３１番目のセリンがトレオニンに、４６番目のグルタミンがグリシンに、８９番目のアラニンがトレオニンに、９７番目のアスパラギンがアルギニンに、２８６番目のバリンがイソロイシンにそれぞれ変異している、特徴的なＣＡＬＢであった。
【００３４】
（Ｂ．ＣＡＬＢ遺伝子導入プラスミドの取得）
ＣＡＬＢ遺伝子中への変異の導入を効率よく行うため、上記Ａで得られたＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８遺伝子を、一度サイズの小さいプラスミドに導入した。
すなわち、プラスミドｐＵＣ１９（ＴａＫａＲａ  ＢＩＯ社製）をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断し、上記Ａで得られたＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＰｒｏＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８断片を挿入して、プラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８を得た。作成の模式図を図1に示す。
【００３５】
（Ｃ．ＣＡＬＢ１遺伝子ならびにＣＡＬＢ１導入プラスミドの取得）
上記Ｂで得られたプラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８をテンプレートとし、従来公知の方法でＤＮＡ合成装置にて合成した、配列番号３及び４に示す塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、ＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８中にポイントミューテーションを導入し、ＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８中のアミノ末端から２５番目のトレオニンをアラニンに、２８番目のトレオニンをセリンに、３１番目のトレオニンをセリンにそれぞれ置換したＣＡＬＢ１遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ１を得た。
【００３６】
（Ｄ．ＣＡＬＢ２遺伝子ならびにＣＡＬＢ２導入プラスミドの取得）
上記Ｃで得られたプラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ１をテンプレートとし、従来公知の方法でＤＮＡ合成装置にて合成した、配列番号５及び６に示す塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、ＣＡＬＢ１中にポイントミューテーションを導入し、ＣＡＬＢ１中のアミノ末端から４６番目のグリシンをグルタミンに置換したＣＡＬＢ２遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ２を得た。
【００３７】
（Ｅ．ＣＡＬＢ３遺伝子ならびにＣＡＬＢ３導入プラスミドの取得）
上記Ｄで得られたプラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ２をテンプレートとし、従来公知の方法でＤＮＡ合成装置にて合成した、配列番号７及び８に示す塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、ＣＡＬＢ２中にポイントミューテーションを導入し、ＣＡＬＢ２中のアミノ末端から８９番目のトレオニンをアラニンに、９７番目のアルギニンをアスパラギンに置換したＣＡＬＢ３遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ３を得た。
【００３８】
（Ｆ．ＣＡＬＢ  ＷＴ遺伝子ならびにＣＡＬＢ  ＷＴ導入プラスミドの取得）
上記Ｅで得られたプラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ３をテンプレートとし、従来公知の方法でＤＮＡ合成装置にて合成した、配列番号９及び１０に示す塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、ＣＡＬＢ３中にポイントミューテーションを導入し、ＣＡＬＢ３中のアミノ末端から２８６番目のイソロイシンをバリンに置換したＣＡＬＢ  ＷＴ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ  ＷＴを得た。
【００３９】
（実施例１）
（Ｇ．各種ＣＡＬＢ遺伝子の取得）
製造例１にて得られた各ＣＡＬＢ導入プラスミドをそれぞれテンプレートとし、従来公知の方法でＤＮＡ合成装置にて合成した、配列番号１１及び１２、あるいは配列番号１３及び１２に示す塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、次いでＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで切断して、それぞれ約１０００ｂｐの長さのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片（ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＰｒｏＣＡＬＢ断片またはＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＣＡＬＢ断片）を得た。ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ ＰｒｏＣＡＬＢ断片は、リパーゼのプロ配列及び成熟タンパク質配列を有しており、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＣＡＬＢ断片はリパーゼの成熟タンパク質配列を有している。ＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８、ＣＡＬＢ１、ＣＡＬＢ２、ＣＡＬＢ３、ＣＡＬＢ  ＷＴそれぞれについて上記二種のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。
【００４０】
（Ｈ．リンカー導入型ＣＡＬＢ遺伝子の取得）
製造例１にて得られた各ＣＡＬＢ導入プラスミドをそれぞれテンプレートとし、従来公知の方法でＤＮＡ合成装置にて合成した、配列番号１４及び１２、あるいは配列番号１５及び１２に示す塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、次いでＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで切断して、それぞれ約１０００ｂｐの長さのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片（ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ断片またはＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＦＬＡＧ−ＣＡＬＢ断片）を得た。ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ断片は、ＦＬＡＧ  ｔａｇ、リパーゼのプロ配列及び成熟タンパク質配列を有しており、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＦＬＡＧ−ＣＡＬＢ断片は、ＦＬＡＧ  ｔａｇ及びリパーゼの成熟タンパク質配列を有している。ＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８、ＣＡＬＢ１、ＣＡＬＢ２、ＣＡＬＢ３、ＣＡＬＢ  ＷＴそれぞれについて上記二種のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。
【００４１】
（Ｉ．ＣＡＬＢ表層発現プラスミドの作成）
目的のＤＮＡを有するプラスミドは、Ｓｈｏｒｔ型ＦＬＯ１遺伝子と上記ＧまたはＨで得られたリパーゼ遺伝子を接続することにより得られる。ＦＬＯ１誘導体とリパーゼとの融合タンパク質を作成するために、以下の操作を行った。作成の模式図を図２に示す。
すなわち、プラスミドｐＷＩＦＳ（Ｔ．  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８：４５１７（２００２））をＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで切断し、上記ＧまたはＨで得られたＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片（ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＰｒｏＣＡＬＢ断片、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＣＡＬＢ断片、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ断片またはＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＦＬＡＧ−ＣＡＬＢ断片）をそれぞれ挿入して、ｐＷＩＦＳ−ＰｒｏＣＡＬＢ、ｐＷＩＦＳ−ＣＡＬＢ、ｐＷＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ、ｐＷＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＣＡＬＢをそれぞれのＣＡＬＢについて得た。
【００４２】
（Ｊ．サッカロミセス属酵母への遺伝子の導入）
上記Ｉで得られたプラスミドｐＷＩＦＳ−ＰｒｏＣＡＬＢ、ｐＷＩＦＳ−ＣＡＬＢ、ｐＷＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ、ｐＷＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＣＡＬＢを、それぞれＹＥＡＳＴ  ＭＡＫＥＲＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）を用いてサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＴ８−１（ＭＡＴａ  ａｄｅ  ｈｉｓ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｕｒａ３）に導入した。これをＳＤ−Ｗ寒天培地（２％グルコース、０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．００２％Ｌ−ヒスチジン、０．０１％Ｌ−ロイシン、０．００２％アデニン、０．００２％ウラシル）を用いて培養した。生育した酵母を選択し、ｓｈｏｒｔ型ＦＬＯ１−ＣＡＬＢを発現するアーミング酵母、すなわちサッカロミセスＭＴ８−１／ＰｒｏＣＡＬＢ、ＭＴ８−１／ＣＡＬＢ、ＭＴ８−１／ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ、ＭＴ８−１／ＦＬＡＧ−ＣＡＬＢアーミング酵母をそれぞれのＣＡＬＢについて得た。
【００４３】
（Ｋ．サッカロミセス−ＣＡＬＢアーミング酵母の調製）
上記Ｊで創製したサッカロミセス・セレヴィシエＭＴ８−１／ＰｒｏＣＡＬＢ、ＭＴ８−１／ＣＡＬＢ、ＭＴ８−１／ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ、ＭＴ８−１／ＦＬＡＧ−ＣＡＬＢアーミング酵母をＳＤＣ培地（２％グルコース、０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２％カザミノ酸、０．００２％Ｌ−ヒスチジン、０．０１％Ｌ−ロイシン、０．００２％アデニン、０．００２％ウラシル）に植菌し、６日間３０℃で振盪培養した。遠心分離により培地と菌体に分離し、酪酸ｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰＢ）を基質とした菌体のリパーゼ活性（３０℃）を確認した。得られた菌体をサッカロミセス−ＣＡＬＢアーミング酵母とした。
【００４４】
改変したリパーゼＢは、次のように表示した。
すなわち、成熟タンパク質配列を有しているＣＡＬＢ１、ＣＡＬＢ２、ＣＡＬＢ３、ＣＡＬＢＷＴを、それぞれｍＣＡＬＢ１、ｍＣＡＬＢ２、ｍＣＡＬＢ３、ｍＣＡＬＢＷＴと表示し、プロ配列と成熟タンパク質配列の両方を有しているＣＡＬＢ１、ＣＡＬＢ２、ＣＡＬＢ３、ＣＡＬＢＷＴを、それぞれｐｍＣＡＬＢ１、ｐｍＣＡＬＢ２、ｐｍＣＡＬＢ３、ｐｍＣＡＬＢＷＴと表示した。さらに、リンカー配列（ＦＬＡＧｔａｇ配列）と成熟タンパク質配列を有しているＣＡＬＢ１、ＣＡＬＢ２、ＣＡＬＢ３、ＣＡＬＢＷＴを、それぞれＦｍＣＡＬＢ１、ＦｍＣＡＬＢ２、ＦｍＣＡＬＢ３、ＦｍＣＡＬＢＷＴと表示し、リンカー配列（ＦＬＡＧｔａｇ配列）とプロ配列と成熟タンパク質配列を有しているＣＡＬＢ１、ＣＡＬＢ２、ＣＡＬＢ３、ＣＡＬＢＷＴを、それぞれＦｐｍＣＡＬＢ１、ＦｐｍＣＡＬＢ２、ＦｐｍＣＡＬＢ３、ＦｐｍＣＡＬＢＷＴと表示した。
【００４５】
（比較例１）
（Ｌ．サッカロミセス属酵母への遺伝子の導入）
ｐＷＩＦＳｐｒｏＲＯＬ（Ｔ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８：４５１７（２００２））をＹＥＡＳＴ  ＭＡＫＥＲＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）を用いてサッカロミセス・セレヴィシエＭＴ８−１（ＭＡＴａ  ａｄｅ  ｈｉｓ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｕｒａ３）に導入した。これをＳＤ−Ｗ寒天培地を用いて培養した。生育した酵母を選択し、ｓｈｏｒｔ型ＦＬＯ１−ＲＯＬを発現するアーミング酵母、すなわちサッカロミセスＭＴ８−１／ＲＯＬアーミング酵母を得た。
【００４６】
（Ｍ．サッカロミセス−ＲＯＬアーミング酵母の調製）
上記Ｌで創製したサッカロミセス・セレヴィシエＭＴ８−１／ＲＯＬアーミング酵母をＳＤＣ培地に植菌し、６日間３０℃で振盪培養した。遠心分離により培地と菌体に分離し、酪酸ｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰＢ）を基質とした菌体のリパーゼ活性（３０℃）を確認した（データ省略）。得られた菌体をサッカロミセス−ＲＯＬアーミング酵母とした。これは特許文献；特開平１１−２９００７８号公報、国際公開第２００２／０８５９３５号パンフレット)と同等のものである。
【００４７】
（比較例２）
【００４８】
（サッカロミセスアーミング酵母の細胞表層に発現及び固定化されたリパーゼＢのエステル合成活性）
製造例１（Ａ〜Ｆ）及び実施例１（Ｇ、Ｉ〜Ｋ）と同様の方法により調製した、キャンディダ・アンタルクチカＮＢＲＣ１０７３６株、ＣＢＳ６６７８株、ＮＢＲＣ１０２６０株、ＬＦ０５８株由来のリパーゼＢ（それぞれＣＡＬＢ１０７３６、ＣＡＬＢ６６７８、ＣＡＬＢ１０２６０、ＣＡＬＢＷＴと表示）を細胞表層に発現及び固定化させたサッカロミセス−ＣＡＬＢアーミング酵母を用いてエステル合成反応を行った。
具体的には、アジピン酸１５０ｍｇ、ｎ−ブタノール３ｍｌ、蒸留水０．１２ｍｌを試験管に量り入れ、ここへ各アーミング酵母凍結乾燥菌体１００ｍｇを加え、４０℃で６時間、１５０ｒｐｍで撹拌しながら反応させた。反応終了後、反応液を１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を０．４５μｍフィルターを用いて濾過した。得られた濾液をｎ−ブタノールで適当な倍率に希釈し、ガスクロマトグラフィーで分析し、生成したジブチルアジピン酸（ＤＢＡ）生成量を測定した。ガスクロマトグラフィーの分析条件は次の通りである。
カラム：ＴＣ−５（ジー・エル・サイエンス製）長さ３０ｍ、内径０．３２ｍｍＩＤ、液相膜厚０．２５μｍ
スプリット分析
気化室温度：２７０℃、カラム温度：１２０℃、４分間保持、温度上昇速度２０℃／ｍｉｎ、３００℃、１０分間保持
検出器：ＦＩＤ
検出器温度：３５０℃
【００４９】
結果を図３に示す。図３に示すように、エステル合成活性に差はあるものの、サッカロミセスアーミング酵母の細胞表層に発現及び固定化されたキャンディダ・アンタルクチカのいずれの株由来のリパーゼＢも、エステル合成活性を示した。なお、図中のＣＫはアーミング酵母を添加しなかった系を示している。
【００５０】
（実施例２）
（サッカロミセスアーミング酵母の細胞表層に発現及び固定化された改変リパーゼＢのエステル合成活性）
製造例１（Ａ〜Ｆ）及び実施例１（Ｈ〜Ｋ）に記載の方法により調製した、キャンディダ・アンタルクチカＣＢＳ６６７８株由来の改変リパーゼＢであるＦｍＣＡＬＢ１、ＦｍＣＡＬＢ２、ＦｍＣＡＬＢ３、及びＦｍＣＡＬＢＷＴを細胞表層に発現及び固定化させたサッカロミセス−ＣＡＬＢアーミング酵母を用いて、エステル合成反応を行った。
具体的には、アジピン酸１５０ｍｇ、ｎ−ブタノール３ｍｌ、蒸留水０．１２ｍｌを試験管に量り入れ、ここへ各アーミング酵母凍結乾燥菌体１００ｍｇを加え、６０℃で６時間、１５０ｒｐｍで撹拌しながら反応させた。反応終了後、反応液を１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を０．４５μｍフィルターを用いて濾過した。得られた濾液をｎ−ブタノールで適当な倍率に希釈し、ガスクロマトグラフィーで分析し、生成したジブチルアジピン酸（ＤＢＡ）生成量を測定した。ガスクロマトグラフィーの分析条件は比較例２と同様である。
【００５１】
結果を図４に示す。図４に示すように、アーミング酵母の細胞表層に発現及び固定化させた改変リパーゼＢのうち、ＦｍＣＡＬＢ２が最も活性が高く、以下、ＦｍＣＡＬＢ３、ＦｍＣＡＬＢ１、ＦｍＣＡＬＢＷＴの順であった。なお、図中のＣＫはアーミング酵母を添加しなかった系を示している。
本実施例の結果は、本発明により得られた改変リパーゼＢが、ＣＡＬＢＷＴよりも更にエステル合成活性が高まっていることを示している。
【００５２】
（実施例３）
（サッカロミセスアーミング酵母の細胞表層に発現及び固定化された改変リパーゼＢのエステル分解活性）
製造例１及び実施例１に記載の方法により調製した、キャンディダ・アンタルクチカＣＢＳ６６７８株由来の改変リパーゼＢであるＦｐｍＣＡＬＢ２、ｐｍＣＡＬＢ２、ＦｍＣＡＬＢ２、ｍＣＡＬＢ２を細胞表層に発現及び固定化させたサッカロミセス−ＣＡＬＢアーミング酵母を用いて、エステル分解反応を行った。
具体的には、各種アーミング酵母を２０ｍＭリン酸緩衝液５００μｌに懸濁し、３０℃で５分間プレインキュベートした。ここへ酪酸ｐ−ニトロフェニル０．０２μｌ／ｍｌ水溶液を１．５ｍｌ加え、３０℃で１０分間反応させた。そして５%トリクロロ酢酸水溶液を１００μｌ加え、反応を停止させ、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）により、菌体を除去した。上清を２０ｍＭリン酸緩衝液で適当に希釈し、ＯＤ４００ｎｍの吸光度を測定し、エステル分解活性を求めた。エステル分解活性は、１０分間にｐ−ニトルフェノールを１μｍｏｌ生成する活性を１Ｕとした。
【００５３】
結果を図５に示す。図５に示すように、サッカロミセスＣＡＬＢ−アーミング酵母の細胞表層に発現及び固定化されている改変リパーゼＢのうち、ＦｐｍＣＡＬＢ２が最も活性が高く、以下、ＦｍＣＡＬＢ２、ｍＣＡＬＢ２、ｐｍＣＡＬＢ２の順であった。この結果から、サッカロミセス−ＣＡＬＢアーミング酵母へ導入する改変リパーゼＢのＤＮＡ配列は、プロ配列をコードするＤＮＡ配列を含まず、成熟タンパク質配列をコードするＤＮＡ配列のみを有するものでも高い活性が得られることが確認された。しかしながら、改変リパーゼＢのＤＮＡ配列と、細胞表層に局在させるための配列（細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、または糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列、あるいはＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列）の間に適当な長さのリンカー配列が存在した方が更に活性が高まり、この場合、改変リパーゼのＤＮＡ配列にプロ配列が含まれる方が、エステル分解活性が高まることが示された。なお、図中のCKはアーミング酵母を添加しなかった系を示している。
【００５４】
（実施例４）
（サッカロミセスアーミング酵母の細胞表層に発現及び固定化された改変リパーゼＢの耐熱性）
製造例１及び実施例１に記載の方法により調製した、キャンディダ・アンタルクチカＣＢＳ６６７８由来の改変リパーゼＢであるＦｐｍＣＡＬＢ１、ＦｍＣＡＬＢ２、ｐｍＣＡＬＢ１、ｍＣＡＬＢ１、ＦｍＣＡＬＢ３、ＦｍＣＡＬＢ１、及びＦｍＣＡＬＢＷＴを細胞表層に発現及び固定化させたサッカロミセス−ＣＡＬＢアーミング酵母を用いて、エステル合成反応を行った。
具体的には、アジピン酸１５０ｍｇ、ｎ−ブタノール３ｍｌ、蒸留水０．１２ｍｌを試験管に量り入れ、ここへ各アーミング酵母凍結乾燥菌体１００ｍｇを加え、４０℃あるいは８０℃で６時間、１５０ｒｐｍで撹拌しながら反応させた。反応終了後、反応液を１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を０．４５μｍフィルターを用いて濾過した。得られた濾液をｎ−ブタノールで適当な倍率に希釈し、ガスクロマトグラフィーで分析し、生成したジブチルアジピン酸（ＤＢＡ）生成量を測定した。ガスクロマトグラフィーの分析条件は比較例２と同様である。
【００５５】
結果を図６に示す。図６に示すように、製造例１及び実施例１により調製したアーミング酵母の細胞表層に発現及び固定化された改変リパーゼＢは、エステル合成活性に差はあるものの、いずれも耐熱性を示し、４０℃よりも８０℃の方が高い活性を示した。
【００５６】
（比較例３）
（サッカロミセスアーミング酵母の細胞表層に発現及び固定化させたリゾプス・オリザエ由来のリパーゼの耐熱性）
比較例１に記載の方法により調製した、リゾプス・オリザエ由来のリパーゼを細胞表層に発現及び固定化させたサッカロミセス−ＲＯＬアーミング酵母Ｓ−ＲＯＬを用いて、エステル合成反応を行った。
具体的には、アジピン酸１５０ｍｇ、ｎ−ブタノール３ｍｌ、蒸留水０．１２ｍｌを試験管に量り入れ、ここへアーミング酵母凍結乾燥菌体１００ｍｇを加え、４０℃あるいは８０℃で６時間、１５０ｒｐｍで撹拌しながら反応させた。反応終了後、反応液を１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を０．４５μｍフィルターを用いて濾過した。得られた濾液をｎ−ブタノールで適当な倍率に希釈し、ガスクロマトグラフィーで分析し、生成したジブチルアジピン酸（ＤＢＡ）生成量を測定した。ガスクロマトグラフィーの分析条件は比較例２と同様である。
【００５７】
結果を図６に示す。図６に示すように、サッカロミセス−ＲＯＬアーミング酵母Ｓ−ＲＯＬの細胞表層に発現及び固定化されている従来のリゾプス・オリザエ由来のリパーゼは、４０℃では、実施例４に示したサッカロミセス−ＣＡＬＢアーミング酵母の細胞表層に発現及び固定化されている改変リパーゼＢよりも高いエステル合成活性を示したが、８０℃ではほとんど活性を示さなかった。
この結果より、本発明で得られたサッカロミセス−ＣＡＬＢアーミング酵母の細胞表層に発現及び固定化されている改変リパーゼＢは、従来のサッカロミセス−ＲＯＬアーミング酵母のリパーゼに比べ、耐熱性に優れ、高温でエステル合成反応を触媒することができることが確認された。すなわち、本発明のアーミング酵母は、吸熱反応であるエステル合成反応に、より適したものであることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、エステル反応に幅広く利用可能であり、環境への負荷が小さい酵素反応として利用できるので、化学産業におけるグリーン・サステイナブル・ケミストリーへの活用に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】製造例１におけるプラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８作成の模式図である。
【図２】実施例１におけるＦＬＯ１誘導体とリパーゼＢとの融合タンパク質作成の模式図である。
【図３】比較例２の結果を示すグラフである。
【図４】実施例２の結果を示すグラフである。
【図５】実施例３の結果を示すグラフである。
【図６】実施例４及び比較例３の結果を示すグラフである。
【図１】
2008092849.tif 000002
【図２】
2008092849.tif 000003
【図３】
2008092849.tif 000004
【図４】
2008092849.tif 000005
【図５】
2008092849.tif 000006
【図６】
2008092849.tif 000007
【配列表】
2008092849000001.app