(57)【要約】      （修正有）【課題】  被検試料の種別を問わず、また慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに簡便に核酸を抽出する処理を行うことができ、且つ、得られた核酸試料を、その後の酵素処理を必要とすることなく、そのままＰＣＲ核酸増幅試験に課しても悪影響を与えない核酸抽出方法を提供する。【解決手段】  核酸抽出方法は、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）を検試料に接触させる工程を有し、特に前記Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）の核酸抽出時の濃度が０．１〜０．２質量％であることが望ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）を被検試料に接触させる処理を行うことを特徴とする、核酸抽出方法。
【請求項２】
請求項１記載の核酸抽出方法において、前記Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）の濃度が０．１〜０．２質量％であることを特徴とする、核酸抽出方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の核酸抽出方法において、被検試料が動物由来の試料であることを特徴とする、核酸抽出方法。
【請求項４】
請求項３記載の核酸抽出方法において、微生物を含む試料であることを特徴とする、核酸抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸抽出方法に関し、特に核酸、遊離ＤＮＡを高収率でかつ簡便に抽出できる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クリプトスポリジウムは世界中に広く分布しており、種々の動物の消化管に寄生する原虫である。
また、本原虫のオーシストは強い塩素耐性を示すためにしばしば水道を介した集団下痢症を引き起こしていることから、クリプトスポリジウムは臨床上あるいは公衆衛生学的に現在最も注目される原虫となっている。
クリプトスポリジウムの検出は、通常、顕微鏡下での目視により行われているが、かかる方法は、操作が煩雑で迅速性かつ検出率も低いため、検出に多大な労力を必要とする。
従って、近年、クリプトスポリジウムの研究にも遺伝子学的手法が用いられるようになり、種の同定や型別を比較的容易に行うことができるようになってきている。
【０００３】
従来より、例えばクリプトスポリジウムのＤＮＡ抽出には凍結融解などによる物理的処理や、界面活性剤や酵素などによる化学的処理により抽出が行われており、各種試料から核酸を抽出する方法としては、例えば細胞壁や細胞膜を物理的にまたは界面活性剤等で処理して破壊した後、水飽和フェノールやクロロホルム等の有機溶媒を用いてこれらを取り除き、タンパク質を変性させ、核酸を分離する等の多くの工程を必要としていた。
この際使用される試薬には、強アルカリ性の水酸化ナトリウム溶液や腐食性の高いフェノール液等の慎重な取り扱いを要するものが含まれている。
【０００４】
また、従来、核酸を抽出する際に用いた試薬は抽出した核酸試料中に残存し、かかる残存試薬、例えばＳＤＳは、核酸を増幅するＰＣＲ分析の際の阻害物質となってしまうことがあり、分析精度が劣り、抽出した核酸試薬をそのままＰＣＲ分析に用いて増幅することは困難であった。
従って、抽出した核酸試料中に含まれるこれらの試薬を処理すべく、更なる精製工程を要することとなっている。
【０００５】
一方、現在は核酸抽出において、迅速化、遺伝子抽出等の自動化が図られており、工程数が増加すると、遠心分離、吸引ろ過などの精製工程が煩雑なものとなり、自動遺伝子機器の省力化、小型化の障壁となっていた。
【０００６】
そこで、かかる問題を解決すべく、特開平５−２３６９６３号公報には、微生物菌体とファージの混合物からＤＮＡを精製する方法であって、具体的には、フェノールとエタノールとを用いたＤＮＡ濃縮工程に代えて、限外濾過膜に試料を通過させる工程を設けることによって、不純物を除去しＤＮＡを濃縮する方法が提案されている。
【０００７】
しかし、前記方法では、慎重な取り扱いを要する試薬であるフェノール液の使用を回避することはできても、強アルカリ性の水酸化ナトリウム溶液は精製に必要であるので、全ての試薬を取り扱いが容易なもので代替することは困難である。
また、当該方法は微生物菌体とファージの混合物を対称とするには有効な方法であるが、あらゆる任意の生物を対象として効率的に核酸を抽出する方法を提供することは困難であった。
更に、従来の抽出方法を用いて抽出した核酸試料に残存する試薬が、後の分析を阻害することがあり、更なる精製工程を必要としたり、分析精度が落ちたりするという問題点がある。
【０００８】
また、特開２００６−６１０４１号公報には、グリココール酸を被検試料体に接触させる工程を有する核酸抽出方法が提案されており、具体的には、クリプトスポリジウムのオーシストからグリコール酸／デオキシコール酸処理とそれに続くプロテアーゼ処理を組み合わせてＤＮＡ精製工程を経ずに、オーシストからＤＮＡを抽出する方法である。
【０００９】
しかし、かかるＤＮＡ抽出方法によれば、若干工程数を減らすことができても、核酸を抽出する際に用いた前記酵素は抽出した核酸試料中に残存し、かかる残存酵素は、核酸を増幅するＰＣＲ分析の際の阻害物質となってしまうことがあり、分析精度が劣り、抽出した核酸試薬をそのままＰＣＲ分析に用いて増幅することは困難である。
従って、酵素処理と失活処理の工程を無くすことは困難であるという問題点を有している。
【特許文献１】特開平５−２３６９６３号公報
【特許文献２】特開２００６−６１０４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、上記問題点に鑑み、被検試料の種別を問わず、また慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに簡便に核酸を抽出する処理を行うことができ、且つ、得られた核酸試料を、その後の酵素処理を必要とすることなく、ＰＣＲ核酸増幅に課しても悪影響を与えない、新規な核酸抽出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、特定の試薬を核酸抽出用に用いることにより達成されたものであり、核酸を抽出するために用いる従来の公知の陰イオン界面活性剤、例えばＳＤＳ等は、その後のＰＣＲ等の酵素反応を強く阻害するため、核酸を取り出すための細胞破壊反応後、ＰＣＲ等の反応に課する前に、これらの従来の陰イオン界面活性剤を取り除く必要があるが、本発明者らは、特定の陰イオン界面活性剤であれば、核酸増幅反応をほとんど阻害せずに、細胞破壊後の試料を用いることができることを見出し、本発明に到達した。
【００１２】
すなわち本発明の核酸抽出方法は、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）を被検試料に接触させる処理を行うことを特徴とする。
好適には、請求項２記載の核酸抽出方法は、請求項１記載の核酸抽出方法において、前記Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）の濃度が０．１〜０．２質量％であることを特徴とする。
更に好適には、請求項３記載の核酸抽出方法は、請求項１または２記載の核酸抽出方法において、前記被検試料が動物由来の試料あることを特徴とする。
また更に好適には、請求項４記載の核酸抽出方法は、請求項３記載の核酸抽出方法において、微生物を含む試料であることを特徴とする。
なお、本明細書において、「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの誘導体を含む概念として用いられているものである。
また、本明細書において、「終濃度」とは、ＰＣＲ時の反応チューブ内のＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）濃度を示す。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の核酸抽出方法は、特定の陰イオン界面活性剤を用いることで、簡便で被検試料の種別を問わず、被検試料が微量であっても確実な抽出か可能であり、また取り扱いが容易な特定の陰イオン界面活性剤を用いて簡便に核酸を抽出する処理を行うことができる。
更にまた、本発明の核酸抽出方法は、得られた核酸試料をその後のＰＣＲ核酸増幅に課しても悪影響を与えないので、ＰＣＲ反応に供するための精製工程や酵素処理工程は不要であり、従って、核酸の抽出処理を短時間で行うことができ、自動遺伝子検査機器の省力化、小型化が実現できる。
【００１４】
すなわち、請求項１記載の、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）を被検試料に接触させる工程を有する核酸抽出方法を用いることで、上記効果を得ることができる。
また、請求項２記載の、被検試料に接触させる際の前記Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）の濃度が０．１〜０．２質量％である核酸抽出方法を用いることで、上記効果に加え、更に、上記効果を確実に、抽出後の酵素反応を阻害せずに、核酸の抽出を行うことができ、核酸抽出の効率が最もよくなるという効果が得られる。
【００１５】
請求項３記載の、被検試料の種別を問わず、動物由来の試料を被検試料とする核酸抽出方法を用いることにより、上記効果に加え、例えば、動物の病気の診断等の医療分野での利用が可能である。
従来では、微生物特有の構造等が障害となって抽出が困難な場合があったが、請求項４記載の、微生物を含む試料の核酸抽出方法を用いることにより、当該微生物を含む試料であっても有効に上記効果を奏することが可能である。
【００１６】
また、上記本発明の核酸抽出方法は、抽出後の酵素反応を阻害せずに、確実に核酸の抽出を行うことができるとともに、慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに短時間で処理を行うことができ、ＤＮＡ抽出反応の自動化、省力化に大きく役立つことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明を次の好適な実施形態により説明するが、これらに限定されるものではない。
本発明の核酸抽出方法は、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）を被検試料に接触させる工程を有するものである。
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）を被検試料と接触させる試薬とすることにより、細菌類や動物細胞などの任意の種類の細胞に適用することができ、ＰＣＲ阻害特性を有さず、被検試料と接触させて核酸を抽出したもの、遊離核酸含有溶液を、ＰＣＲ増幅に用いることができるものである。
【００１８】
当該工程は、被検試料の細胞膜を充分に破壊するまで複数回繰り返して実施できるものであり、特にＰＣＲ用の試料の調製等の少量の試料の調製においては、被検試料の種類や量により当該工程に課す時間は異なるが、例えば、９０℃で５〜３０分程度の接触時間があれば十分に、動物由来等の細胞膜を破壊することができる。
【００１９】
特に好適にはＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）の濃度は、本発明の核酸抽出方法を実施した後に、得られた核酸を各種分析に供するのに必要な量と質を抽出できればよく、特に限定はされず、核酸抽出時のＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）の処理濃度は、高いほど抽出力が高くなる。
当該核酸抽出液をＰＣＲ増幅に供する場合には、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）の終濃度を、好適には０．０１〜０．０２質量％とすることが増幅阻害を呈することなくＰＣＲ増幅でき、また、通常、ＰＣＲ時には、前記核酸抽出処理された液を１０倍に希釈するので、核酸抽出処理時のＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）の濃度は、好適には０．０１〜１質量％、より好適には、０．１〜０．２質量％の濃度で被検試料と接触させることが、核酸抽出を確実に行う上で望ましく、更なる核酸抽出効率の向上と抽出に要する時間の短縮化を図り、検出感度の向上と迅速な検出を達成するものである。
【００２０】
かかるＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）の核酸抽出処理時の濃度調整は、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）を例えば水で希釈して、上記０．０１〜１質量％、更に好適には０．１〜０．２質量％の溶液を調製すればよく、当該溶液にオーシストを投入して、例えば９０℃、５分間の接触処理を行って、核酸を抽出することが可能である。
【００２１】
また、本発明の核酸抽出方法において、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）試薬は、使用時の濃度が前述した如き濃度範囲から選ばれる量となるようにＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）を含有する水溶液等の溶液状態のものでも、また、当該濃度範囲から選ばれる量となるようにＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）を含有する凍結乾燥状態又は乾燥状態のものでも良く、試薬形態については特に限定されない。
また、試薬形態が凍結乾燥状態又は乾燥状態である場合には、必要に応じてそれを溶解するための溶液と組み合わせても良い。
【００２２】
被検試料としては、特に限定されず、動物（ヒトを含む）、植物、微生物（原虫、原生動物等も含む）等の生物を対象とすること可能である。
特に、動物由来の被検試料からの核酸としては、血清、血漿等の血液成分からの血中遊離ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ等のＤＮＡ、血中遊離メッセンジャーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ等のＲＮＡが挙げられる。
本発明の方法はＤＮＡの抽出に有用であり、特に癌等の各種疾患患部の傷害を受けた細胞や死滅した細胞に由来し、血清或いは血漿中を浮遊している所謂血中遊離ＤＮＡ（ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡもしくはｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ）の抽出に有用である。
【００２３】
一般に、細胞膜はリン脂質とたんぱく質から構成されているので、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）がこの細胞膜のリン脂質の脂質二重層の中に入り込み細胞膜を壊れやすくすると考えられ、したがって、動物、植物、微生物の別を問わず、すべての生物由来の被検試料に、本発明の方法を適用することができるものである。
【００２４】
また、植物細胞や酵母、カビの仲間、グラム陽性菌など細胞壁を有する生物から核酸を抽出する場合には、必要に応じて、被検試料とＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）とを接触させる前に、これらの細胞壁を分解する前処理工程を設けることも可能である。
例えば、それらは、工程ごとに必要とされる緩衝液等の試薬と共に溶解し密封した液状物（溶液）の原液又は濃縮液として供給されることも可能である。
【００２５】
細胞壁は生物種によってその組成が異なるので、それぞれの組成に応じた細胞壁分解酵素（例えば、セルラーゼ、ザイモリアーゼ、リゾチウム等）を被検試料に接触させ、細胞壁を溶解させる。
但し、これらの生物に対して細胞壁分解酵素を作用させなくとも、本発明の核酸抽出方法を適用することができる。
【００２６】
本発明の核酸抽出方法の好適な適用例として、被検試料が微生物の１つであるクリプトスポリジウムを用いて説明する。
ここで、検出の対象となるクリプトスポリジウムとは、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属に属する微生物を指し、クリプトスポリジウムには具体的には、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ種（以下、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ  と略する。）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｍｕｒｉｓ種（以下、Ｃ．ｍｕｒｉｓと略する。）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｂａｉｌｅｙｉ種（以下、Ｃ．ｂａｉｌｅｙｉと略する。）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｒｐｅｎｔｉｓ種（以下、Ｃ．ｓｅｒｐｅｎｔｉｓと略する。）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ種（以下、Ｃ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓと略する。）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｆｅｌｉｓ種（以下Ｃ．ｆｅｒｉｓと略する。）等が含まれ、本発明の方法は、これらの種を種識別的に検出するための核酸抽出に用いられる。
【００２７】
また、被検試料としては、環境もしくは生体中に存在するクリプトスポリジウム汚染が疑われる試料を用いることができ、例えば、水道原水、河川水、湖沼水、井戸水、地下水、下水、廃水、プールの水、公園の水等の環境中に存在する水試料、または、牧場土、農地土、湖沼土、河川土等の環境中に存在する土壌試料等の環境試料、ヒト、家畜、ペット等の糞便等の生体試料、飲料食品、生野菜、果物等の食品試料等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
被検試料から核酸試料の調製する工程は、被検試料からクリプトスポリジウムのオーシストを回収し、回収されたオーシストから染色体ＤＮＡを抽出することにより行われるものである。被検試料からオーシストの回収は公知の何れの方法を用いて行うことができる。
【００２９】
オーシストから染色体ＤＮＡの抽出は、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）で処理すれば足り、従来のように、プロテアーゼ処理や精製処理等を実施する必要がない。
核酸抽出処理に、使用するＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）の濃度は、上記したように、０．０１〜１質量％、好適には、０．１〜０．２質量％（ＰＣＲ時にＬＳＳ処理された試料を１０倍希釈する場合）に調整されることが好ましい。
かかるＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）での核酸抽出処理条件は、好ましくは、例えば、７０〜９０℃にて５〜３０分であり、特に好ましくは９０℃にて１０〜３０分間である。
【００３０】
また、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）は、従来の試薬ほどＰＣＲ反応を阻害する物質ではないため、本発明の方法により処理を行ったサンプルは、抽出されたＤＮＡの精製過程を経ることなく、続くＰＣＲ増幅反応に供することができ、従って処理時間が大幅に短縮されるとともに、抽出工程に要する時間の短縮化を図ることが可能となる。
【００３１】
また、通常、ＤＮＡ精製の過程においては核酸の損失が生じることがあり、精製後のＤＮＡの回収率は高くても８０％程度であるが、本発明の核酸抽出方法を用いると、ＤＮＡ精製によるＤＮＡの損失を最小限に抑えることができるため、ほぼ１００％のＤＮＡ抽出効率を保持することができ、検出効率の向上を達成することが可能となる。
【００３２】
オーシストから抽出された核酸試料は、検出感度の向上のため、増幅される。
通常、ＤＮＡの増幅はＰＣＲにより行うことが一般的であり、ＰＣＲの方法としては、上記で得られたＤＮＡを鋳型として、従来の公知の任意のＰＣＲ方法を採用することができる。
また、当該核酸抽出液をＰＣＲ増幅に供する際、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）の終濃度を、好適には０．０１〜０．０２質量％とすることで、ＰＣＲ増幅阻害を呈することなく、有効にＰＣＲ増幅することができる。
【実施例】
【００３３】
本発明を以下の実施例等により説明するが、これらによって制限されるものではない。
但し、「％」は「質量％」を示す。
＜実施例１＞  クリプトスポリジウムの検出
（１）ＤＮＡ標準試料の作成
クリプトスポリジウムのＤＮＡ標準試料の作成を以下のようにして行った。
被検試料としては、クリプトスポリジウムオーシストが１０７個／８ｍｌとなるように、ＰＢＳ緩衝液に懸濁調製済みのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍオーシスト（Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ  社（ＵＳＡ））を使用した。
但し、ＰＢＳ緩衝液は、ｘ１０  ＰＢＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（１１．５ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、８０ｇ  ＮａＣｌ、２ｇ  ＫＣｌ／１ｌ）として調製したものを、希釈して使用した。
【００３４】
なお、当該ＰＢＳ緩衝液に保存されているクリプトスポリジウムオーシスト１０７個／８ｍｌから１０５個を分注し、凍結（−８０℃，２ｍｉｎ）融解（９０℃，２ｍｉｎ）の操作を２回繰り返して行った後、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりＤＮＡ精製を行い、滅菌精製水を加え５０個／μｌ精製ＤＮＡ溶液を調製した。
このうちの、クリプトスポリジウムオーシスト１００個を、下記ＰＣＲ増幅に課して、ＰＣＲ増幅産物とし、下記（４）の電気泳動試験を行い、その結果を図１に示す。
【００３５】
（２）界面活性剤によるＤＮＡ抽出
上記クリプトスポリジウムのオーシスト１０７個／緩衝液８ｍｌから、クリプトスポリジウムのオーシストを１０３個分注して、０．０１〜２０％濃度の各界面活性剤を２〜１０μＩ（非イオン界面活性剤：ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，Ｔｗｅｅｎ２０，Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２３）Ｌａｕｒｙｌ  Ｅｔｈｅｒ、陰イオン界面活性剤：ＳＤＳ，Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ））添加し、これに滅菌精製水を加えて全量２０μｌ（５０個／μｌ）とし、９０℃，１５分間インキュベート処理し、ＤＮＡを抽出してＤＮＡ試料とした。
【００３６】
（３）ＰＣＲ増幅
上記調製して得られたＤＮＡ試料を室温まで冷却し、そのうちの２μｌ（クリプトスポリジウムオーシスト１００個相当）を分取してこれを鋳型とし、ＰＣＲ増幅を行って、ＤＮＡを増幅させ、下記（４）の電気泳動試験を行い、その結果を図１に示す。
ＰＣＲはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのポリスレオニン遺伝子の３１８ｂｐ領域を増幅するｐｒｉｍｅｒ  ｃｒｙ４４及びｃｒｙ３９のプライマセットを用い、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  １．５（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて実施した。
【００３７】
その反応液はＬＣ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ社製）２．０μｌ、２５ｍＭの塩化マグネシウム２．４μｌ、６μＭのプライマ（Ｆｏｒｗａｒｄ：ＣＴＣＴＴＡＡＴＣＣＡＡＴＣＡＴＴＡＣＡＡＣ，Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＡＧＴＣＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＴＧ）１．０μｌ、滅菌精製水１１．６μｌに、上記（２）で得られたＤＮＡ試料２μｌ（クリプトスポリジウムオーシスト１００個相当）を添加して調製した。
ＰＣＲの反応条件は、該反応液を変性工程（９５℃，１０分）で変性後、次いでＰＣＲ工程（変性  ９５℃  ０秒，アニーリング  ５８℃  ５秒，伸長  ７２℃  １３秒が１サイクル）を５５サイクル行って反応させてＰＣＲ反応を終了して、増幅産物を得た。
【００３８】
（４）試験
・電気泳動試験
得られた各ＰＣＲによる増幅産物について、１００個の細胞に相当するＤＮＡ試料を、指標としての同量のＳｕｐｅｒｌａｄｄｅｒ−Ｌｏｗ  １００ｂｐ  Ｌａｄｄｅｒ  ｍａｒｋｅｒ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）とともに、各レーンにロードし、１．５％ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌで電気泳動（電気泳動装置；Ｍｕｐｉｄ−ｅｘｕ）、（ＡＤＶＡＮＣＥ社製１００Ｖ、４０分）を行い、ゲル電気泳動により抽出された増幅ＤＮＡ量を目視して確認した結果を図１に示す。
尚、図１中、Ｍは１００ｂｐラダーの分子量マーカーを示す。
【００３９】
また、図１中、ＳＤＳ番号１〜３及びＬＳＳ番号５〜７は、それぞれ上記（２）の工程で、ＳＤＳ処理濃度０．０１％、０．１％、１％で処理したもの（ＰＣＲ増幅時には、１／１０濃度となる）、及びＬＳＳ処理濃度０．０１％、０．１％、１％で処理したもの（ＰＣＲ増幅時には、１／１０濃度となる）を用いて得られた結果を示す。
【００４０】
図１の結果から、ＳＤＳ「１」はＰＣＲ阻害のないＳＤＳ濃度ではあるが、ＤＮＡ抽出力が弱いので薄いバンドが検出されたことがわかる。
またＳＤＳ「２」と「３」ではＰＣＲ阻害があるので、仮にＤＮＡが抽出されたとしてもＰＣＲ増幅が困難である。
また、ＬＳＳ「５」は、ＰＣＲ阻害のないＬＳＳ濃度であるが、ＤＮＡが十分に抽出されておらず、ＬＳＳ「７」はＰＣＲ阻害があるので、仮にＤＮＡが抽出されたとしてもＰＣＲ増幅が困難である。
更に、ＬＳＳ「６」の強いバンド（図１）から、０．１％ＬＳＳ処理はＰＣＲ阻害がなく、確実にＤＮＡが抽出されていることがわかる。
【００４１】
＜実施例２＞  クリプトスポリジウム精製ＤＮＡに対する界面活性剤のＰＣＲ阻害実験
（１）界面活性剤の添加
上記実験例１の（１）ＤＮＡ標準試料の作成で調製したＤＮＡ標準試薬（５×１０２個／μｌ）２μｌに、上記実施例１の（２）で用いたと同様の０．０１〜２０％各界面活性剤を２〜１０μｌを添加し、これに滅菌精製水を加えて全量２０μｌ（５０個／μｌ）とし、このうち２μｌ（クリプトスポリジウムオーシスト１００個相当）をＤＮＡ試料として、ＰＣＲ増幅に用いた。
次いで、各試料を実験例１と同様にしてＰＣＲ増幅を行い、界面活性剤処理によるクリプトスポリジウムの検出感度を検討した。
【００４２】
陰イオン系界面活性剤添加におけるＰＣＲ増幅では、ＳＤＳで終濃度（ＰＣＲ試薬調整時にＤＮＡ試料が１／１０に希釈されるので、「終濃度＝１／１０処理濃度」となる）０．０１、０．１、１％、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）で終濃度０．１、１％においてＰＣＲ阻害がみられた（図２）。
非イオン系界面活性剤添加におけるＰＣＲ増幅では、ＰＣＲ阻害が認められず、また、両性イオン及び陽イオン界面活性剤においては全ての範囲で阻害された（図なし）。
【００４３】
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）終濃度（ＰＣＲ試薬調整時にＤＮＡ試料が１／１０に希釈されるので、「終濃度＝１／１０処理濃度」となる）０．０１、０．０２、０．０３、０．０４％でＰＣＲを行ない、ＰＣＲ阻害濃度を確認した。その結果０．０２％がＰＣＲ増幅可能な限界濃度であり、０．０３％以上含まれるとＰＣＲ阻害を示すことを確認した（図３）。
【００４４】
（２）Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）０．１％処理によるクリプトスポリジウム検出感度の検討
クリプトスポリジウムオーシスト１０７個／８ｍｌから１０３個分を分注し、１％界面活性剤２μｌを添加し、滅菌精製水を加えて全量２０μｌ（５０個／μｌ）とした。これらをａ）９０℃、５〜１５分間処理、ｂ）６０〜９０℃、５、１０分間処理を行い、ＤＮＡを抽出した。このうち２μｌ（クリプトスポリジウムオーシスト１００個相当）をＰＣＲ増幅に用いた。
かかるクリプトスポリジウムオーシスト１００個のＰＣＲによるＰＣＲ増幅は上記と同様にして行い、ＰＣＲ増幅産物とし、上記電気泳動試験を行い、その結果を図４（ａ）および図４（ｂ）に示す。
【００４５】
上記実施例２の結果から、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）処理濃度０．１％で安定的に検出できることがわかったので、これに加えて処理濃度、時間の条件検討を行った結果、処理濃度０．１％では、９０℃、５分の処理でＰＣＲ増幅を確認した（図４ａ）。
また、６０、７０、８０、９０℃の温度条件で５、１０分間処理した結果、５分間処理では９０℃、１０分間処理では７０〜９０℃でＰＣＲ増幅を確認した（図４ｂ）が、６０℃処理による検出はされなかった。
但し、Ｍは１００ｂｐラダーの分子量マーカーを示し、ＱＩＡＧＥＮはＱＩＡＧＥＮ  Ｔｉｓｓｕｅ  キットにより得た精製ＤＮＡを使用した。
【００４６】
＜実施例３＞  Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）抽出法と市販キット、簡易抽出法との比較
（クリプトスポリジウムオーシスト  １、１０、１００個における抽出増幅）
当該これらの抽出方法の概略工程図を図５に示す。
・市販キット（ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ））
上記クリプトスポリジウムオーシスト１０７個／８ｍｌから１０２，１０３，１０４個を分注し、市販キットであるＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりＤＮＡ精製を行い、それぞれ０．５個／μｌ、５個／μｌ、５０個／μｌになるよう調整した。
このうち２μｌ（クリプトスポリジウムオーシスト  １、１０、１００個相当）を上記と同様のＰＣＲ増幅に用いた。
但し、ＰＣＲ増幅は上記ＰＣＲ方法と同様に行い、上記電気泳動試験を行い、その結果を図６に示す。
【００４７】
・ＴｒｉｔｏｎＸ−１００簡易抽出法（国立感染症研究所簡易抽出方法）
クリプトスポリジウムオーシスト１０７個／８ｍｌから１０、１０２、１０３個を分注し、２０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  １０μｌを添加し、ＴＥバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ  ，１ｍＭＥＤＴＡ）を加え全量２０μｌ（０．５個／μｌ、５個／μｌ、５０個／μｌ）とした。これらを９０℃１５分間処理し、室温で５分間静置した後、３０００ｒｐｍ、数秒遠心を行った。
遠心後上清を回収し、ＤＮＡ抽出液とした。このうち２μｌ（クリプトスポリジウムオーシスト１、１０、１００個相当）を上記ＰＣＲ増幅に用いた。
但し、ＰＣＲ増幅は上記ＰＣＲ方法と同様に行って、ＰＣＲ増幅産物とし、上記電気泳動試験を行い、その結果を図６に示す。
【００４８】
・Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）抽出法
クリプトスポリジウムオーシスト１０７個／８ｍｌから１０、１０２、１０３個を分注し、１％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）２μｌを添加し、滅菌精製水を加えて全量２０μｌ（０．５個／μｌ、５個／μｌ、５０個／μｌ）とした。
これらを９０℃１５分間処理し、ＤＮＡ抽出を行った。このうち２μｌ（クリプトスポリジウムオーシスト１、１０、１００個相当）を上記ＰＣＲ増幅に用いた。
但し、ＰＣＲ増幅は上記ＰＣＲ方法と同様に行って、ＰＣＲ増幅産物とし、上記電気泳動試験を行い、その結果を図６に示す。
【００４９】
但し、図６中、Ｍは１００ｂｐラダーの分子量マーカーを示し、凍結融解＋ＱＩＡＧＥＮは（上記実施例１の（１）で調整したと同様の方法）、ＱＩＡＧＥＮはＱＩＡＧＥＮ  Ｔｉｓｓｕｅ  キットにより得た精製ＤＮＡを使用した。
【００５０】
図６より、凍結融解およびＱＩＡＧＥＮキットによるＤＮＡ抽出・増幅の結果と比べて、凍結融解をせずに行ったＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）処理ＤＮＡ抽出法と国立感染症研究所によるＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いた簡易抽出法及びＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＫｉｔによるＤＮＡ抽出法との比較を行ったところ、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）抽出法及びＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ  ＤＮＡ抽出法ではクリプトスポリジウムオーシスト１０個での抽出・増幅が確認されたが、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００簡易抽出法ではオーシスト１００個でも（１０個も）ＰＣＲ増幅が確認されなかった。
【００５１】
以上の実施例より、再現性良くＤＮＡ検出感度が最も高かったのはＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）０．１％処理であり、核酸抽出時のＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）濃度が０．１〜０．２％であればＰＣＲ阻害が認められず（ＰＣＲ時に濃度は１／１０に希釈）、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）終濃度０．０２％以下ではＰＣＲ阻害がなかったことがわかる。
また、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）核酸抽出処理濃度０．１％では、９０℃、５分でＰＣＲ増幅が確認された。
【００５２】
従って、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）抽出法及びＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ  ＤＮＡ抽出法ではクリプトスポリジウムオーシスト１０個での増幅が確認され、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００簡易抽出法ではオーシスト１００個でのＰＣＲ増幅は確認されなかったことがわかる。
【００５３】
＜実施例４＞  グリココール酸核酸抽出法とＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）
・グリココール酸核酸抽出法  
クリプトスポリジウムオーシスト１０７個／８ｍｌから１０３個を分注し、１％グリココール酸（ＧＣ）２μｌを添加し、滅菌精製水を加えて全量２０μｌ（５０個／μｌ）とした。これらを３７℃で、１５分、３０分、６０分間それぞれ処理し、ＤＮＡを抽出した。
このうちクリプトスポリジウムオーシスト１００個を、それぞれＰＣＲ増幅実験に使用した。但し、ＰＣＲ増幅は上記ＰＣＲ方法と同様に行った。
【００５４】
・Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）抽出法
クリプトスポリジウムオーシスト１０７個／８ｍｌから１０３個を分注し、１％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）２μｌを添加し、滅菌精製水を加えて全量２０μｌ（５０個／μｌ）とした。これらを９０℃で、１５分、３０分、６０分間それぞれ処理し、ＤＮＡ抽出を行った。
このうちクリプトスポリジウムオーシスト１００個をＰＣＲ増幅実験に使用した。但し、ＰＣＲ増幅は上記ＰＣＲ方法と同様に行った。
【００５５】
グリココール酸抽出法とＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）抽出法との比較を行った結果、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）処理で再現性よく抽出・増幅されるのに対し、グリココール酸処理では再現性が低く、検出傾向が認められなかった（図７）。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の核酸抽出方法及びキットは、遺伝子工学、臨床診断、法医学等の分野における、遺伝情報の解析，遺伝子疾患・ウイルス性疾患等の診断・原因究明、また、個人識別・親子鑑定・犯罪鑑識等の各種分析（例えばサザンブロッティング法やＰＣＲ法を利用する方法等）、環境汚染等の検査に用いられる試料として用いることができ、特に血中遊離ＤＮＡを用いた、癌等の各種疾患の早期診断或いは病状のモニタリング等の遺伝子診断ＤＮＡタイピング法やＤＮＡフィンガープリント法（例えばＰＣＲ−ＲＥＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＬＩＰＡ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＡＰＤ法、ＰＣＲ−ＲＤＡ法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＤＧＧＥ法、ＴＧＧＥ法）において有用に用いられる。
【００５７】
また、植物由来の被検試料から核酸を抽出すれば、品種、銘柄の特定等に適用でき、微生物を含む被検試料は、微生物による環境汚染を検査するために適用でき、バイオレメディエーションの分野においては、浄化対象である土壌中の汚染物質資化菌の存在の確認等に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】実施例１で得られた各ＤＮＡ抽出溶液のＰＣＲ増幅後の電気泳動試験結果図
【図２】実施例２で得られた各ＤＮＡ抽出溶液のＰＣＲ増幅後の電気泳動試験結果図
【図３】実施例２における、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）の終濃度を変化させて得られたＰＣＲ増幅後の電気泳動試験結果図
【図４】図４ａは、実施例２における、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）０．１％（ＰＣＲ時の濃度は１／１０）核酸抽出処理の時間を変化させて得られたＰＣＲ増幅後の電気泳動試験結果図であり、図４ｂは、実施例２における、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）０．１％（ＰＣＲ時の濃度は１／１０）核酸抽出処理の時間と温度とを変化させて得られたＰＣＲ増幅後の電気泳動試験結果図
【図５】実施例３におけるＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＬＳＳ）抽出法とＱＩＡＧＥＮ法とＴｒｉｔｏｎＸ−１００簡易抽出法を模式的に示す図
【図６】実施例３で得られた各ＤＮＡ抽出溶液のＰＣＲ増幅後の電気泳動試験結果図
【図７】実施例４で得られた各ＤＮＡ抽出溶液のＰＣＲ増幅後の電気泳動試験結果図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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