(57)【要約】【課題】  工業的生産に耐え得る新規で有用なアンジオテンシン変換酵素阻害物質を提供する。【解決手段】  下記(1)〜(9)のいずれかの構造式を有するペプチドからなることを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。  (1) Ser-Glu-Val-Tyr    (2) Ala-Val-Ser-Lys-Val-Tyr    (3) Asp-Leu-Tyr-Thr-Lys-Pro  (4) Thr-Glu-Lys-Gly-Val    (5) Ser-Ile-Val-Pro  (6) Ala-Met-Tyr  (7) Asn-Val-Pro-Leu    (8) Asp-Leu-Thr    (9) Ala-Ile-Phe【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(1)〜(9)のいずれかの構造式を有するペプチドからなることを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
(1) Ser-Glu-Val-Tyr  
(2) Ala-Val-Ser-Lys-Val-Tyr  
(3) Asp-Leu-Tyr-Thr-Lys-Pro
(4) Thr-Glu-Lys-Gly-Val  
(5) Ser-Ile-Val-Pro
(6) Ala-Met-Tyr
(7) Asn-Val-Pro-Leu  
(8) Asp-Leu-Thr  
(9) Ala-Ile-Phe
【請求項２】
下記(1)〜(9)で示される構造式を有するペプチドを２種以上含有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害組成物。
(1) Ser-Glu-Val-Tyr  
(2) Ala-Val-Ser-Lys-Val-Tyr  
(3) Asp-Leu-Tyr-Thr-Lys-Pro
(4) Thr-Glu-Lys-Gly-Val  
(5) Ser-Ile-Val-Pro
(6) Ala-Met-Tyr
(7) Asn-Val-Pro-Leu  
(8) Asp-Leu-Thr  
(9) Ala-Ile-Phe
【請求項３】
請求項２記載のアンジオテンシン変換酵素阻害組成物を含有する飲食品。
【請求項４】
酵母を中性蛋白質分解酵素で処理して得られる蛋白質分解物を含有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害組成物。
【請求項５】
前記酵母が醸造用酵母、パン酵母およびトルラ酵母の群から選択される１種以上の酵母である請求項４に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害組成物。
【請求項６】
請求項４または５に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害組成物を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
酵母エキス、さらには当該酵母エキスに含まれる新規ペプチドからなるアンジオテンシン変換酵素阻害剤、該ペプチドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害組成物及びそれらを含有する飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活習慣病の１つである高血圧症は、多くの疾患要因として問題となっている。血圧を下げる薬剤として、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、βブロッカー、利尿剤等の多種の薬剤が開発されている。アンジオテンシン変換酵素阻害剤の代表的な薬剤として、カプトプリルや、エナラプリルがあるが、どれも合成品である。同様な効果を安全性が高い食品から得られるのが望ましい。その観点から、天然の食品由来の蛋白質分解物やペプチドを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤、阻害組成物の特許出願が多数行われている。
【０００３】
例えば、特許文献１〜３（乳酸菌等微生物培養物）特許文献４〜７（カゼイン等乳性蛋白質）、特許文献８〜１７（イワシ等魚肉）、特許文献１８〜１９（小麦等穀物由来）、特許文献２０
（卵白）、特許文献２１（ニンニク）、特許文献２２〜２３（哺乳類血液成分）、特許文献２４〜２７（大豆）、特許文献２８〜３２（ワカメ等藻類）、特許文献３３〜３５（ローヤルゼリー）特許文献３６〜３７（魚骨）に天然物由来のアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドが開示されている。
【０００４】
【特許文献１】特開平０３−２５１５４３号公報
【特許文献２】特開平０６−４０９４４号公報
【特許文献３】特開２０００−２２９９９６号公報
【特許文献４】特開平０４−８２８９８号公報
【特許文献５】特表２００３−５１３６３６号公報
【特許文献６】特表２００５−５３０８５１号公報
【特許文献７】ＷＯ２００３／０４４０４４号パンフレット
【特許文献８】特開平０４−９５０９９号公報
【特許文献９】特開平０６−１６６６９７号公報
【特許文献１０】特開平０６−３４０６９２号公報
【特許文献１１】特開平０５−２６２７９０号公報
【特許文献１２】特開平１１−３４３２９７号公報
【特許文献１３】特開２００１−１０６６９９号公報
【特許文献１４】特開２００１−２６１６９８号公報
【特許文献１５】特開２００３−２４０１２号公報
【特許文献１６】ＷＯ２００３／０５５９０１号パンフレット
【特許文献１７】特開２００６−５６８０５号公報
【特許文献１８】特開平０４−１６４０９４号公報
【特許文献１９】特開平０６−１６５６８号公報
【特許文献２０】特開平０４−２０２００号公報
【特許文献２１】特開平０６−２５６３８７号公報
【特許文献２２】特開平０７−１８８２８３号公報
【特許文献２３】特開平０７−２８９２８３号公報
【特許文献２４】特開平０７−１８８２８２号公報
【特許文献２５】特開平０８−２２５５９３号公報
【特許文献２６】特開平０８−２６９０８７号公報
【特許文献２７】ＷＯ２００２／０５５５４６号パンフレット
【特許文献２８】特開平０９−５９２９６号公報
【特許文献２９】特開２００１−６４２９９号公報
【特許文献３０】特開２００３−２６７９９４号公報
【特許文献３１】特開２００３−２６７９９３号公報
【特許文献３２】特開２００３−１２８６９４号公報
【特許文献３３】特開２００１−２６１１６８号公報
【特許文献３４】特開２００２−３３８５９４号公報
【特許文献３５】特開２００６−２８０６５号公報
【特許文献３６】特開２００５−１５４３２６号公報
【特許文献３７】特開２００５−２０６４６９号公報
【０００５】
また、酵母抽出物が、そして当該抽出物から単離されたＧｌｙ−Ｐｈｅ及びＡｌａ−Ｐｈｅが、自然発症高血圧ラットへの投与試験にて、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有していることが報告されている。
【非特許文献１】Ｏｓａｍｕ  Ｋａｎａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．「Ａ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｈｉｇｈ  ｉｎ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｈａｓ  ａ  Ｂｌｏｏｄ−Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｌｏｗｅｒｉｎｇ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  Ｍｏｄｅｌ」  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５、１２、３０８５−３０９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アンジオテンシン変換酵素阻害物質を食品の形態にて工業的に大量に提供するためには、アンジオテンシン変換酵素阻害物質の生理学的作用および安全性を備えていることは勿論のこと、製造・流通に要するコストさらには消費者の官能性・嗜好も十分加味する必要があるにもかかわらず上記従来のアンジオテンシン変換酵素阻害物質ではこれら諸条件を十分に満足させるものではなかった。従って、当該技術分野では工業的生産に耐え得る新規で有用なアンジオテンシン変換酵素阻害物質が切望されていたのが現状である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は上記課題に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、酵母の蛋白質に蛋白分解酵素、特に中性蛋白分解酵素を作用させて分解し調製した蛋白分解物がアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有することを知見し、さらに当該分解物には数種の新規ペプチドが見出されたことに基づき本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、下記の（１）〜（６）に関するものである。
【０００９】
（１）  下記(1)〜(9)のいずれかの構造式を有するペプチドからなることを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【００１０】
(1) Ser-Glu-Val-Tyr  
(2) Ala-Val-Ser-Lys-Val-Tyr  
(3) Asp-Leu-Tyr-Thr-Lys-Pro
(4) Thr-Glu-Lys-Gly-Val  
(5) Ser-Ile-Val-Pro
(6) Ala-Met-Tyr
(7) Asn-Val-Pro-Leu  
(8) Asp-Leu-Thr  
(9) Ala-Ile-Phe
【００１１】
（２）  下記(1)〜(9)で示される構造式を有するペプチドを２種以上含有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害組成物。
【００１２】
(1) Ser-Glu-Val-Tyr  
(2) Ala-Val-Ser-Lys-Val-Tyr
(3) Asp-Leu-Tyr-Thr-Lys-Pro
(4) Thr-Glu-Lys-Gly-Val  
(5) Ser-Ile-Val-Pro
(6) Ala-Met-Tyr
(7) Asn-Val-Pro-Leu  
(8) Asp-Leu-Thr  
(9) Ala-Ile-Phe
【００１３】
（３）  （２）項に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害組成物を含有する飲食品。
（４）  酵母を中性蛋白質分解酵素で処理して得られる蛋白質分解物を含有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害組成物。
（５）  前記酵母が醸造用酵母、パン酵母およびトルラ酵母の群から選択される１種以上の酵母である（４）項に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害組成物。
（６）  （４）項または（５）項に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害組成物を含有する飲食品。
【発明の効果】
【００１４】
すなわち本発明の蛋白分解物は、一般に普及して日常的に摂取されている酵母を原料として製造されるため食品成分として用いることについては安全性の面に何ら問題はなく、また醸造後に発生する酵母を原料とする場合はとりわけ安価に調達できるため、製造コストの抑制も実現可能である。
【００１５】
また、本発明の蛋白分解物は蛋白分解物の中から有効成分を特に分離精製しなくとも蛋白分解物の形態のままで十分にその生理学的作用（アンジオテンシン変換酵素阻害活性、血圧降下作用）を呈するため、製造工程の簡略化が図れ、加えて本来、酵母エキスとして調味料にも使用されており官能的にも優れた食品素材として提供できる。
【００１６】
さらに、本発明の蛋白分解物は、スプレードライ、凍結乾燥等の方法を利用することにより粉末状に容易に加工でき、その耐熱性も高いため、加熱工程や殺菌工程の必要な食品にも応用することが可能である。さらには、スポーツ飲料、スープ等の飲料への応用など、広範囲な用途への適用も期待できるなど様々な優れた効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１８】
本発明で使用される酵母としては、醸造用酵母、パン酵母およびトルラ酵母など各種酵母が使用できるが産業上、副産物の有効利用という観点から醸造用酵母すなわち醸造後に発生する酵母を原料とすることが好ましい。
また、これら酵母を粉砕して、その粉砕物を直接、酵素反応に供することもできるが蛋白分解物を効率的に得るためには原料となる酵母をそのまま酵素反応に供することが好ましい。
【００１９】
本発明に使用可能な酵素としては各種蛋白分解酵素を使用することができるが、安全性を考慮すれば市販の食品用蛋白分解酵素、例えば、ニュートラーゼ[登録商標：ノボ・インダストリージャパン株式会社製造]、プロチンＰ[商品名：大和化成株式会社製造]、プロテアーゼＡ[登録商標：天野エンザイム株式会社製造]、YL-15[登録商標：天野エンザイム株式会社製造]、YL-NL[登録商標：天野エンザイム株式会社製造]、スミチームＦＰ[商品名：新日本化学工業社製造]などが使用できる。
【００２０】
また、酵素反応の反応条件については、基本的には使用する蛋白分解酵素の至適反応温度ならびに至適反応ｐHを考慮して設定されるものであり、その他、酵素の添加量ならびに反応時間については良好なアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する蛋白分解物を安定的に得られる条件とするのがより好ましい。
【００２１】
さらに雑菌汚染などの現象を回避するために反応温度を５０℃以上に加減するなどして反応条件を適宜調節するのが好ましい。
【００２２】
また、酵素反応液から目的とする蛋白分解物を分取するために未分解の酵母残渣および使用された蛋白分解酵素を除去する方法としては、加熱処理あるいは等電点沈澱処理した後に濾別する方法あるいは限外濾過等の方法などが適用可能であり、それによって蛋白分解物溶液を得ることができる。さらに得られた蛋白分解物溶液をスプレードライ、凍結乾燥等の方法により乾燥すれば粉末状の蛋白分解物を得ることもできる。
【００２３】
本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害剤は、下記(1)〜(9)のいずれかの構造式を有するペプチドからなることを特徴とする。
【００２４】
(1) Ser-Glu-Val-Tyr  
(2) Ala-Val-Ser-Lys-Val-Tyr  
(3) Asp-Leu-Tyr-Thr-Lys-Pro
(4) Thr-Glu-Lys-Gly-Val  
(5) Ser-Ile-Val-Pro
(6) Ala-Met-Tyr
(7) Asn-Val-Pro-Leu  
(8) Asp-Leu-Thr  
(9) Ala-Ile-Phe
【００２５】
酵母を中性蛋白質分解酵素で処理して得られる蛋白質分解物から上記(1)〜(9)のいずれかの構造式で示されるアンジオテンシン変換酵素阻害剤を単離するには、酵母懸濁液を中性蛋白質分解酵素で処理して得られる分解液を精密濾過した後、ダウエックス５０Ｗ（Ｈ＋）、セファデックスＧ−２５などを用いるクロマトグラフィー処理を行い、溶出液から活性を有するペプチド画分を得る。次いでこのペプチド画分を逆相ＨＰＬＣ処理し、さらに活性の高いペプチドフラグメント（１）〜（９）を得るのである。
【００２６】
本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害組成物は、下記(1)〜(9)で示される構造式を有するペプチドを２種以上含有することを特徴とする。
【００２７】
(1) Ser-Glu-Val-Tyr  
(2) Ala-Val-Ser-Lys-Val-Tyr  
(3) Asp-Leu-Tyr-Thr-Lys-Pro
(4) Thr-Glu-Lys-Gly-Val  
(5) Ser-Ile-Val-Pro
(6) Ala-Met-Tyr
(7) Asn-Val-Pro-Leu  
(8) Asp-Leu-Thr  
(9) Ala-Ile-Phe
【００２８】
本発明の飲食品は上記アンジオテンシン変換酵素阻害組成物を含有するものであり、飲食品としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等飲料（これらの飲料の濃縮原液および調製用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ギョーザの皮、シュウマイの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠果、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ちくわ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂加工食品；ソース、タレ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物；その他種々の形態の健康食品、栄養補助食品、特定保健用食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチ等の医薬品、医薬部外品が挙げられる。これらを製造するにあたり通常用いられる補助的な原料や添加物と共に添加することができる。
このような原料および添加物としては、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、マンニット、デキストリン、クエン酸、クエン酸ソーダ、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＣ、ビタミンＢ群、ビタミンＥ、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、界面活性剤、色素、香料、保存料等が挙げられる。
【００２９】
実施例  以下、本発明の実施例を詳細に説明する。
【実施例１】
【００３０】
酵母酵素分解物のアンジオテンシン変換酵素阻害活性
醸造後ビール酵母（15％固形分）1,000ｇをプロテアーゼYL-15  0.15ｇで処理し、５０℃７時間加熱し処理した後、遠心分離により得られた可溶性画分を乾燥することにより酵母酵素分解物  65ｇを得た。得られた酵母酵素分解物のアンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。なお、アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定はHippuryl-His-Leu（以下HHL）を基質とするLiebermanの変法を用いて行った。
【００３１】
酵母酵素分解物のアンジオテンシン変換酵素阻害活性  IC50 ＝ 0.515 mg/ml
【実施例２】
【００３２】
酵母酵素分解物GPC画分のアンジオテンシン変換酵素阻害活性
上記、実施例１にて得られた酵母酵素分解物を10%w/vとなるよう再度、水に懸濁し以下のGPC−HPLC法により分子サイズ毎に4画分を分取した。このようにして得た4画分のアンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。測定結果を表１に示す。
【００３３】
カラム；Amersham Biosciences Superdex Peptide HR10/30（1.0ｘ30cm）
溶離液；30%アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸
流速；0.3 ml/min
検出波長；220 nm
カラム温度；35℃
クロマトグラム図；図１参照
【００３４】
【表１】
2008156307.tif 000002
【実施例３】
【００３５】
酵母酵素分解物GPC処理画分３に含まれるペプチドのアンジオテンシン変換酵素阻害活性
上記画分３を1%w/vとなるよう5%アセトニトリルに溶解し、以下のHPLC条件にてペプチドフラグメントを分離した。このようにして得たペプチドフラグメントについてアンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定し、特に活性の高いピークについてそれぞれアミノ酸配列決定を行い、表２の結果を得た。
【００３６】
カラム；Cosmosil5C18-MS-II（Φ4.6ｘ250mm）
溶離液；5%-35%アセトニトリル（60min）
流速；0.4ml/min
検出波長；220nm
カラム温度；35℃
クロマトグラム図；図２、図３参照
【００３７】
【表２】
2008156307.tif 000003
【実施例４】
【００３８】
血圧低下作用（ラット単回投与試験）
１６週齡の高血圧自然発症ラット（日本エスエルシー社）１２匹を温度２３±２℃、湿度５５±５％の個別ゲージに収容し、水および飼料MF食（商品名：オリエンタル酵母社）を自由摂取させ、２週間にわたり馴化飼育し、最高血圧が１８０〜２００mmHgまで上昇したラットを試験に供した。
【００３９】
上記、実施例２の方法に従って調製した酵母酵素分解物GPC画分３を水に溶解したサンプル（濃度は１ｇ／ラット体重１ｋｇ。）１ｍｌを強制経口投与した。なお、対照群として同量の生理食塩水を強制経口投与した。
【００４０】
投与後、非観血的血圧測定装置〔Softron  BP-98A：Softron社製〕を用い、Tail-Cuff法で経時的に最高血圧の変化を測定し、その結果を表３と図４に示す。
【００４１】
【表３】
2008156307.tif 000004
【００４２】
上記表３から明らかなように本発明の酵母酵素分解物GPC画分３は、経口投与６〜９時間後に有意な血圧降下作用を示した。
【実施例５】
【００４３】
血圧低下作用（ラット長期投与試験）
７週齡の高血圧自然発症ラット（日本エスエルシー社）１２匹を温度２３±２℃、湿度５５±５％の個別ゲージに収容し、水および飼料MF食（商品名：オリエンタル酵母社）を自由摂取させ、１週間にわたり馴化飼育し、１週間ごとに血圧、体重および1日あたりの摂食量を測定した。
【００４４】
上記、実施例１の方法に従って調製した酵母酵素分解物を５w/w％となるようMF食へ添加したサンプルを自由摂取させ８週齡から２０週齡まで飼育し、さらに１週間ごとに血圧、体重および1日あたりの摂食量を測定した。なお、対照群として酵母酵素分解物５w/w％相当にあたる粗蛋白分をミルクカゼインとして８４mg/１００mgおよび可溶性無窒素物分をコーンスターチとして８６mg/１００mgとなるよう添加し、自由摂取させた。
【００４５】
血圧測定はラットを４０℃の恒温槽で１０分間の予備保温を行った後、非観血的血圧測定装置〔Softron  BP-98A：Softron社製〕を用い、Tail-Cuff法で最高血圧を測定した。その際に体重および摂食量（１日あたり）も測定した。その結果を表４と図５に示す。
【００４６】
【表４】
2008156307.tif 000005
【００４７】
上記表４から明らかなように本発明の酵母酵素分解物は摂取１２週齡から１８週齡において有意な血圧降下作用を示した。
【００４８】
投与試験中の体重及び摂食量の変化を図６，図７に示した。図６及び図７より対照群及び試験群に有意な差は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
アンジオテンシン変換酵素阻害組成物を含有する機能性食品は、健康食品、栄養補助食品、特定保健用食品あるいは各種飲料や食品に添加する健康志向食品への応用等、広範な用途への適用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】酵母酵素分解物のHPLCクロマトグラム
【図２】酵母酵素分解物HPLC処理画分Ｆ３に含まれるペプチドのHPLCクロマトグラム
【図３】酵母酵素分解物HPLC処理画分Ｆ３に含まれるペプチドのHPLCクロマトグラム
【図４】酵母酵素分解物HPLC処理画分Ｆ３の血圧低下作用を示すグラフ（ラット単回投与試験）
【図５】酵母酵素分解物の血圧低下作用を示すグラフ（ラット長期投与試験）
【図６】酵母酵素分解物の体重に及ぼす影響を示すグラフ（ラット長期投与試験）
【図７】酵母酵素分解物の摂食量に及ぼす影響を示すグラフ（ラット長期投与試験）
【図１】
2008156307.tif 000006
【図２】
2008156307.tif 000007
【図３】
2008156307.tif 000008
【図４】
2008156307.tif 000009
【図５】
2008156307.tif 000010
【図６】
2008156307.tif 000011
【図７】
2008156307.tif 000012