(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトＢ細胞の表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るヒトモノクローナル抗体を提供する。【解決手段】ヒトＢ細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、アゴニスト活性を有さず、これによって、該モノクローナル抗体またはフラグメントが、該Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、該Ｂ細胞の増殖が阻害され、該モノクローナル抗体は、特定な配列からなるアミノ酸配列を含む軽鎖と、別の特定な配列からなるアミノ酸配列を含む重鎖と、を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載される、ヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒトＢ細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、アゴニスト活性を有さず、これによって、該モノクローナル抗体またはフラグメントが、該Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、該Ｂ細胞の増殖が阻害され、該モノクローナル抗体は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
ヒトＢ細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、アゴニスト活性を有さず、これによって、該モノクローナル抗体またはフラグメントが、該Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、該Ｂ細胞の増殖が阻害され、該モノクローナル抗体は、
Glu Ile ValLeu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
Glu Arg AlaThr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ser
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
Ile Tyr Gly AlaSer Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser GlySer Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
Pro Glu AspPhe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Phe
Arg Thr PheGly Gln Gly Thr Lys Gln Glu Ile Lys
に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
ヒトＢ細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、アゴニスト活性を有さず、これによって、該モノクローナル抗体またはフラグメントが、該Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、該Ｂ細胞の増殖が阻害され、該モノクローナル抗体は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
ヒトＢ細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、アゴニスト活性を有さず、これによって、該モノクローナル抗体またはフラグメントが、該Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、該Ｂ細胞の増殖が阻害され、該モノクローナル抗体は、配列番号３に示されるポリヌクレオチドを含む核酸によりコードされる軽鎖と、配列番号４に示されるポリヌクレオチドを含む核酸によりコードされる重鎖と、を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
ヒトＢ細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、アゴニスト活性を有さず、これによって、該モノクローナル抗体またはフラグメントが、該Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、該Ｂ細胞の増殖が阻害され、該モノクローナル抗体は、配列番号５に示されるポリヌクレオチドを含む核酸によりコードされる軽鎖と、配列番号６に示されるポリヌクレオチドを含む核酸によりコードされる重鎖と、を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
ヒトＢ細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、アゴニスト活性を有さず、これによって、該モノクローナル抗体またはフラグメントが、該Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、該Ｂ細胞の増殖が阻害され、該モノクローナル抗体は、
gaaattgtgttgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 
ctctcctgcagggccagtca gagtgttagc tacagctact tagcctggta ccagcagaaa 
cctggccaggctcccagact cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 
gacaggttcagtggcagtgg gtctggaaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 
cctgaggattttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcatttcg gacgttcggc 
caagggaccaagcaggagat caaa
に示されるポリヌクレオチドを含む核酸によりコードされる軽鎖と、配列番号１０に示されるポリヌクレオチドを含む核酸によりコードされる重鎖と、を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
請求項２〜７のうちのいずれか１項に記載のヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、ＣＤ４０に結合し得るヒト抗体、この抗体を使用する方法、およびヒトにおける抗体により媒介される疾患の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野の説明）
ＣＤ４０抗原は、Ｂ細胞および他の細胞（樹状細胞を含む）の細胞表面上に発現される糖タンパク質である。Ｂ細胞の分化の際に、この分子はプレＢ細胞に最初に発現され、次いで、Ｂ細胞がプラスマ細胞になった場合に細胞表面から見えなくなる。ＣＤ４０分子と抗ＣＤ４０抗体との架橋は、Ｂ細胞に対する種々の効果を媒介する。ＣＤ４０抗原は、ヒト神経発育因子（ＮＧＦ）レセプターおよび腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）レセプターに関連することが知られており、これにより、ＣＤ４０がＢ細胞の活性化において重要な機能を有するリガンドに対するレセプターであることが示唆される。
【０００３】
ＣＤ４０は、免疫応答の重要なエレメントである。抗原提示細胞のＣＤ４０の、そのリガンド（ＣＤ４０ＬまたはＣＤ１５４と呼ばれる）による係合は、サイトカインの産生および同時刺激分子のアップレギュレーションを引き起こし、Ｔリンパ球を効果的に活性化する。Ｂリンパ球のＣＤ４０の係合は、Ｂ細胞に対する同時刺激シグナルを提供し、抗体産生を駆動する。従って、ＣＤ４０の係合および活性化のブロックは、抗体および細胞媒介性の免疫応答を抑制する可能性を有する。抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体は、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、乾癬、多発性硬化症、炎症性腸疾患（クローン病）、および慢性関節リウマチ）を処置するために使用され得る。このような抗体はまた、自己免疫応答を抑制することにより、器官および組織移植片の拒絶反応を予防するため、悪性Ｂリンパ球に、ＣＤ４０により提供される活性化シグナルを与えないことによりリンパ腫を処置するため、および特異的な様式でＣＤ４０保有細胞に毒素を送達するために使用され得る。
【０００４】
これまでに、活性化シグナルを提供することなくＣＤ４０に結合するマウスモノクローナル抗体（例えば、５Ｄ１２）が開示されている。これらの抗体は、インビボおよびインビトロでの免疫応答を阻害する能力を有する。しかし、マウス抗体は、ヒト疾患を処置するために使用され得ない。なぜならば、これらは、ヒト抗マウス抗体を惹起し、その処置の効果を妨げるからである。従って、匹敵する特異性であるが、ヒトアミノ酸配列で構成される抗体に対する必要性が、当該分野に存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（発明の簡単な要旨）
本発明の主な目的は、ヒトＢ細胞の表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るヒトモノクローナル抗体を提供することである。この抗体のＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の増殖または分化を防止する。
【０００６】
本発明のさらなる目的は、患者における抗体媒介性の疾患を予防または処置する方法を提供することである。この方法は、このような処置が必要な患者に、ＣＤ４０保有細胞（例えば、ヒトＢ細胞またはヒト樹状細胞）の表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得る、薬学的に受容可能な賦形剤中の治療有効量のヒトモノクローナル抗体を投与する工程を包含する。この抗体のＣＤ４０抗原への結合は、この細胞の増殖または分化を防止する。
【０００７】
本発明の別の目的は、患者におけるＩｇＥ媒介性疾患（例えば、アレルギー)を予防または処置する方法を提供することである。この方法は、このような処置が必要な患者に、ヒトＢ細胞の表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得る、薬学的に受容可能な賦形剤中の治療有効量のヒトモノクローナル抗体を投与する工程を包含する。この抗体のＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の増殖または分化を防止する。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、患者における自己免疫疾患（抗体媒介性疾患を含む）を予防または処置する方法を提供することである。この方法は、このような処置が必要な患者に、ヒトＢ細胞の表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得る、薬学的に受容可能な賦形剤中の治療有効量のヒトモノクローナル抗体を投与する工程を包含する。この抗体のＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の増殖または分化を防止する。本発明による処置について考慮される特定の自己免疫疾患として、全身性エリスマトーデス（ＳＬＥ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、および特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）が挙げられる。
【０００９】
本発明の別の目的は、腫瘍細胞（非ホジキンリンパ腫を含む）の増殖を阻害する方法を提供することである。
【００１０】
上記目的のより好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、１５Ｂ８、２０Ｃ４、１３Ｅ４、１２Ｄ９、または９Ｆ７である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
・本発明は、以下を提供する：
・（項目１）  正常なヒトＣＤ４０発現細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、有意なアゴニスト活性を有さず、これによって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、上記正常細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、上記正常細胞の増殖または分化が阻害され、ここで、上記抗体が、配列番号１９〜３０からなる群より選択される配列を有する軽鎖相補性決定領域を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
・（項目２）  正常なヒトＣＤ４０発現細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、有意なアゴニスト活性を有さず、これによって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、上記正常細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、上記正常細胞の増殖または分化が阻害され、ここで、上記抗体が、配列番号１９〜３０からなる群より選択される配列を有する重鎖相補性決定領域を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
・（項目３）  正常なヒトＣＤ４０発現細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、有意なアゴニスト活性を有さず、これによって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、上記正常細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、上記正常細胞の増殖または分化が阻害され、ここで、上記抗体が、１５Ｂ８、２０Ｃ４、１２Ｄ９、９Ｆ７、および１３Ｅ４からなる群より選択されるハイブリドーマによって分泌される、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
・（項目４）  項目１、２、または３に記載のフラグメントであって、上記フラグメントが、上記モノクローナル抗体のＦａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、およびＦｖフラグメントからなる群より選択されるメンバーである、フラグメント。
・（項目５）  項目１、２、または３に記載のモノクローナル抗体であって、上記モノクローナル抗体が、少なくとも１０−５Ｍ、少なくとも１０−７Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、および少なくとも１０−１１Ｍからなる群より選択される親和性（ＫＤ）で上記ヒトＣＤ４０抗原に結合する、モノクローナル抗体。
・（項目６）  正常なヒトＢ細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、有意なアゴニスト活性を有さず、これによって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、上記正常Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、上記正常Ｂ細胞の増殖または分化が阻害され、ここで、上記モノクローナル抗体が、配列番号１１、１５、２０、２６、３２および３８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
・（項目７）  正常なヒトＢ細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、有意なアゴニスト活性を有さず、これによって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、上記正常Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、上記正常Ｂ細胞の増殖または分化が阻害され、ここで、上記モノクローナル抗体が、配列番号１３、１７、２１、２７、３３および３９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
・（項目８）  正常なヒトＢ細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、有意なアゴニスト活性を有さず、これによって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、上記正常Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、上記正常Ｂ細胞の増殖または分化が阻害され、ここで、上記モノクローナル抗体が、配列番号１２、１６、２２、２８、３４および４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
・（項目９）  正常なヒトＢ細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、有意なアゴニスト活性を有さず、これによって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、上記正常Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、上記正常Ｂ細胞の増殖または分化が阻害され、ここで、上記モノクローナル抗体が、配列番号１４、１８、２３、２９、３５および４１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
・（項目１０）  正常なヒトＢ細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、有意なアゴニスト活性を有さず、これによって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、上記正常Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、上記正常Ｂ細胞の増殖または分化が阻害され、ここで、上記モノクローナル抗体が、配列番号２４、３０、３６および４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
・（項目１１）  正常なヒトＣＤ４０発現細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、有意なアゴニスト活性を有さず、これによって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、上記正常細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、上記正常細胞の増殖または分化が阻害され、ここで、上記モノクローナル抗体が、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、および４３からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む核酸によってコードされる、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
・（項目１２）  核酸であって、上記核酸が、配列番号２０〜２４、２６〜３０、３２〜３６、および３８〜４２からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含み、上記アミノ酸配列が、正常なヒトＢ細胞においてＣＤ４０に特異的に結合し得る抗体の軽鎖および重鎖の相補性決定領域のうちの少なくとも１つを含む、核酸。
・（項目１３）  正常なヒトＣＤ４０発現細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、有意なアゴニスト活性を有さず、これによって、上記モノクローナル抗体またはフラグメントが、上記正常細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原に結合する場合、上記正常細胞の増殖または分化が阻害され、ここで、上記抗体またはそのフラグメントが、１５Ｂ８、２０Ｃ４、１３Ｅ４、１２Ｄ９、および９Ｆ７からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
・（項目１４）  項目７〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体であって、上記モノクローナル抗体が、少なくとも１０−５Ｍ、少なくとも１０−７Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、および少なくとも１０−１１Ｍからなる群より選択される親和性（ＫＤ）で上記ヒトＣＤ４０抗原に結合する、モノクローナル抗体。
・（項目１５）  正常ヒトＢ細胞の増殖または分化を阻害するための方法であって、上記方法が、上記Ｂ細胞を有効量のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体に接触させる工程を包含し、上記抗体が、有意なアゴニスト活性を含まず、これによって、上記抗体が、上記Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原に結合する場合、上記Ｂ細胞の増殖または分化が阻害され、ここで、上記モノクローナル抗体が、少なくとも１０−５Ｍ、少なくとも１０−７Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、および少なくとも１０−１１Ｍからなる群より選択される親和性（ＫＤ）で上記Ｂ細胞に結合する、方法。
・（項目１６）  正常ヒトＢ細胞の増殖または分化を阻害するための方法であって、上記方法が、上記Ｂ細胞を有効量のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体に接触させる工程を包含し、上記抗体が、有意なアゴニスト活性を含まず、これによって、上記抗体が、上記Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原に結合する場合、上記Ｂ細胞の増殖または分化が阻害され、ここで、上記ヒトモノクローナル抗体が、１５Ｂ８、２０Ｃ４、１３Ｅ４、１２Ｄ９、および９Ｆ７からなる群より選択される、方法。
・（項目１７）  項目１５に記載の方法であって、上記モノクローナル抗体が、上記モノクローナル抗体のＦａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、またはＦｖフラグメントである、方法。
・（項目１８）  項目１６に記載の方法であって、上記モノクローナル抗体が、上記モノクローナル抗体のＦａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、またはＦｖフラグメントである、方法。
・（項目１９）  正常ヒトＢ細胞の増殖を阻害するための方法であって、上記増殖が、ＣＤ４０リガンドとＢ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原との相互作用によって増強され、上記方法が、上記Ｂ細胞を有効量のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と接触させる工程を包含し、上記抗体が、有意なアゴニスト活性を含まず、これによって、上記抗体が、上記Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原に結合する場合、上記Ｂ細胞の増殖が阻害され、上記モノクローナル抗体が、少なくとも１０−５Ｍ、少なくとも１０−７Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、および少なくとも１０−１１Ｍからなる群より選択される親和性（ＫＤ）で上記ヒトＢ細胞に結合する、方法。
・（項目２０）  正常ヒトＢ細胞の増殖を阻害するための方法であって、上記増殖が、ＣＤ４０リガンドとＢ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０抗原との相互作用によって増強され、上記方法が、上記Ｂ細胞を有効量のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と接触させる工程を包含し、上記抗体が、有意なアゴニスト活性を含まず、これによって、上記抗体が、上記Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原に結合する場合、上記Ｂ細胞の増殖が阻害され、上記モノクローナル抗体が、少なくとも１０−５Ｍ、少なくとも１０−７Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、および少なくとも１０−１１Ｍからなる群より選択される親和性（ＫＤ）で上記ヒトＢ細胞に結合し、ここで、上記ヒトモノクローナル抗体が、１５Ｂ８、２０Ｃ４、１３Ｅ４、１２Ｄ９、および９Ｆ７からなる群より選択される、方法。
・（項目２１）  ヒト患者におけるＢ細胞による抗体産生を阻害するための方法であって、上記方法が、ヒト患者に有効量のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を投与する工程を包含し、上記抗体が、有意なアゴニスト活性を含まず、これによって、上記抗体が、上記Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原に結合する場合、上記Ｂ細胞による抗体産生が阻害され、ここで、上記モノクローナル抗体が、少なくとも１０−５Ｍ、少なくとも１０−７Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、および少なくとも１０−１１Ｍからなる群より選択される親和性（ＫＤ）で上記ヒトＢ細胞に結合する、方法。
・（項目２２）  ヒト患者におけるＢ細胞による抗体産生を阻害するための方法であって、上記方法が、ヒト患者に有効量のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を投与する工程を包含し、上記抗体が、有意なアゴニスト活性を含まず、これによって、上記抗体が、上記Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原に結合する場合、上記Ｂ細胞による抗体産生が阻害され、ここで、上記モノクローナル抗体が、少なくとも１０−５Ｍ、少なくとも１０−７Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、および少なくとも１０−１１Ｍからなる群より選択される親和性（ＫＤ）で上記ヒトＢ細胞に結合し、ここで、上記ヒトモノクローナル抗体が、１５Ｂ８、２０Ｃ４、１３Ｅ４、１２Ｄ９、および９Ｆ７からなる群より選択される、方法。
（発明の詳細な説明）
抗体は、いくつかの領域から構築され、重要な領域は、相補性決定領域、すなわちＣＤＲである。句「相補性決定領域」は、ネイティブの免疫ブロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に規定するアミノ酸配列をいう。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＮＩＨ発行番号９１−３２４２（１９９１）を参照のこと。句「定常領域」は、エフェクター機能に与える抗体分子の部分をいう。ヒト疾患の治療における使用のための非免疫原性抗体を生成することに関するこれまでの研究において、マウス定常領域は、ヒト定常領域により置換されていた。本発明のヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グログリンから獲得された。しかし、これらのヒト化抗体はなお、ヒトにおいて望ましくない、そして潜在的に危険な免疫応答を惹起し、親和性を喪失していた。
【００１２】
本発明のヒトモノクローナル抗ＣＤ４０抗体は、先行技術のモノクローナル抗体の欠点に取り組んでいる。従って、本発明のヒトモノクローナル抗体は、好ましくは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むよう操作されたトランスジェニック動物を用いて生成される。例えば、ＷＯ９８／２４８９３は、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示している。この動物は、内因性の重鎖および軽鎖の遺伝子座の不活性化に起因して、機能的な内因性の免疫グロブリンを生成しない。ＷＯ９１／１０７４１はまた、免疫原に対する免疫応答をマウントし得るトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示している。この抗体は、霊長類の定常領域および／または可変領域を有し、そして内因性の免疫グロブリンをコードする遺伝子座は置換されているかまたは不活性化されている。ＷＯ９４／０２６０２は、不活性化された内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的なヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示している。米国特許第５，９３９，５９８号は、トランスジェニックマウスを作製する方法を開示しており、このマウスは、内因性の重鎖を欠損しており、そして１つ以上の異種性定常領域を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現する。
【００１３】
上記のトランスジェニック動物を使用して、ＣＤ４０の場合、選択された抗原性分子に対する免疫応答が生成され得、そして抗体産生細胞がこの動物から取り出され得、そしてヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成するために使用され得る。免疫化プロトコル、アジュバントなどは当該分野で公知であり、そして例えば、ＷＯ９６／３３７３５に記載されるようなトランスジェニックマウスの免疫において使用される。このモノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物学的活性または生理学的効果を阻害または中和する能力について試験され得る。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、およびそれらのフラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、および親抗体の抗原結合機能を保持する他のフラグメント）をいう。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、同質の抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、抗体の種または起源に関して限定されないし、作製される様式によっても限定されないことが意図される。この用語は、免疫グロブリン全体およびフラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、および抗体の抗原結合機能を保持する他のフラグメント）を含む。任意の哺乳動物種のモノクローナル抗体が、本発明において使用され得る。しかし、実際には、抗体は、代表的に、モノクローナル抗体を生成するのに必要とされるハイブリッド細胞株またはハイブリドーマを作製する際に使用するためのラットまたはマウスの細胞株の利用可能性に起因して、ラットまたはマウス起源の抗体である。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「単鎖抗体」は、結合する抗体の結合ドメイン（重鎖および軽鎖の両方）を決定し、その結合機能の保存を可能にする連結部位を供給することにより調製される抗体をいう。これにより、本質的に、抗原に結合するのに必要とされる可変ドメインの部分のみを有する根本的に短縮された抗体が形成される。単鎖抗体の決定および構築は、Ｌａｄｎｅｒらに対する米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤ４０抗原エピトープ」は、本発明の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と免疫反応し得る分子（ＣＤ４０抗原自身を除く）をいう。ＣＤ４０抗原エピトープは、タンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド、炭水化物、脂質、および他の分子を含み得るが、本発明の目的のためには、最も一般的には、タンパク質、短いオリゴペプチド、オリゴペプチド模倣物（すなわち、ＣＤ４０抗原の抗体結合特性を模倣する有機化合物）、またはそれらの組み合わせである。適切なオリゴペプチド模倣物は、とりわけ、ＰＣＴ出願ＵＳ９１／０４２８２に記載されている。
【００１８】
本発明の抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスにより産生され、そしてヒト細胞（特に、Ｂ細胞）の表面上のヒトＣＤ４０抗原に結合する。これらの抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、およびそれらのフラグメントであり得る。
【００１９】
モノクローナル抗体１５Ｂ８、２０Ｃ４、１３Ｅ４、１２Ｄ９、および９Ｆ７が、実施例において記載されるように調製される。本発明の他の抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座についてトランスジェニックなマウスを用いて同様に調製され得るか、または当該分野で公知の他の方法および／もしくは本明細書中に記載される他の方法により調製され得る。
【００２０】
ポリクローナル血清は、従来の方法により調製され得る。一般的に、ＣＤ４０抗原を含む溶液が、適切な動物（本発明においては、トランスジェニック動物、好ましくは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウス）を免疫するために最初に使用される。好ましい実施形態において、ＣＤ４０を発現するＳｆ９細胞が、免疫原として使用される。免疫はまた、生理食塩水（好ましくは、フロイント完全アジュバントのようなアジュバント）中で抗原含有溶液を混合または乳化し、そしてこの混合物またはエマルジョンを非経口注入（一般的には、皮下注入または筋肉内注入）することにより実施され得る。５０〜２００μｇ／注入の用量が、代表的に、十分である。免疫は、一般的に、生理食塩水中のタンパク質（好ましくは、フロイント不完全アジュバントを用いて）の１回以上の注入により、２〜６週後にブーストされる。当該分野で公知の方法を用いたインビトロでの免疫によって、抗体が代替的に生成され得、これは、本発明の目的に関して、インビボでの免疫に相当するとみなされる。
【００２１】
ポリクローナル抗血清は、免疫した動物の血液をガラスまたはプラスチック容器に注ぎ、この血液を２５℃にて１時間インキュベートし、その後４℃にて２〜１８時間インキュベートすることにより獲得される。血清は、遠心分離（例えば、１，０００×ｇで１０分間）により回収される。約２０〜５０ｍｌ／血液が、ウサギから獲得され得る。
【００２２】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５−９６（１９７５）の方法またはその改良版を用いて調製され得る。代表的に、マウスは、上記のように免疫される。しかし、血清を抽出するために動物を出血させずに、脾臓（および必要に応じていくつかの大リンパ節）が取り出され、そして単一細胞に分離される。所望の場合、脾臓細胞は、タンパク質抗原でコーティングされたプレートまたはウェルに細胞懸濁物を適用することにより（非特異的接着細胞の除去後に）スクリーニングされ得る。この抗原に対して特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、プレートに結合し、そして懸濁物の残りと共に洗い流されない。次いで、得られるＢ細胞または全ての分離された脾臓細胞は、黒色腫細胞と融合してハイブリドーマを形成するために誘導され、そして選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）で培養される。得られるハイブリドーマは、限界希釈によりプレーティングされ、そして所望の免疫細胞表面抗原に特異的に結合する（そして関連しない抗原に結合しない）抗体の産生についてアッセイされる。次いで、選択されたＭＡｂ分泌ハイブリドーマは、インビトロ（例えば、組織培養ボトルまたは中空繊維リアクターにおいて）またはインビボ（マウスにおける腹水として）のいずれかで培養される。
【００２３】
ハイブリドーマの使用の代替として、抗体は、米国特許第５，５４５，４０３号、同第５，５４５，４０５号および同第５，９９８，１４４号（これらは本明細書中で参考として援用される）に開示されるように、ＣＨＯ細胞株のような細胞株において産生され得る。簡単に述べると、この細胞株は、軽鎖および重鎖をそれぞれ発現し得るベクターによりトランスフェクトされる。別々のベクター上の２つのタンパク質をトランスフェクトすることにより、キメラ抗体が生成され得る。別の利点は、抗体の正確なグリコシル化である。
【００２４】
好ましくは、ＣＤ４０に対する十分なヒト抗体が、トランスジェニックマウスを免疫することにより獲得される。１つのこのようなマウスは、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅと称され、そして米国特許第６，０７５，１８１号；同第６，０９１，００１号；および同第６，１１４，５９８号において開示されている（これらは全て、本明細書中で参考として援用される）。本明細書に開示される抗体を生成するために、ヒトＩｇＧ２重鎖遺伝子座およびヒトＫ軽鎖遺伝子座についてトランスジェニックなマウスを、ヒトＣＤ４０を発現するＳｆ９細胞により免疫した。マウスはまた、他のアイソタイプについてもトランスジェニックであり得る。
【００２５】
Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞の生成は、本明細書中で参考として援用される、ｄｅ  Ｂｏｅｒ、米国特許第６，００４，５５２号に開示される。簡単に述べると、ヒトＣＤ４０をコードする配列を、ｄｅ  Ｂｏｅｒにより記載されるような転移ベクターを用いて、バキュロウイルス中に組み換えた。このプラスミドを、野生型バキュロウイルスＤＮＡと共にＳｆ９細胞中に同時トランスフェクトした。組換えバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を同定し、クローン精製した。
【００２６】
ＣＤ４０を発現する５×１０６個のＳｆ９細胞を、第０日および第１４日に、マウスに腹腔内（ＩＰ）注入した。最後の注入を少なくとも５週間後に実施し、そして脾臓および胸腺細胞を取り出し、そして細胞融合のために使用した。細胞融合を、ｄｅ  Ｂｏｅｒに記載されるように実施した。ハイブリドーマ抗体を、実施例に記載されるようにしてスクリーニングした。５つのハイブリドーマを、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）および抗ＩｇＭにより誘導されたヒト末梢血Ｂ細胞の増殖を阻害するそれらの能力、および抗ＣＤ３不活性化されたヒト末梢血Ｔ細胞により刺激されたヒト末梢血Ｂ細胞によるＩｇＭの産生を阻害するそれらの能力に基づき、さらなる研究のために選択した。
【００２７】
最適な阻害活性を示す５つのハイブリドーマを、１５Ｂ８．８．６（１５Ｂ８）、２０Ｃ４．１．６（２０Ｃ４）、１３Ｅ４．１２．１１（１３Ｅ４）、１２Ｄ９．９．１０（１２Ｄ９）、９Ｆ７．９．１１．１（９Ｆ７）、および１５Ｂ８．７．２と命名した。これらのハイブリドーマのいずれも、休止しているヒト末梢血Ｂ細胞における増殖を誘導する有意な能力を示さなかった。
【００２８】
これらのハイブリドーマの抗体の相対的な結合特性を、フローサイトメトリーにより試験した（実施例に詳細記載される）。簡単に述べると、比較された抗体は、同一または親密に関連するエピトープを認識するそれらの能力にもかかわらず、親和性における差異を示した。例えば、ＭＡｂ  １５Ｂ８は、ヒトＣＤ２０＋末梢血リンパ球へのＭＡｂ  ２０Ｃ４の結合をブロックしたが、ＭＡｂ  ２０Ｃ４は、ＣＤ２０＋リンパ球へのＭＡｂ  １５Ｂ８の結合をブロックしなかった。ハイブリドーマの示差的なＣＤ４０結合を、表４（実施例４）に示す。
【００２９】
試験した４つのハイブリドーマ（１５Ｂ８、２０Ｃ４、１２Ｄ９、および９Ｆ７）は、３つの種（ヒト；アカゲザル；およびカニクイザル）由来の末梢血細胞を染色するモノクローナル抗体を産生した（図７）。
【００３０】
このモクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド配列を決定するために、このハイブリドーマからｍＲＮＡを調製し、そして標準的な手順を用いて、このｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物をゲル上で分析し、配列決定し、そして翻訳した。このポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、表７、実施例１１に示されるように配列番号１〜１８において提供する。
【００３１】
５つのモノクローナル抗体（９Ｆ７、１５Ｂ８、１２Ｄ９、２０Ｃ４、および１３Ｅ４）のアミノ酸配列を、図５（軽鎖）および図６（重鎖）に示されるように、マウス抗ＣＤ４０モノクローナル抗体５Ｈ７のアミノ酸配列と比較した。
【００３２】
５つの開示されるモノクローナル抗体を用いて獲得された結果は、これらの抗体ならびにそれらのフラグメントおよびキメラ形態が拮抗特性を有し、それによりこれらが多くの臨床適用（自己免疫疾患の処置、移植反応および拒絶の処置を含む）に適切であり、遺伝子療法およびタンパク質療法のためのアジュバント療法として適切であり、そして腫瘍細胞（非ホジキンリンパ腫細胞を含む）の増殖を阻害する上で適切であることを示す。さらなる用途として、ＣＤ４０を発現する悪性細胞により媒介される任意の疾患の処置、およびＣＤ４０を発現する細胞の増殖、活性化、または調節に関連する疾患を処置するための使用が挙げられる。５つのＭＡｂの活性を、表１に要約する。
【００３３】
【表１】
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＊１μｇ／ｍｌの抗体からの代表的なデータを示した。
【００３４】
本発明は、本明細書中に記載される５つのモノクローナル抗体だけでなく、これらとは異なるがＣＤＲを保持する抗体；および１つ以上のアミノ酸付加、欠失、または置換を有する抗体もまた包含する。ここで、この活性は、Ｂ細胞増殖および／または抗体分泌を阻害することにより測定される。本発明はまた、例えば、ＷＯ９８／５２９７６、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載されるようにして生成され得る脱免疫抗体（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を包含する。本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質もまた、本発明の範囲内に含まれる。この融合タンパク質は、当該分野で公知のように、合成され得るかまたは対応するポリヌクレオチドベクターから発現され得る。
【００３５】
本発明の抗体は、例えば、特許公報番号ＥＰ０９８３３０３Ａ１、ＷＯ００／３４３１７、およびＷＯ９８／５２９７６（これらは、本明細書中で参考として援用される）に記載される方法を用いて生成される、配列のバリエーションを有し得る。例えば、ＣＤＲ内の配列は、抗体がＭＨＣクラスＩＩに結合しそして望ましくないヘルパーＴ細胞応答を誘導し得る原因となることが示されている。保存的置換は、その抗体が結合活性を保持しているが、望ましくないＴ細胞応答を誘導する能力を失わせることを可能にする。任意のこのような保存的置換または非保存的置換は、当該分野で認識されている方法を用いてなされ得、そして得られる抗体は本発明の範囲内に含まれる。
【００３６】
本発明は、好ましいモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（配列番号１〜１８）を提供する。この配列は、図５および６に示されるように、整列される。これらの整列は、この抗体の所望の生物学的活性を喪失することなく置換するのにより適した特定のアミノ酸位置を示す。慣用的な方法のみを用いて、当業者は、これらの配列の改変体をコードするプラスミドを構築し得る。この改変抗体は、本明細書中に記載される方法を用いて、アンタゴニスト活性、親和性、特異性、およびアゴニスト活性について慣用的に試験され得る。
【００３７】
上記の方法のいずれか、または本明細書中に開示されない他の方法のいずれかによって産生される抗体は、以下の生物学的活性の少なくとも１つを有する場合、本発明の範囲内である：Ｔ細胞によって刺激されたヒト末梢Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌の阻害；Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞によって刺激されたヒト末梢Ｂ細胞の増殖の阻害；およびＣＤ４０−Ｌ発現細胞によって刺激されたヒト末梢Ｂ細胞の増殖阻害。これらのアッセイは、本明細書中の実施例に記載されるように実行され得る。
【００３８】
これらの抗体はまた、当該分野で公知の標準的なアッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して測定されるように、適切なコントロールと比較して、少なくとも１０−５Ｍ、好ましくは少なくとも１０−６〜１０−７Ｍ、より好ましくは少なくとも１０−８Ｍ、そして最も好ましくは少なくとも１０−９Ｍ（例えば、１０−１０Ｍ）の単一部位結合親和性（ＫＤ）を示す。１０−１１Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１５Ｍ、１０−１７Ｍおよび１０−１９Ｍの結合親和性もまた達成され得る。これらのアッセイは自動化され、そして当該分野において公知の標準的な技術を使用してもアッセイされ得る、ＭＡｂの特異性および交差反応性の測定を可能にする。Ｂｉａｃｏｒｅアッセイの詳細は、Ｂｉａｃｏｒｅの「ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｈａｎｄｂｏｏｋ」に提供される。ＷＯ０１／２７１６０に記載される方法をまた使用して、結合親和性を調節し得る。
【００３９】
所望の場合、抗体（ポリクローナルであれ、モノクローナルであれ）は、従来技術を使用して標識され得る。適切な標識としては、発蛍光団、発色団、放射性原子（特に３２Ｐおよび１２５Ｉ）、高電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドが挙げられる。酵素は、代表的にはその活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計で定量可能な青色色素に変換する能力によって検出される。「特異的結合パートナー」とは、例えば、抗原およびその抗原に特異的なモノクローナル抗体の場合のような、高い特異性でリガンド分子に結合し得るタンパク質をいう。他の特異的結合パートナーとしては、ビオチンおよびアビジンもしくはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに当該分野で公知の多数のレセプター−リガンド対が挙げられる。上の記載は、種々の標識を別個のクラスに分類することを意味せず、同じ標識がいくつかの異なる様式で作用し得ることが、理解されるべきである。例えば、１２５Ｉは、放射性標識または高電子密度試薬として作用し得る。ＨＲＰは、酵素またはＭＡｂに対して抗原として作用し得る。さらに、所望の効果のために種々の標識を組み合わせ得る。例えば、ＭＡｂおよびアビジンはまた、本発明の実行において標識を必要とする：従って、ＭＡｂをビオチンで標識し得、そしてその存在を、１２５Ｉで標識したアビジン、またはＨＲＰで標識した抗ビオチンＭＡｂを用いて検出し得る。他の置換および可能性は当業者に容易に明らかであり、本発明の範囲内の等価物とみなされる。
【００４０】
本発明における使用のための抗体は、任意の適切な技術を用いることによって産生され得る。例えば、ＷＯ０１／２７１６０は、抗体アクセプターの可変領域フレームワークに対する結合親和性をドナーＣＤＲに付与する方法を開示する。この方法をまた使用して、可変領域または抗体の結合親和性を最適化（例えば、結合親和性を増強）し得る。１以上のＣＤＲを有するヒト化抗体を生成する方法は、米国特許第６，１８０，３７０号に記載される。ヒトに対する投与のために最適化された抗体を生成する方法は、ＷＯ００／３４３１７に開示され、これは、免疫原性が低いか、または非免疫原性にされたタンパク質の生成を記載する。米国特許第５，５１４，５４８号は、標的リガンドに高い親和性で結合するリガンド結合タンパク質（例えば、抗体）の選択のための方法を開示する。米国特許第５，８７７，３９７号は、異種抗体を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物を開示した。これら全ての特許および特許出願は、本明細書中に参考として援用される。
【００４１】
（処方物および投与方法）
本発明の抗体は、抗体媒介性疾患（例えば、アレルギー、ＳＬＥ、ＰＢＣ、ＩＴＰ、多発性硬化症、疥癬、クローン病、移植片拒絶およびＢ細胞リンパ腫）を予防または処置するために、治療的に有効な濃度で投与される。この目的を達成するために、抗体を、当該分野で公知の種々の受容可能な賦形剤を使用して処方し得る。代表的には、抗体は、静脈内または腹腔内のいずれかで、注射によって投与される。この投与を達成するための方法は、当業者に公知である。局所的または経口的に投与され得るか、あるいは粘膜を介して透過し得る組成物を得ることもまた可能であり得る。
【００４２】
患者への投与の前に、処方剤（ｆｏｒｍｕｌａｎｔ）が抗体に添加され得る。液体処方物が好ましい。例えば、これらの処方物は、オイル、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤または充填剤を含み得る。好ましくは、炭水化物としては、糖または糖アルコール（例えば、単糖、二糖または多糖）あるいは水溶性グルカンが挙げられる。糖またはグルカンとしては、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αシクロデキストリンおよびβシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチル（ｈｙｄｒｏｘｅｔｈｙｌ）デンプンならびにカルボキシメチルセルロースまたはこれらの混合物が挙げられ得る。スクロースが最も好ましい。「糖アルコール」は、−ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８の炭化水素として規定され、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロールおよびアラビトールが挙げられる。マンニトールが最も好ましい。上記のこれらの糖または糖アルコールは、個々にかまたは組み合わせて使用され得る。この糖または糖アルコールが、水性調製物中に可溶である限り、使用される量に固定された制限はない。好ましくは、糖または糖アルコールの濃度は、１．０ｗ／ｖ％と７．０ｗ／ｖ％との間、より好ましくは２．０ｗ／ｖ％と６．０ｗ／ｖ％との間である。好ましいアミノ酸としては、左旋性（Ｌ）形態のカルニチン、アルギニンおよびベタインが挙げられるが、他のアミノ酸もまた加えられ得る。好ましいポリマーとしては、２，０００と３，０００との間の平均分子量を有するポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）または３，０００と５，０００との間の平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。凍結乾燥前または再構成後に溶液中のｐＨ変化を最小化するために、組成物中に緩衝剤を使用することもまた好ましい。大部分の任意の生理学的緩衝剤が使用され得るが、クエン酸塩（ｔｉｔｒａｔｅ）、リン酸塩、コハク酸塩およびグルタミン酸塩の緩衝剤またはこれらの混合物が好ましい。クエン酸緩衝剤が最も好ましい。好ましくは、その濃度は、０．０１モル濃度〜０．３モル濃度である。処方物に添加され得る界面活性剤は、ＥＰ第２７０，７９９号および同第２６８，１１０号に示される。
【００４３】
さらに、抗体は、ポリマーへの共有結合的結合体化によって化学的に修飾されて、例えば、その循環半減期を増大し得る。好ましいポリマーおよびポリマーをペプチドに結合させる方法は、米国特許第４，７６６，１０６号；同第４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号および同第４，６０９，５４６号（これらは全て、その全体が本明細書中に参考として援用される）に示される。好ましいポリマーは、ポリオキシエチレン化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、室温で水溶性であり、そして一般式：Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有し、ここでＲは、水素またはアルキル基もしくはアルカノール基のような保護基であり得る。好ましくは、この保護基は、１〜８個の炭素原子を有し、より好ましくはメチルである。記号ｎは、正の整数であり、好ましくは１と１，０００との間、より好ましくは２と５００との間である。ＰＥＧは、１０００と４０，０００との間、より好ましくは２０００と２０，０００との間、より好ましくは３，０００と１２，０００との間の平均分子量を有する。好ましくは、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有し、より好ましくは、これは末端ヒドロキシ基である。このヒドロキシ基が、好ましくは活性化されて、インヒビター上の遊離アミノ基と反応する。しかし、この反応性基の型および量は、本発明の共有結合的に結合体化したＰＥＧ／抗体を達成するために変えられ得る。
【００４４】
水溶性ポリオキシエチレン化ポリオールもまた、本発明において有用であることが理解される。これらには、ポリオキシエチレン化ソルビトール、ポリオキシエチレン化グルコース、ポリオキシエチレン化グリセロール（ＰＯＧ）などが挙げられ、ＰＯＧが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチレン化グリセロールのグリセロール骨格が、例えば、動物およびヒトにおいて天然に存在する、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド中と同じ骨格であるからである。従って、この分枝は、体内において必ずしも外来因子として見られない。ＰＯＧは、ＰＥＧと同じ範囲の好ましい分子量を有する。ＰＯＧの構造は、Ｋｎａｕｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０６４−１５０７０（１９８８）に示され、そしてＰＯＧ／ＩＬ−２結合体の考察は、米国特許第４，７６６，１０６号に見出される（これら両方は、その全体が本明細書中で参考として援用される）。
【００４５】
循環半減期を増大させるための別の薬物送達システムは、リポソームである。リポソーム送達システムを調製するための方法は、Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｃｈ  ４２：４７３４（１９８２）；Ｃａｆｉｓｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ６４９：１２９（１９８１）；およびＳｚｏｋａ、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｅｎｇ  ９：４６７（１９８０）において考察される。他の薬物送達システムが、当該分野で公知であり、例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ編、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．、１９８０）、２５３−３１５頁；Ｍ．Ｌ．Ｐｏｚｎａｓｋｙ、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｖｓ  ３６：２７７（１９８４）に記載されている。
【００４６】
液体薬学的組成物を調製した後、分解を防止し、そして滅菌を保つために、凍結乾燥することが好ましい。液体組成物を凍結乾燥するための方法は、当業者に公知である。使用の直前に、この組成物は、さらなる成分を含み得る滅菌希釈剤（例えば、リンガー溶液、蒸留水、または滅菌生理食塩水）で再構成され得る。再構成の際に、この組成物は、好ましくは、当業者に公知の方法を使用して被験体に投与される。
【００４７】
上記のように、本発明の抗体および組成物は、ヒト患者を処置して、抗体媒介性の疾患（例えば、アレルギー、ＳＬＥ、ＰＢＣおよびＩＴＰ）を予防または処置するために使用され得る。好ましい投与経路は、非経口である。非経口投与において、本発明の組成物は、薬学的に受容可能な非経口ビヒクルと組み合わせて、注射可能な単位投薬形態（例えば、溶液、懸濁液または乳濁液）で処方される。このようなビヒクルは、本質的に非毒性であり、かつ非治療剤である。このようなビヒクルの例は、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液およびハンクス溶液である。非水性ビヒクル（例えば、不揮発油およびオレイン酸エチル）もまた使用され得る。好ましいビヒクルは、生理食塩水中５％のデキストロースである。このビヒクルは、少量の添加剤（例えば、緩衝液および保存料を含む、等張性および化学的安定性を増強する物質）を含み得る。
【００４８】
投薬量および投与の様式は、個体に依存する。一般に、この組成物は、１μｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間、より好ましくは２０μｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの間、最も好ましくは１ｍｇ／ｋｇと７ｍｇ／ｋｇとの間の用量で抗体が与えられるように、投与される。適切には、これは、注入またはボーラス投与で与えられ、ボーラス投与後４〜６時間にわたって、循環レベルを１０〜２０倍増大させる。連続的な注入はまた、ボーラス投与後に用いられ得る。この場合、抗体は、５μｇ／ｋｇ／分と２０μｇ／ｋｇ／分との間、より好ましくは７μｇ／ｋｇ／分と１５μｇ／ｋｇ／分との間の用量で注入され得る。適切な処置レジメンは、ＷＯ００／２７４２８およびＷＯ００／２７４３３（これらは、本明細書中で参考として援用される）に開示されている。
【００４９】
（非ホジキンリンパ腫治療のための、抗ＣＤ４０抗体治療の使用）
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、脾臓、胸腺およびリンパ節の成分に由来する（Ｊａｎｄｌ  Ｊ．Ｈ．、Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ、Ｊａｎｄｌ  ＪＨ（編）：Ｂｌｏｏｄ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ、１９９６、８５３−８８７頁）。これは、元々Ｂ細胞およびＴ細胞に由来するリンパ球悪性疾患の一群からなる。低悪性度のＮＨＬを有する患者は、通常、放射線療法および化学療法に応答性ではない。この低い応答率および高い再発の可能性は、９年未満の患者生存期間の中央値に寄与する。
【００５０】
ＣＤ４０による生存／増殖シグナルの不均衡およびＦａｓによる不活発なデス（ｄｅａｔｈ）シグナルは、低悪性度のＢ系統悪性疾患（慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）およびＮＨＬを含む）の病因において重要な役割を果たす（Ｇｈｉａ  Ｐ．、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００、７９：１５７−７３）。低悪性度ＮＨＬにおける研究は、疾患の発症が、Ｆａｓ経路を介したアポトーシスの減少およびＣＤ４０を介した生存シグナルの増大の結果としての、リンパ腫細胞の蓄積に起因することを示唆する（Ｇｈｉａ  Ｐ．、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００、７９：１５７−７３）。このことは、化学療法または放射線療法（これは、活発に増殖している細胞を特異的に標的化する）に対するリンパ腫細胞の非感受性を説明し得る。
【００５１】
本発明はさらに、新規ＮＨＬ治療に関し、これは、ＣＤ４０に対する抗体を使用して、ＮＨＬ細胞への生存シグナルをブロックすることを包含する。この戦略は、発行された科学文献中の多数の観察によって支持される。ＣＤ４０は、Ｂ細胞の発生を通じて、Ｂ細胞表面で発現される。研究によって、ＣＤ４０が、悪性Ｂ細胞への生存シグナルを提供し、インビトロでの増殖を刺激することを実証した（Ｒｏｍａｎｏ  Ｍ．Ｆ．ら、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ、２０００年１月、３６（３−４）：２５５−６２；Ｆｕｒｍａｎ  Ｒ．Ｒ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００年２月１５日、１６４（４）：２２００−６；Ｋｉｔａｄａ  Ｓ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１９９９年９月、１０６（４）：９９５−１００４；Ｒｏｍａｎｏ  Ｍ．Ｆ．、Ｂｌｏｏｄ、１９９８年８月１日、９２（３）：９９０−５；Ｊａｃｏｂ  Ａ．、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．、１９９８年４月、２２（４）：３７９−８２；Ｗａｎｇ  Ｄ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１９９７年５月、９７（２）：４０９−１７；Ｐｌａｎｋｅｎ  Ｅ．Ｖ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１９９６年３月、１０（３）：４８８−９３；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ａ．、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９９７年５月、１５０（５）：１５８３−９３）。インビボのＣＤ４０シグナル伝達のためのＣＤ４０Ｌを提供する微小環境が存在するという、患者からの証拠が存在する：ＣＤ４０は、Ｂ系統のＮＨＬを有する患者の８６％において、リンパ腫細胞上に発現される（Ｕｃｋｕｎ  Ｆ．Ｍ．、Ｂｌｏｏｄ、１９９０年１２月１５日、７６（１２）：２４４９−５６）。同じＢ細胞リンパ腫細胞におけるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌの同時発現の発見は、ＮＨＬ患者におけるオートクライン増殖シグナルループの可能性を提起する（Ｃｌｏｄｉ  Ｋ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１９９８年１０月、１０３（１）：２７０−５）。ＮＨＬ患者の血清における可溶性ＣＤ４０Ｌの有意な増加もまた存在する（Ｙｏｕｎｅｓ  Ａ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１９９８年１月、１００（１）：１３５−４１）。可溶性ＣＤ４０Ｌは、初代ＮＨＬリンパ腫細胞培養物において、リンパ腫細胞の増殖を誘導し得る（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｎ．Ｓ．、Ｂｌｏｏｄ、２０００年９月１５日、９６（６）：２２１９−２５；Ｂｕｓｋｅ  Ｃ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１９９７年１１月、１１（１１）：１８６２−７）。ＣＤ４０Ｌの発現は、低悪性度ＭＡＬＴリンパ腫において、腫瘍周辺領域において増大する（Ｃａｒｂｏｎｅ  Ａ．、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９９５年１０月、１４７（４）：９１２−２２；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ａ．、Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｏｌ．、１９９８、６（３−４）：１８７−９５）。Ｂ細胞系統の腫瘍上で発現される高レベルのＣＤ４０、およびこれらの悪性細胞への生存シグナルとしてのその機能を考慮して、アンタゴニストの抗ＣＤ４０抗体は、ＮＨＬにおいて治療的価値を有し得る。
【００５２】
１５Ｂ８（ヒトＩｇＧ２重鎖遺伝子座およびヒトＫ軽鎖遺伝子座を有するトランスジェニックマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ、Ａｂｇｅｎｉｘ）の免疫によって生成されるヒトＩｇＧ２サブタイプの抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体）を使用した。臨床前ＮＨＬインビトロモデルにおける１５Ｂ８の潜在的な効力を実証するために、１５Ｂ８を、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ処置したＮＨＬ患者または未処置のＮＨＬ患者のいずれかから得た悪性Ｂ細胞（ＮＨＬ細胞）を使用して試験した。ｒｉｔｕｘｉｍａｂは、再発性または抵抗性の、低悪性度または小胞性のＮＨＬの処置のための、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
【００５３】
初代リンパ腫細胞は、標準的な培養倍地中で増殖せず、培養物中で数日後にアポトーシスに陥るので、腫瘍細胞を、Ｂ細胞増殖因子であるインターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下または非存在下で、照射したＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）トランスフェクトフィーダー細胞（Ａｒｐｉｎ，Ｃ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、２６８：７２０−７２２）と同時培養した。次いで、示された濃度（０．０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）の抗体（アゴニストの抗ＣＤ４０  ＭＳ８１、またはアンタゴニストの抗ＣＤ４０  １５Ｂ８あるいはアイソタイプコントロールのｈｕＩｇＧ２）を、培地に添加した。３７℃での４８時間のインキュベーション後、培養細胞を３Ｈ−チミジンで１８時間パルスした。次いで、この細胞を収集し、そして３Ｈ−チミジン取り込み量について分析した（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９５、９２：８２００−８２０４）。全てのサンプル条件は、３連であった。
【００５４】
これらのＮＨＬ細胞初代培養物アッセイにおいて、１５Ｂ８単独もＩＬ−４との組み合わせも、ＮＨＬ細胞のインビトロでの増殖を刺激しなかった。対照的に、アゴニストの抗ＣＤ４０  ＭＳ８１は、同じ条件下でＮＨＬ細胞の増殖を誘導した。１５Ｂ８は、インビトロにおいて、ＣＤ４０Ｌによって刺激されるＮＨＬ細胞の増殖（Ｐ＝０．０５）ならびにＣＤ４０ＬおよびＩＬ−４によって刺激されるＮＨＬ細胞の増殖（Ｐ＜０．０５）の統計的に有意な阻害を示した。それぞれ、１〜１０μｇ／ｍｌまたは０．１〜１０μｇ／ｍｌの濃度範囲で、１５Ｂ８は、ＣＤ４０ＬまたはＣＤ４０ＬおよびＩＬ−４によって刺激されるＮＨＬ細胞の増殖の、統計的に有意な用量に関連する阻害を示した（Ｐ＜０．００５）。
【００５５】
リンパ腫について開発された治療剤中のヒト抗原特異的なＭａｂの評価のために現在使用される、２種類の臨床前モデルが存在する。１つのモデルは、異種移植マウスのインビボモデルであり、ここで、ＥＢＶ形質転換リンパ腫細胞株（例えば、Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫）細胞またはＲａｊｉ（バーキットリンパ腫）細胞）が、ＳＣＩＤ／ヌードマウスに異種移植される。しかし、これらのモデルにおいて、結果は、特定の不死細胞株（これは、１つのＥＢＶ形質転換細胞に由来する）に対する影響を反映するだけである。バーキットリンパ腫細胞は、リンパ芽球細胞であることが公知である（Ａｍｂｉｎｄｅｒ  Ｒ．Ｆ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｓ．、１９９９、９９：２７−４５；Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｌａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｌ．、Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ、１９９８年６月、３０（１−２）：１１１−２１；Ｋｌｅｉｎ  Ｇ．、Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｈｕｎｇ．、１９９６、４３（２−３）：９７−１０５）が、一方、ＮＨＬ患者由来のリンパ腫細胞は、成熟Ｂ細胞段階であると考えられる（Ｇｈｉａ  Ｐ．、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００、７９：１５７−７３）。Ｂ細胞のＥＢＶ形質転換は、ＣＤ４０シグナル伝達経路中の多くの構成要素の変化を生じる（Ｕｃｈｉｄａ  Ｊ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年１０月８日、２８６（５４３８）：３００−３；Ｆａｒｒｅｌｌ  Ｐ．Ｊ．、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．、１９９７、５１（６−７）：２５８−６７）。ＮＨＬ細胞および正常Ｂ細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達とは対照的に、ＣＤ４０シグナル伝達は、ＥＢＶ形質転換バーキットリンパ腫細胞株における増殖停止を導く（Ｆｕｋｕｄａ  Ｍ．、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、１３（２）：２１５−２９；Ｂａｋｅｒ  Ｍ．Ｐ．、Ｂｌｏｏｄ、１９９８年１０月１５日、９２（８）：２８３０−４３）。従って、異種移植モデルにおけるアンタゴニスト抗ＣＤ４０  ＭＡｂ（１５Ｂ８）の試験の結果は、ＮＨＬ患者による抗体（１５Ｂ８）に対する応答を予測することはできない。
【００５６】
他のモデルは、ＮＨＬ患者由来のリンパ球細胞のインビトロ増殖阻害アッセイであり、これを、本明細書中で使用した。その利点は、この結果が、ＮＨＬ患者由来のリンパ腫細胞の、試験される薬剤（１５Ｂ８）に対する感受性を予測することである。しかし、その結果は、規定された条件下でのインビトロの研究から得られる。以前に公開された研究は、ラット抗マウスＣＤ４０（これは、インビトロでＡＤＣＣおよびＣＤＤを誘導できない）が、２つの同質遺伝的なマウスＢリンパ腫モデル（ＢＣＬ１およびＡ３１）において良好な効力を示したことを報告した（Ｔｕｔｔ  Ａ．Ｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８年９月１５日、１６１（６）：３１７６−８５）。抗マウスＣＤ４０に関する抗腫瘍効果は、試験された抗Ｉｄよりも時間的にゆっくりと生じた。抗マウスＣＤ４０は、試験されたマウスモデルにおいて抗Ｉｄのようなシグナル伝達を指向しない、表面ＣＤ４０発現に依存する、重要な増殖シグナルをブロックすることによって、作動し得る。この研究は、抗ＣＤ４０によるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌシグナル伝達のブロックが、インビボで有効であり得ることを示唆する。１５Ｂ８は、ヒトＩｇＧ２サブタイプであるので、試験した場合、インビトロでＦｃγレセプターに結合せず、ＡＤＣＣおよびＣＤＣをインビトロで誘導できなかった。１５Ｂ８は、ラット抗マウスＣＤ４０に対して類似の特性のものである。このデータは、１５Ｂ８が、ＮＨＬ患者、特にＲｉｔｕｘａｎ耐性患者にとって有益であるという仮説を支持する。
【００５７】
ここで、本発明は、特定の有利な実施形態を示す以下の実施例を参照して示される。しかし、これらの実施形態は、例示であり、いかようにも本発明を限定するとは解釈されるべきでないことに、留意すべきである。
【実施例】
【００５８】
（実施例）
（一般的方法）
（免疫グロブリン定量のためのＥＬＩＳＡアッセイ）
ヒトＩｇＭおよびＩｇＧの濃度を、ＥＬＩＳＡによって推定した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを、０．０５Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中の２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＭＡｂ（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｒｉｎｅ）または２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＭ  ＭＡｂ  ４１０２（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｌｉｆ．）を用いて、４℃にて１６時間インキュベートすることによってコーティングした。プレートをＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、そしてＢＳＡで１時間飽和させた。２回の洗浄後、プレートを、異なる希釈の試験サンプルと共に、３７℃で２時間インキュベートした。３回の洗浄後、結合したＩｇＧを、１μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＭＡｂまたはヤギ抗ヒトＩｇＭ  ＭＡｂと共に、３７℃で２時間インキュベートすることによって検出した。プレートを４回洗浄し、そして結合したペルオキシダーゼ活性を、Ｏ−フェニレンジアミンを基質として添加することによって検出した。ヒトＩｇＧまたはＩｇＭ標準（Ｃａｌｔａｑ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を使用して、各アッセイについての標準曲線を確立した。
【００５９】
（ヒト末梢血からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離）
５０ｍｌのポリエチレンチューブあたり、２０ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液（低内毒素、Ｐｈｒｍａｃｉａ）を、３０分間、３つのチューブに添加し、その後血液を添加した。このＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液を室温まで温めた。１：１０希釈の３Ｌの漂白剤を調製し、これを使用して血液を含有する全てのチューブおよびピペットを洗浄した。血液を、Ｆｉｃｏｌｌ層を乱さずに、１．５ｍｌ血液／１ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅで、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液の上部に層にした。これらのチューブを、室温にて１７００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、ブレーキをかけて遠心分離をオフにした。上層（血漿）を可能な限り多く除去し、溶液の第二層を除去するのを回避するために、減圧を最小にした。第二層（これは、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を含む）を、滅菌パスツールピペットを用いて収集し、そして２本の５０ｍｌポリスチレンチューブに配置した。収集物を、添加物を含まない冷ＲＰＭＩ（３倍容積）をもちいて希釈し、そしてチューブを１０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。媒体を吸引によって除去し、そして両方の５０ｍｌチューブからの細胞を、合計１０ｍｌの冷ＲＰＭＩ（添加剤を含む）中に再懸濁し、そして１５ｍｌのチューブに移した。細胞を、血球計を用いて計数し、次いで、１０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。媒体を除去し、細胞を４ｍｌのＲＰＭＩ中に再懸濁した。この画分は、ＰＢＭＣを含んだ。
【００６０】
（ＰＢＭＣからのＢ細胞の単離）
１００μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（抗ｈＣＤ１９）を、５ｍｌのプラスチックチューブに配置した。３ｍｌの滅菌ＰＢＳをこのビーズに添加し、混合し、磁性ホルダに配置し、次いで２分間静置させた。溶液を、パスツールピペットを使用して除去し、３ｍｌの滅菌ＰＢＳを添加し、混合し、そして磁性ホルダに配置し、次いで２分間静置させた。滅菌ＰＢＳを用いるこの手順を、もう一度繰り返して、合計３回洗浄した。ＰＢＭＣをこのビーズに添加し、そして混合しながら４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＭＣおよびビーズを含むチューブを、磁性ホルダに２分間配置し、次いで溶液を磁性ホルダ中の新たな５ｍｌチューブに移した。２分後、溶液を、新たな１５ｍｌチューブに移した。この工程をもう４回繰り返し、最初の４回の溶液を１５ｍｌチューブに収集し、１０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。この工程によって、Ｔ細胞分離のためのペレットを生成した。
【００６１】
１００μｌのＲＰＭＩ（添加剤を含む）を添加してビーズを収集し、そして溶液を０．７ｍｌのチューブに移した。１０μｌのＤｙｎａｌ  ＤｅｔａｃｈａＢｅａｄｓを、室温にて懸濁液に添加し、そしてそれを４５分間回転させた。懸濁液を新たな５ｍｌチューブに移し、そして３ｍｌのＲＰＭＩ（添加剤を含む）を添加した。チューブを、２分間磁性ホルダに配置した。溶液を、ホルダ内の新たな５ｍｌチューブに移し（２分間）、次いで１５ｍｌチューブに移した。上記の工程をもう３回繰り返し、溶液を１５ｍｌチューブに収集した。１５ｍｌチューブを１０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、この細胞を１０ｍｌのＲＭＰＩに再懸濁した。洗浄をもう２回繰り返し、合計３回洗浄した。細胞を、最後の遠心分離前に計数した。この工程によって、Ｂ細胞の精製を完了した。細胞を、９０％ＦＣＳおよび１０％ＤＭＳＯ中に保存し、そして−８０℃で冷凍した。
【００６２】
（Ｔ細胞の単離）
ヒトＴ細胞Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、抗ｈＣＤ３カラムキット）を、２ｍｌの１０×カラム洗浄緩衝液および１８ｍｌの滅菌希釈水を混合することによって、２０ｍｌの１×カラム洗浄緩衝液を使用して、調製した。このカラムを７０％エタノールで浄化し、そして１５ｍｌチューブの上部に置いた。カラムの上部キャップを最初に外して、カラムの底に気泡が入ることを回避した。次に、底のキャップを外して、先端を７０％エタノールで洗浄した。カラム内の液体を、１５ｍｌチューブ内に排出させた。カラムの緩衝液が、白色フィルタのレベルまで排出された後、新たな滅菌１５ｍｌチューブを、カラムの下に配置した。Ｂ細胞を枯渇させたＰＢＭＣ画分を、１ｍｌの緩衝液中に懸濁し、そしてカラムの上部に添加した。細胞を、カラムを用いて室温にて１０分間インキュベートさせた。Ｔ細胞を、各々２ｍｌの１×カラム洗浄緩衝液の４アリコートを用いて、カラムから溶出させた。収集したＴ細胞を、１０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を１０ｍｌのＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を計数し、そしてもう１回遠心分離した。上清を除去し、Ｔ細胞の精製を完了した。細胞を、９０％ＦＣＳおよび１０％ＤＭＳＯ中に保存し、そして−８０℃で冷凍した。
【００６３】
上記の手順について、ＲＰＭＩ組成物は、１０％ＦＣＳ（５６度にて４５分間不活化した）、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１００ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）、１％  グルタミン酸、１％ピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｕｒａｖａｔｅ）、５０μＭ  ２−ＭＥを含んだ。
【００６４】
（フローサイトメトリーアッセイ）
Ｒａｍｏｓ細胞（１０６細胞／サンプル）を、１００μｌの一次抗体（ＰＢＳ−ＢＳＡ中１０μｇ／ｍｌ）中で、４℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄した後、細胞を、ヤギ抗（ヒトＩｇＧ）抗体（Ｃａｌｔａｑ）のＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ’）２フラグメント１００μｌ中で、４℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡで３回およびＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を、０．５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。分析を、ＦＡＣＳＣＡＮ  Ｖ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）を用いて実行した。
【００６５】
（ハイブリドーマクローンの生成）
先にｄｅ  Ｂｏｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１１３：１４３（１９８８）によって記載されたように、５０％ポリエチレングリコールを用いて、免疫したマウス由来の脾細胞を、ＳＰ２／０またはＰ３×６３Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞と１０：１の比率で融合した。この融合細胞を、ヒポキサンチン（０．１ｍＭ）、アミノプテリン（０．０１ｍＭ）、チミジン（０．０１６ｍＭ）および０．５ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）を補充した完全ＩＭＤＭ培地中に再懸濁した。次いで、この融合細胞を、９６ウェル組織培養プレートのウェル間に分配して、各ウェルを、平均して１増殖ハイブリドーマに維持した。
【００６６】
１０〜１４日後に、ハイブリドーマ集団の上清を特異的抗体生成についてスクリーニングした。ハイブリドーマクローンによる特異的抗体生成のスクリーニングのために、各ウェルからの上清をプールし、そして最初に抗ＣＤ４０活性特異性について、ＥＬＩＳＡによって試験した。次いで、この陽性物を、ＦＡＣＳアッセイについて上に記載したように、ＥＢＶで形質転換したＢ細胞の蛍光細胞染色のために使用した。陽性ハイブリドーマ細胞を、０．５ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−６を含むＩＭＤＭ／ＦＢＳ中の限界希釈によって２回クローン化した。
【００６７】
（実施例１）
（Ｓｆ９細胞におけるヒトＣＤ４０の発現）
ＣＤ４０をコードする組換えウイルスオートグラファ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ）カリフォルニカバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）に感染させたＳｆ９昆虫細胞を、２４ウェルプレートにおいて４８時間培養した。組織培養培地を除去した後、このプレートを、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）中の０．２５ｍｌの抗体と共に、室温（ＲＴ）にて４５分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡを用いて３回洗浄した後、このプレートを、ＰＢＳ−ＢＳＡ中の西洋わさびペルオキシダーゼに結合体化したヤギ抗（マウス全Ｉｇ）免疫グロブリン（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）の１／２５０希釈（２５０μｌ）と共に、室温にて３５分間インキュベートした。結合していないペルオキシダーゼ活性を、ＰＢＳ−ＢＳＡで５回洗浄して除去した。結合したペルオキシダーゼ活性を、１０ｍｌのエタノール（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ５．０）を含有する）中に、２ｍｇ／ｍｌの３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（０．５ｍｌ）を希釈し、そして０．０３％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を添加することによって調製したアッセイ混合物の添加によって明らかにした。この反応を、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（１００μｌ）の添加によって１０分後に停止させた。
【００６８】
（実施例２）
(ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスにおいて惹起された抗体）
ヒトＩｇＧ２重鎖遺伝子座およびヒトＫ軽鎖遺伝子座に対するトランスジェニックマウスを、ヒトＣＤ４０を発現するＳｆ９細胞で免疫した。免疫の方法を、ｄｅ  Ｂｏｅｒ、米国特許第６，００４，５５２号に記載されるように実行した。要するに、マウスを、ＡｃＣＤ４０ウイルスに感染させたＳｆ９細胞（５×１０６個）を用いて、０日目および１４日目に腹腔内注射した。２１日目に、１００μｌの血清を特異的抗体の存在について試験するために獲得した。少なくとも２週間の静置期間後、このマウスに、ＡｃＣＤ４０ウイルスに感染させた５×１０６細胞を用いる最後の注射を受けさせた。この最後の注射の３日後に、脾細胞を細胞融合のために使用した。
【００６９】
マウスを、ＥＬＩＳＡにおいて、組換え体ＣＤ４０とのマウスの血清反応性に基づく融合について選択した。免疫したマウス由来の脾細胞を、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９６（１９７５）の方法（改変を伴う）によって、マウス骨髄腫細胞（ＮＳ／Ｏ）に融合した。ＨＡＴ選択培地におけるハイブリドーマの増殖を、ＥＬＩＳＡにおいて、ＣＤ４０に結合するこれらの能力に基づくさらなる特徴付けのために選択した。非トランスフェクトＳｆ９細胞溶解物に結合した抗体または抗マウス軽鎖抗体を生成したハイブリドーマを、考察からはずした。Ｓｆ９細胞溶解物に結合しなかったＣＤ４０結合抗体または抗マウス軽鎖抗体を生成したハイブリドーマを、サブクローン化した。サブクローンを、さらなる特徴付けのための抗体を生成するために使用した。ハイブリドーマ抗体をまた、それらの表面上でヒトＣＤ４０を発現するＲａｍｏｓリンパ腫細胞を染色する能力について試験した。ＥＬＩＳＡによって測定した場合の、最大半減のＣＤ４０結合を示す抗体の濃度を以下の表２に示す。
【００７０】
（表２）
（ＥＬＩＳＡによる最大半減ＣＤ４０結合を示す抗ＣＤ４０抗体の濃度）
【００７１】
【表２】
2008156339.tif 000003
次いで、ハイブリドーマ抗体を、抗ＣＤ２８活性化ヒト末梢血Ｔ細胞で刺激したヒト末梢血Ｂ細胞によるＩｇＭの生成を阻害する能力について選択した（図１）。ハイブリドーマ抗体を、ＣＤ４０Ｌおよび抗ＩｇＭによって誘導されるヒト末梢血Ｂ細胞の増殖を阻害する能力について、さらにスクリーニングした（図２）。ハイブリドーマをまた、休止しているヒト末梢血Ｂ細胞における増殖を誘導する能力についてスクリーニングした（図３）。いくつかのハイブリドーマ（例えば、３６Ｃ４−Ｇ２）は、著しい刺激性活性を示した。従って、ＣＤ４０に結合し得る場合でさえ、全てヒト抗体が所望の阻害効果を提示するとは限らない。４つのハイブリドーマを、最適阻害活性を有する約３６個から選択した。
【００７２】
（実施例３）
（選択したハイブリドーマの結合特性）
４つのハイブリドーマを、上記の実施例２に記載のように、Ｂ細胞活性化に関するこれらの阻害効果に基づいて選択した。これらの結合特性を、センサー表面上に捕捉された抗ＣＤ４０抗体を有する移動相として可溶性組換えＣＤ４０を用いるＢＩＡｃｏｒｅ評価によって決定した。阻害抗体は、表３に示すように、本明細書中に記載される使用にとって適切な種々の結合親和性を示した。
【００７３】
（表３）
【００７４】
【表３】
2008156339.tif 000004
＊固定相＝ＣＤ４０、移動相＝Ｆａｂ
＊＊固定相＝抗体、移動相＝ｓＣＤ４０
（実施例４）
（ＣＤ４０に結合する可変ハイブリドーマ）
選択したモノクローナル抗体の相対的な結合特性を、フローサイトメトリーによって試験した。全血を、ＦＩＴＣ−結合体化１５Ｂ８および抗ＣＤ２０−ＰＥＣｙ５の０．１μｇを添加した、種々の濃度の非標識ハイブリドーマ抗体と共に３０分間インキュベートした。次いで、ＲＢＣを溶解し、白血球集団を固定し、そして分析のための標本を獲得した。
【００７５】
これらの研究は、非標識１５Ｂ８が、ヒト末梢血由来のＣＤ２０＋リンパ球への非標識２０Ｃ４の結合をブロックすることを示す（表４）。対照的に、非標識２０Ｃ４は、この細胞集団への標識１５Ｂ８の結合を弱くブロックするだけであった。従って、２つの抗体は、同様かまたは密接に関連したエピトープを認識するが、Ｂｉａｃｏｒｅ分析において示される親和性の差異はまた、低親和性抗体のより弱い競合能力に反映される。標識ＭＡｂを、ヒト、Ｒｈｅｓｕｓ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）およびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）マカーク由来の末梢血細胞を染色するために使用した。全３種を、１５Ｂ８、２０Ｃ４、１２Ｄ９および９Ｆ７のＭＡｂによって染色した（図７）。
【００７６】
（表４）
【００７７】
【表４】
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＊ＭＦＩ：平均の蛍光強度
（実施例５）
（ヒト末梢Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌の阻害）
プレートを、抗ヒトＣＤ３（２μｇ／ｍｌ、ＵＣＨＴｉ、ＮＥ／ＬＥ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、４℃にて一晩コートした。この予めコートしたプレートを、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。Ｔ細胞を、３０００Ｒａｄで放射線照射した。このＢ細胞を、１ｍｌあたり１０４個で、ＲＰＭＩ（＋）に再懸濁した。１００μｌのＢ細胞を、このウェル中に添加し、次いで抗ＣＤ４０抗体をウェル中に添加した。このＴ細胞を、１ｍｌあたり１０５個で、ＲＰＭＩ（＋）に再懸濁した。ヒト組換え体ＩＬ２（Ｃｈｉｒｏｎ、−２０℃で保蔵した１０ｕ／μｌの水溶液）を、細胞懸濁液に２００ｕ／ｍｌまで添加した。１００μｌの懸濁液を各ウェルに入れ、Ｂ細胞および抗体と十分に混合した。ＲＰＭＩ（＋）をウェルに添加し、計２００μｌにした。ＥＬＩＳＡのために細胞を遠心沈殿させた後、このプレートを、培地の回収前の８日間、３７℃にてインキュベートした。その結果を、以下の表５に示す。
【００７８】
（表５）
（Ｔ細胞刺激Ｂ細胞によるＩｇＭ分泌に関するモノクローナル抗体の効果）
【００７９】
【表５】
2008156339.tif 000006
この結果は、本発明に記載の抗体の存在下において、Ｔ細胞刺激ヒト末梢血Ｂ細胞による免疫グロブリン(ＩｇＭ)の分泌が減少することを示す。
【００８０】
（実施例６）
（Ｊｕｒｋａｔ刺激したヒト末梢Ｂ細胞の増殖の阻害）
Ｂ細胞を、上記のように精製した。１０４個の精製したＢ細胞、１０５個の照射（３０００  Ｒａｄ）したＪｕｒｋａｔ細胞、試験されるべき抗体を、抗ＣＤ３でコートした９６ウェルプレートに添加した。このプレートを３７℃にて４日間にわたってインキュベートし、最後の１８時間の間に３Ｈ−チミジンを用いて細胞を標識した。この細胞を収集し、そして計数した。この結果を以下の表６に示す。
【００８１】
（表６）
（Ｊｕｒｋａｔ細胞刺激したＢ細胞増殖に対する抗体の効果）
【００８２】
【表６】
2008156339.tif 000007
この結果は、本発明の抗体の存在下において、Ｊｕｒｋａｔ細胞によって刺激されるＢ細胞増殖が阻害されることを示す。
【００８３】
（実施例７）
（ＣＤ４０Ｌ刺激したヒト末梢Ｂ細胞の増殖の阻害）
Ｂ細胞を上記のように精製した。１０４個の精製したＢ細胞、２×１０４個のホルムアルデヒド固定したＣＨＯ−ＣＤ４０Ｌ細胞、および試験されるべき抗体を、抗ＣＤ３コートした９６ウェルプレートに添加した。このプレートを３７℃にて４日間にわたってインキュベートし、最後の１８時間の間に３Ｈ−チミジンを用いて細胞を標識した。この細胞を収集し、そして計数した。この結果を以下の図１に示す。
【００８４】
（実施例８）
（Ｂ細胞増殖の刺激）
Ｂ細胞（１ウェルあたり、１×１０４個）を、Ｕ底９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、１０％胎仔ウシ血清を補充したＲＰＭＩ（２００μｌ）中で培養した。Ｂ細胞を、固定した抗（ＩｇＭ）抗体（５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）の添加によって刺激した。種々の濃度のＭＡｂを、初めに微少培養物に添加し、そして増殖を１８時間のパルス後、３Ｈ−チミジンの取り込みを測定することによって４日目に評価した。この結果を図２に示す。
【００８５】
（実施例９）
（抗ＩｇＭによって刺激されたヒト末梢Ｂ細胞の増殖に対する抗ＣＤ４０抗体の効果）
１０４個の精製したＢ細胞、抗ＩｇＭビーズ（５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、および試験されるべき抗体を、９６ウェルプレートに添加した。このプレートを３７℃にて４日間にわたってインキュベートし、最後１８時間の間に３Ｈ−チミジンを用いて細胞を標識した。この細胞を収集し、そして計数した。この結果を図３に示す。
【００８６】
（実施例１０）
（ヒト末梢Ｂ細胞の増殖に対する抗ＣＤ４０抗体架橋の効果）
１０４個の精製したＢ細胞を、抗ＣＤ４０コートした９６ウェルプレートに添加した。このプレートを３７℃にて４日間にわたってインキュベートし、最後１８時間の間に３Ｈ−チミジンを用いて細胞を標識した。この細胞を収集し、そして計数した。この結果を図４に示す。
【００８７】
（実施例１１）
（ヒト抗ＣＤ４０抗体のポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列）
ｍＲＮＡを、実施例２に記載のように生成したハイブリドーマから調製し、ＲＴ−ＰＣＲをｍＲＮＡに関して実施した。プライマーの２つのセットを、ＰＣＲ産物を生成するために使用した：ユニバーサルプライマーまたは重鎖および軽鎖のファミリーのプールのプライマー；ならびにファミリー特異的プライマー。ＰＣＲ産物をゲル上で分析し、配列決定し、そして翻訳した。ポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、表７にまとめた配列表において提供する。
【００８８】
（表７）
【００８９】
【表７】
2008156339.tif 000008
抗体の特異的領域を、図５、６および８〜１４に示す。この情報を使用して、本発明に従う使用のためのさらなるモノクローナル抗体を設計し得る。これらのモノクローナル抗体は、１つ以上のフレームワークまたはＣＤＲ領域の置換により、本明細書中に記載される抗体とは異なり得る。このモノクローナル抗体はまた、１つ以上のアミノ酸置換によって異なり得、これはフレームワークおよびＣＤＲの特定領域において異なることが示される（図５および６）。一旦、アミノ酸配列が設定されると、慣用的手順が使用され、モノクローナル抗体の発現のための対応するポリヌクレオチド配列を構築し得る。モノクローナル抗体の発現および精製は、米国特許第５，５４５，４０３号、同第５，５４５，４０５号および同第５，９９８，１４４号（本明細書中で参考として援用される）中に開示されるような、当該分野で公知の方法を用いて行われる。
【００９０】
（実施例１２）
（インビトロでの悪性Ｂ細胞増殖に対する１５Ｂ８の効果）
１５Ｂ８がインビトロにおいてＣＤ４０Ｌ様の増殖シグナルを提供するかどうかを試験するため、腫瘍に浸潤されたリンパ節由来のＢ細胞（ＮＨＬ細胞）を、抗体未処置のＮＨＬ患者１人、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ感受性のＮＨＬ患者１人およびｒｉｔｕｘｉｍａｂ耐性のＮＨＬ患者１人より、採取した。これらのＮＨＬ細胞を、以下の４つの異なる培養条件下で研究した：抗体の添加なし（培地）；ヒトアイソタイプ抗体ＩｇＧ２の添加（コントロール）；抗ＣＤ４０抗体ＭＳ８１（アゴニスト抗体）の添加；および１５Ｂ８の添加。ＩＬ−４の存在下または非存在下にて、全ての抗体を１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬおよび５μｇ／ｍＬで試験した。２人の患者由来のＮＨＬ細胞を、上記のように同じ４つの条件下でＩＬ−４（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、培養した。Ｂ細胞増殖を、上記の３Ｈ−チミジン取り込みにより測定した。
【００９１】
抗ＣＤ４０抗体１５Ｂ８は、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬおよび５μｇ／ｍＬの濃度では、ＩＬ−４の存在下または非存在下のどちらでも、ＮＨＬ細胞が増殖するように刺激しなかった。対照的に、同じ濃度で試験したアゴニスト抗ＣＤ４０抗体（ＭＳ８１）は、ＩＬ−４の存在下および非存在下で、全ての患者のサンプルにおいてＮＨＬ細胞増殖を刺激した。１人の患者からの代表的な結果を、以下に示す（図１５および図１６）。上記２人の患者由来のＮＨＬ細胞のＩＬ−４存在下での結果、および３人の患者由来のＮＨＣ細胞のＩＬ−４非存在下での結果は、同等であった。これらの結果は、１５Ｂ８が、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体ではなく、そしてインビトロにおいてｒｉｔｕｘｉｍａｂ感受性のＮＨＬ患者、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ未処理のＮＨＬ患者またはｒｉｔｕｘｉｍａｂ耐性のＮＨＬ患者由来のＮＨＬ細胞の増殖を刺激しないことを示す。
【００９２】
ＮＨＬ細胞のＦＡＣＳ分析を、直接標識した１５Ｂ８−ＦＩＴＣまたは１５Ｂ８＋抗ＨｕＩｇＧ２−ＦＩＴＣの一方を用いて実施し、試験されたＮＨＬ細胞表面にＣＤ４０が発現されていること、および１５Ｂ８がＮＨＬ細胞に結合することを確認した。ｒｉｔｕｘｉｍａｂ感受性の患者２人およびｒｉｔｕｘｉｍａｂ耐性の患者４人（合計６人の患者）由来のＮＨＬ細胞を試験した。全ての患者由来のＮＨＬ細胞は、ＣＤ４０を発現し、そして１５Ｂ８に結合した。所定のどの患者においても１５Ｂ８結合陽性細胞集団は、約６６％〜９１％であった。
【００９３】
（実施例１３）
（１５Ｂ８は、インビトロでＮＨＬ細胞のＣＤ４０Ｌで刺激した増殖を阻害する）
インビトロにおいてＣＤ４０Ｌによって提供される増殖シグナルをブロックする１５Ｂ８の能力を評価するため、患者由来のＮＨＬ細胞を、実施例１２に記載するように、４つの異なる条件下でＣＤ４０Ｌ発現フィーダー細胞上の懸濁物中にて培養した：抗体の添加なし（培地）；ヒトアイソタイプ抗体ＩｇＧ２の添加（コントロール）；抗ＣＤ４０抗体ＭＳ８１（アゴニスト抗体）の添加；および１５Ｂ８の添加。全ての抗体を、ＩＬ−４存在下または非存在下で１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬおよび５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。抗体未処置の患者１人、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ感受性の患者２人、およびｒｉｔｕｘｉｍａｂ耐性の患者５人（合計８人の患者）由来のＮＨＬ細胞を、上記と同じ４つの条件下で、ＩＬ−４の存在下（２ｎｇ／ｍｌ）にて培養した。ｒｉｔｕｘｉｍａｂ感受性の患者３人およびｒｉｔｕｘｉｍａｂ耐性の患者４人（合計７人の患者）由来のＮＨＬ細胞を、同様の条件下でＩＬ−４の非存在下にて培養した。ＮＨＬ細胞の増殖を、３Ｈ−チミジン取り込みにより測定した。
【００９４】
以下の表８は、インビトロでＣＤ４０Ｌ単独で刺激した、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ感受性の患者２人（一方の患者からのデータは、２回の別々の実験において再現性があった）、およびｒｉｔｕｘｉｍａｂ耐性の患者４人（合計６人の患者）由来のＮＨＬ細胞の増殖に対する１５Ｂ８の阻害効果を示す。１人の患者（Ａ）の細胞からの代表的な結果を示す（図１７）。１５Ｂ８は、６人の患者において、コントロールと比較した場合、約１２〜６８％増殖を阻害する。１５Ｂ８細胞による阻害程度は、患者サンプルおよび１５Ｂ８の用量レベルに依存して変化する。試験した７人の患者サンプルのうちの６つからのデータの統計学的分析は、ＣＤ４０Ｌ刺激したＮＨＬの細胞増殖の１５Ｂ８による阻害が、１μｇ／ｍｌで有意なことを示す（ｐ＝０．０５）。統計学的に有意な用量応答（ｐ＜０．００５）が存在し、この阻害効果は１５Ｂ８用量の増加とともに増強される。
【００９５】
（表８）
（ＩＬ−４非存在下におけるＮＨＬ患者細胞のＣＤ４０−Ｌ刺激した増殖に対する１５Ｂ８  Ｍａｂの効果１）
【００９６】
【表８】
2008156339.tif 000009
１．患者由来のＮＨＬ細胞を、培地、アゴニストＣＤ４０（ＭＳ８１）、アンタゴニスト抗ＣＤ４０（１５Ｂ８）またはｈｕＩｇＧ２アイソタイプコントロールの存在下にて、ヒトＣＤ４０Ｌを発現するマウスＬ細胞と共にインビトロにて培養した。ＮＨＬ細胞の増殖を、３Ｈ−チミジン取り込みによって測定した（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ感受性の患者１人からのデータは、ＣＤ４０Ｌのｃｐｍが２０００未満であるので表にはない）
２．抗ＣＤ２０  Ｍａｂ治療に対する患者の応答；ＣＲ、完全に応答を示す患者；ＮＲ、応答のない患者
３．１５Ｂ８％阻害＝１００−（１５Ｂ８  ｃｐｍ／ｈｕＩｇＧ２  ｃｐｍ×１００）；３つの測定の平均を示す。
【００９７】
（以下の）表９は、インビトロにおいてＣＤ４０ＬおよびＩＬ−４の両方によって刺激された、抗体未処置の患者１人、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ感受性の患者２人（両患者のサンプルからのデータは、再現性よく２回繰り返された）、およびｒｉｔｕｘｉｍａｂ耐性の患者５人（合計８人の患者）由来のＮＨＬ細胞の増殖に対する１５Ｂ８の阻害効果を示す。１５Ｂ８は、１μｇ／ｍｌで、ＮＨＬ細胞のＣＤ４０ＬおよびＩＬ−４の媒介性増殖を有意（ｐ＜０．０５）に阻害した。阻害の程度は、インビトロで、８人全ての患者に由来するサンプルにおいて、高用量（５または１０μｇ／ｍｌ）で、１８〜６９％の範囲であった。０．０１〜１０ｕｇ／ｍｌの１５Ｂ８濃度範囲で、１５Ｂ８によるこの阻害効果の統計学的に有意な用量応答（ｐ＜０．００５）が存在する（図１８は、代表的な、１つの用量応答曲線を示す）。
【００９８】
これらのインビトロにおける結果は、１５Ｂ８を用いた処置が患者のＮＨＬ細胞に対するＣＤ４０媒介性増殖シグナルをブロックし得ることを、示唆する。
【００９９】
（表９）
（ＩＬ−４の存在下での、ＣＤ４０−Ｌ刺激されたＮＨＬ患者細胞に対する１５Ｂ８  ＭＡｂの効果１）
【０１００】
【表９】
2008156339.tif 000010
2008156339.tif 000011
１．患者由来のＮＨＬ細胞を、表１に記載する条件下、ヒトＣＤ４０Ｌを発現するマウスＬ細胞と共に２ｎｇ／ｍｌでのＩＬ−４（ヒトインターロイキン−４）の存在下で培養した。
２．抗ＣＤ２０  Ｍａｂ治療に対する患者の反応；ＣＲ、完全な応答を示す患者；ＮＲ、応答のない患者；未処置、未処置の患者
３．ｈＩｇＧ２と比較した％阻害。１５Ｂ８  ％阻害＝１００−（１５Ｂ８  ｃｐｍ／ｈｕＩｇＧ２  ｃｐｍ  ×  １００）
（実施例１４）
（インビトロでの異なる種における１５Ｂ８のアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性の実証）
１５Ｂ８がアゴニスト抗ＣＤ４０であるか、またはアンタゴニスト抗ＣＤ４０であるか否かを決定するために、１５Ｂ８を、ヒトおよび５つの異なる霊長類種（チンパンジー（ｃｈｉｍｐ）、マーモセット、カニクイザル、アカゲザル、およびヒヒを含む）由来の細胞を用いて、以下に記載するいくつかのインビトロアッセイにて試験した。
【０１０１】
１５Ｂ８は、ヒト末梢血Ｂ細胞を活性化せず、ヒト、チンパンジーおよびマーモセットにおいてインビトロでＰＢＭＣ増殖を引き起こさない。末梢血から得られたヒトＢ細胞上のＣＤ４０の活性化は、Ｂ細胞の増殖を導く（ｖａｎ  Ｋｏｏｔｅｎ  Ｃ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，２０００  Ｊａｎ．，６７（１）：２−１７；Ｄｅｎｔｏｎ  Ｍ．Ｄ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１９９８  Ｆｅｂ．，２（１）：６−１５；Ｅｖａｎｓ  Ｄ．Ｅ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００  Ｊａｎ．１５，１６４（２）：６８８−９７；Ｎｏｅｌｌｅ  Ｒ．Ｊ．，Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｓｕｐｐｌ．，１９９８，４９：１７−２２；Ｌｅｄｅｒｍａｎ  Ｓ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９６，３（１）：７７−８６）。１５Ｂ８がＢ細胞上のＣＤ４０を活性化するか否かを試験するために、末梢血由来の新しく単離したヒトＢ細胞またはＰＢＭＣを用いて、一連の増殖アッセイを実行した。このアッセイにおいて１５Ｂ８の効果を、３Ｈメチル−チミジン取り込みによって測定した（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３：１２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１；Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍ  Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３  Ｊｕｌ，７９（３）：４３９−４４４）。以下の表１０の濃度０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌにおいて示されるように、１５Ｂ８は、ＣＤ４０Ｌに対する効果（これは、ヒトＢ細胞に対する強力な増殖促進効果を実証する）と比較して、精製Ｂ細胞増殖に対して最小の効果しか有さなかった。表３に示されるように、２人の健康なボランティア由来の精製Ｂ細胞における結果は、比較可能である。
【０１０２】
１５Ｂ８をさらに、新しく単離したヒトＰＢＭＣを用いたヒトＰＢＭＣ増殖の刺激に対して、ＣＤ４０Ｌと比較した。以下の表１０に要約されるように、１５Ｂ８は、１６人のボランティア由来の試験したサンプルにおいて０．２〜５μｇ／ｍｌの範囲の濃度にて、３−Ｈメチル−チミジン取り込みによって測定した場合、インビトロにおけるヒトＰＢＭＣ増殖を刺激しない（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３：１２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１；Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍ  Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３  Ｊｕｌ，７９（３）４３９−４４４）。
【０１０３】
（表１０）
（１５Ｂ８抗体によるヒト、チンパンジーおよびマーモセットにおけるＰＢＭＣ／Ｂ細胞増殖の刺激１）
【０１０４】
【表１０】
2008156339.tif 000012
１．Ｂ細胞／ＰＢＭＣを、ＣＤ４０Ｌ、１５Ｂ８またはｈｕＩｇＧ２アイソタイプコントロールの存在下でインビトロで培養した。
２．細胞増殖の結果を、ｈｕＩＧ２コントロールに対する１５Ｂ８の３Ｈ−チミジン取り込みの割合として報告する。
いくつかのサンプル由来のデータは、２０００よりも小さいＣＤ４０Ｌ（ポジティブコントロール）によって誘導されたＣＰＭについて、表に含めていない。
３．表に示すＣＤ４０Ｌについての増加（倍）は、５μｇ／ｍｌのｈｕＩＧ２のｃｐｍに対するＣＤ４０Ｌのｃｐｍの割合である。
ＣＤ４０Ｌ：実験前にホルムアルデヒドで固定した、ＣＤ４０ＬでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞。
【０１０５】
Ｂ細胞活性化の際、多数の細胞表面タンパク質がアップレギュレートされる（Ｄｅｎｔｏｎ  Ｍ．Ｄ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１９９８
Ｆｅｂ．，２（１）：６−１５；Ｅｖａｎｓ  Ｄ．Ｅ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００  Ｊａｎ．１５，１６４（２）：６８８−９７；Ｎｏｅｌｌｅ  Ｒ．Ｊ．，Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｓｕｐｐｌ．，１９９８，４９：１７−２２；Ｌｅｄｅｒｍａｎ  Ｓ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９６，３（１）：７７−８６）。１５Ｂ８がヒトＢ細胞を活性化しないこと、およびＣＤ４０に結合した場合にアゴニストシグナルを誘導しないことを確認するために、Ｂ細胞活性化マーカーをアップレギュレートするその能力を、精製ヒトＰＢＭＣを用いたＦＡＣＳ分析によって試験した。１５Ｂ８処理したヒトＢ細胞において、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）のような活性化マーカーの発現のアップレギュレーションは、存在しなかった（表４）。これらのマーカーのレベルは、細胞を１５Ｂ８またはｈｕＩｇＧ２コントロールのいずれかで処理した場合と類似していた（表１１）。対照的に、ＣＤ６９は、３人の健康なボランティア由来の試験したＰＢＭＣサンプルにおいて、一貫してＣＤ４０Ｌによってアップレギュレートされた。
【０１０６】
（表１１）
（ＦＡＣＳによる、インビトロにおけるＢ細胞活性化マーカーのアップレギュレーションに対する１５Ｂ８の効果）
【０１０７】
【表１１】
2008156339.tif 000013
１．“−”は、アップレギュレーションがないことを意味する。
２．“Ｎ／Ａ”は、測定しなかったかまたは成功しなかったことを意味する。
【０１０８】
Ｂ細胞活性化のさらなる結果は、表面ＦａｓＬのアップレギュレーションおよびアポトーシスである（Ｒｅｖｙ  Ｐ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８  Ｎｏｖ．，２８（１１）：３６４８−３６５４；Ｃａｒｅｙ  Ｇ．Ｂ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２０００  Ａｕｇ．，１７６：１０５−１１５；Ｊｕ  Ｓ．Ｔ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，１８（５−６）：４８５−５１３；Ｂａｕｍｇａｒｔｈ  Ｎ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２０００  Ａｕｇ．，１７６：１７１−１８０）。１５Ｂ８がアゴニスト抗ＣＤ４０抗体ではないことを確認するために、ヒトＢ細胞のＦａｓＬ発現およびアポトーシスを誘導するその能力もまた、試験した。細胞表面上のアネキシンＶ染色は、初期アポトーシスマーカーとして使用され得る（Ｊｕ  Ｓ．Ｔ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，１８（５−６）：４８５−５１３）。ヒトＢ細胞を末梢血から精製し、１５Ｂ８とインキュベートした。ＦＡＣＳ分析を使用して、アネキシンＶおよび抗ＦａｓＬのポジティブ染色を用いて細胞を検出した。１５Ｂ８と共にインキュベートした細胞またはアイソタイプコントロール（ｈｕＩｇＧ２）抗体と共にインキュベートした細胞との間に、２つの試薬による表面染色に、有意な差異は存在しなかった。この結果は、１５Ｂ８がインビトロにおいてヒトＢ細胞のアポトーシスを誘導しないことを示す。これらのデータはさらに、１５Ｂ８がヒトＢ細胞に対するアゴニスト抗ＣＤ４０抗体ではない証拠を提供する。
【０１０９】
１５Ｂ８は、霊長類由来のＣＤ２０ポジティブＰＢＭＣの表面上で発現されるＣＤ４０と交差反応する。１５Ｂ８が他の霊長類種（例えば、チンパンジーおよびマーモセット）由来のＢ細胞上のＣＤ４０を活性化し得るか否かを試験するために、１５匹のチンパンジーおよび５匹のマーモセット由来の新しく単離したチンパンジーＰＢＭＣおよびマーモセットＰＢＭＣを用いて、同じ増殖アッセイを実行した。ヒトＰＢＭＣを用いた結果と同様に、１５Ｂ８は、６匹のチンパンジーおよび５匹のマーモセット由来のＰＢＭＣのインビトロにおける増殖を、１μｇ／ｍｌ濃度および５μｇ／ｍｌ濃度において刺激しなかった（上記の表３）。１５Ｂ８はまた、試験した３個のチンパンジー−ＰＢＭＣサンプルにおいて、活性化マーカー（ＣＤ６９）の発現をアップレギュレートしなかった（表４）。１５Ｂ８は、６匹のチンパンジー由来の試験した全サンプルにおけるインビトロでの２４時間刺激および４８時間刺激の後に、ヒトＰＢＭＣコントロールと類似して、チンパンジーＰＢＭＣにおいて、ＦａｓＬ発現およびアポトーシスに何の影響も示さなかった。
【０１１０】
プラスチック表面に固定された二次抗体による架橋１５Ｂ８は、Ｂ細胞増殖を刺激するその能力を増大しなかった（データは示さず）。この架橋アッセイにおいてヒトおよびチンパンジー由来のＰＢＭＣを用いて試験した場合、１５Ｂ８は細胞増殖を刺激しなかった。この観察は、インビボで投与された場合の、他のＦｃレセプター発現細胞への抗１５Ｂ８（ＨＡＨＡ）またはＦｃの結合誘導の際に、１５Ｂ８がＢ細胞増殖に対して刺激性である（アゴニストである）ことの危険性を低減することを示す。
【０１１１】
まとめると、１５Ｂ８は、インビトロにおいて、ヒトＢ細胞／ＰＢＭＣにおいてもチンパンジー／マーモセットのＰＢＭＣにおいても、活性化シグナルを開始しない。従って、１５Ｂ８は、ヒト、チンパンジーおよびマーモセットにおいて、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体ではない。
【０１１２】
（実施例１５）
（１５Ｂ８は、インビトロで、ヒト、チンパンジーおよびマーモセットにおけるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である）
１５Ｂ８がアンタゴニスト抗ＣＤ４０であるか否かを決定するために、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を阻害するその能力を、ＣＤ４０Ｌ媒介ヒトＢ細胞増殖アッセイにおいて試験した（Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍ  Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３  Ｊｕｌ，７９（３）：４３９−４４４）。ヒトＣＤ４０Ｌを発現するトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株を使用して、精製したヒト末梢血Ｂ細胞またはＰＢＭＣの増殖を刺激した。１０人の健康なボランティア由来のヒトＢ細胞および３人の健康なボランティア由来のヒトＰＢＭＣを試験した。試験した全サンプルにおいて、１５Ｂ８は、０．２〜５μｇ／ｍｌの濃度範囲にて、ＣＤ４０Ｌを発現するＣＨＯ細胞により媒介される増殖を４２〜８８％抑制した（表１２）。図１９は、３人の個体由来の細胞を用いた代表的な用量応答曲線を示す。１５Ｂ８の影響のない用量は、０．００８μｇ／ｍｌであり、そして０．２μｇ／ｍｌにて飽和用量に達する（図１９）。この観察は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体としての１５Ｂ８が、細胞表面に発現されるＣＤ４０Ｌによって提供される、ヒトＢ細胞およびＰＢＭＣにおける増殖シグナルを阻害し得ることを示す。
【０１１３】
（表１２）
（１５Ｂ８抗体を用いたＰＢＭＣ／Ｂ細胞のＣＤ４０Ｌ誘導増殖の阻害１）
【０１１４】
【表１２】
2008156339.tif 000014
１．Ｂ細胞／ＰＢＭＣを、１５Ｂ８またはｈｕＩｇＧ２コントロールの存在下で、ＣＤ４０Ｌを発現するＣＨＯ細胞と共にインビトロで培養した。ＣＤ４０ＬをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、実験前にホルムアルデヒドで固定した。細胞増殖を、３Ｈ−チミジン取り込みによって測定した。
２．“１５Ｂ８  阻害％”＝１００−（１５Ｂ８  ｃｐｍ／ＣＤ４０Ｌ  ｃｐｍ×１００）
−倍のＣＤ４０Ｌ（ポジティブコントロール）によって誘導された増殖について、いくつかのサンプル由来のデータは表中に含めていない。
【０１１５】
９匹のチンパンジーおよび３匹のマーモセット由来の新しく単離したＰＢＭＣを用いて、さらなるアッセイを実行した。ヒトＰＢＭＣを用いたように、１５Ｂ８は、ＣＤ４０Ｌ発現ＣＨＯ細胞によって刺激されたチンパンジーＰＢＭＣおよびマーモセットＰＢＭＣの増殖を、１μｇ／ｍｌの濃度レベルにて阻害し得た（上記表５）。１５Ｂ８による阻害は、３匹のチンパンジーおよび３匹のマーモセット由来のＰＢＭＣサンプルにおいて、それぞれ、約５５〜７３％および６８〜８４％であった（上記の表５）。
【０１１６】
活性化されたＢ細胞は、多数の生物学的応答（例えば、増殖および抗体産生）を引き起こす。Ｔ細胞依存性抗原によるＢ細胞の活性化は、ＣＤ４＋Ｔ−ヘルパー（Ｔｈ）細胞を含む。このＴ細胞ヘルパープロセスは、他の同時刺激因子およびサイトカインの相互作用と一緒に、Ｂ細胞上のＣＤ４０とＴｈ細胞表面上のＣＤ４０Ｌとの相互作用の、協調作用によって媒介される。Ｄｅｎｔｏｎ  Ｍ．Ｄ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１９９８  Ｆｅｂ．，２（１）：６−１５；Ｅｖａｎｓ  Ｄ．Ｅ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００  Ｊａｎ．１５，１６４（２）：６８８−９７；Ｎｏｅｌｌｅ  Ｒ．Ｊ．，Ａｇｅｎｔｓ
Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｓｕｐｐｌ．，１９９８，４９：１７−２２；Ｌｅｄｅｒｍａｎ  Ｓ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９６，３（１）：７７−８６；Ｍａｃｋｅｙ  Ｍ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，６３（４）：４１８−４２８。１５Ｂ８がＴヘルパー細胞により媒介されるＢ細胞抗体産生をブロックし得るか否かを試験するために、精製したヒト末梢血Ｂ細胞を、抗ＣＤ３抗体で活性化した精製照射Ｔ細胞の存在下で培養した。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＩｇＭ産生のレベルを測定した。１５Ｂ８は、このアッセイにおいてＩｇＭ産生を約３０％低減した（データは示さず）。従って、１５Ｂ８は、Ｔ細胞によって媒介されるＢ細胞免疫グロブリン産生を低減し得る。
【０１１７】
まとめると、１５Ｂ８は、ヒト、チンパンジーおよびマーモセットにおいてＣＤ４０Ｌにより誘導されるＢｐ細胞／ＰＢＭＣ増殖を阻害し、そしてインビトロにおける精製ヒトＢ細胞によるＴ細胞誘導性（ｉｎｄｕｃｔｅｄ）抗体産生を阻害する。これらのデータは、１５Ｂ８が、インビトロにおいて、ヒトＢ細胞ならびにチンパンジーおよびマーモセット由来のＰＢＭＣにおいて、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体であることを実証する。
【０１１８】
（実施例１６）
（１５Ｂ８は、インビトロにおいて、アゴニスト抗サル（アカゲザル、カニクイザル、およびヒヒ）ＣＤ４０抗体である）
ＦＡＣＳ分析は、１５Ｂ８がサル（カニクイザル、アカゲザルおよびヒヒ）の末梢血由来のＢ細胞表面上に発現されるＣＤ４０に結合することを実証する。新しく単離したカニクイザルＰＢＭＣに対する１５Ｂ８の効果を、ヒトおよびチンパンジーについて上記に記載した増殖アッセイと同じ増殖アッセイにて試験した（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３：１２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１；Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍ  Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３  Ｊｕｌ，７９（３）：４３９−４４４）。ヒトＰＢＭＣと対照的に、１５Ｂ８は、３Ｈ  メチル−チミジン取り込みによって測定した場合に、インビトロで増殖するようにカニクイザルＰＢＭＣを刺激することが見出された（以下の表１３）。１μｇ／ｍｌレベルにおいて、１５Ｂ８は、１７匹のサル由来の試験した２２個のサンプルにおいて（５匹のサル由来のサンプルを２回試験した）、ｈｕＩｇＧ２コントロールと比較して、ＰＢＭＣの増殖を６〜１２９．７倍刺激した（以下の表１３）。５μｇ／ｍｌレベルにおいて、１５Ｂ８によって刺激された増殖は、サル由来の４個のサンプルにおいて１４〜２４倍であり、そして２匹のサル由来の２個のサンプルにおいて約１．２５倍または１．８５倍であった（表１３）。このことは、５μｇ／ｍｌの濃度レベルにおいて、１５Ｂ８がカニクイザル由来のＰＢＭＣに対するその増殖刺激効果について、飽和用量を超える限界であり得ることを示唆する。表面マーカーによる活性化状態についてのＢ細胞のさらなるＦＡＣＳ分析によって、１５Ｂ８が、サルＢ細胞上でＣＤ６９、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲのアップレギュレーションを誘導することが示された（表１４）。これらのデータは、１５Ｂ８は、インビトロにおいてカニクイザル由来の末梢血Ｂ細胞上で発現されるＣＤ４０に対して、アゴニスト抗体であることを示唆する。
【０１１９】
１５Ｂ８のこのアゴニスト効果がカニクイザル特異的ではないことを確認するために、アカゲザルおよびヒヒ由来のＰＢＭＣを用いて同じアッセイを実行した。以下の表１３に示されるように、カニクイザルの細胞から得られた結果と類似の結果が観察された。１５Ｂ８はインビトロにおいて、アカゲザルおよびヒヒ由来のＰＢＭＣの増殖を刺激した（以下の表１３）。５匹のアカゲザルおよび３匹のヒヒ由来のＰＢＭＣを用いた、１５Ｂ８のアゴニスト活性を示す（表１３）。
【０１２０】
（表１３）
（１５Ｂ８で刺激した、ヒト、カニクイザル、アカゲザルおよびヒヒ由来のＰＢＭＣの増殖１）
【０１２１】
【表１３】
2008156339.tif 000015
１．ＰＢＭＣを、ＣＤ４０Ｌ、１５Ｂ８またはｈｕＩｇＧ２コントロールの存在下でインビトロで培養した。
２．増殖結果を、ｈｕＩｇＧ２コントロールに対する１５Ｂ８の３Ｈ−チミジン取り込みの割合として報告する。
いくつかのサンプル由来のデータは、２０００よりも小さいＣＤ４０Ｌ（ポジティブコントロール）によって誘導されたＣＰＭについて、表に含めていない。
３．表に示すＣＤ４０Ｌについての増加（倍）は、５μｇ／ｍｌのｈｕＩｇＧ２のｃｐｍに対するＣＤ４０Ｌのｃｐｍの割合である。ＣＤ４０ＬをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、実験前にホルムアルデヒドで固定した。
【０１２２】
（表１４）
（ＦＡＣＳ分析による、インビトロでのＢ細胞活性化マーカーのアップレギュレーションに対する１５Ｂ８の効果）
【０１２３】
【表１４】
2008156339.tif 000016
１．“−”は、アップレギュレーションがないことを意味する。
２．“Ｎ／Ａ”は、測定しなかったかまたは成功しなかったことを意味する。
３．１匹のカニクイザル由来の細胞のみを、３日目にＦＡＣＳによって分析した。
【０１２４】
（実施例１７）
（１５Ｂ８は、カニクイザルにおいてインビボでのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体である）
１５Ｂ８は、インビトロにおいて、カニクイザル由来のＰＢＭＣにおける細胞表面活性化マーカーの増大およびアップレギュレーションを刺激し得る。１５Ｂ８がサルにおいてインビボでのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体であるか否かを決定するために、１５Ｂ８の生体分布および冒された末梢Ｂ細胞の運命（すなわち、過剰な拡大（ｅｘｔｒａｖａｓｔｉｏｎ）、アポトーシス、活性化状態または補体溶解（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｌｙｓｉｓ）を調べる研究を実行した［Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  １５Ｂ８．７２  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎｏｎ−Ｎａｉｖｅ  Ｍａｌｅ  ａｎｄ  Ｆｅｍａｌｅ  Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙｓ（ＳＮＢＬ．２１８．３，ＳＮＢＬ  ＵＳＡ）］。
【０１２５】
カニクイザル（１匹の雌および２匹の雄）に、３ｍｇ／ｋｇ  １５Ｂ８の単回静脈内投与をした。以下のパラメーターをモニターした：臨床徴候、給餌の消費、体重、薬物動態、血清補完（ＣＨ５０）、Ｂ細胞（アポトーシスＢ細胞を含む）、Ｔ細胞、および単球についてのフローサイトメトリー。１５Ｂ８でのＢ細胞ＣＤ４０レセプター飽和もまた、測定した。単回用量の１５Ｂ８を与えた２４時間後に動物の検死を行ない、そして標準的な器官の重量を測定した。脾臓および腋窩（ａｘｉｌｉａｒｙ）リンパ節の試験前手術生検を採取して、ベースラインコントロールとした。検死において、リンパ組織および非リンパ組織を、組織病理学および免疫組織化学についてサンプルにした。ＣＤ３抗原、ＣＤ４０抗原、ＣＤ２０抗原、ＣＤ２７抗原、およびＣＤ３８抗原に対する抗体を用いて、組織を免疫染色した。この研究の予備的な結果を、以下に考察する。
【０１２６】
全動物が予定した検死まで生存し、給餌の消費にも、体重にも、ＣＨ５０レベルにも、末梢血Ｔ細胞数にも単球数にも影響を与えなかった。器官の重量に変化はなかった。脾臓の顕微鏡試験によって、壊死を伴なう中程度に分散した小胞性過形成（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）および／または１５Ｂ８処理した動物の胚中心における好中球性の浸潤が示された。腸間膜リンパ節および鼡径部リンパ節の試験によって、３匹中２匹の動物における軽症の小胞性過形成が明らかになった。処理に関連する微視的な影響は、他の組織（肝臓、皮膚、脳、甲状腺、肺、骨髄、副腎および腎臓）において見出されなかった。
【０１２７】
ＣＤ２０抗体、ＣＤ２７抗体、ＣＤ４０抗体、およびＣＤ８６抗体を用いた免疫染色によって、脾臓小胞およびリンパ節小胞におけるこれらのマーカーの増大が明らかとなり、このことは、これらと同じ組織中で見出された小胞性過形成と相関する。ＣＤ２０およびＣＤ４０の増大した染色は、脾臓およびリンパ節に限定されたが、いくつかのさらなる染色（ＣＤ２７での肝臓組織の染色、ならびにＣＤ８６による肝臓クップファー細胞および炎症細胞の染色）が存在した。ＣＤ８６染色はまた、胸腺髄細胞および副腎間質白血球においても増大した。コントロールと比較して、１５Ｂ８処理動物においてＣＤ３の免疫染色に変化は存在しなかった。
【０１２８】
これらの知見は、カニクイザルに投与される１５Ｂ８の３ｍｇ／ｋｇの単回用量が、２４時間の期間内で、リンパ小胞の増殖ならびに／または脾臓およびリンパ節における末梢血からのＢ細胞の再分布をもたらし得ることを示す。ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ４０およびＣＤ８６に対する抗体は、他の細胞型の認識と一緒に、Ｂ細胞および／または活性化Ｂ細胞上に発現された抗原を認識する。これらの抗原を発現する細胞の数の増大が、処理動物の脾臓およびリンパ節で見出され、このことは、活性化ＣＤ２０＋  Ｂ細胞数の増大を示唆する。この研究は、１５Ｂ８が、カニクイザルにおいてインビボでのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体であることを示唆する。インビトロおよびインビボで得られた結果は、カニクイザルにおいて一致する。
【０１２９】
この結果は、１５Ｂ８がカニクイザル、アカゲザルおよびヒヒにおいてアゴニスト抗ＣＤ４０抗体であり、そして、ヒト、チンパンジーおよびマーモセットにおいてアンタゴニスト抗体であることを示唆する。
【０１３０】
１５Ｂ８は、ヒトＩｇＧ２サブタイプを有する抗ヒトＣＤ４０特異的モノクローナル抗体であり、非ヒト霊長類由来のＣＤ４０のみと交差反応性を有する。広範囲のインビトロ試験を通して、１５Ｂ８は、ヒトＢ細胞、ヒト、チンパンジーおよびマーモセット由来のＰＢＭＣ上に発現されるＣＤ４０に対してアンタゴニスト抗ＣＤ４０であることが示された。しかし、１５Ｂ８は、インビトロにおいて、サル（カニクイザル、アカゲザル、およびヒヒ）由来のＰＢＭＣ上に発現されるＣＤ４０に結合する場合、アゴニスト活性を有することが示された。１５Ｂ８のこのアゴニスト活性を、インビボにおいて、カニクイザルで確認した。Ｒｉｔｕｘａｎ感受性およびＲｉｔｕｘａｎ耐性ＮＨＬ患者由来のリンパ腫の初代培養物中で試験した場合、１５Ｂ８は、ＩＬ−４の存在下および非存在下でアゴニスト活性を有さない。１５Ｂ８はまた、両方の条件下の類似する患者群由来のリンパ腫細胞の、ＣＤ４０Ｌで刺激した増殖を阻害し得る。１５Ｂ８は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））を改変する能力を有し、ここで、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路は、その疾患の病因に対して一定の役割を果たし得る。これらの結果を、以下の表に要約する。
【０１３１】
（表１５）
（アゴニスト活性を測定するアッセイ）
【０１３２】
【表１５】
2008156339.tif 000017
（表１６）
（アンタゴニスト活性を測定するアッセイ）
【０１３３】
【表１６】
2008156339.tif 000018
本発明は、特定の実施形態を参照して記載された。しかし、本出願は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく当業者によってなされ得る変更および置換を含むことが、意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１は、ＣＤ４０Ｌ発現細胞により刺激されたＢ細胞の増殖に対する抗ＣＤ４０抗体の効果を示す棒グラフである。
【図２】図２は、Ｂ細胞増殖に対する抗ＣＤ４０抗体の効果を示す棒グラフである。
【図３】図３は、抗ＩｇＭにより誘導されたＢ細胞の増殖に対するＣＤ４０抗体の効果を示す棒グラフである。
【図４】図４は、ヒト末梢Ｂ細胞の増殖に対する架橋された抗ＣＤ４０抗体の効果を示す棒グラフである。
【図５】図５は、５つのヒト抗ＣＤ４０抗体および５Ｈ７の軽鎖のアミノ酸配列の比較である。配列番号は、以下の通りである。５Ｈ７：配列番号１９、２５９Ｆ７：配列番号２０、２６１５Ｂ８：配列番号２１、２７１２Ｄ９：配列番号２２、２８２０Ｃ４：配列番号２３、２９１３Ｅ４：配列番号２４、３０
【図６】図６は、５つのヒト抗ＣＤ４０抗体および５Ｈ７の重鎖のアミノ酸配列の比較である。配列番号は、以下の通りである。５Ｈ７：配列番号３１、３７９Ｆ７：配列番号３２、３８１５Ｂ８：配列番号３３、３９１２Ｄ９：配列番号３４、４０２０Ｃ４：配列番号３５、４１１３Ｅ４：配列番号３６、４２
【図７】図７は、ＣＤ４０を発現する細胞に結合するモノクローナル抗体１５Ｂ８のＦＡＣＳ分析の結果を示す。図７は、この抗体が、３種（ヒト、アカゲザル、およびカニクイザル）由来の末梢血細胞を染色することを示した。
【図８】図８は、ヒトモノクローナル抗体１２Ｄ９のｖＫ領域のＤＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号４３および４４）を提供する。
【図９】図９は、ヒトモノクローナル抗体１２Ｄ９の重鎖定常領域のＤＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１および２）を提供する。
【図１０】図１０は、ヒトモノクローナル抗体２０Ｃ４のｖＫ．１およびｖｈ１領域のＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号３および４）を提供する。
【図１１】図１１は、ヒトモノクローナル抗体９Ｆ７のｖＫ．１およびｖｈ１領域のＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号５および６）を提供する。
【図１２】図１２は、ヒトモノクローナル抗体１５Ｂ８のｖＫ．３およびｖｈ１領域のＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号７および８）を提供する。
【図１３】図１３は、ヒトモノクローナル抗体１３Ｅ４および１２Ｄ９のｖｈ１領域のＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号４５および１０）を提供する。
【図１４】図１４は、以下に示されるヒトモノクローナル抗体の以下の領域のアミノ酸配列を提供する。９Ｆ７ＶＨ１：配列番号１１１２Ｄ９ＶＨ１：配列番号１２１５Ｂ８ＶＨ１：配列番号１３２０Ｃ４ＶＨ１：配列番号１４９Ｆ７ＶＫ１：配列番号１５１２Ｄ９ＶＫ１：配列番号１６１５ＢＶＫ１：配列番号１７２０Ｃ４ＶＫ１：配列番号１８
【図１５】図１５は、ある患者からの細胞を用いて、抗ＣＤ４０抗体ＭＳ８１が、ＩＬ−４の存在下および非存在下でＮＨＬ細胞の増殖を刺激したことを示す。
【図１６】図１６は、第２の患者からの細胞を用いて、抗ＣＤ４０抗体ＭＳ８１が、ＩＬ−４の存在下および非存在下でＮＨＬ細胞の増殖を刺激したことを示す。
【図１７】図１７は、抗ＣＤ４０抗体１５Ｂ８が、ある患者において、ＮＨＬ細胞の増殖を阻害することを示す。
【図１８】図１８は、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）感受性の患者由来のＮＨＬ細胞の増殖における、１５Ｂ８に対する用量応答を示す。これらの細胞を、ＣＤ４０ＬおよびＩＬ−４により刺激した。
【図１９】図１９は、３人の個体由来の細胞を用いて、ＣＤ４０Ｌにより刺激されたヒトＢ細胞の増殖に対する１５Ｂ８の効果についての代表的な用量応答曲線を示す。
【図１】
2008156339.tif 000019
【図２】
2008156339.tif 000020
【図３】
2008156339.tif 000021
【図４】
2008156339.tif 000022
【図５】
2008156339.tif 000023
【図６】
2008156339.tif 000024
【図７】
2008156339.tif 000025
【図８】
2008156339.tif 000026
【図９】
2008156339.tif 000027
【図１０】
2008156339.tif 000028
【図１１】
2008156339.tif 000029
【図１２】
2008156339.tif 000030
【図１３】
2008156339.tif 000031
【図１４】
2008156339.tif 000032
【図１５】
2008156339.tif 000033
【図１６】
2008156339.tif 000034
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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