(57)【要約】【課題】裸のDNAを動物組織に直接インジェクションする従来の実験において用いられたDNAは、細胞内での保持性、核内への取り込み、または標的細胞の核内での転写効率を改善するような修飾または折り畳みを受けていなかった。【解決手段】凝縮物質を投与した組織の標的細胞による、核酸の取り込みを促進するため、核酸は実質的に凝集することなく、凝縮される。核酸はその遺伝子発現、発現が望まれない内在性核酸とのハイブリッド形成、または部位特異的インテグレーションでの標的遺伝子の置き換え、修飾、または欠損、の結果により医療的効果をもたらす。標的化は、標的細胞結合部位による方法により増強される。核酸は好ましく凝縮状態にされる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程
a） i)セルピン酵素複合体受容体に結合可能な標的結合部位；
ii)核酸結合部位；
iii)１つまたはそれ以上の遺伝子産物をコードするオリゴヌクレオチドよりなる発現ベクターであって、折り畳まれている発現ベクター；
iv)セルピン酵素複合体受容体を外側表面に有するヒト以外の哺乳類細胞；
の供給；
b)前述標的結合部位と前述核酸結合部位の担体形成のための結合；
c)前述発現ベクターと前述担体の治療的化合物の形成のためのカップリング；そして
d)前述の哺乳類細胞と前述の治療的化合物の、前述の治療的化合物が前述の受容体に結合し、前述の治療的化合物を前述の哺乳類細胞内に輸送するような条件での接触
よりなるヒト以外の哺乳類細胞へのオリゴヌクレオチドの導入方法。
【請求項２】
前述の発現ベクターはさらに、制御可能に前述の１つまたはそれ以上の遺伝子産物をコードするオリゴヌクレオチドと連結したプロモータ一配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プロモーター配列は哺乳類遺伝子に由来する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前述のプロモーター配列はウィルスプロモーター配列である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前述のウィルスプロモーター配列はシミアンウィルス40プロモーター、モロニーマリンロイケミアウィルスプロモーター、およびサイトメガロウィルスプロモーターよりなる組から選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前述の標的結合部位は前述の受容体の認識配列を含むペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
認識配列はSEQ ID NOS:28および29を含む組から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
標的結合部位はSEQ ID NO:31のアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前述の核酸結合部位はポリ陽イオンである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ポリ陽イオンは、ポリLリジンである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前述のヒト以外の哺乳類細胞は受容動物に位置される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前述のヒト以外の哺乳類細胞は、肝細胞、単核食胞、好中球、小腸上皮細胞、グリア細胞、および神経細胞からなる組から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前述のヒト以外の哺乳類細胞と前述治療的化合物の、前述の接触は前述化合物の前述のヒト以外の受容動物への投与からなる、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前述の投与は前述の治療的化合物を含む水溶性溶液の注射からなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前述の注射は、静脈注射である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前述のヒト以外の哺乳類細胞と前述治療的化合物との接触に続く、前述発現ベクターによりコードされる前述の１つまたはそれ以上の遺伝子産物の発現を前述の接触細胞での試験を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前述の治療的化合物の注射に続き、前述受容動物中の組織での前述発現ベクターによりコードされる前述の１つまたはそれ以上の遺伝子産物の発現を前述の接触細胞での試験を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
核酸結合部位、および哺乳類細胞表面に存在するセルピン酵素複合体受容体に結合可能な標的結合部位を含む、化合物。
【請求項１９】
標的結合部位は前述の受容体に対する認識配列を含むペプチドである、請求項１８記載の化合物。
【請求項２０】
認識配列はSEQ ID NOS:28および29からなる組より選択される、請求項１９記載の化合物。
【請求項２１】
標的結合部位はSEQ ID NO:31にあるアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項２０記載の化合物。
【請求項２２】
核酸結合部位はポリ陽イオンである、請求項１８記載の化合物。
【請求項２３】
前述のポリ陽イオンはポリLリジンである、請求項２２記載の化合物。
【請求項２４】
哺乳類細胞表面に存在するセルピン酵素複合体受容体に結合可能な標的結合部位、および核酸結合部位よりなる、融合タンパク質であって、認識配列がSEQ ID NOS:28および29からなる組から選択される、融合タンパク質。
【請求項２５】
標的結合部位はSEQ ID NO:31にあるアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項２４記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
前述の核酸結合部位は最低プロタミンタンパク質の一部分を含む、請求項２４記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
核酸分子に結合した、請求項２４記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
３０ｎｍ未満の粒子サイズを有する、請求項２７記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
治療用タンパク質に共有結合された受容体であって重合性イムノグロブリン受容体のヒト分泌性成分である受容体に対して向けられた単鎖Ｆｖ分子を含む融合タンパク質。
【請求項３０】
治療用タンパク質がα１−アンチトリプシンである、請求項２９記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
治療用タンパク質がサイトカインである、請求項３０記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
治療用タンパク質がインターロイキン−２である、請求項３１記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
治療用タンパク質がインターロイキン−１０である、請求項３１記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
治療用タンパク質がペプチド性抗生物質である、請求項３０記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
単鎖Ｆｖ分子と治療用タンパク質の間に共有結合された３０を超えないアミノ酸残基のリンカー領域をさらに含む、請求項３０記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
請求項２９記載の融合タンパク質をヒト以外の動物に投与することにより、治療用タンパク質を細胞に到達させることを含む、治療用タンパク質を細胞に到達させる方法。
【請求項３７】
経細胞輸送性受容体が重合性イムノグロブリン受容体のヒト分泌性成分である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
細胞が気道上皮細胞である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
細胞が肺細胞である、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
細胞が腸細胞である、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
細胞が胆管細胞である、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
折り畳みがカオトロピック剤の存在下で実施される、請求項１記載の方法。
【請求項４３】
折り畳みが添加されたカオトロピック剤の不在下で実施される、請求項１記載の方法。
【請求項４４】
折り畳みが添加された塩化ナトリウムの不在下で実施される、請求項１記載の方法。
【請求項４５】
核酸および担体が１００ｎｍ未満の直径まで折り畳まれる、請求項１記載の方法。
【請求項４６】
核酸および担体が９０ｎｍ未満の直径まで折り畳まれる、請求項１記載の方法。
【請求項４７】
核酸および担体が３０ｎｍ未満の直径まで折り畳まれる、請求項１記載の方法。
【請求項４８】
核酸および担体が２３ｎｍ未満の直径まで折り畳まれる、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、国立衛生研Health and Human Services部門の支出する助成金DK49138およびDK43999による政府援助を受け行われた。米国政府は、本発明につき相当の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、多細胞生物の細胞に外来核酸をin vivo導入することに関する。特に、本発明はセルピン酵素複合体受容体を表面に有する細胞に外来核酸を導入することに関する。
【０００３】
従来の技術
機能を有する外来遺伝子は、種々の理学的方法(トランスフェクション、直接的マイクロインジェクション、電気穿孔法、およびりん酸カルシウムによる共沈法を含む)によって、in vitroで哺乳類細胞に導入され得る。しかしこれらの技術の多くは、生きている動物中の細胞に遺伝子を導入するためには実用的ではない。
【０００４】
受容体により媒介される、折り畳まれていないDNAの導入
受容体により媒介される遺伝子導入法は、適当な受容細胞にin vitroおよびin vivoで外来遺伝子を導入する際に有効であることが示されている。この方法は、共有結合したリガンド(目的の組織の表面上の特異的な受容体に結合するように選択される)を含むポリカチオンタンパク質(通常はポリ-L-リジン)にDNAを結合させることから成る。その遺伝子は組織に取り込まれ、細胞の核に輸送され、ある時間の間発現される。標的組織内での外来遺伝子の発現の全体的なレベルは、DNA-担体複合体の安定性、標的細胞表面の特異的受容体の存在および個数、受容体-担体リガンド相互作用、複合体のエンドサイトーシスおよび核への輸送、および標的細胞の核内での遺伝子の転写の効率という、いくつかの因子に依存する。
【０００５】
Wuら(米国特許5,166,320)により、ポリ核酸結合試薬(例えばポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、またはプロタミン)と組織受容体特異的リガンドとの共役物を用いた、DNAの組織特異的導入法が開示されている。肝臓細胞を標的とする場合、Wuらは「アシアロ糖タンパク質(ガラクトース末端)リガンド」を挙げている。
【０００６】
Wagnerら(Proc. Natl. Acad. Sci., 88:4255-4259 (1991)および米国特許5,354,844)は、トランスフェリン-ポリリジン共役物とDNAを複合させ、受容体に媒介されるエンドサイトーシスによってDNAを細胞に導入することを開示している。Wagnerらによれば、DNAを折り畳んで直径80-100nmのドーナツ型構造にする(これによってエンドサイトーシスが生じやすくなる)ことを確かにするために、混合物中に十分量のポリカチオンが存在することが重要である。
裸の、非折り畳みDNAの直接的インジェクション
裸のDNAを動物組織に直接インジェクションして遺伝子発現を検出する可能性は、最初にDubenskiら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7529-33 (1984))によって示された。彼らは、マウスの肝臓または脾臓にインジェクションされたウィルスまたはプラスミドDNAが検出可能なレベルで発現されることを示した。DNAはりん酸カルシウムを用いて沈澱され、ヒアルロニダーゼおよびコラゲナーゼと共にインジェクションされた。トランスフェクションされた遺伝子は、宿主動物の肝臓中で複製することが示された。BenvenistyおよびReshef(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:9551-9555 (1986))は、りん酸カルシウムで沈降されたDNAを新生ラットに腹腔内インジェクションし、トランスフェクション後48時間の個体の肝臓中の発現を発見した。1990年、Wolffら(Science, 247:1456-1468 (1990))は、DNAまたはRNA発現ベクターをマウスの筋肉中に直接インジェクションすることにより、最大2カ月の期間に検出可能な遺伝子発現が生ずることを報告した。この方法はAscadiら(New Biologist, 3:71-81(1991))によって、ラットの心臓に裸のDNAを直接インジェクションすることを含むように拡張され、インジェクションされた遺伝子は個体の心臓中で最大25日間発現された。他の遺伝子(ジストロフィン遺伝子を含む)が、この方法を用いてマウスの筋肉中にインジェクションされてきた。この過程は、直接的インジェクションによって標的組織に遺伝子を投与することにより、動物中に免疫応答を誘導するための広範な方法の基礎を成す。遺伝子は一時的に発現され、特異的な抗原を生産する(最近の総説としてDonnelyら,The Immunologist, 21, 20-26 (1994)参照)。しかしこれらの実験において用いられたDNAは、細胞内での保持性、核内への取り込み、または標的細胞の核内での転写効率を改善するような修飾または折り畳みを受けていなかった。
発明の概要
本発明は、一例として多細胞生物細胞を含む細胞内への外来核酸の導入に関する。核酸が発現可能な遺伝子を含む場合、その遺伝子は細胞内で発現され得る。一部の態様においては、核酸結合領域と標的組織結合領域とを有する二機能性分子である、組織特異的担体分子が調製される。
【０００７】
核酸は、臨界塩濃度で高濃度で担体と折り畳まれ得る。核酸と共役した担体分子は、次に生体に投与される。
一つの態様においては、本発明は、a)i)セルピン酵素複合体受容体に結合し得る標的結合分子、ii)核酸結合分子、iii)一つ以上の遺伝子産物をコードするオリゴヌクレオチドを含む発現ベクター、iv)外表面上にをセルピン酵素複合体受容体を有する哺乳類細胞を提供し、b)標的結合分子を核酸結合分子に結合させて担体を形成し、c)担体と発現ベクターを共役させて薬剤組成物を形成し、そしてd)薬剤組成物が受容体に結合して哺乳類細胞内に薬剤組成物が導入される条件下で薬剤組成物を哺乳類細胞と接触させる段階からなる、哺乳類細胞にオリゴヌクレオチドを導入する方法に関する。発現ベクター(即ち、一つ以上の遺伝子産物をコードする核酸またはオリゴヌクレオチド)は折り畳まれていることが好ましい。TBMとNABM間の共役物からなる担体と結合した核酸(例えば発現ベクター)の折り畳みは、本明細書中で詳細に記載される。好ましくは、担体と発現ベクターからなる薬剤組成物は直径100nm以下、好ましくは80nm以下まで折り畳まれて、最も好ましくは約10から25nmの直径を有し、15から25nmの直径が特に好ましい。
【０００８】
本明細書で用いられる場合、「薬剤組成物」とは、核酸結合分子に結合された標的結合分子からなる担体と、発現ベクター(即ち核酸分子)との集合体(即ち複合体)からなる組成物である。さらに薬剤組成物は薬理的に受容可能な補形薬からなり得る。「薬剤組成物」および「治療組成物」とは、本明細書では互換的に使用される。薬剤組成物はいかなる特定の発現ベクター、担体、または補形薬にも限定されない。
【０００９】
好ましい態様においては、発現ベクターはさらに一つ以上の遺伝子産物をコードするオリゴヌクレオチドに操作可能なように連結されたプロモーター配列からなる。本発明は、使用されるプロモーター配列の性質によっては限定されない。標的細胞(即ち、セルピン酵素複合体(SEC)受容体を外表面上に発現する細胞)中で機能するいかなるプロモーター配列も、目的の遺伝子の発現を達成するために使用され得る。プロモーター配列は、一例として発現ベクターにコードされる遺伝子を含む、哺乳類遺伝子由来であり得る(即ち、発現ベクター上に存在する目的の遺伝子は、自身の天然プロモーターまたは外来プロモーターの転写制御を受け得る)。
【００１０】
プロモーター配列は、例えばβ-アクチン、ヒト伸長因子1α遺伝子等のように、全ての哺乳類細胞で発現される(即ち、構成的または普遍的プロモーター)遺伝子由来(即ち、入手または単離される)であり得る。または、プロモーターは標的細胞中で活性を有する、組織特異的に発現される遺伝子由来であり得る。例えば標的細胞が肝臓細胞である場合、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、アルブミン、メタロチオネイン、界面活性物質、アポE、ピルビン酸キナーゼ、LDL受容体、HMG CoAリダクターゼ等、肝臓中で発現される遺伝子由来のプロモーターが使用され得る。または、プロモーターはウィルス長末端反復配列(LTR)のように種々の細胞型内で発現されるウィルス配列由来であり得る。例えば、ラウスカポジ肉腫ウィルス(RSV)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)およびヒトサイトメガロウィルス(CMV)のLTRが本発明において利用され得る。しかし、本発明では種々のプロモーターが利用され得るため、ウィルスプロモーターは特定のウィルスプロモーターに限定されない。
【００１１】
発現ベクターもまた、エンハンサー配列から成る。真核生物における転写調節シグナルは、「プロモーター」および「エンハンサー」成分/配列から成る。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞内タンパク質と特異的に相互作用する短い一繋がりのDNA配列からなる(Maniatisら,Science 236:1237(1987))。プロモーター/エンハンサー成分は、酵母、昆虫および哺乳類細胞、およびウィルスの遺伝子を含む、種々の真核生物源から単離されている(類似の調節成分、即ちプロモーターは原核生物にも見られる)。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、目的のタンパク質を発現するためにどのような型の細胞が道居られるかによる。ある種の真核プロモーターおよびエンハンサーは広範な宿主を有するが、その他は特定の種類の細胞型中でのみ機能を有する(総説として、Vossら, Trends Biochem. Sci., 11:287(1986)およびManiatisら,上述(1987)参照)。例えば、SV40初期遺伝子のエンハンサーは多くの哺乳類種由来の多様な細胞型において著しく活性を有し、哺乳類細胞中でのタンパク質の発現のために広く用いられて来た(Dijkemaら, EMBO J. 4:761(1985))。広範な型の哺乳類細胞において活性を有するプロモーター/エンハンサー要素の2つの他の例は、ヒト伸長因子1α遺伝子(Uetsukiら, J. Biol. Chem., 264:5791(1989); Kimら, Gene 91:217(1990);およびMizushimaおよびNagata, Nuc. Acids. Res., 18:5322(1990))、およびラウスカポジ肉腫ウィルス(Gormanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777(1982))およびヒトサイトメガロウィルス(Boshartら, Cell 41:521(1985))のLTR由来のものである。
【００１２】
利用されるエンハンサーおよび/またはプロモーター配列は、「内在性」または「外来性」または「異種構造性」であり得る。内在性エンハンサーまたはプロモーターは、天然にはゲノム中の特定の遺伝子に連結したものである。外来性(異種構造性)エンハンサーまたはプロモーターとは、遺伝的操作(即ち分子生物的技術)によってある遺伝子に隣接した位置に置かれるものである。
【００１３】
一部の態様においては、標的結合分子はSEC受容体の認識配列からなるペプチドである。本明細書で用いる場合、「SEC受容体の認識配列」という用語は、SEC受容体のリガンドとして働き得るペプチド配列を指す。5ペプチド結合ドメインFVF/YLI(SEQ ID NO:28および29)からなるペプチドは、好ましい認識配列である。しかし、本発明は、認識配列からなるペプチドの性質によっては限定されず、SEC受容体に結合してそれを介する内在化を媒介するいかなるペプチドも含まれる。好ましい態様においては、認識配列はSEQ ID NO:28および29からなるグループから選択される。また一部の態様においては、標的結合分子はSEQ ID NO:31に示されるアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００１４】
本発明は、核酸結合分子の性質によって限定されない。一部の態様においては、核酸結合分子はポリ-L-リジンのようなポリカチオンである。用いられ得る他の核酸結合分子には、一例としてプロタミン、ポリアルギニン、アビジン(発現ベクターがビオチン分子を含む場合に用いられる)、ポリオルニチン、およびヒストンが含まれる。
【００１５】
「ポリカチオン」という用語は、本明細書で用いられる場合、正に荷電した(即ち塩基性の)側鎖を有する多量のアミノ酸残基(即ちアルギニンおよびリジン)を含み、そのために核酸(負に荷電している)にイオン結合し得るペプチドまたはポリペプチド(即ちタンパク質)配列を指す。好ましくは、ポリカチオンは少なくとも4アミノ酸残基からなる。
【００１６】
本発明は、受容または標的細胞の位置によって限定されない。標的細胞は培養細胞であり得、またはより好ましくは細胞はヒトを含む受容動物中に存在し得る。好ましい態様においては、肝細胞、単核貪食細胞、好中球、腸管上皮細胞、好中球、グリア細胞、および神経細胞からなるグループから受容哺乳類細胞は選択される。
【００１７】
好ましい態様においては、哺乳類細胞を薬剤(即ち治療用)組成物と接触させることは、複合体を受容動物に投与することからなる。本発明は、組成物の投与の性質によっては限定されない。一部の態様においては、投与は薬剤組成物を含む水性溶液を受容動物に注射(即ち皮下注射)することからなる。
【００１８】
本発明は、種々の動物について首尾よく用いられ得る。特に治療の成功は、ヒトにおいて達成される。その観点からは、組成物の注射に続いて、外表面にSEC受容体を発現する対象組織を、発現ベクターにコードされる一つ以上の遺伝子産物の発現について検査することが望ましい。
【００１９】
好ましい態様においては、本発明の方法にはさらに、哺乳類細胞と薬剤組成物を接触させた後に、発現ベクターにコードされる一つ以上の遺伝子産物の発現について、接触させた細胞を検査することからなる。
【００２０】
本発明はさらに、核酸分子および、哺乳類細胞表面に存在するセルピン酵素複合体受容体に結合し得る標的結合分子からなる組成物を提供する。一部の態様においては、標的結合分子はSEC受容体の認識配列からなるペプチドである。本発明は、認識配列からなるペプチドの性質によっては限定されない。SEC受容体に結合してそれを介する内在化を媒介するいかなるペプチドも含まれる。好ましい態様においては、SEQ ID NO:28および29（配列番号28および29）からなるグループから認識配列は選択される。一部の態様においては、標的結合分子はSEQ ID NO:31（配列番号31）に示されるアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００２１】
本発明は、核酸結合分子の性質によっては限定されない。一部の態様においては、核酸結合分子はポリ-L-リジンのようなポリカチオンである。プロタミン、ポリアルギニン、アビジン(発現ベクターがビオチン分子を含む場合に用いられる)、ポリオルニチン、およびヒストンのような他の核酸結合分子が用いられ得る。
【００２２】
本発明はまた、哺乳類細胞の表面に存在するセルピン酵素複合体受容体に結合し得る標的結合分子および核酸結合分子からなる融合タンパク質を提供する。一部の態様においては、標的結合分子はSEC受容体の認識配列からなるペプチドである。本発明は認識配列からなるペプチドの性質によっては限定されない。SEC受容体に結合してそれを介する内在化を媒介するいかなるペプチドも含まれる。好ましい態様においては、SEQ ID NO:28および29からなるグループから認識配列は選択される。一部の態様においては、標的結合分子はSEQ ID NO:31に示されるアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００２３】
本発明は、融合タンパク質中に存在する核酸結合分子の性質によっては限定されない。好ましい態様においては、核酸結合分子はプロタミンタンパク質の少なくとも一部からなる。本発明はプロタミンの原料によっては限定されない。プロタミンは種々の材料(例えばラット、マウス、ヒト、魚等)から単離される。
【００２４】
本発明の融合タンパク質は、一例として望ましいペプチド配列の化学合成、または分子生物学的手法による望ましい融合タンパク質の発現(即ち、望ましい融合タンパク質をコードするコード領域を含む発現ベクターの構築)を含む、当分野で既知の種々の方法を用いて生産され得る。
【００２５】
本発明の融合タンパク質はさらに、SEC受容体に結合し得る標的結合分子と核酸結合分子の間にスペーサーまたはリンカー配列を含み得る。スペーサーは好ましくは0から30アミノ酸残基である。
【００２６】
本発明はさらに、SEC受容体に結合し得る標的結合分子と治療能(例えば酵素活性、サイトカイン活性および抗生物質活性(即ち、抗生物ペプチド))を有するタンパク質の一部を含む融合タンパク質を含む。これらの融合タンパク質は、表面にSEC受容体を発現する細胞に、治癒活性を導入し得る。
【００２７】
さらに本発明は、SEC受容体に結合し得る標的結合分子からなる修飾された(即ちキメラの)外殻タンパク質を含む、レトロウィルス粒子の生産を含む。レトロウィルス粒子は、SEC受容体を発現する細胞に目的の遺伝子を導入するために利用され得る。
好ましい態様の詳細な説明
多細胞生物
外来性核酸を導入することが望まれるいかなる多細胞生物も、本発明の潜在的な対象である。多細胞生物は植物または動物であり、好ましくは後者である。動物は好ましくは脊椎動物であり、より好ましくは高等脊椎動物、即ち哺乳類または鳥類であり、前者が特に好ましい。哺乳類中では、好ましい対象はヒトおよび霊長類であり、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターのような実験動物であり、犬および猫のような愛玩動物であり、馬、牛、ヤギ、豚および羊のような家畜である。これらの動物はMammalia類の４つの目由来であり、Primata、Rodenta、Carnivora、およびArtiodactylaである。
標的細胞
標的細胞は、生物の組織（器官を含む）に属し得、（動物の場合には）神経系（例えば脳、脊髄、および末端神経細胞）、循環系（例えば心臓、血管組織、および赤および白血球）、消化系（例えば胃および腸）、呼吸系（鼻および肺）、生殖系、内分泌系（肝臓、脾臓、甲状腺、副甲状腺）、皮膚、筋肉、または結合組織に属する細胞を含む。
【００２８】
または、細胞は標的生物の何らかの器官または組織、または生物に感染した寄生生物または病原体、または生物のウィルス感染した細胞由来の癌細胞であり得る。
肝臓遺伝子治療に有用な方法には、目的の遺伝子の肝臓への導入の効率的で比較的非浸潤性の方法が必要である。受容体を介した遺伝子導入を用いるある種の技術が、首尾よく用いられて来た。しかし、部分的肝切除も行わない、即ちヒトの遺伝子治療に用いられ得る、肝臓での外来遺伝子の長期間の発現を引き起こす、簡便で再現性の方法の必要がある。外来性DNAは、リガンド-ポリ-L-リジン二共役物によってアシアロ糖タンパク質（ＡＳＧＰ）受容体を標的とすることによって、成体動物の肝臓細胞に導入されて来た。リガンド-標的法が効率的であるためには、DNAが血中で損なわれずに、肝臓細胞表面のASGP受容体によって認識されるほど十分に小さくなるような型でなければならない。Wagnerらは、DNAをポリ-L-リジン/トランスフェリン共役物で凝縮し、直径80-100nmの複合体にすることによって、肝臓癌細胞のトランスフェリン受容体に遺伝子を命中させている。この大きさのDNA共役物は、肝臓癌細胞のトランスフェリン受容体による認識に適当であるが、肝臓細胞のASGP受容体は直径10-20nm以上のリガンドを選択的に回避する。
【００２９】
本発明者は、受容体を介する取り込みによって１４０日の間（実験期間）遺伝子の発現を引き起こす、成体動物の肝臓への遺伝子の導入方法を開発した。この方法はヒトの遺伝子治療に適用され得る。この方法の主な利点は、(i)DNA複合体を簡便に調製でき；(ii)遺伝子を特定の組織に導入でき；(ii)肝臓中で長期間遺伝子が発現され；(iv)感染性のウィルスDNAが無いために複合体が比較的安全であり；および(v)導入された遺伝子がエピソームとして保持されることである。
ターゲティング
A. 一般論
「ターゲティング」とは、凝縮した核酸を、医療目的を達成するために有効量が標的細胞中に侵入するような方法で投与することである。この観点から注目すべきは、DNAおよびRNAは標的細胞の核内で複製され得、その結果細胞中の核酸の最終量は取り込み後上昇することである。さらに、医療効果が核酸によって発現されるタンパク質によって媒介される場合注目すべきは、核酸は鋳型として働き、そのために細胞内の核酸のコピー数が低くても高レベルのタンパク質発現が達成されることである。しかし、高濃度のDNAを凝縮してDNAを取り込む標的細胞のコピー数および各細胞に取り込まれるDNA分子の数を増大させることが望ましい。
【００３０】
投与の経路および部位は、ターゲティングを増強するように選択され得る。例えば筋肉細胞を標的とする場合、目的の筋肉内への筋内注射が論理的に選択されると考えられる。肺細胞は、エアロゾルの形の凝縮DNAを投与することによって標的化され得る。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルを凝縮DNAで被覆して機械的にDNAを導入することによって標的化され得る。
【００３１】
ある場合には、核酸を凝縮状態に保持する核酸結合分子は、ターゲティング試薬としても働き得る。正に荷電したアミノ酸のポリマーは、多くの核タンパク質において核局在シグナル（ＮＬＳ）として働くことが知られている。ポリ-L-リジンで凝縮したpSV40-ルシフェラーゼDNAは、ラットの腹筋にin situで注射された。明確な標的細胞分子を持たないにも関わらず、凝縮DNAを注射したラットではDNA単独を注射したラットよりも20倍高いルシフェラーゼ活性が観察された。しかし、一部の態様においては、ターゲティングは標的細胞結合分子が用いられる場合に改善され得る。
B.標的結合分子（TBM）の使用
TBMが用いられる場合、目的の標的細胞の接近可能な構造（「受容体」）に特異的に結合しなくてはならない。TBMはそれらの細胞のみに特異的でなくともよいが、共役物が治療上有効であるのに十分特異的でなければならない。好ましくは、他の細胞とのTBMの交差反応性は10%以下、より好ましくは5%以下である。
【００３２】
標的細胞の接近可能な構造に対してTBMが有さなければならない絶対な最小親和性は存在しない。しかし、親和性が高いほどよい。好ましくは、親和性は少なくとも103liters/mol、より好ましくは少なくとも106liters/moleである。
【００３３】
TBMは、標的細胞表面のエピトープに特異的に結合する抗体（または、Fab、Vm、VLまたはCDRのような、抗体の特異的結合断片）であり得る。細胞、細胞膜、または単離された細胞表面抗原に対して抗体を作成する方法は、当該分野では知られている。さらに、TBMは、標的細胞表面のエピトープに特異的に結合する一本鎖FVからなり得る。一本鎖FVは、NABMまたは治療タンパク質配列（例えば酵素、サイトカイン、タンパク質性抗生物質等）との融合タンパク質からなり得る。
【００３４】
TBMは、同族炭水化物構造が細胞表面に存在するレクチンであり得る。
標的結合分子は、標的細胞が有する受容体によって特異的に結合されるリガンドであり得る。
【００３５】
目的のリガンドの１つのクラスは炭水化物であり、特にモノ-およびオリゴ糖である。適切なリガンドにはガラクトース、ラクトースおよびマンノースが含まれる。
目的のリガンドの他の１つのクラスはペプチド（本明細書ではタンパク質を含む）、例えばインシュリン、上皮成長因子、腫瘍壊死因子、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、FSH、LH、グルカゴン、ラクトフェリン、トランスフェリン、アポリポプロテインE、gp120およびアルブミンである。
【００３６】
以下の表は、種々のクラスの標的細胞に対する好ましい標的結合分子である。
【００３７】
【表１】
2008092953.tif 000002
【００３８】
標的結合分子はより大きいペプチドまたはタンパク質に含まれ得る。本発明は、セルピン酵素複合体（ＳＥＣ）受容体の５ペプチド結合ドメインを含むペプチドを提供する。本発明はさらに、SEC受容体（または他の何らかの望ましい受容体）に結合し得る表てｋ行け都合分子からなるタンパク質配列を含む、修飾（即ちキメラ）外殻タンパク質からなるレトロウィルス粒子の生産をも含む。これらの修飾外殻タンパク質を有するレトロウィルス粒子は、SEC受容体を発現する細胞に目的の遺伝子を運搬するために利用され得る。ペプチドリガンドおよびレトロウィルス（エコトロピックモロニーマウス白血病ウイルスまたは鳥レトロウィルス）外殻(env)タンパク質の一部を含むキメラタンパク質を有するレトロウィルス粒子は、同族受容体を発現する細胞に結合し得ることが示されている（Kasaharaら, Science 266:1373(1994)およびValsesia-Wittmannら, J. Virl. 68:4609(1994)）。
【００３９】
標的結合分子の利用は、NABM/NA凝縮複合体の直接注射の場合には厳密に必要なわけではない。この場合の標的細胞は、標的細胞の近傍に複合体が注射されることによってNABM/NA凝縮化複合体に受動的に接触可能である。
ｃ.リポソームの媒介する遺伝子導入
種々の脂質および溶媒条件を用い、DNAをリポソーム（脂質二重膜に含まれる構造）に封入して動物組織にリポソームを注射することにより遺伝子発現を検出する可能性が示されている。しかし、この方法が種々の生物系に有効であり得るにも関わらず、それらの実験で用いられたDNAは細胞内での保持性、核への取り込み、または標的細胞核内での転写速度を改善するための修飾または凝縮をされていなかった。即ち、これらの方法は通常はリポソームに含まれる遺伝子の一過性の発現しか引き起こさなかった。
【００４０】
カチオン性脂質は、DNAを導入するために首尾よく用いられた。そのような脂質のカチオン性の要素は、溶液中でDNAを凝縮し得る。この方法は、高度に集合化したDNA複合体を生ずることが示されており、in vitroでDNAをトランスフェクションするのに用いられた場合、遺伝子の導入および発現の効率が（DNA単独に比べて）上昇する。これらの複合体の形成はin vitroで遺伝子の導入を促進するが、このような複合体をin vivoで注射しても長期に渡る効率的な遺伝子の導入は起きなかった。
【００４１】
本発明の凝縮化法は、長期in vivo発現をより容易にする、DNA/カチオン性脂質複合体について構造特性を提供する。このような方法の組み合わせは、以下の２つの方法のいずれでも達成される。
1.凝縮DNA複合体の形成の後に中性脂質体に封入するか、または
2.本発明に記載される方法を用い、カチオン性脂質による凝縮によって高度に凝縮した単分子DNA複合体の形成が達成され得る。これらの複合体は、in vivoでの動物組織への高効率の遺伝子導入をもたらすと考えられる。
【００４２】
DNAの凝縮の本発明の方法は、生ずる凝縮DNAのリポソームへの封入と組み合わせた場合、動物へのトランスフェクションについて種々の利点を提供し得る。即ち、
1.リポソームは組織中の哺乳類細胞の細胞膜の脂質二重膜との受動的融合を促進する。
2.凝縮DNAは次に、細胞内画分を通って核に達して発現し、高効率で遺伝情報を導入し得る。
3.凝縮DNAは細胞内での分解から保護され得、新規に導入された遺伝子の発現の持続性を増強し得る。
4.ポリカチオン凝縮DNAに対して起き得る免疫応答は、免疫的に不活性な脂質二重膜による封入により回避され得る。
核酸結合分子
可逆的に核酸に結合するいかなる物質も、核酸結合分子（NABM）として働き得る。ただし、(1)それが核酸に十分強く特異的に結合して、標的細胞に達して取り込まれるまで核酸を保持し、結合を通して核酸を実質的に損傷したり変えたりしない；(2)それが核酸と溶媒との相互作用を弱め、凝縮化を起こすことが条件である。究極の基準は、共役物の治療上の有効性である。
【００４３】
好ましくは、NABMはポリカチオンである。正に荷電した基は負に荷電したDNAにイオン結合し、生ずる電化の中性化によってDNA-溶媒相互作用が弱められる。好ましいポリカチオンはポリリジンである。他の有望な核酸結合分子には、Arg-Lys混合ポリマー、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、およびプロタミンが含まれる。
核酸
本発明において組み換えDNAおよびRNA分子を構築する基本的な方法は、Sambroook, J.ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)（本明細書では参考文献として挙げる）に開示されている。
【００４４】
核酸はDNA、RNA、または下に示すようにin vivoでの分解に耐性な誘導体のような、DNAまたはRNA誘導体であり得る。本明細書では、文脈によって明らかに否定されない限り、DNAの参考文献は他の核酸にも適用される。核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。好ましくは10から1,000,000塩基（または塩基対）、より好ましくは100から100,000であり、塩基は同一または異なり得る。塩基は「通常の」塩基アデニン（A）、グアニン（G）、チミジン（T）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）であり得、または37CFR 1822(p)(1)に挙げられたような異常な塩基であり得る。核酸は何らかの望ましい方法によって調製され得る。
【００４５】
好ましい態様においては、核酸は標的細胞中で機能を有する発現可能な遺伝子からなる。例えば、遺伝子は、コアグルチニン因子（ファクターIXのような）、特定の代謝欠損に関わる酵素（尿素サイクル酵素のような、特にオルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸合成酵素、およびカルバミルりん酸合成酵素）、受容体（例えばＬＤＬ受容体）、毒素、特定の細胞または組織を切除するためのチミジンキナーゼ、イオンチャンネル（例えば嚢胞性線維症の塩素イオンチャンネル）、膜輸送分子（例えばグルコース輸送分子）、および細胞骨格タンパク質（例えばジストロフィン）をコードし得る。遺伝子は合成、cDNAまたはゲノム由来、またはその組み合わせであり得る。遺伝子は天然に存在するもの、天然に存在するポリペプチドをコードするが天然には存在しない遺伝子、またはそのようなポリペプチドの認識可能な変異体をコードする遺伝子であり得る。また、発見されたDNAに対して「アンチセンス」であり、機能を有するタンパク質に翻訳可能ではないmRNAをコードし得る。
【００４６】
遺伝子が発現可能であるためには、コーディング配列は標的細胞中で機能するプロモーター配列に操作可能のように連結されなければならない。２つのDNA配列（例えばプロモーター領域およびコーディング領域）は、２つのDNA配列間の性質が（１）目的の遺伝子配列の転写に関わる配列領域にフレームシフト変異を起こさず、（２）プロモーター領域配列によって転写されるという遺伝子配列の機能と干渉しない場合に、操作可能なように連結されたと言う。プロモーター領域は、プロモーターがそのDNA配列の転写に影響を与えることができた場合に、DNA配列に操作可能なように連結されたことになる。「操作可能なように連結される」ためには、２つの配列が直接隣接する必要はない。DNAのような核酸分子は、転写制御情報を含む核酸配列を含み、そのような配列がRNAをコードする核酸配列に「操作可能なように連結」している場合に、mRNAを「発現できる」と言う。遺伝子の発現に必要な制御領域の正確な性質は生物によって異なるが、概してRNA転写の開始を行うプロモーターを含む。そのような領域には、TATAボックスのように転写開始に関わる5'非コーディング領域が含まれる。
【００４７】
望ましくは、目的のRNAをコードする遺伝子配列の３'の非コーディング領域が得られる。この領域は、終止およびポリアデニル化をもたらすような転写終結制御配列のために保持され得る。即ち、コーディング配列の後ろに天然に存在する3'領域を保持することによって、転写終結シグナルが提供され得る。転写終結シグナルが発現宿主細胞中で十分に機能しない場合は、宿主細胞中で機能する3'領域が代わりに用いられ得る。
【００４８】
プロモーターは、宿主生物の本質的に全ての細胞で活性である「普遍的」プロモーターであり得(例えば哺乳類ではβアクチンプロモーター)、または標的細胞に程度は違うが特異的な発現をするプロモーターであり得る。一般的に、後者が好ましい。天然には標的細胞中で発現される、ある遺伝子に天然に備わったプロモーターがこの目的に用いられ得る(例えば哺乳類肝臓細胞での発現ではPEPCK(ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ))。他の適当なプロモーターは、アルブミン、メタロチオネイン、肺サーファクタント、アポE、ピルビン酸キナーゼ、LDL受容体HMG CoAリダクターゼ、または単離され、クローン化され、適当な組織特異的発現パターンおよび標的組織中での遺伝子の転写調節に必要な因子(ホルモン、食餌、重金属等)による制御が明らかにされている何らかのプロモーターが含まれる。さらに、広範な種類のウィルスプロモーターが用いられ得る。これらはMMTV、SV-40およびCMVを含む。「発現ベクター」とは、(適当な転写および/または翻訳調節配列の存在のために)ベクター内にクローン化されたDNA(またはcDNA)分子を発現し、RNAまたはタンパク質産物を生産することができるベクターである。クローン化された配列の発現は、発現ベクターが適当な宿主細胞に導入された場合に起きる。原核生物発現ベクターが用いられる場合、適当な宿主細胞はクローン化された配列を発現し得るいかなる原核細胞でもよい。同様に、真核生物発現ベクターが用いられる場合、適当な宿主細胞はクローン化された配列を発現し得るいかなる真核細胞でもよい。
【００４９】
発現可能な遺伝子に加え、またはその代わりに、核酸は標的細胞の遺伝物質に相同な配列からなり得る。相同な配列は相同組み換えによってゲノムに挿入(「インテグレート」)され、遺伝子のコーディングまたは調節配列と置き代わり、または遺伝子を完全に欠失させる。
【００５０】
別の態様においては、核酸分子は標的生物(ウィルスおよび他の病原体を含む)のゲノムまたは他のDNA配列、または生物の細胞内で転写されるmRNAの「アンチセンス」である。それはmRNAにハイブリダイゼーションして、標的ゲノムDNAの転写または標的mRNAの翻訳を阻害する。このようなハイブリダイゼーションの効率は、ハイブリダイゼーションする配列の長さと構造の関数である。配列が長く相補性が高いほど、相互作用は強い。塩基対のミスマッチ数が増加すると、ハイブリダイゼーション効率が減少する。さらに、GC塩基対にはAT(またはAU)と比べて水素結合が多く存在するため、パッケージング配列DNAまたはアンチセンスRNAのGC含量もまたハイブリダイゼーション効率に影響する。即ち、GC含量の高い標的配列は標的として好ましい。
【００５１】
分子内ハイブリダイゼーションにより二次構造を形成するアンチセンス配列は、その目的の活性が減少または消失するため、避けることが望ましい。ある配列が二次構造を形成する傾向にあるかどうかは、当業者は直ちに評価するであろう。二次構造は、異なる標的配列を選択することによって避けられる。
【００５２】
15から100塩基の長さで標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドは天然のモノヌクレオシドまたは非架橋部りん酸結合酸素に置換を有するモノヌクレオシドから合成され得る。好ましい類似分子は天然のモノヌクレオシドのメチルホスホン酸アナログである。より一般的には、モノヌクレオシドアナログは、(a)細胞膜を拡散して通過する能力が改善され、または(b)被験者の体内でヌクレアーゼ消化に耐性である(Miller, P. S.ら, Biochemistry 20:1874-1880(1981))という利点を有するオリゴヌクレオチドを産成するような、いかなるアナログでもよい。そのようなヌクレオチドアナログは当分野ではよく知られている。核酸分子はDNAまたはRNAのアナログでよい。本発明は、いかなる特定のDNAまたはRNAアナログの利用によっても、それが治療目的を果たし、ヌクレアーゼに適当な耐性を有し、適当な生物有用性および細胞取り込み能を有する限り、制限されない。ヌクレオシド内結合を修飾(例えば、メチルホスホン酸またはホスホロチオン酸)すること、または修飾ヌクレオシドを取り込むこと(例えば、2'-0-メチルリボースまたは1'-α-アノマー)によって、DNAまたはRNAは酵素(例えばヌクレアーゼ)によるin vivo分解により耐性に作られ得る。核酸分子全体は、このような修飾結合により形成され得、またはいくつかの部分(例えば5'および3'末端)が変化させられ、エキソヌクレアーゼ耐性を提供する。
【００５３】
本発明での利用に適した核酸分子は、一例としてジデオキシリボヌクレオシドメチルホスホン酸(Millら, Biochemistry, 18:5134-43(1979)参照)、オリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオン酸(Matsukuraら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7706-10(1987))、intercalating試薬に共有結合したオリゴデオキシヌクレオオチド(Zerialら, Nucleic Acids Res., 15:9909-19(1987)参照)、ポリ-L-リジンに結合したオリゴデオキシヌクレオオチド(Leonettiら, Gene, 72:32-33(1988)参照)、リボース由来サブユニットから構成されたカルバミン酸-結合したオリゴマー(Summerton,J.,Antisense Nucleic Acids Conference,37:44(New York 1989))を含む。
核酸の折り畳み化（Compaction）
核酸結合分子と核酸の複合体が、受容体媒介エンドサイトーシスによって取り込まれ、受動的に内在化され、受容体により媒介されて膜を透過し、または他の機構を達成するのに十分小さい粒子サイズまで折り畳まれることが望ましい。肺および脾臓の類洞毛細系は100nmサイズの集合体を捕捉するため、折り畳まれた核酸、標的結合分子、および核酸結合分子の複合体は小さいこと、例えば100nm以下が望ましい。より好ましくは80または90ｎｍ以下が望ましい(被覆小窩形質膜陥入小胞の典型的な内径)。30nm以上の複合体は脾臓および肝臓中ではマクロファージによる非特異的取り込みに感受性であるため、共役物もまた好ましくは30nmより小さい。
【００５４】
肝臓のASGP受容体の場合、15から23nm以上の複合体は取り込みから除外される。in vivoでの受容体のこのサイズの限界は、おそらくKupffer肝臓細胞中のもう一つのガラクトシル化タンパク質の存在に直接的に関連していると考えられる。Kupffer細胞受容体は大きいサイズのガラクトシル化をin vivoで取り込んで分解することに非常に効率的であり、ガラクトシル化DNA複合体の肝細胞表面のASGP受容体による取り込みについて競合していると考えられる。最も好ましくは、肝臓への輸送のために、複合体は23nm以下であり、より好ましくは15nm以下であり、さらに好ましくは12nm以下である。
【００５５】
本発明は、核酸と核酸分子結合担体との複合体が凝集または沈澱をおこさないで凝縮すること、好ましくは凝縮した状態を要求する(図12参照)。本発明の目的のためには、DNAが以下の状態の一つであることを解析することが有用である。即ち、通常(非凝縮);凝縮;弛緩;単分子凝集(ドーナツ型単分子の集合体);多分子凝集(ドーナツ型多分子の集合体);および沈澱。これらの状態は、EM下でのその外見によって定義される(表103参照)。
【００５６】
凝縮DNAは、溶媒との相互作用が最小である状態であり、DNAは単独の球形またはドーナツ型である。それは有意には繊維状でない。弛緩したDNAは典型的にはポリカチオンの解離によって形成される。凝集DNAは塊またはドーナツ型多分子を形成する。
【００５７】
単分子DNA複合体の理論的なサイズは、表106のレジェンドbおよびcに示す式にしたがって計算される。好ましくは、本発明の複合体はこれらの式の一つ以上から計算されたサイズの2倍以下の直径を有する。大きい複合体は多分子凝集DNAに対応すると考えられる。
【００５８】
例えばポリカチオンを加えて電荷を中和し、または溶媒との相互作用を減少することにより、DNAは折り畳なれて凝縮状態になり得る。しかし、カオトロピック試薬が用いられない場合、ポリカチオンはDNAの凝集または沈澱を起こす。即ち、折り畳みはポリカチオン(DNAの凝縮化のため)およびカオトロピック試薬(沈澱を防ぐため)の両者を考慮して用いることにより、達成され得る。
【００５９】
しかし、カオトロピック試薬の過剰な利用は、DNAの弛緩を引き起こす。好ましくは、複合体は非凝集、単分子ドーナツ型構造を有し、直径23nm以下までに凝縮している。凝縮の度合いは、電子顕微鏡で決定され得る。例えば、PEPCK-hFIX遺伝子とガラクトシル化ポリリジンの複合体は、折り畳まれて平均直径約12nmのドーナツ型単分子になった(表106)。
【００６０】
「ドーナツ型単分子」とは、ただ１つの核酸分子を含むドーナツ型を指す。ドーナツ型は多くの担体（例えばガラクトシル化ポリ-Lys）分子を含み得る。典型比は１つのドーナツ型単分子中に、１つのDNA分子に対して約１００担体分子である。または、より正確には、この構造はモノ-核酸ドーナツ型と呼称され得る。単分子および多分子ドーナツ型分子（後者は一つ以上のDNA分子を含む）は、電子顕微鏡で観察した場合の複合体各々の大きさの違いによって区別され得、ドーナツ型の多分子または単分子（DNA分子のみを計数）組成が示される。
【００６１】
ポリ-L-リジンとの結合によるDNAの構造変化を同定するために、他の方法も用いられた。第一は、400nmの吸光を用いた分光光度計による溶液の濁度の決定である。濁度は第一に集合化の指標である。集合化は波長300nmから340nmで０以上の円偏光二色性（ＣＤ）値によって確認された。
【００６２】
図18は、異なるNaCl開始濃度でのDNA溶液へのポリ-L-リジンの添加が濁度に与える影響を示す。濁度は塩の開始濃度が上昇するほど上昇し（肉眼で容易に確認し得る）、低いイオン強度でのDNA複合体の凝縮化は、互いに相互作用する単分子DNA-ポリ-L-リジン複合体からなる粒子の溶液が生ずる。低塩濃度で凝縮化されたDNA溶液は透明で、溶液中に粒子状の物質が見られた。異なる濁度を有するDNA複合体を含む溶液が、各溶液中で形成されたDNA構造を可視化するためにEMで解析された。適切に凝縮化した、単分子DNA複合体は透明な溶液と少し濁った溶液の両者で見られた。これは開始低イオン強度（400nmで吸光が最小になった）でのDNA複合体の凝縮化には当てはまらない（図１８）。なぜなら、懸濁液中に粒子を含む溶液は400nmでは吸光しないからである。しかし、これらの溶液がEMで解析された所、図１に示す予想された一過性の構造が見られた。懸濁液中の粒子が全体に拡散した時、EMで同定された構造は凝縮化単分子DNA複合体と本質的に同一だった。即ち、DNA複合体を含む溶液の濁度は、複合体の凝縮化に用いた塩の開始濃度に依存する。開始低および高イオン強度でのDNAの凝縮化について観察された差異の原因となる機構は明らかではないが、混濁溶液が生ずることを避け、適切にDNAを凝縮させるために本発明者のプロトコールが採択された。
【００６３】
溶液中のDNAポリLリジン複合体の構造の変化のより簡易的な診断技法は凝集複合体のNaCl濃度の上昇における260nmでの吸光度である。特異的物質が260nmで吸収しないため、非凝集DNA複合体は予想される吸光度のわずか10-30%しかない。NaClの添加は溶液中の非凝集DNA複合体を解離させ、図11に記載されるような急激な吸光度の上昇を招く。この時点で、溶液は透明で、溶液中にまったく可視的物質は存在しない。DNAポリLリジン凝集のこのような性質は、明確に図１に示した構造に対応する。急激な260nmでの吸光度の上昇の見られるNaCl濃度において、我々は、非凝集、凝縮複合体をEMにより観測した。このNaCl濃度になる前、DNA複合体は凝集していて、よりNaCl濃度が高いときはDNA複合体は弛緩されるようである。260nmでの2回目の変化は、懸濁中の凝縮したDNA複合体の弛緩の結果、DNA複合体が完全に可溶化することを示す。
【００６４】
円2色性解析(CD)はDNA濃度を監視するために用いられる。DNA単独にスペクトルが対応するとき、DNA複合体は正しく折たたまれている、すなわち単分子複合体となっている。換言すると、220nmでの陽性スペクトルは量的にDNA単独の220nmでのスペクトルに対応し、重複（複合体のスペクトルが0点に交差する波長）はDNA単独に完全に一致する。DNA 多分子複合体に凝集するとき、270nmでの陽性スペクトルはその波長での陰性スペクトルになる（これは、プサイDNA構造、ψDNAと呼ばれる）。
【００６５】
表103は裸眼観察、円2色性スペクトル、電子顕微鏡、および260nmでの吸光度により決定された各々の状態の4つの特徴をまとめたものである。
凝縮したDNA複合体を同定できる他のどの技法も、上記の組み合わせまたはそれぞれの代わりに用いられることを注意する。
【００６６】
核酸の密集のため、担体がDNA溶液に加えられ、それにより担体は核酸を破壊する。溶媒相互作用は核酸が凝縮するのを許す。好ましくは、溶液の濁度は担体を加える毎にはかられ、状態の変化は迅速に検出される。一度濁度が現れると、DNAが凝集または凝縮した状態のどちらにあるか決定するため、DNAの状態はさらにCDスペクトルにより解析される（沈殿は裸眼により検出できる）。好ましくは、十分ゆっくりと核酸溶液に加えられ、沈殿および凝集は最小化される。もし沈殿または凝集が起こったら、塩をゆっくりと加え、その結果はCDスペクトルにより試験される。好ましくは、塩はNaClである。他の塩は動物（または細胞）への投与においてに許容される限り用いられる。適切な薬剤には、硫酸ナトリウム（Na2SO4)、硫酸リチウム（Li2SO4)、 硫酸アンモニウム（(NH4)2SO4)、硫酸カリウム(K2SO4)、硫酸マグネシウム(MgSO4)、リン酸カリウム(KH2PO4)、リン酸ナトリウム(NaH2PO4)、リン酸アンモニウム(NH4H2PO4)、リン酸マグネシウム(MgHSO4)、塩化マグネシウム(MgCl2)、塩化リチウム(LiCl)、塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カリウム(KCl)、塩化カルシウム(CaCl2)、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、フッ化ナトリウム(NaF)、フッ化カリウム(KF)、テトラメチルアンモニウムクロライド、（TMA-Cl)、テトラブチルアンモニウムクロライド（TBA-Cl)、トリエチルアンモニウムクロライド(TEA-Cl)、およびメチルトリエチルアンモニウムクロライド(MTEA-Cl)が含まれる。
【００６７】
我々はガラス器具内でのDNAの凝縮に影響する可変性、およびレポーター経由細胞内取り込みによる動物へのDNA複合体の効率的輸送に関わるこれらの要素の機能的関係について調査した。我々は凝縮したDNAポリLリジン複合体は溶液中で安定なイオン強度、およびDNA濃度について注意した。これらの実験は、PEPCK遺伝子由来のプロモーターに接続したhFIX構造遺伝子を含む4.5kbpのプラスミドを用い、行った。DNAとポリLリジンの比は結果的に１対１の陰性および陽性に溶液中になるように用いた。粒子の可溶化に必要なNaClの最終濃度の可変性はDNA濃度の指数関数である。この中で、高濃度にしたDNAポリLリジン複合体の凝縮はわずかなイオン強度の上昇のみ伴い起こる。この物理的DNA凝縮の特性は、動物血液中のイオンがほとんど影響を受けないため、DNA粒子の成人動物への生体内組織への輸送に明らかに有利である。  
【００６８】
最小2乗法によるデータの線形回帰は、以下の関数により記述される。
log10(NaCl,mM)=b0*(DNA,μM リン酸)+b1  r2=0.97
（式中、b0=2.52×10E-3, b1=0.577である）。
【００６９】
我々が異なるDNAプラスミドおよび異なるDNA調製を凝縮過程において用いたとき、上記等式に記述される関数においてさまざまな多様性を観察した。このような違いはおそらく異なる源および構成のDNAに対するポリLリジンの親和性の多様性に関わる。結合親和性の最大化のため、我々は2度の酢酸ナトリウムと2.5倍量の-40℃エタノールによるDNA沈殿を一般的に用いる（方法参照）。我々は異なるDNA型式（すなわち、スーパーコイルド、ニック、および線形）、および陰イオン交換クロマトグラフィー、または塩化セシウム密度勾配遠心を用いて抽出したDNAに対するポリLリジンの結合親和性に明確な違いを見いださなかった。これは連続的DNA沈殿の過程で除かれた、ポリLリジン結合活性を有する異なる物質がDNA調製中に混合していることを示す。
【００７０】
効果的DNA凝縮（図19)に必要なNaCl濃度でのポリLリジンの長さの効果を我々は調べた。異なる源由来の固定濃度DNAを用いて、このようなポリLリジン長と結合の関係を調べた。我々は広い範囲のポリLリジンの長さを用いた。特に、ポリLリジンの長さは商業的に利用可能なものとする。しかし、さまざまな大きさのタンパク質の平均のポリLリジン長は独立に化学合成されたポリLリジンのロットの低角度光照射解析により決定された。各試料の実際の大きさの分布は、素材の分布の60-80％で、平均の大きさの+/-20％にある。単一の大きさ中の広い分布は我々の決定における誤差の元である。にも関わらず、図19の観察できる明確な関係がポリＬリジンの長さと、溶液中のDNA複合体の凝縮に必要なNaCl必須濃度の間に存在する。この関係は150リジン残基までのポリLリジン長の線形関数である。150残基以降は、関数は飽和値に到達し、より長いポリＬリジン長のDNA複合体との凝縮に必要なNaCl必須濃度の上昇は見られない。これらのデータは、ポリLリジンとDNAリン酸骨格の協調的結合に対応する。故に、DNA凝縮に用いたポリLリジン分子の長さの減少により、動物に注射したDNA複合体溶液はより低浸透圧になる。遺伝子治療のためのこの方法の効率における、このようなイオン強度の変化の機能的有意性を評価するため、動物血液中のDNA複合体濃度の希釈についての考察もまた重要である。我々はDNA複合体と図19に示したポリLリジンの範囲より長い領域を含むポリリジンとをラットに、短い領域とをウサギに注射し、両場合で観戦させた遺伝子の発現および陽性を注意した。
【００７１】
好ましい最小の開始塩濃度は担体の折りたたみ活性と塩の拡散活性に依存する。もしNABMが(Lys)8、または(Lys)27であるなら、開始NaCl濃度はゼロで可能である。より長いリジン鎖ではNaCl非存在下では沈殿は起こらない。(Lys)50で行うとき、開始NaCl濃度は好ましくは、最低300mMである。にもかかわらず、TBMが凝縮に影響するタンパク質であるなら開始塩濃度はゼロ程度低くても可能である。
【００７２】
担体は連続的、または小さく分けた工程で加えられる。ある場合、早い流速で、または大量の小分けを開始され、流速または小分けの量を反応の望みの終結点が近づくにつれ、減少される。典型的には0.1から10%の担体溶液は一度にDNA溶液に加えられる。各添加は、好ましくは2秒から2分毎に、恒常的に撹拌される。しかし、より長い設定時間が許される。
【００７３】
ひとつの態様において、好ましくは最低0.5M、しかし1.5MNaCl以下の塩溶液中の核酸は、共有結合した標的細胞部位（たとえば、ガラクトース）を含む、同一濃度のNaCl溶液に含まれる（たとえば0.5から1.5MNaCl）ポリLリジン（109リジン）と混合される。好ましくは、核酸リン酸基と陽性電荷DNA結合部位のモル比は4:1から1:4の範囲、およびより好ましくは1.5:1である。
【００７４】
いくつかの実施例の結果は表104にまとめる。我々は生体内での実験で、試験し、DNA濃度およびポリLリジン長（独立変数）に対する最終NaCl濃度（独立変数）を回帰した、16の実施例を取り上げ、結果を表105にまとめた。
【００７５】
結合
標的結合担体分子についての具象において、核酸結合部位は共有結合的または非共有結合的に、直接的または間接的に、標的細胞結合部位に結合する。結合は核酸と核酸結合部位の共在のあと、またはより多くの場合前に行われる。どちらも結合は核酸と核酸結合部位の結合、または標的細胞結合部位が標的細胞に結合する能力を有する物質と干渉してはならない。
【００７６】
薬理的化合物および方法
TBMに適当に結合した、折り畳まれた核酸は、被験患者または被験動物に対し投与されるために、薬学的に許容的補形剤（すなわち、担体）と混合される。DNA溶液が凝縮DNAおよび弛緩DNAを含むことが可能かは評価される。本発明の化合物は好ましくは十分豊富に凝縮複合物に含まれ、260nmでの吸光度は等濃度の裸DNAの50%以下となる。表103の状態において、裸DNAに対し、凝縮DNAは普通20から30%の吸光度を、弛緩DNAは80から100%の吸光度を有する。
【００７７】
投与はいかなる適切な投与法でもされる。薬量型式は投与方法に対応しなければならない。適切な投与法および薬量型式は血管内注射（注射溶液）、皮下注射（注射溶液、低速接種）、局所的（軟膏、膏剤、クリーム）、および経口（溶液、錠剤、カプセル）を含む。
【００７８】
いくつかの投与法で、たとえば、保護血漿または核酸分解酵素阻害剤を含むことにより薬量型式は分解から結合体を保護するために、形式化されなければならない。
薬量は代替薬量の系統的試験により、該当技術分野において通常行われるように決定される。
【００７９】
ラット（200-300g)は600μgの薬量の実施例1のDNA複合体にいかなる病的効果も成長または健康に対し伴わず許容である。マウス（25g）は150μgのDNA複合体をいかなる問題も伴わず注射される。
【００８０】
人において典型的な試験量は60-120mgのＤＮＡであろう。もしこれは効果するのに低すぎたり、または毒性となるほど高すぎたら、系統的方法により、最適な薬量を決定するまで、これを各々増加、または減少させるだろう。
【００８１】
生命時間の短い細胞、たとえば肝細胞、に対し2カ月毎の1回の薬量の投与が好ましい。
アジュバントはDNA複合体の大きさの減少に(たとえば、2-10mM MgCl)、安定性の増加のために（たとえば、スクロース、デキシトロース、グリセロール）、または輸送効率の改良のために（たとえば、クロロキンやモネンキンなどの向リソソーム性薬剤）用いられる。
【００８２】
複合体はリポソームにそれらを保護するためおよび標的細胞への取り込みを容易にするため（細胞血漿とリポソームの融合による）入れられる。
実験
以下の実施例はある好ましい具象および本発明のある側面を説明するためのものであり、それ自体に発明を限定するために構成されたものではない。  後にある略号として、℃（摂氏温度）、g(重力場）、vol(容量）、W/V(質量対容量）、v/v(容量対容量）、:BSA(牛血清アルブミン）:CTAB(セチルトリメチルアンモニウム臭素）;fmol（フェムトモル）;FPLC（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）;HEPES（N-[2-ヒドロキシエチル]-ピペラジン-N-[2'-エタネスルフォン酸]）;HPLC（高圧液体クロマトグラフィー）;DTT（ジチオスレイトール）;DMF（N,Nジメチルフォルムアミド）;DNA（デオキシリボ核酸）;i.d.(内径）p(プラスミド）;μl（マイクロリットル）;ml(ミリリットル）;μｇ（マイクログラム）;pmoles（ピコモル）;mg(ミリグラム）;MOPS（3-[N-モルフォリノ]プロパンスルフォン酸)M（モーラー）;mM(ミリモーラー）;μM(マイクロモーラー）;nm（ナノメートル）;kdal（キロダルトン）;OD(光学濃度）;EDTA（エチレンジアミンテトラ酢酸）;FITC(蛍光イソチオシアン酸）;LC sulfo SPDP（LC スルフォ-N-スクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオ）プロピオン酸）;SDS(ドデシル硫酸ナトリウム）;NaPO4（リン酸ナトリウム）;Tris（トリス(ヒドロキシメチル）アミノメタン）;PMSF(フェニルメチルスルフォニルフロライド）;TBE（トリス-ホウ酸-EDTA、たとえば、塩酸でなくホウ酸で滴定したEDTAを含むトリス緩衝液）;PBS（リン酸緩衝塩水）;PPBS（1mMPMSF含有リン酸緩衝塩水）;PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）;Tween（ポリキシレン-ソルビタン）;Boehringer Mannheim またはBM（ベーリンガーマンハイム、インディアナポリス,IN）;New England BiolabsまたはNEB（ニューイングランドバイオラボ、バーバリー、MA);Novagen(ノバゲン、メディソン、WI);Pharmacia（ファルマシアバイオテック、ピスカタウェイ、NJ);Perkin Elmer（パーキンエルマー、ノーウォーク、CT); Pierce（ピース化学、ロックフォールド、IL);Primega(プロメガ、メディソン、WI); Qiagen(キアゲン、チャツワース、CA）;Stratagene(ストラタジーンクローニングシステム、La Jolla,CA);USBまたはU.S.Biochemical（U.S.バイオ化学,クリーブランド,OH) 、を使用する。
【００８３】
実施例1
導入
クリスマス病、またはB型血友病は、循環器の機能的共凝集因子IXの欠損のために起こる伴性劣性遺伝病である。人因子IX（hFIX)は肝臓で普通合成される血漿性糖タンパク質であり、複雑な共凝集経路において重要な役割を果たす。活性化したスロンボプラスチン前駆体（XIa因子）により、一度これがセリンプロテアーゼ型(IXa)に変換されると、活性化したタンパク質は共凝集因子VIIIa、カルシウムイオン、およびリン脂質と、因子XをXaに変換する複合体を合成するために相互作用する。IX因子は、血液に分泌する前に必須であるいくつかの翻訳後修飾を肝臓で行う。これらは、ビタミンK依存のアミノ末端のグルタミン酸残基のγ-カルボキシレーションおよびアスパラギン酸のβ-水素化を含む。
【００８４】
リスマス病はおよそ10から20％の全遺伝凝集異常を引き起こす。病気の個人ごとに、循環因子IXのレベルに対応する、広範囲の治療的疾患程度を呈する。機能的因子IXの深刻な欠損を有する患者は自然に出血し、弱い苦痛の後、軟組織および接点をつくる。血漿の融合、またはIX因子の集中は一過的に欠損をなおし、出血を止める。不幸にも、治療的管理は血漿プールへのウィルスの混合により混乱させられてきた。B型肝炎や免疫不全症候群などの、血液-骨感染はここの述べる凝集異常の処置に対し、重大な問題である。
【００８５】
ヒト共凝集因子IXの遺伝子は同定され、配列が読まれた。1,248塩基対長で、相補DNAから416アミノ酸のタンパク質であり、翻訳後修飾がされ、成熟タンパク質は分子量およそ54,000Daであると予測される。ヒト共凝集因子IXをコードする遺伝子はB画家血友病に対応する遺伝子として用いられる。
【００８６】
p-エノピルビン酸カルボキシキナーゼ-ヒト共凝集因子IX（PEPCK-hFIX)のキメラ遺伝子（50％スーパーコイル/50％開円形）はガラクトシル化したポリLリジン（平均長50または109アミノ酸）と、NaCl滴定で凝縮した。この工程はCDスペクトルおよび電子顕微鏡で監視し、直径10-12nmのDNA-担体複合体が決定的NaCl濃度において形成した。我々はこの方法で結合したPEPCK-hFIX遺伝子を成体ラット正常肝臓に導入し、DNA-担体複合体が特異的にこの器官に標的し、hFIX DNA,mRNAおよびhFIXタンパク質が、DNA-担体複合体の用予後140日(試験器官の間中）まで検出されることを示した。DNA結合物の注射後32日後の動物の肝臓から単離したDNAのサザン解析で決定されるように、遺伝子はエピソームとして存在する。PEPCK-hFIX遺伝子の転写は実験の全時間軸において食事により制御された。炭水化物を含まない食事の週1度の投与によりhFIXの血液での誘導が誘導され、ウェスタンブロット解析で検出された。
方法
A.ガラクトシル化
平均鎖長109のL-リジン-HBrまたはL-リジン-Clのポリマー（Sigma)はMonsigigny.et.al.(1984)Biol. Cell.,51,187.)に記載されるようにガラクトシル化される。簡易的に2mgのポリLリジンは、N,N-ジメチルフォルムアミドに溶解した89gのD-ガラクトピラノシルフェニルイソチオシアン酸(Sigma G-3266)と反応させた。溶液は1/10容量の1Mカルボン酸ナトリウムpH9.0添加でpHを9.0に合わせた。反応は10％の効率のとき、溶液中の0.8％の∈-NH3基がグリコシル化されている。チューブはアルミホイルで遮光し、室温で6時間混合する。そして溶液は、スペクトルポア透析チューブ（Fosher 3500M.W.  切片）を用い、500mlの5mMNaCl緩衝液に対し2日間、頻繁に緩衝液を変えて（2交換/1日）透析した。
B.試料の解析
透析後の溶液は、ポリLリジンおよびフェニルガラクトース残基の濃度を測定するため、おのおの205Aおよび250Aのスペクトル解析した。修飾ガラクトースのみが溶液中で250Aで吸収するため、この工程は、透析中の有意な欠失が起こっていないこと、および、ガラクトシル化が完全に起こったことを確認する。
C.複合体形成
血漿DNAは通常の方法により調製された。DNAは10ｍＭトリス-HCl、pH8.0,1mMEDTA含有中に再懸濁され、光スペクトルにより濃度は決定された。DNA調製はRNase A+T1により2度消化された。この工程はRNAが溶液に存在しないことを確認する（RNAはポリLリジンによるDNA凝縮を阻害する）。高濃度のDNAを含む溶液(1.5-2mg/ml)は次の工程で用いられた。典型的DNA凝縮法の例を以下に記載する。
a)  200μlの0.75M NaCl (5M NaCl溶液から加える）中の300μgのDNAは、VIBRAX機(IKA-VIBRAX-VRX)を用い、中速度で撹拌された。この工程は高塩濃度溶液中の効果的長さのDNAポリマーの増加に望ましい、そして効果的にポリLリジン部位とDNA骨格との結合を成し遂げる。
b)  200μlの0.75M NaCl (5M NaCl溶液から加える）中の 84μgのポリLリジン-ガラクトースは30分から1時間の間隔で20μlづつの小分けに滴下する。この量比はモル比でＤＮＡのPO４−基１に対して、担体のNH３基0.7に変換される。
c)  工程の最後で、溶液は濁る。３μlの5M NaClの分注を撹拌しながら、渦巻き撹拌している溶液に、溶液の濁りが消えるまで目で確認しながら加えられる。この工程はゆっくりで、新たな5M NaClの各分注の添加の間30秒おく。2μlづつの5M NaClの段階的添加のあいだ、溶液をCDスペクトル監視にかける。凝縮過程はDNA複合体の特徴的スペクトルの観察により完結する。次の、同じプラスミドDNAより構成されるDNA複合体の調製のため、同じ核酸濃度でCDによる監視なしにこの方法を用いることはでき、結果は完全に再現性がある。異なる濃度のDNAまたは異なるプラスミドを用いるとき、CD監視は繰り返されるべきである。
【００８７】
DNA複合体生成の代替的監視技法は同様の結果を与えることを我々は発見した。この方法は以下の工程より構成される。
A)およびb)同様
c)工程の最後に溶液は濁る。3μlの5MNaClを、渦巻き撹拌している溶液へ目により監視しながら濁りが消えるまで滴下により加えられる。この工程はゆっくりで、新たな5M NaClの各分注の添加の間に30秒おく。そして、溶液は30秒間マイクロ遠心機を用い、最高速（12,000×g)で遠心し、沈殿が現れるのを監視する。沈殿が観察されたなら、2μlの5MNaClが添加される。溶液はさらに0.5分間撹拌され、遠心工程は繰り返される。沈殿の出現は溶液中のDNA複合体の凝集のためであり、DNAが完全に折り畳まれていないことを示す。
結果と議論
ここで記載した手順の開発において、我々はDNA/薬剤-ポリLリジン結合体の物理的構造の監視を、円2色性解析（CD)、および電子顕微鏡を用い行い、機能的複合体が生成される条件を検討した。我々は、正常動物を用い、DNA/薬剤-ポリLリジン結合体の物理的構造の機能的関連を決定した。DNAは、さまざまな濃度のNaCl濃度の存在下において薬剤-ポリLリジン結合体の添加により凝縮した。60μgのRNAの含まないCMP-β-ガラクトシダーゼ(A)またはphFIX(B,C,D,および,E)のどちらも、700mMNaCl最終容量150μlに希釈され、VIBRAX装置(IKA-VIBRAX-VXR)で中速で撹拌される。19μgのαガラクトピラノシル-フェニルイソチオシアン酸/ポリLリジン2結合体(sigma)は、同じ方法で希釈され、撹拌しているDNA溶液に滴下され加えられる。生体内研究の為に、700mMNaCl最終容量150μlに希釈した、300μgのDNA（TE緩衝液pH８に溶解した）は、700mMNaCl最終容量150μl中のαガラクトピラノシル-フェニルイソチオシアン酸/ポリLリジン2結合体95μgと凝縮する。ポリ陽イオンのゆっくりとした添加5M NaClの3μlの分注の段階的滴下による可溶化する濁った溶液の形成へとつながる。濁りの消失は目で監視され、DNA/ポリLリジン複合体溶液の濁りの消える点は電子顕微鏡(E.M.)およびCDスペクトルにより調べられる。
【００８８】
5M NaClの2μlの添加回数の結果の構造変化は図1Aから1に示される。さまざまなNaCl濃度での、加えたポリLリジンの存在下、非存在下での、DNA複合体のことなる構造に対応するスペクトルは、図1に表される。DNAに結合したポリ陽イオンはより長い波長へ交差の転移により特徴づけられる特異的スペクトルとなる。この転移は高い割合でDNA/ポリLリジン結合体のキラル構造、Ｙ型式のDNAに似た非対照構造に対応する。図1Ａに示されるように、2重鎖DNA(1MNaCl中）はさまざまなイオン強度においてポリLリジンの添加により大きく変わる特徴的スペクトルを有する（図1a）。DNA/ポリLリジン結合体のイオン強度が上昇すると、複合体は凝集状態から（図1C)凝縮状態(図1Dおよび図1E)への変化を促進された。これは図1Aに示される複合体のスペクトルの転移に対応する。220nmでのCDスペクトルの変化および溶液のイオン強度の上昇に伴い起こる交差の転移（図1A中の0レーン）は、特にCDスペクトルにより凝縮したDNA複合体形成の監視に重要である。イオン強度が、DNA複合体の凝縮に必要な有効な、範囲よりも上に上昇したなら、複合体は非凝縮、弛緩構造（図1F）にあると予想される。このDNA複合体の構造変化はCDスペクトルにより監視できないので、この工程の成功において正確なNaClの滴定は重要である。図1D(10nmについて）に観察されるDNA複合体の直径は、肝臓のアシアログリコタンパク質受容体による薬剤分子の内在化に望ましい際だった範囲を確かめることを注意することは重要である。
【００８９】
よって、我々は受容体経由細胞内取り込みによる生体内での肝細胞へのDNA輸送の為の小胞としての、DNA構造の機能的関連を確かめた。取り込みの性質の確立のため、アシアログリコタンパク質受容体を有するHepG2細胞による培地からのDNA複合体の除去を行った。DNA複合体の取り込みは100倍モル過剰のアシアロゲチンが競合剤として用いられると、完全に阻害された。これはASGPにより受容体経由細胞内取り込みにより複合体は取り込まれることを示している。
【００９０】
ラットのP-エノールピルビン酸カルボキシナーゼ(PEPCK)の細胞質型遺伝子のプロモーターと、ヒト共凝集因子IX(hFIF)(Ferkol, et. al., FASEB J., 7:1081(1993))のcDNAを結合し構成される、キメラ遺伝子を含む血漿（pPFIX)は、肝臓でのDNA発現および放出に用いられる。トランスフェクトした動物における、hFIX遺伝子の時系列での発現は成熟hFIXペプチドに対する単一クロン抗体を用い、ウェスタンブロットハイブッド形成により、決定された。ラットはトランスフェクト後0.4,8,12,32,72、および136日で殺され、組織および血液は得られた。
【００９１】
トランスフェクト動物の血漿試料（1μl）および1:4希釈の対照ヒト血漿はSDS/10%ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動され、標準的方法を用い、ニトロセルロース膜へ転写された。ブロットは1×PBS,pH7.4,0.03%ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(トゥウィーン20）、および10％(w/v)乾燥スキムミルクにより2時間室温でブロッキングされた。続いて、1/1000希釈のハツカネズミ抗ヒト因子IXに対する単一クロン抗体（３μg/ml)とともに、室温で2時間保持した。単一クロン抗体は親切にKenneth Smith博士(United Blood Services,Albuquerque, New Mexico)により、供給された。膜は３回、1×PBS,pH7.4,0.03%、tween20で洗浄され、1/500希釈のハーシュラディッシュペルオキシダー結合
ヤギ抗ハツカネズミIgg(H+L)とともに保持した。膜は慎重に４回1×PBS,pH7.4,0.03%、tween20で洗浄され、１分間ウェスタンブロット増強化学蛍光検出溶液10mlにつけられた。フィルターより放出された蛍光は写真フィルムに20秒間露出され、検出された。我々はhFIX単一クロン抗体に特異的にハイブリッド形成したバンドを140日まで検出した。非トランスフェクト対照においてはバンドは検出されなかった。トランスフェクション後32日の動物から単離した肝臓は標準的技法によるゲノムDNAの単離に用いられた。トランスフェクト動物由来および非トランスフェクト動物由来の5μgの全DNAはどちらもEcoRIまたはBglIIの一晩消化された。サザンブロット電気泳動は確立されている方法で行われた。トランスフェクトした動物由来DNAは4.5kbpBglIIおよび2.6kbpEcoRIプローブとのみハイブリッド形成した。
【００９２】
脾臓、肺、心臓、および肝臓組織は300μgのDNA複合体をトランスフェクトしたラットから得られた。これらの組織より回収した全ゲノムDNAについてPCR解析は行われた。トランスフェクトされたラットの肝臓でのみ720bpプローブに対し陽性で、脾臓、肺、または心臓、または非トランスフェクト対照動物の肝臓ではまったく陽性でなかった。
【００９３】
ヒト因子IXのmRNA転写物のpFIXトランスフェクトラットの肝臓における存在は、モロニーハツカネズミロイケミアウィルス逆転写酵素で全細胞性肝臓RNAの処理、およびその結果のcDNAのポリメラーゼ連鎖反応による増幅により検出された。簡易には、1マイクロgの全ラット肝臓RNAは10U DNaseI(RNaseなし）により処理され、500nMの(dT)16オリゴヌクレオチドプライマーおよび500nMの各dNTPを含む溶液に加えられる、そして42℃まで温められ、１μlのｃＤＮＡプールはPEPCKプロモーターの5'UTR領域プライマーおよびhFIXのcDNAを増幅するプライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。対照として、混合したプラスミドDNAからの増幅ではないことを確認するため、逆転写酵素によりcDNAに変換していない同じRNA試料もまた、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用いた。産物はアガロースゲル電気泳動および、放射線標識したヒトIX因子cDNAプローブを用いたサザンブロットハイブリッド形成により分離された。我々はトランスフェクトした動物においてのみ特異的にhFIXプローブとハイブリッド形成するのを観察した。非トランスフェクト対照またはcDNAへ逆転写酵素により変換していないトランスフェクト試料においてバンドは見られなかった。
【００９４】
hFIXのトランスフェクト動物の血漿中での機能的活性はヒト因子IXの前共凝集活性の測定により解析された。ある段階での修飾、カオリン活性化、因子IX欠損ヒト血漿での部分スロンボプラスチン時間、が用いられた。血液試料は静脈穿刺により実験動物より得られた。5分の1容量の500mlクエン酸ナトリウムpH5.0は本発明の結合体に加えられ、血漿は-20℃で保存された。試料は2回検定され、それらの活性は24の正常成人男性由来血漿の機能的活性と比較された。正常ヒト血漿において100%機能活性に等価、または3μgのヒト因子IX/mlであった。ラット血漿中の背景の因子IX活性(およそ0.15ユニット/mlの因子IX活性はラット血清にある）は、ここの動物において決定された人因子IXの各値から差し引かれた。背景値は、この解析において用いたヒト因子IX検定で決定したラット因子IXの非特異交差である。血液試料は静脈穿刺により実験動物より得られた。5分の1容量の500ml硝酸ナトリウムpH5.0は本発明の結合体に加えられ、血漿は-20℃で保存された。通常のヒト血漿中のhFIXの濃度は3μg/mlで、およそ15ng/ml（トランスフェクション後、72日）から1050ng/ml（トランスフェクション後、48日）の活性ヒト因子IXはDNA複合体をトランスフェクトした、個々の動物において合成される（表102）。動物に見られる組換えhFIX濃度の小さなばらつきが、放出効率または新たに導入された遺伝子の発現の違いを反映しているのかは、はっきりしない。hFIX遺伝子は動物において、140日まで発現し試験期間中）、48日目にもっとも高いレベルとなったことを注意した（表102）。
【００９５】
遺伝子組換え動物を用い、高蛋白-低炭水化物、エサの投与によりPEPCKプロモーターからの転写誘導をすることが確立された（mcGrane, et. al., 1988,1990;Short,et. al. 1992)。組換え遺伝子の制御された発現を示すため、われわれはトランスフェクト動物血液の解析をhFIXの存在を調べる、ウェスタンブロットハイブリッド形成を高蛋白-低炭水化物エサのまたは通常のえさを1週間与える前および後の試料に対し行った。我々はPFIX遺伝子発現がPFIX遺伝子を含む動物中で3倍にDNA複合体の注入後140日でなったことに注意した。受容体経由遺伝子転移ASGE標的法の代替的方法によりラット肝臓に導入された、同じPEPCK-hFIX遺伝子は、わずか2日間だけ活性であった（Ferkol,et. al., 1993)。これは高くおりたたまれたDNA複合体の使用は本研究で注意した、移植遺伝子の増長した発現に関わることを示唆する。
【００９６】
140日までの維持したレベルのｈＦＩＸの発現の検出は、実験時間軸を通じての発現を明らかにする。機能的hFIXタンパク質を発現している動物の肝臓において、ヒトFIXの800bpの特異的転写物は逆転写酵素による全細胞性RNAから合成されたcDNAのPCR増幅により検出される（図3A）。実験の経時的なｍRNAの存在は、転写活性的DNAの維持されたプールがこれらの動物中に存在し、増長した発現および、hFIX、および特異的mRNAの検出が説明される。
【００９７】
我々はまた、トランスフェクション後32日の動物の肝臓中のトランスフェクトDNAの存在を確立し、その物理状態を調査した。抽出されたDNAはプラスミド(4.5kbp)を線形にするBglIIおよびプラスミドから2.6kbpのキメラ遺伝子をプラスミドから遊離させるEcoRIで、制限酵素解析される。hFIX特異的プローブを用いたサザンブロットハイブリッド形成は、トランスフェクトされた肝臓中にエピソーム状態のまま存在するトランスフェクトされたDNAを論証する。我々はトランスフェクトされたDNAの低い比率の部分はトランスフェクト動物ゲノムにランダムに挿入されている可能性を否定できない。しかしながら肝臓は体細胞分裂の刺激（すなわち、部分肝切除）にさらされないので、我々はこの出来事は改良的なものであると信じる。
【００９８】
実施例2
この実施例において、異なるプロモーター遺伝子構築物(SV40/ルシフェラーゼ）が異なる細胞型（マクロファージ）に異なる標的細胞結合部位の方法により、持ち込まれる。
【００９９】
特異的細胞による循環糖タンパクの認識および取り込みは、分子表面に存在する露出した糖残基の性質により決まる。特異的糖タンパク質の精製系は比較的排除的で、特異的型の細胞を介している。マンノース受容体は糖タンパク質を露出した非還元型のマンノース、グルコース、フルクトース、およびN-アセチルグルコサミン残基で認識する。これらの炭化水素残基を持っている、さまざまなタンパク質、および糖タンパク質結合体が、単離された歯槽マクロファージに結合し、ラットの循環血に入れたマンノース末端糖タンパク質はカッパー細胞により生体内で清浄化される。逆に、肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体によって清浄化されたガラクトース末端糖タンパク質これらの細胞では認識されない。この細胞表面受容体はさまざまな副型マクロファージで発現するが、循環単核白血球では発現しない、そしてマンノース末端糖タンパク質の輸送および内在化を中継する。前リソソーム画分から細胞表面への、マンノース受容体の恒常的再利用、および受容体の発現はマクロファージにより制御される。
【０１００】
マクロファージはさまざまな器官（すなわち、肝臓、脾臓、肺、および骨髄）に存在し、マンノース末端糖タンパク質に結合する、ゆえに受容体経由遺伝子転移のための標的細胞となる。我々はこの仮説を機能的外因性遺伝子のマンノース受容体を発現している細胞への輸送能力を試験することにより検証した。この報告で、マンノース末端新糖タンパク質担体は合成され、表面に豊富に受容体を発現している腹膜浸出物より単離した１次ハツカネズミマクロファージへの受容体経由遺伝子転移のための薬剤として用いた。さらにレポーター遺伝子は、マンノース末端新糖タンパク質担体に用いた正常ラットの肝臓および脾臓に存在するマクロファージに転移された。
方法
材料：DNA修飾酵素、ヌクレオチド、5臭化4塩化3インドイル-β-D-ガラクトピラノシドはベーリンガーマンハイム（インディアナポリス、インディアナ、米国）より購入された。ポリLリジン、a-D-マンノピラノシルフェニルイソチオシアン酸アルブミン、および1-D-ガラクトピラノシルフェニルイソチアシアン酸を含むすべての化学物質はシグマ化学会社(セントルイス、ミネソタ、米国）より得た。ルシフェラーゼ検定系はプロメガ（メディソン、ウィスコンシン、米国）より得た。ラビット抗ガラクトシダーゼ抗体は蛍光イソチオシアン酸結合ヤギ抗ラビットIgGは5Prime to 3 Prime ,Incより得た。すべての培地、血清、および抗生物質はギブコラボラトリー（グランドアイランド、ニューヨーク、米国）より得た。
【０１０１】
マンノース末端糖タンパク質担体の調製
合成糖タンパク質担体は構築され、その中でポリLリジン平均長100(Mr20,000Da)は、N,N-ジメチルフォルムアミドに溶解したa-D-マンノピラシルフェニルイソチオシアン酸を用いグリコシル化した。溶液はカルボン酸ナトリウムでpH9.5にあわせた。22度で16時間遮光し保持し、溶液は2日間、5mM塩化ナトリウムに対し透析を行った。250nmの吸収スペクトルにより決定されるように、およそ0.8-1.0%のポリリジンのアミノ基側はグリコシル化された。対照として、代替の糖タンパク質担体はa-D-マンノピラノシルフェニルイソチオシアン酸の代わりにa-D-ガラクトピラノシルを用い合成された。
【０１０２】
受容体遺伝子およびプラスミド調製
SV40ウィルスプロモーターおよびエンハンサーを含む発現プラスミドpGEMlucを、P.pyralisのルシフェラーゼ遺伝子に接着した。大腸菌LacZおよびインターロイキン2受容体遺伝子に接続された 巨細胞(CMV)プロモーターより構成されるpCMVおよびpCMVIL2rプラスミドは、おのおのレポーター遺伝子として用いられた。プラスミドは大腸菌DH5α中で増幅され、抽出され、標準の方法で精製された(14)。プラスミドの制限エンドヌクレアーゼによる消化は適切な大きさの断片を産生し、精製は1.0%アガロースゲル電気泳動により行われた。プラスミド大きさは以下のようである。：pGEMluc, 6.0; pCMVlacZ, 10.9; およびpCMVIL2r,5.4kB  大腸菌ゲノムDNAはプラスミド調製においてまったく存在しなかった。
【０１０３】
マンノース末端糖タンパク質担体DNA複合体の調製
複合体は実施例１と同様に形成された、しかしDNAはおよそ80％が超らせん、20％が開放円形であった。
【０１０４】
細胞および細胞培養：
Brewerチオグリコレート培地1ミリリットルを腹膜内注射して、4日後１次マクロファージは腹膜孔より単離された。複膜滲出物のマクロファージは前述のように回収され、RPMI培地1640ないに維持された。この方法はおよそマウス当たり5×106の細胞を産生し、形態的細胞の特徴づけ、および細胞化学同定に基づきこのうち40-75%は単核食胞であった。
回収後１または2日後にトランスフェクションは行われた。同定された細胞はおよそ30-60%トランスフェクション時に融合した。細胞の生存率は連続的な細胞数え上げおよびトリパンブルー除外により決定された。
【０１０５】
培養中のマクロファージへのDNA輸送：
単離後１日、腹膜滲出液より単離されたマウス細胞は、PBS(pH7.4)で１回洗浄され、トランスフェクション前に培地は速やかに換えられた。5μg(0.4-0.7pmol)のプラスミドを含む結合DNA複合体は培養培地に適応され、実験が他の意図でない限り、24時間細胞にとどまることを許容された。細胞はタンパク質回収または細胞内βガラクトシダーゼ検定のためトランスフェクション後いくつかの時間点において回収された。
【０１０６】
動物：
成体、雄、およそ体重250gのスプラングダーレーラットは麻酔された。無菌操作により、300μg(20.8-42.0pmol)の発現プラスミド複合体担体を含む0.3から0.6mlの溶液は尾部静脈穴に注射された。複合体注入後異なる間隔でラットは殺害され、トランスフェクト動物の肝臓、肺、および脾臓は解析のため除かれる。さらに、マクロファージは肺胞、骨髄、および脾臓より単離された。骨髄細胞はラットの大腿骨より得られた。実験動物は犠牲になった後、大腿骨は外科的に除外され、１ミリリットルの培地は注入され、骨髄孔から吸引された。単一骨髄細胞の懸濁はパスツールピペットを用いた、緩やかな吸引により調製された。骨髄細胞抽出はRPMI1640培地で、8から12時間維持され、スライドグラスに接触が許され、この時、凝集細胞は免疫化学的染色のため固定された。非トランスフェクション、および擬トランスフェクション動物はすべての実験で、対照として用いられた。動物研究法はCase Western Reserve University Institutional Animal Care Comitteeによりまとめられ、改定された。
【０１０７】
βガラクトシダーゼ活性の細胞化学検定：
βガラクトシダーゼを発現している個々の細胞は、前記のように続く5ブロモ4クロロ3インドイルβガラクトピラノシド(X-gal）と保持することにより同定された。簡易に、細胞はPBS中１％グルタルアルデヒドで15分間固定され、37度で12時間0.5%X-galを含む溶液中で保持された。細胞は、不溶性の灰-黒色色素を合成する非特異的エステラーゼ活性のためにも染色される。組織培養中の100細胞の最低値はβガラクトシダーゼを発現している細胞の割合を決定するために数えられた。組織のβガラクトシダーゼを発現している個々の細胞は前述のようにX-galとの共存により同定された。簡易に、細胞はPBS中0.5％グルタルアルデヒドで10分間固定され、PBS,pH7.5で2度洗浄され、リン酸緩衝液(pH7.4)中の0.5%X-gal、5ｍＭフェリシアン酸カリウム、および1mM塩化マグネシウムを含む溶液中で、37度で6時間保持された。染色された組織はPBS中2%パラホルムアルデヒド/0.5%グルタルアルデヒド中で一晩固定され、標準的手順でパラフィン固定され、5μmの切片に切られた。切片は0.1%核ファーストレッドにより共染色された。隣接した組織切片もまた、非特異的エステラーゼ活性のための焦げ茶に見える染色をされた。青色細胞は光学顕微鏡により同定される。
【０１０８】
マクロファージの細胞化学同定
細胞および組織切片は非特異的エステラーゼ活性を染色したが、これは比較的単核食胞に対し、特異的である。細胞染色は前述のように固定され、1-ナフサル酢酸およびファーストレッドBB塩を含むフィルター溶液中に室温に10分間保持された。組織切片はこの溶液で1-3時間染色され、0.1%核ファーストレッドで共染色される。
【０１０９】
βガラクトシダーゼの免疫化学染色：
生体内でプラスミドpCMVZをトランスフェクトした組織（脾臓および骨髄）から単離した細胞におけるトランスフェクト遺伝子の発現は間接抗体蛍光法により決定された。細胞染色はメタノール/アセトンにより室温2分間固定され、細胞はラビット抗βガラクトシダーゼポリクロン抗体と37度１時間保持される。１次抗体は固定細胞の免疫検出のためにPBS中に1:100に希釈された。蛍光イソチオシアン酸結合抗ラビット免疫グロブリンIgG抗体はPBS中で1:100に希釈され、2次抗体として使用した。細胞は細胞核中に赤の蛍光を作るポリピディウムイオライドにより共染色された。各保温の間、細胞はPBSで5分間の洗浄を3回行った。染色した細胞は蛍光顕微鏡により試験された。
【０１１０】
ルシフェラーゼ活性の検定
培養中の細胞は回収され、溶解され、前述のようにルシフェラーゼ活性を解析された。動物が犠牲にされ、組織内で50mlの低温PBS,pH7.5をまき散らした後、組織はトランスフェクトされたおよび対照ラットより回収された。組織は妖怪緩衝液中で破砕され、22度で10分間の保温を許された。細胞溶解液は4度で5分間遠心され、タンパク質抽出液はルシフェラーゼ活性解析された。溶解液はタンパク質含量が検定され、全タンパク質で測定された統合光ユニットは標準化された。全測定は3回行われ、値の平均を用いた。
【０１１１】
統計解析：
データは平均±標準偏差の平均（SEM)として扱われ、スチューデントニューマンケール(SNK)を用いた分散解析により評価された。
結果
マンノース末端糖タンパク質担体を用いた１次マクロファージへのin vitroトランスフェクション：大腸菌lacZ遺伝子をレポーター遺伝子としてコードする発現プラスミド(pCMVZ)を用い、プラスミド複合体およびマンノース末端糖タンパク質担体は、マウスより単離した腹膜滲出物細胞に適応された。トランスフェクション後24時間で細胞はβガラクトシダーゼ活性の試験をされた。トランスフェクト細胞の数は全試験細胞の5-26パーセントであった。さらに、非特異的エステラーゼ活性を示す一部の細胞や、単核白血球およびマクロファージに特異な細胞化学マーカーは、40%から75%の範囲でトランスフェクト遺伝子を発現した。担体に結合した無関係なプラスミド(pGEMluc)、またはガラクトース末端糖タンパク質担体に結合した発現プラスミド(pCMVZ)から構成される複合体を用いたトランスフェクションによりまったく有意なβガラクトシダーゼ活性を滲出細胞中に見いださなかった。内在性βガラクトシダーゼ活性によるものと思われるかすかな青色染色は、これらの対照細胞に見られることに注意する。細胞数え上げ、およびトリパン青染色に基づく細胞生存率の割合から、対照細胞の青色染色細胞の割合および強さはトランスフェクト細胞よりもずっと低いにもかかわらず、マンノース末端糖タンパク質担体DNA複合体は細胞に対し無毒であるようで、処理後細胞は対照と有意な違いはなかった。
【０１１２】
マンノース末端糖タンパク質担体および発現プラスミドpGEMlucの複合体は、継続時間上昇のため、腹膜滲出より単離した細胞に適応され、トランスフェクト後24時間のトランスフェクト細胞のタンパク質抽出液のルシフェラーゼ活性は測定された。前出の実験において注意したように、トランスフェクト遺伝子の発現レベルはばらついた。トランスフェクト細胞における比ルシフェラーゼ活性の8倍の上昇は見られる（p<0.01)が、ガラクロース末端糖タンパク質担体を用い、形成した複合体で処理した細胞から得たタンパク質抽出物は、非トランスフェクト対照よりも有意に発現活性は高くなかった。さらにトランスフェクトの前に培養培地への、マンノース受容体に対する担体と競合するべき複合体の100倍モーラーのマンノシル化牛血清アルブミン過剰添加はされた。完全に取り込みおよび受容体遺伝子の発現は阻害された(p<0.01)。これらの細胞において、トランスフェクト遺伝子の発現の期間は試験された。マンノース末端糖タンパク質担体および発現プラスミドpGEMlucの複合体は細胞に24時間適応され、タンパク質抽出液はトランスフェクション後いくつかの時間点においてルシフェラーゼ活性検定がされた。最適なトランスフェクト遺伝子の発現は処理後1日に検出され、トランスフェクション後8日でルシフェラーゼ活性は対照と同等まで減少した。
【０１１３】
マンノース末端糖タンパク質担体を用いたマクロファージのin vivoトランスフェクション：
マンノース末端糖タンパク質担体は、正常動物の脾臓および肝臓にレポーター遺伝子の転移のため用いられた。ラットは麻酔され、300μgのプラスミド(pGEMluc)はマンノース末端糖タンパク質担体と複合体形成され、数分以上尾部静脈穴にゆっくりと注入された。担体結合した無関係のプラスミド(pCMVlacZ)よりなる複合体を用いた擬トランスフェクション、および無トランスフェクションの対照は平行して行われた。複合体注入した全ての動物は生き残った。複合体注入後4日目に、肝臓、脾臓、および肺より抽出した組織破砕物中のルシフェラーゼ活性の検定が行われた。我々はトランスフェクト動物より得た脾臓由来タンパク質抽出液中に有意なトランスフェクト遺伝子の発現を観察した。肝臓および肺においてより低いルシフェラーゼ活性レベルが見られた。非トランスフェクトラット、およびマンノース末端糖タンパク質担体に結合した無関係のプラスミド(pCMVlacZ)よりなる複合体で処理した動物はどの組織からのタンパク質抽出にも有意なルシフェラーゼ活性は見られなかった。トランスフェクション後12日目、試験した全ての組織においておよそ背景レベルにルシフェラーゼ活性はなかった。
【０１１４】
トランスフェクト遺伝子発現の細胞分布は、pCMVlacZを含む複合体の注入後3日の脾臓、肝臓の切片において試験された。組織は細胞化学染色により、βガラクトシダーゼ活性解析された。無関係プラスミド(pCMVIL2r)を用いた複合体で処理した動物は対照として用いた。βガラクトシダーゼ発現の検出は脾臓のカプセル状領域のいくつかの小細胞に検出され、細胞化学染色に基づく非特異的エステラーゼ活性を発現する細胞分布を確かめた。対照の脾臓で対応する細胞にまったくβガラクトシダーゼ活性は見られなかった。まれな青色染色細胞は、トランスフェクト動物の肝切片に存在したが、表面マンノース受容体を有し、トランスフェクト遺伝子が発現している肝内皮細胞にはまったく存在しなかった。脾臓より核を有す細胞は単離され、ガラス器具内で染色された。さらに、細胞はトランスフェクトされおよび対照の動物の骨髄および甲状腺静脈滲出液より単離され、X-galを含む溶液で処理され、βガラクトシダーゼ活性の試験がされた。およそ10-20％の脾臓より単離された有核細胞は青く染色された。擬トランスフェクト細胞から得た細胞にはまれに、かすかな染色が見られ、多くは内在性βガラクトシダーゼ活性によるものであった。
【０１１５】
大腸菌βガラクトシダーゼに対するポリクローナル抗体は脾臓の青色染色細胞は、内在性βガラクトシダーゼまたは非特異的なX-galの加水分解によるものでないことを確かめるため、トランス遺伝子の産物の免疫細胞局在のために用いられた。上記動物の脾臓および骨髄から単離した有核細胞はβガラクトシダーゼに対する抗体および蛍光イソチオシアン酸結合抗ラビット抗体で染色され、免疫蛍光の試験がされた。細胞化学検定で青色染色された細胞と類似の形態の、多くの単離された細胞は免疫蛍光染色を有した。さらにこれらの細胞は非特異的エステラーゼ活性を有した。
議論
我々は機能的遺伝子の培養中および全動物の肝臓中のマクロファージへの転移を媒介可能とする合成糖タンパク質複合体を開発した。非共有結合的なマンノース末端糖タンパク質担体結合発現プラスミドはマンノース受容体を発現する細胞に効率的に導入される。受容体経由遺伝子転移系を用いたDNAの導入は、標的細胞の表面の受容体の存在に依存する。アシアロ糖タンパク質受容体を発現しない細胞はこの系でトランスフェクトされなかった。マクロファージに加え、腹膜滲出物中に存在するマンノース受容体を発言しない別の型の細胞（すなわち、顆粒性白血球、リンパ球、フィブロブラストはトランスフェクトされなかった。レポーター遺伝子の発現は非特異的エステラーゼ活性またはペルオキシダーゼ活性などの信頼性のあるマクロファージの同定に用いた細胞化学マーカーを有する細胞に局在した。
【０１１６】
特異的受容体に対するリガンドの特異性および親和性は、外因性の遺伝子の運搬にとって相当に重要である。マクロファージはマンノース末端糖タンパク質に高い親和性および特異性をもって結合する。マンノース末端糖タンパク質は、培養および健全な動物において成功的に導入されたレポーター遺伝子をマクロファージに運搬するが、導入遺伝子の発現は、ガラクトース末端糖タンパク質運搬体を用いてトランスフェクションされた細胞においては検出されなかった。取り込みは、培養培地における糖タンパク質の存在に続き第二に、飲作用または食作用における非特異的な増加が原因であるとは思われない。プラスミドの運搬および発現は培養培地へのマンノシル化されたウシ血清アルブミンの添加により阻害されるが、それはおそらくマンノース受容体における結合部位に競合すると思われる。最終的に、マンノース受容体は露出部位におけるグルコース、フコース、およびN-アセチルグルコサミン残基をも認識するため、代替単糖のマンノースへの置換はDNA-運搬体複合体の親和性を増加させることが可能であった。さらに、単糖は多価の糖タンパク質よりも受容体に対して乏しいリガンドであるため、遺伝子の導入効率は、炭水化物残基をオリゴ糖、すなわち、オリゴマンノースに変換することにより潜在的に改善することが可能であった。
【０１１７】
標的細胞に導入された遺伝子の発現量の決定における主要な因子は、外因性DNAの生存および核への運搬に関与する。受容体を介したエンドサイトーシスによってマクロファージに導入されたマンノース末端糖タンパク質は、前リソソーム酸性小胞に配達され、続いて二次リソソームに輸送される。明らかに、導入されたDNAは、導入遺伝子が発現するために複合体が細胞に侵入した後に分解されることを回避しなければならないため、導入された共役物の一部は破壊を回避する。これらの配達系により細胞に導入されたDNAの物理状態はその生存性およびその後の発現にも寄与する可能性もあり、DNAの高度に凝縮した形態はヌクレアーゼ消化に対してより耐性でありうる。さらに、運搬体-DNA複合体のサイズの小ささは、食作用によってではなく特異的にマンノース受容体を経由したプラスミドの細網内皮系の細胞への導入を許可することも可能である。
【０１１８】
本研究はマンノース受容体を標的とすることによるマクロファージへの遺伝子導入を特異的に指示する潜在能力を示すものであり、理論的にはゴーシェ病のような様々な先天性の代謝異常の治療への接近方法を供給することが可能である。マンノース受容体を標的とした薬学治療がゴーシェ病の患者に対して効果的であることが示されている。末端のマンノース残基が露出するために外部の炭水化物部分が切り開かれるように修飾されたヒトのグルコセレブロシダーゼを用いた患者の反復治療は、肝脾腫大症の減少および貧血の消散によって説明されるように、病気における実質的な臨床上の改善をもたらした。不幸なことに、この治療の費用は多くの患者にとって極めて高額である。骨髄移植は非神経病の形態の病気において治療効果があることが示されているが、移植の潜在的な合併症が多くの患者、特に経度の病気の患者において、この過程の妨げとなっている。しかし、ゴーシェ病は骨髄移植によって治療することが可能であるため、ゴーシェ病の遺伝子治療として提案されていた一つの潜在的な接近方法は、正常なグルコセレブロシダ−ゼ遺伝子の自家造血幹細胞へのエクスビボ(ex vivo)導入およびそれらのその後の患者への導入を含む。あるいは、野生型遺伝子を有する複製不全、組換えレトロウイルスとともに感染された罹患した個体からリンパ芽球を採集すること、および患者へ戻すことが可能であった。分泌された酵素はマンノース受容体を経由してマクロファージに侵入し、治療の二次標的となる。我々が本記事に記載する系においてマクロファージは遺伝子による矯正の一次標的である。遺伝子配達の効率、本技術を用いて達成される発現の時間および量、およびDNA-運搬体複合体の免疫学的特性に関する実際的な質問が取り組まれる必要がある。それにもかかわらず、受容体を介した遺伝子治療はそれらの病気の治療への非侵入性の接近方法を供給する潜在性を有している。
【０１１９】
実施例3
我々はまた、気道上皮において発現しているラットの同義免疫グロブリン受容体に対する抗体のFab断片を用いている。Fabペプチドはポリ-L-リジンと共有結合により共役し、以下に記載する手順を用いてSV40-ルシフェラーゼ発現ベクターと複合体を形成させた。DNA複合体を注入したラットは受容体を発現した組織においてのみ、8日間(実験期間)ルシフェラーゼ活性を有した。これらの発見は、DNAを成体の動物の特異的な組織に運搬するという点におけるこの系の柔軟性を強調するものである。機能的な遺伝子をインビボで細胞に導入することを許可する、呼吸管への遺伝子導入の幾つかの方法が発達してきた。しかし、これらの接近方法の多くは、特異性に欠け、細胞障害性を有している。様々な動物のモデルにおいて、レポーター遺伝子を呼吸上皮細胞に配達するために複製欠損、組換えアデノウイルスが使用されてきた。しかし、アデノウイルス処理に対する生理的効果はそれほど理解されておらず、最近の証拠は、高い力価で動物に投与された最初の世代のアデノウイルスベクターは、肺において実質的な炎症反応を産生することを示唆している。機能遺伝子を気道上皮に導入するためにリポソームもまた利用されてきたが、この接近方法は一般的に細胞に対して障害的であり、特異性に欠ける。
【０１２０】
受容体を介した遺伝子導入は、非感染性で非障害性のベクターを用いてDNAを特異的な標的細胞に配達するための方法を供給する。この型の遺伝子導入は、特異的な組織が、相当な大きさのDNAプラスミドを用いて標的とすることを可能にし、導入遺伝子のみならず、プロモーターおよびエンハンサー因子の配達が可能となった。受容体を介した系の場合においては、外因性のDNAの配達はDNA-運搬体複合体の安定性、標的細胞の表面の特異的受容体の存在および数、受容体-リガンド親和性および相互作用、および複合体の効果的なインターナリゼーションに依存している。さらに、導入された遺伝子の発現はそれらのエンドソーム小胞からの排出および標的細胞の核への移動に頼っている。受容体を介したエンドサイトーシスを利用することにより配達された動物全体における導入遺伝子の発現期間は一般的に一時的であり、処理後72時間以内で背景の水準に戻る。これは、アデノウイルス-ポリリジンおよびトランスフェリン-アデノウイルス-ポリリジンベクターを用いて、気管を経た経路で気道上皮細胞にレポーター遺伝子を導入した場合である。
【０１２１】
我々は、ヒト気管上皮細胞の一時培養において、同義免疫グロブリン受容体(pIgR)を標的とすることは、受容体を産生する細胞に特異的に導入遺伝子を効果的に配達することを可能にすることを証明している。同義免疫グロブリン受容体は、気道上皮および粘膜下腺細胞を含む粘膜上細胞においてのみ発現しており、大きな分子のインターナリゼーションおよび非分解性の導入のために特異的に適用されている。本報告において、我々は同義免疫グロブリン受容体をインビボで標的とすることにより、受容体を産生する細胞を有する組織における導入遺伝子の、トランスフェクション後最大6日間の発現をもたらすことを示す。
方法論
材料：DNA-修飾酵素、ヌクレオチド、および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドはBoehringer Mannheim (インディアナポリス、インディアナ州、USA)より購入した。ルシフェラーゼ分析系はPromega(マディソン、ウィスコンシン州、USA)より得た。プロテインA MAPS アガロースカラムはBioRad(リッチモンド、カリフォルニア州、USA)より購入した。パパインおよびポリ(L-リジン)はSigma Chemical Company (セントルイス、ミズーリ州、USA)、およびN-スクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロプリオン酸はPierce Chemical Company (ロックフォード、イリノイ州、USA)より得た。マウス抗ヒト・インターロイキン2受容体モノクローナル抗体はDako Corporation(カーペンテリア、カリフォルニア州、USA)より得て、蛍光イソチオシアン酸-標識二次ヤギ抗マウス抗体はSigma Immunochemicals (セントルイス、ミズーリ州、USA)から得た。イムノペルオキシダーゼ染色手順で使用したベクタステインABC法はVector Laboratories(バーリンガム、カリフォルニア州、USA)から購入した。あらゆる培地、血清、および抗生物質はGibco Laboratories(グランドアイランド、ニューヨーク州、USA)より得た。
【０１２２】
Fab断片の調製：ラット分泌成分を用いて免疫化したウサギに由来する抗体の単離およびパパイン消化は以前に記載されている。簡潔に述べると、ポリクローナル抗体をラット血清からプロテインA MAPS アガロースカラムを製造者による記載に従って用いて単離した。単離された免疫グロブリンG (2mg) は、20μgのパパインを用いて100mM 酢酸ナトリウム(pH 5.5)、50mM システイン、および1mM EDTAの存在下で37℃で12時間処理した。Fab断片はプロテインAクロマトグラフィーにより無傷の抗体およびFc断片から分離した。不適切なFab(IFab)は免疫前ウサギ血清から得られたIgGのパパイン消化により産生される。
【０１２３】
Fab-ポリリジン共役物の調製：抗-pIgR 免疫グロブリンGのFab断片は異なる2つの機能を持つクロスリンク試薬であるN-スクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸(SPDP)を用いてポリ(L-リジン) (Mr 10,000 Da) に共有結合で結合させた。Fab断片はモル濃度で75倍過剰のSPDPとともに0.1M りん酸緩衝塩溶液(PBS)pH 7.5において、22℃で60分保温した。2-ピリジルジスルフィド構造は透析によって除去された。修飾されたFab断片のジスルフィド架橋は25mMジチオスレイトールを用いて開裂させた。ポリ(L-リジン)およびSPDPの両方を修飾されたFab断片に対して15倍モル濃度過剰量添加し、反応は22℃で24時間実行した。共役物は低分子量反応産物を除去するために透析し、その結果得られたタンパク質を0.1% SDS-7.5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分離することにより解析した。既に記載されたように、共役物の解析の結果、大きさが200kDaを越えるタンパク質に対応する、低速で移動するタンパク質であることが証明された。
【０１２４】
レポーター遺伝子およびプラスミドの調製：発現プラスミドであるpGEMlucはP.pyralis ルシフェラーゼ遺伝子を結合させたSV40ウイルスプロモーターを有する。各々E.coli lacZおよびインターロイキン2受容体遺伝子に結合したサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターから成るプラスミドpCMVZおよびpCMVIL2rもまたレポーター遺伝子として使用された。ルシフェラーゼ活性の研究に際して、これらのプラスミドは不適切なDNA(IDNA)の対照として使用した。プラスミドはE.coli DH5aにおいて増殖させ、抽出し、標準的な技術によって精製した。制限エンドヌクレアーゼを用いたプラスミドの消化は適切な大きさの断片を生じ、精製は1.0%アガロースゲル電気泳動により行われた。プラスミドの大きさは以下である：pGEMluc, 6.0; pCMVlacZ, 10.9; およびpCMVIL2r, 5.4kB。プラスミド調製におけるバクテリアゲノムDNAまたはRNAの混在は存在しなかった。
【０１２５】
Fab-ポリリジン-DNA複合体の調製：運搬体-DNA複合体は既に記載の方法を用いて形成された。
動物：抗ラット分泌成分Fab抗体-ポリリジン運搬体はレポーター遺伝子を生きている動物の気道および肝臓に導入するために使用した。およそ250gの体重の成体の雄のSprague-Dawleyラットに麻酔をかけた。無菌技術を用いて、運搬体と複合体を形成した300μgの発現プラスミドを有する0.3から0.6mlの溶液を尾部の大静脈に注入した。ラットは複合体の注入後、幾つかの異なる時期に犠牲となり、解析のため様々な器官を取り出した。運搬体に結合した無関係なプラスミド、または無関係なFab断片によって作られた運搬体に結合した発現プラスミドから成る複合体を用いた動物の偽トランスフェクションもまた並行しておこなった。動物の研究実験計画はCase Western Reserve University Institutional Animal Care Committeeによって再審査され、許可された。
【０１２６】
β-ガラクトシダーゼ活性の細胞化学分析：組織においてβ-ガラクトシダーゼを発現している個々の細胞は既に記載されているように、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-βガラクトピラノシド(X-gal)とともに保温した後に同定された。簡潔に述べると、細胞をPBSにおける0.5%グルタルアルデヒドの溶液内で10分間固定し、PBS, pH7.5で2回洗浄し、リン酸緩衝塩溶液(pH7.4)における0.5% X-gal, 5mM フェリシアン酸カリウム、5mM フェロシアン酸カリウム、および1mM 塩化マグネシウムを含む溶液とともに37℃で4時間保温した。染色した組織はPBSにおける2%パラホルムアルデヒド/0.5%グルタルアルデヒド内で一晩4℃で固定し、標準的な手順によってパラフィンで取り囲み、5μm断面に切断した。断面は核をNFR(ヌクレアファースト赤)法で後染色した。青い色の細胞は光学顕微鏡で同定された。β-ガラクトシダーゼを発現している細胞の断面あたりの割合を決定するため、最小100個の細胞を計測した。さらに、隣接した断面を標準的な実験計画を用いて、アルシアンブルー/周期的酸シッフまたはヘマトキシロン/エオシンで染色した。
【０１２７】
ルシフェラーゼ活性の分析：培養中の細胞を採集し、溶解し、既に記載されてた通りにルシフェラーゼ活性を解析した。組織は動物を犠牲にした後、トランスフェクションさせたおよび対照のラットから採集し、低温のPBS, pH7.5とともに5分間in situに灌流した。これらの組織は溶解緩衝液において均質化し、22℃で10分間保温することが可能となった。細胞の溶解産物は次に4℃で5分間遠心し、タンパク質抽出物をルシフェラーゼ活性を解析した。溶解産物はタンパク質容量を分析し、取り込んだ光の単位(10秒間隔)を全タンパク質容量に対して標準化した。全ての測定は3回行われ、その値の平均値として表した。
【０１２８】
インターロイキン2受容体の免疫組織化学染色：プラスミドpCMVZをトランスフェクションした組織における導入遺伝子の発現は間接免疫蛍光法により決定された。様々な組織の凍結断面はアセトンにより-20℃で10分間固定し、自己蛍光を減少させるため、22℃で10回処理した。断面は次にPBS, pH 7.5における10%ヤギ血清とともに室温で1時間保温した。細胞は続いてマウスモノクローナル抗-インターロイキン2受容体抗体および蛍光イソチオシアン酸-共役したヤギ抗マウスIgGとともに保温した。両方の抗体はPBSで1:100に希釈し、各々の保温の間に、細胞はPBS, pH 7.5で5分間、3回洗浄した。染色した細胞は蛍光顕微鏡によって観察した。
結果
抗分泌成分Fab抗体-ポリリジン運搬体を用いたインビボでのトランスフェクション：抗ラット分泌成分Fab抗体-ポリリジン運搬体-DNA複合体を注入した全ての動物は生き残った。肝臓、肺、脾臓、および心臓から抽出した組織ホモジネートにおけるルシフェラーゼ分析を複合体の注入から48時間後におこなった。我々はトランスフェクションさせた動物から得た肝臓および肺からのタンパク質抽出液内に有意な量の導入遺伝子の発現を観測した。pIgRを発現しない組織である脾臓および心臓においては検出できるルシフェラーゼ活性は見られなかった。さらに、運搬体に結合した無関係なプラスミド(pCMVlacZ)または無関係なFab断片を基にした運搬体と結合した発現プラスミド(pGEMluc)から成る複合体とともに処理した動物は、調査したあらゆる組織において有意なルシフェラーゼ活性をもたらさなかった。このように、pIgRを産生している細胞を含む組織のみがトランスフェクションされ、トランスフェクションは無関係なFab抗体を基にした複合体の非特異的な取り込みに原因があるとは考えられない。
【０１２９】
4種類の組織に由来するタンパク質抽出液におけるルシフェラーゼ活性を、複合体の注入後の異なる時点で測定した、導入遺伝子の発現の経時変化を展開した。ルシフェラーゼ活性はpIgRを有する組織である肝臓および肺において持続し、それぞれ注入後4から6日で、タンパク質抽出物1mgあたり 13795±4431 および 461402±230078 摂取光量単位(ILU)の最大値に達した。受容体を発現しなかった組織は有意な導入遺伝子の発現を持たなかった。
【０１３０】
導入遺伝子の発現の細胞内分布を様々な組織の断面において調べた。pCMVlacZを有する複合体の注入から3日後に、気管、肺、および肝臓の組織断面にβ-ガラクトシダーゼ活性を測定する細胞化学染色をおこなった。無関係なプラスミド(pCMVIL2r)を用いて作られた複合体で処理した動物を対照として使用した。気管における発現は上皮表面に並ぶ細胞に限定されていた。偽トランスフェクションした動物からの気管断面においてはβ-ガラクトシダーゼ活性は検出されなかった。導入遺伝子の発現は変動的であり、呼吸上皮のある領域においては、50%以上の細胞が青色に染色された。一般に、発現は呼吸上皮細胞の10-20%の範囲である。気道の隣接する断面のアルシアンブルー／周期的酸シッフ染色に基づいて、鞭毛を有する細胞および分泌(杯状)呼吸上皮細胞の両方が、β-ガラクトシダーゼ活性を表した。トランスフェクションさせた動物または対照の動物のいずれにおいても、末端気道または肺胞における導入遺伝子からの発現は検出されなかった(データは示していない)。これはin situ免疫組織化学染色に基づくpIgRを発現している上皮細胞の分布に一致する。希少な粘膜下腺は気道の断面において明確であり、微かな青色の染色が記されているのみであった。非-、偽-、およびトランスフェクションされた動物からのあらゆる気管断面において炎症反応は発見されなかった。さらに、インビトロで呼吸上皮細胞の形質導入におけるレポーターとして使用されているがこれらの細胞において自然では発現しない表面タンパク質である、ヒトのインターロイキン2受容体に対して向けられたマウスモノクローナル抗体を、プラスミドpCMVIL2rをトランスフェクションした動物の気管における導入遺伝子産物の免疫蛍光局在を調べるために使用した。気管の連続断面に対して、蛍光の存在を調べ、トランスフェクションさせた動物から得た数多くの呼吸上皮細胞の頂膜を適切に染色した。pCMVlacZによって偽-トランスフェクションされた動物の気道上皮において蛍光染色は検出されなかった。希少な、青色に染色された肝細胞もまたトランスフェクションされた動物の肝臓断面において発見された。導入遺伝子の発現は、非-または偽-トランスフェクションされたラットのいずれからの肝臓においても同定されなかった。
議論
我々は、ポリ(L-リジン)に共役し、プラスミドDNAに非共有結合的に結合したラット同義免疫グロブリン受容体に対する免疫グロブリンGのFab部分からなる標的複合体の注入に続くレポーター遺伝子の気道上皮へのインビボでの成功的な導入について報告する。本技術は、この受容体が発現している組織である肝臓および肺に特異的に導入遺伝子を配達する。脾臓および心臓のようなこの受容体を発現していないその他の組織はトランスフェクションされなかった。さらに、無関係なFab断片により調製された共役物の注入後には発現が検出されず、および無関係なレポーター遺伝子を有するプラスミドにより調製された複合体もまた検出可能なルシフェラーゼ活性を産生しなかった。このように、この複合体は受容体を産生する組織を特異的に標的とし、受容体の本来のリガンドの本来の移動はインビボでの導入遺伝子の取り込みに干渉しない。
【０１３１】
現在使用可能な呼吸管への遺伝子を導入するための策略の大部分は、呼吸上皮細胞を特異的に標的としないウイルスベクターに依存しており、気道の標的化を可能にするために気管内の配達経路に頼っている。リポソームおよびアデノウイルス-トランスフェリン-ポリリジン共役体などの他の方法によって気道上皮に特異的に遺伝子導入を指示するために気管内の浸透もまた使用されている。陽イオン性のリポソームに結合したDNAの全身性の配達は選択的ではなく、異なる組織の多くの型の細胞に機能遺伝子を導入する。pIgRを産生する細胞に対する受容体を介した遺伝子導入は嚢胞性線維症の患者の気道における欠陥細胞を標的とすることに有用となりうる。
【０１３２】
実施例4
ファミリー性高コレステロール血症(FH)は、激しいアテローム性動脈硬化および心臓血管病が特徴的なヒトの遺伝病である。低密度リポタンパク質(LDL)の取り込みを仲介する受容体の遺伝子における変異がこの病気の原因である。500人に1人がFHの原因であるLDL受容体の遺伝子における変異のヘテロ接合体である。結果として、LDLは正常の速度のわずか3分の2で血漿から除去される。人生の40から50年で、血漿におけるLDLの上昇した量が患者に徴候性のアテローム性動脈硬化を引き起こす。FHホモ接合体(1億人に1人)は、変異により影響を受けるタンパク質のドメインに依存する機能的なLDL受容体を殆どまたは全く持たない。これは20歳前に徴候性冠アテローム性動脈硬化をもたらす。胆汁酸樹脂およびコレステロール合成の阻害剤による処理は、単一の正常遺伝子からのLDL受容体の産生を刺激することでヘテロ接合体のFH患者において相当な成功を収めている。FHホモ接合体では薬剤治療に対する反応はない。刺激され得るべき正常遺伝子を欠くため、変異を有する遺伝子を置換することがホモ接合体FH患者の治療における唯一可能性のある接近方法である。肝臓はLDL異化作用に責任を担う主要な器官であるため、この器官を標的とする病気の治療のために2種類の接近方法：肝臓移植および遺伝子治療、が取られた。FHを有する患者への正常な肝臓の移植は高脂血症を正常化することが可能であるため、肝細胞LDL受容体の再構成が表現型の改善にとって充分であることが示唆される。この結果に基づいて、FHの治療のために遺伝子治療を利用して行われたあらゆる接近方法が肝細胞を標的としている。
【０１３３】
病気の機構を理解するために、器官におけるコレステロールの代謝／運命を知ることが必要である。各々の細胞は細胞膜の合成のためにコレステロールを必要とする。さらに、副腎および卵巣における黄体はステロイドホルモンの合成のためにコレステロールを必要とする。肝臓は胆汁酸を合成するため、最も高い需要を有する器官である。コレステロールは、血液中の内因性コレステロールの主要な運搬体である低密度リポタンパク質(LDL)の受容体を介した取り込みから、または生合成によって表層組織において得られる。HMG CoAリダクターゼはこの経路における律速酵素である。食物のコレステロールは、肝臓における特異的受容体によって取り込まれるキロミクロン粒子によって血流に運び込まれる。コレステロールを異なる組織に供給するために、肝臓は、トリグリセリド、コレステロールエステル、およびアポタンパク質C, EおよびB-100を成分とする非常に低密度のリポタンパク質(VLDL)粒子を分泌する。脂肪組織および筋肉によるVLDLからのトリグリセリドの取り込みはこれらの粒子を中間密度リポタンパク質(IDL)に変換する。肝臓および副腎において最も高い濃度で存在するが残りの組織においても存在するLDL受容体は、IDLのアポEおよびアポB-100構成因子を認識する。このように、正常な条件下では、IDLは大部分がLDL受容体を介した取り込みによって血流から清浄される。残りのIDLはLDLに変換され、アポB-100構成因子を認識するLDL受容体により同様に取り込まれる。器官からのコレステロールの清浄は肝臓によって実行され、そこで胆汁酸に変換され、消化管に分泌される。大部分のコレステロールは腸において肝臓の再利用化のために再吸収されるが、この経路は出口の道筋を供給する。
【０１３４】
このように、血液からIDLおよびLDLを清浄する能力をもたない非機能LDL受容体の存在は血清LDL量、およびそれゆえに総血清コレステロール量の上昇をもたらす。これは、動脈壁におけるコレステロールの堆積、ゆえにアテローム性動脈硬化の原因である。
【０１３５】
ワタナベ遺伝性高脂血症(WHHL)のウサギが以前から高コレステロール血症の正常化の遺伝子治療技術の効果を研究するために使用されている。FH患者において発見された変異の種類の一つと同様に、LDL受容体のリガンド結合ドメインにおけるA12ヌクレオチドのフレームのあった欠失は、FHのそれらと並行して、徴候、進化および組織病理学をもたらした。
材料と方法
DNAプラスミドの構築
本研究において使用したプラスミドはpLDLR-17, PCK-hLDLR, PCK-rLDLR, およびSV40-ルシフェラーゼである。pLDLR-17はDavid Russell博士(テキサス大学医療センター、ダラス)より供給され、ヒトLDL受容体cDNAに結合したサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター／エンハンサーから成る。それはヒトLDL受容体cDNAに結合したアルファルファモザイクウイルス4 (AMV4)RNAの5'非翻訳領域(UTR)に対応するDNAの断片を含む。この配列はタンパク質合成における開始因子の要求を減少させることによって翻訳の増強因子として働く。PCK-hLDLRプラスミドはhLDL受容体cDNAを、pLDLR-17から、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)プロモーター(-460から+73)およびサルウイルス40 (SV40)スモールT抗原由来のイントロンおよびポリアデニル化シグナルを有するpTZ18Rベクター(Pharmacia)にサブクローン化することにより構築している。2工程の方法において、hLDL受容体cDNAはSacIおよびSmaIを用いてpLDLR-17から切り出され、T4 DNAポリメラーゼを用いて平滑化した。平滑化された断片はpTZ18RベクターのHincII部位にサブクローン化した。cDNAは次にXbaIおよびSalIにより切り出し、pTZ18R-PEPCKプロモーター-SV40ポリAプラスミドの相同部位に導入した。pPCK-rLDLRの構築のためには、ウサギLDL受容体cDNAを有するprLDLR-9 (James Wilson博士、ペンシルバニア大学より供給された)から得たEcoRI-EcoRI断片をpBluescript (Stratagene) のEcoRI部位にサブクローン化した。この構築物はSacIによる消化および平滑化を行い、次にXbaIにより消化し、PEPCKプロモーター(-460から+73)およびサルウイルス40 (SV40)スモールT抗原由来のイントロンおよびポリアデニル化シグナルを有するpTZ18RベクターのXbaI-平滑化したHindIII部位に直接的にサブクローン化した。SV40-ルシフェラーゼプラスミド(Promega)は、pUC19ベクター(Pharmacia)に挿入されたP.pyralis ルシフェラーゼ遺伝子に結合したSV40ウイルスプロモーターおよびエンハンサーを有する。
【０１３６】
ポリ-L-リジン-DNA複合体の形成
ガラクトシル化されたポリ-L-リジンの産生：ポリ-L-リジンは記載されているように(PNAS)ガラクトシル化された。2mg のポリ-L-リジン-HBr (Sigma P-7890, 平均鎖長, 100)を85mg のa-D-ガラクトピラノシルフェニル-イソチオシアン酸(Sigma G-3266)とともに反応させた。溶液は1/10の体積の1M 炭酸ナトリウムpH 9によりpH 9 に調整した。チューブはアルミホイルで遮光し、室温で16時間反応し、Spectra-Por 透析チューブ(分子量3500切り捨て)を用いて500ml の5mM NaCl に対して2日間、緩衝液の頻繁な交換(4交換／日)とともに透析した。反応は?であり、溶液中に存在するうちの0.8から1%のNH3基のガラクトシル化をもたらした。
【０１３７】
DNAの凝縮のための基本的な実験計画：プラスミドDNAは標準的な技術を用いて調製した。DNAは1mM EDTA を有する10mM Tris-HCl, pH 8.0に再懸濁し、DNAの濃度は分光光度計により決定した。DNA調製物はRNAse A+T1 により2回処理した。この工程はRNAが溶液内に存在しないことを明確にする(RNAはポリ-L-リジンによるDNAの凝縮を阻害する)。次の工程においては高い濃度のDNA (1.5-2 mg/ml)を有する溶液を使用した。DNA凝縮の一般的な実験計画の例は以下のようなものである：
a)  200ml の0.75M NaCl (5M NaCl溶液から添加した)内の300mg のDNAを、VIBRAX装置(IKA-VIBRAX-VXR)を用いて中程度の速度でボルテックスする。この工程は、ポリ-L-リジンの一部のDNA骨組への効果的な結合を達成する高塩濃度溶液におけるDNAポリマーの効果的な長さを増加させるために必要である。
【０１３８】
b)  200ml の0.75M NaCl (5M NaCl溶液から添加した)内の120mg のポリ-L-リジンまたはガラクトシル化されたポリ-L-リジン(平均鎖長100)を5μlのアリコートにおいて30分から1時間の周期で滴下により添加する。この量は1 DNA PO4-基に対して1運搬体NH3+基のモル比に換算する。
【０１３９】
c)  溶液はその過程の最後には不透明になる。5M NaClの3μlのアリコートを目で見て不透明色が消えるまでボルテックス中の溶液に滴下により添加する。次に溶液を円偏光二色性(CD)分光器による検討にかけた。DNA/ポリ-L-リジン複合体の溶液はまたJEOL-100C電子顕微鏡を用いて解析した。凝縮過程はDNA複合体の診断スペクトルが観測されたときに完遂し、さらに電子顕微鏡によって確立される。次に続く同一のプラスミドDNAに存在するDNA複合体の同一のヌクレオチド濃度の調製物においては、実験計画はCDによる検討なしに続行することが可能である。異なる濃度のDNAまたは異なるプラスミドを使用するときはCDによる検討は繰り返すべきである。
【０１４０】
動物
6個体の成体の雄のWatanabeウサギ(2.8-3.2  Kgの体重)をこれらの研究に使用した。これらの動物は国立健康研究所において確立された個体群から購入した。動物にDNA複合体を導入するために、我々は3-10mlのDNA-複合体溶液(〜400-900mM NaCl)の、ウサギの耳の縁の静脈への1回の注入を行った。およそ1.5mlの血液を耳の動脈から午後4時に採取した。血清コレステロールの濃度の決定はクリーブランド大学病院の臨床研究所において300μlの血清から行った。DNA複合体の導入に続く異なる時点においてウサギを肝臓の生検にかけた。総DNAは肝臓の試料から単離し、導入DNAの存在を検出するためにPCR増幅にかけられた。ウサギ#774はロバスタチン(Mevacor, Merck および Dohme)によって1日当たり10mg の量で経口で処理した。
【０１４１】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅
処理された動物の肝臓における導入DNAの存在を検出するために、総DNAを生検において得られた肝臓の試料から単離した。ウサギ#737の場合は、PEPCK遺伝子の5' UTRのエキソン1内の32-50の位置に対応する上流プライマーおよびヒトLDL受容体cDNAのヌクレオチド589-607に相補的な下流プライマーを用いて、興味の対象であるDNAをPCRにより次に増幅した。増幅された断片は、ヒトLDL受容体cDNAの5'末端に対応する32P-dCTPにより標識された700bpの断片とハイブリッド形成する1100bpのバンドに対応する。キメラCMV-hLDL受容体遺伝子に対応する適切なプライマーは、ウサギ#774から得られた肝臓組織に由来する導入プラスミドのPCR増幅に使用される。
【０１４２】
ELISA
96穴微小穴プレートの各々の穴を覆うため、新規に調製されたガラクトシル化-ポリ-L-リジン／DNA複合体、プラスミドDNA、またはガラクトシル化-ポリ-L-リジンのいずれかのDNA 1μgに対応する75μlのアリコートを一晩4℃で保温した。翌日、穴をリン酸-緩衝化塩溶液(PBS)により3回洗浄し、PBSにおける5%ウシ血清アルブミン(BSA)とともに37℃で2時間ブロック処理を行い、PBSにおいて1% BSAおよび0.5% Tween-20を含む洗浄緩衝液により3回洗浄した。DNA複合体の1:3および1:30の希釈液での反復投与の前および後の異なる時点においてウサギ#774から得た血清の75μlを穴に添加し、37℃で90分保温した。穴は次に洗浄緩衝液で洗浄し、1:3000の希釈で二次抗体とともに保温した。二次抗体はアルカリホスファターゼ(Sigma)と共役した、ウサギ免疫グロブリンに対するマウスモノクローナル抗体からなる。洗浄緩衝液による最後の洗浄の後、反応を展開するために穴にグリシン緩衝液における1mg/mlのpNPP基質を添加し、410nmにおける分光計の読みをDynatech自動測定ELISA読み取り機において読み取った。120分において取られた値を比較のために選択した。
結果
1.  ウサギ#676：3mg のキメラPCK-hLDLR遺伝子を含むポリ-L-リジン/DNA複合体の注入。最初の組の実験においては、我々は我々の研究室において開発された技術を用いて、3mgおよび9mgのガラクトシル化されたポリ-L-リジンを有するpPCK-hLDLRを凝縮し、それらをワタナベウサギの表層循環に注入した。ラット由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)の細胞質型の遺伝子に由来するプロモーターは、詳細に性格が決定されている。このプロモーターは肝臓において高い水準で発現しており、その発現が食事およびホルモンによって制御することが可能であるため、本実験において使用した。栄養飢餓、および高タンパク質で炭水化物を含まない食事はPEPCK遺伝子の転写を刺激し、一方で高炭水化物の食事はPEPCKプロモーターからの転写を減少させる。さらに、cAMPおよびグルココルチコイドは肝臓におけるPEPCK遺伝子の発現を誘導し、インシュリンは阻害する。PEPCKプロモーターはこのように、肝臓に導入された結合構造遺伝子の制御に適しており、LDL受容体の肝細胞での発現を調べる我々の最初の実験において使用した。我々の最初の接近方法においては、3mgのDNAを含むポリ-L-リジン/DNA複合体を注入した。このDNAの基本的な量はラットにおいて既に行われた実験を基にして決定した。図13に示すように、弛緩状態でのpPCK-hLDLRプラスミド3mgを含むDNA複合体溶液のウサギ#676への投与は総血清コレステロール量における有意な減少をもたらさなかった。同一のDNA3mgを含む適切に凝縮したDNA複合体の2度目の注入は血液内のコレステロール量の20%の減少を引き起こした。この2度目の投与の4週間後、コレステロールはおよそ処理前の量に戻り、約35日でピークに達した。
【０１４３】
PCK-hLDLレポーター遺伝子の発現に起因する総血清コレステロール量の20%の減少は、FH患者における異常の助けにはなるが、総合的な軽減にはならないと思われる。我々の最初の実験からこれらの実験に至るまでの動物に導入した3mgのDNAに対応するポリ-L-リジン/DNA複合体の数は、肝臓におけるアシアロ糖タンパク質受容体の総数の0.01%を説明するものである。結論として、DNA複合体の濃度上昇とPCK-hLDL受容体遺伝子の発現の間の線型な相関が期待される。
【０１４４】
2.  ウサギ#737：9mgのキメラPCK-hLDLR遺伝子を含むポリ-L-リジン/DNA複合体の注入。
我々の第2の実験においては、ガラクトシル化されたポリ-L-リジンとともに適切に凝縮された9mgのPCK-hLDLR遺伝子をウサギ#377に投与した。図14に示すように、この処理は総血清コレステロール量の38%の減少をもたらし、およそ5週間持続した。このように、DNA複合体の量における3倍の増加は総血清コレステロール量における2倍の減少をもたらした。
【０１４５】
3.  ウサギ#16：3mgのCMV-hLDLR遺伝子を含むDNA複合体の注入。
PEPCK遺伝子の細胞質型のプロモーターは、肝臓においてほぼ特異的に、および制御される様式において発現を強制する利点を有している。それらは生理的でも制御されているものでもないが、ウイルスプロモーターは結合した構造遺伝子に高い量の発現を与える。キメラCMVプロモーター／エンハンサーは遺伝子導入のためにアデノウイルスを使用したWHHLウサギにおける遺伝子治療のために成功的に使用されている。近年、Kozarskyらは、CMVプロモーター／エンハンサーおよびキメラ型β-アクチン／CMVプロモーターは、アデノウイルス性の感染を用いてWHHLウサギへ導入したヒトLDL受容体遺伝子の最高の発現を得るために選択されるプロモーターであることを報告している。これらの観察に基づき、我々は、WHHLウサギの肝臓におけるヒトLDL受容体遺伝子の発現量を上昇させるために、キメラ型CMV-hLDLR遺伝子を注入した。
【０１４６】
キメラ型のCMV-hLDL受容体遺伝子3mgを含むDNA複合体溶液のウサギ#16への投与は総血清コレステロール量における最大30%の減少をもたらした(図15)。注入から7週間後、コレステロール量は処理前に観測された量を20%下回ったままであった。
【０１４７】
4.  ウサギ#775：3mgのpCMV-hLDLRを含むDNA複合体の反復投与。
DNA複合体に含まれた3mgのpCMV-hLDLRをウサギ#775に注入したところ、処理後3週間の血液におけるコレステロール濃度において最大24%の減少を引き起こした(図16A)。
【０１４８】
肝細胞の寿命はおよそ108-150日であると報告されており、そのため導入されたDNAの持続性は限られている。さらに、DNA複合体の1回の注入後のより大きな治療効果が興味深いものである可能性がある。このように、肝臓におけるLDL受容体の適切な量を確認するために患者に複数回注入する必要がある可能性がある。我々は、同一の動物に数回DNA複合体を注入する効果を調べた。ウサギ#775は、各々の注入に3週間の間隔をおいて、3mgのpCMV-hLDLR DNA複合体を2回注入してある。複合体の反復投与は総血清コレステロール量において、さらなる有意な減少をもたらさなかった。
【０１４９】
5.  ウサギ#774：3mgのpCMV-hLDLRを含むDNA複合体の反復投与。
ウサギ#774は3mgのpCMV-hLDLR複合体を注入された。我々は血液中におけるコレステロール量の36%の減少を観測した (図16B)。1週間毎に1回、4回の再注入を記載することを同一量のDNA複合体とともに行った。それらの2回は最小の効果をもたらし、他の2回は総血清コレステロール量の完全な減少をもたらした。しかし、3mgのpCMV-hLDLRを含むDNA複合体溶液の5回の投与の後、コレステロールの濃度はおよそ処理前の量に対して48%に降下した。
【０１５０】
6.  ロバスタチンのウサギ#774への投与：コレステロールの内因性合成の阻害。
導入部に記載されているように、細胞内にコレステロールを合成する経路が存在する。ヒトLDL受容体による取り込みを通してコレステロールが肝細胞に供給されるときでさえ、この代謝経路における欠陥はおそらくコレステロールのさらなる清浄を阻害することが可能であった。ロバスタチンは、コレステロール合成における律速酵素であるHMG CoAリダクターゼの阻害剤として知られる。このように、DNA複合体により複数回注入を受けているウサギをこの薬剤で処理することは、コレステロール合成が総血清コレステロール量のさらなる減少のための律速因子であるかどうかを指示するべきである。ウサギ#774は10週間1日あたり10mgのロバスタチンで処理されている。コレステロール量におけるさらに20%の減少が観測されている。コレステロール合成の内因性経路の阻害はこのように、ウサギ#774のコレステロール濃度に最初の遺伝子導入前の40%をもたらした(図16B)。
【０１５１】
7.  無関係なDNAを含むDNA複合体の注入
ウサギに高いNaCl濃度(〜900mM)の溶液でガラクトシル化されたポリ-L-リジン/DNA複合体を注入することにより、総血清コレステロール量において起こり得る人工的な減少を制御するために、我々はウサギ#775にルシフェラーゼ遺伝子などの無関係なDNAを含むDNA複合体溶液を投与した。図17は、その注入が血清コレステロール濃度において非有意的(≦12%)および一時的(≦5日)な減少をもたらすことを示す。さらに、我々はPCK-hLDLR遺伝子をコードする不適切に凝縮したDNA複合体をも注入した。それらは同様に血中コレステロール量において完全または最小、および一時的な減少をもたらした。このように、我々は、LDL受容体遺伝子をコードする適切に凝縮したDNA粒子の注入後の総血清コレステロール量における減少は、溶液の高いNaCl濃度またはガラクトシル化されたポリ-L-リジン/DNA粒子の存在による結果ではないことを確認した。
【０１５２】
8.  ウサギ#774の肝臓における導入されたDNAの検出
本計画において使用されたDNA複合体はガラクトースをリガンドとして用いて肝細胞アシアロ糖タンパク質を標的としている。マクロファージは血流から15nm以上のガラクトシル化された粒子を清浄する能力をもつ同様の受容体を有することが知られている。
【０１５３】
ヒトLDL受容体DNAが肝細胞に配達されたことを証明するために、我々は、3mgのPEPCK-hLDL受容体遺伝子を注入後60日のウサギ#737における肝臓の生検をおこなった。全体のDNAを単離し、上記のプライマーを用いて未注入のウサギの肝臓に由来する全体のDNAとともに、PCR増幅にかけた。期待される1,100bpのバンドが処理されたウサギに対応するレーンに検出され、未処理の動物においては検出されなかった。
【０１５４】
9.  ポリ-L-リジン/DNA複合体の反復投与後のウサギ#774の免疫反応の評価。
遺伝子治療の分野においては、配達運搬体の免疫原性がしばしば関心事となる。レトロウイルス性のベクターは免疫系による検出を逃れることが可能であるが、アデノウイルス性のベクターは不可能であると報告されている。ヒトLDL受容体遺伝子のワタナベウサギへの導入のためのアデノウイルス粒子の2度目の投与の成功はウイルス性のタンパク質に対する免疫反応の開始により阻止される(参考文献  Kozarsky)。
【０１５５】
受容体を介した遺伝子導入の系はその免疫原性に関して深く研究されている。アシアロオロソムコイド-ポリ-L-リジン/DNA複合体のマウスへの反復投与の後に、複合体のアシアロオロソムコイドおよびポリ-L-リジン構成因子に対するがDNAには対しない中和抗体が1:1000の希釈において検出されることが報告されている(参考文献)。FerkolらもまたFab断片-ポリ-L-リジンに対するがマウスへの反復投与における複合体のDNA部分には対しない、1:2000希釈での循環抗体の検出を報告している。
【０１５６】
我々はこのように、DNAの凝縮のためのガラクトシル化-ポリ-L-リジンの使用が同様に免疫原性であるかどうかを試験することが必要であった。この目的のために、ガラクトシル化-ポリ-L-リジン-DNA複合体に対する抗体の存在を、ウサギ#774から得た、複合体の反復投与の前後の異なる時点での血清において評価した。第1の実験においては、1μgのDNAを含むDNA複合体溶液をマイクロタイタープレートの穴に吸収させ、1:3, 1:30, および1:300希釈で血清とともに保温した。結合した抗体はアルカリ性ホスファターゼと共役した抗ウサギ二次抗体により検出された。DNA複合体の反復投与を施したウサギ#774の血清における抗体の増加が存在した。実際に、DNA複合体の1回目または2回目の注入後では検出されなかったが、3回目の注入後に検出され始めた。さらに、1:3および1:30希釈においてのみ反応が検出可能であったことを強調しなければならない。
【０１５７】
第2の実験はDNA複合体のどちらの部分が弱い乃至明らかな免疫反応を誘導する原因であるのかを確立するために実行した。そこで我々は1μgのDNAを含む新規に調製されたDNA複合体である1μgのDNA、または対応する量のガラクトシル化-ポリ-L-リジンのいずれかををマイクロタイタープレートの穴に吸収させた。結果は、ガラクトシル化-ポリ-L-リジン部分が、ワタナベウサギにおける複合体に対する免疫反応の誘導のほぼ全体の原因であることを示す。
議論
本明細書に存在するデータは、その方法がWHHLウサギにおける高脂血症を少なくとも部分的に矯正することが可能であることを強く示唆するものである。
【０１５８】
図13-16は、ヒトLDL受容体遺伝子を含むDNA複合体の1回の注入がWHHLウサギにおける総血清コレステロール量の有意な減少をもたらすことを明確に示す。この減少はウサギ#676における20%からウサギ#737における38%の範囲である。これに対して、我々は、pSV40-ルシフェラーゼ(図17)または適切に凝縮されないヒトLDL受容体をコードするプラスミド(図17)のような無関係なプラスミドDNAの投与は血清コレステロールにおける完全または有意ではない減少をもたらすことを示す。
【０１５９】
我々はヒトLDL受容体遺伝子の発現の制御のために2種類の異なるプロモーター領域を使用した。ウサギの肝臓においてCMV制御領域はPEPCK遺伝子の細胞質型のプロモーターよりもより高い量の発現を与えることが一応示唆される。この観測はあらゆる種において正しいというわけではない可能性がある。ウサギの肝臓におけるPEPCK活性は細胞質型アイソザイムに10%のみ負うことにより性格決定される。さらに、細胞質型遺伝子の刺激は活性のわずか2倍の誘導をもたらすのみである。このように、PEPCKプロモーターはこの種における最善の選択ではないと思われる。しかしPEPCK遺伝子のそれとしての生理的で厳密に制御されたプロモーターの使用は他の種においてまたはその他の遺伝病の治療のためにCMVの様な強力なウイルス性のプロモーターを一つの選択にすることも可能である。治療効果の経時変化を決定するために、ウサギ#676、#737および#16をヒトLDL受容体遺伝子を含むDNA複合体の一回の注入にかけた。血中コレステロール量の減少はウサギ#676においては4週間、およびウサギ#737においては5週間持続した。トランスフェクションされたpPEPCK-ヒトファクターIX遺伝子の発現が140日まで示されたラットにおける以前に行われていた実験に基づいて、我々は効果のより長い持続を期待していた。異なる因子によって高脂血症の矯正効果のこの早期の終結を説明することが可能である。ウサギは高度に免疫原性が強く、ラットは強くないことが知られている。ヒトLDL受容体遺伝子の導入後のWHHLウサギにおけるヒトタンパク質の合成は、タンパク質水準で両種間に80%の相同性があるもののおそらく外来タンパク質に対する免疫反応を引き起こす可能性がある。さらに、肝細胞は限られた寿命を有すると思われる。ラットにおけるある研究は肝細胞の寿命は108-150日であると指示している。この観測に基づけば、DNA複合体の導入後5週間でのコレステロール量における40%の増加が肝細胞の生理的な代謝回転から生じた可能性がある。しかし、この事実は増加の100%を説明することは不可能である。さらに、それはpPEPCK-ヒトFIXを注入されたラットにおいて観測される長期間の発現と矛盾する。ヒトLDL受容体遺伝子の発現から生じる治療効果における早期終結に対する別の可能な説明は、導入されたDNAの不活性化または分解である。
【０１６０】
3mgのDNAにより形成され得るポリ-L-リジン-DNA複合体の理論上の数は肝臓におけるアシアロ糖タンパク質受容体の総数の0.01%にあたる。結果的に、DNA複合体の量における上昇が増強された治療効果をもたらすと期待される。量-反応の関係を研究するために、我々はウサギ#676に3mgのpPCK-hLDLRを、およびウサギ#737に9mgの同一のDNAを導入した。図13および14に示すように、DNA複合体の量における3倍の上昇はコレステロール量における2倍の高い減少をもたらす。これらのデータは線型の相関を確立しないが、量における上昇は明らかに増強された反応をもたらす。
【０１６１】
もし我々がポリ-L-リジン-DNA複合体を潜在的な薬剤と考えるならば、同一の動物に反復的に投与することが可能であることが望ましい。この理由のため、ウサギ#774を3mgのCMV-hLDLR DNAの2週間毎に1回の反復投与にかけた。最初の注入に続く血清コレステロール量における最初の36%の減少の後、DNA複合体の反復投与の効果は一致しない。ウサギ#775は3mgのCMV-hLDLR DNAにより3回処理を行った。再度、コレステロール量における最初の24%の減少の後に、2回目および3回目の処理は明確な効果をもたらしていない。我々はこれらの結果について3種類の可能な説明を発見することが可能である。第1に、DNA複合体が適切に凝縮されていなかった。ポリ-L-リジンを有する凝縮におけるDNAは3種類の異なる構造をもたらすことが可能である：凝集した状態(溶液から凝縮した粒子)、緊密に凝縮した状態、および弛緩した状態。小さい粒子に緊密に凝縮したDNAのみが遺伝子をインビボで配達するために効果的である。第2に、ウサギが運搬体に対する中和抗体を産生する。我々はポリ-L-リジン-DNA複合体に対するウサギ#774の免疫反応と思われる予備のデータを幾らか有している。第3に、血液からのコレステロールのさらなる清浄はワタナベウサギ変異体の肝細胞におけるコレステロールの内因性の代謝における欠陥により制限される。この最後の仮説を試験するために、ウサギ#774を既知のHMG CoAリダクタ−ゼであるロバスタチンにより10週間処理した(10mg/日)。コレステロール濃度における更なる20%の減少の観測は、細胞が異種のLDL受容体によるLDLの取り込みにおけるコレステロールで供給されているときでさえも、肝細胞におけるコレステロール合成の阻害が完全ではないことを示唆する。
【０１６２】
ポリ-L-リジン/DNA複合体の免疫原性と見なされる予備的な結果は、反復投与がワタナベウサギにおける免疫反応の開始を引き起こすことを指示する。それらはまた循環抗体がガラクトシル化-ポリ-L-リジンを認識することが可能であるがDNA部分では可能ではないことも示す。これらの結果はアシアロオロソムコイド-ポリ-L-リジン/DNA複合体およびFab-ポリ-L-リジン/DNA複合体の免疫原性と思われる、以前の報告に合致する。我々の研究室で計画された複合体が実際に同一の動物における反復投与における免疫反応を減少させることも可能であることは明らかであるが、我々は循環抗体を非常に低い希釈液(各々の場合において1:1000および1:2000と比較して1:3および1:30)において検出することのみが可能であることに注意しなければならない。この観測は、免疫系による検出から逃れるためのより良い能力を指示するものである。それにもかかわらず、ワタナベウサギにおけるコレステロール量のさらなる低下においては免疫原性は反復投与の失敗に原因があると結論付けるために、DNA複合体の反復投与にかけられたより多くの動物からの血清は複合体に対する中和抗体の存在を試験する必要がある。
【０１６３】
実施例5
複合化 対 無修飾 のDNAの筋肉への直接注入
方法
1組の実験につき3個体のラットをDNA複合体の直接組織注入を含む実験に使用した。SV40-ルシフェラーゼ遺伝子を有する100マイクログラムの無修飾のDNAを1個体の動物の肝臓および腹部の筋肉に注入した。同僚のSV40-ルシフェラーゼプラスミドをポリ-L-リジンに複合化させ、上記のように凝縮し、同様に他の2個体の動物の肝臓および腹部の筋肉に注入した。注入後48時間でラットを犠牲にした。ルシフェラーゼ活性の測定のために、肝臓および腹部筋肉の小片を得た。
結果
ラットの肝臓および筋肉へのDNA複合体の直接注入の評価：マウスの筋細胞への直接注入による無修飾のDNAの成功的な導入は報告されている。ルシフェラーゼcDNAに結合したラウス肉腫ウイルス(RSV)制御領域を有するキメラ遺伝子の発現が延長され、および高発現であることが観測された。DNAが肝臓または筋肉に直接注入により導入されなければならないときに、遊離のDNAを用いたポリ-L-リジンに複合化され凝縮されたDNAの使用の利点を調査した。3個体のラットをこれらの実験に使用した。SV40-ルシフェラーゼをコードする100マイクログラムの無修飾のDNAを1個体の動物の肝臓および腹部の筋肉に導入した。上記のようにポリ-L-リジンに複合化され凝縮された同量のpSV40-ルシフェラーゼ プラスミドを同様に他の2個体の動物の肝臓および腹部の筋肉に注入した。注入後48時間でラットを犠牲にした。肝臓および腹部筋肉の小片を溶解緩衝液内で均質化し、細胞の溶解産物についてルシフェラーゼ活性を解析した。全てのルシフェラーゼ測定は3回行い、その値の平均で表し、総タンパク質量で標準化した。図9は異なる2組の動物における1mgタンパク質あたりの取り込まれたルシフェラーゼ単位を示す。ポリ-L-リジンに複合化され凝縮されたDNAの導入効率は肝臓に導入したときは微妙に高いように思われる。しかし、筋肉組織に導入したときはより高い効率をもたらすように思われる。凝縮されたDNAを注入した筋肉の試料は無修飾のDNAを注入したものと比較して我々は20倍高いルシフェラーゼ活性を観測する。高度に凝縮され、折り畳まれたDNAはヌクレアーゼに対して保護され、より安定になる可能性があると我々は考えている。さらに、ポリ-L-リジンは細胞内での核輸送の効率を上昇させる可能性もある。第一に、小型の複合体は核膜孔を通過することが可能であり、第二に、リジンおよびアルギニンなどの正に帯電したアミノ酸の列が様々な核タンパク質における核局在化シグナル(NLS)として既知である。肝臓におけるおよび筋肉における反応の間に発見された差異に関しては、骨格筋細胞の特徴的な相互連結した構造がそれらを細胞から細胞へのDNAの受動的な拡散のための良き標的としている可能性が最も高い。これは、筋組織に沿うDNA複合体の分配およびその核への輸送を容易に可能にする。
【０１６４】
実施例6
複合化 対 無修飾 のDNAの脳への直接注入：
網膜神経節細胞のインビボでの遺伝子導入
導入部
成体の神経への外来DNAの挿入は通常の神経生理学の研究に対する、および神経病の治療に対する可能性を有している。神経における遺伝子導入はウイルス性のベクターを用いて遂行されているが、しかしそれは洗練された方法論を必要とし、通常はトランスフェクションされる細胞はある特有の型の神経に制限され得ない。
【０１６５】
軸索逆行性輸送は、広範な様々な異なる型の分子を輸送することが知られている連続的な生理学的過程である。多くの分子は、吸収されるかまたは液相微粒子であるエンドサイトーシスを通して軸索ルーメンに取り込まれることが知られている。軸索が働く状況において、細胞外空間からの可溶性微粒子は軸索内に拡散し、細胞体に向かって移動すると仮定されている。
【０１６６】
本実験において、我々は、視神経における網膜神経節細胞の切断端または脳蓋に添加した、無修飾または折り畳まれ球状に凝縮されたプラスミドDNAが細胞体に逆輸送されタンパク質へと発現されるかどうかを試験した。
【０１６７】
多種の真核細胞種において効果を示す3種のプロモーター、すなわちRSV-lacZ、CMV-lacZおよびSV40-lucのうち1つの制御下にある3種のプラスミドが用いられた。それらは、1から20μg/μlの範囲の異なる濃度に調製された。pCMV-lacZおよびpSV40-lucはJose Carlos Perales(PNAS, 1994)によりポリ-L-リジンと複合体形成(1:1)させられた。
【０１６８】
網膜ガングリオン細胞体へのプラスミド複合体の逆行輸送の評価は、外蛍光顕微鏡の使用により行われ、pCMV-lacZと複合体を形成させるため、FITC-ポリ-L-リジンが用いられた。純プラスミドの逆行輸送を評価するため、pRSV-lacZはHindIIIを用いて１箇所消化された。さらに、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼとの反応により、ビオチン-dNTPがpRSV-lacZの3'-OH末端に連結された。さらに、プラスミドは沈澱させられ、かつ遊離のビオチン-dtyrpを除くために洗浄され、かつ2μg/μlに再懸濁された。
【０１６９】
アダルトのWistarラットは麻酔され、その視神経を露出された。1.5μlのプラスミド溶液(異なる濃度およびプラスミド)が視神経を覆うように投与された。さらに、網膜の血液供給を防ぐため、視神経軸索が切断された。ゲルフォームに浸透した1.5μlの同一のプラスミド溶液がさらに投与された。さらに、結膜が閉鎖された。反対側の眼において、非特異的プラスミドを用いて同一の方法がとられた。個体は3日後に殺された。蓋領域への直接的インジェクションのため、個体は麻酔され、かつ裸のDNAまたは凝縮DNAが、脳の蓋領域に実体的にインジェクションされた。
【０１７０】
液体β-ガラクトシダーゼ定量のため、網膜は、融解および凍結の繰返しにより細胞分解されるまで、-70℃に保温された。組織は12000rpmで2分間遠心分離され、かつ上清が採取され、かつ蛋白質組成の分析に用いられた。360μgの蛋白質を含む体積が、15mg/mlクロロフェノールレッドB-D-ガラクトピラノシド(CPRG)を含む緩衝液Aにおいて37℃で一晩保温された。吸光度が記録された。
【０１７１】
ルシフェラーゼ定量は、ルシフェラーゼ定量緩衝液を添加した網膜分解上清において行われた。D-ルシフェリンが注入された試料はルミノメーターにより分析され、かつ蛍光強度が記録された。
【０１７２】
in situβ-ガラクトシダーゼ定量(pRSV-lacZおよびpCMV-lacZに対する)のため、網膜は2%ホルムアルデヒド、0.5%グルタルアルデヒド-PBSにおいて30分間固定され、PBSにより洗浄され、かつ1mg/ml X-Gal、4mMフェロシアン化カリウム、4mMフェリシアン化カリウム、2mM MgCl2、PBS pH7.3、0.02% Nonidet p-40、0.01%デオキシコレートにおいて37℃で6時間保温された。さらに、組織は洗浄され、かつ即時に分析された。トランスフェクションされた細胞の割合を評価するため、青色に標識された細胞が計数された。
結果
1)ラット視軸索の切断末端へのプラスミドDNAの投与は、細胞体へのプラスミドDNAの逆行輸送を生じた。視神経の切断末端にFITC-ポリ-リジン/pCMV-lacZ複合体を投与し2日後にヨウ化プロピジウム中で保温された網膜の二重標識視野は、FITC(緑色)、ヨウ化プロピジウム(赤色)および両者の混合による核の二重染色(黄色)が、網膜ガングリオン細胞集団の約45%(無作為に抽出された視野において計数)において観察されることを示した。
【０１７３】
異なる倍率による顕微鏡視野は、網膜におけるin situ β-ガラクトシダーゼ定量に続く、網膜ガングリオン細胞層における青色の細胞を示した。20μg/μlのpRSV-lacZが切断された視神経に投与され、かつpSV40-lucにより処理された反対側の眼との比較がなされた。β-ガラクトシダーゼ陽性の細胞は、網膜におけるガングリオン細胞においてのみ知られている範囲の大きさであることが確認された。これらの細胞は、無作為に抽出された視野において計数され、全ガングリオン細胞の35%であると評価された。
2)網膜ガングリオン細胞におけるプラスミドDNAは、投与量依存的に発現され、かつ凝縮DNAは高い効率で発現される。切断された視神経に増加する濃度のpSV40-lacを投与されたラットの網膜におけるルシフェラーゼ活性は、単に軸索切断された網膜、または非特異的プラスミドpCMV-lacZ(1μg/μl)により処理された網膜と比較して、pSV40-lucの活性の濃度依存的な上昇を示した。
【０１７４】
切断された視神経にpCMV-lacZを投与されたラットの網膜におけるβ-ガラクトシダーゼ活性の結果は、単に軸索切断された網膜、または非特異的プラスミドpCMV-lacZ(10μg/μl)により処理された網膜と比較して、最大活性がpCMV-lacZの最大濃度により記録されることを示した。ポリリジンと複合体を形成したpCMV-lacZは、非特異的プラスミドに比べより高いβ-ガラクトシダーゼ活性を示した。
3)この方法は、特定の遺伝子を、インジェクションを通じ適当なタイプのニューロンに転移させる際に用いることができる。
4)裸のおよびポリリジン凝縮プラスミドDNAの蓋内インジェクションにより、ニューロンの細胞体における20日間を越えた高いレベルの発現が達成され得る。DNAがポリ-L-リジンにより凝縮されていない場合には、発現のレベルはインジェクション10日後にバックグラウンドレベルに戻る(図10)。
【０１７５】
実施例7
重合免疫グロブリン受容体を介した標的輸送のための改良された試薬
上述の実施例3において、ポリクローナルウサギ抗ラット分泌成分(SC)抗体より調製されたFab断片が、ラットの肺へのDNAの転移を媒介することが示された。転移は、重合免疫グロブリン受容体(pIgR)により媒介された。この転移システムは、DNAのような高分子を、気管よりはむしろ血液から肺へ導入する方法を提供する。血液を介した転移は、治療学的または薬学的複合体を、気管の詰まった嚢胞性繊維症(CF)患者の肺へ転移させる際に有利である。
【０１７６】
CF患者は、気管上皮細胞および粘膜下腺における機能的な嚢胞性繊維膜貫通コンダクタンス制御体(CFTR)の発現を欠き、慢性、化膿性肺疾患を生ずる。CFは、常染色体劣性異常であり、従って遺伝子転移による矯正に対し感受性が高い。
【０１７７】
ヒトの気管においては、pIgRおよびCFTRの分布は一致する。即ち、両者は上皮の表面および粘膜下腺の漿膜細胞において発現する。上述のように、ポリリジンと結合され、レポーター遺伝子を含むプラスミドとともに濃縮され、pIgRを標的とするウサギポリクローナル抗体のFab部位から成る遺伝子転移複合体は、ラットの静脈内へ投与されることにより、肺蛋白質抽出物1mg当たり最大500,000光単位のルシフェラーゼ活性、および気管上皮細胞の約20%におけるlacZ標識、および70%におけるインターロイキン2受容体遺伝子の標識を生じた。活性は、約2週間持続した。
【０１７８】
受容体の媒介する遺伝子転移の精巧な特異性および方向付けは、必要な遺伝子転移複合体およびプラスミドDNAの量を最小化し、かつ導入遺伝子の異所的な発現を制限する。しかし、異所的な発現が予想される領域、例えば肝臓および腸上皮(肺の外におけるpIgR受容体の濃縮領域)は、CF疾患の領域でもあり、かつ正常なCFTRの輸送が有益である可能性がある。大きな包容能力は、天然の遺伝子制御を模倣する制御配列の含有を可能にする。病原ウイルスの再活性化は起こり得ない。CFに対しては、薬学的または治療学的化合物の血液からの輸送により、詰まったまたは疾患のある気管の管腔の利用が避けられ、かつ治療が直ちに、多量のCFTRを発現するが管腔を経由して到達することが困難な粘膜下腺細胞に到達することが可能となる。しかし、遺伝子発現は一過的である。CFのような慢性疾患の治療のためには、複合体は繰返し投与されなければならない。複数回(2回を越えるインジェクション)の投与により、全てFabに方向づけられた抗体が誘導され、複合体による遺伝子転移がより非効率的になる。さらに、ヒトに対する使用の場合、試薬は特性化され、かつ精製されなければならない。実施例3において用いられた試薬は、SPDPまたはEDCを用いてポリクローナル抗体のFab部位とポリ-L-リジンとを結合させることにより構築された。ポリクローナル抗体は、不均一であり(pIgRに特異的な抗体を含む抗血清は3%に過ぎない)、結合試薬は非選択的であり、かつ不均一な産物を生ずる。均一な産物は、改善された遺伝子転移複合体を提供するであろう。
【０１７９】
本発明は、効率的な遺伝子治療に関連する2つの問題を取り扱う。免疫性(即ち抗原性)および遺伝子転移複合体の分子不均一性である。従って、遺伝子治療の非常に有望な戦略を改善するため、キメラのモノクローナル抗体および単鎖抗体を構築することにより、遺伝子転移複合体の抗原性が最小化され、または消失させられる。Fabにおける不均一配列が免疫反応の原因となる可能性が最も高いため、Fabにおける不均一配列の大部分が同一種の配列に置換される(即ち、ヒトに対する使用の場合、キメラのネズミ-ヒトモノクローナルが生成される)。遺伝子転移複合体の抗原性をさらに低下させるため、単鎖抗体が生成される。ヒトSCに対するモノクローナル抗体の使用、および、カチオンとの融合蛋白質においてpIgRに対する単鎖Fv分子を含む融合蛋白質の構築により、複合体の分子不均一性は低下させられ、または消失させられる。これらの融合蛋白質はポリカチオンのFabへの化学的結合を不必要なものとする。
【０１８０】
上述の考察はCFの治療に焦点が当てられているが、他の疾患の治療にとって、受容体を標的とする遺伝子転移、および特にpIg受容体を標的とする遺伝子転移は有益となるであろう。例えば、α1-アンチプロテアーゼ欠乏症といった肺に影響する他の遺伝的疾患の治療には、上皮遺伝子転移が有益であろう。
【０１８１】
本発明は、α1-アンチトリプシン、サイトカイン(例えば、インターロイキン-2、インターロイキン-10)およびペプチド抗生物質(例えば、エアロスポリン、アンフォマイシン、アスパルトシン、バシトラシン、カペロマイシン、コリスチン、ダクチノマイシン、グルママイシン、グラミシジンD、グラミシジンS、ミカマイシンB、ポリミキシン、プリスチナマイシン、シオマイシン、スタフィロマイシンS、チオトレプトン、チロシジン、チロトリシン、バリノマイシン、バンコマイシン、ベラマイシンB、ビオマイシン等)といった治療学的蛋白質に関連する、ヒトSCに対して方向づけられた単鎖Fvを含む融合蛋白質を意図する。融合蛋白質のFv部位は、治療学的蛋白質を含む部位から、リンカーまたはスペーサーにより分離され得る。スペーサーは0から30アミノ酸の範囲の長さであろう。
【０１８２】
遺伝子または治療学的蛋白質の標的への輸送のための、pIgRに対して方向づけられた抗生物質(Fab断片、単鎖Fvおよび単鎖Fv融合蛋白質)の使用は、慣用的な治療法による処置が比較的難しい部位における疾患の治療に特に有用である。例えば、pIgRを標的とする治療学的複合体または化合物の使用により、肺、腸および胆管といった慣用的なアプローチを用いた処置が難しい部位に治療学的化合物を輸送することが可能となる。
【０１８３】
急性の疾患は、本発明の方法を用いて気管上皮に遺伝子を直接的に輸送することにより改善される。例えば、高いFIO2により処置されなければならない患者、または急性呼吸器疾患症候群(ARDS)を有する患者は、気管における高いレベルのスーパーオキシドジスムターゼの発現により恩恵を受けるであろう。ブレオマイシンによる化学療法を受けようとする患者は、ブレオマイシン水酸化酵素の肺への転移により、投与量限定毒性に対して肺が保護されるであろう。急性ストレスの治療は、一過性の遺伝子発現のみを要求するであろう。さらに、抗体により媒介され、pIgR以外の受容体へ方向づけられる、受容体を標的とした遺伝子治療の使用は、多種の疾患に対する治療を可能にする。下に記載された方法は、pIgRシステムを用いて示されているが、単鎖抗体を含む、pIgR以外の受容体に対する抗体の生成について一般的に適用可能である。
a)ヒト分泌成分に対するモノクローナル抗体の作製
i)ヒト分泌成分の精製
遊離分泌成分(SC)は公開された方法[Kobayashi (1971) Immunochemistry 8: 785-800]によりヒト初乳より精製される。端的には、ヒト初乳乳清は、DEAE-セルロースカラムに注入される。遊離のSCは0.01Mりん酸-ナトリウム緩衝液(pH 7.6)の添加により溶出される。硫酸アンモニウム(pH 7.6において溶液100ml当たり硫酸アンモニウム27g)がさらに添加される。溶液は10,000rpmにて15分間遠心され、沈澱は廃棄され、かつ上清(蛋白質500mg)は0.005M酢酸ナトリウム緩衝液に対して透析される。さらに、透析物は0.005M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)により平衡化されたCMセルロースカラム(2x25cm)に注入される。0.005M(300ml)および0.5M(300ml)の酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)から成る直線的な勾配が適用される。遊離のSCを含む画分が同定され(例えば、寒天ゲルにおける抗結合SC血清による二重免疫拡散による)、採取され、かつさらにμ=0.05のSephadex G-200(Pharmacia)(2.4x100cm)によるゲル濾過により濃縮される。Sephadex G-200カラムは1M NaClを含むTris-HCl緩衝液(pH 8.0)により平衡化され、かつ毎時20mlの流速で溶出され、5mlの画分が採取される。カラムより溶出した試料の吸光度は280nmにおいて測定され、2つの主たるピークが得られ、第2のピーク(およそ画分50-65)は遊離のSCを含む。SCを含む画分は、再度同一のG-200カラムに注入され、蒸留水に対して透析され、かつ凍結乾燥される。精製された遊離のSCは、さらに所望により、しばしばSCと共精製される蛋白質であるヒトラクトフェリンに対して調製された固定化抗体のカラムに2回吸着される。
【０１８４】
ii)抗ヒトSCモノクローナル抗体の作製
マウスは、等体積の完全Freundアジュバントにより乳化された滅菌PBS100μl中の精製ヒト遊離SCの50μgを第一投与量として、腹膜内へインジェクションされた。第一免疫化の後、マウスは3-4週間毎に、等体積の不完全Freundアジュバントにより乳化された滅菌PBS100μl中の精製ヒト遊離SC 25μgにより3回追加抗原刺激された。血清は、精製ヒト遊離SCに対するELISA定量によりスクリーニングされた(ELISAは、ミクロタイタープレートのウェルをコートするために精製ヒトSCが用いられたことを除き、実施例4に記載されたように実施された)。高い抗体価を有するマウスは殺され、かつそれらの脾臓細胞は、マウスミエローマ細胞Sp2/0-Ag14(ATCCCRL 1581)と融合された。ハイブリドーマ細胞は、HAT培地において選択され、かつ当該技術分野において知られるプロトコール[HarlowおよびLane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 196-223]を用いた限定希釈によりクローン化された。
【０１８５】
陽性クローンは、精製ヒトSCに対するELISA定量において、ハイブリドーマクローン由来の細胞上清をスクリーニングすることにより同定された。いくつかの陽性ハイブリドーマクローンが同定され、これらは分泌IgA(sIgA)と交差反応するモノクローナル抗体を分泌し、かつ従って恐らく天然のリガンドに対する結合部位(第一のIg様ドメインは天然リガンドの結合部位である)の外側のエピトープを認識する。従って、sIgA(pIgRに対する天然リガンド)およびこれらのMAbs由来のFab断片は、pIgRへの結合に関して競合しないと考えられる。これらの抗ヒトSC MAbsのうち、最大の親和性を有するもののいくつかは、さらなる解析のため選択された(ハイブリドーマ4121および4114が、それらより選択された)。ハイブリドーマ4121は、pIgRを発現する細胞のFACS分析において、そのMAbsが他に試験されたMAbsと比べ、細胞表面において受容体をより強く認識するため、選択された。
【０１８６】
あるいは、ウシチログロビンと結合したラットSCの第一Ig様ドメイン由来の16アミノ酸合成ペプチド[YYPDTSVNRHTRKYWC(配列番号1)]によりラットを免疫化することにより、ヒトSCへの結合能を有するモノクローナル抗体も作製された。この配列は、マウス
およびラットにおいて同一であり、かつヒト配列と1アミノ酸異なる。ヒトSCを認識するがsIgAを認識しないMAbsを生成するクローンがいくつか得られ、認識部位が二量体IgA(dIgA)に結合する領域に存在することに対応する。
【０１８７】
b)遺伝子転移のための抗ヒトSCモノクローナル抗体の使用
ヒトSCを認識する高力価のモノクローナル抗体(上述のように生成されたもの)は、それらより調製されたFab断片を、(上述の実施例に記載されたように)化学結合により調製された遺伝子転移複合体に含むことにより、遺伝子転移を容易にする能力に関して試験される。モノクローナル抗体の生成は、マウス腹水においてスケールアップされる。モノクローナル抗体は、蛋白質A-MAPSカラムにより精製され、かつパパインにより切断され、Fab断片を形成する(パパインは、除去が容易となるよう、ビーズに結合される)。産物は、Fc断片除去のため、再び蛋白質A-MAPSカラムを通過させられる。Fab部位の精製および産出は、ゲル電気泳動(52kDaバンドの出現)により検査される。このFab部位は、供給業者の使用説明書により、N-スクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオン酸塩(SPDP; Pierce)と反応させられ、かつゲル濾過(例えばSephadex G-200)カラムにより精製される(あるいは、未反応のSPDPおよび低分子反応産物を除去するため、透析が実施される)。同時に、ポリ-L-リジン(平均分子量10kDa; Sigma)はSPDPと反応させられ、かつ産物はDTTにより切断される。追加されたSPDP分子の数は、切断の過程においてOD343により計測される。ポリリジン分子当たり平均2分子未満のSPDPが追加されたと仮定すると、産物は修飾されたFabと反応し、かつ反応はクロモフォアの解離に関して343nmにおいて計測されたことになる。さらに、産物は、52kDaバンドの消失およびスタッキングゲルにおいて非常に遅く泳動される蛋白質の出現を示すゲル電気泳動により試験される。新規のピークの出現を示すため、FPLCも用いられる。
【０１８８】
あるいは、PCRによりマウス精巣よりクローン化されたマウスプロタミン1は、GenBankの配列を利用し、ポリカチオンとして用いることができる。マウスプロタミンは、分子末端に集中するリジンが僅かしかないため(残りのカチオンはアルギニンにより供給される)、結合はより限定された立体配置において生ずる。
【０１８９】
この複合体の蛋白質部位は、2回CsClにより精製されたpGL3(ルシフェラーゼをコードする発現ベクター)とともに、NaClにおいて0.5Mとされる。蛋白質は、継続的にボルテックスされつつDNAへ滴下され、かつ、さらに濁度が消失するまで1M NaClが添加される。アリコートが除去された後、強固なトロイド構造の生成を電子顕微鏡により確認するため、複合体は即時に使用される。
【０１９０】
複合体は、ヒトpIgRに対する遺伝子をトランスフェクションされ、多孔性支持体において成長させられたMDCK細胞(ATCC CRL 6253)(C. Kaetzel博士, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OHより入手)を用いて試験される。これらの細胞は、FACS分析により100%の細胞がpIgRを発現し、かつそれを主に先端表面において放出するため、特に有用である。しかし、抗ヒトSCモノクローナル抗体のFab断片を含む複合体における、遺伝子転移を媒介する能力を試験するため、他の細胞が採用され得る。例えば、コラーゲンゲルにおける初代培養のヒト気管上皮細胞が採用され得る[Fiedlerら (1991) Am J. Physiol 261: L255]。これらの細胞は、5-66%がpIgRに関して陽性である。グルコースを含まない培地において培養され、インターフェロン-γにより処理されることにより、pIgRを発現するよう誘導されたHT29.74細胞もまた採用され得る。これらの細胞は、10-20%がpIgRの発現に関して陽性である。
【０１９１】
凝縮されたモノクローナルFab/ポリカチオン/発現ベクター複合体は、目的の細胞(例えば、pIgRを発現するMDCK細胞)の複数の試料の基底側面へ添加される。24時間後に、細胞は培養され、その後7日間にわたり、24時間毎に採取される。細胞は分解および均質化され、かつ上述のようにルシフェラーゼ活性が測定される。1週間以上にわたり、最大の遺伝子転移を与える抗体が選択される。
【０１９２】
実施例8
ヒトSCに対するマウス-ヒトキメラモノクローナル抗体の作製
抗pIgRマウスMAbsのヒトにおける抗原性を低下させ、かつ抗原特異性を保存するため、ネズミ/ヒトキメラ抗体が生成される。これらの抗体は、マウス由来の多様なドメインおよび抗原結合特性を含むが、ヒトの定常ドメインを使用し、これらのドメインが抗原性を有することが最も予想される。4つのヒトガンマ定常領域およびヒトカッパ遺伝子をコードする遺伝子を有するベクターは、ネズミ抗pIgR MAbsとのキメラを生成するため用いられる(これらのベクターは、MorrisonおよびOi (1989) Adv. Immunol. 44:76、および、ShinおよびMorrison (1989) Methods Enzymol. 178:459に記載されている)。
【０１９３】
a)マウス/ヒト抗ヒトSCキメラMAbsの作製
目的のネズミ抗pIgR MAbsを発現するハイブリドーマ細胞系列由来のRNAが単離され、当該技術分野においてよく知られる技術を用いてcDNAに逆転写される。可変領域であるVHおよびVL、即ち各々重鎖および軽鎖に対するcDNAをPCRにより増幅するため、構成1における保存配列および定常領域から開始するよう設計された縮重プライマーが使用される。PCRは、増幅過程における変異の導入を最小化するため、高忠実度で複製するPfuポリメラーゼ(Stratagene)の使用により実施される。さらに、PCR産物は、pCR IIプラスミドベクター(Invitrogen, San Diego CA)に連結され、かつINVαF' Escherichia coli(Invitrogen)に形質転換される。
【０１９４】
可変領域挿入断片を有するプラスミドを獲得した形質転換体は、大きさおよび制限酵素断片の分析により確認される。形質転換体より得られたプラスミドDNAは、アルカリ分解に続くRNase処理およびポリエチレングリコール沈澱により単離され、さらにSequenase 2.0 DNA sequencing kit (US Biochem, Cleveland OH)を用いたダイデオキシ鎖終止により配列決定される。PCRにより誘導される変異が伝播していないことを確認するため、いくつかの形質転換体が配列決定される。さらに、得られる配列情報を基に、特異的J領域プライマーが設計される。この新規のプライマーは、新規のPCR産物よりマウス定常領域を除くことを可能とする。さらに、VHおよびVL領域は、報告されたように[MorrisonおよびOi、上述、および、ShinおよびMorrison、上述]、新規のJ領域およびリーダー領域のプライマーを用いて増幅され、かつPfuポリメラーゼにより誘導される変異が導入されていないことを確認するため、再度配列決定される。さらに、増幅されたVH領域遺伝子は、PCRプライマーの5'末端に作製されたNheIおよびEcoRV制限酵素部位を用いて、ヒトガンマ1定常領域遺伝子を含むMorrison発現ベクターに連結される。定常領域ベクターは、さらなる選択のため、his遺伝子を含む。
【０１９５】
マウスVL領域をコードする遺伝子も同様に、SalIおよびEcoRVの制限酵素部位を用いて、ヒトカッパ領域に対する遺伝子を含むベクターに挿入される。さらに、双方のベクターは、BTX 600エレクトロポレーターを用いてエレクトロポレーションによりSP2/0-Ag14マウスミエローマ細胞系列に同時トランスフェクトされる。細胞は、選択培地(7.5 mMヒスチジノール)において12日間培養され、かつさらに、ヤギの抗ヒトIgによりコートされたプレートを用いたELISAによりスクリーニングされる。プレートは1%BSAによりブロックされ、3回洗浄され、細胞上清が添加され、洗浄され、かつさらにヤギ抗ヒトカッパ鎖アルカリホスファターゼ共役体にさらされ、かつELISAは基質と共に標準的な方法を用いて展開される。陽性コントロールはIVIG(Sandoglobulin)由来のヒトIgGを含み、一方陰性コントロールは元来のハイブリドーマ由来のキメラでないモノクローナル抗体を含む。ヒスチジノールはキメラの重鎖を選択し、かつELISAは軽鎖をも発現するクローンを同定する。抗体は濃縮され、かつ上清を蛋白質AまたはGカラムおよびAmicon限外濾過を通過させることにより、大量培養物より精製される。あるいは、「Micro-mouse」「Cell-pharm」装置(UniSyn, Inc, Tustin, CA)が用いられ、これらにおいては、中空の繊維膜により抗体が捕捉され、かつ高度に凝縮されることが可能である。
【０１９６】
精製後に、キメラ抗体はELISA定量における抗原(hSC)への結合能に関して試験され、かつ無関係なキメラクローンのみならず、元来のマウス抗体とも比較される。さらに、正しいサイズおよび構造を確認するため、抗体は他の2つの方法により試験される。即ち、(1)SDS-PAGEにより、ネズミおよびヒト標準試料に対して、還元型および非還元型のキメラ抗体の分子サイズが試験される。(2)免疫沈降法により、上清のみならず細胞質の抗体が35Sにより標識され、モノクローナルおよびポリクローナル抗血清により免疫沈降される。
【０１９７】
産物の同一性が確認され、かつ、その結合特性がマウス抗体に近似することが確認されれば、Fab断片は調製され、かつポリカチオンと結合され、DNAとともに凝縮され、かつpIgRを発現するヒト細胞(例えば、以下に記載されたMDCK-hSCシステム)を用いて試験される。
【０１９８】
下記のように、もし必要または望ましいときには、マウス/ヒトキメラMAbsの発現の増加が達成され得る。上述のようにマウス可変領域重鎖および軽鎖遺伝子およびヒト定常領域遺伝子により同時トランスフェクトされ（co-transfected）、かつ、キメラ抗体を生成する細胞系列は、ハイグロマイシンB抵抗性遺伝子(HyR)をも含むサイトメガロウイルスの初期遺伝子(CMV ie1)により、2次的にトランスフェクションされる。キメラ抗体を生成する細胞は、CMV ie1 DNAを含む5μgのpON308と共に、5μgのHyR DNA (B. Zerler博士, Miles Research Institute, West Haven, CT)を含む5μgのpY3を用いてエレクトロポレーションされる。さらに、トランスフェクション後に細胞は1ml当たり400μgのHyを含む培地により、96穴プレートにおいて培養される。ELISAにより検出される高い量の抗体を生成する細胞を含むウェルは、Hy培地へ展開され、かつさらに、抗体は、上述のように収集かつ生成される。この戦略は、キメラ構築物の発現のため、プロモーター領域にNF-kB配列を含むベクターが用いられる際に採用される。
【０１９９】
b)ポリカチオンをコードする配列の添加
遺伝子転移複合体を形成するプラスミドDNAとの凝縮のために適切なポリカチオン配列のみならず、ヒトの定常領域を包埋した抗体の認識部位を含む構築物をも得るため、下記の方法がとられる。「ヒト化された」モノクローナル抗体をコードするプラスミドが重鎖のFc領域における配列を、ポリカチオンをコードする配列に置換するための鋳型として用いられる。
【０２００】
ポリリジンをコードするDNA配列を構築するため、下記の戦略が提唱される。オリゴマー配列5'-AAG AAG AAG AAA AAA A-3'(配列番号2)および5'-C TTC TTC TTC TTC TTT TTT-3'(配列番号3)がアニーリングされ、かつさらに伸長され、かつアガロースゲル電気泳動により目的のサイズ(210-240bp)が分離され、かつ精製される。dTTPによる埋め込みは、1つの平滑末端およびTTオーバーハングを生ずる。同時に、シャトルベクター(pCR IIといった何らかの適切なベクター)は、平滑末端生成酵素であるSmaIにより消化され、かつEcoRI消化され、かつdATPにより埋め込みされ、平滑末端およびAAオーバーハングを生ずる。ベクターおよび挿入断片は連結され、マルチクローニングサイトに包埋されたポリリジンをコードする遺伝子を与え、さらにこれは切除され、かつ、部位特異的変異導入により挿入された、CH2ドメインの3'末端における特異的な制限酵素部位により、CHベクターにクローン化され得る。さらに、ポリ-L-リジンの3'末端は、3'非翻訳領域の5'末端に連結される。
【０２０１】
プロタミンをコードするDNA配列を構築するため、マウスプロタミン1に対する遺伝子はマウス精巣よりPCRによりクローン化される(下記)。PCRにより、有用な制限酵素部位を末端に挿入することができ、かつ生じた末端は、重鎖構築物へクローン化される。
【０２０２】
融合タンパク質は分子量クロマトグラフィおよびセファロースG-200カラムを用いて精製される。我々の複合体の幾つかはFabのみを含んでおり、完全な定常ドメインを持たなず、いくつかの複合体はポリ陽イオン(これはタンパク質Aの結合を減少させ得る)の挿入によって改変された定常ドメインを持つ抗体を含むため、タンパク質Aは適切でないかも知れない。従って融合タンパク質は先ずSCでできたカラムを用いた親和性クロマトグラフィによって精製される。あるいは、融合タンパク質はイオン交換によって精製される。
【０２０３】
新規の複合体は先ずELISA検査によってELISA板に提示されたhSCを認識する能力について試験される。結合親和性が著しく減少している場合、その複合体はその結合部位をよりよく保存するためにポリ陽イオンの相対的な位置を改変することによって作り直される。その結合親和性が良好であれば、そのキメラタンパク質はSV-40-ルシフェラーゼ配列を含むプラスミドDNAとともに凝縮され、遺伝子転移複合体を形成させられ、一部は複合体の大きさおよび折り畳み度を推測するために電子顕微鏡のためにとり置かれ、複合体は遺伝子転移活性を試験される。
(c)キメラタンパク質の遺伝子転移に影響する活性の試験
下に記載されるMDCH-hSC細胞が試験系として用いられる。複合体はMDCK-hSC細胞の底側表面に投与され、24時間放置される。細胞は48、72、96時間後に回収され、溶解され、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性が測定される。投与量依存曲線を得るために異なる濃度のDNAが投与され、これらの細胞のルシフェラーゼタンパク質プロセシング活性の正の対照として同じプラスミドのリポフェクションが用いられる(SV40ルシフェラーゼ構築物をリポフェクションによって形質導入された細胞はこの標識遺伝子を強く発現する)。
【０２０４】
実施例9
抗ヒトSC 単鎖抗体の産生
ゲッ歯類/ヒトMAb(実施例8に記載されたように調製された）ゲッ歯類由来の可変ドメインおよび抗原結合特性を持ち、抗原性の最も高いことの多いドメインである定常ドメインはヒト由来のものを利用する。これらのキメラMAbはヒトに投与された場合にゲッ歯類のMAbより単離された対応するFab断片に比べて抗原性が少ないであろう。ヒトpIgRに結合することのできる抗体の潜在的な抗原性をさらに減少させるため、ヒトSC(pIgR)に対する単鎖抗体分子(scFvs)が作成された。作成されたscFvsはscFv単独、およびマウスプロタミン配列との融合タンパク質としてのscFvを含む。ポリ陽イオン配列(例えばプロタミン)を含むscFv融合タンパク質はポリ陽イオンをpIgRに対するDNAを攻撃するために用いられる抗体と化学的に共役させる必要性を回避する。
【０２０５】
単鎖抗体は短い連結ペプチドによって連結された抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および重鎖可変ドメイン(VH)を含む。連結ペプチドは抗原に結合できる配位をとらせる[Bird et al.,(1988) Science 242:423およびHuston et al. (1988)Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA 85:5879]。細胞表面のタンパク質(例えばトランスフェリン受容体、インターロイキン2受容体のp55サブユニット)に対する単鎖抗体はサイトトキシン(例えばPseudomonas エキソトキシンAまたはジフテリア毒素)[Batra et al.  (1991) Mol.  Cell.  Biol.  11:2200; Chaudhary et al.  (1989) Nature 339:394; Chaudhary et al.  (1990) Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA 87:949; Pantoliano et al.  (1991) Biochem.  30:10118]との融合タンパク質の一部として用いられていた。これらの融合タンパク質は適切な受容体を発現している細胞だけを殺し、その幾つかはその成分から化学的な手段で合成された同種のものに比べて最大750倍の能力を持つ[Batra et al. (1991), supra; および Chaudhary et al.  (1989) Nature, supra]。Fvの結合効率がそれが由来したもとの抗体に比べて2-10倍失われているのにも関わらずこの効率の改善は起きている。Fvの弱い親和性は化学的な共役の過程で起こる結合部位の歪みが少ないことで補われているのだろう。
【０２０６】
再配列された免疫グロブリン遺伝子の第一および第三の相補性決定領域(CDR)の周辺には保存された配列が有り、その特異的な抗体のヌクレオチド配列に関する特異的な知識なしにハイブリドーマのmRNAから可変領域に対するcDNAを増幅することが出来るPCRプライマーを設計することが可能である。Nicholls et al.  は6つのVL特異的プライマーのセットおよび4つのVH特異的プライマーを記載している[J.  Immunological Methods (1993) 165:81]。任意の可変領域は最も類似したプライマーとの間に最大3つのミスマッチを持ち得る。ゲッ歯類抗ヒトSC MAbを発現しているハイブリドーマ細胞株からのVLおよびVHドメインのクローニングおよびこれらの2つのドメインの(GGGGS)3連結物による連結は以下に詳細に記載される。
a)抗ヒトSC単鎖FV
i)VLおよびVH領域のクローニング
問題となっている抗体を発現しているハイブリドーマ細胞(例えばハイブリドーマ4121および4114)からグアニジウムイソチオシネートを用いてRNAが抽出され、ランダム6量体をプライマーとして用いてMoloney murine白血病ウィルス逆転写酵素みよってcDNAに逆転写された。Nicholls et al. (supra)によって記載されたように、その結果できたcDNAは10組のプライマーによるPCRによってスクリーニングされ、重鎖および軽鎖の可変領域が由来したKabat ファミリーが決定された[Kabat et al.  (1991) Sequences of Proteins of Immunologic Interest, 5th edn., U.  S.  Public Health Service,  Bethesda,  MD]。Nichollsのプライマーは以下のとおり(UNI プライマーはセットの中のそれぞれのもう一方のプライマーと組で用いられた。)
VL プライマー:
VL-I/III  5'-GAG ATT GTG ATG ACY CAR TCT-3'  SEQ ID NO:4（配列番号4)
VL-IV/VI  5'-CAA AWT GTK CTC ACC CAG TCT-3'  SEQ ID NO:5（配列番号5）
VL-IIa    5'-GAT GTT KTG ATG ACC CAA ACT-3'  SEQ ID NO:6（配列番号6）
VL-IIb    5'-GAT ATT GTG ATA ACC CAG GMT-3'  SEQ ID NO:7（配列番号7）
VL-Va     5'-GAC ATC SAG ATG ACY CAG TCT-3'  SEQ ID NO:8（配列番号8）
VL-Vb     5'-GAY-ATT GTG MTG ACM CAG TCT-3'  SEQ ID NO:9（配列番号9）
CL-UNI    5'-TTT TAT CTC CAG CTT KGT SCC-3'  SEQ ID NO:10（配列番号10）
VHプライマー
VH-I      5'-CAG GTG CAG CTK MAG GAG TCA-3'  SEQ ID NO:11（配列番号11）
VH-II     5'-CAG GTC CAR CTG CAG CAG YCT-3'  SEQ ID NO:12（配列番号12）
VH-III    5'-GAR GTG AAG CTG GTC GAR TCT-3'  SEQ ID NO:13（配列番号13）
VH-V      5'-GAG GTT CAG CTT CAG CAG TCT-3'  SEQ ID NO:14（配列番号14）
CH-UNI    5'-TCA GGA GAC TGT GAG AGT GGT GCC TTG RCC CCA-3' SEQ ID NO:15
（配列番号15）
但しM=AまたはC、R=AまたはG、S=CまたはG、Y=CまたはT、およびK=GまたはT (Nicholls et al., 前記)である。
【０２０７】
抗ヒトSCクローン4121については可変軽鎖はVbファミリーのプライマー(VL-VbおよびCL-UNI)によって最も効率良く増幅され、可変重鎖はVファミリーのプライマー(VH-VおよびCH-UNI)によって最も効果的に増幅された。そして以下の新しいプライマーが便利な制限酵素部位および開始および終止コドンおよび連結領域をコードした配列を取り入れるために設計された。:
プライマー1(5' VL): 5'-GGC CCA AGC TTG CCA CCA TGG ACA TTG TGC TG-3' (SEQ ID NO:16(配列番号16))。  プライマー1はクローニングのためのHindII部位および、Kozak共通開始部位(太字)およびもとのNicholls VL-Vb 配列(下線)を含む。
【０２０８】
プライマー2  (3' VL): 5'-ACC GGA TCC GCC ACC GCC CGA GCC ACC GCC TCC TTT TAT CTC CAG CTT TGT GCC-3'(SEQ ID NO:17(配列番号17))。プライマー2はもとのNicholls CL-UNI プライマー配列(下線)および望ましい連結領域の始めの11アミノ酸(GGGGSGGGGSG)(SEQ ID NO:18(配列番号18))をコードする配列を含む。プライマー2に存在する21塩基(二重下線)はプライマー3の21塩基と重なり合っており、重なり合った伸長およびPCRによって産物がつなぎ合わされ得るようにしている[例えば重なり合った伸長による遺伝子のスプライシング(SOE)として知られるPCR技術を用いる;Johnson and Bird (1991) Methods in Enzymol. 203:88]。
【０２０９】
プライマー3(5'VH): 5'-TCG GGC GGT GGC GGA TCC GGT GGC GGC GGC TCT GAG GTT CAG CTT CAG CAG TCT-3'(SEQ ID NO:19(配列番号19))。プライマー3は元々のVH-V プライマー配列(下線)と共に連結領域の最後の11アミノ酸(SGGGSGGGS)(SEQ ID NO:20(配列番号20))をコードする配列を含み、プライマー2と重なり合う21塩基(二重下線)を含む。
【０２１０】
プライマー4(3'VH): 5'-CCT AGT CTA GAC TTA CAT CGA TGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT GCC-3' (SEQ ID NO:21(配列番号21))。プライマー4は24塩基のもとのNicholls CH-UNI プライマー配列(下線)、終止コドン、終止コドンの上流のClaI部位、および終止コドンの下流のXbaI部位を含む。
ii)単鎖FVの合成
クローン4121のVLがプライマー1および2を用いたPCRによって再び増幅された。VHはプライマー3および4を用いて再び増幅された。両方の生成物はゲルによって精製され、重なり合った伸長およびプライマー1および4を用いたPCRによってつなぎ合わされた[Johnson and Bird (991), supra]。適切な大きさの生成物(約750bp)が作成され、配列決定された。
【０２１１】
(HindIII-Xba-I断片としての)単鎖FV構築物はHindIIIおよびXbaI部位で切断されていたpRC/CMV(Invitrogen)にクローニングされた。その結果できた構築物はpRC/CMV-4121 scFVと名づけられた。
iii)マウスプロタミン1 cDNAのクローニングおよびA4121単鎖FV/プロタミン融合物の構築
マウスプロタミン1のcDNA配列はGenbankより得られた[Johnson et al.  (988) Biochem. Biophys. Acta 950:45]。以下のプライマーはマウスプロタミン1cDNAを増幅するために設計されたものであり、どちらかの末端に便利な制限酵素部位が取り入れられている。:
プライマー5：5'-GAC CCA TCG ATG GCC AGA TAC CGA TGC TGC-3'(SEQ ID NO:22(配列番号22));ClaI部位は下線で示される。
プライマー6: CCT AGT CTA GAT AAg CTT CTA GTA TTT TTT ACA CCT TAT-3'(SEQ ID NO:23(配列番号23));プライマー6はHindIIIおよびXbaI部位(下線)を終止コドンの下流に含む。
【０２１２】
RNAはマウスの精巣から抽出され、ランダム6量体プライマーを用いたMoloney murine 白血病ウィルス逆転写酵素によってcDNAに逆転写された。プロタミンcDNAはプライマー6および5を用いたPCRによって増幅された。その結果できたPCR産物はClaIおよびXbaIによって消化され、ClaIおよびXbaIによって消化されていたpRC/CMV-4121にサブクローニングされ、融合構築物が作成された。抗ヒトSC単鎖FV/プロタミン融合タンパク質をコードするDNA配列はSEQ ID NO:24(配列番号24)に挙げられている。抗ヒトSC単鎖FV/プロタミン融合タンパク質のアミノ酸配列はSEQ ID NO:25(配列番号25)に挙げられている。
【０２１３】
単鎖FVタンパク質をコードするDNA配列の解析は連結領域内のグリシンをコードする一つのコドンが単鎖FVの合成の際に欠落していたことを明らかにした。その結果できた単鎖FVは意図された(GGGGS)3(SEQ ID NO:27(配列番号27))の代わりにGGGGSGGGGSGGGS(SEQ ID NO:26(配列番号26))というアミノ酸配列を含む。単鎖FV内の連結領域は3.5Aまたはそれ以上の長さが必要であると報告されている(3.5Aは結晶構造によって決定された本来の抗体における軽鎖と重鎖の可変領域の距離である)[Huston et al. (1988) Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA 85:5879]。それぞれのペプチド結合の長さが0.38Aであるから、抗ヒトSC 単鎖FVに存在する14アミノ酸の連結領域はHuston et al/によって報告された必要な連結領域の長さを満たしている。Pantoliano et al.は連結領域が12アミノ酸だけの長さである場合に単鎖FVの親和性が減少するが、14から25アミノ酸の間の長さでは標的タンパク質にたいして同じような結合親和性を示すことを報告している[Biochem.(1991) 30:10117]。14残基の連結領域を含む4121単鎖FVは受容体タンパク質を認識することが"ウェスタンブロット"的解析によって示された(下記)。
【０２１４】
単鎖FVおよびヒトSCに対する単鎖FV/プロタミン融合物をコードするDNAはpBluescript(Stratagene)にクローニングされ、登録商標TnTウサギ網状赤血球溶解物発現系(Promega)において35S-メチオニンの存在下で発現された。4121単鎖FVの翻訳によって期待された大きさである約30kDaのタンパク質が得られた。4121融合タンパク質の翻訳によって約56kDaの太いバンドが得られたが、これはおそらくpH8.8のゲルの中で動くプロタミンの高度に塩基性な性質で(pK1約12)によるのだろう。
【０２１５】
標識された網状赤血球溶解物(4121単鎖FVによりプログラムされた)は透明化されたヒト乳からゲル電気泳動によって分離されたタンパク質が移されていたナイロン膜とともに放置された。ブロットは激しく洗浄され、オートラジオグラフィーが行われた。この放射性タンパク質はヒト乳中のヒトSCに対して適切な分子量のタンパク質に結合した。これらの結果は14残基の連結領域を含む4121単鎖Fvは受容体タンパク質(ヒトSC)を認識することを示す。
iv)単鎖Fvおよび単鎖Fv融合タンパク質の発現
単鎖Fvおよび単鎖Fv融合タンパク質をコードするDNA配列はコード領域をQIAexpress  発現系(Qiagen, Chtsworth, CA)に挿入することによってE.  coli細胞中で発現される。この系においては発現はE.  coli  ファージT5プロモーターおよびIPTGによる誘導以前の"漏洩"発現を最小化する2つのlacオペレーター配列による厳密な制御下におかれる。さらに、これらの発現ベクターはまたNi-NTAカラムでの精製を可能にする6-ヒスチジン  タグをもコードしている。これは発現したタンパク質のカラムに対する緊密な結合(pH8.0でのKdは10-13)を可能にし、そのことで単鎖Fv融合タンパク質に存在するポリ陽イオン配列に結合し得る細菌の核酸を除去することが可能になる。融合構築物はN末端の6-Hisおよび高度に荷電した陽イオンの相互作用による6-Hisの不安定化を最小化するC末端のポリ陽イオンによって集められる。その他の適切で等価な発現系は当該技術分野において知られている。
【０２１６】
単鎖Fvおよび単鎖Fv融合タンパク質の発現は真核細胞[例えばCOS-7(ATCC CRL 1651),ミエローマ細胞株、およびHEK293細胞(ATCC CRL 1573)]において達成され得る。これらのタンパク質を真核細胞において発現させるために、タンパク質にはリーダー配列が付加され、タンパク質が分泌されるようにされる(それによって精製を容易にする)。リーダー配列が付加され得るか、またはNichollsプライマーの上流の免疫グロブリンの配列が単に含まれるかし得る。
【０２１７】
単鎖Fvおよび単鎖Fv融合タンパク質の発現および精製に続いてこれらのタンパク質は望ましい発現ベクターとともに凝縮されて遺伝子転移複合体を形成させられる。一部は複合体の大きさおよび折り畳み度を推測するために電子顕微鏡のためにとり置かれ、複合体は遺伝子転移活性を試験される。
【０２１８】
実施例10
遺伝子のSerpin酵素複合体受容体を介した標的分配の為の
ペプチド-ポリ陽イオン担体の構築
セリンプロテアーゼ阻害剤(serpin)酵素複合体受容体(SEC-R)は肝臓腫細胞、単核貪食球、ヒト好中球細胞株U937およびHL-60、ヒト腸上皮細胞株CaCo2、マウス繊維芽細胞L細胞、ラット神経細胞株PC12、およびヒトグリア細胞株U373MGを含む様々な細胞種において見られる[Perlmutter(1994) Pediatric Res.  36:271-277]。この受容体はセリンプロテアーゼのserpin/セリンプロテアーゼ複合体の形成とともにその酵素的リガンドによるsepinのタンパク質分解的消化によって外に出される領域に結合する[Enghild, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20159-20166; Permutter, et al.  (1990) J.  Biol.  Chem.  265:16713-16716;Permutter, et al.  (1990) Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA 87:3753-3757; Kahalil, et al.  (1994) Brain Res.  651:227-235; Joslin, et al.  (1991) J.  Biol.  Chem.  266:11282-11288; Joslin, et al.  (1993) J. Biol. Chem.  268:1886-1893]。結合に続いてserpin-酵素複合体は細胞内に入り、分解するためにリソソームに運ばれる。α1-アンチプロテアーゼのアミノ酸359-374番の配列に基づく合成ペプチドは特異的かつ飽和可能な様式でHepG2細胞上の受容体に結合し、機能的な応答を仲介する[Permutter, et al.  (1990) J.  Biol.  Chem., supra;  Permutter, et al.  (1990) Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA, supra; Kahalil, et al.  (1994), supra; Joslin, et al. (1991), supra; Joslin, et al.  (1993), supra]。受容体はまたアミロイド-β  ペプチド、基質P、およびボンベシンにも結合する[Joslin, et al.  (1991) J.  Biol.  Chem.  166:21897-21902; Boland, et al.  (1995) J. Biol. Chem. 270:28022-28028]。したがって進行中の実施例中に記載された遺伝子転移に都合の良いその他の受容体のようにSEC-Rは、5量体ペプチド結合ドメイン[FVF/YLI (SEQ ID NO:28(配列番号28)およびSEQ ID NO:29(配列番号29）]が存在する限り、結合および低い選択性での大きな分子複合体の細胞内への移動に適している[Permutter(1994) Pediatric Res.  36:271; Kahalil, et al.  (1994), supra; Joslin, et al.  (1991), supra; Joslin, et al.  (1993), supra およびBu et al.  (1992) J. Biol. Chem. 267:15595]。
【０２１９】
後述される実施例は5量体ペプチド結合モチーフを持った内在的なDNA複合体がSEC受容体によって攻撃され、細胞内に運ばれ得ることを示す。その豊富さ、および予測される標的肝細胞(多くの遺伝的疾患部位)およびアルツハイマー病およびα1-アンチプロテアーゼ疾患によって初めに影響を受ける細胞[Permutter (1994) Pediatric Res., supraに概説されている]に共役した大部分の流動特性によって本受容体系を受容体に仲介される遺伝子分配の魅力的な候補としている。さらにそれが脳に存在することは治療遺伝子を脳血液関門を通過させる能力を与え得る。本実施例においてはSEC受容体に対する合成ペプチドリガンドに共役したポリ-L-リジンを含む担体が構築された。担体上にポリ-L-リジンによって凝縮された外来DNAは攻撃され、受容体をもつ細胞に発現され得る。
【０２２０】
a)  5量体ペプチドSEC-R結合モチーフを含むペプチドの作成
ペプチドC105Y [CSIPPEVKFNKPFVYLI(SEQ ID NO:30(配列番号30))]およびC1315[CFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLIIHRD(SEQ ID NO:31(配列番号31))]は以前に記載されたように固相法によって合成され、精製され、アミノ酸組成および配列解析された[Joslin, et al.  (1991) J. Biol. Chem. 268:1886-1893];5量体ペプチド認識配列は太字で示される。5量体ペプチド結合ドメインはそれぞれの配列について太字で示される。C105Yペプチドは培養細胞株上のSEC-Rの量を定量するために用いられた。C1315ペプチドはポリリジンに共役されてSEC-Rを発現している細胞にDNAを分配することのできる担体を形成される。
【０２２１】
b)C1315-ポリリジン共役物の形成
C1315ペプチドは上記実施例3に記載されたヘテロ2機能架橋試薬LC スルフォ SPDP (Pierce)を用いてポリ-L-リジン(平均分子量=22.5kD;シグマ)に共有結合的に連結された[Ferkoll et al. (1993) J. Clin. Invest. 92:2394も見よ]。簡潔に示すと77μlの20mM LCスルフォSPDP水溶液は30.1Mリン酸緩衝溶液(PBS)、pH7.4中の3mg ポリ-L-リジン(LC スルフォSPDPがポリリジンに対してモル量で10倍過剰)と共に室温(約22℃)で30分放置された。反応混合物は透析されて完全に水から未反応LCスルフォSPDPおよび低分子量反応生成物を除かれた。モル量で3倍過剰な修飾されたポリ-L-リジンがペプチドC1315に加えられ、22℃で24時間反応された。共役物は透析されて未反応のペプチドおよび低分子量の反応生成物が除去された。
【０２２２】
c)  C1315-ポリリジン 共役物のNMR解析
ポリ-L-リジンとC1315ペプチドの共役タンパク質の構築は、ポリリジンのLCスルフォSPDP修飾の段階およびC1315ペプチドの修飾されたポリリジンとの共役の段階の両方がNMRによって調べられた。共役物の一部(5-10mg)は水にたいして完全に透析され先ずみずから、次にD2Oから凍結乾燥され、99.999%D2O(Merck)に再懸濁された。そして試料はNMR分光計(Varian Unity Plus 600)に入れられ、0.5から16時間の間スペクトルをとられた。化学シフトは4.9ppmでのHDO残基共鳴を示した。代表的なNMRスペクトルは図21に示される。
【０２２３】
図21Aは未修飾ポリリジンから得られたスペクトルを示す。;図21BはLCスルフォSPDP-共役ポリリジンから得られたスペクトルを示す。;図21CはDTT処理後のLCスルフォSPDP-共役ポリリジンから得られたスペクトルを示す。;および図21DはC1315ペプチドと複合体を作ったLCスルフォSPDP-共役ポリリジンから得られたスペクトルを示す。
【０２２４】
未修飾ポリリジンのスペクトル(図21A)は共役反応に対する"背景"対照である。リジンの水素は芳香環の水素よりも保護解除されていないため、低い共鳴シフトを持つ(αH:4.25ppm,βH:1.87ppm, γH: 1.46ppm, δH:1.79ppm, ΣH:3.07ppm)。LCスルフォSPDP上の芳香環水素はしかしより保護解除されており、より高いppmの化学シフトを持つ。リジンの第一アミン側鎖に対する連結領域の結合を推定するために、LC スルフォSPDP修飾ポリリジンのスペクトルが得られた(図21B)。7.36ppm、7.88ppm、および8.45ppmの水素の化学シフトはSPDP芳香環の1、2および3および4水素に属している。さらにポリリジン/LCスルフォSPDPのジチオスレイトール処理は芳香環を解裂させ、芳香環水素シフトを98.8%消失させる(図21C)。この操作はまた透析はSPDPおよび低分子量生成物を効率よく溶液から除去することをも示した。従ってNMRスペクトルはポリリジンに共有結合している物質だけを表している。リジンの取り込みおよびSPDP芳香環水素のピークは14のリジンのうち1つが反応してLCスルフォSPDPに結合したことを明らかにした。共役反応の間のポリリジンのLCスルフォSPDPに対するわりあいに基づいて、この反応は75%の効率であったと見積もられた。図21Dに示されたC1315/ポリリジン共役物のH1NMR解析は期待されたように芳香族フェニルアラニンの出現およびLC スルフォSPDPの消失と同時に起こるヒスチジン水素シフトを示した。フェニルアラニン芳香環水素は7.25ppmから7.60ppm(図21Dで標識されている)でシフトした。これらのピークを総合して159中1つのリジンおよび11.4につき1つのLCスルフォSPDP連結部がペプチドに連結されていることが示された。方法の項目に記載されたモル比に基づくと反応は85%の効率であった(例えば加えられたペプチドC1315の85%がポリリジンに共役された。)
実施例11
C1315ペプチドに基づいたDNA複合体の形成
C1315ペプチド/ポリリジン共役物を含む複合体およびいくつかの異なる発現ベクターが作成された。発現ベクターを含むDNAは、エンドサイトーシスの経路(例えばSEC-Rを通じた取り込みと細胞内への輸送)効率よく細胞内に運ばれるのに適した高度にコンパクトな複合体に、ペプチドに基づく担体によって凝縮された。
a)レポーター遺伝子およびプラスミドの調製
3つの異なるレポーター遺伝子をコードした3つのプラスミドが用いられた。発現プラスミドpGL3(Promega)はシミアンウィルス(SV40)ウィルスプロモーターおよび、Photinus pyralis luciferase 遺伝子に繋がれてE.coli pUC19ベクターに挿入されたエンハンサーを含んでいた。プラスミドpCMV lacZ II[Lin and Culp (1991) Biotechniques 11:344-351]およびpFIX (Dr.  E.  Davie,  University of Washington,  Seattle; Immune Response, San Diego, CA より入手できる)はそれぞれE.coli βガラクトシダーゼ(lacZ)およびヒト因子IX(hFIX)遺伝子に繋がれたサイトメガロウィルス(CMV)プロモーターを含む。プラスミドはE.coli DHα株で増殖させられ、抽出され、塩化セシウム密度勾配[Sambrook et al.  (1989) Molecular Cloning: Alaboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]によって2度精製された。プラスミドの性質は制限酵素消化によって確認され、1.0%アガロスゲル上での電気泳動によって純度が確立された。プラスミドの大きさは以下のとおり:pGL3、5Kb;pCMV lacZ。10.8kb; pFIX、5.4kb。
【０２２５】
DNAの純度はDNAの適切な凝縮を可能にするために重要である。特にプラスミドDNAには細菌のRNAおよびタンパク質が含まれないことが望ましい。プラスミドDNAはCsCl密度勾配によって2度精製された後フェノール:クロロフォルム抽出され、2度RNAseAおよびT1によって消化される。精製されたプラスミドDNAを含む溶液の吸光度は260nmおよび280nmにおいて測定され、260nmおよび280nmでの測定値の比(OD260/OD280)は約1.8であることが望ましい。混入したRNAがないことは精製したプラスミドDNA調製物の一部をアガロースゲル中で泳動し、EtBrによって染色することで確かめられる。プラスミドDNAよりも低い分子量を持つ蛍光分子種がなければ混入していたRNAは除去されている。
【０２２６】
b)C1315ペプチドに基づくDNA複合体の形成
担体DNA複合体は以前上記実施例1においてガラクトシル化されたポリリジンリガンドについて記載された一般的な技術を用いて形成された。簡潔に示すと400mM塩化ナトリウム存在下で室温で恒常的にヴォルテックスしながらC1315ペプチド担体をゆっくり(5分間に5μl)加えることでDNAは凝縮された。IKA VIBRAX-VXR 51 voltex mixer (IKA Labortechnik Staufen)が用いられた。ヴォルテックスミキサーは100rpm以上の速さで用いられた。用いられた速度は管内の溶液の量に依存する。容器(例えば微小遠心管)の容積の1/2を占める体積にたいしては約1000から1200rpmが用いられる(溶液が管から出るほどの速度ではならない。);非常に少量が用いられるなら(例えば500μl微小遠心管中に約10μl)、200から300rpmaで混合させるには十分である。
【０２２７】
加えられた担体の量はDNA上のリン酸基の負電荷を中和するのに必要なポリ-L-リジンの電荷量によって計算された。担体のDNAへの付加および凝集物の出現の後、5M NaClを少量加えることで溶液の塩化ナトリウム濃度が調整された。溶液のイオン強度が上昇するに連れて凝集していたC1315/ポリ-L-リジン-DNA複合体が凝縮された状態となり実施例1に記載されたように、溶液の粘性はなくなる。
【０２２８】
溶液の最終的な体積は典型的には500μlであり、重量/重量比で1:0.45のDNAとペプチドポリ-L-リジン共役物を0.8-1M NaCl中に含んでいた。必要な塩化ナトリウムの終濃度が異なることはDNAおよびポリ-L-リジンの大きさおよび物理的な状態の調製物間でのわずかな違いによるものであった。反応混合物の一部は凝縮度を推定するために電子顕微鏡(EM)下で観察された。
【０２２９】
c)凝縮したDNA複合体の電子顕微鏡観察
顕微鏡盤は上記図1の記述に記載されたように調製された。簡潔に示すと、DNA複合体の形成の後、溶液(複合体混合物を水で1:10に希釈したもの)が一滴1,000メッシュの電子顕微鏡炭素盤に加えられ、ブロットされ、0.04%酢酸ウランで染色された。試料はそひて回転陰影によって陰影を付けられ、JEOL-100C電子顕微鏡によって観察された。
【０２３０】
d)C1315ペプチドに基づく担体DNA複合体の電子顕微鏡解析。
明らかに、緊密に凝縮された小胞が細胞内への輸送の効率を増大させるため、C1315ペプチドに基づく担体DNA複合体は電子顕微鏡によって観察された。典型的な場合、C1315/ポリリジン-pGL3 DNA(5.5kb)複合体混合物は直径17から23nmの複合体を含んでいた。複合体を形成するのに用いられた溶液もまた調べれられ、人工物が無いことおよび可視的な構造が含まれないことが確かめられた。複合体の境界の"影"はこれらの複合体の高さの次元に比例して示される。凝集した複合体は5M NaCl付加以前に溶液中に存在した。最終複合体混合物にはこれらの凝集物は0.5%以下含まれた。凝集物の50%以上を含む混合物はHuH7、HepG2(高)またはHepG2(低)細胞をトランスフェクトすることに失敗した(下記のトランスフェクションプロトコールを参照)。これらのデータは緊密に形成された複合体のみが効果的に細胞をトランスフェクトできることを示した以前の報告に一致した[先行するFerkol et al. (1996) nProc Natl. Acad. Sci. USA 93:101の例を見よ]。プラスミドの大きさがこれらの小胞の大きさに影響し得るため、pCMV lac Z II DNA (10.8kb)およびC1315/ポリリジン-pCMV Lac Z II複合体が比較された。これらの複合体はまた直径20から25nmの範囲の大きさであった。pFIX(5.4kb)の複合体はpGL3複合体と同じ大きさであった。
【０２３１】
実施例12
SEC 受容体を発現している細胞への
C1315ペプチド-ポリリジンDNA複合体を用いた遺伝子転移
C1315ペプチド-ポリリジン-DNA複合体は様々なレベルのSEC受容体を細胞表面に発現したヒト肝臓癌細胞株にトランスフェクトするために用いられた。
【０２３２】
a)細胞培養
HepG2細胞の2つの集団が以前に記載されたように維持された[Perlmutter et al. (1990) J.Biol. Chem. 265:16713]。簡潔に示すと、HepG2細胞株は10%FCSを含むL-グルタミン(GibcoBRL)とともにEMEM中で維持された。HepG2(高)細胞(#2節)はATCC(Rockville,MD)より得られた。HepG2(低)細胞(#300節)はDr.Lucyndia Marino (cleveland,OH)より得られた。これらの細胞はSEC受容体リガンドC105YおよびC1315(下記)に結合する能力によって(高)または(低)と示された。HuH7細胞(Immune Response, San Deigo, CA)は10%FCSを含むRPMI培地(GibcoBRL)中で培養された。2日ごとに新しい培地が加えられた。
【０２３３】
b)細胞表面SEC受容体結合の決定
ペプチドC105Yは以下のようにクロラミンT法[Hunter and Greenwood (1962) Nature 194:49]による修飾により放射性ヨウ素化された。簡潔に示すと、20μlのPBSに溶かされた約50μgのC105Yペプチドが20μlのクロラミンT(120mg/10ml)および1mCi125I(DuPont-New England Nuclear, Boston, MA)と混ぜられた。反応混合物は室温に30秒放置され、そして50μlのsodium metabisulfite(36mg/10ml)が加えられた。標識されたC105Yペプチドはヨウ素化されたペプチドが加えられる前にPBSに溶かした3mg/mlのBSAの適用によってブロックされたSephadex G10カラム(Bio-Rad)上で精製された。125IペプチドC105Yの特異的な放射能は3,500から11,700dpm/ngの間であった。
【０２３４】
HuH7細胞および2つのHepG2細胞集団が研究された。細胞は24穴組織培養プレートに入れられ、凝集させられ、1mMCaCl2および2.5mMMgCl2を含むリン酸緩衝溶液(Ca2+/Mg2+ PBS)によって完全に洗浄され、200倍過剰の非標識リガンドの存在下または非存在下で12.5から400nMの濃度の125I標識リガンド(例えばC105Y)とともに4℃で2時間放置され、結合培地(50mM HEPES、0.1mg/mlチトクイロームc、0.01% Tween 80、2mg/ml ウシ血清アルブミンを含むDMEM)によって希釈された。細胞はそしてCa2+/Mg2+PBSですすがれ、1N NaOH中で破砕され、細胞に結合した放射能が決定された。非特異的結合は細胞をモル量で200倍過剰な非標識リガンドとともに放置することで決定された。特異的な結合は全量と非特異的結合量の差として定義された。結合特性はScatchard 解析によって決定された。適切な比較を行うために、3つの細胞株[HuH7、HepG2(高)、およびHepG2(低)]全てについて結合試験が同じに同一のヨウ素化されたC105Yペプチド集団を用いて行われた。
【０２３５】
c)培養された肝臓癌細胞における表面SEC受容体結合の決定
HuH7、HepG2(高)およびHepG2(低)細胞はモル量で200倍過剰の非標識ペプチドの存在下および非存在下で異なる濃度の125I標識C105Yペプチドとともに放置された。結果は図22に要約されている。結果は6つの別々の実験を表す。
【０２３６】
図22において特異的結合(cpm/100万細胞)はヨウ素化されたC105Yペプチドの濃度(nM)に対してプロットされる。線は125I-C105YのHuH7細胞(o)、HepG2(高)細胞(□)およびHepG2(低)細胞(◇)に対する特異的結合を表すために示される。特異的結合は200倍過剰の非標識ペプチド存在下で結合している125I-C105Yによって得られたcpm(非特異的結合)から、結合しているC105Y125Iによって得られたcpm(全結合量)を差し引くことで決定された。
【０２３７】
HuH7およびHepG2(高)細胞の両方が図22に示された特異的で飽和可能な結合を示した(それぞれ円および四角形)。HepG2(高)結合のScatchard解析は以前の報告と一致して50nMのKdを示した[Permutter, et al.  (1990) J.  Biol.  Chem.  265:16716; Permutter. (1990) Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA 87:3753; Kahalil, et al.  (1994) Brain Res.  651:227; Joslin, et al.  (1991) J. Biol. Chem.  266:11282; およびJoslin, et al.  (1993) J. Biol.  Chem. 268:1886]。HuH7細胞はより多くのC105Y[HepG2(高)の1.5倍]を結合し、約70nMのKdを示した。HepG2(低)細胞はHuH7細胞よりも10倍少なく、HepG2(高)細胞よりも7.5倍少ない、ヨウ素化リガンドの特異的結合を示した(図22ダイアモンド型)。HepG2(低)細胞は約22.5のKdでヨウ素化C105Yを結合した。これらの結合蛍光はHuH7、HepG2(高)およびHepG2(低)細胞における結合を比較した7つの実験において一貫していた。
【０２３８】
d)培養中のHuH7およびHepG2細胞に対するDNA分配
C1315ペプチド/ポリ-L-リジン-DNA複合体はHuH7およびHepG2細胞をトランスフェクトするために用いられた。細胞はpGL3、pCMV lacZ IIおよびpFIXを含む複合体によって以下のようにトランスフェクトされた。トランスフェクションの2日前にHuH7またはHepG2細胞はpH7.4のPBSで2度洗浄され、DMEMに溶かした0.05%トリプシンによってトリプシン処理され、グルタミンを含む血清DMEMとともに6穴プレートに入れられた。細胞はプレートに接着され、30%凝集した。細胞濃度は典型的にはプレートあたり5x105細胞であった。トランスフェクションの日には増殖培地は交換され、細胞はCa2+/Mg2+ PBSで洗浄された。C1315ペプチド/ポリ-L-リジン-DNA複合体を含むものの一部(62(lacZ IIについては122)、80(lac ZIIについては160)または97(lacZIIについては194)pmol のC1315/ポリリジン共役物によってそれぞれ凝縮された1220.83、1.11、または1.34pmol pGl3、pFIX(1.34pmolを除く)またはpCMV lacZ II DNA)が個々の穴の2mlの培地に加えられた。
【０２３９】
以下の対照が含まれた。1)80(lacZIIについては160)pmol C1315ペプチドおよび200(lac ZIIについては400)pmol LC スルフォSPDP連結領域によって凝縮された1.11pmol pGL3、pFIX、またはpCMV lacZII DNAによってトランスフェクトされたHuH7またはHepG2(高)細胞。2)80または160pmol C1315/ポリリジン共役物によってそれぞれ凝縮された1.11pmol pGL3またはpCMV lacZ II DNAによってトランスフェクトされたHepG2(低)細胞。3)使用説明書にしたがって(Life Technologies)Lipofectin試薬を用いてリポフェクションすることで1.0pmolのpGL3、pFIXまたはpCMV lacZ II DNAによってトランスフェクトされたHepG2 (高)、HepG2(低)、またはHuH7細胞。および4)ポリリジンで凝縮された1.11pmolのDNAによってLipofectinを用いてトランスフェクトされたHepG2(高)またはHepG2(低)またはHuH7細胞。対照1および2は非特異的な取り込みを調べるために設計され、対照3および4はトランスフェクト遺伝子が分配されれば標的細胞はそれを発現することが出来ることを確かめるために設計された。
【０２４０】
複合体および/またはlipofectinが加えられた後、細胞は37℃で6時間放置された。そして細胞はCa2+/Mg2+ PBSによってすすがれ、新しい増殖培地が加えられ、適切な機能試験が行われるまで37℃で(2日毎に培地を交換しつつ)放置された。10倍過剰のC1315ペプチドの存在および非存在下で1.11pmolのC1315担体によって凝縮されたDNAによってHepG2(高)細胞がトランスフェクトされることで競合実験が行われた。全てのトランスフェクションは複数行われた。DNA/共役ポリリジン複合体によってトランスフェクトされた穴のどれにおいても放置中を通じて細胞死は観察されなかった。
【０２４１】
ルシフェラーぜ発現はトランスフェクションの2、4、6、8、10および12日後に調べられた。lacZ染色はトランスフェクションの36時間後に行われた。pFIXによってトランスフェクトされた細胞の培地はトランスフェクト4日後にヒト因子IX活性について調べられた。
【０２４２】
i)ルシフェラーぜ発現の検査  
pGL3を含む複合体によってトランスフェクトされてから2、4、6、8、10日後に細胞は改修され、溶解緩衝液(Promega)中で破砕され、15分間放置された。溶解物は細胞の残りを沈澱させるために遠心分離(12,000xgで5分間、4℃で)され、上清が検査のために集められた。ルシフェラーぜ活性は使用説明書にしたがってPromega検査試薬を用いて
測定された。それぞれの試料の細胞溶解物20μlは以前に記載されたように[Brasier, et al.  (1989) BioTechniques 7:1116-1122]ルシフェラーぜ活性について解析された。タンパク質はBradford法(Bio-Rad kit)によって決定された。結果はmgのタンパク質当たりの取り込まれた光単位(ILU)として表された。全ての測定は複数行われて平均された。
【０２４３】
ii)β-ガラクトシダーゼ活性の検査
β-ガラクトシダーゼを発現している個々のHuH7およびHepG2細胞は以前に記載されたように[Lim and Chase (1989) Biotechniques 7:576-579]同定された。簡潔に示すと、pCMV lacZ IIプラスミドによってトランスフェクトされた細胞はPBSによって完全に洗浄され、PBSに溶かされた0.5%グルタルアルデヒド溶液によって10分間(6穴プレート中で)固定され、再び洗浄され、0.5% X-gal(BM)を含む溶液中で37℃で4.5時間放置された。そして細胞はNuclear Fast Redによって軽く逆染色された。青色の細胞が同定され、位相差倒立光学顕微鏡を通して写真を撮影された。効率は数えられた100細胞当たりの明らかに青い細胞の数によって計算された。
【０２４４】
iii)ヒト因子IX生産の検査
ヒト因子IX(hFIX)はトランスフェクション後にHepG2細胞において発現され、増殖培地中に分泌された。HepG2細胞は内在的なヒト因子IXを発現しない。HuH7、HepG2(高)およびHepG2(低)細胞は適切な正および負の対照と共に上記のようにトランスフェクトされた。培地は1、2、および5日目に採取され、hFIXの存在についてELISAによって検査された。精製されたヒト血漿因子IX(American Diagnostics,Inc., Greemwich, CT)を用いて0.2から1ng/mlの濃度の標準が調製された。ELISAプレートは繋がれたモノクロナールマウスIgG由来抗ヒト血漿因子IX(hematological Tech., Essex.  VT)によって被覆され、検査の前夜4℃で放置された。次の日、プレートは0.1% Tween-20 PBを含むPBSによって完全にすすがれ、10%FCSを含む100μlのRPMI培地(GibcoBRL)によって1時間ブロックされた。標準および、トランスフェクトされたHuH7およびHepG2細胞から採取された培地の一部が加えられ、室温で2時間放置された。厳しい条件での洗浄(例えばPBSに溶かした0.1%Tween20で3回の洗浄)の後、10%FCS RPM によって1:1,000に希釈された50μlの一次抗体[ウサギIgG 由来ポリクロナール抗ヒト血漿因子IX(Cal. Biotech)]が穴に加えられ、室温で1時間放置された。厳しい条件での洗浄の後、50μlの希釈された2次抗体、すなわちホースラディッシュペルオキシダーゼに結合されたヤギ抗ウサギIgGが加えられ、混合物は室温で1時間放置された(10%FCSを含むRPMIによって1:2,000希釈された)。最後の洗浄の後、テトラメチルベンジジンジヒドロクロライド(TMBD)とともに1時間放置した後の試料のOD測定によってそれぞれの試料のホースラディッシュペルオキシダーゼ活性が測定された。全ての検査は複数行われ、結果はng/ml/100万細胞の単位で表された。
【０２４５】
iv) β-ガラクトシダーゼ/SEC-R 細胞化学染色による共局在
HuH7、HepG2(高)およびHepG2(低)細胞は6穴プレートに入れられ、上記のようにトランスフェクトされた。フルオレシンイソチオシアネートによる フルオレシン標識は以前に記載されたように行われた[Mann and Fish (1972) Methods of Enzymology 26:28-42]。簡潔に示すと、C1315ペプチド(145μg)が1mgのフルオレシンイソチオシアネートとともに室温で1時間放置された。放置の後、10mg/mlのグリシンが加えられて過剰の試薬が破壊され、1N  HClを加えることでpHが6.0に調節され、標識されたペプチドはSephadex G10カラム(Bio-Rad)上で精製された。トランスフェクト後2日後、細胞はCa2+/Mg2+PBSによって洗浄され、100nMのフルオレシン標識C1315ペプチドとともに4℃で放置され、結合緩衝液(50mM Hepes、0.1mg/ml チトクロームc、0.01% tween80、2mg/ml ウシ血清アルブミンを含むDMEM)によって希釈された。個々の細胞は励起波長193.5nmおよび測定波長530nmの条件でZeiss axiovert 35顕微鏡によって映像化された。デジタル映像は冷却CCDカメラ、モデルCH250によって25秒間取り込まれ(Photometrics, Ltd., Tucson, AZ)、Macintosh Quadra 900cinfigurationとともにNu2000カメラ操作盤(Photometrics)によって定量された。データはOncor画像ソフトウェア(Oncor Omaging, Rockville, MD)によって処理された。
【０２４６】
測定の後、細胞は繰り返しすすがれ、後で向きが分かるようにプレートに印が付けられた。そして細胞は上記のようにβ-ガラクトシダーゼ活性について検査され、フルオレシン測定に用いられたのと同じ向きで位相差光学顕微鏡によって映像化された。β-ガラクトシダーゼを発現している細胞に対するフルオレシン標識されたC1315の結合を評価できるような倍率で写真が取られた。
【０２４７】
実施例13
C1315 ペプチド-ポリリジン-DNA複合体は
効率的に遺伝子を肝臓癌細胞株に導入する
肝臓癌細胞株はC1315ペプチド-ポリリジン-DNA複合体によって上記の様にトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は上記の検査を用いて適切なレポーター遺伝子の発現について解析された。以下に記載される結果はC1315-ポリリジン-DNA複合体が効率的に遺伝子を肝臓癌細胞株に導入したことを示した。
【０２４８】
a)pGL3ルシフェラーぜ発現プラスミドによるHepG2細胞のトランスフェクション
様々な濃度のC1315/ポリリジン-pGL3 DNA複合体が実施例12に記載されたようにHepG2細胞に用いられた。トランスフェクションおよび発現は細胞抽出物中のルシフェラーぜ活性によって評価された。正の対照(下記)はHepG2(高)およびHepG2(低)細胞のpGL3遺伝子産物を発現する能力を確立した。受容体によって仲介される導入のピークの平均はそれぞれ20および40%のDNA/リポフェクチンおよび凝縮されたDNA/リポフェクチン対照について2日および4日の間に404,376+/-247,034ILUs/mg タンパク質であった。トランスフェクションの10日後にはルシフェラーゼ活性はバックグラウンドまで減少した。修飾されていないポリリジンによって凝縮されたpGL3(例えば合成されていない複合体)にさらされた細胞は負の対照として働いた。結果は図23に要約され、平均値+-平均の標準偏差として表記される。
【０２４９】
図23Aはペプチドに基づいた複合体によるトランスフェクションの量依存性および時間経過を表す。図23AにおいてはILUs/mgタンパク質数はトランスフェクト後の日数に対してプロットされた。示された時点のそれぞれについて1)合成されていない複合体[例えばそれぞれ1.11pmolの遊離のC1315およびLCスルフォSPDP連結領域の存在下での共役していないポリリジン凝縮DNA(1.11pmol)]によってトランスフェクトされたHepG2(高)細胞、2)0.83pmolのpGL3DNA複合体によってトランスフェクトされたHepG2(高)細胞、3)1.11pmol pGL3 DNAによってトランスフェクトされたHepG2(高)細胞、4)1.34pmolのpGL3 DNA複合体によってトランスフェクトされたHepG2(高)細胞、および5)1.11pmolのpGL3 DNA複合体によってトランスフェクトされたHepG2(低)細胞はそれぞれ左から右に示される。図23Aにおいては試験されたそれぞれの濃度のpGL3複合体によってトランスフェクトされてから2および4日後のHepG2(高)細胞から得られた値は合成されていない複合体によってトランスフェクトされた細胞から得られた値に比べて有意な差(P<0.05)を示す。試験されたそれぞれの濃度のpGL3複合体によってトランスフェクトされてから2、4、および6日後のHepG2(低)細胞から得られた値は対応するトランスフェクトされたHepG2(低)細胞に比べて有意な差(P<0.05)を示す。pGL3トランスフェクトされたHepG2(低）細胞から得られた値は負の対照と比べて統計的な差はなかった。
【０２５０】
図23Aに見られるように10mm穴中の5x105細胞当たり1.11pmolのDNA量のときにトランスフェクションは最大になった。最適濃度より高いまたは低い濃度の複合体はトランスフェクションおよび発現の効率が低い[Wu and Wu (1991) J Biol Chem 262:44299; Wu, et al.  (1990) J. Biol. Chem. 266:14338;Ferkol, et al. (1995) J. Clin. Invest. 95:493; Perales, et al.  (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:4086]。HepG(低)細胞は複合体によって非常に低い効率でトランスフェクトされた(図23A、黒く塗りつぶされたカラム)。対応する濃度の遊離C1315およびLCスルフォSPDP連結領域の存在下で共役していないポリリジン凝縮DNA(1.11pmol)に曝されたHepG2(高)細胞はトランスフェクトされなかった。
【０２５１】
図23Bに示されたようにモル量で10倍過剰の遊離のペプチドをトランスフェクション時に加えることで取り込みと発現が約50%までブロックされた。過剰の遊離のペプチドは細胞の生存率には影響しなかった。図23BにおいてILUs/mgタンパク質数はトランスフェクション後の日数にたいしてプロットされている。示されたそれぞれの時点において1)合成されていない複合体[例えばそれぞれ1.11pmolの遊離のC1315おおよびLC スルフォSPDP連結領域の存在下での共役していないポリリジン凝縮DNA(1.11pmol)]によってトランスフェクトされたHepG2(高)細胞(白いカラム)、2)1.11pmolのpGL3DNA複合体によってトランスフェクトされたHepG2(高)細胞(影を付けられたカラム)、および3)10倍濃度の遊離C1315ペプチド存在下での1.11pmolのpGL3DNA複合体によってトランスフェクトされたHepG2(高)細胞(黒いカラム)はそれぞれ左から右に示される。
【０２５２】
b)pCMV lacZ II-β-ガラクトシダーゼ発現プラスミドによるトランスフェクション
HuH7およびHepG2細胞株の両方がβ-ガラクトシダーゼをコードしたpCMV lacZ IIプラスミドのC1315ペプチド担体との複合体によって、または上記のようにリポフェクチンを用いてトランスフェクトされた。トランスフェクションの3日後細胞は改修されβ-ガラクトシダーゼ活性が決定された。その結果(平均値+-平均値の標準偏差として表記されている)は表107にまとめられている。青く染まった細胞はβ-ガラクトシダーゼを発現していることを表す;蛍光細胞はフルオレシン化されたC105Yペプチドを結合した細胞を表す。青、または蛍光として数えられた細胞は強く染まっていた。平均の%値は無作為に選ばれた100の細胞あたりの青いまたは蛍光の細胞の数を表す。結果は行われた6つの独立な実験を表す。細胞はpCMV LacZ IIによって凝縮した1.11pmolのペプチド担体("ペプチド担体複合体")またはリポフェクチン(登録商標"Lipofectin")と混合された1.0pmol pCMV Lac Z IIによって処理された。
【０２５３】
表107に示されたようにHepG2(低)細胞ではなくHuH7およびHepG2(高)細胞 だけが顕著なβ-ガラクトシダーゼ染色を示した。染色のパターンはDNA濃度とともに、ルシフェラーゼ活性と関連して変わった。HuH7およびHepG2(高)の両方について穴あたり1.11pmolDNAの場合最も高い割合で陽性の細胞を産した(表107)。登録商標"Lipofectin"による細胞の非特異的なトランスフェクションは平均的に我々の複合体によって見られる数の2倍の陽性細胞が得られた。共役していないC1315/ポリ-L-リジンによって凝縮されたDNAはいかなる細胞種もトランスフェクトできなかった。陽性細胞は強く染色され、バックグラウンドのβ-ガラクトシダーゼ活性は見られなかった。
【０２５４】
c)ヒト因子IXのHepG2細胞への導入
C1315ペプチド-ポリリジン-DNA複合体の臨床的に関連のある遺伝子を導入する能力が調べられた。HepG2およびHuH7細胞は内在的なヒト凝固因子IXを発現しない。これらの細胞はヒト因子IXをコードしたプラスミドによってトランスフェクトされた細胞であり、増殖培地中に分泌された因子IXの量は4日後に測定された(実施例12に記載された検査を用いて)。培地は因子IXに対するELISA検査に影響しなかった。図24は24の実験から得られた結果(平均値+-平均値の標準偏差として表記される)を表す。
【０２５５】
図24においてはトランスフェクトされた細胞1x106個あたりの分泌された因子IXの量がもちいられた細胞の種類にたいしてプロットされる。用いられた細胞株のそれぞれについて1)合成されていない複合体(白いカラム)、2)0.83pmolの担体によって凝縮されたpFIX、および3)1.11pmolの担体によって凝縮されたpFIX (黒いカラム)のいずれかを受容した細胞によって発現された因子IXの量が示された。1.11pmolの担体によって凝縮されたDNAによってトランスフェクトされた場合、HuH7細胞は7.01+/-3.34ng/mLの、一方HepG2(高)細胞は5.07+/-3.57ng/mLのヒト因子IXを生産した。以前の発現系(例えばlacZ遺伝子を含む発現プラスミド)によってHepG2(低)細胞は1.11pmolの担体によって凝縮されたDNAによるとき最大0.86ng/mLのヒト因子IXタンパク質量しか発現しなかった。トランスフェクトされたHuH7およびHepG2(高)細胞はトランスフェクトされたHepG2(低)細胞によって発現された量に比べて統計的に有意な量のヒト因子IXを発現した。
【０２５６】
c)  SEC-Rおよびβ-ガラクトシダーゼ発現の共局在
トランスフェクトされた細胞におけるレポーター遺伝子産物およびSEC受容体の局在が得られるように一連の実験が設計された。フルオレシン化されたC1315ペプチドによる受容体の細胞化学染色はHuH7、HepG2(高)およびHepG2(低)細胞の培養物中のいくつかの細胞だけが検出可能な量のリガンドを結合することを明らかにした(表107に示される)。フルオレシン化されたペプチドを結合したHepG2(高)およびHuH7細胞だけがトランスフェクトされた遺伝子を発現し、β-ガラクトシダーゼ活性について陽性の染色を示した。最小の蛍光を示すHepG2(低)細胞はβ-ガラクトシダーゼについて陽性の染色を示さなかった。さらに、HuH7細胞はHepG2(高)細胞よりも低い頻度でフルオレシン化ペプチドを結合した(表107)。しかしながらHuH7の結合はβ-ガラクトシダーゼ発現と共に、より強いものであった。非フルオレシン化ペプチドまたは遊離のフルオレシンによって処理された細胞は検出できる自家蛍光を示さなかった。
【０２５７】
上記の結果はC1315ペプチドに共役したポリリジンによって緊密に凝縮された(直径18-25nm)発現プラスミドはin vitroでSEC受容体を持つ細胞を攻撃し得ることを示す。ペプチドリガンドの大きさはポリ-L-リジンの反復性とともにC1315ペプチドのポリ-L-リジンに対する連結を可能にし、それはNMRによって評価される。受容体によって仲介される遺伝子の導入に関する以前の報告は連結の度合いを決定していなかった。本系の性質はNMRを使うことで連結の度合いを見積もり、反応していないSPDP上の反応基の中和可能にした。反応性の架橋部位は細胞にたいして有害であり得るため、このことは重要である。2つのポリ-L-リジン分子あたり最低2つの受容体リガンドが(小さいプラスミドDNAおよび大きいプラスミドDNAのそれぞれに対し69、および138リガンド)で受容体によって仲介される遺伝子導入には十分である。さらに、過剰の反応性スルフォLC SPDPぶぶんがポリ-Lリジンに対して加えられるような反応条件が設定されると、加えられたリガンドのほとんど全て(85%)がポリ陽イオンに結合し、残ったSPDP基は合成過程の間不活性になる。このデータは緊密に凝縮した複合体が凝集物よりもはるかに効率的であり、これは低いNaCl濃度を形成することがFerko et al.  によってマンノース受容体について報告された[Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.  (1996) 93:101-105]。
【０２５８】
上記の結果は遺伝子導入がSEC-Rによって仲介され、非特異的な機構によって起こるものではないことを示す。HepG2(低)細胞は少量のSEC-Rを発現するが、これは最小量のDNAの取り込みおよび発現を示し(これらはリポフェクチンによって導入された場合は同一のプラスミドを発現することが出来るが)、一方HuH7およびHepG2(高)細胞は豊富にSEC-Rを発現し、10倍高い効率でトランスフェクションされ得る。これは試された全ての遺伝子について真実であった。さらに、モル量で10倍過剰の遊離のリガンドがトランスフェクション時に加えられると遺伝子導入が50%まで阻害され、したがって受容体リガンドは明らかに受容体結合および取り込みについて複合体と競合する。修飾されていないポリリジンによって凝縮されたDNAによって遊離のペプチドの存在および非存在下でトランスフェクトされたHuH7およびHepG2(高)細胞は遺伝子発現を示さないため、取り込みは凝縮したDNA小胞の非特異的なピノサイトーシスによらない。蛍光によってC1315ペプチドとの結合が示された細胞は強いβ-ガラクトシダーゼ活性を示すが、一方蛍光C1315を結合していない細胞はlacZ遺伝子を発現しない。さらに、細胞の蛍光がβ-ガラクトシダーゼ染色の強さと連関することはより多くのSEC-Rを発現する細胞は複合体の高度の取り込みが可能であることを示す。研究されたそれぞれの集団における極一部の細胞がC1315ペプチドを結合することは同じ細胞株の中でもSEC受容体の異なる発現が起きている可能性を示す。3つの異なる受容体遺伝子の成功裡な導入は実験誤差の可能性を著しく減少させる。これらを合わせて、これらのデータはプラスミドDNA遺伝子の取り込みおよび発現はSEC-Rに仲介されることを示す。
【０２５９】
上記のデータは特異性およびSEC受容体を持つ細胞におけるin vitroでの遺伝子導入の成功を示す。遺伝子導入はモル量で10倍過剰な競合リガンドの存在下でin vitroで起こった。実際、標的結合部位として用いられたペプチドはSEC-Rに対してその天然のリガンド以上の親和性で結合し、したがってserpin-プロテアーゼ複合体はin vivoで遺伝子導入を阻害しないだろう。
【０２６０】
SEC-Rは肺、肝臓、および脳に見られ[Permutter(1994) Pediatric Res., supra]、それらの全てが、本発明の手法および構築物が治療的処理に用いられ得る損傷における重篤な疾患を示す。小児の肝臓疾患の最も一般的な遺伝的原因であるα-1-アンチプロテアーゼの欠損およびアルツハイマー病によって影響を受ける細胞はSEC-Rを発現する。本発明の手法および構築物を用いてこれらの細胞を特異的に攻撃することはこれらの疾患の遺伝子治療の方法を提供する。
【０２６１】
本発明の記載に提供された指導および実験例を用いて、望ましい発現ベクター(例えばα-1-アンチトリプシンをコードするベクター)と共役され、凝縮されたSEC受容体に結合することの出来るペプチド-ポリ陽イオン担体を含む製剤学的構築物はヒトを含む動物に投与される。
【０２６２】
上記より、本発明はSEC受容体を発現する細胞に対して遺伝子を導入することを可能にする方法及び構築物を明確に提供する。
【０２６３】
【表２】
2008092953.tif 000003
【０２６４】
【表３】
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【０２６５】
【表４】
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【０２６６】
【表５】
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【０２６７】
【表６】
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【０２６８】
【表７】
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【０２６９】
【表８】
2008092953.tif 000009
【０２７０】
【表９】
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【０２７１】
【表１０】
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【０２７２】
【表１１】
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【０２７３】
【表１２】
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【０２７４】
【表１３】
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【図面の簡単な説明】
【０２７５】
【図１Ａ】図1-ガラクトース-ポリ-L-リジン/DNA複合体の物理的解析。図1Aは、溶液中の通常のDNAおよびいくつかのポリ-L-リジン/DNA複合体に関するCD波形を示す。RNAを含まない60μgのCMV-β-ガラクトシダーゼプラスミド(TE緩衝液(pH8)に懸濁)、150μl 700mM NaClを、VIBRAX機器(IKA-VIBRAX-VXR)で中間速度でボルテックスした。150μl 700mM NaCl中の90μgのα-ガラクトピラノシルフェニルイソチオシアン酸/ポリ-L-リジン二共役物が、ボルテックス用DNA溶液に滴下により加えられた。ポリカチオンを徐々に加えることによって混濁溶液が形成され、段階的に5M NaClを3μlずつ加えることによって溶解された。混濁の消失は肉眼によってモニターされ、ポリ-L-リジン/DNA複合体の溶液はCDによって解析された。この時点(0.97M NaCl)で、CD波形は集合化したDNAに特異的なものであった。さらに2μl 5M NaClを順次加える(最終濃度1.031M NaCl)ことによって、緊縮(または弛緩)DNA複合体について予想されるCD波形が生じた。1M NaClでの非複合体二本鎖DNAのCD波形も観察された。波形はJASCO-600旋光計で0.1cmキュベットを用いて得られた。それぞれの場合について緩衝液の波形が観察された。
【図１Ｂ】図1B-1Gは電子顕微鏡写真(EM)である。1B-1D、1Fおよび1Gは300,000倍の像である。1Dのバーは33.3nmを示す。図1Eは600,000倍の像であり、バーは16.6nmである。ウラニル酢酸染色が、以前に記載されたように行われた(Enneverら, Biochem. Biophys. Acta, 826:67(1985))。簡潔には、格子は染色前に脱荷電された。一滴のDNA溶液が格子に加えられ、ブロッティングされ、0.04%ウラニル酢酸を用いて染色された。
【０２７６】
図1B-1Fに示すEM観察のためには、60μgのPEPCK-hFIXプラスミドDNA(TE緩衝液(pH8)に懸濁)、150μl 700mM NaClを、VIBRAX機器(IKA-VIBRAX-VXR)で中間速度でボルテックスした。150μl 700mM NaCl中の90μgのα-ガラクトピラノシルフェニルイソチオシアン酸/ポリ-L-リジン二共役物が、ボルテックス用DNA溶液に滴下により加えられた。ポリカチオンを徐々に加えることによっ混濁溶液が形成され、段階的に5M NaClを3μlずつ加えることによって溶解された。混濁の消失は肉眼によってモニターされ、ポリ-L-リジン/DNA複合体の溶液はEMによって解析された(図1C)。さらに2μl 5M NaClを順次加えることによって、図1Dおよび1Eに示す構造変化が生じた。
【０２７７】
図1Bは、非複合体DNA(1μg/ml, 1M NaCl)のEMである。
【図１Ｃ】図1Cは、最適下限のNaCl濃度(760mM)におけるDNA複合体を示す。DNAは集合化した状態であり、単分子のドーナツ型のクラスターが観察される。
【図１Ｄ】図1DではDNA複合体は、複合体にとって最適のNaCl濃度(968mM)におけるものである。DNAは正しく折り畳まれており、個々のドーナツ型のみが観察される。
【図１Ｅ】図1Eでは、図1Dの4つのDNA複合体が選択され、高分解能で印刷されている。
【図１Ｆ】図1Fでは、複合体の折り畳みの最適条件よりも高い、1.068M NaClでのDNA複合体が見られる。DNAは弛緩した状態である。枝分かれした単分子ドーナツ型の中の折り畳みの核、および棹状のDNA繊維が見られる。
【０２７８】
上述の実験における凝集、凝縮、および弛緩状態に必要なNaCl濃度の違いは、DNAまたはポリカチオンに特異的な違いである。
3番目の実験では、CMV-β-ガラクトシダーゼおよびガラクトシル化ポリ-L-リジンの複合体が、本質的にWuらのように形成された。簡略には、プラスミドDNAおよびガラクトシル化ポリ-L-リジンは3M NaCl中で混合された。試料は室温で1時間保温され、次に3,500ダルトン分子量分別の膜を通して0.15M NaClに対して16時間透析された。肉眼による観察からは、透析液中には沈殿物は存在しなかった。
【図１Ｇ】図1Gは、多分子集合状態の、生じたDNA複合体の電子顕微鏡写真である。ドーナツ型は1Cまたは1Dのものよりも大きい(スケールは同一)。
【図１Ｈ】図1Hは、非複合体DNAおよび集合化多分子DNA/ポリ-L-リジン複合体のCD波形を示す。269nmで最大になる通常のDNA波形が反転していることが分かる。この反転は多分子集合化において特徴的である。
【０２７９】
ある実験においては、60μgのPEPCK-hFIXプラスミドDNA(TE緩衝液(pH8)に懸濁)、150μl 200mM NaClを、VIBRAX機器(IKA-VIBRAX-VXR)で中間速度でボルテックスした。150μl 200mM NaCl中の90μgのα-ガラクトピラノシルフェニルイソチオシアン酸/ポリ-L-リジン二共役物が、ボルテックス用DNA溶液に滴下により加えられた。ポリカチオンを徐々に加えることによって、沈殿物の形成が肉眼で観察された。
【図１Ｉ】図1Iは沈澱DNA複合体によるCD波形である。240nmから300nmまでは本質的に平坦である。図1Jは沈澱DNAの電子顕微鏡写真である。
【図２】図2-遺伝子導入系の機能関連性および特異性。(A)DNA複合体で処理された動物の血中のヒト ファクターIXの相対濃度は、ヒト ファクターIXの凝血原活性を測定することによって見積もられた。ファクターIX欠損ヒト血漿による、一段階カオリン活性化部分トロンボプラスチン時間が用いられた。血液試料は、実験動物から静脈穿刺によって得られた。1/5体積の500mMクエン酸ナトリウム(pH5.0)が凝血を防ぐために加えられ、-20℃で保存された。試料は二重に検査され、24の正常な成人男性由来の血漿ストックと活性が比較された。全ての計算において、正常ヒト血漿1ml中のファクターIX活性1ユニットは100%機能活性に等しく、または3μgファクターIX/mlとほぼ同等である。ラット血漿中のヒトファクターIX活性の背景値は、グラフ作製に先だって減算された。(B)トランスフェクション動物は、炭水化物を含まない高タンパク質餌を1週間与えられた。血液試料は処理の開始時および食餌1週間後に採られ、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションによって解析された。8および12日目の動物は、標準飼料を与えられたトランスフェクションラットと比較された。データは、ウェスタンブロット写真フィルムのデンシトメーター解析によって得られ、食餌処理後のヒトファクターIXタンパク質の数倍の増加が示唆された。
【図３】図3-in vivoでのマクロファージへのDNAのターゲティングにおける、マンノシル化DNA複合体の組織特異性。マンノシル化ポリ-L-リジンがSV40/ルシフェラーゼDNAに結合された。300μgのDNA複合体がラットの仙骨下大静脈に導入された。注射の4日後、組織抽出物が作製され、ルシフェラーゼ活性について検査された。ルシフェラーゼ活性は、脾臓、肝臓または肺由来のタンパク質抽出物1mg当たりの集積光量単位としてプロットされる。他の組織においては、活性は見られなかった。データは平均±平均の標準誤差(SEM)として表される。白いバーはトランスフェクションしていない対照(n=4)、黒いバーはマンノシル化ポリ-L-リジン/DNA複合体でトランスフェクションした動物(n=5)である。
【図４】図4-in vitroでのマクロファージの一次培養細胞へのDNAのターゲティングにおける、マンノシル化DNA複合体の組織特異性。腹腔マクロファージの一次培養細胞は、SV40/ルシフェラーゼDNAに結合したガラクトシル化ポリ-L-リジン(白いバー)またはマンノシル化ポリ-L-リジン(黒いバー)でトランスフェクションされた。特定の時間(2、4、8および24時間)において、細胞は洗浄された。トランスフェクション後24時間で、細胞は回収され、ルシフェラーゼ活性を検査された。トランスフェクションされていない対照に見られる活性で標準化された後、ルシフェラーゼ活性は相対ルシフェラーゼ活性としてプロットされた。データは平均±平均の標準誤差(SEM)として表される。
【図５】図5-マンノシル化DNA複合体およびマンノシル化ウシ血清アルブミンの、マクロファージマンノース受容体への結合における競合。腹腔マクロファージの一次培養細胞は、SV40/ルシフェラーゼDNAに結合したマンノシル化ポリ-L-リジンでトランスフェクションされた(T)。DNA複合体の添加に先立ち、100倍過剰量のマンノシル化ウシ血清アルブミンが1セットのプレートに加えられた(Tc)。トランスフェクションされない対照(NT)も、トランスフェクション後24時間でルシフェラーゼ活性を検査された。トランスフェクションされていない対照に見られる活性で標準化された後、ルシフェラーゼ活性は相対ルシフェラーゼ活性としてプロットされた。データは平均±平均の標準誤差(SEM)として表される。
【図６】図6-抗ラットplg-R Fab-ポリ-L-リジン結合DNA複合体を用いた、in vivo遺伝子導入。Fab-ポリ-L-リジンはSV40/ルシフェラーゼDNAに結合され、ラットの仙骨下大静脈に導入された(トランスフェクション)(n=3)。トランスフェクションされない対照(対照)(n=3)、非関連IgF(IFab)由来のFab断片を含むFab-ポリ-L-リジン-DNA複合体を注射された動物(n=3)、およびSV40/ルシフェラーゼ遺伝子(IDNA)を含まないDNA複合体を注射された動物(n=3)が、対照として用いられた。注射後2日目に、組織抽出物が調製され、ルシフェラーゼ活性を検査された。ルシフェラーゼ活性はタンパク質抽出物1mg当たりの集積光量単位としてプロットされる。データは平均±平均の標準誤差(SEM)として表される。
【図７】図7-抗ラットplg-R Fab-ポリ-L-リジン結合DNA複合体を用いて注射された動物の肺および肝臓における発現の時間変化。Fab-ポリ-L-リジンはSV40/ルシフェラーゼDNAに結合され、ラットの仙骨下大静脈に導入された(n=9)。ラットは注射後2(n=3)、4(n=3)、6(n=3)日後に屠殺された。肺および肝臓抽出物が調製され、ルシフェラーゼ活性を検査された。ルシフェラーゼ活性はタンパク質抽出物1mg当たりの集積光量単位として対数スケールを用いてプロットされる。データは平均±平均の標準誤差(SEM)として表される。
【図８】図8-ガラクトシル化DNA複合体およびアシアロオロソムコイドの、HepG2細胞のASGP受容体への結合における競合。HepG2肝臓癌細胞は、PEPCK-hFIX DNAに結合したガラクトシル化ポリ-L-リジンでトランスフェクションされた。DNA複合体の添加に先立ち、100倍過剰量のアシアロオロソムコイドが1セットのプレートに加えられた(+競合剤)。DNAの内在化は、DNA複合体を含む培地のスロット-ブロットハイブリダイゼーションでモニターされた。データはトランスフェクション後の異なる時間に受容体によって内在かされたDNAのパーセンテージで表される。
【図９】図9-単独のDNAおよび凝縮DNAの筋肉および肝臓への直接注射。SV40/ルシフェラーゼをコードする100μgの単独のDNAが2匹のラットの肝臓および腹筋内に注射された。実施例１に記載されたようにポリ-L-リジンに結合され凝縮された等量のpSV40-ルシフェラーゼプラスミドが、同様に別の２匹の動物の肝臓および腹筋内に注射された。ラットは注射後４８時間目に屠殺された。肝臓および腹筋の断片は溶解緩衝液中でホモジナイズされ、細胞溶解液はルシフェラーゼ活性を解析された。全てのルシフェラーゼ測定は三重に行われ、平均値として表され、総タンパク質量に対して標準化された。図９は２つの異なる動物のセットにおける集積ルシフェラーゼ単位/mgタンパク質を示す。
【図１０】図10-単独のDNAおよび凝縮DNAの頭蓋内への直接注射。単独のDNAおよびポリ-L-リジン凝縮プラスミドDNAの頭蓋内への注射は、ニューロンの細胞体において２０日以上の高レベルの発現を達成し得る。脳の視蓋領域に注射され、単独のpCMV-lacZまたは凝縮されたpCMV-lacZ（pCMV-lacZ+lys）を示した濃度で投与されたラットの神経網膜中のβ-ガラクトシダーゼ活性。DNAがポリ-L-リジンで凝縮されていない場合、発現レベルは注射後１０日で背景値に戻る。
【図１１】図11-凝縮過程でのDNA複合体の吸光度の変化。実施例１で詳細に記載される方法を用いて、キメラCMV-hLDL受容体遺伝子を含むプラスミドがポリ-L-リジンで凝縮された。ポリ-L-リジンの添加後、溶液の260nmの吸光度が決定された。凝縮されたNaClが次に段階的に加えられ、吸光度が決定された。複合体に含まれるDNAの予想される吸光度は点線で示す。濃縮化反応で用いられたNaClの開始濃度は500mMであった。
【図１２】図12-成体ラットのDNA複合体の構造とその機能間の関係。図1B-1Gに示す種々の凝縮/集合化状態に対応するDNA-ガラトシル化ポリリジン複合体が調製された。DNAは、P. pyralisルシフェラーゼ遺伝子の構造遺伝子に連結されたSV40プロモーターからなる。ラットは仙骨下大静脈に300μgの種々のDNA複合体を注射され、注射後４８時間に肝臓および脾臓からの抽出物中のルシフェラーゼ活性が決定された。各バーは３匹の平均値±SEMである。対照のラットはDNA複合体を注射されていない。
【図１３】図13-弛緩（非複合体）型および複合体型の3mgのPEPCK-hLDLrの導入。動物中にDNA複合体を導入するために、ウサギの外耳縁部静脈へ、3-10mlのDNA-複合体溶液（〜400-900mM NaCl）の一回の注射が行われた。約1.5mlの血液が、耳動脈から4p.m.で特定の時点で回収された。血中コレステロール濃度の決定は、Cleveland大学病院臨床研で、300μlの血清から行われた。ウサギ#676に3mgの弛緩状態のpPEPCK-hLDLrプラスミドを含むDNA複合体の投与を行ったが、総血清中のコレステロールレベルの有意な減少（最初の矢印）は起こらなかった。次に同一の3mgのDNAを含む適切に凝縮されたDNA複合体の注射を行ったところ（二番目の矢印）、血清中のコレステロールレベルが20%減少した。この２番目の投与後４週間のち、コレステロールはほぼ処理前のレベルに戻り、約35日目に最大値に達した。
【図１４】図14-9mgのキメラPEPCK-hLDLr遺伝子を含むポリ-L-リジン/DNA複合体の注射。第二の実験において、ガラトシル化ポリ-L-リジンで適切に凝縮された9mgのPEPCK-hLDLrが遺伝子ウサギ#737に投与された。図14に示すように、処理によって総血清中のコレステロールレベルが38%減少し、約５週間持続した。即ち、DNA複合体の投与量を3倍に増やすことによって、総血清中のコレステロールレベルは2倍減少した。
【図１５】図15-3mgのキメラCMV-hLDLr遺伝子を含むポリ-L-リジン/DNA複合体の注射。第二の実験において、ガラトシル化ポリ-L-リジンで適切に凝縮された3mgのキメラCMV-hLDL受容体遺伝子を含むDNA複合体溶液が遺伝子ウサギ#16に投与され、総血清中のコレステロールレベルが最大30%減少した。注射後１１週間のち、コレステロールレベルは処理前の観察値より20%低くとどまった。
【図１６Ａ】図16-3mgのキメラCMV-hLDLr遺伝子を含むポリ-L-リジン/DNA複合体の種々の投与量の注射。ウサギ#775（図16A）および#774（図16B）は3mgのpCMV-hLDLR複合体を注射された。ウサギ#775では、処理後３週間で血中コレステロール濃度が最大24%減少した。さらに二回注射することによっては、それ以上の有意な血清コレステロールの減少は見られなかった。ウサギ#774では、一回目の注射後に血中コレステロール濃度の36%の減少が観察された。等量のDNA複合体を用いて２週間毎に４回注射が行われた。２匹は最小の影響にとどまり、他の２匹の総血清中のコレステロールレベルは減少しなかった。しかし、3mgのpCMV-hLDLrを含むDNA複合体溶液を５回投与した後、コレステロール濃度は処理前レベルに対して48%減少した。
【図１６Ｂ】ウサギ#774は次に、10mgのロバスタチン（斜線のバー）で１０週間毎日処理された。さらにコレステロールレベルの20%の減少が観察された。即ちコレステロール合成の内在性経路の阻害によって、ウサギ#774のコレステロール濃度は最初の遺伝子導入前の40%に低下した（図16B）。
【図１７】図17-3mgのキメラSV40-ルシフェラーゼ遺伝子（非関連DNA）を含むポリ-L-リジン/DNA複合体の疑似注射。ウサギに高NaCl濃度（〜900mM）の溶液中のガラクトシル化ポリ-L-リジン/DNA複合体を注射することによって総血清中のコレステロールレベルが非特異的に減少し得るため、対照としてルシフェラーゼのような非関連DNAを含むDNA複合体溶液がウサギ#775に投与された。図17は注射によって有意でない（≦12%）一過性の（≦５日）血清中のコレステロール濃度の減少が起きたことを示す。即ち、ヒトLDL受容体遺伝子をコードする適切に凝縮されたDNA粒子の注射後の総血清中のコレステロールレベルの減少は、溶液の高NaCl濃度またはガラクトシル化ポリ-L-リジン/DNA粒子の結果ではない。
【図１８】図18-濁度とNaCl濃度の関係。図は、ポリ-L-リジン/DNA溶液の濁度に与える、開始時および反応中のNaCl濃度の効果を示す。各線は異なる開始時濃度を示す。
【図１９】図19-ポリ-L-リジン長がNaClの凝縮濃度に与える効果。
【図２０】図20-異なる複合体のCD波形。CD波形は、0.1cm光路長キュベットで得られた。DNAはポリ-L-リジンと同じアミノ-りん酸基のモル比で複合体化され、種々のCD波形が比較された。（A）1M NaCl中のDNAの標準対照；（Ｂ）多分子集合化が起きるNaCl濃度で観察されたψ-DNA；（Ｃ）集合化したDNAは混濁し、楕円偏光を減少させる；（Ｄ）凝縮したDNA単分子複合体；および（Ｅ）弛緩したDNA波形。波形はポリマーと同じ濃度で得られ、各々において緩衝液のシグナルは減算された。試験の詳細は方法に示されている。
【図２１】図21A-Dは、それぞれ、非修飾ポリリジン、LCスルホSPDP-結合ポリリジン、DTT処理後のLCスルホSPDP-結合ポリリジン、およびC1315ペプチドと複合体化したLCスルホSPDP-結合ポリリジンから得られたNMRスペクトルである。
【図２２】図22は、ヨウ素化C105Yペプチドの濃度（nM）に対してプロットされた、結合特異性（cpm/100万細胞で表す）を示すグラフである。125I-C105YのHuH7細胞（○）、HepG2（高）細胞（□）、およびHepG2（低）細胞（◇）に対する特異的結合を示す軌跡。
【図２３Ａ】図23Aは、C1315ペプチドによる複合体による、種々の細胞系列のトランスフェクションの量依存性および時間変化を示すグラフである。
【図２３Ｂ】図23Bは、C1315ペプチドによる複合体を用いたトランスフェクション実験中に10M過剰の遊離C1315ペプチド（即ち複合体中に発現ベクターと共に存在しない）が存在する、競合試験を示すグラフである。
【図２４】図24は、種々のトランスフェクション細胞系列によるファクターIXの発現レベルを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月10日(2008.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７９】
ある実験においては、60μgのPEPCK-hFIXプラスミドDNA(TE緩衝液(pH8)に懸濁)、150μl 200mM NaClを、VIBRAX機器(IKA-VIBRAX-VXR)で中間速度でボルテックスした。150μl 200mM NaCl中の90μgのα-ガラクトピラノシルフェニルイソチオシアン酸/ポリ-L-リジン二共役物が、ボルテックス用DNA溶液に滴下により加えられた。ポリカチオンを徐々に加えることによって、沈殿物の形成が肉眼で観察された。
【図１Ｉ】図1Iは沈澱DNA複合体によるCD波形である。240nmから300nmまでは本質的に平坦である。
【図１Ｊ】図1Jは沈澱DNAの電子顕微鏡写真である。
【図２】図2-遺伝子導入系の機能関連性および特異性。(A)DNA複合体で処理された動物の血中のヒト ファクターIXの相対濃度は、ヒト ファクターIXの凝血原活性を測定することによって見積もられた。ファクターIX欠損ヒト血漿による、一段階カオリン活性化部分トロンボプラスチン時間が用いられた。血液試料は、実験動物から静脈穿刺によって得られた。1/5体積の500mMクエン酸ナトリウム(pH5.0)が凝血を防ぐために加えられ、-20℃で保存された。試料は二重に検査され、24の正常な成人男性由来の血漿ストックと活性が比較された。全ての計算において、正常ヒト血漿1ml中のファクターIX活性1ユニットは100%機能活性に等しく、または3μgファクターIX/mlとほぼ同等である。ラット血漿中のヒトファクターIX活性の背景値は、グラフ作製に先だって減算された。(B)トランスフェクション動物は、炭水化物を含まない高タンパク質餌を1週間与えられた。血液試料は処理の開始時および食餌1週間後に採られ、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションによって解析された。8および12日目の動物は、標準飼料を与えられたトランスフェクションラットと比較された。データは、ウェスタンブロット写真フィルムのデンシトメーター解析によって得られ、食餌処理後のヒトファクターIXタンパク質の数倍の増加が示唆された。
【図３】図3-in vivoでのマクロファージへのDNAのターゲティングにおける、マンノシル化DNA複合体の組織特異性。マンノシル化ポリ-L-リジンがSV40/ルシフェラーゼDNAに結合された。300μgのDNA複合体がラットの仙骨下大静脈に導入された。注射の4日後、組織抽出物が作製され、ルシフェラーゼ活性について検査された。ルシフェラーゼ活性は、脾臓、肝臓または肺由来のタンパク質抽出物1mg当たりの集積光量単位としてプロットされる。他の組織においては、活性は見られなかった。データは平均±平均の標準誤差(SEM)として表される。白いバーはトランスフェクションしていない対照(n=4)、黒いバーはマンノシル化ポリ-L-リジン/DNA複合体でトランスフェクションした動物(n=5)である。
【図４】図4-in vitroでのマクロファージの一次培養細胞へのDNAのターゲティングにおける、マンノシル化DNA複合体の組織特異性。腹腔マクロファージの一次培養細胞は、SV40/ルシフェラーゼDNAに結合したガラクトシル化ポリ-L-リジン(白いバー)またはマンノシル化ポリ-L-リジン(黒いバー)でトランスフェクションされた。特定の時間(2、4、8および24時間)において、細胞は洗浄された。トランスフェクション後24時間で、細胞は回収され、ルシフェラーゼ活性を検査された。トランスフェクションされていない対照に見られる活性で標準化された後、ルシフェラーゼ活性は相対ルシフェラーゼ活性としてプロットされた。データは平均±平均の標準誤差(SEM)として表される。
【図５】図5-マンノシル化DNA複合体およびマンノシル化ウシ血清アルブミンの、マクロファージマンノース受容体への結合における競合。腹腔マクロファージの一次培養細胞は、SV40/ルシフェラーゼDNAに結合したマンノシル化ポリ-L-リジンでトランスフェクションされた(T)。DNA複合体の添加に先立ち、100倍過剰量のマンノシル化ウシ血清アルブミンが1セットのプレートに加えられた(Tc)。トランスフェクションされない対照(NT)も、トランスフェクション後24時間でルシフェラーゼ活性を検査された。トランスフェクションされていない対照に見られる活性で標準化された後、ルシフェラーゼ活性は相対ルシフェラーゼ活性としてプロットされた。データは平均±平均の標準誤差(SEM)として表される。
【図６】図6-抗ラットplg-R Fab-ポリ-L-リジン結合DNA複合体を用いた、in vivo遺伝子導入。Fab-ポリ-L-リジンはSV40/ルシフェラーゼDNAに結合され、ラットの仙骨下大静脈に導入された(トランスフェクション)(n=3)。トランスフェクションされない対照(対照)(n=3)、非関連IgF(IFab)由来のFab断片を含むFab-ポリ-L-リジン-DNA複合体を注射された動物(n=3)、およびSV40/ルシフェラーゼ遺伝子(IDNA)を含まないDNA複合体を注射された動物(n=3)が、対照として用いられた。注射後2日目に、組織抽出物が調製され、ルシフェラーゼ活性を検査された。ルシフェラーゼ活性はタンパク質抽出物1mg当たりの集積光量単位としてプロットされる。データは平均±平均の標準誤差(SEM)として表される。
【図７】図7-抗ラットplg-R Fab-ポリ-L-リジン結合DNA複合体を用いて注射された動物の肺および肝臓における発現の時間変化。Fab-ポリ-L-リジンはSV40/ルシフェラーゼDNAに結合され、ラットの仙骨下大静脈に導入された(n=9)。ラットは注射後2(n=3)、4(n=3)、6(n=3)日後に屠殺された。肺および肝臓抽出物が調製され、ルシフェラーゼ活性を検査された。ルシフェラーゼ活性はタンパク質抽出物1mg当たりの集積光量単位として対数スケールを用いてプロットされる。データは平均±平均の標準誤差(SEM)として表される。
【図８】図8-ガラクトシル化DNA複合体およびアシアロオロソムコイドの、HepG2細胞のASGP受容体への結合における競合。HepG2肝臓癌細胞は、PEPCK-hFIX DNAに結合したガラクトシル化ポリ-L-リジンでトランスフェクションされた。DNA複合体の添加に先立ち、100倍過剰量のアシアロオロソムコイドが1セットのプレートに加えられた(+競合剤)。DNAの内在化は、DNA複合体を含む培地のスロット-ブロットハイブリダイゼーションでモニターされた。データはトランスフェクション後の異なる時間に受容体によって内在かされたDNAのパーセンテージで表される。
【図９】図9-単独のDNAおよび凝縮DNAの筋肉および肝臓への直接注射。SV40/ルシフェラーゼをコードする100μgの単独のDNAが2匹のラットの肝臓および腹筋内に注射された。実施例１に記載されたようにポリ-L-リジンに結合され凝縮された等量のpSV40-ルシフェラーゼプラスミドが、同様に別の２匹の動物の肝臓および腹筋内に注射された。ラットは注射後４８時間目に屠殺された。肝臓および腹筋の断片は溶解緩衝液中でホモジナイズされ、細胞溶解液はルシフェラーゼ活性を解析された。全てのルシフェラーゼ測定は三重に行われ、平均値として表され、総タンパク質量に対して標準化された。図９は２つの異なる動物のセットにおける集積ルシフェラーゼ単位/mgタンパク質を示す。
【図１０】図10-単独のDNAおよび凝縮DNAの頭蓋内への直接注射。単独のDNAおよびポリ-L-リジン凝縮プラスミドDNAの頭蓋内への注射は、ニューロンの細胞体において２０日以上の高レベルの発現を達成し得る。脳の視蓋領域に注射され、単独のpCMV-lacZまたは凝縮されたpCMV-lacZ（pCMV-lacZ+lys）を示した濃度で投与されたラットの神経網膜中のβ-ガラクトシダーゼ活性。DNAがポリ-L-リジンで凝縮されていない場合、発現レベルは注射後１０日で背景値に戻る。
【図１１】図11-凝縮過程でのDNA複合体の吸光度の変化。実施例１で詳細に記載される方法を用いて、キメラCMV-hLDL受容体遺伝子を含むプラスミドがポリ-L-リジンで凝縮された。ポリ-L-リジンの添加後、溶液の260nmの吸光度が決定された。凝縮されたNaClが次に段階的に加えられ、吸光度が決定された。複合体に含まれるDNAの予想される吸光度は点線で示す。濃縮化反応で用いられたNaClの開始濃度は500mMであった。
【図１２】図12-成体ラットのDNA複合体の構造とその機能間の関係。図1B-1Gに示す種々の凝縮/集合化状態に対応するDNA-ガラトシル化ポリリジン複合体が調製された。DNAは、P. pyralisルシフェラーゼ遺伝子の構造遺伝子に連結されたSV40プロモーターからなる。ラットは仙骨下大静脈に300μgの種々のDNA複合体を注射され、注射後４８時間に肝臓および脾臓からの抽出物中のルシフェラーゼ活性が決定された。各バーは３匹の平均値±SEMである。対照のラットはDNA複合体を注射されていない。
【図１３】図13-弛緩（非複合体）型および複合体型の3mgのPEPCK-hLDLrの導入。動物中にDNA複合体を導入するために、ウサギの外耳縁部静脈へ、3-10mlのDNA-複合体溶液（〜400-900mM NaCl）の一回の注射が行われた。約1.5mlの血液が、耳動脈から4p.m.で特定の時点で回収された。血中コレステロール濃度の決定は、Cleveland大学病院臨床研で、300μlの血清から行われた。ウサギ#676に3mgの弛緩状態のpPEPCK-hLDLrプラスミドを含むDNA複合体の投与を行ったが、総血清中のコレステロールレベルの有意な減少（最初の矢印）は起こらなかった。次に同一の3mgのDNAを含む適切に凝縮されたDNA複合体の注射を行ったところ（二番目の矢印）、血清中のコレステロールレベルが20%減少した。この２番目の投与後４週間のち、コレステロールはほぼ処理前のレベルに戻り、約35日目に最大値に達した。
【図１４】図14-9mgのキメラPEPCK-hLDLr遺伝子を含むポリ-L-リジン/DNA複合体の注射。第二の実験において、ガラトシル化ポリ-L-リジンで適切に凝縮された9mgのPEPCK-hLDLrが遺伝子ウサギ#737に投与された。図14に示すように、処理によって総血清中のコレステロールレベルが38%減少し、約５週間持続した。即ち、DNA複合体の投与量を3倍に増やすことによって、総血清中のコレステロールレベルは2倍減少した。
【図１５】図15-3mgのキメラCMV-hLDLr遺伝子を含むポリ-L-リジン/DNA複合体の注射。第二の実験において、ガラトシル化ポリ-L-リジンで適切に凝縮された3mgのキメラCMV-hLDL受容体遺伝子を含むDNA複合体溶液が遺伝子ウサギ#16に投与され、総血清中のコレステロールレベルが最大30%減少した。注射後１１週間のち、コレステロールレベルは処理前の観察値より20%低くとどまった。
【図１６Ａ】図16-3mgのキメラCMV-hLDLr遺伝子を含むポリ-L-リジン/DNA複合体の種々の投与量の注射。ウサギ#775（図16A）および#774（図16B）は3mgのpCMV-hLDLR複合体を注射された。ウサギ#775では、処理後３週間で血中コレステロール濃度が最大24%減少した。さらに二回注射することによっては、それ以上の有意な血清コレステロールの減少は見られなかった。ウサギ#774では、一回目の注射後に血中コレステロール濃度の36%の減少が観察された。等量のDNA複合体を用いて２週間毎に４回注射が行われた。２匹は最小の影響にとどまり、他の２匹の総血清中のコレステロールレベルは減少しなかった。しかし、3mgのpCMV-hLDLrを含むDNA複合体溶液を５回投与した後、コレステロール濃度は処理前レベルに対して48%減少した。
【図１６Ｂ】ウサギ#774は次に、10mgのロバスタチン（斜線のバー）で１０週間毎日処理された。さらにコレステロールレベルの20%の減少が観察された。即ちコレステロール合成の内在性経路の阻害によって、ウサギ#774のコレステロール濃度は最初の遺伝子導入前の40%に低下した（図16B）。
【図１７】図17-3mgのキメラSV40-ルシフェラーゼ遺伝子（非関連DNA）を含むポリ-L-リジン/DNA複合体の疑似注射。ウサギに高NaCl濃度（〜900mM）の溶液中のガラクトシル化ポリ-L-リジン/DNA複合体を注射することによって総血清中のコレステロールレベルが非特異的に減少し得るため、対照としてルシフェラーゼのような非関連DNAを含むDNA複合体溶液がウサギ#775に投与された。図17は注射によって有意でない（≦12%）一過性の（≦５日）血清中のコレステロール濃度の減少が起きたことを示す。即ち、ヒトLDL受容体遺伝子をコードする適切に凝縮されたDNA粒子の注射後の総血清中のコレステロールレベルの減少は、溶液の高NaCl濃度またはガラクトシル化ポリ-L-リジン/DNA粒子の結果ではない。
【図１８】図18-濁度とNaCl濃度の関係。図は、ポリ-L-リジン/DNA溶液の濁度に与える、開始時および反応中のNaCl濃度の効果を示す。各線は異なる開始時濃度を示す。
【図１９】図19-ポリ-L-リジン長がNaClの凝縮濃度に与える効果。
【図２０】図20-異なる複合体のCD波形。CD波形は、0.1cm光路長キュベットで得られた。DNAはポリ-L-リジンと同じアミノ-りん酸基のモル比で複合体化され、種々のCD波形が比較された。（A）1M NaCl中のDNAの標準対照；（Ｂ）多分子集合化が起きるNaCl濃度で観察されたψ-DNA；（Ｃ）集合化したDNAは混濁し、楕円偏光を減少させる；（Ｄ）凝縮したDNA単分子複合体；および（Ｅ）弛緩したDNA波形。波形はポリマーと同じ濃度で得られ、各々において緩衝液のシグナルは減算された。試験の詳細は方法に示されている。
【図２１】図21A-Dは、それぞれ、非修飾ポリリジン、LCスルホSPDP-結合ポリリジン、DTT処理後のLCスルホSPDP-結合ポリリジン、およびC1315ペプチドと複合体化したLCスルホSPDP-結合ポリリジンから得られたNMRスペクトルである。
【図２２】図22は、ヨウ素化C105Yペプチドの濃度（nM）に対してプロットされた、結合特異性（cpm/100万細胞で表す）を示すグラフである。125I-C105YのHuH7細胞（○）、HepG2（高）細胞（□）、およびHepG2（低）細胞（◇）に対する特異的結合を示す軌跡。
【図２３Ａ】図23Aは、C1315ペプチドによる複合体による、種々の細胞系列のトランスフェクションの量依存性および時間変化を示すグラフである。
【図２３Ｂ】図23Bは、C1315ペプチドによる複合体を用いたトランスフェクション実験中に10M過剰の遊離C1315ペプチド（即ち複合体中に発現ベクターと共に存在しない）が存在する、競合試験を示すグラフである。
【図２４】図24は、種々のトランスフェクション細胞系列によるファクターIXの発現レベルを示す。