(57)【要約】      （修正有）【課題】低い細胞死亡率でＤＮＡおよび／または生体活性分子を細胞核へと効果的に輸送できる回路装置を提供する。【解決手段】エレクトロトランスフェクションまたは電気融合のための新規な回路装置であり、電荷量のための少なくとも２つの記憶装置と、少なくとも１つの制御装置とからなり、前記記憶装置はそれぞれ高圧電源によって供給され、前記高圧電源はそれぞれ少なくとも１つのパワー半導体を有し、該パワー半導体は前記記憶装置に存在する電荷量をキュベット中の懸濁液に導入し、前記制御装置は前記パワー半導体を制御する。【選択図】図１
2008237214.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸、ペプチド、タンパク質および／または他の生体活性分子を真核細胞の細胞核に電流によって導入するため、または細胞、細胞誘導体、細胞内粒子および／または細胞内小胞を電流によって処理するための回路装置であって、
高電圧電源（５、６）それぞれによって供給される、電荷量のための少なくとも２つの記憶装置（７、８）と、
パワー半導体（９、１０）を制御する少なくとも１つの制御装置と、
からなり、
前記高電圧電源（５、６）はそれぞれ、前記パワー半導体（９、１０）を少なくとも１つ有し、
前記パワー半導体（９、１０）は、前記記憶装置（７、８）に存在する電荷量をキュベット中の懸濁液に移し、
前記第１の記憶装置（７）には、パラメータとしてあらかじめ設定された電圧（Ｕ1）が印加され、
前記第２の記憶装置（８）には、電圧Ｕ2＝Ｒ×Ｉ2×Ｋ2（式中、Ｒは前記キュベットおよびその中に含まれる懸濁液の抵抗であり、Ｉ2は所望の電流であり、Ｋ2は前記キュベットの特性を考慮に入れた補正値である。）が印加され、
１つの前記パワー半導体（９）を制御することによって、前記記憶装置（７）のキャパシタ電圧（Ｕ1）を伴う少なくとも１つの第１のパルスが、あらかじめ設定された時間（Ｔ1）にわたって前記キュベットに伝達可能である、回路装置。
【請求項２】
請求項１において、
１つの前記パワー半導体（１０）を制御することによって、前記記憶装置（８）のキャパシタ電圧（Ｕ2）を伴う少なくとも１つの第２のパルスが、中断なしに前記キュベットに伝達可能であることを特徴とする、回路装置。
【請求項３】
請求項１または２において、
少なくとも１つのパルスの放出電荷量が、少なくとも１つの選択可能な時間間隔で監視装置によって測定可能であり、
あらかじめ設定された所望の電荷量と、放出実電荷量との比較が行われ、
前記放出実電荷量が前記所望の電荷量に到達した場合、あるいは前記放出実電荷量が前記所望の電荷量を超えた場合、前記パワー半導体（９、１０）が閉鎖されることを特徴と
する、回路装置。
【請求項４】
請求項３において、
前記放出電荷量は、対応する前記記憶装置（７、８）の通常電荷と残留電荷との差から決定されることを特徴とする、回路装置。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかまたはいくつかにおいて、
前記第１のパワー半導体（９）は、持続時間が１０〜１００［μｓ］で、かつ電流密度が少なくとも２［Ａ・ｃｍ-2］である２〜１０［ｋＶ／ｃｍ］のパルスを前記キュベットに伝達し、
前記第２のパワー半導体（１０）は、最大持続時間が１００［ｍｓ］で、かつ電流密度が２〜１４［Ａ・ｃｍ-2］であるパルスを中断なしで伝達することを特徴とする、回路措置。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかまたはいくつかにおいて、
前記放出電荷を決定する時間間隔を、前記第１のパルスおよび／または好ましくは前記第２のパルスまたはさらに別のパルスの電荷の放出と同調させて指定できることを特徴とする、回路装置。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかまたはいくつかにおいて、
前記第２のパルスのスイッチオン時間（Ｔ2）が、前記所望の電荷量に到達する時点までに放出された前記放出実電荷量と、前記所望の電荷量とを比較することによって特定可能であることを特徴とする、回路装置。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかまたはいくつかにおいて、
放出実電荷量を決定するために１［ｍｓ］の測定サイクルが指定され、時間（Ｔ2）の間にキャパシタ電圧が指数関数的に低下し、前記放出実電荷量が規定電荷量（Ｑ2）に達すると、前記パワー半導体（９、１９）が閉鎖可能であることを特徴とする、回路装置。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかまたはいくつかにおいて、
第１のパルスおよび／または第２のパルスの放出後であって、少なくとも１つのあらかじめ定められた時間間隔後に、流れる電流が測定され、前記電流が定格値を超える場合または前記電流が前記定格値に満たない場合、前記放出電荷量を一定に保持するために、前記パルスの持続時間を再調整可能であることを特徴とする、回路装置。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれかまたはいくつかにおいて、
第１のパルスおよび／または第２のパルスの放出後であって、少なくとも１つのあらかじめ定められた時間間隔後に、流れる電流が測定され、前記電流が定格値を超える場合または前記電流が前記定格値に満たない場合、エラーメッセージが生じることを特徴とする、回路装置。
【請求項１１】
請求項１ないし８のいずれかまたはいくつかにおいて、
第１および／または第２のパルスの放出後であって、少なくとも１つのあらかじめ定められた時間間隔後に、流れる電流が測定され、前記電流が定格値を超える場合または前記電流が前記定格値に満たない場合、前記定格値が再調整されることを特徴とする、回路装置。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれかまたはいくつかにおいて、
前記パルスのあらかじめ選択された設定パラメータ（Ｕ1、Ｔ1、Ｉ2、Ｔ2、Ｋ2）が手動またはコード入力によって入力可能であることを特徴とする、回路装置。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれかまたはいくつかにおいて、
前記第１および第２のパルスに対する過電流遮断部が設けられていることを特徴とする、回路装置。
【請求項１４】
請求項１ないし１３のいずれかまたはいくつかにおいて、
前記キュベットの抵抗Ｒは前記Ｕ2の計算に使用され、かつ、パワー半導体を制御する前に抵抗測定によって測定可能であることを特徴とする、回路装置。
【請求項１５】
請求項１ないし１３のいずれかまたはいくつかにおいて、
前記キュベットの抵抗Ｒは前記Ｕ2の計算に使用され、かつ、あらかじめ設定されていることを特徴とする、回路装置。
【請求項１６】
請求項１ないし１５のいずれかまたはいくつかにおいて、
前記パルスのあらかじめ選択された設定パラメータ（Ｕ1、Ｔ1、Ｉ2、Ｔ2、Ｋ2、Ｒ）がメモリーカードによって入力可能であることを特徴とする、回路装置。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれかまたはいくつかにおいて、
前記キュベットに印加される電圧の時間経過および／または前記キュベットを流れる電流の時間経過を測定および記録する装置が設けられ、測定された前記電圧の時間経過および／または前記電流の時間経過がメモリーカードに記憶可能であることを特徴とする、回路装置。
【請求項１８】
休止真核細胞または分裂活性真核細胞のトランスフェクションのための請求項１ないし１７のいずれかに記載の回路装置の使用。
【請求項１９】
一次細胞のトランスフェクションのための請求項１ないし１７のいずれかに記載の回路装置の使用。
【請求項２０】
ヒト血液細胞のトランスフェクションのための請求項１ないし１７のいずれかに記載の回路装置の使用。
【請求項２１】
ヒト血液の多分化能性前駆細胞のトランスフェクションのための請求項１ないし１７のいずれかに記載の回路装置の使用。
【請求項２２】
ヒトの一次線維芽細胞、内皮細胞、筋細胞、またはメラニン細胞のトランスフェクションのための請求項１ないし１７のいずれかに記載の回路装置の使用。
【請求項２３】
細胞、細胞誘導体、細胞内粒子および／または細胞内小胞の融合のための請求項１ないし１７のいずれかに記載の回路装置の使用。
【請求項２４】
分析目的または診断目的のための請求項１ないし１７のいずれかに記載の回路装置を用いてトランスフェクトされた真核細胞の使用。
【請求項２５】
生体外遺伝子治療の医薬品を製造するための請求項１ないし１７のいずれかに記載の回路装置を用いてトランスフェクトされた真核細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、ペプチド、タンパク質および／または他の生体活性分子を真核細胞の細胞核に電流によって導入するため、または細胞、細胞誘導体、細胞内（subcellular）粒子および／または細胞内小胞を電流によって処理するための回路装置に関する。前記回路装置は、電荷量のための少なくとも２つの記憶装置と、少なくとも１つの制御装置とからなり、前記記憶装置はそれぞれ高圧電源によって供給され、前記高圧電源はそれぞれ少なくとも１つのパワー半導体を有し、該パワー半導体は前記記憶装置に存在する電荷量をキュベット中の懸濁液に導入し、前記制御装置は前記パワー半導体を制御する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
真核生物ＤＮＡの作用部位は細胞核であるため、外部から供給されるＤＮＡが読み取られるためには、該ＤＮＡが核に入り込む必要がある。従来のトランスフェクション方法では、ＤＮＡが細胞膜を通過して細胞質へと輸送されるのみである。ただし、高等真核生物の細胞分裂の場合、核膜が一時的に溶解されるため、ＤＮＡが受動的に核に入り込むことができ、その結果、前記ＤＮＡによってコードされたタンパク質が発現しうる。極めて小さなＤＮＡ分子（オリゴヌクレオチド）のみが自由に核膜の孔を通過して拡散しうる。したがって、休止細胞または弱分裂活性細胞の有効なトランスフェクションのためには、十分な量のより大きなＤＮＡ分子が核膜を通過して核に入り込むことを誘導する条件をつくることが必要である。本願に記載された回路装置は、高等真核細胞においてこれを可能にする。
【０００３】
［技術の現状］
電流によって緩衝液から細胞にＤＮＡを導入できることは、以前から知られている。しかしながら、これまでに記載されたエレクトロポレーション（電気穿孔）のための回路装置は、高等真核細胞の細胞質へとＤＮＡを輸送することを目的とする。したがって、トランスフェクトされたＤＮＡの発現は依然として、細胞分裂中の核膜の溶解に依存する。これまでに知られているエレクトロポレーションのための回路装置では、高等真核細胞の核にＤＮＡを電気的かつ特異的に導入することに取り組んだものはない。したがって、電気的な核輸送用に最適化されたエレクトロトランスフェクションのための回路装置は知られ
ていない。
【０００４】
バイオ・ラッド  ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社（米国、リッチモンド）の米国特許第４，７５０，１００号（１９８６年）（特許文献１）には、キャパシタの放電によって最大１２５Ａで最大３０００Ｖを供給しうるある種の装置構造が記載されている。
【０００５】
米国特許第５，８６９，３２６号（ジーントロニックス  インク（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、米国、サンディエゴ、１９９６年）（特許文献２）には、２つの分離電流源を用いて２つ、３つ、またはそれ以上多くのパルスを生じうるある種の装置構造が記載されている。しかしながら、これらのパルスがＤＮＡを細胞質へと輸送することを超える作用を有することについては、請求または開示されていない。
【０００６】
米国特許第６，００８，０３８号（特許文献３）および欧州特許出願ＥＰ  ０  ８６６  １２３Ａ１（エッペンドルフ・ネテラー・ヒンツ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｎｅｔｈｅｌｅｒ−Ｈｉｎｚ）有限会社（ＧｍｂＨ）、ハンブルク、１９９８年）（特許文献４）には、１０〜５００［μｓ］で最大１．５［ｋＶ］の短いパルスを生じうる装置が記載されている。しかしながら、これらもまた、特定の条件によってＤＮＡを核へと輸送できることについては言及していない。
【０００７】
これまで知られている回路装置のなかで、ＤＮＡおよび／または他の生体活性分子を、低い細胞死亡率で細胞核へと効果的に輸送できるように最適化されているものはない。
【特許文献１】米国特許第４，７５０，１００号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８６９，３２６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，００８，０３８号明細書
【特許文献４】欧州特許出願公開第０８６６１２３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、低い細胞死亡率でＤＮＡおよび／または生体活性分子を細胞核へと効果的に輸送できる回路装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、前記目的を達成するために、第１の記憶装置について、パラメータとしてあらかじめ設定された電圧（Ｕ1）が印加され、および第２の記憶装置について、電圧Ｕ2＝Ｒ×Ｉ2×Ｋ2（式中、Ｒはキュベットの抵抗およびその中に含まれる懸濁液であり、Ｉ2は所望の電流であり、Ｋ2はキュベットの特性を考慮に入れた補正値である。）が印加され、パワー半導体を制御することによって、前記記憶装置のキャパシタ電圧（Ｕ1）を伴う少なくとも１つの第１のパルスが、あらかじめ設定された時間（Ｔ1）にわたって前記細胞に伝達可能であることが提供されている。
【００１０】
発明の実施においては、パワー半導体を制御することによって、記憶装置のキャパシタ電圧（Ｕ2）を伴う少なくとも１つの第２のパルスもまた、中断なしにキュベットに伝達可能であり、ここで、放出電荷量が、少なくとも１つの選択可能な時間間隔で監視装置によって測定可能であり、あらかじめ設定された所望の電荷量と、放出実電荷量との比較が行われ、前記放出実電荷量が前記所望の電荷量に到達した場合、あるいは前記放出実電荷量が前記所望の電荷量を超えた場合、前記パワー半導体が閉鎖される。
【００１１】
記憶装置から流れ出る電流を用いて放出電荷量を測定する可能性に加えて、その代わりに、ある時間間隔で、あらかじめ設定された所望の電荷量と放出実電荷量との比較が行われ、前記放出実電荷量が前記所望の電荷量に到達した場合、あるいは前記放出実電荷量が前記所望の電荷量を超えた場合、前記パワー半導体が閉鎖される。これにより、使用されるパルスの形状および数に応じて、決定のために選択可能な時間間隔を独立してあらかじめ設定することができ、例えば、第１のパルスまたはその後のそれぞれのパルスの間の放出電荷量を測定することができる。放出電荷量の測定は、前記記憶装置のうち少なくとも１つについて、通常電荷と残留の電荷との差を測定することによって決定することができる。この場合、使用されるパルス数によって、少なくとも２つの記憶装置のうち２つ以上が回路形態で使用される可能性があり、ここで、少なくとも１つの高電圧電源、監視装置、およびパワー半導体が各記憶装置に配置されることにより、細胞懸濁液を含むキュベットへ電荷量を伝達する。パルスの伝達のために、第１のパワー半導体は、持続時間が１０〜１００［μｓ］で、かつ電流密度が少なくとも２［Ａ・ｃｍ-2］である２〜１０［ｋＶ／ｃｍ］のパルスを伝達し、第２のパワー半導体は、最大持続時間が１００［ｍｓ］で、かつ電流密度が２〜１４［Ａ・ｃｍ-2］であるパルスを中断なしに伝達する。したがって、放出電荷量を決定するための時間間隔は、第１のパルスおよび／または好ましくは第２のパルスまたはそれぞれ別のパルスの放出によって特定することができる。
【００１２】
好ましくは、第２のパルスの放出電荷量が監視され、ここで、第２のパルスのスイッチオン時間（Ｔ2）は、前記所望の電荷量に到達する時点までに放出された前記放出実電荷量と、前記所望の電荷量とを比較することによって特定可能であり、ここで、放出実電荷量を決定するために１［ｍ秒］の測定サイクルが指定され、時間（Ｔ2）の間にキャパシタ電圧が指数関数的に低下し、前記放出実電荷量が規定電荷量（Ｑ2）に達すると、パワー半導体は閉鎖可能である。
【００１３】
あるいは、第１のパルスおよび／または第２のパルスの放出後であって、少なくとも１つのあらかじめ定められた時間間隔後に、流れる電流が測定され、前記電流が定格値を超える場合または前記電流が前記定格値に満たない場合、前記放出電荷量を一定に保持するために、前記パルスの持続時間を再調整できる可能性がある。別の代替法では、第１のパルスおよび／または第２のパルスの放出後であって、少なくとも１つのあらかじめ定められた時間間隔後に、流れる電流が測定され、前記電流が定格値を超える場合または前記電流が前記定格値に満たない場合、装置の使用者に警告を与えるために、エラーメッセージが生じる可能性がある。さらに、第１のパルスおよび／または第２のパルスの放出後であって、少なくとも１つのあらかじめ定められた時間間隔後に、流れる電流が測定され、前記電流が定格値を超える場合または前記電流が前記定格値に満たない場合、前記定格値が再調整される可能性がある。
【００１４】
あらゆる必要な定数を決定する場合（特に、細胞懸濁液とともに使用されるキュベットに関する必要な定数を決定する場合）、細胞懸濁液を含むキュベットの抵抗が事前に測定されることがある。他の必要なパルスパラメータは、好ましくは手動であらかじめ選択されるか、あるいは必要に応じてコードの入力によって特定される。したがって、カードリーダによって回収可能なデータを使用する可能性もある。カードリーダは同時に、１つまたは複数のパルス放出過程を市販のメモリーカードに記録する目的のために、キュベットに印加された電圧、あるいはキュベットを流れる電流の時間経過を記録するのに用いられる。このメモリーカードは同時に、設定すべきパルスパラメータを記憶するために好適に使用される。
【００１５】
したがって、少なくとも１つのパルスのために、パルス放出の回路制御によって、所望の電荷量の伝達が確実かつ有利な方法で監視され、さらに、試料中に存在する細胞の障害を回避するために、制御された監視のみならず、あらかじめ設定された電荷量の制御および試料依存性の伝達が達成可能である。
【００１６】
使用者および使用される試料のさらなる安全のために、第１のパルスおよびそれに続く各パルスのための過電流遮断部が設けられる。したがって、あらかじめ設定された限界値を超える場合はいつでも、過電流遮断部により高圧パルスを中断させることができる。
【００１７】
記載された２〜１０［ｋＶ／ｃｍ］の高圧パルスは、ＤＮＡが細胞分裂と独立して細胞核に入り込める条件を得るのに適している。細胞の損傷を少なく維持するために、このパルスは１０〜最大２００［μｓ］の間（好ましくは１０〜５０［μｓ］）に限定される。これは、細胞分裂と独立してトランスフェクションを達成するために十分である。例えば、ヒト臍帯静脈由来の内皮細胞のトランスフェクションのためには、このような単一の短波高圧パルスが最適であることが明らかになった。より低い電界強度、またはより低い電流強度、あるいはより低い電流密度であるが、より長い持続時間の電流パルスは次いで、中断せずに、トランスフェクション効率に影響を及ぼす。明らかにより低い電流密度によって、このパルスは細胞の損傷がほとんどない状態で明らかにより長く持続しうる。細胞型および放電に対する細胞の感受性に応じて、最適な電流密度あるいは第２のパルスの持続時間が決定される。このように組み合わされたパルスは、例えば、ヒトの一次皮膚線維芽細胞またはメラニン細胞、または種々のヒト血液細胞に対して最適であることがわかった。異なる細胞株および異なる発現系を用いた実験において、以下のことが明らかになった。すなわち、第２のパルスの電流密度が高くなればなるほど、トランスフェクション率
、すなわちトランスフェクトされた細胞の比率に対する影響が強くなる。電流密度が低ければ低いほど、より多くの第２パルスが、第１のパルスを通じてすでにトランスフェクトされた細胞へと純粋なＤＮＡを輸送するようになる。トランスフェクトされた細胞の発現レベルはパルスの持続時間の増大とともに増加するが、トランスフェクトされた細胞の割合は増加しない。トランスフェクション率、発現レベル、および細胞生命力について正確な細胞特異的制御を維持するためには、第２のパルスのパルス持続時間および電流密度を制御しなければならない。
【００１８】
細胞懸濁液に実際に伝達されるパルスを正確に制御するために、好ましい実施形態では、放出電荷量が制御される。記憶ユニットの選択可能なキャパシタ電圧によって、電流強度あるいは電流密度を制御するために、キュベットおよびその中に含まれる細胞懸濁液の抵抗を最初にあらかじめ設定しなければならない。アルミニウム電極を使用する場合、キュベットの抵抗が、電気化学的プロセスの結果としてパルス中で変化することが明らかになった。この変化は、あらかじめ設定されたパルス特異的な補正値によって考慮される。したがって、例えば、第２のパルスのための正確なパルス波形は、電荷を制御することにより、Ｕ2＝Ｒ×Ｉ2×Ｋ2を用いてあらかじめ規定でき、式中、Ｕ2は記憶装置に印加されるキャパシタ電圧であり、Ｒはキュベットおよびその中に含まれる細胞懸濁液の抵抗であり、Ｉ2は所望の電流であり、Ｋ2はパルスに関して特異的な補正値である。
【００１９】
本発明の実施形態において、オーム性キュベット抵抗Ｒは、パルス放出の開始直前に試験電圧を印加することによって測定でき、それに応じて電圧Ｕ2の計算に際して考慮することができる。おそらく電気化学的プロセスの結果として、パルス放出前に測定される抵抗は、パルス放出中の抵抗よりも大きく変動しやすいので、抵抗Ｒをあらかじめ確実に設定して、キャパシタ電圧Ｕ2をパラメータとして計算することが有効であることが明らかになった。それにもかかわらず、本発明の好ましい実施形態によれば、キュベットの抵抗があらかじめ設定された抵抗範囲内にあるかどうか決定するために、パルス放出前にキュ
ベットの抵抗が測定される。測定された抵抗がこの範囲の外にある場合は、障害が存在し、パルス放出が行なわれない。
【００２０】
各細胞型のために、トランスフェクション率、トランスフェクション強度、および細胞生命力に対する最適な条件が設定される。回路装置の好ましい実施形態によれば、第１のパルスの電界強度および持続時間、および初期電流強度あるいは電流密度、ならびに第２パルスの実験に基づく持続時間が選択可能であり、種々の細胞型に対する最適な条件がコードによって容易に設定可能である。
【００２１】
回路装置は、休止真核細胞または分裂活性真核細胞のトランスフェクションのために有利な方法で使用可能である。また、回路装置は、同様の方法にて、ヒト血液細胞、ヒト血液由来多分化能性前駆細胞、ヒトの一次線維芽細胞、内皮細胞、筋細胞、またはメラニン細胞などの一次細胞のトランスフェクションに適しており、分析目的または診断目的、または生体外（ｅｘ−ｖｉｖｏ）遺伝子治療用の医薬品の製造に使用することができる。
【００２２】
さらに、本発明による回路装置は、例えば電気融合、すなわち細胞、細胞誘導体、細胞内粒子および／または細胞内小胞を電流によって融合するための方法にも適しており、この方法では、例えば細胞、細胞誘導体、細胞内粒子および／または細胞内小胞が最初に適切な密度で水溶液中に懸濁され、次いでこの懸濁液はキュベットに移され、最後にキュベットの電極に電圧が印加され、懸濁液を通じて電流が発生する。あるいは、例えば、接着性の細胞、細胞誘導体、細胞内粒子および／または細胞内小胞、あるいはまた、例えば接着細胞を、懸濁させた細胞、細胞誘導体、細胞内粒子および／または細胞内小胞と融合させることができる。
【００２３】
本願中に記載された回路装置は、２〜１０［ｋＶ／ｃｍ］のきわめて高い電界強度を生じさせ、これによりＤＮＡおよび／または他の生体活性分子が細胞分裂と独立して核に入り込むことができる。これらの電界強度は、エレクトロポレーションにおいて通常用いられる強度をはるかに上回り、細胞膜内に孔を効果的に形成するために十分な電界強度をはるかに超えている（ルルキン（Ｌｕｒｑｕｉｎ），１９９７年，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，第７巻、第５号）によれば、平均１［ｋＶ／ｃｍ］）。
【００２４】
したがって、本発明の対象は、核酸、ペプチド、タンパク質および／または他の生体活性分子を高等真核細胞の細胞核に電流によって導入する方法を実施するための回路装置であり、この場合、核への導入は、細胞膜に孔を形成するのに十分な電界強度の２〜１０倍の電界強度のパルスによって達成される。このパルスの持続時間は少なくとも１０[μｓ]であり、その電流密度は少なくとも２[Ａ・ｃｍ-2]である。
【００２５】
この場合、核酸、ペプチド、タンパク質および／または他の生体活性分子の細胞核への導入は、２〜１０[ｋＶ／ｃｍ]、好ましくは３〜８[ｋＶ／ｃｍ]のパルスによって達成でき、ここでパルスの長さは最大２００［μｓ］である。
【００２６】
回路装置は、２〜１４［Ａ・ｃｍ-2］（好ましくは、２〜５[Ａ・ｃｍ-2]）の電流密度と、１〜１００[ｍｓ]（好ましくは、１〜５０[ｍｓ]）の波長とを有する電流によって、第１のパルスが中断することなく生じうるように配置される。
【００２７】
回路装置は、細胞分裂と独立したトランスフェクションが可能であるため、分裂活性細胞に加えて、休止または弱分裂活性の一次細胞をもトランスフェクトすることができる。
【００２８】
一次末梢ヒト血球およびヒト血液の多分化能性前駆細胞がトランスフェクトされる。さらに別の好ましい実施形態によれば、高次真核細胞は、一次ヒト繊維芽細胞、内皮細胞、およびメラニン細胞を含む。
【００２９】
本発明によれば、回路装置を用いてトランスフェクトされた真核細胞は、診断目的および分析目的で、生体外遺伝子治療用の医薬品を製造するために使用できる。
【００３０】
本発明によれば、回路装置は、細胞分裂とは独立してトランスフェクションを達成でき、これにより、トランスフェクション実験を大幅に迅速化することができる。発現ベクターを用いるトランスフェクション実験の場合、プロモーターおよび発現タンパク質に応じた分析を、トランスフェクション後数時間で行なうことができる。
【００３１】
「生体活性分子」という概念は、それらが細胞内で生物活性を発現する限り、ペプチド、タンパク質、多糖類、脂質、またはこれらの分子の組合せもしくは誘導体を意味する。
【００３２】
本発明において、回路装置の用途としては、特に、高イオン強度および高緩衝能を有するエレクトロポレーション（電気穿孔）緩衝液に適している。
【００３３】
真核細胞の細胞核に核酸を導入するためには、以下のプロトコルを用いることができる。すなわち、１×１０5〜１×１０7［個］の細胞および１０[μｇ]までのＤＮＡを、電極間距離が２[ｍｍ]のキュベット中のエレクトロポレーション緩衝液１００［μｌ］中で室温にて１０分間インキュベートし、次いで、本発明による条件にしたがってトランスフェクトする。その後直ちに、４００[μｌ]の細胞培地を用いてキュベットから前記細胞を洗い出し、３７℃で１０分間インキュベートする。次いで、３７℃の温かい細胞培地内に前記細胞をプレーティングする。
【００３４】
適切なキュベットは例えば、電極間距離が２[ｍｍ]または１[ｍｍ]である、原核生物のエレクトロポレーション用の市販のキュベットである。
【００３５】
核酸が実際に細胞分裂と独立して細胞核に侵入している証拠は、トランスフェクションと分析との間で分裂していない細胞を分析することによって得られる。前記証拠は、一方では、例えばヒト末梢血細胞などの未分裂細胞のトランスフェクションによって達成でき、他方では、分裂活性細胞に対して、トランスフェクション後数時間（せいぜい細胞の一部分が分裂し得た時点）の分析によって達成できる。
【００３６】
一般に用いられる略語に加えて、以下に示す略語が使用されている：
ＦＡＣＳ  蛍光活性化細胞分類法
ＦＣＳ    ウシ胎児血清
ＰＢＭＣ  末梢血単核球
ＰＥ      サイコエリスリン（ｐｓｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）
［実施例］
以下の実施例は本発明を例示するものだが、本発明を限定的には理解すべきではない。
【実施例１】
【００３７】
ヒト血液由来細胞毒性Ｔ細胞のトランスフェクション
新しく調製した未刺激（未分裂）ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、マウスＭＨＣクラスＩタンパク質Ｈ−２ＫKの重鎖をコードするベクターでトランスフェクトした。高緩衝能（４８ｍＭ×ｐＨ-1）および高イオン強度（２８０ｍＭ）の緩衝液中に、ベクターＤＮＡ５[μｇ]とともに、５×１０6個の細胞を電極間距離が２[ｍｍ]のキュベットに室温で添加し、さらに、持続時間が１００[μｓ]の１０００［Ｖ］のパルスと、それに引き続く、電流密度が５[Ａ・ｃｍ-2]で持続時間が４０[ｍｓ]の電流とによってトランスフェクトした。その直後に、４００[μｌ]の細胞培養培地を用いてキュベットから細胞を洗い出し、３７℃で１０分間インキュベートし、次いで、あらかじめ温めておいた培地を含む培養シャーレに前記細胞を移動させた。２４時間インキュベーションした後、ヒト細胞毒性Ｔ細胞を同定するために、ＰｅｒＣＰ結合抗ＣＤ８−抗体に加えて、ジゴキシゲニン結合抗Ｈ−２ＫK抗体およびＣｙ５結合抗ジゴキシゲニン抗体を用いて、細胞を連続的にインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｊｏｄｉｄ）を用いた染色によって、死細胞の数を決定した
。図１に示すように、生細胞の７４．３％がＨ−２ＫK抗原を発現した。この結果は、きわめて高いトランスフェクション効率に相当する。
【実施例２】
【００３８】
ヒト造血幹細胞（ＣＤ３４）のトランスフェクション
実施例１で記載したように、新しく調製されたＰＢＭＣから磁気細胞分離によってＣＤ３４陽性細胞をあらかじめ濃縮した。次いで、それぞれ１×１０4個のＣＤ３４陽性細胞を１×１０6個のＰＢＭＣと混合し、これらの細胞を５［μｇ］のＨ−２ＫK発現ベクターＤＮＡとともに、高緩衝能（５４ｍＭ×ｐＨ-1）および高イオン強度（２６０ｍＭ）の緩衝液中に、電極間距離が２[ｍｍ]のキュベットに室温で添加し、さらに、持続時間が１００[μｓ]の１０００［Ｖ］のパルスと、それに引き続く、電流密度が４[Ａ・ｃｍ-2]で持続時間が２０[ｍｓ]の電流とによってトランスフェクトした。その直後に、４００[μｌ]の細胞培養培地を用いてキュベットから細胞を洗い出し、３７℃で１０分間インキュベートし、次いで、あらかじめ温めておいた培地を含む培養シャーレに細胞を移動させた。１６時間インキュベーションした後、ヒト造血幹細胞を同定するために、ＡＰＣ結合抗ＣＤ３４抗体に加えて、サイコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）結合抗Ｈ−２ＫK抗体を用いて、細胞を連続的にインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｊｏｄｉｄ）を用いた染色によって、死細胞の数を決定した。図２に示すように、生細胞の６６．７％がＨ−２ＫK抗原を発現した。この結果は、高いトランスフェクション効率に相当する。
【実施例３】
【００３９】
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ｎｅｏ）のトランスフェクション
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（５×１０5細胞（個））を、５［μｇ］のＨ−２ＫK発現ベクターＤＮＡとともに、高緩衝能（６７ｍＭ×ｐＨ-1）および高イオン強度（３８０ｍＭ）の緩衝液中に、電極間距離が２[ｍｍ]のキュベットに室温で添加し、さらに、持続時間が１００[μｓ]の１０００［Ｖ］のパルスと、それに引き続く、電流密度が６[Ａ・ｃｍ-2]で持続時間が３３[ｍｓ]の電流とによってトランスフェクトした。その直後に、４００[μｌ]の細胞培養培地を用いてキュベットから細胞を洗い出し、３７℃で１０分間インキュベートし、次いで、あらかじめ温めておいた培地を含む培養シャーレに細胞を移動させた。５時間インキュベーションした後、Ｃｙ５結合抗Ｈ−２ＫK抗体とともに細胞をインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｊｏｄｉｄ）を用いた染色によって、死細胞の数を決定した。図３に示すように、細胞の９３％がＨ−２ＫK抗原を発現した。この結果は、きわめて高いトランスフェクション効率に相当する。
【実施例４】
【００４０】
ヒト新生児メラニン細胞のトランスフェクション
ヒト新生児メラニン細胞（２．５×１０5細胞（個））を、５［μｇ］のＨ−２ＫK発現ベクターＤＮＡとともに、高緩衝能（５４ｍＭ×ｐＨ-1）および高イオン強度（２６０ｍＭ）の緩衝液中に、電極間距離が２[ｍｍ]のキュベットに室温で添加し、さらに、持続時間が１００[μｓ]の１０００［Ｖ］のパルスと、それに引き続く、電流密度が６[Ａ・ｃｍ-2]で持続時間が３３[ｍｓ]の電流とによってトランスフェクトした。その直後に、４００[μｌ]の細胞培養培地を用いてキュベットから細胞を洗い出し、３７℃で１０分間インキュベートし、次いで、あらかじめ温めておいた培地を含む培養シャーレに細胞を移動させた。５時間インキュベーションした後、Ｃｙ５結合抗Ｈ−２ＫK抗体とともに細胞をインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｊｏｄｉｄ）を用いた染色によって、死細胞の数を決定した。図４に示すように、細胞の７５．１％がＨ−２ＫK抗原を発現した。この結果は、きわめて高いトランスフェクション効率に相当する。
【実施例５】
【００４１】
臍帯静脈由来ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のトランスフェクション
ヒト臍帯静脈由来内皮細胞（１×１０6細胞（個））を、５［μｇ］のＨ−２ＫK発現ベクターＤＮＡとともに、高緩衝能（６７ｍＭ×ｐＨ-1）および高イオン強度（３７８ｍＭ）の緩衝液中に、電極間距離が２ｍｍのキュベットに室温で添加し、さらに、持続時間が１００[μｓ]の１０００［Ｖ］のパルスによってトランスフェクトした。その直後に、４００[μｌ]の細胞培養培地を用いてキュベットから細胞を洗い出し、３７℃で１０分間インキュベートし、次いで、あらかじめ温めておいた培地を含む培養シャーレに細胞を移動させた。５時間インキュベーションした後、Ｃｙ５結合抗Ｈ−２ＫK抗体とともに細胞をインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｊｏｄｉｄ）を用いた染色によって、死細胞の数を決定した。図５に示すように、生細胞の４９．７％がＨ−２ＫK抗原を発現した。この結果は、きわめて高いトランスフェクション効率に相当する。
【実施例６】
【００４２】
Ｋ５６２ヒト細胞株のトランスフェクション
Ｋ５６２細胞（１×１０6細胞（個））を、５［μｇ］のＨ−２ＫK発現ベクターＤＮＡとともに、高緩衝能（２４ｍＭ×ｐＨ-1）および高イオン強度（２５４ｍＭ）の緩衝液中に、電極間距離が２[ｍｍ]のキュベットに室温で添加し、さらに、持続時間が１００[μｓ]の１０００［Ｖ］のパルスと、それに引き続く、電流密度が８[Ａ・ｃｍ-2]で持続時間が１０[ｍｓ]の電流とによってトランスフェクトした。その直後に、４００[μｌ]の細胞培養培地を用いてキュベットから細胞を洗い出し、３７℃で１０分間インキュベートし、次いで、あらかじめ温めておいた培地を含む培養シャーレに細胞を移動させた。４時間インキュベーションした後、Ｃｙ５結合抗Ｈ−２ＫK抗体とともに細胞をインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｊｏｄｉｄ）を用いた染色によって、死細胞の数を測定した。図６に示すように、細胞の６９．５％がＨ−２ＫK抗原を発現した。この結果は、きわめて高いトランスフェクション効率に相当する。
【実施例７】
【００４３】
サイクル３−ＧＦＰでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のトランスフェクション効率および平均蛍光強度
第２のパルス中に流れる電荷量の関数として、トランスフェクトされた細胞のトランスフェクション効率および平均蛍光強度を検査するために、それぞれ７×１０5個のＣＨＯ細胞を、５［μｇ］のサイクル３−ＧＦＰ−ベクターＤＮＡとともに、エレクトロポレーション緩衝液中に、電極間距離が２ｍｍのキュベットに添加し、持続時間が１０[μｓ]の１０００［Ｖ］のパルスと、それに引き続く第２のパルスとによってトランスフェクトした。第２のパルスでは、電流強度あるいは電流密度およびパルス時間のバリエーションを変化させた。５時間の培養後、フローサイトメーター（flow cytometer）を用いて細胞を
分析した。図７は、パルス時間にわたって電流の積分値の関数として決定されたトランスフェクション効率を示している（電荷量Ｑ）。トランスフェクション効率は電流強度の増加とともに上昇しうることが明らかである（開放円）。これに対して、電流強度が一定である場合、パルス時間の増加によって効率が大幅に上昇することはない（閉鎖円）。トランスフェクトされた細胞の蛍光強度（輝度）は、電荷量Ｑの増加とともに上昇するが、Ｑが高い場合飽和に達する。Ｑの増加が電流強度の上昇（開放円）またはパルス長の増加（閉鎖円）によって達成されたかどうかについては、大きな違いは示されていない。
【実施例８】
【００４４】
サイクル３−ＧＦＰでトランスフェクトされたジャーカット（Jurkat）細胞のトランスフェクション効率および平均蛍光強度
第２のパルス中に流れる電荷量の関数として、トランスフェクトされた細胞のトランスフェクション効率および平均蛍光強度を検査するために、それぞれ４．５×１０5個のジャーカット細胞を、５［μｇ］のサイクル３−ＧＦＰ−ベクターＤＮＡとともに、エレクトロポレーション緩衝液中に、電極間距離が２ｍｍのキュベットに添加し、持続時間が１０[μｓ]の１０００［Ｖ］のパルスと、それに引き続く第２のパルスとによってトランスフェクトした。第２のパルスでは、電流強度あるいは電流密度およびパルス時間のバリエーションを変化させた。５時間の培養後、フローサイトメーターを用いて細胞を分析した。図８は、パルス時間にわたって電流の積分値の関数として決定されたトランスフェクション効率を示している（電荷量Ｑ）。ＣＨＯ細胞を用いる場合、トランスフェクション効率は電流強度の増加とともに上昇しうることが明らかである（開放円）。これに対して、電流強度が一定である場合、パルス時間の増加によって効率が大幅に上昇することはない（閉鎖円）。トランスフェクトされた細胞の蛍光強度（輝度）は、電荷量Ｑの増加とともに上昇するが、Ｑが高い場合飽和に達する。Ｑの増加が電流強度の上昇（開放円）またはパルス長の増加（閉鎖円）によって達成されたかどうかについては、大きな違いは示され
ていない。
【実施例９】
【００４５】
Ｈ−２ＫKでトランスフェクトされたジャーカット細胞のトランスフェクション効率および平均蛍光強度第２のパルス中に流れる電荷量の関数として、トランスフェクトされた細胞のトランスフェクション効率および平均蛍光強度を検査するために、それぞれ１×１０6個のジャーカット細胞を、２［μｇ］のＨ２ＫK発現ベクターＤＮＡとともに、エレクトロポレーション緩衝液中に、電極間距離が２ｍｍのキュベットに添加し、持続時間が１０[μｓ]の１０００［Ｖ］のパルスと、それに引き続く第２のパルスとによってトランスフェクトした。第２のパルスでは、電流強度あるいは電流密度およびパルス時間のバリエーションを変化させた。３．５時間の培養後、Ｃｙ５結合抗Ｈ２ＫKで細胞をインキュベートし、フローサイトメーターを用いて細胞を分析した。図９は、パルス時間にわたって電流の積分値の関数として決定されたトランスフェクション効率を示している（電荷量Ｑ）。トランスフェクション効率は電流強度の増加とともに上昇しうることが明らかである（開放円）。これに対して、電流強度が一定である場合、パルス時間の増加によって効率が大幅に上昇することはない（閉鎖円）。トランスフェクトされた細胞の蛍光強度（輝度）は、電荷量Ｑの増加とともに上昇するが、Ｑが高い場合飽和に達する。Ｑの増加が電流強度の上昇（開放円）またはパルス長の増加（閉鎖円）によって達成されたかどうかについては、大きな違いは示されていない。
【００４６】
本発明をさらに以下の図面によって述べる。各図は以下の通りである。
【００４７】
図１は、Ｈ−２ＫK発現ベクターでトランスフェクトされたＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析を示す。ヒト細胞毒性Ｔ細胞を同定するために、ＰｅｒＣＰ結合抗ＣＤ８−抗体に加えて、ジゴキシゲニン結合抗Ｈ−２ＫK抗体およびＣｙ５結合抗ジゴキシゲニン抗体とともに細胞を連続的にインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて細胞を分析した（ＦＬ−２、ＦＬ−３＝蛍光チャネル２，３；ＳＳＣ＝側方散乱、ＦＳＣ＝前方散乱、ＰｅｒＣＰ＝ペリジニンクロロフィルタンパク質、ＣＤ＝分化クラスター）。
【００４８】
図２は、Ｈ−２ＫK発現ベクターでトランスフェクトされたＰＢＭＣから濃縮されたＣＤ３４陽性幹細胞のフローサイトメトリー分析を示す。ヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を同定するために、ＡＰＣ結合抗ＣＤ３４抗体に加えて、サイコエリスリン結合抗Ｈ−２ＫK抗体とともに細胞を連続的にインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて細胞を分析した（ＦＬ−１、ＦＬ−３＝蛍光チャネル１、３；ＳＳＣ＝側方散乱、ＦＳＣ＝前方散乱、ＰＥ＝サイコエリスリン、ＡＰＣ＝アロサイコエリスリン、ＣＤ＝分化クラスター）。
【００４９】
図３は、Ｈ−２ＫK発現ベクターでトランスフェクトされたヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ｎｅｏ）のフローサイトメトリー分析を示す。Ｃｙ５結合抗Ｈ−２ＫKとともに細胞をインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で細胞を分析した（ＦＬ−１、Ｆ−２、ＦＬ−３＝蛍光チャネル１、２、３；ＳＳＣ＝側方散乱、ＦＳＣ＝前方散乱）。
【００５０】
図４は、Ｈ−２ＫK発現ベクターでトランスフェクトされたヒト新生児メラニン細胞（ＮＨＥＭ−Ｎｅｏ）のフローサイトメトリー分析を示す。Ｃｙ５結合抗Ｈ−２ＫKとともに細胞をインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて細胞を分析した（ＦＬ−１、Ｆ−２、ＦＬ−３＝蛍光チャネル１、２、３；ＳＳＣ＝側方散乱、ＦＳＣ＝前方散乱）。
【００５１】
図５は、Ｈ−２ＫK発現ベクターでトランスフェクトされたヒト臍帯由来の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のフローサイトメトリー分析を示す。Ｃｙ５結合抗Ｈ−２ＫKとともに細胞をインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））とともに細胞を分析した（ＦＬ−１、Ｆ−２、ＦＬ−３＝蛍光チャネル１、２、３；ＳＳＣ＝側方散乱、ＦＳＣ＝前方散乱）。
【００５２】
図６は、Ｈ−２ＫK発現ベクターでトランスフェクトされたＫ５６２ヒト細胞株のフローサイトメトリー分析を示す。Ｃｙ５結合抗Ｈ−２ＫK抗体とともに細胞をインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で分析した（ＦＬ−１、Ｆ−２、ＦＬ−３＝蛍光チャネル１、２、３；ＳＳＣ＝側方散乱、ＦＳＣ＝前方散乱）。
【００５３】
図７は、ＣＨＯ細胞のトランスフェクション効率、ならびに流れた電荷量Ｑの関数として陽性細胞の平均蛍光強度（輝度）を示すグラフである。ＣＨＯ細胞をサイクル３−ＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトし、５時間後にフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて細胞を分析した。閉鎖円は一定の電流強度（２Ａ）あるいは電流密度（４Ａ・ｃｍ-2）におけるパルス時間の段階的上昇に相当し、開放円は電流強度の上昇に相当する。
【００５４】
図８は、ジャーカット細胞のトランスフェクション効率、ならびに流れた電荷量Ｑの関数として陽性細胞の平均蛍光強度（輝度）を示すグラフである。ジャーカット細胞をサイクル３−ＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトし、５時間後にフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））とともに細胞を分析した。閉鎖円は一定の電流強度（２Ａ）あるいは電流密度（４Ａ・ｃｍ-2）におけるパルス時間の段階的上昇に相当し、開放円は電流強度の上昇に相当する。
【００５５】
図９は、ジャーカット細胞のトランスフェクション効率、ならびに流れた電荷量Ｑの関数として陽性細胞の平均蛍光強度（輝度）を示すグラフである。ジャーカット細胞をＨ−２ＫK発現ベクターでトランスフェクトし、３．５時間後にＣｙ５結合抗Ｈ−２ＫKとともにインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて細胞を分析した。閉鎖円は一定の電流強度（２Ａ）あるいは電流密度（４Ａ・ｃｍ-2）におけるパルス時間の段階的上昇に相当し、開放円は電流強度の上昇に相当する。
【００５６】
図１０は、必須の個々の構成物とともにエレクトロポレータ１を示すブロック図である。これらは、調整ユニット２、制御ユニット３、および２つのパワー半導体９、１０を含む。制御ユニット３は、電圧供給ユニット４と、少なくとも２つのＨＶ電源５、６とに接続される。ＨＶ電源５、６はそれぞれ後述する記憶装置７、８に接続されている。パワー半導体９、１０はパルス放出のために設けられている。パワー半導体９、１０は、分離ステージ１１、１２を経由して、制御ユニット３によってＨＶスイッチ１３および制御ユニット１４を用いて制御される。記憶装置７、８はパワー半導体９、１０の入力部と直接接
続され、ここで、記憶装置７、８は、使用される電界強度およびパルス持続時間に応じて１つまたは複数のキャパシタからなることができる。パワー半導体９は、例えばＩＧＢＴからなることができ、パワー半導体１０はＭＯＳＦＥＴからなることができる。しかしながら、「パワー半導体」という用語は、他のすべての電気的構成要素または電気的構成要素集合体を包含すべきであり、それらによって本発明の範囲内で切り替えられる電圧および電流が、必要とされる切り替え時間によって切り替えられることを意味する。ＩＧＢＴの出力部はキュベット接続部１５と直接接続されているのに対し、ＭＯＳＦＥＴ１０の出力部は抵抗１６およびダイオード１７を介してキュベット接続部１５と接続されている。
したがって、両方のパワー半導体９、１０が同時に制御された場合、第２のパワー半導体１０を経由してパルスが逆流することはない。この目的のために、ダイオード１７がキュベット接続部１５と陰極側で接続されている。第２のキュベット接続部１８は抵抗１９を経由してアースと接続されている。抵抗１９は電圧降下を測定し、過電流切り替えステージ２０に供給するメス−シャント（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｓｈｕｎｔ）を含む。過電流切り替えステージ２０は、スイッチ２１を用いて、潜在的な分離ステージ１１およびＨＶスイッチ１３を経由したパルス放出を中断させることができるのに対し、第２の過電流切り替えステージ２２はスイッチ２３を経由してＭＯＳＦＥＴ１０用の制御ユニット１４の制御システムを中断する。最大電流を超えた場合に電流を切断するために、抵抗１６を経由して付加された電圧は、過電流切り替えステージ２２に供給される。抵抗１６が高電圧回路内に直接配置されていることにより、スイッチ２３は潜在的な分離ステージ１２の後に配置されている。これにより、高圧パルスが制御ユニット３に達することはないため、操作員が危険にさらされることはない。過電流切り替えステージ２０の場合、低抵抗の測定抵抗１９がキュベット接続部１５、１８の後に配置され、この測定抵抗１９がアースに接続されていることにより、高電圧パルスの伝達を排除することができる。エレクトロポレータ１の使用目的に応じて、付属の記憶装置７、８を伴う１つまたは複数の高電圧電源５、６と、必須の潜在的な分離ステージ１１、１２と、パワー半導体９、１０を制御するためのＨＶスイッチ１３あるいは制御ユニット１４と、を使用することができる。必要な容量およびブレークダウン電圧の１項または複数のキャパシタが記憶装置７、８に設けられることにより、適切な高い電荷量を蓄積でき、前記電荷はキュベット接続部１５へと伝達できる。
【００５７】
以下の図１１〜図１８は、個々の構成要素の回路図を示すブロック図である。
【００５８】
図１１は、設定されるパラメータ信号の入力のための制御パネルの回路図を示し、ここで、前記信号はスイッチキー３０によってあらかじめ選択可能であり、表示要素３１を用いて視覚的に試験することができる。ＬＥＤ３２は装置が動作スタンバイの状態であることを示している。必要なパラメータは回路内に調製され、コネクタ３３を経由して図１４に従った制御システムへと伝達される。
【００５９】
図１２は、カードリーダ３４の回路図を示す。カードリーダ３４では、特定の生体物質に関してあらかじめ設定されたパラメータが読み取られ、このパラメータは図１４に示すような制御ユニットへと伝達される。
【００６０】
図１３は、供給ユニットの回路図を示す。供給ユニットは、実質的に、１５０／２３０ボルトの転換スイッチ３５と、変換ステージ３６とからなる。変換ステージ３６は、必要な操作電圧を発生させるために、一次スイッチと、電圧供給器と、二次制御ステージとを有する。この目的のために、整流器３７の背後には、複数の電圧制御装置３８が挿入されている。
【００６１】
図１４は、ブロック図から確認できる２つのＨＶ電源５、６の回路図を示す。ＨＶ電源５、６はいずれも、供給ユニットからの電圧Ｕ1によって動作し、ここで、各制御ステージ３９が制御システムからの制御信号Ｕ３ｏｎ、Ｕ５ｏｎを受信し、印加電圧Ｕ1は、変換装置ステージ４０を経由したパルスの形で、複数のキャパシタを備えた記憶装置７、８をチャージする。到達する所望の電圧は、図１５に示すように、出力信号Ｕ３ｓｅｎｓｅ、Ｕ５ｓｅｎｓｅによって制御システムに伝達される。図１５に示すように、記憶装置７の電圧Ｕ5はＨＶスイッチ１３に供給され、図１６に示すように、記憶装置８の電圧Ｕ3は電流制御ステージに供給される。
【００６２】
図１５は、ＨＶスイッチ１３の回路図を示す。ＨＶスイッチ１３は、図１６に示すように、パルス制御ステージにより生じる信号ＨＩＮを含み、この信号ＨＩＮは第１のパワー半導体９を制御する。ＨＶスイッチ１３は、印加電圧Ｕ5をソルダパッド４１に伝達し、このソルダパッド４１はキュベットを接続するためのＨＶケーブル用であり、前記キュベットはさらに第２のソルダパッド４２を経由して低抵抗の測定抵抗を介してアースと接続されている。過電流遮断ステージ２０は、あらかじめ設定された最大の電流上昇を超えた場合、パワー半導体９を切断するために、図１８に示すように、制御ユニットに対して制御信号を伝達する。第１のソルダパッド４１はさらに、図１２に示す電流制御ステージの電圧出力部Ｕ4と接続され、制御された電流がキュベットへと流れることにより、高電圧パルスの後に所定の電荷量を放出させる。図１６による電流制御ステージは、潜在的な分離ステージを経由して、図１８による制御ユニット３の制御信号を受け取り、記憶装置８に印加される電圧Ｕ3を、ソルダパッド４１を経由して放出される電圧Ｕ4へと制御する。この場合、本発明によれば、Ｑ制御または電流制御が用いられることにより、記憶装置８に存在する電荷があらかじめ規定された時間間隔（例えば、１ミリ秒）で決定され、通常電荷を考慮に入れた放出電荷量が決定される。
【００６３】
図１８は、制御ユニット３の回路図を示す。制御ユニット３は、あらかじめ設定された手動の値、またはカードリーダ３４によって入力された値のいずれかを考慮し、さらなる監視信号に基づいて、図１６に示す電流制御ユニット１４の制御を行う。これに対して、図１５に示すように、図１７に示すパルス監視ステージ４３を経由して、手動によって高電圧パルスを放出させた後に、ＨＶスイッチ１３が制御される。したがって、ＨＶパルスが放出された後、図１６に示す電流制御ユニット１４を経由して電荷量を監視することができる。
【００６４】
したがって、パルスパラメータの事前設定は、一方では手動によって、他方ではカードリーダによって行うことができる。したがって、存在する制御エレクトロニクスを介してパルスを手動によって放出させる場合、必要に応じて、流れる電流および高電圧パルスを監視しながらあるいは監視せずに、電荷量を監視するとともに、第２のＨＶ電源を経由して連続的な電気信号を放出することができる。
図１９は、本発明の好ましい実施形態による制御ユニット３（図１０参照）によって制御されるパルス放出プロセスの操作手順を模式的に示す流れ図（フローチャート）である。まず、手動またはメモリーカードからの読み出しによって、必要なパルスパラメータをあらかじめ設定する（図示せず）。操作の開始（例えば、相当する押ボタンの作動による）後、キュベット接続部１５、１８に低電圧（例えば、１２[Ｖ]）を印加し、次いでステップ４４において電流を測定（例えば、２[ｍｓ]）することによって、キュベットのオーム性抵抗が最初に測定される。照会４５では、この抵抗が所定の範囲内にあるかどうかを確認する。この抵抗が範囲内にない場合、その後のプロセスを中断する。測定された抵抗値は、本発明の本実施形態における電荷電圧Ｕ2の計算には以降利用されない。抵抗が適切に所定の範囲内にある場合は、ステップ４６において、記憶装置７、８を所定の電圧Ｕ1およびＵ2に荷電する。所望の電荷電圧に達した場合、ＨＶ電源５、６による荷電を切断する。次のパルス放出中に記憶装置の再荷電は行われない。その後、高電圧パルスのパルス放出は、ステップ４７において、半導体スイッチ９の閉鎖によって開始する。その結果、比較的高い電流が細胞を通過して流れる。電流の急上昇が過電流遮断ステージ２０によって確認された場合、安全のためにスイッチ９が直ちに開放され、実験は停止される。本実施形態によれば、高電圧パルスは、あらかじめ設定された時間（数マイクロ秒）後に終了し、その後、第２のパルスが直ちに中断なく続く。このため、ステップ４８において、第１の半導体スイッチ９の開放直前に第２の半導体スイッチ１０はすでに閉鎖されているため、両方のパルス間の中断なしの移行が生じる。短い時間間隔で両方の高電圧スイッチ９、１０が同時に閉鎖され、ダイオード１７が、記憶装置７から記憶装置８へとより高電圧が印加されるのを阻止する。半導体スイッチ１０は次いで、あらかじめ設定された電荷Ｑがキュベットに流れるまで（過電流遮断ステージ２２によって最大電流を超えない限り）開放し続ける。このため、ステップ４９において、キュベットを流れる電流が所定の時間間隔（例えば、１ｍｓ）で測定および積分される。あらかじめ設定された電荷に到達次第（照会５０参照）、スイッチ１０が開放し、実験は終了する。記憶装置８の容量は、第２のパルスの持続時間中に電圧が段階的にあるいはゆっくり低下するように選択される。障害により、記憶装置がほぼ完全に放電したのにも関わらず、依然としてあらかじめ設定された所望の電荷に到達しない場合においても、適切に選択された時間制限を超えた後に操作を中断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ヒト血液由来細胞毒性Ｔ細胞のトランスフェクションを示す図である。
【図２】ヒト血液由来多分化能性前駆細胞のトランスフェクションを示す図である。
【図３】ヒト新生児皮膚線維芽細胞のトランスフェクションを示す図である。
【図４】ヒト新生児皮膚メラニン細胞のトランスフェクションを示す図である。
【図５】臍帯由来ヒト内皮細胞のトランスフェクションを示す図である。
【図６】Ｋ５６２細胞株のトランスフェクションを示す図である（トランスフェクション後４時間の分析）。
【図７】電流強度、パルス時間、および電荷量の関数としたトランスフェクション効率の検査、および電荷量の関数とした発現強度の検査、ＣＨＯ細胞系を用いた実験を示す図である。
【図８】電流強度、パルス時間、および電荷量の関数としたトランスフェクション効率の検査、および電荷量の関数とした発現強度の検査、ジャーカット（Jurkat）細胞系を用いた実験を示す図である。
【図９】電流強度、パルス時間、および電荷量の関数としたトランスフェクション効率の検査、および電荷量の関数とした発現強度の検査、ジャーカット（Jurkat）細胞系および表面マーカータンパク質Ｈ−２ＫKを用いた実験を示す図である。
【図１０】エレクトロポレータの回路を示すブロック図である。
【図１１】制御パネルを示す回路図である。
【図１２】カードリーダを示す回路図である。
【図１３】供給ユニットを示す回路図である。
【図１４】ＨＶ電源を示す回路図である。
【図１５】ＨＶスイッチを示す回路図である。
【図１６】電流制御システムを示す回路図である。
【図１７】磁気パルス検出器を示す回路図である。
【図１８】制御システムを示す回路図である。
【図１９】パルス放出プロセスの手順を説明する流れ図である。
【符号の説明】
【００６６】
１    エレクトロポレータ（電気穿孔装置）
２    調整ユニット
３    制御ユニット
４    電圧供給ユニット
５    ＨＶ電源
６    ＨＶ電源
７    記憶装置
８    記憶装置
９    パワー半導体
１０  パワー半導体
１１  分離ステージ
１２  分離ステージ
１３  ＨＶスイッチ
１４  制御ユニット
１５  キュベット接続部
１６  抵抗
１７  ダイオード
１８  キュベット接続部
１９  抵抗
２０  過電流遮断ステージ（過電流切り替えステージ）
２１  スイッチ
２２  過電流遮断ステージ（過電流切り替えステージ）
２３  スイッチ
３０  スイッチキー
３１  表示要素
３２  ＬＥＤ
３３  コネクタ
３４  カードリーダ
３５  転換スイッチ
３６  変換装置（変換ステージ）
３７  整流器
３８  電圧制御装置
３９  制御ステージ
４０  変換装置ステージ
４１  ソルダパッド
４２  ソルダパッド
４３  パルス監視ステージ
４４  ５１ステップまで
【図１】
2008237214.tif 000003
【図２】
2008237214.tif 000004
【図３】
2008237214.tif 000005
【図４】
2008237214.tif 000006
【図５】
2008237214.tif 000007
【図６】
2008237214.tif 000008
【図７】
2008237214.tif 000009
【図８】
2008237214.tif 000010
【図９】
2008237214.tif 000011
【図１０】
2008237214.tif 000012
【図１１】
2008237214.tif 000013
【図１２】
2008237214.tif 000014
【図１３】
2008237214.tif 000015
【図１４】
2008237214.tif 000016
【図１５】
2008237214.tif 000017
【図１６】
2008237214.tif 000018
【図１７】
2008237214.tif 000019
【図１８】
2008237214.tif 000020
【図１９】
2008237214.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月3日(2008.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸、ペプチド、タンパク質および／またはその他の生体活性分子を電流によって真核細胞の細胞核に導入し、その場合に少なくとも１つの電圧パルスを細胞に供給する方法であって、
電圧パルスによって供給される電荷量を、少なくとも１つの選択可能な時間間隔で測定し、その場合に、あらかじめ設定された所望の電荷量と実際に供給された電荷量との比較を行い、電圧パルスが所望の電荷量に到達した時点あるいは所望の電荷量を超過した時点で電圧パルスを停止することを特徴とする方法。
【請求項２】
キャパシタ電圧（Ｕ1）を伴う第１のパルスを細胞に供給した後、中断なしにキャパシタ電圧（Ｕ2）を伴う少なくとも１つの第２のパルスを供給することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
電荷供給量を、対応する記憶装置（７、８）の通常の電荷と残留電荷との差から決定することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
電界強度が２〜１０［ｋＶ／ｃｍ］、持続時間が１０〜１００［μｓ］、かつ電流密度が少なくとも２［Ａ・ｃｍ-2］である第１のパルスを細胞に印加した後、中断なしに電流密度が２〜１４［Ａ・ｃｍ-2］で最大持続時間が１００［ｍｓ］である第２のパルスをも細胞に供給することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
供給電荷を決定する時間間隔を、第１のパルスおよび／または好ましくは第２のパルスまたはさらに別の各パルスの電荷の供給と同時に指定することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
第２のパルスのスイッチオン時間（Ｔ2）が、所望の電荷量と、測定時間までに供給された実際の電荷量との比較を行うことによって指定され、所望の電荷量に到達した時点で終了することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
実際の電荷量を決定するために１［ｍｓｅｃ］の測定サイクルを選択し、その場合に、時間（Ｔ2）の間にキャパシタ電圧が指数関数的に低下し、パルスが規定電荷量（Ｑ2）に到達した時点でパルスを停止することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
１つの第１のパルスおよび／または第２のパルスを発生させた後、少なくとも１つのあらかじめ定められた時間間隔後に、流れる電流を測定し、前記電流が定格値を超過する場合または定格値に満たない場合、電荷供給量を一定に保持するためにパルスの持続時間を再調整することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
１つの第１のパルスおよび／または第２のパルスを発生させた後、少なくとも１つのあらかじめ定められた時間間隔後に、流れる電流を測定し、前記電流が定格値を超過する場合または定格値に満たない場合、エラーメッセージが生じることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
１つの第１のパルスおよび／または第２のパルスを誘発した後、少なくとも１つのあらかじめ定められた時間間隔後に、流れる電流を測定し、前記電流が定格値を超過する場合または定格値に満たない場合、定格値を再調整することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
パルスのあらかじめ選択された設定パラメータ（Ｕ1、Ｔ1、Ｉ2、Ｔ2、Ｋ2）を、手作業あるいはコード入力により入力することを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
第１のパルスおよび第２のパルスに対する過電流遮断を実行することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
（Ｕ2）の計算に用いられるキュベットの抵抗Ｒを、パワー半導体（９、１９）を起動する前に抵抗測定によって決定することを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
（Ｕ2）の計算に用いられるキュベットの抵抗Ｒをあらかじめ設定することを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
パルスのあらかじめ選択された設定パラメータ（Ｕ1、Ｔ1、Ｉ2、Ｔ2、Ｋ2、Ｒ）を、メモリーカードを介して読み取ることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。