(57)【要約】      （修正有）【課題】長期保存後であってもタンパク質の変性の程度が少ない経時的安定性の高い組成物の提供。【解決手段】下記成分（１）及び（２）を含有する組成物であって、組成物中の成分（２）の含有量が０．７５〜１０重量％であり、かつ成分（２）１モルに対して成分（１）の総量が２０〜５０モルである組成物：（１）分子量７５〜６８０００のアミノ酸、ペプチド及びタンパク質の少なくとも一種（２）分子量７５０００〜１００００００のタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記成分（１）及び（２）を含有する組成物であって、組成物中の成分（２）の含有量が０．７５〜１０重量％であり、かつ成分（２）の総量１モルに対して成分（１）の総量が２０〜５０モルである組成物：
（１）分子量７５〜６８０００のアミノ酸、ペプチド及びタンパク質の少なくとも一種
（２）分子量７５０００〜１００００００のタンパク質。
【請求項２】
前記成分（１）中に含まれる分子量７５〜３５０００のアミノ酸、ペプチド及びタンパク質の割合がモル数で９５〜１００％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
還元糖をさらに含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
還元糖が単糖及び二糖からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
成分（２）が免疫グロブリンである請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
錠剤形である請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
一回摂取量当り成分（２）を７．５〜７０ｍｇの割合で含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリン等のタンパク質を含む組成物に関する。より詳細には、本発明は、還元糖を加えた場合でも経時的安定性を示すタンパク質含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳、血液等に含まれるＩｇＧ等の免疫グロブリンは、インフルエンザウイルス等の感染予防効果等、多くの抗体活性を有するため、食品、医薬品等に用いられている。
【０００３】
しかし、このような免疫グロブリンを含む組成物は、免疫グロブリンだけでは味が悪く、味の改善をすべく組成物中に還元糖を配合する場合、保存の間に免疫グロブリンが変性してしまうため、経時的安定性が低いという問題があった。
【０００４】
例えば、当該組成物に甘味料として糖を配合すると、免疫グロブリンが糖とのメイラード反応により変性し、活性が著しく下がってしまう。特に、ウイルス感染予防効果等を期待して組成物中に免疫グロブリンを多く配合した場合、活性の低下は顕著となる。従って、これらの組成物に、免疫グロブリンとメイラード反応しない非還元糖を配合することが提案されている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、抗体を含む乳清タンパクと、非還元糖であるフラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、ラクチュロース、イソマルトオリゴ糖、又はα−ガラクトシル結合を含まないガラクトオリゴ糖とを含有する乳清タンパク食品が記載されている。
【０００６】
しかし、非還元糖は、高価である、独特な人工的な味があり天然感のあるおいしさを損なってしまう等の問題があり現実的ではない。
【０００７】
このような問題は、免疫グロブリンを有効成分とする組成物に限られない。当該問題は、分子量７５０００〜１００００００程度の高分子量タンパク質全般についても当てはまる。従って、高分子量のタンパク質を含有する組成物に還元糖を配合した場合であっても保存中における高分子量のタンパク質の変性が少なく、経時的安定性が高いタンパク質含有組成物の開発が切望されている。
【特許文献１】特開２００６−１４９３７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記状況に鑑み、還元糖を配合した場合であっても長期保存後の高分子量のタンパク質の変性の程度が少なく、例えば、高分子量のタンパク質として免疫グロブリンを配合した場合に、有効にウイルス感染予防効果を発揮することができる、タンパク質含有組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、分子量７５０００〜１００００００という高分子量のタンパク質と分子量７５〜６８０００のアミノ酸、ペプチド及びタンパク質の少なくとも一種とを特定のモル比で組み合わせることによって、還元糖を含む場合であっても、長期間保存後に当該高分子量タンパク質が高い割合で残存していることを見出し、特に当該高分子量タンパク質として免疫グロブリンを用いた場合には、長期にわたってインフルエンザウイルス感染の予防効果を維持できることを確認した。本発明はかかる新規の知見に基づくものである。
【００１０】
本発明は、以下の項に示す組成物を提供する：
項１．下記成分（１）及び（２）を含有する組成物であって、組成物中の成分（２）の含有量が０．７５〜１０重量％であり、かつ成分（２）の総量１モルに対して成分（１）の総量が２０〜５０モルである組成物：
（１）分子量７５〜６８０００のアミノ酸、ペプチド及びタンパク質の少なくとも一種
（２）分子量７５０００〜１００００００のタンパク質。
【００１１】
項２．成分（１）中に含まれる分子量７５〜３５０００のアミノ酸、ペプチド及びタンパク質の割合がモル数で９５〜１００％である、項１に記載の組成物。
【００１２】
項３．還元糖をさらに含む、項１又は２に記載の組成物。
【００１３】
項４．還元糖が単糖及び二糖からなる群より選択される少なくとも一種である、項３に記載の組成物。
【００１４】
項５．成分（２）が免疫グロブリンである項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【００１５】
項６．錠剤形である項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【００１６】
項７．一回摂取量当り成分（２）を７．５〜７０ｍｇの割合で含む、項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【００１７】
項８．錠菓、栄養補助食品、特別用途食品、特定保健用食品、または経口医薬品である、項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の組成物は、これに還元糖を配合した場合であっても、有効成分である分子量７５０００〜１００００００のタンパク質がほとんど変性することなく残存する。従って、例えば、分子量７５０００〜１００００００のタンパク質として免疫グロブリンであるＩｇＧを含有する場合、本発明の組成物は、還元糖を加えた場合であっても長期にわたって、当該ＩｇＧに起因するウイルス感染予防効果を維持する等の特性を発揮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明組成物
本発明組成物は、下記成分（１）及び（２）を含有し：
（１）分子量７５〜６８０００のアミノ酸、ペプチド及びタンパク質の少なくとも一種
（２）分子量７５０００〜１００００００のタンパク質、
組成物中の成分（１）の含有量が０．７５〜１０重量％であり、かつ成分（１）１モルに対して成分（２）の総量が２０〜５０モルであることを特徴とする。
【００２０】
成分（１）
本発明においてペプチドには、例えば、モノペプチド、ジペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド等が含まれる。
【００２１】
また、本発明において、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質を包括的にアミノ酸類と称することもある。また、アミノ酸類には、その他のアミノ化合物も含む。
【００２２】
本発明の組成物に配合する成分（１）のアミノ酸類の分子量は、通常７５〜６８０００、好ましくは７５〜３５０００である。この範囲内であれば、組成物中に還元糖が存在している場合でも、分子量７５０００〜１００００００のタンパク質、例えば、免疫グロブリンの変性を抑制することができる。
【００２３】
本発明において、成分（１）のアミノ酸、ペプチド及びタンパク質は、分子量が上記範囲にあり、かつ分子の一部に遊離のアミノ基を有するものであれば特に限定されないが、例えば、カゼイン；Ｃ−８００（平均分子量３０２３３、アミノ酸数２２８．２の乳タンパク質分解物（森永乳業株式会社製））；ラクトグロブリン、ウシ血清グロブリン等のグロブリン；ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン等のアルブミン；ＣＵ２５００Ａ（平均分子量５５０、アミノ酸数５の乳タンパク質分解物（森永乳業株式会社製））；Ｗ−８００（平均分子量２４３４５、アミノ酸数１８８．８の乳タンパク質分解物（森永乳業株式会社製））；ＣＰＯＰ（平均分子量９６０、アミノ酸数８．７の乳タンパク質分解物（森永乳業株式会社製））等のペプチド及びグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、グルタミン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、システイン、スレオニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン等のアミノ酸やその他のアミノ酸誘導体が含まれる。
【００２４】
これらのアミノ酸類は、一種単独で用いても、複数種類を組み合わせでもよい。
【００２５】
本発明の組成物に含まれる分子量７５〜６８０００アミノ酸類の総数のうち、分子量７５〜３５０００のアミノ酸類の割合は、物質量（モル数）で、好ましくは、９０〜１００％、より好ましくは９５〜１００％である。
【００２６】
成分（２）
本発明組成物中に含まれる成分（２）のタンパク質としては、分子量７５０００〜１００００００のものであれば、特に限定されることなく、公知のタンパク質を広く使用することができる。当該成分（２）のタンパク質の分子量は、好ましくは、１０００００〜１００００００であり、より好ましくは、１３００００〜１００００００であり、さらに好ましくは、１４００００〜２０００００である。このような成分（２）のタンパク質としては、例えば、ラクトフェリン、トランスフェリン、オボトランスフェリン、βコングリシニン、免疫グロブリン等があげられる。免疫グロブリンとしては、ウシ由来のもの、ヒト由来のもの等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２７】
また、本発明の組成物に使用される免疫グロブリンとしては、特に限定されないが、定常領域の構造の違いにより、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥの５つのアイソタイプがあげられ、なかでも、ＩｇＧが好ましい。
【００２８】
これらの成分（２）のタンパク質は、一種単独で用いても、複数種類を組み合わせてもよい。
【００２９】
成分（１）及び（２）を含有する組成物
組成物中の成分（２）のタンパク質の含有量は、通常０．７５〜１０重量％、好ましくは０．７５〜７．５重量％である。例えば、成分（２）のタンパク質としてＩｇＧをこの範囲内で含有する組成物をチュアブル錠やトローチ錠等として摂取した場合、唾液中のＩｇＧ濃度を一定レベル以上に維持することができるためウイルス感染予防の点で好ましい。
【００３０】
本発明の組成物には、成分（２）のタンパク質総量１モルに対して、成分（１）のアミノ酸類の総量が、通常２０〜５０モル、好ましくは３０〜５０モル、より好ましくは４０〜５０モル配合される。この範囲内であれば、組成物中に還元糖が存在している場合でも、成分（２）のタンパク質の変性を抑制することができる。
【００３１】
ここで、本発明組成物中に含まれるアミノ酸類の物質量は、例えば、以下に示すように算出することができる。
【００３２】
分子量７５０００〜１００００００のタンパク質として、例えば、分子量が既知のＩｇＧを用いた場合、ＩｇＧの物質量は、
本発明の組成物中のＩｇＧ重量／ＩｇＧの分子量  ＝  物質量（ｍｏｌ）
により算出することができる。
【００３３】
同様に、分子量が既知のアミノ酸類の物質量は、
本発明の組成物中のアミノ酸類の重量／アミノ酸類の平均分子量  ＝  物質量（ｍｏｌ）
により算出することができる。
【００３４】
また、分子量が未知のアミノ酸類を用いた場合、まず、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の公知の方法により分子量を決定した上で、上記数式により算出することができる。
【００３５】
前述するように、従来のタンパク質含有組成物は、還元糖を配合した場合、分子量７５０００〜１００００００のタンパク質が糖とのメイラード反応により変性し、活性が著しく下がってしまっていた。これに対し、分子量７５０００〜１００００００のタンパク質（成分（２））と分子量７５〜６８０００のアミノ酸類（成分（１））とを上記特定の配合割合で含有する本発明組成物は、成分（２）のタンパク質に由来する活性が高く、且つ還元糖を配合した場合であってもその経時的安定性が高いため、長期にわたって当該活性が維持されるという利点を有する。例えば、成分（２）のタンパク質としてIｇGを含む本発明組成物は、ウイルス感染予防に十分な抗体活性を備え且つ還元糖を配合した場合であってもその経時的安定性が高いため、長期にわたってウイルス感染予防効果が有効に持続するという利点を有する。
【００３６】
従って、好ましい実施形態において、本発明の組成物は、上記成分（１）及び（２）に加えて、非還元糖のみならず還元糖を含有していてもよい。
【００３７】
還元糖としては、例えば、グルコース、エリトロース、リボース、アラビノース、グルコース、マンノース、エリトルロース、フルクトース等の単糖、マルトース、ラクトース等の二糖、ラフィノース等の三糖等が挙げられる。還元糖は、単糖、二糖、三糖等、いずれでもよいが、味の点で優れ、かつ本発明の効果を発揮しやすいことから、好ましくは、単糖または二糖である。
【００３８】
還元糖を含む実施形態において、本発明の組成物中の還元糖の含有量は、通常３〜４０重量％、好ましくは５〜３０重量％である。
【００３９】
還元糖を配合した実施形態においては、本発明の組成物は、人工的でない天然の甘味を呈し、味に優れる。
【００４０】
本発明の組成物は、経口用の組成物として調製されることが望ましい。本発明の組成物は、健康食品（栄養補助食品、特別用途食品、栄養機能食品、特定保健用食品、サプリメント等）、病者用食品等の食品、及び経口医薬品等の医薬品として用いることができる。このような用途に用いるために、本発明の組成物を調製する場合は、継続的な摂取が行いやすいように、例えば顆粒剤（ドライシロップを含む）、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、錠剤（チュアブル剤、トローチ等を含む）、散剤（粉末剤）、丸剤等の各種の固形製剤、または内服用液剤（液剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）等の液状製剤等の形態で調製することが望ましい。なかでもチュアブル剤、トローチ等の錠剤とすることが、本発明の効果を発揮しやすく、かつ成分（２）のタンパク質としてＩｇＧを配合した場合、摂取者の唾液中のＩｇＧ濃度を一定以上に維持することができる点等から好ましい。カプセル剤、錠剤形態の食品または医薬品とする際には、薬学的に許容される公知の担体を用いることができ、医薬や食品（特にサプリメント）の分野で採用されている通常の製剤化手法を適用することができる。例えば、錠剤は、各成分を処方に従って添加配合し、粉砕、造粒、乾燥、整粒および混合を行い、得られた調製混合物を打錠することによって調製することができる。
【００４１】
さらに、必要に応じて、当該分野において通常用いられる製剤化のための添加物、例えば、溶媒、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、流動化剤、希釈剤、分散剤、湿潤剤、保存剤、防腐剤、粘稠剤、ｐＨ調整剤、着色剤、香料、矯味矯臭剤、界面活性剤、溶解補助剤、錠剤用崩壊剤等を配合することができ、また、コーティング剤を用いてコーティング錠剤にすることもできる。ペースト状の膠剤とすることもできる。また、他の形態に調製する場合であっても、従来の方法に従えばよい。さらに、顆粒状、粉末状、液状等の形態の本発明の組成物を、例えば、飲料、菓子類、パン類、スープ類等の各種飲食品；ドッグフード、キャットフード等の各種ペットフード等に添加して各種飲食品として調製することもできる。また、食品用途において、本発明組成物は、上記形態に加えて、グミ、ガム、クッキー、ヨーグルト、クリーム等の形態をとってもよい。これらの食品または医薬品の製造方法は、本発明の効果を損なわないものであれば特に限定されず、各用途で当業者によって使用されている方法に従えばよい。
【００４２】
成分（２）のタンパク質として、ＩｇＧ等の免疫グロブリンを配合した場合、本発明組成物の摂取量としては、通常、一回当り免疫グロブリンが好ましくは７．５〜７０ｍｇの割合で摂取できるような量を挙げることができる。
【００４３】
本発明組成物の製造方法
本発明の組成物は、当該分野において通常用いられる方法により製造することができる。例えば、錠剤形態の組成物の場合、上記の成分（１）のアミノ酸類及び成分（２）のタンパク質、ならびに必要に応じて還元糖、任意成分等を前述の配合割合に従って混合し、打錠することにより製造することができる。
【００４４】
本発明の組成物を調製する際、成分（１）のアミノ酸類及び成分（２）のタンパク質は、含有量及び配合割合が最終的に上記範囲内となるような割合で用いるのであれば、単離精製したものを原料として用いても、これらの成分を含有する組成物を原料として用いてもよい。
【００４５】
生乳には、上記成分（１）のアミノ酸類及び成分（２）のタンパク質が含まれている。従って、生乳を種々の方法にて加工した乳加工物等を、本発明の組成物を調製するための原料組成物として用いることができる。
【００４６】
ここで、乳加工物としては、任意の乳加工物を用いることができ、例えば、脱脂粉乳、濃縮粉乳、全粉乳、ホエーパウダー、濃縮ホエーパウダー等が挙げられる。
【００４７】
乳加工物の原料となる生乳としては、任意の時期に搾乳されたものを用いることができるが、成分（２）のタンパク質としてＩｇＧを用いる場合、分娩後約１０日以内、好ましくは分娩後約７日以内に搾乳された生乳が、ＩｇＧの含有量が高いため好ましい。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例を用いて本願発明の特定の形態について例示する。
【００４９】
実施例
下記の手順に従い、実施例及び比較例の組成物を調製した。
【００５０】
尚、本明細書中において、特に言及しない限り、％は、重量％を意味する。
（混合物の調製及び打錠）
表１〜７に記載の配合に従い各成分を混合した（実施例１〜５８、比較例１〜２２）。尚、表１〜７に記載する成分は全て粉末形態を有している。実施例１〜４４及び比較例１〜２０において、IｇＧとしては、ウシ由来IｇＧ（Ｓｉｇｍａ社、分子量１５万）を用いた。次いで、混合した粉末を１ｇ秤り取り、造粒することなくそのまま打錠した。打錠は、油圧式打錠機（ＲｉｋｅｎＰｏｗｅｒ Ｔｙｐｅ ＳＭＰ-３, ＣＤＭ-４：ＲＩＫＥＮ ＳＥＩＫＩ ＣＯ．ＬＴＤ．）、１５φの臼杵を使用して、圧力（０．１８ｋｇｆ/ｃｍ２）をかけて行った。
【００５１】
各実施例及び比較例の組成物の各成分の含有割合、ＩｇＧ（成分（２））及びアミノ酸類（成分（１））の物質量（いわゆるモル数）、ならびにＩｇＧとアミノ酸類とのモル比を、表１〜７に示す。
【００５２】
【表１】
2008303176.tif 000002
【００５３】
【表２】
2008303176.tif 000003
【００５４】
【表３】
2008303176.tif 000004
【００５５】
【表４】
2008303176.tif 000005
【００５６】
【表５】
2008303176.tif 000006
【００５７】
【表６】
2008303176.tif 000007
【００５８】
【表７】
2008303176.tif 000008
実施例１〜５８、比較例１〜２２において、各組成物に含まれるＩｇＧ及びアミノ酸類の物質量は、平均分子量が既知の成分については、
配合重量／平均分子量  ＝  物質量  （ｍｏｌ）
により算出した。
【００５９】
実施例４５〜５８、比較例２１〜２２において、各組成物に含まれるＩｇＧ及びアミノ酸類の物質量は、分子量が未知の成分については、分子量５０００以上のアミノ酸類については下記（１）の方法、分子量５０００未満のアミノ酸類については下記（２）の方法に従って算出した。
【００６０】
（１）物質量の測定方法  （分子量５０００以上のアミノ酸類）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる定量を行い分子量に合わせてそれぞれのペプチド数を測定した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
アミノ酸類を精製水に溶解し、１ｍｇ／ｍＬに調製した（標品溶液）。
【００６１】
標品溶液について、１μＬをサンプル緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ６．８、３％ＳＤＳ、１０％グリセリン、１０％β−メルカプトエタノール、０．１％OLE_LINK1ＢＰＢ）１０μＬとそれぞれ混合し、１００℃で５分間加熱したOLE_LINK1。これらについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ（４−２０％グラジエントゲル、ＴＥＦＣＯ社）を用いて分子量マーカー（ＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード  Ｂｒｏａｄ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）と共に泳動（１８ｍＡ定電流，泳動緩衝液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、０．１９Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ  ８．３）を行った後、ＣＢＢ染色（ＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｂｌｕｅ  Ｒ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を行った。
【００６２】
ＣＢＢ染色したゲルをＩｍａｇｅＳｃａｎｎｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で取り込み、Ｉｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒ  １Ｄ  Ｅｌｉｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で解析を行った。分子量マーカーの３１ｋＤａのバンド（Ｃａｒｂｏｎｉｃ  Ａｎｈｙｄｒａｓｅ）を１μｇとして各バンドの定量を行った。
【００６３】
上記の試験より、各バンドの分子量ならびに質量を特定し、実施例中ならびに比較例中の各バンドの質量（ｍｇ）を分子量（ｍｇ換算）で割ることにより、ペプチド数を測定する。
【００６４】
（２）物質量の測定方法（分子量５０００未満のアミノ酸類）
下記の手順で、ＨＰＬＣにより平均分子量を測定した。
【００６５】
カラムとしてはＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２５００ＰＷＸＬ  ７．８ｍｍＩＤ.＊３００ｍｍ（東ソー株式会社製） を使用し、移動相としては０．１％トリフルオロ酢酸／ アセトニトリル＝４５／５５を用い、測定温度２５℃、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２１５ｎｍでＨＰＬＣを行った。
【００６６】
標品として、グリシン、チロトピン放出ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、グルカゴン、ミオグロビンを配合した標品を利用した（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  ＴＳＫ−ＧＥＬ：  ＴＯＳＯＨ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔ  ７３ページ：５−５（２）参照）。
【００６７】
標品のピーク面積より、各試料の分子量５０００以下のペプチドについて平均分子量ならびに質量を測定し、質量（ｍｇ）を平均分子量（ｍｇ換算）で割ることにより、ペプチド数を算出した。
【００６８】
試験例１
インフルエンザのHI試験よりインフルエンザウイルスの感染予防効果を奏する最小のＩｇＧ量を評価した。具体的な操作は以下の通りである：
（Ｉ）ＩｇＧの調製
ＩｇＧ試料として、（１）ウシ由来ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社）、（２）牛乳から抽出したＩｇＧ（以下、牛乳ＩｇＧという）、及び（３）ヒトの血液から抽出したＩｇＧ（以下、ヒトＩｇＧという）を用いた。
【００６９】
（１）ウシ由来ＩｇＧについては、Ｃａｔｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ６０μｌとＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ７０μｌにウシ由来ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社）を加え混合したものを試料液として用いた。
【００７０】
（２）牛乳ＩｇＧ及び（３）ヒトＩｇＧについては、ＩｇＧ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ−Ｇ（株式会社同人化学研究所製）を使用して、牛乳（２）または２年以上インフルエンザに罹っていなく、予防接種もしていないヒト血液（３）からＩｇＧを抽出したもの（最終のろ液）を試料液として使用した。
【００７１】
具体的には、牛乳（２）又はヒト血液（３）各５０μｌにＷａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを５０μｌ入れて混合し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ｔｕｂｅに入れ混合し２分間室温においた。８，０００×ｇで３０秒遠心し、Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ２００μｌと混合し、８，０００×ｇで３０秒遠心を３回繰り返した。１．５ｍｌのマイクロチューブにＣａｔｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ６０μｌ加えた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ｔｕｂｅを取り付け、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ７０μｌ加え混合した。８，０００×ｇで３０秒遠心後のろ液を試料液として用いた。尚、Ｃａｔｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ及びＷａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒは、ＩｇＧ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ−Ｇ（株式会社同人化学研究所製）に同包されているものを使用した。
【００７２】
各試料液のＩｇＧ濃度は２８０ｎｍの吸光度から算出した。その結果、各試料液のＩｇＧ濃度は(１)１０２．４μｇ／ｍｌ（２）１０５．６μｇ／ｍｌ（３）１１２μｇ／ｍｌであった。
【００７３】
（ＩＩ）インフルエンザウイルス液の調製
インフルエンザウイルスとしては、発育鶏卵（１１日目）の尿膜腔内にて培養増殖させたインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）を用いた。当該ウイルスサンプルを、ＰＢＳを用いて２倍段階希釈し、種々の濃度のウイルス液を調製した。このように調製した各濃度のウイルス液２５μｌに、ＰＢＳ２５μｌ及び５０μｌの０．５％赤血球ＰＢＳ溶液を加えて混合し、目視により凝集の有無を確認した。
【００７４】
各濃度につき１２回ずつ同じ試験を繰り返し、１２回すべてにおいて赤血球凝集が生じた濃度のうち最小濃度のウイルス液を以下の試験に用いた。
【００７５】
（ＩＩＩ）インフルエンザウイルスの感染予防効果を奏する最小ＩｇＧ量の評価
９６穴プレート各穴にＰＢＳを２５μｌずつ分注した。（Ｉ）で調製したＩｇＧ試料液２５μｌを１列目にいれマイクロピペットで数回吸吐出を行った。１列目の混合液２５μｌを２列目に移し同様の操作を行った。１２列まで同じ操作をし２倍希釈系列を作製した。次に各穴に（ＩＩ）で調製したインフルエンザウイルス液２５μｌずつ分注する。プレートを軽くゆすり混合させ、室温で１時間静置した。その後各穴に0.5％赤血球を50μｌずつ加え、プレートをゆすって混合し、室温で２時間反応させた後、赤血球凝集の有無を目視で確認し、阻害活性を判定した。
【００７６】
阻害活性の判定は、赤血球が凝集した場合（赤血球が全体に広がる）に阻害活性なし、凝集しなかった場合（赤血球が中心に集まる）阻害活性ありとした。
【００７７】
各ＩｇＧについて
阻害活性を示す最小濃度は下記表８の通りであった。
【００７８】
【表８】
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上記の結果から、ＩｇＧ濃度が３．２μｇ／ｍｌ以上であれば、インフルエンザウイルスの感染予防効果が期待できる。
【００７９】
（ＩＶ）本発明の組成物のインフルエンザウイルス感染予防効果の評価
次に、打錠直後の実施例５及び比較例１の錠剤形態の組成物（１．０ｇ）をそれぞれ、１０名のモニターに口で噛み砕いてもらい、噛み砕き直後の唾液中のウシ由来ＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００８０】
サリベット  コットン（ザルスタット株式会社製）中の脱脂綿を口に入れて唾液を吸収させ、唾液を含んだ脱脂綿を回収し、これを２８００ｒｐｍ  ２０分間遠心し、ろ過液中のＩｇＧ量を測定した。
【００８１】
ろ過された唾液をＰＢＳで２０倍に希釈し、Ｂｏｖｉｎｅ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＥＴＨＹＬ社製）とＥＬＩＳＡ  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ（ＢＥＴＨＹＬ社製）を使用して、ダブルサンドイッチELISA法を使いＩｇＧ量を定量した。
【００８２】
上記表８の結果に基づき、唾液中のＩｇＧ量が平均（ｎ＝１０）３．２μｇ／ｍｌ以上を○、平均（ｎ＝１０）３．２μｇ／ｍｌ未満を×として判定した。結果を表９に示す。
【００８３】
【表９】
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ＩｇＧを０．５０重量％含有する比較例１の錠剤を噛み砕いた後の唾液中ＩｇＧ量は、平均２．７８μｇ／ｍｌと低かったのに対して、ＩｇＧを０．７５重量％含有する実施例５を噛み砕いた際の唾液中ＩｇＧ量は、平均４．０７μｇ／ｍｌと高く、インフルエンザウイルス感染予防効果を奏するＩｇＧ最小濃度である３．２μｇ／ｍｌを大きく上回っていた。
【００８４】
試験例２
実施例５及び比較例４の錠剤を各々打錠直後及び４０℃で６ヶ月保存後にモニター１０名に口で噛み砕いてもらい、直後の唾液中ＩｇＧ濃度を、上記試験例１と同様にして、ＥＬＩＳＡ法により測定した。唾液中のＩｇＧ量が３．２μｇ/ml以上を○として判定した。結果を下記の表１０に示す。
【００８５】
【表１０】
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比較例４及び実施例５の錠剤を、打錠直後に噛み砕いた後の唾液中ＩｇＧ量は、それぞれ、平均４．０３及び４．０７と高く、インフルエンザの予防効果を奏するＩｇＧ最小濃度である３．２μｇ／ｍｌを大きく上回っていた。
【００８６】
４０℃６ヶ月保存後の比較例４の錠剤を噛み砕いた後の唾液中ＩｇＧ量は、平均２．６４μｇ／ｍｌと低かったのに対して、実施例５の錠剤を噛み砕いた際の唾液中ＩｇＧ量は、平均３．５４μｇ／ｍｌと高く、依然として、インフルエンザウイルス感染の予防効果を奏するＩｇＧの最小濃度である３．２μｇ／ｍｌを大きく上回っていた。
【００８７】
試験例３
実施例１〜５７、比較例２〜２２において、錠剤中のＩｇＧ量を打錠直後と４０℃６ヶ月保存後で測定した。
【００８８】
尚、錠剤中のＩｇＧ量は、以下の手順で、中圧液体クロマトグラフィー法を用いて測定した。
【００８９】
錠剤を乳鉢ですりつぶした粉末を０．０２Ｍリン酸緩衝液で１００ｍｇ／ｍｌの濃度になるように調整し、０．４５μｍのフィルターでろ過した試料（処理試料）中のＩｇＧ量を測定した。
【００９０】
各処理試料１００μｌを０．０２Ｍリン酸緩衝液で平衡化したＵｌｔｒａｌｉｎｋ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｐｌｕｓカラム（Φ３×１００ｍｍ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）に添加し、平衡化緩衝液１０ｍｌで洗浄した。次いで、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を１ｍｌ／ｍｉｎの流速で流すことによりプロテインＧに結合したＩｇＧを溶出させた。ＩｇＧ量は、既知濃度の牛乳ＩｇＧを用いて作成した標準曲線を用いて、その２２０ｎｍにおける吸光度から算出した。（文献２：脱脂粉乳中のＩｇＧの抗体機能の解明と新規免疫調節機能の探索  平成17年度  脱脂粉乳の新規需要開拓に関する情報収集・研究報告書  発行：社団法人日本酪農乳業協会  ８９−１１５頁（平成１８年６月発行））
ＩｇＧを０．７５％の割合で含む実施例５の錠剤を打錠直後に噛み砕いた際の唾液中ＩｇＧ濃度は、平均４．０７μｇ／ｍｌであった。試験例１にて示すように、インフルエンザウイルスの感染に対する予防効果を期待できる唾液中のＩｇＧの最小濃度が３．２μｇ／ｍｌであった。これらのことから、錠剤中のＩｇＧ濃度が実施例５と同じ０．７５％であるかまたはそれ以上である場合であって、４０℃６ヶ月保存後のＩｇＧ濃度が、打錠直後のＩｇＧ濃度の８０％以上であれば、当該錠剤は、インフルエンザウイルス感染に対する予防効果を示すことが期待できる。従って、ＩｇＧの経時的安定性を、ＩｇＧ残存率から以下のように評価した。
ＩｇＧ残存率
×：８０％未満
○：８０％以上９０％未満
◎：９０％以上
結果を、上記表１〜７に示す。
【００９１】
表１〜７に示すように、比較例２〜２２の錠剤は全て、４０℃６ヶ月保存後、ＩｇＧの残存率が８０％未満であったのに対し、実施例１〜５７の錠剤は、いずれも８０％以上の割合でＩｇＧが残存し、高い経時的安定性を示した。また、実施例１〜７の錠剤において、ＩｇＧの代わりにラクトフェリン、ＩｇＡまたはＩｇＭを使用して同様に調製した錠剤も、同様の結果が得られた。また、試験例１及び２の結果を併せて考慮すると、実施例１〜５７は全て、４０℃６ヶ月の保存後であってもインフルエンザウイルス感染に対する予防効果を期待できる。
【００９２】
試験例４
実施例１〜７と比較例２〜５の味について「天然感のあるおいしい甘さであるか」という質問を２０名に行い、以下の評価の総合点より○以上を合格とした。
（評価）
１．天然感がありおいしい        ５点
２．やや天然感がありおいしい    ４点
３．どちらともいえない          ３点
４．あまり天然感がない          ２点
５．天然感がない                １点
（総合点）
８０点以上 ・・・ ◎
６０点以上 ・・・ ○
４０点以上 ・・・ △
４０点未満 ・・・ ×
結果を表１〜７に示す。
【００９３】
還元糖を配合した組成物は、いずれも自然な甘味を有し、味がよかった。
処方例
表１１〜１８に記載の処方にしたがって、定法どおり組成物を調製した。
【００９４】
【表１１】
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【００９５】
【表１２】
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【００９６】
【表１３】
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【００９７】
【表１４】
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【００９８】
【表１５】
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【００９９】
【表１６】
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【０１００】
【表１７】
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【０１０１】
【表１８】
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