(57)【要約】【課題】  ＰＣＲ等の核酸増幅反応を簡便かつ短時間に行なうための、核酸増幅装置及び核酸増幅容器を提供する。【解決手段】  本発明の核酸増幅装置は、核酸増幅容器１０を搭載するための搭載手段と、上記搭載手段上にそれぞれ異なる温度に調整された複数の加温領域を形成するための、第一の加温手段２とを備える。また、本発明の核酸増幅容器は、基板１４に開口部１１、流路１２及び槽部１３が設けられ、上記開口部１１及び上記槽部１３は上記流路によって連結されており、上記開口部１１は、上記基板１４から突起した筒状構造である。【選択図】  図１
2008200006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅容器を搭載するための搭載手段と、
上記搭載手段上にそれぞれ異なる温度に調整された複数の加温領域を形成するための、第一の加温手段とを備えることを特徴とする核酸増幅装置。
【請求項２】
核酸増幅容器を移動させるための移動手段を備え、
上記移動手段は、核酸増幅容器全体を、上記複数の加温領域のうち、それぞれ異なる温度に調整された少なくとも二つの加温領域によって同時に加温される状態で移動させるものであることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項３】
上記移動手段は、核酸増幅容器を回転させるものであることを特徴とする請求項２に記載の核酸増幅装置。
【請求項４】
上記回転の回転軸は、上記核酸増幅容器に交わることを特徴とする請求項３に記載の核酸増幅装置。
【請求項５】
上記回転軸は、上記核酸増幅容器の中心に交わることを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅装置。
【請求項６】
上記移動手段は、核酸増幅容器を、一定方向に、一定速度で移動させるものであることを特徴とする請求項２に記載の核酸増幅装置。
【請求項７】
上記第一の加温手段は、核酸増幅容器が移動するとき、当該核酸増幅容器の任意の点がそれぞれの上記加温領域を通過する時間と、予め設定された、当該加温領域により加温する時間とが一致するように、それぞれの上記加温領域を形成するものであることを特徴とする請求項６に記載の核酸増幅装置。
【請求項８】
上記移動手段が核酸増幅容器を回転移動させるものであり、
上記第一の加温手段は、上記回転の回転軸と上記搭載手段とが交わる点から放射状に広がる形状になるように、上記加温領域を形成するものであることを特徴とする請求項７に記載の核酸増幅装置。
【請求項９】
上記搭載手段上に核酸増幅容器を搭載した際に、二つの加温手段により当該核酸増幅容器を挟むように、上記搭載手段の上方に第二の加温手段を備えることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項１０】
上記第一の加温手段及び第二の加温手段は、それぞれ、互いに重畳する領域が同じ温度に調整された加温領域を形成するものであることを特徴とする請求項９に記載の核酸増幅装置。
【請求項１１】
上記核酸増幅容器が、基板に開口部、流路及び槽部が設けられ、上記開口部及び上記槽部は上記流路によって連結されており、上記開口部は、上記基板から突起した筒状構造であるとき、
上記開口部から注入された核酸増幅反応液を、上記流路を介して上記槽部内に移動させる外力を付加する外力付加手段を備えることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項１２】
上記外力付加手段は、上記槽部より上記開口部に近い点で、上記基板と交差する直線を回転軸として上記核酸増幅容器を回転させるものであることを特徴とする請求項１１に記載の核酸増幅装置。
【請求項１３】
核酸増幅容器を移動させるための移動手段を備え、上記移動手段は、当該核酸増幅容器全体を、上記複数の加温領域のうち、互いに異なる温度に調整された少なくとも二つの加温領域によって同時に加温される状態で、当該核酸増幅容器を回転させるものであり、
上記移動手段と上記外力付加手段とが同一部材で構成されていることを特徴とする請求項１２に記載の核酸増幅装置。
【請求項１４】
上記搭載領域に窓部が設けられており、
上記窓部から発せられる光を検出する光検出手段をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項１５】
基板に開口部、流路及び槽部が設けられ、
上記開口部及び上記槽部は上記流路によって連結されており、
上記開口部は、上記基板から突起した筒状構造であることを特徴とする核酸増幅容器。
【請求項１６】
上記基板は円盤状であり、上記開口部は上記槽部より上記基板の中心に近い位置に設けられていることを特徴とする請求項１５に記載の核酸増幅容器。
【請求項１７】
上記基板は、上記槽部内から発せられる光を透過する光透過部を備えていることを特徴とする請求項１５に記載の核酸増幅容器。
【請求項１８】
核酸増幅容器に核酸増幅反応液を充填する充填工程及び、
充填された上記核酸増幅反応液の温度を調整する温度調整工程を含み、
上記温度調整工程は、当該核酸増幅容器全体を、それぞれ異なる温度に調整された複数の加温領域によって同時に加温される状態で、上記核酸増幅容器を移動させる工程を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項１９】
上記核酸増幅容器として、基板に開口部、流路及び槽部が設けられ、上記開口部及び上記槽部は上記流路によって連結されており、上記開口部は、上記基板から突起した筒状構造である核酸増幅容器を用い、
上記充填工程は、上記開口部から注入された核酸増幅反応液に対して外力を付加して、上記槽部内に移動させる工程を含むことを特徴とする請求項１８に記載の核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅装置、核酸増幅容器及び核酸増幅方法に関するものである。さらに詳しくは、核酸増幅反応液に対する温度の調整効率を向上させ、さらに試料の注入を容易とした核酸増幅装置、核酸増幅容器及び核酸増幅方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）等の核酸増幅反応はバイオテクノロジーにおける様々な分野で応用されている。例えば、医学分野では、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列に基づいた診断が注目を集めており、農業分野では遺伝子組み換え作物の判定等でＤＮＡ鑑定が活用されている。
【０００３】
ＰＣＲは、一般に、二本鎖ＤＮＡの解離反応（以下、単に「解離反応」と表記する。）、解離して生じた一本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング反応（以下、単に「アニーリング反応」と表記する。）、アニーリングした一本鎖ＤＮＡとプライマーとの二本鎖ＤＮＡの伸長反応（以下、単に「伸長反応」と表記する。）を繰り返すことにより行なう。具体的には、従来、ＰＣＲ反応液を個々のマイクロチューブに入れて、昇温又は冷却を繰り返すことで、上記各反応に必要な反応温度に調整する方法が主に用いられてきた。
【０００４】
しかし、ＰＣＲを行なうためには、この温度の調整の繰り返しや、微小な量のサンプルを扱うこと等により、煩雑な作業や多大な時間を要する。例えば、上述のマイクロチューブを用いる方法では、マイクロチューブを加温する部材自体の温度の調整に時間を要する。そのため、上記温度の調整の繰り返しを行なうために、約２〜３時間を要する。
【０００５】
そこで、近年、より簡便かつ短時間にＰＣＲを行なうための技術が提案されている（特許文献１〜３）。
【０００６】
特許文献１には、予め、上述の解離反応等の各反応温度に調整することが可能な、複数のヒートブロックを備えた装置が開示されている。特許文献２には、当該装置に用いるための核酸増幅基板が開示されており、当該核酸増幅基板にはＰＣＲを行なうときにＰＣＲ反応液が充填される反応液溜部が形成されている。そして、特許文献１及び２では、当該反応液溜部にＰＣＲ反応液を充填した上記核酸増幅基板を、上記ヒートブロックに順次接触させることでＰＣＲが行なう技術が開示されている。これにより、上述のような、マイクロチューブを加温する部材の温度の調整に時間を要するという問題が生じないとされている。
【０００７】
特許文献３には、ＤＮＡサンプルの調整から、ＰＣＲまでを一つの微量システムプラットホームで行なう技術が開示されている。上記微量システムプラットホームには、ＤＮＡを抽出するための試料及び試薬を注入又は混合するための、ポート、流路、チャンバ等が形成されている。そして、上記微量システムプラットホームを回転させた遠心力によって上記試料及び試薬が流路やチャンバ内を移動することにより、ＤＮＡが抽出される。さらに、上記微量システムプラットホームはヒーターを備えており、抽出されたＤＮＡサンプル及びＰＣＲ試薬を、上記微量システムプラットホーム内のチャンバで混合した上で、当該ヒーターによってＰＣＲを行なうことができる。そのため、ＰＣＲを行なうために必要なＤＮＡ抽出等の作業を簡略化することができ、ＰＣＲを短時間で行なうことができるとされている。
【特許文献１】特開２００６−１１５７４２号公報（２００６年５月１１日公開）
【特許文献２】特開２００６−１１５７４１号公報（２００６年５月１１日公開）
【特許文献３】特表２００３−５０２６５６号公報（２００３年１月２１日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１〜３に開示の装置等では、ＰＣＲ反応液の温度の調整に長時間を要し、作業が簡便でないという問題を有する。
【０００９】
特許文献１及び２に開示の装置等では、核酸増幅基板を一つのヒートブロックのみに接触させて、それぞれの反応温度に調整する工程を繰り返す必要がある。
【００１０】
これでは、反応液溜部の周囲には、各反応で接触しているヒートブロックの温度を有する領域が広く形成される。そのため、次のヒートブロックに当該核酸増幅基板を接触させても、核酸増幅基板上の前回接触していたヒートブロックの温度の影響を受けることによって、反応液溜部内の温度調整に長時間を要することとなる。
【００１１】
例えば、まず、９５℃のヒートブロックに核酸増幅基板を接触させて解離反応を行ない、次に、アニーリング反応のために６５℃のヒートブロックに核酸増幅基板を接触させたとする。当該解離反応時では、反応液溜部のみならず、その周辺にも９５℃又はその近辺の温度を有する領域が広く形成される。そのため、当該アニーリング反応時においても、この領域の影響によって、反応液貯留部が６５℃になるまでに長時間を要する。つまり、反応液貯留部がこの影響を受けなくなるように、反応液溜部の周囲を冷却するために長時間を要する。
【００１２】
特許文献３に開示の微量システムプラットホームでは、ヒーター自体の温度の調整に長時間を要するため、ＰＣＲ反応液の温度の調整には長時間を要する。
【００１３】
このように、核酸増幅反応に用いる容器を、それぞれの反応温度に調整されたヒートブロックのみに接触させたり、一つのヒーター上で当該ヒーターの温度を変化させたりすることにより温度調整を行なうと、温度調整に多大な時間を要する。
【００１４】
また、特許文献１〜３に開示の核酸増幅基板等では、微量の反応液を用いる。しかし、微量の反応液の注入には、精密な作業が要求される。そのため作業効率を向上させることができない。そして、特許文献１〜３には、このような問題は一切記載されておらず、よって、微量の反応液を簡易に注入するための技術も一切開示されていない。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を簡便かつ短時間に行なうための、核酸増幅装置、核酸増幅容器及び核酸増幅方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に係る核酸増幅装置は、上記課題を解決するために、核酸増幅容器を搭載するための搭載手段と、上記搭載手段上にそれぞれ異なる温度に調整された複数の加温領域を形成するための第一の加温手段とを備えることを特徴としている。
【００１７】
上記の構成によれば、上記搭載手段上に、それぞれ異なる温度に調整された複数の加温領域を形成することができる。例えば、解離反応やアニーリング反応等のための反応温度に調整された、複数の加温領域を一つの搭載手段上に形成することができる。
【００１８】
そして、上記搭載手段には、核酸増幅容器を、当該核酸増幅容器全体を複数の加温領域で同時に加温する状態で搭載することができる。これにより、当該状態を維持したまま、核酸増幅容器中の核酸増幅反応液を貯留した部位を、順次それぞれの上記加温領域中に配置することができる。つまり、異なる温度に調整された少なくとも二つの加温領域によって核酸増幅容器全体を加温する状態を維持しながら、核酸増幅反応液をそれぞれの上記加温領域で順次加温させることで、解離反応からアニーリング反応等のように、順次反応を移行させることができる。
【００１９】
これにより、核酸増幅反応液の加温効率を向上させることができる。
【００２０】
この理由を、９５℃の解離反応の後、６５℃に冷却してアニーリング反応及び伸長反応を行ない、核酸増幅容器全体を９５℃の加温領域及び６５℃の加温領域によって同時に加温する場合を例にして説明する。
【００２１】
まず、解離反応時、核酸増幅反応液を貯留した部位及びその周囲は９５℃に加温される。上記の構成によれば、核酸増幅容器には６５℃で加温されている領域も存在する。そのため、当該核酸増幅容器を９５℃のみで加温する場合に比べて、核酸増幅反応液を貯留した部位周囲に形成される９５℃の領域は少なくなる。つまり、当該核酸増幅容器上には６５℃又はこれに近い温度の領域が増える。これにより、アニーリング反応時には、冷却すべき領域も狭く、また、冷却のために吸収すべき熱量も低減できる。そのため迅速に核酸増幅反応液を６５℃に調整することができる。
【００２２】
このように、核酸増幅容器全体を、複数の加温領域で加温する状態を維持することで、次の反応のために核酸増幅反応液を加温するとき、前回核酸増幅反応液に加温した温度による影響を抑えることができる。これにより、核酸増幅反応液の温度調整に必要な熱量を少なくすることができ、迅速に温度調整を行なうことができる。
【００２３】
よって、核酸増幅を迅速に行なうことが可能な核酸増幅装置を提供することができる。
【００２４】
本発明に係る核酸増幅装置では、核酸増幅容器を移動させるための移動手段を備え、上記移動手段は、核酸増幅容器全体を、上記複数の加温領域のうち、それぞれ異なる温度に調整された少なくとも二つの加温領域によって同時に加温される状態で移動させるものであること好ましい。
【００２５】
上記の構成によれば、上述した、異なる温度に調整された少なくとも二つの加温領域によって核酸増幅容器全体を加温しながら、核酸増幅反応液をそれぞれの上記加温領域で順次加温するように核酸増幅容器を移動させるという作業を、手動ではなく、上記移動手段によって行なうことができる。
【００２６】
つまり、上記移動手段を備えることによって、より簡便かつ高効率に核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅装置を提供することができる。
【００２７】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記移動手段は、核酸増幅容器を回転させるものであることがより好ましい。
【００２８】
核酸増幅容器を回転させるための機構は、回転以外の移動をさせるものに比べて、核酸増幅装置を小型化及び簡略化することができる。例えば、直線的に移動させる部材を設ける場合、核酸増幅容器を支持する部品や、駆動させるため部品に加えて、移動の方向を定めるためのレール等がさらに必要となる。しかし、核酸増幅容器を回転させる部材は、当該核酸増幅容器を支持して回転させるだけでよいため、簡易な部品等により実現できる。よって、より簡易な構造を有する核酸増幅装置を提供することができる。
【００２９】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記回転の回転軸は、上記核酸増幅容器に交わることがより好ましい。
【００３０】
上記核酸増幅容器を通る直線を回転軸とすることで、核酸増幅容器から離れた直線を回転軸とする場合に比べて、回転させるために必要なスペースを省スペースにすることができる。よって、装置を小型化することができる。なお、核酸増幅容器に貫通孔が形成されている場合、上記回転軸が当該貫通孔の開口面に交わる場合も、本発明に含まれる。
【００３１】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記回転軸は、上記核酸増幅容器の中心に交わることがより好ましい。
【００３２】
上記回転軸が、上記核酸増幅容器の中心を通ることで、当該核酸増幅容器を回転させるために必要なスペースをさらに省スペースにすることができる。
【００３３】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記移動手段は、核酸増幅容器を、一定方向に、一定速度で移動させるものであることがより好ましい。
【００３４】
上記核酸増幅容器の移動の速度や方向を変化させる場合、複雑な機構や当該移動を制御するための手段が必要になるが、一定方向に、一定速度で移動させるための機構は、簡易なものでよい。よって、さらに簡易な構造を有する核酸増幅装置を提供することができる。
【００３５】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記第一の加温手段は、核酸増幅容器が移動するとき、当該核酸増幅容器の任意の点がそれぞれの上記加温領域を通過する時間と、予め設定された、当該加温領域により加温する時間とが一致するように、それぞれの上記加温領域を形成するものであることがより好ましい。
【００３６】
上記核酸増幅容器は一定の速度及び一定の方向に移動する。そこで、上記第一の加温手段によって、上記のように加温領域を形成することで、核酸増幅容器の任意の点、例えば核酸増幅反応液が充填された部位が、予め所望の核酸増幅反応条件に基づいて設定したそれぞれの加温領域で加温する時間で、当該加温領域を通過する。これにより、核酸増幅反応液に対して、所望の時間、所望の温度を加えることができる。よって、より様々な条件で核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅装置を提供することができる。
【００３７】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記移動手段が核酸増幅容器を回転移動させるものであり、上記第一の加温手段は、上記回転の回転軸と上記搭載手段とが交わる点から放射状に広がる形状になるように、上記加温領域を形成するものであることがより好ましい。
【００３８】
上記放射状に広がる形状は、回転の回転軸が上記搭載手段に交わる点を中心とした、二本の線分で加温領域の形状が規定される。そして、二本の線分により形成される角度は、それぞれの加温領域で加温する時間に比例している。そのため、当該回転軸を中心に核酸増幅容器を一定の回転速度で一定の回転方向に回転させるだけで、核酸増幅反応液に対して、所望の時間、所望の温度を加えることが可能となる。よって、様々な条件を核酸増幅反応を、より小型化した装置で行なうことができる。
【００３９】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記搭載手段上に核酸増幅容器を搭載した際に、二つの加温手段により当該核酸増幅容器を挟むように、上記搭載手段の上方に第二の加温手段を備えることがより好ましい。
【００４０】
上記第二の加温手段によって、核酸増幅容器を二方向から加温することができるため、核酸増幅容器の温度調整に要する時間を短縮することができる。よって、さらに迅速に核酸増幅反応を行なうことができる。
【００４１】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記第一の加温手段及び第二の加温手段は、それぞれ、互いに重畳する領域が同じ温度に調整された加温領域を形成するものであることがより好ましい。
【００４２】
上記第一の加温手段及び第二の加温手段の互いに重畳する領域に、同じ温度に調整された加温領域を形成することで、核酸増幅容器を、二方向から同じ温度で加温することができる。これにより、核酸増幅反応液の温度調整に要する時間をさらに短縮することができる。よって、さらに迅速に核酸増幅反応を行なうことができる。
【００４３】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記核酸増幅容器が、基板に開口部、流路及び槽部が設けられ、上記開口部及び上記槽部は上記流路によって連結されており、上記開口部は、上記基板から突起した筒状構造であるとき、上記開口部から注入された核酸増幅反応液を、上記流路を介して上記槽部内に移動させる外力を付加する外力付加手段を備えることがより好ましい。
【００４４】
上記開口部は、核酸増幅反応液を注入しやすい形状を有している。つまり、上記開口部は筒状であるので、その内壁によって、核酸増幅反応液が漏れること等を防ぐことができ、ピペット等の微細な分注管を用いても照準を定めやすい。
【００４５】
そして、上記外力付加手段によって、上記開口部に注入された核酸増幅反応液に外力を付加することで、当該核酸増幅反応液を容易に上記槽部に充填することができる。例えば、核酸増幅反応液に対する熱伝導率を向上させるためには、核酸増幅反応液を充填する槽部を扁平形状等にして、充填された核酸増幅反応液と加温領域とが重畳する領域の面積を増やすことが好ましい。そして、上記の構成によれば、このような扁平形状の槽部であっても、容易に充填することができる。よって、簡便かつ高効率に核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅装置を提供することができる。
【００４６】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記外力付加手段は、上記槽部より上記開口部に近い点で、上記基板と交差する直線を回転軸として上記核酸増幅容器を回転させるものであることがより好ましい。
【００４７】
上記回転軸で上記核酸増幅容器を回転させると、遠心力によって、上記開口部から上記槽部の方向に外力が生じる。そのため、上記核酸増幅容器を回転させるだけで、上記開口部に注入された核酸増幅反応液に当該外力を付加して、上記槽部に核酸増幅反応液を充填することができる。よって、さらに簡便かつ高効率に核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅装置を提供することができる。
【００４８】
本発明に係る核酸増幅装置では、核酸増幅容器を移動させるための移動手段を備え、上記移動手段は、当該核酸増幅容器全体を、上記複数の加温領域のうち、互いに異なる温度に調整された少なくとも二つの加温領域によって同時に加温される状態で、当該核酸増幅容器を回転させるものであり、上記移動手段と上記外力付加手段とが同一部材で構成されていることがより好ましい。
【００４９】
上記移動手段と上記外力付加手段とを同一の部材で構成することで、同一の直線を回転軸によって、上述した上記槽部への核酸増幅反応液の充填及び上記加温領域による核酸増幅反応液の温度調整を行なうことができる。これにより、上記槽部への核酸増幅反応液の充填を行なった後、核酸増幅反応液の温度調整を行なう際に、上記移動手段と上記外力付加手段とを切り替える必要がないので、より簡便かつ迅速に核酸増幅反応を行なうことができる。また、核酸増幅装置の部品数を削減することができる。よって、さらに迅速かつ簡便に核酸増幅反応を行なうことが可能であり、構造が簡略化された核酸増幅装置を提供することができる。
【００５０】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記搭載領域に窓部が設けられており、上記窓部から発せられる光を検出する光検出手段をさらに備えることがより好ましい。
【００５１】
核酸増幅反応液として、核酸の増幅に応じて発せられる蛍光等の光が変化するものを用いた場合、上記窓部を介して、上記光検出手段によって当該光を検出して解析することで、リアルタイムに核酸増幅反応の進行状況等を判断することができる。よって、核酸増幅反応の結果を確認する作業を簡便に行なうことが可能な核酸増幅装置を提供することができる。
【００５２】
本発明に係る核酸増幅容器は、上記課題を解決するために、基板に開口部、流路及び槽部が設けられ、上記開口部及び上記槽部は上記流路によって連結されており、上記開口部は、上記基板から突起した筒状構造であることを特徴としている。
【００５３】
上記の構成によれば、上記開口部は、核酸増幅反応液を注入しやすい形状を有している。つまり、上記開口部は筒状であるので、その内壁によって、核酸増幅反応液が漏れること等を防ぐことができる。
【００５４】
さらに、上記開口部に注入された核酸増幅反応液に、遠心力や圧力等の外力を付加することで、当該核酸増幅反応液を、容易に上記槽部に充填することができる。一般に、核酸増幅反応液に対する熱伝導率を向上させるためには、核酸増幅反応液を充填する槽部を扁平状構造等にして、充填された核酸増幅反応液と加温領域とが重畳する領域の面積を増やすことが好ましい。そして、上記の構成によれば、このような扁平状構造の槽部であっても、容易に充填することができる。
【００５５】
つまり、核酸増幅反応液を注入しやすい形状の開口部に、核酸増幅反応液を注入して、当該核酸増幅反応液に外力を付加するだけで、核酸増幅反応液を注入し難い形状の槽部であっても簡便に核酸増幅反応液を充填することができる。
【００５６】
よって、簡便かつ高効率に核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅容器を提供することができる。
【００５７】
本発明に係る核酸増幅容器では上記基板は円盤状であり、上記開口部は上記槽部より上記基板の中心に近い位置に設けられていることがより好ましい。
【００５８】
上記基板の中心を通り、上記基板に交差する直線を回転軸として回転させることで、上記開口部に注入された核酸増幅反応液には、上記槽部に向かう遠心力が付加される。また、上記基板は円盤状であるため、当該回転軸により回転させても、核酸増幅容器全体の位置は移動しない。そのため、上記の構成を有する核酸増幅容器を用いるための核酸増幅装置を製造する場合、当該核酸増幅装置を小型化することができる。
【００５９】
また、円盤状であれば、上記槽部より上記開口部のほうが基板の中心に近くなるような、上記開口部、流路及び槽部の組み合わせを、円盤の中心から流路を放射状に形成することで、より多く形成することができる。よって、一度に大量の核酸増幅を行なうことが可能な核酸増幅容器を提供することができる。
【００６０】
本発明に係る核酸増幅容器では、上記基板は、上記槽部内から発せられる光を透過する光透過部を備えていることがより好ましい。
【００６１】
核酸増幅反応液として、核酸の増幅に応じて発せられる蛍光等の光が変化するものを用いた場合、上記窓部を介して、上記光検出手段によって当該光を検出して解析することで、リアルタイムに核酸増幅反応の進行状況等を判断することができる。よって、核酸増幅反応の結果を確認する作業を簡便に行なうことが可能な核酸増幅容器を提供することができる。
【００６２】
本発明に係る核酸増幅方法は、上記課題を解決するために、核酸増幅容器に核酸増幅反応液を充填する充填工程及び、充填された上記核酸増幅反応液の温度を調整する温度調整工程を含み、上記温度調整工程は、当該核酸増幅容器全体を、それぞれ異なる温度に調整された複数の加温領域によって同時に加温される状態で、上記核酸増幅容器を移動させる工程を含むことを特徴としている。
【００６３】
上記の構成によれば、核酸増幅容器全体を複数の加温領域で同時に加温する状態を維持したまま、核酸増幅容器中の核酸増幅反応液を貯留した部位を、順次それぞれの上記加温領域中に配置することができる。つまり、異なる温度に調整された少なくとも二つの加温領域によって核酸増幅容器全体を加温する状態を維持しながら、核酸増幅反応液をそれぞれの上記加温領域で順次加温させて、解離反応からアニーリング反応にというように、次の反応に移行させることができる。
【００６４】
そのため、次の反応のために核酸増幅反応液を加温するとき、前回核酸増幅反応液に加温した温度による影響を抑えることができる。これにより、核酸増幅反応液の温度調整に必要な熱量を少なくすることができ、迅速に温度調整を行なうことができる。
【００６５】
よって、核酸増幅を迅速に行なうことができる。
【００６６】
本発明に係る核酸増幅方法では、上記核酸増幅容器として、基板に開口部、流路及び槽部が設けられ、上記開口部及び上記槽部は上記流路によって連結されており、上記開口部は、上記基板から突起した筒状構造である核酸増幅容器を用い、上記充填工程は、上記開口部から注入された核酸増幅反応液に対して外力を付加して、上記槽部内に移動させる工程を含むことがより好ましい。
【００６７】
上記の構成によれば、上記開口部は、核酸増幅反応液を注入しやすい形状を有している。つまり、上記開口部は筒状であるので、その内壁によって、核酸増幅反応液が漏れること等を防ぐことができ、ピペット等の微細な分注管を用いても照準を定めやすい。
【００６８】
さらに、上記開口部に注入された核酸増幅反応液に、遠心力や圧力等の外力を付加することで、当該核酸増幅反応液を、容易に上記槽部に充填することができる。
【００６９】
つまり、核酸増幅反応液を注入しやすい形状の開口部に、核酸増幅反応液を注入して、当該核酸増幅反応液に外力を付加するだけで、核酸増幅反応液を注入し難い形状の槽部であっても簡便に核酸増幅反応液を充填することができる。
【００７０】
よって、より簡便に核酸増幅を行なうことができる。
【発明の効果】
【００７１】
本発明に係る核酸増幅装置は、以上のように、核酸増幅容器を搭載するための搭載手段と、上記搭載手段上にそれぞれ異なる温度に調整された複数の加温領域を形成するための、第一の加温手段とを備える。そのため、核酸増幅反応液を加温するとき、前回加温した温度による影響を抑えることができる。これにより、核酸増幅反応液の温度調整に必要な熱量を少なくすることができ、迅速に温度調整を行なうことができる。よって、核酸増幅を迅速に行なうことが可能な核酸増幅装置を提供することができるという効果を奏する。
【００７２】
また、本発明に係る核酸増幅容器は、以上のように、基板に開口部、流路及び槽部が設けられ、上記開口部及び上記槽部は上記流路によって連結されており、上記開口部は、上記基板から突起した筒状構造である。そのため、核酸増幅反応液を注入しやすい形状である筒状の開口部に、核酸増幅反応液を注入して、当該核酸増幅反応液に外力を付加するだけで、核酸増幅反応液を注入し難い形状の槽部であっても簡便に核酸増幅反応液を充填することができる。よって、簡便かつ高効率に核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅容器を提供することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７３】
〔実施の形態１〕
本発明に係る核酸増幅装置の一実施形態について図１〜３に基づいて説明すると以下の通りである。
【００７４】
（ＰＣＲ装置１の構成）
まず、図１を用いて本実施の形態に係るＰＣＲ装置１（核酸増幅装置）の概略構成について説明する。図１は、本実施の形態に係るＰＣＲ装置１の概略構成を示す図であり、ＰＣＲ装置１に搭載されたＰＣＲ用ディスク１０（核酸増幅容器）をも示している。
【００７５】
図１に示すように核酸増幅装置１は、ヒートブロック２（搭載手段、第一の加温手段）、ヒートブロック３（第二の加温手段）、ディスク駆動部４（移動手段）、蛍光検出部６（光検出手段）、分注アーム７、試料容器１５を備えている。
【００７６】
ヒートブロック２は、ディスク駆動部４上に設けられている。ヒートブロック２上には、後述するＰＣＲ用ディスク１０を搭載することができる。つまり、本実施の形態では、本発明に係る核酸増幅装置が備える搭載手段及び第一の加温手段が同一部材であるヒートブロック２で構成されている場合について説明するが、これに限定されるものではない。例えば、熱伝導性の高い材質で形成された基板を上記搭載手段とし、当該基板の下に電熱線等によって構成した第一の加温手段を配置した構造によっても、上記基板上に加温領域を形成することができる。
【００７７】
ヒートブロック３は、ヒートブロック２と共に、ＰＣＲ用ディスク１０を上下から挟むことが可能なように設けられている。
【００７８】
ヒートブロック２、３には蛍光透過部９ａ、９ｂが形成されている。ヒートブロック２、３のより詳細な構造等については後述する。
【００７９】
ディスク駆動部４上には回転部５が設けられている。ディスク駆動部４は、ＰＣＲ用ディスク１０を、図１に示す直線Ａを回転軸として、矢印ａ方向に一定の回転速度で回転させることができる。また、回転部５は、ＰＣＲ用ディスク１０の中心に設けられた穴に嵌合することができる。これにより、ＰＣＲ用ディスク１０を回転させることができる。
【００８０】
蛍光検出部６は、蛍光透過部９ａ、９ｂを挟むように備えられている。蛍光検出部６は、蛍光透過部９ａ、９ｂを介して反応液貯留部１３から発せられる蛍光を受光して、その照度等を算出することができる。
【００８１】
分注アーム７は、分注管８を備えている。分注アーム７は矢印Ｂ２方向に回動可能であり、分注管８は図１に示す矢印Ｂ１方向に伸縮可能である。分注アーム７の回動及び分注管８の伸長の動作は、予め設定可能であり、設定に応じて自動的に、試料容器１５に予め格納された所定の試薬及び／又はサンプルを、ＰＣＲ用ディスク１０上の反応液注入部１１に注入することができる。なお、本発明に係る核酸増幅装置は、分注アーム７や試料容器１５を備える構成に限定されるものではない。例えば、別途、人手によって、所望の試薬、サンプル等をＰＣＲ用ディスク１０に注入してもよく、従来公知のオートサンプラー等を外付けしてもよい。
【００８２】
（ヒートブロック２、３の構成）
次に、ヒートブロック２、３の構成について、図１及び２を用いてより詳細に説明する。図２は、ヒートブロック２、３の構成を模式的に示す図であり、搭載するＰＣＲ用ディスク１０をも示している。
【００８３】
図２に示すように、ヒートブロック２には、加温部２ａ、２ｂが形成されており、ヒートブロック３には加温部３ａ、３ｂが形成されている。加温部２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂはそれぞれ独立して温度調整することが可能である。そして、それぞれ温度調整された各加温部によって、加温領域が形成される。図２では、加温部２ａ及び３ａの温度は６５℃に、加温部２ｂ及び３ｂの温度は９５℃に設定されている状態を示している。これはＰＣＲ装置１によってシャトルＰＣＲを行なう場合を想定して設定したものである。つまり、２本鎖ＤＮＡの解離反応の温度を９５℃として、アニーリング反応の温度及び伸長反応の温度を６５℃として設定したものである。なお、加温部２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂの温度は、所望の核酸増幅反応の条件等に応じて、変更することができる。例えば、ホットスタートＰＣＲを行なう場合、最初に加温部２ａ及び３ａの温度を９５℃としてＰＣＲを開始した後、所望の時間を経過した後、６５℃となるように調整すればよい。
【００８４】
加温部２ａと加温部３ａとは重畳するように形成されている。同様に、加温部２ｂと加温部３ｂとは重畳するように形成されている。これは、それぞれ重畳する加温部同士を同じ温度に調整して、当該加温部同士でＰＣＲ用ディスク１０を上下から挟むことで、ＰＣＲ反応液に対して、より正確かつ迅速に所定の反応温度を与えるためである。これにより、加温部２ａ及び３ａによって６５℃の加温領域が形成され、加温部２ｂ及び３ｂによって９５℃の加温領域が形成される。
【００８５】
加温部２ａ、２ｂは、図１に示す点ａ’から放射状に広がる形状を有している。点ａ’は、直線Ａと、ＰＣＲ用ディスク１０を搭載するヒートブロック２上の面とが交わる点である。
【００８６】
加温部２ａ、２ｂは、それぞれ形状を変更することができる。加温部３ａ、３ｂは、それぞれ加温部２ａ、２ｂに重畳するように形成される。
【００８７】
具体的には、一定の回転速度で移動するＰＣＲ用ディスク１０の任意の点が、それぞれの加温部によって形成される加温領域を通過する時間と、予め設定された、当該加温領域により加温する時間とが一致するように、加温部２ａ、２ｂは形成される。予め設定された、当該加温領域により加温する時間とは、核酸増幅反応液を各加温領域で加温する時間であり、解離反応、アニーリング反応、伸長反応等を行なう所望の反応時間である。
【００８８】
このように形成された加温部２ａ、２ｂの形状は、点ａ’からヒートブロック２の外縁に向けて伸びる線分Ｌ１及びＬ２によって規定され、線分Ｌ１、Ｌ２及びヒートブロック２の外縁によってそれぞれの形状が形成される。換言すれば、上述の任意の点が加温領域を通過する時間と、上記所望の反応時間とが一致するように、線分Ｌ１、Ｌ２の位置を算出して加温部２ａ、２ｂを形成する。さらに、線分Ｌ１、Ｌ２にそれぞれ平行な、ヒートブロック３上の線分Ｌ３、Ｌ４の位置を算出して、３ａ、３ｂを形成する。これにより、核酸増幅反応液に対して、所望の時間だけ加温することが可能な加温領域を形成することができる。
【００８９】
線分Ｌ１〜Ｌ４を算出する方法は特に限定されるものではない。例えば、線分Ｌ１と線分Ｌ２とが形成する角度である、θ１と３６０−θ１との比が、解離反応時間と、アニーリング反応時間及び伸長反応時間との比となるように算出すればよい。また、本発明に係る核酸増幅装置は、このような算出が可能な制御手段をさらに設けてもよい。なお、上記任意の点として、例えば、ＰＣＲ用ディスク１０のＰＣＲ反応液が貯留された部位を基準にして上記算出を行なえばよい。本実施の形態に係るＰＣＲ装置１では、後述する実施例に用いるためにθ１を９０度となるように形成している。
【００９０】
ヒートブロック２及び３上には、所望のＰＣＲ条件に応じて、所望の数の加温部を、所望の形状で形成することができる。例えば、ヒートブロック２、３上をそれぞれ点ａ’から放射状に伸びる４本の線分で４分割して、９５℃の加温領域及び６５℃の加温領域を２ヶ所ずつ形成して、ＰＣＲ用ディスクが１周する間に、９５℃、６５℃、９５℃、６５℃と交互に加温される形状にしてもよい。このように互いに異なる温度に調整された複数の加温領域が、複数組形成される構成も、本発明に係る核酸増幅装置の範囲に含まれる。また、アニーリング反応と伸長反応とを異なる温度で行なう場合、ヒートブロック２、３上に、それぞれ加温部を３箇所ずつ形成すればよい。
【００９１】
ヒートブロック２、３の中心部には穴が形成されている。これは回転部５を貫通させるためである。また、ヒートブロック３に形成されている穴は、ＰＣＲ装置１がＰＣＲ用ディスク１０を搭載したとき、図１に示すように、反応液注入部１１をヒートブロック３より上に突出させるためである。
【００９２】
また、ヒートブロック２、３には、それぞれ、ＰＣＲ用ディスク１０に形成された反応液貯留部１３から発せられる蛍光を検出するための蛍光透過部９ａ、９ｂ（窓部）が形成されている。
【００９３】
（本発明に係る核酸増幅容器）
次に、図３を用いて本発明に係る核酸増幅容器の一実施態様について説明する。図３は、本実施の形態に係るＰＣＲ用ディスク１０の構造を模式的に示す図であり、（ａ）は平面図であり（ｂ）は斜視図である。
【００９４】
図３（ａ）及び（ｂ）に示すように、ＰＣＲ用ディスク１０は、反応液注入部１１（開口部）、流路１２、反応液貯留部１３（槽部）、基板１４から形成されている。
【００９５】
また、図３（ａ）に示すように、基板１４上には、反応液注入部１１、流路１２、反応液貯留部１３が、複数個ずつ形成されている。なお、説明の便宜上、図３（ｂ）には、反応液注入部１１、流路１２、反応液貯留部１３を一個ずつ示している。
【００９６】
図３（ｂ）に示すように、反応液注入部１１は、基板１４から突起した筒状構造を有している。これにより、ＰＣＲ反応液を注入したとき、反応液注入部１１からＰＣＲ反応液が漏れることを、当該筒状構造の内壁部分によって防止することができ、また、ピペット等の微細な分注管を用いても照準を定めやすいため、ＰＣＲ反応液の注入が容易となる。
【００９７】
流路１２は一方の端で反応液注入部１１に連結しており、他方の端で反応液貯留部１３に連結している。また、流路１２は基板１４の中心から放射状に伸びている。なお、流路１２は反応液注入部１１及び反応液貯留部１３のみを連絡している。これにより、反応液注入部１１から反応液貯留部１３へのＰＣＲ反応液の移動を、迅速かつ正確に行なうことができる。
【００９８】
反応液貯留部１３は基板１４の内部に形成されている。また、反応液貯留部１３は扁平状に形成されている。これにより、反応液貯留部１３内のＰＣＲ反応液の表面積を大きくすることができるため、当該ＰＣＲ反応液に対する熱伝導性を上げることができる。そのため、ＰＣＲ反応液の温度調整をさらに迅速に行なうことができる。
【００９９】
基板１４は円盤状の構造を有している。また、基板１４の中心には穴が形成されている。当該穴を介して、ＰＣＲ用ディスク１０と回転部５とが嵌合することができる。このように本発明に係る核酸増幅容器の基板として、円盤状の基板を採用することで、上記本発明に係る核酸増幅装置に好適に用いることができ、かつ、多くの開口部、流路、槽部を形成することができる。
【０１００】
ここで、図２に示すように、全ての反応液注入部１１、流路１２、反応液貯留部１３は、加温部２ａ及び３ａに重畳する領域内に収まることができる範囲に形成されている。これは、ＰＣＲ用ディスク１０を回転させたとき、それぞれの反応液貯留部１３が、最初に、加温部２ｂと３ｂとが重畳する領域を通過する時間を等しくするためである。
【０１０１】
つまり、最初に、加温部２ａ及び３ａによる加温領域内に配置された反応液貯留部１３にとって、加温部２ｂ及び３ｂによる加温領域を通過する時間は、加温部２ｂ及び３ｂによる加温領域に入ってから出るまでの時間である。一方、最初に、加温部２ｂ及び３ｂによる加温領域内に配置された反応液貯留部１３にとって、加温部２ｂ及び３ｂによる加温領域を通過する時間とは、反応を開始させた時から、第二の加温領域から出るまでの時間である。このように、最初に反応液貯留部１３が配置された位置によって、最初に加温部２ｂ及び３ｂによる加温領域を通過する時間が異なる場合が生じる。そこで、全ての反応液貯留部１３を、最初に、加温部２ａ及び３ａに重畳する領域内に収まるように搭載することができれば、この時間のずれを解消することができる。
【０１０２】
ＰＣＲ用ディスク１０の材料としては、従来公知の、核酸増幅反応用の容器の材料を用いればよく、限定されるものではない。例えば、ポリカーボネートやポリプロピレン等を用いればよい。本実施の形態に係るＰＣＲ用ディスク１０は、ポリカーボネートを用いて形成されている。ポリカーボネートは透明性が高いので、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）等の、ＤＮＡの増幅によって、発せられる蛍光が変化するＰＣＲ反応液を用いた場合、蛍光の検出が容易となる。つまり、本発明に係る核酸増幅容器が備える光透過部を、別途、透明度の高い材料を用いて槽部周辺を形成する必要がなく、槽部内から発せられる蛍光を透過するための光透過部を形成することができる。
【０１０３】
（ＰＣＲ装置１及びＰＣＲ用ディスク１０を用いた核酸増幅反応）
次に、ＰＣＲ装置１及びＰＣＲ用ディスク１０を用いて核酸増幅反応を行なう方法を、図１〜４を用いて説明する。
【０１０４】
まず、ＰＣＲ用ディスク１０をＰＣＲ装置１に搭載する。図１及び２に示すように、ＰＣＲ用ディスク１０は、ヒートブロック２上に搭載する。次に、ＰＣＲ用ディスク１０の上面からも加温を行なうため、ヒートブロック３を、ヒートブロック２と共にＰＣＲ用ディスク１０を挟むように配置する。
【０１０５】
このとき、全ての反応液貯留部１３が加温部２ａ及び３ａに重畳する領域内に収まるように搭載するとよい。これにより、上述のように、全ての反応液貯留部１３が加温部２ｂ及び３ｂにより形成された加温領域を通過する時間を一致させることができる。
【０１０６】
次に、図１に示すように、分注アーム７によって、ＰＣＲに必要な試薬やサンプルを、反応液注入部１１に注入する。具体的には、まず、分注管８は、伸長して試料容器１５から、所定の量の試薬及び／又はサンプルを吸引した後、収縮する。次に、分注アーム７を回動させて、分注管８を反応液注入部１１上に配置する。次に、分注管８は、反応液注入部１１付近まで伸長した後、吸引していた試薬及び／又はサンプルを反応液注入部１１に注入する。
【０１０７】
反応液注入部１１にＰＣＲ反応液を注入した後、ディスク駆動部４によって、ＰＣＲ用ディスク１０を高速回転させる。これにより、当該ＰＣＲ反応液を反応液貯留部１３に充填させる。具体的には、図３（ｂ）に示すように、直線Ａを回転軸として、ＰＣＲ用ディスク１０を矢印ａ方向に回転させる。当該回転により反応液注入部１１に注入されたＰＣＲ反応液には矢印Ｃ方向に遠心力が働く。そして、当該遠心力によって、当該ＰＣＲ反応液は流路１２を通って、反応液貯留部１３に充填される。
【０１０８】
このようにＰＣＲ用ディスク１０を回転させることで、反応液貯留部１３にＰＣＲ反応液を充填させることができる。これにより、ＰＣＲ反応液を直接注入することが困難な形状の反応液貯留部であっても、容易にＰＣＲ反応液を注入することができる。
【０１０９】
つまり、上述のように、反応液貯留部１３は、ＰＣＲ反応液に対する熱伝導率の向上のため、扁平状構造を有している。ここで、一般に、扁平状構造の槽部に対して、試薬等を充填させることは困難である。例えば、薄く凹んだ皿に反応液を注入する場合、ピペットの先端の照準を定めにくく、また、外側に漏れやすい。さらに、当該皿の上から蓋をする場合、これを上から蓋によって押さえつけることで、当該皿の外に反応液が漏れ、他の皿に入る恐れがある。また、扁平状の槽を容器中に形成して、当該槽に微小な穴を形成して、当該穴から反応液を注入する構成では、その注入のために精密な作業を要する。これでは、人手で行なうことも困難であり、また、オートサンプラー等を用いて自動化する場合も、オートサンプラーに精密な構造が要求され、コストが高くなる。そこで、本発明者らは、微量な核酸増幅反応液であっても注入しやすい筒状構造を有する開口部を設けて、別途、扁平状の槽部を容器中に形成して、当該開口部及び槽部を流路で連結すれば、開口部にＰＣＲ反応液を注入して、これを回転させるだけで、扁平状の槽部に容易にＰＣＲ反応液を充填させることができることを見出した。本発明は、当業者といえども着想し得ない、この全く新しい技術的思想に基づいて、完成に到達したものである。
【０１１０】
また、直線Ａは、ＰＣＲ用ディスク１０の中心である点ａ''を通る。このようにＰＣＲ用ディスク１０を、その中心を通り、面に垂直な直線を回転軸として回転させることで、回転の際に、ＰＣＲ用ディスク１０全体の位置が移動することがない。このため、ＰＣＲ装置を小型化することができる。なお、当該回転軸は、核酸増幅容器の中心に交わる形態に限られるものではない。つまり、槽部より開口部に近い点を通る直線を回転軸とすれば、回転させたとき、遠心力によって開口部に充填された核酸増幅反応液は槽部に向かう方向に力を受けるため、容易に槽部に充填することができる。
【０１１１】
なお、反応液貯留部１３にＰＣＲ反応液を充填するときのＰＣＲ用ディスク１０の回転数は、反応液注入部１１に注入されたＰＣＲ反応液を反応液貯留部１３に充填させることが可能な遠心力が得られればよく、例えば１０００ｒｐｍ〜６０００ｒｐｍでＰＣＲ用ディスク１０を回転させればよい。本発明者らは後述する実施例において３０００ｒｐｍで回転させた。
【０１１２】
本実施の形態では、反応液注入部１１に注入されたＰＣＲ反応液を反応液貯留部１３に移動させる手段として、ＰＣＲ用ディスク１０を回転させる場合について説明したが、これに限定されるものではない。つまり、反応液注入部１１に注入されたＰＣＲ反応液を反応液貯留部１３に移動させるための外力を、ＰＣＲ反応液に付加することが可能であればよい。例えば、ＰＣＲ反応液を反応液注入部１１に注入した後、反応液注入部１１に空気を送り込み、圧力によって、当該ＰＣＲ反応液を反応液貯留部１３に送り込んでもよい。
【０１１３】
反応液貯留部１３にＰＣＲ反応液を充填させた後、ＰＣＲ反応液に対して、解離反応、アニーリング反応、伸長反応のそれぞれに必要な温度を繰り返し加えることでＰＣＲを行なう。本実施の形態では、上述のように解離反応を９５℃で行ない、アニーリング反応及び伸長反応を６５℃で行なう場合について説明する。
【０１１４】
まず、加温部２ａ、３ａを６５℃に調整し、加温部２ｂ、３ｂを９５℃に調整する。これにより、ヒートブロック２及び３の間に９５℃の加温領域及び６５℃の加温領域が形成される。加温部２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂの形状は上述のように所望の反応時間等に応じて形成される。なお、この加温領域の形成は、ＰＣＲ反応液を反応液貯留部１３に充填させる工程の前後で行なってもよく、又は併行して行なってもよい。例えば、予め加温領域を形成した後、上述のＰＣＲ反応液の充填を行なっても、当該充填のための回転速度は上述のように高速であるので、反応に与える影響は極めて少ない。
【０１１５】
次に、ディスク駆動部４によってＰＣＲ用ディスク１０を回転させる。当該回転の回転数は、所望の、解離反応やアニーリング反応等の時間に応じて適宜設定すればよい。例えば、本発明者らは後述する実施例において７ｒｐｍでＰＣＲ用ディスク１０を回転させた。
【０１１６】
この回転によりＰＣＲが行なわれる様子を、図４を用いて説明する。図４は、ＰＣＲ用ディスク１０を回転させて、ＰＣＲを行なう様子を模式的に示す図であり、（ａ）はヒートブロック３上から見たＰＣＲ用ディスク１０が回転する様子を模式的に示す図であり、（ｂ）は、ＰＣＲ用ディスク１０が回転する様子を模式的に示す斜視図である。
【０１１７】
図４（ａ）（ｂ）に示すようにＰＣＲ用ディスクは、矢印ａ方向に回転する。これにより、図４（ａ）に示すように、それぞれの反応液貯留部１３は、まず９５℃に加温される。そして、さらに回転が進むことで、それぞれの反応液貯留部１３は６５℃に加温される。これが繰り返され、反応液貯留部１３内のＰＣＲ反応液は９５℃、６５℃に繰り返し調整されＰＣＲが行なわれる。
【０１１８】
このとき、ＰＣＲ用ディスク１０全体は、同時に９５℃及び６５℃に加温される状態となる。そのため、ＰＣＲ用ディスク１０上には、６５℃より高く９５℃より低い温度を有する領域が存在し、いずれか一方の温度となる領域は少ない。これにより、反応液貯留部１３を９５℃又は６５℃に調整するために必要な熱量を低減することができる。そのため、各反応液貯留部１３を、６５℃又は９５℃に調整するための時間を短縮することができる。
【０１１９】
従来は、ＰＣＲ用の容器を、解離反応等に必要な各温度に、それぞれ接触させたり、ＰＣＲ用の容器を一つのヒーターに搭載して、当該ヒーターの温度全体を繰り返し調整したりしていた。しかし、これでは、反応液を貯留した箇所以外にも当該反応温度になる領域が多く存在し、次の温度調整でも、前回の反応温度を有する領域の影響により昇温又は冷却に必要な熱量が多くなっていた。そのため、熱量のロスにより温度調整の効率が低下して、温度調整に長時間を有していた。本発明者らは、反応液貯留部は所望の温度に加温しつつも、容器全体を複数の加温領域で同時に加温することにより、上述した温度調整の効率が向上することを見出した。本発明は、当業者といえども着想し得ない、この全く新しい技術的思想に基づいて、完成に到達したものである。
【０１２０】
本実施の形態では、ＰＣＲ反応液を加温するときに回転させるＰＣＲ用ディスク１０の回転軸は、図４（ｂ）に示すように直線Ａである。直線Ａは、上述の通り、ＰＣＲ用ディスク１０の中心である点ａ''を通り、ＰＣＲ用ディスク１０の面方向に垂直な直線である。このように、ＰＣＲ用ディスク１０を加温するときに回転させる回転軸は、ＰＣＲ用ディスク１０の中心を通ることが好ましいが、これに限定されるものではない。つまり、本発明に係る核酸増幅装置が備える移動手段は、核酸増幅容器を回転させる構成であれば、移動手段の機構を簡易にすることができ、部品数を削減することができるという点や、装置を小型化できるという効果が得られる。つまり、回転のみの場合は、核酸増幅容器を支持する機構と、これを回転させるモーター等があればよいが、直線方向の移動等、回転以外の移動を伴う場合は、移動の方向を定めるためのレール等の部品がさらに必要となる。ただし、回転軸が、ＰＣＲ用ディスク１０と交差する直線であれば、ＰＣＲ用ディスク１０が移動する範囲をさらに省スペースにすることができ、装置をさらに小型化することができる。さらに、本実施の形態のように、当該回転軸をＰＣＲ用ディスク１０の中心を通る直線とすることで、ＰＣＲ用ディスク１０の搭載位置を固定したまま、反応液貯留部１３の位置のみを移動させることができ、さらに装置を小型化することが可能となる。
【０１２１】
また、本実施の形態では、反応液貯留部１３にＰＣＲ反応液を充填するための回転と、反応液貯留部１３を加温するための回転とを、同一の直線Ａを回転軸で行なう場合について説明したが、これに限定されるものではない。それぞれの回転を行なうために複数の回転手段を設けて、別々の回転軸によりそれぞれの回転を行なってもよい。しかし、本実施の形態で説明したように、反応液貯留部１３にＰＣＲ反応液を充填するための回転と、反応液貯留部１３を加温するための回転とを、同一の回転軸とすることで、一つの部材（ディスク駆動部４）を用いて、両方の回転を行なうことができる。そのため、部品数を削減したり、装置を小型化したりすることができる。
【０１２２】
また、本発明に係る核酸増幅装置が備える移動手段は、核酸増幅容器を回転させる構成のみに限定されるものではない。核酸増幅容器全体を、複数の加温領域のうち、それぞれ異なる温度に調整された少なくとも二つの加温領域によって同時に加温される状態で移動させるものであればよい。例えば、帯状のプレート（搭載手段）に、９５℃の加温領域及び６５℃の加温領域を交互に縞状に形成して、９５℃の加温領域及び６５℃の加温領域の一つずつに、同時に跨るように核酸増幅容器を載せる。これを当該プレートの長さ方向に往復するように移動させると、当該核酸増幅容器全体は９５℃及び６５℃で同時に加温させながら、当該核酸増幅容器中の核酸増幅反応液が充填された部位を９５℃又は６５℃で加温させることができる。ただし、本実施の形態のように核酸増幅容器を回転させる構成は、上述の部品数の削減や、装置を小型化できるという効果を得ることができるという点で好ましい。
【０１２３】
また、ディスク駆動部４によるＰＣＲ用ディスク１０は一定の方向に一定の回転速度で駆動させたが、これに限られるものではない。例えば、加温領域を形成可能な領域が限定されている場合等は、当該加温領域や所望の反応条件等に応じて、移動速度及び移動方向を適宜変更可能な構成であってもよい。ただし、本実施の形態のように、一定の方向に一定の速度で核酸増幅容器を移動させることで、方向及び速度の制御が不要となり、また、上述の加温領域の形状を規定する線分の算出等を容易に行なえる。そのため、核酸増幅装置の動作の制御が容易になる。
【０１２４】
ＰＣＲによるＤＮＡの増幅の確認は、従来公知の電気泳動法等によって行なえばよく、限定されるものではないが、ＤＮＡの増幅によって発せられる蛍光が変化するＰＣＲ反応液を用いれば、蛍光の検出をするだけで増幅を確認することができる。つまり、反応液貯留部１３から発せられる蛍光を、蛍光透過部９ａ、９ｂを介して、蛍光検出部６で検出することによって、リアルタイムにＰＣＲによるＤＮＡの増幅を確認することができる。
【０１２５】
〔実施の形態２〕
本発明に係る核酸増幅容器の他の実施の形態について、図５を用いて説明する。なお、説明の便宜上、実施の形態１に係る構成要素と同様の機能を有する構成要素については、その説明を省略する。本実施の形態では、主に、上記実施の形態１との相違点について説明するものとする。
【０１２６】
図５は、本実施の形態に係るＰＣＲ用チップ２０の構造を模式的に示す斜視図であり、（ａ）は反応液注入部２１に注入されたＰＣＲ反応液を反応液貯留部２３に充填する様子の一例を示し、（ｂ）は反応液注入部２１に注入されたＰＣＲ反応液を反応液貯留部２３に充填する様子の他の例を示している。
【０１２７】
図５（ａ）及び（ｂ）に示すように、ＰＣＲ用チップ２０は、反応液注入部２１（開口部）、流路２２、反応液貯留部２３（槽部）、基板２４から形成されている。
【０１２８】
反応液注入部２１は、基板２４から突起した筒状構造を有している。これにより、当該反応液注入部２１の内壁部分によって、反応液注入部２１からＰＣＲ反応液が漏れることを防止することができ、また、ピペット等の微細な分注管を用いても照準を定めやすい等の理由により、ＰＣＲ反応液の注入が容易となる。
【０１２９】
流路２２は一方の端で反応液注入部２１に連結しており、他方の端で反応液貯留部２３に連結している。また、後述のように基板２４は長方形状を有しており、流路２２は、基板２４の長さ方向に平行に形成されている。
【０１３０】
反応液貯留部２３は基板２４の内部に形成されている。反応液貯留部２３は扁平状に形成されている。これにより、反応液貯留部２３内に充填されたときのＰＣＲ反応液の表面積を大きくすることができるため、当該ＰＣＲ反応液に対する熱伝導率を上げることができる。そのため、ＰＣＲ反応液の温度調整をさらに迅速に行なうことができる。
【０１３１】
基板２４は、長方形状を有している。長方形状であれば、基板２４の材料で形成された一枚のシートから、大量に基板２４を切り出すことができ、円盤状の基板を用いる場合に比べて、廃棄される材料が少なくなるため、製造コストを低減させることができる点で有利である。
【０１３２】
反応液注入部２１に注入されたＰＣＲ反応液を反応液貯留部２３に充填するときは、基板２４上の点であって、反応液貯留部２３よりも反応液注入部２１に近い点を通る直線を回転軸として回転させればよい。
【０１３３】
例えば図５（ａ）に示すように、基板２４の面方向に垂直な直線Ｄを回転軸として回転させるとよい。これにより、注入されたＰＣＲ反応液は矢印Ｅ方向の遠心力を受け、反応液貯留部２３に充填される。
【０１３４】
また、例えば、図５（ｂ）に示すように、図５（ａ）の場合に比べてＰＣＲ用チップ２０を水平から傾けた状態で、直線Ｄを回転軸として回転させてもよい。これにより、これにより、注入されたＰＣＲ反応液は、当該回転による遠心力及び重力によって、矢印Ｅ方向の力を受け、反応液貯留部２３に充填される。
【０１３５】
ＰＣＲ用チップ２０を用いてＰＣＲを行なう場合、従来公知のＰＣＲ装置を用いてもよいが、本発明に係る核酸増幅装置を用いれば、上述のように簡便かつ迅速にＰＣＲを行なうことができる。
【０１３６】
例えば、ＰＣＲ用チップ２０をＰＣＲ装置１に用いる場合、回転部５の代わりに、ＰＣＲ用チップ２０を把持して回転させることが可能なアーム構造の部材等を設ければよい。そして、加温部２ａ及び３ａにより形成される加温領域と、加温部２ｂ及び３ｂにより形成される加温領域とで、同時に加温される状態を保ちながら、反応液貯留部２３はそれぞれの加温領域に交互に加温されるように、当該アーム構造の部材によって、ＰＣＲ用チップ２０を把持して回転させればよい。例えば、まず回転軸が直線Ｄ１となるように当該アーム構造の部材でＰＣＲ用チップ２０を把持して回転させることで、反応液貯留部２３にＰＣＲ反応液を充填し、ＰＣＲ反応液の加温時には、ＰＣＲ用チップ２０の中心を通り、ＰＣＲ用チップ２０の面に垂直な直線を回転軸とするように、当該アーム構造の部材により把持する箇所を変更するか、別途回転させるための部材を設けて、回転させればよい。
【実施例】
【０１３７】
〔実施例：ＣｙｔｏＣｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ｃ１９（ＣＹＰ２Ｃ１９）遺伝子の検出〕
（ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を検出するプライマーの合成）
まず、正鎖プライマー及び逆鎖プライマーを合成した。正鎖プライマーの塩基配列を配列番号１に、逆鎖プライマーの塩基配列を配列番号２に示す。
【０１３８】
正鎖プライマー及び逆鎖プライマーは、ＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社製；３９２型）を用いて、添付のマニュアルに従い、ホスホアミダイト法により合成した。合成した正鎖プライマー及び逆鎖プライマーを、アンモニア水に溶解して、５５℃の環境下で、一晩静置することによって、脱保護した。その後、ＯＰＣカラム（パーキンエルマー社製）にて精製した。なお、プライマーの合成は、ＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）等）に依頼してもよい。
【０１３９】
（ＰＣＲによるＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の解析）
ＰＣＲに供するサンプルとして、ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法によって得たＤＮＡ溶液を用いた。ヒト白血球として、２種類の個体から得たものを用い、ＤＮＡ溶液を２種類調製した（以下、「サンプルＡ」、「サンプルＢ」と表記する）。
【０１４０】
次に、ＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応液は、全量を２５μｌとして、正鎖プライマー ２０ｐｍｏｌ、逆鎖プライマー ２０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製、品番ＫＯＤ−２０１）、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼに添付の×１０緩衝液 ２．５μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ２μｌ及びサンプルＡ又はＢを、溶解しているＤＮＡが１００ｎｇとなるように混合し、残部は水とした。
【０１４１】
ＰＣＲには上記実施の形態１で説明したＰＣＲ装置１及びＰＣＲ用ディスク１０を用いた。
【０１４２】
まず、反応液注入部１１に、調製したＰＣＲ反応液のうち２０μｌを注入した。次に、３０００ｒｐｍで５秒間ＰＣＲ用ディスク１０を回転させて、反応液注入部１１内のＰＣＲ反応液を反応液貯留部１３に移動させた。
【０１４３】
ＰＣＲの温度条件は、加温部２ａ及び３ａを９５℃として５分間静置した後、加温部２ａ及び３ａを６５℃に調整して、７ｒｐｍで５分間、ＰＣＲ用ディスクを回転させた。上述の通り、角度θ１は９０度であるため、当該回転によりＰＣＲ反応液は９５℃で２．１秒、６５℃で６．４秒の加温調整を３５サイクル行なったこととなる。
【０１４４】
（アガロースゲル電気泳動による核酸増幅の確認）
ＰＣＲ反応後、反応液貯留部１３からＰＣＲ反応液５μｌを回収した。回収したＰＣＲ反応液を、３％アガロースゲルによる電気泳動に供した。電気泳動では、１００Ｖの電圧を印加して、６０分間行なった。その結果を図６に示す。図６は本実施例における電気泳動の結果を示す図であり、レーン１及びレーン２は、それぞれサンプルＡ及びＢを用いたＰＣＲの結果を示し、レーン３には比較のためサンプルＡ及びＢの代わりに水を混合して、本実施例に記載の方法でＰＣＲを行なった結果を示している。また、レーンＭには分子量マーカーを供して電気泳動を行なった結果を示している。
【０１４５】
図６に示されるように、サンプルＡ及びＢのいずれのサンプルを用いたＰＣＲにおいても、良好にＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を検出することができた。これは、５分という短時間で良好にＰＣＲが行なわれたことを示している。
【０１４６】
本発明は上述した各実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明に係る核酸増幅装置及び核酸増幅容器は、極めて迅速かつ簡便に核酸増幅反応を行なうことができる。遺伝子解析や、遺伝子をモニタリングすることにより行われるバイオアッセイなど、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を用いるあらゆる産業で利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】本発明の実施形態に係るＰＣＲ装置の概略構成を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係るＰＣＲ装置が備えるヒートブロックの構造を模式的に示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係るＰＣＲ用ディスクの構造を模式的に示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係るＰＣＲ用ディスクを回転させて、ＰＣＲを行なう様子を模式的に示す図である。
【図５】本発明の他の実施形態係るＰＣＲ用チップの構造を模式的に示す斜視図である。
【図６】本発明の実施例における電気泳動の結果を示す図である。
【符号の説明】
【０１４９】
１    ＰＣＲ装置（核酸増幅装置）
２    ヒートブロック（搭載手段、第一の加温手段）
２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ    加温部
３    ヒートブロック（第二の加温手段）
４    ディスク駆動部（移動手段）
５    回転部
６    蛍光検出部（光検出手段）
９ａ、９ｂ    蛍光透過部（窓部）
１０    ＰＣＲ用ディスク（核酸増幅容器）
１１、２１    反応液注入部（開口部）
１２、２２    流路
１３、２３    反応液貯留部（槽部）
１４、２４    基板
２０    ＰＣＲ用チップ（核酸増幅容器）
Ａ、Ｄ    直線（回転軸）
【図１】
2008200006.tif 000003
【図２】
2008200006.tif 000004
【図３】
2008200006.tif 000005
【図４】
2008200006.tif 000006
【図５】
2008200006.tif 000007
【図６】
2008200006.tif 000008
【配列表】
2008200006000001.app