(57)【要約】【課題】  有用な治療法が今のところ存在しない網膜疾患に対して、実際に臨床応用できる可能性が非常に高い新しい治療法に応用できる網膜幹細胞、およびその分離取得手段を提供する。【解決手段】  網膜幹細胞の分離を、哺乳動物の生体組織、又は血清代替物質の添加された培地で培養された哺乳動物の、生体組織の細胞の表面に発現している神経栄養因子の受容体であるｐ７５＋  、ｔｒｋＡ＋  、ｔｒｋＢ＋  又はｔｒｋＣ＋  をマーカーとして、それらに対する抗体を用いて分離する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面に発現している神経栄養因子の受容体であるｐ７５＋、ｔｒｋＡ＋、ｔｒｋＢ＋又はｔｒｋＣ＋をマーカーとして、哺乳動物の生体組織から網膜幹細胞を分離すること
を特徴とする網膜幹細胞の分離方法。
【請求項２】
前記分離が、
ｐ７５＋、ｔｒｋＡ＋、ｔｒｋＢ＋又はｔｒｋＣ＋に対する抗体を用いて行われること
を特徴とする請求項１に記載の網膜幹細胞の分離方法。
【請求項３】
前記分離が、
ｐ７５＋に対する抗体と、ｔｒｋＡ＋又はｔｒｋＢ＋もしくはｔｒｋＣ＋に対する抗体の１種以上とを組み合わせて用いて行われること
を特徴とする請求項１に記載の網膜幹細胞の分離方法。
【請求項４】
前記生体組織が、
血清または血清代替物質を加えた培地で培養した細胞であること
を特徴とする請求項１に記載の網膜幹細胞の分離方法。
【請求項５】
前記生体組織が、
眼球組織由来の細胞であること
を特徴とする請求項１又は４に記載の網膜幹細胞の分離方法。
【請求項６】
前記生体組織が、
眼球の虹彩組織由来の細胞であること
を特徴とする請求項１又は４に記載の網膜幹細胞の分離方法。
【請求項７】
哺乳動物の生体組織から分離された細胞で、かつ、種々の細胞への分化誘導が可能な多能性細胞であること
を特徴とする網膜幹細胞。
【請求項８】
前記細胞が、
眼球組織由来の細胞であること
を特徴とする請求項７に記載の網膜幹細胞。
【請求項９】
前記細胞が、
眼球の虹彩組織由来の細胞であること
を特徴とする請求項７に記載の網膜幹細胞。
【請求項１０】
前記分化誘導が、
血清または血清代替物質と成長因子を加えた培地で培養することにより行われるものであること
を特徴とする請求項７に記載の網膜幹細胞。
【請求項１１】
前記分離が、
請求項１〜６に記載のいずれかの方法で行なわれたものであること
を特徴とする請求項７に記載の網膜幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、哺乳類の生体組織、特に、眼球組織、中でも虹彩組織の細胞を用いて、網膜を構成する細胞の基となる網膜幹細胞を効率的に分離する方法、および、その方法によって取得された網膜神経細胞に分化誘導し得る網膜幹細胞に関するもので、医療に関連する生化学工学技術の分野に属するものである。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物、特に哺乳動物の組織において、傷害、疾患、加齢などによる組織や細胞に損傷が起こった場合、様々な作用が働き、組織や細胞の損傷を元の状態へ回復させようとする、いわゆる再生という現象が起こる。
この再生のプロセスにおいて、当該組織に存在する幹細胞が大きな役割を担っている。これら幹細胞は、必要に応じて様々な細胞や組織（臓器）に分化する多能性を有しているため、多能性組織幹細胞（以後、幹細胞と云う。）と呼ばれ、何らかの原因で損傷を受けた組織（臓器）にこの幹細胞を補うことで、組織（臓器）の回復・再生をさせることができるものである。
この幹細胞を用いた新しい医療技術を応用した再生医療は、今まで治療が不可能であった疾患に対する新しい治療法として期待されている。
【０００３】
哺乳動物において、幹細胞の研究は、骨髄を始めとして様々な研究が進んでいる。
例えば、骨髄には、造血幹細胞と呼ばれる幹細胞が存在する。この幹細胞は、赤血球、顆粒球やリンパ球などの白血球、血小板など様々な機能の異なる細胞へ分化することが可能なものである。
一方、骨髄には、造血幹細胞とは別に骨髄間質細胞と呼ばれる非造血細胞（骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞など）へ分化することができる幹細胞も存在することが分かっている（非特許文献１）。
【０００４】
また、近年の研究成果では、骨髄以外の様々な臓器や組織に、幹細胞が存在することが明らかにされている（非特許文献２，３，４，５）。
【０００５】
このように、現在までに、様々な臓器や組織に存在する幹細胞を材料として、種々の細胞へ分化させる研究がなされ、網膜神経細胞へ分化させる研究も行われているが、神経系細胞、特に網膜神経細胞へ分化させ、かつ生理学的に機能する細胞を作成することは困難であった。
すなわち、第一に、網膜幹細胞を同定、分離するための細胞膜表面に発現している特異的なタンパク質が発見されていない。さらに、生理学的に機能する神経系細胞や網膜神経細胞へ分化誘導できる細胞は、限られた組織由来の細胞でないと難しいという問題が存在しているため、網膜細胞へ分化誘導するために細胞にウイルスベクターを用いて遺伝子を導入した報告や、非自己の細胞であるＥＳ細胞を用いるという研究報告はある。
しかしながら、これらは感染の問題、倫理上の問題が残され、実際の臨床応用には多くの問題点が残され、有効なものとは云えないものである。
【０００６】
一方、上記目的のためには、必要とする幹細胞のみを選択的かつ効率的に分離する技術も必須の技術となる。
近年の報告によると、種々の組織に存在する幹細胞には、組織特異的なタンパクが合成されていることを明らかにし、このマーカータンパク質と云われている、細胞の膜表面に発現している組織特異的なタンパク質を利用することで幹細胞を同定、分離する技術が研究されている。
【０００７】
既に報告されているマーカータンパク質として、骨髄には、「ＡＣ１３３」というマーカータンパク質をもつ細胞が存在している（非特許文献１１）。
また、膵臓には、「ｃ-Ｍｅｔ」「ｃ-Ｋｉｔ」「ＣＤ４５」および「ＴＥＲ１１９」と云うマーカータンパク質を発現している細胞が存在し、このマーカータンパク質を利用した選択的細胞分離法に関する特許も公開されている（特許文献１）。
さらに、肝臓には、「Ｔｔｍ２Ａ」というマーカータンパク質が存在し、さらに、この「Ｔｔｍ２Ａ」をコードする「ｍＲＮＡ」を利用することで幹細胞の分離法についての発明も開示されている（特許文献２）。
【０００８】
このように、様々な組織（臓器）によって、幹細胞のマーカータンパク質は異なっているため、全ての組織においての、組織特異的な幹細胞のマーカータンパク質の研究が再生医療研究の急務の課題となっている。
【０００９】
さらに、最近の研究おいては、様々な組織の幹細胞から神経系細胞へ分化誘導する研究は種々報告されている。しかしながら、それらの方法では、神経系細胞への分化誘導できる成功率は非常に悪く、さらに、神経細胞に特異的なマーカータンパク質を発現する細胞は作成できるが、生理学（電気生理学）的に機能する細胞の作成までは殆どできていないのが現状である。
【非特許文献１】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ Ｍ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４，１４３−１４７
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｅｌｌ  Ｍ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，１９９７，３，１３３７−１３４５
【非特許文献３】Ｚｕｌｅｗｓｋｉ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００１，５０，５２１−５３３
【非特許文献４】Ｓｕｚｕｋｉ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０００，３２，１２３０−１２３９
【非特許文献５】Ｚｕｋ  Ｐ.Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１，７，２１１−２２８
【非特許文献６】Ａｂe  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，日眼会誌，２００２，１０６，７７８−８０３
【非特許文献７】Ｋｕｒｉｍｏｔｏ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｌｅｔｔｅｒ，２００１，３０６，５７−６０
【非特許文献８】Ｔｒｏｐｅｐｅ  Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８７，２０３２−２０３６
【非特許文献９】Ｈａｒｕｔａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，４，１１６３−１１６４
【非特許文献１０】Ｉｋｅｄａ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，２００５，１０２，１１３３１−１１３３６
【非特許文献１１】Ｒｅｙｅｓ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｉｎｖｅｓｔ.，２００２，１０９，３３７−３４６
【特許文献１】ＷＯ２００２／０８８３３５号
【特許文献２】特開２００４−１８７６７９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
この発明はかかる現状を鑑みた上で、上記のような従来技術における問題点を解決し、哺乳動物の生体組織、特に眼球組織から、網膜幹細胞を効率よく同定し、分離、培養および分化誘導できる方法を提供することである。
【００１１】
すなわち、本発明者らはこのような背景から鋭意研究を行った結果、神経の生存や神経軸索の再生促進、神経系の発生や発達に関与する、ニュ−ロトロフィンと呼ばれる神経栄養因子（神経成長因子）のレセプターである「Ｌｏｗ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐ７５（ＮＧＦＲｐ７５；以降、ｐ７５と記す。）」が、眼球組織に存在し、将来網膜幹細胞へ分化誘導できる幹細胞において発現していることを見出し、さらに、このｐ７５をマーカータンパク質として用いることにより、網膜幹細胞を同定、分離することができ、しかも、その方法によれば、網膜幹細胞を効率的に回収することができることを見出し、従来技術が有する問題の存在しない網膜幹細胞の分離方法を確立したのである。
【００１２】
また、発明者等はｐ７５に加えて、神経栄養因子に分類される、すなわち、ニュ−ロトロフィンファミリーと呼ばれている、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５のレセプターであるＴｒｋ（ＴｒｋＡ＋、ＴｒｋＢ＋およびＴｒｋＣ＋）から選択されるマーカータンパク質を１種類以上組み合わせることで、より効率的に網膜幹細胞の同定、分離の効率を飛躍的に高められることを見出したのである。
【００１３】
さらに、発明者等は、特定の培地を用いることにより、網膜幹細胞の分離前の生体組織、特に眼球組織の培養、分離後の培養、その際の網膜細胞への分化誘導効率培養および各種の網膜細胞への分化誘導効率を飛躍的に高められることをも見出して、この発明を完成したのである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
すなわち、この発明の請求項１に記載の発明は、
細胞表面に発現している神経栄養因子の受容体であるｐ７５＋、ｔｒｋＡ＋、ｔｒｋＢ＋又はｔｒｋＣ＋をマーカーとして、哺乳動物の生体組織から網膜幹細胞を分離すること
を特徴とする網膜幹細胞の分離方法である。
【００１５】
また、この発明の請求項２に記載の発明は、
請求項１に記載の網膜幹細胞の分離方法において、
前記分離が、
ｐ７５＋、ｔｒｋＡ＋、ｔｒｋＢ＋又はｔｒｋＣ＋に対する抗体を用いて行われること
を特徴とするものである。
【００１６】
また、この発明の請求項３に記載の発明は、
請求項１に記載の網膜幹細胞の分離方法において、
前記分離が、
ｐ７５＋に対する抗体と、ｔｒｋＡ＋又はｔｒｋＢ＋もしくはｔｒｋＣ＋に対する抗体の１種以上とを組み合わせて用いて行われること
を特徴とするものである。
【００１７】
また、この発明の請求項４に記載の発明は、
請求項１に記載の網膜幹細胞の分離方法において、
前記生体組織が、
血清または血清代替物質を加えた培地で培養した細胞であること
を特徴とするものである。
【００１８】
また、この発明の請求項５に記載の発明は、
請求項１又は４に記載の網膜幹細胞の分離方法において、
前記生体組織が、
眼球組織由来の細胞であること
を特徴とするものである。
【００１９】
また、この発明の請求項６に記載の発明は、
請求項１又は４に記載の網膜幹細胞の分離方法において、
前記生体組織が、
眼球の虹彩組織由来の細胞であること
を特徴とするものである。
【００２０】
さらに、この発明の請求項７に記載の発明は、
哺乳動物の生体組織から分離された細胞で、かつ、種々の細胞への分化誘導が可能な多能性細胞であること
を特徴とする網膜幹細胞である。
【００２１】
また、この発明の請求項８に記載の発明は、
請求項７に記載の網膜幹細胞において、
前記細胞が、
眼球組織由来の細胞であること
を特徴とするものである。
【００２２】
また、この発明の請求項９に記載の発明は、
請求項７に記載の網膜幹細胞において、
前記細胞が、
眼球の虹彩組織由来の細胞であること
を特徴とするものである。
【００２３】
また、この発明の請求項１０に記載の発明は、
請求項７記載の網膜幹細胞において、
前記分化誘導が、
血清または血清代替物質と成長因子を加えた培地で培養することにより行われるものであること
を特徴とするものである。
【００２４】
また、この発明の請求項１１に記載の発明は、
請求項７記載の網膜幹細胞において、
前記分離が、
請求項１〜６に記載のいずれかの方法で行なわれたものであること
を特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２５】
この発明により、今まで困難であった哺乳動物の眼球組織に存在する網膜幹細胞を効率的に同定することが可能となった。さらに、従来の技術と比べて、高純度でより優れた網膜幹細胞を分離、回収することを可能とした。
また、この発明は、眼科再生医療の分野において、現在まで治療が困難であった疾患に対し、自己の細胞を用いた新しい治療法として応用できる可能性が非常に高いことから、社会に対して大きく貢献することができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、この発明にかかる網膜幹細胞の分離法等を、具体的かつ詳細な実施例に基づいて、詳細に説明するが、この発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
＜成体マウス虹彩組織からの細胞採取＞
ＤＢＡ２／Ｃｒマウス（雄、４週齢）を安楽死させたのち、眼球を摘出した。
摘出した眼球をアルコールにて短時間消毒したのち、実体顕微鏡下にて眼球赤道部付近からマイクロスプリング尖刀を用いて切開し、虹彩組織のみを摘出した。
摘出した虹彩組織を酵素処理して個々の細胞に分散させたのち、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ＭｅｄｉｕｍとＦ−１２培地の１：１混合培養液（以降、基礎培地）を用いて洗浄した。
【００２８】
＜フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による細胞の単離解析＞
神経幹細胞マーカーのＮｅｓｔｉｎ＋  は、細胞質内タンパク質で、生きた細胞の状態ではＦＡＣＳによる解析が不可能である。
そのため、細胞質内タンパク質の発現を解析するために、細胞を固定して細胞膜に穴を開けて、抗体が入るように固定する手段を採用し、神経幹細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎ＋  細胞が今回発見したマーカーを発現しているかを、以下のようにして調査した。
【００２９】
各組織から調製した細胞を、１％パラフォルムアルデヒド固定液で１５分固定した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した。
５％ウシ血清（ＦＢＳ）と、細胞膜に穴を開けるための酵素であるサポニンを添加したハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で、抗ｐ７５ポリクローナル抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ製）、抗Ｔｒｋ−Ａ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）、抗Ｔｒｋ−Ｂ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）、抗Ｔｒｋ−Ｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）、および抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）と３０分間氷中で反応させた。
反応後、５％ＦＢＳ、およびサポニンを添加したハンクス液にて３回洗浄し、続いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（インビトロジェン株式会社製）、又はＰＥ−Ｃｙ５で標識した抗ＩｇＧモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）と３０分間氷中にて反応させた。
最後に、５％ＦＢＳを含むハンクス液にて３回洗浄し、５％ＦＢＳ添加ハンクス液中に細胞を懸濁した。
これら蛍光標識した細胞をセルソーターのＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥ（ベックトン・ディッキンソン株式会社製）にて解析した。
ゲートの設定は、ネガティブコントロールを指標にした。
まず、前方散乱光（Ｆｏｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ）、側方散乱光（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ）により、残存する赤血球、細胞の残骸、細胞の凝集魂を除いた部分にゲート（Ｒ１）をかけた。
ついで、ゲート（Ｒ１）内のｐ７５＋  、Ｔｒｋ−Ａ＋  、Ｔｒｋ−Ｂ＋  、Ｔｒｋ−Ｃ＋  、およびＮｅｓｔｉｎ＋細胞を解析した。
つぎに、染色の組み合わせによりＮｅｓｔｉｎ＋  に加えてｐ７５＋  （以下、Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／ｐ７５＋  と記す。）、同様にＮｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ａ＋  、Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ｂ＋  、およびＮｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ｃ＋  の組み合わせで細胞にゲート（Ｒ２）を設定し、それぞれのマーカータンパク質を合成している細胞を解析した。
【００３０】
セルソーターにより、それぞれのマーカータンパク質、あるいはＮｅｓｔｉｎとの共発現をしている細胞についての解析を行った。
【００３１】
ゲート（Ｒ１）内のｐ７５＋  、Ｔｒｋ−Ａ＋  、Ｔｒｋ−Ｂ＋  、Ｔｒｋ−Ｃ＋  、およびＮｅｓｔｉｎ＋  細胞の発現割合を解析したところ、ｐ７５＋  細胞は全体の２２．３８％、Ｔｒｋ−Ａ＋  細胞は全体の２５．０１％、Ｔｒｋ−Ｂ＋  細胞は全体の２３．６９％、Ｔｒｋ−Ｃ＋  細胞は全体の２２．４５％、およびＮｅｓｔｉｎ＋  細胞は全体の２２．２６％に発現していることが分かった。
【００３２】
つぎに、Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／ｐ７５＋  、Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ａ＋  、Ｎｅｓｔｉｎ＋／Ｔｒｋ−Ｂ＋  、およびＮｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ｃ＋  の発現割合を解析したところ、
Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／ｐ７５＋  細胞は全体の１６．７％、
Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ａ＋  細胞は全体の１６．６％、
Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ｂ＋  細胞は全体の１８．５％、および
Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ｃ＋  細胞は全体の１５．５％
に発現していることが分かった。
この結果をさらに詳細に分析すると、Ｎｅｓｔｉｎ＋  の細胞は全てｐ７５＋細胞、Ｔｒｋ−Ａ＋  細胞、Ｔｒｋ−Ｂ＋  細胞、あるいはＴｒｋ−Ｃ＋  細胞の分画に含まれていることが分かった。
【００３３】
従来の方法では、神経幹細胞のみを生きた状態の細胞で分離することはできなかった。それは、神経幹細胞（神経前駆細胞）のマーカーであるＮｅｓｔｉｎは細胞質内タンパク質であるため、生きた細胞の状態でセルソーターを用いて分離することが不可能であること、および効率的な神経幹細胞（神経前駆細胞）を分離することができる細胞膜タンパク質が分かっていなかったためである。
しかしながら、上記の結果から、神経幹細胞の表面に発現していることを見出したｐ７５、Ｔｒｋ−Ａ、Ｔｒｋ−Ｂ、あるいはＴｒｋ−Ｃを用いることで、初めて細胞膜タンパク質を用いて、神経幹細胞を、生きた細胞の状態で効率的にセルソーターを用いて分離することが以下の様に可能となった。
【００３４】
＜生きた状態の虹彩由来組織幹細胞の分離と解析＞
上記結果から明らかなように、Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞は、ｐ７５＋  細胞、Ｔｒｋ−Ａ＋  細胞、Ｔｒｋ−Ｂ＋  細胞、あるいはＴｒｋ−Ｃ＋  細胞であることが分かった。
そこで、上記と同様の方法で成体マウス虹彩組織からの細胞を採取し、固定しないで、生きた状態のままの細胞を、ｐ７５、Ｔｒｋ−Ａ、Ｔｒｋ−Ｂ、およびＴｒｋ−Ｃの抗体でそれぞれ標識して、セルソーターによる細胞分取を行った。
分取したｐ７５＋  細胞、Ｔｒｋ−Ａ＋  細胞、Ｔｒｋ−Ｂ＋  細胞、およびＴｒｋ−Ｃ＋  細胞を血清含有基礎培地で培養した。
なお、セルソーターによるソーティングを行う前の、様々な虹彩由来細胞が混在している状態の細胞を未処理細胞とした。
【００３５】
ｐ７５＋  細胞、Ｔｒｋ−Ａ＋  細胞、Ｔｒｋ−Ｂ＋  細胞、およびＴｒｋ−Ｃ＋  細胞と、未処理細胞を網膜細胞へ分化誘導するにあたって、まず、それぞれのマーカータンパク陽性の細胞を分取した後に接着培養させた細胞において、神経幹細胞（神経前駆細胞）のマーカーを発現する細胞の発現割合の確認評価を行った。
ついで、それぞれのマーカーでソーティングした細胞および未処理細胞を、血清含有基礎培地で３日間培養した後、神経幹細胞（神経前駆細胞）マーカーのＮｅｓｔｉｎ＋  細胞の割合についてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて測定した。
【００３６】
ＦＡＣＳによるＮｅｓｔｉｎ＋  細胞の割合を測定したところ、
ｐ７５でソーティングした細胞では、Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞は全体の９５．４％、
Ｔｒｋ−Ａでソーティングした細胞では、Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞は全体の９２．９％、
Ｔｒｋ−Ｂでソーティングした細胞では、Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞は全体の９０．３％、
Ｔｒｋ−Ｃでソーティングした細胞では、Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞は全体の８５．７％
に存在した。
一方、未処理細胞では４．３％であった。
【００３７】
＜虹彩由来組織幹細胞の状態を維持したまま増殖させた細胞の解析＞
上記に記載した方法と同様にして、成体ＤＢＡ２／Ｃｒマウスの虹彩組織から細胞を採取した。
つぎに、虹彩組織中に含まれる組織幹細胞の状態を維持させたまま増殖させるために、血清代替物質（ＥＳＧＲＯ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）またはＳｙｎＱ（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅ））を加えた低血清の基礎培地に細胞を播種し、１０日間培養した。
【００３８】
１０日間培養した細胞を酵素処理し、培養ディッシュから剥がし、個々の細胞に単離させた後、上記方法と同様に細胞を固定し、培養した細胞におけるｐ７５、Ｔｒｋ−Ａ、Ｔｒｋ−ＢおよびＴｒｋ−Ｃの発現量について、実施例１と同様に抗体を用いて細胞を標識し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて測定した。
【００３９】
Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／ｐ７５＋  、Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ａ＋  、Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ｂ＋  、およびＮｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ｃ＋の発現割合を解析したところ、
Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／ｐ７５＋  細胞は、全体の９９．５％（図１）、
Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ａ＋  細胞は、全体の９７．６％（図２）、
Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ｂ＋  細胞は、全体の９７．７％（図３）、および
Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ｃ＋  細胞は、全体の９５．０％（図４）
に発現していることが分かった。
この結果から、虹彩由来細胞は本培養条件などで培養することによって、Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／ｐ７５＋  、Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ａ＋  、Ｎｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ｂ＋  、およびＮｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ｃ＋  の発現割合を増加させることに成功した。
また、結果を詳細に分析すると、Ｎｅｓｔｉｎ＋  の細胞は全て、ｐ７５＋  、Ｔｒｋ−Ａ＋  、Ｔｒｋ−Ｂ＋  、あるいはＴｒｋ−Ｃ＋  であることが分かったため、これらの細胞表面マーカータンパクを用いて、細胞をソーティングすることで、Ｎｅｓｔｉｎ＋  の細胞を分取することができることが証明された。
【００４０】
＜虹彩組織由来Ｎｅｓｔｉｎ＋細胞の網膜細胞への分化誘導＞
上記の方法に従って、虹彩由来細胞を培養した細胞を生きた状態のままで、ｐ７５、Ｔｒｋ−Ａ、Ｔｒｋ−Ｂ、およびＴｒｋ−Ｃの抗体を用いて細胞を標識し、その陽性細胞をセルソーターでソーティングして、細胞を回収した。
回収した細胞は、上記実施例で明らかなようにＮｅｓｔｉｎ＋  細胞である。
網膜は、神経細胞の集まりであるため、このＮｅｓｔｉｎ＋  細胞は神経幹細胞（神経前駆細胞）であり、網膜幹細胞であるとも云える。
【００４１】
回収した細胞を、神経細胞成長因子、およびＴＧＦ−β  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙや神経細胞成長因子などの成長因子を含む低血清分化誘導培地で培養し、網膜を構成する様々な細胞への分化誘導効率を評価した。
評価には、神経節細胞、ミューラーグリア細胞、水平細胞、双極細胞、視細胞の各細胞特異的マーカーを用いた。
なお、対象には、ソーティングしていない未処理細胞を用いた。
【００４２】
分化誘導培地で１４日間、培養した細胞を様々な網膜を構成する細胞に、特異的なタンパク質の抗体を用いて染色した。
免疫細胞染色に使用した抗体は、
神経節細胞のマーカータンパク質である、Ｂｒｎ−３ｂに対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）、
ミューラーグリア細胞のマーカータンパク質である、ＣＲＡＬＢＰに対する抗体（Ａｂｃａｍ製）、
水平細胞のマーカータンパク質である、Ｃａｌｂｉｎｄｉｎに対する抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ製）、
双極細胞のマーカータンパク質である、ＰＫＣに対する抗体（Ｓｉｇｍａ製）、
視細胞のマーカータンパク質である、Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎに対する抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ製）
である。
【００４３】
ｐ７５、Ｔｒｋ−Ａ、Ｔｒｋ−Ｂ、およびＴｒｋ−Ｃによってソーティングした細胞では、いずれも網膜を構成する神経節細胞（図５）、ミューラーグリア細胞（図６）、水平細胞（図７）、双極細胞（図８）、および視細胞（図９）に分化誘導することができた。
一方、未処理細胞では、網膜の細胞へ分化させることはできなかった。
【００４４】
＜分化誘導した細胞の電気生理学的機能評価＞
上記の方法で取得した、網膜細胞への分化誘導をした細胞について、神経の細胞として機能する細胞かどうかを、電気生理学的に評価した。
評価法としては、細胞の電気生理学的実験で一般的に用いられているホールセル・パッチクランプ法を実施した。
【００４５】
網膜細胞に分化誘導させた、個々の細胞レベルにおける電気生理学的な機能評価を実施したところ、神経細胞に比較的特異的に観察される内向き電流（Ｎａチャネル）が観察された（図１０）。
【００４６】
遺伝子組み換えを行い、マウスの体の、全ての細胞において、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）の蛍光を発するマウスを用いて、上記記載の方法で回収したｐ７５＋  細胞、Ｔｒｋ−Ａ＋  細胞、Ｔｒｋ−Ｂ＋  細胞、およびＴｒｋ−Ｃ＋  細胞を遺伝的に網膜視細胞に障害を持つｒｄマウスの網膜に移植し、移植前と移植４０日後のマウス網膜電位（ＥＲＧ）を測定した。
【００４７】
移植する前のｒｄマウスの網膜電位は、Ａ波も減衰していたが、特に、Ｂ波の振幅が小さい状態であった（図１１−ａ）。
移植４０日後のｒｄマウスの網膜電位は、特にＢ波の振幅が大きくなっており、網膜電位の回復が観察された（図１１−ｂ）。
【００４８】
さらに、移植した網膜組織の切片標本を作成し、上記記載の網膜を構成する細胞に特異的なタンパク質の抗体を用いて染色したところ、移植した細胞（ＧＦＰ：Ｇｒｅｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎの蛍光を発する細胞）が様々な網膜の細胞層で分化し、種々の網膜細胞に分化していた（図１２）。
【００４９】
＜ヒト虹彩組織細胞＞
倫理委員会での承認を得た後、手術の過程で虹彩組織の一部を切除、破棄する疾患に罹患している方で、実験・研究の同意を得られた方から、通常破棄される虹彩組織を回収した。
得られたＨｕｍａｎ由来の虹彩組織細胞を、未分化な状態を保ったままの状態で増殖させることのできる特殊な培養条件（自己血清、人工血清代替物質、Ｗｎｔ経路のアンタゴニスト、ｂ−ＦＧＦを含む基礎培地）で培養した。
培養したヒト虹彩由来細胞を、実施例３と同様にｐ７５、Ｔｒｋ−Ａ、Ｔｒｋ−Ｂ、Ｔｒｋ−Ｃのぞれぞれと、神経前駆細胞マーカーのＮｅｓｔｉｎ、および網膜神経細胞のマスター遺伝子であるＰａｘ６との共発現について調査した。
【００５０】
培養した細胞を、ＦＡＣＳで解析したところ、
ｐ７５＋  ／Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞の割合は、９９．３％（図１３）、
Ｔｒｋ−Ａ＋  ／Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞の割合は、９５．１％（図１４）、
Ｔｒｋ−Ｂ＋  ／Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞の割合は、９２．２％（図１５）、
Ｔｒｋ−Ｃ＋  ／Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞の割合は、９０．２％（図１６）
であった。
同様に、ｐ７５＋  ／Ｐａｘ６＋  細胞の割合は、９４．３％（図１７）、
Ｔｒｋ−Ａ＋  ／Ｐａｘ６＋  細胞の割合は、９３．９％（図１８）、
Ｔｒｋ−Ｂ＋  ／Ｐａｘ６＋  細胞の割合は、８９．５％（図１９）、
Ｔｒｋ−Ｃ＋  ／Ｐａｘ６＋  細胞の割合は、８０．２％（図２０）
であった。
【００５１】
これらの結果をから詳細に検証すると、例えば、
ｐ７５＋  ／Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞の割合は９９．３％であったが、
ｐ７５−  ／Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞は０％で、
ｐ７５＋  ／Ｎｅｓｔｉｎ−  細胞は０．６７％
であったことから、ヒト虹彩由来細胞においても、ｐ７５＋  細胞は、Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
この発明の活用例として、臨床応用の可能性が非常に高い再生医療への応用が期待できる。
すなわち、この発明の新しい細胞表面マーカーを用いることにより、従来不可能であったセルソーターを用いた神経前駆細胞のみを、生きたままの状態で分離することができるようになった。
さらに、新しい細胞表面マーカーで分離した神経前駆細胞マーカー陽性の細胞を、シャーレの中で網膜細胞へ分化誘導できる培養条件で培養すると、網膜を構成する様々な細胞へ分化誘導できること、網膜神経細胞へ分化誘導した細胞は電気生理学的に機能する細胞であること、分離した神経前駆細胞マーカー陽性の細胞を網膜に障害のあるマウスに移植すると、必要な網膜細胞に分化し、神経ネットワークを構築できるため、電気生理学的な機能評価も回復することがわかった。
これらのマウスの実験結果と同様の結果が、ヒト虹彩由来細胞でもシャーレの中の実験では再現できることがわかった。
したがって、今まで治療方法がなかった網膜疾患に対して、実際に臨床応用ができる可能性が非常に高い新しい治療法への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】単離した培養細胞におけるＮｅｓｔｉｎ＋  ／ｐ７５＋  細胞の発現割合を示す図である。
【図２】単離した培養細胞におけるＮｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ａ＋  細胞の発現割合を示す図である。
【図３】単離した培養細胞におけるＮｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ｂ＋  細胞の発現割合を示す図である。
【図４】単離した培養細胞におけるＮｅｓｔｉｎ＋  ／Ｔｒｋ−Ｃ＋  細胞の発現割合を示す図である。
【図５】分化誘導された網膜を構成する神経節細胞の図である。
【図６】分化誘導された網膜を構成するミューラーグリア細胞の図である。
【図７】分化誘導された網膜を構成する水平細胞の図である。
【図８】分化誘導された網膜を構成する双極細胞の図である。
【図９】分化誘導された網膜を構成する視細胞の図である。
【図１０】分化誘導させた細胞のホールセル・パッチクランプ法による電気生理学的機能評価を示す図である。
【図１１】網膜視細胞に障害を持つｒｄマウスの網膜に分離細胞を移植する前（ａ）と移植４０日後（ｂ）の網膜電位を示す図である。
【図１２】移植細胞が様々な網膜の細胞層で分化（白色部分）していることを示す図である。
【図１３】Ｈｕｍａｎ由来の虹彩組織から単離した培養細胞におけるｐ７５＋  ／Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞の発現割合を示す図である。
【図１４】Ｈｕｍａｎ由来の虹彩組織から単離した培養細胞におけるＴｒｋ−Ａ＋  ／Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞の発現割合を示す図である。
【図１５】Ｈｕｍａｎ由来の虹彩組織から単離した培養細胞におけるＴｒｋ−Ｂ＋  ／Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞の発現割合を示す図である。
【図１６】Ｈｕｍａｎ由来の虹彩組織から単離した培養細胞におけるＴｒｋ−Ｃ＋  ／Ｎｅｓｔｉｎ＋  細胞の発現割合を示す図である。
【図１７】Ｈｕｍａｎ由来の虹彩組織から単離した培養細胞におけるｐ７５＋  ／Ｐａｘ６＋  細胞の発現割合を示す図である。
【図１８】Ｈｕｍａｎ由来の虹彩組織から単離した培養細胞におけるＴｒｋ−Ａ＋  ／Ｐａｘ６＋  細胞の発現割合を示す図である。
【図１９】Ｈｕｍａｎ由来の虹彩組織から単離した培養細胞におけるＴｒｋ−Ｂ＋  ／Ｐａｘ６＋  細胞の発現割合を示す図である。
【図２０】Ｈｕｍａｎ由来の虹彩組織から単離した培養細胞におけるＴｒｋ−Ｃ＋  ／Ｐａｘ６＋  細胞の発現割合を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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