(57)【要約】【課題】ゲニステインの血管新生抑制作用を増強した組成物を提示する。【解決手段】乾燥マイタケを純エタノールにより抽出して得られるマイタケ抽出物とゲニステインを含む組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥マイタケを純エタノールにより抽出して得られるマイタケ抽出物とゲニステインを含む組成物。
【請求項２】
乾燥マイタケの水分含量が、８重量％以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
純エタノールが９９．０容量％以上のエタノールを含有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
マイタケ抽出物とゲニステインの比率が、ゲニステイン１００重量部に対し、マイタケ抽出物が１〜１０００重量部の範囲である請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
血管新生抑制のための、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
請求項５記載の組成物を含有する、医薬組成物。
【請求項７】
血管新生を抑制することが有益な疾患もしくは障害を治療または予防するための、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
疾患もしくは障害が、乾癬、関節炎、網膜症、黄斑変性症およびがんからなる群の中から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
血管新生を抑制することが有益な疾患もしくは障害を治療または予防するための医薬組成物を製造するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれか1項に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、乾癬、関節炎、網膜症、黄斑変性症およびがんからなる群の中から選択される疾患もしくは障害の治療または予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイタケの脂質抽出物及びゲニステインを含有する抗血管新生組成物に関する。
【０００２】
また、本発明は、上記抗血管新生組成物を用いた、血管新生を抑制することが有効な疾患や心身機能障害の治療法または予防法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
血管新生とは、新しい血管の増殖、成長のことを意味する。血管新生は、様々な生理的、病的な状態で重要な役割を果たしている。
健康体においては、創傷治癒における細胞の増殖期に、受傷後の組織への血流回復のために、そして女性の月経期や妊娠期に血管新生が起こる。
健康体では、血管新生の促進や抑制は、「ｏｎ」「ｏｆｆ」の切り替えにより制御されている、「ｏｎ」のスイッチは、血管新生刺激因子であり、「ｏｆｆ」スイッチは、血管新生抑制因子と呼ばれている。
通常の健康体においては、血管新生の促進や抑制を制御するために、血管新生因子と血管新生抑制因子のバランスがとられている。
【０００４】
血管新生のコントロールの欠如は、多くの深刻な疾患を引き起こす。いわゆる「血管新生過剰」が引き起こす疾患は数多く知られている。これらの疾患には、乾癬、関節炎、網膜症、黄斑変性症およびがんなどがある。例えば、がんは、正常な成長や臓器と比べて高い代謝効率を有している。従って、がんはより高い栄養供給を得る為に、より多くの血液を必要とするので、血管形成の抑制は、腫瘍の成長を抑制または制御する１つのメカニズムとなりうる。このように、血管新生抑制因子はこれら疾患の進展を遅延させることができる。
【０００５】
ゲニステイン（Genistein、4,5,7-trihydroxyisoflavone）は、次式：
【化１】
2008303199.tif 000002
で示す、大豆イソフラボンの一種類である。
【０００６】
日本をはじめアジアの人々は性別特有のガン（乳ガン、前立腺ガンなど）や大腸ガン、更年期障害、骨粗鬆症などの罹患率が低いことが疫学的調査から知られている。アジア人は大豆食品を日常的に多く摂取するため、その中に含まれるイソフラボンがその健康に大きく関わっていると考えられている。イソフラボンの中でも特に、ゲニステインは血管内皮細胞増殖と生体内の血管新生形成を抑制することが知られている。ゲニステインは生体内の血管新生形成の抑制作用機序としては、それぞれvascular endothelial growth factor 165, platelet-derived growth factor, matrix metalloprotease-2 やmatrix metalloprotease- 9などの活性抑制を示す（非特許文献１〜１１）。
【０００７】
しかし、ゲニステインの作用は十分とはいえないので、その作用を増強することが要望されている。
【０００８】
一方、マイタケ抽出物としては、水又は熱水による抽出物（特許文献１〜４）や含水エタノールによる抽出物（特許文献５及び６）などの水又は水性溶媒による抽出物が知られている。マイタケの水又は水性溶媒による抽出物は、発がん防止剤（特許文献２）、抗酸化剤（特許文献３）、抗真菌剤（特許文献４）やチロシナーゼ及びα−アミラーゼの酵素阻害剤（特許文献６）として使用できるとされている。しかし、マイタケの脂質抽出物に、ゲニステインの血管新生抑制作用を増強する効果があることは知られていなかった。
【非特許文献１】Polkowski K, et al. Acta Pol Pharm. 57(2):135-55. (2000)
【非特許文献２】S. Kapiotis, et al.  Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17:2868-2874 (1997).
【非特許文献３】Setchell, K, et al. J. Nutr., 131, 1362S-1375S (2001).
【非特許文献４】King, R. A, et al. J. Nutr., 126, 176-182 (1996).
【非特許文献５】Slavin, J. et al. Am. J. Clin. Nutr., 68 (suppl), 1492S-1495S (1998).
【非特許文献６】Xu, X. et al. J. Nutr., 125, 2307-2315 (1995).
【非特許文献７】T Akiyama, et al. J. Biol. Chem. 262:12, 5592-5595, (1987)
【非特許文献８】Y Matsukawa, et al. Cancer Research, 53:6 1328-1331, (1993)
【非特許文献９】J Markovits, et al. Cancer Research, 49:18, 5111-5117, (1989)
【非特許文献１０】Y. Li, et al.  J. Nutr. 132:3623-3631, (2002)
【非特許文献１１】Fotsis T, et al.  J Nutr.  125(3 Suppl):790S-797S.(1995)
【特許文献１】特開平１１−７５７６８号公報
【特許文献２】特開２００１−９７８８１号公報
【特許文献３】特開２００５−２２００８７号公報
【特許文献４】特開２００４−１８９７３７号公報
【特許文献５】特開平８−１３１１３３号公報
【特許文献６】特開２０００−３１９１９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ゲニステインの血管新生抑制作用（抗血管新生作用）を増強することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、マイタケの脂質抽出物とゲニステインとの混合物が、ゲニステインの抗血管新生効果を増強することを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
よって、
（１）本発明は、乾燥マイタケを純エタノールにより抽出して得られるマイタケ抽出物とゲニステインを含有する組成物に関する。
（２）本発明は、乾燥マイタケの水分含量が、８重量％以下である、上記（１）に記載の組成物に関する。
（３）本発明は、純エタノールが９９．０容量％以上のエタノールを含有する、上記（１）または（２）に記載の組成物に関する。
（４）本発明は、マイタケ抽出物とゲニステインの比率が、ゲニステイン１００重量部に対し、マイタケ抽出物が１〜１０００重量部の範囲である上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の組成物に関する。
（５）本発明は、血管新生抑制のための、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の組成物に関する。
（６）本発明は、上記（５）に記載の組成物を含有する、医薬組成物に関する。
（７）本発明は、血管新生を抑制することが有益な疾患もしくは障害を治療または予防するための、上記（６）に記載の医薬組成物に関する。
（８）本発明は、疾患もしくは障害が、乾癬、関節炎、網膜症、黄斑変性症およびがんからなる群の中から選択される、上記（７）に記載の医薬組成物に関する。
（９）本発明は、血管新生を抑制することが有益な疾患もしくは障害を治療または予防するための医薬組成物を製造するための、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の組成物の使用に関する。
（１０）本発明は、上記（６）〜（８）のいずれか１つに記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、乾癬、関節炎、網膜症、黄斑変性症およびがんからなる群の中から選択される疾患もしくは障害の治療または予防方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
驚くべきことに、本発明である、マイタケの脂質抽出物とゲニステインとの混合物は、ゲニステイン単独の場合と比較し、顕著に血管新生抑制作用を増強する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で用いるゲニステインとは、次式：
【化２】
2008303199.tif 000003
の化合物を意味し、自ら調製しても市場より入手してもよい。ゲニステインの起源は、特に限定されないが、好ましくは植物、より好ましくはマメ科植物、特に好ましくは大豆、レッドクローバー（Red clover）である。
【００１４】
本発明におけるマイタケは、サルノコシカ科マイタケ属のきのこをいい、マイタケ（Grifola frondosa）、白マイタケ（Grifola albicans）、チョレイマイタケ（Grifola umbellatus）、トンビマイタケ（Grifola gigantean）等が例示できる。本発明におけるマイタケは、好ましくはグリフォラ・フロンドーサであるマイタケである。マイタケは、子実体及び菌糸体のいずれでもよいが、子実体が好ましい。マイタケは市場より入手することができる。
【００１５】
本発明で用いる、マイタケの脂質抽出物とは、乾燥マイタケを純エタノールにより抽出して得られるマイタケ抽出物を意味する。本発明において用いられるマイタケ抽出物およびマイタケの脂質抽出物は、特に記載がない限り、乾燥マイタケを純エタノールにより抽出して得られるものを意味する。
抽出原料の乾燥マイタケは、１０重量％以下の水分含量を有するマイタケをいう。乾燥マイタケは、好ましくは８重量％以下、より好ましくは７重量％以下の水分含量を有する。乾燥マイタケは、生マイタケを任意の方法（例えば、天日乾燥、加熱乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等）により脱水・乾燥することにより得ることができる。乾燥マイタケは、粉末の形態にあるものが好ましい。
【００１６】
本発明における純エタノールは、１５℃でエタノールを９８．０容量％以上含有するエタノールをいう。純エタノールは、好ましくは９９．０容量％以上、より好ましくは９９．５容量％以上のエタノールを含む。
【００１７】
乾燥マイタケの純エタノールによる抽出は、原料である乾燥マイタケに純エタノールを加えた後、常温で又は加熱下で、一定時間攪拌することにより行う。加熱温度は、通常エタノールの沸点以下の温度であるが、密閉容器中では１２０℃以下の温度とすることもできる。好ましい抽出温度は、常温（室温）である。抽出時間は、特に限定されないが、例えば５分〜１０時間程度である。抽出は、１回又は２回以上行うことができる。
【００１８】
抽出における乾燥マイタケに対する純エタノールの使用量は、乾燥マイタケ１００重量部に対して、純エタノールを１００〜１０００重量部、好ましくは２００〜６００重量部、より好ましくは３００〜５００重量部である。
【００１９】
抽出処理後、濾紙又は濾布による濾過又は遠心分離などの分離手段により純エタノール抽出液を得ることができる。
【００２０】
本発明におけるマイタケの純エタノール抽出物は、上記のエタノール抽出液の状態であってもよい。あるいは、純エタノール抽出物は、抽出液から常法によりエタノールを全面的に又は部分的に除去した状態であってもよい。すなわち、エタノールを実質的に含まない状態でも、エタノールを１〜５０重量％含む状態でもよい。１０〜１５重量％のエタノールを含む抽出物は、保存性がよいことから、好ましい態様である。純エタノール抽出物は、乾燥マイタケに対して２〜１０重量％、より特定的には３〜５重量％（固形分として）の収量で得られる。純エタノール抽出物中の有効成分は不明であるが、純エタノール抽出物は、リン脂質、植物性ステロイドが含まれている。
【００２１】
本発明の組成物中のマイタケ抽出物とゲニステインの重量に基づく比率は、どのような重量比率でも良いが、ゲニステイン１００重量部に対して、マイタケ抽出物が１００〜１０００重量部、好ましくは１００〜4００重量部、より好ましくは１００〜２００重量部の範囲である。
【００２２】
本発明の組成物中における、ゲニステインの含有量は、０．１μg／ｇ〜１００mg／ｇ、好ましくは１．０μg／ｇ〜１００mg／ｇである。
【００２３】
本発明の組成物は、さらに慣用の担体、賦形剤、または添加剤等を含んでもよい。慣用の担体、賦形剤、または添加剤等には、溶媒、植物油、鉱油、脂肪油、流動パラフィン、緩衝剤、保存剤、湿潤剤、キレート剤、抗酸化剤、安定化剤、乳化剤、懸濁化剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、坐剤基剤、浸透促進剤、芳香剤、甘味料、着色料、香料および皮膚保護剤などが挙げられる。これら担体、賦形剤、または添加剤等は、医薬での使用が認められたものであることが好ましい。
【００２４】
溶媒には、水、アルコール、ＢＧ（１，３−ブチレングリコール）、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、液体ポリアルキルシロキサンおよびそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００２５】
植物油には、アーモンド油、ヒマシ油、カカオ脂、ココナツ油、トウモロコシ油、綿実油、亜麻仁油、オリーブ油、パーム油、落花生油、ケシの実油、菜種油、ゴマ油、ダイズ油、ヒマワリ油、小麦胚芽油、米油および茶の実油およびそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。これら食用油は、市販のものであっても自分で調製したものであっても良い。好ましくは、オリーブ油である。
【００２６】
緩衝剤には、クエン酸、酢酸、酒石酸、乳酸、リン酸水素、ジエチルアミンンおよびそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
湿潤剤には、グリセリン、プロピレングリコール、ペンチレングリコール、ソルビトール、乳酸、尿素、ＢＧ（１，３−ブチレングリコール）、ダイズステロールおよびそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００２７】
キレート剤には、ＥＤＴＡナトリウム、クエン酸およびそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
抗酸化剤には、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸およびその誘導体、α−、β−、γ−、δ−トコフェロール（tocopherol）およびその誘導体、α−、β−、γ−、δ−トコトリエノール（tocotrienol）およびその誘導体、システインならびにそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００２８】
乳化剤には、天然ゴム（例えば、アカシアゴム）、トラガカントゴム、キサンタンガム；天然ホスファチド（例えば、ダイズレシチン）；モノオレイン酸ソルビタン誘導体；羊毛脂；羊毛アルコール；ソルビタンエステル；モノグリセリド；脂肪アルコール（例えばベヘニルアルコール）；脂肪酸エステル（例えばトリ（カプリル／カプリン酸）グリセリル、ステアリン酸グリセリル（ＳＥ）のような脂肪酸のトリグリセリド）；およびそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００２９】
懸濁化剤には、セルロースおよびその誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、カラゲナン、アカシアゴム、アラビアゴム、トラガカントおよびそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００３０】
ゲル基剤および増粘成分には、流動パラフィン、ポリエチレン、脂肪油、コロイドシリカまたはアルミニウム、亜鉛セッケン、グリセロール、プロピレングリコール、トラガカント、カルボキシビニルポリマー、ケイ酸マグネシウム−アルミニウム、親水性ポリマー（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースおよび他のセルロース誘導体などのセルロース誘導体）、水膨潤性親水コロイド、カラゲナン、ヒアルロン酸塩（例えば、塩化ナトリウムを選択的に含むヒアルロン酸ゲル）、アルギン酸エステル（例えば、アルギン酸プロピレングリコール）およびそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００３１】
軟膏基剤には、蜜蝋、パラフィン、セタノール、パルミチン酸セチル、セテアリルアルコール  ステアリン酸ポリグリセリル−１０、ステアリン酸、ステアリン酸ＰＥＧ−１５０、植物油、脂肪酸のソルビタンエステル、ポリエチレングリコール、脂肪酸のソルビタンエステルと酸化エチレンとの間の縮合生成物（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）およびそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００３２】
疎水性軟膏基剤には、パラフィン、植物油、動物脂、合成グリセリド、ろう、ラノリン、液体ポリアルキルシロキサンおよびそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００３３】
親水性軟膏基剤には、固体マクロゴール（ポリエチレングリコール）などが挙げられるが、これに限定されることはない。さらに、慣用の担体、賦形剤、または添加剤等には、スクワラン、レシチン、水添レシチン、テトラへキシルデカン酸アスコルビル、アラントイン、グリチルリチン酸２Ｋ、グリコシルトレハロース、加水分解水添デンプン  加水分解コラーゲン  バラエキス、ジメチコン、カプリリルグリコール、ベタイン、ステアロイルグルタミン酸Ｎａ、ノバラ油、バチルアルコール、ハイドロプロキシプロリンなどが挙げられる。
【００３４】
組成物中における、マイタケ抽出物とゲニステインをあわせた合計量の含有率は、例えば０．１〜９９．９重量％、好ましくは１〜９９％である。残りの部分は、慣用の担体、賦形剤、または添加剤等である。
【００３５】
本発明で用いられる、血管新生を抑制するとは、新しい血管の増殖や成長を阻害または抑制する作用を意味する。
【００３６】
本発明で用いられる、血管新生を抑制することが有益な疾患もしくは障害とは、血管新生を抑制することにより、疾患もしくは障害の進行が抑制されたり、または症状が改善もしくは軽減されたりする疾患もしくは障害を意味し、例えばがん、網膜症、黄斑変性症、乾癬および関節炎などが挙げられる。好ましくは、がん、乾癬、関節炎である。
【００３７】
本発明で用いられる、乾癬とは、例えば尋常性乾癬、 膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、関節症性乾癬、滴状乾癬などを意味する。
【００３８】
本発明で用いられる、関節炎とは、例えば変形性関節症、顎関節症やリウマチ性関節症を意味する。好ましくは、滑膜炎を伴うリウマチ性関節症を意味する。
本発明で用いられる、網膜症とは、例えば糖尿病網膜症、高血圧網膜症を意味する。
本発明で用いられる、黄斑変性症とは、例えば加齢黄斑変性症を意味する。好ましくは、滲出型の加齢黄斑変性症を意味する。
【００３９】
本発明で用いられる、がんとは、悪性腫瘍を意味し、例えば皮膚がん、肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌、子宮癌、卵巣癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫などが挙げられる。好ましくは、メラノーマなどの皮膚がん、乳癌である。
【００４０】
本発明で用いられる、治療とは、既に発症している疾患もしくは障害の進行を抑制したり、または症状を改善もしくは軽減することを意味する。また、本発明で用いられる、予防とは、疾患もしくは障害の発症を防ぐことまたは遅らせることを意味する。
【００４１】
本発明で用いられる、治療や予防の対象は、哺乳動物、例えば、ヒト；犬、猫等の愛玩動物；ウシ、ブタ、ニワトリ等の家畜動物であるが、特にヒトであることが望ましい。
【００４２】
本発明で用いられる、投与とは、全身投与、局所投与であってよく、全身投与、局所投与は、経皮投与、舌下投与、経口投与、経腸投与、筋肉内投与、皮下投与、静脈投与、経鼻投与、点眼などいずれの投与形態であってもよい。好ましくは、経皮投与、舌下投与である。
【００４３】
本発明で用いられる、疾患もしくは障害を治療または予防するために有効な投与量は、疾患もしくは障害の程度、投与方法によって異なり、血管新生を抑制するために有効な量であれば限定されないが、ゲニステインの量が、０．０１mg〜１００mg／体重ｋｇ・日、好ましくは０．１mg〜１０mg／体重ｋｇ・日、より好ましくは０．１mg〜１．０mg／体重ｋｇ・日である。
【００４４】
本発明の組成物は、これら疾患もしくは障害の治療や予防のための医薬の製造のために用いることができる。医薬の形態は、たとえば、クリーム、舌下剤、マッサジ油、溶液、懸濁液、ローション、軟膏、ゲル、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、坐剤を挙げることができる。好ましくは、クリーム、舌下剤、マッサジ油である。
【００４５】
本発明の組成物は、さらに血管新生抑制作用を有する他の薬剤を含んでもよい。
【００４６】
本発明について、以下の例によって更に説明する。ただし本発明は以下に示す例に限られたものではないことを理解されたい。
【実施例１】
【００４７】
１−１：マイタケ抽出物の製造
マイタケの滅菌乾燥粉末（水分含量：６重量％、ホクト（株）の「乾燥舞茸Ｂ−１−Ａ」）１０００ｇに純エタノール（水分含量：９９．５容量％以上）４０００ｇを加え、２０℃にて１８時間にわたり攪拌しながら抽出した。残渣を遠心分離により除去し、得られた上澄みを濾紙により濾過した。得られた濾液からエタノールを蒸発・除去して、マイタケの純エタノール抽出物（収量４３．２ｇ、内固形分３７．２ｇ及びエタノール６．０ｇ）を得た。
【００４８】
１−２：マイタケ抽出物−オリーブオイル溶液の調製
１−１で調製したマイタケ抽出物をオリーブオイル（モレノ製のエキストラバージン））に混合し（マイタケ抽出物：オリーブオイル＝１：９）、マイタケ抽出物−オリーブオイル溶液を調製した（マイタケ抽出物１０重量％含有）。
【００４９】
１−３：ゲネステイン（Genistein）溶液の調製
ゲネステイン原料（Jian-Feng Natural Product R&D Co.,Ltd製のSoy bean Extract, これは９５重量％ゲネステイン含有製品である）１．０ｇを９９．９容量％エタノール５０mlに混合させ、密閉容器に入れ、５０℃にて３０分間振動水浴し、十分に溶けるまで攪拌した。この溶液を５０００回転数、２５℃で５分間遠心し、上清を回収した（ゲネステイン濃度２０mg／ml）。
【００５０】
１−４：サンプルの調製
１．コントロール：オリーブオイルに同量のエタノールを混合した混合液である。
２．ゲネステイン混合液：１−３で調製したゲネステイン溶液に同量のオリーブオイルを混合した混合液である。混合液中の組成は、オリーブオイル５０重量％、エタノール５０重量％、ゲネステイン濃度１０mg／mlである。
３．マイタケ抽出物混合液：１−２で調製したマイタケ抽出物−オリーブオイル溶液（マイタケ抽出物：オリーブオイル＝１：９）に同量のエタノールを混合した混合液である。混合液中の組成は、マイタケ抽出物５重量％、オリーブオイル４５重量％、エタノール５０重量％である。
４．マイタケ抽出物−オリーブオイル溶液とゲネステイン溶液の混合液の調製：１−２で調製したマイタケ抽出物−オリーブオイル溶液と１−３で調製したゲネステイン溶液を１：１で混合し、マイタケ抽出物−オリーブオイル溶液とゲネステイン溶液の混合液を調製した。混合液中の組成は、マイタケ抽出物５重量％、オリーブオイル４５重量％、エタノール５０重量％、ゲネステイン濃度１０mg／mlである。
【００５１】
１−５：正常ヒト微小血管内皮細胞とその培養培地の調製
実験材料
１．正常ヒト微小血管内皮細胞（Human Micro Vascular Endothelial Cell, HMVEC）
HMVEC（製品番号：KE-4309、凍結、バイエル）はクラボウ（倉敷紡績株式会社）から購入した。
２．正常ヒト微小血管内皮細胞増殖用低血清液体培地（以下、全てクラボウから購入した）
１）正常ヒト微小血管内皮細胞増殖用液体培地（（ＨｕＭｅｄｉａ−ＭｖＧ）、製品番号：ＫＥ−２５５０、５００mlボトル）
２）血管内皮細胞基礎培地（（ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ−２）、製品番号：ＫＥ−２３５０Ｓ、５００mlボトル）
３）ＨｕＭｅｄｉａ−ＭｖＧ増殖添加剤セット（製品番号：ＫＥ−６５５０）
増殖添加剤セットの内容を表−１に示す。
【００５２】
【表１】
2008303199.tif 000004
【００５３】
正常ヒト微小血管内皮細胞の培養
１．培養容器に２５cm２あたり２〜３mlの接着因子を入れ、３７℃で３０分以上放置し、その後除去した。
２．解凍した正常ヒト微小血管内皮細胞１mlを４mlの増殖用液体培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＭｖＧ、添加剤混合済み）に入れ、細胞数を密度約５０００個／cm２となるよう調整し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下、インキュベーターで２４時間培養した。６０〜８０％コンフルエントで継代培養を行った。
３．継代培養には接着因子コ−ティング済みの新しい培養容器を用意した。細胞を培養している容器から培地を除去し、事前に３７℃で暖めたトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（製品番号：ＨＫ−３１２０）２mlを添加し、室温で約１分間放置し細胞を分離させた。その細胞に５mlのＨＥＰＥＳ緩衝液（製品番号：ＨＫ−３３２０）を添加し、細胞を１５ml遠心管に回収した。さらに同量のトリプシン中和液（製品番号：ＨＫ−３２２０）を入れ、１２００回転、５分間、４℃で遠心し、上清を除去後、細胞を１０mlの培地に再度浮遊させ、用意した新しい培養容器に入れ、３７℃、５％ＣＯ２条件下、インキュベーターで２４〜４８時間培養した。
【００５４】
１−６：In vitro 血管新生実験（Tube Formation Assay）
実験材料：
１．実験キット：In Vitro Angiogenesis Assay Kit:CHEMICON（登録商標）（Cat.No. ECM625.）から購入。
<1>  ECMatrixTM Gel Solution：（Part No. 90060）、５×１ml
<2>  ECMatrixTM Dilution Buffer  １０倍濃縮液：（Part No. 90061）、１×１ml
２．１−５で調製した正常ヒト微小血管内皮細胞（Human Micro Vascular Endothelial Cell, HMVEC）
【００５５】
実験方法：
１．正常ヒト微小血管内皮細胞（Human Micro Vascular Endothelial Cell, HMVEC）の培養：１−５に記載のようにＨＭＶＥＣは８０％〜９０％コンフルエント状態で用意した。
２．ECMatrixTM Gelのコ−ティング
<1>  ECMatrixTM Gel Solution  １mlとECMatrixTM Dilution Buffer  １０倍濃縮液１mlを氷水（４℃以下）で解凍した。
<2>  ECMatrixTM Dilution Buffer  １０倍濃縮液１１１μlをECMatrixTM Gel Solution  １mlに添加し、空気泡が出ないように軽く混ぜた。
<3>  ９６ウェル培養プレートもアルミホイルでカバーした氷の上で冷却した。
<4>  希釈したECMatrixTM Gel Solutionを空気泡が出ないように注意しながら５０μl／ウェルとなるよう９６ウェル培養プレートに入れた。
なお、以上の作業はすべて４℃以下状態で行った。
<5>  この９６ウェル培養プレートを３７℃にてインキュベーターで１時間培養した。
１．ＨＭＶＥＣ細胞の用意：ＨＭＶＥＣ細胞を培養していた容器から培地を除去し、事前に３７℃に加温したトリプシン／ＥＤＴＡ溶液２mlを入れ、室温で約１分間放置し、細胞を分離させた。その細胞に５mlのＨＥＰＥＳ緩衝液を添加し、細胞を１５ml遠心管に回収した。さらに同量のトリプシン中和液を入れ、１２００回転数、５分間、４℃で遠心した。上清を除去後、細胞を増殖用液体培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＭｖＧ）１０mlに再度浮遊させ、顕微鏡下で細胞数を数えた後に同培地を用いて３×１０５cells／mlに調整した。
２．調整した細胞を１００μl／ウェル（３×１０４cells／ウェル）となるよう９６ウェル培養プレートに入れた。
３．サンプルの添加：用意したサンプルを増殖用液体培地で希釈し、各サンプル５０μlをウェルに添加した。この際の、サンプル最終濃度を以下に示す。
<1>  コントロール：オリーブオイル０．２５重量％、エタノール０．２５重量％
（以下のサンプルは全てオリーブオイル０．２５重量％、エタノール０．２５重量％を含有している。）
<2>  ゲネステイン：１２．５、２５、５０μg／ml
<3>  マイタケ抽出物：０．０６２５、０．１２５、０．２５重量％（６２．５、１２５、２５０μg／ml）
<4>  ゲネステイン＋マイタケ抽出物：１２．５、２５、５０μg／mlのゲネステイン＋０．０６２５、０．１２５、０．２５重量％（６２．５、１２５、２５０μg／ml）のマイタケ抽出物
【００５６】
以上サンプルの最終濃度は表−２に示す。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
１．この９６ウェル培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２条件下、インキュベーターで１６時間培養した。
２．１６時間培養後（End Point Assay）、９６ウェル培養プレートを取り出し、倒立光学顕微鏡４０×倍率で細胞の管腔形成状態を撮影し、記録した。
【００５９】
管腔形成状態の判断
管腔形成パターンの識別
１６時間培養後に光学顕微鏡４０×倍率で記録した細胞の管腔形成の状態を以下の分類に従いスコア化した。
【００６０】
【表３】
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【００６１】
そして、図１に管腔形成値（Values）０、１、２、３、４および５と判断される細胞の管腔形成の状態の写真を示す。
【００６２】
結果：
各サンプルの血管新生（管腔形成）平均値（Ｎ＝６）と標準差（ＳＤ）は以下の表に示す。
管腔形成平均値＝（６つのウェルにおける管腔形成値の合計）／６
【００６３】
【表４】
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【００６４】
各サンプルの血管新生（管腔形成値）の平均値（Ｎ＝６）と標準差（ＳＤ）を図２に示す。
【００６５】
コントロール（図２のコントロール）およびマイタケ抽出物単独低濃度（図２のマイタケ抽出物６２．５μg／ml）における管腔形成は、６つのウェルすべてにおいて管腔形成の値５（平均値５）を示したのに対し、ゲネステイン単独低濃度（図２のゲネステイン１２．５μg／ml）の管腔形成平均値は４．６６７で弱い血管新生抑制傾向が見られ、同じ低濃度のゲネステイン＋マイタケ抽出物（図２のゲネステイン１２．５μg／ml＋マイタケ抽出物６２．５μg／ml）でも同様の結果であった。
【００６６】
ゲネステイン単独の中濃度（図２のゲネステイン２５μg／ml）では管腔形成平均値は４を示しで弱い血管新生抑制作用が認められた。マイタケ抽出物単独の中濃度（図１のマイタケ抽出物１２５μg／ml）の管腔形成平均値は４．８３３であった。同じ中濃度のゲネステイン＋マイタケ抽出物（図２のゲネステイン２５μg／ml＋マイタケ抽出物１２５μg／ml）による管腔形成の平均値は３であり、顕著な抑制作用が観察された。
【００６７】
さらに、ゲネステイン単独の高濃度（５０μg／ml）では管腔形成平均値が２を示し、同じ高濃度のゲネステイン＋マイタケ抽出物（図２のゲネステイン５０μg／ml＋マイタケ抽出物２５０μg／ml）による管腔形成平均値は０．１６７であり、強力な血管新生抑制作用が観察された。一方、マイタケ抽出物は、低−中濃度（６２．５μg−１２５μg／ml）において、管腔形成に影響を及ぼさないが、高濃度（図２のマイタケ抽出物２５０μg／ml）において、中濃度ゲネステイン（２５μg／ml）と同程度（管腔形成平均値４）の血管新生抑制作用を示した。
【００６８】
これらの結果より、マイタケ抽出物及びゲネステインは抗血管新生作用を示し、かつ両者の併用が抗血管新生作用を増強することが示めされた。
【００６９】
図３−１、２、３に、各サンプルの血管新生（管腔形成）の代表的な写真を示す。コントロールでは、細胞によるメッシュ様構造の発達が観察され、管腔形成が示唆されるが、高濃度のゲネステイン＋マイタケ抽出物（ゲネステイン５０μg／ml＋マイタケ抽出物２５０μg／ml）では、細胞によるメッシュ様構造は観察されず、細胞の分散が観察され、管腔形成の抑制が示唆される。
【００７０】
本発明について例を参考に述べたが、発明の範囲を逸脱しない限り、様々な応用または改善は可能である。さらには、同様の特徴を持つことが知られている物質については、この明細書にて詳述したものと同様に扱われるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の抗血管新生性組成物は幅広い様々な疾患に対する治療、予防に有益である。これらの疾患には、乾癬、関節炎、網膜症、黄斑変性症、乾癬、およびがんなどの血管新生が関与する疾患が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】細胞の管腔形成の状態の写真を示す。値（Values）０、１、２、３、４および５は、管腔形成値（Values）を示す。
【図２】各サンプルの血管新生（管腔形成）阻害作用を示す。血管新生（管腔形成）平均値が小さいほど血管新生（管腔形成）が阻害されていることを表す。Ｎ＝６は、１サンプルあたり６ウェルが測定に用いられたことを表す。
【図３−１】各サンプルの血管新生（管腔形成）の代表的な写真を示す。
【図３−２】各サンプルの血管新生（管腔形成）の代表的な写真を示す。
【図３−３】各サンプルの血管新生（管腔形成）の代表的な写真を示す。
【図２】
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【図１】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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