(57)【要約】【課題】各種の試験、研究で培養される等して使用される細菌を、無凍結状態で保存するにあたり、細菌の菌数の増減がない保存方法を提供する。【解決手段】細菌（大腸菌）を保存するための保存装置１を、大腸菌を入れるための保存室２と、該保存室２内を静電場雰囲気にするための電極３と、該電極３を接続し大腸菌を配置するための棚部４とを備えて構成し、−６℃の氷点下、３０００Ｖの静電気雰囲気下の保存条件で大腸菌を保存したため、大腸菌は、保存してから４週間経過した後も最初の菌数と略同じであり、つまり菌数の増減が殆ど無かった。【選択図】図２
2008092842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被保存物を保存するための保存室と、
該保存室内を冷却するための冷却手段と、
前記保存室内を静電場雰囲気にするための電極とを備えた保存装置で保存するための保存方法において、
前記被保存物を、氷点下、静電場雰囲気下のもとで無凍結状態で保存するにあたり、
被保存物は細菌であり、該細菌は、菌数の変化が殆どない状態で保存されることを特徴とする被保存物の保存方法。
【請求項２】
細菌は、培養可能な状態で保存されることを特徴とする請求項１記載の被保存物の保存方法。
【請求項３】
細菌は大腸菌とし、保存条件は−６℃の氷点下、２０００〜３０００Ｖの静電場雰囲気下であることを特徴とする請求項１または２記載の被保存物の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌に代表される細菌を無凍結状態で保存するための被保存物の保存方法の技術分野に属するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、大腸菌を培養して各種の試験、研究がなされており、このような場合に使用される大腸菌としては、予め培養したものが使用されることが多い。このような大腸菌の培養は、液体培地や寒天培地等の培地に種となる大腸菌を接触させて接触培地を製造し、該接触培地を適当な温度雰囲気下に置くことで増殖していくことになるが、この場合に、前記接触培地を多数製造したものを保存しておき、使用の都合に合わせてその都度接触培地を取り出して培養させることができれば、培養効率の向上が図れ、都合がよい。
【０００３】
ところでこのような保存方法として、低温雰囲気下（例えば氷点以上１０℃以下）に設定した冷蔵庫による保存、氷点下雰囲気下に設定した冷凍庫による保存があるが、冷蔵庫による保存では後述するように大腸菌が時間の経過と共に減少していき、大腸菌を接触した状態を維持できないという問題がある。さらに冷凍庫による保存では、解凍の手間がかかるうえ、凍結による細胞内外の水分の結晶化により組織破壊が起こる可能性があって保存が難しいという問題がある。
【０００４】
そこで、庫内を静電場雰囲気下にして氷点下であっても凍結しないようにした保存方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００５−１１２８３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そしてこのものには、細菌も保存対象である旨の記載があるが、どのような状態で細菌が保存されるかについての言及がなく、その効果については不明であり、ここに本発明が解決しようとする課題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記の如き実情に鑑みこれらの課題を解決することを目的として創作されたものであって、請求項１の発明は、被保存物を保存するための保存室と、該保存室内を冷却するための冷却手段と、前記保存室内を静電場雰囲気にするための電極とを備えた保存装置で保存するための保存方法において、前記被保存物を、氷点下、静電場雰囲気下のもとで無凍結状態で保存するにあたり、被保存物は細菌であり、該細菌は、菌数の変化が殆どない状態で保存されることを特徴とする被保存物の保存方法である。
請求項２の発明は、細菌は、培養可能な状態で保存されることを特徴とする請求項１記載の被保存物の保存方法である。
請求項３の発明は、細菌は大腸菌とし、保存条件は−６℃の氷点下、２０００〜３０００Ｖの静電場雰囲気下であることを特徴とする請求項１または２記載の被保存物の保存方法である。
【発明の効果】
【０００７】
請求項１の発明とすることにより、細菌の菌数の変化が殆ど無い保存が可能であり、各種の試験、研究をするために有効な保存が可能である。
請求項２の発明とすることにより、前記試験等をするための保存方法として有用である。
請求項３の発明とすることにより、大腸菌の菌数の変化が殆どない状態での保存を実効あるものとすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
次に、本発明の実施の形態について、図面に基づいて説明する。図面において、１は、被保存物を保存するための保存装置であって、該保存装置１は、大腸菌を入れるための保存室２と、該保存室２内を静電場雰囲気にするための電極３と、該電極３を接続し大腸菌を配置するための棚部４とを備えて構成されている。本実施の形態の被保存物は、細菌である。
【０００９】
前記保存室２は、図１（Ｂ）の図面視前側が開口しており、ここに開閉自在な扉部２ａが設けられている。
前記棚部４は、アルミニウム等の導電性部材から形成され、接続された電極３を介して電圧を印加すると電子を放出して、保存室２内に静電場雰囲気を形成することができるようになっている。
本実施の形態の棚部４は、左右の縦板４ａと、該縦板４ａとの間に間隙を存して介装される上下複数枚の横板４ｂと、背面板４ｃとを備えて矩形状に形成され、最上段の横板４ｂの上面から突出した突出片４ｄに前記電極３が接続され、そして該電極３から電圧を印加することで棚部４の全体から電子を放出できるようになっている。
【００１０】
さらに大腸菌は、最上段を除いた横板４ｂに配置されることになる。因みに、本実施の形態の棚部４は、外部に電流が漏れることを防止するための配慮として、保存室２および扉部２ａの内周面とは適当な間隔を存し、この間隙に絶縁碍子５を介した状態で保存室２内に配設されている。
【００１１】
また、前記電極３は、図示しない外部電源（交流または直流）から変圧器６を介して電圧が印加されるが、変圧器６で変圧され電極３に印加される電圧はおよそ１００Ｖ〜７０００Ｖであり、１００Ｖ〜３０００Ｖであることが好ましく、さらに好ましくは、３０００Ｖであることが好ましいが、印加する電圧は、被保存物や保存状態により適宜選択することができる。因みに、図１（Ｂ）において、１１は、電極３と、変圧器６と、外部交流電源とのあいだに配される電気配線である。
【００１２】
７は保存室２を冷却するための冷却装置であって、該冷却装置７は、保存室２内の温度を−２０℃〜４０℃程度に設定することができるが、保存を確実にするためには室内温度を氷点下に設定することが好ましく、本実施の形態では、さらに好ましい−６℃に設定していて恒温状態になっている。
【００１３】
８は扉部２ａの開閉を検知するための開閉センサであって、開閉センサ８は、保存室２の扉部２ａに近接する位置に備えられ、検知結果を図示しない制御部に出力するものであるが、該制御部は、電極３に電圧を印加するか否かの判断を、開閉センサ８が扉部２ａの閉鎖を検知したときには電圧印加の制御を実行、開放しているときには電圧印加の停止をするよう制御している。
【００１４】
尚、図１において、１４は保存装置の脚部である。
【００１５】
［実験１］：大腸菌の保存実験
まず、液体培地の作成であるが、該液体培地は、粉末の液体培地原料（トリプトソイブイヨン培地：栄研化学株式会社製）３０グラムを１リットルの蒸留水に溶解した溶解物を製造し、該溶解物を７ミリリットルづつ蓋付き試験管に分中し、該分中した溶解物をオートクレーブ（オート高圧減圧減菌器３０Ｄ：株式会社平山製作所製）で１２１℃の温度で２０分間高圧減菌して作成した。尚、液体培地は、高圧滅菌が終了すると、室温になるまで温度を低下させた後、冷蔵庫で保管した。
【００１６】
次に、寒天培地の作成であるが、該寒天培地は、粉末の寒天培地原料（トリプトソイ寒天培地：栄研化学株式会社製）４０グラムを、三角フラスコの中で１リットルの蒸留水にて溶解し、前記オートクレーブにて１２１℃、２０分間高圧減菌して作成する。前記寒天培地は、減菌終了後約６６℃の温度に低下後、オートピペットを用いて、減滅シャーレ（旭テクノグラス株式会社製）に１２ミリリットルずつ分注し室温にて静置して固める。
【００１７】
まず大腸菌は前記寒天培地で培養されるが、該培養された大腸菌の１コロニーを白金耳で採取し、これを液体培地、７ミリリットルの中に入れて溶解し、３７℃の培養器の中に１８時間静置し、大腸菌を培養して菌の濃度を増やして菌液を作成する。該培養後の菌液の菌の濃度は、約１０９ＣＦＵ／ｍｌと推察される。因みにＣＦＵ／ｍｌは、１ミリリットル中に細菌（大腸菌）が幾つ存在しているかを表したものであり、例えば、前記１０９ＣＦＵ／ｍｌは、１ミリリットル中に大腸菌が１０９個存在していることを表している。
【００１８】
前記菌液を液体培地で１０００倍の希釈をして菌濃度を約１０６ＣＦＵ／ｍｌとしたうえで、この希釈された菌液を試験管１２に入れるが、該試験管１２は６本作り、これを実験に使用した。このうち３本の試験管１２を前記保存装置１に入れ、庫内温度を−６℃、印加電圧を３０００Ｖとした静電場雰囲気下で保存し、残りの３本の試験管１２については汎用の冷蔵庫（庫内温度４℃）に保存し、１週間ごとに、４週間後まで培養液中の大腸菌数を計測した。
【００１９】
培養液中の菌数の計算法については次のようにした。
前記保存した元の大腸菌液０．１ミリリットルを、０．９ミリリットルの生理食塩水が入った希釈用チューブに入れて混合し、１０倍希釈液を作成する。さらに同様にして１０倍希釈を繰り返し、１００倍希釈液、１０００倍希釈液を作成する。前記元の大腸菌液、およびそれぞれの希釈液の０．１ミリリットルを前記シャーレに作成した寒天培地上に注ぐ。そして該シャーレを回転台の上に置き、回転させながらコンラージ棒で、菌液を寒天培地上に満遍なく広げる。菌液が寒天培地の中に染み込んだのを確認後、３７℃の培養器の中に１８時間静置し、培養する。１８時間後、寒天培地上の細菌のコロニー数を計測し、希釈倍率からもとの菌液の濃度を算出する。寒天培地上の細菌のコロニー数を計測し、解釈倍率から元の菌液の濃度を算出する。一方、寒天培地上のコロニー数が、３０から３００個以内に収まっている希釈菌液からも菌液濃度を算出する。
【００２０】
この算出結果を図２（Ａ）に示すが、これによると、保存装置１（−６℃）による保存では、実験開始時の菌数は、平均８．７×１０５ＣＦＵ／ｍｌ、終了時の４週間後の菌数は、平均８．８×１０５ＣＦＵ／ｍｌと、大腸菌数の変化は、途中段階も含めて認められなかった。これに対し冷蔵庫（４℃）による保存では、大腸菌数は、保存期間に比例して減少していることが、つまり、実験開始時の菌数は平均６．８×１０５ＣＦＵ／ｍｌであったが、４週間後の実験終了時の菌数は、平均１７７ＣＦＵ／ｍｌまでと、途中を含めて略直線的に減少しており、−６℃保存と比較し、有意に菌数が減少していることが確認された。
【００２１】
因みに、算出結果は、３つの検体の平均および標準偏差で示した。図２（Ａ）のグラフの横軸は時間経過を縦軸は菌数を示し、該横軸に示した菌数は、自然対数で表示した。
統計処理は、ｒｅｐｒｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ＡＮＯＶＡ  で検定後、Ｐｏｓｔ−ｈｏｃとして、Ｓｃｈｅｆｆｅ（群間の比較）およびＤｕｎｎｅｔｔ（実験開始時からの比較）の検定を用い、ｐ値＜０．０１にて、有意差ありとした。
【００２２】
前記実験１の結果により、保存装置１を用いた氷点下静電場雰囲気下(−６℃、３０００Ｖ)による無凍結状態での保存をすることで、大腸菌は、菌数の増減がない大腸菌を培地に接触させた当初の状態で保存されていることが確認された。そして該保存された大腸菌は培養可能であることが確認されている。
【００２３】
［実験２］：保存メカニズムの確認実験
実験２では、前記保存のメカニズムが温度にあるのか、静電場にあるのかを明らかにすることを目的とした。保存装置１の温度を４℃に設定し、前記実験１の時と同等の電圧を印加した状態で、実験１と同様の実験を行い、大腸菌の生存状態を、前記公知の冷蔵庫（４℃）と比較し、大腸菌保存の有用性ついての検討を行った。
本実験は、保存装置１の保存室２内の温度を４℃に設定すること以外は、前記実験１の工程と同じ装置、工程で行われるため、装置、工程の説明を省略し、以下に本実験の結果について説明する。
【００２４】
実験結果を図２（Ｂ）のグラフ図に示すが、保存装置１での保存（４℃、３０００Ｖ）したものは、前記冷蔵庫での保存（４℃）ともに、大腸菌数は、保存期間に比例的に滅少していることが確認された。本実験における保存装置１での大腸菌の保存では、実験開始時の菌数は、平均１４．９×１０５ＣＦＵ／ｍｌであったが、４週間後の実験終了時には、平均４０ＣＦＵ／ｍｌまで減少していた。同様に前記冷蔵庫の保存では、実験開始時の菌数が平均１１．９×１０５ＣＦＵ／ｍｌであったが、４週間後の実験終了時には、平均９３ＣＦＵ／ｍｌまで減少していた。
【００２５】
実験１と実験２との比較から保存装置１の温度を−６℃から４℃に上昇させると、冷蔵庫保存と同様の菌数減少の結果が得られたことから、保存装置１における大腸菌の生存メカニズムとしては、電極３に電圧を印加した静電場雰囲気下の影響というよりも、−６℃という氷点下でかつ静電場雰囲気下にして生じる非凍結の状態が、大腸菌にとって増減のない保存環境であると考えられる。
【００２６】
［実験３］：マウスによる保存効果確認実験
安楽死させて処理したマウスＭについてその保存状態を確認した。マウスは、さまざまな細菌が体内に繁殖している有菌マウス（通常のマウス）を用い、これを安楽死させてマウスＭの死体を得た。尚、本実施の形態のマウスの安楽死は、頚椎を脱臼させて行った。このように処理したマウスＭは、図３に示すように、安楽死させたそのままの状態でラップ９で包み、トレイ１３に載せ庫内温度が−６℃で、２０００Ｖの電圧が印加された静電気雰囲気下の保存装置１に保存するが、本実験では、該保存装置１の他に、庫内温度が４℃の前記冷蔵庫（ＭＲ−１７０２Ａ：三菱電機株式会社製）と、庫内温度が−２０℃の第一冷凍庫（ＳＪ−５４Ｇ：シャープ株式会社製）と、庫内温度が−８０℃の第二冷凍庫（ＵＬＴＲＡ  ＬＯＷ：三洋電機株式会社製）とに保存し、それぞれ安楽死直後、１日経過後、３日経過後、そして７日経過後のものについてマウスを解剖して検体（膵臓、腎臓、肝臓等の臓器）を摘出したうえ該検体をヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ  染色）法で染色後、生物顕微鏡（ＡＨＢＴ３：オリンパス株式会社製）を用いて観察（倍率１００倍）し、安楽死直後の状態とその他の状態とを比較した。因みに、前記観察をするにあたり、マウス（第一、第二冷凍庫で保存したものについては、９０分間自然解凍した後のマウス）を開腹して取り出した検体を中性緩衝ホルマリン液で固定し、該固定した状態で４８時間経過させた後、検体を固定液から取り出して１６時間水洗い（水道水）して固定液を除去し、さらに自動包埋機（ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ  ＩＩ  マイルス・三共製）でパラフィン包埋により作成されたパラフィンブロックを、ミクロトーム（大和光機工業株式会社）で５マイクロメートルの厚さに薄切りしたものを観察した。
【００２７】
この比較結果を図４の表図に示し、以下説明する。尚、本実施の形態のラップ９は、ポリ塩化ビニリデンからなるフィルムを使用したが、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリメチルベンテン、またはこれらを積層したものであってもよい。
【００２８】
まず、前記観察の他に肉眼で所見を行ったのでこの結果から説明するが、この所見において、保存装置１に保存した検体（臓器）は１日、３日、７日後の何れにおいても臭い、変色、水分流出が見られず安楽死直後の状態が保たれていたのに対し、冷蔵庫に保存した検体は、１日後から腐敗臭、臓器の変色が見られ腐敗、変色の傾向は経時的に強くなり７日後には検体が崩れ易くなる程度まで脆くなって腐敗臭、臓器の変色が強くなっていた。また第一、第二冷凍装置で保存したものは、共に１日後に僅かな腐敗臭と解凍による水分流出、臓器の変色が見られこの状態は７日後まで略同じ結果であった。
【００２９】
次いで膵臓を検体として観察した結果について説明するが、保存装置１で保存した膵臓の組織は、１日、３日、７日後の何れにおいても安楽死直後の組織と比較して殆ど変化が無かった。これに対して冷蔵庫で保存した膵臓の組織は、１日後、保存装置１で１日保存した組織と比較しても大きな差が無かったが、３日後には細胞の中に空胞が見られ隣り合う細胞間の隙間が大きくなっていき、７日後には、隣り合う細胞間の隙間がさらに大きくなったうえ、細胞は萎縮し形がいびつになり輪郭が乱れ、核にも萎縮が見られるようになっていると共に、組織全体がエオジンにのみ染まり正しい染色性が失われた状態になった。また第一、第二冷凍装置は、共に１日後に細胞の保存性が良いもののエオジンに強く染まり染色性に変化が見られこの状態は７日後まで殆ど同じ結果であった。
【００３０】
続いて腎臓を検体として観察した結果について説明するが、保存装置１で保存した腎臓の細胞は、１日後、安楽死直後の細胞に対して殆ど変化が見られず、３日後は、尿細管の刷子縁に乱れが見られるたものの細胞の形に変化はなかったが、７日後には、細胞の萎縮、空隙が見られる部分があった。冷蔵庫での保存では、１日後に尿細管の刷子縁が壊れ輪郭が不揃いに見え、３日後では前記不揃いが広範囲の刷子縁に見えるようになり、７日目になると尿細管が広範囲で壊れ細胞の萎縮が生じ、空胞が目立ってスポンジ状に見えるうえ、染色性も悪くなっており、組織のダメージが大きいことが伺えた。また第一、第二冷凍装置は、共に１日後に細胞の内外にできた氷の結晶のため大小の亀裂が入って破壊されている細胞が見られる一方、正常な構造の細胞も多くあったが、エオジンに強く染まり染色性に変化が見られこの状態は７日後まで殆ど同じであった。
【００３１】
さらに続いて肝臓を検体として観察した結果について説明するが、保存装置１で保存した肝臓の組織は、１日後、３日後それぞれ安楽死直後の組織と殆ど変化が見られなかったが、７日後には、細胞が痩せたうえ、核の変形が見られた。冷蔵庫で保存された肝臓の細胞は、１日後、３日後まで保存装置１に保存した細胞に比べて大きな違いは無く安楽死直後の細胞と殆ど変化が無かったが、７日後になると細胞が萎縮して空隙が目立ち、核の無い細胞も多く見られるうえ細胞間のつながりが薄くなってバラバラになっているように見えた。また、第一、第二冷凍装置は、共に１日後、細胞内外に形成されていた氷の結晶の影響で大小の亀裂が入り破壊されている細胞が見られる一方、構造が正常な細胞も多く見られるが、エオジンに強く染まり染色性に変化が見られこの結果は７日後まで殆ど同じであったが、これらを実際に比較して観察してみると第一冷凍装置で保存した細胞の方が、第二冷凍装置で保存した細胞よりも破壊が顕著に現れていた。
【００３２】
そして、この結果、保存装置１は、前記肉眼での所見において、冷蔵庫に比べて１日、３日、７日後の何れも臭い、臓器、脂肪の変化が少なく、第一、第二冷凍庫のように解凍による水分の流出や各臓器、脂肪の変色が見られなかった。また、保存装置１は、冷蔵庫で保存した場合に比べて膵臓等の各組織が安楽死直後に近い状態になっており、第一、第二冷凍庫で見られるような解凍による組織の破壊も見られなかった。このことから、保存装置１を用いることにより、マウスＭの体内に繁殖する各種の細菌の増減が抑制され、殆ど死後直後の菌数を保った状態で保存されるため、腐敗の進行が抑制されたものと推定され、本発明の有効性が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれ保存装置の使用態様を示す概略斜視図、扉部を外した状態の保存装置の使用態様を示す正面図である。
【図２】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれ大腸菌を、保存装置、冷蔵庫で保存した場合の菌の数と経過時間との関係を示すグラフ図である。
【図３】保存方法の他例の使用態様を示す概略斜視図である。
【図４】保存方法の他例の実験結果を示す表図である。
【符号の説明】
【００３４】
１          保存装置
２          保存室
２ａ        扉部
３          電極
４          棚部
４ａ        縦板
４ｂ        横板
４ｃ        背面板
４ｄ        突出片
７          冷却装置
８          開閉センサ
Ｓ          被保存物
【図１】
2008092842.tif 000003
【図２】
2008092842.tif 000004
【図３】
2008092842.tif 000005
【図４】
2008092842.tif 000006