(57)【要約】【課題】イタリアンライグラスに由来するゲノムＤＮＡ中に存在し、いもち病に対して抵抗性を付与する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーとその利用方法を提供する。【解決手段】イタリアンライグラス解析集団のいもち病抵抗性検定、バルク分離型解析及び連鎖解析により見出した、イタリアンライグラス第３染色体上に座乗するいもち病抵抗性遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカー、該ＤＮＡマーカーを検出するプライマーセット、これを利用してイタリアンライグラスのゲノムＤＮＡの遺伝子増幅反応を行い、増幅断片のバンドないしバンドパターンを確認することにより、いもち病抵抗性遺伝子の有無を識別する方法、該方法によりいもち病抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜する方法及びそのイネ科植物。【効果】イタリアンライグラス第３染色体上に座乗するいもち病抵抗性遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを利用した、いもち病抵抗性イネ科植物の作出方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イタリアンライグラスに由来するゲノムＤＮＡ中に存在し、イタリアンライグラス第３染色体上に座乗するいもち病抵抗性遺伝子座に連鎖することを特徴とするＤＮＡマーカー。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡマーカーを検出するための遺伝子増幅反応用プライマーセット。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第１プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅される、請求項１に記載のＤＮＡマーカー（ＤＮＡマーカー名：０８−０８Ｂ）。
【請求項４】
配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第２プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅される、請求項１に記載のＤＮＡマーカー（ＤＮＡマーカー名：０９−１２Ａ）。
【請求項５】
配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第３プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅される、請求項１に記載のＤＮＡマーカー（ＤＮＡマーカー名：１７−０１Ｈ）。
【請求項６】
配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第４プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅される、請求項１に記載のＤＮＡマーカー（ＤＮＡマーカー名：Ｃ６２００３）。
【請求項７】
配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第５プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅される、請求項１に記載のＤＮＡマーカー（ＤＮＡマーカー名：Ｅ１０３３１）。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のＤＮＡマーカーを検出するプライマーセットを用いて、イネ科植物のゲノムＤＮＡの遺伝子増幅反応を行い、その増幅断片を確認することにより、いもち病抵抗性遺伝子の有無を識別することを特徴とするいもち病抵抗性遺伝子の識別方法。
【請求項９】
上記いもち病抵抗性遺伝子の識別方法により抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜することを特徴とするいもち病抵抗性遺伝子を持つ個体選抜方法。
【請求項１０】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のＤＮＡマーカーを指標として、いもち病抵抗性遺伝子座を植物のゲノムＤＮＡに導入することを特徴とするいもち病抵抗性植物の作出方法。
【請求項１１】
上記植物が、イネ科植物である、請求項１０に記載のいもち病抵抗性植物の作出方法。
【請求項１２】
上記イネ科植物が、Ｌｏｌｉｕｍ属又はＦｅｓｔｕｃａ属に属する植物である、請求項１１に記載のいもち病抵抗性植物の作出方法。
【請求項１３】
上記Ｌｏｌｉｕｍ属に属する植物が、イタリアンライグラスである、請求項１２に記載のいもち病抵抗性植物の作出方法。
【請求項１４】
請求項１０ないし１３のいずれか１項に記載の作出方法により作出された、イタリアンライグラス第３染色体上に座乗する導入されたいもち病抵抗性遺伝子座を保有するいもち病抵抗性植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イタリアンライグラスのいもち病抵抗性遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセット、該遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカー、及びそれらの利用に関するものであり、更に詳しくは、イタリアンライグラスの第３染色体上に座乗するいもち病抵抗性遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセット、上記ＤＮＡマーカーを利用したいもち病抵抗性イネ科植物の選抜方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物の病害の殆どは、カビなどの糸状菌によって引き起こされている。いもち病菌は、これら糸状菌の一種で、多くの宿主範囲を持つが、特にイネの最重要病害菌として知られており、この菌に対する病理学的な基礎研究や抵抗性品種・系統の開発が盛んに行われている。一方、イタリアンライグラスは、主要なイネ科牧草の一つであるが、近年では、イタリアンライグラスを含むＬｏｌｉｕｍ属もいもち病菌に感染することが確認され、その被害が広がりつつある。
【０００３】
いもち病菌が、イタリアンライグラスの感受性個体に感染すると、感染部位が壊死する。感染部位は、いもち病菌が植物体内で成長するにつれ拡大することから、罹病個体の成育は著しく妨げられ、酷い場合には、完全に枯死する。いもち病害に対する対策としては、殺菌剤の使用や抵抗性品種の育成が考えられるが、殺菌剤の利用は、家畜や環境への悪影響が懸念される。したがって、いもち病害対策には、抵抗性品種の育成が最も有力な手段といえる。
【０００４】
現在までに、多くのイタリアンライグラス品種が育成されているが、いもち病抵抗性に関する育種は、殆どされておらず、日本では、品種「さちあおば」のみが、抵抗性品種として存在している（非特許文献１）。しかし、イタリアンライグラスは、広い地域で栽培されており、また、採草利用や放牧利用など、種々の利用方法があることから、品種「さちあおば」だけではなく、各利用場面に対応できるよう、多様ないもち病抵抗性品種を育成する必要がある。
【０００５】
イタリアンライグラスの従来育種では、育種母材の中から目的形質を持つ個体を観察により選抜し、優良個体どうしを交配して後代を得て、更に、優良な個体を観察により選抜する作業が繰り返し行われていた。このような観察による従来育種法は、広大な圃場に多数の個体を栽培しなければならず、また、目的形質が観察できる時期になるまでに相当な時間を要することから、多くの労力と年月を費やす必要があった。
【０００６】
しかし、近年では、ＤＮＡマーカーを指標として優良個体を選抜できるマーカー選抜法が開発され、実際の育種に利用できるようになった。マーカー選抜法では、ＤＮＡマーカーにより遺伝子型を確認することで目的形質の有無を直接観察せずに判別できることから、幼苗の段階で迅速に優良な個体を選抜することができる。このことは、マーカー選抜法を活用することにより、育種に要する労力及び年月の縮減が可能になることを意味する。
【０００７】
マーカー選抜法は、イタリアンライグラスのいもち病抵抗性個体を選抜するのにも有効であると考えられており、これまでに、Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献２）は、イタリアンライグラス品種「さちあおば」と「ミナミアオバ」を交雑して得たＦ１解析集団を用いて、品種「さちあおば」に由来するいもち病抵抗性遺伝子ＬｍＰｉ１が第５染色体上に座乗することを確認した。
【０００８】
一方、Ｃｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献３）は、イタリアンライグラスとその近縁種であるペレニアルライグラスに由来する解析集団を用いて、複数の染色体上において抵抗性遺伝子座を見出し、検出された中で、最もいもち病抵抗性に関連すると思われる遺伝子座が、イタリアンライグラスに由来するものであると推測した。しかし、解析集団が由来するイタリアンライグラスのいもち病抵抗性の検定がなされていなかったことから、検出したいもち病抵抗性遺伝子座が、イタリアンライグラスに由来することを示す直接的な証拠は得られていない。
【０００９】
イネでは、いもち病の研究が盛んに行われており、抵抗性遺伝子を持つ系統も作出されている。しかし、単一の抵抗性遺伝子を持つ系統を栽培すると、いもち病菌のレース分化により抵抗性が打破される現象が頻繁に生じることが知られている。この現象の対策として、栽培する系統に複数の抵抗性遺伝子を集積することや、異なる抵抗性遺伝子を持つ同質遺伝子系統を混合したもの（マルチライン）を栽培する手法が提案されている。
【００１０】
したがって、イタリアンライグラスにおいても、複数の抵抗性遺伝子を集積したり、マルチラインを開発することが、安定していもち病の被害を軽減するための有効な手段であると考えられる。そのためには、既知のいもち病抵抗性遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーに加え、他の抵抗性遺伝子座に連鎖する新規ＤＮＡマーカーを開発し、新品種・系統の開発に活用することが望ましい。
【００１１】
【非特許文献１】山口農試研報，５４：１１−２４（２００３）
【非特許文献２】Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１１：８１１−８１８（２００５）
【非特許文献３】Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１１：１１０７−１７（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、未知のいもち病抵抗性遺伝子座の開発、該いもち病抵抗性遺伝子座に連鎖する新規ＤＮＡマーカーの開発及び該ＤＮＡマーカーを利用した新品種・系統の開発を研究課題として鋭意研究を積み重ねた結果、イタリアンライグラス第３染色体上に座乗するいもち病抵抗性遺伝子座及び該遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は、イタリアンライグラス第３染色体上に座乗するいもち病抵抗性遺伝子座と連鎖する新規ＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセット、該遺伝子座と連鎖する新規ＤＮＡマーカー、及びそれらの利用方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）イタリアンライグラスに由来するゲノムＤＮＡ中に存在し、イタリアンライグラス第３染色体上に座乗するいもち病抵抗性遺伝子座に連鎖することを特徴とするＤＮＡマーカー。
（２）前記（１）に記載のＤＮＡマーカーを検出するための遺伝子増幅反応用プライマーセット。
（３）配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第１プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅される、前記（１）に記載のＤＮＡマーカー（ＤＮＡマーカー名：０８−０８Ｂ）。
（４）配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第２プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅される、前記（１）に記載のＤＮＡマーカー（ＤＮＡマーカー名：０９−１２Ａ）。
（５）配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第３プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅される、前記（１）に記載のＤＮＡマーカー（ＤＮＡマーカー名：１７−０１Ｈ）。
（６）配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第４プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅される、前記（１）に記載のＤＮＡマーカー（ＤＮＡマーカー名：Ｃ６２００３）。
（７）配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第５プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅される、前記（１）に記載のＤＮＡマーカー（ＤＮＡマーカー名：Ｅ１０３３１）。
（８）前記（１）ないし（７）のいずれか１項に記載のＤＮＡマーカーを検出するプライマーセットを用いて、イネ科植物のゲノムＤＮＡの遺伝子増幅反応を行い、その増幅断片を確認することにより、いもち病抵抗性遺伝子の有無を識別することを特徴とするいもち病抵抗性遺伝子の識別方法。
（９）上記いもち病抵抗性遺伝子の識別方法により抵抗性遺伝子を持つ個体を選抜することを特徴とするいもち病抵抗性遺伝子を持つ個体選抜方法。
（１０）前記（１）ないし（７）のいずれか１項に記載のＤＮＡマーカーを指標として、いもち病抵抗性遺伝子座を植物のゲノムＤＮＡに導入することを特徴とするいもち病抵抗性植物の作出方法。
（１１）上記植物が、イネ科植物である、前記（１０）に記載のいもち病抵抗性植物の作出方法。
（１２）上記イネ科植物が、Ｌｏｌｉｕｍ属又はＦｅｓｔｕｃａ属に属する植物である、前記（１１）に記載のいもち病抵抗性植物の作出方法。
（１３）上記Ｌｏｌｉｕｍ属に属する植物が、イタリアンライグラスである、前記（１２）に記載のいもち病抵抗性植物の作出方法。
（１４）前記（１０）ないし（１３）のいずれか１項に記載の作出方法により作出された、イタリアンライグラス第３染色体上に座乗する導入されたいもち病抵抗性遺伝子座を保有するいもち病抵抗性植物。
【００１５】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、いもち病抵抗性遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーであって、イタリアンライグラスに由来するゲノムＤＮＡ中に存在し、イタリアンライグラス第３染色体上に座乗するいもち病抵抗性遺伝子座に連鎖することを特徴とするものである。また、本発明は、上記ＤＮＡマーカーを検出するための遺伝子増幅反応用プライマーセットの点に特徴を有するものである。
【００１６】
本発明では、上記ＤＮＡマーカーが、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第１プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅されるＤＮＡマーカー（０８−０８Ｂ）、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第２プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅されるＤＮＡマーカー（０９−１２Ａ）、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第３プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅されるＤＮＡマーカー（１７−０１Ｈ）、配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第４プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅されるＤＮＡマーカー（Ｃ６２００３）、配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第５プライマーセットを用いて遺伝子増幅反応により増幅されるＤＮＡマーカー（Ｅ１０３３１）、であることを好ましい実施の態様としている。
【００１７】
また、本発明は、いもち病抵抗性植物の作出方法であって、上記ＤＮＡマーカーを検出するプライマーセットを用いて、イネ科植物のゲノムＤＮＡの遺伝子増幅反応を行い、その増幅断片を確認することにより、いもち病抵抗性遺伝子の有無を識別することを特徴とするものである。更に、本発明では、上記植物が、イネ科植物、Ｌｏｌｉｕｍ属に属する植物、又はＦｅｓｔｕｃａ属に属する植物であること、上記Ｌｏｌｉｕｍ属に属する植物が、イタリアンライグラスであること、を好ましい実施の態様としている。
【００１８】
本発明者らは、複数のイタリアンライグラス系統に対していもち病菌の人工接種を行い、いもち病に対して抵抗性を示す１個体（以下「抵抗性個体Ｎｏ．６」と呼ぶ）を見出した。この抵抗性個体Ｎｏ．６と感受性個体（以下「ＭＡ１」と呼ぶ）とを交雑して得たＦ１解析集団をバルク分離型解析に供し、抵抗性個体に特異的に検出されるＡＦＬＰマーカー及びＳＳＲマーカーを得た。
【００１９】
これらＡＦＬＰマーカー及びＳＳＲマーカーの連鎖解析及びＱＴＬ解析の結果、抵抗性個体Ｎｏ．６に由来するいもち病抵抗性遺伝子座がイタリアンライグラス第３染色体上に座乗することを見出した。
【００２０】
配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第１プライマーセットにより検出されるＤＮＡマーカー（０８−０８Ｂ）、及び配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第２プライマーセットにより検出されるＤＮＡマーカー（０９−１２Ｈ）が、該抵抗性遺伝子座に連鎖することを見出した。
【００２１】
そこで、更に、Ｈｉｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献３）によりイタリアンライグラスの第３染色体上に座乗することが報告されているＳＳＲプライマーを用いて多型を検出し、この多型データを用いて追加の連鎖解析を行った。また、イタリアンライグラスの第３染色体には、イネの第１染色体とのシンテニーが認められていることから、イネの１番染色体上のＥＳＴ情報を活用して、プライマーセットを設計した。
【００２２】
これらのＥＳＴ情報由来のプライマーセットにより、抵抗性個体Ｎｏ．６のゲノムＤＮＡの一部を増幅し、得られたＤＮＡ断片に対してＳＳＣＰ多型解析を行い、上記連鎖地図にＤＮＡマーカーを追加した。
【００２３】
その結果、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第３プライマーセットで検出されるＤＮＡマーカー（１７−０１Ｈ）、配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第４プライマーセットで検出されるＤＮＡマーカー（Ｃ６２００３）、及び配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第５プライマーセットで検出されるＤＮＡマーカー（Ｅ１０３３１）も、該抵抗性遺伝子座に連鎖することを確認した。
【００２４】
すなわち、本発明は、以下のプライマーセット及びＤＮＡマーカーの発明を包含する。
（１）配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせで構成される、いもち病抵抗性遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカー（０８−０８Ｂ）を検出できるプライマーセット。
（２）配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせで構成される、いもち病抵抗性遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカー（０９−１２Ａ）を検出できるプライマーセット。
【００２５】
（３）配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせで構成される、いもち病抵抗性遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカー（１７−０１Ｈ）を検出できるプライマーセット。
（４）配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせで構成される、いもち病抵抗性遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカー（Ｃ６２００３）を検出できるプライマーセット。
【００２６】
（５）配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせで構成される、いもち病抵抗性遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカー（Ｅ１０３３１）を検出できるプライマーセット。
（６）上記（１）に記載のプライマーセットを用いてイタリアンライグラス由来のゲノムＤＮＡから増幅される、いもち病抵抗性遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカー（０８−０８Ｂ）。
【００２７】
（７）上記（２）に記載のプライマーセットを用いてイタリアンライグラス由来のゲノムＤＮＡから増幅される、いもち病抵抗性遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカー（０９−１２Ａ）。
（８）上記（３）に記載のプライマーセットを用いてイタリアンライグラス由来のゲノムＤＮＡから増幅される、いもち病抵抗性遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカー（１７−０１Ｈ）。
【００２８】
（９）上記（４）に記載のプライマーセットを用いてイタリアンライグラス由来のゲノムＤＮＡから増幅される、いもち病抵抗性遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカー（Ｃ６２００３）。
（１０）上記（５）に記載のプライマーセットを用いてイタリアンライグラス由来のゲノムＤＮＡから増幅される、いもち病抵抗性遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカー（Ｅ１０３３１）。
【００２９】
また、本発明は、上記ＤＮＡマーカーを指標とすることによりいもち病抵抗性遺伝子の有無を識別する方法、上記いもち病抵抗性遺伝子の有無を識別する方法を利用して選抜したいもち病抵抗性個体から、いもち病抵抗性系統を作出する方法、上記方法によって作出されるいもち病抵抗性系統、を提供する。
【００３０】
次に、本発明の実施の一形態について説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。Ｆ１解析集団の養成については、まず、複数のイタリアンライグラス品種・系統の中から、いもち病菌に対して抵抗性を示す個体を得る。Ｆ１解析集団は、いもち病抵抗性個体といもち病感受性個体とを交雑して養成する。Ｆ１解析集団は、規模が大きいほうが望ましいが、本発明では、１０５個体から成る集団を使用した。
【００３１】
Ｆ１解析集団の親であるいもち病抵抗性個体といもち病感受性個体及びＦ１解析集団のいもち病に対する抵抗性程度や感受性程度は、人工的に増殖させたいもち病菌の胞子懸濁液（胞子密度：５×１０４／ｍＬ）を、播種後約５週間育成した幼植物体あるいは幼植物体より得た切離葉に接種することにより検定できる。
【００３２】
次に、バルク分離型解析については、上記Ｆ１解析集団のいもち病接種検定の結果から、例えば、抵抗性個体１０個体及び感受性個体１０個体を選抜してＤＮＡ抽出し、抵抗性１０個体のＤＮＡをそれぞれ等量ずつ混合した抵抗性バルク、及び感受性１０個体のＤＮＡを等量ずつ混合した感受性バルクを作製し、バルク分離型解析により、いもち病抵抗性形質を識別できるＤＮＡマーカーを探索する。上記選抜対象とする個体数は適宜変更することができる。
【００３３】
いもち病抵抗性形質を識別できるＤＮＡマーカーには、抵抗性バルクにのみ特異的に認められるＤＮＡ多型がその候補として選定される。バルク分離型解析を行う際には、ＡＦＬＰやＳＳＲなどの多型を検出することでマーカーとして利用できるが、その他、ＲＡＰＤなどの多型検出手法を用いることもできる。
【００３４】
上記バルク分離型解析で使用するＤＮＡは、植物体から得られる葉身、根、種子、カルス、葉鞘などから調製することができるが、これらに限定されず、いかなる組織や器官からも抽出できる。上記組織や器官から、市販のキットあるいは常法（ＣＴＡＢ法など）を用いて抽出したＤＮＡを解析に供することができるが、これらの抽出法によって得られたＤＮＡに限定されるものではなく、精製度の高いものであればよい。
【００３５】
次に、いもち病抵抗性ＤＮＡマーカーの選択については、上記バルク解析により選定されたＤＮＡマーカーの多型解析により、連鎖地図を構築した後、いもち病抵抗性遺伝子座と強く連鎖するＤＮＡマーカーを詳細に特定するために、Ｆ１解析集団におけるいもち病検定結果とＤＮＡマーカーが示す多型との関連について、ＱＴＬ解析を行う。
【００３６】
ＱＴＬ解析の結果、本発明においては、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第１プライマーセットを用いて得られる増幅産物、及び配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第２プライマーセットを用いて得られる増幅産物が示す多型が、いもち病抵抗性遺伝子座に連鎖したことから、これらが、いもち病抵抗性遺伝子座を持つ個体を識別・選抜するための好適なＤＮＡマーカーとして使用される。
【００３７】
いもち病抵抗性遺伝子座が存在している染色体の位置は、連鎖地図を構成しているＳＳＲ由来のＤＮＡマーカーから推定できる。本発明においては、連鎖地図を構成するＳＳＲ由来のＤＮＡマーカーが第３染色体上に座乗していることがＨｉｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１３：２７０−２７９（２００６））により報告されていることから、いもち病抵抗性遺伝子座が第３染色体上に座乗していることが推測された。
【００３８】
そこで、更に、イタリアンライグラスの第３染色体上に座乗するＳＳＲプライマー（Ｈｉｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１３：２７０−２７９（２００６））を用いて多型を検出し、この多型データを用いて追加の連鎖解析を行った。また、イタリアンライグラスの第３染色体には、イネの第１染色体とのシンテニーが認められることから、イネの第１染色体上に存在するＥＳＴ情報を利用してプライマーを設計し、ＳＳＣＰの多型解析を実行した。
【００３９】
これらの多型解析の結果、上記の連鎖地図を構成するＤＮＡマーカーに加え、新たにいもち病抵抗性遺伝子座に強く連鎖するＤＮＡマーカーが追加された。
【００４０】
すなわち、本発明においては、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第３プライマーセットを用いて検出されるＤＮＡマーカー、配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第４プライマーセットを用いて検出されるＤＮＡマーカー、及び配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第５プライマーセットを用いて検出されるＤＮＡマーカーが、いもち病抵抗性遺伝子座に強く連鎖するＤＮＡマーカーとして連鎖地図上に追加された。
【００４１】
したがって、これらも、いもち病抵抗性遺伝子座を持つ個体を識別・選抜するために好適なＤＮＡマーカーとして本発明により提供されるものである。上記のように、本発明において、連鎖地図上に位置づけられたＤＮＡマーカーのうち、いもち病抵抗性遺伝子に強く連鎖するＤＮＡマーカーは、複数提供されるが、本発明は、これらのＤＮＡマーカーのみに限定されるものではなく、本発明により見出されたいもち病抵抗性遺伝子座に強く連鎖するものであればよい。また、そのようなＤＮＡマーカーは、上記の工程で示したように、イタリアンライグラスの第３染色体上に存在するＳＳＲ由来の多型や、イネの第１染色体上に存在することが公開されているＥＳＴ情報などを利用することで効率的に見出すことができる。
【００４２】
次に、いもち病抵抗性遺伝子の有無を識別する方法及びいもち病抵抗性系統の作出方法については、本発明において開発されたＤＮＡマーカーは、以下の態様で使用できる。例えば、本発明によれば、上述の各工程を通じて特定されたプライマーセットを用いて、イタリアンライグラスより抽出したＤＮＡに対してＰＣＲを行い、電気泳動により分離したものを、バンドあるいはバンドパターンとして検出し、バンドの位置あるいはバンドパターンを確認することにより、いもち病抵抗性遺伝子の有無を識別する方法が提供される。
【００４３】
また、本発明によれば、上述の各工程を通じて特定されたプライマーセットを用いて、イタリアンライグラスより抽出したＤＮＡに対してＰＣＲを行い、電気泳動により分離したものを、バンドあるいはバンドパターンとして検出し、バンドの位置あるいはバンドパターンを確認することにより、いもち病抵抗性遺伝子を有する個体を選抜し、その後代において、いもち病抵抗性遺伝子を持ついもち病抵抗性系統を得ることを特徴とするいもち病抵抗性系統の作出方法が提供される。
【００４４】
また、イタリアンライグラスは、イタリアンライグラスが属するＬｏｌｉｕｍ属に属する種や、近縁のＦｅｓｔｕｃａ属に属する種と交雑し、後代を得ることができる。したがって、上記いもち病抵抗性系統の作出方法は、イタリアンライグラスに限定されず、イタリアンライグラスと交雑できる全ての植物種を含む方法として本発明により提供される。
【００４５】
本発明におけるＤＮＡマーカーは、上述の各工程を通じて特定されたプライマーセットを用いて、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅し、電気泳動により分離することで、バンドあるいはバンドパターンとして検出される。増幅されるＤＮＡ断片の長さや塩基配列は、同じプライマーセットを用いても、個体ごとに異なる場合がある。
【００４６】
例えば、本発明により見出されたいもち病抵抗性遺伝子座を持つ個体が複数ある場合、同じ抵抗性遺伝子を持っていても、個体によってＤＮＡマーカーのバンドのサイズやバンドパターンが異なる可能性がある。これは、ＤＮＡマーカーが遺伝子そのものではなく、ゲノム上の遺伝的な位置情報を提供するものであることに起因する。
【００４７】
しかし、いずれの場合においても、そのＤＮＡマーカーは、該抵抗性遺伝子座との遺伝的な距離が近いことに変わりないことから、該抵抗性遺伝子座を持つ個体の示すバンドの位置あるいはバンドパターンを指標としていもち病抵抗性遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーとして利用できる。すなわち、このことは、本発明が提供する該病抵抗性遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーは、バンドのサイズやバンドパターンに限定されないことを意味する。
【００４８】
ＤＮＡマーカー検出の際の核酸増幅方法には、ＰＣＲ法が好適であるが、その他の核酸増幅法、例えば、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法などの任意の核酸増幅法を用いることができる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明により次のような効果が奏される。
（１）本発明によれば、イタリアンライグラスの第３染色体上に座乗するいもち病抵抗性遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセット、該遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカーが提供される。
（２）これらを利用することにより、接種検定に頼ることなく、いもち病抵抗性遺伝子を持つ個体を幼苗の段階で高精度に選抜することができる。
（３）本発明により、長い期間と多大な労力を要する従来の育種法に比べ、いもち病抵抗性系統を短期間で効率的に開発することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
次に、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
まず、国内外のイタリアンライグラス２８品種・系統を、湿らせたろ紙の上に播種し、２５℃・連続照明下で１週間培養し、発芽を促した。実生を１品種・系統につき９６個体ずつ、培養土の入った９６穴のプラスチックポットに移植し、２０℃に保温したガラス温室内で育苗した。
【００５２】
播種から約５週間後、幼苗にいもち病菌胞子懸濁液（胞子密度：５×１０４／ｍｌ）を噴霧接種し、湿度１００％・２５℃（暗黒）で２４時間静置した後、２５℃・短日条件（明／暗；８ｈ／１６ｈ）で７日間育成し、表１に示した発病調査基準を用いて発病調査を行った。その結果、発病程度が２に相当する抵抗性個体Ｎｏ．６を選抜した。また、このとき、発病程度が５に相当する感受性個体ＭＡ１も得た。
【００５３】
【表１】
2008237175.tif 000003
【００５４】
上記抵抗性個体Ｎｏ．６と感受性個体ＭＡ１の開花直前の穂を袋がけして単交配を行い、交雑後代を得た。この後代種子を湿ったろ紙上に播種し、２５℃・連続照明下で１週間培養して発芽を促した。実生を培養土の入った９６穴のプラスチックポットに移植し、最終的に１０５個体からなるＦ１解析集団を養成した。
【００５５】
５週間後、解析集団から長さ約２ｃｍの葉身を切り取り、プラスティックシャーレ内の素寒天培地（ベンズイミダゾールを４０ｍｇ／Ｌ含む）に葉身裏面が上になるように置床した。この切離葉の上に、１０μＬの胞子懸濁液（胞子密度５×１０４／ｍｌ）を塗布した幅２ｍｍ、長さ１．５ｃｍのろ紙を置床した後、シャーレにふたをしてパラフィルムで密閉し、２５℃・暗黒下で培養した。
【００５６】
２４時間後、パラフィルムの代わりにサージカルテープを巻いて通気性を確保した後、２５℃・短日条件（８時間日長／１６時間暗黒）で７日間培養した。発病調査は、表１に示した発病調査基準を用いて、１個体につき５回行い、その結果の平均値を個体の発病程度とした。
【００５７】
Ｆ１解析集団のＤＮＡ抽出は、市販のＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて行い、ＤＮＡ濃度を１２．５ｎｇ／μＬに調製した。上記Ｆ１解析集団のいもち病接種検定の結果から、抵抗性個体１０個体及び感受性個体１０個体をＦ１解析集団の中から選定し、抵抗性を示した１０個体のＤＮＡを等量混合して得た抵抗性バルク、及び感受性を示した１０個体のＤＮＡを等量混合して得た感受性バルクを作製した。
【００５８】
これら２種類のバルクに対して、ＡＦＬＰによるバルク分離型解析を行った。ＡＦＬＰ解析は、Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３：４４０７−４４１４（１９９５））の方法より行った。ゲノムＤＮＡの消化は、ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩの組み合わせで行い、ＥｃｏＲＩ側のプライマー（アロカ社製）は、ＩＲＤ７００あるいはＩＲＤ８００の蛍光物質により標識されたものを用いた。
【００５９】
多型は、ＤＮＡアナリシスシステムＬＩＣ−４２００−２（アロカ社製）により検出した。その結果、抵抗性バルク及びＦ１解析集団の抵抗性親であるＮｏ．６に特異的な多型が２つのプライマー組み合わせの増幅産物から確認された。
【００６０】
上記ＡＦＬＰ解析で得られた２つのＡＦＬＰマーカーに対して個体別の解析を行い、多型データを解析ソフトウェアＪｏｉｎＭａｐ  ｖｅｒ．３（Ｋｙａｚｍａ社製）にて解析した結果、連鎖が確認された。
【００６１】
また、ＡＦＬＰマーカーといもち病抵抗性形質の関連を調べるため、解析ソフトウェアＭａｐＱＴＬ  ｖｅｒ．５（Ｋｙａｚｍａ社製）を用いてＱＴＬ解析を行った結果、ＡＦＬＰ由来のＤＮＡマーカーの多型データといもち病抵抗性に関連が認められた。しかし、ＡＦＬＰ由来のＤＮＡマーカーにより構成される連鎖群がどの染色体上に位置するものかは不明であった。
【００６２】
そこで、更に、バルク分離型解析を、Ｈｉｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１３：２７０−２７９（２００６））により公開されているＳＳＲ多型検出用プライマーを用いて行った。ＳＳＲの多型検出の際のＰＣＲでは、Ｑｉａｇｅｎ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑに付属の説明書に従って、１サンプルにつき１０μＬの反応液を調製し、ゲノムＤＮＡ１２．５ｎｇを鋳型として、以下のプログラムをＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステムズ社製）にて実行した。
【００６３】
プログラム：（１）９５℃  １５分、（２）９４℃  １５秒、６５℃  １５秒（１サイクル毎に１℃下げる）、７２℃  １分  １０サイクル、（３）９４℃  １５秒、５５℃  １５秒、７２℃  １分  ３０サイクル、（４）７２℃  ７分。得られた増幅産物をサンプルバッファーと混合した後、ＧｅｎｅＧｅｌ  Ｃｌｅａｎ  １２．５／２４  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）にアプライし、ＧｅｎｅＰｈｏｒ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）により８０分間の電気泳動（電気泳動条件：６００Ｖ、２５ｍＡ、１５Ｗ、２５℃）を行った。
【００６４】
電気泳動後、ゲルをＤＮＡ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）により染色し、多型を検出した。その結果、抵抗性バルク及びＦ１解析集団の抵抗性親であるＮｏ．６に特異的な多型を検出するプライマーセットが特定された。
【００６５】
このプライマーセットを用いて、個体別の多型データをとり、上記のＡＦＬＰマーカーの解析と同様に解析ソフトウェアＪｏｉｎＭａｐ  ｖｅｒ．３（Ｋｙａｚｍａ社製）にて解析した結果、イタリアンライグラスの第２、第３、及び第６染色体に座乗するＳＳＲ由来のＤＮＡマーカーが、上記ＡＦＬＰマーカーにより構成される連鎖地図に追加され、特に第３染色体のＳＳＲ由来ＤＮＡマーカーが多く追加された。
【００６６】
このことから、いもち病抵抗性遺伝子座がイタリアンライグラスの第３染色体に座乗することが推定された。この結果を受けて、イタリアンライグラスの第３染色体に座乗することが公開されているＳＳＲ多型検出用プライマー（Ｈｉｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１３：２７０−２７９（２００６））を個々に解析した結果、上記連鎖地図上にＤＮＡマーカーを追加することができた。
【００６７】
イタリアンライグラスの第３染色体は、イネの第１染色体とのシンテニーが認められる。そこで、上記のＡＦＬＰ由来及びＳＳＲ由来のＤＮＡマーカーにより構成される連鎖地図を更に高密度にし、いもち病抵抗性遺伝子座とより緊密に連鎖するＤＮＡマーカーを見出すため、イネの第１染色体に存在するＥＳＴ情報を利用したプライマー設計を次に示す方法で行った。
【００６８】
まず、イネの第１染色体上に存在するＥＳＴをインターネット上で公開されているデータベースＩＮＥ（ｈｔｔｐ：／／ｒｇｐ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／Ｅ／ｇｉｏｔ／ＩＮＥ．ｈｔｍｌ）により探索し、各ＥＳＴの塩基配列情報、及びＥＳＴが属するＰＡＣクローンあるいはＢＡＣクローンの塩基配列情報を得た。
【００６９】
次に、インターネット上で公開されている解析ソフトウェアＳｐｉｄｅｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＩＥＢ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｏｓｔｅｌｌ／Ｓｐｉｄｅｙ／）により、ＥＳＴの塩基配列とＥＳＴが属するＰＡＣあるいはＢＡＣクローンの塩基配列とのアライメントを解析した。
【００７０】
この解析により、ＥＳＴが由来する遺伝子のゲノム上の構造が明らかになる。すなわち、Ｓｐｉｄｅｙによるアライメント解析により、ＥＳＴと対応する遺伝子のエクソン及びイントロンの構造が明らかとなる。この情報を利用して、イントロンの両隣にあるエクソン配列内にＰＣＲプライマーを設計した。プライマーの設計には、プライマー解析用ソフトウェアＯｌｉｇｏ  ｖｅｒ．６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社製）を用いた。
【００７１】
このようにして設計したプライマーセットにより、Ｆ１解析集団の親個体Ｎｏ．６及びＭＡ１のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ及びＳＳＣＰ多型解析を行い、親個体間で多型の認められるプライマーセットのスクリーニングを行った。このとき、ＰＣＲは、Ｑｉａｇｅｎ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑに付属の説明書に従って１サンプルにつき１０μＬの反応液を調製し、ゲノムＤＮＡ１２．５ｎｇを鋳型として、以下のプログラムをＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステムズ社製）にて実行した。
【００７２】
プログラム：（１）９５℃  １５分、（２）９４℃  １５秒、６５℃  １５秒（１サイクル毎に１℃下げる）、７２℃  １分  １０サイクル、（３）９４℃  １５秒、５５℃  １５秒、７２℃  １分  ３０サイクル、（４）７２℃  ７分。得られた増幅産物を変性溶液と混合し、９５℃で６分間熱処理して氷水で急冷した後、ＧｅｎｅＧｅｌ  Ｃｌｅａｎ  １２．５／２４  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）にアプライし、ＧｅｎｅＰｈｏｒ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）により１００分間の電気泳動（電気泳動条件：６００Ｖ、２５ｍＡ、１５Ｗ、１５℃あるいは５℃）を行った。
【００７３】
電気泳動後、ゲルをＤＮＡ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）により染色し、ＳＳＣＰの多型を検出した。親個体間で多型の認められたプライマーセットについては、更に個体別の多型データをとり、上記のＳＳＲやＡＦＬＰの多型解析と同様に解析ソフトウェアＪｏｉｎＭａｐ  ｖｅｒ．３（Ｋｙａｚｍａ社製）にて解析した。その結果、ＳＳＲ及びＡＦＬＰマーカーにより構成される連鎖地図上にＳＳＣＰに由来するＤＮＡマーカーが追加された。
【００７４】
上記連鎖地図を構成するＤＮＡマーカーのいずれが、該いもち病抵抗性遺伝子に強く関連するかを特定するため、解析ソフトウェアＭａｐＱＴＬ  ｖｅｒ．５（Ｋｙａｚｍａ社製）を用いて、ＱＴＬ解析を行った。ＱＴＬ解析の結果、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第１プライマーセットを用いて得られる増幅産物、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第２プライマーセットを用いて得られる増幅産物、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第３プライマーセットを用いて得られる増幅産物、配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第４プライマーセットを用いて得られる増幅産物、及び配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第５プライマーセットを用いて得られる増幅産物が示す多型が、いもち病抵抗性遺伝子座に連鎖したことから、これらが、いもち病抵抗性遺伝子座を持つ個体を識別・選抜するために有効なＤＮＡマーカーであることが判明した（図１参照）。
【００７５】
なお、第１ないし第３プライマーセットによる増幅産物は、ＳＳＲの多型解析、第４及び第５プライマーセットによる増幅産物は、ＳＳＣＰ多型解析により、ＤＮＡマーカーとして利用するものである。
【００７６】
以下に、第１〜５プライマーセットの塩基配列を示す。
（ＤＮＡマーカー０８−０８Ｂを検出するための第１プライマーセット）
配列番号１：５’−ＧＡＣＡＧＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＧＣＡＣＧ−３’
配列番号２：５’−ＣＣＴＧＴＴＧＴＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣＡＣＧ−３’
（ＤＮＡマーカー０９−１２Ａを検出するための第２プライマーセット）
配列番号３：５’−ＴＴＣＡＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴＧ−３’
配列番号４：５’−ＡＴＧＣＡＴＡＣＣＣＴＣＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＧ−３’
（ＤＮＡマーカー１７−０１Ｈを検出するための第３プライマーセット）
配列番号５：５’−ＡＧＡＡＡＴＴＡＴＣＧＡＴＡＣＧＴＣＧＧＡＧＡＣＧ−３’
配列番号６：５’−ＴＣＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＣＧＡＡＧＣＧＧ−３’
（ＤＮＡマーカーＣ６２００３を検出するための第４プライマーセット）
配列番号７：５’−ＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＣＧＧ−３’
配列番号８：５’−ＣＧＡＧＣＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＣＡＡ−３’
（ＤＮＡマーカーＥ１０３３１を検出するための第５プライマーセット）
配列番号９：５’−ＡＴＴＧＣＧＡＧＧＡＣＧＡＣＴＴＣ−３’
配列番号１０：５’−ＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＴＧＧＴＡＧＴＴＴＧ−３’
【産業上の利用可能性】
【００７７】
以上詳述したように、本発明は、いもち病抵抗性イネ科植物の作出法に係るものであり、本発明により、イタリアンライグラスの第３染色体上に座乗するいもち病抵抗性遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセット、該遺伝子座と連鎖するＤＮＡマーカーを提供することができる。これらを利用することにより、接種検定に頼ることなく、いもち病抵抗性遺伝子を持つ個体を幼苗の段階で高精度に選抜することができる。本発明により、長い期間と多大な労力を要する従来の育種法に比べ、いもち病抵抗性系統を短期間で効率的に開発することが可能になる。本発明は、イタリアンライグラス解析集団のいもち病抵抗性検定、バルク分離型解析及び連鎖解析により見出した、イタリアンライグラス第３染色体上に座乗するいもち病抵抗性遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを利用したいもち病抵抗性イネ科植物の選抜、作出方法を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】いもち病抵抗性遺伝子座近傍の連鎖地図及びＱＴＬ解析（区間マッピング）におけるロッド曲線を示す。図中の“■”は連鎖地図上に位置づけられた各マーカーのＬＯＤ値を表す。本発明における、いもち病抵抗性遺伝子座に強く連鎖するＤＮＡマーカーの名を連鎖地図の左に記した。
【図２】本発明のプライマーセットの塩基配列を示す。
【図１】
2008237175.tif 000004
【図２】
2008237175.tif 000005
【配列表】
2008237175000001.app