(57)【要約】【課題】本発明の一つの目的は、ポリマー結合材を使用することなく、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブを提供することである。本発明の別の目的は、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した上記生体反応性カーボンナノチューブの作製方法を提供することである。  【解決手段】ポリマー結合材を使用することなく、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化させた本発明の生体反応性カーボンナノチューブは、以下の工程を含む方法で製造できる。(i) カーボンナノチューブを濃硝酸中で、高温条件下に酸化する；(ii) 得られた酸化型カーボンナノチューブを精製水に分散させ、所定濃度にする；(iii) レドックスたんぱく質を所定濃度に加え、混合する；(iv) 得られた生体反応性カーボンナノチューブ（固体）を分離する。【選択図】    図１
2008261680.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー結合材を使用することなく、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブ。
【請求項２】
前記レドックスたんぱく質がグルコース・オキシダーゼである、請求項１の生体反応性カーボンナノチューブ。
【請求項３】
ポリマー結合材を使用することなく、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブの製法であって、次の工程を含んでいる製法。
(i) カーボンナノチューブを濃硝酸中で、高温条件下に酸化する；
(ii) 得られた酸化型カーボンナノチューブを精製水に分散させ、所定濃度にする；
(iii) レドックスたんぱく質を所定濃度に加え、混合する；
(iv) 得られた生体反応性カーボンナノチューブを分離する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学的検知のためのバイオセンサーの分野で役立つレドックスたんぱく質を（ポリマー結合材を使用することなく）非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブに関するものである。また、本発明は、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した上記生体反応性カーボンナノチューブの製法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ナノスケールの物質に基づく酵素バイオセンサーについての多くの努力は、そのバイオ医学的な重要性のゆえに、グルコース・バイオセンサーの創作に向けられている。そのようなグルコース・バイオセンサーは、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）とグルコース・オキシダーゼ（ＧＯｘ）との組合せに基づくものであった。グルコース・オキシダーゼとカーボンナノチューブとを、例えば、テフロン（非特許文献１）、鉱油（M.D.Rubianes et al, 2003）、硬エポキシ（B.Perez et al, 2005）、ナフィオン（J.Wang et al, 2004）、ポリピロール（M.Gao et al, 2003; Y.C.Tsai et al, 2006; J.Wang et al, 2005）、キトサン（Y. Liu et al, 2006）、あるいはゾル−ゲル・マトリックス（A.Salimi et al, 2004）中で、物理的に結合（化学的結合ではない）させて、グルコースを検知するバイオ認識／電気化学的システムをつくり出すことにより、有効なグルコース・バイオセンサーが構築されうることが示された。一方、少数ながら、グルコースとカーボンナノチューブとを化学結合により結合させようとする研究もある（F.Patolsky et al, 2004;J.Liu et al, 2005; Y. Lin et al, 2004）。
【０００３】
レドックス酵素バイオセンサーに基づくカーボンナノチューブの分野において公表された印刷物の多くにおいては、酵素とカーボンナノチューブ及び／又はポリマーマトリックスとの間で何らの化学結合をさせることなく、酵素とカーボンナノチューブとを有機もしくは無機のポリマー結合材の中に取り込んでいることに注目するべきである。しかし、これらバイオセンサーの作製においては、酵素は電極物質（カーボンナノチューブでもポリマー結合材でもない）に共有結合で固定されていないので、結合材の使用が本当に必要であるのか、あるいは、グルコース・オキシダーゼをカーボンナノチューブの上に直接に固定させて、電気化学的グルコース・バイオセンサーをつくり出すことが可能かどうかを知ることは興味深いことであろう。
【０００４】
高度に特異的な電気的バイオセンサーに向けて、非共有結合によってカーボンナノチューブを機能化する本質的・重要な仕事は、これまでにいくつかなされてきたが（M.Shim et al, 2002;R.J.Chenet al, 2004; R.J.Chen et al, 2003; D.-W. Park et al, 2006）、電気化学的バイオセンサーに向けての努力はなされていない。
【０００５】
【非特許文献１】J. Wang, M. Musameh, Anal. Chem. 75, 2075 (2003).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、レドックスたんぱく質を、ポリマー結合材を使用することなく非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブを提供することである。本発明のもう一つの目的は、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した上記生体反応性カーボンナノチューブの作製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
〔発明の概要〕
上記目的を達成するため、どのようにすればポリマー結合材を要することなく、グルコース・オキシダーゼ（ＧＯｘ）がカーボンナノチューブのネットワークに固定されうるのか、我々は種々検討した。そして、カーボンナノチューブ上にレドックスたんぱく質ＧＯｘを非共有結合的に吸着させることに成功し、また、得られたＣＮＴ／ＧＯｘハイブリッドはグルコースの検出に好都合な性質を示すものであった。
【０００８】
すなわち、本発明は、 ポリマー結合材を使用することなく、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブ（すなわち、カーボンナノチューブ／レドックスたんぱく質のハイブリッド）を提供する。
【０００９】
また、本発明は、（ポリマー結合材を使用することなく）レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した前記生体反応性カーボンナノチューブの製法も提供するものであり、その製法は以下の工程を含んでいる：
(i) カーボンナノチューブを濃硝酸中で、高温条件下に酸化する；
(ii) 得られた酸化型カーボンナノチューブを精製水に分散させ、所定濃度にする；
(iii) レドックスたんぱく質を所定濃度に加え、混合する；
(iv) 得られた生体反応性カーボンナノチューブ（固体）を分離する。
【００１０】
＜略号＞
用いた略号の意味は次の通り。
ＣＮＴ：カーボンナノチューブ
ＤＷＣＮＴ：二層（double walled）カーボンナノチューブ
ＧＯｘ：グルコース・オキシダーゼ
【発明の効果】
【００１１】
本発明の、（ポリマー結合材なしで）レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブは、バイオセンサーを容易に構築する場合に扉を開くものである。これらは、例えば、電気化学的バイオセンサー（例：グルコースセンサー）として用いることができる。
【発明の実施の形態】
【００１２】
〔発明の更に詳しい説明〕
次に、本発明を更に詳細に説明する。
先に述べたように、本発明は、ポリマー結合材を使用することなく、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブを提供するものであり、言い換えれば、ポリマー結合材のない生体反応性カーボンナノチューブ／レドックスたんぱく質・ハイブリッドを提供するものである。
【００１３】
ここで、本発明における「カーボンナノチューブ」は、炭素の異型（allotype）の一つである。これは、その直径が２ｎｍ〜１００ｎｍの柱状分子の形態を有しており、グラファイト・シートを丸めた形状をしている。そのカーボンナノチューブとして、単層カーボンナノチューブ、二層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブいずれも使用できるが、好ましくは二層カーボンナノチューブ又は多層カーボンナノチューブである。
【００１４】
また、本発明における「非共有結合で結合させ機能化した」とは、“物理的に機能化した（させた）”ことを意味し、これには静電力、水素結合力、疎水性力あるいはπ−π相互作用力のような多くの型の非共有結合力（M. Shim et al, Nano Lett. 2, 285 (2002); R. J. Chen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 4984 (2003); D. Cui, J. Nanosci. Nanotech. 7, 1298 (2007)）を含んでいる。
【００１５】
また、本発明における「レドックスたんぱく質」とは、基質から（又は基質へ）電子を交換（注入、又は引抜き）する生体認識の実行が可能なたんぱく質を意味する。上記レドックスたんぱく質として、基本的に種々のオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ及びレダクターゼが使える。例えば、グルコース・オキシダーゼ、西洋ワサビ・パーオキシダーゼ、アルゼネート・レダクターゼ（アズリン）、アルコール・オキシダーゼ、アルコール・デヒドロゲナーゼ等である。中でも、グルコース・オキシダーゼが最も好ましく用いられる。
【００１６】
また、本発明における「ポリマー結合材」とは、ポリマー・マトリックスを意味する。
【００１７】
先に述べたように、本発明は、また、前記生体反応性ハイブリッドの製法にも関係するものであり、その製法は以下の工程を含んでいる：
(i) カーボンナノチューブを濃硝酸中で、高温条件下に酸化する；
(ii) 得られた酸化型カーボンナノチューブを精製水に分散させ、所定濃度にする；
(iii) レドックスたんぱく質を所定濃度に加え、混合する；
(iv) 得られた生体反応性カーボンナノチューブ（固体）を分離する。
【００１８】
ここで、この方法の工程（ｉ）における「高温」とは、７０℃ないしは９０℃の範囲中の一定温度に維持することを意味する。また、この高温処理は反応が終わるまで、例えば、１２〜３６時間をかけて行なわれる。
工程（ｉｉ）における「酸化型ＣＮＴの所定濃度」とは、０．１−１．０ｍｇ／ｍＬの濃度を意味する。
工程（ｉｉｉ）における「レドックスたんぱく質の所定濃度」とは、０．０４−０．４ｍｇ／ｍＬの濃度を意味する。
また、我々は、本発明の（レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した）生体反応性カーボンナノチューブで修飾した電極を使用して「バイオセンサー」（生体物質を検出する装置）を構築することができる。
【００１９】
図１は、二層カーボンナノチューブ上に、非共有結合で固定化させたグルコース・オキシダーゼによるグルコースの酸化と、それに続くシグナル変換とを示す模式図である。グルコース・オキシダーゼ（たんぱく質）とカーボンナノチューブとの相互作用は複雑であり、例えば、上述したように、静電力、水素結合力、疎水性力、π−π相互作用等の種々の非共有結合力を含んでいる。
【実施例】
【００２０】
本発明で用いた実験方法は、以下の通り。
＜装置＞
電圧電流実験はすべて、パソコンに接続され、一般目的電気化学システムｖ．４．９ソフトウェアで制御されたμオートラブIII（Ecochemie社, ユトレヒト、 オランダ）を用いて行なった。電気化学実験は、電圧電流セル（５ｍＬ）中、室温（２５℃）で三つの電極を配置した形で行なった。補助電極として白金電極が供され、参照電極として飽和Ａｇ／ＡｇＣｌが供された。電気化学的電位は全てＡｇ／ＡｇＣｌに対するものである。スキャンＴＥＭモード（ＳＴＥＭ；スポットサイズは０．７ｎｍ、加速電圧は２００ｋＶ）でＴＥＭイメージを得るためには、２００ｋＶで作動するJEM 2100F電界放出透過型電子顕微鏡（ＪＯＥＬ，東京，日本）を用いた。比表面積は多点ＢＥＴ法を用いたオートソーブ１装置（Quantachrome Instruments, Boynton beach, FL, USA）によって測定し、窒素が吸着物質に用いられた。試料は吸着実験の前に、真空で、２５０℃で１６ｈ処理して脱水した。
【００２１】
＜材料＞
二層カーボンナノチューブ（ＤＷＣＮＴ，カタログｎｏ．６３７３５１，純度９０％以上）、グラファイト粉末、過酸化水素（３０％水溶液）、グルコース、グルコース・オキシダーゼ、二塩基性リン酸カリウム及びリン酸は、シグマ−アルドリッチ社（日本）から購入した。
【００２２】
実施例１
（ｉ）ポリマー結合材を使用せずに、レドックスたんぱく質を非共有結合で結合させ機能化した生体反応性カーボンナノチューブの調製
二層カーボンナノチューブ（ＤＷＣＮＴ）は、濃硝酸（６Ｍ）中、８０℃で、２４ｈ処理し、酸化させた。得られた酸／ＤＷＣＮＴ混合物は次に蒸留水で洗浄し、遠沈し、水溶液のｐＨが中性になるまでこの操作を数回繰り返した。次に、上記酸化カーボンナノチューブを、孔の大きさ０．２μｍの膜（Nuclepore Track-Etch Membrane, Whatman, UK）を用い、フィルム状(又はシート状）カーボンナノチューブを形成させつつ、真空で濾過した。
引き続いて、１ｍｌ当たりＧＯｘ０．２ｍｇ及び（上で得た）酸化ＤＷＣＮＴ０．５ｍｇ（対照として、同量のグラファイト・パウダーを使用）をバイアル中に分散させ、これを７５分間、かき混ぜた。このようにして、ポリマー結合材を使用せずに、グルコース・オキシダーゼを非共有結合で結合させて機能化した生体反応性二層カーボンナノチューブを得た。
【００２３】
（ｉｉ）評価  
電気化学的測定のために、得られた上記ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ（対照：グラファイト／ＧＯｘ）を、研磨布に載せた０．０５μｍのアルミナ粒子を用いて予め研磨したガラス状カーボン電極（直径３ｍｍ）の表面上に落とした。このＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ（対照：グラファイト／ＧＯｘ）を先ず、蒸留水で１ｍｇ／ｍｌの濃度に分散させ、次にその分散液をウルトラソニック・バスの中に１分間置き、その後、処理された分散液のうちの５μLをガラス状カーボン電極の表面から吸い取った。その分散液を室温に置き蒸発させると、ガラス状カーボン電極表面上でランダムな分布のフィルムとなった。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、適切な電圧範囲で毎秒５０ｍＶのスキャン速度で、サイクリック・ボルタメトリー実験を行なった。ＴＥＭの測定のためには、濃度１ｍｇ／ｍｌのＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ（対照：グラファイト／ＧＯｘ）１μＬを銅のＴＥＭグリッド上に落とし、そのまま放置し空気中で乾燥させた。
【００２４】
図２は、得られたＤＷＣＮＴ／ＧＯｘハイブリッドのＴＥＭ像を示すものである。このＴＥＭによってはＧＯｘ分子を直接に観察することは難しいけれども、ＤＷＣＮＴは相互に連絡された濃いナノチューブ・ネットワークを形成していることは明らかである（図２の右側部分では明らかに視認できる）。他方、グラファイト粉は粒構造である（図示せず）。ＤＷＣＮＴとグラファイトの形態上の相違は、電気化学的測定から分かるように、ＧＯｘ分子の物理的捕捉に深く影響する（図３参照）。
【００２５】
図３Ａは５ｍＭ過酸化水素に対するサイクリックボルタモグラムで、（ａ）がグラファイト／ＧＯｘ膜電極を用いた場合、（ｂ）がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極を用いた場合である。この図から、ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極を用いた場合、過酸化水素の酸化は約＋０．６Ｖで始まるが、グラファイト／ＧＯｘ膜電極を用いた場合は過酸化水素の酸化は約＋０．８Ｖで始まることは明かである。この電気化学的測定の結果から、ＤＷＣＮＴを基礎とする電極はグラファイトを基礎とする電極に比べて表面積が大きく、過酸化水素（グルコース・オキシダーゼ酵素によるグルコース酸化の副生物）の低濃度検出に有利であることを示している（ＤＷＣＮＴの表面積／電気化学的容量は、M. Pumera, Nanoscale Res. Lett. 2, 87 (2007)参照)。この観察は、ＢＥＴ法によって測定されたＤＷＣＮＴ及びグラファイトの各々の比表面積（ＤＷＣＮＴ：58.55 m2／g 、グラファイト：11.07 m2／g）と整合している。
【００２６】
グルコースに対するＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極（対照：グラファイト／ＧＯｘ膜電極）の応答を調べた。図３Ｂは１０ｍＭグルコースに対するハイドロダイナミックボルタモグラムである。グラファイト／ＧＯｘ膜電極では、グルコース・オキシダーゼ酵素がグラファイトのミクロ粒子に有意に捕捉若しくは吸着されなかったためか、グルコースに対するレドックス反応が何ら観察されなかった。ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極の場合は、状況は劇的に異なっている。グルコースに対し、約＋０．６Ｖで始まるかなりの酸化電流がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ膜電極で観察される。図３の結果は、ＧＯｘレドックス酵素がＤＷＣＮＴを、優れた信号変換器として作用するＤＷＣＮＴへと機能付与させたことを示している。
【００２７】
次に、ＤＷＣＮＴネットワークに固定されたＧＯｘの安定性を調べた。図４は、２．５ｍＭグルコースに対するＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極の電流応答を連続的に約１５分間記録したものである。図示されるように、この時間における応答電流の減少は観察されていない。ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極の長時間の安定性を見るため、ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極を４℃、乾燥状態で一ヶ月保存した場合には、応答電流は４０％減少していた。この数字は、報告されたカーボンナノチューブ／ポリマー複合物／ＧＯｘ電極における数字（J. Wang, Electroanalysis13, 983 (2001); A. Salimi et al, Anal. Biochem. 333, 49 (2004)）よりも少し低いが、この相違の理由は現在のところ不明である。
【００２８】
図５は、グルコースの添加（濃度範囲は１．４〜１８．５ｍＭ）に対するグラファイト／ＧＯｘ電極（ａ）及びＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極（ｂ）の電流応答を示すものである。濃度と応答の間の関係は、酵素系についての典型的ミカエリスーメンテン曲線である。見かけのミカエリスーメンテン定数（KMapp）は、ラインウィーバー−バーク・プロットから１４．１４ｍＭと計算された。この値は、文献値（H. Zhou et al, Sens. Actuators B 101, 224 (2004)）と整合する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】二層カーボンナノチューブ上に、非共有結合で固定化させたグルコース・オキシダーゼによるグルコースの酸化と、それに続くシグナル変換とを示す模式図。
【図２】ＤＷＣＮＴ／ＧＯｘハイブリッドのＴＥＭ像；加速電圧は２００ｋＶ。
【図３】（上図、Ａ）５ｍＭ過酸化水素水に対するサイクリックボルタモグラムで、（ａ）がグラファイト／ＧＯｘ電極を用いた場合、（ｂ）がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極を用いた場合。条件：スキャンスピードは５０ｍＶ／ｓ；支持電解質はリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）。  （下図、Ｂ）１０ｍＭグルコースに対するハイドロダイナミックボルタモグラムで、（ａ）がグラファイト／ＧＯｘ電極を用いた場合、（ｂ）がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極を用いた場合。支持電解質はリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）、撹拌速度は約５５０ｒｐｍ。
【図４】２．５ｍＭグルコースに対するＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極の応答安定性を示すグラフ。条件：支持電解質はリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）、撹拌速度は約５５０ｒｐｍ、検出電位は＋０．８５Ｖ。
【図５】グルコースの濃度に対する電流依存性を示すグラフで、（ａ）がグラファイト／ＧＯｘ電極を用いた場合、（ｂ）がＤＷＣＮＴ／ＧＯｘ電極を用いた場合。条件：支持電解質はリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）、撹拌速度は約５５０ｒｐｍ、検出電位は＋０．８５Ｖ。
【図１】
2008261680.tif 000003
【図２】
2008261680.tif 000004
【図３】
2008261680.tif 000005
【図４】
2008261680.tif 000006
【図５】
2008261680.tif 000007
【外国語明細書】
[Title of Invention]   
Biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein, and fabrication method thereof
[Field of the Invention]
[0001]
This invention relates to biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein without polymer binder, which may be useful in the field of biosensors for medical sensing. This invention also relates to a fabrication method for the above biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein. 
[Background of the Invention]
[0002]
Most of the nanoscale materials-based enzyme biosensors efforts concentrate on creation of glucose biosensor due to the enormous biomedical importance of glucose sensing. Such glucose biosensors have been based on combination of carbon nanotubes (CNT) and glucose oxidase (GOx). It has been shown that effective glucose biosensor can be constructed by physical interactions (not chemical bonding) of glucose oxidase and carbon nanotubes within e.g. Teflon (non-patent ref. 1), mineral oil(M.D.Rubianes et al, 2003), rigid epoxy(B.Perez et al, 2005), Nafion(J.Wang et al, 2004), polypyrrole(M.Gao et al, 2003; Y.C.Tsai et al, 2006; J.Wang et al, 2005), chitosan(Y. Liu et al, 2006) or in sol-gel matrix(A.Salimi et al, 2004) to create biorecognition/electrochemical system for glucose biosensing. And only few researchers connected glucose oxidase and carbon nanotubes by means of chemical bonding(F.Patolsky et al, 2004;J.Liu et al, 2005; Y. Lin et al, 2004).
[0003]
It should be noted that the most of the published papers in area of carbon nanotube based redox enzyme biosensors incorporate enzyme and carbon nanotubes in the organic or inorganic polymer binder without any chemical bond between enzyme and CNT and/or polymer matrix. However, since in these biosensor designs the enzyme is not covalently attached to the electrode material (neither carbon nanotube nor polymer binder), one may wish to know if it is necessary to use binder at all and if it is possible to immobilize glucose oxidase on carbon nanotubes directly to create glucose electrochemical biosensor. 
[0004]
While there has been done substantial work on noncovalent functionalization of carbon nanotubes for highly specific electronic biosensor(M.Shim et al, 2002;R.J.Chenet al, 2004; R.J.Chen et al, 2003; D.-W. Park et al, 2006), there is no effort in the same direction for electrochemical biosensor.
[0005]
[non-patent ref. 1]   J. Wang, M. Musameh, Anal. Chem. 75, 2075 (2003). 
[Disclosure of Invention]
[Purpose of Invention]
[0006]
A purpose of this invention is to provide biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein without polymer binder. Another purpose of this invention is to provide a fabrication method for the above carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein. 
[Summary of Invention]
[0007]
In order to achieve the above purpose, we have studied variously how GOx can be immobilized in the carbon nanotube network without need of polymer binder. Then, we have succeeded in noncovalently adsorbing redox protein GOx on carbon nanotubes, and the obtained CNT/GOx hybrid showed favorable properties towards detection of glucose. 
[0008]
Namely, this invention provides biosensive carbon nanotubes noncovalentlyfunctionalized with redox protein(namely, carbon nanotubes/ redox protein hybrid) without polymer binder.
[0009]
This invention also provides a fabrication method for the above biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein without polymer binder, whose method comprises the following steps:
(i) Carbon nanotubes are oxidized in concentrated nitric acid under elevated temperature condition;
(ii) The obtained oxidized carbon nanotubes are dispersed in purified water to make defined concentration of them; 
(iii) Redox protein is added to reach defined redox protein concentration, and the mixture is mixed;
(iv) The obtained biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein(solids) are separated.
[0010]
<Abbreviation>  
Abriviated words has the following meaning in this specificaton.
CNT: carbon nanotubes 
DWCNT :double walled carbon nanotubes 
GOx: glucose oxidase
[Advantageous effects]
[0011]
The invented biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein without polymer binder open doors for easy construction of biosensors. They can be used, for example, as electrochemical biosensors(e.g. glucose sensor).
The invented fabrication method is a facile scalable chemical approach.  Therefore, we can easily fabricate the biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein without polymer binder.
[Detailed Description of Invention]
[0012]
Then, we explain this invention in more detail. 
As said above, this invention provides biosensive carbon nanotubes noncovalentlyfunctionalized with redox proteinwithout polymer binder, in other word, this invention provides biosensive carbon nanotubes/ redox protein hybrid without polymer binder.
[0013]
Here, “carbon nanotubes” in this invention are an allotype of carbon. They have the form of cylindrical carbon molecules whose diameter ranges 2nm-100nm, and they have the form which consists of enrolled graphite sheet(s) . Though single carbon nanotubes, double walled carbon nanotubes or multiwalled carbon nanotubes can be used as “carbon nanotubes”, but double walled or multiwalled carbon nanotubes are preferably used.
[0014]
Here, “noncovalently functionalized” in this invention means “physically functionalized”, and it contains many types of noncovalent forces that are electrostatic, hydrogen bonding, hydrophobic or π-π interactions(M. Shim et al, Nano Lett. 2, 285 (2002); R. J. Chen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 4984 (2003); D. Cui, J. Nanosci. Nanotech. 7, 1298 (2007)).
[0015] 
Here, “redox protein” in this invention means protein which is able of biorecognition event in which exchanges (inject or withdraw) electron from/to substrate. As the above redox protein, we can use basically various oxidase, peroxidase, dehydrogenase and reductase; for example, glucose oxidase, horseradish peroxidase, arsenate reductase(azurin), alcohol oxidase and dehydrogenase. Among them we can use glucose oxidase most preferably.
[0016]
Here, “polymer binder” in this invention means polymer matrix.
[0017]
As said above, this invention relates a fabrication method for the above biosensive hybrid, whose method comprises the following steps:
(i) Carbon nanotubes are oxidized in concentrated nitric acid under elevated temperature condition;
(ii) The obtained oxidized carbon nanotubes are dispersed in purified water to make defined concentration of them; 
(iii) Redox protein is added to reach defined redox protein concentration, and the mixture is mixed;
(iv) The obtained biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein(solids) are separated.
[0018]
Here, “elevated temperature” in step (i) in this method means keeping constant temperature of 70-90℃. The treatment are kept until the reaction is completed, for example 12-36 hours. 
“Defined concentration”of them(oxidized CNT) in step (ii) in this method means concentration of 0.1 - 1.0 mg/mL.
“Defined redox protein concentration” in step (iii) in this method means concentration of 0.04 - 0.4mg/mL. 
And we can construct “biosensor”(device to detect biomaterials) by use of  biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein modified electrode.
[0019]
Fig.1 is a schematic drawing showing oxidation of glucose by glucose oxidase noncovalently immobilized on double wall carbon nanotube and following signal transduction. The interactions between glucose oxidase proteins and carbon nanotube are complex, involving many types of noncovalent forces that are electrostatic, hydrogen bonding, hydrophobic or π-π interactions as described above.
[Examples]
[0020]
Experimental methods used in this invention were as followed.
<Apparatus>
All voltammetric experiments were performed using an electrochemical analyzer μAutolabIII (Ecochemie, Utrecht, The Netherlands) connected to a personal computer and controlled by General Purpose Electrochemical Systems v. 4.9 software (Ecochemie). Electrochemical experiments were carried out in a 5 mL voltammetric cell at room temperature (25℃), using three electrode configuration. A platinum electrode served as an auxiliary electrode and a saturated Ag/AgCl as a reference electrode. All electrochemical potential are stated vs. Ag/AgCl.   JEM 2100F field emission transmission electron microscope (JOEL, Tokyo, Japan) working at 200 kV was used to acquire TEM images in a scanning TEM mode(STEM; spot size, 0.7 nm; acceleration voltage, 200 kV). Surface specific area was measured by Autosorb 1 equipment (Quantachrome Instruments, Boynton beach, FL, USA) using multipoint BET method; nitrogen was used adsorbate. Prior to the adsorption experiments, the samples were dehydrated at 250℃ under vacuum for 16 h.
[0021]
<Materials>
Double wall carbon nanotubes (DWCNT, catalog no. 637351, purity >90%), graphite powder, hydrogen peroxide (30% aqueous solution), glucose, glucose oxidase, potassium phosphate dibasic and phosphoric acid were purchased from Sigma-Aldrich (Japan). 
[0022]
Example 1 
(i) Preparation of biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with glucose oxidase without polymer binder
Double wall carbon nanotubes (DWCNT) were oxidized in concentrated nitric acid (6 M) at 80℃ for 24 h. The acid/DWCNT mixture was subsequently washed with distilled water and centrifuged several times until their aqueous solution reached neutral pH. Subsequently, oxidized carbon nanotubes were filtered through 0.2 μm membrane(Nuclepore Track-Etch Membrane, Whatman, UK) using vacuum, creating carbon nanotube films (papers). 
Subsequently, 0.2 mg mL-1 of GOx enzyme and 0.5 mg mL-1of the obtained oxidized DWCNT(the same amount of graphite powder was used as control) was dispersed in vial and stirred for 75 min. Then, we obtained biosensive double wall carbon nanotubes noncovalently functionalized with glucose oxidase without polymer binder.
[0023]
(ii) Evaluation 
For the electrochemistry measurements, the obtained DWCNT/GOx (control; graphite/GOx) was cast onto the glassy carbon electrode surface (diameter of 3 mm), which was previously polished with 0.05 μm alumina on polishing cloth. DWCNT/GOx(control; graphite/GOx) was first dispersed in distilled water in concentration of 1 mg mL-1 and the suspension was then placed for 1 minute into an ultrasonic bath, after which 5 μL of suspension was pipetted on the glassy carbon electrode surface. It was allowed to evaporate at room temperature creating random distribution film on the glassy carbon surface. Cyclic voltammetric experiments were carried out at a scan rate of 50 mV s-1 over relevant potential range using 50 mM phosphate buffer (pH 7.4). For TEM measurements, 1 μL of 1 mg mL-1solution of DWCNT/GOx or control(graphite/GOx) was dropped on copper TEM grid and left to dry in air.
[0024]
Fig.2 shows TEM image of the obtained DWCNT/GOx hybrid. While it is difficult to directly observe GOx molecule by TEM it is clear that DWCNT create dense interconnected nanotube network (clearly visible in the right portion of the Fig. 2) while graphite powder is of grain structure (not shown). The difference in morphology of DWCNT and graphite has profound effect on physical entrapment of GOx, as can be seen from the electrochemical measurements(see Fig.3).
[0025]
Fig. 3 A shows cyclic voltammograms of 5 mM hydrogen peroxide which were carried out using graphite/GOx (a) and DWCNT/GOx (b) film electrodes. It can be clearly seen that oxidation of hydrogen peroxide begins around +0.6 V in case of DWCNT/GOx film electrode while oxidation of H2O2starts at potential about +0.8 V in case of graphite/GOx film electrode. The results of electrochemical measurements indicate that DWCNT-based electrode provides high surface compared to graphite and favorable low detection potential for detection of hydrogen peroxide, which is the co-product of glucose oxidation by glucose oxidase enzyme (surface area/electrochemical capacitance of DWCNT was studied in M. Pumera, Nanoscale Res. Lett. 2, 87 (2007)). This observation is coherent with surface specific area measurements of DWCNT and graphite measured by BET method and which were found to be 58.55 m2 g-1 for DWCNT and 11.07 m2 g-1 for graphite.
[0026]
The response of DWCNT/GOx(control: graphite/GOx) film electrodes toward glucose was investigated.  Fig. 3B shows hydrodynamic voltammograms for 10 mM glucose. No redox activity is observed for glucose at the graphite/GOx film electrode due to the fact that the glucose oxidase enzyme is not entrapped/adsorbed on graphite microparticles in significant ammount. Dramatically different situation is in case of DWCNT/GOx film electrodes. Significant oxidation currents, starting around +0.6 V, are observed for glucose at DWCNT/GOx film electrode. The data of Fig. 3 indicate that the GOx redox enzyme successfully functionalized DWCNT, which acts as excellent signal transducer. 
[0027] 
Next, the stability of immobilized GOx in DWCNT network was investigated. Fig. 4 shows the amperometric response of 2.5 mM glucose as recorded over a continuous ca.15 minutes period. As shown, no decrease was observed in response current. Long term stability study of DWCNT/GOx electrode showed 40% decrease of the response towards glucose after storing DWCNT/GOx modified film electrode in dry state at 4℃ for one month. This value is somehow lower than declared stability of carbon nanotube/polymer composite/GOx electrodes(J. Wang, Electroanalysis 13, 983 (2001); A. Salimi et al, Anal. Biochem. 333, 49 (2004)), however, the exact reason for this difference is currently unknown.
[0028] 
Fig. 5 shows the amperometric response of graphite/GOx(a) and DWCNT/GOx(b) electrodes towards the addition of glucose in the concentration range from 1.4 to 18.5 mM. A relationship between concentration and response is typical Michaelis-Menten for enzymatic systems. The apparent Michaelis-Menten constant KMapp was calculated to be 14.14 mM from the Lineaweaver-Burk plot. This KMapp is coherent with these in the paper(H. Zhou et al, Sens. Actuators B 101, 224 (2004)).
[Brief Description of drawings]
[0029]
[Fig.1] Schematic drawing showing oxidation of glucose by glucose oxidase noncovalently immobilized on double wall carbon nanotube and following signal transduction.
[Fig.2] TEM image of DWCNT/GOx hybrid; acceleration voltage, 200 kV.
[Fig.3] (Upper, A) Cyclic voltammograms for 5 mM hydrogen peroxide using (a) graphite/GOx and (b) DWCNT/GOx electrodes. Conditions: Scan speed, 50 mV/s; supporting electrolyte, phosphate buffer (50 mM, pH 7.4). 
(Lower, B) Hydrodynamic voltammograms for 10 mM glucose using the (a) graphite/GOx and (b) DWCNT/GOx electrode. Supporting electrolyte, phosphate buffer (50 mM, pH 7.4); stirring rate, ca. 550 rpm.
[Fig.4] A graph showing stability of the response of the DWCNT/GOx electrode to 2.5 mM glucose. Conditions: supporting electrolyte, phosphate buffer (50 mM, pH 7.4); stirring rate, ca. 550 rpm, detection potential of +0.85 V.
[Fig.5] A graph showing current dependence upon glucose concentration for (a) graphite/GOx and (b) DWCNT/GOx electrode. Conditions: supporting electrolyte, phosphate buffer (50 mM, pH 7.4); stirring rate, ca. 550 rpm, detection potential of +0.85 V.
1. Biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein without polymer binder.
2. Biosensive carbon nanotubes of claim 1, wherein the above redox protein is glucose oxidase.
3. A fabrication method for the above biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein without polymer binder, whose method comprises the following steps:
(i) Carbon nanotubes are oxidized in concentrated nitric acid under elevated temperature condition;
(ii) The obtained oxidized carbon nanotubes are dispersed in purified water to make defined concentration of them; 
(iii) Redox protein is added to reach defined redox protein concentration, and the mixture is mixed;
(iv) The obtained biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein are separated.
[Abstract]
[Purpose] A purpose of this invention is to provide biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein without polymer binder. Another purpose of this invention is to provide a fabrication method for the above carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein.
[Summary] Invented biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein without polymer binder can be fabricated by a following method, whose method comprises the following steps:
(i) Carbon nanotubes are oxidized in concentrated nitric acid under elevated temperature condition;
(ii) The obtained oxidized carbon nanotubes are dispersed in purified water to make defined concentration of them; 
(iii) Redox protein is added to reach defined redox protein concentration, and the mixture is mixed;
(iv) The obtained biosensive carbon nanotubes noncovalently functionalized with redox protein(solids) are separated.
[Typical figure]     Fig.1
[Fig. 1] 
2008261680.tif 000008
[Fig. 2] 
2008261680.tif 000009
[Fig. 3] 
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[Fig. 4] 
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[Fig. 5] 
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