(57)【要約】 【課題】  標的化合物の水性溶液からの回収に有用な、合理的に設計された混合形式樹脂、およびそのような樹脂の使用方法を提供する。【解決手段】  ここに記載されている樹脂は、標的化合物の結合ｐＨでは疎水性の性質を、そして標的化合物の樹脂からの脱着ｐＨでは親水性および／または静電気的性質を有し、特に、低および高イオン強度の両方の水性溶液から標的タンパク質を結合するために設計されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化合物を結合させるための樹脂であって：
固体支持マトリックス；および
スペーサーアームと該スペーサーアームを介して前記マトリックスに結合している少なくとも１つのイオン性官能基とを含む、前記固体支持マトリックスに共有結合しているイオン性リガンドまたはその混合物；を含み、
前記固体支持マトリックス上における前記イオン性リガンドの密度が、樹脂１ｍｌあたり少なくとも１５０μモルまたは樹脂の乾燥重量１ｇあたり少なくとも１ｍモルの何れか小さい値より大きく、
該樹脂の疎水的特性が前記標的化合物が樹脂に結合する第１のｐＨにおいて高イオン強度および低イオン強度の両方で水性媒体中の前記標的化合物の少なくとも５０％を結合させるのに十分であり、かつ前記標的化合物を樹脂から脱着させる第２のｐＨにおける樹脂の親水的および／または静電気的特性が結合した化合物をその第２のｐＨで脱着させるのに十分であるように、前記イオン性官能基が前記固体支持マトリックスおよび前記標的化合物に関連して選択されており、さらに該イオン性官能基が前記第２のｐＨにおいて前記第１のｐＨでの荷電と比較してさらに静電気的に荷電しているかまたは異なった極性に荷電していることを特徴とする樹脂。
【請求項２】
前記固体支持マトリックスに共有結合した非イオン性リガンドをさらに含み、該非イオン性リガンドの割合が、イオン性リガンドおよび非イオン性リガンドの総数に対して０から８０％であり、
前記非イオン性リガンドが、樹脂の疎水的性質が第１のｐＨにおいて高イオン強度および低イオン強度の両方で水性媒体中の標的化合物の少なくとも５０％を結合させるのに十分であるように前記イオン性リガンドおよび前記固体支持マトリックスに関連して選択されており、かつ第２のｐＨにおける樹脂の親水的および／または静電気的性質が結合した化合物をその第２のｐＨにおいて脱着させるのに十分であるように前記固体支持マトリックスに関連して選択されていることを特徴とする請求項１記載の樹脂。
【請求項３】
樹脂から化合物を脱着させるｐＨでの樹脂上の静電荷が、そのｐＨにおける前記標的化合物の正味の静電荷と同じ極性であることを特徴とする請求項１記載の樹脂。
【請求項４】
樹脂から化合物を脱着させるｐＨでの樹脂上の静電荷が、そのｐＨにおける前記標的化合物の正味の静電荷と反対の極性であることを特徴とする請求項１記載の樹脂。
【請求項５】
前記イオン性官能基が、カルボキシル基、アミノ基およびフェノール基からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の樹脂。
【請求項６】
前記固体支持マトリックスに結合した非イオン性リガンドの割合が、イオン性リガンドおよび非イオン性リガンドの総数に対して０％より大きく４０％までの範囲にあることを特徴とする請求項２記載の樹脂。
【請求項７】
前記固体支持マトリックスが架橋されていることを特徴とする請求項１記載の樹脂。
【請求項８】
前記固体支持マトリックスが非イオン性であることを特徴とする請求項１記載の樹脂。
【請求項９】
前記固体支持マトリックスがその骨格内にイオン性官能基を有することを特徴とする請求項１記載の樹脂。
【請求項１０】
前記標的化合物が、タンパク質またはペプチドであることを特徴とする請求項１記載の樹脂。
【請求項１１】
前記タンパク質またはペプチドが、スブチリシンおよびキモシンから成る群より選択されることを特徴とする請求項１０記載の樹脂。
【請求項１２】
前記リガンドの密度が、樹脂１ｍｌあたり少なくとも１５０μモルであることを特徴とする請求項１記載の樹脂。
【請求項１３】
前記リガンドの密度が、樹脂の乾燥重量１ｇあたり少なくとも１ｍモルであることを特徴とする請求項１記載の樹脂。
【請求項１４】
標的化合物を含む水性媒体から該標的化合物を分離する方法であって、前記媒体のｐＨを調整し、該媒体を請求項１記載の樹脂と接触させて、前記標的化合物の少なくとも５０％を樹脂に結合させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記標的化合物が、タンパク質またはペプチドであることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質またはペプチドが、スブチリシンおよびキモシンから成る群より選択されることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
標的化合物を含む水性媒体から該標的化合物を結合させて回収する方法であって、
ａ）前記媒体を請求項１記載の樹脂と接触させて、前記標的化合物の少なくとも５０％を樹脂に結合させ；
ｂ）結合した前記標的化合物を含む前記樹脂を、媒体の他の成分から分離して、樹脂−媒体複合体を形成し；そして、
ｃ）前記標的化合物が樹脂から脱着するように、前記ａ）の媒体のｐＨとは十分に異なったｐＨを有する溶出液と前記複合体とを接触させることにより、前記結合した標的化合物を前記複合体から脱着させる；工程を含む方法。
【請求項１８】
前記標的化合物が、タンパク質またはペプチドであることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質またはペプチドが、スブチリシンおよびキモシンから成る群より選択されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
撹拌バッチ工程において、前記水性媒体を前記樹脂と接触させることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
クロマトグラフィーカラムにおいて、前記水性媒体を前記樹脂と接触させることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
前記カラムが放射状流体カラムであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記カラムが拡張流動層であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記リガンドの密度が、樹脂１ｍｌあたり少なくとも１５０μモルであることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
前記リガンドの密度が、樹脂の乾燥重量１ｇあたり少なくとも１ｍモルであることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項２６】
前記イオン性官能基が、４−（アミノメチル）ピリジン、３−（アミノメチル）ピリジン、２−（アミノメチル）ピリジン、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール、２−（アミノメチル）ベンズイミダゾール、４−（３−アミノプロピル）モルフォリン、フロロ，クロロ，ブロモおよびヨードからなる群より選択された１から２のハロゲン基を有するハロトリアミン、４−アミノ酪酸、（１Ｓ，２Ｓ）−（＋）−２−アミノ−１−フェニル−１，３プロパンジオール、（−）−フェニルプロパノールアミン、フェニルエチルアミン、フェニルアラニンオール、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホンアミド、ＤＬ−β−ヒドロキシフェニルエチルアミン、チオサリチル酸、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、２−メルカプトベンズイミダゾール、４−メルカプトエチルピリジン、２−メルカプトエチルピリジン、４−メルカプト酪酸、５−メルカプトバレリアン酸、６−メルカプトヘキサノン酸、４−ヒドロキシチオフェノール、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−クロロヒドロキシフェニル酢酸、３，５−ジクロロサリチル酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、３−ニトロチロシン、フロロ，クロロ，ブロモ，ヨードから成る群より選択された１から２のハロゲン基を有するハロチロシン、およびパラ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジンから成る群より選択された化合物から誘導されたものであることを特徴とする請求項１記載の樹脂。
【請求項２７】
前記イオン性官能基が、４−（アミノメチル）ピリジン、３−（アミノメチル）ピリジン、２−（アミノメチル）ピリジン、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール、２−（アミノメチル）−ベンズイミダゾールおよび４−（３−アミノプロピル）モルフォリンから成る群より選択された化合物から誘導されたものであることを特徴とする請求項２６記載の樹脂。
【請求項２８】
前記イオン性官能基が、アミノカプロン酸、２−メルカプトピリジン、４−メルカプトピリジン、アミノエチルベンゼンスルホンアミド、チラミン、チロシンおよびヒスチジンから成る群より選択された化合物から誘導されたものであることを特徴とする請求項１記載の樹脂。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的化合物の水性溶液からの回収に有用な、合理的に設計された混合形式樹脂、およびそのような樹脂の使用方法に関するものである。ここに記載されている樹脂は、標的化合物の結合ｐＨでは疎水性の性質を、そして樹脂からの標的化合物の放出ｐＨでは親水性および／または静電気的性質を有し、特に、低および高イオン強度の両方で水性溶液から標的タンパク質を結合するために設計されている。
【背景技術】
【０００２】
参考文献
以下の参考文献が明細書中で［］内の番号で言及されている：
2008156617.tif 000002
2008156617.tif 000003
2008156617.tif 000004
上で言及された刊行物の各々の開示は、各々の、および全ての参考文献がここに参考文献として取り込まれているのと同様に、全体としてここに参考文献として取り込まれている。
【０００３】
技術の現状
近年、いくつかの技術が、標的化合物の水性混合物からの分離および精製を可能とするために、開発および／または最適化されてきている。このような化合物についてこれまでに用いられている分離および精製技術には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）［１］、アフィニティークロマトグラフィー等がある。そのようなクロマトグラフ技術の多様性は、標的化合物の、分離／精製の複雑さを最小化する一方で、分離および／または精製を行なう困難さを反映しており、そして、上記の技術の各々は、それらの幅広い産業的規模での利用を制限する１以上の欠点を有している。
【０００４】
混合形式のクロマトグラフィー用樹脂はまた、このような樹脂が疎水的な条件下で標的化合物を結合することが可能であり、静電気的（イオン的）または親水性条件下で樹脂から標的化合物を放出することが可能である分野で用いられている。このような混合形式樹脂の例は、Ｋａｓｃｈｅ，ｅｔ  ａｌ．［７］，Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．［６］，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ［１１］およびＢｉｓｃｈｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．［１２］において見られる。
【０００５】
従来技術の混合形式のクロマトグラフィー用樹脂の典型的な問題の１つは、標的化合物の溶液において高い濃度の塩が用いられていない場合、あまり疎水的でない標的化合物の樹脂への結合効率がそれほど高くないことである。例えば、Ｋａｓｃｈｅ，ｅｔ  ａｌ．［７］においては、予備的なレベルでのタンパク質の樹脂への結合は、１Ｍ  ＮａＣｌ溶液を用いることにより達成された。標的化合物を含んでいる水性溶液に塩の添加を必要とするクロマトグラフ技術は、産業的規模での収率を達成するためには、大量の試薬が必要であり、相当な工程を必要とするであろう。従って、高い濃度の塩の使用を必要とするクロマトグラフィー用樹脂は、このような化合物の産業的な量の回収および／または精製のための最も効果的かつコスト効果を有する方法ではない。
【０００６】
本発明は、部分的には、１つのイオン性官能基およびリガンドを樹脂の固体支持マトリックスに共有結合で連結させている１つのスペーサーから成る特定のイオン性リガンドの利用と、組み合わされた混合形式クロマトグラフィー用樹脂上の高リガンド密度の利用により、標的化合物が高および低イオン強度下において樹脂に結合するような、十分に疎水性の性質を提供できるという発見に基づいている。本発明はさらに、部分的には、標的化合物の樹脂からの放出を、イオン性官能基を介した樹脂上の電荷の量を増加させるなどして単に放出溶液のｐＨを変化させることによって、親水的または静電気的（イオン性）相互作用によって達成することが可能であるという発見に基づいている。この後半の特徴は、このようなＨＩＣ樹脂への結合がしばしば不可逆的であり得る一方で、生産物回収のための扱いやすい手段を提供することにより、高密度ＨＩＣ樹脂上に多大な利点を提供している。
【０００７】
本発明においては、イオン性リガンドは、標的化合物に関連して合理的に選択され、それにより標的化合物の、発酵液体培地を含む水性媒体からの、大規模で効果的な回収および／または精製を可能としている。ここで用いられる樹脂は、特に、固体支持マトリックスおよび、少なくとも１５０μモル／樹脂ミリリットルかまたは１ｍモル／グラム樹脂乾燥重量の何れか小さい値より大きい密度で、固体支持マトリックスに共有結合的に選択され取り付けられたリガンドまたはリガンドの混合物を含有するものとして特徴づけられる。イオン性リガンドはスペーサーアームと、少なくとも１つのイオン性官能基であってマトリックスにスペーサーアームを介して結合している官能基を有する。樹脂上で用いられるイオン性リガンドは、固体支持マトリックスおよび標的化合物に関連して、樹脂の疎水的性質が、第１のｐＨにおいては高および低イオン強度で水性媒体中の標的化合物の少なくとも５０％を結合するために十分であるように選択され、さらに、固体支持マトリックスおよび標的化合物に関連して、樹脂の親水的および／または静電気的（イオン的）性質が、第２のｐＨにおいて、結合した化合物を放出するために十分であるように選択される。さらには、イオン性官能基は、化合物の樹脂への結合ｐＨにおいては部分的に静電気的に荷電しており、化合物の樹脂からの放出ｐＨにおいては、さらに荷電しているかまたは異なった極性に荷電している。このような部分的に荷電した樹脂は標的化合物の樹脂への結合を促進または弱めるための第２の成分を提供するものである。
【０００８】
好ましい態様においては、標的化合物が樹脂から放出されるｐＨでの樹脂の荷電は、そのｐＨにおける標的化合物の正味静電気的荷電と同じ極性である。この実施例においては、放出は、樹脂の疎水的結合特性を相殺する電荷−電荷の反発によって成される。別の実施の態様においては、標的化合物の樹脂からの放出ｐＨでの樹脂の荷電は、標的化合物と反対の極性である。何れの実施例においても、高または低イオン強度の放出溶液（溶出液等）の使用により、または、エチレンまたはプロピレングリコール等の極性減少剤の使用により達成されることが出来る。
【０００９】
この発明の樹脂は、少なくとも樹脂１ｍｌに対して１５０μモル、または樹脂の乾燥重量１ｇあたり１ｍモルのうちの小さいほうの値よりも大きいリガンド密度を有するという特徴により、さらに、リガンドがイオン性官能基をマトリックスに共有結合により連結しているスペーサーを含むという特徴により以前に記述されている混合形式樹脂とは、対照を成している。特に、文献中では、イオン性基は、長アルキル鎖（疎水性）セファロース樹脂への結合を弱めより好ましい放出条件とするために、熟慮されて導入されている［２、３］。これらのマトリックス上のリガンド密度は１ｍｌあたり約１５−２１μモルと計算されている。
【００１０】
ポリスチレンカルボキシル樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）もまた、疎水性相互作用によるタンパク質の結合［８、９］およびイオン性相互作用による放出に用いられている。しかしながら、高密度のカルボキシル基は用いられているが、カルボキシル基を固体支持マトリックスに連結しているスペーサーアームはない。
【００１１】
同じく開示されているのは、陽性に荷電した、イソウレア基［４、５］を約１ｍｌあたり２０μモル以下と考えられている密度で有する樹脂である。これらの樹脂は弱い疎水性であり、典型的には標的化合物の樹脂への結合のためには静電気的および疎水的相互作用を必要とする。
【００１２】
標的化合物の、高または低イオン強度での本発明のイオン性官能基を有する樹脂への結合は、典型的には標的化合物の結合に先立って、または標的化合物の樹脂からの放出をもたらすために溶液のイオン強度の調整を要するイオン性官能基を有する従来技術の樹脂と、対照を成す。そのような調整は、標的化合物の回収および／または精製を行なうための効果的な産業的規模の工程と一致するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、部分的には、例えばタンパク質やペプチド等の標的化合物の水性媒体からの回収に有用である、特別に設計された混合形式クロマトグラフィー用樹脂、およびそのような樹脂の利用方法に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ここに記載されている樹脂は、固体支持マトリックス、および、イオン性リガンドからなり、そのリガンドは、イオン性官能基、およびリガンドを共有結合的に固体支持マトリックスに取り付けているスペーサーを有するものである。このイオン性官能基は、化合物の樹脂への結合ｐＨにおいては部分的に静電気的に荷電し、化合物の樹脂からの放出ｐＨにおいてはさらに荷電しているかまたは異なった極性の何れかに荷電している。
【００１５】
これらの樹脂は、少なくとも樹脂１ｍｌあたり１５０μモルまたは樹脂の乾燥重量１ｇあたり１ｍモルのいずれか少ない値よりも大きな樹脂上のイオン性リガンド密度を有し、そこにおいてイオン性リガンドが、固体支持マトリックスおよび標的化合物に関連して、樹脂の疎水的性質が、第１のｐＨにおいて、高および低イオン強度で、水性媒体中の標的化合物の５０％を結合するために十分であるように選択されており、さらにまた、樹脂の親水的および／または静電気的性質が、第２のｐＨにおいて、結合した化合物を前述のｐＨで放出するのに十分であるように選択されているものである。
【００１６】
従って、その組成形態のひとつにおいては、本発明は、標的化合物を結合するための樹脂であって、
固体支持マトリックス、
選択されたイオン性リガンドまたは選択されたイオン性リガンドの混合物であって固体支持マトリックスに共有結合により結合されたもので、そのイオン性リガンドが、スペーサーアームおよび少なくとも１つのイオン性官能基であってスペーサーアームを介してマトリックスに結合されているものからなり、そこにおいて樹脂上のイオン性リガンドの密度が、樹脂１ｍｌあたり約１５０μモルまたは樹脂の乾燥重量１ｇあたり１ｍモルの何れか小さい値よりも大きいものであり、
そのイオン性リガンドは固体支持マトリックスおよび標的化合物に関連して、樹脂の疎水的性質が、第１のｐＨにおいて、高および低イオン強度で、水性媒体中の標的化合物の少なくとも５０％を結合するために十分であるように選択されており、さらに固体支持マトリックスに関連して、樹脂の親水的および／または静電気的性質が、第２のｐＨにおいて、結合した化合物を前述のｐＨで放出するのに十分であるように選択されており、
そのイオン性官能基が、標的化合物の樹脂への結合ｐＨでの荷電と比較して、標的化合物が樹脂から放出されるｐＨでは、さらに荷電しているかまたは異なった極性に荷電しているかの何れかである、
ものであることを特徴とするものに向けられている。
【００１７】
好ましい実施の態様においては、このような樹脂は、付加的に、固体支持マトリックスに共有結合的に選択され取り付けられた非イオン性リガンドを有し、そこにおいて、イオン性および非イオン性リガンドの総量をベースとした、非イオン性リガンドのパーセンテージが、約０から８０％の範囲にある。この態様においては、非イオン性リガンドの量はイオン性リガンドの量および固体支持マトリックスに関連して、樹脂の疎水的性質が、第１のｐＨにおいて、高および低イオン強度で、水性媒体中の標的化合物の少なくとも５０％を結合するために十分であるように選択されており、さらにまた固体支持マトリックスに関連して、樹脂の親水的および／または静電気的性質が、第２のｐＨにおいて、結合した化合物を前述のｐＨで放出するのに十分であるように選択されている。
【００１８】
方法の形態の１つにおいて、本発明は、標的化合物を、標的化合物を含む水性媒体から分離する方法であって、水性媒体を上記の樹脂と、その標的化合物の少なくとも５０％が樹脂と結合する結合に好適な条件下で接触させることから成り、媒体のｐＨを調整することを含むものに向けられている。
【００１９】
本発明のさらに別の面においては、本発明は標的化合物を含む水性媒体からの標的化合物の分離のための方法であって、
ａ）媒体を上記の樹脂と、標的化合物の少なくとも５０％が樹脂に結合するのに好適な条件の下で接触させ、
ｂ）結合した標的化合物を含む樹脂を、他の媒体成分から分離して樹脂−化合物複合体を形成し；および
ｃ）結合した標的化合物を複合体から、上記ａ）で定義された媒体のｐＨとは十分に異なり、標的化合物を樹脂から放出させるｐＨを有する溶出液と接触させることにより放出させる、
各工程からなる方法に向けられている。
【００２０】
その組成物としての別の形態においては、本発明は、固体支持マトリックス上に取り付けられているイオン性官能基を有する新規樹脂に向けられており、該樹脂は、
１つの固体支持マトリックス；および、
１つのイオン性官能基、および、そのイオン性官能基を固体支持マトリックスに共有結合により取り付けている１つのスペーサーアームを有する１つのイオン性リガンドであって、そこにおいて前記イオン性官能基が、４−（アミノメチル）ピリジン、３−（アミノメチル）ピリジン、２−（アミノメチル）ピリジン、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール、２−（アミノメチル）ベンズイミダゾール、４−（３−アミノプロピル）モルフォリン、フロロ、クロロ、ブロモおよびヨードからなる群より選択された１から２のハロ基を有するハロトリアミン、４−アミノ酪酸、（１Ｓ、２Ｓ）−（＋）−２−アミノ−１−フェニル−１、３−プロパンジオール、（−）−フェニルプロパノールアミン、フェニルエチルアミン、フェニルアラニンオール、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホンアミド、ＤＬ−β−ヒドロキシフェニルエチルアミン、チオサリチル酸、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、２−メルカプトベンズイミダゾール、４−メルカプトエチルピリジン、２−メルカプトエチルピリジン、４−メルカプト酪酸、５−メルカプトバレリアン酸、６−メルカプトヘキサノン酸、４−ヒドロキシチオフェノール、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−クロロヒドロキシフェニル酢酸、３、５−ジクロロサリチル酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、３−ニトロチロシン、およびフロロ、クロロ、ブロモ、ヨードから成る群より選択された１から２のハロ基を有するハロチロシン、およびパラ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジンから成る群より選択された化合物から誘導されたものであるもの、
から成ることを特徴とするものである。
【００２１】
本発明の組成物としてのさらに別の形態においては、本発明は、固体支持マトリックス上に取り付けられているイオン性官能基を有する新規樹脂に向けられており、該樹脂は、
１つの固体支持マトリックス；および、
少なくとも樹脂１ｍｌあたり約１５０μモル、または樹脂の乾燥重量１ｇあたり１ｍモルの何れか小さい値よりも大きな密度で上記固体支持マトリックスに取り付けられている、１つのイオン性官能基およびそのイオン性官能基を共有結合により固体支持マトリックスに取り付けている１つのスペーサーアームを有するイオン性リガンドであって、そこにおいて前記イオン性官能基が、アミノカプロン酸、２−メルカプトピリジン、４−メルカプトピリジン、アミノエチルベンゼンスルホンアミド、チラミン、チロシンおよびヒスチジンから成る群より選択された化合物から誘導されたものであるもの、
から成ることを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、部分的には、樹脂を用いた水性媒体からの標的化合物の回収のための合理的な方法に向けられている。本発明の方法は、部分的には、標的化合物の水性媒体からの回収における利用のための樹脂の選択であって、そこにおいてその樹脂の疎水性特性が、第１のｐＨでは高および低イオン強度の水性媒体中の標的化合物の少なくとも５０％を結合するために十分であり、さらに、第２のｐＨでの樹脂の親水的および／または静電気的特性が、結合した化合物をその第２のｐＨで放出するために十分であるものである。本発明の樹脂のイオン性リガンドは、固体支持マトリックス並びに標的化合物の静電気的電荷、ｐＩ、安定性等の特性に関連して、樹脂が、標的化合物が十分に安定である等のｐＨ範囲に対応して、疎水的な性質および親水的および／または静電気的性質を有するように選択されている。当業者は容易にこれらの変数をここにおける教示に基づいて確認することが出来る。
【００２３】
この態様の好ましい形態においては、選択工程は、イオン性リガンドおよびそのようなリガンドの樹脂上の密度と組みあわせて用いられる固体支持マトリックスを含むよう拡張され、そこにおいて、その選択は、標的化合物の結合および樹脂からの放出のｐＨにおいて樹脂全体にわたって要求される疎水性の度合に関連して成される。これに関して、固体支持マトリックスは、イオン性官能基を含まないかまたはイオン性官能基を含むかの何れかであってもよい。さらに、イオン性官能基並びにイオン性リガンドのスペーサーアームの両方が、標的化合物の結合および放出ｐＨでの疎水性についての更なる制御を可能としている。
【００２４】
この態様のさらに好ましい形態においては、選択工程は１またはそれ以上の非イオン性リガンドの、結合および放出ｐＨにおいて樹脂全体について要求される疎水性の度合に関連した選択を含むよう拡張される。例えば、樹脂の疎水性は、結合の増加が必要である場合には、標的化合物の結合を増加させるために、固体支持マトリックスに取り付けられている非イオン性リガンドを用いることにより、そこにおいてリガンドの疎水性を制御し、調整することが出来る。例えば、非常に疎水性である、芳香族基を取り込んでいるような非イオン性リガンドを、樹脂の全体の疎水性を高めるために用いてもよく、一方、より親水性である、例えばいくつかの非イオン性アルコール基（アルカノール等）を含んでいるような非イオン性リガンドを、樹脂の全体の親水性を増加させるために、樹脂への標的化合物の結合および樹脂からの化合物の放出をもたらすために必要である疎水性／親水性の要求に関連して用いることが出来る。
【００２５】
各々の樹脂の成分の適切な選択を成すことにより、標的化合物の樹脂への結合のｐＨにおける疎水性の特徴は、結合効率を促進するため、および／または、標的化合物の樹脂への結合特異性を増加させるために合理的に選択される。同様に、樹脂の標的化合物の放出ｐＨにおける親水的および／または静電気的（イオン的）性質も、標的化合物の樹脂からの適当な放出を確実なものとするために合理的に選択される。
【００２６】
本発明をより詳細に記述する前に、以下の用語を最初に定義する。
【００２７】
定義
用語「標的化合物」とは、特定の化合物、即ち水性溶液から単離することを望んでいる化合物である。標的化合物は、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖類、オリゴ糖、炭水化物、ステロイド、環状芳香族化合物、ジオール、インドール誘導体、薬用化学化合物またはその中間体、１次または２次細胞代謝物、その他で有り得る。特定の標的化合物が重要なのではない。しかしながら、好ましい態様においては、標的化合物はタンパク質またはペプチド、１次または２次細胞代謝物および薬用化学中間体から成る群より選択される。
【００２８】
「固体支持マトリックス」または「固体マトリックス」という用語は、樹脂の固体骨格物質で、リガンドをそれ自体に共有結合で取り付けることを可能とする反応性官能基を含む物質である。骨格物質は無機的（シリカ等）でも有機的であってもよい。骨格物質が有機的である場合、固体ポリマーであることが好ましく、好適な有機ポリマーがこの分野で知られている。ここに記載されている樹脂において用いるために好適な固体支持マトリックスには、例えば、セルロース、再生セルロース、アガロース、シリカ、被膜シリカ、デキストラン、ポリマー（例えばポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ、ＥｎｚａｃｒｙｌおよびＡｚｌａｃｔｏｎｅ等の市販のポリマーを含むポリメタクリルアミド）、コポリマー（スチレンおよびジビニルベンゼンのコポリマー）、それらの混合物およびそれらに類するものが含まれる。また、少なくとも１つのモノマーが、結果として生じるポリマー中において反応性官能基を含むかまたは含むよう誘導させることが可能な場合には、二元、三元、および高度ポリマーを用いることができる。付加的な実施例においては、固体支持マトリックスは、その骨格中に取り込まれたイオン性官能基を含んでいてもよい。例えば、好適なマトリックスには、良く知られているポリエチレンアミン並びに二級または三級アミンを用いているその他のマトリックスが含まれる。しかしながら、好ましくは、固体支持マトリックスは如何なるイオン性官能基をも含まない。
【００２９】
リガンドの共有結合での取り付けを可能としている、固体支持マトリックスの反応性官能基はこの分野で良く知られている。このような原子団には、ヒドロキシル（Ｓｉ−ＯＨ等）、カルボキシル、チオール、アミノおよびその様なものが含まれる。従来の化学反応により、これらの官能基を、それ自体にリガンドを共有結合で取り付けるために用いることが可能である。付加的には、従来の化学反応により、このような原子団を固体支持マトリックスに取り込ませることが出来る。例えば、カルボキシル基はアクリル酸またはそのエステルを重合過程において用いることにより直接取り込ませることが出来る。重合において、アクリル酸が用いられればカルボキシル基が存在し、アクリル酸が用いられればカルボキシル基を含むようポリマーを誘導させることが出来る。
【００３０】
「イオン性リガンド」という用語は、１つのイオン性官能基とリガンドを固体支持マトリックスに共有結合で取り付けるための１つのスペーサーアームとから成り、そこにおいてイオン性官能基が、あるｐＨでは静電気的に荷電し別のｐＨにおいては静電気的に荷電しなくなることが可能な１以上の原子団を含んでいるものから成る原子団を指す。好ましいイオン性官能基には、例えば、アミン基、フェノール基、カルボキシル基、ヒスチジル基、ピリジル基、アニリノ基、モルフォリル基、イミダゾール基、およびそれに類するものが含まれる。イオン性リガンドは滴定しはじめるｐＨを改変する目的で、イオン性官能基またはスペーサーアーム上の置換体もまた含まれても良い。例えば、フェノール基上の１以上のニトロ基、ハロ基、アルキル基等は、この原子団が静電気的に荷電するｐＨを変化させるであろう。このようなリガンドの改変は当業者のうちで良く知られている。
【００３１】
スペーサーアームとは、イオン性官能基を固体支持マトリックスに共有結合的に取り付ける如何なる原子団または置換体をも指す。そのようなスペーサーアームはこの分野で良く知られており、例としてのみあげると、アルキレン基、芳香族基、アルキル芳香族基、アミド基、アミノ基、ウレア基、カルバメート基、Ｒ１およびＲ２が１つのアルキレン基（例えばＣ１−Ｃ６）でＹが酸素または硫黄である−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２−基、およびそれらに類するものが含まれる。
【００３２】
「選択されたイオン性リガンド」とは、固体支持マトリックスへ共有結合で取り付けられる選択されたリガンドまたはリガンドの混合物を指す。イオン性リガンドの選択は、リガンドが疎水的性質を有するであろうｐＨおよびリガンドが親水的および／または静電気的性質を有するであろうｐＨ、並びにこれらのｐＨでの樹脂の安定性に関連して選択される。逆に、結合または放出のために選択されるｐＨは、標的化合物の物理的および化学的性質および標的化合物のこれらのｐＨにおける安定性によっている。
【００３３】
「標的化合物が樹脂に結合するｐＨにおいて部分的に静電気的に荷電している」という用語は、５％より大きく１００％未満で樹脂上のイオン性官能基が、標的化合物の結合ｐＨにおいて荷電していることを意味する。好ましくは５％から約４０％で樹脂上のイオン性官能基がこのｐＨで荷電している。
【００３４】
「非イオン性リガンド」という用語は、固体支持マトリックスに直接的にまたはスペーサーアームを介して直接にではなく共有結合により取り付けられた原子団であって、容易にイオン化する官能基を含まないものを指す。好適な非イオン性リガンドには、例えば、アルキル基、芳香族基、（フェニル、ナフチル等）およびアルキル芳香族基（ベンジル基）等が含まれる。
【００３５】
「高イオン強度」という用語は、約２４．３モリモー（ミリジーメンス）以上の比導電率（伝導率）を提供するために要求されるイオン強度を意味する。例えば、このような導電率は、２５０ミリモル（ｍＭ）塩化ナトリウムを用いることにより到達できる。「低イオン強度」という用語は、約２４．３ミリモー未満の比導電率を提供するために要求されるイオン強度を意味する。溶液の比導電率の決定のための手順は当業者に良く知られている。
【００３６】
方法
クロマトグラフィー用樹脂の標的化合物の精製における利用は、この分野で良く知られている。これらの樹脂は通常、リガンドがそこに直接またはスペーサーアームを介して結合されている粒状またはビーズ状固体支持マトリックスから成る。標的化合物を含む水性溶液を樹脂と接触させる。例えば、化学的荷電、相対的疎水性、または特異的吸着に基づく樹脂と標的化合物との間の相互作用は、溶液中の標的化合物を樹脂へ結合させることを可能としている。樹脂と標的化合物との間の相互作用を相殺する放出バッファーの条件を特異的に変更することにより、標的化合物を選択的に回収することが可能である。
【００３７】
ここに記載されている方法は、これまでの従来技術のクロマトグラフィー用回収方法の改良を表すものであり、これらの方法は産業的な量での標的化合物の発酵液体培地等の水性媒体からの回収のための高効率の手段を提供するものである。１つのとりわけ好ましい態様においては、ここに記載されている方法は、発酵液体培地からのタンパク質の回収（キモシンおよびスブチリシン等）の精製に極めて有用であるが、それは精製がしばしば粗液体培地から直接行われるからであり、さらに清澄化された粗液体培地の標的タンパク質以外の成分はこれらのマトリックスに結合しないであろうからでもある。
【００３８】
ここに記載されている方法は、非常に高い標的化合物純度が要求されていない、産業用酵素等に特に有用であるが、それはこの純度レベルが１段階の精製で達成され得るからである。必要に応じて、液体培地はｐＨ調整の後に、もし必要であれば、希釈、濃縮、脱塩、塩添加または微粒子除去をすることなしに充填されてもよい。同様に、標的化合物の樹脂からの放出は、塩添加または脱塩の必要無しに、単にｐＨ調整によって実行可能である。ここに記載されている樹脂は腐敗に感受性が低く、イオン性ではない樹脂と比較してより容易に再生可能であることは考慮されるべきである。
【００３９】
ここに記載されている樹脂はいくつかの重要な特徴の組合せを提供する。これらは、標的化合物の粗水性溶液からの直接的回収を可能とし、下流の工程の開始時での顕著な精製を可能とするであろう。低イオン強度バッファー中への放出は、クロマトグラフ工程におけるそれに続く段階、即ちイオン交換または吸着クロマトグラフィーの前に好適なものである。それらはまた、迅速で安価な過酷ではない条件下での溶出を可能とする。最小の段階またはグラジエント技術が必要であるが、他の塩は少量必要とされるかまたは必要なく、溶媒は少量必要とされるかまたは必要ない。
【００４０】
本発明の方法における結合の一般的本質により、これらの方法は他のクロマトグラフ的手順と比較して低い特異性を示すかもしれない。例えば、発酵液体培地処理の場合には、液体培地は、異なった疎水性を有する異なった主要タンパク質混在物を有しているかもしれない［１９］。故に、顕著なレベルでの非標的タンパク質の結合も生じうる。
【００４１】
ここに記載された方法を用いた精製または分画は、標的化合物の疎水性および／または等電点（ｐＩ−もし適切なら）がほとんどの混在物と異なっていることを必要とする。非標的化合物と類似した疎水性および等電点を有する標的化合物は、グラジエント放出なしでは共に溶出されることもある。このことは試料の前処理またはリガンド、スペーサーアームおよびマトリックスの変化により、ここに詳細に記載されているように相殺することが可能である。さらに、ここに記載されている方法においては、化合物の結合が高および低イオン強度の両方で実現可能であるため、樹脂に接触している溶液のイオン強度を変化させることにより、樹脂に結合した標的化合物を保持する一方で、いくつかの不純物を除去しうる。また、低イオン強度でのｐＨの変化が、１つの標的化合物を他から選択的に放出するために有効であり得る。他方で、いくつかの工程、例えば、ホエータンパク質回収等においては、定量的な化合物の結合および回収が好ましい。ここに記載されている方法はまた、非共有結合的酵素固定化［１４−１８］のためにも有用であるが、それは結合が強固で酵素の回収が簡単であるからである。
【００４２】
以下に記載されている方法は、標的化合物の結合のために有用な特定の樹脂を用いている。これらの樹脂への結合は、樹脂が疎水性の特性を有するｐＨにおいてなされ、従って、結合は原理的には疎水性相互作用により成されるが、これはこのｐＨで樹脂上のイオン性リガンドが部分的に荷電しているという事実と対立するものではない。樹脂と標的化合物の結合ｐＨにおける疎水性相互作用の度合は、標的化合物の樹脂への結合の強度が制御可能であるように、合理的に選択される。そのような選択は、適当なマトリックスおよびリガンドであって、そこで用いられているスペーサーアームを含めて、樹脂の制御された疎水性を提供しているこれらの材料の組合せを利用することにより成されている。
【００４３】
さらに疎水性を制御するための１つの手段は、固体支持マトリックス上の非イオン性リガンドの集団で、高度に疎水性（フェニルまたはベンジル基を含む等）またはより親水性（アミド、ウレタンまたは非イオン性ヒドロキシル基を含む等）の何れかであるものを含むものである。そのような要素は、ここでの教示に基づいたこの分野の技術の範囲内にある。好ましくは、非イオン性リガンドが用いられたとき、固体支持マトリックス上の非イオン性リガンドの密度は、イオン性と非イオン性のリガンドの総数に基づいて０から８０パーセントの範囲になるであろう。
【００４４】
さらに、リガンドがチオエーテル結合を介して固体支持マトリックスに取り付けられている場合、樹脂の疎水性は、いくつかのまたは全ての樹脂中の硫黄原子をスルホキシドおよび／またはスルホン基に酸化することにより制御されてもよい。樹脂中に存在するスルホキシドおよび／またはスルホン基の密度を増加させることにより、樹脂の疎水性は減少する。チオエーテル基をスルホキシドまたはスルホン基に酸化するために好ましい手順はこの分野で良く知られている。
【００４５】
ここに記載されている方法は、組換え産物を含むタンパク質またはペプチドを含む幅広い範囲の標的化合物を回収するために有用である。この方法はまた、植物および動物給源等の天然給源からの抽出物において、化合物の分離を行うために用いることが出来る。
【００４６】
ここに記載されている樹脂は、固体支持マトリックスに取り付けられたイオン性および必要に応じて非イオン性リガンドを用いている。リガンドの共有結合的取り付けの何れの方法も、取り付けにより所望のイオン性基以外のイオン性基の導入という結果にならない限り、用いることが出来る。そのようなリガンドの固体支持マトリックスへの取り付けのための方法の例としては、共有チオエーテル、エーテル、アミド、アミン、ウレタン結合が含まれる。他のチオエーテル法、ジスルフィド取り付けおよびウレア法もまた用いられてもよい。付加的には、ヒドラジンリガンドがエポキシド基またはアルデヒド官能基に取り付けられてもよい。アルデヒドを介した取り付けの場合は、続いてイミンの還元（シアノボロヒドリドによる等）が好ましい。
【００４７】
代表的なリガンド取り付け化学反応が表１に示されている。ほかのリガンド取り付け化学反応がこの外にも示され、および／またはこの分野で知られている：
【表１】
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【００４８】
これらの各々の化学反応はこの分野で良く知られており、カップリングは上記の連結という結果となる。例えば、リガンドは、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）試薬を図１および３に示されているように用いた中性ウレア結合を介して、活性化セルロースマトリックス等の固体支持マトリックスに取り付けられてもよい。他には、リガンドは、図４、実施例１および３に示されているようにアミノカプロン酸スペーサーアームで誘導されたセルロースマトリックスにアミド結合を介して取り付けられてもよい。必要であれば、スペーサーアームのカルボキシル基の１００％置換を成すことも可能である。このような置換はこの分野で良く知られた小イオン滴定等の手順で確認することが可能である。
【００４９】
カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）活性化マトリックスを介したリガンドの取り付けは、図１に示されている。リガンドのマトリックスのカルボキシル基へのカルボジイミドカップリングは図２に示されている。ＣＤＩ−カプロン酸支持体は図３に示されている。起こりうるＣＤＩ−カプロン酸マトリックスの誘導は図４に示されている。
【００５０】
リガンド取り付けのための、ＣＤＩ活性化マトリックスとは別の選択としては、その調製方法およびそれへのリガンド取り付けが図５および６に例示されている、エポキシド基を含んだ樹脂がある。特に、図５は、チオール含有リガンドのエポキシド活性化固体支持マトリックスへの取り付けを示している。この樹脂においては、リガンドは安定な中性チオエーテル結合を介して取り付けられている［１０］。この化学反応を用いることが出来るリガンドには、例えば、メルカプトベンズイミダゾール、４−メルカプトピリジン、２−メルカプトピリジン、メチマゾールおよび４−ヒドロキシチオフェノールが含まれる。図６は、アミンとエポキシド活性化固体支持マトリックスとの反応を示している。両方の場合に用いられた化学反応は典型的には水性で、それ故にＣＤＩ法と比較してより安価となっている。しかしながら、この化学反応は、マトリックス中に、充填容量を減少させ得る架橋結合を導入する。図６に示されているように、イオン性アミン官能基は、結果として生じるリガンドにおいて保持され、従って、この図においてアミンに取り付けられた原子団はさらにイオン性（ピリジン、−ＣＨ２−ピリジン等）または非イオン性（アルキル等）官能基を含みうる。
【００５１】
その他の、チオールリガンドでのマトリックス改変のために好ましい活性化剤は、１つの高度に反応性である原子団および反応性の原子団へと誘導可能な１つの原子団を有する。その高度に反応性である原子団は、マトリックスのヒドロキシル基とアルカリ性のｐＨで反応し、安定した結合を形成するが、第２の原子団はこのような条件下では反応しない。このことにより、架橋を防止している。第１の活性化段階ののち、第２の原子団は、直接反応させることが可能な反応性の原子団へと誘導される。アリルハライド（アリルブロミド等）およびアリルグリシジルエーテルが好ましい試薬である。他の試薬には、例えば、２および４−ビニルピリジン、２−および４−メルカプトエチルピリジン、およびアミノピリジンが含まれる。例えば、アリルグリシジルエーテルで活性化された固体支持マトリックスは、エピクロロヒドリンで活性化されたものよりも高い置換レベルを可能とする。これらのリガンドの樹脂への共有結合的取り付けにおいて、アリル基は、イオン性官能基（臭素水の反応でブロモ派生体を形成し、続いて４−ヒドロキシ安息香酸のビスナトリウム塩と反応する等）を取り込むように改変され得る。
【００５２】
イオン性官能基は、固体支持マトリックス中に取り込まれていても良いことが理解される。例えば、ポリアミンまたはアミン官能基を含むポリマーを、アミン官能基が低ｐＨでイオン性である場合は用いることができる。このような実施例においては、ポリマーは他の官能基を含むように調製されてもよく、リガンド取り付けはアミン基またはそのような他の官能基の何れかを介して成されてもよい。前者の実施例においては、リガンド取り付け化学反応はマトリックスの骨格のイオン性官能基の少なくとも一部を保持するために用いられている。
【００５３】
ここに記載されている樹脂上で有用なイオン性リガンドには、固体支持マトリックスに共有結合している３−（アミノメチル）ピリジン（３ＡＭＰ）、４−（アミノメチル）ピリジン（４ＡＭＰ）、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール（ＡＰＩ）、２−（アミノメチル）ベンズイミダゾール（ＡＭＢ）、４−（３−アミノプロピル）モルフォリン（ＡＰＭ）、ヒスタミンおよびその様なものによって、上記の表１および以下の実施例に記載されている化学反応を用いて誘導されたものが含まれる。本発明の樹脂を形成するための他の好適な化合物は、４−（アミノメチル）ピリジン、２−（アミノメチル）ピリジン、フロロ、クロロ、ブロモおよびヨードからなる群より選択された１から２のハロ基を有するハロトリアミン、４−アミノ酪酸、（１Ｓ、２Ｓ）−（＋）−２−アミノ−１−フェニル−１、３プロパンジオール、（−）−フェニルプロパノールアミン、フェニルエチルアミン、フェニルアラニンオール、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホンアミド、ＤＬ−β−ヒドロキシフェニルエチルアミン、チオサリチル酸、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、２−メルカプトベンズイミダゾール、４−メルカプトエチルピリジン、２−メルカプトエチルピリジン、４−メルカプト酪酸、５−メルカプトバレリアン酸、６−メルカプトヘキサノン酸、４−ヒドロキシチオフェノール、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−クロロヒドロキシフェニル酢酸、３、５−ジクロロサリチル酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、３−ニトロチロシン、チロシン、およびフロロ、クロロ、ブロモ、ヨードから成る群より選択された１から２のハロ基を有するハロチロシン、ヒスチジン、アニリンおよびパラ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジンが含まれる。
【００５４】
疎水性アミン化合物がイオン性または非イオン性リガンドを生成させるために用いられた場合、それは２−フェニルエチルアミン、Ｌ−フェニルアラニンオール、（１Ｒ、２Ｓ）−（−）−フェニルプロパノールアミン、トリプタミン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホンアミド、（１Ｓ，２Ｓ）−（＋）−２−アミノフェニルプロパンジオールおよび１−ヘキシルアミンから成る群より選択されるのが好ましい。イオン性リガンドが生成される場合、アミノ基はこれらの分子中で、例えばエポキシドとの反応で保持されており、アミンは連結アームの一部を形成する。非イオン性リガンドが生成される場合は、アミン基は比較的、例えば、カルボキシル酸とのアミド形成のための反応により、分子から除去されている。
【００５５】
他の有用なリガンドには、置換されていないフェノールおよび置換されたフェノールを６−９のｐＫａ範囲で含有するものが含まれる。好適なフェニル基の置換基には、ニトロ、ハロゲン（クロロ、ブロモ等）、１−１０の炭素原子を有するアルキル、１−１０の炭素原子を有するアルコキシ、エステル基が１−１０の炭素原子を有するカルボキシルエステル、シアノ、１−１０の炭素原子を有するカルボニルアルキル（−Ｃ（Ｏ）Ｒ）基、およびそれらの混合物が含まれる。典型的には、置換フェニル基は１から４のこのような置換基を有しており、好ましくは１から２である。上記の置換基は、ピリジル基、ヒスチジル基、インドリル基、イミダゾリル基、モルフォリニル基、ベンズイミダゾール基、およびその他の同種類の基を有するリガンドを含む、他の置換リガンドにも取り付けられることが可能である。
【００５６】
ここに示されたイオン性リガンドのリストも、これらのリガンドの固体支持マトリックスへの共有結合的取り付けに用いられた化学反応も、包括的に意図されたものではない。好適なリガンドの固体支持マトリックスへの取り付けはこの分野で良く知られている化学反応を用いると知れば十分である。
【００５７】
イオン性リガンドは、好ましくは、樹脂上に、標的タンパク質が高および低イオン強度の両方で結合可能とするに十分な濃度で存在している。好ましくは、イオン性官能基は、樹脂上に、少なくとも樹脂の乾燥重量１ｇあたり約１ｍモルまたは少なくとも約１５０μモル／ｍｌ樹脂の何れか小さい値より多い濃度で存在している。１つのとりわけ好ましい態様においては、非イオン性リガンドが、イオン性官能基と組み合わせて、標的化合物の樹脂への結合および樹脂からの放出のｐＨにおける疎水性／親水性の度合に関しての更なる制御を提供するために用いられている。この態様においては、非イオン性リガンドのリガンド総数に関連したパーセンテージは、約０から約８０パーセント、好ましくは０から４０パーセントの範囲にあることが望ましい。
【００５８】
本発明の方法においては、回収すべき標的化合物を含む溶液または水性媒体は、あるｐＨにおいては高および低イオン強度で水性媒体中の標的化合物の少なくとも５０％が樹脂に結合するために十分であるようなその疎水的特性である樹脂と接触される。このｐＨにおいては、結合は主に疎水性相互作用によるものであり、樹脂の疎水性の度合はスペーサーアームおよび／またはリガンドを含むイオン性官能基の改変により、いくらか疎水性である固体支持マトリックスを用いることにより、非イオン性リガンドを用いることにより、リガンドの固体支持マトリックス上の密度を増加させることにより、またはこれらの組合せにより調整することができる。ここにおける教示の観点から、当業者は合理的にこれらの変数について標的化合物の性質を所望の促進との組合せに基づいて、調節することができる。
【００５９】
回収すべき標的化合物、例えばキモシン等のタンパク質、を含有する培地は、微生物のまたは動物給源を含む公知の何れの給源から由来してもよい。例えば、キモシン溶液は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母からの発酵液体培地並びに牛の第四胃から得られた水性抽出物を含んでもよい。
【００６０】
水性媒体はバッファーおよび／または塩を、樹脂への結合効率を高めるために含んでもよい。しかしながら、上述のとおり、標的化合物の結合は高および低いずれのイオン強度でも達成され、従って、塩の水性媒体への添加は単にさらなる結合をもたらすためにすぎない。好適な塩は従来クロマトグラフィーで用いられているもので、例えば、塩素、硫酸、リン酸、酢酸のリチウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、およびマグネシウム塩を含む。好ましくは塩化ナトリウムが用いられるが、それは効果的で安価で安全であるためである。
【００６１】
上記のように、ここに記載された樹脂は、水性媒体由来の標的化合物に高および低イオン強度で結合する。特に、これらの樹脂は水性媒体中において約５０％またはそれ以上の標的化合物を、高および低イオン強度で結合するであろう。勿論、用いられた樹脂の量が媒体中のすべての標的タンパク質を結合するために十分な容量を有することは理解されている。
【００６２】
水性媒体は樹脂と標的化合物が樹脂に結合することを可能とするために十分な時間にわたって接触される。この接触は、例えば、樹脂がカラムにつめられている、流動層で用いられている、または樹脂が水性媒体とともに混合されているところの撹拌バッチ系に懸濁されている等のようになされる。このような条件下では、標的化合物は樹脂に結合しそれにより樹脂−化合物複合体を形成する。水性媒体を樹脂と接触させた後、樹脂は続いて、水性媒体を樹脂およびそこに形成された複合体から分離するために、水性媒体と同じｐＨを有するバッファーで洗浄される。バッファーは付加的に少なくとも２Ｍまでの上記の塩を含んでもよい。
【００６３】
標的化合物は続いて、樹脂の特性を疎水性特性から親水性および／または静電気的特性に変化させるｐＨを有する水性媒体と単に接触させることにより、樹脂から放出される。このことは、リガンド上のイオン性官能基がより荷電するかまたは標的化合物結合ｐＨにおけるリガンドの極性とは異なった極性の電荷を帯びるようなｐＨを選択することによって成される。樹脂からの放出が、標的化合物の放出ｐＨでの結合特性を変えることによってもまた成されることは理解できる。
【００６４】
本発明の好ましい態様においては、放出ｐＨにおける樹脂上の電荷は、放出ｐＨにおける標的化合物の正味静電気的電荷と同じ極性であり、それにより生じる樹脂と標的化合物との間の電荷−電荷反発は、何れの樹脂との疎水的相互作用をも克服し、それにより樹脂からの放出をなすために十分である。このことは、上記の樹脂の相対的疎水性を合理的に選択することにより、および／または、樹脂上の大量の静電気的荷電を放出ｐＨにおいて効果的に提供するために十分な量のイオン性リガンドを取り込むことにより成されうる。
【００６５】
別の本発明の態様において、誘導された樹脂上の電荷は標的化合物の放出ｐＨにおける正味静電気的電荷と反対の極性である。この態様においては、標的化合物の樹脂からの放出は、例えば、高イオン強度の溶出液の使用によって成される。何れの態様においても、エチレンまたはプロピレングリコール等の極性減少剤により、樹脂からの標的化合物の放出をなすことができる。
【００６６】
リガンドの選択は標的化合物のｐＨの制限に基づいている。例えば、ある状況において、標的化合物が安定なｐＨにおいて陽性に荷電するイオン性官能基を有する樹脂を、極端なｐＨを避けるために化合物の結合または放出のために用いることが好ましいこともある。同様に、標的化合物が安定なｐＨにおいて陰性に荷電するイオン性官能基を有する樹脂が好ましい場合もある。ここでのリガンドとして有用なイオン性官能基を有する化合物には、例えば、カプロン酸、６−アミノカプロン酸、（ｐＨ３．３から滴定）が含まれる。チラミン等のフェノール性化合物もまたこの点で有用であるが、それはフェノールのヒドロキシル基がｐＨ６およびそれ以上で滴定されるからである。ニトロ化またはクロロ化フェノールまたはチラミンリガンドは、それらが中性ｐＨに近いｐＫａ値を有しているために特に有用である。さらにその他の、ここでのリガンドとして有用であるイオン性官能基を有する化合物には、例えば４−（アミノメチル）ピリジン、３−（アミノメチル）ピリジン、２−（アミノメチル）ピリジン、１−（３−アミノプロピル）−イミダゾール、２−（アミノメチル）ベンズイミダゾール、４−（３−アミノプロピル）モルフォリン、フロロ、クロロ、ブロモおよびヨードから成る群より選択された１から２のハロ基を有するハロトリアミン、４−アミノ酪酸、（１Ｓ、２Ｓ）−（＋）−２−アミノ−１−フェニル−１、３プロパンジオール、（−）−フェニルプロパノールアミン、フェニルエチルアミン、フェニルアラニンオール、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホンアミド、ＤＬ−β−ヒドロキシフェニルエチルアミン、チオサリチル酸、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、２−メルカプトベンズイミダゾール、４−メルカプトエチルピリジン、２−メルカプトエチルピリジン、４−メルカプト酪酸、５−メルカプトバレリアン酸、６−メルカプトヘキサノン酸、４−ヒドロキシチオフェノール、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−クロロヒドロキシフェニル酢酸、３、５−ジクロロサリチル酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、３−ニトロチロシン、チロシンハロチロシン、ヒスチジン、およびパラ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジンが含まれる。
【００６７】
標的化合物（タンパク質等）が生理的ｐＨ（即ち５から９のｐＨ）においてのみ安定である別の態様においては、固体支持マトリックスに取り付けられたイオン性リガンドは、約５から９、より好ましくは約５．５から約８．５のｐＨ範囲で完全にまたは部分的に滴定する樹脂を提供しなければならない。このような範囲は、標的タンパク質の結合および放出を、多くのタンパク質の場合に、より極限的であるｐＨ範囲と比較して、変性等のリスクが減少されているｐＨ範囲で可能とする。
【００６８】
ここに記載された方法においては、マトリックス上のリガンドの密度は標的化合物の結合が高および低イオン強度で成されるように選択される。湿ベースで、そのような結合をもたらすために必要であるリガンド密度は、好ましくは少なくとも樹脂１ｍｌあたり約１５０μモル、そしてより好ましくは少なくとも樹脂１ｍｌあたり約１７５μモル、さらにより好ましくは少なくとも樹脂１ｍｌあたり約２００μモルであることが望ましい。乾燥ベースでは、そのような結合をもたらすために必要であるリガンド密度は、好ましくは少なくとも樹脂の乾燥重量１ｇあたり約１ｍモル、およびより好ましくは少なくとも樹脂の乾燥重量１ｇあたり約１．３３ｍモルであることが望ましい。このことは、水性媒体の処理を希釈、濃縮、脱塩、塩の添加または微粒子の除去を行うことなしに可能としている。ここに記載されている樹脂を用いることによって考えられる別の利点は、これらの樹脂が、液体培地からのタンパク質等の標的化合物の分離のために以前用いられていた樹脂よりも腐敗が少ないであろうことである。
【００６９】
標的化合物の樹脂からの上記の方法での分離において、回収された標的化合物溶液はさらに従来の方法で処理されてもよい。
【００７０】
この工程において用いられた樹脂は、従来の方法で再生されてもよい。例えば、陽性に荷電する官能基を有するリガンドを用いた樹脂は、０．１Ｍ  ＨＣｌを、エタノールやエチレングリコール等の極性減少剤と共に用いるかまたは用いずに使用することにより再生され得るかもしれない。同様に、陰性に荷電する官能基を有するリガンドを用いた樹脂は、０．１Ｍ  ＮａＯＨを、再びエタノールやエチレングリコール等の極性減少剤と共に用いるかまたは用いずに使用することにより再生され得るかもしれない。しかしながら、苛性アルカリへさらすことはＣＤＩマトリックスの加水分解という結果となり、そしてマトリックス膨張を引き起こしうる。活性化の前のセルロースマトリックスへ架橋させることが、膨張を減少させカラム流量比を改善するために行われている。架橋は陽性にイオン化可能な樹脂に行っても良い。
【００７１】
腐敗が問題である場合、水性媒体の、高イオン強度でＤＥＡＥ等の安価な樹脂を通過する流れによる前処理は、分離を改善し得る。例えば、標的化合物がスブチリシンである場合、ＤＥＡＥカラムでのスブチリシン試料の前処理を行うことにより、９９％以上の酵素活性を保持しながら、腐敗の顕著な激減という結果となった。腐敗の激減は再生、樹脂の寿命、および容量を改善する。この余分な段階は、前処理カラムからの流れを、バッファー調節をすることなく直接的に、本発明の分離システムに充填できる場合に特に好ましい。
【００７２】
上記のように、選択された樹脂並びに処理条件（バッファー等）は、精製されるべき標的化合物に関連している。例えば、タンパク質スブチリシンはｐＨ４．５以下では不安定であるので、そのｐＨ以下のバッファーは用いることができない。さらに、スブチリシンを扱う場合は、Ｃａ２＋キレート化を避けるためにクエン酸バッファーは回避されるべきであるが、それはＣａ２＋がこの酵素を安定化するからである。さらに付加的には、リン酸バッファーはＣａ２＋を沈殿させることがあり、それゆえ、このようなバッファーもまた回避されるべきである。好ましいスブチリシンの作用範囲はｐＨ５−７である。ｐＨ７−１０の範囲での操作は限定された期間でのみ許容できる。また、スブチリシン回収方法に関して、１００−２００ｍＭのモル濃度のバッファーが、放出のために必要である初期ｐＨ調整には好適である。一旦ｐＨが調整されると、バッファーのモル濃度は希釈により減少させることができる。酢酸バッファー（ｐＨ５．２）は、ほとんどの疎水性で陽性にイオン性なマトリックスに対して充分な回収を提供する。８％ギ酸、４０％プロピレングリコール、ｐＨ５．５を含むグリコールバッファーは、試験したこのような全てのマトリックスからスブチリシンを溶出した。
【００７３】
ここに記載された樹脂は、簡便な結合および放出手順を用いた大規模な標的化合物回収のための特定の用途を有しているものであり、ここに記載された樹脂および方法は、ＦＰＬＣまたはＨＰＬＣ分析的または高価値調製的利用にも用いてもよい。特に、減少塩グラジエントは、樹脂が疎水的性質を有する場合および（ａ）親水性および／または静電気的（イオン的）の型へのｐＨシフトとそれに続く増加塩グラジエントまたは（ｂ）疎水性型のｐＨからはるかにシフトさせるｐＨグラジエント溶出の場合に用いられてもよい。
【００７４】
アフィニティーリガンドとイオン性リガンドの混合物を用いる場合は、アフィニティー結合の利点は静電気的な反発による簡便な放出と組み合わされてもよい。結合は滴定可能なリガンドが部分的にのみ静電気的に荷電しているか不活性であるｐＨで行われるであろうし、放出はｐＨ変化によるであろう。これはＲｕａｎｎ’ｓ法［２０］およびＴｅｉｃｈｂｅｒｇ’ｓ吸着反発［２１］の共通点である。
【００７５】
さらに、本発明の樹脂およびシステムは、例えば、液体−液体抽出およびポリマー／ＵＦシステム等の非クロマトグラフィー樹脂システムに応用され得る。液体−液体抽出のための［２２、２３］ポリエチレングリコール等の、改変された相分離ポリマー、改変された膜［２４］または水溶性ポリマーＵＦ法［１３、２５］もまた、本発明のシステムを用いることができる。このような態様においては、樹脂およびマトリックスは固体または非水溶性である必要はない。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は本発明の特定の態様を示すために提示されており、本発明の範囲の限定として解釈されてはならない。
【００７７】
実施例１から６は、活性化樹脂の調整のための方法および／またはそれに続く代表的なリガンドの取り付けを示している。これらの実施例は、１９９４年６月２９日に、代理人事件番号第０１００５５−１２６号として出願された米国特許出願第０８／２６８１７８号に記載されており、その出願はここにその全体が参考文献として取り込まれている。
【００７８】
これらの実施例において、用いられた略語は以下の意味を有している。定義されていない場合は、以下に用いられている略語は一般に受け入れられている意味を有する：
ＡＥＢＳ＝ｐ−（２アミノエチル）ベンゼンスルホンアミド；
ＡＰＩ＝ＡＰＩｍｉｄａｚｏｌｅ＝ＡＰＩＭＩＤ＝１−（３−アミノプロピル）イミダゾール；
ＡＭＢ＝ＡＭＢｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ＝２−（アミノメチル）ベンズイミダゾール；
ＡＰＭ＝ＡＰＭｏｒｐｈｏｌｉｎｅ＝１−（３−アミノプロピル）モルフォリン；
２ＡＭＰ＝２ＡＭＰｙｒｉｄｉｎｅ＝２−（アミノメチル）ピリジン
３ＡＭＰ＝３ＡＭＰｙｒｉｄｉｎｅ＝３−（アミノメチル）ピリジン
４ＡＭＰ＝４ＡＭＰｙｒｉｄｉｎｅ＝４−（アミノメチル）ピリジン
ＡＰＰ＝（１Ｓ，２Ｓ）−（＋）−２−アミノフェニルプロパンジオール；
ＣＤＩ＝カルボニルジイミダゾール；
ＤＡＨ＝ジアミノヘキサン；
ＤＥＡＰＡ＝３−ジエチルアミノプロピルアミン；
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド；
ＥＣＨ＝エピクロロヒドリン；
ＥＤＣ＝（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；
ＥＥＤＱ＝Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシジヒドロキノリン；
ｇ＝グラム；
ＨＥＸ＝ヘキシルアミン＝１−ヘキシルアミン；
Ｍ＝モル；
ｍｇ＝ミリグラム；
ＭＧ１＝１−（３−アミノプロピル）イミダゾール−置換Ｐｅｒｌｏｚａ樹脂；
ＭＧ２＝４−（アミノメチル）ピリジン−置換Ｐｅｒｌｏｚａ樹脂；
ＭＧ３＝Ｐｅｒｚｏｌａ  ＭＴ  １００  Ｆｉｎｅ上の架橋されていない樹脂（直径：８０−１００ミクロン；リガンド密度：２０７μモルカプロン酸／ｍＬ）；
ＭＧ３ａ＝Ｐｅｒｚｏｌａ  ＭＴ  １００  Ｆｉｎｅ上で１％エピクロロヒドリン（リガンド密度：２２５μモル／ｍＬ）と架橋された樹脂；
ＭＧ３ｂ＝Ｐｅｒｚｏｌａ  ＭＴ  １００  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｐｅｒｚｏｌａ（直径：１００−２５０ミクロン；リガンド密度：２１６μモル／ｍＬ）上の樹脂；
ｍＬ＝ミリリットル；
ｍＭ＝ミリモル；
ｍｍｈｏ＝ミリモー（１ｍＳ−−ミリシーメンス）；
ｍｍｏｌ＝ミリモル；
ＭＢ＝メルカプトベンズイミダゾール；
メチマゾール＝２−メルカプト−１−メチルイミダゾール；
ＭＰ＝４ＭＰ＝４−メルカプトピリジン；
Ｐ＝Ｐｅｒｌｏｚａ；
ＰＡＬＯＬ＝フェニルアラニンオール；
ＰＣＣ＝Ｐｅｒｌｏｚａ  ＣＤＩ  アミノカプロン酸樹脂；
ＰＣＤＩ＝ＣＤＩ活性化Ｐｅｒｌｏｚａ；
ＰＥＡ＝フェニルエチルアミン；
ＰＰＡ＝フェニルプロパノールアミン；
ｐｓｉ＝平方インチあたりのポンド；
ｒｐｍ＝分あたりの回転数；
Ｓ＝セファロース；
ＴＲＰＮ＝トリプタミン；
μＬ＝マイクロリットル；
上記の略語を用いて、下記の実施例で用いられた樹脂は一般に以下のように略される：［マトリックス］−［カップリング法］−［スペーサーアーム］／［イオン性官能基］。例えば、「Ｐ  ＣＤＩ  ４ＡＭＰｙｒｉｄｉｎｅ」とは、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）で活性化され、４−アミノメチルピリジン基とカップリングされたＰｅｒｌｏｚａ固体支持マトリックス（Ｐ）を指し；「Ｓ  ＥＣＨ  メチマゾール」とは、エピクロロヒドリンで活性化され、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール基（メチマゾール）とカップリングされたセファロース（Ｓ）固体支持マトリックスを指し、さらに、「Ｐ  ＣＤＩ  ＤＡＨ  ヒドロキシフェニル酢酸」は、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）で活性化され、ジアミノヘキサン（ＤＡＨ）スペーサーを介してヒドロキシフェニル酢酸とカップリングされたＰｅｒｌｏｚａ固体支持マトリックスを指す。勿論、スペーサーアームとイオン性官能基がイオン性リガンドを含むことは理解されるであろう。
【００７９】
実施例１
エポキシド活性化
前もって１０倍の容積の水で洗浄されたセファロース６Ｂ（５０ｇ）を、４７ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨおよび５ｍＬのエピクロロヒドリンと、２４時間にわたり４℃で混合した。エポキシド基置換はこの分野で知られている方法により１．０６ｍモル／ｇと測定された。同様の活性化により、１．２８および１．０２ｍモル／ｇのエポキシド基置換を提供した。
【００８０】
実施例２
エポキシド化セファロースへのアミンリガンドの取り付け
実施例１に記載されているように調製されたエポキシド化セファロース（１０ｇ、１．０６ｍモル／乾燥ｇ）を、５モル過剰（即ち５モルのリガンド／樹脂反応性基モル）の、ＡＥＢＳ、ＡＰＰ、ＴＲＰＮから選択され、４ｍＬのＤＭＳＯおよび２ｍＬの水に溶解されたリガンドと、２４時間にわたって３７℃で混合した。５モル過剰のＨＥＸを同様に１０ｇのエポキシド化セファロース（１．２８ｍモル／乾燥ｇ）と混合した。その結果生成した樹脂を１０倍の容積の５０％  ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ：水、１：１）（トリプタミン樹脂のみ）、１０倍の容積の水、２倍の容積の０．１Ｍ  ＨＣｌおよびさらに１０倍の容積の水で洗浄した。リガンド置換は０．１Ｍ  ＨＣｌでのｐＨ４までの滴定により、ＡＰＰは０．８１ｍモル／ｇ、ＨＥＸセファロースは０．９９ｍモル／ｇと決定された。このことは、約８０％のエポキシド基のリガンド置換効率を示している。以下の実施例３および７に示されている手順によれば、改善されたリガンド密度が達成される。
【００８１】
実施例３
アリルグリシジルエーテル活性化
Ｐｅｒｌｏｚａセルロース（Ｐｅｒｌｏｚａ  ＭＴ  １００  ｆｉｎｅ  ビーズ化セルロース、Ｓｅｃｈｅｚａ、Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａから入手可能）を５倍の容積の水（ミリＱグレードの水）および３倍の容積の０．３Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、吸引乾燥した。４０ｇの量のマトリックスを、１２ｍＬの９９＋％アリルグリシジルエーテルと、激しく振とうすることにより混合した。混合物を室温で４８時間、時々振とうしながら放置した。活性化マトリックスを１０倍の容積の水で洗浄し、３倍の容積の水に懸濁した。臭素水（１％）を５分間にわたって混合物が臭素水をそれ以上脱色しなくなるまでゆっくりと添加した。臭素化された樹脂は１０倍の容積の水で洗浄した。樹脂上のアリル基濃度は脱色された臭素水の量により決定した。樹脂上の反応性臭素基は（９ｍＬの水に懸濁された１ｇの試料）は、０．５ｇの亜硫酸ナトリウム（４時間、６０℃）での置換およびそれに続く０．１Ｍ  ＮａＯＨでのｐＨ８までの滴定により決定した。
【００８２】
アリルブロミド活性化
Ｐｅｒｌｏｚａセルロース（ＭＴ  １００  ｆｉｎｅ）を５倍の容積の水（ミリＱグレード）で洗浄し、吸引乾燥した。１０ｇ量のマトリックスを、０．８ｍＬアリルブロミド（再蒸留された）、０．８ｇ水酸化バリウム８水和物、２ｍＬ  ＤＭＳＯおよび１ｍＬの水と、室温で４８時間混合した。活性化されたマトリックスは５倍の容積の１０％ＤＭＳＯ／９０％水混合物、５倍の容積の０．１Ｍ  ＨＣｌおよび１０倍の容積の水で洗浄した。アリル基の濃度は上記の臭素水の方法で決定した。１ｇの活性化樹脂を３ｍＬの水および１００μＬの３−メルカプトプロピオン酸と６０℃で４時間にわたって混合することにより、独立したアリル基の測定を行った。この誘導された樹脂は、２０倍の容積の水、２０倍の容積の０．１Ｍ  ＮａＯＨ、５０倍の容積の水、２０倍の容積の０．１Ｍ  ＨＣｌおよび１００倍の容積の水で洗浄し、０．１Ｍ  ＮａＯＨで滴定した。この滴定方法は、上記の活性化マトリックスに対しても応用可能である。
【００８３】
実施例４
チオールリガンドの取り付け
上記の実施例１または３に記載されているように調製した樹脂（５ｇ）を、５ｍＬの１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁し、窒素を流した。５モル過剰のリガンド（４ＭＰ、メチマゾール、またはＭＢ（５ｍＬのＤＭＳＯに溶解）、またはチオサリチル酸）および０．１ｇ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、混合物を６時間反応させた。実施例１の方法で調製された樹脂を、室温で保持した。実施例３または４の方法で調製された樹脂を６０℃で保持した。その結果生成されたチオエーテル樹脂を５倍の容積の０．１Ｍ  ＨＣｌ、１０倍の容積の水、５倍の容積の０．１Ｍ  ＮａＯＨおよび２０倍の容積の水で洗浄した。試料（１ｇ）を０．１Ｍ  ＨＣｌによりｐＨ３．５−２．７（ＭＢリガンドの最低ｐＨ）まで滴定した。チオサリチル酸樹脂はＮａＯＨ、水、ＨＣｌ、および水で洗浄し、０．１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ８まで滴定した。
【００８４】
実施例５
ヒドロキシル（フェノール）リガンドの取り付け
上記の実施例３に記載されているように調製した樹脂（５ｇ）を、１０モル過剰のヒドロキシルフェニル酢酸（２ｍＬの水およびｐＨを１１．５に調整するために十分な１Ｍ  ＮａＯＨ中に溶解して調製）と混合した。混合物は室温で２４時間反応させた。樹脂は５倍の容積の０．１Ｍ  ＮａＯＨ、１０倍の容積の水、５倍の容積の０．１Ｍ  ＨＣｌおよび２０倍の容積の水で洗浄した。試料（１ｇ）を０．１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ８まで滴定した。
【００８５】
４−ヒドロキシ安息香酸もまた、ｐＨをｐＨ１１に調整した点を除いては同様の方法で用いることができた。この化合物並びにチオサリチル酸は、スブチリシン回収に好適なリガンドの調製に有用である。
【００８６】
実施例６
ＣＤＩ活性化およびリガンド／スペーサーアームの取り付け
セファロースＣＬ６ＢおよびＰｅｒｌｏｚａセルロースをＣＤＩで活性化し、この分野で公知の方法で滴定した。セファロース１ｇあたり３０から８０ｍｇのＣＤＩ、およびセルロース１ｇあたり３０から１２０ｍｇのＣＤＩを用いて、１．０から３．５ｍモル／ｇの活性化レベルが得られた。
【００８７】
ジオキサン可溶アミン試薬（ＡＰＩ、ＡＰＭ、ヒスタミン、ＡＭＢ、４ＡＭＰ、３ＡＭＰ、２ＡＭＰ、ＤＡＨ、チラミン（水に溶かし、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを１２にし、凍結乾燥することにより塩酸塩から調製）およびジブロモチラミン（チラミン塩酸塩からこの分野で公知の方法により調製））を、直接、１０ｇのジオキサン溶解ＣＤＩ活性化マトリックス（１ｍＬの水をチラミンリガンドに含有させた）の試料と反応させた。ＤＡＨ以外は５モル過剰のアミン試薬を用い、ＤＡＨは１０モル過剰で用いた。ジオキサン（５ｍｌ）を添加し、樹脂を２４時間室温で混合した。樹脂は３倍の容積の７５％ジオキサン、２倍の容積の３３％ジオキサン、１０倍の容積の水、２倍の容積の０．１Ｍ  ＨＣｌおよびさらに１０倍の容積の水で洗浄した。
【００８８】
アミノカプロン酸およびニトロチロシン（ナトリウム塩型）はジオキサンに可溶ではない。故に、アミノカプロン酸ナトリウムの４０％溶液は、６４ｍＬの１０Ｍ  ＮａＯＨ中の８０ｇのアミノカプロン酸を、最終容量２００ｍｌとなるまでの水に溶解させて調製した。ジオキサン溶解活性化セルロース（３００ｇ樹脂＋１５０ｍＬジオキサン）およびセファロース（１００ｇ樹脂＋５０ｍＬジオキサン）を、それぞれ８０ｍＬおよび３０ｍＬのアミノカプロン酸ナトリウムの溶液と、室温で２４時間混合した。アミノカプロン酸樹脂は、２倍の容積の６６％ジオキサン、２倍の容積の３３％ジオキサンおよび２０倍の容積の水により洗浄した。同様に、ニトロチロシンを水および３Ｍ  ＮａＯＨに溶解し、ｐＨ１１．３の１５％溶液を生成した。５０％ジオキサンに溶解させた活性化セルロース（１０ｇ）を１３ｍＬのニトロチロシン溶液に２４時間、室温で混合させた。
【００８９】
実施例７
アミド結合によるリガンドの取り付け（縮合反応）
（ａ）樹脂のカルボキシル基へのアミンリガンドの１００％カップリング：
５モル過剰のリガンド（４−ＡＭＰ、３−ＡＭＰ、ジメチルアミノプロピルアミンまたはＡＰＩ）を６Ｍ  ＨＣｌによりｐＨ４．７に調整し、アミノカプロン酸樹脂（１．５５ｍモル／ｇ）と混合した。ｐＨは１Ｍ  ＨＣｌまたはＮａＯＨを適宜用いて４．７に調整し、３Ｍ過剰の水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ、５０％水溶液）を混合した。ｐＨは１Ｍ  ＨＣｌまたはＮａＯＨを適宜用いて１時間にわたって４．７に保持し、さらに調整することなしに１０時間室温で混合した。さらに１モル過剰のＥＤＣを以前と同様の方法（１＋１０時間）で加えた。樹脂を１０倍の容積の水、２倍の容積の０．１Ｍ  ＨＣｌおよび１０倍の容積の水で洗浄した。エタノールアミンをニトロチロシンセルロースに同様の方法でカップリングさせた。２０μモル／ｇが検出可能な滴定によっては、これらの樹脂上に残存カルボキシル基は検出されなかった。
【００９０】
（ｂ）アミノリガンドの、樹脂のカルボキシル基への部分的（５０−８０％）カップリング：
１．５モル過剰の、ＡＰＰ、ＰＰＡ、ＰＥＡまたはＰＡＬＯＬから選択されたリガンドを、ｐＨを６Ｍ  ＨＣｌによりｐＨ４．７に調整し、アミノカプロン酸樹脂と混合した。ｐＨは１Ｍ  ＨＣｌまたはＮａＯＨを適宜用いて４．７に保持し、１．５Ｍ過剰のＥＤＣを添加した。前述のとおり、ｐＨは１Ｍ  ＨＣｌまたはＮａＯＨを適宜用いて１時間にわたって４．７に保持し、さらに続いてｐＨ調整することなしに１０時間混合した。樹脂は前述のとおり洗浄し、残存カルボキシル基の量を滴定によって決定した。
【００９１】
（ｃ）カルボキシルリガンドのジアミノヘキサン樹脂（１．２４ｍモル／ｇ）への１００％カップリング：
この方法は前出の（ａ）と同様であるがリガンド（４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル酢酸または３−ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸）のｐＨは１Ｍ  ＮａＯＨにより調整した。ｐＨは５に維持され、ジアミノヘキサンセルロースを用いて０．１Ｍ  ＮａＯＨ洗浄はＨＣｌ洗浄に置き換えた。ジクロロサリチル酸のために、ナトリウム塩を、水中の酸（０．３ｇ）の懸濁液に１Ｍ  ＮａＯＨをｐＨが安定的に７になるまで加え、凍結乾燥して調製した。この塩を１０ｍＬのＤＭＳＯに溶解させ、エトキシカルボニルエトキシジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）（０．５ｇを５ｍＬのエタノールに溶解した）および５０％ＤＭＳＯに溶解したジアミノヘキサンセルロースと混合した。この混合物は６時間にわたって室温で混合した。さらに０．５ｇのＥＥＤＱを導入し、反応を１８時間続けた。この樹脂は５倍の容積のＤＭＳＯ、２倍の容積の５０％ＤＭＳＯ、１０倍の容積の０．１Ｍ  ＮａＯＨおよび１０倍の容積の水で洗浄した。樹脂のアミノ基のこれらの方法によるカップリングは８０から９０％のみが完遂された。残存アミノ基はこの分野で知られている、アセチル化等の方法でブロックした。
【００９２】
実施例８
キモシン精製のための方法
実施例２、３（４ＭＰを使用）および６（２ＡＭＰ、３ＡＭＰおよび４ＡＭＰを使用）に記載されたように生成された樹脂を、使い捨てのカラムに詰め、充填バッファーＡ（ｐＨ５．５：１０ｍＭクエン酸±０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で平衡化した。キモシン試料を同じｐＨおよびイオン強度に調整し、カラムに接触させた。非結合混在物を、この実施例で列挙されている両方のイオン強度の充填バッファーで、バッファーＡおよびＢ（おのおの３０カラム容量）を用いて洗浄した。この樹脂は、ＨＣｌでｐＨ２に調整した５０ｍＭ  ＫＣｌによって溶出させた。キモシン活性は、２００μｌの試料を５ｍｌの新鮮な全乳を３７℃で１時間まで保温することにより定性的にアッセイした。活性は溶出画分にのみ検出された。
【００９３】
実施例６（ＰＣＣ）および実施例７ｂに記載されたように調製された樹脂を上記のようにカラムに詰め、充填バッファーＢ（ｐＨ４．４および１０ｍＭクエン酸±０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で平衡化した。キモシン試料をこれらの充填条件に調整し、カラムに接触させた。前述のように、混在物は充填バッファーＢで洗浄した。樹脂は２０ｍＭクエン酸、ｐＨ６．２で溶出した。キモシン活性は溶出画分にのみ検出された。
【００９４】
この実施例の結果とは対照的に、同様のマトリックスから調製され、ＤＥＡＰＡおよびＡＰＩＭＩＤを用いた樹脂は高イオン強度においてはキモシンを結合しなかったが、これは疎水性／親水性および電荷のバランスが不適切であるためである。これらの結果は、イオン性官能基、スペーサーアーム、および固体支持マトリックスの適切な選択が、あるｐＨでの結合および別のｐＨでの放出をもたらすために必要であることを明確に示している。
【００９５】
実施例９
キモシンに対する樹脂容量
精製された組換えキモシンを用いて、バッチ操作により容量試験を行った。キモシンを使用前に透析、凍結乾燥した。用いた充填バッファーは、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する実施例８に記載されたものである。樹脂は充填バッファーで（５容量）で平衡化し、吸引乾燥した。この樹脂の１つの試料（２−４ｇ）を、１０ｍＬの計量シリンダー中で重さを計り、充填バッファー中に懸濁させ、４８時間静置して落ち着かせた（樹脂の重量：容量比を決定するため）。別の樹脂の試料（０．１−０．１５ｇ）を２５ｍＬのバイアル中で重さを計り、１０ｍＬの充填バッファーに溶解された２５ｍｇのキモシンと、１時間にわたって４℃で回転ホイール上で混合させた。バイアルの中身は定量的にＰｉｅｒｃｅ使い捨て２ｍＬミニカラムに移し、１０ｍＬの充填バッファーで洗浄した。樹脂を適当なバッファーで（実施例８に記載されているように）、１０ｍＬ容量測定用フラスコ中に溶出した。溶出物は２８０ｎｍの紫外線吸収およびタンパク質アッセイ（ビシンコニニン酸；ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄアッセイ）により分析した。容量データはｍｇタンパク質／樹脂ｍＬによって、以下の表２に示されている：
【表２】
2008156617.tif 000006
【００９６】
％置換とは、所定のイオン性官能基で置換されたカプロン酸またはアミノカプロン酸カルボキシル基のパーセントを指す。
【００９７】
実施例１０
疎水性陽性イオン性樹脂の滴定
滴定されるべき樹脂の試料（１ｇ；湿重量）を０．１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、続いて水で濯いだ。試料を続いて９ｍＬの５００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（または表３で示されたように）に懸濁させ、０．１Ｎ  ＨＣｌで滴定した。滴定の数値は希釈効果に関して、誘導されていないＰｅｒｌｏｚａ対照について得られた滴定値を差し引くことにより訂正した。滴定のデータは表３に示されている：
【表３】
2008156617.tif 000007
【００９８】
実施例１１
疎水性陰性イオン性樹脂の滴定
０．５Ｍ  ＮａＣｌ中の樹脂の試料（１ｇ）を、１Ｍ  ＮａＯＨによりｐＨ１２に調整し、続いて０．１Ｍ  ＨＣｌによってｐＨ３まで滴定した。滴定の数値は、希釈効果に関して、誘導されていないＰｅｒｌｏｚａ対照について得られた滴定値を差し引くことにより訂正した。滴定のデータは表４に示されている：
【表４】
2008156617.tif 000008
【００９９】
表３および４のデータは、イオン性官能基を有する代表的な樹脂が静電気的に荷電していない状態から荷電している状態へ転換されるｐＨ範囲を示している。このデータは、当業者であれば、異なったイオン化特性を有する様々な樹脂を用意し、選択し、それにより回収されるべき標的化合物と両立しうる樹脂の使用を可能とし得ることを示している。
【０１００】
実施例１２
アミノカプロン酸リガンドを有するＣＤＩ活性化Ｐｅｒｌｏｚａセルロースの、粗発酵液体培地からのスブチリシンに対するバッチ結合容量
ＰｅｒｌｏｚａセルロースをＣＤＩで活性化させ、アミノカプロン酸リガンドを、上記の実施例６の記載と同様の方法で取り付けた。３種類の樹脂の誘導体は以下のように調製された：
ＭＧ３＝Ｐｅｒｚｏｌａ  ＭＴ  １００  Ｆｉｎｅの架橋されていない樹脂（直径：８０−１００ミクロン；リガンド密度：２０７μモルカプロン酸／ｍＬ）
ＭＧ３ａ＝１％エピクロロヒドリンと架橋されたＰｅｒｚｏｌａ  ＭＴ  １００Ｆｉｎｅ上の樹脂（リガンド密度：２２５μモル／ｍＬ）
ＭＧ３ｂ＝Ｐｅｒｚｏｌａ  ＭＴ  １００  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｐｅｒｚｏｌａ上の樹脂（直径：１００−２５０ミクロン；リガンド密度：２１６μモル／ｍＬ）。
【０１０１】
容量試験は、同じのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ発酵液体培地を用いてバッチ操作により行った。ＭＧ３樹脂を用いた容量試験では、１９９３年１０月１４日に出願され、ここに参考文献として取り込まれている米国特許出願番号第０８／１３７，２４０号に記載されているＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの変異体を用いた。ＭＧ３ａおよびＭＧ３ｂ樹脂をもちいた容量試験では、市販されているスブチリシン（ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）スブチリシン  Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡより入手可能）を用いた。各々の場合において、スブチリシンは標的化合物であった。各々の場合において、液体培地は多様な、タンパク質を含む無関係の化合物を有していた。培地の伝導率は１６ｍモーであった。粗細胞分離は、培地を４５，０００ｒｐｍでＳｏｒｖａｌｌ冷却遠心分離機で２０分間遠心分離することにより行い、上清のみを用いた。
【０１０２】
４．０ｇの湿樹脂を、ｐＨ５．２の５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーで容量１０ｍｌまで平衡化した。その結果落ち着いた樹脂の容量を、実験の開始に先立って記録した。
【０１０３】
５０ｍＬの液体培地を、氷酢酸によりｐＨ５．２に調整した。この培地の量は、樹脂の容量に対するタンパク質の濃度が大きく過剰であることを示し、樹脂上のタンパク質濃度がその事実上の最大であることを確実なものとしている。時間ゼロにおいて、１０ｍＬのバッファーおよび樹脂を培地に添加した。さらに付加的に１ｍＬの水を、試験管を濯ぐために添加した。混合物を重さが既知のビーカー中で、冷却下で３時間撹拌した。その時、上清をワットマン４７濾紙を含むブフナー漏斗で濾過した。上清の重さをはかり、０．５ｍＬの試料を回収した。
【０１０４】
樹脂を濯ぎ、ビーカーに戻し、１００ｍＬ以下の５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ５．２に接触させ、非特異的結合化合物を除去した。洗浄段階は２５−３０分続いた。この溶液を再び濾過し、試料を回収した。結合および洗浄画分の試料を活性について分析した。以下の表５は、洗浄後、全ての樹脂が、充填前に最低限の処理をされた液体培地中のスブチリシンに対する、非常に高い容量を有していることが判明した：
【表５】
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【０１０５】
実施例１３
放射状流体カラムにおけるアミノカプロン酸リガンドを有するＣＤＩ活性化Ｐｅｒｚｏｌａ  セルロースを用いた粗発酵液体培地からのスブチリシンの回収
実施例１２記載のＭＧ３ａ架橋樹脂を、実施例６記載のとおり調製した。
【０１０６】
５０ｍＬの放射状流体クロマトグラフィーカラム（Ｓｅｐｒａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）をこの樹脂で詰め、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ発酵液体培地からのスブチリシンの回収を実現するために、以下のように用いた：
液体培地処理
全液体培地を、冷凍されたＳｏｒｖａｌｌ遠心機で、４，５００ｒｐｍ、３０分間遠心した。遠心物の導電率は氷酢酸を用いてｐＨ５．２に調整した。希釈は行わなかった。培地の導電率は２０ｍモーであった。スブチリシンは標的化合物であり、培地はまた、タンパク質を含む多様な無関係の化合物を有していた：
バッファー
平衡化バッファー：１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２＋２０ｍモーまでのＮａＣｌ
洗浄バッファー：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２＋２０ｍモーまでのＮａＣｌ
溶出バッファー：１００ｍＭグリシン、４０％プロピレングリコール、８％蟻酸ナトリウム、ｐＨ９、３３ｍモー
再生バッファー０．１Ｍ  ＮａＯＨ
４６０ｍＬの遠心した培地をｐＨ５．２および導電率２０ｍモーでカラムに接触させた。動的容量を評価するために、カラムを意図的に過剰充填し、そのため通過および洗浄画分にも過剰の酵素が期待された。流速は１０ｍＬ／分であった。カラムを１５ｍＬ／分で、紫外線（ＵＶ）吸収がフルスケールの１５％以下になるまで洗浄した。このために６１カラム容量の洗浄バッファーを要した。カラムを、１６カラム容量で５ｍＬ／分で溶出した。洗浄後、樹脂のスブチリシン容量は３１ｍｇ／ｍＬであった。実行の間を通して、圧力は４ｐｓｉ以下であった。
【０１０７】
タンパク質は上記の溶出バッファーを用いて、ｐＨと導電率を増加させることにより溶出させた。９４％の結合タンパク質が回収可能であった。０．５または１カラム容量の溶出画分を集めたが、集めた画分あたりのタンパク質（スブチリシン）濃度は図８に記載されている。最大のフラクション濃度は１７．４ｍｇ／ｍＬであり、回収されたタンパク質の９０％は３カラム容量以内で溶出した。
【０１０８】
この工程は、最小の液体培地の前処理を伴う、複合発酵液体培地からの簡便で高いスブチリシン捕捉容量を示すものである。狭く、濃縮された溶出ピークでの定量的な回収もまた、この工程により可能である。
【０１０９】
より少ないタンパク質を充填し、より短い洗浄工程を用いるという変更をした上で、上に示された手順に従うことにより、この化合物は、全体に高い収率で回収可能である。溶出バッファー中でのプロピレングリコールの使用は補助的であるが、完全な溶出を成すために必須ではない。この手順は、他の標的化合物の回収を可能とするために容易に変更され得る。
【０１１０】
当業者にとっては、本発明の精神から離れることなく様々な変化および明白な本質の変更が可能であること、およびそのような変更は、以下の請求の範囲において示されている本発明の範囲内にあると考えられることは明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）活性化マトリックスへのリガンド取り付けを示している。
【図２】図２は、マトリックスのカルボキシル基への、リガンドのカルボジイミドカップリングを示している。
【図３】図３は、ＣＤＩ−カプロン酸支持体を示している。
【図４】図４は、アミンとＣＤＩ−カプロン酸マトリックスとの縮合（反応）から由来しうる生成物を示している。
【図５】図５は、エポキシ活性化マトリックスとチオールとの反応を示している。
【図６】図６は、エポキシド活性化マトリックスとアミンとの反応で、そのイオン性アミン官能基が保持されているものを示している。
【図７】図７は、本発明において有用であるいくつかの樹脂の構造を示している。
【図８】図８は、放射状流体カラムを用いた、スブチリシンを含む粗発酵液体培地からのスブチリシンの回収の、典型的な溶出特性を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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