(57)【要約】【課題】  ハム、ベーコン、ソーセージなどの塩漬工程を有する食肉加工品の製造に使用する食肉加工用塩漬液を提供する。本発明の食肉加工用塩漬液を使用すると、食肉を適度に軟化し食感を改良でき、食肉に赤みと食味、風味を与えることができる。【解決手段】  担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来のタンパク質分解酵素活性を有する抽出物を含有し、亜硝酸濃度１０〜１０００ｐｐｍ、及び食塩濃度０．１〜２０質量％である食肉加工用塩漬液。担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来の抽出物のタンパク質分解酵素活性は、筋原線維タンパク質のアクチン、ミオシンを選択的に分解するので、適度な軟化度で反応が終結する。またハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来の抽出物には、植物性の渋味、酵素臭がなく、さらにマイタケ由来のタンパク質分解酵素のように特有の強い風味を有していないため、食肉に作用させても異味を残さない。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来のタンパク質分解酵素活性を有する抽出物を含有し、亜硝酸濃度１０〜１０００ｐｐｍ、及び食塩濃度０．１〜２０質量％である食肉加工用塩漬液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハム、ベーコン、ソーセージなどの塩漬工程を有する食肉加工品の製造に使用する食肉加工用塩漬液に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食肉加工用塩漬液は、塩漬け液又はピックル液とも呼ばれ、食肉に貯蔵性を与えるとともに、肉の風味、色調等をととのえ、肉質の向上をはかり、品質を固定化させる目的で用いられ、ハム、ソーセージ、ベーコン等の肉加工品の製造には欠くことのできないものである。食肉加工用塩漬液は、発色助剤、結着剤、保存料、香辛料、着色料、調味料、結着料、調味料、結着補強剤等の各種の成分が配合されている（特許文献１及び特許文献２）。
老廃家畜、経産家畜、ホルスタイン種などの乳用種またはグラスフェッド肥育された肉用種等の硬い食肉を軟化するには、機械的な破壊によるスジ切りや挽肉加工が一般的であるが、食肉加工用塩漬剤にタンパク質分解酵素を加え改質剤して使用することがなされている。タンパク質分解酵素は、パパイヤ未熟果汁の乳液、パイナップルの根茎、豚の胃粘膜等に含まれており、糸状菌、酵母菌、細菌などの微生物にも広く含まれていることが知られている。例えば、パパイヤ乳液を精製して得られるパパインやパイナップルの茎から精製して得られるブロメラインは、非常に安定性の高い酵素であり、熱に強い性質を有することから食肉加工用塩漬液に使用されている（特許文献３）。さらに担子菌門ヒダシナタケ目多孔菌科のキノコに属するマイタケにもタンパク質分解酵素が知られており（特許文献４）、使用が期待されている。
【特許文献１】特開平７−７９７４１号公報
【特許文献２】特開平７−２５５４２６号公報
【特許文献３】特開平５−７４７６号公報
【特許文献４】特開２００２−７８４８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
食肉加工用塩漬液は、湿塩法による塩漬の際に使用され、例えば、ピックル液に肉を浸す浸漬法、肉にピックル液を注入するインジェクション法等に用いられるものであり、このような食肉加工用塩漬液にタンパク質分解酵素を含有させると、種類によっては肉を軟化しすぎたり、逆に軟化できなかったりする。
酵素は、その反応において基質特異性が知られており、また、食肉加工用塩漬液に含まれる各種物質により、その活性が阻害されたり、それ自体が失活したりする。塩漬液のように比較的食塩濃度が高く、しかも亜硝酸など各種の配合成分を含有する液中で、充分な活性を保持し且つ食肉に所望の作用を発揮することは困難であることと考えられていた。
例えば、従来から報告されているパパイン、あるいはブロメラインを含む食肉加工用塩漬液は、タンパク質分解酵素が筋原線維タンパク質を低分子量まで過剰に分解するため食肉本来の食感が失われ易いという問題点があった。また、食肉加工用塩漬液に長時間保存すると酵素活性が失活する。さらに渋味、酵素臭と呼ばれる刺激性の臭いが強いため、風味を重視する食肉加工品の旨味を阻害し、異味を残してしまうという問題点があった。
また、担子菌門ヒダシナタケ目多孔菌科のキノコに属するマイタケに含有するタンパク質分解酵素も、パパインと同様に食肉を低分子量のオリゴペプチドおよびアミノ酸まで分解してしまう。マイタケに含有するタンパク質分解酵素は、マイタケ特有の風味が非常に強いため、食肉の風味に影響を与えてしまう問題点があった。
【０００４】
本発明者らは、食肉加工用塩漬液につき、単なる調味料、香辛料等による味付け技術の改良にとどまらず、原料肉そのものの品質改善を目的とし、新しい塩漬液の開発を目的として鋭意研究を重ねた。食肉加工用塩漬液に担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコに由来するタンパク質分解酵素活性を有する抽出物を含ませるという新しい観点から食肉加工用塩漬液を製造し、該タンパク質分解酵素活性が食肉加工用塩漬液に含まれる亜硝酸、ＮａＣｌなどの酵素活性阻害剤との共存下でも、その活性を維持でき、また食肉を適度に軟化できることを見出して本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来のタンパク質分解酵素活性を有する抽出物を含有し、亜硝酸濃度１０〜１０００ｐｐｍ、及び食塩濃度０．１〜２０質量％である食肉加工用塩漬液である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の食肉加工用塩漬液を使用すると、食肉を適度に軟化し食感を改良でき、食肉に赤みと食味を与えることができる。
担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来の抽出物のタンパク質分解酵素活性は、パパインやブロメラインとは異なり、食肉の硬さに関与するタンパク質のうち、筋原線維タンパク質のアクチン、ミオシンを選択的に分解するので、適度な軟化度で反応が終結する。またハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来の抽出物には、植物性の渋味、酵素臭がなく、さらにマイタケ由来のタンパク質分解酵素のように特有の強い風味を有していないため、食肉に作用させても比較的異味を残さない。
担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来の抽出物のタンパク質分解酵素活性は、亜硝酸、ＮａＣｌなどの酵素活性阻害剤との共存下でも、その活性を維持できるので、長時間の使用あるいは繰り返し使用が可能である。
担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコであるホンシメジ、ブナシメジおよびエノキタケ等は、食用されてあり、アレルギー物質もない安全な食材である。今日では、人工栽培により、季節を問わず大量に同品質のものを入手することが可能であり、パパイヤやパイナップルのような果実系の酵素からの抽出よりも生産効率が高く、食肉加工用塩漬液を製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来の抽出物のタンパク質分解酵素活性）
本発明の食肉加工用塩漬液において使用する、担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来の抽出物のタンパク質分解酵素活性は下記の理化学的性質を有している。
（ａ）作用及び基質特異性：タンパク質及びペプチドに特異的に作用し、そのペプチド結合を切断するエンドタイプのプロテアーゼ活性を示す。  
（ｂ）亜硝酸塩
３７℃、ｐＨ６．０の条件において、１０００ｐｐｍ亜硝酸塩存在下で、８０％以上の相対活性を示す。
（ｃ）耐塩性
３７℃、ｐＨ６．０の条件において、１５質量％の食塩存在下で、６０％以上の相対活性を示す。
酵素活性はｐＨ５．０〜７．０の範囲で安定であり、酵素活性の至適温度４０℃で、５５℃以下の温度では安定である。
他に、（１）水溶液中での保存安定性がよい、（２）水溶液中での振動に耐性がある、等の性質を有する。
水溶液中では、１０℃、２日間、８０％以上の相対活性を維持でき、タンパク質分解酵素でありながら自己失括が少ない。
また、ピックルインジェクターで水溶液を繰り返し２時間循環させても、相対活性が安定であり、空気に対する接触や機械的振動に耐えうる酵素活性を有する。
【０００８】
上記の性質を有する担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来の抽出物に含有されるタンパク質分解酵素は、食肉の硬さに関与するタンパク質のうち、筋原線維タンパク質のミオシン、アクチンの一部を選択的に分解でき、パパインやブロメラインそしてマイタケに含有するタンパク質分解酵素とは異なり、適度な軟化度で反応が終結するので、食肉の改質剤としての使用に適している。しかも酵素の失活温度が比較的に低いため、食肉加工品の殺菌及び調理工程における温度管理や失活コントロールがしやすく、家庭用だけでなく業務用としても使用しやすい。
また、亜硝酸塩、食塩等の阻害物質に対して耐性があり、食肉加工用塩漬液に含ましても、抽出物のタンパク質分解酵素活性が維持される。
【０００９】
（抽出物の抽出）
原料になる担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコとしては、ホンシメジ、ブナシメジ（シメジ）およびエノキタケを挙げることができる。種、原産国、収穫時期等は限定されず、適度にタンパク質分解酵素が存在していれば、キノコの子実体及び菌糸体いずれも使用することができる。
最近ではブナシメジ及びエノキタケの子実体が人工栽培されており、容易に入手できるので、本発明における原料として好適である。タンパク質分解酵素は子実体に多く含まれており、子実体の使用が経済的には適している。キノコは採取したての生のもの、半乾燥品、乾燥品いずれも使用しうる。半乾燥品、乾燥品においては、凍結乾燥品など熱風で乾燥されていない製品の使用が好ましい。これらの子実体をそのまま用いてもよく、ペーストあるいはエキスなどの加工物も使用しうる。生のものを液体窒素あるいはドライアイスを用いて凍結粉砕したもの、カッターミルやフードプロセッサー等で粉砕したものも使用できる。
【００１０】
本発明の担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコに含まれるタンパク質分解酵素は水溶性の成分であるので、本発明の抽出物は水または水系溶剤で抽出することができる。特に子実体を液体窒素あるいはドライアイスを用いて凍結粉砕したもの、半乾燥品、乾燥品を原料に使用する場合には、水または緩衝液による抽出を行うことが好ましい。処理温度としては２０℃以下、好ましくは１０℃以下にすることが好ましく、さらに抽出における溶液についてもｐＨ５．５〜７．０にすることが好ましい。
水としては、イオン交換水、精製水、蒸留水、天然水の他、水道水も場合によっては、使用することができる。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液を使用できるが、特に緩衝剤の濃度１０〜３００ｍＭでｐＨ５．５〜７．０の範囲に調整したものを用いることにより、酵素活性の高い抽出液が得られるので好ましい。
【００１１】
抽出方法は、例えば、以下のとおりである。
まず、キノコの子実体と水との均質化処理を行う。処理にはミキサーを使用するが、酵素の失活がおこらないような条件であれば、ミキサーの種類、攪拌・混合手法、時間等は特に限定されない。攪拌・混合の時間は、例えば家庭用のミキサーを用いた場合、一般的には、１〜１０分間程度が適しており、２０℃以下に保持するとよい。
【００１２】
攪拌・混合終了後の固液分離には、遠心分離、濾過等の公知の手段を採用することができる。遠心分離を行う場合の条件は、相対遠心加速度（ＲＣＦ）２０００〜１００００×ｇで３〜３０分間が適当であり、この上清画分を濾過するのが好ましい。冷却高速遠心分離機を用いる場合、４０００〜８０００×ｇで５〜２０分間遠心分離を行うのが好ましい。また遠心分離操作を行うことなく、混合した後そのまま濾過して抽出液を得ることもできる。
【００１３】
こうして得られる抽出液は、抽出物としてタンパク質分解酵素を含有しタンパク質分解酵素活性を有するが、キノコに付着する細菌類、キノコの菌体を多量に含んでいる。そこで、食品工業分野の製品の滅菌・清澄濾過に使用されている公知の除菌フィルターに通過させて、キノコに付着する細菌類、キノコの菌体を除去することが好ましい。除菌フィルターとしては、ビバシュアＩＩ（商品名、キュノ（株）製  ３０インチの円筒型カートリッジタイプ）などが挙げられる。
得られた抽出液を、場合により、凍結濃縮、減圧濃縮、限外濃縮などの適当な濃縮手段を用いて、濃縮し、抽出物を製造することもできる。
【００１４】
さらに得られた抽出液から、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、その他の各種クロマトグラフィーを単独もしくは併用して、抽出物としてタンパク質分解酵素を精製することができる。なお、塩析における塩類としては硫安、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が使用でき、溶媒添加による濃縮沈殿ではアセトン、低級アルコール等を使用できる。
【００１５】
こうして得られるキノコ由来のタンパク質分解酵素活性を有する抽出物は、保存性や取り扱いを簡便なものにするため、抽出液に乳糖、デキストリンなどを賦形剤として加えた後、常法による真空凍結乾燥法等で粉末化して、使用することも可能である。賦形剤として乳糖、マルトオリゴ糖、デキストリン、イヌリン等の糖質類が好ましい。結晶セルロースなどのセルロース類、その他天然もしくは合成高分子化合物等のような賦形剤も使用できる。これらの賦形剤は、例えば抽出液１００質量部に対して、３〜８０質量部添加するのが好ましい。３質量部未満の場合、後の凍結乾燥工程で容器や器具に付着を起こしやすくなる。
こうして得られる担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来の抽出物は、タンパク質分解酵素活性を有する以外に、食肉加工用塩漬液に含有させると、後味が残ることなく食肉特有の臭みをマスキングさせることができる他、グルタミン酸、イノシン酸、グアニル酸のような旨味成分を含有するため、食肉の風味に深みを与えることができる。
【００１６】
（食肉加工用塩漬液）
本発明の食肉加工用塩漬液は、担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来のタンパク質分解酵素活性を有する抽出物を含有することを特徴とするが、食肉加工用塩漬液自体は従来公知の各種組成のものを使用可能である。
代表的な食肉加工用塩漬液としては、亜硝酸及び食塩とともに発色助剤、結着剤、保存料、調味料、香辛料及び結着補強剤から少なくとも１種を含有するものを例示できる。上記において亜硝酸としては例えば亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等の亜硝酸塩を使用してもかまわない。
発色助剤としては、Ｌ−アスコルビン酸又はそのナトリウム塩等の塩類、エリソルビン酸又はそのナトリウム塩等の塩類、ニコチン酸アミド等；結着剤としては、ピロリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等の重合リン酸塩等；保存料としては例えばソルビン酸又はそのカリウム塩等の塩類等；調味料としてコハク酸ナトリウム、５’−イノシン酸ナトリウム、５’−リボヌクレオチドナトリウム等の核酸系呈味物質、砂糖等の糖類、ソルビット等の糖アルコール類、デキストリン等の糖類等；香辛料としては、例えばコショウ、コリアンダー、ローレル、オールスパイス、ニクズク、トウガラシ、ウィキョウ、コズイシ、セージ、タイム、月桂樹葉、丁香、ショウガ、タマネギ、ニンニク、ケイ皮等；また結着補強剤としては卵白タンパク質、乳タンパク質、カゼイン類、ゼラチン、小麦タンパク質、大豆タンパク質等の動植物タンパク質、その部分分解物や澱粉等を挙げることができる。また上記食肉加工用液には必要に応じてタール系合成色素や植物性天然色素、食用赤色３号、食用赤色４号等の着色料等や食用油脂等を配合される場合もある。
上記各成分の配合量は、特に限定されるものではなく、原料肉の種類や目的に応じて適宜決定されるが、通常食塩では約５〜２０質量％（塩漬液中濃度％、以下同じ）、好ましくは１０質量％、発色剤として亜硝酸ナトリウムでは１０〜１０００ｐｐｍ、好ましくは１００ｐｐｍであることが好ましい。    
【００１７】
本発明の食肉加工用塩漬液は、食肉加工用塩漬液において担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来のタンパク質分解酵素活性が０．５〜５０ｕｎｉｔ（単位）／ｇであることが好ましい。酵素活性がこの範囲では、食肉は、本発明の食肉加工用塩漬液に１５時間以上の浸漬で軟化が十分となり生産効率の点で好ましい。
本発明の食肉加工用塩漬液は、上記の本発明の食肉加工用塩漬液に、担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来のタンパク質分解酵素活性を有する抽出物の酵素活性を調整し、これを加えて製造するが、製造の際に、抽出液をそのまま加えたり、抽出物を含有する粉末を加えることもできる。
製造の際は、タンパク質分解酵素の失括を極力抑えるために２０℃以下で製造することが好ましく、各種成分を水に溶解し調整する。
【００１８】
（食肉加工用塩漬液の使用方法）
このようにして調整された本発明の食肉加工用塩漬液は、食肉としては、通常のハム、ソーセージ、ベーコン等に加工できる各種のもの、例えば牛肉、豚肉、鶏肉、馬肉、羊肉等のいずれにも使用でき、これらはステーキ、角切り、薄切り、ミンチ等の各種の形態で、本発明の食肉加工用塩漬液を使用できる。例えば、浸漬法であれば原料肉を直接塩漬液に浸漬し、インジェクション法であれば、インジェクターにより原料肉に注入した後タンブリングを行い、浸漬される。
本発明の食肉加工用塩漬液の使用量は、インジェクターを使用する場合、食肉１００質量部に対して１０〜３０質量部が好ましい。一方、漬け込みの場合、食肉１００質量部に対して２００〜５００質量部が好ましい。使用温度は３〜１８℃が好ましく、使用時間は２４〜４８時間が好ましい。
本発明の食肉加工用塩漬液は、食肉をこれに浸漬して使用するが、インジェクション法により食肉の内部にあらかじめ本発明の食肉加工用塩漬液を注入した食肉をさらに浸漬に使用してもよい。また、漬け込み工程を行わなくても、本発明の食肉加工用塩漬液を注入した食肉も軟化するのでそのまま使用することができる。    
インジェクション法による注入の方法としては、例えば、ピックルインジェクター等の注入機を用いて、０〜１０℃の食肉に注入する。注入液の液温は０〜３０℃が好ましく、５〜１５℃がより好ましい。注入後は、抽出物に含まれるタンパク質分解酵素による食肉タンパク質の分解を促進させるために、２〜１０℃で１〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間静置することが好ましい。また注入の前後に、テンダーライザーを用いて機械的に軟化する方法や、注入後にタンブリングマシンを用いて注入液の浸透を促進する方法を併用してもよい。
【００１９】
（食肉加工品）
本発明の食肉加工用塩漬液は、豚肉、牛肉、鶏肉、羊肉などの原料肉から製造されるハム、ソーセージ、ベーコン、などの通常塩漬工程を有する畜肉食品であれば、全て利用することができる。
【実施例】
【００２０】
本発明について、実施例を用いて以下に説明する。
なお、各例におけるタンパク質分解酵素活性の測定は次の方法で行った。
（活性測定法）
０．６質量％カゼイン溶液（ｐＨ６．０）５ｍｌに試験（酵素）溶液１ｍｌを混合し、３８℃、６０分反応させた後、４００ｍＭトリクロロ酢酸溶液５ｍｌを加え攪拌し３８℃、３０分間放置後、上清２ｍｌを０．５５Ｍ炭酸ナトリウム溶液５ｍｌに加えさらに２倍希釈したフェノール試薬を１ｍｌ添加攪拌後、３８℃、３０分間放置し、６６０ｎｍの吸光度を測定する。上記の測定条件下で１秒間に１ｍｏｌのチロシンに相当する吸光度を増加させる酵素量を、酵素活性１単位（１ｕｎｉｔ）と定義する。
キノコ由来のタンパク質分解酵素活性を有する抽出物を粉末化した場合は、粉末を約１ｇ精密に量り、２質量％塩化カリウム溶液５０ｍｌを加え攪拌溶解し、適宜希釈した液を試験溶液とし、活性を測定した。
【００２１】
参考例１
市販されているブナシメジの子実体（ホクト（株））を２４時間凍結乾燥させたものを、ブレンダーで２分間粉砕する。粉末化したサンプル１００ｇに対して１００ｍｌの５０ｍＭリン酸‐ＮａＯＨ（ｐＨ６．０、１０℃）を加えて１時間静置させ、ろ紙（アドバンテック東洋（株）、Ｎｏ．５Ｃ）で濾過したものを遠心分離機（（株）コクサン：Ｈ−２０００Ｂ）で遠心分離（８０００×ｇ、１０分間）し、その上澄み液を抽出液とした。この抽出液の酵素活性は、２００単位／ｇであった。
基質にウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ  、Ａｌｂｍｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  、ナカライテスク（株））を使用し、タンパク質分解酵素としての性質を調べた。抽出液（０．２５μｇ／μｌ）と基質（５μｇ／μｌ）を３８℃で、各０ｈ、１ｈ、３ｈ、５ｈ、２４ｈ反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて、基質の分解状態を確認した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件
電気泳動装置：ＡＥ−６５００型（アトー（株）製）
ゲル        ：１０％均一ゲル  １２ウエル
泳動緩衝液  ：２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ
通電        ：定電流  ３０ｍＡ  １００分
染色        ：ＣＢＢ（クマジーブリリアントブルー）染色
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルについては、ＣＳアナライザー（アトー（株）製）を使用し、染色したゲルのバンドを濃度定量および位置を数値化して解析した。
結果を表１に示す。
【００２２】
参考比較例１
市販されているパパイン製剤（和光純薬工業（株）製、酵素活性７０００単位／ｇ）の０．０３質量部（約２００単位／ｇ）を用い、参考例１と同様の実験を行い、その結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
2008161104.tif 000002
【００２４】
ブナシメジ抽出液およびパパイン水溶液ともに２４時間後には、基質（ＢＳＡ）を分解した。しかし、パパイン水溶液は、ＢＳＡの分解により生じたＭｗ６４，３００及び５２，４００の分解ペプチドについても、さらに分解される傾向にあるのに対して、ブナシメジ抽出液の方は、これらの分解ペプチドに対する低分子化が確認されなかった。したがって、ブナシメジ抽出液にはエンドタイプのプロテアーゼ活性を有するタンパク質分解酵素が含まれており、選択的に基質が分解されることが確認された。
【００２５】
参考例２及び参考比較例２
（Ａ）シメジ由来抽出物粉末の製造
市販のブナシメジ（雪国まいたけ（株））を適度な大きさに切断した後、５０ｍＭの緩衝液（ｐＨ６．０）をブナシメジと等量加え、家庭用ミキサーを用いて３分間ホモジナイズした。次に遠心分離機（株式会社コクサン：Ｈ−２０００Ｂ）を用いて５０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清液をプレフィルタレーションした後に、除菌フィルター（３０インチ円筒型カートリッジタイプ  孔径０．４５〜０．８μｍキュノ（株）製  ビバシュアＩＩＩ：商標）で処理したものをブナシメジの水溶性成分とした。この水溶性成分にデキストリン（松谷化学工業（株）製、パインデックス：商標）を５０質量％添加した後、−２０℃にて凍結乾燥を２日間行い、シメジ由来抽出物粉末を製造した。製造したシメジ由来抽出物粉末のタンパク質分解活性は９８単位／ｇであった。
【００２６】
（水溶液下における残存活性の安定性実験）  
上記のように製造したシメジ由来抽出物粉末１ｇを５０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に添加した試験溶液を作製し、１０℃下で１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、そして９６時間放置した。各時間経過した試験溶液から１ｍｌを採取し、０．６質量％カゼイン溶液（ｐＨ６．０）５ｍｌに混合し、２０〜７０℃の範囲に設定した各恒温槽において６０分間反応させ、タンパク質分解酵素活性を調べた。
同様に市販されているパパイン製剤（和光純薬工業（株）製、酵素活性７０００単位／ｇ）の０．０３質量部（約２００単位／ｇ）を５０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に添加した試験溶液を作製し、参考例２と同様の実験を行った。０時間における酵素活性を１００とした場合の各時間の相対活性を示した。
【００２７】
【表２】
2008161104.tif 000003
【００２８】
１：２０％未満、  ２：２０以上４０未満、  ３：４０以上６０未満、  ４：６０以上８０未満、  ５：８０以上
【００２９】
シメジ由来抽出物の水溶液は、９６時間においてもタンパク質分解酵素活性の減少はみられなかった。一方、パパイン酵素水溶液は時間の経過と共に活性値が減少し、４８時間で活性がそれぞれ５０％、９６時間目では４０％にまで減少した。したがってシメジ由来抽出物に含まれるタンパク質分解酵素は自己分解に対しても高い安定性を持っており、他の酵素よりも優位性を持っていることがわかる。
【００３０】
参考例３及び参考比較例３
上記でシメジ由来抽出物粉末１ｇを、各亜硝酸Ｎａおよび各食塩濃度に調整した５０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に添加し、１０℃下で２４時間保持した後、上記の活性測定法に準じて、本発明のタンパク質分解酵素に及ぼす亜硝酸Ｎａ、食塩による影響を調べた。亜硝酸Ｎａ無添加（０ｐｐｍ）、ＮａＣｌ無添加（０質量％）時の酵素活性を１００とした場合の各条件における活性を測定し、その結果を表３に示した。
パパイン酵素（パパイン製剤（和光純薬工業（株）製）０．０３ｇを、同様に各亜硝酸Ｎａおよび各食塩濃度に調整した５０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に添加して実験した（参考比較例３）。
【００３１】
シメジ由来抽出物において、亜硝酸Ｎａ存在下では、タンパク質分解酵素活性は大きな阻害は観察されず、１０００ｐｐｍ濃度下においても、約９０％以上の酵素活性を有していた。
ハム・ソーセージなどの食肉加工品の発色剤として使用される亜硝酸Ｎａの使用基準は、１ｋｇあたり０．０７０ｇ（７０ｐｐｍ）以下に規制されており、実際に使用される基準内での亜硝酸Ｎａの添加量を考慮すると、シメジ由来の酵素に対して亜硝酸Ｎａによる酵素活性阻害はないものと考えられる。一方、比較対象のパパイン酵素では、亜硝酸Ｎａ濃度に比例して、残存活性が低下する傾向があり、使用基準内であっても大きな感受性を示し、残存活性が、約５０％にまで減少した。したがってシメジ由来抽出物に含まれるタンパク質分解酵素は、パパイン酵素などの既存の軟化酵素よりも亜硝酸Ｎａに対する耐性が高く、他の酵素よりも優位性を持っていることがわかる。
また、シメジ由来抽出物の水溶液では、食肉用浸漬液の組成濃度である食塩濃度１５質量％において、６０％以上の残存酵素活性を維持できることがわかる。
【００３２】
【表３】
2008161104.tif 000004
【００３３】
１：２０％未満、  ２：２０以上４０未満、  ３：４０以上６０未満、  ４：６０以上８０未満、  ５：８０以上
【００３４】
実施例１及び比較例１
参考例２で製造したシメジ由来抽出物粉末１ｇを、亜硝酸濃度を１００ｐｐｍとし、各食塩（濃度０〜１８質量％）に調整した５０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に添加し、１０℃下で２４時間保持した後、上記の活性測定法に準じて、亜硝酸Ｎａと食塩を併用した塩漬液の場合における発明のタンパク質分解酵素に及ぼす影響を調べた。各条件における酵素活性を測定し、その結果を表４に示した。
比較としてパパイン酵素（パパイン製剤（和光純薬工業（株）製）０．０３ｇを、同様に各食塩（濃度０〜１８％）に調整した５０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に添加して実験した（比較例１）。
【００３５】
【表４】
2008161104.tif 000005
【００３６】
１：２０％未満、  ２：２０以上４０未満、  ３：４０以上６０未満、  ４：６０以上８０未満、  ５：８０以上
【００３７】
シメジ由来抽出物を使用すると、亜硝酸及び食塩との存在下においても、パパイン酵素などの既存の軟化酵素よりもタンパク質分解酵素活性を維持できることがわかった。食肉用浸漬液が、食塩と亜硝酸存在下の浸漬液に原料肉を長時間浸漬させていることを踏まえると、本発明の担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来のタンパク質分解酵素活性を有する抽出物が食肉用浸漬液の使用に適していることがわかる。
【００３８】
実施例２及び比較例２
参考例２で製造したシメジ由来抽出物粉末１０ｇを、亜硝酸塩濃度１００ｐｐｍ下および食塩濃度１０％下に調整した５０００ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に添加して、ピックル液を作製した。作製したピックル液について、ピックルインジェクターを用いて、液温１０℃に保持しながら、０〜２時間ピックル液を循環させた後、上記の活性測定法に準じて、ピックルインジェクターによる物理的シェアにおける本発明のタンパク質分解酵素に及ぼす影響を調べた。各条件における残存活性を測定し、その結果を表５に示した。比較としてパパイン酵素（パパイン製剤（和光純薬工業（株）製）０．３ｇを、同様に亜硝酸塩濃度１００ｐｐｍ下および食塩濃度１０％下に調整した５０００ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に添加して実験した（比較例２）。
【００３９】
【表５】
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【００４０】
１：２０％未満、  ２：２０以上４０未満、  ３：４０以上６０未満、  ４：６０以上８０未満、  ５：８０以上
【００４１】
シメジ由来抽出物を使用すると、パパイン酵素に比べて全ての処理時間において、相対活性が上回っていた。処理２時間目では、シメジ由来抽出物粉末が約７０％の活性を維持していたのに対し、パパイン酵素では５０％ほどしか活性を維持できていなかった。したがって、本発明の担子菌門ハラタケ目キシメジ科に属するキノコ由来のタンパク質分解酵素活性を有する抽出物はパパイン酵素より振とう性、回転性の物理的衝撃にも優位な耐性を持っており、循環式ピックルインジェクターへの使用適性が優れていることがわかる。
【００４２】
実施例３及び比較例３〜６
冷水（１０℃以下）中に亜硝酸Ｎａを１００ｐｐｍ、食塩１０質量％になるように各々を添加し、溶解させて塩漬液を作製した。作製した塩漬液１０００ｍｌに参考例２で製造したシメジ由来物粉末を１０ｇ添加させて、シメジ由来抽出物を含む塩漬液を作製した。得られた塩漬液１０００ｍｌに市販の牛モモ肉（日本産ホルスタイン種経産牛）２００ｇを冷蔵庫中（５℃）で２４時間浸漬させた後、１ｃｍ幅にスライスカットを行ってから、フライパンで両面を焼成して牛モモ肉のステーキを作った。官能試験を行い、食感と食味そして発色の色合いについて評価した。結果を表６に示す。
食感は、非処理の場合に比べて軟らかくなっているか否かについて「軟らかすぎる」を□、「軟らかい」を◎、「やや軟らかい」を○、「やや硬い」を△、「硬い」を×で表した。
食味は、非処理の場合に比べて向上しているか否かについて「良好」を◎、「やや良好」を○、「やや後味が悪い」を△、「後味が悪い」を×で表した。
発色は、「色合いが良好」を◎、「やや色合いが良好」を○、「やや色合いが悪い」を△、「色合いが悪い」を×で表した。
【００４３】
なお、比較のための実験も、表６の組成にて同様の試験をおこなった。パパイン酵素はパパイン製剤（和光純薬工業（株）製）を使用した。また、マイタ由来抽出物粉末を以下の方法で製造した。
（Ｂ）マイタケ由来抽出物粉末の製造（比較例６）
市販のマイタケ（雪国まいたけ（株）製）の可食部を適度な大きさに切断した後、５０ｍＭの緩衝液（ｐＨ６．０）をマイタケと等量加え、家庭用ミキサーを用いて３分間ホモジナイズした。次に遠心分離機（株式会社コクサン：Ｈ−２０００Ｂ）を用いて５０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清液をプレフィルタレーションした後に、除菌フィルター（３０インチ円筒型カートリッジタイプ  孔径０．４５〜０．８μｍキュノ（株）製  ビバシュアＩＩ：商標）で処理したものをマイタケの水溶性成分とした。この水溶性成分にデキストリン（松谷化学工業（株）製、パインデックス：商標）を５０質量％添加した後、−２０℃にて凍結乾燥を２日間行い、マイタケ由来抽出物粉末を作製した。マイタケ由来抽出物粉末のタンパク質分解活性は、２０５単位／ｇであった。
【００４４】
亜硝酸Ｎａを１００ｐｐｍ、食塩１０％条件下において、シメジ水溶液は、濃度に関係なく、食感、食味そして発色ともに良好であった。一方、パパイン水溶液は、発色に色合いについては、問題なかったが、濃度が低い場合、亜硝酸Ｎａを１００ｐｐｍ、食塩１０％条件下では、活性が阻害されるため、十分な効果を発揮できず、食感は硬かった。一方、濃度が高いと、過度に軟化され、さらに酵素臭により風味が悪くなった。マイタケ水溶液は、濃度に比例して非常に過度に軟化してしまい、マイタケ特有の風味により、食味にかなり影響した。さらに黒褐色の色素によって、発色の色合いを阻害してしまう傾向があった。
【００４５】
【表６】
2008161104.tif 000007
【００４６】
実施例４及び比較例７〜９
表７に示す組成でソーセージを製造した。
卵白粉末（乾燥卵白、キューピー（株）製）、大豆タンパク（フジプロＲ、（株）不二製油製）、乳清タンパク（ラクプロダン８０）、カゼインナトリウム（インスタンラックＳ、中央商工（株）製）を用いた。パパイン製剤（和光純薬（株）製）、デキストリン（パインデックス♯２、松谷化学工業（株）製）を用いた。
試料の調整は、常法にてチョッピングし、豚モモ肉をサイレントカッターで細切りにした挽肉に各々残りの原料を混合、脱気した後、２４時間、５℃にて塩漬した。塩漬した原料を羊腸に充填し、７０℃の湯浴にて３０分間保持し、２０℃の水槽にて１時間冷却し、ソーセージを得た。次に、製造されたソーセージの食感、食味、発色の色合いについて  実施例３と同様に評価した。
【００４７】
【表７】
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【００４８】
実施例５及び比較例１０〜１２
表８に示す組成でロースハムのピックル液を製造した。
卵白粉末、大豆タンパク、カゼインＮａ、デキストリンは、実施例４と同様のものを用いた。以下に説明する方法でピックル液を調整した。ミキサーを備えたチャンバーに、５℃に冷却した水を入れ、原料を溶解した。
豚ロース肉にインジェクターを用いて作製ピックル液を注入し、１２時間のタンブリングを行い、塩漬を５℃にて３６時間行い、常法通り充填した後、中心温度が７３±１℃になるまで加熱した後、冷却し、ロースハムを得た。比較のため、対象品も同様に調整した。次に、製造されたロースハムの食感、食味、発色の色合いについて実施例３と同様に評価した。
【００４９】
【表８】
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【００５０】
実施例の結果より、本発明の食肉加工用塩漬液は、ハム、ソーセージなど塩漬工程を有する畜肉加工食品において、畜肉加工食品の食感、食味、色を良好に改良できることがわかった。