(57)【要約】【課題】  膜に保持された試料に一次線として電子線等の荷電粒子線を、該膜を介して試料に照射し、これによって試料検査を行う際に、該膜に保持された試料に刺激を与えることのできる試料検査装置、試料検査方法、及び試料検査システムを提供する。【解決手段】  本発明における試料検査装置は、膜３２を介して試料２０に一次線７を照射する一次線照射手段１と、一次線７の照射に応じて試料２０から発生する二次的信号を検出する信号検出手段４とを備え、２０試料に接近又は接触可能な先端部を具備するマニピュレータ２６と、試料２０の光学像を取得する光学像取得手段２７と、一次線照射手段１、信号検出手段４、マニピュレータ２６及び光学像取得手段２７の各動作を制御する制御手段２８とを有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜を介して試料に一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射に応じて該試料から発生する二次的信号を検出する信号検出手段とを備える試料検査装置において、該試料に接近又は接触可能な先端部を具備するマニピュレータと、該試料の光学像を取得する光学像取得手段と、該一次線照射手段、該信号検出手段、該マニピュレータ及び該光学像取得手段の各動作を制御する制御手段とを有することを特徴とする試料検査装置。
【請求項２】
第１の面に試料が保持される膜と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する真空室と、該真空室に接続され、該膜を介して該試料に一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射に応じて該試料から発生する二次的信号を検出する信号検出手段とを備える試料検査装置において、該試料に接近又は接触可能な先端部を具備するマニピュレータと、該試料の光学像を取得する光学像取得手段と、該一次線照射手段、該信号検出手段、該マニピュレータ及び該光学像取得手段の各動作を制御する制御手段とを有することを特徴とする試料検査装置。
【請求項３】
前記膜の第１の面が該膜の上面となっており、前記膜の第２の面が該膜の下面となっていることを特徴とする請求項２記載の試料検査装置。
【請求項４】
前記真空室内において、前記膜と前記一次線照射手段との間の空間を仕切る開閉バルブをさらに有することを特徴とする請求項２又は３記載の試料検査装置。
【請求項５】
前記一次線照射手段と前記光学像取得手段とが、前記膜を間に介して対向配置されていることを特徴とする請求項１乃至４何れか記載の試料検査装置。
【請求項６】
前記制御手段が、前記マニピュレータの先端部の位置情報に基づいて前記一次線照射手段からの一次線の照射領域を決定し、これにより該マニピュレータの先端部近傍に位置する該試料の部分に該一次線が照射されることを特徴とする請求項１乃至５何れか記載の試料検査装置。
【請求項７】
前記制御手段が、前記光学像取得手段により取得された光学像を基に前記マニピュレータの先端部の位置情報を求めるとともに、該位置情報に基づいて前記一次線照射手段からの一次線の照射領域を決定し、これにより該マニピュレータの先端部近傍に位置する該試料の部分に該一次線が照射されることを特徴とする請求項１乃至５何れか記載の試料検査装置。
【請求項８】
前記制御手段が、前記光学像取得手段の視野に基づいて前記一次線照射手段からの一次線の照射領域を決定し、これにより該視野に対応した領域に該一次線が照射されることを特徴とする請求項１乃至５何れか記載の試料検査装置。
【請求項９】
前記一次線照射手段の光軸と前記光学像取得手段の光軸とが５０μｍ以下の範囲内で一致している、若しくは該一次線照射手段による一次線の照射領域の中心と該光学像取得手段により得られる光学像の中心とが５０μｍ以下の範囲内で一致していることを特徴とする請求項１乃至８何れか記載の試料検査装置。
【請求項１０】
前記膜を移動するための膜移動手段をさらに有することを特徴とする請求項１乃至９何れか記載の試料検査装置。
【請求項１１】
前記マニピュレータにより、前記試料に対する接触動作又は吸引動作、前記試料への液体の供給又は排出、若しくは前記試料への電気供給のうちの少なくとも一つを行うことを特徴とする請求項１乃至１０何れか記載の試料検査装置。
【請求項１２】
前記膜は、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、カーボン、酸化シリコン、窒化シリコン、若しくは窒化ボロンのうちの少なくとも一つを含み、その膜厚が１０〜１０００ｎｍの範囲にあることを特徴とする請求項１乃至１１何れか記載の試料検査装置。
【請求項１３】
前記一次線は電子線又はイオンビームであり、前記二次的信号は、反射電子、二次電子、吸収電流、カソードルミネッセンス光、若しくはＸ線のうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１乃至１２何れか記載の試料検査装置。
【請求項１４】
前記一次線の照射領域は、２００μｍ四方（２００μｍ×２００μｍ）以下であることを特徴とする請求項１乃至１２何れか記載の試料検査装置。
【請求項１５】
前記マニピュレータを介して前記試料の吸収電流を検出することを特徴とする請求項１３又は１４記載の試料検査装置。
【請求項１６】
前記試料には生体を構成する要素である抗原が含まれており、該抗原には、金属若しくは蛍光物質が標識された抗体が結合されていることを特徴とする請求項１乃至１５何れか記載の試料検査装置。
【請求項１７】
請求項１乃至１６何れか記載の試料検査装置を用いて試料の検査を行うことを特徴とする試料検査方法。
【請求項１８】
一次線照射手段から膜を介して試料に一次線を照射して、これに基づく該試料の情報（第１の情報）を取得し、該試料に物理的又は電気的若しくは化学的作用を加え、該作用が加えられた後の該試料に該膜を介して該一次線を照射し、これに基づく該試料の情報（第２の情報）を取得し、これら第１の情報及び第２の情報の対比を行うことを特徴とする試料検査方法。
【請求項１９】
マニピュレータを用いて前記試料に物理的又は電気的若しくは化学的作用を加えることを特徴とする請求項１８記載の試料検査方法。
【請求項２０】
前記試料に物理的又は電気的若しくは化学的作用を加えるときには、該膜と該一次線照射手段との間の空間を開閉バルブにより仕切ることを特徴とする請求項１８又は１９記載の試料検査方法。
【請求項２１】
前記一次線は電子線又はイオンビームであり、前記二次的信号は、反射電子、二次電子、吸収電流、カソードルミネッセンス光、若しくはＸ線のうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１７乃至２０何れか記載の試料検査方法。
【請求項２２】
前記試料には生体を構成する要素である抗原が含まれており、該抗原には、金属若しくは蛍光物質が標識された抗体が結合されていることを特徴とする請求項１７乃至２１何れか記載の試料検査方法。
【請求項２３】
請求項１乃至１６何れか記載の試料検査装置を備え、該試料検査装置により検出された前記試料からの二次的信号に基づく情報から、該試料についての判定を行う情報処理手段を有することを特徴とする試料検査システム。
【請求項２４】
前記マニピュレータを用いて前記試料に物理的又は電気的若しくは化学的作用を加え、該作用が加えられた後の該試料の情報を基に、該試料についての判定を行うことを特徴とする請求項２３記載の試料検査システム。
【請求項２５】
前記マニピュレータを用いて前記試料に物理的又は電気的若しくは化学的作用を加える前後における該試料の各情報の対比を基に、該試料についての判定を行うことを特徴とする請求項２３記載の試料検査システム。
【請求項２６】
前記試料には生物の一部が含まれており、前記マニピュレータにより化学物質を該試料に供給し、該化学物質が供給された後の該試料の情報を基に、該化学物質の該生物への有効性を判定することを特徴とする請求項２３乃至２５何れか記載の試料検査システム。
【請求項２７】
前記試料には生物の一部が含まれており、該生物の病気についての判定を行うことを特徴とする請求項２３乃至２５何れか記載の試料検査システム。
【請求項２８】
前記試料の情報は、該試料の画像データであることを特徴とする請求項２３乃至２７何れか記載の試料検査システム。
【請求項２９】
請求項１乃至１６何れか記載の試料検査装置を用いて前記試料からの二次的信号を検出し、該二次的信号に基づく試料の情報から該試料についての判定を行うことを特徴とする試料検査方法。
【請求項３０】
前記マニピュレータを用いて前記試料に物理的又は電気的若しくは化学的作用を加え、該作用が加えられた後の該試料の情報を基に、該試料についての判定を行うことを特徴とする請求項２９記載の試料検査方法。
【請求項３１】
前記マニピュレータを用いて前記試料に物理的又は電気的若しくは化学的作用を加える前後における該試料の各情報の対比を基に、該試料についての判定を行うことを特徴とする請求項２９記載の試料検査方法。
【請求項３２】
前記試料には生物の一部が含まれており、前記マニピュレータにより化学物質を該試料に供給し、該化学物質が供給された後の該試料の情報を基に、該化学物質の該生物への有効性を判定することを特徴とする請求項２９乃至３１何れか記載の試料検査方法。
【請求項３３】
前記試料には生物の一部が含まれており、該生物の病気についての判定を行うことを特徴とする請求項２９乃至３１何れか記載の試料検査方法。
【請求項３４】
前記試料の情報は、該試料の画像データであることを特徴とする請求項２９乃至３３何れか記載の試料検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、膜に保持された試料に荷電粒子線等の一次線を照射して、当該試料の検査を行うことのできる試料検査装置、試料検査方法、及び試料検査システムに関する。特に、試料が生体細胞であり、その細胞に刺激を与えた際の反応の観察及び検査に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命科学や、製薬分野では、細胞に刺激（電気、化学物質、薬等）を与え、その反応を観察することが重要となっている。従来、このような観察には光学顕微鏡が用いられていたが、観察すべき重要な箇所は光学顕微鏡では観察不可能な０．１μｍ以下の微小領域であることも多い。
【０００３】
例えば、細胞間の情報伝達物質のやり取りが正常に行えなくなることに起因する病気に高血圧症、尿崩症、不整脈、筋肉疾患、糖尿病、うつ病等がある。この細胞間の物質のやり取りは細胞膜にある１０ｎｍ程度の大きさの膜蛋白分子（リセプターやイオンチャンネル等）により行われる。このような膜蛋白分子は、光学顕微鏡では観察困難である為、分解能の高い走査型電子顕微鏡（以下、「ＳＥＭ」という）を用いた観察が望まれていた。
しかし、ＳＥＭの構成を備える検査装置において、検査対象となる試料は、通常、真空引きにより減圧された試料室内に配置される。そして、このように減圧雰囲気とされた試料室内に配置された試料に電子線（荷電粒子線）が照射され、当該照射により試料から発生する二次電子や反射電子（後方散乱電子）等の二次的信号が検出される。
【０００４】
このようなＳＥＭによる試料検査では、試料が減圧雰囲気に晒されることとなる。よって、試料から水分が蒸発して細胞が死んでしまい、刺激に対する反応を観察することは不可能であった。
【０００５】
従って、試料に水分が含まれた状態で検査を行う際には、試料から水分が蒸発しないように、試料を減圧雰囲気に晒されることがないようにする必要がある。このように試料が減圧雰囲気に晒されることなくＳＥＭを用いて検査を行う例の一つとして、膜により開口（アパーチャ）が密封された試料容器（サンプルチャンバ）の内部に試料を配置し、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内に、この試料容器を設置する手法が考えられている。
【０００６】
ここで、試料が配置される試料容器の内部は減圧されない。そして、試料容器に形成された当該開口を覆う膜は、ＳＥＭの試料室内の減圧雰囲気と試料容器内部の減圧されていない雰囲気（例えば、大気圧雰囲気）との間の圧力差に耐えられるとともに、電子線が透過するものとなっている（特許文献１参照）。
【０００７】
試料検査を行う際には、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内に配置された試料容器の当該膜を介して、試料容器の外部から試料容器内の試料に電子線が照射される。電子線が照射された試料からは反射電子が発生し、この反射電子は試料容器の当該膜を通過して、ＳＥＭの試料室内に設けられた反射電子検出器によって検出される。これにより、ＳＥＭによる像（ＳＥＭ像）が取得されることとなる。しかしながら、この発明では試料は閉じた空間内に封入させるので、マニピュレータを用いて細胞に刺激を与えることは不可能であった。
【０００８】
なお、このように真空と大気圧との圧力差に耐えられる膜を介して試料に電子線を照射し、試料から発生する反射電子を検出してＳＥＭ像を取得する例は、非特許文献１（当該文献のChapter1 Introduction）にも記載されている。
【０００９】
また、このような膜を対向して設置して一対の膜を構成し、該一対の膜の間に試料を配置して透過型電子顕微鏡による像を取得する例は、特許文献２及び特許文献３に記載されている。特に、特許文献２には、このような一対の膜を利用して、その間に配置された試料のＳＥＭ像を取得する場合についても述べられている。
【００１０】
【特許文献１】特表２００４−５１５０４９号公報
【特許文献２】特開昭４７−２４９６１号公報
【特許文献３】特開平６−３１８４４５号公報
【非特許文献１】「Atmospheric scanning electron microscopy」 Green、 Evan Drake Harriman、 Ph.D.、 Stanford University、 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
マニピュレータを用いて細胞に刺激を与えた後の細胞の反応に基づいて生ずる構造変化は、細胞内の微小領域で生じる為、光学顕微鏡では観察不可能でＳＥＭによる観察が必須となる。液体を保持したまま細胞をＳＥＭで観察する為には、試料（細胞）を試料容器に封入し、試料容器に形成された膜を介して電子線を試料に照射することで像を得ていた。しかし、試料容器は閉じた空間である為、刺激を与える為のマニピュレータを用いることが不可能であった。
【００１２】
本発明は、このような点に鑑みてなされたものであり、膜に保持された試料に一次線として電子線等の荷電粒子線を、該膜を介して試料に照射し、これによって試料検査を行う際に、該膜に保持された試料に刺激を与えることのできる試料検査装置、試料検査方法、及び試料検査システムを提供することを目的とする。
【００１３】
また、試料（細胞）にマニピュレータで刺激を与えた際、変化の生ずる部位は刺激を与えた部分近傍が主となる。その領域をすばやくＳＥＭ像の視野に入れることも細胞への放射線ダメージ低減や使い易さの点から重要であり、本発明での課題となる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明に基づく第１の試料検査装置は、膜を介して試料に一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射に応じて該試料から発生する二次的信号を検出する信号検出手段とを備える試料検査装置において、該試料に接近又は接触可能な先端部を具備するマニピュレータと、該試料の光学像を取得する光学像取得手段と、該一次線照射手段、該信号検出手段、該マニピュレータ及び該光学像取得手段の各動作を制御する制御手段とを有することを特徴とする。
【００１５】
本発明に基づく第２の試料検査装置は、第１の面に試料が保持される膜と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する真空室と、該真空室に接続され、該膜を介して該試料に一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射に応じて該試料から発生する二次的信号を検出する信号検出手段とを備える試料検査装置において、該試料に接近又は接触可能な先端部を具備するマニピュレータと、該試料の光学像を取得する光学像取得手段と、該一次線照射手段、該信号検出手段、該マニピュレータ及び該光学像取得手段の各動作を制御する制御手段とを有することを特徴とする。
【００１６】
本発明に基づく第１の試料検査方法は、前記何れか記載の試料検査装置を用いて試料の検査を行うことを特徴とする。
【００１７】
本発明に基づく第２の試料検査方法は、一次線照射手段から膜を介して試料に一次線を照射して、これに基づく該試料の情報（第１の情報）を取得し、該試料に物理的又は電気的若しくは化学的作用を加え、該作用が加えられた後の該試料に該膜を介して該一次線を照射し、これに基づく該試料の情報（第２の情報）を取得し、これら第１の情報及び第２の情報の対比を行うことを特徴とする。
【００１８】
本発明に基づく第３の試料検査方法は、前記何れか記載の試料検査装置を用いて前記試料からの二次的信号を検出し、該二次的信号に基づく試料の情報から該試料についての判定を行うことを特徴とする。
【００１９】
本発明に基づく試料検査システムは、前記何れか記載の試料検査装置を備え、該試料検査装置により検出された前記試料からの二次的信号に基づく情報から、該試料についての判定を行う情報処理手段を有することを特徴とする。
【００２０】
本発明において、膜の第１の面側に、試料の観察やマニピュレータの位置確認の為の光学像取得手段を配置すると、装置の操作が便利である。
【００２１】
また、試料や膜の一次線に対するダメージを防止する為、一次線の照射量を極力低減させることが必要となる。その為に、マニピュレータの位置情報や光学像取得手段の視野の位置情報を取得し、該位置情報を基に一次線の照射領域を設定するとよい。
【００２２】
さらにマニピュレータが膜を破壊した場合の装置内汚染を防止する為、該膜と該一次線照射手段との間の空間を仕切るための開閉バルブを設け、マニピュレータが膜に接した場合、もしくは接する直前に該バルブを閉じるようにするとよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明においては、膜を介して試料に一次線を照射し、一次線の照射に応じて試料から発生する二次的信号を検出できるとともに、マニピュレータによる試料へのマニピュレーション動作並びに試料の光学像の取得をすることができる。
【００２４】
このとき、試料を常圧雰囲気（大気圧雰囲気）に配置することにより、試料を取り囲む液体を蒸発させること無くＳＥＭ観察ができ、かつ、マニピュレータを用いて試料への刺激を行い、その反応も観察することが可能になる。
【００２５】
また、マニピュレータの位置情報を用いて、マニピュレータにより試料に刺激を与えた周囲に一次線の照射範囲を限定することで、膜や試料への一次線の照射量も最小にすることができ、膜や試料への一次線によるダメージを低減できる。
【００２６】
さらに、膜と一次線照射手段との間の空間を仕切るための開閉バルブを設けることにより、マニピュレータにより膜が破壊された場合でも装置内汚染を防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、図面を参照して、本発明における実施の形態について説明する。
【実施例１】
【００２８】
図１は、本発明における検査装置の第１実施例を示す概略構成図である。この図において、一次線照射手段である鏡筒１には、電子銃（電子源）２が配置されている。電子銃２から加速された状態で放出された一次線としての電子線（荷電粒子線）７は、集束レンズ（対物レンズ）３により集束される。
【００２９】
これにより集束された電子線７は、試料保持体１８を構成する試料保持膜３２に保持された試料２０に、該試料保持膜３２を介して照射される。このとき、電子線７は図示しない偏向手段により偏向され、これにより電子線７は当該試料２０を走査する。なお、鏡筒１の先端側は真空室１１に接続されている。また、電子銃２が設けられた鏡筒１の基端側は真空室１１の下方に位置している。試料保持膜３２の上面（第１の面）には試料２０が配置（保持）され、また、試料保持膜３２の下面（第２の面）に接する雰囲気は真空室１１により減圧される。
【００３０】
電子銃２から放出された電子線７は、鏡筒１内を上方向に進み、鏡筒１の先端に設けられた開口１ａを介して真空室１１内の空間、及び試料保持膜３２を通過後、試料２０に到達する。このように、この鏡筒１は、一次線照射手段を構成し、本実施例では倒立型鏡筒となっている。真空室１１内であって鏡筒１の先端側には、反射電子検出器（信号検出手段）４が設けられている。反射電子検出器４は、例えばPN接合を利用した半導体型検出器やYAG結晶を用いたシンチレータ型検出器が用いられる。
【００３１】
鏡筒１内は排気手段８により真空引きされて、所定の圧力（例えば、１０−４〜１０−５Ｐａ）まで減圧される。また、真空室１１内は、図示しない排気手段により真空引きされ、これにより所定の圧力（例えば、１０−３〜１０−４Ｐａ）まで減圧される。ここで、真空室１１は、除振装置１３を介して、架台１０に載置されている。
【００３２】
真空室１１の上部には、試料保持体載置部１２が設けられている。試料保持体載置部１２には、電子線７が通過するための孔１２ａが形成されている。この試料保持体載置部１２には、Ｏリング（図示せず）を介して、試料保持体１８が載置されている。これにより、試料保持体１８は真空室１１に着脱自在に支持される。また、０．５ｍｍ程度であれば真空室１１が真空の状態であっても水平方向に移動も可能であり、光学顕微鏡像やＳＥＭ像に対して試料の位置調整を行うことが出来る。
【００３３】
真空室１１の上側部分には、開閉バルブ１４が設置されている。この開閉バルブ１４は、真空室１１内において、試料保持体１８の試料保持膜３２と鏡筒（一次線照射手段）１の先端部との間の空間１９を仕切るためのものである。図１は、開閉バルブ１４が開かれた状態である。開閉バルブ１４を閉じると、図２のように真空室１１内の当該空間１９が仕切られることとなる。
【００３４】
このように開閉バルブ１４により仕切られた当該空間１９が仕切られることにより、開閉バルブ１４と試料保持膜３２との間において密閉された空間部１９ａが形成される。この空間部１９ａは、開閉バルブ１４を境として試料保持体１８側に位置する空間となる。
【００３５】
当該空間部１９ａに連通して排気手段（減圧手段）９が設けられている。この排気手段９は、当該空間部１９ａを個別に排気できる。また、当該空間部１９ａには、図示しないガス供給手段が接続されている。このガス供給手段は、窒素やエアー等のガスを当該空間部１９ａに供給し、この空間部１９ａ内を減圧状態から常圧（大気圧）状態に復帰させる。これにより、当該空間部１９ａは、独立して減圧状態からの常圧復帰が可能となる。
【００３６】
さらに、当該空間部１９ａには、図示しない洗浄手段が接続されている。この洗浄手段は、当該空間部１９ａ内に洗浄剤を供給し、当該空間部１９ａを洗浄する。これにより、当該空間部１９ａを構成する壁面は洗浄される。
【００３７】
このとき使用される洗浄剤としては、洗剤、エタノール、アルコール、アセトン、過酸化水素水の少なくとも一つからなる洗浄液、又はこれらの物質の蒸気を使用できる。当該空間部１９ａに供給された洗浄剤は、この空間部１９ａの洗浄を実施後、排出管１５により該空間部１９ａから排出される。排出管１５には、開閉弁１６が設けられている。この開閉弁１６が開放されることにより、洗浄剤は排出管１５を介して外部に排出される。なお、後述する試料の検査を実行する際には、開閉弁１６は閉じられる。
【００３８】
また、上記洗浄剤を用いずに、当該空間部１９ａに紫外光を照射することにより、当該空間部１９ａの殺菌を行うこともできる。
【００３９】
試料保持体１８は、図３（Ｂ）のように試料保持膜３２を備えている。この試料保持膜３２の第１の面３２ａ（図３（Ｂ）では下面、図１では上面）は露出されている。この試料保持膜３２の第１の面３２ａには、液体を含んだ試料２０が供給される。第一の面３２ａは大気圧下（大気圧雰囲気）にあるので水分の蒸発を極力抑えることができる。また、試料保持体１８は、試料保持膜３２の第２の面３２ｂ（図３（Ｂ）では上面、図１では下面）に設けられた本体部３４を備えている。
【００４０】
本体部３４の中央には開口３４ａが形成されており、試料保持膜３２における第２の面３２ｂの中央部は該開口３４ａを介して真空室１１の内部雰囲気に露出されている。また、試料保持膜３２は、第一の面３２ａが大気圧雰囲気に、第二の面３２ｂが真空雰囲気に晒されることとなるので、この圧力差に絶える為に、必要に応じて格子３５で補強されている。
【００４１】
次に、試料保持体１８の作成方法について説明する。
【００４２】
まず、図３（Ａ）に示すように、シリコン層３３と、該シリコン層３３の一方の面（同図では下面）に設けられた窒化シリコン膜３６とを有する基板を用意する。このとき窒化シリコン膜３６の第１の面（同図では下面）は露出されており、窒化シリコン膜３６の第２の面はシリコン層３３に覆われている。シリコン層３３は、試料保持体１８の本体部３４を構成することとなる。また、窒化シリコン膜３６は、試料保持体１８の試料保持膜３２を構成することとなる。
【００４３】
次いで、図３（Ａ）におけるシリコン層３３の他方の面（上面）の中央部３３ａを選択的にエッチングする。これにより、シリコン層３３の中央部３３ａには、図３（Ｂ）に示すように、開口３４ａが形成される。これにより、窒化シリコン膜３６における第２の面の一部が該開口３４ａにより露出される。このとき、該開口３４ａ内において、窒化シリコン膜３６の補強のため、複数のシリコンの柱３５を残しておく。窒化シリコン膜３６が十分な強度を持つ場合、当該柱３５は必要ない。
【００４４】
該開口３４ａ内で、当該柱３５が設けられていない部分では、窒化シリコン膜３６の第２の面が露出されている。窒化シリコン膜３６は試料保持体１８の試料保持膜３２を構成し、シリコン窒化膜３６の第２の面は試料保持膜３２の第２の面３２ｂに対応する。これにより、試料保持体１８が作成される。
【００４５】
このようにして作成された試料保持体１８は、図３（Ｂ）の状態から上下反転され、試料保持膜３２である窒化シリコン膜３６の第１の面を上面とする。この窒化シリコン膜３６の上面である第１の面は、試料保持体１８における試料保持面３２の第１の面３２ａとなる。なお、第２の面３２ｂを上面にすることも可能である。
【００４６】
ここで、窒化シリコン膜３６の厚みは、１０〜１０００ｎｍの範囲に設定される。なお、試料保持体１８の試料保持膜３２として用いられる膜としては、窒化シリコン膜の他に、酸化シリコン、窒化ボロン、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、若しくはカーボンからなる膜を用いても良い。これらの膜を用いた場合でも、その膜厚は１０〜１０００ｎｍに設定される。上述した素材からなる試料保持膜３２は、電子線７が透過するが気体や液体は透過しないものとなる。さらに、膜の両面で少なくとも一気圧の圧力差に耐えうると使い勝手が向上する。
【００４７】
なお、このような試料保持膜３２は、その厚さが薄ければ電子線７の散乱が少なくなるので分解能が向上するが破損しやすくなり、また、その厚さが厚くなれば電子線７の散乱が増加して分解能が低下するが破損しにくくなる。好適な膜厚としては、上記の各素材について２０〜２００ｎｍとなる。
【００４８】
次に、図１に戻って、検査装置の構成をさらに説明する。反射電子検出器４により検出された検出信号は、真空室１１の外部に配置された画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データは、ＳＥＭ画像に対応する画像データとなる。
【００４９】
当該画像データは、表示装置２３に送られる。表示装置２３は、送られた画像データに基づく画像を表示する。表示された画像は、ＳＥＭ画像となる。
【００５０】
また、画像形成装置２２により形成された画像データは、必要に応じてコンピュータ２５に送られる。コンピュータ２５は、画像処理を当該画像データに対して施すとともに、当該画像処理の結果に基づく判定を実行する。
【００５１】
ここで、鏡筒１及び真空室１１を備える電子線装置部２９（試料保持体１８より下に位置する構成部であって、真空室１１、鏡筒１及び反射電子検出器４を含む）は電子線制御部２４により制御される。
【００５２】
試料保持体載置部１２には、試料２０に刺激（電圧、化学物質、薬等による物理的又は電気的若しくは化学的作用）を与えるとともに、必要に応じて試料２０を移動させるためのマニピュレータ２６と、試料２０の観察やマニピュレータ２６の先端部の位置を確認する光学顕微鏡２７（光学像取得手段）が載置されている。これらは制御部（制御手段）２８で制御されている。ここで、マニピュレータ２６は、試料２０に接近又は接触可能な先端部を具備しており、当該先端部を介して、試料２０に刺激として上記作用が加えられることとなる。また、鏡筒１と光学顕微鏡２７とは、試料保持膜３２を間に介して対向配置されている。
【００５３】
本発明における試料検査装置は、電子線装置部２９、マニピュレータ２６、光学顕微鏡２７、電子線制御部２４、制御部２８、画像形成装置２２、及び表示装置２３を備えており、各部とコンピュータ２５が接続され、各部の情報がやり取りされることにより、本発明における試料検査システムが構成される。そして、これにより制御部２８は、鏡筒１、反射電子検出器４、マニピュレータ２６及び光学顕微鏡２７の各動作を制御することができる。
【００５４】
本装置では、試料２０にマニピュレータ２６の先端部により刺激を与える前後での試料２０の反応を、電子線装置部２９によりＳＥＭ像として取得することができる。該試料２０が反応する位置はマニピュレータ２６の先端部の近傍となり、該位置の近傍を電子線装置部２９により観察することが必要となる。
【００５５】
ここで、マニピュレータ２６の先端部は試料保持膜３２から離間しており、試料保持膜３２を通過（透過）した電子線７は徐々に減衰して当該先端部まで到達するのが困難であり、また、たとえ到達しても当該先端部から発生する反射電子が試料保持膜３２を通過することは困難であるため、ＳＥＭ像ではその位置を確認することが出来ない。
【００５６】
そこで、マニピュレータ２６の先端部により試料２０に刺激を与えた位置の情報は、該マニピュレータ２６の先端部の位置情報に対応し、マニピュレータ２６の移動制御情報や光学顕微鏡２７により得られた光学像に基づいて取得できる。その位置情報は、制御部２８を介して電子線制御部２４に入力され、該位置を含む領域のみを照射領域として、該領域に電子線７を走査させることが可能になっている。また、光学顕微鏡２７の視野の位置情報は、制御部２８を介して電子線制御部２４に入力され、該視野の一部もしくは全てを含む領域を照射領域として、該領域に電子線７を走査させることが可能になっている。これらにより、ＳＥＭで観察したい領域を探す手間が省け、試料２０への電子線７照射量を最低限にすることができ、試料２０の電子線によるダメージを軽減することができる。
【００５７】
次に、本発明における試料検査方法について図１及び図２を用いて説明する。
【００５８】
試料保持膜３２の第一の面３２ａにフィブロネクチンやコラーゲン等の細胞接着分子を吸着させ、試料２０として神経等の細胞を試料保持膜３２の第一の面３２ａに吸着（培養）させた。細胞接着分子は細胞を試料保持膜３２の第一の面３２ａに近接させるための接着剤の役割を果たす。その後、試料保持体載置部１２に試料保持体１８を載置した。このとき、開閉バルブ１４は閉じられており、図２の状態になっている。この開閉バルブ１４と試料保持膜３２との間において密閉された空間部１９ａは、常圧である大気圧雰囲気となっている。また、真空室１１内において、開閉バルブ１４の下側に位置する空間は所定の真空状態（減圧状態）となっている。さらに、当該空間に連通する鏡筒１内は、真空排気手段８により排気されて減圧され、所定の真空状態となっている。
【００５９】
この状態で、排気手段９を用いて上記空間部１９ａを減圧して真空にした。真空にする際、大気圧状態からの急激な圧力変化による試料保持膜３２の破損を防ぐ為、図示しないニードルバルブ等を用いて１秒〜１００秒の間の時間かけて、大気圧である１気圧（１０１３２５Ｐａ）から１／２気圧〜１／１０気圧程度の圧力（５０ｋＰａ〜１０ｋＰａ）にまで減圧した。この工程で、試料保持体１８の試料保持膜３２が破壊されないことの確認を行う。
【００６０】
上記工程により試料保持膜３２の破壊がないことの確認をした後、光学顕微鏡２７で神経細胞とマニピュレータ２６の位置を確認した。マニピュレータ２６の先端部には微小電極と微小管が設置してあり、微小電極により電圧の印加が、微小管により液体の流出（供給）及流入（排出）が可能になっている。また、マニピュレータ２６の移動により、当該先端部は、試料２０である神経細胞に対して接近又は接触が可能となっている。
【００６１】
光学顕微鏡２７で光を試料２０に照射して観察しながら神経細胞とガラス微小電極が近接するようにマニピュレータ２６を移動させた。その後、マニピュレータ２６の先端部の微小管に負の圧力を掛けて細胞膜と密着させた。これにより、電位応答が測定可能になった。
【００６２】
以上のようなマニピュレータ２６の移動の際、誤ってマニピュレータ２６により試料保持膜３２を破損させることがあっても、開閉バルブ１４が閉まっているので、試料２０の拡散による汚染は当該空間部１９ａ内のみで済む。万が一にも試料保持膜３２が破壊されて、当該空間部１９ａ内が試料２０の拡散により汚染された場合、上述したように、当該空間部１９ａの洗浄は実施可能である。そして、洗浄で用いた洗浄剤である液体又は蒸気は、開閉弁１６を開けることにより、排出管１５を介して排出及び廃棄可能である。なお、当該空間部１９ａを構成する壁面を、窒化ボロンもしくは、フッ素樹脂でコーティング（被膜）することにより、汚染されにくくすることができる。
【００６３】
当該空間部１９ａが減圧（真空）状態において、試料２０が載置された試料保持膜３２が破壊されないことを確認した後、開閉バルブ１４を開けた。これにより、真空室１１内の空間の仕切りが解除され、真空室１１内の下側の空間と当該空間部１９ａとが連通される。その後、光が試料保持膜３２を介して反射電子検出器４に入射しないようにする為に、光学顕微鏡の光の照射を止め、図示しない遮蔽手段により他の外光の遮蔽を行った。この遮蔽は、試料保持体１８や試料２０に電子線７が照射した際に発生する放射線防護の役目も果たしている。
【００６４】
次に、図１のように鏡筒１から電子線７を試料２０に向けて照射して撮像を行った。電子線７は試料保持体１８の試料保持膜３２を透過して試料２０に照射され、当該照射に基づいて試料２０から発生する反射電子（後方散乱電子）は反射電子検出器４で検出される。反射電子検出器４からの検出信号は、画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データに基づいて、表示装置２３が画像（ＳＥＭ画像）を表示する。このときの画像データは、マニピュレータ２６により試料２０に印加される後述の刺激を加える前における第１の情報として取得されて、コンピュータ２５の記憶領域に記憶される。
【００６５】
このとき、マニピュレータ２６により試料（神経細胞）２０に刺激を与えることとなる位置の情報は、マニピュレータ２６の移動情報等に基づいて求められ、制御部２８を介して電子線制御部２４に入力されている。したがって、該位置、すなわち試料２０に刺激を加える位置を含む領域のみに電子線７を走査させることが可能で、観察すべき領域を探す手間が省け電子線７の照射による試料ダメージも低減させることができる。
【００６６】
該領域は、観察すべき細胞の大きさが数十μｍであるので、例えば２００μｍ四方（２００μｍ×２００μｍ）にすると、細胞の刺激に対する反応の生ずる領域を確実に視野内に収めることが可能になる。なお、検査対象（観察対象）の大きさに応じて該領域を設定すればよく、２００μｍ以下に設定することができる。
【００６７】
上述のようにして第１の情報を取得した後、神経細胞である試料２０にマニピュレータ２６の先端部に設置してある微小電極を用いて電気刺激を加え、上記のごとく試料２０に刺激を加える位置を含む領域のみに電子線７を走査させて、試料２０のＳＥＭ画像を取得し、刺激に対する試料２０の応答性を確認することができた。このときの電子線７の走査領域の位置は、マニピュレータ２６により試料２０に刺激を与えた位置情報に基づいて決定され、該走査領域の範囲は２００μｍ四方又はそれ以下に設定される。
【００６８】
このとき取得される画像データは、電気刺激の印加後での第２の情報となる。この第２の情報もコンピュータ２５の記憶領域に記憶される。コンピュータ２５は、上述した第１の情報とこの第２の情報とを対比することにより、該細胞の応答性等を詳細に確認することができる。
【００６９】
試料２０への刺激の印加後での撮像（第２の情報の取得）を行った後は、開閉バルブ１４を閉じることにより、試料保持膜３２が破壊された場合の鏡筒１への汚染を防止した。なお、上述した試料２０への刺激の印加前の撮像（第１の情報の取得）をした後に、一旦開閉バルブを閉じて、この状態でマニピュレータ２６による試料２０への刺激の印加を行い、その後開閉バルブ１４を開放してから第２の情報を取得するようにしてもよい。
【００７０】
また、上記のように細胞に刺激を与えた後の変化をＳＥＭで観察する前に、光学顕微鏡２７で観察する場合もある。その際も、開閉バルブ１４を閉じておくと、膜が破れた際の汚染のリスクを低減できる。いずれにせよ、電子線７を試料２０に照射させない時は開閉バルブ１４を閉じる等、試料検査中における開閉バルブ１４の開放時間を短縮することで、装置内部の汚染確率を低減させることができる。
【００７１】
刺激に対する細胞の反応速度が遅い場合、一旦開閉バルブ１４を閉じ、反応した頃合を見計らって再度開放バルブ１４を開放し、電子線７による撮像を行っても良い。反応の確認は光学顕微鏡２７で行うことができる。
【００７２】
マニピュレータ２６の先端部には、化学物質や薬物を散布可能な機構を設置することができ、ＳＥＭで細胞を観察しながら化学物質や薬物に対する細胞の挙動を観察することができる。また、マニピュレータ２６には、液体の流出機能を設置することもでき、これにより散布した物質の回収も可能になる。
【００７３】
マニピュレータ２６の操作において、誤って試料保持膜３２を破壊した場合の鏡筒１への汚染を防止する必要が有る。そのために、以下の方法を用いた。試料保持膜３２の位置情報を例えば光学顕微鏡やレーザー測定装置（図示せず）を用いて測定し、かつマニピュレータ２６の位置情報をマニピュレータ２６の移動制御情報を基に取得し、試料保持膜３２とマニピュレータ２６の位置が重ならないようにした。重なりそうになった場合、警告の表示（発信）、マニピュレータ２６の操作停止、もしくは／かつ開閉バルブ１４を閉じた。
【００７４】
別の方法では、試料保持膜３２とマニピュレータ２６との間に電圧を印加し、試料保持膜３２とマニピュレータ２６の間の電圧変化、電流変化、もしくは抵抗変化を測定する。試料保持膜３２とマニピュレータ２６が接触する際に生ずる電圧変化、電流変化もしくは抵抗変化を感知し、警告の表示（発信）、マニピュレータ２６の操作停止、もしくは／かつ開閉バルブ１４を閉じた。これら方法により、試料保持膜２６の破壊の確立が低減でき、破壊された場合でも鏡筒１への汚染を防ぐことが出来た。
【００７５】
本実施例では、試料２０を試料保持膜３２に吸着させる為に、フィブロネクチンを用いているが、それ以外にもポリLリジンやコラーゲンを用いても良い。
【００７６】
上記において、像（ＳＥＭ像）を形成するために検出される電子として、反射電子を用いた。反射電子は原子番号に比例した信号強度を持つ。その為、生物試料のようにほぼ全体が低原子番号の物質で構成されている場合、像のコントラストが非常に弱く、分解能を向上させることが困難である。そこで、細胞の挙動で注目すべき部位に、金などの重金属を吸着させると良い。具体的には、該部位（抗原）に吸着する性質を持つ金粒子を標識した抗体を細胞に散布することで、抗原抗体反応を利用して、その部位（抗原）に該抗体を介して金を吸着させる。また、予め、電子線が照射されると発光する蛍光物質（蛍光色素や量子ドット（例えばSiのナノ粒子））を細胞の特定部位に吸着させ発光を光学顕微鏡で観察しても良い。
【００７７】
以上のように、本発明を用いることで、従来技術では不可能であった生きた細胞の刺激に対する反応を、ＳＥＭを用いて高分解能で観察（検査）が可能になった。
【００７８】
上記例では神経細胞を用いたが、それ以外にも副腎皮質細胞、心筋細胞、胃や腸、血管の細胞等さまざまな組織細胞を観察可能である。さらに、製薬における細胞に対する薬の反応検査システムにも応用可能である。その例を次に示す。
１．高血圧
高血圧症の人の血圧を低下させるには、血管にあるイオンチャンネル（ここではその中のカリウムチャンネル）の働きを妨げて、血管を広げる必要がある。このような効果を有する薬の開発では、薬の散布に対するカリウムチャンネルの反応を直接観察することが重要である。本発明を用いた観察例について示す。まず、血管の細胞（試料２０）を試料保持膜３２上に培養させた。観察すべきカリウムチャンネルの大きさは７〜９ｎｍと小さく、かつ該チャンネルを構成する原子の原子番号が小さいので、前述したように反射電子像ではコントラストが付き難く観察困難である。そこで、コントラストを向上させる為に、予め金マーカーの付いた抗体（カリウムチャンネル細胞外ループに対する抗体）をカリウムチャンネル（抗原）に抗原抗体反応を利用して吸着させた。金の反射電子放出効率は高いので、カリウムチャンネルの位置をＳＥＭで観察することが容易になった。その後、該細胞にマニピュレータ２６の先端部を近接させ、薬液を散布した。薬液の散布前後において、走査させた電子線７を、試料保持膜３２を介して細胞に照射させ、発生する反射電子を検出器７で検出した。検出信号を画像形成装置２２に送り、画像表示部２３にＳＥＭ画像を表示することができた。これにより薬液に対するカリウムチャンネルの凝集を観察できた。また、カリウムチャンネルの働きと凝集との間には深い関係があることが知られており、ここで開発された方法により製薬に貢献も可能になった。
【００７９】
その他にもイオンチャンネルは不整脈、筋肉疾患など多くの病気に関係する。これら細胞を用い同様にして製薬開発に利用できる。腎臓の異常により起こる尿崩症は、尿細管にある水チャンネルが反応しなくなる為に起こが、これに対しても同様な方法で観察や製薬開発への応用が可能である。
２．糖尿病
糖尿病は、濃度が高くなった血糖を細胞内に取り込んで低下させる糖輸送体GLUT4（glucose transporter-4）の膜輸送の異常により発生する。この糖輸送体は筋肉および脂肪組織に特異的に発現しているものである。本発明を用いて、この糖輸送体に薬物を与え細胞内で起こる形状変化を観察し、糖尿病の新しい薬や治療法の発見に利用できる。まず、脂肪組織（試料２０）を試料保持膜３２上に培養させた。光学顕微鏡２７で観察しながら培養させた該細胞にマニピュレータ２６の先端部を近接させ、該マニピュレータ２６の先端部から薬液を散布した。薬液の散布前後において、走査させた電子線７を、試料保持膜３２を介して該細胞に照射し、発生する反射電子を検出器７で検出した。検出信号を画像形成装置２２に送り、画像表示部２３にＳＥＭ画像を表示することができた。これにより薬物に対する該細胞の反応を観察することができた。このようにして、糖尿病に有効な薬の開発に貢献できる。
３．インフルエンザ
インフルエンザウイルスは細胞表面のリセプターに吸着することで感染する。インフルエンザ特効薬はこの吸着を防止させるものである。従来、この吸着を直接観察することは困難であり、特効薬開発に膨大な時間を要していた。例えば、インフルエンザウイルスに蛍光マーカーをつけて、光学顕微鏡で観察する方法があった。この方法では、細胞がインフルエンザウイルスを食べる食細胞作用（感染ではない）なのか、インフルエンザが細胞に吸着した（感染）のかを区別することが出来なかった。しかし、本発明を用いれば、その区別が可能になる。まず、細胞（試料２０）を試料保持膜３２に培養させた。マニピュレータ２６先端から金粒子を標識したインフルエンザウイルスを細胞に散布した。その後、別のマニピュレータで薬液を該細胞に散布した。この状態で走査させた電子線７を、試料保持膜３２を介して該細胞に照射し、発生する反射電子を検出器７で検出した。検出信号を画像形成装置２２に送り、画像表示部２３にＳＥＭ画像を表示することができた。この画像により、インフルエンザの細胞への吸着具合を確認することができた。薬が有効な場合には、インフルエンザの細胞への吸着が無いことを確認することができる。また、細胞がインフルエンザを食べた場合（食細胞作用）でも、分解能が高いＳＥＭ画像が得られており、インフルエンザウイルスと細胞の位置確認が可能で感染と食細胞作用の区別ができた。このようにして、インフルエンザの特効薬開発に貢献できる。
４．うつ病
うつ病は神経細胞からの神経間伝達物質の分泌が不調になることが原因である。神経間伝達物質の分泌は、細胞膜内側の電位がCa（２＋）イオン（＋２価のカルシウムイオン）が流入することで＋側に変化することで細胞内にある小胞が細胞膜と融合することにより生じている。従って、細胞（試料２０）を試料保持膜３２に培養させ、マニピュレータ２６の先端部を細胞に近接させ、該マニピュレータを用いて細胞に電気刺激を加えながらＳＥＭで観察した。これにより、細胞内小胞の挙動を解明できる。また、膜蛋白質に作用する薬品を散布し、その変化等も観察することで製薬開発に貢献できる。このような神経間伝達物質の分泌や、それ以外にも伝達物質放出の異常は、様々な病気に関連し、医学や製薬開発に貴重な情報となる。
【００８０】
上記実施例において、通常用いられる金マーカーは１０〜３０ｎｍの粒径である。しかし、抗体と金マーカーとの吸着力が弱く、１０〜３０ｎｍの金マーカーを付けられないこともある。その場合には、まず粒径数ｎｍと非常に小さな金（ナノゴールド）を抗体に付ける。このままでは金が小さすぎ、ＳＥＭでの観察は困難であるが、銀増感を利用して該金の周りに銀を吸着させることで、ＳＥＭで検出し易くする方法を用いても良い。
【００８１】
さらに、上記画像形成装置２２により形成された画像データに基づいて、コンピュータ２５が画像処理し、形状等の特徴の抽出を行い、当該画像処理によって明らかになった特徴（形状）と、予め用意された薬が有効であった場合の細胞形状のデーターベースと比較することによって、病気に効果のある薬を選別する検査システムを構成することができる。
【実施例２】
【００８２】
試料保持膜３２の耐性が十分である場合には、開閉バルブ１４を省略した図４のような検査装置を用いることもできる。装置の構造が簡単になり、装置の価格を下げることができる。また、試料と鏡体１の距離（ワーキングディスタンス）を縮めることができ、分解能の向上や、反射電子の検出効率の向上につながり、より高画質な像の撮影が可能になった。
【実施例３】
【００８３】
図５のように真空室１１において、開閉バルブ１４と試料保持体載置部１２との間に、蛇腹構造を備える移動駆動手段１７を設けた。これにより、試料保持体１８及びこれに備えられた試料保持膜３２が、光学顕微鏡２７および鏡筒１とは独立に垂直方向及び水平方向に移動可能となった。したがって、電子線７の照射が可能な領域と試料２０の観察領域の位置が大きくずれた場合であっても、試料保持体１８を移動させることによって該観察領域に該照射領域を重ねることが可能になった。
【００８４】
さらに、光学顕微鏡２７の光軸と鏡筒１の光軸とを５０μｍ以下の範囲内で一致させる、もしくは、光学顕微鏡２７の視野中心（光学像の中心）とＳＥＭ像の視野中心（電子線７の照射領域の中心）とを５０μｍ以下の範囲内で一致させておけば、試料保持体１８を移動して光学顕微鏡２７で観察対象を確認することで、同時にＳＥＭ像もその観察対象を捉えることになり便利である。
【００８５】
観察すべき細胞の大きさは約数十μｍであるので、光軸もしくは視野中心のずれは５０μｍ以内であると便利である。この構成を用いない場合、実施例１で述べたように、光学顕微鏡２７の視野座標やマニピュレータ２６の位置情報を、制御部２８を介して電子線制御部２４に入力し、該位置を含む領域のみに電子線７を走査させればよい。
【００８６】
また、この移動駆動手段１７を用いた試料保持体１８の回転若しくは傾斜を行って検査を行うことにより、検査対象物の三次元構造も確認できる。なお、これらの場合、試料２０から発生する二次電子や反射電子を、二つ以上の検出器で検出するとさらに明確な三次元構造の確認をすることができる。
【実施例４】
【００８７】
次に、本発明における第４実施例として、試料保持膜３２の破壊発生確率を低減させる為に、図６に示すごとく、試料保持体載置部１２上に圧力調整室５０と、当該圧力調整室５０に接続される真空排気可能な圧力調整手段５１を設けた。この圧力調整室５０は、着脱可能になっている。これにより、試料保持体１８は圧力調整室５０内に位置し、試料保持膜３２の第１の面３２ａに接する雰囲気の圧力は減圧可能に調整される。また、この圧力調整室は、電子線照射に伴い発生する放射線の防護、および外部からの光の遮蔽にも用いられる。
【００８８】
このような構成の装置を用いた検査においては、まず、開閉バルブ１４は、閉じた状態になっており、この開閉バルブ１４と試料保持膜３２との間において密閉された空間部１９ａは、常圧である大気圧雰囲気となっている。このとき、圧力調整室５０は、試料保持体載置部１２上から外された状態となっている。
【００８９】
また、真空室１１内において、開閉バルブ１４の下側に位置する空間は所定の真空状態（減圧状態）となっている。さらに、当該空間に連通する鏡筒１内は、真空排気手段８により排気されて減圧され、所定の真空状態となっている。
【００９０】
この状態で、試料保持体１８の試料保持膜３２の上面３２ａに試料２０を培養（吸着）して載置した後、圧力調整室５０を試料保持体載置部１２上に配置する。これにより、試料保持体１８の試料保持膜３２上に載置された試料２０は、圧力調整室５０の内部に位置することとなる。
【００９１】
次に、上記空間部１９ａを排気手段９により真空に引くと同時に、圧力調整室５０内を圧力調整手段５１により減圧する。圧力調整室５０内の雰囲気の気圧を、例えば１／２気圧程度（約５０ｋＰａ）にすることで、当該空間部５ａと当該雰囲気との間の圧力差が低くなる。それにより、当該圧力差に起因する試料保持膜３２に加わる外力を減らし、試料保持膜３２の破損頻度を低減できる。この圧力調整室の圧力は水蒸気圧以上にすることによって試料２０に含まれる水分の蒸発を防ぐことができる。水蒸気圧を低下させる為に、必要に応じて試料２０を冷却しても良い。
【００９２】
以上、上述した各実施例１〜４において、細胞を生きた状態でＳＥＭ観察でき、さらに該細胞に刺激を与えることにより生ずる反応を検査することができた。なお、上記実施例では二次的信号として反射電子を用いたが、それ以外でも試料２０への電子線７の照射により生ずる二次電子、Ｘ線、もしくはカソードルミネッセンス光、及び試料２０への吸収電流を検出することにより、試料２０の情報を得ることが可能である。なお、吸収電流の測定はマニピュレータ２６を用いると便利である。
【００９３】
本実施例では試料保持膜３２として窒化シリコンを用いたが、この膜は少なくとも一気圧の圧力差に耐えると便利であり、気体や液体の流入出がないことを特徴とする。具体な物質として、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、カーボン、酸化シリコン、窒化シリコン、又は窒化ボロンのうちの少なくとも一つを含み、該膜の厚さが１０〜１０００ｎｍであることを特徴とする。さらに、この試料保持膜３２にアルミニウム等の軽元素金属を例えば４０ｎｍ蒸着させることによって遮光性を持たせ、反射電子検出器４に外部から光の照射を防止し、光学顕微鏡とＳＥＭとを同時に観察可能にさせることができた。
【００９４】
また、上記各実施例においては、一次線として電子線を用いたが、試料保持膜３２が他の荷電粒子線（ヘリウムイオンビーム等）の照射に対する耐衝撃性及び強度が十分に高ければ、当該他の荷電粒子線を用いた場合でも適用可能である。本発明では倒立型ＳＥＭを用いたが、通常の正立型でも問題は無い。
【００９５】
このように本発明の試料検査装置は、膜３２を介して試料２０に一次線７を照射する一次線照射手段１と、一次線７の照射に応じて試料２０から発生する二次的信号を検出する信号検出手段４とを備える試料検査装置において、試料２０に接近又は接触可能な先端部を具備するマニピュレータ２６と、試料２０の光学像を取得する光学像取得手段２７と、一次線照射手段１、信号検出手段４、マニピュレータ２６及び光学像取得手段２７の各動作を制御する制御手段２８とを有することを特徴としている。
【００９６】
また、本発明の試料検査装置は、第１の面に試料が保持される膜３２と、膜３２の第２の面に接する雰囲気を減圧する真空室１１と、真空室１１に接続され、膜３２を介して試料２０に一次線７を照射する一次線照射手段１と、一次線７の照射に応じて試料２０から発生する二次的信号を検出する信号検出手段４とを備える試料検査装置において、試料２０に接近又は接触可能な先端部を具備するマニピュレータ２６と、試料２０の光学像を取得する光学像取得手段２７と、一次線照射手段１、信号検出手段４、マニピュレータ２６及び光学像取得手段２７の各動作を制御する制御手段２８とを有することをも特徴としている。
【００９７】
このとき、膜３２の第１の面が膜３２の上面となっており、膜３２の第２の面が膜３２の下面となっている。しかし、一次線照射手段１が倒立型となっていない場合には、当該第１の面を膜３２の下面とし、当該第２の面を膜３２の上面としてもよい。
【００９８】
また、真空室１１内において、膜３２と一次線照射手段１との間の空間を仕切る開閉バルブ１４をさらに有しており、一次線照射手段１と光学像取得手段２７とが、膜３２を間に介して対向配置されている
さらに、制御手段２８が、マニピュレータ２６の先端部の位置情報に基づいて一次線照射手段１からの一次線７の照射領域を決定し、これによりマニピュレータ２６の先端部近傍に位置する試料２０の部分に一次線７を照射することができる。
【００９９】
そして、制御手段２８が、光学像取得手段２７により取得された光学像を基にマニピュレータ２６の先端部の位置情報を求めるとともに、該位置情報に基づいて一次線照射手段１からの一次線７の照射領域を決定し、これによりマニピュレータ２６の先端部近傍に位置する試料２０の部分に一次線７を照射することができる。
【０１００】
また、制御手段２８が、光学像取得手段２７の視野に基づいて一次線照射手段１からの一次線７の照射領域を決定し、これにより該視野に対応した領域に一次線７を照射することもできる。
【０１０１】
このとき、一次線照射手段１の光軸と光学像取得手段２７の光軸とが５０μｍ以下の範囲内で一致し、若しくは一次線照射手段１による一次線７の照射領域の中心と光学像取得手段２７により得られる光学像の中心とが５０μｍ以下の範囲内で一致するようにするとよい。
【０１０２】
そして、膜３２を移動するための移動駆動機構（膜移動手段）１７をさらに設けることができ、また、マニピュレータ２６により、試料２０に対する接触動作又は吸引動作、試料２０への液体の供給又は排出、若しくは試料２０への電気供給のうちの少なくとも一つを行うことができる。
【０１０３】
ここで、膜３２は、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、カーボン、酸化シリコン、窒化シリコン、若しくは窒化ボロンのうちの少なくとも一つを含み、その膜厚が１０〜１０００ｎｍの範囲に設定されている。
【０１０４】
また、一次線７は電子線以外にもイオンビーム等の他の荷電粒子線とすることができ、二次的信号は、反射電子、二次電子、吸収電流、カソードルミネッセンス光、若しくはＸ線のうちの少なくとも一つとすることができる。
【０１０５】
さらに、一次線７の照射領域は、２００μｍ四方（２００μｍ×２００μｍ）以下とすることができ、また、マニピュレータ２６を介して試料２０の吸収電流を検出することができる。
【０１０６】
ここで、試料２０には生体を構成する要素である抗原が含まれており、該抗原には、金属若しくは蛍光物質が標識された抗体が結合されているようにすることもできる。
【０１０７】
本発明の試料検査方法は、上記試料検査装置を用いて試料の検査を行うことを特徴としている。
【０１０８】
さらに本発明の試料検査方法は、一次線照射手段１から膜３２を介して試料２０に一次線７を照射して、これに基づく試料２０の情報（第１の情報）を取得し、試料２０に物理的又は電気的若しくは化学的作用を加え、該作用が加えられた後の試料２０に膜３２を介して一次線７を照射し、これに基づく試料２０の情報（第２の情報）を取得し、これら第１の情報及び第２の情報の対比を行うことをも特徴としている。
【０１０９】
このとき、マニピュレータ２６を用いて試料２０に物理的又は電気的若しくは化学的作用を加えることができ、試料２０に物理的又は電気的若しくは化学的作用を加えるときには、膜３２と一次線照射手段１との間の空間を開閉バルブ１４により仕切ることができる。
【０１１０】
本発明の試料検査システムは、上記試料検査装置を備え、該試料検査装置により検出された試料２０からの二次的信号に基づく情報から、試料２０についての判定を行うコンピュータ（情報処理手段）２５を有している。
【０１１１】
さらに、本発明の試料検査方法では、上記試料検査装置を用いて試料２０からの二次的信号を検出し、該二次的信号に基づく試料２０の情報から試料２０についての判定を行うことができる。
【０１１２】
ここで、上記試料検査システム及び試料検査方法において、マニピュレータ２６を用いて試料２０に物理的又は電気的若しくは化学的作用を加え、該作用が加えられた後の試料２０の情報を基に、試料２０についての判定を行うことができる。
【０１１３】
また、マニピュレータ２６を用いて試料２０に物理的又は電気的若しくは化学的作用を加える前後における試料２０の各情報の対比を基に、試料２０についての判定を行うことができる。
【０１１４】
このとき、試料２０に生物の一部が含まれている場合に、マニピュレータ２６により化学物質を試料２０に供給し、該化学物質が供給された後の試料２０の情報を基に、該化学物質の該生物への有効性を判定することができる。
【０１１５】
また、試料２０に生物の一部が含まれている場合に、該生物の病気についての判定を行うことができる。
【０１１６】
ここで、上記において、試料２０の情報は、試料２０の画像データとしている。
【０１１７】
本発明においては、膜３２を介して試料２０に一次線７を照射し、一次線７の照射に応じて試料２０から発生する二次的信号を検出できるとともに、マニピュレータ２６による試料２０へのマニピュレーション動作並びに試料の光学像の取得をすることができる。
【０１１８】
このとき、試料２０を常圧雰囲気に配置することにより、試料２０を取り囲む液体を蒸発させること無くＳＥＭ観察ができ、かつ、マニピュレータ２６を用いて試料２０への刺激を行い、その反応（刺激の印加前後での反応を含む）も観察することが可能になる。
【０１１９】
また、マニピュレータ２６の位置情報を用いて、マニピュレータ２６により試料２０に刺激を与えた周囲に一次線７の照射範囲を限定することで、膜３２や試料２０への一次線７の照射量も最小にすることができ、膜３２や試料２０への一次線７によるダメージを低減できる。
【０１２０】
さらに、膜３２と一次線照射手段１との間の空間を仕切るための開閉バルブ１４を設けることにより、マニピュレータ２６により膜３２が破壊された場合でも装置内汚染を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である。
【図２】本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である。
【図３】本発明における試料保持体の作成方法を示す図である。
【図４】本発明における試料検査装置の第２実施例を示す概略構成図である。
【図５】本発明における試料検査装置の第３実施例を示す概略構成図である。
【図６】本発明における試料検査装置の第４実施例を示す概略構成図である。
【符号の説明】
【０１２２】
１…鏡筒（一次線照射手段）、２…電子銃、３…集束レンズ、４…反射電子検出器、７…電子線（一次線）、８…排気手段、９…排気手段、１０…架台、１１…真空室、１２…試料保持体載置部、１３…除震装置、１４…開閉バルブ、１５…排出管、１６…開閉弁、１７…移動駆動機構、１８…試料保持体、１９…空間、１９ａ…空間部、２０…試料、２２…画像形成装置、２３…表示装置、２４…電子線制御部、２５…コンピュータ、２６…マニピュレータ、２７…光学顕微鏡、２８…制御部（制御手段）、２９…電子線装置部、３２…試料保持膜、３２ａ…第１の面、３２ｂ…第２の面、３３…シリコン層、３３ａ…中央部、３４…本体部、３５…格子、３６…窒化シリコン膜、５０…圧力調整室、５１…圧力調整手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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