(57)【要約】【課題】妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断キット及び変異検出方法を提供する。【解決手段】妊孕性診断キットは、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位におけるシトシン塩基の置換変異の有無を検出するための試薬を含んでいる。被験者から得られたゲノムＤＮＡにおいて、この妊孕性診断キットにより、上記第２８３位のシトシン塩基がチミン塩基に置換していることが分かると、その被験者は妊孕可能性が低いと判定される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キット。
【請求項２】
上記試薬は、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基の変異の有無を検出するものであることを特徴とする請求項１に記載の妊孕性診断キット。
【請求項３】
上記試薬は、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基がチミンに置換されていることを検出するものであることを特徴とする請求項２に記載の妊孕性診断キット。
【請求項４】
上記試薬は、
ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の上記第２８３位の塩基を含む領域を増幅させるためのプライマーの組と、
上記領域の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬と、
を含んでいることを特徴とする請求項２に記載の妊孕性診断キット。
【請求項５】
上記試薬は、上記変異の有無をインベーダー法によって検出するものであることを特徴とする、請求項１に記載の妊孕性診断キット。
【請求項６】
上記試薬は、上記変異の有無をＳＭＭＤ法によって検出するものであることを特徴とする、請求項１に記載の妊孕性診断キット。
【請求項７】
ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする変異検出方法。
【請求項８】
上記工程では、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする請求項７に記載の変異検出方法。
【請求項９】
翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第２８３位の塩基がチミンに置換した塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを有していることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを含んでいることを特徴とする発現キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断キット及び変異検出方法、並びに、不妊症の治療方法の研究に用いられる変異型のポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、少子化の問題が頻繁に取り上げられ、この問題を解消するために様々な対策が模索されている。少子化の対策として、不妊症により子供を授からない夫婦を救済することが重要であることは言うまでもない。
【０００３】
非特許文献１では、子供を望む夫婦のうちの約１５％が２年たっても妊娠できないという報告がなされている。近年では、体外受精（ＩＶＦ；In Vitro Fertilization）の技術発展により、精子の活動能が低い場合においても妊娠出産が可能になっているが、不妊の背後にある分子メカニズムは依然として明らかになっていないのが現状である。
【０００４】
非特許文献２によると、マウスにおける雄性不妊の研究により、妊孕性に影響を与える多くの遺伝子の存在が明らかになっており、これらの遺伝子の変異がヒトにおいても男性不妊を引き起こす一因となっている可能性がある。
【０００５】
哺乳類の雄性生殖細胞の成熟は、数々の構造的及び機能的変化を経てなされる。その過程は精子形成と呼ばれ、主として（１）精原細胞の増殖及び分化、（２）精母細胞の前期段階における減数分裂、及び（３）半数体円形精子細胞から精子への分化の際の急激な形態変化、の３つの段階を含んでいる。
【０００６】
このような雄性生殖細胞が存在する精巣において特に多く発現するマウスのタンパク質として、Ｃｅｎｔｒｉｎ１タンパク質が知られている（非特許文献３）。Ｃｅｎｔｒｉｎタンパク質は、酵母から哺乳類まで多種多様な生物に見られ、中心体を構成する部品の１つとして機能する。酵母などにおける実験から、Ｃｅｎｔｒｉｎタンパク質は中心体の複製や分離に重要な役割を果たすことが知られている。
【０００７】
マウスは、Ｃｅｎｔｒｉｎタンパク質をコードする３つの遺伝子、Ｃｅｎｔｒｉｎ１、Ｃｅｎｔｒｉｎ２、Ｃｅｎｔｒｉｎ３を有している。これらのうち、Ｃｅｎｔｒｉｎ１タンパク質は、成熟したオスの精巣において特に強く発現し、また、精子においては尾部に局在する。これらのことから、Ｃｅｎｔｒｉｎ１タンパク質は減数分裂時の中心体の機能又は精子の鞭毛基部の構成に関与すると考えられている。
【０００８】
このＣｅｎｔｒｉｎタンパク質をコードする遺伝子はヒトにも存在する（非特許文献４）。なお、Ｃｅｎｔｒｉｎタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトにおいても３つの遺伝子が存在することが知られている。中でも、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１タンパク質は、マウスＣｅｎｔｒｉｎ１タンパク質と高い相同性を有し、同じ起源に由来していると考えられている（非特許文献３）。
【非特許文献１】de Kretser DM et al., J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84: 3443-3450.
【非特許文献２】Matzuk MM et al., Nat Cell Biol. 2002; 4(Supp1): S41-S49 / Nat Med. 2002; 8 (Supp1): S33-S40.
【非特許文献３】Hart EP et al., Genomics. 1999; 60: 111-120.
【非特許文献４】Errabolu R et al., J Cell Sci. 1994; 107: 9-16.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子は、哺乳類において種を越えて保存され、かつ、半数体生殖細胞に特に強く発現するタンパク質をコードするものであることから、これらの遺伝子における変異は不妊を引き起こし得ると考えられる。しかしながら、現在までに、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の変異と不妊症との関係を示唆する症例は報告されていない。
【００１０】
ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の変異と妊孕性との関係が明らかになれば、妊孕性の診断を簡易な遺伝子診断で行うことができるようになる。具体的には、被験者が不妊症に罹患する可能性が高いか否かの判定、或いは、不妊症患者の原因がこれらの遺伝子によるものか否かの判定を簡易に行うことができるようになる。
【００１１】
さらに、不妊症患者に見られる変異型ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１タンパク質があれば、上記の変異型タンパク質に起因する不妊症の治療を目的とした薬剤や治療法などの研究において極めて有用なツールとなる。
【００１２】
本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断キット及び変異検出方法を提供することにある。
【００１３】
また、本発明の別の目的は、不妊症の治療方法を研究する際に有用なツールを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、後述する実施例に示すように、男性不妊症患者及び健常者男性からなる集団について、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の塩基配列を入念に解析した結果、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の機能欠損を引き起こす変異と不妊症とが関連することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、上記課題を解決するために、本発明に係る妊孕性診断キットは、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする。
【００１６】
また、上記試薬は、翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基の変異の有無を検出するものであることが好ましい。
【００１７】
さらに、上記試薬は、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基がチミンに置換されていることを検出するものであることが好ましい。
【００１８】
また、上記試薬は、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の上記第２８３位の塩基を含む領域を増幅させるためのプライマーの組と、上記領域の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬と、を含んだものであってもよい。
【００１９】
或いは、上記試薬は、上記変異の有無をインベーダー法によって検出するものであってもよい。
【００２０】
さらに或いは、上記試薬は、上記変異の有無をＳＭＭＤ法によって検出するものであってもよい。
【００２１】
また、上記課題を解決するために、本発明に係る変異検出方法は、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする。
【００２２】
また、上記工程では、翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基の変異の有無を検出することが好ましい。
【００２３】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第２８３位の塩基がチミンに置換した塩基配列からなることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係るポリペプチドは、上記ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明に係る発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドを有していることを特徴とする。そして、本発明に係る発現キットは、上記発現ベクターを含んでいることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係る妊孕性診断キット及び変異検出方法には、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する試薬（工程）が含まれているので、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を行うことができる。
【００２７】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、置換変異を含むヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子を提供するものである。また、本発明に係るポリペプチド、発現ベクター及び発現キットは、不妊症患者に見られるヒト置換変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１タンパク質を提供するものである。従って、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の欠失変異に起因した不妊症を研究する上で有用なツールとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（１．妊孕性診断キット及び変異検出方法）
本発明に係る妊孕性診断キット及び変異検出方法について説明する。本発明に係る変異検出方法は、被験者（ヒト）から採取された生体サンプルを用いて被験者における遺伝子の変異を検出する方法であり、被験者が低妊孕性又は不妊症であるか否かを診断するために有用な情報を提供するものである。また、上記妊孕性診断キットは、上記変異検出方法を実施するためのものである。上記変異検出方法では、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の変異の有無を検出する。なお、Ｃｅｎｔｒｉｎ１は、単にＣｅｎｔｒｉｎと呼ばれたり、Ｃｅｔｎ１と略称されたりすることもある。
【００２９】
配列番号１は、ジーンバンク（GenBank）にアクセッション番号gi3337234で登録されているヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の転写産物の塩基配列の中から、翻訳領域のみを抽出したものである。配列番号１に示すように、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子は、５１９ｂｐからなる翻訳領域を有している。また、配列番号２は、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１タンパク質の推定アミノ酸配列を示すものである。
【００３０】
Ｃｅｎｔｒｉｎ１タンパク質は、上述したように、成熟したオスの精巣において特に強く発現し、また、精子においては尾部に局在することが報告されている。図１は、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の構造を示す模式図である。ヒトゲノムプロジェクトによって構築されたヒトゲノムリソース（Human Genome Resources: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/）によれば、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子は、イントロンを持たないレトロポゾン様遺伝子であり、ヒト１８番染色体短腕に位置している。この遺伝子の転写産物は約１．２ｋｂである。
【００３１】
本願発明者らは、後述する実施例に示す調査の結果、男性不妊症患者からなる集団の中に、配列番号１に示すヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の翻訳領域における第２８３位のシトシン（以下、単に「Ｃ」という）が片方のアレルにおいてチミン（以下、単に「Ｔ」という）に置換している患者がいることを見出した。一方、この第２８３位のＣの置換は、妊孕性が確認されている男性からなる集団では全く見られなかった。
【００３２】
ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子に上記の置換変異が起こると、元々グルタミンをコードしていたこの置換部位が終止コドンをコードするようになるため、正常なタンパク質が発現しなくなってしまう。それゆえ、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の上記第２８３位におけるＣからＴへの置換変異は、たとえ片方のアレルのみに起こっている場合であっても、正常なＣｅｎｔｒｉｎ１タンパク質の翻訳量の低下などに基づき不妊症を引き起こす可能性が高いと推測される。
【００３３】
よって、被験者のＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子について上記の第２８３位のＣの置換変異の有無を調べ、Ｔへの置換変異が見つかった場合には、その被験者が不妊症或いは低妊孕性である（又はその可能性が高い）と考えられる。そして、不妊症或いは低妊孕性であると判定された被験者に対しては、ＩＣＳＩ（Intracytoplasmic sperm injection；顕微授精）などの現存の治療法の適格な選択を提示することができる。
【００３４】
また、上記第２８３位の置換変異以外であっても、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の機能欠損を引き起こす変異は、不妊症を引き起こす可能性が高いと推測される。
【００３５】
以上のことから、本発明に係る変異検出方法は、被験者（ヒト）から採取された生体サンプル（血液や頬の内側の粘膜など）に含まれるゲノムＤＮＡ、または、被験者の生体サンプルから単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する工程を含んでいる。
【００３６】
また、本発明に係る妊孕性診断キットは、被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムＤＮＡ、または、被験者の生体サンプルから単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する試薬を含んでいる。
【００３７】
上記変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出するものであれば、その態様は特に限定されるものではない。例えば、変異検出方法及び妊孕性診断キットは、被験者のヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていることを検出するものであってもよいし、被験者のヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていないことを検出するものであってもよい。
【００３８】
例えば、上記変異の存在を検出するものである場合、上記変異検出方法および妊孕性診断キットは、上記の機能欠損を引き起こす変異が少なくとも一方のアレルにおいて起こっていることを検出できればよい。一方、上記変異の非存在を検出するものである場合、上記変異検出方法および妊孕性診断キットは、上記の機能欠損を引き起こす変異が双方のアレルにおいて起こっていないことを検出することが好ましい。
【００３９】
上記変異検出方法又は妊孕性診断キットにより、上記変異の有無を調べ、その結果、変異が検出されなかった場合は、妊孕性に問題がない可能性が高いと判定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因が、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の機能欠損以外のものによる可能性が高いと判定できる。
【００４０】
一方、変異が検出された場合は、低妊孕性又は不妊症でない可能性が高いと判定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因がＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の機能欠損による可能性が高いと判定できる。
【００４１】
このように、上記変異検出方法及び妊孕性診断キットによれば、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を行うことができる。すなわち、上記変異検出方法又は妊孕性診断キットによれば、不妊症の診断を行う上で有用な情報が提供される。それゆえ、上記変異検出方法における変異の有無を検出する工程は、低妊孕性又は不妊症の診断方法において用いられることが好ましいといえる。
【００４２】
なお、上記変異検出方法および妊孕性診断キットは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基の置換変異の有無を検出することが好ましい。
【００４３】
さらに、上記変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基がチミンに置換していることを検出するものであることが好ましい。この場合、上記変異検出方法及び妊孕性診断キットによって、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基がチミンに置換していることが検出されれば、その被験者は、不妊症又は低妊孕性である可能性が高いと判定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因がＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の変異によるものであると判定できる。従って、適切な不妊治療の提案を迅速に行うことができる。
【００４４】
ところで、上記変異検出方法及び妊孕性診断キットとしては、公知の各種手法、例えば、塩基配列決定法、インベーダー法、又はＳＭＭＤ法（simultaneous multiple mutation detection system）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＭＡＳＡ法、塩基伸長法、Ｔａｑｍａｎプローブ法などに基づいたものを用いることができる。また、妊孕性診断キットには、使用方法が記載された取扱説明書が含まれていてもよい。
【００４５】
一実施形態において、上記変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の上記第２８３位の塩基を含む領域の塩基配列を決定することにより、上記の置換変異の有無を検出するものであってもよい。塩基配列の決定には、サンガー法やこれを応用した公知の各種手法を用いることができる。
【００４６】
この場合、妊孕性診断キットには、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基を含む領域を増幅させるために、第２８３位を挟むようにして設計されたプライマーの組が含まれることが好ましい。このプライマーの組には、より詳細には、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位よりも上流の塩基配列の一部または全部を有するプライマーと、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位よりも下流の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列を有するプライマーとが含まれる。
【００４７】
被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムＤＮＡを鋳型として上記のプライマーの組を用いてＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行えば、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基を含む領域がＤＮＡフラグメントとして増幅され、さらに、上記のプライマーの組の一方又は両方のプライマーを用いて塩基配列の決定を行えば、置換変異の有無を確実かつ簡便に検出することができる。塩基配列の決定は、例えばＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems Inc.）などを取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。なお、塩基配列の決定に用いられるプライマーは、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのＰＣＲに用いられるプライマーとは別のものであってもよい。
【００４８】
なお、それぞれのプライマーは、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子又はその周辺と同一の塩基配列、或いは相補的な塩基配列を少なくとも１０塩基以上有することが好ましく、１５塩基以上有することがより好ましく、１８塩基以上有することがさらに好ましく、２０塩基以上有することが特に好ましい。Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子又はその周辺と同一の（或いは相補的な）塩基配列の長さを長くすることにより、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位を含む目的の領域のみを確実に増幅させることができる。
【００４９】
また、上記のプライマーの組は、互いのプライマーによって挟まれる領域の長さが５ｋｂ以下であることが好ましく、３ｋｂ以下であることがより好ましく、２ｋｂ以下であることがさらに好ましく、１．５ｋｂ以下であることが特に好ましい。互いのプライマーによって挟まれる領域の長さを短くすることによって、上記の第２８３位の塩基を含む領域の増幅を効果的に行うことができる。
【００５０】
また、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の第２８３位の塩基から２ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．５ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．０ｋｂ以内の位置に設定されることがより好ましく、０．７ｋｂ以内の位置に設定されることが特に好ましい。上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【００５１】
さらに、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記第２８３位の塩基から２０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが好ましく、３０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがより好ましく、４０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがさらに好ましく、５０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが特に好ましい。また、上記プライマーの組は、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の上記第２８３位の塩基を含む２０ｂｐ以上の領域を増幅させるものであることが好ましい。プライマーの近傍は、塩基配列の決定結果が不正確になる傾向にあるが、上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【００５２】
上記のプライマーの組としては、例えば、それぞれ配列番号５，配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー（図１のＰｒｉｍｅｒＦ１及びＰｒｉｍｅｒＲ１）を用いることができるが、本発明に用いることのできるプライマーの塩基配列がこの配列に限定されないことはいうまでもない。ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の塩基配列及びその周辺の塩基配列は、当業者であれば上述したヒトゲノムリソースやジーンバンク（GenBank）から容易に入手することができるので、入手した塩基配列を基に、Ｏｌｉｇｏ（登録商標、National Bioscience Inc.）又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発）などを用いてプライマーを設計することができる。
【００５３】
各プライマーは、例えばホスホロアミダイト法などの公知の方法によって合成することができ、例えばApplied Biosystems Inc.の３９２型シンセサイザーなどを取扱説明書に従って使用することによって簡単に合成することができる。
【００５４】
なお、上記の各プライマーには、蛍光標識が付されていてもよい。プライマーに蛍光標識が付されている場合、ダイプライマー法によって、放射性同位元素を用いることなく増幅領域の塩基配列を決定することができる。
【００５５】
一方、各プライマーに蛍光標識が付されていない場合、ダイターミネータ法によって塩基配列を決定することができる。この場合、上記妊孕性診断キットには、上記のプライマーの組に加えて、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃの各単量体からなるデオキシリボ核酸、蛍光標識されＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃの各単量体からなるジデオキシリボ核酸（所謂ダイターミネータ）、及びポリメラーゼなどがさらに含まれていてもよい。
【００５６】
一実施形態において、上記変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の上記第２８３位の塩基の置換変異の有無をインベーダー法によって検出するものであってもよい。インベーダー法の詳細については、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖらによる論文（Lyamichev V et al., Nat biotechnol. 17, 292, 1999）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【００５７】
図２は、インベーダー法の原理を説明する模式図である。インベーダー法では、非蛍光標識プローブのインベーダープローブ２及びシグナルプローブ３と、蛍光標識プローブのフレットプローブ５とが用いられる。
【００５８】
インベーダープローブ２は、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａと対応するように設計される。一方、シグナルプローブ３は、ターゲット遺伝子１とは無関係な塩基配列であるフラップ３ｂと、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａに対応するように設計されたヌクレオチド３ａとが連結したものである。ここで、フラップ３ｂは、ヌクレオチド３ａの５’末端側に連結されている。
【００５９】
このように設計されたプローブ２・３をターゲット遺伝子１とハイブリダイゼーションさせると、変異検出部位１ａでは、ターゲット遺伝子１、インベーダープローブ２及びシグナルプローブ３が３重鎖を形成する。すると、フラップエンドヌクレアーゼ（「クリアベース（cleavase）」ともいう）４がこの３重鎖を認識し、シグナルプローブ３を３重鎖の３’側で切断する。その結果、フラップ３ｂと変異検出部位とが連結したフラップ遊離体３ｃが生成される。
【００６０】
フレットプローブ５は、５’末端側が自身とハイブリダイゼーションでき、かつ、３’末端側がフラップ３ｂとハイブリダイゼーションできるヌクレオチド５ａと、蛍光色素５ｂと、クエンチャー（発光抑制体）５ｃとからなる。ここで、ヌクレオチド５ａは、５’末端がフラップ遊離体３ｃの変異検出部位と相補的な塩基配列となっている。また、蛍光色素５ｂは、ヌクレオチド５ａの５’末端に結合している。ただし、フレットプローブ５においては、クエンチャー５ｃにより蛍光色素５ｂの蛍光が抑制されている。
【００６１】
このようなフレットプローブ５に対してフラップ遊離体３ｃがハイブリダイゼーションすると、フラップ遊離体３ｃの変異検出部位について、再び３重鎖が形成される。その結果、上述のフラップエンドヌクレアーゼ４がこの３重鎖を再び認識し、フレットプローブ５の５’末端部分が切断される。その結果、フレットプローブ５の５’末端に結合していた蛍光色素５ｂが遊離し、蛍光が生じる。
【００６２】
従って、妊孕性診断キットがインベーダー法により上記の置換変異の有無を検出するものである場合、妊孕性診断キットには、インベーダープローブ２、シグナルプローブ３及びフレットプローブ５などが含まれることが好ましい。
【００６３】
置換変異が有る場合に蛍光が生じるようにする場合、インベーダープローブ２は、配列番号１に示す塩基配列からなるヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基が変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基（Ｔ）と対応するように設計される。また、シグナルプローブ３のヌクレオチド３ａは、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基が変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基と対応するように設計される。そして、フレットプローブ５は、上記インベーダープローブ２及び上記シグナルプローブ３が変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子とハイブリダイズして３重鎖構造が形成された場合にフラップエンドヌクレアーゼ４によって切断されるフラップ遊離体３ｃを検出できるように設計される。
【００６４】
上記の構成により、被験者のＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基がＴに置換している場合は、ヌクレオチド３ａの３’末端とインベーダープローブ２の５’末端とがオーバーラップすることにより３重鎖が形成されて蛍光が生じる。一方、被験者のＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子が野生型である場合は、インベーダープローブ２の末端部分で３重鎖が形成されないので蛍光が生じない。
【００６５】
また、上記の例では、被験者の有するＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子が置換変異型の場合に蛍光が生じる構成としたが、本発明はこれに限定されず、被験者の有するＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子が野生型の場合に蛍光が生じ、置換変異型の場合に蛍光が抑制される構成としてもよく、様々に改変することができる。
【００６６】
一実施形態において、上記変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の上記第２８３位の塩基の置換変異の有無をＳＭＭＤ法によって検出するものであってもよい。ＳＭＭＤ法の詳細については、Ｗａｋａｉらによる論文（Wakai J et al., Nucleic Acids Res., 2004. 32(18), e141.）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【００６７】
図３は、ＳＭＭＤ法の原理を説明する模式図である。ＳＭＭＤ法は、電気化学的反応を利用して一塩基多型、置換変異、欠失変異、又は挿入変異などを検出するものである。まず、図３に示すように、被験者のゲノムＤＮＡ１１を鋳型として変異検出部位を含む領域をＰＣＲによって増幅させるため、カウンタープライマー１３と特別プライマー１２とを１：４の割合で用いて非対称ＰＣＲを行う（工程Ａ）。ここで、特別プライマー１２は、変異を検出したい遺伝子１１の変異検出部位１１ａよりも下流の領域と相補的な塩基配列からなるオリゴマー１２ａと、タグ１２ｂとからなる。タグ１２ｂは、遺伝子１１の変異検出部位１１ａよりも１塩基下流の塩基から、オリゴマー１２ａがハイブリダイゼーションする塩基よりも１塩基上流の塩基までの領域と相補的な塩基配列を有しており、オリゴマー１２ａの５’末端に連結されている。
【００６８】
上記の非対称ＰＣＲの結果、工程Ｂに示すＰＣＲ産物１４が生成される（工程Ｂ）。このＰＣＲ産物１４のうち、特別プライマー１２を含む一本鎖の非対称ＰＣＲ産物１４は、タグ１２ｂを含んでいるため、自己ループを形成して特別ターゲットを形成する（工程Ｃ・Ｄ）。
【００６９】
次に、変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０を用意する。プローブ２０・３０は、ともに、変異を検出したい遺伝子１１と同一の塩基配列を有し、かつ、変異検出部位１１ａ・１１ｂを３’末端とするオリゴマーをその５’末端側で金電極２５に固定したものである。ここで、変異型プローブ２０はオリゴマーの３’末端が変異型の塩基（Ｔ）となっているのに対して、野生型プローブ３０はオリゴマーの３’末端が野生型の塩基（Ｃ）となっている。これらの変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０は、オリゴマーが上述した特別ターゲット１５の３’末端側と相補的な塩基配列を有しているため、特別ターゲット１５とハイブリダイゼーションすることができる。なお、金電極２５にオリゴマーを固定するための詳細な方法は、Ｔａｋｅｎａｋａらによる論文（Takenaka S et al., Anal Chem., 2000, 72, 1334-1341）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【００７０】
プローブ２０・３０を特別ターゲット１５とハイブリダイゼーションさせる前に、フェロセニルナフタレンジイミド（ferrocenylnaphtalene diimide；以下「ＦＮＤ」と略称する）を含む溶液中で、予めバックグラウンド応答を行い、電流Ｉ０を測定しておく（工程Ｅ）。
【００７１】
そして、特別ターゲット１５と変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０とのハイブリダイゼーション及びライゲーションを行う。ここで、特別ターゲット１５が変異型のものである場合（すなわち、被験者が変異型遺伝子を有している場合）、特別ターゲット１５は変異型プローブ２０と塩基配列が完全に一致するのでライゲーションが行われる一方で、野生型プローブ３０とは塩基配列が末端部分で相違するのでライゲーションが行われない（工程Ｆ）。
【００７２】
その後、変性処理を行うと、野生型プローブ３０と変異型の特別ターゲット１５との組では、野生型プローブ３０から変異型特別ターゲット１５が解離する。一方、変異型プローブ２０と変異型の特別ターゲット１５との組では、ライゲーションが行われているので、解離が起こらない（工程Ｇ）。
【００７３】
そして、それぞれのサンプルを洗浄して余剰のＤＮＡを除去し、ＦＮＤを添加して、ＦＮＤ分子の電気化学的電流Ｉ１を測定する（工程Ｈ）。ここで、２本鎖ＤＮＡを有する電極では、１本鎖ＤＮＡを有する電極に比べて電流Ｉ１が大きくなる（工程Ｉ）。
【００７４】
これにより、被験者のゲノムＤＮＡが変異型であるか野生型であるかを測定した電流値に基づいて判定することができる。なお、ＳＭＭＤ法では、上記の変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０をＥＣＡ（Electrochemial array）チップとしてアレイ状に形成することにより、多数の変異を同時進行的に検出することができる。
【００７５】
従って、本発明に係る妊孕性診断キットがＳＭＭＤ法により上記の置換変異の有無を検出するものである場合、妊孕性診断キットには、特別プライマー１２、カウンタープライマー１３、変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０などが含まれていることが好ましい。なお、変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０は、何れか一方のみでもよい。
【００７６】
上記特別プライマー１２は、配列番号１に示すヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位よりも下流の所定領域と相補的な塩基配列からなるオリゴマー１２ａと、タグ１２ｂとからなる。タグ１２ｂは、配列番号１に示すヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８４位から、オリゴマー１２ａがハイブリダイゼーションする部位までの領域と相補的な塩基配列を有しており、オリゴマー１２ａの５’末端に連結される。一方、上記カウンタープライマー１３は、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位よりも上流の所定領域と同一の塩基配列からなる。
【００７７】
また、上記変異型プローブ２０は、ヒト変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子と同一の塩基配列からなり、かつ、第２８３位の塩基（Ｔ）が３’末端になるオリゴマーを有するように設計される。また、上記野生型プローブ３０は、ヒト野生型Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子と同一の塩基配列からなり、かつ、第２８３位の塩基（Ｃ）が３’末端になるオリゴマーを有するように設計される。
【００７８】
上記の構成によれば、被験者のＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子が置換変異型の場合、特別ターゲット１５は、変異型プローブ２０とライゲーションできるが、野生型プローブ３０とはライゲーションできない。一方、被験者のＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子が野生型の場合、特別ターゲット１５は、野生型プローブ３０とライゲーションできるが、変異型プローブ２０とはライゲーションできない。
【００７９】
なお、上記の各方法において、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子のセンス鎖（コドンをコードする側の鎖）を調べることによって置換変異の有無を判定する構成について詳細に説明したが、アンチセンス鎖を調べることによっても同様に判定することができるのはいうまでもない。
【００８０】
本明細書では、ヒト野生型Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の代表的な塩基配列として、配列番号１に示す塩基配列を例示したが、特許請求の範囲に記載の「ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子」及び「ヒト野生型Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子」は、配列番号１に示された塩基配列のもののみに限定されない。なぜならば、ヒト遺伝子には多くの一塩基多型が存在し、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子においても例外ではないからである。従って、特許請求の範囲に記載の「ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子」及び「ヒト野生型Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子」には、配列番号１に示される塩基配列のみならず、配列番号１に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドからなり、かつ妊孕性に関与するポリヌクレオチド（すなわち、自身のコードするポリペプチドが配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド）も含まれ、特に、配列番号１に示される塩基配列において一塩基多型により１又は数個の塩基が置換された塩基配列のものも含まれる。
【００８１】
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、２０個以下が好ましく、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下の塩基を意図する。このことは、ヒト変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子についても同様である。
【００８２】
（２．ポリヌクレオチド及びポリペプチド）
次に、本発明に係るポリヌクレオチドについて説明する。本発明に係るポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第２８３位の塩基がＴに置換した塩基配列からなるものである。
【００８３】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列からなるものであってもよい。ただし、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列に限定されない。本発明に係るポリヌクレオチドには、配列番号３に示される塩基配列のみならず、配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドからなり、かつ低妊孕性又は不妊症に関与するポリヌクレオチドも含まれ、特に、配列番号３に示される塩基配列において一塩基多型により１又は数個の塩基が置換された塩基配列のものも含まれる。
【００８４】
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、２０個以下が好ましく、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下の塩基を意図する。
【００８５】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」、または「核酸分子」と同義であり、ヌクレオチドの重合体を指す。本明細書において、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と同義であり、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００８６】
上記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の何れであってもよい。さらに、ＤＮＡの場合、二本鎖、一本鎖の何れであってもよい。さらに、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）でもよいし、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）でもよい。
【００８７】
なお、上記ポリヌクレオチドは、その５’末端又は３’末端に、タグ標識（タグ配列又はマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドが連結されていてもよい。
【００８８】
上記ポリヌクレオチドを取得する方法としては、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。具体的には、上記第２８３位の塩基がＴに置換した変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子を有している人のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって得ることもできるし、また、変異を入れたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、野生型Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子から得ることもできる。
【００８９】
また、上記ポリヌクレオチドは、組換えベクターに挿入されていてもよい。この組換えベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【００９０】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択できる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に上記ポリヌクレオチドからヒト変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１タンパク質を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記ポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００９１】
上記発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に応じた発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【００９２】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１タンパク質を回収・精製することができる。
【００９３】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、上記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【００９４】
上記組換えベクターを使用すれば、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入することができ、結果として当該生物または細胞中に変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１タンパク質を発現させることができる。さらに、上記組換えベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１タンパク質を選択的に合成することができる。
【００９５】
また、上述した組換えベクターを含み、かつ、上述した変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１タンパク質を細胞に発現させるために用いられる発現キットの形態にしてもよい。
【００９６】
上記発現キットには、上記の組換えベクター以外の他の試薬を含んでいてもよい。他の試薬としては、例えば、組換えベクターを宿主細胞に導入するための導入用試薬、その宿主細胞、組換えベクターが宿主細胞内に導入されているかどうかを検定するためのプローブ群などが挙げられるがこれに限定されない。つまり、変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１タンパク質の発現実験を、確実かつ簡便にできるように支援する試薬であればどのようなものが含まれていてもよい。上記発現キットを用いることにより、目的の宿主細胞において、確実に、かつ簡便に、変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１タンパク質を発現させることができる。
【００９７】
また、本発明に係るポリペプチドは、上述したポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるものである。
【００９８】
一実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるものであってもよい。ただし、本発明に係るポリペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列に限定されない。本発明に係るポリペプチドには、配列番号４に示されるアミノ酸配列のみならず、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低妊孕性又は不妊症に関与するタンパク質も含まれ、特に、配列番号４に示されるアミノ酸配列において一塩基多型により１又は複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列のものも含まれる。
【００９９】
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、２０個以下が好ましく、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下のアミノ酸残基を意図する。
【０１００】
本明細書において、「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と同義である。また、本発明に係るポリペプチドは、天然供給源より単離したものであっても、化学合成したものであってもよい。
【０１０１】
「単離した」ポリペプチドとは、天然の環境から取り出されたポリペプチドを指す。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生ポリペプチドは、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドと同様に、単離されていると考えられる。本発明に係るポリペプチドは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドの利用方法に従って取得することができる。
【０１０２】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）において組換え技術によって産生された産物を含む。なお、上記ポリペプチドは、組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、グリコシル化されたり、非グリコシル化されたりしたものであってもよい。さらに、上記ポリペプチドは、宿主媒介プロセスの結果として、翻訳開始を示すメチオニン残基が改変されたものであってもよい。
【０１０３】
本発明に係るポリヌクレオチド、発現ベクター、又はポリペプチドによれば、ヒトの不妊症患者に見られる置換変異型Ｃｅｎｔｒｉｎ１タンパク質が得られる。従って、ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位の塩基の置換変異に起因する不妊症の治療を目的とした薬剤及び治療方法を開発する上で、極めて有用なツールを得ることができる。
【実施例】
【０１０４】
（３．ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子における置換変異の解析）
（３−１．材料及び方法）
（３−１−ａ．参加者）
不妊症の日本人男性被験者（Ｎ＝２８２）を精子形成の欠損の程度に基づいてサブグループに分割した。これらの不妊症被験者のうち、１９２人（６８％）は非閉塞性無精子症であり、９０人（３２％）は重症精子過少症（＜５×１０６細胞／ｍＬ）であった。遺伝的要因を調べたところ、これらの被験者は何れも原発性特発性不妊症であった（Birmingham A et al. Fertil Steril 2004; 9: 2313-2317）。
【０１０５】
一方、妊孕性が確認された男性のコントロールグループ（Ｎ＝９６）として、産婦人科医院にいる妊婦のもとに生まれた子供の父親を選択した。
【０１０６】
なお、ドナーは、本研究において血液をゲノムＤＮＡの解析に使用することに同意した。
【０１０７】
（３−１−ｂ．ＰＣＲ増幅ＤＮＡのダイレクトシーケンシングによるＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の変異の同定）
以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って処理を行った。ゲノムＤＮＡは、プロテアーゼ処理及びフェノール抽出により血液サンプルから単離した（Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21）。また、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子を含む領域を増幅させるために、ＰＣＲに用いるプライマーの組として、ＰｒｉｍｅｒＦ１及びＰｒｉｍｅｒＲ１を設計した（図１参照）。ＰｒｉｍｅｒＦ１は、図１に示すように、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の上流領域（Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の翻訳開始点を＋１とすると−１０４〜−８５の領域）と同一の塩基配列（配列番号５；５’−ＧＣＧＴＴＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＧ−３’）からなる。また、ＰｒｉｍｅｒＲ１は、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の下流領域（＋１１４８〜＋１１７１の領域）と相補的な塩基配列（配列番号６；５’−ＴＡＣＡＴＡＣＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＴＡＡＡＣＣＣ−３’）からなる。
【０１０８】
ＰＣＲは以下の条件で行った：９８℃で１０秒間変性、６２℃で３０秒間アニーリング、及び７２℃で１分間伸長を１サイクルとして、これを３５サイクル。ＰＣＲ増幅フラグメントはＳＵＰＲＥＣ  ＰＣＲスピンカラム（タカラバイオ）を用いて精製した。
【０１０９】
ＰｒｉｍｅｒＦ１及びＰｒｉｍｅｒＲ１からなるプライマーの組によって増幅したフラグメント（約１．３ｋｂ）に対して、上述したＰｒｉｍｅｒＦ１、ＰｒｉｍｅｒＲ１、そして新規のＰｒｉｍｅｒＦ２、ＰｒｉｍｅｒＲ２のそれぞれを用いてシーケンシングを行った。なお、ＰｒｉｍｅｒＦ２は、図１に示すように、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の内側領域（＋５３７〜−５５６の領域）と同一の塩基配列（配列番号７；５’−ＡＡＧＴＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣ−３’）からなる。また、ＰｒｉｍｅｒＲ２は、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の内側領域（＋６１７〜＋６４０の領域）と相補的な塩基配列（配列番号８；５’−ＡＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＧＧＧＧ−３’）からなる。このとき、サーマルサイクルシーケンシングキット（アプライドバイオシステムズ）を用いて反応を行い、反応産物をＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）によって解析した。両方向の決定結果を比較し、塩基配列を決定した。
【０１１０】
（３−２．結果）
不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のそれぞれについてＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の塩基配列を解析したところ、Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者の中に１人見出された。この被験者は、精子濃度が６００万／ｍｌの乏精子症（oligo-asthenozoospermia）であり、かつ精子の運動率が０％の精子無力症であった。一方、妊孕性確認被験者からは、上記の置換変異が全く見出されなかった。
【０１１１】
配列番号１に示すヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の第２８３位のシトシン塩基がチミン塩基に置換すると、この部位が終止コドンをコードするようになる。その結果、配列番号２に示すＣｅｎｔｒｉｎ１タンパク質の第９５位のグルタミン以降のアミノ酸が欠失する（配列番号５参照）。
【０１１２】
Ｃｅｎｔｒｉｎ１遺伝子は哺乳類に広く保存されていること、並びに、そのタンパク質が精巣の半数体生殖細胞に特に強く発現することから、Ｃｅｎｔｒｉｎ１タンパク質の変異（又は発現量低下）は、男性不妊を引き起こす（或いは引き起こしやすい）と考えられる。従って、上記の置換変異が見出された上記被験者は、正常なＣｅｎｔｒｉｎ１タンパク質の翻訳量が低減したことにより、不妊症になったものと推測された。
【０１１３】
なお、本研究により、上記の置換変異以外にも様々な一塩基多型がＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子内に見出されたが、これらの一塩基多型は、そのパターンが不妊症被験者と妊孕性確認被験者との間で有意な相違を見せず、特に妊孕性に影響を与えるものとは認められなかった。
【０１１４】
本発明は上述した実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１１５】
また、本明細書で示した数値範囲以外であっても、本発明の趣旨に反しない合理的な範囲であれば、本発明に含まれることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明に係る妊孕性診断キットは、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定に用いることができるので、医療現場において利用可能である。
【０１１７】
また、本発明に係るポリヌクレオチド、発現ベクター及びポリペプチドは、上述した遺伝子の変異に基づく不妊症患者において見られる変異型のポリペプチドを提供するものである。従って、この変異型のポリペプチドを利用して研究を行うことにより、有効な薬剤や治療法の確立が期待される。これらのポリヌクレオチド、発現ベクター及びポリペプチドは、研究現場へ販売することができ、十分に産業上利用可能である。また、これらをキット化することにより、産業上の利用可能性は一層向上する。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】ヒトＣｅｎｔｒｉｎ１遺伝子の構造を示す模式図である。
【図２】インベーダー法の原理を説明する模式図である。
【図３】ＳＭＭＤ法の原理を説明する模式図である。
【符号の説明】
【０１１９】
１    ターゲット遺伝子
１ａ  変異検出部位
２    インベーダープローブ
３    シグナルプローブ
３ａ  ヌクレオチド
３ｂ  フラップ
３ｃ  フラップ遊離体
４    フラップエンドヌクレアーゼ
５    フレットプローブ
５ａ  ヌクレオチド
５ｂ  蛍光色素
５ｃ  クエンチャー
１１    遺伝子
１１ａ・１１ｂ  変異検出部位
１２    特別プライマー
１２ａ  オリゴマー
１２ｂ  タグ
１３    カウンタープライマー
１４    ＰＣＲ産物
１５    特別ターゲット
２０    変異型プローブ
２５    金電極
３０    野生型プローブ
【図１】
2008237114.tif 000002
【図２】
2008237114.tif 000003
【図３】
2008237114.tif 000004
【配列表】
2008237114000001.app