(57)【要約】【課題】簡便、迅速かつ正確にイタリアンライグラスの品種識別を行うためのプライマー対及びその品種識別方法を提供する。【解決手段】イタリアンライグラスのゲノム上のＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いてプライマー対として設計し、対象となるイタリアンライグラスはバルクすることで個体間の遺伝子型のばらつきを平均化し、品種特異的なＳＳＲをＰＣＲで特異的に増幅させ、増幅された断片の長さの違いを検出することで品種の識別を行う。【効果】従来法と比べて、必要とする工程数が少なく、複数個体のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用するイタリアンライグラスの品種識別方法を提供することができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イタリアンライグラスの品種識別用のプライマーであって、イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
【請求項２】
イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜１１のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号１２〜２２のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを1対とするプライマー対である、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
請求項２に記載のプライマー対の単数又は複数の組み合わせからなることを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別用プライマーセット。
【請求項４】
イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する請求項１又は２に記載のプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のイタリアンライグラスＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別方法。
【請求項５】
アキアオバ（４倍体）、ウヅキアオバ、サチアオバ、シワスアオバ、ナガハヒカリ（４倍体）、ニオウダチ、ハタアオバ、ヒタチヒカリ（４倍体）、ミナミアオバ、ミユキアオバ（４倍体）、ワセアオバ、ワセユタカの１２品種からなるイタリアンライグラス品種を識別する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
識別対象のイタリアンライグラス遺伝子の特定マーカーをＰＣＲ法で増幅し、そのマーカーのサイズ又はバンドパターンに基づいて品種の識別を行う、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したイタリアンライグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に数品種の識別を行う、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項８】
単数又は複数のプライマーを使用し、対象となるイタリアンライグラス１２品種内の品種についてＰＣＲ増幅を行い、その増幅断片を比較することで品種を識別する、請求項４又は５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イタリアンライグラスの品種識別用のプライマー及びその利用に関するものであり、更に詳しくは、イタリアンライグラス１２品種を識別することを可能とする、特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対及びその利用に関するものである。本発明は、イタリアンライグラスの品種識別用のＳＳＲプライマー及び該プライマーを利用してイタリアンライグラスのゲノムＤＮＡを増幅させ、その増幅断片を比較することで品種を識別することを可能とするイタリアンライグラス１２品種の識別方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
イタリアンライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ  Ｌａｍ．）は、主に飼料作物として利用される短年生の他殖性のイネ科植物である。イタリアンライグラスの品種識別法として、イタリアンライグラスの５品種を識別する品種識別法が開発されている（特許文献１参照）。
【０００３】
この方法では、ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法を用いてヌクレオチドの出現頻度を調べることにより、ミナミアオバ、ニオウダチ、シワスアオバ、ワセアオバ、ワセユタカの５品種内で、対象品種であるか否かを特定している。
【０００４】
しかし、従来の方法では、ヌクレオチドの出現頻度を調べるために、個体でのＤＮＡ抽出を行う必要があり、なおかつＡＦＬＰ法が用いられているため、制限酵素処理の後、Ｐｒｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅ及びＳｅｌｅｃｔｉｖｅの２回の遺伝子増幅反応（ＰＣＲ）を行う必要があり、品種を特定するまでに多くの工程を要し、また、ヌクレオチドの出現頻度を調べているために、個体単位での解析を必要としている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２０１６２４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、個体単位の解析ではなく、複数個体を解析対象として、短時間で、正確にイタリアンライグラス１２品種を識別できる新しい識別手法を開発することを目標として鋭意研究を重ねた結果、イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマーから増幅されるマーカーを用いることにより所期の目的を達成し得ることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、ＡＦＬＰ法を用いる従来の方法よりも、必要とする工程数を減らし、個体単位の解析ではなく、複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとすることにより、時間の短縮を行い、なおかつ正確なイタリアンライグラスの品種識別を可能にするＰＣＲ用のプライマー対、及び該プライマー対を利用したイタリアンライグラスの品種識別方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）イタリアンライグラスの品種識別用のプライマーであって、イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
（２）イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜１１のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号１２〜２２のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを1対とするプライマー対である、前記（１）に記載のプライマー対。
（３）前記（２）に記載のプライマー対の単数又は複数の組み合わせからなることを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別用プライマーセット。
（４）イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する前記（１）又は（２）に記載のプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のイタリアンライグラスＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別方法。
（５）アキアオバ（４倍体）、ウヅキアオバ、サチアオバ、シワスアオバ、ナガハヒカリ（４倍体）、ニオウダチ、ハタアオバ、ヒタチヒカリ（４倍体）、ミナミアオバ、ミユキアオバ（４倍体）、ワセアオバ、ワセユタカの１２品種からなるイタリアンライグラス品種を識別する、前記（４）に記載の方法。
（６）識別対象のイタリアンライグラス遺伝子の特定マーカーをＰＣＲ増幅し、そのマーカーのサイズ又はバンドパターンに基づいて品種の識別を行う、前記（４）又は（５）に記載の方法。
（７）対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したイタリアンライグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に数品種の識別を行う、前記（４）又は（５）に記載の方法。
（８）単数又は複数のプライマーを使用し、対象となるイタリアンライグラス１２品種内の品種についてＰＣＲ増幅を行い、その増幅断片を比較することで品種を識別する、前記（４）又は（５）に記載の方法。
【０００９】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、イタリアンライグラスの品種識別用のプライマーであって、イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対の点に特徴を有するものである。また、本発明は、イタリアンライグラスの品種識別方法であって、イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する上記のプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のイタリアンライグラスＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするものである。
【００１０】
本発明では、イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマー対から、識別対象のイタリアンライグラス遺伝子の特定マーカーをＰＣＲ増幅し、そのマーカーのサイズ又はバンドパターン（複数の遺伝子座のバンドの有無による組み合わせ）を確認することで品種の識別を行う。
【００１１】
本発明では、個体単位での解析が不要となるため、対象品種のバルクＤＮＡを使用したイタリアンライグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に数品種の識別を行う。他殖性であるイタリアンライグラスは、個体間で遺伝的に異なるが、バルクＤＮＡをテンプレートとして用いることによって、この品種の非特異的な個体間の差異を無くし、かつ効率よく品種の識別が可能となる。
【００１２】
本発明では、２〜３塩基が高頻度に繰り返された配列からなるＳＳＲ領域の両側を挟むように設計した遺伝子増幅用プライマーの１１対のプライマー（表１参照）で、単数又は複数のプライマー対を使用し、対象となるイタリアンライグラス１２品種についてＰＣＲ増幅を行い、その増幅断片を比較することで品種を識別する。
【００１３】
本発明では、実際の使用時にバルクＤＮＡをテンプレートとすることを想定し、品種特異的なＳＳＲマーカーを選抜するため、対象品種のゲノムＤＮＡを複数個体バルクしたＤＮＡをテンプレートとすることにより識別を行う。そのため、本発明では、例えば、濃度を一定にしたイタリアンライグラスのＤＮＡを１０個体合わせて、バルクＤＮＡテンプレートとして使用する。
【００１４】
本発明で使用されるＳＳＲプライマー対は、プライマー設計ソフトウエア「Ｐｒｉｍｅｒ５．０，ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｒｉｍｅｒ０．５」を使用して作成した。本発明のイタリアンライグラスの品種識別に有用なプライマー対の配列を表１に示す。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
次に、上記プライマー対の１２品種内での増幅型の詳細について説明する（表２参照）。「Ａ０４Ａ２３」は、ウヅキアオバを識別するプライマー対で、１７５ｂｐ付近〜２００ｂｐの間で他品種とは異なる増幅パターンを示す。「Ａ１０Ｅ１１」は、ハタアオバを識別するプライマー対で、１７５ｂｐ付近で他品種とは異なる増幅パターンを示す。
【００１７】
「Ｂ０１Ａ１８」は、ナガハヒカリを識別するプライマー対で、２００〜２３０ｂｐの間で増幅しないというパターンを示す。「Ｂ０２Ｆ２１」は、ニオウダチを識別するプライマー対で、２００〜２３０ｂｐの間で他品種とは異なる増幅を示す。「Ｂ０８Ｆ０６」は、ワセユタカを識別するプライマー対で、１４５ｂｐで増幅を示す。しかし、同サイズにシワスアオバの増幅が見られることがあり、「Ｃ０６Ｌ２２」プライマー対を使用し、シワスアオバと比較する必要がある。
【００１８】
「Ｃ０３Ｎ０３」は、サチアオバを識別するプライマー対で、２５５ｂｐ付近で他品種とは異なる増幅を示す。「Ｃ０６Ｌ２２」は、アキアオバ及びシワスアオバを識別するプライマー対で、１４５〜２５５ｂｐの間でアキアオバは他品種とは異なる増幅パターンを示し、２３０〜２５５ｂｐの間でシワスアオバは他品種とは異なる増幅を示す。「Ｃ０７Ｈ０６」は、ヒタチヒカリを識別するプライマー対で、２５５ｂｐ付近で他品種とは異なる増幅を示す。
【００１９】
「Ｄ０１Ｃ１０」は、ワセアオバを識別するプライマー対で、２５５ｂｐ付近で他品種とは異なる増幅を示す。「Ｄ０２Ｃ２２」は、ミナミアオバを識別するプライマー対で、１４５ｂｐ付近で他品種とは異なる増幅を示す。「ＩＲＧａ０９」は、ミユキアオバを識別するプライマー対で、２５５ｂｐ付近で他品種とは異なる増幅を示す。上記のプライマー対を１２品種内で比較した場合、見られるバンドパターンを次の表２に簡単に示す。
【００２０】
【表２】
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【００２１】
本発明では、国内で育成された国内で育成されたイタリアンライグラスのアキアオバ、ウヅキアオバ、サチアオバ、シワスアオバ、ナガハヒカリ、ニオウダチ、ハタアオバ、ヒタチヒカリ、ミナミアオバ、ミユキアオバ、ワセアオバ、ワセユタカの１２品種からＣＴＡＢ法を用いてゲノムＤＮＡを抽出する。
【００２２】
抽出したＤＮＡ溶液は、一定濃度に調整し、１０個体を混合し、バルクしたものをＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡとして用いる。この場合、混合する個体数は、１０個体に制限されるものではなく、８〜１２の個体数を混合し、バルクすることができる。
【００２３】
イタリアンライグラス対象品種から抽出したバルクＤＮＡを用いてＰＣＲ反応液を調製する。ＰＣＲ反応液及びＰＣＲ条件は、後記する実施例に示したものが好適であるが、これらに制限されるものではなく、使用する機器に応じて適宜修正することができる。
【００２４】
ＰＣＲ増幅産物は、色素マーカーを加え、ディネーチャーを行った後、遮光し、氷上に静置して安定化させる。次いで、アクリルアミドゲルを使用して電気泳動を行い、マーカーの増幅を確認する。本発明では、イタリアンライグラスの１２品種のバルクＤＮＡを使用して電気泳動を行い、１２品種内の複数の品種を同時に比較することができる。
【００２５】
本発明では、識別対象のイタリアンライグラス遺伝子の特定マーカーをＰＣＲ増幅し、そのマーカーのサイズを確認することにより、又はバンドパターンを確認する、すなわち、複数の遺伝子座のバンドの有無による組み合わせを確認することにより、品種の識別を実施する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、イタリアンライグラスの品種を識別するイタリアンライグラスのＳＳＲマーカーが提供される。
（２）単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、イタリアンライグラスの品種識別を行うことができる。
（３）本発明により、アキアオバ、ウヅキアオバ、サチアオバ、シワスアオバ、ナガハヒカリ、ニオウダチ、ハタアオバ、ヒタチヒカリ、ミナミアオバ、ミユキアオバ、ワセアオバ、ワセユタカからなる１２品種相互での品種識別を行うことができる。
（４）個体単位の解析ではなく、複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとすることにより、従来法と比べて解析時間の短縮及び正確な品種識別が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
次に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
本実施例で使用した機器は、以下の通りである。
Ｔ  ＧＲＡＤＩＥＮＴ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）及び、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＡＢＩ）、ＤＮＡシーケンシングシステムＬＩＣ−４２００Ｌ（ｓ）（アロカ）。
【００２９】
本実施例で使用した試薬は、以下の通りである。
〈５０％アクリルアミドゲル〉
尿素（和光純薬工業株式会社）、Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｇｅｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ用（タカラバイオ株式会社）、１０ｘＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ（和光純薬工業株式会社）。
【００３０】
〈ＰＣＲ反応液〉
Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ（和光純薬工業株式会社）、１ｐｍｏｌ／μｌ  Ｍ１３  Ｆｏｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒは、ＩＲＤ７００もしくはＩＲＤ８００の蛍光標識を含む（日清紡）。尚、色素マーカーは、５０−３５０ｂｐ  ＳＩＺＩＮＧ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ−ＢＵＬＫ（アロカ）を用いた。また、アロカ社のプロトコールに基づいてゲルと色素マーカーの作成を行った。
【００３１】
本実施例では、イタリアンライグラスのアキアオバ、ウヅキアオバ、サチアオバ、シワスアオバ、ナガハヒカリ、ニオウダチ、ハタアオバ、ヒタチヒカリ、ミナミアオバ、ミユキアオバ、ワセアオバ、ワセユタカの１２品種をテンプレートとして使用した。
【００３２】
国内で育成されたイタリアンライグラスのアキアオバ、ウヅキアオバ、サチアオバ、シワスアオバ、ナガハヒカリ、ニオウダチ、ハタアオバ、ヒタチヒカリ、ミナミアオバ、ミユキアオバ、ワセアオバ、ワセユタカの１２品種の原種からＣＴＡＢ法を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００３３】
抽出したＤＮＡ溶液は、滅菌水でＤＮＡ濃度を５０ｎｇ／μｌに調整し、１０個体を混合し、バルクしたものをＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡとして用いた。
【００３４】
〈ＰＣＲ反応液：計１０μｌ〉
イタリアンライグラス対象品種から抽出したバルクＤＮＡ：１μｌ
１０ｘＧｅｎｅ  Ｔａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ：０．８μｌ
ｄｄＨ２Ｏ：６．５μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆｏｒｗａｄ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．０６μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．３μｌ
Ｍ１３Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒ：０．３μｌ
Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ（５  ｕｎｉｔ／μｌ）：０．１μｌ
【００３５】
〈ＰＣＲ条件〉
９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（２サイクル）９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（１０サイクル。１サイクルごとに６５℃を１℃ずつ下げていく）９５℃１分−５５℃１分−７２℃１分３０秒（３０サイクル）で反応させる。ＰＣＲ増幅産物は、色素マーカー５μｌを加え、９０℃３分のディネーチャーを行った後、遮光し、氷上で１時間以上静置させることで安定させた後、アクリルアミドゲルを使用して電気泳動を行い、マーカーの増幅を確認した。
【００３６】
本実施例では、イタリアンライグラスの１２品種それぞれのバルクしたＤＮＡを４サンプル使用して電気泳動を行い、１２品種を同時に比較した。
【００３７】
「Ａ０４Ａ２３」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１に示す。このプライマー対では、ウヅキアオバのみ１７５ｂｐ〜２００ｂｐの間に他品種とは異なる増幅が示され、ウヅキアオバの識別に有効である。また、２０４〜２３０ｂｐに見られるシワスアオバの増幅も特異的なものである。
【００３８】
「Ａ１０Ｅ１１」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図２に示す。このプライマー対では、１７５ｂｐ付近でハタアオバのみ他品種とは異なる増幅パターンを示し、ハタアオバの識別に有効である。
【００３９】
「Ｂ０１Ａ１８」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図３に示す。このプライマー対では、ナガハヒカリのみが２００ｂｐ以上の増幅が無いという増幅パターンを示し、ナガハヒカリの識別に有効である。
【００４０】
「Ｂ０２Ｆ２１」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図４に示す。このプライマー対では、ニオウダチの２００〜２３０ｂｐの間に他品種とは異なる増幅を示し、ニオウダチの識別に有効である。２００ｂｐ〜２３０ｂｐの間にアキアオバでも増幅が見られるが、ニオウダチよりもアキアオバの増幅サイズが大きく、この２つの品種で増幅されるバンドは異なっている。
【００４１】
「Ｂ０８Ｆ０６」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図５に示す。このプライマー対では、１４５ｂｐでワセユタカが他品種とは異なる増幅を示し、ワセユタカの識別に有効である。また、同サイズにシワスアオバで、増幅が見られることもあり、「Ｃ０６Ｌ２２」プライマー対を使用してシワスアオバの比較を行う必要がある。
【００４２】
「Ｃ０３Ｎ０３」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図６に示す。このプライマー対では、２３０ｂｐ〜２５５ｂｐの間にサチアオバで他品種とは異なる増幅を示し、サチアオバの識別に有効である。２３０ｂｐ〜２５５ｂｐの間には、アキアオバでの増幅も見られるが、サチアオバよりもアキアオバの増幅サイズが小さく、この２つの品種では増幅されるバンドは異なっている。
【００４３】
「Ｃ０６Ｌ２２」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図７に示す。このプライマー対では、アキアオバが１７５ｂｐに増幅した後１７５ｂｐ以上の増幅は見られないというパターンを示し、その他に、２３０〜２５５ｂｐの間でシワスアオバのみ他品種とは異なる増幅パターンを示しており、アキアオバとシワスアオバの２品種を識別するのに有効である。
【００４４】
「Ｃ０７Ｈ０６」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図８に示す。このプライマー対では、２３０ｂｐ〜２５５ｂｐの間でヒタチヒカリが他品種とは異なる増幅を示し、ヒタチヒカリの識別に有効である。
【００４５】
「Ｄ０１Ｃ１０」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図９に示す。このプライマー対では、２５５ｂｐ〜３００ｂｐの間でワセアオバが他品種とは異なる増幅を示し、ワセアオバの識別に有効である。
【００４６】
「Ｄ０２Ｃ２２」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１０に示す。このプライマー対では、１４５ｂｐから１７５ｂｐの間でミナミアオバが他品種とは異なる増幅を示し、ミナミアオバの識別に有効である。
【００４７】
「ＩＲＧａ０９」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１１に示す。このプライマー対では、２５５ｂｐでミユキアオバが他品種とは異なる増幅を示し、ミユキアオバの識別に有効である。２５５ｂｐ付近ではアキアオバでの増幅も見られるが、この２つの品種では、ミユキアオバよりもアキアオバの増幅サイズが小さく、この２つの品種で増幅されるバンドは異なっている。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
以上詳述したように、本発明は、イタリアンライグラスの品種識別に有用なＳＳＲプライマー対及びその利用に係るものであり、本発明により、イタリアンライグラス１２品種を特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対を提供することができる。また、本発明は、単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、イタリアンライグラスの品種識別を行うことができる。本発明により、アキアオバ、ウヅキアオバ、サチアオバ、シワスアオバ、ナガハヒカリ、ニオウダチ、ハタアオバ、ヒタチヒカリ、ミナミアオバ、ミユキアオバ、ワセアオバ、ワセユタカからなる１２品種相互での品種識別を行うことができる。本発明は、短い時間で、正確なイタリアンライグラスの品種識別を可能にする新しい品種識別方法を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例におけるＡ０４Ａ２３を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。Ｍはサイズマーカーを示し、１４５〜３００のｂｐサイズを記載。それぞれ４〜５サンプル電気泳動した結果を示す。（図２〜１１も同様）
【図２】実施例におけるＡ１０Ｅ１１を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図３】実施例におけるＢ０１Ａ１８を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図４】実施例におけるＢ０２Ｆ２１を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図５】実施例におけるＢ０８Ｆ０６を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図６】実施例におけるＣ０３Ｎ０３を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図７】実施例におけるＣ０６Ｌ２２を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図８】実施例におけるＣ０７Ｈ０６を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図９】実施例におけるＤ０１Ｃ１０を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１０】実施例におけるＤ０２Ｃ２２を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１１】実施例におけるＩＲＧａ０９を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１２】本発明のプライマーの塩基配列を示す。
【図１３】マーカーの塩基配列を示す。
【図１４】マーカーの塩基配列を示す。
【図１５】マーカーの塩基配列を示す。
【図１６】マーカーの塩基配列を示す。
【符号の説明】
【００５０】
１  ハタアオバ
２  サチアオバ
３  ミナミアオバ
４  ニオウダチ
５  ヒタチヒカリ
６  ミユキアオバ
７  ワセユタカ
８  ワセアオバ
９  ナガハヒカリ
１０  シワスアオバ
１１  アキアオバ
１２  ウヅキアオバ
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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