(57)【要約】      （修正有）【課題】効果的な癌の免疫療法を提供するための、ヒトの腫瘍の免疫原性を高めると共に、ヒトの抗腫瘍免疫応答を予測する動物モデルの提供。【解決手段】ワクチン評価のための動物および方法を提供する。特に、ヒト免疫不全ウイルスに対して作製したワクチンを含む、ヒトの病原体に対する免疫を付与するようデザインされたワクチンの評価のためのヒト化動物モデルを提供する。さらに、HIVワクチンにも関する。特に、弱毒化された複製可能HIVワクチンおよび複製不能HIVワクチンを提供する。また、HIVタンパク質を発現する修飾リーシュマニア(Leishmania)細胞を提供する。【選択図】図１１
2008237216.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) (i) ヒト細胞を含む免疫不全マウスと、
(ii) ヒトの病原体に由来する少なくとも1つの成分を含む注射用調製物と、
(iii) 感染性ヒト病原体を含む組成物とを提供する段階；
(b) 該マウスに該注射用調製物を注射する段階；
(c) 該注射済みマウスを該組成物に暴露する段階；および
(d)該暴露されたマウスについて、該感染性ヒト病原体による該ヒト細胞の感染の有無をモニターする段階を含む方法。
【請求項２】
免疫不全マウスが、SCID/beigeおよびSCID/nodからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ヒト細胞がヒト免疫細胞である請求項1記載の方法。
【請求項４】
段階(b)の注射が、マウスを組成物に暴露する前に、少なくとも1回は繰り返される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ヒト病原体が、ヒト免疫不全ウイルス、リーシュマニア、マイコバクテリウム、リステリア、およびマラリア原虫からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
ヒト病原体の成分が、該病原体に由来するタンパク質の少なくとも一部を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
ヒト病原体の成分がポリヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが、ウイルスの構造遺伝子を発現する能力はあるがウイルス粒子にパッケージングされる能力は持たないヒト免疫不全ウイルスゲノムをコードするプロウイルスDNAを含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドが、pHP-1、pHP-2、およびpHP-3からなる群より選択されるプラスミドDNAを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
注射用調製物が、弱毒化複製可能ヒト免疫不全ウイルスを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
弱毒化ウイルスのゲノムが、変異tat遺伝子を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ゲノムが変異nef遺伝子をさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
注射用調製物が弱毒化リーシュマニア細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
弱毒化リーシュマニア細胞が、システインプロテアーゼ遺伝子をコードする異種DNAを含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
異種DNAが、env遺伝子、gag遺伝子、pol遺伝子、tat遺伝子、rev遺伝子、vif遺伝子、vpu遺伝子、vpr遺伝子、およびnef遺伝子からなる群より選択されるヒト免疫不全ウイルス遺伝子をコードするDNAをさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
(a) (i) ヒト免疫細胞を含むSCID/beigeマウスと、
(ii) ヒト免疫不全ウイルスに由来する1つまたは複数の成分を含む注射用調製物と、
(iii) 非弱毒化ヒト免疫不全ウイルスを含む組成物とを提供する段階；
(b) 該マウスに該注射用調製物を注射する段階；
(c) 該注射済みマウスを該組成物に暴露する段階；および
(d) 該非弱毒化ヒト免疫不全ウイルスによる該ヒト免疫細胞の感染の有無について、該暴露されたマウスをモニターする段階を含む方法。
【請求項１７】
段階(b)の注射が、マウスを組成物に暴露する前に、少なくとも1回は繰り返される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
ヒト免疫不全ウイルスの成分が、該ウイルス由来のタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
ヒト免疫不全ウイルスの成分がDNAを含む、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
DNAが、ウイルスの構造遺伝子を発現する能力はあるがウイルス粒子にパッケージングされる能力は持たないヒト免疫不全ウイルスゲノムをコードするプロウイルスDNAを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
DNAが、pHP-1、pHP-2、およびpHP-3からなる群より選択されるプラスミドDNAを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
注射用調製物が、弱毒化複製可能ヒト免疫不全ウイルスを含む、請求項16記載の方法。
【請求項２３】
ウイルスゲノムが変異tat遺伝子および変異nef遺伝子を含む、弱毒化ヒト免疫不全ウイルス。
【請求項２４】
ウイルスが、 HIVCMV/tat-B、HIVCMV/AD8/nef-B/tat-B、HIVNL43/AD8/tat-B/nef-B、およびHIVNL43/nef-B/tat-Bからなる群より選択される、請求項17記載のウイルス。
【請求項２５】
免疫スポットアッセイで得られた結果の分析方法において、検出可能シグナルがコンピュータ援用ビデオイメージング手段によってデジタル画像に変換される免疫スポットアッセイの実施、および分析手段を用いた該シグナルの該デジタル画像の分析を含む方法。
【請求項２６】
シグナルが酵素基質反応によって生成される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
デジタル画像がコントラスト、グレースケール、および露出時間について最適化される、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
コンピュータ援用ビデオイメージング手段が、
(a) ビデオ画像を作製することのできるビデオカメラと、
(b) 該ビデオ画像のデジタル画像を作成することのできるイメージングソフトウェアとを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
イメージングソフトウェアがThe Imagerバージョン2.03である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
分析手段が画像処理ソフトウェアを含む、請求項25記載の方法。
【請求項３１】
免疫スポットアッセイが、細胞集団におけるサイトカインの生産を測定するものである、請求項25記載の方法。
【請求項３２】
抗原および免疫調節タンパク質を発現するように修飾された細胞を含むワクチン。
【請求項３３】
免疫調節タンパク質が、サイトカイン、共刺激分子、ケモタクチン、細胞周期の調節因子、アポトーシス誘導因子、ウイルス因子、および腫瘍サプレッサーからなる群より選択される、請求項32記載のワクチン。
【請求項３４】
細胞が、リーシュマニア、マイコバクテリウム、リステリア、およびマラリア原虫からなる群より選択される、請求項32記載のワクチン。
【請求項３５】
免疫調節タンパク質がB7-2である、請求項32記載のワクチン。
【請求項３６】
細胞が腫瘍細胞である、請求項32記載のワクチン。
【請求項３７】
抗原と少なくとも1つの免疫調節タンパク質とをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項３８】
免疫調節タンパク質が、細胞周期調節因子、アポトーシス誘導因子、ウイルス因子、および腫瘍サプレッサーからなる群より選択される、請求項37記載の発現ベクター。
【請求項３９】
免疫調節タンパク質がB7-2である、請求項37記載の発現ベクター。
【請求項４０】
十分な数のヒト免疫細胞を含む免疫不全マウスにおいて、該細胞が、該マウスにおいて持続的免疫応答を生成することができる免疫不全マウス。
【請求項４１】
ヒト免疫細胞が、CD45抗原を発現するヒトＴリンパ球を含み、CD45抗原を発現するヒト免疫細胞の少なくとも約10％が未成熟なナイーブＴリンパ球である、請求項40記載の免疫不全マウス。
【請求項４２】
ヒト免疫細胞が、CD45抗原を発現するヒトＴリンパ球を含み、CD45抗原を発現するヒト免疫細胞の少なくとも約5％が未成熟なナイーブＴリンパ球である、請求項40記載の免疫不全マウス。
【請求項４３】
ヒト免疫細胞が、CD45抗原を発現するヒトＴリンパ球を含み、CD45抗原を発現するヒト免疫細胞の少なくとも約1％が未成熟なナイーブＴリンパ球である、請求項40記載の免疫不全マウス。
【請求項４４】
マウスがSCID/beigeマウスである、請求項40記載のマウス。
【請求項４５】
ヒト腫瘍細胞をさらに含む、請求項44記載のマウス。
【請求項４６】
ヒト免疫細胞を含むSCID/beigeマウス。
【請求項４７】
ヒト腫瘍細胞をさらに含む、請求項46記載のマウス。
【請求項４８】
腫瘍細胞が樹立された腫瘍細胞である、請求項47記載のマウス。
【請求項４９】
腫瘍細胞が初代腫瘍細胞である、請求項47記載のマウス。
【請求項５０】
腫瘍細胞が中枢神経系細胞に由来する、請求項47記載のマウス。
【請求項５１】
腫瘍細胞がグリオブラストーマ細胞である、請求項50記載のマウス。
【請求項５２】
(a) (i) SCID/beigeマウスと、
(ii) ヒト腫瘍細胞と、
(iii) ヒト末梢血リンパ球とを提供する段階；
(b) 該マウスに該腫瘍細胞の初回投与量を導入する段階；
(c) 該腫瘍細胞を含む該マウスを、該リンパ球で再構成する段階；および
(d) 該腫瘍細胞の増殖について、該再構成マウスをモニターする段階を含む方法。
【請求項５３】
腫瘍細胞が少なくとも1つの免疫調節遺伝子を発現する、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
その発現が再構成マウスに導入された腫瘍細胞の増殖を阻害する少なくとも1つの免疫調節遺伝子を同定することをさらに含む、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
再構成後に、腫瘍細胞の第2回目の投与量によって再構成マウスにワクチン接種する付加的段階を含む、請求項52記載の方法。
【請求項５６】
初回投与の腫瘍細胞が非修飾腫瘍細胞を含み、第2回目投与の腫瘍細胞が放射線照射腫瘍細胞を含む、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
放射線照射腫瘍細胞が少なくとも1つの免疫調節遺伝子を発現する、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
腫瘍細胞が樹立された腫瘍細胞である、請求項52記載の方法。
【請求項５９】
腫瘍細胞が初代腫瘍細胞である、請求項52記載の方法。
【請求項６０】
腫瘍細胞が中枢神経系細胞に由来する、請求項52記載の方法。
【請求項６１】
腫瘍細胞がグリオブラストーマ細胞である、請求項52記載の方法
【請求項６２】
腫瘍細胞とリンパ球が同一のドナーから提供される、請求項52記載の方法。
【請求項６３】
腫瘍細胞とリンパ球が異なるドナーから提供される、請求項52記載の方法。
【請求項６４】
(a) (i) SCID/beigeマウスと、
(ii) 放射線照射および非照射ヒト腫瘍細胞と、
(iii) ヒト末梢血リンパ球とを提供する段階；
(b) 該リンパ球で該マウスを再構成する段階；
(c) 該放射線照射腫瘍細胞を該マウスにワクチン接種する段階； 
(d) 該ワクチン接種マウスに該放射線非照射腫瘍細胞を導入する段階：および
(e) 該放射線非照射腫瘍細胞の増殖について、該ワクチン接種マウスをモニターする段階を含む方法。
【請求項６５】
放射線照射腫瘍細胞が少なくとも1つの免疫調節遺伝子を発現する、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
その発現がワクチン接種マウスにおいて放射線非照射腫瘍細胞の増殖を阻害する少なくとも1つの免疫調節遺伝子を同定することをさらに含む、請求項64記載の方法。
【請求項６７】
腫瘍を有する被験者を治療する方法において、
(a) 抗原および少なくとも1つの別の免疫調節因子をコードする発現ベクターを提供する段階と、
(b) 該腫瘍の少なくとも一部によって、該抗原および該免疫調節因子が発現されるような条件下で、該発現ベクターを該腫瘍に導入する段階とを含む方法。
【請求項６８】
発現ベクターの導入の前に、被験者から腫瘍の少なくとも一部を除去し、該発現ベクターの該導入後に、前記抗原および前記免疫調節因子を発現する該腫瘍細胞に放射線照射し、該放射線照射腫瘍細胞を該被験者に戻して、免疫された被験者を作製する段階をさらに含む、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
抗原および免疫調節因子を発現する放射線照射腫瘍細胞の少なくとも1回の追加投与量を、免疫された被験者に導入することをさらに含む、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
免疫調節因子が、サイトカイン、共刺激分子、ケモタクチン、細胞周期の調節因子、アポトーシスの誘導因子、ウイルス因子、および腫瘍サプレッサーからなる群より選択される、請求項68記載の方法。
【請求項７１】
免疫調節因子がB7-2である、請求項70記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、1997年4月9日出願の特許出願第08/838,702号の一部継続出願である1997年5月1日出願の同時係属中の特許出願第08/848,760号の一部継続出願である。本出願は、1997年12月9日出願の米国特許出願第60/069,163号による優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明はワクチンの評価に関する。1つの態様では、本発明はヒト免疫不全ウイルスに対するワクチンを含めた、ヒトの病原体に対する免疫を与えるように設計されたワクチンの評価のためのヒト化動物モデルを提供する。さらに本発明はHIVワクチンにも関する。特に、本発明は弱毒化された複製可能HIVワクチンおよび複製不能HIVワクチンを提供する。別の態様では、本発明は腫瘍の治療のための免疫療法に関する。特に、本発明は腫瘍に対する全身性免疫を誘導する免疫調節タンパク質の組み合わせを提供し、さらに免疫遺伝子療法のためのヒト化動物モデルを提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
通常の癌の治療には化学療法剤が使用される。化学療法の父ポール・エーリッヒは、完ぺきな化学療法剤を、宿主を傷つけることなく侵入する生物体を殺す「魔法の弾丸」と考えた。この標的特異性は、抗癌剤を含め、すべての種類の化学療法剤に求められている。
【０００４】
しかし、通常の抗癌剤では、特異性は大きな問題となっている。抗癌剤の場合、薬剤は癌化した宿主細胞と、癌化していない宿主細胞とを区別する必要がある。抗癌剤の大部分は、このレベルで区別をしない。通常、抗癌剤は血液学的に悪影響（例、有糸分裂の停止ならびに骨髄およびリンパ系組織中に形成された成分の分解）および免疫抑制作用を持ち、さらに上皮組織（例、小腸粘膜）、生殖細胞系組織および神経系に深刻な影響を与える[GoodmanおよびGilman「治療薬の薬理学的基礎 (The Pharmacological Basis of Therapeutics)」(Pergamon Press、第8版)中、CalabresiおよびChabner、pp. 1209-1216（非特許文献１）]。
【０００５】
抗癌剤としての化学療法剤の成功は、多剤耐性という現象、すなわち構造的に関連のない広範囲の細胞傷害性抗癌剤に対する耐性によっても妨げられてきた[Gerlachら(1986) Cancer Surveys 5:25（非特許文献２）]。さらに、一部の癌は既知の化学療法剤に非応答性で、このような癌の患者は、診断後短期間で死亡する（例、多形性グリオブラストーマ、再発性転移性メラノーマ、乳癌、肺癌、および膵臓癌）。
【０００６】
癌の治療の化学療法の欠点を補うために、免疫系に基づいた治療法すなわち癌の免疫療法が開発された。癌の免疫療法の最終目標は、患者自身の免疫系を利用して、腫瘍を認識し、攻撃することである。腫瘍細胞の認識および拒絶には、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の関与が必要である。
【０００７】
Ｔ細胞は、外来抗原の認識、ウイルス感染細胞の破壊、およびＢ細胞が外来抗原を中和する抗体を産生するための支援の提供など、いくつもの免疫応答に重要な役割を果たしている。Ｔ細胞が標的抗原を認識するためには、抗原は、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、およびＢ細胞のような抗原提示細胞(APC)によってＴ細胞に提示されなくてはならない。APCはマウスでは主要組織適合性遺伝子複合体(MHC) およびヒトではヒト白血球抗原(HLA)と呼ばれる免疫分子を含む複合体の一部として、標的抗原を提示する。MHCには2つのクラスが知られている。すべての有核細胞に発現するMHCクラスI分子およびAPCにのみ発現するMHCクラスII分子である。クラスI分子は、内因性タンパク質断片（外来と認識されない）およびウイルス抗原（外来と認識される）を提示し、クラスII分子はエンドサイトーシスまたは貪食作用によって細胞に入ったタンパク質（主に寄生虫や細菌などの感染因子由来のタンパク質）由来のタンパク質断片を提示する。
【０００８】
Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体(TCR)/CD3複合体を介して、APC上のMHC-抗原複合体を認識する。TCR複合体はCD4またはCD8共受容体と共に、それぞれMHCクラスIIまたはIに結合する。TCRへの結合のみではＴ細胞の反応は活性化されない。活性化には、Ｔ細胞の表面に存在する共刺激分子が、これらと連結するAPC表面のリガンドに結合して提供される、抗原非依存性シグナルも必要である。共刺激タンパク質はT細胞とAPCとの相互作用を安定化し、共刺激シグナルを変換し、それによってサイトカインの分泌、T細胞の増殖、およびT細胞のエフェクター機能の誘導が起きる。共刺激なしにTCRへの結合が起きると、T細胞のアネルギー（不応答）が起きる[Schwartz (1992) Cell 71:1065(非特許文献３); LiuおよびLinsley (1992) Curr. Opin. Immunol. 4:265(非特許文献４); Allison (1994) Curr. Opin. Immunol. 6:414(非特許文献５)ならびにLinsleyおよびLedbetter (1993) Annu. Rev. Immunol. 11:191(非特許文献６)]。共刺激シグナルを必要とすることに加えて、抗原反応性T細胞の増殖が起きるためには、T細胞には増殖因子（インターロイキン-2のようなサイトカイン）が必要である。
【０００９】
共刺激分子となる可能性のある分子として、LFA-3、ICAM-1、およびCD28/CTLA-4ファミリーのメンバーなど、いくつかの細胞表面タンパク質が同定された。T細胞の表面に存在するCD28/CTLA-4ファミリーのメンバータンパク質は、インターロイキン-2 (IL-2) に駆動されるT細胞の増殖に必要な、重要な共刺激分子であることが示された。CD28/CTLA-4タンパク質のリガンドは、B7ファミリーのメンバー（B7-1、B7-2およびB7-3）である。
【００１０】
癌の免疫療法は、腫瘍の拒絶に有効な腫瘍特異的T細胞応答を誘導することを目的とする。免疫系がもともと腫瘍の同定および抑制に関与しているという説は、免疫無防備状態の患者に腫瘍の発生頻度が高いという事実で支持されている[Freiら(1993) Transplant. Proc. 25:1394(非特許文献７)]。しかし、癌の発生率を考えると、免疫機能の正常と見られるヒトにおいてさえ、免疫系はすべての腫瘍細胞を認識し破壊することができないのは明らかである。実際、動物実験では、大部分の腫瘍は、認識可能な腫瘍特異的抗原を発現していても、免疫応答を誘導しないことが示された[Boonら(1994) Annu. Rev. Immunol. 12:337(非特許文献８)およびHoughton (1994) J. Exp. Med. 180:1(非特許文献９)]。腫瘍細胞が免疫原性を持たない理由は、MHCクラスI分子の発現の欠如、抗原処理のトランスポーターのダウンレギュレーション、および腫瘍細胞上の共刺激分子の欠如など、いくつか提案されている[Garridoら(1993) Immunol. Today 14:491(非特許文献１０); Restifoら(1993) J. Exp. Med. 177:265(非特許文献１１); Crommeら(1994) J. Exp. Med. 179:335(非特許文献１２); Chongら(1996) Human Gene Ther. 7:1771(非特許文献１３)
]。
【００１１】
腫瘍細胞の免疫原性を高めるために、共刺激タンパク質および/またはサイトカインをコードする遺伝子が腫瘍細胞に導入された。その後、修飾された腫瘍細胞が抗腫瘍反応を誘導する能力（インビボまたはインビトロ）が調べられた。以下に述べるように、これらの実験は動物モデル（例、マウスおよびラット）中で行われ、結果は矛盾するものであったため、当技術分野の一部では、ヒトの治療を目的とした免疫遺伝子療法プロトコールの開発に、既存の動物モデルを使用することを疑問視する声もあった。
【００１２】
免疫遺伝子療法のための既存の動物モデルの大部分は、免疫能力のある同系動物（例、マウスおよびラット）および樹立された腫瘍細胞系を使用している。通常、樹立されたマウス腫瘍細胞系に1つの免疫遺伝子（例、マウスIL-2）を導入し、導入された免疫遺伝子を発現する細胞を同定するために、培養液中で腫瘍細胞の選択を行い、修飾された腫瘍細胞を受容マウスに注射し、マウスにおける腫瘍の存在を調べる。いくつかの実験では、マウスに放射線照射をした修飾腫瘍細胞をワクチンとして注射し、その後、非修飾腫瘍細胞を抗原投与する（ワクチン接種/抗原投与実験）。特定の免疫遺伝子の発現が、腫瘍細胞の免疫原性を高める（すなわち、腫瘍細胞の腫瘍形成能力を低下させる）ことが示された場合がある。放射線照射した同一の腫瘍によって以前に免疫またはワクチン接種をした同系動物への移植後に、その腫瘍が拒絶されれば、実験によって誘導された動物の腫瘍は、免疫原性があるといえる。非免疫原性の腫瘍は、このような条件下で拒絶されない。
【００１３】
このような同系動物の実験結果は、全体として矛盾するものだった。例えば、マウスメラノーマ細胞系B-16において共刺激分子B7-1を発現すると、1つの実験 [Wuら(1995) J. Exp. Med. 182:1415(非特許文献１４)] では、同系マウスにおいて、B7-1を発現するB-16細胞が拒絶されたが、別の実験ではB7-1を発現するB-16細胞が腫瘍を発生させることが分かった [Chenら(1994) J. Exp. Med. 179:523(非特許文献１５)]。B7-1の発現がB-16細胞の免疫原性を高めることが分かった実験では、著者らは、修飾されたB-16細胞を拒絶した動物は、非修飾または野生型B-16細胞に対して、強化された全身性免疫を示さないと報告している[Wuら前記(非特許文献１４)]。別の実験では、マウスの結腸直腸腫瘍またはメラノーマ細胞においてB7-1またはB7-2が発現すると、免疫能力のあるマウスにおいて局所的な抗腫瘍反応が観察されることが分かった [Chongら(1996) Human Gene Ther. 7:1771(非特許文献１３)]。しかし、B7-1またはB7-2を発現する直腸結腸腫瘍細胞をマウスにワクチン接種しても、全身性免疫は観察されず、メラノーマ細胞でB7-1またはB7-2が発現すると、B7発現細胞がインターフェロンγも発現している場合でも、野生型メラノーマ細胞をワクチン接種した場合と比較して、B7発現細胞が与える全身性免疫は低下していることが分かった (Chongら、前記(非特許文献１３))。
【００１４】
免疫原性の低い線維肉腫（例、MAC101、MCA102およびAg104）およびB-16メラノーマ細胞系におけるB7-1の発現は、これらの株の腫瘍形成能力を低下させないので、B7-1発現腫瘍細胞系の拒絶は、高い免疫原性を持つ細胞系に限定されていると報告されている。上述のように、B-16メラノーマ細胞系におけるB7-1の発現は、1つのグループによると、これらの細胞の腫瘍形成能力を低下させることが分かった(Wuら、前記(非特許文献１４))。この食い違いは、グループによってB7-1の発現レベルが異なると説明することができるかも知れない。しかし、B7-1のみを発現する腫瘍細胞は、確立された腫瘍の拒絶を誘導するために有効ではないことが分かった。
【００１５】
B7-1のみでは、確立された腫瘍の拒絶を誘導できなかったことは、潜在的に反応性のT細胞においてアネルギー状態が誘導されたためと仮定された。したがって、B7-1とサイトカインの組み合わせで、アネルギー状態が克服できるかどうか、調べられた。共刺激分子および様々な増殖因子またはサイトカインの組み合わせは、どちらかの種類の分子のみを使用した場合より、有効であることが示された。例えば、マウスNC腺癌細胞系におけるB7-1の発現は、免疫能力を持つ同系マウスにおけるこれらの細胞の腫瘍形成能に対して、影響を持たないことが分かった [Gaekenら(1997) Human Gene Ther. 8:477(非特許文献１６)]。しかし、B7-1およびIl-2の両方がNC腺癌細胞系で発現すると、マウスにおけるこれらの細胞の腫瘍形成能がかなり低下した。
【００１６】
既存の動物モデルは、共刺激分子およびサイトカインおよび/またはケモカインの組合わせの方が、これらのうちの1つを単独で使用するよりも、一般に好ましいことを示したが、異なるグループがこれらの分子の組み合わせを使って得たデータは、矛盾したものである。例えば、Dillooらは、IL-2およびケモカインのリンフォタクチンと混合したB細胞リンパ腫細胞A20で免疫したマウスは、強力な抗腫瘍反応を示したが、GM-CSFと混合したB細胞リンパ腫細胞で免疫したマウスの示した抗腫瘍反応は、はるかに低いと報告した [Dillooら(1996) Nature Med. 2:1090(非特許文献１７)]。これに対して、Levitskyらは、GM-CSFを発現するBリンパ腫細胞A20をマウスにワクチン接種すると、確立されているA20腫瘍を完全に拒絶したが、IL-2またはB7-1を発現するA20細胞をワクチン接種した場合には、拒絶が起こらなかったと報告した [Levitskyら(1996) J. Immunol. 156:3858(非特許文献１８)]。このような明らかに矛盾する結果を受けてDillooおよびBrennerは「現在のマウスモデルを使って、ヒトの特定の腫瘍に対する「最適な」サイトカインを選択することができると確信することは難しい」と述べている [Nature Med. (1997) 3:126(非特許文献１９)]。どのサイトカイン、共刺激分子および/またはケモタクチンまたはその組み合わせが、ヒトの特定の腫瘍の治療に最も適しているかを決定するためには、当技術分野のモデルの改良が必要なのは明らかである。
【００１７】
効果的な癌の免疫療法を提供するためには、当技術分野には、ヒトの腫瘍の免疫原性を高めると共に、ヒトの抗腫瘍免疫応答を予測する動物モデルが必要である。
【００１８】
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染の予防に効果的なワクチンの開発も、適切な動物モデルがないことが障害になっている。HIVと免疫系との複雑な相互作用を考慮すると、HIV感染およびHIVワクチン評価のインビボモデルに代用できるものはない。HIV感染およびワクチン開発に使用されている既存の動物モデルには、HIV-1感染チンパンジー、SIVまたはHIV-2感染マカク、ネコ免疫不全ウイルス感染ネコ、およびヒト細胞で再構成されHIVを感染させたscid/scidマウスなどがある。これらのモデルのいずれも、HIVワクチンの評価に理想的とはいえない。チンパンジーにおけるHIVの複製は、ヒトよりも限定されている。したがって、チンパンジーの方がHIV感染が予防しやすい可能性があるため、チンパンジーで有効なワクチンも、ヒトには有効でない可能性もある。さらに、研究に使用できるチンパンジーの数は少ないため、統計的に意味のある実験結果を得るのは難しく、チンパンジーの飼育費は高く、一旦HIVに暴露したら、チンパンジー一匹当たり10万ドル以上もの費用をかけて、死ぬまで閉じ込めておかなくてはならない [StottおよびAlmond (1995) Nat. Med. 1:295(非特許文献２０)]。マカクの場合はチンパンジーよりも供給数は多いものの、やはり飼育費が高い。最も重要なことは、マカクにHIV-1を感染させることはできないため、HIV-1の感染の代用としてHIV-2またはSIVを感染させなくてはならないということである。ヒトリンパ球で再構成されたScid/scidマウス (hu-PBL-SCIDマウス) は、HIV-1をヒト細胞に感染させることはできるが、HIVワクチンおよびHIV免疫を評価するモデルを提供することはできない。これは、再構成されたscid/scidマウスのヒトTリンパ球の大部分が、再構成後、間もなく活性化細胞の表現型を示し、ほぼすべての（>99％）ヒトT細胞が可逆的アネルギー状態にある成熟した記憶表現型を示すためである [Rizzaら、(1996) J. Virol. 70:7958(非特許文献２１); Tarry-LehmannおよびSaxon (1992) J. Exp. Med. 175:503(非特許文献２２); Tarry-Lehmannら(1995) Immunol. Today 16:529(非特許文献２３)]。したがって、再構成後に十分な数の未成熟ナイーブT細胞がないために、hu-PBL-SCIDモデルは、HIVワクチン投与後の抗HIV免疫の評価には適さない。
【００１９】
HIVワクチン研究の究極の系は、勿論ヒトである。しかし、ヒトではHIV感染がほぼ必然的に死に至ることを考えると、倫理的に、HIVワクチンの評価にヒトのボランティアを使用することが制限される。当技術分野では、HIVワクチンの評価を行うために、抗HIV免疫を評価する動物モデルが必要である。
【００２０】
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【発明の開示】
【００２１】
発明の概要
本発明はヒトの腫瘍の治療に有用な免疫調節遺伝子およびその組み合わせの同定を可能にする、新規のヒト化動物モデルを提供する。また、本発明は少なくとも1つの免疫調節遺伝子を発現するように修飾した細胞を含むワクチンを提供する。また、本発明は1つまたは複数の免疫調節遺伝子を発現するように修飾された腫瘍細胞ワクチンによって、腫瘍を持つ被験者を治療する方法も提供する。本発明の新規の動物は、癌ワクチンおよびヒトの病原体（例、HIV、マラリア、リーシュマニア等）に対するワクチンを含む、ワクチンを評価する手段を提供する。さらに、本発明は弱毒化HIV生ワクチンおよびHIV DNAワクチンを含むHIVワクチンを提供する。
【００２２】
また、本発明は持続的な免疫応答を生成する能力のある十分な数のヒト免疫細胞を含む免疫不全マウスにも関する。1つの態様では、本発明はCD45抗原を発現するヒトTリンパ球の少なくとも約10％が未成熟なナイーブTリンパ球である、CD45発現ヒトTリンパ球を含む免疫不全マウスを提供する。別の態様では、本発明はCD45抗原を発現するヒトTリンパ球の少なくとも約5％が未成熟なナイーブTリンパ球である、CD45発現ヒトTリンパ球を含む免疫不全マウスを提供する。または、CD45抗原を発現するヒトTリンパ球の少なくとも約1％が未成熟なナイーブTリンパ球である。本発明は、使用する免疫不全マウスの系統の性質によって、限定されない。好ましい態様では、免疫不全マウスはSCID/beigeマウスである。
【００２３】
別の具体的態様では、ヒトTリンパ球を含む免疫不全マウスは、さらにヒトの腫瘍細胞を含む。本発明は使用するヒトの腫瘍細胞の性質によって限定されない。ヒトの腫瘍細胞は、樹立された腫瘍細胞、初代腫瘍細胞、または1つまたは複数の免疫調節遺伝子、細胞周期調節因子をコードする遺伝子、およびアポトーシスの誘導因子をコードする遺伝子を発現するように修飾された（樹立または初代）腫瘍細胞であり得る。
【００２４】
別の態様では、本発明は例えば免疫細胞のようなヒトの細胞を含むSCID/beigeマウスを提供する。本発明はヒトの免疫細胞の性質によって限定されず、これらの細胞は、例えばヒトPBL、脾細胞、リンパ節および/または腹腔洗浄液から単離された細胞であり得る。好ましい態様では、ヒト免疫細胞を含むSCID/beigeマウスは、さらにヒト腫瘍細胞を含む。ある好ましい態様では、腫瘍細胞は中枢神経系細胞由来であり、最も好ましくはグリオブラストーマ細胞である。別の好ましい態様では、腫瘍細胞は悪性メラノーマ細胞である。
【００２５】
さらに本発明は、(a) (i) SCID/beigeマウス；(ii) ヒト腫瘍細胞、および(iii) ヒト末梢血リンパ球の提供；(b) 該マウスへの初回投与量の腫瘍細胞の導入；(c) リンパ球による腫瘍細胞を含むマウスの再構成；および (d) 再構成されたマウスにおける腫瘍細胞の増殖の観察を含む方法を提供する。
【００２６】
好ましい態様では、さらに本発明の方法は、それが腫瘍細胞で発現すると、再構成されたマウスに導入された腫瘍細胞の増殖が予防される、少なくとも1つの免疫調節遺伝子、または細胞周期調節因子をコードする遺伝子、またはアポトーシスの誘導因子をコードする遺伝子の同定を含む。別の好ましい態様では、本方法は、再構成後に、2回目の腫瘍細胞投与で再構成されたマウスをワクチン接種する別のステップを含む。好ましい態様では、第1回目に投与する腫瘍細胞には、修飾されていない腫瘍細胞が、第2回目には放射線照射した腫瘍細胞が含まれる。特に好ましい態様では、放射線照射した腫瘍細胞は、少なくとも1つの免疫調節遺伝子、または細胞周期調節因子をコードする遺伝子、またはアポトーシスの誘導因子をコードする遺伝子を発現する。
【００２７】
本発明の方法の1つの態様では、腫瘍細胞とリンパ球は同一のドナーに由来する。別の態様では、腫瘍細胞とリンパ球は異なるドナーに由来する。
【００２８】
さらに本発明は、(a) (i) SCID/beigeマウス；(ii) 放射線照射したヒト腫瘍細胞およびしない腫瘍細胞、および(iii) ヒト末梢血リンパ球の提供；(b) リンパ球による該マウスの再構成する；(c) 放射線照射した腫瘍細胞のマウスへのワクチン接種；および (d) ワクチン接種したマウスへ非照射腫瘍細胞の導入；および(e)ワクチン接種したマウスにおける非放射線照射腫瘍細胞の増殖の観察を含む方法を提供する。
【００２９】
好ましい態様では、さらに本方法は、それが発現すると該ワクチン接種マウスにおいて該非放射線照射腫瘍細胞の増殖が予防される、少なくとも1つの免疫調節遺伝子、または細胞周期調節因子をコードする遺伝子、またはアポトーシスの誘導因子をコードする遺伝子を同定することを含む。
【００３０】
また本発明は、抗原および免疫調節タンパク質を発現する細胞を含むワクチンも提供する。細胞は、例えば腫瘍細胞またはリーシュマニア、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、リステリア(Listeria)、およびマラリア原虫(Plasmodium)のような微生物であり得る。好ましくは、免疫調節タンパク質は、細胞周期の調節因子、アポトーシスの誘導因子、ウイルス因子、腫瘍サプレッサー等である。ウイルス因子は、ウイルスタンパク質およびウイルス増殖調節因子を含む。本発明のワクチンは、使用する免疫調節タンパク質の性質によって限定されない。ある具体的態様では、別の免疫調節因子はサイトカインである。好ましい態様では、サイトカインはインターロイキン2、インターロイキン4、インターロイキン6、インターロイキン7、インターロイキン12、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF) 、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子αからなる群より選択される。例示された態様では、免疫調節タンパク質B7-2をコードする遺伝子およびサイトカインGM-CSFをコードする遺伝子を発現する腫瘍細胞が提供される。
【００３１】
さらに本発明は、(a) (i) 中枢神経系の腫瘍を持つ被験者；(ii) ヒトB7-2タンパク質のような免疫調節タンパク質、および少なくとも1つの別の免疫調節因子または細胞周期調節因子またはアポトーシス誘導因子をコードする発現ベクターの提供；(b) 少なくとも腫瘍の一部で、免疫調節タンパク質および免疫調節因子（および/または細胞周期調節因子またはアポトーシスの誘導因子）が発現される条件下で、発現ベクターを腫瘍に導入することを含む、腫瘍の治療方法を提供する。好ましい態様では、さらに本方法は、発現ベクターの導入の前に、被験者から腫瘍の少なくとも一部を取り除き、該発現ベクターの導入後に、免疫調節タンパク質および免疫調節因子（および/または細胞周期調節因子またはアポトーシスの誘導因子）を発現する腫瘍細胞を放射線照射し、放射線照射した腫瘍細胞を被験者に戻して免疫された被験者を作製する段階を含む。別の態様では、さらに本方法は、免疫調節タンパク質および別の免疫調節因子（および/または細胞周期調節因子またはアポトーシスの誘導因子）を発現する放射線照射腫瘍細胞を、免疫された被験者に、少なくともさらにもう1度投与することを含む。
【００３２】
本発明は、(a) (i) SCID/beigeまたはSCID/nodマウスのような免疫不全マウスで、ヒト細胞を含むもの；(ii) ヒトの病原体由来の少なくとも1つの成分を含む注射用調製物、および(iii)ヒトの感染性病原体を含む組成物の提供；(b)注射用調製物をマウスに注射して、注射済みマウスを作製すること；(c)組成物への注射済みマウスの暴露；および (d) 暴露したマウスにおける、ヒトの感染性病原体が感染したヒト細胞の存在の観察を含む方法を提供する。好ましくは、ヒトの細胞は免疫細胞である。好ましい態様では、(b)の段階の注射は、マウスを組成物に暴露する前に少なくとも1回繰り返す。注射用調製物は、候補ワクチンを含む；候補ワクチンは、タンパク質またはペプチドまたは核酸を含み得、免疫原性を持つ可能性がある。しかし、本方法は候補ワクチンの評価手段を提供するため、候補ワクチンの中には免疫原性を持つと期待される（すなわち、タンパク質、ペプチド、または核酸が由来する病原体に対して免疫応答を誘導する能力を持つ）ものもあるが、免疫原性を持たない（および、したがってヒトのような被験者に使用するワクチンとしては却下される）と期待されるものもある。好ましい態様では、注射用調製物は免疫原性を持つ。注射用調製物は、好ましくはハンクス液、リンゲル液、生理緩衝食塩水のような、生理的適合性を持つ緩衝液中など、水性溶液のような賦形剤または薬理学的キャリアを含む可能性がある。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランのような、懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射用懸濁液としても調製できる。適当な親油性溶媒または賦形剤には、ごま油のような脂肪油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。選択的に、懸濁液には、化合物の溶解度を高めて高度に濃縮された溶液の調製を可能にするような、適当な安定剤または薬剤が含まれる可能性もある。さらに、注射用製剤にはアジュバント（例、ミョウバン、フロイント完全または不完全アジュバント、FAF-1）が含まれることもある。
【００３３】
本発明は、ヒトの病原体の性質によって限定されない。好ましい態様では、ヒトの病原体は、ヒト免疫不全ウイルス、リーシュマニア、マイコバクテリウム（例、結核菌(M. tuberculosis)）、およびマラリア原虫（マラリアの病原体）からなる群より選択される。
【００３４】
本発明は、注射用組成物中に存在するヒトの病原体の成分の性質によって限定されない。好ましい態様では、ヒトの病原体は、病原体由来のタンパク質の少なくとも一部を含む；成分は、完全なタンパク質分子または完全なタンパク質由来（ペプチド合成、組換えDNA技術、完全なタンパク質のプロテアーゼ消化で得られる）のペプチドであり得る。別の好ましい態様では、ヒトの病原体の成分にはDNAが含まれる。特に好ましい態様では、DNAには、ウイルスの構造遺伝子を発現する能力はあるが、ウイルス粒子にパッケージングされる能力を持たない、ヒト免疫不全ウイルスゲノムをコードするプロウイルスDNAが含まれる。好ましい態様では、DNAはpHP-1、pHP-2、およびpHP-3からなる群より選択されるプラスミドDNAを含む。
【００３５】
別の態様では、注射用調製物は、弱毒化した複製可能ヒト免疫不全ウイルス（すなわち、限定された感染の生成能力はあるが、好ましくは非弱毒化HIVによる感染にともなう病理的変化を生成する能力を持たない）を含む。本発明は、ウイルスを弱毒化する変化の性質によって限定されない。好ましい態様では、弱毒化ウイルスは、変異tat遺伝子を含む；好ましくは、この弱毒化ウイルスのゲノムは、機能的なTatタンパク質を発現できない。別の好ましい態様では、弱毒化ウイルスゲノムは、さらに変異nef遺伝子も含む；好ましくは、この弱毒化ウイルスのゲノムは機能的なTatタンパク質とNefタンパク質のいずれも発現できない。好ましい態様では、弱毒化ウイルスは、HIVＣＭＶ／ｔａｔ−Ｂ、HIVＣＭＶ／ＡＤ８／ｎｅｆ−Ｂ／ｔａｔ−Ｂ、HIVＮＬ４３／ＡＤ８／ｔａｔ−Ｂ／ｎｅｆ−Ｂ、およびHIVＮＬ４３／ｎｅｆ−Ｂ／ｔａｔ−Ｂからなる群より選択される。
【００３６】
別の態様では、注射用調製物は弱毒化リーシュマニア細胞を含む。本発明は、リーシュマニア細胞を弱毒化する変化の性質によって限定されない。好ましい態様では、弱毒化リーシュマニア細胞は、システインプロテアーゼ遺伝子をコードする異種DNAを含む。システインプロテアーゼ遺伝子は、リーシュマニアのシステインプロテアーゼ遺伝子、または別の生物体のシステインプロテアーゼ遺伝子であり得る。リーシュマニアのシステインプロテアーゼ遺伝子が使用されるときには、好ましくは、リーシュマニア細胞で機能するプロモーターおよび選択的にエンハンサーと、機能的に組合わせた位置で使用される。リーシュマニアのシステインプロテアーゼ遺伝子は、天然の構成（すなわち、染色体の構成）には存在しないため、異種のDNAを含むことになる。最も好ましくは、リーシュマニアのシステインプロテアーゼ遺伝子は、pALT-NeoまたはpXのような発現ベクター上に存在する。本明細書で示したように、リーシュマニア細胞におけるシステインプロテアーゼの過剰発現は、リーシュマニア細胞を弱毒化し、リーシュマニア症の予防に有効なワクチンを提供する。別の好ましい態様では、異種DNAには、さらに、env遺伝子、gag遺伝子、pol遺伝子、tat遺伝子、rev遺伝子、vif遺伝子、vpu遺伝子、vpr遺伝子、およびnef遺伝子からなる群より選択される、ヒト免疫不全ウイルス遺伝子をコードするDNAが含まれる。リーシュマニア細胞はマクロファージに感染するために、HIVタンパク質を発現するリーシュマニア細胞は、HIV抗原をAPCと共に、宿主に提示する手段を与える（すなわち、HIVワクチンを提供する）。
【００３７】
本発明はヒト免疫細胞を含むSCID/bgマウス（例、hu-PBL-SCID/bgマウス）中のヒト免疫細胞の感染の有無を検出するためのモニタリング法の性質によって限定されない。ワクチン接種および病原体を抗原投与した後にマウスから採取した血清について、病原体に対するヒト免疫グロブリンの存在を調べることができる（液性免疫の証拠）。病原体に対する細胞性免疫は、ワクチン接種および抗原投与したマウス（病原体感染PBLを刺激因子として使用）から単離されたリンパ球（例、脾細胞）によるγIFN生産のインビトロELISPOT分析を含むがこれに限定されることのない、当技術分野で周知の様々な手段によって調べることができる。さらに、マウスにおいて、抗原投与に使用した病原体が感染すると期待される部位における感染の有無を調べることもできる（例、HIVを抗原投与したマウスから採取されたリンパ球の免疫染色により、リンパ球および/またはマクロファージの内部および/または表面におけるHIVタンパク質の存在を検出する）。
【００３８】
また、本発明は、(a) (i) ヒト免疫細胞を含む、SCID/beigeマウスのような免疫不全マウス；(ii) ヒト免疫不全ウイルス（HIV）由来の1つまたは複数の成分を含む注射用調製物、および(iii)非弱毒化ヒト免疫不全ウイルスを含む組成物の提供；(b)注射用調製物をマウスに注射して、注射済みマウスを作製すること；(c)組成物への注射済みマウスの暴露；および (d) 暴露したマウスにおいて、非弱毒化ヒト免疫不全ウイルスが感染したヒトの免疫細胞の存在をモニターすることを含む方法を提供する。本発明は、使用する非弱毒化ウイルスによって限定されない；非弱毒化感染の原因となる能力を持つ任意のウイルスが使用できる。好ましくは、非弱毒化ウイルスは、AIDS患者から分離されたウイルス（すなわち臨床分離株）であるか、病原性実験室株である。特に好ましい非弱毒化HIV株には、NL4-3株、ADA株、および異なるHIV-1分岐群（例、メリーランド州ベセズダ、国立衛生研究所のNIH AIDS Research and Reference Reagent Programから入手可能な92RW008、92BR003、92HT593等）を含むHIV-1初代分離株が含まれる。
【００３９】
好ましい態様では、(b)の段階の注射を、マウスを組成物に暴露する前に少なくとも1回繰り返す。注射用調製物は、候補ワクチンを含む；候補ワクチンは、タンパク質またはペプチドまたは核酸を含み得、免疫原性を持つ可能性がある。しかし、本方法は候補ワクチンの評価手段を提供するため、候補ワクチンの中には免疫原性を持つと期待される（すなわち、タンパク質、ペプチド、または核酸が由来する病原体に対して免疫応答を誘導する能力を持つ）ものもあるが、免疫原性を持たない（および、したがってヒトのような被験者に使用するワクチンとしては却下される）と期待されるものもある。好ましい態様では、注射用調製物は免疫原性を持つ。上述のように、注射用組成物は、薬理学的キャリア、賦形剤、およびアジュバントを含む場合がある。
【００４０】
本発明は、注射用組成物中に存在するHIVの成分の性質によって限定されない。好ましい態様では、HIVの成分は、HIV由来のタンパク質の少なくとも一部を含む；成分は、完全なタンパク質分子または完全なタンパク質由来（ペプチド合成、組換えDNA技術、完全なタンパク質のプロテアーゼ消化で得られる）のペプチドであり得る。別の好ましい態様では、HIVの成分にはHIV由来のDNAが含まれる。特に好ましい態様では、DNAには、ウイルスの構造遺伝子を発現する能力はあるが、ウイルス粒子にパッケージングされる能力を持たない、HIVゲノムをコードするプロウイルスDNAが含まれる。好ましい態様では、DNAはpHP-1、pHP-2、およびpHP-3からなる群より選択されるプラスミドDNAを含む。
【００４１】
本発明は、ウイルスゲノムに変異tat遺伝子および変異nef遺伝子を含む弱毒化ヒト免疫不全ウイルスを提供する。本発明は、tatおよびnef遺伝子中の変異の性質によって限定されない：挿入、欠失、置換を用いて、tatおよびnef遺伝子を変異させることができる。好ましくは、弱毒化ウイルスのゲノムは、機能的なTatタンパク質および機能的なNefタンパク質を発現できない、変異tat遺伝子および変異nef遺伝子を含む。好ましい態様では、弱毒化ウイルスは、HIVＣＭＶ／ｔａｔ−Ｂ、HIVＣＭＶ／ＡＤ８／ｎｅｆ−Ｂ／ｔａｔ−Ｂ、HIVＮＬ４３／ＡＤ８／ｔａｔ−Ｂ／ｎｅｆ−Ｂ、およびHIVＮＬ４３／ｎｅｆ−Ｂ／ｔａｔ−Ｂからなる群より選択される。
【００４２】
さらに本発明は、複製不能ヒト免疫不全ウイルスのプロウイルスを含み、pHP-1、pHP-2、およびpHP-3からなる群より選択される、DNA構築物を提供する。
【００４３】
また、本発明は、(a) (i) SCID/beigeマウス；(ii) ヒト免疫細胞を含むヒト胎児造血組織（例、胎児肝臓、骨髄、胸腺、リンパ節）、 (iii)ヒト免疫不全ウイルスワクチン由来の1つまたは複数の成分を含む注射用調製物；(iv) 非弱毒化ヒト免疫不全ウイルスを含む組成物の提供；(b)造血組織をマウスの腎臓被膜に挿入し、移植マウスを提供すること；(c) 移植マウスにワクチンを注射して注射済みマウスを作製すること；(d)組成物への注射済みマウスの暴露；および (e) 暴露したマウスにおける、非弱毒化ヒト免疫不全ウイルスが感染したヒト免疫細胞の存在を観察することを含む方法を提供する。本発明は、使用する非弱毒化ウイルスによって限定されない；非弱毒化感染の原因となる能力を持つ任意のウイルスが使用できる。好ましくは、非弱毒化ウイルスは、AIDS患者から分離されたウイルス（すなわち臨床分離株）であるか、病原性実験室株である。特に好ましい非弱毒化HIV株には、NL4-3株、ADA株、および異なるHIV分岐群（例、メリーランド州ベセズダ、国立衛生研究所のNIH AIDS Research and Reference Reagent Programから入手可能な92RW008、92BR003、92HT593等）を含むHIV-1初代分離株が含まれる。
【００４４】
好ましい態様では、(b)の段階の注射は、マウスを組成物に暴露する前に少なくとも1回繰り返す。注射用調製物は、候補ワクチンを含む；候補ワクチンは、タンパク質またはペプチドまたは核酸を含み得、免疫原性を持つ可能性がある。
【００４５】
本発明は、酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイのような、免疫スポットアッセイから得られた結果の計数および分析方法にも関する。本方法は、アッセイで得られる検出可能シグナルがコンピュータ援用ビデオイメージングを用いてデジタル画像に変換されるような、免疫スポットアッセイの実行を含む。例示された態様では、検出可能シグナルは、検出可能な比色シグナルを生成する酵素基質反応によって、生成する。検出可能シグナルが処理されてデジタル画像が得られたら、画像は、例えばNIH Imageバージョン1.55シェアウェアのような分析ソフトウェアを用いて分析できる。本発明の方法は1色または2色の免疫スポットアッセイと使用できる。本発明の方法を用いると、免疫スポットアッセイの結果を手作業で計数する必要がなくなり、客観的で再現性のある免疫スポットアッセイ分析が可能になる。
【００４６】
定義
本発明の理解を助けるために、以下にいくつかの用語を定義する。
【００４７】
本明細書で使用される「免疫不全マウス」は、成熟したＢおよびＴリンパ球の機能または存在における少なくとも1つの欠陥を含め、免疫系の機能に欠陥を持つマウスまたはマウス系統を指す。免疫不全マウスの例には、C.B-17-SCID-nod、C.B-17scid/scidおよびC.B-17-SCID-beige系統が含まれるが、これらに限定されるわけではない。特に好ましい免疫不全マウスは、成熟Ｔ、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー(NK)細胞の欠如という特徴を持つ重症複合免疫不全を持つ（例、C.B-17-SCID-beigeマウス系統）。
【００４８】
本明細書で使用される「ヒトTリンパ球」は、ヒト由来のTリンパ球を指す。ヒトTリンパ球がヒトの血液細胞で再構成されたマウス中に存在するときは、血液（末梢血リンパ球、またはPBL）、リンパ節、脾臓、腹腔洗浄液などを含め、再生されたマウスの種々の組織から、これを得ることができる。
【００４９】
ヒトＴリンパ球は、CD3, CD4, CD8, T細胞抗原受容体 (TCR) およびCD45を含む、特定のマーカーまたは細胞表面タンパク質の存在によって識別できる。これらのマーカーがリンパ球上に存在するかどうかは、リンパ球を含む細胞懸濁液をこれらのマーカーに特異的な抗体とインキュベーション（または染色）することなどの、標準的な免疫細胞学的手法によって、決定できる。抗体は直接標識する（例、フルオレセイン、フィコエリスリン、テキサス・レッドなどのような蛍光体による）こともできるし、リンパ球の表面に結合した抗体の存在を、標識した2次抗体（1次抗体またはその成分に対する抗体）を用いて検出することもできる。その後、染色されたリンパ球は蛍光顕微鏡またはFACS（蛍光活性化セルソーター）分析を用いて、分析することができる。「成熟ヒトＴリンパ球」は、CD4、CD8のどちらか、CD3、およびTCRを発現する。「未成熟なヒトＴリンパ球」は、CD4とCD8の両方を発現する（すなわちCD4+8+である）；これらの細胞は、Ｔ前駆細胞とも呼ばれる。「未成熟なナイーブヒトＴ細胞」は、活性化されていない未成熟Ｔリンパ球であり（すなわち、TCRに特異的な抗原と出会っていない、または非特異的なマイトジェンによって刺激されていない）、ナイーブと呼ばれる。「未成熟なナイーブＴリンパ球」には、CD4+8+細胞やCD45RA+ T細胞が含まれる。
【００５０】
「ヒトCD45+ T細胞の少なくとも約5％が未成熟なナイーブTリンパ球である、CD45+ Tリンパ球を含む」マウスは、CD45+ T細胞の約5％またはそれ以上が、CD4+8+ もしくはCD45RA+のいずれかであるか、またはCD45+ T細胞のうちCD4+8+ とCD45RA+の割合の合計が少なくとも約5％であるマウスである。
【００５１】
CD45タンパク質は、赤血球を除くすべての造血細胞の表面に見られる [リンパ球抗原の事実の本 (The Leukocyte Antigen Facts Book) Barclayら(1993), Academic Press, London, UK, pp. 202-204]。リンパ細胞の種類が異なると、CD45のアイソフォームが異なる。CD45ROは活性化および記憶Ｔ細胞に見られ、CD45RAはナイーブＴ細胞上に見られる。
【００５２】
「SCID/beigeマウス」という用語は、C.B-17-SCID-beigeマウス系統を指す。SCID/beige, SCIE-beigeおよびSCID/bgという用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００５３】
「ヒト腫瘍細胞」という用語は、ヒト由来の腫瘍細胞を指す；腫瘍細胞とは、新生細胞または癌細胞である。腫瘍細胞は、「樹立された腫瘍細胞」すなわち組織培養で永久に維持できる細胞、または「初代腫瘍細胞」すなわち患者から新しく単離または外植された細胞であり得る。「初代腫瘍細胞」という用語は、5回の継代またはそれ以下の間、組織培養で維持された初代腫瘍細胞を含む。
【００５４】
「ヒト免疫細胞」という用語は、ヒト由来の免疫系の細胞（例、T, BおよびNKリンパ球、抗原提示細胞）を指す。
【００５５】
「ヒト末梢血リンパ球」という用語は、ヒトの血液に由来する、有核の非赤血球細胞を指す。末梢血リンパ球(PBL)と末梢血単核細胞(PBMC)という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００５６】
「中枢神経系細胞」という用語は、中枢神経系に由来する細胞（すなわち脳および脊髄に由来する細胞）を指す。
【００５７】
「ヒト末梢血リンパ球によって再構成された」マウスは、ヒトのPBLが導入され（例、腹腔内注射による）、それが少なくとも4週間以上継続するマウスを指す。
【００５８】
「ヒト免疫細胞を含むSCID/beigeマウス」とは、ヒトPBLまたはヒトの別の免疫細胞源（例、ヒト胎児造血組織）により再構成され、したがってヒトの免疫細胞を含むSCID/beigeマウスである。ワクチンの評価には、血清中にヒトの免疫グロブリン (Ig) を少なくとも100μg/ml含む、ヒト免疫細胞を含むSCID/beigeマウスが優先的に用いられる。
【００５９】
「注射用調製物」は、動物（例、マウス）に注射するために適した調製物である。
【００６０】
「免疫調節遺伝子」は、免疫反応を調節するタンパク質を含む遺伝子である。免疫調節遺伝子の例には、サイトカイン、共刺激分子、ケモタクチンなどが含まれるが、これらに限定されることはない。免疫調節遺伝子の産物は、「免疫調節因子」と呼ばれる。
【００６１】
「サイトカイン」とは、ホルモン様のタンパク質で、通常低分子であり、免疫応答の強度および/または持続期間を調節し、細胞間コミュニケーションに関与するものである。サイトカインの例には、インターロイキン（例、インターロイキン２、インターロイキン4、インターロイキン6、インターロイキン7、インターロイキン12）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンγ(IFNγ)、および腫瘍壊死因子α(TNFα)があるが、これらに限定されるわけではない。
【００６２】
「細胞周期調節因子」という用語は、その活性が細胞周期の進行を調節する任意のタンパク質を指す。特に好ましい細胞周期の調節因子は、細胞周期の進行を阻止するものである。例にはHIV vpr遺伝子産物、p21、哺乳類サイクリンの阻害因子などがあるが、これらに限定されるわけではない。
【００６３】
「アポトーシスの誘導因子」という用語は、その活性が細胞のアポトーシスを誘導する任意のタンパク質を指す。アポトーシスの誘導因子には、アポプチン（ニワトリ貧血ウイルスVP3遺伝子の産物）、BAX、BAD、BCL-X誘導体、およびHIV vpr遺伝子産物があるが、これらに限定されるわけではない。
【００６４】
「ワクチン」という用語は、本明細書では抗原に対する予防的および/または治療的免疫応答を誘導するために、動物の免疫系の細胞に提示されるまたは提示され得る抗原を誘導する、任意の調製物を指す。
【００６５】
「発現ベクター」という用語は、特定の宿主生物中で機能的に結合したコード配列の発現に必要な、適当な核酸配列および望ましいコード配列を含む組換えDNA分子を指す。原核生物中での発現に必要な核酸配列には、プロモーター、選択的にオペレーター配列、リボソーム結合部位、およびおそらくその他の配列が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサーおよび終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを使用することが知られている。
【００６６】
真核生物の転写制御シグナルには「プロモーター」および「エンハンサー」要素が含まれる。プロモーターとエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用をする短いDNA配列からなる [Maniatisら、Science 236:1237 (1987)]。プロモーターおよびエンハンサー要素は、酵母、昆虫、および哺乳類細胞、ならびにウイルス（類似した調節因子、すなわちプロモーターは原核生物にも見られる）の遺伝子を含む、様々な真核生物から単離されている。特定のプロモーターとエンハンサーの選択は、目的とするタンパク質を発現するためにどのような種類の細胞を使うかに依存する。真核生物のプロモーターとエンハンサーの中には、広範囲の宿主を持つものもあるが、限定された種類の細胞のサブセットでのみ機能するものもある [総説はVossら、Trends Biochem. Sci., 11:287 (1986) およびManiatisら、前記(1987)参照]。例えば、SV40初期遺伝子エンハンサーは、多くの哺乳類種由来の広範囲の種類の細胞で非常に活性が高いため、哺乳類細胞におけるタンパク質の発現に広く使われてきた [Dijkemaら、EMBO J. 4:761 (1985)]。広範囲の哺乳類細胞で活性なプロモーター/エンハンサー要素の別の2つの例は、ヒト延長因子1α遺伝子由来のもの [Uetsukiら、J. Biol. Chem. 264:5791 (1989); Kimら、Gene 91:217 (1990); ならびにMizushimaおよびNagata, Nuc. Acids. Res., 18:5322 (1990)] ならびにラウス肉腫ウイルス [Gorman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)] およびヒトサイトメガロウイルス [Boshartら、Cell 41:521 (1985)] の末端繰返し配列である。
【００６７】
「プロモーター/エンハンサー」という用語は、プロモーターおよびエンハンサーの両方の機能を提供する能力のある配列を含むDNA部分を意味する（例えば、レトロウイルスの末端繰返し配列（LTR）は、プロモーターとエンハンサーの両方の機能を含む）。エンハンサー/プロモーターは、「内在性」または「外来性」または「異種性」である可能性がある。内在性のエンハンサー/プロモーターは、ゲノム中で所定の遺伝子に天然に結合しているものである。外来性（異種性）エンハンサー/プロモーターは、遺伝子操作の手法（分子生物学的テクニック）によって、遺伝子に並列する位置に置かれるものである。
【００６８】
発現ベクター中に「スプライシングシグナル」が存在すると、しばしば組換え転写物の発現レベルが高くなる。スプライシングシグナルは、1次RNA転写物からのイントロンの除去を仲介し、スプライス供与部位および受容部位からなる [Sambrookら、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp. 16.7-16.8]。一般的に使用されるスプライス供与部位および受容部位は、SV40の16S RNA由来のスプライス接合部である。
【００６９】
真核細胞で組換えDNA配列が効率的に発現するためには、転写産物の効率的な終結およびポリアデニル化を指示するシグナルが必要である。転写終結シグナルは、一般的にポリアデニル化シグナルの下流に見つかり、長さは数百ヌクレオチドである。「ポリA部位」または「ポリA配列」という用語は、本明細書では、生成中のRNA転写物の終結およびポリアデニル化の両方を指示するDNA配列を意味する。ポリA配列を持たない転写物は不安定で、素早く分解されるため、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。発現ベクターに使用されるポリAシグナルは、「異種性」または「内在性」であり得る。内在性ポリAシグナルは、ゲノム中で所定の遺伝子のコード領域の3'末端に天然に見られるものである。異種性ポリAシグナルは、1つの遺伝子から単離され、別の遺伝子の3'に結合されるものである。一般的に使用される異種性ポリAシグナルは、SV40ポリAシグナルである。SV40ポリAシグナルは、237 bpのBamHI/BclI制限断片中に含まれており、終結およびポリアデニル化の両方を指示する[Sambrook前記、16.6-16.7]。この237 bpの断片は、671 bpのBamHI/PstI制限断片中に含まれている。
【００７０】
「安定なトランスフェクション」または「安定にトランスフェクトされた」という用語は、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの、外来DNAの導入および組み込みを指す。「安定なトランスフェクタント」という用語は、トランスフェクトされた細胞のゲノムDNA中に、外来または外来性DNAを安定に組み込んだ細胞を指す。
【００７１】
「選択可能マーカー」または「選択可能遺伝子産物」という用語は、本明細書では、選択可能マーカーを発現する細胞に、抗生物質または薬剤に対する抵抗性を与える酵素活性をコードする遺伝子の使用を意味する。選択可能マーカーは「優性」である可能性がある；優性な選択可能マーカーは、任意の哺乳類細胞系中で検出できる酵素活性をコードする。優性選択可能マーカーの例には、哺乳類細胞に薬剤G418に対する抵抗性を与える、細菌のアミノグリコシド3'ホスフォトランスフェラーゼ遺伝子（neo遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を与える、細菌のハイグロマイシンＧホスフォトランスフェラーゼ(hyg)遺伝子、およびミコフェノール酸の存在下で増殖できる能力を与える、細菌のキサンチン-グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（gpt遺伝子をも呼ばれる）が含まれる。その他の選択可能マーカーは、関連する酵素活性を欠失する細胞系と併用する必要があるという意味で、優性ではない。非優性選択可能マーカーの例には、TK-細胞系と併用するチミジンキナーゼ(tk)遺伝子、CAD欠損細胞と併用するカルバモイルリン酸シンセターゼ-アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ-ジヒドロオロターゼ (CAD) 遺伝子、およびHPRT-細胞系と併用する哺乳類ヒポキサンチン-グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ (hprt) 遺伝子が含まれる。哺乳類細胞系における選択可能マーカーの使用に関する総説は、Sambrookら、前記pp.16.9-16.15に記載されている。選択可能マーカーの中には、増幅が可能で、増幅可能マーカーとして使用できるものもある（例、CAD遺伝子）。
【００７２】
詳細な説明
1つの態様では、本発明は抗ヒト腫瘍免疫の評価に適当なヒト化動物モデルを提供する。これらの動物モデルにより、ヒトの腫瘍細胞に送達されたときに、全身の抗腫瘍反応を含めた、効果的な抗腫瘍反応を誘導する、免疫調節遺伝子(IMG)の組み合わせを同定することができる。本発明の説明は、以下の部分に分割される。I. 免疫遺伝療法；II. 免疫療法のためのHu-SCID/beigeモデル；III. 組み合わせ免疫遺伝子療法；IV. Hu-PBL-SCID/beigeモデルを用いた候補ワクチンの評価；V. HIVワクチン；VI.
【００７３】
癌療法に代わる戦略およびワクチン生産；およびVII. コンピュータ援用免疫スポット分析
I. 免疫遺伝療法
免疫遺伝療法には、免疫応答を調整または調節するタンパク質をコードする遺伝子の導入が含まれる。本発明に特に有用なのは、T細胞の活性化に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。上述のように、腫瘍の大部分は免疫原性を持たず、すなわち、動物中で免疫応答を誘導しない。
【００７４】
II. 免疫療法のためのHu-PBL-SCID/beige
免疫無防備状態のマウスであるC.B-17 SCID/beige (SCID/bg) マウスはT細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー(NK)細胞機能を持たない系統であるため[FroidevauxおよびLoor (1991) J. Immunol. Methods 137:275]、ヒト化マウスモデルに使用した。本明細書に示されるように、SCID/bgマウスは、さまざまな樹立されたヒト腫瘍細胞系および初代ヒト腫瘍細胞の増殖を支持する。SCID/bgマウスは、CD45+のヒト末梢血リンパ球(PBL)によって効率良く再構成され、再構成されたマウスにおいて、ヒト細胞が脾細胞の最高60％、および末梢血単核細胞の2〜7％を構成した。
【００７５】
重要なことに、Hu-PBL-SCID/beigeマウスの末梢血は、多数の未成熟なＴ細胞またはＴ前駆細胞（すなわちCD4+8+細胞およびCD45RA+細胞）を含んでいることが分かった。これらの結果は、C.B-17scid/scidマウス（Hu-PBL-SCID）の再構成によって得られた結果と対照的である。ヒトPBL再構成C.B-17 scid/scidマウスでは、大部分のヒトリンパ球は、再構成後間もなく、活性化細胞の表現型（HLA-DR+およびCD25+またはCD69+）を示し、ほぼすべて（>99％）のヒトT細胞は可逆的アネルギー状態にある成熟したメモリーの表現型(CD45RO+)を示す[Rizzaら、前記；Tarry-LehmannおよびSaxon、前記；Tarry-Lehmannら(1995)前記]。したがって、再構成後に十分な数の未成熟ナイーブT細胞がないために、Hu-PBL-SCIDモデルは抗腫瘍免疫の評価には適さないことになる。これに対して、Hu-PBL-SCID/bgマウスは、再構成後4〜6週間に、明らかなレベルのCD45RA+およびCD4+8+細胞を持っている。したがって、本発明のHu-PBL-SCID/bgマウスは、抗腫瘍免疫の評価に適当なモデルを提供する。
【００７６】
ヒトの免疫遺伝療法のためのモデルとしてのHu-PBL-SCID/bgマウスの使用法は、本明細書では、ヒト多形性グリオブラストーマの治療に有効な免疫調節遺伝子(IMG)の組み合わせの同定のために説明してある。
【００７７】
多形性グリオブラストーマは、ヒトで最も多く見られる原発性中枢神経系腫瘍である。多形性グリオブラストーマの診断および治療の進歩にもかかわらず、診断後の平均生存期間は1年以内である[Changら(1983) Cancer 52:997; McDonaldおよびRosenblum (1994) 神経外科の原理(Principles of Neurosurgery)、RegacharyおよびWilkins編、Wolfe Publishing, Toronto, pp 26.21-26.32]。
【００７８】
通常、インサイチューのグリオブラストーマには、リンパ球が様々な度合いで浸潤するが[Kuppnerら(1989) J. Neurosurgery 71:211; Blackら(1992) J. Neurosurgery 77:120]、これらのリンパ球は活性化されないことを示す証拠がある。これは、リンパ球の活性化を抑制する、プロスタグランジンE2、形質転換増殖因子β2、およびインターロイキン10のような免疫抑制因子の分泌にも起因する可能性がある[Fontanaら(1982) J. Immunol. 129:2413; Sieplら(1988) Eur. J. Immunol. 18:593; Kuppnerら、前記；Sawamuraら(1990) J. Neuro-Oncol. 9:125; Nittaら(1994) Brain Res. 649:122; Huettnerら(1995) Am. J. Pathol. 146:317]。免疫遺伝子療法の戦略は、腫瘍抗原の提示の促進および/または抗腫瘍リンパ球の活性化によって、そのような局所的免疫抑制を克服するためにデザインされた。
【００７９】
上述のように、大部分の免疫遺伝子療法の前臨床試験は、齧歯類遺伝子および齧歯類腫瘍モデルを使用してきた。しかし、そのようなモデルがヒトの系に適用できるかどうかは不明である。これは、ヒトの多形性グリオブラストーマとはかなり異なる肉腫性の特徴を持つ齧歯類の腫瘍（ラット9L-神経膠腫およびC6-神経膠腫）を用いたグリオブラストーマモデルに、特にいえることである[Bendaら(1968) Science 161:370; Barkerら(1973) Cancer Res. 33:976; DayおよびBigner (1973) Cancer Res. 33:2362]。したがって、本発明はヒトグリオブラストーマ細胞系、ヒト免疫遺伝子およびヒトリンパ球を用いた、新規のヒト化マウスモデルを提供する。
【００８０】
レトロウイルスベクターを用いて、ヒトGM-CSFおよびおよび/またはB7-2をコードする遺伝子が、インビトロで効率良くヒトグリオブラストーマ細胞系に導入された。その後、ヒト腫瘍/ヒトPBL/重症複合免疫不全マウス（hu-PBL-SCID）モデルにおいて、インビボにおけるグリオブラストーマの増殖に対する、GM-CSFおよび/またはB7-2発現の効果を調べた。ヒトグリオブラストーマ細胞（治療遺伝子導入あり、またはなし）およびヒトPBLをSCID/bgまたはSCID/nodマウスに移植し、局所的および遠隔部位における腫瘍増殖に対する効果を観察した。SCID/bgおよびSCID/nodマウスは、成熟したＴ、Ｂ、およびNKリンパ球を欠失しているため、ヒト腫瘍およびリンパ球移植を拒絶せずに受容した。
【００８１】
本明細書で示されるように、ヒトリンパ球で再構成したSCID/bgマウスでは、GM-CSFおよびB7-2形質導入腫瘍の阻害が観察されたが、これはグリオブラストーマ細胞によるこれらの遺伝子の発現が局所的免疫抑制を克服し、その結果、かなりの抗腫瘍免疫応答を誘導したことを示す。さらに、B7-2およびGM-CSFで形質導入された腫瘍細胞を放射線照射したものをワクチン接種したマウスにおいて野生型抗原投与腫瘍の増殖阻害が起きたことは、グリオブラストーマ細胞によってこれらの遺伝子が発現すると、遠隔部位での腫瘍増殖を阻害する全身性免疫応答が誘導されたことを示す。これらの結果は、ヒトグリオブラストーマモデルにおいて、ヒトGM-CSF免疫遺伝子療法を初めてインビボで示したことになる。
【００８２】
本明細書で使用されているヒトグリオブラストーマ-Hu-PBL-SCID/bgモデルは、樹立されたヒトグリオブラストーマ細胞系および無関係のドナー由来のリンパ球を含む、同種異系の系である。このモデルは、直ちに明らかに分かる以上に、自己の系に類似している。同種異系の臓器移植で見られるような、古典的な免疫を介した拒絶とは異なり、この系には移植片に由来する「パッセンジャーリンパ球」が存在しない。これらのリンパ球は、同種異系のクラスII主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)と結合して、抗原を宿主リンパ球に対して提示することによって、同種異系の臓器拒絶反応を開始する点で、重要である[Larsenら(1990) Annals Surgery 212:308; ChandlerおよびPassaro (1993) Archives Surg. 128:279; Moller (1995) Transplantation Proc. 27:24]。本モデルに使用されたD54MGグリオブラストーマ細胞系は、インビトロではクラスIのMHCのみを発現し、クラスII MHCは発現しない。したがって、このモデルでは、腫瘍抗原の提示に利用できるクラスII MHC分子は、移植されたヒトPBL上に存在する分子のみである。すなわち、このグリオブラストーマモデル系は、クラスI MHCに関しては同種異系であるが、クラスII MHCに関しては、自己の系となる。
【００８３】
本明細書に記載されるように、ヒト腫瘍/Hu-PBL-SCID/bgモデルは、同一の患者のヒト腫瘍細胞およびPBLを含む、自己モデル系として使用できる。このような自己モデルは、同種異系モデルよりも好ましい；しかし、特定の進行の速い腫瘍では、患者の腫瘍がHu-PBL-SCIDマウスで確立された後に、同一の患者からPBLを得ることが困難な場合もある。このような症例では、腫瘍ドナーとは無関係のドナーからのPBLを使用する。
【００８４】
本発明のヒト腫瘍/Hu-PBL-SCID/bgモデルは、インビボでヒトの腫瘍に対するヒトリンパ球の応答を分析するための、簡単で強力な方法を提供するため、特定の腫瘍の治療にとって、どのIMGの組み合わせが最も適当かを決定する手段を提供する。
【００８５】
III. 組合わせ免疫遺伝子療法
本発明のヒト腫瘍/Hu-PBL-SCID/bgモデルは、どのIMGの組み合わせが、および/またはどのIMG、細胞周期調節因子、アポトーシスの誘導因子、および腫瘍抑制遺伝子（例、野生型p53遺伝子）の組み合わせが、特定の腫瘍の治療にとって最も適当かを決定する手段を提供する。
【００８６】
多くの免疫調節遺伝子が有用な可能性があり、腫瘍の免疫抑制を克服するためには複数の遺伝子が必要な可能性がある。このような遺伝子には、サイトカイン、主要組織適合性遺伝子複合体分子、およびT細胞共刺激分子をコードする遺伝子が含まれる[Dranoffら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3539; Gajewskiら(1995) J. Immunol. 154:5637]。理想的な腫瘍ワクチンは、別個の免疫調節経路の免疫刺激遺伝子（例、共刺激分子、サイトカイン、および化学誘因性アジュバント）の組み合わせを同時に発現するもので、また、細胞周期の調節因子、アポトーシスの誘導因子、および腫瘍抑制遺伝子も発現する可能性がある。
【００８７】
本明細書に提供される実施例では、ヒトグリオブラストーマ細胞系の免疫原性を高めるために、T細胞共刺激分子B7-2、および治療用サイトカイン顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の組合わせが採用される。B7-2およびGM-CSFタンパク質をコードする遺伝子を、腫瘍細胞に導入し、同時に発現させた。本発明の方法に従う腫瘍ワクチンとして、少なくとも1つの免疫調節遺伝子および別の免疫調節遺伝子、細胞周期調節因子、アポトーシスの誘導因子、および/または腫瘍抑制遺伝子を発現するように修飾された腫瘍細胞が使用できる。
【００８８】
GM-CSFは、顆粒球、単球/マクロファージ、小グリア細胞、およびその他の抗原提示細胞の増殖と分化を刺激する。これには造血効果があるため、最近、好中球減少症の治療法として、臨床的に広く使われるようになった[LieshckeおよびBurgess (1992) N. Engl. J. Med. 327:28, Agliettaら(1994) Seminars Oncol. 21:5; EngelhardおよびBrittinger (1994) Seminars Oncol. 21:1]。腫瘍の免疫遺伝子療法におけるこのサイトカインの重要性は、最近、放射線照射したGM-CSF形質導入腫瘍細胞によるワクチン接種が、腺癌およびメラノーマのマウスモデルにおいて、野生型腫瘍の抗原投与に対して、特異的かつ著しい増殖阻害を示すことを示したDranoffらによって示された[Dranoffら、前記]。このマウスモデルにおいては、試験された10のサイトカイン遺伝子のうちで、GM-CSFは最大の腫瘍増殖阻害を示した。
【００８９】
B7-2は、主要組織適合性遺伝子複合体と結合した抗原提示と共に、T細胞の活性化に必要な共刺激分子として最近同定された、リンパ球表面分子のファミリー（B7-1、B7-2、およびB7-3）の1つである。腫瘍細胞上に共刺激分子が存在しないことは、免疫系が検出および排除することができないことの一因である可能性がある[Galea-Lauriら(1996) Cancer Gene Ther. 3:202]。様々な共刺激分子の具体的な役割は、また明らかにされていない。B7-1の発現が、中間体のTH細胞前駆体のTH1エフェクター細胞への分化を促進し（細胞性免疫応答）、B7-2の発現がTH2の分化を誘導する（液性免疫応答）ことが示唆されている[KawamuraおよびFurue (1995) Eur. J. Immunol. 25:1913; Thompson (1995) Cell 71:979]。しかし、B7-1およびB7-2のどちらも、動物モデルでは細胞性免疫応答を促進することが示されている[Hodgeら(1994) Cancer Res. 54:5552; Lanierら(1995) J. Immunol. 154:97; Plumasら(1995) Eur. J. Immunol. 25:3332]。より最近には、腫瘍の拒絶におけるB7-1の有効性に疑問が投げ掛けられた(Wuら、前記)。さらに、インターロイキン2の生産が最大になるためには、T細胞は、T細胞受容体刺激から12時間以内に、APCからの共刺激シグナルを受け取らなくてはならない[MondinoおよびJenkins (1994) J. Leukocyte Biol. 55:805]。したがって、抗原刺激後にAPC上に素早くB7-2 （B7-1でなく）が誘導されることから、抗腫瘍細胞性免疫応答の促進には、B7-2が好ましい共刺激分子であることを示唆している（Galea-Lauriら、前記）。
【００９０】
本発明の新規の動物モデルにおいてヒト腫瘍の治療のための有効性が調べられる他のIMGには、APO-1 (Fas)、APO-1リガンド (FasL) [Hahneら(1996) Science 274;1363; Seinoら(1997) Nature Med. 3:165; Strandら(1996) Nature Med. 2:1361] 、IL-12AおよびIL-12B、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、GM-CSF、G-CSF、IFNγ、CD40およびTNFαなどがあるが、これらに限定されるわけではない。さらに、腫瘍細胞の修飾のために、IMGと組合わせて、細胞周期の調節因子またはアポトーシスの誘導因子の遺伝子も使用できる。1つまたは複数のIMG（および/または細胞周期の調節因子またはアポトーシスの誘導因子）を含む、レトロウイルスベクターを含む発現ベクターは、本明細書に記載するようにして作製される。複数のIMG（または細胞周期の調節因子またはアポトーシスの誘導因子をコードする遺伝子）が同一の構築物に含まれるようにする場合には、各IMGは、本明細書に記載されるIRESを用いて他のIMGから分離されていることが好ましい。特に好ましいIRESは、ポリオウイルスのIRESである。
【００９１】
特定のヒト腫瘍に対して、IMGの有効な組み合わせが同定されたら、これらのIMGを、インビボまたはインビトロで患者の腫瘍細胞に送達し、その後、この修飾された腫瘍細胞を戻す（通常、修飾された細胞は、導入の前に放射線照射する）。以下の実施例でさらに詳しく説明するように、IMGのヒト腫瘍細胞への運搬には、様々な手段が使用できる（例、インサイチューでの腫瘍細胞のバイオリスティック形質転換、カチオンリポソーム、レトロウイルス感染など）。
【００９２】
(a) B7-2およびGM-CSFを用いたグリオブラストーマの組合わせ免疫遺伝子療法
以下の実施例に示すように、本発明のヒト腫瘍/Hu-PBL-SCID/bgモデルは、T細胞共刺激分子B7-2および炎症促進型サイトカインGM-CSFをコードする遺伝子によって形質導入したグリオブラストーマ細胞を、これらの動物にワクチン接種した際に、腫瘍の増殖に著しい阻害が見られるかどうかを決定するために使用された。
多形性グリオブラストーマの患者の治療は、以下のようにして実施できる。初めに患者が手術を受けるときに、1から3グラムの腫瘍を採取する。この組織を採取して、実施例11のようにして処理する。レトロウイルスウイルス遺伝子の導入および選択をするのに十分な数になるまで、腫瘍細胞を増殖させる。
【００９３】
初代細胞にはpLSNBG9（B7-2およびGM-CSFの両方をコードする）をトランスフェクトし、以下のようにしてG418存在下で増殖させて選択する。簡単に述べると、-80℃から37℃ににてウイルス保存液を解凍する。解凍したウイルス溶液に、最終濃度が4μg/mlになるようにポリブレンを添加する。ウイルス溶液に培地を加えて、最終容量を1.5 mlにする。T25フラスコ中の対数増殖期の腫瘍細胞を、ウイルス上清中で37℃、5％CO2で3時間インキュベートする。ポリブレンを含むが、ウイルスを含まない同容量の培地を対照として使用する。3時間後に、各フラスコにさらに培地3 mlを添加し、細胞を一晩インキュベートする。翌朝、培地を交換する。レトロウイルスによる形質導入の24時間後に、ネオマイシンアナログG418を200μg/ml（最終濃度）で培地に添加する。培地は、完全な選択が起こるまで（すなわち、対照フラスコのすべての細胞死ぬまで）、2〜3日ごとに交換する。選択後、G418濃度を低下させた（100μg/ml）増殖培地中で細胞を培養し、コンフルエントになるまで増殖させる。
【００９４】
形質導入した腫瘍細胞を、1 x 10６細胞となるように新しいT25培養フラスコに分割して入れる。24時間後に、培地に分泌されたGM-CSFの量を、ELISA（Quantikine, R & D Systems）によって決定する。B7-2の発現は、ヒトB70抗原（すなわちB7-2）に特異的なモノクローナル抗体を用いて、フローサイトメトリーによって評価する。ワクチンとして使用する形質導入された細胞の等量液について、細菌、真菌、マイコプラズマ、HIV、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、および複製可能レトロウイルスの存在を調べる（標準的S+L-アッセイを使用；Bassinら(1971) Nature 229:564）。
【００９５】
GM-CSFおよびB7-2遺伝子で形質導入された腫瘍細胞を選択、増殖させ、将来使用するために凍結保存する。簡単に述べると、細胞を1 x 10６細胞/チューブとなるように凍結保存チューブに少量ずつ分注する。DMEM/F12、 FCSおよびDMSOの混合物を用いて、最終濃度10% FCSおよび20% DMSOとなるように、総容量を0.5 mlにする。細胞を断熱発泡ポリスチレンのラックに置き、24時間-80℃に置き、その後、長期保存のために液体窒素に入れる。細胞が必要な際には、液体窒素から37℃にして解凍し、新しい培地で2度洗い、プレートする。
【００９６】
患者に再度注射する前に、形質導入した腫瘍細胞を放射線照射して、細胞の複製が不能になるようにする。細胞は６０Co装置で20,000ラドの照射をする。
【００９７】
患者には、合計3回の皮下注射をする。各回、B7-2およびGM-CSFを発現するように修飾した2 x 10６の照射済み自己腫瘍細胞を用いる。注射は、側腹腰部に交互に行い、注射部位のすぐ上に墨汁で印を付け、局所反応が明らかではない場合に部位の正確な判定ができるようにする。23ゲージ針を付けた1 mlのシリンジを用いて、各部位の皮下にワクチンを0.1 ml注射する。すべてのワクチンは、無菌リンゲル乳酸溶液中に再懸濁した細胞で調製する。再発性のグリオブラストーマの患者では、最初の注射は術後1日または2日目に行う。治療抵抗性メラノーマ（以下に説明）の患者では、それ以上腫瘍の切除を受けないため、第1回の注射のタイミングはそれほど重要ではない。すべての患者に、第1回のワクチン接種の14日および28日後に、それぞれ第2回および3回のワクチン接種を行う。
【００９８】
再発性グリオブラストーマの患者（おそらく術後入院中）の第1回のワクチン接種以外は、すべての被験者は外来で治療する。免疫前およびSC注射後3時間に渡って30分ごとに、生命徴候をモニターする。3時間にわたって1時間ごとに患者の注射部位の炎症、および発疹、喘鳴、または浮腫の兆候を観察する。禁忌がない場合には、患者は治療の3時間後に帰宅する。有意な反応が起きた場合には、患者を入院させて継続的に観察する。
【００９９】
ワクチン接種の3日後、および8週間にわたり週1度、その後は4カ月に渡り月1度、1年間に渡り3カ月ごと、およびその後は年1度、クリニックで患者を評価する。来診する度に、標準的な血液化学および組織学用に、血液サンプルを採取する。さらに、複製可能レトロウイルスのアッセイ用に、各ワクチン接種の1週間後に採血する。
【０１００】
何らかの毒性がないか患者を観察する。免疫遺伝子療法に対する患者の免疫応答について、局所および全身を観察する。局所免疫応答は、ワクチン接種部位における遅延型過敏症(DTH)応答の症状と兆候によりモニターする。さらに、各ワクチン接種2週間後（14日、28日、42日目）に、注射部位のパンチ生検を行う。これらの生検を、1日目（治療開始前）における正常な側腹腰部の皮膚から得た生検と比較する。生検は、腫瘍細胞および炎症を調べるため、標準的な病理検査を行う。さらに、CD45、CD4、CD8およびNK細胞マーカーの免疫組織化学染色も行う。
【０１０１】
全身性免疫応答は、2つのアッセイを用いて測定する。0、7、21、35および49日目に血液サンプル（各20 ml）を採取する。これらのサンプルは、密度勾配（Hystopaque）遠心によって末梢血単核細胞（PBMCまたはPBL）を単離するために使用する。その後、PBMCを、放射線照射（20,000ラド）自己腫瘍細胞と共に5日間インキュベートすることにより、インビトロで刺激する。刺激したPBMCは、次に以下の2つのアッセイで使用する。まず、自己腫瘍細胞に対して、標準的な５１Cr放出細胞傷害性Tリンパ球（CTL）アッセイを行う。第2に、自己腫瘍細胞に暴露した後に、インターフェロンγ生産のELISPOTアッセイを行う[Zhangら(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14720]。５１Cr放出CTLアッセイは、細胞性免疫の標準的なアッセイである。このアッセイは、刺激されたPBMCが腫瘍細胞を殺す能力について、直接の情報を与える；しかし、感度が比較的低い。この問題を克服するために、感度がはるかに高いインターフェロンγ生産のELISPOTアッセイも使用する。ELISPOTアッセイは、自己腫瘍細胞に暴露されてインターフェロンγを生産するPBMCの濃度を決定する。インターフェロンγ生産は、TH1（細胞性）免疫応答に密接に関与しているため、自己腫瘍細胞に暴露されてインターフェロンγを生産するPBMCの数は、細胞性免疫の尺度となる。
【０１０２】
患者の臨床状態は、病歴、理学的、および検査パラメーターによって追跡する。さらに、8週および24週目、次年度は3カ月ごと、その後は年1回、適当な診断画像試験（例、ガドリニウム増強あり、およびなしのMRIスキャン）を行う。
【０１０３】
(b) B7-2およびGM-CSFを用いた悪性メラノーマの組合わせ免疫遺伝子療法
悪性メラノーマは北米で急速に増加している。手術で治癒できる他の皮膚癌とは異なり、悪性メラノーマは攻撃性が強く、遠隔臓器に初期に転移する傾向があるため、しばしば致死的である。
【０１０４】
悪性メラノーマ患者の治療は、上述のようにしてB7-2およびGM-CSFを発現するように修飾した腫瘍細胞を用いて行うことができる。腫瘍細胞は、患者が手術を受ける際に採取し、細胞は実施例11で説明するようにして処理する。
【０１０５】
本発明のヒト腫瘍-Hu-PBL-SCID/bgモデルにおいて、腫瘍形成能を低下させたり、局所または全身性免疫を誘導するために有効であることが示された他のIMG（および/または細胞周期調節因子またはアポトーシスの誘導因子をコードする遺伝子）の組み合わせは、グリオブラストーマおよび悪性メラノーマを含め、ヒトの腫瘍の治療に使用される。
【０１０６】
免疫調節因子（例、B7-2およびGM-CSF）（および/または細胞周期調節因子またはアポトーシスの誘導因子）をコードするレトロウイルスによって患者の腫瘍細胞に形質導入し、患者に再度導入する前に培養で腫瘍細胞を選択する上述の方法に加え、所望の遺伝子をコードするDNAを導入（例、バイオリスティックまたは他の物理的手段によりプラスミドDNAを導入、組換えアデノウイルス、リポソーム、裸DNAの直接注入）して患者の腫瘍細胞を修飾することができる。その後、細胞には、数日間（以内）、形質導入された遺伝子を発現させておき、放射線を照射してから、患者の免疫に使用する。レトロウイルスによって形質導入して選択した腫瘍細胞を用いて、その後の追加免疫をできる。患者の腫瘍細胞が細胞培養で増殖するために時間がかかる場合には、腫瘍細胞の修飾に、組換えレトロウイルスを使用するよりも、プラスミドDNA（リポソーム、バイオリスティック、アデノウイルスベクターまたは裸DNAとして運搬）を使用するほうが好ましい。これは、一部の腫瘍（例、グリオブラストーマ）ではレトロウイルスによる形質導入および選択には数週間かかり、最初の手術の数日（例、〜3日）以内に、修飾された腫瘍細胞で患者にワクチン接種することが望ましいためである。腫瘍切除の〜3日以内にワクチン接種を行うと、APCの共刺激分子の活性化に必要な「警戒シグナル」を捕らえること、および活性化マクロファージおよびT細胞の血液脳関門の通過の増大が可能になる場合がある[FuchsおよびMatzinger (1992) Science 258:1156およびMatzinger (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:991]。
【０１０７】
IV. Hu-PBL-SCID/beigeモデルを用いた候補ワクチンの評価
上述のように、本発明は腫瘍細胞ワクチンの評価に有用なヒト化動物モデルを提供する。本発明のHu-PBL-SCID/beigeマウスは、ヒトの様々な病原体に対する免疫を与えるようにデザインされたワクチンの評価のための動物モデルも提供する。以下の実施例は、Hu-PBL-SCID/bgマウスおよびヒト化SCID/bgマウス（すなわち、移植されたヒト胎児造血組織を含むSCID/bgマウス）の確立の詳細なプロトコールを提供する。これらの動物は、ヒトの免疫細胞を含み、候補ワクチン（例、HIVワクチン、マラリアワクチン、リーシュマニアワクチン、結核菌ワクチン）の評価に使用される。抗病原体の細胞性免疫および液性免疫のいずれもが、再構成されワクチン接種された動物で評価される。
【０１０８】
ヒトの病原体の異種ワクチンの免疫有効性は、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)の腹腔内注射、またはヒト胎児胸腺/肝臓組織移植を受けた、SCID/beigeマウスにおいて、評価することができる。これらの動物におけるインビボヒト免疫細胞再構成は、ナイーブT細胞(CD45RA)、メモリーT細胞(CD45RO)、活性化(HLA-DR)およびCD4およびCD8細胞を含む、種々のヒト白血球マーカーの発現を分析して立証されている。再構成された動物におけるヒト細胞のインビボ免疫機能が、HIV-1予防免疫モデル（例、実施例16参照）および弱毒化リーシュマニア細胞ワクチンモデル（実施例19参照）を用いて示されている。他の例には、マラリア多段階性抗原またはカルメット・ゲラン桿菌(BCG)株の抗原をコードするDNAワクチンによる、マラリアおよび結核に対する免疫が含まれる。上述のようにして、新しく単離したPBMCをSCID/beigeマウスに注射し、1週間後に、ELISAによってヒトIgレベルを決定する。血清にヒトIgを100μg/ml以上含むHu-PBL-SCID/bgマウスに、裸DNAワクチンまたは適当な病原体抗原を発現する裸DNAワクチンでトランスフェクトされた樹状細胞(CD)の筋肉注射をして、免疫する。免疫されたマウスは、1〜2週後に再度免疫する。ワクチンの最終投与の1週間後に、HIV-1、マラリア、結核菌または森林型熱帯リーシュマニアのような野生型病原体を、免疫されたマウスに抗原投与する。対照マウスには、病原体抗原をコードする遺伝子を持たないDNAワクチンを投与する。野生型病原体による抗原投与後、標準的な方法によって感染および/または疾病の発病を調べる。ヒトの免疫細胞由来の抗病原体免疫を、再構成されたマウスの脾細胞を用いて細胞性免疫(CMI)応答について、また、抗血清を用いて液性免疫応答について分析する。
【０１０９】
V. HIVワクチン
以下の実施例は、弱毒化HIV生ワクチン、HIVプロウイルスDNAワクチン、およびHIVタンパク質を発現する修飾リーシュマニア細胞を含むHIVワクチンの生産の詳細を提供する。これらのHIVワクチンが細胞性の抗HIV免疫および液性の抗HIV免疫を誘導する能力は、上記および以下の実施例に説明するようにして、Hu-PBL-SCID/bgマウス（PBLで再構成または胎児造血組織を移植）において評価する。
【０１１０】
VI. 癌療法の代替戦略およびワクチン生産
腫瘍細胞およびヒトの病原体に対する免疫応答の誘導のために、上述の方法に加えて、以下の代替的方法も提供される。
(a) 自殺遺伝子を含む複製可能ウイルスの使用
上述のように、複製不能MoMLVに基づくベクターを用いて、治療用遺伝子を腫瘍細胞に運搬することができる（セクションIV）。癌治療の目的で遺伝子を腫瘍細胞に運搬する別の方法は、「自殺」遺伝子[例、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV tk)遺伝子]を運ぶ複製可能レトロウイルスベクター（例、MoMLVベースのベクター）を使うことである。自殺遺伝子は、発現の選択が可能な、負の選択マーカーである。つまり、特定の条件下では、自殺遺伝子を発現する細胞が選択的に死ぬ。例えば、HSV tk遺伝子を発現する細胞は、ガンシクロビルの存在下で培養すると死ぬ。HSV tk遺伝子は、癌の遺伝子療法に使用されてきた。HSV tk遺伝子を含む発現ベクターを、脳腫瘍を持つ患者の脳に注射し、患者にガンシクロビルを投与した。これらの実験は、HSV tk遺伝子の発現が注射経路に沿う細胞に限定されていたため、ほとんど成功しなかった；すなわち、この方法を用いると、疾病の転帰に差が出るのに十分な数の腫瘍細胞を殺すほどは、HSV tk遺伝子が腫瘍細胞に運搬されなかったのである。
【０１１１】
患者のより多くの腫瘍細胞に自殺遺伝子を運搬するために、複製可能レトロウイルスベクターを使用する。MoMLVのようなレトロウイルスは、急速に分裂している細胞に優先的に感染する；通常、腫瘍細胞は患者の中で最も急速に分裂する細胞であるため、レトロウイルスを用いて腫瘍細胞に遺伝子を運搬することができる。複製可能レトロウイルスベクターを用いると、ベクター注射部位に存在する細胞の外にある腫瘍細胞にも、治療用遺伝子を広めることができる。HSV tk遺伝子の運搬に適した複製可能MoMLVベクターには、モロニー白血病ウイルス(MLV)ベクター[RNA腫瘍ウイルス（RNA Tumor Viruses） (1995) 腫瘍ウイルスの分子生物学(Molecular Biology of Tumor Viruses), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]が含まれるが、ごれに限定されるわけではない。標準的な組換えDNA技術を用いて、MoMLVベクターにHSV tk遺伝子を挿入して自殺ベクターを作製し、自殺ベクターを含むDNAを調製する。自殺ベクターDNAを患者の腫瘍に注射し（腫瘍内注射）、その後、患者にガンシクロビルを投与して（静注）、HSV tk遺伝子を発現する腫瘍細胞の自殺を誘導する。
【０１１２】
(b) 生産細胞のインサイチュー生産
癌療法のワクチンの運搬または病原体感染の予防の手段として、複製不能レトロウイルスベクター、弱毒化ウイルスを使用する以外にも、本発明は、レトロウイルスベクターのパッケージングに必要な成分をコードするDNA構築物を、治療用ベクターと共に患者の腫瘍細胞に注射することも意図している。3つの別個のDNA構築物を注射する：1) レトロウイルス（例、MoMLV）のgag-pol遺伝子をコードするDNA発現ベクター；2) レトロウイルスのエンベロープ遺伝子または水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質をコードするDNA発現ベクター；および 3) 治療用遺伝子（例、GM-CSF、B7-2など）を含む、複製不能レトロウイルスベクター（例、パッケージングシグナルおよびgag、polおよび/またはenv遺伝子を持たないベクター）。これらの3つのDNA構築物のすべてを受け取る細胞は、治療用遺伝子を含むレトロウイルスベクター由来のRNAを含む偽型ウイルス粒子を取り込んだり、放出したりする。このようにして、患者の腫瘍中で、インサイチューでパッケージング細胞系が作製される。このような方法は、患者にパッケージング細胞系を注射するよりも優れている。パッケージング細胞系（通常は、複製不能ウイルスを生産するマウス線維芽細胞系）を患者に注射すると、患者の免疫応答は、しばしば所望する標的（腫瘍細胞）よりも、外来の細胞タンパク質に向けられる。これに対して、パッケージング細胞系自身ではなく、その成分を含むDNAを注射すると、所望の標的に対する免疫応答が可能になる。
【０１１３】
VII. コンピュータ援用免疫スポット分析
本発明は、コンピュータ援用ビデオイメージング分析を利用した、例えば、酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイのような、免疫スポットアッセイ法にも関する[CuiおよびChang (1997) BioTechniques 22:1146-1149]。元来はＢリンパ球の抗体産生の検出のために開発された免疫スポットアッセイは、様々な免疫エフェクター細胞のサイトカイン産生の評価にも使われてきた。免疫スポットアッセイは、単一細胞レベルで抗体またはサイトカインの産生を検出できるが、顕微鏡下で96ウェル中のスポットを可視的に計数する必要があるために、この方法は、多数のサンプルを扱う場合には適さない。本発明にしたがって免疫スポットアッセイと使用されるコンピュータ援用画像分析システムおよび方法を用いると、この問題が克服できる。このシステムによって、免疫スポットアッセイのデータ分析ステップが便利で、客観的、再現性があり、多数のサンプルを扱うために適したものになる。リンパ球増殖アッセイ、細胞傷害性リンパ球アッセイ、および前駆体頻度アッセイを必要とする試験は、本発明の免疫スポットアッセイを用いて実行できる。これは、混合リンパ球同系異種反応およびヒト免疫不全ウイルス抗原特異的細胞性免疫応答などの実施例を用いて示されている。
【０１１４】
1つの態様では、本発明の方法は、アッセイで生成する検出可能シグナルが、コンピュータ援用ビデオイメージング装置を用いてデジタル画像またはシグナルに変換される免疫スポットアッセイの実施を含む。例示された態様では、検出可能シグナルは、検出可能な比色シグナルを生成する酵素基質反応によって、生成する。一旦、検出可能シグナルが処理されたデジタル画像になれば、画像は、例えばNIH Imageバージョン1.55シェアウェアのような分析ソフトウェアを用いて分析できる。本発明の方法は1色または2色の免疫スポットアッセイと使用できる。本発明の方法を用いると、免疫スポットアッセイの結果をを手作業で計数する必要がなくなり、客観的で再現性のある免疫スポットアッセイ分析が可能である。
【０１１５】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様および局面を説明するためのもので、その範囲を限定するものではない。
【０１１６】
以下の実験の開示において、次の略語が適用される：M（モル濃度）；mM（ミリモル濃度）；μM（マイクロモル濃度）；mol（モル）；mmol（ミリモル）；μmol（マイクロモル）；nmol（ナノモル）；g（重力加速度）；gm（グラム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；pg（ピコグラム）；L（リットル）；ml（ミリリットル）；μl（マイクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；nm（ナノメートル）；hr（時間）；min（分）；msec（ミリ秒）；℃（摂氏）；AMP（アデノシン5'一リン酸）；cDNA（コピーまたは相補的DNA）；DTT（ジチオスレイトール）；ddH2O（再蒸留水）；dNTP（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）；rNTP（リボヌクレオチド三リン酸）；ddNTP（ジデオキシリボヌクレオチド三リン酸）；bp（塩基対）；kb（キロ塩基対）；TLC（薄層クロマトグラフィー）；tRNA（トランスファーRNA）；nt（ヌクレオチド）；VRC（バナジルリボヌクレオシド複合体）；RNase（リボヌクレアーゼ）；DNase（デオキシリボヌクレアーゼ）；polyA（ポリリボアデニル酸）；PBS（リン酸緩衝生理食塩水）；OD（光学密度）；HEPES（N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N-[2-エタンスルホン酸]）；HBS（HEPES緩衝生理食塩水）；SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）；Tris-HCl（トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン-塩酸）；rpm（毎分回転数）；ライゲーション緩衝液（50mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mMジチオスレイトール、25μg/mlウシ血清アルブミン、および26μM NAD+、およびpH 7.8）；EGTA（エチレングリコール-ビス（βアミノエチルエーテル）N, N, N', N'-四酢酸）；EDTA（エチレンジアミン四酢酸）；ELISA（固相酵素結合測定法）；LB（ルリア・ベルターニブロス：1リットル当たり、10 gトリプトン、5 g酵母エキス、および10 g NaCl、1 N NaOHでpH 7.5に調整）；スーパーブロス（1リットル当たり、12 gトリプトン、24 g酵母エキス、5 gグリセロール、3.8 g KH2PO4、および12.5 g K2HPO4）；DMEまたはDMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）；ABI（Applied Biosystems Inc.、カリフォルニア州フォスターシティー）；ATCC（American Type Culture Collection、メリーランド州ロックビル）；Beckman（Beckman Instruments Inc.、カリフォルニア州フラートン）；Becton Dickinson（Becton Dickinson、カリフォルニア州サンノゼ）；BM（Boehringer Mannheim Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス）；Bio-101（Bio-101、カリフォルニア州ビスタ）；BioRad（BioRad、カリフォルニア州リッチモンド）；Brinkmann（Brinkmann Instruments Inc.、ニューヨーク州ウェスベリー）；BRL, Gibco BRLおよびLife Technologies（Bethesda Research Laboratories, Life Technologies Inc.、メリーランド州ゲティスバーグ）；Caltag（Caltag Laboratories Inc.、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）；CRI（Colalborative Research Inc.、マサチューセッツ州ベッドフォード）；Eppendorf（Eppendorf, Eppendorf North America, Inc.、ウィスコンシン州マジソン）；Falcon（Becton Dickinson Labware、ニュージャージー州リンカーンパーク）；Invitrogen（Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ）；New Brunswick（New Brunswick Scientific Co. Inc.、ニュージャージー州エジソン）；NEBまたはNew England Biolabs（New England BioLabs Inc.、マサチューセッツ州ビバリー）；Novagen（Novagen, Inc.、ウィスコンシン州マジソン）；Pharmingen （PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ）；Pharmacia（Pharmacia LKB、メリーランド州ゲティスバ���グ）；Promega（Promega Corporation、ウィスコンシン州マジソン）；R & D Systems（R & D Systems Inc.、ミネソタ州ミネアポリス）；Sigma（Sigma Chemical Co.、ミズーリ州セントルイス）；Stratagene（Stratagene Cloning Systems、カリフォルニア州ラホヤ）。
【０１１７】
特に記載がないかぎり、すべての制限酵素はNew England Biolabsから入手し、製造元の指示にしたがって使用した。特に記載がないかぎり、合成オリゴヌクレオチドは、ABI DNA合成機、モデル391を用いて合成した。
【０１１８】
実施例1−  1-および2-シストロニックなレトロウイルスベクターの作製ならびに組換えウイルスのパッケージング
図1に模式的に示すようにして、GM-CSF、B7-2、GM-CSFおよびB7-2、またはGFP遺伝子を含む遺伝子治療用レトロウイルスベクターが作製された。図1は、親ベクター（pLSN）、pLSNB70（ヒトB7-2をコードする）、pLSNGM1（ヒトGM-CSFをコードする）、pLSN-BG9（B7-2およびGM-CSFの両方をコードする）およびpLSN-GFP（GFPをコードする）の地図を示す模式図である。
すべての遺伝子は、MLVに基づくpLSNプラスミドのポリリンカー領域にクローニングされた[Robinsonら(1995) Gene Therapy 2:269および同時係属中の特許出願第08/336,132号]。治療用遺伝子は、その発現がレトロウイルスLTR（末端繰返し配列）の制御を受け、ネオマイシン耐性遺伝子が、内部のSV40プロモーターの制御下となるように、pLSNに挿入された。ベクターには、レトロウイルスのパッケージングに必要なgag、pol、またはenv遺伝子がないため、複製不能になっている。これらの構造タンパク質は、レトロウイルスパッケージング細胞系PA317 [ATCC CRL 9078; Markowitzら(1988) J. Virol. 62:1120]またはPG13 [ATCC CRL 10686; Millerら(1991) J. Virol. 65:2220]によって、トランスに提供される。GM-CSFおよびB7-2遺伝子を含む2-シストロンベクターでは、2つの遺伝子の間に、脳心筋炎ウイルス(EMCV)ゲノム由来の内部リボソーム進入部位(IRES)が入っている（pCITTE-1、Novagen）。
【０１１９】
(a) pLSNの構築
pLSNは、アメリカ合衆国で臨床使用が認可されたレトロウイルスベクターpLNL6の派生体である。pLSNを構築するために、まず中間体ベクターpLLLが構築された。
【０１２０】
pLLLは、開始点としてpLNL6（配列番号：1）を用いて構築された。pLNL6は、3' LTR中にMoMuLVプロモーターを、5' LTR中にマウス肉腫ウイルス(MSV)プロモーターを含む。pLLLを作製するときには、後のクローニング段階の便宜のために、pLNL6中に存在するいくつかのクローニング部位および内部SV-neo遺伝子を除去し、合成ポリリンカーに置き換えた。
【０１２１】
pLLLを構築するために、pLNL6をClaIおよびBclIで消化し、ベクター断片を、製造元の指示に従ってGeneClean (Bio-101)を用いてゲル精製した。ポリリンカー部位を含む二本鎖インサートは、以下の2つのオリゴヌクレオチドを用いて構築した。5'-GATCTAAGCTTGCGGCCGCAGATCTCGAGCCATGGATCCTAGGCCTGATCACGCGTCGACTCGCGAT-3'（配列番号：2）および5'-CGATCGCGAGTCGACGCGTGATCAGGCCTAGGATCCATGGCTCGAGATCTGCGGCCGCAAGCTTA-3'（配列番号：3）。これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、キナーゼ処理し、ゲル精製したpLNL6ベクター断片にライゲーションし、ライゲーション反応液を用いて、コンピテント細胞DH5α細胞(BRL)を形質転換した。pLLLが正しく作製されたことは、アンピシリン耐性細菌コロニーから調製したプラスミドDNAの制限酵素消化、およびポリリンカーの挿入部位付近のDNA配列決定によって確認された。
【０１２２】
ベクターDNAを取り込んだ細胞が単離できる選択可能マーカーを含むベクターを作製するために、pLSNが作製された。pLSNはSV40エンハンサー/プロモーターの転写制御下にneo遺伝子を含む。pLSNを作製するために、SV40エンハンサー/プロモーターを含むBamHI/StuI断片をpLNSX [Miller, A.D.およびRosman, G.J. (1989) BioTechniques 7:980]から単離した。pLNSXおよびpLLLをBamHIおよびStuIで消化し、消化産物をゲル精製した。pLNSX由来のSV40プロモーターを含む約350 bpの小さな断片を、pLLLベクターにクローニングした。pLLL/SV40と命名した最終産物は、BamHIおよびClaIを用いた制限酵素消化によって確認された。
【０１２３】
neo遺伝子の最初により良い開始コドンを挿入するために、PCRを用いてpLNXSからneo遺伝子を単離した。遺伝子の増幅には、Pfuポリメラーゼ(Stratagene)を使用した。この増幅は、10x Pfu反応緩衝液5μl 、dNTP (15 mM) 0.5μl、以下のプライマーをそれぞれ0.5 mM：5'-AAGCTTGATCACCACCATGATTGAACAAGATGG-3'（配列番号：4）および5'-CCGGATCCGTCGACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAG-3'（配列番号：5）、pLNSX 0.5μl (0.01μg)、およびddH2O 38μl中で実施した。これらのプライマーには、改変された翻訳開始制御配列（-CCACCATG-）が含まれているが、これは、このような改変によって組織培養細胞におけるneo遺伝子の強さが大きく高まることが分かったためである[Kozak, M. (1986) Cell 44:283]。
【０１２４】
混合物を95℃で5分間加熱し、1μlのPfuポリメラーゼを添加した。この反応液を、94℃で1分、55℃で1分、72℃で3分のサイクルで30回処理した。増幅後、neo遺伝子を含むDNAをゲル精製し、BclI消化pLLL/SV40ベクターとライゲーションして、pLSNを作製した。正しく構築されたことは、制限酵素による消化およびDNA配列決定によって確認された。
【０１２５】
(b) ヒトB7-2およびGM-CSF cDNAのクローニング
GM-CSFおよびB7-2のcDNAは、以下のようにして、RT-PCRによって、正常なヒトリンパ球RNAから増幅された。各々の場合に、PCR増幅に使用されたオリゴヌクレオチドには、最適化された真核生物の開始配列が含まれていた。GM-CSF cDNAの増幅には、以下のプライマー対が使用された：5'プライマー：5'-CCCGGGAAGCTTCCACCATGTGGCTGCAGAGCCTG-3'（配列番号：6）および3'プライマー：5'-AATGGATCCTATCACTCCTGGACTGGCTC-3'（配列番号：7）。ヒトGM-CSF cDNAの配列は、GenBank登録番号M11220および配列番号：8に記載されている。B7-2 cDNAの増幅には、以下のプライマー対が使用された：5'プライマー：5'-TGTGGATCCACCATGGGACTGAGTAACATT-3'（配列番号：9）および3'プライマー：5'-TTTGGATCCTTAAAAACATGTATCACTTTTGTCGC-3'（配列番号：10）。ヒトB7-2 cDNAの配列は、GenBank登録番号U04343および配列番号：11に記載されている。RT-PCRは、RT-PCRキット（BRLおよびPromega）を用いて、製造元の指示にしたがって実施した。
PCR増幅B7-2遺伝子は、HincII消化pT7T318U（Pharmacia）に直接クローニング（平滑末端のライゲーション）して、pT7T318U-B7-2を作製した。PCR増幅GM-CSF遺伝子は、HindIIIおよびBamHIで消化し、HindIIIおよびBamHIで消化したpBluescript KS (-)（Stratagene）にクローニングし、pBS-GM-CSFを作製した。B7-2およびGM-CSFのオープンリーディングフレームが正しく増幅およびクローニングされたことは、部分的DNA配列決定および制限酵素の消化によって確認した。
【０１２６】
(c) B7-2、GM-CSFおよびGFP遺伝子を含むレトロウイルスベクターの構築
B7-2およびGM-CSFのcDNAは、レトロウイルスベクターpLSNにサブクローニングして、それぞれpLSNB70およびpLSNGM1を作製した。pLSNB70を作製するために、pT7T318U-B7-2をBamHIで消化し、B7-2断片をゲル精製し、BglII消化pLSNにクローニングした。pLSNGM1を作製するために、pBS-GM-CSFをHindIIIおよびBamHIで消化し、GM-CSF断片をゲル精製し、HindIIIおよびBamHIで消化したpLSNにクローニングした。
さらに、レポーター遺伝子の緑色蛍光タンパク質(GFP)も、レトロウイルスベクターpLSNに挿入し、pLSN-GFPを作製した。以下のプライマー対を用いて、pGFP（Clontech）から、Pfuポリメラーゼ（Stratagene）を用いて、GFP遺伝子をPCR増幅した：：5'プライマー：5'-AAAAGCTTGGATCCACCATGAGTAAAGGA-3'（配列番号：12）および3'プライマー：5'-AATCTAGATTACTATTTGTATAGTTCATCC-3'（配列番号：13）。PCR増幅したGFP遺伝子は、EcoRV消化pBluescript KS(-)に直接クローニングし、pBS-GFP#1を作製した。pBS-GFP#1は、NotIおよびXhoIで消化し、GFP断片をゲル精製し、NotIおよびXhoIで消化したpLSNに挿入してpLSN-GFPを作製した。
得られたそれぞれのベクターには、内部SV40プロモーターに制御されるネオマイシン耐性遺伝子が含まれていた。
【０１２７】
(d) B7-2およびGM-CSFをコードする2シストロンレトロウイルスベクターの構築
IRESによって隔てられたB7-2およびGM-CSF遺伝子を含む2シストロンレトロウイルスベクターpLSN-BG9は、以下のようにして構築した。3つのDNA断片をゲル精製した：XhoIおよびHindIII消化pGEM-IRES8（以下に説明）からのEMCV IRES；HindIIIおよびBamHI消化PCR産物（セクションb）からのGM-CSF遺伝子；NotIおよびXhoI消化pLSNB70からのB7-2遺伝子。これらの3つの精製断片を混合し、NotIおよびBamHI消化pLSNにライゲーションしてpLSN-GB9を作製した。
pGEM-IRES8は、EcoRIおよびMscI消化pCITE-1（Novagen）からEMCV IRES断片を単離し、この断片をEcoRIおよびSmaI消化pGEM-7Zf+（Promega）に挿入して構築した。
【０１２８】
(e) 組換えレトロウイルスの作製
レトロウイルスプラスミドDNAは、記述されるようにして（Robinsonら、前記）、リポフェクションによってパッケージング細胞系PA317 [Miller, A.D.およびButtimore, C. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895およびMiller, A.D. (1990) Hum. Gene Ther. 1:5]にトランスフェクトした。簡単に述べると、リポフェクタミン（Gibko/BRL）を用いて、pLSNGM1、pLSNB70、pLSN-BG9、またはpLSN-GFPをPA317細胞にトランスフェクトした。リポフェクションは、製造元のプロトコールにしたがって実施した。
PA317細胞は、10％ FBSならびにペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDMEM中で、10％CO2を含む大気中で37℃で培養した。リポフェクションの24時間前に、PA317細胞を、50％コンフルエント（約1 x 10６細胞/フラスコ）で、T25フラスコ（Falcon）中に入れた。細胞のトランスフェクトのために、微量遠心チューブ（Eppendorf）中で、抗生物質を含まない300μlの無血清DMEMに、DNA（4μg）を添加し、穏やかに混合した。15 mlのポリカーボネートチューブ（Falcon）中で、300μlの無血清DMEMと12μlのリポフェクタミンを穏やかに混合した。DNA含有溶液をリポフェクタミンのチューブに一滴ずつ添加して2つの溶液を合わせ、混合液を室温で45分間インキュベートした。このインキュベーション後に、2 mlの無血清DMEMを添加して、穏やかに混合した。細胞を無血清DMEMで洗い、DNA/リポフェクタミン混合液を穏やかに細胞に添加した。細胞を10％ CO2インキュベーター中で37℃で5時間インキュベートした。5時間のインキュベーション後、20％FBSおよび抗生物質を含むDMEM 2.5 mlを、T25フラスコに添加し、細胞を一晩インキュベートした。5時間のインキュベーションの20時間後に、培地を、20％FBSおよび抗生物質を含む新しいDMEMと交換した。ベクターの濃度測定のために、培地を新しいDMEMに交換した24時間後に、培地を交換して、24時間後にウイルスを回収した。細胞をクローニングしなければならないときは（安定した生産細胞系の作製のため）、トランスフェクトされたPA317細胞を1:10の比率で選択培地（500μg/ml G418および10％FBSを含むDMEM）に分割して入れた。
PA317細胞のトランスフェクションの48時間後に、トランスフェクトされたPA317培養液の上清から、複製不能ウイルスを回収し、後に使用するために直ちに-80℃に凍らせた。
【０１２９】
実施例2−ヒトグリオブラストーマ細胞系D54MGにおけるB7-2およびGM-CSFの発現
GM-CSF、B7-2、B7-2/GM-CSF、またはGFPのいずれかをコードする組換えレトロウイルスゲノムを含むウイルス粒子を用いて、ヒトグリオブラストーマ細胞系D54MGの形質導入を行った。
(a) 組織培養におけるD54MGの増殖
ヒトグリオブラストーマD54MG [Dr. D. Bigner, Duke University, ノースカロライナ州ダラムから入手；Bignerら(1981) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 40:201]を、10％ウシ胎仔血清（Gibco）、0.2ユニット/mlペニシリン-ストレプトマイシン溶液（Sigma）、および0.2 mMグルタミン酸塩を含むダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)中で、5％CO2を含む加湿大気中で、37℃で培養した。
【０１３０】
(b) レトロウイルス形質導入
凍結したウイルス保存液を37℃で解凍した。解凍したウイルス溶液に、最終濃度が4μg/mlになるようにポリブレンを添加した。ウイルス溶液に培地を添加して、最終容量を1.5 mlにした。T25フラスコに入れた対数増殖期のD54MG細胞（約1 x 10６細胞）を、ウイルス上清中、37℃、5％CO2で、3時間インキュベートした。対照として、ウイルスを含まない同じ容量の培地とポリブレンを使用した。3時間後に、各フラスコにさらに培地3 mlを添加し、一晩インキュベートした。培地は、翌朝交換した。
【０１３１】
(c) 形質導入細胞の選択
レトロウイルス形質導入の24時間後に、500μg/mlのネオマイシンアナログG418を培地に添加した。培地は、完全な選択が起こるまで（すなわち、対照フラスコのすべての細胞死ぬまで）、2〜3日ごとに交換した。選択後、G418濃度を低下させた（250μg/ml）増殖培地中で細胞を培養し、コンフルエントになるまで増殖させた。
【０１３２】
(d) フローサイトメトリーによるB7-2発現の分析
約70％コンフルエントの形質導入D54MG細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中0.02% EDTAで15分間室温でインキュベートした後に、こすり取って回収した。免疫蛍光(IF)緩衝液（PBS中、2%ウシ胎仔血清、0.02%アジ化ナトリウム）200μlに10６細胞の等量液に分注したサンプルを、1μgのRPE結合モノクローナル抗ヒトB7-2抗体（Ancell）または1μgのPRE結合アイソタイプ対照マウスIgG1抗体（Pharmingen）と氷上で1時間インキュベートした。IF緩衝液で4回細胞を洗い、PBS中1％ホルマリンで固定した。その後、標準的なテクニックを使って、サイトメーター（B-D フローサイトメーター）によりサンプルを読んだ。
【０１３３】
(e) ELISAによるGM-CSF発現の分析
T75に入れた約70％コンフルエントの形質導入D54MG細胞を、新しい培地中で24時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を回収して、短時間遠心して細胞および破片を取り除いた。フラスコ当たりの細胞数を決定した。回収した培地中のGM-CSFレベルは、市販のキット（Quantikine, R & D Systems）を用いて、製造元の指示どおりに試験した。GM-CSFレベルは、培地が得られたフラスコにおける細胞数に基づいて、μg/10６細胞/24時間に変換した。
【０１３４】
(f) D54MG細胞におけるB7-2およびGM-CSFの発現
フローサイトメトリー実験から、B7-2は、B7-2およびB7-2/GM-CSFによって形質導入されたD54MG細胞表面には発現するが、野生型またはGM-CSF形質導入細胞では（アイソタイプ対照と比較して、蛍光シフト1〜2桁）発現しないことが示された。染色なしのGFP形質導入D54MG細胞のフローサイトメトリーでは、野生型D54MGと比較して、僅かに自己蛍光が上昇していることが観察された。代表的なフローサイトメトリーヒストグラムは図2A〜Eに示されている。
【０１３５】
図2A〜Eは、野生型D54MG細胞(2A)、B7-2形質導入D54MG細胞(2B)、GM-CSF形質導入D54MG細胞(2C)、B7-2およびGM-CSF形質導入D54MG細胞(2D)、およびGFP形質導入D54MG細胞(2E)のフローサイトメトリーのヒストグラムである。図2A〜2Dについては、左側のヒストグラムは、アイソタイプの一致した対照抗体で染色したD54MG細胞で、右側のヒストグラムは、抗ヒトB7-2モノクローナル抗体で染色したものである。図2Eでは、左側のヒストグラムは非染色の野生型D54MG細胞、右側のヒストグラムは非染色のGFP形質導入D54MG細胞を表わす。
【０１３６】
GM-CSFの生産は、GM-CSF形質導入細胞（30 ng/10６細胞/日）およびB7-2/GM-CSF形質導入細胞（5 ng/10６細胞/日）ではかなり見られたが、野生型またはB7-2形質導入細胞では見られなかった。形質導入D54MG細胞における遺伝子発現は表1にまとめられている。
【表１】
2008237216.tif 000003
上記の結果は、pLSNに基づくレトロウイルスベクターによるインビトロ形質導入後に、ヒトグリオブラストーマ細胞系D54MGにおける治療用遺伝子発現が高いことを示す。GM-CSF生産のレベルは、他のレトロウイルス形質導入腫瘍細胞系で報告されているものと、同程度だった[Dranoffら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3539およびJaffeeら(1993) Cancer Res. 53:2221]。B7-2発現は、本質的にはバイナリーシステム（細胞表面に存在するか、しないかのいずれか）であるので、フローサイトメトリーを用いたB7-2発現の定量化は困難である。しかし、B7-2分子は、B7-2遺伝子を含むレトロウイルスベクターで形質導入されたD54MG細胞表面には、明らかに存在しており、野生型またはGM-CSF形質導入細胞には存在しなかった。これらの結果は、上述のレトロウイルスベクターが、インビトロでヒトグリオブラストーマにGM-CSFおよび/またはB7-2遺伝子を導入するための、簡単で信頼できる手段となることを示す。
【０１３７】
実施例3−SCID/beigeおよびSCID/nodマウスにおける腫瘍増殖効率およびヒトPBL再構成
本実施例では、ヒトPBLを用いたSICD/nodおよびSCID/beigeマウスの再構成およびこれらのマウス系統におけるヒト腫瘍細胞の移植を説明する。
(a) 動物およびヒトPBL再構成
大部分の実験では、4〜5週齢のメスC.B-17-SCID-beigeマウスは、Taconic（ニューヨーク州ジャーマンタウン）から購入した。最初のワクチン接種/抗原投与実験では、4〜5週齢のメスSICD/nodマウスは、Dr. L. Pilarski（Cross Cancer Institute, University of Alberta、アルバータ州エドモントン）から入手した。マウスはウイルスのない環境で、フィルター付きケージで飼育し、週2回、飲料水からコトリモキサゾールを与えた。
【０１３８】
Hu-PBL-SCIDマウスの再構成は、既述されるようにして実施した[Zhangら(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14720]。簡単に述べると、各マウスに、0.5 mlのハンクス平衡塩溶液に懸濁された2〜3 x 10７ PBLを腹腔内(IP)注射した。新しいPBLを使用した場合、ほぼ100％の成功率でSCID/bgマウスの再構成が得られた。再構成後、5日から3週間で、マウスの尾から採血し、ウサギ抗ヒトIgG/IgMモノクローナル抗体（Jackson Labs）および対照のヒトIgG (Sigma) を用いた固相酵素免疫測定法（ELISA）により、ヒトIgレベルを評価した。
【０１３９】
予備的な結果では、ヒト末梢血リンパ球によって、SCID/nodマウスはSCID/bgマウスほど信頼性高く再構成されないことが示された。SCID/bgマウスとは異なり、ヒトPBLによるSCID/nodマウスの再構成は、PBLのドナーによって、またマウスによっても差があると考えられる。さらに、多くのhu-PBL-SCID/nodマウスは、再構成の3〜6週後に、悪液質、脱毛症、および顔面浮腫という特徴を持つ疾病を発生した。これは、再構成しないSCID/nodマウス、または再構成したもしくは再構成しないSCID/bgマウスでは、見られなかった。この病因は不明であるが、移植片対宿主疾患および糖尿病の可能性が考えられた。このような問題のため、腫瘍の増殖およびワクチン接種/抗原投与実験には、再構成されたSCID/bgマウスの方が好ましい。
【０１４０】
(b) 皮下腫瘍増殖実験
5〜7週齢のSCID/bgマウスの右側腹部に、2 x 10６レトロウイルスで形質導入し選択されたD54MG細胞を皮下(SC)注射した。対照のマウスには、右側腹部に、野生型のD54MG細胞を皮下(SC)注射した。注射の6日後に、上述のように、健康なドナー由来の全血の白血球層からHistopaque勾配（Sigma）により単離された2 x 10７ヒト末梢血リンパ球の腹腔内注射により、マウスを再構成した。再構成は、ELISAにより、血清（尾から採血）中のヒトIgの存在を調べてモニターした。1つの実験以外では、各群（形質導入あり、または形質導入なし）のマウスの半数を、対照として再構成しないでおいた。腫瘍のサイズは、3〜5日ごとにカリパスによって3方向で測定した。形質導入腫瘍細胞および非形質導入腫瘍細胞、ならびに再構成マウスおよび非再構成マウスで比較をした。
【０１４１】
(c) 統計分析
異なる群の腫瘍のサイズの比較は、標準的一方向分散分析法(ANOVA)を用いて行った。
【０１４２】
(d) SCID/beigeおよびSCID/nodマウスにおける、腫瘍の増殖およびヒトPBL再構成
下述するように、腹腔内注射によりヒトPBLを提供されたSCID/bgマウスは、ほぼ100％の成功率でヒトメラノーマ細胞系の増殖を支持し、これらの動物では、再構成の38日後に、フローサイトメトリー分析によって、脾臓および末梢血中に、かなりのレベルのヒトリンパ球が観察された。この実施例は、SCID/nodおよびSCID/bgマウスのいずれも、ヒトリンパ球の再構成にもかかわらず、100％（35/35）の効率で、皮下の野生型D54MG細胞（ヒトグリオブラストーマ）の増殖を支持することを示す。B7-2、GM-CSF、またはB7-2とGM-CSFの両方で形質導入されたD54MG腫瘍も、再構成されなかったSCID/bgマウスにおいて100％の効率で増殖した（それぞれ4/4、8/8、および4/4）。ヒトリンパ球で再構成されたマウスにおけるB7-2およびGM-CSFで形質導入されたD54MGの増殖は、以下に詳述する。
ヒトPBLによる再構成は、再構成されたマウスの尾から採取された血清を用いて、ヒトIgの存在をELISAによって観察した。ヒトPBLを提供されたすべてのSCID/bgマウス(46/46)では、再構成後14日以内に、血清中にヒトIgがかなりのレベル（>100μg/ml）で観察された。しかし、ヒトPBLの提供を受けた12匹のSCID/nodマウスのうち3匹は、連続した試験でヒトIgを示さなかったため、試験から除外された。SCID/nodを用いたその後の実験で、ヒトPBLによる再構成の成功は、PBLドナーごとに大きく異なることも分かった。このような問題のため、腫瘍の増殖およびワクチン接種/抗原投与実験には、SCID/bgマウス（SCID/nodではない）の方が好ましい。
【０１４３】
実施例4―  Hu-PBL-SCID/bgマウスにおいて、B7-2およびGM-CSFを形質導入したD54MGでは起こるが、野生型のD54MGでは起こらない増殖抑制
2つの別々の実験において、ヒトPBLで再構成したSCID/bgマウスでは、B7-2を形質導入したD54MGの増殖が、形質導入および/または再構成されていない対照に較べて顕著に阻害された。これらの結果を図3Aと3Bにまとめた。
図3に示した結果では、すべてのマウスに、0日目に、2×10６個の腫瘍細胞（D54MGまたはD54MG-B7-2）を右側腹部に皮下から与えた。腫瘍細胞を注射してから6日後に、2×10７個のヒトPBLをマウスの腹腔内に注射した。血清のヒトIgレベルが100μg/mlよりも高いものを検出して、再構成されたことを確認した。最初の実験（3A）では、すべてのマウスをヒトPBLで再構成した。図3Aでは、形質導入されていないD54MG細胞を与えたマウス（白丸；「D54MG」）、およびpLSNB70によって形質導入されたD54MG細胞（黒四角；「D54MG-B7-2」）を与えたマウスの腫瘍容積（mm３）を一定の時間（日）にわたってプロットしている。2番目の実験（3B）では、両方のグループ（D54MGおよびD54MG-B7-2）のマウスの半分を再構成しないままにした（点線）。図3Bでは、形質導入されていないD54MG細胞を与えたマウス（黒四角）、およびpLSNB70によって形質導入されたD54MG細胞（白三角）を与えたマウスの腫瘍容積（mm３）を一定の時間（日）にわたってプロットしている。図3では、矢印は、腫瘍細胞とリンパ球が注射された時を示している。
【０１４４】
皮下腫瘍増殖モデルにおける統計的な有意性の標準的な検定法は、増殖曲線に沿ったほぼ3分の2のところの腫瘍容積を、ANOVAによって比較することである［Gallagherら、（1993）腫瘍免疫学：実際的方法（Tumor Immunology: A Practical Approach）IRLプレス（IRL Press）、英国、オクスフォード（Oxford）］。この基準によると、最初の実験では22日目まで、また、第2実験においては35日目まで、ヒトリンパ球再構成マウスにおいて、B7-2を形質導入した腫瘍の平均腫瘍容積は、野生型（すなわち、形質導入していない）腫瘍の平均腫瘍容積よりも有意に小さかった（どちらの実験でも、p<0.05）。興味深いことに、非再構成マウスにおけるD54MG-B7-2腫瘍の増殖も、野生型腫瘍に較べると、僅かに阻害された（図3B）。しかし、増殖阻害は、再構成マウスでずっと顕著であった。これらの結果は、D54MG-B7-2で見られる増殖阻害の僅かな部分は、ヒトリンパ球に依存しているが、主要な効果は、ヒトリンパ球に依存しないことを示している。
【０１４５】
2つの別々の実験において、ヒトリンパ球再構成マウスにおける、GM-CSFを形質導入したD54MGの増殖は、形質導入および/または再構成されていない対照に較べ、中度に阻害された。これらの結果を図4Aと4Bにまとめた。
【０１４６】
図4に示した結果では、すべてのマウスに、0日目に、2×10６個の腫瘍細胞（D54MGまたはD54MG-GM-CSF）を右側腹部に皮下から与えた。腫瘍細胞を注射してから6日後に、2×10７個のヒトPBLをマウスの腹腔内に注射した。血清のヒトIgレベルが、ELISAで100μg/mlよりも高いものを検出して、再構成されたことを確認した。図4A、および4Bに示したどちらの実験においても、両方のグループのマウスの半分は、再構成しないままにしておいた（点線）。図4Aでは、形質導入されていないD54MG細胞を与えたマウス（黒四角；「D54MG」）、およびpLSNGM1によって形質導入されたDM54MG細胞（白三角；「D54MG-GM-CSF」）を与えたマウスの腫瘍容積（mm３）を、一定の時間（日）にわたってプロットしている。図4Bでは、形質導入されていないD54MG細胞を与えたマウス（黒四角）、およびpLSNGM1によって形質導入されたD54MG細胞（白三角）を与えたマウスの腫瘍容積（mm３）を一定の時間（日）にわたってプロットしている。図４では、矢印により腫瘍細胞とリンパ球が注射された時を示している。
【０１４７】
図4Aおよび4Bに示したどちらの実験においても、それだけでは、ANOVAによる統計的な有意性は算出されなかった。しかし、二つの実験の結果を合わせると、ヒトPBL再構成マウスにおいて、GM-CSFを形質導入した腫瘍は、55日目までは、野生型よりも有意に小さかった（p<0.001）。非再構成マウスでは、D54MG-GM-CSF腫瘍の増殖阻害は見られなかった。
【０１４８】
これらの結果は、B7-2またはGM-CSFのどちらかをコードする組換えレトロウイルスベクターによる、D54GM腫瘍細胞の形質導入が、ヒトPBL再構成SCID/bgマウスにおいて、腫瘍増殖の阻害をもたらしたことを示している（図3と4）。これは、グリオブラストーマ細胞における、ヒトB7-2遺伝子またはヒトGM-CSF遺伝子のいずれかの発現が、局所的な免疫抑制を凌駕して、有意な抗腫瘍反応をもたらすことを示している。後述の実施例に示されているように、グリオブラストーマにおけるヒトB7-2遺伝子とGM-CSF遺伝子の両方の発現は、遠位の腫瘍増殖を阻害する全身的な免疫反応を誘導する。
【０１４９】
実施例５―  治療用に遺伝子改変したD54MG腫瘍細胞をもつ、Hu-PBL-SCID/nodマウスおよびHu-PBL-SCID/bgマウスの免疫の効果
腫瘍細胞による抗原投与を行う前に、再構成マウスにワクチン接種して、ヒトPBL再構成SCIDマウスにおける、腫瘍増殖阻害能力を調べた。
(a) ワクチン接種/抗原投与実験
最初のワクチン接種/抗原投与実験では、健康なドナーからの2×10７個のPBLを腹腔内注射することによって、5〜6週齢のメスのSCID/nodマウスを再構成した。ELISAによって、ヒトIgが存在するかことを血清（尻尾の血液）で調べることによって、再構成を観察した。再構成してから5日後に、放射線（20,000ラド）照射したD54MG細胞（野生型、GFP形質導入、またはB7-2およびGM-CSFを形質導入したもののいずれか）を1×10５個、腹腔内注射によって、マウスにワクチン接種した。ワクチン接種してから5日後、すべてのマウスに、1×10６個の非照射野生型D54MG細胞を右側腹部に皮下注射した。上記したようにして、腫瘍増殖を測定した。
第二のワクチン接種実験も、同じようにして行ったが、ここでは、SCID/bgマウス（タコニック（Taconic））を用いた。さらに、注射の順序が少し異なっていた。まず、皮下注射によって、右側腹部に1×10６個の野生型D54MG細胞を与えた。10日後、2×10７個のヒトPBLで再構成した。再構成してから10日後、マウスに1×10５個の照射腫瘍細胞（野生型、GFPを形質導入したもの、またはB7-2/GM-CSFを形質導入したもののいずれか）をワクチン接種した。
【０１５０】
(b)治療用遺伝子を発現するD54MG細胞を用いた、Hu-PBL-SCID/bgマウスのワクチン接種により全身的な免疫反応が誘導される
上記のようにして、SCID/nodマウスおよびSCID/bgマウスを再構成し、野生型D54MG細胞によるワクチン接種および抗原投与を行った。図5Aに示したように、ヒトPBLで再構成したSCID/nodマウスに、放射線照射したB7-2/GM-CSF形質導入D54MGをワクチン接種したときの野生型D54MG腫瘍の増殖は、野生型D54MG、またはGFPを形質導入したD54MGに較べ顕著に阻害された。図5Aでは、pLSN-BG9によって形質導入されたD54細胞（白四角；「D54MG-B7-2-GM-CSF」）、pLSN-GFPによって形質導入されたD54MG細胞（黒丸；「D54MG-GFP」）、または形質導入されていないD54MG細胞（黒四角；「DM54MG」）のいずれかをワクチン接種したマウスについて、腫瘍容積（mm３）が、一定の時間（日）にわたってプロットされている。図5Aでは、矢印は、腫瘍細胞が注射された時を示している。
【０１５１】
図5Aに示した結果は、放射線照射したB7-2/GM-CSF形質導入D54MG細胞を用いてワクチン接種したHu-PBL-SCID/nodマウスにおいて、野生型D54MG腫瘍の増殖が阻害されたことを示している。しかし、再構成がうまく行かなかったマウスを数匹（3/12）排除したために、サンプルサイズが小さくなって、この効果が統計的に有意であるというところにまでは到達しなかった。この問題は、再構成されたSCID/bgマウスを用いた残りの実験をすべて行うことによって克服された。
【０１５２】
第二のワクチン接種実験では、野生型の増殖阻害が、ヒトPBLによって再構成されたSCID/bgマウスで、放射線照射したD54MG-B7-2/GM-CSF細胞をワクチン接種したマウスにおいては見られたが、野生型D54MG細胞またはD54MG-GFP細胞のいずれかをワクチン接種したマウスでは見られなかった。この第二のワクチン接種実験では、ELISAで判定したところ（ヒトIg>100μg/ml）、すべてのマウスを、ヒトPBLによって再構成することに成功した。結果は、図5Bにまとめてある。図5Bでは、pLSN-BG9によって形質導入されたD54細胞（白四角；「D54MG-B7-2-GM-CSF」）、pLSN-GFPによって形質導入されたD54MG細胞（黒丸；「D54MG-GFP」）、または形質導入されていないD54MG細胞（黒四角；「DM54MG」）のいずれかをワクチン接種したマウスについて、腫瘍容積（mm３）が、一定の時間（日）にわたってプロットされている。図5Bでは、矢印を用いて、腫瘍細胞とリンパ球を注射した時、およびワクチン接種した時とを示している。
【０１５３】
最初のワクチン接種実験（図5A）とは異なり、第二のワクチン接種実験では、ワクチン接種する20日前に、野生型のD54MG細胞を側腹部に皮下注射してあった。ワクチン接種の時、すべてのマウスに触知可能な腫瘍（1〜2 mm３）が見られた。ワクチン接種後も、野生型D54MG、またはGFPを形質導入したD54MGをワクチン接種したマウスでは、腫瘍増殖が指数的に継続した。しかし、GM-CSF/B7-2形質導入D54MGをワクチン接種したマウスでは、腫瘍の大きさは、ワクチン接種後、僅かに増加し（最大時で、平均8 mm３）、その後退行した。実験グループと対照グループとの違いは、ANOVAによると、42日目までに統計的有意の域（p<0.001）に到達した。
【０１５４】
上記の結果は、B7-2遺伝子およびGM-CSF遺伝子を含むレトロウイルスベクターによって形質導入された放射線照射腫瘍細胞をワクチン接種したマウスにおいて、野生型腫瘍を抗原投与したときに増殖が起こることを示しており、また、グリオブラストーマ細胞による、これらの遺伝子の発現が、遠位における腫瘍増殖を阻害する全身的免疫応答を誘導することを示している。
【０１５５】
同種異系システムではあるが、本モデルは、一見したよりは自己システムに類似していることにも留意すべきである。同種器官移植に見られる古典的な免疫媒介性拒絶反応とは異なり、このシステムは、移植片に由来する「パッセンジャーリンパ球」を含んでいない。これらのリンパ球は、同種のクラスII主要組織適合遺伝子複合体（MHC）に関し、宿主のリンパ球に抗原提示することにより、同種器官拒絶反応を開始する上で重要である［Larsenら、(1990) Annals of Surgery 212:308; ChandlerとPassaro (1993) Achives of Surgery 128:279; Moller (1995) Transplnatation Proc. 27:24］。D54GM細胞系は、インビトロでは、クラスI MHCだけを発現し、クラスII MHCを発現しない。このモデルでは、D54MG細胞によって、同種のクラスI MHC分子は発現されるが、移植片に由来するクラスII MHC陽性細胞が腫瘍内に存在しないため、本モデルは、自己システムによく似たシステムとなる。
【０１５６】
hu-PBL-SCIDマウスモデル、およびヒトグリオブラストーマ腫瘍細胞系を用いたことによって、GM-CSF遺伝子、またはB7-2遺伝子を（単独で、または合わせて）用いた、インビボでの免疫遺伝子治療の治療薬としての有用性と実施可能性とが明らかになった。hu-PBL-SCIDモデルは、ヒト腫瘍に対する、ヒトリンパ球のインビボでの応答を解析するための簡単で強力な方法を提供する。hu-PBL-SCIDマウスを用いた初期の癌免疫治療研究は、滞留しているマウスNKリンパ球の活動の影響による制約を受けた［Reddyら、(1987) Cancer Res. 47:2456; Hillら、(1991) FASEB J. 5:A965; Muellerら、(1991) Cancer Res. 51: 2193; Zhaiら、(1992) Cancer Immunol. Immunother. 35: 237］。この問題は、NK細胞をもたないマウス系統SCID/bgとSCID/nodを用いることで解決した［CroyとChapeau (1990) J. Reprod. Fert. 88: 231; MacDougalら、(1990) Cell. Immunol. 130: 106; Prochazkaら、(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3290; Mosierら、(1993) J. Exp. Med. 177: 191; Malkovskaら、(1994) Clin. Exp. Immunol. 96: 158］。
【０１５７】
結論として、本明細書で提供されているレトロウイルス遺伝子治療用ベクターにより、インビトロで、ヒトグリオブラストーマ細胞への効率的な2-シストロン遺伝子の導入（B7-2とGM-CSF）が行われることが明らかになった。インビボのヒト腫瘍/リンパ球同種システムにおいて、これらの遺伝子を発現するグリオブラストーマ細胞は、局所的に且つ遠位で腫瘍増殖を阻害するリンパ球媒介性応答をもたらす。これらの結果から、B7-2遺伝子とGM-CSF遺伝子とを用いた、グリオブラストーマのさまざまな形を免疫治療することが実施可能になることが明らかである。
【０１５８】
実施例６―樹立した腫瘍細胞系における、B7-2遺伝子の導入と発現
ヒトの腫瘍細胞のほとんどが、レトロウイルスによる遺伝子導入に感受性があるか、また、T細胞の共刺激因子遺伝子であるB7-2が、異なった腫瘍の中で発現できるか否かを判定するために、さまざまな型の一連のヒト腫瘍に、B7-2ベクターを遺伝子導入した。遺伝子導入の条件は、実施例2で説明した通りであった。遺伝子導入してから24時間後に、さまざまな濃度のG418を含む培地の中で細胞培養した。この実験の結果を表2に示す。
【表２】
2008237216.tif 000004
＊1+：<10 scc；  2+：>30 scc；  3+：>50 scc；  4+：>80 scc；  5+：>100 scc；およびscc：単一細胞クローン。MEM（最少必要培地）；NaPy（ピルビン酸ナトリウム）；NEa.a.（非必須アミノ酸）。
【０１５９】
表2に示した結果は、樹立されたヒト腫瘍細胞のほとんどが、pLSNB70ウイルスによって効率的に形質導入されたことを示している。他の腫瘍細胞よりも、G418に抵抗性のある腫瘍細胞もある。G418に抵抗性のある細胞のコロニー数を数えて、形質導入率を決定した。抗B7-2モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色によって、B7-2遺伝子の発現を明らかにした。低レベルのG418に感受性のあるいくつかの細胞系（例えば、PC3）を除き、試験した細胞系のほとんどが、B7-2遺伝子によって効率的に形質導入され、2週間以内にG418によって選抜された。
【０１６０】
実施例７―  初代腫瘍細胞における、B7-2遺伝子の導入と発現
樹立された細胞系のレトロウイルスによる形質導入は、一般的に、初代腫瘍細胞を形質導入するよりは効率的である。しかし、インビボまたはエクスビボの遺伝子導入では、標的細胞は、新しい（すなわち、初代の）組織または腫瘍である。したがって、新しく単離された初代腫瘍細胞における、B7-2形質導入を明らかにすることが重要である。この目的のために、外科手術または生検から得られた試料をいくつか、5回未満の継代回数で培養して増殖させ、実施例2で説明したようにして、pLSNB70ウイルスによって形質導入した。形質導入後、G418で培養細胞を選抜した。結果を表3にまとめた。
【表３】
2008237216.tif 000005
＊（1+：<10 scc；  2+：>30 scc；  3+：>50 scc；  4+：>80 scc；  5+：>100 scc；  scc, 単一細胞クローン）。
【０１６１】
表3に示されているように、初代培養腫瘍細胞は、低濃度のG418（約250 μg/mlのG418）に反応することが分かった。それにもかかわらず、形質導入された細胞のほとんどが、10日以内に選抜された。表3に示されている結果は、3種類の初代グリオーマ、2種類の黒色腫、および2種類の腺癌腫をpLSNB70で形質導入して成功したことを具体的に示している。マウス抗B7-2抗体を一次抗体として、またFITC標識したヤギ抗マウス抗体を二次抗体として用いた免疫組織化学染色によって、B7-2の発現も確認した。選抜された細胞（すなわち、G418存在下で生き残って増殖した形質導入腫瘍細胞）の大部分は、B7-2について、陽性の表面染色を示した。
【０１６２】
実施例８―  樹立された腫瘍細胞および初代腫瘍細胞における、GM-CSFのレトロウイルスによる形質導入
動物実験において、GM-CSFの高レベルの発現は、それの治療効果と関係があることが示されている［Jaffeeら、(1993) Cancer Res. 53:2221、また、Dranoffら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3539］。ヒトGM-CSFのcDNAを含む、2つの異なったレトロウイルスベクターを構築して、形質導入した腫瘍細胞において発現されるGM-CSFのレベルを調べた。一番目のベクターはpLSNは、野生型のMoMLV LTRを含んでおり、上記実施例1で、pLSNGM1の構築として説明されている。二番目のベクター、pLGCTSN（ATCC 97803；Robinsonら、前記）は、ヒト細胞における発現レベルが上昇するよう、CMV-IEエンハンサー/プロモーター、およびHIV TATAとTAR因子で、MoMLVのU3領域を置き換えた改変LTRを含んでおり、さらに、pLGVTSNは、延長されたパッケージングシグナルと、MoMLV由来の3'スプライシング受容配列を含んでいる。ヒトGM-CSF cDNAをpLGCTSNの中に挿入して、以下のようにして、pLGCTSN-GM1を作出した。HindIIIとBamHIで消化して、pBS-GM-CSF（実施例1）からGM-CSF遺伝子を解離させ、この断片を、HindIIIとBamHIで消化したpLGCTSNの中に挿入して、pLGCTSN-GM1を作出した。
【０１６３】
ヒト黒色腫細胞系（SK-MEL-1；ATCC HTB 67）、および初代培養腺癌（LJ）細胞［「AD1(LJ)」］に、pLSNGM1、pLGCTSN-GM、pLSNBG9、またはpLSNB70のいずれか由来のレトロウイルスを形質導入して、G418で選抜した。G418選抜培地から集めた培養上清を用いて、ELISAによってGM-CSFの発現を判定した。表4に、培養上清に存在していたGM-CSFの量（ng/10６細胞/24時間）をまとめた。
【表４】
2008237216.tif 000006
pLSNB70由来のウイルス（B7-2をコードする）は、形質導入された細胞におけるGM-CSF発現に関する陰性対照として用いたが、pLSNB70を形質導入した黒色腫細胞は、24時間で、<0.1 ng/ml/10６細胞のGM-CSFを発現したが、これは、ELISAのバックグランドレベルに近かった。pLSNGM1形質導入細胞およびpLGCTSN-GM形質導入細胞は、24時間で、9 ng/ml/10６細胞のGM-CSFを発現した。この研究では、樹立されたヒト黒色腫細胞系（SK-MEL-1）が用いられ、G418による選抜を行ってから3ヶ月後にGM-CSF発現レベルを測定した。
【０１６４】
初代培養ヒト腺癌細胞AD1(LJ)を用いて、同様の実験を行った。初代培養は以下のようにして調製した。腫瘍組織を外科手術によって取り出し、手術後すぐに、氷上に置いたHBSSの中に入れて、バイオセイフティーフードの中に移した。10ミリリットルのHBSSを滅菌したシャーレの中に入れ、腫瘍組織を加えた。ピンセットとメスを使って、腫瘍の回りの正常な組織を取り除き、腫瘍を、5〜10 mlのHBSSを含む別のシャーレの中に移し、この腫瘍を細かく刻んだ。細かく刻んだ腫瘍を含む懸濁液10 mlを、15 mlチューブの中に移し、100×gで8分間、室温で遠心分離して細胞を集めた。細胞は、20%のFCSを含有する2 mlのDMEMの中に懸濁した。再懸濁細胞（2〜3 ml）を50 mlのチューブに移して、以下の酵素を加えた：1 mg/mlのV型コラゲナーゼ、10 μg/mlのV型ヒアルロニダーゼ、300 U/mlのIV型DNase、および10 μg/mlの硫酸ゲンタマイシン。次に、細胞懸濁液を、振盪しながら、37℃で60分間インキュベートした。そして、この細胞を、20%FCS、10 μg/mlの硫酸ゲンタマイシン、ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン溶液（Gibco/BRL社製）、および1.25 μg/mlのアンホテリシンを含むをDMEM（増殖培地）を入れた組織培養フラスコの中で培養し、5% CO２を含むインキュベーターの中で、37℃で一晩培養した。2日目に、3 mlの増殖培地でフラスコを洗浄して、非接着細胞を取り除いた。培地は、細胞の増殖率を見ながら、3〜7日毎に交換した。pLSNB70ウイルスによって細胞に形質導入し、上記のように、G418存在下で増殖させた。
【０１６５】
表4で示したように、形質導入され、選抜された初代ヒト腫瘍細胞［AD1(LJ)］は、1〜8 ng/ml/10６細胞/24時間の範囲で、GM-CSFを産生した（G418を用いて、細胞を選抜してから2〜3週間後に、GM-CSF発現を測定した）。このように、非改変レトロウイルスベクターpLSNには、初代ヒト腫瘍細胞において高レベルのGM-CSFを産生する能力がある。GM-CSF発現のレベルは、細胞型依存的であり、ベクターをさらに改変する（例えば、細胞型また組織に特異的なエンハンサーおよび/またはプロモーターを使用する）ことによって、特定の腫瘍細胞における発現レベルをさらに上昇させることができる。
【０１６６】
実施例９―  樹立された腫瘍細胞および初代腫瘍細胞における、B7-2とGM-CSFの2-シストロンの発現
B7-2およびGM-CSF両治療用遺伝子を腫瘍細胞の中で同時に発現させるために、2-シストロンを有するレトロウイルスベクターpLSNBG9（実施例1）を用いた。プラスミドDNAをPA317にトランスフェクトして、ウイルスを回収し、実施例1に記載のように形質導入に用いた。樹立された黒色腫細胞系SK-MEL-1と、初代培養腺癌細胞AD1(LJ)を形質導入して、G418で選抜した。選抜後（典型的には、G418を施用してから2週間後）、これら2つの細胞型におけるGM-CSFとB7-2の発現を、それぞれELISA（表4）とフローサイトメトリーによって測定した。表4は、2-シストロンベクターのGM-CSF発現レベルが、SK-MEL-1細胞では、1-シストロンベクターpLSN-GMと同じであるが、初代AD1(LJ)培養細胞では1-シストロンベクターよりも10倍少ないことを示している。FACS解析によって、1-シストロンベクター（pLSNB70）と2-シストロンベクター（pLSNBG9）が、両方の細胞型で、B7-2を発現したことが示された。これらの結果から、樹立された腫瘍細胞および初代腫瘍細胞を、2-シストロンを有するpLSNBG9ベクターに由来するウイルスで形質導入すると、B7-2とGM-CSFの両方が同時に発現されうることが示される。
【０１６７】
実施例１０―  治療用遺伝子の高レベルな発現をもたらすための発現ベクターの構築
レトロウイルスのプロモーター強度が、真核細胞における形質導入遺伝子の発現レベルを決定する。遺伝子発現レベルを上昇させるために、本発明者らは、MLVベクターを改変して、プロモーター強度を高めた一連のベクターを作製した（Robinsonら、前記）。プロモーター強度をさらに向上させるために、レポーターCATアッセイ法を用いて、ヒトの腫瘍細胞系HeLa（ATCC CCL 2）でいくつかのプロモーターの強度を調べた。CMV-IEプロモーター/エンハンサー、イントロン1を持つもしくは持たないEF1αプロモーター/エンハンサー、MCTプロモーター（pLGCTSNにある改変MoMLV LTR）、およびHIV LTRのいずれかの転写調節下に、CAT遺伝子が置かれているプラスミド（これらのCAT構築物のいくつかは、Robinsonら、前記で説明されている）。プラスミドをHeLa細胞に形質導入し、48時間後に、説明させれているところ（Robinsonら、前記）にしたがって、細胞溶解物を調製して、CAT活性を測定した。HIV-1のTAR因子（すなわち、HIV LTRとpMCTプロモーター）を含むプラスミドをもつ構築物も、tat発現構築物とともに同時形質転換に用いられた。結果を表5にまとめた。表5では、プロモーター活性を、CMV-IEプロモーターの活性と比較して示している。表5では、以下の略語が用いられている。すなわち、EF1α+イントロン（イントロン1を含む、1.442 kbのEF1αエンハンサー/プロモーター因子）；EF1α-イントロン（ヒトEF1α遺伝子のマップ単位125から600に相当する、EF1αエンハンサー/プロモーターを含む、475 bpの断片）；HIV+Tat（tat発現構築物と同時に形質転換されたpHIV-1/LTR-cat構築物）；MCT（pMCT-cat）；およびMCT+Tat（tat発現構築物と同時に形質転換されたpMCT-cat）。
【表５】
2008237216.tif 000007
【０１６８】
表5に示した結果は、ヒトEF1αプロモーターにそのイントロンを加えたものが、試験した他のプロモーターすべてに較べて、最も強い活性を持っていることを示している。したがって、EF1αプロモーターを用いて、腫瘍細胞での治療用遺伝子の発現操作を行うことができる。治療用遺伝子の発現を操作するために、EF1α+イントロンプロモーター/エンハンサーが用いられている、レトロウイルスおよびプラスミドの構築物を以下に説明する。
【０１６９】
(a)EF1αエンハンサー/プロモーターを含むプラスミド発現ベクターの構築
ヒトEF1αエンハンサー/プロモーターは、L929細胞、HeLa細胞、CHU-2細胞、およびCOS細胞など、広範な細胞型において大量の転写を行わせる［Uetsuki, Tら、J. Biol. Chem., 264:5791 (1989)、および、Mizushima, SとNagata, S., Nuc. Acids. Res., 18:5322 (1990)］。ヒトEF1α遺伝子のヒトEF1αエンハンサー/プロモーター、およびスプライシング供与部位と受容部位を含む1.442 kbの断片を、以下のようにして、ヒトゲノムDNAから単離した。この1.442 kbの断片は、ヒト伸長因子1α遺伝子のマップ単位125から1567に相当する（配列番号：14）。
【０１７０】
常法［Sambrookら、（分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning. A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリングハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）(1989）9.16〜9.23］を用いて、MOU細胞系（GM 08605, NIGMSヒト遺伝子変異細胞保存所（NIGM Human Genteic Mutant Cell Repository）ニュージャージー州カムデン（Camden））からゲノムDNAを単離した。2つの合成プライマーを用いて、ヒトEF1αエンハンサー/プロモーターを含む1.442 kbの断片を単離するためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行わせた。米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、および第4,965,188号が、PCR法をカバーしており、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１７１】
HEF1αL5と名付けられた5'側プライマーは、次の配列を含んでいる：5'-AAGCTTTGGAGCTAAGCCAGCAAT-3'（配列番号：15）。HEF1αL5プライマーは、1.442 kb断片の5'末端にHindIII部位を作出する。HEF1αL3Bと名付けられた3'側プライマーは、次の配列を含んでいる：5'-TCTAGAGTTTTCACGACACCTGA-3'（配列番号：16）。HEF1α3Bプライマーは、1.442 kb断片の3'末端にXbaI部位を作出する。PCR条件は、サイキ（Saiki, R.K.）ら、Science 239:487 (1988)に報告されている通りであった。簡単に述べると、400 μlのPCR反応において、10μgのMOUゲノムDNA、および最終濃度1μMの各プライマーを用いた。反応条件は、94℃で1分間、60℃で1分間、72℃で1.5分間、30サイクルであった。Taq DNAポリメラーゼは、パーキンエルマーシータス社（Perkin-Elmer Cetus）から入手し、用いた反応バッファーは、製造業者によって推奨されているものであった。PCR反応産物を低融点アガロースゲルで電気泳動して、1.442 kb断片をゲル精製して、HindIIIとXbaIで消化した。そして、HindIII/XbaI断片をpSSD5（後述）に挿入して、pHEF1αBSD5を作出した。
【０１７２】
pSSD5は、プラスミドpLI［Okayama, H.とBerg, P., Mol. Cell. Biol., 3:280 (1983)］をPstIとEcoRIで消化して構築した。合成オリゴヌクレオチド（Operon）を、pLIのPstI末端とEcoRI末端にライゲーションして、pSSD5のポリリンカー（SD5ポリリンカー）を作出した。ポリリンカーを作出するために用いられたオリゴヌクレオチド対の配列は、SD5A 5'-TCTAGAGCGGCCG CGGAGGCCGAATTCG-3'（配列番号：17）、およびSD5B 5'-GATCCGAATTCGGCCTCCGCGGCCGCTCTAGATGCA-3'（配列番号：18）である。このオリゴヌクレオチド対をpLIに挿入したところ、PstI部位が破壊された。ポリリンカーを付加した後、HindIIIで消化して、BamHIで部分消化した。消化産物を低融点アガロースゲル（SeaPlaque, FMC Bioproducts製、メイン州ロックランド（Rockland））で電気泳動して、SV40572エンハンサー/プロモーター、16Sスプライス結合部位、およびSD5ポリリンカーを含む572 bpのHindIII/BamHI断片を単離した。572 bpの断片をゲルから切り出し、β-アガラーゼI（β-Agarase I）（New England Biolabs製）によって分解してアガロースを除去し、その後、製造業者の指示にしたがって、イソプロパノール沈殿を行った。
【０１７３】
この572 bpの断片を、以下のようにしてプラスミドpcDV1の中に挿入した［OkayamaとBerg, 前記］。pcDV1をHindIIIとBamHIで制限酵素消化して、SV40のポリA配列とpBR322バックボーンを含む2.57 kb断片を、SV40エンハンサー/プロモーター、16Sスプライス結合部位、およびポリリンカーを含む572 bpの断片にライゲーションした。この結果できたプラスミドをpSSDと名付けた。
【０１７４】
SV40 DNAからSV40のポリA配列（SV40のマップ単位2533から3204）を含む、671 bpのBamHI/PstI断片を切り出して、BamHIとPstIで消化したpUC19の中にクローニングした。次に、こうしてできたプラスミドをBclI（SV40のマップ単位2770に当たる）で制限酵素消化した。末端をクレノウ酵素とdNTPで処理して、平滑末端を作出した。リン酸化されていないPvuIIリンカー（ニューイングランドバイオラボズ社（New England Biolabs）製）を平滑末端にライゲーションし、プラスミドを環状化して、pUCSSDを作出した。SV40のポリA配列は、BamHI/PvuII断片として、pUCSSDから取り除くことができる。
【０１７５】
pSSD5は、次の3種類の断片を一緒にライゲーションして構築された。1）pUC19からの1873 bpのSspI/PvuII断片；これをプラスミドの骨組みとして提供する；2）SV40エンハンサー/プロモーター、16Sスプライス結合部位、およびpSSDのポリリンカーを含む、796 bpの断片；、この断片は、pSSDをSsPIで消化し、BamHIで部分消化した後、上記のように、低融点アガロースで単離回収して得られた；および3）pUCSSDからの245 bpのBamHI/PvuII断片（この断片は、SV40のポリA配列を含む）。これら3種類の断片を一緒に混ぜ、T4 DNAリガーゼを用いてライゲーションしてpSSD5を作出した。pSSD5のポリリンカーは、次の制限酵素部位、すなわち、XbaI、NotI、SfiI、SacII、およびEcoRIを有する。
【０１７６】
(b)pHEF-B70の構築
EF1αエンハンサー/プロモーターを用いて、ヒトB7-2の遺伝子の発現を操作するプラスミドpHEF-B70を、以下のようにして構築した。BamHIで制限酵素消化して、pLCTSNB70（後述）からB7-2遺伝子を切り出し、単離したB7-2断片をBamHI消化したpHEF1αBSD5の中にライゲーションしてpHEF-B7-2を作出した。
BamHI消化によって、pT7T318U-B7-2（実施例1）から切り出したB7-2遺伝子を、BamHI消化したpLCTSN（ATCC番号97802；Robinsonら、前記）の中にライゲーションしてpLCTSNB70を構築した。
【０１７７】
(c)pHEF-IL-12の構築
プラスミドpHEF-IL-12では、IL-12A遺伝子とIL-12B遺伝子が、EF1αエンハンサー/プロモーターによる転写調節下にある。
（i）ヒトIL-12 cDNAのクローニング
活性化NC37B細胞（ATCC CCL 214）からRNAを単離して、実施例1で説明したように、PCRによって、IL-12AとIL-12BのcDNAを単離した。IL-12AのcDNAを増幅するために、次のプライマーを用いた：5'-GAAGATCTGCGGCCGCCACCATGTGGCCCCCTGGGTCAGC-3' （配列番号：19；下線部は最適化した開始配列）、および5'-CCTCTCGAGTTAGGAAGCATTCAGATAGC-3' （配列番号：20）。PCR産物を、EcoRVで消化したpBluescript KS(-)に直接クローニングして、pKS-IL-12Aを作出した。IL-12Aのコーディング領域は、配列番号：21に示されている。
【０１７８】
IL-12B cDNAを増幅するために、次のプライマーを用いた：5'-AAAGAGCTCCACCATGTGTCACCAGCAGTTGGTC-3' （配列番号：22；下線部は最適化した開始配列）、および5'-AAGGATCCTAACTGCAGGGCACAGATGC-3' （配列番号：23）。このPCR産物を、EcoRVで消化したpBluescript KS(-)に直接クローニングして、pKS-IL-12Bを作出した。IL-12Bのコード領域は、配列番号：24に示されている。IL-12の両構築物が正しい構造になっているかを、制限酵素消化によって確かめた。
【０１７９】
（ii）pLSN-IL-12の構築
pLSN-12は、IL-12A-IRES-IL-12Bという2-シストロンを含むレトロウイルスベクターである。pLSN-IL-12を構築するために、次の4種類の断片をゲル精製した。ClaIとPspAIで消化してpKS-IL-12Aから解離させたpKS-IL-12A遺伝子；NotIとXhoIで消化してpKS-IL-12Bから解離させたpKS-IL-12B遺伝子；XhoIとClaIで消化してpGEM-IRES8から解離させたEMCV IRES；および、MvuIとPspAIで消化して、pLSNvpr（後述）からHIVのvpr遺伝子を取り出して作製された、PspAI部位を含むpLSNベクターの骨組み。これら4種類の断片を、NotIとMluIで消化したpLSNvprと混ぜてライゲーションし、pLSN-IL-12を作出した。
pBS-vprをNotIとXhoIで消化し、vpr遺伝子断片を、NotIとXhoIで消化したpLSNとライゲーションしてpLSNvprを構築した。vpr遺伝子は、pNL4-3［Adachiら、(1986) J. Virol. 59:284］からPCRで増幅し、pBluescript KS(-)に挿入してpBS-vprを作製した。
【０１８０】
（iii）pHEF-IL-12の構築
pHEF-IL-12を構築するために、次の3種類の断片を単離した：ClaIとPspAIで消化してpKS-12Aから解離したIL-12A遺伝子；NotIとXhoIで消化してpKS-IL-12Bから解離したIL-12B遺伝子；XhoIとClaIで消化して、pGEM-IRES8から解離したEMCV IRES。これらの断片を、NotIとPspAIで消化したpHEFvprにクローニングした。pHEFvprは、pLSNvprから単離した360 bpのBamHI断片を、BamHIで消化し、アルカリホスファターゼ処理したpHEF1αBSD5とライゲーションして構築された。
【０１８１】
（d）pHEF-IL-12-GM-CSFの構築
pHEF-IL-12-GM-CSFは、EF1αエンハンサー/プロモーターの転写調節下に、IL-12A-EMCV IRES-IL-12B-ポリオウイルスIRES-GM-CSFという3-シストロンを含んでいる。pHEF-IL-12-GM-CSFを構築するために、次の4種類の断片をゲル精製した。pHEF-IL-12から単離したIL-12B-EMCV IRES-IL-12Aシストロンを含む、2373 bpのNdeI-PspAI断片；pHEF-IL-12から単離されたEF1αイントロンを含む、1320 bpのNdeI-SphI断片；pKS-P2のポリオウイルスIRESを含む、735 bpのPspAI-XhoI断片（同等のDNA断片が、PspAIとXhoI部位を作出するプライマーを用いて、ポリオウイルスゲノムの最初の約730 bpの中に存在するIRESをPCR増幅して作製される［LaMonicaら、(1986) J. Virol. 57:515］）。
【０１８２】
（e）pHEF-GM-CSFの構築
pHEF-GM-CSFは、pHEF-IL-12-GM-CSFをSmaIで完全消化し、HincIIで部分消化して得られた。その結果できた約4409 bpの断片をゲル精製し、セルフライゲーションさせてpHEF-GM-CSFを作出した。
【０１８３】
（f）pHEF-BGの構築
ヒトB7-2、およびGM-CSFの両cDNAの発現を操作するために1.442 kbのEF1αエンハンサー/プロモーターが用いられているプラスミドpHEF-BG（2-シストロン構築物）を次のようにして構築する。NotIとBamHIで消化して、pLSN-BG9（実施例1）からB7-2-IRES-GM-CSFという2-シストロンをもつ断片を切り出し、ゲル精製した断片を、NotIとBamHIで消化したpHEF1αBSD5に挿入して、pHEF-BGを作出した。
【０１８４】
（g）pLSN-IL-12-GM-CSFレトロウイルスベクターの構築
pLSN-IL-12-GM-CSFは、MoMLV LTRを用いてヒトIL-12遺伝子とGM-CSFの両cDNAの発現を操作するレトロウイルスベクターを提供する。pLSN-IL-12-GM-CSFは、次の4種類の断片を、BamHI消化したpLSN-GFPにライゲーションして構築した。すなわち、SacI-XbaI消化したpLSN-GFPから得られた1489 bpのMoMLVベクター；pHEF-IL-12をXbaI-NotI消化して得られる、1680 bpのIL-12B-IRESを含む断片；pHEF-IL-12をNotI-PpsAI消化して得られる、760 bpのIL-12Aを含む断片；および、pHEF-IL-12-GM-CSFをPpsAI-BamHI消化して得られる、1252 bpのGM-CSFを含む断片。
【０１８５】
（h）pLCTSN-pA-BG-EFレトロウイルスベクターの構築
pLCTSN-pA-BG-EFは、（5' LTRからの転写に対して）逆向きに挿入された、EF1αエンハンサー/プロモーター、B7-2とGM-CSFのcDNA、およびSV40のポリアデニル化シグナルを含むシストロンをもっている。次の3種類の断片と、HindIIIとSalIで消化したpLCTSNベクターとをライゲーションして、このベクターを構築した：すなわち、SalI-NotI消化したpHEFからのEF1αエンハンサー/プロモーター、SalI-NotI消化したpLCTSN-BGからのB7-2/IRES/GM-CSFシストロン、およびBglII-HindIII消化したpSP72SVpAからのSV40ポリA。
【０１８６】
次の3種類のDNA断片をゲル精製してpLCTSN-BGを構築した：すなわち、NotI-XhoI切断したpLSNB70からのB7-2 cDNA、XhoI-HindIII切断（HindIIIは部分消化）したpGEM-IRESからのEMCV IRES、および、PCR増幅してHindIII-BamHI消化したDNA（実施例1）からのGM-CSF cDNA。そして、精製した断片を、NotI-BamHI消化したpLCTSNにライゲーションして、pLCTSN-BGを作出した。
【０１８７】
（i）pLCT-pA-BG-EFレトロウイルスベクターの構築
pLCT-pA-BG-EFは、（5' LTRからの転写に対して）逆向きに挿入された、EF1αエンハンサー/プロモーター、B7-2とGM-CSFのcDNA、およびSV40のポリアデニル化シグナルを含むシストロンをもっているが、pLCTSN-pA-BG-EFベクターに存在するneo遺伝子を持っていない。次の3種類の断片と、HindIII-SalI消化したpLCTSNをライゲーションして、pLCT-pA-BG-EFを構築した。すなわち、SalI-NotI消化したpHEFからのEF1αエンハンサー/プロモーター、NotI-BamHI消化したpLCTSN-BGからのB7-2/IRES/GM-CSFシストロン、およびNotI-HindIII消化したpSP72SVpAからのSV40ポリAシグナル。
pSP72SVpAは、pBlueBac-His B（Invitrogen製）から、HindIIIとEcoRI部位を含むプライマーによってSV40ポリAシグナルをPCR増幅し、HindIII-HEcoRI消化したpSP72（Promega製）にクローニングした。
剥出しのDNAの注射、リポソームによる遺伝子導入、または遺伝子銃（バイオリスティクス）によって、上記のプラスミドを、外植された腫瘍細胞、および患者の腫瘍細胞などの腫瘍細胞に導入する。上記のレトロウイルスベクターを用いて、実施例1および2で説明されているようにして、培養している腫瘍細胞（初代および樹立された細胞）の中に、コードされているIMGを形質導入するために用いる組換えウイルスを作出する。
【０１８８】
（j）GM-CSFシストロンから生物学的に活性のあるGM-CSFが生じることの証明
PCR増幅によって単離され、1-シストロンおよび多数のシストロンをもつ構築物を作出するために用いられたGM-CSF cDNA配列が、活性のあるGM-CSFを発現できることを明らかにするために、GM-CSF依存的なMo7e細胞系［遺伝学研究所、マサチューセッツ州ケンブリッジ（Cambridge）；Avanziら、(1990) Cellular Physiol. 145:458］を用いて、以下のGM-CSF生物活性アッセイ法を実施した。
【０１８９】
Mo7e細胞は、10% FBS、2 mM L-グルタミン、100 U/mlのペニシリン-ストレプトマイシン、および100 U/mlのGM-CSFを添加したDMEMの中で、37℃、10% CO２維持した。細胞が対数増殖期になったら（生存率 >90 %）、DMEMで2度洗浄し、GM-CSFなしで48時間培養する。2日間GM-CSFを欠乏させた後、生存率約20%のMo7e細胞をDMEMで1回洗浄して、V底の96穴プレートの中に、全部で200 μlの容量の、既知の濃度の標準GM-CSF溶液を連続希釈したもの、または、pHEF-GM-CSFプラスミドDNAもしくはpHEF-IL-12-GM-CSFプラスミドDNAで形質転換されたHeLa細胞から回収した上清（1:2000の培養液希釈率を用いた）の中で1×10４細胞数/ウェルの細胞を接種した。、37℃、10% CO２で2日間培養した後、各ウェルに、20 μlのMTT（3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（pBS中5 mg/ml）を加えて、プレートをさらに6時間インキュベートした。短時間遠心分離して、紫色の結晶をウェルの底に集め、上清を吸引除去した。この沈殿を100 μlの酸性化したイソプロパノールに溶解した。微量プレート読取器を用いて、各ウェル毎の570 nm（OD５７０）での吸光度を得た。既知のGM-CSF濃度をOD５７０での読み取り値に対してプロットして、標準曲線を作成した。回収した上清のGM-CSF濃度は、そのODを標準曲線と比較することによって得られた。結果を表6にまとめた。
【表６】
2008237216.tif 000008
表6に示した結果は、PCR増幅されたGM-CSF配列が、生物学的に活性のあるGM-CSFをコードしていることを示している。さらに、これらの結果は、GM-CSFシストロンを別のシストロンの下流に置くと（すなわち、pHEF-IL-12-GM-CSF）、発現されるGM-CSFの量が（1-シストロン発現ベクターに較べて）減少することを示している。GM-CSFが2番目か下流のシストロンであるときに、GM-CSFレベルは低下するが、2-シストロンをもつレトロウイルス（すなわち、pLSNBG9）によって形質導入された腫瘍細胞が、非改変腫瘍細胞に対して全身性免疫を誘導できる（実施例5）ことで示されるように、多数のシストンをもつGM-CSF構築物で産生されるGM-CSFの量は生物学的応答を引き起こすのに充分である。
【０１９０】
実施例１１―  SCID/beigeマウスへのヒト腫瘍およびPBLの植え付け
ヒトの腫瘍細胞における、B7-2とGM-CSFの発現が合併した効果を調べるために、インビボHu-PBL-SCIDマウス/ヒトの腫瘍モデルを樹立した。C.B-17 scid/scidマウス［Boussiotisら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11059］は、T細胞もB細胞も持たないが、正常な骨髄細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、マクロファージ、および樹状細胞の機能は維持している［Shpitzら、(1994) J. Immunol. Meth. 169:1］。SCIDマウスのNK活性を防止するために、NK細胞機能を失った新しいSCIDマウス系統を用いた（C.B-17-scid-beige近交系、Taconic）。
【０１９１】
SCID/beigeマウスがヒト腫瘍細胞の増殖を支持することができるかを調べるために、いくつかの樹立されたヒト腫瘍細胞系と、5つの初代腫瘍をSCID/beigeマウスに移植して、5ヶ月までの期間、腫瘍増殖を観察した。初代腫瘍は、次のように処理した。切除手術時に手術室の中で、腫瘍サンプルを無菌状態で入手した。1グラム〜3グラムの腫瘍を回収して、直ちに処理した。新鮮な腫瘍生検試料は、切開して壊死残滓と結合組織を取り除き、1〜2 mmの切片になるよう細かく刻んだ。そして、細胞懸濁液を提供するために、これらの切片を、HBSSに次の酵素を入れた溶液で処理した：
【０１９２】
グリオブラストーマには、0.025 %のコラゲナーゼ、0.04 %のDNase、および0.05%のプロナーゼを入れ、振盪しながら37℃で30分間、さらに、4℃で30分間。初代培養グリオブラストーマ細胞のための増殖培地の基本培地としてはDMEM/F12を用いた；
【０１９３】
肝細胞癌には、1 mg/mlのIV型コラゲナーゼ、300 U/mlのIV型DNase、および10 μg/mlの硫酸ゲンタマイシンで、振盪しながら、37℃で30分間。初代培養肝癌細胞のための増殖培地の基本培地としては、RMPI 1640、またはDMEM/F12を用いた；
【０１９４】
結腸腺癌には、物理的な分離（切断）によるか、または1 mg/mlのV型コラゲナーゼ、10 μg/mlのV型ヒアルロニダーゼ、300 U/mlのIV型DNase、および10 μg/mlの硫酸ゲンタマイシンを用いる酵素処理によって、腫瘍を処理した。そして、37℃で振盪しながら60分間、細胞懸濁液をインキュベートした。初代培養腺癌細胞のための増殖培地の基本培地としてDMEMを用いた；
【０１９５】
黒色腫には、腺癌に関して上述した酵素溶液を用いて、腫瘍細胞を処理した。初代黒色腫培養のための増殖培地の基本培地としてRPMI 1640を用いた。
【０１９６】
そして、この結果できた細胞懸濁液を、細かいメッシュに通して濾過してから、フィコール-ヒペーク（Ficoll-hypaque）密度勾配培地（シグマ社（Sigma）製）の上に載せて、室温で30分間、400×gで遠心分離した。中間層の細胞を取り出し、HBSSで2回洗浄して（100×gで10分間遠心分離）、細胞数を数えた。次に、培養するために、細胞を適当な培地［RPMI 1640、DMEM、DMEM/F12（すべて、シグマ社（Sigma）から入手可能）など、望ましければ、10%FCSと抗体を含んでいる］に接種して、保存のための凍結用培地に再懸濁するか、または、マウスに注射するか、遺伝子形質転換に適用するために直ちに用いた。
【０１９７】
300万〜400万個の初代腫瘍細胞、および200万〜600万個の樹立された腫瘍細胞系からの細胞をSCID/beigeマウスの側腹部に皮下注射した（充分な細胞サンプルを使うことができれば、両方の側腹部に注射した）。マウスを観察して、触知可能な腫瘍があるかを見た。表7に結果をまとめた。
【表７】
2008237216.tif 000009
【０１９８】
表7に示した結果は、SCID/bgマウスが、樹立されたヒト腫瘍細胞系の増殖を非常に効率よく支持することができ、また、樹立された腫瘍細胞系を用いた場合に較べると効率は低いが、いくつかの初代腫瘍細胞（例えば、黒色腫細胞）の増殖を支持することを示している。3×10６個の初代グリオブラストーマ細胞（Ed 86とEd 120）を注射したときと、初代肝癌細胞（単一ドナー）の注射をしたとき、SCID/bgマウスでは、3ヶ月以内に触知可能な腫瘍を生じなかった。
【０１９９】
ヒトPBL［Malkovskaら、(1994) Clin. Exp. Immunol. 96:158］、またはヒト脾細胞［Alegreら、(1994) J. Immunol.  153:2738］を植え付けたSCIDマウス（scid/scid）では、T細胞による同種移植片拒絶が起こることが明らかになっている。しかし、SCID/bgマウス系統は、以前、hu-PBL再構成実験で使用されたことがない。インビボでの癌遺伝子治療のためのモデルを提供するために、ヒトPBLによってSCID/bgマウスを再構成することができたか否かを判定するために、2×10７個の新しく単離したヒトPBLをマウスの腹腔内に注射して、ヒトPBLによってSCID/bgマウスを再構成した。4〜8週間後、PBLを注射したマウスを屠殺して、腹腔、脾臓、および末梢血から細胞を回収し、マウスまたはヒトの細胞マーカーに対する抗体を用いたFACSによって解析を行った。対照用の染色には、アイソタイプ適合するマウスIgを用いた。結果を表8にまとめた。実験には、以下の抗体を用いた。すなわち、ヒトマーカー：抗CD45（抗HLe-1、Becton Dickinson製）、抗CD3（Leu-4、Becton Dickinson製）、抗CD4（Becton Dickinson製）、抗CD8（Becton Dickinson製）、およびマウスマーカー：抗マウスH-2Kｄ（Pharmingen製）。
【表８】
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【０２００】
表8に示した結果は、脾細胞の約60%まで、PBLの17%まで、また、再構成されたマウスを腹腔洗浄して得られた細胞の約70%までを構成するCD45+ヒト細胞であるヒトリンパ球によって、SCID/bgマウスが効率的に再構成されたことを示している。
【０２０１】
再構成されたSCID/bgマウスの中に存在するCD45+集団中のヒトリンパ球のさまざまなサブセットの割合を、以下のようにして、FACSで調べた。実施例3で説明したように、3人の健康なヒトドナーから単離したPBLによって、SCID/bgマウスを再構成した。4〜8週間後、PBLを注射したマウスを屠殺して、リンパ器官、PBL、および腹膜滲出物を回収し、FACSによって解析した。ヒトドナーAおよびBの末梢血中のCD45+集団内でのTリンパ球サブセットの割合も決定した。以下のマーカーを調べた。すなわち、CD45RO（抗CD45RO、Becton Dickinson製）、CD45RA（抗CD45RA、Becton Dickinson製）、HLA-DR（MG2600、Caltag製）、CD4、およびCD8。結果を表9にまとめた。表9において、以下の略語を用いた：RA+（CD45RA陽性）；RO+（CD45RO陽性）；RO+DR+（CD45ROおよびHLA-DRに陽性）。
【表９】
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【０２０２】
表9に示した結果は、Hu-PBL-SCID/bgマウスの末梢血が、多数の未成熟T細胞または前駆T細胞（すなわち、CD4+8+細胞とCD45RA+細胞）を含んでいることを示している。これらの結果は、C.B-17 scid/scidマウス（Hu-PBL-SCID）の再構成によって得られた結果とは対照的である。ヒトPBLで再構成したC.B-17 scid/scidマウスにおいて、再構成のすぐ後に、ほとんどのヒトリンパ球が、活性化された細胞表現型（すなわち、HLA-DR+、およびCD25+またはCD69+）を示し、ほとんどすべて（>99%）のヒトT細胞が、可逆的なアネルギー状態で、成熟メモリー表現型（CD45RO+）を示す［Rizzaら、(1996), 前記；Tarry-LehmannとSaxon, 前記；Tarry-Lehmannら、前記］。したがって、再構成後に、充分な数の未成熟でナイーブなT細胞がないと、Hu-PBL-SCIDモデルが、抗腫瘍免疫を評価するのに適したモデルでなくなる。これに対して、Hu-PBL-SCID/bgマウスは、再構成してから4〜6週間後、明らかなレベルのCD45RA+とCD4+8+細胞を示す。このように、本発明のHu-PBL-SCID/bgマウスは、抗腫瘍免疫を評価するのに適したモデルを提供する。
【０２０３】
実施例12―  自己性Hu-PBL-SCID/bg/ヒト腫瘍モデル
自己性Hu-PBL-SCID/bg/ヒト腫瘍モデルを提供するために、初代ヒト腫瘍細胞を調製して、実施例11で説明したようにして、SCID/bgマウスの側腹部に皮下注射する。初代腫瘍細胞を、まず、一つ以上の治療用タンパク質（例えば、B7-2、GM-CSF、IL-12A、IL-12Bなど）をコードするベクターによって形質導入し、形質導入した腫瘍細胞（選抜後）、ならびに形質導入していない腫瘍細胞をマウスに注射した。触知可能な腫瘍が定着したところで（1〜2ヶ月後）、自己性のPBL（すなわち、腫瘍細胞を提供した患者と同じ患者から分離したPBL）によって再構成する。それぞれの腫瘍について、最低10匹のSCID/bgマウスに腫瘍細胞を注射して、触知可能な腫瘍が定着した割合を決定する。注射したマウスの中で、成功率が40%よりも高い割合で増殖した腫瘍に、自己性PBLを与え、1週間後、IMGを形質導入した腫瘍細胞を与える。3〜4日毎に腫瘍容積（mm３）を測定し、マウスが生き残るかを観察した。これらのマウスを用いて、どのように治療用遺伝子と免疫調節遺伝子（IMG）を組合せれば、腫瘍サイズの減少をもたらし、マウスの生存期間を延長させるかを判定する。
さまざまな時間を置いて、各グループのマウスを屠殺し、脾細胞と流れ出てきたリンパ節細胞の免疫反応性（すなわち、抗腫瘍細胞性免疫）を測定して（例えば、５１Cr解離アッセイ、増殖、およびサイトカイン産生）、免疫反応性アッセイ法が、観察された腫瘍拒絶に相関しているか否かを判定する。
【０２０４】
増殖アッセイ法とインビトロでの初回免疫刺激
再構成したマウスから分離した脾細胞とリンパ節細胞を、致死量の放射線を照射したIMG形質導入細胞と共に、さまざまな時間（最低5日間）共存培養して、例えば、培養4日目に３H-チミジンでパルス標識して、18〜24時間後に細胞DNAへの３H-チミジンの取り込みを測定するなどして増殖を測定する。
応答するリンパ球を、非形質導入腫瘍細胞または形質導入腫瘍細胞によって繰り返し（毎週）再刺激し、腫瘍に特異的なT細胞前駆体の頻度を増加させることができる。そして、腫瘍応答免疫細胞を、元の腫瘍をもつマウスに移入し、インビトロでの初回免疫刺激が腫瘍の退行をもたらすような細胞が生成されるかを判定する。
【０２０５】
サイトカイン産生
インターフェロンγ（IFNγ）、腫瘍壊死因子α（TNFα）、およびIL-2は、NK細胞とリンホカイン活性化キラー細胞（LAK細胞）の展開と活性化、およびCD8+CTLの展開を指令する、細胞媒介性免疫応答に関係したサイトカインである。このようなエフェクター細胞型をもたない動物では、効率的に腫瘍または転移が排除されないため、これらのエフェクター細胞は、腫瘍の除去と特別な関係をもつ可能性が高い［Whitesideら、(1994) Clin. Immunother. 1:56］。
PBLと腫瘍によって再構成されたマウスから分離したリンパ球を、形質導入していないか、または模擬形質導入された、IMGを発現する自己性腫瘍細胞と一緒に共存培養して、細胞媒介性免疫に関連したサイトカインの産生を測定する。共存培養を行っている間のさまざまな時点で、培養上清へのIFNγ、TNFα、およびIL-2の分泌を、サンドイッチ式ELISAによって測定する［Sadら、(1995) Immunity 2:271］。
【０２０６】
インビトロCTLアッセイ法
5日間培養した後、または、何回も（上記したような）毎週刺激を行った後、リンパ球と自己性腫瘍細胞（模擬形質導入されたか、IMGを発現する細胞）との共存培養から生細胞を回収して、その細胞数を数える。形質導入していない自己性腫瘍細胞を、５１NaChromate（クロム酸ナトリウム）で標識して、標準的な5時間５１Cr放出アッセイ法を行う。自己性および同種異系の腫瘍標的の細胞溶解を最初の刺激細胞と比較する。最初の刺激として用いられた腫瘍細胞に一致する細胞は溶解するが、それ以外の腫瘍細胞は溶解しないということは、細胞溶解が抗原特異的である可能性が高いことを示している。クラスI MHC分子に対する抗体を用いて細胞溶解を阻害できること、および、抗CD8と補体によって、細胞溶解に関与するエフェクター細胞を除去できることによって、抗原特異的な細胞溶解が証明される。MHC非拘束性細胞溶解は、LAK細胞の誘導を示しているのかもしれない。
【０２０７】
インビトロNK/LAKアッセイ法
腫瘍細胞には、MHC分子、特に、クラスI MHCタンパク質の発現をインビボでダウンレギュレートすることによって、免疫T細胞による認識と除去を免れるものがある［Rivoltiniら、(1995) Cancer Res. 55:3149］。しかし、CD8+CTLとは異なり、新鮮なNK細胞、およびIL-2によって展開されたNK細胞（LAK細胞）は、標的細胞を認識し、溶解するためにMHC分子を必要としない［LanierとPhillips (1988) ISI Atlas of Science, pp. 15-19］。したがって、NK/LAK細胞は、そのレベルが変化したか、または低下したクラスI分子を発現する細胞で、通常は、CD8+T細胞による監視を免れる細胞を除去するために用いられるのかもしれない。
5時間５１Cr放出アッセイ法を用いて、どの初代（または樹立された）腫瘍がNK感受的であるかを判定する。模擬形質導入したか、またはIMGを発現する腫瘍を用いて、自己性PBL、またはPBLから分離した免疫細胞と、腫瘍再構成SCID/bgマウスとの共存培養を行って、それが、NK/LAK（MHC非）拘束性細胞傷害活性が最初から見られる場合には、腫瘍標的を刺激すること、また、開始時の測定ではそれが見られないときには、実質的なNK/LAK活性（腫瘍標的に対する）の誘導などを含む、NK/LAK（MHC非）拘束性細胞傷害活性の増強がもたらされるか否かを判定する。
【０２０８】
実施例13―  ヒト腫瘍への免疫調節遺伝子の輸送
免疫調節遺伝子は、さまざまな手段によって、インビボおよびエクスビボで、ヒト腫瘍細胞に輸送することができる。
（a）レトロウイルスによる形質導入
免疫調節タンパク質をコードするレトロウイルスベクターを用いて、実施例2、6および7で説明されているようにして、樹立した腫瘍細胞または初代腫瘍細胞の中にIMGを導入することができる。IMGをコードするウイルスの濃度を高めることによって、また、形質導入効率を増加させることによって、レトロウイルスを用いたIMGの移入をより効率的にすることができる。ウイルス濃度を上昇させるには、産生細胞PA317由来の単一細胞クローンを、G418（または、レトロウイルス構築物がもつ選抜マーカーに適した培地）存在下で増殖させて選抜し、最も高い濃度のウイルスを産生するクローンを展開する。産生細胞系の濃度をさらに上昇させるために、PA317細胞をエコトロピックなウイルス［例えば、GPE-86パッケージング細胞で産生されるウイルス］に再感染させて、最もよい産生細胞クローンを選抜することができる。形質導入効率を向上させるためには、ウイルスの取り込みを促進するために、リポソームまたはポリ-L-オルニチンもしくはポリリシンとともにレトロウイルスを用いる。
【０２０９】
レトロウイルスを用いて遺伝子導入効率を向上させる別の方法は、ターゲッティングの効率を上げることである。グリオブラストーマおよび黒色腫など、腫瘍細胞の多くは、過剰なレベルのトランスフェリンレセプターを発現する。トランスフェリンは、アデノウイルスの形質導入効率を上昇させるために、ポリリシンとともに用いられたことがある［Lozierら、(1994) Human Gene Ther. 5:313］。最近のいくつかの報告では、レトロウイルスのenv遺伝子のSU（表面）ドメインを置換すると、レセプターが媒介する形質導入の効率を上げることができることが示されている［Kasaharaら、(1994) Science 266:1373; Cossetら、(1995) J. Virol. 69:6314; Dongら、(1992) J. Virol. 66:7374;およびChuとDornburg (1995)  J. Virol. 69:2659］。ヒトトランスフェリン遺伝子は、2097 bpの長さである（コーディング領域を配列番号：25に示す）。このように長い配列をMLVベクターのenv遺伝子のSUドメインに挿入しても、安定したEnv産物は産生されないと考えられる。しかし、これより前の研究で、改変されたEnv融合タンパク質が、安定的にアセンブリされ、効率的に侵入するためには、天然のEnvを必要とするということが示唆されていた。そのため、野生型Envと組換えEnvを混合してもつレトロウイルス粒子を産生するために、トランスフェリン-env融合遺伝子を、天然のenv遺伝子とともに同時感染させる。高レベルでトランスフェリンレセプターを発現するグリオブラストーマまたは黒色腫を形質導入して、この新しいベクターの遺伝子導入効率を調べる。
【０２１０】
（b）組換えアデノウイルスベクター
組換えアデノウイルスは、比較的大きな外来DNAセグメント（約7 kb）を組み込むことができ、また、宿主細胞範囲が広範であり、高濃度のウイルスを産生するという長所がある［GrahamとPrevec (1991) Meth. Mol. Biol. 7:109-128］。アデノウイルスは、インビボで、ラットの肝臓、およびランゲルハンス島に［ Rothら編、動物細胞におけるタンパク質発現（Protein Expression in Animal Cells）の中のBeckerら、(1994)において概説されている］、また、中枢神経系に［Davidsonら、(1993) Nature Genet. 3:219］遺伝子を効率的に輸送するために用いられている。ラットの肝臓は、エクスビボでも効率的に形質導入され、その後、再移植されている［Shakedら、(1994) Transplantation 57:1508］。
【０２１１】
複製欠損組換えアデノウイルスを用いるが、これらのウイルスは、キーとなる最早期遺伝子のE1aとE1bを欠失させている（GrahamとPrevec、前記）。組換えウイルスを作製して増殖させるために、293細胞など、E1aおよびE1bタンパク質をイントランスで供給するパッケージング細胞系を用いる。ウイルスゲノムのほとんどをコードする、はるかに長い方のプラスミドと、ウイルス組込み部位に相同な領域に挟まれた目的とする遺伝子（例えば、サイトカイン）を含む小さなプラスミドとの間に起こる細胞内組換えを利用して、組換えアデノウイルスを作出する。どちらもCMV最早期エンハンサープロモーターの調節下にあるという、マウスIL-4とIL-10を発現する組換えアデノウイルスが構築されている。ヒトB7-2とGM-CSFを発現する組換えアデノウイルス、および、IL-12AとIL-12Bの両サブユニットを発現する別のウイルスを構築する。このDNA構築物を、実施例1で説明したようにして、IRESをもつ2-シストロン単位としてクローニングする。
【０２１２】
常法を用いて、組換えアデノウイルスを構築する（GrahamとPrevec、前記、Beckerら、前記）。簡単に述べると、各プラスミドを、pJIM17（Microbix Systems製、トロント）とともに、リン酸カルシウム沈殿とグリセロールショックを用いて、293細胞（ATCC CRL 1573）の単層がサブフルエントになったものに同時感染させる。最初の組換え体ウイルス保存液は、293細胞の単層上で濃度を測定し、単離した単一プラークが得られたら、ELISAを用いて、サイトカイン発現をテストする。ウイルス保存液を増幅して、293細胞上で濃度を測り、等量液に分けて-70℃で保存する。また、必要な場合には、密度勾配遠心によって、保存液を濃縮する。組換えアデノウイルスを腫瘍細胞に感染させるために、単離したばかりの腫瘍細胞を、最少容量で、アデノウイルス保存液と混合する。保存液のウイルス濃度は、典型的には、10５〜10８/mlである。数時間後に培地を入れ換えてから、細胞に組換えアデノウイルスがコードするIMG遺伝子、および/またはレポーター遺伝子を発現させる。
【０２１３】
アデノウイルス輸送システムを用いることで考えられる短所は、形質導入された細胞が、その表面上に少量のアデノウイルス抗原を保持または発現しうることである［Yangら、(1994) Nature Genet. 7:362］。E2a遺伝子に欠失をもつ「第二世代」のアデノウイルスベクターを使用することができるが、これは、これに伴って受容個体で起きる炎症の程度が低く、また、目的の遺伝子をより長い期間発現させる［Yangら、前記、およびEngelhardtら、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6196］。必要であれば、IMGを第二世代アデノウイルスベクターに挿入する。しかし、形質導入される腫瘍細胞は、受容個体に注射する前に致死量の放射線照射を受けているため、また、免疫刺激サイトカインを分泌させ、表面シグナル分子を発現させるために、腫瘍細胞を誘導するための別の操作が行われるため、少量のアデノウイルスタンパク質の発現（第一世代ベクターを用いた場合）は、望ましいアジュバント効果を提供するかもしれない。さらに、この後、ウイルスを形質導入した腫瘍細胞（サイトカインと腫瘍抗原を発現するが、アデノウイルス抗原は発現しない）によって受容個体を追加免疫する。受容個体の腫瘍特異的な免疫応答を、非形質導入腫瘍を植え付けた二次的な遠位で観察する。そして、この反応が生じたら、所望の腫瘍特異的な免疫が達成されたことになる。
【０２１４】
（c）標的となる陽イオン性リポソーム
陽イオン性リポソームは、標的細胞でDNAの一過性発現を誘導するのに安全で効果的な手段である［Ledley (1995) Human Gene Ther. 6:1129; Felgner (1990) Adv. Drug Delivery Rev. 5:167; Felgnerら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413; およびSmithら、(1993) Biochim. Biophys. Acta 1154:327］。嚢胞性線維症患者の肺にCFTR遺伝子を導入するために［Caplenら、(1994) Gene Ther. 1:139、および、Altonら、(1993) Nature Genet. 5:135］、または、細胞媒介性免疫応答を誘導するため、腫瘍内に直接注射することによって悪性黒色腫病斑の中にT細胞共刺激因子B7-1を導入するために［Nabelら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11307］陽イオン性リポソームを用いる臨床実験が進行中である。
【０２１５】
腫瘍細胞にIMGを輸送するためには、陽イオン性リポソーム（例えば、DOTAP/DOPE）、およびリガンドの標的となる陽イオン性リポソームを用いる。リガンドの標的となる陽イオン性リポソームは、陽イオン性リポソームの表面に、リガンドまたは抗体を共有的に結合させて作製する。グリオブラストーマ細胞が標的となるときには、グリオブラストーマ細胞がその表面にトランスフェリンレセプターを高レベルで発現しているため、トランスフェリンをリガンドとして用いる。黒色腫細胞を標的するときには、黒色腫特異的な表面抗原に対して作製されたモノクローナル抗体（例えば、mAb HMSA5）である内在化レセプターをリガンドとして用いる。
【０２１６】
常法を用いて、IMG（例えばB7-2、GM-CSF、およびIL-12）をコードするプラスミドDNAが、予め作製しておいた陽イオン性リポソームと複合体を形成するようにさせるか、または、DNAをリポソーム内部に封入する。次に、DNAを含むリポソームを用いて、インビボで、腫瘍内に直接注射して腫瘍細胞にDNAを導入するか、または（外植したばかりの腫瘍細胞を用いて）インビトロでDNAを腫瘍細胞に導入し、その後、形質導入された細胞を受容個体（例えば、患者）に戻す。
【０２１７】
（d）バイオリスティクスを用いた遺伝子導入
バイオリスティクス（微小弾道弾）は、DNAで被覆した粒子を細胞または組織の中に放出して、細胞の中にDNAを輸送する方法である。微小な（直径、約1〜3 μm）金、またはタングステンの微小粒子の表面をDNAで被覆し、これらの粒子を高速になるよう加速して標的細胞にぶつける。粒子は細胞膜を突き破って、標的細胞の内側に打ち込まれる。細胞膜は速やかに再封鎖され、通過してきたDNAが粒子から溶出し発現される。バイオリスティクス法は、哺乳動物細胞の形質転換に用いられている［Williamsら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726; Tangら、(1992) Nature 356:152; Sanfordら、(1993) Methods Enzymol. 217:483］。
【０２１８】
手持ちサイズのバイオリスティクス装置（バイオラド社（BioRad）製）を用いて、腫瘍細胞または分離された腫瘍断片の中にDNAを導入する。この装置は、圧縮ヘリウムを用いて、精製された（スペルミンと共沈した）プラスミドDNAで被覆した金の微小粒子を表面に載せた円盤型のマクロ発射物を駆動する（Williamsら、前記）。この装置を用いて、初代組織を形質転換するのに成功している。
【０２１９】
IMGをコードするプラスミドDNAを、製造業者（BioRad）の指示にしたがって、金微小粒子の表面にコートし、バイオリスティクス装置を用いて、外植したばかりの腫瘍細胞の中に、または、暴露した腫瘍細胞（例えば、肝臓の表面にある転移した小結節、皮膚上の黒色腫病斑）の中に直接、DNAを導入する。
【０２２０】
実施例14―  ヒトPBLで再構成したSCID/beigeマウスおよびSCID/nodマウスのさらなる特徴分析
本実施例では、上記実施例3および11で説明されている再構成されたSCID/nodマウスおよびSCID/beigeマウスのさらなる特徴分析を行う。
scidマウスにおけるヒト免疫細胞の再構成効率を調べるために、実施例3に記載されている異なったドナーからのPBLで、SCID/nodマウスとSCID/beigeマウスを再構成した。再構成してから2週間後、または4〜7週間後のヒトIgレベルを解析したところ、これらのマウス系統は両方とも、平均500〜600 μg/mlのレベルのヒトIgを産生できることが分かった。ただし、Igレベルは、ELISA（実施例3）で測定した。再構成実験に用いたSCID/nodマウスのほぼ半数は、ヒトIgを検出できるほど産生しなかった。
【０２２１】
再構成してから2ヶ月後に、再構成されたマウスのさまざまな器官区分に存在するヒトリンパ球の割合を決定した。実施例11で説明したように、腹腔（P.W.、すなわち腹膜洗浄）、脾臓（脾細胞、すなわちS.P.）、および末梢血（PBL）から細胞を回収して、ヒト白血球表面マーカーCD45に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによって解析した。その結果を、図6Aと6Bにまとめる。
【０２２２】
図6A示した結果は、SCID/beigeマウスが、ドナー（A〜I：ドナーの名前の横の括弧の中の数字は、ドナーのPBLで再構成された動物の数を示している）によって僅かな違いはあるが、3つの器官区分すべてで、定常的にヒトPBLによって再構成されたことを示している。これに対して、SCID/nodマウスの全体的な再構成効率は低かった。すなわち、腹腔では<10%、脾臓では<5%、また、末梢血では、ほとんど検出されなかった（図6B；ドナーX〜Z）。ドナー-ドナーの間の変異も、SCID/nodマウスではより顕著であった。このため、また、実施例3で挙げた理由とともに、ワクチン接種/抗原投与実験（すなわち、候補ワクチンの評価）を行うためには、SCID/beigeマウスが好ましい。
【０２２３】
実施例15―  抗HIV免疫をインビトロアッセイ法で測定することはできない
HIV感染後の病気の時間的な進行経路は、ウイルス系統や宿主の免疫応答など、さまざまな因子によって変化する。HIV感染した患者の大多数は、中央値としては約10年目にAIDSを発症するが、5〜10%までの感染個体は、10年経った後でも、臨床的な病徴を示さない［Haynesら、(1996) Science 271:324; およびBaltimoreら、(1995) N. Engl. J. Med. 332:259 ］。実際、疫学的証拠によって、HIV感染に抵抗性をもつ個体もいることが示唆されている。すなわち、これらの個体は、多数の高リスクな接触があるにも拘らず、HIV陰性のままである［Detelsら、(1994) J. Acqured Immune Defic. Sundr. 7:1263; および、Taylor (1996) J. NIH Res. 6:29 ］。
【０２２４】
宿主の遺伝的因子、およびHIVに暴露された後の感染-免疫過程の両方が、防御的免疫の発生に関与していると考えられる。HIVに暴露されたが、感染しなかった個体におけるHIV感染に対する抵抗性のメカニズムは、細胞傷害性T細胞活性、Th2からTh1へのサイトカイン応答の切り換え、HLAに連鎖した遺伝子座、抗原処理に関係したトランスポーター（TAP）、およびHIVレセプター、または抗HIV抗体の生成に関係していると考えられる。強い間接的証拠により、ウイルスに暴露されたが感染しなかったこれらの個体は、HIV感染に対する防御免疫を持っているとの仮説が裏付けられるが、この仮説を証明するインビボ実験はまだ存在しない。効果的な予防用ワクチン、および免疫療法による治療計画をデザインし、テストするためには、このような防御免疫のメカニズムを理解する必要がある。
【０２２５】
（a）高リスク個体のPBLは、組織培養において、HIV感染に感受性である
高リスク（HR）個体のリンパ球が、HIV-1感染に感受性があるかどうかを判定するために、彼らのPBLを集めて、培養してpHAで活性化してから、T細胞指向性、またはマクロファージ指向性のHIV-1とインキュベートした。HIV-1のRT活性、およびAIDS患者の血清による免疫化学染色に基づいて、感染スコアを記録した。
【０２２６】
（i）被験者
10年に及ぶ期間にわたり、HIV陽性の配偶者と定期的に予防措置をせずに異性間、または同性間で性交渉をもっていたが、繰り返し血清学的測定、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、およびPBL共存培養を行ってもHIV陰性だと判定されたままの個体を2人同定した。高リスク（HR）ドナー1は、1992年7月にHIV陽性と診断された時、CD4数が400〜500/μlであった両性愛の人の異性愛の配偶者である。HR1ドナーと配偶者との間には、彼が診断を受ける前に144回と推定される回数の性器による性交渉があり、このHIV-1陽性の配偶者のCD4数は、実験の時には30/μlにまで減少していた。HRドナー2は、1986年以後HIV-1陽性であることが判明しており、そのCD4数が300〜400/μlに止まっている個体の同性愛の配偶者である。本実験前に約225回の予防措置を講じない肛門での性交渉があったと推定されており、診断後も無防備な性的接触が「継続」している。2人のHIV陽性配偶者のPBLをフィトヘマグルチニン（PHA）で刺激したものから、感染性ウイルスを分離した。後述するHu-PBL-SCID/bgマウス抗原投与実験に参加した、これら2人のHR被験者のHLAハプロタイプは同一ではない。さらに別に、何度もウイルスに暴露されたにも拘らず感染していない個体で、上記の基準に合致する人も、インビトロの実験に組み込んだ。カナダ赤十字社（Canadian Red Cross）と、それ以前HIVとのHR接触をもたない研究室のボランティアから提供された血液が、対照用PBLの供給源であった。
【０２２７】
（ii）ウイルス調製
本実験で用いたHIV-1系統には、実験室で樹立されたT細胞指向性HIV-1（HIVNL4-3）とたマクロファージ指向性HIV-1（HIVADAともいわれるHIVNLAD8）が含まれる［Adachiら、(1986) J. Virol. 59:284］。HIVNL4-3とHIVNLAD8は、メリーランド州ベセスダ（Bethesda）にある国立衛生研究所のNIH AIDS研究および参照用試薬プログラム（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program）から、それぞれ、カタログ番号78と416として入手することができ、また、プロウイルス型のHIVNL4-3をもつプラスミドpNL4-3の配列は、GenBankデータベースの登録番号M19921の下で利用することができる。既述されたようにして［ChangとZhang (1995) Virol. 211:157］、感染した末梢血単核球またはマクロファージからウイルス保存液を調製した。簡単に述べると、以前の説明［Hassenら、(1986) J. Immunol. Methods 95:273］に少し変更を加えたところにしたがって、プラスチック製のフラスコにPBLを接着させて、HIV血清陰性ドナーのマクロファージ培養細胞を調製した。リンパ球分離培地（ノースカロライナ州ダーラム（Durham）にあるOrganon Teknika Corp製）を用いた密度勾配分離によって、PBLを調製した。PBLは、20%熱不活性化ヒト血清を添加したRPMI 1640培地に再懸濁した。約5×10７個のPBLをT-75フラスコに付着させて、37℃で一晩インキュベートした。翌日、PBSで３回洗浄して、PBS中0.02% EDTAで5〜10分間インキュベートした。セルスクレーパーで細胞を集めて、各ウェル当たり5×10４個の細胞を48穴プレート上で培養した。トリパンブルー染色で判定したところ、生存率はほぼ100%であった。ライト染色によって初期単球を特徴づけ、ライト染色と顕微鏡観察とによって成熟マクロファージを特徴づけた。
【０２２８】
HeLa細胞を形質転換して、またはヒトのPBL、CD4+リンパ球（T細胞指向性またはマクロファージ指向性のウイルス）、またはマクロファージ（マクロファージ指向性のウイルス）を感染させてHIVウイルス保存液を調製したが、約0.2のmoiを用いて感染させることができる。形質転換後、48時間が経過したら培養培地を集めて、等量液にして-80℃に凍結した。感染後、HIVのRT反応運動が行われ、RT産生のピーク時にウイルスを回収した。RTアッセイとTCID50アッセイによって、ウイルス等量液を調べた。
【０２２９】
インビトロおよびインビボの実験とも、同一のウイルス保存液を用いた。以前説明したように［ChangとZhang、前記、およびHoら、(1989) N. Engl. J. Med. 321:1621］、HIV-1陰性のPHAで刺激したPBLに対するウイルス保存液の連続希釈によって、感染多重度（moi）、または組織培養感染用量（TCID50）を判定した。簡単に述べると、感染前にHIV血清陰性ドナーからのPBLを0.25 μg/mlのPHAで3日間刺激してから、10%FBSと10%インターロイキン-2を添加したRPMI 1640の中で維持した。各ウェル当たり50万個のPBLを48穴プレートで培養し、反復して、連続希釈したウイルス上清を感染させた。3〜4日毎に培養上清を回収した。約3〜4週間経過した時点で、感染速度を測定した。50%の陽性感染を起こした希釈点をTCID50点と見なした。
【０２３０】
（iii）インビトロのHIV感染
HR、および低リスク（LK）のHIV陰性ドナーから、ヘパリン処理した末梢血を集めた。ヒストペーク（Histopaque）（Sigma製）による勾配遠心によって、PBLを分離した。以前述べたところ（ChangとZhang、前記）にしたがって、感染させた。簡単に述べると、PBLをPHA（5 μg/ml、シグマ社（Sigma）製）で処理して、0.2 moiで、T細胞指向性またはマクロファージ指向性のHIV-1に感染させた。3〜4日おきに、培養液を1：3に分けた。逆転写（RT）アッセイのために培養上清を回収し、また、既に説明したような免疫組織化学的染色（ChangとZhang、前記）によって感染を確認した。簡単に述べると、接着細胞をPBSで3回洗浄し、冷アセトンとメタノール（1：1）で2分間固定し、PBSで3回洗浄し、ブロッキング溶液（PBS中、20%FBS、0.1% TritonX）中で30分間インキュベートした。非接着細胞は、室温で10分間、ポリ-D-リシン（1 mg/ml、シグマ社（Sigma）製）で前処理しておいた24穴プレートの表面に付着する。PBS中に20%FBS、0.1% TritonX、および2%ドライミルクを含むブロッキング溶液で1：2000に希釈したHIV患者の血清を一次抗体として用い、絶えず振盪しながら、室温で1時間、または4℃で一晩インキュベートした。PBSで5分間、4回洗浄した後、非特異的なシグナルを阻害するため、室温で30分間、正常なヒツジ抗血清を1：200に希釈したものとインキュベートした。二次抗体は、ビオチニル化したヒツジ抗ヒト抗体（アマーシャム（Amersham）社製）で、1：2000に希釈したものを室温で1時間インキュベートした。細胞をPBS-Tween 20 ( 0.3 %) で4回洗浄し、超高感度ABC染色溶液（アビジン、およびビオチニル化したホースラディッシュパーオキシダーゼを含んでいる。Pierce Chemical Co.製）の中で、室温で30分間インキュベートした。PBS-Tween 20でさらに4回洗浄した後、細胞を、0.3% NiCl2を含む3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)）溶液（Sigma製）の中で2〜3分間インキュベートした。細胞を水道水で1〜2分間洗浄してこの反応を停止させた。倒立顕微鏡下で細胞染色のスコアを記録して、写真を撮った。バックグランドとなる染色を低減するために、固定したヒトPBLに一次血清と二次血清を予め吸着させておいた。固定した細胞を0.01%のH2O2で、室温で5分間前処理すると、本質的に全ての非特異的なバックグランドシグナルが消失した。1,000〜10,000個の細胞数を3回以上数えたものの平均をとって、陽性細胞の割合を判定した。
【０２３１】
（iv）RTアッセイ法
逆転写酵素のレベルを以下のようにして測定した。10 μlの培養培地（上清）のサンプルを、50 mM Tris-HCl、pH 8.3、20 mM DTT、0.6 mM NaCl、0.05% NP40、5 μg/mlのオリゴデオキシチミジル酸、10 μg/mlのポリリボアデニル酸、および10 μMの[α-３２P]dTTPを含む反応混合液（DuPont NEN製、800 Ci/mmolの特異的活性）50 μlとインキュベートした。反応液を37℃で1時間インキュベートした。次に、3 μlの等量液をDE-81紙（Whatman製）にスポットして乾燥させた。DE-81紙を2×SSC（20×SSCは、3 M NaCl、0.3 M クエン酸ナトリウム、pH 7.0を含む）で3回洗浄してからオートラジオフラフィーを撮った。
【０２３２】
（v）免疫組織化学染色法と蛍光標示式細胞選別（FACS）解析
上記iii節で説明したようにして、免疫組織化学染色を行った。FACS解析を行うためには、塩化アンモニウム溶液［9 mlの0.16 M NH4Clと1 mlの0.17 M Tris (pH 7.62から最終的にはpH 7.2を含む］で赤血球を溶解した。細胞は、PE-抗マウスH-2ｄ（Pharmingen製）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）-抗ヒトCD45（抗HLe-1、Becton Dickinson製）、フィコエリトリン-抗ヒトCD4、またはFITC-抗ヒトCD8（Becton Dickinson製）で、氷上で30分間染色した後、免疫染色バッファー（0.1% FBS、0.02% NaN3を含むPBS）で3回洗浄した。FACScan（Becton Dickinson製）上のLYSIS IIプログラムを用いて、サンプルを解析した。
【０２３３】
（vi）高リスクドナーのPBLは、インビトロで、HIV感染に感受性である
図7aに示したように、RTアッセイによって、これら2人のHRでHIV-1血清陰性個体のPBLは、組織培養では、HIV-1感染に対して通常のLRであるドナーのPBLと同じ程度の感受性であることが明らかになった（図7a）。図7aでは、感染後日数に対するRT活性（CPM/μl）がプロットされている。マクロファージ指向性HIVNLAD8（「HIV-1-M」）を0.2 moiで感染させた、2人のLR個体（LR-1とLR-2）のPBLにおけるRT活性を、それぞれ、白四角と白三角を用いて示し、LR-1の非感染PBLにおけるRT活性を、白丸（「LR-1対照」）を用いて示す。HIVNLAD8を0.2 moiで感染させた、2人のHR個体（HR-1とHR-2）のPBLにおけるRT活性を、それぞれ、黒四角と黒三角を用いて示す。同様の結果が、T細胞指向性系統HIVNL4-3によっても得られた。免疫染色の結果は、RTアッセイの結果を確認するものであった。
HR個体のPBLがHIV-1感染にいくらかでも抵抗性でないか、さらに調べるために、連続希釈したウイルス調製物（moiは10−１〜10−４）を用いて、組織培養感染を行った。この結果を図7bにまとめた。図7bでは、感染後日数に対するRT活性（CPM/μl）がプロットされている。白丸はLR-1の非感染PBLにおけるRT活性を示しており、白四角と白三角は、それぞれ、0.001 moiと0.0001 moiでHIVNL4-3に感染したLR-1のPBLにおけるRT活性を示している。黒丸はHR-1の非感染PBLにおけるRT活性を示しており、黒四角と黒三角は、それぞれ、0.001 moiと0.0001 moiでHIVNL4-3に感染したHR-1のPBLにおけるRT活性を示している。これらの結果は、たとえ、10−４のmoiでも、HRドナーのPBLがなお感染することを示していた。異なった濃度のウイルスを感染させたときに、同じような用量依存的な感染速度が、LRとHRの個体間に見られた。同様の結果が、HRで、HIV-1血清陰性の血友病患者で報告されている［Ledermanら、(1995) J. Inf. Dis. 172:228］。しかし、これらの個体における防御的免疫の可能性についてはほとんど分かっていない。
【０２３４】
実施例16―  HIV-1に暴露されたが感染しなかった個体は、インビボでのHIV-1感染に対して抵抗性をもつ
インビボのHIV-1感染モデルが存在しないという問題を解決するために、実施例3、11および14で説明した、ヒトPBLで再構成した重症複合免疫不全マウスモデル（Hu-PBL-SCID/bgマウス）を用いて、HIV-1に暴露されたが感染しなかった個体における防御免疫の性質を調査した。このインビボモデルを用いて、2人のHRでHIV陰性個体のHIV-1感染への感受性をテストした。PBLを分離し、各ドナーからの細胞を用いて、実施例3で説明したように、1回につき6〜7匹のSCID/bgマウスを再構成した。再構成してから2週間後に、メトファン（methofane）誘導した麻酔の下、腹腔内注射によって、100TCID50を用いて、T細胞指向性またはマクロファージ指向性のHIV-1をHu-PBL-SCID/bgマウスに抗原投与した。HIV-1抗原投与してから2週間後、マウスを屠殺して、腹腔洗浄物、脾臓、および末梢血から単細胞懸濁液を調製して、免疫染色、フローサイトメトリー解析、およびPCRのための処理を行った。すべての実験は、バイオセイフティーレベル3の施設で行い、プロトコールは、アルバータ大学のバイオセイフティー委員会（Biosafety Committee）、研究倫理評議会（Research Ethics Board）、および保健科学動物福祉委員会（Health Sciences Animal Health Committee）による承認を受けた。
【０２３５】
感染した再構成マウスから回収した細胞を、実施例11で説明したようにして、抗マウス主要組織適合遺伝子複合体クラスI抗体（H-2Kｄ）と、抗ヒトCD45、CD3、CD4、およびCD8抗体フローサイトメトリーによって解析した。同時に、実施例15で説明したようにして、HIV陽性患者の血清、またはモノクローナル抗p24抗体を用いて、高感度単細胞免疫組織化学染色法によってHIV-1感染を調べた。代表的な免疫染色結果を図8に示す。図8に示した結果を得るため、すべてのマウスを再構成してから4週間後に屠殺して、免疫染色を行うために、3つの異なる器官区分から単細胞懸濁液を調製した。図8aと8bは、それぞれ、LR個体から再構成したマウスの腹腔洗浄物と脾細胞のHIV陽性免疫染色を示している。図8cと8dは、それぞれ、HR個体から再構成したマウスの腹腔洗浄物と脾細胞のHIV陰性免疫染色を示している。
【０２３６】
免疫染色の結果、対照用個体のPBLで再構成した10匹のHu-PBL-SCID/bgマウスすべてが、腹腔洗浄物からの細胞の約1〜4%（図8a）、脾細胞の0.8〜5%（図8b）、および末梢血単核細胞の0.1〜0.5%という頻度で、細胞T細胞指向性かマクロファージ指向性のHIV-1に感染した。これとは対照的に、HRでHIVに感染していない2個体からのPBLで再構成した9匹のマウスはすべて、HIV免疫染色に対して陰性であった（図8cと8d、それぞれ、腹腔洗浄物と脾臓）が、陰性マウスの1匹が、脾臓において、PCR解析によってHIV-1 DNA配列について陽性であったが、このことは、抗原投与のときに感染が成立したことを示している。これらの結果を図8eにまとめた。図8eでは、黒色の棒、あや目の棒、および斜線棒が、それぞれ、腹腔洗浄物、脾臓、および末梢血からの細胞を表している。LR-1ドナー（＃1〜7）、LR-2ドナー（＃8から14）、HR-1ドナー（＃15〜21）、およびHR-2ドナー（＃22〜27）からのPBLによってマウスが再構成されたことを、ヒトIgについてはELISAによって、ヒトCD45白血球マーカーについてはFACS解析によって確認した。図8eにおいて、「M-トロピック」とは、マクロファージ指向性HIVNLAD8による感染を示し、「T-トロピック」とは、T細胞指向性HIVNL4-3による感染を示す。各ドナーのPBLについて再構成された8匹のマウスでインビボ抗原投与実験を一度反復し、同様の結果を得た。
【０２３７】
実施例17―  HR個体における細胞媒介性免疫応答
インビボでの防御が、少なくともその一部が、HRで血清陰性の個体におけるHIV-1特異的な細胞媒介性免疫応答によるか否かを調べるために、便利で非常に感度の高いELISPOTアッセイ法を、HIV抗原提示後のIFN-γ産生細胞画分を測定するように改変した。IFN-γは、抗原によって活性化されたT細胞とナチュラルキラー細胞によって産生され、CD4+Th1細胞の発生させる主要なメディエーターである［Wennerら、(1996) J. Immunol. 156:1442］。
【０２３８】
（a）IFN-γ産生のELISPOT解析
既述されているところ［Miyaharaら、(1995) J. Immunol. Methods 181:45］に以下の変更を加えて、ELISPOTを行った。IFN-γ産生細胞を定量するために、底がニトロセルロースになっている96穴プレート（マルチスクリーン-HA（Multiscreen-HA）、Millipore製）を、各ウェル当たり75 μlのマウス抗ヒトFN-γ（10 μg/ml）（Pharmingen製）によって室温で一晩被覆した。ELISPOTアッセイにおいては、HIV-1に感染したPBLを刺激因子として用いた。RTアッセイと免疫組織化学的染色によって感染を確認した（3〜5%に及ぶHIV-1陽性）。感染したPBLにおけるRTでもHIV抗原発現でも、HR個体とLR個体との間に違いは見られなかった。HIV-1に感染したPBLをマイトマイシンC（5 μg/ml）で2.5時間処理し、洗浄して、10% FBSと20ユニット/mlのインターロイキン2（Boeringer Mannheim製）を含むRPMI培地1640に再懸濁し、さらに、抗IFN-γで被覆した96穴プレートに、標的細胞（T）として、ウェル当たり1×10５個の細胞を接種した。凍結された刺激を与えていない自己性PBLを融解してから、エフェクター細胞（E）として用いたが、これを、3回反復して、E/T比が0.4：1、2：1、および10：1になるようにウェルに加え、10% FBSと20ユニット/mlのIL-2を含むRPMI培地1640の中で、37℃、95%O2/5% CO2で24時間インキュベートした。
【０２３９】
一晩インキュベートした後、PBS-Tween 20 (PBS-T、0.05%）を用いて4回洗浄し、PBS-T中20%のFBSによって、室温で15分間ブロックしてから、100 μlのビオチニル化したマウス抗ヒトIFN-γ（Pharmingen製、PBS-T中2.5 μg/ml）とともに4℃で一晩インキュベートした。そして、PBS-Tを用いて各ウェルを4回洗浄して、パーオキシダーゼで標識したストレプトアビジン（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ（South San Francisco）、Caltag製）とともに室温で1時間インキュベートした。DAB（Sigma製）と0.3% NiCl2で染色すると、IFN-γ産生細胞は、紫がかった茶色の斑点として検出された。2回蒸留したH2Oでウェルを4回洗浄して乾燥させ、ビデオイメージング（フランス、ストラスブール（Strasbourg）、Appligene製）とコンピュータ解析システムを用いて、IFN-γ産生細胞の数を数えた。同一のエフェクター細胞に、HIV-1に感染していない自己性PBLを加えたものを用いて、対照用のサンプルを調製した。
【０２４０】
（b）HRドナーのPBLは、HIV特異的な応答細胞を含んでいるが、LRドナーのPBLは含んでいない
4人のLR、および3人のHRのドナーの非刺激PBLを、マイトマイシンC処理したHIV感染自己性PBLとともに、底がニトロセルロースになっている96穴プレートで、抗ヒトIFN-γ抗体で被覆したプレートの中でインキュベートした。ホースラディッシュパーオキシダーゼ結合抗IFN-γ二次抗体を用いて、24時間後にIFN-γを検出した。結果を図9にまとめた。図9では、ウェル当たりのIFN-γELISPOTの数を、E/T比に対してプロットしてある。×、白菱形、白丸、白三角は、それぞれ、ドナーLR-1、LR-2、LR-3、LR-4からのPBLを用いた結果を示している。黒四角、黒菱形、および黒丸は、それぞれ、ドナーHR-1、HR-2、およびHR-3からのPBLを用いた結果を示している。HIV特異的なELISPOTを、対照からのバックグランド分を減じた後、3回反復したウェルの平均値±SE（標準誤差）として示している。
【０２４１】
図9に示すように、4人のLRドナーからのPBL中には、HIV特異的なIFN-γ産生応答細胞は見られなかった。ただし、ドナー4は、最も高いE/T比のときで、1×10６個のPBL当たり1個というIFN-γ産生細胞頻度を示した。これとは対照的に、HR血清陰性ドナーのPBLでは、HIV特異的な応答細胞の存在が簡単に検出された。E/T比のとき、3人のHRドナーについて、HIV特異的なIFN-γ産生細胞の頻度は、10６細胞当たり14、21、28個であったが、これらは、LRドナーにおける頻度と有意に異なっていた（p<0.05、t検定）。E/T比が0.4：1のときでさえ、3人のHRドナーすべてで、HIV特異的なIFN-γ産生細胞を検出することができた。
【０２４２】
インビトロELISPOTアッセイを行う前に、これらのHRドナーのうち2人のPBLからCD4細胞、CD8細胞、またはCD56細胞を涸渇させて、このHIV特異的な反応における免疫エフェクター細胞の各サブセットの寄与をさらに研究した。インビトロでのリンパ球涸渇は、次のようにして行った。CD4細胞、CD8細胞、またはCD56細胞を涸渇させるために、融解したPBLを、マウス抗ヒトCD4-、CD8-、CD56-で、またはマウスIgG1-で標識したバイオマグ（BioMag）マグネティックビーズ（マサチューセッツ州ケンブリッジ（Cambridge）、PerSeptive Diagnostics製）の1細胞当たり50個のビーズと氷上で30分間インキュベートした。マウスIgG1選別を対照として用い、マグネット上で5分間ずつ2回、細胞を選別することによって涸渇させた。涸渇後、培養培地で細胞を洗浄して、上記で説明したようにして、抗IFN-γ抗体で被覆したプレートの中で24時間、標的細胞としてのHIV-1感染自己性PBLとともに3回反復して培養した。IFN-γ産生におけるリンパ球の各亜集団の寄与を評価するために、用いたPBLの初期の個数に基づいて比較を行った。すると、E/T比（10：1）は、涸渇前のPBLの開始数に基づいていた。この定量的な解析の結果、CD8 T細胞が、IFN-γの産生に有意に寄与していたこと（48〜71%）を示している。
【０２４３】
実施例18―  HIV-1感染に対するインビボ抵抗性は、CD8 T細胞依存性である
上記の情報を用いて、さらに、再構成されたSCID/bgマウスにおける、HIV-1からのインビボでの防御メカニズムを明らかにした。LRドナーおよびHRドナーからのPBLで、CD8 T細胞を涸渇させたか、または無処理のPBLによって、SCID/bgマウスを再構成した。次に、再構成されたマウスを、マクロファージ指向性HIV-1NLAD8を接種して、インビボでヒトPBLに感染できるかを調べた。本実験では、HRドナー1からのPBLを用いた。CD4細胞が、HIV-1感染の標的であるため、本実験では、それらを涸渇させなかった。
【０２４４】
（a）Hu-PBL-SCID/bgマウスにおける、CD8 T細胞の涸渇
［Baskarら、(1933) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5687］に述べられているところに以下のような変更を加えて、CD8 T細胞を涸渇させた。プロテインAアフィニティーカラム（イムノピュアプラス（ImmunoPure Plus）、Pierce製）を用いて、OKT8ハイブリドーマ（ATCC CRL 8914）の腹水から、抗ヒトCD8抗体を精製した。精製した抗体20 μgを全部で5回、すなわち、PBLで再構成する2日前と、PBLを注射するとき、ならびにPBLを注射した1、2、および3週間後にマウスに腹腔内注射した。CD8 T細胞の涸渇を確認するために、Hu-PBL-SCID/bgマウスを屠殺して、そのリンパ球を、実施例11で説明したようにして、FACS解析によって解析した。PE-抗マウス-H-2Kｄ（Pharmingen製）およびFITC-抗ヒトCD45（抗HLe-1、Becton Dickinson製）、またはPE-抗ヒト抗CD4およびFITC-抗CD8（Becton Dickinson製）によって、氷上で30分間細胞を染色した後、免疫染色バッファー（0.1% FBS、0.02% NaN3を含むPBS）で3回洗浄した。アイソタイプが一致するPE-マウス-IgおよびFITC-マウスIgを対照として用いた。
【０２４５】
（b）HIV-1感染に対するインビボ抵抗性は、CD8 T細胞依存性である
4週間後に、FACS解析して、再構成とCD8涸渇を確認した。代表的なFACS解析を図10に示す。図10aと10cは、図示されているように、抗マウスH-2Kｄ、抗ヒトCD45、抗ヒト抗CD4、または抗ヒトCD8で免疫染色した、再構成Hu-PBL-SCID/bgマウス#11の脾細胞のFACS解析を示している。図10bと10dは、抗CD8抗体で処理した後に、再構成Hu-PBL-SCID/bgマウス#14由来の脾細胞をFACS解析したものを示している。
【０２４６】
図10に示したように、抗体を投与しなかったマウスにおいて、ヒトリンパ球サブセットが、次の割合で見られた。すなわち、再構成してから4週間後の脾臓において、14%のヒトCD45細胞（図10a）、7%のヒトCD4細胞、および8%のヒトCD8細胞（図10c）。抗CD8抗体で処理したマウスにおいては、同数のCD45細胞が脾臓の中にあった（12%、図10b）が、CD8細胞は、事実上存在しなかった（0.1% , 図10d）。これらのマウスに、再構成してから14日後にマクロファージ指向性HIV-1NLAD8を接種し、14日後に殺して、上記の解析を行った。この実験の結果を図10eにまとめた。
【０２４７】
図10eでは、ウイルスを投与してから2週間後の脾臓（白棒）、および腹腔洗浄物（黒棒）におけるHIV-1感染細胞の割合が示されている。模倣感染した（mk）マウスは、抗CD8抗体で処理してなかった。
図10eに示した結果は、HRドナー1（HR-1）のPBLで再構成したマウスが、CD8が存在するかぎり、HIV-1に対する抵抗性を維持したことを示している。しかし、CD8細胞を涸渇させると、同じように再構成されたマウスが、HIV-1感染に感受性になった（図10e、Hu-PBL-SCID/bgマウス#14、#15、および#16）。これらの結果は、再構成されたマウスにおける、HIV-1感染からのインビボ防御が、ヒトCD8リンパ球によって媒介されることを示している。
【０２４８】
本実施例に示されたインビボ実験と実施例16のインビトロ実験との間に見られる違いから、組織培養感染実験、または細胞媒介性免疫のインビトロアッセイだけでは、抗HIV-1防御免疫を適確に評価できないことを示している。本発明のHu-PBL-SCID/bgマウスモデルは、抗HIV-1防御免疫を評価するのに適したモデルを提供する。本実験で抗原投与に用いられた系統、T細胞およびマクロファージ指向性HIV-1は、調査の対象となったHR個体の配偶者に内在するHIV-1系統とは無関係であるから、インビボHIV-1抗原投与の結果は、これらのHR被験者の中で発達する細胞媒介性免疫が、HIV-1の別系統に対する防御も行うことを示唆している。
【０２４９】
別の研究において、HIV-1に暴露されたヒトにおいて、細胞媒介性免疫応答が発生することが示されている［Rowland-Jonesら、(1995) Nat. Med. 1:59；Taylor (1994), 前記；Clericiら、(1992) J. Infect. Dis. 165:1012；Rowland-Jonesら、(1993) Lancet 341:860；Pintoら、J. Clin. Invest.；Clericiら、(1994) J. Am. Med. Assoc.. 271:42；および、ShearerとClerice、(1996) Immunol. Today 17:21］。サルのAIDSモデルの研究によっても、細胞媒介性免疫応答が、サル免疫不全症ウイルス感染に対する防御に重要な役割を演じていることが示唆されている［Salvatoら、(1994) J. Med. Primatol. 23:125］。HLAハプロタイプなどの何らかの遺伝的因子も、HIV-1感染に対する抵抗性を発生させるのに寄与している可能性がある［Hatnesら、前記；Kaslowら、(1996) Nat. Med. 2:404；およびDetelら、(1996) AIDS 10:102］。しかしながら、上記Hu-PBL-SCID/bgマウスの抗原投与実験に参加した2人のHR被験者は、共通なHLAハプロタイプをもっていない。
【０２５０】
HIV-1に対するインビボ防御免疫も、抗HIVケモカインを分泌するCD8 T細胞を含んでいるという仮説が立てられている［Cocchiら、(1995) Science 270:1811］。さらに、頻繁にHIV-1に暴露されているが感染していない25人のうち2人からのCD4 T細胞が、HIV-1感染に対して比較的抵抗性であることが、最近になって判明している［Paxtonら、(1996) Nat. Med. 2:412］；そして、PCRとシークエンシングによって、この２個体の後の遺伝子型解析をしたところ、マクロファージ指向性HIV-1のコレセプターをコードするCCR-5遺伝子座にホモ接合の欠損があることが示された［Liuら、(1996) Cell 86:367］。本発明者らのインビボ実験の2人の被験者を含む、何度もウイルスに暴露されたが感染していない6個体のPCR解析の結果、1個体がヘテロ接合で、5個体が野生型であった。インビボ実験に参加したHR被験者は2人ともホモ接合の野生型CCR-5遺伝子座をもっている。これは、これら2人のHR被験者のPBLが、インビトロでのマクロファージ指向性HIV-1に感受性であったという結果と矛盾しない。
【０２５１】
HIV-1反応性エフェクター機能に関するインビトロのELISPOT解析によって、自己性HIV-1感染細胞に暴露されると、HRドナーでは、Th1に関連しHIV-1抗原特異的なIFN-γの産生は、CD4またはナチュラルキラー細胞よりもCD8で高くなることが示されたが、涸渇アッセイにおいて、二重陽性細胞（CD4+CD8+）の喪失による抵抗性へのCD4細胞が寄与する可能性も排除することはできない。したがって、インビボのSCID/bgマウス抗原投与実験に参加したこれら2人のHRのHIV血清陰性個体は、CD4 T細胞集団で生じた防御免疫も有する可能性がある。CD4またはナチュラルキラー細胞媒介性抵抗性のメカニズムである可能性があるものの特徴を調べるために、さらなる研究を行う必要がある。
【０２５２】
上記の結果は、HIV-1に暴露された個体の防御免疫を評価するのに、インビボのHu-PBL-SCID/bgマウスモデルが有用であることを示している。SCID/bgマウスは、ほぼ100%の成功率で、ヒトPBLで再構成することができ、HIV-1に感染させることができる。さらに、このモデルは、HIV-1ワクチンの接種を受けた人の免疫状態を評価するのにも有用である。
【０２５３】
実施例19―  弱毒リーシュマニア（Leishmania）細胞ワクチン
さまざまな病気に対するワクチンとして用いることのできる組換えタンパク質を探す上で最も大きな失敗の原因となるのは、大腸菌（Escherichia coli）で発現された組換えタンパク質が、哺乳動物にとって元の真核生物病原体およびウイルス病原体に対して防御的でない免疫応答をひき起こすという事実である。バクテリア発現システムの主な欠点は、真核生物のタンパク質が本来の形態をとり、生物学的に活性をもつために必要なグリコシル化およびリン酸化などの翻訳後修飾を行うことができないことである［Zhangら、(1995) Nuc. Acids Res. 23:4073］。大腸菌で発現されるタンパク質に基づく免疫は、野生型タンパク質の形態をとることができないために、防御免疫反応を惹き起こすことができない。新しいワクチンを探索するにあたって、常にワクチン学の歴史を振り返る必要がある。ワクチン接種は、弱毒化した病原体または不活性化した病原体を用いたときに最も成功してきた。HIVワクチンでは、安全性に対する配慮から、このようなアプローチは適当でないが、弱毒化した病原体を含むワクチンがなぜ効果があるのかを理解することは重要である。つまり、これらのワクチンは、病原体と予想されるものがもつ形態と同一の形態をもつタンパク質を含むため有効なのである。
【０２５４】
タンパク質が適正な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、およびリン酸化）を受けたとしても、プロセッシングの様式や、免疫システムへのワクチンタンパク質の提示が適当でないと、やはり、防御免疫を惹き起こすことはできない。これは、抗原提示細胞（APC）によるプロセッシングの様式およびタンパク質の提示が、免疫応答に一定のT細胞サブセットを特異的に投入するのに決定的な役割を果たしているためである［Schirmbeckら、(1994) J. Immunol. 152:1110］。現在、この他に2つの抗原処理経路が知られている［Schirmbeckら、前記、およびMcDonnellとAskari (1996) New Eng. J. Med. 334:42］。一つ目の別経路は、エンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスによって、抗原提示細胞が細胞外タンパク質を取り込む細胞外経路である。小胞体内のMHCクラスII分子は、ゴルジ装置を通過して、外来タンパク質がペプチドに断片されている、酸性化されたエンドソームの中に侵入する。そして、MHC-ペプチド複合体が細胞表面に運ばれ、そこでT細胞（CD4+）によって認識できるようになる。二つ目の別経路は、細胞質にある細胞内タンパク質が短いペプチド（8〜10アミノ酸からなる）に切断される細胞内経路である。ペプチドは、輸送関連タンパク質（TAP-1およびTAP-2）とともに小胞体に入り、そこでMHCクラスI分子と結合する。結合した後、この複合体は、ゴルジ装置を通って細胞表面に輸送され、そこで細胞傷害性T細胞（CD8+）によって認識できるようになる。このように、可溶性タンパク質抗原による免疫は、HIVでは防御的でないCD4+ T細胞を刺激する。実際、HIVワクチンの開発に成功していないのは、ほとんどのワクチンが、大腸菌で発現させたウイルスサブユニットから成っており、細胞外抗原提示経路を通して提示されてきたからである。免疫経路（経口、経直腸、経膣など）、および抗原提示経路（細胞内対細胞外）が、HIVワクチン接種における成功の鍵を握っているかもしれない［MillerとMcGhee (1996) Nat. Med. 2:75、およびBloom (1996) Science 272:1888］。
【０２５５】
上記の実施例17〜18において、何度もウイルスに暴露されながら血清陰性個体におけるHIVに対するインビボでの防御免疫は、抗体媒介性というよりも、細胞媒介性である。したがって、HIVに対する免疫を誘導するためのワクチン接種法は、さまざまな系統に対して非相同な防御を提供することができる細胞傷害性Tリンパ球（CTL）ワクチンを目的とすべきである。HIV感染において防御的であるCD8+CTLは、免疫原となるタンパク質が、マクロファージのような抗原提示細胞の中で生成しないかぎり始動することができない［McDonnellとAskari、前記］。弱毒化生ワクチンによって誘導される免疫応答と同様の免疫応答を誘導するDNA直接注射法を用いることの実行可能性が、動物モデルで示されてきた（Ulmer、前記）が、この技術の態様を臨床的に応用するのはまだ何とも言えない状態である（McDonnellとAskari、前記）。
【０２５６】
HIVタンパク質をそれらの本来の形態で、APCと関係して提示することができるHIVワクチンを提供するために、リーシュマニアの中でシステインプロテアーゼとHIVタンパク質とを発現させて、HIVタンパク質をマクロファージに運ぶベクターとして作用しうる弱毒化リーシュマニア細胞を作出した。このシステムを用いて生物学的活性のあるシステインプロテアーゼを産生させた。別の研究者が、リーシュマニアの中で生物学的活性のあるヒトp53、マウスINF-γ、リーシュマニアgp63、およびプラスモディウム・ヨエリイ（Plasmodium yoelii）のサーカムスポロゾイト（circumsporozoite）タンパク質を産生させたことを報告している［Zhangら、前記；Tobinら、(1993) J. Immunol. 150:5059；LiuとChang (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:4991；およびWangら、(1995) Mol. Biochem. Parasitol. 69:139］。したがって、このシステムで、天然の形態をとる真核生物のタンパク質を産生することが可能である。
【０２５７】
リーシュマニア病原におけるシステインプロテアーゼの過剰発現の影響を調べた。システインプロテアーゼを過剰発現しているリーシュマニア細胞をワクチンとして、感受性のBALB/cマウスに注射したところ、寄生虫は、その後リーシュマニアを抗原投与されたマウスには感染できなかったので、改変されたリーシュマニア細胞が、弱毒化ワクチンとして機能した。このデータは、システインプロテアーゼが、さまざまなリーシュマニア種に対する防御を備えさせる強力な免疫原であることを示唆している。リーシュマニアは、マクロファージのみに感染するため、このシステムは、病気を惹き起こすことなく、マクロファージ（APC）の中で、目的とするタンパク質（すなわち、病原体由来の）を生成させるユニークな機会を提供する。このシステムを用いて、HIVに対するワクチンを輸送するベクターを提供し、想定した病原体（例えば、野生型HIV系統）の形態と同一の形態をもつ免疫原タンパク質をヒトのAPCの中に輸送できるようにする。このようなタンパク質は、加工されて、細胞内経路によって免疫システムに提示され、HIVに対して防御的な細胞傷害性Tリンパ球の産生をもたらす。
【０２５８】
HIVタンパク質を発現するリーシュマニア細胞ワクチンを提供するために、HIVのgag-pol/env、env、および/またはgag遺伝子の配列を、pXベクターまたはpALT-Neoベクター（それぞれ、Steven Beverely博士とDyann Wirth博士より提供していただいた；両博士とも、マサチューセッツ州ボストン（Boston）にあるハーバードメディカルスクール（Harvard Medical School）に所属）を用いて、2-シストロン、または3-シストロンをもつ構築物として、リーシュマニアのシステインプロテアーゼの下流にクローニングする。pALT-Neoは、α-チューブリンの2つの遺伝子間配列の間にneo遺伝子が挿入されているため、リーシュマニア細胞の中で安定した発現が可能になっている。このような2-シストン、または3-シストロンをもつ構築物の発現を明らかにすることに成功している（実施例2、9および10）。複製欠損gag-pol-env構築物（例えば、pHP-1）からのgag-polタンパク質とenvタンパク質の発現に成功したことが示されている（実施例20）。目的とする遺伝子を含むプラスミドを用いて、［Labanら、(1990) Nature 343:572］で説明されているようにして、リーシュマニア・メジャー（Leishumania major）の細胞を形質転換する。簡単に述べると、プラスミドDNAを直鎖化して、エレクトロポレーションによって、プロマスティゴート型のリーシュマニア細胞の中に導入する。そして、エレクトロポレーションした細胞を選択培地（例えば、用いるプラスミドがneo遺伝子をもつ場合には、200 μg/mlのG418を含む培地）の中で増殖させる。
【０２５９】
HIVに対する防御を付与することができるか否かを、形質転換されたリーシュマニア・メジャー（Leishumania major）の細胞について調べる。ヒトPBLで再構成したScid/bgマウス（すなわちHu-PBL-SCID/bgマウス）に、システインプロテアーゼ-HIV-1 gag-pol/env構築物で形質転換したリーシュマニア細胞を感染させる。2〜4週間後、マウスにHIV-1を抗原投与する。HIV-1を抗原投与してから2週間後に、感染に対する防御の評価を行う。再構成されたマウスの脾細胞を単離し、実施例17の修正ELISPOT法を用いて、HIV特異的なCMI（細胞媒介性免疫）を解析する。システインプロテアーゼ遺伝子が、リーシュマニア細胞に対する防御を備えさせるのに対し、gag-pol/env遺伝子は、HIVに対する防御をもたらす。そして、本発明の動物モデルにおいて、HIV感染を低下および/または予防することができることが明らかになり、および/または、HIVに向けられたCMIを誘導する、弱毒化したリーシュマニアワクチンは、ヒトのワクチン接種にも用いられる。
【０２６０】
実施例20―  HIV-1 DNAワクチンの構築
歴史的に、有効なワクチンのほとんどは、生で弱毒化された病原体か、不活性化された病原体であった。弱毒化ウイルスも、AIDS研究において有望であることが示されている。すなわち、マカーク属（macaques）において、弱毒化SIVを用いたところ、霊長類のAIDS様ウイルス（SIV）を最も強力に防御することが観察されている［Danielsら、(1992) Science 258:1938］。したがって、弱毒化HIVワクチンが、ヒトにおいて効果的なHIV免疫を提供する可能性がある。本実施例では、弱毒化されたHIVのゲノムをもつウイルス粒子を生成することができるDNA構築物を提供する。さらに、DNAワクチンとして用いる、複製欠損HIVプロウイルスを含むDNA構築物を提供する。
【０２６１】
（a）弱毒化された複製能をもつプロウイルスDNA構築物
tatおよびnef遺伝子に変異をもつHIVクローンをいくつか構築して、弱毒化したHIV生ワクチンを用意した。これらのtat-nef-HIVクローンは複製能をもつ。これらのHIV構築物を、プロウイルスDNAワクチン（すなわち、裸のDNA）として用いるか、または、ウイルス粒子を含むワクチンとして用いることができる。図11A〜Eは、HIV-1ゲノムの構造（図11A）、ならびにHIVNL4-3（図11B）、HIVNL43/AD8/tat-B/nef-B（図11C）、HIVNL43/tat-B/nef-B（図11D）、HIVCMV/tat-B/nef-B（図11E）、およびHIVCMV/AD8/tat-B/nef-B（図11Ｆ）の各クローンの構造を示す概要図である。図11において、白い四角は、HIVNL4-3に由来する配列を示し、黒い四角は、HIVCMV/tat-Bに由来する配列であることを示し、斜線の入った四角は、HIVNL43/AD8に由来する配列であることを示し、また、縦じまの入った四角は、HIVNL43/nef-Bに由来する配列であることを示している。
【０２６２】
特定のtat-nef-HIVクローンについて考察する前に、前駆HIVクローンのいくつかについて説明する。プロウイルスHIV-1クローンHIVNL43は、全長HIV-1ゲノムを備えている。HIVADAは、エンベロープタンパク質のgp120ドメインに集中するマクロファージ指向性を示すウイルスである。HIVADAのエンベロープタンパク質をコードする配列を、HIVNL43にクローニングして、マクロファージ指向性を示すウイルス、HIVAD8を得た（HIVADAのenv遺伝子の配列は、GenBankデータベースから登録番号M60472として入手することができる）。HIVCMV/tat-Bは、HIVNL43から派生したもので、2箇所を改変してある（ChangとZhang、前記）。一つ目の変更は、HIVの3'LTR領域と5'LTR領域の中にCMV-IEエンハンサーを挿入し、HIV LTRからSp1因子を欠失させたことからなる。二つ目の変異は、tat遺伝子のヌクレオチド5851と5851の間に3個の終止コドンを組み込んでいるということである［ヌクレオチド番号は、ニューメキシコ州ロスアラモス（Los Alamos）にあるロスアラモス国立研究所（Los Alamos National Laboratory）のMyersら、(1992) Human Retroviruses and AIDS, のシステムにしたがった］。このtat-HIVクローンは、いくつかの細胞系で効率的に発現することが示されている（ChangとZhang、前記）。HIVNL43/nef-Bは、ヌクレオチド8781と9031との間にあるnef遺伝子の中に3個の終止コドンを導入した、HIVNL43の派生クローンである。3個の終止コドンを導入したことに加えて、このクローンは、ヌクレオチド8784のところにHndIII部位が作出され、ヌクレオチド9019と9025のところに２つのXbaI部位が作出されている。図12A〜Bは、野生型HIV-1の配列の位置、ならびにtat-B変異配列（図12A；配列番号：26に示されている野生型配列）とnef-B変異配列（図12B；配列番号：27および28に示されている野生型配列）を示す概要図を提供している。TatウイルスであるHIVNL43/AD8/tat-Bは、次の3つの断片をライゲーションして構築された。1）HIVNL43から単離した約5.7 kbのBamHI-EcoRI断片で、envベクターの骨組み-gag-pol領域（ヌクレオチド8465から5743）を提供し、2）HIVCMV/tat-Bから単離した約0.6 kbのEcoRI-Asp718断片で、tat遺伝子（ヌクレオチド5743から6343）を提供し、また、3）HIVAD8から単離した約2.1 kbのAsp718-BamHI断片で、env遺伝子（ヌクレオチド6343から8465）を提供する。
【０２６３】
（i）HIVNL43/AD8/tat-B/nef-Bの構築
次の2つの断片をライゲーションして、HIVNL43/AD8/tat-B/nef-Bを構築した。1）HIVNL43/nef-Bから単離した約5.7 kbのBamHI-EcoRI断片で、envベクターの骨組み-gag-pol領域（ヌクレオチド8465から5743）を提供し、2）HIVNL43/AD8/tat-Bから単離した約2.7 kbのEcoRI-BamHI断片で、tat-env領域を提供する。HIVNL43/AD8/tat-B/nef-Bは、機能をもつTatまたはNefタンパク質を産生せず、また、マクロファージ指向性である（AD8 env遺伝子）。
【０２６４】
（ii）HIVNL43/nef-B/tat-Bの構築
次の2つの断片をライゲーションして、HIVNL43/nef-B/tat-Bを構築した。1）HIVNL43/nef-Bから単離した約5.7 kbのBamHI-EcoRI断片で、envベクターの骨組み-gag-pol領域（ヌクレオチド8465から5743）を提供し、2）HIVCMV/tat-Bから単離した約2.7 kbのEcoRI-BamHI断片で、tat-env領域を提供する。HIVNL43/nef-B/tat-Bは、機能をもつTatまたはNefタンパク質を産生せず、また、T細胞指向性である（NL4-3 env遺伝子）。
【０２６５】
（iii）HIVCMV/nef-B/tat-Bの構築
【０２６６】
HIVCMV/nef-B/tat-Bは、次の3つの断片をライゲーションして構築された。1）HIVCMV/tat-Bから単離した約5.7 kbのNgoMI-SalI断片で、ベクターの骨組み-U3-gag-pol-tat領域（ヌクレオチド10349から5785）を提供し、2）HIVNL43/nef-B/tat-Bから単離した約3.6 kbのSalI-BbrPI断片で、tat-env-nef領域（ヌクレオチド5785から9365）を提供し、また、3）HIVCMV/tat-Bから単離した約0.98 kbの BbrPI-NgoMI断片で、U5（ヌクレオチド9365から10349）を提供する。HIVCMV/nef-B/tat-Bは、機能をもつTatまたはNefタンパク質を産生せず、また、T細胞指向性である（NL4-3 env遺伝子）。
【０２６７】
（iv）HIVCMV/AD8/nef-B/tat-Bの構築
HIVCMV/AD8/nef-B/tat-Bは、次の3つの断片をライゲーションして構築された。1）HIVCMV/tat-Bから単離した約5.7 kbのNgoMI-SalI断片で、ベクターの骨組み-U3-gag-pol-tat領域（ヌクレオチド10349から5785）を提供し、2）HIVCMV/tat-Bから単離した約3.6 kbのSalI-BbrPI断片で、tat-env-nef領域（ヌクレオチド5785から9365）を提供し、また、3）HIVCMV/tat-Bから単離した約0.98 kbの BbrPI-NgoMI断片で、U5（ヌクレオチド9365から10349）を提供する。CMV/tat-Bは、機能をもつTatまたはNefタンパク質を産生せず、また、マクロファージ指向性である（AD8 env遺伝子）。
上記i〜ivで説明したtat-nef-HIVクローンは、裸のDNAワクチンとして用いることができ、または、これらのDNA構築物をPBL（HIVNL43/nef-B/tat-B、およびHIVCMV/nef-B/tat-B）、またはマクロファージ（HIVNL43/AD8/tat-B/nef-B、およびHIVCMV/AD8/nef-B/tat-B）のどちらかにトランスフェクトすることができ、実施例15で説明したようにして、ウイルスを単離して、弱毒化したウイルスをワクチンとして用いることができる。上記のtat-nef-HIVクローンは宿主の中で感染を成立させ、液性および細胞性免疫応答を誘導して、これらのウイルスによって誘導される感染を調節または制限する。後述の実施例21で、Hu-PBL-SCID/bgマウスにおいて、これらの弱毒ウイルスとプロウイルスDNAワクチンを評価するためのプロトコールが提供される。
【０２６８】
（b）複製欠損HIV-1パッケージングベクターワクチン
HIV由来のベクターをパッケージングするのに有用な発現ベクターは、ウイルスの構造遺伝子を発現するが、ウイルス粒子にパッケージングされるウイルスRNAを生成する能力を欠いているため、有用なHIV-1 DNAワクチンを提供する。
【０２６９】
（i）すべてのウイルス構造遺伝子を合成できるが、パッケージングシグナルをもたない発現ベクターの構築
pHP-1には、プライマー結合部位（PBS）、ポリプリン配列（PPT）、3'LTR、および通常のレトロウイルスパッケージングシグナル（Ψ）と主要HIV-1スプライス供与（SD）部位とを含む非翻訳5'リーダー配列の殆どが欠損している。pHP-1は、nef遺伝子以外のすべてのHIV構造遺伝子をもつため、ウイルスタンパク質のほとんどを発現することができる。pHP-1は、発現されるウイルスタンパク質については、HIV-1感染を模倣することのできるプロウイルスを提供するが、このウイルスはウイルス粒子にパッケージされない。さらに、pHP-1プロウイルスに導入された変異によって、野生型HIVウイルスが組換えによって産生される可能性は非常に低くなっている。このように、pHP-1は、優れたHIVワクチンを提供する。
【０２７０】
pHP-1を次のようにして構築した。まず、BrpI-HindIII制限酵素消化によって、dlkB/Sp1-CMV-TATA-TAR HIVからTat反応性エンハンサープロモーターCMV-TATA-TAR断片（約400 bp）［Changら、J. Virol. 67:743］を単離し、HindIIIとBamHIの付着末端を提供し、コーザック（Kozak）翻訳開始配列とともに改変されたgag AUGを含み、またラウス肉腫ウイルスの主要スプライス供与（SD）部位含むリンカーによって、EcoRV-BamHI消化したpSP72（プロメガ社（Promega）製）の中にクローニングした。このリンカーは、次のオリゴヌクレオチドをアニールして作成した：5'-AGCTTGGTCGCCCGGTGGATCAAGACCGGTAGCCGTCATAAAGGTGATTTCGTCG-3'（配列番号：29）、および5'-GATCCGACGAAATCACCTTTATGACGGCTACCGGTCTTGATCCACCGGGCGACCA-3'（配列番号：30）。この最初のサブクローンをpSP-CMV-TAR-SDと名付けた。
【０２７１】
次に、5'側プライマー［5'-CGGGATCCAC CATGGGTGCG AGAGCGTC-3'（配列番号：31）］とgag遺伝子のSphI部位の下流の3'側プライマー［5'-ATCCTATTTGTTCCTGAAGG-3'（配列番号：32）］を用いたPCRによって、pNL4-3（全長HIV-1プラスミド）からgagコーディング配列を得た。このPCR産物をBamHI-SphI（約660 bp）で制限酵素消化して、その断片を、BamHI-SphI消化したpSP-CMV-TAR-SDとライゲーションして、pSP-CMV-TAR-SD-dl.gagを得た。
【０２７２】
次に、以下の3つの断片をライゲーションして、ポリAを取り除いたサブクローンpHP-dl.pAを構築した：pSP-CMV-TAR-SD-dl.gagから単離した1112 bpのHpaI-SphI断片（プロモーター-TAR-SD-dl.gagを含む）、pNLgptの7922 bpのSphI-XhoI断片（dl.gag-pol-env-gpt）、およびpBS-KS(-)（ストラタジーン（Stratagene）社製）をEcoRV-XhoI消化して得られたプラスミドベクターの骨組み。
【０２７３】
最後に、次のライゲーションを行って、pHP-1を作製した。dl.CMV-TATA-TAR-SD-gag-pol-env-gptを含むpHP-dl.pAのNotI-XhoI（9059 bp）、XhoI-PstI消化したpREP9（Invitrogen製）の422 bpのポリA部位、およびNotI-PstI消化したpBS-KS(-)。pHP-1の配列（12494 bp）を配列番号：33に示すが、この配列は、BbrPIの中央の位置にあるプロモーターから始まっている。
【０２７４】
複製能のあるHIV（RC-HIV）組換え体が作出される可能性があるか否かを見るために、ヒトTE671細胞（ATCC CRL 8805）をpHP-1 DNAで形質転換し、形質転換された細胞を、ヒトリンパ腫細胞系MT4とともに7日間共存培養した。MT4細胞（メリーランド州ベセスダ（Bethesda）にある国立衛生研究所のNIH AIDS研究および参照用試薬プログラム（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program））は、HTLV-1で形質転換されたヒトCD4+リンパ腫細胞系で、HIV-1感染に非常に感受性が高い。2ヶ月間共存培養しても、HIV-1感染が検出されなかったことは、pHP-1を含む細胞にはRC-HIV産生がなかったことを示している。HIV-1タンパク質の合成を検出するために、野生型HIV-1構築物であるpNL4-3と比較しながら、細胞溶解物を調製して、ウエスタンブロッティングによって解析した。この実験の結果、pHP-1によって合成されるウイルスタンパク質のレベルは、野生型pNL4-3のレベルと同等であることが明らかになった。
【０２７５】
形質転換された培養上清における逆転写酵素（RT）活性の解析によって、野生型構築物pNL4-3と比較すると、pHP-1では、活性のあるRT産生のレベルが40%低下することが示された。Gag-Pol機能が発現したことから、tatとrevが機能を持つことが示されている。このように、pHP-1構築物の中の人為的に作成されたスプライス供与（SD）部位で、HIV配列とは無関係な配列が、野生型のSD部位と同じように（すなわち、スプライシングを受けたmRNAと受けていないmRNAを細胞質に分配する）作用する。
【０２７６】
pHP-1は、バクテリアのgpt遺伝子をもつが、HIVのnef遺伝子を持たない。次のようにして、pHP-1からgpt遺伝子を除去して、pHP-2を作出した。pHP-1をBamHIとSphIで制限酵素消化して、約7 kbのBamHI（pHP-1のヌクレオチド8870）-SphI（pHP-1のヌクレオチド1842）断片を単離する。pHP-1をBamHIとHindIIIで制限酵素消化して、322 bpのBamHI（pHP-1のヌクレオチド8870）-HindIII（pHP-1のヌクレオチド9192）断片を単離する。pHP-1をXhoIとEcoRIで制限酵素消化して、431 bpのXhoI（pHP-1のヌクレオチド9764）-EcoRI（pHP-1のヌクレオチド10195）断片を単離する。pHP-1をEcoRIとSphIで制限酵素消化して、約1.8 kbのEcoRI（pHP-1のヌクレオチド10195）-SphI（pHP-1のヌクレオチド1842）断片を単離する。これら4つの断片をまとめて、HidII-XhoIアダプターと一緒にライゲーションしてpHP-2を作出する。pHP-2は、pHP-1のgpt遺伝子をもたず、HIVのnef遺伝子ももたない。
【０２７７】
pHP-2にnef遺伝子を挿入して、pHP-3を作出する。pHP-3は、すべてのHIV構造遺伝子を含み、pHP-1およびpHP-2と同様に、複製機能を欠損している。HindIII部位（5'側プライマー）、またはnef遺伝子に相補的な配列に付加したXhoI部位（3'側プライマー）をもつプライマーを用いたPCR増幅によって、nef遺伝子を単離する。増幅したPCR産物をHindIIIとXhoIで制限酵素消化して、pHP-3を作出するためのpHP-2（上記）を作出するために用いたpHP-1に由来する4つの断片をライゲーションする。このように、pHP-3を構築するときにpHP-2を作出するために用いるHindIII-XhoIアダプターの代りに、nef PCR産物を用いる。
【０２７８】
pHP-1、pHP-2、およびpHP-3がもつプロウイルスを、FDAが承認するDNAワクチンの条件を充たすために、常法を用いて、アンピシリン抵抗性遺伝子ではなくカナマイシン抵抗性遺伝子をもつベクターの骨組みに入れることができる。
【０２７９】
pHP-1、pHP-2、および/またはpHP-3のDNA（または、そのカナマイシン抵抗性誘導体）が効果的なHIVワクチンとして機能しうる能力を、後述する実施例21で説明されているようにして、Hu-PBL-SCID/bgマウスの中で評価する。
【０２８０】
実施例21―  Hu-PBL-SCID/bgマウスにおける候補ワクチンの評価
本実施例は、ヒトの病原体に対する免疫を誘導するために設計したワクチンを評価するためにHu-PBL-SCID/bgマウスを用いることについて説明する。弱毒化したHIV、または野生型HIVに暴露したマウスを実験に用いるときは、HIVに暴露されることのないように細心の注意を払う。手袋を二重に装着し、長いピンセットを用いて（麻酔前の）マウスを扱う。バイオセイフティーレベル3の施設において、HIVに関連したあらゆる処置を行う。すなわち、バイオセイフティーレベル3の施設の外に血液サンプルと組織サンプルを持ちだすときには、すべてバイオセイフティー容器に入れたままにする。
【０２８１】
（a）Hu-PBL-SCID/bgマウスの再構成
実施例3で説明したようにして、または次のようにして、Hu-PBL-SCID/bgマウスを調製する。フィコール-ヒペーク（Ficoll-Hypaque）（実施例15）上で密度勾配遠心して、ヒトPBLを単離する。分離したPBLを、濃度が4×10７/mlになるようにPBSで再懸濁する。SCID/bgマウスを再構成するためには、単離したばかりのPBL（すなわち、単離して2時間以内）が好ましい。凍結したPBL、および軟膜調製物（血液銀行から提供される）を約24時間室温に置いておくと、単離したばかりのPBLに較べて再構成効率が落ちることが分かっている。
0.5 mlのPBS中2×10７個のヒトPBLをSCID/bgマウスに腹腔内注射する。注射された動物は、敷きわらを吸い込むのを防ぐために、きれいな飼育カゴの中の（カゴの底の）何枚にも重ねたペーパータオルに入れて、毎日観察した。
【０２８２】
（b）ELISAによる、再構成の確認
ヒトPBLを注射してから3〜4週間後、マイクロテイナー（microtainer）（Becton Dickinson製）を用いて、マウスの尻尾から血液を集める。ELISAによって、ヒト免疫グロブリン（hu-Ig）について血液サンプルを検査する。hu-Igレベルが>100 μg/mlの動物を再構成に成功したものとみなす。ワクチン接種する（すなわち、弱毒化HIV、またはHIV DNA調製物など、ワクチン候補を含む調製物を注射する）ときには、ワクチンの評価をするために、hu-Igレベルが>100 μg/mlの動物を用いるものとする。典型的には、ヒトPBLの注射をしてから1〜2週間後に、初回ワクチンを与える。
【０２８３】
（c）異種DNAワクチンによる、Hu-PBL-SCID/bgマウスの免疫
上記a）で説明したように、Hu-PBL-SCID/bgマウスを作製する。ヒトPBLを接種した1週間後に、メトファン（methofane）で麻酔をする。麻酔が外科手術水準に達したところで、動物を拘束具に固定して、1）腹腔内注射によって、0.5 mlの弱毒化HIV（例えば、HIVNL43/AD8/tat-B/nef-B）（AIM-V血清を含まない培地で、TCID50= 50〜100）で免疫するか、または2）筋肉内注射によって、0.2 ml（食塩水中約30 μgのDNA）の裸のプロウイルスDNA（例えば、pHP-1）で免疫する。初回注射の後、免疫の間を2日おいて、同じ免疫処理を2回繰り返す。
弱毒化生ワクチン、またはDNA HIVを最後に注射してから1週間後、メトファン（methofane）麻酔下、腹腔内注射（0.5 ml、TCID50= 100）によって、野生型HIV菌株を動物に抗原投与する。免疫して、野生型HIV-1を抗原投与した後、血液サンプル（0.1 ml）をマウスの尻尾から毎週集めて、抗p24モノクローナル抗体（国立衛生研究所のNIH AIDS研究および参照用試薬プログラム（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program）から入手することができるハイブリドーマ183-H12-5Cから調製する）を用いる免疫組織化学染色によってHIV-1感染を観察する。なお、染色は、実施例15で説明したようにして行う。さまざまな時点で、麻酔誘導した後、頚椎脱臼によって動物を屠殺する。屠殺した時に、HIV-1感染を調べるために血液、腹腔洗浄液、および脾臓を回収する。脾細胞は、ELISPOT（実施例17）によって、HIV-1特異的CMI反応を調べるためにも用いる。
【０２８４】
（d）ヒト化SCID/beigeマウスにおける、弱毒化HIVワクチン、および抗HIV遺伝子治療ベクターの評価
ヒト胎児造血組織（肝臓、胸腺、リンパ節、または骨髄）を用いると、ヒト免疫は確立されたSCID/beigeマウスにおいて機能する。これらのヒト化動物は、HIVワクチン、および抗HIV遺伝子治療の方法を評価するためのモデルを提供する。
【０２８５】
（i）ヒト化SCID/beigeマウスの確立
次のように、移植のためにヒト胎児組織を調製する。妊娠後17〜24週のヒト胎児（HIV陰性）を、アドバンスドバイオサイエンスリソース社（Advanced Bioscience Resources Inc.）（カリフォルニア州アラミダ（Alameda））から入手し、10%ウシ胎児血清（FCS）、50ユニット/mlのペニシリン、および50 μg/mlのストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培地を入れた滅菌50 mlチューブの中に入れる。このサンプルは、水を入れた氷の中に入れて輸送され、36時間以内に受け取る。PCRアッセイ法を用いて、組織と血液にHIVがあるか否かをテストする。さらに、将来使用するために、器官の断片または解離した細胞は、10%DMSOと40%FCSに入れて凍結させる。
【０２８６】
SCID/bgマウスをメトファン（methofane）で麻酔する。各マウスの背中の1.5 cm２の範囲を#22剃刀で剃り、この領域をポビドンヨードで拭き取る。側腹部に1 cmの切り込みを入れて、右または/および左の腎臓を露出させる。
【０２８７】
ヒト胎児の肝臓と胸腺を鋭い剃刀で小さな切片（1 mm３）に刻む。各組織から約10個の切片を、16または18ゲージのトロカールを用いて腎被膜の下に植え付ける。確実に治癒するように、傷を縫合して、金属クリップで傷口の回りを止める。
【０２８８】
移植を受けたSCID/bgマウスの末梢血の中にヒト免疫細胞（実施例11で説明したところによる；CD25のようなさらに別のマーカーを用いることもできる）とヒトIgが存在することを（ELISAによって）確認するために、毎月マウスの尻尾から血液サンプル（0.1 ml）を採集する。SCID/beigeマウスの免疫システムをヒト化するのに成功したら、それらをワクチン評価に用いる。または、抗HIV遺伝子をもつ、形質導入されたヒト造血幹細胞（CD34+細胞）を、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）に基づくベクター、またはHIVに基づくベクターで抗HIV遺伝子（例えば、抗HIVリボザイム、および細胞内一本鎖抗体遺伝子）を含むベクターを用いて、腹腔内からヒト化SCID/beigeマウスに注射することができる。造血幹細胞を形質転換する（すなわち、感染させる）。抗HIV遺伝子を含む、MoMLVに基づくベクターの例は、同時係属中の米国特許出願第08/336,132号において提示されており、その開示は参照として本明細書に組み入れられる。
【０２８９】
（ii）ヒト化SCID/beigeマウスにおける、弱毒化HIVワクチンおよび抗HIV遺伝子治療ベクターの評価
ヒト化された（すなわち、移植された）SCID/bgマウスをメトファン（methofane）で麻酔して拘束具に固定し、上述のようにして、弱毒化HIVワクチン（AIM-V培地中のウイルス、または食塩水中のDNA）を注射する。弱毒化HIVワクチンを（3〜7日間を開けて）3回注射した後、腹腔内注射（0.5 ml、TCID50= 100）によって、メトファン（methofane）による麻酔下にある動物に野生型HIV-1を抗原投与する。野生型HIV-1を注射した後、HIV感染を確認するため、メトファン（methofane）による麻酔下で尻尾から血液サンプルを毎週採集する。
さまざまな（死亡する前の）時点で、動物を麻酔後頚椎脱臼によって屠殺する。同時に、ELISPOT（実施例17）によって、HIV-1感染とインビトロCMIを調べるために、血液、腹腔洗浄液、および脾臓を回収する。
上記したところから、本発明が、HIVワクチンと抗HIV免疫を評価するのに適した動物モデルを提供することは明らかである。さらに、本発明は、抗HIV免疫を誘導するための弱毒化したHIV生ワクチンとDNAワクチンを提供する。
【０２９０】
実施例22―  コンピュータ援用によるELISPOT解析アッセイ法
（a）材料および方法
（i）細胞
AA-2細胞系は、CD4を高レベルで発現するWIL-2 ヒト脾臓EBV+B-リンパ芽球状細胞系に由来する［Chaffeeら、(1988) J. Exp. Med. 168:605-621］。AA-2は、メリーランド州ベセスダ（Bethesda）にある国立衛生研究所のNIH AIDS研究および参照用試薬プログラム（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program）から入手し、37℃、5% CO2で、10%ウシ胎児血清（FCS）、0.1 mg/mlのペニシリン-ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、1 mM 非必須アミノ酸、およびピルビン酸ナトリウムを添加したRPMI 1640培地の中で維持した。健康な、または繰り返しHIV-1に暴露されていながら血清陰性ドナーから、ヒト末梢血リンパ球（PBL）を採取し、以前報告した［Changら、(1995) Virology 211:157-169］ようにしてFICOLL勾配によって分離し、使用するまで液体窒素で凍結させておいた。
【０２９１】
（ii）ヒトリンパ球サブセットの分離
PBLを37℃で融解して、その生存率が90%よりも高いときにだけ使用した。これらを、マウス抗ヒトCD4-、CD8-、CD56-、またはマウスIgG1標識BIOMEGマグネティックビーズ（マサチューセッツ州フラミンガム（Framingham）、PerSeptive Diagnostics製））と共に、細胞あたり50ビーズになるようにして、氷上で30分間インキュベートした。マウスIgG1選別を対照として用いて、マグネット上の細胞を5分間2回選別することによって細胞涸渇を行った。選別の後、細胞を培地で洗浄して、下述するように、それぞれ実験において、刺激因子か標的細胞のいずれかと共に接種した。
【０２９２】
（iii）刺激因子と標的細胞の調製
同種異系反応における刺激因子または標的細胞として、AA-2細胞を用いた。刺激を与えるために、5 μg/mlのマイトマイシンで2.5時間、AA-2細胞を処理し、リン酸緩衝食塩水で3回洗浄して、ウェル当たり5×10４個の細胞を、上述したようにして、ウェル当たり2×10２から5×10３個の細胞から調製したさまざまなT細胞のサブセットとともに、3回反復して、中丸底の96穴プレートの中の10%FCSと20 U/mlのIL-2（Boeringer Mannheim Canada製）を含む、全部で200 μlのRPMI 1640培地に接種した。細胞は、ELISPOTアッセイに用いる前に、37℃、5% CO2で3日間インキュベートした。HIV-1特異的なエフェクター機能を検出するための標的細胞を調製するために、健康なドナー、またはHIV-1に暴露されたが感染していないドナーのPBLをPHA（5 μg/ml）で2日間処理してから、感染多重量0.2で3時間、野生型HIV-1を感染させた。感染後、PBLを、IL-2（20 U/ml）存在下、10%FCSを含むRPMI 1640培地の中で5日間インキュベートした。以前報告した逆転写酵素アッセイ法［Changら、(1995) Virology 211:157-169］によって、HIV-1感染を確認した。後で使用するため、感染したPBLを液体窒素の中で凍結させた。PHAで刺激したが、感染しなかった同一個体のPBLを陰性対照として用いた。
【０２９３】
（iv）ELISPOTアッセイ法
ELISPOTアッセイ法は、図13に示すように、連続4日間にわたって行われるいくつかの工程：抗体によるプレートの被覆、目的とする細胞の捕捉、二次抗体の結合、酵素の接合、および発色を含み、［Czerkinskyら、(1988) J. Immunol. Methods 110:29-36］に次のような変更を加えて実施した。同種異系反応を測定するために、10%FCSとIL-2（20 U/ml）を含む100 μlのRPMI 1640培地中の、マイトマイシンC処理された、1×10５個のAA-2細胞を各ウェルに加えた。その間に、刺激因子と共に3日間インキュベートしておいたPBLも、96穴丸底プレートからニトロセルロースウェルプレートに100 μlを移し、AA-2、またはPBLのみを対照として用いて、37℃、5% CO2で24時間インキュベートした。
HIV-1に暴露された高リスクの血清陰性ドナー、またはHIV-1に暴露されていない低リスクの血清陰性ドナーから得られた、刺激を加えていない凍結PBL（4×10４から1×10４）を用いて、HIV-1特異的な免疫応答を調べた。各ウェルの中で、融解したエフェクターPBLを、1×10５個の、マイトマイシンC処理した自己性HIV感染PBLと、全量200 μlで24時間インキュベートした。感染していない自己性PBLを対照として用いた。
【０２９４】
（v）コンピュータ化したビデオ画像による計数
乾燥させたニトロセルロース96穴プレートを照明ボックスの上に載せて、プログラム「The Imager」バージョン2.03（ジョージア州プレソントン（Plesonton）にあるアプリジーン社（Appligene）製）を用いてアプリジーン（Appligene）コンピュータに接続されたCohu 4910シリーズモノクロームCCDカメラを用いて画像を捉えた。コントラスト、グレイスケール、および感光時間を調節して画像を最適化し、シェアウエア「NIH Imageバージョン1.55」を用いて解析を行う前に、画像ファイルフォーマットにして保存した。6〜24個のウェルの読み取りを、1つのファイルに捕捉して保存することができ、一緒に処理することができる。画像を再生させたら、グレイスケールを調節して、画像をシャープおよび/またはスムーズにして、できる限りよい解像度を得た。次に、適正な閾値を設定して、この画像をバイナリー（白黒）形式に変換した。プログラムの中の「analysis particle」オプションを用いて、各ウェルを選択して、スポット数を数えた。バックグランドとなる、異なる大きさのスポットを自動的に排除するために、粒子の大きさを予め限定することができる。
【０２９５】
（b）コンピュータ援用によるELISPOTアッセイの結果
正常な免疫適格のある個体では、同種異系抗原による刺激が、顕著なIFN-γ産生を伴う、強力な細胞媒介性免疫応答を誘導する。この反応は、ELISPOTアッセイのよいモデルとして用いられる。同種異系反応を誘導するために、別々のドナーのPBLを、標的細胞の放射線照射したAA-2と3日間混合しておき、材料および方法で説明したELISPOTアッセイによって、PBL集団におけるIFN-γ産生細胞の頻度を決定した。立体顕微鏡で見ると、ニトロセルロースの底をもつ96ウェルの中でIFN-γ分泌細胞によって形成されるスポットは、以前観察したときと同じように、中心が濃い紫色で、周辺領域は少し薄くなっていた［Czerkinskyら、(1988) J. Immunol. Methods 110:29-36］。これらのELISPOTは、比較的小さく比較的色が濃く且つほとんど均一なアーティファクトスポットと、明確かつ容易に区別された。コンピュータのビデオ画像装置を用いると、使用した倍率では、バックグランドからのより小さなアーティファクトは見られなかった。図14Aは、無料のシェアウエア「NIH Image」によって処理した、微調整後のコンピュータELISPOT画像を印刷したものである。左側のウェルは、標的AA-2のみを入れたものである。中央のウェルと右側のウェルは、それぞれ1,000個と200個のPBLを、AA-2と共に入れてあった。バイナリー形式（図14B）を用いると、ELISPOTの画像が黒いスポットとして容易に観察でき、自動的に数を数えることができる（図14C）。このシステムを用いて数えられたIFN-γ産生細胞（IPC）の数は、立体顕微鏡によって判定された数と同じである。この処理システムによって、顕微鏡下で数を数えるという、退屈で不快な経験が回避される。最も重要なのは、解析プログラムを用いて、ELISPOTの濃度と大きさを予め限定することができるため、不要なアーティファクトを一律に除去する結果となる。人間による顕微鏡下での計数に較べると、コンピュータ化された解析は正確で、本物のスポットから小さなアーティファクトスポットを客観的に区別する。「NIH Image」プログラム以外に、どのような画像指向的なプログラムを用いても、捕捉した画像を再生印刷することもできる。
【０２９６】
混合リンパ球を用いた、非特異的な同種異系反応に対する代表的なELISPOTアッセイを図15Aに示す。健康なドナーのPBLは、3日間刺激を加えた後、1×10４個のPBLにおいて1,000を超えるIPCを示すAA-2に対して反応し、6日間刺激した後では、IPCの数は2倍になった（図15A）。これに対して、テストの2週間前まで化学療法を受けていた癌患者の同種異系免疫応答は、健康なドナーの免疫応答よりも50倍低かった。この結果、ELISPOTは、強力で非特異的な免疫応答の頻度を評価するための、簡単、迅速、かつ感度のよいプロトコールであることを示している。
【０２９７】
ELISPOTアッセイ法の特異性と感度を明らかにするため、自己性HIV-1抗原提示細胞を標的細胞として用い、HIV-1に繰り返し暴露されていながら（高リスク）も非感染の個体におけるHIV-1特異的IPCの頻度を、対照とした低リスク個体における頻度と比較して調べた。HIV-1抗原提示細胞と出会ったときにIFN-γの分泌があるのは、HIV-1に以前暴露されたことを示しているかもしれない［Jassoyら、(1993) J. Virology 67:2844-2852］。上記の材料および方法の節で説明したように、自己性PBLをそれに対応する個体に感染させて標的細胞を調製した。本実験の結果、低リスクドナーからのPBLには、1×10６個のT細胞まで、HIV-1特異的な応答細胞が含まれていないことが示された（図15B）。これに対して、高リスクドナーのPBLは、インビトロ刺激なしで、1×10６個のリンパ球当たり28個のHIV-1特異的応答細胞の前駆体頻度をもつ（図15B）。高リスクドナーにHIV-1特異的なIPCが存在することは、高リスクで血清陰性個体が、HIV-1特異的なCTL反応を生じさせるということと符合する［Clericiら、(1992) J. Inf. Dis. 165:1012; Rowland-Jonesら、(1995) Nat. Med. 1:59］。HIV-1に感染した個体では、インビトロ刺激なしに、HIV-1特異的なCTLを検出できる［Walkerら、(1987) Nature 328:345-348］のに対し、高リスク個体におけるHIV-1特異的CTLとその前駆細胞の頻度は、インビトロ刺激をした場合にだけ示された［Aldhousら、(1994) Clin. Exp. Immunol. 97-61-67、Clericiら、(1992) J. Inf. Dis. 165:1012、およびRowland-Jonesら、(1995) Nat. Med. 1:59］。したがって、この結果は、ELISPOTアッセイ法が、インビトロ刺激を加えるという付加的なステップなしに、弱い抗原特異的免疫応答を検出し、前駆細胞頻度を決定するのに十分な感度があることを示している。
【０２９８】
同種異系、およびHIV-1特異的な免疫反応における各T細胞サブセットの役割を調べるために、別々の実験で、CD4、CD8、CD56（NK）、またはこれら3つのリンパ球サブセットのすべてを涸渇させて、上述のELISPOTアッセイを行った。図16Aと16Bに示すように、程度は異なるが、3つの細胞型すべてが、同種異系、およびHIV-1特異的な反応の両方において、IFN-γ産生に寄与していた。同種異系反応においては、NK細胞が約30%の、CD8が26%の、また、CD4が16%のFN-γ産生をもたらした。しかしながら、HIV-1に暴露されたが非感染の個体においては、CD8細胞の寄与が最も大きく、HIV-1特異的IIFN-γ分泌の71%に上った。また、CD4細胞とNK細胞は、それぞれ、全IFN-γ産生の僅か14%と10%を占めるだけであった。これらの実験をまとめたところ、抗原特異的な免疫反応と非特異的な免疫反応において、IFN-γ産生細胞を定量するための迅速な解析が示された。
【０２９９】
免疫スポット法とコンピュータ援用によるデータ収集処理システムを組み合わせることによって、実験手順を簡素化し、特に、大量のサンプルを扱うときに、一般的な免疫応答、および特異的な免疫応答の臨床評価、または実験的な評価を行うために用いることができる。本発明に係る免疫スポット法は、種々雑多なインターロイキン機能に対するバイオアッセイ法をするなどの新しい応用法を含む、免疫学的実験の多くで、より都合よく使用することもできる［ChangとCui、準備中］。また、本発明の方法は、カラー画像捕捉システム、またはモノクローム画像システムの適当なフィルターを組み合わせたものを用いる2色ELISPOT法［Czerkinskyら、(1988) J. Immunol. Methods 115:231-37］とともに用いることもできる。
【０３００】
上記明細書で引用された刊行物と特許のすべてが、参照として本明細書に組み入れられる。上述した本発明の方法とシステムを、本発明の範囲と目的から逸脱することなく、さまざまに改変、変更できることは、当業者にとって明らかであると思われる。本発明は、特異的な好ましい態様に関連して説明されているが、請求されている本発明は、そのような特異的態様に不当に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、分子生物学またはそれに関連する分野における当業者には明らかな、本発明を実施するための上記の方法形態の様々な改変は、以下の請求の範囲内に含まれるものである。
【０３０１】
参考文献
2008237216.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０３０２】
【図１】図1はレトロウイルス構築物pLSN, pLSNB70, pLSNGM1, pLSN-BG9およびpLSN-GFPを模式的に示したものである。
【図２Ａ−Ｃ】図2は、野生型D54MG細胞(2A)、B7-2形質導入D54MG細胞(2B)、GM-CSF形質導入D54MG細胞(2C)、B7-2およびGM-CSF形質導入D54MG細胞(2D)、およびGFP形質導入D54MG細胞(2E)のフローサイトメトリーのヒストグラムである。図2A〜2Cについては、左側のヒストグラムはアイソタイプの一致した対照抗体で染色したD54MG細胞、右側のヒストグラムは、抗ヒトB7-2モノクローナル抗体で染色したものである。
【図２ＤＥ】図2は、野生型D54MG細胞(2A)、B7-2形質導入D54MG細胞(2B)、GM-CSF形質導入D54MG細胞(2C)、B7-2およびGM-CSF形質導入D54MG細胞(2D)、およびGFP形質導入D54MG細胞(2E)のフローサイトメトリーのヒストグラムである。図Dについては、左側のヒストグラムはアイソタイプの一致した対照抗体で染色したD54MG細胞、右側のヒストグラムは、抗ヒトB7-2モノクローナル抗体で染色したものである。図2Eでは、左側のヒストグラムは非染色の野生型D54MG細胞、右側のヒストグラムは非染色のGFP形質導入D54MG細胞を表わす。
【図３Ａ】図3は、Hu-PBL-SCID/bgマウスにおける、非修飾D54MG細胞と比較したB7-2形質転換D54MG細胞の増殖阻害を示す。図3Aでは、すべてのマウスはPBLで再構成されている。
【図３Ｂ】図3は、Hu-PBL-SCID/bgマウスにおける、非修飾D54MG細胞と比較したB7-2形質転換D54MG細胞の増殖阻害を示す。図3Bでは、両群のマウスの半数は、再構成されていない。
【図４Ａ】図4Aおよび4Bは、Hu-PBL-SCID/bgマウスにおける、非修飾D54MG細胞と比較したGM-CSF形質導入D54MG細胞の増殖阻害を示す。図4Aおよび4Bは2回の独立した実験データを示す。
【図４Ｂ】図4Aおよび4Bは、Hu-PBL-SCID/bgマウスにおける、非修飾D54MG細胞と比較したGM-CSF形質導入D54MG細胞の増殖阻害を示す。図4Aおよび4Bは2回の独立した実験データを示す。
【図５Ａ】図5Aおよび5Bは、放射線照射D54MG-B7-2/GM-CSF細胞によってワクチン接種したHu-PBL-SCID/nodマウス(5A)およびHu-PBL-SCID/bgマウス(5B)における、非修飾D54MG細胞抗原投与の阻害を示す。
【図５Ｂ】図5Aおよび5Bは、放射線照射D54MG-B7-2/GM-CSF細胞によってワクチン接種したHu-PBL-SCID/nodマウス(5A)およびHu-PBL-SCID/bgマウス(5B)における、非修飾D54MG細胞抗原投与の阻害を示す。
【図６】図6Aおよび6Bは、それぞれ、再構成されたSCID/bgおよびSCID/nodマウスのCD45+リンパ球の割合を示す。
【図７】図7Aおよび7Bは、それぞれ、多重感染度0.2 (7A)または多重感染度0.001-0.0001 (7B)におけるマクロファージ指向性HIVを用いた、LRおよびHRセロネガティブ個体の感染PBL中のRT活性を示す。
【図８Ａ−Ｄ】図8はHu-PBL-SCID/bgマウスのインビボ感染を示す。図8A〜8DはLR (8Cおよび8D) またはHR (8Aおよび8B) 個体のPBLにより再構成されたマウスの腹腔洗浄液(8Aおよび8C) および脾細胞(8Bおよび8D) 中のHIV-1感染細胞の免疫染色を示す。
【図８Ｅ】図8はHu-PBL-SCID/bgマウスのインビボ感染を示す。図8Eは、LRまたはHR個体のPBLにより再構成され、T細胞またはマクロファージ指向性HIV-1を抗原投与したhu-PBL-SCID/bgマウスの末梢血、脾臓、および腹腔洗浄液中のHIV-1感染細胞の割合を示す。
【図９】図9はHRおよびLRの非感染個体のPBLにおけるHIV-1特異的IFNγ生産のELISPOT分析を示す。
【図１０ＡＢ】図10は抗CD8抗体で処理した、または処理しないhu-PBL-SCID/bgマウス中のヒトPBLのHIV-1感染を示す。図10A、Ｂは再構成したマウス由来の脾細胞のFACS分析を示す（10Aおよび10Cは抗CD-8処理なし；10Bおよび10Dは抗CD-8処理後）。
【図１０ＣＤ】図10は抗CD8抗体で処理した、または処理しないhu-PBL-SCID/bgマウス中のヒトPBLのHIV-1感染を示す。図10Ｃ、Dは再構成したマウス由来の脾細胞のFACS分析を示す（10Aおよび10Cは抗CD-8処理なし；10Bおよび10Dは抗CD-8処理後）。
【図１０Ｅ】図10は抗CD8抗体で処理した、または処理しないhu-PBL-SCID/bgマウス中のヒトPBLのHIV-1感染を示す。図10Eは、抗CD-8処理したまたは処理しない、HIVＮＬＡＤ８を感染させた、LRまたはHR患者のPBLで再構成されたhu-PBL-SCID/bgマウスの脾臓および腹腔洗浄液中のHIV-1感染細胞の割合を示す。
【図１１】図11A〜11Fは、HIV-1ゲノムの構成 (11A) 、およびHIVＮＬ４−３ウイルス (11B)、HIVＮＬ４３／ＡＤ８／ｔａｔ−Ｂ／ｎｅｆ−Ｂ (11C)、HIVＮＬ４３／ｎｅｆ−Ｂ／ｔａｔ−Ｂ (11D)、HIVＣＭＶ／ｎｅｆ−Ｂ／ｔａｔ−Ｂ (11E)、およびHIVＣＭＶ／ＡＤ８／ｎｅｆ−Ｂ／ｔａｔ−Ｂ (11F)クローンの構成を示す。
【図１２】図12A〜Bは野生型HIV-1の配列の一部、ならびにtat-B変異 (図12A；配列番号：26に提供される野生型配列)、およびnef-B変異（図12B；配列番号：27および28に提供される野生型配列）の模式図である。
【図１３】図13はELISPOTアッセイのフローチャートを模式的に表わしたものである。(1) 96ウェルのニトロセルロース底プレート（MULTISCREEN-HA、Millipore社、オンタリオ州ミシソーガ）をマウス抗ヒトIFNγモノクローナル抗体（10 mg/ml、Pharmingen社、カリフォルニア州サンディエゴ）によって70μl/ウェルでコートし、室温で一晩インキュベートする。(2) ウェルをPBSで2回洗浄液し、10％FCSを含むRPMI 1640、100μl/ウェルとともに37℃で1時間インキュベートする。その後、「材料と方法」に説明するようにして、目的の細胞を総容量200μlになるように各ウェルに添加する。(3) 各ウェルをPBS/T (0.05% TWEEN20) で4回洗い、20％FCSを含むPBS/T 100μlで15分間ブロックする。(4) その後、各ウェルにビオチン化抗ヒトIFNγ mAb（2.5 mg/ml、Pharmingen社）を75μl添加し、4℃で一晩インキュベートする。(5)各ウェルをPBS/Tで4回洗い、PBS中のペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（1:800希釈、CALTAG社、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）を100μl加えて1時間インキュベートする。PBS/Tで2回、PBSで2回洗浄液した後、0.3% NiCL2を含む100μl DAB (Sigma Chemical社)溶液を添加し、15〜20分インキュベートし、ddH2Oで4回すすぐ。(6) 一晩、空気乾燥した後、「材料と方法」に説明するようにして、コンピュータ化ビデオイメージングによって、各ウェル中のスポット数を計数する。
【図１４】図14は、ELISPOTアッセイのコンピュータ援用イメージングおよび計数を示す。図14Aは、「NIH image 1.55」を用いたELISPOTアッセイの検索画像を示す。左側のウェルはAA-2のみを含む対照である。中央および右側のウェルは、それぞれ、AA-2と共に1,000 PBLおよび200 PBLを与えたものである。図14Bは、適当な閾値を設定した、変換済みバイナリー画像を示す。図14Cはオプション「粒子分析（Particle Analysis）」を用いたELISPOTのコンピュータ計数を表わす。
【図１５】図15は非特異的アロ抗原またはHIV-1特異的抗原に対するリンパ球の反応のELISPOT分析を示す。図15Aは健康なドナー（斜線）および化学療法中の癌患者（黒塗り）のPBSのAA-2に対する同種異系の反応を示す。図15BはHIV-1非感染（黒塗り）または多数回接触したセロネガティブドナー（斜線）におけるHIV-1特異的リンパ球反応を示す。
【図１６】図16は非特異的同種異系またはHIV-1特異的抗原刺激時の、IFNγ生産に対する異なるリンパ球サブセットの寄与のELISPOT分析を示す。図16Aは、CD4-、CD8-、および/またはCD56-除去した同種異系PBLの、AA-2に対する反応を示す；図16Bは、HIV-1暴露セロネガティブ個体の、自己PBL反応のHIV-1特異的IFNγELISPOT分析を示す。
【図１】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図２ＤＥ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０ＡＢ】
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【図１０ＣＤ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月4日(2008.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原および免疫調節タンパク質を発現するように修飾された細胞を含むワクチン。
【請求項２】
免疫調節タンパク質が、サイトカイン、共刺激分子、ケモタクチン、細胞周期の調節因子、アポトーシス誘導因子、ウイルス因子、および腫瘍サプレッサーからなる群より選択される、請求項1記載のワクチン。
【請求項３】
細胞が、リーシュマニア、マイコバクテリウム、リステリア、およびマラリア原虫からなる群より選択される、請求項1記載のワクチン。
【請求項４】
免疫調節タンパク質がB7-2である、請求項1記載のワクチン。
【請求項５】
細胞が腫瘍細胞である、請求項1記載のワクチン。
【請求項６】
抗原と少なくとも1つの免疫調節タンパク質とをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項７】
免疫調節タンパク質が、細胞周期調節因子、アポトーシス誘導因子、ウイルス因子、および腫瘍サプレッサーからなる群より選択される、請求項6記載の発現ベクター。
【請求項８】
免疫調節タンパク質がB7-2である、請求項6記載の発現ベクター。
【請求項９】
抗原および少なくとも1つの別の免疫調節因子をコードする発現ベクターを含んで成る、腫瘍を有する被験者を治療するための医薬組成物であって、該発現ベクターが、該腫瘍の少なくとも一部で該抗原および該免疫調節因子を発現するような条件下で該腫瘍に導入される、医薬組成物。
【請求項１０】
発現ベクターを導入する腫瘍が、発現ベクターの導入の前に被験者から取り出された、腫瘍の少なくとも一部であり、抗原および免疫調節因子を発現する前記発現ベクターを導入された腫瘍細胞が、放射線照射された後に該被験者に戻され、その結果、被験者を免疫することを特徴とする、請求項9記載の医薬組成物。
【請求項１１】
抗原および免疫調節因子を発現する放射線照射した腫瘍細胞の少なくとも1回の追加投与量を、免疫された被験者にさらに導入することを特徴とする、請求項10記載の医薬組成物。
【請求項１２】
免疫調節因子が、サイトカイン、共刺激分子、ケモタクチン、細胞周期の調節因子、アポトーシスの誘導因子、ウイルス因子、および腫瘍サプレッサーからなる群より選択される、請求項10記載の医薬組成物。
【請求項１３】
免疫調節因子がB7-2である、請求項12記載の医薬組成物。
【請求項１４】
腫瘍を有する被験者を治療するための細胞の製造方法であって、以下の段階を含む方法：
(a) 被験者から取り出された腫瘍細胞に、抗原および少なくとも1つの別の免疫調節因子をコードする発現ベクターを導入する段階、および
(b) 発現ベクターを導入した腫瘍細胞に放射線照射する段階。
【請求項１５】
免疫調節因子が、サイトカイン、共刺激分子、ケモタクチン、細胞周期の調節因子、アポトーシスの誘導因子、ウイルス因子、および腫瘍サプレッサーからなる群より選択される、請求項14記載の細胞の製造方法。
【請求項１６】
免疫調節因子がB7-2である、請求項15記載の細胞の製造方法。