(57)【要約】【課題】自己免疫性膵炎(AIP)及び劇症１型糖尿病(FT1DM)の検査方法及び検査試薬を提供する。【解決手段】検体中の、アミラーゼα２−Ａと免疫学的に反応する抗体を検出することによりAIPもしくはFT1DMを検査する、または、FT1DMの発症可能性を判定する。この抗体の検出は、例えば、この抗体と免疫学的に反応する抗原を用いる免疫学的方法により行われる。抗原は、好ましくは、ヒトアミラーゼα２−Ａのアミノ酸配列のアミノ酸番号２９９〜５１２を含む部分断片である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の、アミラーゼα２−Ａと免疫学的に反応する抗体を検出することにより自己免疫性膵炎を検査することを特徴とする自己免疫性膵炎の検査方法。
【請求項２】
前記抗体と免疫学的に反応する抗原を用いることにより前記抗体を検出する請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
抗原がヒトアミラーゼα２−Ａのアミノ酸配列のアミノ酸番号２９９〜５１２を含む部分断片である請求項２記載の検査方法。
【請求項４】
前記抗体と免疫学的に反応する抗原を含む、請求項１記載の検査方法に用いるための検査試薬。
【請求項５】
抗原がヒトアミラーゼα２−Ａのアミノ酸配列のアミノ酸番号２９９〜５１２を含む部分断片である請求項４記載の検査試薬。
【請求項６】
検体中の、アミラーゼα２−Ａと免疫学的に反応する抗体を検出することにより劇症１型糖尿病を検査することを特徴とする劇症１型糖尿病の検査方法。
【請求項７】
前記抗体と免疫学的に反応する抗原を用いることにより前記抗体を検出する請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
抗原がヒトアミラーゼα２−Ａのアミノ酸配列のアミノ酸番号２９９〜５１２を含む部分断片である請求項７記載の検査方法。
【請求項９】
前記抗体と免疫学的に反応する抗原を含む、請求項６記載の検査方法に用いるための検査試薬。
【請求項１０】
抗原がヒトアミラーゼα２−Ａのアミノ酸配列のアミノ酸番号２９９〜５１２を含む部分断片である請求項９記載の検査試薬。
【請求項１１】
検体中の、アミラーゼα２−Ａと免疫学的に反応する抗体を検出することにより劇症１型糖尿病の発症可能性を判定することを特徴とする劇症１型糖尿病の発症可能性の検査方法。
【請求項１２】
前記抗体と免疫学的に反応する抗原を用いることにより前記抗体を検出する請求項１１に記載の検査方法。
【請求項１３】
抗原がヒトアミラーゼα２−Ａのアミノ酸配列のアミノ酸番号２９９〜５１２を含む部分断片である請求項１２記載の検査方法。
【請求項１４】
前記抗体と免疫学的に反応する抗原を含む、請求項１３記載の検査方法に用いるための検査試薬。
【請求項１５】
抗原がヒトアミラーゼα２−Ａのアミノ酸配列のアミノ酸番号２９９〜５１２を含む部分断片である請求項１４記載の検査試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫性膵炎（AIP）及び劇症１型糖尿病（FT1DM）の検査方法及び検査試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、AIPの診断は2002年に日本膵臓学会が発表した「自己免疫性膵炎診断基準」に従って行われている。この基準によれば、血液検査の項目である、高γグロブリン血症、高IgG血症、自己抗体のいずれかを認める、ことが診断の十分条件になっている。さらに、高IgG血症のなかでも、IgG4サブクラスが特異的に上昇するとの報告があり、自己抗体としては抗核抗体、リウマチ因子が陽性になることもある、としている。
【０００３】
したがって、本疾患の血液検査では、これらγグロブリン、IgG、IgG4、抗核抗体（SS−A抗体およびSS−B抗体）およびリウマチ因子の測定を行わなければならず、非常に高コストとなることが問題となっている。また、これら検査項目は他疾患でも上昇、あるいは陽性となり、その診断的特異性は乏しい。さらに、本疾患は上記診断基準に従って診断したとしても膵癌との鑑別が非常に困難であり、不必要な手術が行われていると言う現実があるため、両疾患の確実な鑑別法が望まれている。
【０００４】
各研究者はAIPに特異的な自己抗体の探索を行っているが、これまでに、血中ラクトフェリン（LF）抗体およびカルボニックアンヒドラーゼII（CAII）抗体の活性があることを見出している。しかしながら、AIPにおける抗体陽性率はそれぞれ73％、53．8％と臨床的感度に欠けており、方法的な信頼性・再現性も乏しく、診断や鑑別診断には不適当である（非特許文献１、２）。
【０００５】
さらに言えば、AIPの治療の経過を血液検査によりモニタリングすることは投薬量や投薬時期の決定に必要であるが、先に述べた理由と同様に、検査費用が高コストであることが問題となっている。
【０００６】
一方、現在、FT1DMの診断は、2004年に日本糖尿病学会劇症型糖尿病調査委員会により提示された、「劇症1型糖尿病診断基準」により診断されている。それによれば、検体検査として、HbA1C、血糖値、尿中または血中C-ペプチドを測定する。さらに、参考所見として、GAD抗体、IA-2抗体などの自己抗体が陰性であることを確認し、血中膵外分泌酵素の上昇を見ることになっている。
【０００７】
したがって、本疾患においても検査項目数が多＜、その診断には費用がかかること，検査が非特異的であることが問題である。
【０００８】
また、本疾患は、高血糖による症状が発現した後、数日でケトアシドーシスに陥ることが多く、確実に診断し治療を早急に開始しないと生命の危機にさらされる。また妊娠中に発症する例が多く、その際は胎児死亡をほとんどがきたす。したがって、通常の糖尿病の発症時にも上記検査項目の測定を行い、FT1DMと1型糖尿病および2型糖尿病を鑑別するのが望ましいが、良い除外診断のためのFT1DMの検査マーカーがなく、検査項目数が多いため、実際には鑑別診断がなされていないと言うのが現状である。
【非特許文献１】N. Engl. J. Med. 2001, 344:732-8
【非特許文献２】J. Gastroenterol. 2001, 36:293-302
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような従来の技術の問題点に鑑みてなされたものであり、自己免疫性膵炎(AIP)及び劇症１型糖尿病(FT1DM)の検査方法及び検査試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、AIP及びFT1DMの患者並びにFT1DMの発症可能性の高い者の血清にアミラーゼα２−Aに対する抗体が存在することを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）  検体中の、アミラーゼα２−Ａと免疫学的に反応する抗体を検出することにより自己免疫性膵炎を検査することを特徴とする自己免疫性膵炎の検査方法。
（２）  検体中の、アミラーゼα２−Ａと免疫学的に反応する抗体を検出することにより劇症１型糖尿病を検査することを特徴とする劇症１型糖尿病の検査方法。
（３）  検体中の、アミラーゼα２−Ａと免疫学的に反応する抗体を検出することにより劇症１型糖尿病の発症可能性を判定することを特徴とする劇症１型糖尿病の発症可能性の検査方法。
上記（１）〜（３）の検査方法においては、前記抗体と免疫学的に反応する抗原を用いることにより前記抗体を検出することが好ましい。抗原は、好ましくは、ヒトアミラーゼα２−Ａのアミノ酸配列のアミノ酸番号２９９〜５１２を含む部分断片である。
【００１２】
また、本発明は、アミラーゼα２−Ａと免疫学的に反応する抗体と免疫学的に反応する抗原を含む、上記（１）〜（３）の検査方法に用いるための検査試薬を提供する。
【００１３】
抗原は、好ましくは、ヒトアミラーゼα２−Ａのアミノ酸配列のアミノ酸番号２９９〜５１２を含む部分断片である。
【発明の効果】
【００１４】
抗アミラーゼ抗体の測定による自己免疫性膵炎の診断は特異的である。従って、検査項目が1項目になることによる検査コストの削減、膵癌との鑑別診断が確実に行われること、治療経過観察が可能であること、による不必要な手術や投薬の削減により、医療費の大幅な削減が実現する。
【００１５】
劇症1型糖尿病と急性発症1型および2型糖尿病の鑑別は、従来の技術の欄で説明したように、特異的なマーカーがなく、また除外診断のための検査項目数が多いために実際には行われていない。しかし、本発明による測定を行えば、わずか１項目の測定で確定診断および鑑別診断を行うことができる。またイムノクロマト法をはじめとした簡易検査方法に本測定法を応用すれば、さらに迅速にその場で劇症１型糖尿病の診断を行うことができる。このようにして、従来は死に至っていた患者（さらに患者の胎児）を早期診断、救命することができるとともに、検査にかかる費用の削減および重症化することによる医療費の削減に大きく寄与する。また、劇症１型糖尿病の発症可能性の検査も医療費の削減に大きく寄与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態を説明する。先ず、本発明検査方法について説明する。
本発明検査方法は、検体中の、アミラーゼα２−Ａと免疫学的に反応する抗体(以下、「抗AMY-2A抗体」とも表記する)を検出することにより自己免疫性膵炎(AIP)もしくは劇症１型糖尿病(FT1DM)を検査する、または、FT1DMの発症可能性を判定することを特徴とする。
【００１７】
検出の方法としては、抗AMY-2A抗体を検出できる限り限定されない。通常には、抗AMY-2A抗体と免疫学的に反応する抗原または抗体を用いる免疫学的方法が挙げられる。抗体よりも抗原の方が、調製が容易であることから、抗AMY-2A抗体と免疫学的に反応する抗原を用いる免疫学的方法が好ましい。免疫学的方法としては、一般に広く使用されているELISA法が挙げられる。
【００１８】
抗原は、検体に存在する抗AMY-2A抗体と免疫学的に反応するものであればよく、ヒトまたは動物から精製したアミラーゼ分子を使用できる。リコンビナント技術によりアミラーゼ分子を調製してもよい。例えば、ヒトアミラーゼα２−Aをコードする塩基配列が公知である（GenBankアクセッション番号M28443）。また、検体に存在する抗アミラーゼα２−Ａ抗体と免疫学的に反応するものである限り、アミラーゼ分子の部分断片を使用することもできる。
【００１９】
抗原の安定供給およびタンパク質分子としての均一性の観点からは、アミラーゼの部分断片を用いることが好ましい。アミラーゼの部分断片を用いる場合、均一性のある分子を調製することが容易になり、この結果、測定の信頼性が向上する。
【００２０】
このような部分断片の例としては、ヒトアミラーゼα２−Ａのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号２９９〜５１２を含む部分断片が挙げられる。また、アミノ酸配列に変異があっても、配列番号１のアミノ酸番号２９９〜５１２に対応する部分断片を使用できる。
【００２１】
測定対象となる検体は、通常には、血清であるが、反応工程の反応を妨げる物質が含まれていない限り、特に限定はされない。
【００２２】
検出の条件は、従来の免疫学的方法と同様の条件で行うことができる。すなわち、各反応物質の添加順序や量、反応温度、反応時間等の条件は、従来の免疫学的方法と同様でよく、例えば、ビーズ、チューブまたはプレート等などの固相に固定した抗原と、血清を反応させ、血清中に含まれる未結合のIgGを除去した後、抗原に結合した抗体に、酵素標識した抗IgG抗体を結合させ、酵素の反応により検出する方法が挙げられる。
【００２３】
抗AMY-2A抗体の量は、通常には、標識の測定値として算出される。あるいは、既知濃度の抗AMY-2A抗体を含む標準試料により検量線を作成して検量線により濃度を求めてもよい。
【００２４】
陽性の判定は、健常人の値と比較することによって行うことができる。同時に測定した、あるいは、予め測定された健常人の値から有意に値が高い場合（例えば、２SD以上高い、統計学的テストにより有意に高い）に、陽性と判定できる。
【００２５】
本発明検査方法により測定される抗AMY-2A抗体の上昇は、AIPやFT1DMに特異的なため、本発明検査方法によれば、AIPやFT1DMが疑われる場合において、１項目の測定により特異的にAIPやFT1DMを検査できる。
【００２６】
また、FT1DMを発症していない場合、FT1DMの発症可能性を判定できる。陽性の場合、発症可能性が高いと判定される。
【００２７】
次に、本発明検査試薬について説明する。本発明検査試薬は、本発明検査方法を実施するためのものであって、抗AMY-2A抗体と免疫学的に反応する抗原を含む。
【００２８】
抗AMY-2A抗体と免疫学的に反応する抗原については、本発明検査方法に関し説明した通
りである。
【００２９】
さらに、本発明検査試薬は、免疫学的測定に必要な試薬類、例えば、陽性コントロール、緩衝液等を必要に応じ含んでいてもよく、キットとして提供することもできる。
【００３０】
本発明検査試薬の各構成要素は、溶液状態であってもよいし、凍結乾燥品などの乾燥状態であってもよい。乾燥状態である場合には、使用前に溶液状態にするための緩衝液等をさらに本発明検査試薬に含めてもよい。各構成要素の量や形態は、測定方法の条件に合わせて調整される。
【００３１】
例えば、ELISAのキットの場合、抗原を固定した固相プレート、洗浄液、検体希釈液、酵素標識抗AMY-2A抗体溶液、基質液、及び、反応停止液を含むキットとすることができる。また、イムノクロマト法のキットでは、反応デバイス及び展開液を含むキットとすることができる。
【実施例１】
【００３２】
以下、実施例により本発明を説明する。なお、実施例中、「％」は、特記しない限り重量％を示す。
【００３３】
［参考例１］ヒト膵臓からのｃＤＮＡのクローニング
ヒト膵臓ｃＤＮＡライブラリー（λTriplEx2ヒト膵臓ラージインサートｃＤＮＡライブラリー、BD Bioscience Clontech）及びE. coli XL-1コンピテント細胞（BD Bioscience Clontech）を用いた。プレート上のプラークを、10 mMイソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)に予め浸したニトロセルロース膜に転写し、0.05% Tween 20を含むTris緩衝食塩水(TBST)で洗浄し、１％ウシ血清アルブミンを含むTris緩衝食塩水でブロッキングした。膜を、慢性膵炎(AIP)患者（６７歳、男性）から提供された血清（TBSTで500倍に希釈）と共に、一晩、４℃でインキュベートした。TBSTで４回洗浄し、ヤギセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ（American Qualex、TBSTで2000倍に希釈）と、室温で30分、反応させた。TBSTで４回洗浄し、3,3'-ジアミノベンチジンで陽性反応を検出した。
【００３４】
以上の方法により、AIP患者の血清を用いて得た2×104個のプラークをスクリーニングして、10個の陽性クローンを得た。
【００３５】
陽性クローンのcDNA断片を、センスプライマー5'-ATGGGGATCCTTGGGGTTTCGTACCTTCTGACAGA-3'（配列番号２）及びアンチセンスプライマー5'-CTTCGAATTCCCAATTTAGATTCAGCATGAATTGC-3'（配列番号３）を用いてPCRで増幅した。PCR産物をBamHI及びEcoRIで消化し、pTrcHisB (Invitrogen)に連結した。挿入cDNAの配列決定及びホモロジー検索により10クローンのうち７つはヒトAMY-２Aの配列に一致した。Wiseら(J. Mol. Biol. Med. 2:307-322, 1984)によりクローニングされたヒトAMY-2Aの配列と比較した結果、図１に示すように、７クローンのうち４つは全長のコード配列を含んでおり、他の３クローンの5'端は、それぞれ、+61、+799、+897であった(ATGのAを１とした)。他の非アミラーゼクローンは、ヒートショックタンパク質や核タンパク質などのハウスキーピング遺伝子であった。
【００３６】
［参考例２］ヒトアミラーゼα２−A(AMY-2A)に対する抗体の検出用ELISA
参考例１に示すように、スクリーニングに用いたAIP患者のIgGは、AMY-2Aの異なる長さのクローンを認識した。これらの７クローンで共通する領域に患者のIgGの共通エピトープがあると考えられたので（図１の予想エピトープ）、E. coli BL21を用いて、ヒスチジンタグを付けたコドン299〜512のヒトAMY-2A断片(AMY-2A/299-512)を調製した。  具体的には、配列決定後、プラスミドをE. coli BL-21 (Novagen)にトランスフェクトし、組換えタンパク質は、1 mM IPTGで誘導して生成させ、His Bondカラムクロマトグラフィーに
より精製した。
【００３７】
Diabetes Care 24:1661-7, 2001に記載されたELISAに準じて、調製したタンパク質をプレートにコートし、血清中の抗アミラーゼ抗体を検出するELISAを構築した。具体的には以下の通りである。マイクロタイタープレート(Coster 3590, Corning Inc.)を、組換えヒトAMY-2Aの0.1μg(50μl)により、一晩４℃でコーティングした。0.05% Tween 20を含むリン酸緩衝食塩水(PBST)で３回洗浄し、リン酸緩衝液中10%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液の200μlと共に30分インキュベートした。PBSTで洗浄後、測定に用いた。測定は、患者の血清を、1%BSAで200または500倍に希釈して３連で行った。結合した抗体を、ヤギセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ（American Qualex、1%BSAで2000倍に希釈）と、室温で30分、反応させた。PBSTで洗浄後、プレートを、1-Step Slow TMB-ELISA (PIERCE) 100μlと共に30分インキュベートした。100μlの1 M H2SO4を加えて反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。
【００３８】
正常血清(500倍希釈)と比較して、患者血清(500倍希釈)は、強いシグナルを生じた。このシグナルは、患者の血清(500倍希釈、1 ml)をAMY-2A/299-512(1μg)と、４℃で一晩、予めインキュベートすると消失した。三連で行われた測定結果を図２に示す。
【００３９】
［実施例１］膵臓疾患患者におけるヒトAMY-2Aに対する自己抗体の存在率
参考例のELISAを用いて種々の膵臓疾患患者におけるヒトAMY-2Aに対する自己抗体の存在率を測定した（図３）。健常人(n=27)の値の±２SDを正常な範囲としたとき、AIP患者(n=15)のIgGは全てAMY-2A/299-512に対して陽性であった。しかし、アルコール性慢性膵炎(n=13)または膵腫瘍（膵臓癌, n=1; IPMT, n=8）の患者の血清は全てこの抗原に対して陰性であった。
【００４０】
さらに、上記ELISAを用いて、AIP患者の治療経過と抗AMY-2抗体価との関連を調べた（図４）。その結果、抗AMY-2A抗体価は、ステロイド治療により低下し、従来有用であると言われていたIgG4の血中濃度よりもさらに病態を反映していた。
以上の結果から、本検査方法はAIPの確定診断および経過観察に非常に有効な方法であることが示された。
【００４１】
［実施例２］DM患者におけるヒトAMY-2Aに対する自己抗体の存在率
参考例２のELISAを用いて種々の型のDM患者（劇症１型DM(n=13)、急性１型DM(n=22)、緩徐進行型１型DM(n=19)、２型DM(n=19)）及び健常人(n=43)におけるヒトAMY-2Aに対する自己抗体の存在率を測定した（図４）。劇症１型DM患者では全て自己抗体が陽性であった(p<0.001 vs 正常対照)。急性発症１型DM患者、緩徐進行型１型DM患者及び２型DM患者では、自己抗体は低頻度で検出された（それぞれ、２２％、１５％及び５％）。健常人では２％のみが陽性であった。
【００４２】
また、FT1DM発症患者の近親者について測定したところ、FT1DM発症患者の第1度近親者16例中4例（25％）で本抗体が陽性になることが判明した。
【００４３】
以上の結果から、本測定により、抗AMY-2A抗体がFT1DMに特異的な抗体であることが明らかとなり、本検査方法がFT1DMの診断に有用であることが示された。また、第1度近親者に高率に陽性者が存在し、発症予測に有用であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】参考例１で得られた、ヒト膵臓ｃＤＮＡライブラリーから得られたヒトアミラーゼα-2AのcDNAクローン。開始コドンATGのAを１とした。
【図２】参考例２の測定結果を示す。
【図３】実施例１で得られた、種々の膵臓疾患患者におけるヒトAMY-2Aに対する自己抗体の存在率の測定結果を示す。AIP：自己免疫性膵炎、CP：アルコール性慢性膵炎、PT：膵腫瘍、N：健常人。
【図４】実施例１で得られた、AIP患者の治療経過と抗AMY-2抗体価との関連を示す。
【図５】実施例２で得られた、種々の糖尿病患者におけるヒトAMY-2Aに対する自己抗体の存在率の測定結果を示す。FT1DM：劇症１型、AT1DM：急性１型、SPIDDM：緩徐進行型１型、T2DM：２型、N：健常人。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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