(57)【要約】      （修正有）【課題】十分な抗酸化作用を有し、水溶性に優れ、取扱いが容易な抗酸化剤を提供する。【解決手段】式［Ｉ］：2008156255.tif 000014で表される１−シナポイルグリセロールまたは１−ｐ−クマロイルグリセロールを有効成分とする抗酸化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式［Ｉ］：
【化１】
2008156255.tif 000010
で表される１−シナポイルグリセロールまたは式［ＩＩ］：
【化２】
2008156255.tif 000011
で表される１−ｐ−クマロイルグリセロールを有効成分とする抗酸化剤。
【請求項２】
有効成分が式［Ｉ］で表される１−シナポイルグリセロールである請求項１に記載の抗酸化剤。
【請求項３】
有効成分が式［ＩＩ］で表される１−ｐ−クマロイルグリセロールである請求項１に記載の抗酸化剤。
【請求項４】
式［Ｉ］：
【化３】
2008156255.tif 000012
で表される１−シナポイルグリセロール。
【請求項５】
式［ＩＩ］：
【化４】
2008156255.tif 000013
で表される１−ｐ−クマロイルグリセロール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化剤に関し、さらに詳しくはシナピン酸（＝３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸）またはｐ−クマリン酸（＝４−ヒドロキシ桂皮酸）のグリセリンエステルを有効成分とする抗酸化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品及び加工食品の酸化を防止する合成添加物は色々あるが、天然物は少なく、その効果も弱い。また、食品や化粧品は、油脂が酸化すると製品の商品価値が著しく低下してしまうことが問題となっている。
【０００３】
そこで、このような酸化を防止する目的として、トコフェロール、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、アスコルビン酸エステル、種々の蛋白質加水分解物及びこれらを組み合わせた抗酸化剤が食品、化粧品及び医薬品などの広い分野で使用されている。しかし、これらの抗酸化剤は、安定性、浸透性、それ自体の色や匂いから使用範囲が限定されているのが現状である。
【０００４】
一方、フェルラ酸エステルなどの桂皮酸類は、従来から抗酸化能があるといわれている（特許文献１、２）。しかし、これらは水への溶解度が低いため、利用が制限されていた。
【特許文献１】特開平９−４０６１３号公報
【特許文献２】特開２００３−５５３１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、水に対する溶解性がよく、かつ抗酸化効果を発揮する抗酸化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、１−シナポイルグリセロールおよび１−ｐ−クマロイルグリセロールの創製に成功すると共に、これらの化合物は水溶性によく、かつ優れた抗酸化効果を有することを見出し、この知見に基づいてさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］  式［Ｉ］：
【化１】
2008156255.tif 000002
で表される１−シナポイルグリセロールまたは式［ＩＩ］：
【化２】
2008156255.tif 000003
で表される１−ｐ−クマロイルグリセロールを有効成分とする抗酸化剤、
［２］  有効成分が式［Ｉ］で表される１−シナポイルグリセロールである前記［１］抗酸化剤、
［３］  有効成分が式［ＩＩ］で表される１−ｐ−クマロイルグリセロールである前記［１］抗酸化剤、
［４］  式［Ｉ］：
【化３】
2008156255.tif 000004
で表される１−シナポイルグリセロール、および
［５］  式［ＩＩ］：
【化４】
2008156255.tif 000005
で表される１−ｐ−クマロイルグリセロール
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の抗酸化剤は、水溶性がよく、かつ優れた抗酸化作用を発揮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の抗酸化剤は、１−シナポイルグリセロールまたは１−ｐ−クマロイルグリセロールを有効成分とすることを特徴とする。
【００１０】
本発明に係る抗酸化剤の有効成分は、１−シナポイルグリセロールまたは１−ｐ−クマロイルグリセロールである。１−シナポイルグリセロールまたは１−ｐ−クマロイルグリセロールは、十分な抗酸化作用を有し、安定性に優れ、取扱いが容易であることに加えて、水溶性であるため、飲食品等への利用が可能である。
【００１１】
本発明に係る１−シナポイルグリセロールまたは１−ｐ−クマロイルグリセロールは、適当な溶媒中に
【化５】
2008156255.tif 000006
で示されるシナピン酸または
【化６】
2008156255.tif 000007
で示されるｐ−クマリン酸とグリセリンとを加え、フェルラ酸エステラーゼの存在下に酵素反応させることによって製造することができる。
【００１２】
シナピン酸またはｐ−クマリン酸の濃度（添加濃度）は特に限定されないが、通常、０．０１〜５０ｗ／ｖ％が好ましく、０．１〜４０ｗ／ｖ％がより好ましい。一方、グリセリンの濃度（添加濃度）は、通常、２０ｗ／ｖ％以上が好ましく、４０ｗ／ｖ％以上がより好ましい。
【００１３】
酵素反応で用いる溶媒としては、水又は、有機溶媒又は、水と有機溶媒との混合溶液が使用される。有機溶媒としては、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、ヘキサン、アセトンまたはベンゼンなどのような芳香族有機溶媒が好ましく用いられる。有機溶媒の量は特に制限はないが、酵素と有機溶媒との適性により、適宜決定してよい。酵素量は特に限定されず、酵素の種類、精製度合い、力価などにより適宜選択すればよい。反応温度は、加温下で行うのが好ましく、通常、３０〜７５℃が好ましく、３５〜７０℃がより好ましい。反応時間は、通常、５分〜１５０時間であるのが好ましく、１０分〜１３０時間であるのがより好ましい。
【００１４】
フェルラ酸エステラーゼは、フェルラ酸と植物細胞膜に存在する糖との間のエステル結合を加水分解してフェルラ酸を遊離させる酵素である。フェルラ酸エステラーゼとしては、公知のフェルラ酸エステラーゼを使用できる。本発明で使用されるフェルラ酸エステラーゼの起源は特に限定されない。例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物（例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus  niger））、ペニシリウム（Penicillium）属に属する微生物（例えば、ペニシリニウム・クリソゲナム（Penicillium  chrysogenum））などに由来するフェルラ酸エステラーゼが使用できる。
【００１５】
例えば、アスペルギルス・ニガーに由来するフェルラ酸エステラーゼは、アスペルギルス・ニガーの培養により得られるペクチナーゼ剤（ペクチナーゼＰＬ「アマノ」の商品名で市販されている。）を限外ろ過、疎水クロマトグラフィー、遠心濃縮、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製することにより純品として得られる。もちろん、純品でなくても、部分精製のものでも差し支えない。精製に際しては、フェルラ酸とグリセロールとを基質としてグリセリルフェルラ酸の生成量を測定することにより酵素力価を求め、これを指標として活性画分を集めることができる。
【００１６】
かくして得られるフェルラ酸エステラーゼは、分子量が約３６０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）であり、プロテインシーケンサー解析により得られる該酵素のＮ−末端アミノ酸配列は次の通りである。
Ala-Ser-Thr-Gln-Gly-Ile-Ser-Glu-Asp-Leu    （配列番号１）
上記で得られたフェルラ酸エステラーゼのＮ−末端アミノ酸配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．１２，ｐ．４６３８−４６４４（１９９７）に記載されている公知のフェルラ酸エステラーゼのＮ−末端アミノ酸配列と同一である。
なお、本発明で使用されるフェルラ酸エステラーゼは遺伝子組み換え技術を用いて製造されたものでもよく、さらにはポリエチレングリコール等で界面活性化した修飾フェルラ酸エステラーゼや固定化されたフェルラ酸エステラーゼなどであってもよい。
【００１７】
酵素反応後、反応液中に生成した１−シナポイルグリセロールまたは１−ｐ−クマロイルグリセロールは、常法（たとえば、抽出、濃縮、遠心分離、シリカゲルクロマトグラフィー、イオン交換樹脂処理など）により、単離・精製することができる。
【００１８】
本発明に係る抗酸化剤は、抗酸化作用を有する前記１−シナポイルグリセロールまたは１−ｐ−クマロイルグリセロールを有効成分として含有していることから、油脂の酸化劣化、香料の劣化、色素の分解、色素の退色等の様々な製品の劣化（主に酸化劣化）を効果的に抑えるための劣化防止剤として飲食品（飲料品または食品）中に添加して利用され得る。
前記１−シナポイルグリセロールまたは１−ｐ−クマロイルグリセロールを飲食品に配合して使用する場合は、乳酸飲料、乳酸菌飲料、濃厚乳清飲料、果汁飲料、果肉飲料、機能性飲料、炭酸飲料等の清涼飲料水、緑茶、紅茶、コーヒー、ココア等の嗜好品及びこれらの飲料、発酵乳、加工乳、チーズ等の乳製品、豆乳、豆腐等の大豆加工食品、ジャム、果実のシロップ漬、フラワーペースト、ピーナツペースト、フルーツペースト等のペースト類、漬物類、ハム、ソーセージ、ベーコン、ドライソーセイジ、ビーフジャーキー等の畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん等の魚貝類製品、魚、貝等の干物、鰹、鯖、鰺等の各種節、ウニ、イカ等の塩辛、スルメ、魚等のみりん干、鮭等の燻製品、のり、小魚、貝、山菜、椎茸、昆布等の佃煮、カレー、シチュー等のレトルト食品、みそ、醤油、ソース、ケチャップ、マヨネーズ、ドレッシング、ブイヨン、焼肉のタレ、カレールー、シチューの素、スープの素、だしの素等の各種調味料、おかき、煎餅、おこし、饅頭、飴等の和菓子、クッキー、ビスケット、クラッカー、パイ、カステラ、ドーナッツ、プリン、スポンジケーキ、ワッフル、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、チョコレート、チョコレート菓子、キャラメル、キャンデー、チューインガム、ゼリー、ホットケーキ、パン、菓子パン等の各種洋菓子、ポテトチップ等のスナック菓子、アイスクリーム、アイスキャンデー、シャーベット等の氷菓、などに好ましく使用することができる。
また、化粧品に配合して使用する場合は、化粧水、サンオイル、サンケアクリーム、サンスクリーンローション、ヘアスプレー、リキッドファンデーション、アンチリンクルエッセンス、オーデコロン、アフターシェービングローションなどに好ましく使用することができる。
【００１９】
本発明の抗酸化剤の飲食品への配合量は、特に制限されないが、通常、有効成分である前記１−シナポイルグリセロールまたは１−ｐ−クマロイルグリセロールの量として、飲食品全量中０．０００１〜２０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１５重量％である。
また、本発明の抗酸化剤の化粧品への配合量は、特に制限されないが、通常、有効成分である前記１−シナポイルグリセロールまたは１−ｐ−クマロイルグリセロールの量として、化粧品全量中の０．０００１〜２０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１０重量％である。
【００２０】
また、本発明の抗酸化剤は、他の抗酸化剤などと併用して使用することができる。
【実施例】
【００２１】
以下に製造例、実験例および実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
［製造例１］
（１−シナポイルグリセロールまたは１−ｐ−クマロイルグリセロールの製造）
１．酵素の調製
ペクチナーゼ剤（商品名：ペクチナーゼＰＬ「アマノ」、天野エンザイム株式会社製）５００ｍｌを限外ろ過装置（分子量１万カット）にて脱塩したのち、硫安を３０％飽和濃度になるまで加え、４℃、３日間、わずかに撹拌しながら、放置した。その後、遠心分離し、沈殿と上清に分け、上清を回収した。
次に、この上清を、予め２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に硫安３０％飽和濃度になるようにして硫安を加えた緩衝液にて平衡化したＢｕｔｙｌ−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東洋曹達工業株式会社製）に流し、その後、平衡化した緩衝液と２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）のリニアーグラジエントによって（全量：６００ｍｌ）、タンパク質を溶出させ、活性画分を回収した。
【００２３】
その後の酵素の精製は、ＦＰＬＣシステム（ファルマシア社製）を用いた。
Ｂｕｔｙｌ−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ後の溶液（活性画分）に硫安３０％飽和濃度になるように硫安を加え、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＰＨＥ（アマシャムバイオサイエンス社製）６ｍｌに供した。タンパク質の溶出は硫安飽和濃度３０％〜０％のリニアーグラジエントにより行った。活性画分を回収した。
ついで、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用い、遠心分離機にて酵素液（活性画分）を遠心濃縮した。
濃縮した酵素液をゲルろ過カラムクロマトグラフィーであるＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、活性画分を回収した。
その後、活性画分をｍｏｎｏＱ（アマシャムバイオサイエンス社製）に吸着させ、ついで２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）と、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に塩化ナトリウムを０．３Ｍになるように溶解させた緩衝液とのリニアーグラジエントによってタンパク質の溶出を行った。活性画分を回収し、充分量の２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて透析した。
【００２４】
透析した酵素液を再度ｍｏｎｏＱに供し、ついで２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）と２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に塩化ナトリウムを０．３Ｍになるように溶解させた緩衝液とのリニアーグラジエントによってタンパク質の溶出を行った。活性画分を回収し、次のステップに進んだ。
酵素液に硫安を２０％飽和濃度になるように加え、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＰＨＥ（アマシャムバイオサイエンス社製）に供した。硫安飽和濃度２０％〜０％のリニアーグラジエントによってたんぱく質の溶出を行った。得られた酵素液を２０ｍＭ酢酸緩衝液にて充分透析することによって、精製酵素液（蛋白質量：０．４３ｍｇ／ｍｌ；全蛋白質：１０．４ｍｇ）を得た。
【００２５】
２．精製酵素の純度確認
Ｌａｅｍｍｌｉ法（Ｎａｔｕｒｅ  ２２７（１９７０）６８０−６８５）に従い、１０％のアクリルアミドを作成し、前項１で得た精製酵素およびタンパク質の分子量マーカーであるｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｄｄｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を同時に電気泳動した。その結果、単一のピークを認めた。また分子量マーカータンパク質との移動距離から、精製酵素の分子量は約３６０００であった。なお、プロテインシーケンサー解析により、本精製酵素のＮ−末端アミノ酸配列を調べたところ、次の通りであった。
Ala-Ser-Thr-Gln-Gly-Ile-Ser-Glu-Asp-Leu    （配列番号１）
【００２６】
３．酵素活性の測定
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）５０μｌに、グリセロール４３９μｌおよびフェルラ酸溶液（フェルラ酸を１ｗ／ｖ％濃度となるようにジメチルスルホキシドに溶解して調製）１０μｌを加え、これに精製酵素液（蛋白質量：０．４３ｍｇ／ｍｌ）１μｌを添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。その後、１００℃で５分間インキュベートすることにより酵素反応を停止させ、生成した１−グリセリルフェルラ酸をＨＰＬＣ［カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８ＧＰ２５０−４．６（５μｍ）（関東化学株式会社製）；展開溶媒：メタノール：０．２％酢酸溶液＝７．３］により定量した。
１Ｕは、基質に１％フェルラ酸を用いて、アクセプターに８０％グリセロールを用いた場合に、１分間に１μｍｏｌのグリセリルフェルラ酸を生成する酵素量とした。その結果、上記で調製された精製酵素液１μｌ当たり６ｍＵの活性を示した。
【００２７】
４．１  １−シナポイルグリセロールの製造
５０ｍｇのシナピン酸を５００μｌのジメチルスルホキシドに溶解し、グリセロール４ｍｌ、１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）２５０μｌ、上記で得た精製酵素５７ｍＵを加え、反応溶液が５ｍｌとなるように蒸留水を加え、５０℃で２４時間反応させた。
１００℃で１０分間インキュベートすることにより、酵素反応を停止させ、反応溶液に５ｍｌの蒸留水を加えた。次いで、この溶液を予め活性化させたセップパックバックカラム（製品名；Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｖａｃ  ３５ｃｃ、Ｗａｔｅｒｓ社製）に供し、目的の化合物を吸着させた。カラムの活性化方法は、セップパックバックカラムの説明書に準じて行った。目的の化合物が吸着したカラムを蒸留水にて洗浄後、アセトニトリルにて吸着物を溶出させ、そのアセトニトリル層を回収した。次いで、アセトニトリル層をエバポレーターにて濃縮し、コスモシールカラム（製品名；ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ｐａｃｋｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ  ｆｏｒ  ＨＰＬＣ  ５Ｃ１８−ＡＲ−２、サイズ；２０ｘ２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）を用いてＨＰＬＣにより、さらに精製を行った。
ＨＰＬＣに上記カラムをセットし、０．２％酢酸：メタノール＝５０：５０の溶媒で平衡化し、エバポレーターにて濃縮したアセトニトリル層をインジェクトした後、分離された化合物を確認しながら、分取した。その後、目的の化合物と思われる画分をエバポレーターにて、濃縮後、遠心乾固させ、クリーム色の粉末として、１−シナポイルグリセロールを３１．５ｍｇ得た。
【００２８】
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：
ｇｌｙｃｅｒｏｌ：４．０８（１Ｈ，ｄｄ，６．１，１１．５），４．１７（１Ｈ，ｄｄ，４．３，１１．５），３．７７（１Ｈ，ｍ），３．４９（１Ｈ，ｄｄ，５．６，１１．２），３．５３（１Ｈ，ｄｄ，５．４，１１．２）
ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ：６．３２（１Ｈ，ｄ，１５．８），７．５５（１Ｈ，ｄ，１５．８），６．８１（１Ｈ，ｓ），６．８１（１Ｈ，ｓ），３．７７（３Ｈ，ｓ），３．７７（３Ｈ，ｓ）
【００２９】
４．２  １−ｐ−クマロイルグリセロールの製造
５０ｍｇのｐ−クマリン酸を５００μｌのジメチルスルホキシドに溶解し、グリセロール４ｍｌ、１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）２５０μｌ、上記で得た精製酵素５７０ｍＵを加え、反応溶液が５ｍｌとなるように蒸留水を加え、５０℃で７２時間反応させた。反応後の精製は、１−シナポイルグリセロールと同様に行い、クリーム色の粉末として、１−ｐ−クマロイルグリセロールを１８．５ｍｇ得た。
【００３０】
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：
ｇｌｙｃｅｒｏｌ：４．０６（１Ｈ，ｄｄ，６．１，１１．５），４．１６（１Ｈ，ｄｄ，４．３，１１．５），３．８０（１Ｈ，ｍ），３．４９（１Ｈ，ｄｄ，５．４，１１．２），３．５３（１Ｈ，ｄｄ，５．４，１１．２）
ｐ−ｃｏｕｍｒｉｃ  ａｃｉｄ：６．２４（１Ｈ，ｄ，１５．９），７．５４（１Ｈ，ｄ，１５．９），６．７０（１Ｈ，ｄ，８．５），７．３５（１Ｈ，ｄ，８．５），７．３５（１Ｈ，ｄ，８．５），６．７０（１Ｈ，ｄ，８．５）
【００３１】
［実験例１］
（ＤＰＰＨラジカル消去活性測定）
１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）は５１７ｎｍに極大吸収を持つ紫色の安定ラジカルであり、水素を得ることにより無色のヒドラジンになる。この呈色反応を利用して以下の方法にてラジカル消去活性を測定し、ラジカル消去活性により抗酸化作用を測定した。
メタノールに５ｍＭになるように１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を溶解させ、ＤＰＰＨ溶液を作製した。作製したＤＰＰＨ溶液５０μｌに、試験化合物を溶解したメタノール溶液９５０μｌを加え、蒸留水１ｍｌを加え、遮光しながら、室温にて２０分間反応させ、吸光度計にて５２０ｎｍの減少量を測定した。ポジティブコントロールとして、抗酸化作用を有するブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を用いて同様に測定した。測定結果を表１に示す。なお、１ｍｍｏｌのＤＰＰＨラジカルを消去するのに必要な濃度をラジカル消去活性とし、各化合物の濃度は、３回実験を行った結果の平均値±標準誤差により計算した。
【００３２】
【表１】
2008156255.tif 000008
この結果、表１から明らかなように、１−シナポイルグリセロールは、ＢＨＴに比べて、抗酸化作用の指標となるラジカル消去活性が高いことが明らかとなった。
【００３３】
［実験例２］
（溶解度測定）
各サンプルを蒸留水に溶解させ、３０℃にて１５時間放置した後、各水溶液の濃度を測定した。測定結果を表２に示す。
【表２】
2008156255.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、飲食品、医薬品および化粧品などの産業分野で利用される。
【配列表】
2008156255000001.app