(57)【要約】【課題】本発明は、血清アミロイドＰコンポーネント、酸化ＬＤＬ及びβ２−グリコプロテインＩからなる複合体、その検知方法及びこれに用いるキット等を提供することを課題とする。【解決手段】血清アミロイドＰコンポーネント、酸化ＬＤＬ及びβ２−グリコプロテインＩの三者は複合体を形成し、この複合体を抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体および抗β２−グリコプロテインＩ抗体のいずれかを用いて検出することにより、高脂血症や動脈硬化などの疾患を判定することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清アミロイドＰコンポーネント、酸化ＬＤＬ及びβ２−グリコプロテインＩからなる複合体。
【請求項２】
請求項１に記載の複合体を含有している可能性がある試料に、抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体及び抗β２−グリコプロテインＩ抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、請求項１に記載の複合体の検知方法。
【請求項３】
請求項１に記載の複合体を含有している可能性がある試料に、抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体及び抗β２−グリコプロテインＩ抗体を接触させて、「抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体−請求項１に記載の複合体−抗β２−グリコプロテインＩ抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、請求項１に記載の複合体の検知方法。
【請求項４】
抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体及び抗β２−グリコプロテインＩ抗体のいずれか一方が固相に固着されているものである、請求項２又は３に記載の検知方法。
【請求項５】
以下の（１）〜（３）のステップを少なくとも含む、請求項４に記載の検知方法；
ステップ（１）：抗体Ａが固着された固相に、請求項１に記載の複合体を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体Ａ−請求項１に記載の複合体」で示される第１複合体を形成させるステップ、
ステップ（２）：ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｂを接触させ、「固相に固着された抗体Ａ−請求項１に記載の複合体−抗体Ｂ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及び
ステップ（３）：ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検知するステップ。
ただし、抗体Ａは抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体及び抗β２−グリコプロテインＩ抗体のいずれか一方の抗体を、抗体Ｂは他方の抗体をそれぞれ示す。
【請求項６】
請求項１に記載の複合体を含有している可能性がある試料が、生体に由来する試料である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の検知方法。
【請求項７】
生体に由来する試料が、体液である、請求項６に記載の検知方法。
【請求項８】
以下の（１）及び（２）のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法；
ステップ（１）：請求項６又は７のいずれか１項に記載の方法を用いて、体液中に存在する請求項１に記載の複合体を検知するステップ、及び
ステップ（２）：ステップ（１）における検知結果と、疾患とを関連づけるステップ。
【請求項９】
疾患が、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものである、請求項８に記載の検知方法。
【請求項１０】
抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体及び抗β２−グリコプロテインＩ抗体を構成成分として少なくとも含む、請求項１に記載の複合体の検知キット。
【請求項１１】
抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体及び抗β２−グリコプロテインＩ抗体のいずれか一方が固相に固着されているものである、請求項１０に記載の検知キット。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載のキットからなる、疾患の検知キット。
【請求項１３】
疾患が、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものである、請求項１２に記載の検知キット。
【請求項１４】
血清アミロイドＰコンポーネント及び酸化ＬＤＬからなる複合体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の複合体を含有している可能性がある試料に、抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体及び抗酸化ＬＤＬ抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、請求項１４に記載の複合体の検知方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の複合体を含有している可能性がある試料に、抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体及び抗酸化ＬＤＬ抗体を接触させて、「抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体−請求項１４に記載の複合体−抗酸化ＬＤＬ抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、請求項１４に記載の複合体の検知方法。
【請求項１７】
抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体及び抗酸化ＬＤＬ抗体のいずれか一方が固相に固着されているものである、請求項１５又は１６に記載の検知方法。
【請求項１８】
以下の（１）〜（３）のステップを少なくとも含む、請求項１７に記載の検知方法；
ステップ（１）：抗体Ｃが固着された固相に、請求項１４に記載の複合体を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体Ｃ−請求項１４に記載の複合体」で示される第１複合体を形成させるステップ、
ステップ（２）：ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｄを接触させ、「固相に固着された抗体Ｃ−請求項１４に記載の複合体−抗体Ｄ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及び
ステップ（３）：ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検知するステップ。
ただし、抗体Ｃは抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体及び抗酸化ＬＤＬ抗体のいずれか一方の抗体を、抗体Ｄは他方の抗体をそれぞれ示す。
【請求項１９】
請求項１４に記載の複合体を含有している可能性がある試料が、生体に由来する試料である、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の検知方法。
【請求項２０】
生体に由来する試料が、体液である、請求項１９に記載の検知方法。
【請求項２１】
以下の（１）及び（２）のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法；
ステップ（１）：請求項１９又は２０のいずれか１項に記載の方法を用いて、体液中に存在する請求項１４に記載の複合体を検知するステップ、及び
ステップ（２）：ステップ（１）における検知結果と、疾患とを関連づけるステップ。
【請求項２２】
疾患が、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものである、請求項２１に記載の検知方法。
【請求項２３】
抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体及び抗酸化ＬＤＬ抗体を構成成分として少なくとも含む、請求項１４に記載の複合体の検知キット。
【請求項２４】
抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体及び抗酸化ＬＤＬ抗体のいずれか一方が固相に固着されているものである、請求項２３に記載の検知キット。
【請求項２５】
請求項２３又は２４に記載のキットからなる、疾患の検知キット。
【請求項２６】
疾患が、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものである、請求項２５に記載の検知キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清アミロイドＰコンポーネント、酸化ＬＤＬ及びβ２−グリコプロテインＩからなる複合体、その検知方法及びこれに用いるキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類において使用する略号及びその意義は以下の通りである。
β2-GPI：β２−グリコプロテインＩ
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＲＰ：Ｃ−反応性タンパク質
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＨＲＰ：ホースラディッシュ（西洋ワサビ）のペルオキシダーゼ
ＬＤＬ：低密度リポタンパク質（酸化されていないネイティブなもの）
ＯＤ：吸光度
oxLDL：酸化ＬＤＬ
oxLDL/β2-GPI複合体：oxLDL及びβ2-GPIからなる複合体
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＳＡＰ：血清アミロイドＰコンポーネント（serum amyloid P component；ペントラキシンタンパク質の１つ）
SAP/oxLDL/β2-GPI複合体：SAP、oxLDL及びβ2-GPIからなる複合体
SAP/oxLDL複合体：SAP及びoxLDLからなる複合体
ＴＢＳ：トリス緩衝生理食塩水
【０００３】
SAPはマウスの炎症において誘導される急性期タンパク質の一種である（非特許文献１）。一方、oxLDLはβ2-GPIと複合体を形成し、ヒトにおいてこのoxLDLとβ2-GPIとの複合体はさらにCRPとの複合体を形成することが知られている（特許文献１）。
しかし、SAPが、oxLDL及びβ2-GPIと複合体を形成することは知られていない。ましてこの複合体が、疾患のマーカーにとして利用できることも知られていない。またSAPがoxLDLと複合体を形成することも知られておらず、この複合体が、疾患のマーカーにとして利用できることも知られていない。
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２７１５０２号公報
【非特許文献２】Carlanda C, Bottazzi B, Bastone A, and Mantovani A. Pentraxins at the crossroads between innate Immunity, inflammation, matrix deposition, and female fertility. Annu Rev Immunol 23: 337-66, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体、SAP/oxLDL複合体、これらの検知方法及びこれらに用いるキット等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、SAP、oxLDL及びβ2-GPIの三者の関係を調べた結果、驚くべきことにこれら三者が複合体を形成することを見出し、当該複合体を提供するに至り、本発明を完成した。さらに本発明者は、当該複合体の検知方法及びキット並びに当該複合体の検知を通じた疾患の検知方法及びキットを提供するに至り、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体（以下、「本発明複合体」という。）を提供する。
また本発明は、本発明複合体を含有している可能性がある試料に、抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、本発明複合体の検知方法（以下、「本発明複合体検知方法」という。）を提供する。本発明複合体検知方法の一例として、本発明複合体を含有している可能性がある試料に、抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体を接触させて、「抗ＳＡＰ抗体−本発明複合体−抗β２−ＧＰＩ抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、本発明複合体の検知方法を挙げることができる。本発明複合体検知方法における抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものであることが好ましい。
【０００８】
また本発明複合体検知方法の一例として、以下の（１）〜（３）のステップを少なくとも含む、本発明複合体の検知方法も挙げることができる；
ステップ（１）：抗体Ａが固着された固相に、本発明複合体を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体」で示される第１複合体を形成させるステップ、
ステップ（２）：ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｂを接触させ、「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体−抗体Ｂ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及び
ステップ（３）：ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検出するステップ。（ただし、抗体Ａは抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体のいずれか一方の抗体を、抗体Ｂは他方の抗体をそれぞれ示す。）。
以上にいう「本発明複合体を含有している可能性がある試料」は、生体に由来する試料であることが好ましい。またこの「生体に由来する試料」は、体液であることが好ましい。
【０００９】
また本発明は、以下の（１）及び（２）のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法（以下、「本発明疾患検知方法」という。）を提供する；
ステップ（１）：本発明複合体検知方法を用いて、体液中に存在する本発明複合体を検知するステップ、及び
ステップ（２）：ステップ（１）における検知結果と、疾患とを関連づけるステップ。
ここにいう「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好ましい。
【００１０】
また本発明は、抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体を構成成分として少なくとも含む、本発明複合体の検知キット（以下、「本発明複合体検知キット」という。）を提供する。この抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものが好ましい。
【００１１】
また本発明は、本発明複合体検知キットからなる、疾患の検知キット（以下、「本発明疾患検知キット」という。）を提供する。この「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好ましい。
同時に本発明者は、SAP及びoxLDLが複合体を形成することを見出し、当該複合体を提供するに至り、本発明を完成した。さらに本発明者は、当該複合体の検知方法及びキット並びに当該複合体の検知を通じた疾患の検知方法及びキットを提供するに至り、本発明を完成した。
すなわち本発明は、SAP/oxLDL複合体（以下、「本発明複合体２」という。）をさらに提供する。
【００１２】
また本発明は、本発明複合体２を含有している可能性がある試料に、抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、本発明複合体２の検知方法（以下、「本発明複合体検知方法２」という。）を提供する。本発明複合体検知方法２の一例として、本発明複合体２を含有している可能性がある試料に、抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体を接触させて、「抗ＳＡＰ抗体−本発明複合体２−抗ｏｘＬＤＬ抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、本発明複合体２の検知方法を挙げることができる。本発明複合体検知方法２における抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものであることが好ましい。
【００１３】
また本発明複合体検知方法２の一例として、以下の（１）〜（３）のステップを少なくとも含む、本発明複合体２の検知方法も挙げることができる；
ステップ（１）：抗体Ｃが固着された固相に、本発明複合体２を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体Ｃ−本発明複合体２」で示される第１複合体を形成させるステップ、
ステップ（２）：ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｄを接触させ、「固相に固着された抗体Ｃ−本発明複合体２−抗体Ｄ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及び
ステップ（３）：ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検出するステップ。（ただし、抗体Ｃは抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体のいずれか一方の抗体を、抗体Ｄは他方の抗体をそれぞれ示す。）。
以上にいう「本発明複合体２を含有している可能性がある試料」は、生体に由来する試料であることが好ましい。またこの「生体に由来する試料」は、体液であることが好ましい。
【００１４】
また本発明は、以下の（１）及び（２）のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法（以下、「本発明疾患検知方法２」という。）を提供する；
ステップ（１）：本発明複合体検知方法２を用いて、体液中に存在する本発明複合体２を検知するステップ、及び
ステップ（２）：ステップ（１）における検知結果と、疾患とを関連づけるステップ。
ここにいう「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好ましい。
【００１５】
また本発明は、抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体を構成成分として少なくとも含む、本発明複合体２の検知キット（以下、「本発明複合体検知キット２」という。）を提供する。この抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものが好ましい。
【００１６】
また本発明は、本発明複合体検知キット２からなる、疾患の検知キット（以下、「本発明疾患検知キット２」という。）を提供する。この「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明複合体は、例えば本発明複合体検知方法、本発明疾患検知方法、本発明複合体検知キット及び本発明疾患検知キットのスタンダード等として利用することができ、極めて有用である。また本発明複合体検知方法によれば、試料中に存在する本発明複合体を簡便、迅速、容易、高感度、高精度かつ安価に検知することができ、これに基づいて本発明複合体検知キットが提供されることから極めて有用である。本発明疾患検知方法は、体液中のSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の検知を通じて、高脂血症や動脈硬化などの疾患を簡便、迅速、容易、高感度、高精度かつ安価に検知することができ、さらにこれに基づいて本発明疾患検知キットが提供されることから極めて有用である。また本発明複合体検知キットや本発明疾患検知キットは、これを用いることによって本発明複合体検知方法や本発明疾患検知方法をさらに簡便、迅速、かつ容易に実施することができ、極めて有用である。そしてこれらの本発明は、疾患（例えば高脂血症や動脈硬化など）のモデル動物を用いてその疾患に対する医薬の候補物質を探索したり、その物質の有効性を評価するような医薬開発の場面においても利用することができる。
【００１８】
また本発明複合体２、本発明複合体検知方法２、本発明疾患検知方法２、本発明複合体検知キット２及び本発明疾患検知キット２についても、上記の本発明複合体、本発明複合体検知方法、本発明疾患検知方法、本発明複合体検知キット及び本発明疾患検知キットと同様に極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞本発明複合体
本発明複合体は、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体である。本発明複合体は、SAP、oxLDL及びβ2-GPIの三者により構成されることを特徴とする。
本発明複合体は、SAP、oxLDL及びβ2-GPIの三者を生理的条件下で接触させることにより製造することができる。SAP、oxLDL及びβ2-GPIは、それぞれ公知の方法で製造することができる。また市販のものを用いることもできる。
ここにいう「生理的条件」も、マウス生体内（特に血液）における塩濃度、ｐＨ、温度等と同等の条件である限りにおいて特に限定されないが、例えば、緩衝作用を有する生理的塩類溶液中、ｐＨ６〜８（好ましくはｐＨ６．５〜７．５）、温度３５℃〜４０℃（好ましくは３６℃〜３８℃）の条件が例示される。
また、本出願書類における「接触」の方法は、接触対象となる分子同士が互いに接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。
【００２０】
また、SAP、oxLDL及びβ2-GPIを接触させる順序も特に限定されない。例えば、これら三者を同時に接触させてもよく、いずれか二者をまず接触させた後これに残りの一者を接触させてもよい。例えば、まずoxLDLとβ2-GPIを接触させ、次いでこれにSAPを接触させる方法が例示される。
接触させる際における各分子の量比も特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。例えば、まずoxLDLとβ2-GPIを接触させ、次いでこれにSAPを接触させる方法を採用する場合には、oxLDLとβ2-GPIの質量比として、oxLDL：β2-GPI＝１：５〜５：１（好ましくは１：４〜４：１、より好ましくは１：３〜３：１、より好ましくは１：２〜２：１）を例示することができる。次いでSAPを接触させる際には、oxLDL/β2-GPI複合体とSAPの質量比として、oxLDL/β2-GPI複合体：SAP＝20：１〜１：10（好ましくは15：１〜１：５、より好ましくは12：１〜１：２）を例示することができる。この場合において、SAPは、終濃度0.1mM〜10mM程度（好ましくは0.5mM〜5mM程度）のカルシウムイオン存在下で接触させることが好ましい。
【００２１】
また、これらの接触時間も特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。一般に、反応は時間依存的で接触時間が長いほど十分に複合体が形成されることから、例えば１０時間〜４８時間（好ましくは１２時間〜２４時間）程度を例示することができる。本発明複合体のより具体的な製造方法の一例は、後述の実施例を参照されたい。
【００２２】
また本発明複合体は、高脂肪食を摂取させた（高脂肪食を負荷した）高脂血症モデルマウスの血液から精製することによっても製造することができる。具体的には、高脂血症モデルマウス（例えば、後述のLDLR-/-マウスや、apoE-/-マウスなど）に高脂肪食を摂取させ、その後採血して、その血液中から本発明複合体を精製することによって製造することができる。
ここにいう「精製」は、いわゆる完全精製のみならず、部分精製を含む概念である。精製の方法も特に限定されないが、例えば、抗SAP抗体又は抗β2-GPI抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー等の手法を採用することができる。これに用いる抗SAP抗体又は抗β2-GPI抗体は、いずれも公知のものを用いることができる。もちろん、市販のものを用いてもよい。例えば、後述の実施例に示す通り、抗SAP抗体は市販されており、これを用いることができる。また抗β2-GPI抗体は、例えば「WB-CAL-1」（J. Immunol., 149, p1063-1068(1992)）を用いることができる。
【００２３】
本発明複合体は、例えば、本発明複合体検知方法、本発明疾患検知方法、本発明複合体検知キット及び本発明疾患検知キット等のスタンダードとして使用することができる。例えば本発明複合体を用いて、これらの検知方法又は検知キットによる本発明複合体の検知の品質をチェックすることができる。また例えば、既知濃度の本発明複合体とELISAによるその検知結果との関係について検量線や関係式を作成すれば、試料中に含まれる未知濃度の本発明複合体を定量することもできる。もちろん、本発明複合体を、本発明の各キットの構成成分として用いることもできる。
【００２４】
＜２＞本発明複合体検知方法
本発明複合体検知方法は、本発明複合体を含有している可能性がある試料に、抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、本発明複合体の検知方法である。
ここで、「本発明複合体を含有している可能性がある試料」とは、本発明複合体の検知が意図されている試料を意味する。このような意図がある限りにおいて、現実にその試料に本発明複合体が含有されているか否かは関係ない。
また「試料」の種類も特に限定されず、人工的に製造された試料であっても、天然物に由来する試料であってもよい。例えば、人工的に製造した本発明複合体の水溶液や、生体に由来する試料等は、当然にここにいう「試料」に包含される。なかでも、生体に由来する試料が好ましく、生体に由来する液体（体液）が好ましい。体液の種類も特に限定されないが、例えば、血液を例示することができる。ここにいう「血液」は、血清や血漿等を包含する概念である。
本発明複合体検知方法は、このような試料に、抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含むことを特徴とする。
【００２５】
したがって、このような試料に抗SAP抗体のみを接触させてもよく、抗β2-GPI抗体のみを接触させてもよく、両者を接触させてもよい。また、両者を接触させる場合、両者を同時に接触させてもよく、まず一方を接触させた後に他方を接触させても良いことは、前記と同様である。両者を接触させる方法を採用すれば、試料中にSAP、β2-GPI、oxLDL/β2-GPI複合体等の夾雑物が存在していても、本発明複合体のみを特異的に検知することができる。ここで用いる抗SAP抗体や抗β2-GPI抗体は、それぞれSAPやβ2-GPIに結合する抗体である限りにおいて特に限定されないが、検知精度を高めるためには、これらの抗原に特異的に結合するものであることが好ましい。なお、これらの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、大量生産や均質性を考慮した場合には、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２６】
これらの抗体は、これらの抗原を用いて、抗体の通常の作製方法に従って作製することができる。また、市販されているものをそのまま用いても良い。例えば、抗SAP抗体は市販のものをそのまま用いることができる。また、抗β2-GPI抗体として具体的には、WB-CAL-1（J. Immunol., 149, p1063-1068(1992)）、Cof-22及びCof-23（Blood, 87, p3262-3270(1996)）、EY2C9（Arthritis Rheum., 37, p1453-1461(1994)）等が例示される。
また「接触」の条件は、これらの抗体と本発明複合体とが抗原抗体反応する条件である限りにおいて特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。
本発明複合体検知方法は、このようなステップを含む限りにおいて、他のステップをさらに含んでいてもよい。例えば、試料を調製するステップや、洗浄するステップ、本発明複合体を検出するための反応を行うステップ、検量線や関係式を作成するステップ、本発明複合体の検知結果を解析するステップ等をさらに含んでいてもよい。
【００２７】
なお、本出願書類において「検知」とは、定性的な検知（存否や有無の検知）及び定量的な検知（存在量や程度の検知）の両方を含む概念である。したがって、例えば本発明複合体の量（濃度）等を測定することもここにいう「検知」の語に包含される。
【００２８】
また本発明複合体検知方法は、前記のステップを含む限りにおいて、その具体的な方法も限定されない。具体的な方法の一例としては、例えば抗体を用いた免疫学的な測定手法（ＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法、競合法、阻害法等）、イムノブロッティング、凝集法等）が例示される。
本発明複合体検知方法の一例として、本発明複合体を含有している可能性がある試料に、抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体を接触させて、「抗SAP抗体−本発明複合体−抗β2-GPI抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、本発明複合体の検知方法を挙げることができる。本発明複合体検知方法における抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものであることが好ましい。
【００２９】
また本発明複合体検知方法の一例として、以下の（１）〜（３）のステップを少なくとも含む、本発明複合体の検知方法も挙げることができる；
ステップ（１）：抗体Ａが固着された固相に、本発明複合体を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体」で示される第１複合体を形成させるステップ、
ステップ（２）：ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｂを接触させ、「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体−抗体Ｂ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及び
ステップ（３）：ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検知するステップ。
（ただし、抗体Ａは抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体のいずれか一方の抗体を、抗体Ｂは他方の抗体をそれぞれ示す。）。
以下、ステップごとに説明する。
ステップ（１）は、抗体Ａが固着された固相に、本発明複合体を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体」で示される第１複合体を形成させるステップである。
ここにいう「抗体Ａが固着された固相」は、抗体Ａを固相に固着させることにより製造することができる。
【００３０】
この抗体Ａを固着するために用いる固相は、抗体Ａを固着させることができ、かつ、水、体液、測定反応液等に不溶性である限りにおいて特に限定されない。固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウェル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等を例示することができる。固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
これらの固相に抗体Ａを固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法等、タンパク質や脂質の一般的な固着方法を利用することができる。これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。物理的吸着法として具体的には、例えば、抗体Ａを緩衝液等に溶解し、この溶液を固相（例えばマイクロプレート）に接触させることによって、抗体Ａを固相に吸着させる方法を挙げることができる。
【００３１】
また、抗体Ａを固着させた固相の表面には、これらが固着していない表面部分が残存している場合があり、そこに試料中の本発明複合体や夾雑分子などが固着すると検知の結果に影響を及ぼすおそれがある。よって、試料を固相と接触させる前にブロッキング物質を添加して抗体Ａが固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、その他ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。
【００３２】
このようにして得られる「抗体Ａが固着された固相」に、本発明複合体を含有している可能性がある試料を接触させることにより、「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体」で示される第１複合体が形成される。ここにいう「接触」は、試料中の本発明複合体分子と、固相に固着された抗体Ａ分子が互いに接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。「接触」の条件も、前記と同様に、抗体Ａと本発明複合体とが抗原抗体反応する条件である限りにおいて特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。
ステップ（２）は、ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｂを接触させ、「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体−抗体Ｂ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップである。
ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｂを接触させることにより、「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体−抗体Ｂ」で示されるサンドイッチ状複合体が形成される。
ここにいう「接触」も、抗体Ｂ分子と、第１複合体分子（固相に固着されている）が互いに接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。「接触」の条件も、前記と同様に、抗体Ｂと第１複合体分子（固相に固着されている）とが抗原抗体反応する条件である限りにおいて特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。
【００３３】
なお、抗体Ａは抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体のいずれか一方の抗体を、抗体Ｂは他方の抗体をそれぞれ意味する。したがって、抗体Ａとして抗SAP抗体を採用した場合には、抗体Ｂは抗β2-GPI抗体である。逆に、抗体Ａとして抗β2-GPI抗体を採用した場合には、抗体Ｂは抗SAP抗体である。
ステップ（３）は、ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検知するステップである。
この「ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体の検知」の方法も、「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体−抗体Ｂ」からなるサンドイッチ状複合体を検知しうる限りにおいて特に限定されないが、当該サンドイッチ状複合体の開放端（固相に直接固着されていない側）に存在する「抗体Ｂ」を検知することによって行うことが好ましい。
そのために、ステップ２において接触させる「抗体Ｂ」自体を標識物質で標識しておいてもよい。また「抗体Ｂ」として標識されていないものを用いる場合には、「『抗体Ｂ』に結合する物質」であって標識物質で標識されたものを用いてもよい。「『抗体Ｂ』に結合する物質」としては、例えば「抗体Ｂ」（免疫グロブリン）が由来する動物又はクラス等に応じた、その免疫グロブリンに特異的に結合する抗体等が例示される。例えば「抗体Ｂ」がヒツジ由来のIgGである場合には、「『抗体Ｂ』に結合する物質」として抗ヒツジIgG抗体を用いることができる。
【００３４】
この標識物質を検出することによって、ステップ２で形成された「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体−抗体Ｂ」からなるサンドイッチ状複合体中に存在する「抗体Ｂ」を検知することができる。すなわち、当該サンドイッチ状複合体が検知されることとなる。
このような標識に使用される標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）など）、化学発光物質（ルミノールなど）、ビオチン、アビジン（ストレプトアビジンを含む）等が挙げられるが、通常タンパク質の標識に可能なものであれば、特に限定されない。標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等〔「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、１９８７年発行参照〕等から適宜選択することができる。例えば標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのヒドラジド誘導体を用いる方法（Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, 57-63, PIERCE CHEMICAL COMPANY, 1994年発行参照）、またフルオレセインイソチオシアネートを使用する場合は特公昭６３−１７８４３号公報記載の方法等から適宜選択できる。
【００３５】
標識物質の検出は、用いた標識物質に応じて当業者が適宜検出方法を選択することができる。例えば、標識物質としてペルオキシダーゼを使用した場合には、当該酵素の基質としてテトラメチルベンジジン、o-フェニレンジアミン等の発色基質および過酸化水素水を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定することにより検出を行うことができる。また、蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。
【００３６】
＜３＞本発明疾患検知方法
本発明疾患検知方法は、以下の（１）及び（２）のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法である。
ステップ（１）：本発明複合体検知方法を用いて、体液中に存在する本発明複合体を検知するステップ、及び
ステップ（２）：ステップ（１）における検知結果と、疾患とを関連づけるステップ。
以下、ステップごとに説明する。
ステップ（１）：本発明複合体検知方法を用いて、体液中に存在する本発明複合体を検知するステップである。
本発明疾患検知方法は、本発明複合体検知方法を疾患の検知方法に応用したものである。ステップ（１）における「本発明複合体検知方法」については、前記の「＜２＞本発明複合体検知方法」を参照されたい。ただし、ここでは「本発明複合体を含有している可能性がある試料」として「体液」を用いることとなる。ここで用いる「体液」は、疾患の検知対象となる動物由来のものである限りにおいて特に限定されない。疾患の検知対象となる動物も特に限定されないが、ヒト以外の動物、例えばマウス、ラット、家兎等を例示することができる。
また「体液」の種類については、含有される本発明複合体の量が疾患によって変動する体液である限りにおいて特に限定されないが、血液（血清や血漿を包含する概念である。）であることが好ましい。
【００３７】
ステップ（２）は、ステップ（１）における検知結果と、疾患とを関連づけるステップである。これにより、疾患の検知を行うことができる。
前記の通り、本出願書類における「検知」の語は、定性的な検知のみならず、定量的な検知をも含む概念である。したがって、ここにいう「ステップ（１）における検知結果」は、体液中の本発明複合体の「存否や有無」（定性的な検知結果）であっても、「存在量や程度」（定量的な検知結果）であってもよい。また「存在量」や「程度」については、濃度既知のスタンダードを用いて作成した検量線や関係式等から求めた量（実測値）であっても良く、健常動物（疾患に罹患していない動物）に対する比（相対値）であっても良い。
そして、体液中における本発明複合体の量は疾患によって増加しうる。この場合において、体液中の当該複合体量が健常動物のそれに比して多い場合には、「疾患に罹患している」もしくは「疾患に罹患している可能性が高い」と関連づけることができる。体液中の当該複合体量が健常動物のそれと同等であれば、「疾患に罹患していない」もしくは「疾患に罹患している可能性は低い」と関連づけることができる。
【００３８】
また本発明疾患検知方法は、疾患への罹患の有無のみでなく、罹患の程度の検知も含まれる。例えば、ある動物の体液中の当該複合体量を定期的に測定し、当該複合体量が増加傾向にある場合には「疾患が進行している」もしくは「疾患が進行している可能性が高い」と関連づけることができる。逆に、測定された当該複合体量が減少傾向にある場合には、「疾患が改善方向にある」もしくは「疾患が改善方向にある可能性が高い」と関連づけることができる。また測定された当該複合体量に変化がない場合には、「疾患の程度（または健常性）に変化がない」もしくは「疾患の程度（または健常性）に変化がない可能性が高い」と関連づけることができる。したがって、本発明疾患検知方法は、医薬品の候補物質の探索やその物質の有効性評価等の用途にも使用しうる。
【００３９】
本発明疾患検知方法によって検知される「疾患」は、疾患により体液中の本発明複合体の量が変動する性質のものである限りにおいて特に限定されないが、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好ましい。
以上のように、本発明複合体検知方法を用いて体液中に存在する本発明複合体を検知し、その検知結果と疾患とを関連づけることによって、疾患を検知することができる。
【００４０】
＜４＞本発明複合体検知キット
本発明複合体検知キットは、抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体を構成成分として少なくとも含む、本発明複合体の検知キットである。
ここで用いることができる抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体は、前記の「＜２＞本発明複合体検知方法」と同様である。この抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものが好ましい。ここで用いることができる固相及び抗体の固着の方法は、前記の「＜２＞本発明複合体検知方法」と同様である。
本発明複合体検知キットは、抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体を構成成分として含んでいる限りにおいて、さらに他の構成成分を含んでいてもよい。
本発明複合体検知キットに加えうる他の構成成分としては、標識物質の検出試薬、「抗SAP抗体又は抗β2-GPI抗体に結合し、かつ標識物質で標識された抗体（二次抗体）」等を例示することができる。これらの構成成分の他に、ブロッキング物質、洗浄液、試料希釈液、酵素反応停止液等を含んでいてもよい。
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明複合体検知方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。本発明複合体検知キットを用いた本発明複合体の検知は、本発明複合体検知方法に従って行うことができる。なかでも、サンドイッチ状複合体を形成させてこれを検知する方法（いわゆるサンドイッチ法；前記の「＜２＞本発明複合体検知方法」参照）において用いられることが好ましい。
【００４１】
＜５＞本発明疾患検知キット
本発明疾患検知キットは、本発明複合体検知キットからなる、疾患の検知キットである。本発明複合体検知キットについては、前記を参照されたい。
ここにいう「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好ましい。本発明疾患検知キットを用いた疾患の検知は、本発明疾患検知方法に従って行うことができる。
【００４２】
＜６＞本発明複合体２
本発明複合体２は、SAP/oxLDL複合体である。本発明複合体２は、SAP及びoxLDLの二者により構成されることを特徴とする。
本発明複合体２は、SAP及びoxLDLの両者を生理的条件下で接触させることにより製造することができる。SAP及びoxLDLは、それぞれ公知の方法で製造することができる。また市販のものを用いることもできる。
ここにいう「生理的条件」については、前記＜１＞と同様である。
また両者を接触させる際における各分子の量比も特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。例えば、oxLDLとSAPの質量比として、oxLDL：SAP＝20：１〜１：10（好ましくは15：１〜１：５、より好ましくは12：１〜１：２）を例示することができる。この場合において、SAPは、終濃度0.1mM〜10mM程度（好ましくは0.5mM〜5mM程度）のカルシウムイオン存在下で接触させることが好ましい。
これらの接触時間、その他の点については前記＜１＞と同様である。
本発明複合体２は、例えば、本発明複合体検知方法２、本発明疾患検知方法２、本発明複合体検知キット２及び本発明疾患検知キット２等のスタンダードとして使用することができる。例えば本発明複合体２を用いて、これらの検知方法又は検知キットによる本発明複合体２の検知の品質をチェックすることができる。また例えば、既知濃度の本発明複合体２とELISAによるその検知結果との関係について検量線や関係式を作成すれば、試料中に含まれる未知濃度の本発明複合体２を定量することもできる。もちろん、本発明複合体２を、本発明の各キットの構成成分として用いることもできる。
【００４３】
＜７＞本発明複合体検知方法２
本発明複合体検知方法２は、本発明複合体２を含有している可能性がある試料に、抗SAP抗体及び抗oxLDL抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、本発明複合体２の検知方法である。
「本発明複合体２を含有している可能性がある試料」、「試料」等についての説明は、前記＜２＞と同様である。
本発明複合体検知方法２は、このような試料に、抗SAP抗体及び抗oxLDL抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含むことを特徴とする。
なお、抗oxLDL抗体は、oxLDLに結合する抗体である限りにおいて特に限定されない。oxLDLを抗原として、抗体の通常の作製方法に従ってモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を作製することができる。なかでも、マウスモノクローナル抗ｏｘＬＤＬ抗体を用いることが好ましい。
他の説明は、前記＜２＞と同様である。
【００４４】
本発明複合体検知方法２の一例として、本発明複合体２を含有している可能性がある試料に、抗SAP抗体及び抗oxLDL抗体を接触させて、「抗SAP抗体−本発明複合体２−抗oxLDL抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、本発明複合体２の検知方法を挙げることができる。本発明複合体検知方法２における抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものであることが好ましい。
【００４５】
また本発明複合体検知方法２の一例として、以下の（１）〜（３）のステップを少なくとも含む、本発明複合体２の検知方法も挙げることができる；
ステップ（１）：抗体Ｃが固着された固相に、本発明複合体２を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体Ｃ−本発明複合体２」で示される第１複合体を形成させるステップ、
ステップ（２）：ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｄを接触させ、「固相に固着された抗体Ｃ−本発明複合体２−抗体Ｄ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及び
ステップ（３）：ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検知するステップ。
（ただし、抗体Ｃは抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体のいずれか一方の抗体を、抗体Ｄは他方の抗体をそれぞれ示す。）。
これらの説明は、前記＜２＞と同様である。前記＜２＞における「抗体Ａ」及び「抗体Ｂ」を、それぞれ「抗体Ｃ」及び「抗体Ｄ」と読み替えて理解されたい。また前記＜２＞における「抗β2-GPI抗体」は「抗oxLDL抗体」と読み替えて理解されたい。
【００４６】
＜８＞本発明疾患検知方法２
本発明疾患検知方法２は、以下の（１）及び（２）のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法である。
ステップ（１）：本発明複合体検知方法２を用いて、体液中に存在する本発明複合体２を検知するステップ、及び
ステップ（２）：ステップ（１）における検知結果と、疾患とを関連づけるステップ。
本発明疾患検知方法２についての説明は、前記＜３＞と同様である。
【００４７】
＜９＞本発明複合体検知キット２
本発明複合体検知キット２は、抗SAP抗体及び抗oxLDL抗体を構成成分として少なくとも含む、本発明複合体２の検知キットである。
本発明複合体検知キット２についての説明は、前記＜４＞と同様である。なお前記＜４＞における「抗β2-GPI抗体」は「抗oxLDL抗体」と読み替えて理解されたい。
【００４８】
＜１０＞本発明疾患検知キット２
本発明疾患検知キット２は、本発明複合体検知キット２からなる、疾患の検知キットである。本発明複合体検知キット２については、前記を参照されたい。
ここにいう「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好ましい。本発明疾患検知キット２を用いた疾患の検知は、本発明疾患検知方法２に従って行うことができる。
【００４９】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
【実施例１】
【００５０】
SAP/oxLDL/β2-GPI複合体の調製と測定系の確立
＜材料及び方法＞
（１）高脂血症モデルマウス（LDLR-/-、apoE-/-）
本実施例では、動脈硬化好発・高脂血症モデルマウスとして、LDLR-/- マウス及びapoE-/- マウス（C57BL/6マウス バックグラウンド；米国Jackson社より購入）を用いた。これらはそれぞれ、LDL代謝に関わる受容体（LDLR）やリガンド（apoE）を欠損させたマウスである。マウスの血中にはLDLがほとんど存在しないため、本来動脈硬化と無縁の動物であるが、これらの高脂血症モデルマウスは、LDLの前駆体であるカイロミクロンレムナントやIDL（intermediate (low)-density lipoprotein）が肝臓や組織に取り込まれなくなり、LDLを血中に滞留させることが可能となる。よって、これらのLDLR-/- マウス及びapoE-/- マウスに高脂肪食を負荷し、血中コレステロールを上昇させることによって、高脂血症および動脈硬化を容易に発症させることができる（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98, p7946-51（2001）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, p4431-5（1994））。
【００５１】
（２）マウスおよびヒトoxLDLの調製
高脂肪食（オリエンタル酵母（株））を２週間負荷したLDLR-/- 又は apoE-/-高脂血症モデルマウス血漿、あるいはヒト新鮮血漿に終濃度0.25 mM となるように200 mM EDTAを添加し、EDTA含有血漿とした。３ml用の超遠心管（3.5 PC, Beckman, fullerton, CA）にそのEDTA含有血漿750μlを添加し、PBS（0.25 mM EDTA含有）250μlを重層し、100,000 rpm、10℃で７分間遠心分離を行った（TL-100ローター；TLA100.3, Beckman）。その後、上清250μlを除去し、PBS（0.25 mM EDTA含有）を250μl重層して、さらに同条件で2.5時間遠心を行った。その後、上清250μlを除去し、KBrを含有するPBS 150μlを添加して混和した。その後、同条件で５時間遠心分離し、上清200μlを回収してLDL画分とした。得られたLDL画分を、PBS（1mM EDTA含有）に対して一晩透析した後、酸化させた。
【００５２】
LDLの酸化は、終濃度100μg/mlのLDLを、５μM 硫酸銅の存在下で37℃でインキュベーションすることにより行った。インキュベーションを開始して12時間後に、EDTAを終濃度1mMとなるように添加して、酸化反応を停止させた。酸化後の画分を、PBS（1mM EDTA含有）に対して透析し、その後濃縮して、thiobarbituric acid reactive substance（TBARS）で酸化度を確認した（J. Lipid Res., 28, p495-509（1987））。
【００５３】
（３）抗体（抗β2-GPI抗体）
抗β2-GPI抗体として、「WB-CAL-1」（IgG2a,κ）を用いた。この抗体はβ2-GPI反応性のモノクローナル自己抗体である。抗リン脂質抗体症候群モデルマウス（NZW x BXSBマウス）由来の抗体であり、遊離のβ2-GPIには反応せず、oxLDLと複合体を形成したβ2-GPIに反応性を示す抗体である。本抗体は複合体型のヒトおよびマウスβ2-GPIを認識する（Immunol., 149, p1063-1068(1992)）。
【００５４】
（４）ELISA（マウスおよびヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体のアッセイ方法）
まず、Immulon 2HB プレート（Thermo Labsystems）に、８μg/mlのWB-CAL-1を50μl/ウェルで添加し、４℃で一晩インキュベートすることによってWB-CAL-1をプレートに固相化した。固相化後、0.05% Tween20を含有するTBS（1.25mM Ca2＋含有）を200μl/ウェル添加し、プレートを洗浄した。洗浄は３回行った。
次いで、0.5% BSAを含有するTBS（1.25 mM Ca2＋含有）でプレートをブロッキングした。プレートを上記と同様に洗浄後、適当な倍率に希釈したサンプルを各ウェルに添加して、27℃で一晩インキュベートした。その後、上記と同様に洗浄した。
【００５５】
次いで、10000倍に希釈したヒツジ抗マウスSAP抗体(あるいは家兎抗ヒトSAP抗体)溶液を100μl/ウェル添加して、室温で１時間インキュベートした。その後、上記と同様に洗浄した。
次いで、4000倍に希釈したHRP標識抗ヒツジIgG抗体（あるいは抗家兎IgG抗体）溶液を100μl/ウェル添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、同様に洗浄した。
次いで、o-PD試薬溶液（o-phenylenediamine dihydrochloride ４mg/10ml 0.1 M クエン酸緩衝液（pH5.0）及び10μl 30％ H2O2）を各ウェルに100μlずつ添加し、室温で20分間インキュベートした。その後、１Ｍ H2SO4  を100μl/ウェル添加して反応を停止させ、490nmで吸光度を測定した。
【００５６】
（５）マウスおよびヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の調製と、当該複合体の標準曲線作成
まず、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体の標準品を調製した。調製は次の通り行った。まずＰＢＳ中でマウスあるいはヒト由来のoxLDLとβ2-GPIを質量比１：１となるように混合し、37℃で一晩インキュベートした。その後、その複合体溶液に終濃度1mMとなるようにカルシウムイオンを添加し、これにマウスあるいはヒト由来のSAPを、oxLDL/β2-GPI複合体：SAPの質量比10：１となるように混合し、37℃で一晩インキュベートした。なお、複合体の最終濃度は、oxLDLとして0.1 mg/mlとなるように調製した。
これにより得られたマウスあるいはヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を段階的に希釈して、前記のELISAにより490nmの吸光度を測定した。対照として、oxLDL/β2-GPI複合体及びSAPを同様に段階的に希釈して、上記複合体と同時に測定した。マウスあるいはヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の濃度とその測定結果との関係について、標準曲線を作成した。
【００５７】
（６）マウスSAP/oxLDL/β2-GPI複合体形成の経時変化
マウスoxLDL/β2-GPI複合体（質量比４：１で混合し、37℃で一晩インキュベートしたもの）に、SAPをカルシウムイオン存在下で混合（oxLDL/β2-GPI複合体：SAPの質量比＝20：１）し、37℃で反応を開始させた。反応開始後、１時間目、２時間目、４時間目及び８時間目にサンプルを一定量ずつ採取し、−80℃で凍結保存することによって反応を停止させた。残りのサンプルはそのまま反応を続行し、反応開始後24時間目に反応を停止させた。
マウスSAP/oxLDL/β2-GPI複合体形成の経時変化を調べるために、このサンプルをELISA及び電気泳動で確認した。ELISAの方法は前記の通りである。
また電気泳動は、サンプルをアガロースゲルフィルム（ヘレナ研究所）に6〜7μgスポットし、0.05 M バルビタール緩衝液（pH8.6）中で90Ｖ、40分間で泳動を行った。染色は脂質染色とタンパク質染色の二通り行った。脂質染色にはFat Red 7B（Sigma-Aldrich）を、タンパク質染色にはAmido Black 10B（ナカライテスク）を用いた。
【００５８】
（７）高脂肪食負荷マウス血清中からの複合体検出
LDLR-/-高脂血症モデルマウス27匹に高脂肪食を２週間与え、その後全採血した。採取した血液をヘパリンを添加したチューブに回収し、10,000rpm、４℃で10分間の遠心分離することにより血漿を分離し、これをサンプルとして前記のELISAによりSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を定量した。また、コントロールとしては、BALB/cマウス及びC57BL/6マウスの血清を用いた。
【００５９】
（８）測定系の信頼性確認試験
（希釈直線性試験）
高脂肪食を負荷した高脂血症モデルマウス（Apoe-/-マウス及びLDLR-/-マウス）から採取した血漿サンプルのうち、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体がポジティブであるサンプルを段階的に希釈して、前記のELISAでSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を測定した。希釈倍率と測定値との相関関係を調べ、濃度依存的かつ正確に定量できているかどうかを調べた。
【００６０】
（添加回収試験）
SAP/oxLDL/β2-GPI複合体の標準品（濃度既知）を、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体がネガティブである血清（BALB/cマウス由来）を用いて段階的に希釈した。このサンプル中のSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を前記のELISAで測定し、期待された量が検出されるか否かを確かめるため、回収率を算出した。
【００６１】
（同時再現性試験）
高脂肪食負荷高脂血症モデルマウスにおけるSAP/oxLDL/β2-GPI複合体がポジティブである血漿サンプルを用いて、同一サンプルを同時に10ウェル分、前記のELISAに付することによってSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を測定した。それぞれの測定値のＣＶ（変動係数）を算出することにより、それぞれの各測定値における平均値からのばらつきを調べた。
【００６２】
＜結果＞
（１）マウスSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の標準曲線
マウスSAP/oxLDL/β2-GPI複合体、マウスoxLDL/β2-GPI複合体、マウスSAP単独の三種類を段階希釈していき、測定した。結果を図１に示す。なお図１中の黒四角印はSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の測定値（対数値）を、白四角印はoxLDL/β2-GPI複合体の測定値を、三角印はSAP単独の測定値をそれぞれ示す。なお、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体濃度はLDLタンパク質相当濃度として表した。
図１から明かな通り、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体の濃度と測定値は、両対数グラフにおいて良好な直線性が確認され、標準曲線を描くことができた。また、本測定系においてoxLDL/β2-GPI複合体とSAP単独との交差反応性は見られなかった。よって、本測定系において、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体を特異的に検出できることが示された。
【００６３】
（２）SAP/oxLDL/β2-GPI複合体形成の経時変化
SAP/oxLDL/β2-GPI複合体形成の経時変化を観察するために、複合体形成の反応時間を変化させて調製したサンプルについて、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体をELISA及び電気泳動で確認した。ELISAの結果を図２に、電気泳動の結果を図３にそれぞれ示す。なお図３中の（ａ）はFat Red 7Bによる染色結果を、（ｂ）はAmide Blackによる染色結果をそれぞれ示す。また図３では、比較のため、oxLDLとoxLDL/β2-GPIについても同時に泳動した。
図２から、反応時間の経過とともにSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の濃度が上昇（複合体形成が進行）していることがわかる。
【００６４】
図３に関し、電気泳動では、oxLDLにβ2-GPIが結合すると陰性荷電が消失し、oxLDL単独のものと比べて移動度が減少することが知られている。このoxLDL/β2-GPI複合体にさらにSAPが結合することによる移動度の変化によって、複合体形成の経時的変化を調べた。その結果、脂質を染色するFat Red 7B染色、タンパク質を染色するAmide Black染色の両染色において、反応時間の経過とともに陽極方向への泳動距離が次第に減少することが示された（図３の右側が陽極である）。したがって、複合体の形成に伴ってoxLDLの陰性荷電が消失していくことが示された。また、Amide Black染色においては、中央付近に太いバンドが二本確認されたが、これはもともとSAP（試薬）中に補体成分C3が存在しており、それが検出されたものと考えられる。
【００６５】
（３）高脂肪食負荷（High fat fed）マウス（16周齢〜24週齢）におけるSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の検出
高脂肪食を２週間負荷したLDLR-/-マウス（high fat fed LDLR-/-マウス）から採取した血漿並びに同週齢のBALB/cマウス及びC57BL/6マウスの血清（いずれもコントロール）をサンプルとして、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体をELISAで測定した。尚、当該週齢の高脂血症モデルマウスで、動脈硬化巣（プラーク）の増加が観察でき始めている。結果を図４に示す。
図４より、高脂肪食を負荷した高脂血症モデルマウス（high fat fed LDLR-/-マウス）のサンプルにおいて、数値の高いものがいくつか観察された。このサンプルにおけるSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の濃度の平均値もコントロール群より高いため、高脂肪食を負荷した高脂血症モデルマウスにSAP/oxLDL/β2-GPI複合体が存在している可能性が示唆された。
【００６６】
（４）測定系の信頼性試験
ELISA測定系の信頼性を確認するため、以下の試験を行ったところ、いずれも良好な結果が得られ、本測定系の信頼性が確認された。
【００６７】
（希釈直線性試験）
結果を図５に示す。希釈率と測定値との間の相関性を調べた結果、全てのサンプルにおいて相関係数（R2値）が１に近い結果を示し、良好な直線関係が認められた。
【００６８】
（添加回収試験）
結果を表１に示す。なお回収率（Recovery）は、以下に示す２通りの計算方法で算出し、それぞれ「Recovery 1」及び「Recovery 2」とした。なお以下の「Ａ」〜「Ｅ」は、それぞれ表１中に「Ａ」〜「Ｅ」として示した部分の数値を意味する。
Recovery 1（Ｄ）＝ （（Ａ−Ｂ）／Ｃ）×１００
Recovery 2（Ｅ）＝ （Ａ／（Ｂ＋Ｃ））×１００
その結果、回収率がほぼ100％に近い値を示していたことから、本ELISA測定系によって、期待された量を測定できていることが示された。
【００６９】
（同時再現試験）
結果を表２に示す。ＣＶ（変動係数）は、個々の測定値の平均値からのばらつきを示すものであり、一般にＣＶ値が10％以内に収まれば良好な結果とされる。表２より、いずれのサンプルについてもＣＶ値は10％以内に収まっており、良好な結果が得られた。
【００７０】
【表１】
2008008894.tif 000002
【００７１】
【表２】
2008008894.tif 000003
【実施例２】
【００７２】
SAP/oxLDL/β2-GPI複合体の動脈硬化マーカーとしての可能性評価
＜材料及び方法＞
（１）マウスにおける血中動態
C57BL/6マウスの静脈に、既知量（LDLタンパク質相当濃度として0.8μg/ml）のSAP/oxLDL/β2-GPI複合体200 mlを投与し、時間経過とともに眼底より採血して遠心により血漿を回収し、ELISAによりSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を測定した。
【００７３】
（２）経時変化
10週齢のオス LDLR-/-マウス３匹を用いて試験した。事前に採血した後、このモデルマウスに高脂肪食を負荷した。その後、12週齢目、14週齢目及び16週齢目に採血し、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体をELISAにより測定した。
また別途、５週齢のオス LDLR-/-マウス６匹を用いて試験した。事前に採血した後、このモデルマウスに高脂肪食を負荷した。その後、10週齢目、15週齢目及び20週齢目に採血し、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体をELISAにより測定した。
その他の材料及び方法は、実施例１と同様である。
【００７４】
＜結果＞
（１）マウスにおけるSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の血中動態
結果を図６及び図７に示す。なお図６及び図７は、別個独立に試験した結果である。
図６及び図７より、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体は、投与から数分のうちに血中から消失することが示された。したがって、高脂肪食を負荷した高脂血症モデルマウス（血中から複合体が検出される）においては、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体が炎症部位（動脈硬化巣）から連続的に血中に供給されていることが示唆された（但し、絶対血中濃度は、投与の手技によって異なる）。
【００７５】
（２）LDLR-/-マウスにおけるSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の経時変化
10週齢のマウスを用いた結果（平均値）を図８に、５週齢のマウスを用いた結果（平均値）を図９にそれぞれ示す。図８及び図９より、血中のSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の量は経時的に増加した。このことから、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体の増加には、加齢に伴うプラーク形成が関係することが示唆された。
【実施例３】
【００７６】
マウスSAP/oxLDL複合体の検知と標準曲線作成
実施例１で調製したSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を段階的に希釈して、実施例１に記載のELISA（ただし、WB-CAL-1に代えて、マウスモノクローナル抗oxLDL抗体（10μg/mlの溶液）を、50μl/ウェルで固相に添加することにより固相化したものを使用）により測定した。測定されるSAP/oxLDL複合体（SAP/oxLDL/β2-GPI複合体における「SAPとoxLDLとが複合体を形成している部分」）の濃度とその測定結果との関係について、標準曲線を作成した。
結果を図１０に示す。図１０から明かな通り、SAP/oxLDL複合体の濃度と測定値は、良好な直線性が確認され、標準曲線を描くことができた。よって、本測定系において、SAP/oxLDL複合体を特異的に検出できることが示された。
【実施例４】
【００７７】
ヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の検知、標準曲線の作成、および患者血清中の複合体の測定
前述のマウスSAP/oxLDL/β2-GPI複合体と同様にELISAによりヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を測定した。図１１には得られた標準曲線を示す。さらに250倍希釈した健常人および急性冠症候群患者(動脈硬化性疾患患者として)血清中の本複合体を測定した。結果を表３に示す。
図１１から明かな通り、ヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の濃度と測定値は、良好な直線性が確認され、標準曲線を描くことができた。よって、本測定系において、ヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を特異的に検出できることが示された。
また、表３の結果から、このように少数例ではあるが、健常人血清に対し疾患群ではヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体濃度が高値を示した。従って、ヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の測定により動脈硬化などが検知できることが明らかとなった。
【００７８】
【表３】
2008008894.tif 000004
【実施例５】
【００７９】
本発明キットの作成
（１）下記の構成からなる本発明キット（ELISAキット）を作成した。
１．９６ウェルのイムノプレート １枚
２．抗β2-GPI抗体（WB-CAL-1；イムノプレートへの固相化用） １本
３．ヒツジ抗SAP抗体（一次抗体）  １本
４．ＨＲＰ標識抗ヒツジIgG抗体（二次抗体）  １本
５．o-PD試薬溶液  １本
６．SAP/oxLDL/β2-GPI複合体（スタンダード）
（２）下記の構成からなる本発明キット（ELISAキット）を作成した。
１．抗β2-GPI抗体（WB-CAL-1）が固着された９６ウェルのイムノプレート １枚
２．抗SAP抗体（一次抗体）  １本
３．ＨＲＰ標識抗イムノグロブリン抗体（二次抗体）  １本
４．o-PD試薬溶液  １本
５．SAP/oxLDL/β2-GPI複合体（スタンダード）
（３）下記の構成からなる本発明キット（ELISAキット）を作成した。
１．抗β2-GPI抗体（WB-CAL-1）が固着された９６ウェルのイムノプレート １枚
２．ＨＲＰ標識抗SAP抗体  １本
３．ＤＡＢ溶液  １本
４．SAP/oxLDL/β2-GPI複合体（スタンダード）
【００８０】
（４）下記の構成からなる本発明キット２（ELISAキット）を作成した。
１．９６ウェルのイムノプレート １枚
２．抗oxLDL抗体（イムノプレートへの固相化用） １本
３．ヒツジ抗SAP抗体（一次抗体）  １本
４．ＨＲＰ標識抗ヒツジIgG抗体（二次抗体）  １本
５．o-PD試薬溶液  １本
６．SAP/oxLDL複合体（スタンダード）
【００８１】
（５）下記の構成からなる本発明キット２（ELISAキット）を作成した。
１．抗oxLDL抗体が固着された９６ウェルのイムノプレート １枚
２．抗SAP抗体（一次抗体）  １本
３．ＨＲＰ標識抗イムノグロブリン抗体（二次抗体）  １本
４．o-PD試薬溶液  １本
５．SAP/oxLDL複合体（スタンダード）
【００８２】
（６）下記の構成からなる本発明キット２（ELISAキット）を作成した。
１．抗oxLDL抗体が固着された９６ウェルのイムノプレート １枚
２．ＨＲＰ標識抗SAP抗体  １本
３．ＤＡＢ溶液  １本
４．SAP/oxLDL複合体（スタンダード）
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】本発明複合体の標準曲線を示す図である。
【図２】本発明複合体の形成の経時変化（ELISAにより検出）を示す図である。
【図３】本発明複合体の形成の経時変化（電気泳動により検出）を示す図である。
【図４】高脂肪食を負荷した高脂血症モデルマウスの血中における、本発明複合体の検知結果を示す図である。
【図５】本発明複合体の検知に用いたELISAの信頼性試験（希釈直線性試験）の結果を示す図である。
【図６】本発明複合体の血中動態を示す図である。
【図７】本発明複合体の血中動態を示す図である。
【図８】血中における本発明複合体の経時変化を示す図である。
【図９】血中における本発明複合体の経時変化を示す図である。
【図１０】本発明複合体２（SAP/oxLDL/β2-GPI複合体における、「SAPとoxLDLとが複合体を形成している部分」）の標準曲線を示す図である。
【図１１】本発明複合体（ヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体）の標準曲線を示す図である。
【図１１】
2008008894.tif 000005
【図１】
2008008894.tif 000006
【図２】
2008008894.tif 000007
【図３】
2008008894.tif 000008
【図４】
2008008894.tif 000009
【図５】
2008008894.tif 000010
【図６】
2008008894.tif 000011
【図７】
2008008894.tif 000012
【図８】
2008008894.tif 000013
【図９】
2008008894.tif 000014
【図１０】
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