(57)【要約】【課題】この発明によれば、近赤外蛍光色素とポリペプチドからなる溶液でも生体組織を定量的に観察することが可能となる。【解決手段】試薬の投与後の画像Ｂから試薬の投与前の画像Ａの画像間の引き算をし(図3の305)、自家蛍光などの両方の画像に写っている部分を取り除き、試薬の投与によって影響を受け検出された蛍光のみを抽出された画像を得る。腫瘍には血管が多くあるため、ここで抽出された画像内で輝度が高い部分の多くは腫瘍と認識できる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも近赤外蛍光色素を用いた生体観察方法であり、
前記色素を投与する前の観察画像を取得する工程と、
前記色素を投与する工程と、前記色素を投与した後の観察画像を取得する工程と、
前記色素の投与前後の画像で画像処理をする工程と、を備えた生体観察方法。
【請求項２】
少なくとも近赤外蛍光色素を用いた生体観察方法であり、
前記色素を投与する工程と、前記色素を投与直後の観察画像を取得する工程と、
前記色素を投与後一定時間経過後の観察画像を取得する工程と、
前記色素の投与直後と一定時間経過後の画像で画像処理をする工程と、を備えた生体観察方法。
【請求項３】
少なくとも近赤外蛍光色素と、被検出物認識部からなる溶液を用いたことを特徴とする、
請求項１または請求項２の生体観察方法。
【請求項４】
前記被検出物認識部が抗体であることを特徴とする、請求項３の生体観察方法。
【請求項５】
少なくとも近赤外蛍光色素と、非結合性分子化合物からなる溶液を用いたことを特徴とする、請求項１または請求項２の生体観察方法。
【請求項６】
前記非結合性分子化合物が多糖類であることを特徴とする、請求項５の生体観察方法。
【請求項７】
前記非結合性分子化合物がポリペプチドであることを特徴とする、請求項５の生体観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織を生きたままの状態（in vivo）で観察する観察方法に関するもの
である。
【背景技術】
【０００２】
小動物など生体試料の内部の様子を生きたままの状態（in vivo）で、光を使って体外計測する手法は、医学研究等にとって重要である。特に腫瘍の位置・大きさを画像解析によって知る事は重要な技術である。
この種の観察方法として、ＧＦＰなどを使った蛍光観察方法もあるが、近年では生体内での透過性のよい近赤外蛍光を観察する方法、例えば、特許文献1に開示されている観察方法が知られている。
この観察方法は、インドシアニングリーンのような毒性の低い、しかし水溶液では実質的に蛍光性でない近赤外線蛍光色素を適当な高密度リポ蛋白質等と複合体を形成することにより、蛍光性となることを見出し、この知見に基づき上記複合体を近赤外線蛍光トレーサーとして、生体内に導入し、生体を励起光照射し、トレーサーからの近赤外線蛍光を検出することにより体外蛍光イメージングする方法である。
【特許文献１】特許3896176号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
近赤外波長でもマウスの体表面や内臓などの自家蛍光があり、従来の方法ではこれも検出してしまう可能性がある。この自家蛍光の影響は観察においては無視することはできない。
また、従来の方法では溶液の濃度や投与する量にもよるが、溶液を投与した後長期間体内に残留する可能性があるため、ある程度の期間を置かないと次の投与ができず、定量的な観察に不向きである可能性がある。
【０００４】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたもので、近赤外蛍光色素を利用して、かつ自家蛍光の影響を取り除き、生体組織を定量的に観察する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
【０００６】
請求項１記載による発明は、少なくとも近赤外蛍光色素を用いた生体観察方法であり、前記色素を投与する前の観察画像を取得する工程と、前記色素を投与する工程と、前記色素を投与した後の観察画像を取得する工程と、前記色素の投与前後の画像で画像処理をする工程とを備えた生体観察方法である。
【０００７】
この発明によれば、近赤外蛍光色素を利用して生体組織を定量的に観察することが可能となる。
【０００８】
請求項２記載による発明は、少なくとも近赤外蛍光色素を用いた生体観察方法であり、前記色素を投与する工程と、前記色素を投与直後の観察画像を取得する工程と、前記色素を投与後一定時間経過後の観察画像を取得する工程と、前記色素の投与直後と一定時間経過後の画像で画像処理をする工程とを備えた生体観察方法である。
【０００９】
この発明によれば、近赤外蛍光色素を利用して生体組織を定量的に観察することが可能となる。
【００１０】
請求項３記載による発明は、少なくとも近赤外蛍光色素と、被検出物認識部からなる溶液を用いたことを特徴とする生体観察方法である。
【００１１】
この発明によれば、近赤外蛍光色素と被検出物認識部からなる溶液でも生体組織を定量的に観察することが可能となる。
【００１２】
請求項４記載による発明は、前記被検出物認識部が抗体であることを特徴とする生体観察方法である。
【００１３】
この発明によれば、近赤外蛍光色素と抗体からなる溶液でも生体組織を定量的に観察することが可能となる。
【００１４】
請求項５記載による発明は、少なくとも近赤外蛍光色素と、非結合性分子化合物からなる溶液を用いたことを特徴とする生体観察方法である。
【００１５】
この発明によれば、近赤外蛍光色素と非結合性分子化合物からなる溶液でも生体組織を定量的に観察することが可能となる。
【００１６】
請求項６記載による発明は、前記非結合性分子化合物が多糖類であることを特徴とする生体観察方法である。
【００１７】
この発明によれば、近赤外蛍光色素と多糖類からなる溶液でも生体組織を定量的に観察することが可能となる。
【００１８】
請求項７記載による発明は、前記非結合性分子化合物がポリペプチドであることを特徴とする生体観察方法である。
【００１９】
この発明によれば、近赤外蛍光色素とポリペプチドからなる溶液でも生体組織を定量的に観察することが可能となる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、近赤外蛍光試薬を使用し、かつ自家蛍光等の影響も取り除くことができる蛍光観察方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の第1の実施の形態について図２から図４を参照して説明する。
【００２２】
本実施例では、近赤外蛍光試薬を生きた実験小動物に投与し、近赤外蛍光を画像化して、腫瘍の面積を計測する例を示す。本発明を適用する観察装置の概略構成例は、図１または図２のようになる。図１は同軸照明、図２は斜照明の例である。
【００２３】
まず図１について説明する。光源108から射出された光は、フィルタ109で近赤外蛍光色素を励起する波長の光のみを透過され、ダイクロイックミラー103で反射され、対物光学系104を通してステージ106上の標本105に照射される。標本105で発せられた蛍光は、対物光学系104を逆に進み、ダイクロイックミラー103を透過して、フィルタ102で不要な光がカットされて、ＣＣＤカメラ101で検出される。
【００２４】
コントローラは一般的なＰＣ等のコンピュータであり、ＣＣＤカメラ101の撮影条件の制御、取得画像の画像化と表示、光源108の光量などの制御などをしている。また、画像処理や画像間演算機能も可能である。そして、フィルタ101やフィルタ１０９、ダイクロイックミラー103が複数備えてられており電動で交換可能になっている場合はその制御も行う。さらには、対物光学系104にズーム機能がある場合や、ステージ106が電動式になっている場合もその制御も行う。
【００２５】
続いて、図２について説明する。光源207から射出された光は、フィルタ208で近赤外蛍光色素を励起する波長の光のみを透過され、ファイバ209を通してステージ205上の標本204に照射される。標本で発せられた蛍光は、対物光学系203を進み、フィルタ202で不要な光がカットされて、ＣＣＤカメラ201で検出される。ＣＣＤカメラ201で検出された光は、コントローラ206に送られ画像化される。また、コントローラ206は、図1のコントローラと同じ機能を有する。
【００２６】
観察する手順としては次のようになる。観察対象は、皮下に腫瘍細胞を導入したマウスである。また、その腫瘍の成長の様子を腫瘍の面積を計測することで経時的に観察する。ここでは、１回の観察の手順について図３および図４を用いて説明する。
【００２７】
なお、近赤外蛍光試薬としては、例えばdextran, Alexa Fluor 680; 10000 MW, anionic, fixable (invitrogen)を用いる。この試薬は、赤外蛍光色素と多糖類からなる試薬である。
まず、図示しないが例えばイソフルランを用いた気化麻酔等によりマウスに麻酔をかける。ここで、近赤外蛍光試薬を投与していない状態のまま一度腫瘍がある部分を含むマウスの画像を取得する(図3の301)。例えば図４の画像Ａのようにマウスのみの画像になる。なお、画像を取得するときには励起側のフィルタおよび検出側のフィルタおよびダイクロイックミラーなどは近赤外蛍光を観察するために必要な設定になっている。
【００２８】
画像を取得したところで、マウスに近赤外蛍光試薬を投与する(図3の302)。少し待つと試薬がマウス体内を循環し、腫瘍の微小血管およびそこからの染み出し等により、腫瘍の外形が判別できる程度に腫瘍全体からの蛍光を検出することができる(図3の303)。この状態で再度同じ位置のマウスの画像を試薬の投与前と同じ撮影条件で取得する(図3の304)。例えば図４の画像Ｂのようにマウスと腫瘍の両方が観察された画像になる、これで試薬の投与前後のマウスの画像が取得されたことになる。
【００２９】
次に腫瘍の面積を計測する。試薬の投与後の画像Ｂから試薬の投与前の画像Ａの画像間の引き算をする(図3の305)。すると自家蛍光などの両方の画像に写っている部分は取り除かれ、試薬の投与によって影響を受け検出された蛍光のみを抽出された画像を得ることができる。例えば図４の画像Ｃのようになる。腫瘍には血管が多くあるため、ここで抽出された画像内で輝度が高い部分の多くは腫瘍と認識できる。したがって、一般的な面積の計測手法、例えば予め指示しておいたしきい値を使い、しきい値以上の画素をカウントすることで面積を計測するという方法で、腫瘍の面積を計測できる(図3の306)。
【００３０】
なお、マウスは、観察後麻酔の効果が切れた時点で起きて、通常の活動に戻ることとなる。
【００３１】
次に第2の実施の形態について図５を用いて説明する。
【００３２】
観察装置、観察対象は実施例１と同様であり、１回の観察手順が異なるため、その点について図５を参照して説明する。
【００３３】
まず、図示しないが例えばイソフルランを用いた気化麻酔等によりマウスに麻酔をかける。麻酔が効いたところでマウスに近赤外蛍光試薬を投与する(図5の501)。ここで、近赤外蛍光試薬を投与した直後に一度腫瘍がある部分を含むマウスの画像を取得する(図5の502)。例えば図４の画像Ａのようにマウスのみの画像になる。なお、画像を取得するときには励起側のフィルタおよび検出側のフィルタおよびダイクロイックミラーなどは実施例１と同様に近赤外蛍光を観察するために必要な設定になっている。
【００３４】
少し待つと試薬がマウス体内を循環し、腫瘍の微小血管およびそこからの染み出し等により、腫瘍の外形が判別できる程度に腫瘍全体からの蛍光を検出することができる(図5の503)。この状態で再度同じ位置のマウスの画像を試薬の投与直後と同じ撮影条件で取得する(図5の504)。例えば図４の画像Ｂのようにマウスと腫瘍の両方が観察された画像になる、これで試薬の投与直後と一定時間経過後のマウスの画像が取得されたことになる。
【００３５】
次に腫瘍の面積を計測する。試薬の投与後一定時間経過後の画像Ｂから試薬の投与直後の画像Ａの画像間の引き算をする(図5の505)。すると自家蛍光などの両方の画像に写っている部分は取り除かれ、試薬の投与によって影響を受け検出された蛍光のみを抽出された画像を得ることができる。例えば図４の画像Ｃのようになる。腫瘍には血管が多くあるため、ここで抽出された画像内で輝度が高い部分の多くは腫瘍と認識できる。したがって、一般的な面積の計測手法で、腫瘍の面積を計測できる(図5の506)。
【００３６】
なお、マウスは、観察後麻酔の効果が切れた時点で起きて、通常の活動に戻ることとなる。
尚、第１の実施の形態では試薬の投与前後の画像、第2の実施の形態では試薬の投与直後と一定時間経過後の画像を取得するときの撮影条件を一致させているが、違う撮影条件で画像を取得してしまった場合は、画像内のマウスの生体組織などの同じ位置の輝度を一致させるように、画像の明るさとコントラストと調整してから画像間演算をしてもよい。
【００３７】
また、第１の実施の形態では試薬の投与前後の画像、第２の実施の形態では試薬の投与直後と一定時間経過後の画像間で引き算をしているが、画像間演算はこの限りではない。
さらに、腫瘍の面積を計測しているが、観察の対象は腫瘍だけには限らず、血管や骨など研究目的に合わせてよい。また、計測項目も面積に限らず、周囲長、円形度、フェレ径など研究目的に合わせてよい。
【００３８】
さらにまた、第1の実施の形態及び第2の実施の形態では、画像を２枚だけ取得しているが、試薬投与前および投与以降の画像があればよいので、投与前から一定時間経過するまでの動画やタイムラプス画像を撮影して、その中の画像を計測に用いてもよい。
【００３９】
また、第1の実施の形態及び第２の実施の形態では、二次元的に画像を取得しているが、三次元的に画像を取得し、体積などの項目を計測してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の実施例の装置構成の例（同軸照明）である。
【図２】本発明の実施例の装置構成の例（斜照明）である。
【図３】本発明の実施例１の１回の観察の流れ図である。
【図４】本発明の実施例の画像の説明図である。
【図５】本発明の実施例２の１回の観察の流れ図である。
【符号の説明】
【００４１】
１０１  ＣＣＤカメラ
１０３  ダイクロイックミラー
１０７  コントローラ
１０９  フィルタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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