(57)【要約】      （修正有）【課題】土壌からの養分吸収能を向上した植物の開発に有用な、植物において根特異的に発現誘導するプロモーターを提供する。【解決手段】以下の(a)〜(d)のいずれかのＤＮＡからなるプロモーター：(a)特定の塩基配列を持つＤＮＡ、(b)（ａ）の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入された塩基配列からなり、かつ植物において根特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するＤＮＡ、(c)（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物において根特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するＤＮＡ、(d)（ａ）の塩基配列の一部からなり、かつ植物において根特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するＤＮＡ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(d)のいずれかのDNAからなるプロモーター：
(a)配列番号１の塩基配列からなるDNA、
(b)配列番号１の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入された塩基配列からなり、かつ植物において根特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA、
(c)配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物において根特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA、
(d)配列番号１の塩基配列の一部からなり、かつ植物において根特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA。
【請求項２】
請求項１記載のプロモーターを含む組換えベクター。
【請求項３】
プロモーターの制御下に発現するように連結された目的遺伝子を有する、請求項２記載の組換えベクター。
【請求項４】
目的遺伝子が、ストレス耐性付与遺伝子、栄養輸送体遺伝子、汚染物質分解遺伝子または汚染物質輸送遺伝子である請求項３記載の組換えベクター。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれか１項記載の組換えベクターが導入された形質転換植物。
【請求項７】
ユーカリ属植物である、請求項６記載の形質転換植物。
【請求項８】
植物において目的遺伝子を根特異的に発現誘導する方法であって、ユーカリ属植物由来EcPT2遺伝子のプロモーターおよび該プロモーターの制御下に発現するように連結された目的遺伝子を有する組換えベクターで植物細胞を形質転換することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物において根特異的に発現誘導するプロモーター、該プロモーターを含む組換えベクター、ならびに該組換えベクターが導入された形質転換体および形質転換植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の人口増加に伴う産業活動の影響を受け、地球環境は悪化の一途をたどっている。二酸化炭素濃度の増加は地球温暖化の要因となり、今日まで認められなかった異常気象、生態系への悪影響が目に見える形となって現れている。この問題を解決すべく、二酸炭素の固定が課題となっている。また、重金属・有機塩素系物質・環境ホルモン等による土壌汚染が深刻な社会問題であり、これらの汚染環境の浄化に植物の能力を利用するファイトリメディエーションが注目されている。
【０００３】
二酸化炭素増加問題の解決手段として、植物の光合成能力を利用した二酸化炭素の固定が挙げられる。植物による二酸化炭素の固定は、大気中の二酸化炭素の削減に寄与するのみならず、固定化された炭素源は、紙、繊維、アルコールといった、欠乏が予想されうる石油エネルギーの代替えとして大きな資源となりうる。また、効率的かつ持続的に二酸化炭素を固定するにあたっては、比較的バイオマスの小さい草本植物より、木本植物を利用するのが望ましい。
【０００４】
植物の生育に比較的適した土地は食糧生産のために優先的に使用され、樹木の栽培は栄養欠乏や乾燥といったより過酷な環境下に追いやられることから、不良土壌でも育成可能な樹種の育種が重要な課題とされる。樹木が健全に育つためには効果的な根からの養水分の吸収が必要である。その養水分の吸収は白根と呼ばれる根端部分に近い細胞で行われている。しかし、土壌環境の変化により、温度、乾燥および金属過剰（カドミウム、亜鉛、鉄およびアルミニウムなど）のストレスにさらされると、根端の生長は停止し、養水分の吸収は極端に減少する。
【０００５】
例えば、不良土壌のひとつである酸性土壌では、アルミニウムが根における養分吸収阻害を引き起こしている。スギやヒノキではアルミニウムが根に蓄積すると、リン酸、カルシウムおよびマグネシウム等の養分の吸収阻害が生じる。アルミニウム蓄積部位は根端であること、およびアルミニウム蓄積により根端部位が黒変し分岐が停止することが明らかにされている。これらアルミニウムストレスを回避するために、植物が根から有機酸（主にクエン酸、リンゴ酸）を分泌することが知られている。有機酸がアルミニウムと安定した複合体をつくることにより、アルミニウム蓄積による害を回避していると考えられている。
【０００６】
また、水圏や地圏でのファイトリメディエーションにおける汚染物質の分解あるいは回収を考えるとき、重要な組織は根である。したがって、根の機能性を強化することが重要な課題である。
【０００７】
上記のように、植物の根の養分吸収能やストレス耐性の向上、および機能性の向上が重要である。しかし、従来の交配技術による育種では長期の期間および労力を要する。また、交配育種では他生物の機構を導入することはできない。一方、近年、目的遺伝子を導入する形質転換技術が確立し、分子生物学的研究が進んでいる草本植物だけでなく、木本植物においても分子育種が可能になっている。
【０００８】
根における機能改善のためには、導入した目的遺伝子の発現を根において制御する必要がある。根で発現させることを目的をとする遺伝子を植物全体で発現させることはエネルギー代謝の点から考えて適切ではないからである。草本植物の分野では、目的遺伝子の発現を根において制御する機構として、シロイヌナズナ（非特許文献１）やイネ（特許文献１）において根特異的に目的遺伝子を制御するプロモーターが報告されている。しかし、木本植物、すなわち樹木の分野では、根において目的遺伝子を発現させる場合であっても、植物全体で発現するカリフラワーモザイク35Sプロモーターが一般的に用いられている。カリフラワーモザイク35Sプロモーターが、樹木の根で目的遺伝子を高発現するといった報告はない。また、カリフラワーモザイク35Sプロモーターは双子葉植物では目的遺伝子を高発現させることが知られているが、単子葉植物の、特に根においては目的遺伝子発現能が低いことが報告されている(非特許文献２および３)。以上のことから、樹木の形質転換にこれまで用いられてきたプロモーターは、目的遺伝子を根特異的に発現させることにおいては実用性が低いと考えられる。また、草本植物において根特異的に目的遺伝子を制御するプロモーターが、木本植物においても根特異的に機能するという例は報告されていない。すなわち、木本植物において根特異的に目的遺伝子を発現させるためのプロモーターは知られていなかった。
【０００９】
【特許文献１】特開2007-107号公報
【非特許文献１】Journal of Bioscience and Bioengineering 99(1) 38-42 2005
【非特許文献２】McElroy et al.: Mol. Gen. Genet.231 150-160 (1991)
【非特許文献３】Mitsuhara et al.: Plant Cell Physiol. 37 49-59 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、植物において根特異的に発現誘導するプロモーターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ユーカリ属植物のリン酸トランスポーターであるEcPT2遺伝子のプロモーターが、植物において根特異的に発現誘導する機能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の(a)〜(d)のいずれかのDNAからなるプロモーター：
(a)配列番号１の塩基配列からなるDNA、
(b)配列番号１の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入された塩基配列からなり、かつ植物において根特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA、
(c)配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物において根特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA、
(d)配列番号１の塩基配列の一部からなり、かつ植物において根特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA。
（２）（１）記載のプロモーターを含む組換えベクター。
（３）プロモーターの制御下に発現するように連結された目的遺伝子を有する、（２）記載の組換えベクター。
（４）目的遺伝子が、ストレス耐性付与遺伝子、栄養輸送体遺伝子、汚染物質分解遺伝子または汚染物質輸送遺伝子である（３）記載の組換えベクター。
（５）（２）〜（４）のいずれかに記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
（６）（２）〜（４）のいずれかに記載の組換えベクター導入された形質転換植物。
（７）ユーカリ属植物である、（６）記載の形質転換植物。
（８）植物において目的遺伝子を根特異的に発現誘導する方法であって、ユーカリ属植物由来EcPT2遺伝子のプロモーターおよび該プロモーターの制御下に発現するように連結された目的遺伝子を有する組換えベクターで植物細胞を形質転換することを含む、前記方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、根特異的に発現誘導するプロモーターが提供される。本発明により、植物において根特異的に目的遺伝子を発現させることが可能になり、植物の分子育種に利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明者らは、ユーカリ属植物のリン酸トランスポーターであるEcPT2遺伝子のプロモーターが、植物において根特異的に発現誘導する機能を有することを見出した。本発明は上記知見に基づくものである。従って、一実施形態において本発明は、植物において根特異的に発現誘導するプロモーターに関する（以下、本発明の根特異的プロモーターと称する場合がある）。EcPT2遺伝子のプロモーターは、ユーカリ属植物に由来するものであれば特に制限されない。ユーカリ属植物としては、例えば、ユーカリ・カマルドレンシス（Eucalyptus camaludulensis）、ユーカリ・グロブラス（Eucalyptus globulus）、ユーカリ・グランディス （Eucalyptus grandis）、ユーカリ ・ユーロフィラ（Eucalyptus urophylla）、ユーカリ・ナイテンス（Eucalyptus nitens）、ユーカリ・グニー（Eucalyptus gunni）、ユーカリ・ラジアータ（Eucalyptus radiata）、ユーカリ・アンプリフォリア（Eucalyptus amplifolia）、ユーカリ・アーチェリ（Eucalyptus archeri）、ユーカリ・バクステリ（Eucalyptus baxteri）、ユーカリ・ビコスタータ（Eucalyptus bicostata）、ユーカリ・ブラッケリー（Eucalyptus blakelyi）、ユーカリ・ボトリオイデス（Eucalyptus botryoides）、ユーカリ・ブリジェシアーナ（Eucalyptus bridgesiana）等が挙げられる。ユーカリ・カマルドレンシス由来EcPT2遺伝子のプロモーターが好ましい。EcPT2遺伝子については、例えば、公開されたデータベース（GenBank、EMBL、DDBJ）において、ユーカリ・カマルドレンシス由来EcPT2遺伝子の塩基配列がアクセッションNo AB242817として登録されている。
【００１５】
植物において根特異的に発現誘導するとは、プロモーターが、植物体を構成する各種組織のなかで根においてのみ発現誘導機能を有すること、および／または、根における発現誘導機能が根以外の組織における発現誘導機能と比較して高いことを意味する。
【００１６】
本発明のプロモーターが根特異的に発現誘導することができる植物は、特に制限されず、草本植物においても木本植物においても可能である。本発明のプロモーターを利用できる草本植物としては、例えば、ナス科、アブラナ科、イネ科、マメ科、バラ科、キク科、ユリ科、セリ科、ナデシコ科、ウリ科、ヒルガオ科、アカザ科に属する植物が挙げられる。本発明のプロモーターを利用できる木本植物としては、例えば、フトモモ科（例えば、ユーカリ属）、マメ科（例えば、アカシア属）、マツ科（例えば、モミ属、マツ属）、ブナ科（例えば、クリ属、ブナ属、コナラ属）、バラ科（例えば、リンゴ属、サクラ属、ナシ属）、モクセイ科（例えば、オリーブ属）、ツバキ科（例えば、ツバキ属、サカキ属）、スギ科、ヒノキ科、イチョウ科、ミカン科、カエデ科、カキノキ科に属する植物が挙げられる。本発明のプロモーターは、好ましくはフトモモ科植物、特にユーカリ属植物、およびナス科植物、特にタバコ属植物において好適に用いられる。ユーカリ属植物としては、上記のものが挙げられる。タバコ属植物としては、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、ニコチアナ・ルスチカ（Nicotiana rustica）等が挙げられる。
【００１７】
プロモーターの発現誘導機能（換言すれば、プロモーター活性）は、以下のような手法により定量的に確認することができる。例えば、種々のレポーター遺伝子（例えば、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）、ルシフェラーゼ遺伝子（LUC）、グリーンフルオレッセントプロテイン遺伝子（GFP）等）をプロモーターの下流域に連結した組換えベクターを作製し、当該ベクターを宿主に導入した後、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認することができる。
【００１８】
本発明の根特異的プロモーターとしては、配列番号１の塩基配列からなるDNAが挙げられる。本発明のプロモーターには、配列番号１の塩基配列からなるDNAと機能的に同等のDNAが包含される。すなわち、植物において根特異的に発現誘導するプロモーターの機能を有する限り、以下のDNAからなるプロモータも本発明のプロモーターに包含される：
(b)配列番号１の塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入された塩基配列からなり、かつ植物において根特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA、
(c)配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物において根特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA、
(d)配列番号１の塩基配列の一部からなり、かつ植物において根特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA。
【００１９】
上記(b)における「数個」とは、2〜10個、好ましくは2〜5個、より好ましくは2〜3個である。上記(c)における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、低ストリンジェントな条件および高ストリンジェントな条件が挙げられるが、高ストリンジェントな条件が好ましい。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、5×SSC、0.1% SDSで洗浄する条件であり、好ましくは50℃、5×SSC、0.1% SDSで洗浄する条件である。高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば65℃、0.1×SSCおよび0.1% SDSで洗浄する条件である。上記のようなストリンジェントな条件下では、配列番号１の塩基配列と高い相同性（相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは99%以上）を有する塩基配列からなるDNAが、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとハイブリダイズする。上記(d)における「配列番号１の塩基配列の一部」とは、配列番号１の塩基配列における1000bp以上、好ましくは2000bp以上、より好ましくは3000bp以上で、4800bp以下、好ましくは4000bp以下、より好ましくは3500bp以下の連続した塩基配列をさす。また、配列番号１における1〜1944番目の連続した塩基配列を含むことが好ましい。
【００２０】
本発明のプロモーターは、ユーカリ属植物から例えば、以下のようにして得ることができる。なお、本発明における遺伝子工学的な実験手法に関しては、例えば、「Molecular Cloning（Sambrookら(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）」などに基づいて実施することができる。
【００２１】
まず、ユーカリ属植物、好ましくはユーカリ・カマルドレンシスの組織からDNAを抽出し、精製する。DNAの抽出、精製に関しては、特開平8-80191号公報等の方法を用いることができる。なお、ISOPLANTキット（ニッポンジーン社製）などの市販のキットを使用することもできる。
【００２２】
抽出・精製したDNAから、EcPT2遺伝子をコードするゲノムDNAを得る。該遺伝子の塩基配列を基に作成したプライマーを利用するPCR法（例えば、Inverse-PCR法、アンカーPCR法、TAIL-PCR法）、あるいは該遺伝子のDNA配列をプローブに用いたハイブリダイゼーション法を実施することにより、該遺伝子上流域のDNA配列を単離して本発明のプロモーターを得ることができる。
【００２３】
あるいは、前記のようにして抽出したユーカリ属植物由来のDNAをλDNA由来のコスミドベクター、TACベクターなどを含む各種クローニングベクターに挿入し、大腸菌を形質転換して得られるゲノムDNAライブラリーについて、EcPT2遺伝子cDNAの配列をプローブとして、またはユーカリ属植物ゲノムDNAを鋳型にしてPCR法により増幅した配列をプローブとして、スクリーニングを行い、該遺伝子と相同なDNA配列が含まれるクローンを単離することができる。単離されたクローンについて、制限酵素切断地図の作成、塩基配列の決定等を行ってクローン化されたDNAの構造を解明し、該遺伝子上流域のDNA配列を決定する。この上流域のDNA配列を適当な制限酵素（例えば、SalI）等によって切り出し、必要に応じて他のプラスミドベクター等にサブクローニングする。なお、この上流域のDNA配列には、TATAボックス配列が含まれているのが好ましい。
【００２４】
さらに、部位特定変異誘発等によって、配列番号１の塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入された塩基配列を合成することもできる。なお、配列番号１の塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法またはこれに準ずる方法を採用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製)やMutant-G(TAKARA社製))などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異の導入を実施できる。
【００２５】
本発明はまた、上記根特異的プロモーターを含む組換えベクターに関する。組換えベクターは、適当なベクターに、本発明の根特異的プロモーターを連結することにより得ることができる。また、本発明の根特異的プロモーターの下流に目的遺伝子を連結したものも、本発明の組換えベクターに包含される。ここで「目的遺伝子」としては、例えば、タンパク質をコードするDNAもしくはそのアンチセンスDNA、アンチセンスRNAをコードするDNA、リボザイムをコードするDNA、RNA干渉の原理を利用するための遺伝子などが挙げられる。また、目的遺伝子は、ストレス耐性付与遺伝子、栄養輸送遺伝子、汚染物質分解遺伝子、汚染物質輸送遺伝子でもよい。目的遺伝子としてストレス耐性遺伝子を連結した組換えベクターを用いることにより、土壌中でのストレスに対して根の耐性を強化でき、根の生長及び養分吸収能が向上した植物を作製することができる。同様に、目的遺伝子を栄養輸送体遺伝子とすることで、養分吸収能が向上した植物を作製することができる。ストレス耐性遺伝子として、例えば、グルタチオンSトランスフェラーゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子（Plant Physiol. 122, 657-665 (2002)、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子（Plant Cell Environ． 24, 1269-1278（2001））、Na+/H+アンチポーター遺伝子（Nature Biotech. 21, 81-85（2003））、クエン酸合成酵素遺伝子（Plant and Cell Physiol. 41, 1030-1037（2000））、NADP特異的イソクエン酸脱水素酵素遺伝子（特願2006-143994）、リンゴ酸輸送体遺伝子（特開2004−105164）などが挙げられる。栄養輸送体遺伝子としては、例えば、リン酸輸送遺伝子（Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol.Biol.50, 665-693 (1999)、Planta 216,23-37 (2002)）、アンモニア輸送遺伝子（Plant Cell Physiol. 44, 726-734（2003）、Plant Cell Physiol. 44, 206-211（2003））、硫酸輸送遺伝（J.Exp.Bot. 34, 1463-1483 (1983)、Nature 408, 796-815 (2000)）、カルシウム輸送遺伝子（Plant Cell 14, S401-S417（2002）、Trends in Plant Science 6 100-104 (2001)）、ホウ酸輸送遺伝子（Nature 420, 337-340 (2002)、Nature 420, 282-283 (2002)）、塩素輸送遺伝子（Biochim. Biophys. Acta. 1465, 199-218 (2000)）、鉄輸送遺伝子（Biochim. Biophys. Acta. 1465, 190-198 (2000)）、糖輸送遺伝子（Int. Rev. Cytol. 178, 41-71 (1998)）、水輸送遺伝子（Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002)、前島正義：朝倉植物生理学講座(2)「代謝」、pp.30-37, 朝倉書店（1991））などが挙げられる。また、目的遺伝子として汚染物質分解遺伝子や汚染物質輸送遺伝子を連結した組換えベクターを用いることにより、ファイトリメディエーションに用いることもできる。すなわち、湖水中または土壌中に存在する汚染物質を分解する、あるいは汚染物質を吸収し植物個体内へ蓄積回収することで、湖水及び土壌の浄化ができる。汚染物質分解遺伝子としては、例えば、PCB分解酵素遺伝子（Nature Biotechnol. 16, 663-666 (1998))、TCE分解およびメタン分解遺伝子（Environ Microbiol. 4,:517-524 (2002))、水銀化合物分解酵素（Environ Geochem Health. 28,103-110 (2006)）などが挙げられる。汚染物質輸送遺伝子としては、例えば、カドミウム輸送遺伝子（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9995-10000 (2001)）、亜鉛輸送遺伝子（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 4956-4960 (2000)）、ニッケル輸送遺伝子（Plant Physiol. 122, 1343-1353 (2000)）、重金属輸送遺伝子（Curr. Opin. Plant Biol. 9, 322-330 (2006））などが挙げられる。
【００２６】
本発明の根特異的プロモーターを挿入するためのベクターは、特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNA（YAC：yeast artificial chromosome）などが挙げられる。
【００２７】
プラスミドDNAとしては、例えばpRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112またはpAUR123などのYCp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pYES2またはYEp13などのYEp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101またはpAUR135などのYIp型大腸菌-酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396またはpTrc99AなどのColE系プラスミド、pACYC177またはpACYC184などのp15A系プラスミド、pMW118、pMW119、pMW218またはpMW219などのpSC101系プラスミド等）、アグロバクテリウム由来のプラスミド（pBI101、pGWB233等）、枯草菌由来のプラスミド（pUB110、pTP5等)などが挙げられる。ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）、φX174、M13mp18またはM13mp19などが挙げられる。レトロトランスポゾンDNAとしては、Ty因子などが挙げられる。YAC用ベクターとしてはpYACC2などが挙げられる。さらに、カリフラワーモザイクウイルスなどの植物ウイルス、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスを用いることもできる。
【００２８】
ベクターに本発明の根特異的プロモーターおよび／または目的遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して連結する方法等が採用される。
【００２９】
組換えベクターにおいて、根特異的プロモーターは、機能しうる形で連結されることが必要である。すなわち、目的遺伝子の機能が発揮されるように、目的遺伝子が発現可能な状態でベクターに組み込まれる。発現可能な状態とは、宿主において、根特異的プロモーターの制御下に目的遺伝子が発現されるように、目的遺伝子と根特異的プロモーターとを連結してベクターに組み込むことを意味する。そこで、組換えベクターには、根特異的プロモーター、目的遺伝子、ターミネーターのほか、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子などの除草剤耐性遺伝子などが挙げられる。
【００３０】
このように作製された組換えベクターを用いて形質転換体を作製することができる。本発明の形質転換体には、形質転換微生物および形質転換植物細胞が含まれる。形質転換体は、上述した組換えベクターを、目的遺伝子が発現しうるように宿主に導入することによって作製することができる。形質転換微生物は、前記組換えベクターを宿主としての微生物に導入して得られた微生物である。宿主微生物としては、植物に組換えベクターを導入しうるもの、すなわち植物に対する感染能を有する微生物が好ましく、例えば、アグロバクテリウム属菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・リゾゲネス）などが挙げられる。また、形質転換植物細胞は、前記組換えベクターを宿主としての植物細胞に導入して得られた植物細胞である。宿主植物細胞としては、特に制限されず、本発明のプロモーターを利用できる上記草本植物および木本植物、特にユーカリ属植物の細胞を用いる。
【００３１】
目的遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００３２】
本発明はまた、上記組換えベクターが導入された形質転換植物に関する。形質転換植物は、前記形質転換植物細胞を有する植物体であれば特に制限されず、形質転換細胞から再生された形質転換植物が包含される。本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、種子、根等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、根部、維管束、柵状組織、海綿状組織等)または植物培養細胞のいずれをも意味するものである。形質転換の対象となる植物は特に制限されず、本発明のプロモーターを利用できる上記草本植物および木本植物、特にユーカリ属植物である。
【００３３】
組換えベクターは、通常の形質転換方法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法、エレクトロポレーション法等によって植物細胞中に導入することができる。
【００３４】
アグロバクテリウム法を用いる場合は、組換えベクターを適当なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス LBA4404株に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著,植物遺伝子操作マニュアル、1990、27-31pp、講談社サイエンティフィック）等に従って宿主の無菌培養片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。
【００３５】
パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばPDS-1000(BIO-RAD社)等）を用いて処理すればよい。処理条件は植物または試料により異なるが、通常は450〜2000psi程度の圧力、3〜12cm程度の距離で行う。
【００３６】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターをパーティクルガン法、エレクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。形質転換の結果得られる腫瘍組織、シュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。
【００３７】
形質転換植物細胞から植物を再生する具体的な方法は、例えば、ユーカリでは土肥らの方法（特願平11-127025号公報）、イネではFujimuraらの方法（Fujimuraら(1995), Plant Tissue Culture Lett., vol.2:p74-）、トウモロコシではShillitoらの方法（Shillitoら(1989), Bio/Technology, vol.7:p581-）、ジャガイモではVisserらの方法（Visserら(1989), Theor. Appl. Genet., vol.78:p589-）、シロイヌナズナではAkamaらの方法（Akamaら(1992), Plant Cell Rep., vol.12:p7-）を参照することができる。また、本発明の形質転換植物には、該形質転換植物から得られる種子、および該種子から得られる植物体も含まれる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例1）
ユーカリ属植物においては、5つのリン酸トランスポーター（EcPT1、EcPT2、EcPT3、EcPT4およびEcPT5）の存在が確認されており、中でもEcPT2（アクセッションNo.AB242817)は根特異的に発現することが報告されている（Plant. Biotec, 23, 215-218 (2006)）。EcPT2のプロモーターを単離するため、ユーカリ・カマルドレンシス（Eucalyptus camaldulensis Deheh）（以下ユーカリと称する）のゲノムライブラリー（λDashII）において、EcPT2遺伝子の部分配列のcDNAをプローブに用いプラークハイブリダイゼーションを行った。スクリーニングの結果、得られたゲノムに対してプライマーウォーキング法を用いて、EcPT2遺伝子の5'上流域のプロモーター配列4821bpを解読した（配列番号１）。
【００３９】
決定した塩基配列をもとに下記のプライマーを用い、ゲノミックPCRを行った。
EcPT2-Fwプライマー：5'-CACCTTTAACTTGCCAATTTGTTATTGTGCTACC-3'（配列番号２）
EcPT2-Rvプライマー：5'-AGCCATGATCGAAGCTGGAGTTCAATG-3'（配列番号３）
【００４０】
プライマーは、EcPT2遺伝子の翻訳開始コドンを+1とし、-4821から+6までに位置する4827塩基対を増幅するように設計した。PCR増幅産物は、Gatewayテクノロジー（Invitrogen社）を利用して、pENTR/D-TOPOベクターにクローニングした。
【００４１】
EcPT2遺伝子プロモーター配列の下流にレポーター遺伝子としてβ-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子を融合させたキメラ遺伝子を作製した。GatewayテクノロジーのLR組換え反応により、pENTR/D-TOPOベクター上のEcPT2プロモーター配列を、形質転換用バイナリーベクターpBI101の改変ベクターpGWB3（中川強, 「植物形質転換の新手法：ハイスループット binaryベクターの開発」, 遺伝子医学 Vol. 6, No. 3, 499-503, 2002）に導入した。本バイナリーベクターには、T-DNA上に選抜マーカー遺伝子として、nos（ノンパリン合成遺伝子）プロモーター：：hpt（ハイグロマイシン耐性遺伝子）：：nosターミネーターを配置し、形質転換された植物がハイグロマイシン耐性を示すように構成されている。その隣接部位にβ-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子のコード領域：：Tiプラスミド由来nosターミネーターから構成されるキメラ遺伝子を配置し、GUS遺伝子の5'上流側にEcPT2遺伝子プロモーター配列を挿入した（以下EcPT2：GUSと称する）。一方、EcPT2遺伝子プロモーターとの比較のため、目的遺伝子を発現させるために従来使用されているカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターを導入した形質転換用バイナリーベクターを構築した（以下35S：GUSと称する）。
【００４２】
上述のプラスミド（EcPT2：GUSおよび35S：GUS）をアグロバクテリウム・リゾゲネス(ATCC15834)および、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（EHA101）に導入した。アグロバクテリウム・リゾゲネスはユーカリ形質転換毛状根の作製に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスはユーカリ形質転換植物の作製に用いた。
【００４３】
上記で構築した形質転換用ベクターを用いて、ユーカリ組織から形質転換毛状根および形質転換植物を作製した。形質転換毛状根の作製にあたっては、Diazら（Nature 338,579-581 (1989)）の手法を利用して行った。ユーカリ感染組織から発生した形質転換毛状根は植物ホルモン無添加の1/4強度のB5培地にて暗化、27℃の条件化で主根から側根が形成されるまで培養した。
【００４４】
一方、ユーカリ形質転換植物の作製には、土肥ら（特開2000-316043）の手法を用いた。アグロバクテリウムを感染させたユーカリ不定苗条から発生したカルスをハイグロマイシンで選抜し、選抜したカルスから苗条原基を、苗条原基から苗条を再分化させ、さらに発根させて完全な形質転換植物を得た。
【００４５】
その結果、得られた形質転換毛状根および形質転換植物の根においてGUSアッセイを行い、プロモーター活性を評価した。
【００４６】
GUSアッセイによる組織染色では、形質転換毛状根および形質転換植物の根を染色液（1mM 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドニル-β-D-グルクロニド：X-Gluc、100 mMリン酸バッファー、10 mM EDTA、5 mMフェリシアン化カリウム、5 mMフェロシアン化カリウム、0.1％ トリトンX-100）に浸漬し、30分間の脱気の後、37℃で一晩培養した。染色した根は0.5％ アンチホルミンおよび70％エタノールで脱色した後、光学顕微鏡で観察した。
【００４７】
実験結果：
得られた5ラインの形質転換毛状根において、いずれも根端特異的なGUS活性が認められた（図1上段）。主根および側根の先端では、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターと比較して非常に強いGUS染色が認められた（図1Aおよび1B）。また、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターでは側根発生基部では一切のGUS活性が認められないのに対し、EcPT2遺伝子プロモーターでは顕著なGUS活性が認められた（図1C）。
【００４８】
形質転換植物の根においても根端特異的に、さらに側根発生器部でGUS活性が認められた（図2）。この形質転換根でのEcPT2遺伝子プロモーターによるGUSの発現パターンは、上記の形質転換毛状根とほぼ同一の発現様式を示した。
【００４９】
これらのことからEcPT2遺伝子プロモーターはユーカリ属植物において根特異的に機能するプロモーターであることが示された。
【００５０】
（実施例2）
ゲノム情報が整備されているシロイヌナズナでは、多くのリン酸トランスポーターの知見が得られている（植物の膜輸送システム  細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ1857-61（2003））。中でもタンパク質および遺伝子の発現解析が進んでおり、根特異的に発現するリン酸トランスポーターとしてPht1;1遺伝子が報告されている（Journal of Bioscience and Bioengineering 99(1) 38-42 2005）。ユーカリ属植物において、目的遺伝子を根特異的に発現させることを目的とし、Pht1;1遺伝子プロモーターが利用可能か否かを検討した。
【００５１】
Pht1;1遺伝子のプロモーター領域、-3888から+3（翻訳開始点を+1とする）の配列（配列番号４）とGUS遺伝子を融合させた形質転換用ベクターpGAH-PHT1（Plant. Biotec, 23 215-218 (2006)）を用い、上記に示したのと同様の方法でユーカリを形質転換した。
【００５２】
Pht1;1プロモーターを導入したユーカリにおいてGUSアッセイを行った結果、ユーカリ組織においてGUS活性は認められなかった（図3）。このことから、Pht1;1プロモーターはユーカリでは機能しないことが明らかとなった。その理由として、草本植物と木本植物との種間差による発現機構の相違が考えられる。双子葉植物であるシロイヌナズナ由来のrd29Aプロモーターは、単子葉植物中で機能はしてもその活性が弱いことが報告されている（特開2004-248638）。そのため、本発明のEcPT2遺伝子プロモーターが植物種を越えて機能するか否かを検討した。
【００５３】
EcPT2遺伝子プロモーター（EcPT2：GUS）をタバコ（ニコチアナ・タバカム）に導入し、形質転換毛状根を作製した。得られた12ラインの形質転換毛状根においてGUS活性を調べた結果、根先端部で特異的に強い活性が認められた（図4）。この発現様式はユーカリ根での発現様式と極めて類似していた。この結果から、EcPT2遺伝子プロモーターはユーカリなどの木本植物だけでなく、草本植物であるタバコでも根特異的に機能することが示された。
【００５４】
以上から、本発明のプロモーターに任意の目的遺伝子を融合させると、目的遺伝子を根で特異的に発現させることが可能となることが示された。また、本発明のプロモーターは草本植物においても機能することから、木本植物だけでなくその他の農作物への利用も可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明のプロモーターを用いて、多種のストレス耐性付与遺伝子、栄養輸送体遺伝子等を結合した樹木や農作物を作製することで、その改良植物の養分吸収能を高め成長性を向上させることが可能である。その結果、土壌への過剰な化学肥料の投与が抑制され、環境への負荷を軽減することができる。また、栄養欠乏土壌での樹木の生育が可能になり、栽培が限定されていた不良土壌における植林の経済性向上、ならびにバイオマス資源の拡大が見込まれる。ひいては、植生拡大による二酸化炭素の固定量の増加も期待される。
【００５６】
また、本発明プロモーターを用いて、汚染物質分解遺伝子や汚染物質輸送遺伝子を発現制御した植物を作製することで、水や土壌に含まれる汚染物質の分解や回収が可能である。その結果、これまでは高価で特殊技術を要した汚染水及び汚染土壌の浄化が省エネルギーかつ低コストで実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ユーカリ形質転換毛状根におけるEcPT2遺伝子プロモーターの活性（上段）およびカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの活性（下段）を示す写真である。主根（一次根）（A）、側根（二次根）（B）、側根発生基部（C）におけるGUS活性を検出した。EcPT2遺伝子プロモーターの活性部位は根端特異的であり、その部位の活性はカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの活性より高いものであった。
【図２】ユーカリ形質転換植物の根におけるEcPT2遺伝子プロモーターの活性を示す写真である。主根（一次根）（A）、側根（二次根）および側根発生基部（B）におけるGUS活性を検出した。図１で示した発現様式と酷似した根端特異的なGUS活性が検出された。
【図３】Pht1;1 プロモーターの活性を示す。シロイヌナズナ（A）およびユーカリ（B）におけるGUS活性を検出した結果を示す写真である。シロイヌナズナでは根特異的な活性が見られたが、ユーカリでの活性は一切見られなかった。
【図４】タバコにおけるEcPT2プロモーターの活性を示す写真である。主根（一次根）（A）、側根（二次根）および側根発生基部（B）におけるGUS活性を検出した。図１および図２で示したユーカリでの活性と同様に、根端特異的なGUS活性が検出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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