(57)【要約】【課題】魚に対する負担が少なく、酵素の失活を抑制し、長時間に亘って測定可能な魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法及びこれに使用するバイオセンサの提供。【解決手段】先端部を除いた外周を絶縁体２で被覆した短線状の作用極１と、絶縁体２の外周に塗布した銀・塩化銀層より成る対極５と、作用極１の先端に装着され、作用極１の直径よりも大径の球体６と、作用極１と対極５を接続する回路に流れる電流を測定する測定部８と、球体６と絶縁体２との間において、作用極１の先端部外周に設けられた酵素固定部１１とを備えたバイオセンサＡを、魚類の眼球付近に存在する粘膜内部の間質液中に刺し込み、魚類生体内のグルコース濃度を測定する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類の眼球付近に存在する粘膜内部の間質液中へ刺し入れたバイオセンサにより魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法。
【請求項２】
注射針の外周に外筒を嵌合し、頭骨を通して生体魚類の眼球付近の粘膜内部に前記注射針及び外筒を刺し入れてから、前記注射針を抜き取って外筒のみを埋設し、次いで、外筒の内部に前記バイオセンサを挿入し、その後、該バイオセンサを頭骨に接着する請求項１に記載された魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法。
【請求項３】
前記バイオセンサの測定値を間質液中のグルコース濃度に変換する請求項１又は２に記載された魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法。
【請求項４】
前記バイオセンサの測定値を送信手段により無線送信し、該送信手段からの信号を、生体魚類の近傍に配置された受信手段により受信し、該受信手段に接続された変換手段によって、前記バイオセンサの測定値を間質液中のグルコース濃度に変換する請求項３に記載された魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載された魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法に使用されるバイオセンサであって、先端部を除いた外周を絶縁体で被覆した短線状の作用極と、前記絶縁体の外周に塗布した銀・塩化銀層より成る対極と、前記作用極の先端に装着され、前記作用極の直径よりも大きい径を有する球体と、前記作用極と対極を接続する回路に流れる電流を測定する測定部と、前記球体と絶縁体との間において、前記作用極の先端部外周に設けられた酵素固定部とを備えたバイオセンサ。
【請求項６】
請求項４に記載された魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法に使用されるバイオセンサであって、先端部を除いた外周を絶縁体で被覆した短線状の作用極と、前記絶縁体の外周に塗布した銀・塩化銀層より成る対極と、前記作用極の先端に装着され、前記作用極の直径よりも大きい径を有する球体と、前記作用極と対極を接続する回路に流れる電流を測定する測定部と、該測定部の測定値を無線送信する送信手段と、前記球体と絶縁体との間において、前記作用極の先端部外周に設けられた酵素固定部とを備えたバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類の眼球付近の間質液を検体として、魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法及びこれに使用するバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
世界的な魚資源の減少により、様々な魚種の栽培漁業が年々盛んになっているが、病気を持った魚は消費者に嫌われるだけでなく、魚の死亡率が高いと経済的損失が大きくなるため、ストレスがない安定した状態で魚を養殖し、しかも、使用する抗生物質等の量を最小限に抑える必要がある。
ところで、魚のストレスと血液中のグルコース濃度との間には密接な関係が有り、血中グルコース濃度が高いと魚が強いストレスを感じており、死亡率が高まる傾向にあるといわれている。
【０００３】
従来、魚類の健康状態を調べる方法として、魚群から選択した１以上の個体を血液学的検査及び血液生化学的検査により検査した検査値と、検査標準域を比較する魚類の異常の検査方法が知られている（特許文献１参照）。
しかし、この方法は、魚類の動脈や心臓から採血しなければならず、魚への負担が大きく、場合によっては開腹が必要なので、検査の対象となる魚を殺すこともある。また、採取した血液を検体としているので、長時間連続的に検査を続けることは不可能であった。
【０００４】
さらに、センサー検出部を直径１ｍｍ程度の針型に形成し、直接生体に刺入し、埋め込んだ状態で体液成分を測定するバイオセンサが開発されている（特許文献２参照）。
しかし、通常のバイセンサは直径が０．５ｍｍ〜１．５ｍｍ程度あって、魚体に対する負担は依然として大きいばかりでなく、生きた魚類に長時間装着しておくのは困難であった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−３７３６８号公報
【特許文献２】特開２００５−２３０５２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、魚に対する負担が少なく、バイオセンサの受容体である酵素の失活を抑制し、長時間に亘って連続して測定可能な魚類生体内のグルコース濃度を測定する方法及びこれに使用するバイオセンサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の測定方法は、魚類の眼球付近に存在する粘膜内部の間質液中へ刺し入れたバイオセンサにより、魚類生体内のグルコース濃度を測定する。
バイオセンサを装着するには、注射針の外周に外筒を嵌合し、頭骨を通して生体魚類の眼球付近の粘膜内部に前記注射針及び外筒を刺し入れてから、前記注射針を抜き取って外筒のみを埋設し、次いで、外筒の内部に前記バイオセンサを挿入し、その後、該バイオセンサを頭骨に接着すると良い。
【０００８】
バイオセンサで測定した電流等の測定値を間質液中のグルコース濃度に変換することがある。
この場合、前記バイオセンサの測定値を送信手段により無線送信し、該送信手段からの信号を、生体魚類の近傍に配置された受信手段により受信し、該受信手段に接続された変換手段によって、前記バイオセンサの測定値を間質液中のグルコース濃度に変換しても良い。
【０００９】
本発明のバイオセンサは、先端部を除いた外周を絶縁体で被覆した短線状の作用極と、前記絶縁体の外周に塗布した銀・塩化銀層より成る対極と、前記作用極の先端に装着され、前記作用極の直径よりも大きい径を有する球体と、前記作用極と対極を接続する回路に流れる電流を測定する測定部と、前記球体と絶縁体との間において、前記作用極の先端部外周に設けられた酵素固定部とを備える。
或いは、先端部を除いた外周を絶縁体で被覆した短線状の作用極と、前記絶縁体の外周に塗布した銀・塩化銀層より成る対極と、前記作用極の先端に装着され、前記作用極の直径よりも大きい径を有する球体と、前記作用極と対極を接続する回路に流れる電流を測定する測定部と、該測定部の測定値を無線送信する送信手段と、前記球体と絶縁体との間において、前記作用極の先端部外周に設けられた酵素固定部とを備える。
【発明の効果】
【００１０】
請求項１〜４に係る発明によれば、眼球付近の粘膜内部にバイオセンサを刺し入れて測定を行うので、血管にバイオセンサを挿入するのに比べて魚に対する負担を軽減でき、魚を生かしたままでグルコース濃度を測定することが可能である。
また、測定対象として血液を用いていないため、凝固した血液が付着して酵素（グルコースオキシダーゼ）が失活するのを抑制できる。
【００１１】
特に、請求項２に係る発明によれば、バイオセンサが硬い頭骨で支持されるので、動き回る生体魚類にも安定して取り付けることが可能であり、魚類の動きによって外れるのを防ぐ。
また、請求項４に係る発明によれば、バイオセンサと変換手段とを導線で接続する必要が無いので、バイオセンサを装着された魚は自由に動くことができ、バイオセンサを試着したままで長期間に亘って測定することが可能であると共に、ストレスによってグルコース濃度が変動する心配が無い。
【００１２】
請求項５及び６に係る発明によれば、直径０．３ｍｍ〜０．５ｍｍというきわめて微細なものでありながら、銀・塩化銀処理を電気化学的に施した銀線を多数回巻きつけて対極を形成したものと同様に対極の表面積を大きくすることが可能であり、この結果、分極を防いで電位を安定させることができる。
また、従来のもののように、銀線表面の薄い銀・塩化銀処理が剥がれ、露出した銀線と銀・塩化銀の二つの金属が対極の役割を果たしてしまう心配が無く、長期間に亘って高い安定性が得られる。
【００１３】
さらに、作用極の先端にこれより径大の球体を装着したので、酵素溶液に浸漬すると、適度な表面張力が生まれて微細な酵素固定部に確実に酵素を固定できるだけでなく、バイオセンサ刺入時に酵素固定部に固定された酵素が剥離するのを防ぐことが可能である。
また、先端に球体を設けてあるので、生体魚類の眼球粘膜に長期間刺し入れた状態でも刺激が少なくて済み、魚類に与える負担を軽減できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
図１〜図７は、本発明の実施例１を示す。
本発明のバイオセンサＡは、生体魚類の眼球付近に存在する粘膜内部の間質液中へ刺し入れるものであって、図１に示すように、短線状の作用極１と、作用極１の外周に被覆した絶縁体２と、絶縁体２の外周に設けられた銀線３と、作用極１の外周に塗布された銀・塩化銀層より成る対極５と、作用極１の先端に装着された球体６と、作用極１及び対極５に接続された定電圧装置７と、定電圧装置７に接続され、作用極１と対極５を接続する回路に流れる電流を測定する測定部８とを備える。
定電圧装置７と測定部８はポテンシオスタット１７に組み込まれている。また、測定部８には、送信線１６を介して、測定値をグルコース濃度へ変換する変換手段（コンピュータ）１５が接続され、測定部８の測定値が送信線１６によって変換手段１５へ送信されるようになっている。
【００１５】
作用極１は、直径０．１７８ｍｍの白金イリジウム線を長さ２ｃｍに切断したものであり、先端から１ｍｍ程度の長さを除いて、その外周をテフロン（登録商標）等より成る絶縁体２で被覆してある。
また、導線１０をハンダ付けするために、絶縁体２の外周の末端寄りに、直径０．１ｍｍの銀線３を１０回程度巻きつけてある。
対極５である銀・塩化銀層は、微細な塩化銀粉末を０．２〜４０重量％含有した銀ペーストを、銀線３を被覆するように、絶縁体２の外周に塗布して形成される。
そして、作用極１及び対極５には、ハンダ付けされた導線１０を介して定電圧装置７が接続され、定電圧装置７から作用極１へ＋０．６５０ｍＶの定電圧を印加できるようになっている。
【００１６】
球体６は、エポキシ樹脂等を素材とし、作用極１の直径よりやや大きい径を有する。そして、球体６と絶縁体２の間において、作用極１の先端部外周の窪んだ部分は、酵素固定部１１となっている。
実際に測定を行う前に、バイオセンサＡをグルコースオキシダーゼ溶液に浸漬し、酵素固定部１１にグルコースオキシダーゼを固定する。酵素固定部１１には表面張力が働いて確実にグルコースオキシダーゼが固定される。
【００１７】
このバイオセンサＡを粘膜Ｃに刺し入れると、間質液中のグルコースと酵素固定部１１に固定されたグルコースオキシダーゼが接触し、グルコースがグルコースオキシダーゼの触媒反応によって酸化され、過酸化水素が発生する。
作用極１には＋０．６５０ｍＶの定電圧が印加されているので、グルコースの酸化反応が起きていないときは、作用極１には＋０．６５０ｍＶの電位が常に維持されているが、過酸化水素が発生すると電子を受け取って電位が上昇し、作用極１と対極５を接続した回路に流れる電流が強まる。
【００１８】
発生する過酸化水素の濃度は間質液中のグルコース濃度に比例するので、グルコース濃度が高いほど作用極１と対極５とを接続する回路には大きい電流が流れる。
また、バイオセンサＡで測定した電流とグルコース濃度とは比例しているので、電流値に比例定数を乗することにより簡単にグルコース濃度に変換できる。
従って、測定部８が測定した電流を変換手段１５へ送信すると、変換手段１５は受信した測定値にこの比例定数を掛けてグルコース濃度へ変換する。
【００１９】
本実施例のバイオセンサＡを用いて、魚類（本実施例ではティラピア）生体内のグルコース濃度を測定した。
ティラピアを水から引き上げ、2-phenoxy  ethanolで麻酔を施す。
次いで、図２に示すように、注射針１２の外周にテフロン（登録商標）製の外筒１３を嵌合したサーフローを用い、頭骨を通してティラピアの眼球Ｂ付近の粘膜Ｃ内部に注射針１２及び外筒１３を刺し入れてから、図３に示すように、注射針１２を抜き取って外筒１３のみを埋設する。
【００２０】
次に、皮膚外にはみ出した外筒１３を切り取り、バイオセンサＡを球体６側から外筒１３へ挿入して、バイオセンサＡを眼球Ｂ付近の粘膜Ｃ内部に刺し入れる。外筒１３はその後で引き抜いてもよいし、残しておいても良い。
次いで、軟組織接合用接着剤（例えば、商品名：アロンアルファＡ，「三共株式会社」等のシアノアクリレート系接着剤）で、バイオセンサＡを皮膚へ接着する。
【００２１】
また、幅４０ｃｍ、奥行２４ｃｍ、高さ１５ｃｍの水槽中に麻酔剤（2-phenoxy  ethanol）を１ｐｐｍ添加し、水槽内部に２枚のセパレータを、ティラピアを収納できるが自由に動けない程度の間隔をあけて設置した。
そして、眼球付近にバイオセンサＡが装着されたティラピアを２枚のセパレータの間に収納し、測定部８で電流を測定した。
ティラピアを水槽へ投入した後、電位が安定するまでしばらく待ってから、１．０７時間後（ａ時点）に水槽から取り出し、眼球付近の間質液中のグルコース濃度を血糖計（アークレイ株式会社製  ＤＩＡｍｅｔｅｒ  αＧＬＵＣＯＣＡＲＤ）により測定した。
その後、ティラピアを水槽中に戻し、１．８５時間後（ｂ時点）及び３．４４時間後（ｃ時点）にそれぞれティラピアを取り出して、間質液中のグルコース濃度を血糖計で測定した。
バイオセンサＡによる電流の測定値と血糖値を表１及び図４に示す。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
ａ時点におけるバイオセンサＡの測定値は４．３７ｎＡ、血糖計によるグルコース濃度は１９４ｍｇ／ｄＬであり、ｂ時点におけるバイオセンサＡの測定値は１５．１１ｎＡ、血糖計によるグルコース濃度は２７２ｍｇ／ｄＬ、ｃ時点におけるバイオセンサＡの測定値は２２．４６ｎＡなので、これらの値から二点校正法によりｃ時点での血糖値Ｇ（ｔ）を求める。
電流とグルコース濃度とは比例するので、ｃ時点における電流値を式で表すと、
２２．４６＝Ｓ×Ｇ（ｔ）＋Ｉ0となる。
【００２４】
ａ時点及びｂ時点での計測結果から比例定数Ｓ及び切片Ｉ0を求めると、
Ｓ＝（１５．１１−４．３７）／（２７２−１９４）＝０．１４
Ｉ0＝４．３７−（０．１４×１９４）＝−２２．３５９８４となる。
よって、
Ｇ（ｔ）＝（２２．４６−Ｉ0）／Ｓ＝｛２２．４６−（−２２．３６）｝／０．１４＝３２５ｍｇ／ｄＬとなる。
ｃ時点で血糖計により計測したグルコース濃度は３１７ｍｇ／ｄＬなので、バイオセンサＡで測定した電流から計算で求めたグルコース濃度はほぼ正しいことがわかった。
【００２５】
また、ディスポーザブル型血糖計を用いて、ティラピアの眼球付近の粘膜内部から採取した間質液中のグルコース濃度と、血中グルコース濃度を一定時間ごとに測定した結果を図５に示す。
図５からは、間質液中のグルコース濃度は血中グルコース濃度よりやや低い傾向にあり、間質液中のグルコース濃度は血中グルコース濃度の変化に伴って一定の割合で変化し、両者には高い相関関係のあることがわかる。
従って、バイオセンサＡの出力から間質液中のグルコース濃度を算出することで、血中グルコース濃度のモニタリングも可能である。
【００２６】
さらに、本発明のバイオセンサＡ用電極と、表面に銀・塩化銀をコーティングした銀線を多数回巻いて対極としてある従来のバイオセンサ用電極の耐久性及び安定性を比較した。
本発明のバイオセンサＡに酵素を固定する前のバイオセンサ用電極、及び、従来のバイオセンサ用電極をｐＨ６．５のＰＢＳに浸漬し、０．６５０ｍＶの定電圧を印加して、電流値の変化を１週間モニタリングした。このモニタリング結果を図６及び図７に示す。
図６及び図７からわかるように、従来のバイオセンサ用電極が時間経過と共に大きく電位のずれが生じたのに対し、本発明のバイオセンサ用の電極は、非常に良い安定性を示した。このような違いが生ずるのは、従来のバイオセンサ用電極では、極細の銀線の表面に銀・塩化銀を電気化学的にコーティングしたものを巻いて対極としてあるので、コーティングが非常に薄くて剥がれやすく、銀・塩化銀が剥がれると、内部の銀線と表層の塩化銀の二つの金属が対極の役割を果たしてしまうことになり、電位が非常に不安定になるためではないかと考えられる。
【００２７】
図８及び図９は、本発明の実施例２を示す。
図８に示すように、バイオセンサＡの測定部８に、その測定値を無線送信する送信手段９を接続し、測定対象である生体魚類の近傍に、送信手段９からの信号を受信する受信手段１４を設置すると共に、受信手段１４に測定した電流をグルコース濃度へ変換する変換手段１５を接続してある。
定電圧装置７、測定部８及び送信手段９は無線ポテンシオスタット１７’としてユニット化されており、その定電圧装置７をバイオセンサＡの導線１０に接続した。
【００２８】
本実施例では、無線ポテンシオスタット１７’として、測定部８の出力信号をＦＭ波に変換して送信する送信手段９を備えた市販の無線ポテンシオスタット基盤（３１０２ＢＰ，ＰＩＮＮＡＣＬＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ株式会社製）を防水加工して使用した。この無線ポテンシオスタット１７’は、直径約３ｃｍ、重量３ｇと小型なので、魚類の表皮にベルトや軟組織用接着剤を用いて装着することができる。
また、ＦＭ波は淡水中で送信が可能なため、ＦＭ波を受信する受信手段１４で受信することができる。
【００２９】
図９に、本実施例のバイオセンサＡを淡水中に沈め、バイオセンサＡから発信された信号を、陸上に設置した受信手段（ＦＭ受信機，３１００ＲＸ）１４で受信した結果を示す。
本実施例によれば、バイオセンサＡと変換手段１５とを送信線１６で直接接続する必要が無いので、バイオセンサＡを装着された魚は自由に動くことができ、バイオセンサＡを試着したままで長期間に亘って測定することが可能であると共に、ストレスによってグルコース濃度が変動する心配が無い。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例１に係るバイオセンサを示す図。
【図２】サーフローの正面図。
【図３】生体魚類に外筒を埋設した状態を示す図。
【図４】測定した電流値を示す図。
【図５】間質液中のグルコース濃度と血中グルコース濃度との関係を示す図。
【図６】本発明のバイオセンサと従来のバイオセンサの電流値の変化を狭い電流範囲内で示す図。
【図７】本発明のバイオセンサと従来のバイオセンサの電流値の変化を広い電流範囲で示す図。
【図８】実施例２に係るバイオセンサとその周辺機器を示す図。
【図９】実施例２のバイオセンサからの出力信号をモニタリングした結果を示す図。
【符号の説明】
【００３１】
Ａ  バイオセンサ
Ｂ  眼球
Ｃ  粘膜
１  作用極
２  絶縁体
３  銀線
５  対極
６  球体
７  定電圧装置
８  測定部
９  送信手段
１０  導線
１１  酵素固定部
１２  注射針
１３  外筒
１４  受信手段
１５  変換手段
１６  送信線
１７  ポテンシオスタット
１７’  無線ポテンシオスタット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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