(57)【要約】【課題】本発明はタンパク質水溶液の濁り抑制方法および組成物に関する。【解決手段】目的のタンパク質水溶液の溶状を安定化するため、該タンパク質に加え、セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物を水溶液中に共存させることにより、濁りの発生を抑制できる。目的のタンパク質に加え、セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物が水溶液中に共存した濁り抑制組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質に加え、セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物を共存させることを特徴とする、タンパク質水溶液の濁りの発生を抑制する方法。
【請求項２】
目的のタンパク質に加え、セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物とセリンを共存させることを特徴とする、タンパク質水溶液の濁りの発生を抑制する方法。
【請求項３】
セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物を、水溶液中に終濃度０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）含有させることを特徴とする、請求項１または２記載の濁り抑制方法。
【請求項４】
セリシンおよび／またはその加水分解物が繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の濁り抑制方法。
【請求項５】
セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の濁り抑制方法。
【請求項６】
セリンを、水溶液中に終濃度０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）含有させることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項記載の濁り抑制方法。
【請求項７】
目的のタンパク質が、乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質、糖タンパク質から選ばれたものであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の濁り抑制方法。
【請求項８】
糖タンパク質が、天然型タンパク質がその表面で受ける修飾を受けていない組換え型タンパク質であることを特徴とする、請求項７記載の濁り抑制方法。
【請求項９】
目的のタンパク質に加え、セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物が水溶液中に共存したことを特徴とする、濁り抑制組成物。
【請求項１０】
目的のタンパク質に加え、セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物とセリンが水溶液中に共存したことを特徴とする、濁り抑制組成物。
【請求項１１】
セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物が、水溶液中に終濃度０．０１〜１％（ｗ／ｖ）含有することを特徴とする、請求項９または１０記載の濁り抑制組成物。
【請求項１２】
セリシンおよび／またはその加水分解物が繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものであることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項記載の濁り抑制組成物。
【請求項１３】
セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものであることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項記載の濁り抑制組成物。
【請求項１４】
セリンを、水溶液中に終濃度０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）含有させることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の濁り抑制組成物。
【請求項１５】
目的のタンパク質が、乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質、糖タンパク質から選ばれたものであることを特徴とする、請求項９〜１４のいずれか１項記載の濁り抑制組成物。
【請求項１６】
糖タンパク質が、天然型タンパク質がその表面で受ける修飾を受けていない組換え型タンパク質であることを特徴とする、請求項１５記載の濁り抑制組成物。
【請求項１７】
請求項９〜１６のいずれか１項記載の濁り抑制組成物を含む診断用キット。
【請求項１８】
請求項９〜１６のいずれか１項記載の濁り抑制組成物を含むバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なタンパク質水溶液の濁り抑制方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を実用化するに際し、その水に対する溶解性の低さが欠点となるケースが少なからず見受けられる。タンパク質を構成するアミノ酸には、トリプトファンやフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンなどの疎水性アミノ酸が含まれており、タンパク質の分子表面にこれらのアミノ酸が存在すると、タンパク質自身の疎水性を高めることとなり、水溶液中で保存時に水溶性が低下して、濁りの発生が見られることがある。水溶性が極めて低い実用的タンパク質の例としては、乳タンパク質であるカゼイン、植物貯蔵タンパク質である小麦グルテン及びその成分であるグリアジン、硬タンパク質であるコラーゲンなどがある。これらのタンパク質の利用のため、水溶性を高める方法が種々試みられてきた（例えば、特許文献１、２、３、４、５参照）。
【０００３】
しかしながら、これまで行われてきた方法は、目的タンパク質を酸やアルカリでの処理、熱処理、或いは酵素的または化学的に加水分解することによる低分子量化など、タンパク質本来の構造を維持するのが困難な条件を伴っていた。また、糖やコハク酸などの化合物によりタンパク質表面を化学的、物理的に修飾し、水溶性を高める方法も試みられており、成果をあげている。しかし、修飾を伴う方法は目的タンパク質の表面状態を変えるため、該タンパク質の特性を変化させることになる。更に、修飾処理を伴う方法も、熱処理や酸・アルカリ処理ほどではないにしても目的タンパク質が変性する危険を伴う。なにより、修飾を伴う方法は操作が煩雑で、手間がかかる。
【０００４】
一方、不溶性タンパク質の可溶化技術は、研究分野においても重要な要素技術のひとつである。特に、遺伝子操作技術によるタンパク質の生産では、宿主生物が本来生産しないタンパク質、すなわち異種タンパク質を発現させると、本来のコンフォメーションをとれずに疎水性の高いタンパク質として凝集、不溶化し、いわゆるインクルージョンボディとなる。このインクルージョンボディを正常なタンパク質とするには、まず可溶化する必要があり、尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤を用いて一旦変性させ、その後で正常なタンパク質に再構成させるという煩雑な操作が必要となる。変性を伴わない温和な可溶化方法が確立できれば、異種タンパク質の高生産技術が大きく飛躍すると考えられる。
【０００５】
このような状況から、水溶性が低いタンパク質の溶解性を改善する方法として、目的タンパク質の構造変化や変性を伴わない温和な条件で実施可能であり、且つ、従来よりも簡便な方法が強く望まれていた。
【０００６】
また、水溶性の低いタンパク質は、その水溶液での保存中に濁りを発生することがあり、目的タンパク質含有水溶液をピペット操作により小分注する際に、チップ先端に目詰まりを起こすことがある。例えば、目的タンパク質含有水溶液を一定量ずつ滴下して、生体成分分析用のセンサチップを作製する際に、試薬滴下量にバラツキが生じた場合、分析結果に誤差を生じる危険性がある。そこで、タンパク質含有水溶液の濁り発生を抑制する方法の開発が望まれていた。
【０００７】
タンパク質含有水溶液の濁り発生を抑制する方法として、従来法である該タンパク質の酸・アルカリ処理、熱処理、或いは加水分解での低分子量化、タンパク質変性剤の使用などは、タンパク質本来の構造を維持できないという問題がある。また、タンパク質表面の化学的・物理的修飾による濁り抑制方法は、該タンパク質の特性を変化させてしまう、該タンパク質が変性する危険を伴う、操作が煩雑で手間がかかるという課題が考えられる。
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−１８６８７号公報
【特許文献２】特開平６−７３０８９号公報
【特許文献３】特開２００４−１１３１８２号公報
【特許文献４】特開２００３−２５０４６０号公報
【特許文献５】特開平７−２５８２９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、タンパク質含有水溶液の濁り発生を抑制する方法であって、従来法と異なり目的タンパク質の構造変化や変性を伴わない温和な条件で実施可能であり、且つ、従来よりも簡便な方法と、それによって濁り発生が抑制された組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成する為に種々検討した結果、セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物を目的タンパク質と水溶液中に共存させることにより、目的タンパク質を含有する水溶液の濁り発生を効果的に抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のようなものである。
［１］目的のタンパク質に加え、セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物を共存させることを特徴とする、タンパク質水溶液の濁りの発生を抑制する方法。
［２］目的のタンパク質に加え、セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物とセリンを共存させることを特徴とする、タンパク質水溶液の濁りの発生を抑制する方法。
［３］セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物を、水溶液中に終濃度０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）含有させることを特徴とする、［１］または［２］の濁り抑制方法。
［４］セリシンおよび／またはその加水分解物が繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものであることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかの濁り抑制方法。
［５］セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものであることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかの濁り抑制方法。
［６］セリンを、水溶液中に終濃度０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）含有させることを特徴とする、［２］〜［５］のいずれかの濁り抑制方法。
［７］目的のタンパク質が、乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質、糖タンパク質から選ばれたものであることを特徴とする、［１］〜［６］のいずれかの濁り抑制方法。
［８］糖タンパク質が、天然型タンパク質がその表面で受ける修飾を受けていない組換え型タンパク質であることを特徴とする、［７］の濁り抑制方法。
［９］目的のタンパク質に加え、セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物が水溶液中に共存したことを特徴とする、濁り抑制組成物。
［１０］目的のタンパク質に加え、セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物とセリンが水溶液中に共存したことを特徴とする、濁り抑制組成物。
［１１］セリシンおよび／またはその加水分解物もしくはその同等物が、水溶液中に終濃度０．０１〜１％（ｗ／ｖ）含有することを特徴とする、［９］または［１０］の濁り抑制組成物。
［１２］セリシンおよび／またはその加水分解物が繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものであることを特徴とする、［９］〜［１１］のいずれかの濁り抑制組成物。
［１３］セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものであることを特徴とする、［９］〜［１１］のいずれかの濁り抑制組成物。
［１４］セリンを、水溶液中に終濃度０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）含有させることを特徴とする、［１０］〜［１３］のいずれかの濁り抑制組成物。
［１５］目的のタンパク質が、乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質、糖タンパク質から選ばれたものであることを特徴とする、［９］〜［１４］のいずれかの濁り抑制組成物。
［１６］糖タンパク質が、天然型タンパク質がその表面で受ける修飾を受けていない組換え型タンパク質であることを特徴とする、［１５］の濁り抑制組成物。
［１７］［９］〜［１６］のいずれかの濁り抑制組成物を含む診断用キット。
［１８］［９］〜［１６］のいずれかの濁り抑制組成物を含むバイオセンサー。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、セリシンやその加水分解物またはその同等物を用いることにより、目的タンパク質を含有する水溶液の濁り発生を抑制することができ、これらタンパク質、およびタンパク質を用いた組成物の用途を拡大させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
我々は、先の検討においてセリン添加により、目的タンパク質溶液の熱安定性および粉末安定性が向上することを見出している。そこで、本検討では、予めセリンを含有させた条件で検討している。また、現在、ＢＳＡは目的タンパク質を安定化する効果が高いタンパク質性の賦形剤として汎用されている。実際、データは未収載であるが、ＢＳＡが存在しない条件下で、目的タンパク質を凍結乾燥処理すると活性値として５０％前後の回収率しか得られていない。そこで、本検討では、セリンとＢＳＡを含む組成物をコントロールとして、これよりも濁り抑制効果の高いタンパク質性賦形剤をスクリーニングすることにより、本発明に至っている。
【００１３】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のタンパク質水溶液の濁りの発生を抑制する方法に用いるセリシンは、繭糸や生糸から抽出される天然状態のものを用いても良いし、その加水分解物を用いても良く、その同等物であっても良い。本発明の実施例においては、セリシン加水分解物を用いている。
【００１４】
セリシンは、国際公開第２００２／０８６１３３号パンフレットに開示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、３８アミノ酸からなる機能性ペプチドの繰り返し配列で構成されており、加水分解物とは、該機能性ペプチドを含む天然物由来セリシンが酸やアルカリにより加水分解されたものなどをいう。また、同等物とは、少なくとも１以上の機能性ペプチドを含むように化学合成されたものや、遺伝子工学的手法により、微生物などで製造されるものをいう。さらに、これらにおいては、本発明の安定化作用を損なわない範囲内で、あるいはその特性を改善する目的で、天然型アミノ酸配列に対して、アミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加されたものであっても良い。
【００１５】
本発明の方法は、タンパク質（ペプチドを含む）水溶液の濁りの発生の抑制を、同じくタンパク質であるセリシンやその加水分解物、その同等物を用いて行うという簡易な手法である。セリシン加水分解物を保湿剤、抗酸化剤として利用したり、界面活性剤として脂質の乳化安定性改善に利用する研究については既に報告が存在するが（特開平１１−２７６８７６号公報）、本発明は、可溶化した目的タンパク質が析出する現象を別のタンパク質が抑制するという従来には無い発想に基づいている。
【００１６】
本発明に用いるセリシンやその加水分解物、その同等物は、国際公開第２００２／０８６１３３号パンフレットに開示される公知の方法に従って得ることができる。
【００１７】
本発明の濁り抑制方法の対象となるタンパク質は特に限定されるものではないが、例えば、食品に利用されるタンパク質、医薬品として利用されるタンパク質、酵素、抗体、抗原など、またはそれらを含有する組成物などが挙げられる。
【００１８】
タンパク質の種類も特に限定されるものではないが、一部例を挙げると、乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質、糖タンパク質などが挙げられる。「乳タンパク質」は、乳汁に含まれるタンパク質をいい、カゼイン、乳漿タンパク質などが例としてあげられる。「植物貯蔵タンパク質」は植物体にエネルギー源などとして貯えられるタンパク質をいい、小麦グルテン、大豆蛋白などが例としてあげられる。「硬タンパク質」は、通常の塩水溶液などには溶けないタンパク質をいい、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロイン、レシリンなどが例として挙げられる。「糖タンパク質」は、糖とタンパク質からなる物質をいう。また、天然型タンパク質がその表面で受ける修飾を受けていない組換え型タンパク質、すなわち、例えば、糸状菌タンパク質などの糖タンパク質を原核生物などを宿主として組換え生産した際に本来の糖の修飾を受けていないタンパク質なども挙げられる。
【００１９】
これらのタンパク質は、他の物質と混合された液状組成物などであってもよい。このような組成物は、適当な容器に入れられたり、適当なデバイスに搭載されて、例えば、分子生物学用途の分析試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工した体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品、食品および飲料など、種々の形態をとることができる。従って、本発明により、濁り抑制組成物、それを含む診断用キット、バイオセンサーが提供される。
【００２０】
本発明においては、水溶液のｐＨ緩衝作用、タンパク質の安定化などの目的で、さらに他の物質を混合しても良い。例えば水溶液は、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳなどのＧｏｏｄ緩衝液の状態であって良く、フタル酸バッファーなどのようなジカルボン酸を用いた緩衝液でもよい。この様な水溶液中に硫安、燐安、食塩、塩化カリウムなどの塩類を含んでいても良い。また、エタノールやメタノール、プロパノールなどのアルコール類、グリセロールやエチレングリコールなどのポリオール類、アルキルグルコシド、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、脂肪酸アルコールエステルなどの界面活性剤を添加しても良い。必要に応じて、ペニシリン系、セフェム系、アミノ配糖体系、マイクロライド系、テトラサイクリン系、ニュー・キノロン系等の抗生物質、アジ化物、１，１‘−Ｍｅｔｈｙｌｅｎ−ｂｉｓ［３−（１−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｄｉｏｘｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎ−５−ｙｌ）−ｕｒｅａ］、２−Ｍｅｔｈｙｌ−３（２Ｈ）−ｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ−ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、５−Ｂｒｏｍｏ−５−ｎｉｔｒｏ−１，３−ｄｉｏｘａｎｅ、２−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ、２−Ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅなどの防腐剤を添加しても良い。
【００２１】
本発明のタンパク質水溶液の濁り抑制方法に用いるセリシンやその加水分解物またはその同等物の、水溶液中における濃度は、特に限定されないが、好ましくは終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）含有させると良い。さらに好ましくは、終濃度０．１〜１％（ｗ／ｖ）含有させると良い。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００２３】
試験例１：ＦＡＤ依存型ＧＤＨ活性の測定方法
本発明において、ＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
＜試薬＞
５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１６３ｍＭ  ＰＭＳ溶液
６．８ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液
【００２４】
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．６ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００２５】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
【００２６】
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
【００２７】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００２８】
実施例１：糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ組換え体標品の調製
アスペルギルス・オリゼの菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号３、４に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡを鋳型としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡績製）を用いてアスペルギルス・オリゼのＧＤＨ（ＡＯＧＤＨ）遺伝子を増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミド（ｐＡＯＧＤＨ）を構築した。
【００２９】
このプラスミドを、コンピテントハイ  ＤＨ５α（東洋紡績製）を用いて導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号１）。ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５９３アミノ酸（配列番号２）であった。
【００３０】
次に、このプラスミドを鋳型に配列番号５のオリゴＤＮＡにて、Ｑｕｉｃｋ ｃｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、５７２位のＶａｌをＣｙｓにするアミノ酸置換を行なった。この遺伝子操作により得られたプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−ＶＸと名づけた。ｐＡＯＧＤＨ−ＶＸをコンピテントハイ  ＤＨ５α（東洋紡績製）に導入した形質転換体をＴＢ培地（２．４％酵母エキス、１．２％ポリペプトン、１．２５％リン酸１水素２カリウム、０．２３％リン酸２水素１カリウム、０．４％グリセロール、５０μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、ｐＨ７．０）にて１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて培養温度３０℃、通気量２Ｌ／分、攪拌回転速度３３０ｒｐｍで２４時間培養した。
【００３１】
培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ５．５）に６６０ｎｍでの菌体濁度が約５０となるように懸濁し、６５ＭＰａの圧力でホモジナイザー破砕を行った。破砕液を遠心分離して得た上清に終濃度９％となるようポリエチレンイミンを添加することで核酸等を沈殿させ、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ５．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去すると同時に、１０ｍＭフタル酸バッファーに置換したＡＯＧＤＨ―ＶＸ組換え体標品を調製した。
【００３２】
実施例２：ＡＯＧＤＨ―ＶＸ組換え体標品の粉末化
実施例１で得られた組換えＡＯＧＤＨ―ＶＸ標品を濃縮して、Ａ２８０測定値が２０（ｍｇ／ｍｌ）となるように調製した。次に、この濃縮標品に対して、タンパク質重量比で数１０％となるように賦形剤を添加した。例えば、２０％セリン、６０％ＢＳＡを含有する賦形剤では、４ｍｇ／ｍｌとなるようにセリンと１２ｍｇ／ｍｌとなるようにＢＳＡを添加した。
【００３３】
表１に示す各種賦形剤の組合せで調製した溶液を、０．４５μｍのフィルターでろ過した後、凍結乾燥を実施した。なお、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）としてＡＬＢＵＭＩＮ、ＢＯＶＩＮＥ ＦｒａｃｔｉｏｎＶ（シグマ製）を用い、セリシン加水分解物としてＮＥＯ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＡＶＥＲ（東洋紡製）を用いた。表中のセリシンとある記載はセリシン加水分解物を表している。凍結乾燥(ＦＤＲ)後得られた粉末酵素標品の活性を測定して、粉末量から総活性量を計算したところ、いずれのサンプルにおいても、ＦＤＲ前後で９０％以上の活性回収率が確認できた。
【００３４】
実施例３：各種粉末標品の溶解性検討
実施例２で得られた各サンプルの粉末標品を５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように蒸留水で溶解した後、３０℃の恒温室で保存して、各サンプル溶解液の濁りの発生状況をＯＤ６６０ｎｍの吸光度を指標に調査した。
【００３５】
ＢＳＡを単独で賦形剤とした時には、溶解直後に１００ｍＡｂｓを超える吸光度があり、セリンを添加することにより、初期吸光度の上昇を著しく抑制できることが明らかとなった。一方、セリシン加水分解物を単独で添加した時には、溶解直後でも数ｍＡｂｓの吸光度に抑えることができた。結果を表１に示す
【００３６】
以上の結果から、セリンおよび／またはセリシン加水分解物の存在によりタンパク質の可溶性が向上することが明らかとなった。
【００３７】
【表１】
2008261653.tif 000002
【００３８】
実施例４：各種粉末標品の濁り発生状況の検討
実施例２と同じ要領にて、２０％セリン、６０％ＢＳＡ、または、２０％セリン、３０％セリシン加水分解物を賦形剤とする２種類の組換えＡＯＧＤＨ―ＶＸ粉末標品を調製した。各粉末標品サンプルを加湿処理、および／または、加速処理した後、各粉末サンプルの粉末安定性を調べた。なお、粉末安定性は、凍結乾燥直後の各粉末サンプルの活性値を１００％として、各処理後の活性値から、相対的な活性残存率を計算して指標とした。
【００３９】
加湿処理と加速処理後の各サンプルの安定性を比較したところ、セリン、ＢＳＡの組合せでは、約７０％程度の残存率であったが、セリン、セリシン加水分解物の組合せにより、約９０％の残存率が得られた。
【００４０】
次に、各処理を施した粉末サンプルを５ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水で溶解して、濁りの発生状況を調べたところ、セリン、セリシン加水分解物の組合せにより、セリン、ＢＳＡの組合せと比べて、濁りの発生を著しく抑制できることが明らかとなった。結果を表２に示す。
【００４１】
なお、セリシン加水分解物の濁りの抑制効果は、この粉末溶解濃度に限られたものではなく、広い濃度範囲で認められている。
【００４２】
【表２】
2008261653.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によれば、産業上有用なタンパク質水溶液の濁り発生を抑制することができ、これらタンパク質を用いた組成物の用途を拡大することが可能となる。食品分野、医薬品分野など産業界に寄与することが大である。
【配列表フリーテキスト】
【００４４】
SEQ ID NO:3: The sequence of designed polynucleotide described in Example 1
SEQ ID NO:4: The sequence of designed polynucleotide described in Example 1
SEQ ID NO:5: The sequence of designed polynucleotide described in Example 1
【配列表】
2008261653000001.app