(57)【要約】      （修正有）【課題】被検試料中の広範囲の血清型のサルモネラ属菌の存否を、前培養することなく迅速かつ簡便に、ハイスループットで検出する。【解決手段】特定の塩基配列などを有する、被検試料中のサルモネラ属（Salmonella）菌を検出するためのオリゴヌクレオチド、かかるオリゴヌクレオチドを用いるサルモネラ属菌の検出方法、およびかかるオリゴヌクレオチドを含むサルモネラ属菌の検出用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中のサルモネラ属（Salmonella）菌を検出するためのプローブまたはプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドであって、
（１）配列表の配列番号１ないし８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、
（２）（１）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の塩基配列に対応するリボ核酸（ＲＮＡ）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、
（３）上記の（１）または（２）の塩基配列と少なくとも７０％以上のホモロジーを有し、かつ、サルモネラ属菌のsigＤまたはfimＡ領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
（４）上記の（１）または（２）の塩基配列において１ないし数個の塩基が欠失、置換および／または付加した塩基配列を有し、かつ、サルモネラ属菌のsigＤまたはfimＡ領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、および
（５）上記の（１）から（４）のオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
よりなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
サルモネラ属菌のsigＤまたはfimＡ領域の核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅用のプライマー対として用いる請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
（１）配列表の配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および、
（２）配列表の配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
よりなる群から選択される請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
被検試料中のサルモネラ属菌のsigＤまたはfimＡ領域の核酸の検出用のプローブとして用いる請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
サルモネラ属菌がサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・エンテリティディス（S.enteritidis）、サルモネラ・コレラスイス（S.choleraesuis）、サルモネラ・チフィ（S.typhi）およびサルモネラ・パラチフィ（S.paratyphi）よりなる群から選択される請求項１ないし４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
被検試料中のサルモネラ属菌を検出するための方法であって、
（１）被検試料から菌検出用画分を調製し；
（２）該菌検出用画分を、
（ｉ）配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および
（ｉｉ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
から選択される少なくとも１組のオリゴヌクレオチドをプライマー対として用いるＰＣＲ増幅に付し；ついで
（３）ＰＣＲ増幅産物の存否を調べてサルモネラ属菌を検出する
工程を含む方法。
【請求項７】
（１）の菌検出用画分の調製工程が、抗−サルモネラ属菌抗体−結合磁性ビーズを用いたサルモネラ属菌の濃縮を含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
（３）のサルモネラ属菌の検出工程が、
（ｉ）配列番号４または８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを電極に結合し、配列番号３または７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを酵素に結合し、または、配列番号４または８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを酵素に結合し、配列番号３または７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを電極に結合し、これらのオリゴヌクレオチドを工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物と反応させ；
（ｉｉ）反応物を洗浄して非特異的な結合物を除去し；
（ｉｉｉ）洗浄後の反応物に該酵素の基質を加え、ここに該基質が該酵素との反応により電気化学的性質が変化するかまたは溶液の電気化学的性質を変化させ；
（ｉｖ）該電極に流れる電流の変化を測定し、電流の変化が生じる場合は被検試料中にサルモネラ属菌が存在すると判定する
ことを含む請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
サルモネラ属菌がサルモネラ・チフィムリウム、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・コレラスイス、サルモネラ・チフィおよびサルモネラ・パラチフィよりなる群から選択される請求項６ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
被検試料が食品、飲用水、河川水、地下水、廃水、血液、嘔吐物および組織滲出液よりなる群から選択される請求項６ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、または、配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、
電極に結合した配列番号４または８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび酵素に結合した配列番号３または７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、または、酵素に結合した配列番号４または８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび電極に結合した配列番号３または７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、
該酵素との反応により電気化学的性質が変化するかまたは溶液の電気化学的性質を変化させる基質とを含む、請求項８記載の方法により被検試料中のサルモネラ属菌を検出するためのキット。
【請求項１２】
サルモネラ属菌がサルモネラ・チフィムリウム、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・コレラスイス、サルモネラ・チフィおよびサルモネラ・パラチフィよりなる群から選択される請求項１１記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サルモネラ属菌を検出するためのオリゴヌクレオチド、それを用いた該サルモネラ属菌を検出するための方法および検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、食品等の被検試料中のサルモネラ属菌を検出する技術として、サルモネラ属菌が保有する種々の遺伝子領域がターゲットとされている（特許文献１）。詳細には、病原性を有するサルモネラ属菌が保有する遺伝子領域に相補的なオリゴヌクレオチドを作製し、それを検出用のプローブおよび／または増幅反応用のプライマー対として用いて被検試料中のサルモネラ属菌を検出する技術である。特に、特定のプライマー対を用いるＰＣＲ法は特定の遺伝子を迅速かつ簡便に増幅し、その遺伝子を保有する生物の存否を検出することができる、現在のところ最も鋭敏な手段である。サルモネラ属菌についても特有の遺伝子領域を同定し、その遺伝子領域に対応したプライマー対を用いたＰＣＲ法で特定の遺伝子領域を増幅することにより、その菌の存否を判定することができる。
【０００３】
一方、被検試料中のサルモネラ属菌を検出することは、感染源を特定し、また感染者によるその後の二次感染を予防して病原菌の拡散を阻止するためにも、より迅速に検出することが求められる。また、サルモネラ属菌には多数の血清型を有するものが存在し、多くの血清型のサルモネラ属菌が食中毒等の病原性を有することから、一回の検査で広範囲のサルモネラ属菌をカバーする検出技術も求められる。
【０００４】
しかしながら、従来のサルモネラ属菌の検出方法は遺伝子増幅の効率が十分に高いとはいえず、被検試料を検査する前に培養してサルモネラ属菌の菌数を増やし、一定の量のサルモネラ属菌遺伝子を得た後に増幅させる必要があった。そのため、検出に時間がかかり、感染源や感染者の特定が遅れてその間に病原菌の拡散が進行してしまうという問題があった。また、従来の検出方法は狭い範囲のサルモネラ属菌を特異的に標的とするものであったため、被検試料中に存在するサルモネラ属菌が標的とする血清型のものと異なる場合には、被検試料中のサルモネラ属菌が増殖して食中毒を引き起こす危険性があるにもかかわらず、陰性と判定されてしまうという問題があった。
【特許文献１】特開平８−２９４３９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、被検試料中のサルモネラ属菌を前培養することが不要であって、迅速かつ簡便に広範囲のサルモネラ属菌を検出することができる遺伝子増幅／検出用のオリゴヌクレオチド、ならびにかかるオリゴヌクレオチドを用いたサルモネラ属菌の検出方法および検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上述したような状況に鑑みて鋭意検討した結果、広範囲の血清型のサルモネラ属菌に共通する遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドの中でも、プライマー対として使用した場合に優れた遺伝子増幅効率を示す特定のオリゴヌクレオチドを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］  被検試料中のサルモネラ属（Salmonella）菌を検出するためのプローブまたはプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドであって、
（１）配列表の配列番号１ないし８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、
（２）（１）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の塩基配列に対応するリボ核酸（ＲＮＡ）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、
（３）上記の（１）または（２）の塩基配列と少なくとも７０％以上のホモロジーを有し、かつ、サルモネラ属菌のsigＤまたはfimＡ領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
（４）上記の（１）または（２）の塩基配列において１ないし数個の塩基が欠失、置換および／または付加した塩基配列を有し、かつ、サルモネラ属菌のsigＤまたはfimＡ領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、および
（５）上記の（１）から（４）のオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
よりなる群から選択されるオリゴヌクレオチド；
［２］  サルモネラ属菌のsigＤまたはfimＡ領域の核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅用のプライマー対として用いる前記［１］記載のオリゴヌクレオチド；
［３］  （１）配列表の配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および、
（２）配列表の配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
よりなる群から選択される前記［２］記載のオリゴヌクレオチド；
［４］  被検試料中のサルモネラ属菌のsigＤまたはfimＡ領域の核酸の検出用のプローブとして用いる前記［１］記載のオリゴヌクレオチド；
［５］  サルモネラ属菌がサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・エンテリティディス（S.enteritidis）、サルモネラ・コレラスイス（S.choleraesuis）、サルモネラ・チフィ（S.typhi）およびサルモネラ・パラチフィ（S.paratyphi）よりなる群から選択される前記［１］ないし［４］のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチド；
［６］  被検試料中のサルモネラ属菌を検出するための方法であって、
（１）被検試料から菌検出用画分を調製し；
（２）該菌検出用画分を、
（ｉ）配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および
（ｉｉ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
から選択される少なくとも１組のオリゴヌクレオチドをプライマー対として用いるＰＣＲ増幅に付し；ついで
（３）ＰＣＲ増幅産物の存否を調べてサルモネラ属菌を検出する
工程を含む方法；
［７］  （１）の菌検出用画分の調製工程が、抗−サルモネラ属菌抗体−結合磁性ビーズを用いたサルモネラ属菌の濃縮を含む前記［６］記載の方法；
［８］  （３）のサルモネラ属菌の検出工程が、
（ｉ）配列番号４または８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを電極に結合し、配列番号３または７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを酵素に結合し、または、配列番号４または８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを酵素に結合し、配列番号３または７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを電極に結合し、これらのオリゴヌクレオチドを工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物と反応させ；
（ｉｉ）反応物を洗浄して非特異的な結合物を除去し；
（ｉｉｉ）洗浄後の反応物に該酵素の基質を加え、ここに該基質が該酵素との反応により電気化学的性質が変化するかまたは溶液の電気化学的性質を変化させ；
（ｉｖ）該電極に流れる電流の変化を測定し、電流の変化が生じる場合は被検試料中にサルモネラ属菌が存在すると判定する
ことを含む前記［６］または［７］記載の方法；
［９］  サルモネラ属菌がサルモネラ・チフィムリウム、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・コレラスイス、サルモネラ・チフィおよびサルモネラ・パラチフィよりなる群から選択される前記［６］ないし［８］のいずれか１に記載の方法；
［１０］  被検試料が食品、飲用水、河川水、地下水、廃水、血液、嘔吐物および組織滲出液よりなる群から選択される前記［６］ないし［９］のいずれか１に記載の方法；
［１１］  配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、または、配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、
電極に結合した配列番号４または８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび酵素に結合した配列番号３または７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、または、酵素に結合した配列番号４または８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび電極に結合した配列番号３または７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、
該酵素との反応により電気化学的性質が変化するかまたは溶液の電気化学的性質を変化させる基質とを含む、前記［８］記載の方法により被検試料中のサルモネラ属菌を検出するためのキット；
［１２］  サルモネラ属菌がサルモネラ・チフィムリウム、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・コレラスイス、サルモネラ・チフィおよびサルモネラ・パラチフィよりなる群から選択される前記［１１］記載のキット
を提供するものである；
【発明の効果】
【０００８】
本発明の請求項１に係るオリゴヌクレオチドによれば、広範囲のサルモネラ属菌を高い効率で増幅し、また、高感度で検出できるため、被検試料を前培養することなく広範囲のサルモネラ属菌の存否を迅速かつ簡便に調べることができる。
【０００９】
本発明の請求項２に係るオリゴヌクレオチドによれば、前記請求項１に係るオリゴヌクレオチドと比較して、広範囲のサルモネラ属菌を高い効率でＰＣＲ増幅するためのプライマー対として好適なオリゴヌクレオチドを提供し得るため、被検試料中の広範囲のサルモネラ属菌の存否を高感度、迅速かつ簡便に調べることができる。
【００１０】
本発明の請求項３に係るオリゴヌクレオチドによれば、前記請求項２に係るオリゴヌクレオチドと比較して、広範囲のサルモネラ属菌の核酸を特に高い効率でＰＣＲ増幅し得るオリゴヌクレオチドを提供し得るため、被検試料中の広範囲のサルモネラ属菌をより高感度、迅速に調べることができる。
【００１１】
本発明の請求項４に係るオリゴヌクレオチドによれば、前記請求項１に係るオリゴヌクレオチドと比較して、サルモネラ属菌の核酸に特異的なオリゴヌクレオチドを提供し得るため、被検試料中の広範囲のサルモネラ属菌の存否を迅速、簡便かつ高感度で調べることができる。
【００１２】
本発明の請求項５に係るオリゴヌクレオチドによれば、前記請求項１ないし４に係るオリゴヌクレオチドと比較して、特に検出に適したサルモネラ属菌に適用されるオリゴヌクレオチドを提供し得るため、被検試料中のサルモネラ属菌の存否をより正確に調べることができる。
【００１３】
本発明の請求項６に係る方法によれば、広範囲のサルモネラ属菌を高い効率で増幅し得るため、被検試料を前培養することなく、被検試料中の広範囲のサルモネラ属菌の存否を迅速かつ簡便に、高感度で調べることができる。
【００１４】
本発明の請求項７に係る方法によれば、前記請求項６に係る方法と比較して、被検試料においてサルモネラ属菌を濃縮し得るため、被検試料中のサルモネラ属菌の存否をより高感度かつ迅速に調べることができる。
【００１５】
本発明の請求項８に係る方法によれば、前記請求項６または７に係る方法と比較して、サルモネラ属菌のＤＮＡの存否を電気化学的に測定し、また検出を自動化し得るため、被検試料中の広範囲のサルモネラ属菌の存否をより高感度、迅速、簡便かつハイスループットで調べることができる。
【００１６】
本発明の請求項９に係る方法によれば、前記請求項６ないし８に係る方法と比較して、特に検出に適したサルモネラ属菌に適用される方法を提供し得るため、被検試料中のサルモネラ属菌の存否をより正確に調べることができる。
【００１７】
本発明の請求項１０に係る方法によれば、前記請求項６ないし９に係る方法と比較して、特にサルモネラ属菌の拡散を予防するために重要な被検試料について本発明の方法を適用し得るため、有効にサルモネラ属菌の感染源または感染者を特定することができ、有効にサルモネラ属菌の拡散が予防される。
【００１８】
本発明の請求項１１に係るキットによれば、サルモネラ属菌のＤＮＡの存否を電気化学的に測定し得るため、被検試料中の広範囲のサルモネラ属菌の存否を高感度、迅速、簡便かつハイスループットで調べることができる。
【００１９】
本発明の請求項１２に係るキットによれば、前記請求項１１に係るキットと比較して、特に検出に適したサルモネラ属菌に適用されるキットを提供し得るため、被検試料中のサルモネラ属菌の存否をより正確に調べることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、第１の態様において、被検試料中のサルモネラ属菌を検出するためのオリゴヌクレオチドを提供し、具体的にはサルモネラ属菌の核酸増幅用のプライマー対または検出用のプローブとして好適なオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、サルモネラ属菌のsigＤ（宿主浸入性タンパク質遺伝子）領域またはfimＡ（繊毛タンパク質遺伝子）領域の一部分をコードするオリゴヌクレオチドであり、sigＤ領域のオリゴヌクレオチドは以下に示す配列表の配列番号１ないし４の塩基配列を有する。また、fimＡ領域のオリゴヌクレオチドは以下に示す配列番号５ないし８の塩基配列を有する。
【００２１】
【表１】
2008161170.tif 000002
【００２２】
このうち、配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは１６９２塩基対からなるサルモネラ属菌のsigＤ領域の５４１ｎｔから５６０ｎｔまでの２０塩基をコードし、配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドはsigＤ領域の９１１ｎｔから９３０ｎｔまでの２０塩基をコードする。また、配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドはsigＤ領域の６０５ｎｔから６２４ｎｔまでの２０塩基をコードし、配列番号４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドはsigＤ領域の８３７ｎｔから８５６ｎｔまでの２０塩基をコードする。
【００２３】
また、配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは６５３塩基対からなるサルモネラ属菌のfimＡ領域の９０ｎｔから１０９ｎｔまでの２０塩基をコードし、配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドはfimＡ領域の３７０ｎｔから３８９ｎｔまでの２０塩基をコードする。また、配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドはfimＡ領域の１４８ｎｔから１６７ｎｔまでの２０塩基をコードし、配列番号８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドはfimＡ領域の２５０ｎｔから２６９ｎｔまでの２０塩基をコードする。
【００２４】
また、本発明のオリゴヌクレオチドには、上記の（１）の配列表の配列番号１ないし８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのほか、
（２）上記（１）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の塩基配列に対応するリボ核酸（ＲＮＡ）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、
（３）上記（１）または（２）のオリゴヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のホモロジーを有し、かつ、サルモネラ属菌のsigＤまたはfimＡ領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
（４）上記（１）または（２）のオリゴヌクレオチドの塩基配列において１ないし数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列を有し、かつ、サルモネラ属菌のsigＤまたはfimＡ領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、および
（５）上記（１）から（４）のオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
が含まれる。
これらのオリゴヌクレオチドは、サルモネラ属菌のゲノムＤＮＡから公知の遺伝子工学的手法によって入手することができ、または、この塩基配列に基づき公知のホスホロアミダイト法等によって化学的に合成することができる。
【００２５】
ここで「ハイブリダイズする」という場合は、２の核酸間の特異的な結合を検出するサザン法またはノザン法などで通常使用される条件下で本発明のオリゴヌクレオチドが結合する状態をいい、より好ましくはストリンジェントな条件下で結合する状態をいう。ストリンジェントな条件の例としては、２×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、９０℃にて３分間、７６℃にて２０秒間、５５℃にて３０秒間につづく２５℃にて３０分間のハイブリダイゼーションまたは５×ＳＳＣ中、９５〜１００℃にて１０分間加熱した後４２℃にて一晩のハイブリダイゼーションの後、２×ＳＳＣ中、２５℃にての洗浄が挙げられる。
【００２６】
また、「１ないし数個の塩基」という場合は、好ましくは１ないし１５個、より好ましくは１ないし１０個、さらに好ましくは１ないし８個、よりさらに好ましくは１ないし７個、なおよりさらに好ましくは１ないし５個の塩基を意味する。
【００２７】
これらの各オリゴヌクレオチドは、sigＤまたはfimＡ遺伝子を保有するサルモネラ属菌を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅用のプライマー対またはプローブとして使用し得る。
ＰＣＲ増幅用のプライマー対として用いる場合は、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーからなる１組のプライマー対として使用する。被検試料中にサルモネラ属菌が存在する場合には該プライマー対に挟まれたサルモネラ属菌のsigＤまたはfimＡ領域のＤＮＡが特異的に増幅され、その増幅産物を調べることにより被検試料中のサルモネラ属菌の存否を調べる。
【００２８】
本発明においては、後記する実験の結果、特に、配列番号１の塩基配列を有するセンスプライマーと配列番号２の塩基配列を有するアンチセンスプライマーとからなるプライマー対、ならびに、配列番号５の塩基配列を有するセンスプライマーと配列番号６の塩基配列を有するアンチセンスプライマーとからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行った場合に、対応するサルモネラ属菌のＤＮＡを最も高い効率で増幅し得ることが判明した。
【００２９】
サルモネラ属菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、各プライマー対を用いたＰＣＲによる増幅産物の推定サイズは、配列番号１および配列番号２の塩基配列を有するプライマー対ではsigＤ領域の５４１ｎｔから９３０ｎｔに対応する３９０塩基対、配列番号５および配列番号６の塩基配列を有するプライマー対ではfimＡ領域の９０ｎｔから３８９ｎｔに対応する３００塩基対となる。これらのサイズは、増幅産物を分離した電気泳動ゲル上で同定するための１の指標となる。
【００３０】
また、プローブとして用いる場合は、通常、ハイブリダイゼーションの検出が可能なように、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、抗原、ハプテン、酵素の基質、またはビオチン／アビジンなどでオリゴヌクレオチドを標識した後に、ゲル、フィルター、またはメンブレンなどの支持体に保持した被検試料の核酸とハイブリダイズさせ、非特異的な結合物を洗い流す。洗浄後にハイブリダイズしているプローブは、その放射能、酵素活性、発光などにより間接的に検出する。ハイブリダイズしたプローブが検出される場合は、被検試料にサルモネラ属菌ＤＮＡが存在し、サルモネラ属菌が存在すると考えられる。
【００３１】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅した産物を同定するためのプローブとしても使用することができる。このハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ＰＣＲに使用したプライマー対に対応する配列番号１ないし８のいずれかのオリゴヌクレオチドが挙げられるが、使用したプライマー対によって増幅されるＤＮＡ（プライマー対によって挟まれる領域のＤＮＡ）に対応するオリゴヌクレオチドとする必要がある。
【００３２】
例えば、配列番号１および配列番号２の塩基配列を有するプライマー対を用いたＰＣＲの場合は、これらのプライマー対によって挟まれる領域、すなわちsigＤ領域の５４１ｎｔから９３０ｎｔまでの領域が増幅されるため、それを同定するためには配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるのが好ましい。
【００３３】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いて調べる被検試料は、サルモネラ属菌が増殖し得るいずれの試料も対象となり得るが、例えば食品、飲用水、河川水、井戸水などの地下水、屠畜場などからの廃水、血液、嘔吐物、組織滲出液などが挙げられる。
【００３４】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いて検出し得るサルモネラ属菌には、sigＤまたはfimＡ領域またはそれらの相等物を保有するいずれの種のサルモネラ属菌も含まれ、例えば、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・エンテリティディス（S.enteritidis）、サルモネラ・コレラスイス（S.choleraesuis）、サルモネラ・チフィ（S.typhi）およびサルモネラ・パラチフィ（S.paratyphi）などが含まれる。
【００３５】
本発明は、第２の態様において、上述したオリゴヌクレオチドを用いたサルモネラ属菌の検出方法を提供する。
本発明の検出方法は、以下の工程からなる。
（１）サルモネラ属菌の存在が疑われる被検試料を、サルモネラ属菌の核酸が調製されるような処理に付して菌検出用画分を調製する。この画分は、ＰＣＲに付す公知のサルモネラ属菌ＤＮＡの調製方法を用いて調製することができる。また、被検試料が固形物である場合は緩衝液と共に被検試料をストマッカーバッグに入れ、ストマッカー処理することにより被検試料からサルモネラ属菌を遊離させた後に、溶解緩衝液等で処理して核酸画分を調製することができる。
（２）調製した菌検出用画分を、配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、および／または、配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、ならびにその他のＰＣＲ増幅用試薬と混合して増幅反応にかける。ＰＣＲの条件は適宜設定することがきるが、本発明のオリゴヌクレオチドと一緒に市販のTOYOBO KOD Dash（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績（株））を用いてＰＣＲを行う場合、９４℃に３０秒間、６２℃にて２秒間および７４℃にて３０秒間を１サイクルとして、３０または４０サイクル、好ましくは４０サイクル行う。
（３）ついで、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡは電気泳動法、ドットブロット・ハイブリダイゼーション法など公知の方法によりサルモネラ属菌の特定の核酸領域が増幅されたかを調べる。特定の核酸領域の増幅が認められる場合は、被検試料にサルモネラ属菌ＤＮＡが存在し、サルモネラ属菌が存在すると判定される。
【００３６】
また、本発明のサルモネラ属菌の検出方法においては、（１）の工程において、可能な限り細菌を濃縮した後にＰＣＲに付してもよい。本発明の検出方法においては、被検試料中のサルモネラ属菌を公知の手法により濃縮することができる。例えば、被検試料と、抗−サルモネラ属菌抗体に結合した磁性ビーズとを混合し、サルモネラ属菌に結合した磁性ビーズを磁石により収集することによって菌を濃縮し得る。予め菌を濃縮しておくことにより、より高い効率でサルモネラ属菌ＤＮＡを増幅し得るため、被検試料中のサルモネラ属菌の検出感度を高めることができる。
【００３７】
また、本発明のサルモネラ属菌の検出方法においては、工程（３）において、ＰＣＲ増幅産物を公知の電気化学的手法により検出することができる。例えば、１つの態様において、ＰＣＲ増幅産物を、電極に結合した捕捉プローブおよび酵素に結合したレポータープローブと混合してサンドイッチ・ハイブリダイゼーションさせた後に、該酵素との反応により電気化学的性質が変化するかまたは該酵素と反応することによって溶液の電気化学的性質を変化させる基質を加えて電極に流れる電流の変化を測定することができる。ここで、捕捉プローブおよびレポータープローブとしては、ＰＣＲに用いたプライマー対によって挟まれる領域のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを用いることができ、前記でプローブとして説明したオリゴヌクレオチドを用いることができる。また、電極へのオリゴヌクレオチドの固定、酵素とオリゴヌクレオチドとのコンジュゲート、反応して電気化学的性質が変化するかまたは溶液の電気化学的性質を変化させる酵素および基質の選択、および電流の変化の測定は、公知の手法を用いて行うことができる。電気化学的手法でＰＣＲ増幅産物を検出することにより、より迅速かつ簡便に被検試料中のサルモネラ属菌の存否を検出することができ、被検試料のハイスループット検査が可能になる。
【００３８】
本発明は、第３の態様において、上述したオリゴヌクレオチドを含むサルモネラ属菌を検出するためのキットを提供する。本発明のキットには、ＰＣＲ増幅用のプライマー対またはプローブとして配列番号１ないし８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、ＰＣＲ試薬、溶菌緩衝液などＰＣＲ増幅反応に使用することが公知の成分などが含まれる。また、サルモネラ属菌核酸の存在を電気化学的手法によって検出するキットには、上記のプローブに代えて、酵素にコンジュゲートしたレポータープローブおよび電極に固定化した捕捉プローブが含まれ、さらに、該酵素との反応により電気化学的性質が変化するかまたは溶液の電気化学的性質を変化させる基質などが含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドをキットとすることにより、被検試料中のサルモネラ属菌の検出をより迅速かつ簡便に行うことができる。本発明のオリゴヌクレオチドはキットとして供給することにより、被検試料中のサルモネラ属菌をより迅速かつ簡便に検出することができる。
【実施例】
【００３９】
１．サルモネラ属菌検出用のオリゴヌクレオチドの設計
従来の本発明者らの研究により、サルモネラ属菌のゲノム領域に依存して遺伝子増幅能に差異があることが明らかになってきている。そこで、サルモネラ属菌に特異的な種々のゲノム領域を選択して、以下のオリゴヌクレオチドを設計した。
sigＤ（宿主浸入性タンパク質遺伝子）領域
センスプライマー            5'-AACGGGCATCACTATACCAA-3'    （配列番号１）
アンチセンスプライマー      5'-AATATTCGACGCGGTGAGTA-3'    （配列番号２）
レポータープローブ          5'-GTTTGATCGGCGGATTTAGT-3'    （配列番号３）
捕捉プローブ                5'-ACTTTCGGATCGCAGTCATT-3'    （配列番号４）
fimＡ（繊毛タンパク質遺伝子）領域
センスプライマー            5'-GAGTGGCGGTACTATTCATT-3'    （配列番号５）
アンチセンスプライマー      5'-TCAAGAATCTCAATCCCGAC-3'    （配列番号６）
レポータープローブ          5'-GTTTGATCGGCGGATTTAGT-3'    （配列番号７）
捕捉プローブ                5'-ACTTTCGGATCGCAGTCATT-3'    （配列番号８）
fliＣ１（鞭毛タンパク質遺伝子）領域
センスプライマー            5'-GGTGGTTTAGCAGTTAAGGT-3'    （配列番号９）
アンチセンスプライマー      5'-GTAATAGCGGAGTTGAAACG-3'    （配列番号１０）
レポータープローブ          5'-ACCGTCATCTGCAGTGTATT-3'    （配列番号１１）
捕捉プローブ                5'-TCAATTTTCTGCAGCGGGTT-3'    （配列番号１２）
fliＣ２（鞭毛タンパク質遺伝子）領域
センスプライマー            5'-GAACGAAATCGACCGTGTAT-3'    （配列番号１３）
アンチセンスプライマー      5'-GCACCATCATCAGCAACATT-3'    （配列番号１４）
レポータープローブ          5'-GAACTGAGTCTGACCGGATA-3'    （配列番号１５）
捕捉プローブ                5'-AGTGCTTAATGTAGCCGAAG-3'    （配列番号１６）
invＡ（侵入性タンパク質遺伝子）領域
センスプライマー            5'-TGTTAAGCGAACGTGTTTCC-3'    （配列番号１７）
アンチセンスプライマー      5'-CTATCTGCTATCTCACCGAA-3'    （配列番号１８）
レポータープローブ          5'-AATGCGAGCGCTTCCATAAT-3'    （配列番号１９）
捕捉プローブ                5'-TAAATCGACGGACATCGACA-3'    （配列番号２０）
invＥ（侵入性タンパク質遺伝子）領域
センスプライマー            5'-CGCAACTTAAAATGTTGCGC-3'    （配列番号２１）
アンチセンスプライマー      5'-ACCATTTCATGCTTGTAGGC-3'    （配列番号２２）
レポータープローブ          5'-CGGAGCGCAACATTTTAAGT-3'    （配列番号２３）
捕捉プローブ                5'-TCAGTCATACTACGTAACGC-3'    （配列番号２４）
ompＣ（外膜タンパク質前駆体遺伝子）領域
センスプライマー            5'-ATCGCTGACTTATGCAATCG-3'    （配列番号２５）
アンチセンスプライマー      5'-TGTTGAAGTAGTAAGTCGCG-3'    （配列番号２６）
レポータープローブ          5'-AGTACGTTTAGACGTGGTGA-3'    （配列番号２７）
捕捉プローブ                5'-AAGGACATCAGCAACGGTTA-3'    （配列番号２８）
prt（パラトースシンターゼ遺伝子）領域
センスプライマー            5'-CCTTGGATCACGACTTACAT-3'    （配列番号２９）
アンチセンスプライマー      5'-CTGGTAAACTTATCGTCTCC-3'    （配列番号３０）
レポータープローブ          5'-ATGTCGACTTTCGAAGTAGG-3'    （配列番号３１）
捕捉プローブ                5'-CTTTATCTATAATGGCGGCG-3'    （配列番号３２）
【００４０】
２．プライマーを用いたＰＣＲ増幅の検討
上記８組のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行い、サルモネラ属菌のゲノムＤＮＡが増幅されるか否かを検討した。
本実験においては、AquaPure Genomic DNA Kit（BIORAD社）を用いてサルモネラ・エンテリティディス（S. enteritidis）IFO3313菌体からゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして調製し、一条件下、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてTOYOBO KOD DASH（登録商標、東洋紡績（株））を用い、プライマー対のみ変化させて鋳型ＤＮＡの増幅を行い、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に付した。
ＰＣＲ溶液の組成
１０×ＰＣＲ緩衝液              ５μｌ
酵素使用量                      １．２５単位
鋳型ＤＮＡ量                    ４０ｎｇ
プライマー量                    ５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ量                      ０．２ｍＭ
合計体積                        ５０μｌ
ＰＣＲサイクル
９４℃にて３０秒間、６２℃にて２秒間、ついで７４℃にて３０秒間を１サイクルとして３０サイクル繰り返した。
各種プライマーを用いて増幅したＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動を図１に示す。
その結果、非特異的な増幅も見られるが、いずれのプライマー対を用いたＰＣＲでも目的断片に対応する箇所にバンドが確認された。また、非特異的な増幅に起因するバックグラウンドを減少するためにプライマー濃度を１／４にしてＰＣＲを行った場合にも、目的断片以外の断片の増幅が減少する以外は同様なＰＣＲ産物が認められた（図に示さず）。
したがって、上記した８種類のプライマー対は、サルモネラ属菌のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅用のプライマー対として適当であることが示された。
【００４１】
３．プライマーの至適アニーリング温度条件の検討
設計した各種プライマーについて、Gene Amp PCR system（登録商標、Applied Biosystems社）を用いてアニーリング温度条件の最適化を検討した。アニーリング温度は５２℃から７４℃の範囲で２℃間隔で設定した。ＰＣＲ条件は下記に示すように設定し、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に付した。
ＰＣＲ溶液の組成
１０×ＰＣＲ緩衝液              ５μｌ
酵素使用量                      １．２５単位
鋳型ＤＮＡ量                    ４０ｎｇ
プライマー量                    １２．５ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ量                      ０．２ｍＭ
合計体積                        ５０μｌ
ＰＣＲサイクル
９４℃にて３０秒間、５２℃〜７４℃の各設定温度にて２秒間、ついで７４℃にて３０秒間を１サイクルとして３０サイクル繰り返した。
各種プライマー対および各アニーリング設定温度で増幅したＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動を図２に示す。
その結果、各種プライマー対に対する好適なアニーリング温度は、図２に示す結果から表２に示す温度であることが明らかになった。
【００４２】
【表２】
2008161170.tif 000003
【００４３】
４．各種プライマーによるＰＣＲ増幅能の検討
上述の実験により好適なアニーリング温度が判明した６種類のプライマー対のＰＣＲ増幅能を調べるために、サルモネラ・エンテリティディス（S. enteritidis）IFO3313菌体懸濁液の希釈系列を作成し、それを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は上記のＰＣＲ溶液の組成およびＰＣＲサイクルに示したものとし、ＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動に付した結果を図３に示す。また、アガロース電気泳動の結果から判断される各種プライマー対を用いた場合の検出限界を表３に示す。
これらの結果から、ＰＣＲ増幅能はfimＡ領域、fliＣ２領域およびsigＤ領域のプライマー対が優れていることが明らかになった。
【００４４】
【表３】
2008161170.tif 000004
【００４５】
５．プライマー特異性の検討
各種プライマーについて、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium)IFO12529、サルモネラ・エンテリティディス（S. enteritidis）IFO3313およびサルモネラ・コレラスイス（S. choleraesuis）IFO3163の３種類のサルモネラ属菌の血清型に対する特異性を検討した。
ＰＣＲの条件は上記のＰＣＲ溶液の組成およびＰＣＲサイクルに示したものとし、ＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動に付した結果を図４に示す。
図４の結果から、fliＣ２以外のすべてのプライマー対において、３種類すべてのサルモネラ属菌の血清型の増幅が認められた。
ＰＣＲ増幅能および特異性の結果から、設計した８種類のプライマー対のうち、fimＡおよびsigＤがＰＣＲ増幅効率および広範囲の血清型のサルモネラ属菌を増幅し得るという観点から優れており、サルモネラ属菌を検出するために用いるプライマー対としてより適当であることが明らかになった。
【００４６】
６．ＰＣＲサイクル数の検出限界に対する影響の検討
ここまでの実験においては、ＰＣＲのサイクル数を３０サイクルに設定したが、サイクル数を４０サイクルまで増加させた場合に検出限界の向上が認められるかを検討した。
ＰＣＲの条件はサイクル数を３０サイクルから４０サイクルに変更し、サルモネラ・エンテリティディス（S. enteritidis）IFO3313菌体懸濁液の希釈系列を調製する以外、上記のＰＣＲ溶液の組成およびＰＣＲサイクルに示したものとした。ＰＣＲ増幅産物のアガロース電気泳動を図５に示す。また、アガロース電気泳動の結果から判断される各プライマー対を用いた場合の検出限界を表４に示す。
【００４７】
【表４】
2008161170.tif 000005
【００４８】
これらの結果から、３０サイクルのＰＣＲではfimＡは１０５細胞／反応、sigＤは１０４細胞／反応が検出限界であったところ、４０サイクルでは各々１０３細胞／反応および１０細胞／反応まで検出限界が向上することが明らかとなった。また、fimＡを用いた場合には、sigＤを用いる場合よりもスメアが多く認められた。
以上のことから、sigＤはfimＡと比較してＰＣＲ増幅効率に優れ、より少ないサルモネラ属菌ＤＮＡでも検出し得ることが示された。
【００４９】
７．磁性ビーズを用いた菌体分離の検討
食品試料からサルモネラ属菌の検出を行う場合の菌体の濃縮およびＰＣＲ増幅を阻害する物質の除去を目的として、抗原抗体反応と磁性ビーズを利用した菌体分離法を検討した。磁性ビーズはサルモネラ属菌検出用として市販されているDynabeads（登録商標）anti-Salmonella（Dynal Biotech社）を用いた。
まず、磁性ビーズ上に菌体が補集されているか否かをＥＬＩＳＡ法によって検討した。
測定は、以下の手順で行った。
（１）２μｌのDynabeads（登録商標）anti-Salmonella（ビーズ重量１０μｇ）および種々の濃度のサルモネラ・チフィムリウム１００μｌをマイクロタイタープレートのウェルに入れて反応させ；
（２）ＰＢＳ−Ｔで洗浄して洗浄液を廃棄し；
（３）anti−Salmonella typhimurium抗体を加えて反応させ；
（４）ＰＢＳ−Ｔで洗浄して洗浄液を廃棄し；
（５）西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗−ＩｇＧ抗体（０.１μｇ／ｍｌ、１００μｌ）を加え、３７℃にて３０分間反応させ；
（６）ＰＢＳ−Ｔで洗浄して洗浄液を廃棄し；
（７）テトラメチルベンチジン水溶液（４００μｇ／ｍｌ、５０μｌ）を加えて反応させ；
（８）６５５ｎｍにおける吸光度を測定する。
また、対照区として工程（１）においてDynabeads（登録商標）を加えない場合の吸光度および菌体を加えない場合の吸光度を各々測定した。
上述した手順で測定したサルモネラ・チフィムリウム菌体数と吸光度との関係を図６に示す。
【００５０】
図６の結果から、菌体を加えずにDynabeads（登録商標）のみで測定した値（横線のレベル）が高く、二次抗体が非特異的に吸着していることが示唆された。しかし、菌体濃度の増加に伴って吸光度の上昇が認められ、ビーズ上への菌体の補集が示された。
【００５１】
８．培養法によるビーズ上への菌体補集の確認の検討
菌体に結合したビーズを１０μｌの生理食塩水に懸濁し、ＬＢプレート培地上で培養して菌数計測を行った。その結果を表５に示す。
【００５２】
【表５】
2008161170.tif 000006
【００５３】
希釈倍率が１０７の場合にのみ、濃縮効果が認められた。他の希釈倍率ではビーズに補集される菌数は菌体懸濁液中の菌数の１０％以下であった。
【００５４】
９．ビーズに補集された菌体からのＰＣＲ増幅の検討
ビーズ上に補集された菌体のＤＮＡを、溶出操作を行わずにＰＣＲによって増幅し得るか否かを検討した。１００ｍｌの菌体培養液に２ｍｌのビーズ（ビーズ重量１０ｍｇ）を加え、３０分間振盪した後、２００ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後のビーズを１０ｍｌの生理食塩水に懸濁し、ＰＣＲに供した。ＰＣＲ条件は表１および表２に示したものとし、サイクルは４０サイクルとした。プライマーはsigＤ領域をターゲットとする配列番号１および２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲ増幅産物のアガロース電気泳動を図７に示す。
図７から明らかなように、この方法によって６×１００ｃｆｕ／ｍｌまでの菌体濃度においてＰＣＲによる遺伝子の増幅が確認された。
【００５５】
１０．サルモネラ菌体補集に使用するビーズ量の検討
菌体補集に用いる最適なビーズ量を決定するために、１μｌから５μｌのDynabeads（登録商標）（ビーズ重量５μｇから２５μｇ）を用いた場合のＰＣＲ増幅効率を検討した。種々の量のビーズを用いて菌体懸濁液からサルモネラ菌体の捕集分離を行い、捕集された菌体をビーズごとＰＣＲに供した。各ビーズ使用量でのＰＣＲ産物のアガロース電気泳動を図８に示す。
図８の結果から、ビーズの使用量とＰＣＲ増幅効率との間に明示的な相関は認められず、また、いくつかの試料はスメアを引いていて目的のバンドを確認することが困難であった。この結果から、ビーズの使用量は製造業者が推奨する２μｌ（ビーズ重量１０μｇ）が適当であることが示された。
【００５６】
１１．食肉試料中からのサルモネラ属菌の検出
実際の食品検査などを想定して、食肉試料から磁気ビーズを用いる菌体の分離・濃縮ならびにＰＣＲによる検出を検討した。
牛肉１０ｇをストマッカーバッグに入れて９０ｍｌの生理食塩水を加え、ストマッカーで５分間処理した。得られた抽出液９０μｌに対してサルモネラ・エンテリティディス（S. enteritidis）IFO3313菌体培養液１０μｌを接種して１００〜１０３ｃｆｕ／１００μｌとなるように調製して試料とした。１００μｌの試料に２μｌの磁性ビーズ（ビーズ量１０μｇ）を加え、３０分間反応させた後にビーズの洗浄を行った。洗浄を終えたビーズは１０μlの生理食塩水に懸濁してＰＣＲに供した。陰性対照区として、上記の抽出液および菌体培養液の代わりに生理食塩水を加えたものを用いて同様の操作をした。ＰＣＲ増幅産物のアガロース電気泳動を図９に示す。
図９の結果から、食肉試料中からの検出において６×１００ｃｆｕ／ウェルの菌体数まで増幅産物のバンドが確認された。一方、菌体培養液のみを用いた場合、増幅は確認されなかった。
【００５７】
１２．ＰＣＲ増幅産物と設計プローブとのハイブリダイゼーション
sigＤおよびfimＡ領域をターゲットとして設計したプローブとそれぞれの遺伝子領域のＰＣＲ増幅産物とのハイブリダイゼーションを、ドットブロット法によって検討した。その結果を図１０に示す。
ナイロン膜上に試料としてsigＤ領域（配列番号１および２）またはfimＡ領域（配列番号５および６）をプライマー対として用いたＰＣＲ増幅の産物（左下側）、陽性対照区としてビオチン化プローブ（上側）、陰性対照区としてinvＡ領域をプライマー対として用いたＰＣＲ増幅の産物（右下側）をスポットした。検出はアルカリホスファターゼ修飾ストレプトアビジンの酵素反応による発色で行った。
図１０の結果から、sigＤおよびfimＡ領域をターゲットとして設計した捕捉プローブ（配列番号４、８）（ＡおよびＣ）およびレポータープローブ（配列番号３、７）（ＢおよびＤ）ともに、各遺伝子領域のＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズすることが確認された。
【００５８】
１３．電気化学的手法によるターゲットＤＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションの同定
サルモネラ属菌のsigＤ領域をターゲットとするレポータープローブ（配列番号３）および捕捉プローブ（配列番号４）を調製し、捕捉プローブの末端にビオチンをコンジュゲートし、一方レポータープローブにはＬ−プロリンデヒドロゲナーゼをコンジュゲートした。
ストレプトアビジン修飾電極を有する容器に、ビオチン化捕捉プローブおよびＬ−プロリンデヒドロゲナーゼをコンジュゲートしたレポータープローブを含む緩衝液と共に、sigＤ領域プライマー対を用いてサルモネラ・エンテリティディス（S. enteritidis）IFO3313菌体培養液からＰＣＲ増幅した産物５μｌを加えて、２×ＳＳＣ中、９０℃にて３分間、７６℃にて２０秒間、５５℃にて３０秒間につづいて２５℃にて３０分間インキュベートした後、２５℃の２×ＳＳＣを用いて洗浄してハイブリダイズしなかったレポータープローブを除去した。洗浄後、緩衝液に浸して０.４５Ｖの印加電圧をかけ、種々の濃度の酵素基質Ｌ−プロリンを加えた時の電流応答値を測定した。また、ＰＣＲ増幅した産物を加えない以外は同様の処理を行う対照区を設けた。その結果を図１１に示す。
図１１の結果から、基質であるＬ−プロリン濃度に依存して電流応答値が増大し、一方、ＰＣＲ増幅産物を含まない対照区ではＬ−プロリンの添加に対して電流応答が得られないことが確認された。また、１０ｍＭのＬ−プロリン添加濃度で１０ｎＡの電流応答が得られれば、ＰＣＲ増幅産物の存否を調べて試料中のサルモネラ属菌を存否を検査できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、食中毒等を引き起こす可能性のある食品等の検査や、サルモネラ属菌による感染が疑われる患者の臨床診断などに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】種々の遺伝子領域をターゲットしたプライマー対を用いたサルモネラ属菌のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す図。右側レーンより、Ｍ：分子量マーカー、１：fimＡ領域プライマー対、２：fliＣ１領域プライマー対、３：fliＣ２領域プライマー対、４：invＡ領域プライマー対、５：invＥ領域プライマー対、６：ompＣ領域プライマー対、７：prt領域プライマー対、８：sigＤ領域プライマー対
【図２】各種プライマー対および種々のアニーリング温度で行ったＰＣＲ増幅を示す図。左側レーンより、１：５２℃、２：５４℃、３：５６℃、４：５８℃、５：６０℃、６：６２℃、７：６４℃、８：６６℃、９：６８℃、１０：７０℃、１１、７２℃、１２：７４℃
【図３】各種プライマーを用いたサルモネラ菌体からＤＮＡをＰＣＲ増幅する能力を示す図。左側レーンより、Ｍ：分子量マーカー、１：１０４細胞／反応、２：１０３細胞／反応、３：１０２細胞／反応、４：１０細胞／反応、５：１細胞／反応
【図４】各種プライマーの鋳型特異性を示す図。左側レーンより、Ｍ：分子量マーカー、１：サルモネラ・チフィムリウムIFO12529、２：サルモネラ・エンテリティディスIFO3313、３：サルモネラ・コレラスイスIFO3163、Ｎ：ＰＣＲ陰性対照区
【図５】ＰＣＲ増幅サイクル数の検出限界に及ぼす影響を示す図。左側レーンより、Ｍ：分子量マーカー、１：１０７ｃｆｕ／反応、２：１０６ｃｆｕ／反応、３：１０５ｃｆｕ／反応、４：１０４ｃｆｕ／反応、５：１０３ｃｆｕ／反応、６：１０２ｃｆｕ／反応
【図６】磁性ビーズを用いた菌体分離を示す図。グラフ中、対照は菌体のみ（磁性ビーズなし）加えた場合の発色、試料は磁性ビーズと菌体とを加えた場合の発色、吸光度０.１９付近の横棒の値はビーズのみ（菌体なし）加えた場合の発色
【図７】磁性ビーズに捕集された菌体からのＰＣＲ増幅を示す図。左側レーンより、１：６×１０６ｃｆｕ／ｍｌ、２：６×１０４ｃｆｕ／ｍｌ、３：６×１０３ｃｆｕ／ｍｌ、４：６×１０２ｃｆｕ／ｍｌ、５：６×１０１ｃｆｕ／ｍｌ、６：６×１００ｃｆｕ／ｍｌ
【図８】菌体収集に用いるビーズ量の検討結果を示す図。左側レーンより、Ｍ：分子量マーカー、レーン１、５、９、１３および１７：１０４ｃｆｕ／ｍｌの菌体培養液、レーン２、６、１０、１４、１８：１０２ｃｆｕ／ｍｌの菌体培養液、レーン３、７、１１、１５、１９：１０１ｃｆｕ／ｍｌの菌体培養液、レーン４、８、１２、１６、２０：陰性対照（水）
【図９】食肉試料からのサルモネラの検出を示す図。左側レーンより、Ｍ：分子量マーカー、１および４：菌数６×１０３ｃｆｕ／ウェル、２および５：菌数６×１０１ｃｆｕ／ウェル、３および６：６×１００ｃｆｕ／ウェル、７：陰性対照
【図１０】プローブとＰＣＲ増幅産物とのドットブロット・ハイブリダイゼーションを示す図。ＡおよびＢ：fimＡ領域プライマー対を用いたＰＣＲ産物を固定した区、ＣおよびＤ：sigＤ領域プライマー対を用いたＰＣＲ産物を固定した区、ＡおよびＣ：捕捉プローブとのハイブリダイゼーション、ＢおよびＤ：レポータープローブとのハイブリダイゼーション。膜の上側：陽性対照区、膜の左下側：ＰＣＲ増幅産物、膜の右下側：陰性対照区。
【図１１】サルモネラ属菌核酸の電気化学的測定を示す図。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
SEQ ID NO: 1
Oligonucleotide for targeting sigD gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 2
Oligonucleotide for targeting sigD gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 3
Oligonucleotide for targeting sigD gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 4
Oligonucleotide for targeting sigD gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 5
Oligonucleotide for targeting fimA gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 6
Oligonucleotide for targeting fimA gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 7
Oligonucleotide for targeting fimA gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 8
Oligonucleotide for targeting fimA gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 9
Oligonucleotide for targeting fliC1 gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 10
Oligonucleotide for targeting fliC1 gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 11
Oligonucleotide for targeting fliC1 gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 12
Oligonucleotide for targeting fliC1 gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 13
Oligonucleotide for targeting fliC2 gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 14
Oligonucleotide for targeting fliC2 gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 15
Oligonucleotide for targeting fliC2 gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 16
Oligonucleotide for targeting fliC2 gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 17
Oligonucleotide for targeting invA gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 18
Oligonucleotide for targeting invA gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 19
Oligonucleotide for targeting invA gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 20
Oligonucleotide for targeting invA gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 21
Oligonucleotide for targeting invE gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 22
Oligonucleotide for targeting invE gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 23
Oligonucleotide for targeting invE gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 24
Oligonucleotide for targeting invE gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 25
Oligonucleotide for targeting ompC gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 26
Oligonucleotide for targeting ompC gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 27
Oligonucleotide for targeting ompC gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 28
Oligonucleotide for targeting ompC gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 29
Oligonucleotide for targeting prt gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 30
Oligonucleotide for targeting prt gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 31
Oligonucleotide for targeting prt gene region of Salmonella bacteria.
SEQ ID NO: 32
Oligonucleotide for targeting prt gene region of Salmonella bacteria.
【図１】
2008161170.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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