(57)【要約】【課題】  クリプトスポリジウム等の水系感染微生物を、短時間かつ高効率で、大量の試料水中から分離し、検出感度を高め、作業の自動化・省力化を図ることができるようにした水中微生物の分離濃縮装置を提供する。【解決手段】  水中微生物を計測する計測システム用いられる水中微生物の分離濃縮装置であって、検出対象とする試料水中の微生物の粒径よりも小さい孔径を有し、親水性かつ表面が平滑な平膜１を、該平膜１の形状を保持する支持体２の上に固定し、該平膜１により試料水をろ過し、検出対象の微生物を捕捉するとともに、上記平膜１の表面に付着した検出対象の微生物を物理的撹拌手段６により浮遊させ、回収することとした。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中微生物を計測する計測システム用いられる水中微生物の分離濃縮装置であって、検出対象とする試料水中の微生物の粒径よりも小さい孔径を有し、親水性かつ表面が平滑な平膜を、該平膜の形状を保持する支持体の上に固定し、該平膜により試料水をろ過し、検出対象の微生物を捕捉するとともに、上記平膜の表面に付着した検出対象の微生物を物理的撹拌手段により浮遊させ、回収することを特徴とする水中微生物の分離濃縮装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、河川及び湖沼等の環境水や上下水道の各処理プロセスの処理水等水中に存在する原虫、細菌、ウイルスといった水中微生物（水系感染性微生物）の分離濃縮装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中には多種多様な化学物質が存在するため、水道原水となる河川や湖沼等の環境水も様々な化学物質で汚染されていると考えられる。しかし、このような水環境の水質問題のほかにクリプトスポリジウム等の原虫類、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７やレジオネラ菌等の細菌、ウイルス等による水系感染症の発生が大きな社会問題となっている。
【０００３】
これらの水系感染症の集団発生を防ぐためには、水処理プロセスにおける原因微生物を高頻度にモニタリングすることが必要不可欠である。しかし、試料中から微生物を効率よく分離濃縮する技術が確立されておらず、環境中にわずかにしか含まれていない病原微生物を分離濃縮するためには、高度な熟練と時間を要するという問題がある。
【０００４】
特に新興の水系感染症の原因となっているものとして、クリプトスポリジウムやジアルジア等が知られている。これらの原虫の検査方法として、例えば、非特許文献１、非特許文献２では、クリプトスポリジウムの検査手順は大きく分けて、試料採取、ろ過濃縮、剥離懸濁、分離精製、免疫蛍光染色、顕微鏡観察の各ステップから成るものとされている。
【０００５】
試料採取ステップでは、容量１０〜２０Ｌのポリエチレン容器に、河川水等の水道原水の場合は１０Ｌ、浄水・水道水の場合は４０Ｌを採取する。
ろ過濃縮ステップでは、直径４７ｍｍ又は９０ｍｍ、ポアサイズ５μmの親水性ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）ディスクフィルターを用い、加圧又は吸引式のフィルターホルダーに取付け試料をろ過する。
【０００６】
剥離懸濁ステップでは、濁質を捕捉したディスクフィルターを５０ｍＬの遠心管に入れ０．０２％ピロリン酸ナトリウム、０．０３％ＥＤＴＡ−３Ｎａ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０からなる誘出液を添加し、激しく攪拌することでクリプトスポリジウムを含む濁質をディスクフィルターから剥離させる。
【０００７】
分離精製ステップでは、クリプトスポリジウムを認識する抗体が結合した免疫磁気ビーズにより懸濁液からクリプトスポリジウムを回収する。
免疫蛍光染色、顕微鏡観察では、蛍光標識した抗クリプトスポリジウム抗体でクリプトスポリジウムを染色し、蛍光顕微鏡で観察する。
【０００８】
【非特許文献１】厚生労働省告示「クリプトスポリジウム暫定対策指針」（１９９８年に指針の改正）
【非特許文献２】日本水道協会「クリプトスポリジウム解説と試験方法」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
浄水処理プロセスにおいて、環境中に存在する水系感染性微生物を適切に除去又は消毒殺菌し、安全な水道水を供給するためには、検出対象微生物を高頻度に測定し、その測定結果を処理プロセスにフィードバックする必要がある。
【００１０】
クリプトスポリジウム等の原虫類、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７やレジオネラ菌等の細菌、ウイルスの検査方法、特に前述のクリプトスポリジウムの検査方法は、クリプトスポリジウムを捕捉し回収する際に、試料の濁質によりディスクフィルターが目詰まりを起こすことがある。
【００１１】
そして、このため、短時間でろ過速度が低下するため全試験工程にかかる時間が長くなり迅速な測定ができず、大量の試料水を効率よく処理できないという問題がある。また、蛍光顕微鏡観察では他の微生物との識別に高度な熟練を要するため、１時間に１回、又は１日に１回程度の高頻度な測定が望まれている。
【００１２】
さらに、上述のろ過濃縮及び剥離懸濁にけるクリプトスポリジウムの回収率は数十％、最大でも８０％前後と低く、バラツキも大きく、検出誤差も陰性と判断される可能性があり改善すべき問題点が多い。
このように、従来、微生物の検査において、検査精度が低いことや操作が複雑であるため熟練した技術が必要であり、作業者の負担が大きいため、作業ステップの自動化・省力化が望まれている。
【００１３】
本発明は、上述の問題点に鑑み、クリプトスポリジウム等の水系感染微生物を、短時間かつ高効率で、大量の試料水中から分離し、検出感度を高め、作業の自動化・省力化を図ることができるようにした水中微生物の分離濃縮装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、水中微生物を計測する計測システム用いられる水中微生物の分離濃縮装置であって、検出対象とする試料水中の微生物の粒径よりも小さい孔径を有し、親水性かつ表面が平滑な平膜を、該平膜の形状を保持する支持体の上に固定し、該平膜により試料水をろ過し、検出対象の微生物を捕捉するとともに、上記平膜の表面に付着した検出対象の微生物を物理的撹拌手段により浮遊させ、回収することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、クリプトスポリジウム等の耐塩素性病原虫をはじめとした細菌、ウイルスのような水系感染微生物である検出対象微生物を短時間で大量の試料水から高効率で分離濃縮できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明に係る水中微生物の分離濃縮装置を、試料水中の病原性原虫であるクリプトスポリジウムオーシスト（以下、クリプトスポリジウムとも指称する）を分離する場合について、その一実施の形態を説明する。
図１は、本発明に係る水中微生物の分離濃縮装置で採用されるフローセルの一実施の形態を示す。
このフローセル１０は、トラックエッチフィルター１を、メッシュクロス２を支持体とし、フィルター固定パッキン３で固定し、これらをフローセル上部４とフォローセル下部５とで挟み込んだ構造となっている。
【００１７】
トラックエッチフィルター１は、試料水中のクリプトスポリジウムを捕捉するための平膜として用いている。トラックエッチフィルター１は、親水性でかつ表面が平滑な平膜であり、孔径２〜３μｍが好適である。
トラックエッチフィルター１としては、例えば、ワットマン社製の、ニュークレポアフィルター（商品名）が好適である。
クリプトスポリジウムの粒径は４〜６μｍであり、またトラックエッチフィルター１の孔径はプラス０％、マイナス１０％の精度を有する。したがって、トラックエッチフィルター１の孔径は、検出対象とするクリプトスポリジウムの粒径よりも小さい。このため、トラックエッチフィルター１は、ほぼ１００％の確率で、クリプトスポリジウムをその上に捕捉することができる。
なお、平膜としては、トラックエッチフィルターに代え、孔径が均一でシャープな孔径分布をもち、孔径よりも大きな粒子を表面捕捉できるメンブレンであれば樹脂製のほか、金属製のフィルターといったものも用いることができる。
【００１８】
さらに、本実施の形態では、メッシュクロス２を支持体として用いている。
トラックエッチフィルター１により試料水をろ過する場合、試料水を吸引又は加圧して供給するため、トラックエッチフィルター１が変形し伸びる可能性がある。それに伴いトラックエッチフィルター１の孔径が広がるおそれがある。
本実施の形態では、ろ液を流下でき、トラックエッチフィルター１の形状を保持できる支持体の上にフィルターを固定することとしている。これによって、試料水の供給圧によるトラックエッチフィルター１の変形を防ぐこととしている。
支持体としては、本実施の形態のようにメッシュクロスが好適である。例えば、ポリプロピレン製の目開き３０メッシュクロス（ＮＢＣ社）を用いることができる。なお、メッシュクロスに代え、表面が滑らかなプラスチック製の多孔質板、金属性の焼結板  を用いることもできる。
【００１９】
フィルター固定パッキン３は、図１では断面のみ現れており、ドーナツ形状に構成されており、下部パッキン３ａ、中間パッキン３ｂ、及び上部パッキン３ｃで構成されている。これらは、合成ゴム等の弾性材料で構成され、内部空間の水密性を保つ。
下部パッキン３ａは、メッシュクロス２を包囲し、段部（Ｌ字状の断面の部分）で該メッシュクロス２を保持している。中間パッキン３ｂは、トラックエッチフィルター１を包囲する。上部パッキン３ａは、トラックエッチフィルター１を押さえる役割を果たす。
フィルター固定パッキン３をフローセル上部４とフォローセル下部５とで挟み込むことによって水密構造が形成される。
【００２０】
さらに、フローセル上部４には試料水供給口７が設けられ、試料水から分離された微生物を回収するための微生物回収口８も設けられている。フローセル下部５には、ろ液排出口９が設けられている。
試料水から分離された微生物を回収するため、フローセル１０は微生物回収口８が下側に来るように全体を傾けた構造が望ましい。これにより、トラックエッチフィルター１の上部に溜まったクリプトスポリジウムを含む液を微生物回収口８に流下させ、効率よく回収することができる。
【００２１】
さらに、図１のフローセル１０では、トラックエッチフィルター１の上を磁石入りの撹拌子６で撹拌する構造としている。
撹拌子６はフローセル下部５側に設置するマグネティックスターラーを用いて磁力により回転させることができる。なお、マグネティックスターラーは、フローセル上部４側に設置することもできる。
このような構成として、撹拌子６を回転させることにより、試料水中の夾雑物がトラックエッチフィルター１の微細孔に目詰まりすることを防ぎ、さらに、クリプトスポリジウムがトラックエッチフィルター１の表面に付着することによる回収率の低下を防ぐことができる。
【００２２】
試料となる環境水（試料水）中には藻類や砂などの夾雑物が多く含まれ、これがトラックエッチフィルター１の微細孔に入り込み目詰まりしたり、トラックエッチフィルター１の表面上に蓄積し、ろ過性能が低下したりする。また、クリプトスポリジウムは夾雑物とともにトラックエッチフィルター１の表面に付着するため、クリプトスポリジウムを回収するときに、トラックエッチフィルター１から剥がす必要がある。
以上のように、本実施の形態に係る水中微生物の分離濃縮装置では、平膜を採用して水中微生物を濃縮するにあたり、生じるおそれのある問題を有効に解決している。
【００２３】
図２は、本発明に係る水中微生物の分離濃縮装置で採用されるフローセルの他の実施の形態を示す。
図２の実施の形態では、フローセル上部４にメカニカルシール１１を設置し、シャフト１２に取り付けた撹拌子６を外部モーター１３により回転させる構造としている。
図２の実施の形態で、図１と同一の参照番号を付した構成要素は、図１と同様の構成であり、同様の機能を果たす。
【００２４】
図１について説明したフローセル１０を組み込んだ本発明に係る水中微生物の分離濃縮装置について、一実施の形態を図３に示す。
図３の水中微生物の分離濃縮装置では、フローセル１０に試料水を試料水吸引ポンプ１４で供給する。そして、試料水を、マグネティックスターラー１５で磁石入り撹拌子６の回転により撹拌しながら、ろ過する。
このとき、夾雑物をトラックエッチフィルター１の孔径よりも小さい微粒子に分散させ、トラックエッチフィルター１の目詰まりを防ぐ。
さらに、クリプトスポリジウムがトラックエッチフィルター１に付着することを防ぐため界面活性剤を供給する。界面活性剤は、試料水切り替えバルブ１６を切り替え、注入することができる。
【００２５】
トラックエッチフィルター１上に捕捉されたクリプトスポリジウムは、微生物回収口８から微生物回収ポンプ１７により回収される。試料水をろ過し終わった後、界面活性剤を、試料水切り替えバルブ１６を切り替えて供給する。そして、トラックエッチフィルター１上を供給した界面活性剤でリンスし、トラックエッチフィルター１上に付着したクリプトスポリジウムを浮遊させ回収する。
【００２６】
また、試料水は、加圧してろ過することも可能である。図４に、そのような実施の形態を示した。この実施の形態では、フローセル１０に試料水を試料水供給ポンプ１８で供給している。
図４の実施の形態で、図３と同一の参照番号を付した構成要素は、図１と同様の構成であり、同様の機能を果たす。
【実施例】
【００２７】
次に、本発明の微生物分離濃縮装置を用い、クリプトスポリジウム代替粒子の分離を行った実施例を以下に示す。
実施例
試料水は、多摩川河川原水を用い、クリプトスポリジウムを含む試料を濃縮する方法である０４Ｐ０２０３５に記載の方法で河川原水濃縮試料を調整した。
河川原水５Ｌ分に相当する濃縮試料にクリプトスポリジウムの代替粒子であるクリプトレーサー（水道技術研究センター）を平均１００．３個添加し、図１、図３について説明したと同様の構成の微生物分離濃縮装置で濃縮試料のろ過を行った。
【００２８】
クリプトレーサーは紫外線を照射することにより、青色の蛍光を発するのでクリプトレーサーの個数を蛍光顕微鏡で計数することとした。
微生物分離濃縮装置に用いたトラックエッチフィルターは直径４７ｍｍのものを用い、該フィルターをポリプロピレンメッシュクロスとフローセルに固定することで有効ろ過面積は直径４０ｍｍの１２．６ｃｍ2となった。
クリプトレーサーを添加した河川原水濃縮試料水を、この微生物分離濃縮装置でろ過した。
【００２９】
ここで、トラックエッチフィルター上を撹拌する撹拌子の長さを変え、撹拌面積を変化させた。
トラックエッチフィルター上に捕捉され、回収したクリプトレーサーの個数を蛍光顕微鏡で計数し、回収率を求めた。図５にろ過面積と撹拌面積の比に対するクリプトレーサーの回収率を示す。
この結果、撹拌面積がろ過面積に近づくにつれクリプトレーサーの回収率が向上することがわかった。
【００３０】
よって、本発明に係る水中微生物の分離濃縮装置により、試料水からクリプトスポリジウムを分離するとき、トラックエッチフィルター上を隈なく撹拌することで、クリプトスポリジウムがトラックエッチフィルター上に付着することを防ぎ、回収率を上げることができた。撹拌面積とろ過面積が０．９のときは、回収率は約９０％となった。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明に係る水中微生物の分離濃縮装置を適用したフローセルの一実施の形態について、その概略を示す断面図である。
【図２】本発明に係る水中微生物の分離濃縮装置を適用したフローセルの他の実施の形態について、その概略を示す断面図である。
【図３】図１について説明したフローセル１０を組み込んだ本発明に係る水中微生物の分離濃縮装置について、その一実施の形態を示す概念図である。
【図４】図１について説明したフローセル１０を組み込んだ本発明に係る水中微生物の分離濃縮装置について、他の実施の形態を示す概念図である。
【図５】本発明に係る水中微生物の分離濃縮装置を用いた実施例における回収率を示すグラフである。
【符号の説明】
【００３２】
１        平膜
２        メッシュクロス
３        フィルター固定パッキン
４        フローセル上部
５        フローセル下部
６        磁石入り撹拌子
７        試料供給口
８        微生物回収口
９        ろ液排出口
１０      フローセル
１１      メカニカルシール
１２      シャフト
１３      モーター
１４      試料水吸引ポンプ
１５      マグネティックスターラー
１６      試料水切り替えバルブ
１７      微生物回収ポンプ
１８      試料水供給ポンプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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