(57)【要約】【課題】スナネズミ由来のミエローマ様細胞の提供。スナネズミ由来のモノクローナル抗体を得るためのハイブリドーマの形成に有用なミエローマ様細胞の提供。【解決手段】スナネズミ由来の細胞を長期培養することで、ＨＡＴ培地非耐性株であり、かつ抗体成分非分泌株であるスナネズミミエローマ様細胞を得た。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）由来のミエローマ様細胞。
【請求項２】
スナネズミの脾臓、腹水又は骨髄由来の細胞をクローン化して得られ、ＨＡＴ培地耐性、抗体非産生を条件に選択されるスナネズミ由来のミエローマ様細胞。
【請求項３】
スナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）由来のＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２７５（ＭｇＭＬ−１）株。
【請求項４】
スナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）由来のＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２７６（ＭｇＭＬ−２）株。
【請求項５】
スナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）由来のＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２７７（ＭｇＭＬ−３）株。
【請求項６】
スナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）由来のＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２７８（ＭｇＭＬ−４）株。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のミエローマ様細胞と抗原で免疫されたスナネズミ又はマウス由来の脾臓細胞とを細胞融合して得られるハイブリドーマ。
【請求項８】
抗原がＴ細胞依存抗原である請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項９】
Ｔ細胞依存抗原がＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）である請求項８に記載のハイブリドーマ。
【請求項１０】
ＫＬＨに対してＩｇＭ及び／又はＩｇＧ抗体を産生する請求項９に記載のハイブリドーマ。
【請求項１１】
ＴＧＦ−β、ＩＬ−２又はＴＮＦ−αのｍＲＮＡを少なくとも１つ以上発現している請求項７〜９のいずれかに記載のハイブリドーマ。
【請求項１２】
Ｍｇｈｙ−Ｂ７、Ｍｇｈｙ−Ｆ３、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０又はＭｇｈｙ−Ｇ３のいずれかである請求項１１に記載のハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はスナネズミ由来のミエローマ様細胞に関する。さらに詳しくはスナネズミ及び他動物由来のモノクローナル抗体及びサイトカインを得るためのハイブリドーマの形成に有用なミエローマ様細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
スナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）はネズミ目ネズミ科アレチネズミ亜科に属する小型の動物であり、ウイリス環の不完全結合を利用した脳梗塞／脳虚血モデル（例えば、非特許文献１参照）、ヒトフイラリア症モデル（例えば、非特許文献２参照）として利用されている。また、総頚動脈の結紮によって誘発される脳虚血、水中毒（例えば、非特許文献３参照）や蚊を媒体とした骨膜マレー糸条虫（例えば、非特許文献４、５参照）等、ウイルスから寄生虫まで高い感受性をもつことが知られている。さらに近年では、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染による胃潰瘍／胃癌の実験的再現、腸管線虫感染症慢性化の要因としてのスナネズミ粘膜肥満細胞の特性の解明やエキノコックス（多包条虫）の終宿主代替動物として利用される等、実験動物としての有用性に新しい可能性が示唆されている。そして、これら感染症メカニズムのさらなる解明において、スナネズミ由来のモノクローナル抗体の提供が望まれている。
【０００３】
モノクローナル抗体作成において、マウスではＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（例えば、非特許文献６参照）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（例えば、非特許文献７参照）、ＮＳ−１（例えば、非特許文献８参照）、ＳＰ２／０（例えば、非特許文献９〜１１参照）等のすでに確立されているマウスミエローマ株と、マウス脾細胞とを細胞融合することによって作成することが一般的である。一方、スナネズミでは、細胞融合パートナーとしてのミエローマは株化されておらず、細胞融合法も確立されていないことから、モノクローナル抗体の作成技術はいまだに得られていない。
【０００４】
ヒトにおいてモノクローナル抗体を作成するために、コメアレルゲン存在下で種々のサイトカインとともに末梢血リンパ球を培養し目的の抗体を分泌する細胞を増殖したり（例えば、非特許文献１２参照）、ヒト脾細胞とヒトミエローマをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気融合法で細胞融合したり（例えば、非特許文献１３、１４参照）、ヒトリンパ球とマウスミエローマとの細胞融合をしたりすること（例えば、非特許文献１５参照）等が従来行われてきたが、細胞融合の効率が低く、ヒト染色体が失われ易く抗体を分泌しないクローンが優勢になる等の問題点があった。
【０００５】
スナネズミにおいても、スナネズミ由来細胞を用いたモノクローナル抗体を作成するには、マウスやラットミエローマ細胞との異種間ハイブリドーマにより得ることが考えられる。しかし、異種間ハイブリドーマにおいては遺伝形質も表現型も雑種化した安定した単核のシンカリオンを形成しにくいという問題がある。そこで、スナネズミにおいても、スナネズミ由来のミエローマ様細胞株を得ることで、スナネズミ由来のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作成することが望まれている。
【非特許文献１】Levine S, PayanH. 1966. Effects of ischemia and other procedures on the brain and retina of the gerbil. Experimental Neurology, 16(3), 255-262.
【非特許文献２】Ash LR, Riley JM. 1970. Development of Brugia pahangi in the jird, Meriones unguiculatus, with notes on infections in other rodents. Journal of parasitology, 56(5), 962-968.
【非特許文献３】Levine S, PayanH. 1966. Effects of ischemia and other procedures on the brain and retina of the gerbil. Experimental Neurology, 16(3), 255-262.
【非特許文献４】Vincent LA, Frommes PS, Lawrence R. 1975. Brugia malayi , Brugia pahangi,and Brugia patei:Pulmonary pathology in jirds, Meriones unguiculatus. Experimental Parasitology, 40(3), 330-354.
【非特許文献５】Bangs MJ, Ash LR, Barr AR. 1995. Susceptibility of various mosquitoes of Californiato subperiodic Brugia malayi. Acta Tropica, 59(4), 323-332.
【非特許文献６】Deyde V, Rizvanov A, Otteson E, Brandt S, Bego M, Pari G, Kozel T, St Jeor S. 2005. Identification of a monoclonal antibody from Peromyscus maniculatus (deer mouse) cytomegalovirus (PCMV) which binds to a protein with homology to the human CMV matrix protein HCMV pp71. Journal of virological methods, 123(1), 9-15.
【非特許文献７】Nanbu A, Hayakawa M, Takada K, shinozaki N, Abiko Y, Fukushima K. 2000. Production, characterization, and application of monoclonal antibodies which distinguish four glucosyltransferases from Streptococcus sobrinus. FEMS Immunology and Medical Microbiology , 27, 9-15.
【非特許文献８】Yiu-Kwong Leung M, Kwok-Keung Ho W. 2006. Production, characterization and applications of mouse anti-grass carp (Ctenopharyngodon idellus) growth hormone monoclonal antibodies. Comparative biochemistry and physiology. Part B. Biochemistry & Molecular Biology, 143(1), 107-115.
【非特許文献９】Dessain SK, Adekar SP, Stevens JB, Carpenter KA, Skorski ML, Barnoski BL, Goldsby RA, Weinberg RA. 2004. High efficiency creation of human monoclonal antibody-producing hybridomas. Journal of Immunological Methods, 291(1-2), 109-122.
【非特許文献１０】Majidi J, Baradaran B, Hassan ZM, Mostafaie A. 2005. Production and characterization of monoclonal antibodies against human IgG in Balb/c mouse. Human Antibodies, 14(1-2), 1-5.
【非特許文献１１】Danger Y, Gadjou C, Devys A, Galons H, Blanchard D, Follea G. 2006. Development of murine monoclonal antibodies to methamphetamine and methamphetamine analogues. Journal of Immunological Methods, 309(1-2), 1-10.
【非特許文献１２】Ichikawa A, Kinoshita T, Watanabe T, Kato H, Nagai H, Tsushita K, Saito H, Hotta T. 1997. Mutations of the p53 gene as a prognostic factor in aggressive B-cell lymphoma. The New EnglandJournal of Medicine, 337(8), 529-534.
【非特許文献１３】Glassy MC, Handley HH, Hagiwara H, Royston I. 1983. UC 729-6, a human lymphoblastoid B-cell line useful for generating antibody -secreting human-human hybridomas. Proceedings of the National Academyof sciences of the United   States of America, 80(20), 6327-6331.
【非特許文献１４】Ohashi H,  Hashizume S, Murakami H, Aihara K, Shinohara K, Omura H. 1986. HO-323, a human B-lymphoblastoid cell line useful for making human-human hybridomas. Cell Biology International Reports, 10(2), 77-83.
【非特許文献１５】Gigliotti F, Smith L, Insel RA. 1984. Reproducible production of protective human monoclonal antibodies by fusion of peripheral blood lymphocytes with a mouse myeloma cell line. Journal of Infections Diseases, 149(1), 43-47.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はスナネズミ由来のミエローマ様細胞を得ることを課題とする。さらに詳しくはスナネズミ及び他動物由来のモノクローナル抗体及びサイトカインを得るためのハイブリドーマの形成に有用なミエローマ様細胞を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、スナネズミの脾臓、骨髄、腹水から得た細胞をＲＰＭＩ１６４０培養液で３ヶ月程度培養し、増殖を示したコロニーからＨＡＴ培地非耐性であり、かつ抗体成分非分泌である細胞株を選び出した。さらに、これらの細胞株が、脾臓細胞と細胞融合を行うことができ、スナネズミ及び他動物由来のモノクローナル抗体及びサイトカインを得るためのハイブリドーマの形成に有用なミエローマ様細胞株であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１２）のミエローマ様細胞株等に関する。
（１）  スナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）由来のミエローマ様細胞。
（２）  スナネズミの脾臓、腹水又は骨髄由来の細胞をクローン化して得られ、ＨＡＴ培地に耐性、抗体非産生を条件に選択されるスナネズミ由来のミエローマ様細胞。
（３）  スナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）由来のＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２７５（ＭｇＭＬ−１）株。
（４）  スナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）由来のＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２７６（ＭｇＭＬ−２）株。
（５）  スナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）由来のＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２７７（ＭｇＭＬ−３）株。
（６）  スナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）由来のＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２７８（ＭｇＭＬ−４）株。
（７）  上記（１）〜（６）のいずれかに記載のミエローマ様細胞と抗原で免疫されたスナネズミ又はマウス由来の脾臓細胞とを細胞融合して得られるハイブリドーマ。
（８）  抗原がＴ細胞依存抗原である上記（７）に記載のハイブリドーマ。
（９）  Ｔ細胞依存抗原がＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）である上記（８）に記載のハイブリドーマ。
（１０）  ＫＬＨに対してＩｇＭ及び／又はＩｇＧ抗体を産生する上記（９）に記載のハイブリドーマ。
（１１）  ＴＧＦ−β、ＩＬ−２又はＴＮＦ−αのｍＲＮＡを少なくとも１つ以上発現している上記（７）〜（９）のいずれかに記載のハイブリドーマ。
（１２）  Ｍｇｈｙ−Ｂ７、Ｍｇｈｙ−Ｆ３、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０又はＭｇｈｙ−Ｇ３のいずれかである上記（１１）に記載のハイブリドーマ。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により確立されたミエローマ様細胞は、スナネズミ及び他動物由来のモノクローナル抗体及びサイトカインを得るために有用である。本発明のミエローマ様細胞を用いることで得られたスナネズミ及び他動物由来のモノクローナル抗体及びサイトカインは、感染症メカニズムの解明等の、基礎医学等の研究の発展に貢献し得るとともに、スナネズミの実験動物としての価値を高める効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の「ミエローマ様細胞」とは、スナネズミ由来の細胞をクローン化して得られる細胞であって、ＨＡＴ培地非耐性であり、かつ抗体非産生である長期培養が可能な株化した細胞のことをいう。本発明の「ミエローマ様細胞」はさらに、ミエローマの選択に用いられる８−ａｓａｇｕａｎｉｎｅ耐性であることが好ましい。
本発明の「ミエローマ様細胞」を得るためのスナネズミ由来細胞としては、いくつかの部位由来の細胞を用いることができる。例えば、脾臓、腹水又は骨髄等を由来とする細胞が挙げられる。
【００１１】
本発明の「ミエローマ様細胞」としては、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領された（受領日平成１９年３月２２日）、スナネズミの腹水細胞由来のＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２７５（以下、ＭｇＭＬ−１とする）、骨髄細胞由来のＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２７６（以下、ＭｇＭＬ−２とする）、脾臓細胞由来のＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２７７（以下、ＭｇＭＬ−３とする）及び骨髄細胞由来のＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２７８（以下、ＭｇＭＬ−４とする）等を用いることが好ましい。
【００１２】
本発明の「ミエローマ様細胞」は、抗原で免疫された様々な動物種由来の細胞と細胞融合することで、ハイブリドーマを形成することができる。細胞融合に用いる細胞としては、動物種としては、スナネズミ、マウス、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ等が挙げられ、これらの脾細胞、胸腺細胞等を用いることが好ましい。
これらの動物種を免疫する抗原としては、他動物の抗体やサイトカイン等のタンパク等いずれのものも用いることができるが、例えばＴ細胞依存性抗原であるＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（以下、ＫＬＨとする）等を用いることができる。また、ヒトを含む医療用としては、がん細胞抗原、ウイルスや細菌等の病原体抗原等が挙げられる。
【００１３】
本発明の「ミエローマ様細胞」とスナネズミのＢ細胞を細胞融合した場合にはＩｇＧ又はＩｇＭ等のモノクローナル抗体を産生し、Ｔ細胞と細胞融合した場合にはＴＧＦ−β、ＩＬ−２又はＴＮＦ−α等のサイトカインを産生することができる。産生された抗体及びサイトカインは精製することができ、研究等に用いることができる。
また、本発明の「ミエローマ様細胞」を用いることにより、従来マウスやラット等に限定されていたモノクローナル抗体産生をスナネズミで産生することが可能となり、マウス又はラットを抗原にした、マウス用やラット用のスナネズミモノクローナル抗体を作成、製品化することが可能となる。
【００１４】
本発明の「ミエローマ様細胞」を用いたハイブリドーマとしては、例えば「ミエローマ様細胞」としてＭｇＭＬ−２を用い、ＫＬＨで免疫したスナネズミより得られた脾臓細胞と細胞融合したＭｇｈｙ−Ｂ７、Ｍｇｈｙ−Ｆ３、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０、Ｍｇｈｙ−Ｇ３が挙げられる。これらのハイブリドーマはＴＧＦ−β、ＩＬ−２又はＴＮＦ−αのｍＲＮＡを少なくとも１つ以上発現していることから、サイトカインを産生し得ると考えられ、有用である。
【００１５】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
スナネズミミエローマ様細胞株の獲得
１．腹水細胞、脾臓又は骨髄由来クローンの単離
＜供試動物＞
本研究室でクローズドコロニーとして維持しているスナネズミ（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎ  ｇｅｒｂｉｌ；Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）を用いた。
飼育条件は、１４Ｌ／１２Ｄ、温度は２０±０．５℃、湿度は４５±５％、餌と水は自由摂取とした。飼料は固形飼料（ラボＭＲストック、日本農産工業）を用いた。出生後２週間から４週間の間は粉末飼料（粉末飼料ＭＦ、オリエンタル工業）を水で練ったものを固形飼料とともに与えた。
【００１７】
＜試薬＞
ａ．基本培地（ＲＰＭＩ１６４０）
ＲＰＭＩ１６４０「ダイゴ」（和光純薬工業）１０．４ｇと炭酸水素ナトリウム（ナカライテクス）２．０ｇを８５０ｍｌの蒸留水に溶解し、結晶ペニシリンジカリウム（明治製菓）１０万単位、硫酸ストレプトマイシン（明治製菓）１００ｍｇ、ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）１０ｍｌ、５×１０−２２−メルカプトエタノール（和光）１ｍｌを添加し、炭酸ガスでｐＨ７．４に調整後、蒸留水で１０００ｍｌにメスアップし、その後フィルター（０．２２μｍ，４７ｍｍ）（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を通過させることにより滅菌した。
ｂ．増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％）
基本培地にＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（以下、ＦＢＳとする）（ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＳＥ）を１０％（ｖ／ｖ）となるよう添加した。
ｃ．０．０１Ｍリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）
Ａ液〔リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ）２５．７９ｇとリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ）４．３７ｇとを超蒸留水で５００ｍｌにメスアップした液〕とＰＢＳ用Ｂ液（塩化ナトリウム８７．６６ｇを超蒸留水で５００ｍｌにメスアップした液）を超蒸留水で５００ｍｌにメスアップして作成した。０．０１Ｍリン酸緩衝液は、以下、ＰＢＳとする。
【００１８】
１）腹水細胞由来のミエローマ様細胞の単離
ａ）雌スナネズミ（１０５週齢、１０８週齢、１１０週齢）をジエチルエーテルによって麻酔した後、頚動脈より放血した。クリーンベンチ内にてこれらの雌スナネズミの腹腔内に０．２２μｍ滅菌フィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）で濾過滅菌したＰＢＳを注射し、腹部をよく揉み、細胞懸濁液を回収した。
ｂ）得られた細胞懸濁液を遠心分離（４℃、８０Ｇ、５ｍｉｎ）し、上清をアスピレートした後、ＰＢＳ１０ｍｌに再浮遊させ、遠心分離（４℃、８０Ｇ、５ｍｉｎ）を行った。
ｃ）上清をアスピレートした後、得られた細胞を増殖培地３ｍｌに浮遊させ、チュルク液（チュルク液：細胞浮遊液＝９：１）で核を染色し、血球計算盤を用いて腹水細胞数を計測した。
ｄ）２４ｗｅｌｌ平底プレート（♯１４３９８２，ＮＵＮＣ）に２×１０６ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ／ｗｅｌｌとなるよう増殖培地を添加し、細胞を播種した。この細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で長期培養することで、ミエローマ様細胞株の腹水細胞クローンを得た。
【００１９】
２）脾臓由来細胞のミエローマ様細胞の単離
ａ）上記１）で腹水細胞を採取したスナネズミの脾臓を無菌的に採取した。シャーレ内で夾雑物を除去した後、基本培地２ｍｌを加え、薬じを用いて脾臓細胞をしごき出した。１ｍｌシリンジ（ＴＥＲＵＭＯ）でよく撹拌し、上清を回収することで、単離した細胞を採取した。
ｂ）得られた脾臓細胞懸濁液を遠心分離（４℃、８０Ｇ、５ｍｉｎ）し、上清をアスピレートした後、得られた細胞を増殖培地３ｍｌに浮遊させ、チュルク液（チュルク液：細胞浮遊液＝９：１）で核を染色し、血球計算盤を用いて脾臓細胞数を計測した。
ｃ）腹水細胞と同様、２４ｗｅｌｌ平底プレート（♯１４３９８２，ＮＵＮＣ）に２×１０６ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ／ｗｅｌｌとなるよう増殖培地を添加し、細胞を播種した。この細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で長期培養することで、ミエローマ様細胞株の脾臓細胞クローンを得た。
【００２０】
３）骨髄細胞の採取
ａ）上記１）で腹水細胞を採取したスナネズミの骨髄を無菌的に採取した。骨髄細胞は骨尖刀で大腿骨を切り取り、１ｍｌシリンジ（ＴＥＲＵＭＯ）に針（２３Ｇ）を付け、基本培地で骨髄を洗い出すことで採取した。１ｍｌシリンジ（ＴＥＲＵＭＯ）でよく撹拌し、上清を回収し、単離細胞を採取した。
ｂ）得られた骨髄細胞懸濁液は遠心分離（４℃、８０Ｇ、５ｍｉｎ）し、上清をアスピレートした後、得られた細胞を増殖培地３ｍｌで浮遊させ、チュルク液（チュルク液：細胞浮遊液＝９：１）で核を染色し、血球計算盤を用いて骨髄細胞数を計測した。
ｃ）腹水細胞と同様、２４ｗｅｌｌ平底プレート（♯１４３９８２，ＮＵＮＣ）に２×１０６ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ／ｗｅｌｌとなるよう増殖培地を添加し、細胞を播種した。この細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で長期培養することで、ミエローマ様細胞株の骨髄細胞クローンを得た。
【００２１】
４）結果
雌スナネズミ（１０５週齢、１０８週齢、１１０週齢）から得られた脾臓、骨髄、腹水細胞を３ヶ月間培養した後、各細胞においてコロニーを観察した。これらのコロニーを９６穴マイクロプレートに移し、クローニングと限界希釈を３回繰り返した。その結果、これらの３個体のスナネズミより、脾臓細胞クローン（ＳＰ−Ｆ２、ＭｇＭＬ−３、ＳＰ−Ｆ４、ＳＰ−５２３）、骨髄細胞クローン（ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−４）、腹水細胞クローン（ＡＳ−Ｂ７、ＡＳ−Ｂ８、ＡＳ−Ｂ９、ＡＳ−Ｂ１０、ＡＳ−Ｃ１、ＡＳ−Ｄ３、ＡＳ−Ｄ４、ＡＳ−Ｄ５、ＡＳ−Ｄ６、ＡＳ−Ｄ７、ＭｇＭＬ−１）を得ることに成功した。
【００２２】
上記１．で得られた脾臓細胞クローン、骨髄細胞クローン、腹水細胞クローンを用い、次の選抜Ａ及びＢをすることで、ミエローマ様細胞として利用できる可能性を調べた。
【００２３】
２．スナネズミミエローマ様細胞株の選択
選抜Ａ．ＨＡＴ培地非耐性株
上記１．で得られた腹水細胞、脾臓又は骨髄由来クローンを細胞融合のパートナーとして用いる場合、ハイブリドーマ選択培地であるＨＡＴ培地非耐性株であることが必要である。そこで、上記１．で得られた各クローンと、比較としてマウスミエローマ（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．６５３）を用いて、ＨＡＴ培地非耐性株を選抜した。
【００２４】
＜ＨＡＴ培地＞
０．２２μｍ滅菌フィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）で濾過滅菌した超蒸留水（１０ｍｌ）をＨＡＴ  ｍｅｄｉａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０Ｘ）（ＳＩＧＭＡ）に加え、よく撹拌したものを増殖培地に２％となるように添加した。
【００２５】
１）ＨＡＴ培地非耐性株の選抜
トリパンブルー染色によって死亡率を測定した。
０．４％トリパンブルー液（＃９１Ｋ２３０５，ＳＩＧＭＡ）を０．２％で使用するため細胞浮遊液で１：１に希釈し、血球計算盤にて細胞数をカウントした。死亡率は死細胞数／全細胞数で算出した。
【００２６】
２）結果
培養２日目でＭｇＭＬ−１（腹水細胞クローン）で８６．４％、ＭｇＭＬ−２（骨髄細胞クローン）で９２．１％、ＭｇＭＬ−３（脾臓細胞クローン）で７４．４％、ＭｇＭＬ−４（骨髄細胞クローン）で７７．７％の非常に高い死亡率が示された。比較として用いたマウスミエローマ（Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３）も同様に８２．１％と非常に高い死亡率を示した。
培養５日目でＭｇＭＬ−２及びＭｇＭＬ−３と、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３の死滅が完全に認められ、培養６日目でＭｇＭＬ−１及びＭｇＭＬ−４の死滅が完全に認められた。また、これらの細胞は、ミエローマの選択に用いられる８−ａｓａｇｕａｎｉｎｅ耐性であることも確認された。
【００２７】
選抜Ｂ．抗体非産生株
細胞融合のパートナーとして用いる場合、それ自身が抗体、又はＨ鎖やＬ鎖を産生しない細胞を選抜する必要がある。そのため、上記Ａ．でＨＡＴ培地非耐性株であった４細胞株についてそれぞれ培養上清中におけるポリクローナルＩｇＭ及びＩｇＧ抗体量の測定、細胞融合時に抗原として用いるＫＬＨ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）に対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体量の測定を行った。
【００２８】
１）培養上清中のポリクローナルＩｇＭ及びＩｇＧ抗体産生量の測定
マウスプール血清を１０，０００倍希釈（ＩｇＭ用）したもの及び２４，０００倍希釈（ＩｇＧ用）したものを陽性対照とした。また、ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）となるように加えたものを陰性対照とした。
ａ）９６ｗｅｌｌプレート（＃４４２４０４，ＮＵＮＣ）に各細胞の培養上清、陽性対照及び陰性対照を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、２５℃、１時間インキュベーター内で反応させた。培養上清は９６穴マイクロプレート（♯３８６０−０９６、ＩＷＡＫＩ）に５×１０４個の細胞を増殖培地２００μｌ／ｗｅｌｌ中で３−５日培養したものを用いた。
その後、サンプルを取り除き、ＢＳＡ／Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：超蒸留水＝１：９）を３００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、２５℃、５分インキュベーター内で固相化し、液を取り除いた。
ｂ）２次抗体としてペルオキシターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（♯０７４−１８０３、ＫＰＬ社）又はＩｇＧ抗体（♯０７４−１８０６、ＫＰＬ社）１μｇ／ｍｌを１００μｌ添加して、２５℃、１時間インキュベーター内で反応させ、液を取り除いた。
ｃ）３００μｌ／ｗｅｌｌ  のＷａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｗａｓｈｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：超蒸留水＝１：１９）で４回洗浄後、室内を暗くし発色剤を１００μｌ／ｗｅ  ｌｌ添加した。
ｄ）マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ６８０，ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＬＡＢＯＲ  ＡＴＯＲＩＥＳ）により４０５ｎｍの吸光度でサンプルの吸光度を測定した。
基準血清としてマウスプール血清を１０，０００倍希釈（ＩｇＭ用）及び２４，０００倍希釈（ＩｇＧ用）を用い、これらの吸光度が２．０を示した時の同一プレート中のサンプルの値を本実験の結果として使用した。
【００２９】
２）培養上清中のＫＬＨに対するＩｇＧ及びＩｇＭ抗体産生量の測定
マウスプール血清を１，０００倍希釈（ＩｇＭ用）したもの及び２０，０００倍希釈（ＩｇＧ用）したものを陽性対照とした。また、ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）となるように加えたものを陰性対照とした。
ａ）Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：超蒸留水＝１：９）で１００倍に希釈したＫＬＨ（１０μｇ／ｍｌ）を９６ｗｅｌｌプレート（＃４４２４０４，ＮＵＮＣ）に１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し２５℃、１時間インキュベーター内で反応させ固相化した。
ｂ）液を取り除きＢＳＡ／Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを３００μｌ／ｗｅｌｌ添加し２５℃で５分間固相化し、液を取り除いた。
ｃ）細胞培養上清を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、陽性対照と陰性対照と共に２５℃，１時間インキュベーター内で反応させた。
ｄ）３００μｌ／ｗｅｌｌ  のＷａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、その後２次抗体としてペルオキシターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ又はＩｇＧ抗体１μｇ／ｍｌを１００μｌ添加して、２５℃、１時間インキュベーター内で反応させ、液を取り除いた。
ｅ）上記１）ｃ）、ｄ）と同様の方法により、サンプルの吸光度を測定した。
【００３０】
結果
図１Ａ、Ｂに示すように、ポリクローナルＩｇＭ及びＩｇＧ抗体産生量において、ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３及びＭｇＭＬ−４とマウスミエローマ（Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３、以下図面におけるＰ３ｘ６３はＰ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３の略である）との間に差は認められなかった。
また、図２Ａ、Ｂに示すように、ＫＬＨに対するＩｇＧ及びＩｇＭ抗体産生量においてもＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３及びＭｇＭＬ−４とマウスミエローマ（Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３）との間に差は認められなかった。
以上の結果より、これらの４細胞株（ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３、ＭｇＭＬ−４）がＨＡＴ培地非耐性株であり、かつ抗体成分非分泌株であることから、細胞融合パートナーとして有用なスナネズミ由来のミエローマ様細胞であることが示された。これらの４細胞株の形態を図３に示した。
【００３１】
３．スナネズミミエローマ様細胞株の性状の検討
検討Ａ．ＣＤ３表面抗原マーカーとＩｇＭ表面レセプターにおけるシグナル発現量
上記１．及び２．で得られた４つのスナネズミミエローマ様細胞株（ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３、ＭｇＭＬ−４）の性状を検討した。比較として、マウスミエローマ（Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３）及び雌スナネズミより下記の方法によって無菌的に単離した脾臓、胸腺細胞を用いた。
【００３２】
＜供試動物＞
ａ．スナネズミ脾臓細胞と胸腺細胞
２８週齢雌スナネズミから得た脾臓及び胸腺を用いて、実施例１．２）と同様の操作によって、脾臓及び胸腺細胞単離し、１サンプル１×１０６ｃｅｌｌｓとなるようＰＢＳを添加し、５ｍｌ滅菌培養チューブ（♯２２３１−０１２Ｎ，ＩＷＡＫＩ）に各細胞を移した。
ｂ．スナネズミミエローマ様細胞及びマウスミエローマ細胞
上記１．及び２．で得られた４つのスナネズミミエローマ様細胞株及びマウスミエローマ（Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３）を用いた。各ミエローマ細胞は、あらかじめ１×１０７ｃｅｌｌｓ／１０ｍｌとなるよう増殖培地にて培養しておいたものを使用した。各ミエローマ細胞を１サンプル１×１０６ｃｅｌｌｓとなるようＰＢＳを添加し、５ｍｌ滅菌培養チューブ（♯２２３１−０１２Ｎ，ＩＷＡＫＩ）に各細胞を移した。
＜試薬＞
ａ．６％ＢＳＡ−ＰＢＳ
ウシ血清製アルブミン・コーンフラクションＶ（Ｗａｋｏ）６ｇをＰＢＳ９４ｍｌで溶解して調製した。
【００３３】
１）ＣＤ３表面抗原マーカーにおけるシグナル発現量の測定
ａ）上記ａ．及びｂ．の５ｍｌ滅菌培養チューブ（♯２２３１−０１２Ｎ，ＩＷＡＫＩ）に７０％エタノールを１ｍｌずつ添加し、滅菌培養チューブの端を指でタッピングして、氷上にて３０分間置き固定を行った。次にＰＢＳを４ｍｌとなるよう加え、遠心分離（４℃、８０Ｇ、５ｍｉｎ）を行い、７０％エタノールを洗った。遠心分離後は上清をアスピレートし、細胞のみにして６％ＢＳＡ−ＰＢＳを１ｍｌずつ加え、インキュベート（２５℃、３０ｍｉｎ）した。その後ＰＢＳを４ｍｌとなるよう加え、遠心分離（４℃、８０Ｇ、５ｍｉｎ）を行い、６％ＢＳＡ−ＰＢＳを洗った。
ｂ）遠心分離後は上清をアスピレートし、細胞のみにして、１次抗体であるウサギ抗マウスＣＤ３−γＩｇＧポリクローナル抗体（♯ｓｃ−２８８１２，ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ．）（０．１μｇ／０．５μｌ）０．５μｌをＰＢＳ９９．５μｌで溶解したものを１００μｌずつ添加し、インキュベート（２５℃、２時間）した。その後ＰＢＳを４ｍｌとなるよう加え、遠心分離（４℃、８０Ｇ、５ｍｉｎ）を行い、上清をアスピレートした。
ｃ）２次抗体であるＰＥ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（♯ｓｃ−３７３９，ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ．）０．４μｇ／μｌを１μｌ、ＰＢＳで１０００倍に希釈したものを１００μｌずつ加え、３０分間インキュベートした（２５℃）。その後、ＰＢＳを４ｍｌとなるよう加え、遠心分離（４℃、８０Ｇ、５ｍｉｎ）を行い、上清をデカンテーションで除き、ＰＢＳ５００μｌで細胞を浮遊させた。
ｄ）セルストレーナーキャップ付き５ｍｌラウンドチューブ（♯３５２２３５，ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に細胞浮遊液を移し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ，ＢＤ）による解析を行った。
【００３４】
２）ＩｇＭ表面レセプターにおけるシグナル発現量の測定
ａ）上記１）ａ）と同様の操作を行った。
ｂ）遠心分離後は上清をアスピレートし、細胞のみにして、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＭポリクローナル抗体（♯０２−１８−０３，ＫＰＬ）（０．５μｇ／μｌ）２．５μｌをＰＢＳ９７．５μｌで溶解したものを１００μｌずつ添加し、１時間インキュベート（２５℃）した。その後ＰＢＳを４ｍｌとなるよう加え、遠心分離（４℃、８０Ｇ、５ｍｉｎ）を行い、上清をアスピレートした。遠心分離後、上清をデカンテーションで除き、ＰＢＳ５００μｌで細胞を浮遊させた。
ｃ）セルストレーナーキャップ付き５ｍｌラウンドチューブ（♯３５２２３５，ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に細胞浮遊液を移し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ，ＢＤ）による解析を行った。
【００３５】
３）結果
本発明で得られたスナネズミミエローマ様細胞株は図４に示すように、脾臓や胸腺細胞と比べ、大きさと密度が非常に高い細胞群であることが示された。
図５に示すように、ＣＤ３表面抗原マーカーのシグナル発現量において、スナネズミ胸腺細胞では２つのピークを示した。４×１０２以下のシグナルを示す細胞群を陰性細胞群、１．１×１０３以上を陽性細胞群として、これと同条件でスナネズミミエローマ様細胞の発現量を測定した結果、図７Ａに示すように、ＭｇＭＬ−１のピーク値は３５７、ＭｇＭＬ−２で４９６、ＭｇＭＬ−３で４７０、ＭｇＭＬ−４では４８１の値を示し、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３では３４８を示した。スナネズミミエローマ様細胞群の４株全てにおいて、マウスミエローマであるＰ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３の発現量と明瞭な差はなく、弱陽性群と同程度のシグナル発現量を示すことが確認された。
また図６に示すように、ＩｇＭ細胞表面レセプターのシグナル発現量において、スナネズミ脾臓細胞では３つのピークを示した。３×１０３以下のシグナルを示す細胞群を陰性細胞群、８×１０３以上をＩｇＭ弱陽性細胞群及び２×１０４以上のシグナルを示す細胞群をＩｇＭ強陽性細胞群として、この条件で測定した結果、図７Ｂに示すように、ＭｇＭＬ−１のピーク値は２８５９、ＭｇＭＬ−２で２８８０、ＭｇＭＬ−３で２７３６、ＭｇＭＬ−４では２１６８の値を示し、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３は２８８５を示した。スナネズミミエローマ様細胞群の４株全てにおいて、マウスミエローマであるＰ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３の発現量と明瞭な差はなく、３×１０３以下シグナルを示す陰性細胞群と同程度のシグナル発現量を示した。
【００３６】
検討Ｂ．ｍｉｔｏｇｅｎ添加培養時における増殖能
上記１．及び２．で得られた２つのスナネズミミエローマ様細胞株（ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２）を用い、培地に添加したＦＢＳ濃度の違いによる増殖能の違いを検討した。
＜試薬＞
Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ，ＢｒｄＵ（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）（＃１１  ６４７  ２２９  ００１，Ｒｏｃｈｅ）（以下、ＢｒｄＵとする）を細胞増殖能の測定に用いた。ＦｉｘＤｅｎａｔ、抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ及び基質液等はキットに含まれているものを用いた。
【００３７】
１）異なるＦＢＳ濃度添加培養時における細胞増殖能の測定
ａ）スナネズミミエローマ様細胞株（ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２）を５０ｍｌスラントネック細胞培養フラスコ（＃３５２０７０，ＦＡＬＣＯＮ）で１×１０７ｃｅｌｌｓ／１０ｍｌとなるよう基本培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４８時間培養した。
ｂ）ＲＰＭＩ１６４０にＦＢＳを０、１、２、３、５、又は１０％添加した培地を用いて、９６ｗｅｌｌ平底プレート（♯３８６０−０９６，ＩＷＡＫＩ）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種した。さらに各ｗｅｌｌ  にＢｒｄＵ標識試薬（１００μＭ）を２０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、総量２２０μｌ／ｗｅｌｌとし、１８時間培養した。
ｃ）培養停止後すぐに遠心分離（２５℃、３００Ｇ、１０ｍｉｎ）した後、プレートを逆さに振り、上清を捨てた後、ヘアドライヤーを使用して１５分間乾燥させた。
ｄ）ＦｉｘＤｅｎａｔを２００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、インキュベーター（２５℃、６０ｍｉｎ）内で培養することで、細胞の固定とＤＮＡの変性を行った。ＦｉｘＤｅｎａｔを除き、抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤを１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、インキュベート（２５℃、９０ｍｉｎ）後、洗浄液２００μｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。
ｅ）基質液を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、その後マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ６８０，ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＬＡＢＯＲ  ＡＴＯＲＩＥＳ）４０５ｎｍの吸光度でサンプルの吸光度を測定した。
【００３８】
結果
ＭｇＭＬ−２では図８−１Ａに示すように、ＦＢＳ無添加群と比較し、３％ＦＢＳ添加群をピークに増加傾向を示したが、５％ＦＢＳ及び１０％ＦＢＳ添加群では無添加群と同等か、それ以下に減少した。一方、ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−３及びＭｇＭＬ−４においてはそれぞれ図８−１Ｂ及び図８−２Ｃ、Ｄに示すように、添加ＦＢＳ濃度に比例し著しく増加を示した。しかし、３〜５％添加群で増加はピークに達しているようであった。
【００３９】
２）ｍｉｔｏｇｅｎ添加培養時におけるＢｒｄＵを用いた細胞増殖能の測定
＜試薬＞
Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（♯Ｌ６５２９，ＳＩＧＭＡ）（以下、ＬＰＳとする）、Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（♯Ｌ８９０２，ＳＩＧＭＡ）（以下、ＰＨＡとする）、Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（♯Ｃ０４１２，ＳＩＧＭＡ）（以下、ＣｏｎＡとする）をｍｉｔｏｇｅｎとして用いた。
【００４０】
ａ）スナネズミミエローマ様細胞株（ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２）を用い、上記１）ａ）と同様に培養した。
ｂ）ＲＰＭＩ１６４０＋１％ＦＢＳに培地交換し、２４時間培養し、９６ｗｅｌｌ平底プレート（♯３８６０−０９６，ＩＷＡＫＩ）に５×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種した。これらの細胞をＬＰＳ（０、０．１、０．３、１、２、１０μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）、ＰＨＡ（０、０．１、１、５、１０、２０μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）、ＣｏｎＡ（０、０．０５、０．１、１、２、１０μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）で刺激し、２４時間培養した。
ｃ）さらに各ｗｅｌｌ  にＢｒｄＵ標識試薬（１００μＭ）を２０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、総量２２０μｌ／ｗｅｌｌで４時間培養した後、上記１）と同様の操作で細胞増殖能の測定を行った。
【００４１】
結果
ＭｇＭＬ−１及びＭｇＭＬ−２はＦＢＳに対する感受性が異なるが、図９Ａ（ＭｇＭＬ−１）及び図９Ｂ（ＭｇＭＬ−２）に示すように、ＬＰＳ、ＰＨＡ、ＣｏｎＡ低濃度添加群では、無添加群との間に細胞増殖能に差は認められなかった。高濃度添加群（ＬＰＳ１０μｇ，ＰＨＡ１０μｇ，ＣｏｎＡ１μｇ）においては細胞増殖能の低下を示したが、これは細胞死によるものと考えられた。
【００４２】
検討Ｃ．スナネズミサイトカインｍＲＮＡの発現量
上記１．及び２．で得られた４つのスナネズミミエローマ様細胞株（ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３、ＭｇＭＬ−４）を用いて、ｍｉｔｏｇｅｎ刺激によるサイトカイン発現量の違いをＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲとする）によって調べた。比較として雌スナネズミより無菌的に単離した脾臓、胸腺細胞を用いた。
【００４３】
＜供試動物＞
スナネズミミエローマ様細胞株
あらかじめ１×１０７ｃｅｌｌｓ／１０ｍｌとなるよう増殖培地にて培養しておいたものを用いた。これを基本培地にて４８時間インキュベートした後、ＲＰＭＩ１６４０＋１％ＦＢＳ条件下でＬＰＳ（２０μｇ／２ｍｌ）、ＣｏｎＡ（１μｇ／２ｍｌ）を添加して培養し、３時間後にＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄して実験に用いた。
【００４４】
＜試薬＞
ａ．プライマー
配列表配列番号１、２のＩＬ−２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ２）（参考文献１）、配列表配列番号３、４のＩＬ−４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ４）（参考文献１）、配列表配列番号５、６のＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β）（参考文献２）、配列表配列番号７、８のＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−α）（参考文献３）、及び各遺伝子相対評価のために配列表配列番号９、１０のＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。
［参考文献１］  Watanabe M, Lee BJ, Yamashita M, Kamitani W, Kobayashi T, Tomonaga K, Ikuta K. 2003. Borna disease virus induces acute fatal neurological disorders in neonatal gerbils without virus- and immune-mediated cell destructions. Virology, 310(2), 245-253.
［参考文献２］  Lee BJ, Watanabe M, Kamitani W, Baba S, Yamashita M, Kobayashi T, Tomonaga K, Ikuta K. 2003. Age- and host-dependent control of Borna disease virus spread in the developing brains of gerbils and rats. Microbes and Infection, 5(13), 1195-1204.
［参考文献３］  Matsubara S, Shibata H, Takahashi M, Ishikawa F, Yokokura T, Sugimura T, Wakabayashi K. 2004. Cloning of Mongolian gerbil cDNAs encoding inflammatory proteins, and their expression in glandular stomach during H. pylori infection. Cancer Science, 95(10), 798-802.
【００４５】
ｂ．ＲＴ−ＰＣＲ用試薬
ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ），（Ｖｅｒ．２．１，Ｔａｋａｒａ）を用い、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ）、Ｏｌｉｇｏ−ｄｔ−Ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓ  ｃｒｉｐｔａｓｅ、ｒＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（全てＴａｋａｒａ）は別売りのものを使用した。
調整した試薬、器具に関しては特に記載のないもの以外、オートクレーブ可能なものは１２１℃、１５分のオートクレーブにより滅菌を行った。
【００４６】
１）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
試料はＭｉｔｏｇｅｎによる刺激をしたスナネズミミエローマ様細胞と刺激しなかったスナネズミミエローマ様細胞を使用した。
ａ）２．０ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた約１×１０６個の細胞に１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、超音波破砕機（Ｈａｎｄｙ  Ｓｏｎｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ＵＲ−２０Ｐ，ＴＯＭＹ  ＳＥＩＫＯ）により細胞を十分に破砕し、５分間氷上に静置した。その後クロロホルムを２００μｌ添加し、転倒混和によりサンプルと混和した。
ｂ）クロロホルムの反応のために室温で３分静置し、遠心分離（４℃、１，４００Ｇ、１５ｍｉｎ）し、ＲＮＡ層のみを回収した。上清と等量のイソプロパノールを添加し、転倒混和後、１０分室温静置し、遠心分離（４℃、１，４００Ｇ、１５ｍｉｎ）した。遠心分離後、デカンテーションにより上清を捨て、タッピングを行った。イソプロパノールの除去のため、７０％エタノールを１ｍｌ添加し、転倒混和後、遠心分離（４℃、１，４００Ｇ、１５ｍｉｎ）した。
ｃ）上清をデカンテーションにより除去し、キムワイプでエタノールを吸い取り、エッペンドルフのふたを開けてエタノールを揮発させた。揮発させている最中はキムワイプでふたをした。ＤＥＰＣ水を３０μｌ加えてタッピングし、氷上で１０分静置した後、ディープフリーザーで保存した。
【００４７】
２）ＲＴ−ＰＣＲ
ａ）ＲＴ
上記１）によって抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、Ｎａｎｏ  Ｄｏｒｐ（ＮＤ−１０００，Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．，Ｉｎｃ，Ａｍｅｒｉｃａ）により純度と濃度を測定し、５００ｎｇをＲＴに用いた。
ＰＣＲ反応３本分の組成は以下のとおりである。ＭｇＣｌ２（６μｌ）、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｍｇ（−）（３μｌ）、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（３μｌ）、Ｒｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ（０．７５μｌ）、Ｏｌｉｇｏ−ｄｔ−Ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｉｍｅｒ（１．５μｌ）、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓ  ｔｒａｎｓ  ｃｒｉｐｔａｓｅ（１．５μｌ），サンプル（１５００ｎｇ）、ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  が３０μｌになるようにＤＥＰＣ水を添加した。
反応は、４２℃、３０分をＲＴのため、９９℃、５分をＲＴ不活化のため行い、反応を安定させるために５℃、５分、その後４℃で１５分静置した。
【００４８】
ｂ）ＰＣＲ
上記ａ）のＲＴによって作られたｃＤＮＡのうち、１０μｌをＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。ＰＣＲ反応の組成は、ｒＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（０．２５μｌ）、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ＋）（５μｌ）、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（４μｌ）、Ｓｅｎｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（１μｌ）、Ａｎｔｉ−Ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（１μｌ）、ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅが５０μｌになるようにＤＥＰＣ水（１８．７５μｌ）を添加した。ＰＣＲ反応は次のように行った。
＜ＰＣＲ反応＞
９４℃      ２分    ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ（熱変性）
９４℃    ３０秒    ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ（２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡへ熱変性）
Ｘ℃      １分    ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（プライマーのアニーリング）
７２℃      １分    ｘｔｅｎｓｉｏｎ（伸長反応）
７２℃      ５分    ｆｉｎａｌ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ
【００４９】
ｃ）アガロースゲル電気泳動
ＰＣＲ産物１０μｌに２μｌの６×ゲルローディングバッファー（ＴａＫａＲａ）を加えて撹拌した。１×ＴＡＥバッファーで満たされた１．５％アガロースゲルに試料を添加し、電気泳動（１００Ｖ、５０ｍｉｎ）を行った。マーカーには１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（ＴａＫａＲａ）を用いた。泳動後、トランスイルミネーター（Ｐｒｉｎｔｇｒａｐｈ：アトー株式会社）でＵＶをゲルに照射し、Ｉｍａｇｅ  Ｓａｖｅｒ  ＡＥ−６９０５ｃ（アトー株式会社）で泳動パターンを撮影した。
【００５０】
ｄ）解析
解析は肉眼で観察可能なバンドのみ数的処理を行い、記録した泳動像は、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって取り込み、バンドの発色強度をＯｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ（Ｏ．Ｄ．）値に換算した。その輝度は標準であるＧＡＰＤＨのバンド濃度を各サイトカインの輝度で除した値に１００を乗じた相対輝度で示した。
【００５１】
結果
図１０、１１−１Ａに示すように、ＭｇＭＬ−１において無添加群ではＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現は示されなかった。しかし、ＬＰＳ添加群、ＣｏｎＡ添加群においては、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡを１００とする相対輝度で比較したところ、３０．０６、２９．０４の輝度を示した。
同様にＭｇＭＬ−２においても図１１−１Ｂに示すように、無添加群ではＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現は示されなかったが、ＬＰＳ添加群においてはＴＮＦ−αは３１．３３の輝度の発現が示された。また、ＣｏｎＡ添加群において相対輝度４２．８６の発現が示された。
さらにＭｇＭＬ−３においても同様に、図１１−２Ｃに示すように、無添加群ではＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現は示されなかったが、ＬＰＳ添加群とＣｏｎＡ添加群においてそれぞれ相対輝度３７．０２と３２．４３でＴＮＦ−αの発現が示された。
これに対しＭｇＭＬ−４においては図１１−２Ｄに示すように無添加群、ＬＰＳ添加群、ＣｏｎＡ添加群でそれぞれ５８．９１、４５．４２、４４．２７の相対輝度を示した。表１に示すように、ＴＧＦ−βは４細胞群の無添加群、ＬＰＳ添加群、ＣｏｎＡ添加群において発現が示された。ＩＬ−２とＩＬ−４は４細胞群の無添加群、ＬＰＳ添加群、ＣｏｎＡ添加群のいずれにおいても発現が示されなかった。
【００５２】
【表１】
2008237065.tif 000002
【実施例２】
【００５３】
スナネズミミエローマ様細胞株とスナネズミ脾細胞との細胞融合
これらの細胞を融合することでハイブリドーマの形成を試みた。
＜供試動物＞
ａ．ミエローマ様細胞
実施例１で得られた４つのスナネズミミエローマ様細胞株（ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３、ＭｇＭＬ−４）を用いた。
ｂ．脾臓細胞
スナネズミ１匹あたりＫＬＨ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）２００μｌを腹腔内に投与した。投与は２回行い、１次投与を細胞融合１２日以前に行い、２次投与を細胞融合５日前に施した。このスナネズミより、実施例１、２）ａ）と同様に単離した脾臓細胞を用いた。
＜試薬＞
ａ．抗原
Ｔ細胞依存性抗原であるＫＬＨ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）を使用した。ＫＬＨはＰＢＳで１０ｍｇ／ｍｌに溶解し、使用時まで−８０℃で保存した。
ｂ．培地
実施例１と同様の方法で作成した基本培地、増殖培地及びＨＡＴ培地を用いた。また、次の方法で調整したＨＴ培地を用いた。
ＨＴ培地
０．２２μｍ滅菌フィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）で濾過滅菌した超蒸留水（１０ｍｌ）をＨＴ  ｍｅｄｉａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０Ｘ）（ＳＩＧＭＡ）に加え、よく撹拌したものを増殖培地に２％となるように添加した。
ｃ．ｆｅｅｄｅｒ細胞
実施例１、１）ａ）と同様に、雌マウス（２８週齢）の腹水細胞を細胞懸濁液として採取し、遠心分離（４℃、８０Ｇ、５ｍｉｎ）を１回行った後、ＨＡＴ培地５ｍｌに再浮遊させて細胞数を計測した。その後、ＨＡＴ培地を用いて９６ｗｅｌｌ平底プレート（♯３８６０−０９６，ＩＷＡＫＩ）に腹水細胞が２×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように播種し、２４時間培養したものを用いた。
【００５４】
１）細胞融合
ａ）スナネズミミエローマ様細胞株（ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３、ＭｇＭＬ−４）及びスナネズミ脾細胞を基本培地に再浮遊させ、５０ｍｌポリプロピレンコニカルチューブ（♯３５２０７０，ＦＡＬＣＯＮ）内で混合した。両者の細胞数の比率はミエローマ：脾細胞＝１：３で行った。ＲＰＭＩ１６４０で３０ｍｌにメスアップし、よく混合した後、遠心分離（２５℃、１８０Ｇ、１０ｍｉｎ）を行い、上清をアスピレートした。上清を吸引除去し、ペレットをほぐすため５０ｍｌコニカルチューブ（ＦＡＬＣＯＮ）を手のひらに打ち付け、３７℃の水槽で１、２分暖めた。これ以降のＰＥＧの添加、ＰＥＧの希釈はすべて３７℃の水槽中で行った。
ｂ）まず、３７℃に加温したＰＥＧ１ｍｌをピペッターの先端で細胞をゆっくりほぐすようにかき混ぜながら１分間かけて添加し、さらに１分間ピペッターの先端でかき混ぜた。次に３７℃に加温したＲＰＭＩ１６４０を１ｍｌ、１分間で完全に出し切るように混ぜながら添加した。
ｃ）同様にＲＰＭＩ１６４０を１分間かけて３ｍｌ、１０ｍｌ、１０ｍｌを前記と同様に添加しＰＥＧを希釈した。遠心分離（２５℃、１８０Ｇ、１０ｍｉｎ）を行い、上清をアスピレートした。
ｄ）ＨＡＴ選択培地３ｍｌを少しずつ添加しながら混合した。９６ｗｅｌｌ平底プレート（ＩＷＡＫＩ）に脾細胞２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるようＨＡＴ選択培地を添加した。細胞塊が残っている程度の状態で、９６ｗｅｌｌ平底プレート（ＩＷＡＫＩ）に脾細胞２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌずつ播種し、その後インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で培養した。
【００５５】
２）培地交換
融合の翌日に培地を半分取り除きＨＡＴ培地１００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。この培地交換を１日目（融合の翌日）、３日目、５日目と行い、培地を完全にＨＡＴ培地に置換することで、ＨＡＴ培地による選択を行った。
融合しなかった細胞は４日目から１週間で死滅し、一方ハイブリドーマはこの頃からコロニーを形成し始めるため、コロニーが増殖してきたら、培地をＨＡＴ培地からＨＴ培地に切り替えた。１０日目にＨＴ培地１００μｌ／ｗｅｌｌを加え、１５日目に増殖培地１００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。
【００５６】
３）培養上清中における抗体量の測定
ＫＬＨ投与により産生された血清中及び培養上清中のＫＬＨに対する抗体量の測定にはＥＬＩＳＡｍａｔｅ（ＫＰＬ社）を使用し、培養上清中のポリクローナルＩｇＭ及びＩｇＧ抗体産生量と、ＫＬＨに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体産生量を測定した。
実施例１、２．選別Ｂ．と同様の操作によって、培養上清中のポリクローナルＩｇＧ、ＩｇＭ量とＫＬＨに対するＩｇＧ、ＩｇＭ量の測定を行った。
【００５７】
４）産生されたＩｇクラス・サブクラス、及びＬ鎖のタイプの同定
ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体のＩｇクラス・サブクラス、及びＬ鎖のタイプをＭｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（♯１４９３０２７，Ｒｏｃｈｅ）を用いて同定した。
【００５８】
５）結果
ＭｇＭＬ−１
融合５日目でＢ１０、Ｃ９、Ｄ４、Ｅ４、Ｇ９、融合１３日目でＢ６にてコロニー形成が確認された。総コロニー数は７、コロニー形成率１１．６７％であった。
１０日目に、これら５つのコロニーを９６穴マイクロプレートに移し、ＨＴ培地（２００μｌ）、ＨＴ培地（１００μｌ）＋ｆｅｅｄｅｒ細胞培養上清（１００μｌ）にて５日間培養した。得られた培養上清中のＫＬＨに対するＩｇＧ量を測定したところ図１２に示すように、５つ全てのコロニーにおいて陽性反応を示した。
このうち特に高いＫＬＨに対するＩｇＧ量を示した陽性コロニー（Ｃ９）について、Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いＩｇクラス／サブクラス、及びＬ鎖のタイプを調べたところ、Ｃ９（ＨＴ培地）において、Ｌ鎖がκであるＩｇＧ１、Ｃ９（ＨＴ培地＋ｆｅｅｄｅｒ細胞培養上清）においてＩｇＧ１、ＩｇＧ３、そしてＩｇＭの産生を確認した。
ＭｇＭＬ−２
融合後１１日で６０ｗｅｌｌ中７ｗｅｌｌにおいてコロニーが観察され、総コロニー数は１８、コロニー形成率は１１．７％であった。このうち４つのコロニー名をＭｇｈｙ−Ｂ７、Ｍｇｈｙ−Ｆ３、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０、Ｍｇｈｙ−Ｇ３とした。図１３Ａ、Ｂに示すように、これらのハイブリドーマにおいて、ＩｇＭとＩｇＧ産生は確認されなかった。
ＭｇＭＬ−３
６０ｗｅｌｌ中２ｗｅｌｌにおいてコロニーが観察され、総コロニー数は２、コロニー形成率は３．３％であった。ＩｇＧ産生は確認されなかった。
ＭｇＭＬ−４
６０ｗｅｌｌ中１ｗｅｌｌにおいてコロニーが観察され、総コロニー数は１、コロニー形成率は１．６７％であった。ＩｇＧ産生は確認されなかった。
【００５９】
各ミエローマ様細胞株を用いた場合の結果を表２にまとめた。本発明で得られた４株のスナネズミミエローマ様細胞のうち、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ作成において、ＭｇＭＬ−１が細胞融合パートナーとして有用であることが示唆された。
【００６０】
【表２】
2008237065.tif 000003
【実施例３】
【００６１】
スナネズミハイブリドーマにおけるサイトカインｍＲＮＡの遺伝子発現解析
スナネズミミエローマ様細胞（ＭｇＭＬ−２）とスナネズミ脾細胞との細胞融合により実施例２で得られたハイブリドーマ（Ｍｇｈｙ−Ｂ７、Ｍｇｈｙ−Ｆ３、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０、Ｍｇｈｙ−Ｇ３）はＨＡＴ培地で増殖するにもかかわらず抗体産生が確認されなかった。そこで、ＲＴ−ＰＣＲ法によるサイトカインｍＲＮＡ発現量、フローサイトメーターによるＣＤ３表面抗原マーカー及びＩｇＭ細胞表面レセプターシグナル発現量を測定し、得られたハイブリドーマの性状を検討した。
【００６２】
＜供試動物＞
実施例１で得られたスナネズミミエローマ様細胞株（ＭｇＭＬ−２）とスナネズミ脾細胞のハイブリドーマ（Ｍｇｈｙ−Ｂ７、Ｍｇｈｙ−Ｆ３、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０、Ｍｇｈｙ−Ｇ３）を用いた。
ハイブリドーマは、あらかじめ５０ｍｌスラントネック細胞培養フラスコ（＃３５２０７０，ＦＡＬＣＯＮ）で１×１０７ｃｅｌｌｓ／１０ｍｌとなるよう増殖培地にて培養しておいたものを用いた。
【００６３】
検討Ａ．サイトカインの発現解析
１）実施例１で示した配列表配列番号１〜１０のプライマーと、ＲＴ−ＰＣＲ用の試薬を用い、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動及び画像解析を行った。
【００６４】
２）結果
ｍＲＮＡ量は電気泳動で得られたバンドの濃度をＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅで測定し、バンド濃度で表した。その輝度は内部標準であるＧＡＰＤＨのバンド濃度を各サイトカインの輝度で除した値に１００を乗じた相対輝度で表し、その結果を図１４、１５に示した。
Ｍｇｈｙ−Ｂ７で９２．６８３、Ｍｇｈｙ−Ｆ３で８０．９１９、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０で５８．３７８、Ｍｇｈｙ−Ｇ３で５６．９８３とＴＧＦ−βｍＲＮＡ発現を示した。また、Ｍｇｈｙ−Ｇ３においてＩＬ−２ｍＲＮＡを４６．６４８、ＴＮＦ−αｍＲＮＡを３６．５９２とそれぞれ発現を示した。
【００６５】
検討Ｂ．ＣＤ３表面抗原マーカー及びＩｇＭ表面レセプターにおけるシグナル発現量
＜供試動物＞
上記１．と同じくあらかじめ培養しておいたハイブリドーマ（Ｍｇｈｙ−Ｂ７、Ｍｇｈｙ−Ｆ３、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０、Ｍｇｈｙ−Ｇ３）を用いた。
【００６６】
１）ＣＤ３表面抗原マーカー及びＩｇＭ表面レセプターにおけるシグナル発現量の測定
ａ）５ｍｌ  滅菌培養チューブ（♯２２３１−０１２Ｎ，ＩＷＡＫＩ）に各ハイブリドーマを１×１０６ｃｅｌｌｓとなるよう加え、遠心分離（４℃、８０Ｇ、５ｍｉｎ）を行った。その後、上清をアスピレートして細胞のみにし、これを１サンプルとした。
ｂ）ＣＤ３表面抗原マーカー及びＩｇＭ表面レセプターにおけるシグナル発現量は、実施例１と同様の操作で測定した。
【００６７】
２）結果
図１６、１８Ａ、Ｂに示すように、Ｍｇｈｙ−Ｂ７は融合パートナーとし用いたＭｇＭＬ−２よりも大きな細胞群であり、ＭｇＭＬ−２におけるＣＤ３とＩｇＭシグナル発現量との間に明瞭な差は示されなかった。Ｍｇｈｙ−Ｆ３はＭｇＭＬ−２よりも密度の高い細胞群であり、ＣＤ３シグナル発現量はＭｇＭＬ−２との間に明瞭な差は示されなかったが、ＩｇＭシグナル発現量においてＭｇＭＬ−２の発現量が２８８０であるのに対し、Ｍｇｈｙ−Ｆ３では４５６５と非常に高い値を示した。
また、図１７、１８Ａ、Ｂに示すように、Ｍｇｈｙ−Ｇ３はＭｇＭＬ−２よりも大きさと密度の高い細胞群であり、ＩｇＭシグナル発現量はＭｇＭＬ−２との間に明瞭な差は示されなかったが、ＭｇＭＬ−２のＣＤ３発現量が７９２であるのに対し、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０で５２５２、Ｍｇｈｙ−Ｇ３で３１４０と非常に高い値を示した。この結果から、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０とＭｇｈｙ−Ｇ３において非常に高いＣＤ３シグナルを示す細胞群（ＣＤ３０陽性）が存在することが明らかとなった。
【００６８】
以上より、ＨＡＴ培地で増殖を示した４細胞株（Ｍｇｈｙ−Ｂ７、Ｍｇｈｙ−Ｆ３、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０、Ｍｇｈｙ−Ｇ３）の内、Ｍｇｈｙ−Ｂ７、Ｍｇｈｙ−Ｆ３、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０においてＴＧＦ−β、Ｍｇｈｙ−Ｇ３においてＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−βｍＲＮＡの発現が観察された。ＩＬ−２は主にＣＤ４＋Ｔリンパ球から産生され、Ｔｈ０、Ｔｈ１双方が産生するＴリンパ球特有のサイトカインである。
またＭｇｈｙ−Ｇ３はＭｇＭＬ−２より、大きさと密度の高い細胞群であり、非常に高いＣＤ３シグナル発現量を示した。一方、Ｍｇｈｙ−Ｆ３はＭｇＭＬ−２より、非常に高いＩｇＭシグナル発現量を示した。これらの結果はＭｇｈｙ−Ｆ１０とＭｇｈｙ−Ｇ３がＴリンパ球様であることを示唆した。このことから、ＭｇＭＬ−２を用いた細胞融合ではＴ細胞と融合したＴ細胞ハイブリドーマを得ることが示唆された。
【００６９】
［参考例］
参考として、得られたスナネズミミエローマ様細胞株とマウス脾細胞との異種間細胞融合について検討した。
【００７０】
スナネズミミエローマ様細胞とマウス脾細胞における細胞融合
＜供試動物＞
ａ．マウス脾細胞
ＩＣＲ系雌マウス２８週齢（日本エスエルシー株式会社）から実施例２のスナネズミ脾細胞と同様の操作によって得た脾細胞を用いた。
ｂ．スナネズミミエローマ様細胞株
骨髄細胞由来ＭｇＭＬ−２を用い、実施例２と同様の操作で調整を行った。
その他、抗原投与、培地、ｆｅｅｄｅｒ細胞の調整、ミエローマ様細胞の調整は、実施例２、１．と同様であった。
【００７１】
１）細胞融合
骨髄細胞由来ＭｇＭＬ−２及びマウス脾細胞を、細胞数の比率がミエローマ：脾細胞＝１：１０となるように混合し、実施例２、１．と同様の操作で異種間細胞融合を行った。
【００７２】
２）結果
融合５日後にコロニー形成が確認された。その後融合１３日目には６０ｗｅｌｌ中５０ｗｅｌｌにおいてコロニーが観察され、総コロニー数は６４個、コロニー形成率８３．３％であった。各コロニー名をＢ４、Ｂ６、Ｂ８、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ１０、Ｄ４、Ｄ７、Ｅ４、Ｅ９及びＧ５とした。図１９に示すように、培養上清中のＫＬＨに対するＩｇＧ抗体産生量を測定したところ、６０ｗｅｌｌ中１７ｗｅｌｌで陽性率は２８．３％であった。
特にＫＬＨに対し陽性反応を示した陽性コロニー（Ｂ８）を限界希釈し再度クローニングを行ったところ、ＫＬＨに対するＩｇＭとＩｇＧ抗体産生を確認した。Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、これらハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体のＩｇクラス／サブクラス、及びＬ鎖のタイプを調べたところ、Ｌ鎖がκであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、そしてＩｇＭを産生するハイブリドーマであると同定された。
従って本発明のスナネズミミエローマ細胞株を用いて異種間細胞融合によりマウスのモノクローナル抗体が生産できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明のミエローマ様細胞は、スナネズミ由来のモノクローナル抗体を得るために有用である。本発明のミエローマ様細胞を用いてスナネズミ及び他の動物由来のモノクローナル抗体及びサイトカインを得ることで、感染症メカニズムの解明等が可能となり、スナネズミの実験動物としての価値も高まるという、産業上の利用可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】Ａ．ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３、ＭｇＭＬ−４及びＰ３Ｘ６３．Ａｇ８−６５３における培養上清中のポリクローナルＩｇＭ抗体産生量を示した図である。Ｂ．ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３、ＭｇＭＬ−４及びＰ３Ｘ６３．Ａｇ８−６５３における培養上清中のポリクローナルＩｇＧ抗体産生量を示した図である（実施例１）。
【図２】Ａ．ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３、ＭｇＭＬ−４及びＰ３Ｘ６３．Ａｇ８−６５３における培養上清中のＫＬＨに対するＩｇＭ抗体産生量を示した図である。Ｂ．ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３、ＭｇＭＬ−４及びＰ３Ｘ６３．Ａｇ８−６５３における培養上清中のＫＬＨに対するＩｇＧ抗体産生量を示した図である（実施例１）。
【図３】ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３、ＭｇＭＬ−４の４細胞株の形態を示した図である（実施例１）。
【図４】スナネズミ脾細胞、胸腺細胞及びスナネズミミエローマ様細胞株の大きさと密度を示した図である（実施例１）。
【図５】ＣＤ３表面抗原マーカーのシグナル発現量を示した図である（実施例１）。
【図６】ＩｇＭ細胞表面レセプターのシグナル発現量を示した図である（実施例１）。
【図７】Ａ．ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３、ＭｇＭＬ−４及びＰ３Ｘ６３．Ａｇ８−６５３のＣＤ３表面抗原マーカーのシグナル発現量を示した図である。Ｂ．ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３、ＭｇＭＬ−４及びＰ３Ｘ６３．Ａｇ８−６５３のＩｇＭ細胞表面レセプターのシグナル発現量を示した図である（実施例１）。
【図８−１】Ａ．ＭｇＭＬ−２のｍｉｔｏｇｅｎ添加培養時における増殖能を示した図である。Ｂ．ＭｇＭＬ−１のｍｉｔｏｇｅｎ添加培養時における増殖能を示した図である（実施例１）。
【図８−２】Ｃ．ＭｇＭＬ−３のｍｉｔｏｇｅｎ添加培養時における増殖能を示した図である。Ｄ．ＭｇＭＬ−４のｍｉｔｏｇｅｎ添加培養時における増殖能を示した図である（実施例１）。
【図９】Ａ．ＭｇＭＬ−１のｍｉｔｏｇｅｎ添加培養時における増殖能を示した図である。Ｂ．ＭｇＭＬ−２のｍｉｔｏｇｅｎ添加培養時における増殖能を示した図である（実施例１）。
【図１０】ＭｇＭＬ−１、ＭｇＭＬ−２、ＭｇＭＬ−３、ＭｇＭＬ−４のサイトカインｍＲＮＡ発現を示した図である（実施例１）。
【図１１−１】Ａ．ＭｇＭＬ−１のＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現を示した図である。Ｂ．ＭｇＭＬ−２のＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現量を示した図である（実施例１）。
【図１１−２】Ｃ．ＭｇＭＬ−３のＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現を示した図である。Ｄ．ＭｇＭＬ−４のＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現量を示した図である（実施例１）。
【図１２】ＭｇＭＬ−１を用いた細胞融合コロニーにおける培養上清中のＫＬＨに対するＩｇＧ産生量を測定した図である（実施例２）。
【図１３】Ａ．ＭｇＭＬ−２を用いた細胞融合コロニーにおける培養上清中のＫＬＨに対するＩｇＭ産生量を調べた図である。Ｂ．ＭｇＭＬ−２を用いた細胞融合コロニーにおける培養上清中のＫＬＨに対するＩｇＧ産生量を調べた図である（実施例２）。
【図１４】Ｍｇｈｙ−Ｂ７、Ｍｇｈｙ−Ｆ３、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０、Ｍｇｈｙ−Ｇ３のサイトカインのｍＲＮＡの発現を調べた図である（実施例３）。
【図１５】Ｍｇｈｙ−Ｂ７、Ｍｇｈｙ−Ｆ３、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０、Ｍｇｈｙ−Ｇ３のサイトカインのｍＲＮＡの発現量を調べた図である（実施例３）。
【図１６】ＭｇＭＬ−２、Ｍｇｈｙ−Ｂ７及びＭｇｈｙ−Ｆ３の大きさと密度、ＣＤ３表面抗原マーカーのシグナル発現量とＩｇＭシグナル発現量を示した図である（実施例３）。
【図１７】ＭｇＭＬ−２、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０及びＭｇｈｙ−Ｇ３の大きさと密度、ＣＤ３表面抗原マーカーのシグナル発現量とＩｇＭシグナル発現量を示した図である（実施例３）。
【図１８】Ａ．ＭｇＭＬ−２、Ｍｇｈｙ−Ｂ７、Ｍｇｈｙ−Ｆ３、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０及びＭｇｈｙ−Ｇ３のＣＤ３表面抗原マーカーのシグナル発現量を示した図である。Ｂ．ＭｇＭＬ−２、Ｍｇｈｙ−Ｂ７、Ｍｇｈｙ−Ｆ３、Ｍｇｈｙ−Ｆ１０及びＭｇｈｙ−Ｇ３のＩｇＭシグナル発現量を示した図である（実施例３）。
【図１９】培養上清中のＫＬＨに対するＩｇＧ抗体産生量を示した図である（参考例）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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