(57)【要約】【課題】種々の適用（例えば、遺伝子療法および組換えタンパク質生成を含む）における使用のための選択された所望の表現型を有する組換えベクターを提供すること。【解決手段】単離された核酸分子であって、組換えアルファウイルス粒子に作動可能に組み込まれた場合に、野生型アルファウイルスと比較して、哺乳動物細胞における発現後に宿主細胞に指向される巨大分子合成の５０％阻害に到達するのに必要な時間を増加させる、改変されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含む、核酸分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載されるような、アルファウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利権の記載
本発明は、部分的に、国立衛生研究所により認可された助成金番号ＡＩ  １７３７７の下での政府の援助でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、一般的に組換えＤＮＡ技術に関する；さらに詳細には、１つ以上の異種遺伝子産物の発現を指向するために有用な組換えベクターの開発に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アルファウイルスは、トガウイルス科の一群の血清学的に関連した、節足動物に運搬されるウイルスを含む。これらのウイルスは全世界に分布しており、そして自然界では蚊から脊椎動物へのサイクルを介して存続する。鳥、齧歯類、馬、霊長類およびヒトは、アルファウイルス脊椎動物病原性物質保有者（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）／宿主として規定されるものの仲間である。
【０００４】
赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイを利用して、アルファウイルス属内で、２６の公知のウイルスおよびウイルスサブタイプが分類されている。このアッセイは２６のアルファウイルスを３つの大きな複合種（ｃｏｍｐｌｅｘ）に分ける：ヴェネズエラウマ脳炎（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）  （ＶＥＥ）  複合種、セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ）  （ＳＦ）複合種、そして西部ウマ脳炎（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）  （ＷＥＥ）複合種。さらに、ＨＩ血清学的アッセイに基づき、４つの他のウイルス、東部ウマ脳炎（ｅａｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）（ＥＥＥ）、バーマー森林（Ｂａｒｍａｈ  Ｆｏｒｅｓｔ）、ミッデルブルグ（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ）、およびヌヅム（Ｎｄｕｍｕ）が、個々に分類されている。
【０００５】
アルファウイルス属のメンバーはまた、ヒトにおけるそれらの相対的な臨床的特徴に基づき分類される：主に脳炎に関連するアルファウイルス、および主に発熱、発疹そして多発性関節炎に関連するアルファウイルス。前者の群に含まれるのは、ＶＥＥおよびＷＥＥ複合種、ならびにＥＥＥである。一般的にこの群による感染は、永続的な後遺症（行動変化および学習障害を含む）、または死に至り得る。後者の群ではＳＦ複合種であり、個々のアルファウイルスであるセムリキ森林、シンドビス、ロスリバー、チクングンヤ（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）、オニオニオン（Ｏ’ｎｙｏｎｇ−ｎｙｏｎｇ）、およびマヤロ（Ｍａｙａｒｏ）  よりなる。この群に関しては、重大な流行が報告されているが、感染は一般的に自己制限型（ｓｅｌｆ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）であり、永続的な後遺症はない。
【０００６】
シンドビスウイルスは、トガウイルス科のアルファウイルス属の原型のメンバーである。細胞の感染後のその複製ストラテジー（図１を参照のこと）は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）およびベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞により十分に特徴付けられている。ここで、シンドビスウイルスは迅速に成長して高力価になり、そして他のアルファウイルスのモデルとして作用する。簡潔には、シンドビスウイルス由来のゲノムは、（他のアルファウイルスと同様に）約１２ｋｂの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡ分子であり、これはキャップされポリアデニル化され、そしてウイルスコードキャプシドタンパク質殻内に含まれる。ヌクレオキャプシドは、さらに宿主由来脂質エンベロープにより囲まれる。２つのウイルス特異的糖タンパク質であるＥ１およびＥ２は、このエンベロープに挿入され、そしてヌクレオキャプシドに固着される。特定のアルファウイルス（例えば、ＳＦ）はまた、さらなるタンパク質であるＥ３（これはＥ２前駆体タンパク質であるＰＥ２の切断産物である）を維持する。標的細胞へのウイルス粒子の吸収、浸透、およびウイルスゲノムＲＮＡを細胞質へ放出するためのヌクレオキャプシドの脱コートの後、複製プロセスが、ウイルスゲノムの５’側の３分の２からの非構造タンパク質（ｎｓＰ）の翻訳により開始される。４つのｎｓＰ（ｎｓＰ１〜ｎｓＰ４）は、ゲノムＲＮＡテンプレートから、２つのポリタンパク質（ｎｓＰ１２３またはｎｓＰ１２３４）の１つとして直接翻訳され、そしてＣ末端ドメインｎｓＰ２において活性プロテアーゼによりモノマー単位に翻訳後プロセシングされる。大部分のアルファウイルスのｎｓＰ３とｎｓＰ４との間に存在するリーキーオパール（ｌｅａｋｙ  ｏｐａｌ）（ＵＧＡ）コドンは、ｎｓＰ１２３ポリタンパク質と比較してｎｓＰ１２３４ポリタンパク質の１０〜２０％の量を占める。両方の非構造ポリタンパク質およびそれら由来のモノマー単位は、ＲＮＡ複製プロセスに関与し得る。このプロセスは、５’および３’末端に存在する保存されたヌクレオチド配列エレメント（ＣＳＥ）、ならびにゲノムの内部に配置される連結領域サブゲノムプロモーターへの結合を含む（以下でさらに議論される）。
【０００７】
ポジティブ鎖ゲノムＲＮＡは、全長の相補的なネガティブ鎖のｎｓＰ触媒合成のためのテンプレートとして作用する。相補的なネガティブ鎖の合成は、ポジティブ鎖ゲノムＲＮＡの３’末端ＣＳＥへのｎｓＰ複合体の結合の後に触媒される。次には、ネガティブ鎖は、順番に、さらなるポジティブ鎖ゲノムＲＮＡおよび大量に発現される２６ＳサブゲノムＲＮＡ（連結領域プロモーターで内部に開始される）の合成のためのテンプレートとして作用する。さらなるポジティブ鎖ゲノムＲＮＡの合成は、相補的なネガティブ鎖ゲノムＲＮＡテンプレートの３’末端ＣＳＥへのｎｓＰ複合体の結合の後に生じる。ネガティブ鎖ゲノムＲＮＡテンプレートからのサブゲノムｍＲＮＡの合成は、連結領域プロモーターから開始される。従って、ポジティブ鎖ゲノムＲＮＡの５’末端および連結領域ＣＳＥは、それらがネガティブ鎖ゲノムＲＮＡ相補体に転写された後にのみ機能的である（すなわち、５’末端ＣＳＥは、それがゲノムネガティブ鎖相補体の３’末端である場合に機能的である）。構造タンパク質（ｓＰ）は、サブゲノム２６Ｓ  ＲＮＡから翻訳される。これは、ゲノムの３’側の３分の１を示し、そしてｎｓＰと同様に、個々のタンパク質に翻訳後プロセシングされる。
【０００８】
いくつかのグループは、アルファウイルス属の特定のメンバーを発現ベクターとして利用することを示唆している。これには、例えば、シンドビスウイルス（Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１１８８−１１９１，１９８９；Ｈａｈｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６７９−２６８３，１９９２；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７０：５０８−５１９，１９９６）、セムリキ森林ウイルス（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６−１３６１，１９９１）、およびヴェネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．１９Ａ：１０，１９９５）が挙げられる。さらに、１つのグループは、インビボでの治療的遺伝子の送達のためにアルファウイルス由来ベクターを使用することを示唆している。しかし、上述のベクターに伴う一つの問題点は、宿主細胞に指向される巨大分子合成（すなわち、タンパク質またはＲＮＡ合成）の阻害が感染後数時間以内に始まり、そして細胞変性効果（ＣＰＥ）が１２〜１６時間の感染後時間（ｈｐｉ）以内に生じることである。宿主細胞タンパク質合成の阻害および遮断は、構造タンパク質発現の存在下または非存在下において、組換えウイルス粒子で感染されたＢＨＫ細胞において２ｈｐｉ以内に始まる。このことは、ウイルス感染後の初期事象（例えば、ｎｓＰおよび−鎖ＲＮＡの合成）が、宿主細胞タンパク質合成の阻害およびそれに続くＣＰＥの発達および細胞死に直接的に影響し得ることを示唆する。
【０００９】
ＳＩＮ−１は、野生型シンドビスに由来する改変体株であり、そして１ヶ月の期間にわたりシンドビスウイルスで持続的に感染させたＢＨＫ細胞の培養物から単離された（Ｗｅｉｓｓら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．３３：４６３−４７４，１９８０）。単一のプラークからの拡大により得られた純粋なＳＩＮ−１ウイルスのストックは、それが感染するＢＨＫ細胞を殺傷しない。重要なことには、ウイルス収率（＞１０３ＰＦＵ／細胞）は、野生型シンドビスウイルスまたは改変体ＳＩＮ−１ウイルスで感染させたＢＨＫ細胞において同一である。従って、感染させたＢＨＫ細胞におけるＳＩＮ−１の主な表現型は、ウイルス誘導細胞死の非存在下における野生型レベルの感染性ウイルスの生成により特徴付けられる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、種々の適用（例えば、遺伝子療法および組換えタンパク質生成を含む）における使用のための選択された所望の表現型を有する組換えベクターを提供し、そして他の関連した利点をさらに提供する。
【００１１】
発明の要旨
簡潔に述べると、本発明は、ＲＮＡベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、真核生物重層ベクター開始系、および組換えアルファウイルス粒子を提供する。これらは、細胞巨大分子合成（例えば、タンパク質またはＲＮＡ合成）の阻害の減少、遅延、または非存在を示し、それによってＣＰＥの発達または細胞死が減少して、遅延して、または存在せずに、タンパク質発現、遺伝子療法などのためのこれらのベクターの使用を可能にする。このようなベクターは、広範な種々のアルファウイルス（例えば、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、ヴェネズエラウマ脳炎ウイルス、またはシンドビスウイルス）から構築され得、そして多数の異種配列（例えば、タンパク質に対応する配列、アンチセンスＲＮＡに対応する配列、非コードセンスＲＮＡ配列に対応する配列、またはリボザイムに対応する配列）を発現するように設計され得る。
【００１２】
本発明の１つの局面において、単離された核酸分子が提供される。この分子は、組換えアルファウイルスに作動可能に組み込まれた場合、野生型アルファウイルスと比較して、哺乳動物細胞における発現後の宿主細胞に指向される巨大分子合成の５０％阻害に到達するのに必要な時間を増加させる、改変されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含む。本発明の文脈内において利用される「改変されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子」は、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、組換えアルファウイルス粒子、または真核生物重層ベクター開始系に作動可能に組み込まれた場合に、所望の表現型（例えば、細胞巨大分子合成の阻害の減少、遅延、または非存在）を生じる遺伝子をいう。このような改変されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子は、野生型アルファウイルス遺伝子のヌクレオチド配列からの配列を改変する１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入を有する。遺伝子は、人工的な（例えば、指示された選択手順から；以下の実施例２を参照のこと）または天然に存在するウイルス改変体（以下の実施例１を参照のこと）のいずれかに由来し得る。さらに、単離された本発明の核酸分子が、上記のアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、組換えアルファウイルス粒子、または真核生物重層ベクター開始系へ組み込まれた場合、特定の実施態様において、それらは宿主細胞に指向される巨大分子合成の５０％阻害に到達するのに必要な時間を、宿主細胞に指向される巨大分子合成の検出可能な阻害が実質的に存在しない程度まで実質的に増加させることは理解されるはずである。宿主細胞に指向される巨大分子合成の阻害パーセントを検出するために適切なアッセイとしては、例えば、実施例１において記載されるアッセイが挙げられる。
【００１３】
本発明の他の局面において、単離された核酸分子が提供される。この核酸分子は、改変されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含む。この遺伝子は、組換えアルファウイルス粒子、真核生物重層ベクター開始系、またはＲＮＡベクターレプリコンに作動可能に組み込まれた場合、野生型と比較して減少したレベル（例えば、２倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍より多い）のベクター特異的ＲＮＡ合成を生じ、そして野生型組換えアルファウイルス粒子、野生型真核生物重層ベクター開始系、または野生型ＲＮＡベクターレプリコンと比較して、同一のまたはより大きいレベルの、ウイルス連結領域プロモーターから転写されたＲＮＡによりコードされるタンパク質を生じる。ＲＮＡレベルを定量するための代表的なアッセイとしては、実施例１に記載されるような［３Ｈ］ウリジン取り込み、またはノーザンブロット分析により検出されるようなＲＮＡ蓄積（実施例４を参照のこと）が挙げられる。タンパク質レベルを定量するための代表的なアッセイとしては、スキャンニングデンシトメトリー（実施例４を参照のこと）および種々の酵素アッセイ（実施例３〜５を参照のこと）が挙げられる。
【００１４】
上記の実施態様の１つにおいて、単離された核酸分子は、非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）をコードする。さらなる実施態様において、単離された核酸分子は、ｎｓＰ２のＬＸＰＧＧモチーフにおいて変異を有する。
【００１５】
本発明の別の局面において、上記の核酸分子の１つに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターが提供される。１つの実施態様において、発現ベクターはさらに、ポリアデニル化配列または核酸分子の３’側に転写終結配列を含む。
【００１６】
本発明のさらに別の局面において、アルファウイルスベクター構築物が提供される。この構築物は、ｃＤＮＡからのインビトロでのウイルスＲＮＡ合成を開始する５’プロモーター、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子（上記のような単離された核酸分子を含む）、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニレート域（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｔｒａｃｔ）を含む。１つの実施態様において、このような構築物はさらに、ウイルス連結領域の下流の、そしてその領域に作動可能に連結された、選択された異種配列を含む。
【００１７】
本発明のさらに他の局面において、真核生物系において翻訳し得るＲＮＡベクターレプリコンが提供される。このレプリコンは、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子（上記の単離された核酸分子を含む）、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニレート域を含む。別の実施態様において、このようなＲＮＡベクターレプリコンはさらに、ウイルス連結領域の下流の、そしてその領域に作動可能に連結された、選択された異種配列を含む。本発明のさらなる局面において、本明細書中に記載されるＲＮＡベクターレプリコンの１つを含む宿主細胞が提供される。本発明のさらなる局面において、上記のＲＮＡベクターレプリコンおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００１８】
本発明の他の局面において、組換えアルファウイルス粒子が提供される。この粒子は、本明細書中に記載のように、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープ、およびＲＮＡベクターレプリコンを含む。１つの実施態様において、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質は、ＲＮＡベクターレプリコンが由来するアルファウイルスとは異なるアルファウイルスに由来する。他の実施態様において、アルファウイルス構造タンパク質および脂質エンベロープは異なる種に由来する。さらなる局面において、薬学的組成物が提供される。この組成物は、上記のような組換えアルファウイルス粒子および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む。さらに、このような組換えアルファウイルス粒子に感染させた哺乳動物細胞もまた、提供される。
【００１９】
本発明の特定の実施態様において、上記のベクターまたは粒子はさらに、異種配列とインフレームで融合された耐性マーカーを含み得る。このような耐性マーカーの代表的な例としては、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよびネオマイシンが挙げられる。
【００２０】
本発明の他の局面において、アルファウイルスまたは組換えアルファウイルスベクター改変体を選択するための方法が提供される。これらの改変体は、本明細書中に記載の、宿主細胞に指向される巨大分子合成の阻害が減少したか、遅延したか、または存在しない表現型を示す。このような方法の代表的な例としては選択薬物または抗原性マーカーの使用が挙げられ、そして以下の実施例２においてより詳細に提供される。
【００２１】
本発明の他の局面において、ゲノム（すなわち、野生型ウイルスゲノム）またはＲＮＡベクターレプリコン核酸を実質的に含まないトガウイルスキャプシド粒子が提供される。トガウイルスの代表的な例としては、例えば、アルファウイルスおよびルビウイルス（例えば、風疹）が挙げられる。特定の実施態様において、キャプシド粒子はさらに、１つ以上のアルファウイルス糖タンパク質を含む脂質エンベロープを含む。他の実施態様において、キャプシド粒子はさらに、アルファウイルスエンベロープ（すなわち、脂質二重層および糖タンパク質相補体）を含む。本発明に関連する局面において、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と共に、上述のキャプシド粒子（脂質二重層（例えば、アルファウイルス糖タンパク質を含むウイルスエンベロープ）を有するかまたは有しない）を含む薬学的組成物が提供される。さらなる局面において、このようなキャプシド粒子（脂質二重層（例えば、アルファウイルス糖タンパク質を含むウイルスエンベロープ）を有するかまたは有しない）または薬学的組成物は、所望のトガウイルスに対する免疫応答を誘導するために、ワクチン接種薬剤として利用され得る。
【００２２】
本発明のさらなる局面において、誘導性プロモーターが提供される。このプロモーターは、コアＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、コアプロモーター配列からの転写を活性化するタンパク質のＤＮＡ結合を指向する作動可能に連結された核酸配列、およびコアプロモーター配列からの転写を抑制するタンパク質のＤＮＡ結合を指向する作動可能に連結された核酸配列を含む。このようなプロモーターは、本明細書中に記載される遺伝子送達ビヒクルにおいて、ならびに当業者に公知の広範な種々の他のベクターにおいて利用され得る。
【００２３】
他の局面において、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットが提供される。このカセットは、ＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター、１つ以上の機能的なアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸分子、発現カセットの転写に作動可能に連結された選択マーカー、および必要に応じて、転写終結を制御する３’配列を含む。１つの実施態様において、このような発現カセットはさらに、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、ウイルス連結領域プロモーター、およびアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む。別の実施態様において、発現カセットはさらに、触媒リボザイムプロセシング配列、核からのＲＮＡの輸送を容易にする翻訳後転写調節エレメント、および／または複数シストロン性の（ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｍＲＮＡの翻訳を可能にするエレメント（内部リボゾーム進入部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ）エレメント、リボソームの読み通し（ｒｅａｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ）を促進するエレメント、およびＢｉＰ配列からなる群より選択される）を含む。他の実施態様において、選択マーカーは、ｃＤＮＡからのアルファウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーターに作動可能に連結される。さらなる実施態様において、選択マーカーは、連結領域プロモーターよりおよびアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸分子より下流に配置される。なお他の実施態様において、５’プロモーターは、本明細書中に記載されるように誘導性プロモーターである。別の実施態様において、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットはさらに、アルファウイルスキャプシドタンパク質遺伝子またはエンハンサー配列の３’側に位置する１つ以上の機能的なアルファウイルス構造タンパク質遺伝子の翻訳を増強し得る他の配列（例えば、タバコエッチウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ）または「ＴＥＶ」リーダー）を含む。好ましくは、キャプシドタンパク質遺伝子配列は、アルファウイルス構造遺伝子をコードする配列が得られたアルファウイルスとは異なるアルファウイルスに由来する。
【００２４】
本発明のなお他の局面において、上記のようなアルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含む細胞を含むアルファウイルスパッケージング細胞株が提供される。特定の実施態様において、アルファウイルスパッケージング細胞株は、本明細書中に提供されるアルファウイルス構造タンパク質発現カセットで安定に形質転換される。関連する局面において、アルファウイルスプロデューサー細胞株が提供される。この細胞株は、安定に形質転換されたアルファウイルス構造タンパク質発現カセット、ならびにＲＮＡベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、および真核生物重層ベクター開始系からなる群より選択されたベクターを含む細胞を含む。
含む。
【００２５】
本発明のなお他の局面において、真核生物重層ベクター開始系が提供される。この系は、ｃＤＮＡからのＲＮＡのインビボでの５’合成を開始し得る５’プロモーター、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始するこの５’プロモーターに続く配列；４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子（上記のような単離された核酸分子を含む）、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニレート域を含む。適切な５’プロモーターの代表的な例としては、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＲＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＭｏＭＬＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、およびＣＭＶプロモーターが挙げられる。好ましい実施態様において、５’プロモーターは、本明細書中に記載されるような誘導性プロモーターである。
【００２６】
特定の実施態様において、ウイルス連結領域に作動可能に連結された異種配列、および／または核からのＲＮＡ輸送を容易にする転写後調節エレメントをさらに含む真核生物重層ベクター開始系が提供される。さらなる実施態様において、本明細書中で提供される真核生物重層ベクター開始系はさらに、転写終結シグナルを含み得る。
【００２７】
関連する実施態様において、本発明はまた、上記のような安定に形質転換された真核生物重層ベクター開始系を含む宿主細胞（例えば、脊椎動物または昆虫）を提供する。本発明のさらなる局面において、選択された異種配列を脊椎動物または昆虫に送達するための方法が提供される。この方法は、本明細書中に記載のような、アルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、組換えアルファウイルス粒子、または真核生物重層ベクター開始系を脊椎動物または昆虫に投与する工程を含む。特定の実施態様において、アルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、組換えアルファウイルス粒子、または真核生物重層ベクター開始系は脊椎動物の細胞にエクスビボで投与され、続いてベクターまたは粒子を含む細胞が温血動物に投与される。
【００２８】
他の局面において、上記のような真核生物重層ベクター開始系および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物が提供される。特定の実施態様において、薬学的組成物はリポソーム製剤として提供される。
【００２９】
さらなる局面において、組換えアルファウイルス粒子を作製する方法が提供される。この方法は、（ａ）ベクター（例えば、上記のような真核生物重層ベクター開始系、ＲＮＡベクターレプリコン、またはアルファウイルスベクター粒子）を、組換えアルファウイルス粒子の生成を可能にするに十分な条件下および時間でパッケージング細胞の集団に導入する工程、ならびに（ｂ）組換えアルファウイルス粒子を収集する工程を含む。関連する局面において、選択されたタンパク質を作製する方法が提供される。この方法は、（ａ）選択された異種タンパク質をコードするベクター（例えば、上記の真核生物重層ベクター開始系、ＲＮＡベクターレプリコン、またはアルファウイルスベクター粒子）を、選択されたタンパク質の生成を可能にするに十分な条件下および時間でパッケージング細胞または他の細胞の集団に導入する工程、ならびに（ｂ）ベクター含有細胞により生成されるタンパク質を収集する工程を包含する。なお他の局面において、選択されたタンパク質を作製する方法が提供される。この方法は、選択された異種タンパク質を生成し得る真核生物重層ベクター開始系を、選択されたタンパク質の発現を可能にするに十分な条件下および時間で宿主細胞に導入する工程を含む。さらなる局面において、本明細書中に記載されるようなＲＮＡベクターレプリコンを含む宿主細胞株が提供される。
【００３０】
本発明のなお他の局面において、アルファウイルスワクチンが提供される。このワクチンは、上記のアルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、真核生物ベクター開始系、または組換えアルファウイルス粒子の一つを含む。これらは、本明細書中で提供される異種配列の１つを発現するかもしれないし、発現しないかもしれない（例えば、それらは、アルファウイルス疾患を処置または予防するためのワクチンとして単独で利用され得る）。例えば、本発明の１つの実施態様において、核酸またはＲＮＡベクターレプリコン核酸を実質的に全く有しない組換えトガウイルス粒子が提供される。さらなる実施態様において、異種ウイルス核酸（すなわち、トガウイルス粒子とは異なるウイルス由来）を含む組換えトガウイルス粒子が提供される。なお別の実施態様において、組換えトガウイルス粒子はＴ＝３以上である。
【００３１】
本発明のさらなる局面において、組換えキメラトガウイルス粒子（空かまたは核酸を含むかのいずれか）が提供される。ここで、ウイルス粒子は、異なるトガウイルス科から得られたかまたは由来するウイルス構造成分を有する（例えば、キャプシドタンパク質および糖タンパク質が異なるアルファウイルス供給源から得られる）。
【００３２】
本発明のこれらのおよび他の局面および実施態様は、以下の詳細な説明および添付された図面を参照すれば明白となる。さらに、より詳細に特定の手順または組成物（例えば、プラスミド、配列など）を記載する種々の参考文献が本明細書中に記載され、従って、各々が援用について個々に記述されたかのように、それらの全体が参考として援用される。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）  単離された核酸分子であって、組換えアルファウイルス粒子に作動可能に組み込まれた場合に、野生型アルファウイルスと比較して、哺乳動物細胞における発現後に宿主細胞に指向される巨大分子合成の５０％阻害に到達するのに必要な時間を増加させる、改変されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含む、核酸分子。
・（項目２）  単離された核酸分子であって、組換えアルファウイルス粒子に作動可能に組み込まれた場合に、野生型と比較して減少したレベルのベクター特異的ＲＮＡ合成を有し、そして野生型組換えアルファウイルス粒子と比較して同一またはより大きいレベルの、ウイルス連結領域プロモーターから転写されたＲＮＡによりコードされるタンパク質を有する、アルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含む、核酸分子。
・（項目３）  アルファウイルスベクター構築物であって、ｃＤＮＡからのインビトロでのウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、項目１または２に記載の核酸分子を含む４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニレート域を含む、アルファウイルスベクター構築物。
・（項目４）  真核生物系において翻訳可能なアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンであって、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、項目１または２に記載の核酸分子を含む４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル域を含む、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン。
・（項目５）  薬学的組成物であって、項目４に記載のアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。
・（項目６）  組換えアルファウイルス粒子であって、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープ、および項目４に記載のＲＮＡベクターレプリコンを含む、組換えアルファウイルス粒子。
・（項目７）  上記アルファウイルス構造タンパク質および脂質エンベロープが異なるアルファウイルス種に由来する、項目６に記載の組換えアルファウイルス粒子。
・（項目８）  項目６または７に記載の組換えアルファウイルス粒子および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。
・（項目９）  項目６または７に記載の組換えアルファウイルス粒子で感染させた、宿主細胞。
・（項目１０）  ゲノム核酸またはＲＮＡベクターレプリコン核酸を実質的に全く含まない、トガウイルスキャプシド粒子。
・（項目１１）  １つ以上のアルファウイルス糖タンパク質を含む脂質エンベロープをさらに含む、項目１０に記載のキャプシド粒子。
・（項目１２）  アルファウイルスエンベロープをさらに含む、項目１０に記載のキャプシド粒子。
・（項目１３）  上記キャプシドが、アルファウイルス、ルビウイルス、フラビウイルス、およびペスチウイルスからなる群より選択されるトガウイルスに由来する、項目１０に記載のキャプシド粒子。
・（項目１４）  項目１０〜１３のいずれか１項に記載のキャプシド粒子および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。
・（項目１５）  アルファウイルス構造タンパク質発現カセットであって、ＤＮＡからのＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター、１つ以上の機能的なアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸分子、発現カセットの転写に作動可能に連結された選択マーカー、および転写終結を制御する３’配列を含む、アルファウイルス構造タンパク質発現カセット。
・（項目１６）  アルファウイルスパッケージング細胞株であって、項目１５に記載のアルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含む細胞を含む、アルファウイルスパッケージング細胞株。
・（項目１７）  アルファウイルスプロデューサー細胞株であって、安定に形質転換されたアルファウイルス構造タンパク質発現カセット、ならびに項目４に記載のＲＮＡベクターレプリコン、項目３に記載のアルファウイルスベクター構築物、および項目１８に記載の真核生物重層ベクター開始系からなる群より選択されるベクターを含む細胞を含む、アルファウイルスプロデューサー細胞株。
・（項目１８）  真核生物重層ベクター開始系であって、ｃＤＮＡからのアルファウイルスＲＮＡのインビボでの５’合成を開始し得る５’プロモーター、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する、上記５’プロモーターに続く配列、項目１または２に記載の核酸分子を含む４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニレート域を含む、真核生物重層ベクター開始系。
・（項目１９）  項目１８に記載の真核生物重層ベクター開始系を含む、宿主細胞。
・（項目２０）  項目１８に記載の真核生物重層ベクター開始系および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。
・（項目２１）  選択された異種配列を脊椎動物または昆虫に送達するための方法であって、項目３に記載のアルファウイルスベクター構築物、項目４に記載のアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、項目６に記載の組換えアルファウイルス粒子、または項目１８に記載の真核生物重層ベクター開始系を、脊椎動物または昆虫に投与する工程を包含する、方法。
・（項目２２）  組換えアルファウイルス粒子を作製する方法であって、以下の工程：
（ａ）項目１８に記載の真核生物重層ベクター開始系、項目４に記載のＲＮＡベクターレプリコン、および項目６に記載の組換えアルファウイルスベクター粒子からなる群より選択されるベクターを、組換えアルファウイルス粒子の生成を可能にするに十分な条件下および時間で、項目１６に記載のパッケージング細胞の集団に導入する工程；ならびに
（ｂ）組換えアルファウイルス粒子を収集する工程、
を包含する、方法。
・（項目２３）  選択されたタンパク質を作製する方法であって、以下の工程：
（ａ）選択された異種タンパク質をコードし、そして、項目１８に記載の真核生物重層ベクター開始系、項目４に記載のアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、および項目６に記載の組換えアルファウイルスベクター粒子からなる群より選択されるベクターを、上記選択されたタンパク質の生成を可能にするに十分な条件下および時間で、項目１６に記載のパッケージング細胞の集団に導入する工程；ならびに
（ｂ）上記パッケージング細胞により生成されるタンパク質を収集する工程、
を包含する、方法。
・（項目２４）  選択されたタンパク質を作製する方法であって、項目１８に記載の真核生物重層ベクター開始系を、上記選択されたタンパク質の発現を可能にするに十分な条件下および時間で、宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
・（項目２５）  項目４に記載のアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンを含む、宿主細胞株。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
用語の定義
以下の用語を明細書を通して使用する。他に示されていなければ、これらの用語を以下のように定義する：
「ゲノムＲＮＡ」とは、標的細胞内でインビボにおけるそれ自身の増幅または自己複製を指向するのに必要な遺伝情報の全てを含むＲＮＡをいう。それ自身の複製を指向するために、ＲＮＡ分子は、１）１つ以上のポリメラーゼ、レプリカーゼ、あるいはウイルスもしくは宿主細胞由来タンパク質、核酸、またはリボヌクレオタンパク質と相互作用し、ＲＮＡ増幅過程を触媒し得る他のタンパク質をコードし得；そして２）複製に必要なシスＲＮＡ配列（これは、その自己コード化タンパク質、または非自己コード化細胞由来タンパク質、核酸もしくはリボヌクレオタンパク質、あるいはこれらの任意の成分間の複合体により、複製過程で結合され得る）を含み得る。アルファウイルス由来ゲノムＲＮＡ分子は、以下の順でのエレメントを含むべきである：複製のためにシスで必要な５’ウイルスまたは欠陥干渉性ＲＮＡ配列（単数または複数）、発現されたとき生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、複製のためにシスで必要な３’ウイルス配列、およびポリアデニレート域。アルファウイルス由来ゲノムＲＮＡベクターレプリコンはまた、特定の実施態様において、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、または減少させるように改変され得るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、および発現されたとき生物学的に活性なアルファウイルス構造タンパク質（例えば、Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、Ｅ１）をコードする配列を含み得る。一般に、用語ゲノムＲＮＡは、＋極の分子、または「メッセージ」センスをいい、そしてゲノムＲＮＡは、任意の公知の天然に存在するアルファウイルスとは異なる長さであり得る。好ましい実施態様において、ゲノムＲＮＡは、任意のアルファウイルス構造タンパク質（単数または複数）をコードする配列を含まず、むしろそれらの配列は、異種配列と置換される。ゲノムＲＮＡが組換えアルファウイルス粒子中にパッケージングされる場合、これは、アルファウイルス構造タンパク質と相互作用を開始させるように作用して粒子形成に至る１つ以上の配列を含まなければならず、好ましくは、用いられるパッケージング系により効率的にパッケージングされる長さである。
【００３４】
「サブゲノムＲＮＡ」（または「２６Ｓ」ＲＮＡ）とは、それが由来するゲノムＲＮＡより小さい長さまたはサイズのＲＮＡ分子をいう。サブゲノムＲＮＡは、配列がゲノムＲＮＡまたはその相補体内に位置する内部プロモーターから転写されるべきである。サブゲノムＲＮＡの転写は、ウイルスコード化ポリメラーゼ（単数または複数）、宿主細胞コード化ポリメラーゼ（単数または複数）、転写因子（単数または複数）、リボヌクレオタンパク質（単数または複数）、またはそれらの組み合わせにより媒介され得る。好ましい実施態様では、サブゲノムＲＮＡは、本発明に従ってベクターから生成され、そして目的の遺伝子（単数または複数）または配列（単数または複数）をコードするか、または発現させる。サブゲノムＲＮＡは、必ずしも２６の沈降係数を有するわけではない。
【００３５】
「アルファウイルスベクター構築物」とは、目的の配列（単数または複数）または遺伝子（単数または複数）の発現を指向し得るアセンブリをいう。このようなベクター構築物は、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始させ得る５’配列（背景では、５’  ＣＳＥとも称される）、ならびに発現されたとき生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、およびアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（背景では、３’  ＣＳＥとも称される）で構成される。さらに、ベクター構築物は、特定の実施態様において、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、または減少させるように改変され得るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、およびまたポリアデニレート域を含むべきである。ベクターはまた、１つ以上の構造タンパク質遺伝子由来の配列またはその部分、生存可能なウイルスの生成を可能にするのに充分なサイズである外来性核酸分子（単数または複数）、ｃＤＮＡからのインビトロでのウイルスＲＮＡの合成を開始させ得る５’プロモーター、発現されるべき異種配列、ならびに異種配列の挿入のための１つ以上の制限部位を含み得る。
【００３６】
「アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン」、「ＲＮＡベクターレプリコン」および「レプリコン」とは、標的細胞内でインビボにおけるそれ自身の増幅または自己複製を指向し得るＲＮＡ分子をいう。それ自身の増幅を指向するために、ＲＮＡ分子は、１）１つ以上のポリメラーゼ、レプリカーゼ、あるいはウイルスもしくは宿主細胞由来タンパク質、核酸、またはリボヌクレオタンパク質と相互作用し、ＲＮＡ増幅を触媒し得る他のタンパク質をコードし得；そして２）複製に必要なシスＲＮＡ配列（これは、その自己コード化タンパク質、または非自己コード化細胞由来タンパク質、核酸もしくはリボヌクレオタンパク質、あるいはこれらの任意の成分間の複合体により、複製過程で結合され得る）を含み得る。特定の実施態様では、増幅はまた、インビトロで生じ得る。アルファウイルス由来ＲＮＡベクターレプリコン分子は、以下の順でのエレメントを含むべきである：複製のためにシスで必要な５’ウイルス配列（背景では、５’  ＣＳＥとも称される）、発現されたとき生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、複製のためにシスで必要な３’ウイルス配列（背景では、３’  ＣＳＥとも称される）、およびポリアデニレート域。アルファウイルス由来ＲＮＡベクターレプリコンはまた、特定の実施態様において、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、または減少させるように改変され得るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、１つ以上の構造タンパク質遺伝子由来の配列またはその部分、生存可能なウイルスの生成を可能にするのに充分なサイズである外来性核酸分子（単数または複数）、ならびに発現されるべき異種配列（単数または複数）を含み得る。細胞におけるＲＮＡベクターレプリコンの供給源は、ウイルスまたは組換えアルファウイルス粒子での感染、あるいはプラスミドＤＮＡまたはインビトロ転写ＲＮＡのトランスフェクションに由来し得る。
【００３７】
「組換えアルファウイルス粒子」とは、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンを含むビリオン単位をいう。一般に、組換えアルファウイルス粒子は、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープ、およびＲＮＡベクターレプリコンを含む。好ましくは、組換えアルファウイルス粒子は、宿主細胞由来脂質二重層（例えば、原形質膜）内に含まれるヌクレオキャプシド構造を含み、ここには、アルファウイルスコード化エンベロープ糖タンパク質が包埋されている。粒子はまた、アルファウイルスが由来する粒子の指向性を指向する他の成分（例えば、ビオチンのような標的化エレメント、他のウイルス構造タンパク質、または他のレセプター結合リガンド）、または他のＲＮＡ分子を含み得る。
【００３８】
「構造タンパク質発現カセット」とは、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質の合成を指向し得る核酸分子をいう。発現カセットは、ｃＤＮＡからのＲＮＡの合成をインビボで開始させ得る５’プロモーター、ならびに発現されたとき１つ以上の生物学的に活性なアルファウイルス構造タンパク質（例えば、Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、Ｅ１）をコードする配列、および転写終結を制御する３’配列を含むべきである。発現カセットはまた、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始させ得る５’配列（背景では、５’  ＣＳＥとも称される）、ウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、およびアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（背景では、３’  ＣＳＥとも称される）を含み得る。特定の実施態様において、発現カセットはまた、スプライス認識配列、触媒リボザイムプロセシング配列、選択マーカーをコードする配列、核輸送シグナル、ならびにポリアデニル化配列を含み得る。さらに、アルファウイルス構造タンパク質（単数または複数）の発現は、特定の実施態様において、誘導性プロモーターの使用により調節され得る。
【００３９】
「安定な形質転換」とは、生細胞への核酸分子の導入、および連続周期の細胞分裂を通した子孫細胞におけるその核酸分子の長期または恒久的な維持をいう。核酸分子は、任意の細胞区画に維持され得、このような区画には、核、ミトコンドリア、または細胞質が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、核酸分子は、核において維持され得る。維持は、染色体内（組み込み）または染色体外（エピソーム事象として）であり得る。
【００４０】
「アルファウイルスパッケージング細胞株」とは、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含み、かつアルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、真核生物重層ベクター開始系、または組換えアルファウイルス粒子の導入後、組換えアルファウイルス粒子を生成する細胞をいう。親細胞は、哺乳動物起源であるか、または哺乳動物起源でなくてもよい。好ましい実施態様では、パッケージング細胞株は、構造タンパク質発現カセットで安定に形質転換されている。
【００４１】
「アルファウイルスプロデューサー細胞株」とは、組換えアルファウイルス粒子を生成し得る細胞株をいう。この細胞株は、アルファウイルスパッケージング細胞株を含み、この中にはまた、アルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、真核生物重層ベクター開始系、または組換えアルファウイルス粒子が含まれる。好ましくは、アルファウイルスベクター構築物は真核生物重層ベクター開始系であり、そしてプロデューサー細胞株はそのベクター構築物で安定に形質転換される。好ましい実施態様では、アルファウイルスベクター構築物の転写および続く組換えアルファウイルス粒子の生成は、１つ以上の因子またはアルファウイルスプロデューサー細胞株の分化状態に応じてのみ生じる。
【００４２】
「欠陥ヘルパー構築物」とは、トランスで供給された生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質に応じて、ＲＮＡ増幅または複製、および１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質の発現を行い得るアセンブリをいう。欠陥ヘルパー構築物は、以下の順でのエレメントを含むべきである：複製のためにシスで必要な５’ウイルスまたは欠陥干渉性ＲＮＡ配列、ウイルスサブゲノム連結領域プロモーター、発現されたとき１つ以上の生物学的に活性なアルファウイルス構造タンパク質（例えば、Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、Ｅ１）をコードする配列、複製のためにシスで必要な３’ウイルス配列、およびポリアデニレート域。欠陥ヘルパー構築物はまた、ｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始させ得る５’プロモーター、転写終結を制御する３’配列、スプライス認識配列、触媒リボザイムプロセシング配列、選択マーカーをコードする配列、および核輸送シグナルを含み得る。
【００４３】
「真核生物重層ベクター開始系」とは、目的の配列（単数または複数）または遺伝子（単数または複数）の発現を指向し得るアセンブリをいう。真核生物重層ベクター開始系は、ｃＤＮＡからのインビボ（即ち、細胞内）でのＲＮＡの合成を開始させ得る５’プロモーター、および真核生物細胞におけるそれ自身の複製を指向し、かつ異種配列を発現させ得る核酸ベクター配列を含むべきである。それ自身の増幅を指向し得る核酸配列は、ウイルス起源であってもなくてもよい。特定の実施態様では、核酸ベクター配列はアルファウイルス由来配列であり、そして、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始させ得る５’配列（背景では、５’  ＣＳＥとも称される）、ならびに発現されたとき生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、およびアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（背景では、３’  ＣＳＥとも称される）で構成される。さらに、ベクター配列は、特定の実施態様において、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、または減少させるように改変され得るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、１つ以上の構造タンパク質遺伝子由来の配列またはその部分、至適な増幅を可能にするのに充分なサイズである外来性核酸分子（単数または複数）、発現されるべき異種配列、異種配列の挿入のための１つ以上の制限部位、ならびにポリアデニル化配列を含み得る。真核生物重層ベクター開始系はまた、スプライス認識配列、触媒リボザイムプロセシング配列、核輸送シグナル、および転写終結配列を含み得る。特定の実施態様では、ｃＤＮＡからのベクター核酸配列のインビボ合成は、誘導性プロモーターの使用によって調節され得る。
【００４４】
「アルファウイルスｃＤＮＡベクター構築物」とは、目的の配列（単数または複数）または遺伝子（単数または複数）の発現を指向し得るアセンブリをいう。ベクター構築物は、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始させ得る５’配列（背景では、５’  ＣＳＥとも称される）、ならびに発現されたとき生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、およびアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（背景では、３’  ＣＳＥとも称される）で構成される。さらに、ベクター構築物は、ｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成をインビボで開始させ得る５’プロモーター、および転写終結を制御する３’配列を含むべきである。特定の実施態様では、ベクター構築物は、特定の実施態様において、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、または減少させるように改変され得るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーターをさらに含み得る。ベクターはまた、１つ以上の構造タンパク質遺伝子由来の配列またはその部分、生存可能なウイルスの生成を可能にするのに充分なサイズである外来性核酸分子（単数または複数）、発現されるべき異種配列、異種配列の挿入のための１つ以上の制限部位、スプライス認識配列、触媒リボザイムプロセシング配列、核輸送シグナル、ならびにポリアデニル化配列を含み得る。特定の実施態様では、ｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡのインビボ合成は、誘導性プロモーターの使用によって調節され得る。
【００４５】
「遺伝子送達ビヒクル」とは、目的の遺伝子または配列を送達するために利用され得る構築物をいう。代表例は、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、真核生物重層ベクター開始系、および組換えアルファウイルス粒子を含む。
【００４６】
本発明の多数の局面および利点は、以下の詳細な説明を考慮すると当業者に明らかである。この詳細な説明により、本発明の実施の啓発が提供される。
【００４７】
発明の詳細な説明
上記のように、本発明は、例えば、ＲＮＡベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、真核生物重層ベクター開始系、および組換えアルファウイルス粒子を含む、新規な遺伝子送達ビヒクルを提供する。簡略には、プラスミドＤＮＡ、インビトロで転写されたＲＮＡ、または粒子に基づく、本発明のベクターの細胞への導入は、野生型由来アルファウイルスベクターの発現レベルと比較して等価であるかまたは高いレベルの異種遺伝子発現をもたらす。しかし、予想外に、合成されるベクター特異的ＲＮＡのレベルは、本発明の遺伝子送達ビヒクルを含む培養細胞においては、野生型由来ベクターと比較して少なくとも約５〜１０倍低い。さらに、このような遺伝子送達ビヒクルは、宿主細胞中への導入の後に、野生型由来ベクターと比較して阻害が減少した、遅延した、または存在しない、宿主細胞に指向される巨大分子合成を示す。
【００４８】
以下でより詳細に議論するように、本発明は、以下を提供する：（Ａ）本発明の遺伝子送達ビヒクルの構築のために適切な野生型アルファウイルスの供給源；（Ｂ）所望の表現型を有するアルファウイルスを選択するための方法；（Ｃ）アルファウイルスベクター構築物およびアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンの構築；（Ｄ）真核生物重層ベクター開始系の構築；（Ｅ）組換えアルファウイルス粒子の構築；（Ｆ）本発明の遺伝子送達ビヒクルにより発現され得る異種配列；（Ｇ）アルファウイルスパッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株の構築；（Ｈ）薬学的組成物；および（Ｉ）アルファウイルスに基づくベクターを利用するための方法。
【００４９】
Ａ．野生型アルファウイルスの供給源
上記のように、本発明は、アルファウイルスに基づく広範囲な種々のベクター（例えば、ＲＮＡベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、真核生物重層ベクター開始系、および組換えアルファウイルス粒子）ならびにこのようなベクター構築物および粒子を利用するための方法を提供する。簡略には、上記のベクターの調製における使用のために適切な野生型アルファウイルスをコードする配列は、本明細書中に提供される開示が与えられれば、天然に存在する供給源または寄託所（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）から容易に入手され得る。さらに、野生型アルファウイルスは、野生型アルファウイルスに感染した細胞における宿主細胞に指向される巨大分子合成のレベルと、本発明の遺伝子送達ビヒクルを含む細胞における宿主細胞に指向される巨大分子合成のレベルとを比較するために利用され得る。
【００５０】
適切なアルファウイルスの代表例は、アウラウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）、キャバソウ（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）、チクングンヤウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）、フォートモルガン（Ｆｏｒｔ  Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９，ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）、キジルアガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）、マヤロウイルス（ＡＣＴＴ  ＶＲ−６６、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２７７）、ミッデルブルグウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）、ヌヅムウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２，ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４８；以下に記載されるＣＭＣＣ番号４６４０もまた参照のこと）、トナテ  （Ｔｏｎａｔｅ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）、トリニティウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）、ウナウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）、ヴェネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）、ワタロアウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）を含む。
【００５１】
細胞巨大分子合成のレベルを比較する目的のために、以下のプラスミドもまた、野生型アルファウイルスストックの標準的な供給源として利用され得る。これらのプラスミドは、以下を含む：セムリキ森林ウイルスのためには、ｐＳＰ６−ＳＦＶ４（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍら，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６５：  ４１０７−４１１３，  １９９１）；ヴェネズエラウマ脳炎ウイルスのためには、ｐＶ２０００（Ｄａｖｉｓら，  Ｖｉｒ．１８３：  ２０−３１，  １９９１）；ロスリバーウイルスのためには、ｐＲＲ６４（Ｋｕｈｎら，  Ｖｉｒ．  １８２：  ４３０−４４１，  １９９１）。簡略には、これらのプラスミドのためには、プラスミド由来のインビトロで転写されたゲノムＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ細胞からウイルスが入手され得る。シンドビスウイルスのためには、感染性ウイルスは、ｐＶＧＥＬＶＩＳ（ＡＴＣＣ番号７５８９１）プラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ細胞から直接単離され得るか、あるいは野生型ウイルスストックとして入手され得る（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２５２６に関して以下に提供される寄託情報を参照のこと）。
【００５２】
Ｂ．所望の表現型を有するアルファウイルスの選択
アルファウイルスに基づくベクターからのインビボ異種遺伝子発現の持続は、いくつかの機構（宿主細胞に指向される巨大分子合成の阻害を含む）により影響される。しかし、本発明の前には、非細胞変性表現型をもたらす、コードまたは非コードベクターウイルス特異的配列の変化を選択するかまたは同定するための明白な方法は存在しなかった。従って、本発明の１つの局面では、宿主細胞に指向される巨大分子合成の阻害が減少しているかまたは存在しない、アルファウイルス由来遺伝子送達ビヒクルを単離および／または構築するための方法が提供される。
【００５３】
１．ウイルス改変体の生物学的選択
ａ．ＤＩ粒子を含むウイルスストックからの選択
非細胞変性性アルファウイルス改変体を単離するための１つのアプローチは、野生型ウイルス調製物における欠陥妨害（ＤＩ）粒子の存在を利用する。簡略には、特定のＲＮＡウイルス（例えば、ラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス）およびアルファウイルス（例えば、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルス））は高度に細胞変性性であるが、これらはそれにもかかわらずＤＩ粒子の存在下で培養細胞において長期間持続した感染を確立する。定義によれば、ＤＩ粒子は、野生型ウイルスに由来し、そしてＤＩによる自律的複製を防ぐ野生型ゲノムからの１つ以上の変異（例えば、欠失、再編、ヌクレオチド置換など）を含む。一般に、ＤＩ粒子のゲノムは、野生型ウイルスと比較して小さく、かつ複雑度が低く、そしてタンパク質をコードする領域を欠失しているが、複製のためにシスで必要とされる領域は維持している。このようなシス配列は、しばしば重複および／または再編されている。特定のアルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス）の場合、ＤＩ  ＲＮＡゲノムの配列および編成は分析されており、そして野生型ウイルスゲノムの一番端の３’末端由来の最小限５０ｎｔを含み、そしてその５’末端では、野生型配列または細胞ｔＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡＡｓｐ）配列のいずれかをウイルス配列に加えて含むことが見出されている。全ての場合において、変異ＤＩゲノムの増殖および維持は、感染細胞において親のヘルパーウイルスの同時存在を必要とする。しかし、それらの遺伝構造の結果として、ＤＩゲノム複製は、その野生型対応物に対して非常に優れており、そして比較して豊富である。この特徴は、野生型ゲノム複製の妨害、感染性ウイルスの非存在または低レベルの生成、および細胞の長期間存続する感染の確立をもたらす。
【００５４】
従って、以下で実施例１および２に記載のように、ＤＩ粒子の集団を含む混合アルファウイルスストックでの感染により許容細胞（例えば、ヒト起源の細胞を含む、哺乳動物細胞）において長期間存続する感染を確立する能力は、ＤＩ粒子の非存在下でさえも存続する感染を確立し得る完全にインタクトなウイルス改変体を経時的に単離するための機構を提供する。このような感染性ウイルス改変体は、長期間存続する感染性培養物から、複数回のプラーク精製により単離され得、そして宿主細胞において増殖性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）、存続性、および非細胞変性性の感染を開始することが見出されている。さらに、このような増殖性、存続性、および非細胞変性性の感染から生成される改変体ウイルスのレベルは、野生型ウイルス感染と区別できない。この観察は、ＤＩ粒子の混合物を含むウイルスストックでの存続性感染の確立の以前の必要要件とは明らかに対照的である。
【００５５】
ｂ．ＤＩ粒子を含まないウイルスストックからの選択
欠陥妨害粒子を含むウイルスストックからの選択に加えて、本発明での使用に適切なウイルス改変体は、精製ウイルスストック（ＤＩ粒子を含まない）から入手され得る。このウイルスストックは、感受性培養細胞の感染の前にランダム変異誘発に供されるか、または培養細胞でのＲＮＡ複製の間に非特異的変異を作製させるかのいずれかである。簡略には、最初のウイルスストックは、天然の単離株またはそれに由来する生物学的改変体として入手され得るか、または培養細胞を、ゲノムｃＤＮＡクローンまたはインビトロで転写されたＲＮＡを含む感染性核酸分子でトランスフェクトすることにより作製され得る。所望の場合、次いで、ウイルスストックは、物理的または化学的変異誘発に供され得る（好ましいとはいえ、このような変異誘発は必要ではない）。化学的変異誘発の場合、好ましい実施態様は、容易に利用され得る変異誘発剤（例えば、亜硝酸、５−アザシチジン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、またはエチルメタンスルホン酸（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ））をウイルス感染の前に利用する。ランダム変異誘発の後に、特異的選択手順を適用して、以下の実施例２により詳細に記載するような所望の表現型を有するウイルス改変体が単離される。
【００５６】
２．ウイルス改変体の遺伝的選択
関連するアプローチにおいて、変異は、ウイルスストックを用いずに、むしろウイルスのクローン化ゲノムｃＤＮＡを用いて入手され得る。このウイルスは、その後、感染性ウイルスＲＮＡをインビトロで（例えば、シンドビスウイルス（Ｒｉｃｅら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６１：  ３８０９−３８１９，  １９８７；  Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０：  ５０８−５１９，  １９９６）、ＳＦＶ（Ｌｉｌｊｅｓｔｒoｍら，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６５：  ４１０７−４１１３，  １９９１），  ＶＥＥ（Ｄａｖｉｓら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８３：  ２０−３１，  １９９１）、ロスリバーウイルス（Ｋｕｈｎら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８２：  ４３０−４４１，  １９９１）、ポリオウイルス（Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｗｅｒｆら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：  ２３３０−２３３４，  １９８６））またはインビボで（シンドビスウイルス（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同書）、ポリオウイルス（ＲａｃａｎｉｅｌｌｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１４：  ９１６−９１９，  １９８１））転写するために使用され得る。簡略には、感染性核酸は、直接に、または上記の方法の１つを用いて行った変異誘発の後のいずれかに、感受性培養細胞（例えば、ヒト起源の細胞を含む、哺乳動物細胞）中に導入される。あるいは、ベクター核酸は、粒子中に最初にパッケージングされ得、そして粒子は選択のために標的細胞集団にベクターを送達するために使用され得る。続いて、所望の表現型を有するウイルス改変体を単離するための特異的選択手順が適用され、そして以下に記載される。
【００５７】
特定の実施態様において、ランダム変異誘発は、Ｅ．ｃｏｌｉのＸＬ１−Ｒｅｄ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）においてウイルスｃＤＮＡを含むプラスミドの増殖により最初に実施され得る。この株は、ｍｕｔＳ、ｍｕｔＤ、およびｍｕｔＴ変異に起因して、３つの主要なＤＮＡ修復経路を欠損している。しかし、他の変異誘発手順（リンカースキャニング変異誘発（Ｈａｌｔｉｎｅｒら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：  １０１５，  １９８５；  Ｂａｒａｎｙ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：  ４２０２，  １９８５）、ランダムオリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５５：  １６６，  １９８７；  ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，  Ｍａｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：  ３２９，  １９８７；  Ｈｉｌｌら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５５：  ５５８，  １９８７；  Ｈｅｒｍｅｓら，  Ｇｅｎｅ  ８４：  １４３，  １９８９）、およびＰＣＲ変異誘発（ＨｅｒｌｉｔｚｅおよびＫｏｅｎｅｎ，  Ｇｅｎｅ  ９１：  １４３，  １９９０）を含むがこれらに限定されない）が、公開されたプロトコルを利用して容易に置換され得る。得られる変異ｃＤＮＡクローンの混合集団は、感受性培養細胞中に、直接的にまたはインビトロでの転写の後に導入される。所望の表現型の変異ウイルスを含むトランスフェクト細胞についての富化は、以下のように、野生型ウイルスに感染した細胞を越える増加した生存時間に基づいて達成される。
【００５８】
３．ウイルス由来ベクターを用いる改変体の遺伝的選択
別のアプローチにおいて、変異は、ウイルス由来発現ベクターの任意の領域（調節領域、非翻訳領域、またはタンパク質コード遺伝子領域を含む）において作製され得る。例えば、本発明の１つの局面において、宿主細胞に指向される巨大分子合成の阻害が低減しているかまたは存在しないウイルス改変体を選択するための方法が提供される。この方法は、（ａ）細胞に真核生物重層ベクター開始系、ＲＮＡベクターレプリコン、または免疫原性細胞表面タンパク質の発現を行う（ベクター含有細胞の検出に適切な）組換えアルファウイルス粒子、あるいは選択マーカー（薬物または非薬物マーカーのいずれかであって、ここで、非ベクター含有細胞は、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ｇｐｔ、ピューロマイシン、またはヒスチジノールのような薬物の添加の際に殺傷される）を導入する工程；（ｂ）所望の表現型を示すベクター含有細胞を選択する条件下でそしてそれに十分な時間で細胞をインキュベートまたは培養する工程；その後、（ｃ）所望の表現型のベクターを含む細胞を単離する工程、および（ｄ）原因の変異についてベクターを分析する工程を含む。
【００５９】
上記のように、本発明のウイルスベクターは、広範囲な種々のウイルス（例えば、シンドビスウイルス（Ｘｉｏｎｇら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：  １１８８−１１９１，  １９８９；  Ｈａｈｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：  ２６７９−２６８３，  １９９２；  Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １１：  １８−２２，  １９９３；  Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，  同書）、セムリキ森林ウイルス（ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：  １３５６−１３６１，  １９９１）、ヴェネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｄａｖｉｓら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｕｐｐｌ．  １９Ａ：  ３１０，  １９９５）、ポリオウイルス（Ｃｈｏｉら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：  ２８７５−２８８３，  １９９１；  Ａｎｓａｒｄｉら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５４：  ６３５９−６３６４，  １９９４；  およびＡｎｄｉｎｏら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：  １４４８−１４５１，  １９９４））に由来し得る。上記の方法の代表例は、以下の実施例２により詳細に議論される。
【００６０】
４．ウイルス改変体の使用
本明細書中でより詳細に議論するように、本明細書中に提供される方法を利用して選択または作製されたウイルス改変体は、所望の表現型を示す広範囲な種々の組換え遺伝子送達ビヒクルを構築するために利用され得る。特定の実施態様では、遺伝子送達ビヒクルは、ｎｓＰ２遺伝子のＬｅｕ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（「ＬＸＰＧＧ」）モチーフ内に変異を含む。簡略には、ｎｓＰ２遺伝子の公開された配列が利用可能であるアルファウイルスについては、高度に保存されたアミノ酸モチーフ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（「ＬＸＰＧＧ」）が観察される。標準的なタンパク質モデリングアルゴリズム（ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍ．  ４７：  ４５−１４８，  １９７８）により推定されたように、このモチーフの残基は、構造中におそらくβターンを含む。シンドビスウイルスにおけるｎｓＰ２のプロリン７２６は、このモチーフの中心の残基である。他のアルファウイルスにおける対応するモチーフを以下の表に例示する。
【００６１】
【化１】
2008200051.tif 000002
＊公開されたｎｓＰ２配列を有するアルファウイルス株：（１）Ｓｔｒａｕｓｓら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３３：  ９２−１１０，  １９８４；  （２）Ｓｉｍｐｓｏｎら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２２：  ４６４−４６９  １９９６；  （３）  Ｓｈｉｒａｋｏら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８２：  ７５３−７６４，  １９９１；  （４）Ｒｕｍｅｎａｐｆら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０８：  ６２１−６３３，  １９９５；  （５）Ｔａｋｋｉｎｅｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：  ５６６７−５６８２，  １９８６；  （６）  Ｋｉｎｎｅｙら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：  １９−３０，  １９８９；  および（７）Ｆａｒａｇｈｅｒら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６３：  ５０９−５２６，  １９８８。
【００６２】
それ故、本発明の種々の実施態様においては、遺伝子送達ビヒクルが提供される。ここで、遺伝子送達ビヒクルは、ＬＸＰＧＧモチーフに変異を有するｎｓＰ２遺伝子を含む。１つの実施態様では、Ｌｅｕコドンは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｓｘ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｘ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、または別の稀なもしくな非タンパク質性のアミノ酸（例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎ．Ｙ．  Ｎ．Ｙ．，  １９７５を参照のこと）からなる群より選択される別のアミノ酸に変異される。別の実施態様では、Ｐｒｏコドンは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｓｘ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｘ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、または別の稀なもしくな非タンパク質性のアミノ酸からなる群より選択される別のアミノ酸に変異される。他の実施態様では、Ｇｌｙコドンのいずれかまたは両方は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｓｘ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｘ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、または別の稀なもしくな非タンパク質性のアミノ酸からなる群より選択される別のアミノ酸に変異され得る。さらに他の実施態様では、Ｘａａアミノ酸またはＬＸＰＧＧモチーフの１〜３残基上流もしくは下流のアミノ酸は、得られる遺伝子送達ビヒクルの表現型に影響を与えるために、野生型アミノ酸から変異され得る。本発明の特定の実施態様では、ＬＸＰＧＧモチーフは、１つより多くのコドンの改変、あるいは１つ以上の挿入または欠失を含むように変異され得る。
【００６３】
Ｃ．アルファウイルスベクター構築物およびアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン
上記のように、本発明は、アルファウイルスに由来するＤＮＡおよびＲＮＡの両方の構築物を提供する。簡略には、本発明の１つの局面では、ｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成をインビトロで開始する５’プロモーター、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つの全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子（上記のような単離された核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニレート域を含む）を含むアルファウイルスベクター構築物が提供される。他の局面では、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子（上記の単離された核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニレート域を含む）を含むＲＮＡベクターレプリコンが提供される。上記の好ましい実施態様では、上記の構築物はさらに、ウイルス連結領域を含む。これらの局面のそれぞれは、以下でより詳細に議論される。
【００６４】
１．ウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモ−ター
上記のように、本発明の特定の実施態様において、インビトロ転写のプロセスによりｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター（例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を含むアルファウイルスベクター構築物が提供される。好ましい実施態様では、このようなプロモーターは、例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。同様に、インビボで（すなわち細胞内で）ｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター（例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を含む真核生物重層ベクター開始系が提供される。特定の実施態様では、このようなＲＮＡポリメラーゼプロモーター（アルファウイルスベクター構築物または真核生物重層ベクター開始系のいずれか）は、原核生物および真核生物の両方に由来し得、そして例えば、細菌のβ−ガラクトシダーゼおよびｔｒｐＥプロモーター、ならびに真核生物ウイルスのシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、即時型）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）のプロモーターを含む。
【００６５】
２．転写を開始する配列
上記のように、好ましい実施態様では、本発明のアルファウイルスベクター構築物およびＲＮＡベクターレプリコンは、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列（５’末端ＣＳＥまたは５’シス複製配列ともいう）を含む。このような配列の代表例は、野生型シンドビスウイルスのヌクレオチド１〜６０、および塩基１５０〜２１０に沿ったより少ない範囲のヌクレオチド、ｔＲＮＡＡｓｐのヌクレオチド１０〜７５（アスパラギン酸、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら、米国特許第５，０９１，３０９号）、ならびに転写を開始する他のアルファウイルス由来の５’配列を含む。−鎖ゲノムコピーの３’末端に対応する配列、ｎｓＰレプリカーゼ複合体により結合される配列、およびおそらくさらなる宿主細胞因子（ここからポジティブ鎖ゲノムＲＮＡの転写が開始される）は、これらの配列相補物である。
【００６６】
３．アルファウイルス非構造タンパク質
本明細書中に提供されるアルファウイルスベクター構築物およびＲＮＡベクターレプリコンはまた、４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質（上記の所望の表現型を提供する配列を含む）をコードする配列を必要とする。簡略には、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする広範な種々の配列は、本明細書中に明白に提供されるものに加えて、本発明において利用され得、従って、用語「アルファウイルス非構造タンパク質」の範囲内にあると判断される。例えば、遺伝コードの縮重のために、１つより多くのコドンが、所定のアミノ酸をコードし得る。従って、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする広範な種々の核酸配列が作製され得る。さらに、多数の任意の位置でのアミノ酸の置換、付加、または欠失は、機能的または生物学的に活性な非構造タンパク質を依然として提供し得る。本発明の状況においては、アルファウイルス非構造タンパク質は、これらがベクター構築物の自己複製（すなわち、ウイルス核酸の複製および必然的にではないが感染性ウイルスの生成）を促進する場合、生物学的に活性であると判断され、そして経時的に行われる代謝的標識またはＲＮａｓｅ保護アッセイにより容易に決定され得る。このような誘導体を作製するための方法は、本明細書中に提供される開示が与えられれば、当業者により容易に達成され得る。
【００６７】
アルファウイルスは、４つの非構造タンパク質（ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、およびｎｓｐ４と称される）を発現する。アルファウイルスに由来する本発明のベクターは、４つの非構造タンパク質をコードする配列を含むべきである。野生型シンドビスウイルスでは、非構造タンパク質１〜３はヌクレオチド６０〜５７４７によりコードされるが、ｎｓＰ４はヌクレオチド５７６９〜７５９８によりコードされる（図１を参照のこと）。非構造タンパク質は、（ｉ）ｎｓＰ３のコード領域とｎｓＰ４のコード領域との間にオパール終結コドンが存在するか否か、および（ｉｉ）このようなオパールコドンが存在する場合、新生ポリペプチドの翻訳終結がその点に存在するか、または読み通され、それゆえＰ１２３４の生成となるかに依存して、ゲノムのポジティブ鎖ＲＮＡから、それぞれ、Ｐ１２３またはＰ１２３４として知られる２つの大きなポリタンパク質の１つとして翻訳される。オパール終結コドンは、アルファウイルスＳＩＮ（株ＡＲ３３９および本明細書中に記載されるＳＩＮ−１株）、アウラ、ＷＥＥ、ＥＥＥ、ＶＥＥ、およびＲＲのｎｓＰ３／ｎｓＰ４連結部に存在し、従ってＰ１２３およびＰ１２３４種は、これらのウイルスで感染した細胞において発現される。対照的に、終結コドンは、アルファウイルスＳＩＮ（株ＡＲ８６、ＳＦ、およびＯＮＮ）のｎｓＰ３／ｎｓＰ４連結部に存在せず、従ってこれらのウイルスで感染した細胞においてはＰ１２３４種のみが発現される。ポリタンパク質およびプロセシングされたモノマー形態の非構造タンパク質は、アルファウイルスＲＮＡゲノムの複製において機能する。アルファウイルス非構造タンパク質の切断変異体の増殖特徴を調べる実験は、ポリタンパク質は、ゲノムのネガティブ鎖ＲＮＡの合成に関与するが、個々のモノマータンパク質は、ゲノムおよびサブゲノムのポジティブ鎖ＲＮＡ種の合成を触媒することを示した（ＳｈｉｒａｋｏおよびＳｔｒａｕｓｓ，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６８：  １８７４−１８８５，  １９９４）。翻訳読み通しは、一般に、ｎｓＰ３／ｎｓＰ４連結部にオパール終結コドンを含む野生型シンドビスウイルスで感染した細胞において、１回に約１０％〜２０％で生じる。Ｐ１２３およびＰ１２３４のプロセシングは、非構造タンパク質の１つによりコードされるプロテイナーゼ活性によるものであり、そして以下にさらに議論される。シスかまたはトランスかのプロセシングの順番は、種々の要因（感染段階を含む）に依存する。例えば、シンドビスウイルスおよびＳＦＶは、Ｐ１２３およびｎｓｐ４を感染の初期に、そしてＰ１２およびＰ３４を感染の後期に生成する。次いでさらなるプロセシングが個々の非構造タンパク質を放出する。各非構造タンパク質は、いくつかの機能を有する。これらのいくつかを以下に記載する。
【００６８】
ａ．ｎｓＰ１
非構造タンパク質１は、−鎖ＲＮＡ合成の開始（または継続）のために必要とされる。これはまた、転写の間に、ゲノムおよびサブゲノムのアルファウイルスＲＮＡの５’末端のキャッピングにおいて役割を果たす。なぜなら、ｎｓＰ１は、メチルトランスフェラーゼ活性（ＭｉおよびＳｔｏｌｌａｒ，  Ｖｉｒ．  １８４：  ４２３−４２７，  １９９１）およびグアニルトランスフェラーゼ活性（ＳｔｒａｕｓｓおよびＳｔｒａｕｓｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５８（３）：  ４９１−５６２，  １９９４）の両方を有するからである。ｎｓＰ１はまた、ｎｓＰ２のプロテイナーゼ活性を調節する。なぜなら、ｎｓＰ１含有ポリタンパク質は、ｎｓＰ２とｎｓＰ３との間で非効率的に切断されるからである（ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ９：  ２６３１−２６３８，  １９９０）。
【００６９】
ｂ．ｎｓＰ２
非構造タンパク質２は、ウイルスＲＮＡの複製および非構造ポリタンパク質のプロセシングに関与する多機能性タンパク質である。このタンパク質のＮ末端ドメイン（最初の４６０アミノ酸にほぼまたがる）は、ＲＮＡ複製および転写の間に二重鎖のねじれを戻すのに活性であるヘリカーゼであると考えられる。本発明によるベクターにおける２６ＳサブゲノムｍＲＮＡ（目的の遺伝子（単数または複数）をコードする）の合成は、機能的ｎｓＰ２を必要とする。シンドビスウイルスのアミノ酸残基４６０〜８０７の間のｎｓＰ２のＣ末端ドメインは、非構造ポリタンパク質を、ｎｓＰ１／ｎｓＰ２、ｎｓＰ２／ｎｓＰ３、およびｎｓＰ３／ｎｓＰ４連結部の間でトランスおよびシスでタンパク質分解により切断する。アルファウイルスｎｓＰ２  Ｃ末端ドメインの一次配列のアラインメントは、ｎｓＰ２がパパイン様プロテイナーゼであることを示唆する（ＨａｒｄｙおよびＳｔｒａｕｓｓ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３：  ４６５３−４６６４，  １９８８）。
【００７０】
ｎｓＰ２の他の観察された特徴は、アルファウイルスの増殖に直接関連する機能に未だに割り当てられていない。例えば、ｎｓＰ２が、ＳＦＶ感染細胞においてリボソームと密接に関連し、そしてＵＶ照射によりｒＲＮＡに架橋され得ることが示されている（Ｒａｎｋｉら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １０８：  ２９９−３０２，  １９７９）。さらに、５０％のｎｓＰ２は、ＳＦＶ感染ＢＨＫ細胞の核マトリックス、特に核小体の領域に局在する（Ｐｅｒaｎｅｎら，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６４：  １８８８−１８９６，  １９９０）。核へのｎｓＰ２の局在は、おそらく活性な輸送により進行される。なぜなら、これは核コア複合体を通しての拡散により核に侵入し得る小タンパク質および代謝産物のサイズ（約２０〜６０ｋＤ）を越えるからである（Ｐａｉｎｅら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：  １０９−１１４，  １９７５）。推定のＮＬＳ配列は、アルファウイルスＳＦＶ、ＳＩＮ、ＲＲ、ＯＮＮ、ＯＣＫ、およびＶＥＥにおいて同定されている（Ｒｉｋｋｏｎｅｎら，  Ｖｉｒ．  １８９：  ４６２−４７３，  １９９２）。
【００７１】
ｃ．ｎｓＰ３
非構造タンパク質ｎｓＰ３は、ウイルス複製におけるそれらの正確な役割は十分には理解されていないとはいえ、２つの異なるドメインを含む。種々のアルファウイルスにおいてＮ末端ドメインは、３２２〜３２９残基長の範囲であり、そして任意の２つのアルファウイルス間で最小５１％のアミノ酸配列同一性を示す。しかし、Ｃ末端ドメインは、公知のアルファウイルス間で長さも配列も保存されておらず、そして複数の変化が許容される（Ｌｉら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １７９：  ４１６−４２７）。タンパク質は、高度にリン酸化された状態で複製複合体と会合して見出される。そのゲノム中にｎｓＰ３／ｎｓＰ４連結部の間でオパール終結コドンを含むアルファウイルスにおいて、オパール終結シグナルの読み通しが存在するか否かに依存して、２つの異なるタンパク質が生成される。読み通しは、ポリタンパク質の切断後に７個のさらなるカルボキシ末端アミノ酸を含むｎｓＰ３タンパク質を生じる。ｎｓＰ３がウイルスＲＮＡ合成の何らかの能力に必要とされることは明白である。なぜなら、このタンパク質の特定の変異体はＲＮＡネガティブであり、そしてＰ１２３ポリタンパク質は−鎖ＲＮＡ合成に必要とされるからである。
【００７２】
ｄ．ｎｓＰ４
ｎｓＰ４は、ウイルスにコードされるＲＮＡポリメラーゼであり、そしてこのような酵素に特有のＧＤＤモチーフを含む（ＫａｍｅｒおよびＡｒｇｏｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：  ７２６９−７２８２，  １９８４）。従って、ｎｓＰ４は、アルファウイルスＲＮＡ複製に不可欠である。ｎｓＰ４の濃度は、感染細胞において厳密に調節される。ほとんどのアルファウイルスにおいて、ｎｓＰ４の翻訳は、ｎｓＰ３コード領域とｎｓＰ４コード領域との間のオパールコドンの読み通しを必要とし、他の非構造タンパク質と比較して細胞内レベルが低い。さらに、ｎｓＰ４の大半は、Ｎ末端規則経路（Ｇｏｎｄａら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：  １６７００−１６７１２，  １９８９）による分解を通して代謝的に不安定である。しかし、分解シグナルを隠す複製複合体とのその会合に起因して、いくらかのｎｓＰ４は安定である。従って、アミノ末端残基を改変することによる酵素の安定化は、本明細書中に記載されるベクターによりコードされるタンパク質のより長期間の発現を促進するのに有用であることを証明し得る。安定化アミノ末端残基は、メチオニン、アラニン、およびチロシンを含む。
【００７３】
４．ウイルス連結領域
アルファウイルスウイルス連結領域は、通常、サブゲノムｍＲＮＡの転写開始を制御する；従って、このエレメントはまた、サブゲノムｍＲＮＡプロモーターとも呼ばれる。シンドビスウイルスの場合、通常のウイルス連結領域は、代表的には、ほぼヌクレオチド数７５７９で始まり、そして少なくともヌクレオチド数７６１２を通って連続する（そしておそらくそれを越える）。最小では、ヌクレオチド７５７９〜７６０２（５’−ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＡＧＴ−配列番号１）が、サブゲノムフラグメントの転写に必要であると考えられる。この領域（ヌクレオチド７５７９〜７６０２）を、本明細書中以下で「最小の連結領域コア」という。
【００７４】
本発明の特定の局面では、ウイルス連結領域は、サブゲノムフラグメントの合成を防ぐために不活化される。本発明の状況において利用されるように、「不活化」は、記載されたように（ＦｒｏｌｏｖおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８：  １７２１−１７２７，  １９９４）、サブゲノムｍＲＮＡに対応する種が、これらのベクターを含む細胞から精製され、そして１μｇ／ｍｌ  ダクチノマイシンで処理され、そして［３Ｈ］−ウリジンで標識され、電気泳動されたＲＮＡの変性ゲルからのオートラジオグラムにおいて観察されないことを意味する。
【００７５】
本発明の１つの実施態様では、遺伝子送達ビヒクルは、リボゾームの読み通しまたは無能力化された連結領域プロモーターのすぐ下流の内部リボゾーム侵入のいずれかを促進するシグナルの置換により構築され得る。このベクター構成において、サブゲノムメッセージの合成は起こり得ない；しかし、異種タンパク質はリボゾームの読み通し（スキャニング）または内部リボゾーム侵入のいずれかにより、ゲノム長のｍＲＮＡから発現される。
【００７６】
本明細書中に記載される遺伝子送達ビヒクルの特定の適用において、１つより多くの異種遺伝子の発現が所望される。例えば、ゴシェ症候群（Ｇａｕｃｈｅｒ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）のような代謝性疾患の処置のためには、治療用緩和剤の持続が限定され得るため、遺伝子送達ビヒクルまたは粒子の複数回投与が必要であり得る。従って、本発明の特定の実施態様においては、グルコセレブロシダーゼ遺伝子のような治療用緩和剤とともに、標的細胞においてアデノウイルス２  Ｅ３遺伝子を同時発現することが所望され得る。野生型ウイルスでは、構造タンパク質（「ｓＰ」）ポリシストロン性メッセージは単一のポリタンパク質に翻訳され、これは次に部分的にｓＰキャプシドプロテイナーゼにより切断されて個々のタンパク質にプロセシングされる。従って、キャプシドｓＰのプロテアーゼ活性、または切断のために認識されるペプチドがアルファウイルスベクターの置換領域内に存在しないため、ポリシストロン性メッセージからの複数の異種遺伝子の発現は、野生型ウイルスとは異なる機構を必要とする。従って、本発明のさらなる実施態様では、複数の独立の異種配列の翻訳を可能にする機能的エレメント（リボゾームの読み通し、キャップとは独立の翻訳、内部リボゾーム侵入、または最小連結領域コア配列を含む）が利用され得る。
【００７７】
５．アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列およびポリ（Ａ）域
上記のように、本発明のアルファウイルスベクター構築物またはＲＮＡベクターレプリコンはまた、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（「アルファウイルスレプリカーゼ認識配列」、「３’末端ＣＳＥ」、または「３’シス複製配列」ともいう）を含むべきである。簡略には、ポジティブ鎖ゲノムＲＮＡの３’末端領域に位置するアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列は、このウイルスがネガティブ鎖の合成によって複製を始める認識部位を提供する。アルファウイルスＲＮＡ  ポリメラーゼ認識配列として、広範な種々の配列が利用され得る。例えば、１つの実施態様において、ポリメラーゼ認識が、認識配列としてなお機能し得る最小の領域（例えば、ヌクレオチド１１，６８４〜１１，７０３）まで端が切断されているシンドビスウイルスベクター構築物が利用され得る。本発明の別の実施態様において、Ｅ１  ｓＰ遺伝子の下流の非翻訳領域全体からウイルスゲノムの３’末端までがポリメラーゼ認識部位を含む（例えば、ヌクレオチド１１，３８２〜１１，７０３）、シンドビスウイルスベクター構築物が利用され得る。
【００７８】
本発明の好ましい実施態様において、アルファウイルスベクター構築物またはＲＮＡベクターレプリコンはさらにポリ（Ａ）域を含み得る。これは、アルファウイルス由来ベクターでトランスフェクトした細胞における異種遺伝子発現の観察レベルを劇的に増加させる（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、前出を参照のこと）。簡略には、ポリ（Ａ）域は、細胞質中での安定性を促進し、それにより、ウイルスの生活環の開始効率を上昇させるに十分な任意のサイズであり得る。本発明の種々の実施態様において、ポリ（Ａ）配列は少なくとも１０アデノシンヌクレオチド、そして最も好ましくは、少なくとも２５アデノシンヌクレオチドを含む。１つの実施態様において、ポリ（Ａ）配列は、シンドビスウイルスヌクレオチド１１，７０３に直接結合される。
【００７９】
Ｄ．真核生物重層ベクター開始系
全長ゲノムアルファウイルスｃＤＮＡクローンのサイズのため、インビトロでの全長のキャップされたＲＮＡ分子の転写は、むしろ効率が悪い。これは、トランスフェクトされたＲＮＡのインビトロ転写量に対して、ウイルスの感染中心に関して低いトランスフェクション効率をもたらす（プラーク形成により測定される）。このような効率の悪さはまた、インビトロでのアルファウイルス発現ベクターの転写に関連する。従って、感染サイクルを開始する能力または異種配列の発現を指向する能力について候補ｃＤＮＡクローンおよび他のアルファウイルスｃＤＮＡ発現ベクターを試験することは、ｃＤＮＡクローンが、ＤＮＡ分子として感受性細胞にトランスフェクトされ、これが次いでインビボでウイルスＲＮＡの合成を指向する場合、非常に促進され得る。
【００８０】
従って、本発明の１つの局面において、インビボでのウイルスＲＮＡ（ゲノムまたはベクター）の合成を指向し得る、ＤＮＡに基づくベクター（「真核生物重層ベクター開始系」という）が提供される。一般に、真核生物重層ベクター開始系は、インビボ（すなわち、細胞内）でｃＤＮＡからのＲＮＡの５’合成を開始し得る５’プロモーター、細胞中でのそれ自身の複製を指向し得る構築物（この構築物はまた、異種核酸配列を発現し得る）、および転写終結を制御する３’配列（例えば、ポリアデニレート域）を含む。このような真核生物重層ベクター開始系は、異種ヌクレオチド配列の発現を制御する、２段階または「重層」機構を提供する。簡略には、第１の層は第２の層の転写を開始し、そしてインビボでｃＤＮＡからのＲＮＡの５’から３’への合成を開始し得るプロモーター（例えば、５’真核生物プロモーター）を含み、そしてさらに他のエレメント（３’転写終結／ポリアデニル化部位、１つ以上のスプライス部位を含む）、ならびに他のＲＮＡ核輸送エレメント（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント（ＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３：  ７４７６，  １９９３；  Ｈｕａｎｇら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８：  ３１９３，  １９９４；  Ｈｕａｎｇら  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：  ３８６４−３８６９，  １９９５）、メイソン−ファイザーサルウイルスの構成性輸送エレメント（ＣＴＥ）（Ｂｒａｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：  １２５６−１２６０，  １９９４）、ＨＩＶ  Ｒｅｖ応答性エレメント（Ｍａｌｉｍら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：  ２５４−２５７，  １９８９；  Ｃｕｌｌｅｎら，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  １６：  ３４６，  １９９１）を含む）、および、所望であれば、他の同様のエレメントを含み得る。本発明での使用に適切な代表的なプロモーターは、真核生物性（例えば、ｐｏｌ  Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ）および原核生物性プロモーター、ならびに誘導性または非誘導性（すなわち、構成性）プロモーター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアクチン５Ｃ遠位プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、熱ショックタンパク質６５プロモーター、熱ショックタンパク質７０プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、マウスポリオーマウイルスプロモーター（Ｐｙ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＢＫウイルスおよびＪＣウイルスのプロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、アルファウイルス連結領域、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルスＥ１またはＶＡ１ＲＮＡのプロモーター、ｒＲＮＡプロモーター、ｔＲＮＡメチオニンプロモーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンセターゼプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、およびｌａｃプロモーターを含む。
【００８１】
本発明のなお他の実施態様では、誘導性プロモーターが利用され得る。例えば、１つの実施態様において、ＤＮＡからのＲＮＡの合成を開始する誘導性プロモーターが提供される。誘導性プロモーターは、コアＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、および転写アクチベータータンパク質のＤＮＡ結合を指向する作動可能に連結された核酸配列、および転写リプレッサータンパク質のＤＮＡ結合を指向する作動可能に連結された核酸配列を含む。さらなる実施態様において、転写アクチベータータンパク質のＤＮＡ結合を指向する核酸配列は、テトラサイクリンリプレッサー／ＶＰ１６トランスアクチベーター融合タンパク質を結合する配列である。さらに別の実施態様において、転写リプレッサータンパク質のＤＮＡ結合を指向する核酸配列は、ラクトースリプレッサー／Ｋｒｕｐｐｅｌドメイン融合タンパク質を結合する配列である。
【００８２】
第２の層は、１つ以上の異種ヌクレオチド配列を発現し得、そして自律的にまたは１つ以上の因子（例えば、誘導性である）に応答してのいずれかで細胞中でそれ自身の複製を指向し得る、自己触媒ベクター構築物を含む。第２の層は、ウイルス起源または非ウイルス起源であり得る。本発明の１つの実施態様において、第２の層の構築物は、上記のアルファウイルスベクター構築物であり得る。
【００８３】
真核生物重層ベクター開始系の第１の層として広範な種々のベクター系が使用され得、以下のＤＮＡウイルスから開発されるウイルスベクター構築物を含む：例えば、カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウイルスを含むポックスウイルス科（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、ＰＮＡＳ  ８６：  ３１７−３２１、１９８９；  Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５６９：  ８６−１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ８  ：  １７−２１，  １９９０；  米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ  ８９／０１９７３）；ＢＫＶ、ＪＣＶまたはＳＶ４０のようなパポーバウイルス科  （例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：  １０８−１１４、１９７９）；  アデノウイルスのようなアデノウイルス科（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：  ６１６−６２７、１９８８；  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：  ４３１−４３４、１９９１）；アデノ関連ウイルスのようなパルボウイルス科  （例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．  Ｖｉｒ．  ６３：  ３８２２−３８２８、１９８９；  Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．  １６６：  １５４−１６５、１９８８；  ＰＡ  ７／２２２，６８４）；単純ヘルペスウイルスのようなヘルペスウイルス科（例えば、Ｋｉｔ，  Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ２１９−２３６、１９８９）；およびヘパドナウイルス科（例えば、ＨＢＶ）、ならびにレトロウイルス科のようなＤＮＡ中間体を通して複製される特定のＲＮＡウイルス（例えば、米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ  ２，２００，６５１、ＥＰ  ０，３４５，２４２、およびＷＯ９１／０２８０５；ＭｏＭＬＶのような白血病中のウイルスおよびＨＩＶのような免疫不全症ウイルスを含むレトロウイルス科（例えば、Ｐｏｎｚａｎｓｋｙ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６５：  ５３２−５３６、１９９１を参照のこと）。
【００８４】
同様に、広範な種々のベクター系は、真核生物重層ベクター開始系の第２の層として利用され得、例えば、以下の科のウイルス由来のベクター系を含む：ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス）、カリチウイルス科、トガウイルス科（例えば、アルファウイルス、風疹）、フラビウイルス科（例えば、黄熱病、ＨＣＶ）、コロナウイルス科（例えば、ＨＣＶ、ＴＧＥＶ、ＩＢＶ、ＭＨＶ、ＢＣＶ）、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、レトロウイルス科（例えば、ＲＳＶ、ＭｏＭＬＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ）、デルタ型肝炎ウイルス、およびアストロウイルス。さらに、非哺乳動物ＲＮＡウイルス（ならびにそれら由来の成分）もまた利用され得、それは、例えば、細菌およびバクテリオファージレプリカーゼ、ならびにポテックスウイルス（例えば、ＰＶＸ）、カルラウイルス（例えば、ＰＶＭ）、トブラウイルス（例えば、ＴＲＶ、ＰＥＢＶ、ＰＲＶ）、トバモウイルス（例えば、ＴＭＶ、ＴｏＭＶ、ＰＰＭＶ）、ルテオウイルス（例えば、ＰＬＲＶ）、ポティウイルス（例えば、ＴＥＶ、ＰＰＶ、ＰＶＹ）、トムブスウイルス（例えば、ＣｙＲＳＶ）、ネポウイルス（例えば、ＧＦＬＶ）、ブロモウイルス（例えば、ＢＭＶ）、およびトパモウイルス（ｔｏｐａｍｏｖｉｒｕｓ）のような植物ウイルス由来の成分を含む。
【００８５】
真核生物ベクター開始系の第２の層に含まれる自己触媒ベクター構築物の複製能力は、例えば、ダクチノマイシンのような細胞ＲＮＡ合成阻害剤の存在下で、トランスフェクトされた細胞中でのポジティブセンスＲＮＡおよびネガティブセンスＲＮＡの両方の増加を経時的に測定するリボヌクレアーゼ保護アッセイ、およびまたトランスフェクトされた細胞中のサブゲノムＲＮＡの合成または異種レポーター遺伝子の発現を測定するアッセイを含む、当業者に公知の種々のアッセイで測定され得る。
【００８６】
本発明の特に好ましい実施態様において、インビボでｃＤＮＡからのアルファウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター（すなわち、ＲＮＡ合成のＤＮＡプロモーター）、続いてアルファウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列、４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸配列（組換えアルファウイルス粒子に作動可能に取り込まれた場合に、所望の表現型をもたらす上記の核酸分子を含む）、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および転写終結／ポリアデニル化を制御する３’配列を含む真核生物重層ベクター開始系が提供される。さらに、発現されるべき異種配列に作動可能に連結されたウイルス連結領域が含まれ得る。種々の実施態様において、ウイルス連結領域は、不活化されるというよりむしろサブゲノムフラグメントのウイルス転写が増加または減少するように改変され得る。他の実施態様において、第２のウイルス接合領域は、第１の不活化ウイルス連結領域に続いて挿入され得、その第２のウイルス連結領域は、サブゲノムフラグメントのウイルス転写が増加または減少するように活性であるかまたは改変されているかのいずれかである。
【００８７】
真核生物重層ベクター開始系の転写に引き続いて、得られるアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン分子は、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、ウイルス連結領域、異種ヌクレオチド配列、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、およびポリアデニル化配列から構成される。
【００８８】
アルファウイルスｃＤＮＡベクター構築物の種々の局面が上記で議論されており、アルファウイルスの転写を開始し得る５’配列、アルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、ウイルス連結領域（サブゲノムフラグメントのウイルス転写を妨害するように不活化された連結領域を含む）、およびアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む。さらに、改変された連結領域および縦列連結領域もまた、上記で議論されている。
【００８９】
本発明の別の実施態様において、真核生物重層ベクター開始系は、特定の真核生物種、特に哺乳動物種（例えば、ヒト）由来の１つ以上の細胞株において複製するように適合されたアルファウイルスベクター（例えば、シンドビスベクター構築物）に由来する。例えば、発現されるべき組換えタンパク質をコードする遺伝子がヒト起源のものであり、そしてタンパク質がヒトの治療的使用を意図される場合、適切なヒト細胞株における産生は、そのタンパク質がヒトにおいて生じることが期待されるように、翻訳後に改変されるために好ましいかもしれない。このアプローチは、（以下でより詳細に議論するように）組換えタンパク質の産生をさらに増強する際に有用であり得る。ウイルスレプリカーゼの不正確さ（ｉｎｆｉｄｅｌｉｔｙ）に起因したアルファウイルスゲノムの全体的な可塑性を仮定すれば、選択された真核生物細胞（例えば、ヒト、マウス、イヌ、ネコなど）における高力価増殖性感染を確立する増強された能力を有する改変体株が単離され得る。さらに、真核生物細胞における高力価存続性感染を確立する増強された能力を有する改変体アルファウイルス株もまた、このアプローチを用いて単離され得る。次いで、アルファウイルス発現ベクターは、これらの改変体株のｃＤＮＡクローンから、本明細書中に提供される手順に従って構築され得る。
【００９０】
本発明の別の実施態様において、真核生物重層ベクター開始系は、分化した細胞型においてのみ転写時に活性がある、最初のアルファウイルスベクター転写のためのプロモーターを含む。簡略には、培養中の哺乳動物細胞（例えば、ハムスター（例えば、ベビーハムスター腎臓細胞）またはニワトリ（ニワトリ胚線維芽細胞）に由来する細胞）のアルファウイルス感染が、典型的には細胞傷害性を生じることが十分に確立されている。従って、安定的に形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞株を産生するために、真核生物重層ベクター開始系が宿主細胞中に導入され得る。ここで、最初のベクター増幅を可能にするプロモーターは転写時に不活性なプロモーターであるが、誘導性プロモーターである。特に好ましい実施態様において、このようなプロモーターは、分化状態依存性である。この構成において、プロモーターの活性化およびその後のアルファウイルスＤＮＡベクターの活性化は、細胞分化の誘導と同時に起きる。このような安定に形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞株の特定の細胞数への増殖の際に、適切な分化刺激が提供され、それによりベクター構築物の転写、ならびに所望の遺伝子およびコードされるポリペプチド（単数または複数）の増幅された発現が開始される。多くのこのような分化状態依存性プロモーターは、特定の刺激の適用により分化するように誘導され得る細胞株と同様に当業者に公知である。代表例は、それぞれ、レチノイン酸、ウマ血清、およびＤＭＳＯにより活性化される、細胞株Ｆ９およびＰ１９、ＨＬ６０、ならびにフロイント赤白血病細胞株およびＨＥＬを含む。
【００９１】
好ましい実施態様において、このようなプロモーターは、２つの別々の成分により調節され得る。例えば、実施例７に記載のように、転写アクチベーターおよび翻訳リプレッサーの両方についての結合部位は、作動可能に依存した様式で「コア」プロモーターに隣接して位置する。この構成において、誘導されていない状態は、転写アクチベーターがその認識部位を見出す能力をブロックするが、転写リプレッサーが構成的に発現され、そしてその認識部位に結合することを可能にすることにより維持される。誘導は、転写リプレッサーをブロックし、そしてトランスアクチベーターブロックを除去することにより可能になる。例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター系（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８９：  ５５４７−５５５１，  １９９２）は、アルファウイルスベクターＲＮＡの誘導性転写のために利用され得る。この系において、テトラサイクリンリプレッサーおよびＨＳＶ−ＶＰ１６トランスアクチベータードメインの「融合」タンパク質（ｒＴＡ）としての発現は、最小「コア」プロモーター（例えば、ＣＭＶ）にすぐ隣接して位置するテトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）に特異的に結合することにより、アルファウイルスベクターＲＮＡのインビボ転写を刺激する。結合およびトランス活性化事象は、テトラサイクリンの存在により可逆的にブロックされ、そして培養培地からテトラサイクリンを除去することにより「オン」にされ得る。転写の誘導されない基底レベルは、異なる細胞型の間で異なるので、他の異なる最小のコアプロモーター（例えば、ＨＳＶ−ｔｋ）は、アルファウイルスベクターヌクレオチド１と並んでいるかまたはそのすぐ近くに位置することを可能にするためにテトラサイクリンオペレーター配列（ただし、転写開始部位は公知である）に連結され得る。
【００９２】
ｒＴＡトランスアクチベーターは、同じ細胞株に安定に形質転換されてもいる、さらなる発現カセットにより提供され得る；そして特定の実施態様において、ｒＴＡ発現カセットは、それ自身自己調節され得る。自己調節ｒＴＡ発現カセットの使用は、ｒＴＡそれ自身が結合する同一のｔｅｔＯ連結プロモーターによって発現を転写制御とリンクさせることにより、ｒＴＡの構成的な高レベル発現に関連する潜在的な毒性の問題を回避する。この型の系は、テトラサイクリンの存在下ではｒＴＡがほとんど生成されないことを保証するが、テトラサイクリンが除去された場合には高度に活性となるネガティブフィードバックサイクルを作製する。このような自己調節性ｒＴＡ発現カセットは、プラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡｋ（Ｓｈｏｃｋｅｔｔら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：  ６５２２−６５２６，  １９９５）において提供される。
【００９３】
転写抑制のために、特定のジンクフィンガータンパク質のＫＲＡＢ抑制ドメインもまた利用され得る。簡略には、ＫＲＡＢ（Ｋｒuｐｐｅｌ関連ボックス）ドメインは、全てのＫｒuｐｐｅｌクラスのＣｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガータンパク質の１／３より多くのアミノ末端領域に存在する、高度に保存された配列である。このドメインは、２つの推定両親媒性α−ヘリックスを含み、そしてＤＮＡ結合依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写リプレッサーとして機能することが示されている（例えば、Ｌｉｃｈｔら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：  ７６−７９，  １９９０）。他の転写因子と同様に、活性な抑制ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインは、別々でありそして分離し得る。従って、抑制ドメインは、融合タンパク質として、標的化のために任意の配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質に結合され得る。従って、ＤＮＡ結合タンパク質成分は、可逆的に、調節可能な様式で結合を妨げられ得、それにより転写サイレンシングを「オフ」にし得る。例えば、ヒトＫｏｘ１（Ｔｈｉｅｓｅｎ，  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．  ２：  ３６３−３７４，  １９９０）からのＫＲＡＢドメインは、ＤＮＡ結合ラクトース（ｌａｃ）リプレッサータンパク質に融合されて、ｔｅｔ応答性プロモーターのすぐ近くに操作されたｌａｃオペレーター配列への可逆的な配列特異的結合を有するハイブリッド転写サイレンサーを形成し得る。この構成において、ｌａｃリプレッサー／ＫＲＡＢドメイン融合物（ｒＫＲ）の構成的な発現は、ｌａｃオペレーター配列への結合および誘導されていないｔｅｔ応答性プロモーターからの何らかの「漏出性の」基底転写の消去をもたらす。ベクター発現が所望され、そしてテトラサイクリンが系から除去される場合、ＩＰＴＧが添加されてｒＫＲ媒介性転写サイレンシングを防ぐ。
【００９４】
さらに、他のジンクフィンガータンパク質からのＫＲＡＢドメイン（例えば、ＺＮＦ１３３（Ｔｏｍｍｅｒｕｐら，  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２：  １５７１−１５７５，  １９９３）、ＺＮＦ９１（Ｂｅｌｌｅｆｒｏｉｄら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２：  １３６３−１３７４，  １９９３）、ＺＮＦ２（Ｒｏｓａｔｉら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：  ５６６１−５６６７，  １９９１））、ならびに他の移入可能なリプレッサードメイン（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｅｎまたはｅｖｅ遺伝子（ＪａｙｎｅｓおよびＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：  １４２７−１４３３，  １９９１；  ＨａｎおよびＭａｎｌｅｙ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ７：  ４９１−５０３，  １９９３）、ヒトジンクフィンガータンパク質ＹＹ１（Ｓｈｉら，  Ｃｅｌｌ  ６７：  ３７７−３８８，  １９９１）、ウィルムス腫瘍抑制タンパク質ＷＴ１（Ｍａｄｄｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：  １５５０−１５５３，  １９９１）、甲状腺ホルモンレセプター（Ｂａｎｉａｈｍａｄら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １１：  １０１５−１０２３，  １９９２）、レチノイン酸レセプター（Ｂａｎｉａｈｍａｄら，  同書）、Ｋｉｄ−１（Ｗｉｔｚｇａｌｌら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：  ４５１４−４５１８，  １９９４））は、本明細書に提供される遺伝子送達ビヒクルにおいて同様に容易に使用され得る。さらに、本システムのｌａｃリプレッサー／ｌａｃオペレーター成分は、他の供給源（例えば、トリプトファンおよびマルトースオペロン、またはＧＡＬ４）に由来する任意の数の他の調節可能な系により置換され得る。
【００９５】
Ｅ．組換えアルファウイルス粒子、ならびに「空の」トガウイルス粒子または非相同ウイルスＲＮＡを含有するトガウイルス粒子の作製および使用
本発明の別の局面では、真核生物標的細胞に感染し得るＲＮＡアルファウイルスベクターを含有する組換えアルファウイルス粒子の作製が記載される。簡略には、このような組換えアルファウイルス粒子は、一般に、本明細書中に記載されるような１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープ、およびＲＮＡベクターレプリコンを含む。
【００９６】
組換えアルファウイルスベクター粒子の作製方法は、例えば、相補するベクターとインビトロで転写されたＲＮＡに由来する欠陥ヘルパー（ＤＨ）分子あるいはプラスミドＤＮＡとの同時トランスフェクションにより、またはウイルスとの同時感染（Ｘｉｏｎｇら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：  １１８８−１１９１，  １９８９，  Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：  ６４３９−６４４６，  １９９３，  Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７０：  ５０８−５１９，  １９９６およびＤｕｂｅｎｓｋｙら，  Ｗ／Ｏ  ９５／０７９９４を参照のこと）により容易に達成され得る。
【００９７】
他の局面では、アルファウイルス由来パッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株から組換えアルファウイルスベクター粒子を作製するための方法が提供される。簡略には、このようなＰＣＬおよびそれらの安定に形質転換された構造タンパク質発現カセットは、Ｗ／Ｏ  ９５／０７９９４に記載される方法を用いて、または本発明に記載される新規な方法を用いて誘導され得る。例えば、ＰＣＬによる組換えアルファウイルスベクター粒子の生成は、望ましい特性を有するアルファウイルスに基づくベクター粒子のＰＣＬへの導入の後に達成され得る（実施例６を参照のこと）。このベクターは、インビトロで転写されたＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または以前に得られた組換えアルファウイルス粒子に由来する。なおさらなる実施例において、アルファウイルスベクタープロデューサー細胞株からの組換え粒子の生成が記載される（実施例７を参照のこと）。
【００９８】
他の実施態様では、ゲノムＲＮＡを含まない（すなわち、実質的にウイルスＲＮＡを含まない）またはＲＮＡベクターレプリコンを全く含まない、高力価の安定なトガウイルスキャプシド粒子を生成するための方法が提供される。本発明で利用されるように、ゲノムまたはＲＮＡベクターレプリコン核酸が「実質的にない」とは、３５Ｓメチオニン対３Ｈウリジンのウイルス粒子への取り込みの、（野生型と比較して）１０：１より大きな、そして好ましくは１５：１より大きな比をいうことが理解されるべきである（例えば、実施例８および図３８を参照のこと）。例えば、１つの実施態様において、空のキャプシド粒子（好ましくは脂質二重層および糖タンパク質相補体を有する）が、トガウイルス科から選択された病原性ウイルス（例えば、アルファウイルスまたはルビウイルス）から構築され、そして免疫原として使用されて野生型トガウイルスによる感染に対する防御免疫を確立する。空のウイルス粒子は、望ましい免疫原性代替物である。なぜなら、これらは、ウイルスを複製および生成することができないが、細胞性および体液性の両方の免疫応答を生じ得るからである。従って、実施例８により詳細に記載される方法を利用して、トガウイルスに由来する空のキャプシド粒子（脂質二重層および糖タンパク質相補体を有するかまたは有さない）が、広範な種々のトガウイルスから作製され得る。このトガウイルスは、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス（例えば、ＳＩＮ−１または野生型シンドビスウイルス）、ヴェネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、およびルビウイルス（例えば、風疹））を含むがこれらに限定されない。
【００９９】
第２の実施態様において、ゲノムウイルスＲＮＡに結合するペプチドをコードする異種ウイルスに由来する配列は、欠陥ヘルパー（ＤＨ）発現カセット中に、アルファウイルスキャプシド遺伝子のアミノ末端領域で挿入され得る。この遺伝子は、相同アルファウイルスゲノムＲＮＡに結合するタンパク質の領域をコードする配列が欠失している。例えば、ＢＨＫ細胞は、アルファウイルスレプリコンＲＮＡ、相同なウイルスゲノムＲＮＡ結合ペプチドをコードする配列を含むＤＨ  ＲＮＡ、および同じ異種ウイルス由来のレプリコンを用いてエレクトロポレーションされ得る。従って生成されるアルファウイルス粒子は、異種ウイルス由来のゲノムＲＮＡを含み、そしてアルファウイルスの宿主域向性を有する。１つの可能な例として、レトロウイルスＲＮＡ結合に必要とされるタンパク質をコードするｇａｇ配列は、ＤＨ発現カセット構築物内に含まれる。この構成において、得られるアルファウイルス粒子は、レトロウイルスベクターＲＮＡを含む。
【０１００】
Ｆ．異種配列
上記のように、本発明の遺伝子送達ビヒクルにより、広範な種々のヌクレオチド配列が担持および発現され得る。好ましくは、ヌクレオチド配列は、生存可能な（ｖｉａｂｌｅ）ウイルスの生成を可能にするのに十分なサイズであるべきである。本発明の状況では、組換えアルファウイルス粒子による任意の測定可能な力価（例えば、プラークアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、またはβ−ガラクトシダーゼアッセイによる）の感染性ウイルスの適切な感受性単層での生成またはＲＮＡもしくはＤＮＡベクターにより生成される異種遺伝子の検出可能なレベルの発現は、「生存可能なウイルスの生成」であると考えられる。これは最小の場合、さらなる異種配列を全く含有しないアルファウイルスベクター構築物であり得る。しかし他の実施態様において、ベクター構築物はさらなる異種配列または外来配列を含有し得る。好ましい実施態様において、異種配列は、少なくとも約１００塩基、２ｋｂ、３．５ｋｂ、５ｋｂ、７ｋｂの異種配列、または少なくとも約８ｋｂの異種配列さえも含み得る。
【０１０１】
本明細書中に提供される開示が与えられれば当業者には明らかなように、組換えアルファウイルス粒子のパッケージング効率、従ってウイルス力価は、ある程度パッケージングされるべき配列のサイズに依存する。従ってパッケージングの効率および生存可能なウイルスの生成を増大させるために、さらなる非コード配列をベクター構築物に付け加え得る。さらに本発明の特定の実施態様において、ウイルスの力価を増加または減少させることが所望され得る。この増加または減少は異種配列のサイズ、従ってパッケージングの効率を増加または減少させることにより達成され得る。
【０１０２】
上記で簡略に述べたように、本明細書中に記載される遺伝子送達ビヒクルには、例えばリンホカインまたはサイトカイン、トキシン、プロドラッグ変換酵素、免疫応答を刺激する抗原、リボザイム、増殖因子または調節因子のような治療的適用のためのタンパク質および免疫応答を補助または阻害するタンパク質のような緩和剤をコードする配列、ならびにアンチセンス配列（または「アンチセンス適用」のためのセンス配列）を含む広範な種々の異種配列が含まれ得る。さらに上記のように、本明細書中に提供される遺伝子送達ビヒクルは２つ以上の異種配列を含有（そして、特定の実施態様においては発現）し得る。
【０１０３】
１．リンホカイン
本発明の１つの実施態様において、異種配列はリンホカインをコードする。簡略には、リンホカインは、免疫エフェクター細胞を増殖、活性化または分化するように作用する。リンホカインの代表例としては、γインターフェロン、腫瘍壊死因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、  ＣＳＦ−１、およびＧ−ＣＳＦ  が挙げられる。
【０１０４】
本発明の関連する実施態様において、異種配列は免疫制御性補助因子をコードする。簡略には、本発明の状況で利用される「免疫制御性補助因子」は、免疫応答に関与する１つ以上の細胞により産生される場合、または細胞に外から加えられる場合、その補助因子の非存在下で生じた免疫応答とは質または強さにおいて異なる免疫応答を引き起こす因子をいう。応答の質または強さは、当業者に公知の種々のアッセイにより測定し得、これには例えば、細胞の増殖を測定するインビトロアッセイ（例えば、３Ｈチミジンの取り込み）、およびインビトロ細胞傷害性アッセイ（例えば、５１Ｃｒ放出を測定するもの）（Ｗａｒｎｅｒら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ７  ：  ６４５−６５５，  １９９１を参照のこと）  がある。
【０１０５】
免疫制御性補助因子の代表例は、αインターフェロン（Ｆｉｎｔｅｒら、Ｄｒｕｇｓ  ４２  （５）  ：  ７４９−７６５，  １９９１；米国特許第４，８９２，７４３号；米国特許第４，９６６，８４３号；ＷＯ  ８５／０２８６２  ；  Ｎａｇａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８４  ：  ３１６−３２０，  １９８０  ；  Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．  ７８  ：  ３８７−３９４，  １９８１  ；  Ｔｗｕら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６  ：  ２０４６−２０５０，  １９８９  ；  Ｆａｋｔｏｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５  ：  ８６７−８７２，  １９９０）  、βインターフェロン（Ｓｅｉｆら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５  ：  ６６４−６７１，  １９９１）  、γインターフェロン（Ｒａｄｆｏｒｄら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈａｐａｔｏｌｏｇｙ  ：  ２００８−２０１５，  １９９１  ；  Ｗａｔａｎａｂｅら、ＰＮＡＳ  ８６  ：  ９４５６−９４６０，  １９８９  ；  Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０  ：  ７８２０−７８２５，  １９９０  ；  Ｍａｉｏら、Ｃａｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ３０  ：  ３４−４２，  １９８９；米国特許第４，７６２，７９１号および同第４，７２７，１３８号）、Ｇ−ＣＳＦ（米国特許第４，９９９，２９１号および同第４，８１０，６４３号）、ＧＭ−ＣＳＦ  （ＷＯ  ８５／０４１８８）  、ＴＮＦ  （Ｊａｙａｒａｍａｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４４  ：  ９４２−９５１，  １９９０）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｋａｒｕｐｉａｈら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４４  ：  ２９０−２９８，  １９９０  ；  Ｗｅｂｅｒら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６６  ：  １７１６−１７３３，  １９８７  ；  Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７２  ：  １２１７−１２２４，  １９９０；米国特許第４，７３８，９２７号）、ＩＬ−４（Ｔｅｐｐｅｒら、Ｃｅｌｌ  ５７  ：  ５０３−５１２，  １９８９  ；  Ｇｏｌｕｍｂｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４  ：  ７１３−７１６，  １９９１  ；  米国特許第５，０１７，６９１号）、ＩＬ−６（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３９  ：  ４１１６−４１２１，  １９８７  ；  ＷＯ  ９０／０６３７０）  、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６５−９６８，  １９９４；Ｇｅｎｂａｎｋ−ＥＭＢＬ  登録番号ＶＯ３０９９）、ＩＣＡＭ−１（Ａｌｔｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３８  ：  ５１２−５１４，  １９８９）  、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、β２  −ミクログロブリン、シャペロン  、ＣＤ３、  Ｂ７／ＢＢ１、ＭＨＣ結合トランスポータータンパク質またはこれらのアナログを含む。
【０１０６】
アルファウイルスベクター構築物中にどの免疫制御性補助因子を含めるかの選択は、補助因子の公知の治療効果に基づき得るか、または実験的に決定され得る。例えば、慢性Ｂ型肝炎感染では、患者の免疫不全を補い、そしてそれゆえ、疾患からの回復を助けるのに、αインターフェロンが有効であることが見出されている。あるいは適切な免疫制御性補助因子を実験的に決定し得る。簡略には、肝疾患の患者からまず血液サンプルを採取する。自己細胞またはＨＬＡ適合細胞（例えば、ＥＢＶ形質転換細胞）でインビトロで末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を再刺激し、そして肝炎抗原の免疫原性部分および免疫制御性補助因子の発現を指向するアルファウイルスベクター構築物で形質導入する。ＨＬＡ適合形質導入細胞を標的として用いて、刺激したＰＢＬをＣＴＬアッセイにおけるエフェクターとして使用する。ＨＬＡ適合刺激物質および抗原のみをコードするベクターで形質導入した標的細胞を用いて行った同じアッセイで見られるＣＴＬ応答の増加は、有用な免疫制御性補助因子を示す。本発明の１つの実施態様において、免疫制御性補助因子であるγインターフェロンが特に好ましい。
【０１０７】
免疫制御性補助因子の別の例は、Ｂ７／ＢＢ１補助刺激因子である。簡略には、Ｔ細胞の完全な機能活性の活性化には２つのシグナルが必要である。第１のシグナルは抗原特異的Ｔ細胞レセプターと主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとの相互作用により提供され、そして第２のシグナル（補助刺激と呼ぶ）は抗原提示細胞によりＴ細胞に送達される。第２のシグナルはＴ細胞によるインターロイキン−２（ＩＬ−２）生成に必要であり、そして抗原提示細胞上のＢ７／ＢＢ１分子と、Ｔリンパ球上のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４レセプターとの相互作用に関与しているようである（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７３  ：  ７２１−７３０，  １９９１ａ、およびＪ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７４  ：  ５６１−５７０，  １９９１）。本発明の１つの実施態様において、Ｂ７／ＢＢ１は  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の補助刺激を起こすために腫瘍細胞に導入され得、その結果ＣＤ８＋  Ｔ細胞は拡張し十分活性化するために十分なＩＬ−２を生成する。これらのＣＤ８＋  Ｔ細胞は、さらなるＣＴＬ機能のために補助刺激がもはや必要ではないため、Ｂ７を発現していない腫瘍細胞を殺傷し得る。補助刺激性Ｂ７／ＢＢ１因子および例えば免疫原性ＨＢＶコアタンパク質の両方を発現するベクターは、本明細書に記載した方法を利用して作製され得る。これらのベクターで形質導入された細胞は、より有効な抗原提示細胞となる。ＨＢＶコア特異的ＣＴＬ応答は、補助刺激性リガンドＢ７／ＢＢ１を介して、十分に活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞により増強される。
【０１０８】
２．トキシン
本発明の別の実施態様において、異種配列はトキシンをコードする。簡略には、トキシンは細胞の増殖を直接阻害するように作用する。トキシンの代表例は、リシン（Ｌａｍｂら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４８  ：  ２６５−２７０，  １９８５）  、アブリン  （Ｗｏｏｄら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８  ：  ７２３−７３２，  １９９１  ；  Ｅｖｅｎｓｅｎら、Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６  ：  ６８４８−６８５２，  １９９１  ；  Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５  ：  ８６６５−８６６９，  １９９０  ；  Ｃｈｅｎら、Ｆｅｄ．  ｏｆ  Ｅｕｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  ３０９  ：  １１５−１１８，  １９９２）、ジフテリアトキシン（Ｔｗｅｔｅｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０  ：  １０３９２−１０３９４，  １９８５）  、コレラトキシン（Ｍｅｋａｌａｎｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０６  ：  ５５１−５５７，  １９８３  ；  Ｓａｎｃｈｅｚ  およびＨｏｌｍｇｒｅｎ，  ＰＮＡＳ  ８６  ：  ４８１−４８５，  １９８９）  ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）  （Ｓｔｉｒｐｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５  ：  ６９４７−６９５３，  １９８０）  、アメリカヤマゴボウ（Ｉｒｖｉｎ，  Ｐｈａｒｍａｃ．  Ｔｈｅｒ．  ２１  ：  ３７１−３８７，  １９８３）  、抗ウイルスタンパク質（Ｂａｒｂｉｅｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２０３  ：  ５５−５９，  １９８２  ；  Ｉｒｖｉｎら、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２００  ：  ４１８−４２５，  １９８０  ；  Ｉｒｖｉｎ，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  １６９  ：  ５２２−５２８，  １９７５）  、トリチン（ｔｒｉｔｉｎ）  、赤痢菌トキシン（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄら、ＰＮＡＳ  ８４  ：  ４３６４−４３６８，  １９８７  ；  Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｐａｔｈ．  ２  ：  １４７−１５３，  １９８７）、シュードモナス外毒素Ａ（Ｃａｒｒｏｌｌ  および  Ｃｏｌｌｉｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２  ：  ８７０７−８７１１，  １９８７）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）  （Ｆｉｅｌｄら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４９  ：  １１５−１２４，  １９８０）、およびＥ．ｃｏｌｉ．グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを含む。
【０１０９】
３．プロドラッグ変換酵素
本発明の他の実施態様において、異種配列はプロドラッグ変換酵素をコードする。簡略には、本発明の状況で利用されるプロドラッグ変換酵素とは、ほとんどまたは全く細胞傷害性のない化合物を毒性産物（プロドラッグ）に活性化する遺伝子産物を意味する。このような遺伝子産物の代表例は、ＨＳＶＴＫおよびＶＺＶＴＫ（ならびにそれらのアナログおよび誘導体）を含み、これらは特定のプリンアラビノシドおよび置換ピリミジン化合物を選択的にモノリン酸化して、これらを細胞傷害性または細胞増殖抑制代謝物に変換する。さらに詳しくは、薬物であるガンシクロビル、アシクロビルまたはそれらの任意のアナログ（例えば、ＦＩＡＵ、ＦＩＡＣ、ＤＨＰＧ）  のＨＳＶＴＫへの曝露は、この薬物を対応する活性ヌクレオチド三リン酸形態にリン酸化する。
【０１１０】
本発明の状況でまた使用され得る他のプロドラッグ変換酵素の代表例は：Ｅ．ｃｏｌｉグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（これはチオキサンチンを毒性のあるチオキサンチン一リン酸に変換する）（Ｂｅｓｎａｒｄら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７  ：  ４１３９−４１４１，  １９８７）  ；アルカリホスファターゼ（これは不活性なリン酸化化合物（例えば、マイトマイシンリン酸およびドキソルビシンリン酸）を毒性の脱リン酸化化合物に変換する）；真菌性（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）または細菌性のシトシンデアミナーゼ（これは５−フルオロシトシンを毒性の化合物５−フルオロウラシルに変換する）（Ｍｕｌｌｅｎ，  ＰＮＡＳ  ８９  ：  ３３，  １９９２）  ；  カルボキシペプチダーゼＧ２（これはパラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノベンゾイルグルタミン酸からグルタミン酸を切断して、それにより毒性の安息香酸マスタードをつくり出す）；およびペニシリン−Ｖアミダーゼ（これはドキソルビシンおよびメルファランのフェノキシアセトアビド誘導体を毒性化合物に変換する）（一般的には、Ｖｒｕｄｈｕｌａら、Ｊ．  ｏｆ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３６  （７）  ：  ９１９−９２３，  １９９３  ；  Ｋｅｒｎら、Ｃａｎｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ３１  （４）  ：  ２０２−２０６，  １９９０を参照のこと）を含む。
【０１１１】
４．アンチセンス配列
本発明の別の実施態様において、異種配列はアンチセンス配列である。簡略には、アンチセンス配列はＲＮＡ転写産物に結合するように設計され、これにより特定のタンパク質の細胞性合成を防止するか、または細胞によるこのＲＮＡ配列の使用を防止する。このような配列の代表例は、アンチセンスチミジンキナーゼ、アンチセンスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭａｈｅｒおよびＤｏｌｎｉｃｋ、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２５３  ：  ２１４−２２０，  １９８７  ；  Ｂｚｉｋら、ＰＮＡＳ  ８４  ：  ８３６０−８３６４，  １９８７）、アンチセンスＨＥＲ２（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０  ：  １１３２−１１３９，  １９８５）、アンチセンスＡＢＬ  （Ｆａｉｎｓｔｅｉｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４  ：  １４７７−１４８１，  １９８９）  、アンチセンスＭｙｃ  （Ｓｔａｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１０  ：  ４２３−４２５，  １９８４）  およびアンチセンスｒａｓ、ならびに任意の細胞周期シグナル伝達成分（例えば、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン依存性阻害剤）またはヌクレオチド生合成経路の任意の酵素をブロックするアンチセンス配列を含む。さらに本発明の他の実施態様において、インターフェロンおよび２ミクログロブリンに対するアンチセンス配列は、免疫応答を減少させるために利用され得る。
【０１１２】
さらに、本発明のさらなる実施態様において、アンチセンスＲＮＡは強力なクラスＩ制限応答を誘導するために抗腫瘍剤として利用され得る。簡略には、ＲＮＡへ結合すること、そしてこれにより特異的ｍＲＮＡの翻訳を防止することに加え、高レベルの特異的アンチセンス配列が多量の２本鎖ＲＮＡの形成によりインターフェロン（γ−インターフェロンを含む）の発現の増加を誘導すると考えられる。γ−インターフェロンの発現の増加は、次いでＭＨＣクラスＩ抗原の発現を増強する。これに関する使用に好ましいアンチセンス配列は、アクチンＲＮＡ、ミオシンＲＮＡ、およびヒストンＲＮＡを含む。アクチンＲＮＡとミスマッチを形成するアンチセンスＲＮＡは特に好ましい。
【０１１３】
５．リボザイム
本発明の他の局面において、宿主細胞の感染によりリボザイムを生成する遺伝子送達ビヒクルが提供される。簡略には、リボザイムは特異的ＲＮＡを切断するために使用され、そして１つの特異的ＲＮＡ配列のみに作用し得るように設計される。一般的には、リボザイムの基質結合配列は１０〜２０ヌクレオチド長である。この配列の長さは、標的ＲＮＡとハイブリダイズし、そして切断されたＲＮＡからリボザイムを解離するのを可能にするのに十分である。
【０１１４】
本発明の状況では、広範な種々のリボザイムが利用され得る。これらのリボザイムは、例えば、グループＩイントロンリボザイム（Ｃｅｃｈら，  米国特許第４，９８７，０７１号）；ヘアピンリボザイム（Ｈａｍｐｅｌら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：  ２９９−３０４，  １９９０，  米国特許第５，２５４，６７８号および欧州特許公開第０  ３６０  ２５７）、ハンマーヘッドリボザイム（Ｒｏｓｓｉ，  Ｊ．Ｊ．ら，  Ｐｈａｒｍａｃ．  Ｔｈｅｒ．  ５０：  ２４５−２５４，  １９９１；  ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ，  Ｃｅｌｌ  ４８：  ２１１−２２０，  １９８７；  ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：  ５９６−６００，  １９８８；  ＷａｌｂｏｔおよびＢｒｕｅｎｉｎｇ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：  １９６，  １９８８；  ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：  ５８５，  １９８８）、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム（ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３１：  １６，  １９９２）；ＲＮａｓｅ  Ｐリボザイム（Ｔａｋａｄａら，  Ｃｅｌｌ  ３５：  ８４９，  １９８３）；ならびに他のタイプのリボザイム（例えば、ＷＯ  ９５／２９２４１、およびＷＯ  ９５／３１５５１を参照のこと）を含む。リボザイムのさらなる例は、米国特許第５，１１６，７４２号、同第５，２２５，３３７号、および同第５，２４６，９２１号に記載されるものを含む。
【０１１５】
６．タンパク質および他の細胞構成成分
本発明の他の局面において、広範な種々のタンパク質または他の細胞構成成分が本明細書中に提供される遺伝子送達ビヒクルに担持および／または発現され得る。このようなタンパク質の代表例は、例えばウイルス、細菌、寄生体、または真菌中に見いだされる、天然のまたは改変された細胞成分、ならびに外来タンパク質または細胞構成成分を含む。
【０１１６】
ａ．改変された細胞成分
１つの実施態様において、免疫原性で非ガン原性の、改変された細胞成分の発現を指向する遺伝子送達ビヒクルが提供される（例えば、ＷＯ  ９３／１０８１４を参照のこと）。本明細書において利用される場合、用語「免疫原性」とは、適切な条件下で免疫応答を引き起こし得る改変された細胞成分をいう。この応答は細胞媒介性でなければならず、そして体液性応答もまた含み得る。用語「非ガン原性」とは、ヌードマウスにおいて細胞形質転換を引き起こさないかまたはガン形成を誘導しない、改変された細胞成分をいう。用語「改変された細胞成分」とは、細胞をガン原性にすることに関連するか、またはガン原性細胞に一般に関連するが細胞をガン原性にすることに必要でも必須でもないタンパク質および他の細胞構成成分をいう。
【０１１７】
簡略には、改変の前に、細胞成分は、正常な細胞の増殖および調節に必須であり得、そして、例えば、細胞内タンパク質分解、転写調節、細胞周期の制御、および細胞−細胞相互作用を調節するタンパク質を含む。改変後には細胞成分はもはやそれらの調節機能を果たさず、従って細胞は調節されない増殖を経験し得る。改変された細胞成分の代表例は、  ｒａｓ＊  ，  ｐ５３＊  ，Ｒｂ＊  、ウィルムス腫瘍遺伝子（Ｗｉｌｍｓ’  ｔｕｍｏｒ  ｇｅｎｅ）によりコードされる改変されたタンパク質、ユビキチン＊  、ムチン＊  、ＤＣＣ、ＡＰＣ、およびＭＣＣ遺伝子によりコードされるタンパク質、乳ガン遺伝子  ＢＲＣＡ１＊  、ならびにレセプターまたはレセプター様構造（例えば、ｎｅｕ、甲状腺ホルモンレセプター、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプター、インスリンレセプター、上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプター、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）レセプター）を含む。
【０１１８】
改変された細胞成分をコードする配列がいったん得られたら、この配列が非ガン原性タンパク質をコードすることを確実にすることが必要である。特定の細胞成分のガン原性を評価する種々のアッセイが公知であり、そして容易に達成され得る。代表的アッセイには、ラット線維芽細胞アッセイ、ヌードマウスまたはラットにおける腫瘍形成、軟寒天中のコロニー形成、およびトランスジェニック動物（例えばトランスジェニックマウス）の調製が含まれる。
【０１１９】
ヌードマウスまたはラットにおける腫瘍形成は、特定の細胞成分のガン原性を決定するのに特に重要でかつ高感度な方法である。ヌードマウスは機能的な細胞免疫系が欠如しており（すなわち、ＣＴＬを有さない）、従って細胞のガン原性の可能性を試験するのに有用なインビボのモデルを提供する。正常な非ガン原性細胞は、ヌードマウス中に感染させた場合に制御されない増殖特性を示さない。しかし形質転換した細胞はヌードマウス中で急速に増殖し、そして腫瘍を発生させる。簡略には、１つの実施態様において、アルファウイルスベクター構築物は同系のマウスの細胞に投与され、次にヌードマウスに注射される。腫瘍の増殖を決定するために注射後２〜８週間の間、マウスを肉眼で観察する。また腫瘍が存在するか否かを決定するために、マウスを屠殺し剖検し得る（Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａら、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ４８  ：  １５３１−１５３３，  １９７２  ；  Ｆｕｒｅｓｚら、Ａｂｎｏｒｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｎｅｗ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｒｉｓｋ，  ＨｏｐｐｓおよびＰｅｔｒｉｃｃｉａｎｉ編、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  １９８５；およびＬｅｖｅｎｂｏｏｋら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｔｄ．  １３  ：  １３５−１４１，  １９８５）  。
【０１２０】
ガン原性はまた軟寒天中のコロニー形成を目視することによっても評価され得る（ＭａｃｐｈｅｒｓｏｎおよびＭｏｎｔａｇｎｉｅｒ，  Ｖｉｒｏｌ．  ２３  ：  ２９１−２９４，  １９６４）。簡略には、正常な非ガン原性細胞の１つの性質は「接触阻害」である（すなわち、細胞は隣接する細胞に接触するとその増殖を止める）。細胞を半固体寒天支持培地中にプレーティングすると、正常な細胞はすぐ接触阻害を受けて増殖を止めるが、ガン原性細胞は増殖し続けて軟寒天中でコロニーを形成する。
【０１２１】
改変された細胞成分が細胞をガン原性にすることに関係しているならば、改変された細胞成分を非ガン原性にすることが必要である。例えば１つの実施態様において、改変された細胞成分をコードする目的の配列または遺伝子は、遺伝子産物を非ガン原性にするために端が切り取られる。改変された細胞成分をコードする遺伝子は種々のサイズに切り取られ得るが、改変された細胞成分をできるだけ多く保持することが好ましい。さらに切り取りが行われても、改変された細胞成分の免疫原性配列の少なくともいくつかは無傷であることが必要である。あるいは複数の翻訳終結コドンが免疫原性領域の下流に導入され得る。終結コドンの挿入によりタンパク質発現が早期に終結され、こうしてタンパク質の形質転換部分の発現を防止する。
【０１２２】
上記のように、適切な免疫応答を発生させるために、変化した細胞成分はまた免疫原性でなければならない。Ｔ細胞のエピトープはしばしば免疫原性で両親媒性のα−ヘリックス成分を有するが、特定の配列の免疫原性はしばしば予測することが難しい。しかし、一般に、免疫原性はアッセイにより決めることが好ましい。代表的なアッセイは、新規に導入したベクターに対する抗体の存在を検出するＥＬＩＳＡ  、ならびにγインターフェロンアッセイ、ＩＬ−２生成アッセイ、および増殖アッセイのようにＴヘルパー細胞を試験するアッセイを含む。
【０１２３】
上記のように、本発明の別の局面において、一般的な抗ガン治療物を形成するために、いくつかの異なる改変された細胞成分が同時発現され得る。一般に、種々の組合せがなされ得ることは当業者には明らかである。好適な実施態様では、この治療物は特定のタイプのガンを標的とし得る。例えば、ほとんどすべての大腸ガンは、ｒａｓ、ｐ５３、ＤＣＣ、ＡＰＣまたはＭＣＣ遺伝子に変異を有する。これらの多数の改変された細胞成分を同時発現するアルファウイルスベクター構築物が、すべての可能な変異を処置するために大腸ガン患者に投与され得る。この方法はまた、他のガンを処置するためにも利用され得る。従って、ムチン＊、ｒａｓ＊、ｎｅｕ、ＢＲＣＡ１＊、およびｐ５３＊を同時発現するアルファウイルスベクター構築物は、乳ガンを処置するために利用され得る。
【０１２４】
ｂ．外来生物または他の病原性物質からの抗原
本発明の他の局面において、外来生物または他の病原性物質からの抗原の免疫原性部分の発現を指向するベクターが提供される。このような抗原の代表例は、細菌性抗原（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、マイコバクテリウムなど）、真菌性抗原、寄生体抗原、およびウイルス抗原（例えば、インフルエンザウイルス、ネコ白血病ウイルス（「ＦｅＬＶ」）、ネコ免疫不全症ウイルス（「ＦＩＶ」）またはヒト免疫不全症ウイルス（「ＨＩＶ」）のような免疫不全症ウイルス、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型肝炎ウイルス（それぞれ、「ＨＡＶ」、「ＨＢＶ」、および「ＨＣＶ」）、ヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）、エプスタインバーウイルス（「ＥＢＶ」）、単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）、ハンタウイルス、ＴＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩＩおよびサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）を含む。本発明の状況で利用される場合、「免疫原性部分」とは、適切な条件下で免疫応答（すなわち、細胞性または体液性）を引き起こし得る各抗原の部分をいう。「部分」とは種々のサイズであり得るが、好ましくは少なくとも９アミノ酸の長さであり、そして抗原全体を含み得る。細胞媒介性免疫応答は、主要組織適合性遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）クラスＩの提示、ＭＨＣクラスＩＩの提示、またはその両方を介して媒介され得る。
【０１２５】
本発明の１つの局面において、Ｂ型肝炎抗原の免疫原性部分（例えば、ＷＯ  ９３／１５２０７を参照のこと）の発現を指向するアルファウイルスベクター構築物が提供される。簡略にはＢ型肝炎のゲノムは、約  ３．２キロベースの長さの環状ＤＮＡで構成され、そしてよく特徴付けられている（Ｔｉｏｌｌａｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１３  ：  ４０６−４１１，  １９８１  ；  Ｔｉｏｌｌａｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１７  ：  ４８９−４９５，  １９８５；およびＧａｎｅｍおよびＶａｒｍｕｓ、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５６  ：  ６５１−６９３，  １９８７  ；  ＥＰ  ０  ２７８，９４０、ＥＰ  ０  ２４１，０２１、ＷＯ  ８８／１０３０１  、ならびに米国特許第４，６９６，８９８号および同第５，０２４，９３８号も参照のこと、これらは参考として本明細書中に援用される）。Ｂ型肝炎ウイルスは数個の異なる抗原を示し、これらは特に、３つのＨＢ「Ｓ」抗原（ＨＢｓＡｇ）（ＨＢｃ抗原（ＨＢｃＡｇ）、ＨＢｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、およびＨＢｘ抗原（ＨＢｘＡｇ））を含む（Ｂｌｕｍら、ＴＩＧ  ５  （５）  ：  １５４−１５８，  １９８９  を参照のこと）。簡略には、ＨＢｅＡｇはＰ２２プレコア中間体のタンパク質分解切断により得られ、そして細胞から分泌される。ＨＢｅＡｇは血清中に１７ｋＤタンパク質として見出される。ＨＢｃＡｇは１８３アミノ酸のタンパク質であり、ＨＢｘＡｇはサブタイプにより異なるが、  １４５〜１５４アミノ酸のタンパク質である。
【０１２６】
ＨＢｓＡｇ（「大」、「中」、および「小」と呼ぶ）はＢ型肝炎ウイルスゲノムの３つの領域によりコードされる：Ｓ、プレ−Ｓ２およびプレ−Ｓ１。３８９〜４００アミノ酸の様々な長さを有する大タンパク質はプレ−Ｓ１、プレ−Ｓ２、およびＳ領域によりコードされ、そしてグリコシル化および非グリコシル化形態で見いだされる。中タンパク質は２８１アミノ酸の長さであり、そしてプレ−Ｓ２およびＳ領域によりコードされる。小タンパク質は２２６アミノ酸の長さであり、そしてＳ領域によりコードされる。これは２つの形態（グリコシル化（ＧＰ２７Ｓ）および非グリコシル化（Ｐ２４Ｓ））で存在する  。これらのそれぞれの領域が別々に発現されると、プレ−Ｓ１領域は約１１９アミノ酸のタンパク質をコードし、プレ−Ｓ２領域は約５５アミノ酸のタンパク質をコードし、そしてＳ領域は約２２６アミノ酸のタンパク質をコードする。
【０１２７】
当業者には明らかなように、本明細書中に記載のアルファウイルスベクター構築物の１つにより投与された場合に免疫応答を誘導するために、上記のＳ抗原の種々の免疫原性部分を組合せ得る。さらに、ＨＢＶのＳオープンリーディングフレームについて様々な地域で見いだされる大きな免疫学的多様性のために、特定の地域での投与のために特定の組合せの抗原が好適であり得る。
【０１２８】
ＨＢＶにより示されるものはまた、ｐｏｌ（「ＨＢＶ  ｐｏｌ  」）、ＯＲＦ５、およびＯＲＦ６抗原である。簡略には、ＨＢＶのポリメラーゼオープンリーディングフレームは、感染した肝臓のビリオンおよびコア様粒子に見いだされる逆転写酵素活性をコードする。ポリメラーゼタンパク質は少なくとも２つのドメインよりなる：逆転写を開始するタンパク質をコードするアミノ末端ドメイン、ならびに逆転写酵素およびＲＮａｓｅ  Ｈ活性をコードするカルボキシル末端ドメイン。ＨＢＶ  ｐｏｌの免疫原性部分は、本明細書に記載の方法を利用して、下記のアルファウイルスベクター構築物を利用して決定され得、そして温血動物中に免疫応答を発生させるために投与され得る。同様にＯＲＦ５およびＯＲＦ６（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ９  ：  ３２２−３２７，  １９８９）  のような他のＨＢＶ抗原が、本明細書に記載のようなアルファウイルスベクター構築物を利用して発現され得る。
【０１２９】
上記のように、Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分が、遺伝子送達ビヒクル中に取り込まれる。遺伝子送達ビヒクルに取り込まれる免疫原性部分（単数または複数）は種々の長さであり得るが、一般的にはこの部分は少なくとも９アミノ酸の長さであることが好ましく、そして抗原全体を含み得る。特定の配列の免疫原性を予測することはしばしば困難であるが、Ｔ細胞のエピトープは、潜在的なＴヘルパー部位およびＣＴＬ部位のコード領域をスキャンするために、ＴＳＩＴＥＳ  （ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  、Ｍａｒｙｌａｎｄ）のようなコンピューターアルゴリズムを利用して予測され得る。この解析から、ペプチドが合成され、そしてインビトロの細胞傷害性アッセイで標的として使用される。しかし、他のアッセイもまた利用され得、例えば、新規に導入したベクターに対する抗体の存在を検出するＥＬＩＳＡ  、ならびにγインターフェロンアッセイ、ＩＬ−２生成アッセイ、および増殖アッセイのようなＴヘルパー細胞を試験するアッセイを含む。
【０１３０】
免疫原性部分はまた他の方法により選択され得る。例えば、ＨＬＡ  Ａ２．１トランスジェニックマウスは、ウイルス抗原のヒトＴ細胞認識のモデルとして有用であることが示されている。簡略にはインフルエンザウイルス系およびＢ型肝炎ウイルス系では、マウスのＴ細胞レセプターレパートリーがヒトＴ細胞により認識される抗原決定基と同じものを認識する。両方の系において、ＨＬＡ  Ａ２．１トランスジェニックマウスにおいて生じるＣＴＬ応答は、ヒトＣＴＬのＨＬＡ  Ａ２．１ハプロタイプにより認識されるエピトープと事実上同じエピトープを指向する（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７３  ：  １００７−１０１５，  １９９１  ；  Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ，  １９９２）。アルファウイルスベクター構築物への組み込みに特に好ましい免疫原性部分は、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｇ、およびＨＢｓＡｇを含む。Ｂ型肝炎ウイルスのさらなる免疫原性部分は、コード配列を種々の位置（例えば、以下の部位を含む：Ｂｓｔ  ＵＩ、Ｓｓｐ  Ｉ、ＰｐｕＭ１、および  ＭｓｐＩ）で切り取ることにより得られ得る（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８０  ：  ８１５−１９，  １９７９  ；  Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、Ａｎｉｍａｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ：  ＩＣＮ／ＵＣＬＡ  Ｓｙｍｐ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １９８０，  Ｂ．  Ｎ．  ＦｉｅｌｄｓおよびＲ．  Ｊａｅｎｉｓｃｈ（編）、  ５７〜７０頁，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ）  。
【０１３１】
上記のように、遺伝子送達ビヒクルには１つより多くの免疫原性部分が組み込まれ得る。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｘＡｇのすべてまたは免疫原性部分、ならびにＨＣＶ抗原の免疫原性部分を（別々に、または１つの構築物として）発現し得る。
【０１３２】
７．異種配列の供給源
上記のタンパク質をコードする配列は、種々の供給源（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ  、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）のような寄託機関、またはＢｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  （Ｃｏｗｌｅｙ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）のような商業的供給源を含む）から容易に得られ得る。代表例は、ＢＢＧ１２  （１２７アミノ酸の成熟タンパク質をコードするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含有する）；ＢＢＧ６（γインターフェロンをコードする配列を含有する）；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３９６５６  （ＴＮＦをコードする配列を含有する）；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０６６３（αインターフェロンをコードする配列を含有する）；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１９０２およびＮｏ．３９５１７（βインターフェロンをコードする配列を含有する）；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６７０２４（インターロイキン−１ｂをコードする配列を含有する）；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３９４０５、Ｎｏ．３９４５２、Ｎｏ．３９５１６、Ｎｏ．３９６２６、およびＮｏ．３９６７３（インターロイキン−２をコードする配列を含有する）；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５９３９９、Ｎｏ．５９３９８、およびＮｏ．６７３２６（インターロイキン−３をコードする配列を含有する）；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５７５９２（インターロイキン−４をコードする配列を含有する）；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５９３９４およびＮｏ．５９３９５（インターロイキン−５をコードする配列を含有する）；ならびにＡＴＣＣ  Ｎｏ．６７１５３（インターロイキン−６をコードする配列を含有する）を含む。
【０１３３】
上記のような改変された細胞成分をコードする配列は、種々の供給源から容易に得られ得る。例えば、改変された細胞産物をコードする配列を含むプラスミドは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）のような寄託機関、またはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）のような商業的供給源から得られ得る。上記の配列のいくつかを含むプラスミドの代表例は、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４１０００  （ｒａｓの１２番目のコドンにＧからＴへの変異を含む）、およびＡＴＣＣ  Ｎｏ．４１０４９  （１２番目のコドンにＧからＡへの変異を含む）を含む。
【０１３４】
あるいは、正常な細胞成分をコードするプラスミドはまた、ＡＴＣＣのような寄託機関から得られ得（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４１００１（正常なｒａｓタンパク質をコードする配列を含む）；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５７１０３（ａｂｌをコードする）；およびＡＴＣＣ  Ｎｏ．５９１２０またはＮｏ．５９１２１（ｂｃｒ遺伝子座をコードする）を参照のこと）、そして改変された細胞成分を形成するために変異され得る。特定の部位を変異誘発する方法は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、１５．３以下を参照のこと）を用いて容易に達成され得る。特に、ｒａｓのような正常な細胞成分の点変異は、特定のコドン（例えば、コドン１２、１３、または６１）の部位特異的変異誘発により容易に達成され得る。
【０１３５】
上記のウイルス抗原をコードする配列も同様に種々の供給源から得られ得る。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスをコードする分子的にクローン化したゲノムは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）のような供給源から得られ得る。例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４５０２０は、ｐＢＲ３２２  （Ｍｏｒｉａｒｔｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８  ：  ２６０６−２６１０，  １９８１）のＢａｍＨＩ部位にＢ型肝炎の全ゲノムＤＮＡ（精製したＤａｎｅ粒子から抽出された）（Ｂｌｕｍら、ＴＩＧ  ５  （５）  ：  １５４−１５８，  １９８９  の図３を参照のこと）を含む。
【０１３６】
あるいは、上記の異種配列をコードするｃＤＮＡ配列は、配列を発現または含有する細胞から得られ得る。簡略には、１つの実施態様において、目的の遺伝子を発現する細胞由来のｍＲＮＡは、オリゴヌクレオチドｄＴまたはランダムプライマーを用いて逆転写酵素により逆転写される。次いでこの１本鎖ｃＤＮＡを、所望の配列のいずれかの側の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用してＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号；同第４，６８３，１９５号および同第４，８００，１５９号を参照のこと。ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｅｒｌｉｃｈ（編）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９も参照のこと）により増幅し得る。特に、２本鎖ＤＮＡは、熱安定性Ｔａｑポリメラーゼ、配列特異的ＤＮＡプライマー、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの存在下で加熱することにより変性される。合成が完了すると２本鎖ＤＮＡが生成される。このサイクルは何回も繰り返し得、所望のＤＮＡの何乗倍もの増幅がもたらされる。
【０１３７】
上記のタンパク質をコードする配列はまた、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．  のＤＮＡ合成機（例えば、ＡＰＢ  ＤＮＡ合成機モデル３９２（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ））で合成され得る。
【０１３８】
Ｇ．アルファウイルスパッケージング細胞株／プロデューサー細胞株
本発明のさらなる局面では、アルファウイルスパッケージング細胞株およびプロデューサー細胞株が提供される。詳細には、本発明の１つの局面において、アルファウイルスパッケージング細胞株を提供する。ここで、ウイルス構造タンパク質は１つ以上の安定に形質転換された発現ベクターからトランスで供給され、そしてトランスフェクトされ、形質導入され、または細胞内に生成されたベクターＲＮＡ転写産物を細胞質においてキャプシド化し得、そして細胞膜を通して感染性パッケージ化ベクター粒子を放出し得る。好ましい実施態様において、パッケージングに必要な構造タンパク質は、ＲＮＡベクターレプリコン自身または提供される他の何らかの刺激により誘導された後にのみ高レベルで合成され、そしてこれらの構造タンパク質をコードする転写産物は、天然のウイルス感染の発現レベルを模倣するに十分な発現レベルを可能にする様式で細胞質で増幅し得る。さらに、他の実施態様において、選択マーカーの発現は、構造タンパク質発現カセットに作動可能に連結される。このような連結された選択マーカーは、機能的で安定に形質転換されたＰＣＬの効率的な生成を可能にする。
【０１３９】
例えば、パッケージングされる所望の表現型のアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン分子は、それ自身細胞の細胞質において自己触媒複製し得、インビトロ転写されたＲＮＡ、組換えアルファウイルス粒子、またはアルファウイルスｃＤＮＡベクター構築物としてパッケージング細胞中に導入され得る。次いで、ＲＮＡベクター転写産物は、高レベルまで複製して、構造タンパク質遺伝子転写産物（単数または複数）の増幅およびその後のタンパク質発現を刺激し、続いてウイルス構造タンパク質によりパッケージングされて感染性ベクター粒子を生じる。特定のレベルより上のレベルのアルファウイルスタンパク質および／またはベクターＲＮＡの細胞内発現は、パッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株において細胞傷害効果をもたらし得る。従って、本発明の特定の実施態様では、これらのエレメントが、それらの発現される構造タンパク質の細胞傷害性の減少、宿主巨大分子合成の減少した阻害、および／または存続した感染を確立する能力について選択されるウイルス改変体に由来することが、望ましいとされ得る。
【０１４０】
ベクターパッケージング細胞株の能力および最終ベクター力価を最適化するために、遺伝子移入およびベクターパッケージングの連続的なサイクルを実行し得る。例えば、パッケージング細胞株のベクタートランスフェクションに由来する感染性のパッケージングされたベクター粒子を含む上清を用いて、新鮮な単層のアルファウイルスパッケージング細胞を感染または「形質導入」し得る。パッケージングされたベクター粒子および新鮮なパッケージング細胞での連続的な形質導入は、核酸トランスフェクションよりも好ましいとされ得る。なぜなら、これは、細胞へのそのより高いＲＮＡ移入効率は、細胞におけるベクターの生物学的置換の最適化、および増大する多数のパッケージング細胞からのベクター生成のためにプロセスを「スケールアップ」する能力のためである。これは、より高い発現およびより高い力価のパッケージングされた感染性組換えアルファウイルスベクターをもたらす。
【０１４１】
本発明の他の局面では、安定に組み込まれたかまたはエピソームに維持されたＤＮＡ発現ベクターを用いて、アルファウイルスベクターＲＮＡ分子を細胞中で生成させ得る。簡略には、このようなＤＮＡ発現ベクターは、好ましい実施態様において、アルファウイルスベクターＲＮＡの転写が、細胞が所望の密度まで増殖したときにのみ生じ、その後誘導されるように、誘導性であるように構成され得る。一旦転写されると、アルファウイルスベクターは、自己触媒的に自己複製する能力を維持し、そしてパッケージングされたベクター粒子生成における最高点に達する事象のカスケードを誘発する。このアプローチは、延長された培養期間にわたる連続したベクター発現を可能にする。なぜなら、組み込まれたＤＮＡベクター発現系は、薬物または他の選択マーカーを通して維持され、そしてＤＮＡ系は、一旦誘導されると、欠陥ＲＮＡコピーにより希釈され得ない改変されていないＲＮＡベクターレプリコンを構成的に発現するからである。大規模で高力価のパッケージングされたアルファウイルスベクターの生成は、このアルファウイルス「プロデューサー細胞株」の構成において可能であり、ＤＮＡに基づくアルファウイルスベクターは、最初にパッケージング細胞株にトランスフェクションにより導入される。なぜなら、サイズ制限は、形質導入のためのウイルスベクター粒子中への発現ベクターのパッケージングを防ぎ得るからである。
【０１４２】
Ｈ．薬学的組成物
上記のように、本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、本明細書中に記載の遺伝子送達ビヒクルを含む薬学的組成物を提供する。例えば、１つの実施態様では、本発明のＲＮＡまたはＤＮＡベクター構築物は、長期間の保存および輸送のために凍結乾燥され得、そして種々の物質を用いて投与の前に再構成され得るが、好ましくは水を用いて再構成される。特定の例において、最終製剤を等張にする希釈塩溶液もまた使用され得る。さらに、再構成された核酸調製物の活性または物理的保護を増強する成分を含む水溶液を使用することも有利であり得る。このような成分は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）、ポリカチオン（例えば、硫酸プロタミン）、脂質製剤、または他の成分を含む。凍結乾燥または脱水された組換えベクターは、任意の便利な容量の水または、凍結乾燥または脱水されたサンプルの実質的な、そして好ましくは完全な可溶化を可能にする、上記の再構成物質により再構成され得る。
【０１４３】
組換えアルファウイルス粒子または感染性組換えウイルス（以下で両方をウイルスという）は、粗製形態または精製形態のいずれかで保存され得る。ウイルスを粗製形態で生成するためには、増殖性細胞は、バイオリアクターまたはフラットストック培養において最初に培養され得、ここで、ウイルス粒子は細胞から培養培地中に放出される。次いで、ウイルスは、最初に十分な量の処方緩衝液を組換えウイルスを含む培養培地中に添加して水性懸濁液を形成することにより、粗製形態で保存され得る。特定の実施態様では、処方緩衝液は、糖、高分子量構造添加物、および緩衝化成分を水中に含む水溶液である。水溶液はまた、１つ以上のアミノ酸を含み得る。
【０１４４】
組換えウイルスはまた、精製形態で保存され得る。より詳細には、処方緩衝液の添加前に、上記の粗製組換えウイルスをフィルターに通すことにより澄明化し、次いで、例えば、向流濃縮システム（Ｆｉｌｔｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）により濃縮し得る。１つの実施態様では、ＤＮａｓｅを濃縮物に加えて、外来ＤＮＡを消化する。次いで、過剰の培地成分を除去し、消化物をダイアフィルトレートして、より望ましい緩衝化溶液中に組換えウイルスを樹立させる。次いで、ダイアフィルトレートした物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｓ−５００ゲルカラムに通し、そして精製組換えウイルスを溶出させる。次に所望の最終成分濃度を得、そして組換えウイルスを最小限で希釈するためにこの溶出液に十分量の処方緩衝液を加える。次いで、水性懸濁液を、好ましくは−７０℃で保存し得るか、または直ちに乾燥し得る。上記のように、処方緩衝液は、糖、高分子量構造添加物、および緩衝化成分を水中に含む水溶液であり得る。この水溶液はまた、１つ以上のアミノ酸を含み得る。
【０１４５】
粗製組換えウイルスはまた、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製され得る。簡略には、粗製組換えウイルスをまずフィルターに通すことにより澄明化し、次に濾液を高度にスルホン酸化されたセルロースマトリックスを含有するカラムにのせ得る。次いで、高塩緩衝液を用いることにより組換えウイルスを精製形態でカラムから溶出させ、そして溶出液を分子排除カラムに通すことにより、高塩緩衝液をより所望される緩衝液に交換し得る。次いで、上記のように、精製組換えウイルスに十分量の処方緩衝液を加え、そして水性懸濁液を、直ちに乾燥させるかまたは好ましくは−７０℃で保存するかのいずれかである。
【０１４６】
粗製形態または精製形態の水性懸濁液は、凍結乾燥または雰囲気温度での蒸発により乾燥され得る。簡略には、凍結乾燥は、水性懸濁液をガス転移温度より低くにまたは水性懸濁液の共晶点温度より低くに冷却する工程、および昇華により冷却した懸濁液から水分を除去して凍結乾燥ウイルスを形成する工程を含む。１つの実施態様では、処方された組換えウイルスのアリコートを凍結乾燥機（Ｓｕｐｅｒｍｏｄｕｌｙｏ  １２Ｋ）  に取り付けたＥｄｗａｒｄｓ  Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ  Ｃｈａｍｂｅｒ  （３  ｓｈｅｌｆ  ＲＣ３Ｓ  ｕｎｉｔ）に入れる。Ｐｈｉｌｌｉｐｓら（Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １８  ：４１４，  １９８１）に記載されるような多段階凍結乾燥手順を用いて、処方された組換えウイルスを、好ましくは−４０℃〜−４５℃の温度で凍結乾燥する。得られる組成物は、凍結乾燥ウイルスの１０重量％未満の水を含む。以下により詳細に議論されるように、一旦凍結乾燥されると、組換えウイルスは安定であり、そして−２０℃〜２５℃で保存され得る。
【０１４７】
蒸発法では、水分は雰囲気温度で蒸発により水性懸濁液から除去される。１つの実施態様において、水分は噴霧乾燥により除去される（ＥＰ  ５２０，７４８）。噴霧乾燥プロセスでは、水性懸濁液は予め加熱された気体流（通常は空気）の中に送達され、この際懸濁液の液滴から水分は急速に蒸発する。噴霧乾燥装置は、多くの製造業者から入手可能である（例えば、Ｄｒｙｔｅｃ  Ｌｔｄ．，Ｔｏｎｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｌａｂ−Ｐｌａｎｔ，  Ｌｔｄ．，  Ｈｕｄｄｅｒｓｆｉｅｌｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）。一旦脱水されると、組換えウイルスは安定であり、そして、−２０℃〜２５℃で保存され得る。本明細書に記載した方法では、乾燥または凍結乾燥ウイルスの得られる水分含量は、カール−フィッシャー装置（ＥＭ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｑｕａｓｔａｒ’  Ｖ１Ｂ  容積滴定機、Ｃｈｅｒｒｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）、または重量法の使用により測定され得る。
【０１４８】
上記のように、処方に使用される水溶液は、好ましくは、糖、高分子量構造添加物、および緩衝化成分および水から構成される。この溶液はまた、１つ以上のアミノ酸を含み得る。これらの成分の組合せは、凍結および凍結乾燥または蒸発による乾燥に際して組換えウイルスの活性を保護するように作用する。利用され得る糖の１つはラクトースであるが、他の糖（例えば、スクロース、マンニトール、グルコース、トレハロース、イノシトール、フルクトース、マルトースまたはガラクトースを含む）も同様に利用され得る。さらに、糖の組合せ（例えば、ラクトースとマンニトール、またはスクロースとマンニトール）が使用され得る。特に好ましいラクトースの濃度は３重量％〜４重量％である。好ましくは、糖の濃度は、１重量％〜１２重量％の範囲にわたる。
【０１４９】
高分子量構造添加物は、凍結の間のウイルスの凝集の防止を助け、凍結乾燥または乾燥状態での構造的支持を提供する。本発明の状況において、構造添加物は、これらが５０００ｍ．ｗ．より大きい場合は「高分子量」であると考えられる。好ましい高分子量構造添加物は、ヒト血清アルブミンである。しかし、他の物質（例えば、ヒドロキシエチル−セルロース、ヒドロキシメチル−セルロース、デキストラン、セルロース、ゼラチン、またはポビドン）もまた使用し得る。ヒト血清アルブミンの特に好ましい濃度は、０．１重量％である。好ましくは、高分子量構造添加物の濃度は、０．１重量％〜１０重量％の範囲である。
【０１５０】
アミノ酸は（存在する場合は）、水性懸濁液の冷却および融解に際して、ウイルス感染性をさらに保護するように機能する。さらに、アミノ酸は、冷却された水性懸濁液の昇華の間および凍結乾燥状態にある間にウイルスの感染性をさらに保護するように機能する。好ましいアミノ酸はアルギニンであるが、他のアミノ酸（例えば、リジン、オルニチン、セリン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸またはアスパラギン酸）もまた使用し得る。特に好ましいアルギニン濃度は、０．１重量％である。好ましくは、アミノ酸濃度は、０．１重量％〜１０重量％の範囲である。
【０１５１】
緩衝化成分は、比較的一定のｐＨを維持することにより、溶液を緩衝化するように作用する。所望のｐＨの範囲（好ましくは７．０と７．８との間）に応じて種々の緩衝液が使用され得る。適切な緩衝液には、リン酸緩衝液およびクエン酸緩衝液が含まれる。組換えウイルス製剤の特に好ましいｐＨは７．４であり、そして好ましい緩衝液はトロメタミンである。
【０１５２】
さらに、水溶液が、最終的に処方された組換えアルファウイルスを適切な等浸透圧塩濃度に調整するために使用される中性の塩を含有することが好ましい。適切な中性の塩には、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化マグネシウムが含まれる。好ましい塩は塩化ナトリウムである。
【０１５３】
上記の、所望の濃度の成分を含有する水溶液は、濃縮されたストック溶液として調製され得る。
【０１５４】
本明細書中に提供される開示を考慮すれば、凍結乾燥ウイルスを室温で保存することを意図する場合は、水溶液中に特定の糖を利用することが好ましいとされ得ることが当業者には明らかである。より詳細には、特に室温での保存には、二糖（例えば、ラクトースまたはトレハロース）を利用することが好ましい。
【０１５５】
本発明の凍結乾燥または脱水されたウイルスは、種々の物質を用いて再構成され得るが、好ましくは水を使用して再構成される。特定の場合には、最終製剤を等張にする希塩溶液もまた使用され得る。さらに、再構成されたウイルスの活性を増強することが公知の成分を含有する水溶液を使用することが有利であり得る。このような成分には、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）、ポリカチオン（例えば、硫酸プロタミン）または再構成されたウイルスの形質導入効率を増強する他の成分が含まれる。凍結乾燥または脱水された組換えウイルスは、任意の便利な容量の水、または凍結乾燥または脱水されたサンプルの実質的な、そして好ましくは完全な可溶化を可能にする上記の再構成物質により再構成され得る。
【０１５６】
Ｉ．遺伝子送達ビヒクルを利用するための方法
上記のように、本発明はまた、選択された異種配列を脊椎動物（例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）または他の温血動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、またはマウス））または昆虫に送達するための方法を提供する。この方法は、脊椎動物または昆虫に、選択された異種配列を発現し得る、本明細書に記載されたような遺伝子送達ビヒクルを投与する工程を含む。このような遺伝子送達ビヒクルは、直接（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経口、直腸、眼内、鼻腔内）または種々の物理的方法（例えば、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：  ７４１３−７１４７，  １９８９）、直接的ＤＮＡ注入（Ｆｕｎｇら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：  ３５３−３５７，  １９８３；  Ｓｅｅｇｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：  ５８４９−５８５２；  Ａｃｓａｄｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：  ８１５−８１８，  １９９１）；マイクロプロジェクタイルボンバードメント（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，  ＰＮＡＳ  ８８：  ２７２６−２７３０，  １９９１）；いくつかのタイプのリポソーム（例えば、Ｗａｎｇら，  ＰＮＡＳ  ８４：  ７８５１−７８５５，  １９８７を参照のこと）；ＣａＰＯ４（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，  ＰＮＡＳ  ８１：  ７５２９−７５３３，  １９８４）；ＤＮＡリガンド（Ｗｕら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：  １６９８５−１６９８７，  １９８９）；核酸単独の投与（ＷＯ  ９０／１１０９２）；または殺傷されたアデノウイルスに結合されたＤＮＡの投与（Ｃｕｒｉｅｌら，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ３：  １４７−１５４，  １９９２）；レセプター特異的リガンドを利用して、ポリリジンのようなポリカチオン化合物を介して；ならびにソラレン不活化ウイルス（例えば、センダイウイルスまたはアデノウイルス）を用いて）のいずれかにより投与され得る。さらに、遺伝子送達ビヒクルは、直接（すなわちインビボで）または取り出されていて（エクソビボで）続いて戻される細胞のいずれかで投与され得る。
【０１５７】
以下でより詳細に議論するように、遺伝子送達ビヒクルは、脊椎動物または昆虫に、広範な種々の治療目的および／または他の生成的目的のために投与され得る。これらの目的は、例えば、特異的な免疫応答を刺激するため；宿主細胞レセプターとの薬剤の相互作用を阻害するため；毒性緩和剤（例えば、条件的毒性緩和剤を含む）を発現するため；免疫系を免疫学的に調節するため；細胞分裂を防ぐため、置換遺伝子治療のためにマーカーを発現するため、創傷治癒を促進するため、および／または組換えタンパク質を生成するための目的を含む。これらおよび他の使用は、以下でより詳細に議論される。
【０１５８】
１．免疫刺激
本発明の１つの局面において、感染性、ガン性、自己免疫性、または免疫疾患を防止、阻害、安定化、または逆転し得る遺伝子送達ビヒクルを投与するための組成物および方法が提供される。このような疾患の代表例として、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩＩ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、およびＨＰＶのようなウイルス感染症、メラノーマ、糖尿病、移植片対宿主病、アルツハイマー病、および心臓疾患などが挙げられる。より具体的には、本発明の１つの局面において、病原性物質が死滅するかまたは阻害されるかのいずれかであるように、病原性物質に対する免疫応答（体液性または細胞媒介性のいずれか）を刺激するための組成物および方法が提供される。病原性物質の代表例として、細菌、真菌、寄生体、ウイルス、およびガン細胞が挙げられる。
【０１５９】
本発明の１つの実施態様において、病原性物質はウイルスであり、そして（１）ウイルス抗原に対する免疫応答を開始させるか、または（２）ウイルスの相互作用に必要な細胞レセプターを占有することによりウイルスの拡散を防止することのいずれかが可能である感受性の標的細胞に、抗原またはその改変型の発現を指向する遺伝子送達ビヒクルを用いることにより、特異的免疫応答を刺激し、そしてウイルスの拡散を阻害するための方法が提供される。ベクターの核酸にコードされたタンパク質の発現は一時的であるか、または時間が経過しても安定なものであり得る。病原性物質抗原に対して免疫応答が刺激される場合、遺伝子送達ビヒクルは好ましくは、免疫応答を刺激しかつ天然の抗原に比較して低下した病原性を有する、改変型の抗原を発現するように設計される。この免疫応答は、細胞が正しい様式で抗原を提示する場合、すなわち、ＭＨＣ  クラスＩおよび／またはＩＩ分子と、ＣＤ３、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、またはこれらのアナログのようなアクセサリー分子とともに抗原を提示する場合に、達成される（例えば、Ａｌｔｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３８  ：  ５１２，  １９８９）。遺伝子送達ビヒクルに感染した細胞は、これらが真のウイルス感染を厳密に模倣し、そしてこれらは、（ａ）複製していない細胞に感染することができ、（ｂ）宿主細胞ゲノム内に組み込まれることがなく、（ｃ）いかなる致死的疾患にも関係がなく、そして（ｄ）高レベルの異種タンパク質を発現するため、これを効率的に行うことが予想される。これらの差異のために、遺伝子送達ビヒクルはワクチン使用のために健常人に対して使用され得る安全なウイルスベクターとして容易に考えられ得る。
【０１６０】
提示細胞が完全に生存しており、健康であり、そして異種遺伝子に比較して低レベルのウイルス抗原が発現されるという点で、本発明のこの局面は、同じ様式で機能すると予想され得る他の系に対してさらなる利点を有する。発現される抗原性エピトープは、抗原の遺伝子のサブフラグメントの組換えアルファウイルスへの選択的クローニングにより改変され得、このことは他の場合には免疫優勢なエピトープにより隠され得る免疫原性エピトープに対する応答を導くので、これは明確な利点を有する。このようなアプローチは多数のエピトープ（このエピトープの１つ以上は、異なるタンパク質由来である）を有するペプチドの発現に拡張し得る。さらに、本発明のこの局面は、細胞内合成およびこれらのペプチドフラグメントとＭＨＣ  クラスＩ分子との会合を介する、抗原性エピトープおよび遺伝子のサブフラグメントによりコードされる抗原のペプチドフラグメントに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の効率的な刺激を可能にする。このアプローチはＣＴＬ誘導について主要な免疫優勢エピトープをマッピングするために利用され得る。
【０１６１】
免疫応答はまた、（もしも必要であるなら適切なＭＨＣ分子と関係して）  目的の抗原を認識する特異的Ｔ細胞レセプターの遺伝子、目的の抗原を認識する免疫グロブリンの遺伝子、またはＭＨＣの関係の非存在下でＣＴＬ応答を提供する２つのものの１つのハイブリッドの遺伝子を、適切な免疫細胞（例えばＴリンパ球）に移入することによっても、達成され得る。従って、遺伝子送達ビヒクル細胞は、免疫刺激剤、免疫調節剤、またはワクチンとして使用され得る。
【０１６２】
本発明の別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルが、ウイルスのアセンブリを阻害する、欠陥のある妨害性ウイルス構造タンパク質を送達および発現する、阻害剤緩和剤を生成するための方法が提供される。このような遺伝子送達ビヒクルは、欠陥のあるｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、または他のウイルス粒子タンパク質またはペプチドをコードし得、そしてこれらはウイルス粒子のアセンブリを優勢な様式で阻害する。これは、ウイルス粒子の正常なサブユニットの相互作用が、欠陥のあるサブユニットとの相互作用により妨害されるために発生する。
【０１６３】
本発明の別の実施態様において、ウイルスプロテアーゼに特異的な阻害性ペプチドまたはタンパク質の発現方法が提供される。簡単に記載すると、ウイルスプロテアーゼはウイルスのｇａｇおよびｇａｇ／ｐｏｌタンパク質を、多くのより小さなペプチドに切断する。この切断がないと、全ての場合に感染性レトロウイルス粒子の生成が完全に阻害される。例として、ＨＩＶプロテアーゼはアスパルチンプロテアーゼであることが公知であり、そしてこれらはタンパク質またはアナログ由来のアミノ酸から作製されるペプチドにより阻害されることが公知である。ＨＩＶを阻害するための遺伝子送達ビヒクルは、このようなペプチド阻害剤の１つまたは多数の融合したコピーを発現する。
【０１６４】
別の実施態様は、ある細胞型で欠失、変異しているか、または発現されない場合に、その細胞型に腫瘍形成を導く、抑制遺伝子の送達に関する。遺伝子送達ビヒクルによる欠失した遺伝子の再導入は、これらの細胞における腫瘍表現型の後退を導く。このようなガンの例は網膜芽細胞腫およびウイルムス腫瘍である。悪性疾患は、細胞増殖と比較して細胞の最終分化の阻害であると考えられ得るので、アルファウイルスベクターの送達、および腫瘍の分化を導く遺伝子産物の発現はまた、一般的には後退を導くはずである。
【０１６５】
さらに別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、病原性機能に対応するＲＮＡ分子を切断し、それゆえそれを不活化するリボザイム（ＲＮＡ  酵素）（Ｈａｓｅｌｏｆｆ  および  Ｇｅｒｌａｃｈ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５，  １９８９）  を転写することにより治療効果を提供する。リボザイムは標的ＲＮＡ中の特異的配列を認識することにより機能し、そしてこの配列は通常１２ｂｐ〜１７ｂｐであるため、これはＲＮＡまたはレトロウイルスゲノムのような特定のＲＮＡ種の特異的認識を可能とする。さらなる特異性が、ある場合にはこれを条件的毒性緩和剤とすることにより達成され得る（以下を参照のこと）。
【０１６６】
阻害性緩和剤の有効性を増加させる１つの方法は、問題のウイルスによる耐性細胞の感染の可能性を増加させる遺伝子の発現とともに、ウイルス性阻害性遺伝子を発現させることである。その結果は、増殖性感染事象に競合する非生産的な「行き止まり（ｄｅａｄ−ｅｎｄ）」事象である。ＨＩＶの具体例では、ＨＩＶ複製を（前述のように、アンチセンスｔａｔなどを発現することにより）阻害し、そしてまたＣＤ４のような感染に必要なタンパク質を過剰発現する遺伝子送達ビヒクルが送達され得る。こうして比較的少数のベクター感染ＨＩＶ耐性細胞は、遊離のウイルスまたはウイルスの感染した細胞を用いる多数の非増殖性融合事象のための「シンク」または「マグネット」として作用する。
【０１６７】
２．ブロッキング剤
多くの感染性疾患、ガン、自己免疫疾患、および他の疾患には、ウイルス粒子と細胞、細胞と細胞、または細胞とそれら自身もしくは他の細胞により生成された因子の相互作用が関与する。ウイルス感染では、ウイルスは普通、感受性細胞の表面のレセプターを介して細胞に入る。ガンまたは他の増殖状態（例えば再狭窄）では、細胞は他の細胞または因子由来のシグナルに不適切に応答し得るかまたはまったく応答し得ないか、または特定の因子は変異、過剰発現、または過少発現されて適切な細胞周期制御の損失をもたらし得る。自己免疫疾患では、「自己」マーカーが不適切に認識される。本発明においては、そのような相互作用は、相互作用におけるパートナーのいずれかに対するアナログをインビボで生成することによりブロックされ得る。あるいは、細胞周期制御は、存在しないかまたは過少発現されるブロッキング因子を用いて、ある期から別の期（例えば、Ｇ１期からＳ期への移行）を防ぐことにより回復され得る。このブロッキング作用は細胞内、細胞膜上、または細胞外で起こり得る。そしてブロッキング剤に対する遺伝子を有するアルファウイルスベクターの作用は、感受性細胞の内部から、または病原性相互作用を局所的にブロックするブロッキングタンパク質の一種を分泌することによるかのいずれかにより媒介され得る。
【０１６８】
ＨＩＶの場合、相互作用の２つの物質はｇｐ１２０／ｇｐ４１エンベロープタンパク質およびＣＤ４レセプター分子である。従って適切なブロッカーは、病原作用を生じずにＨＩＶの侵入をブロックするＨＩＶ  ｅｎｖアナログ、またはＣＤ４レセプターアナログのいずれかを発現する遺伝子送達ビヒクルである。ＣＤ４アナログは分泌され、そして隣接する細胞を保護するように機能するが、一方ｇｐ１２０／ｇｐ４１はベクター含有細胞のみを保護するように、分泌されるかまたは細胞内でのみ生成される。安定性または補体溶解性を強化するために、ＣＤ４にヒト免疫グロブリン重鎖かまたは他の成分を加えることが有利であり得る。そのようなハイブリッド可溶性ＣＤ４をコードする遺伝子送達ビヒクルの宿主への投与は、安定なハイブリッド分子の連続的な供給をもたらす。処置の効力は、抗体レベル、ウイルス抗原生成、感染性ＨＩＶレベル、または非特異的感染のレベルを含む、疾患進行の通常の指標を測定することによりアッセイされ得る。
【０１６９】
制御されない増殖状態（例えば、ガンまたは再狭窄）の場合、細胞サイクルの進行は、サイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）によるシグナル伝達に影響を与える多数の分化因子の発現により停止し得る。例えば、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ｐ１６、ｐ２１、およびｐ２７は、それぞれ、サイクリン：ＣＤＫ媒介性細胞周期シグナル伝達を調節する。遺伝子送達ビヒクルによる細胞内でのこれらの因子の過剰発現は、細胞増殖の細胞分裂停止性の抑制をもたらす。細胞増殖を破壊するためのブロッキング剤または標的として治療的に使用され得る他の因子は、例えば、野生型または変異体のＲｂ、ｐ５３、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＰＣＮＡ、ＧＡＸ、レンチウイルスｖｐｒ、およびｐ１５を含む。関連する実施態様では、心血管疾患（例えば、再狭窄またはアテローム性動脈硬化症）は、再内皮化（ｒｅ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）または血管再構築を促進する産物（例えば、ＶＥＧＦ、ＴＦＰＩ、ＳＯＤ）を発現するベクターを用いて処置または予防され得る。
【０１７０】
３．緩和剤の発現
上記の技術と類似の技術が、病原性物質または遺伝子の機能を阻害し得る物質（または「緩和剤」）の発現を指令する遺伝子送達ビヒクルを生成するのに使用され得る。本発明において「機能を阻害し得る」とは、緩和剤が機能を直接阻害するか、または例えば細胞中に存在する物質を、通常は病原性物質の機能を阻害しないものから、機能を阻害するものに変換することにより、間接的に阻害するかのいずれかであることを意味する。ウイルス疾患についてのそのような機能の例として、吸着、複製、遺伝子発現、アセンブリ、および感染細胞からのウイルスの放出が挙げられる。ガン性細胞、ガン促進成長因子、または制御されない増殖条件（例えば、再狭窄）についてのこのような機能の例として、生存性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、細胞複製、外部シグナルに対する感受性の改変（例えば、接触阻害）、および抗ガン遺伝子タンパク質の生成の欠如またはその変異型の生成が挙げられる。
【０１７１】
ａ．阻害剤緩和剤
本発明の１つの局面において、遺伝子送達ビヒクルは、例えばウイルス疾患または悪性疾患における病原性物質の機能を妨害し得る遺伝子の発現を指向する。このような発現は、本質的に連続的であるか、または病状または特定の細胞型のいずれかに関連する別の物質（「同定物質」）の細胞における存在に応答するかのいずれかであり得る。さらにベクターの送達は、上記のように、ベクターの侵入を特異的に所望の細胞型（例えば、ウイルス感染細胞または悪性細胞）に標的化することにより制御され得る。
【０１７２】
投与の１つの方法は白血球伝達（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）  であり、ここでは任意の一時期に個体の約２０％のＰＢＬが取り出され、そしてインビトロで操作される。従って、約２×１０９個の細胞が処置および置換され得る。繰り返し処置も行われ得る。あるいは骨髄が処置され得、上記のように効果を増幅させ得る。さらにベクターを生成するパッケージング細胞株は被験体に直接注射され得、このことは組換えビリオンの連続的な産生を可能とする。
【０１７３】
１つの実施態様において、重要な病原性遺伝子転写産物（例えば、ウイルス遺伝子産物または活性化された細胞性ガン遺伝子）に対して相補的なＲＮＡを発現する遺伝子送達ビヒクルが、その転写産物のタンパク質への翻訳を阻害（例えば、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質の翻訳の阻害）することに使用され得る。このタンパク質の発現はウイルス複製に必須であるため、遺伝子送達ビヒクルを含む細胞はＨＩＶ複製に耐性である。
【０１７４】
第２の実施態様において、病原性物質がパッケージングシグナルを有する１本鎖ウイルスである場合、ウイルスパッケージングシグナル（例えば、緩和剤がＨＩＶに対して指向されるときはＨＩＶパッケージングシグナル）に相補的なＲＮＡが発現され、その結果これらの分子とウイルスパッケージングシグナルとの会合は、レトロウイルスの場合は、アルファウイルスＲＮＡゲノムの正しいキャプシド形成（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）または複製に必要な、ステムループ形成またはｔＲＮＡプライマー結合を阻害する。
【０１７５】
第３の実施態様において、病原性遺伝子の発現を選択的に阻害し得る緩和剤、または病原性物質により生成されるタンパク質の活性を阻害し得る緩和剤を発現する遺伝子送達ビヒクルが導入され得る。ＨＩＶの場合、１つの例は、ＨＩＶ  ＬＴＲからの発現をトランス活性化する能力が欠如しており、そしてｔａｔタンパク質が正常に機能することを（トランスドミナントな様式で）妨害する変異体ｔａｔタンパク質である。このような変異体はＨＴＬＶ  ＩＩ  ｔａｔタンパク質について同定されている（「ＸＩＩＬｅｕ５」変異体；Ｗａｃｈｓｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５  ：  ６７４，  １９８７  を参照のこと）。変異体トランスリプレッサーｔａｔは、ＨＳＶ−１において類似の変異体リプレッサーについて示されたように複製を大いに阻害するはずである（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３５  ：  ４５２，  １９８８）  。
【０１７６】
このような転写リプレッサータンパク質は、その発現がウイルス特異的トランス活性化タンパク質（上記）により刺激される、任意のウイルス特異的転写プロモーターを用いて組織培養において選択され得る。ＨＩＶの具体的な場合において、ＨＩＶ  ｔａｔ  タンパク質およびＨＩＶプロモーターにより駆動されるＨＳＶＴＫ  遺伝子を発現する細胞株は、ＡＣＶの存在下で死滅する。しかし、もし一連の変異したｔａｔ遺伝子がこの系に導入されるなら、適切な特性（すなわち、野生型ｔａｔの存在下でＨＩＶプロモーターからの転写を抑制する）を有する変異体が増殖しそして選択される。次にこの変異遺伝子は、これらの細胞から再び単離され得る。条件的致死ベクター／ｔａｔ系の多数のコピーを含む細胞株は、生存している細胞クローンはこれらの遺伝子内の内因性変異により引き起こされるのではないことを確認するために、使用され得る。次に、「回収可能な（ｒｅｓｃｕａｂｌｅ）」アルファウイルスベクター（すなわち、変異体ｔａｔタンパク質を発現し、そして細菌内での増殖および選択のために細菌の複製起点および薬物耐性マーカーを含むベクター）を用いて、一組のランダムに変異誘発したｔａｔ遺伝子がこれらの細胞に導入される。これにより多数のランダム変異を評価することができ、そして所望の変異体細胞株のその後の容易な分子クローニングが可能になる。この手順は、潜在的な抗ウイルス療法のための種々のウイルス性転写アクチベーター／ウイルスプロモーター系における変異を同定および利用するために使用され得る。
【０１７７】
ｂ．条件的毒性緩和剤
病原性物質を阻害するための別のアプローチは、病原性条件を発現する細胞にとって毒性である緩和剤を発現することである。この場合、遺伝子送達ビヒクルからの緩和剤の発現は、非病原性細胞の破壊を避けるために、病原性物質に関連した物質（例えば、病原性状態を同定する特異的ウイルスＲＮＡ配列）の存在により制限されるべきである。
【０１７８】
この方法の１つの実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、細胞特異的応答性ベクターから毒性遺伝子（上で議論されたように）を発現するために利用され得る。この様式で、細胞特異的応答性ベクターを活性化し得るＲＮＡ配列を含む、急速に複製している細胞は、遺伝子送達ビヒクルにより生成される細胞傷害性物質により優先的に破壊される。
【０１７９】
上記の実施態様と同様の様式で、遺伝子送達ビヒクルは、リン酸化、ホスホリボシル化、リボシル化、またはプリンもしくはピリミジンに基づくの薬物の他の代謝のための遺伝子を有し得る。この遺伝子は哺乳動物細胞に等価物がない場合があり、そしてウイルス、細菌、真菌、または原生動物のような生物由来であり得る。この１つの例は、チオキサンチンの存在下で致死的である、Ｅ．  ｃｏｌｉのグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子産物である（Ｂｅｓｎａｒｄら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７  ：  ４１３９−４１４１，  １９８７を参照のこと）  。この型の条件的致死遺伝子産物（上記のように「プロドラッグ変換酵素」とも呼ぶ）は、多くの現在公知のプリンまたはピリミジンに基づく抗ガン薬への適用を有し、これは、有効な細胞傷害性物質となるために、しばしば細胞内リボシル化またはリン酸化を必要とする。この条件的致死遺伝子産物はまた、プリンまたはピリミジンのアナログではない非毒性薬物を細胞傷害性形態に代謝し得る（Ｓｅａｒｌｅら、Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５３  ：  ３７７−３８４，  １９８６を参照のこと）  。
【０１８０】
一般的に哺乳動物ウイルスは、他のウイルスプロモーターエレメントからのその後の転写活性化に必要な「即時型（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）」遺伝子を有する傾向がある。この性質を有するＲＮＡ配列は、ウイルス感染のアルファウイルスベクター細胞内シグナル（または「同定物質」）を活性化するための優れた候補である。従って、これらのウイルス「即時型」遺伝子産物に応答するアルファウイルス細胞特異的ベクターから発現される条件的致死遺伝子は、任意の特定のウイルスに感染された細胞を特異的に死滅させ得る。さらに、ヒトおよびインターフェロンプロモーターエレメントは、広範な種々の非関連ウイルスによる感染に応答して転写的に活性化されるため、例えばインターフェロン生成に応答して、ＨＳＶＴＫ  のような条件的致死遺伝子産物を発現するベクターの導入により、種々の異なるウイルスに感染した細胞の破壊がもたらされ得る。
【０１８１】
本発明の別の局面において、他の場合には不活性な前駆体を病原性物質の活性な阻害剤に活性化し得る、遺伝子産物の発現を指向する、遺伝子送達ビヒクルが提供される。例えば、ＨＳＶＴＫ遺伝子産物は、ＡＺＴまたはｄｄＣのような潜在的に抗ウイルス性のヌクレオシドアナログをより効果的に代謝するために使用され得る。ＨＳＶＴＫ遺伝子は細胞特異的応答性ベクターの制御下で発現され得、そしてこれらの細胞型の中に導入され得る。ＡＺＴ（および他のヌクレオシド抗ウイルス剤）は、レトロウイルス逆転写酵素、従って、ＨＩＶ  複製を特異的に阻害するために、細胞性機構によりヌクレオチド三リン酸の形態に代謝されなければならない（Ｆｕｒｍａｍら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３  ：  ８３３３−８３３７，  １９８６）。ＨＳＶＴＫ（非常に広範な基質特異性を有するヌクレオシドおよびヌクレオシドキナーゼ）の構成的発現により、それらの生物学的に活性なヌクレオチド三リン酸形態へのこれらの薬物のより効果的な代謝がもたらされる。従って、ＡＺＴまたはｄｄＣ治療は、より効果的であり、投与量はより少なく、全身性毒性はより低く、そして増殖性感染に対するより高い効力を可能にする。そのヌクレオチド三リン酸の形態がレトロウイルス逆転写酵素に対して選択性を示すが、細胞性ヌクレオシドおよびヌクレオチドキナーゼの基質特異性の結果リン酸化されないさらなるヌクレオシドアナログは、より効果的になる。
【０１８２】
これらの遺伝子送達ビヒクルのヒトＴ細胞およびマクロファージ／単球細胞株への投与は、レトロウイルスベクター処理のない同じ細胞に比べて、ＡＺＴおよびｄｄＣの存在下で、ＨＩＶに対するこれらの耐性を増加させ得る。ＡＺＴでの処理は毒性の副作用を避けるため通常レベルより低いが、それでもＨＩＶの蔓延を有効に阻害する。処理の経路はブロッカーについて記載したものと同様である。
【０１８３】
１つの実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、それ自身毒性はないが、ウイルスまたは他の病原体に特異的なプロテアーゼのようなタンパク質によりプロセシングまたは改変された場合、毒性の形態に変換される産物を特定する遺伝子を有する。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、リシンＡ鎖のプロタンパク質をコードする遺伝子を有し得、これはＨＩＶプロテアーゼによるプロセシングにより毒性になる。より詳しくは、毒素リシンまたはジフテリアＡ鎖の合成の不活性なプロタンパク質形態は、ＨＩＶウイルスによりコードされたプロテアーゼが適切な「プロ」エレメントを認識し、そしてそれを切り離すように配置することにより、活性形態に切断され得る。
【０１８４】
別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、細胞内の同定物質の存在（例えば、ウイルス遺伝子の発現）に応答して標的細胞の表面に「レポーティング産物」を発現し得る。この表面タンパク質は、レポーティングタンパク質に対する抗体のような細胞傷害性物質または細胞傷害性Ｔ細胞により認識され得る。同様の様式で、このような系は、同定タンパク質を発現する特定の遺伝子を有するこれらの細胞を簡単に同定するための検出系（下記を参照のこと）として使用され得る。
【０１８５】
同様に、別の実施態様において、それ自身が治療的に有益である表面タンパク質が発現され得る。ＨＩＶの特定の場合に、ＨＩＶ感染細胞において特異的なヒトＣＤ４タンパク質の発現は、２つの点で有益であり得る：
１．可溶性ＣＤ４が遊離のウイルスを阻害することが示されているが、細胞内でのＨＩＶ  ｅｎｖへのＣＤ４の結合は、生存可能なウイルス粒子の形成を阻害し得る。しかし、このタンパク質は膜に結合したままであり、そして構造的に内因性ＣＤ４（患者はこれに対して免疫学的に寛容（ｔｏｌｅｒａｎｔ）  であるはずである）と同一であるため、全身性のクリアランスおよび可能な免疫原性の問題はない。
【０１８６】
２．ＣＤ４／ＨＩＶ  ｅｎｖ複合体は細胞死の原因に関与するため、（ＨＩＶ感染細胞に存在する過剰のＨＩＶ−ｅｎｖ存在下での）ＣＤ４のさらなる発現は、より急速な細胞死を引き起こし、従ってウイルス拡散を阻害する。これは特に、ＨＩＶ誘導性細胞傷害性に対するそれらの相対的な屈折性の結果（これは次には、明らかにそれらの細胞表面上のＣＤ４の相対的な欠乏のためである）、ウイルス生成の病原性物質保有者として働く単球およびマクロファージに適用可能であり得る。
【０１８７】
別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、ベクターに感染した細胞の生存性に必須のＲＮＡ分子を切断し、そして不活化するリボザイムを提供し得る。リボザイム生成を病原性状態に対応する特異的なＲＮＡ配列（例えば、ＨＩＶ  ｔａｔ）に依存させることにより、毒性は病原性状態に特異的になる。
【０１８８】
４．マーカーの発現
特異的なＲＮＡ配列に応答して細胞中で緩和剤を発現する上記の技術はまた、同定タンパク質を発現する細胞における特定の遺伝子（例えば、特定のウイルスが有する遺伝子）の検出を可能にし、それによりそのウイルスを有する細胞の検出を可能にするように改変され得る。さらにこの技術は、ウイルスに関連する同定タンパク質を有する細胞の臨床サンプルにおけるウイルス（例えば、ＨＩＶ）の検出を可能にする。
【０１８９】
この改変は、感染細胞中における同定タンパク質の存在に応答する遺伝子送達ビヒクル中で、その存在が容易に同定され得る産物（「マーカー産物」）をコードするゲノムを提供することにより達成され得る。例えば、ＨＩＶは、それが適切な細胞に感染した場合、ｔａｔおよびｒｅｖを作る。この指示細胞は、従って、ｔａｔおよび／またはｒｅｖ  ＲＮＡ転写産物による活性化の際に組換えアルファウイルスにより発現されるマーカー遺伝子（例えば、アルカリホスファターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、またはルシフェラーゼ遺伝子）をコードするゲノム（例えば、適切な組換えアルファウイルスでの感染によって）を用いて提供され得る。β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼの場合、細胞を基質アナログに曝すと、サンプルがＨＩＶ陽性の場合は色または蛍光の変化がもたらされる。ルシフェラーゼの場合、サンプルをルシフェリンに曝すことにより、サンプルがＨＩＶ陽性の場合、発光する。β−ガラクトシダーゼのような細胞内酵素の場合、着色細胞または蛍光細胞を計測するか、または細胞抽出物を作製して適切なアッセイを行うことにより、ウイルスの力価を直接測定し得る。また、膜結合型のアルカリホスファターゼの場合、蛍光性基質を用いて細胞表面上で酵素アッセイを行うことにより、ウイルスの力価をまた測定し得る。分泌された酵素（例えば、操作された形態のアルカリホスファターゼ）については、少量の培養上清サンプルを活性についてアッセイすることにより、単一培養物を経時的に連続的にモニターし得る。従って、異なる目的に対して異なる形態のこのマーカー系が使用され得る。これらには、活性のあるウイルスの計測、または培養物中のウイルス蔓延および種々の薬物によるこの蔓延の阻害の感度が高くかつ簡単な測定が含まれる。
【０１９０】
ウイルスに対する中和抗体の存在下または非存在下のいずれかで、このウイルスの存在を試験することにより、上記の系にさらなる特異性を組み込み得る。例えば、試験する臨床サンプルの一部において、ＨＩＶに対する中和抗体が存在し得るが、別の部分では、中和抗体が全く存在しないこともある。抗体が存在する系においてこの試験が陰性であり、かつ抗体が全く存在しない系においてこの試験が陽性の場合、これはＨＩＶの存在を確認することを助ける。
【０１９１】
インビトロアッセイの類似の系で、特定の遺伝子（例えば、ウイルス遺伝子）の存在は、細胞サンプルにおいて決定され得る。この場合、サンプルの細胞を、適切なウイルスＲＮＡ転写産物の存在下でのみ発現されるレポーター遺伝子を有する適切な遺伝子送達ビヒクルで感染させる。レポーター遺伝子は、サンプル細胞に入った後、宿主細胞が適切なウイルスタンパク質を発現する場合のみ、そのレポーター産物（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ）を発現する。
【０１９２】
レポーター遺伝子は、存在する同定物質よりも多量のレポーター産物を発現し得、これにより増幅効果が得られるため、これらのアッセイはより迅速かつ好感度である。
【０１９３】
５．免疫ダウンレギュレーション
上記のように、本発明はまた、アルファウイルスに感染した標的細胞中の免疫系の１つ以上のエレメントを抑制し得る遺伝子送達ビヒクルを提供する。簡単に説明すると、不適切なまたは好ましくない免疫応答（例えば慢性肝炎、または骨髄のような異種組織の移植）の特異的ダウンレギュレーションは、移植（ＭＨＣ）抗原の表面発現を抑制する免疫抑制性ウイルス遺伝子産物を用いて操作され得る。Ｃ群アデノウイルスであるＡｄ２およびＡｄ５  は、ウイルスのＥ３領域にコードされる１９ｋｄ糖タンパク質（ｇｐ１９）を有する。このｇｐ１９分子は細胞の小胞体中のクラスＩＭＨＣ  分子に結合し、そしてクラスＩＭＨＣの末端グリコシル化および細胞表面へのその移動を防止する。例えば、骨髄移植の前に、ドナー骨髄細胞はｇｐ１９の発現の際に、ＭＨＣクラスＩ移植抗原の表面発現を阻害するｇｐ１９コード遺伝子送達ビヒクルを用いて感染され得る。これらのドナー細胞は、移植片拒絶の危険性が低く移植され得、そして移植患者は最小限の免疫抑制療法を必要とし得る。このことは、ほとんど合併症もなく、ドナー−レシピエントの許容されるキメラ状態が存在するのが可能であり得る。いわゆる自己免疫疾患の部類（ループスエリテマトーデス（ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｍｉａｔｉｓ）、多発性硬化症、慢性関節リウマチまたは慢性Ｂ型肝炎感染を含む）を処置するのに、同様の処置が使用され得る。
【０１９４】
別の方法は、事実上自己反応性のＴ細胞クローンに特異的な、アンチセンスメッセージ、リボザイムまたは他の特異的遺伝子発現阻害剤の使用を含む。これらは、自己免疫応答の原因である特定の好ましくないクローンのＴ細胞レセプターの発現をブロックする。このアンチセンス、リボザイムまたは他の遺伝子は、ウイルスベクター送達系を用いて導入され得る。
【０１９５】
６．置換または増強遺伝子療法
本発明のさらに１つの局面は、治療用タンパク質を発現し得る遺伝子配列を供給するため遺伝子送達ビヒクルを用いて、脊椎動物または昆虫の細胞を形質転換することに関する。本発明の１つの実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、代謝、免疫調節、ホルモン調節、酵素的または膜関連構造機能における、遺伝性または非遺伝性の遺伝子欠陥を防止、阻害、安定化または逆転し得る治療用タンパク質を発現するように設計される。この実施態様はまた、個々の細胞を形質導入し得る遺伝子送達ビヒクルを記載し、これにより治療用タンパク質が特定の細胞または組織から全身的にまたは局所的に発現され得、これにより治療用タンパク質は、（ａ）存在しないかもしくは欠陥のある細胞性タンパク質もしくは酵素の置換、または（ｂ）欠陥のある、発現量の少ない細胞性タンパク質もしくは酵素の補充生成を行い得る。このような疾患は、嚢胞性線維症、パーキンソン病、高コレステロール血症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、β−グロビン障害、血友病ＡおよびＢ、ゴーシェ病、糖尿病および白血病を含み得る。
【０１９６】
本発明の１つの例として、ゴーシェ病を処置するために遺伝子送達ビヒクルが構築および利用され得る。簡単に説明すると、ゴーシェ病は酵素グルコセレブロシダーゼの欠陥により特徴付けられる遺伝障害である。この型の治療は、機能的細胞性酵素を提供することによる単一の遺伝子置換療法の１つの例である。この酵素の欠陥により、体内のすべての細胞のリソゾーム中でのグルコセレブロシドの蓄積が導かれる。しかし疾患の表現型は、非常にまれな神経障害性形態のこの疾患を除いて、マクロファージにのみ現れる。この疾患では通常、肝臓および脾臓の肥大、ならびに骨の病変が導かれる（総説については、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６  ：  ７９４，  １９９２、およびＴｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、第６版、Ｓｃｒｉｖｅｒら、第２巻、１６７７頁を参照のこと）。
【０１９７】
遺伝子送達ビヒクルは、疾患または疾患の進行を処置、治療、予防するために、広範な種々の治療用タンパク質を送達するのに同様に利用され得る。このような遺伝子の代表例は、インスリン（米国特許第４，４３１，７４０号およびＢＥ  ８８５１９６Ａを参照のこと）、ヘモグロビン（Ｌａｗｎら，  Ｃｅｌｌ  ２１：  ６４７−５１，  １９８０）、エリスロポエチン（ＥＰＯ；米国特許第４，７０３，００８号を参照のこと）、巨核球増殖および分化因子（ＭＧＤＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｇ−ＣＳＦ（Ｎａｇａｔａら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：  ４１５−４１８，  １９８６）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ（ＷＯ  ８７０６９５４を参照のこと），ｆｌｔ３リガンド（Ｌｙｍａｎら  （１９９３），  Ｃｅｌｌ  ７５：  １１５７−１１６７）、ＥＧＦ、酸性および塩基性のＦＧＦ、ＰＤＧＦ、インターロイキンおよびインターフェロンのファミリーのメンバー（上記）、神経向性因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）（例えば、ＢＤＮＦ；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２９：  １２８９−１２９４，  １９９１、ＮＴ−３；ＷＯ  ９１０３５６９を参照のこと、ＣＮＴＦ；ＷＯ  ９１０４３１６を参照のこと、ＮＧＦ；ＷＯ  ９３１０１５０を参照のこと）、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子）、ｔ−ＰＡのような血栓溶解因子（ＥＰ  ２９２００９、ＡＵ  ８６５３３０２、およびＥＰ  １７４８３５を参照のこと）、およびストレプトキナーゼ（ＥＰ  ４０７９４２を参照のこと）、ヒト成長ホルモン（ＪＰ  ９４０３０５８２および米国特許第４，７４５，０６９を参照のこと）および他の動物のソマトトロピン、インテグリン、および他の細胞接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１およびＥＬＡＭ（上記の「異種配列」もまた参照のこと））、ならびに他の増殖因子（例えば、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質−１（Ｏｚｋａｙｎａｋら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ９：  ２０８５−２０９３，  １９９０））、ならびに他の骨形成性タンパク質（例えば、ＢＭＰ−４、Ｎａｋａｓｅら，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  ９：  ６５１−６５９，  １９９４）を含むがこれらに限定されない。
【０１９８】
７．リンホカインおよびリンホカインレセプター
上記のように、本発明はまた、遺伝子送達ビヒクルを提供し、この遺伝子送達ビヒクルは、他の機能の中でも、１つ以上のサイトカインまたはサイトカインレセプターの発現を指向し得る。簡単に述べれば、ガン治療剤としてのそれら役割に加え、サイトカインは、特定の病状を生じるネガティブな効果を有し得る。例えば、ほとんどの休止Ｔ細胞、Ｂ細胞、大型の顆粒状リンパ球および単球は、ＩＬ−２Ｒ（レセプター）を発現しない。正常な休止細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現の欠如とは対照的に、ＩＬ−２Ｒは、特定の白血病（ＡＴＬ、毛様細胞性白血病、ホジキン病、急性および慢性の顆粒球性白血病）、自己免疫疾患を患う患者の異常細胞によって発現され、そして同種移植片拒絶に関連する。興味深いことに、これらの患者のほとんどにおいて、ＩＬ−２Ｒの可溶性形態の血清濃度が上昇する。従って、本発明の特定の実施態様では、可溶性形態のサイトカインレセプターの血清濃度を増大することによって、治療が達成され得る。例えば、ＩＬ−２Ｒの場合には、遺伝子送達ビヒクルが、可溶性のＩＬ−２ＲおよびＩＬ−２Ｒの両方を生成するために操作され得、これにより高い親和性の可溶性レセプターが作られる。この構成において、血清ＩＬ−２レベルが減少し、パラクリンループを阻害する。この同じストラテジーはまた、自己免疫疾患に対しても有効であり得る。特に、いくつかの自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチＳＬＥ）はまた、ＩＬ−２の異常発現に関係するので、レセプターの血清レベルを増加させることによってＩＬ−２の作用をブロックすることもまた、このような自己免疫疾患を処置するために利用され得る。
【０１９９】
他の場合においても、ＩＬ−１のレベルを阻害することが有益であり得る。簡単に述べれば、ＩＬ−１は、２つのポリペプチドＩＬ−１およびＩＬ−１からなり、これらは各々多面発現効果を有する。ＩＬ−１は、微生物産物または炎症による刺激に応答して、主として単核食細胞により合成される。ＩＬ−１Ｒの天然に存在するアンタゴニストが存在し、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（「ＩＬ−１Ｒａ」）と呼ばれる。このＩＬ−１Ｒアンタゴニストは、成熟ＩＬ−１と同じ分子サイズを有し、そしてそれと構造的に関係がある。しかし、ＩＬ−１ＲａのＩＬ−１Ｒへの結合は、任意のレセプターのシグナル伝達を開始しない。従って、この分子は、可溶性レセプターとは異なる作用機構を有し、これはサイトカインと複合体化し、それゆえレセプターとの相互作用を防げる。ＩＬ−１は、正常なホメオスタシスにおいて重要な役割を果たしていないようである。動物においては、ＩＬ−１レセプターに対する抗体は、内毒素および他の炎症誘発剤による、炎症および食欲不振を弱める。
【０２００】
敗血症ショックの場合において、ＩＬ−１は、強力な血管拡張剤である２次化合物を誘導する。動物においては、外部から供給されたＩＬ−１は平均動脈圧を減少させ、そして白血球減少症を誘発する。ＩＬ−１に対する中和抗体は、動物において、内毒素誘発熱を下げる。ＩＬ−１Ｒの３日間連続的な注入治療を受けた敗血症ショック患者の研究において、２８日の死亡率は１６％であり、これに対してプラシーボ注入を受けた患者は４４％であった。自己免疫疾患の場合には、ＩＬ−１活性の減少が、炎症を減少させる。同様に、組換えレセプターを用いたＩＬ−１活性のブロックは、さらに、おそらく炎症を減少させることにより、動物における同種移植の生存性の増加をもたらし得る。
【０２０１】
これらの疾患は、遺伝子送達ビヒクルを操作して、可溶性レセプターまたはより詳細には、ＩＬ−１Ｒａ分子を生成し得るさらなる例を提供する。例えば、敗血症ショックを受けた患者において、  ＩＬ−１Ｒａ生成ベクター粒子の単一の注射が、組換えＩＬ−１Ｒの連続的注入を必要とする現行のアプローチに取って代わり得る。
【０２０２】
サイトカイン応答性、またはより詳細には、不正確なサイトカイン応答性はまた、感染性疾患の制御または消散の不全に関与し得る。おそらく、最も良く研究された例は、強力で、しかし逆効果のＴＨ２優勢応答を有するマウスおよびヒトのリーシュマニア症の非回復形態である。同様に、癩腫癩が、優勢で、しかし不適切なのＴＨ２応答に関与する。これらの症状において、遺伝子送達ビヒクルは、固形腫瘍の治療について提案される部位特異的アプローチとは反対に、ＩＦＮγの循環レベルを増加させるために有用であり得る。ＩＦＮγは、ＴＨ−１  Ｔ細胞により生成され、そしてＴＨ−２サブタイプ増殖のネガティブレギュレーターとして機能する。ＩＦＮγはまた、ＩｇＥへのアイソタイプスイッチングを含む、Ｂ細胞に対する多くのＩＬ−４媒介効果を拮抗する。
【０２０３】
ＩｇＥ、肥満細胞、および好酸球は、アレルギー反応の媒介に関与する。ＩＬ−４は、Ｔ細胞の分化に作用してＴＨ−２の発達を刺激する一方、ＴＨ−１応答を阻害する。従って、アルファウイルスに基づく遺伝子治療はまた、伝統的なアレルギー治療と共に達成され得る。１つの可能性は、少量の攻撃アレルゲン（すなわち、伝統的なアレルギー注射）と共に、ＩＬ４Ｒを生成する遺伝子送達ビヒクルを送達することである。可溶性ＩＬ−４Ｒは、ＩＬ−４の活性を防げ、そしてそれゆえ、強力なＴＨ−２応答の誘導を防げる。
【０２０４】
８．自殺ベクター
本発明の１つのさらなる局面は、パッケージング／プロデューサー細胞株における野生型アルファウイルスの蔓延を制限するための、遺伝子送達ビヒクル自殺ベクターの使用に関する。簡略には、１つの実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、ベクターの連結領域の３’配列、およびパッケージング細胞株発現ベクターの５’アルファウイルス構造配列との間のＲＮＡ組換え事象から生じる、野生型アルファウイルス配列に特異的な、アンチセンスまたはリボザイム配列から構成される。アンチセンスまたはリボザイム分子は、特異的組換え配列の存在下においてのみ、温度安定性であり、そしてアルファウイルスパッケージング／プロデューサー細胞株においては、その他の効果を何も有さない。あるいは、毒性分子（例えば、本明細書中以下で開示される分子）はまた、野生型アルファウイルスの存在下のみで発現するベクターに関して発現され得る。
【０２０５】
９．転移性腫瘍の蔓延を妨げるための遺伝子送達ビヒクル
本発明の１つのさらなる局面は、悪性新生物の侵襲性を阻害または低減するための、遺伝子送達ビヒクルの使用に関する。簡略には、特に悪性疾患の程度は、代表的には腫瘍の血管新生に関係する。腫瘍の血管新生の１つの原因は、いくつかの腫瘍により発現される可溶性腫瘍血管新生因子（ＴＡＦ）（Ｐａｗｅｌｅｔｚら、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ９：１９７，  １９８９）の生成である。本発明の１つの局面において、腫瘍血管新生は、ＴＡＦに特異的なアンチセンスまたはリボザイムＲＮＡ分子を発現するために遺伝子送達ビヒクルを利用することによって遅らされ得る。あるいは、抗血管新生因子（Ｍｏｓｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１４０８，  １９９０；  Ｓｈａｐｉｒｏら、ＰＮＡＳ  ８４：２２３８，  １９８７）が、単独または上記のリボザイムもしくはアンチセンス配列との組み合わせのいずれかで、腫瘍の血管新生を遅らせるかまたは阻害する目的で、発現され得る。あるいは、遺伝子送達ビヒクルはまた、周辺組織上のＴＡＦレセプターに対して特異的な抗体を発現するために用いられ得る。
【０２０６】
１０．遺伝子送達ビヒクルの投与
本発明の他の局面において、脊椎動物または昆虫に遺伝子送達ビヒクルを投与するための方法が提供される。簡略には、遺伝子送達ビヒクルの最終的な投与様式は、通常特定の治療適用、ベクターの効力を増加させる最良の様式、および最も便利な投与経路に依存する。一般的に、この実施態様は、例えば（１）血流への直接注入；（２）特定の組織または腫瘍への直接注入；（３）経口投与；（４）鼻内吸入；（５）粘膜組織への直接塗付；または（６）脊椎動物もしくは昆虫への形質導入自己細胞のエクスビボ投与により、送達されるように設計され得る遺伝子送達ビヒクルを含む。本発明の特定の実施態様において、エクスビボ適用のためには、細胞はまず宿主から取り出され、少なくとも部分的に精製された細胞集団（例えば、ＣＤ３４＋幹細胞、Ｔ細胞など）を生じるためにポジティブおよび／またはネガティブに選択され、本発明の遺伝子送達ビヒクルの１つを用いて形質導入、トランクフェクトもしくは感染され、そして同じ宿主または別の個体のいずれかに再導入され得る。
【０２０７】
従って、治療用遺伝子送達ビヒクルは、ベクターが（ａ）正常な健常細胞を形質導入し、かつ細胞を形質転換して、全身的または局所的に分泌される治療用タンパク質または物質のプロデューサーにする、（ｂ）異常または欠陥のある細胞を形質転換して細胞を正常な機能性表現型に転換する、（ｃ）異常な細胞をそれが破壊されるように形質転換する、および／または（ｄ）細胞を形質導入して免疫応答を操作する、ことができるような様式で、投与され得る。
【０２０８】
１１．転写因子活性の調節
さらに別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、感染細胞中の転写因子の増殖制御活性を調節するために利用され得る。簡略には、転写因子は、配列特異的トランス活性化または抑制を介して、遺伝子発現のパターンに直接的に影響を与える（Ｋａｒｉｎ，  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ２１  ：  １２６−１３１，  １９９０）。従って、変異された転写因子がガン遺伝子のファミリーを表すことは驚くべきことではない。遺伝子送達ビヒクルは、例えば、その調節されない増殖が腫瘍形成性転写因子により活性化される腫瘍細胞、ならびにホモダイマーおよびヘテロダイマーのトランス活性化または抑制性の転写因子複合体の形成において共同して結合を促進または阻害するタンパク質に対する制御を復帰させるために使用され得る。
【０２０９】
細胞増殖を逆転させる１つの方法は、ｃ−ｍｙｃ／Ｍａｘヘテロダイマー転写因子複合体のトランス活性化の潜在能力を阻害することである。簡略には、核ガン遺伝子ｃ−ｍｙｃは、細胞を増殖させることにより発現され、そしていくつかの異なる機構（レトロウイルス挿入、増幅、および染色体転座を含む）により活性化され得る。Ｍａｘタンパク質は静止細胞中で発現され、そしてｃ−ｍｙｃとは独立して、単独でまたは未同定の因子とともにのいずれかで発現され、ｍｙｃ／Ｍａｘヘテロダイマーにより活性化されるものと同じ遺伝子の発現を抑制するように機能する（Ｃｏｌｅ，  Ｃｅｌｌ  ６５  ：  ７１５−７１６，  １９９１）。
【０２１０】
腫瘍細胞のｃ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｃ／Ｍａｘ増殖の阻害は、遺伝子送達ビヒクルにより制御される標的細胞中でのＭａｘの過剰発現により達成され得る。Ｍａｘタンパク質はわずか１６０アミノ酸（４８０ヌクレオチドのＲＮＡ長に相当する）であり、そして独立してまたは細胞の増殖制御を放出する因子に標的化された他の遺伝子および／もしくはアンチセンス／リボザイム部分とともにのいずれかで、遺伝子送達ビヒクルに容易に組み込まれる。
【０２１１】
ホモ／ヘテロ複合体会合の調節は、転写因子活性化遺伝子発現を制御するための別のアプローチである。例えば、トランス活性化転写因子ＮＦ−Ｂの細胞質から核への輸送は、阻害剤タンパク質ＩＢとともにヘテロダイマー複合体中にある間は防止される。種々の物質（特定のサイトカインを含む）による誘導に際して、ＩＢはリン酸化され、そしてＮＦ−Ｂは放出され、そして核に輸送され、ここでこれはその配列特異的トランス活性化機能を発揮し得る（ＢａｅｕｅｒｌｅおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２  ：  ５４０−５４６，  １９８８）。ＮＦ−Ｂ／ＩＢ複合体の解離は、ＩＢのリン酸化部位を抗体でマスクすることにより防止され得る。このアプローチは、ＮＦ−ＩＢ転写因子の核への移行を防止することにより、ＮＦ−ＩＢ転写因子のトランス活性化活性を有効に阻害する。標的細胞におけるＩＢリン酸化部位特異的抗体またはタンパク質の発現は、アルファウイルス遺伝子移入ベクターを用いて達成され得る。本明細書に記載したアプローチと類似のアプローチは、ｊｕｎタンパク質とｆｏｓタンパク質との間の会合を阻害することにより、トランス活性化転写ヘテロダイマー因子ＡＰ−１（ＴｕｒｎｅｒおよびＴｉｊａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３  ：  １６８９−１６９４，  １９８９）の形成を防止するために使用され得る。
【０２１２】
１２．組換えタンパク質の生成
本発明の別の局面において、トガウイルス（アルファウイルスを含む）遺伝子送達ビヒクルが、真核生物細胞中（エクソビボ、インビボ、または確立された細胞株）で１つ以上の組換えタンパク質の発現を指向するために利用され得る。本明細書中で使用される「組換えタンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、酵素、またはそれらのフラグメントをいう。このアプローチを使用して、治療用または他の商業的実用性を有するタンパク質が、費用に関してさらに効率よく生成され得る。さらに、真核生物細胞中で生成されたタンパク質は、原核生物細胞中で発現されたタンパク質と比較して翻訳後により確実に修飾（例えば、グリコシル化、硫酸化、アセチル化など）され得る。さらに、このような系は種々の化学的化合物（例えば、精製化学薬品または特別な化学薬品）のインビボ生成に使用され得る。
【０２１３】
この局面において、所望のタンパク質、酵素、または酵素経路（所望の化学薬品の生成に必要とされ得るような）をコードする遺伝子送達ビヒクルは、適切な真核生物細胞に形質転換、トランスフェクト、形質導入、またはそれ以外の方法で導入される。このような系を使用して生成され得るタンパク質の代表例として以下が挙げられるが、これらに限定されない：インスリン（Ｕ．Ｓ．  ４，４３１，７４０およびＢＥ  ８８５１９６Ａを参照）、ヘモグロビン（Ｌａｗｎら、Ｃｅｌｌ  ２１：６４７−５１，  １９８０）、エリスロポエチン  （ＥＰＯ；Ｕ．Ｓ．４，７３０，００８を参照）、巨核球成長および分化因子（ＭＧＤＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｇ−ＣＳＦ（Ｎａｇａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：４１５−４１８，  １９８６）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ（ＷＯ  ８７０６９５４を参照）、ｆｌｔ３リガンド（Ｌｙｍａｎら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：１１５７−１１６７）、ＥＧＦ、酸性および塩基性ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、インターロイキンまたはインターフェロンファミリーのメンバー（前出）、神経向性因子（例えば、ＢＤＮＦ；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２９：１２８９−１２９４，  １９９１、ＮＴ−３；ＷＯ  ９１０３５６９を参照、ＣＮＴＦ；ＷＯ  ９１０４３１６を参照、ＮＧＦ；ＷＯ  ９３１０１５０を参照）、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子）、ｔ−ＰＡのような血栓崩壊因子（ＥＰ  ２９２００９、ＡＵ  ８６５３３０２、およびＥＰ  １７４８３５を参照）およびストレプトキナーゼ（ＥＰ  ４０７９４２を参照）、ヒト成長ホルモン（ＪＰ  ９４０３０５８２およびＵ．Ｓ．  ４，７４５，０６９を参照）および他の動物のソマトトロピン、インテグリン、および他の細胞接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１およびＥＬＡＭ）（上記の他の「異質配列」もまた参照）、ならびに他の成長因子（例えば、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質−１（Ｏｚｋａｙｎａｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ９：２０８５−２０９３，１９９０）、ならびに他の骨形態発生タンパク質（例えば、ＢＭＰ−４、Ｎａｋａｓｅら、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  ９：６５１−６５９，  １９９４））。当業者に明らかなように、一旦特徴づけられると、任意の遺伝子が、本発明に従って遺伝子送達ビヒクル中に容易にクローニングされ、続いて適切な宿主細胞中に導入され、そして所望の遺伝子を発現し得る。
【０２１４】
本明細書中に記載されるベクターおよびアルファウイルスパッケージング細胞株を使用する組換えタンパク質の生成方法が、提供される（実施例６および７を参照）。簡潔には、組換えタンパク質をコードする遺伝子送達ビヒクル（インビトロで転写されたＲＮＡの形態、プラスミドＤＮＡの形態、または組換えベクター粒子の形態）は、アルファウイルスパッケージング細胞株（ＰＣＬ）中に（トランスフェクションまたは感染を介して）導入され得、その結果培養細胞の小さい画分（≦１％）のみがベクター分子を含む。ベクターレプリコンは、ベクターＲＮＡの増幅後に、ＰＣＬからトランスで供給されるｓＰによってパッケージされる。これは、シンドビスウイルス複製ストラテジーに従って生じる。ついで、生成された組換えベクター粒子が培養物の残存している細胞に感染する。従って、組換えタンパク質発現の発生は、経時的に、組換えベクター粒子が生成され、続いてＰＣＬ培養物中の全細胞を感染させるという結果を生じる。同様に、ＰＣＬを有するベクター粒子の増幅は、他の適用のための大量の高力価の粒子ストックを生成するために使用され得る。本発明のなお別の局面において、プロデューサー細胞株からの組換えタンパク質の発現が記載される（実施例７を参照）。簡潔には、培養物への細胞外刺激因子の添加によってベクター粒子の生成が誘導され得る全ての遺伝子エレメント（ベクターレプリコン、および欠陥ヘルパー発現カセットを含む）を含む細胞株が誘導される。従って、ベクターコードされる組換えタンパク質の発現は、アルファウイルスベクター粒子プロデューサー細胞株の誘導の結果として生じる。本発明のなおさらに別の局面において、真核生物重層ベクター開始系で安定に形質転換された細胞株からの組換えタンパク質の発現が記載される（実施例７を参照）。簡潔には、目的の組換えタンパク質をコードする誘導性真核生物重層ベクター開始系カセットで安定に形質転換された細胞株が誘導される。従って、ベクターでコードされた組換えタンパク質の発現は、真核生物重層ベクター開始系カセットの誘導の結果として生じる。
【０２１５】
本明細書中に提供される開示を考慮すれば容易に理解されるように、ＲＮＡベクターレプリコン、真核生物重層ベクター開始系、または組換えベクター粒子を利用するタンパク質生成がまた、パッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株への導入以外の方法によっても達成され得る。例えば、所望のタンパク質を生成するために、そのようなベクターが広範な種々の他の真核生物宿主細胞株（例えば、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＣＨＯ、２９３、またはＨｅＬａ細胞）に導入、およびインビボまたはエキスビボで細胞に直接投与され得る。
【０２１６】
Ｊ．寄託情報
以下の物質がアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された：
【０２１７】
【化２】
2008200051.tif 000003
上記の物質は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約によって、カイロン  コーポレイションによってアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）に寄託された。受託番号は、電話番号（３０１）８８１−２６００でＡＴＣＣから入手可能である。
【０２１８】
これらの寄託物は、当業者に対する便宜として提供されるに過ぎず、そして米国特許法第１１２条の下で寄託が必要とされることの承認ではない。これらの寄託物の核酸配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中に記載の配列に誤りのある場合には参照されるべきである。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾は本明細書によって与えられるわけではない。
【０２１９】
以下の実施例は、本発明をより完全に説明するために含まれる。さらに、これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を提供し、そしてその範囲を制限することを意図しない。以下の実施例において記載される多くの手順または適切な変更手順の標準的な方法は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７）および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ＮＹ，  １９９０）のような分子生物学のマニュアルに広範に改編されて提供される。
【実施例】
【０２２０】
実施例
実施例１
ＳＩＮ１の単離および特徴付け
以下には、宿主の巨大分子合成の減少した阻害を示し、そして同じウイルスの溶解性、細胞病原性野生型株と比較して、脊椎動物細胞中での持続感染を確立し得るポジティブ鎖ＲＮＡウイルスの同定および分子の特徴付けが記載される。例えば、シンドビスウイルスが、アルファウイルス属の代表的な原型として使用される。
【０２２１】
Ａ．野生型シンドビスウイルスストックからのＳＩＮ−１の単離、プラーク精製、および特徴付け
シンドビスウイルス改変体株の単離、分子クローニング、および特徴付けを記載する。この株は、細胞変性性の非存在下で生産的な持続感染を確立し得るが、野生型ウイルスと同等のウイルスのレベルを生成する。
【０２２２】
高力価（＞１０８ＰＦＵ／ｍｌ）野生型ストックを、低ＭＯＩ（≦０．１）でシンドビスウイルス（ＣＭＣＣ  ＃４６３９）でのＢＨＫ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１０）の感染によって得た。感染を容易にするために、ウイルス接種物は、細胞に添加された場合に単層を覆うにちょうど十分な容量を含んだ。ＢＨＫ細胞を維持し、そして全てのウイルス希釈を、１０％ウシ胎児血清を補充したＥａｇｌｅ最少必須培地中で行った。細胞を３７℃で５％ＣＯ２大気中で培養した。「ラウンディングアップ（ｒｏｕｎｄｉｎｇ  ｕｐ）」で示される大量のＣＰＥ、接着の欠失、および単層中の個々の細胞の増大した光屈折、さらに単層の減少した全細胞密度を、感染後４８時間（ｈｐｉ）以内に観察した。細胞培養液を採集し、細胞の残骸を低速遠心分離（室温にて４，０００ｒｐｍで１０分間）によって除去し、そしてウイルスストックを等分して−７０℃で保存した。シンドビスウイルスストックの力価を、以前に記載された（Ｓｔｒａｕｓｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：１５４−１６８，  １９７６）ようなプラークアッセイによって決定した。簡潔には、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）単層を、ウイルスストックの種々の希釈物で感染させ、そして単層を０．７５％のアガロースを補充した培地で重層した。２４〜４８ｈｐｉで、細胞溶解によるプラークを可視化し、そして直接あるいはアガロースの重層を除去した後にクリスタルバイオレットで染色するかのいずれかによって定量した。ウイルス力価を、プラークを正確に定量したウイルス希釈物で感染させたサンプルから決定した。
【０２２３】
ＤＩ粒子を富化させたシンドビスウイルスストックを、ＢＨＫ細胞について高ＭＯＩ継代（≧５）を繰り返すことによって得た。ＢＨＫ単層を、ＭＯＩ＝５でシンドビスウイルスシードストックで最初に感染させた。培養培地を採集し、そして感染させた培地の完全な細胞溶解を観察した後（通常は２４ｈｐｉ以内）、低速遠心分離によって清澄化した。次いで、感染させた培養物から採集した清澄化した培地を、新鮮なＢＨＫ単層を感染させるために使用した。例えば、２ｍｌのウイルス接種物を、１０ｃｍのペトリ皿中の新鮮なＢＨＫ単層に添加した。１ｈｐｉ後、８ｍｌの新鮮な培地をウイルス感染培養物に添加した。上記のように、培養培地を採集し、培養物の完全な細胞溶解の観察の後に清澄化した。このプロセスを、感染後に発生するＢＨＫ単層細胞病原性が少なくとも４日目まで遅延される速度で繰り返した。感染後の細胞病原性の開始の遅延は、ウイルス調製物中の高レベルのＤＩ粒子の存在を示す。
【０２２４】
感染させた細胞培地の複数の連続的な未希釈の継代物に由来するウイルス調製物中の高レベルのＤＩ粒子の存在を、干渉アッセイまたはＢＨＫ感染細胞のＲＮＡ分析によって決定した。第１の方法において、相同干渉アッセイを、ＤＩ粒子の存在の測定として行った。簡潔には、ＢＨＫ細胞を、上記のように調製した高力価（＞１０８ＰＦＵ／ｍｌ）の野生型ストックでＭＯＩ＝１０で単独で感染させた。１６ｈｐｉで、ウイルス収量を、上記のようなプラークアッセイによって決定した。この実験によるウイルス収量は、代表的には１×１０９〜１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌであった。別の実験群において、ＢＨＫ細胞を、野生型ストック（ＭＯＩ＝１０）および感染させた細胞培地の複数の連続の未希釈の継代物によって調製したウイルスストック（ＭＯＩ＝５）で同時に共感染させた。上記のように、プラークアッセイによって１６ｈｐｉでウイルス収量を決定した。第２の実験群由来のウイルスストックが高レベルのＤＩ粒子を含む場合、ウイルス収量は、第１の実験よりも少なくとも２〜３桁少ない量（例えば、≦１×１０７ＰＦＵ／ｍｌ）である。
【０２２５】
ウイルス調製物中のＤＩ粒子の存在を示すさらに決定的な方法として、１６ｈｐｉでＢＨＫ感染細胞中のウイルス特異的ＲＮＡを分析した。簡潔には、ＢＨＫ細胞を、高力価（＞１０８ＰＦＵ／ｍｌ）の野生型ストック、またはＤＩ粒子を含有するウイルスストックで感染（ＭＯＩ＝１０）させた。偽感染コントロールおよび感染細胞をダクチノマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）で処理し、そして１〜１６ｈｐｉまで［３Ｈ］ウリジン（２０ｍＣｉ／ｍｌ）で標識した。ＲＮＡを、感染させた細胞およびコントロール細胞から、製造業者（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，Ｔｅｘａｓ）に記載されるようにＲＮＡｚｏｌ  Ｂを使用することによって単離した。あるいは、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，  Ｏｈｉｏ）を用いるか、またはＷｅｉｓｓら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１４：１１８９−１１９８，  １９７４）に記載されるように０．５％のＴｒｉｔｏｎおよび０．５％の再結晶ナフタレンジスルホン酸を含有する緩衝液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中で溶解させた細胞のフェノール抽出を使用する従来の方法によって、ＲＮＡを単離した。ＲＮＡをグリオキサールで変性させ、そして０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で調製した１．１％の水平なアガロースゲルを通して５Ｖ／ｃｍで電気泳動し得る（ＭｃＭａｓｔｅｒ  および  Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４：４８３５−４８３８，  １９７７）。あるいは、ＲＮＡを、ホルムアルデヒドゲルを通して電気泳動し得る。電気泳動後、ゲル乾燥機を用いて減圧下でゲルから全ての水分を除去し、そして乾燥させたゲルを蛍光間接撮影法で処理しそしてフィルムに曝した。ゲノムおよびサブゲノム種に対応する２つのＲＮＡ（それぞれ４２Ｓおよび２６Ｓ）を、野生型ウイルスストックで感染させたＢＨＫ細胞由来のサンプル中で観察した。対照的に、標準的な４２Ｓおよび２６ＳウイルスＲＮＡとは異なる多数のＲＮＡ種が、ＤＩ粒子を含有するウイルスストックで感染させたＢＨＫ細胞由来のサンプル中で観察された。ＤＩ  ＲＮＡに対応する複数のＲＮＡが、野生型ウイルス由来の２６Ｓ  ＲＮＡ種よりも小さい分子量で優先的に移動した。ＤＩ粒子を含有するウイルスストックで感染させたＢＨＫ細胞において観察される４２Ｓおよび２６Ｓ種に加えて、複数のＲＮＡの一例が、Ｗｅｉｓｓら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３３：４６３−４７３，１９８０）の図３レーン３に見られ得る。
【０２２６】
減少された細胞病原性を有する持続感染生成性を確立し得るシンドビスウイルス改変体株を単離し、そしてＤＩ粒子を富化されたウイルスストックから分子クローニングした。ＢＨＫ細胞をＤＩ粒子を富化させたシンドビスウイルスストックで高多重度（ＭＯＩ＝５）で感染させた。細胞病原性は、野生型ウイルスでのＢＨＫ細胞の感染と比較して遅く生じるが、ほとんどの細胞は最終的に溶解し、そしてプレートから分離した。細胞の残骸および非接着性細胞を、培地の交換によって２日おきに取り除いた。最初の感染後２週間以内に、別個の異なるコロニーが観察された。これらのコロニーを成長させ、そしてこれらは、未感染のＢＨＫ細胞コントロールと比較してＣＰＥの形態学的証拠を示さなかった。３〜４週間以内で、細胞コロニーは大きくなり、そして裸眼で識別可能であった。コロニーをクローニングリングで単離し、そして細胞を３ｍＭのＥＤＴＡまたはトリプシンのいずれかで分散させた。各コロニー由来の分散された細胞を、希釈せずに再度プレーティングした。その後、コンフルエントに到達したとき（一般に、４日以内）に細胞を１：１０希釈でサブクローニングした。ＢＨＫ（ＳＩＮ−１）と命名した細胞のアリコートを、長期間の貯蔵のために液体窒素中での５回の継代後に低温チューブ中に調製した。ＢＨＫ（ＳＩＮ−１）細胞は、増殖速度に関しておよび形態学的に、元の未感染のＢＨＫ細胞から区別できなかった。
【０２２７】
Ｂ．ＳＩＮ−１の分子クローニング
ＳＩＮ−１の実質的に低減された細胞病原性の発達に関連する、シンドビスゲノムの変異（単数または複数）を特徴づけるために、ＳＩＮ−１ビリオンからゲノムＲＮＡを単離し、逆転写させ、そして非構造タンパク質遺伝子を含む得られたｃＤＮＡを、以下にさらに完全に記載するように配列決定した。
【０２２８】
簡潔には、ＳＩＮ−１ウイルスを、ＲＮＡの単離に使用するストックの調製の前に３回プラーク精製した。ＢＨＫ（ＳＩＮ−１）細胞を上記のように増殖させ、培養液を採集し、そして種々の希釈を使用して初代ニワトリ胚線維芽細胞単層（ＣＥＦ、３％ウシ胎児血清を補充した最少必須培地中で増殖させた）を感染させた。感染後、０．５％の不活性な寒天を含有する培地を単層に添加した。さらに、ＤＥＡＥ−デキストラン（１００μｇ／ｍＬ）を、寒天重層培地中に含ませてＳＩＮ−１プラークの大きさを拡大し得る。個々の分離したプラークを、ＢＨＫ（ＳＩＮ−１）培養液の適切に希釈した接種物を用いて感染させたプレート中での３０℃で３日間のインキュベーション後に観察した。３回の精製後、クローニングしたＳＩＮ−１ウイルスを、ＭＯＩ＝０．１で感染させたＣＥＦ細胞中に、３０℃で１回継代した。プラーク精製したＳＩＮ−１ウイルス調製物を、上記のような、干渉アッセイおよびＢＨＫ感染細胞中でのＲＮＡ分析によってＤＩ粒子を含まないことを決定した。
【０２２９】
ＢＨＫ細胞を、プラーク精製したＳＩＮ−１ストックで感染させ（ＭＯＩ＝１０）、持続性を確立するこの野生型シンドビスウイルス改変体株の能力を決定した。上記のように、野生型シンドビスウイルスを有するＢＨＫ細胞中での持続感染の確立は、ウイルス調製物中のＤＩ粒子の存在、および僅かな生存細胞の増殖を可能にするための相当な時間を必要とする。対照的に、持続感染は、ＤＩ粒子がウイルス接種物中に存在するかどうかに関わらず、ＳＩＮ−１改変体で３７℃で感染させたＢＨＫ細胞中で容易に確立された。ＳＩＮ−１での感染後６日目に、ＢＨＫ細胞は、野生型シンドビスウイルスでの重感染に完全に耐性であり、このことは、持続感染の確立を示す。しかし、これらの細胞は、異種ウイルスＶＳＶによる感染に敏感であり、このことは、インターフェロンがＳＩＮ−１持続感染の確立に関与しないことを示す。
【０２３０】
ＣＥＦ細胞を、プラーク精製したＳＩＮ−１ストックで感染させ（ＭＯＩ＝１０）、ＲＮＡの単離のために高力価のウイルスストックを生成した。９０ｍｌの培養液（２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ）を、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＧＳＡローター中で２，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって清澄化した。ＳＩＮ−１ウイルスを、ＳＷ２７．１ローター中で２時間、２４，０００ｒｐｍ、４℃での遠心分離によって清澄化した培養液からペレット化した。次いで、ウイルスペレットを３ｍｌの培養培地中に再懸濁し、ピペッティングを繰り返すことによってホモジナイズし、そして２５〜４０％（ｗ／ｗ）のスクロース勾配の上に重層した。次いでこれを、ＳＷ２７．１ローター中で４時間、２４，０００ｒｐｍで４℃で遠心分離した。ウイルスのバンドを白熱光の照射で可視化し、そして２２ゲージ針／シリンジで採集した。ＲＮＡをＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄｉａｎａ）消化（５６℃、１時間）、続いてＨ２Ｏ−飽和フェノール：クロロホルム（１：１ｖ／ｖ、ｐＨ７．０）の等容量での抽出、続く２容量のエタノールおよび０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）での沈澱によってさらに精製した。
【０２３１】
あるいは、ＳＩＮ−１ウイルスを、感染させたＢＨＫ細胞培養培地のポリエチレングリコール沈澱（Ｓｔｒａｕｓｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３３：１５４−１６８，  １９７６）、あるいはスクロースクッションを通してピペッティングすること（Ｐｏｌｏら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６２：２１２４−２１３３，１９８８）によってさらに精製し得る。
【０２３２】
２回の第１鎖ｃＤＮＡの合成を、モロニーマウス白血病ウイルスまたはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用して製造者によって推奨される条件に従って、精製したウイルスＲＮＡを用いて行った。６回の別々の反応を、以下に示すポジティブ鎖に相補的なシンドビスウイルス特異的プライマー（Ｒで示されるプライマー）を用いて行った。Ｒで示される全てのプライマーは、クローニングを容易にするために、第１鎖の合成反応の前にポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてそれらの５’末端でリン酸化されていた。
【０２３３】
【化３】
2008200051.tif 000004
上記のｃＤＮＡテンプレート由来の第２鎖の合成を、製造者により推奨される条件に従ってＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）を用いて、６つの別々の反応において達成した。ネガティブ鎖に相補的なシンドビスウイルス特異的プライマー（上記でＦで示されるプライマー）を使用した。二本鎖ＤＮＡ産物を、全長のシンドビスウイルスゲノムを含有するプラスミドＴｏｔｏ１１０１（Ｒｉｃｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６１：３８０９−３８１９，１９８７）中の対応する領域と段階的に置換した。例えば、Ｔ７／１Ｆ−１４６５Ｒ産物をＳａｃＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩで消化し、ＳａｃＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩ消化しそしてＣＩＡＰ処理したＴｏｔｏ１１０１プラスミド（これは、１％アガロース／ＴＡＥ（５０×／リットル：２４２ｇ  Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅ／５７．１ｍｌ氷酢酸／１００ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）電気泳動およびＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩによりＳａｃＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩ小フラグメント（ＳＰ６プロモーター、シンドビスウイルス  ｎｔ  １−１４０７）から精製した）中に挿入した。次いで、この構築物をＥｃｏ４７ＩＩＩおよびＡｖｒＩＩ（それぞれ、シンドビスウイルスｎｔ番号１４０７および４２８１）で消化し、ＣＩＡＰで処理し、続いてＥｃｏ４７ＩＩＩおよびＡｖｒＩＩで消化した１００３Ｆ−４３０３Ｒ産物から単離した３３００ｂｐのフラグメントを挿入した。完全に組み立てたクローンを、ｐＲＳＩＮ−１ｇ（ｇは、全長のゲノムクローンを意味する）と命名し、これは１１，７０３ｂｐのウイルスゲノム全体を含む。先の表に列挙したプライマーのサブセットは、ＳＩＮ−１ゲノム中の重複する二本鎖ＤＮＡ反応産物を生成した。例えば、４０５１Ｆ／８１１５Ｒ産物中の配列は、１６８０Ｆ／８１１５Ｒ産物中に存在する。これらの重複する産物を、ＳＩＮ−１ゲノムクローンのための別の構築物として提供する。すなわち一般に、ｃＤＮＡクローニングの効率は所望のフラグメントの長さと反比例する。
【０２３４】
上記の方法によって得られなかったウイルスゲノムの一部をクローニングするために、ＳＩＮ−１  ＲＮＡウイルスゲノムを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってクローニングした。第１鎖の合成を上記のように達成した。上記のプライマー対を使用するシンドビスｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、Ｋｌｅｎｔａｑ１酵素およびＢａｒｎｅｓ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：２２１６−２２２０，  １９９４）に記載されるような反応条件を使用して、別々の反応として行った。あるいは、サーマラーゼ（Ｔｈｅｒｍａｌａｓｅ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｒｅｓｃｏ  Ｉｎｃ．，  Ｓｏｌｏｎ，  ＯＨ）を、供給者によって提供される１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する緩衝液を使用してＫｌｅｎｔａｑ１酵素について置換した。あるいは、ＶｅｎｔＲ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）を増幅反応に使用した。さらに、反応は、５％  ＤＭＳＯおよび「ＨＯＴ  ＳＴＡＲＴ  ＷＡＸ」ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含んだ。使用したＰＣＲ増幅プロトコールを以下に示す（７２℃での伸長インキュベーション期間を、テンプレートＤＮＡの１ｋｂあたり１分に調節した）：
【０２３５】
【化４】
2008200051.tif 000005
あるいは、全長のＳＩＮ−１  ＲＮＡゲノムのクローニングを、以前に記載された（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６）方法に類似の方法で行い得る。簡潔には、第１鎖ｃＤＮＡの合成を、ランダムヘキサマープライマー（５０ｎｇ／ｍｌの反応濃度）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および配列が以下の表に示されるプライマー４Ｂの混合物を用いて達成する。次いで、ゲノム長シンドビスウイルスＳＩＮ−１改変体ｃＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅する。重複するプライマーの６つの対を使用する６つの異なるセグメントが、全ゲノムをクローニングするために十分である。ウイルス相補配列に加えて、ＳＩＮ−１の５’末端正方向プライマーは、細菌のＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびその５’末端に連結されたＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ認識配列に対応する１９ヌクレオチド配列を含む。細菌のＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼは維持されて、その結果、インビトロの転写は、真正のシンドビスウイルスの５’末端に対応するＡリボヌクレオチドに連結された単一の非ウイルス性Ｇリボヌクレオチドのみの封入を生じる。ＡｐａＩ認識配列の封入は、プラスミドベクターｐＫＳＩＩ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）ポリリンカー配列中へのＰＣＲアンプリコンの挿入を容易にする。５ヌクレオチドの「緩衝配列」伸長がまた、効率的な酵素消化を容易にするためにＡｐａＩ認識配列の上流に連結される。ＳＰ６−５’  ＳＩＮ−１正方向プライマーおよび全体のＳＩＮ−１ゲノムの増幅に必要な全てのプライマー対の配列が、以下の表に示される（本明細書中以後利用される「ｎｔ」および「ｎｔｓ」が、それぞれ「ヌクレオチド（単数）」および「ヌクレオチド（複数）」を意味することに注意」）。参考配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＪＯ２３６３、遺伝子座：ＳＩＮＣＧ）は、Ｓｔｒａｕｓｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３３：９２−１１０，  １９８４による。
【０２３６】
【化５】
2008200051.tif 000006
上記のプライマー対を用いるシンドビスｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、ＴｈｅｒｍａｌａｓｅまたはＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（上記）、上記のような反応条件およびＰＣＲ増幅条件を使用して別々の反応として行う。
【０２３７】
増幅産物間の配列重複の領域は、ＰＣＲアンプリコン内の単一の酵素認識部位に対応する。ＰＣＲ産物を精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット、Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ｐＫＳＩＩ＋ベクターのＡｐａＩおよびＸｂａＩ部位の間に段階的に挿入した。完全に組み立てたクローンをｐＫＳＲＳＩＮ−１ｇ（ｇは全長のゲノムクローンを意味する）と命名し、そしてこれは、１１，７０３ｂｐのウイルスゲノム全体を含む。
【０２３８】
Ｃ．ＳＩＮ−１表現型の配列
ｐＲＳＩＮ−１ｇクローンのＳＩＮ−１特異的ヌクレオチド配列を、ジデオキシ鎖終結法によって決定した。ウイルス配列の８，０００ｂｐの配列比較は、本明細書中に記載のＳＩＮ−１クローンとＧｅｎＢａｎｋ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｊ０２３６３号、遺伝子座：ＳＩＮＣＧ）において提供されるシンドビスウイルス（ＨＲｓｐ株）配列との間の複数の差異を明らかにした。ＳＩＮ−１（図６）、ＳＩＮＣＧ（図７）、およびＴｏｔｏ１１０１（図８）の間の配列における差異を以下に示す。
【０２３９】
【化６】
2008200051.tif 000007
＊この変異は１つのｃＤＮＡクローンにおいて見出された。これはＳＩＮ−１ウイルスＲＮＡが配列決定された場合には検出されなかった。これはＲＮＡ集団におけるマイナーな種を表しているようである。
【０２４０】
配列変化が本明細書中に記載のクローンに独特である（そしてクローン化人工産物の結果ではない）という証明を、上記のＲＴ−ＰＣＲによりＳＩＮ−１ビリオンＲＮＡを増幅し、問題のヌクレオチドを含む配列をＲＴ−ＰＣＲアンプリコン産物の直接の配列決定によって確立し、そしてその配列を対応するＳＩＮ−１配列と比較することによって決定した。
【０２４１】
Ｄ．分子クローンを用いるＳＩＮ−１表現型の特徴付けおよび遺伝子マッピング：
ＳＩＮ−１ゲノムの種々の領域によって、存続性の確立のための表現型の位置をマッピングするために、Ｔｏｔｏ１１０１プラスミドの対応する野生型シンドビスウイルス領域を置換した（Ｒｉｃｅら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６１：３８０９−３８１９，  １９８７）。以下の表に例示するように、種々のＳＩＮ  ｎｓＰ遺伝子によって、ｐＲＳＩＮ−１ｇから精製した制限酵素フラグメントを使用して、Ｔｏｔｏ１１０１野生型シンドビスウイルスバックグラウンドを置換した。
【０２４２】
【化７】
2008200051.tif 000008
非構造遺伝子コード領域の座標を以下の表に提供する：
【０２４３】
【化８】
2008200051.tif 000009
種々のＳＩＮ−１、Ｔｏｔｏ、およびキメラＳＩＮ−１／Ｔｏｔｏクローン、ｐＲＳＩＮ−１ｇ、Ｔｏｔｏ、ｐＲＳＩＮ−１ｎｓＰ１、ｐＲＳＩＮ−１ｎｓＰ２、ｐＲＳＩＮ−１ｎｓＰ２−Ｎ、ｐＲＳＩＮ−１ｎｓＰ２−Ｃ、ｐＲＳＩＮ−１ｎｓＰ３、ｐＲＳＩＮ−１ｎｓＰ４、およびｐＲＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４を、Ｘｈｏ  Ｉでの消化によって直線化した。これによって、シンドビスウイルス３’末端（ウイルスｎｔ．  １１７０３）に続くポリｄＡ：ｄＴトラクトに直ちに隣接し、そしてその２１ヌクレオチド下流にあるｃＤＮＡクローン中の単一のカットが作製された。直線化クローンをＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ（ＢＩＯ  １０１，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で精製し、そして０．５μｇ／μｌの濃度に調整した。直線化クローンの転写を、以下の反応条件に従って、４０℃にて９０分間、インビトロで実施した：２μｌ  ＤＮＡ／４．２５μｌ  Ｈ２Ｏ）；１０μｌ  ２．５ｍＭ  ＮＴＰ（ＵＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ）；１．２５μｌ  ２０ｍＭ  Ｍｅ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ；１．２５μｌ  １００ｍＭ  ＤＴＴ；５μｌ  ５×転写緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；０．５μｌ  ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；０．２５μｌ  １０μｇ／μｌウシ血清アルブミン；および０．５μｌ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）。インビトロ転写反応産物をＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化し、連続的なフェノール：ＣＨＣｌ３およびエーテル抽出、ならびに続くエタノール沈澱によって精製した。あるいは、インビトロ転写反応産物を、トランスフェクションのために直接使用し得る。インビトロ転写反応産物または精製ＲＮＡを、市販の陽イオン性脂質化合物（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ，  ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）と複合体化し、そして７５％のコンフルエンシーで６０ｍｍペトリ皿中に維持されたＢａｂｙ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｋｉｄｎｅｙ−２１（ＢＨＫ−２１）細胞に適用した。あるいは、ＢＨＫ細胞をインビトロ転写反応産物または精製ＲＮＡと共に、以前に記載されたように（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６−１３６１，  １９９１）正確にエレクトロポレートした。トランスフェクトした細胞を３７℃でインキュベートした。トランスフェクト後４８時間にて培養培地を収集し、そして各ウイルスの力価を、上記のようにプラークアッセイによって決定した。これらのインビトロ転写反応に由来する、力価測定したウイルスストックを、以下の表に示すように命名した。
【０２４４】
【化９】
2008200051.tif 000010
ＳＩＮ−１存続性表現型をマッピングするために、８×１０５のＢＨＫ細胞を上記で調製したウイルスストックの各々で感染させた（ＭＯＩ＝５）。感染後３日にて、培養の生存性をトリパンブルー色素排除によって決定した。この実験の結果（以下に示す）は、存続性非細胞破壊感染を確立するＳＩＮ−１表現型が、非構造遺伝子をマッピングし、そして特にｎｓＰ２遺伝子をマッピングすることを実証した。偽感染培養における細胞の数は、これらの細胞が定常期に達するまでの継続した増殖を表す。３ｄｐｉにて、ＳＩＮ−１ｎｓＰ１、ＳＩＮ−１ｎｓＰ３、ＳＩＮ−１ｎｓＰ３−４、およびＳＩＮ−１ｎｓＰ４に感染した細胞は全て死滅した。ＳＩＮ−１ｎｓＰ２およびＳＩＮ−１ｎｓＰ４での感染を生き抜いた細胞は増殖し続け、そしてこれをシンドビスウイルスに特異的な抗体での染色に基づいて持続的に感染させた。
【０２４５】
【化１０】
2008200051.tif 000011
上記のように、非細胞破壊存続性感染を確立する観察されたＳＩＮ−１表現型は、ｓＰとは反対にｎｓＰをマッピングする。この結論は、ＴｏｔｏまたはＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４ウイルスストックに感染した培養間での細胞生存レベルの比較によって明確に実証された。ＴｏｔｏおよびＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４ウイルスの両方が、野生型ｓＰを含有する；しかし、ＳＩＮ−１クローンに由来するｎｓＰを含有するウイルス（ＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４）に感染したそれらの培養においてのみ、細胞生存が観察された。これらの実験において、細胞生存はシンドビスウイルスｓＰの供給源に依存しない。重要なことに、ＳＩＮ−１表現型は、さらにｎｓＰ２にマッピングされた。細胞生存のレベルは、ＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４またはＳＩＮ−１ｎｓＰ２ウイルスに感染した培養間で匹敵していた。さらに、ＳＩＮ−１ｎｓＰ２遺伝子中のヌクレオチド３８５５におけるＣ→Ｔ転位は、ＳＩＮ−１ウイルス感染細胞における存続性感染の確立の特徴的な表現型を担っている。キメラウイルスＳＩＮ−１ｎｓＰ２−Ｃ感染細胞中で産生されたｎｓＰ２タンパク質における単一のプロリンからセリンの変化が、感染細胞の全てを死滅させたウイルス由来の野生型シンドビスウイルス（Ｔｏｔｏ  １１０１）を、感染細胞の多くが生存しそしてウイルスを産生し続けるのを可能にするウイルスに転換するのに必要な全てであった。ＴｏｔｏバックグラウンドへのＳＩＮ−１  ｎｓＰ１、ｎｓＰ３、またはｎｓＰ４遺伝子の挿入に由来するキメラウイルスの表現型は、野生型から区別不可能であり、そして完全な溶解が、これらのウイルスに感染した培養において観察された。
【０２４６】
ＳＩＮ−１  ｎｓＰにおけるアミノ酸変化の、ＢＨＫ細胞における増殖性感染のレベルに対する可能な効果を、種々のＳＩＮ−１、野生型（Ｔｏｔｏ）、またはＳＩＮ−１／Ｔｏｔｏキメラ株で接種したＢＨＫ細胞における、一定期間にわたるウイルス収量を比較することによって決定した。簡潔には、ＢＨＫ細胞を、ＳＩＮ−１（上記のプラーク精製したストック）、Ｔｏｔｏ、ＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４、またはＳＩＮ−１ｎｓＰ２ウイルスで感染させ（ＭＯＩ＝２０）、そして培養液を感染後３、６、９、および１２時間にて収集した。次いで、培養液中のウイルスの力価を、上記のようにプラークアッセイによって決定した。この研究の結果（図２に示す）は、等価なレベルのウイルスが、野生型またはＳＩＮ−１株に感染したＢＨＫ細胞において産生されたことを実証した。１２ｈｐｉの時点における実際のウイルス力価を、以下の表に示す。ＢＨＫ細胞の半分より多くが、野生株と等価なウイルス産生のレベルと組み合わせたＳＩＮ−１ウイルス（およびＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４、またはＳＩＮ−１  ｎｓＰ２を含有するキメラウイルス）での感染を生き抜いた。
【０２４７】
【化１１】
2008200051.tif 000012
ＳＩＮ−１  ｎｓＰにおけるアミノ酸変化の、ウイルス特異的ＲＮＡ合成のレベルに対する可能な効果を、種々のＳＩＮ−１、野生型（Ｔｏｔｏ）、またはＳＩＮ−１／Ｔｏｔｏキメラ株で接種したＢＨＫ細胞における、一定期間にわたる［３Ｈ］−ウリジン取り込みのレベルを比較することによって決定した。ＢＨＫ細胞（３×１０５細胞／３５ｍｍ皿）を、本明細書中に記載の条件に従って３７℃で増殖させた。細胞を、ＳＩＮ−１、Ｔｏｔｏ１１０１、ＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４、またはＳＩＮ−１ｎｓＰ２ウイルスで感染させた（ＭＯＩ＝２０）。感染後３０分にて、培養培地を１μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤに調整した。さらなる３０分のインキュベーションの後、培養培地を１０μＣｉ／ｍｌ  ［３Ｈ］−ウリジンに調整した。３、６、９、および１２ｈｐｉにて、処理した細胞をＰＢＳで洗浄し、そして２００μｌのＴＴＥ緩衝液（０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の添加によって溶解させた。このＲＮＡを、２００μｌの２５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液の添加によって４℃で沈澱させた。このＲＮＡを、１４，０００ｒｐｍで５分間の微小遠心分離（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）によってペレット化し、５％  ＴＣＡで１回リンスし、そして５０ｍＭ  ＮａＯＨ／０．１％  ＳＤＳからなる溶液に５５℃で溶解させた。溶解したＲＮＡを含有する溶液を、シンチレーションバイアルに移し、そして取り込まれた［３Ｈ］−ウリジンのレベルを、ＥｃｏＬｕｍｅ（ＩＣＮ，  Ｉｒｖｉｎｅ，  ＣＡ）シンチレーション液を使用して決定した。この研究の結果（図３に示す）は、ウイルス特異的ＲＮＡのレベルが、ＳＩＮ−１感染ＢＨＫ細胞において野生型と比較して劇的に低いことを実証した。この低レベルのウイルス特異的ＲＮＡ合成の表現型は、ＳＩＮ−１またはＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４株に感染したＢＨＫ細胞において産生される、野生型と比較して同等に低いレベルのＲＮＡによって示されるように、ｎｓＰにマッピングする。
【０２４８】
【化１２】
2008200051.tif 000013
感染したＢＨＫ細胞におけるウイルス特異的ＲＮＡ合成もまた、ＳＩＮ−１株、Ｔｏｔｏ株、およびＳＩＮ−１／Ｔｏｔｏキメラ株の全てを使用して決定した。９ｈｐｉでの野生型感染（Ｔｏｔｏ）と比較しての［３Ｈ］−ウリジン取り込みのレベルを、図４に示し、そして以下の表に提供する。
【０２４９】
【化１３】
2008200051.tif 000014
従って、ＢＨＫ細胞はＳＩＮ−１ウイルス（およびＳＩＮ−１  ｎｓＰ１−４、またはＳＩＮ−１  ｎｓＰ２を含有するキメラウイルス）での感染を生き抜き、野生型株と同等のＳＩＮ−１ウイルスレベルがＢＨＫ細胞において産生され、そして合成されたウイルス特異的ＲＮＡのレベルは、野生型ウイルスと比較して１０倍低かった。
【０２５０】
ＳＩＮ−１  ｎｓＰにおけるアミノ酸変化の、宿主細胞タンパク質合成の阻害のレベルに対する可能な効果を、種々のＳＩＮ−１、野生型（Ｔｏｔｏ）、またはＳＩＮ−１／Ｔｏｔｏキメラ株で接種したＢＨＫ細胞における一定期間にわたるタンパク質合成のレベルを、非感染細胞に対して比較することによって決定した。簡潔には、２×１０５ＢＨＫ細胞で播種した３５ｍｍ皿を、ＰＢＳ／１％ウシ胎児血清からなる緩衝液中０．５ｍｌウイルス接種材料中の種々のシンドビスウイルス株で感染させた（ＭＯＩ＝２０）。プレートを４℃で１時間、穏やかに振盪させながらインキュベートした。接種材料を、上記のように、１０％ウシ胎児血清を含有する２ｍｌの培地（前記）で置換し、そして皿をＣＯ２インキュベーター中に３７℃で配置した。５、８、および１１時間後にて、培地を２％のウシ胎児血清を有する２ｍｌのメチオニン欠乏ＭＥＭ（Ｍｅｔ−）で置換し、そして３０分間インキュベートした。次いで培地を２％ウシ胎児血清および１０μＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］メチオニンを含有する１ｍｌのＭＥＭ（Ｍｅｔ−）で置換した。３７℃で３０分間のインキュベーションに続いて、１０％のウシ胎児血清を含有する１ｍｌの培地を各ウェルに添加し、そして皿を３７℃でさらに３０分間インキュベートした。この希釈は、タンパク質への放射活性標識のさらなる取り込みを阻害するのに十分であり、そしてポリアクリルアミドゲル中で検出される遊離の［３５Ｓ］メチオニンのバックグラウンドを有意に減少させる。次いで、培地をウェルから取り出した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、皿からＰＢＳへと削ぎ落とし、遠心分離によってペレット化し、そして２５μｌのローディング緩衝液（０．０６Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．７）、２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール、５％グリセロール、０．０５％ブロモフェノールブルー）中に溶解させた。サンプルの５分の１をゲル上で分析した。電気泳動の後、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅブリリアントブルーＲで染色し、乾燥させ、そしてオートラジオグラフした。宿主細胞タンパク質合成の阻害の速度を、宿主タンパク質のみを含有するゲルの切片における放射活性の量を定量化することによって比較した。この研究の結果（図５に示す）は、宿主細胞タンパク質合成の阻害のレベルが、ＳＩＮ−１ウイルス感染細胞において、野生型ウイルス感染細胞と比較して有意に低く、特に、より早期である感染後６時間および９時間の時点において低いことを実証する。
【０２５１】
要約すると、ＢＨＫ細胞はＳＩＮ−１感染を生き抜き、野生型株と等価なウイルスレベルがＢＨＫ細胞において産生され、合成されるウイルス特異的ＲＮＡのレベルは野生型ウイルスよりも１０倍低く、そしてＳＩＮ−１ウイルス感染細胞における宿主細胞タンパク質合成の阻害のレベルは、野生型ウイルス感染細胞と比較して有意に低い。本明細書中に記載のＳＩＮ−１ウイルスの表現型は、ウイルスｎｓＰ遺伝子にマッピングする。
【０２５２】
実施例２
宿主巨大分子合成の減少した阻害を示すポジティブ鎖ＲＮＡウイルスの単離および特徴付け
宿主細胞巨大分子合成の減少した阻害、遅延した阻害、または阻害なしの所望の表現型を示すウイルス改変体の誘導は、野生型ウイルスの配列と異なる配列の生成、特徴付け、および単離に依存する。しかし、実施例１を除いて、このウイルスに基づく巨大分子合成の阻害の改変、または溶解性ではなく存続性の感染を導くウイルスの生成の改変を生じるコードまたは非コードウイルス配列変化を選択または同定するための、明白な方法または以前に開示された方法は全く存在しない。この実施例は、特異的な方法を提供し、そしてこれらの障害を克服することを可能にする。
【０２５３】
Ａ．ウイルス改変体の生物学的選択
宿主巨大分子合成の減少した阻害、遅延した阻害、または阻害なしを生じるか、あるいは存続性感染を確立するウイルス改変体の生物学的誘導を、細胞内での自然突然変異を可能にするか、あるいは最初に所望のウイルスストックを物理的、化学的、または他の人工的な変異誘発に供した後に感受性細胞を感染させ、そして変異したウイルスを有するこれらの細胞集団について連続的に富化することにより、実施し得る。事前の変異誘発は、必要ではないが、適切な変異の発生を促進することが可能である。選択は、所望の改変体に感染した細胞が、野生型ウイルス感染細胞よりも有意に長い期間生存する能力に基づく。以下の実施例は、例としてシンドビスウイルスを使用して、詳細な方法を提供する；しかし、詳細な説明において記載したように、他のウイルスが容易に代用される。
【０２５４】
具体的には、化学的変異誘発の場合には、１０９ｐｆｕ／ｍｌ以上の力価を有するシンドビスウイルスストック懸濁物を、最終濃度１００μｇ／ｍｌのニトロソグアニジンで処理する。室温にて１５分の後、ニトロソグアニジンを４℃での透析によって除去し、そして変異誘発されたストックを引き続いて感染に使用する。フラットストック培養中で増殖させた約５×１０６の所望のタイプの細胞（例えばＢＨＫ−２１）を、全ての細胞が感染することを保証するために、約５の感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）で変異誘発したウイルスで感染させる。感染後１２、２４、３６、および４８時間にて、細胞単層を新たな培地で２回洗浄して死滅細胞を除去し、そして５０％の新たな培地と５０％の馴化培地との混合物からなる培地に置換する。感染後の所望の時間（例えば７２時間）の後、残存する細胞を穏やかにトリプシン消化してそれらを培養皿から脱着させ、そして細胞に付随する細胞外ウイルスを剥ぎ落とし、次いでこれを分画遠心分離によって細胞から分離する。次いで、残存する細胞を、セミコンフルエントな非感染細胞単層を含有する組織培養皿中に、１０３の非感染細胞毎に１つの感染細胞の比で直接再播種する。さらなる回数の選択を、増幅のために非感染細胞上に播種し、続いて上記の洗浄および採取工程を行うことによって実施した。あるいは、初期感染を、野生型ウイルスストックを使用して低Ｍ．Ｏ．Ｉ．で実施し、細胞内での複製の間の自然突然変異を可能にし得る。このアプローチを使用して、変異体ウイルスの異種集団を、感染細胞によって産生する。トリプシン消化後に回収された感染細胞の集団が、有意な数の非生存細胞または重大な損傷を受けた細胞を含むような例においては、１７ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６５、ＨＣｌによる）中の０．７５％ＮＨ４Ｃｌでの簡単な処理（室温で５分間）、またはＰｅｒｃｏｌｌＴＭによる遠心分離が、非感染細胞単層上への再播種に先立っての残存する死滅細胞または損傷細胞の除去に含まれる。最小の連続する２回の選択の後、所望の表現型を示すウイルス改変体を、限界希釈またはプラーク精製によって単離し、そして実施例１に記載のようにｃＤＮＡクローニングに供する。改変体表現型を担う特異的配列の単離および特徴付けを、実施例において概説するように、ゲノムクローンまたは発現ベクター内をｃＤＮＡの規定の領域で置換し、そしてそれに伴う表現型変化を試験することによって達成する。
【０２５５】
Ｂ．ウイルス改変体の遺伝的選択
関連するアプローチにおいて、自然変異またはランダム変異誘発を、ウイルスストック上ではなく、むしろインビトロまたはインビボで感染性ウイルスＲＮＡへと転写され得るウイルスのクローン化されたゲノムｃＤＮＡを使用して、実行した。例えば、事前の変異誘発において、プラスミドｐＲＳＩＮｇ（バクテリオファージＳＰ６プロモーター（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０：５０８−５１９，  １９９６）に機能的に連結した全長のゲノムシンドビスｃＤＮＡを含有する）を、コンピテントなＥ．  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄミューテーター細胞中に形質転換し、そしてアンピシリンプレート上にプレーティングしてコロニーを得る。少なくとも２００のコロニーをランダムに選択し、プールし、そして一晩の増殖のためにアンピシリンを含有する１０ｍｌのブロス培養物中に接種する。プラスミドＤＮＡを培養から調製し、種々の変異を有するｐＲＳＩＮｇの異種集団を得る。ＤＮＡをＸｂａ  Ｉを用いて直線化し、そして以前に記載されたようにＳＰ６ポリメラーゼを使用してインビトロで転写した（Ｒｉｃｅら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６１：３８０９−３８１９，  １９８７）。ＲＮＡ転写物を、シンドウイルス感染サイクルの開始のために、エレクトロポレーション（ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６−１３６１，  １９９１）によって所望の細胞タイプ（例えば、ＢＨＫ細胞）中へ引き続きトランスフェクトした。あるいは、変異誘発されていないテンプレートからインビトロ転写されたＲＮＡもまた、トランスフェクトし得る。存続性感染を確立するか、あるいは宿主巨大分子合成の減少した阻害、遅延した阻害、または阻害なしを示すウイルス変異体の選択を、上記のように実施する。所望の表現型を有する選択されたウイルス改変体を、限界希釈またはプラーク精製によって単離し、ｃＤＮＡクローニングに供し、そして改変体表現型を担う配列を上記のように単離および特徴付けする。
【０２５６】
Ｃ．ウイルス由来ベクターを使用する改変体の遺伝子選択
１．免疫原性タンパク質を発現するベクター
別のアプローチにおいて、自然細胞内変異またはランダム変異誘発を、ウイルスに基づく発現ベクターのウイルス由来配列上で実施する。これらの配列は、非コード領域および調節領域、ならびに非構造タンパク質コード領域を含む。特定の例においては、構造タンパク質コード配列もまた含まれる。このようなランダム変異誘発または自然細胞内変異を、インビトロまたはインビボでＲＮＡへと転写され得るウイルス由来ベクターのクローン化ｃＤＮＡと共に、本発明に記載される任意の技術を使用して実施し得る。例えば、複製にコンピテントなシンドビスウイルス発現ベクターを使用して、感染細胞に添加された特異的抗体によって結合され得る免疫原性細胞表面タンパク質または他のペプチドを発現させ得る。機能性ベクターを有する細胞を、ベクターにコードされる異種抗原の発現、およびコードされる抗原に特異的な抗体によって結合される能力によって同定する。選択プロセスを長期間にわたって生存する細胞（上記を参照のこと）に限定することにより、所望の表現型を示すベクター改変体を有する細胞のみを富化する。
【０２５７】
具体的には、異種遺伝子の発現のための複製されたサブゲノムプロモーターを有する全長のゲノムシンドビスｃＤＮＡに作動可能に連結されたＳＰ６プロモーターを含む、プラスミドｐＴＥ３’２Ｊ（Ｈａｈｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８９：２６７９−２６８３，  １９９２）を、上記のようにランダム変異誘発に供する。このプロセスは、ランダム変異誘発を含有する異種プラスミドの集団の単離を生じる。並行して、所望の異種細胞表面タンパク質またはマーカーペプチド遺伝子を、変異誘発したｐＴＥ３’２Ｊベクターへの挿入のためのシャトルベクター中にクローン化する。マーカーとしての使用に好ましい細胞表面タンパク質は、ヒトＢ７．１（Ｆｒｅｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４３：２７１４−２７２２，  １９８９）およびマウスＨ−２ＫｂクラスＩ分子（Ｓｏｎｇら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：７０２４−７０２９，  １９９４）を含む。ヒトＢ７．１遺伝子を、隣接するＸｂａＩおよびＢａｎＨＩ部位を含有するように設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、全長のｃＤＮＡ配列を含有するｐＣＤＭ８ベクター（Ｆｒｅｅｍａｎら，  同書）から、１．５分間の伸長での標準的な３サイクルＰＣＲによって増幅する。
【０２５８】
正方向プライマー：ｈＢ７．１ＦＸ（５’−制限部位／Ｂ７．１配列）（配列番号２４）
５’−ＡＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡ／ＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＣＧＧＡＧＧＣＡＧ−３’
逆方向プライマー：ｈＢ７．１ＲＢ（５’−制限部位／Ｂ７．１配列）（配列番号２５）
５’−ＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣ／ＣＴＧＴＴＡＴＡＣＡＧＧＧＣＧＴＡＣＡＣＴＴＴＣ−３’。
【０２５９】
増幅に続いて、約８７５ｂｐのＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  ＣＡ）を使用して精製し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてシンドビスシャトルベクターｐＨ３’２Ｊ１（Ｈａｈｎら、同書）（これもまたＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化されており、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理されている）中に連結し、構築物ｐＨ３’Ｂ７．１を作製した。
【０２６０】
ｐＴＥ３’２Ｊ二重サブゲノムベクターのランダム変異誘発に続いて、上記のように、プラスミドｐＨ３’Ｂ７．１およびプラスミドｐＴＥ３’２Ｊの変異した集団を、ＡｐａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  ＩＩＴＭ（Ｂｉｏ１０１，  Ｖｉｓｔａ，  ＣＡ）を使用して０．７％アガロースゲルから精製し、そしてＢ７．１発現ベクターの異種集団（ｐＴＥ３’Ｂ７．１と称する）を形成するように連結した。Ｅ．  ｃｏｌｉの形質転換および個々のクローンの単離なしに、連結されたベクターの完全な集団をＸｈｏＩで直線化し、そして上記のようなインビトロＳＰ６転写反応のためのテンプレートとして使用する。次いで、ランダム変異誘発したＢ７．１ベクター転写物の異種集団を、シンドビス複製サイクルの開始のために、所望の細胞タイプ（例えば、ＢＨＫ細胞）中にエレクトロポレートする。存続性感染を確立するか、あるいは宿主巨大分子合成の減少した阻害、遅延した阻害、または阻害なしを示すウイルス変異体の選択を、Ｂ７．１に特異的なモノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、および磁気細胞選別または蛍光活性化細胞選別のいずれかのプロトコルを使用して実施する。好ましい二次抗体タグは、磁気細胞選別のための磁気マイクロビーズと結合したラット抗マウスＩｇＧ（ｍｉｎｉＭＡＣＳ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉら，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １１：２３１−２３８，  １９９０）、および蛍光活性化細胞選別のためのＦＩＴＣ結合ラット抗マウスＩｇＧ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を含む。このようなアプローチを使用し、そして長時間（上記を参照のこと）の後に細胞を収集して、機能性ウイルス由来ベクター（Ｂ７．１発現によって証明されるような）を含有する生存可能な細胞（所望の表現型を示す）のみを富化する。
【０２６１】
具体的には、ランダム変異誘発したＢ７．１ベクター転写物の異種集団を、ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ（１９９１、同書）の手順に従って５×１０７細胞中にエレクトロポレートし、そしてフラットストック培養としてプレーティングした。感染後１２、２４、３６、および４８時間にて、細胞単層を新たな培地で２回洗浄して死滅細胞を除去し、そして５０％の新たな培地と５０％の馴化培地との混合物からなる培地に置換する。感染後の所望の時間（例えば７２時間）の後、残存する細胞を穏やかにトリプシン消化してそれらを培養皿から脱着させ、そして１０００ｒｐｍ、４℃での遠心分離によってペレット化する。細胞を２ｍｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ＋１０％ウシ胎児血清＋１％ＢＳＡ）中に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートし、そして再ペレット化した。次に、細胞を２００μｌの一次抗Ｂ７．１抗体溶液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ中で希釈）中に再懸濁し、そして氷上で３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで２回洗浄し、ペレット化し、そして２００μｌの磁気ビーズ溶液（２００μｌのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡ中で洗浄した、ラット抗マウスでコートされた磁気ビーズ）中に再懸濁する。４℃で３０分間のインキュベーションに続いて、ビーズに結合した細胞をＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡで２回洗浄し、そして１ｍｌの同じ緩衝液中に再懸濁する。次いで、ビーズに結合した細胞を、製造者の指示に従ってＭｉｎｉＭａｃｓ磁気カラムを使用して精製する。次いで、溶出したポジティブ細胞を、セミコンフルエントな非感染細胞単層を含有する組織培養皿中に、１０４の非感染細胞毎に１つの感染細胞の比で直接再播種する。さらなる回数の選択を、増幅／富化について上記のように実施する。所望の表現型を有する選択されたベクター改変体を、限界希釈またはプラーク精製によって単離し、ｃＤＮＡクローニングに供し、そして改変体表現型を担う配列を、前記のように単離および特徴付けする。
【０２６２】
あるいは、Ｂ７．１発現ベクターであるｐＴＥ３’Ｂ７．１を、事前の変異誘発なしにインビトロ転写に直接使用し得る。これらのＲＮＡ転写産物のトランスフェクションに続いて、所望の表現型の変異体の選択を上記のように実施する。
【０２６３】
２．選択マーカーを発現するベクター
あるいは、抗生物質耐性マーカーは、所望の表現型を示すウイルスベクター改変体の選択のために使用され得る。例えば、シンドビスベクターｐＲＳＩＮ−ｌｕｃ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同書）を、上記のランダム変異誘発に供し、そしてランダム変異を含む異種プラスミドの集団を単離する。さらに、ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性をコードする遺伝子を、隣接するＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位を含むように設計される以下のオリゴヌクレオチドプラスミドを使用して、標準的な３サイクルのＰＣＲ増幅によって、１．５分間の伸長で、プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）から単離する：
正方向プライマー：ＮｅｏＦＸ（５’−制限部位／ｎｅｏ  配列）（配列番号２６）
５’−ＡＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧ／ＡＣＣＡＵＧＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧ−３’
逆方向プライマー：ＮｅｏＲＮ（５’−制限部位／ｎｅｏ  配列）（配列番号２７）
５’−ＴＡＴＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣ／ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧ−３’
増幅に続いて、ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで同じく消化し、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルからその以前のルシフェラーゼ挿入物と離して精製したｐＲＳＩＮ−ｌｕｃベクターの変異した集団に連結する。ネオマイシン耐性マーカーの変異したｐＲＳＩＮベクターへの連結は、ｎｅｏｒ発現ベクター（ｐＲＳＩＮ−ｎｅｏと称される）の異種集団を作製する。Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換せずそして個々のクローンを単離せずに、連結したベクターの全体の集団をＳａｃＩで直線化し、そして上記のように、インビトロでのＳＰ６転写反応のためのテンプレートとして使用する。ランダムに変異誘発したｎｅｏｒベクター転写物の異種集団を、シンドビス複製サイクルの開始および異種遺伝子発現のために所望の細胞型（例えば、ＢＨＫ細胞）にエレクトロポレーションする。トランスフェクションの約１２〜２４時間後、細胞をトリプシン処理し、そしてＧ４１８を含む培地に再プレーティングする。続いて、培地を、死滅細胞を除去するために約２４時間間隔で交換し、そして５０％の新たな培地と５０％の馴化培地との混合物からなるＧ４１８含有培地で置き換える。培地交換を、大部分の死滅細胞が洗い流された後に低減させ、そして細胞増殖巣が形成し始める。この選択を使用して、機能的なウイルス由来ベクターを含み、所望の表現型（ネオマイシン耐性によって実証されるような）を示す生細胞のみを、富化する。所望の表現型を表示する変異体ベクター改変体ゲノムを、ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，  Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，  ＴＸ）を使用して、細胞溶解物から直接ＲＮＡを収集することによって単離する。あるいは、細胞を、欠陥ヘルパーシンドビスＲＮＡ（ｐＲ−ｄｌｎｓＰＳＩＮ，  Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同書）でトランスフェクトし、これは、細胞上清において、パッケージングされたｐＲＳＩＮ−ｎｅｏベクター含有粒子の産生を生じ、続くベクターＲＮＡ単離（上記）のために遠心分離によって濃縮され得る。各場合において、ベクターＲＮＡを、ｃＤＮＡクローニングに供し、そして先に記載のように、改変体表現型を担う配列を単離および特徴付けする。
【０２６４】
あるいは、ネオマイシン耐性マーカーを有するｐＲＳＩＮベクターを、先の変異誘発を含まないインビトロでの転写に直接使用し得る。これらのＲＮＡ転写物のトランスフェクションに続いて、所望の表現型の変異体についての選択を、上記のように実行する。
【０２６５】
別の実施態様において、セムリキ森林ウイルス由来ベクターｐＳＦＶ−１（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を、抗生物質耐性マーカーの挿入および続く所望の表現型の選択のために使用する。ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性をコードする遺伝子を、隣接するＢａｍＨＩ制限部位を含むように設計される以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標準的な３サイクルのＰＣＲ増幅によって、１．５分間の伸長で、プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）から単離する：
正方向プライマー：５’ＢＡＭＨＩ−Ｎｅｏ（配列番号１１８）
５’−ＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＣＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣ−３’
逆方向プライマー：３’ＢＡＭＨＩ−Ｎｅｏ  （配列番号５７）
５’−ＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡ−３’。
【０２６６】
増幅に続いて、ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、ＢａｍＨＩで消化し、そしてＢａｍＨＩで消化し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して、０．７％アガロースゲルから精製した、ＳＰＶ−１の野生型または予め変異した集団に連結する。ＲＮＡベクターの転写および所望の表現型の変異体のための選択を、本質的にシンドビスウイルスの選択について上記のように行う。
【０２６７】
実施例３
ＳＩＮＩに基づくＲＮＡベクターレプリコンの調製
Ａ．ＳＩＮ−１基本ベクターの構築
ＳＩＮ−１由来ベクター骨格を構築し、そしてバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプラスミドＤＮＡに挿入した。その結果、インビトロでの転写は、感受性細胞への導入に際して自己複製分子（レプリコン）として作用するＲＮＡ分子を産生した。基本ＳＩＮ−１  ＲＮＡベクターレプリコンは、以下の順序のエレメントから構成された：ＳＩＮ−１  ｎｓＰｓ遺伝子、サブゲノム性ＲＮＡプロモーター領域、ポリリンカー配列（異種配列挿入物を含み得る）、ＳＩＮ−１  ３’非翻訳領域（ＮＴＲ）、およびポリアデニル化配列。感受性細胞へのトランスフェクションに続いて、ＲＮＡベクターレプリコンの自律複製は、ウイルスについて生じ、そして異種配列は、非常に豊富なサブゲノム性ｍＲＮＡ分子として合成され、次いで、異種遺伝子産物のための翻訳テンプレートとして役割を果たす。
【０２６８】
ベクターの５’領域（ＳＩＮ−１  ｎｓＰ遺伝子およびサブゲノム性プロモーターから構成される）は、キャプシド遺伝子翻訳開始点の２つのヌクレオチド内で伸長する。この領域を、ｐＫＳＩＩ＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＡｐａＩとＸｈｏＩ部位との間に最初に挿入した。ベクター５’領域を、ＰＣＲによって、２つの重複フラグメント中のｐＲＳＩＮ−１ｇプラスミドから、増幅した。第１のフラグメントを、以下のプライマー対とのＰＣＲ反応において生成した：
正方向プライマー：ＳＰ６−１Ｆ（ＡｐａＩ部位／ＳＰ６プロモーター／ＳＩＮ  ｎｔ  １−１８）：（配列番号１２）
５’−ＴＡＴＡＴＧＧＧＣＣＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＴＡＧＴＡＣＡＣ
逆方向プライマー：ＳＩＮ５１６０Ｒ（ＳＩＮ  ｎｔ  ５１６０−５１４０）：（配列番号２８）
５’−ＣＴＧＴＡＧＡＴＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧ。
第２のフラグメントを、以下のプライマー対とのＰＣＲ反応において生成した：
正方向プライマー：５０７９Ｆ（ＳＩＮ  ｎｔ  ５０７９−５１００）：（配列番号２９）
５’−ＧＡＡＧＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＡＣＣＧ
逆方向プライマー：ＳＩＮ７６４３Ｒ（緩衝配列／ＸｈｏＩ部位／ＳＩＮ  ｎｔ  ７６４３−７６２１）：（配列番号３０）
５’−ＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＡＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＧ。
【０２６９】
上記に示されるプライマー対との２つのＰＣＲ反応を、Ｔｈｅｒｍａｌａｓｅ（Ａｍｒｅｓｃｏ，  Ｓｏｌｏｎ，  ＯＨ）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）、またはＫｌｅｎＴａｑ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施した。さらに、反応は、５％ＤＭＳＯおよび「ＨＯＴ  ＳＴＡＲＴ  ＷＡＸ」ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を含んだ。以下に示すＰＣＲ増幅プロトコルを使用した。伸長期間は、ＳＰ６−１Ｆ／ＳＩＮ５１６０Ｒまたは５０７９Ｆ／ＳＩＮ７６４３Ｒプライマー対との反応について、それぞれ５分または２．５分であった。
【０２７０】
【化１４】
2008200051.tif 000015
ＰＣＲに続いて、５１４２ｂｐ（Ｓ６−１Ｆ／ＳＩＮ５１６０Ｒプライマー対）および２５３２ｂｐ（５０７９Ｆ／ＳＩＮ７６４３Ｒプライマー対）の二つの増幅産物を精製し（ＰＣＲ精製キット、Ｑｉａｇｅｎ，  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  ＣＡ）、そしてＡｐａＩおよびＳｆｉＩ（５１４２ｂｐアンプリコン産物）またはＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ（２５３２ｂｐアンプリコン産物）で消化した。消化した産物を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ（Ｂｉｏ  １０１．  Ｖｉｓｔａ，  ＣＡ）を用いて精製し、そしてＡｐａＩおよびＸｈｏＩでの消化によって調製し、ＣＩＡＰでホスファターゼ処理したｐＫＳ＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）とともに連結した。この構築物は、ｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶ５’として公知である。
【０２７１】
ベクターの３’領域（ウイルス３’末端、ポリアデニレート域、および独自の制限認識配列からなる）を、プラスミドｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶ’５のＮｏｔＩとＳａｃＩ部位との間に挿入した。ベクターの３’領域を、ＰＣＲによって、ｐＲＳＩＮ−１ｇプラスミドから、以下のプライマー対を含む反応において増幅した：
正方向プライマー：ＳＩＮ１１３８６Ｆ（緩衝配列／ＮｏｔＩ部位／ＳＩＮ  ｎｔ  １１３８６−１１４０７）：（配列番号３１）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＧＣＣＣＣＡＡＴＧＡＴＣＣＧＡＣ
逆方向プライマー：ＳＩＮ１１７０３Ｒ（緩衝配列／ＳａｃＩおよびＰｍｅＩ部位／Ｔ４０／ＳＩＮ  ｎｔ  １１７０３−１１６９８）：（配列番号３２）
５’−ＣＴＡＴＡＧＡＧＣＴ    ＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴ    ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ    ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ  ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ  ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ  ＡＡＡＴＧ。
【０２７２】
上に示したプライマー対に加えて、ＰＣＲ反応は、Ｔｈｅｒｍａｌａｓｅ、Ｖｅｎｔ、またはＫｌｅｎＴａｑ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、５％ＤＭＳＯ、および「Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｗａｘ」ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含んだ。増幅プロトコルは、７２℃で３０秒間の伸長期間を除いては、上に示した通りであった。
【０２７３】
３’ベクター末端に対応する３７７ｂｐの増幅産物を精製し、ＮｏｔＩおよびＳａｃＩで消化し、精製し、そしてｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶ５’（ＮｏｔＩおよびＳａｃＩでの消化およびＣＩＡＰでの処理によって調製した）に連結した。このプラスミドは、ｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶとして公知である。
【０２７４】
上記の技術を使用して、β−ガラクトシダーゼレポータータンパク質をコードするｌａｃＺ遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、プラスミドｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）から遊離させ、そして対応する酵素制限部位でｐＫＳ＋に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子を。このプラスミド（ｐＫＳ−β−ｇａｌ）から、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶに、ＸｈｏＩとＮｏｔＩ部位との間で挿入した。このプラスミドは、ＳＩＮｒｅｐ／ＳＩＮ−１  ｎｓＰ１−４／ｌａｃＺとして公知である。
【０２７５】
あるいは、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするホタルルシフェラーゼ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩでの消化によってプラスミドｐＴ３／Ｔ７−ＬＵＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）から遊離させ、複数のクローニング配列に含まれる対応する酵素認識部位でｐＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）に挿入し、ｐＫＳ−ｌｕｃを作製した。ルシフェラーゼ遺伝子を、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩでの消化によってｐＫＳ−ｌｕｃから遊離させ、そしてＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶに挿入した。このプラスミドは、ＳＩＮｒｅｐ／ＳＩＮ−１  ｎｓＰ１−４／ｌｕｃとして公知である。
【０２７６】
さらに、アルカリホスファターゼの分泌形態（ＳＥＡＰ）をコードする遺伝子を、ｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶに挿入した。簡潔には、ＳＥＡＰ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩでの消化によってプラスミドｐＣＭＶ／ＳＥＡＰ（Ｔｒｏｐｉｘ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）から遊離させ、複数のクローニング配列に含まれる対応する認識部位でｐＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）に挿入し、ｐＳＫ−ＳＥＡＰを作製した。次いで、ＳＥＡＰ遺伝子を、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩでの消化によってｐＳＫ−ＳＥＡＰから遊離させ、ｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶの対応する酵素認識部位に挿入した。このプラスミドは、ＳＩＮｒｅｐ／ＳＩＮ−１  ｎｓＰ１−４／ＳＥＡＰとして公知である。
【０２７７】
個々のＳＩＮ−１ｎｓｐ遺伝子を、  ＳＩＮ−１および野生型発現ベクターの発現特性を比較するために、以前に記載のシンドビスウイルスに基づくｌａｃＺレプリコンの対応する野生型ウイルス領域（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：６４３９−６４４６，  １９９３）に置換した。ＳＩＮ−１  ｎｓＰ遺伝子のＴｏｔｏ１１０１由来ｌａｃＺレプリコンへの置換を、実施例１に記載のように達成した。これらのベクターを、以下の表に示すように命名した。
【０２７８】
【化１５】
2008200051.tif 000016
ＳＰ６転写物を、ＸｈｏＩで直線化した後、実施例１に記載のように、上記の表に示すレプリコンから調製した。ＲＮＡ転写物は、シンドビスウイルスの転写を開始し得る５’配列、シンドビスウイルス非構造タンパク質遺伝子１−４、パッケージングに必要なＲＮＡ配列、シンドビスウイルス接合領域、ｌａｃＺ遺伝子、およびマイナス鎖ＲＮＡの合成に必要なシンドビスウイルス３’末端近位配列を含んだ。
【０２７９】
インビトロでの転写反応産物または精製ＲＮＡを、以前に記載のように（ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６−１３６１，  １９９１）ベビーハムスター腎臓−２１（ＢＨＫ−２１）細胞にエレクトロポレートした。あるいは、ＢＨＫ−２１細胞を、実施例１に記載のように、市販のカチオン性脂質化合物と複合体化し、そして７５％のコンフルエンシーに維持したＢＨＫ−２１細胞に適用した。トランスフェクトした細胞を、３５ｍｍ皿の中で増殖させ、そして３７℃でインキュベートした。
【０２８０】
ＳＩＮｒｅｐ／ｌａｃＺ  ＲＮＡを用いるＢＨＫ−２１細胞のトランスフェクションの９時間後の効率を、２つの二者択一の方法によって測定した。第１の方法において、β−ガラクトシダーゼを発現するトランスフェクトした細胞を、以前に記載のように（ＭａｃＧｒｅｇｏｒら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １３：２５３−２６５，  １９８７）２％の冷メタノールで細胞を最初に固定した後、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド）で直接染色することによって測定した。第２の方法において、β−ガラクトシダーゼの発現を、ウサギ抗β−ガラクトシダーゼ抗体を使用して、免疫蛍光によって測定した。上記のいずれかの方法によってトランスフェクトされた細胞の一部を、３５ｍｍ皿に含まれた、円形ガラスカバースリップ上で増殖させた。トランスフェクション（ｈｐｔ）の９時間後、培地を吸引によって除去し、そして細胞をＰＢＳＤで２回リンスし、そして−２０℃で一晩インキュベーションすることによってメタノールで固定した。メタノールを吸引によって除去し、細胞をＰＢＳで３回リンスし、次いで、２％ＢＳＡ（画分Ｖ、Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）と室温で３０分間インキュベートした。非特異的抗体結合を防ぐためのＢＳＡとのインキュベーションに続いて、細胞を、一次抗β−ガラクトシダーゼ抗体（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の１：８００希釈）と室温で１時間インキュベートした。次いで、過剰の一次抗体を、吸引およびＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡで３回リンスすることによって除去した。ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ中の１：１００希釈に続いて、１００ｍｌのヤギ抗ウサギＦＩＴＣ結合二次抗体（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を、カバースリップに添加し、そして室温で４５分間、暗所にてインキュベートした。過剰の二次抗体を、カバースリップをＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡで２回、およびＰＢＳで１回リンスすることによって除去した。次いで、カバースリップを、１滴のＣｙｔｏｓｅａｌ  ６０マウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）培地（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｒｉｖｅｒｄａｌｅ，  ＮＪ）の下側の細胞にマウントし、顕微鏡スライド上に置いた。蛍光顕微鏡を使用して、トランスフェクション効率を測定するために、β−ガラクトシダーゼを発現する細胞の頻度を測定した。
【０２８１】
全体のトランスフェクトされた細胞溶解物におけるβ−ガラクトシダーゼのレベルを、２つの二者択一の方法によって、９ｈｐｔで測定した。第１の方法において、トランスフェクトした細胞を、培地を吸引した後にＰＢＳでリンスし、そして１０６細胞あたり２５０μｌのレポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を各皿に添加した。β−ガラクトシダーゼの発現レベルを、細胞溶解物からの上清画分を混合することによって測定し、市販の基質検出系（Ｌｕｍｉ−ｇａｌ，  Ｃｌｏｎｔｈｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ．  ＣＡ）を用いて、１４，０００ｒ．ｐ．ｍ．で室温で１分間の微量遠心分離によってプロセスし、その後、照度測定（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）を行った。（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）。第２の方法において、β−ガラクトシダーゼの活性を、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９，  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ）によって以前に記載されたように、測定した。簡潔には、トランスフェクトした細胞を、培地を吸引した後に、ＰＢＳでリンスし、そして１０６細胞あたり２００μｌのＴＴＥ溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を各皿に添加した。細胞溶解物からの細胞片を、１４，０００ｒ．ｐ．ｍ．で室温で１分間微量遠心分離することによってペレット化した後に、５０μｌの上清を０．５ｍｌのＺ緩衝液（ｐＨ７．０）（６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／４０  ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／１０ｍＭ  ＫＣｌ／１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４／５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）に添加し、そして３７℃で５分間インキュベートした。次いで、試料中のβ−ガラクトシダーゼ活性を、Ｚ緩衝液中に４ｍｇ／ｍｌの色素基質ο−ニトロフェニル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ；  ＳＩＧＭＡ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含む溶液０．２ｍｌを添加した後、分光光度測定（４２０ｎｍ）によって決定した。試料を、黄色が発色するまで（約５分間）３７℃でインキュベートし、そして反応を０．５ｍｌの０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３の添加によって停止させた。
【０２８２】
トランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞中のβ−ガラクトシダーゼの発現のレベルを、上記の方法に従って測定した。これを以下に示す表に表す。示したデータは、上記のように変動するトランスフェクション効率について正規化されている。
【０２８３】
【化１６】
2008200051.tif 000017
この結果は、ＳＩＮ−１改変体株由来のレプリコンベクターが実際は機能的であることを示す。ＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクトした場合、発現されるレポータータンパク質のレベルは、野生型ウイルス由来ベクターでトランスフェクトした細胞において得られるレベルよりも高かった。さらに、増殖性の存続性感染の確立のための表現型を有するため、ＳＩＮ−１由来レプリコンベクターでトランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞における高レベルのβ−ガラクトシダーゼの発現は、主にｎｓＰ２遺伝子にマップした。
【０２８４】
実施例４
ＳＩＮ１に基づくＤＮＡベクターの調製
Ａ．プラスミドＤＮＡ  ＳＩＮ−１由来発現ベクターの構築
シンドビスウイルス感染性周期の効率的な開始は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの発現カセット内に含まれるゲノムｃＤＮＡクローンから、インビボで生じ得る。（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ７０：５０８−５１９，  １９９６）。ＤＮＡフォーマットから機能的なアルファウイルス遺伝子を発現する能力は、２つの新規なアルファウイルスに基づく遺伝子発現系が開発されることを可能にする：（１）遺伝的な免疫に適用される、プラスミドＤＮＡに基づくベクター、および（２）ベクターレプリコンおよびＤＨプラスミドＤＮＡで同時トランスフェクトした細胞における、パッケージングされたアルファウイルス粒子の産生。以前に、感染シンドビスウイルスＲＮＡおよびそれに由来する相補体ベクターを産生するための分子的アプローチは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターからのｃＤＮＡクローンのインビトロでの転写、続いての許容細胞へのトランスフェクションに主に限定された。
【０２８５】
プラスミドＤＮＡに基づくアルファウイルス由来発現ベクターは、ＥＬＶＳＴＭ（真核生物重層ベクター系）として公知である。ＥＬＶＳＴＭプラスミドＤＮＡベクターは、自己複製ベクターＲＮＡ（レプリコン）の重層ＤＮＡに基づく発現系への転換を含む。特定の実施態様内において、最初の層は、第２の層の転写を開始する真核生物の（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）発現カセットを有し、これはＲＮＡベクターレプリコンに対応する。最初の層から発現されるレプリコンの核から細胞質への輸送に続いて、ベクターの自己触媒性増幅は、ウイルス（例えば、アルファウイルス）複製周期に従って進行し、異種遺伝子の発現を生じる。
【０２８６】
ＳＩＮ−１ウイルス由来プラスミドＤＮＡ発現ベクターの構築を、以前に記載の方法（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ７０：５０８−５１９，  １９９６）を改良して行った。発現ベクターを、ｐＵＣ９（Ｓｐｒａｔｔら、Ｇｅｎｅ  ４１：３３７−３４２，  １９８６）のカナマイシン耐性アナログであるプラスミドベクターｐＢＧＳ１３１（ＡＴＣＣ番号３７４４３）上で構築した。ｐＢＧＳ１３１およびそれに由来するプラスミドを、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地において増殖させた。
【０２８７】
異種配列の発現ベクターへの挿入を促進するために、ＸｈｏＩ認識配列（ｐＢＧＳ１３１中のカナマイシン遺伝子の翻訳リーディングフレーム内に位置する）を、ＸｈｏＩ付着末端を含む部分的に相補な１２マーのオリゴヌクレオチドを挿入することによって、取り除いた。ＸｈｏＩ認識部位を、以下に示すように、挿入の結果として消失させた：
オリゴヌクレオチド１：（配列番号３３）
５’−ＴＣＧＡＴＣＣＴＡＧＧＡ
【０２８８】
【化１７】
2008200051.tif 000018
（ＸｈｏＩ部位：ＣＴＣＧＡＧ）（配列番号３３〜３６および１０４）。
【０２８９】
オリゴヌクレオチドを、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下の等モル濃度でゲルアニールし、１００℃で５分間加熱し、室温までゆっくりと冷却し、そしてポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化する。オリゴヌクレオチドを、２００：１の挿入物：プラスミドベクターの比で、ｐＢＧＳ１３１に連結し、これを、ＸｈｏＩ消化およびＣＩＡＰ処理によって調製した。得られるプラスミドを、ｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏＩと呼ぶ。ｐＢＧＳ１３１またはｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏＩプラスミドで形質転換したＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地における増殖速度は、１．５〜８時間の時間経過では区別できなかった。
【０２９０】
ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）転写終結／ポリアデニル化シグナルを、ｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏＩのＳａｃＩとＥｃｏＲＩ部位との間に挿入した。ＢＧＨ転写終結配列を、以下に示すプライマー対およびｐＣＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）をテンプレートとして使用して、ＰＣＲ増幅によって単離した。
【０２９１】
正方向プライマーＢＧＨＴＴＦ（緩衝配列／ＳａｃＩ部位／ｐＣＤＮＡ３  ｎｔ  １１３２−１１６１）：
（配列番号３７）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣ
逆方向プライマーＢＧＨＴＴＲ（緩衝配列／ＥｃｏＲＩ部位／ｐＣＤＮＡ３  ｎｔ  １１８０−１１５４）：
（配列番号３８）
５’−ＴＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＡＧＡＡＴＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＣＡＡＴＧＣＧＡＴＧＣ。
【０２９２】
上に示したプライマーを、３０秒の伸長期間を使用して、３温度サイクルプログラムでのＰＣＲ反応に使用した。５８ｂｐの増幅産物を、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  ＣＡ）を用いて精製し、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて精製し、そしてＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩ消化し、ＣＩＡＰ処理したｐＢＧＳ１３１に連結した。このプラスミドは、ｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏＩ−ＢＧＨＴＴとして公知である。
【０２９３】
次いで、シンドビスウイルス由来プラスミドＤＮＡ発現ベクターの３’末端を、ｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏＩ−ＢＧＨＴＴ構築物に挿入した。このベクターの領域は、以下の順序のエレメントを含む：シンドビスウイルス３’末端非翻訳領域（３’ＮＴＲ）；４０マーのポリ（Ａ）配列；Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）アンチゲノム性リボザイム；およびＳａｃＩ認識配列。これらの順序のエレメントの構築を、以下に示すプライマーおよびｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶプラスミド（実施例４）をテンプレートとして使用して、ネスティッドなＰＣＲによって達成した。
【０２９４】
正方向プライマー：ＳＩＮ１１３８６Ｆ（緩衝配列／Ｎｏｔ  Ｉ部位／ＳＩＮ  ｎｔｓ  １１３８６−１１４０７）：（配列番号３１）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＧＣＣＣＣＡＡＴＧＡＴＣＣＧＡＣ
ネスティッドプライマー：ｐＡＨＤＶ１Ｆ（ポリ（Ａ）／ＨＤＶ  ＲＢＺ  ｎｔｓ  １−４６）：（配列番号３９）
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＧＧＧＴＣＧＧＣＡＴ  ＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡ  ＣＣＴＣＣＴＣＧＣＧ  ＧＴＣＣＧＡＣＣＴＧ  ＧＧＣＡＴＣ
逆方向プライマー：ＳａｃＨＤＶ７７Ｒ（緩衝配列／Ｓａｃ  Ｉ  部位／ＨＤＶ  ＲＢＺ  ｎｔｓ  ７７−２７）：（配列番号４０）
５’−ＴＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＡＧＣＣＡＴＣＣＧＡＧＴＧＧＡＣＧＴＧＣＧＴＣＣＴＣＣＴＴＣＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＧＴＣＧＧＡＣＣＧＣＧ。
【０２９５】
上記のプライマーを、実施例４に記載の反応条件および３つの温度サイクルプログラムに従い、３０秒間の伸長時間を伴うＰＣＲ増幅において使用した。４２２ｂｐの増幅産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  ＣＡ）で精製し、ＮｏｔＩおよびＳａｃＩで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩで精製し、そしてＮｏｔＩ／ＳａｃＩ消化しＣＩＡＰ処理したｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶに連結した。この構築物は、ｐＫＳＳＩＮ−１ＢＶ／ＨＤＶＲＢＺとして識別され、そしてＨＤＶリボザイム配列を含むベクターの３’末端を通って延伸するシンドビス  ｎｔ  ２２８９におけるＢｇｌ  ＩＩ部位からのシンドビスウイルス由来のプラスミドＤＮＡ発現ベクター配列を含む。
【０２９６】
次いで、プラスミドｐＫＳＳＩＮ−１ＢＶ／ＨＤＶＲＢＺを、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＳａｃ  Ｉで消化し、５８１５ｂｐフラグメントを１％アガロース／ＴＢＥゲル電気泳動により単離し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩにより精製し、そしてＢｇｌ  ＩＩ／Ｓａｃ  Ｉで消化しＣＩＡＰで処理したｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏ  Ｉ−ＢＧＨＴＴに挿入して、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１ＢｇｌＬＦとして識別されるプラスミド構築物を生成した。この構築物は、ｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏ  Ｉプラスミド上のＢＧＨ転写終結配列に融合した３’末端を有する上記のプラスミドｐＫＳＳＩＮ−１ＢＶ／ＨＤＶＲＢＺからのシンドビスウイルス発現ベクターの領域を含む。
【０２９７】
シンドビスウイルスプラスミドＤＮＡベクターのアセンブリを、シンドビスウイルスゲノム（５’ウイルス末端およびｎｓＰ遺伝子の一部を含む）の最初の２２８９ｎｔｓと隣接して並べたＣＭＶプロモーターのｐＢＧ／ＳＩＮ−１ＢｇｌＬＦプラスミドへの挿入により達成した。重複ＰＣＲアプローチを使用することにより、ＣＭＶプロモーターを５’ウイルス末端に配置し、その結果転写開始により一個の非ウイルスヌクレオチドのシンドビスウイルスベクターレプリコンＲＮＡの５’末端への付加を生じた。ＣＭＶプロモーターを最初のＰＣＲ反応においてｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）から以下のプライマー対を使用して増幅した：
正方向プライマー：ｐＣＢｇｌ２３３Ｆ  （緩衝配列／Ｂｇｌ  ＩＩ認識配列／ＣＭＶプロモーター  ｎｔｓ  １−２２）：（配列番号４１）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧ
逆方向プライマー：ＳＮＣＭＶ１１４２Ｒ（ＳＩＮ  ｎｔｓ  ８−１／ＣＭＶ  プロモーター  ｎｔｓ  １１４２−１１０８）：（配列番号４２）
５’−ＣＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＧＡＣＣ。
【０２９８】
上記のプライマーを実施例４に記載の反応条件および３つの温度サイクルプログラムに従って、１分間の伸長時間を伴うＰＣＲ反応において使用した。
【０２９９】
ＳＩＮ−１  ５’末端を、ｐＫＳＲＳＩＮ−１ｇクローン（実施例１）から以下のプライマー対を用いて第二のＰＣＲ反応において増幅した：
正方向プライマー：ＣＭＶＳＩＮ１Ｆ（ＣＭＶ  プロモーター  ｎｔｓ  １１２４−１１４２／ＳＩＮ  ｎｔｓ  １−２０）：（配列番号４３）
５’−ＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＴＡＧＴＡＣＡＣＡＣ
逆方向プライマー：ＳＩＮ  ３１８２Ｒ（ＳＩＮ  ｎｔｓ  ３１８２−３１６０）：（配列番号４４）
５’−ＣＴＧＧＣＡＡＣＣＧＧＴＡＡＧＴＡＣＧＡＴＡＣ
上記のプライマーを３つの温度サイクルプログラムで３分間の伸長時間を用いたＰＣＲ反応において使用した。
【０３００】
９３０ｂｐおよび３２００ｂｐの増幅された産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、そして共に以下のプライマー対を用いたＰＣＲ反応において使用した：
正方向プライマー：ｐＣＢｇｌ２３３Ｆ：（配列番号４１）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧ
逆方向プライマー：（ＳＩＮ  ｎｔｓ  ２３００−２２７８）：（配列番号４５）
５’−ＧＧＴＡＡＣＡＡＧＡＴＣＴＣＧＴＧＣＣＧＴＧ。
【０３０１】
上記のプライマーを３つの温度サイクルプログラムで３．５分間の伸長時間を用いたＰＣＲ反応において使用した。
【０３０２】
第一のＰＣＲ増幅産物の３’末端の２６塩基は、第二のＰＣＲ増幅産物の５’末端の２６塩基と重複した；得られた３２００ｂｐの重複する二次ＰＣＲ増幅産物を１％アガロース／ＴＢＥ電気泳動により精製し、ＢｇｌＩＩで消化し、そしてＢｇｌＩＩで消化しＣＩＡＰ処理したｐＢＧ／ＳＩＮ−１ＢｇｌＬＦに連結した。この構築物を、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５と呼ぶ。
【０３０３】
実施例１において議論したように、野生型シンドビスウイルスのｎｓＰ遺伝子配列における比較的少ないヌクレオチド点変化がＳＩＮ−１の表現型特徴を生じる。これらのヌクレオチド変化の結果として、野生型およびＳＩＮ−１遺伝子型に由来するクローンを簡便に識別するのを促進する新たな制限酵素認識部位は生成しない。それゆえ、ＰＣＲに基づく診断アッセイをＳＩＮ−１由来のクローンの同定のための迅速な方法として考案した。手短に言うと、正方向プライマーをＳＩＮ−１と野生型との間の特定の塩基変化がプライマーの３’末端塩基に配置されるように設計した。１つのプライマーはＳＩＮ−１ヌクレオチドを含み、一方、別のプライマーは野生型ヌクレオチドを含んでいた。両方の遺伝子型間で保存されている下流領域における逆方向プライマーを、各正方向プライマーと組み合わせて使用した。正確なアニーリング温度において、ＳＩＮ−ＩテンプレートのみがＳＩＮ−１正方向プライマーを含む反応において増幅された。野生型およびＳＩＮ−１遺伝子型を識別するために使用したプライマー配列を以下に与える。反応条件は、本明細書中に含まれる実施例のすべてにわたって記載される通りであった。
【０３０４】
プライマーセットＩ：
正方向プライマー：
ＷＴ１００Ｆ  ５’−ＧＴＣ  ＣＧＴ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＴＧＣ  ＡＡＣ  ＴＧＣ（配列番号１０５）
ＳＩＮ−１１００Ｆ：５’−ＧＴＣ  ＣＧＴ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＴＧＣ  ＡＡＣ  ＴＧＡ（配列番号１０６）
逆方向プライマー：
ＳＩＮ２３００Ｒ
ＰＣＲプログラム：（９５℃−３０秒、７２℃−２分）２０サイクル
プライマーセット２：
正方向プライマー：
ＷＴ３５２４Ｆ  ５’−ＣＡＡ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＣＧＣ  ＣＴＴ  ＡＧＣ（配列番号１０７）
ＳＩＮ−１３５２４Ｆ     ５’−ＣＡＡ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＣＧＣ  ＣＴＴ  ＡＧＴ  （配列番号１０８）
逆方向プライマー：
ＳＩＮ５４４８Ｒ
ＰＣＲプログラム：  （９５℃−３０秒、６０℃−３０秒、７２℃−２分）２０サイクル
プライマーセット３：
正方向プライマー：
ＷＴ７５９２Ｆ  ５’ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＡＴＡ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＧＴＡ
（配列番号１０９）
ＳＩＮ−１７５９２Ｆ  ５’ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＡＴＡ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＧＴＴ（配列番号１１０）
逆方向プライマー：
ＳＩＮ７６４３Ｒ  ５’−ＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＡＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＧ（配列番号１１１）
ＰＣＲプログラム：（９５℃−３０秒、６０℃−３０秒、７２℃−２分）２０サイクル。
【０３０５】
レポータータンパク質発現ベクターを、ｌａｃＺ、ＳＥＡＰ、またはルシフェラーゼレポーター遺伝子をｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５ベクター骨格に挿入することにより構築した。別の反応において、ｐＫＳ−β−ｇａｌ、ｐＳＫ−ＳＥＡＰ、およびｐＫＳ−ｌｕｃプラスミド（実施例４）を、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化した。ｌａｃＺ、ＳＥＡＰ、またはルシフェラーゼ遺伝子を含むフラグメントを、１％アガロース／ＴＢＥゲル電気泳動により単離し、そして続いてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩで精製した。次いで、これらのレポーター遺伝子を、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ消化しＣＩＡＰ処理したｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５プラスミドに別の反応において連結した。これらの構築物は、ｐＢＳ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌ、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰ、およびｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ｌｕｃとして識別される。
【０３０６】
Ｂ．ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰ、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ｌｕｃまたはｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌ発現ベクターでトランスフェクトした細胞における異種タンパク質の発現
ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５またはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５ベクターを、トランスフェクトしたＢＨＫ細胞において、分泌されたアルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子発現のパターンを比較した。ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５プラスミドは、ＳＩＮ−１改変体というよりは野生型シンドビスウイルス由来の配列を含む。ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５発現ベクターの構築は、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５発現ベクターについての本明細書中の記載と、ベクター構築のためのテンプレートとして野生型シンドビスウイルス（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、ＷＯ  ９５／０７９９４）由来の全長のゲノムｃＤＮＡを用いたこと以外は全く同じであった。ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５発現ベクターの構築は以前に（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、前出）記載されており、従って、株（および、それゆえ配列）は異なっているが、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５発現ベクターおよびｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５発現ベクターに含まれるシンドビスウイルス特異的領域は同じである。
【０３０７】
１２ｍｍディッシュ中で７５％のコンフルエンシーで維持したベビーハムスター腎臓−２１（ＢＨＫ−２１）細胞を、１．０μｇのｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５発現ベクタープラスミドＤＮＡまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５発現ベクタープラスミドＤＮＡ（これらのＤＮＡは４．０μｌの市販の脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）で複合化した）でトランスフェクトした。他方で、トランスフェクション条件は脂質の製造者により示唆されるとおりであった。５％のウシ胎児血清を補充したＥａｇｌｅ最小必須培地を、別に指示しない限りトランスフェクション後４時間（ｈｐｔ）で細胞に添加した。トランスフェクトした細胞を、３７℃にてインキュベートした。トランスフェクション後種々の時間において以下に示すように、いくつかのアッセイを実施して、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５プラスミドＤＮＡまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした細胞における、ベクター特異的ＲＮＡ合成、および分泌されたアルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の発現を比較した。
【０３０８】
ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１  １．５−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞の培養培地へ分泌されたアルカリホスファターゼのレベルを比較した。細胞培養培地を、Ｐｈｏｓｐｈａ−ＬｉｇｈｔＴＭ化学発光レポーター遺伝子アッセイを用いて製造者（Ｔｒｏｐｉｘ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）の指示に従ってアルカリホスファターゼの存在についてアッセイした。手短に言うと、１０μｌの細胞培養上清を３０μｌの希釈緩衝液と混合し、そして６５℃にて３０分間インキュベートした。サンプルを室温まで放冷し、その後４０μｌのアッセイ緩衝液と混合した。サンプルを室温にて５分間インキュベートし、続いて４０μｌの反応緩衝液を添加した。サンプルを室温にて２０分間インキュベートした。全発光をＭＬ３０００マイクロタイタープレート照度計（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，  ＶＡ）上でサイクルモードで測定した。そしてｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１  １．５−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞の培養培地のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を４８ｈｐｔにおいて決定し、そして結果を以下の表に示す。
【０３０９】
トランスフェクトしたプラスミド                    ４８ｈｐｔにおけるＲＬＵ
ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰ    １８±１．７
ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰ          ９４±１０．７
ｐＣＤＮＡ３                                      ０．１３±０．０４。
【０３１０】
さらに、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰプラスミドまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰプラスミドでトランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞において合成されたベクター特異的ＲＮＡのレベルをノーザンブロット分析により、以前に記載されたものと全く同様に（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ、前出）、トランスフェクション後４８時間で決定した。この実験の結果を図９Ａに示す。総細胞性ＲＮＡを、トランスフェクトしたＢＨＫ細胞からＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔを用いて製造者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，  ＯＨ）により記載されるように単離した。トランスフェクトしたＢＨＫ細胞からのサンプル中に存在する総細胞性ＲＮＡ濃度を分光光学的に決定した。さらに、トランスフェクトした細胞から単離された物質が、１０μｌ／ｍｌのエチジウムブロミドにより染色した０．５μｇの総細胞性ＲＮＡの０．７％アガロース／ＴＢＥミニゲルによる電気泳動によりインタクトであることを決定した。ノーザンブロット分析をＳａｍｂｒｏｏｋおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）に従って実施した。すべてのトランスフェクトしたサンプル由来のＲＮＡを単一のノーザンブロット分析からのオートラジオグラムにおいて可視化され得るために、１レーン当たり、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰでトランスフェクトした細胞およびｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰでトランスフェクトした細胞由来のそれぞれ、２．５μｇおよび３０μｇのＲＮＡをロードした。試験した両方のプラスミドを有する別々のトランスフェクション由来の４つのＲＮＡサンプルを０．７％ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動し、そしてＺｅｔａ−ｐｒｏｂｅメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  ＣＡ）に移した。ブロットをアルカリホスファターゼ遺伝子に対応するランダムプライムしたプローブとハイブリダイズさせた。トランスフェクトされたＢＨＫ細胞におけるベクター特異的ＲＮＡ合成のレベルおよびＡＰ発現のレベルを４８ｈｐｔにて比較したこの実験の結果は、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰ  ＤＮＡでトランスフェクトした細胞において合成されるベクター特異的ＲＮＡのレベルが、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰトランスフェクト細胞におけるより少なくとも１００倍低いが、一方ＡＰのレベルはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰ  ＤＮＡと比較してｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰ  ＤＮＡでトランスフェクトした細胞において、５倍低いだけであったことを実証する。
【０３１１】
ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１  １．５−ＳＥＡＰまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞の培養培地へ分泌されるアルカリホスファターゼのレベルをまた、７日間にわたって経時的に比較した。この研究の結果を図９Ｂに示し、これは、初期の時点で培養培地中に存在するＡＰのレベルが、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰプラスミドと比較してｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１  １．５−ＳＥＡＰプラスミドでトランスフェクトした細胞においてはるかに低かったことを実証する。しかし、ＳＩＮ−１シンドビスウイルス改変体株由来ベクターでトランスフェクトした細胞において発現されるＡＰのレベルは迅速に増大し、そして９６ｈｐｔの時点まで、野生型ウイルス由来ベクターでトランスフェクトした細胞におけるよりも高かった。
【０３１２】
ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１  １．５−ｌｕｃプラスミドＤＮＡまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ｌｕｃプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞に存在するルシフェラーゼレベルを、２４、４８、および７２ｈｐｔにおいて比較した。ルシフェラーゼ発現レベルを、１０６のトランスフェクト細胞当たり２５０μｌのレポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を添加し、１４，０００ｒｐｍにて１分間溶解物を遠心分離し、次いで細胞溶解物由来の上清画分を市販の基質検出系（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）と混合し、続いて照度計測定（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）することにより定量した。この実験の結果（以下の表に示す）および図１０において図式的に示される結果は、アルカリホスファターゼ発現ベクターで観察した結果と同様であった。トランスフェクション後の初期の時間において、ルシフェラーゼ発現レベルは、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ｌｕｃプラスミドと比較してｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ｌｕｃプラスミドでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞において、低かった。しかし、４８および７２ｈｐｔ時点において、ルシフェラーゼレベルは、シンドビスウイルスＳＩＮ−１改変体株由来発現ベクターおよび野生型由来発現ベクターでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞と類似していた。
【０３１３】
【化１８】
2008200051.tif 000019
４８ｈｐｔでのＢＨＫ細胞におけるｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドおよびｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドのトランスフェクション効率を、β−ガラクトシダーゼを発現する細胞数を直接測定するために、細胞単層（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １３：２５３−２６５，  １９８７）の直接Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド）染色により決定した。トランスフェクション効率は同等であった。そして以下の表に示す。
【０３１４】
【化１９】
2008200051.tif 000020
ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドでトランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞中で合成されたベクター特異的ＲＮＡのレベルを、トランスフェクション後４８および７２時間後において、以前に記載された（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ、前出）ものと全く同様にノーザンブロット分析により決定した。総細胞性ＲＮＡをトランスフェクトしたＢＨＫ細胞から製造者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，  ＯＨ）によって記載される通りにＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔを用いて単離した。ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞由来のサンプル中に存在する総細胞性ＲＮＡ濃度を、分光光学的に決定した。さらに、トランスフェクトした細胞から単離した物質が、１０μｌ／ｍｌのエチジウムブロミドにより染色した、０．７％アガロース／ＴＢＥミニゲルによる０．５μｇの総細胞性ＲＮＡの電気泳動によりインタクトであることを決定した。ノーザンブロット分析は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）に従って実施した。すべてのトランスフェクトしたサンプル由来のＲＮＡを単一のノーザンブロット分析からのオートラジオグラムにて可視化され得るために、１レーン当たり、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌでトランスフェクトした細胞およびｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌでトランスフェクトした細胞由来のそれぞれ、２．５μｇおよび５μｇのＲＮＡをロードした。試験した両方のプラスミドを有する別々のトランスフェクション由来の２つのＲＮＡサンプルを、４８および７２ｈｐｔにおいて、０．７％ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動し、そしてＺｅｔａ−ｐｒｏｂｅメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  ＣＡ）に移した。ブロットをβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に対応するランダムプライムしたプローブでハイブリダイズした。この実験の結果を図１１Ａに示し、これはｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌ  ＤＮＡでトランスフェクトした細胞において、トランスフェクション後４８および７２時間で合成されたベクター特異的ＲＮＡのレベルが、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌトランスフェクト細胞において検出されたＲＮＡのレベルより少なくとも１００倍低かったことを実証する。
【０３１５】
さらに、β−ガラクトシダーゼ発現レベルを、１０６トランスフェクト細胞当たり２５０μｌのレポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を添加し、１４，０００ｒｐｍにて１分間溶解物を遠心分離し、次いで細胞溶解物由来の上清画分を市販の基質検出系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）と混合し、続いて照度計測定（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）することより、トランスフェクトした全細胞溶解物中で定量した。この実験の結果（以下の表に示し、そして図９Ｃにおいて図式的に示す）は、トランスフェクション後初期の時点において、β−ガラクトシダーゼ発現レベルが、  ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドと比較して、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞において、  顕著に低かったことを実証する。しかし、レポーター発現は、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌトランスフェクト細胞において経時的に迅速に増大し、その結果β−ガラクトシダーゼレベルは、最後の１２０時間の時点において野生型ウイルスでトランスフェクトした細胞におけるよりも高かった。
【０３１６】
【化２０】
2008200051.tif 000021
ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１  １．５−β−ｇａｌプラスミドＤＮＡまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの発現をまた、最後の１２０ｈｐｔ時点において、レポータータンパク質に特異的なモノクローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いるウェスタンブロット分析により直接測定した。１２０ｈｐｔで決定したレポータータンパク質の活性と類似して、β−ガラクトシダーゼタンパク質のレベルは、ＰＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１  １．５−β−ｇａｌトランスフェクトＢＨＫ細胞において、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌと比較して、同レベルであるかそれ以上であり、そして図１１Ｃに示す。
【０３１７】
これらを総合すると、本明細書中に記載の結果は、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳトランスフェクト細胞において合成されるベクター特異的ＲＮＡのレベルは、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳトランスフェクト細胞と比較して、少なくとも１００倍少ないことを示す。しかし重要なことに、４８〜７２時間のラグの後、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳトランスフェクト細胞におけるレポーター遺伝子発現のレベルは、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳトランスフェクト細胞と比較して同等またはそれ以上である。トランスフェクト細胞における低いベクター特異的ＲＮＡ合成との組合せの高発現レベルで特徴付けられるｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳの表現型は、おそらく宿主細胞タンパク質合成が低減しているか、または存在しないことに起因する。従って、このｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳの特性は、トランスフェクト細胞におけるサブゲノムｍＲＮＡ翻訳テンプレート当たりの発現されるレポータータンパク質を、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳと比較してはるかに高いレベルで生じる。要約すれば、ＳＩＮ−１改変体株由来のプラスミドＤＮＡ発現ベクターの表現型は、野生型ウイルス由来ベクターと比較して、比較的低レベルのＲＮＡ合成と組み合わさった同等の発現レベルという点で、親ウイルスに追随している。ベクターは、シンドビスウイルス構造タンパク質を含有していないので、この表現型は、ＳＩＮ−１ウイルス改変体の非構造遺伝子にマップされるはずである。
【０３１８】
実施例５
プラスミドＤＮＡ  ＳＩＮ−１由来発現ベクターの改変
アルファウイルスに基づくベクターからの標的細胞における異種遺伝子の発現レベルは、宿主の属およびベクター構成を含むいくつかの要素によって影響される。例えば、ＢＨＫ細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現レベルは、いくつかのヒト細胞（例えば、ｐＢＧ／ＥＬＶＳベクターでトランスフェクトされたＨＴ１０８０）と比較して、１０〜１００倍高い。ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫおよびいくつかのヒト細胞株におけるレポーター遺伝子発現のレベル（実施例４を参照のこと）を、意図されるインビボ標的属由来の細胞型におけるベクター特異的発現の相対的レベルを樹立するために比較した。ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌプラスミド、または従来のプラスミド発現ベクターでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞およびヒト線維肉腫株のＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １２１）細胞における、β−ガラクトシダーゼ発現のレベルを決定した。ＣＭＶプロモーター駆動ｐＵＣ由来発現プラスミドマルチクローニング部位（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）へのｌａｃ  Ｚ遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）の挿入により、従来のプラスミドベクターを構築した。そしてこれはｐＣＭＶ−β−ｇａｌとして識別される。図１２Ａに示す本研究の結果は、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現のレベルは、ＢＨＫ細胞と比較しておおよそ１００倍低いことを実証する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ発現をシンドビスウイルスベクターレプリコン発現から分離するために、細胞をまた、ｐＣＭＶ−β−ｇａｌでトランスフェクトした。この実験において、ＢＨＫ細胞と比較して、ｐＣＭＶ−β−ｇａｌプラスミドでトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞における発現は５〜１０倍減少したが、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞における発現はおおよそ１００倍減少した。従って、この結果は、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞におけるレポーター遺伝子発現の劇的な減少は、部分的に、これらのヒト細胞におけるシンドビスウイルスベクターレプリコンの減少された活性によることを示す。
【０３１９】
ＲＮＡアルファウイルスゲノムおよびＢＨＫ細胞におけるウイルスの増殖の全体的な柔軟性を考慮すると、異種遺伝子の発現レベルがベクターが由来する宿主細胞株において最も高いことは、驚くべきことではない。従って、比較的低いウイルスＲＮＡレベルおよび同等なウイルス生成レベルと、宿主細胞タンパク質合成の阻害の遅延または非存在を伴うことによって特徴付けられるＳＩＮ−１表現型（実施例１および２に記載）を有するアルファウイルスの選択は、任意のヒト初代細胞、または二倍体もしくは倍数体ヒト細胞において実施され得る。
【０３２０】
最も密接にインビボで標的細胞に類似する細胞（例えば、ヒト）において所望の表現型を有するアルファウイルスの選択に加えて、原型プラスミドＤＮＡ発現カセット成分のいくつかの代替の改変が実施され得る。例えば、強力なＣＭＶ即時型（ＩＥ）プロモーターでのＭｏＭＬＶ  ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの置換は、トランスフェクト細胞における異種遺伝子発現のレベルを有意に増強する（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０：５０８−５１９，  １９９６、およびＤｕｂｅｎｓｋｙら、Ｗ／Ｏ  ９５／０７９９４）。さらに、異種遺伝子の上流または下流のいずれかでのイントロン（例えば、ＳＶ４０スモールｔ抗原またはＣＭＶイントロンＡ）の並列は、いくつかのトランスフェクト細胞型において異種遺伝子発現のレベルを増大し得る（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、前出）。
【０３２１】
インビトロまたはインビボで、トランスフェクト細胞における発現全体を増強するために、原型プラスミドＤＮＡ発現カセット成分のいくつかのさらなる代替の改変もまた利用され得る。１つの改変において、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）転写後調節エレメント（ＰＲＥ）をｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌプラスミドＤＮＡに挿入した。ＰＲＥ配列は、ＨＢＶ  Ｓ転写産物の核から細胞質への輸送をシスで活性化する。ＰＲＥ配列は、スプライスドナーおよびアクセプター部位とは独立して機能するようであり、そしてイントロンを含まないβ−グロブリン転写産物の細胞質発現を活性化することが示されている。シスにおけるＰＲＥ機能は、スプライシング経路と効率的に相互作用しないために、核から十分に輸送されない核転写産物の輸送を可能にすると提案されている（Ｈｕａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：３８６４−３８６９，  １９９５）。
【０３２２】
ＰＲＥ配列を、最初にＰＣＲ生成されたＨＢＶの５６４ｂｐフラグメントをＡＤＷウイルス株のｐＡＭ６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ３９６３０）全長ゲノムクローンから単離することにより、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌにクローン化した。増幅フラグメントは、ＨＢＶゲノムの塩基１２３８〜１８０２にわたる。プライマー配列を以下に示す。
【０３２３】
正方向プライマー：ＮＴＰＲＥ１２３８Ｆ（配列番号４６）
５’−ＣＣＴＡＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＣＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣ
逆方向プライマー：ＥＡＰＲＥ１８０２Ｒ（配列番号４７）
５’−ＣＣＴＡＴＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣＴＡＣ。
【０３２４】
プライマーは、フラグメントの５’末端にＮｏｔ  Ｉ認識部位および３’末端にＥａｅ  Ｉ認識部位を導入する。Ｎｏｔ  ＩおよびＥａｅ  Ｉは、適合性の粘着末端を有する。Ｅａｅ  Ｉ認識部位はＮｏｔ  Ｉ部位に内在するので、Ｅａｅ  Ｉは、両方の部位を切断する。
【０３２５】
ＰＣＲフラグメントをＥａｅ  Ｉで消化し、そしてＮｏｔ  Ｉ消化／ＣＩＡＰ処理ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌにクローン化した。正確なクローンはＰＲＥの５’末端にＮｏｔ  Ｉ部位を保有し、そしてこれをｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ／ＰＲＥ  １．５−βｇａｌと呼ぶ。
【０３２６】
ＥＬＶＳプラスミドに含まれるＰＲＥ配列の、トランスフェクト細胞における異種遺伝子発現への可能な効果を決定した。簡潔には、ＢＨＫおよびＨＴ１０８０細胞を１２ｍｍディッシュ中で７５％コンフルエンスまで培養し、そしてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）で複合体化した５００ｎｇのｐＣＭＶ−β−ｇａｌ、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌ、またはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ／ＰＲＥ  １．５−βｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトし、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現のレベルを４８時間後に決定した。トランスフェクション効率を、実施例４に記載のように、トランスフェクト単層の直接的なＸｇａｌ染色によって決定した。そして以下の表に示す。
【０３２７】
【化２１】
2008200051.tif 000022
この結果は、ＥＬＶＳプラスミドでトランスフェクトされ、βガラクトシダーゼを発現するＢＨＫまたはＨＴ１０８０細胞の数が、ベクター中にＲＮＡ輸送ＰＲＥ配列を含ませることにより、劇的に増大したことを明らかに実証する。さらに、これらの結果は、ＥＬＶＩＳプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞に比較して、ＨＴ１０８０細胞において減少された異種遺伝子発現レベルの１つの原因が、１次転写産物の核からの非効率的な輸送であることを示す。
【０３２８】
ＰＲＥ配列を含むＥＬＶＳプラスミドでトランスフェクトされ、レポータータンパク質を発現するＨＴ１０８０細胞のより高い頻度に類似して、ＰＲＥ配列を含むＥＬＶＳベクターでトランスフェクトされたＨＴ１０８０細胞からの溶解物において、β−ガラクトシダーゼのレベルは劇的により高かった。これらの結果を図１２Ｂに示し、そして上の表に示した結果と一緒に、ＥＬＶＳプラスミドでトランスフェクトされたヒト細胞において、機能的ベクターレプリコンが核から非効率的に輸送されることを実証する。さらに、ＥＬＶＳプラスミド構築にＰＲＥ配列を含ませることにより、試験した全ての細胞において異種遺伝子発現のレベルが増大する。これは、細胞質ベクターレプリコン輸送の効率と、全体の異種遺伝子発現レベルとの間の明らかな相関を実証する。
【０３２９】
非スプライシングＲＮＡの輸送にシスで作動する、いくつかの他のウイルス配列エレメントもまた同定した。例えば、メイソン−パイツァーサルウイルス（ＭＰＭＶ）ゲノムの３’末端の近くのｎｔｓ８０２２と８２４０との間に位置する２１９ｂｐ配列が、Ｒｅｖ非依存性ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）複製を可能にすることを示した（Ｂｒａｙら、ＰＮＡＳ  ９１：１２５６−１２６０，  １９９４）。全長ゲノムクローンテンプレート（Ｓｏｎｉｇｏら、Ｃｅｌｌ  ４５：３７５−３８５，  １９８６）またはＭＰＳＶサブゲノムクローンｐＧＥＭ７ＦＺ（−）ＭＰＳＶ  ８００７−８２４０  （Ｄ．  Ｒｅｋｏｓｈ，  Ｈａｍ−Ｒｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＳＵＮＹ  ａｔ  Ｂｕｆｆａｌｏ，  ３０４  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｈａｌｌ，  Ｂｕｆｆａｌｏ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）からＰＣＲ生成されたＭＰＳＶの２１９ｂｐフラグメントを最初に単離することにより、構成的輸送エレメント（ＣＴＥ）として知られるＭＰＭＶ  ＲＮＡ輸送エレメントを、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌプラスミドに挿入する。増幅されたフラグメントは、ＭＰＳＶゲノムの塩基８０２２〜８２４０にわたる。プライマー配列を以下に示す。
【０３３０】
正方向プライマー：ＮＭＰＶＭ８０２１Ｆ（配列番号４８）
５’−ＣＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＡＴＧＡＣＧ
逆方向プライマー：ＥＭＰＭＶ８２４１Ｒ（配列番号４９）
５’−ＣＣＴＡＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＣＡＧ。
【０３３１】
プライマーは、フラグメントの５’末端にＮｏｔ  Ｉ認識部位および３’末端にＥａｅ  Ｉ認識部位を導入する。Ｎｏｔ  ＩおよびＥａｅ  Ｉは、適合性の粘着末端を有する。Ｅａｅ  Ｉ認識部位はＮｏｔ  Ｉ部位に内在するので、Ｅａｅ  Ｉは、両方の部位を切断する。
【０３３２】
ＰＣＲフラグメントをＥａｅ  Ｉで消化し、そしてＮｏｔ  Ｉ消化／ＣＩＡＰ処理ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌにクローン化した。正確なクローンはＰＲＥの５’末端にＮｏｔ  Ｉ部位を保有し、そしてこれをｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ／ＣＴＥ  １．５−βｇａｌと呼ぶ。
【０３３３】
ＨＢＶ  ＰＲＥおよびＭＰＳＶ  ＣＴＥ配列に加えて、他のウイルスまたは細胞供給源由来のいくつかのＲＮＡ輸送エレメントがＥＬＶＳプラスミド構築物に上記のように挿入され得る。例えば、これらのいくつかのエレメントは、ＨＩＶ  Ｒｅｃ応答エレメント（Ｍａｌｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３３８：２５４−２５７，  １９８９）、ＨＴＬＶ  １  Ｒｅｘエレメント（Ａｈｍｅｄら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ４：１０１４−１０２２，  １９９０）、およびサルレトロウイルス１型由来の別のシス作用配列（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６８：７９４４−７９５２，  １９９４）を含む。さらに、上記のＲＮＡ輸送エレメントの各々はまた、実施例６および７に記載される構造タンパク質発現カセット、パッケージング細胞株、またはプロデューサー細胞株に組込まれ得る。
【０３３４】
原型ＥＬＶＳベクターのなお別の改変において、アルファウイルスレプリコンの発現を、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターから駆動させ得る。簡潔には、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターは組織特異性ではなく、そして本質的に身体の全てのヒト細胞において発現されるので、これらはトランスフェクト細胞におけるプラスミドＤＮＡ指向アルファウイルスレプリコン発現のための魅力的な代替物を提供する。例えば、ヒトｒＤＮＡプロモーター（プラスミドｐｒＨＵ３、ＬｅａｒｎｅｄおよびＴｊｉａｎ，  Ｊ．Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎ．，  １：５７５−５８４，  １９８２）は、異種遺伝子発現のためのベクターを構築するために使用されている（Ｐａｌｍｅｒら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１：３４５１−３４５７，  １９９３）。
【０３３５】
従って、本発明の１つの実施態様において、トランスフェクトされた細胞において転写される最初のヌクレオチドが、真のアルファウイルス５’末端に対応するように、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターをレプリコンｃＤＮＡの５’末端に並列させ得る。転写開始が生じるＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター（例えば、プラスミドｐｒＨＵ３）ヌクレオチドの同定は、以前記載されたように決定される（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｗ／Ｏ  ９５／０７９９４）。
【０３３６】
シンドビスウイルス野生型またはＳＩＮ−１  ｎｓＰ、または任意のアルファウイルス由来のｎｓＰ遺伝子を含むＥＬＶＳ構築物を用いて、本明細書中に記載される全ての改変を実施し得る。例えば、実施例５において提供された全ての構築物もまた、実施例４に構築が記載されるプラスミドｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌを用いて実施し得る。
【０３３７】
実施例６
アルファウイルスパッケージング細胞株の構築
本発明において、アルファウイルスパッケージング細胞株（ＰＣＬ）が提供される。これにより、ＲＮＡパッケージングおよび組換えアルファウイルスベクター粒子の形成に必要なウイルス由来構造タンパク質が、１つ以上の安定に形質転換される構造タンパク質発現カセット（単数または複数）によりコードされる。これらのタンパク質の合成は、好ましくは誘導様式で生じ、そして特に好ましい実施態様において、それらのネイティブな「連結領域」プロモーターからのサブゲノムｍＲＮＡの転写を介して生じる。誘導性サブゲノム転写は、導入アルファウイルスベクターＲＮＡ自体により媒介される（図１３）。構造タンパク質発現カセット（単数または複数）からの１次転写に続き、ベクターにコードされた非構造タンパク質によりＲＮＡ転写産物の細胞質性増幅が開始され、そして最終的に連結領域プロモーターからの転写および高レベル構造タンパク質発現に導く。構造タンパク質発現カセットは、本発明において以前記載された任意のエレメントを含み、ＲＮＡ輸送エレメント（例えば、ＨＢＶ  ＰＲＥおよびＭＰＭＶ  ＣＴＥ）およびスプライシング配列を含み得る。ＰＣＴ出願ＷＯ  ９５／０７９９４に記載される方法を用いて、または本発明に記載される新規なアプローチを用いて、このようなＰＣＬおよびこれらの安定に形質転換される構造タンパク質発現カセットを誘導し得る。ＰＣＬは、哺乳動物および非哺乳動物の両方の細胞を含む、現存するほとんどいかなる親の細胞株に由来し得る。ＰＣＬの誘導のために好ましい実施態様は、ヒト起源の細胞株である。
【０３３８】
Ａ．ベクター誘導性アルファウイルスＰＣＬの構築
例えば、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットを構築した。これにより、ＣＭＶ即時型プロモーターからの１次転写は、効率的な細胞質性増幅、およびベクターＲＮＡからの非構造レプリカーゼタンパク質の翻訳後のみの構造タンパク質発現を可能にするＲＮＡ分子を生成する。詳細には、ＤＮＡに基づくシンドビス欠陥ヘルパー（ＤＨ）ベクターのプラスミドｐＤＣＭＶ−ｄｌｎｓＰＳＩＮ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０：５０８−５１９，  １９９６）を、３’末端ＲＮＡプロセシングのためにδ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）抗ゲノムリボザイム配列（ＰｅｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：４３４−４３６，  １９９１）、および非構造タンパク質遺伝子欠失の領域中に挿入されたＳＶ４０スモールｔ抗原イントロンの両方を含むように改変した。ＨＤＶリボザイム配列の挿入に伴う制限部位の重複により、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（同書）からのさらなるプラスミドｐＤＬＴＲＳＩＮｇＨＤＶを出発物質として用いて、改変ＣＭＶに基づくＤＨ構築物を再構築した。プラスミドｐＤＬＴＲＳＩＮｇＨＤＶはＨＤＶリボザイムを含むＬＴＲに基づくシンドビスゲノムクローンであり、これをＢｇｌ  ＩＩで消化して、存在するＬＴＲプロモーターおよびシンドビスヌクレオチド１〜２２８９（Ｓｔｒａｕｓｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３３：９２−１１０，  １９８４に従う番号づけ）を除去し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩＴＭ（Ｂｉｏ１０１，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いて０．７％アガロースゲルから精製した。シンドビスゲノムクローンｐＤＣＭＶＳＩＮｇ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同書）のＢｇｌ  ＩＩ消化およびＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いる１％アガロースゲルからの精製により、ＣＭＶプロモーターを有する対応する５’末端フラグメントを得、次いでＢｇｌ  ＩＩ欠失ｐＤＬＴＲＳＩＮｇＨＤＶベクターに連結して、構築物ｐＤＣＭＶＳＩＮｇＨＤＶを生成した。ＨＤＶリボザイムを有するこのＣＭＶに基づくゲノムプラスミドは、感染性シンドビスウイルスを生成し、そしてＢＨＫ細胞へのトランスフェクト後の２４時間以内に細胞変性効果を生じることを示した。次いで、ＨＤＶリボザイムを含む欠陥ヘルパープラスミドｐＤＣＭＶｄｌｎｓＰＳＩＮｇＨＤＶを、ＢｓｐＥ  Ｉ消化および希釈条件下での再連結により構築し、ヌクレオチド４２２と７０５４との間の非構造遺伝子配列を除去した。同時に、ＳＶ４０イントロンをＰＣＲにより合成し、非構造タンパク質遺伝子欠失の領域に挿入した。ＳＶ４０イントロン配列の増幅を、テンプレートとしてプラスミドｐＢＲ３２２／ＳＶ４０（７７６株、ＡＴＣＣ  ＃４５０１９）および隣接ＢｓｐＥ  ＩまたはＢａｍＨ  Ｉ部位を含むように設計した以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、３０秒間の伸長時間を有する標準的な３サイクルＰＣＲにより達成した。
【０３３９】
正方向プライマー：ＢｓｐＳＶＳＤＦ  （５’−制限部位／ＳＶ４０イントロン配列）（配列番号５０）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＣＣＧＧＡ／ＡＡＧＣＴＣＴＡＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴ−３’
逆方向プライマー：ＢａｍＳＶＳＡＲ  （５’−制限部位／ＳＶ４０イントロン配列）（配列番号５１）
５’−ＴＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣ／ＴＡＧＧＴＴＡＧＧＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＡＡＡＴＡＣＡＣＡＡＡＣ−３’。
【０３４０】
増幅に続いて、ＤＮＡフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  ＣＡ）を用いて精製し、ＢｓｐＥ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで消化し、ＭｅｒｍａｉｄＴＭ（Ｂｉｏ１０１，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いて１．２％アガロースゲルから精製し、そして欠陥ヘルパープラスミドｐＤＣＭＶ−ｄｌｎｓＰＳＩＮ（これもまたＢｓｐＥ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで消化し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて０．７％アガロースゲルから精製した）に連結し、構築物ｐＤＣＭＶ−ｉｎｔＳＩＮｒｂｚ（図１４）を生じた。プラスミドの別の部分にＳＶ４０プロモーター駆動ネオマイシン耐性選択マーカーをまた含むプラスミドｐＤＣＭＶ−ｉｎｔＳＩＮｒｂｚを、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）を用いて、製造者によって記載されるようにＢＨＫ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトの約２４時間後、細胞をトリプシン処理し、そして６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ネオマイシン）を含む培地に再プレートした。培地を定期的に新鮮なＧ４１８含有培地に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖させた。細胞をトリプシン処理し、そして９６ウェル組織培養ディッシュへの限界希釈によりクローン化し、そして個々の細胞クローンを増殖させそしてスクリーニングのために拡大した。
【０３４１】
個々のクローンについてのポジティブなパッケージング活性を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同書に記載）を発現するシンドビスベクターＲＮＡでのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）トランスフェクション、トランスフェクションの約２４時間後の培養上清を採取すること、およびパッケージ化シンドビス−ルシフェラーゼベクター粒子の存在についてアッセイすることにより同定した。さらに、最初のトランスフェクションレベルを、レポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を用いてトランスフェクト細胞溶解物を採取すること、および製造者によって記載されるようにルシフェリン基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性の存在について試験することにより決定した。培養上清におけるパッケージ化ベクター粒子についてアッセイするために、１ｍｌの希釈していない、明澄化上清を使用して新鮮なＢＨＫ細胞単層を約１８時間感染させた。次いで、細胞を上記のように溶解し、そしてルシフェラーゼ活性を決定した。感染ＢＨＫ細胞におけるルシフェラーゼ活性の存在は、トランスフェクト細胞上清におけるパッケージ化ベクター粒子を確認した。ｐＤＣＭＶ−ｉｎｔＳＩＮｒｂｚ構造タンパク質発現カセットの組み込まれたコピーを保有し、そしてＰＣＬとして機能するいくつかのポジティブ細胞クローンを同定した。群の代表的な２つの個々のＰＣＬクローン（＃１０ｓ−１９および＃１０ｓ−２２）のパッケージング化データを図１５に示す。さらに、生成されたパッケージ化ベクター粒子の力価を、個々のＰＣＬクローン（＃１０ｓ−２２）をＳＩＮ−β−ｇａｌベクターＲＮＡ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同書に記載）でトランスフェクトすることにより決定した。培養上清をトランスフェクションの４８時間後に回収し、０．４５ｍｍフィルターの通過により明澄化し、そして新鮮なＢＨＫ単層を上清の１０倍希釈で感染させた。トランスフェクションの約１４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで再び洗浄し、そしてＸ−ｇａｌで染色した。次いで、ベクター粒子ユニットを、個々の青色染色細胞の計数により決定した。このＰＣＬクローンからのパッケージ化β−ｇａｌベクター力価は、上清の約１０６感染ユニット／ｍｌであった。シンドビス構造タンパク質発現のベクター制御誘導性を、構造タンパク質に対して特異的なポリクローナルウサギ抗血清を用いて、ウェスタンブロット分析により実証した。ポジティブ１０ｓ−２２  ＰＣＬおよびネガティブコントロールＢＨＫ細胞溶解物を、ＳＩＮ−β−ｇａｌベクターＲＮＡでのトランスフェクションの前（Ｕ；非誘導）か、または後（Ｉ；誘導）のいずれかでＬａｍｅｌｉサンプル緩衝液中で作製した。図１６に示すように、ベクターＲＮＡでのトランスフェクションの後に、シンドビス構造タンパク質の発現を示した細胞溶解物は、１０ｓ−２２  ＰＣＬクローンのみであった。キャプシドタンパク質とエンベロープ糖タンパク質との間の発現の見かけ上のレベルの差異は、作製された実際のタンパク質の量か、またはこの特定の実験のために使用した細胞溶解手順におけるエンベロープ糖タンパク質のより低い安定性のいずれをも反映しない。
【０３４２】
ＣＭＶに基づくＤＨ構築物のパッケージング活性はまた、非哺乳動物細胞（例えば、Ｃ６／３６蚊細胞）においても高い効率であった。ＰＣＬの誘導のためのこのような非哺乳動物の親の細胞型の使用は、ＰＣＬがベクタープロデューサー細胞株の生成のための出発物質としての後の使用のために意図される場合に、特に有利であり得る。この細胞型の利点は、宿主巨大分子合成の阻害、および細胞変性効果（ＣＰＥ）を生じる、哺乳動物細胞に伴う表現型を有さずに、アルファウイルスの持続感染を樹立する天然の能力である。従って、適切な選択マーカーを有するＤＮＡに基づくアルファウイルスベクター（実施例４および５）が、蚊または他の非哺乳動物細胞由来のＰＣＬに安定に形質転換され得る。図１７Ａは、ＣＭＶプロモーターの制御下でＤＮＡに基づくルシフェラーゼレポーターベクターおよびシンドビス構造タンパク質を発現するＤＨヘルパーベクターの両方が、ルシフェラーゼベクターパッケージングにより実証されるように、Ｃ６／３６細胞において完全に機能性であったことを示す。
【０３４３】
Ｂ．作動可能に連結された選択マーカーを有するＰＣＬの構築
本発明の他の実施態様において、選択マーカーをアルファウイルス構造タンパク質発現カセットの転写に作動可能に連結した。好ましい実施態様において、この作動可能な連結を、残りのｎｓＰ１アミノ酸との融合物としてのマーカーの非構造タンパク質遺伝子欠失の領域への挿入、または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列の翻訳制御下での構造タンパク質遺伝子の下流への挿入のいずれかによって達成する。再び、一次構造タンパク質遺伝子ｍＲＮＡ転写産物の増幅および構造タンパク質発現の誘導を、インプットベクターＲＮＡ分子および合成されたその非構造タンパク質により制御する。
【０３４４】
詳細には、構造タンパク質発現カセットの構築のために、プラスミドｐＢＧＳ１３１（Ｓｐｒａｔｔら、Ｇｅｎｅ  ４１：３３７−３４２，  １９８６；ＡＴＣＣ  ＃３７４４３）を改変して外来性配列を除去し、そしてカナマイシン耐性遺伝子中に存在するＸｈｏ  Ｉ部位を非機能性にした。プラスミドｐＢＧＳ１３１をＸｈｏ  Ｉで消化し、そしてＸｈｏ  Ｉ適合性末端を有する合成２本鎖オリゴヌクレオチドリンカーをこの部位に連結した。以下に示す合成１２マーオリゴヌクレオチドを、それ自体にアニールして連結のためのＸｈｏ  Ｉ粘着末端を生じる部分的パリンドロームとして設計し、そして４つのインフレームのアミノ酸を挿入することにより、カナマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレームを維持した。
【０３４５】
ｄｌＸｈｏリンカー（配列番号５２）
５’−ＴＣＧＡＴＣＣＴＡＧＧＡ。
【０３４６】
このオリゴヌクレオチドの挿入は、Ｘｈｏ  Ｉ部位欠失プラスミドを生じ、これをｐＢＧＳ１３１ｄｌＸｈｏＩと命名した。次に、このプラスミドをＢｓｐＨ  Ｉで消化し、希釈条件下で自己に連結し、ＣｏｌＥ１レプリコンとカナマイシン耐性マーカーとの間の８２９ｂｐの外来性配列を除去し、プラスミドｐＢＧＳ１３１ｄｌＢを生成した。次に、ｐＢＧＳ１３１ｄｌＢをＢｓｐＨ  Ｉで消化することによりＢｓｐＨ  Ｉ部位をＰａｃ  Ｉ部位に変換し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素およびｄＮＴＰで末端を平滑にし、そして過剰のＰａｃ  Ｉリンカーと連結した。
【０３４７】
Ｐａｃ  Ｉリンカー（配列番号５３）
５’−ＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣ。
【０３４８】
ｐＢＧＳ１３１ｄｌＢ−Ｐと呼ばれるこの新しい構築物を、Ｆｓｐ  ＩおよびＰｖｕ  ＩＩで消化することにより、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含むさらなる４７２ｂｐを除去し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて残りのベクターを１％アガロースゲルから精製することにより、さらに改変した。置換ＭＣＳを、２つの相補的オリゴヌクレオチドＰＭＥ．ＭＣＳＩおよびＰＭＥ．ＭＣＳＩＩをアニーリングし、そして線状化プラスミドと連結することにより、改変ベクターに挿入した。
【０３４９】
ＰＭＥ．ＭＣＳＩ（配列番号５４）
５’−ＣＴＧＴＴＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡ−３’
ＰＭＥ．ＭＣＳＩＩ（配列番号５５）
５’−ＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴＡＡＡＣＡＧ−３’。
【０３５０】
約２４７５ｂｐの新しいクローニングベクターをｐＢＧＳＶＧと命名し、そしてこれは以下のマルチクローニング部位を含んでいた：＜Ｐｍｅ  Ｉ−Ｂｇｌ  ＩＩ−Ｘｈｏ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉ−Ｐｍｅ  Ｉ＞。作動可能に連結された選択マーカーを含む構造タンパク質発現カセットの挿入を、段階的に、以下のように行った。シンドビスウイルスの３’末端、合成Ａ４０路、抗ゲノムＨＤＶリボザイム、およびＢＧＨ転写終結シグナルを含むＤＮＡフラグメントを、Ｎｏｔ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉでの消化およびＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いる１％アガロースゲルからの精製により、プラスミドｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５（実施例５）から取り出した。プラスミドｐＢＧＳＶＧもまた、Ｎｏｔ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて１％アガロースゲルから精製し、そして精製３’末端／Ａ４０／ＨＤＶ／ＢＧＨフラグメントと連結し、構築物ｐＢＧＳＶ３’を生成した。次に、構造タンパク質遺伝子および非構造タンパク質をコードする領域の大部分を含む約９２５０ｂｐのシンドビスｃＤＮＡフラグメントを、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＦｓｐ  Ｉでの消化により、プラスミドｐＤＬＴＲＳＩＮｇ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同書）から取り出し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて０．７％アガロースゲルから精製した。次いで、シンドビスｃＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＢＧＳＶ３’（これもまた、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＦｓｐ  Ｉで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて０．７％アガロースゲルから精製した）に連結した。新たな構築物をｐＢＧＳＶ３’ＢＦと命名した。続いて、この構築物をＢｇｌ  ＩＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩで残りの５’末端および非構造遺伝子配列ならびにＣＭＶ  ＩＥプロモーターの挿入のために精製した。残りの配列を、Ｂｇｌ  ＩＩでのプラスミドｐＤＣＭＶＳＩＮｇ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同書）の消化、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いる１％アガロースゲルからのフラグメントの精製、および線状ｐＢＧＳＶ３’ＢＦベクターとの連結により得、ＣＭＶ駆動シンドビスゲノム構築物であるｐＢＧＳＶＣＭＶｇｅｎを作製した。この構築物のシンドビスウイルス複製サイクルの開始についての機能性を、ｐＢＧＳＶＣＭＶｇｅｎプラスミドのＢＨＫ細胞へのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ媒介トランスフェクションおよびトランスフェクト後２４時間以内のＣＰＥの観察により決定した。
【０３５１】
続いて、プラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｇｅｎを使用し、ほとんどの非構造タンパク質遺伝子を欠失させ、そしてｎｓＰ１オープンリーディングフレームの残りのコドンとのインフレーム融合物としてネオマイシン耐性遺伝子を挿入することにより、ＤＨ構造タンパク質発現カセットを構築した。簡潔には、隣接するＢｓｐＥ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉ部位を含むように設計した以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子をｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）から標準的な３サイクルＰＣＲにより増幅した。
【０３５２】
正方向プライマー：ＮＥＯ５’ＦＵＳＥ（５’−制限部位／ｎｅｏ遺伝子）（配列番号５６）
５’−ＡＴＡＴＡＴＣＣＧＧＡ／ＧＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡ
逆方向プライマー：ＮＥＯ３’ＢＡＭ（５’−制限部位／ｎｅｏ遺伝子）（配列番号５７）
５’−ＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣ／ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡ。
【０３５３】
増幅後、ＤＮＡフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎを用いて精製し、ＢｓｐＥＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して精製し、そしてプラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｇｅｎ（ＢｓｐＥＩおよびＢａｍＨＩで同様に消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製した）に連結した。生じた構築物をｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏと命名した。そしてこれを図１４において模式的に示す。ｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏの構成は、構造タンパク質発現カセットの一部として、そして同じＣＭＶプロモーターによって制御される、開始メチオニンおよびｎｓＰ１のアミノ末端の１２１アミノ酸ならびにメチオニン開始コドンおよび次の１０のアミノ酸を欠失するネオマイシン耐性遺伝子を含む融合タンパク質を含む。
【０３５４】
プラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏを、製造者によって記載されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎを使用して、ＢＨＫ細胞へトランスフェクトした。トランスフェクション約２４時間後、細胞をトリプシン処理し、そして６００μｇ／ｍｌの薬物Ｇ４１８（ネオマイシン）を含有する培地中に再びプレートした。培地を、新たなＧ４１８含有培地で定期的に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖させた。細胞をトリプシン処理し、そして９６ウェル組織培養ディッシュ中で限界希釈によってクローニングし、そしてスクリーニングのために個々の細胞クローンを増殖させ、そして拡大させた。個々のクローンについて、ポジティブパッケージング活性について、シンドビスルシフェラーゼベクターＲＮＡをトランスフェクトし、そして先の節において記載されたようにパッケージングされたシンドビスルシフェラーゼベクター粒子の存在についてアッセイすることによって同定した。組み込まれたｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏ構造タンパク質遺伝子発現カセットのコピーを有し、そしてＰＣＬとして機能するいくつかのポジティブ細胞クローンを同定した。群を代表する個々のクローン（Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ１５）についての、ならびに上記の１０ｓ−２２  ＰＣＬ株のＳＮＢＳＴＭ−ルシフェラーゼベクターパッケージングデータを図１８に示す。
【０３５５】
シンドビス−ルシフェラーゼベクターを用いた機能的なパッケージング活性を実証することに加えて、同じＰＣＬを使用して行ったさらなる実験もまた、他のアルファウイルス由来のベクターもまた、パッケージングされ得ることを示した。例えば、β−ガラクトシダーゼを発現するシンドビス（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同書）およびセムリキ森林（ｐＳＦＶ３−ｌａｃＺ；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）ベクターＲＮＡの両方を、Ｆ１５パッケージング細胞株へトランスフェクトした。トランスフェクションの約４８時間後、培養上清を採取し、明澄化し、連続的に希釈し、そしてベクター粒子力価の測定のために、新鮮なＢＨＫ細胞単層に感染するために使用した。感染１８時間後、上記のようにＢＨＫ細胞を固定し、Ｘ−ｇａｌで染色し、そして青色染色細胞を数えた。シンドビスβ−ｇａｌについて得たベクター力価は、約５×１０６ＩＵ／ｍｌであったが、ＳＦＶβ−ｇａｌについての力価は約４×１０６ＩＵ／ｍｌであった。これらのデータは、２つの異なるアルファウイルスおよびそれらに対応するベクターが、類似のパッケージングシグナルを有すること、および本明細書中で記載されるシンドビス系のために誘導したＰＣＬが別のアルファウイルスとともに使用された場合、十分に機能的であることを実証する。
【０３５６】
ｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏ構築物のパッケージング活性もまた、ヒト起源の細胞（例えば、２９３細胞）において非常に効率的であった。ＰＣＬの誘導のために、このようなヒトの親細胞型の使用は、相補的な耐性組換えアルファウイルス粒子の生成において特に有利であり得る。図１７Ｂは、ＲＮＡに基づくルシフェラーセリポーターベクターおよびＤＮＡに基づくルシフェラーゼベクターの両方が、ＢＨＫ細胞へのルシフェラーゼ発現の上清移入によって示されたように、Ｇ４１８耐性ｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏ形質転換２９３ＰＣＬ中へのトランスフェクション後、効率的にパッケージングされたことを示す。
【０３５７】
別の選択可能な薬物耐性マーカーもまた、そのＮ末端で残りのｎｓＰ１アミノ酸を有する融合タンパク質として、類似のＰＣＬ構成において機能することが示された。簡略には、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ハイグロマイシン耐性マーカー、ｈｙｇｒｏｒ）を、存在するネオマイシン耐性マーカーの代わりに、プラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏ中に置換した。ｈｙｇｒｏｒ遺伝子を、隣接するＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨ１部位を含むように設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プラスミドｐ３’ＳＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から標準的な３サイクルＰＣＲによって増幅した。
【０３５８】
正方向プライマー：５’ＨＹＧＲＯＥＶ（５’制限部位／ｈｙｇｒｏ遺伝子）（配列番号１１２）
５’−ＴＡＴＡＴＧＡＴＡＴＣ／ＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＣＧ
逆方向プライマー：３’ＨＹＧＲＯＢＡ（５’−制限部位／ｈｙｇｒｏ遺伝子）（配列番号１１３）
５’−ＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣ／ＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧ。
【０３５９】
増幅後、ＤＮＡフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮを使用して精製し、そしてプラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏ（ＢｓｐＥＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端化し、さらにＢａｍＨＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎを使用して０．７％ゲルから精製した）に連結した。生じた構築物をｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｈｙｇと命名した。
【０３６０】
プラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｈｙｇを、製造者によって記載されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、ＢＨＫ細胞へトランスフェクトした。トランスフェクトの約２４時間後、細胞をトリプシン処理し、そして１．２ｍｇ／ｍｌの薬物ハイグロマイシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有する培地中に再びプレートした。培地を、新鮮なハイグロマシン含有培地で定期的に交換し、そして耐性細胞のフォーカスをプールに増殖させた。選択されたパッケージング細胞の機能性を、シンドビスルシフェラーゼベクターＲＮＡでトランスフェクトし、そして先の節で記載されたように、パッケージングされたシンドビス−ルシフェラーゼベクター粒子の存在についてアッセイすることによって実証した。これらのパッケージング実験からのポジティブな結果を図３９において示す。
【０３６１】
代替のパッケージング細胞株において、構造タンパク質発現カセット、選択マーカー（この場合ではネオマイシン耐性）を、シンドビス構造タンパク質遺伝子の下流に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の翻訳制御下で挿入した。従って、ネオマイシン耐性をコードするｍＲＮＡの転写は、ゲノムレベル（ＲＳＶプロモーターから）およびまたサブゲノム連結領域プロモーターからの両方で生じる。この構築物にとって独特なさらなる特徴は、一次転写のためのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターおよびシンドビス欠陥干渉ＲＮＡクローンＤＩ２５（ＭｏｎｒｏｅおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：３２７９−３２８３、１９８３）由来のｔＲＮＡＡｓｐ５’末端配列を含む。この特定のＰＣＬ発現カセット構成は、９８７ＤＨＢＢＮｅｏと命名された。そしてこれを図１４において模式的に示す。詳細には、プラスミド９８７ＤＨＢＢＮｅｏを、開始物質として、改変されたプラスミドベクターｐＢＧＳ１３１ｄｌＢ−Ｐ（上記）を使用して段階的に構築する。連結領域プロモーター、構造タンパク質遺伝子配列、および３’非翻訳領域＋ポリＡを含むｃＤＮＡフグメントを、全長シンドビスｃＤＮＡクローンｐＲＳＩＮｇ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同書）のＢａｍＨＩおよびＸｂａＩでの消化、ならびにＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用する０．７％アガロースゲルからの精製によって得る。シンドビスｃＤＮＡ  ＤＮＡフラグメントを、プラスミドベクターｐＢＧＳ１３１ｄｌＢ−Ｐ（これはまたＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製した）で連結し、構築物ｐＢＧＳＩＮｓｐを生成した。
【０３６２】
次いで、ＳＶ４０初期領域由来の転写終結シグナルを、ｐＢＧＳＩＮｓｐのＳａｃＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間、シンドビス配列の直ぐ下流に挿入する。初期領域転写終結配列を含む、ＳＶ４０ウイルスヌクレオチド２６４３〜２５６３を、以下に示すプライマー対およびテンプレートとしてｐＢＲ３２２／ＳＶ４０プラスミド（ＡＴＣＣ＃４５０１９）を使用するＰＣＲ増幅によって単離する。
【０３６３】
正方向プライマー：ＦＳＶＴＴ２６４３（５’−制限部位／ＳＶ４０ｎｔｓ２６４３〜２６１３）（配列番号５８）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣ
逆方向プライマー：ＲＳＶＴＴ２５６３（制限部位／ＳＶ４０ｎｔｓ２５６３〜２５８８）（配列番号５９）
５’−ＴＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧ。
【０３６４】
プライマーを、３０秒間の伸長時間を有する標準的な３サイクルＰＣＲで使用する。増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、Ｍｅｒｍａｉｄ  ｋｉｔで再び精製し、そして９０ｂｐフラグメントを、プラスミドｐＢＧＳＩＮｓｐ（同様にＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製した）に連結する。この構築物は、ｐＢＧＳＩＮｓｐＳＶとして識別される。
【０３６５】
次いで、ＤＩ  ｔＲＮＡＡｓｐ構造を含むＲＳＶプロモーターおよびシンドビス５’末端配列を重複ＰＣＲによって構築し、そして完全なフラグメントを構造タンパク質遺伝子ベクターｐＢＧＳＩＮｓｐＳＶ中へ挿入する。ＰＣＲ反応＃１において、ＲＳＶプロモーターフラグメントを、一方のプライマー中に隣接ＢｇｌＩＩ部位および他方のプライマー中にｔＲＮＡ  ５’末端に重複する配列もまた含むように設計された、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、１分間の伸長を有する標準的な３サイクルＰＣＲによって増幅する。シンドビス  ｔＲＮＡ  ５’末端をＲＳＶプロモーター転写開始部位にすぐに隣接して配置する。
【０３６６】
正方向プライマー：５’ＲＳＶｐｒｏ（５’−制限部位／ＲＳＶ配列）（配列番号６０）
５’−ＴＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴ／ＡＧＴＣＴＴＡＴＧＣＡＡＴＡＣＴＣＴＴＧＴＡＧＴ。
【０３６７】
逆方向プライマー：３’ＲＳＶｔＲ（５’−Ｓｉｎ  ｔＲＮＡ配列／ＲＳＶ配列）（配列番号６１）
５’−ＧＧＧＡＴＡＣＴＣＡＣＣＡＣＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＧＧＴＡＧＧＧＣＡＣＴ。
【０３６８】
ＰＣＲ反応＃２において、一方のプライマー中に隣接するＢａｍＨＩ部位および他方のプライマー中に３’ＲＳＶｔＲプライマーに重複する配列もまた含むように設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、１分間伸長を有する標準的な３サイクルＰＣＲによって、テンプレートプラスミドＴｏｔｏ１１０１（５’ｔＲＮＡＡｓｐ）（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：６４３９−６４４６，  １９９３）からシンドビス５’末端ならびにｔＲＮＡ配列を増幅する。
【０３６９】
正方向プライマー：５’ｔＲＮＡＳｉｎ（５’−シンドビス＋ｔＲＮＡ配列のみ）（配列番号６２）
５’−ＧＡＴＡＴＡＧＴＧＧＴＧＡＧＴＡＴＣＣＣＣＧ
逆方向プライマー：３’ＳｉｎＢａｍ（３’−制限部位／シンドビス配列）（配列番号６３）
５’−ＴＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣ／ＣＧＧＡＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧ。
【０３７０】
増幅後、ＤＮＡフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、そしてさらなる５’ＲＳＶｐｒｏおよび３’ＳｉｎＢａｍプライマーを使用して２分間伸長を有する後続の３サイクルＰＣＲ反応中でテンプレートとして一緒に使用する。生じる重複ＰＣＲアンプリコンをＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して精製し、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてプラスミドｐＢＧＳＩＮｓｐＳＶ（またＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで同様に消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製した）中へ連結した。生じる構造タンパク質発現性の、欠陥ヘルパーを９８７ＤＨＢＢと命名する。
【０３７１】
次いで、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のＩＲＥＳ配列を、選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の直ぐ上流に重複ＰＣＲによって配置し、そして完全なアンプリコンを９８７ＤＨＢＢのＮｓｉＩ部位中に挿入する。ＮｓｉＩ部位での挿入は、選択マーカーを構造タンパク質ＯＲＦの直ぐ下流に配置する。ＰＣＲ反応＃１において、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳフラグメント（ヌクレオチド２６０〜８２７）を、一方のプライマーに隣接ＮｓｉＩ部位および他方にｎｅｏ遺伝子に重複する配列もまた含むように設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、３０秒間の伸長を有する標準的な３サイクルＰＣＲによって、テンプレートプラスミドｐＢＳ−ＥＣＡＴ（Ｊａｎｇら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ６３：１６５１，  １９８９）から増幅する。
【０３７２】
正方向プライマー：５’ＥＭＣＶＩＲＥＳ（５’−制限部位／ＥＭＣＶ配列）（配列番号６４）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＧＣＡＴ／ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＣＧ
逆方向プライマー：３’ＥＭＣＶＩＲＥＳ（５’−ｐｃＤＮＡ＋ｎｅｏ配列／ＥＭＣＶ配列）（配列番号６５）
５’−ＣＡＴＧＣＧＡＡＡＣＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣ／ＣＴＴＡＣＡＡＴＣＧＴＧＧＴＴＴＴＣＡＡＡＧＧ。
【０３７３】
ＰＣＲ反応＃２において、ｎｅｏ耐性マーカーを、一方のプライマーに隣接ＮｓｉＩ部位および他方に３’ＥＭＣＶＩＲＥＳプライマーに重複する配列もまた含むように設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、１．５分間の伸長を有する標準的な３サイクルＰＣＲによって、テンプレートプラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）から増幅する。
【０３７４】
正方向プライマー：５’Ｎｅｏ／ｐｃＤＮＡ（５’−ｐｃＤＮＡ＋ｎｅｏ配列のみ）（配列番号６６）
５’−ＧＡＴＧＡＧＧＡＴＣＧＴＴＴＣＧＣＡＴＧＡＴＴＧＡ
逆方向プライマー：３’Ｎｅｏ／ｐｃＤＮＡ（３’制限部位／ｎｅｏ配列）（配列番号６７）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＧＣＡＴ／ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡ。
【０３７５】
増幅後、ＤＮＡフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎを用いて精製し、そしてさらなる５’ＥＭＣＶＩＲＥＳおよび３’Ｎｅｏ／ｐｃＤＮＡプライマーを使用する、２分間の伸長を有する後続の３サイクルＰＣＲ反応中でテンプレートとして一緒に使用する。生じる重複ＰＣＲアンプリコンをＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して精製し、ＮｓｉＩで消化し、そしてプラスミド９８７ＤＨＢＢ（同様にＮｓｉＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して、０．７％アガロースゲルから精製した）に連結する。シンドビス３’非翻訳領域にＩＲＥＳｎｅｏ挿入物を有する、生じる構造タンパク質発現構築物を９８７ＤＨＢＢＮｅｏと命名する。
【０３７６】
安定なパッケージング細胞株を作製するために、ＢＨＫ細胞を１０μｇのプラスミド９８７ＤＨＢＢＮｅｏで、標準的なリン酸カルシウム沈澱プロトコルを使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの約２４時間後、培地を、１ｍｇ／ｍｌの薬物Ｇ４１８を含有する新鮮な培地で置換した。さらに１日後、細胞をトリプシン処理し、そして５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有する培地中で１／１０密度で再びプレートした。さらに数回の継代の後、細胞を希釈クローニングに供し、そして個々のクローンを拡張した。個々のクローンのパッケージング細胞株として機能する能力を、プラスミドＲＳＶ／Ｓｉｎｒｅｐ／ＬａｃＺ、β−ｇａｌを発現するシンドビスＤＮＡベクターでリン酸カルシウムトランスフェクションし、そして４８時間後上清中でパッケージングされたベクター粒子の存在についてアッセイすることによって測定した。パッケージングされたベクターレプリコンをＦｒｏｌｏｖおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８：１７２１−１７２７，  １９９４）に記載されるＣＰＥアッセイによって力価測定し、そして９８７ＤＨ−ＢＢＮｅｏと命名されたパッケージングされた高い力価の粒子を与えるレプリコンをさらなる特徴づけに使用した。パッケージングされたベクター力価を、いくつかの異なるトランスフェクション技術を使用してＲＮＡに基づくβｇａｌ発現シンドビスベクターまたはＤＮＡに基づくβ−ｇａｌ発現シンドビスベクターのいずれかのトランスフェクション後４８時間目に測定した。結果は以下のようであった：
【０３７７】
【化２２】
2008200051.tif 000023
さらに、９８７ＤＨ−ＢＢ細胞株を用いてパッケージングされたＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ粒子を使用して、続いて、新鮮なＢＨＫ細胞単層に感染させ、そしてＲＮＡおよびタンパク質の発現パターンを評価した。図１９は、ＢＨＫ細胞を１細胞当たり１５０感染性単位のＭＯＩでのＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ粒子（レーン１および２）またはコントロールとして野生型シンドビスウイルス（レーン３）の２つの異なる調製物で感染させた後のＲＮＡパターンを示す。感染から７時間後、ダクチノマイシン（１μｇ／ｍｌ）および［３Ｈ］ウリジン（２０μＣｉ／ｍｌ）を添加し、続いて４時間後、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：６４３９−６４４６，  １９９３）に従ってＲＮＡを採取し、そして分析した。高いＭＯＩを、可能性のある組換え体を検出するために使用した。ゲルレーンの右側の横線は、シンドビスおよび目的のβ−ｇａｌ  ＲＮＡを示す。最も高い分子量バンドは、レプリコンまたはウイルスのゲノムＲＮＡを示す（レーン１および２、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ；レーン３シンドビスウイルス）。次の２つの示されているＲＮＡは、９８７ＤＨ−ＢＢＮｅｏ  ＰＣＬ発現カセットのゲノムＲＮＡおよび同一の９８７ＤＨ−ＢＢＮｅｏ  ＰＣＬカセット由来の誘導性サブゲノム構造タンパク質ｍＲＮＡである。後者の２つのバンドの存在は、パッケージング細胞株由来のヘルパーゲノムＲＮＡもまた同時パッケージングされることを実証する。次のＲＮＡバンド（それらは、最も多量に存在する）は、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ（レーン１および２）またはシンドビスウイルスゲノム（レーン３）のいずれか由来のサブゲノムＲＮＡである。
【０３７８】
タンパク質分析を、パッケージングされたＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺレプリコンを用いた２０感染性単位／細胞のＭＯＩでのＢＨＫ２１細胞の感染後に行った。感染から１５時間後、細胞を［３５Ｓ］メチオニンで３０分間標識し、溶解物を作製し、そしてタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図２０（レーン２および３）に示すように、β−ガラクトシダーゼおよびシンドビスウイルスキャプシドタンパク質の両方が、ベクター粒子感染細胞において標識されるが、非感染細胞においては標識されていない（レーン１）。キャプシドの存在は、パッケージングされた粒子のいくつかもまた、ＰＣＬ由来の構造タンパク質遺伝子ＲＮＡ転写産物を含むことを示す。
【０３７９】
Ｃ．「分割構造遺伝子」ＰＣＬ構成の構築
本発明の他の実施態様において、ＰＣＬが提供される。ここで、アルファウイルス構造タンパク質は、その天然の翻訳後プロセシングを有する単一のｍＲＮＡ由来のポリタンパク質として発現されず、むしろ複数のカセットを介して転写される独立したｍＲＮＡ由来の分離したタンパク質として発現される。このような構成は、複製可能なまたは感染性ウイルスの形成を導く組換えまたは同時パッケージング事象の可能性を非常に少なくする。好ましい実施態様において、キャプシドタンパク質は一つの安定に形質転換されたカセットから発現され、そしてエンベロープ糖タンパク質は、第２の安定に形質転換されたカセットから一緒に発現され、そして各々は、連結領域プロモーターからベクター誘導性様式で発現される（上記）。
【０３８０】
例えば、シンドビスウイルスキャプシドタンパク質遺伝子を、隣接ＸｈｏＩ部位およびキャプシドタンパク質遺伝子開始コドンまたは隣接ＮｏｔＩ部位および翻訳停止コドンを含むように設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、１．５分間の伸長を有する標準的な３サイクルＰＣＲによって、プラスミドｐＤＬＴＲＳＩＮｇ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同書）から増幅した。
【０３８１】
正方向プライマー：ＳＩＮ５’ＣＸｈｏ（５’−制限部位／キャプシド配列）（配列番号６８）
５’−ＡＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧ／ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＣ
逆方向プライマー：ＳＩＮ３’ＣＮｏｔ（５’−制限部位／停止コドン／キャプシド配列）（配列番号６９）
５’−ＴＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣ／ＴＡＴＴＡ／ＣＣＡＣＴＣＴＴＣＴＧＴＣＣＣＴＴＣＣＧＧＧＧＴ。
【０３８２】
増幅後、キャプシドＤＮＡフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩで精製し、そしてＤＮＡに基づくシンドビス発現ベクターｐＤＣＭＶＳＩＮ−ｌｕｃ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同書）（ルシフェラーゼレポーター遺伝子挿入物を除去するためにＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで同様に消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製した）に連結した。生じたキャプシドタンパク質発現構築物を、ｐＤＣＭＶＳＩＮ−Ｃと命名した。プラスミドｐＤＣＭＶＳＩＮ−Ｃを続いてＢｓｐＥＩで消化し、ほとんどの非構造タンパク質遺伝子配列を除去し、そして希釈条件下で自己に再び連結させて、ＤＨベクター構築物のｐＤＣＭＶＳＩＮｄｌ−Ｃを作製した。
【０３８３】
プラスミドｐＤＣＭＶＳＩＮｄｌ−Ｃ（これはまた、ネオマイシン耐性カセットを含む）を、製造者によって記載されるように、Ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎを使用して、ＢＨＫ細胞中へトランスフェクトした。トランスフェクションから約２４時間後、細胞をトリプシン処理し、そして６００μｇ／ｍｌの薬物Ｇ４１８（ネオマイシン）含有培地中へ再びプレートした。培地を新鮮なＧ４１８含有培地で定期的に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖させた。細胞をトリプシン処理し、そして９６ウェル組織培養ディッシュ中に限界希釈することによってクローン化し、そして個々の細胞クローンを増殖させ、そしてスクリーニングのために拡張させた。ベクターの投入に応答して誘導性にキャプシドタンパク質を発現した細胞を、シンドビスルシフェラーゼベクターＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション後の約１５時間に細胞溶解物を作製し、そしてウサギ抗シンドビスポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロット分析を行うことによって同定した。組み込まれたキャプシドタンパク質遺伝子発現カセットのコピーを有し、そして誘導性にタンパク質を発現するを有するいくつかのポジティブ細胞クローンを同定した。
【０３８４】
「分割構造遺伝子」カセットの状況において、発現されたキャプシドの誘導性および機能性の両方を実証するために、シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質を発現したさらなる構築物、ｐＤＣＭＶＳＩＮ−ｌｕｃから生成した。簡潔には、シンドビスエンベロープ糖タンパク質遺伝子を、隣接ＸｈｏＩ部位および良好なＫｏｚａｋ状況における翻訳開始コドン、または隣接ＮｏｔＩ部位および翻訳停止コドンを含むように設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、２．５分間の伸長を有する標準的な３サイクルＰＣＲによってプラスミドｐＤＬＴＲＳＩＮｇから増幅した。
【０３８５】
正方向プライマー：５’ＧＬＹＣＯ−Ｘ（５’−制限部位／開始コドン／糖タンパク質配列）（配列番号７０）
５’−ＡＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧ／ＡＧＣＡＡＴＧ／ＴＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＧＧＣＡ
逆方向プライマー：３’ＧＬＹＣＯ−Ｎ（５’−制限部位／糖タンパク質配列）（配列番号７１）
５’−ＡＴＡＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ／ＴＣＡＴＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＧＣＡＴＣ。
【０３８６】
増幅後、糖タンパク質遺伝子ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して精製し、そしてＤＮＡに基づくシンドビス発現ベクターｐＤＣＭＶＳＩＮ−ｌｕｃ（ルシフェラーゼレポーター遺伝子挿入物を除去するためにＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで同様に消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製した）に連結した。生じた糖タンパク質発現構築物を、ｐＤＣＭＶＳＩＮ１．５ＰＥと命名した。
【０３８７】
図２１は、２つの異なるクローン性のキャプシド株（９−３および９−９）細胞株のベクター制御された誘導性を実証するウェスタンブロットである。これらをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎを使用して、エンベロープ糖タンパク質（１．５ＰＥレーン）またはβ−ガラクトシダーゼレポーター、ｐＤＣＭＶＳＩＮ−β−ｇａｌ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同書；１．５β−ｇａｌレーン）を発現するシンドビスＤＮＡベクターでトランスフェクトしたか、または「偽」トランスフェクトした（Ｍレーン）。細胞溶解物をトランスフェクションから４８時間後に作製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてメンブレンに移した。ここで、メンブレンを、シンドビス構造タンパク質およびβ−ガラクトシダーゼについて特異的である抗体の組合せでプローブした。ブロットは、明らかに、いずれかのベクターによって供給される非構造タンパク質に応答するキャプシドタンパク質の誘導性ならびにβ−ガラクトシダーゼおよびエンベロープ糖タンパク質の発現を示す。「分割構造遺伝子」キャプシド細胞株の機能性（相補性およびベクター粒子パッケージングによる）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用してβ−ガラクトシダーゼおよびエンベロープ糖タンパク質ベクターをキャプシド細胞株中へ同時トランスフェクトし、そして培養上清中のパッケージングされた粒子についてアッセイすることによって実証した。トランスフェクションの約４８時間後に、上清を採取し、そしてパッケージングアッセイおよびベクター力価の測定のために明澄化した。さらに、細胞を、Ｌａｍｅｌｉサンプル緩衝液を使用して溶解し、そしてポリクローナルな抗シンドビス抗体を用いてウェスタンブロット分析によって調べた。これは、キャプシドタンパク質およびベクター供給エンベロープタンパク質の両方の発現を実証した。次いで、上清を、約１８時間天然のＢＨＫ細胞に感染させ、そして本実施例において上記のようにβ−ｇａｌレポーター遺伝子発現のために染色することによって、パッケージングされたベクター粒子の存在について試験した。細胞株の相補性およびパッケージングについての機能性を、青色に染色されたβ−ｇａｌ発現細胞の観察によって実証した。
【０３８８】
キャプシドタンパク質およびエンベロープ糖タンパク質の両方について別々のベクター誘導性発現カセットを有する安定な「分割構造遺伝子（ｓｐｌｉｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｇｅｎｅ）」ＰＣＬを生成するために、上記のキャプシド細胞株を、異なる選択マーカーを含む（例えば、ハイグロマイシンＢ耐性）さらなるエンベロープ糖タンパク質発現構築物とともに使用する。簡潔に記載すると、プラスミドｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌ（実施例５）をＢａｍＨＩおよびＦｓｐＩで消化して、連結領域プロモーター、β−ｇａｌレポーター遺伝子、およびいくつかの３’末端配列を含む配列を単離する。所望のフラグメントをＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して１％アガロースゲルから精製し、そしてこれもまたＢａｍＨＩおよびＦｓｐＩで消化して、全ての構造タンパク質遺伝子配列を除去し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製したプラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏ（上記を参照のこと）中に連結する。得られる構築物をｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｓＰ−ｌｕｃと称する。次に、プラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｓＰ−ｌｕｃをＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を除去し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製し、そしてその後上記からのＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ消化したエンベロープ糖タンパク質ＰＣＲアンプリコンを、消化したｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｓＰ−ｌｕｃベクター中に連結して、エンベロープ糖タンパク質発現ＤＨ構築物ｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌ−Ｇを生成する。このプラスミド中へのハイグロマイシン耐性マーカーカセット、ならびに隣接するＨＳＶ  ＴＫプロモーターおよびポリアデニル化配列の挿入は、２．５分間伸長での標準的な３サイクルプロトコル、テンプレートとしてのプラスミドｐＤＲ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）、および隣接するＰａｃ  Ｉ部位を含むように設計されている以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅により達成される。
【０３８９】
正方向プライマー：５’ＨＹＧＲＯ／Ｐｒｏ−Ｐ（５’−制限部位／ｐＤＲ２配列）（配列番号７２）
５’−ＡＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡ／ＣＧＡＴＧＣＣＧＣＣＧＧＡＡＧＣＧＡＧＡＡ
逆方向プライマー：３’ＨＹＧＲＯ／ｐＡ−Ｐ（５’−制限部位／ｐＤＲ２配列）（配列番号７３）
５’−ＡＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡ／ＧＴＡＴＴＧＧＣＣＣＣＡＡＴＧＧＧＧＴＣＴ。
増幅後、ＤＮＡフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、Ｐａｃ  Ｉで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して精製し、そしてこれもまたＰａｃＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して精製したプラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌ−Ｇ中に連結する。得られる構築物をｐＢＧＳＶｈｙｇｒｏ−Ｇと称する。
【０３９０】
プラスミドｐＢＧＳＶｈｙｇｒｏ−Ｇ（これはまた今やハイグロマイシン耐性カセットを含む）を製造業者により記載されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用してキャプシド細胞株中にトランスフェクトする。トランスフェクション後約２４時間で、細胞をトリプシン処理し、そして１２００  ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を含有する培地中に再プレーティングする。この培地を定期的に新鮮なハイグロマイシン含有培地に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖させる。細胞をトリプシン処理し、そして９６ウェル組織培養ディッシュ中での限界希釈によりクローン化し、そして個々の細胞クローンを増殖させそしてスクリーニングのために拡大する。投入ベクターに応答して生物学的に活性なキャプシドタンパク質およびエンベロープ糖タンパク質を誘導的に発現する細胞を、２つの方法で同定する：第１に、上記のように、シンドビスルシフェラーゼベクターＲＮＡでのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ媒介性トランスフェクション、およびトランスフェクション後１５時間の溶解物をウエスタンブロットにおいてプローブすることによる；そして第２に、同様なシンドビスルシフェラーゼベクタートランスフェクションであるが、上清をトランスフェクション後２４時間に回収し、そして上清での感染による新鮮なＢＨＫ細胞へのルシフェラーゼ発現の移行について試験することによる（上記を参照のこと）。このようにして誘導した分割構造遺伝子ＰＣＬをＣ／ＧＬＹＣＯ  ＰＣＬと称する。
【０３９１】
Ｄ．「ハイブリッド」構造タンパク質を有するＰＣＬの構築
同時パッケージングまたはＤＨとベクターＲＮＡ分子との間の組換えのレベルを減少させて、糖タンパク質遺伝子の翻訳を増強するため、またはパッケージングされた組換えアルファウイルスベクター粒子の細胞もしくは組織特異性を変化させるために利用され得るさらなるアプローチは、他のアルファウイルスまたはトガウイルス由来の構造タンパク質遺伝子を使用する。より詳細には、シンドビスウイルスまたは異なるアルファウイルスベクターとの使用のための、アルファウイルスまたはトガウイルス構造タンパク質遺伝子の多数の組み合わせが意図され得る。例えば、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）のキャプシドタンパク質遺伝子を、シンドビスウイルスのエンベロープ糖タンパク質遺伝子（同一のまたは異なる構築物から発現される）とともに使用して、実施例３、４、または５に記載のシンドビスウイルス由来ベクターをパッケージングし得る。さらに、ＲＲＶキャプシドタンパク質遺伝子の欠失形態を、シンドビス糖タンパク質遺伝子配列の直ぐ上流に配置して、翻訳エンハンサーエレメントとして作用させ得る。別の例として、シンドビスウイルスの構造タンパク質を使用して、セムリキ森林ウイルスＲＮＡベクターをパッケージングし得る。
【０３９２】
詳細には、インタクトなまたは欠失した形態のＲＲＶキャプシド遺伝子（図２２）＋シンドビス糖タンパク質遺伝子を含む欠陥ヘルパー（ＤＨ）構造タンパク質構築物を、それぞれプラスミドテンプレートＴｏｔｏ１１０１（Ｒｉｃｅら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６１：３８０９−３８１９，  １９８７）およびＲＲ６４１５（Ｋｕｈｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８２：４３０−４４１，  １９９１）由来のシンドビスウイルスまたはロスリバーウイルス配列のＰＣＲ増幅、ならびにＳＰ６ポリメラーゼでのインビトロにおける転写のための、以前に記載のＤＨ構築物ＤＨ−ＢＢまたはＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ）（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：６４３９−６４４６，  １９９３）中へのこれらの配列の組み込みにより構築した。ＤＨ構築物ＤＨ−ＢＢまたはＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ）は、シンドビス５’末端におけるＤＩ由来ｔＲＮＡＡｓｐ配列の存在（ＤＨ−ＢＢ）または非存在（ＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ））で異なる。以下の表は、特異的ＰＣＲプライマー配列およびそれらの対応するシンドビスまたはロスリバーヌクレオチド位置を示し、大文字はウイルスヌクレオチドを示し、そして小文字はクローニング工程において使用する制限部位または特異的点変異のさらなるヌクレオチドを示す。プライマー６（ＲＲＶ  Ｂｓｐ）中の点変異は、生じるアミノ酸配列を変化させなかった。
【０３９３】
ＰＣＲのために使用するプライマー：
１．ＲＲＶ  Ａｖａ：（ｎｔ．７５１０〜７５２５）（配列番号７４）
５’−ｃｃａｃｇａａｔｔｃＧＧＴＣＣＴＡＡＡＴＡＧＡＴＧＣ
２．ＲＲＶ  Ｎｃｉ１：（ｎｔ．７６０６〜７６２０）（配列番号７５）
５’−ｃｃａｃａａｇｃｔｔＣＣＧＧＧＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣ
３．ＲＲＶ  Ｎｃｉ２：（ｎｔ．７６１６〜７６３０）（配列番号７６）
５’−ｃｃａｃｇｇａｔＣＣＣＧＧＣＧＴＴＣＣＧＴＣＣ
４．ＲＲＶ  Ａｐａ１：（ｎｔ．８０８８〜８１０２）（配列番号７７）
５’−ｃｃａｃａａｇｃｔｔＧＴＧＣＡＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧ
５．ＲＲＶ  Ａｐａ２：（ｎｔ．８０９７〜８１１１）（配列番号７８）
５’−ｃｃａｃｇｇａｔｃｃＧＴＧＣＡＣＡＴＧＡＡＧＴＣＣ
６．ＲＲＶ  Ｂｓｐ：（ｎｔ．８３３９〜８３６１）（配列番号７９）
５’−ｃｃａｃａａｇＣＴＴＣｃＧＧａＧＴＴＡＣＣＣＧＡＧＴＧＡＣＣ
７．ＲＲＶ  Ａｆｌ１：（ｎｔ．７８２０〜７８３６）（配列番号８０）
５’−ｃｃａｃｃｔｔａａＧＣＧＴＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣ
８．ＲＲＶ  Ａｆｌ２：（ｎｔ．７８９２〜７９０７）（配列番号８１）
５’−ｃｃａｃｃｔｔａａＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＧ
９．ＳＩＮ  Ａｖａ：（ｎｔ．７５９１〜７５９４）（配列番号８２）
５’−ｃｃａｃａａｇｃｔｔＧＧＡＣＣＡＣＣＧＴＡＧＡＧ
１０．ＳＩＮ  Ｂａｍ：（ｎｔ．７３２５〜７３４３）（配列番号８３）
５’−ＣＣＧＣＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧ
１１．  ＳＩＮ  Ｂｓｐ：（ｎｔ．８４１８〜８４３３）（配列番号８４）
５’−ｃｃａｃｇｇａｔＣＣＧＧＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＧ
１２．ＳＩＮ  Ｂｓｕ：（ｎｔ．８８８７〜８９０２）（配列番号８５）
５’−ＣＡＣＧＧＴＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣ。
ＰＣＲ反応を、以下に示すプライマー対を使用して、標準的な３サイクルプロトコルで、３０秒間の伸長およびＶｅｎｔポリメラーゼを用いて実施して、対応するＤＮＡフラグメント（これもまた以下に示す）を生成した。
【０３９４】
ＰＣＲフラグメント：プライマー対、プラスミドテンプレート
フラグメント１：ｐｒ１＋ｐｒ２、ＲＲＶ６４１５プラスミド
フラグメント２：ｐｒ３＋ｐｒ４、ＲＲＶ６４１５プラスミド
フラグメント３：ｐｒ５＋ｐｒ６、ＲＲＶ６４１５プラスミド
フラグメント４：ｐｒ３＋ｐｒ７、ＲＲＶ６４１５プラスミド
フラグメント５：ｐｒ４＋ｐｒ８、ＲＲＶ６４１５プラスミド
フラグメント６：ｐｒ９＋ｐｒ１０、Ｔｏｔｏ１１０１プラスミド
フラグメント７：ｐｒ１１＋ｐｒ１２、Ｔｏｔｏ１１０１プラスミド
増幅後、ＰＣＲ産物を示す酵素で消化し、そしてｐＵＣ１８プラスミドアナログであるｐＲＳ２（これは、さらなるポリリンカー部位を含み、そしてこれもまた同じ酵素の組み合わせで消化した）中に連結した：フラグメント１をＥｃｏＲ  Ｉ＋Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで；フラグメント２をＢａｍＨ  Ｉ＋Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで；フラグメント３をＢａｍＨ  Ｉ＋Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで；フラグメント４をＢａｍＨ  Ｉ＋Ａｆｌ  ＩＩで；フラグメント５をＨｉｎｄ  ＩＩＩ＋Ａｆｌ  ＩＩで；フラグメント６をＢａｍＨ  Ｉ＋Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで；そしてフラグメント７をＢａｍＨ  Ｉ＋Ｂｓｕ  ３６Ｉで切断した。全ての挿入物を配列決定して、ＰＣＲの間に人工物が獲得されていないことを確認した。
【０３９５】
その後、フラグメントをｐＲＳ２プラスミドから以下に示す酵素を使用して遊離させ、そして正確に示すように連結して、次の組の構築物を生成した。ＦＲ８を生成するために、フラグメント６（Ｂａｍ  ＨＩおよびＡｖａ  ＩＩにより切断）をフラグメント１（Ａｖａ  ＩＩおよびＮｃｉ  Ｉにより切断）、フラグメント２（Ｎｃｉ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩにより切断）、ならびにプラスミドｐＲＳ２（Ｂａｍ  ＨＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩにより切断）と連結した。ＦＲ９を生成するために、フラグメント６（ＢａｍＨＩおよびＡｖａ  ＩＩにより切断）を、フラグメント１（Ａｖａ  ＩＩおよびＮｃｉ  Ｉにより切断）、フラグメント４（Ｎｃｉ  ＩおよびＡｆｌ  ＩＩにより切断）、ならびにプラスミドｐＲＳ２（ＢａｍＨ  ＩおよびＡｆｌ  ＩＩにより切断）と連結した。ＦＲ１０を切断するために、フラグメント５（Ａｆｌ  ＩＩおよびＡｐａＬ  Ｉにより切断）を、フラグメント３（ＡｐａＬ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩにより切断）、ならびにプラスミドｐＲＳ２（Ａｆｌ  ＩＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩにより切断）と連結した。Ｅ．  ｃｏｌｉの形質転換の後、プラスミドを制限分析により分析し、そしてそれらのインサートを消化により再度単離し、そしてクローニングの次の工程のために使用した。
【０３９６】
ＦＲ８インサート（ＢａｍＨＩおよびＡｐａＬ  Ｉにより切断）を、フラグメント３（ＡｐａＬ  ＩおよびＢｓｐＭ  ＩＩにより切断）、フラグメント７（ＢｓｐＭ  ＩＩおよびＢｓｕ３６  Ｉにより切断）、ならびにプラスミドＤＨ−ＢＢ（ＢａｍＨ  ＩおよびＢｓｕ３６  Ｉにより切断）と連結した。また同じフラグメントを使用して、プラスミドＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ）のＢａｍＨ  Ｉ−Ｂｓｕ３６  Ｉフラグメントを置換した。得られたプラスミドは、それぞれＤＨ−ＢＢ  ＣｒｒｖおよびＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ）  Ｃｒｒｖと称した（図２３を参照のこと）。ＦＲ９インサート（ＢａｍＨＩ  およびＡｆｌ  ＩＩにより切断）を、ＦＲ１０インサート（Ａｆｌ  ＩＩおよびＢｓｐＭ  ＩＩにより切断）、フラグメント７（ＢｓｐＭ  ＩＩおよびＢｓｕ３６  Ｉにより切断）、ならびにプラスミドＤＨ−ＢＢ（ＢａｍＨＩおよびＢｓｕ３６  Ｉにより切断）と連結した。また同じフラグメントを使用して、プラスミドＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ）のＢａｍＨ  Ｉ−Ｂｓｕ３６  Ｉフラグメントを置換した。得られたプラスミドは、ＤＨ−ＢＢ  ＣΔｒｒｖおよびＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ）  ＣΔｒｒｖと称した（図２３を参照のこと）。
【０３９７】
キメラ構造タンパク質遺伝子を含むＤＨ構築物についての複数の使用が可能であり、そして２つのそのようなアプローチを図２４および２５に例証する。図２４において、インタクトなロスリバーキャプシドタンパク質遺伝子を、欠陥ヘルパー構築物の一部として、シンドビス糖タンパク質遺伝子配列に連結し（ＤＨ−ＢＢ  ＣｒｒｖまたはＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ）  Ｃｒｒｖ）、そしてシンドビスレポーターＲＮＡベクターレプリコンとともに同時トランスフェクトして、組換えアルファウイルス粒子中へのパッケージングを実証する（図２６）。図２５において、欠失形態のロスリバーキャプシドタンパク質遺伝子を、翻訳エンハンサーおよびＤＨ構築物の一部として、シンドビス糖タンパク質遺伝子配列と連結し（ＤＨ−ＢＢ  ＣΔｒｒｖおよびＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ）  ＣΔｒｒｖ）、一方シンドビスキャプシドタンパク質遺伝子を第２のＤＨ構築物から発現させる。両方のＤＨ構築物をシンドビスレポーターＲＮＡベクターレプリコンとともに同時トランスフェクトして、組換えアルファウイルス粒子中へのパッケージングを実証する（図２６）。さらに、ロスリバーキャプシドタンパク質遺伝子を単独でＤＨ構築物から発現させ得、一方シンドビス糖タンパク質をパッケージングにおける使用のために別の構築物から発現させる。この知見および構造タンパク質遺伝子配列が由来するいくつかの他のアルファウイルスの利用可能性を使用して、多数の異なるタンパク質の組み合わせを同様なアプローチで生成し得る。
【０３９８】
あるいは、上でＳＦＶベクターおよびシンドビス構造タンパク質について示したように、１つのアルファウイルスまたは他のＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅのメンバー（例えば、風疹ウイルス）由来の構造タンパク質遺伝子の全体の相補物を、別のウイルス由来のＲＮＡベクターをパッケージングするために使用し得る。別の実施態様において、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）ウイルス由来の構造タンパク質遺伝子を、シンドビスウイルス由来ベクター（野生型または実施例４もしくは５に記載の表現型を示す）をパッケージングするために使用し得る。そのような方法は、本発明の所望の特性（例えば、宿主巨大分子合成の遅延、減少、または阻害なし）を示すベクターＲＮＡ＋組換え粒子の向性を再指向する構造タンパク質を含む組換えアルファウイルス粒子を提供する。ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）は、そのシンドビスウイルス相当物とは異なり、リンパ系起源の細胞に対する向性を示すアルファウイルスである。それゆえ、ＶＥＥ構造タンパク質を発現する細胞株によりパッケージングされたシンドビス由来ベクター構築物は、そこからパッケージング細胞構造タンパク質遺伝子カセットを得た親ＶＥＥウイルスと同一のリンパ向性（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）特性を示す。
【０３９９】
詳細には、ＶＥＥウイルスのトリニダードロバ株（ＡＴＣＣ＃ＶＲ−６９）をＢＨＫ−２１細胞中で増殖させ、そしてビリオンＲＮＡを実施例１に記載の手順と同様の手順を使用して抽出する。全体の構造タンパク質コード領域を、その５’末端がそれぞれオーセンティックなＡＵＧ翻訳開始部位（周囲のＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む）およびＵＧＡ翻訳終始部位をマップするプライマー対を用いるＰＣＲにより増幅する。正方向プライマーはＶＥＥヌクレオチド７５５３〜７５７９に相補的であり、そして逆方向プライマーはＶＥＥヌクレオチド１１２０６〜１１１８６に相補的である（Ｋｉｎｎｅｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：１９−３０，  １９８９由来の配列）。構造タンパク質遺伝子に対応するＶＥＥ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、上記のような２工程逆転写酵素−ＰＣＲプロトコル、テンプレートとしてのＶＥＥゲノムＲＮＡ、および以下の隣接するＸｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ部位を含むオリゴヌクレオチド対を使用して達成する：
正方向プライマー：ＶＥＥ  ７５５３Ｆ（５’制限部位／ＶＥＥキャプシド配列）（配列番号８６）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＴＧＴＴＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＣＣＡ−３’
逆方向プライマー：ＶＥＥ  １１２０６Ｒ（５’制限部位／ＶＥＥ  Ｅ１糖配列）（配列番号８７）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＧＧＴ−３’。
ＰＣＲ増幅後、約３８００  ｂｐのフラグメントを０．７％アガロースゲルからＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して精製し、そしてＸｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化する。次いで、得られるフラグメントをＤＮＡベースのシンドビス発現ベクターｐＤＣＭＶＳＩＮ−ｌｕｃ（上記を参照のこと）（これもまたＸｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化して、そのルシフェラーゼレポーター遺伝子インサートを除去し、アルカリホスファターゼで処理し、そして０．７％アガロースゲルからＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して精製した）中に連結する。得られるＶＥＥ構造タンパク質発現構築物をｐＤＣＭＶ−ＶＥＥｓｐと称する。次に、プラスミドｐＤＣＭＶ−ＶＥＥｓｐを限定部分消化条件下でＢｓｐＥＩで消化して、大部分の非構造タンパク質遺伝子配列を除去し、そして再連結して、構造タンパク質発現ＤＨベクター構築物であるｐＤＣＭＶ−ＶＥＥｄｌを作製する。
【０４００】
プラスミドｐＤＣＭＶ−ＶＥＥｄｌ（これはまた、ネオマイシン耐性マーカーを含む）を、製造業者により記載されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用してＢＨＫ細胞中にトランスフェクトする。トランスフェクション後約２４時間に、細胞をトリプシン処理し、そして６００μｇ／ｍｌの薬物Ｇ４１８を含有する培地中に再プレーティングする。培地を定期的に新鮮なＧ４１８含有培地に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖させた。細胞をトリプシン処理し、そして９６ウェル組織培養ディッシュ中での限界希釈によりクローン化し、そして個々の細胞クローンを増殖させそしてスクリーニングのために拡大する。投入ベクターに応答してＶＥＥ構造タンパク質を誘導的に発現する細胞を、以前に記載のように、シンドビスルシフェラーゼベクターＲＮＡをトランスフェクトし、そして細胞溶解物または上清中のパッケージングされたルシフェラーゼベクターにおけるＶＥＥ構造タンパク質発現についてアッセイすることにより同定する。ＶＥＥの改変体または組織向性が異なる他のアルファウイルスおよびその改変体から得られる構造タンパク質遺伝子もまた、このアプローチに従って有用である。さらに、本実施例に記載の種々の構造タンパク質遺伝子発現カセット構造の各々を使用し得る。
【０４０１】
Ｅ．ＰＣＬからのパッケージングされたアルファウイルスベクターの産生
本実施例を通して記載のアルファウイルス由来ＰＣＬを、組換えアルファウイルス粒子ストックを産生する、そしてＲＮＡまたはＤＮＡ分子のいずれかのトランスフェクションによるベクターの導入、以前に産生したパッケージングされたベクター含有粒子での感染、または安定に形質転換された発現カセットからのベクターの細胞内産生を含む多数の異なる方法で使用し得る。ベクター粒子の産生のためのアルファウイルスＰＣＬの有用性を、まずレポーターベクター構築物を用いて実証し、そして後に所望の異種配列を発現する任意の他のベクター構築物に適用し得る。例えば、パッケージングされたシンドビス−β−ｇａｌベクター粒子のストックを、記載の手順を使用して（ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６−１３６１，  １９９１）、約１０７のアルファウイルスＣ／ＧＬＹＣＯまたは他のＰＣＬ細胞（上記、ならびに例えば図１５、１７、および１８を参照のこと）の、５０  ｕｇのｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶ−β−ｇａｌもしくは−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ＲＮＡ（実施例４）またはｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌもしくは−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ＤＮＡ（実施例５）でのエレクトロポレーションにより得る。トランスフェクトされたＰＣＬを所望の温度（例えば、３７℃）でインキュベートし、そしてトランスフェクション後約４８時間に、上清を回収し、そして０．４５ミクロンフィルターの通過により澄明化する。さらなる処方を、本発明の詳細な説明に例証するパラメーターを使用して実施し得る。
【０４０２】
あるいは、パッケージングされた組換えアルファウイルス粒子のストック（上記のようにＰＣＬを使用して、またはベクターおよびＤＨ構築物の同時トランスフェクションにより得る）を使用して、さらなる増幅のためにＰＣＬの天然培養物を感染する。例えば、５×１０７のアルファウイルスＣ／ＧＬＹＣＯまたは他のＰＣＬ細胞をパッケージングされたｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶ−β−ｇａｌベクターのストックで、約１感染単位／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させる。細胞質への到達に際して、粒子送達ＲＮＡベクターは自己触媒的に増幅され、そしてさらなる子孫粒子中にパッケージングされる。所望の温度（例えば、３７℃）での約４８時間のインキュベーション後、培養上清を回収し、０．４５ミクロンフィルターの通過により澄明化し、そして所望のように処方する。
【０４０３】
パッケージングされた組換えアルファウイルスベクター粒子をさらに増幅するＰＣＬの能力を利用するなお別の方法において、パッケージングされた粒子のストックを使用して、ＰＣＬの天然培養物を感染させ、ベクター含有ＰＣＬ（ベクター産生細胞、図２７）の作業細胞バンクを作製する。次に、これを使用して、ＰＣＬの別の天然培養物を播種し得る。例えば、そのような作業細胞バンクを、アルファウイルスＣ／ＧＬＹＣＯまたは他のＰＣＬ細胞のパッケージングされたベクターストックでのＭ．Ｏ．Ｉ．＝５での感染により得る。感染後約２〜３時間に、ベクター含有ＰＣＬを穏やかに剥がし、そして細胞数を測定する。ベクター含有ＰＣＬを、今や、直接使用し得るか、または小分けし、そしてベクター産生細胞バンクとして液体Ｎ２中で貯蔵し得る。所望の場合は、細胞を、天然のアルファウイルスＣ／ＧＬＹＣＯまたは他のＰＣＬの以前に増殖させた培養物中に、１０００新鮮ＰＣＬ当たり約１ベクター産生細胞の割合で、多量の高力価のパッケージングされたベクター粒子の産生のために、直接播種する。同時培養後種々の時点で培養上清のアリコートを回収して、最大組換えアルファウイルス粒子産生の時間を決定し、そしてその時間を、上記のような、さらなる回収、精製、および処方のために選択する。ベクター産生細胞を使用する同じ一連の増幅方法はまた、任意の所望の組換えタンパク質の大規模産生のために有用である（図２７）。組換えタンパク質の産生のために、組換えタンパク質の性質に依存して、上清または細胞溶解物を回収し得る。
【０４０４】
パッケージングされた組換えアルファウイルス粒子の高力価または大規模ストックを産生するためのなお別の方法において、本明細書中に記載のように、一般的に受容される試薬または方法（例えば、それぞれＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎもしくはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、または低ＭＯＩ［≦０．１］でのベクター粒子での感染）を使用する、インビトロ転写ＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡベクターのトランスフェクションにより、所望の発現ベクターを１〜５％の天然アルファウイルスＰＣＬ培養物中に導入する。その中にベクターを導入した最初の細胞により産生された組換えベクター粒子は、次に、培養物中の他の天然パッケージング細胞を感染し、次にこれはさらにより多くのパッケージングされた粒子を産生する。一時的増幅のこのプロセスは、パッケージングされた組換えアルファウイルス粒子がＰＣＬ培養物の全ての細胞において産生されるまで継続する。この増幅プロセスを図２８に示す。ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドＤＮＡを９８７ＤＨＢＢＮｅｏパッケージング細胞またはＢＨＫ−２１細胞中にトランスフェクトし、そして細胞溶解物中に存在するβ−ガラクトシダーゼのレベルを、以前に記載のように、トランスフェクション後の示す時点に測定した。ＢＨＫ−２１細胞において、β−ガラクトシダーゼ発現のレベルは、約４８  ｈｐｔまでに最大に達し、そしてプラトーになった。対照的に、β−ガラクトシダーゼ発現のレベルは、ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌトランスフェクト９８７ＤＨＢＢＮｅｏ  ＰＣＬ培養物において、より長い期間にわたって増加し続けた。これは、組換えベクター粒子増幅プロセス、および培養物の全ての細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの最終的な発現を反映する。全ての場合において、組換えアルファウイルスベクター粒子のストックを今や、本明細書に記載の任意の方法を使用して、薬学的に受容可能であるように処方し得る。
【０４０５】
実施例７
アルファウイルスプロデューサー細胞株の構築
宿主細胞巨大分子合成の減少、遅延、または阻害なしを示すＤＮＡベースのアルファウイルスベクターの構築と結びつけられた、上記のようなアルファウイルスＰＣＬの生成（実施例１、２、４、および５）は、アルファウイルスベクタープロデューサー細胞株を誘導するための比較的直線的な機構を提供する。本発明の特定の実施態様において、ベクタープロデューサー細胞株は、１つ以上の安定に形質転換された構造タンパク質遺伝子発現カセット、およびまた上記の表現型を有するアルファウイルスＲＮＡ発現ベクター分子を含み、これはトランスフェクトされるか、形質導入されるか、または細胞内で産生され、パッケージングされたベクター粒子の産生を導く。好ましい実施態様において、ＲＮＡベクターレプリコンを、安定に形質転換されたＤＮＡ分子（真核生物重層ベクター開始系）から細胞内で産生する。このＤＮＡ分子は、組み込まれた形態でまたはエピソームＤＮＡとしてのいずれかで存在し、ベクターＲＮＡの転写は所望の時点で提供される１つ以上の刺激により誘導的に制御される。この型のアルファウイルスプロデューサー細胞株構造は、本質的に、以下を含む事象のカスケードを提供する：ベクターＲＮＡの誘導性産生および結果として生じるＲＮＡの自己触媒性細胞質増幅、ベクター供給非構造タンパク質による高レベルの構造タンパク質発現の誘導、発現された構造タンパク質によるベクターＲＮＡのパッケージング、およびパッケージングされたベクター粒子の放出。一旦プロデューサー細胞集団が所望の数に達すると、ベクター複製の低レベル細胞傷害性の潜在力、または非構造タンパク質合成を制御する必要性のために、ＤＮＡ分子からのベクターＲＮＡの強固に調節された、誘導性の発現は好ましい。なぜなら、それは正鎖対負鎖ベクターＲＮＡ比の調節に関連するからである。
【０４０６】
Ａ．単一レベル調節を有するアルファウイルスＤＮＡベクター
本発明の特定の実施態様において、ＤＮＡに基づくアルファウイルスベクターが提供される。ここで、自己触媒的増幅が可能であるアルファウイルスベクターＲＮＡ分子のインビボ転写は、所望の時点に刺激を適用することによって調節可能であるプロモーターから生じる。このようなＤＮＡに基づくアルファウイルスベクターを、引き続いて、アルファウイルスパッケージング細胞株（ＰＣＬ）に安定に形質転換して、誘導性アルファウイルスプロデューサー細胞株を作製し得る。それゆえ、本明細書中に記載されるプロデューサー細胞株構成は、「フィードフォワード（ｆｅｅｄ−ｆｏｒｗａｒｄ）」系であり、ここで：１）刺激が細胞に適用され、アルファウイルスベクターＲＮＡの効率的な転写が生じる；２）ベクターＲＮＡは、自己触媒的に複製し、そして非構造タンパク質を生成する；３）非構造タンパク質は、構造タンパク質発現カセットｍＲＮＡの増幅および高レベルの構造タンパク質発現を刺激する；そして４）構造タンパク質はベクターＲＮＡと相互作用し、そして培養培地に放出される組換えアルファウイルス粒子の引き続くパッケージングを生じる。任意の以前に記載されたアルファウイルスＰＣＬ（１以上の誘導性アルファウイルス構造タンパク質発現カセットで安定に形質転換されている）が、プロデューサー細胞株を派生させるための親株として働き得る。
【０４０７】
例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター系（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８９：５５４７−５５５１，  １９９２）は、図２９に記載されるような、アルファウイルスベクターＲＮＡの誘導性転写のために利用され得る。この系において、「融合」タンパク質（ｒＴＡ）としての、テトラサイクリンリプレッサーおよびＨＳＶ−ＶＰ１６トランスアクチベータードメインの発現は、最小「コア」プロモーター（例えば、ＣＭＶ）にすぐに近接して位置したテトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）への特異的な結合によって、アルファウイルスベクターＲＮＡのインビボ転写を刺激する。結合およびトランス活性化事象は、テトラサイクリンの存在によって可逆的にブロックされ、そして培養培地からテトラサイクリンを除去することによって「オン」にされ得る。転写の非誘導の基底レベルは、異なる細胞型間で変化するので、転写開始部位が既知であり、アルファウイルスベクターヌクレオチド１との並置またはすぐ近傍を許容する場合には、他の異なる最小コアプロモーター（例えば、ＨＳＶ−ｔｋ）を、テトラサイクリンオペレーター配列に連結し得る。
【０４０８】
ｒＴＡトランスアクチベーターは、それもまた同一の細胞株に安定に形質転換されるさらなる発現カセットにより提供され；そして特定の実施態様では、ｒＴＡ発現カセットは、それ自体で自己調節的であり得る。自己調節的ｒＴＡ発現カセットの使用は、ｒＴＡ自体が結合する同一のｔｅｔＯ−連結プロモーターによる転写制御に発現をリンクさせることにより、ｒＴＡの構成的な高レベル発現に関連する潜在的な毒性問題を回避する。このタイプの系は、テトラサイクリンの存在下では非常に少ないｒＴＡが生成されることを確実にするが、テトラサイクリンが除去されると、高度に活性になる負のフィードバックサイクルを作製する（図２９）。このような自己調節的ｒＴＡ発現カセットは、プラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡｋ（Ｓｈｏｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６５２２−６５２６，  １９９５）中に提供される。
【０４０９】
このようなテトラサイクリン調節性のＤＮＡに基づくアルファウイルスベクターの機能性は、改変ＳＩＮ−１−由来ルシフェラーゼプラスミドベクターを構築することによって実証され、これはテトラサイクリンオペレーター／ＣＭＶ最小プロモーターによって駆動される。出発材料としてプラスミドｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ１．５−ｌｕｃ（実施例４）およびｐＢＧＳＶ３’（実施例６）を用いて、ＳＩＮ−１非構造コード領域の多く、連結領域プロモーターおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子、ならびに３’−ＵＴＲの一部を含む、約７２００ｂｐのフラグメントを、  Ｂｇｌ  ＩＩおよびＦｓｐ  ＩでのｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ１．５−ｌｕｃの消化、およびＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いる０．７％アガロースゲルからの精製によって単離する。この７２００ｂｐフラグメントを、引き続いて、同様にＢｇｌ  ＩＩおよびＦｓｐ  Ｉで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて０．７％アガロースゲルから精製したプラスミドｐＢＧＳＶ３’に連結する。得られる構築物をｐＢＧＳＶｄｌＢ／ＳＩＮ１−ｌｕｃと命名する。残りの配列（転写がシンドビスヌクレオチド１の５’側の１つのさらなる非ウイルスヌクレオチドから開始するように、シンドビスヌクレオチド１〜２２８９に連結された７量体化テトラサイクリンオペレーターおよび最小のＣＭＶプロモーター（ｔｅｔＯ／ＣＭＶ）を含む）の挿入を、オーバーラップＰＣＲによって達成する。ＰＣＲ反応＃１において、この配列の約３７０ｂｐのｔｅｔＯ／ＣＭＶ部分を、３０秒伸長を用いる標準的な３サイクルＰＣＲによって、テンプレートプラスミドｐＵＨＣ１３−３（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ，  同書）から、以下のオリゴヌクレオチドプライマー（一方のプライマー上において隣接するＢｇｌ  ＩＩおよびＡｓｃ  Ｉ部位を、そして他方において５’−シンドビスヌクレオチドにオーバーラップする配列をさらに含むように設計されている）を用いて、増幅する。
【０４１０】
正方向プライマー：５’ＢＡｔｅｔＯＦ（５’−制限部位／ｔｅｔＯ  ｎｔｓ．）（配列番号８８）
５’−ＴＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣ／ＴＴＴＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧ−３’
逆方向プライマー：３’ＣＭＶｐｒｏ／ＳＩＮＲ（５’−シンドビスｎｔｓ．／ＣＭＶ  ｎｔｓ．）（配列番号８９）
５’−ＴＡＣＧＣＣＧＴＣＡＡＴ／ＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴＧＣ−３’。
【０４１１】
ＰＣＲ反応＃２において、この配列の２２８９ｂｐのシンドビス５’−末端部分を、３分伸長を用いる標準的な３サイクルＰＣＲによって、テンプレートプラスミドｐＫＳＲＳＩＮ−１（実施例１）から、一方のプライマー上でＣＭＶプロモーターヌクレオチドにオーバーラップする配列をさらに含むように設計した以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、増幅する。
【０４１２】
正方向プライマー：ＣＭＶＳＩＮ５’ｅｎｄＦ（５’−ＣＭＶ  ｎｔｓ．／シンドビスｎｔｓ．）（配列番号９０）
５’−ＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴ／ＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＴＡＧＴＡＣＡＣＡＣＴＡＴＴ
逆方向プライマー：ＳＩＮ２４００Ｒ（全てのシンドビスｎｔｓ．）（配列番号９１）
５’−ＣＧＴＴＧＡＧＣＡＴＡＡＣＣＧＡＡＴＣＴＡＣ。
【０４１３】
増幅に続いて、ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、そして、さらなる５’ＢＡｔｅｔＯＦおよびＳＩＮ２４００Ｒプライマーを用いて、３．５分伸長を用いる引き続く３サイクルＰＣＲ反応において、テンプレートとして一緒に用いる。得られる約２６６０ｂｐのオーバーラップＰＣＲアンプリコンを、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて精製し、Ｂｇｌ  ＩＩで消化し、そして同様にＢｇｌ  ＩＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて０．７％アガロースゲルから精製したプラスミドｐＢＧＳＶｄｌＢ／ＳＩＮ１−ｌｕｃに連結する。得られる構築物をｐｔｅｔＳＩＮ１−ｌｕｃと命名する。他の異種の目的の配列を含有するベクター構築物を、同様のアプローチを用いて、またはＸｈｏ  Ｉおよび／またはＮｏｔ  Ｉ部位への直接クローニングによって生成する。引き続いて、選択可能なＥ．ｃｏｌｉ  ｇｐｔ遺伝子（キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）発現カセットを、生成し、そしてプラスミドｐｔｅｔＳＩＮ１−ｌｕｃの唯一のＰａｃ  Ｉ部位に挿入して、さらなる選択マーカーを提供する。最初に、ｇｐｔ遺伝子オープンリーディングフレームに連結したＳＶ４０プロモーターを含むフラグメントを、プラスミドｐＭＡＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）から、２分伸長を用いる標準的な３サイクルＰＣＲによって、そして上流の隣接するＳａｃＩおよびＰａｃＩ部位ならびに下流のＳａｃＩ部位を含むように設計した以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。
【０４１４】
正方向プライマー：ＳＶ４０ｐｒｏＳＰＦ（５’−制限部位／ＳＶ４０  プロモーター配列）（配列番号９２）
５’−ＡＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡ／ＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＧＧＡＡＣＣＴＴＡＣＴＴＣ
逆方向プライマー：３’ＥＣｇｐｔＲ（５’−制限部位／ｇｐｔ遺伝子配列）（配列番号９３）
５’−ＡＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣ／ＡＧＧＣＧＴＴＧＡＡＡＡＧＡＴＴＡＧＣＧＡＣＣＧ。
【０４１５】
増幅に続いて、ＳＶ４０プロモーター／ｇｐｔ遺伝子ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、Ｓａｃ  Ｉで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて精製し、そして同様にＳａｃ  Ｉで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて０．７％アガロースゲルから精製したプラスミドｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏＩ−ＢＧＨＴＴ（実施例５）に連結する。正しい方向の挿入物を有するクローンを、制限分析によって同定する。この構成は、プロモーターおよびｇｐｔ遺伝子をウシ成長ホルモン転写終結シグナルのすぐ近傍に配置する。得られるｇｐｔ発現構築物をｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏＩ−ｇｐｔと命名する。次に、全体の発現カセットを、プラスミドｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏＩ−ｇｐｔから、２分伸長を用いる標準的な３サイクルＰＣＲによって、そして隣接するＰａｃ  Ｉ部位を含むように設計した以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。
【０４１６】
正方向プライマー：上記に示した、ＳＶ４０ｐｒｏＳＰＦ  （配列番号９２）
逆方向プライマー：ＢＧＨＴＴｐａｃＲ（５’−制限部位／ＢＧＨ配列）（配列番号９４）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＴＡＡＴＴＡＡ／ＡＴＡＧＡＡＴＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＣＡＡＴＧＣＧＡＴＧＣ。
【０４１７】
増幅に続いて、ｇｐｔ遺伝子発現カセットフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、Ｐａｃ  Ｉで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて精製し、そして同様にＰａｃ  Ｉで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて０．７％アガロースゲルから精製したｔｅｔ誘導性アルファウイルスベクター構築物ｐｔｅｔＳＩＮ１−ｌｕｃに連結する。得られる構築物をｐｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃと命名する。
【０４１８】
最初のテトラサイクリン誘導性アルファウイルスベクタープロデューサー細胞株の構築のために、ｐｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃ構築物およびテトラサイクリンリプレッサー／ＶＰ１６トランスアクチベーター（ｒＴＡ）発現カセットを、所望のアルファウイルスＰＣＬに安定に形質転換する。例えば、アルファウイルスＣ／ＧＬＹＣＯ  ＰＣＬ細胞（上記由来）を、選択マーカーをコードする別のプラスミドとの同時トランスフェクションによってプラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡｋ（上記を参照のこと）で安定に形質転換する。プラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡｋおよびヒスチジノールデヒドロゲナーゼマーカーをコードするｐＳＶ２−Ｈｉｓ（Ｓｃｈａｔｚら、１９８９，  Ｃｅｌｌ  ５９：１０３５−１０４８）を、それぞれ、４０：１のモル比で、製造業者によって記載されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて、Ｃ／ＧＬＹＣＯ  ＰＣＬ細胞（または他のＰＣＬ）に同時トランスフェクトする。トランスフェクションの約２４時間後、細胞を、トリプシン処理し、そしてヒスチジノールおよび０．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有する培地に再プレートする。培地を、新鮮な薬物含有培地に定期的に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖させる。細胞を、トリプシン処理し、そして９６ウェル組織培養ディッシュにおける限界希釈によってクローン化し、そして個々の細胞クローンを、スクリーニングのために増殖させ、そして拡大する。ポジティブｐＴｅｔ−ｔＴＡｋ含有パッケージング細胞クローン（Ｃ／ＧＬＹＣＯ／ＴＡｋ細胞と称される）を、テトラサイクリンの存在下または非存在下の両方で、  ｔｅｔＯ／プロモーターの制御下のルシフェラーゼレポータープラスミドｐＵＨＣ１３−３（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ，  同書）をトランスフェクトすることによって同定する。テトラサイクリンの非存在下では、ポジティブＣ／ＧＬＹＣＯ／ＴＡｋ  ＰＣＬ細胞は、ｔｅｔＯ／プロモーターからの誘導、および誘導性の高レベルのルシフェラーゼを提供する。
【０４１９】
引き続いて、ＤＮＡに基づくアルファウイルスベクター構築物ｐｔｅｔＳＩＳ１ｇｐｔ−ｌｕｃを、製造業者によって記載されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて、Ｃ／ＧＬＹＣＯ／ＴＡｋ細胞に安定にトランスフェクトする。トランスフェクションの約２４時間後、細胞を、トリプシン処理し、そして特定の細胞型に至適化しそして０．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有する選択培地（ＤＭＥＭ＋１０％透析ウシ胎仔血清；２５０μｇ／ｍｌキサンチン；１５μｇ／ｍｌヒポキサンチン；１０μｇ／ｍｌチミジン；２μｇ／ｍｌアミノプテリン；２５μｇ／ｍｌミコフェノール酸）に再プレートする。培地を、新鮮な選択培地に定期的に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖させる。細胞を、トリプシン処理し、そして９６ウェル組織培養ディッシュにおける限界希釈によってクローン化し、そして個々の細胞クローンを、スクリーニングのために増殖させ、そして拡大する。ｐｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃで安定に形質転換したポジティブプロデューサー細胞株を、以前に記載されるように、少なくとも２４時間培地からテトラサイクリンを除去し、そして細胞溶解物中のルシフェラーゼについて試験し、そしてさらに培養上清中のパッケージングされたルシフェラーゼベクターについて試験することによって、同定する。
【０４２０】
Ｂ．  ２つのレベル調節を有するアルファウイルスＤＮＡベクター
好ましい実施態様において、ＤＮＡに基づくアルファウイルスベクター（野生型または宿主巨大分子合成の減少した阻害、遅延した阻害もしくは阻害なしの所望の表現型を有する）を構築することが望ましくあり得る。ここで、ＲＮＡベクター分子の転写（自己触媒性増幅が可能である）は、全ての基底レベルの転写を除去する２つのレベルの調節によって非常に厳密に制御されるプロモーターから生じる。このようなアプローチは、１つの誘導性成分（例えば、上記由来のｔｅｔ系）と可逆的な転写のサイレンシング成分とを組み合わせ得る。例えば、特定のジンクフィンガータンパク質のＫＲＡＢ抑制ドメインを使用し得る。
【０４２１】
手短には、ＫＲＡＢ（Ｋｒuｐｐｅｌ関連ボックス）ドメインは、全てのＫｒuｐｐｅｌクラスＣｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガータンパク質の１／３より多くのアミノ末端領域に存在する高度に保存された配列である。これらのドメインは、２つの推定上の両親媒性α−ヘリックスを含み、そしてＤＮＡ結合依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写リプレッサーとして機能することが示されている（例えば、Ｌｉｃｈｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：７６−７９，  １９９０）。他の転写因子と同様に、活性抑制ドメインとＤＮＡ結合ドメインとは、異なり、そして分離可能である。それゆえ、抑制ドメインを、融合タンパク質として、標的化のために任意の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に連結し得る。理想的には、ＤＮＡ結合タンパク質成分は、調節可能様式で結合を可逆的に妨げられ得、従って転写サイレンシングを「オフ」にする。例えば、１つの実施態様において、ヒトＫｏｘ１（Ｔｈｉｅｓｅｎ，  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．  ２：３６３−３７４，  １９９０）由来のＫＲＡＢドメインを、ＤＮＡ結合ラクトース（ｌａｃ）リプレッサータンパク質に融合して、ｔｅｔ応答性プロモーターのすぐ近傍に操作したｌａｃオペレーター配列への可逆性の配列特異的結合を有するハイブリッド転写サイレンサーを形成させる（図３０）。この構成では、ｌａｃリプレッサー／ＫＲＡＢドメイン融合体（ｒＫＲ）の構成的発現は、ｌａｃオペレーター配列への結合および誘導されていないｔｅｔ応答性プロモーターからの何らかの「漏出性の」基底の転写の除去を生じる。ベクター発現が所望であり、そしてテトラサイクリンがこの系から除去される場合には、ＩＰＴＧを、ｒＫＲ媒介転写サイレンシングを妨げるために添加する。
【０４２２】
さらに、他のジンクフィンガータンパク質由来のＫＲＡＢドメイン（例えば、ＺＮＦ１３３（Ｔｏｍｍｅｒｕｐら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．  ２：１５７１−１５７５，  １９９３）、ＺＮＦ９１（Ｂｅｌｌｅｆｒｏｉｄら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２：１３６３−１３７４，  １９９３）、ＺＮＦ２（Ｒｏｓａｔｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：５６６１−５６６７，  １９９１）など）ならびに他の移動させ得るリプレッサードメイン（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｅｎ  またはｅｖｅ遺伝子（ＪａｙｎｅｓおよびＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：１４２７−１４３３，  １９９１；  ＨａｎおよびＭａｎｌｅｙ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ７：４９１−５０３，  １９９３）、ヒトジンクフィンガータンパク質ＹＹ１  （Ｓｈｉら、Ｃｅｌｌ  ６７：３７７−３８８，  １９９１）、ウィルムス腫瘍抑制タンパク質ＷＴ１（Ｍａｄｄｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１５５０−１５５３，１９９１）、甲状腺ホルモンレセプター（Ｂａｎｉａｈｍａｄら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １１：１０１５−１０２３，  １９９２）、レチノイン酸レセプター（Ｂａｎｉａｈｍａｄら、同書）、Ｋｉｄ−１（Ｗｉｔｚｇａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４５１４−４５１８，  １９９４））がこのような系で容易に用いられる。さらに、この系のｌａｃリプレッサー／ｌａｃオペレーター成分を、他の供給源に由来する多数の任意の他の調節可能な系（例えば、トリプトファンおよびマルトースオペロン、ＧＡＬ４など）によって置換し得る。
【０４２３】
詳細には、タンパク質を核に戻るようにより効率的に方向付けるために、連結された核局在化配列（ＮＬＳ；  Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（配列番号１００）；  Ｋａｌｄｅｒｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３９：４９９−５０９，  １９８４）を有する、ヒトＫｏｘ１のＫＲＡＢドメインに融合したｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）タンパク質を含有する発現カセットを、オーバーラップＰＣＲによって構築する。ＰＣＲ反応＃１において、約１１００ｂｐのｌａｃＩ配列を、１．５分伸長を用いる標準的な３サイクルＰＣＲによって、テンプレートプラスミドｐ３’ＳＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）から、以下のオリゴヌクレオチドプライマー（上流プライマーに隣接するＸｈｏＩ部位および良好な翻訳開始状況にあるＡＵＧ開始コドンを、そして他方にＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化配列をさらに含むように設計されている）を用いて増幅する。
【０４２４】
正方向プライマー：ＬａｃＩ５’Ｆ（５’−制限部位／ＡＵＧ＋ｌａｃＩ配列）（配列番号９５）
５’−ＡＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＣＡ／ＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡＴＡＣ
逆方向プライマー：ＬａｃＩ３’ＮＬＳＲ（５’−ＮＬＳ／ｌａｃＩ配列）（配列番号９６）
５’−ＧＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＧ／ＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣ。
【０４２５】
ＰＣＲ反応＃２において、ヒトＫｏｘ１のアミノ末端１２１残基ＫＲＡＢドメインを含む、約４００ｂｐのアンプリコンを、１分伸長を用いる標準的な３サイクルＰＣＲによって、テンプレートプラスミドｐＫｏｘ１（Ｔｈｉｅｓｅｎ，  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．  ２：３６３−３７４，  １９９０）から、以下のオリゴヌクレオチドプライマー（一方のプライマーにおいてＮＬＳおよびＬａｃＩにオーバーラップする配列を、そして他方においてＳａｃＩ制限部位および停止コドンをさらに含むように設計されている）を用いて増幅する。
【０４２６】
正方向プライマー：ＫＲＡＢ５’Ｆ（５’−ＮＬＳ＋ｌａｃＩオーバーラップ配列／ＫＲＡＢ配列）（配列番号９７）
５’−ＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧ／ＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴ
逆方向プライマー：ＫＲＡＢ３’Ｒ（５’−制限部位＋停止コドン／ＫＲＡＢ配列）（配列番号９８）
５’−ＡＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＴＡ／ＡＡＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＡＡＡＴＧＣ。
【０４２７】
増幅に続いて、ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、そして、さらなるＬａｃＩ５’ＦおよびＫＲＡＢ３’Ｒプライマーを用いて、２．５分伸長を用いる引き続く３サイクルＰＣＲ反応においてテンプレートとして一緒に用いる。得られる約１５００ｂｐのオーバーラップするＰＣＲアンプリコンを、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて精製し、Ｘｈｏ  ＩおよびＳａｃ  Ｉで消化し、そして同様にＸｈｏ  ＩおよびＳａｃ  Ｉで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて０．７％アガロースゲルから精製した真核生物発現ベクタープラスミドｐＥＵＫ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）に連結する。得られるｌａｃＩ／ＫＲＡＢ発現構築物をｐＥＵＫ−ｒＫＲと命名する。
【０４２８】
ｌａｃＩ／ＫＲＡＢ発現カセットを含有する安定なＰＣＬ形質転換体を生成するために、ｒＴＡ  ｔｅｔ／トランスアクチベーター融合タンパク質カセットでの形質転換について既に選択されているアルファウイルスＰＣＬを、出発材料として用いる。例えば、アルファウイルスＣ／ＧＬＹＣＯ／ＴＡｋ  ＰＣＬ細胞（上記由来）を、選択マーカーをコードする別のプラスミドとの同時トランスフェクションによってプラスミドｐＥＵＫ−ｒＫＲで安定に形質転換する。プラスミドｐＥＵＫ−ｒＫＲおよびピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ選択マーカー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をコードするｐＰＵＲを、それぞれ、４０：１のモル比で、製造業者によって記載されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて、Ｃ／ＧＬＹＣＯ／ＴＡｋ  ＰＣＬ細胞（または他のＰＣＬ）に同時トランスフェクトする。トランスフェクションの約２４時間後、細胞を、トリプシン処理し、そして５μｇ／ｍｌピューロマイシンおよび０．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有する培地に再プレートする。培地を、新鮮な薬物含有培地に定期的に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖させる。細胞を、トリプシン処理し、そして９６ウェル組織培養ディッシュにおける限界希釈によってクローン化し、そして個々の細胞クローンをスクリーニングのために増殖させ、そして拡大する。ポジティブｐＥＵＫ−ｒＫＲ含有パッケージング細胞クローン（Ｃ／Ｇ／ＴＡｋ／ｒＫＲ細胞と称される）を、ｌａｃＩに特異的なポリクローナル抗血清（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）で免疫染色することによって同定する。
【０４２９】
次に、特異的なｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）配列を、所望のｐｔｅｔに基づくアルファウイルスベクター（上記を参照のこと）に挿入しなければならない。例えば、ベクター構築物ｐｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃを、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いることによって、多コピーのｌａｃＯを含有するように改変する。ＬａｃＯオリゴヌクレオチドを、対称のｌａｃＯ配列を含有するように設計する。これは、全長の２２ｂｐパリンドロームのオペレーター配列（Ｓｉｍｏｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１６２４−１６２８，  １９８４；  Ｓａｄｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：６７８５−６７８９，  １９８３）を含み、そして二本鎖分子に自己アニールした場合には隣接するＡｓｃ  Ｉ部位を含む。
【０４３０】
ＬａｃＯｓｙｍＡ（配列番号９９）
５’−ＣＧＣＧＣＣＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＧＧ
ＬａｃＯｓｙｍＡ  ｏｌｉｇｏを、自己アニールさせてＡｓｃＩ「粘着末端」ＤＮＡフラグメントを形成させ、次いでＡｓｃＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて０．７％ゲルから精製したプラスミドｐｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃに連結する。ｌａｃＯ配列の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のタンデムコピーを含むクローンを配列分析によって同定し、そしてそれらに名称ｐＯＩｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃ、ｐＯＩＩｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃ、ｐＯＩＩＩｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃなどを与える。次いで、異なるｌａｃＯコピー数を有する個々のクローンを、以下に記述するようにトランスフェクトし、そして転写調節の最も厳密なレベルについて試験する。
【０４３１】
アルファウイルスベクタープロデューサー細胞株を生成するために、ＤＮＡに基づくｐＯｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃベクター構築物を、製造業者によって記載されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いてＣ／Ｇ／ＴＡｋ／ｒＫＲ細胞に安定にトランスフェクトする。トランスフェクションの約２４時間後、細胞を、トリプシン処理し、そして特定の細胞型に至適化されそして０．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有する選択培地（ＤＭＥＭ＋１０％透析ウシ胎仔血清；２５０μｇ／ｍｌキサンチン；１５μｇ／ｍｌヒポキサンチン；１０μｇ／ｍｌチミジン；２μｇ／ｍｌアミノプテリン；２５μｇ／ｍｌミコフェノール酸）に再プレートする。培地を、新鮮な選択培地に定期的に交換し、そして耐性細胞のフォーカスを増殖させる。細胞を、トリプシン処理し、そして９６ウェル組織培養ディッシュにおける限界希釈によってクローン化し、そして個々の細胞クローンを、スクリーニングのために増殖させ、そして拡大する。ｐＯｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃ構築物で安定に形質転換されたポジティブプロデューサー細胞株を、培地からのテトラサイクリンの除去、および誘導のための２０ｍＭ  ＩＰＴＧの添加の少なくとも２４時間後のルシフェラーゼの発現（以前に記載される）によって同定する。ルシフェラーゼ活性を、プロデューサー細胞溶解物に対して、およびさらに培養上清を用いる発現の伝達（ｔｒａｎｆｅｒ−ｏｆ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）実験の後の両方で測定する。
【０４３２】
さらなるレベルの制御を、第３の、またはさらに第４のレベルの調節をアルファウイルスベクター分子の転写を担うプロモーターに付加することによって取り込ませ得る。このような付加的なレベルの調節は、最小のプロモーターに取り込まれ得、そして他の誘導性系および／または細胞分化制御を含み得る。上記の場合の各々において、安定な形質転換が、宿主細胞染色体への組み込みとして、または例えば、ＥＢＶエピソームに基づくベクタープロモーター（非組み込みのための）を用いて染色体外エピソームとして、達成され得る。
【０４３３】
実施例８
アルファウイルス由来の空のまたはキメラのウイルス粒子の生成方法
実施例６に示したように、個々の欠陥ヘルパー（ＤＨ）発現カセットを、複数のアルファウイルスまたはそれらの改変体由来のエレメントを含むように構築し得る。従って、実施例６に記載のように、ウイルス糖タンパク質の発現のための分割（ｓｐｌｉｔ）構造遺伝子ＤＨカセットを、異なるアルファウイルス種由来のキャプシド遺伝子および糖タンパク質遺伝子を含むように構築し得る。例えば、このような異種アルファウイルス糖タンパク質ＤＨカセットは、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）由来のキャプシド遺伝子、およびシンドビスウイルス由来の糖タンパク質遺伝子を含み得る。この構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）において、ＲＲＶキャプシド遺伝子は、糖タンパク質遺伝子の翻訳のレベルを増強するように働く。
【０４３４】
本明細書中に記載される異種アルファウイルス糖タンパク質ＤＨカセットの構成は、アルファウイルス粒子へのベクターレプリコンのパッケージングを改善するが、なお組換えの可能性を減少させ、その結果、複製コンピテントなアルファウイルスを形成するように設計される。異種アルファウイルス糖タンパク質ＤＨ発現カセットは、実施例６に記載のＤＨ発現カセットにおけるシンドビスウイルスキャプシド遺伝子の置換物として（「ゲノム」構造タンパク質遺伝子ＰＣＬ）、異種アルファウイルスキャプシド遺伝子（例えば、ＲＲＶ）を含むものである。分割構造遺伝子ＰＣＬにおける第２のＤＨ発現カセットは、例えば、シンドビスウイルスキャプシド遺伝子を含む。従って、シンドビスウイルス構造タンパク質を有する組換えアルファウイルスベクター粒子の生成のための分割構造遺伝子ＰＣＬは、例えば、個々のＤＨ発現カセット上のシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子およびキャプシド遺伝子を伴って誘導され得る。
【０４３５】
ＲＲＶの遺伝子の全てを含むが、シンドビスウイルス由来のキャプシド遺伝子を有するキメラウイルス、または相反するキメラウイルスは、感染性ウイルス粒子へアセンブリしないことが以前に示されている（Ｌｏｐｅｚら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８：１３１６−１３２３，  １９９４）。その著者らは、この報告においてウイルスアセンブリにおける糖タンパク質Ｅ２のカルボキシ末端とキャプシドタンパク質との相互作用が、異種アルファウイルスの構造タンパク質の間では起こり得ないと結論した。従って、実施例６に記載の分割構造遺伝子アルファウイルスＰＣＬに起こる組換えゲノムであって、シンドビスウイルスの非構造タンパク質遺伝子（ベクターレプリコン起源）、ＲＲＶキャプシド遺伝子、およびシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子からなるゲノムは、複製コンピテントであるべきではなく、ウイルス（複製コンピテントなシンドビスウイルス、ＲＣＳＶ）の増殖を生じる。異種アルファウイルス種間のパッケージング制限は、キャプシド遺伝子（１つのアルファウイルス由来の翻訳増強エレメントおよび異なるアルファウイルス由来の糖タンパク質遺伝子を含む）で構成されるＤＨカセットの構築を可能にする。
【０４３６】
しかし、図３１に例示されるように、異種アルファウイルスの構造タンパク質間ではアセンブリは起こり得ないというＬｏｐｅｚら（同書）の観察は、正確ではない。実際、ＲＲＶキャプシド遺伝子、およびシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子からなるＤＨカセットは、感染性ウイルス粒子を生成する。簡単に述べれば、ＢＨＫ細胞を、ＳＩＮｒｅｐ／Ｌａｃ  Ｚレプリコン（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６７：６４３９−６４４６，  １９９３）およびＤＨ−ＢＢ（５’ｔＲＮＡ／ＳＩＮ）Ｃｒｒｖ（実施例６および図２４；ＲＲＶキャプシド／シンドビスウイルス糖タンパク質）でインビトロで転写したＲＮＡと同時エレクトロポレートした。エレクトロポレーションおよびインビトロ転写を、実施例１に記載のように行った。エレクトロポレーションの後、ＢＨＫ細胞を、実施例１に記載と全く同様に、ダクチノマイシンで処理し、そして［３Ｈ］ウリジンで標識した。エレクトロポレーションの１８時間後、培養培地を回収し、そして６，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって明澄化した。上清に残ったベクター粒子を、超遠心分離によって、スクロースクッション上に最初に重層したあとにペレット化した。ＲＮＡを、実施例１に記載と全く同様に、エレクトロポレーションの１８時間後にＢＨＫ細胞から、およびウイルスペレットから単離し、変性グリオキサールアガロースゲル上で電気泳動し、そしてオートラジオグラフィーによって可視化した。ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ  Ｃｒｒｖ  ＲＮＡでエレクトロポレートしたＢＨＫ細胞およびウイルス粒子に存在するウイルスＲＮＡを、図３１（レーン１、パネルＡ、およびレーン１、パネルＢ）に示す。ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ  Ｃｒｒｖ  ＲＮＡについてのゲノムおよびサブゲノム複製種に対応するＲＮＡは、エレクトロポレートしたＢＨＫ細胞および生成されたウイルス粒子の両方に存在した。結果は、Ｌｏｐｅｚら（同書）とは対照的に、ＲＲＶキャプシドタンパク質およびシンドビスウイルス糖タンパク質からなるキメラアルファウイルス粒子の形成を実証する。さらに、キメラアルファウイルス粒子中のゲノムおよびサブゲノムＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ  Ｃｒｒｖ  ＲＮＡの無差別パッケージングは、ロスリバーキャプシドタンパク質が、シンドビスウイルスパッケージング配列（これは、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺベクターレプリコンのｎｓＰ１遺伝子中に存在する）を特異的に認識し得ないことを示す。
【０４３７】
エレクトロポレーションの１８時間後にＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ  Ｃｒｒｖ  ＲＮＡでエレクトロポレートしたＢＨＫ細胞中に存在するウイルスタンパク質、および生成されたウイルス粒子を、図３２（レーン１、パネルＡ、およびレーン１、パネルＢ）に示す。エレクトロポレートした細胞中のウイルス特異的構造タンパク質と生成されたキメラアルファウイルス粒子とを、区別できなかった。つまり、図３２は、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ  Ｃｒｒｖ  ＲＮＡでエレクトロポレートしたＢＨＫ細胞から生成されたウイルス粒子が、ＲＲＶキャプシドならびにシンドビスウイルス糖タンパク質Ｅ１およびＥ２を含んでいたことを明確に示す。この結果は、Ｌｏｐｅｚら（同書）とは対照的に、異種アルファウイルスキャプシドと糖タンパク質との間にはアセンブリにおける制限（これは、キメラウイルス粒子の形成を防止する）が存在しないという疑う余地のない証拠を提供する。
【０４３８】
従って、Ｌｏｐｅｚらの結果および考察とは明確に対照的に、ＲＲＶキャプシドタンパク質のアミノ末端は、異種シンドビスウイルスゲノムに結合し、そして感染性キメラアルファウイルス粒子を形成し得る。重要なことに、異種アルファウイルスキャプシドタンパク質と糖タンパク質との間にはウイルスアセンブリの制限が存在するという以前の結論は、不正確である。次いで、本明細書中に記載されるキメラアルファウイルス粒子の生成はまた、上記の分割構造遺伝子ＰＣＬにおいてＲＣＳＶの形成を生じる。なぜなら、シンドビスウイルス非構造タンパク質遺伝子（ベクターレプリコン由来）、ＲＲＶキャプシド遺伝子、およびシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子からなる組換えゲノムは、感染性ウイルスを生成するからである。あるいは、個々のアルファウイルス構造タンパク質とベクターレプリコンとの間のこのパッケージングの制限の欠如は、ベクター粒子の指向性が改変されることを可能にする。例えば、シンドビスウイルスレプリコンは、リンパ指向性の組換えベクター粒子を生成するために、ヴェネズエラウマ脳炎ウイルス構造タンパク質とともにパッケージングされ得る。
【０４３９】
２つの別々の以前の研究において記載された結果は、キャプシドタンパク質と、三角測量数（ｔｒｉａｎｇｕｌａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）（Ｔ）＝３を有する２つの正十二面体ウイルスポジティブＲＮＡ鎖ゲノム、ｔｕｒｎｉｐ  ｃｒｉｎｋｌｅウイルス（ＴＣＶ）およびｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｅａｎ  ｍｏｓａｉｃウイルス（ＳＢＭＶ）、との間の相互作用のインビトロでの消失が、ウイルス粒子の解離、および核酸を含まないＴ＝１粒子の形成を生じたことを示している（Ｓｏｒｇｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９１：６３９−６５６，  １９８６、およびＥｒｉｃｋｓｏｎおよびＲｏｓｓｍａｎｎ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １１６：１２８−１３６，  １９８２）。核酸の非存在下では、野生型ウイルスに類似のＴ＝３粒子は、インビトロで形成されなかった。ＯｗｅｎおよびＫｕｈｎ  （Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７０：２７５７−２７６３，  １９９６）は、インビボでのキャプシド形成反応の特異性を指示するのに必要であるキャプシドタンパク質の領域を同定するために、キャプシドに欠失を含むシンドビスウイルスゲノムのパッケージング特性を調査した。キャプシドの残基９７−１０６に対応する欠失を含む１つの変異体ウイルス［ＣＤ（９７−１０６）］は、ゲノムＲＮＡおよびサブゲノムＲＮＡの両方をキャプシド形成し、このことは、キャプシドタンパク質のドメインが、ゲノムＲＮＡパッケージングシグナルの特異的認識のために必要とされることを示す。なお別の報告において、アウラアルファウイルスのパッケージング特性が調査された（Ｒｕｍｅｎａｐｆら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６９：１７４１−１７４６，  １９９５）。この研究において、キャプシドタンパク質キャプシド形成配列相互作用開始複合体を含むアルファウイルスパッケージングのための機構が提唱された。この提唱された機構は、その筆者らおよび他者（ＯｗｅｎおよびＫｕｈｎ、同書を含む）の観察（そこでは、２６Ｓおよび４９ＳアルファウイルスＲＮＡがＴ＝１、Ｔ＝３、Ｔ＝４、およびＴ＝７ウイルス粒子にパッケージングされる）に基づいており、アルファウイルスでの感染の間に生じる空のキャプシドは報告されていない。
【０４４０】
上記の文献およびそれに含まれる議論に基づいて、キャプシド形成反応の特異性を指示するために必要とされるキャプシドタンパク質ドメインに対応する領域を欠失するＲＲＶキャプシド遺伝子、およびさらにウイルスＲＮＡと静電的に結合するそのまわりの塩基性残基は、ウイルスＲＮＡを含む安定なキャプシド粒子を形成し得るべきではない。従って、この欠失したＲＲＶキャプシド遺伝子およびシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子からなる異種アルファウイルスＤＨカセットから発現されたアルファウイルス構造タンパク質は、アセンブリして安定なキメラウイルス粒子にならないはずである。従って、上記および実施例６において考察された分割構造遺伝子ＰＣＬにおいて、シンドビスウイルス非構造タンパク質遺伝子、ＲＲＶキャプシド遺伝子（パッケージング特異性に対応する領域およびそのまわりの塩基性残基を欠失する）、およびシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子からなる組換えゲノムは、感染性ウイルスを生成し得なかった。実施例６において記載したように、シンドビスウイルスキャプシドタンパク質は、別々のＤＨ発現カセットから発現される；従って、３つのシンドビスウイルス構造タンパク質は、全体として発現され、その結果、組換えベクター粒子を生成する。
【０４４１】
シンドビスウイルスパッケージング配列に結合する発現されるタンパク質の予想される領域に対応するＲＲＶキャプシド遺伝子のヌクレオチド（Ｗｅｉｓｓら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  ２２：７８０−７８６，  １９９４、およびＬｏｐｅｚら、同書）（ウイルスＲＮＡに静電的に結合する塩基性残基を含む）を、異種アルファウイルスキャプシド糖タンパク質ＤＨを構築するために欠失させた。これは、翻訳増強および翻訳後切断による正確なｐＥ２−６Ｋ−Ｅ１ポリタンパク質プロセシングを提供したが、安定なキメラＲＲＶ／シンドビスウイルス粒子をアセンブリし得なかった。図３３は、ＲＲＶキャプシドタンパク質、および３つの個々のＲＲＶキャプシド遺伝子変異体（ＣD１ｒｒｖ、ＣD２ｒｒｖ、およびＣD３ｒｒｖ）から発現されるキャプシドタンパク質の疎水性プロフィール（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｌｉｔｔｌｅ）を例示する。ここで、ウイルスパッケージング配列ＲＮＡと相互作用するリジンリッチタンパク質をコードする種々の量のキャプシド遺伝子が欠失していた。ＲＲＶキャプシドタンパク質のリジンリッチ塩基性領域を図３３に示す。さらに、疎水性プロフィールは、このリジンリッチ塩基性領域が、３つの個々のＲＲＶキャプシド遺伝子変異体ＣD１ｒｒｖ、ＣD２ｒｒｖ、およびＣD３ｒｒｖにおいて段階的に排除されていることを実証する。図３４は、変異体ＣD１ｒｒｖ、ＣD２ｒｒｖ、およびＣD３ｒｒｖにおける欠失の結果として、発現されたＲＲＶキャプシドタンパク質において排除されているリジン残基を示す。以下に示す表は、構築物ＣD１ｒｒｖ、ＣD２ｒｒｖ、およびＣD３ｒｒｖのＲＲＶゲノムにおいて欠失したヌクレオチドを示す。
【０４４２】
【化２３】
2008200051.tif 000024
ＲＲＶキャプシド遺伝子欠失を、図２３に示し、そして実施例６で記載したＤＨ−ＢＢ  ＣｒｒｖプラスミドＤＮＡ上で構築した。指示されたＲＲＶキャプシド遺伝子配列を、実施例６に示すプライマーおよび他のクローニング工程を用いてＰＣＲによって欠失させた。
【０４４３】
上記で考察した図３１および３２は、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ  ＣD１ｒｒｖ、ＣD２ｒｒｖ、またはＣD３ｒｒｖ  ＲＮＡでエレクトロポレートされたＢＨＫ細胞において合成され、これらの細胞の培養液に含まれるウイルス粒子中に存在するウイルス特異的ＲＮＡ（図３１）およびタンパク質（図３２）を図示する。ゲノムおよびサブゲノム種を、エレクトロポレートした細胞において、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺレプリコンおよび３つ全てのＤＨ−ＢＢ  ＣD１ｒｒｖ、ＣD２ｒｒｖ、またはＣD３ｒｒｖ  ＤＨ  ＲＮＡの両方について検出した（図３１、パネルＡ）。しかし、ＳＩＮｒｅｐ／ｌａｃＺレプリコンは、ウイルス粒子中のレプリコンゲノムＲＮＡの不在によって示されるように、ＲＲＶキャプシド遺伝子に欠失を含むＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレートした細胞においてベクター粒子にパッケージングされなかった（図３１、パネルＢ）。さらに、細胞をＲＲＶキャプシドのより大きな欠失（ＣD２ｒｒｖまたはＣD３ｒｒｖ）を含むＤＨ分子でエレクトロポレートした場合、ヘルパーゲノムＲＮＡおよびサブゲノムＲＮＡは、非常に非効率的にパッケージングされ、そして変性ゲルのオートラジオグラムにおいてほとんど不可視であった（図３１、パネルＢ、レーン３および４）。対照的に、ＳＩＮｒｅｐ／ｌａｃＺゲノムＲＮＡ（およびＣD２ｒｒｖまたはＣD３ｒｒｖでのエレクトロポレーションにおけるＤＨ  ＲＮＡ）を、ＲＲＶキャプシド遺伝子に欠失を含むＤＨでエレクトロポレートしたＢＨＫ細胞由来のウイルス粒子において検出しなかったのに対し、等価なＲＲＶキャプシドタンパク質およびシンドビスウイルス糖タンパク質レベルを、全てのＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレートした細胞由来のウイルス粒子において、ＲＲＶキャプシド遺伝子が欠失を含むか否かに関わらず、観察した（図３２、パネルＡおよびＢ）。この結果は、ベクターレプリコンを含んでいない安定なキメラウイルス粒子、または他のウイルス特異的ＲＮＡが、ＳＩＮｒｅｐ／ｌａｃＺゲノムＲＮＡおよびＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレートされたＢＨＫ細胞（これから、ゲノムＲＮＡに結合し得ないキャプシドタンパク質が発現された）において形成されたことを示す。安定な空の異種アルファウイルス粒子の形成は、以前の調査の結果および議論に基づいて予期されずそして予想されない（Ｌｏｐｅｚら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８：１３１６−１３２３，  １９９４，  Ｓｏｒｇｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９１：６３９−６５６，  １９８６，  ＥｒｉｃｋｓｏｎおよびＲｏｓｓｍａｎｎ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １１６：１２８−１３６，  １９８２、およびＲｕｍｅｎａｐｆら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６９：１７４１−１７４６，  １９９５）。
【０４４４】
生成されたウイルス粒子の組成を決定するために、本明細書中に記載されるように、ＳＩＮｒｅｐ  ｌａｃＺおよび種々のＲＲＶキャプシド遺伝子構成を含むＤＨ  ＲＮＡで、ＢＨＫ細胞をエレクトロポレートし、そして続いて実施例１に記載のように、ダクチノマイシンで処理し、［３５Ｓ］メチオニンおよび［３Ｈ］ウリジンで標識した。生成されるウイルス粒子の構成を、明澄化した細胞培養培地を３５，０００ｒｐｍにて２時間、ＳＷ−４１ローター中で２０％〜４０％（ｗ／ｗ）スクロース勾配上で超遠心分離することによって決定した。この研究の結果は、図３５〜３７に示され、そして安定な空の異種アルファウイルス粒子の形成を再び示す。図３５は、高ＭＯＩ（５）で野生型ウイルス、Ｔｏｔｏ１１０１に感染したＢＨＫ細胞において合成された粒子中に取り込まれた［３５Ｓ］メチオニンおよび［３Ｈ］ウリジンの相対的レベルを示す。図３６は、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ（５’ｔＲＮＡ）Ｃｒｒｖ（図２３）ＲＮＡでエレクトロポレートしたＢＨＫ細胞において合成された粒子中に取り込まれた［３５Ｓ］メチオニンおよび［３Ｈ］ウリジンの相対的レベルが、野生型ウイルスに感染した細胞におけるレベルと同様であったことを示す。対照的に、図３７は、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ（５’ｔＲＮＡ）ＣD３ｒｒｖでエレクトロポレートしたＢＨＫ細胞において生成された粒子が、非常に低レベルの取り込まれた［３Ｈ］ウリジンを含んでいたことを示す。図３８は、図３５〜３７を編集したものであり、粒子に取り込まれた［３５Ｓ］メチオニンおよび［３Ｈ］ウリジンの相対的レベルが、野生型アルファウイルスキャプシド遺伝子を含むＲＮＡで感染またはエレクトロポレートしたＢＨＫ細胞におけるレベルと類似であったのに対し、ＲＲＶキャプシド遺伝子のｎｔ７７６０〜７８９１の欠失を含むＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレートしたＢＨＫ細胞が、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ  ＲＮＡを欠失する安定なキメラの空のアルファウイルス粒子を形成したことを明らかに示す。ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ  ＲＮＡおよびＤＨ−ＢＢ  ＣＤ３ｒｒｖでインビトロで転写されたＲＮＡでエレクトロポレートした細胞株において生成され、そして［３５Ｓ］メチオニンで標識された空のアルファウイルス粒子の力価を、Ｔｏｔｏ  １１０１野生型ウイルスで感染し、そして［３５Ｓ］メチオニンで標識したＢＨＫ細胞との比較によって決定した。Ｔｏｔｏ１１０１感染細胞由来のウイルス含有スクロース勾配画分に存在する放射能のレベルを定量し、そして実施例１に記載した方法に従うプラークアッセイによって決定されるこれらの同一の画分に存在するウイルス力価に関連付けた。空のアルファウイルス粒子力価決定のために、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ  ＲＮＡおよびＤＨ−ＢＢ  ＣＤ３ｒｒｖでインビトロ転写されたＲＮＡでエレクトロポレートしたＢＨＫ細胞由来のウイルス粒子含有スクロース勾配画分に存在する放射能のレベルを定量し、そしてＴｏｔｏ  １１０１感染細胞からの［３５Ｓ］メチオニン／ウイルス力価に関連付けた。欠失ロスリバーウイルスキャプシドおよびシンドビスウイルス糖タンパク質を含み、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ  ＲＮＡおよびＤＨ−ＢＢ  ＣＤ３��ｒｖでインビトロ転写されたＲＮＡでエレクトロポレートした細胞において生成された空のキメラウイルス粒子の力価は、１×１０９粒子／ｍｌであった。
【０４４５】
本発明は、先に、一般的におよび好ましい実施態様に関しての両方で記載されたが、前述の記載を考慮して、変化および改変が当業者に想到されることが理解される。それゆえ、添付の請求の範囲は、請求される本発明の範囲内にある全てのこのような改変を含むことが意図される。
【０４４６】
さらに、本発明の背景を明らかにするため、そして特に詳細な説明および実施例において記載したような本発明の実施に関するさらなる詳細を提供するために引用された刊行物および他の資料は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０４４７】
【図１】図１は、シンドビスゲノムの編成および複製ストラテジーの模式図である。
【図２】図２は、ＳＩＮ−１、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ１−４、Ｔｏｔｏ１１０１、またはＳｉｎ−１／ｎｓＰ２ウイルスでＭＯＩ  １０で感染されたＢＨＫ細胞からのウイルス放出のグラフである。培養上清は、感染の３、６、９および１２時間後に採集した。ウイルス力価は、プラークアッセイにより決定した。
【図３】図３は、Toto1101、SIN-1/nsP2、SIN-1/nsP1-4、またはSIN-1ウイルスによる感染後のBHK細胞におけるウイルスRNA合成を示すグラフである。細胞はMOI 10で感染させ、そして感染１時間後、アクチノマイシンＤおよび３Ｈウリジンを添加した。３、６、９、および12hpiで、３Ｈウリジン取り込みの量を決定した。
【図４】図４は、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ１、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ２、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ３、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ３−４、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ４、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ２−Ｃ、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ２−Ｎ、Ｔｏｔｏ１１０１、ＳＩＮ−１またはＳｉｎ−１／ｎｓＰ１−４により感染されたＢＨＫ細胞におけるウイルスＲＮＡ合成を示すグラフである。３Ｈウリジン取り込みのレベルを野生型（Ｔｏｔｏ１１０１）感染に対して表す。
【図５】図５は、ＳＩＮ−ＩｎｓＰ１−４、ＳＩＮ−１、ＳＩＮ−１ｎｓＰ２、またはＴｏｔｏ１１０１ウイルスにより感染されたＢＨＫ細胞における宿主細胞タンパク質合成の遮断を示すグラフである。
【図６Ａ】図６は、ＳＩＮ−１ウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０１）。
【図６Ｂ】図６は、ＳＩＮ−１ウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０１）。
【図６Ｃ】図６は、ＳＩＮ−１ウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０１）。
【図６Ｄ】図６は、ＳＩＮ−１ウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０１）。
【図７Ａ】図７は、ＳＩＮＣＧウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０２）。
【図７Ｂ】図７は、ＳＩＮＣＧウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０２）。
【図７Ｃ】図７は、ＳＩＮＣＧウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０２）。
【図７Ｄ】図７は、ＳＩＮＣＧウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０２）。
【図８Ａ】図８は、Ｔｏｔｏ１１０１ウイルスのｃＤＮＡ配列である（配列番号１０３）。
【図８Ｂ】図８は、Ｔｏｔｏ１１０１ウイルスのｃＤＮＡ配列である（配列番号１０３）。
【図８Ｃ】図８は、Ｔｏｔｏ１１０１ウイルスのｃＤＮＡ配列である（配列番号１０３）。
【図８Ｄ】図８は、Ｔｏｔｏ１１０１ウイルスのｃＤＮＡ配列である（配列番号１０３）。
【図８Ｅ】図８は、Ｔｏｔｏ１１０１ウイルスのｃＤＮＡ配列である（配列番号１０３）。
【図９Ａ】図９Ａは、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞から単離され、そして放射性標識ウイルスＲＮＡプローブとハイブリダイズしたＲＮＡのノーザンブロットである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ細胞におけるアルカリホスファターゼ発現の７日の時間経過を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ｌｕｃまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ｌｕｃプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ細胞におけるルシフェラーゼ発現の４日の時間経過を示すグラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１．５−β−ｇａｌまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞から単離され、そして放射性標識ウイルスＲＮＡプローブとハイブリダイズしたＲＮＡのノーザンブロットである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１．５−β−ｇａｌまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドＤＮＡのいずれかでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞におけるβ−ｇａｌ発現を検出しているウエスタンブロットである。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１．５−β−ｇａｌまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ細胞におけるアルカリホスファターゼ発現の５日の時間経過を示すグラフである。
【図１２】図１２ＡおよびＢは、ＲＬＵ（相対的光単位）により測定した、ＨＢＶ  ＰＲＥ配列を有するまたは有さないＥＬＶＳ  β−ｇａｌベクターでトランスフェクトされたＨＴ１０８０およびＢＨＫ−２１細胞におけるβ−ｇａｌ発現を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ベクター誘導性アルファウイルスパッケージング細胞株によるＲＮＡ増幅、構造タンパク質発現、およびベクターパッケージングの模式図である。
【図１４】図１４は、アルファウイルスパッケージング細胞株の生成において用いられるベクター誘導性構造タンパク質発現カセットの模式図である。
【図１５】図１５は、異なるアルファウイルスパッケージング細胞株によるルシフェラーゼベクターパッケージング（発現の移行）を示すグラフである。
【図１６】図１６は、アルファウイルスパッケージング細胞株によるベクター誘導性構造タンパク質発現を示すウエスタンブロットである。
【図１７】図１７Ａは、ｐＤＣＭＶ−ｉｎｔＳＩＮｒｂｚ構造タンパク質発現カセットを含むＣ６／３６蚊細胞によるルシフェラーゼベクターパッケージングを示すグラフである。図１７Ｂは、プラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏで安定に形質転換されたヒト２９３パッケージング細胞によるルシフェラーゼベクターパッケージングを示すグラフである。
【図１８】図１８は、異なるアルファウイルスパッケージング細胞株によるルシフェラーゼベクターパッケージングを示すグラフである。
【図１９】図１９は、アルファウイルスパッケージング細胞株から生成されたＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺベクター粒子で感染されたＢＨＫ細胞からの３Ｈウリジン標識ＲＮＡを示すＲＮＡゲルオートラジオグラフである。
【図２０】図２０は、アルファウイルスパッケージング細胞株から生成されたＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺベクター粒子で感染されたＢＨＫ細胞からの３５Ｓメチオニン標識タンパク質を示すタンパク質ゲルオートラジオグラフである。
【図２１】図２１は、キャプシド細胞株のβ−ｇａｌまたは糖タンパク質ベクタートランスフェクション後のベクター誘導性キャプシドタンパク質発現を示すウエスタンブロットである。
【図２２】図２２は、野生型または欠失変異体ロスリバーウイルスキャプシドタンパク質遺伝子を含む構造タンパク質発現カセットの領域の模式図である。
【図２３】図２３は、野生型または欠失変異体ロスリバーウイルスキャプシドタンパク質遺伝子を含むベクター誘導性構造タンパク質発現カセットの模式図である。
【図２４】図２４は、シンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子の上流にロスリバーウイルスキャプシドタンパク質遺伝子配列を含む「分割（ｓｐｌｉｔ）」構造タンパク質遺伝子発現カセットによるベクターパッケージングの模式図である。
【図２５】図２５は、１つのカセットにおいてシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子の上流にロスリバーウイルスキャプシドタンパク質遺伝子配列、そして別のカセットにおいてシンドビスウイルスキャプシドタンパク質遺伝子を含む「分割」構造タンパク質遺伝子発現カセットによるベクターパッケージングの模式図である。
【図２６】図２６は、上記「分割」構造タンパク質遺伝子発現カセットを用いるベクター粒子パッケージングの結果を示す表である。
【図２７】図２７は、パッケージング化ベクター粒子調製物の増幅および組換えタンパク質の大規模生成のためのアルファウイルスパッケージング細胞株の使用の模式図である。
【図２８】図２８は、アルファウイルスパッケージング細胞株を用いる経時的なβ−ｇａｌタンパク質の増幅および生成を示すグラフである。
【図２９】図２９は、インビボにおけるｃＤＮＡからのアルファウイルスベクターＲＮＡの発現を制御するためのテトラサイクリン調節プロモーター系の使用の模式図である。
【図３０】図３０は、インビボにおけるｃＤＮＡからのアルファウイルスベクターＲＮＡの発現を制御するための連結転写リプレッサーおよび転写インデューサー／アクチベーター調節プロモーター系の使用の模式図である。
【図３１】図３１ＡおよびＢは、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺレプリコン、およびＤＨ構築物を含む種々のＲＲＶキャプシド由来のＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレートされたＢＨＫ細胞から、およびエレクトロポレーションの１８時間後の培養液に存在するベクター粒子から単離された変性グリオキサールゲル上で電気泳動された［３Ｈ］ウリジン標識ＲＮＡのオートラジオグラフである。
【図３２】図３２ＡおよびＢは、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺレプリコン、およびＤＨ構築物を含む種々のＲＲＶキャプシド由来のＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレートされたＢＨＫ細胞から、およびエレクトロポレーションの１８時間後の培養液に存在するベクター粒子からの３５Ｓメチオニン標識タンパク質を示すタンパク質ゲルオートラジオグラフである。
【図３３Ａ】図３３Ａ〜Ｄは、野生型遺伝子（Ａ）および３つの欠失変異体ＣΔ１ｒｒｖ、ＣΔ２ｒｒｖ、およびＣΔ３ｒｒｖ（それぞれＢ〜Ｄ）から発現された種々のロスリバーウイルス（ＲＲＶ）キャプシドタンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロットである。
【図３３Ｂ】図３３Ａ〜Ｄは、野生型遺伝子（Ａ）および３つの欠失変異体ＣΔ１ｒｒｖ、ＣΔ２ｒｒｖ、およびＣΔ３ｒｒｖ（それぞれＢ〜Ｄ）から発現された種々のロスリバーウイルス（ＲＲＶ）キャプシドタンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロットである。
【図３３Ｃ】図３３Ａ〜Ｄは、野生型遺伝子（Ａ）および３つの欠失変異体ＣΔ１ｒｒｖ、ＣΔ２ｒｒｖ、およびＣΔ３ｒｒｖ（それぞれＢ〜Ｄ）から発現された種々のロスリバーウイルス（ＲＲＶ）キャプシドタンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロットである。
【図３３Ｄ】図３３Ａ〜Ｄは、野生型遺伝子（Ａ）および３つの欠失変異体ＣΔ１ｒｒｖ、ＣΔ２ｒｒｖ、およびＣΔ３ｒｒｖ（それぞれＢ〜Ｄ）から発現された種々のロスリバーウイルス（ＲＲＶ）キャプシドタンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロットである。
【図３４】図３４は、野生型遺伝子（配列番号１１４）および３つの欠失変異体ＣΔ１ｒｒｖ（配列番号１１５）、ＣΔ２ｒｒｖ（配列番号１１６）、およびＣΔ３ｒｒｖ（配列番号１１７）から発現されたアミノ末端ＲＲＶキャプシドタンパク質を示す模式図である。ＲＲＶキャプシド遺伝子変異体において欠失されたリジン残基が示される。
【図３５】図３５は、Ｔｏｔｏ１１０１野生型ウイルスで高いＭＯＩで感染されたＢＨＫ細胞においてウイルス粒子に取り込まれた［３５Ｓ］メチオニンおよび［３Ｈ］ウリジンの相対的レベルを示すグラフである。
【図３６】図３６は、ＳＩＮｒｅｐ／ｌａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ（５’ｔＲＮＡ）Ｃｒｒｖ  ＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレートされたＢＨＫ細胞においてウイルス粒子に取り込まれた［３５Ｓ］メチオニンおよび［３Ｈ］ウリジンの相対的レベルを示すグラフである。
【図３７】図３７は、ＳＩＮｒｅｐ／ｌａｃＺおよびＲＲＶキャプシド欠失変異体ＤＨ−ＢＢ（５’ｔＲＮＡ）ＣΔ３ｒｒｖ  ＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレートされたＢＨＫ細胞においてウイルス粒子に取り込まれた［３５Ｓ］メチオニンおよび［３Ｈ］ウリジンの相対的レベルを示すグラフである。
【図３８】図３８は、ＳＩＮｒｅｐ／ｌａｃＺおよびＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレートされた、またはＴｏｔｏ１１０１野生型ウイルスで感染されたＢＨＫ細胞においてウイルス粒子に取り込まれた［３５Ｓ］メチオニンおよび［３Ｈ］ウリジンの相対的レベルを示す、図３５〜３７に示す結果をまとめるグラフである。
【図３９】図３９は、ｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｈｙｇで安定に形質転換されたＢＨＫ細胞によるルシフェラーゼベクターパッケージングを示すグラフである。（配列表）
【０４４８】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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