(57)【要約】      （修正有）【課題】海岸の施設に来襲したクラゲ成体集団の発生源ポリプ集団を近隣海域に棲息する複数の候補ポリプ集団の中から簡易な方法で高精度に特定することができる方法を提供する。【解決手段】海岸の施設に来襲したクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を、近隣海域に棲息する複数の候補ポリプ集団の中から遺伝子解析により特定する方法であって、以下のステップを含むことを特徴とする方法：（１）前記クラゲ成体集団及び前記複数の候補ポリプ集団におけるＣＯ１遺伝子の各遺伝子型の頻度を推定し、いくつかのポリプ集団を有力候補として選択し、そして（２）前記クラゲ成体集団及び前記選択された有力候補ポリプ集団における１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の各遺伝子型の頻度を推定し、前記クラゲ成体集団に対する類似性が最も高いポリプ集団を前記クラゲ成体集団の発生源として特定する。【選択図】図５
2008092840.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
海岸の施設に来襲したクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を、近隣海域に棲息する複数の候補ポリプ集団の中から遺伝子解析により特定する方法であって、以下のステップを含むことを特徴とする方法：
（１）前記クラゲ成体集団及び前記複数の候補ポリプ集団におけるＣＯ１遺伝子の各遺伝子型の頻度を推定し、これらの頻度に基づいて前記クラゲ成体集団に対する各候補ポリプ集団の類似性を判断し、前記クラゲ成体集団に対する類似性が比較的高いいくつかのポリプ集団を有力候補として選択し、そして
（２）前記クラゲ成体集団及び前記選択された有力候補ポリプ集団における１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の各遺伝子型の頻度を推定し、これらの頻度に基づいて前記クラゲ成体集団に対する各有力候補ポリプ集団の類似性を判断し、前記クラゲ成体集団に対する類似性が最も高いポリプ集団を前記クラゲ成体集団の発生源として特定する。
【請求項２】
ステップ（１）における類似性の判断及び有力候補ポリプ集団の選択が、各候補ポリプ集団において最も高い頻度で出現するＣＯ１遺伝子の遺伝子型がクラゲ成体集団において最も高い頻度で出現するＣＯ１遺伝子の遺伝子型と同一であるかどうかを判断し、遺伝子型が同一であると判断されたポリプ集団を有力候補ポリプ集団として選択することによって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（２）における１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の各遺伝子型の頻度の推定が、前記クラゲ成体集団及び前記選択された有力候補ポリプ集団のそれぞれにおいて最も高い頻度で出現する遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有する亜集団を１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子について分析し、各亜集団における１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の各遺伝子型の頻度を推定することによって行われることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
海岸の施設が火力発電所、原子力発電所又は漁業施設であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
クラゲがミズクラゲであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法により海岸の施設に来襲したクラゲ成体集団の発生源のポリプ集団を特定し、その発生源のポリプ集団を除去又は死滅させることにより海岸の施設へのクラゲ成体集団の来襲を予防することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海岸の施設に来襲したクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を近隣海域に棲息する複数の候補ポリプ集団の中から簡易な遺伝子分析により高精度に特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クラゲ成体は火力発電所、原子力発電所等の海水利用プラントの取水口付近にしばしば大量に来襲し、プラントの海水取水を妨げる。かかるクラゲ成体の大量来襲による海水の取水障害は機器の性能低下、発電出力の低下、取水及び発電停止等の極めて深刻な被害をもたらす。また、クラゲ成体は漁業施設にもしばしば大量に来襲する。この場合、クラゲ成体は定置網等の漁網に入り込み、漁網中の魚類の窒息、死亡、品質低下及び漁網破損等の被害を発生させる。
【０００３】
このようなクラゲ成体大量来襲による被害への対策として、現在、クラゲ成体出現状況の監視、海水取水口前面でのクラゲ成体防止網の設置、船舶・人手やスクリーンによるクラゲ成体回収、クラゲ成体来襲予知による対策の早期化等の様々な対策がなされている（例えば特許文献１参照）。しかし、これらの対策は全て、大量来襲したクラゲ成体にどう対応するかという対症療法的な対策に過ぎないため、クラゲ成体が突発的に大量来襲した場合、対策が追いつかず深刻な被害が生じているのが現状である。また、回収したクラゲ成体の運搬・処理にも苦慮しているのが現状である。
【０００４】
これに対して、本発明者らは、クラゲ成体がその着生世代であるポリプから発生することに着目し、来襲したクラゲ成体集団と近隣海域に棲息する複数のポリプ集団との間の類似性を遺伝子分析により解析して、来襲したクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を特定してそのポリプ集団を除去又は死滅させることにより、クラゲ成体集団の発生、ひいいてはその来襲を予防する方法を提案した（特許文献２参照）。この方法では、発生源の候補となるポリプ集団間の遺伝的変異が比較的大きいＣＯ１遺伝子（ミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼサブユニット１の遺伝子）を分析することにより、近隣海域の複数の候補ポリプ集団の中から来襲したクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団をある程度特定することが可能である。しかし、特許文献２の方法に従って遺伝子分析すると、クラゲ成体集団の発生源の候補となるポリプ集団の中に最も高い頻度で出現する遺伝子型が共通する類似の変異パターンを示す集団、特に同一の遺伝子型が優占する類似の変異パターンを示す集団が存在する場合があり、複数の候補ポリプ集団を遺伝的に区別しにくく発生源ポリプ集団を特定しにくいことがあった。
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−２０４８５６号公報
【特許文献２】特開２００４−２７９１３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はかかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は海岸の施設に来襲したクラゲ成体集団の発生源ポリプ集団を近隣海域に棲息する複数の候補ポリプ集団の中から簡易な方法で高精度に特定することができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者はかかる目的を達成するために、クラゲの遺伝子分析に使用される様々な遺伝子について鋭意検討した結果、１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子が特に多くの種内変異を有し、しかもそれらの変異の型がＣＯ１遺伝子の変異の型と連動しているため、ＣＯ１遺伝子に加えて１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子を分析することにより、ＣＯ１遺伝子について集団内で最も高い頻度で出現する遺伝子型を有する亜集団を遺伝的にさらに分類することができ、結果として発生源ポリプ集団の特定精度を高めることができることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００８】
即ち、本発明は、海岸の施設に来襲したクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を、近隣海域に棲息する複数の候補ポリプ集団の中から遺伝子解析により特定する方法であって、以下のステップを含むことを特徴とする方法である：
（１）前記クラゲ成体集団及び前記複数の候補ポリプ集団におけるＣＯ１遺伝子の各遺伝子型の頻度を推定し、これらの頻度に基づいて前記クラゲ成体集団に対する各候補ポリプ集団の類似性を判断し、前記クラゲ成体集団に対する類似性が比較的高いいくつかのポリプ集団を有力候補として選択し、そして
（２）前記クラゲ成体集団及び前記選択された有力候補ポリプ集団における１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の各遺伝子型の頻度を推定し、これらの頻度に基づいて前記クラゲ成体集団に対する各有力候補ポリプ集団の類似性を判断し、前記クラゲ成体集団に対する類似性が最も高いポリプ集団を前記クラゲ成体集団の発生源として特定する。
【０００９】
本発明の好ましい実施態様によれば、ステップ（１）における類似性の判断及び有力候補ポリプ集団の選択は、各候補ポリプ集団において最も高い頻度で出現するＣＯ１遺伝子の遺伝子型がクラゲ成体集団において最も高い頻度で出現するクラゲＣＯ１遺伝子の遺伝子型と同一であるかどうかを判断し、遺伝子型が同一であると判断されたポリプ集団を有力候補ポリプ集団として選択することによって行われる。本発明の好ましい実施態様によれば、ステップ（２）における１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の各遺伝子型の頻度の推定は、前記クラゲ成体集団及び前記選択された有力候補ポリプ集団のそれぞれにおいて最も高い頻度で出現する遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有する亜集団を１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子について分析し、各亜集団における１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の各遺伝子型の頻度を推定することによって行われる。本発明の好ましい実施態様によれば、海岸の施設は火力発電所、原子力発電所又は漁業施設であり、クラゲはミズクラゲである。また、本発明によれば、上述の方法により海岸の施設に来襲したクラゲ成体集団の発生源のポリプ集団を特定し、その発生源のポリプ集団を除去又は死滅させることにより海岸の施設のクラゲ成体集団の来襲を予防することを特徴とする方法も提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、火力発電所等の海岸の施設に来襲したクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を近隣海域に棲息する複数の候補ポリプ集団の中から高精度に特定することができる。特に、本発明の方法によれば、発生源候補ポリプの複数の集団の一部にＣＯ１遺伝子について同一の遺伝子型が最も高い頻度で出現する類似の変異パターンを示す集団がある場合であっても、これらの集団を遺伝的にさらに分類して区別することができるため、クラゲ成体集団の発生源ポリプ集団を高精度に特定することができる。さらに、本発明の方法によれば、まずＣＯ１遺伝子の解析を行って有力候補ポリプ集団を絞ってから１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の解析を行うので、解析する個体数の総数が少なく、費用及び時間を抑えつつも高精度に発生源ポリプ集団を特定することができる。また、本発明の方法により特定した発生源ポリプ集団を適切な方法で除去又は死滅させれば、火力発電所等の海岸の施設へのクラゲ成体集団の来襲を効果的に予防することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、火力発電所等の海岸の施設に来襲したクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を、近隣海域に棲息する複数の候補ポリプ集団の中から遺伝的多型解析により特定する方法である。クラゲ成体はクラゲの着生世代であるポリプから発生するが、このポリプは一般的に浮き桟橋や防波堤のオーバーハング等の海上の人工構造物の下側の海水接触領域に密集棲息し、コロニーを形成することが知られている。クラゲ成体はこのポリプコロニーから水温の変化等の環境条件の変化に伴って一斉に発生する。発生したクラゲ成体は海中において水平方向には自力でほとんど移動することができないため、海流の影響を受けて一団となって移動する。従って、ある海岸の施設にある時期に来襲するクラゲ成体集団は、その施設に到達する海流の上流に相当する地点の浮き桟橋等に棲息している一つのポリプ集団から発生する可能性が高い。それ故、ある海岸の施設にある時期に来襲したクラゲ成体集団とその施設に到達する海流の上流に相当する近隣海域に棲息する候補ポリプ集団のからサンプルを採集してそれらの遺伝的多型を解析することにより、前記海岸の施設に前記時期に来襲したクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を特定することができる。
【００１２】
本発明の方法は、このようにクラゲ成体集団と候補ポリプ集団の遺伝的多型解析を利用して行うが、解析される遺伝子としてＣＯ１遺伝子に加えて１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子を使用することを特徴とする。背景技術の欄で述べた通り、ＣＯ１遺伝子だけを使用して解析を行うと、複数の集団間の遺伝区別がつきにくい場合がある。本発明の方法はそのような場合であっても二つの遺伝子を解析することにより、複数の集団を遺伝的に一層明確に区別することができるようになり、発生源ポリプ集団の特定精度を高めることができる。
【００１３】
なお、本発明の方法では、ＣＯ１遺伝子の解析は、来襲したクラゲ成体集団の発生源の候補ポリプ集団の中から有力候補であるポリプ集団を絞るために行い、１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の解析は、有力候補ポリプ集団の中から発生源ポリプ集団を特定するために行う。つまり、すべての候補集団について二つの遺伝子の解析を均等に行う従来の一般的な遺伝子解析方法とは異なり、本発明の方法では二番目に解析を行う１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の解析個体数を少なくしている。従って、本発明の方法によれば、発生源ポリプ集団の高い特定精度を維持しながら特定に要する費用及び時間を抑制することができる。
さらに、本発明の方法では、１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の解析は、有力候補ポリプ集団全体に対して行うのではなく、有力候補ポリプ集団のうち最も高い頻度で出現する遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有する亜集団のみに対して行うことが好ましい。これは、１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の変異の型がＣＯ１遺伝子の変異の型と連動している性質を利用して最小限の個体数の解析で最大限の情報を得ようとするものである。従って、この方法によれば、解析する個体数の総数をさらに減らすことができ、発生源ポリプ集団の特定に要する費用及び時間をさらに抑制することができる。
【００１４】
本発明の方法において、遺伝子解析は、前記クラゲ成体集団及び前記複数の候補ポリプ集団から予め採集したサンプルに基づいて行うことができる。前記クラゲ成体集団からのサンプル採集は、海岸の施設にクラゲ成体集団が来襲した時にそのうち少なくとも数十個体を採集しておくことによって行うことができる。海岸の施設はクラゲ成体集団の来襲により被害を生ずる可能性があるいかなる施設であることができ、例えば火力発電所や原子力発電所等の海水利用プラントや定置網等の漁業施設であることができる。また、クラゲ成体はいかなるクラゲの成体であることもできるが、例えば夏場に原子力発電所の取水口に大量来襲して問題となっているミズクラゲの成体であることができる。なお、本発明の方法において、「クラゲ成体」という用語は、成熟クラゲ個体のみならず未成熟クラゲ個体も含むものとする。サンプルクラゲ成体の採集は常法により行えばよく、例えば来襲したクラゲ成体集団を単に網で捕獲することにより行うことができる。サンプルクラゲ成体の採集数は、来襲したクラゲ成体集団の遺伝子型の頻度の統計学的に有意な推定を与えるのに十分な数であることが、発生源ポリプ集団を確実に特定するために好ましい。また、採集されたサンプルクラゲ成体は、腐敗によるサンプル劣化を防止するためにその場でエタノール等で前処理されることが好ましい。
【００１５】
前記複数の候補ポリプ集団からのサンプル採取は、前記海岸の施設の近隣海域で潜水探査を行うなどしてそこに棲息するポリプ集団を複数発見して各集団について少なくとも数十個体を採集しておくことによって行うことができる。なお、本発明の方法において近隣海域は海岸施設からの実際の距離によってその範囲を限定されるものではなく、来襲したクラゲ成体集団を発生させた可能性があるポリプ集団が棲息する全ての海域を含む。クラゲ成体は上述の通り海流に乗って移動するため、発生源であるポリプ集団が予想以上に距離的に遠方にあることもあり得るからである。例えば、関西地方の海域のポリプ集団から発生したクラゲ成体集団が海流に乗って関東地方の海岸の施設に来襲することもあり得、この場合は「近隣海域」に関西地方の海域も含まれることになる。サンプルポリプの採集はサンプルクラゲ成体の採集と平行して、又はそれと前後して行えばよい。サンプルポリプの採集はカキ、イガイの貝殻などに付着して棲息しているポリプ集団を貝殻ごと採集して海水を充填したプラスチック容器に収容することにより行うことができる。サンプルポリプの採集数は、ポリプ集団の遺伝子型の頻度の統計学的に有意な推定を与えるのに十分な数であることが、発生源ポリプ集団を確実に特定するために好ましい。採集したポリプ集団は、１個体ずつ分割してシャーレに収容し、数週間飼育して数十個体の同一クローンのポリプ集団に成長させてから遺伝子型分析に供することが十分な量のＤＮＡを確保するために好ましい。
【００１６】
本発明の方法では、まずＣＯ１遺伝子の解析により、来襲したクラゲ成体集団の発生源の候補である複数のポリプ集団の中から有力候補ポリプ集団をある程度絞り込み、次に１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の解析により有力候補ポリプ集団の中から発生源ポリプ集団を特定する。ＣＯ１遺伝子の解析は、前記クラゲ成体集団及び前記複数の候補ポリプ集団におけるＣＯ１遺伝子の各遺伝子型の頻度を推定し、これらの頻度に基づいて前記クラゲ成体集団に対する各候補ポリプ集団の類似性を判断し、前記クラゲ成体集団に対する類似性が比較的高いいくつかのポリプ集団を有力候補として選択することを含む。ＣＯ１遺伝子の各遺伝子型の頻度の推定は、上述の予め採集しておいたサンプル個体のＣＯ１遺伝子の遺伝子型を分析することによって行うことができる。
【００１７】
サンプル個体のＣＯ１遺伝子の遺伝子型の分析は、ＲＦＬＰや塩基配列決定等の遺伝的多型解析に従来使用されているいかなる方法で行うことができるが、詳細な分析が可能である点で、塩基配列決定を行うことが好ましい。塩基配列の決定は、サンプル個体からＤＮＡを常法により抽出し、適当なプライマーを使用してＰＣＲを行いＣＯ１遺伝子を増幅させ、その塩基配列を決定することによって行うことができる。遺伝子増幅用プライマーは、クラゲの遺伝的多型解析に従来使用されているいかなるプライマーであることができるが、例えば配列表の配列番号１及び配列番号２に表わされるプライマーであることができる。
【００１８】
サンプル個体のＣＯ１遺伝子の塩基配列の決定が完了すれば、次に各サンプル個体のＣＯ１遺伝子の塩基配列をいくつかの遺伝子型に分類して各集団からのサンプルにおける各遺伝子型の頻度を計算し、これを各集団における各遺伝子型の頻度の推定値とする。遺伝子型の分類は厳密に行う必要はない。ＣＯ１遺伝子の塩基配列を決定すると、種内で多数の配列変異が発見されるが、それらはその変異パターンに応じていくつかのグループに分類できるので、便宜上各グループを一つの遺伝子型とみなして分類することができる。
【００１９】
次に、このようにして推定されたＣＯ１遺伝子の各遺伝子型の頻度に基づいて前記クラゲ成体集団に対する各候補ポリプ集団の類似性を判断し、前記クラゲ成体集団に対する類似性が比較的高いいくつかのポリプ集団を有力候補として選択する。類似性の判断及び有力候補ポリプ集団の選択は、類似度の計算やソフトウェアを使用した系統樹作成等の遺伝的多型解析の分析で従来公知のいかなる方法を使用して行うことができるが、ＣＯ１遺伝子分析の目的は候補ポリプ集団から直ちに発生源ポリプ集団を特定することではなく有力候補ポリプ集団をある程度絞り込むことにあるので、各集団の遺伝子型組成の類似性を大まかに検討する等の比較的簡便な方法を使用して行うことが望ましい。例えば、各集団で最も高い頻度で出現するＣＯ１遺伝子の遺伝子型に着目して、各候補ポリプ集団で最も高い頻度で出現するＣＯ１遺伝子の遺伝子型が前記クラゲ成体集団で最も高い頻度で出現するＣＯ１遺伝子の遺伝子型と同一であるかどうかを判断し、同一であるポリプ集団を有力候補ポリプ集団として選択することができる。
【００２０】
このようにＣＯ１遺伝子の解析結果に基づいて複数の候補ポリプ集団から有力候補ポリプ集団をある程度絞り込んだ後、１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子を解析してその結果に基づいて発生源ポリプ集団を最終的に特定する。具体的には、前記クラゲ成体集団及び前記選択された有力候補ポリプ集団における１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の各遺伝子型の頻度を推定し、これらの頻度に基づいて前記クラゲ成体集団に対する各有力候補ポリプ集団の類似性を判断し、前記クラゲ成体集団に対する類似性が最も高いポリプ集団を前記クラゲ成体集団の発生源として特定する。
【００２１】
１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の各遺伝子型の頻度の推定は、ＣＯ１遺伝子の場合と同様に、前記クラゲ成体集団及び前記有力候補ポリプ集団のそれぞれのサンプルの１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型を分析することによって行うことができる。サンプルの採集は改めて行う必要はなく、ＣＯ１遺伝子を分析したサンプルと同一のサンプルを使用して１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子を分析すればよい。具体的には、ＣＯ１遺伝子の分析の際に各サンプルから抽出したＤＮＡを一部保存しておき、これらのＤＮＡを使用して１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型を分析すればよい。１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型の分析は、ＣＯ１遺伝子の遺伝子型の分析と同様の方法で行えばよく、具体的には例えば配列表の配列番号３及び配列番号４に表されるプライマーを使用して１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子を増幅して塩基配列を決定し、決定された塩基配列をいくつかの遺伝子型に分類し、各集団からのサンプルにおける各遺伝子型の頻度を計算し、これを各集団における各遺伝子型の頻度の推定値とすることによって行うことができる。
【００２２】
１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型の頻度の推定は、前記クラゲ成体集団及び前記選択された有力候補ポリプ集団からのすべてのサンプルに基づいて行う必要はなく、前記クラゲ成体集団及び前記選択された有力候補ポリプ集団のうち最も高い頻度で出現する遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有する亜集団からのサンプルのみに基づいて行うことができる。後述の実施例で示す通り、１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の変異の型はＣＯ１遺伝子の変異の型と連動しており、ある遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有するサンプルに見出される１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型は、他の遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有するサンプルには見出されないことが明らかになっている。従って、前記クラゲ成体集団及び前記選択された有力候補ポリプ集団からのすべてのサンプルに基づいて１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型を分析しても、これらの集団のうち最も高い頻度で出現するＣＯ１遺伝子の遺伝子型を有する亜集団からのサンプルのみに基づいて１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型を分析しても、得られる情報に大差はなく、遺伝子型分析に要する費用及び時間を考慮すると、最も高い頻度で出現する遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有する亜集団からのサンプルのみに基づいて１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型を分析することが有利である。
【００２３】
このようにして前記クラゲ成体集団及び前記選択された有力候補ポリプ集団における、又はこれらの集団のうち最も高い頻度で出現する遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有する亜集団における１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の各遺伝子型の頻度を推定した後、これらの頻度に基づいて前記クラゲ成体集団に対する各有力候補ポリプ集団の類似性を判断し、前記クラゲ成体集団に対する類似性が最も高いポリプ集団を前記クラゲ成体集団の発生源として特定する。この類似性の判断及び発生源ポリプ集団の特定は、ＣＯ１遺伝子の遺伝子型頻度に基づく類似性の判断及び有力候補ポリプ集団の選択と同様に、各集団又は亜集団で最も高い頻度で出現する１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型に着目して行うことができるが、発生源ポリプ集団の特定精度を高めるためには、１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子のその他の遺伝子型の組成や頻度も考慮に入れて総合的に判断することが好ましい。また、必要により、類似度の計算やソフトウェアを使用した系統樹の作成等も行うべきである。
【００２４】
以上の手順により、ある海岸の施設に来襲したクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を高精度に特定することができる。そして、この発生源であると特定されたポリプ集団を適切な方法で除去又は死滅させれば、このポリプ集団からのクラゲ成体の発生を防止でき、この海岸の施設へのクラゲ成体集団の来襲を効果的に予防することができる。また、本発明の方法によれば、除去又は死滅させられるポリプ集団は近隣海域の一部のポリプ集団に限定されるので、ポリプ集団の除去などに要する費用を最低限に抑えることができる。なお、ポリプ集団の除去又は死滅方法としては、例えば淡水、空気又は熱水に一定時間以上ポリプを暴露させる方法（特開２００４−２７５０２８号公報参照）が有効であるので、その方法を適宜利用することが好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明の方法の有効性を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
１．サンプルクラゲ成体及びサンプルポリプの採集、並びにＤＮＡ抽出
（１）サンプルクラゲ成体の採集
若狭湾にある海水利用プラントＡに来襲したミズクラゲ成体集団から３０個体をサンプルとして採集した。また、瀬戸内海にある海水利用プラントＢに来襲したミズクラゲ成体集団から３２個体をサンプルとして採集した。サンプル採集は網により行い、採集されたクラゲ成体はその場で１００％エタノールに浸してＤＮＡ分析用に前処理した。
【００２７】
（２）サンプルポリプの採集
海水利用プラントＡの近隣海域の漁港Ａ及び漁港Ｂで潜水探査を行い、浮き桟橋などの構造物の下側の海水接触領域に棲息していたポリプのコロニーを発見し、漁港Ａ及び漁港Ｂからそれぞれポリプコロニーを採集した。また、海水利用プラントＢの近隣海域の漁港Ｃ及び漁港Ｄで同様の潜水探査を行い、それぞれポリプコロニーを採集した。サンプル採集は、ポリプコロニーが殻に付着したカキやイガイを収集し、実験室に持ち帰って殻からポリプを取りはずして１個体ずつに分けてシャーレで約１ヶ月培養してクローン増殖させ、１００％エタノールに浸してＤＮＡ分析用に前処理することにより行った。この方法により、漁港Ａ、Ｂ，Ｃ及びＤからそれぞれ１１試料、１０試料、３試料及び１試料のポリプ試料をサンプルとして準備した。
【００２８】
（３）ＤＮＡ抽出
（１）及び（２）で得られたサンプルクラゲ成体及びサンプルポリプから遺伝的多型解析用のＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出は、特開２００４−２７９１３８号公報に記載の方法に従って行った。
【００２９】
２．ＣＯ１遺伝子の解析
（１）遺伝子増幅及び塩基配列の決定
１．（３）でＤＮＡを抽出したサンプルクラゲ成体及びサンプルポリプ計８７個体について、配列表の配列番号１及び２に表されるプライマーを使用してＰＣＲによりＣＯ１遺伝子を増幅して塩基配列を決定した。
【００３０】
（２）遺伝子型の分類
決定したそれぞれの塩基配列の遺伝子型を、本発明者らの以前の研究により確立されているＣＯ１遺伝子の遺伝子型の分類に従って分類した。なお、この分類は、配列決定された塩基配列を、その１２番目（Ｔ又はＣ）、１９２番目（Ａ又はＧ）及び３０３番目（Ａ又はＧ）の塩基の種類から四つの配列型グループ（ａ型、ｂ型、ｃ型、ｄ型）に大まかに分け、それぞれの配列型グループを必要によりさらに図１ａ−ｆに示すように細分化（ａ−１型、ａ−２型‐‐‐‐‐）するものである。その結果を表１に示す。
【００３１】
（３）ＣＯ１遺伝子の分析結果
表１から明らかな通り、海水利用プラントＡに来襲したクラゲ成体集団のＣＯ１遺伝子の遺伝子型はａ型が最も出現頻度が高くて優占しており、またａ型の中でもａ−１型が優占していた。海水利用プラントＢに来襲したクラゲ成体集団のＣＯ１遺伝子の遺伝子型はｄ型が優占し、またｄ型の中でもｄ−１型が優占していた。漁港Ａに棲息するポリプ集団のＣＯ１遺伝子の遺伝子型はｄ型が優占し、またこのｄ型は全てｄ−１型であった。漁港Ｂに棲息するポリプ集団のＣＯ１遺伝子の遺伝子型はａ型が優占し、またこのａ型は全てａ−１型であった。従って、このように集団中で最も高頻度で優占して出現する遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有する亜集団（例えば海水利用プラントＡに来襲したクラゲ成体集団ではａ型のＣＯ１遺伝子、特にａ−１型のＣＯ１遺伝子を有する亜集団）を遺伝的にさらに分類して区別することができれば、類似のＣＯ１遺伝子型組成を有する複数の集団を遺伝的に区別して発生源ポリプ集団の特定精度を高めることができると考えられる。
【００３２】
３．１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子及び１８Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の解析
（１）集団中で優占して出現する遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有する亜集団を遺伝的にさらに分類して区別することができる遺伝子を見出すため、各サンプルについてクラゲの遺伝子分析に使用される遺伝子である１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子及び１８Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子を分析した。１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子については配列番号３及び配列番号４に表されるプライマーを使用して遺伝子増幅及び塩基配列の決定を行った。１８Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子については配列番号５及び配列番号６に表されるプライマーを使用して遺伝子増幅及び塩基配列の決定を行った。
【００３３】
（２）その結果、１８Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子については、計８７個体のサンプルで図３に示すように２種類の配列変異パターン（遺伝子型）（１８Ｓ  ０．ｇｎｕ及び１８Ｓ  １．ｇｎｕ）しか見出されず、種内変異が極めて小さいことが明らかになった。従って、集団中で優占して出現する遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有する亜集団をさらに分類して区別するために１８Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子を使用することは有効でないと考えられた。
【００３４】
（３）１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子については、計８７個体のサンプルで２２種類の配列変異パターンが見出され、種内変異が極めて大きいことが明らかになった。従って、１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子は集団中で優占して出現する遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有する亜集団を遺伝的にさらに分類して区別するのに有効であると考えられた。
【００３５】
さらに、１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の配列変異パターンを分析したところ、興味深いことに、その変異パターンはＣＯ１遺伝子の変異の型と連動していることが明らかになった。即ち、ある遺伝子型（例えばａ型）のＣＯ１遺伝子を有するサンプルに見出される１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の配列変異パターンは、他の遺伝子型（例えばｄ型）のＣＯ１遺伝子を有するサンプルには見出されなかった（この理由は、１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子はＣＯ１遺伝子と同じミトコンドリアＤＮＡ上に位置しており、進化の過程で関連した遺伝子変異を生じたためであると考えられる）。
【００３６】
そこで、本発明者らは１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型をＣＯ１遺伝子の遺伝子型に連動させた形で分類することにした。その分類を図４ａ−ｄに示す。図４中、例えば１６Ｓ：Ａ１はａ型のＣＯ１遺伝子を有するサンプルで１番目に見出された配列変異パターンを意味し、１６Ｓ：Ａ２はａ型のＣＯ１遺伝子を有するサンプルで２番目に見出された配列パターンを意味する。なお、１６Ｓ：０は例外であり、ｃ型のＣＯ１遺伝子を有するサンプル及びｄ型のＣＯ１遺伝子を有するサンプルで共通に出現する配列変異パターンである。
【００３７】
この遺伝子型分類に従って各サンプル個体の１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型を分類した結果を表１に示す。また、各集団からのサンプルで特に優占する遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有する個体の１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型をまとめた円グラフを図５に示す。表１及び図５から、海水利用プラントＡに来襲したクラゲ成体サンプル中で最も高頻度で優占して出現する遺伝子型（この場合はａ型、特にａ−１型）のＣＯ１遺伝子を有する個体間でも、その１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型は、様々に異なることがわかる。同様のことが海水利用プラントＢに来襲したクラゲ成体サンプル、及び漁港Ａ及びＢに棲息するポリプサンプルについても言える。従って、集団内で優占する遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有する亜集団を１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子について分析すれば、ＣＯ１遺伝子について類似の変異パターンを示す複数の集団を遺伝的にさらに分類することができるので、結果として発生源ポリプ集団の特定精度を高めることができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明によれば、火力発電所等の海岸の施設に来襲するクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を高精度に特定することができる。従って、本発明の方法により特定された発生源ポリプ集団を除去又は死滅させることにより、海岸の施設へのクラブ成体集団の来襲を効果的に予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１ａ】ＣＯ１遺伝子における４種類の遺伝子型とアミノ酸配列の詳細を示す。
【図１ｂ】ＣＯ１遺伝子における４種類の遺伝子型とアミノ酸配列の詳細を示す。
【図１ｃ】ＣＯ１遺伝子における４種類の遺伝子型とアミノ酸配列の詳細を示す。
【図１ｄ】ＣＯ１遺伝子における４種類の遺伝子型とアミノ酸配列の詳細を示す。
【図１ｅ】ＣＯ１遺伝子における４種類の遺伝子型とアミノ酸配列の詳細を示す。
【図１ｆ】ＣＯ１遺伝子における４種類の遺伝子型とアミノ酸配列の詳細を示す。
【図２ａ】海水利用プラントＡに来襲したクラゲ成体サンプルの分析結果を示す表である。
【図２ｂ】海水利用プラントＢに来襲したクラゲ成体サンプルの分析結果を示す表である。
【図２ｃ】漁港Ａ〜Ｄに棲息するポリプサンプルの分析結果を示す表である。
【図３】１８Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型分類を示す。
【図４ａ】１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型分類を示す。
【図４ｂ】１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型分類を示す。
【図４ｃ】１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型分類を示す。
【図４ｄ】１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型分類を示す。
【図５】各集団からのサンプルで特に優占する遺伝子型のＣＯ１遺伝子を有する個体の１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ遺伝子の遺伝子型をまとめた円グラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００４０】
配列番号１及び２はＣＯ１用プライマーの配列である。
配列番号３及び４は１６Ｓ  ｒ−ＲＮＡ用プライマーの配列である。
配列番号５及び６は１８Ｓ  ｒ−ＲＮＡ用プライマーの配列である。
【図１ａ】
2008092840.tif 000003
【図１ｂ】
2008092840.tif 000004
【図１ｃ】
2008092840.tif 000005
【図１ｄ】
2008092840.tif 000006
【図１ｅ】
2008092840.tif 000007
【図１ｆ】
2008092840.tif 000008
【図２ａ】
2008092840.tif 000009
【図２ｂ】
2008092840.tif 000010
【図２ｃ】
2008092840.tif 000011
【図３】
2008092840.tif 000012
【図４ａ】
2008092840.tif 000013
【図４ｂ】
2008092840.tif 000014
【図４ｃ】
2008092840.tif 000015
【図４ｄ】
2008092840.tif 000016
【図５】
2008092840.tif 000017
【配列表】
2008092840000001.app