(57)【要約】      （修正有）【課題】イタリアンライグラスの品種識別方法を提供する。【解決手段】イタリアンライグラスの品種識別用のオルガネラゲノム由来１塩基多型プライマー対、及びイタリアンライグラスの品種を識別する方法であって、オルガネラゲノム由来１塩基多型マーカーを検出できるプライマー対を利用して、被検個体のゲノムＤＮＡの遺伝子増幅反応により該１塩基多型マーカーを増幅し、その出現頻度を調べて品種を判定することを特徴とする品種識別方法。【効果】オルガネラのゲノムＤＮＡ上の１塩基多型を用いた迅速、簡便且つ正確なイタリアンライグラスの品種識別方法を提供することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イタリアンライグラスの品種識別用のオルガネラゲノム由来１塩基多型プライマー対であって、以下の配列番号の塩基配列、
（１） 配列表の配列番号１及び２；
（２） 配列表の配列番号３及び４；
（３） 配列表の配列番号５及び６；
からなる群から選択されるオルガネラゲノム由来のプライマー対。
【請求項２】
イタリアンライグラスの品種識別用のオルガネラゲノム由来１塩基多型プライマー対であって、配列番号７及び８の塩基配列からなるオルガネラゲノム由来のプライマー対。
【請求項３】
イタリアンライグラスの品種識別用のオルガネラゲノム由来１塩基多型プライマー対であって、配列番号９及び１０の塩基配列からなるオルガネラゲノム由来のプライマー対。
【請求項４】
イタリアンライグラスの品種を識別する方法であって、オルガネラゲノム由来１塩基多型マーカーを検出できるプライマー対を利用して、被検個体のゲノムＤＮＡの遺伝子増幅反応により該１塩基多型マーカーを増幅し、その出現頻度を調べて品種を判定することを特徴とする品種識別方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のプライマー対を使用してイタリアンライグラスの品種を識別する方法であって、イタリアンライグラスのゲノムＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡの遺伝子増幅反応を行うことによりオルガネラゲノム由来の１塩基多型マーカーを増幅し、各１塩基多型マーカーの出現頻度を調べて品種を判定することを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別方法。
【請求項６】
オルガネラゲノム由来の１塩基多型の出現頻度を、７０％前後の高頻度、５０％前後の中頻度、１０％前後の低頻度及び頻度０％に区分し、これらの区分を指標としてイタリアンライグラスの品種群の識別を行う、請求項４又は５に記載のイタリアンライグラスの品種識別方法。
【請求項７】
オルガネラゲノム由来の１塩基多型の出現頻度により、ウヅキアオバ、さちあおば、シワスアオバ、ニオウダチ、ハタアオバ、ミナミアオバ、ワセアオバ、ワセユタカ、アキアオバ、ナガハヒカリ、ヒタチヒカリ及びミユキアオバからなるイタリアンライグラス１２品種内の品種を識別する、請求項４から６のいずれかに記載のイタリアンライグラスの品種識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イタリアンライグラス１２品種を識別できる１塩基多型マーカー及びそれを用いたイタリアンライグラスの品種識別方法に関するものであり、更に詳しくは、イタリアンライグラスの品種識別用のオルガネラゲノム由来１塩基多型プライマー対、当該プライマーセットを用いた遺伝子塩幅反応により増幅された１塩基多型の出現頻度を指標としてイタリアンライグラスの品種を識別する方法に関するものである。本発明は、細胞内において母系遺伝を示し、系統発生等の推測ができるオルガネラのゲノムＤＮＡ上の１塩基多型を用いた、従来法に比べて迅速、簡便且つ正確に品種識別ができるイタリアンライグラス品種の識別方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
イタリアンライグラスは、家畜の飼料用に用いられる他殖性のイネ科牧草類である。イタリアンライグラスのうち、ウヅキアオバ、さちあおば、シワスアオバ、ニオウダチ、ハタアオバ、ミナミアオバ、ワセアオバ、ワセユタカ、アキアオバ、ナガハヒカリ、ヒタチヒカリ及びミユキアオバは、国の公的機関で育成され、毎年、種子の売り上げが上位を占めている品種である。また、我が国において、イタリアンライグラスは、家畜の飼料として重要であり、品種識別の必要性が高い。
【０００３】
従来の方法では、圃場での表現型の観察による特性調査により品種識別が行われている。圃場での特性調査とは、例えば、一検体につき１０個体６反復計６０個体を栽培し、草丈、出穂月日等からなる重要形質について調査を行い、共に栽培した比較品種と比較して品種の判定を行う方法である。
【０００４】
しかしながら、このような圃場での特性調査は、検定のための圃場が必要であり、また、環境要因の影響を受けやすく正確な判断が困難であり、また、調査に多くの労力と時間が必要なため、検査結果が判明するまでに多くの時間がかかってしまう等の問題点がある。このため、環境影響を受けず、かつ圃場ではなく、実験室で十分解析可能なＤＮＡの多型性に基づく品種の識別法が開発されつつある（特許文献１参照）。
【０００５】
一般的な品種識別法としては、それぞれの個体の遺伝子について、品種特異的なＤＮＡマーカーの有無を調査することによる品種識別法が挙げられる。品種特異的なＤＮＡマーカーとは、自殖性植物の場合は、ある品種の遺伝子中には１００％の頻度で存在し、それ以外の品種では、０％の頻度で存在する塩基配列である。しかしながら、イタリアンライグラスをはじめとする他殖性の牧草類は、遺伝的にヘテロであり、一つの品種が異なる遺伝子型の個体で構成されている。
【０００６】
このため、上記のようなＤＮＡマーカーを発見するのは困難であり、これまでのところ、ＡＦＬＰ（Amplified Fragment Length Polymorphism）マーカーの出現頻度の差によるイタリアンライグラス品種シワスアオバ、ニオウダチ、ミナミアオバ、ワセアオバ及びワセユタカの５品種の識別法しか開発されていないのが実情である（特許文献１参照）。
【０００７】
現在までに開発された上記のＤＮＡマーカーは、ＡＦＬＰ法により開発されたものである。この公知の品種識別方法は、（１）ゲノムＤＮＡを２種の制限酵素で処理し、アダプターを連結する、（２）アダプター配列に基づくプライマーを使用してＰＣＲを行う（このプライマーは、アダプター配列の３’末端に特定の鋳型のみを増幅するための選択塩基を加えた配列を有する）、（３）増幅産物を、電気泳動によって分離し、特異的な増幅産物の有無を検出する、という工程を包含する方法である。
【０００８】
この方法は、一般的なＰＣＲと比較して、工程が複雑であり、また、検出にはアクリルアミドゲルを使用することから、アガロースゲルの検出に比べて使用には注意が必要である。更に、ＡＦＬＰ法では、一回のＰＣＲで複数のバンドが増幅されるため、後に目標とするバンドを切り出し、容易に分析するためのＳＴＳマーカーに変換する必要がある。
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−２０１６２４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、イタリアンライグラスの品種を、簡便な操作で、迅速且つ正確に識別できる新しい手法を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、細胞内において母系遺伝を示し、系統発生等の推測ができるオルガネラのゲノムＤＮＡ上の１塩基多型を利用することにより所期の目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、細胞内において母系遺伝を示し、系統発生等の推測ができるオルガネラのゲノムＤＮＡ上の１塩基多型を検出できるプライマー対、これらの一塩基多型とプライマー対を用いることで、労力及び時間が必要な圃場での特性調査に代わる、また、他殖性の遺伝形式でも安定した結果が得られる、迅速、簡便且つ正確なイタリアンライグラスの品種識別方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）イタリアンライグラスの品種識別用のオルガネラゲノム由来１塩基多型プライマー対であって、以下の配列番号の塩基配列、
１） 配列表の配列番号１及び２；
２） 配列表の配列番号３及び４；
３） 配列表の配列番号５及び６；
からなる群から選択されるオルガネラゲノム由来のプライマー対。
（２）イタリアンライグラスの品種識別用のオルガネラゲノム由来１塩基多型プライマー対であって、配列番号７及び８の塩基配列からなるオルガネラゲノム由来のプライマー対。
（３）イタリアンライグラスの品種識別用のオルガネラゲノム由来１塩基多型プライマー対であって、配列番号９及び１０の塩基配列からなるオルガネラゲノム由来のプライマー対。
（４）イタリアンライグラスの品種を識別する方法であって、オルガネラゲノム由来１塩基多型マーカーを検出できるプライマー対を利用して、被検個体のゲノムＤＮＡの遺伝子増幅反応により該１塩基多型マーカーを増幅し、その出現頻度を調べて品種を判定することを特徴とする品種識別方法。
（５）前記（１）から（３）のいずれかに記載のプライマー対を使用してイタリアンライグラスの品種を識別する方法であって、イタリアンライグラスのゲノムＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡの遺伝子増幅反応を行うことによりオルガネラゲノム由来の１塩基多型マーカーを増幅し、各１塩基多型マーカーの出現頻度を調べて品種を判定することを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別方法。
（６）オルガネラゲノム由来の１塩基多型の出現頻度を、７０％前後の高頻度、５０％前後の中頻度、１０％前後の低頻度及び頻度０％に区分し、これらの区分を指標としてイタリアンライグラスの品種群の識別を行う、前記（４）又は（５）に記載のイタリアンライグラスの品種識別方法。
（７）オルガネラゲノム由来の１塩基多型の出現頻度により、ウヅキアオバ、さちあおば、シワスアオバ、ニオウダチ、ハタアオバ、ミナミアオバ、ワセアオバ、ワセユタカ、アキアオバ、ナガハヒカリ、ヒタチヒカリ及びミユキアオバからなるイタリアンライグラス１２品種内の品種を識別する、前記（４）から（６）のいずれかに記載のイタリアンライグラスの品種識別方法。
【００１３】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、イタリアンライグラスの品種識別用のオルガネラゲノム由来１塩基多型プライマー対であって、以下の配列番号の塩基配列、（１）配列表の配列番号１及び２；（２） 配列表の配列番号３及び４；（３） 配列表の配列番号５及び６；からなる群から選択されるプライマー対であること、また、配列番号７及び８、又は、配列番号９及び１０の配列番号からなるプライマー対、であること、を特徴とするものである。
【００１４】
また、本発明は、イタリアンライグラスの品種を識別する方法であって、オルガネラゲノム由来１塩基多型マーカーを検出できるプライマー対を利用して、被検個体のゲノムＤＮＡの遺伝子増幅反応により該１塩基多型マーカーを増幅し、その出現頻度を調べて品種を判定することを特徴とするものである。更に、本発明は、上述のプライマー対を使用してイタリアンライグラスの品種を識別する方法であって、イタリアンライグラスのゲノムＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡの遺伝子増幅反応を行うことによりオルガネラゲノム由来の１塩基多型マーカーを増幅し、各１塩基多型マーカーの出現頻度を調べて品種を判定することを特徴とするものである。
【００１５】
本発明では、オルガネラゲノム由来の１塩基多型の出現頻度を、７０％前後の高頻度、５０％前後の中頻度、１０％前後の低頻度及び頻度０％に区分し、これらの区分を指標としてイタリアンライグラスの品種群の識別を行うこと、を好ましい実施の態様としている。
【００１６】
本発明者らは、イタリアンライグラスの品種識別方法について種々研究を重ねた結果、イタリアンライグラスの１２品種で多型が見られる５種類の１塩基多型マーカーを見出した。更に、本発明者らは、これら５種類の１塩基多型マーカーを利用して、イタリアンライグラスのなかでも、我が国の飼料用として重要なウヅキアオバ、さちあおば、シワスアオバ、ニオウダチ、ハタアオバ、ミナミアオバ、ワセアオバ、ワセユタカ、アキアオバ、ナガハヒカリ、ヒタチヒカリ及びミユキアオバの１２品種を迅速、簡便且つ正確に識別できることを見出した。
【００１７】
具体的には、イタリアンライグラスのＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを遺伝子増幅反応により上記５種類のオルガネラゲノム由来の１塩基多型マーカーのそれぞれを増幅し、各１塩基多型マーカーの出現頻度を調べて品種を判定することにより、イタリアンライグラス１２品種を迅速、簡便且つ正確に識別できることを見出した。
【００１８】
本発明は、配列表の配列番号１及び２，３及び４，５及び６の塩基配列からなるオルガネラゲノム由来のプライマー対であり、８０個体について試験した結果、イタリアンライグラスの４品種、ウヅキアオバ（２倍体）、ハタアオバ（２倍体）、アキアオバ（４倍体）及びヒタチヒカリ（４倍体）に存在せず、また、シワスアオバ（２倍体）及びミユキアオバ（４倍体）の２品種に高頻度で存在することを特徴とする。
【００１９】
また、本発明は、配列表の配列番号７及び８の塩基配列からなるオルガネラゲノム由来のプライマー対であり、８０個体について試験した結果、イタリアンライグラスの２品種、ウヅキアオバ（２倍体）及びアキアオバ（４倍体）に存在せず、また、シワスアオバ（２倍体）、ヒタチヒカリ（４倍体）及びミユキアオバ（４倍体）の３品種に高頻度で存在することを特徴とする。
【００２０】
更に、本発明は、配列表の配列番号９及び１０の塩基配列からなるオルガネラゲノム由来のプライマー対であり、８０個体について試験した結果、イタリアンライグラスの１品種、さちあおば（２倍体）に存在しないことを特徴とする。
【００２１】
本発明は、上述のプライマー対により得られるオルガネラゲノム由来１塩基多型のそれぞれの出現頻度により、ウヅキアオバ、さちあおば、シワスアオバ、ニオウダチ、ハタアオバ、ミナミアオバ、ワセアオバ、ワセユタカ、アキアオバ、ナガハヒカリ、ヒタチヒカリ及びミユキアオバからなるイタリアンライグラスの１２品種を識別することを可能とするイタリアンライグラスの品種識別法である。
【００２２】
まず、本発明のプライマー対について説明すると、本発明のオルガネラゲノム由来のプライマー対は、配列表の配列番号１〜１０記載の塩基配列からなる。これらのプライマー対により増幅されるオルガネラゲノム由来の１塩基多型は、８０個体について試験した結果、いずれもイタリアンライグラスの１品種以上で存在しない、又は１品種以上で高頻度で存在することを特徴とするものである。
【００２３】
本明細書において、「１塩基多型」は、「ＳＮＰ」及び「ＳＮＰｓ」と互換可能に使用される。１塩基多型（single nucleotide polymorphism）とは、１個の塩基置換により生じる多型のことである。１塩基多型は、ゲノム全域にわたって高頻度（数百〜千塩基に１箇所）に、比較的均一に存在すると予想されている。手法としては、最初に特定領域の塩基配列を比較して、１塩基多型を見出し、その変異を検出できるプライマーを設計する。
【００２４】
プライマーの設計には、例えば、ＳＮＡＰＥＲ（http://patho.mgh.harvard.edu/ausubelweb）等のプログラムを利用することができる。１塩基多型を検出するプライマーの３’末端は、判別すべき１塩基多型の位置に対応し、プライマーの３’末端から３塩基以内に新たなミスマッチを導入している。
【００２５】
本発明では、イタリアンライグラス１２品種原種種子（原原種を増殖させた種子）の各品種８０個体からＣＴＡＢ法で抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、オルガネラゲノム由来の１４プライマー対を用いて、ミスマッチが少ないと言われているStarTaq（ＴＡＫＡＲＡ）を使用したクローニング及びシークエンスを行い、その結果、１塩基多型の見られた箇所について、その１塩基多型を検出可能なプライマー対をいくつか設計する。
【００２６】
その後、設計したいくつかの候補プライマー対のうち少なくとも１つ以上のプライマー対で多型の区別が判定できるＰＣＲの条件を設定する。このようにして確立されたプライマー対を用いて、後述する１塩基多型検出を行い、その頻度を調査した結果、イタリアンライグラスの１２品種のうち１品種以上で存在しない、又は高頻度で存在する５種類のオルガネラゲノム由来のプライマー対、即ち、配列番号１〜１０に係わる本発明のオルガネラゲノム由来の各プライマー対を解明した。
【００２７】
本発明のイタリアンライグラスの品種識別法において、オルガネラゲノム由来の各１塩基多型の出現頻度を調べるには、（ａ）：イタリアンライグラスのＤＮＡを抽出する工程、（ｂ）：工程（ａ）にて抽出されたＤＮＡを遺伝子増幅反応により上述のオルガネラゲノム由来のプライマー対内部のオリゴヌクレオチドをそれぞれ増幅する工程、及び、（ｃ）：工程（ｂ）で得られるオルガネラゲノム由来の各１塩基多型の出現頻度を調べて品種を判定する工程、からなる方法により行うことが望ましい。
【００２８】
第一に、工程（ａ）について説明すると、工程（ａ）では、イタリアンライグラスのＤＮＡを抽出する。イタリアンライグラス１２品種（ウヅキアオバ、さちあおば、シワスアオバ、ニオウダチ、ハタアオバ、ミナミアオバ、ワセアオバ、ワセユタカ、アキアオバ、ナガハヒカリ、ヒタチヒカリ及びミユキアオバ）について、原原種各８０個体の３−４葉期の葉身からＣＴＡＢ法（Cetyl trimetyl ammonium bromide）法（文献：Rapid isolation of high molecular weight plant DNA, Nucleic Acids Res., 8, 4321-4325 (1980) Murray, M. G. and Tompson, W. F.）でゲノミックＤＮＡを抽出する。抽出したＤＮＡの吸光度を測定し、例えば、５０ｎｇ／μｌに調製し、ＳＮＰ検出のためのテンプレートとして使用する。
【００２９】
第二に、工程（ｂ）について説明すると、工程（ｂ）では、工程（ａ）にて抽出されたＤＮＡを遺伝子増幅反応により本発明の第１の様態のオルガネラゲノム由来のプライマー対、本発明の第２の態様のオルガネラゲノム由来のプライマー対及び本発明の第３の態様のオルガネラゲノム由来のプライマー対内部のオリゴヌクレオチドをそれぞれ増幅する。
【００３０】
このような工程（ｂ）の一連の操作は、１塩基多型を検出するための工程である。１塩基多型とは、ＰＣＲにより１個の塩基置換により生じる多型を検出する手法であり、文献［a simple procedure for the analysis of single nucleotide polymorphisms facilitates map-based cloning in Arabidopsis. Plant Physiology. Vol. 124, 1483-1492 (2000) E. Drenkard et al.］に記載された条件を参考に行うことができる。ただし、使用するプライマーによって、ＰＣＲサイクル数が異なる等、各プライマー対に応じた条件設定が必要である。
【００３１】
テンプレートについて、配列表の配列番号１〜１０の各プライマー対を使用してＰＣＲ増幅を行い、ＳＮＰ解析を行う。なお、各プライマー対についてのＰＣＲサイクル数の条件としては、プライマー（配列表の配列番号１及び２）は３５サイクルで、プライマー（配列表の配列番号３及び４、５及び６）は２８サイクルで、プライマー（配列表の配列番号７及び８）は３５サイクルで、プライマー（配列表の配列番号９及び１０）は３５サイクルである。しかし、これらに制限されるものではなく、使用する機器及び試薬等によって適宜変更することができる。
【００３２】
第三に、工程（ｃ）について説明すると、工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られるオルガネラゲノム由来の各１塩基多型の出現頻度を調べて品種を判定する。各オリゴヌクレオチドが増幅されたかどうかは、遺伝子増幅反応の後にアガロースゲル電気泳動により分画して、イメージアナライザー等により、予想される増幅断片のサイズに対するバンドの有無によって確認することができる。
【００３３】
工程（ｂ）で得られるオルガネラゲノム由来の１塩基多型の出現頻度は、工程（ｂ）で得られたオルガネラゲノム由来の各１塩基多型に対応するバンドの有無を求めて、百分率（％）として算出することができる。ＰＣＲで増幅された各ＤＮＡ断片を、例えば、１．６％アガロースゲル電気泳動で分画し、それぞれの個体についてＳＮＰマーカーＮｏ．１〜５のそれぞれの有無を調査する。
【００３４】
イタリアンライグラス１２品種の各８０個体の集団における配列番号１〜１０に係わる本発明のオルガネラゲノム由来の各１塩基多型の出現頻度（％）、即ち、ＳＮＰマーカーＮｏ．１〜５の出現頻度（％）は、後記する実施例に示す通りである。尚、以下の記載において、配列番号１及び２のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーをＳＮＰマーカーＮｏ．１と称する場合がある。
【００３５】
配列番号３及び４のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーをＳＮＰマーカーＮｏ．２、配列番号５及び６のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーをＳＮＰマーカーＮｏ．３、配列番号７及び８のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーをＳＮＰマーカーＮｏ．４及び配列番号９及び１０のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーをＳＮＰマーカーＮｏ．５と称する場合がある。
【００３６】
配列番号１及び２に係わる本発明のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカー（マーカーＮｏ．１）は、ウヅキアオバ、ハタアオバ、アキアオバ及びヒタチヒカリで出現しない。また、シワスアオバ及びミユキアオバでは高頻度で存在する。配列番号３及び４に係わる本発明のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカー（マーカーＮｏ．２）は、ウヅキアオバ、ハタアオバ、アキアオバ及びヒタチヒカリで出現しない。また、シワスアオバ及びミユキアオバでは高頻度で存在する。
【００３７】
配列番号５及び６に係わる本発明のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカー（マーカーＮｏ．３）は、ウヅキアオバ、ハタアオバ、アキアオバ及びヒタチヒカリで出現しない。また、シワスアオバ及びミユキアオバでは高頻度で存在する。
【００３８】
配列番号７及び８に係わる本発明のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカー（マーカーＮｏ．４）は、ウヅキアオバ及びアキアオバで出現しない。また、シワスアオバ、ヒタチヒカリ及びミユキアオバでは高頻度で存在する。配列番号９及び１０に係わる本発明のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカー（マーカーＮｏ．５）は、さちあおばで出現しない。
【００３９】
以上のように、本発明は、細胞内において母系遺伝を示し、系統発生等の推測ができるオルガネラのゲノムＤＮＡ上の１塩基多型を用いた迅速、簡便且つ正確なイタリアンライグラスの品種識別法を構築し、提供するものである。
【００４０】
本発明では、イタリアンライグラスの１品種以上で多型を示すことを特徴とするオルガネラゲノム由来の１塩基多型マーカーを使用し、識別対象のイタリアンライグラスについてＰＣＲによる増幅を行い、１塩基多型マーカーの出現頻度により、ウヅキアオバ（２倍体）、さちあおば（２倍体）、シワスアオバ（２倍体）、ニオウダチ（２倍体）、ハタアオバ（２倍体）、ミナミアオバ（２倍体）、ワセアオバ（２倍体）、ワセユタカ（２倍体）、アキアオバ（４倍体）、ナガハヒカリ（４倍体）、ヒタチヒカリ（４倍体）及びミユキアオバ（４倍体）からなるイタリアンライグラス１２品種を識別する。
【００４１】
本発明における１塩基多型の検出は、具体的には、（ａ）イタリアンライグラスのＤＮＡを抽出する工程、（ｂ）：工程（ａ）にて抽出されたＤＮＡを遺伝子増幅反応に付す工程、（ｃ）：工程（ｂ）で得られるオルガネラゲノム由来の１塩基多型の出現頻度を調べて品種を判定する工程から構成される。
【発明の効果】
【００４２】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）イタリアンライグラスの品種識別用のオルガネラゲノム由来１塩基多型プライマー対を提供することができる。
（２）上記プライマーセットを用いたイタリアンライグラス品種の識別方法を構築し、提供することができる。
（３）オルガネラゲノムＤＮＡ上の１塩基多型を利用した迅速、簡便且つ正確なイタリアンライグラスの品種識別方法を提供することができる。
（４）本発明により、イタリアンライグラス１２品種内の品種を迅速、簡便且つ正確に識別することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
次に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
以下の記載において、特に説明がない場合には、文献［Rapid isolation of high molecular weight plant DNA, Nucleic Acids Res., 8, 4321-4325 (1980) Murray, M. G. and Tompson, W. F.： a simple procedure for the analysis of single nucleotide polymorphisms facilitates map-based cloning in Arabidopsis, Plant Physiology, Vol., 124, 1483-1492 (2000) E. Drenkard et al.］に記載の方法、或いはそれらの方法を修飾又は改変した方法により行ったものである。また、市販のキットや測定装置を用いるとした場合に、特に説明がないときは、それらに添付のプロトコールの指示に従って行ったものである。
【００４５】
本発明のイタリアンライグラスの品種識別法について、本実施例においては、オルガネラゲノム由来の各１塩基多型の出現頻度を調べるために、（ａ）：イタリアンライグラスのＤＮＡを抽出する工程、（ｂ）：工程（ａ）にて抽出されたＤＮＡを遺伝子増幅反応により上述のオルガネラゲノム由来のプライマー対内部のオリゴヌクレオチドをそれぞれ増幅する工程、及び、（ｃ）：工程（ｂ）で得られるオルガネラゲノム由来の各１塩基多型の出現頻度を調べて品種を判定する工程、からなる方法により行った。
【００４６】
第一に、工程（ａ）では、イタリアンライグラスのＤＮＡを抽出するために、イタリアンライグラス１２品種（ウヅキアオバ、さちあおば、シワスアオバ、ニオウダチ、ハタアオバ、ミナミアオバ、ワセアオバ、ワセユタカ、アキアオバ、ナガハヒカリ、ヒタチヒカリ及びミユキアオバ）について、原原種各８０個体の３−４葉期の葉身からＣＴＡＢ法でゲノミックＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡの吸光度を測定し、５０ｎｇ／μｌに調製し、ＳＮＰ検出のためのテンプレートとして使用した。
【００４７】
第二に、工程（ｂ）では、工程（ａ）にて抽出されたＤＮＡを、遺伝子増幅反応により、本発明の第１の態様のオルガネラゲノム由来のプライマー対、本発明の第２の態様のオルガネラゲノム由来のプライマー対及び本発明の第３の態様のオルガネラゲノム由来のプライマー対内部のオリゴヌクレオチドをそれぞれ増幅した。
【００４８】
このような工程（ｂ）の一連の操作で、１塩基多型の検出、即ち、ＰＣＲにより１個の塩基置換により生じる多型の検出を行った。この場合、文献［a simple procedure for the analysis of single nucleotide polymorphisms facilitates map-based cloning in Arabidopsis. Plant Physiology. Vol. 124, 1483-1492 (2000) E. Drenkard et al.］に記載された条件を参考に行った。ただし、使用するプライマーによって、ＰＣＲサイクル数が異なるので、各プライマー対に応じた条件設定を行った。
【００４９】
テンプレートＤＮＡは、ＡＢＩ（アプライドバイオシステムズジャパン）社の試薬を用いてＳＮＰ解析を行った。テンプレートＤＮＡについて、下記の組成で試薬を配合、調製し、ＰＣＲを行った。また、プライマー対は、上述の各プライマー対（配列表の配列番号１〜１０参照）を使用した。
【００５０】
［一塩基多型検出反応  各試薬の組成］
ＤＮＡサンプル（５０ｎｇ／μｌ）                      １．００μｌ
10×PCR Gold Buffer Contains no MgCl2                            ２．００μｌ
dNTP  Ｍｉｘ  ２ｍＭ  each dNTP                        １．２５μｌ
MgCl2  Solution  ２５ｍＭ                              １．２０μｌ
H2O                                                  １２．３５μｌ
Ampli Taq GoldTM 5U/μl                                ０．２０μｌ
Primer Pairs                                          ２．００μｌ
Ｔｏｔａｌ                                          ２０．００μｌ
【００５１】
ＰＣＲの反応条件は、９４℃５分→９４℃３０秒・６４℃１分からなる工程を１サイクルとした反応を２８もしくは３５サイクル（後述のように、使用するプライマー対によって異なる）→７２℃１０分として行った（図１参照）。
【００５２】
なお、各プライマー対についてのＰＣＲサイクル数の条件としては、プライマー（配列表の配列番号１及び２）は３５サイクルで、プライマー（配列表の配列番号３及び４、５及び６）は２８サイクルで、プライマー（配列表の配列番号７及び８）は３５サイクルで、プライマー（配列表の配列番号９及び１０）は３５サイクルとした（表１のプライマー対のサイクル数を参照）。
【００５３】
【表１】
2008237178.tif 000003
【００５４】
第三に、工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られるオルガネラゲノム由来の各１塩基多型の出現頻度を調べて品種を判定した。各オリゴヌクレオチドが増幅されたかどうかは、遺伝子増幅反応の後にアガロースゲル電気泳動により分画して、イメージアナライザー等により、予想される増幅断片のサイズに対するバンドの有無によって確認した。
【００５５】
工程（ｂ）で得られるオルガネラゲノム由来の１塩基多型の出現頻度は、工程（ｂ）で得られたオルガネラゲノム由来の各１塩基多型に対応するバンドの有無を求めて、百分率（％）として算出した。ＰＣＲで増幅された各ＤＮＡ断片を、１．６％アガロースゲル電気泳動で分画し、それぞれの個体についてＳＮＰマーカーＮｏ．１〜５のそれぞれの有無を調査した。
【００５６】
イタリアンライグラス１２品種の各８０個体の集団における配列番号１〜１０に係わる本発明のオルガネラゲノム由来の各１塩基多型の出現頻度（％）、即ち、ＳＮＰマーカーＮｏ．１〜５の出現頻度（％）は、表２に示す通りである。尚、配列番号１及び２のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーをＳＮＰマーカーＮｏ．１とした。
【００５７】
配列番号３及び４のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーをＳＮＰマーカーＮｏ．２、配列番号５及び６のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーをＳＮＰマーカーＮｏ．３、配列番号７及び８のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーをＳＮＰマーカーＮｏ．４及び配列番号９及び１０のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーをＳＮＰマーカーＮｏ．５とした。表２に、原種種子における１塩基多型の出現頻度（％）を示す（上段：２倍体品種、下段：４倍体品種）。
【００５８】
【表２】
2008237178.tif 000004
【００５９】
表２から明らかなように、配列番号１及び２に係わる本発明のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカー（マーカーＮｏ．１）は、ウヅキアオバ、ハタアオバ、アキアオバ及びヒタチヒカリで出現しない。また、シワスアオバ及びミユキアオバでは高頻度で存在する。配列番号３及び４に係わる本発明のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカー（マーカーＮｏ．２）は、ウヅキアオバ、ハタアオバ、アキアオバ及びヒタチヒカリで出現しない。また、シワスアオバ及びミユキアオバでは高頻度で存在する。
【００６０】
配列番号５及び６に係わる本発明のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカー（マーカーＮｏ．３）は、ウヅキアオバ、ハタアオバ、アキアオバ及びヒタチヒカリで出現しない。また、シワスアオバ及びミユキアオバでは高頻度で存在する。
【００６１】
配列番号７及び８に係わる本発明のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカー（マーカーＮｏ．４）は、ウヅキアオバ及びアキアオバで出現しない。また、シワスアオバ、ヒタチヒカリ及びミユキアオバでは高頻度で存在する。配列番号９及び１０に係わる本発明のプライマー対を使用して得られるオルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカー（マーカーＮｏ．５）は、さちあおばで出現しない。
【００６２】
品種の判定は、上述の工程（ｂ）で得られるオルガネラゲノム由来の１塩基多型の出現頻度を、表２の出現頻度と比較し、対応を見ることによって判定した。高頻度を７０％前後、中頻度を５０％前後、低頻度を１０％前後として、オルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーＮｏ．１が存在しなければ、その品種はウヅキアオバ（２倍体）、ハタアオバ（２倍体）、アキアオバ（４倍体）及びヒタチヒカリ（４倍体）のいずれかの可能性があり、高頻度で存在すればシワスアオバ（２倍体）もしくはミユキアオバ（４倍体）の可能性がある。
【００６３】
中頻度であれば、ニオウダチ（２倍体）、ミナミアオバ（２倍体）及びナガハヒカリ（４倍体）、のいずれかの可能性があり、低頻度であれば、さちあおば（２倍体）、ワセアオバ（２倍体）及びワセユタカ（２倍体）のいずれかの可能性がある。
【００６４】
オルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーＮｏ．２が存在しなければ、その品種は、ウヅキアオバ（２倍体）、ハタアオバ（２倍体）、アキアオバ（４倍体）及びヒタチヒカリ（４倍体）のいずれかの可能性があり、高頻度で存在すればシワスアオバ（２倍体）もしくはミユキアオバ（４倍体）の可能性がある。
【００６５】
中頻度であれば、ニオウダチ（２倍体）、ミナミアオバ（２倍体）及びナガハヒカリ（４倍体）のいずれかの可能性があり、低頻度であれば、さちあおば（２倍体）、ワセアオバ（２倍体）及びワセユタカ（２倍体）のいずれかの可能性がある。
【００６６】
オルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーＮｏ．３が存在しなければ、その品種はウヅキアオバ（２倍体）、ハタアオバ（２倍体）、アキアオバ（４倍体）及びヒタチヒカリ（４倍体）のいずれかの可能性があり、高頻度で存在すればシワスアオバ（２倍体）もしくはミユキアオバ（４倍体）の可能性がある。
【００６７】
中頻度であれば、ニオウダチ（２倍体）、ミナミアオバ（２倍体）及びナガハヒカリ（４倍体）のいずれかの可能性があり、低頻度であれば、さちあおば（２倍体）、ワセアオバ（２倍体）及びワセユタカ（２倍体）のいずれかの可能性がある。
【００６８】
オルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーＮｏ．４が存在しなければ、その品種はウヅキアオバ（２倍体）及びアキアオバ（４倍体）のいずれかの可能性があり、高頻度で存在すればシワスアオバ（２倍体）、ヒタチヒカリ（４倍体）及びミユキアオバ（４倍体）のいずれかの可能性がある。中頻度であれば、ニオウダチ（２倍体）、ミナミアオバ（２倍体）及びナガハヒカリ（４倍体）のいずれかの可能性があり、低頻度であれば、ワセアオバ（２倍体）もしくはワセユタカ（２倍体）の可能性がある。
【００６９】
オルガネラゲノム由来のＳＮＰマーカーＮｏ．５が存在しなければ、その品種はさちあおば（２倍体）である可能性があり、中頻度で存在すれば、ウヅキアオバ（２倍体）もしくはニオウダチ（２倍体）の可能性がある。低頻度であれば、シワスアオバ（２倍体）、ハタアオバ（２倍体）、ミナミアオバ（２倍体）、アキアオバ（４倍体）及びミユキアオバ（４倍体）のいずれかの可能性がある。
【００７０】
このように、上記ＳＮＰマーカーを組み合わせて評価することにより、いくつかの品種群の識別を行うことが可能である（図２参照）。即ち、本発明のイタリアンライグラスの品種識別法は、本発明の第１の態様のプライマー対、第２の態様のプライマー対及び第３の態様のプライマー対によるオルガネラゲノム由来の１塩基多型のそれぞれの出現頻度により、イタリアンライグラス１２品種、ウヅキアオバ、さちあおば、シワスアオバ、ニオウダチ、ハタアオバ、ミナミアオバ、ワセアオバ、ワセユタカ、アキアオバ、ナガハヒカリ、ヒタチヒカリ及びミユキアオバ内の品種群を識別することができる。更に、上述のプライマー対を組み合わせることによって、個々の品種を識別できることが明らかになった。但し、ワセアオバ及びワセユタカについては、供試個体数を増やすことで、より正確な識別が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
以上詳述したように、本発明は、イタリアンライグラスの品種識別用のオルガネラゲノム由来１塩基多型プライマー対及び当該プライマーセットを用いたイタリアンライグラス品種の識別方法に係るものであり、本発明により、イタリアンライグラスの品種識別用のオルガネラゲノム由来１塩基多型プライマー対を提供することができる。本発明は、細胞内において母系遺伝を示し、系統発生等の推測ができるオルガネラのゲノムＤＮＡ上の１塩基多型を用いた迅速、簡便且つ正確なイタリアンライグラスの品種識別法を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】Ｎｏ．４のＳＮＰマーカー（ＯＲＦ１００）によるバルク解析の結果、及びＮｏ．２のＳＮＰマーカー（ＴｒｎＳ−ＴｒｎＴ）による個体解析の結果を示す。
【図２】品種判別早見表の一例を示す。＊高頻度：７０％前後、中頻度：５０％前後、低頻度：１０％前後として表記（８０個体について個体解析を行った結果、バンド有りの頻度）。
【図３】本発明のプライマーの塩基配列を示す。
【図４】プライマー対内部の塩基配列を示す。
【図５】プライマー対内部の塩基配列を示す。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【配列表】
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