(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なキチナーゼ酵素及びそれをコードする核酸の提供。【解決手段】Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．  Ａ−４７１由来のキチン分解能を有する、特定な配列のアミノ酸配列を有し、キチナーゼ活性を有する蛋白質、又はそのアミノ酸配列修飾体、及びそれらをコードする核酸。当該酵素は、ｐＨ６．０において最適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０において安定であり、３０℃においても比較的高い活性を示し、６０℃まで安定な耐熱性酵素である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に示すアミノ酸配列を有し、キチナーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項２】
配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項３】
配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項４】
配列番号：１に示す塩基配列を有する核酸に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項５】
配列番号：２に示すアミノ酸配列を有し、キチナーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項６】
配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項７】
配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項８】
配列番号：１に示す塩基配列を有する核酸に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のキチナーゼ活性を有する蛋白質の製造方法において、請求項10に記載の宿主細胞を培養し、培養物から当該蛋白質を採取することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質をキチン又はキチン含有物に作用させることを特徴とするキチンの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱安定性を有し、60℃以上の最適作用温度を有するキチン分解酵素、及びそれをコードする核酸、並びに当該酵素の製造及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
キチナーゼはグルコースの2位の炭素の水酸基がアセトアミド基に置換されたN-アセチルグルコサミンを構成単糖とするポリマーで、甲殻類、カビ、酵母、きのこなどに含まれており、地球上に広く分布している。キチンの地球上における年間の生産量は、セルロースの1011トンに対し、109トンあるいはセルロースに匹敵する1011トンとも言われている（「最後のバイオマス  キチン、キトサン」キチン、キトサン研究会編、技報堂出版、1（1988））。しかし、資源として実際に使用されている量はそのうちの数千トンにとどまっており、ほとんどが廃棄物となっている。
【０００３】
キチンが加水分解されてできたオリゴ糖は、抗菌活性効果や免疫賦活効果、抗腫瘍活性効果などの機能を持ち様々な分野で利用可能である。キチンを有効資源とするためにはキチンを効率的に分解し、しかもオリゴ糖を生産することができるようなキチナーゼが望まれている。キチンオリゴ糖を生産する方法には化学的に調製する方法と酵素を用いて調製する方法とがある。化学的にキチンオリゴ糖を調製する方法は、キチンを濃硫酸で加水分解し活性炭カラムに吸着させエタノールにより溶出する（「キチン、キトサン実験マニュアル」キチン、キトサン研究会編、技報堂出版（1991)）。しかしながらこの方法は重合度の高い5以上のオリゴ糖を得るには必ずしも効果的な方法ではなく、また処理過程で出る廃液が環境に悪影響を及ぼしかねない。そこで、最近ではキチン分解酵素を用いた酵素学的方法によるオリゴ糖の生産が試みられている。
【０００４】
キチナーゼは触媒ドメインの一次構造や三次構造の違いにより糖加水分解酵素のFamily18と19に分類されており（Henrissat,B. (1991), Biochem.J. 280:309-316；Henrissat,B. etc., (1993), Biochem.J. 293:781-788）)、細菌や昆虫、ウイルス、植物、動物など広範囲の生物に存在し、生理学的、生態学的に重要な役割をもつ。また、成長期の外骨格の再構成や細胞分化にも関与しており（Kuranda MJ., et.  al., (1991), J.Biol.chem. 266(29):19758-19767）、植物では、β-1,3-グルカナーゼなどと共に病原菌やエリシターなど外的刺激により誘導されるPRたんぱく質（Pathogenesis-related proteins）として働いている（Neuhas J. (1999), Plant chitinase(PR-3,PR-4,PR-8,PR-11)；In:Datta,SK., Muthukrishnan,S.(Eds.), CRC Press,Boca Raton,FL:77-105）。
【０００５】
最近、植物病原菌として知られているラルストニア・ソラナカルム（Ralstonia solanacarum）の全ゲノム配列が明らかとなり（Salanoubat M., et. al., (2002), Nature 31:415(6871):497-5029）、Family 18のキチナーゼの触媒領域とキチンバインディングドメインと相同性を有する配列をコードする遺伝子があることが明らかとなった。
しかしながら、ラルストニア（Ralstonia）属由来の耐熱性キチナーゼをコードする遺伝子はクローニングされていない。
【０００６】
【非特許文献１】キチン、キトサン実験マニュアル」キチン、キトサン研究会編、技報堂出版（1991)
【非特許文献２】Henrissat,B. (1991), Biochem.J. 280:309-316；Henrissat,B. etc., (1993), Biochem.J. 293:781-788
【非特許文献３】Kuranda MJ., et.  al., (1991), J.Biol.chem. 266(29):19758-19767
【０００７】
【非特許文献４】Neuhas J. (1999), Plant chitinase(PR-3,PR-4,PR-8,PR-11
【非特許文献５】In:Datta,SK., Muthukrishnan,S.(Eds.), CRC Press,Boca Raton,FL:77-105
【非特許文献６】Salanoubat M., et. al., (2002), Nature 31:415(6871):497-5029
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明は、ラルストニア（Ralstonia）属由来のキチナーゼ及びそれをコードする核酸、並びに当該キチナーゼの製造方法及び使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って本発明は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有し、キチナーゼ活性を有する蛋白質；配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質；配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質；並びに、配列番号：１に示す塩基配列を有する核酸に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質、を提供する。
【００１０】
本発明はまた、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有し、キチナーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸；配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸；配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸；並びに、配列番号：１に示す塩基配列を有する核酸に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸、を提供する。
【００１１】
本発明は更に、上記の核酸を含むベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクター、特に発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明は更に、前記のキチナーゼ活性を有する蛋白質の製造方法において、前記の宿主細胞を培養し、培養物から当該蛋白質を採取することを特徴とする方法を提供する。
本発明は更に、前記のキチナーゼ活性を有する蛋白質をキチン又はキチン含有物に作用させることを特徴とするキチンの分解方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のキチナーゼ活性を有する蛋白質は、典型的には配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する。しかしながら、一般に、酵素はその作用に必須の部分と必須でない部分を有し、非必須部分においてはアミノ酸配列が修飾されていても酵素活性が維持されることが知られている。本発明のキチナーゼ活性を有する蛋白質においては、キチン結合ドメインおよび酵素活性ドメインが推定できる。従って、本発明は、配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質をも提供する。
【００１３】
同様に、本発明はまた、配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質を提供する。アミノ酸配列の同一性は、例えば、遺伝子情報処理ソフト GENETYX（株式会社 ゼネフィックス）を用いて算出する。
【００１４】
本発明はまた、配列番号：１に示す塩基配列を有する核酸に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、且つキチナーゼ活性を有する蛋白質を提供する。高ストリンジェント条件とは、例えば、55〜65℃で数時間から一晩、標識したプローブとハイブリダイズする条件をいう。
ここで、上記「ハイブリダイズする核酸」としては、例えば、ラルストニア（Ralstonia）属微生物由来の核酸が上げられる。
【００１５】
本発明は更に、前記の蛋白質をコードする核酸、特にDNAを提供する。
本発明は更に、上記核酸を含んでなるベクター、特に発現ベクター、例えばプラスミド又はファージベクターを提供する。本発明は更に、上記ベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１６】
宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Escherichia）属に属する細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli）、バシルス（Bacillus）属微生物、例えばバシルス.スブシルス（Bacillus subtilis）など従来公知の宿主細胞を用いることができる。
【００１７】
真核細胞としては、脂肪酸合成能を有する必要はなく、例えば真核微生物、好ましくは酵母または糸状菌が使用できる。酵母としては例えばサッカロミセス.セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等のサッカロミセス（Saccharomyces）属酵母が挙げられ、また糸状菌としては、例えばアスペルギルス.オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス.ニガー（Aspergillus niger）等のアスペルギルス（Aspergillus）属微生物、及びペニシリウム（Penicillium）属微生物、等が挙げられる。さらに動物細胞または植物細胞も宿主細胞として使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
【００１８】
本発明の発現ベクターはそれらを導入すべき宿主の生物種に依存したプロモーターおよびターミネーター等の発現制御領域、及び複製起点等を含有する。細菌用、特に大腸菌における発現ベクターのプロモーターとしては、従来公知のプロモーター、例えばtrcプロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター等が使用できる。また、酵母用プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼ、trpC等のプロモーターが使用できるが、これらのプロモーターに限定されるものではない。また動物細胞用プロモーターとしてはウイルス性プロモーター、例えばSV40アーリープロモーター、SV40レートプロモーター等が使用される。発現ベクターの作成は制限酵素、リガーゼ等を用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主細胞の形質転換も従来公知の方法に従って行うことができる。
【００１９】
本発明はまた、前記のキチナーゼ活性を有する蛋白質の製造方法において、前記の宿主細胞を培養し、培養物から当該蛋白質を採取することを特徴とする方法を提供する。発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養し、培養物から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により目的とする酵素蛋白質を回収、精製することができる。
【００２０】
本発明のキチナーゼ酵素は、pH 6.0に最適pHを有し、pH  ５〜10において安定である。また、最適温度は60℃付近にあり、30℃においても比較的高い活性を示す。60℃まで安定であり、耐熱性酵素である。
本発明のキチナーゼをコードする遺伝子は、例えば、16S rDNAシークエンス法によりRalstonia sp. と同定される菌株、Ralstonia sp. A-471（NITE AP-296）からクローニングすることが出来る。
【実施例】
【００２１】
次に、本発明を実施例により更に、具体的に説明する。
実施例１. Ralstonia sp. A-471由来のキチン分解能を有する酵素遺伝子の獲得
（１）ショットガンクローニングによるキチン分解能を有する酵素遺伝子の獲得
1-1  方法
1-1-1  フラグメントの調製
Ralstonia sp. A-471ゲノムDNA を制限酵素Sau3AIで部分消化した後２〜９kbpの断片を回収し、QIAGEN のgel extraction kitを用いてゲルからDNAの抽出を行った。
【００２２】
1-1-2  プラスミドDNAの調製
プラスミドDNA pUC19（TOYOBO）に制限酵素BamH Iで処理した後Bacterial Alkaline phosphatase（和光純薬）を加えて再び37 ℃で1 時間インキュベートし、脱リン酸化を行った。反応後、フェノール／クロロホルム溶液を加え、遠心分離（15,000 rpm、4 ℃、5 min.）により上清を回収後、エタノール沈殿を行い、遠心分離（15,000 rpm、4℃、5 min.）により沈殿を回収した。沈殿を70 ％エタノールで洗浄し乾燥させ、TE bufferに溶解した。再度フェノール／クロロホルム溶液を加え、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿をもう一度行った。その後、QIAquick gel extraction kit(QIAGEN)を用いてプラスミドDNAの精製を行った。
【００２３】
1-1-3  ライゲーション及び形質転換
前記1-1-1で調製したフラグメントと前記1-1-2で調製したプラスミドベクターをライゲーションした後、得られたプラスミドにより大腸菌の形質転換を行った。
【００２４】
1-2  結果
ライゲーション及び形質転換の結果、約２〜９kbpのフラグメントが挿入されたプラスミドを含む大腸菌を取得することができた。
【００２５】
（２）組換え大腸菌によるRalstonia sp. A-471由来キチン分解能を有する酵素遺伝子の発現
2-1  方法
2-1-1  CM（carboxyl methyl）キチン培地の作製
500 mlの蒸留水にCMキチン0.5 gを添加し、一晩撹拌した後超音波発生装置を用いて15分間脱気した。これにトリパンブルーを0.025 g、LBを10 g、アガロースを7.5 g添加し、121 ℃で15分オートクレーブを行った後終濃度100 μg/mlのAmpicillinを加えてシャーレに分注した。
【００２６】
2-1-2  CMキチン培地における形質転換した大腸菌の培養
前記1-1-3の方法で得られたプラスミドにより形質転換された大腸菌を前記2-1-1で作成したCMキチン培地に塗布し、37 ℃で一晩培養した。培養後、ハロを形成していると思われるものを爪楊枝でつつき、新しいCMキチン培地とLBAmp+プレートにそれぞれ植え継ぎ37 ℃で一晩培養した。
【００２７】
2-1-3  染色および脱色
前記2-1-2で一晩培養したCMキチン培地の方に0.2 %CONGO RED溶液を加え、5分間染色を行った後、1 M NaClを加え一晩脱色を行った。
【００２８】
2-2  結果
CMキチン培地で培養した組換え大腸菌とその培地を染色したところ、非常に大きなハロを形成しているものが１つ存在した。これをサンプル２と名づけてDNA配列決定を行い、遺伝子の塩基配列を詳しく調べることにした。
【００２９】
2-3  考察
CONGO REDはキチンと結合する色素で、菌体がキチンを分解する酵素を生産して培地中のキチンが分解されると、その部分は色が抜けて白くなる（ハロを形成する）。今回得られたサンプル２の形質転換体はCMキチン培地においてCONGO RED溶液を用いて染色を行った時に大きなハロを形成していたので、このサンプル２の形質転換体は何らかのキチン分解酵素を生産していると考えられる。そこで、サンプル２のプラスミドDNAを抽出してDNAの配列決定を行い、この形質転換体が生産している酵素を特定することを試みた。
【００３０】
（３）クローン化したキチナーゼの塩基配列・アミノ酸配列の解析
3-1  方法
3-1-1  サンプル２の培養
サンプル２のシングルコロニーを平板培地より、爪楊枝で2×TY培地を50 ml含む300 ml容の三角フラスコに植菌した後、37 ℃で一晩振とう培養した。
【００３１】
3-1-2  DNAの抽出及び配列決定
DNAの抽出は前記1-1-2と同様の方法で行った。更に、DNAの配列決定を行い、BLASTによってホモロジ−検索を行った。DNAの塩基配列を配列番号：１に示し、推定されるアミノ酸配列を配列番号：２に示す（図２）。
【００３２】
3-2  結果
DNAの配列決定の結果、サンプル２の塩基配列及びアミノ酸配列が明らかとなり、サンプル２はキチン結合ドメインを含むリゾチーム様酵素をコードする遺伝子を持っていることが明らかとなった（図１）。この酵素遺伝子の5‘-上流領域にはプロモーター（-35，-10）配列とSD配列が存在した。また，ストップコドンより3’側にはターミネーター様配列が存在していた（図２）．この酵素遺伝子は759 bp, 252アミノ酸をコードしている。前駆体酵素（１番目のメチオニンから252番目のチロシンまでを含む）の分子量は26,886で、成熟型酵素（37番目のアラニンから252番目のチロシンを含む）の分子量は23,191となる。
【００３３】
この酵素の触媒ドメインにはG-type lysozyme（Simpson, R. J., et al., Biochim. Biophys. Acta, 744, 349-351 (1983); Gruetter, M. G., et al., Nature, 303, 828-831 (1983); Isaacs, N. W., et al., J. Biol. Sci., 38, 13-22 (1985)）の活性部位であるグルタミン酸が保存されており、その触媒ドメイン部分のアミノ酸の相同性は18 %程度であった。しかしながら、本酵素のキチン結合ドメインのアミノ酸配列は他種微生物由来のキチナーゼにおけるキチン結合ドメインと比較的高い相同性を示し、バシルス・サーキュランス（B. circulans）由来のキチナーゼ（登録番号AAF74782）と約61 %、クルチア・ゾプフィ（Kurthia zopfii）由来のキチナーゼ（登録番号BAA09831）と約61 %の相同性を示した。
【００３４】
実施例２. キチナーゼ酵素遺伝子の大腸菌における大量発現
発現用ベクターの構築と大腸菌を用いた大量発現
1-1  方法
1-1-1  PCRによるDNA フラグメントの調製
本発明の酵素遺伝子の成熟型酵素（シグナルペプチドを含まない）をコードする領域をPCRにより増幅を行った。Forward primer は336番目の塩基（グアニン）から357番目の塩基（チミン）までの塩基を含みNdeI サイトを含むようにデザインした．Reverse primer は983番目の塩基（チミン）から962番目の塩基（チミン）までの塩基を含み Xba Iサイトを含むようにデザインした。
【００３５】
【化１】
2008161127.tif 000002
【００３６】
PCRには鋳型（サンプル２から抽出したDNA）1μl、5x Prime STAR buffer 10μl、2.5 mM dNTPs 4.0μl、20μM Forward prime 2.5μl、20μM Reverse primer 2.5 μl、Prime STAR DNA ポリメラーゼ0.5μl、蒸留水30μlからなる反応液を用いた。
PCR  反応条件
98℃，10秒、55℃，10秒、72℃，１分、25サイクル
【００３７】
1-1-2  DNAフラグメントのpCR II-Blunt-Topo ベクターへのライゲーション
PCR後の反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、QIAquick gel extraction kit(QIAGEN)を用いてプラスミドDNAの精製を行った。このフラグメントをpCR II-Blunt-Topo（Invitrogen） ベクター中にライゲーションし、大腸菌 DH5αを形質転換した。形質転換後、Colony-PCRを行い、目的とするフラグメント（650 bp）の確認をおこなった。フラグメントが確認された大腸菌を50 ml のLB培地（アンピシリンを含む）で培養（37℃）し、プラスミドを Wizard Plus MidiPreps DNA Puification systems (Qiagen)用いて調製した。このプラスミドを用いて酵素遺伝子の塩基配列の解析を行ったところ、間違いのないことが確認したので、次に発現ベクターの構築を行った。
【００３８】
1-1-3  pCold I（TakaRa）を用いた発現ベクターの構築
前記1-1-2で調製したpCR-II-Blunt Topoに挿入されているリゾチーム様酵素遺伝子を制限酵素Nde IとXba Iを用いて処理し、アガロースゲル電気泳動後、フラグメント(650 bp)をQIAquick gel extraction kit (QIAGEN)を用いて回収した。そのフラグメントを pCold I ベクターのNde IとXba Iサイトに連結し，大腸菌 JM 109を形質転換した。形質転換後、Colony PCRを行い、フラグメント（650 bp）の確認を行った。フラグメントの確認できたクローンを用いて発現を行った。
【００３９】
1-1-4  大腸菌における発現
フラグメントの確認できたクローンを用いて、100mlのLB培地（アンピシリンを含む）を含む500 ml容の坂口フラスコを用いて37℃で前培養し、その培養液を １リットルのLB培地（アンピシリンを含む）を含む２リットル用坂口フラスコに１％（V/V）添加し、37℃で培養を行った（合計3.5リットルの培地を用いて培養）。培養後OD600が0.4〜0.5に達したとき、15℃で30分放置し、1.0 mM IPTG (isopropyl-1-thio-β-galactoside) を添加し、15℃で24時間震盪培養を行った。
【００４０】
1-1-5  粗酵素液の調製
培養後の溶液を遠心分離（9,000 rpm x 20 min）にかけ、菌体を回収した。回収した菌体を20 mM Tris-HCl (pH 7.0)に懸濁し、超音波破砕(TOMY, UD-201)に供した。破砕後、再度、遠心分離（9,000 rpm x 20 min）にかけ、その上清を粗酵素液とした。
【００４１】
1-1-6  キチナーゼ活性の測定
キチナーゼ活性測定は、Shalesの変法（Imoto, T., and Yagishita, K.（1971）, Agric. Biol. Chem. 35, 1154-1156）を用いて行った。0.1 Mのリン酸緩衝液（pH 6.0）0.4 ml, 0.3% エチレングリコールキチン 0.2 mlおよび適当に希釈した酵素液 0.2 ml からなる反応液を37℃で15分間インキュベートし、フェリシアン化カリウム溶液（0.037％ K3[Fe(CN)6]/0.37M Na2CO3）を2.7 ml加え反応を停止させた。この溶液を沸騰水浴中で15分間加熱した後、流水中で急冷し、A420を測定した。酵素活性は、１分間に１μmolのN-アセチルグルコサミンに相当する還元糖を遊離する酵素量を 1 unitとした。0.0607U/ml培養液のキチナーゼ活性が測定された。
【００４２】
1-1-7  リゾチーム活性の測定
リゾチーム活性は、井本らの方法（井本  泰治  著「研究例：リゾチーム；機能」新生化学  実験講座  １  タンパク質  VII  タンパク質工学  p389-398（1993））に従って測定した。ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）(A540の値を0.9〜1.0になるように調整) 0.2 ml、0.1 Mのリン酸緩衝液（pH 6.0）0.8 mlに適当に希釈した酵素液 0.1 mlを添加し、37℃で A540の値を経時的に５分間測定した。酵素活性は酵素溶液１mlが１分間に540 nmにおける基質濃度の濁度を0.1減少させる活性の強さを1 unitとした。リゾチーム活性は検出されなかった。
【００４３】
1-1-8  酵素の精製
前記1-1-5で調製した上清を粗酵素液として用いて精製を行った。HisTrap HP カラム（アマシャムバイオサイエンス，容量1 ml）を蒸留水で10 mlで洗浄し、次に結合緩衝液(50 mM リン酸緩衝液(pH 8.0), 300 mM NaCl, 5 mM イミダゾール) 10mlで洗浄した。洗浄後のカラムに粗酵素液 3ml（HisTrap HP カラムは 1 mlあたり40 mgのタンパク質を吸着できる）を供し、結合緩衝液10 mlで洗浄した。次に、溶出緩衝液(50 mM リン酸緩衝液(pH 8.0), 300 mM NaCl, 500 mM イミダゾール)で酵素の溶出を行った。
【００４４】
1-1-9  酵素の性質
酵素の最適 pH
エチレングリコールキチンを基質とし，各種 pH のバッファーを使用して37℃で反応を行った。用いた各種 pHの緩衝液： 0.1 M CH3COOH-HCl (pH 2〜4)、0.1 M CH3COOH-CH3COONa (pH 4〜6)、0.1 M KH2PO4-NaOH (pH 6〜8)、0.1 M Tris-HCl (pH 8〜9)。その結果、最適pHは6.0付近にあった。
【００４５】
酵素のpH安定性
酵素を各種 pH の緩衝液中、37℃で30分インキュベートした後、pHを6.0に戻してエチレングリコールキチンを基質として、37℃で15分間反応させ、残存活性を測定した。結果を図３に示す。測定した範囲内では、pH５〜10の間で安定であった。
【００４６】
酵素の最適温度
エチレングリコールキチンを基質とし、0.1 Mリン酸バッファー（pH 6.0）を使用して各温度で反応を行った。結果を図４に示す。最適温度は60℃付近であった。
酵素の熱安定性
酵素を pH 6.0、各温度で30分インキュベートした後、残存活性をエチレングリコールキチンを基質として、37℃で15分間反応させ測定を行った。結果を図５に示す。60℃付近まで安定であった。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、本発明の酵素の構造を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の酵素のアミノ酸配列及びそれをコードする核酸の塩基配列を示す図である。
【図３】図３は、本発明の酵素のpH安定性を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の酵素の最適温度を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の酵素の熱安定性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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