(57)【要約】【課題】様々な精神障害を簡便に治療することができる薬学的組成物および当該薬学的組成物のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量を検出する検出工程を含む方法によって、概日リズムの位相前進性光同調機構を形成する分子、概日リズムの位相前進性光同調機構の活性化物質、または概日リズムの位相前進性光同調機構の不活性化物質をスクリーニングする。また、概日リズムの異常に起因する障害を治療するために、プロスタグランジンＤ２の作用に関連する薬剤を含む薬学的組成物を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量を検出する検出工程を含む、概日リズムの位相前進性光同調機構を形成する分子、概日リズムの位相前進性光同調機構の活性化物質、または概日リズムの位相前進性光同調機構の不活性化物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記検出工程は、
リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素を発現する細胞と被検物質とを接触させる接触工程と、
前記接触工程後、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量を検出する発現検出工程と、を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項３】
さらに、接触工程にて被検物質と接触させた細胞を、グルタミン酸またはＰＡＣＡＰ存在下で培養する培養工程を含むことを特徴とする請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記細胞は、初代培養大脳皮質神経細胞、ＳＣＮ２．２細胞株、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞株、視交叉上核由来の細胞、または初代培養ＳＣＮスライスであることを特徴とする請求項２または３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
プロスタグランジンＤ２、プロスタグランジンＤ２の作用を活性化させる薬物またはプロスタグランジンＤ２の作用を抑制する薬物を含有し、
概日リズムの異常に起因する障害の治療に用いられることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項６】
プロスタグランジンＤ２を含有し、
睡眠相後退性症候群または鬱の治療に用いられることを特徴とする請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
プロスタグランジンＤ２の作用を活性化させる薬物を含有し、
睡眠相後退性症候群または鬱の治療に用いられることを特徴とする請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
プロスタグランジンＤ２の作用を抑制する薬物を含有し、
睡眠相前進性症候群の治療に用いられることを特徴とする請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
さらに、三環系抗鬱薬または選択的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）を含むことを特徴とする請求項５〜８の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素を発現する細胞と、
グルタミン酸またはＰＡＣＡＰと、
前記リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現を検出するためのプライマーまたは抗リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素抗体と、を含むことを特徴とする、概日リズムの位相前進性光同調機構に関与する分子、概日リズムの位相前進性光同調機構の活性化物質、または概日リズムの位相前進性光同調機構の不活性化物質のスクリーニングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精神障害治療用の薬学的組成物およびそのスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
地球上において生物は、１日２４時間からなる明暗周期の中で生活をしている。そして、生物では、外界からの明暗情報が遮断された条件においても、さまざまな行動および生理現象に、約２４時間周期のリズムが存在していることが知られている。例えば、睡眠覚醒、体温およびホルモン分泌に至るまで、さまざまな現象に、約２４時間周期のリズムが存在することが知られており、当該リズムは概日リズムと呼ばれている。生物の体内には、上記概日リズムを形成するための機構が備えられており、当該機構は体内時計と呼ばれている。体内時計は多くの分子群のネットワークからなっており、現在これらの分子群の同定が行われている。
【０００３】
約２４時間周期の概日リズムを外界の明暗環境に適応させるために、体内時計には大きく分けて２つの機構が備わっている。その１つ目は、概日リズム自体を生み出す発振機構である。上記発振機構はリズム自体を内因性に作り出すが、当該発振機構によって生み出されるリズムは、２４時間からなる明暗周期からは、ずれがあることが知られている。２つ目は、上記ずれを補正するための同調機構である。当該同調機構によって上記ずれが補正され、その結果、生体内で生み出された概日リズムは、外界の２４時間周期からなる明暗周期と同調するように日々補正されている。当該補正は光や食餌、覚せい剤等の薬物でなされうるが、生理的条件下では、主として光刺激によって行われていることが知られている。つまり、光は生体機能を直接制御する視覚とは独立した情報（非視覚光情報）を有しており、すなわち光刺激によって、体内時計の位相変化（位相前進性および位相後退性の位相変化）が誘導され、その結果、生物の概日リズムが２４時間のリズムに維持されることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
２０世紀末の時計遺伝子の発見以来、概日リズムに関連する分子群の同定が進んでいるが、現在までに明らかにされてきた概日リズムの形成に関わる分子群は、主として上記発振機構に関連する分子が大半であり、上記同調機構に関連する分子群の同定は、ようやく始まったところであるといえる。上記同調機構に関連する遺伝子としては、例えば、ｃ−ｆｏｓ（例えば、非特許文献２参照）、Ｐｅｒ１（例えば、非特許文献３参照）およびＰｒｏｋ２（例えば、非特許文献４参照）等を挙げることができる。しかしながら、同調機構に関連するとされる上記分子は、いずれも位相前進および位相後退の両条件において共通して発現誘導されており、位相前進と位相後退との差異を生み出す機構(位相スイッチング機構)には関係がないと考えられている。なお、Ｐｅｒ１に関しては、上記スイッチング機構との関連について相反する報告がなされており、その結論は未だ明らかではない。
【０００５】
哺乳類における体内時計の中枢は、網膜から伸びる視神経が脳内で交差する領域の真上に存在することから、視交叉上核（ＳＣＮ：suprachiasmatic nucleus）と呼ばれている。ＳＣＮは、種々の生命活動に概日リズムを与えるほか、主として光情報（主として視神経終末から放出されるグルタミン酸、およびＰＡＣＡＰ(pituitary adenylate cyclase activating-polypeptide)）に基づいて、概日リズムを外界の明暗サイクルに同調させることが知られている。つまり、哺乳類において、視交叉上核は、上述した発振機構と同調機構との両機能を有する体内時計の中枢であり、本部位における体内時計調節が、末梢器官を含む生体各器官の機能の、明暗環境への適応を制御する中枢である考えられている。
【０００６】
ところで近年の科学技術の発展は、昼夜を問わない社会活動や、体内時計とは全く異なる時刻である遠隔地への移動、および当該遠隔地における活動を可能とした。しかしながら、それによって外界の明暗環境と体内時計との間に著しいずれが生み出され、不適切な非視覚光情報伝達および概日リズムの撹乱を起因とする不眠や、それに付随しておこる精神機能の変調（記憶や意欲の低下）、並びに循環器、消化管および生殖器などの不調が問題視されるようになっている（例えば、非特許文献５参照）。さらに近年、特定の精神障害が、非視覚光情報伝達および概日リズムの異常によって引き起こされることが明らかになった。例えば、上記精神障害として、睡眠相後退性症候群（例えば、非特許文献６参照）、睡眠相前進性症候群および季節性鬱病（例えば、非特許文献７参照）などを挙げることができる。これらの精神障害は主として上記同調機構に異常があると考えられており、上記精神障害の治療には、主として高照度の光刺激による治療法（高照度光療法）が用いられている。例えば、睡眠相後退性症候群、季節性鬱病、および一部の躁鬱病の治療には、午前中に患者に対して高照度の光を照射する高照度光療法（例えば、非特許文献８および９参照）が用いられている。つまり、午前中に患者に対して光を照射することによって位相前進性の位相変化のみを誘導し、それによって患者を治療している。  また高照度光療法以外にも、患者を通常よりも早く寝かせ、早く起こすという位相前進療法によっても、鬱病が改善されることも知られている(非特許文献９参照)。これらの結果は、上記精神障害の原因が、同調機構の中の特に位相前進性光同調機能に特異的な異常（スイッチング機構の異常）にあることを示唆している。また三環系抗鬱薬や選択的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）などの既存の抗鬱薬に反応しない、あるいはこれらによって十分な治療効果が得られない治療抵抗性鬱病の割合は、全鬱病患者の２０％までにもなる。したがって既存の薬物とは異なる、新規作用メカニズムを有する抗鬱薬の開発が期待されていることは言うまでもない。
【非特許文献１】Annu. Rev. Neurosci. (2000) 23: 713-742
【非特許文献２】Behav. Genet. (1996) 26: 221-240
【非特許文献３】J. Biol. Chem. (2003) 278: 718-723
【非特許文献４】Nature (2002) 417: 405-410
【非特許文献５】Nat. Rev. Neurosci. (2005) 6: 407-414
【非特許文献６】CNS Spectr. (2005) 10: 647-663
【非特許文献７】J. Biol. Rhythms. (2002) 17: 89-101
【非特許文献８】Expert Rev. Neurother. (2006) 6:1039-48
【非特許文献９】Neuropsychopharmacol. (2000) 22:335-345
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記従来の治療法では、簡便に患者を治療することができないという問題点を有している。
【０００８】
例えば、上記従来の高照度光療法では、所定の時間に所定の強度を有する光を患者に照射する必要がある。したがって、このような治療を毎日続けるには、毎日決まった時間に装置を操作するという煩雑な作業を必要とするという問題点を有している。また、このような装置は高価であるため個々の患者が当該装置を所有することができず、その結果、個々の患者が毎日治療を受け続けることが困難であるという問題点を有している。さらに、患者が外出先で治療を受けるためには装置を持ち運ぶ必要があるため、患者が外出先で治療を受けることが困難であるという問題点を有している。
【０００９】
また、上記従来の位相前進療法では、患者の生活時間帯が制限されること、および医療関係者の補助が必要であるという問題点を有している。
【００１０】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、患者を簡便に治療することができる精神障害治療用の薬学的組成物およびそのスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
種々の精神障害の病態と位相スイッチング機構との関連が示唆されていたにも関わらず、スイッチング機構の分子基盤が不明であったために有効な治療法が見出せなかった状況下において、本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、１）マウスの体内時計の中枢である視交叉上核におけるリポカリン型のプロスタグランジンＤ２合成酵素（lipocalin-type prostaglandin D2 synthase：Ｌ−ＰＧＤＳ）の光誘発性発現増加が、野生型マウスでは位相前進性光同調が誘発される条件特異的に見られ、一方、位相前進性光同調が選択的に障害された遺伝子改変動物（ＰＡＣＡＰ−ＫＯマウス）では見られないこと、２）プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）のII型受容体（ＣＲＴＨ２）に対する拮抗薬によって、位相前進性光同調が抑制されること、を見出し、本願発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、上記課題を解決するために、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量を検出する検出工程を含み、概日リズムの位相前進性光同調機構を形成する分子、概日リズムの位相前進性光同調機構の活性化物質、または概日リズムの位相前進性光同調機構の不活性化物質のスクリーニングに用いられることを特徴としている。
【００１３】
本願発明のスクリーニング方法では、前記検出工程は、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素を発現する細胞と被検物質とを接触させる接触工程と、前記接触工程後、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量を検出する発現検出工程と、を含むことが好ましい。
【００１４】
本願発明のスクリーニング方法では、さらに、接触工程にて被検物質と接触させた細胞を、グルタミン酸またはＰＡＣＡＰ存在下で培養する培養工程を含むことが好ましい。
【００１５】
本願発明のスクリーニング方法では、前記細胞は、初代培養大脳皮質神経細胞、ＳＣＮ２．２細胞株、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞株、視交叉上核由来の細胞、または初代培養ＳＣＮスライスであることが好ましい。
【００１６】
本発明の薬学的組成物は、上記課題を解決するために、プロスタグランジンＤ２、プロスタグランジンＤ２の作用を活性化させる薬物またはプロスタグランジンＤ２の作用を抑制する薬物を含有し、概日リズムの異常に起因する障害の治療に用いられることを特徴としている。
【００１７】
本発明の薬学的組成物は、プロスタグランジンＤ２を含有し、睡眠相後退性症候群または鬱の治療に用いられることが好ましい。
【００１８】
本発明の薬学的組成物は、プロスタグランジンＤ２の作用を活性化させる薬物を含有し、睡眠相後退性症候群または鬱の治療に用いられることが好ましい。
【００１９】
本発明の薬学的組成物は、プロスタグランジンＤ２の作用を抑制する薬物を含有し、睡眠相前進性症候群の治療に用いられることが好ましい。
【００２０】
本発明の薬学的組成物は、さらに、三環系抗鬱薬または選択的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）を含むことが好ましい。
【００２１】
また、本発明のキットは、上記課題を解決するために、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素を発現する細胞と、グルタミン酸またはＰＡＣＡＰと、前記リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現を検出するためのプライマーまたは抗リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素抗体と、を含み、概日リズムの位相前進性光同調機構に関与する分子、概日リズムの位相前進性光同調機構の活性化物質、または概日リズムの位相前進性光同調機構の不活性化物質のスクリーニングに用いられることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のスクリーニング方法は、以上のように、概日リズムの位相前進性光同調機構を形成する分子、概日リズムの位相前進性光同調機構の活性化物質、または概日リズムの位相前進性光同調機構の不活性化物質のスクリーニングに用いる方法であって、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量を検出する検出工程を含むものである。
【００２３】
それゆえ、概日リズムの位相前進性光同調機構に関連した分子を特異的にスクリーニングすることができるという効果を奏する。
【００２４】
また、本発明の薬学的組成物は、以上のように、プロスタグランジンＤ２、プロスタグランジンＤ２の作用を活性化させる薬物またはプロスタグランジンＤ２の作用を抑制する薬物を含むものである。
【００２５】
それゆえ、簡便に、概日リズムの異常に起因する障害（例えば、睡眠相前進性症候群、睡眠相後退性症候群または鬱）を治療することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の一実施形態について図１〜６に基づいて説明する。なお、以下の説明では、スクリーニング方法、スクリーニングキット、薬学的組成物の順に説明することにする。
【００２７】
〔１：スクリーニング方法〕
本実施の形態のスクリーニング方法によれば、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量を指標として、概日リズムの位相前進性光同調機構を形成する分子、概日リズムの位相前進性光同調機構の活性化物質、または概日リズムの位相前進性光同調機構の不活性化物質をスクリーニングすることができる。
【００２８】
本明細書において「概日リズムの位相前進性光同調機構を形成する分子」とは、光刺激による概日リズムの位相前進に関与する生体内分子を意図する。換言すれば、通常の生体内において、光刺激による概日リズムの位相前進を制御する内在的な生体内分子を意図する。例えば、上記分子としては、同調機構に光刺激が入力された場合に概日リズムの位相を前進させるため、あるいは同調機構に光刺激が入力されるまで概日リズムの位相の前進を抑制するための生体内タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび各種ホルモンなどに代表される生体内分子を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２９】
具体的には、本実施の形態のスクリーニング法では、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量が増加することを指標として、概日リズムの位相を前進させる機構に含まれる生体内分子をスクリーニングすることができる。また、本実施の形態のスクリーニング法では、グルタミン酸またはＰＡＣＡＰによって概日リズムの位相の前進を誘導した場合に観察されるリポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量の増加が抑制されることを指標として、概日リズムの位相の前進を抑制する機構に含まれる生体内分子をスクリーニングすることができる。
【００３０】
また、本明細書において「概日リズムの位相前進性光同調機構の活性化物質」とは、概日リズムの位相前進を促進させる物質が意図される。当該物質は、概日リズムの位相前進を促進することができるものであればよく、特に限定されない。例えば、当該物質としては、薬剤として用いることのできる低分子化合物であることが好ましい。更に具体的には、低分子化合物のライブラリーに含まれる個々の化合物または当該化合物の混合物であることが好ましい。上記構成によれば、概日リズムの位相前進性光同調機構に異常を有する精神障害の治療に用いることができる薬剤をスクリーニングすることができる。
【００３１】
具体的には、本実施の形態のスクリーニング方法では、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量が増加することを指標として、概日リズムの位相前進を促進させる物質をスクリーニングすることができる。
【００３２】
また、本明細書において「概日リズムの位相前進性光同調機構の不活性化物質」とは、概日リズムの位相前進を抑制する物質が意図される。当該物質は、概日リズムの位相前進を抑制することができるものであればよく、特に限定されない。例えば、当該物質としては、薬剤として用いることのできる低分子化合物であることが好ましい。更に具体的には、低分子化合物のライブラリーに含まれる個々の化合物または当該化合物の混合物であることが好ましい。上記構成によれば、概日リズムの位相前進性光同調機構に異常を有する精神障害の治療に用いることができる薬剤をスクリーニングすることができる。
【００３３】
具体的に、本実施の形態のスクリーニング方法では、グルタミン酸またはＰＡＣＡＰによって概日リズムの位相の前進を誘導した場合に観察されるリポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量の増加が抑制されることを指標として、概日リズムの位相前進を抑制する物質をスクリーニングすることができる。
【００３４】
後述するように、本願発明者らは鋭意検討した結果、概日リズムの位相前進時に、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量が増加することを見出した。この発見は、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量の変化を指標として、概日リズムの同調機構において位相前進がなされたか否かを特異的に検出することができることを示唆している。
【００３５】
そこで、本実施の形態のスクリーニング方法は、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量を検出する検出工程を含んでいる。
【００３６】
上記検出工程では、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量が検出される。上記発現量を検出する方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いて検出すればよい。例えば、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素をタンパク質レベルで検出しようとすれば、ウエスタンブロッティング法または抗体染色法などを用いればよい。当該方法の用いられる一次抗体も特に限定されず、適宜公知の抗体を用いればよい。例えば、PGD2 synthase（T-17）（Santa Cruz社製）を用いてリポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素を検出すればよい。
【００３７】
また、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素をｍＲＮＡレベルで検出しようとすれば、ノーザンブロッティング法またはＲＴ−ＰＣＲ法などを用いればよい。上記検出工程では、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法を用いることが好ましい。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法を用いれば、簡便かつ同時に多くのサンプルについて、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現を検出することができる。
【００３８】
上記検出工程においてノーザンブロッティング法を用いる場合のプローブは特に限定されず、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素のｍＲＮＡの少なくとも一部を含めばよい。
【００３９】
上記検出工程においてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる場合のプライマーは特に限定されず、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素のｍＲＮＡの核酸配列の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドを用いればよい。例えば、下記の配列番号１および２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いればよい。
【００４０】
５’−ＴＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧ−３’（配列番号１）
５’−ＴＧＡＡＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣＧ−３’（配列番号２）
本実施の形態のスクリーニング方法は、上記検出工程にてリポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量が検出されるので、概日リズムの位相前進性光同調機構を形成する分子、概日リズムの位相前進性光同調機構の活性化物質、または概日リズムの位相前進性光同調機構の不活性化物質をスクリーニングすることができる。
【００４１】
さらに、上記検出工程は、
１）リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素を発現する細胞と被検物質とを接触させる接触工程、
２）上記接触工程後、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量を検出する発現検出工程、とを有することが好ましい。
【００４２】
さらに、
３）上記接触工程にて被検物質と接触させた細胞を、グルタミン酸もしくはＰＡＣＡＰ存在下で培養する培養工程、を上記発現検出工程の前に適宜含めることが好ましい。
【００４３】
例えば、上記検出工程が接触工程および発現検出工程を備えていれば、概日リズムの位相前進性光同調機構の活性化物質、および概日リズムの位相前進性光同調機構を形成する分子（位相前進を促進する分子）をスクリーニングすることができる。また、上記検出工程が接触工程、培養工程および発現検出工程を備えていれば、概日リズムの位相前進性光同調機構の不活性化物質、および概日リズムの位相前進性光同調機構を形成する分子（位相前進を抑制する分子）をスクリーニングすることができる。
【００４４】
以下に、各工程について説明する。
【００４５】
まず、上記接触工程について説明する。上記接触工程は、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素を発現する細胞と被検物質とを接触させる工程である。
【００４６】
上記細胞は、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素を発現している細胞であれば特に限定されない。例えば、初代培養大脳皮質神経細胞、視交叉上核から樹立された神経系細胞株であるＳＣＮ２．２細胞株、リズムの発振／同調研究に汎用されるＮＩＨ−３Ｔ３細胞株、視交叉上核由来の細胞、または初代培養ＳＣＮスライスであることが好ましい。上記細胞は、視交叉上核由来の細胞であることが、より好ましく、視交叉上核由来の神経細胞、ＳＣＮ２．２細胞株、または初代培養ＳＣＮスライスであることが、最も好ましい。上述したように、視交叉上核は哺乳類における体内時計の中枢である。したがって、上記細胞として視交叉上核由来の細胞、ＳＣＮ２．２細胞株、または初代培養ＳＣＮスライスを用いれば、より生体内の体内時計に近い環境下でスクリーニングを行うことができる。その結果、目的とする物質を、より精度良くスクリーニングすることができる。
【００４７】
上記被検物質としても特に限定されない。例えば、上記被検物質としては、ＲＮＡおよびＤＮＡを含むポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、低分子化合物などを挙げることができるが、これらに限定されない。また、上記ＤＮＡは、ベクター（例えば、発現ベクター）に挿入されたＤＮＡであってもよい。上記構成によれば、細胞内で所望のタンパク質を発現させることによって、当該タンパク質が概日リズムの位相前進性光同調機構に関与するか否かを検討することが可能である。また、上記ＲＮＡとしては、ＲＮＡｉを目的としてデザインされたＲＮＡであってもよい。上記構成によれば、細胞内の所望の遺伝子の発現を抑制することによって、当該遺伝子産物が概日リズムの位相前進性光同調機構に関与するか否かを検討することが可能である。
【００４８】
また、上記被検物質と細胞とを接触させる場合には、細胞をバッファー中に懸濁したあと、上記被検物質をバッファー中に加えればよい。当該バッファーとしても特に限定されず、適宜公知のバッファーを用いることができる。例えば、リン酸バッファーなどを用いることができる。また、上記被検物質がポリヌクレオチドである場合には、当該バッファー中に脂質を加えてもよい。当該脂質としても特に限定されないが、例えば、リポフェクトアミン２０００（invitrogen社製）などに代表される、細胞内へのポリヌクレオチドの取り込みを促進する脂質であることが好ましい。
【００４９】
次いで、上記発現検出工程において、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量を検出する。当該工程は、上述した検出工程にて行うように、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量をタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルで検出すればよい。これらの具体的内容は、上記検出工程の説明において既に述べたのでここでは省略することにする。
【００５０】
次いで、上記培養工程について説明する。なお、上述したように上記検出工程が接触工程および発現検出工程を備えていれば、概日リズムの位相前進性光同調機構の活性化物質、および概日リズムの位相前進性光同調機構を形成する分子（位相前進を促進する分子）をスクリーニングすることができる。また、上記検出工程が接触工程、培養工程および発現検出工程を備えていれば、概日リズムの位相前進性光同調機構の不活性化物質、および概日リズムの位相前進性光同調機構を形成する分子（位相前進を抑制する分子）をスクリーニングすることができる。
【００５１】
上記培養工程は、上記接触工程にて被検物質と接触させた細胞を、グルタミン酸またはＰＡＣＡＰ存在下で培養する工程である。ＰＡＣＡＰ（pituitary adenylate cyclase activating polypeptide）は、視神経の機能に関与する神経ペプチドの一種である。光による同調機構のシグナルは、主にグルタミン酸およびＰＡＣＡＰによって伝達されることが知られている（例えば、Int. Rev. Cytol. (2006) 251: 1-39参照）。脳スライス切片を用いた検討では、グルタミン酸またはＰＡＣＡＰの何れか一方によって脳スライス切片を処理すれば、ＳＣＮの電気的生理活動リズムに対して位相前進作用を示すことが明らかになっている（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 13468-13473、およびJ. Neurosci. (1999) 19: 6637-6642参照）。つまり、グルタミン酸またはＰＡＣＡＰは、上記細胞に作用し、当該細胞で位相前進を促すシグナルとして機能する。したがって、細胞に接触させた被検物質が位相前進を抑制するものであれば、グルタミン酸またはＰＡＣＡＰが存在する当該培養工程において、グルタミン酸またはＰＡＣＡＰによるリポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現増加が抑制される。一方、上記接触工程において細胞に接触させた被検物質が位相前進に無関係である場合には、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量は、被検物質の接触前後で変化することはない。したがって、上述の発現検出工程にて、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現を検出すれば、被検物質の性格を特定することができる。
【００５２】
上記培養工程に用いられる培地は特に限定されず、上記細胞の種類に合わせて適宜公知の培地を用いればよい。当該培地には、グルタミン酸またはＰＡＣＡＰが含まれている。培地中に含まれるグルタミン酸の濃度としては１００ｎＭ〜１０ｍＭであることが好ましい。また、培地中のＰＡＣＡＰの濃度としては、１ｎＭ〜１０μＭであることが好ましい。上記濃度範囲であれば、細胞の位相前進を誘導することができる。
【００５３】
次いで、上記発現検出工程において、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量を検出する。当該工程は、検出工程の説明にて記載したように、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量をタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルで検出すればよい。これらの具体的内容は、上記検出工程の説明において既に述べたのでここでは省略することにする。
【００５４】
〔２：スクリーニングキット〕
本実施の形態のスクリーニングキットは、概日リズムの位相前進性光同調機構に関与する分子、概日リズムの位相前進性光同調機構の活性化物質、または概日リズムの位相前進性光同調機構の不活性化物質のスクリーニングに用いることができるキットである。
【００５５】
本実施の形態のスクリーニングキットには、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素を発現する細胞が含まれる。上記細胞は、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素を発現する細胞であればよく特に限定されない。例えば、上記細胞は、初代培養大脳皮質神経細胞、視交叉上核から樹立された神経系細胞株であるＳＣＮ２．２細胞株、リズムの発振/同調研究に汎用されるＮＩＨ−３Ｔ３細胞株、視交叉上核由来の細胞、または初代培養ＳＣＮスライスであることが好ましい。上記細胞は、視交叉上核由来の細胞であることが、より好ましく、視交叉上核由来の神経細胞であることが、最も好ましい。上述したように、視交叉上核は哺乳類における体内時計の中枢である。したがって、上記細胞として視交叉上核由来の細胞を用いれば、より生体内の体内時計に近い環境下でスクリーニングを行うことができる。その結果、目的とする物質を、より精度良くスクリーニングすることができる。
【００５６】
また、本実施の形態のスクリーニングキットは、グルタミン酸またはＰＡＣＡＰを含んでいることが好ましい。グルタミン酸またはＰＡＣＡＰの存在下で上記細胞を培養すれば、当該細胞に対して位相前進を促すことができる。
【００５７】
また、本実施の形態のスクリーニングキットは、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現を検出するためのプライマーまたは抗リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素抗体を含む。上記構成によれば、簡便に、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現を検出することができる。
【００５８】
上記プライマーは特に限定されず、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素のｍＲＮＡの核酸配列の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドを用いればよい。例えば、上述した配列番号１および２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、プライマーとして用いることができる。当該プライマーを用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法によって、簡便にリポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現を検出することができる。
【００５９】
また、上記抗リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素抗体は、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素を認識し得るものであればよく、特に限定されない。上記抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、適宜公知の方法にて作製することができる。当該抗リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素抗体を用いたウエスタンブロッティング法または抗体染色法によって、簡便に、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現を検出することができる。
【００６０】
〔３：薬学的組成物〕
本願発明の薬学的組成物は、以下の１）〜３）、つまり
１）プロスタグランジンＤ２
２）プロスタグランジンＤ２の作用を活性化させる薬物
３）プロスタグランジンＤ２の作用を抑制する薬物
の何れかを含むものである。
【００６１】
上記１）〜３）の何れかを含むことによって、本実施の形態の薬学的組成物は、概日リズムの異常に起因する障害を治療することができる。また、本実施の形態の薬学的組成物は、非視覚光情報伝達の異常に起因する障害も治療することができる。上記異常に起因する障害としては、例えば、睡眠相後退性症候群、睡眠相前進性症候群または鬱などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６２】
例えば、プロスタグランジンＤ２を含む場合、本実施の形態の薬学的組成物を、睡眠相後退性症候群または鬱の治療に好適に用いることができる。また、プロスタグランジンＤ２の作用を活性化させる薬物を含む場合、本実施の形態の薬学的組成物を、睡眠相後退性症候群または鬱の治療に好適に用いることができる。また、プロスタグランジンＤ２の作用を抑制する薬物を含む場合、本実施の形態の薬学的組成物を、睡眠相前進性症候群の治療に好適に用いることができる。
【００６３】
上記プロスタグランジンＤ２の作用を活性化させる薬物としては特に限定されず、適宜公知の薬物を用いることができる。例えば、当該薬物としては、ＰＧＤ２のＩ型受容体（ＤＰ）の作動薬であるＢＷ２４５Ｃ（Cayman社製）、II型受容体（ＣＲＴＨ２）の作動薬であるＤＫ−ＰＧＤ２（Cayman社製）が挙げられるが、これらに限定されない。上記薬物としては、ＣＲＴＨ２受容体作動薬であることが望ましい。
【００６４】
また、上記プロスタグランジンＤ２の作用を抑制する薬物としても特に限定されず、適宜公知の薬物を用いることができる。例えば、当該薬物としては、ＤＰ受容体拮抗薬であるＢＷＡ８５８Ｃ、およびＣＲＴＨ２受容体拮抗薬であるＣＡＹ１０４７１並びにＢＡＹ−ｖ３４０５（いずれもCayman社製）が挙げられるが、これらに限定されない。上記薬物としては、ＣＲＴＨ２受容体作動薬であることが望ましい。なお、ＢＡＹ−ｖ３４０５は、異なる用途、つまり喘息の治療薬として既に臨床で用いられていることから、特に好ましい。
【００６５】
また、本願発明の薬学的組成物は、三環系抗鬱薬または選択的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）を含むことが好ましい。上記構成によれば、鬱に対する治療効果を上昇させることができ、三環系抗鬱薬あるいは選択的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）による治療が無効である治療抵抗性の鬱病に対しても治療効果が期待できる。また、上記構成によれば、三環系抗鬱薬または選択的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）の使用量を減らすことが可能であり、これら薬物の副作用として問題視されている眠気や自殺企図などの副作用を軽減することができる。なお、上記三環系抗鬱薬および選択的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）としては特に限定されず、適宜公知の三環系抗鬱薬および選択的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）を用いることができる。例えば、上記三環系抗鬱薬としては、アミトリプチリン、アモキサピン、イミプラミン、クロミプラミン、ドスレピン、トリミプラミン 、ノルトリプチリン、またはロフェプラミンを挙げることができる。上記選択的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）としては、フルボキサミン、パロキセチン、フルオキセチン、またはサートラリンを挙げることができる。
【００６６】
上記薬学的組成物中に含まれるプロスタグランジンＤ２、プロスタグランジンＤ２の作用を活性化させる薬物、プロスタグランジンＤ２の作用を抑制する薬物、または選択的セロトニン再取り込み阻害薬の量は特に限定されず、薬学的組成物の製剤形態若しくは投与方法、または投与対象である患者の年齢、体重、症状若しくは性別などによって適宜設定され得る。
【００６７】
本実施の形態の薬学的組成物の患者に対する投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回、または数回に分けて行ってもよい。また、１週、１ヶ月あるいは１年内において単回、または数回に分けて行ってもよく、特に限定されるものではない。
【００６８】
また、本実施の形態の薬学的組成物は、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。上記キャリアとしては、薬学的に用いられ得る賦形剤および助剤が含まれる。
【００６９】
また、本実施の形態の薬学的組成物は、機能補助剤または健康食品として、患者を含む一般人に投与されることが好ましい。上記構成によれば、現代社会で顕在化してきた、概日リズムまたは非視覚光情報伝達の異常に起因する体調不全（記憶や意欲の低下等）を、広く改善することが可能になる。
【実施例】
【００７０】
〔ＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスのＳＣＮの遺伝子発現プロファイリング〕
恒暗条件における時刻、circadian time（ＣＴ）は、恒暗条件における約２４時間の活動周期、すなわちfree-running periodを２４等分し、マウス等の夜行性動物では、活動開始時刻をＣＴ１２と定義したものである。ＣＴ０〜ＣＴ１２を主観的明期、ＣＴ１２〜ＣＴ２４を主観的暗期と呼ぶ。一般に、恒暗条件下におけるマウスの行動リズムは、主観的暗期の前半（ＣＴ１３−１７）にマウスに対して光を照射すれば位相後退が誘導され、主観的暗期の後半（ＣＴ１９−２３）にマウスに対して光を照射すれば位相前進が誘導されることが知られている。そして、位相後退および位相前進には多くの遺伝子が関与することが予測されており、例えば、位相後退時または位相前進時に発現量が変化する遺伝子が存在することも予測されている。
【００７１】
ＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスに関しては既に、概日リズムの発振機構には異常がないものの、同調機構のうち位相前進性光同調機構が選択的に障害を受けていることが報告されていた（Biochem. Biophys. Res. Commun. (2003) 310: 169-175参照）。しかしながら、ＰＡＣＡＰの下流に位置するシグナルのうち、どのシグナルに異常があるために、同調機構のうち位相前進性光同調機構が選択的に阻害されるのか不明であった。そこで、まず、ＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスのＳＣＮにおいて、位相前進時に発現量が変化する遺伝子の発現プロファイリングを行った。
【００７２】
まず、ＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスおよび野生型マウス（実験対照）を恒暗条件下で１週間以上飼育した。その後、マウスの光同調（位相前進）を惹起するために、ＣＴ２１において、マウスに対して白色光を照射した（２０  ｌｘにて３０ｍｉｎ）。つまり、ＣＴ２１に白色光を照射することによって位相前進を誘導した。
【００７３】
次いで、ＳＣＮを含む脳の急速凍結切片を作製したあと、Laser-Captured Microdissection（ＬＣＭ）によって、上記急速凍結切片からＳＣＮを特異的に回収した。図１（ａ）に示すように、視交叉上には左右対称に２つの神経核（ＳＣＮ）が存在している。そして、このＬＣＭ処理によって、脳内からＳＣＮのみを特異的に分離することができた。
【００７４】
次いで、分離したＳＣＮからRNeasy MinElute Cleanup kit（QIAGEN社製）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製したあと、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて当該ＲＮＡを増幅した。なお、上記ＲＮＡの増幅には、RiboAmp OA RNA Amplification Kit（Arcturus社製）を用い、当該キットに添付されているプロトコールにしたがってＲＮＡを増幅した。そして、このＲＮＡ増幅によって、ｇｅｎｅ  ｃｈｉｐ解析が可能なＲＮＡ量を確保することができた。
【００７５】
次いで、増幅したＲＮＡを用いて、Superscript II（Invitrogen社製）によるｃＤＮＡ合成、およびEnzo High Yield RNA Transcript Labeling kit（Enzo Diagnostics社製）によるビオチン化ｃＲＮＡの作製を行い、これをプローブとして用いて、ｇｅｎｅ  ｃｈｉｐ解析を行った。上記ｇｅｎｅ  ｃｈｉｐ解析にはマイクロアレイとしてＭＯＥ４３０Ａ（Affymetrix社製）を用いた。当該マイクロアレイに結合した上記プローブの信号を検出した後、当該信号に基づいて、ｋ−ｍｅａｎｓ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍを用いたクラスター解析によって、遺伝子発現プロファイリングを行った。
【００７６】
図１（ｂ）に示すように、約２２０００個の遺伝子のうち、ＰＡＣＡＰおよび白色光照射の有無によって発現量が変動する遺伝子として、４５１個の遺伝子を抽出することができた。上記４５１個の遺伝子は更に７つのクラスターに分類され、ＣＬ０〜ＣＬ２は、白色光の照射によって発現量が増加する遺伝子からなるクラスターであり、ＣＬ３〜ＣＬ６は、白色光の照射によって発現量が減少する遺伝子からなるクラスターであった。
【００７７】
興味深い２つの知見を得ることに成功した。当該知見の１つ目は、図２に示すように、白色光の照射によって発現量が増加した遺伝子数は、野生型マウスおよびＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスを合わせて１０４個であったのに対し、白色光の照射によって発現量が減少した遺伝子数は、野生型マウスおよびＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスを合わせて、その約３倍の３３１個であった。従来、白色光の照射によって発現量が増加する遺伝子は１０報告されているが、白色光の照射によって発現量が減少する遺伝子についてはほとんど報告がなかった。
【００７８】
また、上記知見の２つ目は、白色光の照射によって発現量が増加する遺伝子は、野生型マウスでは８５個であったのに対し、ＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスでは２８個であった。一方白色光の照射によって発現量が減少する遺伝子は、野生型マウスでは２９６個であったのに対し、ＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスでは６２個であった。つまりＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスは、野生型マウスと比較して、白色光の照射によって発現量が変化する遺伝子が、圧倒的に少ないことが明らかになった。また、野生型マウスでは白色光を照射しても発現量が変化しなかった遺伝子であって、ＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスでは白色光を照射すると発現量が変化するようになった遺伝子のグループを見出すことに成功した。
【００７９】
また、白色光の照射によって野生型マウスでは発現量が増加するものの、ＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスでは発現量が増加しない遺伝子として７６遺伝子を見出した。なお、上記実験において、概日リズムの光同調に関連することが知られているＰｅｒ１遺伝子の発現量は、白色光の照射後に照射前の１．７倍に増加していた。そこでこれら７６遺伝子のうち、特に白色光の照射によって発現量が照射前の１．７倍以上に増加する遺伝子に着目し、さらに白色光を照射しない状態では野生型マウスとＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスとの間で発現量に違いが認められる遺伝子として１６個の遺伝子を同定することに成功した。
〔リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の同定〕
上記１６遺伝子を、マイクロアレイ上の位置に基づいて同定した。その結果、当該１６遺伝子には、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）が含まれていた。
【００８０】
まず、ＲＴ−ＰＣＲ解析によって、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現が、ＣＴ２１における白色光の照射によって野生型マウスでは誘導されるが、ＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスでは誘導されないことを確認した。対照としては、Ｐｅｒ１遺伝子およびＰｒｏｋ２遺伝子を用いた。
【００８１】
ＲＴ−ＰＣＲに用いたｔｏｔａｌ  ＲＮＡの精製方法は上述したので、ここではその詳細を省略する。また、ＲＴ−ＰＣＲ解析は、下記の配列番号１および２にて示されるポリヌクレオチドをプライマーとして用いてリポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現を検出し、下記の配列番号３および４にて示されるポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰｅｒ１遺伝子の発現を検出し、下記の配列番号５および６にて示されるポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰｒｏｋ２遺伝子の発現を検出した。なお、下記の配列番号７および８にて示されるポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を検出し、当該遺伝子の発現量を基準として、各遺伝子の発現量を補正した。ＲＴ−ＰＣＲには、DyNAmo SYBR Green qPCR Kit（Fynzymes社製）を用い、反応条件は、９５℃にて１０分間の前処理の後、９５℃にて１０秒間の変性反応、５７℃にて２０秒間のアニーリング反応、および７２℃にて２０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを４５サイクル行った。なお蛍光強度の測定は、各サイクルにおける伸長反応の後、７８℃の条件下で２秒間行った。
【００８２】
５’−ＴＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧ−３’（配列番号１）
５’−ＴＧＡＡＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣＧ−３’（配列番号２）
５’−ＡＧＣＧＣＡＴＣＣＡＣＴＣＴＧＧＴＴＡ−３’（配列番号３）
５’−ＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＴＧＴＧＴＣ−３’（配列番号４）
５’−ＣＧＧＡＧＧＡＴＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣ−３’（配列番号５）
５’−ＣＣＧＧＴＴＧＡＡＡＧＡＡＧＴＣＣＴＴＡＡＡＣＡ−３’（配列番号６）
５’−ＧＴＧＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＣＡＡＴＧＴＧ−３’（配列番号７）
５’−ＴＡＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴＧＡＣ−３’（配列番号８）。
【００８３】
図３（ａ）および図３（ｂ）に、上記各遺伝子の発現量の変化を示す。更に具体的には、図３（ａ）に、ＣＴ２１において白色光による刺激を加えた場合（位相前進を惹起する条件）の、各遺伝子の発現量の変化を示す。また、図３（ｂ）に、ＣＴ１５において白色光による刺激を加えた場合（位相後退を惹起する条件）の、各遺伝子の発現量の変化を示す。
【００８４】
図３（ａ）に示すように、野生型マウスでは、位相前進を惹起する条件（ＣＴ２１における白色光の照射）では、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現が増加することが確認された。一方、ＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスでは、位相前進を惹起する条件（ＣＴ２１における白色光の照射）では、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現の増加がほぼ消失していた。
【００８５】
また、図３（ｂ）に示すように、野生型マウスおよびＰＡＣＡＰ−ＫＯマウス共に、白色光の刺激前後で、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現に変化が認められなかった。
【００８６】
つまり、位相前進性光同調時のリポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量の増加の欠如が、ＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスの位相前進性光同調の選択的障害に関与することが示された。
【００８７】
〔脳におけるリポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現〕
次いで、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の脳内における発現を確認した。なお、上記発現を、抗体染色法によって検出した。以下に、上記抗体染色法の方法および結果について説明する。
【００８８】
まず、ＳＣＮを含む脳の急速凍結切片を作製したあと、ビオチン共役抗goat IgG抗体およびVECTASTAIN ABC standard Kit（VECTASTAIN社製）を用いて、ＳＣＮにおけるリポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現を検出した。なお、具体的な染色方法は、上記キットのプロトコールに従った。また、当該抗体染色法に用いた抗リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素抗体としては、PGD2 synthase（T-17）（Santa Cruz社製)を用いた。なお、対照実験としては、抗リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素抗体をその抗原によって吸収したものを用いて抗体染色した。
【００８９】
図４（ａ）〜図４（ｄ）に結果を示す。図４（ａ）および図４（ｂ）に示すように、概日リズムの中枢であるＳＣＮにおいて、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現を検出することができた。一方、図４（ｃ）および図４（ｄ）に示すように、対象実験では、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の染色像が確認できなかったので、図４（ａ）および図４（ｂ）の染色像は、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素特異的な染色像であることが確認できた。
【００９０】
〔脳におけるプロスタグランジンＤ２受容体の発現〕
リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素によって合成されるプロスタグランジンＤ２が作用する脳内領域を特定するために、脳内におけるプロスタグランジンＤ２受容体の脳内分布を抗体染色法によって検討した。
【００９１】
実体顕微鏡下で脳切片からＳＣＮを切り出し、当該脳切片由来のサンプルを用いたウエスタンブロッティング法によって、プロスタグランジンＤ２受容体のＳＣＮにおける発現の有無を検出した。更に具体的には、プロスタグランジンＤ２受容体として、プロスタグランジンＤ２のＩ型受容体（ＤＰ）およびII型受容体（ＣＲＴＨ２）の発現の有無を検出した。なお、Ｉ型受容体の検出には一次抗体としてDP1 Receptor Polyclonal Antibody（Cayman社製）を用い、一方、II型受容体の検出には一次抗体としてCRTH2/DP2(N-Term) Receptor Polyclonal Antibody（Cayman社製）を用いた。
【００９２】
図５に示すように、II型受容体は、野生型マウスおよびＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスの両マウスのＳＣＮにて発現していた。一方、Ｉ型受容体は、野生型マウスのＳＣＮにて発現していた。なお、一次抗体を当該抗体の抗原にて阻害した場合、ウエスタンブロッティング法によって検出されていたバンドが消失したので、検出されたバンドはプロスタグランジンＤ２受容体特異的なバンドであることが確認できた。
【００９３】
〔ＣＲＴＨ２の拮抗薬の検討〕
次いで、ＣＲＴＨ２の拮抗薬が位相前進に及ぼす影響を検討した。
【００９４】
ＣＲＴＨ２の拮抗薬としてはＣＡＹ１０４７１（Cayman社製）を用い、マウスの脳内に１．５ｍｇ／ｋｇ（ｉｃｖ）の量を投与した。なお、マウスの脳内にＣＡＹ１０４７１を投与する方法については以下のとおりである。まず、マウスに対してペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）による麻酔を行い、当該マウスの側脳室（ブレグマより０．４ｍｍ後方かつ１．０ｍｍ右側方、頭蓋表面より深さ２．３ｍｍ）にガイドカニューレおよびダミーカニューレ（深さ４ｍｍ、Eicom社製）を挿入固定した。マウスを明暗条件下で１週間以上飼育して術後の回復を待ち、その後、恒暗条件に移行させて、９日間飼育した。
【００９５】
薬物投与の際はマウスの頭蓋骨に装着したダミーカニューレを取り外し、代わりにテフロンチューブ（０．１（ＩＤ）×０．４（ＯＤ）×５０ｃｍ、Eicom社製）につないだマイクロインジェクションカニューレ（Eicom社製）を挿入した。テフロンチューブの一方をマイクロシリンジポンプにつなぎ、ＤＭＳＯ（Sigma社製）、またはＣＡＹ１０４７１を２５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させたＤＭＳＯを、１μｌ／分の流速にて脳室に投与した。投与終了後さらに１分間待った後、マイクロインジェクションカニューレを取り外し、再びダミーカニューレをキャップナットによって、マウスの頭蓋骨に固定した。なおすべての実験終了後、１％エバンスブルー（３μｌ）をマウスの脳室内に投与して、当該マウスの脳切片を作製した。これによって、薬物の第３脳室内への投与が成功したことを確認し、投与が成功したマウスのデータのみを検討した。
【００９６】
薬物投与の２０分後、マウスの光同調（位相前進）を惹起するために、ＣＴ２１において、マウスに対して白色光を照射した（２０  ｌｘにて３０ｍｉｎ）。つまり、ＣＴ２１に白色光を照射することによって位相前進を誘導した。マウスの経時的活動量を遠赤外線モニター装置（Bio-Medica, Japan）で計測し、公知の方法（例えば、J Comp Physiol A (1976)106:253-266参照）にしたがって、光照射の前後における概日リズムの位相変化の程度を解析した。
【００９７】
その結果、図６に示すように、ＣＡＹ１０４７１が投与されたマウスでは、位相前進が有意に抑制された。したがって、概日リズムの位相前進に、ＣＲＴＨ２が関与することが示された。
【００９８】
プロスタグランジンＤ２が各受容体への結合を介して発揮する生理機能に関しては、ＤＰについては睡眠誘発作用等が（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2001) 98: 11674-11679）、ＣＲＴＨ２については免疫系の作用が（Curr. Top. Med. Chem. (2006) 13: 1427-1444）報告されているのみであり、いずれも体内時計調節への関与は全く報告されていない。したがって、上記知見は本願発明者らによってはじめて見出された知見であって、本願発明はこのような独自に見出した知見に基づいて完成されたものである。
【００９９】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
以上のように、本発明は、リポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現量を指標としてスクリーニングを行うものであって、概日リズムの位相前進性光同調機構を形成する分子、概日リズムの位相前進性光同調機構の活性化物質、または概日リズムの位相前進性光同調機構の不活性化物質を特異的にスクリーニングすることができるのみならず、睡眠相前進性症候群、睡眠相後退性症候群および鬱に代表される精神障害の治療薬をスクリーニングすることができる。
【０１０１】
また、本発明では、薬学的組成物中にプロスタグランジンＤ２、プロスタグランジンＤ２の作用を活性化させる薬物、またはプロスタグランジンＤ２の作用を抑制する薬物を含むので、概日リズムの位相前進性光同調能を調節することができる。その結果、概日リズムまたは非視覚光情報伝達の異常に起因すると考えられる障害を改善する機能補助剤として機能するほか、睡眠相前進性症候群、睡眠相後退性症候群および鬱に代表される精神障害を治療することができる。
【０１０２】
すなわち、本発明は、生体内に概日リズムの位相前進を特異的に誘導することによって体調不全の改善や精神障害を治療するという新規な作用点を有する薬学的組成物、および当該薬学的組成物のスクリーニング方法を提供することができる。
【０１０３】
その結果、本願発明は、電気技術の発展により現代社会で顕在化してきた概日リズム障害に伴う体調不全や、睡眠相前進性症候群、睡眠相後退性症候群および鬱に代表される精神障害の治療を目的とする分野に広く応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】（ａ）は、ＬＣＭによって分離されたＳＣＮの顕微鏡写真であり、（ｂ）は、野生型マウスおよびＰＡＣＡＰ−ＫＯマウスの遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。
【図２】遺伝子発現プロファイリングによって検出された遺伝子の分類を示す図である。
【図３】（ａ）は、ＣＴ２１における各種遺伝子の発現量の変化を示すグラフであり、（ｂ）は、ＣＴ１５における各種遺伝子の発現量の変化を示すグラフである。
【図４】ＳＣＮにおけるリポカリン型プロスタグランジンＤ２合成酵素の発現を示す抗体染色像である。
【図５】ＳＣＮにおけるプロスタグランジンＤ２受容体の発現を示すウエスタンブロッティング像である。
【図６】ＣＲＴＨ２の拮抗薬が位相前進に及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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