(57)【要約】【課題】  エンテロバクター属の微生物を用いてアルドン酸を製造する方法を提供する。本発明により、より効率的にアルドン酸を製造することが可能となる。【解決手段】  ヘミアセタール水酸基を有する糖に、エンテロバクター属の微生物（例えば、エンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１５６）、エンテロバクター・アエロゲネスＮＢＲＣ１３５３４など）の菌体を接触させ、ヘミアセタール水酸基を酸化し基質としたヘミアセタール水酸基を有する糖に対応するアルドン酸を生成することを特徴とするアルドン酸の製造方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘミアセタール水酸基を有する糖に、エンテロバクター属の微生物菌体を接触させ、ヘミアセタール水酸基を酸化しアルドン酸を生成することを特徴とするアルドン酸の製造方法。
【請求項２】
エンテロバクター属の微生物を、ヘミアセタール水酸基を有する糖を含有する培地で培養することにより、培養液中にアルドン酸を蓄積させ、該培養液からアルドン酸を分離することを特徴とするアルドン酸の製造方法。
【請求項３】
エンテロバクター属の微生物が、エンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１(ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１５６)である請求項１又は２記載のアルドン酸の製造方法。
【請求項４】
ヘミアセタール水酸基を有する糖からアルドン酸を生産する能力を有するエンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１５６）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロバクター属に属する微生物を用いたアルドン酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルドン酸の一つであるラクトビオン酸は米国では既にＦＤＡの認可を受け、凝固剤としてプリンのプレミックスに添加されたり、保湿剤として化粧品に利用されている。機能面では、ラクトビオン酸はビフィズス菌選択増殖活性を持ち（例えば、特許文献１参照）、ミネラル吸収促進効果があること（例えば、特許文献２参照）が知られている。
【０００３】
ラクトビオン酸を得るための具体的な方法としては、ラクトースを臭素ナトリウムとともに電気を印加することによって酸化する方法が知られている。また、微生物変換・発酵法により得る方法としては、アシネトバクター属やブルクホルデリア属などの微生物を、ラクトースに作用し酸化することによって得る方法が知られている（例えば、特許文献３参照）。
【特許文献１】特許第３５５９０６３号公報
【特許文献２】特許第３５０１２３７号公報
【特許文献３】特開２００１−２４５６５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来のアシネトバクター属やブルクホルデリア属の微生物を用いたラクトビオン酸の製造方法では、２０％の乳糖溶液から、乳糖をすべてラクトビオン酸に変換するために、１００時間という、長期間の発酵時間が必要であった。その結果、製造コストが高価になる問題点があった。そのため、より短時間で高濃度の乳糖溶液を発酵できる方法が望まれていた。
【０００５】
本発明はエンテロバクター属の微生物を用いて効率よくアルドン酸を製造する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記課題を達成するために、各種微生物のヘミアセタール水酸基の酸化活性を広く検索した結果、エンテロバクター属の微生物が効率的にヘミアセタール水酸基を持つ糖からアルドン酸を製造することを見出し、本発明に至った。エンテロバクター属の微生物がヘミアセタール水酸基を持つ糖からアルドン酸を製造することはこれまでに知られていなかった。
【０００７】
すなわち、本発明の第１は、ヘミアセタール水酸基を有する糖に、エンテロバクター属の微生物菌体を接触させ、ヘミアセタール水酸基を酸化しアルドン酸を生成することを特徴とするアルドン酸の製造方法を要旨とするものであり、好ましくは、エンテロバクター属の微生物が、エンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１(ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１５６)である前記のアルドン酸の製造方法である。
【０００８】
本発明の第２は、エンテロバクター属の微生物を、ヘミアセタール水酸基を有する糖を含有する培地で培養することにより、培養液中にアルドン酸を蓄積させ、該培養液からアルドン酸を分離することを特徴とするアルドン酸の製造方法を要旨とするものであり、好ましくは、エンテロバクター属の微生物が、エンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１(ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１５６)である前記のアルドン酸の製造方法である。
【０００９】
本発明の第３は、ヘミアセタール水酸基を有する糖からアルドン酸を生産する能力を有するエンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１５６）を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、エンテロバクター属の微生物によりアルドン酸を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明において用いられるヘミアセタール水酸基を有する糖とは、その還元末端がアルデヒドである糖をいう。そのようなものの具体例としては、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース等の単糖、セロビオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、メリビオース、ラクトース等のオリゴ糖があげられる。この中でも好ましくは、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、セロビオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、メリビオース及びラクトースであり、特に好ましくはラクトースである。
【００１３】
本発明においてアルドン酸とは、単糖であるアルドースのヘミアセタール水酸基が酸化されたもののほか、還元末端にアルドース構造を有する二糖以上の糖のヘミアセタール水酸基が酸化されたものも含み、さらにこれらの塩の形態も含むものをいう。また、アルドン酸のうちラクトビオン酸とは、遊離のラクトビオン酸のみならず、ラクトビオン酸塩またはラクトビオノラクトンを含むものである。
【００１４】
本発明に用いるエンテロバクター属は、例えば、エンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１（Enterobacter sp. ＫＹＧ−１１）（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１５６）を用いることができる。エンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１は、本発明者らが、自然界から新規に単離した菌体であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１５６（受託日：平成１９年１月１６日）で寄託されている。
【００１５】
エンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１５６）の菌学的特性は、下記に示すとおりである。
（形態的特性）
培養温度：３０℃
形状：短桿菌
大きさ：０．７×０．８μｍ
運動性の有無：あり
胞子の形成：なし
（培養的性質）
コロニーの形：円形
色調：淡黄色
周縁：波状
隆起状態：レンズ状
表面の形状：スムーズ
透明度：不透明
粘稠度：バター様
（生理学的性質）
グラム染色：−
ＭＲテスト：−
カタラーゼ：＋
オキシダーゼ：−
O/F試験：＋
インドール産生：−
クエン酸の利用：＋
アルギニンジヒドロラーゼ：＋
ウレアーゼ：−
エスクリン加水分解：−
ゼラチン加水分解：−
βガラクトシダーゼ：＋
オルニチンデカルボキシラーゼ活性：＋
基質資化能
ブドウ糖  ＋
Ｌ−アラビノース  ＋
Ｄ−マンニトール  ＋
イノシトール  −
Ｄ−ソルビトール  ＋
Ｌ−ラムノース  ＋
スクロース  ＋
Ｄ−メリビオース＋
Ｄ−アミグダリン＋
【００１６】
上記した性質はEnterobacter cancerogenusの性状と類似しており、オルニチンデカルボキシラーゼ活性を示す点以外はほぼ一致した。以上のことから、エンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１はEnterobacterに含まれ、既知種としてはEnetrobacter cancerogenusに比較的近縁と考えられる。しかし、オルニチンデカルボキシラーゼ活性を示すことから、両者が同種となる可能性は低いと推察されたため、エンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１をEnterobacter sp.として上記したように寄託した。 
【００１７】
このように自然界から分離したエンテロバクター属に属する菌株を用いることもできるが、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構の様に、いずれの人の要求に対しても分譲できるような公的な寄託機関によって保存されているエンテロバクター属に属する微生物を使用することもできる。それらには、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスＮＢＲＣ１３５３４やエンテロバクター・クロアカエＮＢＲＣ１３５３５が挙げられる。ただし、用いることのできる菌体は、これらの菌株に限るものではない。
【００１８】
本発明の第１の製造方法は、ヘミアセタール水酸基を有する糖に、エンテロバクター属の微生物菌体を接触させ、菌体中または細胞膜上の酵素によって、ヘミアセタール水酸基を有する糖を酸化し、対応するアルドン酸を生成する方法である。本発明で用いられるエンテロバクター属の微生物菌体には、エンテロバクター属の微生物の生菌体そのまま、あるいは菌体処理物又はそれらを担体に固定化したものがあげられる。
【００１９】
先ずエンテロバクター属の微生物菌体を得るには、培養を行なう必要がある。培地としては、通常の微生物と同様に培養することができる。微生物が通常資化しうる炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラルなどの成分を適宜配合したものが用いられる。炭素源としては、グルコース、果糖などの単糖類、ショ糖、麦芽糖などのオリゴ糖類、デンプン等の多糖類、糖アルコール、グリセロールなどが挙げられ、一般的な炭水化物としては、トウモロコシ澱粉、モルトなどがあり、さらには、オリーブ油、コーン油、などの植物油も炭素源にふくめられる。また、ＣＳＬ（コーンスティーブリカー）や、大豆フレークを用いてもよい。その他、アルコール、有機酸、アルカンの様な炭素化合物でもよい。
【００２０】
窒素源としては、無機、有機どちらの窒素も利用できるが、無機態の窒素はアンモニア塩、硝酸体などを用いる。有機窒素はアミノ酸、たんぱく質または尿素の形で与えられる。天然の有機窒素複合体としては、ＣＳＬ、大豆や、大豆フレーク、ピーナッツミール、綿花ミール、ディスティラーズソルブル（Distillers’solubles）、カゼイン水解物、屠殺場廃棄物、魚粉、酵母エキスなどを使用する。
【００２１】
ビタミンとしては、天然の炭素源、窒素源を用いることで微生物の生育にとって必要なビタミン類は十分に補給できるが、パントテン酸カルシウムや、ビオチン、ビタミンＢ１などを必要に応じて添加する。
【００２２】
ミネラルとしては、マグネシウム、カリウム、カルシウムが必要であるが、さらに、コバルト、銅、鉄、マンガン、モリブデン、亜鉛なども微量ながら必要である。
【００２３】
その他の成分としては、ｐＨのコントロールのために、培養液中に炭酸カルシウムを添加したり、緩衝作用を持たせるために、リン酸塩などを加えてもよい。また、培養系のｐＨを制御するために、アンモニアや、苛性ソーダ、塩酸、硫酸などを添加してよい。
【００２４】
培養は、使用する菌株の最適培養条件で行うことが好ましいが、概略、温度としては、２０〜４０℃が好適であり、ｐＨとしては、塩酸、水酸化ナトリウム水溶液や炭酸カルシウムなどによりｐＨ４〜８に維持することが好ましい。
【００２５】
培養方法としては静置培養、振とう培養、深部通気撹拌培養があげられる。大量培養の場合、回分法、逐次添加培養法、連続培養法を用いた深部通気撹拌培養が好ましい。このような条件で培養を行うと、培養から１５〜１６８時間で十分な量の微生物が得られる。
【００２６】
上記のようにして得られたエンテロバクター属の微生物の生菌体をそのまま用いる場合は、回収した菌体をそのまま用いることができる。エンテロバクター属の微生物の菌体処理物として用いる場合は、アセトン、第四アンモニウム化合物、硫酸ラウリルソーダ、Ｔｗｅｅｎまたは、微生物の細胞壁の特異的な結合を分解する酵素などで処理した菌体、凍結した菌体を減圧下で水分を昇華することで得られる凍結乾燥菌体、ホモジナイザーやガラスビーズを用い、物理的に破砕した菌体破砕物や菌体膜画分、さらには菌体破砕物の上清である無細胞抽出物、これらから酵素を抽出した粗酵素液などを用いることができる。
【００２７】
エンテロバクター属の微生物の菌体あるいは処理物を担体に固定化するには、セルロース担体、セラミック担体、ガラスビーズ担体のような物質に吸着させる方法や、格子構造を持つゲル状物質、たとえば寒天、アルギン酸カルシウム、カラギーナンや、公知のポリマーに包括する方法などが挙げられる。この方法は糖酸化活性を有する微生物菌体や菌体処理物を繰り返し使用することを可能にする。
【００２８】
本発明の第１の製造方法においては、基質となるヘミアセタール水酸基を有する糖を反応溶媒に溶解し、上記したように調製したエンテロバクター属の培養液、菌体、菌体処理物、または菌体や菌体処理物の担体固定化物を加えて必要により反応温度、反応液のｐＨを制御しながら反応させる。反応溶媒としては、イオン交換水、緩衝液などの水性溶媒が使用できる。反応液の基質濃度は特に制限はないが、基質となる前記糖の溶解度、生産性などを考慮すると１０〜５０質量％で実施するのが好ましい。
【００２９】
反応時間に特に制限はないが、通常６〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間で反応が終了する条件を選択することが好ましい。反応ｐＨは、用いる微生物の酵素の至適ｐＨに依存するが、一般的にはｐＨ４〜８の範囲で、特に５〜７が好ましい。また、反応温度は微生物酵素が失活しない条件であればよく、２０〜６０℃が好ましいが、３０〜４５℃がより好ましい。
【００３０】
反応方法としては静置、振とう、深部通気撹拌があげられるが、好気的に反応させることがアルドン酸の収量を上げる上で好都合である。このような条件で反応を行うと、８〜１６８時間で十分な量の生産物が得られる。
【００３１】
以上のようにして得られた反応液から、目的とするアルドン酸を単離精製するには、抽出、カラム分離などの一般的な分離方法を用いることができる。例えば、エタノールを反応液に添加して、目的産物を沈殿し回収する方法、活性炭や、多孔性有機樹脂粒子を用いた吸着クロマトグラフィーや、ゲルろ過、イオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて単離することができる。
【００３２】
また、本発明の第２の製造方法は、エンテロバクター属の微生物を、ヘミアセタール水酸基を有する糖を含有した培地で培養することにより、培養液中にアルドン酸を蓄積させ、培養液からラクトビオン酸を分離するものである。培養に用いられる培地成分としては、培地中にヘミアセタール水酸基を有する糖を含有させる以外は、本発明の第１の製造方法で用いる上記の培地成分が同様に用いられる。ヘミアセタール水酸基を有する糖の含有量としては、０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは、０．５〜２００ｇ／Ｌである。
【００３３】
また、培養条件としては、培養期間が通常１２時間〜１０日間であることを除いて、前記した培養条件と同様に行うことができる。
【００３４】
培養液中に蓄積したアルドン酸は、前述した方法と同様に分離、精製することができる。
【００３５】
本発明の製造方法により製造されたアルドン酸、なかでもラクトビオン酸は、整腸作用、脂質代謝改善作用、ミネラル吸収促進作用、卵殻強化作用を示し、医薬品、飲食品や、飼料として有用である。上記アルドン酸、なかでもラクトビオン酸を医薬品として用いる場合は、当該分野で常套的に用いられている賦形剤、潤沢剤、希釈剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、甘味剤、芳香剤、乳化分散剤などを用いて錠剤、粉剤、水和剤、乳剤として経口的にまたは非経口的に投与することができる。また、上記アルドン酸、なかでもラクトビオン酸を飲食品や、飼料として用いる場合、そのままで、または他の飲食品や飼料に添加もしくは混合して使用することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例のみに限定されるものではない。なお、実施例中、％は、質量％を表す。
【００３７】
実施例において、反応液中あるいは培養液中のラクトビオン酸の定量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い以下の条件により行なった。
ＨＰＬＣ分析条件
カラムAsahipak NH２P−５０（昭和電工社製）
溶離液  アセトニトリル：４０mMクエン酸−NaH2PO4緩衝液（ｐＨ5.0）＝60：40（体積比）
条件  温度：４０℃
流速：0.8ｍL/ｍＬ
検出器：示差屈折計
【００３８】
実施例１、２、比較例１〔菌体を接触させてのラクトビオン酸の生産〕
〔菌体の調製〕
試験管（18 mm×200 mm）に、グルコース0.5％、酵母エキス0.5％、ポリペプトン0.5％、硫酸マグネシウム0.1％（pH7.0)を含む培地3mLを分注し、121℃で20分間殺菌した。その試験管にエンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１５６）（実施例１）、エンテロバクター・アエロゲネスＮＢＲＣ１３５３４（実施例２）および、ブルクホルデリア・セパシアＮｏ.２４−２−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６３２）（比較例１）の一白金耳を植菌し、エンテロバクター属は３７℃、ブルクホルデリア・セパシア  Ｎｏ．２４−２−１は３０℃で１日間振とう培養（220rpm）した。その後、培養液を遠心し菌体を回収した。
【００３９】
〔ラクトビオン酸の生産〕
上記の方法で得られた菌体の全量を２％ラクトース1mLに再懸濁し、40℃で２時間インキュベーションし、反応液中のラクトビオン酸をＨＰＬＣで測定した。
【００４０】
【表１】
2008237100.tif 000003
【００４１】
反応液中のラクトビオン酸濃度を表１に示す。表１に示されたように、ラクトースにエンテロバクター属の微生物菌体を接触させることでラクトースからラクトビオン酸が生産されることが示された。
【００４２】
実施例３〔各種アルドン酸の生産〕
実施例1と同様にして、エンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１５６）の菌体を調製し、ヘミアセタール水酸基を有する糖１２種（Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、セロビオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、ラクトース）の２％水溶液1mLに再懸濁し、40℃で6時間インキュベーションした。反応液中に含まれる各種アルドン酸の定量結果を表２に示した。
【００４３】
【表２】
2008237100.tif 000004
【００４４】
実施例４、比較例２〔ラクトースを含む培地によるラクトビオン酸の生産〕
〔前培養〕
試験管（18 mm×200 mm）に、グルコース0.5％、酵母エキス0.5％、ポリペプトン0.5％、硫酸マグネシウム0.1％（pH7.0)を含む培地3mLを分注し、121℃で20分間殺菌した。その試験管に一白金耳のエンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１５６）（実施例５）及びブルクホルデリア・セパシアＮｏ.２４−２−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６３２）（比較例２）を各々植菌し、エンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１は３７℃、ブルクホルデリア・セパシアＮｏ．２４−２−１は３０℃で1晩振とう培養（220rpm）した。
【００４５】
〔本培養〕
ラクトース20％、酵母エキス0.1％、ポリペプトン5.0％、塩化ナトリウム0.05%、リン酸二カリウム0.1%、硝酸アンモニウム0.2％、硫酸マグネシウム0.05％、炭酸カルシウム3.5％を含む培地を100 ml調製し、500 ml容量坂口フラスコに入れて、121℃で20分間殺菌した。これに上記前培養液を植菌し、所定の温度で、約5日間往復振とう培養した。培養液中に蓄積したラクトビオン酸濃度を図１に示す。図１に示されたように、エンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１はブルクホルデリア・セパシアＮｏ.２４−２−１と較べ、短時間でより多くのラクトビオン酸を培地中に蓄積した。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】エンテロバクター・エスピーＫＹＧ−１１とブルクホルデリア・セパシアＮｏ.２４−２−１によるラクトビオン酸の生成を経時的に測定した結果を示す図である。
【図１】
2008237100.tif 000005