(57)【要約】【課題】本発明は、病変した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を選択的に検出し得る手段を提供する。【解決手段】本発明は、（ａ）変形性関節症（ＯＡ）由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子、（ｂ）関節リウマチ（ＲＡ）由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子、および（ｃ）ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子を検出マーカーとして利用することによって、病変したＭＳＣを検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記表１ａ〜１ｃに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、病変間葉系幹細胞の検出方法。
【表１ａ】
2008092919.tif 000042
【表１ｂ】
2008092919.tif 000043
【表１ｃ】
2008092919.tif 000044
【請求項２】
下記表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、病変間葉系細胞の検出方法。
【表２】
2008092919.tif 000045
【請求項３】
下記表３に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、病変間葉系細胞の検出方法。
【表３】
2008092919.tif 000046
【請求項４】
下記表４に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、病変間葉系細胞の検出方法。
【表４】
2008092919.tif 000047
【請求項５】
下記（ａ１）〜（ｄ１）のいずれかのうち、少なくとも１つ以上が固定されてなる、病変間葉系幹細胞検出用のマイクロアレイ：
（ａ１）下記表５ａ〜表５ｃのいずれかに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ１）下記表５ａ〜表５ｃのいずれかに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；
（ｃ１）上記（ａ１）または（ｂ１）の部分塩基配列を有するポリヌクレオチド；および
（ｄ１）上記（ａ１）〜（ｃ１）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【表５ａ】
2008092919.tif 000048
【表５ｂ】
2008092919.tif 000049
【表５ｃ】
2008092919.tif 000050
【請求項６】
下記（ａ２）〜（ｄ２）のいずれかのうち、少なくとも１つ以上が固定されてなる、病変間葉系幹細胞検出用のマイクロアレイであって、当該病変間葉系幹細胞が変形性関節症由来滑膜細胞である、上記マイクロアレイ：
（ａ２）下記表６に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ２）下記表６に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；
（ｃ２）上記（ａ２）または（ｂ２）の部分塩基配列を有するポリヌクレオチド；および
（ｄ２）上記（ａ２）〜（ｃ２）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【表６】
2008092919.tif 000051
【請求項７】
下記（ａ３）〜（ｄ３）のいずれかのうち、少なくとも１つ以上が固定されてなる、病変間葉系幹細胞検出用のマイクロアレイであって、当該病変間葉系幹細胞が関節リウマチ由来滑膜細胞である、上記マイクロアレイ：
（ａ３）下記表７に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ３）下記表７に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；
（ｃ３）上記（ａ３）または（ｂ３）の部分塩基配列を有するポリヌクレオチド；および
（ｄ３）上記（ａ３）〜（ｃ３）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【表７】
2008092919.tif 000052
【請求項８】
下記（ａ４）〜（ｄ４）のいずれかのうち、少なくとも１つ以上が固定されてなる、病変間葉系幹細胞検出用のマイクロアレイであって、当該病変間葉系幹細胞が変形性関節症由来滑膜細胞および関節リウマチ由来滑膜細胞である、上記マイクロアレイ：
（ａ４）下記表８に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ４）下記表８に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；
（ｃ４）上記（ａ４）または（ｂ４）の部分塩基配列を有するポリヌクレオチド；および
（ｄ４）上記（ａ４）〜（ｃ４）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【表８】
2008092919.tif 000053
【請求項９】
下記（ａ５）〜（ｃ５）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなることを特徴とする病変間葉系幹細胞の検出用プローブ：
（ａ５）下記表９ａ〜表９ｃのいずれかに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ５）下記表９ａ〜表９ｃのいずれかに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；および
（ｃ５）上記（ａ５）または（ｂ５）の部分塩基配列。
【表９ａ】
2008092919.tif 000054
【表９ｂ】
2008092919.tif 000055
【表９ｃ】
2008092919.tif 000056
【請求項１０】
下記（ａ６）〜（ｃ６）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなることを特徴とする病変間葉系幹細胞の検出用プローブであって、当該病変間葉系幹細胞が変形性関節症由来滑膜細胞である、上記検出用プローブ：
（ａ６）下記表１０に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ６）下記表１０に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；および
（ｃ６）上記（ａ６）または（ｂ６）の部分塩基配列。
【表１０】
2008092919.tif 000057
【請求項１１】
下記（ａ７）〜（ｃ７）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなることを特徴とする病変間葉系幹細胞の検出用プローブであって、当該病変間葉系幹細胞が関節リウマチ由来滑膜細胞である、上記検出用プローブ：
（ａ７）下記表１１に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ７）下記表１１に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；および
（ｃ７）上記（ａ７）または（ｂ７）の部分塩基配列。
【表１１】
2008092919.tif 000058
【請求項１２】
下記（ａ８）〜（ｃ８）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなることを特徴とする病変間葉系幹細胞の検出用プローブであって、当該病変間葉系幹細胞が変形性関節症由来滑膜細胞および関節リウマチ由来滑膜細胞である、上記検出用プローブ：
（ａ８）下記表１２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ８）下記表１２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；および
（ｃ８）上記（ａ８）または（ｂ８）の部分塩基配列。
【表１２】
2008092919.tif 000059
【請求項１３】
下記（ａ９）または（ｂ９）に記載のポリペプチドを用いて誘導され、かつ当該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えてなる病変間葉系幹細胞の検出用抗体：
（ａ９）下記表１３ａ〜１３ｃに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるポリペプチドのうち、少なくとも１つ以上のポリペプチド；
（ｂ９）上記（ａ９）の部分ポリペプチド。
【表１３ａ】
2008092919.tif 000060
【表１３ｂ】
2008092919.tif 000061
【表１３ｃ】
2008092919.tif 000062
【請求項１４】
下記（ａ１０）または（ｂ１０）に記載のポリペプチドを用いて誘導され、かつ当該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えてなる病変間葉系幹細胞の検出用抗体であって、当該病変間葉系幹細胞が変形性関節症由来滑膜細胞である、上記検出用抗体：
（ａ１０）下記表１４に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるポリペプチドのうち、少なくとも１つ以上のポリペプチド；
（ｂ１０）上記（ａ１０）の部分ポリペプチド。
【表１４】
2008092919.tif 000063
【請求項１５】
下記（ａ１１）または（ｂ１１）に記載のポリペプチドを用いて誘導され、かつ当該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えてなる病変間葉系幹細胞の検出用抗体であって、当該病変間葉系幹細胞が関節リウマチ由来滑膜細胞である、上記検出用抗体：
（ａ１１）下記表１５に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるポリペプチドのうち、少なくとも１つ以上のポリペプチド；
（ｂ１１）上記（ａ１１）の部分ポリペプチド。
【表１５】
2008092919.tif 000064
【請求項１６】
下記（ａ１２）または（ｂ１２）に記載のポリペプチドを用いて誘導され、かつ当該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えてなる病変間葉系幹細胞の検出用抗体であって、当該病変間葉系幹細胞が変形性関節症由来滑膜細胞および関節リウマチ由来滑膜細胞である、上記検出用抗体：
（ａ１２）下記表１６に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるポリペプチドのうち、少なくとも１つ以上のポリペプチド；
（ｂ１２）上記（ａ１２）の部分ポリペプチド。
【表１６】
2008092919.tif 000065
【請求項１７】
下記表１７ａ〜１７ｄに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする、病変間葉系幹細胞が関連する疾患用治療剤。
【表１７ａ】
2008092919.tif 000066
【表１７ｂ】
2008092919.tif 000067
【表１７ｃ】
2008092919.tif 000068
【表１７ｄ】
2008092919.tif 000069
【請求項１８】
下記表１８に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする、変形性関節症治療剤。
【表１８】
2008092919.tif 000070
【請求項１９】
下記表１９に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする、関節リウマチ治療剤。
【表１９】
2008092919.tif 000071
【請求項２０】
下記表２０に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする、変形性関節症および関節リウマチ治療剤。
【表２０】
2008092919.tif 000072
【請求項２１】
下記表２１に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする、変形性関節症および関節リウマチ治療剤。
【表２１】
2008092919.tif 000073
【請求項２２】
下記表２２ａ〜２２ｃに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
生体から分離した試料において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、病変間葉系幹細胞が関連する疾患の当該生体における発症またはその発症危険性を検出する方法。
【表２２ａ】
2008092919.tif 000074
【表２２ｂ】
2008092919.tif 000075
【表２２ｃ】
2008092919.tif 000076
【請求項２３】
下記表２３に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
生体から分離した試料において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、当該生体における変形性関節症の発症またはその発症危険性を検出する方法。
【表２３】
2008092919.tif 000077
【請求項２４】
下記表２４に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
生体から分離した試料において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、当該生体における関節リウマチの発症またはその発症危険性を検出する方法。
【表２４】
2008092919.tif 000078
【請求項２５】
下記表２５に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
生体から分離した試料において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、当該生体における変形性関節症および関節リウマチの発症またはそれらの発症危険性を検出する方法。
【表２５】
2008092919.tif 000079
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変形性関節症由来滑膜細胞や関節リウマチ由来滑膜細胞をはじめとする病変間葉系幹細胞において高発現する遺伝子、より好ましくは当該病変間葉系幹細胞において選択的に高発現する遺伝子の利用に関する。より具体的には、本発明は、上記遺伝子を検出マーカーとして用いて病変間葉系幹細胞を検出する方法、および上記遺伝子を検出マーカーとして用いて被検体における病変間葉系幹細胞が関連する疾患（例えば、変形性関節症、関節リウマチ等）の発症またはその発症危険性を検出する方法に関する。さらに、本発明は、上記遺伝子を検出するために用いられる手段（例えばマイクロアレイ、プローブ、抗体等）を提供する。
【０００２】
また本発明は、上記遺伝子の発現抑制を行うことによる、病変間葉系幹細胞が関連する疾患（例えば、変形性関節症、関節リウマチ等）の治療剤をも提供する。上記治療薬は、上記遺伝子またはその部分断片に対するｓｉＲＮＡを含み、ＲＮＡｉの原理によって当該遺伝子の発現を抑制する。
【背景技術】
【０００３】
間葉系幹細胞（以下、適宜「ＭＳＣ」と略す）は、哺乳類の骨髄等に存在し、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞に分化する多能性の幹細胞として知られている。間葉系幹細胞は、その分化多能性の故に、多くの組織の再生医療のための移植材料として注目されている。すなわち、間葉系幹細胞を用いて、従来の治療方法では再生しなかった、疾病や障害により失った組織を再生し、機能を回復させる「細胞移植による再生医療」である。具体的には、例えば、下肢虚血（ビュルガー病）患者に対する骨髄間葉系幹細胞の移植、歯周病患部への骨髄間葉系幹細胞の移植、変形性関節症患者に対する骨髄間葉系幹細胞の移植、火傷患部への羊膜上皮シートの移植、糖尿病患者への羊膜幹細胞の移植等の治療が開始または計画されている。
【０００４】
このように間葉系幹細胞を再生医療に利用するためには、まず、幹細胞を生体組織から採取し、それを未分化のまま増殖させ、さらに増殖させた未分化幹細胞を所望の細胞へ分化誘導し、再生治療用の組織の調製を行うことが必要となる。
【０００５】
ここで、本発明者らはこれまでに、間葉系幹細胞の採取に際して、採取母体に安全で、且つ採取が容易な分離採取を行うために、口腔組織から間葉系幹細胞を分離採取する方法を報告している（特許文献１参照）。また、基底膜細胞外基質の存在下において、または線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等の含有培地で間葉系幹細胞を培養することによって、間葉系幹細胞が著しく速く増殖させ、かつ、その分化能を維持できることを見い出して、従来の培養方法と比較して顕著に多くの間葉系幹細胞を得る培養方法を報告している（特許文献２参照）。
【０００６】
さらに、本発明者らは間葉系幹細胞を用いた再生医療を実用化するために、培養した細胞から間葉系幹細胞を識別し、当該間葉系幹細胞を分離する方法を開発した。より具体的には、本発明者らは、形態的に類似しているためにその区別が困難な間葉系幹細胞と線維芽細胞とを、間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカーおよび／または間葉系幹細胞検出用タンパク質マーカーを用いて効果的に識別し、分離する方法を開発した（特許文献３参照）。また本発明者らは、分子マーカーを用いて、未分化の間葉系幹細胞と、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞等の他の結合組織系の細胞とを精度よく識別し、未分化の間葉系幹細胞を分離する方法を開発した（国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０６６５８、国際出願日２００６年３月３０日）。
【０００７】
ところで、変形性関節症（以下「ＯＡ」という）や関節リウマチ（以下「ＲＡ」という）由来の滑膜細胞が、骨、軟骨、脂肪などへの分化能を有していることが、最近報告された（非特許文献１参照）。また本発明者らによる検討によっても、ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞が多分化能を有していることが確認され、ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞は病的に変化したＭＳＣ（「病変ＭＳＣ」ともいう）であるということが明らかとなった。また上記病変ＭＳＣが有する異常な増殖能および分化能によって、関節症が悪化することも知られている（非特許文献２参照）。
【０００８】
したがって、ＭＳＣを用いた再生医療においてより安全を期すためには、上記病変ＭＳＣを検出し、病変ＭＳＣを再生医療へ適用することを未然に防ぐ必要がある。つまり、病変ＭＳＣを検出し得る手段、より好ましくは病変ＭＳＣを選択的に検出し得る手段が必要となる。
【０００９】
ところで、病変ＭＳＣが関連する疾患であるＯＡおよびＲＡは、不治の慢性疾患として知られており、各所で当該疾患の診断方法や治療薬の開発が模索されている。しかし、上記疾患の診断は、医師の経験によって判断されているのが現状であり、有効な診断方法は確立されていない。また上記疾患の治療薬としてステロイドやメソトレキセートなどが現在用いられているが、これらの薬剤は副作用が強いという欠点を有している。一方、上記疾患の治療薬として生物製剤（例えば炎症性サイトカインを標的としたもの）が用いられる場合があるが、生物製剤は高価である上に、病変ＭＳＣ特異的でないため肺炎などの感染症を併発し易いという欠点を有している。よって、上記疾患の治療薬として十分なものが開発されるに至っていないというのが現状である。
【特許文献１】特開２００３−５２３６５号公報（公開日：平成１５（２００３）年２月２５日）
【特許文献２】特開２００３−５２３６０号公報（公開日：平成１５（２００３）年２月２５日）
【特許文献３】特開２００５−２７５７９号公報（公開日：平成１７（２００５）年２月３日）
【非特許文献１】Arthritis Rheum. 2005 Aug;52(8):2521-9. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source.Sakaguchi Y, Sekiya I, Yagishita K, Muneta T.
【非特許文献２】「骨、関節疾患」宮坂信之、野田政樹、西岡久寿樹（編集）、３関節リウマチ、p２１８-２２７、２００３年、朝倉書店
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、ＭＳＣを用いた再生医療においてより安全を期すべく、病変ＭＳＣを選択的に検出し得る手段を提供することを目的とした。より具体的には、ＯＡ由来滑膜細胞やＲＡ由来滑膜細胞をはじめとする病変ＭＳＣにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子を見出し、上記遺伝子を検出マーカーとして用いて病変ＭＳＣを検出する方法、および上記遺伝子を検出マーカーとして用いて被検体における病変ＭＳＣが関連する疾患（例えば、ＯＡ、ＲＡ等）の発症またはその発症危険性を検出する方法を提供することを、本発明は目的とした。さらに、本発明は、上記遺伝子を検出するために用いられる手段（例えばマイクロアレイ、プローブ、抗体等）を提供することを目的とした。また本発明は、上記遺伝子の発現抑制を行うことを作用機序とする、病変ＭＳＣが関連する疾患（例えば、ＯＡ、ＲＡ等）の治療剤を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、正常ＭＳＣ、線維芽細胞（以下「ＦＢ」という）、骨芽細胞（以下「ＯＳ」という）、軟骨細胞（以下「ＣＨ」という）、脂肪細胞（以下「ＡＤ」という）、ＯＡ由来滑膜細胞、およびＲＡ由来滑膜細胞において、ＤＮＡマイクロアレイを用いて各種遺伝子の発現プロファイルを調べたところ、
（ａ）ＯＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子、
（ｂ）ＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子、
（ｃ）ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子、並びに
（ｄ）正常ＭＳＣ、ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子が存在するという新規知見を得た。そして本発明者らは、定量的ＲＴ-ＰＣＲ法によって、上記遺伝子の中から各細胞において特異的発現が観察される遺伝子をさらに選抜し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、以下の発明を包含する。なお、以下の説明において、上記（ａ）の遺伝子のことを「グループａの遺伝子」と称し、上記（ｂ）の遺伝子のことを「グループｂの遺伝子」と称し、上記(ｃ)の遺伝子のことを「グループｃの遺伝子」と称し、上記(ｄ)の遺伝子のことを「グループｄの遺伝子」と称する。
【００１２】
（１）下記表１ａ〜１ｃに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、病変間葉系幹細胞の検出方法。
【００１３】
【表１ａ】
2008092919.tif 000002
【００１４】
【表１ｂ】
2008092919.tif 000003
【００１５】
【表１ｃ】
2008092919.tif 000004
【００１６】
表１ａに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループａの遺伝子であり、表１ｂに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｂの遺伝子であり、表１ｃに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｃの遺伝子である。よって、被検細胞において、上記グループａ〜ｃの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出することによって、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを検出することができる。
【００１７】
（２）下記表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、病変間葉系細胞の検出方法。
【００１８】
【表２】
2008092919.tif 000005
【００１９】
表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループａの遺伝子である。よって、被検細胞において、グループａの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出することによって、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを検出することができる。特にグループａの遺伝子は、ＯＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子であるため、本検出方法によれば、被検細胞にＯＡ由来滑膜細胞が含まれているか否かを検出することができる。
【００２０】
（３）下記表３に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、病変間葉系細胞の検出方法。
【００２１】
【表３】
2008092919.tif 000006
【００２２】
表３に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｂの遺伝子である。よって、被検細胞において、グループｂの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出することによって、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを検出することができる。特にグループｂの遺伝子は、ＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子であるため、本検出方法によれば、被検細胞にＲＡ由来滑膜細胞が含まれているか否かを検出することができる。
【００２３】
（４）下記表４に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、病変間葉系細胞の検出方法。
【００２４】
【表４】
2008092919.tif 000007
【００２５】
表４に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｃの遺伝子である。よって、被検細胞において、グループｃの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出することによって、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを検出することができる。特にグループｃの遺伝子は、ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子であるため、本検出方法によれば、被検細胞にＯＡ由来滑膜細胞および／またはＲＡ由来滑膜細胞が含まれているか否かを検出することができる。
【００２６】
（５）下記（ａ１）〜（ｄ１）のいずれかのうち、少なくとも１つ以上が固定されてなる、病変間葉系幹細胞検出用のマイクロアレイ：
（ａ１）下記表５ａ〜表５ｃのいずれかに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ１）下記表５ａ〜表５ｃのいずれかに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；
（ｃ１）上記（ａ１）または（ｂ１）の部分塩基配列を有するポリヌクレオチド；および
（ｄ１）上記（ａ１）〜（ｃ１）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２７】
【表５ａ】
2008092919.tif 000008
【００２８】
【表５ｂ】
2008092919.tif 000009
【００２９】
【表５ｃ】
2008092919.tif 000010
【００３０】
表５ａに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループａの遺伝子であり、表５ｂに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｂの遺伝子であり、表５ｃに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｃの遺伝子である。よって、上記マイクロアレイは、被検細胞において、上記グループａ〜ｃの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出する際に用いられ得る。それゆえ、上記マイクロアレイによれば、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを効率良く検出することができる。
【００３１】
（６）下記（ａ２）〜（ｄ２）のいずれかのうち、少なくとも１つ以上が固定されてなる、病変間葉系幹細胞検出用のマイクロアレイであって、当該病変間葉系幹細胞が変形性関節症由来滑膜細胞である、上記マイクロアレイ：
（ａ２）下記表６に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ２）下記表６に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；
（ｃ２）上記（ａ２）または（ｂ２）の部分塩基配列を有するポリヌクレオチド；および
（ｄ２）上記（ａ２）〜（ｃ２）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００３２】
【表６】
2008092919.tif 000011
【００３３】
表６に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループａの遺伝子である。よって、上記マイクロアレイは、被検細胞において、上記グループａの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出する際に用いられ得る。それゆえ、上記マイクロアレイによれば、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを効率良く検出することができる。特にグループａの遺伝子は、ＯＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子であるため、上記マイクロアレイによれば、被検細胞にＯＡ由来滑膜細胞が含まれているか否かを効率良く検出することができる。
【００３４】
（７）下記（ａ３）〜（ｄ３）のいずれかのうち、少なくとも１つ以上が固定されてなる、病変間葉系幹細胞検出用のマイクロアレイであって、当該病変間葉系幹細胞が関節リウマチ由来滑膜細胞である、上記マイクロアレイ：
（ａ３）下記表７に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ３）下記表７に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；
（ｃ３）上記（ａ３）または（ｂ３）の部分塩基配列を有するポリヌクレオチド；および
（ｄ３）上記（ａ３）〜（ｃ３）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００３５】
【表７】
2008092919.tif 000012
【００３６】
表７に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｂの遺伝子である。よって、上記マイクロアレイは、被検細胞において、上記グループｂの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出する際に用いられ得る。それゆえ、上記マイクロアレイによれば、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを効率良く検出することができる。特にグループｂの遺伝子は、ＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子であるため、上記マイクロアレイによれば、被検細胞にＲＡ由来滑膜細胞が含まれているか否かを効率良く検出することができる。
【００３７】
（８）下記（ａ４）〜（ｄ４）のいずれかのうち、少なくとも１つ以上が固定されてなる、病変間葉系幹細胞検出用のマイクロアレイであって、当該病変間葉系幹細胞が変形性関節症由来滑膜細胞および関節リウマチ由来滑膜細胞である、上記マイクロアレイ：
（ａ４）下記表８に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ４）下記表８に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；
（ｃ４）上記（ａ４）または（ｂ４）の部分塩基配列を有するポリヌクレオチド；および
（ｄ４）上記（ａ４）〜（ｃ４）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００３８】
【表８】
2008092919.tif 000013
【００３９】
表８に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｃの遺伝子である。よって、上記マイクロアレイは、被検細胞において、上記グループｃの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出する際に用いられ得る。それゆえ、上記マイクロアレイによれば、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを効率良く検出することができる。特にグループｃの遺伝子は、ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子であるため、上記マイクロアレイによれば、被検細胞にＯＡ由来滑膜細胞および／またはＲＡ由来滑膜細胞が含まれているか否かを効率良く検出することができる。
【００４０】
（９）下記（ａ５）〜（ｃ５）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなることを特徴とする病変間葉系幹細胞の検出用プローブ：
（ａ５）下記表９ａ〜表９ｃのいずれかに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ５）下記表９ａ〜表９ｃのいずれかに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；および
（ｃ５）上記（ａ５）または（ｂ５）の部分塩基配列。
【００４１】
【表９ａ】
2008092919.tif 000014
【００４２】
【表９ｂ】
2008092919.tif 000015
【００４３】
【表９ｃ】
2008092919.tif 000016
【００４４】
表９ａに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループａの遺伝子であり、表９ｂに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｂの遺伝子であり、表９ｃに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｃの遺伝子である。よって、上記プローブは、被検細胞において、上記グループａ〜ｃの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出する際に用いられ得る。それゆえ、上記プローブによれば、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを効率良く検出することができる。
【００４５】
（１０）下記（ａ６）〜（ｃ６）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなることを特徴とする病変間葉系幹細胞の検出用プローブであって、当該病変間葉系幹細胞が変形性関節症由来滑膜細胞である、上記検出用プローブ：
（ａ６）下記表１０に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ６）下記表１０に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；および
（ｃ６）上記（ａ６）または（ｂ６）の部分塩基配列。
【００４６】
【表１０】
2008092919.tif 000017
【００４７】
表１０に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループａの遺伝子である。よって、上記プローブは、被検細胞において、上記グループａの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出する際に用いられ得る。それゆえ、上記プローブによれば、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを効率良く検出することができる。特にグループａの遺伝子は、ＯＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子であるため、上記プローブによれば、被検細胞にＯＡ由来滑膜細胞が含まれているか否かを効率良く検出することができる。
【００４８】
（１１）下記（ａ７）〜（ｃ７）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなることを特徴とする病変間葉系幹細胞の検出用プローブであって、当該病変間葉系幹細胞が関節リウマチ由来滑膜細胞である、上記検出用プローブ：
（ａ７）下記表１１に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ７）下記表１１に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；および
（ｃ７）上記（ａ７）または（ｂ７）の部分塩基配列。
【００４９】
【表１１】
2008092919.tif 000018
【００５０】
表１１に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｂの遺伝子である。よって、上記プローブは、被検細胞において、上記グループｂの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出する際に用いられ得る。それゆえ、上記プローブによれば、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを効率良く検出することができる。特にグループｂの遺伝子は、ＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子であるため、上記プローブによれば、被検細胞にＲＡ由来滑膜細胞が含まれているか否かを効率良く検出することができる。
【００５１】
（１２）下記（ａ８）〜（ｃ８）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなることを特徴とする病変間葉系幹細胞の検出用プローブであって、当該病変間葉系幹細胞が変形性関節症由来滑膜細胞および関節リウマチ由来滑膜細胞である、上記検出用プローブ：
（ａ８）下記表１２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ８）下記表１２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；および
（ｃ８）上記（ａ８）または（ｂ８）の部分塩基配列。
【００５２】
【表１２】
2008092919.tif 000019
【００５３】
表１２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｃの遺伝子である。よって、上記プローブは、被検細胞において、上記グループｃの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出する際に用いられ得る。それゆえ、上記プローブによれば、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを効率良く検出することができる。特にグループｃの遺伝子は、ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子であるため、上記プローブによれば、被検細胞にＯＡ由来滑膜細胞および／またはＲＡ由来滑膜細胞が含まれているか否かを効率良く検出することができる。
【００５４】
（１３）下記（ａ９）または（ｂ９）に記載のポリペプチドを用いて誘導され、かつ当該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えてなる病変間葉系幹細胞の検出用抗体：
（ａ９）下記表１３ａ〜１３ｃに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるポリペプチドのうち、少なくとも１つ以上のポリペプチド；
（ｂ９）上記（ａ９）の部分ポリペプチド。
【００５５】
【表１３ａ】
2008092919.tif 000020
【００５６】
【表１３ｂ】
2008092919.tif 000021
【００５７】
【表１３ｃ】
2008092919.tif 000022
【００５８】
表１３ａに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループａの遺伝子であり、表１３ｂに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｂの遺伝子であり、表１３ｃに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｃの遺伝子である。よって、上記検出用抗体は、被検細胞において、上記グループａ〜ｃの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を、当該遺伝子がコードするポリペプチドの発現をもって検出する際に用いられ得る。それゆえ、上記検出用抗体によれば、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを効率良く検出することができる。
【００５９】
（１４）下記（ａ１０）または（ｂ１０）に記載のポリペプチドを用いて誘導され、かつ当該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えてなる病変間葉系幹細胞の検出用抗体であって、当該病変間葉系幹細胞が変形性関節症由来滑膜細胞である、上記検出用抗体：
（ａ１０）下記表１４に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるポリペプチドのうち、少なくとも１つ以上のポリペプチド；
（ｂ１０）上記（ａ１０）の部分ポリペプチド。
【００６０】
【表１４】
2008092919.tif 000023
【００６１】
表１４に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループａの遺伝子である。よって、上記検出用抗体は、被検細胞において、上記グループａの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を、当該遺伝子がコードするポリペプチドの発現をもって検出する際に用いられ得る。それゆえ、上記検出用抗体によれば、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを効率良く検出することができる。特にグループａの遺伝子は、ＯＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子であるため、上記検出用抗体によれば、被検細胞にＯＡ由来滑膜細胞が含まれているか否かを効率良く検出することができる。
【００６２】
（１５）下記（ａ１１）または（ｂ１１）に記載のポリペプチドを用いて誘導され、かつ当該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えてなる病変間葉系幹細胞の検出用抗体であって、当該病変間葉系幹細胞が関節リウマチ由来滑膜細胞である、上記検出用抗体：
（ａ１１）下記表１５に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるポリペプチドのうち、少なくとも１つ以上のポリペプチド；
（ｂ１１）上記（ａ１１）の部分ポリペプチド。
【００６３】
【表１５】
2008092919.tif 000024
【００６４】
表１５に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｂの遺伝子である。よって、上記検出用抗体は、被検細胞において、上記グループｂの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を、当該遺伝子がコードするポリペプチドの発現をもって検出する際に用いられ得る。それゆえ、上記検出用抗体によれば、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを効率良く検出することができる。特にグループｂの遺伝子は、ＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子であるため、上記抗体によれば、被検細胞にＲＡ由来滑膜細胞が含まれているか否かを効率良く検出することができる。
【００６５】
（１６）下記（ａ１２）または（ｂ１２）に記載のポリペプチドを用いて誘導され、かつ当該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えてなる病変間葉系幹細胞の検出用抗体であって、当該病変間葉系幹細胞が変形性関節症由来滑膜細胞および関節リウマチ由来滑膜細胞である、上記検出用抗体：
（ａ１２）下記表１６に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるポリペプチドのうち、少なくとも１つ以上のポリペプチド；
（ｂ１２）上記（ａ１２）の部分ポリペプチド。
【００６６】
【表１６】
2008092919.tif 000025
【００６７】
表１６に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｃの遺伝子である。よって、上記検出用抗体は、被検細胞において、上記グループｃの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を、当該遺伝子がコードするポリペプチドの発現をもって検出する際に用いられ得る。それゆえ、上記検出用抗体によれば、被検細胞に病変ＭＳＣが含まれているか否かを効率良く検出することができる。特にグループｃの遺伝子は、ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子であるため、上記抗体によれば、被検細胞にＯＡ由来滑膜細胞および／またはＲＡ由来滑膜細胞が含まれているか否かを効率良く検出することができる。
【００６８】
（１７）下記表１７ａ〜１７ｄに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする、病変間葉系幹細胞が関連する疾患用治療剤。
【００６９】
【表１７ａ】
2008092919.tif 000026
【００７０】
【表１７ｂ】
2008092919.tif 000027
【００７１】
【表１７ｃ】
2008092919.tif 000028
【００７２】
【表１７ｄ】
2008092919.tif 000029
【００７３】
表１７ａに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループａの遺伝子であり、表１７ｂに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｂの遺伝子であり、表１７ｃに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｃの遺伝子であり、表１７ｄに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｄの遺伝子である。上記いずれかの遺伝子またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡによれば、ＲＮＡｉの原理によって当該遺伝子の発現を抑制することができ、病変ＭＳＣが関連する疾患の治療および予防を行うことができる。なお、本明細書における「治療剤」とは、発症した疾患の治療に用いられる薬剤のみならず、疾患の予防に用いられる薬剤をも含む意味である。
【００７４】
（１８）下記表１８に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする、変形性関節症治療剤。
【００７５】
【表１８】
2008092919.tif 000030
【００７６】
表１８に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループａの遺伝子である。上記いずれかの遺伝子またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡによれば、ＲＮＡｉの原理によって当該遺伝子の発現を抑制することができ、病変ＭＳＣが関連する疾患、特にＯＡの治療および予防を行うことができる。
【００７７】
（１９）下記表１９に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする、関節リウマチ治療剤。
【００７８】
【表１９】
2008092919.tif 000031
【００７９】
表１９に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｂの遺伝子である。上記いずれかの遺伝子またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡによれば、ＲＮＡｉの原理によって当該遺伝子の発現を抑制することができ、病変ＭＳＣが関連する疾患、特にＲＡの治療および予防を行うことができる。
【００８０】
（２０）下記表２０に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする変形性関節症および関節リウマチ治療剤。
【００８１】
【表２０】
2008092919.tif 000032
【００８２】
表２０に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｃの遺伝子である。上記いずれかの遺伝子またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡによれば、ＲＮＡｉの原理によって当該遺伝子の発現を抑制することができ、病変ＭＳＣが関連する疾患、特にＯＡおよびＲＡの治療および予防を行うことができる。
【００８３】
（２１）下記表２１に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする、変形性関節症および関節リウマチ治療剤。
【００８４】
【表２１】
2008092919.tif 000033
【００８５】
表２１に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｄの遺伝子である。上記いずれかの遺伝子またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡによれば、ＲＮＡｉの原理によって当該遺伝子の発現を抑制することができ、病変ＭＳＣが関連する疾患、特にＯＡおよびＲＡの治療および予防を行うことができる。
【００８６】
（２２）下記表２２ａ〜２２ｃに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
生体から分離した試料において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、病変ＭＳＣが関連する疾患の当該生体における発症またはその発症危険性を検出する方法。
【００８７】
【表２２ａ】
2008092919.tif 000034
【００８８】
【表２２ｂ】
2008092919.tif 000035
【００８９】
【表２２ｃ】
2008092919.tif 000036
【００９０】
表２２ａに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループａの遺伝子であり、表２２ｂに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｂの遺伝子であり、表２２ｃに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｃの遺伝子である。
【００９１】
したがって、被検細胞において、上記グループａ〜ｃの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出することによって、試料中に病変ＭＳＣが含まれているか否かを検出することができる。よって上記方法によれば、病変ＭＳＣが関連する疾患の発症またはその発症危険性を検出することができる。
【００９２】
（２３）下記表２３に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
生体から分離した試料において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、当該生体における変形性関節症の発症またはその発症危険性を検出する方法。
【００９３】
【表２３】
2008092919.tif 000037
【００９４】
表２３に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループａの遺伝子である。よって、被検細胞において、上記グループａの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出することによって、試料中に病変ＭＳＣが含まれているか否かを検出することができる。よって上記方法によれば、病変ＭＳＣが関連する疾患、特にＯＡの発症またはその発症危険性を検出することができる。
【００９５】
（２４）下記表２４に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
生体から分離した試料において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、当該生体における関節リウマチの発症またはその発症危険性を検出する方法。
【００９６】
【表２４】
2008092919.tif 000038
【００９７】
表２４に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｂの遺伝子である。よって、被検細胞において、上記グループｂの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出することによって、試料中に病変ＭＳＣが含まれているか否かを検出することができる。よって上記方法によれば、病変ＭＳＣが関連する疾患、特にＲＡの発症またはその発症危険性を検出することができる。
【００９８】
（２５）下記表２５に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
生体から分離した試料において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、当該生体における変形性関節症および関節リウマチの発症またはそれらの発症危険性を検出する方法。
【００９９】
【表２５】
2008092919.tif 000039
【０１００】
表２５に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子はグループｃの遺伝子である。よって、被検細胞において、上記グループｃの遺伝子のいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出することによって、試料中に病変ＭＳＣが含まれているか否かを検出することができる。よって上記方法によれば、病変ＭＳＣが関連する疾患、特にＯＡおよびＲＡの発症またはその発症危険性を検出することができる。
【発明の効果】
【０１０１】
本発明によれば、正常なＭＳＣ、ＦＢ、ＯＳ、ＣＨおよびＡＤでは発現せず、ＯＡ由来滑膜細胞やＲＡ由来滑膜細胞をはじめとする病変ＭＳＣにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子を検出マーカーとして利用することによって、病変ＭＳＣを選択的に検出し得る手段を提供することができる。よって、病変ＭＳＣを再生医療へ適用することを未然に防ぐことができるという効果を本発明は奏する。
【０１０２】
また本発明によれば、病変ＭＳＣが関連する疾患（例えば、ＯＡ、ＲＡ等）の治療剤として有効なものを提供することができる。上記治療薬は、病変ＭＳＣを標的とするものであるため、効率良く疾患の治療および予防を行うことができるとともに、副作用も少ないことが期待できる。
【０１０３】
したがって本発明は、ＭＳＣを用いた再生医療の実用化に大きく貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え生成されても、化学合成されてもよい。また、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。また、「遺伝子」には、ＤＮＡのみならず、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）をも含む意味である。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「遺伝子配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【０１０５】
＜１．病変ＭＳＣの検出方法＞
本発明に係る病変ＭＳＣの検出方法（以下「本発明の検出方法」という）の一態様は、上記表１ａ〜１ｃに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含む方法である。また本発明の検出方法の一態様は、上記表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含む方法である。また本発明の検出方法の一態様は、上記表３に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含む方法である。また本発明の検出方法の一態様は、上記表４に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含む方法である。本発明に係る病変ＭＳＣの検出方法は、上記の工程が少なくとも含まれていればよく、その他の工程、条件、使用材料、使用機器等の具体的な構成については特に限定されるものではない。
【０１０６】
本発明の検出方法において使用する「被検細胞」は、本発明の検出方法が適用され得る細胞であれば特に限定されるものではない。例えば、ＭＳＣが含まれている、またはＭＳＣが含まれている可能性がある細胞であって、病変ＭＳＣが含まれているか否かの判断を行う必要がある細胞が挙げられる。より具体的には、公知の方法（例えば特許文献１に記載の方法）によって採取母体から採取されたＭＳＣ、公知の方法（例えば特許文献２に記載の方法）によって培養されたＭＳＣ等が本発明の方法の被検細胞として適用され得る。
【０１０７】
本発明者らは、正常ＭＳＣ、ＦＢ、ＯＳ、ＣＨ、ＡＤ、ＯＡ由来滑膜細胞、およびＲＡ由来滑膜細胞において、ＤＮＡマイクロアレイを用いて各種遺伝子の発現プロファイルを調べたところ、以下の遺伝子が存在するという新規知見を得た：
（ａ）グループａの遺伝子：ＯＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子、
（ｂ）グループｂの遺伝子：ＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子、
（ｃ）グループｃの遺伝子：ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子、並びに
（ｄ）グループｄの遺伝子：正常ＭＳＣ、ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子。
【０１０８】
グループａの遺伝子は、ＯＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子である。すなわち、グループａの遺伝子は、正常ＭＳＣ、ＦＢ、ＯＳ、ＣＨ、ＡＤ、およびＲＡ由来滑膜細胞においてその発現量が相対的に低く、かつＯＡ由来滑膜細胞においてのみその発現量が相対的に高い遺伝子であるといえる。したがって、被検細胞においてグループａの遺伝子の発現を検出し、その発現量が相対的に高いということが検出されれば、当該被検細胞は病変ＭＳＣ、特にＯＡ由来滑膜細胞（ＯＡ由来滑膜細胞様に病変したＭＳＣを含む）を含む細胞であるということが判断できる。つまり、グループａの遺伝子は病変ＭＳＣ検出用の検出マーカーとして利用し得るということである。ここで被検細胞においてグループａの遺伝子の発現量が相対的に高いか否かの判断は、適当な比較対照細胞（正常ＭＳＣ、ＦＢ、ＯＡ由来間葉系細胞、ＲＡ由来間葉系細胞）における遺伝子の発現量と対比することで判断すればよい。また、発現量の基準値をあらかじめ設定しておき、当該基準値を基準として、上記判断が行なわれてもよい。すなわち被検細胞におけるグループａの遺伝子の発現量が、基準値より高ければ当該遺伝子の発現量が高いと判断し、基準値より低ければ当該遺伝子の発現量が低いと判断される。なお、グループａの遺伝子は、上記表１ａまたは表２に記載されている。ただし表１ａと表２とは同一である。
【０１０９】
またグループｂの遺伝子は、ＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子である。すなわち、グループｂの遺伝子は、正常ＭＳＣ、ＦＢ、ＯＳ、ＣＨ、ＡＤ、およびＯＡ由来滑膜細胞においてその発現量が相対的に低く、かつＲＡ由来滑膜細胞においてのみその発現量が相対的に高い遺伝子であるといえる。したがって、被検細胞においてグループｂの遺伝子の発現を検出し、その発現量が相対的に高いということが検出されれば、当該被検細胞は病変ＭＳＣ、特にＲＡ由来滑膜細胞（ＲＡ由来滑膜細胞様に病変したＭＳＣを含む）を含む細胞であるということが判断できる。つまり、グループｂの遺伝子は病変ＭＳＣ検出用の検出マーカーとして利用し得るということである。被検細胞においてグループｂの遺伝子の発現量が高いか否かの判断方法ついては、グループａの遺伝子の場合に準じて行えばよい。なお、グループｂの遺伝子は、上記表１ｂまたは表３に記載されている。ただし表１ｂと表３とは同一である。
【０１１０】
またグループｃの遺伝子は、ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子である。すなわち、グループｃの遺伝子は、正常ＭＳＣ、、ＦＢ、ＯＳ、ＣＨ、およびＡＤにおいてその発現量が相対的に低く、かつＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞においてその発現量が相対的に高い遺伝子であるといえる。したがって、被検細胞においてグループｃの遺伝子の発現を検出し、その発現量が相対的に高いということが検出されれば、当該被検細胞は病変ＭＳＣ、特にＯＡ由来滑膜細胞（ＯＡ由来滑膜細胞様に病変したＭＳＣを含む）またはＲＡ由来滑膜細胞（ＲＡ由来滑膜細胞様に病変したＭＳＣを含む）を含む細胞であるということが判断できる。つまり、グループｃの遺伝子は病変ＭＳＣ検出用の検出マーカーとして利用し得るということである。被検細胞においてグループｃの遺伝子の発現量が高いか否かの判断方法ついては、グループａの遺伝子に準じて行えばよい。なお、グループｃの遺伝子は、上記表１ｃまたは表４に記載されている。ただし表１ｃと表４とは同一である。
【０１１１】
またグループｄの遺伝子は、正常ＭＳＣ、ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞において選択的に発現が亢進されている遺伝子である。すなわち、グループｄの遺伝子は、ＦＢ、ＯＳ、ＣＨおよびＡＤにおいてその発現量が相対的に低く、かつ正常ＭＳＣ、ＯＡ由来滑膜細胞、およびＲＡ由来滑膜細胞においてその発現量が相対的に高い遺伝子であるといえる。したがって、被検細胞においてグループｄの遺伝子の発現を検出し、その発現量が相対的に高いということが検出されれば、当該被検細胞は正常ＭＳＣまたは病変ＭＳＣを含む細胞であるということが判断できる。よって、グループｄの遺伝子を検出するのみでは、被検細胞が正常ＭＳＣであるか病変ＭＳＣであるかを識別することはできないが、少なくとも被検細胞が分化能を有するＭＳＣであることを判断することができる。つまり、グループｄの遺伝子は正常ＭＳＣまたは病変ＭＳＣ検出用の検出マーカーとして利用し得るということである。すなわちグループｄの遺伝子は、ＭＳＣ以外にＦＢ、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などの種々の細胞が含まれている細胞集団から、ＭＳＣを識別する際に用いられる。ここで被検細胞においてグループｄの遺伝子の発現量が高いか否かの判断方法ついては、グループａの遺伝子の場合に準じて行えばよい。なお、グループｄの遺伝子は、上記表１７ｄに記載されている。
【０１１２】
ここで、上記表１ａ〜表１ｃおよび表１７ｄ中、「No.」は通し番号を、「Common Name」は一般的な遺伝子の略称を、「Description」は遺伝子に関連する詳細情報を、「GenBank Accession No.」はGenBankのアクセッション番号をそれぞれ示している（その他同様の項目を有する表において同じ）。
【０１１３】
上記表１ａ〜表１ｃおよび表１７ｄに記載されている遺伝子群の塩基配列および当該遺伝子群がコードするタンパク質のアミノ酸配列情報は既に公知であり、特に、遺伝子群の塩基配列情報は、GenBankの遺伝子データベースにおいて、上記表１ａ〜表１ｃおよび１７ｄに記載のアクセッション番号によりアプローチすることができる。
【０１１４】
本発明の検出方法においては、表１ａ〜表１ｃに記載されている遺伝子のうち１つ以上を検出することにより本発明の目的を達成し得るが、２つ以上の遺伝子を適宜組み合わせて検出することが好ましい。２つ以上の遺伝子を検出することによって、病変ＭＳＣの検出精度を向上させることができる。
【０１１５】
本発明の検出方法において、上記検出マーカーの遺伝子の発現を検出する際には、遺伝子の発現の検出に用いられる従来公知の方法を好適に用いることができる。例えば、下記（ａ１）〜（ｄ１）のいずれかを、少なくとも１つ以上が固定されてなる病変ＭＳＣ検出用のマイクロアレイを用いて検出マーカーの遺伝子の発現を検出することができる：
（ａ１）上記表５ａ〜表５ｃのいずれかに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ１）上記表５ａ〜表５ｃのいずれかに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；
（ｃ１）上記（ａ１）または（ｂ１）の部分塩基配列を有するポリヌクレオチド；および
（ｄ１）上記（ａ１）〜（ｃ１）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【０１１６】
また、下記（ａ２）〜（ｄ２）のいずれかを、少なくとも１つ以上が固定されてなる病変ＭＳＣ検出用のアレイを用いて検出マーカーの遺伝子の発現を検出することができる：
（ａ２）上記表６に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ２）上記表６に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；
（ｃ２）上記（ａ２）または（ｂ２）の部分塩基配列を有するポリヌクレオチド；および
（ｄ２）上記（ａ２）〜（ｃ２）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【０１１７】
また、下記（ａ３）〜（ｄ３）のいずれかを、少なくとも１つ以上が固定されてなる病変ＭＳＣ検出用のマイクロアレイを用いて検出マーカーの遺伝子の発現を検出することができる：
（ａ３）上記表７に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ３）上記表７に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；
（ｃ３）上記（ａ３）または（ｂ３）の部分塩基配列を有するポリヌクレオチド；および
（ｄ３）上記（ａ３）〜（ｃ３）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【０１１８】
また、下記（ａ４）〜（ｄ４）のいずれかを、少なくとも１つ以上が固定されてなる病変ＭＳＣ検出用のマイクロアレイを用いて検出マーカーの遺伝子の発現を検出することができる：
（ａ４）上記表８に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子；
（ｂ４）上記表８に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子のアンチセンス鎖；
（ｃ４）上記（ａ４）または（ｂ４）の部分塩基配列を有するポリヌクレオチド；および
（ｄ４）上記（ａ４）〜（ｃ４）のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【０１１９】
上記検出マーカーの遺伝子の部分塩基配列からなるポリヌクレオチドのサイズは、当該ポリヌクレオチドも用いてマイクロアレイを構成した場合に、目的とする検出マーカーの遺伝子が検出し得るサイズであれば特に限定されるものではない。
【０１２０】
上記マイクロアレイとしては、例えば、米国Affymetrix社のＤＮＡマイクロアレイやスタンフォード（Stanford）型のＤＮＡマイクロアレイ等、その他半導体製造で用いられる微細加工技術を用いてシリカ基板上に直接オリゴヌクレオチドを化学合成するＤＮＡマイクロアレイを含む従来公知のあらゆるタイプのマイクロアレイを好適に用いることができ、その具体的な大きさ、形状、システム等については特に限定されるものではない。上記病変ＭＳＣ検出用マイクロアレイは、本発明の検出方法の実施に利用されるものであり、本発明が意図する範囲に含まれる。
【０１２１】
上述した病変ＭＳＣ検出用マイクロアレイには少なくとも一つの遺伝子が検出することができるように構成されていれば、本発明の目的を達成し得るが、多数の検出マーカーの遺伝子群の発現を網羅的かつ体系的に解析できるとの理由により、２つ以上の遺伝子、より好ましくはできるだけ多数の遺伝子を検出し得るように構成されていることが好ましい。病変ＭＳＣと正常ＭＳＣとを非常に簡便かつ精度よく識別できるようになるからである。
【０１２２】
また、病変ＭＳＣ検出用マイクロアレイには、病変ＭＳＣ検出用のマーカーのみならず、その他の分子マーカーが固定化されていてもよい。被検細胞について病変ＭＳＣの検出以外の目的を同時に達成し得るからである。例えば、グループｄの遺伝子のごとくＭＳＣ検出用マーカー（病変ＭＳＣと正常ＭＳＣとの区別ができないものであってもよい）、公知のＭＳＣ検出用遺伝子マーカー（例えば特許文献３）や、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０６６５８（国際出願日２００６年３月３０日）に開示されているＭＳＣ検出用遺伝子分子マーカー、「      Ishii,M., Koike,C., Igarashi,A., Yamanaka,K., Pan,H., Higashi,Y., Kawaguchi,H., Sugiyama,M., Kamata,N., Iwata,T., Matsubara,T., Nakamura,K., Kurihara, H., Tsuji,K., and Kato,Y. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun.332(1),297-303,2005.」に開示されている分子マーカー、等が挙げられる。
【０１２３】
他方、上記病変ＭＳＣ検出用マイクロアレイを用いる方法以外によっても、本発明の検出方法における検出マーカーの遺伝子の発現を検出し得る。例えば、本発明における検出マーカーの遺伝子の発現の検出のために、ノーザンブロッティング法を用いることができる。また、本発明における検出マーカーの遺伝子の発現を検出するために、本発明における検出マーカーの遺伝子の全長ＤＮＡ配列またはその部分配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する検出用プローブを用いることができる。
【０１２４】
上記検出用プローブを用いて病変ＭＳＣと正常ＭＳＣとにおける遺伝子の発現を検出するには、公知の方法を用いて適宜実施することができる。例えば、本発明における検出マーカーの遺伝子の公知の塩基配列から、ＤＮＡプローブとして適当な長さのＤＮＡプローブを作製し、蛍光標識等の標識を適宜付与しておき、これを被検細胞とハイブリダイズさせることにより、病変ＭＳＣの検出を行い得る。また上記検出用プローブとしては、本発明における検出マーカーの遺伝子のアンチセンス鎖の全長配列または部分配列からなる検出用のプローブも採用し得る。
【０１２５】
なお、上記検出用プローブの作製に際して、検出マーカーの遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）を含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、より好適には、６５℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【０１２６】
また、被検細胞における検出マーカーの遺伝子の発現を検出するに際しては、被検細胞の遺伝子を増幅するために、定量的または半定量的ＰＣＲを用いることができる。上記定量的または半定量的ＰＣＲとしては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）を用いることができる。上記定量的または半定量的ＰＣＲを行うに際しては、本発明における検出マーカーの遺伝子を増幅するためのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーからなる１対のプライマーセットを用いる。
【０１２７】
また、本発明の病変ＭＳＣの識別方法は、インベーダ（Invader（登録商標））法を利用して簡便に行うこともできる。例えば、上述の検出マーカーの遺伝子に特異的にハイブリダイズする塩基配列と酵素切断部位とを有するシグナルプローブを設計し、被検細胞から抽出したトータルＲＮＡ（ｃＤＮＡでも構わない）、インベーダオリゴ（Invader（登録商標） Oligo）、クリベース酵素（Cleavase（登録商標） Enzyme）、およびフレットプローブ（FRET Probe）とともに所定の温度、所定の時間（例えば、６３℃、２時間等）反応させることにより行うことができる。なお、具体的な実験手法や条件については、下記参考文献を参照して適宜行うことができる（参考文献：(i) T. J. Griffin et al., Proc Natl Acad Sci U S A 96, 6301-6 (1999) 、(ii) M. W. Kaiser et al., J Biol Chem 274, 21387-94 (1999) 、(iii) V. Lyamichev et al., Nat Biotechnol 17, 292-6 (1999) 、(iv) R. W. Kwiatkowski et al., Mol Diagn 4, 353-64 (1999) 、(v) J. G. Hall et al., Proc Natl Acad Sci U S A 97, 8272-7 (2000) 、(vi) M. Nagano et al., J Lipid Res 43, 1011-8 (2002) 等参照）。上記のように、インベーダ法を利用すれば、遺伝子増幅の必要がない場合もあり、迅速かつ低コストで行うことができる。なお、市販のインベーダ法キットを利用すれば、より一層簡便に本発明を実施できる。
【０１２８】
また、in situハイブリダイゼーションを用いて、本発明の検出方法を行うこともできる。例えば、上述の検出マーカーまたはその部分配列を標識したものを検出用プローブとして用い、スライドグラス上の被検細胞の標本に直接分子雑種を形成させて、その部分を検出することにより簡易に行うことができる。具体的には、スライドグラス上に被検細胞の薄切片（パラフィン切片、凍結切片など）を調製し、これに標識した検出用プローブをハイブリダイズさせ、ノーザンハイブリダイゼーション法と同じように、検出用プローブを洗い落とし、写真用エマルジョンを塗布し、露光する。現像後、銀粒子の分布から、ハイブリダイズした場所を特定する。より具体的な実験手法や条件については、下記参考文献を用いて適宜行うことができる（参考文献：(i)「in situハイブリダイゼーション法」、（1995年７月）、古庄敏行、井村裕夫監修、金原出版（株）発行、932頁〜937頁、(ii)「in situハイブリダイゼーションによる遺伝子発現の解析」、「遺伝子工学実験」、（1991年５月）、野村慎太郎著、（社）日本アイソトープ協会発行、221頁〜232頁等参照）。in situハイブリダイゼーション法には、ラジオアイソトープ（主として３Ｈ）標識したＤＮＡを検出用プローブとして、その座位をオートラジオグラフィーで検出する方法と、標識された検出用プローブの蛍光シグナルを蛍光顕微鏡下で検出する方法があるが、いずれの方法を用いてもよい。
【０１２９】
また、本発明の検出マーカーの遺伝子の発現を、当該遺伝子がコードするタンパク質の発現をもって検出する場合には、当該タンパク質を用いて当該タンパク質と特異的に結合する抗体を作製し、当該抗体を用いて、後述するそれ自体公知の方法で当該タンパク質の発現量を検出すればよい。
【０１３０】
このため、上記表１３ａ〜表１３ｃ（表１ａ〜表１ｃに対応する）のいずれかに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子にコードされるポリペプチドのうち、いずれか１つ以上のポリペプチドを含む病変ＭＳＣ検出マーカーも本発明に含まれる。また上記表１４のいずれかに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子にコードされるポリペプチドのうち、いずれか１つ以上のポリペプチドを含む病変ＭＳＣ検出マーカーも本発明に含まれる。また上記表１５のいずれかに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子にコードされるポリペプチドのうち、いずれか１つ以上のポリペプチドを含む病変ＭＳＣ検出マーカーも本発明に含まれる。また上記表１６のいずれかに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子にコードされるポリペプチドのうち、いずれか１つ以上のポリペプチドを含む病変ＭＳＣ検出マーカーも本発明に含まれる。
【０１３１】
さらに、上記（ａ９）または（ｂ９）に記載のポリペプチドを用いて誘導され、当該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む病変ＭＳＣの検出用抗体も本発明に含まれる。また上記（ａ１０）または（ｂ１０）に記載のポリペプチドを用いて誘導され、当該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む病変ＭＳＣの検出用抗体も本発明に含まれる。また上記（ａ１１）または（ｂ１１）に記載のポリペプチドを用いて誘導され、当該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む病変ＭＳＣの検出用抗体も本発明に含まれる。また上記（ａ１２）または（ｂ１２）に記載のポリペプチドを用いて誘導され、当該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む病変ＭＳＣの検出用抗体も本発明に含まれる。
【０１３２】
なお、上記抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。上記抗体の作製は、例えば、本発明における検出マーカーの遺伝子がコードするポリペプチドの全長またはその部分断片を抗原として、従来公知の常法により作製することができる。上記ポリペプチドの部分断片は、免疫原性を有するものであればよい。
【０１３３】
例えば、モノクローナル抗体を生産する方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、抗原でマウスを免疫した後、そのマウス脾臓リンパ球とマウス由来のミエローマ細胞とを融合させてなる抗体産生ハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を得ればよい。ハイブリドーマの生産方法は、従来公知の方法、例えば、ハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 77-96(1985)）等を利用することが可能であり、特に限定されるものではない。
【０１３４】
また、上記抗原としては、ポリペプチドであれば特に限定されるものではないが、抗原決定基とする物質をキャリアタンパク質に結合してなる抗原タンパク質が用いられてもよい。具体的には、上記抗原がハプテンであれば、抗体の産生等を誘導する能力をもたないため、抗体を産生することができないが、抗原を異種由来のタンパク質などの生体高分子からなる担体と共有結合させて抗原タンパク質を得て、これで免疫すれば、抗体産生を誘導することができる。上記担体としては、特に限定されるものではなく、オボアルブミン、γグロブリン、ヘモシアニン等、この分野で従来公知の各種タンパク質を好適に用いることができる。また、モノクローナル抗体は遺伝子組換え技術等によっても生産できる。
【０１３５】
また、ポリクローナル抗体を生産する方法としては、実験動物に抗原を接種・感作させ、その体液から抗体成分を精製して取得する方法を挙げることができる。なお、免疫させる動物としては、マウス、ラット、ウサギ、サル、ウマ等の従来公知の実験動物を用いることができ、特に限定されるものではない。また、抗原を接種し感作させる場合、その間隔や量についても常法にしたがって適宜行うことができる。
【０１３６】
また、本発明の抗体を用いて、被検細胞における検出マーカーのタンパク質の発現を検出するには、公知の抗体を用いた免疫学的測定法を用いて実施することができる。上記免疫学的測定法としては、例えばＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法等の公知の免疫学的測定法を挙げることができる。また、上述した以外にも、例えば、ウェスタンブロッティング法、酵素免疫測定法、抗体による凝集や沈降や溶血反応を観察する方法、組織免疫染色や細胞免疫染色などの形態学的検出法も必要に応じて利用することができる。
【０１３７】
また本発明の抗体を用いることにより、生体内（例えば、骨髄中、関節等）の病変ＭＳＣの局在を調べることができる。よって、この技術を応用すれば、病変ＭＳＣが局在している患部に対して的確な治療を施すことができ、効率的な治療を実現することができる。またＭＳＣの病変のメカニズムの解明にも上記技術は適用され得る。
【０１３８】
上記本発明の検出方法において、病変ＭＳＣが含まれていると判断された被検細胞は再生医療に適用されるべきものではないが、例えば被検細胞に正常ＭＳＣが含まれているものであれば、正常ＭＳＣを被検細胞から分離精製することによって、被検細胞の一部を再生医療に利用することができる。
【０１３９】
本発明において、正常ＭＳＣを精製する方法としては、例えば、蛍光活性化セルソーター（Fluorescence-Activated Cell Sorter：ＦＡＣＳ）を用いることができる。具体的には、上記本発明の抗体を用いた蛍光抗体法により、病変ＭＳＣを標識化することによって、正常ＭＳＣと病変ＭＳＣとを識別し、分離することができる。蛍光抗体法により病変ＭＳＣを標識化するには、本発明の抗体を蛍光標識し、病変ＭＳＣに結合させて、病変ＭＳＣを標識化する（直接蛍光抗体法）か、または病変ＭＳＣに未標識の本発明の抗体を結合させた後に、標識化した二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）を結合させて病変ＭＳＣを標識化することができる（間接蛍光抗体法）。上述の手法により標識化した病変ＭＳＣは、フローサイトメトリーで測定分離を行い、採取することができる。これによって、病変ＭＳＣを含む細胞から病変ＭＳＣを除去することができる。また本発明の抗体を用いたアフィニティーカラムによっても、病変ＭＳＣを含む細胞から病変ＭＳＣを除去することができる。なお、公知のＭＳＣ検出用遺伝子マーカー（例えば特許文献３）や、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０６６５８（国際出願日２００６年３月３０日）に開示されている遺伝子マーカーを用いて、精製される前の細胞にＭＳＣが含まれていることが確認されていれば、当該細胞から病変ＭＳＣを除去した残渣が、精製された正常ＭＳＣである。さらに、公知のＭＳＣ検出用遺伝子マーカー（例えば特許文献３）や、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０６６５８（国際出願日２００６年３月３０日）に開示されている遺伝子マーカーの中から正常ＭＳＣに特異的なものを選択し、それを用いて上記残渣が正常ＭＳＣであることを確認しておくことが好ましい。
【０１４０】
また、正常ＭＳＣの精製は、上記正常ＭＳＣに特異的な遺伝子マーカーがコードするポリペプチドに特異的な抗体を用いた上記ＦＡＣＳまたはアフィニティー精製によっても、実施され得る。
【０１４１】
また、上述のＦＡＣＳ以外にも、磁気セルソーティング（Magnetic Cell Sorting：ＭＡＣＳ）システムにより分離することもできる。ＭＡＣＳは、蛍光標識に替えて磁性を帯びたマイクロビーズを標識化した抗体を用いる。目的細胞はＭＡＣＳ用の磁性マイクロビーズにて標識化された抗体により特異的に標識され、強力な永久磁石に設置された分離カラムにアプライされる。分離カラムでは強力な磁場が生じており、磁気標識された細胞はカラムに保持され、標識されていない細胞はカラムを通過する。分離カラムを強磁場から外すと磁気標識により保持されていた細胞が溶出され、間葉系幹細胞のみを分離し取得することができる。
【０１４２】
なお、上述のＦＡＣＳやＭＡＣＳ等による分離工程の前段階として、メンブレンフィルターまたは凝集法により試料を濃縮する工程を含んでいてもよい。
【０１４３】
＜２．病変ＭＳＣが関連する疾患用治療剤＞
本発明には、上記表１７ａ〜１７ｄに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする病変ＭＳＣが関連する疾患用治療剤が包含される。また本発明には、上記表１８に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする変形性関節症治療剤が包含される。また本発明には、上記表１９に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする関節リウマチ治療剤が包含される。また本発明には、上記表２０に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする変形性関節症および関節リウマチ治療剤が包含される。また本発明には、上記表２１に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、またはその部分配列に対するｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする変形性関節症および関節リウマチ治療剤が包含される。本発明に含まれる、病変ＭＳＣが関連する疾患用治療薬のことを「本発明の治療薬」と称する。
【０１４４】
上記ｓｉＲＮＡを標的細胞に導入すれば、それに対応する遺伝子の発現がＲＮＡｉの原理によって抑制される。上記遺伝子はＭＳＣの病変に密接に関連しているため、当該遺伝子の発現が抑制されることによってＭＳＣの病変が抑制され、その結果、病変ＭＳＣに関連する疾患の治療または予防を行うことができる。よって本発明は上記ｓｉＲＮＡを生体に導入することを特徴とする、病変ＭＳＣが関連する疾患の治療および予防方法をも包含する。
【０１４５】
後述する実施例において、本発明者らは、表１７ａ〜１７ｄに記載されたグループａ〜ｄの遺伝子の代表例に対するｓｉＲＮＡを、ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞へ導入したところ、ＯＡ由来滑膜細胞およびＲＡ由来滑膜細胞の明らかな増殖抑制効果が確認された。よって、上記ｓｉＲＮＡは病変ＭＳＣの増殖を抑制し得るものといえ、当該ｓｉＲＮＡを病変ＭＳＣが関連する疾患の治療剤として利用し得るということがわかった。
【０１４６】
上記「病変ＭＳＣが関連する疾患」としては、従来公知のＭＳＣの異常、またはＭＳＣからの分化異常等の間葉系幹細胞が関連して引き起こされる疾患（所謂、「再生不良症候群」）であればよく、その具体的な疾患については特に限定されるものではない。例えば、疾病や障害により失った組織を再生し、機能を回復させる「細胞移植による再生医療」の対象となる疾患の他、間葉系幹細胞の量的変化（細胞数の異常等）や質的変化（分化能の異常等）が低下する結果、引き起こされる疾患、つまりＭＳＣの供給不足により発症する疾患等を挙げることができる。具体的には、例えば、下肢虚血（ビュルガー病）、歯周病、変形性関節症、関節リウマチ、難治性皮膚疾患、糖尿病、骨欠損、骨粗しょう症、並びに虚血性の心疾患、肝疾患、腎疾患、および神経変性疾患（アルツハイマー病等）等を挙げることができる。
【０１４７】
ｓｉＲＮＡ（short interference RNA, small interfering RNA）は、目的の遺伝子の発現をＲＮＡｉの原理によって抑制することができるものであればその塩基配列は特に限定されるものではない。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｔＲＮＡ（small temporal RNA）、およびｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）をも含む意味である。またｓｉＲＮＡの塩基配列の設計は発現抑制を所望する遺伝子の塩基配列情報をもとにして、公知の方法によって行われ得る。現在、ｓｉＲＮＡを設計する際に用いられるソフトウェアが市販されており、効率の観点から当該ソフトウェアを用いて設計することが好ましい。市販のソフトウェアとしては、例えばRNAi社製（http://www.rnai.co.jp/）のsiDirectＴＭ等が挙げられる。
【０１４８】
上記にようにして設計されたｓｉＲＮＡの合成は公知の自動ヌクレオチド合成器によって行われ得る。なお現在、ｓｉＲＮＡの設計から合成までを、企業に委託することが可能である。委託先としては、Ambion社、Invitrogen社、QIAGEN社、Dharmacon社等が挙げられる。
【０１４９】
後述する実施例において使用したｓｉＲＮＡの塩基配列は以下の通りである。ＧＬＩＳ３に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号２に示した。ＨＯＸＤ１０に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号３に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号４に示した。ＥＴＶ１に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号５に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号６に示した。ＭＥＯＸ２に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号７に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号８に示した。ＰＲＤＭ１６に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号９に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１０に示した。なお、参考として使用したＧＡＴＡ６に対するｓｉＲＮＡは、Dharmacon社製  siGENOME SMART pool Cat No. # M-008351-01から入手した。
【０１５０】
本発明の治療薬は、ｓｉＲＮＡのほか、ｓｉＲＮＡを細胞へ導入する際に用いられる公知の試薬、例えばLipofectamine 2000 (Invitrogen社製), RNAiFectＴＭTransfection Reagent (QIAGEN社製)が含まれていてもよい。上記の試薬等が含まれていることで、ｓｉＲＮＡの細胞への導入効率の向上するとともに、ｓｉＲＮＡの安定性が向上するからである。
【０１５１】
また、本発明の治療薬は、薬学的に許容できる所望の担体と組み合わせて組成物とすることができる。担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、植物油、乳化剤、懸濁剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、徐放剤、他のタンパク質（ＢＳＡなど）、トランスフェクション試薬（リポフェクション試薬、リポソーム等を含む）等が挙げられる。さらに、使用可能な担体としては、グルコース、ラクトース、アラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンのり、マグネシウムトリシリケート、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、ばれいしょデンプン、尿素、ヒアルロン酸、コラーゲン等の細胞外マトリックス物質、ポリ乳酸、リン酸カルシウム担体などが挙げられる。
【０１５２】
製剤化する場合の剤型は制限されず、たとえば溶液（注射剤）、マイクロカプセル、錠剤などであってよい。投与は全身または局所的に行い得るが、全身投与による副作用や効果の低下がある場合には、局所投与することが好ましい。
【０１５３】
ここで、臨床適用のための上記本発明の治療剤の投与条件は、常法のモデル動物系等を用いて適宜決定することができる。すなわち、モデル動物を用いて投与量、投与間隔、投与ルートを含む投与条件を検討し、適切な予防または治療効果を得られる条件を決定することができる。
【０１５４】
また、患者への投与は、各種細胞や疾患等の性質に応じて、例えば外科的、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、脳室内、または経口的に行われうるがそれらに限定されない。投与は全身的または局所的にされ得るが、全身投与による副作用が問題となる場合には病変部位への局所投与が好ましい。投与量、投与方法は、本医薬の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１５５】
治療対象となる個体は、原則としてヒトを対象としているが、これ以外にも、愛玩動物（ペット）用の治療用の用途へ使用してもよい。愛玩動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウマ、ヒツジ、ウシなどの非ヒト哺乳動物およびその他の脊椎動物を挙げることができる。
【０１５６】
＜３．病変ＭＳＣが関連する疾患の発症または発症の可能性を検出する方法＞
本発明は以下の発明をも包含する：
上記表２２ａ〜２２ｃに記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
生体から分離した試料において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、病変間葉系幹細胞が関連する疾患の当該生体における発症またはその発症危険性を検出する方法；
上記表２３に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
生体から分離した試料において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、当該生体における変形性関節症の発症またはその発症危険性を検出する方法；
上記表２４に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
生体から分離した試料において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、当該生体における関節リウマチの発症またはその発症危険性を検出する方法；
上記表２５に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を検出マーカーとして用い、
生体から分離した試料において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含むことを特徴とする、当該生体における変形性関節症および関節リウマチの発症またはそれらの発症危険性を検出する方法。
【０１５７】
生体から分離した試料に対して、上記＜１．病変ＭＳＣの検出方法＞で説示した本発明の検出方法を実施することで、当該生体において病変ＭＳＣが関連する疾患が発症しているか、または将来発症する可能性があるかを判定（検出）することができる。すなわち被検対象である生体（被検体）中に病変ＭＳＣが検出されれば、被検体において病変ＭＳＣが関連する疾患が発症しているか、または将来発症する可能性があるかを判定（検出）することができるというものである。なお上記本発明に係る、病変ＭＳＣが関連する疾患の発症または発症の可能性を検出する方法のことを「本発明の疾患検出方法」という。
【０１５８】
本発明の疾患検出方法の対象は、有用性の観点からヒトを対象とすることが好ましいが、これ以外にも、愛玩動物（ペット）用の治療用の用途へ使用してもよい。愛玩動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウマ、ヒツジ、ウシなどの非ヒト哺乳動物およびその他の脊椎動物を挙げることができる。なお、本発明の疾患検出方法をヒトに適用する場合、直接人体に対して処置するのではなく、生体から分離した試料を対象とする。上記生体から分離した試料とは、常法により人体より得ることが可能であるが、例えば、骨髄液、末梢血、臍帯血、脂肪組織、骨膜、筋肉、滑膜、口腔組織から採取した細胞等を挙げることができる。
【０１５９】
本発明の疾患検出方法は、被検体のみに対して上記本発明の検出方法等を適用すれば、病変ＭＳＣが関連する疾患の発症または発症の可能性を検出し得るが、当該疾患が発症していない被検体（健常体）と当該疾患が発症した被検体（罹病体）とにおける検出マーカーの遺伝子の発現プロファイルをあらかじめ調べておき、被検体における検出マーカーの遺伝子の発現プロファイルが上記健常体および罹病体のいずれの発現プロファイルと類似するかを比較検討することによって、被検体が現在疾病を発症しているか、あるいは将来的に疾病を発症する危険性がどの程度あるかを高精度で判定することができる。なお、本発明の疾患検出方法の具体的方法は、上記＜１．病変ＭＳＣの検出方法＞で説示した方法に準じて行なわれ得るが、本発明はこれに限定されるものではなく、出願当時の常法を用いて適宜変更して実施され得る。
【０１６０】
以下実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１６１】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【０１６２】
〔実施例１：病変ＭＳＣ検出マーカーのスクリーニング〕
本実施例では、ヒト由来のＦＢ３株、正常ＭＳＣから分化したＯＳ３株、正常ＭＳＣから分化したＣＨ３株、正常ＭＳＣから分化したＡＤ３株、正常ＭＳＣ（本実施例においては単に「ＭＳＣ」と表記する）３株、ＯＡ由来滑膜細胞（本実施例においては単に「ＯＡ」と表記する）３株、およびＲＡ由来滑膜細胞（本実施例においては単に「ＲＡ」と表記する）３株を対象として、ＤＮＡマイクロアレイを用いて、それぞれの細胞における遺伝子の発現プロファイルを調べた。上記ＭＳＣ、ＯＡ、ＲＡ、およびＦＢは、BioWhittaker社またはCell Apprication社から購入されたもの、あるいは広島大学病院で分離されたものである。
【０１６３】
（０）分化誘導及びトータルＲＮＡの回収
ＯＳ、ＣＨ、およびＡＤについては、ＭＳＣをＯＳ、ＣＨ、またはＡＤへと分化させ、トータルＲＮＡを回収した。具体的には、以下のように行った。
【０１６４】
（０−１）ＡＤへの分化誘導及びＲＮＡ回収
基本培地及び脂肪分化誘導培地、脂肪分化維持培地として以下の組成の培地を使用した。
＜脂肪分化誘導培地＞
基本培地：ＤＭＥＭ（Sigma: D5796, high glucose＝4500 mg/L）
添加物：10％(V/V) FBS (Hyclone, Lot No.: ANC18139)
Penicillin-Streptomycin（Sigma: P0781）
以下は、用時添加する（２週間で使い切り）
Insulin: 10 μg/mL（10 mg/mL 酢酸水溶液ストック）（Wako: 090-03446）
Dexamethason: 1 μM（10 mM EtOHストック）（Sigma: D4902）
Indomethacin: 200 μM（2000 mM DMSOストック）（Wako: 097-02471）
3-isobutyl-1-methylxanthine: 500 μM（1000 mM DMSOストック）（Wako: 537-72353）
＜脂肪分化維持培地＞
基本培地：ＤＭＥＭ（Sigma:#D-5796, high glucose＝4500mg/L）
添加物：10％(V/V) FBS (Hyclone, Lot No.: ANC18139)
Penicillin-Streptomycin（Sigma: P0781）
以下は、用時添加する（2週間で使い切り）
Insulin: 10 μg/mL（10 mg/mL 酢酸水溶液ストック）（Wako: 090-03446）
なお、培地が２週間経過した場合は、L-glutamine: 2 mM（200mM PBSストック）（Sigma: G3126）を添加した。以後、２週間毎に再添加する。
【０１６５】
Insulin: 10 μg/mL（10 mg/mL 酢酸水溶液ストック）（Wako: 090-03446）
なお、培地が２週間経過した場合は、L-glutamine: 2 mM（200mM PBSストック）（Sigma: G3126）を添加した。以後、２週間毎に再添加する。
【０１６６】
2 × 105 cells/35-mm well (2.3 × 104 cells/cm2)で播種されたＭＳＣがコンフルエントに達した後、上記脂肪分化誘導培地で３日、脂肪分化維持培地で３日間交互に培地交換し、計２８日間培養した。培養は、３７℃, ５%CO2条件下で行われた。
【０１６７】
上記のようにして得られたＡＤからトータルＲＮＡを回収した。細胞培養液から培地を吸引除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（4000 μL /φ100 mmディッシュ） を加え、２１Ｇニードル、１ｍｌシリンジを使用してホモジナイズした。続いて、クロロホルムを１／４量加えてボルテックス後、２０分間室温で静置した。次に、14000 rpm, ２０分間室温で遠心した（Tomy, MCX-150）。その後、上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、上清と等量の７０％ＥｔＯＨ（RNase free 水使用）を加えた。サンプル７００μｌをＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムにアプライ後、バキュームを行った（Qiagen, QIAvac 24）。全てのサンプルが無くなるまで繰り返した（２カラム/φ100 mmディッシュ1枚）。なお、以上の処理は、ＲＮｅａｓｙキットに添付の説明書に従った。最後に、Ambion社製のキット（#1906）を使用し、ＲＮＡの精製を行った。
【０１６８】
（０−２）ＣＨへの分化誘導及びＲＮＡ回収
軟骨分化誘導培地として以下の組成の培地を使用した。
＜軟骨分化誘導培地＞
αＭＥＭ  （Sigma:#4526）
Penicillin Streptomycin: （Sigma: #P0781）
L-glutamine: 2 mM （stock sol 200 mM PBS）  （Sigma: #G3126）
Dexamethason: 10-7 M （stock sol 1 M EtOH）  （Sigma: #D-1756）
Ascorbate 2-phosphate: 50 μg/ml （stock sol 50 mg/ml MQ）  （Sigma: #A-8960）
D-(+)-glucose: 4.5 g/l （stock sol 450 g/l）  （Sigma: #G-8769）
Pyruvate: 100 μg/ml （stock sol 100 mg/ml MQ）  （Sigma: #28-4020-2）
ITS-plus: 1 %（V/V） (insulin 6.25 μg/ml, transferring 6.25 μg/ml, selenite 6.25 μg/ml, linolate 5.33 μg/ml, bovine serum albumim 1.25 mg/ml)  （BD: #354352）
TGF-β3: 10 ng/ml (stock sol 10 μg/ml HCl 4 mM, HSA or BSA 1mg/ml)  （Pepro Tec ECL Ltd #100-36）
なお、軟骨分化誘導培地は２週間使い切りとした。また、TGF-β3は最初に添加せず、培地交換の際に用時添加した。
【０１６９】
軟骨分化培養法は、ペレット培養法を用いた。具体的には、まず、播種密度は２．５×１０５ｃｅｌｌ／試験管とし、最初の軟骨分化培地添加量は、０．５ｍｌ／試験管として培養した。次に、播種後、遠心した（５００ｇ×５ｍｉｎ）。続いて、細胞播種した日をｄａｙ０とし、１回目の培地交換から１ｍｌ／試験管とし、３日ごとに培地交換を行った。培養期間は２８日とした。
【０１７０】
トータルＲＮＡの抽出は以下のように行った。まず、２８日間軟骨分化誘導した細胞（×６ペレット以上）を準備した。次に、培地を吸引除去し、ＰＢＳ０．４ｍｌ加えて、これを吸引した。続いて、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Invitrogen: 15596-018）を０．２ｍｌ／ｔｕｂｅ加え、ペレットペッスルとシリカ粉末で粉砕抽出した。さらに０．８ｍｌ／ｔｕｂｅ追加し、抽出物をチューブに移した後、クロロホルム処理、エタノール処理以後はＲＮｅａｓｙ  キットを用いた。その後の処理は、上述のＡＤの場合と同様にされた。
【０１７１】
（０−３）ＯＳへの分化誘導及びＲＮＡ回収
基本培地及び骨分化誘導培地として以下の組成の培地を使用した。
＜基本培地＞
・ＤＭＥＭ（Sigma D6046）
・終濃度10% FBS (Hyclone社)（牛胎仔血清）
・抗生剤penicillin- streptmycin (Sigma:P0781) 
＜骨分化誘導培地＞
・DMEM（Sigma D6046含 glucose 1000mg/L）
・終濃度10% FBS (Hyclone社)
・終濃度10-7M Dexamethason (Sigma D-1756)
・終濃度１０ｍＭβ-glycerophosphate (東京化成工業G-0195)
・終濃度50μg/ml Ascorbate 2-phosphate (Sigma: A-8960) を２週間おきに添加
・終濃度２ｍＭ L-glutamineを２週間おきに添加
・抗生剤penicillin- streptmycin (Sigma:P0781) 
なお、参考文献として、「Osteogenic differentiation of purified culture-expanded human、mesenchymal stem cell in vitro. 、Jaiswal N. J. et al., Cell Biochem. 64, 295-312, 1997」を参照した。
【０１７２】
まず、０．０１％ Collagen type１溶液（機能性ペプチドＩＦＰ９６６０）で、培養プレート表面を４℃、一昼夜浸した。その後、溶液を除き、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で２回洗浄した。次に、上記基本培地で細胞を播種した（１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）。コンフルエント状態（集密状態）になるまで培養（播種後２〜３日）し、上記骨分化誘導培地に培地交換した（ｄａｙ０）。以降３日おきに骨分化誘導培地で培地交換した。
【０１７３】
上記のようにして得られたＯＳは、4 × 104cells/16-mm well (2.3 × 104 cells/cm2)で播種し、１０% FBS、１０ mM glycerophosphate (Tokyo Kasei Kogyo, Tokyo, Japan)、１００nM dexamethasone (Sigma)、および50 μg/ml ascorbic acid-2-phosphate (Sigma) (osteogenic induction medium)が添加されたＤＭＥＭを用いて、37℃, ５%CO2条件下で２８日間培養された。細胞培養後２８日目にトータルＲＮＡを回収した。なお、トータルＲＮＡの回収は、上述したＡＤの欄で説明したものと同様の方法で行われた。
【０１７４】
（０−４）ＭＳＣ、ＦＢ、ＯＡ、ＲＡからのＲＮＡ回収
ＭＳＣ、ＦＢ、ＯＡ、ＲＡは、10% fetal bovine serum (FBS) (Hyclone, Logan, UT, U.S.A.), 100 U/ml penicillin G (Sigma)、100 μg/ml streptomycin (Sigma)、 1 ng/ml fibroblast growth factor-2 (FGF-2) (Kaken Pharmaceutical, Tokyo, Japan)が添加されたＤＭＥＭ(Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.)を用いて、３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養された。そして上記細胞は、トータルＲＮＡの回収の７２時間前からは、10% fetal bovine serum (FBS) (Hyclone, Logan, UT, U.S.A.)、100 U/ml penicillin G (Sigma)、100 μg/ml streptomycin (Sigma)が添加されたＤＭＥＭ(Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.)を用いて、３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養された。
【０１７５】
上記細胞からのトータルＲＮＡの回収は、上述したＡＤの欄で説明したものと同様の方法で行われた。
【０１７６】
（１）ｃＤＮＡ／ｃＲＮＡ合成
まず、ＲＮＡからＴ７オリゴｄＴプライマーを使用して２本鎖ｃＤＮＡを合成した。続いて、得られた２本鎖ｃＤＮＡを用いて、in vitro Transcription反応によりｃＲＮＡを合成した。このｃＲＮＡ合成の際にビオチン標識リボヌクレオチドを取り込み、サンプルを標識した。
【０１７７】
（２）ハイブリダイゼーション
次に、ビオチン標識ｃＲＮＡを断片化してGeneChip（登録商標、Affymetrix社製）プローブアレイにハイブリダイズした。
【０１７８】
（３）蛍光標識
次いで、オーバーナイトでハイブリダイズさせたアレイを洗浄した後、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（Molecular Probes社, S-866）を投入しサンプルを蛍光標識した。
【０１７９】
（４）スキャニング／データ解析
最後に、蛍光標識されたアレイをスキャニングし、イメージ画像を取得した。得られた画像を、専用解析ソフトを用いて、シグナルの数値化および発現解析を行った。
【０１８０】
なお、上記（１）〜（４）の各工程については、（株）ＫＵＲＡＢＯが提供する、Affymetrix社の作製するＤＮＡマイクロアレイ「GeneChip（登録商標）」を使用した受託解析サービスを利用した（http://www.bio.kurabo.co.jp/idensi/genechip/genechiptop.htm）。本受託解析サービスは、サンプルＲＮＡを提供するだけで、GeneChip（登録商標）を使用した遺伝子発現プロファイル解析を行ってくれるものである。したがって、（２）〜（４）の各工程についての説明は上記ＵＲＬおよび同社の提供する受託解析サービスを参照することにより当業者であれば理解可能であるため、ここではその詳細な説明を省略する。
【０１８１】
本実施例では、GeneChip（登録商標）は、Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays( HG-U133 Plus 2.0)を用いた。また、本実施例における上記受託解析サービスのGeneChip解析条件は以下の通りである。
【０１８２】
ビオチン標識ターゲット調製は、開始条件としてトータルＲＮＡを２μｇ用いた。解析プロトコールとして、One-cycle Target Labeling、GeneChip Expression Analysis Technial Manual, 701021 Rev.5、Section 2 Eukaryotic Sample and Array Processing、Chapter 1 Eukaryotic Target Preparationを用いた。
【０１８３】
ハイブリダイゼーション／スキャンにおいては、解析プロトコールとして、GeneChip Expression Analysis Technial Manual, 701021 Rev.5、Section 2 Eukaryotic Sample and Array Processing、Chapter 2 Eukaryotic Target Hybridizationを用いた。また、ハイブリダイゼーションオーブンとしては、Hybridization Oven 640 110V (Affymetrix 800138)を用いた。洗浄／染色装置として、Fluidies Station 450 (Affymetrix 00-0079)を用いた。スキャナとして、GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix 00-0074)を用いた。ソフトウェアは、GeneChip Operating Software ver1.1 (Affymetrix 690036)を用いた。
【０１８４】
スキャン画像解析および数値化においては、解析プロトコールとして、GeneChip Expression Analysis Technial Manual, 701021 Rev.5、Section 2 Eukaryotic Sample and Array Processing、Chapter 3 Washing, Staining, and Scanningを用いた。ソフトウェアとして、GeneChip Operating Software ver1.1を用い、アルゴリズムとして、Statisticalを用いた。解析パラメータとして、ＣＩＩＰファイル作成時に、Scaling Factor; 1、Target Value; 500、Detection Call; Alpha1=0.05, Alpha2=0.065, Tau=0.015を用いた。
【０１８５】
上記（４）のスキャニング／データ解析の結果得られたシグナルの数値化および発現解析に関するデータを、Silicon Genetics社製の遺伝子解析ソフトウェアGeneSpring（商品名、登録商標、http://www.silicongenetics.com/cgi/SiG.cgi/Products/GeneSpring/index.smf）を用いて遺伝子リストの作成等の解析作業を行った。なお、ソフトウェアGeneSpringの使用方法については、添付の取扱説明書にしたがった。
【０１８６】
すなわち、本実施例では、MSC, FB, OS, CH, AD, OA, RAの各３株を用いてヒト遺伝子（プローブ）５４６７５個に関する、各種細胞の遺伝子発現プロファイルを解析した。
【０１８７】
上述の解析結果、病変ＭＳＣの検出マーカーの候補遺伝子がスクリーニングされた。
【０１８８】
次にスクリーニングされた各種候補遺伝子について、ＦＢ、ＭＳＣ、ＯＡ、ＲＡの各４株を用いてリアルタイムＰＣＲ解析を行った。具体的には以下のようにした。トータルRNAをRNeasy minicolumns and reagents (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて単離し、DNase I (Ambion)処理後、1 μg のトータルRNAからfirst-strand cDNAをReverTra Ace-a (Toyobo, Osaka, Japan)を用いて合成した。リアルタイムＰＣＲは、ready-made probe and primer setsからなるカスタムカードのTaqMan Low Density Array (Applied Biosystems)を用いて、ABI Prism 7900 Sequence Detection System Instrument and Software (Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.)で行われた。各種候補遺伝子の発現量は、１８Ｓ遺伝子の発現で補正された。
【０１８９】
上記リアルタイムＰＣＲの結果、ＦＢ４株のうちのある１株の遺伝子の発現レベルを「１」とした時の、各種細胞における相対的発現レベルを算出した。そして各種細胞における相対的発現レベルの平均値から各細胞間の比を求め、表２６に示す条件にしたがって、検出マーカー遺伝子を選抜した。
【０１９０】
【表２６】
2008092919.tif 000040
【０１９１】
表２６左端のカラムはグループ名を示している。各グループは以下の通りである。
（ａ）グループａの遺伝子：ＯＡにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子；
（ｂ）グループｂの遺伝子：ＲＡにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子；
（ｃ）グループｃの遺伝子：ＯＡおよびＲＡにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子；並びに
（ｄ）グループｄの遺伝子：ＭＳＣ、ＯＡおよびＲＡにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子。
【０１９２】
また表２６中の「ＭＳＣ／ＦＢ」、「ＯＡ／ＦＢ」、「ＲＡ／ＦＢ」、「ＯＡ／ＭＳＣ」、「ＲＡ／ＭＳＣ」、「ＯＡ／ＲＡ」および「ＲＡ／ＯＡ」は、２つの細胞間における遺伝子発現レベルの相対値の条件を示している。例えば「ＭＳＣ／ＦＢ」は、ＦＢにおけるある遺伝子の発現レベルに対する、ＭＳＣにおけるある遺伝子の発現レベルの相対値を示す。そして、「２未満」および「２以上」は、上記遺伝子発現レベルの相対値が「２未満」および「２以上」であることをそれぞれ示す。例えば表２６のグループｃの欄を用いて説明すれば、ある遺伝子がグループｃの遺伝子に属するためには、「ＭＳＣ／ＦＢ」が２未満、「ＯＡ／ＦＢ」が２以上、「ＲＡ／ＦＢ」が２以上、「ＯＡ／ＭＳＣ」が２未満、「ＲＡ／ＭＳＣ」が２未満、「ＯＡ／ＲＡ」が２未満、かつ「ＲＡ／ＯＡ」が２未満であるか、あるいは「ＭＳＣ／ＦＢ」が２以上、「ＯＡ／ＦＢ」が２以上、「ＲＡ／ＦＢ」が２以上、「ＯＡ／ＭＳＣ」が２以上、「ＲＡ／ＭＳＣ」が２以上、「ＯＡ／ＲＡ」が２未満、および「ＲＡ／ＯＡ」が２未満であることが必要であるということが当該欄によって読み取れる。他のグループの条件についても同様にして理解される。
【０１９３】
図１〜図６に上記リアルタイムＰＣＲによって算出された、各種遺伝子の各種細胞における相対的発現レベルを示した。図１はグループａに属する各種遺伝子（１２遺伝子）に関する結果である。棒グラフ中に遺伝子の一般的な略称が記載されている。当該略称は表１ａのCommon Nameに対応している。図２はグループｂに属する各種遺伝子（９遺伝子）に関する結果である。棒グラフ中に記載されている遺伝子の一般的な略称は表１ｂのCommon Nameに対応している。図３〜５はグループｃに属する各種遺伝子（４９遺伝子）に関する結果である。棒グラフ中に記載されている遺伝子の一般的な略称は表１ｃのCommon Nameに対応している。図６はグループｄに属する各種遺伝子（１９遺伝子）に関する結果である。棒グラフ中に記載されている遺伝子の一般的な略称は表１７ｄのCommon Nameに対応している。なお図１〜６の棒グラフの縦軸は相対的発現レベルを示し、垂直線は標準誤差を示している。
【０１９４】
図１によれば、グループａに属する１２遺伝子は、ＯＡにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子であるということが分かる。また図２によれば、グループｂに属する９遺伝子は、ＲＡにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子であるということが分かる。また図３〜５によれば、グループｃに属する４９遺伝子は、ＯＡおよびＲＡにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子であるということが分かる。また図６によれば、グループｄに属する１９遺伝子は、ＭＳＣ、ＯＡおよびＲＡにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子であるということが分かる。以上の結果より、グループａ〜ｃの遺伝子が病変ＭＳＣの検出マーカーとして有効であることが確認された。
【０１９５】
なお上記グループａ〜ｄの全遺伝子は、ＦＢ、ＯＳ、ＣＨ、およびＡＤでの発現レベルが低いことがＤＮＡマイクロアレイ解析によって確認されている。図１３にグループａ〜ｄの遺伝子（代表例を１つ）について、ＤＮＡマイクロアレイによる解析の結果を示す。図１３（ａ）はグループａのＴＭＥＦＦ２の結果を示し、図１３（ｂ）はグループｂのＨＯＸＤ１０の結果を示し、図１３（ｃ）はグループｃのＭＧＣ４５７８０の結果を示し、図１３（ｄ）はグループｄのＩＦの結果を示す。その他の遺伝子についても同様の結果であった。
【０１９６】
〔実施例２：ｓｉＲＮＡ導入による効果の検討〕
実施例１において見出された各種検出マーカー遺伝子（転写因子）から任意に選択された、１または２個の遺伝子のｓｉＲＮＡを常法により設計し、ｓｉＲＮＡオリゴを合成した。なお、ｓｉＲＮＡの設計は、RNAi社製 siDirectＴＭを用いて半自動的に行われた。またｓｉＲＮＡの合成は、RNAi社に委託された。または、Dharmacon社製のsiGENOME SMART poolを注文することによって、所望のｓｉＲＮＡを入手した。グループａの遺伝子からＧＬＩＳ３が選択され、グループｂの遺伝子からＨＯＸＤ１０が選択され、グループｃの遺伝子からＥＴＶ１およびＭＥＯＸ２が選択され、グループｄの遺伝子からＰＲＤＭ１６が選択され、以下の実験に供された。また本発明者らによってＭＳＣの検出マーカーであると同定された、ＧＡＴＡ６（GenBank Accession No. D87811）も同様に以下の実験に供された。
【０１９７】
ＧＬＩＳ３に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号２に示した。ＨＯＸＤ１０に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号３に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号４に示した。ＥＴＶ１に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号５に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号６に示した。ＭＥＯＸ２に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号７に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号８に示した。ＰＲＤＭ１６に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号９に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１０に示した。なお、参考として使用したＧＡＴＡ６に対するｓｉＲＮＡは、DHARMACON社製  siGENOME SMART pool Cat No. # M-008351-01から入手した。
【０１９８】
まず各種ｓｉＲＮＡオリゴの各種細胞における導入効率を確認すべく、以下の実験を行った。各種細胞を播種し１日培養後、Lipofectamine（登録商標）2000試薬（Invitrogen社製）を用いて、fluorescein標識をしたｓｉＲＮＡオリゴを導入した。さらに、１日培養後、４％パラフォルムアルデヒドで細胞を固定し、０．１％  Triton-X100にて細胞膜透過処理を行い、ＤＡＰＩ試薬を用いて核を染色した。染色された細胞の位相差顕微鏡像および各蛍光顕微鏡像を得て、Adobe Photoshop（登録商標）を用いて画像を合成した。合成した画像の蛍光強度を比較することによって、各種ｓｉＲＮＡオリゴの各種細胞における導入効率がほぼ同等であるということが確認された。
【０１９９】
次に、各種ｓｉＲＮＡオリゴの各種細胞への導入効果を検討した。各種細胞を播種し１日培養後、Lipofectamine（登録商標）2000試薬を用いて、各種遺伝子に対するｓｉＲＮＡオリゴをそれぞれの細胞に導入した。遺伝子導入後、所定時間において細胞からＲＮＡを回収し、各種遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＰＣＲ法によって測定した。陰性対照として、negative control ｓｉＲＮＡオリゴを導入した。
【０２００】
また遺伝子導入後の所定時間における細胞数を、TetraColor ONEキット（生化学工業株式会社製）を用いて評価した。
【０２０１】
上記の結果を図７〜１２に示した。図７はＧＬＩＳ３に関する結果を、図８はＨＯＸＤ１０に関する結果を、図９はＥＴＶ１に関する結果を、図１０はＭＥＯＸ２に関する結果を、図１１はＰＲＤＭ１６に関する結果を、図１２はＧＡＴＡ６に関する結果をそれぞれ示す。
【０２０２】
図７（Ａ）は、リアルタイムＰＣＲ解析によって得た、各細胞におけるＧＬＩＳ３の相対的発現レベルを示す図であり、図１に示したものと同様である。図７（Ｂ）は遺伝子導入後、所定時間においてＯＡからＲＮＡを回収した際のＧＬＩＳ３の相対的発現レベル（同図中「相対ｍＲＮＡレベル」と表記する）を示す図である。なお図７（Ｂ）の結果は２回の試行による結果の平均値であり、垂直線は標準誤差を示す。図７（Ｃ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＯＡの細胞数を示す図である。図７（Ｄ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＲＡの細胞数を示す図である。なお図７（Ｃ）および（Ｄ）の結果は３回の試行による結果の平均値であり、垂直線は標準誤差を示す。
【０２０３】
図８（Ａ）は、リアルタイムＰＣＲ解析によって得た、各細胞におけるＨＯＸＤ１０の相対的発現レベルを示す図であり、図２に示したものと同様である。図８（Ｂ）は遺伝子導入後、所定時間においてＲＡからＲＮＡを回収した際のＨＯＸＤ１０の相対的発現レベル（同図中「相対ｍＲＮＡレベル」と表記する）を示す図である。なお図８（Ｂ）の結果は２回の試行による結果の平均値であり、垂直線は標準誤差を示す。図８（Ｃ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＯＡの細胞数を示す図である。図８（Ｄ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＲＡの細胞数を示す図である。なお図８（Ｃ）および（Ｄ）の結果は３回の試行による結果の平均値であり、垂直線は標準誤差を示す。
【０２０４】
図９（Ａ）は、リアルタイムＰＣＲ解析によって得た、各細胞におけるＥＴＶ１の相対的発現レベルを示す図であり、図３に示したものと同様である。図９（Ｂ）は遺伝子導入後、所定時間においてＭＳＣからＲＮＡを回収した際のＥＴＶ１の相対的発現レベル（同図中「相対ｍＲＮＡレベル」と表記する）を示す図である。なお図９（Ｂ）の結果は２回の試行による結果の平均値であり、垂直線は標準誤差を示す。図９（Ｃ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＭＳＣの細胞数を示す図である。図９（Ｄ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＦＢの細胞数を示す図である。図９（Ｅ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＯＡの細胞数を示す図である。図９（Ｆ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＲＡの細胞数を示す図である。なお図９（Ｃ）〜（Ｆ）の結果は３回の試行による結果の平均値であり、垂直線は標準誤差を示す。
【０２０５】
図１０（Ａ）は、リアルタイムＰＣＲ解析によって得た、各細胞におけるＭＥＯＸ２の相対的発現レベルを示す図であり、図４に示したものと同様である。図１０（Ｂ）は遺伝子導入後、所定時間においてＯＡからＲＮＡを回収した際のＭＥＯＸ２の相対的発現レベル（同図中「相対ｍＲＮＡレベル」と表記する）を示す図である。なお図１０（Ｂ）の結果は２回の試行による結果の平均値であり、垂直線は標準誤差を示す。図１０（Ｃ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＯＡの細胞数を示す図である。図１０（Ｄ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＲＡの細胞数を示す図である。なお図１０（Ｃ）および（Ｄ）の結果は３回の試行による結果の平均値であり、垂直線は標準誤差を示す。
【０２０６】
図１１（Ａ）は、リアルタイムＰＣＲ解析によって得た、各細胞におけるＰＲＤＭ１６の相対的発現レベルを示す図であり、図６に示したものと同様である。図１１（Ｂ）は遺伝子導入後、所定時間においてＭＳＣからＲＮＡを回収した際のＰＲＤＭ１６の相対的発現レベル（同図中「相対ｍＲＮＡレベル」と表記する）を示す図である。なお図１１（Ｂ）の結果は２回の試行による結果の平均値であり、垂直線は標準誤差を示す。図１１（Ｃ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＭＳＣの細胞数を示す図である。図１１（Ｄ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＦＢの細胞数を示す図である。図１１（Ｅ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＯＡの細胞数を示す図である。図１１（Ｆ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＲＡの細胞数を示す図である。なお図１１（Ｃ）〜（Ｆ）の結果は３回の試行による結果の平均値であり、垂直線は標準誤差を示す。
【０２０７】
図１２（Ａ）は、リアルタイムＰＣＲ解析によって得た、各細胞におけるＧＡＴＡ６の相対的発現レベルを示す図である。図１２（Ｂ）は遺伝子導入後、所定時間においてＭＳＣからＲＮＡを回収した際のＧＡＴＡ６の相対的発現レベル（同図中「相対ｍＲＮＡレベル」と表記する）を示す図である。なお図１２（Ｂ）の結果は２回の試行による結果の平均値であり、垂直線は標準誤差を示す。図１２（Ｃ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＭＳＣの細胞数を示す図である。図１２（Ｄ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＦＢの細胞数を示す図である。図１２（Ｅ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＯＡの細胞数を示す図である。図１２（Ｆ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＲＡの細胞数を示す図である。なお図１２（Ｃ）〜（Ｆ）の結果は３回の試行による結果の平均値であり、垂直線は標準誤差を示す。
【０２０８】
図７〜１２の結果をまとめると、各遺伝子に対するｓｉＲＮＡオリゴを導入することによって、対応する遺伝子の発現の５０〜８０％程度抑制することができた。既述の通り、各種細胞へのｓｉＲＮＡオリゴの導入効率はほぼ等しいことが確認されているため、遺伝子発現の抑制効率も同等であると考える。
【０２０９】
各種遺伝子の発現抑制による各種細胞増殖に対する効果を表２７に示した。
【０２１０】
【表２７】
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【０２１１】
表２７中において、「−」は「データなし」、「→」は「影響なし」、「↓」は「弱い増殖抑制効果あり」、「↓↓」は「中程度の増殖抑制効果あり」、「↓↓↓」は「強い増殖抑制効果あり」をそれぞれ示す。
【０２１２】
いずれの遺伝子の発現抑制も、ＯＡおよび／またはＲＡの増殖抑制効果を示した。一方いずれの遺伝子の発現抑制もＭＳＣおよびＦＢの増殖に対して大きな影響を与えなかった。またグループａのＧＬＩＳ３、グループｃのＥＴＶ１によって、ＯＡおよびＲＡの増殖が著しく抑制された。また、ＭＳＣの検出マーカーであるＧＡＴＡ６の発現抑制によっても、ＯＡおよびＲＡの増殖が強く抑えられた。よって、グループａ〜ｄの遺伝子に対応するｓｉＲＮＡを導入することによって、ＯＡおよびＲＡの増殖が抑制されるということが分かった。
【０２１３】
ＧＬＩＳ３の発現抑制に関しては、ＭＳＣおよびＦＢにおける検討を行っていないため、ＯＡおよびＲＡに対する特異的な効果であるかは不明であるが、ＥＴＶ１とＧＡＴＡ６の発現抑制による効果は、病的状態のＯＡおよびＲＡに選択的なものであることが示唆された。
【０２１４】
以上の結果より、グループａ〜ｄの遺伝子に対応するｓｉＲＮＡは、変形性関節症および関節リウマチに対する治療または予防効果を有していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０２１５】
本発明によれば、ＯＡ由来滑膜細胞やＲＡ由来滑膜細胞をはじめとする病変ＭＳＣにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子を検出マーカーとして利用することによって、病変ＭＳＣを選択的に検出し得る手段を提供することができる。よって、病変ＭＳＣを再生医療へ適用することを未然に防ぐことができるという効果を本発明は奏する。
【０２１６】
また本発明によれば、病変ＭＳＣが関連する疾患（例えば、ＯＡ、ＲＡ等）の治療剤として有効なものを提供することができる。上記治療薬は、病変ＭＳＣを標的とするものであるため、効率良く疾患の治療および予防を行うことができるとともに、副作用も少ないことが期待できる。
【０２１７】
したがって本発明は、ＭＳＣを用いた再生医療の実用化に大きく貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】リアルタイムＰＣＲによって算出された、グループａに属する各種遺伝子（１２遺伝子）の各種細胞における相対的発現レベルを示す棒グラフである。なお上記遺伝子はＦＢ、ＯＳ、ＣＨ、およびＡＤでの発現レベルが低いことがＤＮＡマイクロアレイ解析によって確認されている。
【図２】リアルタイムＰＣＲによって算出された、グループｂに属する各種遺伝子（９遺伝子）の各種細胞における相対的発現レベルを示す棒グラフである。なお上記遺伝子はＦＢ、ＯＳ、ＣＨ、およびＡＤでの発現レベルが低いことがＤＮＡマイクロアレイ解析によって確認されている。
【図３】リアルタイムＰＣＲによって算出された、グループｃに属する各種遺伝子（２１遺伝子）の各種細胞における相対的発現レベルを示す棒グラフである。なお上記遺伝子はＦＢ、ＯＳ、ＣＨ、およびＡＤでの発現レベルが低いことがＤＮＡマイクロアレイ解析によって確認されている。
【図４】リアルタイムＰＣＲによって算出された、グループｃに属する各種遺伝子（１５遺伝子）の各種細胞における相対的発現レベルを示す棒グラフである。なお上記遺伝子はＦＢ、ＯＳ、ＣＨ、およびＡＤでの発現レベルが低いことがＤＮＡマイクロアレイ解析によって確認されている。
【図５】リアルタイムＰＣＲによって算出された、グループｃに属する各種遺伝子（１３遺伝子）の各種細胞における相対的発現レベルを示す棒グラフである。なお上記遺伝子はＦＢ、ＯＳ、ＣＨ、およびＡＤでの発現レベルが低いことがＤＮＡマイクロアレイ解析によって確認されている。
【図６】リアルタイムＰＣＲによって算出された、グループｄに属する各種遺伝子（１９遺伝子）の各種細胞における相対的発現レベルを示す棒グラフである。なお上記遺伝子はＦＢ、ＯＳ、ＣＨ、およびＡＤでの発現レベルが低いことがＤＮＡマイクロアレイ解析によって確認されている。
【図７】（Ａ）はリアルタイムＰＣＲ解析によって得た、各細胞におけるＧＬＩＳ３の相対的発現レベルを示す棒グラフであり、（Ｂ）は遺伝子導入後、所定時間においてＯＡからＲＮＡを回収した際のＧＬＩＳ３の相対的発現レベルを示す折れ線図あり、（Ｃ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＯＡの細胞数を示す折れ線図であり、（Ｄ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＲＡの細胞数を示す折れ線図である。
【図８】（Ａ）はリアルタイムＰＣＲ解析によって得た、各細胞におけるＨＯＸＤ１０の相対的発現レベルを示す棒グラフであり、（Ｂ）は遺伝子導入後、所定時間においてＲＡからＲＮＡを回収した際のＨＯＸＤ１０の相対的発現レベルを示す折れ線図であり、（Ｃ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＯＡの細胞数を示す折れ線図であり、（Ｄ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＲＡの細胞数を示す折れ線図である。
【図９】（Ａ）はリアルタイムＰＣＲ解析によって得た、各細胞におけるＥＴＶ１の相対的発現レベルを示す棒グラフであり、（Ｂ）は遺伝子導入後、所定時間においてＭＳＣからＲＮＡを回収した際のＥＴＶ１の相対的発現レベルを示す折れ線図であり、（Ｃ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＭＳＣの細胞数を示す折れ線図であり、（Ｄ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＦＢの細胞数を示す折れ線図であり、（Ｅ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＯＡの細胞数を示す折れ線図であり、（Ｆ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＲＡの細胞数を示す折れ線図である。
【図１０】（Ａ）はリアルタイムＰＣＲ解析によって得た、各細胞におけるＭＥＯＸ２の相対的発現レベルを示す棒グラフであり、（Ｂ）は遺伝子導入後、所定時間においてＯＡからＲＮＡを回収した際のＭＥＯＸ２の相対的発現レベルを示す折れ線図であり、（Ｃ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＯＡの細胞数を示す折れ線図であり、（Ｄ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＲＡの細胞数を示す折れ線図である。
【図１１】（Ａ）はリアルタイムＰＣＲ解析によって得た、各細胞におけるＰＲＤＭ１６の相対的発現レベルを示す棒グラフであり、（Ｂ）は遺伝子導入後、所定時間においてＭＳＣからＲＮＡを回収した際のＰＲＤＭ１６の相対的発現レベルを示す折れ線図であり、（Ｃ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＭＳＣの細胞数を示す折れ線図であり、（Ｄ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＦＢの細胞数を示す折れ線図であり、（Ｅ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＯＡの細胞数を示す折れ線図であり、（Ｆ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＲＡの細胞数を示す折れ線図である。
【図１２】（Ａ）はリアルタイムＰＣＲ解析によって得た、各細胞におけるＧＡＴＡ６の相対的発現レベルを示す棒グラフであり、（Ｂ）は遺伝子導入後、所定時間においてＭＳＣからＲＮＡを回収した際のＧＡＴＡ６の相対的発現レベルを示す折れ線図であり、（Ｃ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＭＳＣの細胞数を示す折れ線図であり、（Ｄ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＦＢの細胞数を示す折れ線図であり、（Ｅ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＯＡの細胞数を示す折れ線図であり、（Ｆ）は遺伝子導入後、所定時間におけるＲＡの細胞数を示す折れ線図である。
【図１３】グループａ〜ｄの遺伝子（代表例を１つ）について、ＤＮＡマイクロアレイによる解析の結果を示す棒グラフであり、（ａ）はグループａのＴＭＥＦＦ２の結果を示し、（ｂ）はグループｂのＨＯＸＤ１０の結果を示し、（ｃ）はグループｃのＭＧＣ４５７８０の結果を示し、（ｄ）はグループｄのＩＦの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2008092919.tif 000089
【図１１】
2008092919.tif 000090
【図１２】
2008092919.tif 000091
【図１３】
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【配列表】
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