(57)【要約】【課題】大きさが１０〜数１０μｍ径の細胞の一つ一つに含まれるタンパク質の種類を高感度で同定する方法を提供すること。また、これを達成するために必要となる検体の処理液を提供すること。【解決手段】（１）病変組織の切片を、金粒子と消化酵素を含む水溶液で処理し、注目するタンパク質を限定分解分解する工程、（２）ＴＯＦ−ＳＩＭＳを用い、断片化したペプチドの二次元分布を測定する工程、（３）プロテオーム解析結果と数値解析的手法を用いることにより、病変組織の切片における注目タンパク質の二次元分布を可視化する工程、の三工程により上記の課題を解決する。【選択図】図１
2008275422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の対象物を分析するための前処理に用いる処理溶液であって、少なくとも金属粒子と消化酵素を含み、かつ該金属粒子が常温常圧下で分散された状態にあることを特徴とする処理溶液。
【請求項２】
前記金属粒子が金粒子であることを特徴とする請求項１に記載の処理溶液。
【請求項３】
前記金属粒子の直径が１ｎｍから１００ｎｍの範囲であることを特徴とする請求項１または２に記載の処理溶液。
【請求項４】
前記金属粒子と前記消化酵素とが化学結合していることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の処理溶液。
【請求項５】
前記消化酵素が人工消化酵素であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の処理溶液。
【請求項６】
前記対象物がタンパク質であることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の処理溶液。
【請求項７】
請求項１から６に記載の処理溶液をインクジェット装置に充填し、該装置を用い、該処理溶液を液滴として所定の位置に付与することを特徴とする前処理方法。
【請求項８】
検体中の対象物に関する情報を取得する方法であって、
請求項７に記載の前処理方法を用いて検体を処理する工程と、
処理後の検体に含まれる対象物の質量に関する情報（消化酵素で分解されたペプチド断片の質量に関する情報を含む）を飛行時間型二次イオン質量分析法により取得する工程とを備えることを特徴とする情報取得方法。
【請求項９】
前記検体が病変組織の切片であることを特徴とする請求項８に記載の情報取得方法。
【請求項１０】
前記対象物がタンパク質であることを特徴とする請求項８または９に記載の情報取得方法。
【請求項１１】
検体中における疾病に関わる特有な対象物の有無を検出する方法であって、請求項８から１０に記載の情報取得方法を利用して検体中における疾病に関わる特有な対象物の有無を検出することを特徴とする検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の対象物を分析するための前処理に用いる処理溶液、該前処理方法、検体中の対象物に関する情報を取得する方法および、特有な対象物の有無を検出する方法に関する。特に、生体組織または細胞中に含まれるタンパク質を分析するための前処理に用いる処理溶液、該前処理方法および、生体組織または細胞中に含まれるタンパク質に関する情報を取得する方法、該タンパク質の有無を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のゲノム解析の進展により、生体内に存在する遺伝子産物であるタンパク質の解析の重要性が急速にクローズアップされてきている。
【０００３】
従来から、タンパク質の発現及び機能解析の重要性が指摘されており、その解析手法の開発が進められている。これらの手法は、
（１）二次元電気泳動や高速液体クロマトグラフ(ＨＰＬＣ)による分離精製と、
（２）放射線分析、光学的分析、質量分析等の検出系
の組み合わせを基本としている。
【０００４】
タンパク質解析技術の基盤はプロテオーム解析と呼ばれるもので、これは遺伝子から作り出され実際に生体内で働いているタンパク質を解析し、細胞の機能や疾患の原因を究明することを目的としている。代表的な解析手法としては、
（１）対象とする生体組織や細胞からのタンパク質の抽出、
（２）二次元電気泳動によるタンパク質の分離、
（３）ＭＡＬＤＩ法（マトリクス支援レーザー脱離−飛行時間型質量分析法：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）などの質量分析によるタンパク質またはその断片の分析、
（４）ゲノムプロジェクトなどのデータベースを利用したタンパク質の同定、
などが挙げられる。
【０００５】
この他に、
（１）対象とする生体組織や細胞からのタンパク質の抽出、
（２）抽出したタンパク質の消化（または変性）、
（３）液体クロマトグラフ(ＬＣ)とイオントラップ型質量分析計(Ｉｏｎ−ｔｒａｐ ＭＳ)を組み合わせたシステムを用いた上記消化(または変性)タンパク質の分析、
（４）データベースの構築およびタンパク質の同定、
などもある（例えば非特許文献１）。
【０００６】
これらのプロテオーム解析により、癌を例に挙げれば、再発や転移に関わるタンパク質が明らかになりつつあるなど、既に成果が出始めている。
【０００７】
一方、プロテインチップや生体組織切片におけるタンパク質の二次元分布の可視化を目的とした、飛行時間型二次イオン質量分析法（以下、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法と略す。）をベースとする情報取得手法及び装置を本願発明者らが提案した（特許文献１）。この手法は、インクジェット法などを用い、イオン化促進物質かつ／または消化酵素を上記のプロテインチップや生体組織切片に付与し、タンパク質の種類に関する情報（消化酵素により限定分解されたペプチドの情報を含む）を、その位置情報を保持したままＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により可視化するというものである。
【０００８】
また、上記を発展させた手法や装置も本願発明者らが提案した。すなわち、インクジェット法で使用する水溶液のｐＨを工夫したもの、細胞内代謝物質を検出するために工夫したもの、電気泳動法や薄層クロマトグラフィーなどの分離精製手法を併用しタンパク質の識別能を高めたものなどを提案した。
【０００９】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法において検出感度を向上させる方法として金属粒子を使う方法が提案されている。例えば、Ａ.ＭａｒｃｕｓとＮ．Ｗｉｎｏｇｒａｄは、金や銀のナノ粒子をサブモノレイヤー程度、サンプル表面に成膜(deposition)することでＴＯＦ−ＳＩＭＳの検出感度が向上することを報告している（非特許文献２）。また、Ｙ.Ｐ.Ｋｉｍらは、金ナノ粒子上に配置したペプチド分子の(ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法における)イオン化効率が、金ナノ粒子の効果により向上することを報告している(非特許文献３）。
【００１０】
また、個々の細胞を対象としたＳＩＭＳ分析の例としては、Ｓ.Ｇ.Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉらの報告（非特許文献４）などが挙げられる。
【００１１】
さらに特許第３２０７７０６号には、金属コロイドを含む水溶液を液滴化し、インクジェット方式により基板上へ付与する方法が開示されている。
【非特許文献１】磯辺俊明、高橋信弘編「実験医学別冊  プロテオーム解析」、羊土社、２０００年
【非特許文献２】Ａ.Ｍａｒｃｕｓ ａｎｄ Ｎ.Ｗｉｎｏｇｒａｄ，Ａｎａｌ.Ｃｈｅｍ.，７８，１４１−１４８（２００６）
【非特許文献３】Ｙ.Ｐ.Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ.Ｃｈｅｍ．，７８，１９１３−１９２０（２００６）
【非特許文献４】Ｓ.Ｇ.Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ Ｌｅｖｅｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ”，Ｄｅｋｋｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ １−１１（２００６）
【特許文献１】特許第３６５８３９７号明細書
【特許文献２】特許第３２０７７０６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、従来のプロテオーム解析方法は特定の生体組織や体液、血液などを対象としたもので、大きさが１０〜数１０μｍ径の細胞を直接対象としたものではなかった。癌細胞など特定の病変細胞の中に含まれるタンパク質、あるいは癌細胞に隣接する細胞中に含まれるタンパク質、さらにはその両者を同定できれば診断デバイスや創薬（薬剤候補スクリーニング）デバイスの開発に寄与できることになる。また、初期の癌細胞や癌組織について、転移や再発に関わるタンパク質の有無を直接調べることも原理的には可能になり、新たな予後診断方法にもなり得る。
【００１３】
また、本願発明者らが提案した情報取得方法は、細胞レベルでのタンパク質に関する情報（消化酵素により限定分解されたペプチドの情報を含む）を取得できるが、検出感度が十分でない場合があった。
【００１４】
Ｓ.Ｇ.Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉらの方法は、ＳＩＭＳ法における空間分解能を高めることで、質量情報を用いた細胞レベルのイメージングを可能としたが、質量／電荷（ｍ／ｚ）比の上限が５００程度という制限があった。すなわち、本願発明者らが提案した特許文献２に記載されている、消化分解ペプチドから分解前のタンパク質を決定するのに必要な「ｍ／ｚ比が５００〜５０００程度の特徴的なフラグメントイオン」を検出するには、その方法は十分でなかった。
【００１５】
Ａ.ＭａｒｃｕｓとＮ.Ｗｉｎｏｇｒａｄの方法や、Ｙ.Ｐ.Ｋｉｍらの方法は、金ナノ粒子を共存させる（成膜させる、または被検出分子の下部に配置する）ことが、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法の検出感度を向上させることを開示している。しかしながらこれらの方法は、消化分解させたペプチドを対象としたものではないことから、生体組織や細胞中の特定タンパク質の分析に利用することは難しい（均一に消化分解する方法が開示されていない）。
【００１６】
また、特許文献２には、金属コロイドを含む水溶液を液滴化し、インクジェット方式により基板上へ付与する方法が開示されているが、電子デバイスの配線形成を目的としたものであり、消化酵素の付与に関する記載がない。すなわち、この方法も、生体組織や細胞中の特定タンパク質を分析するための前処理法としてそのまま利用することは難しい。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の処理溶液は、検体中の対象物を分析するための前処理に用いる処理溶液であって、少なくとも金属粒子と消化酵素を含み、かつ該金属粒子が常温常圧下で分散された状態にあることを特徴とする。ここでいう常温常圧とは、摂氏２５度±５度、１０１３２５±１０００Ｐａを意味する。
【００１８】
前記の金属粒子は金粒子であることが好ましく、またその直径は１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲にあることが好ましい。本発明の処理溶液は、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法で分析する被検体の前処理に好適に用いられる。したがって、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法で感度が向上する微粒子であれば金以外の金属を使用することもできる。また、本発明の処理溶液はインクジェット法を用い、該処理溶液を液滴として所定の位置に付与することを特徴とする。したがって、上記金属粒子は、インクジェット装置の吐出口で目詰まりを起こさないことが必要で、該金属粒子の大きさの上限は１００ｎｍ程度である。また通常は水溶液として使用するため、該金属粒子は水溶液に分散された状態であることが必要である。なお、該金属粒子の大きさの下限は１ｎｍ程度が好ましい。
【００１９】
また、本発明の処理溶液は、前記の金属粒子と消化酵素とが化学結合（配位結合を含む）していることが好ましい。これは、インクジェット法を用いて該処理溶液を検体に付与するに際し、金属粒子が水溶液に分散された状態を長く保つためである。金属粒子として金を例に挙げれば、金と消化酵素の結合（配位結合を含む）に、消化酵素中のチオール基（メルカプト基）やアミノ基などを利用するのが一般的である。
【００２０】
さらに、本発明の処理溶液は、前記消化酵素が人工消化酵素であることを特徴とする。ここでいう人工消化酵素とは、人工的に合成した酵素であって、タンパク質を消化分解する消化部位と上記金属粒子との結合部位との、少なくとも二つの部位を持つ酵素を指す。タンパク質を消化分解する消化部位とは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシンなどの消化活性部位と基本的には同一である。
【００２１】
また、前記検体中の対象物として、検体中のタンパク質を挙げることができる。
【００２２】
本発明の前処理方法は、上記の処理溶液をインクジェット装置に充填し、該装置を用い、該処理溶液を液滴として所定の位置に付与することを特徴とする。インクジェット装置としては、ピエゾ方式、バブルジェット方式のいずれの装置を用いることができる。
【００２３】
本発明の情報取得方法は、検体中の対象物に関する情報を取得する方法であって、前記の前処理方法を用いて検体を処理する工程と、処理後の検体に含まれる対象物の質量に関する情報（消化酵素で分解されたペプチド断片の質量に関する情報を含む）をＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により取得する工程とを備えることを特徴とする。ＴＯＦ−ＳＩＭＳで用いる一次イオン種としては、イオン化効率、質量分解能等の観点から、ガリウムイオン、セシウムイオン、金イオン、ビスマスイオンなどの単原子イオンや、Ａｕ3イオン、Ｂｉ3イオン、Ｃ60イオンなどのクラスターイオンなどが用いられる。
【００２４】
本発明の情報取得方法は、前記の検体が病変組織の切片であることを特徴とし、また前記の対象物がタンパク質であることを特徴とする。
【００２５】
さらに本発明は、検体中における、疾病に関わる特有な対象物の有無を検出する方法であって、上記の情報取得方法を利用して検体中における疾病に関わる特有な対象物の有無を検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、大きさが１０〜数１０μｍ径の細胞の一つ一つに含まれるタンパク質の種類を高感度で同定する方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は上記の特徴を持つものであるが以下に最良の実施形態について述べる。
【００２８】
本発明の処理溶液は、直径が１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲にある金粒子と消化酵素を含む水溶液であって、これらが常温常圧下で分散された状態にあることが好ましい。特に、前記金粒子と消化酵素が化学結合（配位結合を含む）していることが好ましい。最良の形態としては、前記消化酵素として、チオール基（メルカプト基）またはアミノ基を有する（金粒子との）結合部位と、ペプシン、トリプシン、キモトリプシンなどの消化活性部位とを有する人工消化酵素を用いることである。この第一の理由は、水溶液中での分散安定性が向上するためである。また第二の理由は、後述のＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析工程において検出感度が向上するためである。すなわち、二次イオンの生成効率を高める作用のある金粒子の近傍で効率よく消化反応を進行させ、結果として、金粒子の近傍に消化分解ペプチドを集めることができる。図１に金粒子と結合した人工消化酵素の模式図を示す。図１において、１は金粒子、２は人工消化酵素、３は人工消化酵素２内の金粒子との結合部位、４は人工消化酵素２内の消化活性部位、である。
【００２９】
本発明において、検体として病変組織の切片を挙げることができ、また対象物としては検体中のタンパク質を挙げることができる。そのほか、検体としては分子量が１００００以下のペプチドなどを挙げることができる。
【００３０】
本発明の情報取得方法の基本工程は、（１）病変組織の切片を、金粒子と消化酵素を含む水溶液で処理し、注目するタンパク質を限定分解する工程、（２）ＴＯＦ−ＳＩＭＳを用い、断片化したペプチドの二次元分布を測定する工程、（３）プロテオーム解析結果と数値解析的手法を用いることにより、病変組織の切片における注目タンパク質の二次元分布を可視化する工程、の三つからなる。
【００３１】
上記（１）の工程では、検体に消化酵素等を均一に付与させるためにインクジェット法を用いることが好ましい。
【００３２】
上記（２）の工程において、ＴＯＦ−ＳＩＭＳの代表的測定条件を以下に示す。
【００３３】
一次イオン種：Ａｕ3イオン、Ｂｉ3イオン、Ｃ60イオン等のクラスターイオン
一次イオンビーム径：約１μｍ
一次イオンフルーエンス（ドーズ量）：１×１０14 ｉｏｎｓ／ｃｍ2
測定領域：１００μｍ×１００μｍ
測定質量範囲：１〜５０００（ｍ／ｚ）
測定時間：約１０分。
【００３４】
一次イオンとしてクラスターイオンを用いるのは、単原子イオンに比べクラスターイオンの方が質量数の大きい二次イオンの検出に有利であるからである（例えば、本発明者らの特許文献１）。一次イオンビーム径を約１μｍとするのは、直径２０μｍ前後の個々の細胞を識別するために必要だからである。一次イオンフルーエンスを上記の値とするのは、一定以上の二次イオン感度（積算信号強度）を得るために必要だからである。測定質量範囲を上記の値とするのは主測定対象が消化分解ペプチドであるからである（例えば、特開２００６−０１０６５８号公報参照）。測定時間を約１０分程度と設定するのは、長時間の測定が定量的評価に悪影響を与える場合があるからである（例えば、Ｈ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ.Ｓｕｒｆ.Ｓｃｉ．，２３１−２３２，３８５−３９１（２００４））。
【００３５】
上記（３）の工程における数値解析的手法とは、因子分析などの統計的手法を指す。
【００３６】
本発明は、病変組織の切片において、疾病に関わる特有なタンパク質の有無を検出する方法でもある。
【実施例】
【００３７】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。以下に示す具体例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明はかかる具体的形態に限定されるものではない。
【００３８】
本開示によりトリプシン組換えタンパク質の取得とその方法を示す。以下の実施例では、ウシ膵臓由来のトリプシノーゲン（トリプシン前駆体）の大腸菌発現ベクターを設計・作製し、不溶性顆粒画分として大腸菌に発現させて巻き戻しと精製工程の後、自己触媒により酵素活性を有する組換えトリプシンタンパク質を取得する。また、以下に記す組換えＤＮＡ法はＳａｍｂｒｏｏｋら著書のモレキュラークローニング(実験マニュアル第二版Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ(１９８９))に基づいて行い、市販のキットを用いる場合は、特記しない限り当業者が推奨プロトコールに準じて行うことができる。また、発現ベクターの構築にはＮｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴＢｌｕｅ−１Ｓｙｓｔｅｍ(Ｃａｔ.Ｎｏ.７０６７３−３）に付属のベクターｐＥＴＢｌｕｅ−１を用いてコンストラクトを作製する。宿主大腸菌には、サブクローニング用としてＪＭ１０９株(Novagen社)を、たんぱく質生産用としてＲｏｓｅｔｔａ (ＤＥ３) ｐＬａｃＩ株(Novagen社)を用いる。
【００３９】
また、実施例に用いる化学薬品は特記しない限り分析級またはそれ以上であり、シグマ社及びナカライテスク社より購入できる。オリゴＤＮＡはシグマジェノシス社、制限酵素および修飾酵素はタカラバイオ社より購入できる。
【００４０】
（実施例１）  ウシ膵臓由来のトリプシノーゲン遺伝子発現ベクターの構築
以下、ウシ膵臓由来のトリプシノーゲン組換え遺伝子は、トリプシノーゲン遺伝子コーディング領域(ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号；Ｘ５４７０３)の３'末端に、アフィニティー精製用Ｈｉｓ６配列と金担体に固定するためのＣｙｓ残基をコードするスペーサー能を有するＤＮＡタグ配列を設けたＤＮＡ配列（図２）をさす。
【００４１】
（１）上記ウシ膵臓由来のトリプシノーゲン組換え遺伝子の合成
プライマーセット１（配列番号１〜４）、プライマーセット２（配列番号５〜１０）と、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用い当業者の推奨する配合で調合し、温度サイクル９８℃×１ｍｉｎ.→（９８℃、１０ｓｅｃ．→５５℃、３０ｓｅｃ.→７２℃、３０ｓｅｃ．）×４０ｃｙｃｌｅｓ→４℃でオーバーラップＰＣＲを行う。それぞれ目的サイズ約３００ｂｐと４５０ｂｐの断片の増幅を電気泳動とＥｔＢｒ染色により確認する。
配列番号１（５’→３’）
atgttcccctcggacgacgatgacaagatcgtcgggggctacacctgcgcagagaatt
配列番号２
ggacaccacccactggtcattgatgagggagcccccgcagaagtggtagccagcattcagggacacctggtaagggacggaattctctgcgcaggtgtag
配列番号３
atgaccagtgggtggtgtccgcggctcactgctaccagtaccacatccaggtgaggctgggagaatacaacattgatgtcttggagggtggtgagcagtt
配列番号４
agagtttgatcagcaggatgtcattgtccagagtccagctgctgtacttggggtggcggatgatcttggacgcatcgatgaactgctcaccaccctccaa
配列番号５
catcctgctgatcaaactctccacgcctgcggtcatcaatgcccgggtgtccaccttgctgctgcccagtgcctgtgcttccgcaggcacagagtgcctc
配列番号６
ctcagcagcggggccaccaggcattgcagcaggtccgggtagttgacgccactgctcagggtgttgccccagccggagatgaggcactctgtgcctgcgg
配列番号７
ctggtggccccgctgctgagccacgccgactgtgaagcctcataccctggacagatcactaacaacatgatctgcgctggcttcctggaaggaggcaagg
配列番号８
acagccgtagccccaggacacaatgccctggagctgtccgttgcaagccacagggccgccagagtcaccctggcaggaatccttgcctccttccaggaag
配列番号９
tgtcctggggctacggctgtgcccagaagggcaagcctggggtctacaccaaggtctgcaactacgtggactggattcaggagaccatcgccgccaacag
配列番号１０
ggcttagcaatggtggtgatgatggtggctagcgctgttggcggcgatggtctc
次に、目的サイズの断片を市販のゲル精製キット（Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ Ｎｏ ＃Ａ９２８１ Ｐｒｏｍｅｇａ社））により精製する。次に精製した上記二つの断片を鋳型にし、プライマーセット３（配列番号１１および１２）を用いて再度同条件でオーバーラップＰＣＲを行い、最終目的サイズ約７３０ｂｐの断片が増幅していることを確認し、同様に精製する。
配列番号１１
atgttcccctcggacgacgatga
配列番号１２
ggcttagcaatggtggtgatgat
（２）大腸菌発現ベクターへのサブクローニング
ｐＥＴＢｌｕｅ−１発現ベクターをＥｃｏＲＶ酵素で消化した後、ＢＡＰにより脱リン酸化処理（３７℃、１時間）を行い、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ Ｎｏ ＃Ａ９２８１ Ｐｒｏｍｅｇａ社）により脱リン酸化されたＤＮＡ断片を精製する。次に、市販のＤＮＡライゲーションキット（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＬＧＫ−１０１（ＴＯＹＯＢＯ社））を用いて、（１）で合成したＤＮＡ断片と脱リン酸化ベクターを業者推奨の方法にて調合し連結させる。
【００４２】
そして、ライゲーション溶液をＪＭ１０９株コンピテントセル(Novagen社)にヒートショック法により形質転換した後に、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ  ｍｅｄｉｕｍ(ＬＢ)＋Ａｍｐ．（１００μｇ/ｍ）＋ＩＰＴＧ＋Ｘ−ｇａｌ寒天プレートに撒き、３７℃にて一晩静置する。
【００４３】
次に、プレート中から青白選択を行い任意のコロニーをＬＢ／Ａｍｐ液体培地３ｍｌに植菌し、３７℃にて一晩振盪培養を行う。その後、市販のＭｉｎｉＰｒｅｐキット（Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ(Promega社））を使用して、プラスミドＤＮＡを回収する。
【００４４】
得られたプラスミドの塩基配列を決定し、目的の断片が正しい方向に挿入され且つ配列が正しいことを確認することができ、結果としてウシ膵臓由来のトリプシノーゲン組換え遺伝子発現ベクターが得られる。
【００４５】
（実施例２）  トリプシノーゲン組換えタンパク質の大腸菌による発現、巻き戻し実験
（１）形質転換
上記実施例１で取得した発現ベクターを、タンパク質生産用のＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ株コンピテントセル溶液に形質転換する。形質転換は、ヒートショックを氷中→４２℃、９０ｓｅｃ．→氷中の条件でおこなう。ヒートショックにより形質転換した上記Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ株コンピテントセル溶液にＴｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ(ＴＢ；１％（Ｗ/Ｖ）ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，２％（Ｗ/Ｖ）ｐｅｐｔｏｎｅ，０．１Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ７．５），１％グリセロール)培地５００μＬを加え、一時間３７℃にて振盪培養を行った。その後、６０００ｒ.ｐ.ｍ.で５分間遠心を行い、培養上清６５０μＬを廃棄し、残った培養上清と沈殿となった細胞画分を攪拌し、ＴＢ／Ａｍｐ.１００μｇ/ｍｌ／ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ３４μｇ／ｍｌ寒天プレートに撒き、一晩３７℃にて培養する。
【００４６】
（２）予備培養
プレート上のコロニーを無作為に選択し、５０ｍｌのＴＢ／Ａｍｐ.２００μｇ/ｍｌ／ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ３４μｇ/ｍｌ培地にて３７℃でＯＤ６００ｎｍ値が０．２〜０．６になるまで振盪培養を行う。次に１，０００×ｇ、５分間遠心して上清を捨て、菌を集菌し、新しい培地（上記）で懸濁した後２ｍｌとり、ＴＢ／Ａｍｐ.４００μｇ/ｍｌ／ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ３４μｇ/ｍｌ培地５００ｍｌに植菌し３７℃でＯＤ６００ｎｍ値が０．２〜０．６になるまで振盪培養を行う。
【００４７】
（３）本培養
上記予備培養溶液を更に培養を３０℃にて継続する。Ｄ６００ｎｍ値が１．０を越えた時点で、終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、更に３０℃にて終夜培養を行う。
【００４８】
（４）精製
目的のポリペプチド鎖を不溶性顆粒画分から以下の工程により精製する。
【００４９】
（ｉ）不溶性顆粒の回収
上記３）で得られた培養液を６，０００ｒ.ｐ.ｍ.で３０分間遠心し、沈殿を菌体画分として得る。得られた菌体を１００μｇ/ｍｌリゾチーム入りトリス溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)／５００ｍＭ ＮａＣｌ）１５ｍｌに懸濁し、３７℃で３０分反応後、氷中保管する。得られた懸濁液をフレンチプレスにて破砕し、菌破砕液を得る。１０ｕｎｉｔのＤＮａｓｅＩ酵素を加え、３７℃で１５分間反応させる。その後、最終２％になるようにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え不溶性顆粒画分を２回洗浄する。
【００５０】
次に、菌破砕液を１２，０００ｒ.ｐ.ｍ.で１５分間遠心を行い、上清を除き、沈殿を不溶性顆粒画分として得る。
【００５１】
（ｉｉ）不溶性顆粒画分の可溶化
上記（ｉ）で得られた不溶性画分を６Ｍ  塩酸グアニジン／トリス溶液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)／５００ｍＭ  ＮａＣｌ）１０ｍｌを加え、超音波で不溶画分を分散させた後室温で一晩浸漬する。次に、１２，０００ｒ.ｐ.ｍ.で１０分間遠心し、上清を可溶化溶液として得る。
【００５２】
（ｉｉｉ）金属キレートカラム
金属キレートカラム担体としてＨｉｓ−Ｂｉｎｄ(Novagen社製)を用いる。カラム調整やサンプル負荷、及び洗浄工程は、前記業者の推奨方法に準拠し、室温（２０℃）にて行う。目的であるＨｉｓタグ融合のポリペプチドの溶出は６０ｍＭイミダゾール／トリス溶液にて行う。溶出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（アクリルアミド１５％）の結果、単一バンドであり、精製されていることを確認する。
【００５３】
（ｉｖ）透析
上記溶出液に対して、外液を６Ｍ塩酸グアニンジン／トリス溶液として４℃にて透析を行い、溶出液中のイミダゾールの除去を行い、上記ポリペプチド鎖溶液を得る。
【００５４】
（ｖ）巻き戻し
上記と同様にして、ポリペプチド鎖溶液を以下の工程により、脱塩酸グアニンジンを透析（４℃）にて行いながらタンパク質の巻き戻しを行う。
【００５５】
（ａ）６Ｍ塩酸グアニジン／トリス溶液を用い、ポリペプチド鎖のモル吸光係数とΔＯ.Ｄ.(２８０ｎｍ−３２０ｎｍ)値から濃度７．５μＭのサンプル（希釈後体積１０ｍｌ）を調製する。次にβ−メルカプトエタノール(還元剤)を終濃度３７５μＭ(タンパク濃度５０倍)になるよう添加し、室温、暗所で４時間還元を行う。このサンプル溶液を透析バック(ＭＷＣＯ；８，０００)に入れ、透析用サンプルとする
（ｂ）透析外液を６Ｍ塩酸グアニンジン／トリス溶液として、透析サンプルを浸漬し、緩やかに攪拌しながら６時間透析する
（ｃ）外液の塩酸グアニジン濃度を３Ｍ、２Ｍと段階的に下げる。それぞれの外液濃度において、６時間透析する
（ｄ）酸化型グルタチオン(ＧＳＳＧ)を終濃度３７５μＭ、Ｌ−Ａｒｇを終濃度０．４Ｍとなるようにトリス溶液に加え、上記（ｃ）の２Ｍの透析外液を加え、塩酸グアニジン濃度を１Ｍとし、ＮａＯＨでｐＨ８．０(４℃)に調整した溶液にて、１２時間緩やかに攪拌しながら透析する
（ｅ）上記（ｄ）と同様の作業にて塩酸グアニジン濃度０．５ＭのＬ−Ａｒｇ含有トリス溶液を調整し、更に１２時間透析する
（ｆ）最後にトリス溶液にて１２時間透析する
（ｇ）透析終了後、１０，０００ｒ.ｐ.ｍ.で約２０分間遠心分離し凝集体と上清とを分離し、可溶性の巻き戻しトリプシノーゲン組換えタンパク質を得る。
【００５６】
（実施例３）  トリプシノーゲン組換えタンパク質の活性化と活性組換えトリプシンタンパク質の精製取得
（１）トリプシノーゲン組換えタンパク質の活性化
得られた巻き戻しトリプシノーゲン組換えタンパク質を１時間、室温に放置した後、４℃で１２時間静置することで自己触媒能による組換えトリプシンタンパク質を得る。
【００５７】
（２）クロマトグラフィーによる精製
上記（１）で得られた５μＭ可溶性の巻き戻しトリプシン組換えタンパク質溶液をスーパーデックス２００カラム（ＧＥヘルスケアサイエンス社）（バッファー；２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのＮａＣｌ、流速；０．５ｍｌ/分）にてゲルろ過し、目的サイズの単ピークのフラクションを得る。
【００５８】
（３）トリプシン活性測定
Ｎ−Ｂｅｎｚｏｙｌ−ＤＬ‐ａｒｇｉｎｉｎｅ‐ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＢＡＰＡ）を基質とするＥｒｌａｎｇｅｒらの方法（ＢＡＰＡ法）に準じる。２５℃で５分間、基質と上記フラクションのサブフラクションとを反応させ、ＢＡＰＡ分解物であるパラニトロアニリンの４０５ｎｍ吸光度を測定し、トリプシン活性の最も高いフラクションを取得する。結果として、活性を有する組換えトリプシンタンパク質を得る。このタンパク質を後の評価に用いる。
【００５９】
（実施例４）  組換えトリプシンタンパク質と金粒子を含む水溶液の調製と、インクジェットプリンタを用いた検体への該水溶液の付与
平均粒径が４０ｎｍ程度の金粒子を含む溶液（分散剤：クエン酸）を出発材料とし、常法に従い、上記組換えトリプシンタンパク質と金粒子が結合した、本願発明の処理溶液である水溶液を調製する。この水溶液が十分分散された状態にあるか否かは、例えば、二日間程度常温で放置した後に沈殿が生じるか否かなどにより判断することができる。この水溶液を、本発明者らの特許第３６５８３９７号明細書に記載されているバブルジェットプリンタに充填する。より具体的には、バブルジェットプリンタＢＪＦ−８５０（キヤノン(株)製）用のプリンターヘッドＢＣ−５０（キヤノン(株)製）を、数１００μｌの溶液を吐出可能とするべく改造したものを使用し、このヘッドのタンク部に、前記水溶液を数１００μｌ注入する。その後、シリコン基板上に配置した検体を前記プリンタに挿入し、検体表面の全面に前記水溶液を液滴として付与する。その際、検体表層のタンパク質を均一に消化するために、最終的に付与される水溶液量が二次元的に均一になるように工夫する必要がある（例えば、液滴を付与する地点を少しずつ移動させながら行う）。なお、液滴量は通常１滴あたり１〜８ｐｌとし、ある一定の地点における付与回数（重ねうちの回数）は上記組換えトリプシンタンパク質の濃度に応じて調整する。該組換えトリプシンタンパク質の濃度は１〜１００μＭ程度とする。また、検体に前記水溶液を付与した後は、消化反応を進行させるために、常温、高湿度下で一定時間保持することが必要である。
【００６０】
なお、上記バブルジェットプリンタで使用する水溶液は、吐出の安定化などを目的のため、グリセリン、尿素、チオジグリコール、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル社）の中から選ばれる一種または複数を含んでもよい。
【００６１】
（実施例５）  ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のトリプシン消化物のＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析
ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ、アミノ酸の配列番号１３）をシリコン基板などにスピンコートし、これを実施例４に示す方法により消化分解する。
配列番号１３
mkwvtfisllflfssaysrgvfrrdahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqcpfedhvklvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctatlretygemadccakqepernecflqhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddadlayicenqdsissklkeccekpllekshciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhek tpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl
上記の消化分解処理により、基本的には上記配列１３中のｋとｒの右側が選択的に切断され、多数のペプチド断片が生成する。この断片ペプチドの内、例えば、ｄａｈｋ，ｓｅｖａｈｒ，ｎｅｃｆｌｑｈｋ，ｈｐｙｆｙａｐｅｌｌｆｆａｋ，ｃａｓｌｑｋ，ａｅｆａｅｖｓｋ，ｌｖｔｄｌｔｋ，ａｄｌａｙｉｃｅｎｑｄｓｉｓｓｋ，ｄｖｆｌｇｍｆｌｙｅｙａｒ，ｈｐｄｙｓｖｖｌｌｌｒ，ｖｐｑｖｓｔｐｔｌｖｅｖｓｒｖｇｓｋ，ｃｃｋｈｐｅａｋ，ｔｐｖｓｄｒ，ｃｃｔｅｓｌｖｎｒ，ｅｒｑｉｋ，ａｖｍｄｄｆａａｆｖｅｋ，ｌｖａａｓｑａａｌｇｌなどの特徴的なペプチドを、それらの水素付加イオンまたは金付加イオンなどの形でＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により検出する。これらの分子量は概ね５００〜５０００ｍ／ｚの範囲にある。上記のように、特徴的な断片ペプチドを複数検出することで、消化分解前のタンパク質がＨＳＡであることを同定することができる。なお、検体表層に金粒子が共存するため二次イオンの検出感度が向上し、上記同定精度が向上する。
【００６２】
（実施例６）  ヒト癌組織切片のトリプシン消化物のＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析
ヒトの癌組織から、厚さ０．５〜５μｍ程度、大きさ１〜１０ｍｍ2程度の切片を切り出し、これを基板上に配置し、次に実施例４に示す方法により消化分解する。図３にその模式図を示す。図３において、５は癌組織切片中の異常細胞、６は癌組織切片中の正常細胞、７はインクジェットプリンタヘッド、８は液滴を示す。
【００６３】
消化分解処理を行った後、実施例５と同様に消化分解ペプチドをＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により検出する。その後、例えば、再発や転移に関わるタンパク質を分解ペプチドのパターンから同定し、これらの信号強度の二次元分布を再表示させる。この模式図を図４に示す。図４において、９は注目するタンパク質の存在個所（再発や転移に関わるタンパク質の存在個所）である。上記のように、本発明の方法を用いることで、注目するタンパク質の存在個所を細胞レベルで調べることが可能になる。なお、検体表層に金粒子が共存するため二次イオンの検出感度が向上し、結果として上記の注目するタンパク質の検出感度が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】金粒子と結合した人工消化酵素の模式図である。
【図２】金担体に固定するためのＣｙｓ残基をコードするスペーサー能を有するＤＮＡタグ配列を設けたＤＮＡ配列である。
【図３】ヒトの癌組織切片に対し、金粒子と消化酵素を含む水溶液をインクジェット法により付与する工程を示す模式図である。
【図４】注目するタンパク質の存在個所（再発や転移に関わるタンパク質の存在個所）を、断片ペプチドの検出パターンから同定し、これを二次元表示した例である。
【符号の説明】
【００６５】
１  金粒子
２  人工消化酵素
３  人工消化酵素２内の金粒子との結合部位
４  人工消化酵素２内の消化活性部位
５  癌組織切片中の異常細胞
６  癌組織切片中の正常細胞
７  インクジェットプリンタヘッド
８  液滴
９  注目するタンパク質の存在個所（再発や転移に関わるタンパク質の存在個所）
【図１】
2008275422.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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