(57)【要約】      （修正有）【課題】内皮前駆細胞および心筋前駆細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させ得るＭＶ０６培地の提供。【解決手段】イスコフ改変ダルベッコ培地と、ウシ胎児血清と、ウマ血清と、Ｌ‐グルタミン２００ｍＭ（１００倍）と、ペニシリン（１００００ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１０００μｇ／ｍＬ）と、Ｈｕ‐Ｒ骨形態形成蛋白質２（ＢＭＰ‐２）と、Ｈｕ‐Ｒ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）と、Ｈｕ‐Ｒ血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）からなるＭＶ０６培地。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮前駆細胞および心筋前駆細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させ得る
‐イスコフ改変ダルベッコ培地と、
‐ウシ胎児血清と、
‐ウマ血清と、
‐Ｌ‐グルタミン２００ｍＭ（１００倍）と、
‐ペニシリン（１００００ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１０００μｇ／ｍＬ）と、
‐Ｈｕ‐Ｒ骨形態形成蛋白質２（ＢＭＰ‐２）と、
‐Ｈｕ‐Ｒ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）と、
Ｈｕ‐Ｒ血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）からなるＭＶ０６培地。
【請求項２】
イスコフ改変ダルベッコ培地が前記容積の８３％である、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
ウシ胎児血清が前記容積の１２．５％である、請求項１に記載の培地。
【請求項４】
ウマ血清が前記容積の２．５％である、請求項１に記載の培地。
【請求項５】
Ｌ‐グルタミン２００ｍＭ（１００倍）が前記容積の１％である、請求項１に記載の培地。
【請求項６】
ペニシリン（１００００ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１０００μｇ／ｍＬ）が前記容積の１％である、請求項１に記載の培地。
【請求項７】
ｈｕ‐Ｒ  ＢＭＰ‐２の濃度が１ｎｇ／ｍＬである、請求項１に記載の培地。
【請求項８】
塩基性ｈｕ‐Ｒ  ＦＧＦ２の濃度が５ｎｇ／ｍＬである、請求項１に記載の培地。
【請求項９】
ｈｕ‐Ｒ  ＶＥＧＦの濃度が１０ｎｇ／ｍＬである、請求項１に記載の培地。
【請求項１０】
培養が、
‐フィブロネクチンと
‐ゼラチン
からなる細胞外マトリックス上で実施される、請求項１に記載の培地。
【請求項１１】
前記フィブロネクチンが前記容積の０．０００５％である、請求項１０に記載の培地。
【請求項１２】
前記ゼラチンが前記容積の０．０２％である、請求項１０に記載の培地。
【請求項１３】
前記ゼラチンがウシ皮膚由来のＢ型である、請求項１２に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ３４＋細胞由来の内皮前駆細胞と心筋前駆細胞の両方のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖を可能にする培地ＭＶ０６に関する。
【０００２】
さらなる臨床適用のため、以前免疫選択により精製されたＣＤ３４＋由来の内皮前駆細胞および心筋前駆細胞の分化およびｅｘ  ｖｉｖｏ増幅を進展させることが求められている。
【０００３】
重要な問題は、ＣＤ３４＋細胞のサブセットに特有の分化および機能的能力がｅｘ  ｖｉｖｏ増幅後に変化しないことを証明することである。
【背景技術】
【０００４】
ヒト成体幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮細胞または心筋細胞へ分化させ得るとして、様々な培地が文献で報告されている。
【０００５】
内皮細胞について、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚらは、血液アフェレーシスから生じた単核細胞（ＭＮＣ）を内皮細胞へ分化させる培地を開発した。ここでＭＮＣをウシ胎児血清（ＦＣＳ）、インスリン、トランスフェリン、内皮細胞成長サプリメント、およびヘパリンを加えたＭ１９９培地中のゼラチンまたはフィブロネクチン上で培養した。
【０００６】
Ｐｏｒａｔらも、Ｘ‐ＶＩＶＯ１５（登録商標）培地上で培養後、内皮細胞分化用にヒト末梢血ＭＮＣを使用し、自己血清、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、およびヘパリンを加えた。細胞は、以前フィブロネクチンまたは自己血漿でコーティングした培養皿で培養された。
【０００７】
Ｅｎｄｏｃｕｌｔ（登録商標）は、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から販売されている、ＣＦＵ‐内皮細胞（ＣＦＵ‐ＥＣ）を作製するための培地である。この培地により末梢血（ＰＢ）を循環する、あるいは骨髄に存在する総ＭＮＣ中の内皮細胞サブ集団の定量化が可能になる。しかし、本培養法は、ＭＮＣの代わりに精製された血液ＣＤ３４＋細胞を平板培養する際には不適切と考えられる。それはこのような培養条件下に限って、ＣＤ３４＋細胞が２日後にアポトーシスを受けるためである。
【０００８】
Ｐｅｉｃｈｅｖら側は、コラーゲンでコーティングした皿に入れたウシ胎児血清（ＦＢＳ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、およびヘパリンを加えたＭ１９９培地を用いて、ヒトＰＢ‐ＣＤ３４細胞から著明な内皮細胞への分化を誘発することに成功した。
【０００９】
心筋細胞については、ヒト成体幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで心筋細胞へ分化させ得る培地を開発した研究グループはごくわずかである。
【００１０】
内皮細胞の部分的分化については、Ｐｏｒａｔの研究グループがＰＢ‐ＭＮＣの心筋細胞への分化にも関心を示し、５‐アザシチジン含有培地を使用した。しかし、５‐アザシチジンは変異原物質であるため、この方法では幹細胞の自然な分化は促進されない。しかも、この変異原性機序により、分化した細胞のその後の最終的な臨床使用も危険なものとなり得る。
【００１１】
ヒト成体幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの心筋細胞への分化に用いられる別の方法は、初代培養における幹細胞と新生ラットとの共培養である。ＹｏｏｎらはＢａｎｄｏｒｆｆらと同じく、この方法を用いてヒト骨髄細胞株の心筋細胞への分化を誘発した。アフェレーシスにより生じたヒトＰＢ  ＣＤ３４＋細胞は用いなかった。しかし、このようなヒト細胞とラット細胞の共培養によって２種類の細胞間で融合メカニズムが促進されると考えられ、このような方法のさらなる臨床使用の可能性を不適切なものにしかねない。
【００１２】
このように、これら全ての培養法を考慮しても、現段階では、心筋細胞内再注入後に起こり得ることと同様の方法で、いわゆる造血幹細胞について内皮細胞と心筋細胞の両方への分化を誘発する能力を有する単独の培地を開発したものはいない。
【発明の開示】
【００１３】
本発明によれば、内皮前駆細胞と心筋前駆細胞の両方をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させ得るＭＶ０６培地は、
イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｂｅｌｌｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）と、
ウシ胎児血清と、
ウマ血清と、
Ｌ‐グルタミン２００ｍＭ（１００倍）と、
ペニシリン（１００００ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１０００μｇ／ｍＬ）と、
ヒト組換え（ｈｕ‐Ｒ）骨形態形成蛋白質‐２（ＢＭＰ‐２）と、
Ｈｕ‐Ｒ線維芽細胞成長因子‐２（ＦＧＦ２）と、
Ｈｕ‐Ｒ血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）からなる。
【００１４】
本発明の培養を実現するための好適な方法によれば、イスコフ改変ダルベッコ培地は容積の８３％である。
【００１５】
本発明の培養を実現するための好適な方法によれば、ウシ胎児血清は容積の１２．５％である。
【００１６】
本発明の培養を実現するための好適な方法によれば、ウマ血清は容積の２．５％である。
【００１７】
本発明の培養を実現するための好適な方法によれば、Ｌ‐グルタミン２００ｍＭ（１００倍）は容積の１％である。
【００１８】
本発明の培養を実現するための好適な方法によれば、ペニシリン（１００００ｕ／ｍＬ／ストレプトマイシン（１０００μｇ／ｍＬ）は容積の１％である。
【００１９】
本発明の培養を実現するための好適な方法によれば、Ｈｕ‐Ｒ  ＢＭＰ‐２の濃度は１ｎｇ／ｍＬである。
【００２０】
本発明の培養を実現するための好適な方法によれば、Ｈｕ‐Ｒ  ＦＧＦ２の濃度は５ｎｇ／ｍＬである。
【００２１】
本発明の培養を実現するための好適な方法によれば、ｈｕ‐Ｒ  ＶＥＧＦの濃度は１０ｎｇ／ｍＬである。
【００２２】
本発明を実現するための有利な方法によれば、この培養は、
フィブロネクチンと、
ゼラチンからなる細胞外マトリックス上で実施される。
【００２３】
好ましくは、フィブロネクチンは容積の０．０００５％、ゼラチンは容積の０．０２％である。
【００２４】
有利には、ゼラチンはウシ皮膚由来のＢ型である。
【００２５】
本発明の組成は、ＣＤ３４＋細胞を７日間以上生存させ得る能力と、これらの細胞を内皮細胞および心筋細胞へ分化させ得る能力のどちらも有することで評価されている。ＦＧＦ２およびＶＥＧＦは内皮細胞への分化に使用し、ＢＭＰ‐２（胚発生時の心筋分化の主要な誘発因子として知られている）およびＦＧＦ２は心筋細胞への分化に使用する。さらに、梗塞後の心筋組織の瘢痕を厳密に再現するため、フィブロネクチンとゼラチンにより培養皿をコーティングする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明により開発された培地ＭＶ０６は、各細胞型の遺伝子マーカーの著明な発現により示された通り、ＣＤ３４＋細胞から内皮前駆細胞および心筋前駆細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化を可能にする。
【００２７】
図１は、ＭＶ０６培地上で培養したときのＣＤ３４＋細胞による内皮前駆細胞（１Ａ）または心筋前駆細胞（１Ｂ）のいずれかに関する分子生物学的マーカーの漸次的発現を示す。
【００２８】
図２は、免疫蛍光法により、ＭＶ０６培地上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養において増殖させた一部のＣＤ３４＋前駆細胞の内皮細胞への漸次的分化を、抗フォンウィルブラント因子抗体（ｖＷＦ）抗体およびジアセチル‐ＬＤＬの取り込みにより標識化し可視化している。
【００２９】
図３は、免疫蛍光法により得られた、本発明の培地上で増殖させ、抗トロポニンＴおよび抗α‐サルコメアアクチンモノクローナル抗体で標識化したＣＤ３４＋細胞由来の心筋細胞の結果の写真である。
【００３０】
本発明によるＭＶ０６培地は、
イスコフ改変ダルベッコ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃２１９８０）８３％と、
ウシ胎児血清１２．５％と、
ウマ血清２．５％と、
Ｌ‐グルタミン２００ｍＭ（１００倍）１％と、
ペニシリン（１００００ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１０００μｇ／ｍＬ）１％と、
Ｈｕ‐Ｒ骨形態形成蛋白質‐２（Ｅｕｒｏｂｉｏ）１ｎｇ／ｍＬと、
Ｈｕ‐Ｒ線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）（Ｅｕｒｏｂｉｏ）５ｎｇ／ｍＬと、
Ｈｕ‐Ｒ血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｅｕｒｏｂｉｏ）１０ｎｇ／ｍＬからなる。
【００３１】
さらにこの培養は、
フィブロネクチン（ウシ血漿由来の溶液、ＳＩＧＭＡ＃Ｆ１１４１）０．０００５％と
ゼラチン（ウシ皮膚由来のＢ型、ＳＩＧＭＡ＃Ｇ１３９３）０．０２％からなる細胞外マトリックス上で実施される。
【００３２】
第１段階では、本発明によるＭＶ０６培地は、ＣＤ３４＋細胞増幅の評価にのみ使用される。ＭＶ０６培地は様々な動物起源（主にウシ）の成分を含むため、直接的な臨床使用には不適切である。
【００３３】
しかし、動物成分の代わりにヒト起源の成分を用いる可能性については現在試験されており、計画された臨床的手順全体に関与するまさに細胞増幅用培地として、本発明による培地がさらに使用される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
本発明とその利点は、非制限的な実施例という形で提供された添付図に関する以下の好適な実施形態の説明によりさらに明らかになる。
【図１】ＭＶ０６培地で増殖させた、ＣＤ３４＋細胞における内皮細胞および心筋細胞の遺伝子発現を示す図。
【図２】免疫蛍光法により明らかにされた、ＣＤ３４＋細胞由来の内皮前駆細胞の増殖結果を示す写真。
【図３】免疫蛍光法によるＣＤ３４＋細胞由来の心筋細胞の増殖を標識した写真。
【図１】
2008161183.tif 000002
【図２】
2008161183.tif 000003
【図３】
2008161183.tif 000004