(57)【要約】【課題】従来よりも保存安定性及び反応性が高く、高感度でＨＣＶ抗体を検出できるＨＣＶ抗原を含むＨＣＶ抗体測定用試薬キットを提供することを課題とする。【解決手段】固相結合部位を付加したＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）合成ペプチド抗原を含む第１試薬と、ＨＣＶ遺伝子組換え抗原を固定化した第１固相及び前記固相結合部位に結合可能な結合物質を固定化した第２固相を含む第２試薬とを含むＨＣＶ抗体測定用試薬キットにより、上記の課題を解決する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相結合部位を付加したＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）合成ペプチド抗原を含む第１試薬と、
ＨＣＶ遺伝子組換え抗原を固定化した第１固相及び前記固相結合部位に結合可能な結合物質を固定化した第２固相を含む第２試薬と
を含むＨＣＶ抗体測定用試薬キット。
【請求項２】
前記ＨＣＶ遺伝子組換え抗原が、遺伝子組換えＮＳ３抗原、遺伝子組換えＮＳ４抗原、遺伝子組換えＮＳ５抗原及び遺伝子組換えコア抗原からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１に記載のＨＣＶ抗体測定用試薬キット。
【請求項３】
前記ＨＣＶ合成ペプチド抗原が、合成ペプチドＮＳ４抗原、合成ペプチドＮＳ５抗原及び合成ペプチドコア抗原からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１又は２に記載のＨＣＶ抗体測定用試薬キット。
【請求項４】
前記第１固相及び第２固相が、磁性粒子、ラテックス粒子又はマイクロタイタープレートのウェルである請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＣＶ抗体測定用試薬キット。
【請求項５】
前記固相結合部位がビオチンを含み、前記結合物質がアビジン類である請求項１〜４のいずれか１項に記載のＨＣＶ抗体測定用試薬キット。
【請求項６】
標識物質により標識された、ＨＣＶ抗体に結合可能な物質を含む第３試薬をさらに含む請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＣＶ抗体測定用試薬キット。
【請求項７】
前記ＨＣＶ抗体に結合可能な物質が、ＨＣＶ抗体に結合可能な抗体である請求項６に記載のＨＣＶ抗体測定用試薬キット。
【請求項８】
前記標識が酵素であり、
前記酵素に対する基質を含む第４試薬をさらに含む請求項６又は７に記載のＨＣＶ抗体測定用試薬キット。
【請求項９】
検体と、固相結合部位を付加したＨＣＶ合成ペプチド抗原を含む第１試薬と、ＨＣＶ遺伝子組換え抗原を固定化した第１固相及び前記固相結合部位に結合可能な結合物質を固定化した第２固相を含む第２試薬とを接触させる工程、及び
前記第２固相上に形成されたＨＣＶ合成ペプチド抗原とＨＣＶ抗体との第１複合体及び／又は前記第１固相上に形成されたＨＣＶ遺伝子組換え抗原とＨＣＶ抗体との第２複合体を検出する工程
を含む、検体中に含まれるＨＣＶ抗体を測定する方法。
【請求項１０】
前記接触させる工程が、前記検体と前記第１試薬とを接触させた後に、前記第２試薬を接触させることにより行われる請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体の測定用試薬キット及び測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により引き起こされる伝染性の疾病である。
ＨＣＶは、全長約９．５ｋｂの１本鎖（＋鎖）ＲＮＡゲノムをもつウイルスであり、そのゲノム構造は、５'末端側の非翻訳領域、翻訳領域及び３’末端側の非翻訳領域からなる。
約３０００アミノ酸残基からなる翻訳領域には、構造タンパク質としてのコアタンパク質、エンベロープタンパク質（Ｅ１、Ｅ２）に対応する領域があり、さらに非構造タンパク質としてのＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５に対応する領域が存在する。
【０００３】
ＨＣＶの検出方法として、検体中のＨＣＶ抗原に対する抗体（ＨＣＶ抗体）を検出する免疫学的方法が知られている。この方法は、通常、試薬中のＨＣＶ抗原と検体中のＨＣＶ抗体とが結合して形成された抗原−抗体複合体を検出することにより行われる。ＨＣＶ抗体の免疫学的検出には、異なる種類のＨＣＶタンパク質を認識する複数種のＨＣＶ抗体を検出できるように、各種のＨＣＶタンパク質に対応する配列を有するＨＣＶ抗原が用いられる。ＨＣＶ抗原は、天然から単離したものや、遺伝子組み換え法や化学合成法などにより製造されるものが知られており、例えば、特表平５−５０８２１９号（特許文献１）、特許第２９９５２１６号（特許文献２）、特許第３２１９４０９号（特許文献３）などに開示されている。
【０００４】
ＨＣＶ抗体を免疫学的に検出するための従来の試薬キットは、固相に固定化した複数種のＨＣＶ抗原を提供するものであり、これらの抗原を検体中のＨＣＶ抗体と反応させて該固相上で抗原−抗体複合体を形成させ、複合体を検出することによりＨＣＶ抗体の測定を行うものである（特許文献１〜３）。
【特許文献１】特表平５−５０８２１９号公報
【特許文献２】特許第２９９５２１６号公報
【特許文献３】特許第３２１９４０９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、ＨＣＶ抗体の検出に用い得る種々のＨＣＶ合成ペプチド抗原及びＨＣＶ遺伝子組換え抗原を用いるＨＣＶ抗体測定用試薬について研究する過程において、これらの抗原を含む試薬の安定性や反応性について検討したところ、ＨＣＶ合成ペプチド抗原とＨＣＶ遺伝子組換え抗原では、安定性や反応性が異なることを見出した。
【０００６】
そこで、本発明は、従来のＨＣＶ抗体測定用試薬に比べてより安定性が高く、高感度でＨＣＶ抗体を検出できるＨＣＶ抗原を含むＨＣＶ抗体測定用試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、固相結合部位を付加したＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）合成ペプチド抗原を含む第１試薬と、
ＨＣＶ遺伝子組換え抗原を固定化した第１固相及び前記固相結合部位に結合可能な結合物質を固定化した第２固相を含む第２試薬と
を含むＨＣＶ抗体測定用試薬キットである。
【０００８】
また、本発明は、検体と、固相結合部位を付加したＨＣＶ合成ペプチド抗原を含む第１試薬と、ＨＣＶ遺伝子組換え抗原を固定化した第１固相及び前記固相結合部位に結合可能な第２の結合物質を固定化した第２固相を含む第２試薬とを接触させる工程、及び
前記第２固相上に形成された、ＨＣＶ合成ペプチド抗原とＨＣＶ抗体との第１複合体及び／又は前記第１固相上に形成されたＨＣＶ遺伝子組換え抗原とＨＣＶ抗体との第２複合体を検出する工程
を含む、検体中に含まれるＨＣＶ抗体を測定する方法でもある。
【０００９】
本発明において、上記の第１試薬は、ＨＣＶ合成ペプチド抗原を遊離の状態で含む。本明細書において「遊離の状態」とは、ＨＣＶ合成ペプチド抗原がいずれの固相にも固定化されていないことを意味する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＨＣＶ抗体測定用試薬キットは、測定に使用する各種ＨＣＶ抗原が保存安定性に優れ、かつ抗体との良好な反応性を有するので、長期間にわたって良好な測定を行うことを可能にする。また、本発明のＨＣＶ抗体測定用試薬キットを用いることにより、ＨＣＶ抗原の保存安定性の低下による測定感度の低下を防ぐことができるので、より高精度な測定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、約３０００アミノ酸残基からなるタンパク質をコードするゲノムを有する。この約３０００アミノ酸残基からなるタンパク質は、構造タンパク質ドメイン（コアタンパク質、エンベロープタンパク質（Ｅ１及びＥ２））と非構造タンパク質ドメイン（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５）とから構成され、これらの各ドメインは、少なくとも１つのエピトープを有する抗原であることが知られている。ＨＣＶのゲノムがコードするタンパク質及び該タンパク質に含まれる各ドメインの配列の例は、例えば特表平５−５０８２１９号に記載されている。
ＨＣＶは高度に変異するウイルスであるので、そのゲノムがコードするタンパク質の配列は、一義的に表すことができない。本明細書において、「抗原」とは、ＨＣＶのゲノムがコードする抗原性を有するタンパク質又はペプチド並びに抗原性を有するそれらの変異形の両方を含む。
【００１２】
本実施形態のＨＣＶ抗体測定用試薬キットは、固相結合部位を付加したＨＣＶ合成ペプチド抗原を含む第１試薬と、ＨＣＶ遺伝子組換え抗原を固定化した第１固相及び前記固相結合部位に結合可能な結合物質を固定化した第２固相を含む第２試薬とを含む。
【００１３】
ＨＣＶ抗体測定用試薬キットの原理を、次に説明する。検体中に含まれ得るＨＣＶ抗体は、第１試薬中のＨＣＶ合成ペプチド抗原及び／又は第２試薬中のＨＣＶ遺伝子組換え抗原に結合できる。また、第１試薬中のＨＣＶ合成ペプチド抗原に付加した固相結合部位は、第２試薬中の第２固相に固定化された結合物質と結合することができる。ここで、検体、第１試薬及び第２試薬が接触すると、第１固相に固定化されたＨＣＶ遺伝子組み換え抗原には検体中のＨＣＶ抗体が結合でき、ＨＣＶ合成ペプチド抗原には検体中のＨＣＶ抗体が結合でき、また、第２固相に固定化された結合物質には固相結合部位を付加したＨＣＶ合成ペプチド抗原（ＨＣＶ抗体と結合しているか又はしていない）が結合できる。
よって、第１固相及び／又は第２固相上にＨＣＶ抗体が捕捉されることとなる。このようにして固相上に捕捉されたＨＣＶ抗体は、当該技術における公知の方法を用いて検出することができる。
【００１４】
上記のＨＣＶ合成ペプチド抗原は、天然のタンパク質から単離され切断されたか又は化学合成法により合成された、ＨＣＶのゲノムによりコードされるタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含むアミノ酸配列を有するペプチドである。ＨＣＶ合成ペプチド抗原は、少なくとも８個のＨＣＶタンパク質のアミノ酸残基を含み、６０個以下のＨＣＶタンパク質のアミノ酸残基を含むのが好ましく、少なくとも１０個のＨＣＶタンパク質のアミノ酸残基を含み、５０個以下のＨＣＶタンパク質のアミノ酸残基を含むのがより好ましい。また、ＨＣＶ合成ペプチド抗原は、分子量が９００〜７５００の範囲であるものが好ましく、１０００〜６０００の範囲であるものがより好ましい。
ＨＣＶ合成ペプチド抗原は、例えば固相合成法、フラグメント縮合法、溶液合成法などの従来公知の化学合成法により得ることができる。より好ましくは、該合成ペプチド抗原は、Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, p.2149, 1963に記載されるような固相合成法を用いて合成したものである。
【００１５】
上記のＨＣＶ合成ペプチド抗原は、好ましくは、合成ペプチドＮＳ４抗原、合成ペプチドＮＳ５抗原及び合成ペプチドコア抗原からなる群から選択される少なくとも１種である。これらの合成ペプチド抗原は、２種以上を用いることができる。これらの抗原の配列は、例えば特表平５−５０８２１９号に記載されるものであるが、抗原性を有する限りこれら特定の配列に限定されず、変異を含んでいてもよい。本明細書において、例えば「合成ペプチドコア抗原」という場合、ＨＣＶタンパク質のコアドメインのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する合成ペプチド抗原を意味する。
【００１６】
上記のＨＣＶ遺伝子組換え抗原は、遺伝子組み換え法により作製された、ＨＣＶのゲノムによりコードされるタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含むアミノ酸配列を有するタンパク質である。該ＨＣＶ遺伝子組換え抗原は、好ましくは少なくとも８０個のアミノ酸残基を有するものであり、より好ましくは少なくとも９０個のアミノ酸残基を有するものである。また、ＨＣＶ遺伝子組換え抗原は、分子量が９０００以上であるものが好ましく、１００００以上であることがより好ましい。
該ＨＣＶ遺伝子組換え抗原は、従来公知の遺伝子組み換え法により作製することができる。例えば、所望の抗原のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニングし、適切な宿主細胞を該ベクターで形質転換してＨＣＶ遺伝子組換え抗原を作製することができる。該ＨＣＶ遺伝子組換え抗原は、例えば特表平５−５０８２１９号に記載される遺伝子組み換え法を用いて作製することができる。
【００１７】
上記のＨＣＶ遺伝子組換え抗原は、好ましくは、遺伝子組換えＮＳ３抗原、遺伝子組換えＮＳ４抗原、遺伝子組換えＮＳ５抗原及び遺伝子組換えコア抗原からなる群から選択される少なくとも１種である。これらの抗原の配列は、例えば特表平５−５０８２１９号に記載されるものであるが、抗原性を有する限りこれらの特定の配列に限定されず、変異を有していてもよい。本明細書において、例えば「遺伝子組み換えＮＳ３抗原」という場合、ＨＣＶタンパク質のＮＳ３ドメインのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組換え抗原を意味する。
【００１８】
上記の固相結合部位と結合物質は、試薬キットを用いる条件下で接触させたときに特異的に結合できる物質の組み合わせであれば特に限定されない。これらの組み合わせは、例えばビオチンとアビジン類、ハプテンと抗ハプテン抗体、ニッケルとヒスチジンタグ、グルタチオンとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどが挙げられる。ハプテンと抗ハプテン抗体としては、例えば、ＤＮＰと抗ＤＮＰ抗体が挙げられる。好ましくは、ビオチンとアビジン類との組み合わせである。より好ましくは、固相結合部位がビオチンを含み、結合物質がアビジン類である。固相結合部位と結合物質との組み合わせの各々の物質は、どちらを第２固相に固定化してもよく、特に限定されない。なお、本明細書において「アビジン類」は、アビジン及びストレプトアビジンを含むことを意味する。
【００１９】
本明細書において、ＨＣＶ合成ペプチド抗原に「固相結合部位を付加する」とは、ＨＣＶ合成ペプチド抗原が固相結合部位を有することとなるように反応させたことを意味する。該反応は、上記の固相結合部位の種類により適宜選択されればよく、例えば、共有結合などの化学的結合が挙げられる。
固相結合部位をＨＣＶ合成ペプチド抗原に付加する方法は、公知である。例えば、固相結合部位がビオチンを含む場合、例えば、ＨＣＶ合成ペプチド抗原中のアミノ基やチオール基などと反応性を有する基を介してビオチンを該抗原に結合させることができる。アミノ基と反応性を有する基としてはNHS基が挙げられ、チオール基と反応性を有する基としてはマレイミド基などが挙げられる。
【００２０】
上記の結合物質を第２固相に固定化する方法は、公知である。該固定化は、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、これらの組み合わせなどにより行うことができる。
結合物質がアビジン類である場合、例えば、物理的吸着によりアビジンを直接第２固相に固定化することができる。また、アビジン類と結合可能な物質、例えばビオチンが結合した第２固相にアビジン類を結合させる方法により、アビジン類を第２固相に固定化することができる。また、特開2006−226689号公報に記載の方法により、アビジン類を固相に固定化することも可能である。
また、アビジン類を結合させた固相は、例えばＪＳＲ株式会社やダイナルバイオテック社などから購入することもできる。
【００２１】
ＨＣＶ遺伝子組換え抗原を第１固相に固定化する方法は、公知である。該固定化は、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、これらの組み合わせなどにより行うことができる。
また、ビオチンとアビジン類の結合を介して、ＨＣＶ遺伝子組換え抗原を第１固相に固定化することもできる。なお、ＨＣＶ遺伝子組換え抗原の固相への固定化を仲介する物質の組み合わせとしては、上記のビオチンとアビジン類以外に、ハプテンと抗ハプテン抗体、ニッケルとヒスチジンタグ、グルタチオンとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどが挙げられる。ハプテンと抗ハプテン抗体としては、例えば、ＤＮＰと抗ＤＮＰ抗体が挙げられる。
ＨＣＶ遺伝子組換え抗原を第１固相に固定化する手段は、結合物質を第２固相に固定化する手段と同じであってもよいし、異なってもよい。
【００２２】
上記の第１固相及び第２固相の材料は、同じであってもよいし、異なっていてもよいが、試薬キットの製造の簡便性の点から、同じ材料であることが好ましい。該材料としては、免疫測定に用いられる通常の固相の材料であれば特に限定されず、例えば、ラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコーンなどのポリマー材料；アガロース；ゼラチン；赤血球；シリカゲル、ガラス、不活性アルミナ、磁性体などの無機材料などが挙げられる。これらの１種又は２種以上を組み合わせてもよい。
また、固相の形状としては、免疫測定に用いられる通常の固相の形状であれば特に限定されず、マイクロタイタープレート、試験管、ビーズ、粒子、ナノ粒子などが挙げられる。粒子としては、磁性粒子、ポリスチレンラテックスのような疎水性粒子、粒子表面にアミノ基、カルボキシル基などの親水基を有する共重合ラテックス粒子、赤血球、ゼラチン粒子などが挙げられる。
【００２３】
より好ましくは、第１固相及び第２固相は、磁性粒子、ラテックス粒子又はマイクロタイタープレートのウェルである。ＨＣＶ抗体測定用試薬キットにおいて、第１固相及び第２固相は、それぞれ独立した粒子又は独立したウェルを意味することを意図する。
磁性粒子は、磁性を有する材料を基材として含む粒子である。このような磁性粒子は当該技術において公知であり、基材として例えばＦｅ2Ｏ3及び／又はＦｅ3Ｏ4、コバルト、ニッケル、フェライト、マグネタイトなどを用いたものが知られている。磁性粒子の表面へのタンパク質などの結合を目的として、基材の表面をポリマーなどで被覆したものなどがより好ましい。
マイクロタイタープレートは、通常、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において用いられるものを好適に用いることができ、ポリスチレン、ポリプロピレンなどの材料からなるものが好ましい。
【００２４】
上述したように、上記の第１試薬は、ＨＣＶ合成ペプチド抗原を遊離の状態で含む。第１試薬は、ＨＣＶ合成ペプチド抗原の安定性及びＨＣＶ抗体との反応性に影響を与えない緩衝液中にＨＣＶ合成ペプチド抗原が溶解した液体の形態、又は用時に水などの液体を加えて用いるための、ＨＣＶ合成ペプチド抗原を凍結乾燥することなどにより得られる固体の形態であり得る。試薬キットの使用操作の簡便性の点から、好ましくは、第１試薬は、緩衝液中にＨＣＶ合成ペプチド抗原が溶解した溶液の形態である。
【００２５】
第１試薬が溶液の形態であり、かつ複数種のＨＣＶ合成ペプチド抗原を含む場合、該第１試薬は、同じ緩衝液中に複数種のＨＣＶ合成ペプチド抗原を含んでもよいし、１種のＨＣＶ合成ペプチド抗原を含む緩衝液を複数含んでもよい。好ましくは、第１試薬は、同じ緩衝液中に複数種のＨＣＶ合成ペプチド抗原を含む。
【００２６】
第１試薬が溶液の形態である場合、ＨＣＶ合成ペプチド抗原の濃度は、ＨＣＶ合成ペプチド抗原の種類、その数などに応じて適宜選択することができる。
【００２７】
上記の緩衝液は、ｐＨ６．５〜８．０程度が好ましく、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液（ＴＥＡ）、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）などを用いることができる。該緩衝液は、界面活性剤、保存剤、血清タンパク質などの公知の添加剤を含んでいてもよい。
【００２８】
上記の第２試薬は、複数種のＨＣＶ遺伝子組換え抗原を含む場合、複数種のＨＣＶ遺伝子組換え抗原を固定化した１つの第１固相を含んでもよいし、１種のＨＣＶ遺伝子組換え抗原を固定化した複数の第１固相を含んでもよいし、これらの組み合わせであってもよい。
【００２９】
上記の第２試薬は、好ましくは、第１固相及び第２固相を適切な緩衝液に懸濁又は接触した形態で提供される。第１固相と第２固相は、同じ緩衝液に懸濁又は接触してもよいし、別々の緩衝液に懸濁又は接触してもよいが、試薬キットの使用操作の簡便性の点で、同じ緩衝液に懸濁することが好ましい。なお、固相が緩衝液に懸濁した形態とは、例えば、固相としての磁性粒子やラテックス粒子などの粒子が緩衝液に懸濁された形態が挙げられる。また、固相が緩衝液に接触した形態とは、例えば、固相としてのマイクロタイタープレートのウェルに緩衝液が添加された形態が挙げられる。
第２試薬に含まれる第１固相と第２固相との量比は、第１試薬中のＨＣＶ合成ペプチド抗原の種類及び量、第１固相に固定化されたＨＣＶ遺伝子組換え抗原の種類及び量、第２固相に固定化された結合物質の種類及び量などに応じて適宜選択できる。例えば第１固相と第２固相とがともに磁性粒子である場合、第２試薬中に含まれる磁性粒子の数は、第１固相：第２固相＝１〜１０：１０〜１の範囲であり得る。
上記の緩衝液としては、第１試薬に用いることができるものと同様のものを用いることができる。
【００３０】
上記のＨＣＶ抗体測定用試薬キットは、標識物質により標識されたＨＣＶ抗体に結合可能な物質を含む第３試薬をさらに含むことが好ましい。
ＨＣＶ抗体に結合可能な物質は、ヒトのＨＣＶ抗体に対する抗体、ＨＣＶ抗原などを含む。なお、ここで例示した抗体とは、抗体のフラグメント及びその誘導体も含む。具体例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）2フラグメント、及びｓＦｖフラグメント等が挙げられる。抗体のクラスはＩｇＧ、ＩｇＭなどを含み得るが、これらに限定されない。
上記の標識物質は、通常の免疫測定法において用い得る標識物質であれば特に限定されず、酵素、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリンなどが挙げられる。放射性同位元素としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。
【００３１】
上記の標識物質が酵素である場合、上記のＨＣＶ抗体測定用試薬キットは、該酵素に対する基質を含む第４試薬をさらに含むことが好ましい。
上記の基質は、上記の酵素に対する当該技術において公知の基質を用いることができる。上記の酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、当該技術において公知の発光基質、発色基質などを用いることができ、例えばＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標）（４−クロロ−３−（メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（登録商標）（３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質；ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸（ＢＣＩＰ）、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）などの発色基質が挙げられる。
【００３２】
上記の第４試薬は、適切な緩衝液中に基質を溶解した溶液の形態が好ましい。基質の濃度は、基質の種類により適宜選択できる。第４試薬に用い得る緩衝液は、基質の種類により適宜選択でき、当該技術において公知のものを用いることができる。
【００３３】
ＨＣＶ抗体測定用試薬キットは、固相結合部位を付加したＨＣＶ合成ペプチド抗原を含む第１試薬と、ＨＣＶ遺伝子組換え抗原を固定化した第１固相及び該固相結合部位に結合可能な結合物質を固定化した第２固相を含む第２試薬とを備える。ＨＣＶ抗体測定用試薬キットにおいて、第１試薬と第２試薬は別々にパッケージされている。図１は、第１試薬が溶液の形態であり第２試薬が固相を緩衝液に懸濁した形態である場合の試薬キットの一例である。図１では、第１試薬は第１の試薬容器１に収容されており、第２試薬は第２の試薬容器２に収容されている。なお、ＨＣＶ抗体測定用試薬キットは、所望により、別の試薬（例えば上述した第３試薬や第４試薬）を別の試薬容器に収容したものを備えてもよい。さらに、ＨＣＶ抗体測定用試薬キットは、所望により、試薬の１つ又は複数を希釈するための１種又は複数の緩衝液、使用説明書、反応に用い得る容器などを備えてもよい。
【００３４】
本実施形態のＨＣＶ抗体を測定する方法は、検体と、固相結合部位を付加したＨＣＶ合成ペプチド抗原を含む第１試薬と、ＨＣＶ遺伝子組換え抗原を固定化した第１固相及び前記固相結合部位に結合可能な結合物質を固定化した第２固相を含む第２試薬とを接触させる工程（接触工程）と、
前記第２固相上に形成された、ＨＣＶ合成ペプチド抗原とＨＣＶ抗体との第１複合体及び／又は前記第１固相上に形成されたＨＣＶ遺伝子組換え抗原とＨＣＶ抗体との第２複合体を検出する工程（検出工程）とを含む。
【００３５】
上記の検体は、ヒトを含む哺乳動物から採取された生体試料であり、血液、血清、血漿、を含む。
【００３６】
上記の接触工程では、検体と第１試薬とを先に接触させた後に第２試薬を接触させてもよいし、検体と第２試薬とを先に接触させた後に第１試薬を接触させてもよく、第１試薬と第２試薬とを先に接触させた後に検体を接触させてもよい。検体中の遊離のＨＣＶ抗体と試薬中の遊離のＨＣＶ抗原との結合が進行しやすいという点で、検体と第１試薬とを先に接触させ、その後に第２試薬を接触させることがより好ましい。なお、ここで「接触」とは、検体と第１試薬と第２試薬とを混合することを含む。例えば、第１試薬が溶液の形態であり第２試薬が固相を緩衝液に懸濁した形態である場合、上記の接触工程では、検体と第１試薬とを先に混合させた後に第２試薬を混合させてもよいし、検体と第２試薬とを先に混合させた後に第１試薬を混合させてもよく、第１試薬と第２試薬とを先に混合させた後に検体を混合させてもよい。
【００３７】
上記の接触工程において、第１試薬と第２試薬の量の比は、第１試薬中のＨＣＶ合成ペプチド抗原に対して充分な量の第２固相が存在するようなものであれば特に限定されず、適切に選択することができる。
また、検体と第１試薬及び第２試薬との量の比は、検体に含まれうるＨＣＶ抗体を検出するのに充分な量の各ＨＣＶ抗原が存在するようなものであれば特に限定されない。
【００３８】
上記の接触工程は、検体中のＨＣＶ抗体と第１試薬及び第２試薬中のＨＣＶ抗原との反応が良好に行われる温度で行われることが好ましく、３０〜４５℃程度の温度がより好ましい。
接触させる時間は、用いるＨＣＶ合成ペプチド抗原、ＨＣＶ遺伝子組換え抗原、固相結合部位、結合物質の種類などにより適宜選択できる。
【００３９】
上記の検出工程は、当該技術において公知の免疫学的検出方法に従って行うことができ、上記の標識物質で標識されたＨＣＶ抗体に結合可能な物質を用いて行うことが好ましい。
【００４０】
上記の検出工程は、好ましくは、上記の標識物質で標識されたＨＣＶ抗体に結合可能な物質を、上記の第１複合体及び／又は第２複合体と接触させ、上記の標識物質を検出することにより行われる。
標識物質の検出は、該標識物質が酵素である場合、上記のような該酵素に対する基質を反応させることにより発生する光、色などを適切な装置を用いて測定することにより行うことができる。該装置としては、分光光度計、ルミノメータなどが挙げられる。
【実施例】
【００４１】
実施例で使用した各ＨＣＶ抗原の調製方法を説明する。
（１）遺伝子組換えＮＳ３抗原の調製
ＨＣＶ遺伝子組換え抗原として、特表平５−５０８２１９号の図１に記載されるアミノ酸配列の１１９２〜１４５７の領域のアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えＮＳ３抗原を、特表平５−５０８２１９号の実施例１に記載されるようにして作製した。
（２）合成ペプチドＮＳ４抗原の調製
合成ペプチド抗原として、特許第２９９５２１６号の図１に記載されるアミノ酸配列の１６８８〜１７０７番目のアミノ酸配列を有する合成ペプチドＮＳ４抗原（特許第２９９５２１６号のペプチドＶＩＩＩ）を、特許第２９９５２１６号の実施例に記載されるペプチド合成法に従って作製した。そして、Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)（（株）同仁化学研究所）を用いて合成ペプチドＮＳ４抗原をビオチン化した。
【００４２】
（３）合成ペプチドコア抗原の調製
合成ペプチド抗原として、特許第２９９５２１６号の図１に記載されるアミノ酸配列の７〜２６番目のアミノ酸配列を有する合成ペプチドコア抗原（特許第２９９５２１６号のペプチドＩＩ）、１３〜３２番目のアミノ酸配列を有する合成ペプチドコア抗原（特許第２９９５２１６号のペプチドＩＩＩ）、及び４９〜６８番目のアミノ酸配列を有する合成ペプチドコア抗原（特許第２９９５２１６号のペプチドＶ）を、特許第２９９５２１６号の実施例に記載されるペプチド合成法に従って作製した。そして、Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)（（株）同仁化学研究所）を用いて合成ペプチドコア抗原をビオチン化した。
【００４３】
（４）遺伝子組換えＮＳ３抗原固定化磁性粒子の調製
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ）を約５ｍｇ／ｍＬとなるように２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して、磁性粒子懸濁液を調製した。上記（１）で調製した遺伝子組換えＮＳ３抗原を、１ｍｇ／ｍＬとなるように２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解して、ＮＳ３抗原溶液を調製した。磁性粒子懸濁液１０ｍＬとＮＳ３抗原溶液０．１ｍＬを混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることにより磁性粒子に遺伝子組換えＮＳ３抗原を固定化した。次に、ＮＳ３抗原が固定化された磁性粒子とブロッキング溶液（１％ＢＳＡ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）を混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることによりブロッキング処理を行った。こうして得られた磁性粒子を、以降はＮＳ３抗原磁性粒子と省略する。
【００４４】
（５）合成ペプチドＮＳ４抗原固定化磁性粒子の調製
市販のストレプトアビジン被覆磁性粒子（以下、「ＳＴ磁性粒子」という）を、約５ｍｇ／ｍＬとなるように２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して、ＳＴ磁性粒子懸濁液を調製した。上記（２）で調製した合成ペプチドＮＳ４抗原を、１ｍｇ／ｍＬとなるように２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解してＮＳ４抗原溶液を調製した。ＳＴ磁性粒子懸濁液１０ｍＬとＮＳ４抗原溶液０．０１ｍＬを混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることによりＳＴ磁性粒子に合成ペプチドＮＳ４抗原を固定化した。次に、ＮＳ４抗原が固定化された磁性粒子と上記ブロッキング溶液（１％ＢＳＡ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）を混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることによりブロッキング処理を行った。こうして得られた磁性粒子を、以降はＮＳ４抗原磁性粒子と省略する。
【００４５】
（６）合成ペプチドコア抗原固定化磁性粒子の調製
市販のＳＴ磁性粒子を約１ｍｇ／ｍＬとなるように２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して、ＳＴ磁性粒子懸濁液を調製した。上記（３）で調製した各合成ペプチドコア抗原を混合し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解してコア抗原溶液を調製した。なお、コア抗原溶液は、含まれる各合成ペプチドコア抗原の濃度が約１ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。ＳＴ磁性粒子懸濁液１０ｍＬとコア抗原溶液０．０１ｍＬを混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることによりＳＴ磁性粒子に合成ペプチドコア抗原を固定化した。次に、コア抗原が固定化された磁性粒子とブロッキング溶液（１％ＢＳＡ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）を混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることによりブロッキング処理を行った。こうして得られた磁性粒子を、以降はコア抗原磁性粒子と省略する。
【００４６】
参考例１
まず、遺伝子組換えＮＳ３抗原について、磁性粒子に固定化した場合と固定化せずに溶液中で遊離した場合とでの反応性の違いを調べた。
【００４７】
ここでは、上記（１）で調製したＮＳ３抗原にビオチン化処理して得られたビオチン化遺伝子組換えＮＳ３抗原を用いた。ＮＳ３抗原に対するビオチン化処理は、Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)（（株）同仁化学研究所）を用いた。
また、ビオチン化ＮＳ３抗原をＳＴ磁性粒子に固定化する方法は、ＨＣＶ抗原としてビオチン化ＮＳ３抗原を用い、磁性粒子としてＳＴ磁性粒子を用いた以外は上記（４）と同様である。
【００４８】
本例で使用した試薬の組成は以下の通りである。
（７）第１試薬（Ａ）
２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
（８）第１試薬（Ｂ−１）
２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
２．５μｇ／ｍＬ  ビオチン化ＮＳ３抗原
（９）第１試薬（Ｂ−２）
上記第１試薬（Ｂ−１）を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で１０倍希釈したものを、第１試薬（Ｂ−２）とする。
（１０）第１試薬（Ｂ−３）
上記第１試薬（Ｂ−１）を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で５０倍希釈したものを、第１試薬（Ｂ−３）とする。
（１１）第２試薬（Ａ）
２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
３ｍｇ／ｍＬ  ビオチン化ＮＳ３抗原結合ＳＴ磁性粒子
２ｍｇ／ｍＬ  ＳＴ磁性粒子
（１２）第２試薬（Ｂ）
２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
５ｍｇ／ｍＬ  ＳＴ磁性粒子
（１３）第３試薬
２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
０．１Ｕ／ｍＬ  アルカリホスファターゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体（ＡＬＫＡＬＩＮＥ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＡＳＥ−ＭＯＵＳＥ、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
（１４）第４試薬
ＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標）ｗｉｔｈ  Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
【００４９】
測定方法は以下の通りである。
（１５）磁性粒子に固定化した場合の遺伝子組換えＮＳ３抗原の反応性
まず、ＨＣＶ陽性血清１０μＬと上記第１試薬（Ａ）１２０μＬを混合して、４２℃にて約２分間インキュベートした。続いて、この混合液に上記第２試薬（Ａ）３０μＬを添加して４５℃にて約１分間インキュベートし、血清中のＨＣＶ抗体と第２試薬（Ａ）中の磁性粒子上のＮＳ３抗原とを反応させた。この磁性粒子を洗浄液（０．１％Tween20、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５））で洗浄した後、上記第３試薬１００μＬを加え、室温にて５分間インキュベートした。磁性粒子を上記の洗浄液で洗浄した後に、上記第４試薬１００μＬを加え、ＬＵＭＩ−ＣＯＵＮＴＥＲ  ７００（（株）マイクロテック・ニチオン）を用いて発光強度を測定した。
検体としては、２種類のＨＣＶ陽性血清（陽性血清１及び陽性血清２）を用いた。さらに、ネガティブコントロールとしてＨＣＶ陽性血清の代わりに２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて測定をおこなった。同一の検体についてそれぞれ３回測定を行い、その平均発光強度を求めた。結果を、図２に示す。
【００５０】
（１６）溶液中に遊離させた場合の遺伝子組換えＮＳ３抗原の反応性
第１試薬として上記第１試薬（Ｂ−１）、（Ｂ−２）又は（Ｂ−３）を用い、第２試薬として上記第２試薬（Ｂ）を用いた以外は、上記（１５）と同様の方法で測定を行った。なお、第１試薬（Ｂ−１）は、第２試薬Ａ中の固定化ＮＳ３抗原と同じ濃度になるように、遊離ＮＳ３抗原を含んでいる。結果を、図２に示す。
【００５１】
図２において、１は遺伝子組換えＮＳ３抗原を磁性粒子に固定化した場合の結果を示し、２〜４は遺伝子組換えＮＳ３抗原を溶液中に遊離させた場合の結果を示す。また、縦軸には、測定により得られた発光強度を示した。Ｎは、ネガティブコントロールの結果である。
図２より、いずれのＨＣＶ陽性血清においても、遺伝子組換えＮＳ３抗原を磁性粒子に固定化した場合の方が、遺伝子組換えＮＳ３抗原を溶液中に遊離させた場合よりも、高い発光強度が得られることがわかった。以上のことから、ＨＣＶ遺伝子組換え抗原については、溶液中に遊離させるよりも、磁性粒子に固定化した方がＨＣＶ抗体との反応性が高いということがわかった。
【００５２】
参考例２
次に、遺伝子組換えＮＳ３抗原について、磁性粒子に固定化した場合と固定化せずに溶液中で遊離した場合とでの保存安定性の違いを調べた。
本例では、参考例１で使用した第２試薬（Ａ）（固定化ＮＳ３抗原を含む）及び第１試薬（Ｂ−２）（遊離ＮＳ３抗原を含む）を用いて加速試験を実施し、試薬の保存安定性を調べた。加速試験では、第２試薬（Ａ）及び第１試薬（Ｂ−２）を、暗所にて３７℃で０、１又は５日間保存した。加速試験を実施した各試薬を用いてＨＣＶ抗体を測定した。
【００５３】
測定方法は以下の通りである。
（１７）磁性粒子に固定化した場合の遺伝子組換えＮＳ３抗原の安定性
第２試薬として加速試験を実施した第２試薬（Ａ）を用いた以外は、参考例１に記載の（１５）と同様の方法で測定を行った。検体は、参考例１で使用した２種類のＨＣＶ陽性血清（陽性血清１及び陽性血清２）を用いた。結果を、図３及び図４に示す。
【００５４】
（１８）溶液中に遊離させた場合の遺伝子組換えＮＳ３抗原の安定性
第１試薬として加速試験を実施した第１試薬（Ｂ−２）を用いた以外は、参考例１に記載の（１６）と同様の方法で測定を行った。検体は、参考例１で使用した２種類のＨＣＶ陽性血清（陽性血清１及び陽性血清２）を用いた。結果を、図３及び図４に示す。
【００５５】
図３は検体として陽性血清１を用いた場合の結果であり、図４は検体として陽性血清２を用いた場合の結果である。図３及び図４において、１は遺伝子組換えＮＳ３抗原を磁性粒子に固定化した場合の結果を示し、２は遺伝子組換えＮＳ３抗原を溶液中に遊離させた場合の結果を示す。また、縦軸は加速試験前（０日目）の試薬を用いて得られた平均発光強度を１００％として、各保存日数での平均発光強度のパーセンテージを示したものであり、横軸は加速試験の保存日数を示している。
図３及び図４の結果から、遺伝子組換えＮＳ３抗原を溶液中に遊離させた状態で保存すると、安定性が悪く、加速試験で１日経過した後であっても反応性が急激に低下することがわかった。また、遺伝子組換えＮＳ３抗原を磁性粒子に固定化した状態で保存すると、安定性が良く、加速試験で５日経過した後であっても高い反応性を維持することがわかった。以上のことから、ＨＣＶ遺伝子組換え抗原については、溶液中に遊離させるよりも、磁性粒子に固定化した方が保存安定性が高いということがわかった。
【００５６】
実施例１
次に、合成ペプチドＮＳ４抗原及び合成ペプチドコア抗原について、磁性粒子に固定化した場合と固定化せずに溶液中で遊離した場合とでの保存安定性の違いを調べた。
ここでは、遊離のＨＣＶ抗原として、上記（２）で調製した合成ペプチドＮＳ４抗原、及び上記（３）で調製した合成ペプチドコア抗原を用いた。また、固定化したＨＣＶ抗原として、上記（４）で調製したＮＳ３抗原磁性粒子、上記（５）で調製したＮＳ４抗原磁性粒子、及び上記（６）で調製したコア抗原磁性粒子を用いた。
【００５７】
本例で使用した試薬の組成は以下の通りである。なお、第３試薬及び第４試薬は、参考例１で使用したものを用いた。
（１９）第１試薬（Ｃ）
２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
１μｇ／ｍＬ  合成ペプチドＮＳ４抗原
１０μｇ／ｍＬ  各合成ペプチドコア抗原
（２０）第１試薬（Ｄ）
２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
（２１）第２試薬（Ｃ）
２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
３ｍｇ／ｍＬ  ＮＳ３抗原磁性粒子
２ｍｇ／ｍＬ  ＳＴ磁性粒子
（２２）第２試薬（Ｄ）
２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
３ｍｇ／ｍＬ  ＮＳ３抗原磁性粒子
１ｍｇ／ｍＬ  ＮＳ４抗原磁性粒子
１ｍｇ／ｍＬ  コア抗原磁性粒子
【００５８】
本例では、第１試薬（Ｃ）（遊離ＮＳ４抗原と遊離コア抗原を含む）及び第２試薬（Ｄ）（固定化ＮＳ４抗原と固定化コア抗原を含む）を用いて加速試験を実施し、試薬の保存安定性を調べた。加速試験では、第１試薬（Ｃ）及び第２試薬（Ｄ）を、暗所にて４５℃で０又は１日間保存した。加速試験を実施した各試薬を用いてＨＣＶ抗体を測定した。
【００５９】
測定方法は以下の通りである。
（２３）溶液中に遊離させた場合の合成ペプチドＮＳ３抗原及び合成ペプチドコア抗原の安定性
第１試薬として加速試験を実施した第１試薬（Ｃ）を用い、第２試薬として上記第２試薬（Ｃ）を用いた以外は、参考例１に記載の（１５）と同様の方法で測定を行った。検体は、１種類のＨＣＶ陰性血清（陰性血清１）及び４種類のＨＣＶ陽性血清（陽性血清３〜６）を用いた。結果を、表１に示す。
【００６０】
（２４）磁性粒子に固定化させた場合の合成ペプチドＮＳ３抗原及び合成ペプチドコア抗原の安定性
第１試薬として上記第１試薬（Ｄ）を用い、第２試薬として加速試験を実施した第２試薬（Ｄ）を用いた以外は、参考例１に記載の（１５）と同様の方法で測定を行った。検体は、１種類のＨＣＶ陰性血清（陰性血清１）及び４種類のＨＣＶ陽性血清（陽性血清３〜６）を用いた。結果を、表１に示す。
【００６１】
【表１】
2008261840.tif 000003
【００６２】
表１において、加速試験前（０日目）及び加速試験１日目の試薬を用いて得られた平均発光強度を示した。さらに、０日目の試薬を用いて得られた平均発光強度を１００％として、１日目の試薬を用いて得られた平均発光強度のパーセンテージを示した。
表１より、合成ペプチドＮＳ４抗原及び合成ペプチドコア抗原を磁性粒子に固定化した状態で保存すると、安定性が悪く、加速試験で１日経過した後であっても全ての陽性血清（陽性血清３〜６）の反応性が急激に低下することがわかった。また、合成ペプチドＮＳ４抗原及び合成ペプチドコア抗原を溶液中に遊離させた状態で保存すると、安定性が良く、加速試験で５日経過した後であっても全ての陽性血清において高い反応性を維持することがわかった。以上のことから、ＨＣＶ合成ペプチド抗原については、固相に固定化するよりも、溶液中に遊離させた方が保存安定性が高いということがわかった。
【００６３】
実施例２
合成ペプチドＮＳ４抗原及び合成ペプチドコア抗原を遊離した状態で含む第１試薬、及び遺伝子組換えＮＳ３抗原を磁性粒子に固定化した状態で含む第２試薬を用いて加速試験を実施し、試薬の保存安定性を調べた。加速試験では、第１試薬及び第２試薬を、暗所にて３７℃で０、２又は７日間保存した。加速試験を実施した各試薬を用いてＨＣＶ抗体を測定した。なお、本例では、第１試薬として実施例１で使用した第１試薬（Ｃ）を用い、第２試薬として実施例で使用した第２試薬（Ｃ）を用いた。
【００６４】
測定方法は以下の通りである。
第１試薬として加速試験を実施した第１試薬（Ｃ）を用い、第２試薬として加速試験を実施した第２試薬（Ｃ）を用いた以外は、参考例１に記載の（１５）と同様の方法で測定を行った。検体は、４種類のＨＣＶ陽性血清（陽性血清７〜１０）を用いた。陽性血清７は、ＮＳ３抗原に対するＨＣＶ抗体、ＮＳ４抗原に対するＨＣＶ抗体及びコア抗原に対するＨＣＶ抗体を含んだ血清である。陽性血清８はＮＳ３抗原に対するＨＣＶ抗体を含んだ血清であり、陽性血清９はコア抗原に対するＨＣＶ抗体を含んだ血清であり、陽性血清１０は、ＮＳ３抗原に対するＨＣＶ抗体及びＮＳ４抗原に対するＨＣＶ抗体を含んだ血清である。また、ネガティブコントロールとしてＨＣＶ陽性血清の代わりに２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて測定をおこなった。結果を、表２に示す。
【００６５】
【表２】
2008261840.tif 000004
【００６６】
表２において、加速試験前（０日目）、加速試験２日目及び７日目の試薬を用いて得られた平均発光強度を示した。さらに、陽性血清７〜１０について、０日目の試薬を用いて得られた平均発光強度を１００％として、２日目及び７日目の試薬を用いて得られた平均発光強度のパーセンテージを図５〜８に示した。図５は、陽性血清７を測定した場合の結果を示し、図６は陽性血清８を測定した場合の結果を示し、図７は陽性血清９を測定した場合の結果を示し、図８は陽性血清１０を測定した場合の結果を示す。図５〜８において、縦軸は加速試験前（０日目）の試薬を用いて測定して得られた発光強度を１００％として、各保存日数での平均発光強度のパーセンテージを示したものであり、横軸は加速試験の保存日数を示している。
【００６７】
表２及び図５〜８の結果から、ＨＣＶ合成ペプチド抗原を遊離した状態で含む第１試薬、及びＨＣＶ遺伝子組換え抗原を磁性粒子に固定化した状態で含む第２試薬を含む試薬キットを用いることにより、ＨＣＶタンパク質の種々の部位に反応する抗体を含む種々の検体を良好に検出できることがわかった。また、該試薬キット中の抗原の保存安定性が非常に優れていることもわかった。
【００６８】
以上のことから、ＨＣＶ遺伝子組換え抗原は緩衝液中の固相に固定化させた状態の方が保存安定性及び反応性が優れているのに対し、ＨＣＶ合成ペプチド抗原は緩衝液中の固相に固定化しない状態（遊離の状態）の方が保存安定性が優れていることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明のＨＣＶ抗体測定用試薬キットの一実施形態を示す模式図である。
【図２】参考例１の結果を示すグラフである。
【図３】参考例２において陽性血清１を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図４】参考例２において陽性血清２を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図５】実施例２において陽性血清７を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図６】実施例２において陽性血清８を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図７】実施例２において陽性血清９を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図８】実施例２において陽性血清１０を測定して得られた結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００７０】
１    第１の試薬容器
２    第２の試薬容器
【図１】
2008261840.tif 000005
【図２】
2008261840.tif 000006
【図３】
2008261840.tif 000007
【図４】
2008261840.tif 000008
【図５】
2008261840.tif 000009
【図６】
2008261840.tif 000010
【図７】
2008261840.tif 000011
【図８】
2008261840.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月1日(2008.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
測定方法は以下の通りである。
（２３）溶液中に遊離させた場合の合成ペプチドＮＳ４抗原及び合成ペプチドコア抗原の安定性
第１試薬として加速試験を実施した第１試薬（Ｃ）を用い、第２試薬として上記第２試薬（Ｃ）を用いた以外は、参考例１に記載の（１５）と同様の方法で測定を行った。検体は、１種類のＨＣＶ陰性血清（陰性血清１）及び４種類のＨＣＶ陽性血清（陽性血清３〜６）を用いた。結果を、表１に示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
（２４）磁性粒子に固定化させた場合の合成ペプチドＮＳ４抗原及び合成ペプチドコア抗原の安定性
第１試薬として上記第１試薬（Ｄ）を用い、第２試薬として加速試験を実施した第２試薬（Ｄ）を用いた以外は、参考例１に記載の（１５）と同様の方法で測定を行った。検体は、１種類のＨＣＶ陰性血清（陰性血清１）及び４種類のＨＣＶ陽性血清（陽性血清３〜６）を用いた。結果を、表１に示す。