(57)【要約】【課題】特有の細胞配置を保持した歯を効率よく得ることができる歯形成用間葉系細胞を提供すること、及びこれを用いて特有の細胞配置を保持した歯を効率よく得る。【解決手段】全能性幹細胞、例えば胚性癌腫細胞を、ジメチルスルホキシドなどの分化誘導剤の存在下で培養して、分化誘導後の細胞集団から、ＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞を歯形成用間葉系細胞として選別する。また、間葉系細胞と上皮系細胞とのいずれか一方から実質的になる第１の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第２の細胞集合体とを、細胞の接触状態を保持可能な支持担体の内部に混合することなく密着させて配置して培養する際、上記間葉系細胞を、歯形成用間葉系細胞を含むものとすることよって、特有の細胞配置を有する歯を得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯を形成するために用いられる間葉系細胞の製造方法であって、
全能性幹細胞を分化誘導剤の存在下で培養して、ＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞を含む分化誘導処理後の細胞集団を生成すること、
前記分化誘導処理後の細胞集団から、ＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞を、歯形成用間葉系細胞として選別すること
を含む製造方法。
【請求項２】
前記歯形成用間葉系細胞が更に、Ｓｌｕｇ遺伝子、Ｐａｘ３遺伝子、Ｍｓｘ１遺伝子及びＰａｘ９遺伝子からなる群より選択された少なくとも１つを発現しているものである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記歯形成用間葉系細胞が更に、Ｓｌｕｇ遺伝子及びＰａｘ３遺伝子を共に発現しているものである請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
前記全能性幹細胞が、胚性幹細胞、胚性癌腫細胞、胚性生殖幹細胞からなる群より選択された少なくとも１つである請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
前記全能性幹細胞が、胚性癌腫細胞であることを特徴とする請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記分化誘導剤が、ジメチルスルホキシド及びレチノイン酸から選択された少なくとも一方である請求項１〜請求項５のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項７】
支持担体の内部に、間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第１の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第２の細胞集合体とを混合することなく密着させて配置すること、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること、
を含み、前記間葉系細胞が請求項１〜請求項６のいずれか１項記載の上記歯形成用間葉系細胞を含むものである歯の製造方法。
【請求項８】
前記培養が、歯周組織が形成するまで継続するものである請求項７記載の歯の製造方法。
【請求項９】
前記上皮系細胞が歯胚由来のものである請求項７又は８記載の歯の製造方法。
【請求項１０】
全能性幹細胞から誘導されるＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性の歯形成用間葉系細胞。
【請求項１１】
前記歯形成用間葉系細胞が更に、Ｓｌｕｇ遺伝子、Ｐａｘ３遺伝子、Ｍｓｘ１遺伝子及びＰａｘ９遺伝子からなる群より選択された少なくとも１つを発現しているものである請求項１０記載の歯形成用間葉系細胞。
【請求項１２】
前記歯形成用間葉系細胞が更に、Ｓｌｕｇ遺伝子及びＰａｘ３遺伝子を共に発現しているものである請求項１０記載の歯形成用間葉系細胞。
【請求項１３】
前記全能性幹細胞が、胚性幹細胞、胚性癌腫細胞、胚性生殖幹細胞からなる群より選択された少なくとも１つである請求項１０〜請求項１２のいずれか１項記載の歯形成用間葉系細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯を形成するために用いられる間葉系細胞の製造方法、歯の製造方法及び歯形成用間葉系細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯は、最外層にエナメル質、その内層に象牙質という硬組織を有し、さらに象牙質の内側に象牙質を産生する象牙芽細胞、その更に中心部に歯髄を有する器官であって、齲蝕や歯周病等によって失われることがある器官である。一般に歯の損失については、生命に対する危惧が少ないと考えられているため、現在は主として入れ歯やインプラントにより補うことが多い。しかしながら、歯の有無は外見や食べ物の味覚に大きく影響し、また健康維持や質の高い生活を維持するという観点から歯の再生技術の開発への関心が高まって来た。
【０００３】
歯は、胎児期の発生過程の誘導によって形成され、複数の細胞種によって構築された機能単位であり、器官や臓器と同じであると考えられている。そのため歯は、成体内の造血幹細胞や間葉系幹細胞のような幹細胞から細胞種が発生する幹細胞システムによって発生するのではない。このことから、現在、再生医療によって進められている幹細胞の移入のみ（幹細胞移入療法）では、歯を再生することができない。
そこで、近年、単離された歯胚細胞を用いた歯胚を再構成させて、この再構成歯胚を移植することによる歯の再生を中心とした検討が行われている。
【０００４】
例えば、非特許文献１には、歯胚から単離された上皮系細胞や間葉系の歯嚢細胞などの細胞を、生体吸収性の担体と共にラットの腹腔内に移植することで歯様の組織が再生されることが開示されている。
歯胚の再生方法としては、例えば、特許文献１には、生体から単離された歯胚細胞を、線維芽細胞増殖因子等の生理活性物質の存在下で培養することが記載されている。また、特許文献２には、生体から単離された歯胚細胞及びこれらの細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも１種類を、フィブリンを含む担体と一緒に培養することが提案されており、ここでフィブリンを含む担体は、歯胚の目的形状のものを使用して、特有の形態を有する「歯」を形成すると記載されている。
【０００５】
特許文献３及び特許文献４号公報には、６ヶ月のブタの下顎骨から、象牙質を形成する歯髄由来の間葉系細胞とエナメル形成に寄与する上皮系細胞とを含む歯胚との細胞混合物を、ポリグリコール酸−ポリ酢酸共重合体からなる生分解性ポリマーを固化させた担体（Scaffold）に播種して、動物の体内へ移植し、歯を形成する方法が開示されている。ここで担体は、歯胚の目的形状のものを使用して、特有の形態を有する「歯」を形成すると記載されている。
【０００６】
一方、特許文献５には、骨の欠損又は損傷を有する患者を治療するための歯の再生方法を開示している。この方法によれば、ポリグリコール酸メッシュ担体に、例えば歯胚由来の間葉系細胞を播種した後に、上皮系細胞をコラーゲンと共に重層する又は上皮細胞シートで包むことによって、骨が形成される。なお、特許文献５では、骨の形状を構築するために担体を用いている。
【０００７】
また、特許文献６には、歯胚由来の上皮系細胞と間葉系細胞とをそれぞれ細胞集合体とした上で、コラーゲンゲルの内部に細胞集合体同士を密着させ、その状態を保持しながら培養することによって、歯特有の細胞配置を備えた歯を製造する技術が開示されている。
【０００８】
しかしながら、上記技術では、歯又は歯胚を再生するために歯胚細胞又はこれに分化可能な細胞を生体から入手している。このように生体から採取する細胞を用いる技術では、入手可能な細胞数が充分でない場合がある。また、細胞の入手元について制限が設けられることがある。
また、組織として機能するには、組織を構成する複数種の細胞が適切な相対位置に配置（細胞配置）され、組織としての方向性を有することが必須である。
【０００９】
【非特許文献１】J. Dent. Res., 2002, Vol.81(10), pp.695-700
【特許文献１】特開２００４−３３１５５７号公報
【特許文献２】特開２００４−３５７５６７号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２００２／０１１９１８０号公報
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４／０２１９４８９号公報
【特許文献５】国際公開第２００５／０１４０７０号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００６／１２９６７２号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記技術では、歯又は歯胚を再生するために歯胚細胞又はこれに分化可能な細胞を生体から入手している。このように生体から採取する細胞を用いる技術では、入手可能な細胞数が充分でない場合があるだけでなく、入手元について制限が設けられることがある。
また、組織として機能するには、組織を構成する複数種の細胞が適切な相対位置に配置（細胞配置）され、組織としての方向性を有することが必須である。
【００１１】
従って本発明は、特有の細胞配置を保持した歯を効率よく得ることができる歯形成用間葉系細胞を提供すること、及びこれを用いて特有の細胞配置を保持した歯を効率よく得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の間葉系細胞の製造方法は、歯を形成するために用いられる間葉系細胞の製造方法であって、全能性幹細胞を分化誘導剤の存在下で培養して、ＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞を含む分化誘導処理後の細胞集団を生成すること、前記分化誘導処理後の細胞集団から、ＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞を、歯形成用間葉系細胞として選別することを含む。
本発明の歯の製造方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第１の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第２の細胞集合体とを混合することなく密着させて配置すること、前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること、を含み、前記間葉系細胞が上記歯形成用間葉系細胞を含む。
本発明の歯形成用間葉系細胞は、全能性幹細胞から誘導されるＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性の歯形成用間葉系細胞である。
【００１３】
本発明の間葉系細胞の製造方法は、全能性幹細胞に分化誘導処理を行うことによって得られたＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞を歯形成用間葉系細胞として選別するので、この間葉系細胞を得るために生体由来の歯等を使用する必要がなく、目的とする歯を大量に作製することができる。
また、このような歯形成用間葉系細胞を用いるので、目的とする歯を効率よく製造することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、目的とする歯を効率よく大量に作製することができる間葉系細胞の製造方法、及びエナメル質及び象牙質による特有の細胞配置を保持した歯を、効率よく大量に製造することができる歯の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
［間葉系細胞の製造方法］
本発明の間葉系細胞の製造方法は、歯を形成するために用いられる間葉系細胞を製造する間葉系細胞の製造方法であって、全能性幹細胞を分化誘導剤の存在下で培養して、ＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞を含む分化誘導処理後の細胞集団を生成すること、前記分化誘導処理後の細胞集団から、ＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞を、歯形成用間葉系細胞として選別することを含むものである。
【００１６】
本発明は、全能性幹細胞を分化誘導して得られたＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞が、歯形成用間葉系細胞として使用できることを見出したものである。これにより、歯を作製するために必要な間葉系細胞を、生体由来の歯又は歯胚以外からも得ることができ、歯を形成するための間葉系細胞を得るために、生体由来の歯等を使用する必要性を排除することができる。この結果、歯胚から直接採取した細胞数が充分でない事情や、入手元における制限の有無といった事情を考慮することなく、必要な量の間葉系細胞を容易に、また場合よって大量に得ることができる。
【００１７】
本発明において、「歯」とは、内側に象牙質及び外側にエナメル質の層を連続して備えた組織をいい、特に歯冠や歯根を有する方向性を備えた組織をいう。歯の方向性は、歯冠や歯根の配置によって特定することができる。歯冠や歯根は、形状や組織染色などに基づいて目視にて確認することができる。歯冠とは、エナメル質と象牙質の層構造を有する部分をいい、歯根にはエナメル質の層は存在しない。
【００１８】
象牙質及びエナメル質は、当業者には、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。また、エナメル質は、エナメル芽細胞の存在によって特定することができ、エナメル芽細胞の存在は、アメロジェニンの有無によって確認することができる。一方、象牙質は、象牙芽細胞の存在によって特定することができ、象牙芽細胞の存在は、デンチンシアロプロテインの有無によって確認することができる。アメロジェニン及びデンチンシアロプロテインの確認はこの分野で周知の方法によって容易に実施することができ、例えば、in situ ハイブリダイゼーション、抗体染色等をあげることができる。
【００１９】
また本発明における間葉系細胞は、歯を形成するために、まず歯胚を形成するために使用できる。
本発明において「歯胚」及び「歯芽」は、後述する発生段階に基づいて区別されたものに特に言及する場合に用いられる表現である。この場合の「歯胚」とは、将来歯になることが決定付けられた歯の初期胚であり、歯の発生ステージで一般的に用いられる蕾状期（Bud stage）から鐘状期（Bell stage）までの段階であり、特に歯の硬組織としての特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が認められない組織である。一方、「歯芽」とは本発明で用いられる「歯胚」の段階移行の、歯の硬組織の特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が始まった段階から歯が歯肉から萌芽して一般的に歯としての機能を発現する前の段階の組織をいう。
【００２０】
歯胚から歯への発生は、図１に示されるように個体発生の過程で、蕾状期、帽状期、鐘状前期及び後期の各ステージを経て行われる。ここで、蕾状期では、上皮系細胞が間葉系細胞を包むように陥入し、鐘状前期及び鐘状後期に至ると、上皮系細胞部分が外側のエナメル質となり、間葉系細胞部分が内部に象牙質を形成するようになる。従って、上皮系細胞と間葉系細胞との細胞間相互作用によって歯胚から歯が形成される。
なお本発明において「間葉系細胞」とは、間葉組織由来の細胞を意味し、「上皮系細胞」とは上皮組織由来の細胞を意味する。
また本発明において「歯周組織」とは、歯の主として外層の形成された歯槽骨及び歯根膜をいう。歯槽骨及び歯根膜は、当業者には、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。
【００２１】
以下に本発明にかかる歯形成用間葉系細胞について説明する。
本発明に係る歯形成用間葉系細胞を得るために用いられる全能性幹細胞は、少なくとも２以上の細胞に分化可能な多分化能を有する細胞を言い、好ましくは胚性癌腫細胞、胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞からなる群より選択されたものを使用することができる。このうち、入手の容易性の観点から胚性癌腫細胞（以下、「ＥＣ細胞」という）であることがより好ましい。本発明に適用可能なＥＣ細胞には、神経、睾丸、卵巣などいずれの組織に由来するものであってもよい。このようなＥＣ細胞としては。例えばヒト由来としてはＮＣＲ−Ｇ３細胞、並びにＮＴＥＲＡ−２細胞を挙げることができ、マウス由来としてはｃ−１３００細胞やＦ９細胞、ＬＴ−２細胞、ＯＴＴ６０５０細胞、ＰＣＣ４細胞、Ｐ１９細胞、ＭＥＴＴ−１細胞、ＳＴＴ−３細胞などの細胞株を挙げることができる。これらの細胞は、哺乳動物の霊長類（例えばヒト、サルなど）、有蹄類（例えば豚、牛、馬など）、小型哺乳類の齧歯類（例えばマウス、ラット、ウサギなど）の種々の動物に由来するものから、適宜使用目的に応じて選択することができる。例えばマウス由来の胚性癌腫細胞株としては、上記に記載した細胞株やこれらの派生クローンを挙げることができる
【００２２】
全能性幹細胞の培養には、通常使用される培地を使用することができる。培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等を用いることができる。この培地には、細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常１０％とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、例えば３７℃の温度で５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加したものであってもよい。
【００２３】
本発明では、全能性幹細胞に対して、分化誘導剤の存在下で培養することによる分化誘導処理が行われる。この分化誘導処理によって、全能性幹細胞から、ＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞を含む細胞集団が生成する。誘導処理によって得られる細胞集団には、上記のＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞が含まれていればよく、これらの双方の細胞が含まれていてもよい。
【００２４】
上記分化誘導剤としては、少なくとも全能性幹細胞からＣＤ４４発現細胞への分化誘導が可能なＣＤ４４陽性細胞誘導因子であれば使用することができる。このようなＣＤ４４陽性細胞誘導因子としては、神経堤細胞系誘導因子、神経堤細胞発生関与因子、神経堤細胞増殖促進因子を挙げることができる。神経堤細胞系誘導因子は、全能性幹細胞を神経堤細胞又はその派生細胞（平滑筋細胞、心筋細胞等）へ誘導することができる因子であり、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｄｅｘ、ｃＡＭＰ、ヘキサメチレンビスアセトアミド、５’−アザシチジン、ＴＧＦβ、Ｎｏｇｇｉｎ等を挙げることができる。神経堤細胞発生関与因子としては、レチノイン酸（ＲＡ）、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、Ｓｈｈ、Ｗｎｔ、ＦＧＦ２、エンドセリン−１、エントセリン−３、アクチビンβＡ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ等を挙げることができる。神経堤細胞増殖促進因子としては、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＢＭＰ−２、ＳＣＦ、活性型ビタミンＤ３等を挙げることができる。神経堤細胞系誘導因子、神経堤細胞発生関与因子及び神経堤細胞増殖促進因子はそれぞれ明確に区別されるものではなく、また、これらを単独で又は１以上を組み合わせて使用することができる。このうち、後述する本発明の目的細胞集団を効率よく生成可能なＤＭＳＯ及びＲＡが好ましく、これらは単独又は組み合わせて使用することができる。
【００２５】
これらの分化誘導剤は、全能性幹細胞の培地に分化誘導可能な濃度、添加すればよい。ここで分化誘導可能な濃度とは、用いられる分化誘導剤の種類や全能性幹細胞の種類等によって異なる。
例えばＤＭＳＯの場合、一般に培地の容量に対して、０．５容量％〜１０容量％、処理に対する細胞の生存率及び培養によって得られる目的の細胞の取得効率の観点から、好ましくは２．５容量％〜５容量％、更に好ましくは４容量％〜５容量％の濃度とすることができる。２．５容量％以上の濃度であれば、全能性幹細胞の分化を充分に誘導することができ、一方、５容量％以下の濃度であれば目的の細胞取得の効率を著しく損なうことがない。
また、ＲＡの場合、一般に培地中で０．１μＭ〜１０μＭ、処理に対する細胞の生存率及び培養によって得られる目的の細胞の取得効率の観点から、好ましくは０．５μＭ〜５μＭ、更に好ましくは０．５μＭ〜２μＭの濃度とすることができる。０．１μＭ以上の濃度であれば、全能性幹細胞の分化を充分に誘導することができ、一方、１０μＭ以下の濃度であれば目的の細胞取得の効率を著しく損なうことがない。
【００２６】
全能性幹細胞に対する分化誘導処理は、上記分化誘導剤の存在下で全能性幹細胞を培養によって行われる。分化誘導処理（培養）の期間は、分化誘導剤の濃度と細胞の成育活性によって異なるが、一般に２時間〜３日、細胞の生存率、ならびに目的の細胞の入手効率の観点から好ましくは６時間〜２４時間とすることができる。６時間以上とすることにより充分に分化誘導された細胞を効率よく得ることができ、２４時間以下とすることによって効率を著しく損なうことがない。
【００２７】
なお、分化誘導処理の期間と分化誘導剤の濃度との間には、全能性幹細胞に対する分化誘導を効果的に起こさせるために一定の関係が成立する。即ち、一般に、分化誘導剤存在下での培養期間（処理時間）は、分化誘導剤の濃度と分化誘導剤の種類によって異なるが、特定の分化誘導剤の場合には、培養日数を固定した場合、一般にその濃度には好ましい至適濃度域が存在する。また培養日数を短くした場合には、至適濃度域は高い濃度側に移行し、逆に培養日数を長くする場合には至適濃度域は低い濃度側に移行する。これらの要素を考慮すると、培養日数の調節によって幅広い濃度域での分化誘導効果が得られると共に、当業者には、誘導効果が得られる至適濃度域を容易に設定することができる。
【００２８】
上記分化誘導処理によって得られた分化誘導処理後の細胞集団には、ＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞を含む細胞集団が生成する。これら双方の細胞が含まれていてもよい。この分化誘導処理後の細胞集団は、次いで、ＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞を歯形成用間葉系細胞として選別する選別処理に供される。
【００２９】
細胞の選別は、上述したような本発明にかかる間葉系細胞を選別することができる手段であればいずれを用いてもよい。このような選別手段としては、遺伝子発現パターン、細胞表面抗原、形態などを基準とする選別を挙げることができ、これらの１つ又は２つ以上を用いて、全能性幹細胞を選別することができる。選別手段は、細胞選別の効率の観点から、細胞表面の発現をもとにしたセルソーターを用いることが好ましく、確実に間葉系細胞を選別するためには、複数の組み合わせ、特に、遺伝子発現パターンと細胞表現抗原の発現とを組み合わせて使用することが好ましい。
【００３０】
本発明において選別された歯形成用間葉系細胞は、ＣＤ４４陽性であることに加えて、ＣＤ２９陽性又はＣＤ１０６陽性の細胞性状を示すものである。ＣＤ４４は、ヒアルロン酸受容体として細胞表面に発現する膜タンパク質であることが知られている。一方、ＣＤ２９は、インテグリンβ１分子として細胞表面に発現する膜タンパク質であることが知られており、ＥＣ細胞では弱陽性、間葉系細胞ではｍＲＮＡレベルで発現していることがそれぞれ報告されている。またＣＤ１０６は、接着分子として既知のＶＣＡＭ−１分子であることが知られており、主として上皮系細胞のマーカーとして利用されることが多い。このような性状を示す細胞であれば、後述するように歯の形成において間葉系細胞として使用することができる。
本発明における歯形成用間葉系細胞は、ＣＤ４４陽性に加えて、ＣＤ２９及びＣＤ１０６の少なくともいずれか一方の抗原が陽性となる集団であればよく、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ１０６の３種の抗原が共に陽性となる三重陽性細胞が含まれていてもよい。
【００３１】
本発明における歯形成用間葉系細胞は、上記ＣＤ４４、ＣＤ２９及びＣＤ１０６の細胞表現抗原に加えて、他の細胞性状に基づいて選別を行ってもよい。
他の細胞性状としては他の細胞表面抗原パターンや遺伝子発現パターンを挙げることができる。細胞表現抗原パターンとして、例えばＣＤ１４陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性等を挙げることができ、これらを単独又は組み合わせて使用することができる。また遺伝子発現パターンとしては、例えばＳｌｕｇ発現、Ｗｎｔ５ａ発現、Ｌｈｘ８発現、ＢＭＰ４発現、Ｐａｘ３発現、Ｐａｘ９発現、Ｍｓｘ１発現、Ｏｃｔ３／４非発現、ｎａｎｏｇ非発現、Ｓｏｘ９非発現、Ｓｏｘ５非発現等を挙げることができ、これらを単独又は組み合わせて使用することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の歯形成用間葉系細胞は、好ましくは、上記ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ１０６に加えて、歯形成能の高さから、Ｓｌｕｇ遺伝子、Ｐａｘ３遺伝子、Ｍｓｘ１遺伝子及びＰａｘ９遺伝子の群から選択された少なくとも１つの遺伝子を発現していることが好ましく、Ｓｌｕｇ遺伝子及びＰａｘ３遺伝子を共に発現していることが更に好ましく、これら４つの遺伝子をすべて発現していることが特に好ましい。
【００３３】
これらの細胞表面抗原や遺伝子発現パターンの確認及びこれに基づく選別には、表面抗原を認識する各種抗体や遺伝子発現の確認が可能な核酸配列などを用いる。これらの抗体及び核酸配列は、いずれも公知であり容易に入手可能である。また、これらの表面抗原や遺伝子発現に基づく確認及び選別は、この用途に一般的に用いられる手段、例えば、各種抗体による免疫染色、フローサイトメトリー、セルソーター、ＲＴ−ＰＣＲ等を用いればよい。
【００３４】
また、本発明の製造方法では、上記選別手段に組み合わせて、単一の間葉系細胞とするためのクローニングを用いることができる。クローニングの方法としては、通常この目的で用いられている方法、例えば、限界希釈法、セルソーター、クローニングリングなどを用いることができる。クローニングは、上記選別手段による選別の前後のいずれで行ってもよいが、目的とする間葉系細胞を効率よく得るためには選別の後に行うことが好ましい。
【００３５】
選別工程において目的とする細胞数を効率よく得るために、選別工程の前に増殖工程を設けてもよい。このような増殖工程では、分化誘導剤を含まない通常培養用の培地を用いて分化誘導後の細胞集団の培養を行う。これにより、分化誘導された目的細胞を所定の細胞数まで増殖させることができる。その結果、充分な細胞数により選別を容易に実施可能にすることができる。
このような増殖工程の期間は、分化誘導処理後の細胞数及び細胞の状態に基づいて適宜設定することができるが、目的細胞の濃縮効率の観点から一般に３〜３０日、好ましくは５〜１０日とすることができる。この結果、選別工程の対象となる細胞集団中に、目的とする歯形成用間葉系細胞が含まれることになり、このような細胞集団を選別工程に供することによって、本発明にかかる歯形成用間葉系細胞を効率よく且つ大量に得ることができる。
【００３６】
本発明の方法で得られた間葉系細胞は、歯を形成するために用いられる。歯の形成は、本発明に係る間葉系細胞を用いるものであればいずれの方法であってもよいが、以下の本発明の歯の製造方法に用いられることが最も好ましい。
以下、本発明の歯の製造方法について説明する。
【００３７】
［歯の製造方法］
本発明の歯形成用間葉系細胞を用いた好ましい歯の製造方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第１の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第２の細胞集合体とを混合することなく密着させて配置すること（配置工程）、前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること（培養工程）、を含み、前記間葉系細胞が上記歯形成用間葉系細胞を含むものである。
本製造方法では、間葉系細胞と上皮系細胞とを細胞集合体として支持担体の内部で混合することなく密着させた状態で生育させるので、緊密な接触状態によって細胞間相互作用を効果的に再現することができ、内側に象牙質、外側にエナメル質という歯に特有の細胞配置を有する歯を得ることができる。この際、間葉系細胞から実質的になる細胞集合体が本発明にかかる歯形成用間葉系細胞を含むので、特有の細胞配置を有する歯を効率よく大量に製造することができる。
【００３８】
配置工程では、支持担体の内部に、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体とを接触させて配置する。
ここで第１の細胞集合体及び第２の細胞集合体は、それぞれ間葉系細胞のみ、又は上皮系細胞のみから実質的に構成されているものである。ここで、間葉系細胞のみから実質的に構成されている細胞集合体は、上述した歯形成用間葉系細胞を含むものである。この歯形成用間葉系細胞を含む細胞集合体は、上述した製造方法に従った調製工程によって調製することができ、一方、上皮系細胞のみから実質的に構成されている細胞集合体は、間葉系細胞から実質的になる細胞集合体とは独立して調製することができる（第１の細胞調製工程及び第２の細胞調製工程）。
【００３９】
また、「細胞集合体」とは、細胞が密集した状態をいい、組織の状態であっても、単一細胞の状態から調製された細胞集合体（細胞凝集体）であってもよい。また「実質的になる」とは、対象となる細胞以外のものをできるだけ含まないことを意味する。このため上皮系細胞からなる細胞集合体は、組織の一部又は単一細胞の集合体とすることができる。また、上皮系細胞及び間葉系細胞は共に単一細胞で構成された細胞集合体であってもよい。
第１の細胞集合体第２の細胞集合体は、いずれが上皮系細胞及び間葉系細胞であってもよく、この細胞集合体を構成する細胞の数は、動物の種類や、支持担体の種類、硬さ及び大きさによって異なるが、細胞集合体１個あたり、一般に１０１〜１０８個、好ましくは１０３〜１０８個とすることができる。
【００４０】
間葉系細胞から実質的になる細胞集団は、歯形成用間葉系細胞を含んでいれば他の間葉系細胞を含んでいてもよい。
上記間葉系細胞以外の他の間葉系細胞としては、歯胚及び歯胚以外に由来する間葉系細胞を挙げることができる。歯胚以外に由来する間葉系細胞としては、生体内の他の間葉系組織に由来する細胞であり、好ましくは、血液細胞を含まない骨髄細胞や間葉系幹細胞、さらに好ましくは口腔内間葉系細胞や顎骨の内部の骨髄細胞、頭部神経堤細胞に由来する間葉系細胞、前記間葉系細胞を生み出しうる間葉系前駆細胞やその幹細胞等を挙げることができる。
【００４１】
本製造方法で用いられる上皮系細胞は、生体内での細胞配置を再現して特有の構造及び方向性を有する歯を効果的に形成するために歯胚に由来するものであることが好ましく、細胞の分化段階の幼若性と均質性の観点から蕾状期から帽状期からのものであることが好ましい。
また、歯胚以外に由来する上皮系細胞であってもよく、これには、生体内の他の上皮系組織に由来する細胞を挙げることができる。好ましくは、皮膚や口腔内の粘膜や歯肉の上皮系細胞、さらに好ましくは皮膚や粘膜などの分化した、例えば角化した、あるいは錯角化した上皮系細胞を生み出しうる未熟な上皮系前駆細胞、たとえば非角化上皮系細胞やその幹細胞等を挙げることができる。
【００４２】
細胞集合体を調製するために各細胞を組織から単離する場合、歯胚及び他の組織は、哺乳動物の霊長類、例えばヒト、サルなど、有蹄類、例えば豚、牛、馬など、小型哺乳類の齧歯類、例えばマウス、ラット、ウサギなどの種々の動物の顎骨等から採取することができる。歯胚及び組織の採取は、通常、組織の採取で用いられる条件をそのまま適用すればよく、無菌状態で取り出し、適当な保存液に保存すればよい。なお、ヒトの歯胚としては、第３大臼歯いわゆる親知らずの歯胚の他、胎児歯胚を挙げることができるが、自家組織の利用との観点から、親知らず歯胚を用いることが好ましい。
【００４３】
組織、例えば歯胚から、上記細胞を調製する場合には、まず周囲の組織から単離された歯胚を、形状に従って歯胚間葉組織及び歯胚上皮組織に分ける。このとき、歯胚組織は顕微鏡下で構造的に見分けることが可能であるため、解剖用ハサミやピンセット等で切断、あるいは引き剥がすことによって容易に分離することができる。また、歯胚組織からの歯胚間葉組織及び歯胚上皮組織の分離は、その形状に従って注射針、タングステンニードル、ピンセット等で切断、あるいは引き剥がすことにより容易に行うことができる。
好ましくは、周囲組織から歯胚細胞を容易に分離するため及び／又は歯胚組織から上皮組織及び間葉組織を分離するために、酵素を用いてもよい。このような用途に用いられる酵素としては、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等を挙げることができる。
【００４４】
細胞集合体を構成する細胞は、採取した組織から単一細胞の状態に調製してもよい。調製工程において単一の細胞に容易に分散可能とするために、酵素を用いてもよい。このような酵素としては、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等を挙げることができる。このとき、上皮組織からの上皮系細胞の分離にはコラーゲナーゼ処理後にトリプシン処理とＤＮａｓｅ処理をすることが好ましい。他方、間葉組織からの間葉系細胞の分離には、コラーゲナーゼとトリプシンで同時に処理し、最終的にＤＮａｓｅ処理をすることが好ましい。このときＤＮａｓｅ処理を行うのは、酵素処理により一部の細胞がダメージをうけ、細胞膜が溶解したときに溶液中に放出されるＤＮＡによって細胞が凝集し細胞の回収量が低下することすることを防ぐためである。
【００４５】
なお、細胞集合体を構成する細胞は、それぞれ充分な細胞数を得るために、配置工程に先立って予備的な培養を経たものであってもよい。細胞の培養は、一般に動物細胞の培養に用いられる温度等の条件をそのまま用いることができる。
培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等を用いることができ、細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常１０容量％とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、例えば３７℃の温度で５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加したものであってもよい。
【００４６】
この予備的な培養を間葉系細胞に適用する場合、上述した歯形成用間葉系細胞の増殖のための培養を兼ねたものであってもよく、選別工程後に行うもの、又はこの双方であってもよい。
また、細胞の性質を変えないという観点から、間葉系細胞の予備培養や上述した歯形成用間葉系細胞の単なる増殖のための培養では、前述した分化誘導剤を含有しない培地で行うことが好ましい。
【００４７】
配置工程における細胞集合体の配置は、上記第１及び第２の細胞集合体を、細胞の接触状態を保持可能な支持担体の内部に配置する。このとき、各細胞集合体は互いに混合することがない。このように各細胞集合体を混合することなく配置するので、細胞集合体の間に境界線が形成される。このような配置形態を、本明細書中では適宜「区画化」と表現する。
【００４８】
ここで用いられる支持担体としては、細胞を内部で培養可能なものであればよく、好ましくは、上記培地との混合物である。このような支持担体としては、コラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス（商品名）、メビオールゲル（商品名）、マトリゲル（商品名）、エラスチン、フィブリン、ラミニン、細胞外マトリクス混合物、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸／グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等を挙げることができる。これらの支持担体は、細胞を内部に配置したときに配置した位置をほぼ維持可能な程度な硬さを有するものであればよく、ゲル状、繊維状、固体状のものを挙げることができる。中でも細胞外マトリクス混合物等のゲルが適切な硬さや保持力を提供しやすいといった観点から、コラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス、メビオールゲル、マトリゲル、細胞倍マトリクス混合物、エラスチン、フィブリン、ラミニンがより好ましい。ここで、細胞の位置を維持可能な硬さとは、通常、三次元培養として適用される硬さ、即ち、細胞の配置を保持できると共に増殖による肥大化を阻害しない硬さであればよく、容易に決定することができる。
なお、ここで支持担体は、第１及び第２の細胞集合体が担体内部で成育することができる程度の厚みを有すればよく、目的とする組織の大きさ等によって適宜設定することができる。
【００４９】
また、支持担体は、細胞が分散することなく細胞の接触状態を保持可能な保持力を備えていればよい。ここでいう「接触状態」とは、各細胞集合体において、また細胞集合体間において、確実に細胞相互作用させるために緊密（高密度）の状態であることが好ましく、このような高密度の状態とは、細胞凝集体の場合には、例えば、単に触れ合うよりも強く密着した状態を維持可能な保持力で細胞を培養可能なものとすることができる。例えば、コラーゲンの場合、最終濃度２〜３ｍｇ／ｍｌの濃度、即ちJIS-K6503-1996に準拠した方法（１２．７ｍｍ径のプランジャーで４ｍｍ押し下げるのに必要な荷重として測定）によって１２０ｇ〜２５０ｇのゼリー強度となる濃度での使用が適切な硬さを提供する。また、このゼリー強度は限定されず、他の種の支持担体においても、同様の評価方法によって同様の強度があれば本発明の支持担体として好ましく用いられる。また１種又は複数種の支持担体を混合することによって、目的とするゼリー強度に相当する硬さの支持担体を得てもよい。
【００５０】
高密度の状態とは、組織を構成する際の密度と同等程度であることをいい、例えば、細胞集合体の場合、細胞配置時で５×１０７〜１×１０９個／ｍｌ、細胞の活性を損なわずに確実に細胞相互作用させるため好ましくは１×１０８〜１×１０９個／ｍｌ、最も好ましくは２×１０８〜８×１０８個／ｍｌの密度をいう。このような細胞密度に細胞集合体を調製するには、細胞を遠心によって凝集させ沈殿化することが細胞の活性を損なわずに簡便に高密度化できるため好ましい。このような遠心は、細胞の生存を損ねない３００〜１２００×ｇ、好ましくは５００〜１０００×ｇの遠心力に該当する回転数で３〜１０分間行えばよい。３００×ｇよりも低い遠心では、細胞の沈殿が不十分となって細胞密度が低くなる場合があり、一方、１２００×ｇよりも高い遠心では細胞が損傷を受ける場合があるため、それぞれ好ましくない。
【００５１】
遠心分離によって高密度の細胞を調製する場合には、通常、細胞遠心分離するために用いられるチューブ等の容器に単一細胞の懸濁液を調製した後に遠心分離し、沈殿物としての細胞を残して上清をできるだけ取り除けばよい。このときに使用されるチューブ等の容器は、上清を完全に除去する観点から、シリコーンコートされたものであることが好ましい。
【００５２】
遠心分離による沈殿物とした場合には、沈殿物をそのまま支持担体の内部に配置すればよい。このとき、目的とする細胞以外の成分（例えば、培養液、緩衝液、支持担体等）は、細胞の容量と等量以下であることが好ましく、目的とする細胞以外の成分を含まないことを最も好ましい。このような高密度の細胞集合体では、細胞が緊密に接触しており、細胞間相互作用が効果的に発揮される。特に目的とする細胞以外の成分が極端に少ない細胞集合体を支持担体の内部に配置すると、支持担体の固化等によって更に凝集し、より一層緊密状態となる。
【００５３】
組織の状態で使用する場合には、酵素処理等を行って、対象となる細胞以外の結合組織等を除去することが好ましい。目的とする細胞以外の成分が多い場合、例えば細胞の容量と等量以上になると、細胞間相互作用が充分に発揮されないため、好ましくない。
【００５４】
また、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体との接触は、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の接触は密接であるほど好ましく、第１の細胞集合体に対して第２の細胞集合体を押し付けて配置することが特に好ましい。また、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体との周囲を培養液、酸素透過を阻害しない固形物で包み込むことも、細胞集合体同士の接触を密接にするのに有効である。粘度の異なる溶液に密度の高い細胞懸濁液を入れて配置させ、溶液をそのまま固化することも、細胞の接触の保持を容易に達成できるため、好ましい。このとき、第１の細胞集合体を歯胚間葉系細胞の単一細胞集合物とし、第２の細胞集合体を歯胚上皮組織とした場合には、歯胚上皮組織のエナメル結節が第１の細胞集合体に接触するように配置することが好ましいが、これに限定されない。
【００５５】
支持担体がゲル状、あるいは溶液状等の場合には、配置工程の後に支持担体を固化する固化工程を設けてもよい。固化工程によって、支持担体内部に配置された細胞が支持担体内部に固定化される。支持担体の固化には、一般に用いた支持担体の固化条件をそのまま適用すればよい。例えば支持担体にコラーゲン等の固化可能な化合物を用いた場合には、通常適用される条件で、例えば培養温度下で数分〜数十分間静置させることにより、固化することができる。これにより、支持担体内部における細胞間の結合を固定化できると共に、強固なものにすることができる。
【００５６】
本発明の製造方法における培養工程では、第１の細胞集合体及び第２の細胞集合体を支持担体内部で培養する。この培養工程では、互いに緊密に接触された第１の細胞集合体及び第２の細胞集合体によって細胞間相互作用が効果的に行われて、組織、即ち歯が再構成される。
培養工程は、支持担体によって第１の細胞集合体と第２の細胞集合体との接触状態が維持されて行われればよく、第１及び第２の細胞集合体を有する支持担体単独による培養であっても、他の動物細胞の存在下での培養であってもよい。
【００５７】
培養期間としては、支持担体内部に配置された細胞数及び細胞集合体の状態、更には培養工程の実施条件によって異なるが、一般に、１〜３００日、エナメル質を外側に有し、象牙質を内側に有する歯を形成するためには、好ましくは１〜１２０日、迅速に提供可能とする観点からは、好ましくは１〜６０日とすることができる。更に歯周組織を備えた歯とするためには、一般に１〜３００日、好ましくは１〜６０日とすることができる。
【００５８】
支持担体のみによる培養とした場合には、動物細胞の培養に用いられる通常の条件下での培養とすることができる。ここでの培養は、一般に動物細胞での培養条件をそのまま適用すればよく、前述した条件をそのまま適用することができる。また培養には、哺乳動物由来の血清を添加してもよく、またこれらの細胞の増殖や分化に有効であることが既知の各種細胞因子を添加してもよい。このような細胞因子としては、ＦＧＦ、ＢＭＰ等を挙げることができる。
【００５９】
また、組織や細胞集合体のガス交換や栄養供給の観点から器官培養を用いることが好ましい。器官培養では、一般に、動物細胞の増殖に適した培地上に多孔性の膜をフロートさせ、その膜上に支持担体で包埋された細胞集合体を置いて培養を行う。ここで用いられる多孔性の膜には、０．３〜５μｍ程度の孔を多数有した膜であることが好ましく、具体的にはセルカルチャーインサート（商品名）、アイソポアフィルター（商品名）を挙げることができる。
【００６０】
他の動物細胞の存在下での培養の場合には、動物細胞からの各種サイトカイン等の作用を受けて、早期に特有の細胞配置を有する歯を形成することができるので、好ましい。このような他の動物細胞の存在下での培養は、単離細胞や培養細胞を用いて生体外での培養によって行ってもよい。
【００６１】
また、第１及び第２の細胞集合体を有する支持担体を生体へ移植して、生体内で培養を行ってもよい。このような生体内での培養は、歯、更には歯周組織の形成を早期に行うことができるため特に好ましい。この場合、支持担体と共に第１及び第２の細胞集合体が生体内へ移植される。
【００６２】
この用途に利用可能な動物は、哺乳動物、例えばヒト、豚、マウス等を好ましく挙げることができ、歯胚組織と同一の種に由来するものであることが更に好ましい。ヒト歯胚組織を移植する場合には、ヒト、又は免疫不全に改変したヒト以外の他の哺乳動物を用いることが好ましい。このような生体内成育に好適な生体部位としては、動物細胞の器官や組織をできる限り正常に発生させるためには、腎臓皮膜下、腸間膜、皮下移植、口腔内等が好ましい。
移植による成育期間としては、移植時の大きさと発生させる歯の大きさによって異なるが、一般に、３〜４００日とすることができる。例えば、腎臓皮膜下への移植期間は移植する培養物の大きさと再生させる歯の大きさによっても異なるが、歯の再生と移植先で発生させる歯の大きさの観点から７〜６０日間であることが好ましい。
【００６３】
生体への移植を行う前に、生体外での培養（前培養）を行ってもよい。この前培養によって細胞間の結合と第１及び第２の細胞集合体同士の結合を強固にして、細胞間相互作用をより強固にすることができるため好ましい。その結果、全体の成育期間を短縮することができる。
前培養の期間は短期であっても長期であってもよい。長期間、例えば３日以上、好ましくは７日以上とした場合には、歯胚から歯芽に発生させることができるので、移植後に歯ができるまでの期間を短縮することもできるため好ましい。前培養の期間としては、例えば腎臓皮膜下へ移植を行う場合の器官培養として、好ましくは１〜７日とすることが効率よく歯を再生するために好ましい。
【００６４】
本発明の製造方法によって製造された歯は、内側に象牙質、外側にエナメル質という歯としての特有の細胞配置（構造）を有するものであり、また好ましくは、更に歯の先端（歯冠）と歯根という方向性も備えているものである。少なくともこのような特有の細胞配置、好ましくは細胞配置に加えて方向性を有することによって、歯としての機能も発揮できるものである。このため、歯の代替物として広く利用することが可能である。特に、自家の歯胚に由来した間葉系細胞及び上皮系細胞を用いた場合には、拒絶反応による問題を回避しつつ使用することができる。また一般に移植抗原が適合した他人の歯胚に由来する細胞を用いる場合にも拒絶反応による問題を回避することが可能である。
【００６５】
また本発明の製造方法によって製造された歯は、歯特有の細胞配置を有する歯の集合体であってもよい。
このような歯の集合体は、歯特有の細胞配置を有する複数の歯で構成されているため、個々の歯を集合体から分離して、以下に述べるように１つの歯の移植片として用いることができる。この結果、移植片としての歯を効率よく作製することができる。
【００６６】
複数の歯で構成された歯の集合体を得るためには、第１及び第２の細胞集合体いずれも、複数本の歯が発生するための歯胚の再誘導を容易にするために共に単一細胞により構成されていることが好ましい。
なお、培養工程は、前記と同様に、器官培養であっても腎臓皮膜下での培養であってもよいが、得られた歯を移植片として用いる場合には、他の動物細胞との接触がなく且つ全行程in vitroで調製することができる器官培養とすることが好ましい。
【００６７】
さらに本発明の製造方法では、培養期間を歯周組織が形成されるまで継続してもよい。これにより、歯そのものに加えて、歯を顎骨上で支持し、固定化する歯槽骨や歯根膜などの歯周組織も形成させることができる。この結果、移植後に実用可能な歯を提供することが可能である。
【００６８】
なお、歯周組織を製造するためには、上記培養工程の後に、前記培養によって得られた歯周組織を単離する工程を設けて歯周組織のみを得てもよい。歯周組織の単離は、培養工程の過程で形成された歯周組織と歯とを分離することができる如何なる方法によって行ってもよく、ピンセット等による分離や、酵素による部分消化等を挙げることができる。
【００６９】
本発明に従って得られた歯及び歯周組織は、移植片として用いられる他、歯の発生過程を解明するための研究にも好ましく利用することができ、今後の歯に関連する組織発生のために有効なリサーチツールとして利用することができる。
なお、得られた歯又は歯周組織を移植片として用いる場合には、製造方法における培養工程を、他の動物細胞との接触がなく且つ全行程in vitroで調製することができる器官培養としたものであることが好ましい。
【００７０】
また、本発明には、歯の移植方法が含まれる。この移植方法では、上記歯の集合体を得る工程と、歯の複合体から個々の歯を分離する工程と、分離された歯を、移植部位での他の歯と同一の方向性となるように揃えて移植する工程とを含む。
これにより、歯の移植を、特有の細胞配置と方向性を備えた複数の歯を同時に得て、効率よく実施することができる。
【００７１】
本発明による歯は、歯の欠損及び損傷を伴う各種症状、例えば、齲蝕、辺縁性歯周炎（歯槽膿漏）、歯周病による歯の欠損、事故などによる折損や脱落等の治療又は処置に適用することもできる。
即ち、本発明の治療方法は、本発明による製造方法によって得られた歯及び／又は歯周組織を、欠損及び／又は損傷部位へ移植することを含む。これにより、欠損及び／又は損傷部位の上記症状を治療及び／又は緩和することができる。
本発明の他の治療方法は、本発明における培養工程のみ、或いは、配置工程及び培養工程を、欠損及び／又は損傷部位において実施させることを含む。この場合、支持担体としては、上述したものに加えて、欠損及び／又は損傷部位の周囲組織そのものを支持担体として適用してもよい。これにより、生体内での周辺組織からのサイトカイン等によって、より迅速に欠損及び／又は損傷部位の治療等を行うことができる。
【実施例】
【００７２】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
［実施例１］
１．  ＥＣ細胞の培養方法
ＥＣ細胞は、ＡＴ８０５細胞（１２９系ＥＣ細胞であるＯＴＴ６０５０の派生クローン、理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室より入手）を使用した。ＡＴ８０５細胞の培養は、１０容量％牛胎児血清（ＦＣＳ：ＪＲＨ又はＪＢＳ、Hyclone社製）及び５５μＭ ２−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：ＳＩＧＭＡ社又はコージンバイオ社製）を用いて行った。ＥＣ細胞は通常、１００ｍｍディッシュあたり５〜８×１０５個の濃度で播種し、一日おきに全量培地交換と継代培養を繰り返した。継代培養では、細胞をＨＣＭＦバッファ（ｐＨ７．４、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１３６．９ｍＭ ＮａＣｌ、０．３４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ３、１３．９ｍＭグルコース、５．３７ｍＭ  ＫＣｌ）にて１回洗浄後、最終濃度０．０２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ・２Ｎａ（ＧＩＢＣＯ社製）を溶解した酵素溶液を５ｍｌ添加し、３７℃にて１分間酵素処理を行った。その後、等量の１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭを加えて細胞を分散させた後、遠心分離によって沈殿回収した細胞を再度懸濁し、新たな培養ディッシュへ播種し、継代培養した。
【００７３】
２．ＥＣ細胞の分化誘導及び細胞の回収
トリプシン処理により回収したＥＣ細胞を、終濃度０．５〜５容量％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ＳＩＧＭＡ社製）を添加した１０容量％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭで懸濁し、１．０×１０６個／１００ｍｍディッシュの濃度で播種した。５％ＣＯ２濃度条件下で３７℃にて培養し、１４時間後、ＨＣＭＦバッファにて細胞を１回洗浄し、培養液を１０容量％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭに培地交換した。
【００７４】
ＤＭＳＯで処理したＥＣ細胞は、３日ごとに培養液の半量を１０容量％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭに交換を行いながら培養を６日間（５容量％ＤＭＳＯのみ１９日間）継続し、適宜観察を行った。未分化細胞を含む細胞集団が増殖した時点で、ＨＣＭＦバッファにて１回洗浄後、３ｍＭ ＥＤＴＡ、並びに０．５％ＢＳＡを含むＣａ２＋、Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ（−）（ＥＤＴＡ／ＢＳＡ−ＰＢＳ）を添加して細胞を分散し、遠心操作により細胞を沈殿として回収した。細胞を再びＥＤＴＡ／ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁し、ＦＩＴＣ標識した抗ＣＤ４４抗体（ＣＤ４４−ＦＩＴＣ：BD Pharmingen社製）及びＰＥ標識した抗ＣＤ２９抗体（ＣＤ２９−ＰＥ：BD Pharmingen社製）により二重染色を行い、ＣＤ４４陽性かつＣＤ２９陽性の細胞フラクションを、セルソーター、Epics ALTRA（Beckman Coulter社製）を用いて分離取得することで、未分化ＥＣ細胞が除去されたＤＭＳＯ処理により分化誘導したＥＣ細胞フラクションを得た（図２参照）。この細胞をＤＭＳＯ−ＥＣ細胞と名付けた。
また、各ＤＭＳＯ濃度で処理した場合のＤＭＳＯ−ＥＣ細胞の割合について、表１に示す。表１に示されるように、ＤＭＳＯ処理濃度に依存して、ＣＤ４４陽性かつＣＤ２９陽性の細胞は増加することが判明した。なお、５容量％ＤＭＳＯで処理したＥＣ細胞は、ほとんどの細胞が処理直後に死滅するため、処理後の培養日数が他の処理濃度より長く必要になる一方で、培養後に得られたＣＤ４４陽性かつＣＤ２９陽性の細胞は高い割合であることが明らかになった。
以後の実験には、５容量％のＤＭＳＯを用いて得られた細胞を用いた。
【００７５】
【表１】
2008200033.tif 000002
【００７６】
ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞のクローン化
ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞のクローン化には、クローニングリングによるコロニーの分離、あるいは限界希釈法によって行った。
クローニングリングによる細胞の取得では、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞を培養ディッシュに低濃度（約１００個）で播種し、増殖によってできたコロニーの細胞数が１０個以上になったところで、滅菌済みのシリコングリースをクローニングリングの一端に塗り、培地を取り除いたディッシュ底面に、細胞のコロニーを囲うようにして貼り付けた。その後、クローニングリング内でトリプシン処理を行い、細胞を回収して、増殖した細胞から順次、培養のスケールアップを行ない、クローンを取得した。
限界希釈法によるクローンの取得は、上記方法により取得したＤＭＳＯ−ＥＣ細胞をＨＣＭＦバッファにて１回洗浄後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収された細胞数を計測し、１細胞／２００μｌ／ウエル（説明）になるように９６ウエル培養プレートに播種した。３〜５日後に単一のコロニーであることを確認した。その後５日ごとに、半量の培地交換を行いながら培養を継続し、増殖した細胞から順次、培養のスケールアップを行ない、クローンを取得した。
これにより、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞由来のクローン１（ＤＭＳＯ−ＥＣクローン１：Clone #1）及びクローン２（ＤＭＳＯ−ＥＣクローン２：Clone #2）を得た。
【００７７】
［実施例２］
ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞の性状
（１）位相差顕微鏡像
上記で得られたクローン１及び２の形態と、ＥＣ細胞、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞、並びにＥＣ細胞由来軟骨系前駆細胞であるＡＴＤＣ５細胞（理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室より入手）の形態をそれぞれ位相差顕微鏡で観察した。
この結果、ＥＣ細胞は、コロニー内の細胞が小さく、高い密度で増殖するほか、コロニー周辺が盛り上がっており、典型的な全能性幹細胞様の形態であることが観察された。これに対して、ＤＭＳＯ−ＥＣやＤＭＳＯ−ＥＣクローン１及び２、ＡＴＤＣ５細胞はいずれも、コロニーを構成するひとつずつの細胞の面積が大きく、付着性細胞としての特徴である単一層を形成しており、特徴的なＥＣ細胞の形態と明らかに異なる形態を示した。このような付着性の細胞形態は、ＥＣ細胞よりは間葉系細胞に類似している。
【００７８】
（２）各種遺伝子発現
ＥＣ細胞、ＤＭＳＯ−ＥＣ、ＤＭＳＯ−ＥＣクローン１及び２、ＡＴＤＣ５細胞における各種遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により解析し、各種マーカー遺伝子の発現を検討した。
ＥＣ細胞、並びにＤＭＳＯ−ＥＣ、ＤＭＳＯ−ＥＣクローン１及び２、ＡＴＤＣ５細胞からの全ＲＮＡの抽出は、TRIzol Reagent（Invitrogen社製）を用いて行なった。解析する細胞の培養液を除去し、１００ｍｍの培養ディッシュに直接２ｍｌのTRIzol Reagentを滴下し、Cell Scraper（Falcon社製）で充分混合した後、エッペンチューブに回収し、ポリトロンホモゲナイザー（ポリトロン社製）でホモジナイズを行った。その後のＲＮＡ抽出までの操作は、添付の使用説明書に従った。細胞・組織から抽出された全ＲＮＡは、ＤＥＰＣ処理水に溶解し、分光光度計にて濃度算定を行った後、−３０℃に保存した。
【００７９】
細胞から抽出した全ＲＮＡを鋳型として、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）解析のためテンプレートとなるｃＤＮＡの合成を行った。ｃＤＮＡ合成は、ReverTra Ace（TOYOBO）を用いて行い、操作は添付された使用説明書に従って行った。
ＰＣＲ及び解析は、ABI PRISM 7000（Applied Biosystems社製）を使用して行った。ポリメラーゼはSYBR Premix Ex Taq（TAKARA社製）を使用し、内在性コントロールはβ−アクチンを用いた。ＲＴ−ＰＣＲ専用９６ウエルプレートに１サンプルあたり、SYBR Premix Ex Taq （TAKARA社製）を１３μｌ、２０倍に希釈したｃＤＮＡ反応溶液を２μｌ、１μＭの濃度のプライマーをそれぞれ５μｌ、滅菌水を５μｌ添加し、最終容量２５μｌの反応系を調製し、ＰＣＲ反応を常法に従って行なった。また、それぞれの遺伝子についてコントロールの反応を行って検量線を作成し、それぞれの定量化を行った。解析に使用したプライマーの配列を表２及び表３に示した。
遺伝子発現は、それぞれの細胞におけるβ−アクチンの発現量により標準化し、β−アクチン発現量を一定にした場合の相対的な発現量で比較した。結果を表４に示す。
【００８０】
【表２】
2008200033.tif 000003
【００８１】
【表３】
2008200033.tif 000004
【００８２】
【表４】
2008200033.tif 000005
【００８３】
表４に示されるように、未分化幹細胞マーカー遺伝子であるＯｃｔ３／４とＮａｎｏｇの発現は、ＥＣ細胞でのみ検出され、ＤＭＳＯで処理して得られたＥＣ細胞やそのクローン細胞、ＡＴＤＣ５細胞では認められなかった。神経堤細胞のマーカー遺伝子であるＳｌｕｇ、Ｐａｘ３、Ｗｎｔ１の発現は、ＥＣ細胞では認められず、ＳｌｕｇはＥＣ細胞以外の細胞群の全てで認められ、Ｐａｘ３とＷｎｔ１は、発現量の差異はあるものの、ＥＣ細胞とＡＴＤＣ５細胞以外のＤＭＳＯ−ＥＣ細胞群で認められた。
【００８４】
このことから、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞とそのクローン化細胞は、ＤＭＳＯの添加によって未分化幹細胞から神経堤細胞へと分化誘導された細胞であることが示唆され、遺伝子発現の特性から、Ｏｃｔ３／４陰性、Ｎａｎｏｇ陰性、Ｓｌｕｇ陽性、Ｐａｘ３陽性、Ｗｎｔ１陽性の細胞であることが判明した。
一方、歯の間葉細胞のマーカー群では、ＥＣ細胞ではＭｓｘ１とＢＭＰ−７が発現しているほかはいずれの遺伝子も発現していないのに対して、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞、並びにそのクローン化細胞では、Ｍｓｘ１、Ｐａｘ９、Ｗｎｔ５ａ、Ｌｈｘ８が特異的に高発現していた。ＢＭＰ４、Ｒｕｎｘ２、Ｄｌｘ１は、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞、並びにそのクローン化細胞とＡＴＤＣ５細胞で、発現量に多少の差異はあるものの発現が認められた。
また軟骨細胞における特異的なマーカー遺伝子であるＳｏｘ９、Ｓｏｘ５の発現は、ＡＴＤＣ５細胞でのみ高発現しており、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞とそのクローン化細胞は軟骨系への分化をしていない細胞であると判断された。
従って、ＤＭＳＯによって、ＥＣ細胞が神経堤細胞様ないしは間葉系細胞様の細胞へ分化誘導されたことは明らかであった。
【００８５】
［実施例３］
ＥＣ細胞から分化誘導した細胞の歯形成能の評価
次に、本発明によって得られたＤＭＳＯ−ＥＣ細胞、そのクローン化細胞の象牙芽細胞への分化能、並びに歯の象牙質形成能を、以下のように行って、確認した。
【００８６】
（１）歯胚上皮組織の調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＳＬＣより購入）の胎齢１４．５日、胚仔から下顎切歯歯胚組織を顕微鏡下で常法により摘出した。摘出した下顎切歯歯胚組織をＰＢＳ（−）で洗浄し、ＰＢＳ（−）に最終濃度１．２Ｕ／ｍｌのディスパーゼ II (Roche, Mannheim, Germany)を添加した酵素液で室温にて１２．５分間処理した後、１０％ＦＣＳ（JRH Biosciences, Lenexa, KS)を添加したＤＭＥＭ（Sigma, St. Louis, MO)で３回洗浄した。さらにＤＮａｓｅＩ溶液 (Takara, Siga, Japan)を最終濃度７０Ｕ／ｍｌになるよう添加し歯胚組織を分散させ、２５Ｇ注射針 (Terumo, Tokyo, Japan)を用いて外科的に歯胚上皮組織を分離した。
【００８７】
（２）再構成歯胚の作製
再構成歯胚の作製には、上記で調製された歯胚上皮組織と、間葉系細胞として、ＥＣ細胞、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞、ＤＭＳＯ−ＥＣクローン１及び２のいずれかの評価対象細胞とを用いた。
歯胚再構築に使用する評価対象細胞群を、それぞれトリプシン処理によりディッシュから回収した。シリコングリースを塗布した１．５ｍｌマイクロチューブ（Eppendorf, Hamburg, Germany）に、１０％ＦＣＳ（ＪＲＨ）添加ＤＭＥＭ（Sigma）で懸濁した評価対象細胞を入れ、遠心分離（５８０×ｇ）により細胞を沈殿として回収した。遠心後の培養液の上清をできる限り除去し、再度遠心操作を行い、実体顕微鏡で観察しながら細胞の沈殿周囲に残存する培養液をGELoader Tip ０．５−２０μＬ（エッペンドルフ社製）を用いて完全に除去し、再構成歯胚作製に用いるそれぞれの評価対象細胞を準備した。
【００８８】
シリコングリースを塗布したペトリディッシュに２．４ｍｇ／ｍｌのCellmatrix type Ｉ−Ａ（新田ゼラチン社製）を３０μｌ滴下してコラーゲンゲルドロップを作製した。この溶液に、上記評価対象細胞を、０．１−１０μｌのピペットチップ（エッペンドルフ社製）を用いて、０．２μｌ〜ｌ０．３μｌアプライして、高密度の細胞集合体として細胞凝集体を作製した（細胞密度：２×１０８個／ｍｌ）。続いて、１０μｌのピペットチップを用いて、歯胚上皮組織或いは歯胚間葉組織を同じゲルドロップ内にアプライし、タングステン針を用いて、分離した歯胚由来上皮組織が本来、間葉組織と接触していた面を評価対象細胞の細胞凝集体に密着させた。その後、ゲルドロップを固化させることにより、歯胚組織と評価対象細胞間の結合をより強固にすることで、高密度再構成歯胚を作製した。
【００８９】
これを、図３を参照して説明する。
ピペットチップ１６で先にゲルドロップ１０（図３Ａ参照）内に配置された細胞凝集体１２は、ゲルドロップ１０内で球体を構成する（図３Ｂ参照）。この後に他方の細胞凝集体１４を押し込むことによって、球体の細胞凝集体１２がつぶされて、他方の細胞凝集体１４を包むようになることが多い（図３Ｃ参照）。その後にゲルドロップ１０を固化させることにより、細胞間の結合が強固になる（図３Ｄ参照）。
【００９０】
（３）再構成した歯胚の器官培養
ゲル中で作製した高密度再構成歯胚は、ＣＯ２インキュベーターに１０分間静置してCellmatrix type I-A (Nitta Gelatin)を固形化した。１０容量％ＦＣＳ（ＪＲＨ社製）、０．１ｍｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸（Sigma社製）、２ｍＭのＬ−グルタミン（GIBCO社製）添加したＤＭＥＭ（Sigma社製）に、セルカルチャーインサート（ポアサイズが０．４ミクロンのＰＥＴメンブレン；ＢＤ社製）が接するように培養容器を準備した。培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に、再構成歯胚を、支持担体である周囲のゲルと共に移して、器官培養した。
【００９１】
器官培養により歯の発生を解析する場合には、通常、１４日間の培養を行なった。器官培養した場合には、移植後１０〜３０日目に再構成歯胚を摘出し、４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で６時間固定した後、４．５％ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）を用いて２４時間の中性脱灰を行った。その後、常法によりパラフィン包埋して、１０μｍの切片を作製した。組織学的解析のためには常法に従い、ヘマトキシリン−エオジン染色（ＨＥ染色）を行った。
【００９２】
器官培養による評価
１４．５日齢、下顎切歯歯胚上皮組織とＥＣ細胞の高密度再構成歯胚では、ＥＣ細胞の異常増殖により再構成歯胚は肥大化し、ＨＥ染色においても歯の間葉細胞に由来する象牙芽細胞や象牙質は観察されなかった。
これに対し、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞、ＤＭＳＯ−ＥＣクローン１及び２では、上皮組織との相互作用が誘導され、位相差顕微鏡像においても歯胚の器官培養と同様に組織誘導が観察された。またさらに、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞、ＤＭＳＯ−ＥＣクローン１及び２ではいずれも、外側にエナメル質、内側に象牙質を有する再構成歯胚を形成できることがＨＥ染色像から確認でき、歯に特有の組織構造が形成可能であることが示された。
これらのことから、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞、ＤＭＳＯ−ＥＣクローン１及び２は、歯胚上皮細胞との相互作用によって、歯の間葉組織である象牙芽細胞へ分化し、歯に特有の象牙質を産生できることは明らかであった。また高密度再構成歯胚法によって、器官培養においても、外側にエナメル質、内側に象牙質、内部に歯髄細胞、歯の先端と歯根を有する歯に特有の組織構造を有する歯を形成できることが明らかであった。
【００９３】
［実施例４］
腎皮膜下移植方法
次に、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞、ＤＭＳＯ−ＥＣクローン１及び２の細胞と１４．５日齢胎児下顎切歯歯胚上皮細胞とから、高密度再構成歯胚を作製し、得られた再構成歯胚をＣ５７ＢＬ６マウス（日本クレア社から入手）腎皮膜下に移植して、歯形成能を評価した。
実施例３と同様にして作製した再構成歯胚を、４８時間から９６時間、器官培養を行った後、周囲のゲルごと８週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（チャールズリバー社から入手）の腎皮膜下に移植して異所的な歯の発生を進行させ、解析を行った。
腎皮膜下に移植した場合には、移植後１０〜３０日目に周囲の腎組織ごと再構成歯胚を摘出した。摘出組織を、４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で６時間固定した後、４．５％ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）を用いて２４時間の中性脱灰を行った。その後、常法によりパラフィン包埋して、１０μｍの切片を作製した。組織学的解析のためには常法に従い、ＨＥ染色を行った。
【００９４】
（１）腎皮膜下移植による評価
腎皮膜下移植では、１４．５日齢胎児切歯歯胚を移植した場合には、内側に象牙質及び外側にエナメル質を有する特徴的な構造の歯を１６日の期間で腎皮膜下移植により発生させることができた（図４参照）。１４．５日齢胎児切歯歯胚に由来する歯胚上皮組織と歯胚間葉細胞（図４Ａ参照）、歯胚上皮組織とＤＭＳＯ−ＥＣ細胞（図４Ｂ参照）、歯胚上皮組織とＤＭＳＯ−ＥＣクローン（クローン＃１、図４Ｃ参照）による再構成歯胚では、腎皮膜下移植によって移植後１４日目には、正常歯胚をそのまま腎皮膜下へ移植した場合と同様に、外側のエナメル芽細胞、エナメル質、その内側に象牙質、象牙芽細胞が容易に認められた。できた歯は、先端と歯根を有しており、正常発生の歯と同様の構造を有していた。
歯形成の頻度は、ＥＣ細胞及びＡＴＤＣ細胞が０％であるのに対して、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞では５１．３±８．８％、ＤＭＳＯ−ＥＣクローン１では２３．３％±１６．７％、クローン２では３３．３％±４７．１％であった。
【００９５】
これらのことから、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞、ＤＭＳＯ−ＥＣクローン１及び２は、歯の間葉由来組織である象牙芽細胞へと分化し、歯の硬組織である象牙質を産生することが可能であることが明らかになった。さらに高密度再構成歯胚法によって、腎皮膜下移植においても、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞、ＤＭＳＯ−ＥＣクローン１及び２によって特有の組織構造を有する歯を形成できることが明らかになった。
【００９６】
（２）In situハイブリダイゼーション
１４．５日齢胎児切歯歯胚に由来する歯胚上皮組織とＤＭＳＯ−ＥＣ細胞を腎皮膜下へ移植し、１４日後に摘出した組織について、In situハイブリダイゼーションにより、エナメル質の構成分子であるアメロジェニンと、象牙質の構成要素であるデンチンシアロホスホプロテイン（ＤＳＰＰ）のｍＲＮＡの発現、並びに歯根膜特異的な遺伝子であるペチロスタチンｍＲＮＡの発現を解析した。
【００９７】
腎皮膜下移植後１４日目の再構成歯胚を摘出し、４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で６時間固定した後、４．５％ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）を用いて２４時間の中性脱灰を行った。その後、１２．５％スクロース溶液、２５％スクロース溶液へと順次浸漬した後、OCT compound（SAKURA Finetechnica社製）に包埋した。包埋後はクリオスタット（Leica社製）で１０μｍの切片を作製した。
【００９８】
上記切片を、最終濃度２μｇ／ｍｌのプロテアーゼＫ（Nacalai tesque, kyoto, Japan）を含むＰＢＳ（−）で１０分間処理し、最終濃度４％パラホルムアルデヒド（Nacalai tesque）を含むＰＢＳ（−）で１０分間固定した。それぞれ最終濃度で１．３２５％トリエタノールアミン、０．０１７５ＮのＨＣｌ（Wako）、０．２５％無水酢酸を含むジエチルピロカーボネート処理（ＤＥＰＣ）水で１０分間処理した後、ＰＢＳ（−）で５分間、３回洗浄した。１．５％ (v/v) トリエタノールアミン(Nacalai tesque)、０．３３ＮのＨＣｌ（Wako）、０．２５％（v/v）の無水酢酸（Nacalai tesque) in ＤＥＰＣ水で１０分間処理した後、２×ＳＳＣで１０分間、２回洗浄した。歯根膜特異的遺伝子であるペリオスチン (Genbank accession no. NM_015784) プローブは、センスプライマー (-7; ggctgaagatggttcctctc：配列番号３５)とアンチセンスプライマー (573; gtacattgaaggaataacca：配列番号３６)を用いてＰＣＲにより取得したｃＤＮＡ断片を、ＤＩＧ標識して用いた。
【００９９】
定法に従ってin situ ハイブリダイゼーションを行い、抗ＤＩＧ−アルカリホルファターゼ（ＡＰ）Ｆａｂフラグメント（Roche）とＮＢＴ／ＢＣＩＰStock Solution（Roche）で発色させ、Axio Imager A.1 (Zeiss)とAxioCam MRc5 (Zeiss)で解析を行なった。
その結果から、ＨＥ染色像におけるエナメル芽細胞ではアメロジェニンｍＲＮＡの発現が、象牙芽細胞ではＤＳＰＰ ｍＲＮＡの発現がそれぞれ認められた。またペリオスタチンｍＲＮＡの発現が認められた。このことから硬組織形成に関与する分子のｍＲＮＡは、それぞれが適切にその産生細胞において明らかに発現していた。また歯根膜で発現するペリオスチンが検出されたことから歯周組織が形成されていることが示唆された。
【０１００】
［実施例５］
レチノイン酸による誘導
（１）ＣＤ４４陽性かつＣＤ２９陽性の細胞の取得のためのＥＣ細胞の分化誘導の方法
実施例１と同様にして、トリプシン処理にて回収されたＡＴ８０５細胞を１．０×１０６個／１００ｍｍディッシュの濃度で播種し、翌日、終濃度０〜１０．０μＭのレチノイン酸（ＲＡ）（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した１０容量％ＦＣＳ ＤＭＥＭに置換して刺激を加えた。培養７２時間後、ＨＣＭＦバッファにて２回洗浄を行い、全量１０容量％ＦＣＳ ＤＭＥＭで培地交換を行った。
【０１０１】
（２）ＲＡ処理後のＣＤ４４陽性かつＣＤ２９陽性の細胞の取得
３日毎に１０容量％ＦＣＳ ＤＭＥＭを用いて半量培地交換を行いながら培養を７日間継続し、適宜観察を行った。ＲＡ処理後増殖してきた、未分化細胞を含む細胞集団をＨＣＭＦにて１回洗浄後、３ｍＭのＥＤＴＡ−０．５％ ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃でインキュベートして回収した。回収後の細胞はＣＤ４４ ＦＩＴＣ（BD Pharmingen）及びＣＤ２９（BD Pharmingen）ＰＥにより二重染色を行い、ＣＤ４４陽性かつＣＤ２９陽性の細胞をEpics ALTRA（Beckman Coulter）を用いて分離取得することで、未分化細胞を除いた分化した細胞集団のみを得た。この細胞をＲＡ−ＥＣ細胞と名付けた。結果を図５に示す。
また、各ＲＡ濃度で処理した場合のＲＡ−ＥＣ細胞の割合について表５に示す。表５に示されるようにＲＡ濃度に依存して、ＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞が変化することが判明した。
またＲＡ処理後のＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞について実施例２（２）と同様に遺伝子の発現について確認したところ、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞と同様に、Ｏｃｔ３／４陰性、Ｎａｎｏｇ陰性、Ｓｌｕｇ陽性、Ｐａｘ３陽性、Ｗｎｔ１陽性の細胞であることが判明した。
【０１０２】
【表５】
2008200033.tif 000006
【０１０３】
（３）ＲＡ処理後のＣＤ４４陽性かつＣＤ２９陽性の細胞による歯形成能の評価
上記のようにして得られたＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞（ＲＡ濃度２μＭ）を用いて、実施例３と同様にして歯胚再構築及び器官培養を行い、評価した。器官培養１４日後には、歯胚上皮細胞との相互作用によって、歯の間葉組織である象牙芽細胞へ分化した。また高密度再構成歯胚法によって、外側にエナメル質、内側に象牙質、内部に歯髄細胞を有する歯に特有の組織構造を有する歯が形成された（図６参照）。
またＲＡ処理後のＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞について実施例４（２）と同様にしてアメロジェニン及びＤＳＰＰ、ペルオスタチンの発現を確認したところ、ＤＭＳＯ−ＥＣと同様に各ｍＲＮＡの発現が認められた。このことから、硬組織、歯根膜を含む歯周組織が形成されていることが示唆された。
【０１０４】
［実施例６］
（１）ＣＤ４４陽性かつＣＤ１０６陽性の細胞の取得のためのＥＣ細胞の分化誘導の方法
実施例１と同様にしてトリプシン処理により回収したＡＴ８０５細胞を、１．０×１０６個／１００ｍｍディッシュの濃度で播種し、翌日、終濃度２μＭのＲＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した１０容量％ＦＣＳ ＤＭＥＭに置換して刺激を加えた。培養７２時間後、ＨＣＭＦバッファにて２回洗浄を行い、全量１０容量％ＦＣＳ ＤＭＥＭで培地交換を行った。翌日、ＨＣＭＦバッファにて２回洗浄を行い、死細胞を除去した後、さらに１０容量％ＦＣＳ ＤＭＥＭで培養を継続した。以降１日おきに培地交換を行い、７日間培養した。
【０１０５】
（２）ＣＤ４４陽性かつＣＤ１０６陽性の細胞の取得
上記処理により取得された未分化細胞を含む細胞集団はＨＣＭＦにて１回洗浄後、３ｍＭ ＥＤＴＡ−０．５％ ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃でインキュベートして回収した。回収後の細胞はＣＤ４４ ＦＩＴＣ（BD Pharmingen）及び抗ＣＤ１０６抗体（ＣＤ１０６（BD Pharmingen）ＰＥ）により二重染色を行い、ＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性フラクションをEpics ALTRA（Beckman Coulter）を用いて分離取得することで、未分化細胞を除いた分化した細胞集団のみを得た。結果を図７に示す。
【０１０６】
（３）ＲＡ処理後のＣＤ４４陽性かつＣＤ１０６陽性の細胞による歯形成能の評価
上記のようにして得られたＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞を用いて、実施例３と同様にして歯胚再構築及び器官培養を行い、評価した。器官培養１４日後には、歯胚上皮細胞との相互作用によって、歯の間葉組織である象牙芽細胞へ分化した。また高密度再構成歯胚法によって、外側にエナメル質、内側に象牙質内部に歯髄細胞を有する歯に特有の組織構造を有する歯が形成された。
またこれらのＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性のＤＭＳＯ−ＥＣ細胞について実施例２（２）と同様に遺伝子の発現について確認した。この結果、ＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞と同様に、Ｏｃｔ３／４陰性、Ｎａｎｏｇ陰性、Ｓｌｕｇ陽性、Ｐａｘ３陽性、Ｗｎｔ１陽性の細胞であることが示された。
更に、実施例４（２）と同様にしてアメロジェニン及びＤＳＰＰ、ペルオスタチンの発現を確認したところ、ＤＭＳＯ−ＥＣと同様に各ｍＲＮＡの発現が認められた。このことから、硬組織、歯根膜を含む歯周組織が形成されていることが示唆された。
【０１０７】
［実施例７］
実施例６（２）及び（３）と同様にして、ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞についてＣＤ４４ ＦＩＴＣ及びＣＤ１０６ ＰＥを用いて二重染色したところ、ＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞の存在が示された。これらのＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性のＤＭＳＯ−ＥＣ細胞について実施例２と同様に遺伝子の発現について確認したところ、ＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性ＤＭＳＯ−ＥＣ細胞と同様に、Ｏｃｔ３／４陰性、Ｎａｎｏｇ陰性、Ｓｌｕｇ陽性、Ｐａｘ３陽性、Ｗｎｔ１陽性の細胞であることが判明した。
ここで得られたＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞の細胞集団を用いて、実施例３及び実施例４（２）と同様に歯胚再構築、器官培養及びｍＲＮＡの発現を行い評価した。その結果、歯胚上皮細胞との相互作用による特有の組織構造を有する歯が形成された。また実施例４（２）と同様にしてアメロジェニン及びＤＳＰＰ、ペルオスタチンの発現が認められた。このことから、硬組織、歯根膜を含む歯周組織の形成が可能であることが示唆された。
【０１０８】
このように全能性幹細胞からＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞又はＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞を分化誘導することができ、これらの細胞を上皮系細胞と共に区画化して培養することにより、歯胚を再構成して、エナメル質及び象牙質を有する特有の構造を示す歯を提供することができた。
従って、本発明によれば、全能性幹細胞から歯形成用間葉系細胞を得ることができ、効率よく大量に歯を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】歯胚の形成を模式的に表した概念図である。
【図２Ａ】本発明の実施例１にかかるＥＣ細胞のＣＤ４４及びＣＤ２９の二重染色の様子を示す図である。
【図２Ｂ】本発明の実施例１にかかるＤＭＳＯ処理後６日目の細胞のＣＤ４４及びＣＤ２９の二重染色の様子を示す図である。
【図２Ｃ】本発明の実施例１にかかる、選別されたＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞のＣＤ４４及びＣＤ２９の二重染色の様子を示す図である。
【図３Ａ】本発明の実施例にかかる、歯胚由来間葉系細胞と上皮系細胞を用いた歯胚再構築の手順を概念的に示した図であり、細胞配置前のゲルパックの様子を示した図である。
【図３Ｂ】本発明の実施例にかかる、歯胚由来間葉系細胞と上皮系細胞を用いた歯胚再構築の手順を概念的に示した図であり、第一の細胞集合体をゲルパック内に配置した様子を示した図である。
【図３Ｃ】本発明の実施例にかかる、歯胚由来間葉系細胞と上皮系細胞を用いた歯胚再構築の手順を概念的に示した図であり、第二の細胞集合体をゲルパック内に配置した様子を示した図である。
【図３Ｄ】本発明の実施例にかかる、歯胚由来間葉系細胞と上皮系細胞を用いた歯胚再構築の手順を概念的に示した図であり、第一の細胞集合体及び第二の細胞集合体が配置されたゲルパックを固化した様子を示した図である。
【図４Ａ】本発明の実施例４にかかる歯胚上皮組織と歯胚間葉細胞から作製した歯胚のＨＥ染色像である（倍率：１００倍）。
【図４Ｂ】本発明の実施例４にかかる歯胚上皮組織とＤＭＳＯ−ＥＣ細胞から作製した歯胚のＨＥ染色像である（倍率：１００倍）。
【図４Ｃ】本発明の実施例４にかかる歯胚上皮組織とＤＭＳＯ−ＥＣクローン化細胞から作製した歯胚のＨＥ染色像である（倍率：１００倍）。
【図５Ａ】本発明の実施例５にかかるＥＣ細胞のＣＤ４４及びＣＤ２９の二重染色の様子を示す図である。
【図５Ｂ】本発明の実施例５にかかるＲＡ処理後７日目の細胞のＣＤ４４及びＣＤ２９の二重染色の様子を示す図である。
【図５Ｃ】本発明の実施例５にかかる、選別されたＣＤ４４陽性且つＣＤ２９陽性細胞のＣＤ４４及びＣＤ２９の二重染色の様子を示す図である。
【図６】本発明の実施例５においてＲＡ処理により得られたＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞と歯胚上皮組織とから作製した歯胚のＨＥ染色像である（倍率：２００倍、バーは５０μｍ）。
【図７Ａ】本発明の実施例６にかかるＥＣ細胞のＣＤ４４及びＣＤ１０６の二重染色の様子を示す図である。
【図７Ｂ】本発明の実施例６にかかるＲＡ処理後７日目の細胞のＣＤ４４及びＣＤ１０６の二重染色の様子を示す図である。
【図７Ｃ】本発明の実施例６にかかる選別されたＣＤ４４陽性且つＣＤ１０６陽性細胞のＣＤ４４及びＣＤ１０６の二重染色の様子を示す図である。
【符号の説明】
【０１１０】
１０      ゲルパック（支持担体）
１２      細胞凝集塊（第１の細胞集合体）
１４      細胞凝集塊（第２の細胞集合体）
１６      ピペットチップ
【図２Ａ】
2008200033.tif 000007
【図２Ｂ】
2008200033.tif 000008
【図２Ｃ】
2008200033.tif 000009
【図５Ａ】
2008200033.tif 000010
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2008200033.tif 000014
【図７Ｃ】
2008200033.tif 000015
【図１】
2008200033.tif 000016
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
2008200033.tif 000021
【図４Ｂ】
2008200033.tif 000022
【図４Ｃ】
2008200033.tif 000023
【図６】
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【配列表】
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