(57)【要約】  【課題】  高生産速度が期待できる高濃度での細胞の膜分離を長期間、持続的に安定に実現すること。  【解決手段】  変換させる物質を含んだ原液をバイオリアクターに導入し、ｐＨ調整を行いながら細胞浮遊液を用いて該物質を変換し、膜ユニットを用いてろ過し、非透過液をバイオリアクターに保持しつつ変換された物質を含んだ透過液を取り出す、メンブレンバイオリアクターの運転方法において、該膜ユニットの透過液側からｐＨ調整液を該バイオリアクターに供給する【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
変換させる物質を含んだ原液をバイオリアクターに導入し、ｐＨ調整を行いながら細胞浮遊液を用いて該物質を変換し、膜ユニットを用いてろ過し、非透過液をバイオリアクターに保持しつつ変換された物質を含んだ透過液を取り出す、メンブレンバイオリアクターの運転方法において、該膜ユニットの透過液側からｐＨ調整液を該バイオリアクターに供給する操作を行うことを特徴とするメンブレンバイオリアクターの運転方法。
【請求項２】
複数の膜ユニットを有し、少なくとも一つの膜ユニットを用いてろ過し、同時に少なくとも一つの膜ユニットの透過液側からｐＨ調整液をバイオリアクターに供給する請求項１記載のメンブレンバイオリアクターの運転方法。
【請求項３】
ｐＨ調整液をバイオリアクターに供給する膜ユニットを順次代える請求項２記載のメンブレンバイオリアクターの運転方法。
【請求項４】
ｐＨ調整液がアルカリ溶液である請求項１〜３記載のメンブレンバイオリアクターの運転方法。
【請求項５】
該変換された物質が有機酸である請求項１〜４のいずれかに記載のメンブレンバイオリアクターの運転方法。
【請求項６】
バイオリアクター部、変換させる物質を含んだ原液導入部、ｐＨ調整液供給部、膜ユニット部、透過液回収部を有したメンブレンバイオリアクター装置であって、膜ユニットの透過液側からｐＨ調整液をバイオリアクター部に供給する手段を具備することを特徴とするメンブレンバイオリアクター装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌や酵母、カビ、放線菌などの微生物や動物、昆虫などの細胞を用いた有価物の生産方法に関する。さらに詳しくは、これらの細胞をメンブレンバイオリアクターを用いて連続培養することにより高速かつ長期間にわたり有価物を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物や細胞の培養を伴う有価物質の生産方法である発酵法は、大きく（１）バッチ発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と（２）連続発酵法に分類することができる。（１）のバッチおよび流加発酵法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害のリスクが少ないというメリットがある。しかし、時間経過とともに培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性及び収率が低下してくる。このため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持するのが困難である。
【０００３】
一方、（２）の連続発酵法は、バイオリアクター内で阻害物質が高濃度に蓄積するのを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。例えば、Ｌ−グルタミン酸の連続培養法が開示されている（特許文献１）。しかし、これらの例では、培養液へ原料の連続的な供給を行うとともに、微生物や細胞を含んだ培養液をバイオリアクターから抜き出すため、培養液中の微生物や細胞が希釈されることから、生産効率の向上は限定されたものであった。
【０００４】
このことから、連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜でろ過し、膜透過液から生産物を回収すると同時にろ過された微生物や培養細胞を培養液に保持または還流させることで、培養液中の微生物や細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。例えば、乳酸菌（ビフィズス菌）を培養するに際し、培地の糖濃度を１〜１．５重量％に調整し、培養により培地中に生成した菌の阻害物質を培養槽に連通して配設したろ過膜を介して除去し、該阻害物質を除去した培養液を培養槽へ循環させると共に、上記ろ過膜を介して除去された部分に相当する液量の新鮮な培地を培養槽へ補給する方法が提案されている（特許文献２）。これらの方法において、分離膜には、一般に多孔性分離膜が用いられるが、該膜の目詰りによるろ過流量やろ過効率の低下が大きな問題となっており、このことが本方法の普及の大きな障害となっている。
【０００５】
ろ過流速低下抑制の対策としては、膜透過液を用いた逆洗、空気を用いた逆洗（特許文献３）、超音波処理等が報告されているが、これらの中では、膜透過液を用いた逆洗が良く利用されている。しかし、これら膜性能の物理的維持方法を用いても、微小な有機物等の吸着によるファウリングが進行し、膜性能が低下してしまうため（非特許文献１）、長時間にわたり連続使用し難いという課題があった。膜性能を回復させるためには、発酵を終了または中断して、膜を交換するか薬品による化学洗浄を行うことが必要となるが、物質生産を行いながら適用できないという問題があった。
【０００６】
なお、膜透過液量を稼ぐ方法としては、ろ過に使用する膜ユニットを増やす方法があるが、設備・運転コストが上昇するなどの問題が生じ、実用的とは言い難い。
【特許文献１】特開平１０−１５０９９６号公報
【特許文献２】特公平６−６９３６７号公報
【特許文献３】特開平６−９８７５８号公報
【非特許文献１】松本幹治監修、化学工学会・膜分離技術ワーキンググループ編、「ユーザーのための実用膜分離技術」、初版、日本国、日刊工業新聞社、１９９６年４月３０日、２５１ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、連続発酵法において、微生物や細胞を分離膜でろ過し、膜透過液から生産物を回収すると同時にろ過された微生物や細胞を培養液に還流させ、培養液中の微生物や細胞濃度を高い状態に維持して運転することで高い物質生産性を持続させることは、依然として困難であり、特に、これを長期間にわたり実施するのは極めて困難で、技術の革新が望まれていた。本発明の目的は、膜を用いた連続発酵法の上記課題を解決し、高生産速度が期待できる高濃度での細胞の膜分離を長期間、持続的に安定に実現することであり、生産速度の改善とバイオリアクターの稼働率向上の相乗効果により、生産性の大幅上昇を実現し、生産コストを低減することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明は以下の構成を有する。
【０００９】
変換させる物質を含んだ原液をバイオリアクターに導入し、ｐＨ調整を行いながら細胞浮遊液を用いて該物質を変換し、膜ユニットを用いてろ過し、非透過液をバイオリアクターに保持しつつ変換された物質を含んだ透過液を取り出す、メンブレンバイオリアクターの運転方法において、該膜ユニットの透過液側からｐＨ調整液を該バイオリアクターに供給する操作を行うことを特徴とする。また、複数の膜ユニットを有し、少なくとも一つの膜ユニットを用いてろ過し、同時に少なくとも一つの膜ユニットの透過液側からｐＨ調整液をバイオリアクターに供給しながら前記のメンブレンバイオリアクターの運転を行うことを特徴とする。
【００１０】
また、バイオリアクター部、変換させる物質を含んだ原液導入部、ｐＨ調整液供給部、膜ユニット部、透過液回収部を有したメンブレンバイオリアクター装置であって、膜ユニットの透過液側からｐＨ調整液をバイオリアクター部に供給する手段を具備することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明を適用することにより、膜を用いた連続発酵法において、膜間差圧、すなわち、膜の非透過液側と透過液側との圧力の差が上昇する前に生産を続けながら予防的に化学洗浄を行うことが可能となり、膜の透水性能を長期にわたり安定に発揮させることが可能となる。膜を用いた連続発酵法において、高濃度での細胞の膜分離を長期間、安定に実現することが可能となり、生産速度上昇とバイオリアクターの稼働率向上の相乗効果により、生産性の大幅な改善を実現し、生産コストを低減することが可能となる。また、ｐＨ調整液が膜の化学的洗浄とｐＨ調整の２つの用途に有効に利用でき、薬液費の低減につながる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の方法は、例えば、バクテリアや酵母、カビなどの微生物や動物細胞を用いた医薬品、化成品やそれらの原料、アミノ酸などの食品の生産などに適用することが可能である。また、特に、高効率で大規模にエネルギー物質やポリマー原料、化成品中間体などを生産する必要性が高い、再生可能な植物バイオマスを原料としたバイオリファイナリーにおける発酵プロセスにおいて、より好適に用いることができる。
【００１３】
本発明においては、例えば、図１に示す装置にて物質の変換により有価物の生産を行う。
【００１４】
図１に示す装置は、（１）微生物等の細胞を収容し発酵により有価物生産を行うバイオリアクター部と、（２）そのバイオリアクター部での発酵反応により生産された溶解性の有価物を細胞と固液分離するための膜分離部と、（３）膜分離部を介して、あるいは直接ｐＨ調整用の薬液をバイオリアクター部に供給するｐＨ調整部からなる
バイオリアクター部には、バイオリアクター１、原液１４を供給する原液供給ライン４、微生物の増殖や生育に酸素が必要な場合は酸素含有ガス供給ライン３、槽内の液を混合するための撹拌装置５、が備えられている。
【００１５】
膜分離部には、膜ユニット２Ａ、２Ｂ、レベルセンサー７、膜ろ過用ポンプ９、流路切り替え用のバルブ１０、透過液１６を回収するための透過液回収ライン８、が備えられている。バイオリアクターでの発酵反応により生産された溶解性の有価物を細胞と固液分離するために細胞浮遊液に浸漬した型式の２系列の膜ユニット２Ａ、２Ｂが設けられており、レベルセンサー７の指示を受けて作動する膜ろ過用ポンプ９が、２系列ある膜ユニットのいずれかを吸引することにより有価物を含んだ透過液１６が透過液回収ライン８を通して得られる。ここでは、膜ユニット２Ａを吸引して、有価物を含んだ透過液１６が得られるものとする。
【００１６】
ｐＨ調整部には、ｐＨ調整液貯槽１２、ｐＨセンサー６、ｐＨ調整液供給ポンプ１３、ｐＨ調整液供給ライン１５、流路切り替え用のバルブ１１が備えられている。ｐＨ調整は、ｐＨセンサー６の信号を受けて作動するｐＨ調整液供給ポンプ１３がｐＨ調整液をろ過に使用されていない方の膜ユニット２Ｂの透過液回収側からバイオリアクター部に供給することにより行われる。
【００１７】
透過液回収ライン８、ｐＨ調整液供給ライン１５の途中には、それぞれ複数ある膜ユニットのいずれか片方を使用するようにするための流路切り替え用のバルブ１０、１１が備えられ、流路切り替え用のバルブ１０，１１、タイマー１７により、膜ユニット２Ａを用いてろ過を行い膜ユニット２Ｂを通してｐＨ調整液を供給する工程と、膜ユニット２Ｂを用いてろ過を行い膜ユニット２Ａを通してｐＨ調整液を供給する工程とが交互に繰り返されるよう作動する。
【００１８】
ここで、本発明における膜ユニットとは、ろ過やｐＨ調整液供給の動作を同時に行う膜の単位のことを意味し、平膜エレメント、平膜エレメントが複数配置された平膜モジュール、中空糸膜モジュール、複数の中空糸膜モジュールやこれらの組み合わせなどを例示することができる。
【００１９】
透過液とは、細胞浮遊液を膜でろ過し得られる細胞を含まない液のことであり、非透過液とは、透過液を得る過程で同時に得られる細胞が濃縮された液のことである。
【００２０】
有機酸、アルコール、抗生物質、ホルモン、アミノ酸、ビタミン、抗体等の有価物の生産を目的とするメンブレンバイオリアクターの場合は、原液とは培地のことであり、変換とは発酵反応や好気発酵反応のことであり、変換させる物質とは、有価物やそれを生産する細胞を生産するのに必要な培地に含まれる成分のことであり、代表としてグルコースやアンモニウム塩を例示することができる。
【００２１】
また、細胞浮遊液とは、液を揺らすと細胞またはこの凝集体がけん濁する状態で浮遊する液のことであり、酵母培養液や遺伝子組換え大腸菌の培養液を例示することができる。
【００２２】
ｐＨ調整は、変換を行う過程で、細胞浮遊液のｐＨが上昇または下降することによって物質の変換速度が低下するのを回避する為にｐＨを所定の範囲に保つために、ｐＨが上昇した場合はｐＨが低下する作用を有する液を、ｐＨが下降した場合はｐＨが上昇する作用を有する液を必要量供給する操作のことである。具体的には、ｐＨセンサー、コントローラー、ポンプ、ｐＨ調整液等を用いて自動的に行う方法を例示できる。
【００２３】
特に、有機酸発酵等の物質の変換において細胞浮遊液のｐＨが下降する場合に、ｐＨ調整液としてアルカリ溶液を添加する場合に、本発明はより好適に用いることができる。これは、発酵生産において一般にみられる汚れはアルカリ溶液で除去できるものが多く、特にタンパク質などの有機性物質は高いｐＨによって徐々に加水分解され溶解性となるためである。ここで、アルカリ溶液はｐＨが上昇する作用を有する液のことであり、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液などが挙げられる。
【００２４】
膜の素材としては、酢酸セルロース、ポリアミド、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、硝酸セルロース、再生セルロース、ポリアクリルニトリル、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリエステルなどの有機系素材やセラミックなど無機系素材が挙げられるが、この中から、運転開始時の滅菌や殺菌条件、温度、ｐＨなどの培養条件、ｐＨ調整液として使用する薬液のｐＨの特性を考慮し、運転に際し、物理的強度、耐熱性、化学的耐久性の条件を満足するものを適宜選定し、使用すればよい。
【００２５】
膜の形状は限定されるものではなく、中空糸膜、平膜、管状膜など、適宜用いればよい。
細胞浮遊液を膜でろ過する方式も限定されるものではなく、細胞浮遊液をバイオリアクター外部に循環しその液に対して膜ろ過を施した後の非透過液をバイオリアクターに戻し透過水を生産水として得てもよいし、バイオリアクターの液面下に膜を浸漬配置して直接細胞浮遊液の膜ろ過を行い透過水を生産水として得てもよい。
【００２６】
バイオリアクターの液量管理の方法も特に限定されるものではなく、電極式や圧力式のレベルセンサーを用いた液面レベルの値や培地や透過液などのタンク液量を天秤で計測した値を元に、コントローラーによって、培地の供給や膜ろ過ユニットでのろ過、細胞浮遊液引き抜きの一つ以上を制御して実施する方法を挙げられる。
【００２７】
ｐＨ調整液の供給は、その全量を膜ユニットを通して行ってもよいし、一部を膜ユニット以外の別流路からおこなってもよい。特に膜ユニット素材の耐ｐＨ性と洗浄に効果的なｐＨを考慮して、適切なｐＨのｐＨ調整液を膜ユニットを通して供給し、残りのｐＨ調整液を別流路から供給することが好ましい。
【００２８】
メンブレンバイオリアクターの下流プロセスに供給される透過水である生産水へのｐＨ調整液混入を最小限にとどめるため、ｐＨ調整液供給手段として使用した膜ユニットを細胞分離用に使用する前に、一定量の透過水や滅菌水を透過液側から通液してラインや膜孔をリンスしてもよい。また、ｐＨ調整液と透過液との混入による不溶物の生成を膜の細孔内あるいは透過液側ラインにおいて回避する必要がある場合、細胞分離用に使用した膜ユニットをｐＨ調整液供給手段として使用する前に、滅菌水を透過液側から通液してラインや膜孔をリンスするか、無菌ガスでライン膜孔をブローするなど行う必要がある。
【００２９】
膜ユニット全体を一定期間ろ過に使用し、一定期間をｐＨ調整液供給用に使用しても良いが、複数の膜ユニットを設け、少なくとも一つの膜ユニットを用いてろ過し、同時に少なくとも一つの膜ユニットの透過液側からｐＨ調整液をバイオリアクターに供給する方が運転安定性の観点から好ましい。後者の場合、膜ユニット全体を何分割するかは２分割以上であれば特に限定されるものではないが、ろ過稼働中の膜の負担を軽減するために、分割数はある程度多くして、その中の半分以下の膜ユニットをｐＨ調整液供給部として使用することが好ましい。ｐＨ調整液供給部として使用する膜ユニットを順次代える操作は、煩雑になったりｐＨ調整液の生産水への混入が多くなりすぎない範囲で頻繁な方が好ましい。一方で、膜ユニット全体の分割数は無制限に多いと制御が煩雑になるため、２４サイクル以下が好ましい。
【００３０】
各膜ユニットが、ｐＨ調整液供給用に稼働する頻度は、膜ユニット全体としての性能安定維持の観点から、なるべく平等にする方が好ましい。ｐＨ調整液供給用に使用する時間や、次にｐＨ調整液供給用に使用するまでの間隔は、細胞浮遊液の性質や運転条件により異なるため、最適な条件は、小スケールの実験あるいは経験的に決定すればよい。例えば、１０個の膜ユニットのうち１個の膜ユニットをｐＨ調整液供給手段として、残りを細胞浮遊液のろ過手段として用い、ｐＨ調整液供給手段として使用する膜ユニットをｐＨ調整液供給に使用する時間を１２時間とし、ｐＨ調整液供給用に使用する膜ユニットを順次代えた場合、１ユニットあたり週に１．４回の頻度でｐＨ調整液供給用に使用され、適度な化学洗浄が施せる。
【００３１】
バイオリアクター、ｐＨセンサー、撹拌装置、ポンプなどは特に限定される物でなく、通常の発酵生産に使用可能なものから、物理的強度、化学的強度、無菌性等の条件を満たすものを適宜、選択し、用いればよい。
【実施例】
【００３２】
トルロプシス・グラブラータＮＬ２ａ株を用いてグルコースを原料にピルビン酸の好気的連続発酵を行った。ｐＨ調整液としては、６規定のＮａＯＨ溶液を使用し、ｐＨを約５．５に、温度を３０℃に維持した。培地およびｐＨ調整液によって供給される液の合計量の８割は膜ユニットを介してポンプで、残りは膜ユニットを介さないでポンプにより系外に排出した。膜ユニットは孔径０．４５μmのポリプロピレン製の平膜ユニットを使用し、ポンプによる吸引により細胞浮遊液をろ過した。また、透過液側のポンプに至る間のチューブを分岐してマノメーターをつくり、膜間差圧の変化を記録した。酵母の乾燥菌体濃度は遠心分離法により測定し、菌体ペレットは１０５℃で６時間以上乾燥させた後、秤量した。
【００３３】
その結果、運転５日経過し、乾燥菌体濃度が約３０ｇ/Ｌとなった時点で、膜間差圧（絶対値）の運転開始時からの変化が５ｋＰａ以上に急上昇し、膜が詰まった。
【００３４】
そこで、次に同様の装置を２系列運転し、片方（系列１）は１日１回２時間、チューブを手でつなぎ換え、ＮａＯＨ液を膜の透過液側から膜を通してバイオリアクターに供給した。ＮａＯＨ液供給はｐＨコントローラーの指示により作動するポンプを用いて断続的に実施した。この間、酵母浮遊液抜き出しポンプの流量を調節することによりバイオリアクター内の液量を一定に保った。もう片方の系（系列２）は、１日１回２時間、透過液を用いて膜を逆洗した。透過液の供給は、２又のコンセントを用いて、上記ＮａＯＨ液供給ポンプが作動するとき、同時に同じ流量（ポンプダイアル設定上）供給した。この間、酵母浮遊液抜き出しポンプの流量を調節することによりバイオリアクター内の液量を一定に保った。
【００３５】
その結果、系列２は約５日経過時点で膜間差圧（絶対値）の運転開始時からの変化が５ｋＰａ以上に急上昇し、その後、膜が詰まり運転継続困難となった。一方、系列１は約１７日間、膜間差圧（絶対値）の運転開始時からの変化は２ｋＰａを超えることなく推移し、安定運転可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明における装置の一例
【符号の説明】
【００３７】
１：バイオリアクター
２Ａ：膜ユニット
２Ｂ：膜ユニット
３：酸素含有ガス供給ライン
４：原液供給ライン
５：撹拌装置
６：ｐＨセンサー
７：レベルセンサー
８：透過液回収ライン
９：膜ろ過用ポンプ
１０：流路切り替え用のバルブ
１１：流路切り替え用のバルブ
１２：ｐＨ調整液貯槽
１３：ｐＨ調整液供給ポンプ
１４：原液
１５：ｐＨ調整液供給ライン
１６：透過液
１７：タイマー
【図１】
2008161071.tif 000002