(57)【要約】【課題】  染色体上の任意の部位において、染色体構造を最小化しつつ、減数分裂期相同組換えの活性化を誘導する迅速な染色体改変方法の提供を目的とする。【解決手段】  本発明は、選択マーカー遺伝子、該選択マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側近傍に減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ、及び、該選択マーカー遺伝子と該減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを染色体上に組み込むためのＤＮＡを有する汎用性の高い単一のＤＮＡ断片を提供し、該断片を用いた任意の染色体上における減数分裂期組換えを活性化する方法を提供するものである。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択マーカー遺伝子と、該選択マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側近傍に減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを有し、さらに、該選択マーカー遺伝子と該減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを染色体上に組み込むためのＤＮＡを有するＤＮＡ断片。
【請求項２】
前記減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ配列が、ＶＤＥエンドヌクレアーゼ認識配列である請求項１に記載のＤＮＡ断片。
【請求項３】
前記減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ配列が、ＧＡＬ２遺伝子プロモータ配列である請求項１に記載のＤＮＡ断片。
【請求項４】
選択マーカー遺伝子と、該選択マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側近傍に減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを有するＤＮＡ断片を含むベクター。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程からなる細胞中の相同組換えを活性化する方法。
（ａ）請求項１乃至３のいずれかに記載の前記ＤＮＡ断片を細胞へ導入し、該細胞の染色体上の目的の部位へ該ＤＮＡ断片を挿入する工程、
（ｂ）染色体中の該ＤＮＡ断片から前記選択マーカー及び前記減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ断片の１つが欠失した細胞株を選択する工程、
（ｃ）相同組換えに適した条件で該細胞株を培養する工程
【請求項６】
前記工程（ｃ）の前に、ＶＤＥエンドヌクレアーゼを前記細胞内で発現させる工程を、さらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｃ）の前に、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質を前記細胞内で発現させる工程を、さらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、動物細胞、植物細胞、真菌細胞からなるグループより選択されるものである請求項５乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記真菌細胞が酵母細胞である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵母細胞が、出芽酵母細胞である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記相同組換えが交叉型である請求項５乃至１０いずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相同組換えを活性化する方法に関する。より詳細には、真核細胞の染色体上の所望の位置において減数分裂期組換え活性化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物の減数分裂期相同組換えは、古くから作物や家畜の育種や交配による品種改良に利用されてきた。近年の研究から、真核生物の染色体には、減数分裂期の相同組換えが起きやすい活性(ホット）領域と、起きにくい不活性（コールド）領域が存在することが明らかになっている（非特許文献１及び２）。不活性領域に存在する遺伝子群は強く連鎖し、交配を通じて遺伝情報が再編成される頻度がきわめて低いため、この領域に存在する有用遺伝子群の交配による改良には時間がかかることが想定される。
この問題を打破する技術として、出芽酵母の減数分裂期組換えを開始するＤＮＡ切断酵素であるＳｐｏ１１にＧａｌ４転写因子を融合させたＧａｌ４ＢＤＳｐｏ１１を用い、出芽酵母染色体に存在するＧａｌ４結合部位で組換えを標的活性化する技術が開発されている（非特許文献３及び特許文献１）。この系では、本来ＤＮＡ配列に依存せずにＤＮＡを切断するＳｐｏ１１に、新たにＤＮＡ配列特異的結合性を付与することで、出芽酵母ゲノムに天然に存在するＧａｌ４結合部位での減数分裂期相同組換えの活性化を促すことが可能になる。また、Ｓｐｏ１１は真核生物に広く保存されており、同様の手法が他の生物種でも利用可能であると推測されている。しかるに、元来のゲノム配列における配置ではなく、他の任意の染色体部位に人工的に移植したＧａｌ４の認識配列で、実際に減数分裂期の相同組換え（特に減数分裂の特徴である交叉型組換え）が促進される証拠はこれまで得られていなかった。
【０００３】
また、出芽酵母ＶＤＥエンドヌクレアーゼが減数分裂期に部位特異的な遺伝子ホーミングを行うことが知られている（非特許文献４）。この因子の認識配列は３１塩基対と長いため切断部位は一群の出芽酵母株にのみ認められ、ヒトゲノム中においても切断可能な配列が存在しない。ＶＤＥの認識配列を任意の染色体部位へ移植すると、認識配列部位に高頻度でＤＮＡ切断が導入されることは発明者らによって報告されているが（非特許文献５）、実際に交叉型（減数分裂期のみ検出される）もしくは遺伝子変換型の相同組換えを促進する効果があるかについてはこれまで明らかにされていなかった。
上記とは別に、有糸分裂期において相同組換えを任意の染色体部位で活性化するために、相同組換えの開始に関わるＤＮＡ切断酵素の認識配列を染色体に導入することが行われる。例えば、部位特異的ＤＮＡ切断酵素であるＩ−ＳｃｅＩ（特許文献２、特許文献３及び非特許文献６）やＨＯエンドヌクレアーゼ（特許文献４及び非特許文献７）の認識配列を任意の染色体部位に導入することにより、酵母やヒトの細胞で染色体組換えを部位特異的に活性化することが可能になる。これらのＤＮＡ切断酵素の認識配列はＶＤＥまたはＧａｌ４ＢＤＳｐｏ１１のそれとは全く異なっており、特に減数分裂でなくても常時活性化を受ける酵素である。また、有糸分裂期の組換え反応過程は減数分裂期と異なる分子機構で行われることもあり、通常はもっぱら有糸分裂期の組換え促進に利用されている。したがって、これらの手法は減数分裂期の相同組換えを活性化する手段としては、積極的に利用されていなかった。
【０００４】
すなわち、減数分裂期組換え開始に関わるＤＮＡ切断酵素の認識配列を任意の染色体部位に移植し、その部位で減数分裂期相同組換えの頻度を上昇させて、染色体上の組換え頻度の分布を変更する手段は、これまでに獲得されていないし、また当該業者が自明かつ容易に解決策を入手できる段階でもない。
さらに、従来法にはこれらに加え別の問題点が指摘されている。従来、相同組換えを活性化するＤＮＡ配列を染色体に導入する際、選択マーカーの配列を含む比較的長い配列からなる構築物を組換えＤＮＡ技術によってその都度構築し、細胞内へ形質転換することが行われてきた。ところが、相同組換えの一種である減数分裂期相同組換えでは、比較的長い外来ＤＮＡが染色体に組み込まれると、挿入部位周辺のクロマチン構造に影響が生じ、結果的に意図しない制御不能な組換えが誘発されたり、その結果生じる組換え頻発部位（ホットスポット）が目的の標的部位における相同組換えと干渉したりする結果が報告されている（非特許文献８）。さらに、染色体への標的部位導入により、意図しない遺伝子の活性化や不活化が生じる可能性も存在する。したがって、組換えを活性化する配列を導入する際には、導入部位に最小限の長さの配列を導入し、クロマチン構造や組換えへの影響を最小化する必要がある。
また、多数の標的部位に認識配列を挿入するためには、その都度標的部位のＤＮＡ配列のクローニングと組換えベクターの構築を新たに実施する必要があり、数週間に及ぶ複数の組換えＤＮＡ操作など多くの手間がかかる。加えて、従来法では選択マーカーが染色体に残留するため、再度同じ選択マーカーが使用できない上、選択マーカー配列による組換えへの影響が排除できない問題が存在していた。
以上の状況から、上記全ての問題点を同時に解決する手法が必要とされている。
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｕｄａｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：５２１３−５２１８（１９９７）
【非特許文献２】Ｐｅｔｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２：３６０−３６９（２００１）
【非特許文献３】Ｐｅｃｉｎａら，Ｃｅｌｌ  １１１：１７３−１８４（２００２）
【非特許文献４】Ｇｉｍｂｌｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：３０１−３０６（１９９２）
【非特許文献５】Ｆｕｋｕｄａら，Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｃｅｌｌ  ５：９８１−９９０（２００６）
【非特許文献６】Ｊａｃｑｕｉｅｒ及びＤｕｊｏｎ，Ｃｅｌｌ  ４１：３８３−３９４（１９８５）
【非特許文献７】Ｒｕｄｉｎら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８：３９１８−３９２８（１９８８）
【非特許文献８】Ｂｏｒｄｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９：４８３２−４８４２（１９９９）
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／００３３４９４号明細書
【特許文献２】米国特許第６，６１０，５４５号明細書
【特許文献３】特開２００６−２０６４０号公報
【特許文献４】米国特許第６，０３７，１６２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、上記事情に鑑み、染色体構造への影響を最小化しつつ、効率的に染色体上における減数分裂期相同組換え頻度の分布状態を制御する方法について鋭意研究を行った結果、減数分裂期組換えを活性化する配列を適当な選択マーカーの両側に配置させた単一種類のＤＮＡ断片を用いることで、任意の染色体部位に効率的に組換え活性化配列を挿入し、挿入部位の染色体構造への影響を最小化しつつ、減数分裂期相同組換えを活性化し得ることを明らかにし、本発明を完成させるに至った。
よって、本発明は、染色体上の任意の部位において、染色体構造を最小化しつつ、減数分裂期相同組換えの活性化を誘導する方法、及び該方法を実施するためのツールの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従来技術では、相同組換え活性化配列の導入時に、選択マーカーやプラスミドＤＮＡなどの余分な外来ＤＮＡが混入し、これが染色体に挿入されることで挿入部位のクロマチン構造・染色体構造に影響が生じる。これにより、挿入部位周辺の遺伝子発現や、相同組換え頻度に意図しない悪影響が生じることが報告されていた（Ｏｈｔａら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７：２１７５−２１８０，１９９９；Ｗｕら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４０：５５−６６，１９９５）。この点については、例えば、選択マーカーを挟む形で組換え活性化配列を配置したプラスミド構築物から、ＰＣＲ法等により選択マーカー及び組換え活性化配列のみから成るＤＮＡ断片を作製し、該ＤＮＡ断片を目的の細胞に導入することによって、克服することが可能である。つまり、細胞に導入したＤＮＡ断片のうち、選択マーカー配列は、両側に存在する組換え活性化配列の作用により、細胞内ポップアウト型相同組換えによって削除される。その結果、組換え活性化配列のみが染色体の任意箇所に導入されることになるため、染色体構造への影響を最小化することが可能となる。
【０００８】
一般的に従来技術では、相同組換えを誘発するＤＮＡ配列を染色体に導入する際、選択マーカーや標的染色体部位の配列を含む比較的長い配列をその都度構築する必要があった。この過程には、組換えＤＮＡ技術を用いた煩雑な操作が含まれるため、多くの標的部位に対する染色体導入ベクターの構築には多大な労力が必要とされていた。
本発明では、一度組換え活性化配列を含むプラスミド構築物を作製すれば、その後ＰＣＲプライマー配列合成時に標的部位の配列（出芽酵母では最低限４５塩基以上）を含ませることで、染色体導入ベクターが数時間程度の短期間のうちにＰＣＲ法で合成でき、数週間にわたる手間のかかる組換えＤＮＡ操作を省くことが可能になる。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「選択マーカー遺伝子と、該選択マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側近傍に減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを有し、さらに、該選択マーカー遺伝子と該減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを染色体上に組み込むためのＤＮＡを有するＤＮＡ断片」である。
（２）本発明の第２の態様は、「前記減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ配列が、ＶＤＥエンドヌクレアーゼ認識配列である上記（１）に記載のＤＮＡ断片」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ配列が、ＧＡＬ２遺伝子プロモータ配列である上記（１）に記載のＤＮＡ断片」である。
（４）本発明の第４の態様は、「選択マーカー遺伝子と、該選択マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側近傍に減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを有するＤＮＡ断片を含むベクター」である。
（５）本発明の第５の態様は、「以下の（ａ）〜（ｃ）の工程からなる細胞中の相同組換えを活性化する方法。
（ａ）上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の前記ＤＮＡ断片を細胞へ導入し、該細胞の染色体上の目的の部位へ該ＤＮＡ断片を挿入する工程、
（ｂ）染色体中の該ＤＮＡ断片から前記選択マーカー及び前記減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ断片の１つが欠失した細胞株を選択する工程、
（ｃ）相同組換えに適した条件で該細胞株を培養する工程」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記工程（ｃ）の前に、ＶＤＥエンドヌクレアーゼを前記細胞内で発現させる工程を、さらに含む上記（５）に記載の方法」である。  
（７）本発明の第７の態様は、「前記工程（ｃ）の前に、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質を前記細胞内で発現させる工程を、さらに含む上記（５）に記載の方法」である。
（８）本発明の第８の態様は、「前記細胞が、動物細胞、植物細胞、真菌細胞からなるグループより選択されるものである上記（５）乃至（７）のいずれかに記載の方法」である。
（９）本発明の第９の態様は、「前記真菌細胞が酵母細胞である上記（８）に記載の方法」である。
（１０）本発明の第１０の態様は、「前記酵母細胞が、出芽酵母細胞である上記（９）に記載の方法」である。
（１１）本発明の第１１の態様は、「前記相同組換えが交叉型である上記（５）乃至（１０）のいずれかに記載の方法」である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、染色体上の目的の位置における減数分裂期相同組換えを活性化する場合に、該染色体の構造に悪影響を及ぼすことなく、活性化することができる。
【００１１】
本発明の方法によれば、単一の汎用性の高いベクターを用いて、任意の染色体上の目的の位置において減数分裂期相同組換えを活性化する配列を挿入ために必要な期間を通常の４?５週間から２週間以内に短縮できる。
【００１２】
また、本発明の方法によれば、遺伝子交換型相同組換えのみならず、減数分裂期組換えの特徴である交叉型相同組換えをも活性化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の実施形態の一つである「選択マーカー遺伝子と、該選択マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側近傍に減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを有し、さらに、該選択マーカー遺伝子と該減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを染色体上に組み込むためのＤＮＡを有するＤＮＡ断片」は、真核細胞の染色体上の所望の位置における減数分裂期相同組換えを活性化させる上で極めて有効なものである。
【００１４】
ここで、「減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ」とは、減数分裂期ＤＮＡ二重鎖切断を誘発する因子が認識する配列からなるＤＮＡのことである。減数分裂期ＤＮＡ二重鎖切断を誘発する因子は、天然に存在するもの（例えば、ＶＤＥエンドヌクレアーゼなど）だけではなく、人工的な融合タンパク質（例えば、Ｇａｌ４−Ｓｐｏ１１など）も含まれる。「減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ」としては、限定はしないが、例えば、ＶＤＥ認識配列、ＧＡＬ４−ＵＡＳ配列を含むＤＮＡを挙げることができ、ＶＤＥ認識配列が好ましい。本発明で使用可能なＶＤＥ認識配列は、配列番号１（５’−ＣＴＡＴＧＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＡＡＴＧＡＡＡ−３’）を含む配列であり、また、ＧＡＬ４−ＵＡＳ配列は、配列番号２（５’−ＣＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＣＧ−３’）を少なくとも１つ含む配列である。ここで、配列番号２中のＮは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれであってもよい。
また、「減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ」は、「選択マーカー遺伝子」５’上流及び３’下流側近傍に同方向になるように配置し、「選択マーカー遺伝子」との距離は、「減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ」同士で相同組換えが生じ得る距離であればよく、通常、数１０ベース程度が望ましい。このような構成にすることで、目的細胞内におけるポップアウト型相同組換え機構により、「減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ」のいずれか１つと「選択マーカー遺伝子」が染色体上から除去される（図１参照）。その結果、目的の染色体の位置には、１つの「減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ」のみが導入されることになるため、導入位置における染色体構造への影響を最小化することができる。
「減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ」は、本実施形態のＤＮＡ断片上に２つ必要となるが、各「減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ」が減数分裂期ＤＮＡ二重鎖切断を誘発する因子によって認識され、その近傍でＤＮＡの二重鎖切断が生じ、各「減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ」同士の間で相同組換えが生じ得るものであれば、２つのＤＮＡの配列は完全に同一でなくてもよい。
【００１５】
「選択マーカー遺伝子」とは、「減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ」が染色体上の所望の位置に導入されたことを確認することができるものであれば、如何なるものでも使用することができる。「選択マーカー遺伝子」としては、好ましくは、該マーカー遺伝子が目的の染色体上に存在すること、及び、目的の染色体上に存在しないことのいずれの場合も、確認できるものがよい。例えば、ＵＲＡ３遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子などが好適に利用可能である。
【００１６】
「選択マーカー遺伝子と該減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを染色体上に組み込むためのＤＮＡ」とは、選択マーカー遺伝子及び組換えを活性化するＤＮＡからなるＤＮＡ断片を、目的細胞中の染色体上の所望の位置に相同組換え等によって、組込むために必要なＤＮＡのことで、組込む染色体領域の一部と相同性のあるＤＮＡのことである（後述の実施例中に記載の「標的配列」のこと）。このＤＮＡは、通常、選択マーカー遺伝子及び組換えを活性化するＤＮＡからなる配列領域の５’及び３’両側に配置される。このＤＮＡの長さとしては、目的の細胞の種類に応じて、数１０ベース〜数キロベースが必要となる。一般に、出芽酵母などでは、約４０ベース程度以上の長さがあれば十分であるが、哺乳類細胞など、高等真核生物細胞になる程、必要な長さが長くなる。このＤＮＡは、あらかじめ化学合成させた後、選択マーカー遺伝子及び組換えを活性化するＤＮＡからなるＤＮＡ断片の両側にＤＮＡリガーゼなどの酵素を用いた方法などによっても作製することができるが、後述するように、本発明に係るベクターからＰＣＲ法によって構築する方が簡便である。
【００１７】
本発明の他の実施形態である、「選択マーカー遺伝子と、該選択マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側近傍に減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを有するＤＮＡ断片を含むベクター」は、前述の「選択マーカー遺伝子と、該選択マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側近傍に減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを有し、さらに、該選択マーカー遺伝子と該減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを染色体上に組み込むためのＤＮＡを有するＤＮＡ断片」を容易に作製するための有効なツールとなる。本ベクターは、当該技術分野の通常の技術に基づいて、「選択マーカー遺伝子」と減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ」を既知のベクター上に構築することで作製することができる。ここで、用いられる既知のベクターは、如何なるものであっても良いが、例えば、大腸菌を用いて増幅可能な、ｐＢｌｕｅｓｃｒｐｔ系プラスミド、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドなどが好適に利用可能である。
【００１８】
本ベクターを鋳型にしてＰＣＲ法などにより、「選択マーカー遺伝子と、該選択マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側近傍に減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを有し、さらに、該選択マーカー遺伝子と該減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを染色体上に組み込むためのＤＮＡを有するＤＮＡ断片」を調製することができる。例えば、本ベクター上に構築された２つの「減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ」及び「選択マーカー遺伝子」からなる領域の両側（５’及び３’）近傍にＰＣＲプラマーが結合できる配列（タグ配列）を構築することで、２つの「減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ」及び「選択マーカー遺伝子」からなる領域をＰＣＲ法で増幅することができる。この場合、ＰＣＲプライマーとして、該プライマーの５’側に、前述の「選択マーカー遺伝子と該減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを染色体上に組み込むためのＤＮＡ」配列を有するものを用いることで、「選択マーカー遺伝子と、該選択マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側近傍に減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを有し、さらに、該選択マーカー遺伝子と該減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを染色体上に組み込むためのＤＮＡを有するＤＮＡ断片」を増幅することが可能となる。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態は、「選択マーカー遺伝子と、該選択マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側近傍に減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを有し、さらに、該選択マーカー遺伝子と該減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを染色体上に組み込むためのＤＮＡを有するＤＮＡ断片を用いて、細胞中の染色体上の所望の位置において相同組換えを活性化する方法」である。
本実施形態においては、「選択マーカー遺伝子と、該選択マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側近傍に減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを有し、さらに、該選択マーカー遺伝子と該減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを染色体上に組み込むためのＤＮＡを有するＤＮＡ断片」を、目的の細胞内へ形質導入する必要がある。形質導入の方法としては、例えば、酵母の場合、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が、動物細胞の場合、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質による方法等、用いる細胞に応じて当該技術分野における通常の知識に基づき、容易に選択することができる。
【００２０】
本実施形態において、使用可能な細胞としては、真核細胞であれば組織由来の細胞であっても、株化培養細胞であってもよく、限定はしないが、動物細胞、植物細胞、真菌細胞などが適している。動物細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ヒツジ、ネコ、イヌなどの哺乳類細胞の他、鳥類、は虫類、両生類などの細胞であっても使用可能である。また、植物細胞としては、例えば、イネ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ライムギ、綿花、トウモロコシ、イモ、ピーナッツ、アラビドプシスが適している。さらに、遺伝子操作が比較的容易な真菌細胞なども使用可能であり、糸状菌細胞や酵母菌細胞など、特に出芽酵母細胞が好ましい。
【００２１】
本発明の方法を実施する場合、用いた「減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡ」配列を認識して、減数分裂期ＤＮＡ二重鎖切断を誘発する因子（例えば、ＶＤＥエンドヌクレアーゼ、Ｇａｌ４−Ｓｐｏ１１など）が、目的の細胞中で発現していない場合には、当該因子の発現ベクターを目的の細胞中に導入して、該細胞中で発現させてもよい。当該因子の発現ベクターの構築及び目的細胞中における発現の工程は、後述の実施例において示すように、定法に従って容易に実施することができる。
【００２２】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
１．プラスミドｐＴＦ１０１およびｐＴＦ１００の作成
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に存在するＶＤＥは、減数分裂期に特定の認識配列において染色体ＤＮＡの二重鎖切断を引き起こすタンパク質である。一方、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質は、出芽酵母のＧａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合領域と出芽酵母のＳｐｏ１１タンパク質との融合タンパク質であり、減数分裂期にＧａｌ４タンパク質が認識して結合するＵＡＳＧＡＬを含む配列において染色体ＤＮＡの二重鎖切断を引き起こす。これらＶＤＥあるいはＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質を発現する出芽酵母細胞において、そのゲノム中にＶＤＥの認識配列あるいはＵＡＳＧＡＬを含む配列を任意箇所に導入することで、当該箇所へ減数分裂期な染色体ＤＮＡの二重鎖切断を引き起こす。
プラスミドｐＴＦ１０１は、ＶＤＥの認識配列を含む１８０ｂｐの配列を同方向反復配列としてもち、その間に出芽酵母ＵＲＡ３遺伝子を挿入したものである（図２）。プラスミドｐＴＦ１００は、出芽酵母ゲノムＤＮＡよりＵＡＳＧＡＬを複数含むＧＡＬ２遺伝子プロモータ領域の２２０ｂｐの配列を同方向反復配列としてもち、その間に出芽酵母ＵＲＡ３遺伝子を挿入したものである（図２）。
プラスミドｐＴＦ１０１及びｐＴＦ１００は、いずれも両反復配列の外側に、各々、タグ配列１（配列番号３）及びタグ配列２（配列番号４）を持つ。出芽酵母ゲノム中の任意箇所を標的とし、標的箇所の両側に位置するそれぞれ約５０ｂｐの配列を標的配列（選択マーカー遺伝子と減数分裂期組換えを活性化するＤＮＡを染色体上の標的箇所に相同組換えにより組み込むために必要な配列）として両タグ配列の５’側にそれぞれ付加したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ｐＴＦ１０１あるいはｐＴＦ１００を鋳型にＰＣＲを行うことで任意の標的配列を両端にもち、ＶＤＥの認識配列あるいはＧＡＬ２遺伝子プロモータ領域を含む配列をＵＲＡ３遺伝子の両端に含むＤＮＡ産物を得た（図３）。以下に詳細について説明する。
【００２４】
ＶＤＥの認識配列をクローニングするため、ＶＤＥの認識配列を含む配列がクローニングされているプラスミドｐＹＯ２１９７（Ｙｅａｓｔ  １９：７７３−７８２、２００２）を鋳型にＴＦＯ５（配列番号５）ＴＦＯ６（配列番号６）及びＴＦＯ７（配列番号７）とＴＦＯ８（配列番号８）をプライマーとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）により５０μｌスケールでＰＣＲにより増幅を行った。９８℃５分加温した後、９８℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を１５サイクル行い、最後に７２℃１０分反応させた。プライマーＴＦＯ５とＴＦＯ６の組み合わせで得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造）とＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）で処理した後０．８％のアガロースゲル電気泳動により分離してＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）により精製したものと、同様に、制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造）とＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）で処理してゲルより精製したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）とをライゲーションキット（宝酒造）により連結した。大腸菌ＤＨ１０Ｂ株でプラスミドを増幅した後、正しく連結されたプラスミドを選択し、ＸｈｏＩ（宝酒造）とＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）で処理した後０．８％のアガロースゲル電気泳動により分離してＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）により精製した。この精製産物と、プライマーＴＦＯ５とＴＦＯ６の組み合わせで得られたＰＣＲ産物を同じくＸｈｏＩ（宝酒造）とＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）で処理し、泳動、精製を行った産物とをライゲーションキット（宝酒造）により連結した。得られたプラスミドはＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）で切断し、０．８％のアガロースゲル電気泳動により分離してＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）により精製した。このＨｉｎｄＩＩＩ切断箇所へＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）で切断された出芽酵母ＵＲＡ３遺伝子を含むＤＮＡ断片をライゲーションキット（宝酒造）により連結した。大腸菌ＤＨ１０Ｂ株でプラスミドを増幅した後、正しく連結されたプラスミドを選択しｐＴＦ１０１とした（図２及び図３）。
【００２５】
ＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域をクローニングするため、出芽酵母ゲノムＤＮＡ鋳型にＴＦＯ１（配列番号９）とＴＦＯ２（配列番号１０）及びＴＦＯ３（配列番号１１）とＴＦＯ４（配列番号１２）をプイマーとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）により５０μｌスケールでＰＣＲにより増幅を行った。プライマーＴＦＯ１とＴＦＯ２の組み合わせで得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造）とＳｍａＩ（宝酒造）で処理した後０．８％のアガロースゲル電気泳動により分離してＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）により精製したものと、同様に制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造）とＳｍａＩ（宝酒造）で処理してゲルより精製したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）とをライゲーションキット（宝酒造）により連結した。大腸菌ＤＨ１０Ｂ株でプラスミドを増幅した後、正しく連結されたプラスミドを選択し、ＸｈｏＩ（宝酒造）とＳｍａＩ（宝酒造）で処理した後０．８％のアガロースゲル電気泳動により分離してＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）により精製した。この精製産物と、プライマーＴＦＯ３とＴＦＯ４の組み合わせで得られたＰＣＲ産物を同じくＸｈｏＩ（宝酒造）とＳｍａＩ（宝酒造）で処理し、泳動、精製を行った産物とをライゲーションキット（宝酒造）により連結した。得られたプラスミドはＳｍａＩ（宝酒造）で切断し、０．８％のアガロースゲル電気泳動により分離してＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）により精製した。このＳｍａＩ切断箇所へＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）で切断した後ブランティングキット（宝酒造）により平滑化した出芽酵母ＵＲＡ３遺伝子を含むＤＮＡ断片をライゲーションキット（宝酒造）により連結した。大腸菌ＤＨ１０Ｂ株でプラスミドを増幅した後、正しく連結されたプラスミドを選択しｐＴＦ１００とした（図２及び図３）。
【００２６】
２．形質転換
上記１で調製したＤＮＡ産物を出芽酵母細胞に形質転換し、ＤＮＡ産物の両端にある標的配列とゲノム中の標的配列との間で相同組換えが生じ、ＤＮＡ産物がゲノム中の標的箇所に組込まれた細胞を選択した（図４）。得られた細胞を培養後、ＶＤＥの認識配列あるいはＧＡＬ２遺伝子プロモータ領域を含む同方向反復配列間で組換えが生じ、ＵＲＡ３遺伝子がポップアウトした細胞を選択した（図４）。かくして、出芽酵母染色体の任意箇所にＶＤＥの認識配列あるいはＧＡＬ２遺伝子プロモータ領域を含む配列を導入することができた。以下に詳細について説明する。
【００２７】
ｐＴＦ１００あるいはｐＴＦ１０１を鋳型にＰＣＲを行うことで、出芽酵母のゲノム中にＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域あるいはＶＤＥの認識配列を導入するためのＤＮＡ産物を作成した。ＰＣＲのプライマーとして、出芽酵母のＨＩＳ３遺伝子中の配列とｐＴＦ１００及びｐＴＦ１０１中のタグ配列を含むＴＦＯ２８（配列番号１３）とＴＦＯ２９  （配列番号１４）とを使用し、反応はＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）により５０μｌスケールで９８℃５分加温した後、９８℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル行い、最後に７２℃１０分反応させた。反応産物は、エタノール沈殿後１０μｌのＴＥバッファーに溶解して形質転換に使用した。形質転換は、一般的な酢酸リチウム法を用いた。形質転換した細胞を選択するため、ウラシルを欠く選択培地（ＳＤ−Ｕｒａ）を用い、ＳＤ−Ｕｒａ寒天培地上に出現したコロニーを選択した。ＤＮＡ産物が正しくゲノムに導入されていることを確認するため、コロニーを液体培養した後、ゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、導入箇所の外側にある配列を用いたプライマーＴＦＯ３４（配列番号１５）とＴＦＯ３５（配列番号１６）によりＰＣＲを行った。反応はＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）により５０μｌスケールで９８℃５分加温した後、９８℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行い、最後に７２℃１０分反応させた。反応産物は０．７％のアガロースゲル電気泳動により検出した（図４）。次に、反復配列間で相同組換えを起こしてＵＲＡ３マーカーをポップアウトし、ゲノム中にＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域あるいはＶＤＥの認識配列を含む領域のみを残すために、ＤＮＡ産物が正しくゲノムに導入されていることを確認した酵母細胞を富栄養の寒天培地（ＹＰＤ）に塗布して３０℃で一晩培養した後５−Ｆｒｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ  Ａｃｉｄ（５−ＦＯＡ）（和光純薬）を含む完全培地に塗り、出現したコロニーを選択した。ＵＲＡ３遺伝子がポップアウトしていることを確認するため、コロニーを液体培養した後、ゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてプライマーＴＦＯ３４（配列番号１５）とＴＦＯ３５（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行った。反応はＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）により５０μｌスケールで９８℃５分加温した後９８℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行い、最後に７２℃１０分反応させた。反応産物は０．７％のアガロースゲル電気泳動により検出した（図４）。
【００２８】
３．サザン解析
ＶＤＥを発現する酵母細胞にＶＤＥの認識配列を導入した後、減数分裂の同調培養を行い、減数分裂期に標的部位で染色体ＤＮＡの二重鎖切断が誘導されることを確認した（図５）。また、ＧＡＬ２遺伝子プロモータ領域を導入した酵母細胞に減数分裂の同調培養を行い、減数分裂期に標的部位でＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質による染色体ＤＮＡの二重鎖切断が誘導されることを確認した（図６）。以下に詳細について説明する。
【００２９】
上記２で作成した株を液体培地ＳＰＳ（ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５％，  ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ  １％，  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ０．１７％，  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  １％，  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ  ０．５％，  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｔｈａｌａｔｅ  ５０  ｍＭ  ｐＨ  ５．０）で３０℃一晩培養した後、遠心分離により細胞を回収し、胞子形成培地（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  １％，）に懸濁して同調した減数分裂を誘導した。同調した減数分裂培養直前と、培養中の培養液をサンプルとして回収した。回収したサンプルからそれぞれゲノムＤＮＡを精製し、制限酵素処理を行った。ＶＤＥによるＨＩＳ３遺伝子座での染色体切断を検出する場合には制限酵素ＥｃｏＲＶ（宝酒造）を、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質によるＨＩＳ３遺伝子座での染色体切断を検出する場合には制限酵素ＨｐａＩ（宝酒造）を使用した。制限酵素処理後、エタノール沈殿を行い、１０μｌのＴＥバッファーに溶解し、０．７％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後ゲル中のＤＮＡを、ＶａｃｕＧｅｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）装置を用いて、正電荷チャージメンブレンに転写した。転写したメンブレンに対し、チャーチの方法（ＰＮＡＳ誌９２：１１２７４−１１２７８、１９８４）によりサザン解析を行った（図５及び図６）。プローブの鋳型にはＨＩＳ３遺伝子の近傍のＤＮＡ配列をもつＰＣＲ産物を用いた。具体的には、出芽酵母ゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーＴＦＯ８９（配列番号１７）とＴＦＯ９０（配列番号１８）とを用い、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）により５０μｌスケールで９８℃５分加温した後９８℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行い、最後に７２℃１０分反応させ、０．８％のアガロースゲル電気泳動により分離してＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）により精製した。
【００３０】
４．ＨＩＳ３遺伝子座でＶＤＥが引き起こす組換えの頻度測定。
ＶＤＥの認識配列を導入した酵母細胞を減数分裂に導入した後、得られた胞子を解析することで、ほとんどの細胞において標的部位での組換えが生じていることを確認した。（図７）。以下に詳細について説明する。
ＨＩＳ３遺伝子座において、野生型のＨＩＳ３遺伝子とＶＤＥの認識配列を挿入したＨＩＳ３遺伝子（ｈｉｓ３：：ＶＲＳ）をヘテロにもつ二倍体酵母細胞をＨＩＳ３遺伝子座でおきる組換え頻度の測定に使用した。この株を胞子形成寒天培地に塗布し、３０℃で２−３日培養した後形成された胞子を０．３ｍｇ／ｍｌのＺｙｍｏｌｙａｓｅ（生化学工業）で３７℃５分処理した後、マイクロマニピュレータにより４個胞子をそれぞれ富栄養寒天培地ＹＰＤへと置き３０℃で２−３日培養し、コロニーを形成させた後、ヒスチジンを欠く寒天培地（ＳＤ−Ｈｉｓ）へとレプリカして３０℃で２−３日培養し、ヒスチジンの要求性を確認した（四分子解析）。ＶＤＥの認識配列を挿入したＨＩＳ３遺伝子（ｈｉｓ３：：ＶＲＳ）はＨＩＳ３遺伝子を破壊しているため、組換えが起きなければ４個胞子のうち２個はヒスチジン非要求性で２個はヒスチジン要求性となる。一方、ＶＤＥの認識配列が切断されて組換えが起きると、ｈｉｓ３：：ＶＲＳアレルがＨＩＳ３アレルへと組換えられるため、４個胞子のうちヒスチジン非要求性の胞子が３あるいは４つになる。コントロールとしてＶＤＥの認識配列中に変異をもち、ＶＤＥに切断されない認識配列を上記１及び２の方法で同様にＨＩＳ３遺伝子中に挿入したもの（ｈｉｓ３：：ＶＲＳ１０３）をネガティブコントロールとして使用した。
図７に示す通り、ＶＤＥの認識配列を挿入したＨＩＳ３遺伝子（ｈｉｓ３：：ＶＲＳ）をヘテロにもつ二倍体酵母細胞株を用いた場合、用いた株のほとんどが、４つの胞子においてスチジン非要求性を示す結果となった。従って、挿入したＶＤＥ認識配列の部位において組換えが誘導されていることが示された。
【００３１】
５．ＨＩＳ３遺伝子座近傍での相同組換えの測定
VDEの認識配列を導入した酵母細胞を減数分裂に導入した後、得られた胞子を解析することで、標的部位の近傍で相同組換えが生じていることを確認した（図８）。また、GAL2遺伝子プロモータ領域を導入した酵母細胞を減数分裂に導入した後、得られた胞子を解析することで、標的部位の近傍で相同組換えが生じていることを確認した（図９）。以下に詳細について説明する。
【００３２】
ＨＩＳ３遺伝子座近傍での遺伝子シャッフリングを測定するために、近傍に位置する２遺伝子がそれぞれ異なるマーカー遺伝子で置き換わっている株で四分子解析を行い、マーカー間の遺伝的距離を測定した。測定には、ＨＩＳ３遺伝子の上流にあるＭＣＡ１遺伝子がＣｇＬＥＵ２遺伝子で置き換わっている一倍体とＨＩＳ３遺伝子の下流にあるＦＭＰ３８遺伝子がＫａｎＭＸ４遺伝子で置き換わっている一倍体とが接合してできた二倍体株を用いた。ＣｇＬＥＵ２遺伝子をもつ側の染色体のＨＩＳ３遺伝子中にＶＤＥの認識配列を挿入している場合としていない場合とで測定を行い比較する。上記４と同様に四分子解析を行い、ＣｇＬＥＵ２遺伝子の有無はロイシンを欠く寒天培地（ＳＤ−Ｌｅｕ）へ、ＫａｎＭＸ４遺伝子の有無は３００μｇ／ｍｌのｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ社）を含むＹＰＤ寒天培地へレプリカすることで確認した。ＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域の導入により生じたＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質の二重鎖切断がもたらす相同組換えについても同様にして解析を行った。この場合はＭＣＡ１遺伝子がＣｇＬＥＵ２遺伝子で置き換わっている一倍体とＦＭＰ３８遺伝子をＣｇＵＲＡ３遺伝子で置き換えた一倍体とが接合してできた二倍体株を使用した。両方の相同染色体のＨＩＳ３遺伝子中にＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域を挿入している場合としていない場合とで測定を行い比較する。ＣｇＵＲＡ３遺伝子の有無はウラシルを欠く寒天培地（ＳＤ−Ｕｒａ）へレプリカすることで確認した。
図８及び図９に示すように、ＨＩＳ３遺伝子中にＶＤＥの認識配列を挿入した株（ＨＩＳ３／ｈｉｓ３：：ＶＲＳ）、及びＨＩＳ３遺伝子中にＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域を挿入した株（ｈｉｓ３：：ＵＡＳ  ／ｈｉｓ３：：ＵＡＳ）において、交叉型の相同組換えが生じていることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、真核生物の減数分裂期における相同組換えを、染色体上の所望の位置において活性化することができる。そのため、従来、交配による遺伝情報の再編成の頻度が低かった領域においても組換えを引き起こすことが可能となる。従って、有用遺伝子群の交配を誘導することが可能となり、醸造酵母等の微生物育種などの産業分野において有効は手段を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ポップアウト相同組換え機構の概念図を示す。
【図２】プラスミドｐＴＦ１０１及びｐＴＦ１００の構造を示す。出芽酵母ＵＲＡ３遺伝子の両端にＶＤＥの認識配列を含む配列（ｐＴＦ１０１）あるいは出芽酵母ＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域を含む配列（ｐＴＦ１００）がそれぞれ同方向の反復配列として存在している。さらに、反復配列の外側にタグ配列１とタグ配列２とよぶ特定の配列をそれぞれ含む。
【図３】出芽酵母の形質転換に用いるＤＮＡの増幅結果を示す。ＶＤＥの認識配列あるいはＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域を含む配列を導入するために、標的部位の配列にタグ配列を付加したものをプライマーとして用い、ｐＴＦ１００（レーン１）あるいはｐＴＦ１０１（レーン２）を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離、検出した。レーンＭは分子量マーカー（ＳｔｙＩで切断されたλファージＤＮＡ）。
【図４】ＶＤＥの認識配列あるいはＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域を含む配列の導入結果を示す。図３で示される増幅産物を形質転換に用い、正確にゲノム中の標的部位へ導入された株からＵＲＡ３遺伝子をポップアウトし、ＶＤＥの認識配列あるいはＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域を含む配列を標的部位に残す。図は、形質転換前の株、図３の増幅産物が正確に導入された株とさらにＵＲＡ３遺伝子をポップアウトした株のゲノムＤＮＡを、標的部位の外側に位置する配列をプライマーにＰＣＲを行い、産物をアガロースゲル電気泳動により分離、検出した結果を示す。レーンＭは分子量マーカー（ＳｔｙＩで切断されたλファージＤＮＡ）。
【図５】ゲノムに導入したＶＤＥの認識配列で起きる減数分裂期二重鎖切断の検出結果を示す。相同染色体の片側のＨＩＳ３遺伝子中にＶＤＥの認識配列を挿入した株（ｈｉｓ３：：ＶＲＳ／ＨＩＳ３）と挿入していない株（ＨＩＳ３／ＨＩＳ３）を同調した減数分裂を誘導したのち、表記の時間においてサンプリングし、サザン解析を行った。ＶＤＥの認識配列を挿入した株では減数分裂誘導後、ＶＤＥによって切断されたＤＮＡが検出される。
【図６】ゲノムに導入したＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域で起きる減数分裂期二重鎖切断の検出結果を示す。両方の相同染色体のＨＩＳ３遺伝子中にＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域を挿入した株（ｈｉｓ３：：ＵＡＳ）と挿入していない株（ＨＩＳ３）を同調した減数分裂を誘導したのち、表記の時間においてサンプリングし、サザン解析を行った。ＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域を挿入した株では減数分裂誘導後、切断されたＤＮＡが検出された。切断ＤＮＡはＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質を発現していない株（ＳＰＯ１１）では検出されないことも確認した。
【図７】片方の相同染色体のＨＩＳ３遺伝子中にＶＤＥの認識配列を挿入した株（ＨＩＳ３／ｈｉｓ３：：ＶＲＳ）と、ＶＤＥの認識配列中に変異を含むためＶＤＥに切断されない配列を挿入した株（ＨＩＳ３／ｈｉｓ３：：ＶＲＳ１０３）とをそれぞれ減数分裂に誘導し、形成された胞子の四分子解析を行った結果を示す。四個胞子のうちヒスチジン非要求性とヒスチジン要求性のものの比が表記の比になるものの割合を示す。２：２となる株以外で組換えが生じていると判断される。
【図８】ゲノムに導入したＶＤＥの認識配列はゲノム改変を引き起こした結果を示す。片方の相同染色体のＨＩＳ３遺伝子中にＶＤＥの認識配列を挿入した株（ＨＩＳ３／ｈｉｓ３：：ＶＲＳ）と、挿入していない株（ＨＩＳ３／ＨＩＳ３）とをそれぞれ減数分裂に誘導し、形成された胞子の四分子解析を行った。ＨＩＳ３遺伝子座の近傍に存在するマーカー遺伝子の分離から判断して遺伝子の相同組換えが起きたと判断される胞子の割合を示す。
【図９】ゲノムに導入したＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域はゲノム改変を引き起こした結果を示す。ＨＩＳ３遺伝子中にＧＡＬ２遺伝子のプロモータ領域を挿入した株（ｈｉｓ３：：ＵＡＳ  ／ｈｉｓ３：：ＵＡＳ）と、挿入していない株（ＨＩＳ３／ＨＩＳ３）とをそれぞれ減数分裂に誘導し、形成された胞子の四分子解析を行った。ＨＩＳ３遺伝子座の近傍に存在するマーカー遺伝子の分離から判断して遺伝子の相同組換えが起きたと判断される胞子の割合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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