(57)【要約】【課題】細胞の酵素欠損突然変異体の遺伝子を破壊する新規な方法の提供。【解決手段】細胞の酵素欠損突然変異体の遺伝子を破壊する方法であって、(a) 該遺伝子又はその一部を含む第3 の核酸配列及び該遺伝子又はその一部内の第1 の核酸配列を含んで成る核酸構築物を導入することによる、呼吸欠損突然変異細胞の遺伝子を置換し、ここでこの第1 の核酸配列は、発現時に呼吸欠損を補完するものであり；そして(b) 前記第1 及び第3 の核酸配列を含む細胞を、第1 の核酸配列の発現に適した好気性の条件下で、培地において培養する；工程を含んで成る方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の酵素欠損突然変異体の遺伝子を破壊する方法であって、
（ａ）該遺伝子又はその一部を含む第３の核酸配列及び該遺伝子又はその一部内の第１の核酸配列を含んで成る核酸構築物を導入することによる、呼吸欠損突然変異細胞の遺伝子を置換し、ここでこの第１の核酸配列は、発現時に呼吸欠損を補完するものであり；そして
（ｂ）前記第１及び第３の核酸配列を含む細胞を、第１の核酸配列の発現に適した好気性の条件下で、培地において培養する；
工程を含んで成る方法。
【請求項２】
酸化的リン酸化に必須の遺伝子の少なくとも１個の修飾を含む、第１の核酸配列を含む細胞の呼吸欠損突然変異体であって、ここで該突然変異体が同じ条件下で培養した場合の細胞と比較して呼吸欠損である、突然変異体。
【請求項３】
ヘム欠損である、請求項２に記載の呼吸欠損突然変異体。
【請求項４】
細胞の呼吸欠損突然変異体を獲得する方法であって、
（ａ）該細胞に、酸化的リン酸化に必須の遺伝子の少なくとも１個の修飾を含む核酸配列を導入し；そして
（ｂ）該核酸配列を含む工程（ａ）の細胞の突然変異体を同定し、ここでこの突然変異体は該細胞と同じ条件下で培養された場合に呼吸欠損である
工程を含んで成る方法。
【請求項５】
前記突然変異体がヘム欠損突然変異体である、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸欠損突然変異細胞におけるポリペプチド合成法に関する。本発明は同じく、呼吸欠損突然変異細胞における遺伝子の破壊法にも関する。更に本発明は、呼吸欠損突然変異細胞及びこのような突然変異細胞を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
宿主細胞において組換えDNA 分子を選別し、そして維持するための様々な方法がある。ひとつの方法は、クローン化された野生型遺伝子による栄養要求性突然変異体の補完（complementation)に関する。しかしながら、例えば、やはり栄養要求性を補完するアミノ酸または核酸が存在する複合培地における補完DNA の維持は困難である。別の方法は、野生型受容細胞中で選択することができるマーカー遺伝子、特に抗生物質耐性遺伝子のような耐性マーカー遺伝子を使用するものである。
【０００３】
抗生物質耐性遺伝子の使用においては、一般に培地中で高価な抗生物質を使用し、そしてその後に所望の生成物からそれを除去することが必要である。更なる方法は、組換えDNA クローニングベクターによって担持される遺伝子によって抑制される致死的染色体標識の使用に関する。この方法は、細菌はうまく適用されているが、他の宿主、例えば真菌に適用することは難しい。更にこの方法では、転写活性化配列が起動する組換えDNA 分子の発現を妨害することのないようなプラスミド担持リプレッサー遺伝子の使用が必要である。
【０００４】
宿主細胞中に組換えDNA 分子を有する発現ベクターの不安定性は、組換えDNA 分子の一貫した高レベルの発現に関する重大な問題点を引き起こしている。形質転換体を継代培養する際に、この組換えDNA 分子によってコードされた生成物の収量は、劇的かつ予想できないほどに減少することがある。このことは、特に組換えDNA 分子の発現が、宿主細胞に悪い影響を及ぼす場合に、例えば発現された生成物が細胞毒性である場合などに当てはまる。組換えDNA 分子を含む形質転換体の微生物培養は、培地中の実質的に全ての微生物細胞がこの組換えDNA 分子を含有するように選択されかつ維持されることが望ましい。
【０００５】
当該技術分野において、培養時の形質転換体の高レベルの発現および遺伝的安定性の両方を保証する他の選択及び維持システムが特に必要である。
米国特許第4,902,620 号は、ヘム生合成酵素(5- アミノレブリン酸シンターゼ) 遺伝子をヘム欠損細胞へ導入し5-アミノレブリン酸を生成することを開示している。
本発明の目的は、遺伝子の異種性発現において組換え細胞を選択しかつ維持する新規方法を提供することである。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、以下の工程を含む、ポリペプチドの製造に関する：
(a) 細胞の呼吸欠損突然変異体に、1 個以上の第1 の核酸配列及び第2 の核酸配列を含む核酸構築物を導入し、ここでこの第1 の核酸配列は、発現時に呼吸欠損を補完し、かつ第2 の核酸配列は該ポリペプチドをコードしており；
(b) 前述の第1 及び第2 の核酸配列を含む細胞を、第1 及び第2 の核酸配列の発現に適した好気的条件下で、培地において培養し；そして
(c) この細胞の培養培地から該ポリペプチドを単離する。
【０００７】
本発明は同じく、呼吸欠損突然変異細胞における遺伝子を破壊する方法にも関する。本発明は更に、呼吸欠損突然変異細胞及びこのような突然変異細胞を得る方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、以下の工程を含む、ポリペプチドの合成法に関する：
(a) 細胞の呼吸欠損突然変異体に、１個以上の第１の核酸配列及び第2 の核酸配列を含む核酸構築物を導入し、ここで第1 の核酸配列は、発現時に呼吸欠損を補完し、そして第2 の核酸配列は該ポリペプチドをコードしており；
(b) 前述の第１及び第２の核酸配列を含む細胞を、第１及び第２の核酸配列の発現に適した好気的条件下で、培地において培養し；そして
(c) この細胞の培養培地から該ポリペプチドを単離する。
【０００９】
本発明の方法は、細胞が増殖のために酸素を必要とすることが唯一の必要条件であるような、いずれかの適切な工業的発酵培地において細胞を選別するための酸化的リン酸化の使用を基にしている。呼吸欠損突然変異細胞への１個以上の第１の核酸配列の導入は、その呼吸欠損性を克服し、その結果、酸素存在下で増殖する細胞の能力を基に選択することを可能にする。従って、１個以上の第１の核酸配列を含むこれらの突然変異細胞は、培地中で培養することができ、その結果前述の導入がうまくいかなかった突然変異細胞から選別することができる。
【００１０】
用語“酸化的リン酸化”とは、電子が、一連の電子伝達体により、NADHから、FADH2 に、さらにO2へと移動されたことによる、ATP 形成を意味する。NADH及びFADH2 は、解糖、脂肪酸酸化、及びクエン酸回路において形成され、かつ各分子は高い移動電位を伴う電子対を有するので、エネルギーが豊富な分子である。酸化的リン酸化は、例えばミトコンドリア内膜又は原核細胞の形質膜に存在する呼吸機構によって実行される。この呼吸機構は、シトクロムのような多くの電子伝達体を含んでいる。これらの伝達体を介してのNADH又はFADH2 からO2への順を追った電子の移動は、プロトン駆動力を生じるミトコンドリアマトリックスのプロトンポンプによる送出に繋がっている。ATP は、酵素複合体により、ミトコンドリアマトリックスへとプロトンが戻される際に合成される。O2が最終の電子受容体として利用されるこのATP 合成過程は、呼吸と称される。これらの伝達体を介して電子を移動することができない微生物が、呼吸欠損体である。
【００１１】
電子は、NADHからO2へと、いわゆるNADH-Qレダクターゼ(NADH デヒドロゲナーゼとも称される) 、シトクロムレダクターゼ、及びシトクロムオキシダーゼである、３種の大きいタンパク質複合体の鎖を介して移動される。これらの酵素の電子を伝達する基は、フラビン、鉄−硫黄クラスター、ヘム、及び銅イオンである。電子は、NADH-Qレダクターゼからシトクロムレダクターゼへと、還元型ユビキノンにより伝達される。ユビキノンは更に、FADH2 からシトクロムレダクターゼへと電子を伝達する。シトクロムc は、小さいタンパク質であり、シトクロムレダクターゼからシトクロムオキシダーゼへと電子を往復させる。
【００１２】
この第１の反応は、その補欠分子族として密に結合したフラビンモノヌクレオチド(FMN) を含むフラビンタンパク質である、NADH-QレダクターゼによるNADHの酸化である。2 個の電子が、NADHからFMN へと移動され、還元型FMNH2 を生成する。その後これらの電子は、FMNH2 から、NADH-Qレダクターゼ中の第2 の補欠分子族である一連の鉄−硫黄クラスターへと移される。NADH-Qレダクターゼ中の鉄−硫黄クラスターの電子は、次に、補酵素Q(ユビキノンとしても公知) へと往復させられる。ユビキノンは、長いイソプレノイド鎖(tail)を有するキノン誘導体であり、これは1 個の電子の受け取りによりユビキノールへと還元される。ユビキノールは同じくFADH2 からの電子の侵入点でもある。
【００１３】
その後ユビキノールは、その２個の電子のうちの１個を、シトクロムレダクターゼ中の鉄−硫黄クラスターへと移動する。シトクロムは、補欠分子族としてヘムを含む電子伝達タンパク質である。シトクロムレダクターゼの機能は、ユビキノールからシトクロムc への電子の移動を触媒することである。シトクロムレダクターゼは、シトクロムb 及びc1、並びに鉄−硫黄クラスタータンパク質を含んでいる。シトクロムb 、c1及びc の補欠分子族は通常ヘムとして公知の鉄−プロトポルフィリンIXである。
【００１４】
シトクロムb においては、ヘムは、タンパク質と共有結合しないが、シトクロムc 及びc1においては、ヘムは、チオエステル結合を介してタンパク質へと共有結合している。シトクロムa 及びa3は、ホルミル基がメチル基の1 個で置換されていて、かつ炭化水素鎖がビニル基の1 個で置換されている点で、シトクロムc 及びc1のヘムとは異なる、ヘムA と称される異なる鉄−ポルフィリン補欠分子族を有している。ユビキノールは、その２個の電子のうちの１個を、このレダクターゼ中の鉄−硫黄複合体へと移動し、これは次に順次シトクロムc1及びc へと往復され、該複合体から外へと運ばれる。シトクロムb は、ユビキノールを鉄−硫黄クラスターと相互作用させることができる。
【００１５】
シトクロムa 及びa3から形成されるシトクロムオキシダーゼは、還元型シトクロムc から、最終受容体である分子酸素への電子の移動を触媒する。
本発明の方法において、呼吸欠損突然変異細胞は、呼吸過程の１種以上の段階の欠損をもたらす１種以上の遺伝子が欠損している細胞か、あるいは、１個以上の遺伝子の破壊により呼吸欠損となっている細胞かのいずれかであることができる。これらの遺伝子は、電子伝達鎖の成分であるいずれかのタンパク質をコードしている遺伝子、もしくは、フラビンの生合成、キノンの生合成又はヘムの生合成に関る酵素をコードしている遺伝子を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
呼吸欠損突然変異体は、機能的シトクロム類が欠如しているために、酸化的リン酸化を行う能力を有しない。従って破壊は、絶対好気性生物の増殖を完全に排除する。破壊後、この呼吸欠損突然変異体は、本質的に、当該欠損を補完しかつ酸化的リン酸化を回復するために適当な物質が補充された培地においてのみ良好に増殖するような栄養要求体である。
【００１７】
例えば、この呼吸欠損突然変異細胞は、更に、ヘム生合成遺伝子の活性化を媒介しているアクチベーターをコードしている遺伝子のような、酸化的リン酸化において重要な役割を果たす調節遺伝子又は関連経路の遺伝子が変更又は破壊されたような細胞でもある。例えば、サッカロミセス・セレビシエのコプロポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の誘導は、ヘム−欠損下でのCyp1p によって媒介される活性化を介して一部生じる(Amilletらの論文、Current Genetics、28:503-511(1995)) 。この遺伝子の破壊は、ヘム−欠損しており、そして最終的に呼吸欠損であるような細胞を生じ得る。
【００１８】
更に、この突然変異細胞は、遺伝子の核酸残基の挿入、欠失又は置換のような、当該技術分野において周知の方法を用いて、酸化的リン酸化に重要な遺伝子を破壊することにより構築することができる。例えば、これらの遺伝子のひとつは、相同領域の重複(duplication) を形成し、そしてこれらの重複領域の間にベクターDNA を取りこむような、遺伝子に対し相同の核酸断片を含む組込みプラスミド（integrative plasmid)を該遺伝子へ挿入することにより破壊される。これは、挿入されたベクターが、そのコード領域から該遺伝子プロモーターを分離するか、または非機能的遺伝子産物を生じるようにコード配列を妨害する場合に、遺伝子発現を排除することができる。さらに、例えばプロモーターのような、酸化的リン酸化に重要な１又は複数の遺伝子の発現に必要又は有利である1 又は複数の制御配列を、修飾することができる。
【００１９】
あるいは、遺伝子変換法によるか( 例えば、Iglesias及びTrautnerの論文、MolecuLar General Genetics、189:73-76(1983) を参照のこと) 、または、遺伝子置換により、遺伝子発現を減少または排除することができる。後者の方法において、突然変異された遺伝子型は、選択マーカーと組合わせて非複製（non-replicating)線状のDNA 断片に導入される。このプラスミドの組込みの選択は、該マーカーの選択によって行われる。遺伝子置換を導く組換え事象のスクリーニングは、突然変異した遺伝子を獲得しているかどうかについてコロニーを試験することによって行われる。更に、酸化的リン酸化に重要な1 種以上の遺伝子発現の減少又は排除は、転位（transposition)及びUV又は化学物質による突然変異誘発を含むが、これらに限定されるものではない、当該技術分野において周知の方法を用いるランダム突然変異誘発により達成することができる。
【００２０】
宿主細胞としての前述の呼吸欠損突然変異細胞の選択は、いくつかの要因に大きく依存しているであろう。ひとつの要因は、１又は複数の第１の核酸配列を導入するに先立っての突然変異細胞の増殖のために突然変異細胞の呼吸欠損を補完する能力である。この突然変異細胞の呼吸欠損の補完は、例えばフェロプロトポルフィリン又はフェリプロトポルフィリン（ヘミン）のようなヘム原料などの物質、又はヘムの生合成に関連した遺伝子の破壊を克服するためのヘモグロビンを培地に補充することによって達成され得る。しかしながら、この選択は、培地への物質の添加によって回復されるべき突然変異細胞の能力によって左右される。別の重要な要因は、前述の第１の核酸配列が、宿主細胞において発現することができるかどうかである。更なる要因は、第2 の核酸配列が宿主細胞において発現することができるかどうかである。
【００２１】
この宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核細胞であるか、または、単細胞でない微生物、例えば真核細胞であることができる。
【００２２】
有用な単細胞は、細菌細胞であり、これはバシラス(Bacillus)属の細胞、例えば、バシラス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus) 、バシラス・アミノリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・ブレビス(Bacillus brevis）、バシラス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バシラス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、バシラス・ラウタス(Bacillus lautus) 、バシラス・レンタス(Bacillus lentus) 、バシラス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガリウム(Bacillus megaterium）、バシラス・ステアロテルモフィス(Bacillus stearothermophilus) 、バシラス・サブチリス(Bacillus subtilis）、及びバシラス・チュリンジエンシス(Bacillus thurigiensis）；又はストレプトマイセス(Streptomyces)属の細胞、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans）又はストレプトマイセス・ムリナス(Streptomyces murinus)のようなグラム陽性菌、もしくはE.コリ（E.coli) 及びシュードモナス(Psendomonas）属の種のようなグラム陰性菌を含むが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様において、細菌宿主細胞は、バシラス・レンタス、バシラス・リシェニフォルミス、バシラス・ステアロテルモフィス又はバシラス・サブチリス細胞である。
【００２３】
前述の宿主細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞のような真核細胞であることができる。有用な哺乳類細胞は、チャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO) 細胞、HeLa細胞、胎児ハムスター腎(13HK)細胞、COS 細胞、又は例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATTC)から入手できるいくつかの他の不滅化した細胞株である。
【００２４】
好ましい実施態様において、宿主細胞は菌類(fungus)細胞である。本願明細書において使用される“菌類”(fungus)とは、子嚢菌(Ascomycota)門、担子菌(Bacidiomycota）門、ツボカビ(Chytridiomycota) 門、及び接合菌(Zygomycota)門（Hawksworthらの定義による、Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi 、第8 版、1995年、CAB International, University Press, Cambridge, UK) 、更には卵菌(Oomycota)門（Hawksworthらの前述の著書(1995 年) の171 頁から引用) 並びに全ての不完全菌類(mitosporic fungi)（Hawksworthらの前述の著書、(1995 年))である。
【００２５】
子嚢菌門の代表的グループは、例えばニューロスポラ(Neurospora)、ユーペニシリウム(Eupenicillium)(＝ペニシリウム(Penicillium))、エメリセラ(Emericella)( ＝アスペルギルス(Aspergillus))、ユーロチウム(Eurotium)（＝アスペルギルス(Aspergillus))、及び下記に列記する真の酵母を含む。担子菌門の例は、菌じん類、サビキン類、及びクロポキン類を含む。ツボカビ門の代表的グループは、例えばカワリミズカビ(Allomyces) 、コウマクノウキン(Blastocludrella) 、ボウフラキン(coelomomyces)、及び水生菌である。卵菌門の代表的グループは、例えば、アクリア(Achlya)のようなミズカビ(Saprolegniomycetous) 水生菌（ミズカビ）を含む。不完全菌類の例は、アスペルギルス(Aspergillus) 、ペニシリウム(Penicillium) 、カンジダ(Candida) 、及びアルテルナリア(Alternaria)を含む。接合菌門の代表的グループは、例えばクモノスカビ(Rhizopus)及びケカビ（Mucor)を含む。
【００２６】
好ましい実施態様において、真菌宿主細胞は酵母細胞である。本願明細書において使用される“酵母”とは、子嚢菌類(ascosporogenous) 酵母（Endomycetales)、担子菌類(basidiosporogenous)酵母、及び不完全菌に属する酵母(Blastomycetes）を含む。子嚢菌類酵母は、スパーモフトラセー(Spermophthoraceae) 科及びサッカロミセス(Saccharomycetaceae)科に分けられる。
【００２７】
後者は4 つの亜科を有し、スキゾサッカロミセス(Schizosaccharomycoideae) 亜科（例えばスキゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces) 属) 、ナドソニオイデ(Nadsonioideae) 、リポミコイデー(Lipomycoideae) 亜科、及びサッカロミセス(Saccharomycoideae) 亜科（例えばピキア(Pichia)、クルイベロミセス(Kluyveromyces) 及びサッカロミセス(Saccharomyces) 属）である。担子菌類酵母は、ロイコスポリジウム(Leucosporidim) 属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、スポリジオボラス(Sporidiovolus) 属、フィロバシジウム(Filobasidium)属、及びフィロバシジエラ(Filobasidiella)属を含む。
【００２８】
不完全菌に属する酵母は、２つの科に分けられ、スポロボロミセス(Sporobolomycetaceae) 科（例えばスポロボロミセス(Sorobolomyces) 属及びブレラ(Bullera) 属) 及びクリプトコッカス(Cryptococcaceae) 科（例えばカンジダ(Candida) 属）である。酵母の分類は今後変更されることがあり得るので、本発明の目的のためには、酵母はBiology and Activities of Yeast （Skinner, F.A. 、Passmore, S.M.及びDavenport, R.R. の編集、Soc. App. Bacteriol. Symposium Series 、No.9, 1980年）に記されたように定義する。酵母の生物学及び酵母遺伝子の操作は、当該技術分野において周知である（例えば、Biochemistry and Genetics of Yeast、Bacil, M. 、Horecker, B.J.及びStopani, A.O.M. 編集、第2 版、1987年；The Yeasts、Rose, A.H.及びHarrison, J.S.編集、第2 版、1987年；並びに、The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces、Strathern らの編集、1981年を参照のこと）。
【００２９】
より好ましい実施態様において、酵母宿主細胞は、カンジダ、クルイベロミセス、サッカロミセス、スキゾサッカロミセス、ピキア又はヤロウィア(Yarrowia)属の種の細胞である。
【００３０】
最も好ましい実施態様において、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カールスバージェンシス(Saccharomyces curlsbergensis)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ディアスタティカス(Saccharomyces diastaticus) 、サッカロミセス・ダグラシ(Saccharomyces douglasii) 、サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロミセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis) 又はサッカロミセス・オビフォルミス(Saccharomyces oviformis) 細胞である。別の最も好ましい実施態様において、酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)細胞である。別の最も好ましい実施態様において、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica) 細胞である。
【００３１】
別の好ましい実施態様において、菌類宿主細胞は、糸状菌細胞である。“糸状菌”とは、ユーミコタ(Eumycota)及び卵菌(Oomycota)亜門の糸状体を全て含む( 前述のHawksworthらの定義、1995年) 。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖類で構成された菌糸壁によって特徴付けられる。栄養増殖は菌糸の伸長によるものであり、かつ炭素異化作用は絶対好気性である。対照的にサッカロミセス・セレビシエのような酵母の栄養増殖は、単細胞期の葉状体の出芽により、かつ炭素異化作用は発酵性である。より好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillus) 、フサリウム(Fusarium)、フミコラ(Humicola)、ムコール(Mucor) 、ミセリオフソラ(Myceliophthora)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium) 、シエラビア(Thielavia) 、トリポクラジウム(Tolypocladium) 及びトリコデルマ(Trichoderma) 属の種の細胞であるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
なお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はアスペルギルス細胞である。別のなお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はアクレモニウム細胞である。別のなお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はフサリウム細胞である。別のなお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はフミコラ細胞である。別のなお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はムコール細胞である。別のなお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はミセリオフソラ細胞である。
【００３３】
なお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はニューロスポラ細胞である、別のなお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はペニシリウム細胞である。別のなお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はシエラビア細胞である。別のなお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はトリポクラジウム細胞である。別のなお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はトリコデルマ細胞である。
【００３４】
最も好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori) 、アスペルギルス・フォエチダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus) 、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 又はアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)細胞である。別の最も好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・セレアリス(Fusarium cerealis) 、フサリウム・クロックウェレンス(Fusarium crookwellense)、フサリウム・グラミネアラス(Fusarium graminearum)、フサリウム・オキシルポルム(Fusarium oxysporum)、フサリウム・サンブシナム(Fusarium sambucinum) 、フサリウム・スルフォレウム(Fusarium sulphureum) 、又はフサリウム・ベネナタム(Fusarium venenatum)細胞である。
【００３５】
別の最も好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞は、フミコラ・インソレンス(Humicora insolens) 又はフミコラ・ラヌギノサ(Humicora lanuginosa) 細胞である。別の最も好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞は、ムコール・ミエハイ(Mucor miehei)細胞である。別の最も好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞は、ミセリオフソラ・サーモフィラム(Myceliophthora thermophilum) 細胞である。別の最も好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa) 細胞である。
【００３６】
別の最も好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はペニシリウム・プルプロゲナム(Penicillium purpurogenum)細胞である。別の最も好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はシエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)細胞である。別の最も好ましい実施態様において、トリコデルマ細胞は、トリコデルマ・ハリアナム(Trichoderma harrianum) 、トリコデルマ・コニンギ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum) 、トリコデルマ・リセイ(Trichoderma reesei)又はトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)細胞である。
【００３７】
好ましい実施態様においては、電子伝達鎖の成分である1 種以上のタンパク質をコードし、かつ呼吸欠損を相補することが可能な突然変異体を生じるような1 個以上の第1 の核酸配列が、該突然変異体へと導入される。これらのタンパク質は、NADH-Qレダクターゼ、シトクロムレダクターゼ（シトクロムb 及びc1を含む）、シトクロムc 、及びシトクロムオキシダーゼ（シトクロムa 及びa3を含む) を含む。
【００３８】
別の好ましい実施態様においては、フラビンを産生することが可能な突然変異体を生じるような1 種以上のフラビン生合成酵素をコードしている1 個以上の第1 の核酸配列が、該突然変異体へと導入される。
別の好ましい実施態様において、ユビキノンを産生することが可能な突然変異体を生じるような1 種以上のユビキノン( 又はCoQ)生合成酵素をコードしている1 個以上の第1 の核酸配列が、該突然変異体へと導入される。
【００３９】
別の好ましい実施態様において、ヘムを産生することが可能な突然変異体を生じる1 又は複数のヘム生合成酵素をコードしている1 又は複数の第1 の核酸配列が、該突然変異体に導入される。ヘムは、プロトポルフィリンIX及び鉄のキレート複合体であり、ヘモタンパク質の補欠分子族として利用される。プロトポルフィリンIXは、4 個のメチル基、2 個のビニル基、及び2 個のプロピオン酸基で置換されたポルフィリン環から成り、これは鉄原子を獲得し、ヘムを形成する。
【００４０】
本願明細書においては用語“ヘム生合成酵素”は、ヘムの生合成に関るいずれかの酵素を意味すると定義される。このようなヘム生合成酵素の例は、5-アミノレブリン酸シンターゼ(EC 2.3.1.37) 、ポルホビリノーゲン・シンターゼ(EC 4.2.1.24) 、ポルホビリノーゲン・デアミナーゼ(EC 4.3.1.8)、ウロポルフィリノーゲンIII ・シンターゼ(EC 4.2.11.75)、ウロポルフィリノーゲンIII ・デカルボキシフラーゼ(EC 4.1.1.37) 、コプロポルフィリノーゲンIII ・オキシダーゼ(EC 1.3.3.3)、プロトポルフィリノーゲンIX・オキシダーゼ(EC 1.3.3.4)、及びフェロケラターゼ(EC 4.99.1.1) を含むが、これらに限定されるものではない。5-アミノレブリン酸シンターゼは、グリシン及びスクシニル-CoAの縮合を触媒し、5-アミノレブリン酸を生成する。
【００４１】
ポルホビリノーゲン・シンターゼ（5-アミノレブリン酸デヒドラターゼ又は5-アミノレブリン酸デヒドラーゼとも称される）は、2 個の5-アミノレブリン酸分子の縮合を触媒し、ポルホビリノーゲンを生成する。ポルホビリノーゲン・デアミナーゼ（ヒドロキシメチルビラン・シンターゼ又はウロI ・シンターゼとも称される）は、ピロールポルホビリノーゲンの4 分子の重合(tetrapolymerization) を触媒し、プレウロポルフィリノーゲンを生成する。ウロポルフィリノーゲンIII ・シンターゼ（ウロIII ・シンターゼ又はウロIII ・コシンターゼとも称される) は、プレウロポルフィリノーゲンの第4 番目の環の転位、その後の閉環を触媒し、ウロポルフィリノーゲンIII を生成する。
【００４２】
ウロポルフィリノーゲンIII ・デカルボキシラーゼ（ウロD 又はウロポルフィリノーゲン・デカルボキシラーゼとも称される）は、ウロポルフィリノーゲンIII の4 個の全ての酢酸側鎖のメチル基への脱炭酸を触媒し、コプロポルフィリノーゲンIII を生成する。コプロポルフィリノーゲンIII ・オキシダーゼ（コプロポルフィリノーゲナーゼとも称される）は、コプロポルフィリノーゲンIII のA 及びB 環の2 位及び4 位の2 個のプロピオン酸基のビニル基への酸化的脱炭酸を触媒し、プロトポルフィリノーゲンIXを生成する。プロトポルフィリノーゲンIX・オキシダーゼは、プロトポルフィリノーゲンIXの6 個の電子的酸化を触媒し、プロトポルフィリンIXを生じる。フェロケラターゼ（フェロリアーゼ、ヘムシンターゼ、又はプロトヘムフェロリアーゼとも称される）は、鉄のプロトポルフィリンへの導入を触媒し、ヘムを生成する。
【００４３】
あるいは、5-アミノレブリン酸の生合成は、tRNA-Gluが媒介した経路によりグルタミン酸から生じることもできる。このグルタミン酸経路は、多くの好気性細菌、植物、及び光合成をすることが可能な生物において発見されている。グルタミン酸からの5-アミノレブリン酸の生合成は、グルタミン酸-tRNA glu シンターゼ(EC 6.1.1.17) 、グルタミン酸-tRNA glu ・レダクターゼ、及びグルタミン酸1-セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼで触媒された、3 種の酵素的工程に関連している。
【００４４】
グルタミン酸-tRNA glu ・シンテターゼ（グルタミン酸-tRNA glu シンターゼとも称される）は、ATP 及びマグネシウムイオンの存在下での、tRNAのグルタミン酸へのカップリングを触媒する。グルタミン酸-tRNA glu ・レダクターゼ（グルタミン酸-tRNA glu デヒドロゲナーゼとも称される）は、NADPH の存在下において、tRNAが結合したグルタミン酸の還元を触媒し、グルタミン酸1-セミアルデヒドを生成する。グルタミン酸1-セミアルデヒド・アミノトランスフェラーゼ（グルタミン酸1-セミアルデヒドアミノムターゼとも称される）は、グルタミン酸1-セミアルデヒドの5-アミノレブリン酸への転換を触媒する。
【００４５】
前述の第１の核酸配列は、5-アミノレブリン酸シンターゼ、ポルホビリノーゲン・シンターゼ、ポルホビリノーゲン・デアミナーゼ、ウロポルフィリノーゲン・シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン・デカルボキシラーゼ、コプロポルフィリノーゲン・オキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼ、フェロケラターゼ、及びグルタミン酸-tRNAglu・シンターゼ、グルタミン酸-tRNAglu・レダクターゼ、及びグルタミン酸1-セミアルデヒド・アミノトランスフェラーゼからなる群から選択されるヘム生合成酵素をコードしている配列であることが好ましい。
【００４６】
この第１の核酸配列は、いずれかの微生物原料から得ることができ、かつ宿主細胞に対し天然又は外来のものであることができる。このような第1 の核酸配列の原料の選択は、宿主細胞として使用されるヘム欠損突然変異細胞によって左右されるが、好ましい原料は、例えば酵母及び糸状菌のような菌類原料である。好ましい糸状菌原料は、アクレモニウム、アスペルギルス、フサリウム、フミコラ、ミセリオフソラ、ムコール、ニューロスポラ、ペニシリウム、ファネロキエテ(Phanerochaete) 、シエラビア、トリポクラジウム、及びトリコデルマ属の種を含むが、これらに限定されるものではない。好ましい酵母原料は、カンジダ、クルイベロミセス、ピキア、サッカロミセス、スキゾサッカロミセス、及びヤロウィア属の種を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
ヘム生合成酵素をコードしている第1 の核酸配列は、下記のもののいずれかであることができる：
１．5- アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子：
a.サッカロミセス・セレビシエ(Urban-Grimal らの論文、European Journal of Biochemistiy、156:511-59(1986)) ；
b.アスペルギルス・ニジュランス(Bradshaw らの論文、Current Genetics、23:501-507(1993)) ；
c.ロドバクテル・スファロイデス(Rhodobacter sphaeroides) （Tai らの論文、Gene、70:139-152(1988)）；
d.ロドバクテル・カプスラタス(capsulatus)（Hornbergerらの論文、Molecular General Genetic 、211:371-378(1990))；及び
e.エッセリシヤ・コリ（Droletらの論文、Molecular General Genetics、216:347-352(1989))。
【００４８】
２．ポルホビリノーゲンシンターゼ遺伝子：
a.サッカロミセス・セレビシエ（Myers らの論文、Journal of Biological Chemistry 、262:16822-16829(1987))；
b.スタフィロコッカス・アウレウス（Kafala及びSasarmanの論文、Canadian Journal of Microbiology、40:651-657(1994)) ；
c.ロドバクテル・スファロイデス（De1aunayらの論文、Journal of Bacteriology 、173:2712-2715(1991))；
d.エッセリシヤ・コリ（Echelardらの論文、Molecular General Genetics、214:503-508(1988) ）；及び
e.バシラス・サブチリス（Hansson らの論文、Journal of Bacteriology 、173:2590-2599(1991) ）。
【００４９】
３．ポルホビリノーゲンデアミナーゼ遺伝子
a.サッカロミセス・セレビシエ（Kengらの論文、Molecular General Genetics、234:33-43(1992))；
b.ヒト（Yoo らの論文、Genomics、15:221-29(1993) ；Raich らの論文、Nucleic Acids Research、14:5955-5968(1986)) ；
c.エッセリシヤ・コリ（Thomas及びJordan、Nucleic Acids Research、14:6215-6226(1986)）；及び
d.バシラス・サブチリス（Petricekらの論文、Journal of Bacteriology 、172:225O-2258(1990))。
【００５０】
４．ウロポルフィリノーゲンIII シンターゼ遺伝子：
a.サッカロミセス・セレビシエ（Amillet 及びLabbe-Boisの論文、Yeast 、11:419-424(1995)）；
b.バシラス・サブチリス（Hansson らの論文、Journal of Bacteriology 、173:2590-2599(1991) ）；及び
c.エッセリシヤ・コリ（Jordanらの論文、Nucleic Acids Research、15:10583(1987)）。
【００５１】
５．ウロポルフィリノーゲンIII デカルボキシラーゼ遺伝子：
a.サッカロミセス・セレビシエ（Garey らの論文、European Journal of Biochemistry、205:1011-1016 （1992）) ；及び
b.ヒト（Romeo らの論文、Journal of Biological Chemistry 、261:9825-9831(1986))。
【００５２】
６．コプロポルフィリノーゲンIII オキシダーゼ遺伝子：
a.ヒト（Martasekらの論文、Proceedings of the National Academy of Sciences   USA 、911:3024-3028(1994))；
b.エッセリシヤ・コリ（Troup らの論文、Journal of Bacteriology 、176: 673-680(1994)）；及び
c.サッカロミセス・セレビシエ（Zaagorecらの論文、Journal of Biological Chemistry 、263:9718-9724(1986))。
【００５３】
７．プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ遺伝子：
a.ヒト（Taketaniらの論文、Genomics、29:698-703(1995)) ；
b.バシラス・サブチリス（Daileyらの論文、Journal of Biological Chemistry 、269:813-815(1994))；及び
c.エッセリシヤ・コリ（Sasamun らの論文、Canadian Journal of Microbiology、39:155-161(1993)) 。
【００５４】
８．フェロケラターゼ遺伝子：
a.サッカロミセス・セレビシエ(Labbe-Bois 、Journal of Biological Chemistry 、265:7278-7283(1990))；
b.ウシ（Shibuya らの論文、Biochimica Biophysica Acta、1231:117-120(1995)) ；
c.ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Furustaci 及びO'Brian の論文、Applied Environmental Microbiology、59:2347-2351(1993)) ；
d.エッセリシヤ・コリ（Frustaci及びO'Brian の論文、Journal of Bacteriology 、175:2154-2156(1993))；及び
e.バシラス・サブチリス（Hansson 及びHederstedt、Journal of Bacteriology 、174:8081-8093(1992))。
【００５５】
９．グルタミン酸-tRNA glu シンテターゼ遺伝子：
a.メタノバクテリウム・サモアトトロフィカム(thermoautotrophicum) （Moore らの論文、Biochimica et Biophysica Acta 、1305:113-116（1996））;
b.サーマス・サーモフィラス（Nurekiらの論文、European Journal of Biochemistiy、204:465-472(1992))；
c.バシラス・サブチリス（Bretonらの論文、Journal of Biological Chemistry 、265:18248-18255(1990))；
d.バシラス・ステアロテルモフィラス（Bretonらの論文、Journal of Bio1ogical Chemistry 、265:18248-18255(1990))；
e.サッカロミセス・セレビシエ（Ludmerer及びSchimmelらの論文、Journal of Bacteriology 、163:763-768(1985))；
f. E. コリ（Bretonらの論文、Journal of Biological Chemistry 、261:10610-10617(1986))。
【００５６】
10．グルタミン酸-tRNA glu レダクターゼ遺伝子：
a.大麦（Vothkenecht らの論文、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 、93:9287-9291(1996)) ；
b.緑膿菌（Hungererらの論文、Molecular and General Genetics、248:375-380(1995))；
c. E. コリ（Ikemi らの論文、Gene、121:127-132(1992))；
d.バシラス・サブチリス（Petricekらの論文、Journal of Bacteriology 、172:2250-2258(1990))；
e.メタノバクテリウム・サモアトトロフィカム（Hungererらの論文、Bioorg. Med. Chem.、4:1089-1095(1996))。
【００５７】
11．グルタミン酸1-セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼ遺伝子：
a.ネズミチフス菌（Elliott らの論文、Journal of Bacteriology 、172:7071-7084(1990))；
b.大麦 (Grimm の論文、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 、87:4169-4173(1990)) ；
c. E. コリ（Ikemi らの論文、Gene、121:127-132(1992))。
【００５８】
より好ましい実施態様において、前述の第１の核酸配列は、アスペルギルス種から得られる。なお一層好ましい実施態様において、第１の核酸配列は、アスペルギルス・フィカム(ficuum)、アスペルギルス・フォエチダス、アスペルギルス・ジャポニカス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニジュランス、又はアスペルギルス・オリザエから得られる。別のより好ましい実施態様において、第1 の核酸配列は、サッカロミセス種から得られる。なお一層好ましい実施態様において、第1 の核酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・カールスバージエンス、サッカロミセス・ディアスタティカス、サッカロミセス・ダグラシ、サッカロミセス・クルイベリ、サッカロミセス・ノルベンシス、又はサッカロミセス・オビフォルミスから得ることができる。
【００５９】
最も好ましい実施態様において、5-アミノレブリン酸シンターゼをコードしている第1 の核酸配列は、例えば配列番号：１に記された核酸配列であるアスペルギルス・オリザエ株A1560(IFO 4177) から得られる。この第1 の核酸配列は、更に遺伝子コードの縮重が配列番号：1 とは異なる、配列番号：２に記されたアミノ酸配列を有する5-アミノレブリン酸シンターゼをコードしている核酸配列であってもよい。別の最も好ましい実施態様において、ポルホビリノーゲンシンターゼをコードしている第1 の核酸配列は、例えば配列番号：3 に記された核酸配列であるアスペルギルス・オリザエ株A1560(IFO 4177) から得ることができる。
【００６０】
この第1 の核酸配列は、更に遺伝子コードの縮重が配列番号：３とは異なる、配列番号：4 に記されたアミノ酸配列を有するポルホビリノーゲンシンターゼをコードしている核酸配列であってもよい。本発明の第１の核酸配列は更に、配列番号：1 及び配列番号：３に記された両ゲノム配列に加え、対応するcDNA及びRNA 配列を包含している。本願明細書において使用した用語“核酸配列”は、合成DNA を含むこのような変種を全て包含すると理解されるであろう。
【００６１】
プラスミドコピー数を最大にしようとして、例えば、プロモーターを切断／変異させることにより、ヘム又は前駆体の不存在下での迅速な増殖を支持するために導入されるべき多コピーのベクターを必要とする転写レベルを低下させることにより、前述の第1 の核酸配列の発現は損われるであろう。更に、該タンパク質の活性の低下をもたらす第1 の核酸配列によって発現されたタンパク質のアミノ酸配列の突然変異を、コピー数を最大化するために使用することができる。例えば、導入されたヘム生合成遺伝子の酵素活性を低下するいずれかの突然変異を使用することができる。
【００６２】
前述のポリペプチドをコードしている第２の核酸配列は、該突然変異細胞に対して生来的(native)又は異種性(heterologeus)であることができる。異種性ポリペプチドの場合、この異種性ポリペプチドをコードしている核酸配列は、いずれかの原核生物、真核生物、又は他の原料、例えば古細菌から得ることができる。本願明細書において、用語“ポリペプチド”は、特定の長さのコードされた生成物を意味せず、従ってペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質を包含している。更に用語“ポリペプチド”は、コードされた生成物を形成するために結合した2 種以上のポリペプチドも包含している。更にポリペプチドは、１種以上がその宿主細胞に対して異種であり得るような、少なくとも２種の異なるポリペプチドから得られた部分的又は完全なポリペプチド配列の組合せを含む、ハイブリッドポリペプチドも含んでいる。ポリペプチドは更に、前述のポリペプチドの天然に生じた対立遺伝子変異体及び遺伝子操作された変異体を含む。
【００６３】
これらのポリペプチドは、酵素、ホルモン、ホルモン変異体、受容体又はそれらの一部、抗体又はそれらの一部、もしくはレポーターであることができる。最も好ましい実施態様において、該ポリペプチドは、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼである。なお一層好ましい実施態様において、該ポリペプチドは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グリコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルタミナーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼである。
【００６４】
本発明の方法は更に、用語“生来のポリペプチド”の範囲において、その発現が宿主細胞に対して生来的でない遺伝要素の使用、又は宿主細胞に通常認められない態様で機能するように操作された天然の要素の使用を含むような、突然変異細胞に対して生来的又は内因性のポリペプチドの組換え産物を包含している。例えば生来のポリペプチドは、該ポリペプチドの発現を増強する様々なプロモーターの制御下に、もしくは、該細胞の外部への生来のポリペプチドの輸送を促進する様々なシグナル配列の制御下に、該ポリペプチドをコードしている遺伝子を配置すること、及び宿主細胞によって通常生成されるポリペプチドをコードしている遺伝子のコピー数を増加することなどにより、組換え産生することができる。
【００６５】
このポリペプチドは、更にヘモタンパク質であることができる。本願明細書において“ヘモタンパク質”とは、補欠分子族としてヘムを含むタンパク質のグループのいずれかの一員と定義される。このヘムタンパク質は、グロブリン、シトクロム、酸化還元酵素、又はいずれか他の補欠分子族としてヘムを含むタンパク質であることができる。ヘム含有グロブリンは、ヘモグロビン又はミオグロビンを含む。ヘム含有シトクロムは、シトクロムP450、シトクロムb 、シトクロムC1、及びシトクロムc を含む。ヘム含有酸化還元酵素は、カタラーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ハロペルオキシダーゼ、及びペルオキシダーゼを含むが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
好ましい実施態様において、酸化還元酵素はカタラーゼである。別の好ましい実施態様において、酸化還元酵素はオキシダーゼである。更なる好ましい実施態様において、酸化還元酵素はオキシゲナーゼである。別の好ましい実施態様において、酸化還元酵素はハロペルオキシダーゼである。別の好ましい実施態様において、酸化還元酵素は、ペルオキシダーゼである。より好ましい実施態様において、このペルオキシダーゼは、コプリヌス(Coprinus)の株、アルソロミセス(Arthromyces) の株、又はファネロセテ(Phanerochaete) の株から得られる。
【００６７】
なお一層好ましい実施態様において、このペルオキシダーゼは、コプリヌス・シネラウス（Coprinus cinereus)株、例えばコプリヌス・シネラウスIFO 8371、コプリヌス・マクロリザス(Coprinus macrorhizus)の株、又はアルソロミセス・ラモサス(Arthromyces ramosas) の株から得られる。別のより好ましい実施態様において、カタラーゼは、シタリジウム(Scytalidium) の株、アスペルギルスの株、又はフミコラの株から得られる。別のなお一層好ましい実施態様において、カタラーゼは、シタリジウム・テルモフィラム(Scytalidium thermophilum)の株、例えばシタリジウム・テルモフィラCBS 117.65、アスペルギルス・ニガーの株、又はフミコラ・インソレンの株から得られる。
【００６８】
第１及び第２の核酸配列は、ある核酸構築物に含まれることが好ましい。本願明細書における用語“核酸構築物”は、１本鎖又は2 本鎖のいずれかの核酸分子であり、天然の遺伝子から単離されたもの、又は天然には存在しない態様で結合し隣接する核酸セグメントを含むように修飾されたものを意味すると定義される。用語核酸構築物は、この核酸構築物が、コード配列の発現に必要な制御配列を全て含む場合は、用語「発現カセット」と同義語である。本願明細書において定義される用語“コード配列”とは、前述の制御配列の制御下にある場合に、mRNAに転写され、かつポリペプチドに翻訳される配列である。このコード配列の境界は、一般に5'- 末端の翻訳開始コドンATG 、及び3'- 末端の翻訳終結コドンによって決定される。コード配列は、DNA 、cDNA、及び組換え核酸配列を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
前述の第１の核酸配列は、第１の核酸配列のコピー数を増加するために、酵素の発現を提供するか、もしくは発現を低下する様々な態様で操作することができる。発現ベクターによっては、ベクターに挿入する以前の核酸配列の操作が望ましい、もしくは、必要であることがある。例えば、クローニング法又は突然変異誘発などを使用する核酸配列の修飾の技術は、当該技術分野において周知である。
【００７０】
本願明細書において使用される用語“制御配列”は、第1 の核酸配列のコード配列の発現に必要であるか、もしくは、利点をもたらすような成分全てを含む。この制御配列は、第1 の核酸配列に対して天然であるか、他の原料から得るか、もしくは天然又は外来の制御配列の組合せであることができる。外来の制御配列は、通常コード配列に結合している天然の制御配列に関連した第1 の核酸配列の発現を増強するために、天然の制御配列と単純に置換するか、もしくは、これに追加される。
【００７１】
このような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写終結因子を含むが、これらに限定されるものではない。制御配列の指示に従った発現に関して、本発明において使用される第1 の核酸配列は、第1 の核酸配列のコード配列の発現が、該制御配列と適合する条件下で達成されるように、制御配列に作用可能に連結されている。本願明細書において定義された用語“コード配列”は、前述の制御配列の制御下に置かれた場合に、mRNAに転写され、かつ生成物に翻訳される配列である。このコード配列の境界は、5'- 末端の翻訳開始コドン及び3'- 末端の翻訳終結コドンによって決定される。コード配列は、DNA 、cDNA、及び組換え核酸配列を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
前述の第1 の制御配列は、第1 の核酸配列の発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列である適当なプロモーター配列であることができる。このプロモーター配列は、ヘム生合成酵素の発現を媒介する転写制御配列を含んでいる。このプロモーターは、突然変異体、切断された、又はハイブリッドプロモーターを含む、選別された宿主細胞において、転写活性を示すいずれかのプロモーターであることができる。このプロモーターは、宿主細胞と同種性又は異種性のいずれかの遺伝子から得ることができる。
【００７３】
特に細菌宿主細胞において、第１の核酸配列の転写を指令する適当なプロモーターの例は、E.コリのラクトース(lac) オペロン、ストレプトマイセス・コエリコラー（streptomyces coelicolor)・アガラーセ(agarase) 遺伝子(dagA)、バシラス・サブチリス・レバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バシラス・リシェニフォルミス・α−アミラーゼ遺伝子(amyL)、バシラス・ステアロテルモフィス・マルターゼ性アミラーゼ遺伝子(amyM)、バシラス・アミノリクエファシエンス・α−アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バシラス・リシェニフォルミス・ペニシリナーゼ遺伝子(penP)、バシラス・サブチリスxylA及びxylB遺伝子、並びに真核生物のβ−ラクタマーゼ遺伝子から得られたプロモーター類（Villa-Kamaroffらの論文、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 、75:3727-3731(1978)) 、更にはtac プロモーター(DeBoer らの論文、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 、80:21-25(1983)) である。更にプロモーター類は、“組換え細菌からの有用なタンパク質”（Scientific American 、242:74-94(1980) ；及びSambrookらの論文、Molecular Cloning 、A Laboratory Manual 、第2 版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年) において説明されている。
【００７４】
糸状菌宿主細胞において第1 の核酸配列の転写の指示に適当なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエ・TAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミエハイ・アスパラギン酸プロテアーゼ、アスペルギルス・ニガー・中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー・酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリ・グルコアミラーゼ(glaA)、リゾムコール・ミエハイ・リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ・アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ・トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュランス・アセトアミダーゼ、フサリウム・オキシスポラム・トリプシン様プロテアーゼ（本願明細書に組み入れられている、米国特許第4,288,627 号に開示されている）をコードしている遺伝子から得られたプロモーター類、並びにそれらの突然変異体、切断された、及びハイブリッドプロモーターである。糸状菌宿主細胞において使用するのに特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、NA2-tpi （アスペルギルス・ニガー・中性α−アミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエ・トリオースリン酸イソメラーゼをコードしている遺伝子のプロモーターのハイブリッド）、及びglaAプロモーターである。
【００７５】
酵母宿主において、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエ・エノラーゼ(ENO-1) 遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ・ガラクトキナーゼ遺伝子(GAL1)、サッカロミセス・セレビシエ・アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ADH2/GAP)、及びサッカロミセス・セレビシエ・3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romanos らの論文（Yeast 、8:423-488(1992) ）に記載されている。哺乳類の宿主細胞において有用なプロモーターは、シミアンウイルス40(SV4O)、ラウス肉腫ウイルス(RSV) 、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス(BPV) などの、ウイルス性プロモーターを含む。
【００７６】
前述の第1 の制御配列は、更に転写を終結するために該宿主細胞によって認識された配列である、転写終結因子配列であることができる。この終結配列は、第1 の核酸配列の3'末端に操作できるように連結される。この終結配列は、第1 の核酸配列に対して天然であるか、もしくは、他の原料、すなわち、外来の終結因子配列から得ることができる。選別された宿主細胞において機能するあらゆる終結因子が、本発明において有用であろう。
【００７７】
糸状菌宿主細胞について好ましい終結因子は、アスペルギルス・オリザエ TAKA アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランス・アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー・α−グルコシダーゼ、及びフサリウム・オキシサポラム・トリプシン様プロテアーゼをコードしている遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のための好ましい終結因子は、サッカロミセス・セレビシエ・エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ・シトクロムC(CYCl) 、又はサッカロミセス・セレビシエ・グリセルアルデヒド-3- リン酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のために有用な他の終結因子は、前述のRomanos らの論文（1992年）に記されている。終結因子配列は、哺乳類宿主細胞ついて、当該技術分野において周知である。
【００７８】
この第1 の制御配列は、更に宿主細胞による翻訳にとって重要であるmRNAの非翻訳領域である、適当なリーダー配列であることができる。このリーダー配列は、第1 の核酸配列の5'末端に操作できるように連結している。このリーダー配列は、第1 の核酸配列に対して天然であるか、もしくは、他の原料、すなわち、外来のリーダー配列から得ることができる。選別された宿主細胞において機能するあらゆるリーダー配列が、本発明において有用であろう。
【００７９】
糸状菌宿主細胞にとって好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエ・TAKAアミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエ・トリオースリン酸イソメラーゼをコードしている遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞にとって適当なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエ・エノラーゼ(ENO-l) 遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ・3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ・α- 因子、及びサッカロミセス・セレビシエ・アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ADH2/GAP)から得られる。
【００８０】
第１の制御配列は、更に第１の核酸配列の3'末端に作用可能に連結され、かつ転写された際に宿主細胞によって認識され、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を添加するような配列である、ポリアデニル化配列であることができる。このポリアデニル化配列は、第1 の核酸配列に対して生来的であるか、又は、他の原料、すなわち、外来のポリアデニル化配列から得ることができる。選択された宿主細胞において機能するあらゆるポリアデニル化配列が、本発明において有用であろう。
【００８１】
糸状菌宿主細胞にとって好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザエ・TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランス・アントラニル酸シンターゼ、及びアスペルギルス・ニガー・α−グルコシダーゼをコードしている遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞にとって有用なポリアデニル化配列は、Guo 及びSherman の論文（Molecular Cellular Biology、15:5983-5990(1995)）に記載されている。ポリアデニル化配列は、哺乳類宿主細胞については、当該技術分野において周知である。
【００８２】
第１の制御配列は更に、発現されたタンパク質のアミノ末端に連結し、タンパク質を特定の細胞コンパートメントへの局在させるアミノ酸配列をコードしているシグナルペプチドコード領域であることができる。このシグナルペプチドコード領域は、第1 の核酸配列に対して生来的であるか、もしくは、他の原料から得ることができる。第1 の核酸配列のコード配列の5'末端は、局在化されるタンパク質をコードしているコード領域のセグメントに、翻訳読み枠に天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を本来備えることができる。あるいは、このコード配列の5'末端は、局在化されたタンパク質をコードしているコード配列の部分に対して外来であるような、シグナルペプチドコード領域をコードしている核酸を含むことができる。選択された宿主細胞においてタンパク質の局在化をもたらすことが可能なあらゆるシグナルペプチドコード領域が、本発明において有用であろう。
【００８３】
更に第１の制御配列は、生化学活性を有する成熟ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードしているプロペプチドコード領域であることができる。得られたポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は一部の場合はチモーゲン）として公知である。プロ酵素は一般に不活性であり、かつプロ酵素由来のプロペプチドの触媒的又は自己触媒的切断により、成熟活性ポリペプチドに転換され得る。本願明細書において生化学的活性のあるポリペプチドとは、その天然の対応物の生化学活性を発揮する活性型で産生されたポリペプチドと定義される。
【００８４】
プロペプチド配列は、ヘム生合成酵素をコードしている第1 の核酸配列に対して生来的であるか、又は、他の原料、すなわち外来プロペプチド配列から得ることができる。プロペプチドをコードしている核酸配列は、バシラス・サブチリス・アルカリ性プロテアーゼ(aprE)、バシラス・サブチリス・中性プロテアーゼ遺伝子(nprT)、サッカロミセス・セレビシエ・α−因子、及びミセリオフソラ・サーモフィラム・ラッカーゼをコードしている遺伝子から得ることができる。
【００８５】
好ましい実施態様において、第2 の核酸配列は、宿主細胞に導入され、1 又は複数の第2 の制御配列に作用可能に連結されている。この第2 の制御配列は、ポリペプチドをコードしている第2 の核酸配列に対して生来的であるか、もしくは、外来原料から部分的又は全体的に得ることができる。この外来制御配列は、通常コード領域に結合される生来の制御配列に関連した所望のポリペプチドの増強された産生を得るために、天然の制御配列と簡単に置換することができる。第2 の制御配列は、先に第1 の制御配列に関連して例示した制御配列のいずれかであることができる。
【００８６】
細胞の分泌経路に発現されたポリペプチドを向けることができるシグナルペプチドコード配列の場合、いくつかの可能性がある。細菌宿主細胞にとっての効果的なシグナルペプチドコード領域は、バシラス・NCIB 11837由来のマルトース性アミラーゼ遺伝子、バシラス・ステアロテルモフィス・α−アミラーゼ遺伝子、バシラス・リシェニフォルミス・サブチリシン遺伝子、バシラス・リシェニフォルミス・β−ラクトアミナーゼ、バシラス・ステアロテルモフィス・中性プロテアーゼ遺伝子(nprT, nprS, nprM)、並びにバシラス・サブチリス・PrsA遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。更なるシグナルペプチドは、Simonen 及びPalva の論文（Microbiological Reviews 、57:109-137(1993)）に記載されている。
【００８７】
糸状菌宿主細胞のための効果的シグナルコード領域は、アスペルギルス・オリザエ・TAKAアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニガー・中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコール・ミエハイ・アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、フミコラ・ラヌギノサ・セルラーゼ遺伝子、又はリゾムコール・ミエハイ・リパーゼ遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【００８８】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ・α−因子及びサッカロミセス・セレビシエ・インベルターゼのための遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、前述のRomanos らの論文（1992年）に記載されている。
【００８９】
これらの第1 及び第2 の核酸配列は、当該技術分野において周知の方法を用いて、突然変異した宿主細胞に導入することができる。例えば、これらの配列は、これらの配列の1 又は複数のコピーが単一の標的配列及び／又は複数の標的配列に組込まれるような相同又は非相同的組換えによって、宿主ゲノムに導入しかつ組込むことができる。あるいは、これらの配列は、非組込み発現ベクター、例えば自律複製染色体外プラスミドとして、導入しかつ維持することができる。
【００９０】
これらの第１及び第２の核酸配列は、両方の核酸配列の選択を強制するために、好ましくは同じ核酸構築物に含まれるが、これらは異なる核酸構築物に含まれてもよい。各核酸構築物は、正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えにより、組込みを指示するために、組込み要素を含むことができる。正確な位置への組込みの可能性を増すために、この組込み要素は、例えば100 〜1,500 塩基対、好ましくは400 〜1,500 塩基対、最も好ましくは800 〜1,500 塩基対のような、十分な数の核酸を含むことが好ましく、これは、相同的組換えの可能性を増強するために、対応する標的配列と相同性が高い。この組込み要素は、宿主細胞のゲノムの標的配列と相同であるいずれかの配列であることができる。更に、この組換え要素は、非コード又はコードの核酸配列であることができる。他方で、各核酸構築物は、非相同的組込みにより、宿主細胞のゲノムに組込むことができる。
【００９１】
この核酸構築物は、適当なベクターに挿入することができるか、又は、第１及び第２の核酸配列コード領域を、既に制御配列を含むベクターに直接挿入することができる。この第1 及び第2 の核酸配列又は構築物は、個別のベクター上に含まれることもできる。これらのベクターは、組換えDNA 法を都合良く施すことができ、かつ本発明の核酸配列の発現をもたらすことができるような、いずれかのベクターであることができる。ベクターの選択は、典型的にはベクターとベクターが導入される宿主細胞との適合性によって決まるであろう。ベクターは、自律複製ベクター、すなわち染色体外の物(entity)に存在するベクターであることができ、その複製は、染色体の複製とは無関係であり、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソーム、又は人工の染色体である。あるいはベクターは、細胞に導入された場合に、ゲノムに組込まれ、かつそれが組込まれた染色体（複数）と共に複製されるものであることができる。このベクターシステムは、単一のベクター、又は宿主細胞のゲノムへ導入されたDNA 全体を共に含む2 個以上のベクターであることができる。
【００９２】
自律複製に関するベクターは、更に注目の宿主細胞においてベクターを自律的に複製することができるような複製起点を含むことができる。細菌性の複製起点の例は、E.コリにおける複製を可能にするプラスミドpBR322、pUC19 、pACYC177、及びpACYC184、並びにバシラス・において複製を可能にするpUB110、pE194 、pTA106O 、及びpAM β1 の複製起点である。酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例は、2 ミクロン複製起点、CEN6及びARS4の組合せ、並びにCEN3及びARS1の組合せである。複製起点は、宿主細胞において、その機能的温度感受性を生じる突然変異を有するものであることができる（例えば、Ehrlich の論文を参照のこと、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 、75:1433(1978))。
【００９３】
これらの核酸構築物、プロモーター、ターミネーター及び他の要素の連結、並びにそれらの複製に必要な情報を含む適当なベクターへの挿入に使用する方法は、当業者には周知である（例えば、前述のSambrookらの論文(1989)を参照のこと）。
【００９４】
細菌性宿主細胞の形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、Chang 及びCohen の論文を参照のこと、Molecular General Genetics、168:111-115(1979) ）、コンピテント細胞の使用（例えば、Young 及びSpizizinの論文、Journal of Bacteriology 、81:823-829(1961)、又はDubnau及びDavidoff-Abelsonの論文、Journal of Molecular Biology、56:209-221(1971)を参照のこと) 、電気穿孔法（例えば、Shigekawa 及びDower の論文を参照のこと、Biotechniques 、6:742-751(1988))、又は接合（例えば、Koehler 及びThorneの論文、Journal of Bacteriology 、169:5771-5278(1987) を参照のこと) によってもたらすことができる。
【００９５】
糸状菌細胞へ核酸配列を導入する当該技術分野における標準的方法は、プロトプラストの形成、このプロトプラストの形質転換、及びそれ自身公知の方法による形質転換されたプロトプラストの細胞壁の再形成に関する。アスペルギルス宿主細胞の形質転換の適当な方法は、欧州特許第EP 238 023号及びYeltonらの論文（Proceedings of the National Academy of Sciences USA 、81:1470-1474(1984)）に開示されている。フサリウム種の形質転換の適当な方法は、Malardier らの論文（Gene、78:147-156(1989)）又は同時係属出願である米国特許出願第08/269,449号に記されている。
【００９６】
酵母は、Becker及びGuarenteの論文（In Abelson, J.N.及びSimon, M.I. 編集、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology 、Methods in Enzymology 、194 巻、182-187 頁、Academic Press社、ニューヨーク）；Ito らの論文、Journal of Bacteriology 、153:163(1983) ；及び、Hinnenらの論文、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 、75:1920(1978) に記された方法を用いて形質転換することができる。
哺乳類細胞は、Graham及びVan der Ebの論文(Virology 、52:546(1978)) に記されたリン酸カルシウム沈殿法を用いた直接取りこみにより形質転換することができる。
【００９７】
本発明の方法において、細胞は、当該技術分野において公知の方法を用い、ポリペプチド及びヘム生合成酵素の産生に適した栄養培地において培養される。例えば、細胞は、適当な培地の中及びポリペプチドの発現及び／又は単離を可能にするような条件下で行われる、振盪フラスコ培養、実験室又は工場の発酵槽中での小規模又は大規模発酵（連続発酵、バッチ発酵、供給バッチ(fed-batch) 発酵、又は固相(solid state) 発酵を含む）によって培養することができる。
【００９８】
この培養は、当該技術分野において公知の方法を用いて、炭素及び窒素源、並びに無機塩を含有する、適当な栄養培地中で行われる（例えば、Bennett, J.W. 及びLaSure, L.編集、More Gene Manipulations in Fungi、Academic Press社、CA、1991年を参照のこと）。適当な培地は、商業的業者から入手するか、もしくは、公表された組成を用いて調製することができる（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログを参照のこと）。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合は、このポリペプチドを培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されない場合は、これは細胞の溶菌液から回収される。
【００９９】
これらのポリペプチドは、当該技術分野において公知のポリペプチドに特異的な方法を用いて検出することができる。これらの検出法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の産生、又は酵素基質の消失を含む。例えば、ポリペプチドが酵素活性を持つ場合は、ポリペプチドの活性を測定するために、酵素アッセイを使用することができる。
【０１００】
得られるポリペプチドは、当該技術分野において公知の方法により回収することができる。例えば、このポリペプチドは、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿を含むが、これらに限定されるものではない常法に従い、栄養培地から回収される。回収されたポリペプチドは、その後更に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのような、様々なクロマトグラフィー法により精製される。
【０１０１】
本発明は、更にヘム欠損突然変異細胞を破壊する方法に関する。この方法は、下記の工程を含む：
(a) ヘム欠損突然変異細胞中の遺伝子又はその一部を含む第3 の核酸配列、及び該遺伝子又はその一部内の第１の核酸配列を含む核酸構築物を導入することにより、ヘム欠損突然変異細胞中の遺伝子を置換し、ここでこの第1 の核酸配列は、ヘム生合成酵素をコードし、かつこの第1 の核酸配列の導入が、ヘムを生成することが可能な突然変異体を生じさせ；そして
(b) ヘム非含有及びヘム中間体非含有の培地において、第１の核酸配列の発現に適した条件下で、第１及び第３の核酸配列を含む細胞を培養する。
【０１０２】
細胞に対し外来性の遺伝子の破壊は、前述の方法のような遺伝子中の核酸残基の導入、欠失又は置換のような、当該技術分野において周知の方法を用いて達成することができる。第３の核酸配列は、標的遺伝子への組込みが、遺伝子を破壊し、発現を低下または除去するような、いずれかの配列（欠失した又は標識された対立遺伝子を生成することが望ましい）であることができる。この第３の配列は、前述の第2 の核酸配列のいずれかのサブシーケンス（subsequence)であることができる。外来性遺伝子への組込みを確実にするために、この構築物は、先に記した組込み要素を含むべきである。
【０１０３】
本発明は更に、酸化的リン酸化に必須の少なくとも1 種の遺伝子の修飾を含む、第1 の核酸配列をを含有する細胞の呼吸欠損突然変異体で、ここでこの突然変異体が、同じ条件下で培養された細胞と比べて、呼吸欠損であるような突然変異体に関する。好ましい実施態様において、この呼吸欠損突然変異体は、ヘム欠損である。
【０１０４】
本発明は更に、細胞の呼吸欠損突然変異体を得る方法に関し、これは、(a) 酸化的リン酸化に必須の遺伝子の少なくとも1 種の修飾を含む核酸配列を、該細胞に導入し；そして、(b) 該核酸配列を含む工程(a) 由来の細胞の突然変異体を同定することを含み、ここでこの突然変異体が、該細胞と同じ条件下で培養した場合に、呼吸欠損である。好ましい実施態様において、この突然変異体は、ヘム欠損である。
本発明は、以下の実施例により更に説明されるが、これらは本発明の範囲を限定するものとして構成されるものではない。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：アスペルギルス・オリザエ株A1560 ゲノムDNA の抽出
アスペルギルス・オリザエ株A1560(IFO 4177) を、0.5 ％酵母抽出液−2 ％グルコース(YEG) 培地25mlの中で、32℃で24時間、250rpmで増殖させた。その後菌糸体を、Miracloth （カルビオケム社、ラ・ホヤ、CA) を通して濾過することにより収集し、そして10mMトリス−1mM EDTA(TE)緩衝液25mlで洗浄した。過剰な緩衝液を菌糸体から抜き取り、引き続き液体窒素中で凍結した。この凍結した菌糸体を、電動式コーヒーミル(grinder) 中で細かい粉末に粉砕し、かつ粉末を、使い捨てのプラスチック製遠心管中のTE緩衝液20ml及び20％(w/v) ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)5mlに加えた。この混合物を、混合を確実にするためにゆっくりと数回逆さまにし、かつ等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25:24:1 v/v/v) で 2回抽出した。
【０１０６】
酢酸ナトリウム(3M 溶液) を添加し、最終濃度を0.3Mとした後、更に2.5 倍容の氷冷したエタノールを添加し、核酸を沈殿した。次に、管を15,000×g で30分間遠心分離することによって、核酸をペレットとした。このペレットを30分間風乾し、その後、TE緩衝液0.5ml に再懸濁した。DNase −非含有リボヌクレアーゼA を添加して、濃度を100 μg/mlとし、この混合物を37℃で30分間インキュベーションした。その後、プロテイナーゼK を濃度200 μg/ml添加し、この混合物を更に1 時間37℃でインキュベーションした。最後に、この混合物を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25:24:1 v/v/v) で 2回抽出し、その後DNA を先に記したように酢酸ナトリウム及びエタノールで沈殿した。このDNA ペレットを、真空で乾燥し、TE緩衝液に再懸濁し、かつ使用時まで4 ℃で保存した。
【０１０７】
実施例２：プラスミドpSE04 の構築
実施例１に記されたものと同じ方法を用いて、アスペルギルス・ニジュランス株A26 (Fungal Genetics Stock Center 、カンサスシティー、KS）からゲノムDNA を得た。アスペルギルス・ニジュランスA26 ゲノムDNA を含む増幅反応液から得たPCR 断片の連結により、プラスミドpSE04 を構築した。
【０１０８】
この増幅反応液は、以下の成分を含んだ：アスペルギルス・ニジュランスA26 ゲノムDNA を50ng、dATP、dCTP、dGTP及びdTTP（ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、IN）を各々100 μM 、プライマーALAS3d 5' TTTATGATGGAGGCCCTTCTCCAGCAGTCTC 3'（配列番号：5)及びALAS4e 5' CTATGCATTTAAGCAGCAGCCGCGACTGG 3'（配列番号：6)を50ピコモル、Taq DNA ポリメラーゼ（パーキンエルマー社、ブランチバーグ、NJ）を2 ユニット、及び1 ×Taq DNA ポリメラーゼ緩衝液（パーキンエルマー社、ブランチバーグ、NJ）。
【０１０９】
この反応液を、95℃で1 分間、55℃で1 分間、及び72℃で90秒間の各30サイクルにプログラムされたパーキンエルマーサーマルサイクラー（パーキンエルマー社、ブランチバーグ、NJ) 中でインキュベーションした。2kb のPCR 産物を、40mMトリス酢酸−1mM EDTAニナトリウム(TAE) 緩衝液による1.1 ％低融点アガロースゲル（FMC 社、ロックランド、MB）を用いて電気泳動した後、切り出して単離し、かつ製造業者の指示に従いpCRII ベクター（インビトロゲン社、サンディエゴ、CA）にサブクローニングし、pSE04 を生成した（図１）。
【０１１０】
実施例３：アスペルギルス・オリザエ株A1560 のDNA ライブラリー及びALA シンターゼ(hemA)クローンの同定
アスペルギルス・オリザエ株A1560 ゲノムDNA ライブラリーを、製造業者の指示に従ってバクテリオファージクローニングベクターλZipLox（ライフテクノロジー社、ゲティスバーグ、MD）を用い、組換えバクテリオファージのプレーティング及び精製のための宿主としてE.コリ Y1090ZL細胞を、並びに個々のpZL1-hemA クローンの切り出しにはE.コリ DH1OBzip を用いて構築した。
【０１１１】
実施例１において記したように調製した細胞DNA 全体を、Tsp5O9I により部分的に消化し、かつ1 ％アガロースゲルで、50mMトリス−50mMホウ酸−1mM EDTAニナトリウム(TBE) 緩衝液によりサイズ分画した。サイズ範囲4 〜7kb に移動したDNA 断片を切り出し、かつPrep-a-Gene 試薬（バイラドラボラトリー社、ヘラクレス、CA）を用いてゲルから溶出した。この溶出したDNA 断片を、EcoRI で切断しかつ脱リン酸化したλZipLoxベクターアームで連結し、かつこの連結混合物を、市販のパッケージング抽出物（ストラータジーン社、ラホヤ、CA）を用いて、パッケージングした。このパッケージングしたDNA ライブラリーを、E.コリYlO9OZL 細胞に導入し、かつ増幅した。増幅されなかったゲノムライブラリーは1 ×106 pfu/mlを含む。
【０１１２】
バクテリオファージDNA の7 ×104 プラークは、2 枚の円形のNytran Plus 膜（シュレイヒャー・シュエル社、キーン、NH）に移し、かつ実施例2 に記載されたプラスミドpSEO4 由来のアスペルギルス・ニジュランスhemAゲノムDNA のPCR 増幅により調製したジゴキシゲニン(DIG) で標識したプローブでプロービングした。この増幅反応液は、以下の成分を含んだ：1 ×DIG プローブ合成混合液（ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、IN）、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPを各々100 μM 、実施例2 に記されたプライマーALAS3d及びプライマーALAS4eを50ピコモル、Taq DNA ポリメラーゼを2 ユニット、及び1 ×Taq DNA ポリメラーゼ緩衝液。
【０１１３】
この反応液を、95℃で1 分間、55℃で1 分間、及び72℃で2 分間の各30サイクルにプログラムしたパーキンエルマーサーマルサイクラー中でインキュベーションした。変性したプローブを、このハイブリダイゼーション緩衝液に2ng/mlの濃度で添加し、かつプレハイブリダイゼーションした膜と一晩インキュベーションした。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを、5 ×SSC 、0.1 ％サルコシル、0.02％SDS 、1 ％Genius阻害剤（ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、IN）、及び30％ホルムアルデヒドの中で、42℃で行った。これらの膜を、5 ×SSC-0.1 ％SDS で2 回洗浄し、引き続き2 ×SSC-0.1 ％SDS で2 回洗浄した。各洗浄は、室温で15分かけて行った。
【０１１４】
洗浄した膜を、室温で約2 時間コダックX-OMAT AR フィルムに露し、その後コニカQX-70 自動フィルム処理装置で製造業者の指示に従い現像した。初代プラークを精製し、かつ二次スクリーニングを行った。5 種のクローンを同定し、かつ製造業者の指示に従いpZL 誘導体に切断した（ベセスダリサーチラボラトリー社、ゲイサースバーグ、MD）。これらのpZL 誘導体を、E.コリDH5 αのpSEll 、pSEl3 、pSEl5 、pSEl7 、及びpSE20 と称した。これらのクローンは、図2 に示した制限地図の4.2kb 領域に重なりかつ長さが及ぶことがわかった。
【０１１５】
実施例４：5-アミノレブリン酸シンターゼ(hemA)プローブによるアスペルギルス・オリザエ株A1560 ゲノムDNA のサザンハイブリダイゼーション
実施例1 に記したように調製したアスペルギルス・オリザエ株A1560 ゲノムDNA(10μg)を、BamHI 又はEcoRI のいずれかで消化した。これらの断片を、1 ％アガロース-TBEゲル電気泳動により分離した。DNA を、製造業者の指示に従いTurboBlot 装置（シュレイヒャーシュエル社、キーン、NH）を用い、0.4N NaOH 中で、Nytran Plus 膜に転移した。この膜を、Hybaid炉（ラブネット社、ウッドリッジ、NJ）の中で、5 ×SSC 、0.1 ％サルコシル、0.02％SDS 、1 ％Genius阻害剤、及び50％ホルムアルデヒドの中で、42℃で、プレハイブリダイゼーションした。
【０１１６】
ハイブリダイゼーションは、hemAクローンpSE17 を鋳型とし、プライマーhemA5' 5'-TCATTTAAATGATGGAGTCTCTTCTCC-3'( 配列番号：7)及びプライマーhemA3' 5'-TCTTAATTAATCAGCTCACATGCGGG-3'(配列番号：8)を用いた以外は、実施例3 に記されたPCR 増幅によって生成したDIG-標識したhemAプローブにより達成した。DIG-標識したhemAプローブ(1ngプローブ/ml 溶液) を、新鮮なハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、かつ前述の膜を一晩42℃インキュベーションした。引き続き、この膜を、2 回、5 ×SSC −0.1 ％SDS で、各々室温で15分間洗浄し、その後同じ条件で、2 ×SSC −0.1 ％SDS で2 回洗浄した。この洗浄した膜を、コダックX-OMAT AR フィルムを、室温でおよそ2 時間露し、その後コニカQX-70 自動フィルム処理装置を製造業者の指示に従って用いて現像した。
【０１１７】
アスペルギルス・オリザエhemAプローブによるアスペルギルス・オリザエゲノムDNA のサザンブロットハイブリダイゼーションは、１個の遺伝子コピー数に一致したハイブリダイゼーションシグナルを示した。BamHI のレーンに認められた1.7kb バンドを、制限地図から予想した（図２）。
【０１１８】
実施例５：アスペルギルス・オリザエA1560 の5-アミノレブリン酸シンターゼ(hemA)遺伝子の特徴
実施例3 に示したE.コリDH5 α pSEl7に、以下の方法に従ったDNA 塩基配列決定を行った。DNA 塩基配列決定を、M13 リバース(48)プライマー及びM13 フォワード(-20) プライマー（ニューイングランドバイオラド社、ビバリー、MA）並びに配列決定されるDNA に対する独自のプライマーを用いたダイ−ターミネーター化学(Giesecke らの論文、Journal of Virol Methods、38:47-60(1992)) によるプライマーウォーキング法を用いて、両鎖について、アプライドバイオシステムモデル373A自動DNA シークエンサー（アプライドバイオシステム社、フォスターシティー、CA）を用いて行った。
【０１１９】
クローン化された遺伝子のヌクレオチド配列は、図3 に示された1911個のヌクレオチドのオープンリーディングフレームを明らかにした( 配列番号：1)。このコード配列は、cDNAクローニング及び配列分析によって確認したところ、いかなるイントロンも含まなかった。このことは5'末端に1 個のイントロンを含むアスペルギルス・ニジュランスhemA遺伝子とは対照的であった(Bradshaw らの論文、Current Genetics、23:501-507(1993)) 。
アスペルギルス・オリザエ株Al560 遺伝子産物の推定されたアミノ酸配列は、図3 に示した( 配列番号：2)。このヌクレオチド配列は、分子量68kDa である、アミノ酸636 個の予想されたタンパク質をコードしている。この酵素はミトコンドリアに位置しているので、そのN-末端は、ミトコンドリアのリーダー配列を含むことが予想された。実際に、この初めの35個のアミノ酸は、セリン、トレオニン、リシン、及びアルギニン残基が豊富であり、ミトコンドリアのリーダーとしての機能に一致している。
【０１２０】
実施例６：PCR によるゲノムポルホビリノーゲンシンターゼ遺伝子(hemB)プローブの作成
縮重したPCR プライマーを、アスペルギルス・オリザエに由来する126bp hemB断片に隣接するアミノ酸配列（Jesper Vind の論文、1994年、Ph.D. Dissertation、University of Copenhagen、コペンハーゲン、デンマーク) 、並びに酵母及びヒトのhemBクローンの相同領域(Myersらの論文、Journal of Biological Chemistiy 、262:16822-16829(1987) ；Wetmurらの論文、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 、83:7703-7707(1986)) を基にデザインした。これらのオリゴヌクレオチドプライマーを、アプライドバイオシステムモデル394 DNA/RNA シンセサイザーを用いて合成した。以下に示したセンス及びアンチセンスプライマーを用いて、鋳型としてpJVi6O( 前述のVindの論文、(1994)) を用いて、hemB断片をPCR 増幅した。
【０１２１】
センス：5'-GT(AGCT)GC(AGCT)CC(AGCT)(AT)(CG)(AGCT)GA(CT)ATGATGGA-3'( 配列番号：9)
アンチセンス：5'-GC(AG)TC(AGCT)CG/T(AG)AA(AGCT)CC(AG)TA-3'( 配列番号：10)
【０１２２】
このPCR 反応液(50 μl)は、10mMトリス-HCl pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgC12 、 0.01 ％(w/v) ゼラチン、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPを各々200 μM 、500ng のpJVi6O、及び前述のPCR プライマーを各々50ピコモル含んだ。この反応液を、95℃で3 分間インキュベーションし、かつ80℃に冷やした。その後Taq ポリメラーゼ5 ユニットを添加した。この反応液を、95℃で30秒間、45℃で1 分間、及び72℃で1 分間で各35サイクルにプログラムしたパーキンエルマー9600サーマルサイクラーにおいてインキュベーションした。最後のサイクルの後、反応液を72℃で5 分間インキュベーションした。予想された126bp のhemB PCR産物を、pCRII ベクターにクローニングし、プラスミドpAJOO5-1を生成した( 図4)。
【０１２３】
実施例７：アスペルギルス・オリザエ株A1560 DNA ライブラリー及びポルホビリノーゲンシンターゼ(hemB)クローンの同定
アスペルギルス・オリザエ株A1560 ゲノムDNA ライブラリーを、実施例3 のように構築した。
【０１２４】
プラーク8 ×104 のバクテリオファージDNA を、2 枚の円形Nytran Plus 膜（シュレイヒャー・シュエル社、キーン、NH）に移し、かつMertz 及びRashtchianの論文(Analytical Biochemistry、221:160-165(1994))に従って、pAJ005-1のhemB断片（実施例6 を参照のこと）を増幅することによって得た、32P-標識したPCR 産物でプロービングした。この増幅反応液(50 μl)は、以下の成分を含んだ：10mMトリス-HCl pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2 、0.01％(w/v) ゼラチン、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPを各々0.04mM、32P-dCTP 5μl （3000Ci/mmol 、3.3 μM ；アマシャム社、アーリントンハイツ、IL) 、並びにセンスプライマー5'-GTGGCTCCGAGTGATAT-3'(配列番号：11) 及びアンチセンスプライマー5'-GCATCGCGAAAAGGACCG-3'( 配列番号：12) を各々50ピコモル。
【０１２５】
この反応液を、95℃で3 分間加熱し、その後Taq ポリメラーゼ5 ユニットを添加した。その後この反応液を、95℃で1 分間、55℃で1 分間、及び72℃で1 分間の各30サイクルにプログラムしたパーキンエルマーサーマルサイクラー中でインキュベーションした。この反応液を、セファデックスG50 カラム（ファルマシア社、アラメダ、CA）を通し、取り込まれていないヌクレオチドを除去し、かつその後変性し、ハイブリダイゼーション緩衝液に添加した。変性したプローブ(106cpm/ml) を、ハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、かつプレハイブリダイゼーションした膜と一晩インキュベーションした。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを、5 ×SSC 、50mMリン酸ナトリウムpH7 、5 ×デンハルト溶液、0.01％(w/v)SDS、5mM EDTA pH8、10μg/ml変性したサケ精巣DNA 、及び50％ホルムアルデヒドの中で、42℃で行った。
【０１２６】
これらの膜を、42℃で15分かけて、0.1 ×SSC 、0.1 ％SDS で4 回洗浄した。陽性シグナルを発する初代プラークを、二次スクリーニングし、製造業者の指示に従い精製した。陽性シグナルを発する10種のゲノムクローンを、製造業者の指示に従い、pZL 誘導体として、λZipLoxベクターから切り出し（ベセスダリサーチラボラトリー社、ベセスダ、MD）、並びにHattori 及びSakakiの論文(Analytical Biochemistry、152:232-237(1986))の方法に従い塩基配列決定した。このpZL 誘導体を、pAJ007-1からpAJ007-10 と称した。クローンE.コリDH5 αのpAJ007-6は、制限地図を基にした3.7kb ゲノム断片を含み、更に分析した。
【０１２７】
実施例８：ポルホビリノーゲンシンターゼ(hemB)遺伝子の特性決定
実施例7 に記したE.コリDH5 α pAJOO7-6 について、実施例7 に記した方法に従い、DNA 塩基配列決定を施した。
【０１２８】
クローニングしたアスペルギルス・オリザエA1560 hemB遺伝子のヌクレオチド配列は、図5 に示した推定分子量40kDa の374 個のアミノ酸のポリペプチド（配列番号：4 ）をコードしている、図5 に示した1308個のヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（配列番号：3 ）を明らかにした。このヌクレオチド配列は、コンセンサス配列のスプライシング部位に挟まれた48bpの予想されるイントロンを含み、かつUnklesの論文(1992 年、Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi 、第2 章、J.R. Kinghorn 及びG. Turner 編集、Blackie Academic and Professional Publications) によって予想された内部コンセンサス配列を含む。
【０１２９】
3'スプライシング部位(TAG) は、Met の254bp 下流に位置し、5'スプライシング部位(GTCCGC)は、3'スプライシング部位の46bp上流に位置し、かつ内部コンセンサス配列(TCTAAC)は、5'スプライシング部位の30bp下流に位置した。この5'非翻訳領域は、-377及び-233の位置に2 個のCAATモチーフを含み、かつ転写調節において重要な役割を果たす(Gurr らの論文、1987年、In Kinghorn, J.R. ( 編集) 、Gene Structure in Eukaryoric Microbes 、93-139頁、IRL Press 、オックスフォード) 。これに加えて、いくつかの予想されるTATA様ボックスが、3'非翻訳領域に見つけられた(-117 、-208、-650) 。予想されたように、hemBは、植物以外の生物では細胞質であるので、これはN-末端にリーダー配列を含むようには見えなかった(Bottemley及びMuller-Eberhard の論文、Seminars in Hematology、25:282-302(1988)) 。
【０１３０】
実施例９：hemAΔ::pyrG対立遺伝子を含むpSF52 の構築
プラスミドpSES2 を、図6 に示したようにhemAΔ::pyrG対立遺伝子を含むように構築した。特に、アスペルギルス・オリザエpyrG遺伝子並びに5'及び3'の両方のフランキングDNA を含み、pyrGマーカーの組換え及び除去を促進するようにデザインされた直接反復を含む4.1kb 断片を、Expand PCRキット（ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、IN）を製造業者の指示に従って使用し、そして以下に示したプライマーhemAdel.A 及びhemAdel.B を用い、pJaL394 から増幅した：
hemAdel.A ：5'-ATCCATTGAAGCATCCAGGGTTATTGTCTC-3'( 配列番号：13)
hemBdel.A: 5'-GGATTGACGAAGCAGAGGATGACGATGAGC-3'(配列番号：14)
【０１３１】
このExpand PCR増幅は、94℃で2 分間、62℃で30秒間、及び68℃で3 分間の1 サイクル；各サイクルの後30秒間の延長を伴う、94℃で15秒間、62℃で30秒間、及び68℃で3 分間の10サイクル；94℃で15秒間、62℃で30秒間、及び72℃で5 分間の15サイクル；並びに、4 ℃の浸漬サイクルにプログラムし、パーキンエルマーGeneAmp PCR システム9600において実施した。
【０１３２】
この産物は、製造業者の指示に従いpCRII （インビトロゲン社、サンディエゴ、CA）にクローニングし、pSE4O を生成し、かつそのオープンリーディングフレーム(ORF) のヌクレオチド配列を、2 種の独立したクローンにおいて確認した。pyrG遺伝子を含むpSE40 のEcoRI 断片を、pSEl7 のEcoRI 部位に連結し、これをhemA遺伝子の3'フランキング配列のpyrG遺伝子に置き、pSE4l を生成した。pSE4l は、平滑末端を生じる酵素MluNI 及びEco47IIIで消化し（hemA ORFの445bp 断片から取り出す）、ゲルで精製し、かつ再度連結し、プラスミドpSE48bを生成した。この欠失を含むhemA遺伝子の領域を塩基配列決定し、hemAΔ::pyrG対立遺伝子の性質を確認した。
【０１３３】
図７に示されたように、配列決定は、hemA欠失が、該遺伝子のコード配列を除去し、かつリーディングフレームを破壊することを明らかにした( 配列番号：15及び16) 。この対立遺伝子は、製造業者の指示に従いExpand PCRキットを用い、かつ以下に示したプライマーSE48up及びSE48dwn を用いて、前述と同じ条件下で、pSE48bからPCR 増幅した：
SE48up：5'-AATGGTCAAAACTGGCTCCTAC-3'( 配列番号：17)
SE48dwn:5'-TGTACCTGTTCTTGGGCTGTC-3'(配列番号：18)
【０１３４】
その後このPCR 増幅した断片を、pCR2.1（インビトロゲン社、サンディエゴ、CA）にサブクローニングし、pSE52 を生成し、制限エンドヌクレアーゼSacI及びNotIによりhemAΔ::pyrG対立遺伝子を含む6.3kb 断片の単離を行った。6.3kb のSacI-NotI 断片は、hemA遺伝子のゲノムコピーによる相同組換えを促進する、約700bp の5'及び3'の両方のフランキングDNA を含んでいた。
【０１３５】
実施例10：hemAΔ::pyrG対立遺伝子断片によるアスペルギルス・オリザエの形質転換
野生型hemA遺伝子をhemAΔ::pyrG欠失対立遺伝子と置換するために、アスペルギルス・オリザエHowB425 を、SacI-NotI で切断された6.3kb のhemAΔ::pyrG断片約20μg で形質転換した。この形質転換は、プロトプラストにより、濃度2 ×107 プロトプラスト／mlで行った。プロトプラスト100 μl を、34℃で、10μg DNA 、及び60% PEG4000-10mM HEPES-10mM CaCl2 溶液200 μl と共に、30分間インキュベーションした。
【０１３６】
SPTC(40% PEG4000、0.8Mソルビトール、0.05M トリスpH8.0 、0.05M CaCl2)3ml を添加し、かつこのプロトプラストを、2.5mM 又は5mM のいずれかの5-アミノレブリン酸を補った最小培地の上に直接接種した。5-アミノレブリン酸栄養要求性を、5-アミノレブリン酸非含有最小培地上での初代形質転換体の34℃での増殖を評価することによって決定した。これらの条件下での増殖が不十分と判定された菌株は、単一のコロニーの単離のために線状に接種した。この精製した単一のコロニー単離体に、その後、一次スクリーニングにおいて記したものと同じ条件を用いて、5-アミノレブリン酸栄養要求性二次スクリーニングを行った。
【０１３７】
欠失対立遺伝子を伴うアスペルギルス・オリザエHowB425 の形質転換体を265 コロニー得た。5-アミノレブリン酸非含有最小培地上での240 の初代形質転換体のスクリーニングでは、増殖が不充分であるとみなされたのは15株であった。二次スクリーニングにおいて11株が最小培地上で非常に増殖不良を示し、かつ6 株SE29-70 、29-86 、29-87 、29-180、29-192及び29-197を、更なる単一のコロニーの精製及びサザン分析のために選択した。
6 種の各形質転換体からのゲノムDNA(10μg)を、実施例1 に記したように調製し、かつBamHI で消化した。
【０１３８】
これらの断片を、1 ％アガロース-TBEゲル上で電気泳動し、分離した。DNA を、製造業者の指示に従いTurboBlot 装置（シュレイヒャー・シュエル社、キーン、NH）を用い、0.4N NaOH 中で、HybondN ナイロン膜（アマシャム社、アーリントンハイツ、IL）に移した。この膜を、Hybaid炉（ラブネット社、ウッドリッジ、NJ）において、5 ×SSC 、0.1 ％サルコシル、0.02％SDS 、1 ％Genius阻害剤、及び50％ホルムアルデヒド中で、42℃で2 時間、プレハイブリダイゼーションした。プローブを、以下に示したプライマーhemAdelup1及びhemAdeldwn1 を用いて、pSEl7 のPCR 増幅により調製した：
hemAdelup1：5'-AGGCCTCTTGGGTTATGAATG-3'(配列番号：19)
hemAdeldwn1 ：5'-TGACCTGGAGATTAGACATAG-3'(配列番号：20)
【０１３９】
この増幅反応液(100μl)は、以下の成分を含んだ：1 μg のpSE17 、50ピコモルのhemAdelup1プライマー、50ピコモルのhemAdeldwn1 プライマー、dATP、dCTP、dGTP、及びdTTPを各200 μl 、1 ×Taq ポリメラーゼ緩衝液（パーキンエルマー社、ブランチバーグ、NJ）、及び5 ユニットのTaq ポリメラーゼ（パーキンエルマー社、ブランチバーグ、NJ）。この反応液を、以下のようにプログラムされたパーキンエルマーモデル480 サーマルサイクラーにおいてインキュベーションした：サイクル1 −95℃で5 分間、55℃で2 分間、及び72℃で５分間；サイクル２−30〜95℃で１分間、55℃で１分間、及び72℃で１分間；並びに４℃の浸漬サイクル。
【０１４０】
このPCR 産物DNA を、ゲルで単離し、QiaPure カラム（キアゲン(Qiagen)社、チャストウォース、CA）を用いて精製し、エタノール沈殿し、かつ25μl のTE中に再度溶解した。α-32P-dCTP-標識したプローブを、製造業者の指示に従い、Prime-It II キット（インビトロゲン社、サンディエゴ、CA）及び2.5 μl の精製したDNA を用いて、ランダムプライミングすることにより調製した。この標識したプローブを、G50 ミディカラム（ファイブプライム・スリープライム社、ボールダー、CO）を用いて精製した。
【０１４１】
この精製したプローブ(2μl 、〜1 ×106 cpm)を、最初に0.5N NaOH 中で37℃で2 分間変成し、その後前述の新鮮なハイブリダイゼーション溶液10mlに添加した。一晩42℃でハイブリダイゼーションした後、この膜を、2 ×SSC 、0.1 ％SDS で、10分間室温で洗浄し、引き続き0.2 ×SSC 、0.1 ％SDS で、10分間室温で洗浄し、最後に2 回、0.1 ×SSC 、0.1 ％SDS で、68℃で15分間洗浄した。この洗浄した膜を、2 ×SSC ですすぎ、かつコダックXomat ARフィルムに露した。
【０１４２】
これらの菌株のサザン分析は、5 株はhemAΔ::pyrG対立遺伝子のみを含み、かつ1 株は野生型及びhemAΔ::pyrG対立遺伝子の両方を含むことを示した。菌株SB29-70 、29-87 及び29-197の胞子の精製を2 回行い、最小培地上では増殖できない、5-アミノレブリン酸栄養要求性を示す単離体を得た。
【０１４３】
実施例11：5-アミノレブリン酸又はヘミンの補充による致死的hemA欠失表現型の救済
5-アミノレブリン酸又はヘミンのいずれかがhemA欠失表現型を救済する能力は、増殖培地の補充によって示された。
5-アミノレブリン酸（ポルフィリンプロダクツ社、ローガン、UT）の250mM 保存溶液を、水を溶媒として調製し、0.22ミクロンフィルターで滅菌し、−20℃で暗所保存し、使用直前に調製した培地に添加又は注入した。濃度が0.005mg/ml〜0.3mg/mlの範囲の5-アミノレブリン酸を、最小寒天培地又はYEG 液体培地に添加した(1リットルにつき酵母抽出物5g及びグルコース20g)。
【０１４４】
ヘミンの10mg/ml 保存溶液を、50mM NaOH を溶媒として新たに調製し、0.22ミクロンフィルターで滅菌し、使用時まで氷上で保存した。濃度が0.05mg/ml 〜0.2mg/mlの範囲のヘミンを、最小寒天培地に添加した。
結果は、5-アミノレブリン酸を、30μM(5.0 μg/ml) と低い濃度で最小寒天培地に添加した場合は、この栄養要求性表現型を救済するのに十分であることを示した。液体YEG 培地における増殖には、わずかに高い濃度が必要であった(1mMまで) 。
【０１４５】
結果は更に、ヘミンを最小培地に添加した場合には、試験したあらゆる欠損菌株の増殖も支持することができなかったことを示した。これらのヘミン濃度は、野生型hemA遺伝子を含む株の増殖を阻害しなかった。別の増殖培地でヘミン添加の条件は、hemA表現型の救済を可能にした。
【０１４６】
実施例12：野生型hemAによる形質転換体のhemAの欠失表現型の救済
形質転換体の救済は、第1 の単一のコロニー単離体アスペルギルス・オリザエ株SE29-70 から調製したプロトプラストにおいて行った。
【０１４７】
実施例8 に記された方法に従い、アスペルギルス・オリザエ株SE29-70 のプロトプラストを、4.2kb ゲノムhemA領域を含むpSE17 、又はNA2-tpi プロモーターに融合したhemA ORFを含むpSE31 のいずれかの10μg で、形質転換し、かつ5-アミノレブリン酸非含有の最小培地に接種し、34℃でインキュベーションした。形質転換されたコロニーは、2 日間インキュベーションした後明確になったが、多くの比較的小さい“未発達の”コロニーであった。真の形質転換体は、更なる日数インキュベーションした後のより大きいサイズ及び良く胞子を形成する能力によって区別することができた。pSE17 により200 コロニーを得、かつpSB31 により299 コロニーを得る一方で、“DNA の無い”対照プレートではわずかに28コロニーが明確になった。形質転換の効率は、20〜30形質転換体／μg DNA の範囲であった。
【０１４８】
更なる分析のために選択した全てのコロニーは、5-アミノレブリン酸原栄養体であることがわかった。DNA を、8 種のpSEl7 形質転換体から単離し( 菌株SB40-1-7、9 及び10と称される) 、並びに実施例10に記された方法に従って行ったサザン分析は、これらがhemA欠失対立遺伝子に加えて、無傷のhemA遺伝子の少なくとも1 個のコピーを含むことを明らかにした。このデータは、hemA欠失表現型が、野生型hemA遺伝子で形質転換されることによって救済できることを確認している。
【０１４９】
微生物の寄託
以下の菌株が、ブダペスト条約に従い、the Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory(NRRL)（1815 University Street, Peoria, Illinois 61604, USA ）に寄託されている。
菌株                        受託番号          寄託日
E.コリ DH5α(pSE17)       NNRL B-21563    1996年4 月22日
E.コリ DH5α(pAJ007-6)    NRRL B-21564    1996年4 月22日
【０１５０】
これらの菌株は、37連邦法施行規則(C.F.R.)第1.14項及び35米国成文法(U.S.C.)第122 項の下で資格を与えられた特許局長によって決定が成されるまでの本特許出願の審査期間中に、培養物が入手できることを保証にする条件の下で寄託されている。これらの寄託物は、本出願の対応特許又はその継続特許が出願された国において外国特許法によって必要とされる場合に入手できる。しかしながら、寄託物の利用可能性は、政府通知により付与された特許権の減損において本発明の実施許諾を構成するものではないことは理解されなければならない。
【０１５１】
本願明細書に記載されかつ請求された発明は、ここに明らかにされた具体的な実施態様は、本発明のいくつかの態様を例証することが意図されているので、これらの実施態様によって範囲が制限されるものではない。あらゆる同等の実施態様が、本発明の範囲内であることが意図されている。実際に、本願明細書に示されかつ記載されたものに加え、本発明の様々な修飾が、前述の説明から、当業者には明らかであろう。このような修飾は更に、添付された請求の範囲内に納まることが意図されている。
本願明細書に引用された様々な参照文献、それらの内容は、その全体が参照として組み入れられている。
【０１５２】
開示の要約
1.  ポリペプチド製造法であって：
(a) 細胞の呼吸欠損突然変異体へ、1 又は複数の第1 の核酸配列及び第2 の核酸配列を含む核酸構築物を導入し、ここでこの前記第1 の核酸配列は、発現の際に呼吸欠損を補完し、そして第2 の核酸配列は前記ポリペプチドをコードしており；
(b) 前述の第1 及び第2 の核酸配列を含む細胞を、第1 及び第2 の核酸配列の発現に適した好気的条件下で、培地において培養し；そして
(c) この細胞の培養培地から前記ポリペプチドを単離する；
工程を含んで成る方法。
【０１５３】
2.  前記第1 の核酸配列が、電子伝達鎖の成分であるタンパク質をコードしている、上記１記載の方法。
3.  前記成分が、NADH-Qレダクターゼである、上記２記載の方法。
4.  前記成分が、シトクロムレダクターゼである、請求項２記載の方法。
5.  前記成分が、シトクロムb である、上記４記載の方法。
6.  前記成分が、シトクロムc1である、上記４記載の方法。
7.  前記成分が、シトクロムc である、上記２記載の方法。
8.  前記成分が、シトクロムオキシダーゼである、上記２記載の方法。
【０１５４】
9.  前記成分が、シトクロムa である、上記８記載の方法。
10. 前記成分が、シトクロムa3である、上記８記載の方法。
11. 前記第1 の核酸配列が、ユビキノンの生合成に関連した酵素をコードしている、上記１記載の方法。
12. 前記第1 の核酸配列が、フラビンの生合成に関連した酵素をコードしている、上記１記載の方法。
13. 前記第1 の核酸配列が、ヘムの生合成に関連した酵素をコードしている、上記１記載の方法。
【０１５５】
14. 前記第1 の核酸配列が、5-アミノレブリン酸シンターゼ、ポルホビリノーゲン・シンターゼ、ポルホビリノーゲン・デアミナーゼ、ウロポルフィリノーゲン・シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン・デカルボキシラーゼ、コプロポルフィリノーゲン・オキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼ、フェロキレターゼ、グルタミン酸-tRNA glu シンターゼ、グルタミン酸-tRNA glu レダクターゼ、及びグルタミン酸-1- セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼからなる群から選択された酵素をコードしている上記13記載の方法。
【０１５６】
15. 前記第1 及び第2 の核酸配列が、同じベクター上に含まれる、上記１記載の方法。
16. 前記第1 の核酸配列が第1 のベクター上に含まれ、そして第2 の核酸配列が第2 のベクター上に含まれている、上記１記載の方法。
17. 前記ポリペプチドが、該細胞に生来のものであるか又は異種性のものである、上記１記載の方法。
18. 前記ポリペプチドが、酵素、ホルモン、ホルモン変異体、受容体もしくはその部分、抗体もしくはその部分、又はレポーターである、上記１記載の方法。
19. 前記酵素が、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼである、上記18記載の方法。
【０１５７】
20. 前記酵素が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、シクロデキストリン・グリコシルトランスフェラーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グリコシダーゼ、グルタミナーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼである、請求項19記載の方法。
21. 前記細胞が、細菌又は菌類細胞である、上記１記載の方法。
【０１５８】
22. 前記細菌細胞が、バシラス(Bacillus)、シュードモナス(Pseudomonus) 、ストレプトマイセス(Streptomyces)、又はE.コリ(E.coli)細胞である、上記21記載の方法。
23. 前記菌類細胞が、糸状菌細胞である、上記21記載の方法。
24. 前記糸状菌細胞が、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillus) 、フサリウム(Fusarium)、フミコラ(Humicola)、ミセリオフソラ(Myceliophthora)、ムコール(Mucor) 、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium) 、シエラビア(Thielavia) 、トリポクラジウム(Tolypocladium) 、又はトリコデルマ(Trichoderma) 細胞である、上記23記載の方法。
【０１５９】
25. 前記菌類細胞が、酵母細胞である、上記21記載の方法。
26. 前記酵母細胞が、カンジダ(Candida) 、クルイベロミセス(Kluyveromyces) 、サッカロミセス(Saccharomyces) 、スキゾサッカロミセス(Schzosaccharomyces)、ピキア(Pichia)、又はヤロウィア(Yarrowia)細胞である、上記25記載の方法。
【０１６０】
27. 細胞の酵素欠損突然変異体の遺伝子を破壊する方法であって、
(a) 該遺伝子又はその一部を含む第3 の核酸配列及び該遺伝子又はその一部内の第1 の核酸配列を含んで成る核酸構築物を導入することによる、呼吸欠損突然変異細胞の遺伝子を置換し、ここでこの第1 の核酸配列は、発現時に呼吸欠損を補完するものであり；そして
(b) 前記第1 及び第3 の核酸配列を含む細胞を、第1 の核酸配列の発現に適した好気性の条件下で、培地において培養する；
工程を含んで成る方法。
【０１６１】
28. 酸化的リン酸化に必須の遺伝子の少なくとも1 個の修飾を含む、第1 の核酸配列を含む細胞の呼吸欠損突然変異体であって、ここで該突然変異体が同じ条件下で培養した場合の細胞と比較して呼吸欠損である、突然変異体。
29. ヘム欠損である、上記28記載の呼吸欠損突然変異体。
30. 細胞の呼吸欠損突然変異体を獲得する方法であって、
(a) 該細胞に、酸化的リン酸化に必須の遺伝子の少なくとも1 個の修飾を含む核酸配列を導入し；そして
(b) 該核酸配列を含む工程(a) の細胞の突然変異体を同定し、ここでこの突然変異体は該細胞と同じ条件下で培養された場合に呼吸欠損である
工程を含んで成る方法。
31. 前記突然変異体がヘム欠損突然変異体である、上記30記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１は、プラスミドpSE04 の制限地図を示す。
【図２】図２は、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）IFO 4177の5-アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子を含む4.2kb ゲノム断片の制限地図を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、アスペルギルス・オリザエIFO 4177の5-アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列を示す( 各々、配列番号:１及び２)。
【図３Ｂ】図３Ｂは、アスペルギルス・オリザエIFO 4177の5-アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列を示す( 各々、配列番号:１及び２)。
【図４】図４は、プラスミドpAJOO5-1の制限地図を示す。
【図５】図５は、アスペルギルス・オリザエIFO 4177のポルホビリノーゲンシンターゼ（porphobilinogen synthase）遺伝子のヌクレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列を示す( 各々、配列番号:３及び４)。
【図６】図６は、pSE52 の構築を示す。
【図７】図７は、プラスミドpJaL394 の制限地図を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、hemA欠損対立遺伝子のヌクレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列を示す( 配列番号:15 及び16)。
【図８Ｂ】図８Ｂは、hemA欠損対立遺伝子のヌクレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列を示す( 配列番号:15 及び16)。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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