(57)【要約】      （修正有）【課題】前立腺上皮内新形成を同定、確認する方法、腫瘍の転移可能性を測定する方法および癌の転移を抑制または予防する方法の提供。【解決手段】ウテログロビン、第二の治療薬、および医薬組成物を生体に治療上有効に投与するための担体を含有し、第二の治療薬が、非ステロイド系抗炎症剤、ホスホリパーゼＡ２の阻害剤およびシクロオキシゲナーゼの阻害剤からなる群より選ばれる上記医薬組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体における上皮細胞起源の癌の転移を抑制するための医薬組成物であって、
（ｉ）    ウテログロビン、
（ｉｉ）  第二の治療薬、および
（ｉｉｉ）医薬組成物を生体に治療上有効に投与するための担体
を含有し、第二の治療薬が、非ステロイド系抗炎症剤、ホスホリパーゼＡ２の阻害剤およびシクロオキシゲナーゼの阻害剤からなる群より選ばれる上記医薬組成物。
【請求項２】
前記第二の治療薬が、非ステロイド系抗炎症剤である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記第二の治療薬が、ホスホリパーゼＡ２の阻害剤またはシクロオキシゲナーゼの阻害剤である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記第二の治療薬が、メパクリン、インドメタシンまたはリポコルチンである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記上皮細胞起源の癌が、乳房、結腸、膀胱、胃腸管、子宮内膜、気管・気管支、膵臓、肝臓、子宮、鼻咽頭および皮膚の癌からなる群より選ばれる請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記癌が乳癌である請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ウテログロビンがヒトウテログロビンである請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ウテログロビンが組換えウテログロビンである請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ウテログロビンが、約１μＭの血中濃度を達成するに有効な量である請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本出願は、１９９５年３月７日に提出されたアメリカ合衆国特許出願通し番号０８／４００，０８４の部分継続出願である１９９５年６月７日に提出されたアメリカ合衆国特許出願通し番号０８／４８６，２０３の部分継続出願であり、これら両者の全体を引用により本明細書に組み入れるものである。）
本発明は、前立腺上皮内新形成の診断および治療を可能ならしめる方法および組成物に関するものである。本発明の特別な一面は、ホスホリパーゼＡ2を阻害する化合物を含有する方法および組成物、とくにウテログロビン、ウテログロビンムテイン、ウテログロビン擬似体、ウテログロビンのペプチド類似体、リポコルチン、リポコルチンムテインおよびリポコルチンのペプチド類似体を含有するものに関する。本発明のさらなる組成物は、上記のものと組合せた他のタイプの活性成分を含有する。
【０００２】
本発明はまた、腫瘍含有組織の細胞におけるアラキドン酸放出のエフェクターを測定することにより上皮細胞起源の腫瘍の転移可能性を測定する方法に関するものでもある。本発明のこの面は、とくに、前立腺腫瘍の転移可能性を測定するために生体組織検査試料の細胞中のウテログロビンタンパク質またはｍＲＮＡを定量することに関する。
【０００３】
本発明はさらに、上皮細胞起源の癌、とくにヒトの前立腺癌の転移を予防または抑制するための方法および組成物に関する。本発明の特別な一面は、これらの癌の細胞中でのアラキドン酸放出を阻害し、転移を抑制または防止する方法および組成物に関する。この点での一面では、本発明はとりわけ癌細胞中でのアラキドン酸の放出を媒介するホスホリパーゼＡ2を阻害する方法および組成物に関する。本発明の組成物はまたとりわけ、癌細胞によるアラキドン酸放出を阻害するウテログロビン、ウテログロビンムテイン、ウテログロビンのペプチド類似体、リポコルチン、リポコルチンムテインおよびリポコルチンのペプチド類似体を含有するものを包含する。この点でさらに有用なのは、擬似体化合物、とくにウテログロビンおよびリポコルチンの擬似体である。この点では、本発明はとくに、ウテログロビンの擬似体、とくにヒトウテログロビンの擬似体を含有する組成物に関する。本発明のさらなる組成物は、アラキドン酸放出を阻害するものと組合せての他のタイプの活性成分を含む。
【０００４】
本発明はまたとりわけ、上記の組成物を投与することにより、上皮細胞起源のヒトの癌の転移を予防または抑制する方法に関する。とくにこの点に関しては、本発明は、ヒト前立腺癌の転移を抑制または予防するためにヒトウテログロビンを用いる方法に関する。さらに、本発明のこの側面は遺伝子療法によって達成できる。
【０００５】
本発明の方法および組成物は、それら単独で使用でき、また他の治療法とともに使用することもできる。
【背景技術】
【０００６】
癌は、細胞の抑制されない増殖から生じる。すべての癌は生命をおびやかすものである。癌が死という結果に至らなくても、患者にとってのみならず、家族、友人および共働者にとっても、永続的に消耗、衰弱をもたらすものである。さらに、あまりにもしばしば、癌は致命的であることを証明してくれる。すべての若死にのかなりの部分を引き起こすこの疾患群からくる個人的および社会的損失は計り知れない。
【０００７】
少数の場合に有効な治療法が開発されてきているが、多くの癌がいぜんとして現在利用できる療法に対して抵抗性のままである。とくに治療が困難なのが、転移性の癌である。これらの癌は、患者に対してもっとも高いリスクをもたらし、最良の予後のためには、有害な副作用のリスクを高める侵襲性の方法によって処置しなければならない。それゆえ、転移しそうな腫瘍を転移しそうでないものと正確に識別する方法の必要性は大きい。さらに、転移性癌を処置する方法はしばしば不適切であり、改良された抗転移剤および転移性癌を処置する方法に対する明瞭な必要性もある。
【０００８】
同様に、前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）において見られるもののごとき、前立腺癌と関連している細胞を正確に同定、確認する方法に対するニーズも大きい。現行の診断法は、ＰＩＮ細胞と正常細胞とを識別するには不適切である。かくして、癌の早期の診断、予後および処置を可能ならしめうる改善されたＰＩＮの早期検出法に対する明瞭な必要がある。
【０００９】
転移性の癌は、原発腫瘍に由来する。原発腫瘍の転移は、続発性腫瘍および播種性の癌を生じさせる。原発腫瘍および続発腫瘍がともに多数の細胞をまき散らすことは、周知である。まき散らされた細胞は全身に拡散しうる。たとえば、原発腫瘍は、周囲のリンパ管または循環系血管を損傷させて、まき散らされた細胞のリンパ系または循環系への入り込みを可能ならしめ、体内でのそれらの拡散を促進する。さらに、癌性腫瘍による細胞のまき散らしは、手術および放射線療法の間に増大する。
【００１０】
まき散らされた細胞のほとんどは新しい腫瘍を形成しない。腫瘍を形成するためには、それらの細胞は一連の物理的および生理的障壁を乗り越えなければならない。実際、転移が起こるためには、一連の区別される事象が起こらなければならない。原発腫瘍は、物理的に、（ｉ）一次組織の間隙空間に侵入しなければならない。とくに、それは（ｉｉ）組織の基底膜を貫通しなければならない。ほとんどの転移の場合、腫瘍がリンパ管または血管の上皮細胞壁を損傷して、まき散らされた細胞への接近路を提供しなければならない。リンパまたは血液に入った細胞は（ｉｉｉ）循環系内での血流力学的ストレスおよび宿主の防御機構から免れて生き残らなければならず、さらに（ｉｖ）それら細胞は循環系内の新しい部位に滞留しなければならない。これは、凝集した血小板が関与するらしい過程である。細胞は、つぎに、（ｖ）血管から外へ遊出して、間隙空間に入らなければならない。最後に、それは（ｖｉ）二次器官の間質空間に侵入し、新しい部位で増殖しなければならない。転移の過程は生理学的には複雑であるけれども、転移の全体としてのパターンは、多くのタイプの癌に共通している。
【００１１】
転移の過程は、また、明らかに、癌性細胞およびそれらの周囲の細胞および組織との相互作用を変化させる複雑な細胞内機構を包含している。たとえば、癌性細胞は、接着タンパク質、マトリックス成分を分解する酵素、自己分泌因子、リガンド応答性レセプター、血管新生因子、プロスタグランジン類などの異常発現により特徴付けられる。とくに、腫瘍細胞の移行を開始させるシグナル伝達経路は、侵入および転移のもっとも理解されていない側面に属している。現在のところ、多くの癌性細胞の増殖は、特異的なリガンド−レセプター相互作用に依存していると考えられている。しかし、これまでは、この理論的枠組みまたは転移の基礎的機構に関する概念を利用して、転移性癌の転移を予防し、または効果的に抑制する治療法を開発することは、不可能であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
転移に関係する諸過程の複雑さおよび基礎となる分子的機構の理解の欠如のために、場合によっては、転移しそうな腫瘍をしそうでない腫瘍と区別することをとくに困難にしてきた。腫瘍の転移可能性を識別できないために、正確な診断が不可能であり、不可避的に、あまりにも侵襲的であるかまたは不十分に侵襲的な治療的介入に至っている。さらに、すべてのタイプの癌について、転移性腫瘍の拡散を抑制または予防する処置法を開発することが、これまでは困難または不可能であった。明らかに、腫瘍の転移可能性を正確に判断する方法および有効な抗転移組成物および方法に対する大きいニーズが残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
それゆえ、本発明の一目的は、ＰＩＮを正常な前立腺上皮と区別するための方法および組成物を提供することである。
【００１４】
また、本発明の一目的は、前立腺癌および前立腺癌に関連した細胞の早期検出のための方法および組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の他の一つの目的は、転移を抑制または予防する方法を提供することである。
【００１６】
本発明の別の一つの目的は、転移を抑制または予防する組成物を提供することである。
【００１７】
上記の諸目的を達成するに当たって、本発明の一面に従って、上皮細胞起源の癌をもっている生体に、該癌の細胞によるアラキドン酸の放出を阻害する化合物を、前立腺上皮内新形成を同定するのに有効な経路で、それに有効な量だけ投与する工程を包含する前立腺上皮内新形成同定、確認法が提供された。
【００１８】
本発明の他の方法は、生体組織検査試料において前立腺上皮内新形成を検出するための診断キットに向けられており、該キットは：エフェクターの測定のために調製された生体組織検査試料中の細胞中のアラキドン酸放出のエフェクターに特異的に結合する第一の試薬および該生体組織検査試料中の細胞に特異的に結合された一次結合試薬を検出可能に標識するための第二の試薬を包含し、該エフェクターの定量は前立腺上皮内新形成の診断に役立つものである。
【００１９】
本発明のキットのある種の好ましい実施態様においては、該エフェクターはＰＬＡ2の阻害剤であり、なかでもウテログロビンがとくに好ましい。
【００２０】
本発明のこの面でのさらにある種の好ましい実施態様においては、該第一の試薬は抗体である。これらの具体化例では、ウテログロビン抗体染色が強く起こったならば、それが正常な前立腺上皮を示し、弱い染色が起こったならば、前立腺上皮内新形成を、シグナルが生じなかったならば、癌を示しているとして、測定が行われることになる。
【００２１】
本発明のこの面での追加の好ましい実施態様は、該第一の試薬がハイブリダイゼーションプローブであるものである。本発明のこの面でのいくつかの好ましい具体化例では、該エフェクターはＰＬＡ2の阻害剤であり、なかでもウテログロビンがとくに好ましい。
【００２２】
本発明の他の好ましい具体化は、上皮細胞起源の癌をもっている生体に、該癌の細胞によるアラキドン酸の放出を阻害する化合物を、該腫瘍の転移を抑制または予防するのに有効な経路で、それに有効な量だけ投与する段階を包含する上皮細胞起源の癌の転移を予防または抑制する方法に向けられる。
【００２３】
この点での本発明の一面の好ましい実施態様においては、該化合物はホスホリパーゼＡ2またはシクロオキシゲナーゼの阻害剤である。とくにホスホリパーゼＡ2阻害剤が好ましい。
【００２４】
本発明のこの面でのいくつかの特に好ましい実施態様においては、該化合物がウテログロビン、ウテログロビンのムテイン、ウテログロビンのペプチド類似体またはウテログロビンの擬似体、リポコルチン、リポコルチンのムテイン、リポコルチンのペプチド類似体もしくはリポコルチンの擬似体である。この点でとりわけ好ましいのは、該化合物がウテログロビン、ウテログロビンのムテイン、ウテログロビンのペプチド類似体またはウテログロビンの擬似体である場合の方法である。この点では、ウテログロビンが好ましく、ヒトウテログロビンがとりわけ好ましい。
【００２５】
本発明のこの面に従えば、該化合物が小型分子薬物、すなわち非ステロイド抗炎症薬であるいくつかの好ましい具体化例が提供される。これらの薬物のうちでは、ホスホリパーゼＡ2およびシクロオキシゲナーゼの阻害剤が好ましい。とくに好ましいのは、メパクリンおよびインドメタシンである。
【００２６】
別の観点からは、本方法の好ましい具体化例は、ヒト患者における前立腺の癌を処置するのに用いられるものである。
【００２７】
さらに別の好ましい実施態様においては、該方法を、他の治療法と組合せて用いる。この点で、好ましい治療法としては、外科的介入、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、化学療法、寒冷療法または遺伝子療法が含まれる。
【００２８】
本発明の別の一面に従って、（ｉ）上皮細胞起源の腫瘍の細胞によるアラキドン酸放出を阻害し、生体内での腫瘍の転移を抑制または予防するのに有効な化合物および（ｉｉ）該化合物の該生体への治療的投与に有効な担体を含んでなる、上皮細胞起源の癌の転移を抑制または予防するための医薬組成物が提供されている。
【００２９】
本発明のいくつかの好ましい実施態様においては、該化合物はホスホリパーゼＡ2またはシクロオキシゲナーゼの阻害剤である。この点では、ホスホリパーゼＡ2の阻害剤が好ましい。いくつかのとくに好ましい実施態様においては、該化合物はウテログロビン、ウテログロビンのムテイン、ウテログロビンのペプチド類似体、ウテログロビンの擬似体、リポコルチン、リポコルチンのムテイン、リポコルチンのペプチド類似体またはリポコルチンの擬似体である。この点でのとくに好ましい実施態様においては、該化合物はウテログロビン、ウテログロビンのムテインまたはウテログロビンのペプチド類似体である。これらのうちでは、ウテログロビンがきわめて好ましく、ヒトウテログロビンが本発明のとりわけ好ましい化合物に属する。
【００３０】
本発明のこの側面に従えば、該化合物が非ステロイド抗炎症剤である小型分子薬物であるいくつかの好ましい実施態様も提供される。これらの薬物のうち、ホスホリパーゼＡ2およびシクロオキシゲナーゼの阻害剤が好ましい。とりわけ好ましいのはメパクリンおよびインドメタシンである。
【００３１】
本発明の他の一面に従って、腫瘍、とくに上皮細胞起源の腫瘍の転移可能性を測定する方法が提供されている。本発明のこの面でのいくつかの好ましい実施態様においては、（Ａ）腫瘍の生体組織検査試料中の細胞内でのアラキドン酸放出のエフェクターを定量し；（Ｂ）該生体組織検査試料中の腫瘍細胞中のエフェクターを基準細胞中のエフェクターと比較し；（Ｃ）正常基準細胞に特徴的な、または良性腫瘍の基準細胞に特徴的な腫瘍細胞中エフェクターは低い転移可能性を示し、転移性腫瘍の基準細胞に特徴的な腫瘍細胞中エフェクターは高い転移可能性を示すとして、転移可能性を判断する各段階を包含する、上皮細胞起源の腫瘍の転移可能性を判定する方法が提供されている。
【００３２】
本発明のこの面での若干の好ましい実施態様においては、該エフェクターはＰＬＡ2の阻害剤である。この点でのとくに好ましい実施態様においては、該エフェクターはウテログロビンである。
【００３３】
いくつかの好ましい実施態様においては、腫瘍の細胞中のエフェクタータンパク質を定量することにより、エフェクターを測定する。この点でのとくに好ましい実施態様においては、該エフェクターはＰＬＡ2の阻害剤である。とくに好ましいのは、ウテログロビンである。この点でのとくに好ましい実施態様においては、腫瘍は前立腺腫瘍であり、該阻害剤はウテログロビンである。
【００３４】
本発明の別の一面においては、本発明の好ましい具体化は、タンパク質を免疫細胞化学的に定量する転移可能性判定法を提供する。このタイプのいくつかの好ましい実施態様においては、該エフェクターはＰＬＡ2の阻害剤である。この点での本発明の具体化においてとくに好ましいのは、ウテログロビンである。この点でのとくに好ましい実施態様においては、腫瘍は前立腺腫瘍であり、該阻害剤はウテログロビンである。
【００３５】
この点での本発明のさらにいくつかの好ましい実施態様においては、腫瘍の細胞中のｍＲＮＡを定量することによって、エフェクターを測定する。この点でのとくに好ましい実施態様においては、該ｍＲＮＡはＰＬＡ2の阻害剤をコードするものである。とくに好ましいのはウテログロビンである。この点でのとくに好ましい実施態様においては、腫瘍は前立腺腫瘍であり、該阻害剤はウテログロビンである。
【００３６】
この点でのいくつかの好ましい実施態様においては、ある表面に固定した細胞にプローブをハイブリダイズさせる段階を含む方法によって、ｍＲＮＡを定量する。本発明のこの面のいくつかの好ましい実施態様においては、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってｍＲＮＡを定量する。
【００３７】
これらの両面での本発明の好ましい実施態様では、該エフェクターはＰＬＡ2の阻害剤、とくにウテログロビンである。この点でのとくに好ましい実施態様においては、腫瘍は前立腺腫瘍であり、阻害剤はウテログロビンである。
【００３８】
この点での本発明の他の一面では、異常ｍＲＮＡを測定する。この点での本発明の好ましい実施態様においては、ｍＲＮＡはＰＬＡ2の阻害剤、とりわけウテログロビンをコードするものである。この点でのとくに好ましい実施態様においては、腫瘍は前立腺腫瘍であり、阻害剤はウテログロビンである。
【００３９】
本発明のさらに別の目的に従い、腫瘍の転移可能性を判定するためのキットが提供された。いくつかの好ましい実施態様においては、本発明のキットは、（Ａ）エフェクターの定量のために調製された生体組織検査試料中の細胞内のアラキドン酸放出のエフェクターに特異的に結合する第一の試薬および（Ｂ）該生体組織検査試料中の細胞に特異的に結合された一次結合試薬を検出可能に標識するための第二の試薬を包含し、該エフェクターの定量が該腫瘍の転移可能性の判断に役立つものである。
【００４０】
本発明のキットのいくつかの好ましい実施態様においては、エフェクターはＰＬＡ2の阻害剤であり、それらのうちではウテログロビンがとくに好ましい。
【００４１】
本発明のこの面でのいくつかのさらなる好ましい実施態様においては、第一の試薬が抗体である。この点でのとくに好ましい実施態様においては、エフェクターはＰＬＡ2の阻害剤であり、それらのうちではウテログロビンがとくに好ましい。
【００４２】
本発明のこの面でのさらなる好ましい実施態様は、第一の試薬がハイブリダイゼーションプローブであるものである。本発明のこの面のいくつかの好ましい実施態様においては、エフェクターはＰＬＡ2の阻害剤であり、それらのうちではウテログロビンがとくに好ましい。本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、一般的および特定的説明を提供し、本発明の好ましい具体化例を示すものではあるが、単なる説明として示すものである。本発明の精神および範囲の中での種々の変更、改良は、当業者には、詳細な説明および本開示の他の面から明らかになるであろう。
【００４３】
図１は、ヒト前立腺腫瘍由来の上皮細胞系であるＴＳＵ−Ｐｒ１およびＤＵ−１４５細胞系の細胞の侵襲性に対するウテログロビンの用量効果を示す棒グラフである。ＴＳＵ−Ｐｒ１およびＤＵ−１４５細胞はともにアンドロゲン非依存性である。細胞を、０、０．０１、０．１および１．０μＭのウテログロビン中で２４時間培養した。つぎに、血清不含培地または線維芽細胞で調整された培地（ＦＣＭ）に応答しての再構成基底膜（ＲＢＭ）被覆フィルターを通しての移行によって、侵襲性を測定した。侵入細胞をクリスタルバイオレットで染色し、染料を抽出し、５８５ｎｍでの吸光度により染料濃度を測定して、侵襲性を求めた。グラフ中の各点は、各々に３検体の培養を用いて行った３つの別々の実験の結果の平均である。棒は、各点についての平均の標準誤差を示している。
【００４４】
図２は、ヒト前立腺腫瘍由来の上皮細胞系であるＰＣ３−ＭおよびＬＮＣａＰの細胞の侵襲性に対するウテログロビンの用量効果を示す棒グラフである。ＬＮＣａＰ細胞はアンドロゲン感受性である。ＰＣ３−Ｍ細胞はアンドロゲン非依存性である。アッセイは、図１の説明に記載した通りに行った。
【００４５】
図３は、ミオグロビン、アルブミンおよび熱不活性化ウテログロビンがＤＵ−１４５細胞の侵襲性に影響しないことを示す棒グラフである。アッセイは、実質的に、図１の説明に記載した通りに行った。
【００４６】
図４は、ＦＣＭに刺激されたＤＵ−１４５細胞の侵襲性に対するウテログロビンの影響の時間的経過を示すグラフである。細胞を、１．０μＭのウテログロビンとともに、またはそれなしで、３、６、１２または２４時間インキュベートしたのち、図１の説明に記載した通りに、ＦＣＭに応答しての侵入を検定した。
【００４７】
図５は、ウテログロビンがＦＣＭ刺激ＤＵ−１４５によるアラキドン酸放出を５時間にわたって阻害することを示すグラフである。14Ｃ−標識アラキドン酸を含有するαＭＥＭ／ＳＦ培地中で細胞を２４時間インキュベートした。つぎに遊離の標識を洗い去り、細胞をＦＣＭ中、１μＭのウテログロビンとともに、またはそれなしで、インキュベートした。アラキドン酸の放出は、細胞から培地へ放出された14Ｃによって測定した。
【００４８】
用語の説明
本開示における略号および用語は、開示し、特許を請求している発明と矛盾しない意味を十二分に熟慮して採用している。以下の簡単な説明は、完全に説明のためのものであって、ここに開示し、特許を請求している発明を網羅的に定義するものでも、限定するものでもない。関係技術の完全な理解に照らし、全体としての開示の熟考に基づいて本発明を理解すれば、それらの用語の完全な意味は明らかであろう。
【００４９】
アラキドン酸カスケード：細胞によるアラキドン酸の産生および放出に至る一連の酵素反応。このカスケードはリガンドシグナルに感受性であり、アラキドン酸自身は自己分泌因子である。
【００５０】
ＤＵ−１４５：ヒト前立腺腫瘍由来のアンドロゲン非依存性上皮細胞系。
【００５１】
ＬＮＣａＰ：ヒト前立腺腫瘍由来のアンドロゲン感受性上皮細胞系。ＬＮＣａＰ細胞系は、ヒト前立腺癌の鎖骨上リンパ節転移から導かれた。この系統の細胞は、インビトロでアンドロゲンに応答して増殖の増進を示し、それらは、分化上皮細胞のマーカーである前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を分泌する。
【００５２】
ＴＳＵ−Ｐｒ１：ヒト前立腺腫瘍由来のアンドロゲン非依存性上皮細胞系。
【００５３】
ＰＣ３−Ｍ：ヒト前立腺腫瘍由来のアンドロゲン非依存性上皮細胞系。
【００５４】
エフェクター：細胞のある活性を生じさせ、変化させ、調整し、または制御する物質；細胞または生体のある生理的活性を生じさせ、変化させ、調整し、または制御する物質。典型的には、たとえば、酵素、補因子または転写調節タンパク質、酵素活性化物質または酵素阻害剤、酵素複合体、レセプターまたはレセプター複合体などのタンパク質。
【００５５】
上皮細胞起源：どの組織であれ、上皮細胞に由来。
【００５６】
ＦＣＭ：線維芽細胞により調整された培地。
【００５７】
基準：結果を評価するために、試験結果を比較するための基準。基準系列は、定性的または定量的尺度に沿った点を代表する複数のかかる物質である。
【００５８】
同定、確認：ＰＩＮの同定、確認というとき、前立腺上皮内新形成または類似の中間状態の一つ以上の特性を確かめ、確証し、もしくは決定すること。
【００５９】
抑制、阻害：転移の抑制は、本発明に従って多くのパラメータによって測定でき、たとえば、続発腫瘍の発現の遅れ、原発または続発腫瘍の発達の遅れ、続発腫瘍の発生の減少、疾患の二次的影響の遅れまたは重篤度の減少、腫瘍生育の遅滞、腫瘍の退行などによって評価できる。極端な場合には、完全な抑制で、これは、本明細書では予防という。
【００６０】
転移：「基礎腫瘍学（Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）」、Ｔａｎｎｏｃｋら編、マグロー・ヒル、ニューヨーク（１９９２年）第１１章、Ｈｉｌｌ，Ｒ．Ｐ．「転移（Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）」、ページ１７８−１９５（これの全体を引用によりここに挿入する）に述べられているように、転移は「癌の細胞の拡散し、非近接部位に新しい増殖巣を形成する（すなわち転移を形成する）能力」である。
【００６１】
同様に、Ａｚｎａｖｏｏｒｉａｎら、Ｃａｎｃｅｒ ７１：１３６８−１３８３（１９９３）（これの全体を引用によりここに挿入する）には、転移は「発生部位での（ｉｎｓｉｔｕ）腫瘍成長から転移性疾患への移行は、原発部位の腫瘍細胞の局所組織を侵襲し、組織の障壁を越える能力によって定義される。・・・転移過程を始めるためには、癌細胞はまず上皮基底膜を透過し、つぎに間質性支質に侵入しなければならない。・・・遠隔転移の場合には、管内侵入のために内皮下基底膜への腫瘍細胞の侵入が要求され、それは腫瘍細胞の管外遊出の間にも通り抜けられなければならない。・・・悪性腫瘍の発生は、腫瘍により誘起される血管新生とも関連しており、血管新生は原発腫瘍の拡大の余地を残すだけでなく、新しく形成された血管の基底膜の欠陥のために、血管のコンパートメントへの容易な接近を可能にする。」と記載されている。
【００６２】
擬似体（ミメティック）：それの設計の基礎となっている他の分子または分子複合体の形態を、従って活性を、形態および効果において模倣している分子。
【００６３】
ムテイン：タンパク質のアミノ酸配列上の変異体。一次構造の変異としては、欠失、挿入および置換が含まれる。置換は保存的であっても非保存的であってもよい。天然タンパク質とムテインとの差は、通常、所望の性質を保存しており、望ましくない性質を軽減または除去し、所望の、または新規な性質を付加するものである。本発明においては、ムテイン類は、通常は、抗変異活性を維持するかまたは増強しているものである。とくに、ウテログロビンムテイン類は、ウテログロビンのアミノ酸配列の変異体であって、ウテログロビンの抗変異活性を維持するかまたは増強しているものである。
【００６４】
ＮＳＡＩＤ：非ステロイド抗炎症剤。シクロオキシゲナーゼを阻害するが、ホスホリパーゼＡ2は直接には阻害しないところの本明細書でいう小型分子薬物。これらの化合物は、それらの抗炎症作用のために使用されてきた。アスピリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スルフィンピラゾン（アンツラン）およびインドメタシンはＮＳＡＩＤである。
【００６５】
ペプチド類似体（アナログ）：あるタンパク質のアミノ酸配列またはそれに関連するアミノ酸配列を有するオリゴまたはポリペプチド。本発明のペプチド類似体は、抗転移活性を有し、ウテログロビンなどの抗転移性タンパク質のある領域と同じまたはそれに類似のアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００６６】
ＰＩＮ：前立腺上皮内新形成。前立腺癌のリスクの高い高度のＰＩＮと前立腺癌のリスクの低い低度のＰＩＮとの２つの等級のある前立腺癌関連状態。ＰＩＮはまた、異形成、管内異形成、大腺房非定型過形成、非定型原発性過形成、悪性変化をもつ過形成、顕著な異型性および管−腺房異形成として知られている。ＰＩＮは、高い核／細胞質比、過染色性、粗い粒状のクロマチン（染色質）、核小体の不存在、分離した細胞ならびに細胞および核の多形性によって特徴付けられうる。
【００６７】
ＰＬＡ：ホスホリパーゼＡ
ＰＬＡ2：ホスホリパーゼＡ2
予防：転移に関して、実質的に完全な抑制、起こっていないとしても転移はなく、すでに癌の転移があったとしても、さらなる転移はない。抑制、阻害の項参照。
【００６８】
ＰＳＡ：前立腺特異抗原
ＲＢＭ：再構成基底膜。細胞内組織マトリックスおよび上皮細胞基底膜の分子組成を近似した多成分マトリックス。ＲＢＭ調製用の製剤は周知であって、商業的供給者から入手できる。
【００６９】
ＳＦＭ：血清不含培地
ＵＧ：ウテログロビン
ｈＵＧ：ヒトウテログロビン
【００７０】
前立腺上皮内新形成を同定、確認する方法または非転移性の異常および転移可能性の低い腫瘍を転移可能性の高い腫瘍と区別する方法を開発することが過去にはできなかったにもかかわらず、本発明は、異常な増殖、腫瘍および癌の転移可能性を測定し、前立腺上皮内新形成を同定、確認する方法を提供する。
【００７１】
さらに、有効な抗転移処置方法を開発することが過去にはできなかったにもかかわらず、本発明は癌転移を抑制する化合物および組成物ならびに生体における上皮細胞起源の腫瘍の転移を抑制または予防するために該化合物および組成物を投与する方法を提供する。
【００７２】
腫瘍の転移可能性の測定
細胞内でのアラキドン酸の放出に影響する因子の活性の測定は、腫瘍の転移可能性を示すのに役立ちうる。この点では、ＰＬＡ2活性、およびＰＬＡ2の活性に影響する因子の活性または量を測定することは、転移可能性を示すのに役立ちうる。本発明のこの面に従っての転移可能性の測定を、本発明のとくに好ましい実施態様である、前立腺腫瘍の転移可能性の指標としてのウテログロビンタンパク質、ｍＲＮＡまたはＤＮＡについての以下の論述により説明するが、これを限定的なものと解してはならない。
【００７３】
方法
転移可能性を示すためのウテログロビン
前立腺は、精液を生産する男性の生殖腺である。立位の男性では、それは膀胱の垂直下方に位置し、尿道に囲まれている。通常、それは、クルミ様の、わずかに細長い球形にほぼ似た形をしている。ほとんどの男性においては、約５０歳までは、それは直径が約１インチであり、その後は大きくなる傾向がある。
【００７４】
前立腺の病態は、感染、良性の腫脹または癌として現れうる。良性の増殖は、腫脹した前立腺が尿道を狭窄させ、排尿を妨害するときにのみ、健康に悪影響を及ぼす。悪性の増殖は常に患者の健康および生命に脅威を及ぼす；ただし、後述のように、予後および指示される治療法は、発生ごとに大きく相違する。
【００７５】
前立腺癌は、アメリカ合衆国の男性においてもっとも頻繁に診断される癌である。前立腺癌は一般に速やかに大きくなることはない。それらは、通常、３〜４年ごとに大きさが２倍になる。前立腺癌の有害な影響も、腫瘍自身の発育により影響されるので、ゆっくりあらわれる。
【００７６】
前立腺癌のゆっくりした進行は、前立腺癌の症例の大部分を占める５０歳以上の男性においては、一種の難問を提起する。前立腺癌の通常の進行からみて、衰弱させるような影響は、通常の患者の余命のうちにはあらわれないであろうことが示唆されることがしばしばである。有効な治療法に欠けていることおよび現在適用しうる治療法につきものの有害な副作用からみて、多くの高齢患者の場合には、待つことが最善の療法であるかもしれない。
【００７７】
遺憾ながら、良性腫瘍を癌性腫瘍と区別すること、より重要なことであるが、成長の遅い限局性腫瘍をより侵襲的な転移性癌により形成されたものと区別することは困難である。かくして、最良の医師であっても、所与の前立腺癌の進行の経過を正確に予測することはできず、最善の治療方式を指示できない。
【００７８】
本発明は、その一面において、前立腺腫瘍の転移可能性を判定する方法を提供することによって、かかる腫瘍の効果的処置の上での前記障害を克服する。本発明のこの側面に従えば、生体組織検査材料の細胞中のウテログロビンタンパク質もしくはｍＲＮＡまたはＤＮＡを定量する。細胞中で定量されたタンパク質、ｍＲＮＡまたはＤＮＡは、前立腺腫瘍、とくに上皮細胞起源のそれらの転移可能性を示してくれる。
【００７９】
これに関連して、以前の研究は、腫瘍の転移可能性とウテログロビン（または他の任意のアラキドン酸放出阻害剤）の発現の減少との間の関係を明らかにしていないことは、述べておくに値する。以前の研究では、たとえば、ウテログロビン（クララ細胞１０ｋＤａタンパク質、略号ＣＣ１０と呼ばれる）はいくつかのタイプの細胞のマーカーとして用いられ、それの発現の細胞タイプ特異性が研究された。（Ｌｉｎｎｏｉｌａら、Ａ．Ｊ．Ｃ．Ｐ．９７（２）：２３５−２４３（１９９２）およびＰｅｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２０９９−２１０９（１９９３）に記載されているように。これらの全体を引用によりここに挿入する。）さらに、ＣＣ１０の発現は、患者および細胞タイプの間で変動することが報告された。とくに、ＣＣ１０の発現は肺癌患者および肺癌のない喫煙者では、非喫煙者におけるよりも低いこと、そして、ＣＣ１０の発現の低減は新生物と漠然と関連していることが報告された。（Ｂｒｏｅｒｓら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６６：３３７−３４６（１９９２）およびＪｅｎｓｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５８：６２９−６３７（１９９４）。これらの全体を引用によりここに挿入する。）しかしながら、ＣＣ１０に関するいずれの研究も、腫瘍の細胞中でのウテログロビンの発現を転移可能性の測定に利用できることを示唆してはいない。
【００８０】
タンパク質の特異的検出
生体組織検査材料中の細胞内の、腫瘍の転移可能性をあらわすタンパク質は、当業者に周知の慣用的方法によって測定できる。かかる方法は、多くの標準的な教科書および実験室マニュアルに記載されている。たとえば、抗体および他の免疫試薬を作成し、使用する手法およびかかる試薬を用いて試料中の特定のタンパク質を検出する手法は、「現行免疫学プロトコール（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｃｏｌｉｇａｎら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（１９９５年）に記載されており、この刊行物の、試料中の特定のタンパク質を定量するのに有用な試薬の作成および使用に関係する部分をここに引用により挿入する。他の例としては、組織中の細胞内タンパク質を定量するための免疫組織化学的方法が、「現行分子生物学プロトコール（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｕｓｕｂｅｌら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（１９９４年）第２巻第１４章に記載されており、これの、かかる定量の実施に関わる部分を引用によりここに挿入する。最後に、Ｌｉｎｎｏｉｌａら、Ａ．Ｊ．Ｃ．Ｐ．９７（２）：２３５−２４３（１９９２）およびＰｅｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２０９９−２１０９（１９９３）（上述の通り本明細書に挿入されている）は、本発明のこの面において、部分的に利用できる手法を記載している。
【００８１】
たとえば、試料中のウテログロビンを、本発明に従って、宮本ら、Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １４９：１０１５−１０１９（１９９３）（これの全体を引用によりここに挿入する）に述べられている組織化学的方法によって測定できる。たとえば、そこに記載されているように、良性の前立腺過形成もしくは前立腺癌が疑われる患者から適当な生体組織検査材料を取得し、直ちに、０．０１Ｍ燐酸緩衝食塩液中へ入れる。その後、材料を直ちに処理する。それを、ラット肝ホモジネートを接着剤として用いて、しんちゅうのプレートに載せる。つぎに、液体窒素で冷却したイソペンタン中で材料を凍結させる。材料の細胞中のウテログロビンのアッセイに適した切片をクリオスタット中で切り取る。生検材料の損傷されたまたは摘出過程により有害なまでに変化させられた部分を避けて、生検材料を横切る切片を取得する。
【００８２】
切片を室温で乾燥し、固定し、ついで洗う。パラホルムアルデヒドはこの点でとくに有用な固定剤であるが、多くの他の固定剤も使用できる。切片を、過酸化水素およびトライトンＸ−１００などの非イオン界面活性剤で前処理することもできる。また、切片をブロッキング溶液とともにインキュベートして、非特異性結合を減少させることもできる。たとえば、ヤギ血清、ヤギ抗体またはヤギ抗体由来の試薬とともにインキュベートするに先立ち、切片をヤギブロッキング血清とともにインキュベートすることができる。
【００８３】
つぎに、ウテログロビンに特異的に結合する試薬、たとえばモノクローナルまたはポリクローナル抗ウテログロビン抗体を用いて、試料中のウテログロビンを可視化する。切片中の細胞へのウテログロビン特異的試薬の結合は、該試薬が検出可能な標識に結合されておれば直接に、または二次抗体−酵素複合体などの二次試薬または追加の試薬を用いて、測定できる。
【００８４】
本発明の好ましい実施態様においては、ウテログロビン特異的試薬は抗血清、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体の誘導体、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の誘導体、または一本鎖抗体などの処理された抗体である。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の誘導体には、複合体および断片が含まれる。この点では、検出可能な標識に結合された抗体が好ましい。検出可能な標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素がある。この点で好ましい断片としては、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片およびＦ（ａｂ’）断片がある。
【００８５】
切片をウテログロビン特異的試薬とともに、該細胞中のウテログロビンにウテログロビン特異的試薬が効率的に結合するのに有効な、しかし他の細胞成分への結合は非効率的であるような条件下で、すなわち、特異的結合対非特異的結合の比が生検材料の細胞中のウテログロビン含量の正確な測定を可能ならしめるのに効果的な条件下で、インキュベートする。
【００８６】
同時に、バックグラウンド結合を推定するためには、対照切片を、ウテログロビンに特異的でない対応試薬とともに同条件下でインキュベートすればよい。たとえばポリクローナル免疫血清の場合、バックグラウンドの非特異的結合をモニターするためには、対照切片を免疫前血清とともにインキュベートすればよい。インキュベーション期間後、洗浄などにより、該特異的試薬および対照で用いたいずれの試薬をも除去する。
【００８７】
ウテログロビンに特異的な一次試薬が検出可能に標識されておれば、その標識を測定すればよく、それにより試料中の細胞のウテログロビン含量を求めることができる。この場合、対照を標識し、同様にして測定することが好ましい。よりしばしば、かつ好ましくは、後述のように、切片上での試薬の結合を可視化するのに、二次試薬を使用する。
【００８８】
未結合の特異的および非特異的試薬を除去後、試験切片および対照切片を、ウテログロビンに特異的な一次試薬および対照中のそれの対応物に特異的に結合する二次試薬とともにインキュベートする。二次試薬はビオチニル化抗抗体であることが好ましい。
【００８９】
切片は、二次試薬とともに、該試薬が細胞中の一次試薬（および対照中のそれの対応物）に効率的に結合し、一方他の細胞成分への結合は非効率的であるような条件下で、すなわち、特異的結合対非特異的結合の比が生検材料の細胞中のウテログロビン含量の正確な測定を可能ならしめるのに有効な条件下で、インキュベートする。
【００９０】
その後、切片から二次試薬の未結合部分を除去する。つぎに、二次試薬および対照中の対応物を定量する。二次試薬が検出可能な標識を含んでいるときには、三次試薬とのインキュベーションは通常不必要である。しかし、一般に、免疫細胞化学的分析には、検出可能な標識を含む三次試薬の使用がより普通に採用されている。それゆえ、説明のために、３成分アッセイをここに記載する。
【００９１】
切片をつぎに、検出可能な標識を含み、二次試薬に特異的に結合する三次試薬とともにインキュベートする。インキュベーションは、試験切片の細胞中で一次試薬に結合している二次試薬ならびに対照切片中の対応物に三次試薬が効率的に結合し、他の細胞成分への結合は非効率的となるような条件下で、すなわち、特異的結合対非特異的結合の比が生検材料の細胞中のウテログロビン含量の正確な測定を可能ならしめるのに有効な条件下で、実施する。検出可能な標識を含む三次試薬の好ましいものは、ビオチニル化二次試薬に結合するためのアビジン化酵素である。この点で好ましい酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【００９２】
たとえば切片を緩衝液で洗って、未結合三次試薬を除去する。つぎに、生検材料の細胞中で結合している検出可能な標識を測定することができる。本発明の好ましい実施態様においては、三次触媒中の酵素が発色反応を接触するのに有効な条件下で、切片をインキュベートする。ウテログロビン特異的試薬の結合は、該反応によって生じた色によって測定することができる。
【００９３】
生検試料中の細胞内ウテログロビンの定量を実施するのに適当な試薬および条件は周知であり、容易に入手できる。この目的には、多数の操作法および試薬を効果的に採用できる。かかる試薬および手法は、免疫細胞化学、組織病理学および細胞学の領域の当業者によりルーチン的に採用されている。
【００９４】
かかるアッセイを実施するためのキットは、全部または一部を、多くの商業的供給者から広く入手できる。二次抗体のインキュベーションおよびその後のウテログロビンの可視化は、商業的供給者が指示している所与の操作法に従って実施できる。
【００９５】
好ましい実施態様においては、切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色して、病態を確認し、同じ切片中の正常細胞と疾患細胞との中のウテログロビンの比較を容易ならしめる。
【００９６】
とくに好ましい実施態様では、切片中の疾患細胞と正常細胞との相対的染色を規準細胞における染色と比較する。規準細胞は、正常細胞、良性腫瘍に特徴的な細胞および悪性腫瘍に特徴的な細胞において所与の操作法によって得られた結果を代表する規準標準品である。さらに、規準細胞は、任意の範疇内において、等級付けられた一連の特徴的な結果を与えることができる。規準細胞中のウテログロビンは、生検試料の細胞中のウテログロビンの定量と同時に、または別の時に測定することができる。本発明のとくに好ましい一実施態様においては、その後の臨床アッセイの標準参照シリーズとして役立つ規準細胞中のウテログロビンを定量する。
【００９７】
正常組織においては、上記のごとき免疫細胞化学的手法は、前立腺上皮細胞の内腔表面においてウテログロビンのきわめて強い染色を明らかにする。前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）などの新形成に先行すると考えられる中間的病態をあらわす生検試料は、正常細胞のそれと類似の、しかしより弱いウテログロビン染色パターンを示す。悪性腫瘍からの生検試料は、細胞中ウテログロビンの染色の有意の減少を示す。前立腺腫瘍における上皮細胞の内腔表面の染色の減少は、とくに劇的である。正常組織では、上皮細胞の内腔表面は最高のウテログロビン染色を示すが、転移性前立腺組織の同じ細胞では、ウテログロビン染色は検出できないかまたはかすかである。
【００９８】
正常組織、前立腺上皮内新形成および癌を識別することがこのように可能であるので、ＰＩＮの同定が可能になるのである。ＰＩＮは癌と関連があるので、とくに高度のＰＩＮは癌と７０％関連があると報告されているので、これは前立腺癌の早期の診断、予後および治療に役立つ。
【００９９】
さらに、年齢との関係でみたＰＩＮの有病率と年齢との関係でみた前立腺癌の有病率との間には密接な関係があって、ＰＩＮの発生は前立腺癌の発生を、２０〜３０年間の時間のずれはあるが、反映していると、報告されている。この関係が、開業医に、早期検出・早期治療という診断・予後能力を与える。
【０１００】
侵食癌になるリスクは、生体組織検査試料の疾患細胞中のウテログロビンを同タイプの正常組織の細胞と比較したときの相対的減少によって評価する。正常および疾患組織の両方を含む生体組織検査材料においては、正常組織中および疾患組織中の細胞の染色を同一切片で比較することができる。一般に、比較的に限定された低度の腫瘍の中の細胞が、正常細胞と同程度の量のウテログロビンを発現する。攻撃的な侵食腫瘍中の細胞は、ウテログロビンをほとんど発現しないかまたはまったく発現せず、形態の分化が不十分である。
【０１０１】
ｍＲＮＡおよびＤＮＡの特異的検出
生体組織検査試料の細胞中のｍＲＮＡを定量して、転移可能性を求めることもできる。ｍＲＮＡは、当業者に周知の種々の方法によって定量でき、それは、商業的供給者から容易に入手できるものを含めて、入手の容易な周知の材料を用いて実施できる。この点で有用な手法は前記諸引例に記載されている。ウテログロビンに関してこの点でとくに適切と思われる手法が、Ｂｒｏｅｒｓら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６６：３３７−３４６（１９９２）およびＪｅｎｓｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５８：６２９−６３７（１９９４）に記載されており、これらは前述の通り本明細書に挿入されるものである。
【０１０２】
生検組織の細胞中の所与のｍＲＮＡは、特異的プローブとのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって定量できる。かかるプローブは、クローン化ＤＮＡまたはそれらの断片、ＲＮＡ、一般にはｉｎｖｉｔｒｏ転写によって作られたＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、通常は固相合成法によって作られたオリゴヌクレオチドであってよい。特異的ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションに適したプローブの調製法および使用法は、当該技術において周知であり、いたるところで用いられている。
【０１０３】
特異的ハイブリダイゼーションとは、当該プローブが所与の標的ｍＲＮＡと二本鎖を形成し、その二本鎖はハイブリダイゼーションおよびその後のインキュベーションの条件下で安定であるが、プローブと他の非標的ｍＲＮＡとの間に形成された二本鎖は不安定であって、通常はその後のインキュベーションに耐えて存在しつづけることはないことを、意味する。かくして、特異的ハイブリダイゼーションは、標的ｍＲＮＡと非標的ｍＲＮＡとに対するハイブリダイゼーションの比から、生体組織検査試料の細胞中の標的ｍＲＮＡの正確な定量ができることを意味する。
【０１０４】
本発明のとくに好ましい一実施態様においては、ウテログロビンｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするプローブを用いて、生検組織、とくに前立腺生体組織検査材料の細胞中のウテログロビンｍＲＮＡを定量する。
【０１０５】
ウテログロビンｍＲＮＡなどの標的ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ定量に適した手法は、よく知られた入手容易な種々の実験室マニュアルならびに一次文献に記載されている。これに関する一次文献からの実例的な操作法が、Ｂｒｏｅｒｓら、ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ６６（３）：３３７−３４６（１９９２）に記載されており、その全体を引用によりここに挿入する。
【０１０６】
一般に、生体組織検査材料は適当な外科的操作により取得し、メチルブタン／ドライアイス中での凍結によるなどの方法で速やかに凍結する。試料は、生検試料中のタンパク質の定量について上述したところとほぼ同様にして、包埋し、切片とすることができる。切片は、前もって酸およびエタノールで浄化し、ポリ−Ｌ−リシンで被覆したスライドガラス上で融解させ、これにはりつけることができる。組織切片は、その後、緩衝ホルムアルデヒドに暴露し、アセチル化し、緩衝グリシンで処理し、つぎに、１０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０である）中でプレハイブリダイゼーション処理する。プレハイブリダイゼーション後、５０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、２ｘＳＳＣ中で、切片を標識したプローブにハイブリダイズさせる。
【０１０７】
操作法中の段階、とくにプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび判定基準段階の適格な条件は、プローブのＴｍ（融解温度）（もしくはＴｄ（分解温度））に応じて調整して、所望度合いのハイブリダイゼーション特異性、すなわち所望の厳密さを得るようにする。
【０１０８】
この点での適切な条件を求めるための理論的近似および実験的方法は、周知であり、当業者がルーチン的に実施しているところである。この点での近似計算および実験的手法は、たとえば、上記において言及したＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）中に記載されている。
【０１０９】
当業者ならば、たとえば、上記溶液中のホルムアミドが低温で同等のハイブリダイゼーション条件を与えることを知っているであろう。たとえば、５０％ホルムアミド中、約５０℃でのハイブリダイゼーションは、ホルムアミドなしでの６５℃でのハイブリダイゼーションと同様の条件を与えることとなる。より低温でのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション操作中の生体組織検査切片の保護・保存を助け、その後の細胞およびｍＲＮＡ含量の同定・吟味を助けることができる。組織切片の特性を保存し、分析を助けるその他の試剤も同様に好ましい。
【０１１０】
周知のように、ハイブリダイゼーション反応を促進し、より短い時間でそれを完了させるために、通常、デキストラン硫酸を使用する。ハイブリダイゼーションの速度を増し、特定のｍＲＮＡの含量の正確な決定を妨げない同様の試剤も、本発明において有用である。
【０１１１】
ハイブリダイゼーションに続いて、プローブ含有溶液および未結合プローブを除去する。一般的には、切片をプレハイブリダイゼーション緩衝液、たとえば５０％ホルミアミド、２ｘＳＳＣで、ハイブリダイゼーション温度よりも若干高い温度で、数回洗う。
【０１１２】
標的ｍＲＮＡの検出にＲＮＡプローブを用いる場合には、切片をつぎにＲＮアーゼＡで、一般的には同一溶液中で、処理し、つぎに、先の洗浄と同じ条件下で５０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣで洗浄して、ＲＮアーゼＡおよび副生物を除去する。
【０１１３】
最後に、切片を、一般的には、２ｘＳＳＣ中、室温で、もう数回洗い、つぎに乾燥する。
【０１１４】
放射性プローブは、通常、オートラジオグラフィーにより可視化する。このためには、スライドを写真乳剤に浸漬し、乾燥し、乳剤を４℃で適当な時間感光させる。好ましい乳剤であるＮＴＢ−２ヌクレアートラックエマルションを用いるときには、３〜７日間の感光時間が適当である。感光時間は、より高度に標識されたプローブの使用をも含めて、種々の要因によって変えることができる。
【０１１５】
感光時間が終了すると、乳剤を現像し、つぎに、一般的には、ヘマトキシリンおよびエオシンで逆染色する。その後、細胞中の標的ｍＲＮＡの標識を、明視野および暗視野照明を用いての顕微鏡観察により評価することができる。
【０１１６】
タンパク質に関して上で論じたように、生体組織検査切片の細胞内標的ｍＲＮＡの量および分布が、腫瘍の転移可能性を示してくれる。とくに、疾患細胞および正常細胞中のｍＲＮＡの相対量が、転移可能性を示してくれる。
【０１１７】
このタイプのアッセイの正確さを改善するために、種々の対照を有益に採用できる。たとえば、切片を無関係なプローブにハイブリダイズさせてもよく、切片を、ハイブリダイゼーションに先立って、ＲＮアーゼＡで処理して、擬似ハイブリダイゼーションを評価してもよい。
【０１１８】
かくして、たとえば、ウテログロビンタンパク質について論じたように、正常組織は、前立腺上皮細胞中に高い濃度のウテログロビンｍＲＮＡを提示する。前立腺上皮内新形成（「ＰＩＮ」）などの中間病態は、正常細胞が示すウテログロビンｍＲＮＡ特異的プローブへのハイブリダイゼーションと類似の、しかしそれより少ない、相対的に低いウテログロビンｍＲＮＡ濃度を示す。悪性腫瘍からの生体組織検査材料は、ウテログロビンｍＲＮＡ特異的ハイブリダイゼーションプローブへのハイブリダイゼーションをほとんど示さないかまたはまったく示さないことによって、細胞中ｍＲＮＡ濃度の有意な減少を示す。
【０１１９】
ここでも、正常組織、前立腺上皮内新形成および癌の間の識別により、ＰＩＮの識別・確認、癌の早期の診断、予後および治療が可能になる。
【０１２０】
異常ｍＲＮＡまたは異常ＤＮＡ
前立腺起源のいくつかの転移組織は、同じ組織内の細胞がウテログロビンタンパク質を、合成するとしても、あまり多量には合成しないけれども、ウテログロビン特異的プローブに対して見かけ上正常なハイブリダイゼーションを示す。これらの細胞は一般的には、ウテログロビンｍＲＮＡの減少よりはむしろ異常なウテログロビンｍＲＮＡを示す。たとえば、すくなくとも一つのヒト前立腺癌において、異常スプライシングが証明されている。
【０１２１】
転移組織の細胞のｍＲＮＡにおけるスプライシングその他の異常は、ノーザンおよびサザンブロット法およびＰＣＲ手法により知ることができる。これらの手法も当業者には周知であり、本発明に従っての生体組織検査材料の細胞中のｍＲＮＡの測定に容易に適用できる。
【０１２２】
制限断片長多形（「ＲＦＬＰ」）を評価するのに用いられている手法を、異常スプライシングパターンと関連した若干の変異の検出に適用することができる。この評価は常にｍＲＮＡについて行うことができるが、若干の機能不全では、ゲノムＤＮＡについても行いうる。ｍＲＮＡまたはＤＮＡは、ＲＦＬＰ分析に先立っても、ＰＣＲまたはその他の適当な手法を用いて、増幅することができる。
【０１２３】
ＲＦＬＰ手法のほかに、ウテログロビン特異的ｍＲＮＡなどのメッセージの異常スプライシングの検出に、ＳＳＣＰを用いることができる。このためには、ウテログロビンｍＲＮＡなどの標的ｍＲＮＡを逆転写酵素を介在させたＰＣＲによって増幅する。増幅された二本鎖ＤＮＡを変性し、ゲル上で泳動させる。このときの移動度は二次構造のわずかな変化に対してきわめて敏感に反応する。
【０１２４】
異常スプライシングを測定するのに使用できるさらに別の手法は、とりわけ、リガーゼを介在させたＰＣＲである。この手法も当業者には周知で、文献に記載されてきたｍＲＮＡおよびゲノム異常の分析、測定に適した手法を、腫瘍の細胞中の異常ｍＲＮＡの測定に容易に適用できる。
【０１２５】
上記のすべてに関して、生体組織検査材料の上皮細胞中のｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡを測定することが好ましい。この点でとくに好ましいのは、前立腺生体組織検査材料である。
【０１２６】
標的ｍＲＮＡおよびＤＮＡの測定による腫瘍の転移可能性の測定のためのプローブおよびハイブリダイゼーション標的としては、ウテログロビンｍＲＮＡに特異的な、もしくはウテログロビンの発現の変化、従って転移可能性を表わすようなウテログロビンｍＲＮＡまたはウテログロビンをコードするＤＮＡの異常に対して特異的な、プローブがある。
【０１２７】
基準
本発明のこの側面に従って、結果の解釈の手引きとするための基準をつくりだすことができる。この点では、特定の転移可能性を特徴付ける特定タイプの代表的腫瘍からの生体組織検査材料について、上記に従ったタンパク質またはｍＲＮＡを測定すればよい。
【０１２８】
この点での特性決定に際しては、治療を受けているときおよびその後の患者における腫瘍の進行の実際の経過に従ったあと知恵の恩恵を受けることができる。等級付けられた一連の転移可能性を特徴付ける基準的結果は、本明細書中の他の場所に記載しており、下記の例において明らかにされている細胞培養試験からも得ることができる。
【０１２９】
転移特性が既知の種々の腫瘍における上述のごときタンパク質またはｍＲＮＡもしくはその他の因子の測定ならびにそれら測定と転移可能性との相関関係が、本発明の別の一つの好ましい態様である。
【０１３０】
キット
上に記載した諸方法を実施するための試薬は、腫瘍の転移可能性の判定もしくは前立腺上皮内新形成の判定に使用するためのキットに組み込むことができる。転移可能性の判定および前立腺上皮内新形成の確認に関して本明細書中で論じた手法および試薬は、後記の例で述べる試薬、方法をも含めて、すべてこれらのキットに含めることができる。好ましいキット構成成分は、一般に、本明細書中の他の場所で論じている要因、とくに、転移可能性またはＰＩＮを判断させるタンパク質またはｍＲＮＡの測定に関して上記諸節において論じたごとき要因を検出するものである。
【０１３１】
それらキットはまた、１つ以上の基準結果、たとえば転移可能性の高い腫瘍および低い腫瘍に特徴的な免疫細胞化学的結果を示す基準スライド、または同じ点で特徴的なｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果の基準スライドをも包含しうる。この点では、結果の解釈のための一連の基準を包含しているキットが好ましい。基準は、１枚以上の写真の形をとっていても、あるいは、書面による説明を含めて、その他の方法で描写されていてもよい。さらに、基準は、腫瘍のタイプに高度に特異的であってもよく、あるいは関連するタイプの腫瘍に適用できるものであってもよい。
【０１３２】
抗転移剤および方法
本明細書で開示されている発明は、転移を抑制または防止する薬剤および方法を提供する。以下の論述は、この点での本発明の具体的説明である。
【０１３３】
抗転移剤
とくに、生体内での上皮細胞起源の腫瘍の細胞によるアラキドン酸放出を抑制する化合物を包含する本発明のこの側面に従えば、かかる化合物を、腫瘍の転移を抑制または防止するのに有効な経路により、それに有効な量を投与する。
【０１３４】
アラキドン酸放出阻害剤
本発明のなんらかの理論に限定されることなく、出願人は、アラキドン酸が細胞内エイコサノイド合成経路における基質であることに注目している。種々のエイコサノイドが、細胞の形、付着、運動性および増殖を刺激または阻害する上である役割を演じている。本発明のいくつかの側面においては、上皮細胞起源の腫瘍の細胞におけるアラキドン酸放出の阻害は、転移可能性を阻害し、または消し去る。
【０１３５】
ホスホリパーゼＡ2阻害剤
ホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ2）を阻害する化合物は、本発明の好ましい化合物である。ＰＬＡ2は、アラキドン酸の生産および分泌に関与する一連の酵素、基質、生産物および補因子を意味するアラキドン酸カスケードの膜シグナル伝達酵素であり、一般に、ＰＬＡ2阻害剤が通常はアラキドン酸の放出を阻害するというのが実際である。ＰＬＡ2が、腫瘍形成や転移よりも、むしろ炎症の過程と関連付けられてきたのであり、それは慢性炎症を制御するための標的として示唆されてきたのであって、抗転移剤の標的としては示唆されたことはない。しかしながら、本発明は、上皮細胞起源の腫瘍の転移を阻害するためのＰＬＡ2阻害剤の組成物および方法を提供する。本発明におけるこれらの化合物の処方および使用法は、以下の論述する好ましい実施態様を参照すれば説明される。
【０１３６】
ＰＬＡ2阻害剤のうちでもとくに好ましいのは、リポコルチン類およびウテログロビン類、リポコルチン類およびウテログロビン類のペプチド類似体、ウテログロビン類のムテイン類およびウテログロビンのペプチド類似体である。とりわけ好ましいのは、ウテログロビン類であり、とりわけヒトウテログロビンがとくに好ましい。ウテログロビン、とくにヒトウテログロビンを対象とした下記の論述は、本発明をこの点について説明するものである。
【０１３７】
ウテログロビン類
ウテログロビンはブラストキニンとも呼ばれるが、これは、最初、妊娠初期のウサギ子宮液の主なタンパク質成分として発見された。ウサギウテログロビンに対するヒトの対応物は、最初、遠位細気管支の無線毛クララ細胞中で見出され、もとはクララ細胞１０ｋＤタンパク質、略して「ＣＣ１０」と名付けられた。ウテログロビンはまた、ヒトにおいて、免疫組織化学的方法により、子宮、気道および前立腺で検出されている。
【０１３８】
ヒトウテログロビン（ＣＣ１０）の相補ＤＮＡは、クローン化されており、その配列が決定されている。ＳｉｎｇｈらがＢＢＡ ９５０：３２９−３３７（１９８８）で報告している通りであり、これの全体を引用してここに挿入する。
【０１３９】
ウテログロビンは、少なくとも２つのグループによって均質にまで精製されており、構造上および機能上かなり詳しく特性決定がされている。簡略に言えば、ウテログロビンはウサギ中では２本の同じ鎖の二量体として存在している。単量体は７０アミノ酸の長さがある。それらは二量体中では互いに逆平行に配列されている。また、二量体中で、それらは、’Ｃｙｓ−３’と”Ｃｙｓ−６９”との間および逆に’Ｃｙｓ−６９’と”Ｃｙｓ−３”との間に形成された２つの対称性ジスルフィド結合によって共役結合的に連結されている（ここに、’は二量体の一方の鎖を、”は他方の鎖を意味している）。各単量体鎖は、４つのαヘリックスと１つのβターンを含み、後者はＬｙｓ−２６〜Ｇｌｎ−２９にある。ウテログロビンの構造、機能および活性は、たとえば、Ｍｉｅｌｅら、ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖｉｅｗｓ ８：４７４−４９０（１９８７）により概観されており、これの全体を引用によりここに挿入する。
【０１４０】
ウテログロビンは、インビトロアッセイによって示されるように、ＰＬＡ2の活性を阻害する。一般に、それは、免疫調節作用または抗炎症作用もしくはそれらの両方を有すると考えられており、それらの作用は、外部環境に通じている器官の湿性上皮を保護する働きをする。ウテログロビンの発現はステロイド感受性であり、子宮内膜におけるそれの分泌はプロゲステロンによって刺激されることが示されている。ウテログロビンはまた、好中球および単球に対して抗走化性作用をもつことが報告されている。ウテログロビンは、癌または転移においてなんらかの役割を演じているとは認められていなかった。従って、本発明に従って、ウテログロビンを生体における上皮細胞起源の腫瘍の転移の抑制または防止に用いうることが見出されたのは、驚くべきことであった。
【０１４１】
ウテログロビンが転移を抑制する機構についてのなんらかの理論に拘束されることなく、実施例が示すように、ウテログロビンの転移抑制作用はＰＬＡ2活性の抑制および腫瘍細胞によるアラキドン酸放出の抑制によるものと思われる。本発明においては、アラキドン酸放出を抑制し、上皮細胞起源の腫瘍の転移を抑制または防止するウテログロビンはいずれも有用である。本発明に使用すべきウテログロビン類は、天然源から回収してもよく、組換え手段によって製造してもよく、化学的手法で製造してもよく、半合成法によって製造してもよく、諸手法を組み合わせて得ることもできる。
【０１４２】
天然源からウテログロビンを均質にまで精製する方法は、Ｎｉｅｔｏら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１８０：８０−９２（１９７７）に記載されており、その全体を引用によりここに挿入する。この点では、同じ目的のための他の方法も同様に有用でありうる。
【０１４３】
現在の時点で本発明に用いるのにもっとも好ましいウテログロビンは、ヒトウテログロビンである。本発明に使用すべきヒトウテログロビンは、培養宿主細胞または動物中でクローン化された遺伝子の発現によって製造されることが好ましい。このようにウテログロビンを発現させる手法は、当業者には周知である。
【０１４４】
この目的に有用なヒトウテログロビンをコードするｃＤＮＡは、単離され、配列決定され、培養細胞中で発現されている。ウテログロビンをコードするクローン化ＤＮＡを発現させる方法は、とくにヒトウテログロビンに関して、Ｍａｎｔｉｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２０３４３−２０３５１（１９９３）およびＭｉｅｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：６４２７−６４３５（１９９０）に記載されており、下記に言及する通り、それらの全体を引用によりここに挿入する。
【０１４５】
本発明で使用するウテログロビンを得るために、クローン化遺伝子を取得し、操作し、発現させる手法は、当業者には周知であり、種々の実験室向けマニュアルにプロトコール様に詳細に記載されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．（１９８９）にかかる方法が述べられており、その全体を引用によりここに挿入する。
【０１４６】
リポコルチン類
リポコルチンタンパク質は、アネキシン類としても知られており、当該技術には周知のものである。それらは、一般に、カルシウム依存性燐脂質結合性タンパク質として性格描写されている。たとえば、Ａｒｃｏｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：３４７−３５５（１９９３）（その全体を引用によりここに挿入する）は、ヒトリポコルチン１の構造および大腸菌での発現ベクターを用いた活性タンパク質の発現について報告している。
【０１４７】
リポコルチン類は、グルココルチコイドの抗炎症作用機構に包含されてきた。さらに、抗炎症作用は、Ｃｉｒｉｎｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０８：５７３−４（１９９３）（その全体を引用によりここに挿入する）によって合成され、特性決定されたヒトリポコルチン残基２−２６に相当するアシル化ポリペプチドの活性によって示されるように、ヒトリポコルチン１のアミノ末端部と関連付けられてきた。
【０１４８】
一つの仮説に従えば、リポコルチン類は、ホスホリパーゼＡ2のグルココルチコイド依存性阻害を媒介する。いくつかの研究が、たとえばＢａｓｔｉａｎら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０１：３５９−６３（１９９３）（これの全体を引用によりここに挿入する）が報告しているように、ホスホリパーゼＡ2阻害の「基質枯渇」機構を支持している。
【０１４９】
それらの研究は、グルココルチコイドに対する抗炎症反応におけるリポコルチン類の中間的役割に焦点を当てているが、転移におけるリポコルチンタンパク質の役割は知られていなかった。
【０１５０】
本発明の一側面によれば、リポコルチン類は、上皮細胞起源の腫瘍の転移を抑制または防止するために使用できる。本発明に従ってのリポコルチン類の使用法およびリポコルチン組成物は、本明細書中の他の場所においての論述を参照すれば、とくに、ウテログロビンおよび前立腺癌に関する例証的開示を参照すれば、理解されるであろう。
【０１５１】
リポコルチン類は、全般的に、本発明のこの側面に従って使用できる。高い治療効果をもち、有害な副作用の発現率の低いリポコルチンが好ましい。とくに好ましいリポコルチン類は、ヒト起源のものである。ヒトリポコルチン１は、とくに好ましいものの一つである。
【０１５２】
ムテイン類おおよびペプチド類似体
本発明で有用なウテログロビンおよび他のタンパク質の変異体および類似体を製造するには、上述のマニュアル中に記載されているものなどの手法を使用できる。ムテイン類およびペプチド類似体類を製造し、改変し、使用するための組換えＤＮＡ法、化学合成法、酵素法および混成法は周知であり、ここでは、それらの本発明への適用可能性を説明するために簡単に記載するにとどめる。
【０１５３】
−ムテイン類
タンパク質のアミノ酸配列を変えるために、クローン化された遺伝子を操作するのが容易なことは、認識されるであろう。クローン化されたヒトウテログロビン遺伝子は、とりわけ、本発明に従って使用できるところの天然ヒトタンパク質の変異体類（本明細書ではムテイン類と呼んでいる）を製造するために、種々の周知のｉｎｖｉｔｒｏ突然変異誘発手法により操作することができる。
【０１５４】
本発明で使用しうるリポコルチン類またはウテログロビン類のムテイン類の一次構造の変化には、たとえば、欠失、挿入および置換が含まれる。置換は、保存的であっても、非保存的であってもよい。天然タンパク質とムテインとの間の差が、通常、所望の性質を保存し、望ましくない性質を弱め、または除去し、所望の、または新しい性質を付加する。本発明においては、ムテイン類は、一般に、抗転移活性を維持または増強するものである。とくに。ウテログロビンムテイン類は、ウテログロビンの抗転移活性を維持または増強するアミノ酸配列変異体類である。
【０１５５】
−ペプチド類似体
同様に、それらを誘導した（一次配列について）もととなるより大きいタンパク質の活性を呈する小型のオリゴペプチドおよびポリペプチドを製造する手法は周知であり、当業界においてルーチンなものとなっている。かくして、リポコルチンおよびウテログロビンのペプチド類似体であって抗転移作用を示すものなどの本発明のタンパク質のペプチド類似体も、本発明において有用である。
【０１５６】
擬似体
擬似体も、本発明に従って、腫瘍の転移を抑制または防止するのに使用することができる。擬似体の設計は、当業者にとって既知であり、それらは、通常、それらのモデルであるより大きい分子（多くの場合タンパク質）の活性と同じまたは類似の活性を有するペプチドまたはその他の比較的小さい分子であると理解されている。
【０１５７】
かくして、実例を挙げれば、たとえばウテログロビン擬似体を、本発明に従って、ウテログロビン自身と同様に、腫瘍の転移の防止または抑制のために使用できる。
【０１５８】
かかる擬似体の設計は、ウテログロビンの構造機能相関を基礎とすることができる。ウテログロビンの抗転移活性に対する諸変異の影響を研究することによって、タンパク質中の抗転移活性を受け持つ部位を同定することができる。本発明の抗転移活性をもつウテログロビンおよびその他のタンパク質などをコードするｃＤＮＡなどのクローン化された遺伝子を系統的に変化させるのに用いうる諸々のｉｎｖｉｔｒｏ突然変異誘発法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８８）中に記載されている。本明細書中の他の場所で言及しているようにムテインとも呼ばれるところの系統的に変異を誘発されたタンパク質は、かかる変化させたＤＮＡを用い、クローン化された遺伝子を生体内で発現させて異種タンパク質を製造するための標準的方法によって製造できる。かかる方法は当業者には周知であって、たとえば、上記で引用したＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８８）の中に記載されている。このようにして製造したムテイン類は、つぎに、抗転移活性のモデルとなるかまたはそれを測定するインビトロまたはインビボアッセイ法を用いて、抗転移活性についてアッセイすることができる。好適な方法をここに記載し、下記の例において説明する。
【０１５９】
タンパク質構造の諸相を求める方法も、当業者には周知である。ある程度までは、所与のタンパク質の構造を、関連タンパク質類の構造との類推によって近似することができる。あるタンパク質の構造に関する物理的および化学的情報は、活性部位修飾手法、ＮＭＲ、Ｘ線結晶解析を含めての周知の種々の手法によって得ることができる。
【０１６０】
この情報を、前記の突然変異誘発研究などの構造上の変化を活性の変化と関連させる諸研究からの情報と組合せて、タンパク質の所与の活性にとって重要な形態および化学的機能のマップを作成することができる。
【０１６１】
その後は、所望の活性を提供する形態および化学的機能を模擬した分子を設計し、合成することができる。この目的で採用できるコンピュータによる設計ならびに本発明のこの面に従って擬似体を製造するのに利用できる有機合成、ペプチド合成の諸方法および他のクラスの化合物の合成のための諸方法は、当業者にとって周知である。
【０１６２】
いったんある擬似体が設計され、合成されたならば、本明細書中の他の場所で記載しているものなどの、このための手法を用いて、抗転移活性についてそれをアッセイすることができる。
【０１６３】
擬似体自身の活性試験および構造研究の結果を用いて、２つの擬似体を組合せて、単一の分子とするなどにより、より有効で、望ましくない副作用のより少ない、または追加の活性を有するさらなる擬似体を設計することができる。
【０１６４】
ウテログロビンの場合と同様に、抗転移活性を有する他の化合物の擬似体を設計することができる。この点で好ましいのは、上記の通り、上皮細胞起源の癌の細胞によるアラキドン酸放出を阻害する抗転移性擬似化合物である。とくに好ましいのは、かかる細胞においてホスホリパーゼＡ2を阻害する擬似体である。この点では、ウテログロビンまたはリポコルチンの擬似体がとくに好ましい。この点でもっとも好ましい擬似体としては、ヒトウテログロビンの擬似体がある。
【０１６５】
小型分子薬物
上に論じたタンパク質類、ムテイン類、タンパク質から誘導したペプチド類、擬似体など以外の化合物で、上皮細胞起源の癌の細胞によるアラキドン酸放出を阻害するものも、本発明において有用でありうる。かかる化合物としては、アラキドン酸放出を阻害するある種の小型有機分子（擬似体であってもよい）が挙げられる。阻害は、ＰＬＡ2の阻害により、またはアラキドン酸放出にいたる代謝反応に関与する他の酵素または中間体の阻害により媒介されうる。
【０１６６】
かかる化合物としては、ＰＬＡ2を阻害することが示されている抗炎症剤メパクリンならびにシクロオキシゲナーゼを阻害することが示されている実験的薬物インドメタシンがある。両化合物は、インビトロアッセイにおいて、患者において無毒性であることが示されている用量で抗転移活性を示す。従って、両化合物ともに、本発明に従って利用することができる。
【０１６７】
前述の通り、ＰＬＡ2はアラキドン酸カスケードにおける中心的酵素である。上述の通り、この点では、ＰＬＡ2の阻害剤が本発明においてとくに好ましい。小型分子薬物のうちでは、メパクリンがＰＬＡ2阻害剤として好ましい。メパクリンと同様にＰＬＡ2を阻害する比較的小型の分子の他の薬物（この場合の小型とは、平均サイズのタンパク質に比して小さいことを意味する）も、上で論じたメパクリンおよび他のＰＬＡ2阻害剤と同じようにして、本発明において有用であろう。小型分子薬物のうちでは、かかるＰＬＡ2阻害剤がとくに好ましい。この点では、メパクリンがきわめて好ましく、化学構造がメパクリンに類似している他の化合物がとくに好ましい。
【０１６８】
シクロオキシゲナーゼは、シクロオキシゲナーゼ依存性アラキドン酸代謝経路における中心的酵素であり、その経路において、アラキドン酸はプロスタグランジン類、プロスタサイクリン類およびトロンボキサン類の合成に際しての前駆体である。小型分子薬物のうち、シクロオキシゲナーゼ阻害剤も、ここに開示した本発明において使用するのに好ましいものである。非ステロイド抗炎症剤（「ＮＳＡＩＤ」）は、シクロオキシゲナーゼを阻害するところの、本明細書において使用した語の通りの小型分子薬物に含まれ、この点で、本発明において好ましいものである。ＮＳＡＩＤ類は、たとえば、薬理学原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、Ｍｕｎｓｏｎら編、ちゃっぷまん・アンド・ホール社、ニューヨーク（１９９５年）に記載されており、これの関連する部分を、とくに第７４章を含めて、引用してここに挿入する。
【０１６９】
本発明のこの面に従ったＮＳＡＩＤ類のうちには、アスピリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スルフィンピラゾン（アンツラン）およびインドメタシンがある。この点では、インドメタシンがとくに好ましく、化学構造上インドメタシンに類似の化合物も好ましい。
【０１７０】
リポキシゲナーゼは、リポキシゲナーゼ依存性アラキドン酸代謝経路における中心的酵素であり、その経路において、アラキドン酸はトロンボキサン類の合成における前駆体である。リポキシゲナーゼおよび他のリポキシゲナーゼ依存性経路の他の下流酵素の阻害剤も、本発明において有用でありうる。
【０１７１】
組成物
本発明の組成物を処方するために、任意の無毒性、不活性で、有効な担体を使用できる。ヒトへの投与のために他の治療用化合物を処方するのに用いられる周知の担体が、とくに本発明の組成物において有用であろう。この点では、製薬上許容しうる担体、賦形剤および希釈剤は、メルクインデックス第１１版、Ｂｕｄａｖａｒｉら編、メルク・アンド・カンパニー・インコポレイテッド、ラーウェイ、ニュージャージー州（１９８９年）に記載されているものなど、当業者に周知であり、この刊行物の全体を引用によりここに挿入する。かかる有用な、製薬上許容しうる賦形剤、担体および希釈剤の例としては、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクの溶液およびＤＭＳＯが包含され、これらは本発明において使用するのに好ましいものに属する。
【０１７２】
とくに、たとえばＭａｎｔｉｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２０３４３−２０３５１（１９９３）（上記において引用して挿入）は、本発明のウテログロビン組成物の調製に有用でありうる滅菌処方の凍結乾燥ウテログロビンについて報告している。
【０１７３】
癌
本発明の方法および組成物は、上皮細胞起源の種々の癌の治療に適用できる。これらの癌のうちには、乳房、肺、直腸、膀胱、前立腺、胃腸管、子宮内膜、気管−気管支、膵臓、肝臓、子宮、鼻咽頭および皮膚の転移癌がある。とくに好ましい標的は前立腺癌、とくに上皮細胞起源の前立腺癌である。
【０１７４】
前立腺癌についての以下の詳細な論述は、前立腺癌のみならず本発明に従って類似の方式で、または同様にして処置しうる他の癌についても、本発明の組成物および方法を説明するために、行うものである。
【０１７５】
前立腺腺癌
前立腺の腺癌は、もっともありふれた悪性腫瘍の一つである。１９９５年にアメリカ合衆国において新しい前立腺癌が２４万例診断されるであろうと推定されており、それがその年のうちに５万件をこえる死亡を引き起こすと推定されている。実際、前立腺腺癌は、アメリカ合衆国における癌関連の死亡の第二の主たる原因である。
【０１７６】
前立腺癌とともに、すべての固形（充実性）腫瘍と同様に、患者の死亡を惹起するのは、他の生活機能に対する腫瘍の転移による侵食である。患者のおよそ１０％が初期に転移性疾患であると診断される。終局的には、この癌の患者の３０−４０％が転移性疾患になる。いったん転移が起こったならば、癌は容赦なく進行する。
【０１７７】
侵入が、腫瘍細胞の移動の必要条件となる。結合組織、間質および基底膜が、移動過程に対する主たる物理的障壁を形成する。従って、腫瘍細胞による局所細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の侵襲は、転移の第一段階であると考えることができる。ＥＣＭ侵襲の一連の生化学的機構は、まず、ＥＣＭの特異的成分への細胞付着とそれに続く累進性の分解的タンパク質溶解のカスケードを包含する。臨界的な大きさにまで成長する前立腺癌は、それらの成長、増殖に必要なストロマ細胞分泌タンパク質に見たところ応答して、特定の解剖学的部位に対して被膜外侵襲を示し、そこに転移する。前立腺内部の腫瘍細胞の侵入的移動は、神経周囲管などの、抵抗のもっとも少ない解剖学的経路に沿って、化学運動性の関数として生起しうる。転移のそれ以上の確立は、循環系またはリンパ系への成功裏の侵入と、それに続く二次器官（前立腺起源の癌の場合には骨髄であることが多い）での血管外遊出にたよることとなる。これらの段階のほとんどすべては、付着、マトリックス崩壊および移動を含めて、インビトロで、誘引物質の役目をする線維芽細胞調整培地（ＦＣＭ）に応答しての再構成基底膜（ＲＢＭ）障壁の侵入を測定することによって、実験的に模倣することができる。
【０１７８】
インビボでは、前立腺腫瘍細胞の成育および増殖は、主としてストロマ細胞（線維芽細胞）分泌タンパク質に応答する。前立腺腫瘍細胞の被膜外侵入性は、インビトロでの、線維芽細胞調整培地（ＦＣＭ）などの誘引物質の存在下および不存在下における腫瘍細胞の再構成基底膜（ＲＢＭ）内への移動によって模擬できる。アッセイは、ＲＢＭに付着し、酵素的にＲＢＭを破壊し、最終的にその膜のＦＣＭ側へ移動した細胞を測定する。インビトロ侵入アッセイでのそれらの事象は、インビボでの基底膜を通っての腫瘍細胞の転移的拡散の際に観察される重要な諸段階と一致している。
【０１７９】
前立腺腫瘍は、リンパ循環を介して散乱して、まず局所リンパ節に転移することが多い。それらは、リンパ管と広範囲にわたって相互連絡している血管系を介して他の部位にも拡がる。転移形成の最終部位は、（ｉ）腫瘍を流出させる血管が出会う最初の毛細血管床および（ｉｉ）転移可能性を有する腫瘍細胞の付着および増殖のために栄養を与える特定の組織の特性に関しての腫瘍細胞の器官選択性を含めた多くのパラメータの関数である。
【０１８０】
上皮細胞起源の前立腺癌の転移可能性は、本発明の組成物および方法によって抑制することができる。とくに、これらの癌の転移は、後記実施例に示されているように、ヒトウテログロビンによって抑制できる。
【０１８１】
投与経路
ウテログロビンによる治療処置には、局所、その他の非侵襲的および侵襲的手段を含む任意の投与タイプを利用できる。
【０１８２】
非侵襲的手段による投与は、とりわけ経口、鼻内または経皮経路によって行いうる。
【０１８３】
現時点では、一般的には、侵襲的手法が好ましい。侵襲的手法による投与としては、とりわけ静脈内、腹腔内、筋肉内投与または腫瘍内への直接投与が挙げられる。
【０１８４】
投与は、１回投与によってもよく、間隔をおいて反復してもよく、連続的であってもよい。ウテログロビンは小さくて、容易に拡散でき、比較的安定であるので、灌流ポンプによるなどの長期連続投与によく適している。連続投与を適用するときには、注入が好ましい。この場合には、しばしばポンプ手段が投与にとくに好ましい。とくに、この点からは、皮下ポンプ手段がしばしば好ましいであろう。
【０１８５】
他の状況下では、ウテログロビンおよび本発明のその他の薬剤を規則的な筋肉内自己注射により投与することが望ましいであろう。
【０１８６】
本発明の組成物および方法には、放出調節技術を利用することもできる。たとえば、ウテログロビンを何日間にもわたっての制御された放出のための疎水性ポリマーマトリックス中に含ませることができる。かかる徐放性フイルムは当該技術分野で周知である。この目的で通常採用されていて、本発明に使用できるポリマーの例としては、非分解性のエチレン−酢酸ビニルコポリマーおよび分解性の乳酸−グリコール酸コポリマーがある。ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）やポリ（ビニルアルコール）などのある種のヒドロゲルも有用でありうるが、相対的に短い放出サイクルのためには、上記のものなどの他のポリマー放出系が有用である。
【０１８７】
用量
効果的な治療のための活性薬物の量は、癌のタイプ、投与手段、患者の生理的状態、投与する他の薬物などを包含した種々の因子に依存するであろう。
【０１８８】
治療薬量は、安全性および有効性を最適化するように定めることができる。典型的には、インビトロの研究からの用量効果相関関係から、まず、患者への投与のための適切な用量について有用な手引きが得られるであろう。動物モデルでの研究も、通常、本発明に従っての転移性癌を治療するための有効量に関する手がかりとして用いることができる。
【０１８９】
これらの考慮すべき事情ならびに有効な処方および投与法は、当該技術において周知であり、標準的教科書、たとえばグッドマンとギルマンの「ザ・ファーマコロジカル・ベイシス・オヴ・セラピューティックス」第８版、ギルマンら編、パーガモンプレス（１９９０年）およびレミントンのファーマシューティカル・サイエンシズ、第１７版、マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ペンシルバニア（１９９０年）に記載されており、これら両者の全体を引用によりここに挿入する。
【０１９０】
典型的な治療量は、純粋なウテログロビンとして約０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重であろう。用量は、まずは、約０．１μＭという血中レベルが得られるように調節すればよい。
【０１９１】
本発明の特定の処方では、周知の手法に従って、凍結乾燥形態のウテログロビンを使用する。たとえば、個々のバイアル中で１〜１００ｍｇのウテログロビンを、担体および緩衝剤化合物、たとえばマンニトールおよび燐酸ナトリウムとともに、凍結乾燥すればよい。本明細書中の他の場所で記載しているように、このウテログロビンは、それらのバイアル中で、静菌性の水で再構成して、投与することができる。
【０１９２】
投与方式
治療を実施するのに必要な任意の有効な治療方式を利用し、反復することができる。
【０１９３】
臨床の実地においては、ウテログロビンまたは組換えウテログロビンを、単独でまたは他の治療薬剤と組合わせて、含有する組成物を、反応が得られるまで、一定のサイクルで投与する。
【０１９４】
とりあえずは転移性疾患を呈していない患者には、ウテログロビンをベースとした薬物を、手術および照射線療法に先立つ当面の初期療法として使用することができ、再発または転移のリスクのある（高いＰＳＡ、高いグリーソンスコア、疾患の局所的拡大、および／または手術検体中の腫瘍侵襲の病理学的証拠からみて）患者には、連続的な処置後療法として使用することができる。これらの患者に対する処置は、たとえば、手術または放射線療法の間に原発腫瘍から転移可能性のある細胞が逸出するのを減少させ、検出できない残存原発腫瘍から腫瘍細胞が逸出するのを減少させ、血管内壁への腫瘍細胞の付着を減少させ、血管からの腫瘍細胞の移動を減少させ、かくして、遠位の器官の間質空間への進入を減少させることを目的とする。
【０１９５】
最初から転移性疾患を呈している患者の場合には、ウテログロビンベースの薬剤は、ホルモン除去に対する連続的補足として使用でき、またはホルモン除去の代替としても可能である。これらの患者での治療目標は、未処置原発腫瘍およびすでに存在いている転移性傷害の双方からの腫瘍細胞の逸出を減少させて、さらなる転移が進行的に侵食するのを遅らせることである。
【０１９６】
さらに、本発明は、術後回復期間にとくに効果的でありうる。そこでは、本組成物および方法は、外科的介入によっては除去できない脱落細胞によって惹起される腫瘍の再発の可能性を減少させるのに、とくに有効でありうる。
【０１９７】
遺伝子療法
本発明のいくつかの具体化は、抗転移遺伝子療法に関係するものである。遺伝子療法は、疾患処置への新しいアプローチである。現在のところ、遺伝子治療のプロトコールは、ある種の遺伝病、いくつかの侵襲性の致命的な癌およびエイズを含めた、慎重に選択されたいくつかの障害の治療に関するものである。遺伝子療法の適用が少数の障害に限定されているのは、このアプローチ一般の効果、安全性および倫理上のかかわりについての、またとりわけ現行の手法についての懸念を反映している。これらの関心により要求される慎重なアプローチにもかかわらず、また、遺伝子療法を実施するための手法がいまだ初期の開発段階にあるにもかかわらず、最初のわずかな試験的実施の成果は、きわめて勇気づけるものであり、劇的なものもある。遺伝子療法手法が速やかに向上し、遺伝子療法がまもなく疾患処置のためのますます重要で、普遍的な方法となるのは、確かであると思われる。（たとえばＴｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｏｒｇａｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）で論評されており、これらの全体を引用によりここに挿入する。）
種々の治療薬物の送達が、遺伝子療法手法によって達成されるであろうことは明らかである。現在用いられているかまたは現在開発中の遺伝子療法手法の多くを、本発明に従って転移を防止または抑制するのに使用できる。将来開発される追加の手法も、本発明において有用であることが判明することであろう。以下の論述は、本発明に従って転移を防止または抑制するための遺伝子療法手法の使用を例示するものである。
【０１９８】
以下の論述において、遺伝子療法とは、一般的に、その場で（ｉｎ ｓｉｔｕ）、すなわち患者内で、ある薬物を産生させ、該薬物を腫瘍へ送達せしめて、抗転移効果を生じさせるために、細胞内でポリヌクレオチドを使用することを意味する。該薬物自身が抗転移剤であってもよく、またはそれが患者内へ導入されたときに抗転移剤の産生を惹起するものであってもよい。
【０１９９】
本明細書で開示した発明のこの側面に従って用いうる現在開発されている遺伝子療法へのアプローチは、しばしば、２つの主要なカテゴリー、すなわち体外（ｅｘｖｉｖｏ）手法および体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）手法に分類される。
【０２００】
体外手法は、一般に、患者またはドナーから細胞を採取し、それら細胞にポリヌクレオチドを導入し、ポリヌクレオチドを組込まれ、とくに頻繁にそれらを発現しうる細胞を通常は選択し、可能なかぎり増殖させ、選択された細胞をつぎに患者に導入することにより行われる。このタイプの遺伝子療法においては、原発腫瘍または続発腫瘍の部位から移動してきた腫瘍細胞を含めての生体内腫瘍細胞を標的とする細胞が、一般に好ましい。
【０２０１】
さらに、後記のように、ポリヌクレオチドを患者に直接導入してもよい。この場合、ポリヌクレオチドは、全身的に、または腫瘍部位への注射によって導入しうる。さらに後述のように、ポリヌクレオチドはＤＮＡの形であっても、ＲＮＡの形であってもよく、単独であっても、複合体中またはベクター中にあってもよい。
【０２０２】
ポリヌクレオチドは、周知の種々の形態、たとえばＤＮＡ，ＤＮＡベクター中にクローン化されたＤＮＡ断片、ＤＮＡベクター中にクローン化され、ウイルスキャプシドに包まれたＤＮＡ断片など、のいずれであってもよい。
【０２０３】
ポリヌクレオチドはＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。より典型的にはＤＮＡである。それは、アンチセンスＲＮＡなどのＲＮＡを、すなわちタンパク質をコードする領域に機能可能に連結されていて、該領域の細胞内における所望のレベル、所望の特異性での発現を可能にするプロモーター、エンハンサー、その他のシス作用性調節領域を包含しうる。ポリヌクレオチドは、１つ以上のｍＲＮＡまたはタンパク質もしくはこれら２者の混合物の発現のためのかかる機能可能に連結された調節領域およびコード領域をいくつか含んでいてもよい。
【０２０４】
この点で好ましいのは、上記した抗腫瘍剤をコードするポリヌクレオチドである。上記論述において言及したように、アラキドン酸放出阻害剤が好ましい。ＰＬＡ2活性阻害剤がとくに好ましい。ＰＬＡ2阻害剤のうちでは、ウテログロビン類およびリポコルチン類がとくに好ましく、ウテログロビン類がとりわけ好ましく、ウテログロビン類のうちではヒトウテログロビンがとくに好ましい。
【０２０５】
タンパク質阻害剤のムテインおよびポリペプチド類似体も、本発明において有用であり、転移を抑制する遺伝子療法のためのポリヌクレオチドによってコードされうる。この点では、上記の好ましい具体例のムテインおよびポリペプチド類自体も、本発明のこの側面において好ましいものである。
【０２０６】
さらに、細胞内合成のためにポリペプチドによりコードされうるペプチド擬似体は、本発明のこの側面に従って使用しうる。この観点で好ましい具体例は、前記したものである。
【０２０７】
ポリヌクレオチドは、体内腫瘍のその場への導入を含めて、体外法または体内法により細胞中へ導入しうる。ポリヌクレオチドを構成的発現または誘導的発現のために細胞へ送達するために、種々の手法が考案されており、これらのルーチン的手法は、本発明の遺伝子療法にも使用できる。カチオン性の脂質、リポソームまたはウイルスベクターを用いて、ポリヌクレオチドを体外で細胞内に送り込む。また、ポリヌクレオチドを、直接的または全身的注射を利用して、体内腫瘍のその場の細胞内への導入を含めての体内法で細胞内へ導入する。このようなポリヌクレオチドの導入法には、ポリヌクレオチドの直接的注射が含まれうる。そのときには、通常、ポリヌクレオチドを、生体内細胞によるＤＮＡの直接的取込みを容易にするカチオン性脂質または他の化合物の１種以上との組成物とする。かかる組成物は、生理的持続性を調節する成分をも含んでいてもよい。また、ポリヌクレオチドをウイルスベクターに組み込んで、生体内細胞中に導入することもできる。
【０２０８】
本発明に従った遺伝子療法は、患者内に遺伝子療法ポリヌクレオチドの一過性（一時的）存在または患者へのポリヌクレオチドの永久的導入を包含しうる。後者に関しては、遺伝子療法を、機能不全遺伝子の修復または転移の予防または抑制のために使用できる。
【０２０９】
本発明に従った遺伝子療法は、上述の薬物の直接投与と同様に、単独で、または他の治療法とともに採用することができる。
【０２１０】
他の処置法との組合せ
ウテログロビンを、他の処置法と組合せて用いることができる。他の一般的な処置法を、前立腺癌との関連で、以下に詳細に論述する。他の転移性癌の処置についても同様に考えうることは了解されるであろう。本発明は、現行または将来のいかなる療法とも組合せて利用できるものである。
【０２１１】
手術および放射線
一般に、手術および放射線は、臨床的に局在する疾患を呈し、７０歳未満で、余命が少なくとも１０年と予測される患者に対する治癒可能性のある療法として採用される。転移性疾患の取扱いに際しては、意義のある役割を演じる処置法はなく、最初の診断で転移が存在すれば、通常は、なんらの処置も行われない。
【０２１２】
新たに前立腺癌と診断された患者のおよそ７０％がこの範疇に入る。これらの患者のおよそ９０％（全患者の６３％）が手術を受け、これらの患者のおよそ１０％（全患者の７％）が放射線療法を受けている。
【０２１３】
外科的試料の組織病理検査から、手術を受ける患者のおよそ６３％（全患者の４０％）が最初の診断では検知されなかった局所的拡大腫瘍または限局性（リンパ節）転移をもっていることを明らかになっている。これらの患者は、再発または転移のリスクが有意により大きい。実際、これらの患者のおよそ４０％は、術後５年以内に再発または転移を起こすであろう。放射線処置後の成果は、さらに悲観的である。一次療法として放射線を受けた患者のおよそ８０％が、処置後５年以内に疾患が持続していたり、再発したり、転移を起こす。
【０２１４】
現在のところ、手術または放射線療法患者はなんらの即時継続療法をも受けていないのが通常である。むしろ、それら患者らは、典型的には、再発または転移の主要な指標である前立腺特異抗原（「ＰＳＡ」）の上昇についてモニターを受けている。
【０２１５】
このように、外科的侵襲と組合せて本発明を利用する機会がかなりある。
【０２１６】
ホルモン療法
最初の診断で転移性疾患のある患者の１０％にとっては、ホルモン除去がもっとも効果のある待期的療法である。薬物投与および／または精巣摘出によるホルモン除去を利用して、前立腺癌の一層の増殖および転移を支えるホルモンをブロックする。時間とともに、これらの患者のほとんどすべての原発腫瘍および転移性腫瘍がともにホルモン依存性となり、治療に抵抗性となる。転移性疾患をもつ患者のおよそ５０％が最初の診断から３年以内に死亡し、かかる患者の７５％が診断後５年以内に死亡する。
【０２１７】
これに関して、天然のウテログロビン遺伝子はその発現がホルモン依存性であり、ホルモン除去が、腫瘍細胞および腫瘍周囲の正常細胞の双方において内因性ウテログロビン遺伝子の発現を低下させる可能性のあることは、指摘しておくに値するであろう。ウテログロビン不足の状態は、患者を成功裏の転移をより受けやすくさせる可能性がある。ホルモン療法処置態様において、ウテログロビンをベースとした薬物の継続的補足を利用して、この起こりうべき転移許容状態を進展するのを阻止し、または逆転させることができよう。
【０２１８】
化学療法
化学療法は、いくつかの癌では、他の癌の場合よりも成功してきた。化学療法と本発明の療法との組合せは、場合により相乗的なようである。現在のところ、化学療法は前立腺癌に対してはほとんど効果がなく、最後の手段としてのみ用いられており、一般には暗い結果に終わっている。
【０２１９】
免疫療法
本発明は免疫療法とも組合せて利用できる。ここに開示した方法および組成物を、癌の治療に試験されているまたは使用されているところの種類の増しつつある免疫試薬とともに用いうるのみならず、将来に実用化されるものとも併用できる。かくして、本発明は、たとえばポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を基礎とした免疫療法とともに利用できる。それらのうちでも、モノクローナル抗体をベースとした試薬がこの点ではとりわけ好ましい。かかる試薬は周知であり、たとえばＲｉｔｔｅｒ「モノクローナル抗体−生産、工学的処理および臨床応用（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ − Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ｒｉｔｔｅｒら編、ケンブリッジ大学出版部、ケンブリッジ、英国（１９９５年）に記載されており、その全体をここに引用により挿入する。とくに癌治療用の放射性同位元素標識モノクローナル抗体も周知であり、たとえば「放射性同位元素標識抗体による癌の治療（ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＲａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ編、ＣＲＳプレス、ボカ・レイトン、フロリダ州（１９９５年）に記載されており、これの全体を引用によりここに挿入する。
【０２２０】
寒冷療法
最近、ある種の癌に寒冷療法が適用されてきている。本発明の方法および組成物も、このタイプの効果的な療法と組合せて用いることができる。
【０２２１】
いくつかの有効成分を含有する組成物
本発明の別の側面に従えば、上記化合物に加えて、追加の治療剤を含有し、癌転移の抑制に有用な重要な医薬組成物が提供される。かかる薬剤としては、化学療法剤、除去または他の治療用ホルモン、抗新生物薬、癌に対して有用なモノクローナル抗体および血管新生阻害剤がある。以下の論述はこれに関連していくつかの薬剤に注目したものであるが、それは説明のためであって、限定を意味するものではない。他の広い範囲の有効な薬物も使用できる。
【０２２２】
本発明との組合せで使用できるホルモンのうちでは、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、ロイプロリド、フルタミド、酢酸シプロテロン、ケトコナゾールおよびアミノグルテチミドが好ましい。
【０２２３】
本発明と組合せて使用しうる抗新生物剤および抗癌剤のうちでは、５−フルオロウラシル、硫酸ビンブラスチン、燐酸エストラムスチン、スラミンおよびストロンチウム−８９が好ましい。
【０２２４】
本発明と組合せて使用しうるモノクローナル抗体のうちでは、ＣＹＴ３５６が好ましい。
【０２２５】
以下に例示的な例を挙げて、本発明をさらに説明する。
【０２２６】
実施例１  遺伝子発現によるヒトウテログロビンの調製
全長ｃＤＮＡを発現している大腸菌細胞からヒトウテログロビンを精製した。ｃＤＮＡを取得し、それを宿主での発現用のベクターに組み込み、構築物を発現させ、タンパク質を精製する方法は、すべて、当該技術においてルーチンの手法を包含するものである。かかる方法は、Ｓｉｎｇｈら、ＢＢＡ９５０：３２９−３３７（１９８８）、Ｍａｎｔｉｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２０３４３−２０３５１（１９９３）ならびにＭｉｅｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：６４２７−６４３５（１９９０）にヒトウテログロビンに関して詳細に記載されており、これらの全体を引用によりここに挿入する。
【０２２７】
簡略に述べれば、例示的な本実施例は上記の諸引例中に述べられている手法に従ったが、そこでは、周知のベクターｐＧＥＭ４Ｚ中にヒトウテログロビンをコードする全長ｃＤＮＡを含有するクローンをＰｓｔＩで消化した。（ｐＧＥＭ４Ｚはプロメガ社から入手できる。他の多くの同等に適したベクターも商業的に入手可能である。）消化により、該ｃＤＮＡの全体およびｐＧＥＭ４Ｚのポリリンカーの５３ヌクレオチドを含む３４０塩基対の断片が遊離された。この断片を低融点アガロース中での分取ゲル電気泳動により精製した。精製した断片を、発現ベクターｐＬＤ１０１の誘導プロモーターの下流のＰｓｔＩ部位に挿入連結させた。このライゲーションおよびその後のクローニングにより、プラスミドｐＧＥＬ１０１が得られた。この構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の細胞に導入して、ウテログロビンタンパク質を発現させた。
【０２２８】
発現のためには、大腸菌の生育のためのルーチン条件下で細菌を培養し、つぎに、培地をＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−Ｄ−ガラクトピラノシド）０．４５ｍＭとすることにより、ウテログロビンの発現を誘導した。発現されたタンパク質を蓄積させるためのさらに適当なインキュベーションを行ったのち、細胞を集め、ついで溶解させた。溶解した細胞から、ウテログロビンを、サイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィーの標準的方法を用いて精製した。
【０２２９】
実施例２  転移可能性の検定のための細胞
ここに説明する例示的具体例において用いた細胞系は、周知のもので、容易に入手できる。本実施例の４つの細胞系は、すべてヒト前立腺癌に由来していて、上皮細胞起源のものである。ＴＳＵ−Ｐｒ１、ＤＵ−１４５およびＰＣ−３Ｍはアンドロゲン非依存性である。ＬＮＣａＰはアンドロゲン感受性である。
【０２３０】
ＤＵ−１４５は、Ｓｔｏｎｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２１：２７４−２８１（１９７８）に記載されており、この報文の全体を引用によりここに挿入する。この細胞系は、たとえばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックヴィル、メリーランド州）を含めて種々の供給源から入手できる。
【０２３１】
ＬＮＣａＰは、Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４３：１８０９−１８１８（１９８３）に記載されており、これの全体を引用によりここに挿入する。この細胞系は、たとえばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックヴィル、メリーランド州）から入手できる。
【０２３２】
ＰＣ−３Ｍは、Ｋａｉｇｈｎら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｕｒｏｌ．１１：１６−２３（１９７６）に記載されており、これの全体を引用によりここに挿入する。
【０２３３】
ＴＳＵ−Ｐｒ１は、Ｈｚｕｍｉら、Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １３７：１３０４−１３０６（１９８７）に記載されており、これの全体を引用によりここに挿入する。
【０２３４】
各細胞系の細胞を、グルタミン、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００（ｇ／ｍｌ）を補足したαＭＥＭ（最小必須培地）中での単層培養により増殖させ、維持した。培養は、３７℃、５０％ＣＯ2／９５％空気中でのインキュベーションにより行った。２日ごとに培地を交換した。
【０２３５】
実施例３  細胞の侵襲性の総合検定
１．培養
以下に略述したように、細胞の侵襲性を、Ａｌｂｉｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４７：３２３９−３２４５（１９８７）に記載されている方法によって検定した。この報文の全体を引用によりここに挿入する。後述の侵襲性検定および他の抗転移効果評価法は、Ｌｅｙｔｏｎら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ ５４：３６９６−３６９９（１９９４）に記載されており、これの全体を引用によりここに挿入する。
【０２３６】
対数期の細胞を、０．２５％トリプシン、０．２５％ＥＤＴＡに短時間曝露することによって生育面からはがし、集め、８００ｘｇで５分間遠心分離した。ペレットをＳＦ培地に再懸濁し、計数し、１．５ｘ１０6細胞／皿を６ｍｍ平皿に接種した。つぎに、細胞を、ウテログロビンを０、０．０１、０．１および１．０μＭ含有する培地中で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、ゴムポリスマンを用いて細胞を穏やかに集め、侵襲性を検定した。
【０２３７】
線維芽細胞調整培地（ＦＣＭ）が、侵入を刺激するための誘引物質として役立った。これは、ＳＦ培地中で増殖中の３Ｔ３細胞を２４時間培養し、つぎに細胞不含の培地を集めることにより、調製した。このようにして得られた細胞不含培地をＦＣＭとした。
【０２３８】
侵襲性は、再構成基底膜（ＲＢＭ）で前もって被覆したポリカーボネート膜を用いて測定した。この目的には、周知のＲＢＭ類が適している。たとえば前掲のＡｌｂｉｎｉらが、これらの実験に採用されているタイプのＲＢＭを記述している。
【０２３９】
アッセイは、ブラインドウエルのボイデンチェンバー中で実施した。各チェンバーの下室に誘引物質としてのＦＣＭ２２０μｌまたは基礎侵入を求めるための対照としての血清不含培地２２０μｌを満たした。２５μｇ／５０μｌのＲＢＭで被覆したポリカーボネート膜（細孔径１２μｍ）を下室に載せた。検定すべき腫瘍細胞を上室に３．０ｘ１０5細胞／ウエルの割合で加え、３７℃で６時間インキュベートした。
【０２４０】
（上記アッセイ法に従って用いるための再構成基底膜調製品は多くの商業的供給者から容易に入手できる。この点で一つの好適な膜の例は、ベッドフォード、マサチューセッツ州のコラボラティヴ・バイオメディカル・プロダクツが販売している「マトリゲルＭＡＴＲＩＧＥＬ」である。）
２．定量
ボイデンチェンバーで使用するために開発されたクリスタルバイオレット染色を包含する手法によって、ＲＢＭを透過した細胞の数によって、侵襲活性を測定した。以下に要約したその手法は、周知であり、たとえばＦｒａｎｄｓｏｎら、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ６（補遺４）：７１−７６（１９９２）に記載されており、これの全体を引用によりここに挿入する。
【０２４１】
インキュベーション期間が終了したとき、ＲＢＭ被覆膜を各チェンバーから取り出した。それらフィルターをワックスプレートに、侵入細胞のある面を上向きにして、ピン留めした。フィルター上の細胞を、２５％メタノール中の０．５％クリスタルバイオレットにより１０分間染色した。つぎに、フィルターを蒸留水で４回またはクリスタルバイオレットが洗浄水中にもはや溶出しなくなるまですすいだ。洗浄後、各フィルターのワックスプレートに接していた面を湿った綿棒で慎重にぬぐい清めて、移行していない細胞を除去した。フィルターをつぎに２４ウエルのクラスタープレートに入れ、一夜乾燥した。
【０２４２】
各フィルター上の侵入細胞の中のクリスタルバイオレットを、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、５０％エタノール５００μｌ中１０分間の処理を２回行って抽出した。抽出液中のクリスタルバイオレットの量を、標準的な分光計を用いて、５８５ｎｍでの吸光度により分析した。
【０２４３】
３．解析
アッセイは、各データ点につき３回ずつ実施した。
【０２４４】
対照群と試験群との差を、分散分析のための標準的な反復測定の検定法を用いて、有意性について検定した。一般に、Ｐ＜０．０１が、本明細書中の他の場所で述べている例外を別にして、有意の効果を示していると考えた。
【０２４５】
実施例４  光学濃度と細胞数との相関ならびに基礎侵襲性の検定
クリスタルバイオレット抽出液の光学濃度をフィルター上の移行細胞数に対して補正するために、細胞を計数し、フィルター上に種々の既知濃度で蒔種し、インキュベートして付着させ、洗った。２セットずつのプレートの一方を細胞数算定に用いた。他方のセットを染色に用いた。計数のためには、細胞を緩和なトリプシン処理によってフィルターから遊離させ、つぎに自動細胞数算定装置を用いて計数した。染色のためには、洗浄後、細胞を染色し、クリスタルバイオレットをつぎに染色された細胞から実施例３に記載の通りにして抽出した。抽出液の光学濃度を標準的分光法により測定した。各フィルター抽出液について求めた光学濃度を、直接計数によって求めたそれの相手方フィルターに付着した細胞の数と比較した。これらの対応させたデータ点は、光学濃度と細胞数との相関関係を知るのに役立った。プロットされた・・・示した
上記の操作法に従い、いくつかの濃度のＤＵ−１４５細胞をボイデンジャーの上室に接種した。ジャーは対にして組み立て、各対につき、上記のようにして、一方のフィルターで細胞による染料取込みを測定し、他方のフィルターで細胞数を数えた。
【０２４６】
結果を表１に示す。この表は、フィルターの下面へ移行した細胞の数を上室に蒔いた細胞数の関数として示している。フィルター下面へ移行している細胞の数が、上室に蒔いた細胞の全数に対する百分率としても示されている。表中のデータは、各条件についての３回ずつの測定の平均値であり、示されている差は、平均の標準誤差である。
【０２４７】
２ｘ１０5個よりも多い細胞蒔種では、６時間で細胞のおよそ２２％がＲＢＭを侵襲して、フィルターを通過して移行した。より多数の細胞を蒔いても、６時間後の侵襲性は増大しなかった。（表には示していない。）
細胞は、ハイアリー、フロリダ州のコールター社製の「コールターマルティサイザー（ＭＵＬＴＩＳＩＺＥＲ）」などの自動細胞計数装置を用いて計数した。これらの実験によって、クリスタルバイオレット抽出液の０．１単位の吸光度がフィルターを通過して移行した細胞およそ５０００個に対応することが確認された。
【０２４８】
同様の操作法を適用して、他の細胞についての移行アッセイを補正し、本発明の他の組成物の治療活性測定にそのアッセイ法を採用することができる。
【０２４９】
表１：細胞侵入と吸光度との関係
蒔種細胞      Ｏ．Ｄ．単位＊        侵入細胞            侵入百分率
（ｘ１０3）       （５８５ｎｍ）            （ｘ１０1）
１００                  ．６０±０．１            ３１．８±０．２    ３１．８±０．２
２００                １．５０±０．２            ４２．０±２．１    ２１．２±１．２
３００                １．２０±０．２            ７２．３±２．７    ２３．０±０．４
＊１Ｏ．Ｄ．単位はおよそ５，０００の細胞に対応する。
【０２５０】
表１に示したように、ＴＳＵ−Ｐｒ１細胞系の細胞が、もっとも高い基礎侵入度およびもっとも高いＦＣＭ刺激侵襲性を示した。ＤＵ−１４５細胞の基礎侵入度はＴＳＵ−Ｐｒ１細胞のそれの半分であったが、刺激侵入度はそれら２つの細胞系について同等であった。図２に示したように、ＰＣ３−Ｍ細胞の基礎および刺激侵襲性はともに、ＤＵ−１４５細胞で観察されたものの半分であった。（注：図２では尺度が変わっている。）ＬＮＣａＰ細胞は、もっとも低い基礎侵襲性およびもっとも低い刺激侵襲性を示した。ＦＣＭ刺激は、やはり図２に示した通り、この細胞系の侵襲性を２〜３倍に増大させた。
【０２５１】
実施例５  ウテログロビンは腫瘍細胞の侵襲性を抑制する
ウテログロビンの腫瘍細胞の侵襲性を抑制する能力は、０．０１、０．１または１．０μＭのウテログロビンで処理した細胞系に対するそれの影響によって例証される。４つの細胞系の各々を、これら濃度のウテログロビンとともに、２４時間インキュベートした。インキュベーション期間後、細胞をすすぎ洗いし、つぎに侵襲性を検定した。つぎに、刺激侵襲性の抑制を、各処置群につき、ＦＣＭ刺激侵襲性から基礎侵襲性を差し引くことにより、量的に求めた。最後に、結果を無処置細胞の侵襲性の百分率として算出した。
【０２５２】
４つの細胞系はすべて、図１および図２にＦＣＭ／ＵＧに対する棒で示されているように、ＦＣＭ刺激侵入の用量依存的抑制を示した。明らかに、ウテログロビンは、ＳＦＭ／ＵＧと名付けられている棒により示されている基礎侵襲性に影響していない。表２は、各々に３回ずつ実施した３つの独立した実験において観測された平均抑制率を示している。ウテログロビンによる侵襲性抑制は、０．０１μＭウテログロビン処理のＰＣ３−ＭおよびＴＳＵ−Ｐｒ１細胞においてはＰ＜０．０５のレベルで有意であったのを除いて、すべての条件においてＰ＜０．０１のレベルで有意であることが見出された。表２に示した通り、１．０μＭのウテログロビンはＤＵ−１４５細胞の侵襲性を６０％、ＰＣ３−Ｍ細胞では８８％、ＬＮＣａＰ細胞では９２％、ＴＳＵ−Ｐｒ１細胞では５９％抑制した。
【０２５３】
表２：ウテログロビンによる腫瘍細胞の侵襲性の抑制
ウテログロビンによる侵入の抑制率％
細胞系                        ０．０１μＭ              ０．１μＭ        １．０μＭ
ＤＵ−１４５        ４５．４±６a               ４９．９±５a     ６０．２±１１a
ＰＣ３−Ｍ          ４３．４±１５b     ８２．４±１４a   ８７．９±１１a
ＴＳＵ−Ｐｒ１      ３３．５±１０b     ４４．４±１１a   ５８．９±８a
ＬＮＣａＰ          ７１．５±１０a     ８１．３±６a     ９２．３±７a
この表は、上記アッセイの結果を示している。手短かに言えば、腫瘍細胞をウテログロビン含有培地中で２４時間培養し、つぎに侵入活性を検定した。基礎移行を差引いて調整した測定値を各細胞タイプについて無処理対照細胞の百分率として表現している。データは３連で実施した３回の独立した実験の平均値として表現されており、変動は平均の標準誤差である。
【０２５４】
aＰ≦０．００１；すなわち、０．００１で統計学的に有意。
【０２５５】
bＰ≦０．０５；すなわち、０．０５で統計学的に有意。
【０２５６】
実施例６  ウテログロビンによる侵襲性抑制の経時変化
ウテログロビンによるＤＵ−１４５細胞侵襲性抑制の経時変化を、２４時間にわたり測定した。細胞を上記の通りにして３、６、１２または２４時間処理し、つぎに侵襲性を検定した。ウテログロビン存在下で培養した細胞で観測された最大の侵襲性抑制は、１２時間時点での７４％であった。３時間後に、最大の５０％の抑制が観測され、２４時間時点での抑制は最大の７９％であった。図４は、これらの結果をグラフとして示している。
【０２５７】
実施例７  ウテログロビンは単純運動性に影響しない
運動性それ自体を評価するために実施した実験は、ウテログロビンが正常な細胞の運動性、すなわちＲＢＭ不存在下での移行に影響しないことを示している。結果は、ウテログロビンが、上皮腫瘍細胞の侵入に関連した運動性を特異的に抑制することを示している。運動性自体よりも転移においてより特異的に関連している侵入関連運動性は、コラゲナーゼ類、カテプシン類、プラスミノーゲン活性化因子類ならびに基底膜およびＥＣＭの崩壊に必要な種々のメタロプロテイナーゼ類を含むいくつかの異なる種類のタンパク質分解酵素の合成、補充または活性化に関係している。ウテログロビンは細胞の運動性を変化させないが、ＦＣＭにより刺激された侵襲性を抑制するという観察結果は、ウテログロビンが、正常細胞の運動性を直接に変化させることなく、転移性の侵襲性を抑制できることを示している。これは、正常な運動性に対するウテログロビンの非特異的な影響があれば不利となったであろう薬理的介入にとっての有利な性質である。
【０２５８】
実施例８  ウテログロビンはＲＢＭへの付着に影響しない
ウテログロビンの抗侵入活性には、細胞接着への影響は介在していない。これは、ＳＭ培地または１．０μＭのウテログロビンを含有するＳＭ培地中で２４時間のインキュベーションののちのＤＵ−１４５およびＰＣ３−Ｍ細胞の接着性を測定した実験から知ることができる。インキュベーション培地を除き、細胞を新鮮なαＭＥＭ／ＳＭ培地に再懸濁し、計数し、細胞を再度平板培養し、再平板培養後１、３および６時間の付着細胞数を数えることにより、接着性を試験した。結果は、ウテログロビンが細胞の接着性を変化させないことを示している。図１および図２に示した結果が示しているところの、ウテログロビンの基礎移行への影響のないことは、同じ結論を支持している。これは、正常な細胞接着性に対するウテログロビンの非特異的な影響があれば不利となったであろう薬理的介入にとっての有利な性質である。
【０２５９】
実施例９  ウテログロビンの抗転移作用の特異性
ＤＵ−１４５細胞において、ミオグロビン、アルブミンおよび熱不活性化ウテログロビンを用いて、ウテログロビンの活性の特異性が証明された。細胞をミオグロビン、アルブミンまたは５５℃で４５分間のインキュベーションによって不活性化したウテログロビンで２４時間処理した。図３のグラフに示した結果は、ミオグロビン、アルブミンおよび熱不活性化ウテログロビンが腫瘍細胞の侵入活性に影響しないことを示している。
【０２６０】
実施例１０  ウテログロビンはＦＣＭにより刺激された腫瘍細胞によるアラキドン酸放出を抑制する
腫瘍細胞によるアラキドン酸（「ＡＡ」）放出に対するウテログロビンの作用を、基礎的および刺激されての侵襲性の条件下で検定した。比放射能が５８．０ｍＣｉ／ｍｍｏｌの（14Ｃ）ＡＡを用いて、アラキドン酸の放出を追跡した。このタイプの標識アラキドン酸は、イリノイ州アーリントン・ハイツのアマーシャム社などのいくつかの商業的供給者から入手できる。
【０２６１】
下記の実験により示されるように、ウテログロビンは、ＦＣＭにより刺激されたＤＵ−１４５細胞によるアラキドン酸の放出を抑制する。
【０２６２】
ＤＵ−１４５細胞中の細胞内アラキドン酸を、14Ｃ標識アラキドン酸を含有する培地中でそれらの細胞をインキュベートすることにより標識した。これのために、およそ０．７５ｘ１０5個の細胞を、１μＣｉの（14Ｃ）ＡＡを含有するα−ＭＥＭ／ＳＦ培地２ｍｌ中、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、細胞を０．２％ウシ血清アルブミン２０ｍｌで３回洗って、遊離の放射能を除去した。
【０２６３】
洗浄した標識化細胞をα−ＭＥＭ／ＳＦ、ＦＣＭまたは１．０μＭのウテログロビンを含有するＦＣＭ２ｍｌに再懸濁した。３種の培地の各々の中の細胞を３７℃でインキュベートし、インキュベーション期間の始まりから０．５、１０、２０および３０分後および１、２、３、４および５時間後に各培養培地から５０μｌずつのアリコートを取り出した。
【０２６４】
各アリコートをＡＡの放出についてアッセイした。この放出は、シンチレーション計数によって求めた培地中遊離14Ｃとして測定した。試料中の14Ｃによる放射線の定量には、標準的なシンチレーターおよびカウンター、たとえばＩＣＮ社からのＥｃｏＬｉｔｅ生分解性シンチレーターを用いた。
【０２６５】
ＦＣＭによるＡＡ放出の刺激は、ＦＣＭ培地中でインキュベートした細胞が放出した（14Ｃ）ＡＡの量からαＭＥＭ／ＳＦ培地中でインキュベートした細胞が放出した（14Ｃ）ＡＡの量（きわめて少ない）を差し引くことにより計算した。ＦＣＭにより刺激されたＡＡ放出に対するウテログロビンの影響は、同様に、１μＭのウテログロビンを含有するＦＣＭ中でインキュベートした細胞が放出した（14Ｃ）ＡＡの量からαＭＥＭ／ＳＦ培地中でインキュベートした細胞が放出した（14Ｃ）ＡＡの量を差し引くことにより計算した。
【０２６６】
図５のグラフに示したように、ＦＣＭ培地中で培養した細胞は、二相性のプロフィールを示した。放出されたＡＡは２０分でピークに達し、そのピークには、たとえば６０分間の再取込み期が続き、そのつぎに、この実験の５時間のインキュベーション期間の終了まで、持続的放出期があった。
【０２６７】
ＦＣＭ培地中に１μＭのウテログロビンが存在すると、ＦＣＭに刺激されたアラキドン酸の放出が、２０分時点で７７％、５時間時点で８６％減少した。
【０２６８】
ＦＣＭに刺激された腫瘍細胞によるアラキドン酸放出のこの劇的な抑制は、ウテログロビンの侵襲性に対する抑制効果を示している上記の結果とともに、腫瘍の侵襲性をコントロールするシグナル伝達経路における初期の事象にウテログロビンが影響することを示している。
【０２６９】
実施例１１
ある患者が前立腺の転移性腺癌を呈している。この腺癌は転移していないように思われる。手術によりその腺癌を除去する。術前、術後に、およそ１μＭの血中ウテログロビン濃度に到達し、その後それを維持する用量割合のウテログロビンを投与する。術後の回復ののち、定期的筋肉内自己投与方式によって、患者に低レベルのウテログロビンを維持させる。腺癌のさらなる発生は起こらない。
【０２７０】
実施例１２
ある患者が前立腺の転移性腺癌を呈している。この腺癌は転移していないように思われる。手術によりその腺癌を除去する。術前、術後に、およそ１μＭの血中ウテログロビン濃度に到達し、その後それを維持する用量割合のウテログロビンを投与する。術後の回復ののち、硬膜下ポンプによる間欠的または連続的投与によって、患者に低レベルのウテログロビンを維持させる。腺癌のさらなる発生は起こらない。
【０２７１】
実施例１３
ある患者が前立腺の転移性腺癌を呈している。この腺癌は転移していないように思われる。手術によりその腺癌を除去する。術前、術後に、およそ１μＭの血中ウテログロビン濃度に到達し、その後それを維持する用量割合のウテログロビンを投与する。術後の回復ののち、経皮パッチ剤を用いた間欠的または連続的投与によって、患者に低レベルのウテログロビンを維持させる。腺癌のさらなる発生は起こらない。
【０２７２】
実施例１４
ある患者が前立腺の転移性腺癌を呈している。この腺癌は転移しているように思われるが、有効な治療方式としてやはり手術が必要であるとされる。手術により腫瘍組織を除去する。１μＭより高い血中ウテログロビン濃度に到達し、その後それを維持する用量割合のウテログロビンの筋肉内および静脈内投与を、ほぼ最初の診断の時から行い、術後にそれを続ける。術後の回復ののち、定期的筋肉内自己投与方式によって、患者にこのレベルのウテログロビンを維持させる。高用量ウテログロビン投与の不耐性の有害副作用について患者を慎重にモニターする。さらなる腫瘍は生じない。
【０２７３】
実施例１５
ある患者が前立腺の転移性腺癌を呈している。この腺癌は転移しているように思われるが、有効な治療方式としてやはり手術が必要であるとされる。手術により腫瘍組織を除去する。１μＭより高い血中ウテログロビン濃度に到達し、その後それを維持する用量割合のウテログロビンの筋肉内および静脈内投与を、ほぼ最初の診断の時から行い、術後にそれを続ける。術後の回復ののち、定期的筋肉内自己投与方式によって、患者にこのレベルのウテログロビンを維持させる。高用量ウテログロビン投与の不耐性の有害副作用について患者を慎重にモニターする。術後に最初の小さい腫瘍状のかたまりがいくつか検知されるが、それらは大きくならない。
【０２７４】
実施例１６
ある患者が前立腺の転移性腺癌を呈している。この腺癌は転移しているように思われるが、有効な治療方式としてやはり手術が必要であるとされる。手術により腫瘍組織を除去する。１μＭより高い血中ウテログロビン濃度に到達し、その後それを維持する用量割合のウテログロビンの筋肉内および静脈内投与を、ほぼ最初の診断の時から行い、術後にそれを続ける。術後の回復ののち、定期的筋肉内自己投与方式によって、患者にこのレベルのウテログロビンを維持させる。高用量ウテログロビン投与の不耐性の有害副作用について患者を慎重にモニターする。術後に腫瘍状のかたまりが検知されるが、それらの成長は遅延する。
【０２７５】
実施例１７
ある患者が上皮細胞起源の乳房腫瘍を呈している。転移性タイプのものと思われるその腫瘍は転移していないように思われる。腫瘍を手術により除去する。術後、およそ１μＭの血中ウテログロビン濃度に到達し、その後それを維持する用量割合のウテログロビンを筋肉内および静脈内投与する。術後の回復ののち、定期的筋肉内自己投与方式によって、患者に低レベルのウテログロビンを維持させる。それ以上の腫瘍の発生は起こらない。
【０２７６】
実施例１８
ある患者が上皮細胞起源の乳房腫瘍を呈している。転移性タイプのものと思われるその腫瘍は転移している。多くの続発性腫瘍が検知される。可能なかぎり腫瘍組織を手術により除去する。外科的介入は侵襲的である。１μＭより高い血中ウテログロビン濃度に到達し、その後それを維持する用量割合のウテログロビンの筋肉内および静脈内投与を、ほぼ最初の診断の時から行い、術後にそれを続ける。術後の回復ののち、定期的筋肉内自己投与方式によって、患者にこのレベルのウテログロビンを維持させる。高用量ウテログロビン投与の不耐性の有害副作用につき患者を慎重にモニターする。残った方の乳房にも身体のどこにも、それ以上の腫瘍は生じない。
【０２７７】
実施例１９  ウテログロビンは前立腺腺癌細胞によっては発現ないしは分泌されない
７６歳の男性が、生体組織検査に基づいて、グリーソンスコア４の前立腺腺癌と診断されたため、根治的な会陰式前立腺切除術を受けた。術後の病理学的確定診断により、グリーソンスコア８の中程度ないしはわずかに分化した腺癌、結節性前立腺過形成および多病巣性の高度な前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）が示された。神経周囲およびリンパ系の侵襲が認められたが、精嚢には腫瘍は見られなかった。
【０２７８】
インフォームドコンセントを得て、承認された操作法に従い、除去後の疾患前立腺から、ウテログロビンの発現を評価するための前立腺組織を得た。組織断片を液体窒素中で凍結した。凍結組織の個々の薄片をクリオスタットにより切片化し、シラン処理した顕微鏡スライドに載せた。
【０２７９】
試料を室温で３時間４％ホルマリンにより固定し、ｐＨ８．０の燐酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で１０分間洗った。試料をウサギ血清（１：１００希釈）とともに３０分間インキュベートして、非特異的反応性をブロックした。つぎに、試料をヤギ抗ヒトウテログロビン一次抗体の１：１，０００希釈液に４℃で一夜曝露した。対照試料はヤギ血清の１：１００希釈液に曝露した。
【０２８０】
つぎに、すべての試料をビオチニル化ウサギ抗ヤギ抗体（１：１０，０００）に３０分間曝露し、つぎにＰＢＳで１０分間洗った。ストレプトアビジン複合体を１５分間加え、試料を再度ＰＢＳで１０分間洗った。ＤＡＢを試料に１０分間反応させ、続いて、組織をヘマトキシリン−エオシンで標準的に染色した。
【０２８１】
スライドは２名の有資格病理学者が解析したが、彼らはスライドの正体は知らされておらず、解析は互いに独自に行った。
【０２８２】
各例において、正常な前立腺組織は、上皮細胞中のウテログロビンについて、とくに細胞内の内腔面で、強い陽性に染色された。支質細胞は陰性であった。両病理学者により独立してＰＩＮと診断された過形成領域は、陽性に染色された（ＰＩＮは初期の新形成前の前駆体であると考える人もいる）。対照的に、腫瘍性上皮細胞はウテログロビンの染色をほとんどまたはまったく示さず、腫瘍細胞がこのタンパク質を合成、分泌する能力を失っていることを実証した。
【０２８３】
実施例２０  ヒト前立腺腫瘍の転移に由来する細胞の中では、ウテログロビンｍＲＮＡは検出されないかまたは異常なプロセシングを受ける
正常な前立腺組織ならびに転移性ヒト前立腺腫瘍由来のＤＵ−１４５、ＰＣ−３およびＴＳＵ−ＰＲ１細胞系からＲＮＡを単離した。ＲＮＡを、放射性同位元素標識ウテログロビンｃＤＮＡプローブを用いてのルーチンの標準的操作法に従ってノーザンブロッティングに付した。オートラジオグラフィー分析により、正常組織は、正常にプロセシングを受けた６００塩基対のｍＲＮＡウテログロビンの転写産物を多量に発現することが示された。対照的に、転移性腫瘍の細胞はウテログロビン転写産物を検出可能なほどには発現しなかったか（ＤＵ−１４５およびＰＣ−３）または多量の異常な転写産物を発現した（ＴＳＵ−ＰＲ１）。
【０２８４】
実施例２１
ある患者が尿路閉塞を呈しており、直腸指診ののち、前立腺の生体組織検査試料を採取する。最初の術前報告書はグリーソンスコアを３としており、低度の限曲性腫瘍を示唆している。生検試料の一部を、正常な組織には存在するが、腫瘍細胞には存在しないことが判明しているウテログロビンの発現について、免疫組織化学的に分析する。ウテログロビン発現の欠如に基づいて、腫瘍が最初の診断よりは実際にはより高度のものであり、おそらくは侵襲性で、転移性である可能性が高いということを反映させるべく、診断、予後および治療計画を適宜変更する。ウテログロビン療法を直ちに開始する。
【０２８５】
実施例２２
ある患者が、根治的前立腺切除ののち、ホルモン療法に抵抗性となった高度の転移性前立腺腺癌を呈している。患者は、前立腺癌に対する効果がとぼしく、副作用が強いことを根拠に、化学療法を拒絶している。腫瘍生検試料のｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析は、ウテログロビン遺伝子が腫瘍細胞中で発現されていないことを示している。ＳＳＣＰおよびＲＦＬＰによりウテログロビン遺伝子構造をさらに分析して、該遺伝子が変異していて、機能不全になっていることが示されている。患者は遺伝子療法の候補者となることを選択する。前立腺細胞中で特異的に発現されるＰＳＡ遺伝子のプロモーターに連結したウテログロビン遺伝子を含有するアデノウイルスベースのプラスミド発現ベクターを患者に注射する。該ベクターは、表面に抗ＰＳＡ抗体を固定されたリポソーム中に包まれている。その抗体−リポソーム複合体は、転移性腫瘍細胞のみであると推定されるＰＳＡ分泌細胞に特異的に結合する。それらの細胞によってリポソームは取り込まれ、プラスミドを放出し、プラスミドは細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれて、ウテログロビンを発現し始める。トランスフェクトされたウテログロビン発現細胞は、それらの侵襲性の表現型を転換し、それによりさらに転移することをやめ、身体の自然防御作用により徐々に破壊される。転移性腫瘍は消退し、患者の寿命が延長される。
【０２８６】
以上、本発明を説明したが、これを種々に変更しうることは明らかであろう。かかる変更は本発明の精神、範囲から逸脱すると考えてはならず、かかる変更はすべて特許請求の範囲の範囲に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２８７】
【図１】図１は、ヒト前立腺腫瘍由来の上皮細胞系であるＴＳＵ−Ｐｒ１およびＤＵ−１４５細胞系の細胞の侵襲性に対するウテログロビンの用量効果を示す棒グラフである。ＴＳＵ−Ｐｒ１およびＤＵ−１４５細胞はともにアンドロゲン非依存性である。細胞を、０、０．０１、０．１および１．０μＭのウテログロビン中で２４時間培養した。つぎに、血清不含培地または線維芽細胞で調整された培地（ＦＣＭ）に応答しての再構成基底膜（ＲＢＭ）被覆フィルターを通しての移行によって、侵襲性を測定した。侵入細胞をクリスタルバイオレットで染色し、染料を抽出し、５８５ｎｍでの吸光度により染料濃度を測定して、侵襲性を求めた。グラフ中の各点は、各々に３検体の培養を用いて行った３つの別々の実験の結果の平均である。棒は、各点についての平均の標準誤差を示している。
【０２８８】
【図２】図２は、ヒト前立腺腫瘍由来の上皮細胞系であるＰＣ３−ＭおよびＬＮＣａＰの細胞の侵襲性に対するウテログロビンの用量効果を示す棒グラフである。ＬＮＣａＰ細胞はアンドロゲン感受性である。ＰＣ３−Ｍ細胞はアンドロゲン非依存性である。アッセイは、図１の説明に記載した通りに行った。
【０２８９】
【図３】図３は、ミオグロビン、アルブミンおよび熱不活性化ウテログロビンがＤＵ−１４５細胞の侵襲性に影響しないことを示す棒グラフである。アッセイは、実質的に、図１の説明に記載した通りに行った。
【０２９０】
【図４】図４は、ＦＣＭに刺激されたＤＵ−１４５細胞の侵襲性に対するウテログロビンの影響の時間的経過を示すグラフである。細胞を、１．０μＭのウテログロビンとともに、またはそれなしで、３、６、１２または２４時間インキュベートしたのち、図１の説明に記載した通りに、ＦＣＭに応答しての侵入を検定した。
【０２９１】
【図５】図５は、ウテログロビンがＦＣＭ刺激ＤＵ−１４５によるアラキドン酸放出を５時間にわたって阻害することを示すグラフである。14Ｃ−標識アラキドン酸を含有するαＭＥＭ／ＳＦ培地中で細胞を２４時間インキュベートした。つぎに遊離の標識を洗い去り、細胞をＦＣＭ中、１μＭのウテログロビンとともに、またはそれなしで、インキュベートした。アラキドン酸の放出は、細胞から培地へ放出された14Ｃによって測定した。
【図１】
2008156353.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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