(57)【要約】【課題】Gs alpha遺伝子変異の高感度検出法、骨疾患等の検査方法およびそのための検査・診断キットを提供すること。【解決手段】本発明は、Gs alpha遺伝子のArg201コドンに生じた変異を高感度に検出する事により、Gs alpha遺伝子変異により発症する疾患群を同定し、他の腫瘍性疾患と鑑別する方法であって、試料中のゲノムＤＮＡのArg201コドンを含む領域を増幅するために第１の増幅反応を行うステップと、当該第１の増幅反応により得た産物を鋳型として、制限酵素ＥａｇＩの切断部位を導入するためのミスマッチプライマーを用いた第２の増幅反応を行うステップと、当該第２の増幅反応により得た産物が、制限酵素ＥａｇＩによって切断されなかった場合に変異が生じたと判定するステップとを含み、上記第１および第２の増幅反応において、正常アリルの増幅を抑制するためＰＮＡ（ペプチド核酸）プローブを添加する方法等を提供するものである。【選択図】図３
2008092899.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Gs alpha遺伝子のArg201コドンに生じた変異を高感度に検出する事により、Gs alpha遺伝子変異により発症する疾患群を同定し、他の腫瘍性疾患と鑑別する方法であって、
試料中のゲノムＤＮＡのArg201コドンを含む領域を増幅するために第１の増幅反応を行うステップと、
上記第１の増幅反応により得た産物を鋳型として、制限酵素ＥａｇＩの切断部位を導入するためのミスマッチプライマーを用いた第２の増幅反応を行うステップと、
上記第２の増幅反応により得た産物が、制限酵素ＥａｇＩによって切断されなかった場合に変異が生じたと判定するステップとを含み、
上記第１および第２の増幅反応において、正常アリルの増幅を抑制するためＰＮＡ（ペプチド核酸）プローブを添加することを特徴とする方法。
【請求項２】
上記第１および第２の増幅反応は、Ｐｆｕ（Pyrococcus furiosus）由来のＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって行われることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記ＰＮＡプローブは、配列表の配列番号５記載の塩基配列を有することを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
上記ミスマッチプライマーは、配列表の配列番号３記載の塩基配列を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記第２の増幅反応は、配列表の配列番号３記載の塩基配列を有するミスマッチプライマーと、配列番号４記載の塩基配列を有するリバースプライマーとを用いて行われることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を用いて、骨疾患等の疾患を検査する方法。
【請求項７】
線維性骨異形成症と骨腫瘍との鑑別検査・診断に用いられることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を行うための検査・診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Gs alpha遺伝子変異の高感度検出法、骨疾患等の検査方法およびそのための検査・診断キットに関する。本発明は、たとえば、線維性骨異形成症と骨腫瘍との鑑別診断に好適に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
線維性骨異形成症（fibrous dysplasia）は、正常の骨組織を石灰化物の混じった線維性結合組織で置換する骨疾患であり、MaCune-Albright症候群（多発性線維性骨異形成症、皮膚疾患、内分泌機能亢進）や Mazabraud症候群（筋肉内粘液腫）を伴うこともあり、骨の変形、骨折、および圧迫による神経症状や機能障害が見られる。
【０００３】
線維性骨異形成症の診断は、現在、病理診断にレントゲン診断や臨床症状を加味して最終診断がなされているが、その特徴が明らかでないことが多く、特に骨腫瘍である仮骨性線維腫（ossifying fibroma）とは非常に類似した病理組織像やレントゲン像を示すために、正確に両者を区別して診断することができないのが現状である。しかし、両者の臨床経過や治療法が異なるため、両者を区別して診断することは極めて重要である。すなわち、線維性骨異形成症では、ほとんどの病変の増殖は、骨格成長後に停止する傾向にある。したがって、外科切除や矯正治療を骨格成長期やそれ以前に行うことは避けるべきである。また、現在、ビスフォスフォネートによる治療法が臨床検討されている。他方、仮骨性線維腫では、腫瘍の再発を防ぐため、できる限り早く全摘出を行うべきである。このように、両者の臨床経過や治療法が異なるため、両者を早い段階から正確に鑑別診断する必要がある。また、時に、線維性骨異形成症は病理診断により悪性腫瘍である骨肉腫と誤診されることもあり、形態学に頼らない正確な診断法が必要である。
【０００４】
現在、線維性骨異形成症は、上記の２つの症候群も含めて、そのすべてがGs alpha（Ｇｓα）遺伝子のArg201コドンの体細胞変異により、アデニル酸シクラーゼが構成的（constitutive）に活性化するため発症すると考えられている。また、これらの骨疾患以外にもGs alpha遺伝子の体細胞変異で発症する内分泌性疾患等があるが（非特許文献５）、Gs alpha 遺伝子の変異検出法が実用化されていないので、同メカニズムによるその他の疾患の有無については明らかになっていない。
【０００５】
これまで２種類のGs alpha遺伝子のArg201コドンの体細胞変異検出法が報告されている。しかし、Gs alpha遺伝子の変異細胞は、モザイク状態で人体に分布するため、病変部においても変異細胞は少量しか含まれないことがあり、いずれの方法とも変異遺伝子の検出感度が問題となっている。第１の方法は、Gs alpha遺伝子のArg201コドンを含む短い遺伝子断片をnested-PCR法で増幅し、ＥａｇＩ制限酵素で切断し、制限酵素断片長多型（RFLP）で判定し、その後、切断されなかった遺伝子変異断片をＰＣＲ法により増幅してシークエンスするものである（非特許文献１・２）。第２の方法は、ＰＣＲ法による増幅時にＰＮＡ（ペプチド核酸：Peptide Nucleic Acid）プローブを添加し、正常の野生型遺伝子断片の増幅をブロックし、変異遺伝子断片を優先的に増幅させて変異部位をシークエンスするものである（非特許文献３・４）。
【０００６】
【非特許文献１】Bone. 1997 Aug;21(2):201-6.
【非特許文献２】J Mol Diagn. 2000 May;2(2):67-72
【非特許文献３】J Bone Miner Res. 2000 Jan;15(1):120-8.
【非特許文献４】J Bone Joint Surg Am. 2005 Nov;87(11):2489-94.
【非特許文献５】Nature. 1989 August;340(6236):692-6.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記第１の方法では擬陽性の判定が多く、その精度に問題があり、上記第２の方法ではＰＮＡプローブを添加するためにその増幅効率が下がり、ＰＣＲ法に用いる酵素（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）の校正活性が保証されている増幅サイクル数内では解析に必要な十分量の遺伝子断片を増幅できない、という問題がある。また、これらの両方法では、脱灰されたサンプルやパラフィン・ブロックから抽出されたＤＮＡや断片化したＤＮＡ等からは目的遺伝子を増幅できないことが多く、いずれの方法とも各種疾患検査への実用化には問題がある。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に着目してなされたものであり、Gs alpha遺伝子変異の高感度検出法を提供することをその第１の課題とする。また、本発明の第２の課題は、上記の遺伝子変異検出に基づく、骨疾患や内分泌性疾患等の高精度遺伝子検査・診断法を提供すること、とりわけ、線維性骨異形成症とその他の骨疾患（主に骨腫瘍）との高精度な鑑別検査・診断法を提供すること、さらに、これらの方法に用いられる検査・診断キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、通常の病理標本ブロックから抽出されたゲノムＤＮＡ等のようにＤＮＡ試料が劣化し短く断片化されている場合にも、Gs alpha遺伝子のArg201コドンを含む領域を効率良くかつ特異的に増幅できるように、各プライマーを設計して、いわゆるnested-PCR法による２回の増幅反応を行った。また、制限酵素切断部位導入のため、ミスマッチプライマーを用いて２回目の増幅反応を行うと共に、変異アリルを選択的かつ高感度に増幅できるように、２回の増幅反応とも正常アリルの増幅を抑えるＰＮＡプローブを添加して行った。その結果、Gs alpha遺伝子変異が含まれる試料からは変異アリルのみ精度良く増幅することができ、PCR-RFLP法やシークエンスによって簡便かつ高精度に上記Arg201コドンの変異を検出できること、また、これにより、線維性骨異形成症とその他の骨疾患（主に骨腫瘍）との高精度な鑑別診断が実現するなど、この検出方法を骨疾患等の検査・診断に応用できること、等を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、医療上および産業上有用な発明として、下記（１）〜（８）の発明を含むものである。
（１）  Gs alpha遺伝子のArg201コドンに生じた変異を高感度に検出する事により、Gs alpha遺伝子変異により発症する疾患群を同定し、他の腫瘍性疾患と鑑別する方法であって、
試料中のゲノムＤＮＡのArg201コドンを含む領域を増幅するために第１の増幅反応を行うステップと、
上記第１の増幅反応により得た産物を鋳型として、制限酵素ＥａｇＩの切断部位を導入するためのミスマッチプライマーを用いた第２の増幅反応を行うステップと、
上記第２の増幅反応により得た産物が、制限酵素ＥａｇＩによって切断されなかった場合に変異が生じたと判定するステップとを含み、
上記第１および第２の増幅反応において、正常アリルの増幅を抑制するためＰＮＡ（ペプチド核酸）プローブを添加することを特徴とする方法。
（２）  上記第１および第２の増幅反応は、Ｐｆｕ（Pyrococcus furiosus）由来のＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって行われることを特徴とする上記（１）記載の方法。
（３）  上記ＰＮＡプローブは、配列表の配列番号５記載の塩基配列を有することを特徴とする上記（１）又は（２）記載の方法。
（４）  上記ミスマッチプライマーは、配列表の配列番号３記載の塩基配列を有することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）  上記第２の増幅反応は、配列表の配列番号３記載の塩基配列を有するミスマッチプライマーと、配列番号４記載の塩基配列を有するリバースプライマーとを用いて行われることを特徴とする上記（４）記載の方法。
（６）  上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法を用いて、骨疾患等の疾患を検査する方法。
（７）  線維性骨異形成症と骨腫瘍との鑑別検査・診断に用いられることを特徴とする上記（６）記載の方法。
（８）  上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法を行うための検査・診断キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、試料に微量にしか含まれないGs alpha遺伝子Arg201コドンの変異アリルを選択的に効率良く増幅させることができる。たとえば、通常のギ酸脱灰・パラフィン包埋・病理標本ブロックから抽出されたゲノムＤＮＡや劣化して断片化したゲノムＤＮＡ等からも、Gs alpha遺伝子断片の増幅効率が良く、且つ、Gs alpha遺伝子の変異遺伝子断片を選択的に高感度に増幅させることができる。したがって、その後に増幅断片を制限酵素ＥａｇＩで消化し、制限酵素断片長多型（RFLP）を用いてGs alpha遺伝子Arg201コドンの変異を簡便かつ高精度に検出することができる。また、Gs alpha遺伝子変異が含まれる試料では増幅産物はほとんどが変異アリルなので、増幅産物をシークエンスすることによっても遺伝子変異を確認することができる。
【００１２】
さらに、上記Arg201コドンの変異を検出することにより、線維性骨異形成症とその他の骨疾患（主に骨腫瘍）との高精度な鑑別診断が可能になるなど、本発明の遺伝子変異検出法を骨疾患や内分泌性疾患等の検査・診断に応用することができる。このような鑑別診断に応用する場合、たとえば線維性骨異形成症の患者では、身体中にモザイク状態で変異細胞が分布するため、本発明の高感度検出法を用いることによって、組織採取などの観血処置をしなくとも血液検査により、血液細胞中の変異細胞からGs alpha遺伝子変異を検出することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の好ましい態様について説明する。なお、本明細書および図面において、塩基・アミノ酸等を略号で表記する場合、その表記はIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、たとえばＤＮＡの塩基の表記については、Ａまたはａ：アデニン、Ｇまたはｇ：グアニン、Ｃまたはｃ：シトシン、Ｔまたはｔ：チミン、である。
【００１４】
また、遺伝子配列、アミノ酸配列等に関する番号、数値その他の情報は、米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のウェブページなどで利用可能な主要な遺伝子データベースにおいて使用されている番号、数値等を参酌して解釈されるものとする。
【００１５】
［１］本発明のGs alpha遺伝子変異検出法
本発明のGs alpha遺伝子変異検出法は、前述のとおり、第１および第２の増幅反応において、正常アリルの増幅を抑制するためＰＮＡ（ペプチド核酸）プローブを添加するものである。
【００１６】
ここで、Gs alpha遺伝子とは、アデニル酸シクラーゼの活性化に促進的に働くＧ蛋白質（stimulatory G protein：Ｇｓ）のαサブユニット（alpha subunit）をコードする遺伝子のことである。このヒトGs alpha遺伝子からは、４種の異なったアイソフォーム（ａ−ｄ）が発現することが知られている。このうちの１つであるアイソフォームａは、配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列からなり、その２０１番目のアミノ酸はアルギニン（Arg）である。また、このアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列番号６に示されるが、２０１番目のアルギニンをコードするコドンは「CGT」となっている。本発明において、「Arg201コドン」とは、この２０１番目のアルギニンをコードするコドン「CGT」のことをいい、本発明のGs alpha遺伝子変異検出法は、このコドンに生じた変異を検出する方法である。なお、Gs alpha遺伝子は「GeneID:2778」として、また、そのアクセッション番号「M21142 J03647」として、Genbankに登録されている。
【００１７】
上述のように、Gs alpha遺伝子の正常アリルでは、上記コドンは「CGT」であり、アルギニンをコードするが、線維性骨異形成症などの疾患ではこのコドンには少なくとも２種類の変異アリルが知られている。その１つの変異アリルでは、当該コドンはヒスチジン（His）をコードする「CAT」に変異しており、他の１つでは、当該コドンはシステイン（Cys）をコードする「TGT」に変異している（図１参照）。本発明は、このような当該コドンの１番目及び／又は２番目の塩基に生じたいかなる変異も精度良く検出するものである。
【００１８】
検査対象となるＤＮＡ試料は、特に限定されるものではなく、たとえばホルマリン固定後、脱灰しパラフィン包埋した病理組織ブロックから抽出したゲノムＤＮＡ等であってもよい。このように、ＤＮＡが劣化し断片化されたサンプルや、変異アリルが微量しか含まれていないサンプルであっても、本発明の方法により変異アリルを選択的にかつ効率良く増幅してその変異を検出することができる。病理標本からのＤＮＡの精製・抽出は、公知の方法にしたがって行えばよく、市販のキットを使用しても勿論よい。
【００１９】
その他、被検者の任意の器官・組織・細胞（爪、毛、血液、採取した組織等を培養した細胞を含む）から常法に従ってＤＮＡを精製・抽出したものを検査対象の試料としてもよい。たとえば、後述の骨疾患の検査方法においても、変異細胞が血中に分布している疾患の場合は、患者末梢血から抽出したゲノムＤＮＡを試料・検体として使用することができる。また、後工程の増幅方法において遺伝子増幅が可能な限りにおいて、ＤＮＡの精製・抽出工程は省略又は簡略化してもよい。
【００２０】
本発明では、上記ＤＮＡ試料から２回の増幅反応を行い、目的の遺伝子領域を特異的に効率良くかつ正確に増幅する。増幅方法は特に制限されるものではないが、後述の実施例で用いた、nested-PCR法により目的領域を増幅する方法は簡易な方法であり、精度も良好であるので、以下ではこの方法について簡単に説明する。
【００２１】
上記nested-PCR法では、まず、Gs alpha遺伝子のArg201コドンを含む領域を増幅するため、予め設計した一組のプライマーを用いて第１のＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行う。使用するプライマー対の各配列は特に制限されないが、たとえば、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、それぞれ下記(a),(b)に示す配列のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
(a) 5’-CCATTGACCTCAATTTTGTTTCAG-3’（配列番号１）
(b) 5’-GGTAACAGTTGGCTTACTGGAAGTTG-3’（配列番号２）
【００２２】
使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、目的の遺伝子領域をより正確に増幅するため、校正活性（プルーフリーディング活性）を有し、忠実性が高いＰｆｕ（ピロコッカス フリオサス：Pyrococcus furiosus）由来のＤＮＡポリメラーゼを使用することが好ましいが、校正活性を有するその他のＤＮＡポリメラーゼ、あるいは遺伝子組換えにより人為的に改変された酵素等を使用してもよい。
【００２３】
また、この第１のＰＣＲにおいては、正常アリルの増幅を抑制し、変異アリルを選択的に増幅するため、反応液にＰＮＡプローブ（「ＰＮＡプライマー」ともいう。）を添加してＰＣＲを行う。ＰＮＡ（ペプチド核酸）とは一般に、N-(2-アミノエチル)グリシンがペプチド結合することにより、核酸の５炭糖−リン酸バックボーンをポリアミドに置換した核酸類似体（合成オリゴマー）のことであるが、ここで使用するＰＮＡプローブは、前記Arg201コドンが「CGT」である正常アリルとハイブリッドを形成し、その増幅を抑制する一方、変異アリルとはハイブリッドを形成せず、変異アリルを選択的に増幅するように設計された塩基配列を有するものである。したがって、ここで使用するＰＮＡプローブとしては、正常アリルのコドン「CGT」を含む長さ１０〜１８個程度の塩基配列、またはその相補配列を有するものが好ましく、変異アリルとのハイブリッド形成を抑制するため、塩基配列の長さを１０〜１５個程度に短く設計することがより好ましく、たとえば、下記(c)に示す塩基配列を有するものを使用することができる。
(c) Gly-NH2-CGCTGCCGTGTC-HAc（配列番号５にこの塩基配列が示される）
【００２４】
ＰＮＡプローブの添加量は、正常アリルの増幅を抑制するのに必要な量であればよく、たとえばＰＣＲ反応液の最終体積モル濃度で、０．１μＭ〜２μＭ程度とすることができる。
【００２５】
その他のＰＣＲ反応液の組成は特に制限されるものではなく、上述したＤＮＡ試料、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＮＡプローブのほかに、常法にしたがって、至適バッファー、デオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）をそれぞれ所定量、水に加えた組成として反応液を調製することができる。
【００２６】
第１のＰＣＲの反応条件は通常の条件にしたがって行えばよいが、前記Ｐｆｕ由来のＤＮＡポリメラーゼなど校正活性のある酵素を使用する場合は、その至適増幅サイクル内（たとえば３０サイクル程度）で増幅させることが好ましい。これによって、その増幅過程で新たな変異の発生を防ぎ、精度を高めることができる。たとえば、(i) 90-95℃を20-60秒、(ii) 65-70℃を20-60秒、(iii) 45-55℃を30-60秒、(iv) 60-72℃を30秒-2分を１サイクルとして、この(i)- (iv)のサイクルを２８〜３５サイクル程度繰り返することにより、目的のＤＮＡ断片を増幅する。
【００２７】
次に、第１のＰＣＲで得られた増幅断片を鋳型として、第２のＰＣＲを行う。この第２のＰＣＲでは、標的配列を特異的に増幅するため、第１のＰＣＲで使用したプライマー対よりも内側の標的配列に基づいて設計されたプライマー対を使用するが、使用するプライマー対のうち一方は第１のＰＣＲで使用したものと同じものであってもよく、あるいは、両プライマー配列が一部重複するものであってもよい。
【００２８】
また、この第２のＰＣＲにおいては、正常アリルの増幅断片に制限酵素ＥａｇＩの切断部位を導入するため設計されたミスマッチプライマー（変異プライマー）を使用する。より具体的には、図１に示すように、前記Arg201コドンの近傍に位置する、２００番目のアミノ酸をコードするコドン「TGC」の最初の塩基をチミン（Ｔ）からグアニン（Ｇ）へ置換したコドン「GGC」を３’末端側にもつよう設計されたミスマッチプライマーを使用する。ミスマッチプライマーの長さは特に制限されるものではないが、後工程の電気泳動で制限酵素断片長の差異を検出できるように、たとえば塩基配列の長さを１５〜２０個程度に設計することができる。したがって、使用するnested-PCRプライマー、すなわち、フォワードプライマーであるミスマッチプライマー、およびリバースプライマーとして、たとえば、それぞれ下記(d),(e)に示す配列のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
(d) 5’-AGGACCTGCTTCGCGGC-3’（配列番号３）
(e) 5’-CAGTTGGCTTACTGGAAGTTGACTTT-3’（配列番号４）
【００２９】
第２のＰＣＲにおいて使用するＤＮＡポリメラーゼも、第１のＰＣＲと同様に精度を高めるため、Ｐｆｕ由来のＤＮＡポリメラーゼなど校正活性をもつものが好ましい。また、第２のＰＣＲにおいても、第１のＰＣＲと同様に、正常アリルの増幅を抑制し、変異アリルを選択的に増幅するため、反応液にＰＮＡプローブを添加してＰＣＲを行う。このＰＮＡプローブには、第１のＰＣＲで使用したものと同じものを使用できるが、前述の条件内で異なる配列構造のものを使用してもよい。
【００３０】
その他のＰＣＲ反応液の組成は特に制限されるものではなく、鋳型となる第１のＰＣＲで得られた増幅産物、nested-PCRプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＮＡプローブのほかに、常法にしたがって、至適バッファー、デオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）をそれぞれ所定量、水に加えた組成として反応液を調製することができる。なお、第１のＰＣＲで得られた増幅産物は、たとえば１０〜５０倍程度、蒸留水等で希釈したものを使用することが好ましい。
【００３１】
第２のＰＣＲの反応条件は、第１のＰＣＲと同様に行うことができ、校正活性のある酵素を使用する場合は、その至適増幅サイクル内（たとえば３０サイクル程度）で増幅させることが好ましい。
【００３２】
その後、第２のＰＣＲで得られた増幅産物を、制限酵素ＥａｇＩによって消化し、切断の有無を電気泳動等で検出する。前記Arg201コドンが正常アリルの場合は、増幅産物はＥａｇＩによって切断されるため、前記nested-PCRプライマーを使用したときには電気泳動で７４ｂｐのバンドが現れるのに対して、変異アリルの場合は、ＥａｇＩによって切断されないため、８８ｂｐのバンドが現れる（図３参照）。本発明の方法によれば、Gs alpha遺伝子変異アリルが含まれる試料では、変異アリルのみを選択的に効率良く増幅させることができるので、このPCR-RFLP法により、また、シークエンスにより、Arg201コドンの変異の有無を簡便にかつ高感度に検出することができる。
【００３３】
本発明の変異検出法は、上述したPCR-RFLP法に限定されるものではない。たとえば、ＰＣＲの様々な変法やＰＣＲ以外の方法を使用して増幅してもよいし、PCR-RFLP法により判定するにしても、各反応条件、使用する試薬・プライマー・制限酵素などは様々に変更可能である。各プライマー配列は、前記例示の配列に限らず、各例示の配列よりも１〜５塩基程度長くても短くてもよく、あるいはGs alpha遺伝子上の異なる領域の配列に基づいて各プライマーを設計してもよい。また、RFLP法とあわせて（又はその代わりに）、第２の増幅反応後に塩基配列決定装置（シークエンサー）などで直接増幅断片の塩基配列を決定し、変異の有無を検出してもよい。
【００３４】
［２］本発明の骨疾患等の検査方法
本発明のGs alpha遺伝子変異検出法は、試料に変異アリルが微量にしか含まれていない場合にも、Gs alpha遺伝子Arg201コドンの変異を高精度に検出することができる方法であり、この変異が関係する骨疾患や内分泌疾患等の検査に利用可能である。
【００３５】
好適には、本発明の検出法を、線維性骨異形成症と骨腫瘍との鑑別診断に利用することができる。後述の実施例に示すように、線維性骨異形成症の患者検体からは、Arg201コドンの変異アリルが検出される一方、仮骨性線維腫（ossifying fibroma）や骨線維性異形成症（osteofibrous dysplasia）の患者検体からは正常アリルのみ検出されることが、本実施例によってはじめて明確にされた。とりわけ、線維性骨異形成症にはGs alpha遺伝子Arg201コドンの変異が認められるのに対して、仮骨性線維腫には当該変異は認められないという新たな知見が、今回の解析によってはじめて得られた。すなわち、線維性骨異形成症と仮骨性線維腫とを、Gs alpha遺伝子Arg201コドンの変異の有無により区別できることが今回はじめて明らかにされたので、本発明の高感度変異検出法によって高信頼性の鑑別診断を実現することができる。
【００３６】
線維性骨異形成症は親から子へと伝わる遺伝病ではなく、癌などと同様に体細胞変異によって発症する疾患である。遺伝病ではないため、患者は症状が出現し、整形外科や小児科などで検査を受けてはじめてその疑いがもたれる。ところが、線維性骨異形成症に類似する骨疾患は骨腫瘍を含めて多数あり、それらとは予後や治療法が異なるので、鑑別診断が常に問題となっている。本発明の高感度遺伝子診断法は患者の予後や治療法の重要な指針となるばかりか、線維性骨異形成症に類似した病理組織像を示す悪性骨腫瘍の補助診断に非常に有効である。さらに、Gs alpha 遺伝子Arg201コドンの体細胞変異は、MaCune-Albright症候群（多発性線維性骨異形成症、皮膚疾患、内分泌機能亢進）や Mazabraud症候群（筋肉内粘液腫）にも見られるように、骨病変だけではなく、皮膚や軟組織にも病変を引き起こすことが明らかである。したがって、骨疾患以外の疾患の遺伝子診断にも有効である可能性を有する。
【００３７】
また、本発明の骨疾患等の検査方法は、患者の末梢血にごく微量にしか存在しない変異細胞が有する変異遺伝子の検出にも有効であり、患者の病変部組織を外科的に生検で採取するなどの観血処置をせずに遺伝子診断が可能になるために患者の負担を大きく軽減でき、骨疾患のスクリーニング検査としても取り入れることが可能である。
【００３８】
［３］本発明の検査・診断キット
本発明の検査・診断キットは、これまで述べた本発明のGs alpha遺伝子変異検出法に用いられるプライマー・プローブを含むもの、あるいはさらに酵素・試薬等を含むものであればよく、ほかは特に限定されるものではない。たとえば、前記(a)-(e)のプライマーおよびＰＮＡプローブの組み合わせを、あるいはさらに校正活性を有するＤＮＡポリメラーゼや制限酵素ＥａｇＩを組み合わせたものを、線維性骨異形成症の高感度遺伝子診断キットとして提供することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明は下記実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４０】
本発明のGs alpha遺伝子変異検出法を用いて、線維性骨異形成症の遺伝子診断を次のように行った。
【００４１】
まず、患者等から採取され、ＥＤＴＡ溶液で脱灰されホルマリン固定されたパラフィン包埋組織ブロックから、DNeasy Tissue Kit（QIAGEN）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを試料として、以下のnested-PCRとＰＮＡクランピング法とを組み合わせた方法により、試料に微量にしか含まれないGs alpha遺伝子Arg201コドンの変異アリルを選択的にかつ効率良く増幅させた。
【００４２】
第１のＰＣＲでは、ＰＣＲ反応液（50μL）は、抽出したゲノムＤＮＡ（20-100ng）に、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（各１μM）、酵素（2.5 units）、25mM dNTP mix（５μL）、至適バッファー（５μL）、さらにＰＮＡプローブ（２μM）を含む組成とした。設計したフォワードプライマー、リバースプライマーおよびＰＮＡプローブの配列はそれぞれ下記(a)-(c) に示すとおりである。酵素には、Ｐｆｕ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Pfu Ultra DNA polymerase (Stratagene, La Jolla, CA)）を使用した。
(a) プライマー１：5’-CCATTGACCTCAATTTTGTTTCAG-3’（配列番号１）
(b) プライマー２：5’-GGTAACAGTTGGCTTACTGGAAGTTG-3’（配列番号２）
(c) Gly-NH2-CGCTGCCGTGTC-HAc（配列番号５）
【００４３】
プライマー１・２は非特許文献１、ＰＮＡプローブは非特許文献３の記載に従い設計した。ＰＮＡプローブの特異性は１００％ではないため、ＰＮＡプローブを用いると変異アリルの増幅率も低下する。そこで、微量なＤＮＡ試料や劣化したＤＮＡ試料では１回目の増幅に用いるフォワードプライマーと重なるように設計すると、変異アリルの増幅量が劇的に落ちるため、フォワードプライマーは、ＰＮＡプローブの外側に重ならない既知のもの（非特許文献１）を用い、ある程度増幅された鋳型のある２回目のフォワードプライマー（下記プライマー３）はＰＮＡプローブに重なるように、且つ増幅効率が上がるように設計した。
【００４４】
第１のＰＣＲの反応条件は、(i)９５℃を６０秒、(ii) ６８℃を６０秒、(iii) ５５℃を６０秒、(iv) ７２℃を６０秒を１サイクルとして、これを（使用した上記酵素の至適増幅サイクルである）３０サイクル行うステップによって目的遺伝子領域を増幅した。
【００４５】
次に、第１のＰＣＲで得られた増幅産物を蒸留水で２０倍希釈し、その１μLを鋳型に使用して、第２のＰＣＲを行った。また、この第２のＰＣＲにおいては、正常アリルの増幅断片に制限酵素ＥａｇＩの切断部位を導入するため設計されたミスマッチプライマー（変異プライマー）を、フォワードプライマーに使用した。第２のＰＣＲで使用したフォワードプライマー（ミスマッチプライマー）およびリバースプライマーの配列はそれぞれ下記(d),(e)に示すとおりである。
(d) プライマー３：5’-AGGACCTGCTTCGCGGC-3’（配列番号３）
(e) プライマー４：5’-CAGTTGGCTTACTGGAAGTTGACTTT-3’（配列番号４）
【００４６】
フォワードプライマーであるプライマー３はＰＮＡプローブに重なるように、且つ、特異的に増幅されるようＴｍ値を低く設定し、リバースプライマーであるプライマー４は特異的バンドが増幅されるよう３’末端のＴｍ値が低くなるよう、且つ、両者のＴｍ値が一致するように設計した。
【００４７】
第２のＰＣＲにおいても、正常アリルの増幅を抑制するため、第１のＰＣＲと同じＰＮＡプローブを添加してＰＣＲを行った。使用した酵素も、第１のＰＣＲと同じであり、第２のＰＣＲの反応液（５０μL）は、鋳型となる増幅産物（１μL）に、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（各１μM）、酵素（2.5 units）、25mM dNTP mix（５μL）、至適バッファー（５μL）、さらにＰＮＡプローブ（２μM）を含む組成とした。反応条件は、(i)９５℃を６０秒、(ii) ６８℃を６０秒、(iii) ５５℃を３０秒、(iv) ７２℃を６０秒を１サイクルとして、これを３０サイクル行うステップによって遺伝子増幅した。
【００４８】
上記の遺伝子増幅によって、図１に示すように、Arg201コドンの正常アリルの増幅断片では、ＥａｇＩの切断部位「CGGCCG」が現れる。他方、Arg201コドンの１番目及び／又は２番目の塩基に変異が生じている変異アリルの増幅断片では、ＥａｇＩの切断部位（制限サイト）が現れないため、第２のＰＣＲで得られた増幅産物をＥａｇＩで消化するPCR-RFLP法によって、変異の有無を簡便に検出することができる。すなわち、正常アリルの場合は、増幅産物はＥａｇＩによって切断されるため７４ｂｐと１４ｂｐの２つの断片となり、これに対して、変異アリルの場合は、増幅産物はＥａｇＩによって切断されず８８ｂｐの断片のままであるため、電気泳動等で消化反応後の断片長を調べることによって、変異の有無を簡便に検出することができる。
【００４９】
本実施例では、第２のＰＣＲで得られた増幅産物をＥａｇＩによって消化した後、4% NuSieve GTGアガロースゲル（FMC BioProducts, Rockland, ME）を用いて電気泳動を行い、ＤＮＡバンドをエチジウムブロマイドで可視化して、各試料の断片長を調べた。また、各疾患は、臨床症状、レントゲン診断および病理診断に基づいて典型的な症例であると判断されたものである。
【００５０】
図２は、本実施例の方法による判定結果（右側のＰＮＡプローブ（＋）の結果）を、ＰＮＡプローブ非存在下（−）で増幅した結果と比較して示す図である。この図では、陽性および陰性コントロールの結果が示される。レーン１の陽性コントロールは、多骨性の線維性骨異形成症（大腿骨）と診断された患者検体の結果である。このような症状のケースでは、臨床症状、レントゲン診断および病理診断に基づいて信頼性の高い診断が可能である。一方、陰性コントロールのレーン２−４は正常骨の検体、レーン５−６は骨線維性異形成症（osteofibrous dysplasia）と診断された患者検体の結果である。この結果からもわかるように、正常骨および骨線維性異形成症の患者の検体からは、既知の論文に報告されているように、Gs alpha遺伝子Arg201コドンの変異は検出されなかった（非特許文献２）。これに対して、陽性コントロールでは変異が検出されたが、左側のＰＮＡプローブ非存在下（−）では正常アリルの増幅も検出され、変異アリルの微量なサンプルでは誤診をする可能性が考えられた。一方、右側のＰＮＡプローブ存在下（＋）では変異アリルが選択的に増幅され、Arg201コドン変異の有無を高精度に検出でき、明確な判定結果を得ることができた。
【００５１】
図３は、本実施例の方法による判定結果（下側のＰＮＡプローブ（＋）の結果）を、ＰＮＡプローブ非存在下（−）で増幅した結果と比較して示す図である。この図では、線維性骨異形成症（fibrous dysplasia）および仮骨性線維腫（ossifying fibroma）の患者検体の結果が示される。線維性骨異形成症患者９検体のうち、４検体は長管骨症例、残り５検体は顎骨症例である。図中の１４検体について、下記の表１には、各患者の年齢、性別、疾患部位などが、シークエンシング解析により明らかにされた分子病理学的特徴と共に示される。
【００５２】
【表１】
2008092899.tif 000003
【００５３】
図３において、★印は、本解析によりGs alpha遺伝子Arg201コドンの変異が検出された検体を示す。この結果からもわかるように、仮骨性線維腫（ossifying fibroma）の患者検体すべてにおいて、Arg201コドンの変異は検出されなかった。これに対して、線維性骨異形成症（fibrous dysplasia）では変異が検出されたが、上側のＰＮＡプローブ非存在下（−）では変異アリルの存在を検出できなかった検体も存在した。一方、下側のＰＮＡプローブ存在下（＋）では線維性骨異形成症の患者検体すべてにおいて、変異アリルが選択的に優勢に増幅され、Arg201コドン変異の有無を高精度に検出でき、明確な判定結果を得ることができた。
【００５４】
また、本解析によって、線維性骨異形成症の患者からはGs alpha遺伝子Arg201コドンの変異が検出される一方、仮骨性線維腫の患者からは変異が検出されないことがはじめて明確になり、本発明の方法によって、線維性骨異形成症と骨腫瘍との高精度な信頼性の高い鑑別診断が実現できることがわかった。
【００５５】
本実施例のGs alpha遺伝子変異検出に基づく鑑別診断の利点、特徴などを説明すれば、以下のとおりである。
i) 正常アリルと変異アリルを含むサンプルの中から変異アリルを選択的・優先的に増幅させるためＰＮＡプローブを用いるとＰＣＲ増幅率が低下するので、増幅サイクル数を増やす必要がある。しかし、ＰＮＡプローブは完全に正常アリルをブロックするものではなく、実際、ＰＮＡプローブを添加しても、サイクル数を増すと正常アリルもかなり増幅され、その増幅物をシークエンスしても正常アリルの増幅割合によっては正常アリルが読まれて誤診する可能性がある。
本実施例の方法では、nested-PCR法とＰＮＡクランピング法とを組み合わせることによって変異アリルを選択的に効率良く増幅させることができる。また、制限酵素ＥａｇＩで切断するステップを組み合わせることにより、増幅産物における変異アリルの有無を高精度に検出することができる。
ii) 病理組織ブロックなどの劣化して断片化したＤＮＡからもGs alpha遺伝子Arg201コドンを含む遺伝子領域が増幅されるように、増幅させる長さの検討を行った結果、既知のプライマーペアーの内側に新たに我々の設計した２つのnested-PCR用のプライマーを用いることにより、ほとんどのサンプルから増幅が可能なことがわかった。
iii) また、ＰＣＲの増幅過程で増幅物に変異が起こらないように、酵素の検討を行った結果、２回のＰＣＲ増幅過程でＰｆｕ由来のＤＮＡポリメラーゼを用いると精度が高くなることがわかった。
iv) ＰＣＲ反応において、温度と時間の調整を行い、上記のＰＣＲプロトコール（反応条件）によって１回目と２回目のＰＣＲを行ったところ、ほとんどの線維性骨異形成症で、変異アリルが選択的に増幅されるように調節することができた。
v) したがって、線維性骨異形成症では、ＥａｇＩ酵素処理に耐性の変異アリルのバンドがゲル上で明確に確認できるとともに、２回目のＰＣＲ増幅物をシークエンスすることにより、２度にわたって変異を確認できるシステムを組むことができた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
以上のように、本発明は、Gs alpha遺伝子変異の高感度検出法、骨疾患や内分泌疾患等の検査方法およびそのための検査・診断キットに関するものであり、前述のとおり、線維性骨異形成症と骨腫瘍との鑑別診断をはじめ、各種疾患の検査・診断などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の実施例に係るGs alpha（Ｇｓα）遺伝子Arg201コドンの変異検出法について説明する図である。
【図２】本発明の実施例に係るGs alpha遺伝子変異検出法による、陽性および陰性コントロールの判定結果を示す図である。陽性コントロールは、多骨性fibrous dysplasia（大腿骨）、陰性コントロールは、正常骨（レーン：２−４）とosteofibrous dysplasia（レーン：５−６）であり、ＰＮＡプローブの存在下（＋）および非存在下（−）で増幅した結果をそれぞれ比較して示す。
【図３】本発明の実施例に係るGs alpha遺伝子変異検出法による、患者検体の判定結果を示す図である。ＰＮＡプローブの存在下（＋）および非存在下（−）で増幅した結果をそれぞれ比較して示す。★印は、本解析によりGs alpha遺伝子変異が検出されたものを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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