(57)【要約】【課題】好気的条件下で連続エタノール生産性の高いアルコールの連続生産方法を提供すること。【解決手段】サッカロマイセス属セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＭ１２菌株からなる酵母を用いて培養された酵母培養液と、アルコール原料とを、発酵槽２に供給してアルコール発酵を行い、得られたアルコール培養液を前記発酵槽２から引き抜いてアルコールを連続発酵するアルコールの連続生産方法であって、前記発酵槽２内を好気条件に維持してアルコールを連続発酵することを特徴とするアルコールの連続生産方法。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロマイセス属セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＭ１２菌株からなる酵母を用いて培養された酵母培養液と、アルコール原料とを、発酵槽に供給してアルコール発酵を行い、得られたアルコール培養液を前記発酵槽から引き抜いてアルコールを連続発酵するアルコールの連続生産方法であって、
前記発酵槽内を好気条件に維持してアルコールを連続発酵することを特徴とするアルコールの連続生産方法。
【請求項２】
好気条件下での培養において、菌体あたりのエタノール生成収率Ｙｐ/ｘが、Ｙｐ/ｘ＝Ｙｐ/ｓ／Ｙｘ/ｓ（Ｙｐ/ｓはエタノール収率、Ｙｘ/ｓ菌体収率）で表わされ、該Ｙｐ/ｘの値が３．６０〜４．６０の範囲であることを特徴とする請求項１記載のアルコールの連続生産方法。
【請求項３】
好気条件下での培養において、菌体あたりのエタノール生成収率Ｙｐ/ｘが、Ｙｐ/ｘ＝Ｙｐ/ｓ／Ｙｘ/ｓ（Ｙｐ/ｓはエタノール収率、Ｙｘ/ｓ菌体収率）で表わされ、該Ｙｘ/ｓが０．１０〜０．２０の範囲であることを特徴とする請求項１記載のアルコールの連続生産方法。
【請求項４】
好気条件下での培養において、菌体あたりのエタノール生成収率Ｙｐ/ｘが、Ｙｐ/ｘ＝Ｙｐ/ｓ／Ｙｘ/ｓ（Ｙｐ/ｓはエタノール収率、Ｙｘ/ｓ菌体収率）で表わされ、該Ｙｐ/ｘの値が３．６０〜４．６０の範囲であり、該Ｙｘ/ｓが０．１０〜０．２０の範囲であることを特徴とする請求項１記載のアルコールの連続生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコールの連続生産方法に関し、詳しくは菌体あたりのエタノール生成収率Ｙp/xが、従来酵母よりはるかに高いアルコールの連続生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、特許文献１には、サッカロマイセス属セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＭ１２菌株（以下、必要によりＡＭ１２菌株と称する）からなる酵母を用いたアルコールの発酵生産法が開示されており、ＡＭ１２菌株は高温発酵能と強い凝集性を有する記載がある。
【特許文献１】特開昭５９−１３５８９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、特許文献１におけるアルコール発酵は嫌気培養であるため（同文献実施例２参照）、連続エタノール生産プロセスに適さず、連続発酵プロセスにおける単位時間あたりのエタノール生産性が不十分である欠点があった。
【０００４】
そこで、本発明は、好気的条件下で連続エタノール生産性の高いアルコールの連続生産方法を提供することを課題とする。
【０００５】
本発明の他の課題は、以下の記載によって明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題は、以下の各発明によって解決される。
【０００７】
（請求項１）
サッカロマイセス属セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＭ１２菌株からなる酵母を用いて培養された酵母培養液と、アルコール原料とを、発酵槽に供給してアルコール発酵を行い、得られたアルコール培養液を前記発酵槽から引き抜いてアルコールを連続発酵するアルコールの連続生産方法であって、
前記発酵槽内を好気条件に維持してアルコールを連続発酵することを特徴とするアルコールの連続生産方法。
【０００８】
（請求項２）
好気条件下での培養において、菌体あたりのエタノール生成収率Ｙｐ/ｘが、
Ｙｐ/ｘ＝Ｙｐ/ｓ／Ｙｘ/ｓ（Ｙｐ/ｓはエタノール収率、Ｙｘ/ｓ菌体収率）で表わされ、該Ｙｐ/ｘの値が３．６０〜４．６０の範囲であることを特徴とする請求項１記載のアルコールの連続生産方法。
【０００９】
（請求項３）
好気条件下での培養において、菌体あたりのエタノール生成収率Ｙｐ/ｘが、
Ｙｐ/ｘ＝Ｙｐ/ｓ／Ｙｘ/ｓ（Ｙｐ/ｓはエタノール収率、Ｙｘ/ｓ菌体収率）で表わされ、該Ｙｘ/ｓが０．１０〜０．２０の範囲であることを特徴とする請求項１記載のアルコールの連続生産方法。
【００１０】
（請求項４）
好気条件下での培養において、菌体あたりのエタノール生成収率Ｙｐ/ｘが、
Ｙｐ/ｘ＝Ｙｐ/ｓ／Ｙｘ/ｓ（Ｙｐ/ｓはエタノール収率、Ｙｘ/ｓ菌体収率）で表わされ、該Ｙｐ/ｘの値が３．６０〜４．６０の範囲であり、該Ｙｘ/ｓが０．１０〜０．２０の範囲であることを特徴とする請求項１記載のアルコールの連続生産方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、好気的条件下で連続エタノール生産性の高いアルコールの連続生産方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００１３】
はじめに本発明に係るアルコールの連続生産方法の基本原理について説明する。
【００１４】
連続発酵プロセスにおける単位時間あたりのエタノール生産性は以下の式（１）にて表される。
【００１５】
エタノール生産性（ｇ／Ｌ／ｈ）：Ｊ＝Ｄ・Ｙｐ/ｘ・ｘ          （１）
Ｄ：希釈率（糖化液供給速度を培養体積で割った値）
Ｙｐ/ｘ：菌体あたりのエタノール生成収率
ｘ：菌体濃度（ｇ／Ｌ）
【００１６】
従来酵母（パン酵母：文献値）のＹｐ/ｘは、０．８４（好気条件）〜３．５４（−）（嫌気条件）の範囲であるが、本発明で使用する酵母（ＡＭ１２株、本発明酵母ともいう）固有の実験の一例によると、Ｙｐ/ｘは４．５５（−）（微好気条件）である結果（実施例参照）が得られた。
【００１７】
従って、従来酵母のＹｐ/ｘより本発明酵母のＹｐ/ｘが高いために、高いエタノール生産能力を有することを見出した。
【００１８】
菌体あたりのエタノール生成収率Ｙｐ/ｘは、次式（２）にて表される。
【００１９】
Ｙｐ/ｘ＝Ｙｐ/ｓ／Ｙｘ/ｓ（Ｙｐ/ｓはエタノール収率、Ｙｘ/ｓは菌体収率）  （２）
【００２０】
本発明者らの好気培養で得られた実験の一例によると、本発明酵母においては、Ｙｐ/ｓ＝０．５０（−）、Ｙｘ/ｓ＝０．１４６（−）であった。
【００２１】
これに対して、従来酵母（パン酵母：文献値）はＹｐ/ｓ＝０．３〜０．４（−）、Ｙｘ/ｓ＝０．１４（嫌気）〜０．５３（好気）である。
【００２２】
従来酵母の好気培養ではエタノール生産よりも菌体増殖が優勢になるのに対し、本酵母では好気条件での菌体収率Ｙｘ/ｓは従来酵母の嫌気条件下の値とほぼ同じであり、Ｙｐ/ｘ値が従来酵母の嫌気条件での値よりはるかに高い結果が得られることがわかった。
【００２３】
すなわち、好気培養における以下の反応式（３）式において、本発明酵母においては、従来酵母と異なり、菌体（ｃｅｌｌ）増殖よりもエタノール生産が優勢であり、菌体あたりのエタノール生成収率Ｙｐ/ｘ値が極めて高いことことに起因しているものと推定される。
【００２４】
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋Ｎ２−ｓｏｕｒｃｅ＋Ｏ２→ｃｅｌｌ＋Ｃ２Ｈ５ＯＨ＋ＣＯ２（好気条件）  （３）
【００２５】
即ち、本発明者らは、本発明酵母が好気培養においても極めて高い範囲のＹｐ/ｘ値を有することを見出したものであり、また上記（２）式におけるＹｐ/ｓとＹｘ/ｓの関係より、Ｙｘ/ｓが従来酵母の嫌気条件下と同等の値であることを見出したものであり、これらの知見を見出したことにより、本発明を完成させるに至ったものである。
【００２６】
次に、本発明に係るアルコールの連続生産方法の構成要件を以下に説明する。
【００２７】
本発明で用いるアルコール原料は、穀物由来の原料が好ましく、例えば米、麦、イモなどは糖濃度が高いので好ましい例として挙げられる。糖濃度としては、穀物原料の糖化反応効率の観点から、１００〜３００ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは１５０〜２００ｇ／Ｌの範囲である。
【００２８】
好気発酵温度は、酵母の至適発酵温度の観点から、４０℃以下が好ましく、より好ましくは３０〜３５℃の範囲である。温度調節には、ヒーターおよび冷却器などの調節手段を採用できるが、格別限定されない。
【００２９】
本発明において、発酵槽内を好気条件に維持する上で、発酵槽内のＤＯ（溶存酸素濃度）は、０．１〜３ｐｐｍの範囲が好ましく、より好ましくは、０．１〜１ｐｐｍの範囲である。ＤＯの調整は、空気供給量および発酵槽内攪拌翼の回転速度を増減することにより可能であり、例えばＤＯメータと空気供給量制御手段を連動させる手法を採用することもできる。
【００３０】
ｐＨは、酵母の至適ｐＨの観点から、３〜７の範囲が好ましく、より好ましくは３．５〜５．０の範囲である。ｐＨ調整手法としては、ｐＨメータで計測したデータに基づきｐＨ調整剤を連続的に供給してｐＨを調整するｐＨ制御システムを採用することができる。
【００３１】
希釈率Ｄは、０．１〜０．２５の範囲が好ましく、より好ましくは０．１５〜０．２０の範囲である。希釈率Ｄは糖化液供給速度を培養体積で割った値である。        
【００３２】
菌体濃度ｘは、２０〜４０ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは２５〜３０ｇ／Ｌの範囲である。菌体濃度の測定は吸光度測定（濁度測定）によって行なうことができる。
【００３３】
本発明に用いるサッカロマイセス属セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＭ１２菌株は、工業技術院生物工業研究所に、微工研受託番号第６７４９号として寄託されている。詳しくは特開昭５９−１３５８９６号公報を参照できる。
【００３４】
本発明において、連続発酵というのは、発酵槽に糖液を連続的に供給しながら、一方で、生成物を連続的に取り出すもので、エタノールと酵母の混ざった培養液が連続的に取り出されるものを指す。
【００３５】
好気条件下での培養において、菌体あたりのエタノール生成収率Ｙｐ/ｘの値は、３．６０〜４．６０の範囲であることが好ましく、より好ましくは３．６１〜３．６３の範囲であり、更に好ましくは３．６２である。
【００３６】
また本発明において、好気条件下での培養において、Ｙｘ/ｓ（菌体収率）は０．１０〜０．２０の範囲であることが好ましく、より好ましくは０．１３〜０．１６の範囲であり、更に好ましくは０．１４である。    
【実施例】
【００３７】
以下に、本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例によって限定されない。
【００３８】
実施例１
＜１．糖化液調製法＞
エタノール連続生産の原料となる糖化液は、単糖（グルコース）濃度換算で約20％の糖化液に、酵母用培地成分（ビタミンおよびミネラル源、酵母エキス、ポリペプトン）を添加し（酵母エキス、ペプトンを、希釈液に対して0．1（w／w）％、0．2（w／w）％の割合で添加）、さらにオートクレープ処理（120℃、1気圧、20分間）により、滅菌処理を施したものを用いた。
【００３９】
＜２．AM12酵母種菌作成法＞
AM12酵母の種菌は、バッフル付フラスコにYPD培地（酵母エキス1％、ペプトン2％、グルコース5％、培地pH5．0）を入れ、滅菌処理をしたフラスコ培地中に、−80℃にて凍結保存した本酵母を接種（白金耳を用いて、凍結した酵母懸濁液を添加）し、培養温度30℃、好気（振とう速度160rpmの振とう培養）条件にて、一晩振とう培養を行った酵母培養液を用いた。
【００４０】
＜３．AM12酵母による連続エタノール発酵法＞
図１に示す連続エタノール発酵槽を用いて実験を行った。
【００４１】
図１において、１は糖液供給タンク、２は発酵槽である。糖液供給タンク１から糖液は供給ポンプ１０を用いて発酵槽２に供給する。
【００４２】
発酵槽２はｐＨコントローラ２０を備えており、ｐＨ測定器２１の測定値を入力して、ｐＨが下記制御条件の範囲にない場合には、ｐＨ調整ポンプ２２を稼動させて、1N−HClおよび2N−NaOHをタンク２３から発酵槽２に供給するように構成されている。
【００４３】
また発酵槽２は温度コントローラ２４を備えており、温度測定器２５の測定温度を入力して下記制御条件の範囲を越える場合には、発酵槽２の外周に設けられる冷却管２６に冷却水を供給して冷却したり、ヒーターで加熱して温度調整できるように構成されている。
【００４４】
更に発酵槽２はＤＯコントローラ２７、ＤＯメータ２８を備えており、溶存酸素（ＤＯ）濃度は通気および発酵槽内攪拌翼２９の回転速度を増減することにより制御する。
【００４５】
図１において、３０は生産されたアルコールを取り出すアルコールポンプである。
【００４６】
最初に、連続エタノール発酵のスタートアップを行う。即ち、加熱滅菌処理を施した図１に示す３Ｌの発酵槽２に、上記１．にて作成した糖化液を１Ｌ入れ、上記２．にて作成した酵母種菌を接種口より発酵槽内に接種し、酵母によるエタノール発酵を開始する。
【００４７】
表１に発酵槽の制御条件を記す。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
次いで、エタノール発酵開始後、約40時間後、上記１．にて作成した糖化液を、f＝0．1［Ｌ/h］（希釈率0．1［h-1］）の速度で発酵槽に添加しながら、同時に同速度で発酵槽内の培養液を抜き取る（連続エタノール発酵の開始）操作を行なった。
【００５０】
fは実験開始と共に増加させ、最大で0．18［L／h］（希釈率0．18［h−1］）まで増加させることによって、連続エタノール生産を行った。
【００５１】
＜４．連続エタノール発酵における分析方法＞
連続エタノール生産中の発酵槽から流出する酵母とエタノールが混合した培養液を取得した。ＡＭ１２酵母の菌体増殖は、吸光度計（shimadzu ＵＶ−mini１２４０）を用いて、濁度（OD600の吸光度）を測定した後、濁度から菌体濃度への換算式（菌体濃度（g/L）＝０．３８×OD600）により算出した。
【００５２】
エタノール発酵に伴うグルコースの消費状況は培養液のグルコース濃度をグルコースキッド（和光純薬製グルコールテスト−ｃ−ワコー）を用いて測定した。
【００５３】
エタノール生成の経時変化はFID検出器付のガスクロマトグラフ（shimadzu GC−２０１４）により測定した。
【００５４】
＜５．連続エタノール発酵における実験結果＞
上記手法によりAM12株を用いて連続エタノール発酵を実施した際の、菌体収率、エタノール収率、エタノール生成収率を表２に示す。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
本連続エタノール生産手法により、f＝0．18［Ｌ/h］（希釈率0．18［h-1］）にて、最大エタノール生産性は１８．３ｇ／Ｌとなった。
【００５７】
比較例１
実施例１と同様の手法により、通常酵母(Saccharomyces cerevisiae JCM7255標準酵母菌株)を用いて連続エタノール発酵を実施した際の、菌体収率、エタノール収率、エタノール生成収率を表３に示す。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
本連続エタノール生産手法により、f＝0．18［Ｌ/h］（希釈率0．18［h-1］）にて、最大エタノール生産性は１３．３ｇ／Ｌとなった。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】連続エタノール発酵槽の概略図
【符号の説明】
【００６１】
１：糖液供給タンク
１０：供給ポンプ
２：発酵槽
２０：ｐＨコントローラ
２１：ｐＨ測定器
２２：ｐＨ調整ポンプ
２３：タンク
２４：温度コントローラ
２５：温度測定器
２６：冷却管
２７：ＤＯコントローラ
２８：ＤＯメータ
２９：攪拌翼
３０：アルコールポンプ
【図１】
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