(57)【要約】【課題】 Ｌ−グルタミン酸生産能を有する新規なＬ−グルタミン酸生産菌を取得し、安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発につなげる。【解決手段】 コリネ型細菌由来のクエン酸シンターゼ遺伝子を、パントエア属に属する腸内細菌に導入し、得られた微生物を液体培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することにより、Ｌ−グルタミン酸を製造する。【選択図】図１
2008200044.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属するコリネ型細菌由来のクエン酸シンターゼ遺伝子が導入され、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する、パントエア属に属する微生物。
【請求項２】
配列番号１および２のプライマーを用いて増幅されるコリネ型細菌由来のクエン酸シンターゼ遺伝子が導入され、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する、パントエア属に属する微生物。
【請求項３】
前記クエン酸シンターゼ遺伝子が、コリネバクテリウム・グルタミカムまたはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムに由来する請求項１または２記載の微生物。
【請求項４】
前記微生物がパントエア・アグロメランスに属する請求項１〜３のいずれか一項記載の微生物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物を液体培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＬ−グルタミン酸生産菌及びそれを用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（非特許文献１）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（特許文献１）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（特許文献２）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（特許文献３）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（特許文献４）等が知られている。
【０００３】
上記のような微生物の育種や製造法の改良により、Ｌ−グルタミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められている。
【０００４】
上記観点から、本発明者は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物を広く検索、研究した。その結果、エンテロバクター属、セラチア属、クレブシエラ属又はエルビニア属に属する微生物のＬ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素（クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）の活性を高めることによって、高いＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物が得られることを見いだしている（特許文献５，６）。
【０００５】
また、エシェリヒア属に属するバリン感受性株に、エシェリヒア属細菌由来のクエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）及びフォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼをコードする遺伝子を導入し、これらの酵素活性を増幅することによって、高いＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物が得られることを見出している（特許文献７）。
【０００６】
一方、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝子（ＣＳ遺伝子）の導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（特許文献８）。これらのコリネ型細菌を宿主とした場合は、宿主と同種のコリネバクテリウム・グルタミクム由来のＣＳ遺伝子導入が、大腸菌由来のＣＳ遺伝子導入に比べ若干高めの効果を示したが、顕著な差は見られなかった。
【０００７】
上記のように、各種微生物にＣＳ遺伝子を導入し、Ｌ−グルタミン酸生産能を高めることが知られているが、エシェリヒア属細菌をはじめとする腸内細菌群に属する微生物にコリネ型細菌由来のＣＳ遺伝子を導入した例は知られていない。
【特許文献１】米国特許第３，２２０，９２９号
【特許文献２】米国特許第３，５６３，８５７号
【特許文献３】特公昭３２−９３９３号
【特許文献４】特開平５−２４４９７０号
【特許文献５】特願平10-224909号
【特許文献６】特願平10-297129号
【特許文献７】WO 97/08294号
【特許文献８】特公平7-121228号
【非特許文献１】アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する新規なＬ−グルタミン酸生産菌を見出し、安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発につなげることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、腸内細菌群のＬ−グルタミン酸生産能の向上を目指し、遺伝子導入による育種を行った。通常、遺伝子増幅による微生物の育種においては、宿主が目的遺伝子を有している場合は、宿主固有の遺伝子又は宿主に近縁の微生物由来の遺伝子を用いた方が、異種遺伝子を導入するよりも、より良い効果が得られると考えられている。しかし本発明者等は、腸内細菌群においては同種の微生物由来のＣＳ遺伝子に比べて、コリネ型細菌由来のＣＳ遺伝子の導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に非常に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下のとおりである。
【００１０】
（１）コリネ型細菌由来のクエン酸シンターゼ遺伝子が導入され、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する腸内細菌群に属する微生物。
【００１１】
（２）コリネ型細菌がブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムである（１）の微生物。
【００１２】
（３）腸内細菌群に属する微生物がパントエア属に属する細菌である（１）又は（２）の微生物。
【００１３】
（４）前記細菌がパントエア・アグロメランスに属する（３）の微生物。
【００１４】
（５）前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の微生物を液体培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、腸内細菌群に属する微生物に効率よくＬ−グルタミン酸生産能を付与することが可能となることから、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌で従来知られている育種手法等を用いてさらに高い生産能を付与できると考えられる。また培養条件等の検討により、安価で、効率の良いＬ−グルタミン酸製造法の開発につながるものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の微生物本発明の腸内細菌群に属する微生物は、腸内細菌群に属し、かつ、コリネ型細菌由来のＣＳ遺伝子の導入によってＬ−グルタミン酸生産能が付与されるか、又はＬ−グルタミン酸生産能が向上するものであれば特に制限されないが、例えば、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、パントエア属又はエシェリヒア属に属する細菌が挙げられる。これらの中では、エンテロバクター属またはクレブシエラ属に属する細菌が好ましい。以下に、これらの細菌の具体的な例を示すが、本発明の微生物はこれらに限定されない。
【００１７】
本発明で使用されるエンテロバクター属に属する微生物には、以下のようなものがある。エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）
エンテロバクター・アムニゲナス（Enterobacter amnigenus）
エンテロバクター・アスブリア（Enterobacter asburiae）
エンテロバクター・クロエッケ（Enterobacter cloacae）
エンテロバクター・ディソルベンス（Enterobacter dissolvens）
エンテロバクター・ジェルゴビア（Enterobacter gergoviae）
エンテロバクター・ホルマエッケ（Enterobacter hormaechei）
エンテロバクター・インターメディウス（Enterobacter intermedius）
エンテロバクター・ニミプレスラリス（Enterobacter nimipressuralis）
エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）
エンテロバクター・テイロレ（Enterobacter taylorae）
【００１８】
さらに好ましくは、以下に示す菌株が挙げられる。
エンテロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ１２２８７エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４４として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４が付与されている。また、エンテロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ１２２８７は、ＡＴＣＣより分譲を受けることができる。
【００１９】
エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５株は静岡県磐田市の土壌から分離された株である。ＡＪ１３３５５の生理的性質を記す。
【００２０】
（１）グラム染色性：陰性
（２）酸素に対する挙動：通性嫌気性
（３）カタラーゼ：ポジティブ
（４）オキシダーゼ：ネガティブ
（５）硝酸還元能：ネガティブ
（６）フォゲス−プロスカウエル試験：ポジティブ
（７）メチルレッド試験：ネガティブ
（８）ウレアーゼ：ネガティブ
（９）インドール生成：ポジティブ
（１０）運動性：有り
（１１）ＴＳＩ培地での硫化水素生成：微弱な活性あり
（１２）β−ガラクトシダーゼ：ポジティブ
【００２１】
（１３）糖資化性：アラビノース：ポジティブシュークロース：ポジティブラクトース：ポジティブキシロース：ポジティブソルビトール：ポジティブイノシトール：ポジティブトレハロース：ポジティブマルトース：ポジティブメリビオース：ポジティブアドニトール：ネガティブラフィノース：ポジティブサリシン：ネガティブメリビオース：ポジティブ
【００２２】
（１４）グリセロース資化性：ポジティブ
（１５）有機酸資化性：クエン酸：ポジティブ酒石酸：ネガティブグルコン酸：ポジティブ酢酸：ポジティブマロン酸：ネガティブ
（１６）アルギニンデヒドラターゼ：ネガティブ
（１７）オルチンデカルボキシラーゼ：ネガティブ
（１８）リジンデカルボキシラーゼ：ネガティブ
（１９）フェニルアラニンデアミナーゼ：ネガティブ
（２０）色素形成 黄色
（２１）ゼラチン液化能：ポジティブ
（２２）生育ｐＨ ｐＨ４生育不良、ｐＨ４．５〜７生育良好
（２３）生育温度 ２５℃生育良好、３０℃生育良好、３７℃生育良好、４２℃生育可、４５℃生育不可
【００２３】
これらの菌学的性質からＡＪ１３３５５はエンテロバクター・アグロメランスと判定された。
【００２４】
本発明で使用されるクレブシエラ属に属する微生物には、以下のようなものがある。
クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）
クレブシエラ・テリゲナ（K. terrigena）
さらに好ましくは、クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９が挙げられる。クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭＰ−１６６４６として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６６１６が付与されている。
【００２５】
クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株は、北海道札幌市の土壌から分離された株である。以下に、ＡＪ１３３９９の生理的性質を記す。
【００２６】
（１）細胞の形：桿菌
（２）運動性：なし
（３）胞子：なし
（４）ＬａｂＭ栄養寒天培地でのコロニー形態：円形、表面は平滑、クリーム色、なめらか、隆起状、光沢有り。
（５）グルコースＯＦテスト：発酵能ポジティブ
（６）グラム染色性：陰性
（７）酸素に対する挙動：通性嫌気性
（８）カタラーゼ：ポジティブ
（９）オキシダーゼ：ネガティブ
（１０）ウレアーゼ：ポジティブ
【００２７】
（１１）チトクロームオキシダーゼ：ネガティブ
（１２）β−ガラクトシダーゼ：ポジティブ
（１３）アルギニンデヒドラターゼ：ネガティブ
（１４）オルニチンデカルボキシラーゼ：ネガティブ
（１５）リジンデカルボキシラーゼ：ポジティブ
（１６）トリプトファンデアミナーゼ：ネガティブ
（１７）フォゲス−プロスカウエル試験：ポジティブ
（１８）インドール生成：ポジティブ
（１９）ＴＳＩ培地での硫化水素生成：ネガティブ
（２０）クエン酸資化性：ポジティブ
【００２８】
（２１）Ｍ−ハイドロキシベンゼン酸資化性：ネガティブ
（２２）ゼラチン液化能：ネガティブ
（２３）糖からの酸の生成グルコース：ポジティブマンニトール：ポジティブラムノース：ポジティブアラビノース：ポジティブシュークロース：ポジティブソルビトール：ポジティブイノシトール：ポジティブメリビオース：ポジティブアミグダリン：ポジティブア
ドニトール−ペプトン−水：ポジティブセロビオース−ペプトン−水：ポジティブデュルシトール−ペプトン−水：ネガティブラフィノース−ペプトン−水：ポジティブ
（２４）生育温度 ３７℃生育良好、４５℃生育不可
【００２９】
これらの菌学的性質からＡＪ１３３９９は、クレブシエラ・プランティコーラと判定された。
【００３０】
本発明で使用されるセラチア属に属する微生物には、以下のようなものがある。
セラチア・リクエファシエンス（Serratia liquefacience）
セラチア・エントモフィラ（Serratia entomophila）
セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）
セラチア・フォンティコーラ（Serratia fonticola）
セラチア・グリメシ（Serratia grimesii）
セラチア・プロテアマキュランス（Serratia proteamaculans）
セラチア・オドリフェラ（Serratia odorifera）
セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）
セラチア・ルビダエ（Serratia rubidaea ）
【００３１】
さらに好ましくは、以下に示す菌株が挙げられる。
セラチア・リクエファシエンス ＡＴＣＣ１４４６０セラチア・リクエファシエンス ＡＴＣＣ１４４６０は、ＡＴＣＣより分譲を受けることができる。
【００３２】
本発明で使用されるエルビニア属に属する微生物には、以下のようなものがある。
エルビニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）（現在はパントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)として分類されている）
エルビニア・アナナス（E. ananas）
エルビニア・カクティシダ（E. cacticida）
エルビニア・クリサンテミ（E. chrysanthemi）
エルビニア・マロティボラ（E. mallotivora）
エルビニア・ペルシシナス（E. persicinus）
エルビニア・プシディ（E. psidii）
エルビニア・ケルシナ（E. quercina）
エルビニア・ラポンティシ（E. rhapontici）
エルビニア・ルブリファシエンス（E. rubrifaciens）
エルビニア・サリシス（E. salicis）
エルビニア・ウレドボラ（E. uredovora）
【００３３】
さらに好ましくは、エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５（パントエア・アグロメランス ＡＪ２６６６）が挙げられる。エルビニア・ヘルビコーラＩＡＭ１５９５は、東京大学分子細胞生物学研究所より分譲を受けることができる。尚、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology）第９版には、エルビニア・ヘルビコーラは記載されておらず、エルビニア・ヘルビコーラとして分類されていた微生物は、パントエア・アグロメランスに分類されている。このように、エルビニア属に属する微生物及びパントエア属に属する微生物は、互いに近縁である。したがって、パントエア属に属する微生物は、エルビニア属に属する微生物と同様に使用することができる。そのようなパントエア属に属する微生物として、パントエア・アグロメランス及びパントエア・ディスパーサ（Pantoea dispersa）が挙げられる。エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５は、パントエア・アグロメランス ＡＪ２６６６と命名され、平成１１年２月２５日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６６６０としてブダペスト条約に基づき国際寄託され
ている。
【００３４】
本発明で使用されるエシェリヒア属に属する微生物には、エシェリヒア・コリ（Esherichia coli）が挙げられる。
【００３５】
さらに好ましくは、バリン耐性を有するエシェリヒア・コリ、具体的には以下に示す菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリＢ１１エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８）
エシェリヒア・コリＢ（ＡＴＣＣ１１３０３）
エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７）
エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８）、エシェリヒア・コリＢ（ＡＴＣＣ１１３０３）、エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７）は、ＡＴＣＣより分譲を受けることができる。
【００３６】
尚、上記したようなエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、パントエア属又はエシェリヒア属に属する細菌等の腸内細菌による糖の代謝はエムデン−マイヤーホフ経路を経て行われ、同経路で生成するピルビン酸は好気的条件下ではトリカルボン酸サイクルにて酸化される。Ｌ−グルタミン酸は、トリカルボン酸サイクルの中間体であるα−ケトグルタル酸より、ＧＤＨあるいはグルタミンシンセターゼ／グルタミン酸シンターゼによって生合成される。このように、これらの微生物ではＬ−グルタミン酸生合成経路は共通のものであり、本発明においては、上記のような微生物は単一の概念を形成する。従って、上記した種または菌株以外の腸内細菌群に属する微生物も本発明に含まれる。
【００３７】
本発明の微生物は、上記のような腸内細菌群に属する微生物であって、コリネ型細菌由来のＣＳ遺伝子が導入され、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物である。ここで「Ｌ−グルタミン酸生産能を有する」とは、培養したときに培地中にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有することをいう。このＬ−グルタミン酸生産能は、野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。また、コリネ型細菌由来のＣＳ遺伝子が導入されることによってＬ−グルタミン酸生産能が付与される微生物であってもよい。腸内細菌群に属する微生物においてＬ−グルタミン酸生産能が付与または増強された微生物としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められた微生物、またはＬ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損した微生物が挙げられる。また、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められ、かつ、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損した微生物も含まれる。
【００３８】
腸内細菌群に属する微生物に導入するｇｌｔＡ遺伝子の供給源となるコリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
【００３９】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムコリネバクテリウム・アセトグルタミカムコリネバクテリウム・アルカノリティカムコリネバクテリウム・カルナエコリネバクテリウム・グルタミカムコリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）コリネバクテリウム・メラセコーラコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスコリネバクテリウム・ハーキュリスブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラムブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウムブレビバクテリウム・サッカロリティカムブレビバクテリウム・チオゲニタリスブレビバクテリウム・アルバムブレビバクテリウム・セリヌムミクロバクテリウム・アンモニアフィラム具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
【００４０】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２１５１１コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４
【００４１】
コリネ型細菌由来のｇｌｔＡ遺伝子は、ＣＳ活性を欠失した微生物、例えばコリネ型細菌の変異株を用いてその栄養要求性を相補するＤＮＡ断片を上記コリネ型細菌の染色体ＤＮＡから単離することによって取得できる。コリネ型細菌のｇｌｔＡ遺伝子の塩基配列が明らかにされていることから（Microbiology, 1994,140, 1817-1828）、その塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。前記プライマーとしては、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００４２】
腸内細菌群に属する微生物にコリネ型細菌由来のＣＳ遺伝子を導入するには、例えば、該ＣＳ遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られた組換えプラスミドを用いて宿主となる上記出発親株を形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のＣＳ遺伝子（以下、「ｇｌｔＡ遺伝子」と略する）のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ活性が高められる。
【００４３】
上記プラスミドとしては、腸内細菌群に属する微生物の細胞中で自律複製可能なプラスミドであれば特に制限されないが、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００４４】
ｇｌｔＡ遺伝子の導入は、ｇｌｔＡ遺伝子を、宿主となる上記出発親株の染色体ＤＮＡ上に、好ましくは多コピーで存在させることによっても達成できる。腸内細菌群に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にｇｌｔＡ遺伝子を多コピーで導入するには、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピート等、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列が利用できる。あるいは、ｇｌｔＡ遺伝子をトランスポゾンに搭載して、これを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。形質転換株の細胞
内のｇｌｔＡ遺伝子のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ活性が高められる。
【００４５】
形質転換は、例えば、D.A.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326(1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。
【００４６】
導入されるｇｌｔＡ遺伝子は、ｇｌｔＡ遺伝子固有のプロモーターに代えて、腸内細菌群に属する微生物の細胞に好適なプロモーター、例えばｌａｃ、ｔｒｐ、ＰL等のプロモーター等に置換してもよい。
【００４７】
遺伝子のクローニング、ＤＮＡの切断、連結、形質転換法等の技術については、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)）に詳述されている。
【００４８】
本発明の微生物は、コリネ型細菌由来のｇｌｔＡ遺伝子の導入に加えて、ＣＳ以外のＬ−グルタミン酸生合成を触媒する酵素の活性が高められていてもよい。このようなＬ−グルタミン酸生合成を触媒する酵素としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルタミンシンターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等がある。さらに、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、αケトグルタール酸デヒドロゲナーゼ（αＫＧＤＨ）、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ、等がある。これらの酵素の中では、αＫＧＤＨが好ましい。
【００４９】
ＰＥＰＣをコードする遺伝子、およびＧＤＨをコードする遺伝子は、おのおのＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を欠失した変異株を用いて、その栄養要求性を相補するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離することによって取得できる。またエシェリヒア属細菌のこれら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９８４年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２年）、それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。
【００５０】
腸内細菌群に属する微生物において、上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。
【００５１】
変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。
【００５２】
また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用い
る方法がある。例えば、クローン化された目的遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入し、機能を失った遺伝子（欠失型遺伝子）を作製する。次いで、この欠失型遺伝子をエンテロバクター属またはセラチア属に属する微生物の細胞に導入し、相同組み換えを利用して染色体上の目的遺伝子を前記欠失型遺伝子に置換する（遺伝子破壊）。
【００５３】
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株と比較することによって確認することができる。例えば、αＫＧＤＨ活性は、Reedらの方法（L.J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って酵素活性を測定することができる。
【００５４】
また、目的とする酵素によっては、変異株の表現型によって目的変異株を選択することができる。例えば、αＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株は、好気的培養条件ではグルコースを含む最少培地、あるいは、酢酸やＬ−グルタミン酸を唯一の炭素源として含む最少培地で生育できないか、または生育速度が著しく低下する。ところが、同一条件でもグルコースを含む最少培地にコハク酸またはＬ−リジン、Ｌ−メチオニン、及びジアミノピメリン酸を添加することによって通常の生育が可能となる。これらの現象を指標としてαＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の選抜が可能である。
【００５５】
相同組換えを利用したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのαＫＧＤＨ遺伝子欠損株の作製法は、ＷＯ９５／３４６７２号に詳述されており、エンテロバクター属およびセラチア属に属する微生物にも同様の方法を適用することができる。
【００５６】
以上のようにして得られるαＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の具体例としては、エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５６、及びクレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３４１０が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５６及びクレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３４１０は、それぞれ平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４５及びＦＥＲＭ Ｐ−１６６４７として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５及びＦＥＲＭ ＢＰ−６６１７が付与されている。腸内細菌群に属し、コリネ型細菌由来のｇｌｔＡ遺伝子を導入された微生物を液体培地に培養することにより、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させることができる。
【００５７】
前記培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は、培養する菌株の利用可能なものならばよい。
【００５８】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【００５９】
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【００６０】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必
要である。
【００６１】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。培養方法は、発酵温度２０ないし４２℃、ｐＨを４ないし８に制御しつつ通気培養を行う。かくして１０時間ないし４日間程度培養することにより培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
【００６２】
培養終了後、培養液中に蓄積されたＬ−グルタミン酸を単離する方法としては公知の方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００６４】
＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドは、以下のようにして構築した。コリネバクテリウム・グルタミカムのｇｌｔＡ遺伝子の塩基配列（Microbiology, 1994, 140, 1817-1828）をもとに、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するプライマーＤＮＡを用い、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、約３ｋｂのｇｌｔＡ遺伝子断片を得た。この断片をＳｍａＩ消化したプラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株）より購入）に挿入し、プラスミドｐＨＳＧＣＢを得た（図１）。次に、ｐＨＳＧＣＢをＨｉｎｄＩＩＩで切断し切り出された約３ｋｂのｇｌｔＡ遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩ消化したプラスミドｐＭＷ２１８（ニッポンジーン（株）より購入）に挿入し、プラスミドｐＭＷＣＢを得た（図１）。得られたプラスミドｐＭＷＣＢがｇｌｔＡ遺伝子を発現していることは、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５株中での酵素活性の測定によって確認した。
【００６５】
＜２＞エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドの作製
対象として、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドを、以下のようにして構築した。ｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＴＷＶＣ（ＷＯ９７／０８２９４号）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ消化して得られたｇｌｔＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収後、プラスミドｐＭＷ２１９（ニッポンジーン（株）より購入）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに導入することによって、プラスミドｐＭＷＣを得た（図２）。得られたプラスミドｐＭＷＣがｇｌｔＡ遺伝子を発現していることは、エシェリヒア・コリのｇｌｔＡ遺伝子欠損株の栄養要求性の相補と酵素活性の測定によって確認した。
【００６６】
＜３＞エンテロバクター・アグロメランスとクレブシエラ・プランティコーラへのｇｌｔＡ遺伝子の導入、及びＬ−グルタミン酸の製造
エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５株及びクレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株を、ｐＭＷＣあるいはｐＭＷＣＢを用いて形質転換した。得られた形質転換株、AJ13355/pMWC、AJ13355/pMWCB、AJ13399/pMWC、AJ13399/pMWCBを、それぞれグルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌを含有する培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ容フラスコに接種して、３７℃で１５時間振とう培養した。培養終了後
、培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸及び残存したグルコースを測定した結果を表１に示した。
【００６７】
【表１】
2008200044.tif 000003
【００６８】
エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５株及びクレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株ともに、ｇｌｔＡ遺伝子の導入によりＬ−グルタミン酸生産能が認められた。Ｌ−グルタミン酸の蓄積は、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子よりも、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を導入した方が顕著であった。尚、AJ13355/pMWCBは、上記条件ではかなりの量のグルコースが消費されずに残っていたが、グルコースを全て消費するまで培養を行えば、１．５〜２ｇ／Ｌ程度のＬ−グルタミン酸を蓄積することが予想される。
【００６９】
尚、AJ13355/pMWCとAJ13355/pMWCB、及びAJ13399/pMWCとAJ13399/pMWCBは、それぞれ保持するプラスミドのコピー数に顕著な差は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＢの構築を示す図。
【図２】ｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣの構築を示す図。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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