(57)【要約】【課題】本発明は繰り返し施行可能な血液の体外循環方法により、アジュバント関節炎ラットを用いて白血球除去器の関節炎治療効果を評価する方法を提供することを課題とする。【解決手段】アジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法であって、麻酔した該ラットの頚静脈と尾静脈の間に、白血球除去器を含む回路容量が０．５ｍＬ以上１．５ｍＬ以下である血液回路を注射針を介して接続し、該ラットの頚静脈から該血液回路に血液を採血し、抗凝固剤を持続投与しながら該ラットの全血液量の６０％から１００％に相当する血液を白血球除去器に通して尾静脈へ返血する白血球除去処理をアジュバント投与後６日〜１３日の間に２回以上施行し、該白血球除去処理前後にアジュバント関節炎に関するパラメータを少なくとも１つ測定して、該パラメータ値を比較して治療効果を判定することを特徴とする、アジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法であって、
麻酔した該ラットの頚静脈と尾静脈の間に、白血球除去器を含む血液回路を注射針を介して接続し、
該ラットの頚静脈から該血液回路に血液を採血し、抗凝固剤を持続投与しながら該ラットの全血液量の６０％から１００％に相当する血液を白血球除去器に通して尾静脈へ返血する白血球除去処理をアジュバント投与後６日〜１３日の間に２回以上施行し、
該白血球除去処理前後にアジュバント関節炎に関するパラメータを少なくとも１つ測定して、該パラメータ値を比較して治療効果を判定することを特徴とする、アジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法。
【請求項２】
前記アジュバント関節炎に関するパラメータが、アジュバント関節炎ラットの足の腫脹率または／および骨破壊スコアであることを特徴とする、請求項１記載のアジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法。
【請求項３】
前記ラットの頚静脈から採血する血流速度が０．２ｍＬ／分以上０．４ｍＬ／分以下であることを特徴とする、請求項１または２記載のアジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法。
【請求項４】
前記ラット頚静脈に穿刺する注射針が留置針であり、ラット頚静脈上の上皮を切開して、頚静脈上の筋肉を介して穿刺することを特徴とする、請求項１から３の何れかに記載のアジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法。
【請求項５】
白血球除去器を含む血液回路の容量が０．５ｍＬ以上１．５ｍＬ以下である、請求項１から４の何れかに記載のアジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法。
【請求項６】
前記白血球除去器が不織布を充填したカラムであり、該不織布の総面積と関節リウマチ患者の治療に使用する白血球除去器の不織布総面積の比がラット全血液量とヒト全血液量の比と同等になるように設定されていることを特徴とする、請求項１から５の何れかに記載のアジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医療分野において、各種の血液浄化器が使用されている。血液浄化器には透析器、血球除去器、吸着器などが存在し、これらを用いた治療では週に１回以上繰り返し施行する方法が提唱されている。従って、血液浄化器の動物における評価においても、同一個体で１週間に１回以上繰り返し施行できる体外循環方法が必要である。
【０００３】
従来、この頻度で体外循環を動物に行うためには、個体へのダメージ、血管確保の困難さ、回路・カラムの作製の困難さから、ブタ、犬、ウサギなどの大、中動物において行われることが一般的であった。一方、疾患動物での評価系としては、ラットを用いた評価が、汎用性、治療効果の推定、作用解析などの点で有利であることから、ラットでの血液浄化治療器評価系が望まれていた。
【０００４】
アジュバント関節炎ラットは多発性の関節炎や関節疼痛などヒトリウマチに近い症状を呈するリウマチの動物モデルで、結核死菌を懸濁したアジュバントをラットのフットパッド、または尾根部に投与して関節炎を誘発する。非特許文献１には、アジュバント関節炎ラットを用いた血液浄化治療器評価が記載されており、このモデルラットにセルロースビーズを充填したカラムを用いて３回血液浄化を行うと後肢腫脹が減少することが報告されている。非特許文献１では、血液浄化に際して頚静脈２本を使用して採血と返血を行っている。
【０００５】
しかし、これに従い頚静脈に穿刺してみたところ、頚静脈への穿刺は３回の失敗で血管に針を刺せなくなることから、穿刺にはかなりの熟練が必要であった。さらに、動物の動きによって針が抜ける、血液が抜けなくなる、針を抜いた後に内出血が起こるなどの問題があった。したがって、ラットにおいて、同一個体に1週間に１回以上、複数回繰り返して血液体外循環を行うことは困難であった。
【０００６】
【非特許文献１】免疫・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ 、１９９６年、Ｖｏｌ．６、Ｎｏ．１、ｐ４９。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、上記のような従来技術の問題点に鑑みて、繰り返し施行可能な血液の体外循環方法により、アジュバント関節炎ラットを用いて白血球除去器の関節炎治療効果を評価する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討したところ、アジュバント関節炎ラットの頚静脈と尾静脈の間に白血球除去器を含む回路を接続すれば血液の体外循環が繰り返し施行可能で、アジュバント投与後６日〜１３日の間に該白血球除去処理を２回以上施行することにより、アジュバント関節炎ラットに対する白血球除去器の治療効果や安全性を容易かつ確実に評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下に関する。
【０００９】
（１）アジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法であって、麻酔した該ラットの頚静脈と尾静脈の間に、白血球除去器を含む血液回路を注射針を介して接続し、該ラットの頚静脈から該血液回路に血液を採血し、抗凝固剤を持続投与しながら該ラットの全血液量の６０％から１００％に相当する血液を白血球除去器に通して尾静脈へ返血する白血球除去処理をアジュバント投与後６日〜１３日の間に２回以上施行し、該白血球除去処理前後にアジュバント関節炎に関するパラメータを少なくとも１つ測定して、該パラメータ値を比較して治療効果を判定することを特徴とする、アジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法。
【００１０】
（２）前記アジュバント関節炎に関するパラメータが、アジュバント関節炎ラットの足の腫脹率または／および骨破壊スコアであることを特徴とする、（１）記載のアジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法。
（３）前記ラットの頚静脈から採血する血流速度が０．２ｍＬ／分以上０．４ｍＬ／分以下であることを特徴とする、（１）または（２）記載のアジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法。
【００１１】
（４）前記ラット頚静脈に穿刺する注射針が留置針であり、ラット頚静脈上の上皮を切開して、頚静脈上の筋肉を介して穿刺することを特徴とする、（１）から（３）の何れかに記載のアジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法。
（５）  白血球除去器を含む血液回路の容量が０．５ｍＬ以上１．５ｍＬ以下である、（１）から（４）の何れかに記載のアジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法。
【００１２】
（６）  前記白血球除去器が不織布を充填したカラムであり、該不織布の総面積と関節リウマチ患者の治療に使用する白血球除去器の不織布総面積の比がラット全血液量とヒト全血液量の比と同等になるように設定されていることを特徴とする、（１）から（５）の何れかに記載のアジュバント関節炎ラットを用いた白血球除去器の関節炎治療効果の評価方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る評価方法を使用すれば、アジュバント関節炎ラットに対する白血球除去器の関節炎治療効果を容易かつ確実に評価できる。
【００１４】
また本発明に係る評価方法で使用するラット血液体外循環方法によれば、同一ラットに対して、血液体外循環を３日置きに計３回以上、確実かつ容易に実施できるので、該方法は、白血球除去器以外の血液浄化器（透析器、血球除去器、吸着器）の治療効果の確認、治療効果の作用機序解析、血液浄化器のスクリーニング、最適な治療方法の開発、血液浄化器の安全性評価に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
血液体外循環とは血管から血液を取り出し、目的の血液処理をした後、別の血管に戻すことを継続的に行えるシステムである。循環用の回路と血液浄化器を連結し、循環用ポンプで循環させることで、採血、血液処理、返血を継続的に行うことができる。
【００１６】
本発明でいう白血球除去器とは、粒子集合体、多孔質体、平膜、不織布、織布、綿状繊維集合体等の担体からなる白血球除去材を入口と出口を有する容器に充填したものをいい、該白血球除去材に血液を通過させることによって、白血球が吸着またはろ過され、血液から少なくても白血球の一部を除く作用を有する器具をさす。以下、白血球除去材の具体例について詳細に説明する。
【００１７】
不織布、織布、綿状繊維集合体などの繊維状媒体を白血球除去材とする場合、平均繊維直径は０．５μｍ以上５０μｍ以下が好ましく、より好ましくは０．５μｍ以上２０μｍ以下である。また、平均孔径は２μｍ以上２００μｍ以下が好ましく、より好ましくは２μｍ以上１００μｍ以下である。更に嵩密度は０．０５ｇ／ｃｍ3以上０．５ｇ／ｃｍ3以下であることが好ましく、より好ましくは０．０７ｇ／ｃｍ3以上０．２５ｇ／ｃｍ3以下である。平均繊維直径が０．５μｍ未満、平均孔径が２μｍ未満、嵩密度が０．５ｇ／ｃｍ3 を超えると血球の目詰まりや圧力損失の増大を引き起こし易くなる傾向があり、好ましくない。また、平均繊維直径が５０μｍを超え、平均孔径が２００μｍを超え、嵩密度が０．０５ｇ／ｃｍ3未満になると白血球を捕捉できなくなる傾向にあるため好ましくない。ここで嵩密度とは、繊維重量（ｇ）を繊維のかたまりが占める体積（ｃｍ3）で割った値（ｇ／ｃｍ3）である。
【００１８】
連続孔を有するスポンジ状多孔質体を白血球除去材とする場合には、２μｍ以上２００μｍ以下の平均孔径を有することが好ましく、２μｍ以上１００μｍ以下の平均孔径を有することが望ましい。平均孔径が２μｍ未満であると血球目詰まりや圧力損失の増大を引き起こし好ましくない。また、平均孔径が２００μｍを超えると白血球を捕捉できなくなる傾向にあるため好ましくない。
【００１９】
なお、本発明における平均繊維直径とは、以下の方法に従って求められる値をいう。即ち、白血球除去材を構成する繊維状媒体から実質的に均一と認められる部分をサンプリングし、走査電子顕微鏡などを用いて、写真に撮る。サンプリングに際しては、繊維体の有効濾過断面部分を、一辺が０．５ｃｍの正方形によって区分し、その中から６ケ所をランダムサンプリングする。ランダムサンプリングするには、例えば上記各部分に番地を指定した後、乱数表を使うなどの方法で、必要箇所の区分を選べば良い。またサンプリングした各区分について、３ケ所以上好ましくは５ケ所以上を拡大倍率２５００倍で写真に撮る。サンプリングした各区分について中央部分及びその近傍の箇所の写真を撮っていき、その写真に撮られた繊維の合計本数が１００本を超えるまで写真を撮る。ここで直径とは、繊維軸に対して直角方向の繊維の幅をいう。測定した全ての繊維の直径の和を、繊維の数で割った値を平均繊維直径とする。但し、複数の繊維が重なり合っており、他の繊維の陰になってその幅が測定できない場合、また複数の繊維が溶融するなどして、太い繊維になっている場合、更に著しく直径の異なる繊維が混在している場合、等の場合には、これらのデータは削除する。
【００２０】
また、本発明における白血球除去材の平均孔径とは、水銀ポロシメーター（島津製作所、ポアサイザ９３２０または同等の装置）で測定した値であり、水銀が白血球除去材担体の細孔に全く入っていない状態を水銀圧入量０％、フィルター材の全ての細孔に入っている状態を水銀圧入量１００％とした時、水銀圧入量５０％にあたる点が本発明でいう平均孔径である。尚、水銀ポロシメーターでの測定は１〜２６５０ｐｓｉの圧力範囲で測定する。
【００２１】
粒子集合体を白血球除去材とする場合には、０．１ｍｍ以上１０ｍｍ以下の直径を有することが好ましく、０．５ｍｍ以上５ｍｍ以下の直径を有することがより好ましい。粒子の直径が小さすぎると血液の移送に高い圧力を要し、それにより溶血を引き起こす傾向にある。また、血栓の生成による目詰まりを引き起こす可能性が高くなるため好ましくない。一方、粒子の直径が大きすぎると単位体積あたりの表面積が減少するので処理効率が低下する傾向になるため好ましくない。粒子径は、ふるい法、遠心沈降法、レーザー回折散乱法、動的光散乱法、画像処理、細孔電気抵抗法等の方法によって測定することができる。例えば細孔電気抵抗法は以下のようにして測定する方法である。即ち、電解質溶液（電解質の溶けた水溶液または有機溶剤）中の小さな径の細孔（アパチャー）に一定の電流を流し、その系の電気抵抗を計測する。電解質溶液中に粒子を均一に懸濁させ、陰圧により粒子が細孔を通過するようにする。粒子が細孔を通過することによって排除された電解液の体積により変化する細孔の電気抵抗（インピーダンス）が電圧パルスの変化によって計測される。この電圧パルス高を計測処理して、粒子の体積分布ヒストグラムを得ることができる。
【００２２】
また、本発明の白血球除去材の材質としては、血球にダメージを与えにくいものであれば特に限定はなく各種のものを用いることができ、有機高分子、無機物、金属等が例として挙げられる。その中でも有機高分子は切断等の加工性に優れるため好ましい素材である。有機高分子としては、例えば、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリスルホン、セルロース、セルロースアセテート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ポリトリフルオロエチレン、ポリトリフルオロクロロビニル、フッ化ビニリデン−テトラフルオロエチレン共重合体、ポリエーテルスルホン、ポリ（メタ）アクリレート、ブタジエン−アクリロニトリルコポリマー、ポリエーテル−ポリアミドブロックコポリマー、エチレン−ビニルアルコールコポリマー等が挙げられるが、本発明のフィルター材は上記例示に限定されるものではない。
【００２３】
本発明に係る評価方法で使用する白血球除去器を含む血液回路の容量は、ラットの全血液量から考えて０．５ｍＬ以上１．５ｍＬ以下であることが好ましい。
【００２４】
白血球除去器を用いた白血球除去は、白血球除去器をつないだ血液の体外循環によって行われ、これを用いた疾患治療は白血球除去療法（ＬＣＡＰ）と呼ばれている。
【００２５】
白血球除去療法の有効性はリウマチにおいて示されおり、ラットモデルではアジュバント関節炎モデルが広く使用されてきた。アジュバント関節炎はＭ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを流動パラフィンにて懸濁したアジュバントを投与することによって起こる関節炎で、ヒトのリウマチ性関節炎に類似の症状を呈し、現在までに各種のリウマチ薬について、このモデルで有効性が示されてきた経緯がある。
【００２６】
本発明でいうアジュバント関節炎に関するパラメータとは、アジュバント関節炎の病態を反映するラットに関する測定値を指し、例えば、足の腫脹率、骨破壊スコア、疼痛、CRP、炎症性サイトカインなどがあり、特に足の腫脹率や骨破壊スコアが好適に用いられる。足の腫脹率とはアジュバント感作前の後肢容積に対するアジュバント感作後の後肢容積の変化量をアジュバント感作前の後肢容積で除した値（％）であり後肢容積は足容積測定装置により測定する。足の腫脹率としては、右後肢と左後肢の腫脹率を平均した平均腫脹率を用いることがより好ましい。
【００２７】
また、骨破壊スコアとは後肢の軟X線写真を撮影し、後肢の骨の減少、変形、破壊の度合いをスコア化して定量するものである。また、経時的に体重を測定することで、体外循環による生体へのダメージを推測することが可能である。
【００２８】
白血球除去器の性能評価はラットの血液を採取し、プールした血液をカラムに通過させ、白血球除去器通過前と通過後の血液の血球を解析することで、通過血液に対する白血球除去器の性能を評価することが可能である。また、ラットで血液体外循環を行い、血液体外循環前と循環開始後経時的に静脈から採血して、その血球を解析することで、血液体外循環が生体に及ぼす影響を評価することも可能である。
【００２９】
ヒトのリウマチにおける白血球除去治療では、同一個体で繰り返し血液体外循環を施行することから、ラットモデルでの白血球除去器の評価においても、同一個体で繰り返し血液体外循環を施行する必要がある。そのためには、血液体外循環に使用する静脈を確実に確保することが重要であり、針の穿刺、採血と返血の確実性を考慮することが望ましい。上記観点から、本発明におけるラット血液体外循環では頚静脈から採血し、尾静脈に返血する。
【００３０】
静脈へのカニュレーションでは、血液体外循環の間、安定した血液流路が確保されることが重要である。ラットは呼吸などで常に動いており、それでも採血を継続的に行えるようにするには留置針を用いたカニュレーションが望ましい。本発明でいう留置針とはヒト用に市販されている静脈用留置針を指し、外筒と内筒によって針が構成され、穿刺後外筒を静脈内に留置する針を意味する。
【００３１】
留置針はその構造上針が柔らかく、上皮の外からの頚静脈への確実な穿刺は不可能であり、確実な穿刺のためには、頚静脈上の上皮を切開してからの穿刺が望ましい。
【００３２】
頚静脈への穿刺では、血管に直接針を刺すと、針を抜いた後に出血が起こる場合がある。穿刺後の頚静脈の止血のためには、血管に直接針を挿入するのではなく、頚静脈上の筋肉を介しての穿刺が望ましい。
【００３３】
血液体外循環中にラットが動くと、針が抜けたり、カニューレの位置が動いて採血、返血が滞る場合があるため、確実な麻酔が必要である。そのためには、ペントバルビタールの４０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与と３０分ごとの１５ｍｇ／ｋｇ皮下投与が望ましい。
【００３４】
抗凝固剤としては、抗凝固作用を有する投与量において生体への重篤な副作用が無いものが使用可能である。具体的にはヘパリンナトリウム、メシル酸ナファモスタット、クエン酸ナトリウム、 ａｃｉｄ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＡＣＤ）、ＥＤＴＡなどが使用可能である。
【００３５】
ヘパリンナトリウムを用いた場合、まずヘパリン２００Ｕ／ｋｇを静脈内投与し、続いてヘパリンを１００Ｕ／ｋｇ／時間で持続投与すると、少なくとも1時間の血液体外循環が可能で、且つ循環後の出血は起こらない。
【００３６】
血液体外循環後には上皮の切開部の接合が必要である。この接合に縫合を用いると、全身抗凝固剤処理をしているために縫合穴からの出血が見られる。そこで、傷口の接合には瞬間接着剤の使用が望ましい。
【００３７】
ヒト用の白血球除去器をラットにて評価するには、血液に作用する機器であることから、ヒトとラットの全血液量を基準に各種の条件設定をすることが望ましい。全血液量とは生体内で循環している全ての血液量であり、ライフサイエンス社、実験動物の血液学、１９４ページ（１９８１年、関  正利  等編）に記されている、体重あたりの全血液量から計算したものである。具体的には、ヒトでは７７．８±１５ml／ｋｇとされていることから、ヒト体重を６０ｋｇと想定して、７７．８ｍｌ／ｋｇ  X  ６０ｋｇの計算から、ヒト全血液量を４６８８ｍｌと算定した。ラットでは５８±１４ｍｌ／ｋｇとされていることから、この数値を用いて、ラット体重から全血液量を算定した。
【００３８】
ヒトにおける白血球除去の血液体外循環では１回、１時間で、３０００ｍｌの血液が循環されることから、全血液量の約６０％が処理されることになる。臨床においては全血液量の６０％処理が一般的であり、この処理量にて治療効果が証明されている。さらに全血液量の１００％の処理においては６０％処理時より高い治療効果が期待できることも近年報告されている（２００５年  第１４回日本リウマチ学会、順天堂大学、山路  健先生）。したがって、十分な治療効果を期待するためには６０％以上の血液処理が望ましい。また、全血液量の１００％以上の血液処理は過去の使用例がなく、有効性、副作用、圧上昇のデータもないことから評価には適さない。従って、ラット血液体外循環による白血球除去処理においても、ラット全血液量の６０％から１００％に相当する血液を処理する必要がある。更に、ラットにおいても１時間以内にヒトと同率以上の血液を循環させることが望ましく、そのためには１５０ｇから３００ｇのラットにおいて０．２ｍｌ／分から０．４ｍｌ／分の流速で循環させ、ラット全血液量の６０％を循環できるように、循環時間を設定するのが望ましい。０．２ｍｌ／分以下では循環時間が長くなり、安定した麻酔、抗凝固剤の作用時間を超過するため０．２ｍｌ／分以上の血液流速が望ましい。さらには０．４ｍｌ／分以上の流速では溶血、圧上昇のリスクが高くなることから、血液流速は０．２〜０．４ｍｌ／分が望ましい。
【００３９】
アジュバント関節炎ラットでは、感作後０，３，６日目に白血球除去処理を行っても治療効果がないことから、白血球除去処理は１次炎症には効果が少なく、２次炎症に効果的であることが考えられた。このモデルで２次炎症が発症する時期は６日目以降であることから、治療開始時期は６日目以降とした。さらに、より感度よく２次炎症の治療効果を評価するためには、２次炎症の程度が低い時期から治療することが効果的であり、２次炎症反応が急激に高くなる１３日目までに治療を行うことが重要である。したがって、このモデルで白血球除去処理による治療効果を得るには、アジュバント投与後６日〜１３日の間に白血球除去処理を２回以上施行する必要がある。
【００４０】
本発明でいう不織布総面積とは白血球除去器の中に充填されている不織布の総面積を指し、白血球除去器をラットにて評価する場合には、ヒト用白血球除去器とラット用白血球除去器の不織布総面積比がヒトとラットの全血液量比と一致するように、ラット用白血球除去器を作製することが望ましい。
【００４１】
フィルター担体の表面積はＢＥＴ法、Ｌａｎｇｍｕｉｒ法等公知の方法を用いて測定することができる。フィルター担体が繊維の場合は平均繊維径値及び繊維比重値等を用いて計算により求めることも可能である。
【００４２】
以下の実施例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により限定されるものではない．
【実施例】
【００４３】
[実施例１]  血液体外循環に使用する静脈の検討
ラット血液体外循環に適する静脈を検討した。ペントバルビタール生理食塩水溶液４０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与してラットを麻酔した。麻酔ラットに対して、１ｍｌの注射筒を繋いだ２５ Gｘ１注射針を用いて穿刺後、１ｍｌの採血と返血を行い、穿刺、採血、返血の可否を調べた。（表１）
【００４４】
【表１】
2008161468.tif 000002
【００４５】
以上の検討から、穿刺の確実性では尾静脈が有利であること、採血は頚静脈から実施する必要があることがわかった。そして、穿刺の成功確率を高くするためには、採血は頚静脈、返血には尾静脈を使用することが適していることが明らかとなった。
【００４６】
[実施例２]  静脈に刺す針の検討
静脈に刺す針を翼状針と留置針で比較検討した。ラットにペントバルビタール生理食塩水溶液を４０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与して、麻酔した。翼状針のチューブには１０Ｕ／ｍｌのヘパリン生理食塩水溶液を満たした注射筒を連結して、翼状針を静脈に刺し入れた。留置針は、まず留置針を静脈に挿入後、留置針の太さに合うチューブで注射筒と連結した。チューブ、注射筒は予め１０Ｕ／ｍｌのヘパリン生食水で満たした。
穿刺の成否と静脈確保の安定性は注射筒を動かしたときの血液の出入りで確認し、安定性は穿刺から１時間まで調べ、表２の結果が得られた。
【００４７】
【表２】
2008161468.tif 000003
【００４８】
ヒトの血液体外循環は１時間以上行うため、ラットでも同等時間以上の血液体外循環ができることが望ましい。したがって、穿刺の針には、長時間の安定性が期待できる留置針を用いることが適していることが明らかとなった。
【００４９】
[実施例３]  頚静脈への留置針穿刺方法
注射針を用いて、麻酔下ラットの上皮から頚静脈へ穿刺する場合の成功確率は５０％であった。同様に留置針を用いて穿刺を検討したが、穿刺の成功確率はさらに低いものであった。さらに、針を抜いたときにまれに内出血した。
そこで、ペントバルビタール生理食塩水を４０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与して麻酔したラットを用いて、留置針の頚静脈への成功確率が高い穿刺方法を検討した。
【００５０】
その結果、上皮を切開して頚静脈を露出させ、血管を見ながら穿刺を実施すると、２０例において１００％の確率で穿刺できた。さらに頚静脈上の筋肉を介して穿刺することで、針を抜いたあとの止血が全例で可能であった。
以上の検討から、頚静脈への穿刺は、上皮を切開して頚静脈を露出させ、血管を見ながら、頚静脈上の筋肉を介して穿刺することが適していることが明らかとなった。
【００５１】
[実施例４]  血液体外循環における麻酔の検討
血液体外循環は１時間を想定し、その間ペントバルビタールで麻酔のかかる条件を検討した。ＬＥＷラットにペントバルビタール生理食塩水溶液を各種のパターンで投与して、耳をピンセットでつまんだ時の反応の有無で麻酔のかかり判定し、１時間まで調べた。表３の結果が得られた。
【００５２】
【表３】
2008161468.tif 000004
【００５３】
以上の結果から、１時間麻酔が可能で、かつペントバルビタール投与量が最も少ないパターン３が麻酔投与パターンに適していることが明らかとなった。
【００５４】
[実施例５]  ラット血液体外循環用の装置、回路の作製
血液を体外循環させる装置はペリスタポンプとした。ラット血液体外循環用回路の作製では回路容量をできるだけ減らす事、ジョイントをなるべく減らす事、カラムの上流に抗凝固剤を持続注入するラインを作る事を目標に作製した。
以上の検討から、マイクロシリンジポンプによる持続注入ラインをカラム上流に接続でき、カラムを除く回路内容量が５００μｌの循環用回路が作製できた。
【００５５】
[実施例６]  血液体外循環時のヘパリン量の検討
上記の回路を用いて、ＬＥＷラットでの血液体外循環を行い、最適なヘパリン投与量を検討した。血液体外循環は０．２ ｍｌ／分の流速で１時間行い、傷口を糸にて縫合して、血液体外循環中と循環後の観察を行った。
【００５６】
【表４】
2008161468.tif 000005
【００５７】
以上より、パターン２のヘパリン投与方法で、０．２ｍｌ／分の流速で１時間の血液体外循環が可能であることが明らかとなった。
さらに、この検討方法を用いて、ヘパリン以外のメシル酸ナファモスタット、クエン酸ナトリウムなどの抗凝固剤も最適条件を見出すことが可能である。
【００５８】
[実施例７]  傷口の接合方法の検討
血液体外循環後のラットの頚静脈上皮には、カニュレーション時に生じた切開部位が存在する。この接合には糸を用いた縫合を試みたが、ヘパリンの全身投与をしているために、縫合の穴からゆっくりとした出血が見られた。
【００５９】
そこで切開部位の接合には生体用瞬間接着剤を用いた傷の接合を試みた。ＬＥＷラット、６匹の上皮を頚静脈カニューレ時と同様に切開後、生体用の瞬間接着剤にて接合した。３日間の経過観察において、どの個体も行動および体重上昇は正常であり、傷口も３日間で完全にふさがっていた。
したがって、頚静脈上皮の切開部位の接合には生体用の瞬間接着剤が適していることが明らかとなった。
【００６０】
[実施例８]  回路による血液体外循環
これまで設定した血液体外循環の条件で、以下の方法で回路のみを用いた血液体外循環を実施した。循環用回路をペリスタポンプにセットし、マイクロシリンジポンプに５０Ｕ／ｍｌの ヘパリン生食を満たした注射筒をセット後、循環用回路に連結してチューブ内を同溶液で満たした。ペリスタポンプを動かし、生食を流して回路内空気を抜きながら、回路内を生食で満たした。
ラットは体重１５０ｇ−１６０ｇの個体を用い、ペリスタポンプの流速は０．２ｍｌ／分に設定し、５分間生理食塩水を流した。ペントバルビタールを４０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与し、さらに腹腔内投与後３０分毎にペントバルビタールを１５ｍｇ／ｋｇで 皮下投与して麻酔した。
【００６１】
麻酔をかけたラットは仰向けに固定台に固定し、頚静脈上皮をバリカンにて剃毛後、切開して頚静脈を露出させた。筋肉を介して留置針を頚静脈に挿入し、１０Ｕ／ｍｌ ヘパリン生食を満たした採血用チューブを留置針に繋いだ。次に、尾静脈に留置針を挿入後、１０Ｕ／ｍｌ ヘパリン生食を満たした返血用チューブを繋いだ。
尾静脈カニューレチューブからヘパリン生理食塩水溶液を２００Ｕ／ｋｇで投与後、頚静脈の採血用チューブを回路に接続し、ペリスタポンプを動かし、回路内の空気を抜いた。ペリスタポンプをいったん停止後、尾静脈の返血用チューブを回路の他端に繋いだ。マイクロシリンジポンプ、ペリスタポンプをスタートさせ、血液体外循環を開始した。血液体外循環は３０分間と４５分間で実施した。
【００６２】
ラットの全血液量をライフサイエンス社、実験動物の血液学、１９４ページ（１９８１年、関  正利  等編）を参考に計算すると、このときに循環する全血液量に対する割合は３０分間では６０％、４５分間で１００％であった。血液体外循環後、頚静脈のサーフローフラッシュを抜き取り、ここから０．２ ｍｌ／分の流速で生食を５分間流すことで回路内の血液を返血した。
頚静脈切開した上皮は生体用瞬間接着剤で接合した。返血後、尾静脈の留置針を抜き取り、この部位の止血も生体用瞬間接着剤にて行った。
血液体外循環後のラットは３日間飼育して、術後観察し、以下の結果を得た。（表５ａ，ｂ）
【００６３】
【表５】
2008161468.tif 000006
【００６４】
どの個体も正常に生存しており、体重も増加していた。さらに、頚静脈上皮の傷、カニューレした頚静脈ともに３日間で正常に回復していた。  以上より、本方法にて、ラット全血液量の６０−１００％の血液体外循環が可能であることが明らかとなった。
【００６５】
さらに、体重約３００ g のラット４匹について、流速：０．４ｍｌ／分 、３０分間の血液体外循環を行い、３日間の観察を行った。どの個体も３日間まで正常に生存し、体重増加と傷口と静脈の治癒が確認できた。
【００６６】
これらの検討から、ラットにおいて、０．２ｍｌ／分から０．４ｍｌ／分の流速にて血液体外循環が可能であることが確認できた。
以上より、回路を用いたラット血液体外循環系が構築できたこと、３日後には次の体外循環も可能であることが明らかになった。
【００６７】
[実施例９]  白血球除去器の作製
ラット用白血球除去器の作製にあたって、ヒト用で既に市販されている旭化成メディカル株式会社製の白血球除去カラムを参考に作製した。
ラット用白血球除去器内の不織布量は不織布総面積がヒト：ラットの全血液量比と同等になるように設定し、構造は不織布を積層するものとした。なお、このときの白血球除去器の容量は１ｍｌであり、白血球除去器を含む回路容量は１．５ｍｌであった。
【００６８】
[実施例１０]  回路、白血球除去器のラット血液を用いた性能試験
ラット血液を回路と白血球除去器に通し、回路と白血球除去器の性能を調べた。
血液循環に先立ち、体外循環用回路の準備を行った。循環用回路をペリスタポンプにセットし、マイクロシリンジポンプに５０Ｕ／ｍｌのヘパリン生食を満たした注射筒をセットした後、注射筒を循環用回路に連結して回路内を同溶液で満たした。
【００６９】
白血球除去器に４ｍｌの生食を流して洗浄後、白血球除去器を回路に繋ぎ、ペリスタポンプを動かして生食を循環させた。ペリスタポンプの流速を０．２ｍｌ／分に設定し、０．０４ｍｇ／ｍｌのフサン生理食塩水溶液を１０分間流した。
ＬＥＷラット１８匹の腹大動脈から全採血を行い、ヘパリン処理血漿をプールした。
血液体外循環用回路の採血用チューブをプール血漿に入れ、ペリスタポンプとマイクロシリンジポンプをスタートさせて、白血球除去器による血液処理を開始した。白血球除去器を通過した血液を返血用チューブから５分ごとにフラクションし、５５分間の血液処理能力を調べた。
【００７０】
回路と白血球除去器は６セット実施し、通過前血液、通過後血液を血球カウンターにて解析し、図１、２の結果を得た。
ラット用白血球除去器は赤血球をほとんど除去せずに、白血球を３０分までほとんど除去したことから、ヒト用白血球除去器とほぼ同等の性能を持つことがわかった。さらにカラムの性能差も非常に少ないことも確認できた。
したがって、作製したラット用の白血球除去器、回路は性能的にラット血液体外循環に十分使用できるものであることが明らかとなった。
【００７１】
[実施例１１]  ラット血液体外循環による血球の変動
これまでの検討から、図３に示すシステムにて、ラット血液体外循環が可能であることが確認できた。そして、このシステムで血液を体外循環し、末梢血液の血球変動を調べた。
血液循環に先立ち、体外循環用回路の準備を行った。循環用回路をペリスタポンプにセットし、マイクロシリンジポンプに５０Ｕ／ｍｌのヘパリン生食を満たした注射筒をセットした後、注射筒を循環用回路に連結して回路内を同溶液で満たした。
【００７２】
白血球除去器に４ｍｌの生食を流して洗浄後、回路に繋ぎ、ペリスタポンプを動かし、生食を循環させた。ペリスタポンプの流速を０．２ｍｌ／分に設定し、０．０４ｍｇ／ｍｌフサン生食を１０分間流した。
ラットは８週令、雌のＬＥＷラットを使用し、４０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタール生理食塩水溶液を腹腔内投与した後、さらに３０分毎にペントバルビタール生理食塩水溶液を１５ｍｇ／ｋｇで皮下投与して麻酔した。
【００７３】
麻酔下ラットを仰向けに固定台に固定し、頚静脈上皮をバリカンにて剃毛後、切開して頚静脈を露出させた。筋肉を介して留置針を頚静脈溜に挿入し、１０Ｕ／ｍｌヘパリン生食を満たした採血用チューブを留置針に繋いだ。尾静脈に留置針を挿入後、１０ Ｕ／ｍｌヘパリン生食を満たした返血用チューブを繋いだ。
尾静脈カニューレチューブから２００Ｕ／ｍｌのヘパリン生食を１ｍｌ／ｋｇで投与後、頚静脈の採血用チューブを回路に接続し、ペリスタポンプを動かし、回路内の空気を抜いた後、ペリスタポンプを停止させた。尾静脈の返血用チューブを回路の他端に繋いだ。マイクロシリンジポンプ、ペリスタポンプをスタートさせて、血液体外循環を開始した。血液体外循環は０．２ｍｌ／分の流速で、全血液量の６４％が循環する時間（３６−３８分間）施行した。
【００７４】
血液体外循環後、頚静脈から留置針を抜き取り、ここから０．２ｍｌ／分の流速で生食を９分間流すことで回路内の血液を返血した。
頚静脈切開した上皮は生体用瞬間接着剤で接合した。返血後、尾静脈の留置針を抜き取り、この部位の止血も生体用瞬間接着剤にて行った。
血液体外循環を開始してから１００分間にわたり、１０分毎に循環回路の採血用チューブから血液を１５０μｌづつ採取した。採取はペリスタポンプを停止して行い、血液採取する容器には予め２０ｍｇ／ｋｇのＥＤＴＡ水溶液を１０μｌ添加することで血液凝固を抑制した。
【００７５】
６個体について血液体外循環し、血液は血球カウンター（シスメックス XT-２０００iv）にて解析し、図４、５の結果を得た。
血液体外循環によって、赤血球はわずかに減少した。これは複数回の採血による貧血のためである可能性が考えられた。一方、白血球は循環開始後６０分から８０分で０分よりも明らかに上昇した。これはヒトでの白血球除去においても報告されており(Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ、６（６）、 ４０２−、２００２)、白血球のオーバーシュートと呼ばれる現象であると考えられた。
【００７６】
さらに白血球について詳細に変動きを解析し、図６、７の結果を得た。
ラット体内の白血球は血液体外循環後、好中球がオーバーシュートし、リンパ球はほとんど変化しなかった。この変動はヒトで報告されている結果(Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ、６（６）、４０２−、 ２００２)と同様であった。
以上の検討から、ラットでの血液体外循環によって、ヒトと類似の白血球の変動を起こせることが明らかとなった。
【００７７】
[比較例１]  アジュバント関節炎ラットの感作後０、３、６日目の血液体外循環の影響
アジュバントを投与することによりラットに関節炎を発症させ、１個体について血液体外循環を３日おきに合計３回実施した。
アジュバントは必要量のＭ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを秤量後、流動パラフィンにて１０ｍｇ／ｍｌになるよう懸濁して作製した。アジュバント関節炎ラットは体重１５０−１８０ g の８週令、雌、ＬＥＷラットの尾根部にアジュバントを１００μｌ／匹で皮内投与して作製した。感作日を０日目とし、感作後０、３、６日目にラット用白血球除去器を用いた血液体外循環を実施した。各群ｎ＝６で行い、感作から１７日まで体重を測定し、その結果を図８に示す。
【００７８】
６匹全例に対して、３日毎に計３回の血液体外循環を施行することができた。どの群も最終日まで生存し、血液体外循環を施行した群（施行群）と血液体外循環を施行しなかった群（非施行群）で行動に変化はなかった。
施行群の体重は、どの時点においても非施行群の体重と有意差はなく（Ｐ＜０．０５, Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）、施行群の体重が非施行群の体重より低下することはなかった。
感作後０、６、１２、１７日目にラット用肢容積測定装置（７１４０、ＵＧＯ  ＢＡＳＩＬＥ製）を用いて両足後肢容積の測定を行った。アジュバント感作前および各測定日の足容積から、以下に示した式（１）を用いて足の腫脹率、式（２）を用いて足の平均腫脹率を算出した。
【００７９】
足の腫脹率（％）＝１００ｘ（測定日の後肢容積−感作前の後肢容積）／感作前の後肢容積  ・・・（１）
足の平均腫脹率（％）＝（右後肢の足の腫脹率＋左後肢の足の腫脹率）／２  ・・・（２）
【００８０】
感作日からの平均腫脹率の変化を図９に示す。
非施行群ではアジュバント感作後１２日目以降に平均腫脹率が増加した。施行群の平均腫脹率はいずれの測定日においても、非施行群に対して有意な低下は見られなかった（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
以上の結果から、アジュバント感作後０日目から６日目の白血球除去器による血液体外循環はアジュバント関節炎ラットの腫脹に対して治療効果がないことが明らかとなった。
【００８１】
[実施例１２]  アジュバント関節炎ラットの感作後７、１０、１３日目の血液体外循環の影響
比較例１と同様に、ＬＥＷラットにてアジュバント関節炎ラットを作製し、１個体についてアジュバント感作後７、１０、１３日目に３日おきに計３回の血液体外循環を実施した。各群n=８で行い、感作から２１日目までの体重を測定し、その結果を図１０に示す。
どの個体に対しても、感作後７、１０、１３日目に計３回の血液体外循環を行うことができた。どの群も最終日まで生存し、施行群と非施行群で行動に変化はなかった。施行群の体重が非施行群の体重より低下することはなかった。
【００８２】
比較例１および実施例１２の検討より、ここで作製した血液体外循環方法によれば、アジュバント関節炎ラットにおいて、感作後０日目から１３日目の期間において、１個体について、３日おきに計３回以上の血液体外循環をラットにダメージを与えることなく施行できることが明らかとなった。
【００８３】
[実施例１３]  アジュバント関節炎ラットの足腫脹に対する、感作後７、１０、１３日目の血液体外循環による治療効果
実施例１２のラットについて、感作後０、９、１２、１５、１７、２１日目に比較例１と同様に両足後肢容積の測定を行った。アジュバント感作前および各測定日の足容積から、足の腫脹率及び足の平均腫脹率を算出した。
感作日からの平均腫脹率の変化を図１１に示す。
【００８４】
非施行群ではアジュバント感作後１０日以降に平均腫脹率は増加し、感作後１５日目で８５．１±９．４％となった。施行群では感作後１３、１５、１７、２１日目の平均腫脹率がいずれも非施行群に対して、有意に低くなった（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
以上の結果から、アジュバント感作後７日目から１３日目の白血球除去器による血液体外循環がアジュバント関節炎ラットの腫脹に対して治療効果をもつことが明らかとなった。
【００８５】
[実施例１４]  アジュバント関節炎ラットの骨破壊における、感作後７、１０、１３日目の血液体外循環による治療効果
実施例１２のラットについて、試験最終日（感作２１日目）の左右後肢を大腿骨中央部から切断して、２０ｗ／ｖ％中性緩衝ホルマリンで固定した。固定後、軟Ｘ線撮影装置（ＳＯＦＲＯＮ  ＳＲＯ−５０５Ｃ、株式会社ソフロン社製）で軟Ｘ線写真を撮影し、軟Ｘ線画像を観察して骨破壊の程度をスコア化した。スコア化は、０：正常、１：軽度の骨破壊、骨密度低下、２：中等度の骨破壊、骨密度低下、３：強度の骨破壊、変形の４段階で、踵骨、足根骨、中足骨、頚骨の合計スコアを各足の骨破壊スコアとした。
【００８６】
各個体の骨破壊スコアは両足の骨破壊スコアを合計して算出し、その結果を図１２に示す。施行群は非施行群と比較して、有意に低値を示した（Ｐ＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）。
以上の結果から、白血球除去器による血液体外循環がアジュバント関節炎ラットの骨破壊に対して治療効果をもつことが明らかとなった。
【００８７】
[実施例１５]  アジュバント関節炎ラットの足腫脹に対する、感作後６、９、１２日目の血液体外循環による治療効果
アジュバントは必要量のＭ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを秤量後、流動パラフィンにて２ｍｇ／ｍｌになるように懸濁して作製した。アジュバント関節炎ラットは体重１５０−１８０ g の８週令、雌、ＬＥＷラットの尾根部にアジュバントを１００μｌ／匹で皮内投与して作製した。感作日を０日目とし、感作後６、９、１２日目にラット用白血球除去器を用いた血液体外循環を実施した。非施行群ｎ＝６、施行群ｎ＝５で行い、感作から２１日目の腫脹率を実施例１３の方法に従って測定し、その結果を図１３に示す。施行群では感作後２１日目の平均腫脹率が非施行群に対して、有意に低くなった（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
以上の結果から、アジュバント感作後６日目から１２日目の白血球除去器による血液体外循環がアジュバント関節炎ラットの腫脹に対して治療効果をもつことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明に係る評価方法を使用すれば、アジュバント関節炎ラットに対する白血球除去器の関節炎治療効果を容易かつ確実に評価できるから、ヒト関節リウマチに対する白血球除去器の開発に有用である。
更に、本発明に係る評価方法で使用したラット血液体外循環方法は、血液体外循環による血液浄化器（透析器、血球除去器、吸着器）の性能評価、生体への作用の確認と安全性評価に利用できるので、白血球除去器以外の血液浄化器の開発にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】ラット用白血球除去器を用いた血液体外循環による白血球数の変動
【図２】ラット用白血球除去器を用いた血液体外循環による赤血球数の変動
【図３】ラット用血液体外循環システムの概略図
【図４】ラット用白血球除去器を用いた血液体外循環による白血球数の変動
【図５】ラット用白血球除去器を用いた血液体外循環による赤血球数の変動
【図６】ラット用白血球除去器を用いた血液体外循環による好中球数の変動
【図７】ラット用白血球除去器を用いた血液体外循環によるリンパ球数の変動
【図８】感作後０、３、６日目に血液体外循環を施行した場合の体重変化
【図９】感作後０、３、６日目に血液体外循環を施行した場合の足腫脹に対する効果
【図１０】感作後７、１０、１３日目に血液体外循環を施行した場合の体重変化
【図１１】感作後７、１０、１３日目に血液体外循環を施行した場合の足腫脹に対する効果
【図１２】感作後７、１０、１３日目に血液体外循環を施行した場合の骨破壊に対する効果
【図１３】感作後６、９、１２日目に血液体外循環を施行した場合の足腫脹に対する効果
【符号の説明】
【００９０】
１  頚静脈側注射針
２  尾静脈側注射針
３  チューブ
４  シリコンチューブ
５  ジョイント
６  白血球除去器
７  抗凝固剤投与ライン
８  シリンジ
１０  血液回路
２１、２２  血流方向
２３  抗凝固剤流入方向
２４  シリンジポンプ
２５  ペリスタポンプ
【図１】
2008161468.tif 000007
【図２】
2008161468.tif 000008
【図３】
2008161468.tif 000009
【図４】
2008161468.tif 000010
【図５】
2008161468.tif 000011
【図６】
2008161468.tif 000012
【図７】
2008161468.tif 000013
【図８】
2008161468.tif 000014
【図９】
2008161468.tif 000015
【図１０】
2008161468.tif 000016
【図１１】
2008161468.tif 000017
【図１２】
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【図１３】
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