(57)【要約】【課題】物質の細胞に対する効果のスクリーニング試験においてインクジェットプリンターで分注された微小溶液を細胞の一部分にだけに暴露させるための細胞チップを提供する。【解決手段】  固定する細胞が塞ぐことが可能である貫通孔を有する基板、および該貫通孔の開口部の一方の面に接し該固定化細胞の培養液を含む液相領域、を有する細胞固定化支持体と、前記貫通孔の開口部の他方の面から、前記固定された細胞に微小液滴を投与する装置と、を具備する細胞への物質導入装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一方の面と他方の面とを貫通する貫通孔を有する基板と、該貫通孔を塞ぐように該貫通孔に固定された細胞と、を有する細胞固定化支持体と、
該支持体の一方の面に接して存在し、前記細胞の培養液を含む液相領域と、
該支持体の他方の面に対向して存在し、該他方の面の開口部に露出した前記細胞の一部に微小液滴を付与する機構と、
を具備する細胞への物質導入装置。
【請求項２】
一つの前記貫通孔には、一つの細胞が固定されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞への物質導入装置。
【請求項３】
前記微小液滴は細胞膜物質透過亢進剤を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞への物質導入装置。
【請求項４】
貫通孔を有する基板の該貫通孔に、該貫通孔を塞ぐように細胞を固定する工程、
細胞に導入する物質を含む微小液滴を調製する工程、
前記貫通孔の一方の開口部に露出している前記細胞の一部に該微小液滴を付与する工程、
を含む物質導入方法。
【請求項５】
前記基板として、前記貫通孔の前記一方の開口部が該貫通孔の他方の開口部よりも小さい基板を用意し、
該他方の開口部の側から前記細胞を該貫通孔に固定することを特徴とする請求項４に記載の物質導入方法。
【請求項６】
前記貫通孔の一つには、細胞を一つ固定することを特徴とする請求項４または５に記載の物質導入方法。
【請求項７】
前記微小液滴として、細胞膜物質透過亢進剤を含む微小液滴を用いることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の物質導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内に物質を導入するための装置及びその方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
新規治療薬や新規診断薬を開発するために、医薬品候補物質の細胞に対する応答性を効率よく評価する技術が求められている。近年では医薬品候補物質はコンビナトリアルケミストリー技術を応用して合成されることも多く、数多くの種類の化合物が効率よく系統的に調製されている。このように準備された候補物質は微量であることが多く、評価に用いる細胞の培養スケールも微小化され、細胞に候補物質を投与するときも微小液滴分注器、例えばインクジェットプリンターが利用されることもある（特許文献１参照）。つまり観察装置が微小化される。
【０００３】
細胞に薬品や遺伝子などの薬液を注入するために、一般には、先端が非常に細く絞られてガラスピペットを細胞に刺し、注射の如く薬液を注入するマイクロインジェクション法が採用されている。ガラスピペットは、ガラス管をバーナーなどで加熱して引き伸ばすことにより得られている。
【０００４】
また、候補物質としては、一般的な化学物質をはじめ、ペプチド、抗体誘導体、核酸など様々なものが考えられる。候補物質によっては、細胞内に取り込まれなければ効果を発揮しないものも含まれる。そこで、培養液中にある細胞に候補物質を取り込ませるために様々な方法が報告されている。このような方法として、例えば、細胞膜の一部をストレプトリシンＯ（ＳＬＯ）で半透膜化し、細胞内に物質導入する方法が挙げられる（特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００３−３３１７７号公報
【特許文献２】特開２００６−１２９７９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来技術には以下のような問題点がある。まず、候補物質の細胞に対する効果を調べるためのスクリーニング試験においてインクジェットプリンターを使う場合、候補物質溶液を細胞全体に与えてしまい、細胞の一部分にだけに分注溶液を与えるのは困難であった。一方、マイクロインジェクション法を用いる場合、ガラスピペットを細胞に刺すと細胞膜に大きな穴が開くばかりでなく、ガラスピペットの差込量を制御するのが困難である。また、候補物質を細胞内に取り込ませるために、特許文献２に示されたようなＳＬＯを細胞に与える場合、細胞全体にＳＬＯを作用させると、細胞膜全体に小孔が開き、細胞内液が細胞外に流出する。これでは細胞の性質が変化してしまい、物質の評価に支障をきたす。
【０００６】
そこで本発明は、微小溶液を細胞の一部分にだけに接触させて細胞への物質導入を行うための装置とその装置を用いた細胞への物質導入方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的は下記により達成することができる。
【０００８】
（ｉ）一方の面と他方の面とを貫通する貫通孔を有する基板と、該貫通孔を塞ぐように該貫通孔に固定された細胞と、を有する細胞固定化支持体と、
該支持体の一方の面に接して存在し、前記細胞の培養液を含む液相領域と、
該支持体の他方の面に対向して存在し、該他方の面の開口部に露出した前記細胞の一部に微小液滴を付与する機構と、
を具備する細胞への物質導入装置。
【０００９】
なお、この装置は、固定化する細胞が塞ぐことが可能である貫通孔を有する基板、および該貫通孔の開口部の一方の面に接し該固定化細胞の培養液を含む液相領域、を有する細胞固定化支持体と、前記貫通孔の開口部の他方の面から、前記固定化された細胞に微小液滴を投与する装置と、を具備する細胞への物質導入装置、と表現することも可能である。
【００１０】
（ｉｉ）貫通孔を有する基板の該貫通孔に、該貫通孔を塞ぐように細胞を固定する工程、
細胞に導入する物質を含む微小液滴を調製する工程、
前記貫通孔の一方の開口部に露出している前記細胞の一部に該微小液滴を付与する工程、
を含む物質導入方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、インクジェットプリンターなどにより微小液滴を細胞の一部分にだけ与えることによって、細胞への物質導入効率を高めるための処理と同時に物質投与を行っても、細胞に与える障害性を最小限にとどめることができ、物質評価の精度を高めることができる。さらにインクジェットプリンターなどの安価且つ高速な液滴付与手段が適用できるため、多検体処理に適している。つまりハイスループットが高く、評価精度が高い性質をもつ上記候補物質の細胞への機能評価用の固定化細胞アレイ装置、およびその製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明にかかる、（ｉ）一方の面と他方の面とを貫通する貫通孔を有する基板と、該貫通孔を塞ぐように該貫通孔に固定された細胞と、を有する細胞固定化支持体と、該支持体の一方の面に接して存在し、前記細胞の培養液を含む液相領域と、該支持体の他方の面に対向して存在し、該他方の面の開口部に露出した前記細胞の一部に微小液滴を付与する機構と、を具備する細胞への物質導入装置、及び、（ｉｉ）貫通孔を有する基板の該貫通孔に、該貫通孔を塞ぐように細胞を固定する工程、細胞に導入する物質を含む微小液滴を調製する工程、前記貫通孔の一方の開口部に露出している前記細胞の一部に該微小液滴を付与する工程、を含む物質導入方法、について具体的な形態を挙げて説明する。
【００１３】
（実施形態１：細胞を固定化するための貫通孔をもつ基板の構造）
図２を用いて、本実施形態に係る基板の構造に関して説明する。
【００１４】
１は細胞を固定化するための基板である。その厚さは、細胞が固定化でき且つ顕微鏡での細胞の観察に支障が少ないという観点からは、５μｍ以上１ｍｍ以下であることが好ましい。また、貫通孔を開ける加工に都合がよいという観点からは、基板の厚さは７．５μｍ以上１００μｍであることがより好ましい。基板の素材は、細胞が下記で示された方法により固定化でき、目的の細胞観察に支障がなければ、限定されない。基板の素材の好適な例としては、ポリイミド、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリエチレンやポリジメチルシロキサンなどの合成樹脂薄膜を挙げることができる。また、細胞の全体像を観察するためには、基板は無色透明であることが好ましいが、透明であることは必須条件ではない。
【００１５】
２は基板に空けられた貫通孔の微小液滴添加側の開口部である。１０は貫通孔周辺の基板の立体断面を表示した立体断面表示部分である。なお、図２の立体断面表示部分１０を横から見た図を図３に示す。基板に空けられる貫通孔（一方の面と他方の面とを貫通する貫通孔）の形状は図２の立体断面表示部分１０や図３に現れているように円錐台形であることが貫通孔内に細胞を保持するという観点から好ましい。もっとも、円錐台形以外の形状、たとえば、円筒形や角錐台形や角柱形およびこれらの複合形状などであってもよい。ただし貫通孔開口部（上記「他方の面」の開口部）２の大きさは観察に用いる細胞によって塞がれる大きさであることを特徴にもつ。例えば、開口部２を円形とする場合、その直径は、１μｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。もっとも、開口部２の大きさは保持する上記条件を満たしていればよく、目的の細胞に応じて適宜調整することが可能である。設計思想としては、一般的な細胞の直径が１０〜２０μｍであることを考慮すると開口部２の大きさは０．７８５μｍ2以上７８．５μｍ2以下とすることが好ましい。また基板断面図の図４に示したように貫通孔の開口部２の上に１１で示したような微小液滴を保持するための微小なくぼみ（図では円筒形のくぼみを意図している）を形成してもよい。このようにした場合の「開口部２の大きさ」はくぼみの図中下側の開口部（すなわち、円筒と円錐台形の境界部分）の大きさとする。基板がもつ貫通孔の作製方法としては、従来から報告されている手段を適宜選択すればよい。例えば、フェムト秒パルスレーザーで穴あけ加工したり、半導体技術を用いて貫通孔が空いた基板を作製したりすることもできる。
【００１６】
（実施形態２：基板の貫通孔に固定された細胞）
まず、図５を用いて、本実施形態に係る基板の貫通孔に固定された細胞に関して説明する。１は予め用意しておいた細胞を固定するための基板であり、２が基板に空けられた細胞直径より小さい貫通孔開口部である。
【００１７】
本発明において、「貫通孔に固定する」とは、少なくとも細胞の一部が貫通孔内に存在する状態で、細胞を基板に固定することを意味する。細胞の全部が貫通孔内に存在してもよいし、貫通孔から細胞がはみ出していてもよい。
【００１８】
本実施形態においては、この貫通孔の開口部２を塞ぐように、細胞３が基板１に結合し、開口部２に細胞の一部分（以下、「露出部分」という場合がある）４が露出している。細胞の露出部分４に接する領域（図５では細胞の上側）は気相にすることが可能であるので、インクジェットプリンターなどを使って、予め調整された微小液滴を直接細胞の露出部分４に接触させることができる。このとき、その微小液滴と接触するのは細胞の一部分である露出部分４に限定される。また、上記のように微小液滴を直接細胞４に投与することができるのであれば、インクジェットプリンターに限定されるのではなく、例えばエレクトロスプレー法などを用いて投与することも可能である。
【００１９】
一方、細胞３の露出部分４と反対側（図５では細胞の下側）は培養液等が存在する液相領域である。この部分を液相にすることにより、細胞の乾燥を防ぎ、細胞の生存を長時間維持することが可能となる。この液相には、培養液の他に、緩衝液、無機塩溶液などを含ませることができる。
【００２０】
本発明の物質導入装置は主として動物細胞を利用することを想定したものであるが、プロトプラスト化した植物細胞を用いることも可能である。また、本発明においては、接着性細胞、非接着性細胞のどちらも利用可能である。観察時間に生存を維持できるのであれば、生体から摘出した細胞でも培養細胞でも利用可能である。貫通孔を塞ぐことの容易性の観点からは、本装置は一つの基板貫通孔に一つの細胞を固定することが好ましい。その点からは、一つずつ分散した細胞を用いることが好ましい。ただし、貫通孔を塞ぐように固定できるのであれば、細胞塊（例えば、組織片、スフェロイド）を用いることも可能である。細胞の固定方法は従来から様々な方法が報告されているため、必要に応じていずれかの方法を選択すればよいが、以下に示す方法がより好ましい結合様式である。しかし、同様な効果を持つ方法があれば以下の方法に限定されない。
【００２１】
（細胞固定方法の例１）
以下、図６を用いて説明する。本例では、まず、基板１に牛血清アルブミンをコーティングし、基板表面にアミノ基を修飾する。次に、このアミノ基を介して、商品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＯＥ−０２０ＣＳ （化学名:αサクシンイミジルオキシサクシニル、ω−オレイルオキシ、ポリオキシエチレン、日本油脂株式会社製）１３を、基板１表面全体あるいは貫通孔内壁表面に修飾する。次に、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＯＥ−０２０ＣＳ修飾基板１の貫通孔開口部２を有する面と反対側の面を細胞１２懸濁液に接触させ添加し、基板１の貫通孔開口部２を有する面側から吸引することで、基板の貫通孔に細胞１２を吸いつける。吸いつけた細胞１２は基板表面のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＯＥ−０２０ＣＳ１３によって基板貫通孔を塞ぐように固定される（図６）。
【００２２】
（細胞固定方法の例２）
以下、図７を用いて説明する。まず、商品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＯＥ−０２０ＣＳ（化学名:αサクシンイミジルオキシサクシニル、ω−オレイルオキシ、ポリオキシエチレン、日本油脂株式会社製）にアミノ基を持つビオチン誘導体を結合させて結合体を形成する。次に、この結合体１４を細胞懸濁液に添加する。それにより、結合体１４が細胞表面に結合し、細胞表面がビオチン修飾される。次に、貫通孔を持つ基板１にアビジン１５をコーティングする。続いて、このビオチン修飾された細胞１２の懸濁液を、アビジンコーティング基板１の貫通孔開口部２を有する面と反対側の面に接触させ、該基板１の貫通孔開口部２を有する面側から吸引することで基板の貫通孔に細胞を吸いつける。吸いついたビオチン修飾細胞は基板表面のアビジンと結合し、基板貫通孔を塞ぐように固定される。
【００２３】
（細胞固定方法の例３）
以下、図８を用いて説明する。まず、貫通孔を持つ基板１に牛血清アルブミンをコーティングし、基板表面にアミノ基１７を修飾する。この基板表面のアミノ基１７と細胞膜上に存在するアミノ基とをアミノ基反応性二価性架橋剤１８を用いて架橋結合することによって、基板貫通孔を塞ぐように細胞１２を固定する。ここでは、商品名:ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＤＳＰＥ−０２０ＰＡ（化学名：Ｎアミノプロピル、ポリエチレングリコール、カルバミル、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、日本油脂株式会社製）１６を細胞懸濁液に添加することによって、細胞表面にアミノ基を修飾し、このアミノ基を細胞側のアミノ基として利用している。それに代えて、細胞膜タンパク質由来のアミノ基を利用してもよい。基板１の貫通孔開口部２を有する面と反対側の面に細胞１２の懸濁液を接触させ、該基板１の貫通孔開口部２を有する面側から吸引することで基板の貫通孔に細胞を吸いつける。吸い付いたアミノ基修飾細胞のアミノ基を架橋剤１８を使って基板表面のアミノ基１７と結合させて、基板貫通孔を塞ぐように細胞を固定する。
【００２４】
（細胞固定方法の例４）
以下、図９を用いて説明する。貫通孔を持ち且つ表面が疎水性の基板１の開口部２を有する面と反対側の面に細胞１２懸濁液を接触させ、該基板の開口部２を有する面側から吸引することで、基板の貫通孔に細胞１２を吸いつける。吸い付いた細胞の細胞膜１９と基板１疎水表面とが相互作用して結合し、その結果基板貫通孔を塞ぐように細胞１２が固定される。
【００２５】
（細胞固定方法の例５）
以下、図１０を用いて説明する。ここでは、細胞として接着性細胞を用いる。貫通孔を持つ基板にコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンなどの細胞外マトリクスタンパク質（ＥＣＭ）２０あるいはＥＣＭの改変体をコーティングする。１の開口部２を有する面と反対側の面に細胞１２懸濁液を接触させ、該基板の開口部を有する面側から吸引することで、基板の貫通孔を塞ぐように細胞１２を吸いつける。その後、３０分間から２時間程度静置して、細胞を貫通孔に接着させる。
【００２６】
（実施形態３：基板に固定された細胞の一部分に微小液滴を投与する方法）
図１に示したように、インクジェットプリンターに代表される微小液滴排出装置を用いて、検査したい物質の溶液の微小液滴を基板１の貫通孔開口部２の部分に添加する。微小液滴の大きさは、２００ｆＬから１ｐＬの範囲が好ましいが、１ｐＬ程度が市販のインクジェットプリンターを用いることができるという点で実用的である。
【００２７】
開口部２周辺では固定された細胞３の一部分４が露出しており、微小液滴７として与えられた溶液はその細胞の一部分４に投与される。また、微小液滴７を形成する溶液の中に細胞膜物質透過亢進剤を添加することにより、４の細胞膜部分に約３０ｎｍ程度の穴を開けることができ、この穴を通って細胞内に所望の物質を導入することができる。即ち、細胞膜物質透過亢進剤を用いて、固定された細胞の限定された一部分に微小孔を開けることができる。それにより、物質を導入することによる細胞へのダメージを減少できる。可能である細胞膜物質透過亢進剤としては、ストレプトリシンＯ（ＳＬＯ）、界面活性剤などを挙げることができる。なお、ＳＬＯの利用条件に関しては、前記特開２００６−１２９７９８号公報及び以下の文献を参考にすることができる：Ｉｗａｎ  Ｗａｌｅｖ  ｅｔ．ａｌ，  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ−Ｏ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，ｖｏｌ．９８，ｎｏ．６，ｐｐ３１８５−３１９０。
【００２８】
なお、図１中、５は細胞と基板との結合部分、６はインクジェットプリンターのヘッド、８は細胞の一部分に着弾した微小液滴、９は培養液、１０は貫通孔周辺の基板の立体断面表示部分である。
【実施例】
【００２９】
図１１に示すように、３ｃｍ角の厚さ２５μｍのポリイミドフィルム（カプトン（登録商標）、東レ・デュポン株式会社製）２１の中心部に、フェムト秒パルスレーザー加工機を用いた公知の方法で、表側開口（図１２の２３）直径約５μｍ、裏側開口（図１２の２４）直径約１５μｍの円錐台形の貫通孔を９点（３×３、貫通孔中心点の間隔０．５ｍｍ）空ける。このフィルムを酸素プラズマ処理し、次に１％牛血清アルブミン溶液に室温１６時間浸漬する。フィルムを水洗し、乾燥し、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＯＥ−０２０ＣＳ（化学名：αサクシンイミジルオキシサクシニル、ω−オレイルオキシ、ポリオキシエチレン、日本油脂株式会社製）の０．１ｍＭ溶液に室温で２時間浸漬する。浸漬後フィルムを水洗する。ヒト白血病細胞ＴＨＰ−１細胞（大日本住友製薬株式会社より入手）をリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、同溶液に懸濁し、細胞濃度１×１０6細胞／ｍｌに調整する。次に、図１３に示すように、シリコンチャンバー２７とスライドグラス２８とを不図示の顕微鏡ステージに設置し、このチャンバー２７上にフィルム２１の裏側を上にして設置する。その後、フィルム２１の上に細胞懸濁液２６を適量滴下し、直ちに吸引ポンプ２５でチャンバー内を吸引する。そして、細胞が貫通孔に固定されたことを顕微鏡観察により観察する。細胞が固定されたフィルムをＰＢＳ中に浸漬し洗浄する。引き続き、図１４に示すように、細胞３０が固定されたフィルム２１を、裏側を下にして、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地３１が入ったシリコンチャンバー３２の上に空気が入らないように設置する。インクジェットプリンター（キヤノン株式会社製）に下記の溶液を充填して、高湿度下で細胞固定化支持体の貫通孔開口部に向けて微小液滴を滴下する。高湿度下、３７℃で１５分間静置した後、細胞を蛍光顕微鏡観察することにより細胞内への物質導入を観察する。
【００３０】
（インクジェットプリンターへの充填溶液）
３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液を添加したカルシウムイオン非存在のハンクス平衡塩溶液（ｐＨ７．２）の中にＳＬＯ（終濃度２０から８０ｎｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ標識抗体断片（Ｆ(ａｂ')２）（終濃度１μＭ）を添加する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】インクジェットプリンターから排出された微小液滴を細胞の一部に投与するための固定化細胞チップの概要を示す図である。
【図２】細胞を固定するための基板形状例１を示す図である。
【図３】細胞を固定するための基板形状例１（図２の平面断面図）を示す図である。
【図４】細胞を固定するための基板形状例２を示す図である。
【図５】細胞が固定された基板例を示す図である。
【図６】細胞固定化方法例１を示す図である。
【図７】細胞固定方法例２を示す図である。
【図８】細胞固定方法例３を示す図である。
【図９】細胞固定方法例４を示す図である。
【図１０】細胞固定方法例５を示す図である。
【図１１】貫通孔を開けた基板を示す図である。
【図１２】貫通孔を開けた基板断面を示す図である。
【図１３】細胞の吸引装置を示す図である。
【図１４】微小液滴を投与する時の細胞固定化支持体のセッティングを示す図である。
【符号の説明】
【００３２】
１    基板
２    貫通孔の基板開口部
３    固定された細胞
４    貫通孔の基板開口部から露出した固定化細胞の一部分
５    細胞と基板との結合部分
６    インクジェットプリンターのヘッド
７    微小液滴
８    細胞の一部分に着弾した微小液滴
９    培養液
１０  貫通孔周辺の基板の立体断面表示部分
１１  ２の上部に設けた微小液滴を入れる微小ウェル
１２  細胞
１３  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＯＥ−０２０ＣＳ
１４  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＯＥ−０２０ＣＳとアミノ基を持つビオチン誘導体との結合体
１５  アビジン
１６  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−０２０ＰＡ
１７  基板の貫通孔内部表面に修飾したアミノ基
１８  アミノ基に反応性を持つホモ２価性架橋剤
１９  基板の貫通孔内部表面の疎水性部分に結合した細胞膜
２０  細胞外マトリクスタンパク質
２１  ポリイミドフィルム
２２  貫通孔
２３  表側の貫通孔の開口部
２４  裏側の貫通孔の開口部
２５  吸引ポンプ
２６  細胞懸濁液
２７  シリコンチャンバー
２８  スライドグラス
２９  ＰＢＳ
３０  固定された細胞
３１  無血清ＲＰＭＩ１６４０培地
３２  シリコンチャンバー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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