(57)【要約】      （修正有）【課題】  新規な抗インフルエンザウイルス剤および該化合物の製造方法を提供する。【解決手段】 5,7-ジデオキシエピガロカテキンガレート、具体的には下記一般式2008156324.tif 000036で示される化合物が例示され、製造方法としてはニトロオレフィン誘導体とo-ヒドロキシベンズアルデヒド誘導体との閉環反応により得られる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（A）又は一般式（B）で表されるベンゾピラン（カテキン）誘導体またはその塩。
【化１】
2008156324.tif 000030
【化２】
2008156324.tif 000031
（式中 R1, R2 および R3 はそれぞれ独立して水素原子または水酸基を示し、R4 は水酸基またはガロイル基を示す）
【請求項２】
下記の一般式（C）又は一般式（D）で表されるベンゾピラン（カテキン）誘導体またはその塩。
【化３】
2008156324.tif 000032
【化４】
2008156324.tif 000033
【請求項３】
下記の一般式（E）又は一般式（F）で表されるベンゾピラン（カテキン）誘導体またはその塩。
【化５】
2008156324.tif 000034
【化６】
2008156324.tif 000035
【請求項４】
ニトロオレフィン誘導体とo-ヒドロキシベンズアルデヒド誘導体との閉環反応により得られる請求項２記載のベンゾピラン（カテキン）誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項５】
請求項２記載のベンゾピラン（カテキン）誘導体のエステル化により得られる請求項３記載のカテキン誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項６】
請求項１乃至３に記載のベンゾピラン（カテキン）誘導体またはその塩を有効成分とする抗インフルエンザウィルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗インフルエンザウイルス活性を有する新規なベンゾピラン（カテキン）誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは空中感染によって不特定多数の人々が感染し、毎年のように流行を惹き起こしている。そのため抗インフルエンザ薬は世界規模の人々の健康維持に必須の薬剤となっている。しかし現在使用されている抗インフルエンザ薬に耐性をもつウィルスの出現も危惧されており、新規な薬剤の開発が待ち望まれている。ところが、新しい構造、作用をもつ薬剤の開発は技術的に容易でなく、解決すべき重要な課題となっている。
これまでに抗インフルエンザウィルス活性剤として種々提案されており、例えば、特許文献１には、茶を有効成分とするインフルエンザウィルス感染予防剤が開示されている。
【特許文献１】特開平３−１０１６２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、これまでに知られていない抗インフルエンザウイルス作用を有する新規物質および該物質の製造方法、並びに該物質を有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、下記のカテキン誘導体が強い抗インフルエンザウイルス作用を有することを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、請求項１記載の本発明は、一般式（A）又は一般式（B）
で表されるカテキン誘導体またはその塩である。
【化１】
2008156324.tif 000002
【化２】
2008156324.tif 000003
（式中 R1, R2 および R3 はそれぞれ独立して水素原子または水酸基を示し、R4 は水酸基またはガロイル基を示す）
【０００６】
請求項２記載の本発明は、一般式（C）又は一般式（D）で表されるカテキン誘導体またはその塩である。
【化３】
2008156324.tif 000004
【化４】
2008156324.tif 000005
【０００７】
請求項３記載の本発明は、一般式（E）又は一般式（F）で表されるカテキン誘導体またはその塩である。
【化５】
2008156324.tif 000006
【化６】
2008156324.tif 000007
【０００８】
請求項４記載の本発明は、ニトロオレフィン誘導体とo-ヒドロキシベンズアルデヒド誘導体との閉環反応により得られるカテキン誘導体またはその塩の製造方法である。
【０００９】
請求項５記載の本発明は、請求項２記載のカテキン誘導体のエステル化により得られる請求項３記載のカテキン誘導体またはその塩の製造方法である。
【００１０】
請求項６記載の本発明は、請求項１乃至３に記載のカテキン誘導体またはその塩を有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明における新規物質は、抗インフルエンザウイルス剤として利用が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、下記の一般式（A）、一般式（B）で表される新規物質を提供する。
【化７】
2008156324.tif 000008
【化８】
2008156324.tif 000009
（式中 R1, R2 および R3 はそれぞれ独立して水素原子または水酸基を示し、R4 は水酸基またはガロイル基を示す）
【００１３】
一般式（A）又は一般式（B）により表される化学構造を有するカテキン誘導体の具体例としては、以下のような化合物が挙げられる。
【化９】
2008156324.tif 000010
【化１０】
2008156324.tif 000011
【化１１】
2008156324.tif 000012
【化１２】
2008156324.tif 000013
【００１４】
本発明の物質は、実施例に示すとおり優れた抗インフルエンザウイルス活性を有することから、抗インフルエンザウィルス剤として使用することができる。
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、飲食品、医薬品、医薬部外品及び化粧品等へ配合した形態で摂取してもよいが、そのまま単独で摂取することもできる。その場合の摂取量は摂取形態、年齢、体重などにより異なり、特に制限されるものではない。
本発明の抗インフルエンザウイルス剤の摂取方法は特に限定されるものではなく種々の方法で摂取することができる。
本発明の抗インフルエンザウイルス剤の利用形態は、特に限定されず、例えば粉末状、顆粒状、錠剤などの固形状であってもよいし、液状や半固形状などであってもよい。
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、例えばタミフル等、他の抗インフルエンザウイルス剤と併用して用いても何ら問題は生じない。他の抗インフルエンザウィルス剤と併用した場合には、より優れた抗インフルエンザウイルス効果を期待することができる。
本発明の抗インフルエンザウイルス剤を、飲食品、医薬品、医薬部外品及び化粧品等に配合して使用する場合、対象となる物品に対する本発明の抗インフルエンザウイルス剤の配合量は、有効量、すなわち、抗インフルエンザウイルス効果を発揮する配合量となるように、対象となる物品の形態や種類に応じて適宜設定することが好ましい。一般的には、飲料の場合、最終製品中で0.01〜10 重量％であることが好ましく、0.1〜5 重量％であることがより好ましい。
本発明の抗インフルエンザウイルス剤が配合されうる物品は、抗インフルエンザウイルス剤の有効成分となるカテキン誘導体を配合することができるものであればどのような形態であってもよく、例えば、水溶液や混濁物や乳化物などの液状形態であっても、ゲル状やペースト状の半固形状形態であっても、粉末や顆粒やカプセルやタブレットなどの固形状形態であってもよい。
本発明の抗インフルエンザウイルス剤を製剤化する際、或いは飲食品、医薬品、医薬部外品及び化粧品等に配合する際は、必要に応じて、増量剤、酸化防止剤、着色剤、香料、矯味剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、糖類、甘味料、酸味料、ビタミン類などの公知の各種添加剤と適宜組み合わせて用いてもよい。
また、本発明の抗インフルエンザウイルス剤を繊維等に吸着、結合させる場合、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル等の合成高分子、あるいはキチン、キトサン、ポリグルタミン酸等の天然高分子ポリマーが利用できる。特に、5,7-ジデオキシエピガロカテキンガレートは、下記の実施例（００３５）に示すように、分子左側（A 環部分）のフェノール性水酸基が存在しないにもかかわらず、天然の (−)-エピガロカテキンガレート（化２７）よりも強い抗インフルエンザウイルス活性を示す。このことから、A 環部分でリンカーを介したポリマーへの連結も可能となり、5,7-ジデオキシエピガロカテキンガレートを共有結合で結合したポリマー（化１３）の開発やそのフィルター等への応用も可能である。
【化１３】
2008156324.tif 000014
【００１５】
次に、本発明の新規物質の製造法について説明する。
本発明の製法では下式（G）
【化１４】
2008156324.tif 000015
で表される化合物を用いる。R1, R2 および R3 はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基あるいは保護された水酸基を表す。この保護基として例えばベンジル (Bn)、アルキル、シリルおよびアシル基、スルホニル基等が考えられる。
【００１６】
このような一般式（G）で表される化合物として下記のような化合物が挙げられる。
【化１５】
2008156324.tif 000016
【００１７】
また本発明の製法では下式（I）
【化１６】
2008156324.tif 000017
で表される化合物を用いる。  
【００１８】
また本発明の製法では下式（J）
【化１７】
2008156324.tif 000018
で表される化合物を用いる。R1, R2 および R3 はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基あるいは保護された水酸基を表す。この保護基として例えばベンジル (Bn)、アルキル、シリルおよびアシル基、スルホニル基等が考えられる。
【００１９】
このような一般式（J）で表される化合物として下記のような化合物が挙げられる。
【化１８】
2008156324.tif 000019
【００２０】
また本発明の製法では下式（L）
【化１９】
2008156324.tif 000020
で表される化合物を用いる。R1, R2 および R3 はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基あるいは保護された水酸基を表す。この保護基として例えばベンジル (Bn)、アルキル、シリルおよびアシル基、スルホニル基等が考えられる。
【００２１】
このような一般式（L）で表される化合物として下記のような化合物が挙げられる。
【化２０】
2008156324.tif 000021
【００２２】
本発明の製法は、上記一般式（G）で表される化合物と上記一般式（I）で表される化合物とを、塩基存在下で反応させる第１段階、及び上記一般式（J）で表される化合物について還元剤を用いて反応させる第２段階、及び上記一般式（L）で表される化合物について還元剤を用いて反応させる第３段階からなる。
【００２３】
第１段階は、クロメン骨格を形成する閉環反応である。溶媒としては、塩化メチレンなどの非プロトン性溶媒の他に、メタノールなどのプロトン性溶媒を用いることも可能である。溶媒中の上記一般式（G）で表される化合物の濃度は 0.01 M〜1.0 M の比較的薄い条件から無溶媒条件まで用いることが可能である。これに上記一般式（I）で表される化合物をほぼ化学量論量加える事が好ましい。
塩基は、R3N で表される塩基（R は水素原子あるいはアルキル基を表す）を用いることが出来る。溶媒中の塩基の濃度は通常 0.001〜1.0 M であり、好ましくは 0.01〜0.1 M である。塩基は、一般式（G）で表される化合物の濃度のほぼ 10% の濃度で用いることができる。反応温度は通常 0 ℃〜150 ℃、好ましくは 20 ℃〜100 ℃、より好ましくは 70 ℃〜100 ℃ で行われる。
この段階の反応により上記一般式（J）で表される有用な中間体が生成する。
【００２４】
第２段階は、上記一般式（J）のニトロ基を直接ケトン基に導く反応である。溶媒としては、水、メタノールなどのプロトン性溶媒を用いる。溶媒中の上記一般式（J）で表される化合物の濃度は好ましくは 0.01〜1.0 M である。
還元剤としては、TiCl3 あるいは Pb, Zn 等を用いることが出来る。溶媒中の還元剤の濃度は通常 0.001〜1.0 M であり、好ましくは 0.01〜0.1 M である。反応温度は通常 −40 ℃〜150 ℃、好ましくは 0 ℃〜60 ℃ で行われる。
この段階の反応により上記一般式（L）で表される有用な中間体が生成する。
【００２５】
第３段階は、還元剤により 5,7-ジデオキシカテキン誘導体（上記一般式（A）および（B）、R2 は水酸基）に導く反応である。溶媒としては、テトラヒドロフランなどの非プロトン性溶媒を用いる。溶媒中の上記一般式（L）で表される化合物の濃度は好ましくは 0.01〜1.0 M である。
還元剤としては、L-Selectride あるいは NaBH4 等を用いることが出来る。特に立体的に嵩高い還元剤を用いるのが望ましい。溶媒中の還元剤の濃度は通常 0.001〜1.0 M であり、好ましくは 0.01〜0.1 M である。反応温度は通常 −100 ℃〜30 ℃、好ましくは −78 ℃〜0 ℃ で行われる。
この段階の反応により上記一般式(（A）および（B）、R2 は水酸基)で表される 5,7-ジデオキシカテキン誘導体が生成する。
【００２６】
本発明の製法は、上記の第１段階、第２段階、及び第３段階を主反応として含むことを特徴とするが、これら反応の前後や最終生成物（5,7-ジデオキシエピガロカテキンガレート）を生成するまでの間に公知の反応を適宜加えても良い。そのような反応として、(i) ガロイル基の導入反応、(ii) 水酸基の脱保護反応等が挙げられる。これらの反応は本発明の特徴的な部分ではなく、一般的な方法に従って行えばよく、以下その一般的方法を挙げるが、これらに限定されない。
(i) ガロイル基の導入反応は、ガリックアシッド（又はこのハライド若しくは無水物や水酸基が保護されたものでもよい）を非プロトン性溶媒中、縮合剤（DCC 等）と共に用いて行う、又は塩基存在下反応させるのが一般的である。
(ii) 水酸基の脱保護反応は、保護基にもよるが、保護基がシリル基やアルキル基の場合には酸性条件下又は F−イオン存在下行い、ベンジル基等では触媒的水素化条件下（例えばPd 触媒を加えた水素ガス存在下）行うのが一般的である。
【実施例】
【００２７】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１  カテキン誘導体の製造方法
【００２８】
Ar 雰囲気下、1 (569 mg, 1.34 mmol) に toluene 9 mL、CH3NO2 (184 μL, 4.03 mmol)、pyrrolidine (353 μL, 4.03 mmol)、AcOH (231 μL, 4.03 mmol) を加え、80 ℃ で 30 分攪拌した。水を加えた後、EtOAc で三回抽出し、有機層を MgSO4 で乾燥、減圧下濃縮した。その後、カラムクロマトグラフィー (n-hexane : EtOAc = 4 : 1) により精製し、黄色油状の 2 (1,2,3-Tribenzyloxy-5-(2-nitrovinyl)-benzene, 393 mg, 63%) を得た。
1H NMR :δ7.85 (d, 1H, J = 13.5 Hz), 7.42 (d, 1H, J = 13.5 Hz), 7.26〜7.44 (m, 15H), 6.79 (s, 2H, aromatic H), 5.14 (s, 2H, -OCH2Ph), 5.13 (s, 4H, -OCH2Ph).
【化２１】
2008156324.tif 000022
【００２９】
Ar 雰囲気下、2 (10 mg, 21.4 μmol) にCH2Cl2 0.5 mL、3 (2.3 mL, 21.4 μmol)、DABCO (0.24 mg， 2.1 μmol) を加え封管中、90 ℃ で 15 分攪拌した。反応液を acetone に溶解させ、カラムクロマトグラフィー (n-hexane : EtOAc = 6 : 1) により精製し、黄色油状の 4 (3-nitro-2-(3,4,5-tris(benzyloxy)phenyl)-2H-chromene, 6.4 mg, 52%) を得た。
1H NMR :δ8.95 (s, 1H), 7.23〜7.39 (m, 17H), 6.79 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.70 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 6.62 (s, 2H), 6.45 (s, 1H), 5.00 (s, 4H, -OCH2Ph), 4.99 (s, 2H, -OCH2Ph).
【化２２】
2008156324.tif 000023
【００３０】
Ar 雰囲気下、4 (152 mg, 0.266 mmol) にdioxan / 50% AcOH 2.5 mL (5 : 1)、AcONH4 (42 mg, 0.532 mmol)、TiCl3 (860 μL, 1.33 mmol) を加え室温で 17 時間攪拌した。水を加えた後、EtOAc で三回抽出し、MgSO4 で乾燥後、減圧下濃縮し、黄色油状の 5 (2-(3,4,5-tris(benzyloxy)phenyl)chroman-3-one, 129.2 mg) を得た。
1H NMR :δ7.03〜7.37 (m, 19H), 6.64 (s, 2H, B ring H), 5.22 (s, 1H, 2H), 5.05 (s, 4H, -OCH2Ph), 5.02 (s, 2H, -OCH2Ph), 3.68 (d, 1H, J = 18.9 Hz), 3.59 (d, 1H, J = 18.9 Hz).
【化２３】
2008156324.tif 000024
【００３１】
Ar 雰囲気下、−78 ℃ で 5 (152 mg, 0.266 mmol) にTHF 2 mL、L-Selectride (387 μL, 0.387 mmol) を加え、−78 ℃ から室温で 24 時間攪拌した。 satd. NaHCO3 水溶液を加えた後、EtOAc で三回抽出し、有機層を MgSO4 で乾燥、減圧下濃縮した。その後、カラムクロマトグラフィー (n-hexane : EtOAc = 3 : 1) により精製し、黄色油状の 6 (2,3-cis-2-(3,4,5-tris(benzyloxy)phenyl)chroman-3-ol, 44.2 mg, 30%, 2 steps) を得た。
1H NMR :δ6.91〜7.41 (m, 19H), 6.81 (s, 2H), 5.16 (s, 4H, -OCH2Ph), 5.06 (s, 2H, -OCH2Ph), 4.97 (s, 1H,), 4.22 (s, 1H), 3.24 (dd, 1H, J = 3.6, 16.2 Hz), 2.93 (dd, 1H, 4H, J = 9.6, 17.5 Hz)
【化２４】
2008156324.tif 000025
【００３２】
Ar 雰囲気下、6 (36.3 mg, 66.7 μmol) にCH2Cl2 3 mL、7 (29.4 mg, 66.7 μmol) 、WSC (19 mg, 100 μmol)、 DMAP (0.8 mg, 6.67 μmol) を加え、室温で 19 時間攪拌した。 satd. NH4Cl 水溶液を加えた後、CH2Cl2 で三回抽出し、有機層を MgSO4 で乾燥、減圧下濃縮した。その後、カラムクロマトグラフィー (n-hexane : EtOAc = 3 : 1) により精製し、黄色油状の 8 (2,3-cis-2-(3,4,5-tris(benzyloxy)phenyl)chroman-3-yl 3,4,5-tris(benzyloxy)benzoate, 42 mg, 69%) を得た。
1H NMR :δ6.98〜7.36 (m, 36H), 6.74 (s, 2H), 5.65 (s, 1H), 5.12 (s, 1H), 4.68〜4.98 (m, 12H, -OCH2Ph ), 3.39 (dd, 1H, 4H, J = 4.3, 17.1 Hz), 3.06 (dd, 1H, 4H, J = 2.4, 17.1 Hz).
【化２５】
2008156324.tif 000026
【００３３】
H2 雰囲気下、8 ( 58.4 mg, 60.4 μmol ) に1,4-dioxane / MeOH 4 mL (1 : 1)、10 % Pd(OH)2/C (86 mg) を加え、室温で 17 時間攪拌した。反応液を濾過した後、減圧下濃縮した。その後、カラムクロマトグラフィー (CH2Cl2 : EtOAc = 3 : 7) により精製し、無色結晶の 9 (2,3-cis-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl 3,4,5-trihydroxybenzoate, 14.6 mg, 57% ) を得た。
1H NMR :δ7.75 (m, 6H, OH), 6.71~7.04 (m, 4H), 6.85 (s, 2H), 6.50 (s, 2H), 5.42 (s, 1H), 5.04 (s, 1H), 3.29 (dd, 1H, J = 4.3, 17.5 Hz), 2.85 (m, 1H).
【化２６】
2008156324.tif 000027
実施例２  カテキン誘導体の抗インフルエンザウィルス活性試験
【００３４】
Serum free medium (SFM) (hybridoma-SFM complete DPM, Invitrogen Corp. NY, USA) に溶解した化合物（1mg/ml）を 連続 2 倍希釈した。各希釈液 75 μL にインフルエンザウイルスの(A/Memphis/1/71 (H1N1)) 懸濁液 (100 FFU) 75 μL を混合し、4 ℃ で 1 時間反応した。
96 ウエル microplates (Corning Costar Corporation, Cambridge, MA) に単層培養したMadine-Darby canine kidney (MDCK) 細胞に 化合物とインフルエンザウイルスの混合液 100  μL を室温で加え、34 ℃ で 1 時間反応後、上清をとり除き、PBSで三回洗浄した。次いで、100 μL の SFM を加え、34 ℃ で 16 時間培養した。培養細胞をPBSで三回洗浄後、室温下 5 min ほど MeOH を加えて固定した。PBSで三回洗浄後、ウイルス感染細胞を Anti-NP モノクローナル抗体 と horseradish peroxidaseconjugated goat anti-mouse immunoglobulin G plus M (IgG+M) 抗体を用いる 酵素抗体法により検出した。ウイルス感染細胞は、１ウエル中で青色に染色された細胞数を三重測定した平均値として算出した。ウイルス感染の 50% 阻害濃度は、サンプル濃度に対して、阻害パーセントをプロットしたグラフから求めた。
【００３５】
上述の活性試験より求めた 5,7-ジデオキシエピガロカテキンガレートの抗インフルエンザウィルス活性は IC50 にして 11.92±4.50 (μL) であり、天然の (−)-エピガロカテキンガレート（化２７）（IC50: 41.25±15.45 (μL)）より強い活性（表１）を示した。
【化２７】
2008156324.tif 000028
【表１】
2008156324.tif 000029
aValues are means of three experiments, standard deviation is given in parentheses. 
表１. 5,7-ジデオキシエピガロカテキンガレートのインフルエンザウイルス感染阻害活性
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明のカテキン誘導体は、前記のとおり、抗インフルエンザウィルス剤に利用することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月5日(2007.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
Ar 雰囲気下、-78 ℃で 5 (152 mg, 0.266 mmol) にTHF 2 mL、L-Selectride (387 mL, 0.387 mmol) を加え、-78 ℃から室温で 24 時間攪拌した。 satd. NaHCO3 水溶液を加えた後、EtOAc で三回抽出し、有機層を MgSO4 で乾燥、減圧下濃縮した。その後、カラムクロマトグラフィー (n-hexane : EtOAc = 3 : 1) により精製し、黄色油状の 6 (2,3-cis-2-(3,4,5-tris(benzyloxy)phenyl)chroman-3-ol、44.2 mg、30%、2 steps) を得た。
1H NMR (CDCl3) : d 6.9~7.5 (m, 19H)、6.82 (s, 2H)、5.14 (s, 4H, -OCH2Ph)、5.06 (s, 2H, -OCH2Ph)、4.97 (s, 1H,)、4.22 (s, 1H)、3.23 (dd, 1H, J = 4.3, 16.4 Hz)、2.95 (dd, 1H, J = 1.8, 16.4 Hz)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
H2 雰囲気下、8 ( 58.4 mg, 60.4 mmol ) に1,4-dioxane / MeOH 4 mL (1 : 1)、10 % Pd(OH)2/C (86 mg) を加え、室温で 17 時間攪拌した。反応液を濾過した後、減圧下濃縮した。その後、カラムクロマトグラフィー (CH2Cl2 : EtOAc = 3 : 7) により精製し、無色結晶の 9 (2,3-cis-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl 3,4,5-trihydroxybenzoate、14.6 mg、57% ) を得た。
1H NMR (acetone-d6) : d 7.2~6.8 (m, 4H)、6.98 (s, 2H)、6.63 (s, 2H)、5.56 (s, 1H)、5.16 (s, 1H)、3.41 (dd, 1H, J = 4.0, 17.8 Hz)、2.97 (d, 1H, J = 17.8 Hz).
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
Serum free medium (SFM) (hybridoma-SFM complete DPM, Invitrogen Corp. NY, USA) に溶解した化合物（1mg/ml）を 連続 2 倍希釈した。各希釈液 75 mL にインフルエンザウイルスの(A/Memphis/1/71(H3N2))懸濁液 (100 FFU) 75 mL を混合し、4 ーC で 1 時間反応した。
96 ウエル microplates (Corning Costar Corporation, Cambridge, MA) に単層培養したMadine-Darby canine kidney (MDCK) 細胞に 化合物とインフルエンザウイルスの混合液 100  mL を室温で加え、34℃で 1 時間反応後、上清をとり除き、PBSで三回洗浄した。次いで、100  mL の SFM を加え、34℃で 16 時間培養した。培養細胞をPBSで三回洗浄後、室温下 5 min ほど MeOH を加えて固定した。PBSで三回洗浄後、ウイルス感染細胞を Anti-NP モノクローナル抗体 と horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin G plus M (IgG+M) 抗体を用いる 酵素抗体法により検出した。ウイルス感染細胞は、１ウエル中で青色に染色された細胞数を三重測定した平均値として算出した。ウイルス感染の 50% 阻害濃度は、サンプル濃度に対して、阻害パーセントをプロットしたグラフから求めた。