(57)【要約】【課題】ＰＣＲ増幅産物を二本鎖のまま特異的に検出しうるキットおよび検出方法を提供すること。【解決手段】検体中の標的核酸を検出するためのキットは、前記標的核酸がレジオネラ属菌遺伝子であり、前記遺伝子中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がＰＣＲ反応により増幅されるよう設計されたプライマー対を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の標的核酸を検出するためのキットであって、
前記標的核酸がレジオネラ属菌遺伝子であり、
前記遺伝子中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がＰＣＲ反応により増幅されるよう設計されたプライマー対を含むキット。
【請求項２】
前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列に結合しうるジンクフィンガー蛋白質をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記ジンクフィンガー蛋白質は、検出可能な標識により標識されている、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記ジンクフィンガー蛋白質は、タグポリペプチドとの融合蛋白質の形態である、請求項２記載のキット。
【請求項５】
前記タグポリペプチドはＧＳＴである、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記ジンクフィンガー蛋白質がＺｉｆ２６８であり、
前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列が５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３’である、請求項２ないし５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
前記ジンクフィンガー蛋白質がＳＰ１であり、
前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列が５’−ＧＧＧＧＣＧＧＧＧ−３’である、請求項２ないし５のいずれかに記載のキット。
【請求項８】
前記ジンクフィンガー蛋白質がＳＰ２であり、
前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列が５’−ＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴ−３’である、請求項２ないし５のいずれかに記載のキット。
【請求項９】
前記標的核酸が、レジオネラ・ニューモフィリアの２−デオキシ−Ｄ−グルコナート−３−デヒドロゲナーゼ遺伝子、レジオネラ・ニューモフィリアのｆｌｈＡ遺伝子及びレジオネラ・ニューモフィリアの膜貫通蛋白質の遺伝子から選ばれる一である、請求項１ないし８のいずれかに記載のキット。
【請求項１０】
前記プライマー対は、検出可能な標識により標識されている、請求項１ないし９のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
検体中の標的核酸を検出する方法であって、
前記標的核酸がレジオネラ属菌遺伝子であり、
（ａ）前記遺伝子中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がＰＣＲ反応により増幅されるよう設計されているプライマー対を用いて、検体中の核酸をＰＣＲ反応により増幅させること、および
（ｂ）ジンクフィンガー蛋白質を用いて、前記増幅させることにより得られたＰＣＲ増幅産物を検出すること、
を含む方法。
【請求項１２】
前記ジンクフィンガー蛋白質は、検出可能な標識により標識されている、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ジンクフィンガー蛋白質は、タグポリペプチドとの融合蛋白質の形態である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タグポリペプチドはＧＳＴである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ジンクフィンガー蛋白質がＺｉｆ２６８であり、
前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列が５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３’である、請求項１１ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ジンクフィンガー蛋白質がＳＰ１であり、
前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列が５’−ＧＧＧＧＣＧＧＧＧ−３’である、請求項１１ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ジンクフィンガー蛋白質がＳＰ２であり、
前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列が５’−ＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴ−３’である、請求項１１ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記標的核酸が、レジオネラ・ニューモフィリアの２−デオキシ−Ｄ−グルコナート−３−デヒドロゲナーゼ遺伝子、レジオネラ・ニューモフィリアのｆｌｈＡ遺伝子及びレジオネラ・ニューモフィリアの膜貫通蛋白質の遺伝子から選ばれる一である、請求項１１ないし１７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジンクフィンガー蛋白質を用いるレジオネラ属菌（Legionella species）遺伝子を検出するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、浴槽、プール、人工池、人工河川等を備えたレジャー施設、医療施設、介護施設等でレジオネラ症の発生が多く報告されている。レジオネラ症の報告例としては、例えばビル内での集団感染、病院内においての院内感染、温泉施設においての集団感染が挙げられる。
【０００３】
レジオネラ症は、レジオネラ・ニューモフィリア（Legionella pneumophilia）等に代
表されるレジオネラ属菌によって引き起こされる感染症であり、レジオネラを含むエアロゾルまたは水の吸引による経気道感染のみならず、特に新生児の院内感染においては、経口感染、外傷からの感染の可能性も考えられている。レジオネラ属菌は、特に温水で繁殖し易いため、温泉等で病気の療養をかねた湯治が免疫力の弱まった老人の肺炎を引き起こすという事例も報告されている。
【０００４】
ところで、レジオネラ属菌の検査方法としては、例えば、培養法や核酸増幅法であるＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法が知られている。培養法は、レジオネラを培養により増殖させて検出する方法である。しかしながら、レジオネラ属菌は、増殖させるのがきわめて難しい菌であり、培養法によりレジオネラ属菌の検出を行う場合、レジオネラ属菌が検出可能な程度に増殖するまでに時間がかかり、検出結果が得られるまでに時間がかかるという問題がある。一方、ＰＣＲ法等は、レジオネラの遺伝子を増幅して検出する方法である。しかしながら、ＰＣＲ法等では、二本鎖の遺伝子を一本鎖にする必要があるため、時間および手間がかかる。その原因としては、ＰＣＲ法等では、ＰＣＲ増幅産物をハイブリダイゼーションにより検出するために、二本鎖であるＰＣＲ増幅産物を変性させて一本鎖とした後に、プローブＤＮＡとハイブリダイズさせなければならないことが挙げられる。また、上記ＰＣＲ法では、（ｉ）相補的なＰＣＲ増幅産物同士が互いに塩基対を形成する確率が高いため、プローブＤＮＡのハイブリダイゼーション効率が低いこと、（ｉｉ）一旦解離した一本鎖が再び元の二本鎖に戻ってしまうため、ハイブリダイゼーション効率がきわめて悪いという問題がある。したがって、ＰＣＲ増幅産物を二本鎖のまま検出する方法が求められている。
【０００５】
二本鎖ＤＮＡを変性させずに分析する方法としては、支持体上に固定された二本鎖ＤＮＡ認識物質を用いて、検体中の二本鎖ＤＮＡを分析する方法が開示されている（例えば、特開２００２‐１２５７００号公報）。この方法は、二本鎖ＤＮＡ認識物質と検体中の二本鎖ＤＮＡとを結合させ、結合した二本鎖をインターカレーター、抗ＤＮＡ抗体、ＤＮＡ転写因子等を用いて検出することを特徴とする。しかしながら、この方法によっては、存在する二本鎖ＤＮＡの量を測定することは可能であっても、標的とする核酸を特異的に検出することは困難である。すなわち、インターカレーターまたは抗ＤＮＡ抗体を用いて検出する場合には、塩基配列の選択性が殆ど得られず、ＤＮＡ転写因子を用いて検出する場合には、認識配列の長さが短いため特異性の高い検出を行うことができない。
【０００６】
また、ＰＣＲ増幅産物を二本鎖のまま検出する方法として、例えば、特開２００３−２８５７０６号公報には、ジンクフィンガー蛋白質を用いて、ＰＣＲ増幅産物中のジンクフィンガー蛋白質配列を検出することによって、標的とする二本鎖ＤＮＡを特異的に検出できることが開示されている。しかしながら、この検出方法においては、ジンクフィンガー蛋白質とＰＣＲ増幅物との結合能を調べる際に、融合蛋白質を発現するファージを使用しているため、標的分子によっては分子認識能が十分ではなく、その結果、高感度なレジオネラ属菌の検出は困難となっている。このように、ＰＣＲ増幅産物を二本鎖のまま検出する方法においては、より迅速でかつ簡便なレジオネラの検出が求められている。一方、上記遺伝子検査法としてのＰＣＲ法等は、検査に使用する装置が高価であり、その操作も煩雑であるため現在のところ普及には至っていないという問題点がある。
【特許文献１】特開２００２−１２５７００号公報
【特許文献２】特開２００３−２８５７０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明によれば、検体中のレジオネラ属菌遺伝子等に代表されるレジオネラ属菌遺伝子のＰＣＲ増幅産物を二本鎖のまま特異的に検出しうる測定系（キット）および方法が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様に係る検体中の標的核酸を検出するためのキットは、
前記標的核酸がレジオネラ属菌遺伝子であり、
前記遺伝子中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がＰＣＲ反応により増幅されるよう設計されたプライマー対を含む。
【０００９】
上記キットにおいて、前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列に結合しうるジンクフィンガー蛋白質をさらに含むことができる。この場合、前記ジンクフィンガー蛋白質は、検出可能な標識により標識されている。この場合、前記ジンクフィンガー蛋白質は、タグポリペプチドとの融合蛋白質の形態であることができる。また、この場合、前記タグポリペプチドはＧＳＴであることができる。さらにこの場合、前記ジンクフィンガー蛋白質がＺｉｆ２６８であり、前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列が５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３’であることができる。あるいは、この場合、前記ジンクフィンガー蛋白質がＳＰ１であり、前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列が５’−ＧＧＧＧＣＧＧＧＧ−３’であることができる。あるいは、この場合、前記ジンクフィンガータンパク質がＳＰ２であり、前記ジンクフィンガータンパク質認識配列が５’−ＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴ−３’であることができる。
【００１０】
上記キットにおいて、前記標的核酸が、レジオネラ・ニューモフィリアの２−デオキシ−Ｄ−グルコナート−３−デヒドロゲナーゼ遺伝子、レジオネラ・ニューモフィリアのｆｌｈＡ遺伝子及びレジオネラ・ニューモフィリアの膜貫通蛋白質の遺伝子から選ばれる一であることができる。
【００１１】
上記キットにおいて、前記プライマー対は、検出可能な標識により標識されていることができる。
【００１２】
本発明の一態様に係る検体中の標的核酸を検出する方法は、
前記標的核酸がレジオネラ属菌遺伝子であり、
（ａ）前記遺伝子中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がＰＣＲ反応により増幅されるよう設計されているプライマー対を用いて、検体中の核酸をＰＣＲ反応により増幅させること、および
（ｂ）ジンクフィンガー蛋白質を用いて、前記増幅させることにより得られたＰＣＲ増幅産物を検出すること、
を含む。
【００１３】
上記方法において、前記ジンクフィンガー蛋白質は、検出可能な標識により標識されていることができる。この場合、前記ジンクフィンガー蛋白質は、タグポリペプチドとの融合蛋白質の形態であることができる。また、この場合、前記タグポリペプチドはＧＳＴであることができる。
【００１４】
上記方法において、前記ジンクフィンガー蛋白質がＺｉｆ２６８であり、前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列が５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３’であることができる。
【００１５】
上記方法において、前記ジンクフィンガー蛋白質がＳＰ１であり、前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列が５’−ＧＧＧＧＣＧＧＧＧ−３’であることができる。
【００１６】
上記方法において、前記ジンクフィンガータンパク質がＳＰ２であり、前記ジンクフィンガータンパク質認識配列が５’−ＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴ−３’であることができる。
【００１７】
上記方法において、前記標的核酸が、レジオネラ・ニューモフィリアの２‐デオキシ‐Ｄ‐グルコナート−３−デヒドロゲナーゼ遺伝子、レジオネラ・ニューモフィリアのｆｌｈＡ遺伝子及びレジオネラ・ニューモフィリアの膜貫通蛋白質の遺伝子から選ばれる一であることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のキットおよび検出方法によれば、ジンクフィンガー蛋白質は二本鎖に結合するため、ＰＣＲ増幅産物を変性させて一本鎖に解離させる必要がない。このため、標的核酸であるレジオネラ属菌遺伝子の検出をより迅速かつ簡便に行うことができる。
【００１９】
また、本発明のキットおよび検出方法によれば、ジンクフィンガー蛋白質の形態をタグペプチドとの融合蛋白質とすることにより、簡易かつ高感度にレジオネラ属菌遺伝子を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の一実施形態に係る標的核酸を検出するためのキットおよび方法について詳細に説明する。
【００２１】
１．検体中の標的核酸を検出するための方法
本発明の一実施形態に係る検体中の標的核酸（レジオネラ属菌遺伝子）を検出するための方法（以下、単に「検出方法」ともいう）は、（ａ）標的核酸中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がＰＣＲ反応により増幅されるよう設計されているプライマー対を用いて、検体中の核酸をＰＣＲ反応により増幅させること、および（ｂ）ジンクフィンガー蛋白質を用いて、増幅させることにより得られたＰＣＲ増幅産物を検出することを含む。
【００２２】
１．１．ジンクフィンガー蛋白質
ジンクフィンガー蛋白質は、特定のＤＮＡ配列（ジンクフィンガー蛋白質認識配列）に特異的に結合しうるジンクフィンガーモチーフを有する蛋白質である。これまでに数百種類以上のジンクフィンガー蛋白質が同定されている。
【００２３】
ジンクフィンガーモチーフは、典型的には、４個の残基（２個のシステイン残基および２個のヒスチジン残基）を含む長さ約３０アミノ酸のモチーフであり、逆平衡二本鎖β構造およびαヘリックスから主に構成され、これらの４個の残基が亜鉛イオンに配位している立体構造を有している。
【００２４】
ジンクフィンガーモチーフは、特定の配列を有する二本鎖ＤＮＡと特異的に結合することができる。例えば、マウス由来のジンクフィンガー蛋白質であるＺｉｆ２６８は３連のジンクフィンガーモチーフを有し、５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３’の９個の連続するＤＮＡ配列を認識して、該ＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡに特異的に結合することができる。また、例えば、ヒト由来のジンクフィンガー蛋白質であるＳＰ１（転写制御因子）もまた３連のジンクフィンガーモチーフを有し、５’−ＧＧＧＧＣＧＧＧＧ−３’の９個の連続するＤＮＡ配列を認識して、該ＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡに特異的に結合することができる。
【００２５】
ジンクフィンガー蛋白質と標的とする二本鎖ＤＮＡとの結合に際しては、標的とする二本鎖ＤＮＡの主溝にαヘリックス部位が挿入されるため、ジンクフィンガー蛋白質が認識するＤＮＡの配列は、ジンクフィンガー蛋白質のαヘリックスのアミノ酸配列により決定される。これまでに、それぞれ独特のＤＮＡ配列を認識する数千種類のジンクフィンガーモチーフが同定されている。αヘリックスのアミノ酸配列と認識されるＤＮＡ配列との関係をより詳細に解明することにより、目的とする特定のＤＮＡ配列を認識するジンクフィンガー配列を設計することも可能となると考えられる。また、ファージディスプレイにより作製されたジンクフィンガーペプチドのライブラリを用いて、目的とする特定のＤＮＡ配列を認識しうるジンクフィンガー配列を選択する方法が知られている。
【００２６】
本実施形態に係る検出方法によれば、ジンクフィンガー蛋白質を用いることにより、標的とする二本鎖ＤＮＡを特異的に検出することができる。
【００２７】
ジンクフィンガー蛋白質としては、例えば、認識部位が明らかにされている既知のいずれのジンクフィンガー蛋白質を用いてもよく、あるいは、所望の認識部位を有するように遺伝子工学的に改変されているジンクフィンガー蛋白質を用いてもよい。当該技術分野においては、ジンクフィンガー蛋白質の認識配列を変更する種々の方法が試みられている。
【００２８】
また、ジンクフィンガー蛋白質は検出可能な標識により標識されていてもよい。これにより、ＰＣＲ増幅産物に結合したジンクフィンガー蛋白質を容易に検出することができる。このような標識としては、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチン、アビジン等のアフィニティー標識、酵素標識等が挙げられる。なお、ジンクフィンガー蛋白質は、タグポリペプチドとの融合蛋白質の形態であってもよい。この場合、タグポリペプチドとしては、例えばＧＳＴ（グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ）やＨｉｓタグ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）が挙げられる。タグポリペプチドを上述の標識で標識化して、該標識の量または存在を検出することにより、ＰＣＲ増幅産物に結合したジンクフィンガー蛋白質を検出することができる。
【００２９】
あるいは、ジンクフィンガー蛋白質は、適当な宿主中で組換え蛋白質として発現させてもよい。あるいは、ジンクフィンガー蛋白質は、組換えファージ中で発現させてファージ上に提示させることができる。このことにより、組換えジンクフィンガー蛋白質を精製することなく利用することができ、ファージに対する抗体を用いてジンクフィンガー蛋白質を容易に検出することができる。このようなファージディスプレイの手法は当該技術分野においてよく知られており、また、本明細書の実施例においても詳細に記載されている。
【００３０】
１．２．核酸の調製
本実施形態に係る検出方法においては、まず、試験対象の検体から核酸（ＤＮＡ）を調製する。検体としては、菌体の培養物、水（例えば、浴槽・プール・人工池・人工河川等で使用される水、水道水、汚水、生活排水、工業排水、農業排水、井戸水、湖水、海水、河川水、沼水、池水、湧水、温泉水）、農産物、食品、医薬品、化粧品、ならびに検査すべき動物およびヒトからの組織、体液、血液、唾液、汗、尿、糞便、喀痰、空調機室外冷却塔の冷却水、貯湯タンク水、給湯系水、加湿器の水、生物膜（バイオフィルム）（ここで、生物膜とは、壁面に付着した微生物が増殖するとともに、粘液性物質を体外に産出し、これらが混在、結合して形成されたものをいう。）、原生動物（アメーバなど）、循環浴槽のろ過装置（ろ過装置がアメーバの定着、増殖場所である場合、そのアメーバ細胞中でレジオネラ菌が増殖する。）などを用いることができる。このようなサンプルから核酸（ＤＮＡ）を調製する手法は当該技術分野においてよく知られている。あるいは、試験すべきサンプルからＲＮＡを調製し、定法によりｃＤＮＡを合成してもよい。
【００３１】
１．３．（ａ）ＰＣＲ反応による核酸の増幅
本実施形態に係る検出方法は、（ａ）標的核酸であるレジオネラ属菌遺伝子中のジンクフィンガー蛋白質により認識される配列を増幅しうるよう設計されたプライマー対を用いて、検体中の核酸をＰＣＲ反応により増幅させることを含む。すなわち、検体中の核酸（ＤＮＡ）をテンプレートとして、プライマー対および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ増幅を行う。ここで用いられるＰＣＲ増幅の条件および方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００３２】
ジンクフィンガー蛋白質により認識される配列は、その長さが比較的短いため配列の出現頻度が高く、目的とする標的核酸配列中のみならず、検体中に存在しうる他の核酸中にも多数見いだされることが予測される。
【００３３】
例えば、Ｚｉｆ２６８およびＳＰ１、ＳＰ２により認識される配列はいずれも、９−１０個の連続するヌクレオチドからなり、このような配列は約２６万塩基に１個の確率で存在する。したがって、検出の特異性を高めるためには、ジンクフィンガー蛋白質認識配列の周囲の配列についての広範囲な検索を行って、適切なＰＣＲプライマーを設計する必要がある。
【００３４】
ＰＣＲプライマーは、ジンクフィンガー蛋白質により認識される配列を含む配列領域が特異的に増幅されるように設計される。このためには、まず検出すべき生物（例えば、微生物、細菌、ウイルスなど）のゲノム配列中のジンクフィンガー認識配列を検索する。
【００３５】
例えば、ジンクフィンガー蛋白質としてＺｉｆ２６８を用いる場合、その認識配列であるＧＣＧＴＧＧＧＣＧを含む遺伝子を同定する。次に、この認識配列の５’側および３’側の配列に基づいて、認識配列を増幅しうるプライマー対を選択する。同様に、例えば、ジンクフィンガー蛋白質としてＳＰ１を用いる場合、その認識配列であるＧＧＧＧＣＧＧＧＧを含む遺伝子を同定する。次に、この認識配列の５’側および３’側の配列に基づいて、認識配列を増幅しうるプライマー対を選択する。同様に、例えば、ジンクフィンガー蛋白質としてＳＰ２を用いる場合、その認識配列であるＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴを含む遺伝子を同定する。次に、この認識配列の５’側および３’側の配列に基づいて、認識配列を増幅しうるプライマー対を選択する。
【００３６】
プライマーの長さは、好ましくは１２−３０ヌクレオチド、より好ましくは１５−２５ヌクレオチドである。さらに、プライマーの選択においては、各プライマーが、分子内に二次構造を形成せず、融解温度がＰＣＲ反応に適した温度（例えば約５８−６３℃の範囲内）である等の、当該技術分野において知られるプライマー選定の基準も考慮すべきである。各プライマーとジンクフィンガー認識配列の間の距離は任意に選択することができ、ジンクフィンガー認識配列の５’側と３’側とでプライマーとの距離が同じであっても異なっていてもよい。
【００３７】
好ましくは、プライマーとジンクフィンガー認識配列との距離は０から５００ｂｐであり、より好ましくは０から３００ｂｐである。距離が０であるとは、後述の実施例において例示されるように、ジンクフィンガー認識配列に隣接してプライマーが配置されることを意味する。この距離が長いほど検出の特異性は高くなるが、検体中の核酸が分解・切断されていると検出されないため、糞便や生検組織切片を検体として用いる場合には、１５０ｂｐより短いことが好ましい。次に、ＰＣＲにより増幅される配列、すなわち、両方のプライマーとジンクフィンガー認識配列とを含む配列について、検体中に存在する可能性のある他の核酸中にこれと相同な配列が存在しないことを確認する。これにより、標的核酸のみが特異的に検出されるようにすることができる。
【００３８】
このようにして設計されたプライマー対の各オリゴヌクレオチドは、例えば汎用のＤＮＡ合成装置（例えば、Applied Biosystems社製 Model 394）を用いて化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野においてよく知られる他の方法のいずれかを用いて合成してもよい。
【００３９】
１．４．（ｂ）ＰＣＲ増幅産物の検出
本実施形態に係る検出方法は、上記（ａ）ＰＣＲ反応による核酸の増幅の後、（ｂ）ジンクフィンガー蛋白質を用いて、増幅させることにより得られたＰＣＲ増幅産物を検出することを含む。具体的には、上記（ａ）で得られたＰＣＲ増幅産物とジンクフィンガー蛋白質とを接触させ、ジンクフィンガー蛋白質がＰＣＲ増幅産物に結合するか否かを検出することができる。
【００４０】
例えば、標識によって適切に標識されたジンクフィンガー蛋白質を用いる場合、この標識の量を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物に結合したジンクフィンガー蛋白質の存在または量を測定することができる。
【００４１】
例えば、ジンクフィンガー蛋白質がタグポリペプチド（例えばＧＳＴ）との融合蛋白質の形態である場合、タグポリペプチドに特異的な抗体を用いるＥＬＩＳＡによって、ＰＣＲ増幅産物に結合したジンクフィンガー蛋白質を検出することができる。
【００４２】
より具体的には、例えば、タグポリペプチドがＧＳＴである場合、抗ＧＳＴ抗体を融合蛋白質のＧＳＴ（抗原）部分に結合させ、未結合抗体を洗浄除去した後に、酵素反応や蛍光反応等によりＧＳＴ（タグポリペプチド）の存在または量を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物に結合したジンクフィンガー蛋白質の存在または量を測定することができる。
【００４３】
または、ＰＣＲ増幅産物を標識し、該標識されたＰＣＲ増幅産物を検出することにより、ＰＣＲ増幅産物とジンクフィンガー蛋白質との結合を検出してもよい。このような標識は、ＰＣＲ反応に用いるプライマー対をあらかじめ標識しておくか、あるいは、ＰＣＲ増幅反応中に標識ヌクレオチドを取り込ませることにより行うことができる。
【００４４】
標識の方法は当該技術分野においてよく知られており、標識としては、放射性標識、蛍光標識、ビオチン、アビジン等のアフィニティー標識等を用いることができる。または、インターカレーター法や蛍光偏光法を用いてジンクフィンガー蛋白質に結合した二本鎖ＤＮＡを検出してもよい。
【００４５】
あるいは、ファージ上に提示されたジンクフィンガー蛋白質を用いる場合、このファージに特異的な抗体を用いるＥＬＩＳＡを用いて検出することができる。すなわち、適切に標識された抗ファージ抗体を結合させ、未結合抗体を洗浄除去した後に、酵素反応、蛍光反応などにより標識の存在または量を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物に結合したジンクフィンガー蛋白質の存在または量を測定することができる。
【００４６】
１．５．用途
本実施形態に係る検出方法の１つの好ましい用途は、検体中の標的核酸（レジオネラ属菌遺伝子）を近縁の細菌と区別して検出することである。
【００４７】
本実施形態に係る検出方法によって検出可能なレジオネラ属菌としては、特に限定されないが、例えば、レジオネラ・ニューモフィリア（L. pneumophilia）、レジオネラ・ボゼマニイ（L. bozemanii）、レジオネラ・ミクダデイ（L. micdadei）、レジオネラ・ロング
ビーチ（L. longbeachae）、レジオネラ・ワドスワヒ（L. wadsworthii）、レジオネラ・ハッケリー（L. hackeliae）、レジオネラ・ビルミングハメンシス（L. birminghamensis）、レジオネラ・シンシナティエンシス（L. cincinnatiensis）、レジオネラ・ツクソネンシス（L. tucsonensis）、レジオネラ・ランシンジェネンシス（L. lansingenensis）
、レジオネラ・デュモフィ（L. dumoffii）、レジオネラ・ゴルマニィ（L. gormanii）、レジオネラ・ヨルダニス（L. jordanis）、レジオネラ・オークリジェンシス（L. oakridgensis）、レジオネラ・フェレイ（L. feeleii）、レジオネラ・サインテレンシス（L. sainthelensis）、レジオネラ・パリシエンシス（L. parisiensis）、レジオネラ・マッシェンケルニィー（L. maceachernii）、レジオネラ・アニサ（L. anisa）、レジオネラ・サンティクルシス（L. santicrucis）が挙げられる。
【００４８】
レジオネラ菌の検出およびレジオネラ症の診断のためには、レジオネラ属菌を他の細菌と区別して検出することが必要である。
【００４９】
レジオネラ属菌遺伝子の検出方法としては、一般に、分離培養法による培養とその形態学的観察、血清学的検査、特異的プローブを用いたハイブリダイゼーション、およびＰＣＲ増幅とハイブリダイゼーションとの組み合わせが用いられている。しかしながら、上述したように、レジオネラ属菌は、培養により増やすことが難しい菌であるため、培養による方法では日数がかかるという問題がある。
【００５０】
後述の実施例に詳細に説明されるように、本実施形態に係る検出方法によれば、レジオネラ属菌遺伝子（例えばレジオネラ・ニューモフィリア遺伝子）を他の細菌と区別して特異的に検出することができる。
【００５１】
例えば、レジオネラ・ニューモフィリア遺伝子を特異的に検出するためのＰＣＲ増幅の標的配列としては、ジンクフィンガー蛋白質としてＺｉｆ２６８を使用する場合、レジオネラ・ニューモフィリアの２−デオキシ−Ｄ−グルコナート−３−デヒドロゲナーゼ遺伝子（例えば、Legionella pneumophilia str.Philadelphia 1 2−deoxy−D−gluconate−3−dehydrogenase gene、Legionella pneumophilia str.Lens 2−deoxy−D−gluconate−3−dehydrogenase gene、Legionella pneumophilia str.Paris 2−deoxy−D−gluconate−3−dehydrogenase gene）中のジンクフィンガー蛋白質認識配列を含むことが好ましく、
ジンクフィンガー蛋白質としてＳＰ１を使用する場合、レジオネラ・ニューモフィリアのｆｌｈＡ遺伝子（例えば、Legionella pneumophilia str.Philadelphia flhA gene、Legionella pneumophilia str.Lens flhA gene、Legionella pneumophilia str.Paris flhA gene）中のジンクフィンガー蛋白質認識配列を含むことが好ましい。また、ジンクフィンガー蛋白質としてＳＰ２を使用する場合、レジオネラ・ニューモフィリア（Legionella pneumophila）の膜貫通蛋白質（transmembrane protein）の遺伝子(locus_tag = lpg1883)（例えば、Legionella pneumophila str. Philadelphia transmembrane proteinの gene、Legionella pneumophilia str. Lens transmembrane proteinの gene、Legionella pneumophilia str.Paris transmembrane proteinの gene）中のジンクフィンガー蛋白質認識配列を含むことが好ましい。
【００５２】
したがって、レジオネラ・ニューモフィリアの２‐デオキシ−Ｄ−グルコナート−３−デヒドロゲナーゼ遺伝子、レジオネラ・ニューモフィリアのｆｌｈＡ遺伝子及びレジオネラ・ニューモフィリア（Legionella pneumophilia）の膜貫通蛋白質（transmembrane protein）の遺伝子(locus_tag = lpg1883)はそれぞれ、ジンクフィンガー蛋白質（Ｚｉｆ２６８、ＳＰ１、ＳＰ２）による検出の標的遺伝子であるのが好ましい。
【００５３】
２−デオキシ−Ｄ−グルコナート−３−デヒドロゲナーゼ遺伝子は、２−デオキシ−Ｄ−グルコナート−３−デヒドロゲナーゼの生成に関与する遺伝子であり、２−デオキシ−Ｄ−グルコナート−３−デヒドロゲナーゼは炭水化物の代謝に関与する。
【００５４】
ｆｌｈＡ遺伝子は、鞭毛の生合成蛋白質であるＦｌｈＡ（flagellar biosynthetic protein）の生成に関与する遺伝子であり、ＦｌｈＡは走化性、運動性、細胞分裂に関与する。
【００５５】
膜貫通蛋白質（transmembrane protein）の遺伝子(locus_tag = lpg1883)は、膜貫通型の蛋白質の生成に関与する遺伝子であるが、蛋白質の詳細は不明である。
【００５６】
１．６．作用効果
本実施形態に係る検出方法によれば、ＰＣＲ増幅産物の二本鎖の変性工程を必要としないため、検体中の標的核酸（レジオネラ属菌遺伝子、例えばレジオネラ・ニューモフィリア遺伝子）を高感度でかつ特異的に簡便に検出することができる。また、本実施形態に係る検体中の標的核酸の検出方法は、例えばセンサや電極を使用することにより、検体中の標的核酸を検出するための装置により実施することができる。
【００５７】
２．キット
本発明の一実施形態に係る検体中の標的核酸（レジオネラ属菌遺伝子）を検出するためのキット（以下、単に「キット」ともいう）は、上述のプライマー対を含む。また、本実施形態に係るキットは、上述のジンクフィンガー蛋白質をさらに含むことができる。この場合、ジンクフィンガー蛋白質は、タグポリペプチドとの融合蛋白質の形態であることができ、この場合、タグポリペプチドはＧＳＴであるのが好ましい。
【００５８】
また、本実施形態に係るキットは、標的核酸が、レジオネラ・ニューモフィリアの２−デオキシ−Ｄ−グルコナート−３−デヒドロゲナーゼ遺伝子、レジオネラ・ニューモフィリアのｆｌｈＡ遺伝子及びレジオネラ・ニューモフィリア（Legionella pneumophilia）の膜貫通蛋白質（transmembrane protein）の遺伝子(locus_tag = lpg1883)から選ばれる一であることが好ましい。
【００５９】
なお、ジンクフィンガー蛋白質は適当な担体上に固定化されて用いられてもよい。固定化されたジンクフィンガー蛋白質に上述のＰＣＲ増幅産物を結合させ、結合した二本鎖ＤＮＡの量を測定することにより、標的核酸を検出することができる。このような態様においては、ＰＣＲ増幅産物が検出可能なように標識されていることが好ましい。
【００６０】
３．実施例
以下に、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００６１】
３．１．実施例１
［レジオネラ・ニューモフィリアゲノム中のＺｉｆ２６８認識配列の選択］
まず、NCBI nucleotide BLAST Search for short nearly exact matchesを用いて、レ
ジオネラ・ニューモフィリアのゲノム中からＺｉｆ２６８認識配列であるｇｃｇｔｇｇｇｃｇの９塩基の配列を検索した（図１参照）。レジオネラ・ニューモフィリアのゲノム配列は先の報告にしたがった（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＥ０１７３５４(Strain Philadelphia 1),ＣＲ６２８３３７(Strain Lens),ＣＲ６２８３３６(Strain Paris)）。次に、この９塩基配列の５’側および３’側のそれぞれ２０塩基をプライマー領域として含む連続する４９塩基配列についてＢＬＡＳＴで検索し、他の細菌が類似した配列を有するか否かを調べた（図２参照）。さらに、その遺伝子の比較対照となる他の遺伝子配列の多さ、進化速度、水平移動能の有無等を基準として、標的とすべき遺伝子を選択した。
【００６２】
その結果、Ｚｉｆ２６８の認識配列およびその５’側および３’側のプライマー領域は、レジオネラ・ニューモフィリアの糖代謝関連遺伝子（２−デオキシ−Ｄ−グルコナート−３−デヒドロゲナーゼ遺伝子）と高い相同性を示すことが明らかになった。以上の結果より、レジオネラ・ニューモフィリアの２−デオキシ−Ｄ−グルコナート−３−デヒドロゲナーゼ遺伝子を標的遺伝子として選択した。
【００６３】
図２は、３種のレジオネラ・ニューモフィリアの２−デオキシ−Ｄ−グルコナート−３−デヒドロゲナーゼ遺伝子のＺｉｆ２６８認識配列（結合部位）を含む４９ｂｐの配列アライメントを示す。図２によれば、Ｚｉｆ２６８認識配列およびその５’側および３’側の各２０ｂｐのプライマー領域を含む４９ｂｐの塩基配列は、レジオネラ・ニューモフィリア間で高い相同性を示すのに対して、確認を行った他の生物の遺伝子に対する相同性は低かった。これにより、Ｚｉｆ２６８認識配列およびその５’側および３’側の各２０ｂｐのプライマー領域を含む４９ｂｐの塩基配列を標的配列として用いることにより、レジオネラ・ニューモフィリア（特にLegionella pneumophilia str. Philadelphia 1）を特
異的に検出できると考えられる。
【００６４】
３．２．実施例２
［Ｚｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質の調製］
本実施例において、Ｚｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質の調製は下記の手順で行った。
【００６５】
マウス骨格筋ｃＤＮＡライブラリ（ＴａＫａＲａ）から、制限酵素サイト(ＳｆｉＩ、ＮｏｔＩ)を導入したＺｉｆ２６８のＤＮＡ結合部位の構造遺伝子を増幅し、それを制限
酵素消化した後、ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５に挿入し、ベクターｐＣＡＮ／Ｚｉｆ２６８を得た。
【００６６】
得られたベクターｐＣＡＮ／Ｚｉｆ２６８から、制限酵素サイト(ＢａｍＨI、ＥｃｏＲI)を導入したＺｉｆ２６８構造遺伝子（３００ｂｐ）をＰＣＲ増幅し、ＴＡクローニングすることにより、ベクターｐＧＥＭ／Ｚｉｆ２６８を得た。これを増幅し、制限酵素処理した後、Schistosoma japonicum（日本住血吸虫）由来ＧＳＴ融合発現ベクターｐＧＥＸ
−２Ｔとライゲーションすることにより、ベクターｐＧＥＸ／Ｚｉｆ２６８を得た。Ｚｉｆ２６８構造遺伝子およびｐＧＥＸ−２Ｔの塩基配列は、先の報告に従った（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００７９１３（Ｚｉｆ２６８構造遺伝子）、Ｕ１３８５０（ｐＧＥＸ−２Ｔ）。Ｚｉｆ２６８構造遺伝子とＧＳＴ構造遺伝子間のリンカー配列は、ＬＶＰＲＧＳである。
【００６７】
ベクターｐＧＥＸ／Ｚｉｆ２６８を大腸菌ＢＬ２１株に導入した後、この大腸菌ＢＬ２１株を３７℃で培養し、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧにより発現を誘導した。その後、集菌および洗浄し、フレンチプレスにより菌体を破砕した。菌体破砕物の水溶性画分を、ＧＳＴｒａｐ（商標）ＨＦカラムを用いてアフィニティー精製することにより、Ｚｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質を得た。ＧＳＴ活性測定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことにより、ｈＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質の精製度を確認した。
【００６８】
３．３．実施例３
［Ｚｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質と標的二本鎖ＤＮＡとの結合能の確認］
本実施例では、実施例２で得られたＺｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質と二本鎖ＤＮＡとの結合能をＥＬＡＳＡによって確認した。本実施例で用いたＥＬＡＳＡ用キット（標的核酸検出用キット）の構成を図３に示す。
【００６９】
また、二本鎖ＤＮＡの配列を図４および以下に示す（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．７）。なお、「Ｂｉｏ」はビオチンを示し、下線はジンクフィンガー蛋白質認識配列である。
No.1： Zif268−L.pneumophila Philadelphia 1 target（標的１）
Bio 5'−ATTGGTGTTCCGGAAGATAT CGC CCA CGC AATTGTGTTTTTGCTTAATC−3'
3'−TAACCACAAGGCCTTCTATA GCG GGT GCG TTAACACAAAAACGAATTAG−5'
No.2： Zif268−L.pneumophila Lens target（標的２）
Bio 5'−ATTGGTGTTCCGGAAGATAT TGC CCA CGC AATTGTGTTTTTGCTTAATC−3'
3'−TAACCACAAGGCCTTCTATA ACG GGT GCG TTAACACAAAAACGAATTAG−5'
No.3： Zif268−L.pneumophila random（比較例１、ランダム変異）
Bio 5'−ATTGGTGTTCCGGAAGATAT AGG CTC AGT AATTGTGTTTTTGCTTAATC−3'
3'−TAACCACAAGGCCTTCTATA TCC GAG TCA TTAACACAAAAACGAATTAG−5'
No.4： Zif268−S.typhiriumium target（比較例２）
Bio 5'−CAGAGCGTTGACTACCGAGA CGC CCA CGC CGTGCAGACCGCCGGAGACT−3'
3'−GTCTCGCAACTGATGGCTCT GCG GGT GCG GCACGTCTGGCGGCCTCTGA−5'
No.5： Zif268−S.typhiriumium random（比較例３）
Bio 5'−CAGAGCGTTGACTACCGAGA AGG CTC AGT CGTGCAGACCGCCGGAGACT−3'
3'−GTCTCGCAACTGATGGCTCT TCC GAG TCA GCACGTCTGGCGGCCTCTGA−5'
No.6： ＤＮＡ未使用（対照１）
No.7： 蛋白質（Ｚｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質）未使用（対照２）
ストレプトアビジン２０でコートされたウエル（９６穴プレート）１８に、５’末端をビオチンで標識された一本鎖ＤＮＡとその相補鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ２４（１００ｐｍｏｌ／ウエル）を添加し、室温で１時間インキュベートした後、２％スキムミルクを添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。次に、融合蛋白質（実施例２で得られたＺｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質）２６（５．７ｐｍｏｌ／ウエル）を添加して、室温で１時間インキュベートした後、抗タグポリペプチド抗体２８および基質酵素３０（抗ＧＳＴ抗体−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）複合体溶液）を添加して室温で１時間インキュベートした。次いで、発色試薬３２（ＡＢＴＳ溶液（０．４ｍＭ  ＡＢＴＳ（2,2'−Azinobis(3−ethylbenzothiazolin−6−sulfonic Acid)、５０ｍＭクエン酸、０．２％Ｈ２Ｏ２、ｐＨ４．０））をウエル１８に添加し、０、１５、３０、６０分毎にプレートリーダーで波長４０５ｎｍの光の吸光度を測定した。６０分後の吸光度を図５に示す。
【００７０】
図５によれば、二本鎖ＤＮＡとして標的１，２（Ｎｏ．1，Ｎｏ．２）を用いた場合、
ランダム変異二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．３，Ｎｏ．５）と比較して優位に吸光度が高かった。これにより、Ｚｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質が標的二本鎖ＤＮＡに結合する能力を有することが理解できる。
【００７１】
３．４．実施例４
［Ｚｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質とＰＣＲ増幅産物との結合能の確認］
本実施例では、図６に示す各４９ｂｐの二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行った。より具体的には、ビオチン修飾一本鎖ＤＮＡ（センス鎖）およびＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）修飾された一本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）（図６のＮｏ．１〜Ｎｏ．６）を混合し、熱処理により各４９ｂｐの二本鎖ＤＮＡを得た。なお、図６のＮｏ．１〜Ｎｏ．５の二本鎖ＤＮＡはそれぞれ、実施例２で用いた二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５）と同じ配列を有する。
【００７２】
次に、各４９ｂｐの二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、９５℃５分間→（９５℃３０秒間→４８℃３０秒間→７４℃３０秒間）×３０回→４℃の条件にてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物をそれぞれ得た。各ＰＣＲ増幅産物のゲル電気泳動パターンを図７に示す。図７によれば、標的二本鎖ＤＮＡがレジオネラ・ニューモフィリア遺伝子である場合（Ｎｏ．１およびＮｏ．２）、目的とするビオチン標識４９ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られたことが理解できる。
【００７３】
次いで、実施例３と同様の方法にて、実施例２で得られたＺｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質と各ＰＣＲ増幅産物（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．６）との結合能をＥＬＡＳＡによって確認した。その結果を図８に示す。
【００７４】
図８によれば、レジオネラ・ニューモフィリア遺伝子中のＤＮＡ配列を用いて得られたＰＣＲ増幅産物（Ｎｏ．１およびＮｏ．２）は、他のＰＣＲ増幅産物（Ｎｏ．３〜Ｎｏ．６）と比べて高い吸光度を示した。これにより、Ｚｉｆ２６８‐ＧＳＴ融合蛋白質が標的配列（Ｚｉｆ２６８認識配列）に特異的に結合することが理解できる。すなわち、Ｚｉｆ２６８‐ＧＳＴ融合蛋白質を用いて、レジオネラ・ニューモフィリア遺伝子中の標的配列を用いて得られたＰＣＲ増幅産物を特異的に検出することができることが明らかになった。
【００７５】
３．５．実施例５
［レジオネラ・ニューモフィリアゲノム中のＳＰ１認識配列の選択］
まず、NCBI nucleotide BLAST Search for short nearly exact matchesを用いて、レ
ジオネラ・ニューモフィリアのゲノム中からＳＰ１認識配列であるｇｇｇｇｃｇｇｇｇの９塩基の配列を検索した（図９参照）。レジオネラ・ニューモフィリアのゲノム配列は先の報告にしたがった（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＥ０１７３５４(Strain Philadelphia
1),ＣＲ６２８３３７(Strain Lens),ＣＲ６２８３３６(Strain Paris)）。次に、この９塩基配列の５’側および３’側のそれぞれ２０塩基をプライマー領域として含む連続する４９塩基配列についてＢＬＡＳＴで検索し、他の細菌が類似した配列を有するか否かを調べた（図１０参照）。さらに、その遺伝子の比較対照となる他の遺伝子配列の多さ、進化速度、水平移動能の有無等を基準として、標的とすべき遺伝子を選択した。
【００７６】
その結果、ＳＰ１の認識配列およびその５’側および３’側のプライマー領域は、レジオネラ・ニューモフィリアのｆｌｈＡ遺伝子と高い相同性を示すことが明らかになった。以上の結果より、レジオネラ・ニューモフィリアのｆｌｈＡ遺伝子を標的遺伝子として選択した。
【００７７】
図１０は、３種のレジオネラ属細菌のｆｌｈＡ遺伝子のＳＰ１認識配列を含む４９ｂｐの配列アライメントを示す。図１０によれば、ＳＰ１認識配列およびその５’側および３’側の各２０ｂｐのプライマー領域を含む４９ｂｐの塩基配列は、レジオネラ・ニューモフィリア間で高い相同性を示すのに対して、確認を行った他の生物の遺伝子に対する相同性は低かった。これにより、ＳＰ１認識配列およびその５’側および３’側の各２０ｂｐのプライマー領域を含む４９ｂｐの塩基配列を標的配列として用いることにより、レジオネラ・ニューモフィリア（特にLegionella pneumophilia str. Philadelphia 1）を特異
的に検出できると考えられる。
【００７８】
３．６．実施例６
［ＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質の調製］
本実施例においては、ＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質の調製を図１１に示す手順で行った。
【００７９】
ヒトリンパ腺ｃＤＮＡライブラリ(ＴａＫａＲａ)から入手したＳＰ１（ｈＳＰ１）構造遺伝子（３０３ｂｐ）をＰＣＲ増幅し、ＴＡクローニングすることにより、ベクターｐＧＥＭ／ｈＳＰ１  ４０を得た。次に、得られたベクターｐＧＥＭ／ｈＳＰ１  ４０に制限酵素サイト(ＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩ)を導入することにより、ｈＳＰ１遺伝子断片（３０２ｂｐ）４２を得た。このｈＳＰ１遺伝子断片４２を増幅し、制限酵素処理した後、Schistosoma japonicum（日本住血吸虫）由来由来ＧＳＴ融合発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔとライゲーションすることにより、ベクターｐＧＥＸ／ｈＳＰ１  ４４を得た。ｈＳＰ１構造遺伝子およびｐＧＥＸ−２Ｔの塩基配列は、先の報告に従った（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１３８４７３（ｈＳＰ１構造遺伝子）、Ｕ１３８５０（ｐＧＥＸ−２Ｔ））。Ｚｉｆ２６８構造遺伝子とＧＳＴ構造遺伝子間のリンカー配列は、ＬＶＰＲＧＳＰＧである。
【００８０】
次いで、ベクターｐＧＥＸ／ｈＳＰ１  ４４を大腸菌ＢＬ２１株に導入した後、この大腸菌ＢＬ２１株を３７℃で培養し、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧにより発現を誘導した後、集菌および洗浄し、フレンチプレスにより菌体を破砕した。菌体破砕物の水溶性画分を、ＧＳＴｒａｐ（商標）ＨＦカラムを用いてアフィニティー精製することにより、ｈＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質を得た。ＧＳＴ活性測定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことにより、ｈＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質の精製度を確認した。
【００８１】
図１２（ａ）および図１２（ｂ）にｈＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質の電気泳動パターンを示す。図１２（ａ）はＩＰＴＧにより発現を誘導した後、１時間、２時間、３時間、４時間の菌体破砕物の水溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示し、図１２（ｂ）は各溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。
【００８２】
図１２（ａ）および図１２（ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果において、ＧＳＴのバンド（２８ｋＤａ）とは異なる３９ｋＤａのシングルバンドが検出された。このバンドはｈＳＰ１‐ＧＳＴ融合蛋白質のものであると推測される。以上により、高純度のｈＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質が得られたことが確認された。
【００８３】
３．７．実施例７
［ｈＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質と標的二本鎖ＤＮＡとの結合能の確認］
本実施例では、実施例６で得られたｈＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質と二本鎖ＤＮＡとの結合能を、実施例３と同様の方法（ＥＬＡＳＡ）によって確認した。
【００８４】
また、用いた二本鎖ＤＮＡの配列を以下に示す（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．６）。なお、「Ｂｉｏ」はビオチンを示し、下線はジンクフィンガー蛋白質認識配列である。
No.1： SP1−L.pneumophila Philadelphia 1 target（標的３）
Bio 5'−GATCCTGACTGA CCC CGC CCC CA GTGA−3'
3'−TGACT GGG GCG GGG GTCACTAG−5'
No.2： SP1−L.pneumophila Lens 1 mutation（比較例４、１塩基変異）
Bio 5'−GATCCTGACTGA CCC CAC CCC CAGTGA−3'
3'‐TGACT GGG GTG GGG GTCACTAG−5'
No.3： SP1−L.pneumophila 1 mutation−2（比較例５、１塩基変異）
Bio 5'−GATCCTGACTGA CCC CGC CCT CAGTGA−3'
3'−TGACT GGG GCG GGA GTCACTAG−5'
No.4： SP1−L.pneumophila 1 random（比較例６、ランダム変異）
Bio 5'−GATCCTGACTGA TCA ATC GCA CAGTGA−3'
3'−TGACT AGT TAG CGT GTCACTAG−5'
No.5： SP1−L.pneumophila 1 random−2（比較例７、ランダム変異）
Bio 5'−GATCCTGACTGA ATC CTC ATT CAGTGA−3'
3'−TGACT TAG GAG TAA GTCACTAG−5'
No.6： ＤＮＡ未使用（対照）
ストレプトアビジン２０でコートされたウエル（９６穴プレート）１８に、５’末端をビオチンで標識された一本鎖ＤＮＡとその相補鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ２４（１００ｐｍｏｌ／ウエル）を添加し、室温で１時間インキュベートした後、２％スキムミルクを添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。次に、融合蛋白質（実施例２で得られたＳＰ１‐ＧＳＴ融合蛋白質）２６（５．７ｐｍｏｌ／ウエル）を添加して、室温で１時間インキュベートした後、抗タグポリペプチド抗体２８および基質酵素３０（抗ＧＳＴ抗体‐ＨＲＰ複合体溶液）を添加して室温で１時間インキュベートした。次いで、発色試薬３２（ＡＢＴＳ溶液（０．４ｍＭ  ＡＢＴＳ、５０ｍＭクエン酸、０．２％Ｈ２Ｏ２、ｐＨ４．０））をウエル１８に添加し、０、１０、３０、６０分毎にプレートリーダーで波長４０５ｎｍの光の吸光度を測定した。６０分後の吸光度を図１３に示す。
【００８５】
図１３によれば、二本鎖ＤＮＡとして標的３（Ｎｏ．１）を用いた場合、１塩基変異二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．２，Ｎｏ．３）およびランダム変異二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．４，Ｎｏ．５）と比較して吸光度が高かった。これにより、ｈＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質が二本鎖ＤＮＡに結合する能力を有することが理解できる。
【００８６】
３．８．実施例８
［ｈＳＰ１‐ＧＳＴ融合蛋白質と標的二本鎖ＤＮＡとの結合能の確認］
本実施例では、実施例６で得られたｈＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質と二本鎖ＤＮＡとの結合能を、実施例７と同様の方法（ＥＬＡＳＡ）によって確認した。
【００８７】
また、用いた二本鎖ＤＮＡの配列を図１４および以下に示す（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４）。なお、「Ｂｉｏ」はビオチンを示し、下線はジンクフィンガー蛋白質認識配列である。
No.1： SP1−L.pneumophila target（標的１）
Bio 5'−GCACTTACTTCAGATACTCT CCC CGC CCC TTTTGTCACTACAACAAAGT−3'
3'−CGTGAATGAAGTCTATGAGA GGG GCG GGG AAAACAGTGATGTTGTTTCA−5'
No.2： SP1−L.pneumophila random（比較例８、ランダム変異）
Bio 5'−GCACTTACTTCAGATACTCT AGG CTC AGT TTTTGTCACTACAACAAAGT−3'
3'−CGTGAATGAAGTCTATGAGA TCC GAG TCA AAAACAGTGATGTTGTTTCA−5'
No.3： ＤＮＡ未使用（対照１）
No.4： 蛋白質（ｈＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質）未使用（対照２）
標的１の配列は、Legionella pneumophila Philadelphia 1及びLens, Paris間で一致するものである。また、ＥＬＩＳＡにより結合能を確認した結果を図１５に示す。図１５に示されるように、標的１（SP1−Legionella pneumophila Target配列）存在下においてのみ、高い吸光度が確認された。このことから、ｈＳＰ１を用いることにより、レジオネラ属菌遺伝子（Legionella pneumophila philadelphia1, Lens, Paris）を特異的に検出することができることが理解できる。
【００８８】
３．９．実施例９
［Ｚｉｆ２６８（またはｈＳＰ１）−ＧＳＴ融合蛋白質とＰＣＲ増幅産物との結合能の確認］
本実施例では、図１６（ａ）および下記に示す各菌のゲノム（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４）の存在下、下記に示す各４９ｂｐの二本鎖ＤＮＡ（Ａ、Ｂ）をテンプレートとして、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行った。より具体的には、ビオチン修飾一本鎖ＤＮＡ（センス鎖）およびＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）修飾された一本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）を混合し、熱処理により各４９ｂｐの二本鎖ＤＮＡを得た。なお、「Ｂｉｏ」はビオチンを示し、下線はジンクフィンガー蛋白質認識配列である。
【００８９】
（テンプレート）
A： Zif268−L.pneumophila Philadelphia 1
Bio 5'−ATTGGTGTTCCGGAAGATAT CGC CCA CGC AATTGTGTTTTTGCTTAATC−3'
3'−TAACCACAAGGCCTTCTATA GCG GGT GCG TTAACACAAAAACGAATTAG−5' FITC
B： SP1‐L.pneumophila Philadelphia 1
Bio 5'−GCACTTACTTCAGATACTCT CCC CGC CCC TTTTGTCACTACAACAAAGT−3'
3'−CGTGAATGAAGTCTATGAGA GGG GCG GGG AAAACAGTGATGTTGTTTCA−5' FITC
（ゲノム）
No.1： Legionella pneumophila philadelphia1（NC_002942）
No.2： Escherichia coli DH５α（NC_000913：E.coli K12株 complete genome）
No.3： Lactobacillus Plantarum（IAM1216）
No.4： Proteus vulgaris（IAM1054）
各菌（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４）の存在下、各４９ｂｐの二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、９５℃５分間→（９５℃３０秒間→４８℃３０秒間→７４℃３０秒間）×３０回→４℃の条件にてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物をそれぞれ得た。各ＰＣＲ増幅産物のゲル電気泳動パターンを図１６（ｂ）に示す。図１６（ｂ）によれば、レジオネラ・ニューモフィリアの存在下でＰＣＲ増幅を行った場合（Ｎｏ．１）、目的とするビオチン標識４９ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られたことが理解できる。
【００９０】
次いで、実施例３と同様の方法にて、ＰＣＲ増幅産物と実施例２で得られたＺｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質との結合能、ならびに、ＰＣＲ増幅産物と実施例６で得られたＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質との結合能をＥＬＡＳＡによって確認した。その結果を図１６（ｃ）に示す。
【００９１】
図１６（ｃ）によれば、テンプレートとしてＡ，Ｂのいずれを用いた場合においても、レジオネラ・ニューモフィリアの存在下で得られたＰＣＲ増幅産物（Ｎｏ．１）のみが高い吸光度を示した。これにより、ジンクフィンガー蛋白質がＺｉｆ２６８およびＳＰ１のいずれの場合においても、ジンクフィンガー蛋白質−ＧＳＴ融合蛋白質と標的配列とが特異的に結合することが理解できる。すなわち、ジンクフィンガー蛋白質‐ＧＳＴ融合蛋白質を用いて、レジオネラ・ニューモフィリア遺伝子中の標的配列を用いて得られたＰＣＲ増幅産物を特異的に検出することができることが明らかになった。
【００９２】
３．１０．実施例１０
［ＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質とＰＣＲ増幅産物の検出限界の確認］
本実施例では、種々のコピー数のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムをテンプレートとして、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行った。より具体的には、ビオチン修飾プライマーおよびＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）修飾プライマーを用いて、10000 コピー、1000コピー、100コピー、10コピー、0コピー のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムをテンプレートとして、10000倍コピーのEscherichia coli DH5αゲノムおよびLactobacillus plantarumゲノム混在下で Herculase II fusion enzyme（STRATAGENE）を用い、９５℃２分間→（９５℃２０秒間→５５℃２０秒間→７４℃３０秒間）×３５回→７４℃２分間→４℃の条件にてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物を得た。
【００９３】
各ＰＣＲ増幅産物のゲル電気泳動パターンを図１７に示す。図１７（Ａ）によれば、１００コピー以上のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムをテンプレートとした場合、目的とするビオチン標識４９ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られたことが理解できる。
【００９４】
次いで、実施例３と同様の方法にて、実施例６で得られたＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質と各ＰＣＲ増幅産物との結合能をＥＬＡＳＡによって確認した。その結果を図１７（Ｂ）に示す。図１７（Ｂ）によれば、１００コピー以上のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムを用いて得られたＰＣＲ増幅産物は、１０コピーのテンプレート及びテンプレートを含まないＰＣＲ増幅産物と比べて高い吸光度を示した。これにより、ＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質が１００コピー以上のテンプレートから増幅されたＳＰ１認識配列を含むＰＣＲ増幅産物に特異的に結合することが理解できる。すなわち、ＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質を用いて、１００コピー程度の少量のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムから得られたＰＣＲ増幅産物を特異的に検出することができることが明らかになった。
【００９５】
３．１１．実施例１１
［ＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質のＰＣＲ増幅産物に対する特異性の確認］
本実施例では、Legionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムをテンプレートとして、ＳＰ１認識配列を含む標的配列と認識配列を含まないコントロール配列をＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行い、ＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質のＰＣＲ増幅産物に対する特異性を確認した。
より具体的には、異なるビオチン修飾プライマーおよびＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）修飾プライマーを用いて、Legionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムをテンプレートとして、ＳＰ１認識配列を含む４９ｂｐの標的配列と、認識配列を含まない４９ｂｐのコントロール配列（図１８（Ａ）参照）を９５℃５分間→（９５℃３０秒間→４８℃３０病間→７４℃３０秒間）×３０回→４℃の条件にてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物を得た。
【００９６】
各ＰＣＲ増幅産物のゲル電気泳動パターンを図１８（Ｂ）に示す。図１８（Ｂ）によれば、どちらのプライマーを用いてもLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムから、目的とするビオチン標識４９ｂｐのＰＣＲ増幅産物がそれぞれ得られたことが理解できる。
【００９７】
次いで、実施例３と同様の方法にて、実施例６で得られたＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質と各ＰＣＲ増幅産物との結合能をＥＬＡＳＡによって確認した。その結果を図１８（Ｃ）に示す。図１８（Ｃ）によれば、ＳＰ１標的配列のＰＣＲ増幅産物は、コントロール配列のＰＣＲ増幅産物と比べて高い吸光度を示した。これにより、ＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質がＳＰ１認識配列を含むＰＣＲ増幅産物に特異的に結合することが理解できる。すなわち、ＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質を用いて、標的のＰＣＲ増幅産物とそれ以外のＰＣＲ増幅産物を特異的に区別することができることが明らかになった。
【００９８】
３．１２.実施例１２
［蛍光偏光解消法を用いたＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質とＰＣＲ増幅産物との結合能の確認］
本実施例では、Legionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ増幅して得られたＰＣＲ増幅産物とＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質との結合能を蛍光偏光解消法により確認した。より具体的には、ビオチン修飾プライマーおよびＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）修飾プライマーを用いて、10000 コピー、1000コピー、100コピー、10コピー、0コピー のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムをテンプレートとして、10000倍コピーのEscherichia coli DH5αゲノムおよびLactobacillus plantarumゲノム混在下で Herculase II fusion enzyme（STRATAGENE）を用い、９５℃２分間→（９５℃２０秒間→５５℃２０秒間→７４℃３０秒間）×３５回→７４℃２分間→４℃の条件にてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物を得た。
【００９９】
次いで、実施例６で得られたＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質と各ＰＣＲ増幅産物との結合能を蛍光偏光解消法によって確認した。より具体的には、得られたＰＣＲ増幅産物とＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質を混合し、ＰＣＲ増幅産物に修飾されているＦＩＴＣの蛍光偏光度を励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍで測定した。ＰＣＲ増幅産物にＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質が結合することによって、ＤＮＡに修飾されているＦＩＴＣの回転が遅くなり、蛍光波長の偏光度が変化する。
【０１００】
その結果を図１９に示す。図１９によれば、混合してから１分で、１０コピー以上のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムから増幅されたＰＣＲ増幅産物は、テンプレートを含まないＰＣＲ増幅産物と比べて蛍光偏光度が大きく変化した。これにより、ＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質が１００コピー以上のテンプレートから増幅されたＳＰ１認識配列を含むＰＣＲ増幅産物に特異的に結合することが理解できる。すなわち、ＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質を用いて、１００コピー程度の少量のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムから得られたＰＣＲ増幅産物を特異的に検出することができることが明らかになった。
【０１０１】
３．１３．実施例１３
［レジオネラ・ニューモフィリアゲノム中のＳＰ２標的配列の選択］
まず、NCBI nucleotide BLAST Search for short nearly exact matchesを用いて、Legionella pneumophilaのゲノム中からＳＰ２認識配列であるGGGCGGGACTの１０塩基の配列を検索した。Legionella pneumophilaのゲノム配列は先の報告にしたがった（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＥ０１７３５４（Strain Philadelphia 1）， ＣＲ６２８３３７（Strain Lens）， ＣＲ６２８３３６（Strain Paris））。次に、この１０塩基配列の５’側及び３’側にそれぞれ２１塩基をプライマー領域として含む連続する５２塩基配列についてＢＬＡＳＴで検索し、他の細菌が類似した配列を有するか否かを調べた。さらに、その遺伝子の比較対照となる他の遺伝子配列の多さ、進化速度、水平移動能の有無等を基準として、標的とすべき遺伝子を選択した。
【０１０２】
その結果、ＳＰ２の認識配列およびその５’側および３’側のプライマー領域は、レジオネラ・ニューモフィリアの膜貫通蛋白質の遺伝子（locus tag = lpg1883）と高い相同性を示すことが明らかになった。以上の結果より、レジオネラ・ニューモフィリアの膜貫通蛋白質の遺伝子（locus tag = lpg1883）を標的遺伝子として選択した。
【０１０３】
図２０は、３種のLegionella属細菌の膜貫通蛋白質の遺伝子（locustae = lpg1883）のＳＰ２認識配列を含む５２ｂｐの配列アライメントを示す。図２０によれば、ＳＰ２認識配列およびその５’側および３’側の各２１ｂｐのプライマー領域を含む５２ｂｐの塩基配列は、レジオネラ・ニューモフィリア間で高い相同性を示すのに対して、確認を行った他の生物の遺伝子に対する相同性は低かった。これにより、ＳＰ２認識配列およびその５’側および３’側の各２１ｂｐのプライマー領域を含む５２ｂｐの塩基配列を標的配列として用いることにより、Legionella pneumophila Philadelphia1を特異的に検出できると考えられる。
【０１０４】
３．１４．実施例１４
［ＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質の調製］
本実施例においては、ＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質の調製を実施例６におけるＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質の調製と同様に図２１に示す手順で行った。
【０１０５】
ヒトリンパ腺ｃＤＮＡライブラリ(ＴａＫａＲａ)から入手したＳＰ２（ｈＳＰ２）構造遺伝子（２６４ｂｐ）をＰＣＲ増幅し、ＴＡクローニングすることにより、ベクターｐＧＥＭ／ｈＳＰ２を得た。次に、得られたベクターｐＧＥＭ／ｈＳＰ２に制限酵素サイト(ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ)を導入することにより、ｈＳＰ２遺伝子断片（２７６ｂｐ）を得た。このｈＳＰ２遺伝子断片を増幅し、制限酵素処理した後、Schistosoma japonicum（日本住血吸虫）由来ＧＳＴ融合発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔとライゲーションすることにより、ベクターｐＧＥＸ／ｈＳＰ２を得た。ｈＳＰ２構造遺伝子およびｐＧＥＸ−２Ｔの塩基配列は、先の報告に従った（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＥ０１７３５４（ｈＳＰ２構造遺伝子）、Ｕ１３８５０（ｐＧＥＸ−２Ｔ）。ＳＰ２構造遺伝子とＧＳＴ構造遺伝子間のリンカー配列は、ＬＶＰＲＧＳである。
【０１０６】
次いで、ベクターｐＧＥＸ／ｈＳＰ２を大腸菌ＢＬ２１株に導入した後、この大腸菌ＢＬ２１株を３７℃で培養し、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧにより発現を誘導した後、集菌および洗浄し、フレンチプレスにより菌体を破砕した。菌体破砕物の水溶性画分を、ＧＳＴｒａｐ（商標）ＨＦカラムを用いてアフィニティー精製することにより、ｈＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質を得た。ＧＳＴ活性測定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことにより、ｈＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質の精製度を確認した。
【０１０７】
図２２は各溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。図２２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果において、ＧＳＴのバンド（２８ｋＤａ）とは異なる３４ｋＤａのシングルバンドが検出された。このバンドはｈＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質のものであると推測される。以上により、高純度のｈＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質が得られたことが確認された。
【０１０８】
３．１５．実施例１５
［ｈＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質と標的二本鎖ＤＮＡとの結合能の確認］
本実施例では、実施例１４で得られたｈＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質と二本鎖ＤＮＡとの結合能を、実施例３と同様の方法（ＥＬＡＳＡ）によって確認した。
【０１０９】
また、用いた二本鎖ＤＮＡの配列を以下に示す（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３）。なお、「Ｂｉｏ」はビオチンを示し、下線はジンクフィンガー蛋白質認識配列である。
No.1: SP2-L.pneumophila target（標的１）
Bio 5'- AAGCCAGTCATTATTTTTTTA GGG CGG GACT CTGAACATAACAGGTTTTGTC -3'
3'- TTCGGTCAGTAATAAAAAAAT CCC GCC CTGA GACTTGTATTGTCCAAAACAG -5'
No.2: SP2-L.pneumophila 1-mutation（比較例１、１塩基変異）
Bio 5'- AAGCCAGTCATTATTTTTTTA GAG CGG GACT CTGAACATAACAGGTTTTGTC -3'
3'- TTCGGTCAGTAATAAAAAAAT CTC GCC CTGA GACTTGTATTGTCCAAAACAG -5'
No.3: SP2-L.pneumophila random（比較例２、ランダム変異）
Bio 5'- AAGCCAGTCATTATTTTTTTA CAC CCT GCGT CTGAACATAACAGGTTTTGTC -3'
3'- TTCGGTCAGTAATAAAAAAAT GTG GGA CGCA GACTTGTATTGTCCAAAACAG -5'
ストレプトアビジンでコートされたウエル（９６穴プレート）に、５’末端をビオチンで標識された一本鎖ＤＮＡとその相補鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ（１００ｐｍｏｌ／ウエル）を添加し、室温で１時間インキュベートした後、２％スキムミルクを添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。次に、融合蛋白質（実施例１４で得られたＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質）２６（５．７ｐｍｏｌ／ウエル）を添加して、室温で１時間インキュベートした後、抗タグポリペプチド抗体および基質酵素（抗ＧＳＴ抗体−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）複合体溶液）を添加して室温で１時間インキュベートした。次いで、発色試薬（ＡＢＴＳ溶液（０．４ｍＭ  ＡＢＴＳ（2,2'-Azinobis（3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic Acid）、５０ｍＭクエン酸、０．２％Ｈ２Ｏ２、ｐＨ４．０））をウエル１８に添加し、０、１５、３０、６０分毎にプレートリーダーで波長４０５ｎｍの光の吸光度を測定した。６０分後の吸光度を図２３に示す。
【０１１０】
図２３によれば、二本鎖ＤＮＡとして標的１（Ｎｏ．1）を用いた場合、1塩基変異及びランダム変異二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．２，Ｎｏ．３）と比較して優位に吸光度が高かった。これにより、ＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質が標的二本鎖ＤＮＡに結合する能力を有することが理解できる。
【０１１１】
３．１６．実施例１６
［ＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質とＰＣＲ増幅産物との結合能の確認］
本実施例では、Legionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムをテンプレートとして、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行った。より具体的には、ビオチン修飾プライマーおよびＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）修飾プライマーを用いて、Legionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムをテンプレートとして、DNAポリメラーゼとしてHerculase II fusion enzyme（STRATAGENE）を用い、９５℃２分間→（９５℃２０秒間→５５℃２０秒間→７４℃３０秒間）×３５回→７４℃２分間→４℃の条件にてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物を得た。コントロールとして、Escherichia coli DH5αゲノム、Proteum vulgaris （IAM 1025）ゲノムをテンプレートとして用い、またテンプレートを含まないサンプルも同様にＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物をそれぞれ得た。
【０１１２】
各ＰＣＲ増幅産物のゲル電気泳動パターンを図２４（Ａ）に示す。図２４（Ａ）によれば、テンプレートとしてLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムを用いた場合（Ｎｏ．１）、目的とするビオチン標識５２ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られたことが理解できる。
【０１１３】
次いで、実施例３と同様の方法にて、実施例１４で得られたＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質と各ＰＣＲ増幅産物（Ｎｏ．１〜４）との結合能をＥＬＡＳＡによって確認した。その結果を図２４（Ｂ）に示す。図２４（Ｂ）によれば、Legionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムを用いて得られたＰＣＲ増幅産物（Ｎｏ．１）は、他のＰＣＲ増幅産物（Ｎｏ．２〜Ｎｏ．４）と比べて高い吸光度を示した。これにより、ＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質がＳＰ２認識配列を含むＰＣＲ増幅産物に特異的に結合することが理解できる。すなわち、ＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質を用いて、Legionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムを用いて得られたＰＣＲ増幅産物を特異的に検出することができることが明らかになった。
【０１１４】
３．１７実施例１７
［ＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質とＰＣＲ増幅産物の検出限界の確認］
本実施例では、種々のコピー数のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムをテンプレートとして、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行った。より具体的には、ビオチン修飾プライマーおよびＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）修飾プライマーを用いて、10000 コピー、1000コピー、100コピー、10コピー、0コピー のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムをテンプレートとして、10000コピーのEscherichia coli DH5αゲノム混在下で Herculase II fusion enzyme（STRATAGENE）を用い、９５℃２分間→（９５℃２０秒間→５５℃２０秒間→７４℃３０秒間）×３５回→７４℃２分間→４℃の条件にてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物を得た。
【０１１５】
各ＰＣＲ増幅産物のゲル電気泳動パターンを図２５（Ａ）に示す。図２５（Ａ）によれば、１０コピー以上のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムをテンプレートとした場合、目的とするビオチン標識５２ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られたことが理解できる。
【０１１６】
次いで、実施例３と同様の方法にて、実施例１４で得られたＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質と各ＰＣＲ増幅産物（Ｎｏ．１〜５）との結合能をＥＬＡＳＡによって確認した。その結果を図２５（Ｂ）に示す。図２５（Ｂ）によれば、１０コピー以上のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムを用いて得られたＰＣＲ増幅産物（Ｎｏ．１〜４）は、テンプレートを含まないＰＣＲ増幅産物（Ｎｏ．５）と比べて高い吸光度を示した。これにより、ＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質が１０コピー以上のテンプレートから増幅されたＳＰ２認識配列を含むＰＣＲ増幅産物に特異的に結合することが理解できる。すなわち、ＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質を用いて、１０コピー程度の少量のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムから得られたＰＣＲ増幅産物を特異的に検出することができることが明らかになった。
【０１１７】
３．１８．実施例１８
［ＰＣＲ増幅産物に対するＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質の特異性の確認］
本実施例では、ＳＰ２の標的配列に対する特異性を確認した。より具体的には、認識配列及びプライマー領域に変異導入した配列、計１０種類 (図２６参照)をテンプレートとして、９５℃２分間→（９５℃２０秒間→５５℃２０秒間→７４℃３０秒間）×３５回→７４℃２分間→４℃の条件にてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物を得た。
各ＰＣＲ増幅産物のゲル電気泳動パターンを図２７（Ａ）に示す。図２７(Ａ)によれば、どの配列においても５２ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られたことが理解できる。これはプライマー領域が類似しているからだと考えられる。
【０１１８】
次いで、実施例３と同様の方法にて、実施例１４で得られたＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質と各ＰＣＲ増幅産物（Ｎｏ．１〜１０）との結合能をＥＬＡＳＡによって確認した。その結果を図２７（Ｂ）に示す。図２７(Ｂ)によれば、標的配列のＰＣＲ増幅産物（Ｎｏ．１）は、類似した配列のＰＣＲ増幅産物（Ｎｏ．２〜１０）と比べて高い吸光度を示した。これにより、ＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質は１〜２塩基の変異を認識し、標的配列のみに特異的に結合することが理解できる。すなわち、ＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質を用いて、標的配列を含むＰＣＲ増幅産物を特異的に検出することができることが明らかになった。
【０１１９】
３．１９．実施例１９
［認識配列に対するＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質の特異性と検出限界の確認］
本実施例では、ＳＰ２の認識配列に対する特異性と結合能を確認した。より具体的には、実施例３と同様の方法にて、認識配列に変異導入された配列（図２６参照）との結合能をＥＬＩＳＡによって確認した。
【０１２０】
その結果を図２８に示す。図２８によれば、認識配列を含む（Ｎｏ．１、４、７）及び認識配列の４残基目に一塩基変異をもつ配列（Ｎｏ．５、６）は、類似した配列のＰＣＲ増幅産物（Ｎｏ．２〜３、８〜１０）と比べて高い吸光度を示した。これにより、ＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質は認識配列の４残基目の変異を区別する事ができないがそれ以外の一塩基配列は区別する事ができると理解できる。すなわち、ＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質だけでもある程度特異的に検出する事ができるが、ＰＣＲと組み合わせることでより特異的に検出できる事が明らかになった。  次いで、認識配列をもつ標的配列に対する検出限界を確認するために、実施例３と同様の方法にて、種々の濃度の標的配列との結合能をＥＬＩＳＡによって確認した。
【０１２１】
その結果を図２９に示す。図２９によれば、１０１２コピー以上の標的配列に対して、それ以下のコピー数の標的配列と比べて高い吸光度を示した。これにより、ＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質で１０１２コピー以上の標的配列があれば検出できる事が明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明に係る検体中のレジオネラ属菌遺伝子を検出するためのキットおよび方法は、実験室における利用のみならず、例えば浴槽、プール、人工池、人工河川等を備えたレジャー施設、医療施設、介護施設等でのレジオネラの検出、ならびに医療機関における被験者のレジオネラ症感染の検出の他、空調機室外冷却塔の冷却水、給水給湯系などのビル施設の管理面でのレジオネラ属菌の検出にも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、レジオネラ・ニューモフィリア遺伝子およびジンクフィンガー蛋白質（Ｚｉｆ２６８）認識配列を模式的に示す。
【図２】図２は、レジオネラ・ニューモフィリアの２−デオキシ−Ｄ−グルコナート−３−デヒドロゲナーゼ遺伝子中のジンクフィンガー蛋白質（Ｚｉｆ２６８）認識配列およびその５’側および３’側のプライマー領域のヌクレオチド配列アライメントを示す。
【図３】図３は、実施例３、４および７で用いられた標的核酸の検出キットを模式的に示す。
【図４】図４は、実施例３で用いられたヌクレオチド配列（ビオチン標識二本鎖ＤＮＡ）２４の配列アライメントを示す。
【図５】図５は、実施例３で用いられたヌクレオチド配列（ビオチン標識二本鎖ＤＮＡ）２４に結合するＺｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質に対するＥＬＩＳＡの結果（吸光度）を示す。
【図６】図６は、実施例４でのＥＬＩＳＡに用いたＰＣＲ増幅産物の配列アライメントを示す。
【図７】図７は、実施例４で得られたＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターンを示す。
【図８】図８は、実施例４で得られたＰＣＲ増幅産物に結合するＺｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質に対するＥＬＩＳＡの結果（吸光度）を示す。
【図９】図９は、レジオネラ・ニューモフィリア遺伝子およびジンクフィンガー蛋白質（ＳＰ１）認識配列を模式的に説明する。
【図１０】図１０は、レジオネラ・ニューモフィリアのｆｌｈＡ遺伝子中のジンクフィンガー蛋白質（ＳＰ１）認識配列およびその５’側および３’側のプライマー領域のヌクレオチド配列アライメントを示す。
【図１１】図１１は、実施例６におけるジンクフィンガー蛋白質（ＳＰ１）とタグポリペプチド（ＧＳＴ）との融合蛋白質の発現ベクターの調製方法を模式的に説明する。
【図１２】図１２（ａ）および図１２（ｂ）は、実施例６で得られたジンクフィンガー蛋白質（ＳＰ１）とタグポリペプチド（ＧＳＴ）との融合蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１３】図１３は、実施例７で用いられたヌクレオチド配列に対するＥＬＩＳＡの結果（吸光度）を示す。
【図１４】図１４は、実施例８で用いられたヌクレオチド配列（ビオチン標識二本鎖ＤＮＡ）２４の配列アライメントを示す。
【図１５】図１５は、実施例８で得られたＰＣＲ増幅産物に結合するＺｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質に対するＥＬＩＳＡの結果（吸光度）を示す。
【図１６】図１６（ａ）は、実施例９で用いたゲノムおよびジンクフィンガー蛋白質（Ｚｉｆ２６８，ＳＰ１）認識配列を模式的に示す図であり、図１６（ｂ）は、実施例９で得られたＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターン（左図はＺｉｆ２６８認識配列を含むテンプレートＡを用いた場合のＰＣＲ増幅産物を示し、右図はＳＰ１認識配列を含むテンプレートＢを用いた場合のＰＣＲ増幅産物を示す。）を示し、図１６（ｃ）は、実施例９で得られたＰＣＲ増幅産物に結合するジンクフィンガー蛋白質−ＧＳＴ融合蛋白質（左図は融合蛋白質がＺｉｆ２６８−ＧＳＴ融合蛋白質である場合、右図は融合蛋白質がＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質である場合）に対するＥＬＩＳＡの結果（吸光度）を示す。
【図１７】図１７（Ａ）は、実施例１０において種々のコピー数のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムを用いて得られたＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターンを示す。図１７（Ｂ）は、実施例６で得られたＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質と実施例１０で得られた各ＰＣＲ増幅産物との結合能を確認するＥＬＡＳＡの結果（吸光度）を示す。
【図１８】図１８（Ａ）は、実施例１１においてＰＣＲ増幅させたＳＰ１標的配列とコントロール配列を示す。図１８（Ｂ）は、実施例１１において二種類のプライマーを用いてレジオネラゲノムから得られたＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターンを示す。図１８（Ｃ）は、実施例１１で得られたＰＣＲ増幅産物に対する実施例６で得られたＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質の結合能を確認するＥＬＡＳＡの結果（吸光度）を示す。
【図１９】図１９は、実施例１２における蛍光偏光解消法を用いたＳＰ１−ＧＳＴ融合蛋白質とＰＣＲ増幅産物との結合能を確認する蛍光偏光度を示す。
【図２０】図２０は、実施例１３におけるＳＰ２の認識配列を含む標的配列のホモロジー検索の結果を示す。
【図２１】図２１は、実施例１４におけるＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質のクローニングを示す。
【図２２】図２２は、実施例１４における精製ＳＰ２-ＧＳＴ融合蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図２３】図２３は、実施例１５における標的二本鎖ＤＮＡに対するＳＰ２―ＧＳＴ融合蛋白質の結合能を確認するＥＬＡＳＡの結果（吸光度）を示す。
【図２４】図２４（Ａ）は、実施例１６において各ゲノムからのＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターンを示す。図２４（Ｂ）は、実施例１６で得られたＰＣＲ増幅産物に対するＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質の結合能を確認するＥＬＡＳＡの結果（吸光度）を示す。
【図２５】図２５(Ａ)は、実施例１７における種々のコピー数のLegionella pneumophila subsp. pneumophila philadelphia1ゲノムを用いて得られたＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターンを示す。図２５(Ｂ)は、実施例１７におけるＰＣＲ増幅産物に対するＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質の結合能を確認するＥＬＡＳＡの結果（吸光度）を示す。
【図２６】図２６は、実施例１８におけるＳＰ２認識配列及びプライマー領域に変異が導入された類似配列を示す。
【図２７】図２７（Ａ）は、実施例１８における１０種類の配列を用いて得られたＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターンを示す。図２７（Ｂ）は、実施例１８で得られた１０種類のＰＣＲ増幅産物に対するＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質の結合能を確認するＥＬＡＳＡの結果（吸光度）を示す。
【図２８】図２８は、実施例１９における認識配列及び変異導入配列に対するＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質の結合能を確認するＥＬＡＳＡの結果（吸光度）を示す。
【図２９】図２９は、実施例１９における標的配列に対するＳＰ２−ＧＳＴ融合蛋白質の検出限界を確認するＥＬＡＳＡの結果（吸光度）を示す。
【符号の説明】
【０１２４】
１０・・・レジオネラ・ニューモフィリア遺伝子
１２・・・ジンクフィンガー蛋白質（Ｚｉｆ２６８）認識部位
１８・・・ウエル（９６穴プレート）
２０・・・ストレプトアビジン
２２・・・ビオチン
２４・・・ビオチン標識二本鎖ＤＮＡ
２６・・・タグポリペプチドとジンクフィンガー蛋白質との融合蛋白質
２８・・・抗タグポリペプチド抗体（抗ＧＳＴ抗体）
３０・・・基質酵素（ＨＲＰ）
３２・・・発色試薬（ＡＢＴＳ）
４０・・・ｐＧＥＭ／ｈＳＰ１
４２・・・ｈＳＰ１遺伝子断片
４４・・・ベクターｐＧＥＸ／ｈＳＰ１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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