(57)【要約】【課題】従来のビフィドバクテリウム属細菌よりも優れた腸内到達性を有する菌株を作出し、これを用いたビフィドバクテリウム属細菌含有発酵乳飲食品を提供する。【解決手段】ビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵乳飲食品を、ｐＨ４．３の酸で３７℃３０分間処理、次いで胆汁を１％含む溶液で３７℃３０分間連続処理したとき、これらの処理後の生残性が２０％以上であるビフィドバクテリウム属細菌、及び当該細菌を含有する発酵乳飲食品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵乳飲食品を、ｐＨ４．３の酸で３７℃３０分間処理、次いで胆汁を１％含む溶液で３７℃３０分間連続処理したとき、これらの処理後の生残性が２０％以上であるビフィドバクテリウム属細菌。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム又はビフィドバクテリウム・ロンガムである請求項１記載のビフィドバクテリウム属細菌。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ ４１２５株又はビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ４１２６株である請求項１又は２記載のビフィドバクテリウム属細菌。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のビフィドバクテリウム属細菌を含むことを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵乳飲食品。
【請求項５】
７日間保存した当該発酵乳飲食品を、ｐＨ４．３の酸で３７℃３０分間処理、次いで胆汁を１％含む溶液で３７℃３０分間連続処理したとき、これらの処理後のビフィドバクテリウム属細菌の生残性が２０％以上である請求項４記載の発酵乳飲食品。
【請求項６】
更に、シロップを含有する請求項４又は５記載の発酵乳飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトに経口で投与された発酵乳飲食品中のビフィドバクテリウム属細菌の腸内到達度を簡便に評価する方法、及び該評価方法において高い生残性を有するビフィドバクテリウム属細菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリウム属細菌については、腸内有害細菌の抑制作用や整腸作用、免疫賦活作用等の様々な生理作用が報告されている。このため、各種発酵乳製品や生菌製剤等の形態で多数の市販品が販売されており、現在では確固たる市場を形成している。特に発酵乳飲食品は、優れた嗜好性を有していることから、継続的に飲用しやすい、ビフィドバクテリウム属細菌の投与に適したものである。
【０００３】
ビフィドバクテリウム属細菌の生理効果の多くは、菌が腸管に到達した後、代謝産物である酢酸等を産生することにより奏される。このため、十分な効果を得るには、菌が生きたまま腸に到達することが必要になる。このような菌の腸管への到達性は、従来から、菌の糞便からの回収率を指標として判断されている。すなわち、糞便中に存在する生菌数は、腸管への到達度を反映しているので、菌を投与したヒトの糞便を回収し、糞便中の生存菌数（回収率）を測定することにより到達性の確認がなされていたのである。
【０００４】
ところで、ビフィドバクテリウム属細菌は、酸耐性、胆汁耐性等が弱いため、一般に腸管への到達率が低いと考えられている。すなわち、菌が経口的に摂取されると、腸への到達前に胃酸や胆汁等によって、死滅してしまう可能性もある。
近年では、各種製造技術の向上等により、摂取し得る菌数そのものが増加しているため、ある程度の死滅が起こっても、これを許容して生理効果を期待することも可能である。また、ビフィドバクテリウム属細菌を含む発酵食品等の製造に際しては、保存時の生残性を改善するための様々な成分、例えばＮ−アセチルグルコサミン、パントテン酸、ペプチド類、ラクチュロース等の添加もなされているため、その作用により、摂取後の腸管への到達性も高まっていると考えられる。
【０００５】
しかし、菌の生理効果をより強くするには、より多くの生菌を腸管へ到達させる必要があるため、更なる到達性の向上が望まれる。ところが、上記のように腸管への到達性、すなわち糞便からの回収率を測定するためには、ヒトへの投与試験が必要となり、煩雑かつ長期間の作業を必要とするため、実際にこのような実験を行うことは非常に困難であった。
【０００６】
一方で、経口摂取後の障壁となる胃酸や胆汁に対し、予め耐性を付与した菌株を作出した旨の報告もいくつかなされている。例えば、特許文献１には、酸、胆汁塩及び酸素耐性の高いビフィドバクテリウム属細菌に関し記載されており、これを用いれば、成長促進物質を加えることなく、脱脂乳等で好気条件下でも培養を行えるとされている。また、非特許文献１にも、酸及び胆汁への耐性が高いビフィドバクテリウム属細菌２株が記載されている。
【０００７】
このような耐性株を用いれば、投与時の菌の腸への到達性が向上することも考えられる。そこで、本発明者は、上記のような酸及び胆汁への耐性が高い菌株を作出し、これを用いてシロップ含有発酵乳飲食品を製造し、ヒトへの投与を行い、その糞便からの回収率を測定した。その結果、上記耐性と回収率とは必ずしも相関しないことが明らかとなった。
【特許文献１】特開平９−３２２７６２号公報
【非特許文献１】International Journal of Food Microbiology 47 (1999) p.25−32
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、発酵乳飲食品中のビフィドバクテリウム属細菌の腸内到達度を反映する簡便かつ正確な評価系を構築することにある。また、本発明は、従来のビフィドバクテリウム属細菌よりも優れた腸内到達性を有する菌株を作出し、これを用いたビフィドバクテリウム属細菌含有発酵乳飲食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者らは、ビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵乳飲食品におけるビフィドバクテリウム属細菌の糞便からの回収率について検討してきたところ、発酵乳飲食品、特にシロップを配合した発酵乳飲食品においては、製造直後は比較的回収率が高いものの、製造から１週間程度超えると回収率の低下が著しいことが判明した。発酵乳飲食品の流通を考慮すると、この程度の保存後でも充分高い回収率を確保する必要がある。そこで、一週間程度保存したビフィドバクテリウム属細菌及びシロップを含有する発酵乳飲食品を用いて、更に検討した結果、酸、胆汁の連続処理後の生残性を測定すれば、経口投与した発酵乳飲食品中のビフィドバクテリウム属細菌の腸内到達度を簡便かつ正確に評価できることを見出した。また、本発明者は、この酸、胆汁の連続処理後の生残性を指標として、ある値以上の生残性を有する菌株を含有する発酵乳飲食品は、製造から一週間程度経過しても優れた腸内到達性が得られることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵乳飲食品を、ｐＨ４．３の酸で３７℃３０分間処理、次いで胆汁を１％含む溶液で３７℃３０分間連続処理したとき、これらの処理後の生残性が２０％以上であるビフィドバクテリウム属細菌、及び当該細菌を含むことを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌含有発酵乳飲食品を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、発酵乳飲食品中のビフィドバクテリウム属細菌の腸内到達度を簡便かつ正確に評価することができる。
また、本発明によれば、保存後でも腸内への到達速度の高いビフィドバクテリウム属細菌含有発酵乳飲食品を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明における評価の対象はビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵乳飲食品であればいずれを用いてもよい。例えば、ビフィドバクテリウム属細菌をＧＡＭ培地（日水製）等の栄養培地で培養して、これを種菌として乳培地で更に培養を行い得られた発酵乳にシロップを添加した発酵乳飲食品が挙げられる。特に、シロップを含有する発酵乳飲食品中では、保存時にビフィドバクテリウム属細菌の腸内到達性が低下してしまうため、シロップを含むものを対象とした場合に本発明の評価方法が有効である。ここで乳としては、牛乳（全脂乳）及びその加工品である脱脂乳、その他の山羊、羊などの獣乳等、更には植物性の豆乳等が挙げられる。シロップとしては、グルコース、シュークロース、果糖ブドウ糖液糖、ブドウ糖果糖液糖、蜂蜜などの糖類；ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニットなどの糖アルコールが挙げられる。シロップの含有量は０．１〜１０重量％程度が好ましい。当該発酵乳飲食品には、ビフィドバクテリウム属細菌を１×１０7 〜５×１０9 cfu/mL、特に１×１０8 〜１×１０9 cfu/mL含むのが好ましい。５×１０9 を超える菌数では、含まれる菌に対する酸や胆汁の負荷が十分でなく、正確な判定ができない。また、１×１０7 未満では逆に、個々の菌に対する酸や胆汁の負荷が大きすぎるため適当でない。
【００１３】
また、当該発酵乳飲食品には、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グァーガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム等の増粘（安定）剤を配合することができる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等の各種ビタミン類やハーブエキス等を配合することも可能である。
【００１４】
発酵乳飲食品の製造には、ビフィドバクテリウム属細菌以外の菌を併用することも可能である。このような菌としては、例えばラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ガセリ（L.gasseri）、ラクトバチルス・プランタラム（L.plantarum）、ラクトバチルス・ブヒネリ（L.buchneri）、ラクトバチルス・カゼイ（L.casei）、ラクトバチルス・ジョンソニー（L.johnsonii）、ラクトバチルス・ガリナラム（L.gallinarum）、ラクトバチルス・アミロボラス（L.amylovorus）、ラクトバチルス・ブレビス（L.brevis）、ラクトバチルス・ラムノーザス（L.rhamnosus）、ラクトバチルス・ケフィア（L.kefir）、ラクトバチルス・パラカゼイ（L.paracasei）、ラクトバチルス・クリスパタス（L.crispatus）、ラクトバチルス・デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキー（L.delbrueckii subsp.delbrueckii）、ラクトバチルス・デルブルッキー  サブスピーシーズ  ブルガリクス（L.delbrueckii subsp.bulgaricus）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）等のラクトコッカス属細菌、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属細菌、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyses cerevisiae）、トルラスポラ・デルブルエッキー（Torulaspora delbrueckii）、キャンジダ・ケフィア等のサッカロマイセス属、トルラスポラ属、キャンジダ属等に属する酵母等が好ましい微生物として挙げられる。
【００１５】
中でも上記ラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌及びラクトコッカス属細菌から選ばれる乳酸菌のうち１種以上を併用して発酵乳飲食品を製造すれば、高い嗜好性が得られるため継続的な飲用が容易であり、また、腸内到達度又は回収率の向上効果も高いため好ましい。
【００１６】
発酵乳飲食品の製造は常法に従えばよく、例えば発酵乳を製造する場合には、まず殺菌した乳培地にビフィドバクテリウム属細菌を単独もしくは乳酸菌と同時に接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。次いで、別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、更にフレーバーを添加して最終製品に仕上げればよい。
このようにして得られる発酵乳飲食品は、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等いずれの形態の製品とすることも可能である。
【００１７】
また、酸、胆汁連続処理に供する発酵乳飲食品は、培養終了後、低温で保存し始めた日を０日として（シロップ含有発酵乳飲食品であれば、シロップ及びビフィドバクテリウム属細菌を混合した日を０日として）、７日間保存した飲食品が好ましい。また、そのpHは５．０〜５．８であることが好ましい。
【００１８】
また、用いるビフィドバクテリウム属細菌の菌種は特に限定されないが、ヒト由来の細菌が好ましく、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B.bifidum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B.infantis）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（B.adolescentis）、ビフィドバクテリウム・カテニュラータム（B.catenulatum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラータム（B.pseudocatenulatum）等がより好ましく、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ロンガムが特に好ましい。
【００１９】
本発明において、酸、次いで胆汁による連続処理とは、前記発酵乳飲食品を酸で処理した後、連続して胆汁処理を行う処理のことである。ここで、連続処理とは、酸処理した発酵乳飲食品を即時ないし菌の活性を回復させることなく、胆汁処理することを意味し、菌の活性を回復させることなくとは、酸処理液への中和剤の添加や緩衝剤あるいは培地での希釈など、菌の活性を積極的に回復させる処理を施さないことを意味する。
【００２０】
本発明において、酸処理とは、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、酪酸、プロピオン酸等の有機酸、あるいは塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸を添加して、ビフィドバクテリウム属細菌の至適pHよりも酸性にした液に、発酵乳飲食品を添加し障害を与える処理のことである。用いる酸は特に限定されないが、ビフィドバクテリウム属細菌の菌株によっては、塩の存在により生育に障害を受けるものもあり、その影響は回収率との相関において無視できない場合もあるため有機酸を用いることが好ましく、特に、酢酸、乳酸又は塩酸を用いれば、腸内到達度との相関性が高くなるため好ましい。
【００２１】
酸処理用の酸含有液のpHは３．０〜５．５程度、特に４．０〜４．５程度にすることが好ましい。pH５．５以上では、一般の発酵乳製品自体のpHより高い値となってしまう場合がほとんどであり、ビフィドバクテリウム属細菌にわずかな障害しか与えることができず、一方、pH３．０未満ではストレスが強すぎるため、ごく短時間の間にほとんどの菌が死滅してしまうため、どちらの場合も処理後の生残性に関して菌株間の差を検出できないためである。
【００２２】
また酸含有液に発酵乳飲食品を添加した後の処理は、ビフィドバクテリウム属細菌の生育可能温度、すなわち３０〜４２℃程度、１〜６０分間程度行えばよく、特に３６〜３８℃程度で、１０〜３０分間程度処理することが生体条件の反映や試験の簡便性の点から好ましい。
【００２３】
本発明においては、次いで、酸処理後の発酵乳飲食品に対し胆汁処理を行う。すなわち、前記酸処理後の発酵乳飲食品を直接胆汁溶液に添加し処理を行う。胆汁処理の条件も特に限定されないが、０．１〜５％程度の胆汁又は胆汁塩及び中和剤としてリン酸ナトリウムを添加した溶液を用い、酸処理後の発酵乳飲食品の添加後は３０〜４２℃で、１〜２４０分間程度の処理を行えばよい。特に、腸内到達度との相関を高め、菌株間の耐性の差異を明確にするためには、０．５〜２％程度の胆汁又は胆汁塩を添加し、発酵乳飲食品の添加後は３６〜３８℃で、３０〜６０分間程度の処理を行うことが好ましい。
【００２４】
より好ましい酸、胆汁連続処理は、７日間保存した、ビフィドバクテリウム属細菌（初発菌数約１×１０8 程度）を含有する発酵乳飲食品を用い、pH４．３の酸で３６〜３８℃、１０〜３０分、次いで１％の胆汁で３６〜３８℃、３０〜６０分間の処理である。
【００２５】
上記酸、胆汁連続処理として、特に好ましい条件を具体的に挙げれば、以下のとおりとなる。まず、酢酸によりpH４．３に調整した酸処理液１０mLに発酵乳飲食品１mLを添加し、３７℃で３０分間処理する。処理後は直ちに、この酸処理液１mLを胆汁を１％含む胆汁処理液１０mLに添加し、引き続き３７℃で３０分間処理する。この条件であれば、対象となる菌株の種類に関わらず腸内到達度とほぼ同様の生残性を導くことが可能であり、菌株間の生残性の差異も明確に判定することが可能である。
【００２６】
上記酸、胆汁連続処理による生残性は、発酵乳飲食品中の処理前の生菌数と処理後の生菌数とを比較することにより測定できる。すなわち、処理前の生菌数に対する処理後の生菌数の割合を求めればよい。なお、生菌数は常法に従って測定できる。
【００２７】
このような酸、胆汁連続処理に対するビフィドバクテリウム属細菌の生残性は、発酵乳飲食品ヒト経口投与時のビフィドバクテリウム属細菌の腸内到達度と強い相関を示す。すなわち、酸、胆汁連続処理による生残性の高低は、発酵乳飲食品ヒト経口投与時におけるビフィドバクテリウム属細菌の腸内到達度の高低と相関するパラメーターとなっているのである。これは、酸処理により活性の低下したビフィドバクテリウム属細菌に対し、更に胆汁で処理を行うことにより与えられるストレスが、ヒト腸管内でのそれと類似するためと考えられるが、定かではない。
【００２８】
なお、本発明の腸内到達度とは、ビフィドバクテリウム属細菌及びシロップを含む発酵乳飲食品をヒトに経口投与した場合に、該投与菌数に対して、腸内に到達する菌数の割合のことである。腸内への到達菌数は糞便からの回収菌数とほぼ同等と考えられていることから、実際には後者の測定結果を腸内到達菌数としている。
【００２９】
これに対し、酸処理又は胆汁処理をそれぞれ単独で行った場合の菌の生残性を測定しても、腸内到達度又は回収率との相関は得られず、また、酸処理の後時間を経過させて胆汁処理した場合、胆汁処理した後酸処理する場合などでも腸内到達度又は回収率に相関する生残性を得ることはできない。
【００３０】
従来のビフィドバクテリウム属細菌は、例えば発酵乳製品等の飲食品の製造に用いられた場合に、製造直後に飲食されれば十分な腸内到達度又は回収率を得られるものの、１週間程度冷蔵保存に供された後には、腸内到達度又は回収率が低下してしまうものであった。特に発酵乳飲食品中にシロップを含むもので、その傾向が顕著であったが、本発明の評価方法により高い生残性を有することが確認された株は、発酵乳飲食品等の形態で１週間の保存を経た後でも優れた腸内到達度又は回収率を保持し得る菌株である。
【００３１】
すなわち、本発明では、上記の酸、胆汁連続処理に対して、２０％以上、より好ましくは３０％以上の生残性を有する菌株を新たに作出し、この菌株を用いて製造した発酵乳飲食品は、１週間程度の保存を行っても、製造直後と同等の腸内到達度又は回収率を有していることを確認した。特に、発酵乳飲食品中のビフィドバクテリウム属細菌の菌数が高い場合には、菌の腸内到達菌数も高いと予測しがちであるが、１週間保存した場合、菌の腸内到達率が低下しやすく、実際の到達菌数が減少することが、本発明者らの研究結果より明らかとなっている。
【００３２】
しかし、１×１０8 cfu/mL以上のヒト由来のビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵乳飲食品であって、当該発酵乳飲食品を１週間冷蔵保存した後、１０倍量の酢酸によりpH４．３に調整した酸処理液で３７℃、３０分間処理し、更に、この酸処理液を１０倍量の１％胆汁酸で３７℃、３０分間処理した後の発酵乳飲食品中の菌の生残性が２０％以上の発酵乳飲食品であれば、１週間保存後ヒト飲用時における腸内への到達菌数として１×１０7 cfu/ｇ程度を確保できるため、このような菌数及び菌の生残性を具備する発酵乳飲食品は、特に好ましい。１×１０7 cfu/ｇ程度の到達菌数を確保できれば、腸内有害菌といわれているバクテロイデス属細菌やクロストリジウム属細菌等の繁殖を抑制できるためである。
【００３３】
酸、胆汁連続処理で高い生残性を有するビフィドバクテリウム属細菌の菌種も特に限定されず、上記に例示したヒト由来の各菌種等いずれを用いても高い腸内到達度又は回収率を期待することができる。中でも、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・ロンガムは、乳幼児や高齢者への生理効果や安全性がよく確認されているため好ましい。
【００３４】
このような酸、胆汁連続処理耐性の高い菌株の作製は、例えば以下に示す方法によって行うことができる。
すなわち、親株とするビフィドバクテリウム属細菌を使用して発酵乳を調製し、シロップを添加して発酵飲料品を作製した後、適当な容器に分注し冷蔵保存する。保存後の発酵飲料品に酸、胆汁処理を施し、処理後菌体を遠心分離により回収し、この菌体の中から酸、胆汁連続処理耐性の優れたものを選抜していくのである。
【００３５】
上記の方法に供するビフィドバクテリウム属細菌もいずれの菌種でもよく、上記と同様の理由からビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・ロンガムから選ばれる菌を用いることが好ましい。
【００３６】
上記濃縮法により、特に酸、胆汁連続処理で高い生残性を有する菌株と認められた２株ＹＩＴ ４１２５株及びＹＩＴ ４１２６株は、前者をビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ ４１２５（FERM BP-7813）として、後者をビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ ４１２６（FERM BP-7814）として、それぞれ平成１２年１０月２７日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託している。
【００３７】
また、上記の方法によらずとも、紫外線照射やニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等突然変異誘導剤等による処理を施して、酸、胆汁連続処理での高い生残性を有する株を選択することも可能である。
【００３８】
これらの作出方法、あるいはその他の方法によってでも、得られた酸、胆汁連続処理で高い生残性を有するビフィドバクテリウム属細菌は、いずれも高い腸内到達度又は回収率を示すものである。なお、上記の２菌株は、いずれも酸、胆汁連続処理後の生残性が３５％以上の優れた菌株である。
【００３９】
また、本発明は、上記酸、胆汁連続処理での高い生残性を有するビフィドバクテリウム属細菌及びシロップを含有する発酵乳飲食品に関する。発酵乳飲食品の形態としては、前記と同じものが挙げられる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４１】
参考例１
ビフィドバクテリウム・ブレーベ４０５２株（B. breve A）を親株とし、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理を施した菌体を嫌気脱脂乳培地にて培養後、その１mLを酸処理液（pH３．８）１０mLに添加し、３７℃で、８分間処理した。その１％量を嫌気脱脂乳培地に接種して、３７℃、２０時間培養した。培養後、１０℃にて４日間保存後、その１mLを酸処理液（pH３．８）１０mLに添加して、同様に処理を行った後、処理後の菌体を脱脂乳培地にて培養した。得られた培養物から単一のコロニーを数株選び、酸耐性を比較したところ、酸耐性の向上した株としてビフィドバクテリウム ブレーベＮ４株（B. breve B）が選抜された。この株は同時に胆汁耐性も向上していた。
【００４２】
嫌気脱脂乳培地の組成
脱脂粉乳                                １２％
酵母エキス                                １％
システイン                                ０．０３％
炭酸カルシウム                            ２％
窒素を２０分吹き込んだ後にゴム栓をし、１１５℃、２０分間オートクレーブ滅菌する。
【００４３】
実施例１
１００℃、９０分間殺菌した１８％全脂乳培地（０．０３％酵母エキス添加）にB.breve Ａ、Ｂ（Ｎ４株）及びB.bifidum Ｃ（ＹＩＴ４００７株）のシードカルチャーを接種し、３４℃にて約２０時間培養して、３種の発酵乳を得た。得られた発酵乳それぞれにぶどう糖果糖液糖を終濃度が８％となるように添加し、これを供試サンプルとした。このサンプルをガラス容器に分注し、ゴム栓をして空気の流入を遮断した状態で、１０℃にて７日間保存した。
【００４４】
これらのサンプルについて、ヒトにおける飲用後の糞便へのビフィズス菌の回収性を測定した。健康な成人男子１８名（平均年令３３歳）を無作為に３群に分け、各菌株で調製した発酵乳を１日１００mL、３日間飲用してもらった。飲用終了日の翌日、便の回収を行い、嫌気希釈水で段階希釈し、選択プレートに生じるコロニー数から回収菌数を算出した。B.breve Ａ、Ｂ株についてはＴ−ＣＢＰＣプレートを、B.bifidum Ｃ株についてはＴ−ＬＣＭプレートを用いた。
【００４５】
嫌気希釈水の組成
リン酸二水素カリウム                      ０．０２２５％
リン酸水素二カリウム                      ０．０２２５％
塩化ナトリウム                            ０．０４５％
硫酸アンモニウム                          ０．０２２５％
塩化カルシウム                            ０．００２２５％
硫酸マグネシウム                          ０．００２２５％
【００４６】
上記組成を蒸留水に溶解した後、窒素を吹き込んで嫌気状態にし、ゴム栓をして空気の流入を遮断してオートクレーブ殺菌（１２１℃、１５分）する。
【００４７】
Ｔ−ＣＢＰＣプレートの組成
ＴＯＳ（ヤクルト製）                      １％
トリプチケースペプトン（ＢＢＬ）          １％
酵母エキス（Difco）                       ０．１％
リン酸二水素カリウム                      ０．３％
リン酸水素二カリウム                      ０．４５％
硫酸アンモニウム                          ０．３％
硫酸マグネシウム                          ０．０２％
システイン塩酸塩                          ０．０５％
Lab-Lemco powder(OXOID)                   ０．１％
寒天（Difco）                             １．５％
【００４８】
上記組成を蒸留水に溶解後、１１５℃、１５分オートクレーブ殺菌する。５０℃まで冷却後、ろ過滅菌したCarbenicillin（Sigma）及びStreptomycinaulfate（Sigma）をそれぞれ終濃度が１μｇ／mL、０．５％となるように添加し、寒天平板を作製する。
【００４９】
Ｔ−ＬＣＭプレートの組成
ろ過滅菌した抗生剤としてCarbenicillin（Sigma）を１μｇ／mL添加する代わりに、Lincomycin（Sigma）を２μｇ／mL添加するほかはＴ−ＣＢＰＣプレートと共通である。
その結果、３株のビフィズス菌で調製した発酵乳の回収性には以下の様な差がみられた。
【００５０】
【表１】
2008237224.tif 000002
【００５１】
実施例２
実施例１の回収性を反映するin vitroのモデル系の検討を行った。この際、簡便さを優先し、処理は３０分から１時間で終了する系を検討した。
まず、消化管の中で最初に通過する胃のモデルとして、酸処理に対する耐性を評価した。酸処理液としては、小林らの方法（日細菌誌、２９、６９１−６９７、１９７４）を参考にし、ビスィズス菌培地に酸を加え、pHを下げた溶液を用いた。
【００５２】
酸処理液の組成
トリプチケースペプトン（ＢＢＬ）          １％
酵母エキス（Difco）                       ０．５％
トリプトース（Difco）                     ０．３％
塩化ナトリウム                            ０．２％
クエン酸−アンモニウム                    ０．２％
システイン塩酸塩                          ０．０５％
ラクトース                                １％
ピルビン酸                                ０．１％
ツイーン８０                              ０．１％
硫酸マグネシウム                          ０．０５７５％
硫酸第一鉄                                ０．００３４％
硫酸マンガン                              ０．０１２％
【００５３】
上記組成を蒸留水に溶解した後、酢酸等の酸を添加して、pH３〜５．５に調整し、１２１℃、１５分オートクレーブ滅菌する。
酸処理液のpHに関して検討した結果、pHを３．８以上に設定すれば１〜３０分の処理後の生残菌数が測定可能であったため、pH３．８の酸処理液を用いることとした。
pH３．８の酸処理液１０mLに、実施例１で用いた３種のサンプルを１mL加え、３７℃でインキュベートした。処理中に適宜サンプリングを行い、生菌数測定を行った。得られたデータより死滅速度を測定した結果以下のようになった。
【００５４】
【表２】
2008237224.tif 000003
【００５５】
この結果より、酸処理による死滅速度に関してはＢ株が最も良好となり、実施例１に示す実際の飲用回収菌数の順と矛盾がみれらた。
【００５６】
実施例３
次に腸に到達した場合を考えて、胆汁処理に対する耐性を比較した。酸処理と同様、処理時間や生菌数が測定可能かを考慮した場合、oxgallを用いた以下の組成の処理液が適当であると判断した。
【００５７】
胆汁処理液の組成
トリプチケースペプトン（ＢＢＬ）          １％
酵母エキス（Difco）                       ０．５％
トリプトース（Difco）                     ０．３％
リン酸水素二ナトリウム１２水塩            ２．０３％
リン酸二水素ナトリウム２水塩              ０．１５６％
クエン酸二アンモニウム                    ０．２％
システイン塩酸塩                          ０．０５％
ラクトース                                １％
ピルビン酸                                ０．１％
ツイーン８０                              ０．１％
硫酸マグネシウム                          ０．０５７５％
硫酸第一鉄                                ０．００３４％
硫酸マンガン                              ０．０１２％
【００５８】
上記組成を蒸留水に溶解した後、Oxgall(Difco)を０．１〜５％加えて溶解し、水酸化ナトリウム溶液を用いてpH８．０に調整し、１２１℃、１５分オートクレーブ滅菌する。
Oxgallの濃度について検討した結果、Oxgall濃度を１％以下に設定すれば１〜３０分の処理後の生残菌数が測定可能であったため、１％のOxgallを含む胆汁処理液を用いることとした。１％ Oxgallを含む胆汁処理液１０mLに、実施例１で用いた３種のサンプルを１mL加え、３７℃にて３０分間処理し、処理後の生菌数を測定した。得られたデータより、胆汁処理による生残率を算出した結果以下のようになった。
【００５９】
【表３】
2008237224.tif 000004
【００６０】
胆汁に対しての耐性についても、Ｂ株が最も良好で、実際の回収性との矛盾がみられた。
【００６１】
実施例４
消化管を通過する際は、胃と腸を連続して通過することを考慮し、in vitro処理も酸処理と胆汁処理を連続して行ってみた。この酸、胆汁連続処理の場合は、酸の処理液のpHを４．３以上にし、胆汁処理液に含まれるOxgall濃度を１％と設定すれば処理後の生残菌数の測定が可能であった。すなわち、以下のような処理を酸胆汁連続処理として行った。
pH４．３に酢酸を用いて調整した酸処理液１０mLに、実施例１で用いたシロップ入り発酵乳を１mL加え、３７℃にて３０分間処理した。処理後の酸処理液１mLをただちに１％ Oxgallを含む胆汁処理液に添加し、更に３７℃、３０分間処理した。この酸胆汁連続処理後の菌の生残率を３株間で比較すると以下のようになった。
【００６２】
【表４】
2008237224.tif 000005
【００６３】
この連続処理による評価では、実施例１に示す実際の回収性の順との一致がみれらた。つまり、酸、又は胆汁の単独処理では処理後の生残率はＢ株が最も高かったのに対し、酸、胆汁連続処理では処理後の生残率はＣ株が最も高く、実際の飲用回収性との一致が見られた。よって、in vitro 連続処理の結果をもとに飲用回収性を予測できる可能性があることが見い出された。
【００６４】
実施例５
この連続処理による評価を、以下の方法で胆汁耐性を付与した育種株B.breve ＮＥ株（Ｄ株）において行った。
B. breve Ａ株を元株として、まず変異処理を行った。５μｇ／mL ＮＴＧを含む５０mMリン酸緩衝液（pH７．０）と、B. breve の洗浄菌体を１：１で混合し、３７℃で３０分処理したのち、リン酸緩衝液（pH７．０）で２回洗浄した。この菌体を栄養培地に１％接種し、３７℃で１６時間培養した。
このＮＴＧ処理した菌体に、更にＥＭＳ処理を行った。０．４％ ＥＭＳを含む５０mM リン酸緩衝液（pH７．０）と上記培養菌体を１：１で混合し、３７℃で３０分処理したのち、リン酸緩衝液（pH７．０）で２回洗浄した。この菌体を栄養培地に１％接種し、３７℃で１６時間培養した。
【００６５】
この菌体を初発の種菌（０．０３％酵母エキス添加）としてシードカルチャーを作製し、１００℃、９０分間滅菌した１８％全脂乳培地に接種し、３４℃にて約２０時間培養して発酵乳を調製した。ここに、終濃度が８％になるようにぶどう糖果糖液糖を加え、ガラス容器に分注した後、ゴム栓をして１０℃、１０日間保存した。保存後のサンプルを１０mLとり、実施例４に示す組成の２％ Oxgallを含む胆汁処理液１００mLに加え、３７℃、３０分間胆汁処理した。処理後、５０００×ｇ、１０分間遠心して菌体を回収し、寒天平板に塗抹し、得られた培養物から単一コロニーを数株選び、耐性の向上した、Ｄ株を得た。
この菌株とＣ株を用い、実施例１と同様にシロップ入り発酵乳を調製し、１０℃、７日間保存したサンプルを用いて実施例４と同様の方法により酸胆汁連続耐性を比較すると以下の様な結果となった。
【００６６】
【表５】
2008237224.tif 000006
【００６７】
これらのサンプルについて同時に、飲用試験を行った。健康成人１２名を２群に分け、実施例５で調製したシロップ入り発酵乳２種をそれぞれ１日１００mL、３日間飲用してもらった。飲用終了日の翌日、便の回収を行い、嫌気希釈水で段階希釈し、選択プレートに生じるコロニー数から回収菌数を算出した。B.breve Ｄ株についてはＴ−ＣＢＰＣプレートを、B.bifidum Ｃ株についてはＴ−ＬＣＭプレートを用いた。その結果を以下に示す。
【００６８】
【表６】
2008237224.tif 000007
【００６９】
これらの結果より、胆汁処理のみを行って育種したＤ株は、酸胆汁連続処理後の生残性が２０％には至らず、飲用回収菌数も１×１０7 に満たないことがわかった。
【００７０】
実施例６
連続処理による耐性評価と飲用回収性が相関する可能性が高いことが見出されたので、連続処理による菌株の育種を行い、得られた耐性株の飲用回収性について検討した。
Ａ株を元株としてシードカルチャーを作製し、１３５℃、３．５秒ＵＨＴ殺菌した２０％全脂乳（０．０３％酵母エキス添加）に接種し、３４℃にて約２０時間培養して発酵乳を得た。ここに、パラチノースを終濃度が１０％になるように加え、ガラス容器に分注し、ゴム栓をして空気の流入を遮断した状態で、１０℃、１１日間保存した。保存後のサンプルを１０mLとり、実施例４に示す組成のpH４．３に調製した酸処理液１００mLに添加し、３７℃にて３０分間処理した。処理液の１０mLをただちに１％ Oxgallを含む胆汁処理液に加え、３７℃にて３０分間処理した。この後、５６４０×ｇで１０分間遠心して菌体を回収し、寒天平板に塗抹し、得られた培養物から単一のコロニーを数株選び、酸、胆汁連続耐性の向上した菌株 B. breve ＹＩＴ４１２５株（以下、４１２５株ともいう）及びＹＩＴ４１２６株（以下、４１２６株ともいう）を得た。
【００７１】
これらの株及びＡ株を用い、実施例６冒頭と同様の方法でシロップ入り発酵乳を調製、１０℃にて７日間保存後、実施例４と同様の方法により酸胆汁連続処理後の生残菌数を求めた。
また、このサンプルについて飲用試験も行った。健康な成人男子１０名を２群に分け、４１２５株又はＡ株で調製したサンプルのいずれかを１日１００mL、３日間飲用してもらい、飲用終了の翌日の便を回収、投与菌の回収性をＴ−ＣＢＰＣプレートを用いて測定した。１週間の間隔を置いて各群のボランティアに、前回と異なるサンプルを飲用してもらい、回収菌数を求めた。この２回分の結果は菌株ごとにまとめ、その平均値を回収菌数とした。
以上の保存７日目の製品における酸、胆汁連続処理後の生残性結果と、飲用回収性結果、及び７日間保存中の製品中の生菌数の変化率を表７に示した。なお、この場合の変化率とは、低温保存中の１日あたりに減少する生菌数を対数で表したものである。
【００７２】
【表７】
2008237224.tif 000008
【００７３】
ここで得られた４１２５株及び４１２６株は、酸胆汁耐性が２０％以上であった。また、４１２５株の飲用時の回収菌数は１×１０7 以上であった。
更に、保存中の製品中生菌数の変化率も小さく、高菌数が維持されていた。
以上の結果から、この酸胆汁連続処理後の生残性が２０％以上であれば、飲用時の回収菌数が１０7 cfu/mLになることがわかった。
上記サンプルについて、引き続き１０℃、３週間の保存試験を行った。３週間保存後の製品中生菌数の生残率を表８に示した。
【００７４】
【表８】
2008237224.tif 000009
【００７５】
得られた４１２５株は３週間保存しても製品中の菌の生残率が良好であった。
【００７６】
実施例７
次に市販製品について検討を行った。市販のシロップ入りビフィドバクテリウム属細菌含有発酵乳（発酵乳Ｅ）及び４１２５株により作製した実施例６の発酵乳（いずれも７日保存相当）の酸胆汁連続耐性を実施例４と同様に測定した。
同時に健康成人１名がそれぞれの製品を１週間の間隔を空けて昼食後に飲用し、翌日の便に含まれる製品由来のビフィドバクテリウム属細菌数を測定した。製品由来のビフィドバクテリウム属細菌数は、まずＴＯＳプレート（実施例１のＴ−ＣＢＰＣプレートを抗生物質を加えずに作製したもの）で、糞便中のビフィドバクテリウム属細菌のみを選択的に生育させ、その中からRandam Amplified Polymorphic DNA Fingerprinting(RAPD法)を用いて製品由来のビフィドバクテリウム属細菌を同定し、その存在割合から回収菌数を算出した。結果を表９に示す。
【００７７】
【表９】
2008237224.tif 000010
【００７８】
市販のシロップ入り発酵乳についても、酸、胆汁連続処理後の生残率が２０％未満であり、飲用回収率も１×１０7 cfu/mLに満たなかった。