(57)【要約】【課題】生体適合性に優れ、安全にかつ早期に組織再生が可能な組織再生用組成物を提供すること。【解決手段】本発明の組織再生用組成物は、キトサン及びセリシンを含有することを特徴とする。これにより、良好な生体適合性を有し、細胞増殖性や細胞分化能に優れることから、安全にかつ早期に組織再生をすることが可能になる。したがって、皮膚、血管、神経、骨、軟骨、食道、弁、その他臓器等の再生のために直接使用することが可能であり、例えば、組織培養におけるスキャフォールドとして使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キトサン及びセリシンを含有する、組織再生用組成物。
【請求項２】
キトサンとセリシンとの含有割合が重量比で９０〜６０：１０〜４０である、請求項１記載の組織再生用組成物。
【請求項３】
請求項１又は２記載の組織再生用組成物からなる、スキャフォールド。
【請求項４】
請求項１又は２記載の組織再生用組成物からなる、創傷治癒剤。
【請求項５】
請求項３記載のスキャフォールドを細胞に接触させて再生された組織構造体。
【請求項６】
キトサンと、セリシンと、溶媒とを含有する混合溶液を凍結乾燥又は凍結ゲル化に供する、組織再生用組成物の製造方法。
【請求項７】
混合溶液が酸成分を含む、請求項６記載の組織再生用組成物の製造方法。
【請求項８】
凍結乾燥又は凍結ゲル化に供する前に混合溶液を予備凍結する、請求項６又は７記載の組織再生用組成物の製造方法。
【請求項９】
凍結乾燥に供した後に凍結乾燥物を中和する、請求項７又は８記載の組織再生用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織再生用組成物及びそれを用いたスキャフォールドに関する。
【背景技術】
【０００２】
重度の熱傷による皮膚の損傷や瘢痕、床ずれによる褥瘡、糖尿病性潰瘍、重症アトピー性皮膚炎、交通事故による皮膚の損傷などによる皮膚欠損には、従来から、本人の健康皮膚を移植、あるいは自家培養皮膚の移植などが行われてきた。しかし、真皮まで達するような重度の損傷の場合、移植皮膚の生着率が必ずしも良好ではなく再移植が必要となる場合があるなど、患者に与える負担は少なからず、また自家培養は緊急時に対応できないなど、必ずしも満足のいくものではなかった。
【０００３】
近年、組織工学や再生医工学の進歩により、生体から取り出した細胞多分化能や自己複製能を有する細胞（幹細胞）を生体組織の欠損部等に移植して目的組織を再生する研究が行なわれている。細胞を増殖させるべく、スキャフォールド（足場材料）の利用が検討されているが、スキャフォールドは脂肪族ポリエステルやコラーゲンといった生体吸収性材料を含有する多孔性の組織再生用組成物から構成されている（特許文献１及び２）。これにより、その孔内に細胞を播種して増殖させ、これを生体に移植することにより、生体内で組織再生が起こると共に、足場である生体吸収性材料が徐々に生体内で分解吸収される結果、細胞の増殖に利用した足場をそのまま増殖細胞と共に生体へ移植することが可能になると考えられる。
【特許文献１】特開２００４−７５５４７号公報
【特許文献２】特開２００５−２２９８７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このため、組織再生用組成物やスキャフォールドには、生体適合性や安全性の他、早期に組織再生することが可能であるなどの特性が求められているが、従来の組織再生用組成物やスキャフォールドは必ずしも十分に満足できるものではなかった。
【０００５】
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は生体適合性に優れ、安全にかつ早期に組織再生が可能な組織再生用組成物及びそれを用いたスキャフォールドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記問題点を解決すべく鋭意検討した結果、キトサン及びセリシンを含有する組織再生用組成物が細胞増殖性や細胞分化能に優れるため、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）キトサン及びセリシンを含有する、組織再生用組成物。
（２）キトサンとセリシンとの含有割合が重量比で９０〜６０：１０〜４０である、上記（１）記載の組織再生用組成物。
（３）上記（１）又は（２）記載の組織再生用組成物からなる、スキャフォールド。
（４）上記（１）又は（２）記載の組織再生用組成物からなる、創傷治癒剤。
（５）上記（３）記載のスキャフォールドを細胞に接触させて再生された組織構造体。
（６）キトサンと、セリシンと、溶媒とを含有する混合溶液を凍結乾燥又は凍結ゲル化に供する、組織再生用組成物の製造方法。
（７）混合溶液が酸成分を含む、上記（６）記載の組織再生用組成物の製造方法。
（８）凍結乾燥又は凍結ゲル化に供する前に混合溶液を予備凍結する、上記（６）又は（７）記載の組織再生用組成物の製造方法。
（９）凍結乾燥に供した後に凍結乾燥物を中和する、上記（７）又は（８）記載の組織再生用組成物の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の組織再生用組成物は、生体適合性の良好なキトサン及びセリシンを含有することから、生体適合性だけでなく、安全性にも優れるようになる。また、本発明の組織再生用組成物は多孔性を有し、細胞増殖性や細胞分化能に優れることから、早期に組織再生をすることが可能になる。
したがって、皮膚、血管、神経、骨、軟骨、食道、弁、その他臓器等の再生のために直接使用することが可能であり、また、in vitro又はin vivoにおける、組織培養におけるスキャフォールドとして使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
（組織再生用組成物）
本発明の組織再生用組成物は、キトサン及びセリシンを含有することを特徴とする。以下、構成材料について説明する。
キトサンは、主にカニやエビ等の甲殻類をはじめ、昆虫、貝、キノコ等から得られるキチンを脱アセチル化して得られる多糖類であり、通常、脱アセチル化度が６０％以上のものをいうが、本発明においては、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上のものが使用される。キチンには分子結晶構造の違いによってα型、β型、γ型の３種類存在するが、いずれのキチンから得られたキトサンを使用することができる。中でも、細胞増殖性や細胞分化能に優れる点でβ型が好適である。なお、脱アセチル化度における「％」は、脱アセチル化によりキチン分子中のアセトアミド基がアミノ基に変換され、結果としてキチン分子の繰返し単位（Ｎ-アセチルグルコサミン残基）１００個あたりに存在するアミノ基の割合を示す。
キトサンは、製造方法によって、例えば、３０，０００〜１，０００，０００以上の重量平均分子量（Ｍｗ）のものが存在するが、本発明においては、ひび割れが防止の観点から、概ね１，０００，０００前後（好ましくは５００，０００〜１，０００，０００、より好ましくは７００，０００〜１，０００，０００）のものが好適に使用される。このようなキトサンは、商業的に入手可能である。
【００１０】
セリシンは、蚕の繭中にフィブロインを取り囲むかたちで２０〜３０％含まれており、複数のアミノ酸を含むタンパク質である。本発明においては、セリンを主成分として含有するものであれば特に限定なく使用することができる。
セリシンには、Ｍｗが２０，０００〜５００，０００以上のものが存在するが、本発明においては、好ましくは２０，０００〜５０，０００、より好ましくは２０，０００〜４０，０００のものが使用される。このようなセリシンも、キトサンと同様に商業的に入手することができる。
【００１１】
キトサンとセリシンとの含有割合は特に限定されるものではないが、キトサンが過剰であることが好ましく、例えば、重量比で、好ましくは９０〜６０：１０〜４０、より好ましくは９０〜７０：１０〜３０である。これにより、細胞の再生に好適な孔径を有する組織再生用組成物とすることができ、その結果、細胞増殖性や細胞分化能がより一層高められ、組織再生をより確実に、かつ早期に実現することが可能になる。
【００１２】
本発明の組織再生用組成物は、キトサン及びセリシンの混合物であるが、キトサン及びセリシンの一部において静電結合やファンデルワールス結合等の結合による複合体を形成していてもよい。
【００１３】
本発明の組織再生用組成物には、所望によりキトサン及びセリシン以外の成分を含有していてもよい。例えば、ポリエチレンオキシド、ポリ乳酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等の生体適合性・生分解性ポリマーが挙げられる。なお、これらの成分の含有量は、本発明に影響を与えない範囲で使用目的に応じて適宜設定することができる。
【００１４】
本発明の組織再生用組成物は、多孔性であり、デジタル顕微鏡（キーエンス社製）観察及び走査電子顕微鏡（日立製作所S-2300）観察により、５０〜３００μｍ（好ましくは１００〜２５０μｍ）程度の平均孔径を有することを確認している。このように、本発明の組織再生用組成物は、細胞の侵入に適した孔径を有しているため、孔内に細胞を播種して増殖させることが可能であり、損傷し、欠損した生体組織の再生に有効である。
また、本発明の組織再生用組成物は、膜状又はシート状に成形して創傷治癒剤として利用することが可能であり、これを必要に応じて粘着シートに積層して使用してもよい。
【００１５】
（スキャフォールド）
本発明のスキャフォールドは、上記した組織再生用組成物により構成されるものである。そのため、上記した組織再生用組成物と同様の性状を有する。また、スキャフォールドの形態は特に限定されず、損傷・欠損した生体組織の部位に対応した形状・構造（例えば、膜状、シート状、棒状、チューブ状、バルク状等）に成形され、皮膚、血管、神経、骨、軟骨、食道、弁、その他臓器等の再生のために直接使用し、また、in vitro又はin vivoにおける、組織培養に使用することができる。そして、スキャフォールドを細胞に接触させることで、再生された組織構造体を得ることができる。
【００１６】
（組織再生用組成物の製造方法）
次に、本発明の組織再生用組成物の製造方法を説明する。
本発明の組織再生用組成物の製造方法は特に限定されないが、キトサンと、セリシンと、溶媒を含有する混合溶液を調製し、これを凍結乾燥又は凍結ゲル化に供することを特徴とする。なお、混合溶液には酸成分を含有することが好ましい。これにより、キトサンの溶解性を高めることができる。以下、酸成分を含む好適な製造方法に即して説明する。
本発明においては、凍結乾燥又は凍結ゲル化に供する前に混合溶液を凍結処理（予備凍結）してもよい。また、凍結乾燥又は凍結ゲル化に供した後に、後処理として、凍結乾燥物を中和・水洗又は凍結ゲル化物を水洗し、これを２次乾燥することが好ましい。これにより、多孔性の組織再生用組成物を得ることができる。
【００１７】
（混合溶液の調製）
先ず、キトサン及びセリシンの各溶液を調製する。キトサン及びセリシンを溶解すべき溶媒としては、キトサン及びセリシンをそれぞれ溶解できるものであれば特に限定なく使用できるが、例えば、キトサンの場合には酸性水溶液が好適に使用され、セリシンの場合には蒸留水が好適に使用される。
キトサンを溶解すべき酸性水溶液の酸成分としては、人体に影響がなく、かつｐＨが２〜６（好ましくは３〜５）程度の弱酸であれば、有機酸及び無機酸のいずれをも使用することができる。中でも、有機酸が好適に使用される。このような有機酸としては、蟻酸、酢酸、酪酸、乳酸，コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、等が挙げられ、中でも酢酸、クエン酸、リンゴ酸が好適である。酸の使用量は、キトサン１００重量部に対して、好ましくは２０〜８０重量部、より好ましくは４０〜７０重量部である。
キトサン溶液及びセリシン溶液の各濃度は、溶液の全重量基準で、例えば、１〜２重量％（好ましくは１．２〜１．５重量％）である。そして、上記濃度に調製されたキトサン溶液及びセリシン溶液を所望の割合で混合する。キトサン及びセリシンの配合割合は特に限定されるものではないが、キトサンが過剰であることが好ましく、重量比で、より好ましくは９０〜６０：１０〜４０、更に好ましくは９０〜７０：１０〜３０である。キトサン及びセリシンは、上記したＭｗのものが好適に使用される。
【００１８】
（予備凍結）
混合溶液を容器に入れ、これを所定温度に冷却し凍結処理物を得る工程である。予備凍結には、例えば、市販の冷蔵庫や凍結乾燥機を用いることができる。容器としては、金属製及びプラスチック製のいずれの材質のものであってもよい。
凍結温度は溶媒の凝固点よりも低い温度に設定すればよいが、例えば、混合溶液の溶媒として水を含む場合、好ましくは−８０〜−１０℃、より好ましくは−４０〜−２０℃である。また、凍結時間は、混合溶液の濃度や凍結温度により一様ではないが、好ましくは１２〜３６時間、より好ましくは２０〜３０時間である。予備凍結は、凍結乾燥の成否を左右する重要な前処理工程であるため、十分に行なうことが好ましい。
【００１９】
（凍結乾燥）
凍結処理物を、減圧状態で一次乾燥する工程である。凍結乾燥には、例えば、市販の凍結乾燥機を用いることができる。この工程では、例えば、混合溶液の溶媒として水を含む場合、凍結処理物中の水分が氷のまま融解することなく昇華除去される。すなわち、凍結乾燥においては、凍結処理物の表面から水分の昇華が始まるが、徐々に乾燥部分と未乾燥部分とに分かれて、その境目で昇華が起こるようになる。そして、昇華面が次第に凍結処理物の表面から奥へと延びていき、通路が形成される。その結果、凍結処理物に多孔性を付与することが可能になる。
処理温度は、混合溶液の溶媒の種類により一様ではないが、例えば、混合溶液の溶媒として水を含む場合、好ましくは−５０〜−１０℃、より好ましくは−４０〜−２０℃である。また、減圧度は、好ましくは０．１５〜１．５Ｐａ（１〜１１×１０-3ｍｍＨｇ）、より好ましくは０．３〜１．０Ｐａ（２〜７×１０-3ｍｍＨｇ）である。処理時間は、処理温度や減圧度により一様ではないが、好ましくは１２〜７２時間、より好ましくは２０〜４０時間である。
凍結乾燥は、凍結機内で予備凍結した凍結処理物を凍結乾燥機に移して行なってもよいが、予備凍結を凍結乾燥機内で行なった後、凍結乾燥をそのまま凍結乾燥機内で凍結温度や減圧度を設定し直して行なってもよい。
【００２０】
（凍結ゲル化）
凍結処理物を凍結状態で強アルカリ溶液に浸漬してゲルを形成させる工程である。凍結ゲル化により酸成分が中和され、高分子鎖が凍結状態を維持したまま再生されることにより凍結ゲル化物に多孔性が付与される。同時に凍結水もゲル化液中に溶出する。
強アルカリとしては、アルカリ金属の水酸化物が挙げられ、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、等が例示される。中でも、水酸化ナトリウムが好適に使用される。また、溶媒としては、水、アルコール、等が挙げられ、これらは１種単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等の一価アルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール等が挙げられ、一価アルコールが好適に使用される、中でも、水及びアルコールの組み合わせが好ましく、水及び一価アルコール（特に、低級アルコール）の組み合わせがより好ましく、水及びエタノールの組み合わせが更に好ましい。なお、水及びアルコールの配合割合は、重量比で好ましくは３０：７０〜７０：３０であり、より好ましくは４０：６０〜６０：４０である。アルカリの濃度は、溶液の全重量基準で、好ましくは１〜７重量％、より好ましくは２〜４重量％である。
強アルカリ溶液への浸漬は冷却状態で行なわれるが、例えば、溶媒が水とアルコール混合液である場合、好ましくは−５０〜−１０℃、より好ましくは−３０〜−２０℃である。また、浸漬時間は、凍結処理物の組成や冷却温度により一様ではないが、好ましくは１５〜４０時間、より好ましくは２０〜３０時間である。
【００２１】
（中和）
凍結乾燥物を中和する工程である。
凍結乾燥後においては、凍結乾燥物をアルカリに接触させて中和する。アルカリとしては、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられ、中でもアンモニアが好ましく、アンモニアの飽和蒸気がより好ましい。アルカリ濃度は、好ましくは３〜１０重量％、より好ましくは５〜８重量％である。また、処理時間は、使用するアルカリの種類により一様ではないが、例えば、アンモニアの飽和蒸気の場合、好ましくは２〜５日、より好ましくは３〜４日である。
なお、凍結ゲル化後においては、ゲル化時点で酸成分が中和されているため必ずしも中和工程を要しないが、生成した塩を除去するために凍結ゲル化物を水洗する。
【００２２】
（２次乾燥）
中和処理物を乾燥する工程であるが、例えば、混合溶液の溶媒として水を含む場合、中和処理物に吸着している分子状態の水を除去して乾燥する工程である。２次乾燥工程においては、中和処理物を必要により加熱してよく、また室温程度（２５℃程度）の温度で自然乾燥してもよい。乾燥時間は、乾燥温度により一様ではないが、好ましくは１２〜３６時間、より好ましくは２０〜３０時間である。これにより、凍結時の形状（例えば、多孔性）を保持した、スポンジのような感触の組織再生用組成物を得ることができる。
【００２３】
（スキャフォールド・創傷治癒剤の製造方法）
本発明のスキャフォールド及び創傷治癒剤は、組織再生用組成物と同様の方法により製造することが可能であるが、上記した混合溶液を所望形状の容器内で予備凍結、又は凍結乾燥若しくは凍結ゲル化に供するか、あるいは上記した製法により得られた組織再生用組成物を所望形状に加工することで製造することができる。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を実施例によって更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、キトサンの脱アセチル化度を除き、特に断りのない限り、「％」は「重量％」を意味する。また、本実施例で使用した材料は、以下のとおりである。
α−キトサン（α−ＣＳ）：Ｍｗ１，０００，０００、ＤＡＣ９６％、カニ由来キトサン、片岡チッカリン（株）製
β−キトサン（β−ＣＳ）：Ｍｗ９６０，０００、ＤＡＣ９０％、イカ由来キトサン、Ｄｏｎｇ社製
セリシン（ＳＥＲ）：Ｍｗ３０，０００、商品名；低分子量セリシン、セーレン（株）製
酢酸：特級、ナカライテスク（株）製
水酸化ナトリウム：特級、ナカライテスク（株）製
アンモニア水：濃度２５％、メルク・ジャパン（株）製
【００２５】
（実施例１）
α−ＣＳをキトサン１００重量部に対して５０重量部の酢酸を含む水溶液に溶解して１．２％のα−ＣＳ溶液を調製した。他方、ＳＥＲを蒸留水に溶解して１．２％のＳＥＲ溶液を調製した。次いで、得られたα−ＣＳ溶液及びＳＥＲ溶液を、ＣＳ／ＳＥＲ（重量比）が８０／２０になるように混合してα−ＣＳ／ＳＥＲ溶液を得た。
次いで、アクリル製容器（内法：長径４０ｍｍ、短径２０ｍｍ、深さ０．５ｍｍ）にα−ＣＳ／ＳＥＲ溶液を満たし、−２６℃の冷蔵庫内で１日予備凍結した。次いで、以下の凍結乾燥法により凍結乾燥物を得た。すなわち、凍結処理物を凍結乾燥機（形式：ＮＥＯ ＣＯＯＬ、ヤマト科学（株）製）により、−２６℃、０．３Ｐａ（２×１０-3ｍｍＨｇ）の条件で１日凍結乾燥して凍結乾燥物を得た。次いで、得られた凍結乾燥物をアクリル製容器から剥がし、それを密閉可能な容器内に入れ、５％ＮＨ３飽和蒸気中で４日間中和した。そして、中和処理物を取り出し、それを１日間自然乾燥することで膜厚０．１５ｍｍ、平均孔径２００μｍの組織再生用組成物からなるスキャフォールドを得た。なお、孔径は、デジタル顕微鏡（キーエンス社製）観察及び走査電子顕微鏡（日立製作所S-2300）観察により得たものである。得られたスキャフォールドの写真を図１に示す。
【００２６】
（実施例２）
実施例１と同様の方法により、α−ＣＳ／ＳＥＲ（重量比）が８０／２０の溶液を得、次いで得られた溶液を−２６℃の冷蔵庫内で１日予備凍結した。次いで、以下の凍結ゲル化法により凍結ゲル化物を得た。すなわち、凍結処理物を−２６℃で３％ＮａＯＨを含むエタノール／水（重量比１／１）溶液に１日浸漬して凍結ゲル化物を得た。そして、凍結ゲル化物を水洗した後、１日間自然乾燥することで、膜厚０．１２ｍｍ、平均孔径１００μｍの組織再生用組成物からなるスキャフォールドを得た。
【００２７】
（実施例３）
α−ＣＳの代わりにβ−ＣＳを用いたこと以外は、実施例１と同様の方法に膜厚０．１５ｍｍ、平均孔径２００μｍの組織再生用組成物からなるスキャフォールドを得た。
【００２８】
（実施例４）
α−ＣＳの代わりにβ−ＣＳを用いたこと以外は、実施例２と同様の方法により膜厚０．１２ｍｍ、平均孔径１００μｍの組織再生用組成物からなるスキャフォールドを得た。
【００２９】
（実施例５）
α−ＣＳの代わりにβ−ＣＳを用い、β−ＣＳ／ＳＥＲ（重量比）を９０／１０にしたこと以外は、実施例２と同様の方法により膜厚０．１２ｍｍ、平均孔径１００μｍの組織再生用組成物からなるスキャフォールドを得た。
【００３０】
（実施例６）
α−ＣＳの代わりにβ−ＣＳを用い、β−ＣＳ／ＳＥＲ（重量比）を７０／３０にしたこと以外は、実施例２と同様の方法により膜厚０．１２ｍｍ、平均孔径１００μｍの組織再生用組成物からなるスキャフォールドを得た。
【００３１】
（比較例１）
α−ＣＳ／ＳＥＲ（重量比）を１００／０にしたこと以外は、実施例１と同様の方法により膜厚０．１５ｍｍ、平均孔径２００μｍのスキャフォールドを得た。
【００３２】
（比較例２）
α−ＣＳの代わりにβ−ＣＳを用い、β−ＣＳ／ＳＥＲ（重量比）を１００／０にしたこと以外は、実施例１と同様の方法により膜厚０．１５ｍｍ、平均孔径２００μｍのスキャフォールドを得た。
【００３３】
（比較例３）
α−ＣＳ／ＳＥＲ（重量比）を１００／０にしたこと以外は、実施例２と同様の方法により膜厚０．１２ｍｍ、平均孔径１００μｍのスキャフォールドを得た。
【００３４】
（比較例４）
α−ＣＳの代わりにβ−ＣＳを用い、β−ＣＳ／ＳＥＲ（重量比）を１００／０にしたこと以外は、実施例２と同様の方法により膜厚０．１２ｍｍ、平均孔径１００μｍのスキャフォールドを得た。
【００３５】
（評価）
１．広角Ｘ線回折（ＷＡＸＤ）測定
実施例４で得たスキャフォールドを折り畳み、大きさ１０×３（ｍｍ）、厚さ０．１ｍｍの試料を得、これをデシケータ中で十分に乾燥した。
【００３６】
（１）ＷＡＸＤ強度測定
乾燥後の試料を用いて、赤道線（β＝０°）上についてＷＡＸＤ強度測定を行なった。測定結果を図２に示す。また、セリシン粉末について同様のＷＡＸＤ強度測定を行なった結果を図３に示す。
（測定条件）
装置：ＲＩＮＴ２１００（理学電機製）
Ｘ線：ＣｕＫα（Ｎｉフィルターろ過） 
管電圧：４０ｋＶ
管電流：２０ｍＡ
走査範囲：２θ  ３〜４０°
スキャンスピード：１°／ｍｉｎ
【００３７】
（２）ＷＡＸＤ写真
乾燥後の試料を用いて、ＷＡＸＤ写真を撮影した。その結果を図４に示す。
（測定条件）
装置：ＸＣ−４０Ｈ（東芝製）
Ｘ線：ＣｕＫα（Ｎｉフィルターろ過） 
管電圧：４０ｋＶ
管電流：２０ｍＡ
照射時間：６時間
コリメータ：０．５ｍｍ径
カメラ長：３２ｍｍ
【００３８】
図２に示すＷＡＸＤ強度測定により、実施例４で得たスキャフォールドは２θ＝１０．８°、１５．３°。２０．５°及び３５．２°に回折ピークを有することが確認された。これは、酢酸、蟻酸、酪酸に溶解したキトサンをキャストしたフィルムをＮａＯＨにより中和したものの回折ピークに似ていた。このことから、実施例４のスキャフォールドも中和されていることが確認された。また、図３よりセリシンは低結晶性であり、図４より実施例４で得たスキャフォールドは結晶性を示すことが確認された。
【００３９】
２．ＦＴ−ＩＲ測定
実施例１〜６及び比較例１〜４で得た各スキャフォールドをデシケータ中で十分に乾燥した後、ＦＴ−ＩＲ測定を行なった。また、キトサン粉末及びセリシン粉末について同様のＦＴ−ＩＲ測定を行なった。測定結果を図５〜９に示す。
【００４０】
図５中、（ａ）は実施例１で得たスキャフォールドのＦＴ−ＩＲ曲線、（ｂ）は実施例２で得たスキャフォールドのＦＴ−ＩＲ曲線をそれぞれ示す。
図６中、（ｃ）は実施例３で得たスキャフォールドのＦＴ−ＩＲ曲線、（ｄ）は実施例４で得たスキャフォールドのＦＴ−ＩＲ曲線、（ｅ）は実施例５で得たスキャフォールドのＦＴ−ＩＲ曲線、（ｆ）は実施例６で得たスキャフォールドのＦＴ−ＩＲ曲線をそれぞれ示す。
図７中、（ｇ）は比較例１で得たスキャフォールドのＦＴ−ＩＲ曲線、（ｈ）は比較例２で得たスキャフォールドのＦＴ−ＩＲ曲線、（ｉ）は比較例３で得たスキャフォールドのＦＴ−ＩＲ曲線、（ｊ）は比較例４で得たスキャフォールドのＦＴ−ＩＲ曲線をそれぞれ示す。
図８中、（ｋ）はα−ＣＳのＦＴ−ＩＲ曲線、（ｌ）はβ−ＣＳのＦＴ−ＩＲ曲線をそれぞれ示す。図９は、ＳＥＲのＦＴ−ＩＲ曲線を示す。
【００４１】
図５〜７のいずれにも１０５０ｃｍ−１付近に吸収ピークがあり、これは多糖類が有するＣ−Ｏ結合に由来するものであって、キトサンを示すものと考えられる。また、図９には１５３０ｃｍ−１と１６５０ｃｍ−１付近に吸収ピークがあり、これらの吸収ピークは図５及び６にも存在するため、これらのピークはセリシンに由来するものと推察される。これにより、実施例１〜６で得たスキャフォールドは、キトサン及びセリシンを含有することが確認された。
【００４２】
３．走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察
実施例１〜２で得たスキャフォールドの表面又は断面をＥ−１０１型イオンスパッタで金属（Ａｕ）蒸着した後、ＳＥＭ観察した。なお、スキャフォールドの断面は、スキャフォールドを液体窒素中に１０分程度入れた後、すばやく取り出してカッターで切断して形成された切断面である。なお、試料は、ＳＥＭ観察前にデシケータ中で十分に乾燥した。測定結果を図１０及び１１に示す。図１０中、（ａ）は実施例１で得たスキャフォールドの表面のＳＥＭ像（×１００）であり、（ｂ）は実施例１で得たスキャフォールドの断面のＳＥＭ像（×１５０）である。また、図１１中、（ａ）は実施例２で得たスキャフォールドの表面のＳＥＭ像（×１００）であり、（ｂ）は実施例２で得たスキャフォールドの断面のＳＥＭ像（×１５０）である。
【００４３】
（測定条件）
装置：Ｓ−２３００（日立製作所製）
加速電圧：２５ｋＶ
ワーキングdistance：２５ｍｍ
【００４４】
（マウスに対する創傷治癒実験）
（１）試料の作製
実施例１〜６及び比較例１で得たスキャフォールドを１０×２０（ｍｍ）程度の大きさに裁断し、それぞれを絆創膏のガーゼを剥がした粘着部に貼付し、絆創膏の４隅を切り取ったものを試料とした（図１２参照）。
【００４５】
（２）創傷の作製
マウスの表皮を剥がすために、脱毛剤を背中に塗り肌が赤くなる状態まで脱脂綿で背中を擦った。その後、表皮を剥がした部分にカミソリで真皮に達する傷を３本入れた。
【００４６】
（３）創傷治癒効果の観察
創傷部にスキャフォールドが接触するように、試料をマウスの体に巻付けた（図１３参照）。創傷処理直後、３、６及び１０日目に試料を剥がし創傷部の治癒状態を観察し、下記基準で評価した。評価結果を表１に示す。
（評価基準）
◎：傷や瘡蓋が見られず、綺麗に治癒している。
○：傷跡は見られないが、表面が少し荒れている。
△：傷跡が見られる。
×：傷が残っている。
【００４７】
【表１】
2008161502.tif 000002
【００４８】
創傷処理直後、３日目、６日目及び１０日目の創傷部の治療状態を撮影した。図１４は実施例１で得たスキャフォールドを用いた結果であり、図１５は実施例２で得たスキャフォールドを用いた結果であり、図１６はコントロール（比較例１で得たスキャフォールドの結果）である。
【００４９】
実施例１〜６で得たスキャフォールドを貼付した場合、試料貼付後３日目には出血が見られなくなっており、また試料貼付後６日目には創傷部位に新しい皮膚が形成されていることが確認された。更に、試料貼付後１０日目には創傷部位の皮膚がきれいに再生されており、皮膚下感染症も発症しなかった。中でも、実施例２及び４で得たスキャフォールドが最も良好な結果を与えた。これにより、実施例１〜６で得たスキャフォールドは、早期に組織再生することが可能であることが確認された。
【００５０】
（４）創傷領域の皮膚断面サンプルの作製及び観察
創傷処理後１０日目のマウスから創傷領域の皮膚を切り取り、それをホルマリンで固定した。そして、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色し、顕微鏡を用いて観察した。図１７及び１８に切り取った皮膚の断面写真を示す。図１７中、（ａ）は皮膚断面を示す図であり、（ｂ）は表皮を剥がした状態の皮膚断面を示す図であり、図１８中、（ａ）は実施例１で得たスキャフォールドを接触させた皮膚断面を示す図であり、（ｂ）は実施例２で得たスキャフォールドを接触させた皮膚断面を示す図であり、（ｃ）はコントロールの皮膚断面を示す図である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】スキャフォールドの一例を示す図である。
【図２】実施例４で得たスキャフォールドのＷＡＸＤ強度曲線を示す図である。
【図３】セリシン粉末のＷＡＸＤ強度曲線を示す図である。
【図４】実施例４で得たスキャフォールドのＷＡＸＤ写真を示す図である。
【図５】実施例１〜２で得たスキャフォールドのＦＴ−ＩＲ曲線を示す図である。
【図６】実施例３〜６で得たスキャフォールドのＦＴ−ＩＲ曲線を示す図である。
【図７】比較例１〜４で得たスキャフォールドのＦＴ−ＩＲ曲線を示す図である。
【図８】α−ＣＳ及びβ−ＣＳのＦＴ−ＩＲ曲線を示す図である。
【図９】ＳＥＲのＦＴ−ＩＲ曲線を示す図である。
【図１０】実施例１で得たスキャフォールドのＳＥＭ像を示す図である。
【図１１】実施例２で得たスキャフォールドのＳＥＭ像を示す図である。
【図１２】創傷治癒実験で使用した試料の一例を示す図である。
【図１３】マウスに試料を貼付した状態を示す図である。
【図１４】実施例１で得たスキャフォールドを用いた場合の治療状態を示す図である。
【図１５】実施例２で得たスキャフォールドを用いた場合の治療状態を示す図である。
【図１６】コントロールの治療状態を示す図です。
【図１７】皮膚の断面写真を示す図である。
【図１８】試料貼付後１０日目のマウスから切り取った皮膚の断面写真を示す図である。
【図２】
2008161502.tif 000003
【図３】
2008161502.tif 000004
【図５】
2008161502.tif 000005
【図６】
2008161502.tif 000006
【図７】
2008161502.tif 000007
【図８】
2008161502.tif 000008
【図９】
2008161502.tif 000009
【図１】
2008161502.tif 000010
【図４】
2008161502.tif 000011
【図１０】
2008161502.tif 000012
【図１１】
2008161502.tif 000013
【図１２】
2008161502.tif 000014
【図１３】
2008161502.tif 000015
【図１４】
2008161502.tif 000016
【図１５】
2008161502.tif 000017
【図１６】
2008161502.tif 000018
【図１７】
2008161502.tif 000019
【図１８】
2008161502.tif 000020