(57)【要約】【課題】小型で低コストえ遺伝子の増幅を行う遺伝子増幅用反応装置を提供する。【解決手段】遺伝子の増幅を行う遺伝子増幅用の反応装置であって、遺伝子を保持して増幅を行わせる反応領域と、該反応領域の温度により発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、検出された蛍光から求められた温度に基づき該反応領域を加熱または冷却する加熱冷却手段とを備えており、かつ該反応領域の少なくとも一部に温度に応答して蛍光を発生する蛍光性温度プローブを備えている遺伝子増幅用反応装置。【選択図】図１（ａ）
2008092860.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料の温度を制御する温度制御装置であって、液体試料を保持して反応を行わせる反応領域と、該反応領域の温度により発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、検出された蛍光から求められた温度に基づき該反応領域を加熱または冷却する加熱冷却手段とを備えており、かつ該反応領域の少なくとも一部に温度に応答して蛍光を発生する蛍光性温度プローブを備えていることを特徴とする温度制御装置。
【請求項２】
前記蛍光性温度プローブは２つ以上のセグメント鎖から構成されるブロックポリマーあるいはグラフトポリマーであって、該ブロックポリマーあるいは該グラフトポリマーのうち、１つ以上のセグメント鎖中に下限臨界共溶温度を有する感熱部位と蛍光性を有する部位の両方を有することを特徴とする請求項１に記載の温度制御装置。
【請求項３】
前記反応領域は基板上に一つ以上備えられた凹型反応容器であることを特徴とする請求項１または２に記載の温度制御装置。
【請求項４】
前記反応領域は基板上に形成された微小流路であることを特徴とする特徴とする請求項１または２に記載の温度制御装置。
【請求項５】
遺伝子の増幅と遺伝子の検出を行う遺伝子増幅および遺伝子検出用の反応装置であって、遺伝子を保持して増幅を行わせる第一の反応領域と、該増幅された遺伝子を保持してハイブリダイゼーション反応を行わせる第二の反応領域と、該第一の反応領域の温度により発生する蛍光と該第二の反応領域のハイブリダイゼーション反応により発生する蛍光とを検出する蛍光検出手段と、検出された蛍光から求められた温度に基づき該第一の反応領域を加熱または冷却する加熱冷却手段とを備えており、かつ該第一の反応領域の少なくとも一部に温度に応答して蛍光を発生する蛍光性温度プローブを備えていることを特徴とする遺伝子増幅用反応装置。
【請求項６】
前記蛍光性温度プローブは２つ以上のセグメント鎖から構成されるブロックポリマーあるいはグラフトポリマーであって、該ブロックポリマーあるいは該グラフトポリマーのうち、１つ以上のセグメント鎖中に下限臨界共溶温度を有する感熱部位と蛍光性を有する部位の両方を有することを特徴とする請求項５に記載の遺伝子増幅用反応装置。
【請求項７】
前記反応領域は基板上に一つ以上備えられた凹型反応容器であることを特徴とする請求項５または６に記載の遺伝子増幅用反応装置。
【請求項８】
前記反応領域は基板上に形成された微小流路であることを特徴とする特徴とする請求項５または６に記載の遺伝子増幅用反応装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料を加熱および冷却する温度制御装置および遺伝子の増幅を行う遺伝子増幅用反応装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子操作技術、生化学分析技術、微量化学反応合成技術の進展に伴い、バイオチップ、遺伝子チップ、遺伝子増幅（ＰＣＲ）システム、および集積化化学分析システムといわれる装置が開発されている。これらの装置は、マイクロマシン技術を遺伝子増幅、生化学反応、および生化学物質合成のために応用したものである。これらの装置に用いる反応容器は寸法が微小であるため、マイクロリットルおよびナノリットル範囲の容量を非常に短時間で所定の温度に調節することができる。
【０００３】
このような微小領域の温度を制御する方法として、反応容器に温度センサーを集積する方法が提案されている（特許文献１）。この提案について、図１０を用いて説明する。反応容器の大きさは、開口部が縦１．２ｍｍ×横１．２ｍｍで深さ０．４２ｍｍ、底面が縦０．６ｍｍ×横０．６ｍｍである。装置の母材はシリコンであり、底面に１０１乃至１０５からなる半導体ペルティエ素子が形成されている。１０１、１０２は拡散法（半導体プロセス）により形成したＰ型およびＮ型半導体、１０３はリード線、１０４はヒータおよび冷却プレート（温調プレート）、１０５は全反応容器共通の定温度接点である。定温度接点１０５を適当な温度に制御しておき、リード線１０３の両端に必要な電圧をかけることにより、１０４に示す温調プレートの温度を反応容器毎に独立に制御可能である。また、リード線に電圧をかけず両端の電位差を測定すればこのペルティエ素子を温度計測用の熱電対として使用することも可能である。
【０００４】
一方、温度によって発光する色が異なる蛍光体を反応溶液中に混在させ、蛍光体の反射光を測定することによって反応溶液の温度を測定する方法が提案されている（特許文献２）。
【０００５】
遺伝子増幅の技術においては、微量なＤＮＡを増幅させる方法としてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法があり、このＰＣＲ法では温度上昇、温度保持、温度下降、温度保持、温度上昇、温度保持のサイクルを繰り返してＤＮＡを増幅させる。
【０００６】
ＰＣＲ法の時間短縮のため、ＤＮＡを入れる容器（チャンバ）の体積をマイクロ化したものがある。例えば、複数のマイクロチャンバ内にペルティエ素子を作り込み、各マイクロチャンバ内を独立に温度制御可能としたものが提案されているが、この装置の構造は複雑で高価なものとなる。
【特許文献１】特許第０３０９９５１３号公報
【特許文献２】特開２００１−１３６９５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、この様な背景技術に鑑みてなされたものであり、構造の簡単な反応器を用いて、液体試料の温度を正確に制御する温度制御装置を提供するものである。また、小型で低コストで遺伝子の増幅を行う遺伝子増幅用反応装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明の温度制御装置は、液体試料の温度を制御する温度制御装置であって、液体試料を保持して反応を行わせる反応領域と、該反応領域の温度により発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、検出された蛍光から求められた温度に基づき該反応領域を加熱または冷却する加熱冷却手段とを備えており、かつ該反応領域の少なくとも一部に温度に応答して蛍光を発生する蛍光性温度プローブを備えていることを特徴とする。
【０００９】
上記課題を解決するための本発明の遺伝子増幅用反応装置は、遺伝子の増幅と遺伝子の検出を行う遺伝子増幅および遺伝子検出用の反応装置であって、遺伝子を保持して増幅を行わせる第一の反応領域と、該増幅された遺伝子を保持してハイブリダイゼーション反応を行わせる第二の反応領域と、該第一の反応領域の温度により発生する蛍光と該第二の反応領域のハイブリダイゼーション反応により発生する蛍光とを検出する蛍光検出手段と、検出された蛍光から求められた温度に基づき該第一の反応領域を加熱または冷却する加熱冷却手段とを備えており、かつ該第一の反応領域の少なくとも一部に温度に応答して蛍光を発生する蛍光性温度プローブを備えていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の温度制御装置を用いることで、液体試料の温度を正確に制御することができる。これにより、反応器にヒータや熱電対を集積する必要がないため、反応器の構造を簡素化できる。また、温度に応答して蛍光を発する蛍光体を反応領域に固定するため、反応溶液に蛍光体を混在させる必要がなく、蛍光体の使用量を低減できる。
【００１１】
また、本発明の遺伝子増幅用反応装置は、小型で低コストで遺伝子の増幅を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の温度制御装置は、液体試料の温度を制御する温度制御装置であって、液体試料を保持して反応を行わせる反応領域と、該反応領域の温度により発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、検出された蛍光から求められた温度に基づき該反応領域を加熱または冷却する加熱冷却手段とを備えており、かつ該反応領域の少なくとも一部に温度に応答して蛍光を発生する温度応答性を有する蛍光性温度プローブを備えている。
【００１３】
前記蛍光性温度プローブは２つ以上のセグメント鎖から構成されるブロックポリマーあるいはグラフトポリマーであって、該ブロックポリマーあるいは該グラフトポリマーのうち、１つ以上のセグメント鎖中に下限臨界共溶温度を有する感熱部位と蛍光性を有する部位の両方を有することが好ましい。
【００１４】
前記反応領域は基板上に一つ以上備えられた凹型反応容器であることが好ましい。
前記反応領域は基板上に形成された微小流路であることが好ましい。
本発明の遺伝子増幅用反応装置は、遺伝子の増幅を行う遺伝子増幅用の反応装置であって、遺伝子を保持して増幅を行わせる反応領域と、該反応領域の温度により発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、検出された蛍光から求められた温度に基づき該反応領域を加熱または冷却する加熱冷却手段とを備えており、かつ該反応領域の少なくとも一部に温度に応答して蛍光を発生する温度応答性を有する蛍光性温度プローブを備えている。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。なお、実施例中における、寸法、形状、材質、作製方法は一例であり、本発明の用件を満たす範囲内であれば、設計事項として任意に変更することができる。
【００１６】
なお、本発明は遺伝子増幅反応をはじめ、生化学反応、生化学物質合成および化学反応合成に利用することも可能である。
実施例１
図１は、実施例１の遺伝子増幅用反応装置を説明する図である。本実施例では反応領域として基板上に凹型反応容器が形成された反応器を用いる。以下、遺伝子増幅用反応装置と前記装置に用いる反応器について説明する。
【００１７】
［遺伝子増幅用反応装置］
図１は本発明の遺伝子増幅用反応装置の概略図である。図１（ａ）は遺伝子増幅用反応装置の側面図、図１（ｂ）は遺伝子増幅用反応装置の平面図を示す。遺伝子増幅用反応装置１０は、共焦点レーザー蛍光スキャナー１１、ペルティエ素子１２、遺伝子増幅用反応器１３、遺伝子検出用反応器１４、反応溶液保存容器１５、洗浄液保存容器９１、蛍光標識液保存容器９２、ピペッタ１６、反応器搬送用Ｘ−Ｙステージ１７、ピペッタ用Ｘ−Ｙステージ９３、計測用Ｘ−Ｙステージ９４、搬送アーム１８および制御器１９で構成される。
【００１８】
本発明の装置を用いて遺伝子増幅反応および遺伝子検出を行う場合の流れについて説明する。
（１）遺伝子増幅反応を行う工程
ピペッタ１６により反応溶液を遺伝子増幅用反応器１３に導入する。次に、反応器搬送用Ｘ−Ｙステージ１７により遺伝子増幅用反応器１３をペルティエ素子１２上に搬送する。ペルティエ素子１２上で、反応溶液を加熱又は冷却する工程を繰り返すことにより、遺伝子増幅反応を行う。
【００１９】
（２）遺伝子検出を行う工程
（１）の工程を経た遺伝子増幅用反応器１３を反応器搬送用Ｘ−Ｙステージ１７によりもとの位置に戻し、ピペッタ１６により反応溶液を回収する。該回収した反応溶液を蛍光標識し、該蛍光標識した反応溶液をピペッタ１６により遺伝子検出用反応器１４に導入する。次に、反応器搬送用Ｘ−Ｙステージ１７により再びペルティエ素子１２上に搬送する。ペルティエ素子１２上で、ハイブリダイゼーションを行った後、遺伝子検出を行う。
【００２０】
遺伝子増幅用反応器および遺伝子検出用反応器について詳細に説明する。
［遺伝子検出用反応器］
遺伝子検出用反応器１４は、スライドガラスにＤＮＡ（デオキリボ核酸）又はＲＮＡ（リボ核酸）が固定されたものである。本発明の遺伝子増幅用反応装置は、遺伝子検出用反応器として市販のＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いてもよい。
【００２１】
次に、遺伝子増幅用反応器について説明する。
［遺伝子増幅用反応器の構成および作製方法］
遺伝子増幅用反応器の構成について説明する。図２（ａ）に遺伝子増幅用反応器の平面図、図２（ｂ）に遺伝子増幅用反応器の拡大図、図２（ｃ）に図２（ｂ）のＡ−Ａ’断面図を示す。遺伝子増幅用反応器１３は支持基板２１と側壁部材２２で構成されており、凹型反応容器２４が４０行×４０列配置されている。全体寸法は２２ｍｍ×２２ｍｍ×１ｍｍであり、凹型反応容器２４の開口部は０．５ｍｍ×０．５ｍｍ、深さは０．５ｍｍである。支持基板２１上には蛍光性温度プローブ２３が固定されている。支持基板２１の母材はシリコンである。側壁部材２２の母材はＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）である。側壁部材２２はあらかじめ凹凸を反転した鋳型を作製しておき、そこに未重合のＰＤＭＳを流し込むことより作製される。なお、側壁部材２２および支持基板２１は、正確に位置合わせをして張り合わせるためのアライメントマーク（図示しない）が設けられている。
【００２２】
蛍光性温度プローブおよび蛍光性温度プローブを支持基板に固定する方法について詳細に説明する。
［蛍光性温度プローブ］
図３を用いて蛍光性温度プローブの説明をする。図３（ａ）は支持基板２１上に固定された蛍光性温度プローブの概念図である。蛍光性温度プローブ２３は、親水性セグメント２５、温度応答性セグメント２６で構成されている。
【００２３】
温度応答性セグメント２６は感熱部位２７と蛍光部位２８で構成されている。感熱部位２７は、水溶液中で臨界共溶温度を示す物質である。臨界共溶温度とは、ある物質の溶解度が低下しはじめる温度をいう。特定温度以上で溶解性が低下する場合を下限臨界共溶温度という。感熱部位２７として特にＮ置換アクリルアミド誘導体の重合体であるポリ（Ｎ置換アクリルアミド）を用いることが好ましい。ただし、それ以外の物質であっても同様の効果が期待できる範囲において適用可能である。
【００２４】
蛍光部位２８はベンゾフラン誘導体である。ベンゾフラン誘導体は極性変化に応じて蛍光を発する機能を有する蛍光団である。ただし、本発明の蛍光部位に用いられる蛍光団はこれらに限定されない。
【００２５】
親水性セグメント２５として、ポリアクリルアミド誘導体やポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）などの親水性の高い物質を使用することが好ましい。親水性セグメントを含有する蛍光性温度プローブは、それを含有しない蛍光性温度プローブと比較して水溶液における溶解特性が向上するため、センシング感度や分散安定性が向上する。
【００２６】
本発明における蛍光性温度プローブが、温度変化に応じて可逆的に発光する機構を説明する。ベンゾフラン誘導体の分子内に強い電子供与性と電子吸引性の置換基を有する蛍光物質は、水分子が存在しない場合に強い蛍光を発する。下限臨界共溶温度以上では、温度応答性セグメント近傍の水分子数が急激に減少する。この下限臨界共溶温度前後における水分子数の変化を蛍光部位が検知することによって蛍光強度が可逆的に変化する。
【００２７】
図３（ｂ）は蛍光性温度プローブの形態の変化を説明する図である。
形態２９は下限臨界共溶温度未満の状態を示している。形態３０は下限臨界共溶温度以上の状態を示している。このとき、相転移により温度応答性セグメント２６の溶解性が減少する。これによって蛍光部位２８近傍の水分子が排除される結果、蛍光性温度プローブが蛍光を発する。ここで、温度応答性セグメント２６には親水性セグメント２５が結合していることから、蛍光性温度プローブ／水溶液界面３１の表面特性は変化しない。
【００２８】
［蛍光性温度プローブの固定化方法］
図４に図２（ｂ）のＡＡ線拡大図を示す。支持基板２１には、３つの異なる温度に応答する蛍光性温度プローブが固定されている。それぞれ、下限臨界共溶温度が９６℃の蛍光性温度プローブ４０、下限臨界共溶温度が７６℃の蛍光性温度プローブ４１、下限臨界共溶温度が４６℃の蛍光性温度プローブ４２が固定されている。
【００２９】
蛍光性温度プローブの固定化方法について図５を用いて説明する。蛍光性温度プローブはマスクを用いることにより、所望の位置に固定させることができる。支持基板２１およびマスク４４はそれぞれアライメントマーク（図示しない）が形成されている。前記アライメントマークを用いることにより、所望の位置に蛍光性温度プローブを固定させることができる。
【００３０】
次に、支持基板に蛍光性温度プローブを固定する方法について詳細に説明する。
・支持基板に重合開始基を導入
支持基板２１をシランカップリング剤である（（クロロメチル）フェニルエチル）トリクロロシランのメタノール溶液に浸漬させ、支持基板２１表面にクロロメチル基を導入する。次に、前記クロロメチル基が導入された支持基板をＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム水溶液に浸漬させる。前記支持基板に導入されたクロロメチル基とＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムを反応させることにより、リビングラジカル重合の開始点となる光イニファーター基４３が導入される［図５（ａ）］。
【００３１】
・溶液の調製１
第一のシュレンク管に、４−Ｎ−（２アクリロイルオキシエチル）−Ｎ−メチルアミノ−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（以下ＤＢＤＡＥ）、Ｎイソプロピルメタクリルアミド（以下ＮＩＰＭＡＭ）、蒸留水を採取し、窒素バブリングによりシュレンク管内の酸素を窒素に置換する。この溶液を反応溶液Ａとする。
【００３２】
・溶液の調製２
第二のシュレンク管に、ＤＢＤＡＥ、Ｎ−エチルアクリルアミド、蒸留水を採取し、窒素バブリングによりシュレンク管内の酸素を窒素に置換する。この溶液を反応溶液Ｂとする。
【００３３】
・溶液の調製３
第三のシュレンク管に、ＤＢＤＡＥ、Ｎ−エチルアクリルアミド、アクリル酸、蒸留水を採取し、窒素バブリングによりシュレンク管内の酸素を窒素に置換する。この溶液を反応溶液Ｃとする。
【００３４】
・溶液の調製４
第四のシュレンク管に、アクリルアミド、蒸留水を採取し、窒素バブリングによりシュレンク管内の酸素を窒素に置換する。この溶液を反応溶液Ｄとする。
【００３５】
・蛍光性温度プローブ４２（下限臨界共溶温度４６℃）の導入
反応溶液Ａをピペッタにより図５（ａ）の工程を経た支持基板に滴下し、マスク４４をかぶせて光イニファーター重合を行う。光イニファーター重合は、ＵＶランプ４５として照射波長３１２ｎｍから５７７ｎｍのものを用い室温にて実施する。重合終了後は支持基板を蒸留水にて洗浄する。これにより、蛍光性温度プローブ４２を固定することができる［図５（ｂ）］。
【００３６】
・蛍光性温度プローブ４１（下限臨界共溶温度７６℃）の導入
反応溶液Ｂをピペッタにより図５（ｂ）の工程を経た支持基板に滴下する。アライメントマーク（図示しない）を用いてマスク４４を図５（ｂ）の位置から１２５μｍ移動させた位置に設置する。この状態において、光イニファーター重合を行う。光イニファーター重合は、ＵＶランプ４５として照射波長３１２ｎｍから５７７ｎｍのものを用い室温にて実施する。重合終了後は支持基板を蒸留水にて洗浄する。これにより、蛍光性温度プローブ４１を固定することができる［図５（ｃ）］。
【００３７】
・蛍光性温度プローブ４０（下限臨界共溶温度９６℃）の導入
反応溶液Ｃをピペッタにより図５（ｃ）の工程を経た支持基板に滴下する。アライメントマーク（図示しない）を用いてマスク４４を図５（ｃ）の位置から１２５μｍ移動させた位置に設置する。この状態において、光イニファーター重合を行う。光イニファーター重合は、ＵＶランプ４５として照射波長３１２ｎｍから５７７ｎｍのものを用い室温にて実施する。重合終了後は支持基板を蒸留水にて洗浄する。これにより、蛍光性温度プローブ４０を固定することができる［図５（ｄ）］。
【００３８】
・親水性セグメントの導入
反応液Ｄをピペッタにより図５（ｄ）の工程を経た支持基板に滴下する。ＵＶランプとして照射波長３１２ｎｍから５７７ｎｍのものを用い室温にて重合を行う。各々の蛍光性温度プローブに親水性セグメントを導入させるため、マスク４４は使用しない。重合終了後は支持基板を蒸留水にて洗浄する。
【００３９】
以上の工程により、支持基板２１に、異なる温度において蛍光を発する蛍光性温度プローブを固定させることができる。
最後に、側壁部材２２と図５（ｄ）の工程を経た支持基板を張り合わせることにより、遺伝子増幅用反応器が完成する［図５（ｅ）］。なお、側壁部材２２及び支持基板２１は予めアライメントマークが形成されているため、蛍光性温度プローブと側壁部材の位置を正確に合わせることができる。
【００４０】
以下、本発明の遺伝子増幅用反応装置の動作について詳細な説明を行う。
［遺伝子増幅反応］
反応溶液は、鋳型プラスミドＤＮＡ：４．０μｌ、ポリメラーゼ：２．０μｌ、緩衝液：８．０μｌ、基質「ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  （２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）」：６．４μｌ、プライマー「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（１ｐｍｏｌ／μｌ）」：２０μｌ、プライマー「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ−Ｍ（１ｐｍｏｌ／μｌ）」：２０μｌ、及び滅菌蒸留水：１９．６μｌを混合して調製される。遺伝子増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いる。
【００４１】
ＰＣＲ法は、前記反応溶液を９５℃前後の温度で保持してＤＮＡを解離させる工程、４５℃前後の温度で保持してアニーリングする工程、および７５℃前後の温度で保持してＤＮＡの複製を行う工程、を１サイクルとしてこのサイクルを繰り返すことによりＤＮＡを増幅する反応方法である。
【００４２】
［温度制御］
遺伝子増幅反応における温度制御は、支持基板２１上に固定された蛍光性温度プローブ２３の蛍光を計測して行う。前記［蛍光性温度プローブの固定化方法］で説明したとおり、支持基板２１上には３つの異なる温度に応答する蛍光性温度プローブが固定されている。本実施例では蛍光性温度プローブの計測位置により、反応溶液の温度を判断することができる。
【００４３】
遺伝子増幅反応における温度制御について、図６および図７を用いて説明する。図６は図１の遺伝子増幅用反応装置のうち温度制御に必要な構成のみ模式的に表した図である。図７は反応溶液の温度のタイムチャートを説明する図であり、図７（ｂ）は９６℃付近を拡大した図である。
【００４４】
（１）  反応溶液の温度を９６℃に制御する流れについて説明する。
まず、ペルティエ素子１２を用いて遺伝子増幅用反応器１３を加熱する［図７（ａ）時間０からＴ1］。蛍光性温度プローブ４０からの蛍光を共焦点レーザー蛍光スキャナー１１により計測する。蛍光が検出できれば、反応溶液の温度は９６℃以上である［図７（ｂ）時間ｔ1］。このとき、制御器１９によりペルティエ素子１２の加熱を停止する。次に、反応溶液の温度が下がり、蛍光がなくなることが確認できれば、反応溶液の温度は９６℃未満である［図７（ｂ）時間ｔ2］。このとき、再び制御器１９によりペルティエ素子１２の加熱を開始する。このように、蛍光の有無に応じてペルティエ素子の加熱と加熱停止を繰り返すことにより、反応溶液を９６℃近傍に制御することができる。この条件のもと、所定の時間反応を行う［図７（ａ）時間Ｔ1からＴ2］。
【００４５】
（２）  （１）の工程の後、反応溶液の温度を４６℃に制御する流れについて説明する。
まず、共焦点レーザー蛍光スキャナー１１が蛍光性温度プローブ４２を計測できるように、遺伝子増幅用反応器１３を計測用Ｘ−Ｙステージ９４により移動させる。このとき、反応溶液の温度は９６℃であるため、蛍光性温度プローブ４２からの蛍光が検出される。ペルティエ素子１２を用いて遺伝子増幅用反応器１３を冷却する［図７（ａ）時間Ｔ2からＴ3］。蛍光がなくなることを確認できれば、反応溶液の温度は４６℃未満であることがわかる。このとき、ペルティエ素子１２により遺伝子増幅用反応器１３を加熱する。反応溶液の温度が上がり、蛍光が検出できれば、４６℃以上である。以下、（１）の工程と同様の操作を繰り返すことにより、反応溶液の温度を４６℃近傍に制御することができる。この条件のもと、所定の時間反応を行う［図７（ａ）時間Ｔ3からＴ4］。
【００４６】
（３）  （２）の工程の後、反応溶液の温度を７６℃に制御する流れについて説明する。
まず、（２）の工程と同様に共焦点レーザー蛍光スキャナー１１が蛍光性温度プローブ４１を計測できるように、遺伝子増幅用反応器１３を計測用Ｘ−Ｙステージ９４により移動させる。このとき、反応溶液の温度は４６℃であるため、蛍光性温度プローブ４１からの蛍光は検出できない。ペルティエ素子１２を用いて遺伝子増幅用反応器１３を加熱する［図７（ａ）時間Ｔ4からＴ5］。蛍光性温度プローブ４１からの蛍光が検出できれば、反応溶液の温度は７６℃以上である。次に、制御器１９によりペルティエ素子１２の加熱を停止する。これにより、蛍光がなくなることを確認できれば７６℃未満であることが分かる。以下、（１）又は（２）の工程と同様の操作により、反応溶液の温度を７６℃近傍に制御することができる。この条件のもと、所定の時間反応を行う［図７（ａ）時間Ｔ5からＴ6］
［遺伝子検出］
次に、遺伝子検出について図１を用いて詳細に説明する。
【００４７】
上記（１）から（３）の工程を合計２０サイクル行なった後、遺伝子増幅用反応器１３をもとの位置に搬送する。ピペッタ１６により反応溶液を採取し、採取した反応溶液を蛍光標識液保存容器９２に導入する。これにより、蛍光標識された反応溶液はピペッタ１６により遺伝子検出用反応器１４に導入される。次に、反応器搬送用Ｘ−Ｙステージ１７により該遺伝子検出反応器をペルティエ素子１２上に搬送する。ペルティエ素子１２を用いて前記蛍光標識された反応溶液を所定の温度で一定時間保つことにより、ハイブリダイゼーションを行う。次に、遺伝子検出用反応器１４をもとの位置に搬送する。ピペッタ１６により洗浄液保存容器９１から洗浄液を該遺伝子検出用反応器に導入する。再びピペッタ１６により、該遺伝子検出用反応器から未反応物を回収する。次に、反応器搬送用Ｘ−Ｙステージ１７により遺伝子検出用反応器１４をペルティエ素子１２上に搬送する。最後に、共焦点レーザー蛍光スキャナ−１１により蛍光標識された遺伝子を検出することができる。
【００４８】
本発明の遺伝子増幅用反応装置は、蛍光性温度プローブを反応器に固定するため、液体試料の温度を正確に計測できる。これにより、反応器にヒータや熱電対を集積する必要がなく、従来よりも反応器の構造を簡素化できる。また、蛍光体を試料中に混在させる必要がないので、従来よりも蛍光体の使用量を低減することができる。また、本発明は遺伝子増幅反応と遺伝子検出を共通の装置で行うことができるため、装置の小型化、低コスト化および自動化が可能である。
【００４９】
また、本実施例では３つの異なる温度に応答する蛍光性温度プローブを固定する方法について説明したが、本発明はこれに限定されない。例えば、希望温度に対して上限温度と下限温度を設け、それぞれの温度に応答して蛍光を発する蛍光性温度プローブを固定することも可能である。これにより、より正確な温度制御が可能となる。
【００５０】
なお、本実施例は凹型反応容器のうち一箇所に蛍光性温度プローブを固定する方法について説明したが、本発明はこれに限定されない。例えば、加熱領域を分割する場合、各々の加熱領域に対応する反応領域に蛍光性温度プローブを固定することが望ましい。これにより、反応領域毎の温度制御が可能になる。
【００５１】
実施例２
図８は、実施例２の遺伝子増幅用反応装置を説明する図である。本実施例では反応領域として基板上に微小流路が形成された反応器を用いる。以下、遺伝子増幅用反応装置、該遺伝子増幅用反応装置に用いる反応器について説明する。
【００５２】
［遺伝子増幅用反応装置］
図８（ａ）は遺伝子増幅用反応装置の側面図、図８（ｂ）は遺伝子増幅用反応装置の平面図である。遺伝子増幅用反応装置５０は、共焦点レーザー蛍光スキャナー５１、ペルティエ素子５２、遺伝子増幅用反応器５３、ピペッタ用Ｘ−Ｙステージ５４、反応器搬送用Ｘ−Ｙステージ９５、シリンジポンプ５５、蛍光標識液保存容器５６、遺伝子検出用反応器５７、洗浄液保存容器５８およびピペッタ５９で構成される。遺伝子増幅用反応器５３は反応領域として基板上に微小流路が形成されている。
【００５３】
本発明の装置を用いて遺伝子増幅反応および遺伝子検出を行う場合の流れについて説明する。
（１）遺伝子増幅反応を行う工程
実施例１と同様に遺伝子増幅反応はＰＣＲ法を用いる。そのため、微小流路は９５℃、７５℃、４５℃の３つの温度領域を繰り返し通過するように形成されている。シリンジポンプ５５により反応溶液を遺伝子増幅用反応器５３に送液する。このとき、ペルティエ素子５２により該温度領域は一定の温度に保たれているため、送液された反応溶液は順次遺伝子増幅反応が行われる。
【００５４】
（２）遺伝子検出を行う工程
（１）の行程を経た反応溶液は、蛍光標識液保存容器５６に回収される。ここで反応溶液は蛍光標識され、ピペッタ５９により遺伝子検出用反応器５７に導入される。次に、反応器搬送用Ｘ−Ｙステージ９５により該遺伝子検出用反応器をペルティエ素子５２上に移動させる。ペルティエ素子５２により該反応溶液を所定の温度で一定時間保つことにより、ハイブリダイゼーションを行う。最後に、ピペッタ５９により洗浄液保存容器５８から洗浄液を該遺伝子検出用反応器に導入する。再びピペッタ５９により、該遺伝子検出用反応器内の未反応物を回収する。最後に、共焦点レーザー蛍光スキャナー５１により遺伝子検出を行うことができる。
【００５５】
［遺伝子増幅用反応器の構成および作製方法］
遺伝子増幅用反応器について詳細に説明する。まず、遺伝子増幅用反応器の構成について説明する。図９（ａ）は遺伝子増幅用反応器５３の平面図、図９（ｂ）は図９（ａ）のＡ−Ａ’断面図、図９（ｃ）は図９（ａ）のＢ−Ｂ’断面図を示す。図９（ａ）に示すように、遺伝子増幅用反応器５３は、反応溶液を導入する導入口６１、微小流路６２、反応溶液を回収するための排出口６３で構成されている。遺伝子増幅用反応器５３の全体寸法は、５０ｍｍ×５０ｍｍ×０．５ｍｍである。微小流路６２の幅は１７６μｍ、深さは８８μｍであり、長さは１８ｍｍ×２０ターンである。微小流路６２は、９６℃設定希望温度領域６４、７６℃設定希望温度領域６５、４５℃設定希望温度領域６６で構成された領域である。
【００５６】
遺伝子増幅用反応器の作製方法について説明する。図９（ｂ）において、基板６８は母材がパイレックス（登録商標）であり、微小流路６２はフォトリソグラフィーとウエットエッチングにより形成される。基板６９は基板６８と同様に母材がパイレックス（登録商標）であり、導入口６１および排出口６３は機械的加工手段により形成されている。
【００５７】
遺伝子増幅用反応器と外部との接続について説明する。導入口６１はテフロン（登録商標）製コネクター（図示しない）を用いることにより配管６０と接続され、シリンジポンプ５５に接続されている。排出口６３も同様にテフロン（登録商標）製コネクター（図示しない）を用いて配管６０と接続され、回収容器５６に接続されている。
【００５８】
［蛍光性温度プローブ］
微小流路は９５℃、７５℃、４５℃の３つの温度領域を繰り返し通過するように形成されている。反応溶液の温度を制御するため、各領域には蛍光性温度プローブが固定されている。
【００５９】
蛍光性温度プローブについて図９（ｃ）を用いて説明する。微小流路６２の底面には、９６℃設定希望温度領域６４内に蛍光性温度プローブ７０、７６℃設定希望温度領域６５内に蛍光性温度プローブ７１、４６℃設定希望温度領域６６内に蛍光性温度プローブ７２が固定されている。蛍光性温度プローブ７０の下限臨界共溶温度は９６℃、蛍光性温度プローブ７１の下限臨界共溶温度は７６℃、蛍光性温度プローブ７２の下限臨界共溶温度は４６℃である。
【００６０】
次に、蛍光性温度プローブの固定化方法について説明する。蛍光性温度プローブは実施例１と同様にマスクを用いて固定する。マスクを用いることにより、各温度領域に異なる温度に応答する蛍光性温度プローブを固定することができる。なお、本実施例で使用する蛍光性温度プローブの材料および固定化方法は実施例１で用いたものと同様のものを使用する。
【００６１】
［遺伝子検出用反応器］
次に、遺伝子検出用反応器について説明する。遺伝子検出用反応器５７は、スライドガラスにＤＮＡ（デオキリボ核酸）又はＲＮＡ（リボ核酸）が固定されたものである。本発明の遺伝子増幅用反応装置は、遺伝子検出用反応器として市販のＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いてもよい。
【００６２】
以下、本発明の遺伝子増幅用反応装置の動作について詳細な説明を行う。
［遺伝子増幅反応］
遺伝子増幅反応は、反応溶液として実施例１に用いたものと同様の反応溶液を使用し、ＰＣＲ法を用いる。室温２５℃にて、遺伝子増幅用反応器５３の導入口６１から、シリンジポンプ５５を用いて反応溶液を滞留時間２０分となるように、流量０．２８μｌ／ｍｉｎで４０分間流してＰＣＲを行う。
【００６３】
［温度制御］
遺伝子増幅反応における反応溶液の温度は、実施例１と同様の方法を用いて制御することができる。前記［蛍光性温度プローブ］で説明したとおり、微小流路６２には３つの異なる温度に応答する蛍光性温度プローブが固定されている。各温度領域において、蛍光性温度プローブを計測し、ペルティエ素子の加熱と加熱停止を繰り返すことにより、反応溶液の温度を制御する。共焦点レーザー蛍光スキャナー５１が各温度領域を計測するため、反応器搬送用Ｘ−Ｙステージ９５により、遺伝子増幅用反応器５３を移動させる。なお、実施例１と異なり、各領域の温度は一定である。
【００６４】
［遺伝子検出］
排出口６３から流出した反応溶液は蛍光標識液保存容器５６に導入される。これにより、蛍光標識された反応溶液はピペッタ５９により遺伝子検出用反応器５７に導入する。次に、反応器搬送用Ｘ−Ｙステージ９５により該遺伝子検出用反応器をペルティエ素子５２上に移動させる。次に、ペルティエ素子５２により該蛍光標識された反応溶液を所定の温度で一定時間保つことにより、ハイブリダイゼーションを行う。次に、ピペッタ５９により洗浄液保存容器５８から洗浄液を採取し、該遺伝子検出用反応器に導入する。次に、ピペッタ５９により該遺伝子検出用反応器から未反応物を回収する。最後に、共焦点レーザー蛍光スキャナ−５１により蛍光標識された遺伝子を検出することができる。
【００６５】
本発明の遺伝子増幅用反応装置は、蛍光性温度プローブを微小流路の所望の位置に固定するため、液体試料の温度を正確に制御することができる。これにより、微小流路にヒータや熱電対を集積する必要がないので、従来よりも微小流路の構造を簡素化できる。また、蛍光体を試料中に混在させる必要がないので、蛍光体の使用量を低減することができる。また、本発明は遺伝子増幅反応と遺伝子検出を共通の装置で行うことができるため、装置の小型化、低コスト化および自動化が可能である。
【００６６】
また、本実施例では３つの異なる温度に応答する蛍光性温度プローブを固定する方法について説明したが、本発明はこれに限定されない。例えば、希望温度に対して上限温度と下限温度を設け、それぞれの温度に応答して蛍光を発する蛍光性温度プローブを固定することも可能である。これにより、より正確な温度制御が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明によれば、液体試料の温度を正確に計測し温度制御できるため、その実用性及び経済性が飛躍的に向上される。その結果、本発明の温度制御装置は、遺伝子操作、生化学分析、微量化学反応合成など様々な分野で好適に有効利用することができる。特に、本発明の温度制御装置は、バイオチップ、遺伝子チップ、遺伝子増幅（ＰＣＲ）システム、および集積化化学分析システム（ｍｉｃｒｏ  ｔｏｔａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ：μ−ＴＡＳ）などの領域で使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１（ａ）】実施例１に用いた遺伝子増幅用反応装置の概略図である。
【図１（ｂ）】実施例１に用いた遺伝子増幅用反応装置の概略図である。
【図２】実施例１に用いた遺伝子増幅用反応器の概略図である。
【図３】実施例１に用いた蛍光性温度プローブの概念図である。
【図４】遺伝子増幅用反応器の平面図を説明する図である。
【図５】蛍光性温度プローブを支持基板に固定するプロセスを説明する図である。
【図６】図１の遺伝子増幅及び検出装置のうち温度制御に必要な構成のみ模式的に表した図である。
【図７】反応溶液の温度のタイムチャートを説明する図である。
【図８（ａ）】実施例２に用いた遺伝子増幅用反応装置の概略図である。
【図８（ｂ）】実施例２に用いた遺伝子増幅用反応装置の概略図である。
【図９】実施例２に用いた遺伝子増幅用反応器の概略図である。
【図１０】従来の微小反応器を説明する図である。
【符号の説明】
【００６９】
１０、５０  遺伝子増幅用反応装置
１１、５１  共焦点レーザー蛍光スキャナー
１２、５２  ペルティエ素子
１３、５３  遺伝子増幅用反応器
１４、５７  遺伝子検出用反応器
１５  反応溶液保存容器
１６  ピペッタ
１７、９５  反応器搬送用Ｘ−Ｙステージ
１８  搬送アーム
１９  制御器
２１  支持基板
２２  側壁部材
２３  ７０、７１、７２：蛍光性温度プローブ
２４  凹型反応容器
２５  親水性セグメント
２６  温度応答性セグメント
２７  感熱部位
２８  蛍光部位
２９  下限臨界共溶温度未満のときの蛍光性温度プローブの形態
３０  下限臨界共溶温度以上のときの蛍光性温度プローブの形態
３１  蛍光性温度プローブ／水溶液界面
４０  下限臨界共溶温度が９６℃の蛍光性温度プローブ
４１  下限臨界共溶温度が７６℃の蛍光性温度プローブ
４２  下限臨界共溶温度が４６℃の蛍光性温度プローブ
４３  光イニファーター基
４４  マスク
４５  ＵＶランプ
５４、９３  ピペッタ用Ｘ−Ｙステージ
５５  シリンジポンプ
５６、９２  蛍光標識液保存容器
５８、９１  洗浄液保存容器
６０  配管
６１  導入口
６２  微小流路
６３  排出口
６４  ９５℃希望温度領域
６５  ７５℃希望温度領域
６６  ４５℃希望温度領域
６８、６９  基板
９４  計測用Ｘ−Ｙステージ
【図１（ａ）】
2008092860.tif 000003
【図１（ｂ）】
2008092860.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008092860.tif 000008
【図６】
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【図７】
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【図８（ａ）】
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【図８（ｂ）】
2008092860.tif 000012
【図９】
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【図１０】
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