(57)【要約】【課題】標的細胞に特異的に結合し、非標的細胞とは結合することのないＤＮＡを容易に得る方法の提供。【解決手段】標的細胞に特異的に結合するＤＮＡ候補を選択すること、前記候補の内、非標的細胞に特異的に結合するＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡを選択すること、標的細胞に特異的に結合するＤＮＡ候補から非標的細胞に特異的に結合するＤＮＡを削除して標的細胞に特異的に結合するＤＮＡする。標的細胞の複数について標的細胞に特異的に結合するＤＮＡを決定した後、標的細胞の二つについて標的細胞に特異的に結合するＤＮＡを対比して、ともに存在するＤＮＡを最終的な標的細胞に特異的に結合するＤＮＡとする。【選択図】図２
2008237041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）細胞群から標的細胞群と非標的細胞群とを分離する工程、
（ｉｉ）標的細胞に１本鎖ＤＮＡプールを適用して前記標的細胞に特異的に結合する１本鎖ＤＮＡを結合させる工程、
（ｉｉｉ）前記特異的に結合する１本鎖ＤＮＡが結合した前記標的細胞を選択して、前記選択された標的細胞に結合している標的細胞特異的候補ＤＮＡからなる標的細胞特異的候補ＤＮＡプールを作成する工程、
（ｉｖ）非標的細胞に前記標的細胞特異的候補ＤＮＡプールを適用して、前記非標的細胞にも特異的に結合する標的細胞特異的候補ＤＮＡを前記非標的細胞に結合させる工程、
（ｖ）前記非標的細胞にも特異的に結合する標的細胞特異的候補ＤＮＡが結合した前記非標的細胞に結合している標的細胞特異的候補ＤＮＡからなる非標的細胞特異的ＤＮＡプールを作成する工程、および
（ｖｉ）工程（ｉｉｉ）において取得した前記標的細胞特異的候補ＤＮＡの内、工程（ｖ）において取得した前記非標的細胞特異的ＤＮＡと相補的に対合するＤＮＡをアニーリングにより除去して標的細胞特異的ＤＮＡを決定する工程、
を含む、標的細胞に特異的に結合する核酸の選択法。
【請求項２】
前記工程（ｉ）〜（ｖｉ）を異なる複数の標的細胞について行う工程をさらに含み、
前記異なる複数の標的細胞のそれぞれについて決定された標的細胞特異的ＤＮＡを含むそれぞれの標的細胞特異的ＤＮＡプールを互いに対比して、全ての前記標的細胞特異的ＤＮＡプールに関して一致する核酸配列を有するＤＮＡを前記標的細胞群についての標的細胞特異的ＤＮＡと決定する、請求項１記載の核酸選択法。
【請求項３】
（ｉ）細胞群から標的細胞群と非標的細胞群とを分離する工程、
（ｉｉ）標的細胞に１本鎖ＤＮＡプールを適用して前記標的細胞に特異的に結合する１本鎖ＤＮＡを結合させる工程、
（ｉｉｉ）前記特異的に結合する１本鎖ＤＮＡが結合した前記標的細胞を選択して、前記選択された標的細胞に結合している１本鎖ＤＮＡをセンス鎖ＤＮＡとして、該結合している１本鎖ＤＮＡを１細胞リアルタイムＰＣＲにより増幅する工程、
（ｉｖ）前記増幅された１本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡを選択して、標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡプールを作成する工程、
（ｖ）前記非標的細胞に前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡプールを適用して前記非標的細胞にも特異的に結合する前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡを前記非標的細胞に結合させる工程、
（ｖｉ）前記非標的細胞にも特異的に結合する標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡが結合した前記非標的細胞に結合している前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをセンス鎖ＤＮＡとして前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをＰＣＲにより増幅する工程、
（ｖｉｉ）前記増幅された標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡを選択して、非標的細胞特異的アンチセンス鎖ＤＮＡプールを作成する工程、および
（ｖｉｉｉ）工程（ｉｖ）において取得した前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡの内、工程（ｖｉｉ）において取得した前記非標的細胞特異的アンチセンス鎖ＤＮＡと相補的に対合するＤＮＡをアニーリングにより除去する工程、
を含む、標的細胞に特異的に結合する核酸の選択法。
【請求項４】
前記工程（ｉ）が、
前記標的細胞に結合する抗体が固定化された磁気ビーズを前記細胞群に適用して、前記磁気ビーズが結合した前記標的細胞を磁気的に分離すること、
を含む、請求項３記載の核酸選択法。
【請求項５】
前記工程（ｖｉ）が、
前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより増幅すること、
を含む、請求項３記載の核酸選択法。
【請求項６】
前記工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、
アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーは無修飾とされ、
前記増幅されたアンチセンス鎖ＤＮＡはフィルタにより除去されて、１本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡのみが選択されて、標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡプールが作成される、
請求項３記載の核酸選択法。
【請求項７】
前記工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、
アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーは無修飾とされ、
前記増幅されたアンチセンス鎖ＤＮＡはビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に除去されて、１本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡのみが選択されて、標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡプールが作成される、
請求項３記載の核酸選択法。
【請求項８】
前記工程（ｉｉｉ）および（ｖｉ）において、
センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはアミノ基で修飾され、
前記増幅されたセンス鎖ＤＮＡはフィルタにより除去されて、非標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡプールが作成される、
請求項３記載の核酸選択法。
【請求項９】
前記工程（ｉｉｉ）および（ｖｉ）において、
アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーは無修飾とされ、
前記増幅されたアンチセンス鎖ＤＮＡはビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に残されて、非標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡが除去されて、非標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡプールが作成される、
請求項３記載の核酸選択法。
【請求項１０】
前記工程（ｖｉｉｉ）が、
前記非標的細胞特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡをクロマトグラフィーのカラム内に設けられている担体に固定すること、および
前記クロマトグラフィーのカラムに前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡを導入して前記非標的細胞特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをアニーリングにより除去すること、
を含む、請求項８記載の核酸選択法。
【請求項１１】
前記クロマトグラフィーのカラムから流出する前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより増幅して、前記クロマトグラフィーのカラムに繰り返し導入することを含む、請求項１０記載の核酸選択法。
【請求項１２】
前記工程（ｖｉｉｉ）が、
前記ビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に残されたアンチセンス鎖ＤＮＡに前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡを導入して前記非標的細胞特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをアニーリングにより除去すること、
を含む、請求項９記載の核酸選択法。
【請求項１３】
前記非標的細胞特異的センス鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをアニーリングにより除去された残りの前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより増幅して、前記ビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に残されたアンチセンス鎖ＤＮＡに前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡを繰り返し導入して前記非標的細胞特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の前記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをアニーリングにより除去することを含む、請求項１２記載の核酸選択法。
【請求項１４】
前記工程（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）を異なる複数の標的細胞について行う工程をさらに含み、
前記異なる複数の標的細胞のそれぞれについて決定された標的細胞特異的ＤＮＡを含むそれぞれの標的細胞特異的ＤＮＡプールを互いに対比して、全ての前記標的細胞特異的ＤＮＡプールに関して一致する核酸配列を有するＤＮＡを前記標的細胞群についての標的細胞特異的ＤＮＡと決定する、請求項３記載の核酸選択法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか記載の核酸選択法を使用する工程を含む、標的細胞に特異的に結合する核酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞に特異的に結合する核酸の選択法に関する。特に、本発明は、標的細胞に特異的に結合する核酸のアニーリングによる選択法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一本鎖核酸はその高次構造により、特定の標的分子に対して結合能を有することが、１９９０年にC. Tuerkらのグループによって報告（非特許文献１：Science, 249, 505-510 (1990)）され、それらの核酸は「アプタマー」と命名された。これまでイオンや糖鎖、タンパク質、生細胞表面上の分子に親和性のあるアプタマー、さらにはタンパク質のリン酸化状態を判別するアプタマーなどが先行研究により多数報告されている。アプタマーは大別して一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡから成るが、他にもペプチドアプタマーなどが報告されている。またそれらの中には人工塩基を用いたアプタマー、ポリエチレングリコールなどの有機分子により修飾されたアプタマーなど、使用目的に合わせた修飾アプタマーも開発されている。
【０００３】
これらアプタマーは、C. Tuerkらによって提案されたＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）という、目的の核酸分子の選別と、それら分子の増幅という２つのステップによって選択される。
【０００４】
一般的には、まず、１０14〜１０16分子種の、両端が１８〜３８塩基ほどのプライマー配列に挟まれた３０〜１００塩基のランダム配列からなる全長が約６０〜１４０塩基の核酸プールを準備する。次に、この核酸プールから、標的分子に親和性をもつ配列を選別するが、この操作にはこれまで様々な方法が開発されている。一般に、標的分子のみを用いて親和性をもつ核酸を選別する場合、最終的に得られたアプタマーの中には、非標的分子にも親和性を持つ（抗体で言う“cross reactivity”）アプタマーが存在することも珍しくない。そのため、用いることが想定される多種類の分子が混合されているようなサンプルにおいて、標的分子には親和性をもつが非標的分子に親和性を持たないというアプタマーを、対向選別法（Counter Selection）によって選別することも行われている。
【０００５】
ここでは、一例として、Dihua Shangguanらによって２００６年に報告（非特許文献２：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103, 11838-11843）された、以下のような標的細胞に特異的に結合するＤＮＡアプタマーの選択法を簡単に説明する。Dihua Shangguanらは、Ｔ細胞株（CCRF-CEM細胞）とＢ細胞株（Ramos細胞）とを用いて、前者には親和性をもつが、後者には親和性をもたない一本鎖ＤＮＡアプタマーを対向選別法によって選別した。ここで用いたＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞とは、ヒト急性リンパ芽球性白血病・Ｔ細胞の株化細胞のことで、ヒト白血病のモデル細胞として広く使用されている。まず、用いる核酸プールとして一本鎖ＤＮＡプールを調整した。次にこの一本鎖ＤＮＡプールを標的細胞であるＴ細胞株（１〜２×１０6個の細胞）に適用した。その後、遠心により細胞を沈殿させ、その上清に含まれる、結合しなかった一本鎖ＤＮＡを除去し、細胞に結合した一本鎖ＤＮＡを回収した。その回収した一本鎖ＤＮＡを非標的細胞であるＢ細胞株に適用して、遠心により細胞を沈殿させ、今度は逆にその上清に含まれる結合しなかった一本鎖ＤＮＡを回収した。回収した一本鎖ＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。この過程を２０サイクル行った後、ＴＡクローニング法により大腸菌内でクローニングして、最終的に得られた一本鎖ＤＮＡの配列を決定した。
【０００６】
以上の操作で、Ｔ細胞株には親和性をもつが、Ｂ細胞株には親和性を持たない一本鎖ＤＮＡアプタマーを得たと報告している。さらに、性質が均一な細胞の集団であると考えられていたＴ細胞株（CCRF-CEM細胞）集団において、そのある一部の集団にのみ親和性を持つ一本鎖ＤＮＡアプタマーも得られたと報告している。またその中には、実際に複数種の細胞が混在する正常ヒト骨髄から採取した血液に上記ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を加えたサンプル中で、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のみに親和性をもつアプタマーが存在したと報告している。さらにＢリンパ腫患者の骨髄から採取したＢ細胞には親和性を持たず、Ｔリンパ腫患者の骨髄から採取したＴ細胞にのみ親和性をもつアプタマーも存在したと報告しており、実際の医療への応用を目指した基礎技術としても充分に可能性があることを示している。
【非特許文献１】Science, 249, 505-510 (1990)
【非特許文献２】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103, 11838-11843
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、従来のＳＥＬＥＸ法では核酸プールを標的分子に結合させ回収し、（対向選別法の操作を経るならば、非標的細胞に適用した後に）ＰＣＲによって増幅後、核酸を再度、標的分子に結合させるという操作を行う。上記例はＤＮＡの場合であったが、ＲＮＡの場合は、標的細胞に結合したＲＮＡを回収し、（ここでも、対向選別法の操作を経るならば、非標的細胞に適用した後に）ＲＴ−ＰＣＲによる増幅後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってＲＮＡプールを再生し、再度、標的分子に結合させる。通常、このプロセスを１回行っただけではアプタマーを選別することができないため、１０〜２０回は繰り返す必要がある。非標的分子に親和性を持つ核酸を除去するための対向選別法も、各ラウンドについて都度行わなければならないため、操作が非常に煩雑であり時間を要する方法である。
【０００８】
これは、選別初期では選別予定核酸の絶対量・相対量がともに少なく、この中から選別予定の核酸のみを分離することが困難だからである。もし、この中からそれら選別予定以外の配列のみを除去できる方法が開発されれば、操作は非常に簡便なものになると考えられる。また上記例では非標的細胞として１種を用いているが、複数種の非標的細胞を用いて、それら全てに親和性を持たないが標的細胞にのみ親和性を持つような核酸を選別したという報告はされていない。ただし上記例のように、最終的に選別された核酸が、結果的に複数種の非標的細胞すべてに親和性をもたず、標的細胞にのみ親和性をもったという報告はされている。
【０００９】
さらに上記例のように、従来のＳＥＬＥＸ法では、性質が均一な細胞の集団であると考えられていた細胞集団において、そのある一部の細胞集団にのみ親和性を持つ核酸が得られることもある。このように、性質が均一な細胞の集団といっても、実は従来の抗体を用いた研究ではその細胞集団の分類に限界があっただけで、標的細胞の性質をより詳細に認識できるアプタマーを用いることで、より詳細な分類が可能であることを、この報告は示唆している。
【００１０】
さらに、この分類が個々の細胞を対象にして行われることで、個々の細胞の性質の相違を検出できることも期待される。従来の研究では、例えば、細胞の膜タンパク質発現解析などにおいて得られる結果は、性質が均一な細胞の集団を扱っていることを前提にした細胞集団で得た結果であり、いわば個々の細胞が持つ値の平均を表しているようなものである。そこで、１細胞レベルでＳＥＬＥＸを行い、細胞集団を構成する各細胞に親和性を持つ核酸を取得することができれば、その細胞集団における各細胞の性質をより詳細に決定することができると期待される。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、短時間で標的細胞に特異的に結合し、かつ非標的細胞に結合しない核酸を選択できる方法を提案すること、また、それを１細胞レベルで選択できる方法を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明は、以下の核酸選択方法および核酸製造方法を提供する。
（１）（ｉ）細胞群から標的細胞群と非標的細胞群とを分離する工程、
（ｉｉ）標的細胞に１本鎖ＤＮＡプールを適用して上記標的細胞に特異的に結合する１本鎖ＤＮＡを結合させる工程、
（ｉｉｉ）上記特異的に結合する１本鎖ＤＮＡが結合した上記標的細胞を選択して、上記選択された標的細胞に結合している標的細胞特異的候補ＤＮＡからなる標的細胞特異的候補ＤＮＡプールを作成する工程、
（ｉｖ）非標的細胞に上記標的細胞特異的候補ＤＮＡプールを適用して、上記非標的細胞にも特異的に結合する標的細胞特異的候補ＤＮＡを上記非標的細胞に結合させる工程、
（ｖ）上記非標的細胞にも特異的に結合する標的細胞特異的候補ＤＮＡが結合した上記非標的細胞に結合している標的細胞特異的候補ＤＮＡからなる非標的細胞特異的ＤＮＡプールを作成する工程、および
（ｖｉ）工程（ｉｉｉ）において取得した上記標的細胞特異的候補ＤＮＡの内、工程（ｖ）において取得した上記非標的細胞特異的ＤＮＡと相補的に対合するＤＮＡをアニーリングにより除去して標的細胞特異的ＤＮＡを決定する工程、
を含む、標的細胞に特異的に結合する核酸の選択法。
（２）上記工程（ｉ）〜（ｖｉ）を異なる複数の標的細胞について行う工程をさらに含み、
上記異なる複数の標的細胞のそれぞれについて決定された標的細胞特異的ＤＮＡを含むそれぞれの標的細胞特異的ＤＮＡプールを互いに対比して、全ての上記標的細胞特異的ＤＮＡプールに関して一致する核酸配列を有するＤＮＡを上記標的細胞群についての標的細胞特異的ＤＮＡと決定する、上記（１）記載の核酸選択法。
（３）（ｉ）細胞群から標的細胞群と非標的細胞群とを分離する工程、
（ｉｉ）標的細胞に１本鎖ＤＮＡプールを適用して上記標的細胞に特異的に結合する１本鎖ＤＮＡを結合させる工程、
（ｉｉｉ）上記特異的に結合する１本鎖ＤＮＡが結合した上記標的細胞を選択して、上記選択された標的細胞に結合している１本鎖ＤＮＡをセンス鎖ＤＮＡとして、該結合している１本鎖ＤＮＡを１細胞リアルタイムＰＣＲにより増幅する工程、
（ｉｖ）上記増幅された１本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡを選択して、標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡプールを作成する工程、
（ｖ）上記非標的細胞に上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡプールを適用して上記非標的細胞にも特異的に結合する上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡを上記非標的細胞に結合させる工程、
（ｖｉ）上記非標的細胞にも特異的に結合する標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡが結合した上記非標的細胞に結合している上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをセンス鎖ＤＮＡとして上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをＰＣＲにより増幅する工程、
（ｖｉｉ）上記増幅された標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡを選択して、非標的細胞特異的アンチセンス鎖ＤＮＡプールを作成する工程、および
（ｖｉｉｉ）工程（ｉｖ）において取得した上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡの内、工程（ｖｉｉ）において取得した上記非標的細胞特異的アンチセンス鎖ＤＮＡと相補的に対合するＤＮＡをアニーリングにより除去する工程、
を含む、標的細胞に特異的に結合する核酸の選択法。
（４）上記工程（ｉ）が、
上記標的細胞に結合する抗体が固定化された磁気ビーズを上記細胞群に適用して、上記磁気ビーズが結合した上記標的細胞を磁気的に分離すること、
を含む、上記（３）記載の核酸選択法。
（５）上記工程（ｖｉ）が、
上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより増幅すること、
を含む、上記（３）記載の核酸選択法。
（６）上記工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、
アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーは無修飾とされ、
上記増幅されたアンチセンス鎖ＤＮＡはフィルタにより除去されて、１本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡのみが選択されて、標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡプールが作成される、
上記（３）記載の核酸選択法。
（７）上記工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、
アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーは無修飾とされ、
上記増幅されたアンチセンス鎖ＤＮＡはビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に除去されて、１本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡのみが選択されて、標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡプールが作成される、
上記（３）記載の核酸選択法。
（８）上記工程（ｉｉｉ）および（ｖｉ）において、
センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはアミノ基で修飾され、
上記増幅されたセンス鎖ＤＮＡはフィルタにより除去されて、非標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡプールが作成される、
上記（３）記載の核酸選択法。
（９）上記工程（ｉｉｉ）および（ｖｉ）において、
アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーは無修飾とされ、
上記増幅されたアンチセンス鎖ＤＮＡはビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に残されて、非標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡが除去されて、非標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡプールが作成される、
上記（３）記載の核酸選択法。
（１０）上記工程（ｖｉｉｉ）が、
上記非標的細胞特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡをクロマトグラフィーのカラム内に設けられている担体に固定すること、および
上記クロマトグラフィーのカラムに上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡを導入して上記非標的細胞特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをアニーリングにより除去すること、
を含む、上記（８）記載の核酸選択法。
（１１）上記クロマトグラフィーのカラムから流出する上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより増幅して、上記クロマトグラフィーのカラムに繰り返し導入することを含む、上記（１０）記載の核酸選択法。
（１２）上記工程（ｖｉｉｉ）が、
上記ビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に残されたアンチセンス鎖ＤＮＡに上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡを導入して上記非標的細胞特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをアニーリングにより除去すること、
を含む、上記（９）記載の核酸選択法。
（１３）上記非標的細胞特異的センス鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをアニーリングにより除去された残りの上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより増幅して、上記ビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に残されたアンチセンス鎖ＤＮＡに上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡを繰り返し導入して上記非標的細胞特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の上記標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡをアニーリングにより除去することを含む、上記（１２）記載の核酸選択法。
（１４）上記工程（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）を異なる複数の標的細胞について行う工程をさらに含み、
上記異なる複数の標的細胞のそれぞれについて決定された標的細胞特異的ＤＮＡを含むそれぞれの標的細胞特異的ＤＮＡプールを互いに対比して、全ての上記標的細胞特異的ＤＮＡプールに関して一致する核酸配列を有するＤＮＡを上記標的細胞群についての標的細胞特異的ＤＮＡと決定する、上記（３）記載の核酸選択法。
（１５）上記（１）〜（１４）のいずれか記載の核酸選択法を使用する工程を含む、標的細胞に特異的に結合する核酸の製造方法。
【００１３】
本発明では、標的細胞のみに親和性を持ち、非標的細胞（非標的細胞は複数種であってもよい）には親和性を持たない核酸を選別する。この選別過程は以下のようである。
まず、細胞群から標的細胞を選択する。次いで、核酸プールを標的細胞に適用し、標的細胞に親和性を持つ核酸を選別する。この段階では、非標的細胞にも親和性のある核酸が存在する。
そこで、次に、上記選別した標的細胞に親和性を持つ核酸プールを非標的細胞にも適用し、非標的細胞に対して親和性のある核酸を分離する。
次いで、標的細胞に親和性を持つ核酸からこの非標的細胞に対して親和性のある核酸を分離・除去することによって、標的細胞に特異的に結合するのみならず、非標的細胞に親和性を持たない核酸のみを選別する。
上述した第１ステージの選別に加えて、さらに、標的細胞の個々に親和性を持つ核酸相互を対比して、対比した個々の標的細胞のすべてに存在する核酸のみを選別する（第２ステージ）の実行によって、より厳密な標的細胞に特異的に結合する核酸を得ることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、標的細胞に特異的に結合するのみならず、非標的細胞に親和性を持たない核酸を短時間で簡便に得ることができ、さらに細胞集団ではない１細胞レベルでの核酸を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
図１は本発明を実施する第１ステージを説明するフロー図である。すなわち、標的細胞に特異的に結合するのみならず、非標的細胞に親和性を持たない核酸のみを選別するステージである。
【００１６】
図１（Ａ）は、標的細胞と非標的細胞とからなる多数の細胞を含む細胞群から標的細胞を含む細胞群と非標的細胞を含む細胞群とに分離する過程であり、たとえば、標的細胞に特異的に結合する抗体を利用して標的細胞Ａ1，Ａ2，Ａ3，‐‐‐，Ａkと非標的細胞Ｂ，Ｃ，Ｄ，‐‐‐，Ｚとに分離した状態を示す。ここで、標的細胞をＡ1，Ａ2，Ａ3，‐‐‐，Ａkと表示したのは、同じ標的細胞でも、性質の違いのあるものが存在し、これらに特異的に結合する核酸が異なる可能性があるから、これらを考慮した選別ができることを説明するためである。
【００１７】
図１（Ｂ）は、分離された標的細胞に、あらかじめ準備された１０15レベルの種類の１本鎖ＤＮＡプールを適用することを示す図である。
【００１８】
図１（Ｃ）は、標的細胞Ａ1，Ａ2，Ａ3，Ａkそれぞれに核酸が結合した状態を模式的に示す図である。標的細胞Ａ1には核酸Ａ，Ｂ，ａ，ｂ，ｄが、標的細胞Ａ2には核酸Ａ，Ｂ，ａ，ｃ，ｅが、標的細胞Ａ3には核酸Ａ，Ｃ，ｂ，ｆ，ｇが、標的細胞Ａkには核酸Ａ，Ｄ，ｂ，ｅ，ｆが、それぞれ、結合している。したがって、標的細胞Ａ1についてみれば、標的細胞特異的候補ＤＮＡプールは核酸Ａ，Ｂ，ａ，ｂ，ｄである。同様に、標的細胞Ａ2についてみれば、標的細胞特異的候補ＤＮＡプールは核酸Ａ，Ｂ，ａ，ｃ，ｅである。
【００１９】
図１（Ｄ）は、非標的細胞Ｂ，Ｃ，Ｄ，‐‐‐，Ｚに標的細胞特異的候補ＤＮＡプールである核酸Ａ，Ｂ，ａ，ｂ，ｄを適用することを示す図である。
【００２０】
図１（Ｅ）は、非標的細胞Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅそれぞれに核酸が結合した状態を模式的に示す図である。非標的細胞Ｂには核酸Ｂ，ｄが、非標的細胞Ｃには核酸Ｂ，ｄが、非標的細胞Ｄには核酸ｂが、非標的細胞Ｅには核酸Ｂ，ｄが、それぞれ、結合している。したがって、これらの非標的細胞に結合したすべての核酸から、非標的細胞特異的ＤＮＡプールとして核酸Ｂ，ｂ，ｄが得られる。この結果、標的細胞Ａ1に標的細胞特異的候補ＤＮＡプールの核酸Ａ，Ｂ，ａ，ｂ，ｄと評価された核酸の内、核酸Ｂ，ｂ，ｄは不適切なものであることが分かる。
【００２１】
図１（Ｆ）は、この処理を示す図である。すなわち、標的細胞特異的候補ＤＮＡプールの核酸Ａ，Ｂ，ａ，ｂ，ｄから非標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸Ｂ，ｂ，ｄを取り除き、核酸Ａ，ａが標的細胞特異的ＤＮＡプールであることを示す。この処理は、例えば、図２（Ａ）の下段部に示すように、非標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸Ｂ，ｂ，ｄをクロマトグラフィーのカラム４１内に設けられている担体ＮＨＳ４２に固定し、これにトラップされる核酸を除去することにより、容易に実行できる。
【００２２】
このようにして、第１ステージの処理でおおむね標的細胞に特異的に結合する核酸を得ることができる。しかしながら、図１（Ｃ）、図１（Ｆ）から容易に分かるように、たとえば、標的細胞Ａ2について標的細胞特異的候補ＤＮＡプールの核酸Ａ，Ｂ，ａ，ｃ，ｅから非標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸Ｂ，ｂ，ｄを取り除く処理をすれば、標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸はＡ，ａ，ｃ，ｅとなる。このことは、標的細胞Ａの標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸が、図１（Ｆ）の処理の際、標的細胞Ａ1，Ａ2，Ａ3，Ａkのどれが選ばれて決定されたかによって変化することを意味し、標的細胞Ａの標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸の選別が一義的に決定できないことを意味する。
【００２３】
第２ステージでは、このことに着目して、より厳密に標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸を選別する処理を行う。第２ステージを図２を参照して説明する。
【００２４】
図２（Ａ）は、標的細胞Ａ1，Ａ2，Ａ3，Ａkの標的細胞特異的候補ＤＮＡプールから、それぞれ、非標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸Ｂ，ｂ，ｄを取り除く処理をした結果の標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸を示したものである。このように、第１ステージだけでは、厳密な意味での標的細胞特異的ＤＮＡが決定できないことが分かる。
【００２５】
図２（Ｂ）は、まず、標的細胞Ａ1，Ａ2，Ａ3，Ａkのそれぞれの標的細胞特異的ＤＮＡプールから標的細胞Ａ1の標的細胞特異的ＤＮＡプールである核酸Ａ，ａと標的細胞Ａ2の標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸Ａ，ａ，ｃ，ｅのＡＮＤが取れた標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸Ａ，ａを得る。次いで、このＡＮＤが取れた標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸Ａ，ａと標的細胞Ａ3の標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸Ａ，Ｃ，ｇ，ｆのＡＮＤが取れた標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸Ａを得る。次いで、このＡＮＤが取れた標的細胞特異的ＤＮＡプールである核酸Ａと標的細胞Ａkの標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸Ａ，Ｄ，ｇ，ｆのＡＮＤが取れた標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸Ａを得る。というように、標的細胞Ａ1，Ａ2，Ａ3，Ａkのそれぞれの標的細胞特異的ＤＮＡプールを相互に対応させてＡＮＤ条件を満足するものに段階的に絞っていくことにより、厳密な意味での標的細胞特異的ＤＮＡを決定する。この処理は、例えば、図２（Ｂ）の下段部に示すように、例えば、標的細胞Ａ1の標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸Ａ，ａをクロマトグラフィーのカラム４１内に設けられている担体ＮＨＳ４２に固定し、これに標的細胞Ａ2の標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸Ａ，ａ，ｃ，ｅを適用して担体ＮＨＳ４２にトラップされた核酸を得る。この担体ＮＨＳ４２にトラップされた核酸を取り出す。次いで、この取り出した核酸をクロマトグラフィーのカラム４１内に設けられている担体ＮＨＳ４２に固定し、これに標的細胞Ａ3の標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸Ａ，Ｃ，ｇ，ｆを適用して担体ＮＨＳ４２にトラップされた核酸を得る。この担体ＮＨＳ４２にトラップされた核酸を取り出す。という手順を繰り返すことにより、容易に実行できる。
【００２６】
上述の各過程で、必要により、ＰＣＲにより核酸の増幅を行うことは当然である。また、上述した標的細胞の標的細胞特異的ＤＮＡプールの核酸を得る操作は、１細胞に限らず少数の細胞をグループとして処理し、これを、上述の１細胞の標的細胞の標的細胞特異的ＤＮＡプールとしても良い。以下により具体的な処理について説明する。
【実施例】
【００２７】
（実施例１）
実施例１では、以下の手順により標的細胞に特異的に結合する核酸を得る。まず、第１ステージの処理を説明する。
（Ｉ）標的細胞と非標的細胞の分離
【００２８】
（１）標的細胞の表面に結合する抗体が固定化された磁気ビーズを準備し、細胞群が懸濁されているバッファーに混ぜる。図３（Ａ）はこの状態を模式的に示す図であり、１１1は試験管、１２1はバッファー、１３は標的細胞、１４は非標的細胞、１５は抗体が固定化された磁気ビーズである。バッファー１２1内で抗体が固定化された磁気ビーズ１５が標的細胞１３に結合するのを待って試験管１１1の外から磁石１６を接近させて、磁気ビーズ１５を引き付ける。その状態のまま、バッファー１２1とともに磁気ビーズ１５が結合しなかった非標的細胞１４を他の試験管１１2に移動させて細胞の磁気分離を行う。図３（Ｂ）、（Ｃ）はこの状態を模式的に示す図であり、抗体が固定化された磁気ビーズ１５が結合した標的細胞１３は試験管１１1に残り、磁気ビーズ１５が結合しなかった非標的細胞１４は試験管１１2に移される。磁気分離の方法は、確立している手順に従って行う。
【００２９】
（２）本発明の目的とする標的細胞に特異的に結合する核酸となり得る核酸候補を選定するために、５’末端側に所定の数の固有の配列の塩基よりなる固定部、３’末端側に所定の数の固有の配列の塩基よりなる固定部を有し、両固定部の間にランダムな塩基配列を有するランダム部よりなる１本鎖ＤＮＡプールを準備する。５’末端側の固定部および３’末端側の固定部の塩基配列は、それぞれ、同一であり、塩基の数は１８から３８、ランダム部の塩基の数は３０〜１００程度とすればよい。１本鎖ＤＮＡプールは全体で１０15程度の種類のＤＮＡとすればよい。この１本鎖ＤＮＡプールは核酸合成装置で作成してもよいし、市販されているものを購入するものとしてもよい。図４の上部にはこれを模式的示す。２１1，２１2，---，２１nはそれぞれＤＮＡを意味する参照番号であり、両側に示す塗りつぶし部が塩基配列の固定部、これら固定部に挟まれたパターン表記部が塩基配列のランダム部である。
【００３０】
前記１本鎖ＤＮＡプールのＤＮＡを９５度で熱変性を加え、次いで氷上で急冷を行って、１本鎖ＤＮＡプール内の各ＤＮＡの高次構造を均一にする。この高次構造を保ったＤＮＡを、前記標的細胞１３を集めた試験管１１1のバッファー１２2へ添加し、氷上で細胞と結合させる。このとき標的細胞１３には、前記１０15程度の種類のＤＮＡのうちのいくつかの配列のＤＮＡが結合する。実際には、親和性の大きい配列のＤＮＡほど、多く結合する。図４の下部の左側にこれを模式的に示す。図４では、１本鎖ＤＮＡプールに模式的に示した７つのＤＮＡパターンの内、４つのＤＮＡが標的細胞１３に結合した様子を模式的に示す。このとき標的細胞１３に結合したＤＮＡは、標的細胞１３に特異的に結合する配列を持つＤＮＡである可能性があるものである。このとき用いるバッファー１２2はマグネシウムイオンＭｇ2+を含むバッファーなどの標準的なものを用い、さらに結合時には非特異的結合を抑えるために酵母のｔＲＮＡとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加しておくのが良い。
（ＩＩ）標的細胞に結合するＤＮＡの増幅
【００３１】
（３）次に、試験管１１1の中から１本鎖ＤＮＡが結合した任意の１細胞を取り出す。
【００３２】
（４）次に、１細胞リアルタイムＰＣＲによって、その細胞表面上に結合した１本鎖ＤＮＡを増幅する。ここでは、１本鎖ＤＮＡプールのＤＮＡ２１1が増幅されるものとした。このときセンス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端の固定部に相補のプライマー２３を無修飾で用いる。一方、アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端の固定部に相補のプライマー２２をビオチン２４で修飾して用いる。図４の下部の中央にこれを模式的に示す。ここで、標的細胞１３に特異的に結合するＤＮＡと非特異的に結合するＤＮＡとのＳ／Ｎ比を大きくするため、リアルタイムＰＣＲによって増幅量を確認し、プラトーに達する前に反応を終了するのが良い。リアルタイムＰＣＲの条件は、既に確立されている方法に従う。
【００３３】
（５）次に、リアルタイムＰＣＲ後、電気泳動によって未反応のプライマーを除去し、アルカリ処理により２本鎖を解離させ、不要であるアンチセンス鎖ＤＮＡについては、その５’末端にビオチン２４が修飾されていることを利用してフィルタを用いて除去する。図４の下部の右側にこれを模式的に示す。リアルタイムＰＣＲ後のＤＮＡを含むバッファーは、ビオチン２４を透過させないフィルタ２６を有する試験管１１3に注入される。フィルタ２６を透過したバッファー２７は、したがって、標的細胞１３に特異的に結合する配列を持つＤＮＡである可能性があるＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡのみを有するものとなる。図４では、これを標的細胞特異的候補ＤＮＡプールと表示した。図の例では、試験管１１1の標的細胞１３に結合した４つのＤＮＡが該当する。
【００３４】
（６）次に、得られた標的細胞特異的候補ＤＮＡプールを希塩酸ＨＣｌなどで中和後、ＴＥバッファーなどの一般的な試薬で洗浄する。これにより、アンチセンス鎖ＤＮＡ除去のためのアルカリ処理によりアルカリ変性したセンス鎖ＤＮＡを復帰させる。図４では、この過程は図示されていない。
（ＩＩＩ）非標的細胞１４に結合するＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡの増幅
【００３５】
（７）次に、図３（Ｃ）に示したように、抗体が固定化された磁気ビーズ１５が結合しなかった非標的細胞１４が入っている試験管１１2のバッファー１２2に、前記操作（６）で得られた標的細胞特異的候補ＤＮＡプールのＤＮＡを注入して非標的細胞１４に結合させる。図５の左側にこれを模式的に示す。図５では、標的細胞特異的候補ＤＮＡプールに模式的に示した４つのＤＮＡパターンの内、３つのＤＮＡが非標的細胞１４に結合した様子を模式的に示す。このとき非標的細胞１４に結合したＤＮＡは、標的細胞１３に特異的に結合する配列を持つＤＮＡであるとともに、非標的細胞１４にも特異的に結合する可能性があるものである。
【００３６】
（８）次に、試験管１１2内の細胞すべてを遠心によって集め、通常のＰＣＲによりその細胞表面上に結合したＤＮＡを増幅する。ここでは、１本鎖ＤＮＡプールのＤＮＡ２１2が増幅されるものとした。このときセンス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端にビオチン２４が修飾されたプライマー２３を、アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端にアミノ基２５が修飾されたプライマーを用いる。図５の中央にこれを模式的に示す。ここで行うＰＣＲは既に確立されている従来の方法に従って行う。
【００３７】
（９）次に、ＰＣＲ後、電気泳動によって未反応のプライマーを除去し、アルカリ処理により２本鎖を解離させ、不要であるセンス鎖ＤＮＡについては、その５’末端にビオチン２４が修飾されていることを利用してフィルタを用いて除去する。図５の右側にこれを模式的に示す。ＰＣＲ後のＤＮＡを含むバッファー１２2は、ビオチン２４を透過させないフィルタ２６を有する試験管３５に注入される。フィルタ２６を透過したバッファー３７は、したがって、非標的細胞１４に特異的に結合する配列を持つＤＮＡのアミノ基修飾アンチセンス鎖ＤＮＡのみを有するものとなる。図５では、これを非標的細胞特異的アンチセンス鎖ＤＮＡプールと表示した。図の例では、試験管１１1の標的細胞１３に結合した４つのＤＮＡの内の３つのＤＮＡが該当する。
【００３８】
（１０）次に、得られた非標的細胞特異的ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡを希塩酸ＨＣｌなどで中和後、ＴＥバッファーなどの一般的な試薬で洗浄する。これにより、センス鎖ＤＮＡ除去のためのアルカリ処理によりアルカリ変性したアンチセンス鎖ＤＮＡを復帰させる。図５では、この過程は図示されていない。
（ＩＶ）アフィニティクロマトグラフィーによるＤＮＡ精製
【００３９】
（１１）次に、前記（１０）の過程で得られた非標的細胞特異的アンチセンス鎖ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡをクロマトグラフィーのカラム４１内に設けられている担体ＮＨＳ４２等に固定する。これを、図６の中央部に模式的に示す。担体へのＤＮＡの固定はすでに確立されている従来の方法に従って行う。
【００４０】
（１２）次に、カラム４１全体を９５℃にして担体４２に固定されたＤＮＡを熱変性させる。
【００４１】
（１３）次に、前記（ＩＩ）標的細胞に結合するＤＮＡの増幅の過程（６）で精製した標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡプールのＤＮＡを９５℃で熱変性し、カラム４１に添加する。これを、図６の上部に模式的に示す。
【００４２】
（１４）次に、カラム４１をアニーリング温度に保持することで、標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡと、非標的細胞特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡを対合させることで、相補的なＤＮＡをカラム４１内でトラップさせる。その結果、標的細胞特異的候補センス鎖ＤＮＡの内、非標的細胞特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補であるＤＮＡはカラム４１内でトラップされ、逆に、非標的細胞特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補でないＤＮＡのみがカラム４１から流出する。これを、標的細胞特異的センス鎖ＤＮＡと表示し、図６の下部に模式的に示す。
【００４３】
（１５）もっとも、カラム４１から流出してくるＤＮＡには、それでもなお標的細胞に特異的に結合するセンス鎖ＤＮＡのみならず、完全にトラップしきれなかった非標的細胞に結合するセンス鎖ＤＮＡも含まれることが予想される。このため、カラム４１から流出してくるＤＮＡを前記過程（４）−（６）と同様にリアルタイムＰＣＲによって増幅し、再度カラム４１に適用する。ここではＳ／Ｎ比を大きくするために、増幅量が確認できるリアルタイムＰＣＲを行い、プラトーに達する前に反応を終了するのが良い。このリアルタイムＰＣＲによる増幅および再度カラム４１に適用する処理は、必要により、繰り返し行うことができる。これを、図６の中央部右側に模式的に示す。図６では、標的細胞に特異的に結合するセンス鎖ＤＮＡの内、非標的細胞に結合するセンス鎖ＤＮＡを除いたセンス鎖ＤＮＡが１つのみであるように表示したが、これは複数種であることが一般的である。リアルタイムＰＣＲの条件は、既に確立されている方法に従う。
（Ｖ）選択されたＤＮＡのシーケンシング
【００４４】
（１６）次に、過程（１５）で選択された複数種の標的細胞に特異的に結合するセンス鎖ＤＮＡをＴＡクローニング法によって、プラスミドベクター内に挿入し、大腸菌に導入してクローニングするとともに増幅する。
【００４５】
（１７）次に、通常のシーケンス反応により、各々の標的細胞に特異的に結合するセンス鎖ＤＮＡの配列を決定する。
【００４６】
（１８）次に、必要に応じて、各々のセンス鎖ＤＮＡの配列を標的細胞に結合させて結合定数を評価する。
【００４７】
上述した第１ステージだけでは、最終的に得られる標的細胞特異的ＤＮＡは、１種類のＤＮＡではなく、図２（Ａ）の上段部に示すように、複数種のＤＮＡが含まれることが考えられる。また、標的細胞中のある細胞には親和性をもつが、標的細胞中の他の細胞には親和性を持たないＤＮＡが得られることも考えられる。
【００４８】
そのため、以下の第２ステージの操作によって、より厳密な標的細胞に特異的に結合する標的細胞特異的ＤＮＡを選別する。
【００４９】
（１９）標的細胞１細胞（細胞Ａ1とする）を用いて得られた標的細胞特異的候補ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡプールの調整を行う。細胞Ａ1を用いて最終的に得られた標的細胞特異的候補ＤＮＡプールに対して、過程（８）と同様にしてＰＣＲを行う。標的細胞Ａ1に特異的候補ＤＮＡプールセンス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端にビオチン２４が修飾されたプライマー２３を、標的細胞Ａ1特異的候補ＤＮＡプールアンチセンス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端にアミノ基２５が修飾されたプライマーを用いる。ここで行うＰＣＲは既に確立されている従来の方法に従って行う。
【００５０】
（２０）次に、ＰＣＲ後、電気泳動によって未反応のプライマーを除去し、アルカリ処理により２本鎖を解離させ、不要である標的細胞Ａ1特異的候補ＤＮＡプールセンス鎖ＤＮＡについては、その５’末端にビオチン２４が修飾されていることを利用してフィルタを用いて除去する。ＰＣＲ後のＤＮＡを含むバッファー１２2は、ビオチン２４を通過させないフィルタ２６を有する試験管３５に注入される。フィルタ２６を通過したバッファー３７は、したがって、標的細胞Ａ1特異的候補ＤＮＡプールのアミノ基修飾アンチセンス鎖ＤＮＡのみを有するものとなる。
【００５１】
（２１）次に、得られた標的細胞Ａ1特異的候補ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡを希塩酸ＨＣｌなどで中和後、ＴＥバッファーなどの一般的な試薬で洗浄する。これにより、標的細胞Ａ1特異的候補センス鎖ＤＮＡ除去のためのアルカリ処理により変性した標的細胞Ａ1特異的候補アンチセンス鎖ＤＮＡを復帰させる。
【００５２】
（２２）標的細胞１細胞（細胞Ａ2とする）を用いて得られた標的細胞特異的候補ＤＮＡプールのセンス鎖ＤＮＡプールの調整を行う。上記の細胞Ａ1とは異なる１細胞（細胞Ａ2）を用いて以下の操作を行う。細胞Ａ2を用いて最終的に得られた標的細胞Ａ2特異的候補ＤＮＡプールに対して、過程（８）と同様にしてＰＣＲを行う。ただしここでは、標的細胞Ａ2特異的候補ＤＮＡプールセンス鎖ＤＮＡの増幅には無修飾のプライマーを、標的細胞Ａ2特異的候補ＤＮＡプールアンチセンス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端にビオチンが修飾されたプライマーを用いる。ここで行うＰＣＲは既に確立されている従来の方法に従って行う。
【００５３】
（２３）ＰＣＲ後、電気泳動によって未反応のプライマーを除去し、アルカリ処理により２本鎖を解離させ、不要であるアンチセンス鎖ＤＮＡについては、その５’末端にビオチン２４が修飾されていることを利用してフィルタを用いて除去する。ＰＣＲ後のＤＮＡを含むバッファーは、ビオチン２４を透過させないフィルタ２６を有する試験管１１3に注入される。フィルタ２６を透過したバッファー２７は、したがって、標的細胞Ａ2特異的候補ＤＮＡプールのセンス鎖ＤＮＡのみを有するものとなる。
【００５４】
（２４）次に、得られた標的細胞Ａ2特異的候補ＤＮＡプールのセンス鎖ＤＮＡを希塩酸ＨＣｌなどで中和後、ＴＥバッファーなどの一般的な試薬で洗浄する。これにより、標的細胞Ａ1特異的候補センス鎖ＤＮＡ除去のためのアルカリ処理により変性した標的細胞Ａ2特異的候補センス鎖ＤＮＡを復帰させる。
【００５５】
（２５）次に、上記３で得られた標的細胞Ａ1特異的候補アンチセンス鎖ＤＮＡをクロマトグラフィーのカラム内に設けられている担体ＮＨＳ等に固定する。担体へのＤＮＡの固定はすでに確立されている従来の方法に従って行う。
【００５６】
（２６）次に、カラム全体を９５℃にして担体に固定されたＤＮＡを熱変性させる。
【００５７】
（２７）次に、上記６で得られた標的細胞Ａ2特異的候補センス鎖ＤＮＡプールのＤＮＡを９５℃で熱変性し、カラム４１に添加する。
【００５８】
（２８）次に、カラム４１をアニーリング温度に保持することで、標的細胞Ａ1特異的候補アンチセンス鎖ＤＮＡと、標的細胞Ａ2特異的候補ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡを対合させることで、相補的なＤＮＡをカラム４１内でトラップさせる。その結果、標的細胞Ａ2特異的候補センス鎖ＤＮＡの内、標的細胞Ａ1特異的候補アンチセンス鎖ＤＮＡと相補であるＤＮＡはカラム４１内でトラップされる。即ち、標的細胞Ａ1と標的細胞Ａ2とに共通に含まれるＤＮＡはカラム内でトラップされることになる。逆に、標的細胞Ａ1と標的細胞Ａ2とに共通に含まれないＤＮＡはカラムから流出してくることになる。
【００５９】
（２９）その後、アルカリ処理により２本鎖を解離させ、カラム担体上に対合していたＤＮＡを流出し取得する。
【００６０】
（３０）次に、ＤＮＡを希塩酸ＨＣｌなどで中和後、ＴＥバッファーなどの一般的な試薬で洗浄することにより、同様にしてＤＮＡを復帰させる。
【００６１】
（３１）前記過程３０で得られた標的細胞Ａ1特異的候補センス鎖ＤＮＡに対して、再度過程２１以降の操作を行う。一方、新たな標的細胞１細胞（細胞Ａ3とする）を用いて、過程２２以降の操作を行う。これを他の細胞にも同様に行っていくことで、より厳密な標的細胞に特異的に結合する標的細胞特異的ＤＮＡを選別する。
【００６２】
前記手順の内、過程（１）の標的細胞の選択は抗体が固定化された磁気ビーズよる方法に代えて、位相差顕微鏡像等をもとにした細胞の外見上の特徴、あるいは、たとえば蛍光による標識を利用してセルソータにより分離するものとしても良い。特に、最近の造血幹細胞の研究等で、骨髄由来の血球細胞をＤＮＡ結合色素であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色すると、その蛍光輝度が他の細胞のそれと比較して小さい細胞が存在し、またそれらには造血幹細胞が非常に高濃度に存在するということが明らかにされた。これは、造血幹細胞は、その細胞膜上トランスポーター活性によるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２排出能が他の細胞のそれと比較して高いため、その結果、他の細胞よりもＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２による染色の度合いが小さくなるためであるとされている。このように蛍光色素などによる標識を利用し、セルソータで分離してもよい。
【００６３】
また、過程（３）では、標的細胞を１細胞のみ取り出して１細胞リアルタイムＰＣＲを行うとしたが、標的細胞１細胞に結合している標的細胞特異的ＤＮＡプール内のＤＮＡ絶対量が少なすぎて、１細胞リアルタイムＰＣＲで増幅されない可能性も考えられる。その場合は、はじめのＤＮＡプール内に存在するＤＮＡの種類を少なくし、各ＤＮＡの絶対量を大きくしても行っても良い。またそれでも困難であった場合には、１細胞のみを取り出してくるのではなく、少数細胞を取り出してリアルタイムＰＣＲを行ってもよい。
【００６４】
また、前記、図５で説明した通常のＰＣＲによるＤＮＡの増幅をリアルタイムＰＣＲとしても良い。この場合、図４で説明した１細胞リアルタイムＰＣＲで増幅するほどの精密さは要求されないので、プラトーの管理をする必要はない。
【００６５】
また、過程（５）、（９）のプライマーを除去するための電気泳動を用いる方法は、フィルタを用いて分子量の相違によって除去しても良い。
【００６６】
また、過程（５）のアンチセンス鎖除去、過程（９）のセンス鎖除去については、担体にストレプトアビジンが結合したカラムを用いて、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行っても良い。
【００６７】
（実施例２）
実施例２では、以下の手順により標的細胞に特異的に結合する核酸を得る。実施例１との違いは、ビオチンが修飾されたＤＮＡの除去をフィルタで行うのに代えて、ビオチンと結合するストレプトアビジンが付加された磁気ビーズを利用して行うことにある。以下の説明では、処理過程（４１）からはじめるが、処理過程５０までは実施例１の処理過程（１）から（１０）対応し、実施例１の処理過程に付した番号に４０を加えた番号となっている。
（Ｉ）標的細胞と非標的細胞の分離
【００６８】
（４１）標的細胞の表面に結合する抗体が固定化された磁気ビーズを準備し、細胞群が懸濁されているバッファー１２1に混ぜ、磁気ビーズ１５が結合した標的細胞１３と磁気ビーズ１５が結合しなかった非標的細胞１４と分離する。この過程は、図３に示す実施例１と同じであるので図示は省略する。
【００６９】
（４２）本発明の目的とする標的細胞に特異的に結合する核酸となり得る核酸候補を選定するため、１本鎖ＤＮＡプールを準備して標的細胞１３に結合させる手順についても、図４に示す実施例１と同じであるので、説明および図示は省略する。
（ＩＩ）標的細胞に結合するＤＮＡの増幅
【００７０】
（４３）次に、実施例１と同様、図７の下部の左側に模式的に示すように、磁気ビーズ１５が結合した標的細胞１３の入った試験管１１1のバッファー１２2中に１本鎖ＤＮＡプールのＤＮＡを添加した後、試験管１１1の中から任意の１細胞を取り出す。
【００７１】
（４４）次に、実施例１と同様、１細胞リアルタイムＰＣＲによって、その細胞表面上に結合したＤＮＡを増幅する。ここでは、１本鎖ＤＮＡプールのＤＮＡ２１1が増幅されるものとした。このときセンス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端の固定部に相補のプライマー２３を無修飾で用いる。一方、アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅には３’末端の固定部に相補のプライマー２２をビオチン２４で修飾して用いる。図７の中央にこれを模式的に示す。
【００７２】
（４５）次に、リアルタイムＰＣＲ後、アルカリ処理により２本鎖を解離させ、不要であるアンチセンス鎖ＤＮＡ５２については、その３’末端にビオチン２４が修飾されていることを利用してストレプトアビジン磁気ビーズ５０を添加することで除去し、必要とするセンス鎖ＤＮＡ５１を回収する。磁気ビーズ５０とビオチン２４修飾アンチセンス鎖ＤＮＡの結合は、従来の方法に従って行う。図７の右側にこれを模式的に示す。リアルタイムＰＣＲ後のＤＮＡを含む試験管２８1内のバッファー４６には、ビオチン２４と結合するストレプトアビジンを固定した磁気ビーズ５０が注入される。その結果、ビオチン２４修飾アンチセンス鎖ＤＮＡ５２のビオチン２４と磁気ビーズ５０は結合するから、試験管２８1の外部から磁石１６を接近させるとビオチン２４修飾アンチセンス鎖ＤＮＡ５２のＤＮＡは、磁石１６に引き付けられる。一方、試験管２８1内のバッファー４６に残っているＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡ５１を試験管２８2に移す。
【００７３】
その結果、試験管２８2には標的細胞１３に特異的に結合する配列を持つＤＮＡである可能性がある１本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡ５１のみを有するものとなる。図７では、これを標的細胞特異的候補ＤＮＡプールと表示した。図の例では、実施例１の試験管１１1の標的細胞１３に結合した４つのＤＮＡが該当する。
【００７４】
（４６）次に、得られた標的細胞特異的候補ＤＮＡプールを希塩酸ＨＣｌなどで中和後、ＴＥバッファーなどの一般的な試薬で洗浄する。これにより、アンチセンス鎖ＤＮＡ除去のためのアルカリ処理によりアルカリ変性したセンス鎖ＤＮＡを復帰させる。図７では、この過程は図示されていない。
（ＩＩＩ）非標的細胞に結合するＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡの増幅
【００７５】
（４７）次に、図３（Ｃ）に示したように、抗体が固定化された磁気ビーズ１５が結合しなかった非標的細胞１４が入っている試験管１１2に、前記操作（２６）で得られた標的細胞特異的候補ＤＮＡプールのＤＮＡを非標的細胞１４に結合させる。図８の左側にこれを模式的に示す。図８では、標的細胞特異的候補ＤＮＡプールに模式的に示した４つのＤＮＡパターンの内、３つのＤＮＡが非標的細胞１４に結合した様子を模式的に示す。このとき非標的細胞１４に結合したＤＮＡは、標的細胞１３に特異的に結合する配列を持つＤＮＡであるとともに、非標的細胞１４にも特異的に結合する可能性があるものである。
【００７６】
（４８）次に、試験管１１2内の細胞１４すべてを遠心によって集め、通常のＰＣＲによりその細胞表面上に結合したＤＮＡを増幅する。ここでは、１本鎖ＤＮＡプールのＤＮＡ２１2が増幅されるものとした。このときアンチセンス鎖ＤＮＡの増幅には３’末端にビオチン２４が修飾されたプライマー２２を、センス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端が不修飾のプライマーを用いる。図８の中央にこれを模式的に示す。ここで行うＰＣＲは既に確立されている従来の方法に従って行う。
【００７７】
（４９）次に、ＰＣＲ後、アルカリ処理により２本鎖を解離させ、必要であるアンチセンス鎖ＤＮＡ６２については、その３’末端にビオチン２４が修飾されていることを利用してビオチン２４と結合するストレプトアビジンを固定した磁気ビーズ５０と結合させて試験管内に残し、ＰＣＲ後のＤＮＡを含むバッファー４６中にあるセンス鎖ＤＮＡ６１は廃棄する。図８の右側にこれを模式的に示す。ＰＣＲ後の試験管２８1にはビオチン２４と結合するストレプトアビジンを固定した磁気ビーズ５０が注入される。ストレプトアビジンとビオチン２４が結合し、試験管２８1に磁石１６を近づけて、磁気ビーズ５０を引き寄せると、アンチセンス鎖ＤＮＡ６２が試験管２８1の壁に引き寄せられる。この状態でバッファーとセンス鎖ＤＮＡ６１を廃棄する。したがって、試験管２８1内は非標的細胞１４に特異的に結合する配列を持つＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡ６２のみを有するものとなる。図８では、これを非標的細胞特異的ＤＮＡプールと表示した。図の例では、試験管１１1の標的細胞１３に結合した４つのＤＮＡの内の３つのＤＮＡが該当する。
【００７８】
（５０）次に、得られた非標的細胞特異的ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡをＨＣｌなどで中和後、ＴＥバッファーなどの一般的な試薬で洗浄する。これにより、センス鎖ＤＮＡ除去のためのアルカリ処理によりアルカリ変性したアンチセンス鎖ＤＮＡを復帰させる。図８では、この過程は図示されていない。
（ＩＶ）ストレプトアビジン磁気ビーズ上でのアニーリング
【００７９】
（５１）次に、前記（４６）、（５０）の過程で得られた標的細胞特異的候補ＤＮＡプールのセンス鎖ＤＮＡ５１と磁気ビーズ５０付の非標的細胞特異的ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡ６２を試験管２８2に一緒に入れて混合し、９５℃で熱変性させ、その後アニーリング温度に保持する。その結果、前記過程（４６）と過程（５０）で得られた標的細胞特異的候補ＤＮＡプールのセンス鎖ＤＮＡ５１の内、非標的細胞特異的ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡ６２と相補であるものについては、相補的に対合させることができ、それらの配列をもつセンス鎖ＤＮＡ５１を磁気ビーズ５０上でトラップさせることができる。磁石１６を試験管２８2の外部から近づけると、磁気ビーズ５０が試験管２８2の外壁に引き付けられる。したがって、試験管内２８2のバッファー４６には、標的細胞特異的候補ＤＮＡプールの内、その相補鎖が非標的細胞特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡ６２に含まれないＤＮＡのみが残される。これを、標的細胞特異的ＤＮＡのセンス鎖プールと表示し、図９の下部に模式的に示す。
【００８０】
（５２）もっとも、試験管２８2のバッファー４６に残されたＤＮＡには、それでもなお標的細胞に特異的に結合するＤＮＡのみならず、完全にトラップしきれなかった非標的細胞に結合するＤＮＡも含まれることが予想される。このため、試験管２８2のバッファー４６に残されたＤＮＡを前記過程（２４）−（２６）と同様にリアルタイムＰＣＲによって増幅し、再度、磁気ビーズ５０付の非標的細胞特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡ６２と試験管２８2に一緒に入れて、磁気ビーズ５０上でトラップさせる。ここではＳ／Ｎ比を大きくするために、増幅量が確認できるリアルタイムＰＣＲを行い、プラトーに達する前に反応を終了するのが良い。このリアルタイムＰＣＲによる増幅および再度磁気ビーズ５０上でトラップさせる処理は、必要により、繰り返し行うことができる。これを、図９の中央部右側に模式的に示す。図９では、標的細胞に特異的に結合するＤＮＡの内、非標的細胞に結合するＤＮＡを除いたＤＮＡが１つのみであるように表示したが、これは複数種であることが一般的である。リアルタイムＰＣＲの条件は、既に確立されている方法に従う。
（Ｖ）選択されたＤＮＡのシーケンシング
【００８１】
（５３）次に、過程（５２）で選択された複数種のＤＮＡをＴＡクローニング法によって、プラスミドベクター内に挿入し、大腸菌に導入してクローニングするとともに増幅する。
【００８２】
（５４）次に、通常のシーケンス反応により、各々のＤＮＡの配列を決定する。
【００８３】
（５５）次に、必要に応じて、各々のＤＮＡの配列を標的細胞に結合させて結合定数を評価する。
【００８４】
実施例２においても、以下の第２ステージの操作によって、より厳密な標的細胞に特異的に結合する標的細胞特異的ＤＮＡを選別する。
【００８５】
（５６）標的細胞１細胞（細胞Ａ1とする）を用いて得られた標的細胞特異的候補ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡプールの調整を行う。細胞Ａ1を用いて最終的に得られた標的細胞特異的候補ＤＮＡプールに対して、過程（４８）と同様にしてＰＣＲを行う。このときアンチセンス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端にビオチン２４が修飾されたプライマー２２を、センス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端が無修飾のプライマーを用いる。ここで行うＰＣＲは既に確立されている従来の方法に従って行う。
【００８６】
（５７）過程（４９）（５０）と同様。これにより、標的細胞Ａ1特異的候補ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡをストレプトアビジン磁気ビーズ表面に固定する。
【００８７】
（５８）他の標的細胞１細胞（細胞Ａ2とする）を用いて得られた標的細胞特異的候補ＤＮＡプールのセンス鎖ＤＮＡプールの調整を行う。上記の細胞Ａ1とは異なる１細胞（細胞Ａ2）を用いて以下の操作を行う。細胞Ａ2を用いて最終的に得られた標的細胞Ａ2特異的候補ＤＮＡプールに対して、過程（４８）と同様にしてＰＣＲを行う。ただしここでは、標的細胞Ａ2特異的候補ＤＮＡプールセンス鎖ＤＮＡの増幅には無修飾のプライマーを、標的細胞Ａ2特異的候補ＤＮＡプールアンチセンス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端にビオチンが修飾されたプライマーを用いる。ここで行うＰＣＲは既に確立されている従来の方法に従って行う。
【００８８】
（５９）ＰＣＲ後、過程（４５）と同様にして、不要である標的細胞Ａ2特異的候補ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡを除去し、標的細胞Ａ2特異的候補ＤＮＡプールのセンス鎖ＤＮＡのみを有するものとなる。
【００８９】
（６０）次に、過程（４６）と同様に、得られた標的細胞Ａ2特異的候補ＤＮＡプールのセンス鎖ＤＮＡを希塩酸ＨＣｌなどで中和後、ＴＥバッファーなどの一般的な試薬で洗浄する。これにより、標的細胞Ａ2特異的候補センス鎖ＤＮＡ除去のためのアルカリ処理により変性した標的細胞Ａ2特異的候補センス鎖ＤＮＡを復帰させる。
【００９０】
（６１）次に、過程（５１）と同様に、ストレプトアビジン磁気ビーズ上でアニーリングさせる。標的細胞Ａ1特異的候補アンチセンス鎖ＤＮＡと、標的細胞Ａ2特異的候補ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡを対合させることで、相補的なＤＮＡをトラップさせる。その結果、標的細胞Ａ2特異的候補センス鎖ＤＮＡの内、標的細胞Ａ1特異的候補アンチセンス鎖ＤＮＡと相補であるＤＮＡがトラップされる。即ち、標的細胞Ａ1と標的細胞Ａ2とに共通に含まれるＤＮＡはトラップされることになる。逆に、標的細胞Ａ1と標的細胞Ａ2とに共通に含まれないＤＮＡはトラップされず、上清に残ったままであるので洗浄により除去する。
【００９１】
（６２）その後、アルカリ処理により２本鎖を解離させ、ストレプトアビジン磁気ビーズ上に固定された標的細胞Ａ特異的候補アンチセンス鎖ＤＮＡに対合していた標的細胞Ａ1特異的候補センス鎖ＤＮＡを取得する。
【００９２】
（６３）次に、ＤＮＡを希塩酸ＨＣｌなどで中和後、ＴＥバッファーなどの一般的な試薬で洗浄することにより、同様にしてＤＮＡを復帰させる。
【００９３】
（６４）前記過程６３で得られた標的細胞Ａ特異的候補センス鎖ＤＮＡに対して、再度過程１以降の操作を行う。一方、新たな標的細胞１細胞（細胞Ｃとする）を用いて、過程４以降の操作を行う。これを他の細胞にも同様に行っていくことで、より厳密な標的細胞に特異的に結合する標的細胞特異的ＤＮＡを選別する。
【００９４】
実施例２においても、前記手順の内、過程（４１）の標的細胞の選択は抗体が固定化された磁気ビーズよる方法に代えて、細胞の外見上の特徴、あるいは、たとえば蛍光による標識を利用してセルソータにより分離するものとしても良い。
【００９５】
また、標的細胞１細胞のみを取り出してくるのではなく、少数細胞を取り出してリアルタイムＰＣＲを行ってもよい。
【００９６】
また、前記、図８で説明した通常のＰＣＲによるＤＮＡの増幅をリアルタイムＰＣＲとしても良いが、図７で説明した１細胞リアルタイムＰＣＲで増幅するほどの精密さは要求されないので、簡便に通常のＰＣＲとすればよい。
【００９７】
また、過程（４５）、（４９）のプライマーを除去するための電気泳動を用いる方法は、フィルタを用いて分子量の相違によって除去しても良い。
【００９８】
また、過程（４５）のアンチセンス鎖除去、過程（４９）のセンス鎖除去については、担体にストレプトアビジンが結合したカラムを用いて、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行っても良い。
【００９９】
以上、本発明の例示的実施形態を説明したが、種々の変更、改変、および改良が当業者に容易に想起される。上記は、本発明の原理を例示的に示したものに過ぎず、当業者であれば、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な改変を為し得る。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明によれば標的細胞に特異的に結合し、非標的細胞とは結合することのないＤＮＡを容易に得ることができるので、創薬、医療分野の研究発展に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】（Ａ）−（Ｆ）は本発明を実施する第１ステージを説明するフロー図である。
【図２】（Ａ）、（Ｂ）は本発明を実施する第２ステージを説明するフロー図である。
【図３】（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は実施例１の標的細胞と非標的細胞の分離を細胞の表面に結合する抗体が固定化された磁気ビーズを利用して行う手順を模式的に示す図である。
【図４】実施例１の標的細胞特異的候補ＤＮＡを選定する手順を模式的に示す図である。
【図５】実施例１の標的細胞特異的候補ＤＮＡの内の非標的細胞に結合するＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡを選定する手順を模式的に示す図である。
【図６】アフィニティクロマトグラフィーにより、標的細胞特異的候補ＤＮＡから、非標的細胞に結合するＤＮＡを除去してＤＮＡを精製する手順を模式的に示す図である。
【図７】実施例２の標的細胞特異的候補ＤＮＡを選定する手順を模式的に示す図である。
【図８】実施例２の標的細胞特異的候補ＤＮＡの内の標的細胞に結合するＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡを選定する手順を模式的に示す図である。
【図９】ストレプトアビジン磁気ビーズ上でのアニーリングにより、標的細胞特異的候補ＤＮＡの内の標的細胞に結合するＤＮＡを除去してＤＮＡを精製する手順を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【０１０２】
１１1，１１2，１１3，２８1，２８2，３５…試験管、１２1，１２2，２７，３７，４６…バッファー、１３…標的細胞、１４…非標的細胞、１５…抗体が固定化された磁気ビーズ、１６…磁石、２１1，２１2，---，２１n…ＤＮＡ、２２，２３…プライマー、２４…ビオチン、２５…アミノ基、２６…フィルタ、４１…クロマトグラフィーのカラム、４２…カラム内の担体、５０…ストレプトアビジン磁気ビーズ、５１，６１…センス鎖ＤＮＡ、５２，６２…アンチセンス鎖ＤＮＡ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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