(57)【要約】【課題】液相中の反応に比べ、高効率核酸増幅反応を行うことを目的とする。【解決手段】気相中での核酸増幅反応を行う。微細水滴中にプライマー１２、対象の核酸１、ＤＮＡポリメラーゼ２、デオキシヌクレオシド三燐酸３を加え、気相中へ放出し、反応させる。気相であるため、加圧による温度管理が可能となり、高効率、迅速な温度調整が可能となる。プライマー１２、対象の核酸１、ＤＮＡポリメラーゼ２、デオキシヌクレオシド三燐酸３は微細分化手段５により気相中に放出され、それぞれが反応、増幅するものである。増幅時の温度調整はシリンジ６を利用し、加圧変化により温度調整するものである。検出は蛍光反応を利用し、リアルタイムで検出させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細水滴を噴霧し、その微細水滴中にプライマー、検出対象の核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸を全て含むか、若しくは一つ以上を含ませ、気相中で反応させる核酸増幅方法。
【請求項２】
超音波振動を利用した請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
加温スチームを利用した請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
水分子の衝突による分散を利用した請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
加温対象を、プライマー、検出対象の核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸のいずれか一つ以上、若しくは全てとした請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
３０から１００℃まで加温、冷却可能な材質の反応容器を備えた請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項７】
加温可能な材質として熱伝導性が高い金属とした請求項６記載の核酸増幅装置。
【請求項８】
圧力調整できる反応容器を備えた請求項１記載の核酸増幅装置。
【請求項９】
反応容器を内部容積の増減で圧力および温度を調整できる構造とした請求項８記載の核酸増幅装置。
【請求項１０】
反応容器内の圧力を圧力調整弁で調整可能な構造とした請求項８記載の核酸増幅装置。
【請求項１１】
核酸増幅の反応容器を光透過性の容器とし、容器内の蛍光を検出できる構造とした請求項６乃至１０のいずれかに記載の核酸増幅装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を気相中に放出・反応させることで高効率に増幅するための方法ならびに装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来この種の核酸増幅方法はリアルタイムポリメラーゼチェインリアクションを含め液相中で行なわれてきた（例えば非特許文献１、特許文献１参照）。マイクロチューブ内に増幅に関する薬剤として、プライマー、検出対象の核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸を加え、反応させる手法であり、マイクロチューブ内の温度を、加温機を使用し、調整することで反応させるものである。マイクロチューブ内の温度と加温機の加温とは時間差があり、また温度が十分でないなどの理由から事前にマイクロチューブ内の温度を把握し、設定温度の場所で反応させるなどの事前評価が必要であった。また、ポリメラーゼチェインリアクションは温度の増減が激しいため、加温機の材質を熱伝導性の高いアルミニウムなどで加工することで反応を実施してきた。
【非特許文献１】Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９６  Ｎｏｖ  １；２４２（１）：８４−９
【特許文献１】特表２００５−５２２９８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このような従来の核酸増幅方法および装置は増幅反応の原理から効率が低く、装置側の設定負担が大きい。また、液相反応の場合、熱伝導性の問題などから反応が遅くなるという課題がある。また、液相反応の場合、液中温度の増減が不十分あるいは過剰な場合があり、反応が促進されない場合があるといった課題がある。そこで安定した反応条件の核酸増幅方法ならびに装置が要求されている。
【０００４】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、核酸増幅反応を気相中で実施することにより効率が高い反応を可能にする手段である。また、容器全体を加温、もしくは圧縮し、気相全体の温度を調整することで液相に比べ、反応が促進され、安定した反応が可能になる。その結果、反応が早くなる核酸増幅方法および装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の気相中での核酸増幅方法および装置は上記課題解決を達成するために、微細水滴を噴霧し、その微細水滴中にプライマー、検出対象の核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸を全て含むか、若しくは一つ以上を含ませ反応できるようにしたことを特徴とする。
【０００６】
本発明の気相中での核酸増幅方法および装置は、微細化水滴手段として超音波振動を利用することを特徴とする。
【０００７】
本発明の気相中での核酸増幅方法および装置は、微細化水滴手段として加湿スチームを利用することを特徴とする。
【０００８】
本発明の気相中での核酸増幅方法および装置は、水分子の衝突による分散を利用したことを特徴とする。
【０００９】
本発明の気相中での核酸増幅方法および装置は、加温対象を、プライマー、検出対象の核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸のいずれか一つ以上、若しくは全てとすることを特徴とする。
【００１０】
本発明の気相中での核酸増幅方法および装置は、少なくとも反応容器が３０℃から１００℃まで加温可能な材質とすることを特徴とする。
【００１１】
本発明の気相中での核酸増幅方法および装置は、加温可能な材質として熱伝導性が高い金属とすることを特徴とする。
【００１２】
本発明の気相中での核酸増幅方法および装置は、反応容器を加圧できることを特徴とする。
【００１３】
本発明の気相中での核酸増幅方法および装置は、反応容器を内部容積の増減で温度調整できることを特徴とする。
【００１４】
本発明の気相中での核酸増幅方法および装置は、反応容器の圧力を圧力調整弁で調整可能な構造とすることを特徴とする。
【００１５】
本発明の気相中での核酸増幅方法および装置は、反応容器を光透過性の容器とし、容器内の蛍光発光を計測できる構造としたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、気相中で核酸増幅反応を実施することで反応容器内の加温化および低温化を迅速、安定に行なうことで効率が高く、安定した反応をもたらすことができる核酸増幅方法および装置を提供できる。また、気相中であるため、液相中の反応に比べ、温度管理が緻密になり、安定した反応が可能となり、反応が早くなる。また、また、微細分化水滴下で反応させることにより、微量な検出対象核酸でもＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸と効率よく接触し、反応が促進され、安定して反応させることが可能となる。また、反応容器内の気相温度を増減することで反応させることが可能であり、液相に比べ容易に温度調整が可能となる。また、反応容器内部圧力を調整し、温度管理することで、低エネルギーでの加温が可能となり、さらに温度を下げる場合にも圧力調整で容易に迅速に行なうことができる装置を提供でき、結果として早い反応が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の請求項１記載の発明は、反応容器内の気相中にプライマー、検出対象の核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸を全て含むか、若しくは一つ以上を含ませた微細水滴を噴霧し、気相中で核酸増幅を行なうことで、検出対象の核酸と各試薬を高効率で接触させ、反応させることができるという作用を有する。
【００１８】
また、請求項２記載の発明は、微細分化手法として超音波振動を利用することで熱が発生せず、また一定の微細分水滴を噴霧することができるという作用を有する。
【００１９】
また、請求項３記載の発明は、微細分化手法として加温スチームを利用することで、低エネルギーで、また一定の微細分水滴を噴霧することができるという作用を有する。
【００２０】
また、請求項４記載の発明は、微細分化手法として水分子の衝突による分散を利用することで熱が発生せず、また一定の微細分水滴を噴霧することができるという作用を有する。
【００２１】
また、請求項５記載の発明は、加温対象をプライマー、検出対象の核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸のいずれか若しくは全てとすることで加温による影響が大きい酵素の活性維持などに繋がるという作用を有する。
【００２２】
また、請求項６記載の発明は、反応容器を３０℃から１００℃まで加温可能な材質とすることで反応容器ごと加温、低温化することができ、反応の高効率化に繋がるという作用を有する。
【００２３】
また、請求項７記載の発明は、反応容器の材質を熱伝導性が高い金属とすることでより迅速な反応容器内温度調整が可能となるという作用を有する。
【００２４】
また、請求項８記載の発明は、反応容器を加圧できる加圧容器とすることで加圧・減圧により温度を迅速に調整できるという作用を有する。
【００２５】
また、請求項９記載の発明は、反応容器の加圧・減圧を内部容積の増減で行なうことで簡便に温度を調整できるという作用を有する。
【００２６】
また、請求項１０記載の発明は、反応容器内の圧力を圧力調整弁で調整可能な構造とすることで圧力調整弁の圧力放出で温度調整が可能となる作用を有する。
【００２７】
また、請求項１１記載の発明は、反応容器を光透過性の容器とし、容器内の蛍光を検出できる構造とすることで蛍光ラベルなどにより核酸増幅反応をリアルタイムに検出できるという作用を有する。
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２９】
（実施の形態１）
検体中に存在する核酸の種類を検出する手法の一つにポリメラーゼチェインリアクションがある。ポリメラーゼチェインリアクションは、特定の生体由来の、特定の核酸配列を特異的に増幅させ、その増加から特定の生体を同定するものである。これまでのポリメラーゼチェインリアクションは溶液中の反応をマイクロチューブ内で行い、加温機によって熱増減を行い、反応させ、短いもので、２時間程度で反応が可能となっている。しかしながら、加温位置、加温方法によっては反応が十分に進まず、また、溶液中の反応であるため、温度の低下が難しい。温度の低下には加温機の低温化が求められるが、多くのエネルギーを消費するものである。さらに核酸が微量であった場合、マイクロチューブ内の液量によっては反応がうまく進まない場合も懸念される。
【００３０】
そのため、安定した反応が可能で、全体の加温、低温化が迅速に実施できる方法、装置の開発が期待されている。例えば、接触効率の向上である。目的の検出対象核酸との反応を高効率化させるために反応液を微量にする必要がある。また、反応液中の低温化は一度加温してしまった場合、外部から過剰なエネルギーを提供しなければ低温化が難しい。特にポリメラーゼチェインリアクションの場合、９０度以上まで温度を上げる反応が想定されるため、温度管理は特に重要である。そこで、気相中に目的の検出対象の核酸を放出させ、さらにプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸を加えることで温度管理、ならびに接触性の向上が可能になることを利用する。
【００３１】
微細水滴を、例えば、反応容器中の微細水滴が漂って安定して存在する程度の高湿度下で噴霧し、その微細水滴中にプライマー、検出対象の核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸を全て含むか、若しくは一つ以上を含ませ、気相中で反応させる。
【００３２】
微細水滴中に核酸やプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸を含ませて接触することで個々が接触する確率が上がり、反応が促進される。そのため気相中に放出された検出対象の核酸やプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸は気相中の微細化された水滴中に保持されることでそれぞれが効率よく、高濃度で接触することができる。それに伴い、反応の加速化が可能となる。検出対象の核酸やプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸は最初に混合することも、あるいは個別に噴霧することも有効であるが、特に後者の場合、個別に噴霧することでＤＮＡポリメラーゼのような酵素の熱失活を防止することができる。
【００３３】
噴霧条件は、反応容器の気相中に浮遊する条件であるが、回収して再噴霧することで再度反応を促進することもできる。微細化水滴手段として超音波振動、加湿スチーム、水分子の衝突による分散が挙げられるが、超音波振動は一定量、大きさの水分子を常時提供することが可能である。さらに一度下部にたまった水滴を再度噴霧することが可能である。加湿スチームは加温するものの、低エネルギーで一定量、大きさの水分子を常時提供することができる。水分子の衝突による分散は水分子の大きさが不安定になるが、温度が掛からず、ＤＮＡポリメラーゼの活性維持に有効である。
【００３４】
ポリメラーゼチェインリアクションのような核酸増幅反応は温度管理が重要な要素であるが、この際の加温対象は反応前の検出対象核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸のいずれか若しくは全てでよい。加温は反応容器ごと行なうこともできる。そのため、加温反応容器は耐熱性の材質が望ましい。具体的に、反応容器ごと加温する場合は、熱伝導性が高い金属が有効である。一方、反応容器内のみ反応させる場合は、気相反応であるため、加圧で温度コントロールできる。加圧の場合、反応容器を耐圧性、耐熱性の容器である必要がある。加圧での温度コントロールは内部容積の増減、圧力弁の利用による内部圧力、温度調整が可能である。耐熱ガラスや耐圧ガラスなどが有効である。また、反応容器を光透過性の容器とすることで容器内蛍光発光を計測できる。これにより、リアルタイムで反応状態を確認することが可能となる。
【実施例１】
【００３５】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００３６】
気相中での核酸増幅により高効率な反応を行なう。本技術はポリメラーゼチェインリアクションを行なうための反応容器、温度調節部、微細分化部からなる。ポリメラーゼチェインリアクションを行なうために対象の核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸を気相中に放出する手段が必要となる。気相中で反応させるために対象の核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸を微小な水滴中に含ませ、気相に放出し、容器内で反応させるものである。具体的な微細分化による気相放出手段として、超音波振動、加湿スチーム、水分子の衝突などが挙げられるが、加圧による拡散なども手段として挙げられる。微小な水滴の大きさとしては、対象の核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸の一分子が含まれる水滴量以上、凝結等により落下しない大きさである。反応は微小な水滴中で行なわれるため、反応気相内を攪拌することなども有効である。反応気相のポリメラーゼチェインリアクションの、温度管理のために、反応容器ごとあるいはその内部を加温することが求められる。
【００３７】
反応容器ごとの加温はペルチェ素子による加温、低温化などが有効である。反応容器材質は、アルミニウム、銅、銀、金、など熱伝導性の高い金属、ポリカーボネート、ポリスチレンなど反応温度内の耐熱性がある容器、耐熱ガラス、耐圧ガラスなどが有効である。一方、加圧による温度管理は内部圧力の増減、加温に伴う、密閉状態維持による温度上昇などが有効である。特に加圧による温度管理は、加熱時のみならず、低温化にも対応可能である。すなわち、加温時は内部圧力を向上させ、低温化は内部圧力の低下により行なうものである。反応容器は耐圧、耐熱のものが有効である。また、リアルタイムポリメラーゼチェインリアクションに利用されるインターカレート型蛍光試薬なども同時に気相へ放出することで反応を促進、リアルタイムでの検出が可能となる。液相の場合、インターカレート型蛍光試薬の蛍光発光を捉えるために２時間程度の反応時間が必要であるが、気相の場合、反応効率が高いことから迅速化ができる。光透過性の反応容器を利用することで検出器９を備えた光学機器での計測が可能となる。
【００３８】
気相中での核酸増幅方法を好適に実施するための核酸増幅装置の一態様を示す概念図を図１に示す。
【００３９】
図１に示すように、対象の核酸１、ＤＮＡポリメラーゼ２、デオキシヌクレオシド三燐酸３を含む反応容器４に微細分化手段５で気相に放出する。気相に放出された対象の核酸１、ＤＮＡポリメラーゼ２、デオキシヌクレオシド三燐酸３を気相中で接触させる。一方、反応容器４には圧力調整が可能なシリンジ６が設置されており、内部圧力を調整することができる。必要に応じ微細分化手段５は凝集した対象の核酸１、ＤＮＡポリメラーゼ２、デオキシヌクレオシド三燐酸３を再び再気相化させることが可能である構造となっている。
【００４０】
反応後、若しくは反応途中でＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮなどインターカレート型蛍光試薬７を同様の微細分化手段５で投入し、反応した核酸を検出する。反応容器４は光透過性の材質を用いており、水銀ランプなどの励起光源８から放出された励起光に対し、反応した発光を総発光輝度として認識させるものである。
【００４１】
図２に反応容器４の温度調整手段として、ヒータなどの外部加温手段１０を示した。
【００４２】
なお、対象の核酸を微細水滴中に一分子のみ導入することで、インターカレート型蛍光試薬を反応させ、発光微細水滴を個々に計数することも可能である。これにより、初期に含まれる対象の核酸の個数を把握することができる。
【００４３】
なお、インターカレート型蛍光試薬はＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮに限らず、ＤＡＰＩ、ＰＩ、ＳＹＴＯシリーズなども有効である。
【００４４】
なお、核酸の増幅は、蛍光発光ではなくとも回収した反応液を従来の電気泳動法などで検出することも可能である。
【００４５】
なお、蛍光発光検出は、容器外部からの励起光照射だけではなく、容器内部への励起光照射による検出も可能である。図３に反応容器４ならびに励起光源８を示した。
【００４６】
なお、ノズル噴出で微細水滴化させることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の気相中での核酸増幅方法及び装置を用いることで、気相中での核酸増幅反応を可能とし、高効率に反応させることができる。また、気相で行なうことで外部からの温度調整により反応容器内部の温度の増減を効率よく、調整できる。さらに内部圧力調整により加温、低温化を高効率で行なうことができ、安定した反応が可能となる。気相中での高効率反応であるため、微量な検体量でも安定した反応が可能となり、迅速検出、安定反応に非常に有効な方法である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の実施例１の気相中での核酸増幅方法を含む、核酸増幅装置の一態様を示す概念図
【図２】同、外部加温手段を含む反応容器示す図
【図３】同、励起光源を設置した反応容器を示す図
【符号の説明】
【００４９】
１    対象の核酸
２    ＤＮＡポリメラーゼ
３    デオキシヌクレオシド三燐酸
４    反応容器
５    微細分化手段
６    シリンジ
７    インターカレート型蛍光試薬
８    励起光源
９    検出器
１０  外部加温手段
１２  プライマー
【図１】
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【図２】
2008237132.tif 000004
【図３】
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