(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、リボソームの解離の機構を明らかにし、従来から知られた伸長阻害剤をリボソーム解離阻害剤を用いずに、有効で安全なリボソームの解離を阻害する方法を提供することにある。【解決手段】  したがって本発明は、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を用いて真核細胞のリボソームの解離を阻害する方法に関する。とくに、リボソームが、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下において真核生物伸長因子２（ｅＥＦ２）によって解離される、前記の方法に関する。【選択図】図１１
2008303190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を用いて真核細胞のリボソームの解離を阻害する方法。
【請求項２】
リボソームが、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下において真核生物伸長因子２（ｅＥＦ２）によって解離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
真核細胞が、がん細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
真核細胞が、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類、軟体動物、昆虫、節足動物、植物、藻類、真菌類、酵母、原生生物から選択される真核生物に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
真核生物が、真菌類である、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リボソームの解離を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物のリボソームは、８０Ｓリボソームと称され、６０Ｓサブユニットおよび４０Ｓサブユニットからなる。細胞内タンパク質合成の翻訳の段階において、リボソーム上でのｔＲＮＡとｍＲＮＡとの転位を行うためには、この８０Ｓリボソームが二つのサブユニットへ解離しなければならない。細胞が静止期にある場合、またはタンパク質合成に適さない条件（ショック条件）にある場合においては、ほとんど全てのリボソームが８０Ｓ形態で存在する。しかし、環境が増殖に好適でタンパク質合成が可能な条件に変化した場合、速やかに８０Ｓリボソームがサブユニットへと解離して、翻訳サイクルを開始する。
【０００３】
細菌などの原核生物のリボソーム（７０Ｓリボソーム）は、３０Ｓおよび５０Ｓの二つのサブユニットからなり、その解離反応は、伸長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）およびリボソームリサイクリング因子（ＲＲＦ）によって触媒され、この反応にはＧＴＰの加水分解によって生じるエネルギーが利用される。ＥＦ−Ｇ−ＧＴＰ／ＲＲＦによって解離された状態は一時的なものであり、開始因子３（ＩＦ３）が、解離したサブユニットをその状態に保つ。ＩＦ３は、３０Ｓサブユニットに結合して、５０Ｓサブユニットとの結合を妨げる。ＩＦ３自体も７０Ｓリボソームを解離し得るが、この解離反応は、ＥＦ−Ｇ−ＧＴＰ／ＲＲＦの働きと比較すると、極めて速度が遅く規模も小さい。
【０００４】
一方、真核生物においても、ＩＦ３と同様のリボソーム抗結合活性またはリボソーム解離活性を有する翻訳開始因子がいくつか存在する。しかし、細菌におけるＥＦ−Ｇ−ＧＴＰ／ＲＲＦによる７０Ｓリボソーム解離過程に対応するような、８０Ｓリボソームの能動的な解離機構は、まだ解明されていない。ここで重要なことは、真核生物におけるＲＲＦの類縁体（analog）は、細胞小器官に存在し、細胞質中には存在しないと考えられていることである。すなわち、ＲＲＦの代替となる機構が、リボソームの解離を触媒している可能性がある。
【０００５】
真核生物伸長因子２（ｅＥＦ２）は、細菌のＥＦ−Ｇの類縁体であり、ＥＦ−Ｇより分子量が大きいが、ＥＦ−Ｇ同様にＧＴＰの存在下においてｔＲＮＡとｍＲＮＡとの転位を触媒する。一方、ＥＦ−Ｇと対照的に、ｅＥＦ２はアデニンヌクレオチドについて特異的な結合部位を有し、リボソームの存在下においてＡＴＰまたはＡＤＰに結合し得ることが、酵母および哺乳動物細胞において見出されている。しかし、このｅＥＦ２のＡＴＰ／ＡＤＰ結合部位が、リボソームのリサイクリング機構において果たす機能については、まだ解明されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生物（細胞、組織を含む）の生存には、タンパク質合成が不可欠であり、このタンパク質合成には、リボソームの解離が大きく関わっている。したがって、このリボソームの解離を制御することは、タンパク質合成を制御する上で非常に有用な手段となるとともに、生物（細胞、組織を含む）を対象とした制御も可能となり得ると考えられるが、リボソームの解離の機構は十分に解明されていないのが現状である。一方、シクロヘキシミド、ソルダリン（非特許文献１）、フシジン酸（非特許文献２）、パロモマイシン（非特許文献３）、スペルミジン（非特許文献４）、プトレシン（非特許文献５）などの伸長阻害剤は、リボソーム解離阻害剤としての機能を有し得ることも考えられるが、リボソームの解離の機構が解明されていない現時点では、その有効性・安全性については全く不明である。したがって、本発明の課題は、かかるリボソーム解離の機構を解明するとともに、その解離制御を利用した医薬の開発などへの応用に寄与することにある。
【非特許文献１】Dominguez,J.M.ら、「Sordarin Inhibits Fungal Protein Synthesis byBlocking Translocation Differently to Fusidic Acid.」、J. Biol. Chem.、1991年、第274号、p.22423-22427
【非特許文献２】Shenvi,C.L.ら、「Accessibility of 18S rRNA in human 40S subunits and80S ribosomes at physiological magnesium ion concentrations--implications forthe study of ribosome dynamics.」、RNA、2005年、第11巻、p.1898-1908
【非特許文献３】Spahn,C.M.ら、「Structure of the 80S ribosome from Saccharomycescerevisiae--tRNA-ribosome and subunit-subunit interactions.」、Cell、2001年、p.107, 373-386
【非特許文献４】Igarashi,K.およびKashiwagi,K.、「Polyamines: Mysterious Modulators of CellularFunctions.」、Biochem. Biophys. Res. Comm.、2000年、第271巻、p.559-564
【非特許文献５】Tuite,M.F.ら、「Faithful and efficient translation of homologousand heterologous mRNAs in an mRNA-dependent cell-free system from Saccharomycescerevisiae.」、J. Biol. Chem.、1980年、第255巻p.8761-8766
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するため、本発明者らは、まず、リボソームのリサイクリングにおけるｅＥＦ２の機能を研究する中で、ｅＥＦ２がＡＴＰの存在下において真核生物の８０Ｓリボソームをサブユニットへ解離するとの知見を得た。この得られた知見に基づいて、真核生物の細胞におけるリボソームのリサイクリングを制御する上で、ＡＴＰ依存的なｅＥＦ２によるリボソームの解離をＧＴＰが阻害するという予想外の知見を得、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を用いて真核細胞のリボソームの解離を阻害する方法に関する。
さらに本発明は、リボソームが、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下において真核生物伸長因子２（ｅＥＦ２）によって解離される、前記の方法に関する。
また本発明は、真核細胞が、がん細胞である、前記の方法に関する。
さらに本発明は、真核細胞が、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類、軟体動物、昆虫、節足動物、植物、藻類、真菌類、酵母、原生生物から選択される真核生物に由来する、前記の方法に関する。
また本発明は、真核生物が、真菌類である、前記の方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を用いて真核細胞のリボソームの解離を阻害することができる。また本発明の方法に従い、リボソームの解離を阻害することによって、真核細胞におけるタンパク質合成を、実験系において、または生体内の細胞レベル、組織レベル、個体レベルで制御することが可能となる。例えば、本発明の方法を従来の実験手法に組み合わせることによって、タンパク質合成や細胞分裂を容易に制御することが可能となり、これらの機構の研究に大きく寄与し得る。また、本発明の方法は、タンパク質合成の異常または細胞分裂の異常を特徴とする疾患（例えば、癌）の処置において、非常に有用であり得る。さらに、本発明の方法は、真核生物の細胞分裂および成長を阻害し得るので、抗真菌剤、除草剤などの用途についても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の方法は、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を用いて真核細胞のリボソームの解離を阻害する。
【００１１】
本発明にかかる方法において、リボソームの解離が、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下において真核生物伸長因子２（ｅＥＦ２）によって行われてもよい。ここで真核生物伸長因子２（eukaryotic elongation factor 2：ｅＥＦ２）とは、真核細胞のタンパク質合成においてｔＲＮＡとｍＲＮＡとを転移する転移酵素（トランスロカーゼ）であり、細菌の伸長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）の類縁体である。
【００１２】
本発明の方法によって解離が阻害される真核細胞のリボソームは、細胞内のものに限定されず、in vitroにおいてタンパク質合成を行うものであってもよい。本発明によれば、例えば、市販の無細胞タンパク質合成キット（例えば、ウサギ網状赤血球無細胞タンパク質合成システム、昆虫培養細胞を用いたバキュロウイルス発現系タンパク質合成システムなど）において、タンパク質合成反応液中にＧＴＰを添加し、反応液中のリボソームの解離を阻害することによって、例えばタンパク質合成を停止することも可能である。
【００１３】
また培養細胞、培養組織などにおいても、細胞中のＧＴＰ濃度を高めることによって細胞内または組織内のリボソームの解離を阻害することができる。例えば、複数の種類の細胞が存在する場合、特定の細胞に選択的にＧＴＰ濃度を高めることによって、かかる特定の細胞を死滅させることができる。したがって、組織レベルでは、例えば、がん細胞などに特異的にＧＴＰ濃度を高めることによって、がん細胞を死滅させることができる。このような細胞特異的にＧＴＰ濃度を高めることは、従来から知られる方法を用いて行うことができるが、例えば、ＧＴＰを脂質二重膜で作られたリポソーム（liposome）内に留め、これをがん細胞内に取り込ませることによっても可能である。
【００１４】
また個体レベルとして、同様にリボソームの解離を阻害することにより、例えば、真菌類においても死滅させることができ、抗真菌剤などの代替手段として用いることができる。また、例えば、医薬、洗浄剤、動物の真菌感染予防、農業、環境衛生などに適用することができる。
このように本発明の方法によるリボソームの解離を阻害することは、おおよそ真核細胞由来の８０Ｓリボソームを対象とする限り、いかなる実験系、細胞、組織、個体に対しても有効である。ここで真核細胞とは、真核生物に由来する細胞をいうところ、前記真核生物としては、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類、軟体動物、昆虫、節足動物、植物、藻類、真菌類、酵母、原生生物などが挙げられるが、これらに限定されない。
また、例えば、植物に適用することによって、農薬および除草剤の代替技術としても用いることができる。
【００１５】
本発明のさらに別の態様において、本発明の方法にタンパク質合成阻害剤を組み合わせてもよい。タンパク質合成阻害剤として、例えば、以下のようなｅＥＦ２活性を阻害する薬剤：ソルダリン、シクロヘキシミド、パロモマイシン、およびスペルミジンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００１６】
材料と方法
緩衝液：
緩衝液５／１００（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ）；緩衝液５／５００（緩衝液５／１００に、５００ｍＭ  ＫＣｌを添加）；緩衝液２／１５０（緩衝液５／１００に、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１５０ｍＭ  ＫＣｌを添加）；緩衝液１０／１５０（緩衝液５／１００に、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１５０ｍＭ  ＫＣｌを添加）。
【００１７】
ｅＥＦ２、酵母リボソーム、および組換えｅＩＦ６の精製：
ｅＥＦ２の精製
Jorgensen,R.ら（2003年、Nat.Struct.Biol.,10,379-385.）の方法によって、酵母ｅＥＦ２−６ｘＨｉｓを精製した。Raj,V.S.ら（2005年、RNA,11,275-284.）に記載される方法によって、リボソーム依存的なＧＴＰアーゼ活性アッセイによって、Ｈｉｓタグ付けされたｅＥＦ２の活性を確認した。
【００１８】
酵母リボソームの精製
酵母リボソームの精製のために、完全なｒＲＮＡを備える機能的に活性なリボソームをヒト胎盤から単離するための通常のプロトコルを、以下の方法において改変した。酵母株ＷＹ３４４を、０．８ＬのＹＰＤ培地中３０℃で、６００ｎＭでの光学密度（ＯＤ６００）が２に到達するまで培養した。以下の手順の全ては、４℃で行った。酵母細胞を氷上で冷却し、１５分間６，０００×ｇで回収し、緩衝液５／１５０（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ）中で、１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）、１μｇ／ｍｌのペプスタチン、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍｇ／ｍｌのヘパリンを加えて再懸濁した。細胞をフレンチプレスに１，２００ｐｓｉで２回通し、溶菌液を３０分間１７，０００×ｇで遠心し、さらに３時間１２５，０００×ｇで沈降させることによって、リボソームのペレットを得た。リボソームを、緩衝液５／５００（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、５００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ）中で再懸濁し、次いで、中程度のボルテックスを行いながら氷上で４０分間保ち、ＫＣｌを含有しない緩衝液５／５００で５倍希釈し、Centriprep YM-10（Amicon）において濃縮した。このようにして得られたリボソームを、緩衝液５／１００（５００ｍＭのＫＣｌの代わりに１００ｍＭのＫＣｌを用いた緩衝液５／５００）中で調製された５〜４０％（ｗ／ｖ）のスクロース密度勾配に適用し、１４時間４℃で沈降させた（Beckman  SW28ローター、２０，０００ｒｐｍ）。このスクロース勾配を分画し、８０Ｓリボソームを含有する画分をプールした。４０Ｓサブユニットおよび６０Ｓサブユニットの精製のために、これらのリボソームを、緩衝液５／５００中で濃縮し、同じ緩衝液中で調製された５〜４０％のスクロース勾配に適用し、上述のように沈降させた。４０Ｓサブユニットおよび６０Ｓサブユニットを含有する画分をプールした。このようにして精製されたこれらのリボソーム（８０Ｓまたはサブユニット）を、緩衝液５／１００に対して透析し、濃縮した（Centriprep  YM-10）。８０Ｓリボソームのアリコート（２〜３μＭ）を、液体窒素中で急冷し、−８０℃で保存した。
【００１９】
組換えｅＩＦ６の精製
出芽酵母（Saccharomyces  cerevisiae）のＴＩＦ６遺伝子を、pGEX-4T-3プラスミド（Senger,B.ら、2001年、Mol.Cell,8,1363-1373.）から、以下のプライマー配列：5’-TACGACATATGGCTACCAGGACTCAAT-3’（配列番号１：下線部はNdeI部位）；および5’-TAGTCAAGCTTCTATGAGTAGGTTTCAAT-3’（配列番号２：下線部はHindIII部位）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、まずpDriveベクター（Qiagen）にクローニングした。次いで、ＴＩＦ６配列を含むNdeI-HindIIIフラグメントを単離し、さらにpET28aプラスミド（Novagen）にクローニングした。生じたプラスミド（pET28-TIF6）は、Ｔ７プロモーターの制御下にあるＮ末端が６×ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）されたｅＩＦ６をコードする。
【００２０】
Ｈｉｓタグ化ｅＩＦ６を調製するために、E.  coli株Rosetta(DE3)pLysS（Novagen）を、プラスミドpET28-TIF6で形質転換した。形質転換細胞を、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌのクロランフェニコルを添加した２ＬのＬＢ培地中３７℃で、ＯＤ５４０が０．６〜０．８に達するまで培養した。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを０．３ｍＭまで添加し、細胞をさらに１６℃で一晩インキュベートした。６，０００×ｇ、１５分間、４℃で遠心して回収した細胞を、０．２ｍＭのＰＭＳＦを添加した８０ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ  ＤＴＴ）中で再懸濁し、再度上記のように遠心した。以下の手順の全てを、４℃で行った。上記で得られたペレットを、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、０．１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および５単位／ｍｌのＤＮａｓｅ  Ｉ（Roche）を含有する２５ｍｌの溶解緩衝液中で溶解し、１０分間氷上で静置した。超音波処理によって細胞溶菌液を調製し、２０，０００×ｇで２０分間遠心し、次いで２５０，０００×ｇで１．５時間遠心した。Ni-NTA  Superflowカラム（Qiagen）を製造者の指示書に従って使用して、上清からＨｉｓタグ化ｅＩＦ６を精製した。精製されたＨｉｓタグ化ｅＩＦ６を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１５％グリセロールを含有する緩衝液で透析し、−８０℃で保存した。Groft,C.M.ら（2000年、Nat.Struct.Biol.,7,1156-1164）の方法によって、ｅＩＦ６の抗結合活性を確認した。
【００２１】
リボソームの沈降プロフィール：
凍結リボソームを、使用する前に、緩衝液２／１５０中で、５分間３０℃でインキュベートし、次いで７０００ｒｐｍで４分間、室温で遠心した。リボソームを、図（または表）の説明文において特定するように、６０μｌの緩衝液２／１５０、５／１００、もしくは５／５００中で、ｅＥＦ２、ｅＩＦ６、およびヌクレオチドを用いて処理するか、またはｅＥＦ２、ｅＩＦ６、およびヌクレオチドを含まない緩衝液で処理した。次いで、反応混合液を、同緩衝液中で調製した５〜３０％（ｗ／ｖ）のスクロース密度勾配にロードし、２時間４℃で沈降させた（Beckman製ローターSW50.1、４６，５００ｒｐｍ）。図４Ｃおよび図４Ｄに示す実験においては、インキュベーション後に、これらの反応混合液を、２分間氷上でグルタールアルデヒド溶液（最終濃度０．４５％（ｖ／ｖ）：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１５０ｍＭ  ＫＣｌ中で調製）で処置した。図５Ｆにおいて示す実験においては、リボソームを、緩衝液２／１５０中で以下の但し書き以外は上記と同一の条件下において、グルタールアルデヒドで処置した（但し、グルタールアルデヒドの最終濃度が１．５％であり固定を０．３ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンの存在下において行った）。リボソームの沈降の様子を、ISCO
UA-6吸光光度計を使用して、２５４ｎｍでモニタリングした。ImigeJ  1.31jソフトウェア（Bethesda,USA）によって測定された４０Ｓリボソーム、６０Ｓリボソーム、および８０Ｓリボソームに対応する面積から、８０Ｓリボソームのパーセンテージを算出した。
【００２２】
光拡散分析：
光拡散実験は、室温で、吸光光度計を用いて行った（Photon Technology International、入力スリット：１ｍｍ×０．１ｍｍ、出力スリット：０．３ｍｍ×１ｍｍ；波長：４３６ｎｍ、角度：９０°）。ｅＥＦ２、ｅＩＦ６、ＡＴＰおよび／またはＡＤＰを含有する「ファクターミックス」を、２０μｌの、０．５μＭの８０Ｓリボソーム、または０．２５μＭの４０Ｓもしくは６０Ｓサブユニットと、手作業で混合した。各々の場合において、ＭｇＣｌ２およびＫＣｌの最終濃度を、それぞれ２ｍＭおよび１５０ｍＭに調製した。生じた混合物（２００μｌ）を、ただちにキュベットに静置し、混合の２０秒後から、攪拌しないで、光拡散の強度（ＣＰＳ）を持続的に記録した。２０秒での開始値（×１０２）に対するパーセンテージとして算出される光拡散を、％ＣＰＳとして表す。Kyplotソフトウェア（Tokyo,Japan）を使用して、データを二重指数関数式にフィットさせることによって、リボソーム開裂の見かけの速度定数を得た。
【００２３】
ｅＥＦ２局在のウェスタンブロッティング分析：
リボソーム（０．０５μＭ）を、８０μｌの緩衝液２／１５０中で、１μＭのｅＥＦ２のみとともに、または１μＭのｅＥＦ２および各０．５ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、またはＡＤＰＮＰとともに、３０℃で１５分間のインキュベーションし、その後、この反応混合液を、０．４５％のグルタールアルデヒド（「沈降プロフィール」を参照のこと）で処置した。この密度勾配を底部から分画し（画分毎に１０滴）、各画分中のタンパク質成分を、１００％のＴＣＡを１０％の最終濃度まで添加することによって沈降させた。このタンパク質のペレットを、エーテル：エタノール（１：１）で洗浄し、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。酵母ｅＥＦ２に対するウサギ抗体（希釈率１：２０，０００）を使用してウェスタンブロッティングを行い、ｅＥＦ２を検出した。ｅＥＦ２に結合した抗体に対応するバンドの強度を、ImigeJ 1.31jソフトウェアを使用して測定し、ｅＥＦ２標準物質を使用して、ｅＥＦ２の量を概算した。
【００２４】
ＡＴＰ加水分解アッセイ：
加水分解の際に［γ−３２Ｐ］ＡＴＰから放出される無機リン酸を、Rajら（2005）の方法で分析した。標準的な反応混合物（１５μｌ）は、０．０５μＭのリボソーム、２．５μＭのｅＥＦ２、および０．５ｍＭの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（特異的活性０．１２μＣｉ／ｎｍｏｌ）を含有していた。３０℃で、１分間、２分間、４分間、６分間、および１０分間、インキュベーションを行った。
【００２５】
試験例１：ｅＥＦ２／ＡＴＰによる８０Ｓリボソームの開裂の光分散法による検出
リボソーム（０．０５μＭ）を、０．８％のグリセロールを含有する緩衝液２／１５０中２．５μＭのｅＥＦ２および０．５ｍＭのＡＴＰとともにインキュベートした。コントロール実験においては、リボソームを、ＡＴＰのみもしくはｅＥＦ２のみ、またはｅＥＦ２／ＡＤＰとともにインキュベートした。光分散（ＣＰＳ）を、混合の２０秒後での初期値のパーセンテージとして表し、インキュベーション時間に対してプロットする（図１）。次に、リボソームへのｅＥＦ２の結合に起因する光分散の瞬間的増加（ΔＣＰＳ）を、リボソームとｅＥＦ２（またはｅＥＦ２／ＡＴＰ）との混合の２０秒後に測定した。ΔＣＰＳを、リボソームがｅＥＦ２について飽和した時点で観察された最大光拡散増加に対するパーセンテージとして表し、添加されたｅＥＦ２の量に対してプロットする（図２）。上のパネル：ＡＴＰの存在下（黒菱形）およびＡＴＰの非存在下（白菱形）における、８０ＳリボソームへのｅＥＦ２の結合。下のパネル：ＡＴＰの存在下（黒丸）およびＡＴＰの非存在下（白丸）における、６０ＳサブユニットへのｅＥＦ２の結合。実験の条件は、図１と同じであった。図３に示す実験においては、（グリセロールの非存在下において）、示されるように種々の量のｅＥＦ２が添加されたこと以外は、図１と同じ条件である。
【００２６】
結果
リボソームの光分散は、サブユニットへの解離の際に低下する。なぜならば、８０Ｓリボソームはそのサブユニットより大きいので、より多く光を分散するからである。図１において示すように、リボソームをｅＥＦ２およびＡＴＰとインキュベートすると、光分散の低下が起きる（下の曲線）。このことは、ｅＥＦ２／ＡＴＰが、８０Ｓリボソームの開裂を引き起こすことを示唆する。対照的に、リボソームをｅＥＦ２のみまたはＡＴＰのみとともに、またはｅＥＦ２およびＡＤＰとともにインキュベートした場合、インキュベーション中の光分散は、ほとんど変化しなかった。
【００２７】
上記の光分散の変化の測定は、リボソーム開裂を評価する方法としては間接的であり、この光分散の変化は多数の理由によって起こり得るので、確定的な結論に達するために、さらなる実験が必要と考えられた。リボソームに、ｅＥＦ２単独のみを添加するか、またはｅＥＦ２とＡＴＰとを共添加すると、光分散が瞬間的に増大した（データは示さず）。アルテミア（Artemia）および哺乳動物のリボソームにおいて、ｅＩＦ３添加の際に同様の光分散の増大が報告されており（Gossら、1988年、Biochemistry,27,3610-3613.）、リボソームへのこのファクターの結合を研究するために使用されている。図２は、光分散の増大によって測定された、リボソームへのｅＥＦ２の結合を示す。観察され得るように、ＡＴＰは、８０Ｓリボソームまたは６０ＳサブユニットへのｅＥＦ２の結合を引き起こした。ＡＴＰが存在する場合においても存在しない場合においても、ｅＥＦ２は４０Ｓサブユニットへは結合しなかった（データは示さず）。図１において示す光分散の結果は、ＡＴＰに起因するリボソームへのｅＥＦ２の親和力の差によって影響されない。なぜならば、この反応の開始の１０分後で、９９％のＡＴＰがまだ残っているからである（図９を参照のこと）。従って、図１において観察される光分散の低下は、８０Ｓのサブユニットへの解離を示すことが、結論づけられた。
【００２８】
ｅＥＦ２／ＡＴＰによるリボソームの開裂の程度を決定するためには、完全に解離した８０Ｓリボソームによる光分散と、開裂反応が起こる（図１）緩衝液（２ｍＭのＭｇＣｌ２および１５０ｍＭのＫＣｌ（２／１５０）を含有する）中のリボソームによる光分散とを比較しなければならない。上記と同様の方法で、かかる比較をおこなった。結果は、８０Ｓリボソームの９２％が、２．５μＭのｅＥＦ２およびＡＴＰによってサブユニットへ変換されることを示した。注意すべきこととして、ここで使用された８０Ｓ調製物は、８０Ｓリボソームの精製手順に起因して過剰の６０Ｓサブユニットを含有していたが、この条件下ですら、２．５μＭのｅＥＦ２が、存在した８０Ｓリボソームをほぼ完全にサブユニットに変換した（データは示さず）。
【００２９】
図３に記載される実験において、種々の量のｅＥＦ２を添加して、リボソーム開裂の速度および程度を決定した。これらのデータから計算されたミカエリス・メンテン定数（ＫＭ）値は、０．２４±０．１μＭであった。この値は、概算されるＡＴＰの存在下における８０ＳリボソームへのｅＥＦ２の解離定数（Ｋｄ）値（図２）である０．２６±０．０４μＭに近似する。
【００３０】
試験例２：８０ＳリボソームのｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的開裂の一過性性質：スクロース密度勾配超遠心法（ＳＤＧＣ）による検出
光拡散の変化の測定から推測される８０ＳリボソームのｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的開裂を確認するために、ｅＥＦ２／ＡＴＰとともにインキュベートされたリボソームとｅＥＦ２／ＡＴＰなしでインキュベートされたリボソームとの沈降パターンを比較した（図４Ａおよび図４Ｂ）。リボソーム（０．０５μＭ）を、緩衝液２／１５０のみ（図４Ａ）、または緩衝液２／１５０と１μＭのｅＥＦ２および０．５ｍＭのＡＴＰとともに（図４Ｂ）、２０分間３０℃でインキュベートし、ＳＤＧＣに供した。図４Ｃおよび図４Ｄの条件は、反応混合液をＳＤＧＣの前に０．４５％のグルタールアルデヒド（ｖ／ｖ）で処理したこと以外は、各々、図４Ａおよび図４Ｂと同一であった。
【００３１】
ｅＥＦ２／ＡＴＰの存在下において、８０Ｓの有意な解離を検出することは出来なかった。これらの結果は、ＥＦＧ−ＧＴＰ／ＲＲＦによる細菌の７０Ｓリボソームの一時的な開裂が、ＳＤＧＣ分析では観察されないかもしれないことを暗示している。従って、これらの結果は、光分散の低下（図１）として検出されるｅＥＦ２／ＡＴＰによる８０Ｓリボソームの解離は一時的であり、分離されたサブユニットがＳＤＧＣ分析の間に再結合する可能性があることを示唆する。
【００３２】
ｅＥＦ２／ＡＴＰによる８０Ｓリボソームの開裂が一時的であるとしても、これは、解離したサブユニットを安定化すれば、ＳＤＧＣによって検出することが出来る。図４Ｄに示す実験において、８０Ｓリボソーム、１μＭのｅＥＦ２、およびＡＴＰを含有する反応混合液を、０．４５％のグルタールアルデヒドで処置した。この処置は、リボソームの沈降パターンに影響をおよぼすことなく、ｅＥＦ２を８０Ｓリボソーム上に固定する。図４Ｃはコントロール実験であり、リボソームを、ｅＥＦ２／ＡＴＰなしで、グルタールアルデヒドで処置した。リボソームとｅＥＦ２／ＡＴＰとをインキュベートすると、８０Ｓリボソームの見かけの量は、全リボソームの３６％から１８％に低下した。これは、５０％の８０Ｓリボソームがサブユニットへ転換されたことに等しい。使用された緩衝液の条件下において超遠心分析中に８０Ｓリボソームの解離が誘導されるので、全リボソームの３６％および１８％の８０Ｓリボソーム量は、実際には６０％および３０％に対応する（次セクションを参照のこと）。従って、図４Ｄに示す結果は、ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的な８０Ｓリボソームの開裂が実際に一時的であり、ＳＤＧＣによって観察するためには、ｅＥＦ２をサブユニットに安定化する必要があることを示す。注目すべきことは、ＳＤＧＣ分析によって得られた結果が、光分散のデータと著しく相関しているである。従って、リボソームを、１μＭのｅＥＦ２およびＡＴＰとともにインキュベートした場合、光分散の低下は、８０Ｓリボソームがほぼ完全に解離するｅＥＦ２濃度（２．５μＭ：図６、図７）で記録されるシグナルの約５０％であった（データは示さず）。
【００３３】
試験例３：サブユニットに転換された８０Ｓリボソームの量の決定
以下のセクションにおいて記載する実験は、緩衝液２／１５０中でおこなった。この緩衝液のイオン条件は、インビトロタンパク質合成のための至適条件と近似する。２／１５０中で解離する８０Ｓリボソームの量（図１）を決定するために、この緩衝液中に存在する８０Ｓリボソームの正確な量を概算することが必要である。図４Ａにおいて記すように、これらの条件下では、全リボソームの３７％のみが８０Ｓ形態としてＳＤＧＣによって検出された。超遠心法は、リボソームをサブユニットに解離する効果を有することが知られている。この効果に起因して、上記の値は、緩衝液２／１５０中に存在する８０Ｓリボソームの実際の量を表してはいない。
【００３４】
図５Ｅ〜Ｇにおいて、３種類のイオン条件（５／１００、２／１５０、および５／５００）下において、ＳＤＧＣによってリボソームを分析した。リボソームのストック溶液（緩衝液５／１００中、０．５μＭ）を、緩衝液５／１００、２／１５０、および５／５００で、最終濃度０．０５μＭまで希釈した。緩衝液５／１００（８０Ｓリボソームが強く結合する条件；図５Ｅ）および緩衝液５／５００（サブユニットへ完全に解離する条件；図５Ｇ）については、グルタールアルデヒド固定をせずに分析を行った。緩衝液２／１５０中での超遠心中に誘導されるリボソーム解離を防ぐために、この緩衝液中のリボソームを、１．５％グルタールアルデヒド（ｖ／ｖ）を用いて固定した。図４Ａ〜Ｄに示す実験と同様に、リボソームを沈降させた。全リボソーム成分に相対的な８０Ｓリボソームのパーセンテージを示す（図５Ｅ〜Ｇ）。結果は、緩衝液２／１５０中で、リボソームの５７％が８０Ｓ形態において存在することを示した（図５Ｆ）。他の二つの方法（光分散分析およびゲル濾過）による、緩衝液２／１５０中の８０Ｓリボソーム量の決定によって、同様の値が明らかとなった（データは示さず）。ここで８０Ｓリボソームについて得られた値（６０％）は、アルテミアのリボソームの光分散データ（Gossら、1986年、Biochemistry,25,3690-3695.）と著しく相関する。これらの実験においては、２ｍＭのＭｇ２＋によって、８０Ｓリボソームの６５％がリボソームのサブユニットとの平衡状態で存在することが示された。従って、図１において使用した実験条件下において、８０Ｓリボソームの開始濃度は、０．０３μＭであった。この値と、開裂反応の計算される最大速度とを使用して（図６、図７）、ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的な解離の代謝回転数（ｋｃａｔ）を、０．７２±０．１ｍｉｎ−１として概算した。
【００３５】
試験例４：ｅＥＦ２／ＡＴＰによって一時的に開裂されたリボソームの、リボソーム抗結合因子による安定化
図６に記載する実験において、ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的に８０Ｓリボソームが開裂した後に、ｅＩＦ６（６０Ｓサブユニットに結合する抗結合因子）を種々の量で加え、その後ＳＤＧＣ分析を行った。リボソーム（０．０５μＭ）を、２．５μＭのｅＥＦ２および０．５ｍＭのＡＴＰとともに、緩衝液２／１５０中６時間３０℃でインキュベートし、各量のｅＩＦ６を添加して、さらに１５分間インキュベートした。この反応混合物をＳＤＧＣによって分析した。コントロール実験においては、リボソームを、１５分間ｅＩＦ６またはｅＩＦ６／ＡＴＰのみに暴露した。解離した８０Ｓリボソームのパーセンテージ（Ｚ）を、以下のように算出した：Ｚ＝１００×（１−（Ｙ／Ｗ））；ここで、（Ｙ）は、各因子の添加後に残った全リボソームに対するパーセンテージとして表される８０Ｓリボソーム量であり、（Ｗ）は、因子を添加しない場合の８０Ｓリボソームの量（全リボソームに対するパーセンテージ）である。観察され得るように、ｅＩＦ６の用量に依存的な様式において安定なサブユニットが形成され、存在した８０Ｓリボソームのうち最大８０％までが、サブユニットへ変換された。この値は光分散分析によって観察された値よりいくらか低く、このことは、おそらく、超遠心中に結合したｅＩＦ６が部分的に放出されることに起因する。ｅＥＦ２またはｅＥＦ２／ＡＴＰが省略されたコントロール実験においては、解離の程度が著しく低いことが明らかとなり、このことは、抗結合因子ｅＩＦ６の存在下での８０Ｓリボソームのサブユニットへの解離において、ｅＥＦ２が主要な役割を果たすことを示している。
【００３６】
図７において記載するように、ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的な８０Ｓリボソームの解離に対するｅＩＦ６の効果を、リボソームの光拡散測定によって確認した。リボソーム（０．０５μＭ）を、図中に示すように、０．８％のグリセロールを含有する緩衝液２／１５０中で各因子と混合し、光分散の変化を測定した。ｅＥＦ２、ｅＩＦ６、およびＡＴＰの最終濃度は、各々、２．５μＭ、２．５μＭ、および０．５ｍＭであった。この図は、ｅＩＦ６が添加された場合に、ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的な８０Ｓリボソームの解離の初期速度および最終値が増大したことを示す。本発明者らは、ｅＩＦ６／ＡＴＰによる解離の速度は、ｅＥＦ２／ＡＴＰによる解離の速度よりはるかに低いことを強調する。これらの結果は、リボソームの解離はｅＥＦ２／ＡＴＰによって行われ、ｅＩＦ６は解離したサブユニットを安定化するが、リボソームの解離は行わないことを示す。
【００３７】
試験例５：ｅＥＦ２依存的な８０Ｓリボソーム解離のエネルギー依存性およびヌクレオチド特異性
図８において、ＡＴＰを、その加水分解されない類縁体である５’−アデニリル−［β，γ−イミド］二リン酸（ＡＤＰＮＰ）またはＡＤＰによって置換し、反応混合液を、ＳＤＧＣによって分析した。リボソーム（０．０５μＭ）を、緩衝液２／１５０中で、２．５μＭのｅＥＦ２、および０．５ｍＭの特定されたヌクレオチドのうちの１種類とともに、６分間３０℃でインキュベートし、次いで、ｅＩＦ６を２μＭまで添加して、さらに１５分間インキュベートした。この反応混合液をＳＤＧＣによって分析し、８０Ｓリボソームの解離のパーセンテージを決定した。標準誤差は±５％であった。結果は、リボソームとｅＥＦ２／ＡＤＰＮＰまたはｅＥＦ２／ＡＤＰとのインキュベーションは、８０Ｓリボソームの開裂をもたらさないことを示した。他のヌクレオチドの存在下においても、開裂が起こらない（図８；ＧＴＰもしくはＧＤＰについての結果）か、または、ＡＴＰと比べてはるかに低い程度であった（図８；ＵＴＰもしくはＣＴＰについての結果）。このことは、ｅＥＦ２による８０Ｓリボソームの解離が、特にＡＴＰを伴うエネルギー依存的なプロセスであることを示す。
【００３８】
加水分解されないＡＴＰの類縁体が８０Ｓリボソームの開裂において不活性であるという事実は、リボソームの解離がＡＴＰの加水分解と関連することを強く示唆した。このことを図９において示す。ここでは、０．０５μＭの８０Ｓリボソームおよび２．５μＭのｅＥＦ２を含有する反応混合液（１５μｌ）を、図中に示す緩衝液中で０．５ｍＭの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとともに３０℃でインキュベートすることによって、解離反応の間に、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを無機リン酸［３２Ｐｉ］に変換した（白丸）。対照的に、ｅＥＦ２またはリボソームを別々にインキュベートした場合、各々は単独でははるかに少ないＡＴＰを加水分解する（それぞれ、白三角形および黒四角形）。８０ＳリボソームおよびｅＥＦ２を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えた緩衝液中で（すなわち、ｅＥＦ２／ＡＴＰによる８０Ｓリボソームの開裂が起こらない条件下（データは示さず）において）インキュベートした場合、ＡＴＰの加水分解のレベルは、緩衝液２／１５０中より著しく高かった（図９、黒丸）。このことは、ＡＴＰの加水分解は、かならずしも常に開裂反応と共役していないことを示す。重要なことに、８０Ｓリボソームの解離に対して阻害的であるソルダリン（sordarin）（表２）は、ＡＴＰアーゼ反応を著しく促進する（白四角形）。このことはやはり、ＡＴＰアーゼ活性がリボソームの解離と完全には共役しないことを示している。
【００３９】
図１０においては、リボソームを、緩衝液２／１５０中で、ｅＥＦ２および図中に示す量の［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとともに、インキュベートした。各画分中のｅＥＦ２の量を、ウェスタンブロッティングによって概算した。解離条件下において、種々の濃度のＡＴＰをリボソームとｅＥＦ２とに添加した場合、ＡＴＰ濃度が高いほど、［３２Ｐｉ］放出の速度が増大した（図１０）。これらのデータから、リボソーム／ｅＥＦ２  ＡＴＰアーゼの代謝回転数を、４０．２±４ｍｉｎ−１と概算した。この値は、ｅＥＦ２／ＡＴＰによって触媒される開裂反応のｋｃａｔ値（０．７２±０．１ｍｉｎ−１；上記）に比べて、有意に高い。
【００４０】
実施例１：ＡＴＰの存在下におけるリボソーム開裂中のサブユニットへのｅＥＦ２の結合
ｅＥＦ２／ＡＴＰによる８０Ｓリボソームの解離の機構をさらに理解するために、開裂反応の間のサブユニットへのｅＥＦ２の結合を分析した。リボソーム（０．０５μＭ）を、存在する８０Ｓリボソームの５０％がサブユニットに変換される条件（図４Ｄ：緩衝液２／１５０中で、ｅＥＦ２（１μＭ）および示される０．５ｍＭのヌクレオチドとともに）下においてインキュベートし、その後、０．４５％のグルタールアルデヒド（ｖ／ｖ）でて処置し、ＳＤＧＣを行った（図１１）。各画分中のｅＥＦ２の量を、ウェスタンブロッティングによって概算した。ＡＴＰの存在下において残りの８０Ｓリボソーム上のｅＥＦ２の存在を試験するように、特に条件を選択した。同時に、リボソームを、ｅＥＦ２単独とともに、またはＧＴＰもしくはＡＤＰＮＰとともに、インキュベートした。結果（図１１）は、ＡＴＰの存在下においては、８０ＳリボソームへのｅＥＦ２の結合は、サブユニットへの結合よりも有意に低いことを示した。対照的に、ＧＴＰは、８０ＳリボソームへのｅＥＦ２の結合を強く促進した。ＡＤＰＮＰの存在下においては、８０Ｓリボソーム上にのみ少量のｅＥＦ２が局在した。このことは、ＡＴＰの存在下において観察されるサブユニットへのｅＥＦ２の結合が、開裂反応と関連することを示している。ＡＴＰが存在する場合、６０Ｓサブユニットのみならず、４０Ｓサブユニット上にもｅＥＦ２が見出されたことは、注目されるべきである（図１１、菱形）。
【００４１】
実施例２：ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的な８０Ｓリボソーム開裂のＧＴＰによる阻害
上記のセクションにおいて指摘したように、ＧＴＰは、サブユニットへのｅＥＦ２の結合よりも、８０ＳリボソームへのｅＥＦ２の結合を促進する（図１１、四角形）。反対に、ＡＴＰは、主にサブユニットへのｅＥＦ２の結合を促進する。これらの結果は、リボソームに対するｅＥＦ２／ＧＴＰの効果は、ｅＥＦ２／ＡＴＰの効果とは異なることを示唆するので、開裂およびＡＴＰアーゼ活性に対するＧＴＰの効果を試験することが重要である。その結果を表１に示す。（Ａ）緩衝液２／１５０中で、リボソーム（０．０５μＭ）を、２．５μＭのｅＥＦ２および０．５ｍＭのＡＴＰ、ならびに示された量のＧＴＰとともに、６分間３０℃でインキュベートし、次いで、ｅＩＦ６を２．５μＭの最終濃度まで添加して、１５分間インキュベーションを続けた。この反応混合液を、ＳＤＧＣによって分析した。標準誤差は±３％であった。（Ｂ）表中に示す量のＧＴＰを添加して、１０分後にリボソーム／ｅＥＦ２による［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの加水分解を概算し、加水分解された全ＡＴＰをピコモル濃度で表した。
【００４２】
【表１】
2008303190.tif 000003
【００４３】
ＧＴＰ濃度が増加するにつれて、ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的なリボソームの解離、ならびにＡＴＰアーゼ活性が阻害された。解離反応の阻害効果よりＡＴＰアーゼ活性の阻害効果の方が効率的であった。
【００４４】
試験例６：ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的な８０Ｓリボソームの解離に対するｅＥＦ２活性阻害剤の効果
ｅＥＦ２活性を阻害することが知られている従来の種々の薬剤を、ｅＥＦ２／ＡＴＰによって触媒される解離反応について試験した（表２）。緩衝液２／１５０中で、リボソーム（０．０５μＭ）を、ｅＥＦ２（２．５μＭ）、ＡＴＰ（０．５ｍＭ）、および示した阻害剤のうちの１種類とともに、６分間３０℃でプレインキュベートし、次いで、ｅＩＦ６を２．５μＭまで添加し、１５分間インキュベーションを続けた。この反応混合液を、ＳＤＧＣによって分析し、解離した８０Ｓリボソームのパーセンテージを概算した。＊で示すように、パロモマイシンの存在下において、８０Ｓリボソームの量は、阻害剤を何も含まないコントロールより１．４倍多かった。標準誤差は±３％であった。
【００４５】
【表２】
2008303190.tif 000004
【００４６】
０．２ｍＭでのシクロヘキシミドおよびソルダリンの阻害率は、６０％より高く、一方、同じ濃度でのフシジン酸は、１１％しか阻害しなかった。ＥＦ−Ｇ−ＧＴＰ／ＲＲＦ依存的な７０Ｓリボソームの開裂を妨げるアミノグリコシドであるパロモマイシンの存在下においては、ｅＥＦ２／ＡＴＰによる８０Ｓリボソームの解離は完全に妨げられ、８０Ｓリボソームの量は、初期量より４０％増加した。
【００４７】
８０Ｓリボソームは、そのサブユニットと平衡状態にあるので、この平衡状態に影響をおよぼす条件および要因は、ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的な開裂に対しても効果を有するはずである。サブユニットの結合を促進するポリアミンは、ｅＥＦ２／ＡＴＰによる８０Ｓリボソームの解離を阻害することが予測される。しかし、表２に示すように、インビボでの濃度より高い濃度でのスペルミジンの存在下においてですら、ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的にリボソームの開裂が起こる。さらに、インビトロでタンパク質合成を促進する濃度でのプトレシンは、開裂にほとんど影響を及ぼさなかった。
【００４８】
マグネシウムイオンは、ポリアミンと類似の効果（８０Ｓリボソーム側への平衡の移行）を有するので、Ｍｇ２＋の増加は、ｅＥＦ２／ＡＴＰによるリボソームの開裂の段階的な阻害をもたらす（データは示さず）。従って、４ｍＭのＭｇ２＋を適用した場合、開裂活性の１０％しか検出されなかった。このＭｇ２＋濃度では、インビトロタンパク質合成が完全に非効率化されることは、指摘されるべきである。存在するリボソームの濃度が高くなるにしたがって、観察される解離の程度が低くなった。同時に、ｅＥＦ２濃度を増加させた場合は、リボソーム濃度が高くとも、ｅＥＦ２／ＡＴＰによるリボソームの開裂がもたらされた（データは示さず）。
【００４９】
考察
ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的な８０Ｓリボソームの開裂の生物学的重要性
既存の生理学的データおよび遺伝子データは、細胞における遊離の８０Ｓリボソームの解離においてｅＥＦ２が重要な役割を果たし得るという、本発明者らの知見と一致する。ショック条件下において、または静止期の間、リボソームのプールは、主に８０Ｓ形態において貯蔵されている。従って、栄養が欠乏すると遊離８０Ｓリボソームが劇的に増加し、このことはインビボのＡＴＰ濃度の低下を伴う。また、ＡＴＰの欠乏によってｅＥＦ２のリン酸化が促進され、ｅＥＦ２はリン酸化によって不活化される。同様に、ｅＥＦ２の非機能的形態（変異Ｈ６６９ＫまたはＶ４８８Ａ）の発現は、８０Ｓモノマーの増加をもたらす。これらのことは、同時にＡＴＰの低下を伴うｅＥＦ２の不活化が８０Ｓ形態のリボソームの蓄積をもたらすという事実を指摘している。逆に、条件が細胞増殖に好適であり、十分なＡＴＰが存在する場合、ｅＥＦ２は活性化され、その結果、蓄積された８０Ｓリボソームのポリソームへの急速な転換をもたらす。
【００５０】
ｅＩＦ３、ｅＩＦ１Ａ、およびｅＩＦ６は、８０Ｓリボソームをサブユニットへ解離すると考えられている。本発明者らは、これらの因子ではなく、ｅＥＦ２が、８０Ｓリボソームの開裂において活発な触媒的役割を果たすことを、以下の６個の理由から提案する。第１に、ｅＩＦ３は、抗結合因子であり、４０Ｓサブユニットの溶媒側から作用して、サブユニットの結合を妨げる。対照的に、ｅＥＦ２は、８０Ｓリボソームのサブユニット間の間隙を通して、ｔＲＮＡとｍＲＮＡとを転位させる。ｅＥＦ２の結合部位は、主に、８０Ｓリボソームのサブユニット間の間隙に位置し、ドメインＩＶが、最も広いサブユニット間架橋であるＢ２ａと接触する。このことから、サブユニット間の間隙内へ入り込みリボソームを開裂させるのに、ｅＥＦ２はｅＩＦ３より適している。第２に、ｅＩＦ３の細胞での含有量は、インビボでのリボソーム濃度より低い。ｅＩＦ３のコアサブユニットであるｅＩＦ３ｉの分子は酵母１個あたり２，４００個しか存在せず、ｅＥＦ２の分子は７８，１００個しか存在しない（http://www.yeastgenome.org/）。第３に、４０ＳサブユニットへのｅＩＦ３の結合速度は、８０Ｓリボソームへの結合速度の１２倍速い。このことは、ｅＩＦ３の主要な標的が、４０Ｓサブユニットであることを示唆する。第４に、ｅＩＦ３は、ポリウリジル酸の存在下においてのみ、８０Ｓリボソームをサブユニットへ開裂する。第４に、ｅＩＦ１Ａの解離活性は、ｅＩＦ３の解離活性より弱い。最後に、抗結合因子であるｅＩＦ６は、６０Ｓサブユニットの生合成において役割を果たし、開始ステップの遅いイベントまで６０Ｓサブユニットに結合したままであり、ｅＩＦ６による８０Ｓリボソームの解離の速度は、ｅＥＦ２／ＡＴＰによる速度とは比較にならないほど遅い（図７）。
【００５１】
ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的解離の動態学的パラメーターは、ＡＴＰが８０ＳリボソームへのｅＥＦ２の結合を促進するという生理学的機能の提案（NygardおよびNilsson,L.、1984年、Eur.J.Biochem.,140,93-96.）と一致する。本発明者らは、８０Ｓリボソームに対するｅＥＦ２／ＡＴＰのＫＭが、０．２μＭであると概算した。これは、ＧＴＰ（０．４μＭ）またはＧＴＰの加水分解され得ない類縁体（０．３μＭ）の存在下における、転位後の状態の８０Ｓリボソームに対するｅＥＦ２のＫｄ（Nygard,O.およびNilsson,L.、1989年、Eur.J.Biochem.,179,603-608.）と、比較し得る。８０Ｓリボソーム開裂についてのｅＥＦ２／ＡＴＰの代謝回転数（ｋｃａｔ）は、約０．７ｍｉｎ−１である。これは、インビトロ系での酵母におけるペプチド結合形成の代謝回転数（２ｍｉｎ−１）（Dresiosら、2003年）と、比較し得る。本発明者らの解離条件下においては、開裂したサブユニットが８０Ｓリボソームへ再結合することに起因して、計算されるｋｃａｔは、形成されるサブユニットが、開始ステップによって急速に「除去」される実際のインビボでの開裂の代謝回転数よりはるかに小さい。さらに、本発明者らのリボソーム／ｅＥＦ２のＡＴＰアーゼ活性のｋｃａｔ値（４０ｍｉｎ−１）は、リボソーム／ｅＥＦ２複合体のＧＴＰアーゼ活性（９ｍｉｎ−１）（４７）の４倍速い。さらに、酵母において、グルコース欠乏下において８０Ｓ形態で蓄積された全てのリボソームは、培養条件のシフトアップの後１０分以内に、ポリソームに変換される。このことは、リボソームの公知の細胞内成分（von
der Haarら、2002年、Mol.Microbiol.,46,531-544.）、および、本発明者らがｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的な８０Ｓリボソームの開裂について概算したｋｃａｔ値を有するｅＥＦ２に基づいて、説明することが出来る。
【００５２】
至適イオン条件下における８０Ｓリボソームのサブユニットへの自発的解離が、特に、形成されたサブユニットが効率的に開始ステップのために「利用」される条件下において、十分であり得るという議論も可能である。しかし、図７において示す実験は、自発的に生成される６０Ｓサブユニットとリボソームの再結合を妨げるｅＩＦ６とを組み合わせることのみでは、８０Ｓリボソームの解離の速やかな完了には十分ではないことを示す。ｅＩＦ６による開裂の速度は、ｅＥＦ２／ＡＴＰの活性と比較して極めて遅い。
【００５３】
原核生物のＩＦ３と同様の様式において、真核生物の因子（ｅＩＦ３、ｅＩＦ１（５０）、ｅＩＦ１ＡまたはｅＩＦ６）は、リボソームのサブユニットがｅＥＦ２／ＡＴＰによって分離された後で、これらのサブユニットを安定化させることが出来る。図６および図７に記載する実験において、本発明者らは、ｅＩＦ６（強力なリボソーム抗結合因子）を、ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的反応によって形成されるサブユニットを解離させたままに保つための、便利なツールとして使用した。
【００５４】
推測されるｅＥＦ２／ＡＴＰによる８０Ｓリボソームの開裂のステップ
本研究および文献から得られるデータにおける観察に基づいて、推測されるｅＥＦ２／ＡＴＰによる８０Ｓリボソームの開裂の機構を、図１２に示す。タンパク質合成を行っていない酵母８０Ｓリボソームは、自発的にラチェット様サブユニット再編成（ratchet-like subunit rearrangement：ＲＳＲ）を行う（Spahnら、2004年、EMBO  J.,23,1008-1019.）。本発明者らは、ｅＥＦ２／ＡＴＰが、転位後の状態のリボソーム（Ａと表記されている）に結合することを提案する。なぜならば、８０Ｓリボソームに対するｅＥＦ２／ＡＴＰの親和力は、転位後複合体に対するｅＥＦ２の親和力と類似（図２および図３）であるからである（NygardおよびNilsson,L.、1989年、Eur.J.Biochem.,179,603-608.）。アポ形態のリガンドが存在しない場合、ｅＥＦ２は、ＥＦ−Ｇ／ＧＤＰの立体構造と類似の緻密な立体構造をとることが推測されるが、一方、ソルダリンを有する複合体においては、ｅＥＦ２は、広がってねじれている（Jorgensenら、2003年）。本発明者らは、ＡＴＰの存在下において、ｅＥＦ２は、リボソーム−ｅＥＦ２／ソルダリン複合体中のｅＥＦ２の立体配座に類似する立体配座の広がった／ねじれた形態において、リボソームに結合することを推測する（ステップ２、Ｂ）。これは、ソルダリンがリボソーム−ｅＥＦ２のＡＴＰアーゼ活性を著しく促進するという事実（図９）に基づく。この状態におけるｅＥＦ２の立体構造は、ｅＥＦ２のアポ形態と、リボソームと結合しないでソルダリンと結合したｅＥＦ２の形態との中間である。ｅＥＦ２のドメインＩおよびドメインＶは６０Ｓサブユニットとのみ相互作用し、ドメインＩＩは４０Ｓサブユニットと接触するが、一方、ドメインＩＩＩおよびドメインＩＶは、両サブユニットの結合部位を共有する。
【００５５】
次のステップ（３）において、ＡＴＰの加水分解の際に放出されるエネルギーが８０ＳリボソームおよびｅＥＦ２へと「移動」され、リボソーム複合体Ｃを形成することが推測される。ステップ４において、貯蔵エネルギーが使用され、ｅＥＦ２のドメインＩＩＩ、ドメインＩＶ、およびドメインＶを、ｅＥＦ２の遊離のアポ形態においてこれらのドメインが占める位置へと戻す。ｅＥＦ２のドメインＩＶは最も広いサブユニット間の架橋Ｂ２ａと接触するので、このｅＥＦ２の立体構造の変化が、８０Ｓリボソームを開裂させる。ｅＥＦ２／ＧＴＰによる転位前の状態から転位後の状態への移行を阻害するソルダリンは、ｅＥＦ２のドメインＩＩＩ、ＩＶ、およびＶの回転を妨げることによって、このステップを遮断する（表２）。リボソームの解離後に、ｅＥＦ２は、ＡＤＰ形態において「瞬間的に」サブユニットに結合したままである（Ｄ）。このことは、リボソーム開裂後にグルタールアルデヒド固定を行った後で、ｅＥＦ２が４０Ｓおよび６０Ｓサブユニットに結合していた（図４Ｄ）ことによって支持される。さらに光拡散実験によって、６０ＳサブユニットへのｅＥＦ２の結合が明らかとなった（図２）。ステップ５において、ｅＥＦ２がサブユニットから放出され、一時的に単離されたサブユニットを生じる（Ｅ）。形成されたサブユニットがタンパク質合成に利用（ステップ６’）されない限り、これらのサブユニットは、再結合して８０Ｓリボソームを形成する（ステップ６）。最後に、放出されたｅＥＦ２にＡＴＰが結合する（１６、１７）（ステップ７）。
【００５６】
ｅＥＦ２は、結合するリガンド（ＡＴＰまたはＧＴＰ）に依存して、８０Ｓリボソームに対して異なる効果を与える
本研究において表されるデータから、ｅＥＦ２／ＧＴＰが、リボソームに対して、ｅＥＦ２／ＡＴＰとは異なる効果を与えることが考えられる。ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的な８０Ｓリボソームの解離の存在下において、正常なペプチド伸長は、どのようにおこなわれるのであろうか。伸長ステップの間は、リボソームに対するｍＲＮＡおよびペプチジル−ｔＲＮＡの安定化作用のために、開裂反応は起こり得ない。加えて、転位後のリボソームへのｅＥＦ２／ＧＴＰの親和力は、リボソームへのｅＥＦ２／ＡＴＰの親和力よりもはるかに強力である。
【００５７】
本発明者らは、ＧＴＰが、ＡＴＰ依存的開裂およびＡＴＰアーゼ活性を阻害することを示した（表１）。それでは、ＧＴＰの存在下において、ｅＥＦ２／ＡＴＰは、どのようにして８０Ｓリボソームを動員することができるのであろうか。本発明者らは、インビボでは、遊離リボソームのほとんどが、転位後の状態にあることを推測する。これらのリボソームへのｅＥＦ２／ＡＴＰの親和力およびｅＥＦ２／ＧＴＰの親和力は、ほぼ同じである（図２およびNygardおよびNilsson、1989年）。シフトアップ条件の間は、ＡＴＰの濃度は、ＧＴＰの濃度の約６倍高い（Ditzelmullerら、1983年、Arch.Microbiol.,135,63-67.）。ｅＥＦ２／ＡＴＰによって生成されるサブユニットは、速やかに開始ステップのために利用され、この開始ステップは、次いで、開裂反応を促進する。これらの考察から、本発明者らは、ｅＥＦ２／ＡＴＰによるタンパク質合成を行っていない８０Ｓリボソームの動員が、インビボで起こり得ることを結論づけた。
【００５８】
リボソーム上でのｅＥＦ２の作用に対するＡＴＰおよびＧＴＰの効果には、多数の相違点が存在する。第一に、フシジン酸は、リボソーム−ｅＥＦ２／ＧＴＰ複合体形成を促進し、リボソームへのｅＥＦ２の結合を保ち、それによって、ｅＥＦ２によるサブユニット結合作用を促進する（未公開の観察）。対照的に、ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的開裂に対しては、フシジン酸は効果を有さない（表１）。第二に、ｅＥＦ２上のＡＴＰのための結合部位は、ＧＴＰのための結合部位と異なる。ヌクレオチド三リン酸は、結合部位に依存して、ｅＥＦ２に対して異なる立体構造の変化を与えるはずである。この仮説は、ＧＴＰが、ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的解離、およびＡＴＰアーゼ活性を阻害する（表１）ことによって支持される。第三に、リボソーム／ｅＥＦ２によるＧＴＰ加水分解は、ｅＥＦ２上のＧＴＰの結合部位で起こることが推測されるが、一方、リボソームは、ｅＥＦ２による解離中に、ＡＴＰの加水分解において、より大きな役割を果たし得る。８０Ｓリボソームは、内因性ＡＴＰアーゼ活性を有し、この活性レベルは、内因性ＧＴＰアーゼ活性よりも高い。このＡＴＰアーゼは、５Ｓ  ＲＮＰ複合体と結合し、ｅＥＦ２によって刺激されることが予測される。５Ｓ  ＲＮＰ複合体と関与し、Ｂ１ａおよびＢ１ｂ／ｃサブユニット間架橋を形成する中心隆起は、ｅＥＦ２／ソルダリンの結合の際に、実質的な立体構造変化を行う。これらことは、ｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的な８０Ｓリボソームの開裂が、中心隆起の立体構造変化によって誘導され得ることを示唆する。
【００５９】
ポリペプチド合成の開始ステップおよび伸長ステップのためにはＡＴＰが必要である。本研究において、本発明者らは、ＡＴＰは８０Ｓリボソームのサブユニットへの開裂のためにも消費されることを示した。このことは、遊離８０Ｓリボソームが開始ステップに動員されるために重要であり得る。従って、原核生物でのタンパク質合成と対照的に、真核細胞での翻訳においては、ＡＴＰが重要な役割を果たす。さらに、本発明者らは、このＡＴＰ依存的な８０Ｓリボソームの解離がＧＴＰによって阻害されるという、予想外の知見を得た。この知見は、真核細胞においてタンパク質合成を制御するという、これまでなし得なかった課題を解決する重要な手段となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、ｅＥＦ２が、ＡＴＰの存在下において、８０Ｓリボソームを解離させることを、光分散分析によって示す。
【図２】図２は、ｅＥＦ２が、ＡＴＰの存在下において、８０Ｓリボソームを解離させることを、光分散分析によって示す。
【図３】図３は、ｅＥＦ２が、ＡＴＰの存在下において、８０Ｓリボソームを解離させることを、光分散分析によって示す。
【図４】図４は、ｅＥＦ２／ＡＴＰによる８０Ｓリボソームの開裂を、沈降試験によって示す。
【００６１】
【図５】図５は、ｅＥＦ２／ＡＴＰによる８０Ｓリボソームの開裂を、沈降試験によって示す。
【図６】図６は、ｅＥＦ２／ＡＴＰによって一時的に解離した８０Ｓリボソームは、ｅＩＦ６によって安定化されることを示す。
【図７】図７は、ｅＥＦ２／ＡＴＰによって一時的に解離した８０Ｓリボソームは、ｅＩＦ６によって安定化されることを示す。
【００６２】
【図８】図８は、ｅＥＦ２依存的な８０Ｓリボソームの解離、およびサブユニットへのｅＥＦ２の結合のために、ＡＴＰが不可欠であるが、他のヌクレオチドは不可欠ではないことを、開裂の間のＡＴＰ加水分解によって示す。各々の画分中のｅＥＦ２の存在を、ウェスタンブロッティングによって概算した。
【図９】図９は、ｅＥＦ２依存的な８０Ｓリボソームの解離、およびサブユニットへのｅＥＦ２の結合のために、ＡＴＰが不可欠であるが、他のヌクレオチドは不可欠ではないことを、開裂の間のＡＴＰ加水分解によって示す。各々の画分中のｅＥＦ２の存在を、ウェスタンブロッティングによって概算した。各々の曲線は、３回の独立した実験の平均を表す。
【図１０】図１０は、ｅＥＦ２依存的な８０Ｓリボソームの解離、およびサブユニットへのｅＥＦ２の結合のために、ＡＴＰが不可欠であるが、他のヌクレオチドは不可欠ではないことを、開裂の間のＡＴＰ加水分解によって示す。各々の画分中のｅＥＦ２の存在を、ウェスタンブロッティングによって概算した。各々の曲線は、３回の独立した実験の平均を表す。
【００６３】
【図１１】図１１は、ＡＴＰの存在下におけるリボソーム開裂の間の、サブユニットへのｅＥＦ２の結合を表す。
【図１２】図１２は、推測されるｅＥＦ２／ＡＴＰ依存的な８０Ｓリボソームの解離の機構を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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