(57)【要約】【課題】基板上に形成するマイクロ流路を用いたセルソーターを利用して細胞が放出する光子を検出して細胞の分離を行う。【解決手段】ポジトロン断層法では人体に陽電子(positron)崩壊する核種で標識された化合物を放射性トレーサとして用いる。投与されたトレーサが人体の臓器の癌、腫瘍等の部位に集まることに着目して、この部位のサンプルから細胞を得て、マイクロ流路を用いたセルソーターで細胞分離を行う。細胞検出領域に近接して光電子検出器を配置し、光電子検出器の光子検出信号に応じてコンピュータから細胞分離領域に信号を送り分離する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
周辺がすべて緩衝液の流れによりシースされた細胞を含む緩衝液の流れを形成するための流路を備える基板と、該細胞を含む緩衝液の流れの中を流下する細胞の放出するガンマー線を所定の大きさの開口を有する遮蔽壁を介して検出する光電子増倍管とを含み、前記光電子増倍管が細胞の放出するガンマー線を検出するか否かにより細胞を分離する細胞分離装置であって、前記流下する個々の細胞間の間隔を前記開口の大きさより大きいものとしたことを特徴とする細胞分離装置。
【請求項２】
前記細胞を含む緩衝液の流れの中を流下する細胞を、前記光電子倍増管が細胞の放出するガンマー線を検出する位置で光学的に検出する光学系を備え、該光学系が細胞を検出するとともに、前記光電子増倍管が細胞の放出するガンマー線を検出したとき、前記光電子増倍管が細胞の放出するガンマー線を検出したとする請求項１記載の細胞分離装置。
【請求項３】
基板、該基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための第１の流路、該第１の流路を挟み該第１の流路の両側から細胞を含まない緩衝液を流下させる第２及び第３の流路、前記第１の流路の緩衝液と第２および第３の流路の緩衝液が合流して１本の流路となって緩衝液を流下させる第４の流路、前記第４の流路に前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域および検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域をカスケードに設け、該細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路を設けるとともに、前記第１の流路から第４の流路を流下する緩衝液が共通の液面位置を有するリザーバから供給され、前記第１の流路と第４の流路の幅あるいは断面積が実質的に等しい構造を有する細胞分離チップを設置する手段と、
該細胞分離チップの前記細胞検出領域には当該領域を流下する細胞から放出される光子を検出するための光電子増倍管と、
該光電子増倍管から供給される検出信号に応じて前記細胞分離領域に細胞分離のための信号を与えるコンピュータと、
を有することを特徴とする細胞分離装置。
【請求項４】
前記細胞分離チップが、前記第１の流路の上流に前記第１の流路を延伸するとともに前記リザーバから緩衝液が供給される第５の流路と、前記第１の流路に細胞を供給する位置より下流で前記第１の流路の上面に前記リザーバから緩衝液を供給する穴とを有する請求項３記載の細胞分離装置。
【請求項５】
前記細胞分離チップが、前記四つの流路に加えて、第４の流路に合流する緩衝液を流下させる第５の流路を有し、前記第１の流路と第４の流路を加えた流路長と第５の流路長が実質等しく、前記第５の流路を流下する緩衝液が前記共通のリザーバから供給され、前記細胞検出領域および細胞分離領域が前記第５の流路の緩衝液合流位置より下流に設けられるとともに、前記第２及び第３の流路長が実質等しい請求項３または４記載の細胞分離装置。
【請求項６】
前記細胞分離チップの前記細胞分離領域は、流路の両側に対向し、かつ、緩衝液の流れに対して位置をずらして配置された電解質を含むゲルからなる二つのゲル電極の開口部が設けられ、前記細胞分離領域において二つのゲル電極間に所定の電流を流した場合と流さない場合に応じて、細胞が前記細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路に分配されるものである請求項３または４記載の細胞分離装置。
【請求項７】
光子（γ線）を放出する細胞を分離するための細胞分離装置であって、
細胞を含む緩衝液が流れるための流路を備えた基板を設置する手段と、
前記流路を流れる細胞が放出するγ線を検出する手段と、
γ線を放出する細胞を分離する手段と、
を含む、細胞分離装置。
【請求項８】
前記γ線が、前記細胞に付着した陽電子崩壊する核種で標識された化合物からなるトレーサにより放出される、請求項７に記載の細胞分離装置。
【請求項９】
前記基板が、細胞を含む緩衝液の流れが、細胞を含まない緩衝液の流れによりシースされるような緩衝液の流れを形成するための流路を備える、請求項７に記載の細胞分離装置。
【請求項１０】
さらに、前記流路を流れる細胞を光学的に検出する手段を含み、
前記γ線を放出する細胞を、前記光学的に検出する手段と前記γ線を検出する手段とを用いて検出する、請求項７に記載の細胞分離装置。
【請求項１１】
前記γ線を検出する手段が、光電子倍増管またはアパランアシア型のフォトダイオードである、請求項７に記載の細胞分離装置。
【請求項１２】
前記基板が、分離された細胞をそれぞれ別々に流下させるための複数の流路を備え、
前記細胞を分離する手段が、細胞に電界を作用させる手段を備える、請求項７に記載の細胞分離装置。
【請求項１３】
光子（γ線）を放出する細胞を分離するための細胞分離装置であって、
細胞を含む緩衝液が流れるための流路を備えた基板を設置する手段と、
前記流路を流れる細胞を光学的に検出するための光学系と、
前記流路を流れる細胞が放出するγ線を検出するためのγ線検出手段と、
前記流路と前記γ線検出手段との間に配置された、前記細胞が放出するγ線が通過する開口部を有するγ線遮蔽板と、
前記γ線遮蔽板と前記γ線検出手段との間に配置されたγ線蛍光変換部と、
前記γ線検出手段および／または前記光学系により得られた検出信号に基づいて、前記流路を流れる細胞を分離するために該細胞に電界を印可するための電界印加手段と、
を含む、細胞分離装置。
【請求項１４】
前記細胞を含む緩衝液が流れるための流路を備える基板が、
該流路に細胞を含まない緩衝液を流入するための第１の開口部と、
該第１の開口部の下流に細胞を含む緩衝液を流入するための第２の開口部と、
該第２の開口部の下流に細胞を含まない緩衝液を流入するための第３の開口部とを備え、
前記第３の開口部の下流の流路内では、細胞を含む緩衝液の流れが、細胞を含まない緩衝液の流れによりシースされるような緩衝液の流れが形成され、
前記第３の開口部の下流に細胞を検出するための細胞検出領域と、該検出された細胞を分離するための細胞分離領域とを備える、請求項１３に記載の細胞分離装置。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の細胞分離装置を用いて細胞を分離する方法であって、
前記流路を流下する個々の細胞間の間隔が、前記γ線遮蔽板の前記開口部のサイズより大きくなるように細胞を流下させることを特徴とする、方法。
【請求項１６】
前記γ線検出手段が、光電子倍増管またはアパランシア型のフォトダイオードである、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、陽電子(positron)崩壊する核種で標識された化合物を放射性トレーサとして利用する診断方法により採取された細胞の分離装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の細胞を分離し回収することは生物学・医学的な分析においては重要な技術であり、例えば、蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収するセルソーターがある（非特許文献１：Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)）。
【０００３】
しかし、この技術は高価であること、装置が大型であること、数千ボルトという高電界が必要であること、試料が多量に必要であること、液滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、直接試料を観察できないことなどの問題がある。これらの問題を解決するため、本発明者らは、マイクロ加工技術を活用して、基板上に構成される流路を、細胞を緩衝液とともに流下させ、細胞の画像を採取して細胞分離を行うセルソーターを提案している（特開２００６−１８０８１０、特開２００６−２２０４２３）。
【非特許文献１】Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)
【特許文献１】特開２００６−１８０８１０号公報
【特許文献２】特開２００６−２２０４２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ポジトロン断層法として知られる診断方法は、陽電子検出を利用したコンピュータ断層撮影技術である。人体に陽電子(positron)崩壊する核種で標識された化合物を放射性トレーサとして用いる。トレーサの中の陽電子は体内で崩壊して1個の陽電子を放出し、近傍にある原子の電子と対消滅して光子（γ線）が放出される。投与されたトレーサは人体の臓器の癌、腫瘍等が疑われる部位に集中するので、人体の周囲にγ線検出器を配置して光子放出の情報を集めてＣＴと同様に画像処理を施して三次元画像を得ると人体の臓器の癌、腫瘍等が疑われる部位が特定できる診断方法である。
【０００５】
ポジトロン断層法では、使用される核種が人体の臓器の癌、腫瘍等の部位に集まることに着目して診断が行われるわけであるが、本発明では、ポジトロン断層法による診断の結果、人体の臓器の癌、腫瘍等が疑われる部位の細胞を採取して、この細胞を、上記基板上に構成される流路を、細胞を緩衝液とともに流下させ、細胞の画像を採取して細胞分離を行うセルソーターに導入して、細胞の画像の採取による細胞分離に代えて分離取得の対象となる細胞自体が出す光子（γ線）を検出して、細胞分離を高精度、高速度で可能とする細胞分離装置（セルソーター）を提案するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、以下の細胞分離装置、および細胞分離方法を提供する。
（１）周辺がすべて緩衝液の流れによりシースされた細胞を含む緩衝液の流れを形成するための流路を備える基板と、該細胞を含む緩衝液の流れの中を流下する細胞の放出するガンマー線を所定の大きさの開口を有する遮蔽壁を介して検出する光電子増倍管とを含み、上記光電子増倍管が細胞の放出するガンマー線を検出するか否かにより細胞を分離する細胞分離装置であって、上記流下する個々の細胞間の間隔を上記開口の大きさより大きいものとしたことを特徴とする細胞分離装置。
（２）上記細胞を含む緩衝液の流れの中を流下する細胞を、上記光電子倍増管が細胞の放出するガンマー線を検出する位置で光学的に検出する光学系を備え、該光学系が細胞を検出するとともに、上記光電子増倍管が細胞の放出するガンマー線を検出したとき、上記光電子増倍管が細胞の放出するガンマー線を検出したとする上記（１）記載の細胞分離装置。
（３）基板、該基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための第１の流路、該第１の流路を挟み該第１の流路の両側から細胞を含まない緩衝液を流下させる第２及び第３の流路、上記第１の流路の緩衝液と第２および第３の流路の緩衝液が合流して１本の流路となって緩衝液を流下させる第４の流路、上記第４の流路に上記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域および検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域をカスケードに設け、該細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路を設けるとともに、上記第１の流路から第４の流路を流下する緩衝液が共通の液面位置を有するリザーバから供給され、上記第１の流路と第４の流路の幅あるいは断面積が実質的に等しい構造を有する細胞分離チップを設置する手段と、
該細胞分離チップの上記細胞検出領域には当該領域を流下する細胞から放出される光子を検出するための光電子増倍管と、
該光電子増倍管から供給される検出信号に応じて上記細胞分離領域に細胞分離のための信号を与えるコンピュータと、
を有することを特徴とする細胞分離装置。
（４）上記細胞分離チップが、上記第１の流路の上流に上記第１の流路を延伸するとともに上記リザーバから緩衝液が供給される第５の流路と、上記第１の流路に細胞を供給する位置より下流で上記第１の流路の上面に上記リザーバから緩衝液を供給する穴とを有する上記（３）記載の細胞分離装置。
（５）上記細胞分離チップが、上記四つの流路に加えて、第４の流路に合流する緩衝液を流下させる第５の流路を有し、上記第１の流路と第４の流路を加えた流路長と第５の流路長が実質等しく、上記第５の流路を流下する緩衝液が上記共通のリザーバから供給され、上記細胞検出領域および細胞分離領域が上記第５の流路の緩衝液合流位置より下流に設けられるとともに、上記第２及び第３の流路長が実質等しい上記（３）または（４）記載の細胞分離装置。
（６）上記細胞分離チップの上記細胞分離領域は、流路の両側に対向し、かつ、緩衝液の流れに対して位置をずらして配置された電解質を含むゲルからなる二つのゲル電極の開口部が設けられ、上記細胞分離領域において二つのゲル電極間に所定の電流を流した場合と流さない場合に応じて、細胞が上記細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路に分配されるものである上記（３）または（４）記載の細胞分離装置。
（７）光子（γ線）を放出する細胞を分離するための細胞分離装置であって、
細胞を含む緩衝液が流れるための流路を備えた基板を設置する手段と、
上記流路を流れる細胞が放出するγ線を検出する手段と、
γ線を放出する細胞を分離する手段と、
を含む、細胞分離装置。
（８）上記γ線が、上記細胞に付着した陽電子崩壊する核種で標識された化合物からなるトレーサにより放出される、上記（７）に記載の細胞分離装置。
（９）上記基板が、細胞を含む緩衝液の流れが、細胞を含まない緩衝液の流れによりシースされるような緩衝液の流れを形成するための流路を備える、上記（７）に記載の細胞分離装置。
（１０）さらに、上記流路を流れる細胞を光学的に検出する手段を含み、
上記γ線を放出する細胞を、上記光学的に検出する手段と上記γ線を検出する手段とを用いて検出する、上記（７）に記載の細胞分離装置。
（１１）上記γ線を検出する手段が、光電子倍増管またはアパランアシア型のフォトダイオードである、上記（７）に記載の細胞分離装置。
（１２）上記基板が、分離された細胞をそれぞれ別々に流下させるための複数の流路を備え、
上記細胞を分離する手段が、細胞に電界を作用させる手段を備える、上記（７）に記載の細胞分離装置。
（１３）光子（γ線）を放出する細胞を分離するための細胞分離装置であって、
細胞を含む緩衝液が流れるための流路を備えた基板を設置する手段と、
上記流路を流れる細胞を光学的に検出するための光学系と、
上記流路を流れる細胞が放出するγ線を検出するためのγ線検出手段と、
上記流路と上記γ線検出手段との間に配置された、上記細胞が放出するγ線が通過する開口部を有するγ線遮蔽板と、
上記γ線遮蔽板と上記γ線検出手段との間に配置されたγ線蛍光変換部と、
上記γ線検出手段および／または上記光学系により得られた検出信号に基づいて、上記流路を流れる細胞を分離するために該細胞に電界を印可するための電界印加手段と、
を含む、細胞分離装置。
（１４）上記細胞を含む緩衝液が流れるための流路を備える基板が、
該流路に細胞を含まない緩衝液を流入するための第１の開口部と、
該第１の開口部の下流に細胞を含む緩衝液を流入するための第２の開口部と、
該第２の開口部の下流に細胞を含まない緩衝液を流入するための第３の開口部とを備え、
上記第３の開口部の下流の流路内では、細胞を含む緩衝液の流れが、細胞を含まない緩衝液の流れによりシースされるような緩衝液の流れが形成され、
上記第３の開口部の下流に細胞を検出するための細胞検出領域と、該検出された細胞を分離するための細胞分離領域とを備える、上記（１３）に記載の細胞分離装置。
（１５）上記（１３）または（１４）に記載の細胞分離装置を用いて細胞を分離する方法であって、
上記流路を流下する個々の細胞間の間隔が、上記γ線遮蔽板の上記開口部のサイズより大きくなるように細胞を流下させることを特徴とする、方法。
（１６）上記γ線検出手段が、光電子倍増管またはアパランシア型のフォトダイオードである、上記（１３）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
【０００７】
ポジトロン断層法による診断では、標識化合物の核種の半減期が短いため、人体の臓器の癌、腫瘍等が疑われる部位に集まっているトレーサの放射能は十分とはいえないとしても、トレーサの中には陽電子が残存している。したがって、診断直後の被検体から微量のサンプルを採取して、例えば、トリプシン処理により、サンプルから細胞を得て、この細胞を基板上に構成される流路を緩衝液とともに流下させ、細胞の放出する光子（γ線）を検出して、細胞分離を行えば、人体の臓器の癌、腫瘍等が疑われる部位の細胞を分離、収集することができる。本発明では、緩衝液とともに流下してくる細胞の放出する光子（γ線）を所定の位置で光電子増倍管で検出し、流路中を連続して高速で流れてくる細胞を識別する。この際、流下する細胞を光学的に観察して、細胞が所定の位置にあることを検出して、細胞が光学的に検出されたことと光電子増倍管で光子（γ線）が検出されたこととの信号が一致したことで、所定の位置を流下している細胞が光子（γ線）を放出している細胞である、とするのが良い。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、光子（γ線）を放出する細胞の細胞分離が高精度、高速度で可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
図１は、本願発明の概念を模式的に示すブロック図である。１は緩衝液の流れであり、２はその中央部に形成された細胞が流下する緩衝液の流れである。３は細胞であり、上述したように、放射性トレーサを取り込んでいる場合には光子（γ線）を放出する。一例を具体的に後述するように、細胞が流下する緩衝液の流れ２のＸ方向、Ｙ方向の両側に層流を形成すれば、細胞３は流路を形成する構造物９の壁に接すること無く緩衝液の流れ２を流下するものとできる。４は光電子増倍管であり、適当な開口５が形成されたガンマー線遮蔽板（たとえば、鉛板）６を介して緩衝液の流れ２に対向して配置される。ここで、流下する細胞の間隔は開口５の細胞の流下する方向の長さよりも大きくすることが必要である。隣接して流下する二つの細胞の放出するガンマー線が開口５から、同時に、光電子増倍管４に入力されることを防止するためである。流下する細胞の間隔は、例えば、緩衝液の流速、緩衝液中の細胞の濃度を調節することによって調節することができる。
【００１０】
一方、緩衝液の流れ２の反対側にはこれに対向して光学系の対物レンズ７を配置して細胞３を光学的に検出する系を構成する。光電子増倍管４と対物レンズ７とが緩衝液の流れ２を流下する一つの細胞３を同時に検出する位置に配置されると、光電子増倍管４が細胞３が放出する光子（γ線）を検出するときには、対物レンズ７による光学系も同じ細胞を必ず検出する。細胞３が放射性トレーサを取り込んでいない場合には、対物レンズ７による光学系でのみ細胞が検出される。
【００１１】
対物レンズ７による光学系は細胞３が蛍光標識されたものであるときは、その蛍光を検出して細胞を検出するものとすればよい。また、細胞３にレーザ光を照射してその散乱光を検出して細胞を検出するものとしても良い。さらには、カメラを備え、蛍光カメラ、実体像カメラにより細胞を撮影して、外形、寸法等あらかじめ定めたパラメータにより細胞の有無を評価するものとすればよい。
【００１２】
図２は本願発明を適用して好都合なセルソーターの一例を、上記特開２００６−１８０８１０号公報に開示された細胞分離装置（セルソーター）を基礎とした構成として模式的に示す平面図である。
【００１３】
セルソーター１００は基板１０１を含む構造を有する。基板１０１の下面に流路となる溝を、上面にこの溝に連通する開口を設け、試料や必要な緩衝液の供給口とする。また、十分な緩衝液の供給と各流路での流量の調整のためにリザーバ（２０３，２１３）を設ける。溝や開口の作成はＰＭＭＡなどのプラスチックを金型に流し込むいわゆる射出成型で作成することができる。チップ基板１０１全体のサイズは、例えば、２０×３０×１ｍｍ（ｔ）であるが、このサイズに限定されない。チップ基板１０１の溝が刻まれた下面側に、例えば、０．１ｍｍ厚のラミネートフィルムを熱圧着することにより、基板１０１の下面に刻まれた溝や基板１０１の貫通穴を、流路やウェルとすることができる。チップ基板１０１の上面には、マイクロ流路に細胞を含む試料緩衝液を導入する穴２０１、細胞を含まない緩衝液を導入する穴２０１’，２０２および２０２’が設けられるとともに、これらを包括するリザーバ２０３が設けられる。具体的には、リザーバ２０３を形成するために基板１０１の上面に設けられたウェルの底面にそれぞれ穴２０１’、２０２、および２０２’が設けられる。
【００１４】
したがって、リザーバ２０３に十分な緩衝液を供給すると穴２０１，２０１’，２０２および２０２’は緩衝液でつながる。これにより、穴２０１および２０１’に連なるマイクロ流路２０４とマイクロ流路２０４’には同じ液面高さの緩衝液が供給される。したがって、両流路の流路幅（流路高さを等しいとすれば）、あるいは、断面積、さらに両流路の流路長を実質等しくすれば、両流路の流量を実質同量にすることができる。同様に、穴２０２，２０２’に連なる流路２０５，２０５’には同じ液面高さの緩衝液が供給され、流路２０５，２０５’を流れる緩衝液の流量をマイクロ流路２０４に流れる流量と所定の比にそろえることができる。
【００１５】
穴２０１に導入された細胞を含む緩衝液は、マイクロ流路２０４（例：幅２０μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、細胞検出領域２２１および細胞分離領域２２２まで導入される。他方、穴２０２，２０２’に導入された細胞を含まない緩衝液は流路２０５，２０５’（幅１２μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液と合流する。２４０は合流後のマイクロ流路であり、細胞検出領域２２１となる。さらに、マイクロ流路２４０は細胞分離領域２２２まで延伸される。マイクロ流路２４０は、図１で言えば、緩衝液の流れ１に対応する。
【００１６】
一方、穴２０１’に導入された細胞を含まない緩衝液は、マイクロ流路２０４’（例：幅２０μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、細胞分離領域２２２に導入され、マイクロ流路２４０からの細胞を含む緩衝液と合流する。合流後に溶液が通過する流路の流路幅については、後述する。また、この合流した流路は、細胞分離領域２２２の出口で、マイクロ流路２１８（例：幅２０μｍ、深さ１５μｍ）および２１９（例：幅２０μｍ、深さ１５μｍ）に分流する。
【００１７】
また、マイクロ流路２０４の上流には流路３０１が延伸され、穴３０２を通してリザーバ２０３に開口している。さらに、マイクロ流路２０４の穴２０１に隣接した下流部にはリザーバ２０３に開口している穴３０３が設けられている。
【００１８】
２０６，２０６’および２０７，２０７’は電解質を含むゲルを導入する穴であり、それぞれ、穴２０６および２０７に導入されたゲルは基板１０１の下面のマイクロ構造２０８，２０９（例えば、幅２００μｍ×高さ１５μｍの溝）を通して穴２０６’および２０７’に送り込まれる。したがって、マイクロ構造２０８，２０９は電解質を含むゲルで満たされている。マイクロ構造２０８，２０９の流路２４７側の端はマイクロ流路２０４，２０４’にそれぞれ接続する２０μｍ程度の長さの液絡構造の連結部２４１，２４２からなっていて、細胞分離領域２２２において、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に、ゲルが、直接、接触できる構造とされる。ゲルと緩衝液が接触する面積は、例えば、１５μｍ（流路に沿った長さ）×１５μｍ（高さ）である。ゲルを導入する穴２０６および２０７には、黒丸で示す電極が挿入され、これらの電極は、配線１０６，１０７およびスイッチ２１６を通して電源２１５に接続される。スイッチ２１６は、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に電圧をかける時のみＯＮとされる。
【００１９】
細胞分離領域２２２でマイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流して形成される流路２４７を流れる緩衝液に、連結部２４１と２４２からのゲルが接触する。図に示すように、連結部２４２よりも連結部２４１のほうが流路の上流に位置する構造となっている。これは、穴２０６の電極にプラス、穴２０７の電極にマイナスの電圧をかけたときに、マイクロ流路２４０を流れてくる細胞を流路２１８に効率よく移動させるためである。すなわち、電流を流したときにマイナスにチャージしている細胞は電気泳動的な力が働くが、この電気泳動力のベクトルと流路内を流れる緩衝液から受ける力のベクトルとの合成ベクトルが、実際に細胞に働く力になる。連結部２４２よりも連結部２４１を流路の蒸留に位置させたほうが、連結部２４１と２４２とを流路の流れ方向に対して同じレベルの位置に作成した場合に比べ、実際に細胞に働く力のベクターの向きがより直接的に連結部２４２または２４１の方に向くようになる。したがって、より低電圧で安定した細胞のマイクロ流路２１８あるいはマイクロ流路２１９への移動が可能となり、効率のよい電界利用が可能となる。
【００２０】
マイクロ流路２１８，２１９の下流部には、細胞分離領域２２２で振り分けられた細胞の回収穴２１１，２１２が開けられている。それぞれの穴２１１，２１２には、これらを包括するリザーバ２１３が設けられる。具体的には、リザーバ２１３を形成するために基板１０１の上面に設けられたウェルの底面にそれぞれ穴２１１，２１２が設けられる。リザーバ２１３は緩衝液で満たされているが、この緩衝液の液面の位置は、リザーバ２０３に満たされている緩衝液の液面の位置よりは低いものとされる。
【００２１】
リザーバ２０３の緩衝液の液位はリザーバ２１３のそれよりも高いから、この落差が流路を流れる緩衝液の移動の駆動力となるとともに、脈動のない安定した流れを作り出す。リザーバ２１３の容積を十分大きなものとしておけば、穴２０１に導入された細胞を含む緩衝液を、全て、マイクロ流路２０４に流入させることができる。
【００２２】
細胞検出領域２２１を流下する細胞は光電子増倍管４により細胞が放出する光子が検出される。光電子増倍管４の信号により、コンピュータ２５２が光子を放出する細胞が検出されたと判定すると、コンピュータ２５２は細胞が細胞分離領域２２２に到達する時点に、スイッチ２１６をオンとする。これにより、光子を放出する細胞はマイクロ流路２１８を流下し、光子を放出しない細胞はマイクロ流路２１９を流下することになる。
【００２３】
図３は、マイクロ流路２０４からの細胞を含む緩衝液と、マイクロ流路２０５，２０５’からの緩衝液とが合流した後、マイクロ流路２４０上の細胞検出領域２２１に進入し、さらに、マイクロ流路２４０を流下して、マイクロ流路２０４’からの緩衝液と合流して、さらにマイクロ流路２４７を流下する状況を説明する図である。図に示すように、細胞分離領域２２２は、マイクロ流路２０４’の下流端と、マイクロ流路２４０の下流端と、連結部２４１の一部と、連結部２４２の一部と、マイクロ流路２４７とを含む。
【００２４】
ここで、細胞検出領域２２１の上流部で、流路２０５，２０５’を流下する細胞を含まない緩衝液を、マイクロ流路２０４を流下する細胞を含む緩衝液と合流させる理由を説明する。細胞を含む緩衝液の流れるマイクロ流路２０４には、細胞を含まない緩衝液の流れる流路２０５，２０５’が細胞検出領域２２１の上流部で合流するが、それぞれの流路の最上流に設けられた穴２０１および２０２，２０２’は、共通の液位の緩衝液のリザーバ２０３中に開口部を有する。したがって、それぞれの流路を流下する緩衝液の流量は、流路の高さが同じであるから、流路幅に比例したものとなる。これらの緩衝液の合流後の流路２４０の幅を、細胞を含む緩衝液の流れるマイクロ流路２０４の幅と実質的に等しい幅を持つものとする。実質的に等しいとは、加工精度を考慮して等しいということで、厳密に等しいというわけではない。これにより、マイクロ流路２０４を流下する緩衝液は流路２０５，２０５’を流下する緩衝液によって、一定の比率で中央部に押しやられるので、マイクロ流路２０４では側壁に接触しながら流れてくる細胞が、合流後の流路２４０中では側壁に接触しなくなる。
【００２５】
細胞分離領域２２２におけるマイクロ流路２４７は、流路２４０とマイクロ流路２０４’をそれぞれ流下する緩衝液が、それぞれの流れの層を維持しながら、同じ幅の流路を保って流下している。細胞検出領域２２１のマイクロ流路２０４で流下する細胞を検出して、細胞分離領域２２２で、ゲルが流下する緩衝液と接触する連結部２４１と２４２により電界を作用させて分離するのである。
【００２６】
さらに、細胞検出領域２２１および細胞分離領域２２２で流路側壁に細胞が付着するのを防止するために、基板１０１の断面方向でもシース流を形成する一例を図４を参照して説明する。
【００２７】
図４はマイクロ流路２０４の最上流部の部分をマイクロ流路２０４に沿った方向での断面を示す図である。基板１０１の下面にマイクロ流路２０４が形成され、ラミネートフィルム４０１により覆われている。マイクロ流路２０４の上流部には流路３０１が形成され、その端部は穴３０２により基板１０１の上面まで連通している。穴２０１のマイクロ流路２０４に沿った下流部には穴３０３が形成されて、マイクロ流路２０４の上面が基板１０１の上面に連通するものとされている。これらの領域はリザーバ２０３の中にあるので、穴２０１に細胞を入れ、リザーバ２０３に緩衝液を入れれば、穴２０１から細胞がマイクロ流路２０４に流入するとともに、穴３０２および穴３０３からも緩衝液がマイクロ流路２０４に流入する。その結果、穴３０２から流入する緩衝液がマイクロ流路２０４の下面部を流れて細胞がマイクロ流路２０４の下面に接触するのを防止する。穴３０３から流入する緩衝液はマイクロ流路２０４の上面部を流れて細胞がマイクロ流路２０４の上面に接触するのを防止する。
【００２８】
したがって、マイクロ流路２０４に細胞が流入した直後から細胞はマイクロ流路２０４の上下面で緩衝液によって上下の壁面との接触を防止され、マイクロ流路２０４の下流域、すなわち、細胞検出領域２２１の上流部で、流路２０５，２０５'を流下する細胞を含まない緩衝液によりマイクロ流路２０４の左右の壁面との接触を防止される。その結果、細胞検出領域２２１では細胞は上下、両側面を緩衝液の流れによってシースされて基板１０１およびラミネートフィルム４０１と接触しないで流下する。図４のマイクロ流路２０４の中に示す線は穴３０２から流入した緩衝液、穴２０１から細胞とともに流入した緩衝液、および、穴３０３から流入した緩衝液が３層の層流となって流れていることを模式的に示すものである。
【００２９】
図５は細胞が蛍光標識されているものとして、細胞検出領域２２１を通過する細胞を、対物レンズ７で構成する光学系では蛍光カメラ２０により検出し、細胞が放出する光子（ガンマー線）は遮蔽板６を介して配置された光電子増倍管４により検出する構成を模式的に示す図である。
【００３０】
ＸＹステージ１５の上に載っているのはマイクロ流路により構成されたセルソーター１００であり、駆動装置２２によって前記ＸＹステージを移動させることで前記セルソーター１００の位置を計測に適した位置に調整することができるようにしている。
【００３１】
前記セルソーター１００の細胞検出領域２２１を流下する細胞は、対物レンズ７で観察される。対物レンズ７の焦点位置は駆動装置１７によって移動させることができる。たとえば、セルソーターの基板１０１の底面のラミネートフィルムの厚さを０．１８ｍｍ以下とすれば、対物レンズ７は開口数を１．４、倍率を４０倍として、細胞を十分な大きさで観察できる。細胞の発する蛍光を反射するダイクロイックミラー２５およびバンドパスフィルタ１９によって、細胞検出領域２２１を通過する細胞が蛍光カメラ２０によって撮像され、細胞検出領域２２１を流下する細胞の検出を行うとともに、必要なら、焦点合わせ操作、移動速度の検出も行う。細胞から放出される光子は光電子増倍管４に入射されて検出される。
【００３２】
コンピュータ２５２は蛍光カメラ２０によって撮像された細胞が所定の条件にあるとき細胞が通過したと判定するとともに、細胞が放出する光子を検出したとき、当該細胞が放射性トレーサを吸収した細胞であると判定する。この判定をしたときは、コンピュータ２５２は細胞の流下速度を考慮して細胞が細胞分離領域２２２に到達する時点に、スイッチ２１６をオンとする信号を送出する。
【００３３】
なお、上述の実施例では、細胞が放射性トレーサを吸収した細胞であると判定したとき、この細胞に電界を作用させて分離するものとした。これに対して、細胞検出領域２２１を通過する細胞を対物レンズ７で構成する光学系で検出したが光電子増倍管４の信号が無いときに細胞に電界を作用させて細胞を分離することとすれば、光子を放出するターゲットの細胞に電界をかけることなく細胞分離をすることができる。
【００３４】
さらに、上述の実施例では、細胞を対物レンズ７で構成する光学系で検出するとともに、細胞が放出する光子（ガンマー線）を光電子増倍管４により検出することにより、細胞が放射性トレーサを吸収した細胞であると判定した。しかしながら、装置が配置される環境をガンマー線のノイズが少なくなるように管理し、光電子増倍管４のノイズ信号が細胞が放出する光子（ガンマー線）と所定のレベルで識別できるときは、対物レンズ７で構成する光学系で細胞を検出することは、省略しても良い。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本願発明の概念を模式的に示すブロック図である。
【図２】本願発明を適用して好都合なセルソーターの一例を模式的に示す平面図である。
【図３】マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液に、マイクロ流路２０５，２０５’の緩衝液が合流して、マイクロ流路２４０を流下し、細胞検出領域２２１の直前で、マイクロ流路２０４’を流下する緩衝液と合流してマイクロ２４０を流下する状況を説明する図である。
【図４】マイクロ流路２０４の最上流部の部分をマイクロ流路２０４に沿った方向での断面を示す図である。
【図５】細胞検出領域２２１を通過する細胞を、細胞が放出する光子によって光電子増倍管４により検出する構成を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【００３６】
１…緩衝液の流れ、２…細胞が流下する緩衝液の流れ、３…細胞、４…光電子増倍管、５…開口、６…ガンマー線遮蔽板、７…対物レンズ、１９…フイルター、２０…蛍光カメラ、２５…ダイクロイックミラー、１００…セルソーター、１０１…基板、１０６，１０７…配線、２０１，２０１’，２０２，２０２’，２０６，２０７，３０２，３０３…穴、２０６’，２０７’…空気抜き、２０３，２１３…リザーバ、２０４，２０４’，２０５，２０５’，２４０，２１８，２１９，３０１…マイクロ流路、２０８，２０９…マイクロ構造、２１５…電源、２１６…スイッチ、２２１…細胞検出領域、２２２…細胞分離領域、２４１，２４２…液絡構造の連結部、２５２…コンピュータ、４０１…ラミネートフィルム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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