(57)【要約】【課題】  神経再生効果が高く、製造が容易な神経再生チューブ及びその製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】  キトサン繊維からなるメッシュ状のマトリックスを筒状とした筒状繊維体からなる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キトサン繊維からなるメッシュ状のマトリックスを筒状とした筒状繊維体からなることを特徴とする神経再生チューブ。
【請求項２】
請求項１に記載の神経再生チューブにおいて、前記筒状繊維体がメッシュ状のマトリックスを二層以上積層して筒状としたものであることを特徴とする神経再生チューブ。
【請求項３】
請求項２に記載の神経再生チューブにおいて、前記筒状繊維体が、キトサン繊維が筒状繊維体の軸方向に配向した配向層と、キトサン繊維が配向していない無配向層とからなることを特徴とする神経再生チューブ。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の神経再生チューブにおいて、前記キトサン繊維が前記筒状繊維体の軸方向に配向していることを特徴とする神経再生チューブ。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載の神経再生チューブにおいて、前記キトサン繊維がエレクトロスピニングにより形成されたものであることを特徴とする神経再生チューブ。
【請求項６】
請求項１〜５の何れかに記載の神経再生チューブにおいて、前記キトサン繊維が、脱アセチル化度が９０％以上であることを特徴とする神経再生チューブ。
【請求項７】
請求項１〜６の何れかに記載の神経再生チューブにおいて、前記キトサン繊維の繊維径が５μｍ以下であることを特徴とする神経再生チューブ。
【請求項８】
請求項７に記載の神経再生チューブにおいて、前記キトサン繊維の繊維径が４００ｎｍ以下であることを特徴とする神経再生チューブ。
【請求項９】
請求項１〜８の何れかに記載の神経再生チューブにおいて、内径がφ１．５〜２．０ｍｍであることを特徴とする神経再生チューブ。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れかに記載の神経再生チューブにおいて、厚さが０．３〜０．５ｍｍであることを特徴とする神経再生チューブ。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れかに記載の神経再生チューブにおいて、前記キトサン繊維がペプチド修飾されていることを特徴とする神経再生チューブ。
【請求項１２】
エレクトロスピニング法により形成された筒状繊維体からなる神経再生チューブの製造方法であって、キトサン類を含むキトサン溶液の液滴を液滴供給部から紡糸空間へ供給し、紡糸空間に設けられた回転支持体にキトサン繊維を巻き取る捕集工程と、前記回転支持体を回転させながら捕集したキトサン繊維に押圧部材を押し当てる押圧工程とを具備することを特徴とする神経再生チューブの製造方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の神経再生チューブの製造方法において、前記捕集工程の前記回転支持体の外周速度を３ｍ／秒以上とすることを特徴とする神経再生チューブの製造方法。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の神経再生チューブの製造方法において、前記押圧工程後に得られたメッシュ状のマトリックスを前記回転支持体から取り外して巻き取ることで筒状繊維体を得る巻取り工程を具備することを特徴とする神経再生チューブの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経の再生に用いられる神経再生チューブ及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種の事故により末梢神経を損傷した場合、切断した神経を外科手術により繋ぐという方法が従来から行われているが、損傷が大きい場合には他の材料によって損傷部位を補うことになる。このとき用いられる材料は、生体適合性に優れ、神経の再生を促すものが求められる。
【０００３】
神経の再生に適した材料として、例えば、ペプチドを基材に固定化した神経再生用材料及び神経再生用材料を生体吸収性のチューブに充填した神経再生材（特許文献１参照）、スポンジ及び該スポンジより分解吸収期間の長い生体吸収性高分子から構成される神経再生チューブ（特許文献２参照）、管状被覆材と繊維の束とからなる神経再生チューブ（特許文献３参照）などが提案されている。
【０００４】
しかしながら、これらの神経再生材料は、製造するのが困難であるという問題があった。
【０００５】
また、さらなる神経再生効果が求められている。
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−１４３５３１号公報（特許請求の範囲等）
【特許文献２】特開２００３−１９１９６号公報（特許請求の範囲等）
【特許文献３】特開２００５ー２３７４７６号公報（特許請求の範囲等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこのような事情に鑑み、神経再生効果が高く、製造が容易な神経再生チューブ及びその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決する本発明の第１の態様は、キトサン繊維からなるメッシュ状のマトリックスを筒状とした筒状繊維体からなることを特徴とする神経再生チューブにある。
【０００９】
かかる第１の態様では、キトサン繊維が絡み合ったメッシュ状のマトリックスを筒状とした筒状繊維体からなることより、製造が容易で、神経系細胞の接着性に優れ、且つ神経断端から発芽しやすく、神経再生効果の高い神経再生チューブとなる。
【００１０】
本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の神経再生チューブにおいて、前記筒状繊維体がメッシュ状のマトリックスを二層以上積層して筒状としたものであることを特徴とする神経再生チューブにある。
【００１１】
かかる第２の態様では、機械的強度に優れた神経再生チューブとなる。また、線維芽細胞の侵入を防止しつつ筒状繊維体の内壁へ生体内の栄養分を取り入れることができ、より効果的に神経再生を促すことができる神経再生チューブとなる。
【００１２】
本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の神経再生チューブにおいて、前記筒状繊維体が、キトサン繊維が筒状繊維体の軸方向に配向した配向層と、キトサン繊維が配向していない無配向層とからなることを特徴とする神経再生チューブにある。
【００１３】
かかる第３の態様では、接着した神経系細胞が所望の方向に配向し、再生軸索がその方向へ伸びやすく、より神経再生効果が高くなる。また、より機械的強度に優れた神経再生チューブとなる。
【００１４】
本発明の第４の態様は、第１又は２の態様に記載の神経再生チューブにおいて、前記キトサン繊維が前記筒状繊維体の軸方向に配向していることを特徴とする神経再生チューブにある。
【００１５】
かかる第４の態様では、接着した神経系細胞が所望の方向に配向し、再生軸索がその方向へ伸びやすく、より神経再生効果の高い神経再生チューブとなる。また、より機械的強度に優れた神経再生チューブとなる。
【００１６】
本発明の第５の態様は、第１〜４の何れかの態様に記載の神経再生チューブにおいて、前記キトサン繊維がエレクトロスピニングにより形成されたものであることを特徴とする神経再生チューブにある。
【００１７】
かかる第５の態様では、小さく均一な繊維径の繊維からなる神経再生チューブとなり、繊維部分に神経系細胞が接着するのみならず、繊維と繊維の間に神経系細胞が接着しやすく、接着した神経系細胞を安定して保持することができ、より神経再生効果の高い神経再生チューブとなる。
【００１８】
本発明の第６の態様は、第１〜５の何れかの態様に記載の神経再生チューブにおいて、前記キトサン繊維が、脱アセチル化度が９０％以上であることを特徴とする神経再生チューブにある。
【００１９】
かかる第６の態様では、生体内において変性しにくく、吸収されにくい神経再生チューブとなる。また、生体内での炎症細胞浸潤が少ない神経再生チューブとなる。
【００２０】
本発明の第７の態様は、第１〜６の何れかの態様に記載の神経再生チューブにおいて、前記キトサン繊維の繊維径が５μｍ以下であることを特徴とする神経再生チューブにある。
【００２１】
かかる第７の態様では、より神経系細胞や再生軸索の接着性に優れ、且つ安定して保持することができるため、より神経再生効果の高い神経再生チューブとなる。
【００２２】
本発明の第８の態様は、第７の態様に記載の神経再生チューブにおいて、前記キトサン繊維の繊維径が４００ｎｍ以下であることを特徴とする神経再生チューブにある。
【００２３】
かかる第８の態様では、より神経系細胞や再生軸索の接着性に優れ、且つ安定して保持することができるため、より神経再生効果の高い神経再生チューブとなる。
【００２４】
本発明の第９の態様は、第１〜８の何れかの態様に記載の神経再生チューブにおいて、内径がφ１．５〜２．０ｍｍであることを特徴とする神経再生チューブにある。
【００２５】
かかる第９の態様では、生体内で好適に使用できる神経再生チューブとなる。
【００２６】
本発明の第１０の態様は、第１〜９の何れかの態様に記載の神経再生チューブにおいて、厚さが０．３〜０．５ｍｍであることを特徴とする神経再生チューブにある。
【００２７】
かかる第１０の態様では、生体内で好適に使用できる神経再生チューブとなる。
【００２８】
本発明の第１１の態様は、第１〜１０の何れかの態様に記載の神経再生チューブにおいて、前記キトサン繊維がペプチド修飾されていることを特徴とする神経再生チューブにある。
【００２９】
かかる第１１の態様では、より神経系細胞の接着性に優れた神経再生チューブとなる。
【００３０】
本発明の第１２の態様は、エレクトロスピニング法により形成された筒状繊維体からなる神経再生チューブの製造方法であって、キトサン類を含むキトサン溶液の液滴を液滴供給部から紡糸空間へ供給し、紡糸空間に設けられた回転支持体にキトサン繊維を巻き取る捕集工程と、前記回転支持体を回転させながら捕集したキトサン繊維に押圧部材を押し当てる押圧工程とを具備することを特徴とする神経再生チューブの製造方法にある。
【００３１】
かかる第１２の態様では、接着剤等を塗布することなく、繊維径の小さいキトサン繊維のメッシュ状のマトリックスを二層以上積層した筒状繊維体からなる神経再生チューブを容易に製造することができる。
【００３２】
本発明の第１３の態様は、第１２の態様に記載の神経再生チューブの製造方法において、前記捕集工程の前記回転支持体の外周速度を３ｍ／秒以上とすることを特徴とする神経再生チューブの製造方法にある。
【００３３】
かかる第１３の態様では、回転支持体の円周方向にキトサン繊維を配向させたメッシュ状のマトリックスを容易に製造することができ、配向した神経再生チューブを容易に製造することができる。
【００３４】
本発明の第１４の態様は、第１２又は１３の態様に記載の神経再生チューブの製造方法において、前記押圧工程後に得られたメッシュ状のマトリックスを前記回転支持体から取り外して巻き取ることで筒状繊維体を得る巻取り工程を具備することを特徴とする神経再生チューブの製造方法にある。
【００３５】
かかる第１４の態様では、機械的強度に優れた神経再生チューブを製造することができる。また、回転支持体の回転方向と異なる方向に巻き取ることで、キトサン繊維を回転支持体の円周方向とは異なる、任意の方向に配向させた神経再生チューブを製造することができる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、製造が容易で、神経系細胞の接着性に優れ、且つ神経断端から発芽しやすく、神経再生効果の高い神経再生チューブとなる。また、線維芽細胞の侵入を防止しつつ筒状繊維体の内壁へ生体内の栄養分を取り入れることができ、より効果的に神経再生を促すことができる神経再生チューブとなる。
【００３７】
また、接着剤等を塗布することなく、繊維径の小さいキトサン繊維のメッシュ状のマトリックスを二層以上積層した筒状繊維体からなる神経再生チューブを容易に製造することができる。さらに、容易にキトサン繊維を一定方向に配向させた筒状繊維体を容易に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明にかかる神経再生チューブは、キトサン繊維からなるメッシュ状のマトリックスを筒状とした筒状繊維体からなる。かかる神経再生チューブは、キトサン繊維からなることにより、生体適合性に優れ、メッシュ状のマトリックスを筒状とした筒状繊維体からなることで、神経系細胞の接着性に優れ、且つ神経断端から発芽しやすく、神経再生効果が高いものである。また、製造が容易な神経再生チューブである。
【００３９】
筒状繊維体は、キトサン繊維からなるメッシュ状のマトリックスを筒状としたものである。メッシュ状のマトリックスとは、繊維が絡み合って開口を有する網目状となるように形成された繊維の集合体のことをいい、外部との栄養交換、ガス交換、液交換の効率がよく、代謝産物の廃棄に好適な不織布である。このため、本発明にかかる神経再生チューブにおいては、神経系細胞が接着し易く、神経軸索の発芽が促進され、また再生神経の成熟も促進されやすい。
【００４０】
キトサン繊維は、エレクトロスピニングにより形成されたものであることが好ましい。エレクトロスピニングにより形成された繊維は、小さく均一な繊維径の繊維からなるため、繊維部分に神経系細胞や再生軸索が接着するのみならず、繊維と繊維の間に神経系細胞や再生軸索が接着しやすく、接着した神経系細胞や再生軸索を安定して保持することができる。なお、キトサン繊維の繊維径は、好ましくは５μｍ以下であり、さらに好ましくは０．０１〜３．０μｍ、特に好ましくは１００〜４００ｎｍである。繊維径がこの範囲となることで、より神経再生効果の高いものとなり、さらに機械的強度に優れた筒状繊維体とすることができる。
【００４１】
キトサン繊維は、キトサン類を主成分とする繊維である。すなわち、本発明における繊維体はキトサン類繊維からなるものである。このため、本発明の神経再生チューブは、神経系細胞の接着性に優れ、且つ神経断端から発芽しやすく、神経再生の効果が高いものとなる。
【００４２】
なお、キトサン類とは、キチン(β‐ポリ‐Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン)を脱アセチル化した生成物又はこの誘導体をいい、キトサン（β‐ポリ‐Ｄ‐グルコサミン）及びその誘導体の他、未反応のキチン及びその誘導体を含有するものをいう。本発明で用いることができるキトサン類は、特に限定されないが、脱アセチル化度が５０％以上であることが好ましく、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは、キチンの脱アセチル化度が９０％以上である。なお、脱アセチル化度とは、キトサン類におけるキトサンの割合を示すものである。
【００４３】
キトサンの脱アセチル化度を９０％以上とすることで、生体内において変性しにくく、吸収されにくい神経再生チューブとすることができる。また、生体内での炎症細胞浸潤が軽度な神経再生チューブとすることができる。さらに、エレクトロスピニングした場合、キトサン繊維の繊維径を小さいものとしやすくなる。具体的には、例えば、４００ｎｍ以下にすることができ、このように径の細い繊維が密集することで、神経再生チューブは機械的強度が非常に高いものとなる。また、移動してきた神経系細胞や再生軸索が接着しやすく、接着した細胞を安定して保持することができるものとなる。
なお、本発明で用いるキトサン類の主成分は特に限定されず、例えば、キトサン、Ｎ−アリルキトサン、Ｎ−アルキルキトサン、ｏ−アリルキトサン、ｏ−アルキルキトサン、硫酸化キトサン、ニトロ化キトサン、カルボキシメチル化キトサン等が挙げられるが、キトサン、カルボキシメチル化キトサンが好ましい。
【００４４】
なお、キトサン繊維は、キトサン類を含有するものであればよく、生体適合性に優れた他の成分を含んでいてもよい。例えば、性能を最大限に発揮させるために必要に応じて、合成高分子や繊維の改質剤、生理活性物質（細胞接着活性因子、細胞増殖因子、線維芽細胞成長因子、免疫活性因子、神経作用因子等）、血清成分、生物組織成分、界面活性剤等を加えることができる。具体的には、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、絹フィブロイン、プリテオグリカン、フィブロネクチン、ヴィトロネクチン、エンタネクチン、エラスチン、ラミニン、セレクチン、ガレクチン、レクチン（ＷＧＡ、コンカナバリンＡ等）、コラーゲン、ゼラチン、酵素（コラゲナーゼ、トリプシン、グルコシダーゼ、プロテインキナーゼ、ウロキナーゼ、ＳＯＤ等）、アルブミン、フィブリン、フィブリノーゲン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、細胞外マトリクスタンパク質、インテグリン、アミノ酸（グリシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、システイン、ロイシン、メチオニン等）、ジペプチド、トリペプチド、ペプチドタンパク質（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン配列、アルギニン−グルタミン酸−アスパラギン酸−バリン配列、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を含む）、グリコサミノグリカン、ムチン型結合糖鎖、アスパラギン型結合糖鎖、オリゴ糖（トレハロース、キチンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フルクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、シクロデキストリン等）、単糖（マンノース、Ｎ-アセチル−Ｄ−グルコサミン、グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、シアル酸、ムラミン酸、グルコース、ガラクトース、ラクトース、フコース、アラビノース等）、ガングリオシド、スフィンゴ脂質、糖脂質（アルキルグリコシド、ガラクトシルセラミド等）、ショ糖脂肪酸エステル、脂肪酸エステル（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、長鎖脂肪酸（アラキドン酸、リノール酸、レチノイン酸等）、グリセロール、多価アルコール、コレステロール、スクアレン、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、ステロイド、インシュリン、トランスフェリン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、チロキシン、トリヨードチロシン、β‐メルカプトエタノール、アセチルコリン、酸類（乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、グルコン酸、グルコロン酸、パントテン酸、ピルビン酸等）、グリチルリチン、ルチン、ステビオシド、サポニン、アルブチン、ポリフェノール（カテキン）、ＳＯＤ様活性物質、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、ＴＮＦ‐α、モノクローナル抗体、補体因子、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アデニン、牛胎仔血清、ビタミン類、無機塩類、シリコン、セラミック、アパタイト、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、エチレンジアミンテトラ酢酸等が挙げられる。  
また、神経再生チューブの神経再生効果を向上させるために、適宜、キトサン繊維の表面を修飾してもよく、例えば、ペプチドによる修飾等が挙げられる。キトサン表面を修飾するペプチドとしては、例えば、ラミニン由来活性ペプチドである、ＹＩＧＳＲ、ＩＫＶＡＶなどが挙げられる。ペプチド修飾することにより神経系細胞の接着性に優れた神経再生チューブとなる。
【００４５】
本発明にかかるキトサン繊維は、筒状繊維体の軸方向に配向していることが好ましい。
キトサン繊維が筒状繊維体の軸方向に配向していることにより、軸索が神経再生チューブの軸方向へ伸びやすく、接着した神経系細胞が軸方向に配列してこれを支持することにより神経再生効果の高い神経再生チューブとなるからである。また、軸方向に配向することで軸方向に対する機械的強度が向上する。
【００４６】
ここで、繊維が筒状繊維体の軸方向に配向しているとは、キトサン繊維の軸方向への配向度が例えば６０％以上の状態を指す。なお、軸方向に配向とは、軸方向に実質的に平行に延びている状態だけではなく、軸方向に対して傾斜して延びている状態も含むものである。すなわち、軸方向に傾斜した繊維や一部の配向していない繊維と、軸方向に実質的に平行な繊維とが絡まり合うことで、メッシュ状のマトリックスとなっている。
【００４７】
なお、ここでいう配向度は、キトサン繊維を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察された画像を画像処理ソフト（Ａ像くん：旭化成エンジニアリング製）により処理して求められる。具体的には、得られた繊維の傾きを０〜１８０°まで１０°刻みで１８等分に区分けし、各範囲の繊維の個数（度合）の度数分布図（ヒストグラム）を描き、下記式より求められる。
【００４８】
【数１】
2008200299.tif 000003
【００４９】
図１に配向繊維の配向角度のヒストグラムの一例を示す。図１に示すヒストグラムは、全区間数は１８であり、最大度数６０の半分、すなわち３０以下の区間数は１５であることより、配向度は８３．３％と求められる。
【００５０】
また、筒状繊維体は、メッシュ状のマトリックスを二層以上積層して筒状としたものであることが好ましい。なお、ここでいう積層とは、メッシュ状のマトリックスを複数回巻き回して形成されるものでもよい。筒状繊維体がメッシュ状のマトリックスを二層以上積層して筒状としたものであることより、機械的強度に優れた神経再生チューブとなる。また、線維芽細胞の侵入を防止しつつ筒状繊維体の内部へ生体内の液性因子や酸素を取り入れることができ、代謝産物を外部へ廃棄できることにより効果的に神経再生を促すことができる神経再生チューブとなる。
【００５１】
筒状繊維体は、異なる種類のメッシュ状マトリックスを積層させたものであってもよい。例えば、キトサン繊維が軸方向に配向した配向層を複数設け、その外周面にキトサン繊維が配向していない無配向層を複数設けたものが挙げられる。この場合は、配向層の外表面に無配向層を設けるのが好ましい。軸方向に配向した配向層において、神経軸索が神経再生チューブの軸方向へ伸びやすく、より神経再生効果の高い神経再生チューブとなるからであり、また、無配向層により配向層が保護されることで、例えば、外部からの径方向への圧迫に耐性のある機械的強度に優れた神経再生チューブとなるからである。
【００５２】
また、キトサン繊維が軸方向に配向した配向層と、キトサン繊維が配向していない無配向層とを交互に積層させてもよい。このような構成とすることで、神経再生チューブの内層が剥離したとしても、配向層へ接着した神経断端からの軸索が軸方向へ伸びやすいため、高い神経再生効果が得られる。
【００５３】
本発明にかかる筒状繊維体は、何層から形成されるものであってもよい。所望の機械的強度、浸透性等にあわせて、適宜、調整すればよい。
【００５４】
なお、筒状繊維体は、キトサン繊維が軸方向に配向した配向層と、キトサン繊維が円周方向に配向した配向層とからなるものであってもよい。このような層から形成されることで、いずれの方向に対しても機械的強度の高い筒状繊維体となる。
【００５５】
また、本発明における神経再生チューブは、内径は特に限定されないが、φ１．５〜２．０ｍｍであることが好ましい。例えば、生体内の指神経等の太さにマッチし好適に用いることができるものとなるからである。なお、太い神経部分に移植する場合は、神経再生チューブを何本か束ねてケーブルグラフトすることで、血行不良により壊死しやすい中央部分の再生神経も壊死することがなくなる。
【００５６】
神経再生チューブの厚さは、特に限定されないが、例えば０．３〜０．５ｍｍであることが好ましい。この範囲であれば、外部との栄養交換、ガス交換、液交換の効率が優れたものとなり、神経再生効果が高いものとなる。また、機械的強度を十分に保つことができる。
【００５７】
本発明の神経再生チューブの製造方法は、キトサン類を含むキトサン溶液の液滴を液滴供給部から紡糸空間へ供給し、紡糸空間へ設けられた回転支持体にキトサン繊維を巻き取る捕集工程と、回転支持体を回転させながらキトサン繊維に押圧部材を押し当てる押圧工程とを具備する。この製造方法によれば、繊維径の小さいキトサン繊維のメッシュ状のマトリックスの積層体からなる神経再生チューブを容易に製造することができる。具体的には、回転支持体にキトサン繊維を巻き取ることでメッシュ状のマトリックスの筒状繊維体を容易に得ることができ、押圧工程により筒状繊維体の形状を整えながら、メッシュ状のマトリックスの積層体を形成することができ、接着剤を塗布することなく容易に神経再生チューブを製造することができる。
【００５８】
また、捕集工程において、回転支持体の外周速度を３ｍ／秒以上とすることにより回転支持体の円周方向にキトサン繊維を配向させたメッシュ状のマトリックスを容易に形成することができる。配向していないキトサン繊維を形成する場合は、回転支持体の外周速度を３ｍ／秒未満とすればよい。このように、回転支持体の外周速度を調整することにより、容易に繊維の配向を調整することができる。
【００５９】
また、神経再生チューブの製造方法は、押圧工程後に得られたメッシュ状のマトリックスを前記回転支持体から取り外して巻き取ることで筒状繊維体を得る巻取り工程を具備していてもよい。これにより、機械的強度の優れた神経再生チューブを製造することができる。また、回転支持体の回転方向と異なる方向に巻き取ることで、キトサン繊維を回転支持体の円周方向とは異なる、任意の方向に配向させた神経再生チューブを製造することができる。例えば、金属軸を中心に回転支持体と垂直な方向に巻き取ることで、軸方向に配向した筒状繊維体、すなわち、神経再生チューブを得ることができると共に、神経再生チューブを多層化することもできる。勿論、斜め方向に巻き取ることで、斜め方向に配向した神経再生チューブも得ることができる。
【００６０】
なお、上述した方法により配向した配向層からなる筒状繊維体を形成した後、回転支持体に筒状繊維体を再び装着し、回転支持体の外周速度を３ｍ／秒未満として同様の操作を行うことで、繊維が配向した配向層と、繊維が無配向の無配向層との境目がない神経再生チューブを形成することもできる。
【００６１】
ここで、神経再生チューブの製造方法の一実施形態を詳細に説明する。
【００６２】
まず、キトサン類をトリフルオロ酢酸等の溶媒に溶解させて、適宜ろ過等を行うことでキトサン溶液を調製する。このとき、キトサン溶液には生体適合性に優れた他の成分を溶解させてもよい。
【００６３】
次に、キトサン溶液をエレクトロスピニング（静電紡糸）することにより繊維化する。図２及び図３に、キトサン繊維からなる神経再生チューブの成形を行うエレクトロスピニング装置の模式図を示す。当該装置は、図２に示すようにインフュージョンポンプ１、注射器２、液滴供給部３、高圧直流定電圧電源４、電極板５、回転支持体６及び回転モーター７から構成されている。
【００６４】
まず、注射器２中にキトサン溶液８を充填する。また、シリンジ針等の液滴供給部３に注射器２を接続する。さらに、注射器２をインフュージョンポンプ１にセットする。一方、液滴供給部３は、高圧直流定電圧電源４の陽極に接続する。また、電極板５を高圧直流定電圧電源４の陰極に接続する。さらに、棒状の回転支持体６を回転モーター７に接続する。
【００６５】
次いで、液滴供給部３と電極板５との間に高圧直流定電圧電源４を使用して、高電圧をかけることで電場を発生させる。その電場に対して、インフュージョンポンプ１からキトサン溶液８を押出し、液滴供給部３から液滴が形成されるように、キトサン溶液８を噴射する。このようにして形成された液滴が電荷反発と電場によって、細分化し、延伸する。同時に、液滴中のほとんどの溶媒が蒸発する。
【００６６】
この際、回転モーター７の駆動によって、回転モーター７に接続した回転支持体６を回転させることで、図３に示すように、メッシュ状のマトリックス１０が回転支持体６の表面に直接筒状繊維体が形成されることとなる。このとき、回転支持体６の外周速度を３ｍ／秒以上とすると、円周方向に配向した繊維が得られ、回転支持体６の外周速度を３ｍ／秒未満とすることで配向していない繊維を得ることができる。そして、例えば、数分に１、２回、回転支持体６を回転させたまま、押圧部材９を回転支持体６上に捕集したキトサン繊維に押し当てる。この操作を繰り返すことで、二層以上の層からなる筒状繊維体を回転支持体６上に形成することができる。
【００６７】
液滴を形成する際のインフュージョンポンプ１の送液速度は、０〜３０ｍｌ／時間、好ましくは０〜１０ｍｌ／時間、特に好ましくは０〜５ｍｌ／時間とする。また、電場を発生させるための電圧は、１〜１００ｋＶ、好ましくは１〜５０ｋＶ、特に好ましくは１０〜３０ｋＶとする。
【００６８】
また、インフュージョンポンプ１からのキトサン溶液８の噴出量、回転支持体６の種類や径の大きさ及び回転支持体６の回転速度を変えることでチューブの寸法、密度、強度等を任意に設定することができる。
【００６９】
押圧部材９の押圧は、０．２〜２．０ｋｇ／ｃｍ2程度が好ましい。
【００７０】
そして、得られたキトサン繊維に不溶化処理を行う。本発明に係る製造方法では、成形された筒状繊維体を不溶化処理することで、製造された筒状繊維体を水分が多い環境である生体内に曝露しても溶解しないものとすることができる。不溶化処理として、例えば残存する溶媒に対して脱溶媒や中和処理を行った後、水による洗浄を行う。特に、キトサン溶液の作製に使用した溶媒を完全に除去すべく、アンモニア水や水酸化ナトリウム溶液等の高濃度（例えば、１０〜５０％の濃度）のアルカリ水溶液中に、成形された筒状繊維体を１〜１００時間、好ましくは１〜５０時間、特に好ましくは１〜２０時間浸漬することで、不溶化処理を行う。
【００７１】
最後に、得られた筒状繊維体付きの回転支持体をエタノール等の溶液に浸漬する。これにより、得られた筒状繊維体がわずかに収縮し、回転支持体から容易に除去することができる。
【００７２】
本発明の製造方法によれば、積層体からなる神経再生チューブを容易に形成することができる。
【００７３】
本実施形態では、陰極として電極板５を設けたが、回転支持体６を陰極としてもよい。
【００７４】
また、回転支持体６は、金属棒でも、金属ドラムでもよい。金属棒を用いた場合は、容易に筒状繊維体を得ることができる。なお、軸方向に配向した筒状繊維体を製造する場合は、回転支持体６として金属ドラムを使用する。そして、キトサン繊維を配向させたメッシュ状のマトリックを回転支持体６から取り外して、例えば、金属軸を中心に回転支持体６の回転方向と垂直方向に手動で巻くことで軸方向に配向した筒状繊維体が得られる。勿論、無配向の筒状繊維体も同様の方法により製造してもよい。
【００７５】
本実施形態により、配向層と無配向層を形成する場合は、例えば、配向した配向層からなる筒状繊維体を金属棒上に形成した後、当該金属棒を回転支持体６とし、回転支持体６の外周速度を３ｍ／秒未満として同様の操作を再び行うことで、繊維が配向した配向層と、繊維が無配向の無配向層との境目をつくることなく神経再生チューブを形成することもできる。
【００７６】
本発明の製造方法によれば、継ぎ目をつくることなく、繊維径の小さく均一なキトサン繊維のメッシュ状のマトリックスを二層以上積層した筒状繊維体からなる神経再生チューブを製造することができる。
【００７７】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
【００７８】
（実施例１）
＜キトサン溶液の調製＞
脱アセチル化度９３％のキトサン（北海道曹達株式会社製）１．６ｇをトリフルオロ酢酸（和光純薬工業株式会社製）２０ｍｌに５０℃で１２時間かけて溶解し、塩化メチレン５ｍｌを加え、ガラスフィルター（３Ｇ型−２、フィルター径３０ｍｍ、ポアサイズ４０〜１００μｍ；日本理化学器械株式会社製）でろ過してキトサントリフルオロ酢酸液を得た。
【００７９】
＜キトサン繊維のメッシュ状のマトリックスの製造＞
得られたキトサントリフルオロ酢酸液を注射器（テルモシリンジＳＳ−３０ＥＳＺ；テルモ株式会社製）に入れて内径φ０．７ｍｍの針（シェアフィールドＳＶセット２２Ｇ；テルモ株式会社製）につなぎ、インフュージョンポンプ（１１Ｐｌｕｓ；ＨＡＲＶＡＲＤ  ＡＰＰＲＡＴＵＳ製）にセットした。針先に高電圧直流電圧電源（ＨＳＰ−３０ｋ−２；日本スタビライザー株式会社製）の陽極を接続した。そして、回転支持体としてφ１．２ｍｍのステンレス棒を針の向きに対して垂直かつ同じ高さになるように設置し、ステンレス棒の一端を回転モーターと連結し、他端を高電圧直流電圧電源の陰極に接続した。
【００８０】
ステンレス棒の回転速度０．０１ｍ／秒、２５ｋｖの電圧をかけて、１時間かけて針からステンレス棒へトリフルオロ酢酸液を噴出し、ステンレス棒と平行に設けたテフロン（登録商標）棒を１分に１回、１．０ｋｇ／ｃｍ2で押し付けることで、ステンレス棒上にキトサン繊維のメッシュ状のマトリックスを得た。
【００８１】
＜神経再生チューブの製造＞
その後、メッシュ状のマトリックスをステンレス棒ごと２８重量％のアンモニア水（和光純薬工業株式会社製）に室温で１時間浸漬させた後、蒸留水を室温で２時間連続的に供給して洗浄した。
【００８２】
得られたメッシュ状のマトリックスをステンレス棒ごとエタノールに３分間浸漬させ、その後、ステンレス棒からメッシュ状のマトリックスをはがすことで、外径φ２．０ｍｍ×内径φ１．２ｍｍの実施例１の神経再生チューブを得た。
【００８３】
（実施例２）
脱アセチル化度７８％のキトサンを用いた以外は、実施例１と同様にして実施例２の神経再生チューブを得た。
【００８４】
（実施例３）
ステンレス棒の代わりにステンレスドラム（直径１００ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を用い、その外周速度を０．５２ｍ／秒とした以外は実施例1と同様にしてキトサン繊維を得た。得られたキトサン繊維をステンレスドラムからはずし、ステンレス棒を中心にステンレスドラムの回転方向と垂直方向に手動で巻き取り、ステンレス棒上にキトサン繊維のメッシュ状のマトリックスを得た。その後、実施例１と同様の方法によりステンレス棒からキトサン繊維のメッシュ状のマトリックスをはずすことで、無配向のキトサン繊維からなる外径φ２．０ｍｍ×内径φ１．２ｍｍ、０．００６ｇ／ｃｍの実施例３の神経再生チューブを得た。
【００８５】
また、得られたメッシュ状マトリックスを厚さ７０μｍ、ダンベル状６号形（ＪＩＳ  Ｋ６２５１：加硫ゴムの引張試験方法に準拠）に打ち抜き、実施例３の試験片を作製した。なお、引張方向がステンレスドラムの回転方向に垂直な方向となるようにした試験片を試験片（１）、引張方向がステンレスドラムの回転方向と一致するようにした試験片を試験片（２）とした。
【００８６】
（実施例４）
ステンレスドラムの外周速度を５．２ｍ／秒とした以外は、実施例３と同様にしてキトサン繊維を得た。得られたキトサン繊維をステンレスドラムからはずし、ステンレス棒を中心に繊維がステンレス棒の軸方向に配向するように手動で巻き取り、ステンレス棒上にキトサン繊維のメッシュ状のマトリックスを得た。その後実施例１と同様にしてステンレス棒からキトサン繊維のメッシュ状のマトリックスをはずすことで、外径φ２．０ｍｍ×内径φ１．２ｍｍ、０．００６ｇ／ｃｍのキトサン繊維が軸方向に配向した実施例４の神経再生チューブを得た。
【００８７】
また、得られたメッシュ状マトリックスを厚さ７０μｍ、ダンベル状６号形（ＪＩＳ  Ｋ６２５１：加硫ゴムの引張試験方法に準拠）に打ち抜き、実施例４の試験片を作製した。なお、引張方向がステンレスドラムの回転方向に垂直な方向となるようにした試験片を試験片（１）、引張方向がステンレスドラムの回転方向と一致するようにした試験片を試験片（２）とした。
【００８８】
（実施例５）
キトサントリフルオロ酢酸液の量を半分とした以外は実施例４と同様にして０．００３ｇ／ｃｍのキトサン繊維を作製し、このキトサン繊維をステンレス棒の軸方向に配向するようにステンレス棒上に巻き取った。さらにこのステンレス棒を実施例１と同様にして装置にセットし、外周速度０．０１ｍ／秒、２５ｋｖの電圧をかけ、３０分かけて針からステンレス棒へ残り半分のキトサントリフルオロ酢酸液を噴出し、ステンレス棒と平行に設けたテフロン（登録商標）棒を１分に１回、１．０ｋｇ／ｃｍ2で押し付けることで、キトサン繊維のメッシュ状のマトリックスを得た。その後、実施例１と同様にしてステンレス棒からキトサン繊維のメッシュ状のマトリックスをはがすことで、外径φ２．０ｍｍ×内径φ１．２ｍｍ、０．００６ｇ／ｃｍの実施例５の神経再生チューブを得た。このマトリックスは軸方向に配向したキトサン繊維を無配向のキトサン繊維が覆うように構成されており、このときの配向繊維と無配向繊維の重量比は５０：５０であった。
【００８９】
（比較例１）
脱アセチル化度９３％のキトサン（北海道曹達株式会社製）５．５ｇを、酢酸５．５ｇ、水８９．５ｇに溶かし、室温で２時間攪拌し、ろ過した。得られた溶液にφ２．０ｍｍのＳＵＳ棒を浸漬させ、５０℃で２０分間乾燥させた。この操作を４回行い、５％の苛性ソーダに１０分間浸し、蒸留水で２時間洗浄することで、外径φ２．１ｍｍ×内径φ２．０ｍｍのフィルムからなる比較例１の神経再生チューブを得た。
【００９０】
（試験例１）：表面観察
実施例１及び２の神経再生チューブ断面のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）写真をそれぞれ図４及び図５に示す。これより、実施例１及び２の神経再生チューブはいずれも多層構造となっていることがわかった。
【００９１】
また、実施例３及び４の試験片表面のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）写真をそれぞれ図６及び図７に示す。回転支持体（ステンレス棒）の外周速度を０．５２ｍ／秒として製造した実施例３の試験片表面は、図６に示すように繊維が無配向であった。また、回転支持体（ステンレス棒）の外周速度を５．２ｍ／秒として製造した実施例４の試験片表面は、図７に示すように繊維が配向していた。
【００９２】
（試験例２）：繊維径分布
実施例１及び２の神経再生チューブの繊維径をチューブのＳＥＭ像をＩｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ４．１（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で測定し、繊維径の分布を求めた。結果を図８に示す。
【００９３】
脱アセチル化度（ＤＡｃ）９３％のキトサンを用いた実施例１の神経再生チューブは、４０％以上の繊維が繊維径φ２００ｎｍ未満であり、非常に繊維径が小さいものであった。これに対し、ＤＡｃ７８％のキトサンを用いた実施例２の神経再生チューブは、繊維径φ４００〜６００ｎｍが最も多かった。これより、同様の条件でエレクトロスピニングにより繊維を作製する場合には、ＤＡｃ９３％のキトサンを用いた方が繊維径は小さくなることがわかった。
【００９４】
（試験例３）：機械的特性
実施例１及び実施例２の神経再生チューブのヤング率、破断歪、破断応力を測定した。結果を表１に示す。
【００９５】
【表１】
2008200299.tif 000004
【００９６】
表１に示すように、ＤＡｃ９３％のキトサンを用いた実施例１の神経再生チューブは、ＤＡｃ７８％のキトサンを用いた実施例２の神経再生チューブに比べていずれの機械的特性も著しく向上することがわかった。
【００９７】
（試験例４）：生体移植
１８０〜２００ｇのオスのラットにペントバルビタールソーダで麻酔をかけ、右大腿中央部で坐骨神経１０ｍｍを切除した。その後、実施例１、２、及び比較例１の神経再生チューブを１５ｍｍにカットして、ラットの生体内にそれぞれ移植し、切除された神経をつなぐように神経再生チューブを縫合（架橋移植）した。
【００９８】
また、対照実験として、切除した部分に他のラットから坐骨神経を取り出し、１５ｍｍの架橋移植（同系移植）を行った。
【００９９】
これらの移植後、知覚神経、運動神経の機能的回復を評価するため、術後４週、８週、１２週において、それぞれＶｏｎ  Ｆｒｅｙ  Ｈａｉｒ  ｔｅｓｔ、及びｓｔａｔｉｃ  ｔｏｅ  ｓｐｒｅａｄ  ｆａｃｔｏｒ  （ＳＴＳＦ）の測定を行った。Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  Ｈａｉｒ  ｔｅｓｔでは、ナイロンファイバー（Ｔｏｕｃｈ−Ｔｅｓｔ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒ，  Ｎｏｒｔｈ  Ｃｏａｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を用いて、ラットの足の裏に刺激を与え、反応が観察されたときのナイロンファイバーの直径を記録した。下記式（１）より求めた値を図９に示す。
【０１００】
（式１）
Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  Ｈａｉｒ  ｔｅｓｔ  ：（Ｒｔφ−Ｌｔφ）／Ｌｔφ  ・・・（１）
なお、Ｒｔφは移植を行った右足が反応した際のナイロンファイバーの直径、Ｌｔφは移植を行っていない左足が反応した際のナイロンファイバーの直径を表す。
【０１０１】
また、ｓｔａｔｉｃ  ｔｏｅ  ｓｐｒｅａｄ  ｆａｃｔｏｒ  （ＳＴＳＦ）では、ラットを透明なプレートにのせて傾けたとき、デジタルカメラ（Ｅｘｉｌｉｍ−Ｚ５５，カシオ社製）で下から両足の画像を撮り、足の第１指と第５指間の距離を求めた。なお、距離はそれぞれ３連続で画像を取り、平均値を求めた。下記式（２）より求めた値を図１０に示す。
【０１０２】
（式２）
ｓｔａｔｉｃ  ｔｏｅ  ｓｐｒｅａｄ  ｆａｃｔｏｒ  （ＳＴＳＦ）  ：
（ＬｔＴＤ1-5−ＲｔＴＤ1-5）／ＬｔＴＤ1-5      ・・・（２）
なお、ＲｔＴＤ1-5は移植を行った右足の第１指と第５指間の距離、ＬｔＴＤ1-5 は移植を行っていない左足の第１指と第５指間の距離を表す。
【０１０３】
図１０に示すようにいずれの群においても運動神経の機能回復は遅れたが、図９に示すように知覚神経の機能はまず同系移植群で回復し、これにＤＡｃ９３％の実施例１の神経再生チューブの回復が続いた。
【０１０４】
また、術後１５週で電気生理学的検査を行った。むき出しの坐骨神経の付近の坐骨神経のノックに２極式電極を配置し、１−Ｈｚ  ｓｑｕａｒｅ−ｗａｖｅ  ｐｕｌｓeｓ（日本光電社製：０．２-ｍｓ duration, provided by Neuropack 8）により、筋肉活動電位を測定した。結果を図１１に示す。
【０１０５】
図１１より運動神経の機能回復が実施例１の神経再生チューブで同系移植に次いで生じていることがわかった。
【０１０６】
また、各神経再生チューブと同系移植神経を採取して組織学的観察を行った。
【０１０７】
まず、実施例１の神経再生チューブの移植５週間後の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を図１２Ａに、移植後１０週間後のＴＥＭ画像を図１２Ｂに示す。
【０１０８】
図１２Ａに示すように、５週間後では多くのマクロファージ（Ｍａｃ）浸潤が多かったが、図１２Ｂに示すように、１０週間後には、マクロファージ浸潤は減少し、神経再生チューブの内壁に沿って、神経再生していることが確認された。
【０１０９】
さらに、実施例１、２、及び比較例１の神経再生チューブの移植後１５週間後のトルイジンブルー染色標本を図１３（Ａ）及び（Ｂ）に示す。なお、図１３（Ｂ）は、拡大画像である。ＤＡｃ７８％の実施例２の神経再生チューブはつぶれてしまったのに対し、ＤＡｃ９３％の実施例１の神経再生チューブは内腔が保たれ、大きな神経組織が形成されていた。また、実施例１及び２の神経再生チューブにおいてはチューブ壁に沿って再生神経が形成されていた。これに対し、比較例１のフィルムチューブにおいては、チューブの中央部分に神経が再生しており、再生神経の足場として不適切なものであった。これは、フィルム層が再生神経の足場として不適切なため、フィブリンを足場として軸索が伸びたと考えられる。
【０１１０】
図（Ｂ）に示すように、ＤＡｃ９３％の実施例１の神経再生チューブではＤＡｃ７８％の実施例２の神経再生チューブより軸索数が多く、その専有面積も優位に大きかった。これより、特にＤＡｃ９３％のメッシュ状マトリックスからなる実施例１の神経再生チューブは、神経再生に好適なものであることがわかった。
【０１１１】
さらに、各神経再生チューブの中央断面図における有髄軸索数と占有領域を計測した。また再生血管数と直径も計測した。結果を表２に示す。
【０１１２】
【表２】
2008200299.tif 000005
【０１１３】
表２に示すように、実施例１の神経再生チューブは、他のチューブに比べ軸索数と軸索占有領域が有意に大きかった。また、大径の再生血管数が他のチューブに比べ有意に多かった。これより、実施例１の神経再生チューブは、再生神経の効果的な足場となるだけでなく、血行の再生も促進する効果があることが証明された。
【０１１４】
以上より、特に、ＤＡｃ９３％のメッシュ状マトリックスからなる神経再生チューブは、神経再生に好適なものであることがわかった。
【０１１５】
（試験例５）：引張試験
実施例３及び４の各試験片を万能材料試験機 ((株)島津製作所製)に取り付け、試験速度５ｍｍ／ｍｉｎにて引張り、破断するときの荷重を求めた。結果を表３、図１４に示す。
【０１１６】
【表３】
2008200299.tif 000006
【０１１７】
図１４に示すように、無配向繊維からなる実施例３は試験片（１）、試験片（２）とも破断時の荷重は変わらなかった。これに対し、実施例４は、試験片（２）の破断荷重が非常に高かった。すなわち、軸方向に配向させた繊維は軸方向に対する破断荷重が非常に高いことがわかった。これより、軸方向に配向繊維を用いることで、神経再生チューブは軸方向の強度が非常に高くなることがわかった。
【０１１８】
（試験例６）：扁平試験
実験例１、３、４、５の神経再生チューブの扁平荷重を万能材料試験機（(株)島津製作所）にて測定した。図１５に扁平荷重の測定方法の模式図を示す。図１５に示すように、各神経再生チューブの軸方向と直角方向に荷重をかけ、チューブの内径（φ１．２ｍｍ）の半分がつぶれた時（０．６ｍｍ）の際の荷重を求めそれを１／２扁平強さとした。結果を表４に示す。
【０１１９】
【表４】
2008200299.tif 000007
【０１２０】
表４に示すように、キトサン繊維を手動で巻き取った実施例３及び実施例４の神経再生チューブは、配向、無配向に関わらず扁平強さが高くなることがわかった。なお、いずれの実施例の神経再生チューブも十分な扁平強さを有するものであった。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】配向繊維の配向角度のヒストグラムの一例を示す図である。
【図２】キトサン繊維からなる神経再生チューブの成形を行うエレクトロスピニング装置の模式図である。
【図３】キトサン繊維からなる神経再生チューブの成形を行うエレクトロスピニング装置の模式図である。
【図４】実施例１の神経再生チューブ断面のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）写真である。
【図５】実施例２の神経再生チューブ断面のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）写真である。
【図６】実施例３の試験片表面のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）写真である。
【図７】実施例４の試験片表面のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）写真である。
【図８】試験例２の結果を示すグラフである。
【図９】Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  Ｈａｉｒ  ｔｅｓｔの結果を示すグラフである。
【図１０】ＳＴＳＦの結果を示すグラフである。
【図１１】電気生理学的検査の結果を示すグラフである。
【図１２】神経再生チューブの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。
【図１３】トルイジンブルー染色標本である。
【図１４】試験例５の結果を示すグラフである。
【図１５】試験例６の扁平荷重の測定方法を示す図である。
【符号の説明】
【０１２２】
１  インフュージョンポンプ
２  注射器
３  液滴供給部
４  高圧直流定電圧電源
５  電極板
６  回転支持体（ステンレス棒）
７  回転モーター
８  キトサン溶液
９  押圧部材
【図１】
2008200299.tif 000008
【図２】
2008200299.tif 000009
【図３】
2008200299.tif 000010
【図４】
2008200299.tif 000011
【図５】
2008200299.tif 000012
【図６】
2008200299.tif 000013
【図７】
2008200299.tif 000014
【図８】
2008200299.tif 000015
【図９】
2008200299.tif 000016
【図１０】
2008200299.tif 000017
【図１１】
2008200299.tif 000018
【図１２】
2008200299.tif 000019
【図１３】
2008200299.tif 000020
【図１４】
2008200299.tif 000021
【図１５】
2008200299.tif 000022