(57)【要約】      （修正有）【課題】メバロン酸リン酸化酵素活性を有し、その活性の至適ｐＨが酸性である新規耐熱性タンパク質の提供。【解決手段】下記（１）〜（２）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質である。（１）超好熱性古細菌アエロパイラム  ペルニクス由来の、上記酵素活性を有する特定なアミノ酸配列。（２）前記（１）のアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列であって、４５℃以上でメバロン酸リン酸化酵素活性を有し、その活性の至適ｐＨが酸性である耐熱性タンパク質となり得るアミノ酸配列。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（１）配列番号１のアミノ酸配列。
（２）配列番号１のアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列であって、４５℃以上でメバロン酸リン酸化酵素活性を有し、その活性の至適ｐＨが酸性である耐熱性タンパク質となり得るアミノ酸配列。
（３）配列番号２の塩基配列又は配列番号２の相補配列とハイブリダイズな塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列であって、４５℃以上でメバロン酸リン酸化酵素活性を有し、その活性の至適ｐＨが酸性である耐熱性タンパク質となり得るアミノ酸配列。
【請求項２】
超好熱性古細菌アエロパイラム  ペルニクス(Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ)（登録番号ＪＣＭ９８２０）由来である請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のタンパク質の製造方法であって、請求項５記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法。
【請求項７】
酸性条件下でリン酸化メバロン酸を生成する工程における請求項１又は２に記載のタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メバロン酸リン酸化酵素活性を有する新規耐熱性タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
メバロン酸リン酸化酵素（EC2.7.1.36、Mevalonate kinase）は、イソプレノイド化合物の生合成経路の一つであるメバロン酸経路に関与しリン酸化メバロンを生成するリン酸化酵素（kinase）である。リン酸化メバロン酸は、心疾患や骨粗鬆症の改善、止血、がん予防、免疫賦活等を目的とした医薬品、健康食品の合成中間体であり、および貝類付着防止塗料等の原料として利用が期待されている。このメバロン酸リン酸化酵素は、微生物および植物等のテルペノイド生合成経路において、ヒドロキシ‐３‐メチルグルタリル‐ＣｏＡ(hydroxyl-3-methylglutaryl-coenzymeA)をヒドロキシメチルグルタリル‐ＣｏＡレダクターゼで還元生成させたメバロン酸をメバロン酸５−リン酸（Mevalonic acid 5-phosphate）にリン酸化する段階を触媒し、種々のイソプレノイド誘導体生合成制御の鍵となる酵素である。このような酵素は、植物、ニチニチソウ（Catharanthus roseus）由来のものなどがすでに公知である（非特許文献１参照）。ニチニチソウではその植物体の果実、茎等の種々の組織で比較的高い活性が見出されている。また、本酵素活性はニチニチソウの細胞を培養した細胞にも見出されている。
【０００３】
さらに、従来から、メバロン酸リン酸酵素は上記した植物由来の酵素のほかに、酵母（Saccharomyces cerevisiae）、ヒト（Homo sapiens）、メタノコッカス  ヤニシ（Methanococcus jannaschii）など由来の酵素が知られている（例えば、非特許文献２、非特許文献３参照）。リン酸化メバロン酸合成をはじめイソプレノイドを効率的に産生する方法として、パラコッカス属菌種（Paracoccus sp.）を利用して遺伝工学手法によりメバロンリン酸化酵素を含むメバロン酸径路の酵素を産生する方法も報告されている（特許文献１参照）。
【０００４】
前記の植物、酵母、ヒト由来の酵素は作用温度が比較的低い酵素である。工業的には耐熱性が高いことが重要であるが、耐熱性のメバロン酸リン酸化酵素は少なくメタノコッカス  ヤニシ（Methanococcus jannaschii）由来の酵素は耐熱性が認められているが、至適ｐＨがｐＨ８．０〜８．５でアルカリ性である（非特許文献４及び５）。
【特許文献１】特表2004-527265号公報
【非特許文献１】Schulte, A.E. et al., Plant Sci. 150, 59-69 (2000); Mevalonate kinase activity in Catharanthus roseus plants and suspension cultured cells
【非特許文献２】Tchen,T.T., J. Biol. Chem. 233, 1100-1103 (1958); Mevalonic kinase purification and properties
【非特許文献３】Rios, S.E. et al., Biochim. Biophys. Acta 1531, 165-168 (2001); Characterization of mevalonate kinase V377I, a mutant implicated in defective isoprenoid biosynthesis and HIDS/periodic fever syndrome
【非特許文献４】Ke-xcu Huang, et al., Protein Expression and Purification 17, 33-40(1999); Overexpression, Purification, and Characterization of the Thermosatable Mevalonate Kinase from Methanococcus jannaschii
【非特許文献５】Xiusheng Chu, et al. , Protein Expression and Purification 30, 210-218(2003); Expression and Purification of Arg196 and Lys272 mutants of mevalonate kinase from Methanococcus jannaschii
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、メバロン酸リン酸化酵素活性を有し、その活性の至適ｐＨが酸性である新規耐熱性タンパク質の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明のタンパク質は、下記（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質である。
（１）配列番号１のアミノ酸配列。
（２）配列番号１のアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列であって、４５℃以上でメバロン酸リン酸化酵素活性を有し、その活性の至適ｐＨが酸性である耐熱性タンパク質となり得るアミノ酸配列。
（３）配列番号２の塩基配列又は配列番号２の相補配列とハイブリダイズな塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列であって、４５℃以上でメバロン酸リン酸化酵素活性を有し、その活性の至適ｐＨが酸性である耐熱性タンパク質となり得るアミノ酸配列。
【発明の効果】
【０００７】
本発明者らは、超好熱性古細菌アエロパイラム  ペルニクス(Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ)のゲノム情報（文献「Yutaka kawarabayasi et al., DNA Research 6, 83-101(1999); Complete Genome Sequence of an Aerobic Hyper-thermophilic Crenarchaeon, Aeropyrum pernix K1」参照）について鋭意研究を重ねてこの菌からメバロン酸リン酸化酵素を産生する可能性があることを突き止めた。この知見に基づき、さらに研究を重ねたところ、この菌の遺伝子から、好熱菌には従来には存在しなかったメバロン酸リン酸化酵素活性の至適ｐＨが酸性である新規耐熱性タンパク質を発現させることに成功し、本発明に到達した。
【０００８】
従来知られている超好熱菌メタノコッカス  ヤニシ（Methanococcus jannaschii）由来の耐熱性メバロン酸リン酸化酵素（上記非特許文献４及び５）は、至適ｐＨ範囲が狭く、ｐＨ５-７では活性が６０％以下となると報告されている。それに対して本発明のタンパク質であれば至適ｐＨが酸性であるため、好ましくは、メバロン酸のリン酸化工程で細菌の生育による汚染をさけて酸性側で反応させることができる。また、通常、酵素を利用する化学合成は、反応速度や細菌による腐敗予防のため高温で反応を行うことが工業的に重要であることから、超好熱菌由来の酵素は、好ましくは、工業的用途が広がることが期待される。現在では、前記メタノコッカス  ヤニシ（Methanococcus jannaschii）由来の１種類の菌由来のメバロン酸リン酸化酵素が知られているが、いまだ不十分である。本発明のタンパク質であれば、好ましくは、バイオリアクターを利用したリン酸化メバロン酸の工業的生産に適用されうる。
【０００９】
さらに、本発明のタンパク質がメバロン酸リン酸化酵素であることは既に見出されているゲノム配列の相同性検索から予測はされていた。このような遺伝子をクローニングして発現させても、タンパク質が精製できなかったり、予測通りの酵素活性を有していなかったりする例は多い。本発明のタンパク質は、従来と同様の酵素活性であることに加え、さらに、その活性の至適ｐＨが従来の酵素と正反対に属するという、当業者の予測をはるかに超える特性を備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のタンパク質は、超好熱性古細菌アエロパイラム  ペルニクス(Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ)（登録番号ＪＣＭ９８２０）由来であることが好ましい。
【００１１】
本発明は、その他の態様として、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、さらにその他の態様として、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。さらに、本発明は、さらにその他の態様として、本発明のベクターにより形質転換された形質転換体を提供する。
【００１２】
本発明は、その他の態様として、本発明のタンパク質の製造方法であって、本発明の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、本発明のタンパク質の使用であって、酸性条件下でリン酸化メバロン酸を生成する工程における使用を提供する。
【００１４】
本発明において、「メバロン酸リン酸化酵素」は、メバロン酸に作用してメバロン酸５−リン酸を生成する活性を有する酵素をいう。
【００１５】
本発明において、「超好熱性古細菌アエロパイラム  ペルニクス(Aeropyrum pernix)」とは、「子宝島の海岸の硫気孔から採取された超好熱性古細菌」として理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設に保存されている菌であって、第三者の要求により分譲可能なものをいう。前記超好熱性古細菌アエロパイラム  ペルニクス(Aeropyrum pernix)の最適生育温度は一般的に例えば９０〜９５℃であり、生育限界温度が１００℃であるから、本発明のタンパク質は、９０〜１００℃の高温であっても活性があることが知られている。
【００１６】
本発明において、「ポリヌクレオチド」とは、特に限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、遺伝子、オリゴヌクレオチド又は、従来公知のこれらの誘導体や類縁体等をいう。ポリヌクレオチドに含まれる塩基長は特に制限されず、例えば、２塩基以上であればポリヌクレオチドに含めてよい。また、特に制限しない限り、ポリヌクレオチドは、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。ポリヌクレオチドの製造方法としては、特に制限されず、例えば、従来公知の方法により化学合成により製造してもよく、酵素的にインビボ又はインビトロで製造してもよい。
【００１７】
本発明において、「タンパク質」とは、ポリペプチド及びオリゴペプチドを含む。
【００１８】
本発明において、「耐熱性」とは、本発明のタンパク質が、例えば、４５〜１００℃、好ましくは、６０〜１００℃、より好ましくは、７０〜１００℃でメバロン酸リン酸化酵素活性を備えることをいう。
【００１９】
本発明において、「至適ｐＨ」とは、メバロン酸リン酸化酵素活性が、Ｅｎｄ Ｐｏｉｎｔ法又はＣｏｕｐｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ法にて測定した場合における前記活性が最も促進されるｐＨの範囲をいう。前記Ｅｎｄ Ｐｏｉｎｔ法及びＣｏｕｐｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ法は、従来公知の方法であるが、後述の実施例を参照することも好ましい。
【００２０】
本発明において、「酸性」とは、例えば、ｐＨ１以上ｐＨ７未満であって、好ましくはｐＨ５以上ｐＨ７未満であって、より好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ６．５である。
【００２１】
本発明において、アミノ酸配列及び／又は塩基配列において付加、欠失又は置換されるものの数としては、例えば、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個であって、好ましくは１〜５個であって、より好ましくは、１〜３個である。
【００２２】
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の製造方法により製造可能であるが、これに限定されず、他の製造方法で製造されてもよい。例えば、配列番号１に示すように、そのアミノ酸配列が決定されているタンパク質については、その配列を元に当業者に公知の手法、例えば、個々のアミノ酸を化学的に重合してタンパク質を合成する方法に従って調製することができる。
【００２３】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の一例としては、配列番号２に示す遺伝子がある。前記遺伝子は、例えば、後記する実施例２に示すように超好熱性古細菌アエロパイラム  ペルニクス(Aeropyrum pernix)Ｋ１株（JCM９８２０）のゲノムから、例えば配列番号２で示される塩基配列の一部をプライマーとして用いるＰＣＲ法あるいは該ＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により調製することができる。また、その塩基配列をもとに、当業者に公知である核酸化学合成法等に従って前記遺伝子を得ることもできるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを適当なベクターに挿入することによって得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に制限されるものではなく、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ＡｃＭＮＰＶなどのバキュロウイルスなどが挙げられる。プラスミドＤＮＡは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法又はその変法などにより調製することができる。また、市販プラスミドとして、例えばｐＥＴ-１１ａ（Novagen社製）あるいはバチルス属の宿主を用いて分泌型のプラスミドなどを用いてもよい。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが含まれていてもよい。ベクターへの遺伝子等の挿入は、例えば、精製された遺伝子の塩基配列を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを用いることができるが、これらに限定されない。また、本発明の遺伝子の機能が発揮されるように、本発明の発現ベクターには本発明の遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合配列などを組み込んでいてもよい。さらに、本発明の遺伝子も他のタンパク質のコードする配列を融合したものを挿入してもよい。
【００２５】
前記発現ベクターで宿主生物を形質転換すれば、本発明の形質転換体が得られる。宿主生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、大腸菌などの原核生物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。形質転換法としては、既に公知である塩化カルシウム法などを使用することができるが、これらの方法に限定されない。
【００２６】
本発明のタンパク質の製造方法は、前記形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。前記培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の微生物を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行えるものであれば、天然培地、合成培地などのいずれを用いてもよい。本発明のタンパク質の回収は、特に制限されない。前記タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによって前記タンパク質を回収する。また、本発明の前記タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離などにより菌体又は細胞を除去した後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。なお、培養液をそのまま使用する場合、熱処理をすることにより、本発明のタンパク質以外のタンパク質が失活するので、実質上、本発明のタンパク質のみの酵素液として使用できる。
【００２７】
本発明の使用は、本発明のタンパク質の使用であって、本発明のタンパク質の至適ｐＨである酸性化でメバロン酸からメバロン酸５−リン酸を生成する工程、及び、前記工程を含むあらゆる組成物製造方法における本発明の使用である。
【００２８】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されない。
【実施例１】
【００２９】
染色体ＤＮＡの調製
アエロパイラム  ペルニクス(Aeropyrum pernix)種Ｋ１（JCM9820）をＬ培地で３７℃にて一晩培養し、集菌したものに、ＳＳＣ溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）溶液を１０ｍＬ，０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液を０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬニワトリ卵白リゾチームを０．１ｍＬおよび１０％非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ−５８溶液を０．５ｍL加え、０℃で３０分間放置した後、プロテイナーゼＫ（Merck社製）５ｍｇを０．２ｍLの１０％ＳＤＳ溶液に溶かした溶液を加え、３７℃で２、３日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて３７℃で１時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてＤＮＡを沈殿濃縮した。このＤＮＡの沈殿をＴＥ溶液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ８．０))１０ｍＬに溶解し、リボヌクレアーゼ０．２５ｍＬ(最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ)を加えて、３７℃で一晩放置した後、エタノールで沈殿させた。次いで、ＤＮＡをＴＥ溶液５ｍＬに溶解した後、２６０ｎｍの吸光度より、ＤＮＡ濃度を決定した（Clarke,L.& Carbon,J.(1979) Methods Enzymol.68,396-408）。
【００３０】
発現ベクターの構築と遺伝子発現
１．発現ベクターの構築
目的とするメバロン酸リン酸化酵素をコードする遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩサイトを含むＤＮＡを構築する目的で下記のＤＮＡプライマーを合成し、このプライマーを用いてＰＣＲを行い、目的の酵素遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素サイトを導入した。用いたＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡社製）であった。
フォワードプライマー：5'- ATATCATATGCGTCGTGCTGCTCGTGCGTCTGCCCCGGGG -3'（配列番号３）
リバースプライマー：5'- ATATGGATCCGCGGCCGCTTATTAGAACTCCTCGAGTCTAGC -3'（配列番号４）
ＰＣＲ反応後、Ｅｘ  Ｔａｑ（宝バイオ社製）を用いて増幅断片の３'末端側にデオキシアデノシンを付加した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＴ４リガーゼで１５℃、３０分間反応させ、連結した。連結したＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ培地（１８ｍＬ）で２４時間培養し、その培養液から発現ベクターを改変アルカリＳＤＳ法で精製した。精製ベクターの挿入ＤＮＡ断片が存在することを、アガロース電気泳動で確認した。精製ベクターの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍs社製）とＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とを用いて決定し、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列がメバロン酸リン酸化酵素遺伝子の正しい配列であることを確認した。正しい配列を有するベクターの一部を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで完全分解（37℃で２時間）した後、アガロース電気泳動により本酵素をコードする遺伝子を精製した。ｐＥＴ−１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩとで切断・精製した後、Ｔ４リガーゼで反応させ、上記の構造遺伝子とを連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量撒き、３７℃で一晩培養し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地（１８ｍＬ）で２４時間培養し、その培養液から発現ベクターを改変アルカリＳＤＳ法で精製した。
【００３１】
２．ＤＮＡ組換え遺伝子の発現
大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ-ｇａｍｉ(ＤＥ３)(Novagen社製)のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに０．１ｍＬ移す。その中に上記１．の精製発現プラスミドの溶液０．００２ｍＬを加え氷中に２０分間放置した後、４２℃でヒートショックを９０秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地(５ｍＬ)で18時間培養し、メバロン酸リン酸化をコードする遺伝子を発現させた。培養後、遠心分離（９，１００ｇ、１０分）で集菌した。
【００３２】
集菌した菌体に，菌体破砕液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０)を０．２ｍＬ加え，超音波発生器で細胞を破砕し，その懸濁液を０．１ｍＬずつ２本のサンプルチューブに分けた。一方のサンプルチューブは遠心分離(９，１００Ｇ、１０分)して上清と沈殿に分け，沈殿は破砕液  ０．１ｍＬで懸濁した。もう一方のサンプルチューブは，熱処理（８０℃，１０分）を施した後，遠心分離（９１，００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け，沈殿は前記菌体破砕液０．１ｍＬで懸濁した。これらの試料の一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析し，発現を確認できた。
【００３３】
ＤＮＡ組換え大腸菌の大量培養
前記発現ベクターを同様に精製し、この発現ベクターを用いて大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ−gａｍｉ（ＤＥ３）を形質転換した。プレート上に生えてきたコロニーを３白金耳量とり、５ｍＬのＬＢＬ培地（１％ペプトン、０．５％酵母抽出液、０．５％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）に植菌して約６時間３７℃で前培養した。この前培養液の全量を、３Ｌの４×ＬＢＬ培地（４％ペプトン、２％酵母抽出液、 ２％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン）に加え、高密度培養槽（ＡＢＬＥ社製）にて所定の条件（３７℃、ｐＨ７．２、圧力０．０２ＭＰａ）にコンピュータプログラム制御して培養した。ｐＨは、オートクレーブ済みの２Ｍ  ＨＣｌ（和光純薬社製）および２Ｍ  ＮａＯＨ（和光純薬社製）で調整した。集菌約１８時間前（培養開始後約２４時間後）にオートクレーブ済みの発現誘導液（１０％ラクトース、２０％グリセロール）を３００ｍＬ加えた。大腸菌の生育度が定常期に入ったところ（培養開始４２時間後）で大型遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製、商品名ＡｖａｎｔｉＨＰ−３０Ｉ）を用いて集菌した。回収した菌体のうち少量を分取し、残りの菌体は−３０℃で保存した。前記分取した菌体を、破砕液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノール（和光純薬社製））に懸濁し、超音波破砕装置（ＴＯＭＹ社製、商品名ＵＤ−２０１）で破砕した。この溶液を２等分し、一方を９，１００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離して上清と沈殿に分けた。他方は、７５℃に設定した恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製、商品名ＤＴＵ−１Ｃ）で１０分間加熱した後、９，１００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離して上清と沈殿に分けた。得られた沈殿は、前記破砕液に再懸濁した。これら４種の上清および沈殿懸濁液に変性剤（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、２．４％β−メルカプトエタノール、０．００５％ブロムフェノールブルー（和光純薬社製））を加え、９５℃で５分間加熱して変性させた。各変性タンパク質液を１２．５％ポリアクリルアミドゲルに加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行った。染色液（和光純薬社製、商品名Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ）を用い、電気泳動後のゲルを染色・脱色した結果、目的タンパク質（メバロン酸リン酸化酵素）の発現が確認できた。
【００３４】
ＤＮＡ組換えタンパク質の精製
−３０℃で保存した前記菌体を破砕液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノール（和光純薬社製））に懸濁し、超音波破砕装置（ＴＯＭＹ社製、商品名ＵＤ−２０１）で破砕した。この菌体破砕液を８０℃に設定した恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製、商品名ＤＴＵ−１Ｃ）で１０分間加熱した後、すばやく冷却した。ついで、大型遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製、商品名Ａｖａｎｔｉ  ＨＰ−３０Ｉ）を用いて、１００，０００Ｇで１時間遠心分離し、上清を回収した。
【００３５】
この上清をタンパク質精製装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、商品名ＡＫＴＡTM  ｅｘｐｌｏｒｅｒ）を用いて、１．５０Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む緩衝溶液に置換した後、疎水カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、商品名ＲＥＳＯＵＲＣＥTMＩｓｏ  ６ｍＬ）に通した。１．５０Ｍ→０Ｍの硫酸アンモニウム濃度勾配で溶出させ、各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
【００３６】
回収した前記画分を５０ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ９．０）及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む緩衝溶液に置換した後、陰イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、商品名ＲＥＳＯＵＲＣＥTMＱ  ６ｍＬ）に通した。０〜２Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝溶液で溶出を行い、０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度で溶出した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
【００３７】
回収した前記画分を、遠心濃縮チューブ（ザルトリウス社製、商品名ＶＩＶＡＳＰＩＮTM  １００００）を用いて遠心分離して濃縮し、タンパク質精製装置（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いて、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶液で平衡化したゲルろ過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、商品名ＨｉＬｏａｄTM  １６／６０、ＳｕｐｅｒｄｅｘTM  ７５）に通した。溶出した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
【００３８】
回収した前記画分を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む溶液に置換した後、遠心濃縮チューブ（ザルトリウス社製、商品名ＶＩＶＡＳＰＩＮTM  １００００）を用いて遠心分離して濃縮し、これを以下の測定にサンプルとして使用した。
【００３９】
精製メバロン酸リン酸化酵素サンプルについてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果の一例を図１に示す。この発現タンパク質は、アミノ配列から推定されるアミノ酸残基数は３２４アミノ酸残基より構成されており、標準タンパク質の移動度から、その推定分子量は３４．０４ｋＤであった。この電気泳動の結果により、発現タンパク質が目的たんぱく質であるメバロン酸リン酸化酵素であることを確認できた。さらに本サンプルを上記と同様にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲルを染色した。染色により可視化された目的の組み換えタンパク質のバンドを切り出し、脱色後、タンパク分解酵素トリプシン（Promega社製、20μg／ｍL）で３７℃、終夜消化を行い、消化物を抽出液（５％トリフルオロ酢酸：アセトニトリル（ｖ／ｖ）＝１：１）で抽出した。本抽出物をｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）を用いて質量分析を行った。その結果図５に示すスペクトルが得られ、ＭＡＳＣＯＴ（ＭＡＴＲＩＸ  ＳＣＩＥＮＣＥ社製）、本精製タンパク質サンプルは塩基配列から推定されるタンパク質であると確認された。
【００４０】
精製タンパク質の活性測定
メバロン酸リン酸化酵素（Mevalonate kinase）はＡＴＰのγ位のリン酸基をメバロン酸のC-5-ヒドロキシ酸素に転移し５−リン酸化メバロン酸を生成する反応を触媒する。本酵素の活性測定を以下のように行った。まず基質のメバロン酸を合成するため、６５ｍｇのＭｅｖａｌｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ(SIGMA)を３.０ｍｌの０，２Ｎ ＫＯＨに溶解した。この溶液を３７度で１時間インキュベーションした後、０．１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ７.２に中和した。得られた溶液をＭｉｌｌｉＱ水で５.０ ｍｌにｆｉｌｌ ｕｐし、０.１ Ｍ (Ｒ,Ｓ)-Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅとして実験に供した。
【００４１】
活性測定を行うためのメバロン酸リン酸化反応は基本的には次の条件で実施した。全量を１.０ ｍｌとして３.０ ｍＭ (Ｒ,Ｓ)-Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ, ４.０ｍＭ ＡＴＰ (オリエンタル酵母)、２ｍＭ ＭｇＣｌ2の存在下で種々のｐＨ、反応温度で反応液量は１．０ ｍＬで行った。活性は以下の２種類の方法を用いて測定した。
【００４２】
１）Ｅｎｄ Ｐｏｉｎｔ法
まず、次の方法でＡＤＰの検量線を作製した。全量を１．０ ｍｌとして０−０．２ ｍＭ ＡＤＰ (オリエンタル酵母), ０．２５ｍＭ ＮＡＤＨ (オリエンタル酵母), ０．５ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ Ｔｒｉｓ Ｓａｌｔ (和光純薬)， ５．０ｍＭ ＭｇＣｌ2(和光純薬), １０ｍＭ ＫＣｌ(和光純薬), １０Ｕ/ｍｌ Ｄ-Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ (from Rabbit muscle, 東洋紡), １０Ｕ/ｍｌ Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ (from Rabbit muscle, 東洋紡), ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ (ｐＨ７．５) (ナカライテスク)の組成にて室温で５分間インキュベーションし、反応溶液の波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定することで検量線を作製した。吸光度の測定にはＵ-３０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ (HITACHI)を用いた。本反応系にて０から０．２ｍＭの範囲でＡＤＰの定量が可能であった。Ｅｎｄ Ｐｏｉｎｔ法は最初にメバロン酸リン酸化酵素（Mevalonate kinase）反応を行い、次にＰｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ反応とＤ-Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ反応を行うことでＡＤＰ濃度を定量する。その方法は以下に示した通りである。
【００４３】
１回目の反応は、全量１．０ｍｌとして３．０ｍＭ (Ｒ，Ｓ)-Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ， ４．０ｍＭ ＡＴＰ (オリエンタル酵母), ５．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 (和光純薬)， １００ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ (ｐＨ７．０) (ナカライテスク),０．１６μｇ/ｍｌ 精製メバロン酸リン酸化酵素の組成にて行った。反応は前記メバロン酸リン酸化酵素を加えることで開始し、反応後直ちに氷中にて急冷することで反応を止め、２回目の反応に供した。
【００４４】
２回目の反応は、全量を１．０ｍｌとして８００μｌの1回目の反応後の溶液, ０．２５ｍＭ ＮＡＤＨ (オリエンタル酵母)， ０．５ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ Ｔｒｉｓ Ｓａｌｔ (和光純薬), ５．０ｍＭ ＭｇＣｌ2(和光純薬), １０ ｍＭ ＫＣｌ (和光純薬), １０Ｕ/ｍｌ Ｄ-Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ (from Rabbit muscle, 東洋紡), １０Ｕ/ｍｌ Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ (from Rabbit muscle, 東洋紡), ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ (ｐＨ７．５) (ナカライテスク)の組成にて室温で５分間インキュベーションした。なお、インキュベーターは、ＴＡＩＴＥＣ Ｄｒｙ Ｔｈｅｒｍｏ Ｕｎｉｔ ＤＴＵ-Ｎを用い、吸光度の測定にはＵ-３０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ (HITACHI)を用いた。このＥｎｄ Ｐｏｉｎｔ法は酵素活性測定反応を２段に分けることにより、追随酵素のＤ-Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅの１回目の反応における高温等による失活を回避することができ、メバロン酸リン酸化酵素の真の性質を測定できる長所がある。
【００４５】
２)Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ法
測定は、全量を１．０ｍｌとして３．０ｍＭ (Ｒ，Ｓ)-Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ， ４．０ｍＭ ＡＴＰ (オリエンタル酵母), ０．５ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｕｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ Ｔｒｉｓ Ｓａｌｔ (和光純薬)， ０．１６ｍＭ ＮＡＤＨ (オリエンタル酵母), ５．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 (和光純薬)， ２５Ｕ/ｍｌ Ｄ-Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ (from B. stearothermophilus, SIGMA), ２５Ｕ/ｍｌ Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ (from B. stearothermophilus, SIGMA), １００ ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ (ｐＨ７．５) (ナカライテスク)の組成にて行った。反応は精製メバロン酸リン酸化酵素を加えることで開始した。測定はＵ-３０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ (HITACHI)を用いて波長３４０ｎｍの吸光度の変化をモニターすることで行った。なお、反応中はＪｕｌａｂｏ ＵＣ (JULABO LABORTECHNIK GMBH)とＪｕｌａｂｏ Ｆ１０ (JULABO LABORTECHNIK GMBH)を用いて温度調整をした。活性の算出にはＮＡＤＨのモル吸光係数としてεNADH=６２２０を用いた。
【００４６】
至適温度の決定
Ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ法に従って活性測定を行った。第１回目の反応のメバロン酸リン酸化酵素反応は全量１．０ｍｌとして３．０ｍＭ (Ｒ，Ｓ)-Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ， ４．０ ｍＭ ＡＴＰ (オリエンタル酵母)， ５．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 (和光純薬), １００ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ (ｐＨ７．０) (ナカライテスク), ０．１６μｇ/ｍｌ 精製メバロン酸リン酸化酵素の組成にて行った。反応は前記メバロン酸リン酸化酵素を加えることで開始し、反応後直ちに氷中にて急冷することで反応を止め、２回目の反応（生成ＡＤＰ測定のための反応）に供した。ただし、１回目の反応を４５，５５，６５，７５，８５，９５℃で３分間インキュベーションした。酵素を加えない反応溶液をＣｏｎｔｒｏｌとした。その結果の一例を図２に示す。同図に示すように前記メバロン酸リン酸化酵素９５℃以上で最大のメバロン酸リン酸化酵素（Mevalonate kinase）活性を示した。
【００４７】
反応のｐＨ依存性
前記至適温度の決定の場合と同様に、Ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ法に従って活性測定を行った。ただし、１回目の反応の緩衝液濃度を３０ｍＭとし、２回目の反応を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ (ｐＨ ７．５)で行った。また、１回目の反応は８５度で３分間行った。前記メバロン酸リン酸化酵素を加えない反応溶液をＣｏｎｔｒｏｌとした。以下の緩衝液をそれぞれ対応するｐＨ下で使用した；ＭＥＳ: ｐＨ ４．５−５．５， Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ: ｐＨ ５．５−７．０， Ｔｒｉｃｉｎｅ: ｐＨ ７．０−７．５， Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ: ｐＨ ７．５−９．０， ＮａＯＨ／ＮａＨＣＯ3: ｐＨ ９．０−１０．０。
【００４８】
その結果の一例を図３に示す。同図のように前記メバロン酸リン酸化酵素は酸性側で高い酵素活性を示し、ｐＨ ６．０で最大の活性を示した。
【００４９】
熱安定性
前記精製メバロン酸リン酸化酵素のサンプルを所定の温度（７０、８５及び ９５℃）でインキュベーションし、その残存活性を経時的に測定した。なお、タンパク質のインキュベーション溶液の緩衝液は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ７．０)緩衝液を使用し、タンパク濃度は１．０ｍｇ／ｍｌで行った。残存活性の測定はＥｎｄ ｐｏｉｎｔ法及びＣｏｕｐｌｉｎｇ ａｓｓａｙ法に従った。それぞれ結果の一例を図４（Ａ）及び（Ｂ）に示す。同図に示すように、どちらの場合でも９５℃では速やかに失活するが７０℃では３日間でも失活が見られず優れた安定性を示した。
【００５０】
Ｋｉｎｅｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒ（Ｋｍ値及びＶｍａｘ値）の測定
メバロン酸およびＡＴＰについてＫｍおよびＶmaxを求めた。その結果の一例を下記表１に示す。活性測定はＥｎｄ ｐｏｉｎｔ法に従って行った。基質濃度は下記表１のとおりとした。ただし、１回目の反応を９５℃、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ ６．０)で行い、２回目の反応を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ ７．５)で行った。メバロン酸リン酸化酵素を加えない反応溶液をＣｏｎｔｒｏｌとした。下記表１に示すように、ＡＴＰ: Ｋｍ＝１．４ｍＭ， Ｖｍａｘ＝４００(μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ)、 Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ: Ｋｍ＝１．４ｍＭ， Ｖｍａｘ＝４００(μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ)であった。
【００５１】
【表１】
2008092814.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明により、メバロン酸リン酸化酵素活性を有する新規耐熱性タンパク質が提供できる。本発明のタンパク質は、酸性条件下や高温下で使用することが可能であり、工業的用途が広がると共に、基質濃度の増加、反応効率の向上、混入微生物の除去、保存期間および耐用期間の延長などの多くの利点がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、本発明の一実施例における組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。
【図２】図２は、本発明の一実施例における所定の温度条件下でのタンパク質の酵素活性を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の一実施例における所定のｐＨでのタンパク質の酵素活性を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の一実施例における所定の温度条件下でのタンパク質の熱安定性を示すグラフである。図４（Ａ）はＥｎｄ ｐｏｉｎｔ法の、及び、図４（Ｂ）はＣｏｕｐｌｉｎｇ ａｓｓａｙ法の結果の一例を示す。
【図５】図５は、本発明の一実施例における精製組換えタンパク質のトリプシン消化物の質量分析のスペクトルである。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
配列番号３：順方向プライマー
配列番号４：逆方向プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
2008092814.tif 000006
【図４】
2008092814.tif 000007
【図５】
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【配列表】
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