(57)【要約】【課題】試料における集光位置の深さが変動することによる散乱の変化に関わらず、簡易に鮮明な蛍光画像を取得する。【解決手段】レーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源から出射されたレーザ光を試料Ａ上において走査させる走査部と、走査されるレーザ光の試料Ａ内における集光位置の深さを調節する集光深さ調節部と、試料Ａ内におけるレーザ光の集光位置から発せられる蛍光を検出する蛍光検出部と、集光深さ調節部によるレーザ光の試料Ａ内における集光位置の所定の基準深さの絶対高さＺ１０を記憶する基準深さ情報記憶部と、レーザ光の各集光位置における、基準深さの絶対高さＺ１０に対する相対高さｄ１〜ｄ５とレーザ光源、走査部または蛍光検出部の少なくとも１つの設定値ＨＷ１〜ＨＷ５とを対応づけて記憶するハードウェア設定記憶部とを備える走査型光学装置を提供する。【選択図】      図１
2008261769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源から出射されたレーザ光を試料上において走査させる走査部と、
該走査部により走査されるレーザ光の試料内における集光位置の深さを調節する集光深さ調節部と、
前記試料内におけるレーザ光の集光位置から発せられる蛍光を検出する蛍光検出部と、
前記集光深さ調節部により調節される集光位置の所定の基準深さにおける絶対高さを記憶する基準深さ情報記憶部と、
レーザ光の各集光位置における、前記基準深さの絶対高さに対する相対高さと前記レーザ光源、前記走査部または前記蛍光検出部の少なくとも１つの設定値とを対応づけて記憶するハードウェア設定記憶部とを備える走査型光学装置。
【請求項２】
レーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源から出射されたレーザ光を試料上において走査させる走査部と、
該走査部により走査されるレーザ光の試料内における集光位置の深さを調節する集光深さ調節部と、
前記試料内におけるレーザ光の集光位置から発せられる蛍光を検出する蛍光検出部と、
前記集光深さ調節部により調節される集光位置の所定の基準深さにおける絶対高さを記憶する基準深さ情報記憶部と、
レーザ光の各集光位置における、絶対高さと前記レーザ光源、前記走査部または前記蛍光検出部の少なくとも１つの設定値を含むハードウェア設定値とを対応づけて記憶するハードウェア設定記憶部と、
前記基準深さの絶対高さが変更された場合に、変更前後の基準深さの絶対高さの差分を算出し、当該差分を前記ハードウェア設定記憶部に記憶されている絶対高さに加算する高さ情報換算手段とを備える走査型光学装置。
【請求項３】
前記レーザ光源が、超短パルスレーザ光を出射する多光子励起用レーザ光源である請求項１または請求項２に記載の走査型光学装置。
【請求項４】
前記ハードウェア設定値が、前記レーザ光の各集光位置において所定の明るさの蛍光画像を得るための設定値である請求項１または請求項２に記載の走査型光学装置。
【請求項５】
レーザ光の試料内における集光位置の所定の基準深さを検出する基準深さ検出部を備え、
前記基準深さ情報記憶部が、前記基準深さ検出部により検出された基準深さの絶対高さを記憶する請求項１または請求項２に記載の走査型光学装置。
【請求項６】
前記基準深さ情報記憶部が、前記基準深さにおける絶対高さとハードウェア設定値とを対応づけて記憶し、
前記基準深さにおける設定値が変化したときに、該設定値の変化量に基づいて、前記ハードウェア設定記憶部に記憶されている各集光位置におけるハードウェア設定値を補正する設定値補正部を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の走査型光学装置。
【請求項７】
試料に集光させたレーザ光を、その集光位置を深さ方向に変化させつつ、深さ方向に交差する方向に走査させて、各深さ位置における２次元的な蛍光画像を取得する観察方法であって、
レーザ光の試料内における集光位置の所定の基準深さにおける絶対高さを記憶し、
レーザ光の各集光位置における、前記基準深さの絶対高さに対する相対高さと、当該集光位置におけるレーザ光の強度、走査速度および蛍光検出感度を含むハードウェア設定値とを対応づけて記憶し、
前記基準深さの絶対高さが変更された場合に、記憶されている相対高さを変更後の基準深さの絶対高さに対して適用し、該相対高さに対応して記憶されているハードウェア設定値を用いて蛍光画像を取得する観察方法。
【請求項８】
試料に集光させたレーザ光を、その集光位置を深さ方向に変化させつつ、深さ方向に交差する方向に走査させて、各深さ位置における２次元的な蛍光画像を取得する観察方法であって、
レーザ光の試料内における集光位置の所定の基準深さにおける絶対高さを記憶し、
レーザ光の各集光位置における絶対高さと、当該集光位置におけるレーザ光の強度、走査速度および蛍光検出感度を含むハードウェア設定値とを対応づけて記憶し、
前記基準深さの絶対高さが変更された場合に、変更前後の基準深さの絶対高さの差分を算出し、当該差分を記憶されている絶対高さに加算して新たな集光位置の絶対高さとする補正を行い、
補正された集光位置の絶対高さと、対応するハードウェア設定値とを用いて蛍光画像を取得する観察方法。
【請求項９】
試料に集光させたレーザ光を、その集光位置を深さ方向に変化させつつ、深さ方向に交差する方向に走査させて、各深さ位置における２次元的な蛍光画像を取得する観察方法であって、
レーザ光の試料内における集光位置の所定の基準深さの絶対高さと、当該基準深さにおけるレーザ光の強度、走査速度および蛍光検出感度を含むハードウェア設定値とを対応づけて記憶し、
レーザ光の各集光位置における高さと、当該集光位置におけるハードウェア設定値とを対応づけて記憶し、
前記基準深さにおける各種設定値が変化したときに、その変化量に応じて、記憶されている前記各集光位置におけるハードウェア設定値を補正し、
補正されたハードウェア設定値を用いて蛍光画像を取得する観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型光学装置および観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、多光子励起現象を利用して試料の深さ方向に高い分解能を有する明るい蛍光画像を取得する走査型光学装置が知られているが、試料の内部から発生する蛍光は試料によって散乱されるため、試料の深い位置で発生した蛍光に基づく蛍光画像は、試料の浅い位置で発生した蛍光に基づく蛍光画像よりも暗くなるという問題がある。
この問題を解決するために、例えば、特許文献１に開示された発明は、取得された画像データに対し画像処理を施すことにより、画面上における見かけの明るさの変動を補正することとしている。
【０００３】
【特許文献１】特開２０００−２７５５４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、取得された画像データに画像処理を施して補正する場合には、画像データ自体に含まれている輝度情報量が少なく、補正して得られた蛍光画像が不鮮明になるという不都合がある。例えば、試料の浅い位置から発生した蛍光に基づく蛍光画像が鮮明なものとなるように光源、光走査部あるいは光検出器を調節して、試料の深い位置から発生した蛍光を検出することにより取得された蛍光画像は、全体的に暗く輝度情報が少ないので、画像処理により明るさを補正しても鮮明な画像を構築することはできない。
【０００５】
逆に、試料の深い位置から発生した蛍光に基づく蛍光画像が鮮明なものとなるように光源、光走査部あるいは光検出器を調節して、試料の浅い位置から発生した蛍光を検出することにより取得された蛍光画像は、輝度が飽和してしまい、同様に画像処理により明るさを補正しても鮮明な画像を構築することはできない。
すなわち、試料の深さにかかわらず鮮明な蛍光画像を取得するためには、画像処理を施すことなく同等の明るさの蛍光画像を取得することが必要である。
【０００６】
また、試料の表面に起伏が存在する場合に、観察位置を水平方向に移動させると、装置側の励起光の集光位置の絶対高さが変動しなくても、試料における集光位置の深さが変動してしまい、散乱の大きさが変動するという不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、試料における集光位置の深さが変動することによる散乱の変化に関わらず、簡易に鮮明な蛍光画像を取得することができる走査型光学装置および観察方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源から出射されたレーザ光を試料上において走査させる走査部と、該走査部により走査されるレーザ光の試料内における集光位置の深さを調節する集光深さ調節部と、前記試料内におけるレーザ光の集光位置から発せられる蛍光を検出する蛍光検出部と、前記集光深さ調節部により調節される集光位置の所定の基準深さにおける絶対高さを記憶する基準深さ情報記憶部と、レーザ光の各集光位置における、前記基準深さの絶対高さに対する相対高さと前記レーザ光源、前記走査部または前記蛍光検出部の少なくとも１つの設定値を含むハードウェア設定値とを対応づけて記憶するハードウェア設定記憶部とを備える走査型光学装置を提供する。
【０００８】
本発明によれば、レーザ光源から出射されたレーザ光が走査部の作動により試料上において走査され、集光深さ調節部の作動により調節された試料内の深さ位置に集光されることにより試料内において蛍光が発せられる。試料内において発生した蛍光は、蛍光検出部により検出される。走査部による走査位置と蛍光検出部により検出された蛍光の強度情報とに基づいて蛍光画像を取得することができる。
【０００９】
この場合に、同一の走査位置においてレーザ光の集光位置の深さを変化させつつ、蛍光画像の取得を行う場合には、基準深さ情報記憶部に記憶されたレーザ光の所定の基準深さの絶対高さと、ハードウェア設定記憶部に記憶された各集光位置における前記基準深さの絶対高さに対する相対高さとに基づいて集光深さ調節部を作動させるとともに、ハードウェア設定記憶部に前記相対高さに対応づけて記憶されているハードウェア設定値に、各集光位置毎にレーザ光源、前記走査部または前記蛍光検出部のようなハードウェアを設定することができる。
【００１０】
その結果、試料の厚さに基づく散乱等の影響を考慮したハードウェアの設定を集光位置毎に実現して、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。所定の基準深さは、例えば、試料の表面位置である。また、ハードウェア設定記憶部に記憶される相対高さが連続的ではない場合には、記憶された複数の相対高さおよびハードウェア設定値を補間して、任意の高さ位置における適正なハードウェア設定値を容易に得ることができる。
【００１１】
また、レーザ光の走査位置を変更した場合には、試料の表面の起伏によって、記憶されている所定の基準深さの絶対高さが変化する。すなわち、走査位置の変更の前後において、同じ絶対高さに集光位置を配置しても、試料の厚さが変化してしまうので、同じハードウェア設定値を用いたのでは、適正な観察を行うことができなくなる。本発明によれば、ハードウェア設定記憶部に、各集光位置の高さを基準深さの絶対高さからの相対高さによって記憶しているので、基準深さの絶対高さを変更するだけで、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。
【００１２】
また、本発明は、レーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源から出射されたレーザ光を試料上において走査させる走査部と、該走査部により走査されるレーザ光の試料内における集光位置の深さを調節する集光深さ調節部と、前記試料内におけるレーザ光の集光位置から発せられる蛍光を検出する蛍光検出部と、前記集光深さ調節部により調節される集光位置の所定の基準深さにおける絶対高さを記憶する基準深さ情報記憶部と、レーザ光の各集光位置における、絶対高さと前記レーザ光源、前記走査部または前記蛍光検出部の少なくとも１つの設定値を含むハードウェア設定値とを対応づけて記憶するハードウェア設定記憶部と、前記基準深さの絶対高さが変更された場合に、変更前後の基準深さの絶対高さの差分を算出し、当該差分を前記ハードウェア設定記憶部に記憶されている絶対高さに加算する高さ情報換算手段とを備える走査型光学装置を提供する。
【００１３】
本発明によれば、レーザ光源から出射されたレーザ光が走査部の作動により試料上において走査され、集光深さ調節部の作動により調節された試料内の深さ位置に集光されることにより試料内において蛍光が発せられる。試料内において発生した蛍光は、蛍光検出部により検出される。走査部による走査位置と蛍光検出部により検出された蛍光の強度情報とに基づいて蛍光画像を取得することができる。
【００１４】
この場合に、同一の走査位置においてレーザ光の集光位置の深さを変化させつつ、蛍光画像の取得を行う場合には、ハードウェア設定記憶部に記憶された各集光位置における絶対高さに基づいて集光深さ調節部を作動させるとともに、ハードウェア設定記憶部に前記相対高さに対応づけて記憶されているハードウェア設定値に、各集光位置毎にレーザ光源、前記走査部または前記蛍光検出部のようなハードウェアを設定することができる。
【００１５】
その結果、試料の厚さに基づく散乱等の影響を考慮したハードウェアの設定を集光位置毎に実現して、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。所定の基準深さは、例えば、試料の表面位置である。また、ハードウェア設定記憶部に記憶される絶対高さが連続的ではない場合には、記憶された複数の絶対高さおよびハードウェア設定値を補間して、任意の高さ位置における適正なハードウェア設定値を容易に得ることができる。
【００１６】
また、レーザ光の走査位置を変更した場合には、試料の表面の起伏によって、記憶されている所定の基準深さの絶対高さが変化する。すなわち、走査位置の変更の前後において、同じ絶対高さに集光位置を配置しても、試料の厚さが変化してしまうので、同じハードウェア設定値を用いたのでは、適正な観察を行うことができなくなる。本発明によれば、基準深さの絶対高さが変更された場合に、高さ情報換算手段の作動により、変更前後の基準深さの絶対高さの差分を算出し、当該差分を各集光位置の絶対高さに加算するので、基準深さの絶対高さを変更するだけで、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。
【００１７】
上記発明においては、前記レーザ光源が、超短パルスレーザ光を出射する多光子励起用レーザ光源であることとしてもよい。
このようにすることで、各集光位置のみから発生した蛍光を容易に検出して鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００１８】
また、上記発明においては、前記ハードウェア設定値が、前記レーザ光の各集光位置において所定の明るさの蛍光画像を得るための設定値であることとしてもよい。
このようにすることで、全ての集光位置において所定の明るさの蛍光画像を取得することができ、深さ方向に明るさムラを生ずることなく適正な観察を行うことができる。
【００１９】
また、上記発明においては、レーザ光の試料内における集光位置の所定の基準深さを検出する基準深さ検出部を備え、前記基準深さ情報記憶部が、前記基準深さ検出部により検出された基準深さの絶対高さを記憶することとしてもよい。
このようにすることで、基準深さ検出部の作動により、より正確に基準深さの絶対高さを把握して、各集光位置において適正なハードウェア設定を適用して適正な観察を行うことができる。
【００２０】
また、上記発明においては、前記基準深さ情報記憶部が、前記基準深さにおける絶対高さとハードウェア設定値とを対応づけて記憶し、前記基準深さにおける設定値が変化したときに、該設定値の変化量に基づいて、各集光位置におけるハードウェア設定値を補正する設定値補正部を備えることとしてもよい。
【００２１】
このようにすることで、基準深さの絶対高さが変更されることにより、基準深さの観察に適用するハードウェア設定値が変化する場合においても、設定値補正部の作動により、基準深さの観察に適用する設定値の変化量に基づいて、各集光位置におけるハードウェア設定値を補正して、適正な観察を行うことが可能となる。例えば、試料の表面を基準深さとする場合に、試料の表面が水その他の散乱媒体等で覆われている場合には、その散乱媒体の厚さの変化によって基準深さにおいて同等の蛍光画像を得るためのハードウェア設定値が変化する。このような場合においても、本発明によれば、各集光位置に適正なハードウェア設定値を適用することができ、適正な観察を行うことができる。
【００２２】
また、本発明は、試料に集光させたレーザ光を、その集光位置を深さ方向に変化させつつ、深さ方向に交差する方向に走査させて、各深さ位置における２次元的な蛍光画像を取得する観察方法であって、レーザ光の試料内における集光位置の所定の基準深さにおける絶対高さを記憶し、レーザ光の各集光位置における、前記基準深さの絶対高さに対する相対高さと、当該集光位置におけるレーザ光の強度、走査速度および蛍光検出感度を含むハードウェア設定値とを対応づけて記憶し、前記基準深さの絶対高さが変更された場合に、記憶されている相対高さを変更後の基準深さの絶対高さに対して適用し、該相対高さに対応して記憶されているハードウェア設定値を用いて蛍光画像を取得する観察方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は、試料に集光させたレーザ光を、その集光位置を深さ方向に変化させつつ、深さ方向に交差する方向に走査させて、各深さ位置における２次元的な蛍光画像を取得する観察方法であって、レーザ光の試料内における集光位置の所定の基準深さにおける絶対高さを記憶し、レーザ光の各集光位置における絶対高さと、当該集光位置におけるレーザ光の強度、走査速度および蛍光検出感度を含むハードウェア設定値とを対応づけて記憶し、前記基準深さの絶対高さが変更された場合に、変更前後の基準深さの絶対高さの差分を算出し、当該差分を記憶されている絶対高さに加算して新たな集光位置の絶対高さとする補正を行い、補正された集光位置の絶対高さと、対応するハードウェア設定値とを用いて蛍光画像を取得する観察方法を提供する。
【００２４】
また、本発明は、試料に集光させたレーザ光を、その集光位置を深さ方向に変化させつつ、深さ方向に交差する方向に走査させて、各深さ位置における２次元的な蛍光画像を取得する観察方法であって、レーザ光の試料内における集光位置の所定の基準深さにおける絶対高さと、当該基準深さにおけるレーザ光の強度、走査速度および蛍光検出感度を含むハードウェア設定値とを対応づけて記憶し、レーザ光の各集光位置における高さと、当該集光位置におけるレーザ光の強度、走査速度および蛍光検出感度を含むハードウェア設定値とを対応づけて記憶し、前記基準深さにおける各種設定値が変化したときに、その変化量に応じて、記憶されている前記各集光位置におけるハードウェア設定値を補正し、補正された各種設定値を用いて蛍光画像を取得する観察方法を提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、試料における集光位置の深さが変動することによる散乱の変化に関わらず、簡易に鮮明な蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の一実施形態に係る走査型光学装置１について、図１〜図６を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型光学装置１は、例えば、多光子励起現象を利用する光学装置であって、図１に示されるように、超短パルスレーザ光を出射する多光子励起用光源２と、該多光子励起用光源２から出射された超短パルスレーザ光の強度を調節するレーザ強度調節部３と、超短パルスレーザ光を２次元的に走査させるスキャナ（走査部）４と、走査された超短パルスレーザ光を集光する瞳投影レンズ５および結像レンズ６と、該結像レンズ６により略平行光にされた超短パルスレーザ光を標本Ａに集光させる一方、標本Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ７と、該対物レンズ７により集光され、結像レンズ６を介して戻る蛍光を超短パルスレーザ光から分岐するダイクロイックミラー８と、分岐された蛍光を集光する集光レンズ９，１０と、蛍光に含まれる超短パルスレーザ光を遮断するバリアフィルタ１１と、集光レンズ９，１０により集光された蛍光を検出する光検出器（蛍光検出部）１２とを備えている。
【００２７】
また、本実施形態に係る走査型光学装置１は、前記レーザ強度調節部３、前記スキャナ４および前記光検出器１２を制御するコントロールユニット１３と、該コントロールユニット１３に対し観察者が種々の入力を行う入力部１４と、コントロールユニット１３により構築された多光子蛍光画像を表示するモニタ１５とを備えている。また、前記対物レンズ７には、該対物レンズ７を光軸方向に沿って移動させる集光位置調節機構１６が備えられ、コントロールユニット１３により制御されるようになっている。
【００２８】
前記超短パルスレーザ光源２は、所定の強度の超短パルスレーザ光を出射するようになっている。レーザ強度調節部３は、例えば、音響光学素子により構成され、コントロールユニット１３からの指令により、スキャナ４に入射させる超短パルスレーザ光の強度を調節するようになっている。
【００２９】
前記コントロールユニット１３は、図２および図６に示されるように、所定の観察位置における試料Ａの表面位置（基準深さ）の絶対高さＺ０を記憶する第１の記憶部（基準深さ情報記憶部）１７と、当該観察位置における試料Ａの深さ方向に間隔をあけて配置される複数の集光位置の前記表面位置からの距離（相対高さ）ｄ１〜ｄ５と各集光位置において同等の輝度条件の蛍光画像を得るための前記レーザ強度調節部３、前記スキャナ４または前記光検出器１２の少なくとも１つの設定値（以下、ハードウェア設定値という。）ＨＷ１〜ＨＷ５とを対応づけて記憶する第２の記憶部（ハードウェア設定記憶部）１８とを備えている。ここで、「絶対高さ」および「相対高さ」は集光位置調節機構１６における光軸方向移動の位置座標である。
【００３０】
ハードウェア設定値としては、レーザ強度調節部３は「標本に照射するレーザ光の強度」、スキャナ４は「１画素あたりの走査速度」、光検出器１２は「検出感度」をそれぞれ設定することにより画像の明るさを調節する。なお、これらを任意に組み合わせて設定してもよい。
【００３１】
また、コントロールユニット１３は、第２の記憶部１８に記憶された複数の集光位置における距離ｄ１〜ｄ５および設定値ＨＷ１〜ＨＷ５を補間して、記憶されている集光位置間において同等の明るさの蛍光画像を得るための設定値を算出する設定値補間部（高さ情報換算部）１９を備えている。設定値補間部１９における補間方法は、直線補間の他、任意の曲線補間を採用することができる。
【００３２】
このように構成された本実施形態に係る走査型光学装置１を用いた観察方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る走査型光学装置１を用いて試料Ａの深さ方向に複数の蛍光画像を取得して行くには、まず、図３に示されるように、所定の観察位置における表面位置の絶対高さＺ０を第１の記憶部１７に記憶する（ステップＳ１）。表面位置の絶対高さＺ０は、観察者がモニタ１５を見ながら手動で入力部１４から第１の記憶部１７に記憶させてもよいし、集光位置調節機構１６により対物レンズ７を所定範囲にわたって移動させつつ画像を取得し、画像のコントラストが最も高くなる位置を表面位置と判断してその絶対高さＺ０を第１の記憶部１７に記憶させることにしてもよい。
【００３３】
次いで、ハードウェア設定が既になされているか否かが判断され（ステップＳ２）、設定がなされていない場合には、ハードウェア設定を行う（ステップＳ３）。ハードウェア設定がなされている場合には、第２の記憶部１８に記憶されたハードウェア設定値ＨＷ１〜ＨＷ５を用いて、所望の深さ範囲にわたる試料Ａの多光子蛍光画像を取得する（ステップＳ４）。
【００３４】
ハードウェア設定は、図４に示されるように、集光位置調節機構１６を作動させて、試料Ａの表面に集光位置が配置されている状態から、対物レンズ７を下降させつつ、複数箇所において行われる。ここで、対物レンズ７を下降させるとは、対物レンズ７を試料Ａに近接させる方向に移動させることを意味する。
具体的には、集光位置調節機構１６の作動により、対物レンズ７を下降させ（ステップＳ１１）、その各集光位置において、同等の輝度条件が達成されるようにハードウェア設定値を手動でまたは自動で調節し（ステップＳ１２）、調節されたハードウェア設定値を、各集光位置の表面位置からの距離ｄ１〜ｄ５と対応づけて第２の記憶部１８に記憶する（ステップＳ１３）。そして、ハードウェア設定が終了したか否かが判断され（ステップＳ１４）、終了していない場合には、ステップＳ１１〜Ｓ１４が繰り返される。ハードウェア設定を行うレーザ光の集光位置は、次の画像取得ステップＳ４における集光位置と一致していても異なっていてもよい。
【００３５】
前記多光子蛍光画像の取得においては、図５に示されるように、観察者により入力部から入力された観察範囲内の所定の深さ位置に、集光位置調節機構１６の作動により、レーザ光の集光位置を移動し（ステップＳ２１）、その位置におけるハードウェア設定値を設定値補間部１９により算出し、設定する（ステップＳ２２）。そして、設定されたハードウェア設定値を用いて、多光子励起用光源２から超短パルスレーザ光を出射させ、スキャナ４により超短パルスレーザ光を２次元的に走査させ、光検出器１２により蛍光を検出することにより２次元的な多光子蛍光画像を取得する（ステップＳ２３）。
観察範囲内の全ての集光位置における多光子蛍光画像が取得されたか否かが判断され（ステップＳ２４）、終了していない場合には、ステップＳ２１〜Ｓ２４が繰り返される。
【００３６】
このようにすることで、各集光位置において取得される多光子蛍光画像は、試料Ａの表面位置からの距離ｄ１〜ｄ５が異なるためにレーザ光の散乱量が異なるにもかかわらず、同等の輝度条件を有する多光子蛍光画像として取得することができる。したがって、試料Ａの深さ方向に得られる多光子蛍光画像に明るさムラを生じることが防止され、適正な観察を行うことができる。
【００３７】
この場合において、本実施形態に係る走査型光学装置１によれば、第２の記憶部１８に、試料Ａの表面位置からの距離ｄ１〜ｄ５とその位置におけるハードウェア設定値ＨＷ１〜ＨＷ５とが対応づけて記憶されているので、観察範囲を光軸に直交する方向に移動させることにより、試料Ａの表面位置の絶対高さＺ０が変化しても、ハードウェア設定を再度行う必要がない。
【００３８】
すなわち、図６に示されるように、第１の観察位置において、試料Ａの表面位置の絶対高さＺ１０と、複数の集光位置における試料Ａの表面位置からの距離ｄ１〜ｄ５およびハードウェア設定値ＨＷ１〜ＨＷ５とを設定しておけば、第１の観察位置とは異なる第２の観察位置に移動したときに試料Ａの表面位置の絶対高さＺ２０が変動しても、第２の記憶部１８に記憶されているハードウェア設定値ＨＷ１〜ＨＷ５を、新たな表面位置の絶対高さＺ２０に対して記憶されている距離ｄ１〜ｄ５だけ離れた位置のハードウェア設定値ＨＷ１〜ＨＷ５としてそのまま利用することができる。
これにより、ハードウェア設定値ＨＷ１〜ＨＷ５を設定した際の観察位置とは異なる観察位置に対しても、設定されたハードウェア設定値ＨＷ１〜ＨＷ５を再利用することができ、観察に要する時間と手間を低減することができるという利点がある。
【００３９】
なお、本実施形態においては、同一の試料Ａに対する観察位置の変更に際してハードウェア設定値ＨＷ１〜ＨＷ５を再利用することができる場合について説明したが、これに限定されるものではなく、全く別の試料Ａを観察する場合においても、その光学特性が同一である場合には、ハードウェア設定値ＨＷ１〜ＨＷ５を利用することにしてもよい。
【００４０】
また、本実施形態においては、多光子励起現象を利用する多光子励起型の走査型光学装置１を例示して説明したが、これに限定されるものではなく、共焦点型の走査型光学装置に適用してもよい。
【００４１】
次に、本発明の第２の実施形態に係る走査型光学装置について、図７および図８を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る走査型光学装置１と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。
【００４２】
本実施形態に係る走査型光学装置１は、図８に示されるように、第２の記憶部１８に記憶するデータが、観察位置における試料Ａの深さ方向に間隔をあけて配置される複数の集光位置の表面位置からの距離ｄ１〜ｄ５に代えて、各集光位置の絶対高さＺ１１〜Ｚ１５である点、コントロールユニット１３に、新たな表面位置の絶対高さＺ２０を記憶する第３の記憶部２０が設けられている点、および、設定値補間部１９の動作において第１の実施形態に係る走査型光学装置１と相違している。
【００４３】
設定値補間部１９は、第１の記憶部１７に記憶された設定時の表面位置の絶対高さＺ１０と新たな表面位置の絶対高さＺ２０との差分ΔＺを算出し、第２の記憶部１８に記憶されている各集光位置の絶対高さＺ１１〜Ｚ１５にその差分ΔＺを加算して新たな絶対高さＺ１１＋ΔＺ〜Ｚ１５＋ΔＺを算出するようになっている。さらに設定値補間部１９は、第２の記憶部１８に記憶されているハードウェア設定値ＨＷ１〜ＨＷ５を新たな絶対高さＺ１１＋ΔＺ〜Ｚ１５＋ΔＺに対するハードウェア設定値ＨＷ１〜ＨＷ５として設定し、これに基づいて各集光位置のハードウェア設定値を補間演算するようになっている。
【００４４】
このように構成された本実施形態に係る走査型光学装置によれば、第１の実施形態に係る走査型光学装置１と同様に、表面位置の異なる観察位置においても、１箇所の観察位置において登録したハードウェア設定値ＨＷ１〜ＨＷ５を再利用することができ、観察にかかる手間と時間を削減することができるという利点がある。
【００４５】
次に、本発明の第３の実施形態に係る走査型光学装置について、図９および図１０を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る走査型光学装置１と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。
【００４６】
本実施形態に係る走査型光学装置は、第１の記憶部１７に記憶する情報が、表面位置の絶対高さＺ１０のみならず、その表面位置におけるハードウェア設定値ＨＷ０１を含んでいる点、および、コントロールユニット１３に、新たな表面位置の絶対高さＺ２０およびハードウェア設定値ＨＷ０２を記憶する第３の記憶部２０が設けられている点、および、設定値補間部１９の動作において第１の実施形態に係る走査型光学装置１と相違している。
【００４７】
設定値補間部１９は、第１の記憶部１７に記憶されている表面位置におけるハードウェア設定値ＨＷ０１と第３の記憶部２０に記憶されている表面位置における新たなハードウェア設定値ＨＷ０２との差分ΔＨＷを算出し、第２の記憶部１８に記憶されている各集光位置のハードウェア設定値ＨＷ１〜ＨＷ５に差分ΔＨＷを加算する変換関数ｆ（ＨＷ）により、各集光位置の新たなハードウェア設定値ｆ（ＨＷ１）〜ｆ（ＨＷ５）を算出し（ステップＳ５）、これに基づいて、各集光位置のハードウェア設定値を補間演算するようになっている。
【００４８】
このように構成された本実施形態に係る走査型光学装置によれば、第１の実施形態に係る走査型光学装置１と同様に、表面位置の異なる観察位置においても、１箇所の観察位置において登録したハードウェア設定値ＨＷ１〜ＨＷ５を再利用することができ、観察にかかる手間と時間を削減することができるという利点がある。
また、本実施形態に係る走査型光学装置によれば、図９に示されるように、試料Ａの表面が、水その他の散乱媒体Ｍにより覆われている場合であって、試料Ａの表面の起伏等によって観察位置毎に散乱媒体Ｍの厚さが変化するような場合であっても、この散乱を考慮して、試料Ａ内の各集光位置におけるハードウェア設定値ｆ（ＨＷ１）〜ｆ（ＨＷ５）を適正に設定でき、それによって明るさムラのない適正な観察を行うことができるという利点がある。
【００４９】
なお、本実施形態においては、変換関数ｆ（ＨＷ）として、２つの観察位置の表面位置におけるハードウェア設定値ＨＷ０１，ＨＷ０２の差分ΔＨＷを加算するものを例示したが、これに代えて、他の任意の変換関数を採用してもよい。
また、変換関数としては、光検出器１２のチャネル毎あるいは多光子励起用光源２のユニット毎に異なる変換関数を用意することが好ましい。
また、第３の実施形態の内容は、第２の実施形態のように絶対位置を用いた制御方法と組み合わせて使用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る走査型光学装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の走査型光学装置のコントロールユニットを説明するブロック図である。
【図３】図１の走査型光学装置のコントロールユニットによる処理を説明するフローチャートである。
【図４】図３の処理におけるハードウェア設定値の設定処理を説明するフローチャートである。
【図５】図３の処理における蛍光観察の処理を説明するフローチャートである。
【図６】図１の走査型光学装置において異なる観察位置を観察する場合のハードウェア設定値の再利用について説明する図である。
【図７】本発明の第２の実施形態に係る走査型光学装置のコントロールユニットを説明するブロック図である。
【図８】図７の走査型光学装置において異なる観察位置を観察する場合のハードウェア設定値の再利用について説明する図である。
【図９】本発明の第３の実施形態に係る走査型光学装置において異なる観察位置を観察する場合のハードウェア設定値の再利用について説明する図である。
【図１０】図９の走査型光学装置のコントロールユニットによる処理を説明するフローチャートである。
【符号の説明】
【００５１】
Ａ  試料
ｄ１〜ｄ５  距離（相対高さ）
ＨＷ０１，ＨＷ０２  基準深さにおけるハードウェア設定値
ＨＷ１〜ＨＷ５  ハードウェア設定値
Ｚ１０，Ｚ２０  基準深さの絶対高さ
Ｚ１１〜Ｚ１５  集光位置の絶対高さ
１  走査型光学装置
２  多光子励起用光源（レーザ光源）
４  スキャナ（走査部）
１２  光検出器（蛍光検出部）
１６  集光深さ調節部
１７  第１の記憶部（基準深さ情報記憶部）
１８  第２の記憶部（ハードウェア設定記憶部）
１９  設定値補間部（高さ情報換算手段：設定値補正部）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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