(57)【要約】      （修正有）【課題】高い安全性を有する活性酸素消去剤、皮膚保全剤および変色防止剤の提供。【解決手段】ユーカリ属の樹木から単離されるペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する活性酸素消去剤、皮膚保全剤および変色防止剤。皮膚保全剤および変色防止剤は、ユーカリ属の樹木の水溶性抽出物を有効成分とすることもできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする活性酸素消去剤。
【請求項２】
ペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする皮膚保全剤。
【請求項３】
ユーカリ属の樹木から抽出される水溶性抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚保全剤。
【請求項４】
ペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする変色防止剤。
【請求項５】
ユーカリ属の樹木から抽出される水溶性抽出物を有効成分として含有することを特徴とする変色防止剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飲食品、医薬品、化粧品等の用途に好適な活性酸素消去剤、皮膚保全剤および変色防止剤に関し、より詳しくは活性酸素を消去する活性酸素消去剤、皮膚の健康を保つのに有効な皮膚保全剤、食品等の変色を防止するのに有効な変色防止剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康志向が高まるなか、自然治癒力を利用した東洋医学が注目されている。また、食品、化粧品、医薬品等の安全性に対する関心が高まるにつれ、安全性の高い天然素材への回帰が認められるようになってきた。特に、日常生活に関係の深い食品、化粧品においては、天然志向が追求されている。また、様々な慢性疾患の原因とされている活性酸素についても、その消去剤に天然素材が求められている。
【０００３】
上記活性酸素、特にスーパーオキシドアニオン（Ｏ2 - ）は、通常、生体内で発生し、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をはじめとする種々の酵素や抗酸化剤によって消去されるが、老化等に伴って活性酸素消去物質は減少し、生体は活性酸素の攻撃を受けやすくなっていくと考えられている。そこで、従来より活性酸素消去剤を食品または医薬品の形態で摂取することが推奨されている。また、活性酸素は、食品等の変色、退色、光劣化にも大きく関与していることが指摘されている。かかる活性酸素消去剤のうち、天然素材から得られるものとしては、従来より没食子酸、フラボノイド類、カテキン類、アスコルビン酸、クロロゲン酸といったＳＯＤ様活性素材が知られている。
【０００４】
一方、シミ、ソバカス等の原因となるメラニン色素の生成には、チロシナーゼが大きく関与していることはよく知られている。そして、メラニン色素の生成を防止するためのチロシナーゼ阻害剤の開発も従来より行われている。また、上記チロシナーゼは、食品等の変色にも関与していることが指摘されつつある。チロシナーゼ阻害剤のうち、天然素材から得られるものとしては、アルブチンがよく知られている。チロシナーゼ阻害剤は、通常、美白化粧品や外用剤に配合して使用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記各化合物は、天然素材から得られるものゆえ、安全性の高いものであるが、活性酸素消去活性、チロシナーゼ阻害活性または変色防止活性が十分でなかった。そのため、従来より、より活性の高い天然素材が求められていた。そこで、本発明の目的は、活性酸素消去活性、チロシナーゼ阻害活性、変色防止活性等に優れ、しかも高い安全性を有する、天然素材から得られる活性酸素消去剤、皮膚保全剤および変色防止剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ユーカリ属（Eucalyptus属) の樹木、特に葉から水、親水性有機溶媒またはそれらの混合溶媒で抽出処理して得られる水溶性抽出物が上記活性酸素消去活性、チロシナーゼ阻害活性および変色防止活性に優れているという事実を見いだし、さらに検討を重ねたところ、上記ユーカリ抽出物から単離したペドゥンクラジン(pedunculagin)またはテリマグランディンＩ(tellimagrandin I)が上記各活性の発現に大きく寄与しているという新たな事実を見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の活性酸素消去剤、皮膚保全剤（チロシナーゼ阻害剤）および変色防止剤はいずれも上記ペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする。上記ペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩは、タンニン、特に加水分解型エラジタンニンに属する化合物である。これらの化合物は、従来、抗レトロウイルス剤としての用途が知られている（特開平４−２６４０２６号公報）。また、広くタンニン化合物群としてみると、抗ウイルス剤、免疫抑制剤として有用なＮｆ−ｋＢ活性化抑制剤（特開平９−５９１５１号公報）、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤（抗ＨＢＶ剤）（特開平４−３６２３９号公報）といった用途のほか、強い止血作用を有することに着目して歯周病の予防・治療に有用であるという報告（特開昭５８−３８２０８号公報）や、皮膚炎症の治療や予防に有用であるといった報告（特開昭５８−３８２０９号公報）がある。
【０００８】
しかし、本発明における上記ペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩが優れた活性酸素消去活性、チロシナーゼ阻害活性および変色防止活性を有することは知られていない。また、上記ユーカリ属の樹木から抽出される水溶性抽出物はそれ自体で優れたチロシナーゼ阻害活性および変色防止活性を有する。
【０００９】
よって、本発明は、ユーカリ属の樹木から抽出される水溶性抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚保全剤および変色防止剤をも提供するものである。なお、上記ペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩは、前述のように、ユーカリ属の樹木の抽出物から単離することができるが、ユーカリ属のみならず、他の植物から単離されたものであってもよく、あるいは化学的に合成されたものであってもよい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の活性酸素消去剤、皮膚保全剤および変色防止剤は、いずれもユーカリ属等の植物に含まれているペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有しているため、安全性に優れていると共に、活性酸素消去活性、チロシナーゼ阻害活性、変色防止活性等に優れているという効果がある。
【００１１】
また、ユーカリ属の樹木から抽出される抽出物を有効成分として含有した本発明の皮膚保全剤および変色防止剤は、安全性に優れ、かつチロシナーゼ阻害活性、変色防止活性等に優れているという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
上記ペドゥンクラジンは、式(1):
【化１】
2008156340.tif 000002
で表される。
上記テリマグランディンＩは、式(2):
【化２】
2008156340.tif 000003
で表される。
【００１３】
各式中、グルコース部分の１位は、水酸基がアシル化されていないため、グルコースの痾体および竈体の平衡混合物（アノマー）となって存在している。そこで、上記各式では、アノマーであることを表すために、グルコース部分の１位における水酸基の結合を波線で表している。上記式(1) で表されるペドゥンクラジンおよび式（2)で表されるテリマグランディンＩはこれらの各式から明らかなように、グルコース部分の２位および３位の水酸基にヘキサヒドロキシジフェノイル基またはガロイル基がエステル結合した構造を有する。
【００１４】
ペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩは、前述のようにユーカリ属の樹木、特にユーカリの葉を原料として、抽出処理から分離、精製処理を経て得ることができる。ユーカリは、フトモモ科目の植物で、シネオール(cineole) を主成分とするユーカリ油を含んでいる。本発明において原材料として使用可能なユーカリ属としては、特に制限されないが、例えばE. globulus, E. rostrata, E. robsta などがあげられる。
【００１５】
ユーカリからの抽出処理は、以下のようにして行う。まず、原料植物、好ましくは葉を粉砕して、水、親水性有機溶媒またはこれらの混合物を使用して有効成分を抽出する。親水性有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、プロパノール等の低級アルコール、アセトン等が使用可能である。抽出方法としては、特に制限はなく、常温ホモジナイズ抽出、還流抽出などが使用可能である。抽出後、得られたエキスを水飽和ｎ−ブタノール、酢酸エチル等でさらに抽出を行い、さらに得られた抽出エキスを水含有エタノール等で抽出処理を行ってもよい。抽出後、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を使用して有効成分を単離し、さらに常法に従って精製を行う。
【００１６】
しかし、本発明におけるペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩは、上記のようにユーカリからの抽出処理によって得られるものゆえ、精製が不十分であっても安全性に問題はなく、むしろ未精製であっても他の未検出成分との相乗作用（crude drug効果) 等が期待できる。
本発明の活性酸素消去剤は、通常の飲食品に添加して使用するほか、その高い活性酸素消去活性を利用して医薬品としても使用可能である。医薬品としては、これに通常の製薬上許容される担体を加えて、固体、半固体または液体の形態で使用することができる。具体的には、例えば錠剤、カプセル、丸剤、顆粒剤、散剤、乳濁液、懸濁剤、シロップ剤、ペレット剤等の経口投与剤、注射液、点滴液、坐薬などの非経口投与剤があげられる。さらに、本発明の活性酸素消去剤は、皮膚の老化防止等を目的として、後述のような外用剤や化粧品にも配合することができる。
【００１７】
製剤化に際しては、従来より使用されている界面活性剤、賦形剤、着色剤、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤などの補助剤を使用することができる。投与量は、通常１日当たりペドゥンクラジンまたはテリマグランディンＩとして０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であるのがよい。
【００１８】
次に、本発明の皮膚保全剤について説明する。本発明の皮膚保全剤は、前記と同様にしてユーカリから単離されたペドゥンクラジンまたはテリマグランディンＩを有効成分として含有するか、あるいはユーカリの水溶性抽出物を有効成分として含有する。抽出物を用いる場合、活性に影響を与えない範囲で、脱臭（シネオール臭を除く）、脱色等の処理を施してもよい。また、適宜、分画処理、各種クロマトグラフィー等による分離精製処理を施して、より活性の強い皮膚保全剤を得るようにしてもよい。本発明の皮膚保全剤は、皮膚表面のメラニン色素の生成に関与するチロシナーゼの活性阻害剤として機能するゆえ、美白効果を有する。また、本発明におけるペドゥンクラジン、テリマグランディンＩまたはユーカリの水溶性抽出物は、チロシナーゼ阻害活性に加えて、高いヒアルロニダーゼ阻害活性をも有する。ヒアルロニダーゼは、生体内において真皮表層等の結合組織に多く分布し皮膚の保湿・保水性、潤滑性、柔軟性を保つ機能を有するヒアルロン酸の加水分解酵素である。また、ヒアルロン酸は、皮膚の坑炎症作用、坑アレルギー作用にも関与するといわれている。従って、ヒアルロニダーゼ阻害活性をも有する本発明の皮膚保全剤は、前記した美白効果に加えて、皮膚の保湿・保水性、潤滑性、柔軟性を高める効果をも有するため、健康な皮膚を保つのに有益である。そのため、本発明の皮膚保全剤は、化粧品の形態で使用されるほか、外用剤としても好適に使用可能であり、さらに必要に応じて錠剤、注射剤等の形態で経口投与してもよい。
【００１９】
化粧品としては、例えば化粧水、乳液、ローション、トニック、化粧クリーム、スプレー剤、口紅、ファンデーション、シャンプー、リンス、入浴剤等があげられる。これらの化粧品は、上記有効成分またはユーカリからの抽出物を、通常使用される化粧料基剤と混合して製造される。外用剤としては、例えば軟膏、クリーム、液剤、貼付剤等があげられ、従来より製薬上使用されている担体と組み合わせて製造できる。これらの化粧品および外用剤における有効成分の含有量は、ペドゥンクラジンまたはテリマグランディンＩとして０．１〜１００ｍｇ／ｇ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｇであるのがよい。
【００２０】
抽出物を用いる場合、その含有量は、０．５〜１００ｍｇ／ｇ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｇであるのがよい。
次に、本発明の変色防止剤について説明する。本発明の変色防止剤は、前記と同様にしてユーカリから抽出されたペドゥンクラジンまたはテリマグランディンＩを有効成分として用いてもよく、あるいはユーカリの抽出物を有効成分として用いてもよい。抽出物を用いる場合、活性に影響を与えない範囲で、脱臭（シネオール臭を除く）、脱色等の処理を施してもよい。また、適宜、分画処理、各種クロマトグラフィー等による分離精製処理を施して、より活性の強い変色防止剤を得るようにしてもよい。
【００２１】
食品等の変色の原因の１つとして、活性酸素およびチロシナーゼが関与していると考えられているため、上記ペドゥンクラジンまたはテリマグランディンＩを有効成分とする本発明の変色防止剤は上記活性酸素消去剤および皮膚保全剤と同じ機能に基づいていると推測される。本発明の変色防止剤は、固体、半固体または液体の形態で食品に添加される。固体としては粉状、粒状、ペレット状、錠剤などが、半固体としては、ゼリー状、シロップ状などが、液体としては乳剤、懸濁剤などがそれぞれあげられる。本発明の変色防止剤の添加量は、ペドゥンクラジンまたはテリマグランディンＩとして、食品１ｇに対して０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇであるのがよい。抽出物の場合は、該抽出物が食品１ｇに対して０．０５〜５０ｍｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇで添加されているのがよい。
【００２２】
本発明の変色防止剤は、例えば蓄肉加工品、魚肉加工品、飲料等の食品に添加することにより、変色、退色、光劣化等を防止することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、参考例、実施例および試験例をあげて本発明の活性酸素消去剤、皮膚保全剤および変色防止剤を詳細に説明する。
参考例１
ユーカリの乾燥葉５００ｇを４０％エタノール３ｋｇで２時間還流を行い、室温冷却後、ろ過し、ろ液を一晩冷蔵放置した。ついで、ろ液をさらにろ過し、得られたろ液をユーカリエキスとした。
【００２４】
このエキスを３００ｍｌまで減圧濃縮し、ついで濃縮液についてエーテル、酢酸エチル、水飽和ｎ−ブタノールおよび水で順次抽出を行った。得られた各抽出エキスについて、減圧濃縮を行い、さらに凍結乾燥して、乾燥抽出物を得た。上記ユーカリエキスおよび各乾燥抽出物について活性酸素消去活性およびチロシナーゼ阻害活性を調べた。測定方法は以下の通りである。
【００２５】
(1) 活性酸素消去活性の測定法
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２０ｍｌ、５ｍＭジエチレントリアミン５酢酸（ＤＥＴＡＰＡＣ）３０ｍｌ、０．７５ｍＭニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）１０ｍｌおよび０．３ｍＭキサンチン３０ｍｌからなる混和液０．９ｍｌに、所定濃度に調整した試料物質の水溶液０．２ｍｌを加え、よく混和した後、２５℃で１０分間攪拌した。これに０．０８Ｕ／ｍｌキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）０．１ｍｌを添加することにより反応を開始させた。反応開始後、２５℃、５６０ｎｍでの吸光度を約２分間連続記録し、そのうちの直線部より１分間の吸光度変化値を求めた（Oberley, L. W. and Spitz, D. R., "Methods inEnzymology", 105, 457 (1984) に記載のOberley らの改良法) 。一方、これとは別に２９５ｎｍの吸光度を測定することにより尿酸生成率を求め、この値で上記吸光度変化値を補正した値を活性酸素消去率とした。そして、試料物質の濃度を段階的に変更して上記活性を測定し、消去率が５０％を示す濃度を５０％有効濃度（ＥＣ50）とした。この値が小さいほど、活性は強いことを示している。
【００２６】
(2) チロシナーゼ阻害活性の測定法
１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）０．４ｍｌ、０．０５％Ｌ−ドーパ溶液０．１ｍｌおよび所定濃度に調整した試料物質の水溶液０．４ｍｌを混和し、２５℃で５分間攪拌した。これに３００Ｕ／ｍｌチロシナーゼ０．１ｍｌを加え、反応を開始させた。反応開始から１分後および６分後の吸光度を４７５ｎｍ、２５℃で測定した。そして、その差５分間の吸光度変化値（Ａ1 ）を求めた。また、試料物質を添加しない場合についても同様にして吸光度変化値（Ａ0 ）を求め、下記式よりチロシナーゼ阻害率を算出した。
チロシナーゼ阻害率（％）＝［（Ａ0 −Ａ1 ）／ Ａ0 ］×１００
試料物質の濃度を段階的に変更して上記活性を測定し、阻害率が５０％を示す濃度を５０％阻害濃度（ＩＣ50）とした。この値が小さいほど、活性は強いことを示している。
【００２７】
各測定結果を表１に示す。
【表１】
2008156340.tif 000004
【００２８】
表１から、ｎ−ブタノールの抽出エキスが最も活性が高く、ユーカリエキスについても高い活性が認められた。
参考例２
参考例１で得られたｎ−ブタノールの抽出エキスについて、ダイアイオンＨＰ−２０（直径３．３ｃｍ、長さ２０ｃｍ、三菱化学社製）を使用してカラムクロマトグラフィーを行い、水、２０％エタノール、４０％エタノール、６０％エタノール、エタノールの順で各１リットルずつ順次溶出を行った。得られたエキスについて減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、乾燥抽出物とした。各抽出物について、参考例１と同様にして活性酸素消去活性およびチロシナーゼ阻害活性を調べた。その結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
2008156340.tif 000005
表２に示すように、活性酸素消去活性およびチロシナーゼ阻害活性は２０％エタノール溶出部および４０％エタノール溶出部で活性が強かった。
【００３０】
実施例１
参考例１および２において、酢酸エチル抽出エキスおよびｎ−ブタノール抽出エキスについてのカラムクロマトグラフィーで得られた２０％および４０％エタノール抽出エキスについて、上記ダイアイオン、トヨパールＨＷ−４０（微細グレード品、直径２．２ｃｍ、長さ２０ｃｍ、５０％エタノールで溶出、東ソー社製）およびＭＣＩ−ｇｅｌＣＨＰ−２０Ｐ（直径１．１ｃｍ、長さ２０ｃｍ、水、１０％エタノール、２０％エタノールおよび３０％エタノールで順次溶出、三菱化学社製）の順にカラムクロマトグラフィーを繰り返し、数種の活性物質を単離することができた。
【００３１】
これらはＮＭＲ等の同定試験の結果、没食子酸（単離収量９０ｍｇ）、エラグ酸（単離収量８６ｍｇ）、ペドゥンクラジン（単離収量３０ｍｇ）およびテリマグランディンＩ（単離収量２６１ｍｇ）であることが判明した。ペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩのＮＭＲによる同定試験結果を以下に示す。
【００３２】
(I) ペドゥンクラジンの 1H-NMR(600MHz, アセトン-d6 +D2 O, J in Hz):
【表３】
2008156340.tif 000006
【００３３】
(II)テリマグランディンＩの 1H-NMR(600MHz, アセトン-d6 +D2 O, J in Hz): 
【表４】
2008156340.tif 000007
【００３４】
試験例１
実施例１で単離した各化合物について、参考例１と同様にして活性酸素消去活性を調べた。また、比較のため、活性酸素消去活性物質として知られているケルセチン、カテキン、エピカテキンおよびアスコルビン酸についても、同様にして活性を調べた。それらの試験結果を表３に示す。
【００３５】
【表５】
2008156340.tif 000008
表５から、ペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩはいずれも他の比較活性物質や他の単離物質（没食子酸、エラグ酸）に比べて顕著な活性酸素消去活性を有していることがわかる。
【００３６】
試験例２
実施例１で単離した各化合物について、参考例１と同様にしてチロシナーゼ阻害活性を調べた。また、比較のため、阻害活性物質として知られているアルブチンについても、同様にして活性を調べた。それらの試験結果を表４に示す。
【００３７】
【表６】
2008156340.tif 000009
表６から、ペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩはいずれもアルブチンや他の単離物質（没食子酸、エラグ酸）に比べて顕著な活性酸素消去活性を有していることがわかる。
【００３８】
試験例３
天然色素のシコニンの０．５％エタノール溶液１００ｍｌに、変色防止剤として、ユーカリ乾燥葉の４０％エタノール抽出により得られたユーカリエキスの乾燥物、実施例１で得たペドゥンクラジンまたはテリマグランディンＩを０．１ｇ加え、５１５ｎｍにおける吸光度を指標に変色の経時変化を測定し、これから下記式より変色抑制率を求めた。なお、一日の照射量は７５０ルクスに設定した。
【００３９】
変色抑制率（％）＝［（ｚ−ｙ）／（ｘ−ｙ）］×１００
ｘ：光照射前のシコニンの５１５ｎｍでの吸光度
ｙ：供試変色防止剤を共存させない状態での光照射後のシコニンの５１５ｎｍでの吸光度
ｚ：供試変色防止剤を共存させた状態での光照射後のシコニンの５１５ｎｍでの吸光度
【００４０】
この変色抑制率が大きいほど、活性が強いことを示している。また、比較のため、従来より変色防止効果が知られている没食子酸、クロロゲン酸およびアスコルビン酸についても同様にして変色抑制率を求めた。これらの試験結果を表５に示す。
【００４１】
【表７】
2008156340.tif 000010
表７から、比較対照化合物に比べて、ユーカリエキス、ペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩは高い活性を有し、特にユーカリエキスは顕著な変色防止効果を有していることがわかる。
【００４２】
試験例４
シコニンに代えて、ベニバナ黄色素を使用し、４００ｎｍにおける吸光度にて変色抑制率を求めたほかは、試験例３と同様にして変色抑制率を求めた。その結果を表６に示す。
【００４３】
【表８】
2008156340.tif 000011
表８から、ベニバナ黄色素を使用した場合も、シコニンと同様に、ユーカリエキス、ペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩは高い活性を有し、特にユーカリエキスは顕著な変色防止効果を有していることがわかる。
【００４４】
試験例５
参考例１で得たユーカリエキスの乾燥抽出物、実施例１で得たペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩについて、ヒアルロニダーゼ阻害活性を測定した。試験は、牛睾丸由来のヒアルロニダーゼ（シグマ社製のタイプＩＶ）を用いて、コンパウンド４８／８０による、不活性型酵素の活性化段階の阻害作用を中心に測定した。酵素活性は、ヒアルロン酸の加水分解により生成するＮ−アセチルヘキソサミンを還元末端とする四糖の還元力の増加を５８５ｎｍにおける吸光度で比色定量することにより測定した（食衛誌、３１巻、２３３〜２３７頁、１９９０）。
まず、適量の被検試料を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）１００μｌに溶解して試験管にとり、同緩衝液５０μｌに溶解した酵素０．１０ｍｇ（１００ＮＦユニット）を加え、３７℃で２０分間培養した。ついで、上記と同じ緩衝液１００μｌに溶解したコンパウンド４８／８０の５０μｇを加え、さらに３７℃で２０分間培養した。
【００４５】
さらに、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）２５０μｌに溶解した、微生物由来のヒアルロン酸ナトリウム塩２００μｇを加えて、３７℃で４０分間培養した。ついで、０．４ＮのＮａＯＨ１００μｌを加えて、氷冷後、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）１００μｌを加えて３分間煮沸し、氷冷後、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド試液３ｍｌを加えて、３７℃で２０分間培養した後、５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。
対照には、試料溶液に代えて上記酢酸緩衝液を用いた。また、それぞれのブランクとして、酵素溶液に代えて上記酢酸緩衝液を用いた。
【００４６】
阻害活性は次の式から求められるヒアルロニダーゼ阻害率で表した。
ヒアルロニダーゼ阻害率（％）＝
｛［（Ａ−Ｂ）−（Ｃ−Ｄ）］／（Ａ−Ｂ）｝×１００
Ａ：対照溶液の５８５ｎｍでの吸光度
Ｂ：対照溶液のブランクの５８５ｎｍでの吸光度
Ｃ：試料溶液の５８５ｎｍでの吸光度
Ｄ：試料溶液のブランクの５８５ｎｍでの吸光度
試料物質の濃度を段階的に変更して上記活性を測定し、阻害率が５０％を示す濃度を５０％阻害率（ＩＣ50）とした。この値が小さいほど、活性が強いことを示している。試験結果を下記に示す。
【００４７】
（被検試料）                       （ＩＣ50）
ペドゥンクラジン                      ０．１６ｍｇ／ｍｌ
テリマグランディンＩ                  ０．１０ｍｇ／ｍｌ
ユーカリエキス                        ０．５４ｍｇ／ｍｌ
上記試験結果から、ユーカリエキス、ペドゥンクラジンおよびテリマグランディンＩは、高いヒアルロニダーゼ阻害活性を有していることから、保湿・保水作用等を有し、チロシナーゼ阻害活性と相まって皮膚の健康を保つうえで有用であることがわかる。