(57)【要約】【課題】  評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価すること。【解決手段】  評価試料を評価する場合、まず、光合成サンプルを含む評価試料に第１の励起光を第１の照射条件で照射する。続いて、評価試料に第２の励起光を第１の照射条件と比較して光エネルギー積算値が小さい第２の照射条件で照射する。続いて、評価試料から発生する遅延発光の発光量を測定する。最後に、測定ステップにおいて測定された発光量に基づいて評価値を導出し、評価値と標準データとに基づいて評価試料を評価する。このとき、第２の照射条件を変更して第１励起ステップ及び第２励起ステップの後の発光量を測定し、測定された発光量に対応する評価値と当該評価値に対応する標準データとに基づいて評価試料を評価する。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光合成機能を有する光合成サンプルを含む評価試料を評価する光合成サンプルの評価方法であって、
前記評価試料に第１の励起光を所定の第１の照射条件で照射する第１励起ステップと、
前記第１励起ステップの後、前記評価試料に第２の励起光を前記第１の照射条件と比較して光エネルギー積算値が小さい第２の照射条件で照射する第２励起ステップと、
前記第２励起ステップの後、前記評価試料から発生する遅延発光の発光量を測定する測定ステップと、
前記測定ステップにおいて測定された遅延発光の発光量に基づいて評価値を導出し、前記評価値と標準データとに基づいて前記評価試料を評価する評価ステップとを備え、
前記測定ステップでは、前記第２の照射条件を変更して前記第１励起ステップ及び前記第２励起ステップの後の前記発光量を測定し、
前記評価ステップでは、前記測定ステップにおいて測定された発光量に対応する評価値と当該評価値に対応する標準データとに基づいて前記評価試料を評価することを特徴とする光合成サンプルの評価方法。
【請求項２】
前記標準データとは基準値であって、前記評価ステップでは、前記測定ステップにおいて測定された発光量に対応する評価値と当該評価値に対応する前記基準値とに基づいて前記評価試料を評価することを特徴とする請求項１に記載の光合成サンプルの評価方法。
【請求項３】
前記評価ステップは、前記測定ステップにおいて測定された遅延発光の発光量を１以上の測定時間帯毎に積算した積算値に基づいて評価値を導出することを特徴とする請求項１又は２に記載の光合成サンプルの評価方法。
【請求項４】
前記評価ステップは、前記測定ステップにおいて測定された遅延発光の発光量の経時変化が予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするように前記複数の関数の係数値を導出し、前記係数値に基づいて評価値を導出することを特徴とする請求項１又は２に記載の光合成サンプルの評価方法。
【請求項５】
前記第２の照射条件は、前記第１の励起光の照射終了時から前記第２の励起光の照射開始時までの待機時間であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の光合成サンプルの評価方法。
【請求項６】
前記第２の照射条件は、前記第２の励起光の光量、波長、パルス幅及び照射時間のうち少なくとも一つであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の光合成サンプルの評価方法。
【請求項７】
前記測定ステップは、前記第２の照射条件を変更しながら前記第１励起ステップ及び前記第２励起ステップを複数回繰り返した後にそれぞれの前記発光量を測定することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の光合成サンプルの評価方法。
【請求項８】
前記評価ステップは、前記評価試料に与えられた環境要因を評価することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の光合成サンプルの評価方法。
【請求項９】
光合成機能を有する光合成サンプルを含む評価試料を評価する光合成サンプルの評価プログラムであって、
コンピュータを、
前記評価試料に第１の励起光を所定の第１の照射条件で照射する第１励起手段と、
前記第１励起手段の後、前記評価試料に第２の励起光を前記第１の照射条件と比較して光エネルギー積算値が小さい第２の照射条件で照射する第２励起手段と、
前記第２励起手段の後、前記評価試料から発生する遅延発光の発光量を測定する測定手段と、
前記測定手段により測定された遅延発光の発光量に基づいて評価値を導出し、前記評価値と標準データとに基づいて前記評価試料を評価する評価手段として機能させ、
前記測定手段は、前記第２の照射条件を変更して前記第１励起手段及び前記第２励起手段の後の前記発光量を測定し、
前記評価手段は、前記測定手段により測定された発光量に対応する評価値と当該評価値に対応する標準データとに基づいて前記評価試料を評価することを特徴とする光合成サンプルの評価プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光合成サンプルの評価方法及び光合成サンプルの評価プログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、環境中に存在する未知化学物質の生物に対する影響を評価する方法として、細菌、藻類等の生物個体に対する生育阻害を検査する生物学的な毒性検査「バイオアッセイ」が用いられている。このバイオアッセイの一つとして、遅延蛍光を用いる手法が知られている。例えば、下記非特許文献１には、遅延発光計測前に暗中で２時間放置した試料と放置しない試料とで遅延発光の発光パターンが変化すること、及び、遅延発光計測前に照射する光の波長を変更した場合に遅延発光の発光パターンが変化することが開示されている。
【０００３】
また、下記特許文献１には、遅延蛍光を用いた有害物質の評価方法が開示されている。この有害物質の評価方法は、まず、有害物質を含む水溶液サンプルからの遅延蛍光（遅延発光）の光量と比較サンプルからの遅延蛍光の光量とをそれぞれ計測する。そして、計測した各遅延蛍光の光量に基づいて、遅延蛍光の光量の時間的変化の特徴点における経過時間を算出し、当該経過時間の比較値を求めることにより、水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価する。下記特許文献１においても、対象物に照射する光の光強度又は光波長を変更した場合に遅延発光のパターンが変化することが開示されている。
【特許文献１】国際公開第２００５／０６２０２７号パンフレット
【非特許文献１】Werner Schmidt and Horst Senger、“Long-term delayed luminescence in Scenedesmus obliquus II Influenceof exogeneous factors”、Biochimica et Biophysica Acta、Elsevier Science Publishers、1987、891(1987)、p.22-27
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述した従来の評価方法においては、光合成サンプルの光合成機能の反応過程における影響が適切に評価されていない。すなわち、光合成サンプルの光合成機能全体への影響は分かっても、その各反応過程への影響を評価するのは困難である。
【０００５】
本発明は、上記課題を解決する為になされたものであり、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価することが可能な光合成サンプルの評価方法及び光合成サンプルの評価プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の発明者は、通常、光合成サンプルに照射する励起光の光量が多くなるにつれて増加する、当該光合成サンプルからの遅延発光（遅延蛍光：以下、遅延発光とする）の発光量について以下のような知見を得た。すなわち、本発明の発明者は、遅延発光の発光量の経時変化に関し、強光を光合成サンプルに照射した場合に、ある測定時間帯の発光量が減少する一方で、他のある測定時間帯の発光量が増加するという知見を得た。更に、本発明の発明者は、このような遅延発光の発光量の増減は、強光による光合成サンプルの光合成電子伝達系の酸化還元状態（以下、「光合成サンプルの酸化還元状態」という）の変化と関係があり、光合成電子伝達系における分子の動きと電子の分布の変化とを反映しているという知見を得た。
【０００７】
そこで、上述の知見に基づいて上記課題を解決するため、本発明の光合成サンプルの評価方法は、光合成機能を有する光合成サンプルを含む評価試料を評価する光合成サンプルの評価方法であって、評価試料に第１の励起光を所定の第１の照射条件で照射する第１励起ステップと、第１励起ステップの後、評価試料に第２の励起光を第１の照射条件と比較して光エネルギー積算値が小さい第２の照射条件で照射する第２励起ステップと、第２励起ステップの後、評価試料から発生する遅延発光の発光量を測定する測定ステップと、測定ステップにおいて測定された遅延発光の発光量に基づいて評価値を導出し、評価値と標準データとに基づいて評価試料を評価する評価ステップとを備え、測定ステップでは、第２の照射条件を変更して第１励起ステップ及び第２励起ステップの後の発光量を測定し、評価ステップでは、測定ステップにおいて測定された発光量に対応する評価値と当該評価値に対応する標準データとに基づいて評価試料を評価することを特徴とする
【０００８】
また、本発明の光合成サンプルの評価プログラムは、光合成機能を有する光合成サンプルを含む評価試料を評価する光合成サンプルの評価プログラムであって、コンピュータを、評価試料に第１の励起光を所定の第１の照射条件で照射する第１励起手段と、第１励起手段の後、評価試料に第２の励起光を第１の照射条件と比較して光エネルギー積算値が小さい第２の照射条件で照射する第２励起手段と、第２励起手段の後、評価試料から発生する遅延発光の発光量を測定する測定手段と、測定手段により測定された遅延発光の発光量に基づいて評価値を導出し、評価値と標準データとに基づいて評価試料を評価する評価手段として機能させ、測定手段は、第２の照射条件を変更して第１励起手段及び第２励起手段の後の発光量を測定し、評価手段は、測定手段により測定された発光量に対応する評価値と当該評価値に対応する標準データとに基づいて評価試料を評価することを特徴とする
【０００９】
このような光合成サンプルの評価方法及び光合成サンプルの評価プログラムによれば、評価試料に対して、まず、第１の励起光が照射される。その後、この評価試料に、第１の励起光よりもエネルギー積算値が小さくなるように設定された照射条件で第２の励起光が照射される。第２の励起光の照射が終了すると、評価試料からの遅延発光の発光量が測定される。このような遅延発光の発光量は、第２の照射条件を変更することで複数得られる。そして、測定された発光量に対応した評価値が導出され、この評価値と標準データとに基づいて評価試料が評価される。このように、評価試料について、異なった第２の照射条件毎に遅延発光の発光量を得ることができるので、光合成サンプルの酸化還元状態が異なる場合に対する影響を導出することができ、その結果、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価することが可能となる。
【００１０】
また、第１の励起光の照射後、当該第１の励起光よりもエネルギー積算値が低くなるように第２の励起光を照射した上で遅延発光の発光量が測定される。そのため、遅延発光の発光量の測定条件を一定にすることが可能となり、その結果、遅延発光の発光量をより精度高く測定することができる。なお、標準データとは、評価試料を評価する際に基準として用いられるデータであり、エネルギー積算値とは、光合成サンプルにとっての光エネルギー積算値のことをいう。
【００１１】
本発明の光合成サンプルの評価方法では、標準データとは基準値であって、評価ステップが、測定ステップにおいて測定された発光量に対応する評価値と当該評価値に対応する基準値とに基づいて評価試料を評価することが好ましい。この場合、評価試料を基準値に基づいて評価することで、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価することができる。
【００１２】
本発明の光合成サンプルの評価方法では、評価ステップが、測定ステップにおいて測定された遅延発光の発光量を１以上の測定時間帯毎に積算した積算値に基づいて評価値を導出することが好ましい。
【００１３】
この場合、ある測定時間帯における遅延発光の発光量の積算値が算出され、その積算値に基づいて評価値が導出される。このような積算値を用いることで、遅延発光の発光量の経時変化に現れる、ある測定時間帯における光合成サンプルの酸化還元状態を簡易かつ適切に抽出することが可能となる。その結果、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能をより適切に評価することができる。また、測定時間帯を複数設け各測定時間帯の積算値を算出した場合には、遅延発光の発光量の経時変化を適切に把握することが可能となる。そのため、この複数の測定時間帯にわたる経時変化を利用して、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価することができる。
【００１４】
本発明の光合成サンプルの評価方法では、評価ステップが、測定ステップにおいて測定された遅延発光の発光量の経時変化が予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするように複数の関数の係数値を導出し、係数値に基づいて評価値を導出することが好ましい。
【００１５】
この場合、遅延発光の発光量の経時変化が予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするような当該複数の関数の係数値が導出され、その係数値に基づいて評価値が導出される。このような数学的手法を用いることで客観的に評価値を導出することが可能となる。また、遅延発光の発光量の経時変化を複数の関数の和にフィッティングさせているので、遅延発光のメカニズムに基づいた評価が可能となる。したがって、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価することができる。
【００１６】
本発明の光合成サンプルの評価方法では、第２の照射条件が、第１の励起光の照射終了時から第２の励起光の照射開始時までの待機時間であることが好ましい。
【００１７】
この場合、第２の励起光の照射開始時期を変更して、第１の励起光の照射から遅延発光の発光量の測定までの処理が行われる。第２の励起光の照射をいつ開始するか（待機時間をどのくらい設けるか）ということは、光合成サンプルの酸化還元状態の変化と密接に関係する。そのため、第２の励起光の照射開始時期を変更して得た遅延発光の発光量に基づいて評価値を導出することで、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価することができる。また、第２の照射条件を変更するためには、待機時間を変更すれば足り励起光自体を変える必要がないので、光合成サンプルの酸化還元状態が異なる状況を容易に設定することができる。
【００１８】
本発明の光合成サンプルの評価方法では、第２の照射条件が、第２の励起光の光量、波長、パルス幅及び照射時間のうち少なくとも一つであることが好ましい。
【００１９】
この場合、第２の励起光の光量、波長、パルス幅及び照射時間のうち少なくとも一つを変更して、第１の励起光の照射から遅延発光の発光量の測定までの処理が行われる。変更されるこれらの条件は、光合成サンプルの酸化還元状態の変化と密接に関係するものである。そのため、これらの要素のうち少なくとも一つを変更して得た遅延発光の発光量に基づいて評価値を導出することで、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価することができる。
【００２０】
本発明の光合成サンプルの評価方法では、測定ステップは、第２の照射条件を変更しながら第１励起ステップ及び第２励起ステップを複数回繰り返した後にそれぞれの発光量を測定することが好ましい。
【００２１】
この場合、第１の励起光の照射から遅延発光の発光量の測定までの処理は、第２の照射条件を変更しながら複数回繰り返される。そして、測定された各発光量に対応した評価値が導出され、この評価値と標準データとに基づいて評価試料が評価される。このように、比較的短い時間内で第２の照射条件を変更しながら遅延発光の発光量の測定を複数回行うことで、外的要因に影響されることなく、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価することが可能となる。
【００２２】
本発明の光合成サンプルの評価方法では、評価ステップは、評価試料に与えられた環境要因を評価することが好ましい。この場合、環境要因が評価試料中の光合成サンプルに与える影響を適切に評価することができる。
【００２３】
本発明の光合成サンプルの評価方法では、環境要因は、有害物質であることが好ましい。この場合、有害物質が評価試料中の光合成サンプルに与える影響を適切に評価することができる。
【００２４】
本発明の光合成サンプルの評価方法では、環境要因は、光合成サンプルの光合成反応を阻害するものであることが好ましい。この場合、環境要因が光合成サンプルの光合成反応を阻害するメカニズムを適切に評価することができる。
【００２５】
本発明の光合成サンプルの評価方法では、評価ステップは、光合成サンプルの光合成電子伝達の効率を評価することが好ましい。この場合、光合成サンプルの光合成電子伝達の効率を適切に評価することができる。
【００２６】
本発明の光合成サンプルの評価方法では、評価ステップは、光合成サンプルの生育状態を評価することが好ましい。この場合、光合成サンプルの生育状態を適切に評価することができ、ひいては植物の生育診断に貢献することができる。
【００２７】
本発明の光合成サンプルの評価方法では、評価ステップは、評価試料に与えられた農薬の機能を評価することが好ましい。この場合、農薬の機能を適切に評価することができる。
【発明の効果】
【００２８】
このような光合成サンプルの評価方法及び光合成サンプルの評価プログラムによれば、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、添付図面を参照しながら本発明の実施形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一又は同等の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００３０】
（理論的背景）
まず、図１を用いて、本発明に係る光合成サンプルの評価方法の理論的背景である光合成電子伝達について説明する。図１は、光合成電子伝達を示す模式図である。
【００３１】
一般に、光合成機能を有する光合成サンプルは、光エネルギーを多く吸収すると、光合成電子伝達系の個々の反応で律速が生じるため、光合成電子伝達が円滑に進まなくなる。言い換えれば、光合成サンプルの酸化還元状態が通常とは異なる状態になる。このような状態は、光合成サンプルに与える光条件を変更することで得ることが可能である。ここで、光条件とは、例えば、光合成サンプルに与える光の光量、波長、パルス幅及び照射時間である。本明細書では、光合成電子伝達が円滑に進まない状態（光合成サンプルの酸化還元状態が通常と異なる状態）を光合成電子伝達系の「飽和」という。これに対し、光合成電子伝達が円滑に進む状態（光合成サンプルの酸化還元状態が通常の状態）を「飽和なし」という。
【００３２】
図１に示すように、光合成サンプルの光合成反応は、主として、葉緑体チラコイド膜に存在する光化学系ＩＩ複合体（ＰＳＩＩ）、シトクロムｂ６ｆ複合体（ｃｙｔｂ６ｆ）、光化学系Ｉ複合体（ＰＳＩ）、及びＡＴＰ合成酵素（ＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅ）により生産させる還元物質（ＮＡＤＰＨ）と、ＡＴＰ合成酵素を利用した二酸化炭素固定反応（Ｃａｌｖｉｎ−Ｂｅｎｓｏｎ  ｃｙｃｌｅ）により行われる。
【００３３】
まず、ＰＳＩＩ及びＰＳＩが光を吸収し電子伝達反応を行う。具体的には、光が照射されるとＰＳＩＩにおいて水分子（Ｈ２Ｏ）が分解され、電子（ｅ−）が取り出される。この電子は、ＰＳＩＩ反応中心（Ｐ６８０）からＱＡ電子受容体（ＱＡ）を経て、ＱＢ電子受容体（ＱＢ）部位に結合している酸化型プラストキノン（ｐＱＯＸ）に伝達される。そして、これにより還元型プラストキノン（ｐＱｒｅｄ）が生じる。
【００３４】
還元型プラストキノンは、ＱＢ部位から遊離してプラストキノンプール（ｐＱｐｏｏｌ）に移動した後、ｃｙｔｂ６ｆにより再酸化され、酸化型プラストキノンに戻る。この際、ｃｙｔｂ６ｆを介して水素イオン（Ｈ＋）がチラコイド膜内に流入し、プロトン勾配を形成する。プロトン勾配を形成した水素イオンは、ＡＴＰ合成酵素によるＡＴＰ合成に利用される。一方、還元型プラストキノンの再酸化の際に抜き取られた電子は、ＰＳＩ反応中心（Ｐ７００）へ伝達される。この電子は、ＰＳＩ内でＰ７００からフェレドキシン（Ｆｄ）に伝達され、ＮＡＤＰＨの生産に寄与する。ＰＳＩ以降の過剰な電子（還元力）は、循環型電子伝達によりＦｄを介してｃｙｔｂ６ｆに伝えられ、酸化型プラストキノンを還元する。この結果、還元型プラストキノンが生じる（循環的電子伝達）。
【００３５】
遅延発光は、上記の光合成電子伝達反応の逆反応の結果、主にＰＳＩＩの反応中心クロロフィルが化学的に再励起されることで起こる発光であるとされているが、ＰＳＩも同様に発光に関与しているとする報告もある。また、ＰＳＩＩ内部、ｐＱｐｏｏｌ、ＰＳＩ以降のそれぞれに分布する電子がクロロフィルの再励起に寄与する主要な成分であると理解されている。従って、上記の光合成電子伝達反応が環境要因（例えば有害物質）の影響により変化すると、遅延発光に変化が現れる。
【００３６】
一般的に、ｐＱｐｏｏｌ、ｃｙｔｂ６ｆ、ＰＳＩの電子伝達能力は、ＰＳＩＩの電子伝達能力に比べて低い。そのため、光照射によりＰＳＩＩが過剰に還元されると、ＰＳＩＩからの電子伝達によりｐＱｐｏｏｌが過剰に還元されるので、ＰＳＩＩから電子を受け取る酸化型プラストキノンが減少し、ＰＳＩＩからの光合成電子伝達の効率が低下することが知られている。このような現象は、光合成電子伝達の飽和の一つである。より具体的には、ＰＳＩＩが過剰に光吸収を行った場合、まず始めにｃｙｔｂ６ｆによる還元型プラストキノンの再酸化が律速となり、ＰＳＩＩから電子を受け取ることができる酸化型プラストキノンが不足する。そのため、ＰＳＩＩからｃｙｔｂ６ｆへの電子伝達が停滞する。その結果、ＰＳＩＩ内に過剰に電子が蓄積し、ＰＳＩＩの反応中心が破壊されるなど、光合成反応に種々の影響を及ぼす。なお、このような影響を光阻害という。
【００３７】
このような光阻害を回避するために、本来ＰＳＩＩに電子を供給するための集光性色素タンパク複合体（ＬＨＣ２）がＰＳＩに移動する（ステート遷移）など、種々の代謝変化を引き起こすことが知られている。このような光阻害により引き起こされる代謝変化は、過剰な光照射を停止することで徐々に回復する。
【００３８】
本発明は、上記のような光合成電子伝達の酸化還元状態の変化に注目し、励起光の照射を制御して遅延発光を計測することにより、光合成サンプルに与えた環境要因を評価するものである。
【００３９】
（遅延発光計測装置）
まず、図２及び３を用いて、本発明による光合成サンプルの評価方法を実施するための遅延発光計測装置について説明する。図２は、実施形態に係る遅延発光計測装置１を模式的に示す図である。図３は、図２に示す遅延発光計測装置１を部分的に示すブロック図である。
【００４０】
遅延発光計測装置１は、計測ユニット１０、解析ユニット２０及び制御ユニット３０を備えている。計測ユニット１０と解析ユニット２０とは、第１ケーブル４１で接続されており、解析ユニット２０と制御ユニット３０とは、第２ケーブル４２で接続されている。
【００４１】
計測ユニット１０は、試料設置部１１、光源１２、フィルタ１３、集光光学系１４、シャッタ１５及び検出部１６を備え、これらの構成要素は筐体１７に収容されている。筐体１７は、本体部１７ａと蓋部１７ｂとを有している。
【００４２】
試料設置部１１は、測定対象である試料を設置するための部分である。試料設置部１１は、試料を入れた容器を設置可能なように構成され、蓋部１７ｂを開くことで試料の交換を行うことができる。なお、試料設置部１１は、筐体１７外から送液ポンプ等により試料を導入することができるように構成されてもよい。
【００４３】
光源１２は、試料設置部１１に設置された試料に光（励起光）を照射する。光源１２は、植物の光合成に有効な光波長（２８０〜８００ｎｍ）を放射可能であればよく、例えば、発光ダイオード、半導体レーザー素子又は電球が用いられる。光源１２は、単色光源であっても、複数の光源を組み合せた光源であってもよい。光源１２の発光方法は限定されず、例えば、所定時間連続して発光し続ける方法、任意のパターンでパルス点灯させる方法、同一又は異なる波長特性を有する複数の光源を順番に発光させる方法、複数の光源を同時に発光させる方法などが考えられる。
【００４４】
フィルタ１３は、遅延発光を透過するものであり、筐体１７の内壁面に接するように設けられている。
【００４５】
集光光学系１４は、フィルタ１３を透過してきた微弱な遅延発光を集光する。集光光学系１４は、これにより集光された遅延発光が検出部１６に進むように設けられている。
【００４６】
シャッタ１５は、開閉自在なように設けられている。シャッタ１５が閉じている場合には、集光光学系１４から検出部１６に進む遅延発光が遮断される。なお、シャッタ１５はフィルタ１３及び集光光学系１４よりも光源１２に近い位置に設けてもよい。この場合、光源１２からの光がフィルタ１３及び集光光学系１４に直接入射することによる、集光光学系等の構成部品の発光（残光）を防ぐことができる。
【００４７】
検出部１６は、光源１２から照射された光によって試料内の光合成サンプルから生じる遅延発光の光量を測定し、測定結果を解析ユニット２０に送信する。検出部１６は、遅延発光を検知する光センサ１６ａと、光センサ１６ａが検知した信号に基づいて遅延発光の光量を算出する光量算出部１６ｂとを有する。検出部１６は、例えば、電子増倍管を用いたフォトンカウンタや、アバランシェフォトダイオードを用いた微弱光計測装置などにより構成される。
【００４８】
解析ユニット２０は、記録部２１、演算部２２、表示部２３及び入力部２４を備える。記録部２１は、検出部１６から送信されてきた測定結果と解析又は評価に必要なデータとを記録する。演算部２２は、記録部２１に記録されている測定結果及びデータに基づいて演算解析と評価を行う。表示部２３は、演算部２２により解析・評価された結果の表示を行う。入力部２４は、解析に必要なデータを入力することが可能なインタフェースである。
【００４９】
制御ユニット３０は、計測ユニット１０及び解析ユニット２０の動作を制御可能であり、例えば、コンピュータ、タイマ及びリレーなどを組み合わせて構成される。特に、制御ユニット３０は、光源制御部３１と検出制御部３２とを有している。光源制御部３１は、光源１２から照射される励起光の光条件（例えば、照射時期、光量、波長、パルス幅及び照射時間）を制御することが可能である。検出制御部３２は、所定時間における遅延発光の発光量の検出（測定）を制御することが可能であり、例えば、検出時期、検出時間などを制御する。
【００５０】
なお、解析ユニット２０及び制御ユニット３０の構成はこれに限定されず、例えば、１台のコンピュータが解析ユニット２０及び制御ユニット３０の機能を併せ持っていてもよい。
【００５１】
（光合成サンプルの評価方法）
次に、図４を用いて、上記遅延発光計測装置１による光合成サンプルの評価方法の手順について説明する。図４は、光合成サンプルの評価方法の手順を示すフローチャートである。
【００５２】
まず、光合成サンプルを含む試料を２種類調製する。このうちの一方は、光合成サンプルの量、光合成サンプルに照射する光の光量又は波長、温度、緩衝液の組成、化学物質の曝露などの環境を所定の条件に設定した標準試料である（ステップＳ１１ｂ）。もう一方は、その標準試料に対して環境条件（有害物質の付加や温度など）又は光合成サンプルそのものの条件（生育条件など）のうち少なくとも一つが異なる評価試料である（ステップＳ１１ａ）。調製された標準試料及び評価試料は、キュベット等の容器内に格納され、光合成サンプルに対する比較条件の影響が十分に現れるまで、必要に応じて、温度や光などが管理された条件下で放置又は培養される。
【００５３】
続いて、光合成サンプルに対する比較条件の影響が十分に現れるに至った評価試料に対して第１の励起光を所定の第１の照射条件で照射する（ステップＳ１２ａ、第１励起ステップ）。光源制御部３１は、光源１２から照射される励起光が第１の照射条件を満たすように、光源１２に制御信号を出力する。第１の照射条件とは、光合成サンプルで行われる光合成電子伝達が飽和するような所定光量及び所定波長の光を所定時間だけ照射させることである。光源１２から照射された励起光は、試料設置部１１に設置してある容器に至る。このような第１の励起光の照射は、標準試料に対しても同様に行われる（ステップＳ１２ｂ、第１励起ステップ）。
【００５４】
続いて、第１の励起光を照射した評価試料を所定の光条件の中で所定時間（０秒以上）だけ待機させる（ステップＳ１３ａ、第２励起ステップ）。具体的には、評価試料に照射される光の光エネルギーが後述する第２の励起光のそれよりも小さいような環境下で評価試料を待機させる。例えば、計測ユニット１０の外部からその内部に光が漏洩しないようにし、試料設置部１１に設置した評価試料を暗中で待機させる。このような待機は、標準試料に対しても同様に行われる（ステップＳ１３ｂ、第２励起ステップ）。
【００５５】
続いて、光源１２を用いて、所定の光条件の中で待機させた評価試料に対して第２の励起光を第２の照射条件で照射する（ステップＳ１４ａ、第２励起ステップ）。第２の照射条件とは、第１の照射条件と比較して光エネルギー積算値が小さくなるような条件を含む。光源制御部３１は、光源１２から照射される励起光が第２の照射条件を満たすように、光源１２に制御信号を出力する。ここで、エネルギー積算値とは、光合成サンプルにとっての光エネルギー積算値のことをいい、光量子束密度（μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）と光合成サンプルの光合成有効放射吸収率（％）と照射時間（秒）との積で表される。このような第２の励起光の照射は、標準試料に対しても同様に行われる（ステップＳ１４ｂ、第２励起ステップ）。
【００５６】
続いて、第２の励起光を照射した評価試料から発生する遅延発光の発光量を測定する（ステップＳ１５ａ、測定ステップ）。評価試料から発生する遅延発光は、フィルタ１３を透過し、集光光学系１４で集光される。そして、集光された遅延発光が検出部１６に送られ、この検出部１６で遅延発光の発光量が測定される。かかる測定は、検出制御部３２から光量算出部１６ｂに出力される制御信号に基づいて、所定時間毎（例えば０．１秒毎）に行われる。測定された遅延発光の発光量は測定時刻又は測定時間と対応付けられた上で、検出部１６から解析ユニット２０に出力され、記録部２１に記録される。このような測定は、標準試料に対しても同様に行われる（ステップＳ１５ｂ、測定ステップ）。
【００５７】
上述した第１の励起光の照射から遅延発光の発光量の測定までの処理は、第２の照射条件を変更しながら複数回繰り返される（ステップＳ１６ａ；ＹＥＳ、ステップＳ１６ｂ；ＹＥＳ）。ここで、第２の照射条件とは、例えば、第２の励起光の照射開始時期、言い換えれば、第１の励起光の照射終了時から第２の励起光の照射開始時までの時間（以下「待機時間」という）を含む。このような第２の照射条件は、光源制御部３１で設定される。第２の照射条件を変更すると酸化還元状態が変わるので、このような測定方法を採用することで、酸化還元状態が異なる条件における遅延発光の発光量を測定することができる。
【００５８】
なお、第１の励起光の照射から遅延発光の発光量の測定までの処理を繰り返す回数は限定されず、任意の回数を設定することができる。また、同一条件の比較試料を複数用意しておき、それぞれに対して第２の照射条件を変更して遅延発光を測定することもできる。この場合、試料に前回の測定の影響が出ず、より精確な測定を行うことができる。更に、第２の照射条件を変えて測定された遅延発光の発光量の経時データ、又はそれに基づく評価値を予め記憶部に格納していてもよい。この場合、遅延発光の測定は必ずしも繰り返し行わなくてもよい。
【００５９】
第１の励起光の照射から遅延発光の発光量の測定までの処理を複数回繰り返した後（ステップＳ１６ａ；ＮＯ、ステップＳ１６ｂ；ＮＯ）、得られた測定結果から光合成サンプルの光合成電子伝達やその他の代謝を反映する解析値を算出する（ステップＳ１７ａ及びステップＳ１７ｂ、評価ステップ）。この算出は、評価試料及び標準試料のそれぞれについて行われる。具体的には、演算部２２が所定の算出プログラムに記録部２１から読み出された測定結果を当てはめることで解析値を算出する。解析値としては、例えば、１以上の測定時間帯毎に積算した遅延発光の発光量の積算値、遅延発光の発光量が減衰する過程で特定の変化が現れる測定時間（測定時刻）、及び、遅延発光の発光量の経時変化を関数の和としてフィッティングして得られる係数が挙げられる。
【００６０】
なお、試料に第２の励起光のみを照射して遅延発光の発光量を計測し、その発光量を解析値を算出する際に用いることが好ましい。この場合、試料が飽和していない場合の遅延発光の発光量が解析値に反映されるため、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能をより適切に評価することができる。解析値を算出する際には、測定結果をすべて用いてもよいし、測定結果の一部のみを用いてもよい。
【００６１】
特に、測定された遅延発光の発光量を１以上の測定時間帯毎に積算した積算値を解析値とすることが好ましい。これにより、遅延発光の発光量の経時変化に現れる、ある測定時間帯における光合成サンプルの酸化還元状態を簡易かつ適切に抽出することが可能となる。また、測定時間帯を複数設け各測定時間帯の積算値を算出することで遅延発光の発光量の経時変化を適切に把握することが可能となるので、光合成サンプルの酸化還元状態をより適切に評価することができる。
【００６２】
また、測定された遅延発光の発光量の経時変化が予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするように導出した複数の関数の係数値を解析値とすることも好ましい。このような数学的手法を用いることで、客観的に評価値を導出することが可能となる。また、遅延発光の発光量の経時変化を複数の関数の和にフィッティングさせているので、遅延発光のメカニズムに基づいた評価が可能となる。
【００６３】
なお、上述した調製から解析までの処理は、評価試料及び標準試料について同時に行ってもよいし、それぞれ別の時期に行ってもよい。また、後述する標準データが得られている場合には、標準試料の測定を必ずしも行わなくてもよい。
【００６４】
続いて、評価試料の解析値と標準試料の解析値とに基づいて評価値を算出（導出）する（ステップＳ１８、評価ステップ）。評価値の算出は、解析値の算出と同様、演算部２２において実行される。評価値の算出方法は一つに限定されない。例えば、評価試料及び標準試料のそれぞれについて、酸化還元状態が異なる条件における解析値を比較したり、評価試料の解析値と標準試料の解析値とを比較したりすることで評価値を算出することなどが挙げられる。また、これらのように算出された評価値同士を比較して更に評価値を算出してもよい。更に、解析値をそのまま評価値とする手法、解析値を加減乗除した結果を評価値とする手法、解析値を所定の関数に代入して演算した結果を評価値とする手法を採用してもよい。算出される評価値の種類及び個数は限定されない。
【００６５】
最後に、算出して得られた評価値に基づいて光合成サンプルの状態を評価する（ステップＳ１９、評価ステップ）。具体的には、算出して得られた評価値と標準データとを照らし合わせることにより評価する。標準データとしては、例えば、標準試料の測定データに基づいて得られた評価値が挙げられる。また、標準試料の評価値から基準値を算出し評価試料を評価してもよい。基準値としては、閾値及び範囲などが挙げられる。ここで得られた光合成サンプルの状態についての評価結果は、表示部２３に表示されるなどして評価者に提示される。なお、評価者への提示方法はこれに限られず、例えば、評価値を算出した時点でその評価値を評価者に提示してもよい。
【００６６】
このような光合成サンプルの評価方法によれば、異なった待機時間毎に遅延発光の発光量を測定することができるので、より詳細な評価値を導出することができ、その結果、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態を適切に評価することができる。
【００６７】
（遅延発光の測定例）
次に、測定例を示しつつ、酸化還元状態を変えながら行う遅延発光の測定について説明する。
【００６８】
ここでは、光合成サンプルとして緑藻（Pseudokirchneriella subcapitata）を用いる。緑藻は、標準的なＣ（７５）培地（ｐｈ７．５）を用い、気温２５℃±１℃の環境下で５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の白色光を照射しつつ旋回培養（１２０ｒｐｍ）で生育させたものである。計測試料は、Ｃ（７５）培地を希釈液として６８５ｎｍ吸光度ＯＤ６８５＝０．０５に調製した後に、気温２５℃±１℃の環境下で５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の白色光を照射しつつ１時間培養した細胞懸濁液２．５ｍＬである。そして、この計測試料を、励起光を照射して遅延発光を測定する前に予め６０秒間暗中に静置する。これは、光合成サンプル内の光合成電子伝達を円滑に進む状態にさせるため（光合成サンプルの酸化還元状態を一定の状態に保つため）である。通常、計測を６０秒間暗中に静置することにより、ＰＳＩＩ、ｐＱｐｏｏｌ、ＰＳＩが十分酸化された状態になる。
【００６９】
遅延発光の計測は、光源１２による励起光照射後に計測試料から発せられる遅延発光を検出部１６により検出し、検出された信号を０．１秒毎に積算して、遅延発光の発光量と相関する値（ｃｏｕｎｔ）として出力する手法により行う。この計測は、励起光消灯後、例えば５０秒間継続して行う。一般的に、励起光消灯後の遅延発光の発光量は、励起光の照射終了時点からの経過時間（励起後時間）が経過するとともに減衰していく。
【００７０】
まず、図５を用いて、待機時間と遅延発光の経時変化との関係について説明する。図５は、待機時間と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。このグラフの横軸は、励起後時間（第２の励起光の照射終了時点からの経過時間）（秒）を表し、縦軸は、遅延発光の強度（ｃｏｕｎｔｓ）を表す。なお、遅延発光の強度は、遅延発光の発光量と相関するものであるから、以下において遅延発光の強度に基づいて評価するということは、遅延発光の発光量に基づいて評価することと同等である。また、以下では、励起後時間と遅延発光の強度との関係をグラフ化したものを減衰曲線という。
【００７１】
待機時間と遅延発光の経時変化との関係を求めるにあたり、まず、計測試料に、光合成電子伝達を飽和させる第１の励起光として、５００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の白色光を１０秒間照射した（第１の照射条件）。その後、計測試料に光を照射しないステップ（以下「待機」という）を設け、更にその後、第２の励起光として、５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の赤色光を２秒間照射した。この第２の励起光は、光合成サンプルの酸化還元状態をほとんど変化させずに遅延発光を発生させることができるものである。このような処理は、待機時間を０、２、１０、３０及び６０秒と変更しながら繰り返し行われる。また、これらに加えて、第１の励起光の照射及び待機を実施せずに第２の励起光の照射のみを実施した場合、すなわち、光合成電子伝達が飽和しない場合についても測定する。
【００７２】
図５に示すグラフは、これらの各場合における待機時間と遅延発光の経時変化との関係を表している。このグラフに示されるように、第１の励起光の照射、待機及び第２の励起光の照射を組み合わせることにより、光合成サンプルの酸化還元状態が異なる状態を段階的に作り出し、その酸化還元状態を反映する遅延発光を測定することができる。第１の励起光を照射していない「飽和なし」の場合には、光合成電子伝達が最も円滑に進む。これに対し、第１の励起光を照射した直後に第２の励起光を照射した場合（待機時間が０秒の場合）には、光合成電子伝達が飽和に最も近くなる。そして、待機時間が長くなるにつれて、光合成電子伝達の飽和が解消されていく（光合成サンプルの光合成電子伝達系が回復していく）。
【００７３】
図５に示す、待機時間が０秒の場合の減衰曲線を見ると、励起後０．１秒から０．５秒付近の発光量が飽和なしの場合よりも増加しており、逆に励起後０．５秒付近から１０秒付近では、飽和なしの場合よりも発光量が減少している。また、励起後１０秒付近から５０秒までは、飽和なしの場合よりも発光量がやや増加している。飽和なしの場合と比較した励起後１０秒付近から５０秒までの発光量の減少は、待機時間を２秒とした場合にやや低減している。このような減衰曲線の変化は、待機時間が長くなるにつれて飽和なしの場合に近づき、待機時間を６０秒とした場合の減衰曲線と飽和なしの場合の減衰曲線との相違は、ほとんど認められない。このことから、第１の励起光による光合成電子伝達系の飽和は、６０秒の待機時間の間に解消されていると考えられる。
【００７４】
上述の測定結果が光合成サンプルの酸化還元状態の変化を表していると考えられる根拠について説明する。上述のように、光合成サンプルの酸化還元状態は、照射される励起光の光条件、より具体的には、励起光の光エネルギー量により決まる。そして、この光エネルギー量を決める要素として、例えば照射光量及び照射時間がある。そこで、説明のため、まず、照射光量及び照射時間と遅延発光の経時変化との関係を示す。
【００７５】
図６は、励起光の照射光量と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。このグラフの横軸及び縦軸が表すものは、図５の場合と同様である。励起光の照射光量と遅延発光の経時変化との関係を求めるにあたっては、第１の励起光の照射光量を５０、１００、２００及び５００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１と変更しながら上記の測定（待機時間は０秒とした。）を繰り返し行った。なお、第１の励起光の照射光量が５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の場合、光合成電子伝達系の飽和は発生しない。図６を見ると、第１の励起光の照射光量が少なくなるにつれて、減衰曲線が飽和なしの場合（励起光の照射光量が５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の場合）に近づく。
【００７６】
図７は、励起光の照射時間と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。このグラフの横軸及び縦軸が表すものは、図５の場合と同様である。励起光の照射時間と遅延発光の経時変化との関係を求めるにあたっては、第１の励起光の照射時間を５、１０及び３０秒と変更しながら上記の測定（待機時間は０秒とした。）を繰り返し行った。図７を見ると、第１の励起光の照射時間が少なくなるにつれて、減衰曲線が飽和なしの場合（励起光を照射しない場合）に近づく。
【００７７】
図６及び７で示したように、減衰曲線の変化は、第１の励起光の照射光量及び照射時間に依存する。すなわち、図５に示すような、待機時間の長さにより生じる特定の測定時間帯の発光量の増減は、光照射による光合成電子伝達系の飽和及び回復を直接又は間接的に反映していると考えられる。
【００７８】
この点につき、図８〜１０を用いて、酸化還元状態と遅延発光の発生とを対比しつつ光合成電子伝達に関わる分子の動きも踏まえて詳細に説明する。図８は、飽和なしの状態における酸化還元状態と遅延発光との対比を示す模式図である。図９は、第１の励起光照射後に待機時間を設けなかった（待機時間０秒）場合の、酸化還元状態と遅延発光との対比を示す模式図である。図１０は、第１の励起光照射後に待機時間を２秒設けた場合の、酸化還元状態と遅延発光との対比を示す模式図である。
【００７９】
飽和なしのときには、計測試料に対して光合成サンプル（緑藻）の培養時と同じ光強度の励起光が照射されているため、光合成電子伝達にはほとんど影響がないと考えられる。この場合、図８に示すように、ＰＳＩＩからｐＱｐｏｏｌを経てＰＳＩに電子が伝達される過程で飽和は生じず、ｐＱｐｏｏｌには酸化型プラストキノンと還元型プラストキノンとがバランス良く存在する。遅延発光に影響する３つの主要な電子蓄積部分（ＰＳＩＩ、ｐＱｐｏｏｌ、ＰＳＩ）の電子が逆反応により最終的にＰ６８０を化学的に再励起するため、遅延発光が生じる。なお、測定される遅延発光は、これら３つの電子蓄積部分のそれぞれから発生する遅延発光の総和である。
【００８０】
待機時間０秒の場合には、第１の励起光を照射した後直ちに第２の励起光を照射した上で遅延発光を計測している。そのため、光合成電子伝達系が最も飽和した状態であるといえる。この場合、図９に示すように、ｐＱｐｏｏｌでは、強光を照射したことにより生成された還元型プラストキノンが多くなる一方で、酸化型プラストキノンが少なくなる。このような状況では、ｃｙｔｂ６ｆによる還元型プラストキノンの再酸化が律速となり、ＰＳＩＩから電子を受け取ることができる酸化型プラストキノンが不足する。このため、ＰＳＩＩ内部からの電子伝達の取り出しが低下し、ＰＳＩＩ内部の電子の蓄積が多くなる。その結果、ＰＳＩＩ内部の電子蓄積を反映する遅延発光が増加する。このようなＰＳＩＩ内部の電子蓄積を反映した遅延発光の増加は、図５に示すように、待機時間が０秒の場合の減衰曲線における励起後０．１秒から０．５秒付近の発光量の増加として現れる。
【００８１】
なお、励起後それほど時間が経過していない場合における遅延発光がＰＳＩＩの電子を反映することは、Kretsch, G. and Gerhardt, V.、“Numerical analysis of delayed fluorescence kinetics of algae”、Archiv furHydrobiologie-Beiheft Ergebnisse der Limnologie、1987、29、p.47-54.（以下「参考文献１」とする）、及び、Schmidt,W. and Senger, H.、“Long-term delayed luminescence in Scenedesmus obliquus I. Spectral and kinetics properties”、Biochemica et BiophysicaActa、1987、890、p.15-22.（以下「参考文献２」とする）に記載されている。
【００８２】
また、ｐＱｐｏｏｌからＰＳＩＩのＰ６８０に電子が逆流する経路としては、ＰＳＩＩのＱＢ部位に結合した酸化型プラストキノンを介する経路と、ＱＢ部位から解離しｐＱｐｏｏｌに移動した還元型プラストキノンの平衡状態を反映した経路との二つが考えられる。これら予想される二つの経路は、ＰＳＩＩ内部にあるＱＢ部位を介した反応ではあるが、ｐＱｐｏｏｌの酸化還元状態を反映した遅延発光であるため、ｐＱｐｏｏｌの電子蓄積を反映する遅延発光として扱う。光合成電子伝達が飽和し還元型プラストキノンが多く存在する状況では、酸化型プラストキノンを反映する遅延発光が減少する一方で、還元型プラストキノンを反映する遅延発光が増加する。
【００８３】
図５の待機時間０秒の減衰曲線が示すように、酸化型プラストキノンの減少を反映した遅延発光の減少は、励起後０．５秒付近から１０秒付近における発光量の減少として現れていると考えられる。また、還元型プラストキノンの増加に伴う発光量の増加は、励起後１０秒付近から５０秒までの発光量の増加として現れていると考えられる。還元型プラストキノンを反映する発光量の減少が還元型プラストキノンを反映する発光量の増加よりも時間的に早く現れるのは、ＰＳＩＩ内部のＱＢ部位に結合した酸化型プラストキノンの方が、ＰＳＩＩとチラコイド膜内を移動して平衡状態を作っている還元型プラストキノンよりも短時間で反応が進行するためであると考えられる。ｐＱｐｏｏｌを反映する遅延発光がＰＳＩＩを反映する遅延発光よりも遅れて発光することは、参考文献１に記載されている。
【００８４】
さらに、ＰＳＩ以降に蓄積された電子がＰ６８０へ逆流する経路としては、Ｐ７００からｃｙｔｂ６ｆにおける還元型プラストキノンの酸化反応を介した平衡状態の逆反応を反映する経路と、ＰＳＩのフェレドキシン（Ｆｄ）を経由してｃｙｔｂ６ｆ内の酸化型プラストキノンへ電子が伝達され還元型プラストキノンを生じる循環的電子伝達による経路とが考えられる。この場合、どちらの経路においても、ＰＳＩの電子が還元型プラストキノンを介してＰ６８０に逆流することになる。図５の待機時間０秒の減衰曲線が示すように、ＰＳＩから還元型プラストキノンを介した遅延発光の増加は、励起後１０秒付近から５０秒までの発光量の増加として現れていると考えられる。ＰＳＩを反映する遅延発光が励起後数十秒の範囲で発光することは、参考文献１及び参考文献２に記載されている。
【００８５】
すなわち、励起後１０秒付近から５０秒までの発光量の増加は、光照射に伴うｐＱｐｏｏｌの還元、及び、ＰＳＩからの循環的電子伝達とＰ７００との平衡状態を反映したｐＱｐｏｏｌの還元の双方による還元型プラストキノンを反映する。本明細書では、主として、励起後１０秒から５０秒までの間に測定される遅延発光を、ＰＳＩからの循環的電子伝達とＰ７００との平衡状態を反映したものとして扱う。
【００８６】
待機時間２秒の場合には、第１の励起光を照射後、待機時間を２秒間設けた上で第２の励起光を照射し遅延発光を測定している。そのため、この測定結果は、待機時間を０秒とした場合と比較して、光合成電子伝達系の飽和がやや回復した時点のものであるといえる。この場合、図１０に示すように、待機時間の間に酸化型プラストキノンが生成されるためにＰＳＩＩからの電子取出しが可能となり、待機時間０秒で観察された励起後０．１秒から０．５秒付近の発光量の増加は認められない。また、酸化型プラストキノンのＱＢ部位への移動も可能となるため、励起後０．５秒付近から１０秒付近までの発光量の減少の度合いもやや低減する。
【００８７】
このことからすれば、還元型プラストキノンを反映する励起後１０秒付近から５０秒までの遅延発光の増加の程度も同様に低減するはずである。しかし、待機時間を２秒間設けた場合には、励起後１０秒付近から５０秒までの遅延発光が待機時間を０秒とした場合よりも増加している。これは、ＰＳＩ以降の電子の逆流によるものであると考えられる。すなわち、待機時間を長くすることで増加する励起後１０秒付近から５０秒までの遅延発光は、主としてＰＳＩ以降の電子を反映しているといえる。
【００８８】
以上のように、図５に示すような、互いに酸化還元状態が異なる各計測試料から得られる遅延発光の減衰曲線に基づいて、光合成電子伝達の飽和とその回復に伴うＰＳＩＩ、ｐＱｐｏｏｌ、ＰＳＩにおける電子蓄積を評価することができる。例えば、励起後時間のうち、特徴的に発光量の増減が観察される時間帯として、励起後０．１〜０．５秒、励起後０．６〜１０秒及び励起後１０．１〜５０秒のそれぞれの時間帯の発光量の変化に注目すれば、かかる電子蓄積を明確に評価することができる。
【００８９】
このように、評価試料について、第２の励起光の照射開始時期を変更しながら得た各遅延発光の発光量に基づいて評価値を導出することで、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態を適切に評価することができる。また、第１の励起光よりもエネルギー積算値が低くなるように第２の励起光を照射した上で遅延発光の発光量が測定される。そのため、第１の励起光の照射による酸化還元状態の変化を第２の励起光の照射により妨げることなく、且つ、遅延発光の減衰を防止することができる。その結果、遅延発光の発光量をより精度高く測定することが可能となる。
【００９０】
（積算値による試料の評価）
このようにＰＳＩＩ、ｐＱｐｏｏｌ、ＰＳＩにおける電子蓄積を評価することは、光合成サンプルを含む試料を評価する上で有用である。具体的には、光合成サンプルを含む評価試料中に存在する環境要因を評価する上で有用である。より具体的には、光合成サンプルの光合成電子伝達の効率の評価、光合成反応を阻害する化学物質の評価、植物の生育診断、植物に対する有害物質の影響、農薬の機能解析及び光合成の研究に対して有用である。そこで測定された遅延発光の発光量（遅延発光の強度）の積算値に基づいて試料を評価する手法について説明する。
【００９１】
以下では、励起後時間０．１〜０．５秒の積算範囲（測定時間帯）、励起後０．６〜１０秒の積算範囲及び励起後１０．１秒〜５０秒の積算範囲についてそれぞれ積算値を算出する場合について説明する。なお、積算範囲の設定はこれに限定されない。積算範囲の個数は、１以上であれば何個でも構わない。また、積算範囲を複数設けた場合に、各積算範囲の時間幅を等しくするかしないかは任意である。更に、本実施形態のように積算範囲同士を互いに所定の時間だけ離すだけでなく、積算範囲同士を接するように設けてもよいし（例えば、励起後時間０．１〜０．５秒の積算範囲と励起後時間０．５秒〜１０秒の積算範囲を設ける）、積算範囲同士が所定の時間帯において重なり合うように設けてもよい（例えば、励起後時間０．１〜０．５秒の積算範囲と励起後時間０．４秒〜１０秒の積算範囲を設ける）。
【００９２】
図１１は、図５に示した遅延発光の強度の減衰曲線について、上記３つの積算範囲毎に積算値を算出した結果を示すグラフである。図１１の各グラフにおいて、横軸は測定条件を表し、縦軸は遅延発光の強度の積算値（ｃｏｕｎｔｓ）を表す。なお、以下では、励起後時間０．１〜０．５秒の積算範囲における積算値、励起後０．６〜１０秒の積算範囲における積算値及び励起後１０．１秒〜５０秒の積算範囲における積算値を、それぞれ積算値１、積算値２及び積算値３という。図１１（ａ）、図１１（ｂ）及び図１１（ｃ）は、それぞれ積算値１、積算値２及び積算値３についてのグラフである。
【００９３】
まず、積算値１に基づいて検討する。図１１（ａ）に示すように、待機時間０秒の場合の積算値１は、飽和なしの場合のそれと比較して高い値となっている。これに対し、待機時間２秒の場合の積算値１と飽和なしの場合のそれとの差は大きくない。待機時間０秒の場合の変化は、第１の励起光の照射により、還元型プラストキノンが過剰に形成され、ＰＳＩＩ内のＱＢ部位に結合しＰＳＩＩ内部から電子を受容可能な酸化型プラストキノンが不足することで、ＰＳＩＩ内の電子蓄積が増加した結果である。これに対し、待機時間を２秒以上に設定した場合は、その待機時間中に酸化型プラストキノンが生成され、ＰＳＩＩ内の電子が取り出されたためである。すなわち、積算値１は、ＰＳＩＩ内部の電子蓄積を反映する。積算値１が高い場合は、ＰＳＩＩ内部に蓄積される電子が多く、還元状態にあることを示している。
【００９４】
これを光合成サンプルの酸化還元状態の違いによる変化という観点から検討する。光合成電子伝達が通常の状態では、電子伝達を飽和させるような励起光の照射（例えば第１の励起光の照射）直後にｐＱｐｏｏｌが還元状態になり、ＱＢ部位に結合可能な酸化型プラストキノンが不足する。そのため、一過的に積算値１が増加するが、飽和状態が回復する条件（例えば、所定時間の待機）により解消する。したがって、飽和なしの場合の積算値１と比較した、待機時間０秒（最も飽和に近い状態）の積算値１の増分が、電子伝達の飽和によってＰＳＩＩ内に蓄積された電子を表しているといえる。すなわち、飽和が回復する条件（例えば、所定時間の待機）においてその増分が減少する過程が酸化型プラストキノンによるＰＳＩＩからの電子取出しを反映している。したがって、互いに光合成サンプルの酸化還元状態が異なる積算値１同士の違いに注目することで、ＰＳＩＩ内部の電子蓄積、及び、電子の取り出しに対する環境要因（例えば有害物質）の作用を評価することができる。
【００９５】
次に、積算値２に基づいて検討する。図１１（ｂ）に示すように、積算値２は、待機時間０秒の場合に、飽和なしの場合の値と比較して最も値が減少している。待機時間が長くなるに従いその差は減少し、待機時間６０秒の場合では、積算値２が飽和なしの場合と同等になる程度まで回復している。すなわち、積算値２は、ＰＳＩＩのＱＢ部位に結合して電子を受け取ることのできる酸化型プラストキノンを反映している。待機時間０秒の場合には、第１の励起光の照射により還元型プラストキノンが過剰に形成され、ＰＳＩＩ内のＱＢ部位に結合してＰＳＩＩ内部から電子を受容可能な酸化型プラストキノンが不足する。このため、ＱＢ部位に結合したプラストキノンの電子蓄積を反映した遅延発光が減少する。しかし、待機時間が長くなるに従って酸化型プラストキノンの生成が進み、ＱＢ部位を介した遅延発光の量が回復する。
【００９６】
すなわち、飽和なしの場合の積算値２と比較した、待機時間０秒（最も飽和に近い状態）の積算値２の差分が、強光照射によるｐＱｐｏｏｌの還元を表している。また、飽和が回復する条件下（例えば、所定時間の待機）でその差分が減少する過程が、還元型プラストキノンがｃｙｔｂ６ｆなどにより再酸化される過程を表している。したがって、互いに酸化還元状態の異なる積算値２同士の違いに注目することで、ｐＱｐｏｏｌの還元状態、及び、再酸化の過程に対する環境要因の作用を評価することができる。
【００９７】
次に、積算値３に基づいて検討する。図１１（ｃ）に示すように、積算値３は、待機時間２秒の場合に、飽和なしの場合の値と比較して最も値が増加し、待機時間６０秒の場合では飽和なしと同等になる程度まで減少している。待機時間を２秒以上設けた場合の積算値３は、主としてＰＳＩ以降の電子蓄積を反映した還元型プラストキノンに相当するものといえる。すなわち、飽和なしの場合の積算値３と比較した、待機時間０〜６０秒のそれぞれの条件における積算値３の増分が、ＰＳＩ以降から循環的電子伝達やＰ７００を介した逆反応によりＰＳＩＩに到達する電子の流れを表している。したがって、互いに酸化還元状態の異なる積算値３同士の違いに注目することで、ＰＳＩ以降の電子蓄積、及び、循環的電子伝達に対する環境要因の作用を評価することができる。
【００９８】
このような積算値を用いることで、遅延発光の発光量の経時変化に現れる、光合成サンプルの酸化還元状態をより適切に抽出することが可能となる。その結果、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態を適切に評価することができる。また、上記のように、複数の積算値を算出した場合には、遅延発光の発光量の経時変化を把握することができるので、この経時変化を利用することにより酸化還元状態を適切に評価することができる。
【００９９】
以上より、光合成電子伝達系の飽和とその回復を評価する方法として、互いに酸化還元状態が異なる状態を複数作り、これら各状態について遅延発光を測定し、ＰＳＩＩ内部、プラストキノンプール及びＰＳＩ以降の電子蓄積を反映する遅延発光を表す指標（例えば、上記積算値１、２及び３）を用いることが有効であることがわかる。
【０１００】
（環境要因の評価）
次に、光合成電子伝達系の飽和と回復を評価することにより光合成サンプルに対する環境要因の影響を評価する方法について説明する。その際、評価方法として、上記積算値１、２、３を用いた評価手法を用いる。
【０１０１】
ここでは、標準試料（Ｃｏｎｔ）及び評価試料を用意する。各試料に含まれる光合成サンプルとして、上述したものと同様の緑藻を用いる。具体的には、Ｃ（７５）培地を希釈液として６８５ｎｍ吸光度ＯＤ６８５＝０．０５に調製し、気温２５℃±１℃の環境下で５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の白色光を照射しながら１時間培養した細胞懸濁液２．５ｍＬを標準試料として用いる。一方、評価試料は、標準試料と同様の手順で調製した後、気温２５℃±１℃の環境下で５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の白色光を照射しながら１時間培養する際に、環境要因として３６５ｎｍの紫外線を１００μＷ／ｃｍ２の強度で添加（ＵＶ照射）することにより得る。なお、遅延発光の発光量の測定は、標準試料及び評価試料を予め６０秒間暗中に静置して測定前の環境が光合成電子伝達系に与える影響を取り除き、光合成電子伝達系を一定の酸化還元状態に統一した後に行った。
【０１０２】
図１２は、標準試料における待機時間と遅延発光の発光量の経時変化との関係を示すグラフである。また、図１３は、評価試料における待機時間と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。各グラフには、飽和なし、待機時間０秒、待機時間１０秒及び待機時間６０秒の各場合の遅延発光の発光量の経時変化が示されている。図１２と図１３とを比較すると、ＵＶ照射により減衰曲線の形状が特徴的に変化していることがわかる。
【０１０３】
以下、ＵＶ照射が与える影響について詳細に説明する。図１４は、図１２及び１３に示した遅延発光の発光量に基づいて算出した、各試料についての積算値１、２及び３を示すグラフであり、図１４（ａ）、図１４（ｂ）及び図１４（ｃ）は、それぞれ積算値１、積算値２及び積算値３についてのものである。
【０１０４】
まず、標準試料について見ると、ＰＳＩＩ内部の電子を反映する積算値１は、待機時間０秒の場合に最大値を示し、待機時間が１０秒及び６０秒の場合に飽和なしの場合と同程度の値を示している。これは、上述したように、第１の励起光照射直後（待機時間０秒の場合）だと、ｐＱｐｏｏｌに還元型プラストキノンが多く存在しＰＳＩＩから電子を取り出すことのできる酸化型プラストキノンが少なくなることで、ＰＳＩＩ内部の電子蓄積が増加するためである。これに対し、待機時間１０秒及び６０秒の場合には、その待機時間の間に酸化型プラストキノンが生成されるので、光合成電子伝達系がＰＳＩＩの電子伝達反応が円滑に進んでいる飽和なしの場合と同等な程度まで回復する。
【０１０５】
これに対し、ｐＱｐｏｏｌの電子を反映する積算値２は、待機時間０秒で最小値を示し、待機時間が長くなるにつれ徐々に増加して飽和なしの値に近づく。これは、上述したように、第１の励起光照射直後（待機時間０秒の場合）だと、ｐＱｐｏｏｌに還元型プラストキノンが多く存在し、ＰＳＩＩ内のプラストキノン結合部位であるＱＢ部位に結合可能な酸化型プラストキノンが不足しているためである。一方、待機時間が所定の時間だけ設けられるとその待機時間の間に酸化型プラストキノンが生成されるので、光合成電子伝達系が飽和なしの場合と同等な程度まで回復する。
【０１０６】
更に、ＰＳＩ以降の電子を反映する積算値３は、飽和なし、待機時間０秒及び待機時間６０秒の場合でほぼ同じ値をとり、待機時間１０秒の場合のみ値が増加する。これは、ＰＳＩ以降のフェレドキシンやＮＡＤＰＨに蓄えられた電子がフェレドキシンを介して酸化型プラストキノンに伝達され還元型プラストキノンを生じる循環的電子伝達反応や、Ｐ７００を介した逆反応などによる遅延発光を反映するものである。積算値３に反映される遅延発光は、積算値１又は積算値２に反映される遅延発光と比較して多くの反応経路を経由するので、待機時間０秒の場合よりも待機時間１０秒の場合の方が高い値をとる。この積算値３は、待機時間６０秒の場合には飽和なしの場合と同等まで回復する。
【０１０７】
次に、ＵＶ照射を行った評価試料について見ると、ＰＳＩＩ内部の電子を反映する積算値１は、待機時間０秒の場合で増加せず、待機時間１０秒及び６０秒の場合でも大きな変化はみられない。これは、紫外線照射によりＰＳＩＩに何らかの変化が生じていることを示唆する。
【０１０８】
これに対して、ｐＱｐｏｏｌの電子を反映する積算値２は、標準試料のそれと比べてやや減少しているものの、待機時間０秒で最小値を示し、待機時間が長くなるにつれ徐々に飽和なしの値に近くなっていく傾向は変わらない。これは、紫外線照射がｐＱｐｏｏｌの作用にそれほど影響を及ぼさないことを示唆する。
【０１０９】
更に、ＰＳＩ以降の電子を反映する積算値３は、飽和なしの場合と待機時間６０秒の場合とでほぼ同じ値になっているが、待機時間１０秒の場合に加え、待機時間０秒の場合でも値が増加している。これは、紫外線照射により、ＰＳＩを介して酸化型プラストキノンに伝達され還元型プラストキノンを生じる循環的電子伝達反応や、Ｐ７００を介した逆反応が増加したことを示唆する。
【０１１０】
（評価値算出方法）
次に、上記の評価ステップにおける評価値の算出（導出）方法について説明する。この説明は、第２の照射条件が上述の待機時間（待機時間０秒、待機時間１０秒及び待機時間６０秒）であり、評価値が上記積算値１、２及び３に基づくものであることを前提とする。更に、飽和なしの場合についても同様に上記積算値１、２及び３が算出されていることも前提とする。
【０１１１】
まず、光合成サンプルのＰＳＩＩの電子蓄積状態を評価するための評価値を算出する方法について説明する。このような評価値の一つとして、例えば、ＰＳＩＩの電子蓄積がどのように変化したかを示すＰＳＩＩの電子蓄積の変化（ｅＩＩ）がある。この値ｅＩＩは、（評価試料の積算値１）／（標準試料の積算値１）×１００によって求めることができる。ＰＳＩＩの電子蓄積の変化（ｅＩＩ）は、飽和なし、待機時間０秒、待機時間１０秒及び待機時間６０秒の各条件について算出することができる。
【０１１２】
ＰＳＩＩの電子蓄積の変化（ｅＩＩ）が１００を超えているということは、ＰＳＩＩの電子蓄積が増加していることを示す。例えば、飽和なしの条件においてこのｅＩＩを算出すれば、強光の影響のない標準的な条件下（例えば、飽和なしの場合）におけるＰＳＩＩの電子蓄積の変化を評価することができる。
【０１１３】
上述したように、待機時間０秒における一過的な積算値１の増加は、ＰＳＩＩからの電子取出しが律速となったことによるＰＳＩＩの電子蓄積の増加を反映している。この積算値１の一過的増加は、光を照射しない待機時間を設けることにより飽和なしと同等まで回復する。例えば、ある待機時間でのＰＳＩＩからの電子取出し能力は、待機時間０秒での積算値１の一過的増加が、その待機時間を設けることでどの程度減少したかにより評価できる。そこで、待機時間０秒からある条件までのＰＳＩＩの電子取出し能力（ｔＩＩ）を評価値として算出する。この値ｔＩＩは、（（待機時間０秒の場合の積算値１）／（飽和なしの場合の積算値１）―（ある待機時間における積算値１）／（飽和なしの場合の積算値１））×１００によって求めることができる。
【０１１４】
待機時間０秒からある待機時間までのＰＳＩＩの電子取出し能力（ｔＩＩ）が大きければ、待機時間０秒からある待機時間までにＰＳＩＩの一過的な電子蓄積が多く解消されたことを示す。逆に、この値ｔＩＩが負の値となった場合には、待機時間０秒からある待機時間までＰＳＩＩの電子蓄積が何らかの要因により増加したことを示す。
【０１１５】
さらに、環境要因を与えていない標準試料についての、待機時間０秒からある条件までのＰＳＩＩの電子取出し能力（ｔＩＩ）と、ある環境要因を与えた評価試料についてのそれと比較することにより、ＰＳＩＩからの電子取出しがどのように変化したかを知ることができる。そこで、この変化を示す値として、待機時間０秒からある条件までのＰＳＩＩの電子取出しの変化（ｖＩＩ）を評価値として算出する。この値ｖＩＩは、（評価試料のｔＩＩ）／（標準試料のｔＩＩ）×１００によって求めることができる。この値ｖＩＩが１００であれば、ＰＳＩＩからの電子取出し能力が環境要因により変化していないことを示す。これに対し、この値ｖＩＩが小さい場合にはＰＳＩＩからの電子取出し能力が低下していることを示し、負の値になった場合はＰＳＩＩに電子が流入していることを示す。
【０１１６】
また、本実施形態に係る光合成サンプルの評価方法によれば、光合成サンプルのｐＱｐｏｏｌの酸化還元状態を評価することができる。例えば、ｐＱｐｏｏｌの酸化還元状態を反映する積算値２を用いて評価値を導出することが可能である。
【０１１７】
本実施形態では、予め光合成サンプルを６０秒間暗中に静置しているため、飽和なしの場合には、光照射により生成される還元型プラストキノンが再酸化され、ｐＱｐｏｏｌがほぼ酸化された状態になる。また、第１の励起光を照射した直後である待機時間０秒では、ｐＱｐｏｏｌがほぼ全て還元され、酸化型プラストキノンがほとんど存在しない状態である。すなわち、飽和なしの場合の積算値２と待機時間０秒の場合の積算値２との差分は、光照射による酸化還元反応の大きさを表している。そこで、この大きさを示す値として、酸化還元反応の大きさ（ｓＱ）を評価値として算出する。この値ｓＱは、（飽和なしの場合の積算値２）−（待機時間０秒の場合の積算値２）によって求めることができる。
【０１１８】
この値ｓＱを標準試料及び評価試料の双方について算出し、これらを比較することにより、環境要因によって光合成サンプルの酸化還元反応の大きさがどのように変化したかを知ることができる。そこで、標準試料についての酸化還元反応の大きさ（ｓＱ）に対する評価試料についての酸化還元反応の大きさ（ｓＱ）の割合を、ｓＱの環境要因による変化（ｖＱ）という評価値として算出する。この値ｖＱは、（評価試料のｓＱ）／（標準試料のｓＱ）×１００によって求めることができる。
【０１１９】
上述したように、待機時間０秒においてほぼ還元状態にあるｐＱｐｏｏｌは、待機時間を設けることでｃｙｔｂ６ｆによる再酸化反応が進み酸化型プラストキノンが生成されるため、飽和なしの状態に回復していく。つまり、ｐＱｐｏｏｌの酸化還元状態を反映する積算値２について、ある待機時間における積算値２と待機時間０秒における積算値２とを比較することにより、その待機時間での酸化型プラストキノンの生成量を知ることができる。この酸化型プラストキノンの生成量は、ｃｙｔｂ６ｆによる再酸化反応が阻害されると減少し、ｃｙｔｂ６ｆにおいて酸化型プラストキノンを還元する循環的電子伝達が阻害されると増加する。そこで、ある待機時間での酸化型プラストキノンの生成量（ｏＱ）を評価値として算出する。この値ｏＱは、（ある待機時間での積算値２）−（待機時間０秒での積算値２）によって求めることができる。
【０１２０】
更に、ｐＱｐｏｏｌの酸化還元反応の大きさに対する、ある待機時間での酸化型プラストキノンの割合（％ｏＱ）は、（ある待機時間でのｏＱ）／ｓＱ×１００によって求めることができる。
【０１２１】
また、本実施形態に係る光合成サンプルの評価方法によれば、光合成サンプルのＰＳＩの電子蓄積の状態を評価することができる。例えば、遅延発光の計測結果から算出したＰＳＩの電子蓄積の状態を反映する積算値３を用いて評価値を導出することが可能である。
【０１２２】
具体的には、ある待機時間における標準試料の積算値３と評価試料の積算値３とを比較することにより、ＰＳＩの電子蓄積がどのように変化したかを知ることができる。そこで、ＰＳＩの電子蓄積の変化（ｅＩ）を評価値として算出する。ＰＳＩの電子蓄積の変化（ｅＩ）は、（評価試料の積算値３）／（標準試料の積算値３）×１００によって求めることができる。この値ｅＩは、飽和なし、待機時間０秒、待機時間１０秒及び待機時間６０秒の各条件において算出することができる。この値ｅＩが１００を超えているということは、ＰＳＩの電子蓄積が増加していることを示す。例えば、飽和なしの条件においてＰＳＩの電子蓄積の変化（ｅＩ）を算出すれば、強光の影響のない標準的な条件下でのＰＳＩの電子蓄積の変化を評価することができる。
【０１２３】
上述したような第１の励起光を照射するとＰＳＩの電子蓄積が増加する。ＰＳＩの電子の一部は、循環的電子伝達経路によりｐＱｐｏｏｌを還元し、還元型プラストキノンを生じる。還元型プラストキノンに伝えられた電子の多くは、ｐＱｐｏｏｌからＱＢ部位及びＱＡ部位を介してＰＳＩＩ反応中心（Ｐ６８０）で遅延発光を生じる。飽和なしの場合の積算値３に対して、待機時間１０秒の場合の積算値３が一過的に上昇する。すなわち、ある待機時間を設けた場合の積算値３から飽和なしの場合の積算値３を減算した差分がその待機時間でのＰＳＩからの循環的電子伝達を表している。そこで、このＰＳＩからの循環的電子伝達（ｃＩ）を評価値として算出する。この値ｃＩは、（ある待機時間での積算値３）／（飽和なしでの積算値３）×１００によって求めることができる。
【０１２４】
以上のように、本実施形態により酸化還元状態の変化を評価することができる。例えば、上述のように評価試料に環境要因（例えば、紫外線や化学物質など）を与えれば、その環境要因が光合成サンプルに対して有害か否か、また、その環境要因がどのような作用を持っているのかを評価することができる。更に、評価試料を調整する際に河川水や土壌抽出水を用いれば、これらの水に含まれている環境要因（有害もしくは有益な化学物質）を評価することができる。
【０１２５】
本実施形態で示す酸化還元状態の変化の評価の有用性は上述したものに限定されない。例えば、植物の生育診断、植物に対する化学物質の影響、農薬の機能解析・開発及び光合成の研究に利用することも可能であると考えられる。
【０１２６】
（光合成サンプルの評価プログラム）
次に、図１５及び１６を用いて、実施形態に係る光合成サンプルの評価プログラム（以下、単に「評価プログラム」という）５０について説明する。図１５は、実施形態に係る評価プログラム５０の構成を記録媒体６０と共に示す図である。また、図１６は、図１５に示す評価プログラム５０が動作するコンピュータ７０のハードウェア構成を示す図である。
【０１２７】
この評価プログラム５０がコンピュータ７０と協働することで、そのコンピュータ７０が遅延発光計測装置１として動作することが可能となる。これにより、上述した光合成サンプルの評価をそのコンピュータ７０上で実現することができる。
【０１２８】
図１５に示すように、評価プログラム５０は、光源制御モジュール５１と、検出制御モジュール５２と、演算モジュール５３を備えている。光源制御モジュール５１は光源制御部３１に対応し、検出制御モジュール５２は検出制御部３２に対応し、演算モジュール５３は演算部２２に対応する。すなわち、光源制御モジュール５１によりコンピュータ７０が第１励起手段及び第２励起手段として機能し、検出制御モジュール５２によりコンピュータ７０が測定手段として機能し、演算モジュール５３によりコンピュータ７０が評価手段として機能する。
【０１２９】
図１６に示すように、コンピュータ７０は、オペレーティングシステムやアプリケーションプログラムなどを実行するＣＰＵ７１、ＲＯＭ及びＲＡＭで構成される主記憶装置７２、ハードディスクなどで構成される補助記憶装置７３、ネットワークカードなどの通信制御装置７４、モニタやプリンタなどの出力装置７６、キーボードやマウスなどの入力装置７５で構成される。図１５を示して説明した各モジュールは、図１６に示すＣＰＵ７１や主記憶装置７２の上に所定のソフトウェアを読み込ませ、ＣＰＵ７１の制御の下で通信制御装置７４を動作させるとともに、主記憶装置７２や補助記憶装置７３におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。
【０１３０】
この評価プログラム５０によれば、異なった第２の照射条件毎に遅延発光の発光量を測定することができるので、より詳細な評価値を導出することができる。その結果、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態を適切に且つ簡便に評価することができる。
【実施例１】
【０１３１】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１３２】
光合成サンプルとして緑藻を用いた。そして、Ｃ（７５）培地を希釈液として６８５ｎｍ吸光度ＯＤ６８５＝０．０５に調製した後に気温２５℃±１℃の環境下で５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の白色光を照射しつつ１時間培養した細胞懸濁液２．５ｍＬを標準試料とした。一方、評価試料は、3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethyl-urea（ＤＣＭＵ）を１２ｕｇ／Ｌの濃度で曝露したもの、2,5-dibromo-6-isopropyl-3-methyl-1,4-benzoquinone（ＤＢＭＩＢ）を３２２ｕｇ／Ｌの濃度で曝露したもの及びAntimycinA（Ａｎｔ−Ａ）を０．５５ｍｇ／Ｌの濃度で曝露したものを用意した。これらの化学物質は、いずれも光合成電子伝達の阻害剤である。以下、ＤＣＭＵ、ＤＢＭＩＢ及びＡｎｔ−Ａを曝露した試料をそれぞれＤＣＭＵ曝露試料、ＤＢＭＩＢ曝露試料及びＡｎｔ−Ａ曝露試料という。そして、標準試料及び３種類の曝露試料のそれぞれについて、飽和なし、待機時間０秒、待機時間１０秒、待機時間６０秒の各条件で上述の評価方法を実施した。光合成サンプルの酸化還元状態は、これらの各条件で異なる。
【０１３３】
図１７〜２０は、それぞれ、実施例における標準試料、ＤＣＭＵ曝露試料、ＤＢＭＩＢ曝露試料及びＡｎｔ−Ａ曝露試料についての遅延発光の発光量の経時変化（減衰曲線）を示したグラフである。図１７〜２０に示すように、化学物質を曝露したことにより、各曝露試料についての減衰曲線の形状が変化した。
【０１３４】
以下、積算値を用いてこれら減衰曲線の形状の変化を詳細に説明する。この説明のために、図２１〜図２３を用いる。図２１は、実施例における標準試料の積算値とＤＣＭＵ曝露試料の積算値とを比較したグラフであり、図２１（ａ）、図２１（ｂ）及び図２１（ｃ）は、それぞれ積算値１、積算値２及び積算値３についてのグラフである。図２２は、実施例における標準試料の積算値とＤＢＭＩＢ曝露試料の積算値とを比較したグラフであり、図２２（ａ）、図２２（ｂ）及び図２２（ｃ）は、それぞれ積算値１、積算値２及び積算値３についてのグラフである。図２３は、実施例における標準試料の積算値とＡｎｔ−Ａ曝露試料の積算値とを比較したグラフであり、図２３（ａ）、図２３（ｂ）及び図２３（ｃ）は、それぞれ積算値１、積算値２及び積算値３についてのグラフである。
【０１３５】
まず、各曝露試料に共通する標準試料の結果について説明する。ＰＳＩＩ内部の電子を反映する積算値１は、待機時間０秒の場合に最大値を示したのに対し、待機時間１０秒及び待機時間６０秒の場合には、飽和なしと同程度の値をとった。これは、上述したように、第１の励起光照射直後にはｐＱｐｏｏｌに還元型プラストキノンが多く存在し、ＰＳＩＩから電子を取り出すことのできる酸化型プラストキノンが少なくなってＰＳＩＩ内部の電子蓄積が増加するためである。待機時間１０秒及び６０秒の場合には、その待機時間の間に酸化型プラストキノンが生成されたことで、ＰＳＩＩの電子伝達反応が円滑に進む飽和なしの状態と同等まで回復したと理解できる。
【０１３６】
ｐＱｐｏｏｌの電子を反映する積算値２は、待機時間０秒の場合に最小値を示し、待機時間が長くなるにつれ徐々に飽和なしの場合の値に近づいていった。これは、上述したように、第１の励起光照射直後ではｐＱｐｏｏｌに還元型プラストキノンが多く存在しており、ＰＳＩＩ内のプラストキノン結合部位であるＱＢ部位に結合可能な酸化型プラストキノンが不足しているためである。酸化型プラストキノンは待機時間の間に生成されるので、待機時間６０秒の場合には、飽和なしの場合と同等まで回復した。
【０１３７】
ＰＳＩ以降の電子を反映する積算値３は、飽和なし、待機時間０秒及び待機時間６０秒の場合でほぼ同じ値となり、待機時間１０秒の場合のみ値が増加した。これは、ＰＳＩ以降のフェレドキシンやＮＡＤＰＨに蓄えられた電子がフェレドキシンを介して酸化型プラストキノンに伝達され、還元型プラストキノンを生じる循環的電子伝達反応や、Ｐ７００を介した逆反応などが生じたためである。積算値３で示される反応は、積算値１又は積算値２で示される反応と比較して多くの反応経路を経由するため、待機時間０秒の場合よりも待機時間１０秒の場合の方が発光量が多くなる。積算値３は、待機時間６０秒の場合には飽和なしの場合と同等まで回復した。
【０１３８】
次に、各曝露試料固有の結果について説明する。まず、ＤＣＭＵ曝露試料の結果について説明する。ＤＣＭＵは、ＰＳＩＩの中にあるＱＢ部位への酸化型プラストキノンの結合を阻害することにより、ＰＳＩＩ内部からｐＱｐｏｏｌへの電子の移動を阻害する。したがって、還元型プラストキノンの生成が阻害され、プラストキノンプールでは酸化型プラストキノンの存在量が多くなる。プラストキノンプールの電子蓄積が減少した結果、ｃｙｔｂ６ｆによるプロトン勾配の形成、光化学系Ｉ（ＰＳＩ）への電子供給の低下及びＮＡＤＰＨ合成の減少が発生する。
【０１３９】
ＤＣＭＵ曝露試料の積算値１は、飽和なし、待機時間１０秒及び待機時間６０秒の各場合で標準試料の値の２倍近い値を示し、標準試料に関するデータの中で最も飽和に近い状態にある待機時間０秒の場合よりも高い値となった。標準試料では、飽和なしの場合よりも待機時間０秒（飽和状態）の方が積算値１が大きくなったのに対し、ＤＣＭＵ曝露試料では逆の結果となった。また、ＤＣＭＵ曝露試料では、飽和が回復する場合（待機時間１０秒及び６０秒の場合）においても値が減少しなかった。これにより、ＰＳＩＩ内部からの電子取出しが強光照射による電子伝達の飽和とは無関係に阻害されていることがわかった。これは、ＤＣＭＵがＰＳＩＩの電子伝達を阻害する事と一致している。
【０１４０】
なお、標準試料とＤＣＭＵ曝露試料とで待機時間０秒の場合に顕著な差は見られなかったのは、第１の励起光照射直後ではＰＳＩＩ内での循環的電子伝達などの電子消散機構が働いているためであると考えられる。
【０１４１】
ＤＣＭＵ曝露試料の積算値２は、全ての条件において標準試料のそれよりも低くなった。しかし、待機時間０秒の場合に最小値を示し、待機時間が長くなるにつれ徐々に飽和なしの場合の値に近づいていく傾向は、標準試料の結果と同じであった。これは、ｐＱｐｏｏｌにおける電子蓄積は低下したが、還元型プラストキノンを再酸化する過程は阻害されなかったことを示している。これは、ＤＣＭＵがＰＳＩＩ以降への電子伝達を低下させるが、それ以外の反応を阻害しないことと一致している。
【０１４２】
ＤＣＭＵ曝露試料の積算値３は、全ての条件において標準試料のそれよりも低くなった。更に、ＤＣＭＵ曝露試料の積算値３は、待機時間０秒及び１０秒の場合に飽和なしの場合より高い値となった。標準試料では認められない待機時間０秒での値の増加の違いがあるものの、基本的には標準試料と同じ傾向であった。これは、ＰＳＩ以降からの逆反応によるＰＳＩＩへの電子流入は減少したが、ＰＳＩ以降からの電子の逆流は阻害されなかったことを示している。これは、ＤＣＭＵがＰＳＩＩ以降への電子伝達を低下させるが、それ以外の反応を阻害しないことと一致している。
【０１４３】
次に、ＤＢＭＩＢ曝露試料の結果について説明する。ＤＢＭＩＢは、ｃｙｔｂ６ｆ複合体のプラストキノン結合部位に結合し還元型プラストキノンの酸化を阻害する。したがって、ｐＱｐｏｏｌでは還元型プラストキノンの存在量が増加し酸化型プラストキノンの存在量が減少する。
【０１４４】
ＤＢＭＩＢ曝露試料の積算値１は、全ての条件で標準試料のそれよりも高くなった。しかし、飽和なしの場合と比較して待機時間０秒で値が増加し、待機時間１０秒及び６０秒の場合に飽和なしの場合と同程度にまで回復したことは、標準試料の場合と同じであった。このことは、ＰＳＩＩ内部の電子蓄積は増加したが、ＰＳＩＩからの電子の取り出しそのものは阻害されなかったことを示している。これは、ＤＢＭＩＢが酸化型プラストキノンの生成を阻害し、ＰＳＩＩからの電子の取り出しが低下することと一致する。
【０１４５】
ＤＢＭＩＢ曝露試料の積算値２と標準試料の積算値２とを比較したところ、最も飽和に近い状態にある待機時間０秒の場合では大きな差は認められなかった。しかし、それ以外の条件（飽和なし、待機時間１０秒及び待機時間６０秒）では、ＤＢＭＩＢ曝露試料の積算値２の方が標準試料のそれよりも低くなった。すなわち、ＤＢＭＩＢ曝露試料では、最も飽和に近い状態（待機時間０秒）での積算値２と飽和なしの状態での積算値２との差が少なくなった。これは、飽和なしの条件で、強光照射が無いにもかかわらずｐＱｐｏｏｌが還元状態になり、ｐＱｐｏｏｌの酸化型プラストキノンの存在量が増加したためである。このことは、ＤＢＭＩＢが還元型プラストキノンの酸化を阻害するが、それ以外の電子伝達を阻害しないことと一致する。
【０１４６】
ＤＢＭＩＢ曝露試料の積算値３と標準試料の積算値３とを比較したところ、飽和なし、待機時間０秒及び待機時間６０秒の各場合では、両者の間に大きな差は認められなかった。しかし、待機時間１０秒の場合について比較したところ、標準試料では値が比較的大きく増加したのに対し、ＤＢＭＩＢ曝露試料での増分は標準試料の場合よりも低いものであった。これは、ＰＳＩ以降からｐＱｐｏｏｌへの電子の流れが低下したことを示している。このことは、ＤＢＭＩＢがＰＳＩからプラストキノンへの電子の流れの一つである循環的電子伝達の電子受容体となる酸化型プラストキノンの存在量を低下させることと一致する。
【０１４７】
次に、Ａｎｔ−Ａ曝露試料の結果について説明する。Ａｎｔ−Ａは、ＰＳＩのフェレドキシン（Ｆｄ）を介してｃｙｔｂ６ｆの酸化型プラストキノンへ電子を伝達し、還元型プラストキノンを生じる循環的電子伝達を阻害する化学物質である。すなわち、Ａｎｔ−Ａは、ＰＳＩからｐＱｐｏｏｌへ電子を循環させる反応を阻害する。
【０１４８】
Ａｎｔ−Ａ曝露試料の積算値１と標準試料の積算値１とを比較したところ、飽和なし、待機時間０秒及び待機時間６０秒の各場合では大きな差は認められなかった。また、待機時間０秒の場合には飽和なしの場合よりも積算値１が増加した点も同様であった。しかし、待機時間１０秒の場合に注目すると、標準試料では積算値１が飽和なしと同じ程度まで減少したのに対して、Ａｎｔ−Ａ曝露試料では待機時間０秒の場合と同様に増加しており、待機時間６０秒の場合に飽和なしと同等まで減少した。本来ＰＳＩＩ内部の電子蓄積が解消されているはずの待機時間１０秒においてもＰＳＩＩ内部の電子蓄積が多い状態にあったことについては、ＰＳＩＩからの電子取出しが阻害されたのではなく、飽和の回復が遅かったか、又は、異なる経路からＰＳＩＩに電子が流入した可能性が考えられる。
【０１４９】
Ａｎｔ−Ａ曝露試料の積算値２は、全ての条件において標準試料の場合よりも発光量が低くなった。しかし、待機時間０秒の場合に最小値を示し、待機時間が長くなるにつれ徐々に飽和なしの値に近づく傾向は、標準試料の場合と同じであった。このことは、標準試料に比べて酸化型プラストキノンが減少しているが（ｐＱｐｏｏｌが還元状態である）が、ｃｙｔｂ６ｆにおける酸化型プラストキノンの生成は阻害されていないことを表している。このことは、Ａｎｔ−Ａがｃｙｔｂ６ｆにおける酸化型プラストキノンの生成を阻害しないことと一致する。
【０１５０】
Ａｎｔ−Ａ曝露試料の積算値３は、全ての条件において標準試料よりも発光量が低くなった。また、標準試料において観察された、待機時間１０秒における積算値３の増加も観察されなかった。上記のように、待機時間１０秒における積算値３の増加には循環的電子伝達が関与していると考えられるので、この結果は、ＰＳＩ以降の電子蓄積が減少し且つＰＳＩからｐＱｐｏｏｌへ至る電子の流れが阻害されたことを表しているといえる。ＰＳＩからｐＱｐｏｏｌへの電子の流れが阻害されたことは、Ａｎｔ−Ａが循環的電子伝達を阻害することと一致する。ＰＳＩＩの電子蓄積の減少についても、循環的電子伝達の阻害によりｐＱｐｏｏｌから再度ＰＳＩに流入する電子が減少したためと考えられる。循環的電子伝達の阻害により行き場を失った電子は何らかの機構によりＰＳＩＩに移動し、その結果、上述した待機時間１０秒における積算値１の増加を引き起こしたという可能性も考えられる。
【０１５１】
次に、図２４〜２６を用いて、実施例における標準試料および各曝露試料の測定値に基づいて上述の評価値算出方法を実施して得た値ｅＩＩ、ｖＩＩ、ｖＱ、％ｏＱ、ｅＩ及びｃＩについて説明する。図２４は、各試料の飽和なしにおける値ｅＩＩ及びｖＩＩを示す表である。図２５は、各試料の値ｖＱ及び％ｏＱを示す表である。図２６は、各試料の飽和なしにおける値ｅＩ及びｃＩを示す表である。
【０１５２】
図２４に示すように、ＤＣＭＵ曝露試料の飽和なしにおける値ｅＩＩは１８８であったので、標準試料の場合よりもＰＳＩＩでの電子蓄積が増加したことがわかる。また、ＤＣＭＵ曝露試料のｖＩＩが負の値となったことから、ＰＳＩＩからの電子取出しはなく、逆にＰＳＩＩに電子が流入している状態であったことがわかる。これは、ＰＳＩＩからの電子取出しを阻害し、ＰＳＩＩの電子蓄積を増加させるＤＣＭＵの作用と合致する。
【０１５３】
また、図２５に示すように、ＤＢＭＩＢ曝露試料は値ｖＱが３０となった。これは、標準試料に比べ光照射による酸化還元反応が減少したことを示している。また、値％ｏＱについて見ると、標準試料では、待機時間１０秒で３６、待機時間６０秒で１０７であったのに対して、ＤＢＭＩＢ曝露試料では、待機時間１０秒で４、待機時間６０秒で２２というように、標準試料の場合と比較して減少した。これは、ＤＢＭＩＢ曝露試料では、標準試料と比べてｐＱｐｏｏｌの酸化還元反応が低下しｃｙｔｂ６ｆでのプラストキノンの再酸化が低下したことを示す。このことは、ｃｙｔｂ６ｆでのプラストキノンの再酸化反応を阻害するＤＢＭＩＢの作用と合致している。
【０１５４】
また、図２６に示すように、Ａｎｔ−Ａ曝露試料の飽和なしにおける値ｅＩは８９であり、ＰＳＩの電子蓄積は標準試料の場合比較してそれほど減少していない。しかし、標準試料の待機時間１０秒における値ｃＩが３８であるのに対して、Ａｎｔ−Ａ曝露試料の待機時間１０秒における値ｃＩは−１２となっている。これは、Ａｎｔ−Ａ曝露試料では、ＰＳＩの電子蓄積がそれほど変化しなかったが、ＰＳＩからｐＱｐｏｏｌへの循環的電子伝達などによる電子の流入が低下したことを示す。このことは、循環的電子伝達を阻害するＡｎｔ−Ａの機能と合致している。
【０１５５】
以上、ＤＣＭＵ、ＤＢＭＩＢ及びＡｎｔ−Ａを用いた計測結果から、有害物質を曝露しない標準試料と有害物質を曝露した曝露試料とについて、異なる酸化還元状態の光合成サンプルの遅延発光を計測して計測結果を比較することで、有害物質の有無及びその光合成電子伝達反応への作用の違いを評価することができることがわかった。このような特徴は、化学物質生態リスク評価に代表される、藻類などの光合成サンプルに対する有害物質の影響の評価に対して有用である。
【０１５６】
以上、本発明をその実施形態に基づいて詳細に説明した。しかし、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明は、その要旨を逸脱しない範囲で以下のような様々な変形が可能である。
【０１５７】
上記実施形態では、測定された遅延発光の発光量を測定時間帯毎に積算した積算値に基づいて評価値を導出したが、評価値の導出方法はこれに限定されない。例えば、遅延発光の発光量の経時データ（減衰曲線）が予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするように当該複数の関数の係数値を決定し、この係数値に基づいて評価値を導出してもよい。
【０１５８】
遅延発光の発光量の経時データを経時データ関数にフィッティングする手法（以下「フィッティング手法」という）について詳細に説明する。フィッティング手法を利用するために、複数の関数の情報を予め遅延発光計測装置１の記録部２１に記憶させておく。関数としては、山型の関数を用いることが好ましい。山型の関数とは、形状が山型になる関数のことで、所定の変数値において関数値が最大値となり、当該所定の変数値以下の変数値では単調非減少、当該所定の変数値以上の変数値では単調非増加な関数である。
【０１５９】
複数の関数としては、例えば、ａｉ，ｂｉ，ｃｉ（ｉ＝１，２，３）を複数の関数の係数値、ｔを基準時刻からの経過時間（励起後時間）を示す変数としたときに、それぞれ
【数１】
2008116401.tif 000003
で示されるローレンツ関数（コーシー分布）を用いることが考えられる。係数値ａｉは時間方向への広がり、係数値ｂｉは発光量が最大値を取る励起後時間ｔ、係数値ｃｉは最大値の極大値に、それぞれ影響する。
【０１６０】
この場合、フィッティングに用いる複数の関数の和は、
【数２】
2008116401.tif 000004
となる。ここで、励起後時間ｔの基準時刻は、例えば、光源１２からの光の照射が終了した時刻から予め設定した所定の時間が経過した時刻とする。また、上記（２）の式において、右辺の第１項、第２項、第３項を、それぞれ時間軸上で最大値の現れる順番で、第１関数、第２関数、第３関数というように表す。すなわち、複数の関数の係数において、ｂ１＜ｂ２＜ｂ３の関係が成立する。
【０１６１】
なお、フィッティング手法で用いる関数はこれに限定されず、二次関数、正規分布関数等の他の山型の関数を用いてもよい。また、よくフィッティングする関数であれば、山型の関数でなくてもよい。例えば、上記（２）で示される式に更に係数ｄｉ（ｉ＝１，２，３）を加えた、以下の式で表される関数を用いてもよい。
【数３】
2008116401.tif 000005
【０１６２】
フィッティング手法を実施するためには、フィッティングを行うためのアルゴリズムについても予め記録部２１に記憶させておく。例えば、シンプレックス法、Gauss-Newton法、Davidon Fletcher Powell法、Brent法、モンテカルロ法及びシミュレーテッド・アニーリング法をフィッティングを行うためのアルゴリズムとして用いることができる。
【０１６３】
そして、上記フィッティング手法で算出された係数値に基づいて評価値を導出する。例えば、記録部２１が予め記憶している、評価値を算出するための式に基づいて評価値を算出する。
【０１６４】
このようなフィッティング手法を用いることで、客観的に評価値を導出することが可能となる。また、遅延発光の発光量の経時変化を、例えば上記（２）で示される式又は上記（３）で示される式にフィッティングさせているので、図１などを用いて説明した遅延発光のメカニズムに基づいた評価が可能になる。したがって、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態を適切に評価することができる。
【０１６５】
上記実施形態では、遅延発光の発光量の測定を複数回繰り返す際に変更する第２の照射条件として待機時間を採用したが、変更する第２の照射条件はこれに限定されない。光合成サンプルの酸化還元状態は、光合成サンプルに照射する光のエネルギーと光合成サンプルの電子伝達の効率とに依存するので、例えば、第２の励起光の光量、波長、パルス幅及び照射時間のうち少なくとも一つを変更してもよい。第２の励起光に関するこれらの条件は、図１などを用いて説明した光合成サンプルの酸化還元状態の変化と密接に関係する。そのため、これらの要素のうち少なくとも一つを変更しながら第１の励起光の照射及び第２の励起光の照射を複数回繰り返し、測定された各発光量に基づく評価値を導出することで、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態を適切に評価することができる。
【０１６６】
また、気温や電場など、光合成サンプルの電子伝達効率が変化するような環境要因を変更しながら測定を複数回繰り返してもよい。更に、待機条件と上記変形例との組合せや、上記変形例同士の組み合わせを用いても、複数の酸化還元状態を発生させることができる。そのため、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態を適切に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】光合成電子伝達を示す模式図である。
【図２】実施形態に係る遅延発光計測装置を模式的に示す図である。
【図３】図２に示す遅延発光計測装置を部分的に示すブロック図である。
【図４】光合成サンプルの評価方法の手順を示すフローチャートである。
【図５】待機時間と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。
【図６】励起光の照射光量と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。
【図７】励起光の照射時間と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。
【図８】飽和なしの状態における酸化還元状態と遅延発光との対比を示す模式図である。
【図９】第１の励起光照射後に待機時間を設けなかった場合の、酸化還元状態と遅延発光との対比を示す模式図である。
【図１０】第１の励起光照射後に待機時間を２秒設けた場合の、酸化還元状態と遅延発光との対比を示す模式図である。
【図１１】図５に示した減衰曲線についての積算値を示すグラフであり、（ａ）は積算値１について、（ｂ）は積算値２について、（ｃ）積算値３についてのグラフである。
【図１２】標準試料における待機時間と遅延発光の発光量の経時変化との関係を示すグラフである。
【図１３】評価試料における待機時間と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。
【図１４】図１２及び１３に示した遅延発光の発光量に基づく積算値を示すグラフであり、（ａ）は積算値１について、（ｂ）は積算値２について、（ｃ）積算値３についてのグラフである。
【図１５】実施形態に係る評価プログラムの構成を記録媒体と共に示す図である。
【図１６】図１５に示す評価プログラムが動作するコンピュータのハードウェア構成を示す図である。
【図１７】実施例における標準試料についての遅延発光の発光量の経時変化を示したグラフである。
【図１８】実施例におけるＤＣＭＵ曝露試料についての遅延発光の発光量の経時変化を示したグラフである。
【図１９】実施例におけるＤＢＭＩＢ曝露試料についての遅延発光の発光量の経時変化を示したグラフである。
【図２０】実施例におけるＡｎｔ−Ａ曝露試料についての遅延発光の発光量の経時変化を示したグラフである。
【図２１】実施例における標準試料の積算値とＤＣＭＵ曝露試料の積算値とを比較したグラフであり、（ａ）は積算値１について、（ｂ）は積算値２について、（ｃ）積算値３についてのグラフである。
【図２２】実施例における標準試料の積算値とＤＢＭＩＢ曝露試料の積算値とを比較したグラフであり、（ａ）は積算値１について、（ｂ）は積算値２について、（ｃ）積算値３についてのグラフである。
【図２３】実施例における標準試料の積算値とＡｎｔ−Ａ曝露試料の積算値とを比較したグラフであり、（ａ）は積算値１について、（ｂ）は積算値２について、（ｃ）積算値３についてのグラフである。
【図２４】実施例における標準試料及び各曝露試料の飽和なしにおける値ｅＩＩ及びｖＩＩを示す表である。
【図２５】実施例における標準試料及び各曝露試料の値ｖＱ及び％ｏＱを示す表である。
【図２６】実施例における標準試料及び各曝露試料の飽和なしにおける値ｅＩ及びｃＩを示す表である。
【符号の説明】
【０１６８】
１…遅延発光計測装置、１０…計測ユニット、１１…試料設置部、１２…光源、１３…フィルタ、１４…集光光学系、１５…シャッタ、１６…検出部、１６ａ…光センサ、１６ｂ…光量算出部、１７…筐体、１７ａ…本体部、１７ｂ…蓋部、２０…解析ユニット、２１…記録部、２２…演算部、２３…表示部、２４…入力部、３０…制御ユニット、３１…光源制御部、３２…検出制御部、４１…第１ケーブル、４２…第２ケーブル、５０…評価プログラム、５１…光源制御モジュール、５２…検出制御モジュール、５３…演算モジュール、６０…記録媒体、７０…コンピュータ。
【図１】
2008116401.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2008116401.tif 000011
【図７】
2008116401.tif 000012
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2008116401.tif 000015
【図１１】
2008116401.tif 000016
【図１２】
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【図１３】
2008116401.tif 000018
【図１４】
2008116401.tif 000019
【図１５】
2008116401.tif 000020
【図１６】
2008116401.tif 000021
【図１７】
2008116401.tif 000022
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2008116401.tif 000027
【図２３】
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【図２４】
2008116401.tif 000029
【図２５】
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【図２６】
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