(57)【要約】【課題】酵素などの複数の認識物質が、基板上の一つの流路中に、反応順に別の場所に固定化されたマイクロ流体素子を提供する。【解決手段】基板２に、異なる複数の流路を形成する凹部を有する層を貼り付け、各々の流路に異なる酵素などの認識物質溶液を流し、各流路中の基板上に該異なる認識物質９を固定した後、前記複数の流路を形成する凹部を有する層を剥がし、次いで複数の固定化された認識物質経路に沿った一本の凹部を有する層３を貼り付けることにより、一本の反応流路４中に前記異なる認識物質が異なる場所に固定化されたマイクロ流体素子１が作製される。異なる認識物質として、インベルターゼ、ムタロターゼ、グルコースオキシダーゼが流路４に沿って配置されたマイクロ流体素子を用いて、サトウキビ液などの蔗糖量の測定を行うことができる。【選択図】図１
2008298600.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に反応流路を形成するための凹部を有する層が貼り付けられてなるマイクロ流体素子において、該凹部により一つの流路が形成され、かつ該一つの流路中に、複数の認識物質が、反応順に異なる場所に混在することなく固定化されていることを特徴とするマイクロ流体素子。
【請求項２】
認識物質が酵素であることを特徴とする請求項１記載のマイクロ流体素子。
【請求項３】
流路中の異なる酵素が、インベルターゼ、ムタロターゼ、及びグルコースオキシダーゼであり、これらの酵素が流路にこの順に固定化されていることを特徴とする請求項２に記載のマイクロ流体素子。
【請求項４】
流路を形成する凹部を有する層が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリカーボネート、アクリル樹脂、ガラスまたはシリコンからなる層であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロ流体素子。
【請求項５】
基板に、流路内を流れる溶液の成分量を測定するための測定素子が設けられていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロ流体素子。
【請求項６】
測定素子が電極であることを特徴とする請求項５記載のマイクロ流体素子。
【請求項７】
基板に、互いに異なる液体流路を形成するために用いられる複数の凹部を有する層を貼り付けて、認識物質固定化用流路を形成する工程、
前記複数の認識物質固定化用流路にそれぞれ異なる認識物質溶液を流して流路内の基板面に複数の異なる認識物質を固定化する工程、
前記認識物質固定化流路形成層を剥がす工程、
前記複数の異なる認識物質が固定化された基板に、前記複数の異なる認識物質が固定化された経路に沿った凹部を有する層を貼り付けて、基板上に一つの反応流路を形成し、前記複数の異なる認識物質を該一つの反応流路内に配置せしめる工程
からなることを特徴とするマイクロ流体素子の製造方法。
【請求項８】
認識物質溶液が酵素溶液であることを特徴とする請求項７記載のマイクロ流体素子の製造方法。
【請求項９】
認識物質固定化流路形成層を貼り付ける工程の前に、基板面の認識物質固定場所に認識物質固定化用前処理膜を形成する処理工程が設けられることを特徴とする請求項７又は８に記載のマイクロ流体素子の製造方法。
【請求項１０】
認識物質固定化用前処理膜が金蒸着膜であることを特徴とする請求項９記載のマイクロ流体素子の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載のマイクロ流体素子の微細反応流路に液体を導入し、液体中の成分を認識物質により順次反応させ、得られた反応生成物の量を測定することを特徴とする液体中の成分分析を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、μ−ＴＡＳ（マイクロ  トータル  アナリシス  システムズ）などで用いられるマイクロ流体素子及びその製造方法並びに該マイクロ流体素子を用いた分析方法に関し、詳細には、微細流路内に複数の認識物質が各々別の場所に固定化されたマイクロ流体素子及びその製造方法、並びに該マイクロ流体素子を用いた分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、様々な分野において、液体の成分分析が行われているが、成分分析は特定の施設で、特定の装置を用いて行わなければならず、分析に長時間を有していた。このような事態を解決するため、基板上に分離器、混合器、検出部、分析部を設け、カードサイズに小型化したマイクロ化学分析システム（μ−ＴＡＳ）の開発が近年特に盛んに行われている。このようなマイクロ化学分析システムの利用により、サンプル液を分析設備を有する施設まで送る必要なく、現場で直ちに且つ少いサンプル量により分析ができる。また、マイクロ化学分析システムでは、分析試薬の量も少なくて済み、反応用液の温度の均一性、制御性も優れ、マイクロ流体素子は使い捨とすることもでき、安全、衛生的であり且つ安価に分析、検査を行えることが期待できる。
【０００３】
このような液体の成分分析は、例えば医療分野、工業分野、農業分野、遺伝子解析、犯罪捜査など幅広い分野での利用が考えられる。例えば医療分野では、赤血球や白血球の数などの血液成分の測定、検査や、各種タンパク質、ホルモン、抗体などの測定、検査などの生化学分析が、工業分野では製品中の成分検査、廃液の成分検査などが、農業分野では、野菜、果実の糖度測定、残留農薬測定などが、また遺伝子解析では遺伝子情報の解読による病気の予防診断が考えられる。このような液体の成分分析におけるマイクロ化学分析システムなどにおいては、流路内に酵素などの反応触媒や、抗体、結合タンパク質、レセプターなど、被検出物と特異的に反応または結合することにより、特定の被検出物のみを認識し得る物質（本明細書においては、これら反応触媒及び特定の被検出物のみを認識し得る物質を総称して、「認識物質」という。）が固定されたマイクロ流体素子が用いられている。従来提案されている酵素、抗体などの前記するような認識物質が微細流路内に固定されたマイクロ流体素子においては、マイクロ流体素子の流路内に一つの認識物質が固定されたものであり、液体の特定成分の分析に複数の酵素、抗体などの認識物質を用い、これら固定された異なる複数の認識物質とサンプル液が順次接し、反応が順次行われなければならないような場合には、前記各々一つの認識物質が固定された異なる複数のマイクロ流体素子を用い、これら複数のマイクロ流体素子の流路を新たな流路で接続して使用するか、前記複数のマイクロ流体素子を多段に重ね合わせることにより各素子の流路を接続して、測定、検査を行うことがなされている。しかし、このような新たな流路を設けたり、複数の素子を用いることは、操作が煩雑となり、また取り扱い性や液漏れの問題、流路の接続部の空間が大きく、試薬量や計測時間、費用的な問題もあり、好ましいものではない。
【０００４】
一方、マイクロ流路を形成する方法としても種々の方法が知られている。例えばシリコン、ガラス又はセラミックス基板上に樹脂層を設け、この樹脂層をレーザ加工したのち、上面に樹脂被覆膜を設ける方法（特許文献１、２参照）、フォトレジストをマスクを用いて紫外線照射し、未露光部を現像液で除去して流路を形成する方法（特許文献３参照）、マイクロ放電加工法やダイヤモンドのような固い材料で作られたマイクロ工具を用いる機械的マイクロ切削加工法などが挙げられる。また、シリコン基板上にフォトレジストを塗布し、マスクを通して露光した後現像することにより、基板上にマイクロ流路の母型となる凸部を形成し、この母型上にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）原液／硬化液混合液を流し込み、硬化させて流路となる凹部を有する硬化膜を形成し、この硬化膜を剥がして他のシリコン、ガラスなどの基板に貼り付けてマイクロ流路を形成する方法（例えば、特許文献４参照）なども知られている。
【０００５】
上記の通り、マイクロ流体素子を形成するための方法として種々の方法が知られており、また酵素などの固定化手法も種々知られているが、複数の異なる酵素、抗体などの認識物質を用いて連続的に反応を起こさせる場合に有効な、複数の認識物質を一つの微細な流路の別の場所に固定化する方法は知られていない。例えば、従来、スクリーン印刷などで複数の酵素を固定化しようとした例もあるが、現在のところ５００μｍ〜１ｍｍ幅で可能となっているにすぎず、これより更に微細な流路ではスクリーン印刷による方法は採用できない。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−２８３２９３号公報
【特許文献２】特開２００４−１６７６０７号公報
【特許文献３】特開２００４−１９４６５２号公報
【特許文献４】特開２００４−２９６０９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、複数の酵素、抗体などの認識物質を用いて触媒的反応、結合反応、抗原抗体反応などの反応を順次連続的に行う場合、マイクロ流路を用いると、必要な反応を必要な量のみ行う制御が可能となることから、高効率、高収率化が期待できる。また、反応をカスケード式に行う場合、一つのマイクロ流路で行うことで、必要としている反応のみを行わせることができるようになる。例えば、マクロな系であれば、１と２の反応の場所を明確に分けることが困難であるが、マイクロ流路に複数の認識物質を固定すると、１の反応のみを起こさせて得られた生成物に、引き続き別の２の反応を起こさせるということが可能となる。このとき複数の認識物質を流路に沿って、別々の場所に固定化することが必要となるが、上記するように、基板上の微細な一つの流路に沿って、別々の場所に異なる酵素、抗体などの認識物質を５００μｍ以下の幅で精度よく、かつ必要な場所に固定化することは従来困難であった。流路幅は小さければ小さいほど使用する試薬の量は少なくできる上、温度などの応答性は良くなる。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、異なる酵素、抗体などの認識物質が、基板上の一つの微細流路中に、反応順に別の場所に固定化されたマイクロ流体素子を提供することである。
本発明の他の目的は、異なる酵素、抗体などの認識物質を、基板上の一つの流路中に、反応順に別の場所に固定化する方法を提供することである。
また、本発明の他の目的は、上記固定化法により固定化された、複数の異なる認識物質を流路の別の場所に有するマイクロ流体素子を製造する方法を提供することである。
さらに、本発明の他の目的は、上記マイクロ流体素子を用いた分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究、検討を行った結果、本発明を成したものである。
すなわち、本発明は、基板上に反応流路を形成するための凹部を有する層が貼り付けられてなるマイクロ流体素子において、該凹部により一つの流路が形成され、かつ該一つの流路中に、複数の認識物質が、反応順に異なる場所に混在することなく固定化されていることを特徴とするマイクロ流体素子に関する。
【００１０】
また、本発明は、基板に、互いに異なる液体流路を形成するために用いられる複数の凹部を有する層を貼り付けて、認識物質固定化用流路を形成する工程、前記複数の認識物質固定化用流路にそれぞれ異なる認識物質溶液を流して流路内の基板面に複数の異なる認識物質を固定化する工程、前記認識物質固定化流路形成層を剥がす工程、前記複数の異なる認識物質が固定化された基板に、前記複数の異なる認識物質が固定化された経路に沿った凹部を有する層を貼り付けて、基板上に一つの反応流路を形成し、前記複数の異なる認識物質を該一つの反応流路内に配置せしめる工程からなることを特徴とするマイクロ流体素子の製造方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、上記マイクロ流体素子の微細反応流路に液体を導入し、液体中の成分を認識物質により順次反応させ、得られた反応生成物の量を測定することを特徴とする液体中の成分分析を行う方法に関する。なお、前記反応は、認識物質と液体中の成分の結合をも含むものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のマイクロ流体素子は、複数の酵素、抗体などの認識物質が、基板上の一つの流路中の異なる場所に反応順に固定されていることから、従来のように各々異なる認識物質を固定化した複数の基板を用い、これら複数の基板を重ねたり、これら基板の流路を結合する新たな流路を設ける必要がなく、無駄な空間がなく、操作性、取り扱い性に優れるとともに、液漏れなどが発生することはなく、また分析あるいは検査試料となる液体、使用される試薬も少なくて済み、安価で、短時間に分析対象となる反応生成物を得ることができるマイクロ流体素子を提供できる。
【００１３】
また、本発明の認識物質を基板上の流路の異なる場所に固定化する方法により、従来困難であった複数の酵素などの認識物質を微細な幅で異なる場所に簡単に固定化することができる。
【００１４】
また、本発明のマイクロ流体素子の製造方法により、一つの基板上の一つの流路中の異なる場所に複数の異なる認識物質が各々固定化されているマイクロ流体素子を簡単に製造することができる。
【００１５】
また、本発明の液体中の成分分析を行う分析方法においては、複数の酵素、抗体などの認識物質が基板上の一つの流路中の異なる場所に反応順に固定化されていることから、成分分析において複数のマイクロ流体素子を用いる必要がなく、一枚の基板により分析を行うことができることから、分析を安価に、短時間で、制御性良く行うことができ、分析、検査に使用されるサンプル量も少量で済み、且つ分析も正確に行うことが可能となる。また、マイクロ流体素子の特徴として、温度などの制御性に優れることを利用して、複数のそれぞれの反応の条件を最適にすることも可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
まず、本発明のマイクロ流体素子を、図１及び図２を参照して説明する。なお、図は本発明を説明するためのものであり、各々の要素の大きさは説明の都合上大きさを変えて表現してある。図１は本発明のマイクロ流体素子の平面模式図であり、図２はその一部（Ｘ−Ｘ’線）断面模式図である。図１及び図２において、１はマイクロ流体素子、２は基板、３は反応用流路形成層、４は流路、５は流路始点の孔、６は流路終点の孔、７は測定用電極、８は認識物質固定化前処理膜、９は酵素、抗体、結合タンパク質、レセプターなどの認識物質を示す。図２から明らかなように、本発明のマイクロ流体素子は、基板２上に液体の流路４を形成する凹部を有する反応用流路形成層３が積層されて形成されている。液体流路４中には、必要に応じ設けられる、認識物質を固定化するための前処理膜８及び該前処理膜上に固定化された認識物質層９を有している。そして、図１に記載されるように、液体流路４は始点５から終点６まで１本の流路とされている。流路は複数の折り返し流路の集合体Ａ、Ｂ、Ｃからなる３つのブロックに分けられ、各ブロックでは異なった認識物質が固定化されている。また、図１のマイクロ流体素子においては、基板上に、反応液の成分を測定するための電極７が設けられている。
【００１７】
本発明のマイクロ流体素子の各要素について説明する。マイクロ流体素子を構成する基板２は、流路を流れるサンプル液の成分及び反応後のサンプル液の成分と反応せず、また認識物質にダメージを与えないものである限りどのような材料であってもよい。具体的には、例えば、ガラス、シリコンなどの無機材料からなる基板、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアミド、アクリル樹脂、ポリカーボネート、酢酸セルロース、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリルなどの合成樹脂からなる有機材料基板が挙げられる。サンプル液は通常水溶液であることから、基板として合成樹脂を用いる場合には、水に対する濡れ性のよいものを用いることが好ましい。水に対する濡れ性が低いものについては、表面処理を行うとか、表面に親水性の膜を設けるなどして、水との親和性を改善することが好ましい。基板の厚さは、特に限定されるものではない。しかし、マイクロ流体素子が撓んでも流路が塞がれて液体が流れなくなったり、液体が外部や近接の流路に漏れたりしないことは必要である。
【００１８】
また、反応流路形成層３の材料も、基板同様、サンプル液に対する濡れ性に優れ、また流路を流れる分析用溶液の成分、反応後のサンプル液の成分と反応せず、認識物質にダメージを与えない材料であればどのような材料であってもよい。しかし、反応流路形成層は、複数の認識物質を基板に固定化した後、該基板に貼り付けられて形成され、流路は微細であり、さらに少なくとも流路形成層は分析中は密着した状態で剥れないことも必要とされることから、このような基板との密着性並びに基板への粘着性を有し、また微細流路用の凹部を一面に形成することのできる材料を用いることが好ましい。この様な微細な流路用凹部を一面に形成することができ、また基板との密着性、粘着性に優れた材料としては、従来からマイクロ流体素子の流路を形成する材料として利用されているシリコン樹脂の一種であるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が挙げられる。しかし、本発明で用いられる反応流路形成層材料が、これに限られるものでなく、前記諸特性を満たすものであれば、どのような材料でも使用可能である。例えば、ＰＤＭＳ以外のシリコン樹脂で、上記特性を有するものが挙げられる。また、前記流路形成層の凹部形成面に、流路が潰れないように接着剤や粘着剤層を設けることができれば、このときには、流路形成層材料に、基板との密着性、自己粘着性のような特性は要求されない。このため流路形成層の材料としては、例えばガラス、シリコンなどの無機材料、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）などのアクリル樹脂、ポリカーボネートなど従来周知あるいは公知の合成樹脂などを用いることもできる。
【００１９】
図１においては、流路４は折り返し経路とされている。通常反応を進行させるためには、流路内に導入されたサンプル液と認識物質との接触時間をある程度の時間保つ必要がある。図１において、流路が折り返し形状とされているのは、小面積で長い流路を確保するためであり、流路が短くてよい場合には、直線状としてもよい。また流路は折り返し形状以外の形状とされてもよい。図１においては、３組の認識物質の流路の長さは同じ長さとされているが、分析、測定を行おうとする成分、認識物質の種類に応じ、必要であればそれぞれの認識物質に対する流路の長さを異なったものとしてもよい。要は、各認識物質に対応する流路の長さは、その認識物質による溶液成分の測定に必要な反応がそれぞれ行われる長さがあればよいのである。
【００２０】
基板上には、複数の認識物質が各々異なった場所に、流路に沿って線状パターンとして設けられる。図１では、３種の異なる認識物質層が折り返し線状パターンとして設けられているが、認識物質は２種でもよいし、３種以上であってもよい。分析を行う溶液の成分に応じ、また必要とされる分析成分に応じ、その種類と数を調製すればよい。認識物質としては、反応触媒として機能する酵素を用いることが好ましいが、反応触媒は酵素に限られるものではないし、反応触媒以外にも、特定の被検出物のみを認識し得る物質として知られた、抗体、結合タンパク質、レセプターなどを用いることもできる。また、認識物質は、これら以外のものであってもよい。酵素としては、例えば、インベルターゼ、ムタロターゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、カタラーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ、ウリアーゼ、トリプシン、セファロスポリナーゼなどが挙げられるが、本発明のマイクロ流体素子で用いられる酵素がこれらに限定されるものではない。また、本発明のマイクロ流体素子においては、認識物質は基板上に複数固定されるが、その種類、順番は、分析対象となる成分が何かによって適宜の組み合わせとすればよい。例えば、果物、サトウキビなどの液中の蔗糖量を測定する場合、好ましい組み合わせとしては、第１ブロックＡにインベルターゼが、第２ブロックＢにムタロターゼが、第３ブロックＣにグルコースオキシダーゼが固定される。
【００２１】
前記認識物質は基板に直接固定化することが難しいことが多い。このため、通常、認識物質を固定化する前に基板の前処理や固定用試薬を用いて固定化することがなされる。基板上に認識物質固定化用の前処理膜８を形成する場合、この前処理膜形成処理法としては、従来マイクロ流体素子において認識物質を基板上に固定化する際に行うことが知られた何れの方法が用いられてもよい。例えば酵素を固定化する際の前処理法としては、金、銀、白金などを蒸着する方法、オスニウムポリマーを流して用いる方法などが挙げられる。しかし本発明での前処理法が、これらに限られるものではない。前処理膜は、これら前処理により基板表面に形成された層であり、例えば金蒸着法によれば、ガラス板との密着性をよくするため必要に応じ用いられるクロムあるいはチタン層を介した金蒸着膜であり、オスニウムポリマーを用いる場合であれば、オスニウムポリマー層となる。これら前処理膜は、さらに他の材料によって処理されてもよい。また、認識物質溶液とともに固定化するための試薬を流すようにしてもよい。例えば、酵素を固定化するための固定化試薬の一例としては、グルタルアルデヒドなどが挙げられる。このときには前処理膜８は形成されること無く、認識物質が基板に直接固定される。さらに、認識物質が基板に直接固定化できる場合には、勿論前処理膜を形成することは必要とされない。
【００２２】
以下、本発明のマイクロ流体素子を製造する方法を、図３、図４及び図５を参照しつつ説明する。図３は、認識物質固定化のための前処理膜が設けられた基板の平面模式図である。図４（ａ）は認識物質を固定化する際の流路を形成するために用いられる認識物質固定化流路形成層の平面模式図であり、図４（ｂ）は図４（ａ）のＹ−Ｙ’線の断面模式図である。図５は、認識物質固定化流路形成層が貼り付けられた基板の平面模式図である。
【００２３】
図３に示されるように、清浄な基板２上に反応流路に沿って、反応流路の幅より幾分小さい幅を有する前処理膜８Ａ、８Ｂ、８Ｃが３箇所線状パターンとして形成される。図３では、前処理膜の線状パターンが３箇所設けられているが、前記したように、分析を行うために認識物質が２種類必要な場合には、前処理膜の線状パターンは２箇所設ければよいし、４種類以上必要な場合には、４箇所以上設ければよい。なお、前処理膜は、認識物質が基板に直接固定化できれば設けられなくてよい。しかし、認識物質として酵素、抗体、ＤＮＡ断片などの結合タンパク質、レセプターなどが用いられる場合、これらは基板に直接固定化することが難しく、このためマイクロ流体素子を製造する場合、通常認識物質を基板に固定化するために基板の前処理が行われる。前処理方法としては、従来マイクロ流体素子に前記酵素などの認識物質を固定化する際に採用されている方法であればどのようなものであってもよい。このような認識物質固定化前処理として、金の蒸着膜を形成する方法が挙げられる。金の蒸着膜を微細な線状パターンとして基板上に形成するには、例えば基板上にフォトレジスト膜を塗布形成するあるいはドライフィルムを貼り付けるなどした後、線状パターンを有するマスクを通して露光し、現像して、基板上に線状の溝を有するレジストパターンを形成し、金を蒸着した後レジストを除去する方法、基板上に金を全面に蒸着した後、この蒸着膜の上にフォトレジスト膜を形成し、線状パターンを有するマスクを通して露光し、現像して、基板上に線状部を覆うレジストパターンを形成し、レジストパターン部以外の金をエッチング除去する方法、蒸着したいところに孔の開いているステンシルマスクを基板に密着させて直接蒸着させる方法など、任意の方法が採られる。金蒸着膜が前処理膜として形成される場合には、必要に応じ同時に測定素子としての電極７が形成されてもよい。なお、測定素子としての電極は予め基板上に設けられてもよい。また、このとき、基板に位置合わせ用のマーク１０が同時に形成されてもよい。勿論位置合わせ用のマーク１０は予め基板に設けられてもおいてもよい。
【００２４】
次いで、この前処理された基板上に、図４に示される、酵素などの認識物質を固定化するために用いられる、前記前処理膜に沿った流路を形成する凹部１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃを有する認識物質固定化流路形成層１１が貼り付けられる。認識物質固定化流路形成層１１を基板２上に貼り付けたものを図５に示す。認識物質固定化流路形成層１１は、流路内に認識物質溶液が流されている間は流路から認識物質溶液が漏れないよう基板に密着されていることが必要であるが、認識物質が基板に固定化された後には、基板から剥がされる。このため、認識物質固定化流路形成層１１は、基板との密着性がよく、また剥がしやすい特性を有する層であることが必要とされる。通常接着剤や粘着剤を用いて層を貼り付けると、層を剥がすことが難しくなることから、認識物質固定化流路形成層１１の基板への貼り付けには接着剤や粘着剤を用いることはできない。しかし、粘着剤として易剥離性の粘着剤を用い、凹部が粘着剤で潰れることなく、また液漏れが生ずることなく認識物質固定化流路形成層を貼り付けることができる場合には、層自体に密着性や、自己粘着性は必要とされない。このような場合には、ガラス、シリコンなどの無機材料やポリカーボネート、アクリル樹脂などの従来周知あるいは公知の層形成性材料を用いることができる。上記のごとき基板との密着性がよく、また剥がしやすい特性を有する層としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）層が好ましいものとして挙げられる。ポリジメチルシロキサン層に、前処理膜に沿った、認識物質溶液を流すために利用される線状の凹部（溝）を形成するには、次のような方法が好ましい方法として挙げられる。すなわち、ガラスなどの基板上に前記溝の深さに対応する厚さを有するフォトレジスト膜を形成し、前処理膜のパターンに沿ったパターンのマスクを通して露光し、現像して前処理膜のパターンに沿った、前処理膜と同じ又は前処理膜より幾分幅の広い凸状のレジストパターンを形成する。これを母型として用い、この型の上に硬化前のポリジメチルシロキサン原液と硬化液との混合液を流し、加熱硬化させて、複数の線状の凹部を有するポリジメチルシロキサン層を形成する。これを母型から剥がし、各流路用凹部の始点及び終点部に孔１３、１４を開けて、認識物質固定化流路形成層１１が形成される。認識物質固定化流路形成層１１にも、基板との位置合わせのために位置合わせ用のマーク１５が設けられるが、この位置合わせ用マークは母型に形成しておくことにより、そのレプリカである認識物質固定化流路形成層１１に転写、形成させることが好ましい。
【００２５】
認識物質固定化流路形成層１１が貼り付けられた基板には、凹部１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃにより形成された各流路の始点孔１３から終点孔１４に向けて、各々異なる認識物質溶液が流される。このとき、終点孔部を減圧することにより、認識物質溶液を流すようにすると、認識物質固定化流路形成層１１が基板から剥がされることなく溶液が流路内を流れることから、このような方法を採用することが認識物質溶液を流路内に導入する際には好ましい。始点孔１３、終点孔１４には、孔から認識物質溶液が零れ出ることを防ぎ、また孔内に液が流れ込みやすいようにパイプなどが接続されてもよい。終点孔１４にも、孔を減圧しやすいように、また液を回収しやすいようにパイプなどが接続されてもよい。また、始点孔と終点孔はそれぞれ逆に使われてもよい。例えば、認識物質として酵素であるムタロターゼが用いられる場合、市販のムタロターゼの溶液を始点孔に垂らし、終点孔から減圧すると１分程度で内部に霧状に付着する様子が見えた。また、内面の親水性の処理を行えば、溶液が流れ込んでくるため、その場合は１分程度流路内で接触させ、その後溶液を流路から除去し、流路内を乾燥させる。こうした手順により、酵素が前処理膜に固定化される。その後認識物質固定化流路形成層１１が剥がされて、認識物質が固定化された基板が形成される。
【００２６】
こうして得られた認識物質が固定化された基板上に、反応流路形成層３を貼り付けることにより、図１に示されるマイクロ流体素子１が形成される。反応流路形成層の材料としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましいが、反応流路形成層３がこれに限定されないことは既に述べたとおりである。また、反応流路形成層がポリジメチルシロキサン層から形成される場合には、認識物質固定化流路形成層膜１１を形成した方法と同様な方法により流路を有する層を形成することができる。反応流路の幅は、認識物質層の幅と同じでもよいが、通常幾分広くされることが好ましい。このため、反応流路形成層の凹部の幅は、認識物質層の幅より広く形成されることが好ましい。
【００２７】
なお、認識物質固定化流路形成層や反応流路形成層の凹部の形成は、上記の方法に限られるものでなく、使用材料などに応じ、従来知られた他の方法、例えばレーザ加工やフォトレジストを用いる方法など任意の方法を採用することができる。
【００２８】
得られたマイクロ流体素子は、種々の溶液の成分分析、検査に用いることができる。これら成分分析の一例として、果物あるいはサトウキビなどの蔗糖量の測定が挙げられる。例えば、サトウキビの蔗糖量を測定する場合には、酵素としてインベルターゼ、ムタロターゼ、グルコースオキシダーゼを流路Ａ、Ｂ、Ｃに固定化したものが用いられる。マイクロ流体素子１の孔５にサトウキビからの搾り液を垂らし、終点孔部を減圧にすることにより反応流路４内に液が導入されると、液は流れていくにしたがって、Ａブロックにおいて蔗糖（スクロース）がα−Ｄグルコースと果糖（フルクトース）に加水分解され、Ｂブロックにおいてα−Ｄグルコースがβ−Ｄグルコースに変換され、Ｃブロックにおいてβ−Ｄグルコースが過酸化水素とグルコン酸とされる。検出部においては、電極７により過酸化水素量すなわち電荷を測定することにより、液の蔗糖量が決定される。
【００２９】
溶液の成分または成分量の測定は、上記のような電極電位変化などの電気量の測定に限られるものでなく、光量、熱量、圧電素子の振動周波数変化など、従来知られた測定法が測定物質に応じ適宜用いられればよい。例えば、化学発光酵素イムノアッセイにおいては発光光量測定、ケミルミネッセンスアッセイにおいては、吸光量、蛍光発光量、化学発光量測定が行われる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
【００３１】
（実施例１）
酵素の流路中への固定
（１−１）ガラス基板上への金蒸着パターンの形成
ガラス基板上にフォトレジスト法により、１００μｍ幅で、折り返し４回とされた３組の線状の金蒸着膜８Ａ、８Ｂ、８Ｃを形成した（図３参照）。この金蒸着部の折り返し形状は、作製されるマイクロ流路素子の流路に沿った形状とされる。また、３組の折り返し金蒸着部には、後の工程で各々異なる酵素が固定される。このとき、基板上に、流された分析用の液の成分を分析するために用いられる白金電極７を設けた。
【００３２】
（１−２）酵素を固定化するための流路の作製
ガラス基板上に厚膜フォトレジストＳＵ−８（マイクロケム社製）を乾燥膜厚４０μｍとなるようスピンコートし、９０℃で１時間予備加熱した。流路幅１５０μｍを有し、折り返し形状の３組の流路パターンの描かれたマスクを通して紫外線を照射し、９０℃１時間加熱することにより光照射部を硬化させた。ＰＧＭＥＡ（プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート）を用いて現像し、未硬化部を除去し、水洗した後乾燥し、ガラス基板／ＳＵ−８凸型（ガラス基板凸型）を形成した。この凸型を酵素固定用の流路を形成するために用いられる膜の成形母型とした。
【００３３】
こうして得られたガラス基板凸型上に、ＰＤＭＳ原液（ダウ・コーニング社製：ＳｙｌｇａｒａｄTM  １８４）１０重量部に対し硬化液１重量部を混合した混合液を１〜２ｍｍ厚となるよう流し込み、真空脱気した後、７０℃で１時間硬化させた。次いで、硬化された膜をガラス基板凸型から静かに剥がし、凹状の３組の溝を有するＰＤＭＳ層（ＰＤＭＳ凹型）を作製した。凹状の溝は酵素を固定するための酵素溶液供給流路となるもので、その幅は２３０μｍ、深さは３０−４０μｍであった。
【００３４】
この作製された３本の流路の各始点と終点部分に孔を開け、先に作製されていた金蒸着パターンを有するガラス基板に、前記金蒸着折り返し層が酵素固定用流路内に位置するよう貼り合わせた。なお、位置合わせを簡単に且つ正確に行うため、ガラス基板、ガラス基板凸型に各々位置合わせマークを形成しておいた。ガラス基板凸型に位置合わせマークが形成されていることから、そのレプリカであるＰＤＭＳ凹型にも、位置合わせマークが転写、形成された。
【００３５】
（１−３）酵素の固定
酵素固定化用流路形成層を貼り合わせ後、各流路の始点となる孔から各々異なる酵素液を注入し、終点の孔を吸引して減圧とすることにより流路に酵素溶液を導入し、金蒸着膜に酵素を固定化した。前記減圧により、ＰＤＭＳ凹型のガラス基板との密着性も増し、酵素溶液が流路外に漏れることが防止でき、且つスムースに液を流すことができた。本実施例では、第１流路１２Ａにインベルターゼ溶液を、第２流路１２Ｂにムタロターゼ溶液を、第３流路１２Ｃにグルコースオキシダーゼ溶液を流し、各々流路内の金蒸着膜に固定化した。各酵素はおよそ３ｍｏｌ／Ｌの濃度とした。こうして得られた、酵素が固定化されたガラス基板から酵素固定用のＰＤＭＳ凹型を剥がし、純水で洗浄して、酵素固定ガラス基板を得た。
【００３６】
マイクロ流体素子の形成
（１−４）反応用流路の形成
上記（１−２）と同様の方法で、反応用流路形成用ＰＤＭＳ凹型を形成するためのガラス基板凸型を作製し、この凸型を用い、上記（１−２）と同様の方法で、反応用流路が凹状に形成されたＰＤＭＳ層（反応用ＰＤＭＳ凹型）を作製した。反応用流路の幅は２５０μｍ、深さ（高さ）は７０μｍであった。反応用流路は、酵素固定化用流路と異なり、図１に示されるように始点から終点まで一本の流路４とされた。
【００３７】
（１−５）
反応用ＰＤＭＳ凹型の流路形成凹部の始点と終点に孔を開けた後、反応用ＰＤＭＳ凹型の流路にガラス基板上の各固定酵素膜パターンが一致するように位置合わせし、貼り付けて、マイクロ流体素子とした。このときも、酵素固定用ＰＤＭＳ凹型と同様にして、反応用ＰＤＭＳ凹型に位置合わせマークを形成し、この位置合わせマークを利用して酵素膜パターンと反応流路の位置合わせを行った。このようにすることで、一本の流路中の異なる場所に微細な酵素パターンを固定化することができた。
【００３８】
蔗糖量の測定
得られたマイクロ流体素子を用いて、サトウキビの蔗糖量の測定を行った。サトウキビの絞り液をサンプル液として用い、マイクロ流体素子の流路始点孔にサンプル液を垂らし、終点孔部を減圧としてやることにより、流路内にサンプル液を流した。得られた反応物の過酸化水素量を電荷量として測定することにより、サトウキビ液中の蔗糖量が算出された。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明のマイクロ流体素子の平面模式図である。
【図２】図１のマイクロ流体素子のＸ−Ｘ’線の断面模式図である。
【図３】認識物質固定化のための前処理膜が設けられた基板の平面模式図である。
【図４】（ａ）は認識物質を固定化する際の流路を形成するために用いられる層の平面模式図であり、（ｂ）はＹ−Ｙ’線の断面模式図である。
【図５】認識物質固定化流路形成層が貼り付けられた基板の平面模式図である。
【符号の説明】
【００４０】
１  マイクロ流体素子
２  基板
３  反応用流路形成層
４  液体の流路
５、１３  流路始点の孔
６、１４  流路終点の孔
７  測定用電極
８  認識物質固定化前処理膜
９  認識物質層
１０、１５  位置合わせマーク
１１  認識物質固定化流路形成層
１２  凹部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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