(57)【要約】【課題】サンプル液がごく微量しかない場合でも効率的に濃縮し、ハンドリングによる誤差を低減する。【解決手段】検出対象物質を含むサンプル液の濃縮方法であって、サンプル液と磁気ビーズ１４とを接触させてサンプル液中の検出対象物質以外の媒質を吸着させる工程と、磁気ビーズ１４に磁場を印加することにより、濃縮させたサンプル液から磁気ビーズ１４を取り除く工程と、を備えた。【選択図】  図１
2008249422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象物質を含むサンプル液の濃縮方法であって、
前記サンプル液と磁気ビーズとを接触させて前記サンプル液中の検出対象物質以外の媒質を吸着させる工程と、
前記磁気ビーズに磁場を印加することにより、前記サンプル液から前記磁気ビーズを取り除く工程と、
を備えたことを特徴とするサンプル液の濃縮方法。
【請求項２】
前記サンプル液の量は、２０μＬ以下であることを特徴とする請求項１に記載のサンプル液の濃縮方法。
【請求項３】
前記磁気ビーズは、磁性粒子と、該磁性粒子の周囲に前記媒質を吸着するコート層を備えた粒子であることを特徴とする請求項１又は２に記載のサンプル液の濃縮方法。
【請求項４】
前記サンプル液と接触させる磁気ビーズの量を変えることにより、前記サンプル液の濃縮量を調整することを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のサンプル液の濃縮方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のサンプル濃縮方法により前記サンプル液を濃縮する工程と、
前記濃縮した後のサンプル液に含まれる検出対象物質を検出する工程と、
を備えたことを特徴とする検出対象物質の検出方法。
【請求項６】
前記濃縮したサンプル液には抗原が含まれるとともに、
前記検出工程においては、前記濃縮したサンプル液に更に抗体を接触させて抗原抗体反応させるとともに、該抗原抗体反応により得られる反応生成物を検出することを特徴とする請求項５に記載の検出対象物質の検出方法。
【請求項７】
基板表面に、
磁気ビーズとサンプル液とを接触させる領域と、
前記領域から前記磁気ビーズを退避させる退避部と、
を備えたことを特徴とするバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル液の濃縮方法、検出対象物質の検出方法及びバイオチップに係り、特に、血液等の生体サンプル液に含まれるタンパク等の検出対象物質（生体関連物質）を抗原抗体反応により検出することで、生体関連情報を得る技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
微小空間を利用した抗原抗体反応のバイオセンシングは、臨床検査や環境問題に関わる微量物質の分析方法の中でも、近年著しく開発が進められている。このような微量成分を高精度で検出するためには、検出感度を向上させる必要がある。
【０００３】
検出感度を向上させる方法としては、サンプル液を濃縮し、検出対象となる物質の濃度を高くする方法が常套である。たとえば、自然乾燥は、サンプル液中の媒質を蒸発させることにより検出対象物質の濃度を高める方法としてシンプルかつ有効である。しかし、媒質の蒸発速度が極めて遅く、媒質を大量に含むサンプル液を濃縮する場合には、時間がかかりすぎることが問題であった。
【０００４】
これに対して、例えば、特許文献１では、Ｎ−ビニルカルボン酸アミドを６０モル％以上含むノニオン性水溶性モノマーと該ノニオン性水溶性モノマーに対して０．１〜１０モル％の多価ビニル化合物を共重合させて得られるポリマーの乾燥物からなる生体液濃縮用吸水性樹脂を用いることが提案されている。この生体液濃縮用吸水性樹脂を被検液に投入することで、被検液を濃縮できるとともに、水素結合由来の吸着固定作用（たんぱく質との結合など）を排除できることが記載されている。なお、濃縮した生体液は、遠心濾過や吸引濾過により吸水性樹脂から分離回収し、分析している。
【特許文献１】特開２０００−７２８２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記特許文献１の方法のように、分析装置とは別の場所で濃縮を行った場合、濾別により濃縮後のサンプル液を回収した後、ピペットや注射器を用いて分析装置に導入する必要があった。このとき、導入するサンプル液の分量に、ハンドリング等に起因する誤差があると、分析成分の量に及ぼす影響が大きく、分析データに誤差が生じ易くなる。特に、生体液のように、サンプル液がごく微量しか採取できない場合、上記の誤差の影響が大きくなるという問題があった。また、濃縮したサンプル液を分析装置に導入する手間が煩雑であり、前処理も含めた全体の分析時間が増大することもあった。
【０００６】
また、サンプル液に含まれる検出対象物質が反応により生成される場合、たとえば、抗原を含む生体液を抗体と接触させて抗原抗体反応をさせ、これにより得られる生成物を検出する場合、短時間で上記の抗原抗体反応を生じさせるためにも、サンプル液中の抗原濃度を高くする必要がある。
【０００７】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、サンプル液がごく微量しかない場合でも効率的に濃縮できると共に、ハンドリング等による誤差を低減できるサンプル液の濃縮方法、検出対象物質の検出方法及びバイオチップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の請求項１は前記目的を達成するために、検出対象物質を含むサンプル液の濃縮方法であって、前記サンプル液と磁気ビーズとを接触させて前記サンプル液中の検出対象物質以外の媒質を吸着させる工程と、前記磁気ビーズに磁場を印加することにより、前記濃縮させたサンプル液から前記磁気ビーズを取り除く工程と、を備えたことを特徴とするサンプル液の濃縮方法を提供する。
【０００９】
請求項１によれば、サンプル液に磁気ビーズを接触させてサンプル液中の検出対象物質以外の媒質を吸着させる工程を行うので、サンプル液に含まれる検出対象物質の濃度を高めることができる。また、濃縮させたサンプル液に対して、磁場の作用で磁気ビーズを相対的に移動させることによりサンプル液内から取り除く工程を行うので、濃縮後のサンプル液を濾別したり、注射器等で採取したりしなくても、濃縮したサンプル液のみを分離できる。したがって、サンプル液がごく微量しかない場合でも、検出対象物質を効率的に濃縮でき、ハンドリング等の誤差を低減できる。
【００１０】
ここで、磁場の印加方法としては、特に限定されないが、例えば、磁石をサンプル液に近づける方法や、コイルを配置した基板上にサンプル液を滴下し、該コイルに電流を流す方法等、が挙げられる。
【００１１】
なお、磁気ビーズとは、鉄やニッケル、コバルト、又はそれらの酸化物で作製された磁性を有するコア粒子の周囲に、検出対象物質以外の媒質成分を吸着するコート層を備えた粒子状のものをいう。コート層の材料としては、例えば、水溶性の高分子が挙げられる。サンプル液としては、特に限定されないが、例えば、血液、唾液、鼻咽頭液、母乳等の生体液が含まれる。媒質としては、サンプル液のうち、検出対象物質以外のものであれば特に限定されないが、たとえば、水などの溶媒が含まれる。
【００１２】
請求項２は請求項１において、前記サンプル液の量は、２０μＬ以下であることを特徴とする。
【００１３】
このように、サンプル液がごく微量しかない場合でも、検出対象物質を高精度に検出できる範囲まで、サンプル液を濃縮できる。
【００１４】
請求項３は請求項１又は２において、前記磁気ビーズは、磁性粒子と、該磁性粒子の周囲に前記媒質を吸着するコート層を備えた粒子であることを特徴とする。
【００１５】
請求項３によれば、磁気ビーズが、磁性粒子と、該磁性粒子の周囲に検出対象物質以外の媒質を吸着するコート層とを備えているので、サンプル液中の検出対象物質以外の媒質を選択的に吸着除去できると共に、磁場の作用によりサンプル液に対して磁性ビーズを相対的に移動させることができる。これにより、サンプル液の液滴を検出エリアに配置した状態で濃縮し、分析することができる。したがって、サンプル液の分量にハンドリング等に起因する誤差が生じるのを抑制できる。
【００１６】
請求項４は請求項１〜３の何れか１項において、前記サンプル液と接触させる磁気ビーズの量を変えることにより、前記サンプル液の濃縮量を調整することを特徴とする。
【００１７】
請求項４によれば、自然乾燥のみで濃縮する場合よりも、濃縮する量を精度よく調節できる。このため、検出結果を再現性よく得ることができる。
【００１８】
本発明の請求項５は前記目的を達成するために、請求項１〜４の何れか１項に記載のサンプル濃縮方法により前記サンプル液を濃縮する工程と、前記濃縮した後のサンプル液に含まれる検出対象物質を検出する工程と、を備えたことを特徴とする検出対象物質の検出方法を提供する。
【００１９】
請求項５によれば、磁気ビーズをサンプル液に対して相対的に移動させて取り除くことにより、濃縮したサンプル液を取り出さなくても簡単に分離回収でき、更に濃縮したサンプル液中の検出対象物質を検出できる。したがって、サンプル液の分量にハンドリング等に起因する誤差が生じるのを抑制できる。
【００２０】
請求項６は請求項５において、前記濃縮したサンプル液には抗原が含まれるとともに、前記検出工程においては、前記濃縮したサンプル液に更に抗体を接触させて抗原抗体反応させるとともに、該抗原抗体反応により得られる反応生成物を検出することを特徴とする。
【００２１】
このように、ごく微量しか採取できない生体液中の生体関連情報を高感度で検出するような場合に、本発明が特に有効である。
【００２２】
本発明の請求項７は前記目的を達成するために、基板表面に、磁気ビーズとサンプル液とを接触させる領域と、前記領域から前記磁気ビーズを退避させる退避部と、を備えたことを特徴とするバイオチップを提供する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、サンプル液がごく微量しかない場合でも効率的に濃縮でき、ハンドリングによる誤差を低減できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、添付図面に従って、本発明に係るサンプル液の濃縮方法、検出対象物質の検出方法及びバイオチップの好ましい実施の形態について詳説する。
【００２５】
まず、本発明に係るサンプル液の濃縮方法について図１を参照して説明する。図１は、本発明に係るサンプル液の濃縮方法の時系列的な流れを説明する説明図であり、図２は、磁気ビーズの概念を説明する概念図である。なお、本実施形態では、抗原を含む生体液を磁気ビーズを用いて濃縮した後、基板上に予め固着させた抗体と接触させて抗原抗体反応させる例について述べるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
まず、図１（Ａ）に示すように、予め基板１０上に所定の量だけ固着させた抗体１２上に、濃縮する程度に応じた量の乾燥させた磁気ビーズ１４を配置し、その上に抗原１６を含むサンプル液Ｌを滴下する。本発明に使用される生体液としては、例えば、血液、唾液、鼻咽頭液、母乳等が含まれる。なお、磁気ビーズ１４の詳細については後述する。
【００２７】
次いで、図１（Ｂ）に示すように、滴下したサンプル液Ｌ中の媒質を磁気ビーズ１４に吸着させ、例えば、自重と等量の媒質（水分等）を吸収させる。具体的には、サンプル液の液滴が１０μＬであるとき、５ｍｇの磁気ビーズ１４を投入することにより、サンプル液Ｌ中の５μＬの媒質を吸収できる。このように、磁気ビーズ１４は、検出対象となる抗原（たんぱく質等）以外の媒質のみを吸着することができる。
【００２８】
次いで、図１（Ｃ）に示すように、サンプル液Ｌを所定の割合に濃縮した後、磁場印加手段１８によりサンプル液Ｌに磁場を印加し、サンプル液Ｌ内から磁気ビーズ１４を取り除く。取り除いた磁気ビーズ１４は、検出エリア（サンプル液Ｌが配された位置）の外側に退避させる。
【００２９】
そして、図１（Ｄ）に示すように、磁気ビーズ１４を取り除いた濃縮後のサンプル液Ｌを、基板１０上に予め固着させた抗体１２と直接接触させる。これにより、サンプル液Ｌ中の抗原１６と基板１０の表面上の抗体１２とにより抗原抗体反応させ、生成する凝集物や反応生成物等を光学的に分析することができる。なお、取り除いた磁気ビーズ１４は、乾燥させることにより繰り返し使用できる。
【００３０】
このように、サンプル液を磁気ビーズ１４と接触させることによりサンプル液を濃縮できる。また、濃縮後は、サンプル液をピペット等で採取しなくても、磁気ビーズ１４をサンプル液から取り除くことにより簡単に分離回収できる。したがって、サンプル液がごく微量しかない場合でも、ハンドリング等による誤差を低減できるとともに、抗原抗体反応を高効率で行わせることができる。
【００３１】
また、上記の濃縮方法は、媒質を蒸発させるものとは異なり、サンプル液と接触させる磁気ビーズ１４の量によって濃縮する量を調節できるので、定量的かつ再現性よく濃縮を行うことができる。
【００３２】
なお、磁場を変化させることによりサンプル液の液滴内で磁気ビーズ１４を小刻みに移動させることにより、サンプル液Ｌ内を攪拌することもできる。
【００３３】
本実施形態において使用される磁気ビーズ１４としては、図２に示すように、磁性粒子１９ａの表面に媒質を吸着する吸着層１９ｂが形成されたものが挙げられる。
【００３４】
磁性粒子１９ａとしては、常磁性を有し、磁場の作用を受けるものであれば特に限定されず、例えば、鉄やニッケル、コバルト、又はそれらの酸化物等が挙げられる。
【００３５】
吸着層１９ｂとしては、検出対象物質以外の媒質を吸着できるものであれば特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリルアミド系化合物等が挙げられる。なお、吸着層１９ｂは、１種類に限らず、２種類以上でもよい。
【００３６】
磁気ビーズ１４の粒径は、サンプル液内でも磁場を作用させることで磁気ビーズ１４を操作できる範囲であれば、特に限定されず、例えば、４．５μｍ程度のものが使用できる。
【００３７】
磁気ビーズ１４の製造方法としては、特に限定されないが、例えば、媒質の吸着性を有するポリマー溶液に磁性粒子１９ａを浸漬した後、乾燥させる方法や、各種表面改質方法により磁性粒子１９ａの表面に官能基等を付与する方法等、が挙げられる。
【００３８】
磁気ビーズ１４の具体例としては、微細結晶化した酸化鉄粒子（Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４）を親水性又は疎水性のポリマーでコーティングされたものが挙げられる。この磁気ビーズ１４は、エポキシ基が表面に露出したビーズ（Ｄｙｎａｌ社製）に、末端にアミノ基が付いたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を反応させ、エポキシ基とアミノ基を共有結合させることにより作製できる。
【００３９】
磁気ビーズ１４は、超常磁性を有しつつも永久的磁性は示さないため、磁性は残留することなく再分散する。また、磁気ビーズ１４内部の磁性粒子１９ａは、吸着層１９ｂによって外部から保護されているため、液滴内の試薬等と余分に反応することはない。これにより、磁気ビーズ１４は、サンプル液の媒質だけを選択的に取り除くことができる。
【００４０】
なお、磁気ビーズ１４は図２の態様に限らず、例えば、多孔質体の磁性粒子の表面に媒質を吸着する層又は部位を備えたものでもよい。
【００４１】
また、磁場印加手段１８としては、磁場を印加することができるものであれば、特に限定されないが、例えば、磁石や電磁コイル等が挙げられる。
【００４２】
次に、本発明に係るサンプル液の濃縮方法が適用される例について説明する。
【００４３】
図３は、本発明が適用されるバイオチップの一例を示す説明図である。このうち、図３（Ａ）は、斜視図であり、図３（Ｂ）はＡ−Ａ線断面図である。本実施形態は、抗原を含む生体液（サンプル液）をバイオチップ内に滴下し、該バイオチップ内に予め固着させた抗体と接触させることにより、抗原抗体反応させる方法である。
【００４４】
図３に示すように、バイオチップ２０は、サンプル液の液滴を保持するための凹部２２が形成された透明な平板状の基板２４と、基板２４を覆うための透明な覆い板２６と、を備えている。
【００４５】
基板２４上には、さらに上記凹部２２に連通し、磁気ビーズ１４を退避させるための凹状の退避部２８、２８が形成されている。退避部２８は、凹部２２内のサンプル液から取り除いた磁気ビーズ１４を収納できる形状及びサイズであればよく、図３の形態に限定されない。
【００４６】
凹部２２と対向する覆い板２６面には、凹部２２にサンプル液を供給するための供給口３０が形成されており、例えば、シール部材３２により塞ぐことができるようになっている。
【００４７】
図３（Ｂ）に示すように、基板２４上に形成された凹部２２の底面には、サンプル液に含まれる抗原と特異的に反応する抗体１２が固着されている。抗体１２の固着方法としては、特に限定はないが、例えば、抗体を含む試料を塗布することにより形成できる。抗体１２上には、サンプル液を濃縮するための磁気ビーズ１４が配置されている。このように、凹部２２は、サンプル液を保持するだけでなく、濃縮や検出が行える領域となっている。
【００４８】
基板２４と覆い板２６とは、図示しないねじ等により組み付けられたり、接着剤により密着されたりすることにより一体化される。
【００４９】
基板２４及び覆い板２６のサイズは、特に限定しないが、携帯できるサイズ、たとえば８０×５０ｍｍ程度とすることができる。基板２４及び覆い板２６の厚さも、特に制限はないが、強度、経済性等より、たとえば、それぞれ５ｍｍ程度とすることができる。
【００５０】
基板２４及び覆い板２６の材質としては、特に制限はないが、例えば、樹脂材料が好ましい。また、バイオチップ２０内のサンプル液を視覚的、光学的に認識可能とすることより、透明であることが好ましい。このような材料として、各種樹脂板、より具体的には、ポリジメチルスルホキシド（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタアクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、紫外線硬化樹脂、ポリカーボネート（ＰＣ）等、各種樹脂膜、より具体的には、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）等、各種ガラス（ソーダライムガラス、硼珪酸ガラス等）が採用できる。
【００５１】
このように構成されたバイオチップ２０は、例えば、磁場印加手段１８を備えた光学的分析装置（不図示）にセットされ、磁場印加手段１８がバイオチップ２０の基板２４面に対して相対的にスライドすることにより、バイオチップ２０内の磁気ビーズ１４がサンプル液の内部から取り除かれる。その後、濃縮された凹部２２内のサンプル液は、図示しない光学的分析装置によって分析される。
【００５２】
このように本実施形態によれば、サンプル液を磁気ビーズ１４と接触させることで濃縮できる。また、濃縮後は、サンプル液をピペット等で採取しなくても、磁場を印加して磁気ビーズ１４をサンプル液から取り除くことにより簡単に分離できる。したがって、サンプル液がごく微量しかない場合でも、ハンドリング等の誤差を低減でき、抗原抗体反応を高効率で行わせることができる。
【００５３】
また、本実施形態の濃縮方法は、媒質を蒸発させるものとは異なり、サンプル液と接触させる磁気ビーズ１４の量によって濃縮する量を調節できる。したがって、定量的かつ再現性よく分析を行うことができる。
【００５４】
次に、本発明に係る第２の実施形態について説明する。本実施形態が上記第１の実施形態と異なる点は、主に、サンプル液の液滴を基板上に複数配置し、各液滴について濃縮及び検出を行う点である。
【００５５】
図４は、本発明が適用される第２の実施形態を説明する斜視図である。このうち、図４（Ａ）は、バイオチップ４０の一部を示す斜視図であり、図４（Ｂ）はＢ−Ｂ線断面図である。
【００５６】
図４に示すように、バイオチップ４０は、サンプル液の液滴を複数配置するための基板４２を備えている。
【００５７】
基板４２上には、抗体１２が複数箇所に所定の間隔を設けて固着されている。さらに、各抗体１２上には磁気ビーズ１４が配されている。なお、磁気ビーズ１４を安定に固定するために、抗体１２が固着される部分が基板４２に対して凹状に形成されたり、粘着性が付与されたりしてもよい。
【００５８】
磁気ビーズ１４の構成、該磁気ビーズ１４の製造方法や抗体１２の基板４２への固着方法、その他については、上記第１の実施形態とほぼ同様であるため、その詳細な説明は省略する。
【００５９】
図５は、本実施形態における時系列的な作用を説明する図である。
【００６０】
図５（Ａ）に示すように、同じ種類の抗体１２が所定の間隔を設けて複数配された基板４２上に、抗原を含む生体液のサンプル液Ｌを滴下する。そして、各サンプル液Ｌ・・・について磁気ビーズ１４により媒質が吸着され、濃縮される。
【００６１】
次いで、図５（Ｂ）に示すように、基板４２の裏面（サンプル液が配置されていない側の面）において、各サンプル液Ｌに対応する位置に磁場印加手段１８を配置し、例えば、矢印方向へ移動させることにより各サンプル液Ｌに磁場を印加する。これにより、各サンプル液Ｌ内から磁気ビーズ１４を取り除く。
【００６２】
そして、図５（Ｃ）に示すように、サンプル液Ｌに含まれる抗原１６と、基板４２上に予め固着された抗体１２との間で抗原抗体反応がおこる。
【００６３】
このように、本実施形態によれば、上記した第１の実施形態と同様の効果に加え、複数のサンプル液について同時に濃縮及び反応させることができるので、再現性を調べたり、異なる種類の分析を一度で実施したりすることが可能となる。
【００６４】
以上、本発明に係るサンプル液の濃縮方法、検出対象物質の検出方法及びバイオチップの好ましい実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、各種の態様が採り得る。
【００６５】
たとえば、上記各実施形態では、サンプル液として、抗原又は抗体等の生体関連物質を含む液体試料を用いたが、これに限らず、各種分析用の液体試料の濃縮に適用できる。
【００６６】
上記各実施形態では、基板上に予め抗体を固着させておき、その上から抗原を含むサンプル液を滴下することにより抗原抗体反応させる方法について述べたが、これに限定されず、サンプル液を基板上に滴下した後、その上から抗体を含む試料を添加することもできる。
【００６７】
上記各実施形態では、水分等の媒質を主に吸着する磁気ビーズ１４について述べたが、これに限定されず、分析に不要なたんぱく質等を選択的に吸着する部位を備えた磁気ビーズも使用できる。
【００６８】
上記各実施形態では、磁気ビーズ１４の駆動方法として、基板本体上にコイルを配設し、該コイルに電流を流すことにより磁場を印加する方法も採用できる。
【００６９】
上記各実施形態では、媒質を吸着させてサンプル液を濃縮する目的で磁気ビーズ１４を使用する例について説明したが、これに限定されず、例えば、磁気ビーズ１４の表面に反応に関与する物質を形成し、サンプル液中の成分との接触効率を高めることにより反応を促進させる目的にも使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明に係るサンプル液の濃縮方法の時系列的な流れについて説明する説明図である。
【図２】図１における磁気ビーズの概念を説明する概念図である
【図３】本発明が適用されるバイオチップの第１の実施形態を示す説明図である。
【図４】本発明が適用されるバイオチップの第２の実施形態を示す斜視図である。
【図５】第２の実施形態の作用を示す説明図である。
【符号の説明】
【００７１】
１０…基板、１２…抗体、１４…磁気ビーズ、１６…抗原、１８…磁場印加手段、１９ａ…磁性粒子、１９ｂ…吸着層、２０、４０…バイオチップ、２２…凹部、２４、４２…基板、２６…覆い板、２８…退避部
【図１】
2008249422.tif 000003
【図２】
2008249422.tif 000004
【図３】
2008249422.tif 000005
【図４】
2008249422.tif 000006
【図５】
2008249422.tif 000007