(57)【要約】      （修正有）【課題】ＥＧＦＲ（上皮細胞成長因子レセプター）のリン酸化を阻害する活性を有し、抗癌剤として有用なリゾＧＭ３及びその類似体のオリゴマーの提供。【解決手段】（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−３−Ｏ−ベンゾイル−４−オクタデセニル４−Ｏ−（２，４−ジ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−（１−メチル−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−シアリル）６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシドと、Ｃ末端をアミノ基としたグルタミン酸２〜４量体との縮合化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
2008013496.tif 000010
（式中、Ｒは、下記：
【化２】
2008013496.tif 000011
である。）
で示される化合物。
【請求項２】
下記式：
【化３】
2008013496.tif 000012
（式中、Ｒは、下記：
【化４】
2008013496.tif 000013
である。）
で示される化合物、又は請求項１に記載の化合物
を有効成分として含む医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リゾＧＭ３及びその類似体のオリゴマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞の増殖を抑制するための一つの方法として、癌組織で活発に活動していている上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）の働きを阻害することが挙げられる。癌細胞におけるＥＧＦは、癌細胞表面のＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）に結合してＥＧＦＲをリン酸化に導き、癌細胞の増殖（癌組織の増大）を促す。したがって、ＥＧＦＲのリン酸化を阻害することが、癌細胞の増殖を抑制することに直結している。
【０００３】
ガングリオシドは、シアル酸と呼ばれる酸性糖をもつスフィンゴ糖脂質の総称であり、特に神経組織中に多く存在していることが知られている。ＧＭ３はガングリオシドの生合成機構において重要な位置を占めるとともに、細胞認識機能に重要な役割を担っていると考えられている。また、上皮細胞成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）等の自己リン酸化を抑制する作用やプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）に対する活性抑制作用を示すことが知られている。
【０００４】
リゾガングリオシドは、ガングリオシドのセラミド部分から脂肪酸がとれたものをいう。リゾＧＭ３は、ＧＭ３よりもはるかに強いＰＫＣ抑制作用を示し、ＥＧＦＲ抑制作用も有していることが知られている。また、リゾＧＭ３オリゴマーは、知られているが、そのＥＧＦＲ抑制作用については、知られていない。
【０００５】
また、ＧＭ３やリゾＧＭ３のＥＧＦＲ阻害活性は、治療目的としては不十分なものであることから、より阻害活性の強い化合物の開発が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＥＧＦＲのリン酸化を阻害する活性を有し、抗癌剤として有用なリゾＧＭ３及びその類似体のオリゴマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、リゾＧＭ３及びリゾＧＭ３類似体のオリゴマーがＥＧＦＲのリン酸化を協力に阻害することを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
したがって、本発明は、下記：
１．下記式：
【化５】
2008013496.tif 000002
（式中、Ｒは、下記：
【化６】
2008013496.tif 000003
である。）
で示される化合物、
２．下記式：
【化７】
2008013496.tif 000004
（式中、Ｒは、下記：
【化８】
2008013496.tif 000005
である。）
で示される化合物、又は上記１に記載の化合物
を有効成分として含む医薬品、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のリゾＧＭ３及びその類似体のオリゴマーは、天然物と比較してより強いＥＧＦＲのリン酸化阻害作用を有し、その結果、癌細胞の増殖を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の化合物は、たとえば、下記の方法にしたがって入手することができる。なお、式中、Ａｃはアセチルであり、Ｍｅはメチルである。
【００１１】
１．リゾＧＭ３の合成方法、
【化９】
2008013496.tif 000006
２．リゾＧＭ３類似体の合成方法、
【化１０】
2008013496.tif 000007
３．オリゴマーの合成方法
【化１１】
2008013496.tif 000008
【化１２】
2008013496.tif 000009
【００１２】
上記スキームの各反応工程における条件、たとえば温度、溶媒などとしては、後記実施例を参照することにより、適宜最適な条件を選択することができ、上記スキーム中の上記に限定されることはない。
【００１３】
ＥＧＦＲを高発現している細胞に本発明の化合物を種々の濃度で添加したところ、本発明の化合物に高いチロシンキナーゼ活性阻害能があることが見出された。したがって、本発明の化合物は、ＥＧＦＲに対するチロシンキナーゼの有効な阻害剤であり、ＥＧＦＲのリン酸化に関連する疾病、たとえば、悪性腫瘍に対する処置のための医薬品として有用である。
【００１４】
本発明の医薬品は、経口的または非経口的に投与することができ、剤形としては、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、散剤、パップ剤、坐剤、注射剤の形であることができる。
【００１５】
この医薬品は、その高い薬理活性からきわめて少量の投与量で効果を発揮することができ、投与方法によってもその投与量は変動しうるが、たとえば経口投与の場合、通常０.０１〜１０００mg、非経口投与の場合通常０.００１〜１００mgの投与量を１〜３回に分けて投与することができる。
【実施例】
【００１６】
ラクトース１００ｇ（２９２mmol）にピリジン７００ml、無水酢酸２５０mlを加え、６５℃で１時間撹拌し、ラクトースを溶解させた。さらに３時間撹拌し、薄層クロマトグラフィーで反応が完全に進行していることを確認した。反応液を氷水にあけ、激しくかき混ぜた後、クロロホルムを加え、飽和食塩水×２、飽和重曹水×２、飽和食塩水×１で順次中和、洗浄を行った。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートした。ピリジンを除くためにトルエンと共沸し、真空乾燥を行ってオクタアセチルラクトースの白色結晶を得た。収量：１８１．８ｇ（２６７．９mmol）  収率：９１．８％
【００１７】
ナス型フラスコにオクタアセチルラクトース４１．６１ｇ（６１．３２mmol）を撹拌子と共に入れ、真空ポンプで充分に乾燥させた。アルゴン雰囲気下、ジクロロメタン７８mlを加えて溶解させた後、０℃で約１５分間撹拌した。そこへ０℃の３３％臭化水素酸酢酸溶液８３mlを少しずつ加え、平栓でふたをして上からクランプでしっかり押さえた。しばらくしてから氷浴をはずし、室温でさらに１．５時間撹拌した。０℃の飽和食塩水×１、飽和重曹水×３、飽和食塩水×１で順次中和、洗浄を行った。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、４０℃以下でエバポレートした。得られたシロップを真空乾燥したあと、酢酸エチル約１００mlに溶解させた。ｎ−ヘキサン約４５mlを少しずつ加え、氷冷することによってヘプタアセチルラクトシルブロミドの白色結晶を得た。収量：３６．４１ｇ（５２．０６mmol）  収率：８３．３％
【００１８】
ナス型フラスコにヘプタアセチルラクトシルブロミド３３．９７ｇ（４８．５７mmol）と活性化した粉末モレキュラーシーブ４Ａ（ＭＳ４Ａ）約３０ｇ、撹拌子を入れ、充分に真空乾燥した。アルゴン置換し、乾燥したジクロロメタン２００mlを加えて約２時間室温で撹拌した（Ａ）。これとは別のフラスコに活性化した粉末ＭＳ４Ａ約２０ｇと撹拌子を入れ、アルゴン雰囲気下、遮光して過塩素酸銀１１．１９ｇ（１．１eq）、炭酸銀１３．９ｇ（１．０eq）、乾燥したジクロロメタン１３０ml、２−（トリメチルシリル）エタノール１６．５５ml（２．４eq）を加えて約２時間室温で撹拌した（Ｂ）。ＡをＢに加え、アルゴン雰囲気下、遮光して室温で一晩撹拌した。薄層クロマトグラフィーで反応が完全に進行していることを確認し、反応液をセライトろ過した。ろ液をエバポレートし、得られたシロップをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）で精製し、２−（トリメチルシリル）エチルラクトシドヘプタアセテートを得た。しかし、得られた白色結晶は目的物と副生成物の混合物で分離が非常に困難であったため、次の反応後に精製することにした。
【００１９】
前段階で得られたトリメチルシリルエチルラクトシドヘプタアセテートと副生成物の混合物２１．３１ｇをメタノール２２０mlに溶解させ、ナトリウムメトキシド（Ｎａ２．１２ｇ、メタノール６５ml）を加え、室温で２．５時間撹拌した。反応液に陽イオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ＋型）を加えて中和し、ろ過でこれを取り除いた後エバポレートした。得られた白色粉末をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１：０→２：１）で精製し、２−（トリメチルシリル）エチルラクトシドの白色粉末を得た。収量：６．４６ｇ（１４．６０mmol）  収率：３０．１％
【００２０】
ナス型フラスコに２−（トリメチルシリル）エチルラクトシド９．４４ｇ（１９．１６mmol）とジブチルスズオキシド６．３４ｇ（２５．４８mmol）を入れて充分真空乾燥した後、アルゴン置換した。乾燥メタノール３１０mlを加え、３時間撹拌しながら還流した。反応溶液をスターラーチップを入れたままエバポレートし、さらに真空ポンプで充分に乾燥した。乾燥ベンゼン３１０mlを加え、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップをつけて２時間還流した後、テトラブチルアンモニウムブロミド６．１８ｇ（１９．１６mmol）、臭化ベンジル１８．０ml（１５１．４mmol）を加え、さらに３時間還流した。薄層クロマトグラフィーで反応が完全に進行していることを確認し、還流を止めて反応溶液をエバポレートした。得られたシロップをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製し、２−（トリメチルシリル）エチル４−Ｏ−（３−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシドの白色粉末を得た。この反応に用いたフラスコやDean-Starkトラップは、あらかじめ乾燥させておいた。収量：７．７０ｇ（１４．４６mmol）  収率：６７．８％
【００２１】
ジクロロメタン１２５ml、ピリジン５０mlの混合溶媒に２−（トリメチルシリル）エチル４−Ｏ−（３−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ＝グルコピラノシド７．８０ｇ（１４．６４mmol）を溶解させ、−５０℃に冷却した。そこへ、冷却器付き滴下ロートを用いて塩化ベンゾイル５．６ml（４８．３１mmol）を加えたジクロロメタン溶液９５mlをゆっくり滴下した。−５０℃で３０分間撹拌し、薄層クロマトグラフィーで原料のスポットが完全に消失していることを確認してから、メタノール約５mlを加えて−５０℃で約１０分間撹拌し、反応を停止させた。反応溶液をエバポレートし、得られたシロップをクロロホルムに溶解させ、２Ｍ塩酸×１、水×２で順次中和、洗浄を行った。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートした。得られたシロップをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０（230-400 mesh, Merck）；クロロホルム：メタノール＝１：０→２００：１→１５０：１）で精製し、２−（トリメチルシリル）エチル４−Ｏ−（６−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシドの白色粉末を得た。収量：４．９３ｇ（５．８３４mmol）  収率：３９．９％
【００２２】
ナス型フラスコに２−（トリメチルシリル）エチル４−Ｏ−（６−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシド４．３８ｇ（５．１７８mmol）と撹拌子を入れ、充分に真空乾燥させ、アルゴン置換した。メタノール１７５mlを加え、アルゴン雰囲気下１０％パラジウム炭素３．０７ｇ、ギ酸３．０７mlを加えて２時間還流した。薄層クロマトグラフィーで反応が完全に進行していることを確認し、還流を止めて反応溶液をセライトろ過した。ろ液をエバポレートし、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Silica gel 60（230-400 mesh, Merck）；クロロホルム：メタノール＝５０：１→１５：１）で精製し、２−（トリメチルシリル）エチル４−Ｏ−（６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシドの白色粉末を得た。収量：１．８１ｇ（２．３９３mmol）  収率：４６．２％
【００２３】
ナス型フラスコ２−（トリメチルシリル）エチル４−Ｏ−（６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシド４００mg（０．５３０mmol）とメチル１−メチル−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−チオシアロシド８３０mg（１．５９mmol；３当量）、活性化したモレキュラーシーブ４Ａ０．６mgを入れ、充分に真空乾燥させた後、アルゴン置換して乾燥アセトニトリル６mlを加えた。約３時間室温で撹拌し、系内の水分を除去した後、−４０℃まで冷却した。Ｎ−ヨードコハク酸イミド７６８mg（３．４１mmol）とトリフルオロメタンスルホン酸１２μl（０．１４mmol）を加え、−４０℃〜−５０℃に保って２．５時間撹拌した。反応液にジクロロメタンを加えてセライトろ過し、ろ液を蒸留水×１、飽和重曹水×２、蒸留水×１で順次中和、洗浄を行った。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートした。得られたシロップをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０（230-400 mesh, Merck）；ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：７）で精製し、２−（トリメチルシリル）エチル４−Ｏ−（３−Ｏ−（１−メチル−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−シアリル）−６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシドの白色粉末を得た。収量：４２４mg（０．３４５mmol）  収率：６５．１％
【００２４】
ナス型フラスコに２−（トリメチルシリル）エチル４−Ｏ−（３−Ｏ−（１−メチル−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチルシリル）−６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシド８９mg（７２．４６μmol）とピリジン５ml、無水酢酸３mlを入れ、室温で４時間撹拌した。クロロホルム約１０mlを反応溶液に加え、飽和食塩水×１、飽和重曹水×２、飽和食塩水×１で順次中和、洗浄を行った。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、トルエンを加えてエバポレートした。得られたシロップを真空乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝６０：１）で精製し、２−（トリメチルシリル）エチル４−Ｏ−（２，４−ジ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−（１−メチル−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−シアリル）−６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシドの白色粉末を得た。収量：８２．６mg（６１．０３μmol）  収率：８４％
【００２５】
ナス型フラスコに２−（トリメチルシリル）エチル４−Ｏ−（２，４−ジ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−（１−メチル−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−シアリル）−６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシド７９mg（５８．３３μmol）とジクロロメタン１．２mlを撹拌子と共に入れ、０℃で三フッ化ホウ素エーテル錯体５９．５μlを滴下した。１５℃〜２０℃で６時間撹拌し、薄層クロマトグラフィーでチェックすると、原料がまだ残っていた。さらに三フッ化ホウ素エーテル錯体２０μlを加え、１時間撹拌したが、原料のスポットは完全には消えていなかった。ジクロロメタン５mlを反応溶液に加え、飽和重曹水×２、飽和食塩水×２で順次中和、洗浄を行った。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートした。得られたシロップを真空乾燥したあと、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Silica gel 60（230-400 mesh, Merck）；クロロホルム：メタノール＝８０：１→４０：１）で精製し、４−Ｏ−（２，４−ジ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−（１−メチル−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−シアリル）−６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノースの白色粉末を得た。収量：６０mg（４７．８４μmol）  収率：８２．０％
【００２６】
ナス型フラスコに４−Ｏ−（２，４−ジ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−（１−メチル−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−シアリル）−６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノース１５０mg（１１９．６μmol）とジクロロメタン１mlを撹拌子と共に入れ、アルゴン雰囲気下、−５℃でトリクロロアセトニトリル３９６μl（３．９２mmol）を滴下した。ＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン）７．２８μl（４８．８μmol）を加え、アルゴン雰囲気下、０℃で２時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料のスポットが完全に消失していることを確認してから、反応溶液をエバポレートした。得られたシロップを真空乾燥したあと、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Silica gel 60（230-400 mesh, Merck）；クロロホルム：メタノール＝８０：１→６０：１）で精製し、４−Ｏ−（２，４−ジ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−（１−メチル−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−シアリル）−６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシルトリクロロアセトイミデートの白色粉末を得た。収量：１６１mg（１１５μmol）  収率：９６．６％
【００２７】
ナス型フラスコに４−Ｏ−（２，４−ジ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−（１−メチル−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−シアリル）−６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシルトリクロロアセトイミデート３９４．４mg（２８２μmol）と（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アジド−３−Ｏ−ベンゾイル−４−オクタデセン−１−オール２４２．６mg（５３５μmol）、活性化したモレキュラーシーブ４Ａ４．７ｇ、撹拌子を入れ、アルゴン置換してからジクロロメタン８mlを加えた。室温で２−３時間撹拌し、系内の水分を充分に取り除いてから０℃に冷却した。そこへ三フッ化ホウ素エーテル錯体７６μl（２８２μmol）を滴下し、０℃で４時間撹拌した。ＴＬＣで原料のスポットが完全に消失していることを確認してから、飽和重曹水×２、飽和食塩水×２で順次中和、洗浄を行った。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートした。得られたシロップをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Silica gel 60（230-400 mesh, Merck）；クロロホルム：メタノール＝１００：０→８０：１）で精製し、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アジド−３−Ｏ−ベンゾイル−４−オクタデセニル４−Ｏ−（２，４−ジ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−（１−メチル−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−シアリル）−６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシドの白色粉末を得た。収量：３１６．５mg（１９０μmol）  収率：６７．４％  元素分析：Calc. : C, 60.57; H, 6.29; N, 3.36. Found : C, 60.05; H, 5.78; N, 3.23. IR (CHCl3 solution)  2106.85 cm-1 (-N3) 500 MHz-13C-NMR (CDCl3) 170.7-169.5 (COCH3), 167.8 (C''-1), 165.7-164.8 (COC6H5), 138.8 (Cs-5), 122.2 (Cs-3), 101.1 (C'-1), 100.5 (C-1), 76.3 (C-4), 73.1 (C-5), 72.9 (C-3), 72.0 (C''-6), 71.8 (C-2), 71.2 (C'-3), 70.3 (C'-5), 69.8 (C'-2), 69.2 (C''-4), 68.0 (Cs-1), 67.2 (C'-4), 66.9 (C''-7), 63.3 (Cs-2), 62.5 (C-6), 62.3 (C''-9), 52.9 (COOMe), 48.9 (C''-5), 37.2 (C''-3), 32.1 (Cs-6). (C : グルコース, C' : ガラクトース, C'' : シアル酸, Cs : スフィンゴシン)
【００２８】
ナス型フラスコに（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アジド−３−Ｏ−ベンゾイル−４−オクタデセニル４−Ｏ−（２，４−ジ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−（１−メチル−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−シアリル）−６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシド５０mg（３０μmol）とベンゼン約１５ml、水約０．５mlを撹拌子と共に入れ、４５℃でトリフェニルホスフィン１５mg（５７μmol；１．９eq）を加えて１０時間激しく撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料のスポットが完全に消失し、生成物がニンヒドリン反応を示すことを確認してから室温に戻し、酢酸エチルを約０．５ml加えた。１０分間ほど撹拌し、エバポレートしてから真空ポンプで水を完全に除いた。得られた（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−３−Ｏ−ベンゾイル−４−オクタデセニル４−Ｏ−（２，４−ジ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−（１−メチル−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−シアリル）−６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシド（リゾＧＭ３誘導体）は特に精製を行わずに次のオリゴペプチドとのカップリングに進んだ。
【００２９】
ナス型フラスコに（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−３−Ｏ−ベンゾイル−４−オクタデセニル４−Ｏ−（２，４−ジ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−（１−メチル−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−シアリル）−６−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−グルコピラノシド１２μmol、Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｕ）２−ＮＨ２（グルタミン酸２量体のＮ末端を９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基で保護し、Ｃ末端をアミド基とした化合物）２．５mg（５μmol）を撹拌子と共に入れ、乾燥塩化メチレン／無水ジメチルホルムアミド（１／１，ｖ／ｖ）１．２mlを加えて溶けるまで撹拌した。縮合剤（アミド化試薬である）ＷＳＣ（水溶性カルボジイミド）２．９mg（１５μmol）を加え、室温で１５時間撹拌した。原料のＦｍｏｃ−（Ｇｌｕ）２−ＮＨ２のスポットが消失し、ＵＶランプをあてるとＦｍｏｃ基に特有な青い色を発するスポット（ニンヒドリン反応は示さず、アニスアルデヒドで黒く染まる）が生成したことが確認された。溶媒をエバポレートし、クロロホルムを加え、飽和食塩水×３で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートした。得られたシロップを分取用薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１）で精製し、リゾＧＭ３ダイマー誘導体の白い固体を得た。収量：６mg（１．６０３９μmol）  収率：３２．０％  MALDI-TOF MS (positive) at 3765.06, 3779.96 (monoisotopic M. W. = 3738.51)
【００３０】
ダイマーの合成と同様の方法で、Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｕ）３−ＮＨ２３．１mg（５μmol）を用いてリゾＧＭ３トリマー誘導体（収量：５mg（０．９１０４μmol）  収率：１８．２％  MALDI-TOF MS (positive) at 5516.95, 5531.51 (monoisotopic M. W. = 5488.22)）を、Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｕ）４−ＮＨ２４．７mg（６．２５μmol）を用いてリゾＧＭ３テトラマー誘導体（収量：６mg（０．８２８４μmol）  収率：１３．３％  MALDI-TOF MS (positive) at 7265.56 (monoisotopic M. W. =7237.93)）を合成した。
【００３１】
リゾＧＭ３ダイマー誘導体１４６mg（１．６０３９μmol）が入ったナス型フラスコにメタノール約１．２mlと撹拌子を加え、良く撹拌した。ナトリウムメトキシド約１mg（１８．５μmol）を室温で加え、１８時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料のスポットが消失したことを確認してから、０℃で冷水約０．３mlを加えた。室温に戻して８時間撹拌し、Ｈ＋型にした陽イオン交換樹脂 (Dowex HCR-W2) を少量加えた。ＰＨ（ペーハー）試験紙でチェックしたところ、反応溶液には水が混ざっているために、溶液はｐＨ＝３〜４を示した。溶媒をエバポレートし、真空ポンプでメタノールを完全にとばしてからさらに水を加えて凍結乾燥すると、リゾＧＭ３ダイマーの白い綿状の固体が得られた。収量：２．８mg（１．３５μmol）  収率：２７．１％
【００３２】
ダイマーと同様の方法で、リゾＧＭ３トリマー（収量：２．５mg（０．８８μmol）  収率：１６．２％）とリゾＧＭ３テトラマー（収量：２．５mg（０．６０７μmol）  収率：９．７％）を合成した。
【００３３】
シアリルラクトース（１．００ｇ，１．５８mmol）を５mlの乾燥ピリジンに５０℃で溶解し、５mlの無水酢酸を滴下した後５mlのジメチルホルムアミドを加えた。２４時間後にメタノールを加えて反応を停止し、トルエンを加えてからエバポレーとした。得られたシロップをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝２０：１）で精製し、シアリルラクトースパーアセテートを得た。収量：１．４５ｇ  収率：８３．７％
【００３４】
シアリルラクトースパーアセテート（３２９mg，０．３０mmol）、２−アジド−１−ドデカノール（１３６mg，０．６０mmol）のジクロロエタン溶液をモレキュラーシーブ４Ａとともにアルゴン雰囲気下、５０℃で１．５時間撹拌した。反応混合物に三フッ化ホウ素エーテル錯体（１２６μl，１．０mmol）を滴下し、４０℃で２４時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで希釈した後、重曹水溶液で中和し、水洗し、クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。得られたシロップをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１０：１）で精製し、２−アジドドデシルシアリルラクトシドパーアセテートを得た。収量：１２０mg  収率：３１．７％
【００３５】
２−アジドドデシルシアリルラクトシドパーアセテート（９９．０mg，７８．４μmol）を５mlのジメチルホルムアミドに溶解し、トリフェニルホスフィン（６１．６mg，２３５μmol）と０．１mlの蒸留水を加えて５０℃で終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーを用いた出発物質消失の確認とニンヒドリン反応によるアミノ基生成の確認を行った後、トルエンを加えてエバポレーとした。得られたシロップをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１→５：１）で精製し、２−アミノドデシルシアリルラクトシドパーアセテートを得た。収量：８８．８mg  収率：９１．６％
【００３６】
Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｕ）２−ＮＨ２（グルタミン酸ダイマーのＮ末端をＦｍｏｃ基（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基）で保護し、Ｃ末端をアミド基とした化合物）（１１．３mg，２２．７μmol）、ＰｙＢＯＰ（（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）（２４．８mg，４７．７μmol）、触媒量のＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノメチルピリジン）、ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）（１５．４μl，９０．８μmol）を１mlの無水ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴン雰囲気下、室温で３０分間撹拌した。この混合物を２−アミノドデシルシアリルラクトシドパーアセテート（６７．４mg，５４．５μmol）のジメチルホルムアミド（３ml）溶液に滴下し、アルゴン雰囲気下、室温で１６時間撹拌した。トルエンを加えてエバポレーとし、得られたシロップをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製し、縮合生成物を得た。収量：６１．７mg  収率：９２．６％
【００３７】
上記縮合生成物（６１．０mg，２０．８μmol）を３mlの乾燥メタノールに溶解し、ナトリウムメトキシド（２４．３mg，４５０μmol）を加えて室温で終夜撹拌した後、カチオン交換樹脂（Amberlite IR120B ＮＡ，Ｈ＋型）で中和した。ろ過してエバポレートして得られたシロップを蒸留水に溶解してクロロホルムで洗浄後、凍結乾燥して、白い綿状のＧＭ３類似体ダイマーを得た。収量：２６．０mg  収率：６６．8％
1H-NMR (600 MHz, methanol-d3): 8.21 (m, 2H, -NHAc), 7.70 (m, 2H, -NHCO-), 4.41 (m, 2H, H-1'), 4.28 (m, 2H, H-1), 2.82 (m, 2H, H-3eq''), 1.82 (m, 2H, H-3ax''), 1.61-1.26 (m, -CH2-), 0.87 (t, 6H, J = 7.2 Hz, -CH3)
ESI-MS: calcd. for C80H141N7O42 (M + H)+, 1872.9; found (M + H)+, 1873.1
【００３８】
Ａ４３１細胞を無血清ＤＭＥＭ培地中、ＧＭ３、ＧＭ３ダイマー、ＧＭ３類似体ダイマーと共に３７℃で２４時間培養した。その後、ＥＧＦを含む無血清培地と交換して１時間培養した。細胞を溶解する界面活性剤を入りの緩衝溶液で細胞を溶解し、溶解液を遠心分離（１５，０００回転、４℃、１５分）した。上澄み液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド電気泳動）で分離した後、ウエスタンブロット法で解析（定量はデンシトメーター）した。
【００３９】
その結果、ＥＧＦＲのリン酸化に関して、ＧＭ３ダイマーは１０μＭの濃度においてＧＭ３の４．５倍、５０μＭの濃度で２．０倍の阻害活性を示し、ＧＭ３類似体ダイマーは１０μＭの濃度においてＧＭ３の２．５倍、５０μＭの濃度でも２．２倍の阻害活性を示した。特に、ＥＧＦＲのリン酸化を５０％阻害する濃度である５０μＭにおける細胞毒性は観察されなかった。さらに、ＥＧＦＲのリン酸化を強く阻害する天然のリゾＧＭ３と比較しても、ＧＭ３ダイマー、ＧＭ３類似体ダイマー共にリゾＧＭ３に匹敵する阻害活性を示した。特筆すべきは、リゾＧＭ３がＥＧＦＲのリン酸化を５０％阻害する濃度である５０μＭでは強い細胞毒性（細胞の３分の１以上が死滅）を示すのに対して、ＧＭ３ダイマー、ＧＭ３類似体ダイマー共に細胞毒性は観察されなかった。さらに、２００μＭの濃度でリゾＧＭ３を投与するとほとんどの細胞が死滅してしまうのに対して、ＧＭ３ダイマー、ＧＭ３類似体ダイマー共に２００μＭの高濃度で投与しても５０％以上の細胞が生存しており、その際のＥＧＦＲのリン酸化阻害は８０％という驚異的な値を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の化合物は、ＥＧＦＲのリン酸化に関連する疾病、たとえば、悪性腫瘍に対する処置のための医薬品として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＧＭ３ダイマーとＧＭ３類似体ダイマーのＥＧＦＲリン酸化阻害（ＧＭ３との比較）              横軸の単位はμＭ、縦軸はコントロールを１とした時の相対値
【図２】ＧＭ３ダイマーのＥＧＦＲリン酸化阻害（リゾＧＭ３との比較）              横軸の単位はμＭ、縦軸はコントロールを１とした時の相対値
【図３】ＧＭ３ダイマーとＧＭ３類似体ダイマーの細胞毒性（ＧＭ３との比較）
【図４】ＧＭ３ダイマーの細胞毒性（リゾＧＭ３との比較）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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