(57)【要約】【課題】  本発明は、歯周病関連細菌の一種であるＥｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓによって形成されるバイオフィルムの生成を抑制する薬剤を提供する。【解決手段】  上記課題の解決する薬剤として、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓによって形成されるカテキンの一種であるエピガロカテキン−３−ガレート又は、その薬理学上許容可能な誘導体を有効成分とする、バイオフィルム抑制剤である。また、本発明は、エピガロカテキン−３−ガレート又はその薬理学上許容可能な誘導体とＮ−アセチルガラクトサミン又はその薬理学上許容可能な誘導体との混合物よりなるバイオフィルム抑制剤である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エピガロカテキン−３−ガレート又はその薬理学上許容可能な誘導体を有効成分とするＥｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの活性阻害剤。
【請求項２】
エピガロカテキン−３−ガレートの薬理学上許容可能な誘導体がエピガロカテキン−３−ガレートの塩又はエステルである、請求項１に記載のＥｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの活性阻害剤。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のＥｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの活性阻害剤を有効成分とする口腔内でのバイオフィルム生成抑制剤。
【請求項４】
エピガロカテキン−３−ガレート又はその薬理学上許容可能な誘導体を０．４ｍＭから5ｍＭの範囲で含有する請求項３に記載のバイオフィルム生成抑制剤。
【請求項５】
請求項３又は請求項４に記載のバイオフィルム生成抑制剤を有効成分とする歯科用薬剤。
【請求項６】
請求項１又は請求項２に記載のＥｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの活性阻害剤を有効成分とする細菌性心内膜炎の治療及び予防用薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病関連細菌が口腔内に形成するバイオフィルムの抑制に関するものであり、より詳しくは、歯周病関連細菌の一種Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓが口腔内に形成するバイオフィルムを抑制する物質及びこれを用いた歯科用等薬剤に関する。更には、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ感染による疾患の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は口腔内に「歯周病菌」と総称される細菌が感染し、デンタルプラーク（歯垢）と呼ばれる構造を形成して炎症などを引き起こす疾患である。デンタルプラークの実体は細菌が細胞外に分泌する種々の物質（タンパク質、多糖類など）からなるバイオフィルムであり、この中にある細菌は貧食細胞や抗体などから守られ、また内部で毒素を放出し歯周組織を破壊するなどの挙動を示すことが知られている。歯周病は一種類の細菌が起こすのでは無く、複数種の細菌が複合的に感染して引き起こされるのが特徴であり、主要な菌種としてはＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓなどが知られている。またＥｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓも、日和見感染的に増殖する歯周病関連菌として知られている。
【０００３】
歯周病の予防には、毎日の歯磨きで口腔内細菌にデンタルプラークの形成を行わせない様にする事が最も重要であるが、デンタルプラークの形成を抑制するような物質を見いだし、これを効果的に用いることもまた有効である。こうした観点から、たばこ抽出物、ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼ、オリーブオイル、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウムなどの殺菌剤、ラクトフェリンとエピガロカテキンガレートを歯垢や歯周病の予防に用いる方法が開示されている（特許文献１−５）。
【０００４】
この中でも特に、カテキンに代表される茶ポリフェノールについては、抗菌活性が見いだされて以降様々な方面で利用されている。デンタルプラークもまた細菌の作用によって形成されるものであるため、茶（Ｃａｍｅｒｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）から抽出されたカテキン類、すなわちカテキン、ガロカテキン、エピカテキン、エピガロカテキンを歯周病や歯垢、歯石予防用に用いる発明が開示されている（特許文献６−１１）。しかしながらこれらの発明は、カテキンの持つ抗菌活性や細菌の付着阻害活性を利用するものであり、また対象とする細菌はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓやＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓなど歯周病のいわば主要菌種と見られる細菌であった。
【０００５】
しかしながら、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキンなど、茶葉から抽出されるカテキン類はビーカーテストなどにおいてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓやＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓなどの歯周病関連細菌に対しては殺菌力を示すが、実際にヒトの口腔内においては期待される程の強力な効果は見られなかった。
【０００６】
そこで、更なる歯周病予防或いは歯周病の治療薬剤の開発が望まれていた。
【特許文献１】特許第３２８４０４２号  歯周病の予防用或いは治療用組成物
【特許文献２】特表２００３−５１９１６７  微生物による接着を阻害するための方法及び組成物
【特許文献３】特表２００４−５１１５０６  口腔内のバクテリアによるプラークおよび／またはバクテリアを除去または低減するための口内衛生製品の調製におけるオリーブオイルの用途
【特許文献４】特表２００５−５３３８６４  ラクトフェリンを含む組成物
【特許文献５】特開２０００−２５６１５５  口腔用組成物
【特許文献６】特公平７−２５６７０  抗歯周病剤
【特許文献７】特公平８−１３７３８  歯垢除去剤及び歯石沈着防止剤
【特許文献８】ＷＯ２００３／０９４８７８  ガロカテキンガレート含有組成物
【特許文献９】特開平５−９４４  歯周病原因菌付着阻害用組成物
【特許文献１０】特開平６−５６６８７  歯垢除去剤及び歯石沈着防止剤
【特許文献１１】特開２００４−３１５４１４  歯石形成抑制剤
【非特許文献１】Ａｚａｋａｍｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：４４１−４４６．
【非特許文献２】Ｒｅｚａｉ−Ｚａｄｅｈ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５（３８）：８８０７−１４．
【非特許文献３】Ｙａｍａｄａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１（１２）：１０８０−８９．
【非特許文献４】Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：２９５０−５８．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の現状に鑑み、本発明者らは、ヒトの口腔内で、より有効に歯周病を抑制する薬剤の開発を目的とし、まずヒト口腔内で歯垢や歯石が形成されるメカニズムを研究した結果、主としてＥｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ（以下、Ｅ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓともいう）が、バイオフィルム形成の初期段階に関与し（非特許文献１）、その後バイオフィルムによって保護された状態下に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓやＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓなどの主要歯周病菌が繁殖し、強固な歯垢や歯石を形成することを見出した。
【０００８】
そこで、本発明者らは、まずＥ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの作用を抑制する方法を検討した。
【０００９】
その結果、驚くべきことに、カテキン類の中でも特異的にエピガロカテキン−３−ガレートがＥ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの活性を阻害し、口腔中でのバイオフィルムの生成を抑制する効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで本発明は、次の態様からなる。
（１）本発明の第１の態様は、エピガロカテキン−３−ガレート又はその薬理学上許容可能な誘導体を有効成分とするＥｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの活性阻害剤である。
（２）本発明の第２の態様は、上記第１の態様におけるエピガロカテキン−３−ガレートの薬理学上許容可能な誘導体がエピガロカテキン−３−ガレートの塩又はエステルである第１の態様に記載のＥｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの活性阻害剤である。
（３）本発明の第３の態様は、前記第１の態様又は第２の態様に記載のＥｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの活性阻害剤を有効成分とする口腔内でのバイオフィルム生成抑制剤である。
（４）本発明の第４の態様は、エピガロカテキン−３−ガレート又はその薬理学上許容可能な誘導体を０．４ｍＭから5ｍＭの範囲で含有する上記第３の態様に記載のバイオフィルム生成抑制剤である。
（５）本発明の第５の態様は、上記第３の態様又は第４の態様に記載のバイオフィルム生成抑制剤を有効成分とする歯科用薬剤である。
（６）本発明の第６の態様は、上記第１の態様又は第２の態様に記載のＥｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの活性阻害剤を有効成分とする細菌性心内膜炎の治療及び予防用薬剤である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明を利用することにより、歯周病細菌の一種であるＥ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓに起因して形成されるバイオフィルムを効果的に抑制することが可能となり、延いてはその他の歯周病細菌の増殖を容易に抑制することができ、デンタルプラークの予防となる。またＥ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓは、歯科治療過程などで体内にも感染することが知られ、細菌性の心内膜炎や冠状動脈疾患との関連が指摘されており、本発明の提供するＥ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの活性阻害剤は同菌の感染に起因するこれらの疾患を予防または治療するためにも利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の最大のポイントは、Ｅ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの活性を阻害するため、エピガロカテキン−３−ガレート及び／又はエピガロカテキン−３−ガレートの薬理学上許容可能な誘導体（以下、これらを総称してＥＧＣＧともいう）が特異的に効果を有すること、具体的には、口腔内でのバイオフィルムの形成を抑制することを見出した点にある。
【００１３】
ＥＧＣＧは、他のカテキン類と共に茶葉に多く含まれていることは知られている。
【００１４】
そして、従来茶葉から抽出されるカテキン類が、歯周病予防又は治療剤として、用いられることも知られている。
【００１５】
しかし、従来茶葉抽出カテキン類は、抽出物自体混合物の状態で用いられることが多く、特に茶葉抽出カテキン誘導体混合物の中から、ＥＧＣＧを単離して用いられることはほとんどなかったのである。
【００１６】
そのため、ＥＧＣＧの持つ特異的な作用効果は全く知られていなかった。
【００１７】
その理由の一つとして、本発明者らの知見によると後述する実施例及び比較例に示すとおり、所謂カテキン（３−オキシフラバン）を用いた場合には、逆にＥ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓによるバイオフィルムの生成を抑制するどころか、かえって助長する傾向さえ見られるのである。
【００１８】
このため、従来ＥＧＣＧがバイオフィルムの生成を抑制するという特異な作用効果が見逃されていたものと思われる。
【００１９】
そこで、本願の明細書及び特許請求の範囲において「エピガロカテキン−３−ガレート」という表現は、エピガロカテキン−３−ガレート（すなわちトリヒドロキシ安息香酸のカテキンエステル）、その塩或いはエステルその他の誘導体以外のカテキン類を含まないものを意味すると定義される。
【００２０】
本発明の特徴は、ＥＧＣＧを有効成分とするＥ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの活性を阻害する薬剤である。ＥＧＣＧは、下記一般式（１）に示す構造を有する化合物である。
【００２１】
【化１】
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本発明において用いられるエピガロカテキン−３−ガレートの薬理学上許容可能な誘導体とは次の構造式（２）の骨格を持ち、且つ薬理学上許容可能な化合物である。
【００２２】
【化２】
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構造式（２）において、カテキンが有する水酸基の水素の一部が塩基で置換された構造の塩や、水酸基が酸と結合したエステル等が本発明の対象となる。
【００２３】
ＥＧＣＧは、化学的に合成可能な化合物であるが、主として歯科薬剤として経口的に用いられることに鑑み、これを多く含む茶（Ｃａｍｅｒｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の葉などから抽出し、精製して用いるのが好ましい。
【００２４】
茶葉から抽出されたカテキン類からのＥＧＣＧの分離精製方法は何等特定されない。公知の方法、例えば減圧蒸留やクロマトカラムによる分離方法等が採用される。
【００２５】
本発明のバイオフィルム抑制剤に含まれるＥＧＣＧの有効濃度としては、一般にあまり低濃度では効果がなく、少なくとも０．４ｍＭ以上で用いるのが好ましい。より好ましくは０．４５ｍＭ以上で用いる。なお、あまりに高濃度で用いても、一定の効果以上は期定できないし、かえって効果が下がる傾向さえ示すため、上限としては５ｍＭ程度で用いることが推奨される。中でも０．４５〜１ｍＭの範囲とするのが好ましい。
【００２６】
本発明者らは、これまでに次の一般式（３）で示すアミノ糖の一種であるＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａＬＮＡｃという）がＥ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓによるバイオフィルムの形成を抑制することを見出しており、濃度１ｍＭから１０ｍＭの範囲内のＧａｌＮＡｃが４０％程度のバイオフィルム形成阻害作用を示すと報告している（非特許文献１）。ＧａｌＮＡｃは、Ｅ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの持つＧａｌＮａｃ特異的レクチン様物質（ＥｃＬＳ）と結合することで、ＥｃＬＳが仲介している菌体とヒト組織との結合（非特許文献３）或いはＥ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓと他種の歯周病関連細菌との相互作用を阻害すると考えられており、本発明におけるＥＧＣＧの作用とは別種の効果であると考えられることから、これを本発明の補助成分として利用することもまた有効である。
【００２７】
【化３】
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本発明の提供するバイオフィルム抑制剤は、主として経口的な利用法、すなわち歯科用薬剤や練り歯磨き、うがい薬やチューインガムの内容物等の形で利用可能であるが、歯周病関連菌が抜歯などの出血時に血液を通じて感染し、心内膜などに感染巣を形成して細菌性の心内膜炎を引き起こす事が知られるようになり、その感染巣にＥ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓが見られる事から、本発明のＥ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの活性阻害剤を注射薬等の形で利用することもまた可能である。注射薬に適用した場合の安全性については、非特許文献２で示された様に、エピガロカテキン−３−ガレートをマウスに注射してもそれ自体では害が無いことが明らかとなっており、ヒトに適用した場合の安全性確認が必要としても、本発明の注射薬としての利用もまた可能であると考えられる。
【００２８】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
（Ｅ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓの培養）
Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓは、Ｆａｒｓｙｔｈ  ＤｅｎｔａｌＣｅｎｔｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）より分与された１０７３株を用いた。培養液はＴｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ；２ｍｇ／ｍｌ  ＫＮＯ３、５μｇ／ｍｌヘミン含有）を用い、３７℃で培養した。
（バイオフィルム形成の定量化のためのＡｄｈｅｒｅｎｃｅ  ａｓｓａｙ）
Ｅ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓによるバイオフィルム形成態の定量化はＤｊｏｓｃｉｅｎｃｅらの方法（非特許文献４）に従った。すなわち、ポリスチレン製９６穴プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ．平底タイプ）を用い、Ｅ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓを含むＴＳＢ培養液を各穴に分注し、更にプレートの各穴には、１２穴ずつ次表に示す薬剤をそれぞれ加え、３７℃で３６時間培養した。
【００３０】
その後、プレートをＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で４回軽く洗い、残った（バイオフィルムを形成してプレートに付着した）細胞をメタノールで固定してクリスタルバイオレットで染色した。分光光度計を用い、着色したバイオフィルムの光学的密度を、５９５ｎｍの吸収（ＯＤ５９５）を測定することによって測定した。以上の一連の操作を３回繰り返し行い、各実験データの平均値を求めた。
【００３１】
【表１】
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（結果）
結果を図１に示す。
【００３２】
図１の縦軸はバイオフィルムの形成量（ＯＤ５９５換算値）を示す。グラフのＥｒｒｏｒ  Ｂａｒは、標準誤差（ＳＥＭ）をあらわす。
【００３３】
図１より、比較例１（Ａ）の薬剤無添加（対照）と比較して、本願発明の実施例３（Ｃ）はバイオフィルムの形成が１／４以下と明らかな有意差を示している。また、カテキンとＥＧＣＧとを併せ用いた場合（Ｂ）は、驚くべきことにバイオフィルムが、対照の約１．４倍以上となるのである。
【００３４】
また、ＥＧＣＧの濃度については、０．５ｍＭ近辺で最良の効果を示す。
【００３５】
ＥＧＣＧにＧａｌＮＡｃを混合した場合は、ＥＧＣＧ単独の場合より更に効果が期待されるものと思われる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の提供するバイオフィルム抑制剤は、歯周病関連細菌の一種Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓによるバイオフィルム形成を効果的に抑制可能なものであり、予防歯科の重要性が認識されている今日において、口腔衛生産業等に利用する事が可能である。
【００３７】
更に、本発明はＥＧＣＧと併せてＧａｌＮＡｃ或いは他の歯周病予防剤、例えばポリフェノールオキシダーゼ、アスパラキネーゼオリーブオイル、塩化セチルピリジニウム、ラクトフェリンなど、所謂カテキン以外の歯周病予防又は治療用薬剤と混用することにより、更に有力なデンタルプラークの予防又は治療剤となると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】はＥＧＣＧ添加によるバイオフィルム形成の抑制効果を示す。グラフ縦軸はバイオフィルムの形成量（ＯＤ５９５換算）を示し、本発明のバイオフィルム抑制剤と対照（無添加）、比較例を比較した。また、バイオフィルム抑制剤の濃度による影響を示すグラフである。
【図１】
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