(57)【要約】  【課題】アレルギー性喘息あるいはアレルギー性鼻炎のモデル動物の迅速な提供が求められている。  【解決手段】本発明により、アレルギー性喘息モデル動物またはアレルギー性鼻炎モデル動物を短期間で作製することができる。本発明により得られるアレルギー性喘息あるいは鼻炎モデル動物は、アレルギー性喘息あるいはアレルギー性鼻炎の予防・治療薬のスクリーニング・評価等に有用である。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３〜１４日間に１回の頻度で２回以上アレルゲンを投与した後に、同種のアレルゲンを２回以上気管内投与することを特徴とする、非ヒト霊長動物の感作方法。
【請求項２】
３〜１４日間に１回の頻度で２回以上アレルゲンを投与した後、同種のアレルゲンを２回以上気管内投与する前、あるいは同種のアレルゲンを２回以上気管内投与する期間中に、同種のアレルゲンを１回以上投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アレルゲンの投与を１０週間以内に行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アレルゲンの合計投与回数が８回以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
３〜１４日間に１回の頻度で２回以上投与するアレルゲンの投与量が非ヒト霊長動物の体重１ｋｇあたり１〜１００ｍｇ／回である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
２回以上気管内投与する同種のアレルゲンの投与量が非ヒト霊長動物の体重１ｋｇあたり１μｇ〜１０ｍｇ／回である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
３〜１４日間に１回の頻度で２回以上アレルゲンを投与した後、同種のアレルゲンを２回以上気管内投与する前、あるいは同種のアレルゲンを２回以上気管内投与する期間中に１回以上投与する同種のアレルゲンの投与量が非ヒト霊長動物の体重１ｋｇあたり０．１〜１０ｍｇ／回である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
アレルゲンの気管内以外の投与部位が腹腔、筋肉または皮下である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
アレルゲンを２以上の部位に投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の感作方法により得られた非ヒト霊長動物にさらに同種のアレルゲンを投与する、アレルギー性喘息非ヒト霊長動物の作製方法。
【請求項１１】
３〜１４日間に１回の頻度で２回以上アレルゲンを腹腔、筋肉または皮下に投与することを特徴とする、非ヒト霊長動物の感作方法。
【請求項１２】
アレルゲンを２以上の部位に投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アレルゲンの投与を３週間以内に行う、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
アレルゲンの合計投与回数が５回以下である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
アレルゲンの投与量が非ヒト霊長動物の体重１ｋｇあたり１〜１００ｍｇ／回である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
１週間に４回以上の頻度でアレルゲンを鼻腔内投与することを特徴とする、非ヒト霊長動物の感作方法。
【請求項１７】
アレルゲンの投与を３週間以内に行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アレルゲンの合計投与回数が７回以上３０回以下である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
アレルゲンの投与量が非ヒト霊長動物の１鼻腔あたり１〜１００μｇ／回である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の感作方法により得られた非ヒト霊長動物にさらに同種のアレルゲンを投与する、アレルギー性鼻炎非ヒト霊長動物の作製方法。
【請求項２１】
非ヒト霊長動物がサルである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
サルがカニクイザル、アカゲザルあるいはニホンザルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アレルゲンがアスカリス、ダニあるいはスギ花粉アレルゲンである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
アスカリス、ダニあるいはスギ花粉アレルゲンが水酸化アルミニウムに吸着させたアスカリス、ダニあるいはスギ花粉アレルゲンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法で得られた非ヒト霊長動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ヒト霊長動物の感作方法及びアレルギー性喘息またはアレルギー性鼻炎モデル非ヒト霊長動物の作製方法に関する。          
【背景技術】
【０００２】
通常、アレルギー反応とはアレルゲンによって惹起されるI型アレルギー反応を指すことが多く、アレルギー性疾患の代表的なものはアレルギー性喘息あるいはアレルギー性鼻炎である。
アレルギー性喘息は気道の炎症と発作性の気流制限による呼吸困難を特徴とする。気流制限は軽度のものから致死的な高度のものまで存在する。近年、先進国での喘息の発症率は増加の一途をたどっており、今後社会的に大きな問題になる疾患の１つとされている。      
【０００３】
アレルギー性鼻炎は鼻内掻痒感、くしゃみ、粘膜蒼白化、鼻汁、鼻閉が主症状であり、代表的なものにスギ花粉症に伴う鼻炎がある。アレルギー性鼻炎は死に至る病ではないが、患者にとっては非常に不愉快な症状である。先進国の罹患率は１０〜２０％と高い。
アレルギー性疾患の治療には、対症療法として抗ヒスタミン薬、抗アレルギー剤、ステロイド剤、さらには免疫抑制剤等が使われている。根治療法としては減感作療法があるが、副作用としてアナフィラキシーが起こること、また治療期間が数年に及ぶこと等から、新たな治療薬が望まれている。
【０００４】
アレルギー性喘息あるいはアレルギー性鼻炎の新たな治療薬を開発するには、アレルギー性喘息あるいはアレルギー性鼻炎モデル動物を用いた治療薬のスクリーニングが重要である。主要抗原により免疫応答が惹起され、ヒトに類似したアレルギー病態を備えたモデル動物は、抗原特異的なアレルギーの治療法および治療薬開発の際に必要であり、また、アレルギーの発症、緩解・治療等の機序解明に有用である。
【０００５】
アレルギー性喘息モデル動物に関しては、例えばダニアレルゲンを抗原としてアカゲザルに筋肉および鼻腔内投与することにより作製されたモデルザルが知られている（非特許文献１）。またダニアレルゲンを皮下投与することにより誘発されるアレルギー性喘息をカニクイザルに発現させる方法が知られている（非特許文献２）。  
アレルギー性鼻炎モデル動物に関しては、スギ粗抗原をアカゲザルに皮下投与することにより作製されたアレルギー性鼻炎モデルザルが知られている（非特許文献３）。またスギ花粉抗原を皮下投与することにより誘発されるアレルギー性鼻炎をマーモセットに発現させるアレルギー性鼻炎モデル動物の作製方法が知られている（非特許文献４）。
【０００６】
しかしながら、これらの方法はアレルギー性喘息あるいはアレルギー性鼻炎のモデル動物を作製するまでに少なくとも６ヵ月以上という、非常に長い期間を必要とする。
【非特許文献１】American Journal of Pathology, 158: 333-341, 2001.
【非特許文献２】Journal of Applied Physiology 96: 1433-1444, 2004.
【非特許文献３】International archives of allergy and applied immunology, 93: 83-88, 1990.
【非特許文献４】アレルギー，48巻，1086, 1999年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、アレルギー性喘息あるいはアレルギー性鼻炎に対する予防・治療作用を有する化合物のスクリーニング等において有用なモデル動物を短期間で作製する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、新たなアレルギー性喘息あるいはアレルギー性鼻炎モデル動物を作製することを検討した結果、従来の半分以下の期間で効率的に作製する方法を見出した
すなわち本発明は、以下の（１）〜（２５）に関する。
（１）３〜１４日間に１回の頻度で２回以上アレルゲンを投与した後に、同種のアレルゲンを２回以上気管内投与することを特徴とする、非ヒト霊長動物の感作方法。
（２）３〜１４日間に１回の頻度で２回以上アレルゲンを投与した後、同種のアレルゲンを２回以上気管内投与する前、あるいは同種のアレルゲンを２回以上気管内投与する期間中に、同種のアレルゲンを１回以上投与する、（１）に記載の方法。
（３）アレルゲンの投与を１０週間以内に行う、（１）または（２）に記載の方法。
（４）アレルゲンの合計投与回数が８回以下である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）３〜１４日間に１回の頻度で２回以上投与するアレルゲンの投与量が非ヒト霊長動物の体重１ｋｇあたり１〜１００ｍｇ／回である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）２回以上気管内投与する同種のアレルゲンの投与量が非ヒト霊長動物の体重１ｋｇあたり１μｇ〜１０ｍｇ／回である、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
（７）３〜１４日間に１回の頻度で２回以上アレルゲンを投与した後、同種のアレルゲンを２回以上気管内投与する前、あるいは同種のアレルゲンを２回以上気管内投与する期間中に１回以上投与する同種のアレルゲンの投与量が非ヒト霊長動物の体重１ｋｇあたり０．１〜１０ｍｇ／回である、（２）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８）アレルゲンの気管内以外の投与部位が腹腔、筋肉または皮下である、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９）アレルゲンを２以上の部位に投与する、（８）に記載の方法。
（１０）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の感作方法により得られた非ヒト霊長動物にさらに同種のアレルゲンを投与する、アレルギー性喘息非ヒト霊長動物の作製方法。
（１１）３〜１４日間に１回の頻度で２回以上アレルゲンを腹腔、筋肉または皮下に投与することを特徴とする、非ヒト霊長動物の感作方法。
（１２）アレルゲンを２以上の部位に投与する、（１１）に記載の方法。
（１３）アレルゲンの投与を３週間以内に行う、（１１）または（１２）に記載の方法。
（１４）アレルゲンの合計投与回数が５回以下である、（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）アレルゲンの投与量が非ヒト霊長動物の体重１ｋｇあたり１〜１００ｍｇ／回である、（１１）〜（１４）のいずれか１項に記載の方法。
（１６）１週間に４回以上の頻度でアレルゲンを鼻腔内投与することを特徴とする、非ヒト霊長動物の感作方法。
（１７）アレルゲンの投与を３週間以内に行う、（１６）に記載の方法。
（１８）アレルゲンの合計投与回数が７回以上３０回以下である、（１６）または（１７）に記載の方法。
（１９）アレルゲンの投与量が非ヒト霊長動物の１鼻腔あたり１〜１００μｇ／回である、（１６）〜（１８）のいずれか１項に記載の方法。
（２０）（１１）〜（１９）のいずれか１項に記載の感作方法により得られた非ヒト霊長動物にさらに同種のアレルゲンを投与する、アレルギー性鼻炎非ヒト霊長動物の作製方法。
（２１）非ヒト霊長動物がサルである、（１）〜（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２２）サルがカニクイザル、アカゲザルあるいはニホンザルである、（２１）に記載の方法。
（２３）アレルゲンがアスカリス、ダニあるいはスギ花粉アレルゲンである、（１）〜（２２）のいずれか１項に記載の方法。
（２４）アスカリス、ダニあるいはスギ花粉アレルゲンが水酸化アルミニウムに吸着させたアスカリス、ダニあるいはスギ花粉アレルゲンである、（２３）に記載の方法。
（２５）（１）〜（２４）のいずれか１項に記載の方法で得られた非ヒト霊長動物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、非ヒト霊長動物の感作を短期間に行うことができ、アレルギー性喘息モデル動物およびアレルギー性鼻炎モデル動物を短期間で作製することができる。本発明により得られるアレルギー性喘息あるいはアレルギー性鼻炎モデル動物は、アレルギー性喘息あるいはアレルギー性鼻炎の予防・治療のための治療薬の開発等に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で用いられる非ヒト霊長動物としては、非ヒト霊長動物であれば特に制限はないが、サル、マーモセット等があげられる。非ヒト霊長動物の週齢、体重等については特に制限はない。
サルとしては、カニクイザル、アカゲザルあるいはニホンザルが好ましく用いられる。
本発明で用いられるアレルゲンとしては、動物にアレルギーを惹起させるものであれば特に制限はないが、例えばアスカリスアレルゲン、ダニアレルゲン、スギ花粉アレルゲン等があげられる。
【００１１】
本発明においてアスカリスアレルゲン（Gundel RH. et al.; J Appl Physiol. 68(2), 779-786, 1990, Doyle WJ. et al.; Journal of Allergy and Clinical Immunology. 83(1), 304, 1989）は、アスカリス虫体あるいはアスカリスアレルゲンの固形、粒状、ゲル状、液状、溶媒に懸濁または溶解したもの、水酸化アルミニウム等の吸着剤に吸着させたもの、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）等のハプテンとの結合体、エアロゾル状等どのような形態でもよいが、水酸化アルミニウム等の吸着剤に吸着させたものが好ましく用いられる。
本発明においてダニアレルゲン（Schelegle ES. et al.; American Journal of Pathology, 158, 333-341, 2001, J Appl Physiol. 91, 1029-1034, 2001）は、ダニ(Dermatophagoides pterobyssinus（Ｄｐ）、Dermatophagoides farinae（Ｄｆ）)虫体あるいはダニアレルゲンの固形、粒状、ゲル状、液状、溶媒に懸濁または溶解したもの、水酸化アルミニウム等の吸着剤に吸着させたもの、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）等のハプテンとの結合体、エアロゾル状等どのような形態でもよいが、水酸化アルミニウム等の吸着剤に吸着させたものが好ましく用いられる。
【００１２】
本発明においてスギ花粉アレルゲン（特開2004-275183、特開2004-275184）は、スギ花粉あるいはスギ花粉アレルゲン（Ｃｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２）の固形、粒状、ゲル状、液状、溶媒に懸濁または溶解したもの、水酸化アルミニウム等の吸着剤に吸着させたもの、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）等のハプテンとの結合体、エアロゾル状等どのような形態でもよいが、水酸化アルミニウム等の吸着剤に吸着させたものが好ましく用いられる。
【００１３】
本発明におけるアレルギー性喘息モデル非ヒト霊長動物の作製において、まずアレルゲンの感作として、（a）麻酔もしくは非麻酔下で、アレルゲンを通常３〜１４日の投与間隔を置いて２回以上投与する。アレルゲンの投与間隔は通常３〜１４日であるが、より好ましくは５〜１０日、さらに好ましくは６〜８日、特に好ましくは７日である。アレルゲンの投与回数は２〜５回であり、好ましくは２〜４回、より好ましくは３回である。アレルゲンの投与量は１回につき動物個体の体重１ｋｇあたり１〜１００ｍｇであり、好ましくは１０〜５０ｍｇ、より好ましくは１５〜４０ｍｇ、さらに好ましくは１８〜２５ｍｇ、特に好ましくは約２０ｍｇである。アレルゲンの投与部位は気管内、腹腔、皮下あるいは筋肉内等、投与可能な部位であればいずれの部位でもよいが、腹腔、皮下あるいは筋肉内への投与が好ましく、腹腔、皮下あるいは筋肉内の２以上の部位へ投与することがより好ましい。
(a)に引き続き追加感作として、（b）麻酔もしくは非麻酔下で、同種のアレルゲンを適当な間隔をおいて２回以上気管内投与する。投与間隔は３〜４２日であり、より好ましくは７〜３５日、さらに好ましくは１４〜２８日、特に好ましくは２１日である。投与方法としては特に制限はないが、ネブライザを用いた吸入方法があげられる。具体的な方法としては、以下の方法があげられる。超音波式ネブライザで霧化したアレルゲンを人工呼吸器（３０回転/分）にて気管チューブを介して吸入させる。吸入量は１回につき動物個体の体重１ｋｇあたり１μｇ〜１０ｍｇであり、好ましくは５μｇ〜５ｍｇ、より好ましくは５００μｇ〜１ｍｇである。
さらに(b)とは別の追加感作として、麻酔もしくは非麻酔下で、（a）と（b）の間あるいは（b）の工程中に同種のアレルゲンを１回以上投与してもよい。アレルゲンの投与量は１回につき動物個体の体重１ｋｇあたり０．１〜１０ｍｇであり、好ましくは０．５〜８ｍｇ、より好ましくは０．８〜５ｍｇ、さらに好ましくは１〜３ｍｇ、特に好ましくは２ｍｇである。アレルゲンの投与回数は通常１〜３回であり、好ましくは１〜２回であり、より好ましくは１回である。アレルゲンの投与部位は気管内、腹腔、皮下あるいは筋肉内等、投与可能な部位であればいずれの部位でもよいが、腹腔、皮下あるいは筋肉内への投与が好ましく、腹腔、皮下あるいは筋肉内の２以上の部位へ投与することがより好ましい。
【００１４】
本発明におけるアレルギー性喘息モデル動物の作製において、以上の過程を経ることにより、短期間、例えば約８〜１０週間でアレルゲンによる感作を終了することができる。上記の感作方法により得られた非ヒト霊長動物に同種のアレルゲンを投与することにより、アレルギー性喘息モデル非ヒト霊長動物を作製することができる。同種のアレルゲンの投与によるアレルギー反応の惹起は、感作が終了してから１〜６週間後に行うことが好ましく、２〜５週間後に行うことがより好ましい。すなわち本発明により、アレルギー性喘息モデル非ヒト霊長動物の作製を９〜１６週間、好ましくは１０〜１５週間で完了することができる。
【００１５】
本発明におけるアレルギー性鼻炎モデル動物の作製において、まずアレルゲンの感作法としては、全身感作法と局所感作法の２種類の方法があげられる。全身感作法としては鼻腔以外の部位にアレルゲンを投与する方法があげられ、局所感作法としては鼻腔にアレルゲンを投与する方法があげられる。
本発明において全身感作法では、麻酔もしくは非麻酔下で、アレルゲンを通常３〜１４日の間隔を置いて２回以上投与する。アレルゲンの投与間隔は通常３〜１４日であるが、好ましくは２〜１０日、より好ましくは７日である。アレルゲンの投与量は１回につき動物個体の体重１ｋｇあたり１〜１００ｍｇであり、好ましくは２〜５０ｍｇ、より好ましくは５〜２５ｍｇ、さらに好ましくは８〜２０ｍｇ、特に好ましくは約１０ｍｇである。アレルゲンの合計投与回数は２〜５回であり、好ましくは２〜４回であり、より好ましくは３回である。アレルゲンの投与部位は気管内、腹腔、皮下あるいは筋肉内等、投与可能な部位であればいずれの部位でもよいが、腹腔、皮下あるいは筋肉内への投与が好ましく、腹腔、皮下あるいは筋肉内の２以上の部位へ投与することがより好ましい。
【００１６】
本発明において局所感作法では、麻酔もしくは非麻酔下で、アレルゲンを１週間に４回以上の頻度で鼻腔内投与する。アレルゲンの投与量は１回につき動物個体の１鼻腔あたり１〜１００μｇであり、好ましくは２〜５０μｇ、より好ましくは３〜４０μｇ、さらに好ましくは５〜２０μｇ、特に好ましくは１０μｇである。アレルゲンの投与頻度は１週間あたり４〜１０回であり、好ましくは４〜８回であり、より好ましくは４〜７回であり、さらに好ましくは５回である。アレルゲンの合計投与回数は７〜３０回であり、好ましくは７〜２５回、より好ましくは７〜２０回、さらに好ましくは８〜１２回であり、特に好ましくは１０回である。アレルゲンの投与方法は点鼻あるいは噴霧等鼻腔内投与可能な方法であればいずれでもよいが、点鼻投与が好ましい。
【００１７】
本発明におけるアレルギー性鼻炎モデル動物の作製において、以上の過程を経ることにより、短期間、例えば約２〜３週間でアレルゲンによる感作を終了することができる。上記の感作方法により得られた非ヒト霊長動物に同種のアレルゲンを投与することにより、アレルギー性鼻炎モデル非ヒト霊長動物を作製することができる。同種のアレルゲンの投与によるアレルギー反応の惹起は、感作が終了してから１〜３週間後に行うことが好ましく、１〜２週間後に行うことがより好ましい。すなわち本発明において、アレルギー性鼻炎モデル動物の作製を３〜６週間、好ましくは３〜５週間で完了することができる。
【００１８】
本発明において、動物がアレルゲンにより感作されたか否かは、例えば血中のアレルゲン特異的抗体の抗体価を測定することにより調べることができる。抗体価の測定方法としては、抗体価を測定できる方法であればいずれの方法でも良いが、ＥＬＩＳＡ法が好ましく用いられる。
本発明により作製されるアレルギー性喘息モデル非ヒト霊長動物は、（１）血液中の免疫グロブリン・化学伝達物質・補体成分等の濃度や白血球相の測定、（２）好塩基球・組織肥満細胞のヒスタミン遊離能測定、（３）Ｔ細胞・Ｂ細胞の反応性試験、（４）白血球の遊離能測定試験、（５）気管支肺胞洗浄液中の細胞相・化学伝達物質測定、（６）抗原・アセチルコリンアナログ・ヒスタミン・ロイコトリエン等の吸入による気道収縮反応惹起試験、（７）気道粘膜等の抗原刺激によるアレルギー性炎症惹起試験等に用いることができる。
【００１９】
本発明により作製されるアレルギー性鼻炎モデル非ヒト霊長動物は、（１）血液中の免疫グロブリン・化学伝達物質・補体成分等の濃度や白血球相の測定、（２）好塩基球・組織肥満細胞のヒスタミン遊離能測定、（３）Ｔ細胞・Ｂ細胞の反応性試験、（４）白血球の遊離能測定試験、（５）鼻腔洗浄液中の細胞相・化学伝達物質測定、（６）抗原・アセチルコリンアナログ・ヒスタミン・ロイコトリエン等の吸入による鼻腔収縮反応惹起試験、（７）鼻粘膜等の抗原刺激によるアレルギー性炎症惹起試験等に用いることができる。
【００２０】
本発明により作製されるアレルギー性喘息モデル動物またはアレルギー性鼻炎モデル動物は、アレルギー性喘息または鼻炎の予防・治療作用を有する化合物のスクリーニングや評価にも用いることができる。
例えば被験物質を本発明のアレルギー性喘息動物に投与し、気道過敏性、即時型喘息反応、気道内炎症細胞浸潤、ＩｇＥ抗体価およびサイトカイン産生等を指標にその被験物質の治療効果を調べることができる。また被験物質を本発明のアレルギー性鼻炎動物に投与し、鼻汁あるいは鼻閉等を指標にその被験物質の治療効果を調べることができる。
【００２１】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
ＤＮＰ（ジニトロフェニル）アスカリスの感作および追加感作による喘息モデルの作製
（１）感作
約４〜６歳齢の雄性カニクイザル（Siconbrec Inc.から購入）１２頭に、ＤＮＰ（ジニトロフェニル）化後に水酸化アルミニウムゲル（１００ｍｇ／ｍＬ）を吸着させたアスカリスアレルゲン（以下ＤＮＰアスカリスという）を麻酔下にて、図１に示す通り１週間間隔で３回、腹腔および筋肉内に総量として体重１ｋｇあたり２０ｍｇ／回の用量で投与した。
（２）追加感作
図１に示す通り感作終了から３週間後に、ＤＮＰアスカリス（４０〜４０００ μｇ／ｍＬ）を３週間間隔で２回、吸入により気管内投与した。さらに、１回目の気管内投与から１週間後に、ＤＮＰアスカリスを筋肉内に体重１ｋｇあたり２ｍｇの用量で投与した。
【実施例２】
【００２３】
血中抗体の測定
感作１週間後、血中抗体価を測定するために、無麻酔下でサルの後肢伏在静脈から採血を行い、血清中のＤＮＰアスカリス特異的ＩｇＥ抗体価を以下の手順でＥＬＩＳＡ法により測定した。
なお以下の記載において、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩液（Phosphate Buffered Saline）、ＢＳＡはウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin）、ＴＭＢは発色基質液（Tetramethylbenzidine）をそれぞれ示す。
（１）コーティング
ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した抗ヒトＩｇＥ抗体および10μｇ／ｍＬに希釈したＤＮＰアスカリスをそれぞれカラム１およびカラム２に50 μＬ／wellとなるように添加した。プレートがＤＮＰアスカリスおよび抗ヒトＩｇＥ抗体溶液で覆われるように振盪させ、４℃で一夜静置した。各ウェルを３００μＬのＰＢＳ/Tween（０．０５％(ｖ/ｖ) Tween-２０／ＰＢＳ）で３回洗浄した。
（２）ブロッキング
プレートを１ウェルあたり３００μＬのブロッキングバッファー（１％(ｗ/ｖ)ＢＳＡ／ＰＢＳ）でブロック後、プレートをカバーし、室温で１時間静置した。プレートを１ウェルあたり３００μＬのＰＢＳ/Tween（０．０５％(ｖ/ｖ) Tween-２０／ＰＢＳ）で３回洗浄した。
（３）標準物質および被験物質の添加
ヒトＩｇＥ（Human IgE Calibrator, Bethyl Laboratories社製）を前記ブロッキングバッファーで２５、１０、５、２．５、１、０．５、０．２５ｎｇ／ｍＬに希釈した。各希釈液５０μＬにブロッキングバッファーを１００μＬ加え、さらにＰＢＳを等量加えたSephadex G25M（ＰＤ−１０, Amersham Biosciences社製）を攪拌しながら２００μＬ加え、室温で４時間静置した。この混液を約１，５００×ｇで３分間遠心ろ過したものを標準物質とした。
【００２４】
血清５０μＬにブロッキングバッファーを１００μＬ加え、ＰＢＳを等量加えたProtein G Sephaloseを攪拌しながら２００μＬ加え、室温で４時間静置した。これを約１，５００×ｇで３分間遠心ろ過したものを被験物質とした。
カラム１には標準物質、カラム２には被験物質を１ウェルあたり５０μＬずつ添加した。プレートをカバーし、４℃で一夜静置した後、ブロッキングバッファーで５回洗浄した。
（４）検出抗体の添加
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＥ（Goat Anti-Human IgE, Biosource社製）をブロッキングバッファーで１０００倍に希釈し、プレートに各ウェルあたり５０μＬずつ添加した。プレートをカバーし、室温で１時間静置後、ブロッキングバッファーで５回洗浄した。
【００２５】
１ウェルあたり５０μＬずつのTMBを添加し、室温で３０分間静置させた。１ウェルあたり５０μＬずつ１ｍｏｌ／Ｌ硫酸を添加し、呈色反応を終止した。４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＤＮＰアスカリス特異的ＩｇＥ抗体価を測定した。その結果を図２に示す。
図２に示すように、実施例１でＤＮＰアスカリスに感作させたサルは、血清中のＤＮＰアスカリス特異的ＩｇＥ抗体価が高く維持されていた。
【実施例３】
【００２６】
末梢血ＣＣＲ４陽性細胞数の測定
感作から１週間後、無麻酔下でサルの後肢伏在静脈から血液を採取し、フローサイトメーターにより末梢血中のＣＣＲ４陽性Ｔｈ２細胞数を以下の手順で測定した。
（１）測定サンプルの調製
ＰＥ標識抗ヒトＣＣＲ４（Becton Dickinson社製）、ＰＥ標識ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１（Becton Dickinson社製）、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４（Becton Dickinson社製）をチューブに分注し、末梢血または対照細胞を１ウェルあたり１００μＬずつ添加し、撹拌した。室温・暗所にて３０分間静置した。超純水で希釈したFACS lysing solution（Becton Dickinson社製）を２ｍＬ添加し、撹拌した後、室温・暗所にて１２分間静置した。４３０×ｇ、４℃で５分間遠心分離後、上清を除去して細胞塊をほぐし、Washing Buffer（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）を２ｍＬ添加し、撹拌した後４３０×ｇ、４℃で５分間遠心分離後、上清を除去して細胞塊をほぐした。再度、同工程を繰り返した。Dilution Buffer（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）を５００μＬ添加した後、撹拌し、氷中遮光下で静置し、６時間以内に以下の測定に供した。
（２）測定
細胞浮遊液をナイロンメッシュでろ過した後、EPICS XL-MCL(Beckman Coulter社製)を用いてＣＣＲ４陽性細胞数を測定した結果を図３に示す。なお、ソフトウェアはSystem 2 ver.3.0(Beckman Coulter社製)を用い、ＦＳ(前方散乱光)、ＳＳ(側方散乱光)、ＦＬ１Ｌｏｇ(ＦＩＴＣの蛍光を検出)、ＦＬ２Ｌｏｇ(ＰＥの蛍光を検出)の４種のパラメーターを設定した。
【００２７】
図３に示すように、実施例１でＤＮＰアスカリスに感作させたサルは、末梢血ＣＣＲ４陽性Ｔｈ２細胞数が増加していた。
【実施例４】
【００２８】
末梢血サイトカイン産生
感作から１週間後、末梢血サイトカイン産生を測定するために、無麻酔下でサルの後肢伏在静脈から採血した血液を刺激剤と共に培養し、培養上清中のＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ法により以下の手順で測定した。
なお以下の記載において、ＦＢＳはウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）、ＰＭＡはPhorbol 12-Myristate 13-Acetate、ＩＮＭはIONOMYCINをそれぞれ示す。
（１）培地調製
刺激剤無添加の培地（-）は、ＲＰＭＩ  １６４０（９容）、ペニシリン・ストレプトマイシン液（０．１容）、ＦＢＳ（１容）で調製した。刺激剤添加の培地（+）は、５ｍＬの培地(-)に０．１ｍｇ／ｍＬ  ＰＭＡを２．５μＬと０．５ｍｇ／ｍＬ  ＩＮＭを １０μＬ添加して調製した。
（２）末梢血培養
末梢血をプレートの各ウェルに０．５ｍＬずつ添加し、その上から培地（-）あるいは培地（+）を添加して軽く攪拌した。プレートはＣＯ２インキュベーター(５％ＣＯ２、３７℃)内で２４時間培養した。
（３）測定
各ウェルより血球ごと培地を回収し、７，８００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した。上清中のＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡキットにて測定した。培地（+）から培地（-）を差し引いた値をサイトカイン産生量とし、その結果を図４に示す。
【００２９】
図４に示すように、実施例１でＤＮＰアスカリスに感作させたサルは、末梢血からのＴｈ２サイトカインであるＩＬ−４およびＩＬ−５の産生が増加していた。一方、Ｔｈ１サイトカインであるＩＮＦ−γの産生は逆に減少していた。
【実施例５】
【００３０】
スキンテスト
追加感作から５週間後、皮膚反応にて感作状態を確認した。サルの胸部にＤＮＰアスカリスを麻酔下にて皮内投与し、投与２０分後に投与部位の腫脹の直径(縦横)を計測した。その結果を図５に示す。感作は、腫脹の縦横の何れかの直径が１５ｍｍ以上で陽性と判定した。
【００３１】
図５に示すように、実施例１でＤＮＰアスカリスに感作させたサルは、皮内投与したＤＮＰアスカリスに対して陽性反応を示した。
【実施例６】
【００３２】
気道過敏性
追加感作から５週間後、気道のアレルゲンに対する応答性を確認するために、アレルゲン吸入前後にメサコリン吸入における呼吸機能を測定し、以下の手順でアレルゲン誘発気道過敏性を評価した。
（１）呼吸機能測定
メサコリン吸入における呼吸機能測定は、実施例１の筋肉内投与２回目終了から５週間後に実施した。麻酔下のサルにメサコリンを低濃度（０．０３〜１００ｍｇ／ｍＬ）から順に吸入させ、メサコリン吸入前の気道抵抗を５０％上昇させるメサコリン濃度（ＰＣ５０）を算出した。メサコリン吸入における呼吸機能測定の１週間後にＤＮＰアスカリス（濃度: ４０〜４０００ μｇ／ｍＬ）を気道内投与した。投与翌日に前記の呼吸機能測定を再度行い、ＰＣ５０を算出した。
（２）評価
アレルゲン投与後のＰＣ５０（ＰｏｓｔＰＣ５０）を投与前のＰＣ５０（ＰｒｅＰＣ５０）で除した値(％：ＰｏｓｔＰＣ５０／ＰｒｅＰＣ５０)からアレルゲン誘発気道過敏性を評価した。その結果を図６に示す。
【００３３】
図６に示すように、実施例１でＤＮＰアスカリスに感作させたサルは、アレルゲンの気道内投与により気道過敏性の亢進を誘発することができた。
【実施例７】
【００３４】
気道内細胞浸潤
追加感作から５週間後、気道のアレルゲンに対する応答性を確認するために、以下の手順でアレルゲン投与前後に気管支肺胞洗浄を行い、アレルゲン誘発炎症細胞浸潤について評価した。
（１）肺胞の洗浄
気道内細胞浸潤の評価は、実施例６の呼吸機能測定と同日に行った。呼吸機能測定終了後、麻酔下にて気管支内視鏡を右肺気管支に挿入し、ＰＢＳを１５ｍＬ注入し、洗浄した後、可能な限り回収した。
（２）塗沫標本の作製
回収した気管支肺胞洗浄液(Bronchoalveolar Lavage Fluid: ＢＡＬＦ)を１９０×ｇ、４℃で１０ 分間遠心分離し、上清を除き、ＰＢＳを１ｍＬ添加し攪拌した。この懸濁液１５０μＬを３００ｒｐｍで３分間サイトスピンにかけて塗沫標本を作製し、標本を染色した。
（３）細胞分類
約３００個の細胞をカウントし、マクロファージ、好酸球、好中球、リンパ球の細胞分類を行い、総細胞数に各細胞の割合を乗じ、ＢＡＬＦ  １ｍＬ中の細胞数を算出した。その結果を図７に示す。
【００３５】
図７に示すように、実施例１でＤＮＰアスカリスに感作させたサルは、アレルゲンの気道内投与により、主として好酸球からなる前記炎症細胞の浸潤を誘発することができた。
【実施例８】
【００３６】
即時型喘息反応
追加感作から６週間後、気道のアレルゲンに対する応答性を確認するために、麻酔下にて即時型喘息反応を測定した。アレルゲン投与直後に認められる気道抵抗の上昇を即時型喘息反応とした。その結果を図８に示す。
図８に示すように、実施例１でＤＮＰアスカリスに感作させたサルは、アレルゲンの気道内投与により即時型喘息反応を誘発することができた。
【実施例９】
【００３７】
鼻炎モデルの作製におけるダニアレルゲンの全身感作
約４歳齢の雄性カニクイザル（Siconbrec Inc.から購入）３頭に水酸化アルミニウムゲル（１００ｍｇ／ｍＬ）を吸着させたダニアレルゲン（Ｄｆ and Ｄｐ equal parts mixture）を麻酔下にて、図９に示す通り１週間間隔で３回、腹腔、筋肉および皮下に総量として体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／回の用量で投与した。
【実施例１０】
【００３８】
全身感作により作製した鼻炎モデルの鼻閉、鼻汁および粘膜蒼白化
感作終了から２週間後に、麻酔下にてダニアレルゲン（５００ μｇ/ｍＬ）をネブライザを用いて１鼻腔あたり１分間、合計１００〜５００μＬ程度を鼻腔内噴霧し、噴霧後５分、１５分および３０分後に鼻腔鏡にて鼻腔内を観察した。その結果を図１０に示す。  
図１０に示すように、実施例９でダニアレルゲンに全身感作させたサルは、アレルゲンの鼻腔内投与により鼻閉、鼻汁および粘膜蒼白化を誘発させることができた。
【実施例１１】
【００３９】
鼻炎モデルの作製におけるスギ花粉アレルゲンの局所感作
約４歳齢の雄性カニクイザル（Siconbrec Inc.から購入）２頭に水酸化アルミニウムゲル（１００ｍｇ／ｍＬ）を吸着させたスギ花粉を１鼻腔あたり１０μｇを麻酔下で、図１１に示す通り１回/日、５回/週で２週間（計１０回）点鼻した。
【実施例１２】
【００４０】
局所感作により作製した鼻炎モデルの鼻掻き
鼻腔内噴霧終了から１週間後に、無麻酔下にてスギ花粉を１鼻腔あたり１０ｍｇ鼻腔内噴霧し、噴霧後６０分間の鼻掻き回数を計測した。その結果を図１２に示す。
図１２に示すように、実施例１１でスギ花粉アレルゲンに感作させたサルは、アレルゲンの鼻腔内投与により鼻掻き（鼻内掻痒感）を誘発させることができた。
【実施例１３】
【００４１】
局所感作により作製した鼻炎モデルの鼻閉および鼻汁
鼻腔内噴霧終了から１週間後に、麻酔下にてスギ花粉アレルゲンを１鼻腔あたり１０ｍｇ鼻腔内噴霧し、噴霧後５分、１５分および３０分後に鼻腔鏡にて鼻腔内を観察した。
実施例１１でスギ花粉アレルゲンに感作させたサルは、アレルゲンの鼻腔内投与により鼻閉（図１３Ａ）および鼻汁（図１３Ｂ）を誘発させることができた。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明により、非ヒト霊長動物のアレルゲンへの感作を短期間で行うことができ、アレルギー性喘息モデル動物およびアレルギー性鼻炎モデル動物を短期間で作製することができる。本発明により得られるアレルギー性喘息あるいはアレルギー性鼻炎モデル動物は、アレルギー性喘息あるいはアレルギー性鼻炎の予防・治療薬のスクリーニング、評価等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、アスカリスアレルゲン感作喘息ザルの作製手順を示す図である。
【図２】図２は、血清中のＤＮＰアスカリス特異的ＩｇＥ抗体価（平均値）を示す図である。縦軸はＤＮＰアスカリス特異的ＩｇＥ抗体価を、横軸は測定時期を示す。
【図３】図３は、末梢血中のＣＣＲ４陽性Ｔｈ２細胞数を示す図である。縦軸は細胞数を、横軸は測定の時期を示す。スキンテストの皮膚反応（腫脹の直径(縦横)）を示す図である。
【図４】図４は、末梢血のサイトカイン産生を示す図である。縦軸はサイトカイン濃度を、横軸は測定の時期を示す。
【図５】図５は、スキンテストの腫脹の縦横の直径を示す図である。
【図６】図６は、アレルゲン誘発気道過敏性を示す図である。縦軸はアレルゲン投与後のＰＣ５０（ＰｏｓｔＰＣ５０）を投与前のＰＣ５０（ＰｒｅＰＣ５０）で除した値(％：ＰｏｓｔＰＣ５０／ＰｒｅＰＣ５０)を、横軸は測定の時期を示す。
【図７】図７は、ＢＡＬＦ中の細胞浸潤数を示す図である。縦軸は細胞数を、横軸は細胞の種類を示す。
【図８】図８は、即時型喘息反応を示す図である。縦軸は気道抵抗を、横軸は吸入させたアレルゲン濃度を示す。
【図９】図９は、ダニアレルゲン全身感作鼻炎ザルの作製手順を示す図である。
【図１０】図１０は、ダニアレルゲン誘発鼻閉、鼻汁および粘膜蒼白化を示す図である。Ａ、Ｂ、Ｃで示された矢印はそれぞれ、ダニアレルゲン誘発鼻閉、鼻汁および粘膜蒼白化を示している。
【図１１】図１１は、スギ花粉アレルゲン局所感作鼻炎ザルの作製手順を示す図である。
【図１２】図１２は、アレルゲン誘発鼻掻き回数を示す図である。縦軸に鼻掻き回数を、横軸にアレルゲン噴霧後の経過時間を示す。
【図１３】図１３は、スギ花粉アレルゲン誘発鼻閉（Ａ）および鼻汁（Ｂ）反応を示す図である。矢印はそれぞれ、スギ花粉アレルゲン誘発鼻閉（Ａ）および鼻汁が顕著に観察される部分（Ｂ）を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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