(57)【要約】【課題】血清以外の血液中の液性成分を用いて、循環血液量が少ない患者に対しても安全に使用することができ、かつ、高い培養効率を付与することが可能な培地添加剤、及びこの培地添加剤を含む培地、及びこの培地を用いた細胞培養方法を提供する。【解決手段】ヒトの細胞を培養する培地に使用される培地添加剤であって、ヒト由来の血漿と、細胞増殖因子と、を含有した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの細胞を培養する培地に使用される培地添加剤であって、ヒト由来の血漿と、細胞増殖因子と、を含有する培地添加剤。
【請求項２】
前記細胞増殖因子は、血小板以外の細胞由来の増殖因子である請求項１に記載の培地添加剤。
【請求項３】
前記細胞増殖因子は、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する請求項１又は２に記載の培地添加剤。
【請求項４】
請求項１から３いずれかに記載の培地添加剤を含む培地。
【請求項５】
請求項４に記載の培地を用いた細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地添加剤、この培地添加剤を含む培地、及びこの培地を用いた細胞培養方法に関する。より具体的には、患者自身の血漿を細胞培養に使用するための培地添加剤、この培地添加剤を含む培地、及びこの培地を用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、再生医療分野においては、対象者から採取した幹細胞を体外で増殖又は分化させたうえで対象者に移植することで対象者の組織の再生を促進させるという研究が行われている。幹細胞は、種々の組織や器官に分化する多分化能を有し、再生医療のカギを握る細胞として注目されている。
【０００３】
幹細胞の培養では、培地に対して血清を添加すれば効果的であることが知られている。一般的にはウシ胎児血清が多く使用されているが、ウシ胎児血清存在下で培養した細胞をヒトに移植する場合、未知の病原菌への感染の危険性があるだけでなく、細胞膜上に、ウシ胎児血清由来の糖鎖が付加され、これが抗原抗体反応を引き起こす可能性が示唆されている（非特許文献１参照）。
このため、近年では、患者へ移植することを目的とする細胞培養においては、ウシ胎児血清等の動物由来の血清を用いるよりも、ヒト由来、望ましくは患者本人の血清を用いる方が、安全性が高く、好ましいといわれている。
【０００４】
しかし、血清は細胞培養に適しているが、血液を凝固させて調製するため、一度に調製できる量は、成人でも１００ｍｌから２００ｍｌ程度である。また、血清を分離する際に、生成する血餅から赤血球を分離して体内に戻すことは可能であるが、赤血球の回収率は最大で７０％程度である。そのため、循環血液量が少ない小児や、貧血症の患者等では、移植に必要な細胞を培養するのに十分な量の血清を採取することが困難である。
【０００５】
このような事情から、血清の代わりに、抗凝固剤存在下で採血して、分離される多血小板血漿や、血漿のように、血液から採取されるその他の液性成分を、細胞培養に用いることが検討されている（特許文献１参照）。
特許文献１には、血漿にカルシウム化合物等を添加して、凝固させたタンパク質性の血液凝固因子を除去した液体を、細胞培養に用いる方法が開示されている。特許文献１に開示されている方法によれば、血漿にカルシウム化合物等を添加することにより、血清に相当する液性成分が得られる。
また、細胞培養用の培地に、所定量の細胞増殖因子を直接添加する方法も開示されている（特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００４−２６９４０９号公報
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００２／０２２７８８号パンフレット
【非特許文献１】Ｍａｒｉａ  Ｊ．Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｎｏｈｕｍａｎ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００５  Ｆｅｂ；１１（２）２２８−３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、再生医療において、細胞培養には高い培養効率が求められている。培養効率を向上させるためには、細胞増殖因子や細胞接着因子が必要であると考えられている。
しかしながら、特許文献１に開示されている方法により得られた血清は、細胞増殖因子が含有されていないため、細胞の培養効率は低く、再生医療の現場では実用的ではない。
また、特許文献２に開示されている方法は、培地に細胞増殖因子のみを添加しており、細胞接着因子は含まれないため、特許文献１に開示されている血清と同様に、実用性に欠ける。
【０００７】
以上の課題に鑑み、本発明では、血清以外の血液中の液性成分を用いて、循環血液量が少ない患者に対しても安全に使用することができ、かつ、血清を用いた場合と同程度の、若しくはそれ以上の高い培養効率を付与することが可能な培地添加剤、及びこの培地添加剤を含む培地、及びこの培地を用いた細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、血漿に所定量の細胞増殖因子を添加することによって、培地に高い培養効率を付与することが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
（１）  ヒトの細胞を培養する培地に使用される培地添加剤であって、ヒト由来の血漿と、細胞増殖因子と、を含有する培地添加剤。
【００１０】
上述のように、細胞の培養には、ヒト由来の血清、望ましくは患者本人の血清を用いることが好ましいということが知られている。血漿は、採血時に抗凝固剤を添加して、血球成分を除くことにより得られる液性成分のことをいい、細胞接着因子は含んでいるが、血小板を含まないため、血小板由来の細胞増殖因子は含まれず、従来は細胞培養には適していないと認識されていた。
しかしながら、血漿は多血小板血漿と同様に、抗凝固剤を添加し、遠心分離して得られる以外に、成分献血において、血球成分をそのまま患者に戻しながら血漿のみを採取することができる。
そのため、成分献血により採取された血漿を用いれば、循環血液量が少ない患者からでも培地添加剤を製造することが可能となる。
【００１１】
従って、（１）の発明によれば、ヒト由来の血漿を用いることによって、循環血液量が少ない患者からでも採取することができ、安全性の高い培地添加剤を提供することができる。
また、細胞増殖因子を含有することによって、高い培養効率を付与することが可能となる。従って、安全性が高く、かつ、高い培養効率を有する培地添加剤を提供することが可能となる。
【００１２】
（２）  前記細胞増殖因子は、血小板以外の細胞由来の増殖因子である（１）に記載の培地添加剤。
【００１３】
（２）の発明によれば、細胞増殖因子を血小板以外の細胞由来のものとしたことによって、血清を用いた場合と同程度若しくはそれ以上の高い培養効率を有する培地添加剤を提供することが可能となる。
【００１４】
（３）  前記細胞増殖因子は、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する（１）又は（２）に記載の培地添加剤。
【００１５】
（３）の発明によれば、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有したことによって、細胞をより効率よく培養することが可能な培地添加剤を提供することが可能となる。なお、上記の細胞増殖因子は、培養対象の細胞によって単独又は組み合わせて用いてもよい。
【００１６】
（４）  （１）から（３）いずれかに記載の培地添加剤を含む培地。
【００１７】
（５）  （４）に記載の培地を用いた細胞の培養方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、血清以外の血液中の液性成分を用いて、循環血液量が少ない患者に対しても安全に使用することができ、かつ、血清を用いた場合と同程度若しくはそれ以上の高い培養効率を付与することが可能な培地添加剤を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００２０】
［培地添加剤］
本発明に係る培地添加剤は、ヒト由来の血漿と、細胞増殖因子と、を含む。
本発明における「血漿」とは、血液から血球及び血小板等の細胞成分を分離操作により除去した液体成分であって、抗凝固剤として、クエン酸ナトリウム、ヘパリン等を用いた常法の分離操作によって血液から分離された血漿分画をいう。
また、本発明において、使用する血漿は、上記の分離操作によって細胞成分が完全に除去されているものが好ましいが、分離操作により若干の血小板等の細胞成分が残存している血漿であっても使用可能な血漿に含まれるものとする。
【００２１】
上記ヒト由来の血漿は、細胞培養を行う患者自身のものであることが最も望ましいが、健康上の問題がなく、通常の献血基準を満たしている人から採取された血漿であってもよい。
具体的には、日本赤十字社において全血献血又は成分献血された血液由来のもの（新鮮凍結血漿等）が挙げられる。血漿は、採取後の血漿をすぐに用いることも可能であるが、凍結血漿も使用可能である。なお、凍結血漿を使用する場合には、使用時に凍結血漿を解凍（例えば、３６℃で急速解凍）してから使用することができる。
なお、採血には通常の血液バックの他に、例えば採血管のように、血液を無菌的に採取することが可能な容器を用いてもよい。
【００２２】
血漿の製造方法としては、上述のように、日本赤十字社における全血献血、又は成分献血にて行われるような採血方法による血液より得られる。なお、この血漿は、５６℃で３０分間非働化処理を行い、補体とフィブリノゲンを失活させたものを用いることがより好ましい。非働化処理を行うことにより、細胞の増殖を阻害する補体やフィブリノゲンを、外気に触れることなく取り除くことが可能となる。
【００２３】
本発明における「細胞増殖因子」としては、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、ヒト内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等が挙げられる。
上記細胞増殖因子は、培養対象の細胞の増殖が促進されるように、培養対象の細胞によって適宜選択される。中でも、塩基性線維芽細胞増殖因子を用いることが好ましい。これらは単独又は２種以上を組み合わせて用いることが可能である。
【００２４】
上記細胞増殖因子は、ヒト由来のものを用いることが望ましいが、例えば、ヒト以外の哺乳動物由来のものを用いてもよい。これらの細胞増殖因子としては、具体的には、遺伝子組換技術による産生される「ヒト細胞増殖因子」や、ヒト体液（血液を含む）を精製することにより産生される「ヒト細胞増殖因子」や、ヒト以外の哺乳動物由来の「細胞増殖因子」等が挙げられる。
なお、細胞増殖因子の製造方法としては、遺伝子組換技術による製造方法や、動物の体液（血液を含む）より、精製して、回収する方法等が挙げられる。ここで、遺伝子組換技術による製造方法とは、目的蛋白質をコードしている遺伝子を発現し得るベクターを大腸菌等のホスト細胞に導入してホスト細胞を形質転換し、これを増殖させながら、ホスト細胞に目的蛋白質を産生させ、目的蛋白質を回収する方法をいう。
【００２５】
本発明に係る培地添加剤は、血漿に所定量の細胞増殖因子を添加して、攪拌することにより得られる。細胞増殖因子の添加量は、１０ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加することが好ましい。
【００２６】
本発明に係る培地添加剤は、抗生物質、分化誘導因子、分化阻止因子等の公知の添加剤を含有していてもよい。
【００２７】
［培地］
本発明に係る培地は、上記の培地添加剤を含有する。
培地添加剤が添加される前の基礎培地としては、通常用いられている市販の基礎培地を用いることが好ましい。
基礎培地は、培養する細胞種によって異なり、どのようなものであってもよい。例えば、通常動物細胞の培養に用いられるイスコフ培地、ＲＰＭＩ培地、ダルベッコＭＥＭ培地等の血清を含まない培地を用いることができる。また、基礎培地は、細胞の増殖及び維持に有効であることが知られている血清以外の公知又は新規の物質、例えば、血清アルブミン、トランスフェリン、脂質、コレステロール、ピルビン酸、グルココルチコイド、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成用ヌクレオシド、増殖因子（例えば、表皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、及びインシュリン）、並びに細胞外マトリックス（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、及びラミニン）等を添加したものであってもよい。
【００２８】
本発明に係る培地中の培地添加剤の含有量は、５ｖｏｌ％から２０ｖｏｌ％であることが好ましく、１０ｖｏｌ％から１５ｖｏｌ％であることが更に好ましい。
また、本発明に係る培地の製造は、上記の培地添加剤を調製した後に、基礎培地と混合しても、基礎培地と血漿と細胞増殖因子とを一度に調整してもよい。
【００２９】
［細胞培養方法］
培養対象となるヒト細胞は、間葉系細胞を含む中胚葉組織細胞、内胚葉組織細胞、外胚葉組織細胞あるいは受精卵からこれらの細胞へ分化する過程に含まれるあらゆる細胞、及び胚性幹細胞等の幹細胞のいずれでもよい。
培養されたヒト細胞は、皮膚、骨、軟骨、筋肉、腱、脂肪組織、毛乳頭、歯髄等に用いられる。
【００３０】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態について更に詳しく説明するが、以下の例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
［実施例１，２及び比較例１〜６］
まず、３名のドナーにより、ヘパリン存在下で１０ｍｌの採血を行い、直ちに遠心分離（２，３３０ｇで１０分間）を行った。遠心分離後、透明な液性成分である上層のみを、バフィーコートを含まないよう留意しながら吸引し、別の容器に移し替え、実験に供するまで−８０℃にて保存した。
次いで、１０ｖｏｌ％ヒト血漿に、細胞増殖因子として、ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  ＥＣ社製）をそれぞれ１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、それぞれ培地添加剤（Ａ）、培地添加剤（Ｂ）として調製した。
【００３２】
基礎培地をα−ＭＥＭとし、上記の培地添加剤を用いて以下の（１）から（７）の培養液を調製した。
（１）１０ｖｏｌ％ヒト血漿（比較例１）
（２）１０ｖｏｌ％培地添加剤（Ａ）：（最終ｂＦＧＦ濃度：１ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ）（実施例１）
（３）１０ｖｏｌ％培地添加剤（Ｂ）：（最終ｂＦＧＦ濃度：１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ）（実施例２）
（４）１ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（比較例２）
（５）１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（比較例３）
（６）添加物なし（比較例４）
（７）１０ｖｏｌ％ヒト血清（比較例５）
（８）１０ｖｏｌ％ウシ胎児血清（比較例６）
【００３３】
次いで、培養に用いる細胞を、以下の手順で調整した。
市販のヒト間葉系幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社）を、１０％のウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地にてコンフルエントに達するまで培養した。
コンフルエントに達した細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ社製）により剥離させ、遠心して細胞を回収した。ウシ胎児血清の成分を除くために、血清を含まないα−ＭＥＭで懸濁させ、遠心して回収する工程を、更に２回行った後に、血清を含まないα−ＭＥＭに懸濁させた。血球計算盤（サンリード硝子社製）を用いて、懸濁液中の細胞数を測定した。
【００３４】
実施例１，２及び比較例１〜６のそれぞれの培地５００μｌ中に、細胞が４，０００個含まれるように細胞を懸濁させ、２４ウェルディッシュ（ＢＤ社；ベクトン・ディッキンソン株式会社）に３ウェルずつ播種した。
培養開始後７日目に、培地を抜き取り、ＰＢＳ（−）で洗浄した後に、１ウェルあたり１００μｌのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ社）を添加し、３７℃で１０分間インキュベートして細胞を剥離し、アイソトン液９．９ｍｌに懸濁してコールターカウンタ（ベックマンコールター社製）により細胞数を測定した。
【００３５】
その結果を図１、図２に示す。図１より実施例１の培地で培養した場合は、比較例１のような細胞増殖因子を含まない培地や、比較例２，３のような細胞増殖因子のみからなる培地で培養した場合以上の増殖が確認された。
また図２より、実施例２の培地で培養した場合は、比較例５の血清を用いた場合と比べ、若干劣るものの、血清を使用した場合と同程度の増殖が確認された。
以上の結果より、本発明に係る培地添加剤又は培地が、ヒト細胞の培養に有効であることが確認された。更には本発明に係る培地添加剤は、血清を用いた場合と同程度若しくはそれ以上の高い培養効率を付与することが可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】培養７日目の細胞数を示した図である。
【図２】培養７日目の細胞数を示した図である。
【図１】
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【図２】
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