(57)【要約】【課題】本発明は、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型を解析し、多型をブタ育種のための遺伝マーカーとして利用し、その遺伝マーカーに基づき、所望の形質（肉質）のブタを選択しうるブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法を提供することを目的とする。【解決手段】上記課題を解決するために、本発明は、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子近傍に存在し、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子のエクソン２におけるヌクレオチド配列に存在する連続したＴ（チミン）の反復回数が、５回である対立遺伝子、もしくは６回である対立遺伝子に対して、強い連鎖不平衡にあるゲノム配列上の多型を解析し、間接的にブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型を解析することを特徴とするブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法の構成とした。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタベータ３アドレナリンレセプターのＣ末端部を解析し、アミノ酸残基数の違いに基づいて、ブタ（個体）のロース面積が大きい若しくは小さい形質を判断することを特徴とするブタ形質診断方法。
【請求項２】
ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型を解析し、ブタ（個体）の形質を判断することを特徴とするブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法。
【請求項３】
前記多型の位置が、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子のエクソン２の２０番目の塩基配列であることを特徴とする請求項２に記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法。
【請求項４】
前記２０番目が、Ｔ又はＡであるかを解析することを特徴とする請求項３に記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法。
【請求項５】
前記多型の解析が、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子のエクソン２におけるヌクレオチド配列に存在する連続したＴの反復回数が５回であるか６回であるかに基づくことを特徴とする請求項２に記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法。
【請求項６】
前記多型の解析に、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項２〜請求項５の何れかに記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法。
【請求項７】
前記解析が、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子、又はＲＮＡを増幅し、制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動法により、増幅遺伝子の切断パターン基づく解析であることを特徴とする請求項２〜請求項６に何れかに記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法。
【請求項８】
前記増幅に、配列番号１及び配列番号２のプライマーペアー、又は配列番号３及び配列番号４のプライマーペアーを用いることを特徴とする請求項７に記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法。
【請求項９】
前記解析が、単鎖コンホーメーション多形分析法（ＳＳＣＰ）、又は変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、或いは飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ）による核酸断片の質量分析法であることを特徴とする請求項２〜請求項５に何れかに記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法。
【請求項１０】
前記解析が、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子近傍に存在し、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子のエクソン２におけるヌクレオチド配列に存在する連続したＴ（チミン）の反復回数が、５回である対立遺伝子、もしくは６回である対立遺伝子に対して、強い連鎖不平衡にあるゲノム配列上の多型を解析し、間接的にブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型を解析することを特徴とする請求項２〜請求項５に何れかに記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法。
【請求項１１】
前記形質が、ロース面積が大きい若しくは小さいことを特徴とする請求項２〜１０の何れかに記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法。
【請求項１２】
前記請求項１〜請求項１０の何れかに記載のブタ形質診断方法に基づき、所定の形質のブタを選択し、育成、又は繁殖することを特徴とするブタの育種方法。
【請求項１３】
前記請求項２〜請求項８の何れかに記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法に用いられるプライマーペアー、ＤＮＡ複製酵素、制限酵素を必須とするブタの遺伝子型解析診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型、遺伝子型を解析し、ブタの形質を診断（予測）することに関する。更に詳しくは、エクソン２の２０番目の塩基（Ａ又はＴ）、即ちＴの繰り返し数に基づき、肉質（ロース面積の大きさ）を診断する方法に関する。更には、所望の遺伝子型のブタを選択し、所望の形質のブタを育種する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アドレナリン、ノルアドレナリンなどカテコールアミンによる神経分泌系、エネルギー代謝系などの調節又は制御は、アドレナリンレセプターと呼ばれる膜結合（膜貫通）性タンパク・ファミリーにより介在される。
【０００３】
ＡＤＲＢ３（ベータ３アドレナリンレセプター）は、ヒトでは１９８９年Emorineらによりクローニングされ、その後、２つのエクソンからなる遺伝子であり、Gタンパク共役型の７回膜貫通型レセプターであること、ヒトの場合は８番染色体に座していることが示された。ベータ３アドレナリンレセプター遺伝子は主に脂肪細胞で発現しており、脂質代謝と熱産生の制御に関与しているといわれている。
【０００４】
また、ヒトＡＤＲＢ３遺伝子の多型として、６４番目のアミノ酸がＴｒｐからＡｒｇに置換されたものが報告され、基礎代謝量の減少と肥満傾向を示すことが報告されている。しかし、ブタにおいて、基礎代謝或いは肥満形質と相関のあるベータ３アドレナリンレセプター遺伝子多型はこれまで報告されていない。
【０００５】
ブタにおいてもベータ３アドレナリンレセプターの全コード領域の配列が決定され、図１（Ａ）に示すような２つのエクソンからなるものであったが、多型の報告はされていなかった。なお、エクソン１は１１９６ｂｐであり、エクソン２は２８ｂｐであった。エクソン２が２２ｂｐである多型は、非特許文献１において、本発明者等が初めて報告したものである。
【０００６】
家畜の成長とエネルギー代謝制御は、家畜生産において最も重要な形質の一つである。家畜の形質は、環境的要因（例えば飼養管理）と、遺伝的要因の双方が関与している。
【０００７】
家畜の形質を左右する遺伝的要因（遺伝情報）については、家畜の生産性の向上を目指し、多くの研究者によって研究されている。例えば、非特許文献２では、ブタメラノコルチン−４レセプター（ＭＣ４Ｒ）遺伝子中にある遺伝マーカーが、ブタの背脂肪量に関与することが示されている。
【特許文献１】特表２００２−５２１０６８号公報
【０００８】
成長・飼料の利用性・代謝エネルギー・および脂肪蓄積は、ブタの経済形質を決める重要な要因である。ブタはイノシシから家畜化されたものであり、現在においても両者を自由に交配することが可能である。しかし、家畜ブタとイノシシの間では行動学的にも形態学的にも大きな差異がある。これらの差異は遺伝的要因によると考えられるが、原因となる遺伝的変異は、これまで報告されている遺伝子多型では十分に説明できない。
【０００９】
家畜化されたブタとイノシシの間には、多くの形質の違いが存在する。両者の表現型における最も大きな違いの１つに脂肪量がある。ブタとイノシシ間に存在する遺伝子変異を探索すれば、ブタの経済形質に関与する遺伝子マーカーが開発できると考えられた。
【００１０】
そこで、発明者等は、非特許文献１にあるように、ヒトで肥満との関連が示唆されている遺伝子のホモログについて、数種のブタ、イノシシのベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の塩基配列、推定アミノ酸配列
クラウンミニブタ： 登録番号ＡＢ２５２７７８／配列番号５、６
ミャンマー産イノシシ：登録番号ＡＢ２５２７７９／配列番号７、８
メイシャン：             登録番号ＡＢ２５２７８０／配列番号９、１０
ニホンイノシシ：   登録番号ＡＢ２５２７８１／配列番号１１、１２
リュウキュウイノシシ：登録番号ＡＢ２５２７８２／配列番号１３、１４
を解析し、既知のブタベータ３アドレナリンレセプター：登録番号ＡＦ２７４００７／配列番号１５、１６の遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を比較した。
【００１１】
なお、配列を決定したメイシャン種（１頭）は、ＡＢ２５２７８０（配列番号９）とＡＢ２５２７７９（配列番号７） のヘテロ接合体であった。ニホンイノシシのＡＢ２５２７８１（配列番号１１）はランドレース（１頭）でも見出された。また、推定アミノ酸配列１２、１４は同一配列であり、推定アミノ酸配列６と８も同一の配列である。
【００１２】
その結果、アミノ酸配列に翻訳した場合においても、図１（Ｂ）に示すように、既知の配列と全ての個体が多型を示し、６ヶ所のアミノ酸置換が生じていた（黒丸、なお＊はストップコドンを示す、）。その中１つとして、塩基配列において、エクソン２領域における一塩基挿入によるフレームシフト変異を発見した。
【００１３】
この変異は既知の配列におけるエクソン２の２０塩基目にＴ（チミン／下線）が挿入されており（図２）、コドンの読み枠がずれること４０６番目のコドンがアルギニン（Ｒ）をコードするＡＧＧから終止コドン（＊）であるＴＧＡに変化してしまい、結果として通常型よりも２残基少ないアミノ酸をコードしていた。以下、Ｔが挿入された変異型をＴ６型、以前から知られていた挿入のないものをＴ５型という。なお、配列番号５、７がＴ６型であり、配列番号９、１１、１３がＴ５型であった。
【非特許文献１】井脇吉淳、田中和明、他１１名、日本畜産学会１０５回大会                          （２００５年９月９日）学会発表要旨「ブタとイノシシにお                          けるＡＤＲＢ遺伝子の多型とその分布」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、Ｔ５型、Ｔ６型の遺伝子を持つブタについて、どのような形質の差異があるか知られていなかった。そこで、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型である対立遺伝子のＴ５型、Ｔ６型とブタの形質との関係を解析し、対立遺伝子のＴ５型、Ｔ６型である多型をブタ育種のための遺伝マーカーとして利用し、その遺伝マーカーに基づき、所望の形質（肉質）のブタを選択しうるブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、上記の課題を解決するために、ブタベータ３アドレナリンレセプターのＣ末端部を解析し、アミノ酸残基数の違いに基づいて、ブタ（個体）のロース面積が大きい若しくは小さい形質を判断することを特徴とするブタ形質診断方法の構成とし、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型を解析し、ブタ（個体）の形質を判断することを特徴とするブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法の構成とし、前記多型の位置が、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子のエクソン２の２０番目の塩基配列であることを特徴とするブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法の構成とし、前記２０番目が、Ｔ又はＡであるかを解析することを特徴とするブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法の構成とし、前記多型の解析が、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子のエクソン２におけるヌクレオチド配列に存在する連続したＴの反復回数が５回であるか６回であるかに基づくことを特徴とするブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法の構成とし、前記多型の解析に、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする前記何れかに記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法の構成とし、又は前記解析が、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子、又はＲＮＡを増幅し、制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動法により、増幅遺伝子の切断パターン基づく解析であることを特徴とする前記に何れかに記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法の構成とし、前記増幅に、配列番号１及び配列番号２のプライマーペアー、又は配列番号３及び配列番号４のプライマーペアーを用いることを特徴とするブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法の構成とし、或いは前記解析が、単鎖コンホーメーション多形分析法（ＳＳＣＰ）、又は変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、或いは飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ）による核酸断片の質量分析法であることを特徴とする前記何れかに記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法の構成とし、さらに前記解析が、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子近傍に存在し、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子のエクソン２におけるヌクレオチド配列に存在する連続したＴ（チミン）の反復回数が、５回である対立遺伝子、もしくは６回である対立遺伝子に対して、強い連鎖不平衡にあるゲノム配列上の多型を解析し、間接的にブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型を解析することを特徴とする前記何れかに記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法の構成とし、前記形質が、ロース面積が大きい若しくは小さいことを特徴とする前記何れかに記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法の構成とし、加えて前記何れかに記載のブタ形質診断方法に基づき、所定の形質のブタを選択し、育成、又は繁殖することを特徴とするブタの育種方法の構成とし、さらに前記何れかに記載のブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法に用いられるプライマーペアー、ＤＮＡ複製酵素、制限酵素を必須とするブタの遺伝子型解析診断キットの構成とした。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、以上の構成であるから以下の効果が得られる。先ず、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型であるＴ５型、Ｔ６型の解析をすることで、簡易にブタの形質（ロース面積）を予測でき、市場ニーズにあったブタ肉を的確選択し提供することができる。また、所望の形質のブタを選択的に飼育することもでき経済的である。
【００１７】
さらに、Ｔ５型のホモ接合体、Ｔ６型のホモ接合体、Ｔ５／Ｔ６型のヘテロ接合体を選択し、繁殖させることで、所定の形質（ロース面積）のブタの品種改良を可能にし、より形質を顕著に表す新品種の作出を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
ブタベータ３アドレナリンレセプター、その遺伝子の多型を解析し、所望の形質（肉質）のブタを選択しうるブタ形質診断方法を提供する目的を、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子近傍に存在し、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子のエクソン２におけるヌクレオチド配列に存在する連続したＴ（チミン）の反復回数が、５回である対立遺伝子、もしくは６回である対立遺伝子に対して、強い連鎖不平衡にあるゲノム配列上の多型を解析し、即ち、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子、又はＲＮＡを（請求項８）配列番号１及び配列番号２のプライマーペアー、又は配列番号３及び配列番号４のプライマーペアーを用い増幅し、制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動法により、増幅遺伝子の切断パターン基づき、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型を解析し、ブタ（個体）のロース面積が大きい若しくは小さいことを判断することを特徴とするブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法の構成とすることで実現した。
【実施例１】
【００１９】
以下、添付図面に基づき、本発明であるブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型に基づくブタ形質診断方法について詳細に説明する。
【００２０】
［診断に供したブタ］
全国農業協同組合連合会所有のデュロック種。
【００２１】
［染色体ＤＮＡの抽出］
ブタの尾の肉片よりDNesay
Blood & Tissue Kit（販売：株式会社キアゲン）を用いて染色体ＤＮＡを抽出した。なお、染色体ＤＮＡは、ＰＣＲに供することができれば、特に抽出用の組織、抽出方法は限定されない。一旦ベクターなどにクローニングされたＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡを用いてもよい。
【００２２】
［ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）反応溶液］
ＰＣＲは、一反応あたり４０μＬで行った。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼには、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（登録商標／タカラバイオ株式会社製品コードＲ００１Ａ）を用い、一反応あたりの使用量は１ユニットとした。また、プライマーは、Ａａｓｌ解析の場合は配列番号１のフォワードプライマー４０ｐｍｏｌ、配列番号２のリバースプライマー４０ｐｍｏｌ、Ｘａｇｌ解析の場合は、配列番号３のフォワードプライマー４０ｐｍｏｌ、配列番号４のリバースプライマー４０ｐｍｏｌを添加した。その他の反応組成は、前記ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（登録商標）に添付の１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅを所定量、遺伝子型解析を行う個体より抽出したゲノムＤＮＡ試料約２００ｎｇを添加し、最後に滅菌超純水を加え合計４０μＬになるように調製した。なお、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されない。
【００２３】
［プライマー］
なお、多型の解析には、Ｔ５型と、Ｔの挿入によるＴ６型を判別するため、ミスマッチプライマーＰＣＲ法とＲＦＬＰ（Restriction
Fragment Length Polymorphism；制限酵素断片長多型）法を組み合わせた判別を行った。ミスマッチプライマーＰＣＲ法においては、制限酵素Ａａｓｌ及びＸａｇｌが（以下、それぞれ単にＡａｓｌ及びＸａｇｌという）Ｔ５型、Ｔ６型部位を認識できるようプライマーを合成した。
【００２４】
Ａａｓｌを用いて遺伝子型解析を行うためのプライマー
・フォワードプライマー
TTTGTGGCTGGGTGAATCCCGGAAG・・・配列番号１
・リバースプライマー
ATCAACAGAGCTGTTTCTTCAAGGACT・・・配列番号２
この２つのプライマーで増幅される増幅産物（約１７５ｂｐ）をＡａｓｌ（GACNNNN↓NNGTC）の消化に供するとＴ６型は切断されず、Ｔ５型は切断され約２０ｂｐと約１５５ｂｐの断片となる。下線がミスマッチ部である。
【００２５】
Ｘａｇｌを用いて遺伝子型解析を行うための
・フォワードプライマー
CCATTTTCAGGGCTTCCTGGGGCCTT・・・配列番号３
・リバースプライマー
GCCACTTGGTAAGGAATTCCCCCTT・・・配列番号４
この２つのプライマーで増幅される増幅産物（約１８５ｂｐ）をＸａｇｌ（CCTNN↓NNNAGG）で消化するとＴ６型は切断され約２０ｂｐと約１６５ｂｐの断片となるが、Ｔ５型は切断されない。下線がミスマッチ部である。
【００２６】
［ＰＣＲ反応条件（Ａａｓｌ）］
アプライドバイオシステムジャパン株式会社製  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００を用いて、次の温度、時間で３０サイクル行った。
１）９４℃  ６０秒
２）５６℃  ３０秒
３）７２℃  ４５秒
【００２７】
［ＰＣＲ反応条件（Ｘａｇｌ）］
アプライドバイオシステムジャパン株式会社製  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００を用いて、次の温度、時間で３０サイクル行った。
１）９４℃  ６０秒
２）５４℃  ３０秒
３）７２℃  ４５秒
【００２８】
［制限酵素反応］
前記ＰＣＲによる増幅産物を、増幅用前記プライマーセットによって決まるＡａｓｌ（コスモ・バイオ株式会社；コードＦＥＲ  ＥＲ１７２１）又はＸａｇｌ（コスモ・バイオ株式会社；コードＦＥＲ  ＥＲ１３０１）の使用説明書に従い、３時間反応させた。
【００２９】
［ＲＦＬＰ法］
３％アガロースゲルを用いてアガロースゲル電気泳動を行った。ＲＦＬＰ法による遺伝子型の解析方法の概要を図３、図４に示す。具体的結果を図５、図６に示す。
【００３０】
図３は、遺伝子型解析方法の一例（ミスマッチ・プライマー法／Ａａｓｌ）を示す概略図である。ここでは、ＡａｓｌでＰＣＲ増幅産物を消化し、Ｔ５型の対立遺伝子を切断する場合について説明する。
【００３１】
図３（Ａ）は、配列番号２のリバースプライマーが染色体ＤＮＡ（対立遺伝子の一方）アニールした様子を示している。  図３（Ｂ）は、上記条件で、ＰＣＲ増幅を行った後の塩基配列を示している。リバースプライマーの３’末端から３番がＡであるため、増幅産物はＧがＴ（下線）に置換（ミスマッチ）される。これによって、Ａａｓｌの認識配列（ＧＡＣＮ６ＧＴＣ）を増幅産物の配列中に作り出すことができる。
【００３２】
図３（Ｃ）は、Ａａｓｌの消化位置（一点鎖線）を示す。対立遺伝子がＴ５型であれば、図３（Ｃ）の配列上でＧＡＣとＧＴＣの配列の間に存在する塩基対の数が６塩基となるため、Ａａｓｌによって約１５５ｂｐと約２０ｂｐに切断される。一方、対立遺伝子がＴ６型であれば、図３（Ｃ）の配列上でＧＡＣとＧＴＣの配列の間に存在する塩基対の数が７塩基となるため消化されない。
【００３３】
従って、配列番号１、２のプライマーセットを用いて増幅したＰＣＲ産物を、Ａａｓｌの消化反応に供すれば、アガロースゲル電気泳動法によって、容易に対立遺伝子がＴ５型か、Ｔ６型かを解析することができる。
【００３４】
図４は、遺伝子型解析方法の一例（ミスマッチ・プライマー法／Ｘａｇｌ）を示す概略図である。ここでは、ＸａｇｌでＰＣＲ増幅物を消化し、Ｔ６型の対立遺伝子を切断する場合について説明する。
【００３５】
図４（Ａ）は、配列番号３のフォワードプライマーが染色体ＤＮＡ（対立遺伝子の一方）にアニールした様子を示している。  図４（Ｂ）は、上記条件で、ＰＣＲ増幅を行った後の塩基配列を示している。フォワードプライマーの３’末端から４番がＣであるため、増幅産物はＴがＧ（下線）に置換（ミスマッチ）される。これによって、Ｘａｇｌの認識配列（ＣＣＴＮ５ＡＧＧ）を増幅産物の配列中に作り出すことができる。
【００３６】
図４（Ｃ）は、Ｘａｇｌの消化位置（一点鎖線）を示す。対立遺伝子がＴ６型であれば、図４（Ｃ）の配列上でＣＣＴとＡＧＧの配列の間に存在する塩基対の数が５塩基となるため、Ｘａｇｌによって約１６５ｂｐと約２０ｂｐに切断される。一方、対立遺伝子がＴ５型であれば消化されない。
【００３７】
従って、配列番号３、４のプライマーセットを用いて増幅したＰＣＲ産物を、Ｘａｇｌの消化反応に供すれば、アガロースゲル電気泳動法によって、容易に対立遺伝子がＴ５型か、Ｔ６型かを解析することができる。
【００３８】
図５は、ＲＦＬＰ法（Ｘａｇｌ）により、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子エクソン２の多型を解析した結果を示す図である。
【００３９】
図５に示す写真は、個別の豚（１５頭）から上記方法にて抽出したゲノムＤＮＡを基質に、上記Ｘａｇｌ用プライマーセット、上記反応条件でＰＣＲ増幅したブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の部分配列約１８５ｂｐ増幅産物の上記反応条件にてＸａｇｌ消化し、３％アガロースゲル電気泳動法の結果である。定法にしたがい臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）液に浸漬し染色した後、紫外線光下で撮影を行ったものである。
【００４０】
レーン１がサイズマーカー（Ｍ）で、１００ｂｐ間隔で１ｋｂ〜１００ｂｐを示す。レーン２〜１６の被検体である。Ｔ５／Ｔ５はそれぞれの対立遺伝子がＴ５型のホモ接合型、Ｔ５／Ｔ６型は対立遺伝子がＴ５型とＴ６型のヘテロ接合型、Ｔ６／Ｔ６はそれぞれの対立遺伝子がＴ６型のホモ接合型であることを意味する（図６において同じ）。
【００４１】
Ｘａｇｌの切断パターンによって遺伝子型が解析できる。即ち、対立遺伝子がＴ５型の場合切断されず約１８５ｂｐ（左向矢印）の位置にのみバンドが確認できる。一方、対立遺伝子がＴ６型の場合は切断され約１６５ｂｐ（左向矢印）及び約２０ｂｐの位置にバンドが確認できる。
【００４２】
従って、対立遺伝子がそれぞれＴ５型であるホモ接合の場合は、約１８５ｂｐの位置のみにバンドが確認され、対立遺伝子がそれぞれＴ６型であるホモ接合の場合は、約１６５ｂｐ及び約２０ｂｐの位置にバンドが確認される。また対立遺伝子がＴ５／Ｔ６型のヘテロ接合の場合は、約１８５ｂｐ、約１６５ｂｐ及び約２０ｂｐの位置にそれぞれバンドが確認できる。
【００４３】
レーン２〜１６を上記に従い遺伝子型を解析すると、レーン２〜１６の上部に記載さいた遺伝子型であることが分かる。即ち、レーン２〜４がＴ６型のホモ接合、レーン５〜１３がＴ５／Ｔ６型のヘテロ接合、レーン１４、１５がＴ５型のホモ接合である。
【００４４】
なお、約２０ｂｐのバンドは、ＤＮＡ長が短くＥｔＢｒの発色が弱いため確認が困難である。また、レーン２〜１６の全てでマーカー１００ｂｐの下方に確認できる低分子のバンドはプライマーダイマーであると思われ、多型解析には関係ない。
【００４５】
また、制限酵素処理に供するＰＣＲ産物の量が過剰の場合は、例えばＴ６型のホモ接合であっても、レーン４のように未切断の断片がわずかに残ることがある。このような分離像の場合には、再試験を行うことが好ましい。しかし、レーン５〜１３のＴ５／Ｔ６型のヘテロ接合の分離像とは、バンドの濃淡が異なるので熟練した術者ならこの程度であれば区別できる。
【００４６】
Ｔ５／Ｔ６型のヘテロ接合の場合、切断されないＴ５型由来の約１８５ｂｐは、切断されて生じるＴ６型由来の約１６５ｂｐに比べ、バンドのシグナル強度が常に強い。これは切断後のＤＮＡの長さに起因していることに加え、Ｔ６型をテンプレートする場合何らかの理由でＰＣＲ増幅効率に差があることも考えられる。
【００４７】
再試験として、Ｘａｇｌによる再消化及びアガロースゲル電気泳動法によってもよいが、後述のＡａｓｌ用プライマーセットによるＰＣＲ増幅、及びＡａｓｌ消化及びアガロースゲル電気泳動法による解析をすることで、より精度よく解析できる。
【００４８】
図６は、ＲＦＬＰ法（Ａａｓｌ）により、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子エクソン２の多型を解析した結果を示す図である。
【００４９】
図６に示す写真は、個別の豚（図５の豚とは異なる１０頭）から上記方法にて抽出したゲノムＤＮＡを基質に、上記Ａａｓｌ用プライマーセット、上記反応条件でＰＣＲ増幅したブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の部分配列約１７５ｂｐ増幅産物の上記反応条件にてＡａｓｌ消化し、３％アガロースゲル電気泳動法の結果である。定法にしたがい臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）液に浸漬し染色した後、紫外線光下で撮影を行ったものである。
【００５０】
レーン１がサイズマーカー（Ｍ）で、１００ｂｐ間隔で１ｋｂ〜１００ｂｐを示す。レーン２〜１１が被検体である。Ａａｓｌの切断パターンによって遺伝子型が解析できる。即ち、対立遺伝子がＴ５型の場合切断され約１５５ｂｐ（左向矢印）及び約２０ｂｐの位置にバンドが確認できる。一方、対立遺伝子がＴ６型の場合は切断されず約１７５ｂｐ（左向矢印）の位置にのみバンドが確認できる。
【００５１】
従って、対立遺伝子がそれぞれＴ５型であるホモ接合の場合は、約１５５ｂｐ（左向矢印）及び約２０ｂｐの位置にバンドが確認され、対立遺伝子がそれぞれＴ６型であるホモ接合の場合は、約１７５ｂｐの位置にのみバンドが確認される。また対立遺伝子がＴ５／Ｔ６型のヘテロ接合の場合は、約１７５ｂｐ、約１５５ｂｐ及び約２０ｂｐの位置にそれぞれバンドが確認できる。
【００５２】
レーン２〜１１を上記に従い遺伝子型を解析すると、レーン２〜１１の上部に記載さいた遺伝子型であることが分かる。即ち、レーン２〜７、９〜１１がＴ５／Ｔ６型のヘテロ接合、レーン８がＴ６型のホモ接合である。
【００５３】
なお、約２０ｂｐのバンドは、ＤＮＡ長が短くＥｔＢｒの発色が弱いため確認が困難である。また、レーン２〜１１の全てでマーカー１００ｂｐの下方に確認できる低分子のバンドはプライマーダイマーであると思われ、多型解析には関係ない。
【００５４】
また、レーン２においては、解析に供するＰＣＲ産物量が不足気味で泳動バンドが不明瞭になり判定が困難になっている。しかし、この程度までであれば判断をすることはでき、解析を信頼できる。
【００５５】
レーン３では、解析に供するＰＣＲ産物量が不足しているため遺伝子型解析を保留した。その後、試料量を増やして電気泳動を行った結果、レーン３は約１７５ｂｐ及び約１５５ｂｐのバンドが確認でき、Ｔ５／Ｔ６型のヘテロ接合であることが判明した。なお、高感度カメラ等、核酸の検出感度のよい装置を利用すれば、用いる試料の量を減らすことができる。
【００５６】
以上のように、遺伝子型解析には、検出効率においてどちらも大差がないことから、Ｘａｇｌ反応単独でもＡａｓｌ反応単独でも構わない。また、Ａａｓｌ、Ｘａｇｌそれぞれ単独による解析でなく、両酵素による解析を行うことでより精度が増す。或いは、一方の制限酵素でＲＦＬＰ法解析を行い、結果が不明瞭なときに誤判定を避けるためさらに他方の制限酵素によるＲＦＬＰ法解析を行ってもよい。
【００５７】
このことから、ミスマッチプライマーＰＣＲ法で、目的の部位を増幅し、ＲＦＬＰ法と組み合わせることで、アガロースゲル電気泳動によって、簡易にブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型が解析できることが分かる。
【００５８】
なお、多型解析として、ここではミスマッチプライマーＰＣＲ法とＲＦＬＰ法を組み合わせる多型の解析方法について説明したが、ミスマッチプライマーＰＣＲ法とＲＦＬＰ法を組み合わせる多型の解析方法でなくとも、エクソン２の２０番目にＴが挿入されているか、いないかを解析するために、染色体の塩基配列を直接シーケンスしてもよく、一旦ベクター等にクローニングしたものを用いて塩基配列を決定し解析してもよい。
【００５９】
或いは、 多型を解析する方法として、ＲＦＬＰ法の他、単鎖コンホーメーション多形分析法（ＳＳＣＰ）、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、及び、飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ）による核酸断片の質量分析法などが例示できる。
【００６０】
例えば、ＴＯＦ−ＭＳによる核酸断片の質量分析法においては、エクソン２における連続したＴの繰り返し（５回又は６回）部分を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、ＴＯＦ−ＭＳを用いて質量を分析すれば、Ｔの繰り返し数（５回又は６回）の違いを質量の差として容易に検出することが可能である。
【００６１】
要は、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子のエクソン２におけるヌクレオチド配列に存在する連続したＴの反復回数が５回であるか６回であるかに基づき、あるいはエクソン２の２０番目にＴが挿入されているかいないかを解析できれば、如何なる方法を採用してもよい。従って、アガロースゲル電気泳動法によるＲＦＬＰ法でなく、他の方法が採用できる。
【００６２】
当然、プライマーについても、ここに記載したプライマーに限定することをなく、Ｔが挿入されるエクソン２の２０番目を含む近傍を増幅できれば、特に限定されない。
【００６３】
また、塩基配列を決定せず、抗原交配反応、アミノ酸配列を解析し、Ｔ６型のように、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子のＣ末端にアミノ酸残基がＴ５型に比べ少ない（２アミノ酸残基）があることを判断できればそれでもよい。
【００６４】
例えば、ブタベータ３アドレナリンレセプターのアミノ酸配列における３９８番目のアミノ残基がＡｓｎであるかＡｓｐであるかを解析することで、間接的にアミノ酸残基の数を推測することができる。即ち、Ｔ６型であれば翻訳産物における３９８番目のアミノ産残基がＡｓｐであるが、Ｔ５型ではＡｓｎである。このように目的とするエクソン２におけるＴの繰り返し数の多型と強固に連鎖し連鎖不平衡にある多型部位を解析することで、結果としてブタの形質を診断することができる。
【００６５】
次に、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型と、ブタの形質の関係について述べる。
【００６６】
上記のミスマッチプライマーＰＣＲ法で、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子のエクソン２の２０番目を含む領域を増幅し、ＲＦＬＰ法と組み合わせ、診断したブタ（デュロック種）の遺伝子型（Ｔ５／Ｔ５、Ｔ５／Ｔ６、Ｔ６／Ｔ６）と形質（肉質）として、ロース面積に着目し、前記遺伝子型と相関があるか調べた。
【００６７】
図７は、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の遺伝子型と、ロース面積の関係を示す図表である。図７（Ａ）が統計値、図７（Ｂ）が（Ａ）をグラフ化したものである。
【００６８】
測定対象は、全国農業協同組合連合会所有のデュロック種、雄３２３頭、雌３５９頭である。雄・雌毎のロース面積をブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の遺伝子型別に３群に分類し、それぞれの平均値を図７（Ａ）に示した。
【００６９】
ロース面積は、Ｂモード超音波診断装置（販売：アロカ株式会社  製品番号SSD500EV）を用いて、豚の体重が凡そ９０〜１００ｋｇ到達時に、体長の１／２の部位に位置するロース部分の画像を撮影し、ロース部分の面積をイメージ解析ソフトウェア（販売：株式会社ヒューリンクス  ソフトウェア名：ＳｉｇｍａＳｃａｎ  Ｐｒｏ）を用いて測定した。
【００７０】
その結果、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の遺伝子型の違いにより、ロース面積にも違いが確認された。即ち、Ｔ５／Ｔ５型、Ｔ５／Ｔ６型、Ｔ６／Ｔ６型の順にロース面積は大きくなる傾向があった。よって、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の対立遺伝子の遺伝型にＴ５型を有するブタのロース面積は小さい傾向にあると言える。また、その差は雄より雌の方がより顕著であった。
【００７１】
図８は、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の遺伝子型と、ロース面積の育種価の関係を示す図表である。図８（Ａ）が統計値、図８（Ｂ）が（Ａ）をグラフ化したものである。
【００７２】
ロース面積の育種価の算出対象は、全国農業協同組合連合会所有のデュロック種、雄３２３頭、雌３５９頭である。雄・雌毎のロース面積の育種価をブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の遺伝子型別に３群に分類し、それぞれの平均値を図８（Ａ）に示した。
【００７３】
ロース面積の育種価は、他の形質の測定値（例えば背脂肪厚、検定時体重等）及び豚の血統情報を基に、多形質アニマルモデルＢＬＵＰ（Best Linear Unbiased Predictor）法で算出した。この時、育種価算出のプログラムとしてＰＥＳＴを用いた。
【００７４】
育種価とは、当該個体が持つ量的形質に働く各対立遺伝子の相加的遺伝子効果の総和のことであり、当該個体の育種価はその個体の子の平均値の集団平均からの偏差の２倍としても定義される。家畜の育種改良の中で最も重要な値である。
【００７５】
ＢＬＵＰ法とは、育種価を求める方法の１つであり、測定年次等の母数効果を取り除き、さらに個体の血縁情報を加味することで、最も正確かつ偏りがない育種価を予測する方法である。ＢＬＵＰ法は家畜の育種改良において、育種価を求める際、一般的に使われている手法である。
【００７６】
その結果、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の遺伝子型の違いにより、ロース面積の育種価にも違いが確認された。即ち、Ｔ５／Ｔ５型、Ｔ５／Ｔ６型、Ｔ６／Ｔ６型の順にロース面積の育種価は大きくなる傾向があった。よって、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の対立遺伝子の遺伝子型にＴ５型を有するブタのロース面積の育種価は小さい傾向にあると言える。また、その差は雄より雌の方がより顕著であった。
【００７７】
図９は、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の遺伝子型間におけるロース面積の平均値及びロース面積の育種価の平均値の検定を分散分析で行った結果を示した表である。
【００７８】
上記分散分析を行うに当たり、一般的に、ロース面積の大きさは測定時の体重と相関があるため、測定時の体重を共変量として使用した。すなわち、ロース面積の分散分析による検定方法として、遺伝子型を独立変数とし、共変量としてロース面積測定時の体重を用いた共分散分析を行った。ロース面積の育種価の場合、育種価算出時に測定時体重が既にＢＬＵＰ法のモデルに含まれている。そのため、ロース面積の育種価の検定方法として遺伝子型を独立変数とした一元配置の分散分析を行った。
【００７９】
その結果、雌のロース面積においてブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の遺伝子型間で有意差（ｐ＝０．００２）、さらに雄・雌のロース面積の育種価（それぞれｐ＜０．００１、＜０．００１）でもブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の遺伝子型間で有意差があった。しかし、各遺伝子型間において測定時の体重の平均に有意差は存在しなかった（ｐ＞０．３図９）。すなわち、図７、図８に示した遺伝子型によるロース面積の平均及びロース面積の育種価の増減は、体重の増減を伴っていない。
【００８０】
次いで、遺伝子型間で有意差が認められた雌のロース面積及び雄・雌のロース面積の育種価について、Ｔｕｋｅｙ検定を用いて群間比較検定を行い、図９において、数値の後に符号（ａ、ａｂ、ｂ）を付してそれぞれの群間の有意差の有無を表した。５％未満の危険率で有意差がある遺伝子型に数値の後に異符号（ａ、ｂ）を付した。例えば、図９（Ｂ）の雌のロース面積（ｃｍ２）の平均においては、Ｔ５／Ｔ５型（ｂ）、Ｔ５／Ｔ６（ａｂ）、Ｔ６／Ｔ６（ａ）であるので、Ｔ５／Ｔ５型（ｂ）とＴ５／Ｔ６（ａｂ）間では、同符号（ｂ）が付されているので有意差がないことを意味する。同様に、Ｔ５／Ｔ６（ａｂ）とＴ６／Ｔ６（ａ）間では、同符号（ａ）が付されているので有意差はない。また、Ｔ５／Ｔ５型（ｂ）とＴ６／Ｔ６（ａ）間では、異符号のみであるので、有意差があることを意味する。
【００８１】
図９から明らかなように、雄雌（Ａ）（Ｂ）の両方においてＴ６／Ｔ６型のロース面積の育種価の平均値は、Ｔ５／Ｔ６型、Ｔ５／Ｔ５型のロース面積の育種価の平均に対して有意差が認められた。また、雌（Ｂ）の表現型であるロース面積（ｃｍ２）の平均値においてもＴ６／Ｔ６型はＴ５／Ｔ６型、Ｔ５／Ｔ５型に対して有意差が認められた。
【００８２】
以上のように、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の多型と、ブタのロース面積に関係があることが見いだされた。従って、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子を遺伝マーカーとすることで、所望の形質（ロース面積が大きいもしくは小さい）を持つ豚を予測することが幼少期の段階で可能となるため、効率的に所望の形質（ロース面積が大きいもしくは小さい）を持つ系統を作出する手段として有用である。
【００８３】
所定の形質のブタを選択し、育成、又は繁殖するブタの育種方法として、例えば、雄Ｔ６／Ｔ６型、雌Ｔ６／Ｔ６型を掛け合わせると、よりロース面積の大きいブタの系統が造成可能である。逆に、ロース面積が大きすぎる系統に対しては、Ｔ５／Ｔ５型、Ｔ５／Ｔ６型を導入することで、他の形質（体型や筋肉内脂肪等）を維持しつつ、ロース面積の低減が図れる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の構造及びいくつかのイノシシ、ブタのベータ３アドレナリンレセプター遺伝子のアミノ酸配列を比較した図である。
【図２】図１のベータ３アドレナリンレセプター遺伝子末端部である。
【図３】遺伝子型解析方法の一例（ミスマッチ・プライマー法／Ａａｓｌ）を示す概略図である。
【図４】遺伝子型解析方法の一例（ミスマッチ・プライマー法／Ｘａｇｌ）を示す概略図である。
【図５】ＲＦＬＰ法（Ｘａｇｌ）により、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子エクソン２の多型を解析した結果を示す図である。
【図６】ＲＦＬＰ法（Ａａｓｌ）により、ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子エクソン２の多型を解析した結果を示す図である。
【図７】ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の遺伝子型と、ロース面積の関係を示す図表である。
【図８】ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の遺伝子型と、ロース面積の育種価の関係を示す図表である。
【図９】ブタベータ３アドレナリンレセプター遺伝子の遺伝子型とロース面積及びロース面積の育種価の有意差判定結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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