(57)【要約】      （修正有）【課題】コークス炉から排出される特殊な組成の安水中でもカテコールを分解可能なカテコール分解酵素を、安水活性汚泥から単離して利用できるようにし、更には、当該カテコール分解酵素を用いた排水処理方法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列のＤＮＡでコードされるカテコール分解酵素。及び、前記の少なくともいずれかのカテコール分解酵素とカテコールを含む排水とを混合して前記排水中のカテコールを分解する排水中のカテコールの分解方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１から４３のいずれかに示す塩基配列のＤＮＡでコードされるカテコール分解酵素。
【請求項２】
配列番号１から４３のいずれかに示す塩基配列のＤＮＡでコードされるカテコール分解酵素のうちの１種又は２種以上とカテコールを含む排水とを混合して、前記排水中のカテコールを分解することを特徴とする排水中のカテコールの分解方法。
【請求項３】
配列番号１から４３の少なくともいずれかに示す塩基配列のＤＮＡを細胞の中に含む微生物を培養して、前記微生物に前記１種又は２種以上のカテコール分解酵素を産生させ、
前記培養されたカテコール分解酵素を有する微生物と前記カテコールを含む排水とを混合し、又は、前記微生物から前記産生されたカテコール分解酵素を抽出して当該抽出されたカテコール分解酵素とカテコールを含む排水とを混合して、前記排水中のカテコールを分解することを特徴とする、請求項２に記載の排水中のカテコールの分解方法。
【請求項４】
前記カテコールを含む排水がコークス炉から排出される安水であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の排水中のカテコールの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カテコール分解酵素、および、本酵素を利用した排水中のカテコールの分解方法に関する。更には、本発明は、製鉄所のコークス炉から排出される安水中に含まれるカテコールを分解可能なカテコール分解酵素、および、本酵素を利用した安水中のカテコールの分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
製鉄所においてコークス炉から発生する安水にはフェノール類、チオシアン、チオ硫酸など環境上好ましくない成分や、高濃度のアンモニアが含まれている。現在の安水処理システムでは、化学的酸素要求量（ＣＯＤ）成分となるフェノール類などの有機物や、チオシアン、チオ硫酸などの硫黄化合物が活性汚泥法で除去されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
安水を処理する活性汚泥を構成する微生物には、フェノール類、チオシアン、チオ硫酸などを分解できる微生物が存在する（例えば、特許文献１，２参照）。これらのＣＯＤ成分を分解する微生物では、微生物が産生する酵素が直接分解に関わっている。しかし、どのような酵素が安水に含まれるフェノール類、チオシアン、チオ硫酸などの分解に関わるのかは解明されていない。
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２４２５７８号公報
【特許文献２】特開２００４−３４４１３８号公報
【非特許文献１】Ｓｈａｗ，Ｋ．Ｃ．（１９９３）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｃｏｋｅ  ｐｌａｎｔ  ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ  ａｔ  Ｇｅｎｏｖａ  Ｓｔｅｅｌ．，Ｉｒｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ，２９−３２．
【非特許文献２】Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｒ．（１９９０）Ｔｈｅ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉａ．，  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  １，１９１−２０６．
【非特許文献３】Ｅｌｔｉｓ，Ｌ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｂｏｌｉｎ，Ｊ．Ｔ．（１９９６）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  ｅｘｔｒａｄｉｏｌ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ．，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，５９３０−５９３７．
【非特許文献４】Ｍｅｓａｒｃｈ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｔｅｃｈｏｌ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ．，  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６，６７８−６８３．
【非特許文献５】Ｊｕｎｃａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｃａｔｅｃｈｏｌ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｏｌｌｕｔｅｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５０，４１８１−４１８７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
コークス炉から排出される安水の中で最も高濃度に含まれるＣＯＤ成分はフェノールである。このフェノールの分解は、主として好気性微生物による酸化分解によるものと考えられており、フェノールは、先ず、水酸化酵素によって初発酸素添加を受け、中間反応生成物質であるカテコールに変換されることが知られている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００６】
また、カテコールの芳香環を開裂する反応は一般に進みにくい反応であると考えられ、フェノールの酸化分解反応においては、カテコールの芳香環の開裂反応が、反応律速になっていると考えられている。そして、カテコールを分解する酵素としては、例えば、３−メチルカテコール・ジオシキナーゼ（ＴｏｄＥ）等が知られている。
【０００７】
ところが、高濃度のアンモニアや硫黄化合物等を含む特殊な組成である安水の処理においては、安水処理を担う活性汚泥中の微生物が産生する、フェノールの分解に関わる酵素については、現在のところ全く判っておらず、安水中でこのカテコールの芳香環を開裂する反応を触媒するカテコール分解酵素についても、詳細が全くわかっていない。
【０００８】
そこで、本発明においては、コークス炉から排出される特殊な組成の安水中でもカテコールを分解可能なカテコール分解酵素を、安水活性汚泥から単離して利用できるようにし、更には、当該カテコール分解酵素を用いた排水処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者らは、安水を処理する活性汚泥のメタゲノム解析を行い、安水処理でのフェノールの分解反応における共通の中間反応生成物質であるカテコールの分解に関わる酵素及び当該酵素をコードするＤＮＡの塩基配列について、鋭意検討した結果、安水活性汚泥中に安水の処理に使用可能な新規なカテコール分解酵素を複数発見し、これらを利用することに成功し、発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明の特徴は以下の通りである。
（１）配列番号１から４３のいずれかに示す塩基配列のＤＮＡでコードされるカテコール分解酵素。
（２）配列番号１から４３のいずれかに示す塩基配列のＤＮＡでコードされるカテコール分解酵素のうちの１種又は２種以上とカテコールを含む排水とを混合して、前記排水中のカテコールを分解することを特徴とする排水中のカテコールの分解方法。
（３）配列番号１から４３の少なくともいずれかに示す塩基配列のＤＮＡを細胞の中に含む微生物を培養して、前記微生物に前記１種又は２種以上のカテコール分解酵素を産生させ、前記培養されたカテコール分解酵素を有する微生物と前記カテコールを含む排水とを混合し、又は、前記微生物から前記産生されたカテコール分解酵素を抽出して当該抽出されたカテコール分解酵素とカテコールを含む排水とを混合して、前記排水中のカテコールを分解することを特徴とする（２）の排水中のカテコールの分解方法。
（４）前記カテコールを含む排水がコークス炉から排出される安水であることを特徴とする（２）又は（３）の排水中のカテコールの分解方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、従来知られていなかった新規な酵素を用いて、排水中に含まれるカテコールを酵素反応により分解促進することが可能となる。
特に、コークス炉から排出される安水には、高濃度のフェノールが含まれるが、本発明のカテコール分解酵素および当該酵素を使用した排水中のカテコールの分解方法を用いることで、特殊な組成を有する安水中においても、カテコールの分解を効率的に促進することができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明者らは安水処理活性汚泥から環境ＤＮＡ（メタゲノム）を採取して、そこから新規なカテコール分解酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を解明することに成功した。さらに、この塩基配列のＤＮＡを用いて、新規なカテコール分解酵素を宿主微生物に産生させて、排水中のカテコールの分解をおこなうことにも成功した。
【００１３】
まず、本発明のカテコール分解酵素を入手する方法について説明する。本発明のカテコール分解酵素をコードする配列番号１から４３のいずれかに示す塩基配列のＤＮＡは製鉄所の安水活性汚泥から当該ＤＮＡをクローニングすることにより入手可能である。
【００１４】
例えば、大腸菌などの微生物を宿主として、配列番号１から４３のいずれかに示す塩基配列のＤＮＡを組み込んだプラスミドや、フォスミドを組み込んだファージ等を用いて宿主微生物を形質転換することにより、本発明のカテコール分解酵素を宿主微生物に産生させて、本発明のカテコール分解酵素を入手することができる。
【００１５】
本発明のカテコール分解酵素を産生する宿主微生物となりうるかどうかの判別、及び、形質転換した微生物がカテコール分解酵素を産生できているかどうかの確認は、以下のようにして行うことができる。
【００１６】
先ず、形成転換し、培養した宿主微生物の細胞を破壊して得られる細胞抽出液に、基質となるカテコールを添加する。本発明のカテコール分解酵素を産生する宿主微生物の細胞抽出液では、カテコールの芳香環の開裂により、反応生成物として、２−ヒドロキシムコネート・セミアルデヒド（２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｕｃｏｎａｔｅ  ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ）を形成して黄色を呈するため、３７５ｎｍの吸光度を測定することで、本発明のカテコール分解酵素を産生する宿主微生物かどうかを特定することが可能である。３７５ｎｍの吸光度が増加すれば、カテコールが分解されて２−ヒドロキシムコネート・セミアルデヒドが形成されることになるため、カテコールの分解酵素により、カテコールの分解が起こったことを判定できる。
【００１７】
次に、以上のようにして得られる、配列番号１から４３のいずれかに示す塩基配列で特定されるカテコール分解酵素を用いて、排水中に含まれるカテコールを分解する方法について説明する。本発明のカテコール分解酵素の至適温度は、20℃以上40℃以下、至適ｐHは５以上９以下である。排水中のカテコールを分解しようとする場合には、この温度とｐHの条件を満足する条件で本発明のカテコール分解酵素を使用することが望ましい。
【００１８】
また、本発明のカテコール分解酵素を用いて、排水中のカテコールを分解しようとする際のカテコール濃度について特に上限はない。製鉄所の安水はフェノールを高濃度に含むが、フェノールが分解される際の中間反応性生物としてカテコールが蓄積する可能性がある。安水であればカテコールを生成するもととなるフェノールが最大で１０００ｍｇ/L程度まで含まれることがあるが、これらフェノールが全て変換されてカテコール濃度が１０００ｍｇ/Lとなっても、本発明のカテコール分解酵素による処理は適用可能である。
【００１９】
排水中のカテコールを分解する際は、本発明のカテコール分解酵素を産生する宿主微生物をそのままカテコール分解に利用することはもちろん可能である。例えば、宿主微生物が産生したカテコール分解酵素が細胞表層の細胞膜やペリプラズムに存在したり、細胞外に分泌される場合などは、カテコール分解酵素が細胞外部の水と接することができるため、宿主微生物をそのまま利用できる。また、宿主微生物により産生されたカテコール分解酵素が、宿主微生物の細胞内に蓄積される場合には、カテコール分解酵素が細胞外部の水と接することができないため、宿主微生物の細胞を破壊して、本発明のカテコール分解酵素を含む細胞抽出液などを利用することも可能である。
【００２０】
また、本発明のカテコール分解酵素を用いて、排水中のカテコールを分解処理する際は、配列番号１から４３の少なくともいずれか１つに示す塩基配列のＤＮＡでコードされるカテコール分解酵素を用いれば良いが、複数の酵素を一緒に用いて分解処理してももちろん構わない。単一の種類のカテコール分解酵素のみを使用する場合、排水のｐH変動や、温度変化、基質となるカテコールの濃度などによってカテコールの分解活性が影響を受ける可能性がある。したがって、異なる反応至適条件をもつ複数種類のカテコール分解酵素を使用することで、このような影響を受けにくくすることができると考えられ、より好ましい。尚、微生物に２種以上のカテコール分解酵素を産生させることも可能である。この場合、２種以上の配列番号１から４３の塩基配列のＤＮＡを結合させたプラスミド、フォスミドなどを用いて、宿主微生物を形質転換することにより可能となる。宿主微生物としては、プラスミドなどのベクターが利用できる大腸菌が最も利用しやすい。酵母など他の遺伝子組み換え可能な微生物も、宿主微生物として利用可能である。また、本発明のカテコール分解酵素は、酸素が存在する環境で生育する好気性微生物に由来するものであるから、宿主微生物を利用してカテコールを分解する際には、空気で曝気することが望ましい。
以下、本発明を実施例により説明する。
【実施例】
【００２１】
実施例１  新規カテコール分解酵素によるカテコールの分解（１）
配列番号１から４３（配列表及び図１〜４３）の塩基配列をコードするＤＮＡ断片を精製して、平滑末端化した。次いで、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有するｐＣＣ１ＦＯＳフォスミドにライゲーションした。フォスミドへのライゲーションにはＴ４ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ）を使用した。このフォスミドへライゲーションしたものを、ＭａｘＰｌａｎｘ  Ｌａｍｂｄａ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｓを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐａｃｋａｇｉｎｇを行なった。宿主微生物として大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＰＩ−３００Ｔ１Ｒを使用した。そして、１２．５μｇ/ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ（ＬＢ/Ｃｍ）寒天プレートで、ラムダファージにより形質転換した大腸菌をクロラムフェニコール耐性により選択した。
【００２２】
大腸菌のコロニーをとり、１２．５μｇ/ｍＬのクロラムフェニコールを含む２ｘＹＴ培地（２ｘＹＴ/Ｃｍ）１ミリリットル中で、３７℃で１８時間培養した。ついで、このコロニーを採取した大腸菌の培養液のうち、２００マイクロリットルを、新しい８００マイクロリットルの２ｘＹＴ/Ｃｍ培地に移して混合し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で３０分間培養した後、１マイクロリットルのＣｏｐｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を添加した。こうすることにより、大腸菌の中にあるフォスミドのコピー数を増加させた。さらに大腸菌を３７℃で２時間、１２００ｒｐｍで激しく振とうしながら培養し、４℃で３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、大腸菌を沈殿させて回収した。回収した大腸菌を５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。そして、１５０マイクロリットルのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｌｕｓ  Ｂｅｎｚｏａｔｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加して、大腸菌の細胞を溶解させた。４℃で３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、大腸菌の溶解された残りの菌体部分を沈殿させて、上清を細胞抽出液として得た。
【００２３】
次に、この細胞抽出液がカテコール分解酵素を含むことを、以下のように確認した。基質となるカテコール（ＳＩＧＭＡ製）を最終濃度が０．５ｍＭとなるように、５マイクロリットルずつ、１００マイクロリットルの細胞抽出液に添加して混合した。２５℃で２５０ｒｐｍでゆるやかに振とうしながら反応させた。反応時間は１時間および１６時間とした。カテコールの分解により、２−ヒドロキシムコネート・セミアルデヒドの形成により黄色を呈するようになるため、３７５ｎｍの吸光度を調べて、カテコール分解酵素の活性を調べた。
【００２４】
結果を表１に示す。各配列番号のカテコール分解酵素は、そのアミノ酸配列の相同性からグループ分けされるサブファミリーについても表１に示した。カテコール分解酵素のサブファミリーは、非特許文献３，４，５の報告に基づいてグループ分けした。明確にグループ分けできないものについては、サブファミリーを記さなかった。また、各配列番号の各カテコール分解酵素について、アミノ酸配列の相同性が最も高い既知酵素名と、その相同性についても表１に記した。ＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）が０．５以上のものを＋＋、ＯＤが０より大きく０．５以下のものを＋、ＯＤが０のものを−で示した。なお、対照実験として形質転換しない大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＰＩ−３００Ｔ１Ｒの細胞抽出液についてもカテコール分解活性を調べた。
【００２５】
【表１Ａ】
2008301719.tif 000002
【００２６】
【表１Ｂ】
2008301719.tif 000003
【００２７】
以上の結果から、配列番号１から４３の塩基配列のＤＮＡでコードされた酵素全てが、カテコールの分解活性を有するカテコール分解酵素であることを確認できた。
【００２８】
実施例２  新規カテコール分解酵素によるカテコールの分解（２）
サブファミリーの異なるカテコール分解酵素として、配列番号１９（Ｉ．１．Ｃサブファミリー）、配列番号１２、１３、１４（Ｉ．２．Ａサブファミリー）、配列番号２、４３（Ｉ．２．Ｂサブファミリー）、配列番号３１、３８（Ｉ．２．Ｃサブファミリー）、配列番号１、３、８、３２（Ｉ．２．Ｇサブファミリー）、配列番号３４（Ｉ．３．Ｍサブファミリー）、配列番号６（Ｉ．３．Ｎサブファミリー）の各塩基配列をコードする遺伝子を含むフォスミドＤＮＡを精製して、平滑末端化した。次いで、ｐＵＣ１１８プラスミドにライゲーションし、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、５０μｇ/ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ（ＬＢ/Ａｐ）寒天プレートで、大腸菌を選択した。続いて、大腸菌のコロニーをとり、５０μｇ/ｍＬのアンピシリンと０．１ｍＭのｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地（２ｘＬＢ/Ａｐ/ＩＰＴＧ）１ミリリットル中で、３７℃で１８時間培養した。次に４℃で３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、大腸菌を沈殿させて回収した。回収した大腸菌を５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。そして、１５０マイクロリットルのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｌｕｓ  Ｂｅｎｚｏａｔｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  （Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加して、大腸菌の細胞を溶解させた。４℃で３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、大腸菌の溶解された残りの菌体部分を沈殿させて、上清を細胞抽出液として得た。
【００２９】
次に、この細胞抽出液がカテコール分解酵素を含むことを、以下のように確認した。基質となるカテコールを最終濃度が０．５ｍＭとなるように、５マイクロリットルずつ、１００マイクロリットルの細胞抽出液に添加して混合した。２５℃で２５０ｒｐｍでゆるやかに振とうしながら反応させた。反応時間は１時間とした。
【００３０】
カテコールの分解により、２−ヒドロキシムコネート・セミアルデヒドを形成して黄色を呈するようになるため、３７５ｎｍの吸光度（吸収係数ε＝３３０００Ｍ−１ｃｍ−１）が変化するので吸光度を測定した。吸光度変化と吸収係数からカテコール分解酵素の活性を算出した。カテコール分解活性の1単位は1分間で１マイクロモルのカテコール分解反応産物である２−ヒドロキシムコネート・セミアルデヒドを生成するカテコール分解酵素の活性を意味する。１ｇの蛋白質あたりの上記反応単位でカテコール分解活性を表示した。結果を表２に示す。
【００３１】
なお、対照実験として、上記各カテコール分解酵素とは異なるサブファミリーに属するカテコール分解酵素である、既知の３−メチルカテコール・ジオキシゲナーゼ（ＴｏｄＥ）（Ｉ．３．Ｂサブファミリー）の遺伝子を、同様の方法で大腸菌に産生させた場合の細胞抽出液でもカテコール分解活性を測定した。
【００３２】
【表２】
2008301719.tif 000004
【００３３】
以上、既知のカテコール分解酵素である３−メチルカテコール・ジオキシゲナーゼ（ＴｏｄＥ）（Ｉ．３．Ｂサブファミリー）とは異なるサブファミリーに属する、本発明の配列番号１９（Ｉ．１．Ｃサブファミリー）、配列番号１２、１３、１４（Ｉ．２．Ａサブファミリー）、配列番号２、４３（Ｉ．２．Ｂサブファミリー）、配列番号３１、３８（Ｉ．２．Ｃサブファミリー）、配列番号１、３、８、３２（Ｉ．２．Ｇサブファミリー）、配列番号３４（Ｉ．３．Ｍサブファミリー）、配列番号６（Ｉ．３．Ｎサブファミリー）の各塩基配列のＤＮＡにコードされている、各カテコール分解酵素について、カテコール分解酵素活性があることを確認した。
【００３４】
実施例３  安水中のカテコールの分解
配列番号１２（Ｉ．２．Ａサブファミリー）、１８（Ｉ．２．Ｇサブファミリー）、６（Ｉ．３．Ｎサブファミリー）の各塩基配列をコードする遺伝子を含むフォスミドのＤＮＡを精製して、平滑末端化した。次いで、ｐＵＣ１１８プラスミドにライゲーションし、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、５０μｇ/ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ（ＬＢ/Ａｐ）寒天プレートで、大腸菌を選択した。続いて、大腸菌のコロニーをとり、５０μｇ/ｍＬのアンピシリンと０．１ｍＭのｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地（２ｘＬＢ/Ａｐ/ＩＰＴＧ）１ミリリットル中で、３７℃で１８時間培養した。次に４℃で３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、大腸菌を沈殿させて回収した。
【００３５】
以上のようにカテコール分解酵素を産生する大腸菌を、カテコールを100ｍｇ/L含む人工安水（組成を表３に示す。）に、菌体濃度が5×105細胞/ｍLとなるように入れて混合し、空気曝気しながら25℃で24時間処理した。対照実験として、形質転換せずカテコール分解酵素を産生しない大腸菌を同じ菌体濃度で同一条件で処理する試験（対照１）、及び本発明のカテコール分解酵素とはサブファミリーが異なるカテコール分解酵素である３−メチルカテコール・ジオキシゲナーゼ（ＴｏｄＥ）（Ｉ．３．Ｂサブファミリー）を産生する大腸菌にについても同じ菌体濃度で同一条件で処理する試験（対照２）を行なった。
【００３６】
実施例１と同様に、カテコールの分解を、カテコールの芳香環が開裂することにより形成される２−ヒドロキシムコネート・セミアルデヒドを３７５ｎｍの吸光度の増加で測定した。結果を表４に示した。表では、ＯＤが０．５以上のものを＋＋、ＯＤが０より大きく０．５以下のものを＋、ＯＤが０のものを−で示した。
【００３７】
表４より、配列番号１２、１８、６の各カテコール分解酵素を産生する大腸菌を入れた系では、安水中で良好にカテコールの分解がおこっている。対照１のカテコール分解酵素を産生しない大腸菌を入れた系では、カテコールの分解は進まなかった。また、対照２の既知のカテコール分解酵素であるＴｏｄＥを産生する大腸菌を入れた系では、本発明の配列番号１２、１８、６のカテコール分解酵素を産生する大腸菌を入れた系と比較して、安水中でカテコール分解活性が低くなった。
【００３８】
【表３】
2008301719.tif 000005
【００３９】
【表４】
2008301719.tif 000006
【００４０】
以上、安水のような特殊な組成の排水中のカテコールであっても、本発明のカテコール分解酵素は、カテコール分解反応を促進できることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号１）を示す。
【図２】図２は、サブファミリーＩ．２．Ｂに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号２）を示す。
【図３】図３は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号３）を示す。
【図４】図４は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号４）を示す。
【図５】図５は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号５）を示す。
【図６】図６は、サブファミリーＩ．３．Ｎに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号６）を示す。
【図７】図７は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号７）を示す。
【図８】図８は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号８）を示す。
【図９】図９は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号９）を示す。
【図１０】図１０は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号１０）を示す。
【図１１】図１１は、カテコール分解酵素の塩基配列（配列番号１１）を示す。
【図１２】図１２は、サブファミリーＩ．２．Ａに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号１２）を示す。
【図１３】図１３は、サブファミリーＩ．２．Ａに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号１３）を示す。
【図１４】図１４は、サブファミリーＩ．２．Ａに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号１４）を示す。
【図１５】図１５は、サブファミリーＩ．２．Ａに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号１５）を示す。
【図１６】図１６は、サブファミリーＩ．２．Ｃに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号１６）を示す。
【図１７】図１７は、カテコール分解酵素の塩基配列（配列番号１７）を示す。
【図１８】図１８は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号１８）を示す。
【図１９】図１９は、サブファミリーＩ．１．Ｃに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号１９）を示す。
【図２０】図２０は、サブファミリーＩ．２．Ｂに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号２０）を示す。
【図２１】図２１は、サブファミリーＩ．２．Ｃに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号２１）を示す。
【図２２】図２２は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号２２）を示す。
【図２３】図２３は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号２３）を示す。
【図２４】図２４は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号２４）を示す。
【図２５】図２５は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号２５）を示す。
【図２６】図２６は、サブファミリーＩ．２．Ａに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号２６）を示す。
【図２７】図２７は、サブファミリーＩ．２．Ａに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号２７）を示す。
【図２８】図２８は、サブファミリーＩ．１．Ｃに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号２８）を示す。
【図２９】図２９は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号２９）を示す。
【図３０】図３０は、サブファミリーＩ．２．Ｂに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号３０）を示す。
【図３１】図３１は、サブファミリーＩ．２．Ｃに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号３１）を示す。
【図３２】図３２は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号３２）を示す。
【図３３】図３３は、サブファミリーＩ．２．Ｃに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号３３）を示す。
【図３４】図３４は、サブファミリーＩ．３．Ｍに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号３４）を示す。
【図３５】図３５は、サブファミリーＩ．３．Ｍに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号３５）を示す。
【図３６】図３６は、サブファミリーＩ．２．Ａに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号３６）を示す。
【図３７】図３７は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号３７）を示す。
【図３８】図３８は、サブファミリーＩ．２．Ｃに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号３８）を示す。
【図３９】図３９は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号３９）を示す。
【図４０】図４０は、サブファミリーＩ．２．Ｇに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号４０）を示す。
【図４１】図４１は、カテコール分解酵素の塩基配列（配列番号４１）を示す。
【図４２】図４２は、サブファミリーＩ．２．Ｃに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号４２）を示す。
【図４３】図４３は、サブファミリーＩ．２．Ｂに属するカテコール分解酵素の塩基配列（配列番号４３）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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