(57)【要約】【課題】  哺乳動物の幹細胞の未分化状態を維持させたまま、効率よく増殖させ、さらに幹細胞の移植時における生着率の高い幹細胞を調製する方法及び／又は、幹細胞の未分化状態維持剤を提供すること。【解決手段】  哺乳動物の胚性の幹細胞、または、骨髄、血液、脂肪、皮膚組織をはじめとする生体組織における体性の幹細胞に対して、マンネンタケの溶媒抽出物を用いることにより、幹細胞の未分化状態を維持したまま細胞増殖を促進し、さらに、幹細胞の移植時における生体組織への幹細胞の生着率が向上し、組織の再生治療に役立つものである。以上より、本発明は、組織の再生の分野において大きく貢献できるものであり、医学、医薬品、医薬部外品、美容、健康分野への応用が期待される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンネンタケ属に属するキノコの抽出物を含有する培地を用いて培養することを特徴とする幹細胞。
【請求項２】
マンネンタケ属に属するキノコの抽出物を含有する培地を用いて培養することで未分化状態を維持させることを特徴とする幹細胞。
【請求項３】
マンネンタケ属に属するキノコが、黒霊芝、赤霊芝およびマゴジャクシからなる群より一種又は二種以上選ばれたキノコであることを特徴とする請求項１又は２に記載の幹細胞。
【請求項４】
幹細胞が哺乳動物由来であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の幹細胞。
【請求項５】
マンネンタケ属に属するキノコの抽出物を含有する培地を用いて培養することを特徴とする幹細胞の製造方法。
【請求項６】
マンネンタケ属に属するキノコの抽出物を含有することを特徴とする幹細胞の未分化状態の維持剤。
【請求項７】
マンネンタケ属に属するキノコの抽出物を含有することを特徴とする幹細胞の未分化状態の維持方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンネンタケ属に属するキノコの抽出物および該成分を含有する培地を用いて培養することを特徴とする幹細胞及び／又はその製造方法などに関する。詳しくは、マンネンタケ属に属するキノコの抽出物を含有することで、哺乳動物の幹細胞の未分化状態を維持させる機能を有し、さらに、該機能の効果を保持したまま、幹細胞の増殖促進効果、幹細胞移植時の幹細胞の生体組織への生着率を高める効果を有する未分化状態の幹細胞及び／又はその製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物、特に哺乳動物の組織は、傷害もしくは疾患、又は加齢などに伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に備わる幹細胞が大きな役割を果たしている。幹細胞は、あらゆる細胞・臓器に分化する多能性を有しており、この性質により細胞・組織の損傷部を補うことで回復に導くと考えられている。このような幹細胞を応用した、次世代の医療である再生医療に期待が集まっている。
【０００３】
哺乳動物における幹細胞研究で最も進んでいる組織は骨髄である。骨髄には生体の造血幹細胞が存在しており、すべての血液細胞再生の源であることが明らかにされた。さらに骨髄には、造血幹細胞とは別に、その他の臓器（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪など）へ分化可能な幹細胞が包含されていることが報告されている（非特許文献１参照）。
【非特許文献１】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  Ｍ．  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４，１４３−１４７
【０００４】
さらに、近年、骨髄以外にも、肝臓、膵臓、脂肪など、あらゆる臓器・組織に幹細胞が存在することが明らかにされ、各臓器・組織の再生および恒常性維持を司っていることがわかってきた（非特許文献２〜５参照）。また、各組織に存在する幹細胞は可塑性に優れており、今まで自己複製が不可能であった臓器の再生にも利用できる可能性がある。これらの幹細胞の能力を十二分に引き出し、細胞移植治療や組織工学（再生医療や再生美容）に利用するためには、生体組織から幹細胞を分離し、それを体外培養によって、未分化状態を維持したまま増殖させ、さらに、移植した場合に生着率の高い培養技術が重要になる。
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｅｌｌ  Ｍ．  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  １９９７，３，１３３７−１３４５
【非特許文献３】Ｚｕｌｅｗｓｋｉ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ２００１，５０，５２１−５３３
【非特許文献４】Ｓｕｚｕｋｉ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ２０００，３２，１２３０−１２３９
【非特許文献５】Ｚｕｋ  Ｐ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ２００１，７，２１１−２２８
【０００５】
現在までに、幹細胞の未分化状態を維持させたまま増殖させる技術について、幾つか報告があるが、未だ発展途上である。例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や造血幹細胞は、支持細胞（ストローマ細胞、もしくはフィーダー細胞）と共培養することで未分化を維持することができる（非特許文献６〜８、特許文献１参照）。しかし、最近になってフィーダー細胞由来の内在性ウイルスによる異種動物間の感染例が報告されており（非特許文献９参照）、医療用途を目的とした幹細胞の培養には適していない。
【０００６】
【非特許文献６】Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｊ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  １９９５，９２，７８４４−７８４８
【非特許文献７】Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｊ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９８，２８２，１１４５−１１４７
【非特許文献８】Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  Ｂ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，  ２０００，１８，３９９−４０４
【特許文献１】特開２００４−２４０８９号公報
【非特許文献９】Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ  ＬｕｃＪ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２０００，４０７，９０−９４
【０００７】
その他の方法に、サイトカインを複雑に組合せることによって幹細胞の未分化状態を維持させる方法がある。例えば、マウスＥＳ細胞は、ＬＩＦ（白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ））を培地に添加することによって、未分化性が維持される（非特許文献１０、特許文献２参照）。その他、初期作用性サイトカイントロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＦＬＴ−３リガンド、および幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で、未分化性を維持させることが胚性幹細胞、体性幹細胞などで報告されている（特許文献３、非特許文献１１参照）。
【非特許文献１０】Ｓｍｉｔｈ  Ａ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１２１，１−９
【特許文献２】特表２００２−５２５０４２号公報
【特許文献３】特許登録３５７３３５４号
【非特許文献１１】Ｍａｄｌａｍｂａｙａｎ  Ｇ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２００１，１０，４８１−４９２
【０００８】
しかし、サイトカインは、高価であり、採取原料や保存性などの問題があり容易な使用は難しい。加えて、ＬＩＦの効果は極めて特定の細胞系統に限定的であり、特に霊長類のＥＳ細胞や体性幹細胞においては、ＬＩＦの添加のみでは未分化状態を維持することができないことが明らかにされている（非特許文献７参照）。
【０００９】
現在、報告されている幹細胞の未分化状態の維持方法はいずれも、煩雑な操作を必要としたり、未分化状態の維持効果が低いことから、幹細胞を再生医療に利用する際には、未分化状態を維持したまま移植に足りうる数まで増殖させ、かつ目的組織へ移植した場合に、生着率の高い幹細胞が求められていた。つまり、安全かつ簡便で効率的に、幹細胞の未分化状態を維持させたまま増殖させ、生着率の高い幹細胞及びそれに関する技術と物質が求められていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
かかる状況に鑑み、本発明は、上記のような従来技術における問題点を解決し、哺乳動物の幹細胞の未分化状態を維持させたまま、効率よく増殖させ、さらに生着率の高い幹細胞及びその製造方法などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題の解決に向けて鋭意検討を行った結果、マンネンタケ属に属するキノコの抽出物を含有する培地を用いて培養することで、優れた幹細胞の未分化維持効果と増殖促進効果を見出し、さらに、該幹細胞を移植した際に、生体への生着率が極めて向上することを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち本発明は、以下のとおりである。
【００１３】
マンネンタケ属に属するキノコの抽出物を含有する培地を用いて培養することを特徴とする幹細胞。
【００１４】
マンネンタケ属に属するキノコの抽出物を含有する培地を用いて培養することで未分化状態を維持させることを特徴とする幹細胞。
【００１５】
マンネンタケ属に属するキノコが黒霊芝、赤霊芝およびマゴジャクシからなる群より選ばれた一種以上であることを特徴とする幹細胞。
【００１６】
幹細胞が哺乳動物由来であることを特徴とする幹細胞。
【００１７】
マンネンタケ属に属するキノコの抽出物を含有する培地により培養することを特徴とする幹細胞の製造方法。
【００１８】
マンネンタケ属に属するキノコの抽出物を含有することを特徴とする幹細胞の未分化状態の維持剤。
【００１９】
マンネンタケ属に属するキノコの抽出物（以降、マンネンタケの溶媒抽出物と記す）を含有することを特徴とする幹細胞の未分化状態の維持方法。
【００２０】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２１】
本発明は、マンネンタケの溶媒抽出物を含有する培地を用いて培養することで、幹細胞の未分化状態を維持させたまま細胞増殖を促進し、さらに、移植時における幹細胞の組織への生着率の向上をもたらすことが可能な幹細胞及びその製造方法を提供する。
【００２２】
本発明に用いるマンネンタケ属に属するキノコは、マンネンタケ科（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｔａｃｅａｅ）、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）に属するキノコであり、生薬「霊芝」に用いられる担子菌である。また、その学名は、赤霊芝（赤芝、学名：Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍ）、黒霊芝（黒芝、学名：Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｕｍ）、紫霊芝（紫芝：Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  Ｓｉｎｅｓｅ）、マゴジャクシ（学名：Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  Ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）等に分類されるが、分類法はこれらのみに限定されるものではなく、中国の薬学古書である「本草綱目」や「神農本草経」には、赤霊芝（赤芝）、黒霊芝（黒芝）、紫霊芝（紫芝）、青霊芝（青芝）、黄霊芝（黄芝）及び白霊芝（白芝）が存在すると記載されている（非特許文献１２参照）。また、本発明に用いられるマンネンタケ属に属するキノコは、広く中国や日本市場等で流通しているものを用いることができるし、自生品や栽培品を用いても良い。また、菌糸体の培養物も用いることができる。これらは乾燥や粉砕したものを用いることができる。いずれの場合も、使用する部分としては、子実体、菌糸体、菌糸体培養物等から選択され、好ましくは子実体を用いるのがよい。
【非特許文献１２】Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ．，１９７９，１９（３），２６５−２７９
【００２３】
抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコールが良く、特に好ましく、水、エタノールが良い。これらの溶媒は１種でも２種以上を混合して用いても良い。また、抽出法は特に限定されないが、加熱による抽出が好ましい。さらに上記抽出溶媒に酸やアルカリを添加してｐＨ調整して用いてもよい。
【００２４】
マンネンタケの溶媒抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、稀釈、濾過等の処理及び活性炭等による脱色、脱臭処理をして用いても良い。特に、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いることが好ましい。
【００２５】
マンネンタケの溶媒抽出物を溶液の状態で用いる場合の成分含有量は特に限定されないが、乾燥物として０．００００１〜１０重量％であることが好ましく、０．０００１〜１重量％含まれる濃度で使用することが最も好ましい。０．００００１重量％未満であると本発明の効果が十分に発揮されにくい。
【００２６】
また、本発明の幹細胞やその製造方法、未分化維持剤、未分化維持方法などは、細胞培養用添加剤、研究用試薬、医療用試薬、細胞移植剤をはじめとし、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等への配合や応用が可能である。
また、マンネンタケの溶媒抽出物を直接体内に導入することも可能である。
【００２７】
本発明の幹細胞としては、本発明の目的に沿うものであれば、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）、もしくは、骨髄、血液、皮膚、脂肪、脳、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉やその他の組織に存在する、体性の幹細胞、さらには当該細胞の初代培養細胞、継代培養細胞、凍結細胞いずれであってもよい。好ましくは、骨髄、血液、皮膚、脂肪組織由来の幹細胞に対してより効果を発揮する。また、哺乳動物における、幹細胞の分化の方向性、および、分化の過程等について同等の特性を持っていれば、全ての哺乳動物に応用が可能である。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物の幹細胞に対して効果を発揮することができる。
【００２８】
本発明の幹細胞を培養する培地、または同時に用いる添加剤としては、以下のものを使用できるが、限定されるものではない。
【００２９】
具体的には、細胞の生存に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）を含む基本培地、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｄｅ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ），Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ），ＲＰＭＩ１６４０，Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ），Ｄｕｌｂｅｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｄｅ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２），Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ），ハンクス液（Ｈａｎｋ‘ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に、増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）の少なくともいずれか１種を添加した培地が用いられ、好ましくは、これら増殖因子の全てが含有されたものである。また、必要に応じて、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント、抗生物質が含有されてもよい。
【００３０】
また、上記以外には、１〜２０％の含有率で血清が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。
【００３１】
市販品としては、インビトロジェン製の間葉系幹細胞基礎培地や、三光純薬製の間葉系幹細胞基礎培地、ＴＯＹＯＢＯ社製のＭＦ培地、Ｓｉｇｍａ社製のハンクス液（Ｈａｎｋ‘ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などを用いることができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明のマンネンタケの溶媒抽出物を含有する培地を用いて培養した幹細胞は、極めて高い未分化状態を維持した。さらに、この未分化状態を維持させたまま幹細胞の増殖を促進させ、生体へ移植した場合、組織への生着率が著しく向上した。以上より、本発明は、組織の再生治療、再生美容に役立つものであり、組織の再生の分野において大きく貢献できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、次に本発明を詳細に説明するため、具体的且つ詳細な実施例を挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００３４】
次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いるマンネンタケの溶媒抽出物の製造例および幹細胞の未分化状態の維持効果を示す実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
以下に、マンネンタケとして、黒霊芝、赤霊芝、マゴジャクシを用いた溶媒抽出物の製造例を示す。
【００３６】
製造例１  黒霊芝の熱水抽出物の調製
黒霊芝の乾燥物２０ｇに精製水４００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して黒霊芝の熱水抽出物を１．４ｇ得た。
【００３７】
製造例２  黒霊芝のエタノール抽出物の調製
黒霊芝の乾燥物１００ｇに９００ｍＬのエタノールを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、黒霊芝のエタノール抽出物を１．５ｇ得た。
【００３８】
製造例３  赤霊芝の熱水抽出物の調製
赤霊芝の乾燥物２０ｇに精製水４００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して赤霊芝の熱水抽出物を２．０ｇ得た。
【００３９】
製造例４  赤霊芝のエタノール抽出物の調製
赤霊芝の乾燥物１００ｇに９００ｍＬのエタノールを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、赤霊芝のエタノール抽出物を２．５ｇ得た。
【００４０】
製造例５  マゴジャクシの熱水抽出物の調製
マゴジャクシの乾燥物１００ｇに精製水２Ｌを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してマゴジャクの熱水抽出物を５．４ｇ得た。
【００４１】
製造例６  マゴジャクシのエタノール抽出物の調製
マゴジャクシの乾燥物１００ｇに９００ｍＬのエタノールを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、マゴジャクシのエタノール抽出物を２．０ｇ得た。
【実施例２】
【００４２】
以下に、実施例１で示した製造例１〜６のマンネンタケの溶媒抽出物を用いた、幹細胞の未分化状態の維持剤（未分化状態維持効果、細胞増殖促進効果）の実験例とその結果を示す。
【００４３】
実験例１  幹細胞に対する未分化状態維持効果の評価
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｄｅ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ培養液（Ｇｉｂｃｏ社製）に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１５％、Ｓｉｇｍａ社製）、ヌクレオシド液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、非必須アミノ酸液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、β２−メルカプトエタノール液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、Ｌ−グルタミン液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）を加えて調製した培地を用いて、マウス胚性幹細胞（マウスＥＳ細胞：コスモバイオ社製）を、６ｃｍディッシュに１ｘ１０５個播種し、各抽出物（製造例１〜６）を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、血球計数板にて細胞数をカウントした後、ＣｅｌＬｙｔｉｃ（Ｓｉｇｍａ社製）にてタンパク質を抽出し、未分化状態の測定を豊岡らの報告に従って行った（文献：豊岡  やよい，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｒ臨時増刊号  再生医学，２００３，１０６−１１５）。すなわち、幹細胞の未分化状態を示しているオクタマーバインディングプロテイン３／４タンパク質（Ｏｃｔ３／４タンパク質）の発現量を指標に、培養開始時に播種した幹細胞（１ｘ１０５個）が発現していたＯｃｔ３／４タンパク質の量を１００％未分化状態とし、各各抽出物（製造例１〜６）を添加して３日間培養した後のＯｃｔ３／４タンパク質の量をウエスタンブロッティング法にて定量解析し、培養開始時と３日間培養後のＯｃｔ３／４タンパク質の量を比較することで、未分化状態の維持効果について評価した。
この評価の時に、培養開始時の単一細胞数（１ｘ１０５個）に発現しているＯｃｔ３／４タンパク質量を１００％未分化状態とし、各抽出物添加時の未分化状態の（％未分化状態）を算出し、未分化状態維持効果の評価を行った。
【００４４】
これらの試験結果を表１に示した。その結果、マンネンタケの溶媒抽出物（製造例１〜６）全てに、顕著な幹細胞の未分化状態維持効果が認められた。以上より、マンネンタケの溶媒抽出物の極めて優れた幹細胞の未分化状態維持効果を明らかにした。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、体性の幹細胞についても同様な試験を行ったところ、顕著な幹細胞の細胞増殖促進効果が認められた。
【００４５】
【表１】
2008301726.tif 000002
【００４６】
実験例２  幹細胞に対する細胞増殖促進効果の評価
ヒト幹細胞培養液（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ヒト体性幹細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を６ｃｍディッシュに１ｘ１０５個播種し、各マンネンタケの溶媒抽出物（製造例１〜６）を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、それぞれの細胞数をカウントした。
抽出物未添加時の総細胞数をコントロールとし、コントロールを１００（％）とした場合の、各抽出物添加時の細胞数の増減（％）を算出し、幹細胞の細胞増殖促進効果の評価を行った。
【００４７】
これらの試験結果を表２に示した。その結果、マンネンタケの溶媒抽出物（製造例１〜６）全てに、顕著な幹細胞の細胞増殖促進効果が認められた。以上より、マンネンタケの溶媒抽出物の極めて優れた幹細胞の細胞増殖促進効果を明らかにした。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）についても同様な試験を行ったところ、顕著な幹細胞の細胞増殖促進効果が認められた。
【００４８】
【表２】
2008301726.tif 000003
【実施例３】
【００４９】
本発明によるマンネンタケの溶媒抽出物を添加して培養した幹細胞を用いて、実際に移植を行い、移植後のそれぞれの生着率（％）を比較した。
【００５０】
実験例３  移植用の幹細胞の調製
ヒト体性幹細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を６ｃｍディッシュに１ｘ１０６個播種し、各抽出物（製造例１〜６）を最終濃度が０．０１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に、それぞれの細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、無菌的にラバーポリスマンにて回収し、遠沈後、５％ＦＢＳ添加ハンクス液（Ｈａｎｋ‘ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に分散し、移植用の幹細胞として用いた。その後、以下の方法にて、皮膚移植を行い、生着率（％）について測定した。
【００５１】
実験例４  幹細胞の移植および生着率（％）の測定
実験例３で調整した幹細胞１ｘ１０６個を、ヌードマウス（雄性、４週齢）の皮下に移植した。具体的には、移植する１ｘ１０６個の細胞を、予めＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ（モレキュラープローブ社製）にて蛍光標識し、その時点の蛍光強度を測定し、移植細胞の総数（１００％）とした。移植部位をマジックにてマーキングし、移植３日後、７日後に移植部位を摘出し、酵素処理により細胞を分散させ、得られた細胞の蛍光強度を測定し、移植時の蛍光強度（１００％）と比較することで、生着率（％）を算出した。
【００５２】
これらの試験結果を表３に示した。その結果、移植３日後、７日後ともに、マンネンタケの溶媒抽出物（製造例１〜６）を用いる場合全てにおいて極めて高い生着率を示した。
【００５３】
【表３】
2008301726.tif 000004
【００５４】
以上の結果より、マンネンタケの溶媒抽出物は、幹細胞移植における生着率を優位に向上させることを確認した。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）についても同様な試験を行ったところ、顕著な幹細胞移植における生着率の向上効果が認められた。
【００５５】
本発明のマンネンタケの溶媒抽出物を幹細胞に用いることで、従来の技術に比べて、未分化状態を維持させたまま幹細胞の増殖を促進させ、さらに、移植した場合には、生着率の極めて高い幹細胞を簡便に調製することが可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の活用例として、再生医療、再生美容への応用が期待される。例えば、本発明を利用することで、再生医療、再生美容に用いる生着率の高い未分化状態の幹細胞を簡便に効率よく調製することが可能となる。また、幹細胞を移植後または組織に存在する幹細胞に対して、本発明のマンネンタケの溶媒抽出物を直接的に注入または経口投与、塗布、貼付などにより導入させることで幹細胞の未分化状態を維持させたまま増殖させることが可能である。
すなわち、本発明は、再生医療、再生美容における、幹細胞の調製方法及び／又は、幹細胞の未分化状態の維持剤として利用が可能である。