(57)【要約】【課題】アディポネクチン受容体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能を解明するための手段の開発。【解決手段】アディポネクチン受容体１及び／又はアディポネクチン受容体２の機能が欠失した非ヒト動物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アディポネクチン受容体１及び／又はアディポネクチン受容体２の機能が欠失した非ヒト動物。
【請求項２】
アディポネクチン受容体１及び／又はアディポネクチン受容体２の機能が、時期特異的及び／又は部位特異的に欠失した非ヒト動物。
【請求項３】
非ヒト動物がマウスである請求項１又は２記載の動物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の非ヒト動物由来の、アディポネクチン受容体１及び／又はアディポネクチン受容体２の機能が欠失した細胞。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の非ヒト動物よりなるメタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、インスリン分泌不全、糖尿病、動脈硬化症、ミトコンドリア機能低下、酸化ストレス又は高血圧症のモデル動物。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の非ヒト動物に被検物質を投与することを特徴とするアディポネクチン受容体１及び／又はアディポネクチン受容体２作動薬、ＡＭＰキナーゼ活性化薬、ＰＰＡＲα活性化薬、インスリン分泌促進薬、グルコキナーゼ作動性糖取り込み促進薬、抗炎症薬、抗酸化ストレス薬、ミトコンドリア機能改善、高血圧症治療薬又はメタボリックシンドローム治療薬のスクリーニング法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項記載の非ヒト動物に被検食品を投与することを特徴とするメタボリックシンドローム、肥満、糖尿病、動脈硬化、ミトコンドリア機能低下、酸化ストレス又は高血圧症に有効な機能性食品の評価法。
【請求項８】
被検物質の存在下に請求項４記載の細胞を培養することを特徴とする、アディポネクチン受容体１及び／又はアディポネクチン受容体２作動薬、ＡＭＰキナーゼ活性化薬、ＰＰＡＲα活性化薬、インスリン分泌促進薬、グルコキナーゼ作動性糖取り込み促進薬、抗炎症薬、抗酸化ストレス薬、メタボリックシンドローム治療薬、ミトコンドリア機能改善薬又は高血圧症治療薬のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタボリックシンドロームに代表される種々の疾患のモデル動物として有用なアディポネクチン受容体遺伝子欠損非ヒト動物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アディポネクチン又はＡｃｒｐ３０（非特許文献１）は、アディポサイト由来のホルモンであり、様々な生理機能を有している。肥満、２型糖尿病、冠動脈性心疾患は、アディポネクチンの血漿レベルの減少と関連しており、アディポネクチンはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて抗アテローム発生性を示すことが報告されている（非特許文献２、３）。また、Ａｃｒｐ３０の循環レベルの急増は、肝臓におけるグルコース産生を低下させることが報告されている（非特許文献４、５）。また、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｃｒｐ３０は、筋肉における脂肪酸酸化を亢進させ、マウスにおける体重減少を引き起こすことが報告されている（非特許文献６）。また、脂肪組織萎縮性マウス又は肥満マウスにおけるインスリン抵抗性が、ｇｌｏｂｕｌａｒドメインのみからなるアディポネクチン（ｇｌｏｂｕｌａｒ  ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ；ｇＡｄ）で処理することにより、筋肉における脂肪酸酸化の亢進を介して改善したこと、及び全長アディポネクチンで処理することにより程度はｇＡｄよりも低いが改善したことが報告されている（非特許文献７）。さらに最近になって、骨格筋において、アディポネクチンがＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ）を急性的に活性化し、その結果、脂肪酸酸化及びグルコース取り込みが亢進されることが報告されているとともに（非特許文献８）、アディポネクチンがＰＰＡＲαを慢性的に活性化し、その結果、脂肪酸酸化が亢進されるが筋肉における組織ＴＧ含量は減少すること、そしてこれらの効果は全長アディポネクチンよりもｇＡｄの方が大きいことが報告されている（非特許文献９）。また、興味深いことに、肝臓においては、全長アディポネクチンのみがＡＭＰＫを急性的に活性化し、その結果、糖新生に関連する分子を減少させるとともに脂肪酸酸化を亢進させる一方、全長アディポネクチンのみがＡＭＰＫを慢性的に活性化し、その結果、脂肪酸酸化を亢進させるとともに肝臓における組織ＴＧ量を減少させる。そして、これらの変化はいずれもｉｎ  ｖｉｖｏにおけるインスリン感受性を増加させる（非特許文献１０、１１）。
【０００３】
さらにこれらのアディポネクチンの作用は、細胞膜表面のアディポネクチン受容体を介していると考えられ、最近アディポネクチン受容体が明らかにされた。アディポネクチン受容体には、アディポネクチン受容体１（ＡｄｉｐｏＲ１）とアディポネクチン受容体２（ＡｄｉｐｏＲ２）とがあることが報告されている（特許文献１）。
【非特許文献１】Ｈｕ，Ｅ．，Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１０６９７−１０７０３．（１９９６）
【非特許文献２】Ｏｕｃｈｉ，Ｎ．ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３，１０５７−１０６３．（２００１）
【非特許文献３】Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．ら，Ｂｌｏｏｄ  ９６，１７２３−１７３２．（２０００）
【非特許文献４】Ｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，９４７−９５３．（２００１）
【非特許文献５】Ｃｏｍｂｓ，Ｔ．Ｐ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８，１８７５−１８８１．（２００１）
【非特許文献６】Ｆｒｕｅｂｉｓ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８，２００５−２０１０．（２００１）
【非特許文献７】Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，９４１−９４６．（２００１）
【非特許文献８】Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２８８−１２９５．（２００２）
【非特許文献９】Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２４６１−２４６８（２００２）
【非特許文献１０】Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２８８−１２９５．（２００２）
【非特許文献１１】Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２４６１−２４６８（２００２）
【特許文献１】ＷＯ２００４／０６１１０８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２がそれぞれｉｎ  ｖｉｖｏにおいてどのように作用しているのか、また実際の機能性については不明である。
従って、本発明は、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２のｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能を解明するための手段及びその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、種々検討した結果、ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損動物、ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物の作成に成功し、これらの動物由来の培養細胞の樹立にも成功した。さらにこれらの遺伝子欠損動物を解折した結果、ＡｄｉｐｏＲ１は、アディポネクチンによるＡＭＰキナーゼ活性化に必須であり、インスリン分泌に重要な役割を果たすことが明らかとなった。一方、ＡｄｉｐｏＲ２は、アディポネクチンによるＰＰＡＲα活性化に必須であり、抗炎症、抗酸化ストレス作用、グルコキナーゼ発現誘導、ミトコンドリア機能、血圧に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。従って、これらの遺伝子欠損動物がメタボリックシンドローム等のモデル動物として有用でありこれらを使い分けることによって、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２が関与する疾患の治療薬及び機能性食品のスクリーニングが可能となることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、アディポネクチン受容体１及び／又はアディポネクチン受容体２の機能が欠失した非ヒト動物を提供するものである。
また、本発明は、上記非ヒト動物由来の、アディポネクチン受容体１及び／又はアディポネクチン受容体２の機能が欠失した細胞を提供するものである。
さらに、本発明は、上記非ヒト動物よりなるメタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、インスリン分泌不全、糖尿病、動脈硬化症、ミトコンドリア機能低下、酸化ストレス又は高血圧症のモデル動物を提供するものである。
さらに本発明は、上記非ヒト動物に被検物質を投与することを特徴とするアディポネクチン受容体１及び／又はアディポネクチン受容体２作動薬、ＡＭＰキナーゼ活性化薬、ＰＰＡＲα活性化薬、インスリン分泌促進薬、グルコキナーゼ作動性糖取り込み促進薬、インスリン分泌促進薬、抗炎症薬、抗酸化ストレス薬、ミトコンドリア機能改善薬、高血圧治療薬、又はメタボリックシンドローム治療薬のスクリーニング法を提供するものである。
さらに本発明は、上記非ヒト動物に被検食品を投与することを特徴とするメタボリックシンドローム、肥満、糖尿病、動脈硬化、ミトコンドリア機能低下、酸化ストレス、高血圧症に有効な機能性食品の評価法を提供するものである。
さらに、本発明は、被検物質の存在下に、前記細胞を培養することを特徴とする、アディポネクチン受容体１及び／又はアディポネクチン受容体２作動薬、ＡＭＰキナーゼ活性化薬、ＰＰＡＲα活性化薬、インスリン分泌促進薬、グルコキナーゼ作動性糖取り込み促進薬、抗炎症薬、抗酸化ストレス薬、メタボリックシンドローム治療薬、ミトコンドリア機能改善薬又は高血圧症治療薬のスクリーニング法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の遺伝子欠損非ヒト動物はＡＭＰキナーゼ、ＰＰＡＲα、インスリン分泌、グルコキナーゼ、炎症、酸化ストレス、ミトコンドリア機能、血圧に異常をきたすモデル動物として、また、インスリン抵抗性、糖尿病やメタボリックシンドローム、動脈硬化、癌のモデル動物として、医学研究のツールとして有用である。また本発明の遺伝子欠損非ヒト動物を用いることによって、肥満、糖尿病、動脈硬化等のアディポネクチンの低下に起因する疾病の予防・治療薬となりうるアディポネクチン受容体作動薬のスクリーニングが可能になる。また、アディポネクチン受容体に作用し、肥満、糖尿病、動脈硬化、高血圧等のメタボリックシンドローム関連疾病を予防する機能性食品の評価に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２の機能が欠失した非ヒト動物又は細胞は、ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の発現が人為的に抑制されたものである。ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２遺伝子は、本発明者により既にクローニングされ特許文献１に記載されている。配列番号１及び２にマウスＡｄｉｐｏＲ１のアミノ酸配列及び塩基配列を示す。配列番号３に、ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子を含むマウスのゲノム配列を示す。配列番号３の塩基配列中の塩基番号２００１〜２１０６はエクソン１を、９４４２〜９６７６はエクソン２を、１０４７９〜１０５９５はエクソン３を、１１２７２〜１１４４３はエクソン４を、１２４２９〜１２６１６はエクソン５を、１４６０３〜１４７９０はエクソン６を、１８０５１〜１８８５６はエクソン８を示す。配列番号４及び５にマウスＡｄｉｐｏＲ２のアミノ酸配列及び塩基配列を示す。配列番号６にＡｄｉｐｏＲ２遺伝子を含むマウスのゲノム配列を示す。配列番号６の塩基配列中の塩基番号１００１〜１０６４はエクソン１を、４８０７６〜４８３３４はエクソン２を、５３１０４〜５３２３３はエクソン３を、５８９４７〜５９１３３はエクソン４を、５９３７５〜５９５６２はエクソン６を、６１０７５〜６１２６８はエクソン７を、６２５５６〜６５３３２はエクソン８を示す。
【０００９】
本発明において、ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損の対象となる非ヒト動物としては、ヒト以外であればよいが、動物モデルとして用いる点から、マウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類、特にマウスが好ましい。
【００１０】
本発明において、「ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２の機能が欠失した」とは、染色体上のＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子が破壊され、その機能が正常に発現しなくなったことを意味する。従って、ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子産物が全く発現されない場合だけでなく、遺伝子産物が発現されても、正常な機能を有しない場合も含む。ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の破壊は、ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子、又はその発現制御領域（転写調節領域及びプロモータ領域を含む）上の部分配列の欠失、置換又は挿入などにより行なわれる。
【００１１】
本発明の非ヒト動物には、ＡｄｉｐｏＲ１の機能が欠失した非ヒト動物、ＡｄｉｐｏＲ２の機能が欠失した非ヒト動物、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の機能が欠失した非ヒト動物、ＡｄｉｐｏＲ１の機能が時期特異的及び／又は部位特異的に欠失した非ヒト動物、ＡｄｉｐｏＲ２の機能が時期特異的及び／又は部位特異的に欠失した非ヒト動物、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の機能が時期特異的及び／又は部位特異的に欠失した非ヒト動物が含まれる。
【００１２】
ここで、「ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２の機能が時期特異的及び／又は部位特異的に欠失した」とは、これらの遺伝子機能の欠失が、動物のある特定の成長時期に生じるように制御された場合；及びこれらの遺伝子欠損が動物の部位特異的に生じるように制御された場合をいう。
ここで遺伝子機能の欠失時期特異的に制御する例としては、任意の各発生・成長段階や、検討したい化合物の動物投与の前後など、が挙げられ、いつでも自由自在である。このような制御は、例えば、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ法をもとにして、キメラＣｒｅ組換え酵素（ＣｒｅＥＲＴ）を発現させ、その遺伝子組換え活性を薬剤投与により時間的にコントロールすることによってなされる。その結果ＬｏｘＰを導入した遺伝子は時間特異的に組換えをおこすことによって行なわれる。
【００１３】
また遺伝子機能の欠失を部位特異的に制御する例としては、肝臓、骨格筋、脂肪細胞、膵ベータ細胞、血管、心臓、中枢、それぞれの神経ニューロンなどが挙げられる。このような制御は、例えば、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ法をもとにして、Ｃｒｅ酵素をそれぞれの細胞・組織特異的に発現させ、その遺伝子組換え活性を部位特異的にコントロールする。その結果ＬｏｘＰを導入した遺伝子は細胞・組織特異的に組換えをおこすことによって行なわれる。
【００１４】
本発明のＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子機能が欠失した非ヒト動物は、例えば、ジーンターゲティング、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム、体細胞クローン技術などにより作成することができる。以下、ジーンターゲティング法について説明する。１）ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子又はその発現制御領域上における、少なくとも一部の配列の欠失置換及び／又は他の配列の挿入を目的としたターゲティングベクターを構築する。２）得られたベクターをＥＳ細胞に導入し、該ベクターで相同組換えされたＥＳ細胞を得る。３）得られた組換えＥＳ細胞を初期胚に導入し、発生させてキメラ動物を得る。４）得られたキメラ動物を野生型動物と交配すれば、本発明のＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子機能が欠失した動物が得られる。
【００１５】
まず、ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子を欠損させるためのターゲティングベクターを構築する。ターゲッティングベクターの構築に先立って、使用する動物のゲノムＤＮＡライブラリーを調製する。そのようなライブラリーとしては市販のもの（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製  １２９Ｓｖ／Ｊゲノムライブラリー等）を用いてもよい。ゲノムライブラリーは、標的とするＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２  ｃＤＮＡまたはその部分配列をプローブとしてスクリーニングを行い、ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２ゲノムＤＮＡをクローニングする。
【００１６】
クローニングされたゲノムＤＮＡはシークエンシング、サザンブロッティング、制限酵素消化等を行うことにより、各エクソンの位置を明示した制限酵素地図を作成し、変異導入部位等を決定する。また、ターゲティングベクターに使用する相同領域の外側には相同組換え体をスクリーニングするためのプローブ（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｐｒｏｂｅ）を設定する。
【００１７】
本発明において、染色体上に導入する変異はＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の機能を欠失できる限り特に限定されない。例えば、欠失または置換される配列は、ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子のイントロン領域であってもエクソン領域であっても、あるいはＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の発現制御領域であってもよい。特に、ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子のエクソン領域の相当部分を欠失、置換させるような変異であれば、確実にＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の機能を欠損させることができる。また、挿入される他の配列も特に限定されないが、以下のような各マーカー遺伝子配列が好適に用いられる。
【００１８】
ターゲティングベクターは、変異導入部位の３’および５’側の相同領域とともに、組み換え体を選択するための適当な選択マーカーを含む。該マーカーとしては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｐＧＫｎｅｏ、ｐＭＣ１ｎｅｏ等）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子等のポジティブセレクションマーカー、ＬａｃＺやβラクタマーゼ遺伝子等の破壊対象遺伝子の発現レポーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴ−Ａ）等のネガティブセレクションマーカー等が挙げられるが、これらに限定されない。また、ベクターは相同領域の外側に、ベクターを直鎖化するための適当な制限酵素切断部位を含む。
かかるターゲティングベクターの構築は、市販のプラスミドベクターを利用して行うことができる。
【００１９】
図１にマウスＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損用のターゲティングベクターの一例を示す。このコンストラクトは、マウスＡｄｉｐｏＲ１遺伝子を欠損のため、ＡｄｉｐｏＲ１をコードしているエクソン２、３、４をｎｅｏ耐性遺伝子に置き換えたターゲティングベクターを作成した。
【００２０】
図２に、マウスＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損用のターゲティングベクターの一例を示す。このコンストラクトは、マウスＡｄｉｐｏＲ２遺伝子を欠損のため、ＡｄｉｐｏＲ２をコードしているエクソン３をｎｅｏ耐性遺伝子に置き換えたターゲティングベクターを作成した。
【００２１】
マウスＡｄｉｐｏＲ１−ＡｄｉｐｏＲ２ダブル遺伝子欠損マウスはＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損マウスとＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損マウスの交配によって得られる。
【００２２】
次に、構築されたターゲティングベクターを胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の全能性を有する細胞に導入する。ＥＳ細胞は、マウス、ハムスター、ブタ等では細胞株が樹立されており、特にマウスでは、１２９系マウス由来のＫ１４株、Ｅ１４株、Ｄ３株、ＡＢ−１株、Ｊ１株や、Ｒ１株、ＴＴ２株等、複数の細胞株が入手可能である。また、マウスではＥＳ細胞に代えて胚性ガン腫細胞（ＥＣ細胞）を利用することもできる。
【００２３】
ＥＳ細胞は、ターゲティングベクターの導入に先立って、適当な培地で培養しておく。例えば、マウスＥＳ細胞であれば、マウス繊維芽細胞等をフィーダー細胞として、これにＥＳ細胞用の液体培地（例えば、ＧＩＢＣＯ製）を加えて共培養する。
【００２４】
ＥＳ細胞へのターゲティングベクターの導入は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法等、公知の遺伝子導入法により実施することができる。ターゲティングベクターが導入されたＥＳ細胞は、ベクター中に挿入されたマーカーにより容易に選択することができる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして導入した細胞であれば、Ｇ４１８を加えたＥＳ細胞用培地で培養することにより、一次セレクションを行うことができる。
【００２５】
ターゲティングベクターが導入されたＥＳ細胞では、相同組換えによって、染色体上のＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の一部が該ベクターで置換され、内因性のＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子が破壊される。所望の相同組換えがなされたか否かは、サザンブロティングやＰＣＲ法等を利用したジェノタイプ解析によって判定できる。サザンブロッティングによるジェノタイプ解析は、変異導入部位の外側に設定したプローブ（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｐｒｏｂｅ）を用いて行うことができる。ＰＣＲ法によるジェノタイプ解析は、それぞれ野性型と変異型ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の特異的増幅産物を検出することにより実施できる。
【００２６】
ターゲティングベクターが導入されたＥＳ細胞（組換えＥＳ細胞）は、ＥＳ細胞が由来する系統とはコートカラーが明らかな相違を有する別な系統由来の初期胚に導入し、キメラ動物として発生させる。例えば、マウスであれば、アグーチ色の毛色を有する１２９系由来のＥＳ細胞に対しては、黒色の毛色を有し、マーカーとして利用できる各種遺伝子座が１２９系マウスとは異なっているＣ５７ＢＬ／６マウス等の初期胚を用いることが望ましい。これにより、キメラマウスはその毛色によって、キメラ率を判断することができる。
【００２７】
ＥＳ細胞の初期胚への導入は、マイクロインジェクション法（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）や、アグリゲーション法（Ａｎｄｒａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，８４２４−８４２８，１９９３，Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ａ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，４５８２−４５８５，１９９３）等により行うことができる。
【００２８】
マイクロインジェクション法は、ＥＳ細胞を８細胞期胚〜胚盤胞（ブラストシスト）に直接注入する方法である。すなわち、動物より採取した胚に、マイクロマニピュレーター等を用いて組換えＥＳ細胞を顕微鏡下で直接注入してキメラ胚を作製する。このキメラ胚を、仮親（偽妊娠動物）の子宮に移植し、発生させれば、所望のキメラ動物を得ることができる。
【００２９】
一方、アグリゲーション法では、透明帯を除去した１〜２個の８細胞期胚とＥＳ細胞を共培養し、凝集させてキメラ胚を得る。このキメラ胚を、仮親（偽妊娠動物）の子宮に移植し、発生させれば、キメラ動物を得ることができる。
【００３０】
仮親から得られたキメラ動物は、さらに同系の野性型動物と交配する。得られる動物の約半分は、ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠失染色体をヘテロで有するはずである。各個体のジェノタイプは、毛色等の外見上の特徴で一時判定できるほか、前述したサザンブロッティングやＰＣＲ法を利用したジェノタイプ解析によって決定することができる。こうして、ヘテロ型のＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物が同定されたら、このヘテロ型のＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物同士を交配して、ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の欠損をホモで有する動物を得ることができる。
【００３１】
上記のようにして作製されたＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物の子孫も、染色体上のＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の機能が欠失している限り、本発明のＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物に含まれる。
【００３２】
一方、前記の時期特異的及び／又は部位特異的遺伝子欠損動物は、バクテリオファージ由来のＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用して、時期特異的、部位特異的に標的遺伝子を欠損させる方法（Ｋｕｈｎ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，１４２７−１４２９，１９９５）である。ｌｏｘＰ（ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  Ｘ−ｉｎｇ−ｏｖｅｒ）配列は３４塩基対からなるＤＮＡ配列でＣｒｅ（Ｃａｕｓｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）組換え酵素の認識配列である。遺伝子上の２つのｌｏｘＰ配列はＣｒｅ蛋白の存在下で特異的組換えを起こす。すなわち、欠損させたい標的遺伝子をｌｏｘＰで挟んだものに置換し、さらにＣｒｅ発現ベクターを組み込めば、時期特異的、部位特異的なＣｒｅ蛋白の産生により、ｌｏｘＰで挟まれた標的遺伝子を欠失させることができる。
【００３３】
例えば、前記のターゲティングベクター構築において、欠損させるＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子領域の５’側にｌｏｘＰ遺伝子を３’側にｌｏｘＰ遺伝子で挟んだマーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）を組み込んだターゲティングベクターを作製し、ＥＳ細胞に導入する。ＥＳ細胞はマーカーによる選択の後、サザンブロッティングあるいはＰＣＲ法によるジェノタイプ解析を行って相同組換えを確認する。この相同組換えＥＳ細胞に、さらにＣｒｅ蛋白を特異的プロモーターに連結したＣｒｅ発現ベクターを導入する。得られたＥＳ細胞から、ｌｏｘＰ組換えによってマーカー遺伝子のみが欠失し、ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子領域は欠失していないＥＳ細胞クローンを同定する。このＥＳ細胞を前記のようにして動物に導入し、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え動物を得る。
【００３４】
あるいは、ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子両端にｌｏｘＰ遺伝子を組み込んだターゲッティングベクターを導入したｌｏｘＰ導入組換え動物と、Ｃｒｅ発現ベクターを導入したＣｒｅ発現組換え動物を別個に作製し、両者を交配することによって、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え動物を作製してもよい。
【００３５】
図３にマウスＡｄｉｐｏＲ１コンディショナル遺伝子欠損用のターゲティングベクターの一例を示す。このコンストラクトは、Ｃｒｅ蛋白の発現に応じて、時期特異的、部位特異的にマウスＡｄｉｐｏＲ１遺伝子を欠損させるため、ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子のイントロン５に、前後をＦＬＴサイト及びｌｏｘＰサイトではさまれたｎｅｏ耐性遺伝子に置き換えたターゲティングベクターを作成し、挿入したものである。さらに、ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子のイントロン２に、ｌｏｘＰサイトを挿入している。
【００３６】
図４にマウスＡｄｉｐｏＲ２コンディショナル遺伝子欠損用のターゲティングベクターの一例を示す。このコンストラクトは、Ｃｒｅ蛋白の発現に応じて、時期特異的、部位特異的にマウスＡｄｉｐｏＲ２遺伝子を欠損させるため、ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子のイントロン７に、前後をＦＬＴサイト及びｌｏｘＰサイトではさまれたｎｅｏ耐性遺伝子に置き換えたターゲティングベクターを作成し、挿入したものである。さらに、ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子のイントロン４に、ｌｏｘＰサイトを挿入している。
【００３７】
こうして得られたＣｒｅ−ｌｏｘＰ組換え動物は、Ｃｒｅ蛋白の発現に応じて、時期特異的、部位特異的にＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子を欠損しうる。従って、特定時期、特定部位におけるＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の機能解析に極めて有用である。
【００３８】
マウスＡｄｉｐｏＲ１−ＡｄｉｐｏＲ２コンディショナルダブル遺伝子欠損マウスはＡｄｉｐｏＲ１コンディショナル遺伝子欠損マウスとＡｄｉｐｏＲ２コンディショナル遺伝子欠損マウスの交配によって得られる。
【００３９】
本発明のＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損動物、ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物及びＡｄｉｐｏＲ１−ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損動物は、それぞれ以下の特性を有する。
【００４０】
（１）ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損動物
ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損動物はＡＭＰキナーゼの経路などが異常となり、インスリン抵抗性を来たし、さらにインスリン分泌にも異常をきたし、糖尿病やメタボリックシンドローム、癌のモデル動物となる。例えば、肝臓においては、ＡＭＰキナーゼによって通常抑制されている糖新生に関わる酵素(ＰＥＰＣＫやＧ６Ｐａｓｅなど)や脂肪合成に関わる分子(ＳＲＥＢＰ１ｃやＳＣＤ１など)の発現が上昇しているのが認められた。さらに脂肪酸燃焼の活性が低下しているのが認められた。そして空腹時血糖値・インスリン値の上昇と糖負荷後の血糖値の上昇、すなわちインスリン抵抗性と耐糖能障害、メタボリックシンドロームが認められた。インスリン抵抗性の責任臓器としては、高インスリン正常血糖クランプ法により、主には肝臓であることも分かっている。さらに、単離膵島を用いた実験により、インスリン分泌にも不全があることが明らかとなっている。さらに、ＡｄｉｐｏＲ１の発現が低下すると、癌細胞の増殖が促進されることも明らかとなっている。
【００４１】
（２）ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物
ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物はＰＰＡＲαの経路などが異常となり、さらに肝臓への糖の取り込みに重要なグルコキナーゼの発現の低下、脂肪組織や肝臓での酸化ストレスの増大と慢性炎症の惹起などによりインスリン抵抗性を来たし、糖尿病やメタボリックシンドローム、癌のモデル動物となる。例えば、通常は、ＰＰＡＲαによって発現が誘導されている脂肪燃焼に関わる酵素(ＡＣＯなど)やエネルギー消費に関わる分子(ＵＣＰ２など)の発現が低下しており、実際に脂肪酸燃焼の活性も低下しているのが認められた。さらに、酸化ストレスの消去に関わる酵素（ＳＯＤ１やｃａｔａｌａｓｅなど）の発現の低下と炎症性サイトカイン（ＴＮＦαなど）やケモカイン(ＭＣＰ−１など)の発現の上昇が認められ、各々の臓器障害を惹起しているのが認められた。そしてインスリン値の上昇、すなわち全身性のインスリン抵抗性、メタボリックシンドロームが認められた。さらに、ＡｄｉｐｏＲ２の発現が低下すると、動脈硬化が促進や癌細胞の増殖が促進されることも明らかとなっている。
【００４２】
（３）ＡｄｉｐｏＲ１−ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損動物
ＡｄｉｐｏＲ１−ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損動物はＡＭＰキナーゼやＰＰＡＲαの経路などが異常となり、さらに肝臓への糖の取り込みに重要なグルコキナーゼの発現の低下、脂肪組織や肝臓での酸化ストレスの増大と慢性炎症の惹起などにより、インスリン抵抗性を来たし、さらにインスリン分泌にも異常をきたし、糖尿病やメタボリックシンドローム、動脈硬化、癌のモデル動物となる。例えば、肝臓においては、ＡＭＰキナーゼによって通常抑制されている糖新生に関わる酵素(ＰＥＰＣＫやＧ６Ｐａｓｅなど)や脂肪合成に関わる分子(ＳＲＥＢＰ１ｃやＳＣＤ１など)の発現が上昇しているのが認められた。ＰＰＡＲαによって発現が誘導されている脂肪燃焼に関わる酵素(ＡＣＯなど)やエネルギー消費に関わる分子(ＵＣＰ２など)の発現が低下しており、実際に脂肪酸燃焼の活性も低下しているのが認められた。さらに、酸化ストレスの消去に関わる酵素（ＳＯＤ１やｃａｔａｌａｓｅなど）の発現の低下と炎症性サイトカイン（ＴＮＦαなど）やケモカイン(ＭＣＰ−１など)の発現の上昇が認められ、各々の臓器障害を惹起しているのが認められた。そして空腹時血糖値・インスリン値の上昇と糖負荷後の血糖値の上昇、すなわち全身のインスリン抵抗性と耐糖能障害、メタボリックシンドロームが認められた。インスリン抵抗性の責任臓器としては、高インスリン正常血糖クランプ法により、主には肝臓であることも分かっている。さらに、単離膵島を用いた実験により、インスリン分泌にも不全があることが明らかとなっている。さらに、ＡｄｉｐｏＲ１・ＡｄｉｐｏＲ２の発現が低下すると、動脈硬化の促進や癌細胞の増殖が促進されることも明らかとなっている。
【００４３】
ＡｄｉｐｏＲ１・Ｒ２ダブル欠損マウスの骨格筋では、筋細胞でのミトコンドリアの多いｔｙｐｅ  １  ｆｉｂｅｒへの分化促進因子であるmyocyte enhancer factor 2（ＭＥＦ２）の発現は有意に低下しており、ＭＥＦ２を転写促進因子とするＰＰＡＲγ  co-activator  １α（ＰＧＣ−１α）の発現も有意に低下していた。ＰＧＣ−１αは骨格筋においてミトコンドリア生合成及び機能を調節している可能性のある因子の一つとして注目されていが、ミトコンドリア電子伝達に関わる酵素Cytochrome  Ｃ（CytC）の有意な発現低下も認められた。また、ＡＭＰＫの下流で酸化ストレスの消去に関わるsuper oxide dismutase 2（ＳＯＤ２）も低下していた。
以上よりアディポネクチン／ＡｄｉｐｏＲ経路が骨格筋においてＭＥＦ２、ＰＧＣ−１αを介し、ミトコンドリア機能調節を行っている可能性が示唆された。また、酸化ストレスの消去に関わるＳＯＤ２の低下が認められたことより、アディポネクチンのＡＭＰＫ、ＰＧＣ−１αを介した、酸化ストレス消去作用が存在する可能性が示唆された。
【００４４】
脂肪細胞の肥大化に伴う、脂肪細胞の機能低下のメカニズムの一つとして、肥大化に伴う脂肪細胞の低酸素が考えられている。ＡｄｉｐｏＲ１・Ｒ２ダブル欠損マウスのＷＡＴでは線溶系を抑制するＰＡＩ−１の発現が有意に上昇しており、更に、細胞内の低酸素状態を示す、ＨＩＦ１αの発現が有意に上昇していた。
【００４５】
ＡｄｉｐｏＲ２及びＡｄｉｐｏＲ１・Ｒ２欠損マウスの収縮期血圧は有意に上昇していた。
【００４６】
また、ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の時期特異的又は部位特異的欠損動物は、前記のそれぞれの特性が、時期特異的、部位特異的に発現する。
【００４７】
従って、本発明のＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物は、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、インスリン分泌不全、糖尿病、動脈硬化症、癌、ミトコンドリア機能、酸化ストレス、高血圧症のモデル動物として有用である。このうち、ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損動物は、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、インスリン分泌不全、糖尿病、癌のモデル動物として特に有用である。一方、ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物は、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、糖尿病、動脈硬化症、癌、高血圧症のモデル動物として特に有用である。また、ＡｄｉｐｏＲ１−ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損動物は、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、インスリン分泌不全、糖尿病、動脈硬化症、癌、ミトコンドリア機能低下、酸化ストレス、高血圧症のモデル動物として有用である。
【００４８】
本発明者は、さらに本発明のＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物由来の細胞の培養細胞の樹立に成功した。かかる細胞の培養は、例えば、肝臓細胞の場合、１０％ウシ胎仔血清、１０ｎＭデキサメタゾン、１ｎＭインスリン、１００Ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むウィリアム培地Ｅ上で、５％ＣＯ2存在下３７℃で行うことができる。
【００４９】
本発明のＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物及び細胞は、アディポネクチンが関与する種々の疾患の治療薬又は機能性食品のスクリーニングに利用することができる。特に、本発明のＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損動物、ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物及びＡｄｉｐｏＲ１−ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損動物の２種又は３種、あるいはこれらの動物由来の細胞の２種又は３種を組み合せて用いれば、前記治療薬や機能性食品のスクリーニングに有用である。
【００５０】
本発明のＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損動物に被検物質を投与して該動物の各種マーカーの変化を測定するから、あるいは被検物質の存在下に当該動物由来の細胞を培養して該細胞の各種マーカーの変化を測定すれば、被検薬物がアディポネクチンが関与する疾患の治療薬又は機能性食品となり得るか否かをスクリーニングできる。
アディポネクチンが関与する疾患の治療薬としては、ＡｄｉｐｏＲ１−ＡｄｉｐｏＲ２作動薬、ＡＭＰキナーゼ活性化薬、ＰＰＡＲα活性化薬、インスリン分泌促進薬、グルコキナーゼ作動性糖取り込み促進薬・インスリン分泌促進薬、抗炎症薬、抗酸化ストレス薬、メタボリックシンドローム治療薬（肥満治療薬、糖尿病治療薬、動脈硬化治療薬等）ミトコンドリア機能改善薬、高血圧治療薬が挙げられる。また機能性食品としては、メタボリックシンドローム、肥満、糖尿病、動脈硬化、ミトコンドリア機能改善、酸化ストレス、高血圧症に有効な機能性食品が挙げられる。
【００５１】
ここで、動物及び細胞の各種マーカーの変化の測定は、公知の手段で行えばよい。
【実施例】
【００５２】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１  アディポネクチン受容体遺伝子欠損マウスの作製
ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子（配列番号１）及びＡｄｉｐｏＲ２遺伝子（配列番号４）を含むクローンをクローニングし、ＡｄｉｐｏＲ１をコードしているエクソン２、３、４をｎｅｏ耐性遺伝子に置き換えたターゲティングベクター（図１）、及びＡｄｉｐｏＲ２をコードしているエクソン３をｎｅｏ耐性遺伝子に置き換えたターゲティングベクター（図２）を構築し、それぞれＪ１ＥＳ細胞（１２９／Ｓｖ）にエレクトロポレーション法により導入してトランスフェクトした。ターゲティングベクターには、ネガティブセレクションのマーカーとして、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴ−Ａ）を用いた。Ｊ１ＥＳ細胞（１２９／Ｓｖ）は、ターゲティングベクター導入に先立って、マウス繊維芽細胞等をフィーダー細胞として、これにＥＳ細胞用の液体培地（ＧＩＢＣＯ社）を加えて共培養した。培養、エレクトロポレーション、相同組み換え体の選択は、公知の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７，  ２５８６３−２５８６６（２００２））に則って行った。トランスフェクトされた細胞を、マイクロインジェクション法（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）により黒色の毛色を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの初期胚に導入し、キメラ胚を作製し、得られた胚を、仮親（偽妊娠動物）の子宮に移植し発生させ、キメラマウスを作製し、Ｃ５７Ｂ１／６雌マウスとの交配によりＦ１、さらにＦ２を作製し、ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損マウス、ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損マウスを得た。遺伝子型の確認は、サザンブロッティング及びＰＣＲ法により行った。サザンブロッティングの結果を図５に示す。ＰＣＲ法によるＡｄｉｐｏＲ１遺伝子の確認で用いたプライマーは、forward primer 1(5'- GCA GGG TAA GCT GAT TAG CTA TG -3'：配列番号７)、forward primer 2(5'- ATA GAT CTC TCG TGG GAT CAT TG -3'：配列番号８)、reverse primer(5'- TTA CTG CAC TTC TTC TGC TGG A -3'：配列番号９)であり、ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の確認で用いたプライマーは、forward primer 1(5'- AGC CTA CTG CCT ACT GTA TTG T -3'：配列番号１０)、forward primer 2(5'- ATA GAT CTC TCG TGG GAT CAT TG -3'：配列番号１１)、reverse primer(5'- ACT CTT CTA ACC TTC ATC AGG AG -3'：配列番号１２)である。
なお、用いたＣ５７Ｂ１／６雌マウスは、８〜１０週齢であり、ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎから購入した。マウスの飼育は、１２時間の明暗周期で行い、餌としては、ＣＥ−２（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ；タンパク質２５．６％、食物繊維３．８％、灰分５０．５％、脂肪分４％、水分９．２％を含有する）を与えた。
【００５４】
実施例２
前記のターゲティングベクター構築において、欠損させるＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子領域の５’側にｌｏｘＰ遺伝子を３’側にｌｏｘＰ遺伝子で挟んだマーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）を組み込んだターゲティングベクターを作製し、ＥＳ細胞に導入した。ＥＳ細胞はマーカーによる選択の後、サザンブロッティングあるいはＰＣＲ法によるジェノタイプ解析を行って相同組換えを確認した。
ＡｄｉｐｏＲ１及び／又はＡｄｉｐｏＲ２遺伝子両端にｌｏｘＰ遺伝子を組み込んだターゲッティングベクターを導入したｌｏｘＰ導入組換え動物と、Ｃｒｅ発現ベクターを導入したＣｒｅ発現組換え動物を別個に作製し、両者を交配することによって、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え動物を作製した。
図３にマウスＡｄｉｐｏＲ１コンディショナル遺伝子欠損用のターゲティングベクターを示す。このコンストラクトは、Ｃｒｅ蛋白の発現に応じて、時期特異的、部位特異的にマウスＡｄｉｐｏＲ１遺伝子を欠損させるため、ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子のイントロン５に、前後をＦＬＴサイト及びｌｏｘＰサイトではさまれたｎｅｏ耐性遺伝子に置き換えたターゲティングベクターを作成し、挿入した。さらに、ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子のイントロン２に、ｌｏｘＰサイトを挿入した。
図４にマウスＡｄｉｐｏＲ２コンディショナル遺伝子欠損用のターゲティングベクターを示す。このコンストラクトは、Ｃｒｅ蛋白の発現に応じて、時期特異的、部位特異的にマウスＡｄｉｐｏＲ２遺伝子を欠損させるため、ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子のイントロン７に、前後をＦＬＴサイト及びｌｏｘＰサイトではさまれたｎｅｏ耐性遺伝子に置き換えたターゲティングベクターを作成し、挿入した。さらに、ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子のイントロン４に、ｌｏｘＰサイトを挿入した。
マウスＡｄｉｐｏＲ１−ＡｄｉｐｏＲ２コンディショナルダブル遺伝子欠損マウスはＡｄｉｐｏＲ１コンディショナル遺伝子欠損マウスとＡｄｉｐｏＲ２コンディショナル遺伝子欠損マウスの交配によって得られた。
【００５５】
試験例１  ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損マウスの特性
実施例１で得られたＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損マウス（以下、ＡｄｉｐｏＲ１-/-マウス又はＲ１ＫＯと称する）は、ＡＭＰキナーゼの経路などが異常となり、インスリン抵抗性を来たし、さらにインスリン分泌にも異常をきたしていた。例えば、肝臓においては、ＡＭＰキナーゼによって通常抑制されている糖新生に関わる酵素(ＰＥＰＣＫやＧ６Ｐａｓｅなど)や脂肪合成に関わる分子(ＳＲＥＢＰ１ｃやＳＣＤ１など)の発現が上昇しているのが認められた。さらに脂肪酸燃焼の活性が低下しているのが認められた。そして空腹時血糖値・インスリン値の上昇と糖負荷後の血糖値の上昇、すなわちインスリン抵抗性と耐糖能障害、メタボリックシンドロームが認められた。
以下、及び試験例３及び４に、これらの結果を含め、得られた欠損動物の特性についての実験結果を詳細に示す。
【００５６】
ＡｄｉｐｏＲ１-/-マウスの遺伝子欠損について、ノザンブロット及びリアルタイムＰＣＲ法により、肝臓におけるＡｄｉｐｏＲ１遺伝子ｍＲＮＡ発現量を調べた（図６）。プライマーとしては、acgttggagagtcatcccgtat（配列番号１３）及びctctgtgtggatgcggaagat,（配列番号１４）を用い、プローブとしては、cctgctacatggccacagaccacct（配列番号１５）を用いた。肝細胞の単離は以下の実施例３のように行った。図６に示すように、ヘテロ接合体であるＡｄｉｐｏＲ１+/-マウスでは、ＡｄｉｐｏＲ１ｍＲＮＡの発現量は、約５０％の減少であったが、ＡｄｉｐｏＲ１-/-マウスでは、同発現が検出されなかった。
【００５７】
ＡｄｉｐｏＲ１-/-マウスを観察したところ、生存及び繁殖に問題なく、体重も通常と相違なく、発育も正常であった。成長曲線も、野生型マウスと３０週齢までほぼ同じであった。また、食糧摂取量も正常であった。
次に、血漿中のグルコース及びインスリン量を調べた（図７）。グルコースの測定には、グルコースＢテスト（和光純薬工業株式会社）を、インスリンの測定には、株式会社シバヤギの抗体を用いた。図７に示すように、ＡｄｉｐｏＲ１-/-マウス（Ｒ１ＫＯ）では、血漿中のグルコース及びインスリンの量は、野生型（ＷＴ）と比較して顕著に多かった。
【００５８】
また、ＡｄｉｐｏＲ１-/-マウスについて、経口的耐糖能試験（ＯＧＴＴ）を行った（図８、９）。図８左図に示すように、ＡｄｉｐｏＲ１-/-マウス（ＡｄｉｐｏＲ１ＫＯ）では耐糖能が顕著に欠損していた。図８右図に示すように、血漿中のインスリン濃度は、野生型に比べて顕著に高かった。図９に示すように、インスリン抵抗性指数は、野生型より高かった。なお、インスリン抵抗性指数は以下のように求めた。すなわち、グルコース値（１ｍｇ／ｍｌ＝１ｃｍ）、インスリン値（１ｍｇ／ｍｌ）の累積平均の高さを、それぞれ時間（６０ｍｉｎ＝１ｃｍ）と掛けてグルコース、インスリン曲線で囲む面積を求め、得られた値（但し、インスリンは×１０-2とする）をインスリン抵抗性指数とした。
【００５９】
さらに、ＡｄｉｐｏＲ１-/-マウスについて、hyperinsulinemic euglycemic clamp studyを行った（図１０）。実験は、以下のように行った。実験の２〜３日前にペントバルビタールナトリウムによる麻酔下で頚動脈に注入カテーテルを挿入したマウスに、インスリンを５．０ｍｉｌｌｉｕｎｉｔｓ／ｋｇ／ｍｉｎで与え、５分毎にモニターして血中グルコース濃度が１２０ｍｇ／ｄＬとなるようにグルコース（［６，６−2Ｈ2］グルコースが２０％となるよう濃縮した０．５ｇ／ｍＬグルコース溶液）を１２０分間投与した。９０、１０５、１２０分後に尾の先から血液を採取し、グルコース消失率（Ｒｄ）を求めた。endogenous glucose production(EGP)は、ＲｄとＧＩＲの差として求めた。図１０中段に示すように、endogenous glucose production(EGP)は、ＡｄｉｐｏＲ１-/-マウス（Ｒ１ＫＯ）では野生型（ＷＴ）に比して顕著に多かった。
【００６０】
また、肝臓中のＧ６Ｐａｓｅ、ＳＲＥＢ１ｃ、ＡｄｉｐｏＲ２及びＡＣＯ発現量を野生型との対比において調べた（図１１）。これらの発現量は、野生型に比して多かった。
【００６１】
試験例２  ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損マウス、及びＡｄｉｐｏＲ１・ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損マウスの特性
実施例１で得られたＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損マウス（以下、ＡｄｉｐｏＲ２-/-マウス又はＲ２ＫＯと称する）は、ＰＰＡＲαの経路などが異常となり、さらに肝臓への糖の取り込みに重要なグルコキナーゼの発現の低下、脂肪組織や肝臓での酸化ストレスの増大と慢性炎症の惹起などによりインスリン抵抗性を来たしていた。例えば、通常は、ＰＰＡＲαによって発現が誘導されている脂肪燃焼に関わる酵素（ＡＣＯなど）やエネルギー消費に関わる分子（ＵＣＰ２など）の発現が低下しており、実際に脂肪酸燃焼の活性も低下しているのが認められた。さらに、酸化ストレスの消去に関わる酵素（ＳＯＤ１やｃａｔａｌａｓｅなど）の発現の低下と炎症性サイトカイン（ＴＮＦαなど）やケモカイン（ＭＣＰ−１など）の発現の上昇が認められ、各々の臓器障害を惹起しているのが認められた。そしてインスリン値の上昇、すなわち全身性のインスリン抵抗性、メタボリックシンドロームが認められた。
【００６２】
また、ＡｄｉｐｏＲ１-/-マウスとＡｄｉｐｏＲ２-/-マウスを交配して、ＡｄｉｐｏＲ１・ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損マウス（以下、ＡｄｉｐｏＲ１-/-・ＡｄｉｐｏＲ２-/-マウス又はＤｏｕｂｌｅＫＯを称する）を得た。得られたＡｄｉｐｏＲ１−ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損マウスは、ＡＭＰキナーゼやＰＰＡＲαの経路などが異常となり、さらに肝臓への糖の取り込みに重要なグルコキナーゼの発現の低下、脂肪組織や肝臓での酸化ストレスの増大と慢性炎症の惹起などにより、インスリン抵抗性を来たし、さらにインスリン分泌にも異常をきたしていた。例えば、肝臓においては、ＡＭＰキナーゼによって通常抑制されている糖新生に関わる酵素(ＰＥＰＣＫやＧ６Ｐａｓｅなど)や脂肪合成に関わる分子(ＳＲＥＢＰ１ｃやＳＣＤ１など)の発現が上昇しているのが認められた。ＰＰＡＲαによって発現が誘導されている脂肪燃焼に関わる酵素(ＡＣＯなど)やエネルギー消費に関わる分子(ＵＣＰ２など)の発現が低下しており、実際に脂肪酸燃焼の活性も低下しているのが認められた。さらに、酸化ストレスの消去に関わる酵素（ＳＯＤ１やｃａｔａｌａｓｅなど）の発現の低下と炎症性サイトカイン（ＴＮＦαなど）やケモカイン(ＭＣＰ−１など)の発現の上昇が認められ、各々の臓器障害を惹起しているのが認められた。そして空腹時血糖値・インスリン値の上昇と糖負荷後の血糖値の上昇、すなわち全身のインスリン抵抗性と耐糖能障害、メタボリックシンドロームが認められた。
以下、及び試験例３、４に、これらの結果を含め、得られた欠損動物の特性について実験結果を詳細に示す。
【００６３】
これらのマウスについて、試験例１と同様に、肝臓におけるＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ｍＲＮＡ発現量を調べた（図１２）。プライマーとしては、tcccaggaagatgaagggtttat（配列番号１６）及びttccattcgttcgatagcatga,（配列番号１７）を用い、プローブとしては、atgtccccgctcctacaggccc（配列番号１８）を用いた。図１２に示すように、スプライシングに異常のあるｍＲＮＡが少量観察された。
また、これらのマウスを観察したところ、体重は通常と相違なかった。
【００６４】
次に、ＡｄｉｐｏＲ２-/-マウスについて、試験例１と同様の方法で経口的耐糖能試験（ＯＧＴＴ）を行った（図１３、９）。グルコース負荷後の血漿中のインスリンレベルは、野生型に比して顕著に高かった。試験例１と同様にインスリン抵抗性指数を求めたところ、野生型より高かった。
インスリン抵抗性は、ＡｄｉｐｏＲ１-/-・ＡｄｉｐｏＲ２-/-マウスについても同様の方法で調べた。結果をＡｄｉｐｏＲ１-/-マウス及びＡｄｉｐｏＲ２-/-マウスに並べて図１４に示す。ＡｄｉｐｏＲ１-/-・ＡｄｉｐｏＲ２-/-マウスでは、これら単独の遺伝子欠損マウスよりもインスリン抵抗性が悪化していた。
【００６５】
ＡｄｉｐｏＲ１-/-・ＡｄｉｐｏＲ２-/-マウスについて、adiponectin sensitivitytestを行った。結果を図１５に示す。野生型では、血漿中グルコースレベルが顕著に減少するのに対し、ＡｄｉｐｏＲ１-/-・ＡｄｉｐｏＲ２-/-マウス由来のものでは、そのような減少が起こらなかった。
【００６６】
次に、ＡｄｉｐｏＲ１-/-・ＡｄｉｐｏＲ２-/-マウスについて、肝臓中のＡｋｔのリン酸化を調べた（図１６）。この欠損マウスでは、インスリン投与によるＡｋｔのリン酸化が野生型に比して少なかった。
【００６７】
さらに、ＡｄｉｐｏＲ１-/-・ＡｄｉｐｏＲ２-/-マウスについて、肝臓におけるＰＥＰＣＫ、ＳＣＤ−１、ＳＰＲＥＢＰ１ｃのｍＲＮＡ発現量、中性脂肪（ＴＧ）容量、筋肉におけるＡＣＯ、ＵＣＰ２のｍＲＮＡ発現量、白色脂肪組織におけるＭＣＰ−１、カタラーゼ、ＳＯＤ−１、ＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量を調べ、野生型と対比して示した（図１７）。欠損マウスでのＰＥＰＣＫ、ＳＣＤ−１、ＳＰＲＥＢＰ１ｃのｍＲＮＡ発現量、中性脂肪容量は、野生型に比して高かった。ＡＣＯ、ＵＣＰ２、カタラーゼのｍＲＮＡ発現量は野生型に比して低かった。
【００６８】
ＡｄｉｐｏＲ１・Ｒ２ダブル欠損マウスの骨格筋では、筋細胞でのミトコンドリアの多いｔｙｐｅ  １  ｆｉｂｅｒへの分化促進因子であるmyocyte enhancer factor 2（ＭＥＦ２）の発現は有意に低下しており（図１８）、ＭＥＦ２を転写促進因子とするＰＰＡＲγ  co-activator  １α（ＰＧＣ−１α）の発現も有意に低下していた（図１９）。ＰＧＣ−１αは骨格筋においてミトコンドリア生合成及び機能を調節している可能性のある因子の一つとして注目されていが、ミトコンドリア電子伝達に関わる酵素Cytochrome  Ｃ（CytC）の有意な発現低下も認められた（図２０）。また、ＡＭＰＫの下流で酸化ストレスの消去に関わるsuper oxide dismutase 2（ＳＯＤ２）も低下していた（図２１）。
以上よりアディポネクチン／ＡｄｉｐｏＲ経路が骨格筋においてＭＥＦ２、ＰＧＣ−１αを介し、ミトコンドリア機能調節を行っている可能性が示唆された。また、酸化ストレスの消去に関わるＳＯＤ２の低下が認められたことより、アディポネクチンのＡＭＰＫ、ＰＧＣ−１αを介した、酸化ストレス消去作用が存在する可能性が示唆された。
【００６９】
脂肪細胞の肥大化に伴う、脂肪細胞の機能低下のメカニズムの一つとして、肥大化に伴う脂肪細胞の低酸素が考えられている。ＡｄｉｐｏＲ１・Ｒ２ダブル欠損マウスのＷＡＴでは線溶系を抑制するＰＡＩ−１の発現が有意に上昇しており（図２２）、更に、細胞内の低酸素状態を示す、ＨＩＦ１αの発現が有意に上昇していた（図２３）。
【００７０】
また、ＡｄｉｐｏＲ２及びＡｄｉｐｏＲ１・Ｒ２欠損マウスの収縮期血圧は有意に上昇していた（図２４）。
【００７１】
試験例３  ＡＭＰキナーゼ活性試験
ＡｄｉｐｏＲ１-/-マウス（Ｒ１ＫＯ）、ＡｄｉｐｏＲ２-/-マウス（Ｒ２ＫＯ）及びＡｄｉｐｏＲ１-/-・ＡｄｉｐｏＲ２-/-マウス（ＤｏｕｂｌｅＫＯ）について、肝臓におけるアディポネクチン誘導のＡＭＰキナーゼ活性を調べた（図２５）。キナーゼ活性測定においては、全長のアディポネクチンを３０μｇ／１０ｇの濃度で肝臓に１０分間処理した。野生型で見られたアディポネクチン投与によるＡＭＰＫリン酸化は、Ｒ１ＫＯ及びＤｏｕｂｌｅＫＯでは阻害されていた。
【００７２】
試験例４  放射性リガンド結合試験
ＡｄｉｐｏＲ１-/-マウス、ＡｄｉｐｏＲ２-/-マウス及びＡｄｉｐｏＲ１-/-・ＡｄｉｐｏＲ２-/-マウスについて、肝細胞に対するアディポネクチンの結合性を、以下のような放射性リガンド結合試験により行った。まず、Ｎａ［125Ｉ］（２０００Ｃｉｍｍｏｌ-1、アマシャムファーマシアバイオテック）存在下でＩＯＤＯビーズによって組換え体アディポネクチンのＴｙｒを125Ｉで標識した。後記実施例２で得た肝細胞を３．７５×１０5ｃｅｌｌ／１２ｗｅｌｌの濃度で植えた。４８時間後、125Ｉ標識したアディポネクチン（５０００カウント／ｍｉｎ・ｎｇ）と非標識の競合アディポネクチンを含む結合バッファー（氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．１％ウシ血清アルブミン）で４℃一晩インキュベートした。その後細胞をウェルあたり１ｍｌの氷冷ＰＢＳを用いて２０回洗浄し、８００μＬのＰＢＳ中でトリプシン分解した。細胞懸濁液の125Ｉ標識を測定した。細胞に結合したものの放射活性は、γ−カウンターを用いて求めた。非特異的結合は、２００倍過剰の非標識アディポネクチンを用いて求めた。特異的結合は、合計結合量から非特異的結合量を減じて求めた。３回の測定の平均値として、結果を図２６に示す。野生型で見られたアディポネクチンの特異的結合活性は、これらの遺伝子欠損マウスでは低下していた。
【００７３】
実施例３  培養細胞の樹立
試験例１及び２で得たＡｄｉｐｏＲ１遺伝子やＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損の８週齢の雌マウスからコラゲナーゼかん流法により肝細胞を単離した。これを、コラーゲンＩ被覆１２ウェル培養皿に３．７５×１０5ずつ植えた。培地としては、１０％ウシ胎仔血清、１０ｎＭデキサメタゾン、１ｎＭインスリン、１００Ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むウィリアム培地Ｅを用いた。５％ＣＯ2存在下、３７℃で４８時間インキュベートしたのち、ＰＢＳによって細胞を２度洗浄し、ウシ胎仔血清を含まないウィリアム培地Ｅによって６時間培養した。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損についてのジーンターゲティングの模式図を示す。
【図２】ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損についてのジーンターゲティングの模式図を示す。
【図３】マウスＡｄｉｐｏＲ１コンディショナル遺伝子欠損用のターゲティングベクターを示す図である。図３中、白四角は、エクソンを示し、Ｐ、Ｒは制限酵素サイトを示す。黒矢印は、ｌｏｘＰサイトの位置を示し、白矢印は、ＦＲＴサイトの位置を示す。
【図４】マウスＡｄｉｐｏＲ２コンディショナル遺伝子欠損用のターゲティングベクターを示す図である。図４中、白四角は、エクソンを示し、Ｐ、Ｒは制限酵素サイトを示す。黒矢印は、ｌｏｘＰサイトの位置を示し、白矢印は、ＦＲＴサイトの位置を示す。
【図５】サザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。＋／＋は野生型を示し、＋／−はヘテロ接合体を示し、−／−はホモ接合体を示す。
【図６】肝臓中のＡｄｉｐｏＲ１ｍＲＮＡ発現量についての検証結果である。左図は、リアルタイムＰＣＲ法による定量結果である。＋／＋は野生型を示し、＋／−はヘテロ接合体を示し、−／−はホモ接合体を示す。右図は、ノザンブロットの結果である。
【図７】ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損マウスの血漿中のグルコース（左図）及びインスリン（右図）量を示す図である。
【図８】ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損マウスについての経口的耐糖能試験結果を示す図である。左図は、血漿中のグルコースレベル、右図は、インスリンレベルを示す。
【図９】ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損マウスのインスリン抵抗性指数を示す図である。
【図１０】ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損マウスについてのhyperinsulinemic euglycemic clamp studyの結果を示す図である。
【図１１】ｃｌａｍｐ試験後のＡｄｉｐｏＲ１遺伝子欠損マウスの肝臓における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図１２】ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子やＡｄｉｐｏＲ２遺伝子が欠損したマウスの肝臓におけるＡｄｉｐｏＲ２ｍＲＮＡ発現量をノザンブロットで検証した結果を示す。
【図１３】ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子欠損マウスについての経口的耐糖能試験結果を示す図である。左図は、血漿中のグルコースレベル、右図は、インスリンレベルを示す。
【図１４】ＡｄｉｐｏＲ１・ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損マウスなど各遺伝子欠損マウスについてのインスリン抵抗性指数を示した図である。
【図１５】ＡｄｉｐｏＲ１・ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損マウスについてのAdiponectin sensitivity testの結果を示す図である。
【図１６】ＡｄｉｐｏＲ１・ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損マウスの肝臓におけるＡｋｔのリン酸化の程度を野生型（ＷＴ）との対比において示す図である。
【図１７】ＡｄｉｐｏＲ１・ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損マウスの各器官における各ｍＲＮＡの発現量などを検証した結果を示す図である。
【図１８】ＡｄｉｐｏＲ１・ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損マウスの骨格筋（腓腹筋（Gastrocnemius）及びヒラメ筋（Soleus））におけるＭＥＦ２の発現を示す図である。
【図１９】ＡｄｉｐｏＲ１・ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損マウスの骨格筋（腓腹筋（Gastrocnemius）及びヒラメ筋（Soleus））におけるＰＧＣ−１αの発現を示す図である。
【図２０】ＡｄｉｐｏＲ１・ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損マウスの骨格筋（腓腹筋（Gastrocnemius）及びヒラメ筋（Soleus））におけるＣｙｔＣの発現を示す図である。
【図２１】ＡｄｉｐｏＲ１・ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブル欠損マウスの骨格筋（腓腹筋（Gastrocnemius）及びヒラメ筋（Soleus））におけるＳＯＤ２の発現を示す図である。
【図２２】ＡｄｉｐｏＲ１・ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブルノックアウトマウスの脂肪細胞におけるＰＡＩ−１の発現を示す図である。
【図２３】ＡｄｉｐｏＲ１・ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブルノックアウトマウスの脂肪細胞におけるＨＩＦ１αの発現を示す図である。
【図２４】ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ノックアウト又はＡｄｉｐｏＲ１・ＡｄｉｐｏＲ２遺伝子ダブルノックアウトの収縮期血圧の上昇作用を示す図である。
【図２５】各遺伝子欠損マウスの肝臓におけるアディポネクチンによるＡＭＰＫのリン酸化の程度を示す図である。
【図２６】各遺伝子欠損マウスから単離した肝細胞を用いて、放射性リガンド結合試験を行った結果を示す図である。
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１２】
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【図１６】
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【図２５】
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【配列表】
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