(57)【要約】【課題】水溶液中で還元アミノ化反応を行うことにより人工糖脂質を合成する方法。【解決手段】アミノ基を有する人工脂質のミセル水溶液と糖質を用いて、水溶液中で還元アミノ化反応を行うことにより人工糖脂質を合成する。例えば、式（１）で示されるアミノ基を有する人工脂質のミセル水溶液と糖質を用いて、水溶液中で還元アミノ化反応を行うことにより人工糖脂質を合成する。【化３】2008201762.tif 000004  （ただし、式中で、ｍは１から１００までの整数を、ｎは１１から１７までの整数を、Ｒ２はＯ（ＣＨ2）nＣＨ3またはＨを表す。）【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ基を有する人工脂質のミセル水溶液と糖質を用いて、水溶液中で還元アミノ化反応を行うことにより人工糖脂質を合成する方法。
【請求項２】
式（１）で示されるアミノ基を有する人工脂質のミセル水溶液と糖質を用いて、水溶液中で還元アミノ化反応を行うことにより人工糖脂質を合成する方法。
【化１】
2008201762.tif 000003
（ただし、式中で、ｍは１から１００までの整数を、ｎは１１から１７までの整数を、Ｒ２はＯ（ＣＨ2）nＣＨ3またはＨを表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工脂質のミセル水溶液を用い、水溶液中で還元アミノ化反応により人工糖脂質を合成する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は生体内で様々な機能を担っていることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。そうした糖鎖の機能の多くは、各々の糖鎖とそれを特異的に認識する物質との相互作用を分子的な基盤としている。従って、糖鎖に結合する物質を探索、捕捉するための糖鎖プローブの一つとして用いられる人工糖脂質は、研究用の試薬としてだけでなく、糖鎖の機能を医薬品や診断薬に応用する上でも重要である。
【０００３】
我々はこれまでに、長鎖アルキルオキシベンジルアルコール誘導体あるいは長鎖アルキルオキシベンズアミド誘導体を基本骨格とする人工脂質に糖鎖を結合した糖鎖プローブ（特許文献１〜３参照）、あるいは、長鎖アルキルオキシベンズアミド誘導体の基本骨格に天然由来の糖鎖を、有機溶媒・水混合溶媒中で還元アミノ化することによって導入した糖鎖プローブ（特許文献４参照）等を提供してきた。これらの人工糖脂質型の糖鎖プローブは、その脂質部分を利用してプラスチックディッシュ等の疎水表面に固定することにより、糖鎖に結合する物質を探索、捕捉するための糖鎖プローブとして使用することができる。
【０００４】
また、我々は疎水性相互作用に由来する非特異的な相互作用をできる限り低く抑える目的で、オリゴエチレングリコールが結合した長鎖アルキルオキシベンズアミド誘導体を提供し（特許文献５参照）、さらに、その末端にグリコシル化反応により糖鎖を導入した糖鎖プローブを提供している（特許文献６参照）。
【０００５】
人工脂質へ糖鎖を導入する方法として、グリコシル化反応または、還元アミノ化反応を用いるものなどがある。グリコシル化反応により糖鎖を、水酸基を有する人工脂質に導入する方法は、合成の工程数が多いうえに収率が低い反応もあり、グリコシル化反応により糖鎖を有する人工糖脂質を調製することは実用性に乏しい。アミノ基を有する人工脂質と還元末端を持つ糖鎖が形成したシッフ塩基を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどにより還元することで、人工脂質に糖鎖を導入する還元アミノ化反応は、糖鎖部分の保護、脱保護が不要なため、糖鎖の導入には還元アミノ化反応を用いるのが有効である（非特許文献２参照）。
【０００６】
しかし、還元アミノ化反応を用いる方法にも問題点は存在する。糖質は水溶液に溶解するが、例えば、一般に人工脂質としてよく用いられるジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）などは、有機溶媒にしか溶解しないため、糖質と人工脂質を用いた還元アミノ化反応は、有機溶媒・水混合溶媒中で行われている。しかし、有機溶媒中の水分量比の上昇は反応に大きな影響を与え、水溶液の比率が増すと収率の低下がみられることが知られている（非特許文献３参照）。また、糖質の種類により混合溶媒に対する溶解度が異なるため、その都度条件検討を行う必要がある。人工糖脂質を還元アミノ化反応により合成することは簡便であるとされながらも、有機溶媒と水溶液の混合溶媒を用いる限りこの問題は避けて通れない。
【特許文献１】特開２００１−１２２８８９
【特許文献２】特開２００１−２５３８９６
【特許文献３】特開２００２−３００９１
【特許文献４】特開２００４−７５６４１
【特許文献５】特開２００５−２３２０６１
【特許文献６】特開２００６−３３５６５２
【非特許文献１】谷口直之他編、「糖鎖機能」（蛋白質核酸酵素２００３年６月号増刊、共立 出版、２００３年
【非特許文献２】メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１９９４年、２３０巻、４８４−５１９
【非特許文献３】バイオメソッド（ＢｉｏＭｅｔｈｏｄｓ）、１９９７年、９巻、３２９−３４８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、水溶液中で還元アミノ化反応を行うことにより、反応溶媒中の水分量比に左右されることなく、簡便に人工糖脂質を合成する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を鋭意検討した結果、本発明者らは、水溶液中でミセル形成する人工脂質を用いることにより、人工脂質のミセル溶液と糖質を均一な水溶液とすることができ、その水溶液中で還元アミノ化反応を行うことにより、目的とする人工糖脂質が合成できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、アミノ基を有する人工脂質のミセル水溶液と糖質を用いて、水溶液中で還元アミノ化反応を行うことにより人工糖脂質を合成する方法を提供する。
さらに本発明は、式（１）で示されるアミノ基を有する人工脂質のミセル水溶液と糖質を用いて、水溶液中で還元アミノ化反応を行うことにより人工糖脂質を合成する方法を提供する。
【化２】
2008201762.tif 000002
（ただし、式中で、ｍは１から１００までの整数を、ｎは１１から１７までの整数を、Ｒ２はＯ（ＣＨ2）nＣＨ3またはＨを表す。）
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、アミノ基を有する人工脂質のミセル水溶液と糖質を用いて水溶液中で還元アミノ化反応を行うため、反応溶媒の検討が不要となる。糖蛋白質及び、糖脂質から糖鎖を酵素で切り出す場合、糖鎖の切り出しと還元アミノ化反応を連続して行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の合成方法には、式（１）で示される化合物以外に、一般に、アミノ基を持ち、水溶液中でミセルを形成する人工脂質を用いることが可能であるが、以下では、便宜上、式（１）で示される化合物を例として説明を行う。
【００１２】
式（１）で示される化合物は、既知の合成法（特開２００５−２３２０６１、特開２００６−３３５６５２参照）に従って合成される。
式（１）において、ｍは１から１００までの整数であるが、化合物調製に必要とする工程数等を考慮すると、好ましくは２から１１の整数である。
【００１３】
糖質は、還元末端を持つものであれば何でもよいが、天然の糖蛋白質からヒドラジン分解やアルカリ性条件下の水素化ホウ素分解あるいはエンドグリコシダーゼなどの加水分解酵素を用いて切り出したＮ−結合型糖鎖またはＯ−結合型糖鎖、または、それらの部分オリゴ糖、天然の糖脂質からエンドグリコセラミダーゼなどの加水分解酵素を用いて切り出した糖鎖または、その部分オリゴ糖、天然のプロテオグリカン由来の糖鎖、または、その部分オリゴ糖、あるいは、有機合成等を用いて調製した天然型および非天然型の糖鎖等が挙げられる。特に、糖蛋白質及び、糖脂質から加水分解酵素を用いて糖鎖を切り出した後、続いて式（１）で示される化合物と還元アミノ化反応を行うことが可能であるため、より簡便に様々な糖鎖を有する人工糖脂質を合成することができる。
【００１４】
人工糖脂質の合成は、例えば、式（１）の化合物を水溶液に溶解した後、糖質、還元剤を加え、反応が十分に進行するまで加熱することによって行うことができる。還元剤としては、水溶液中でも還元活性を維持し、かつ、シッフ塩基を還元してアミンを与えるものであれば何でもよいが、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどを用いることができる。水溶液としては、純水を用いることができるが、好ましくはｐＨ７．０から３．０までの酸性水溶液である。
【００１５】
式（１）の化合物と糖質を用い、還元アミノ化反応によって得られた人工糖脂質の精製は、化合物が紫外吸収を持つために、ＨＰＬＣを用いて行うことができる。さらに、生成物は分子量が大きくなるため、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーで精製することも可能である。また、ＤＰＰＥなどを用いた場合と同様に、シリカゲルの分取用ＴＬＣやカラムクロマトグラフィーを用いることができる。
【００１６】
以下に、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の記述に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
（ラクトースとＮ―（１７―アミノ―３，６，９，１２，１５―ペンタオキサヘプタデシル）―３，５―ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドを用いた人工糖脂質の合成）
ｐＨ３．０の酢酸水溶液にＮ―（１７―アミノ―３，６，９，１２，１５―ペンタオキサヘプタデシル）―３，５―ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドを分散させ２０ｍＭ溶液を調製した後、最終濃度が１ｍＭになるようにラクトース１水和物を加え、６０℃で１．５時間撹拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを２５．４ｍｇ加えてさらに６０℃で１８時間以上撹拌した。反応後、反応液をＨＰＬＣにより解析し、目的の人工糖脂質（収率４１％（ピーク面積から算出））を得た。
ＨＰＬＣ（ＧＬサイエンス  ＧＬ―７４００；カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ―３，４．６×２５０ｍｍ；カラム温度：４０℃；移動相：０．１％ＴＦＡ水溶液―０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル（２０：８０から２０分かけて１０：９０）；流速：１ｍｌ／分；検出器：ＰＤＡ（２１０ｎｍ））保持時間：１１．８分
【実施例２】
【００１８】
（ラクトシルセラミドとＮ―（１７―アミノ―３，６，９，１２，１５―ペンタオキサヘプタデシル）―３，５―ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドを用いた人工糖脂質の合成）
天然の糖脂質であるラクトシルセラミド（１ｍｇ）を２０ｍＭ酢酸バッファー（１ｍｌ）（ｐＨ５．５、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ―Ｘ）に溶解させた後、リコンビナント  エンドグリコセラミダーゼI I（ｒＥＧＣａｓｅI I）溶液を５０μｌ（１００ｍＵ）加え、３７℃、２０時間インキュベートし、その後、溶媒を留去した。Ｎ―（１７―アミノ―３，６，９，１２，１５―ペンタオキサヘプタデシル）―３，５―ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドを酢酸水溶液（ｐＨ３．０）に溶解させ２０ｍＭ溶液を調製し、この溶液を酵素反応粗生成物に１ｍｌ加え、６０℃で１．５時間撹拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを１９．７ｍｇ加えてさらに６０℃で１８時間以上撹拌した。反応後、反応液をＨＰＬＣにより解析し、目的の人工糖脂質の生成を確認した。
ＨＰＬＣ（ＧＬサイエンス  ＧＬ―７４００；カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ―３，４．６×２５０ｍｍ；カラム温度：４０℃；移動相：０．１％ＴＦＡ水溶液―０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル（２０：８０から２０分かけて１０：９０）；流速：１ｍｌ／分；検出器：ＰＤＡ（２１０ｎｍ））保持時間：１１．８分
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明は、アミノ基を有する人工脂質のミセル水溶液と糖質を用いて、水溶液中で還元アミノ化反応を行うことにより、人工糖脂質を簡便に合成する方法を提供することにあり、水溶液中ですべての反応を進行させるため、溶液中の水分量比の影響を受けることなく、人工糖脂質の合成を行うことが可能になる。また、糖蛋白質及び、糖脂質から加水分解酵素を用いて糖鎖を切り出した後、続いて還元アミノ化反応を行うことが可能であるため、様々な種類の糖鎖を有し、脂質構造の均一な人工糖脂質を、簡便に提供するのに有効に利用できる。