(57)【要約】      （修正有）【課題】相同性の高い配列を有する核酸間のクロスハイブリ率を正確に測定し、プローブ設計に依存しない核酸の検出方法、及び相同性の高い配列を有する核酸の存在比を算出する方法で提供する。【解決手段】以下の工程を含む、相同性の高い配列を有する核酸の存在比を推定する方法。（１） 相同性の高い配列を有する核酸の各々に対応する完全相補な配列を有するプローブを作製し、それらのプローブが搭載されたマイクロアレイを調製する工程。（２） 前記マイクロアレイに、相同性の高い配列を有する核酸の各々を、個々にハイブリダイズし、ハイブリットを検出し、相同性の高い配列を有する核酸の存在比を算出可能な数式を作成する工程。（３） 相同性の高い配列を有する核酸の存在比が不明な検体をマイクロアレイに供し、ハイブリッドを検出し、前記（２）の数式に検出結果を代入し、検体中の相同性の高い配列を有する核酸の存在比を算出する工程。【選択図】図１
2008035801.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、相同性の高い配列を有する核酸の存在比を推定する方法。
（１） 相同性の高い配列を有する核酸の各々に対応する完全相補な配列を有するプローブを作製し、それらのプローブが搭載されたマイクロアレイを調製する工程。
（２） 前記マイクロアレイに、相同性の高い配列を有する核酸の各々を、個々にハイブリダイズし、ハイブリットを検出し、相同性の高い配列を有する核酸の存在比を算出可能な数式を作成する工程。
（３） 相同性の高い配列を有する核酸の存在比が不明な検体をマイクロアレイに供し、ハイブリッドを検出し、前記（２）の数式に検出結果を代入し、検体中の相同性の高い配列を有する核酸の存在比を算出する工程。
【請求項２】
第２の工程において、異なるストリンジェンシーでハイブリットの検出を行い、複数の数式を作成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
相同性の高い配列を有する核酸が、１０塩基以上、３０塩基以下の塩基数より構成されるものである請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイクロアレイのデータ解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイとは、担体上に多数のプローブを高密度に、互いに混ざり合うことのないようにそれぞれ独立に固定化したものである。マイクロアレイ上に搭載されるプローブは、その塩基配列と相補な配列からなる核酸分子をハイブリダイゼーションによってキャプチャーするためのセンサーとして働く。
【０００３】
マイクロアレイとしては、表面加工を施したガラスやシリコンなどの担体、ゲル担体に、プローブを固定化したものが知られている。例えば、光照射で選択的に除去される保護基をもつ物質を使い、フォトリソグラフィー技術と固相合成技術を組み合わせて、微小なマトリックスの所定の領域（反応部位）に選択的にＤＮＡを合成（マスキング）することによってマイクロアレイを作製することができる。また、あらかじめＰＣＲや人工的な合成によって別途作製したプローブＤＮＡを含む溶液を、スポッターまたはアレイヤーにより数ｎｌから数ｐｌの微小体積でチップ表面に並べ、基板上の特定領域に固定することによってマイクロアレイを作製することができる。
【０００４】
さらには、貫通孔基盤を使用したマイクロアレイも知られている。例えば、複数本の中空繊維を繊維軸方向に規則正しく配列し、各中空繊維にプローブを固定した後、中空繊維配列体を横切断することにより製造することができる（特許文献１）。
【０００５】
上記のマイクロアレイを使用した核酸分子の検出は、核酸マイクロアレイに、検査対象となる核酸試料を配列特異的にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション後に個々のプローブ、及びそれに配列特異的に結合した核酸分子とのハイブリッドを、蛍光物質等によりシグナルを検出することにより行われる。この検出により、複数のプローブに対応する核酸試料中の核酸分子を、一度に検査することができる。よって、複数の核酸塩基配列に関する発現量又は特定の核酸塩基配列の配列自体を解析するために広範に利用される。
【０００６】
従来の核酸マイクロアレイによる検出では、予め設定した適切な条件下でハイブリダイゼーションを実施し、次いで洗浄工程により、核酸マイクロアレイ表面に残存した核酸試料、その他不要物等の除去を行い、プローブと特異的なハイブリッドを形成している核酸試料を検出する。プローブは、配列解析、機能解析等、検出対象となる所望の核酸塩基配列と相補又は同一に設計される。プローブとしては、ｃＤＮＡ等の比較的長鎖の核酸、短鎖の合成オリゴ核酸等が使用される。合成オリゴ核酸をプローブとして使用する場合、ヒトやマウスなど、遺伝子情報の知見が蓄積している生物については、それらの塩基配列情報を用い、各配列の相同性や機能などに着目した上で、合成オリゴ核酸の配列を設計し、プローブを作製する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、プローブを作成する際、検出対象となる塩基配列は、生体内に非常に相同性の高い配列が複数、存在する場合がある。例えば塩基鎖長が２０塩基程度であるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの配列数の短い核酸の場合、塩基配列の違いが、数塩基程度しかない場合も多い。このような場合、プローブと標的核酸配列間の特異性を維持させ、プローブを設計することは非常に困難となる。よって、ハイブリダイゼーションによる検出結果は、完全相補のみならず、例えば１塩基違いの配列のシグナルも含まれることもあり、そのまま標的核酸分子の検出結果として適用することができなかった。本発明は上記課題を解決することを目的とする。
【特許文献１】特許第３５１０８８２号
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、相同性の高い複数種類のプローブに関して、下記の工程により検出データを取得することにより、未知の試料核酸中に含まれる複数種類の相同性の高い配列を有する核酸の存在比率がほぼ正確に推定できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の工程を含む、相同性の高い配列を有する核酸の存在比を推定する方法である。
【００１０】
（１） 相同性の高い配列を有する核酸の各々に対応する完全相補な配列を有するプローブを作製し、それらのプローブが搭載されたマイクロアレイを調製する工程。
【００１１】
（２） 前記マイクロアレイに、相同性の高い配列を有する核酸の各々を、個々にハイブリダイズし、ハイブリットを検出し、相同性の高い配列を有する核酸の存在比を算出可能な数式を作成する工程。
【００１２】
（３） 相同性の高い配列を有する核酸の存在比が不明な検体をマイクロアレイに供し、ハイブリッドを検出し、前記（２）の数式に検出結果を代入し、検体中の相同性の高い配列を有する核酸の存在比を算出する工程。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、いままでのマイクロアレイ実験ではクロスハイブリが避けられず、特異的かつ配列特異的に測定することができなかった相同性が高い核酸の存在比率を、正確に測定することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、以下の工程を含む、相同性の高い配列を有する核酸の存在比を推定する方法である。
【００１５】
（１） 相同性の高い配列を有する核酸の各々に対応する完全相補な配列を有するプローブを作製し、それらのプローブが搭載されたマイクロアレイを調製する工程。
【００１６】
（２） 前記マイクロアレイに、相同性の高い配列を有する核酸の各々を、個々にハイブリダイズし、ハイブリットを検出し、相同性の高い配列を有する核酸の存在比を算出可能な数式を作成する工程。
【００１７】
（３） 相同性の高い配列を有する核酸の存在比が不明な検体をマイクロアレイに供し、ハイブリッドを検出し、前記（２）の数式に検出結果を代入し、検体中の相同性の高い配列を有する核酸の存在比を算出する工程。
【００１８】
以下、順次、各工程を説明する。
【００１９】
まず、第一の工程では、相同性の高い配列を有する核酸の各々に対応する完全相補な配列を有するプローブを作製し、それらのプローブが搭載されたマイクロアレイを調製する。
【００２０】
相同性の高い配列を有する核酸とは、少なくとも２０塩基内に一塩基程度の違いがある核酸であって、例えば、ｍＲＮＡにおける、同一遺伝子由来のバリアントや、ホモログ、ｍｉＲＮＡの同一ファミリー種、遺伝子多型等が挙げられる。また、パーフェクトマッチとミスマッチのハイブリダイゼーション効率に少しでも差が認められるのであれば、ＲＮＡ、ＤＮＡを問わず、どのような核酸でもよい。まずはこれらの核酸に完全相補な配列を有するプローブを設計し、それらが搭載されたマイクロアレイを作製する。
【００２１】
マイクロアレイは、複数の区画にオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ等のプローブを固定し、遺伝子の発現パターンのモニタリング、新規遺伝子のスクリーニング、遺伝子変異、多型の検出等を行うことができるデバイスを意味する。マイクロアレイの形態は様々なものが知られている。例えば、光リソグラフ技術を利用して、基板上に高密度でプローブを固定したマイクロアレイ、ガラス基板等にスポッティングによりプローブを固定したマイクロアレイ等が知られている。また、繊維型マイクロアレイも知られている（特許第３５１０８８２号公報参照）。
【００２２】
本発明においては、後述する連立方程式を作成する過程と、未知のサンプルを使用する過程で、プローブと、検体量比の違いから由来するバイアスを低減するために、プローブ固定化量が多いマイクロアレイが好適に使用される。また、洗浄、検出を繰り返すため、検出時にマイクロアレイ表面を乾燥させずに検出できるマイクロアレイが好適に使用される。
【００２３】
このようなマイクロアレイとしては、基板に複数の貫通孔が存在し、それら貫通孔にはゲルを介してプローブが固定されているマイクロアレイが好適に使用される。そのようなマイクロアレイとしては、特開２０００−６０５５４号に記載のマイクロアレイや、繊維型マイクロアレイが例示できる。
【００２４】
以下に、繊維型マイクロアレイについてより詳細に説明する。
【００２５】
繊維型マイクロアレイは、例えば、下記のａ）〜ｄ）の工程により作製することができる。
【００２６】
ａ）複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように配列し配列体を製造する工程。
【００２７】
ｂ）前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程。
【００２８】
ｃ）プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を該ブロック体の各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、プローブを含むゲル状物を中空部に保持する工程。
【００２９】
ｄ）中空繊維の長手方向と交叉する方向で、切断してブロック体を薄片化する工程。
【００３０】
中空繊維材料としては、例えば、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系中空繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系中空繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系中空繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系中空繊維、ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリレート系中空繊維、ポリビニルアルコール系中空繊維、ポリ塩化ビニリデン系中空繊維、ポリ塩化ビニル系中空繊維、ポリウレタン系中空繊維、フェノール系中空繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系中空繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系中空繊維等が挙げられる。
【００３１】
上記中空繊維は、その長手方向が同一となるように３次元に配列される。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平１１−１０８９２８号公報参照）が挙げられる。また、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ねあわせ、それらの孔部に、中空繊維を通過させ、２枚の多孔板の間隔を開き、２枚の多孔板間の、中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させ硬化させる方法（特開２００１−１３３４５３号公報参照）が挙げられる。
【００３２】
次に配列体はその配列が乱れないように包埋される。包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法、繊維同士を熱融着により接着する方法等が挙げられる。
【００３３】
次に包埋された配列体の各中空繊維の中空部に、プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入し、中空部内で重合反応を行う。これにより中空部にゲルが保持され、ゲルにはプローブが固定される。
【００３４】
ゲル前駆体溶液としては、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の一種類以上と、架橋性モノマーとしてメチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等を含むものである。予めプローブの末端を不飽和官能基で修飾しておけば、プローブの末端を介してゲル前駆体と共重合することにより、ゲルの構成にプローブが化学結合する（特開２００４−１６３２１１号公報参照）。
【００３５】
次に、中空繊維の長手方向と交叉する方向で、切断してブロック体を薄片化する。ここで作製された薄片は、マイクロアレイとして使用できる。マイクロアレイの厚みは、０．１ｍｍ〜１ｍｍ程度である。切断は、例えばミクロトーム、レーザー等により行うことができる。
【００３６】
上述のマイクロアレイでは、中空繊維の中空部、すなわちマイクロアレイの貫通孔中のゲルにプローブが固定されている。よって、プローブは、３次元構造体に固定されているため、プローブはある空間内に固定されていることとなる。プローブの固定されているこの周辺環境は、空間自由度を有し、さらには異なる種類のプローブは物理的な隔壁を隔てて固定されている。よって、上記マイクロアレイは、平面基板上に高密度にプローブが固定されているマイクロアレイと異なり、そこに搭載されたプローブはプローブとして十分に機能し、さらに隣接する種類の異なるプローブとの非特異的反応はない。したがって、プローブは、リンカー、スペーサー等のハイブリダイゼーションに関与しない余分な配列を結合する必要なく設計され、マイクロアレイに固定することが可能である。
【００３７】
第２の工程では、上述のごとく調製したマイクロアレイに、相同性の高い配列を有する核酸の各々を、個々にハイブリダイズし、ハイブリットを検出し、検出データにより、相同性の高い配列を有する核酸の存在比を算出可能な数式を作成する。
【００３８】
ここで相同性の高い配列を有する核酸の各々を個々にハイブリダイズしハイブリットを検出する、とは、相同性が高い、つまりクロスハイブリする可能性が高いグループを構成する核酸Ａ及びＢが存在する場合、核酸Ａと核酸Ｂをそれぞれ単独でマイクロアレイに対してハイブリダイゼーションを行い、核酸Ａをハイブリした際の、プローブＡ及びプローブＢのシグナル強度を検出する。次に、新たなマイクロアレイに対して、同様に核酸Ｂをハイブリし、プローブＡ及びプローブＢのシグナル強度を検出することをいう。
【００３９】
このようにして得られたデータは、数式化する。具体的には、核酸Ａをハイブリした際のプローブＡのシグナル強度をＡ、プローブＢのシグナル強度をＢ’、核酸Ｂをハイブリした際のプローブＡのシグナル強度をＡ’、プローブＢのシグナル強度をＢとした場合、同一条件でハイブリした、核酸Ａ、核酸Ｂ混合物の、プローブＡにおけるシグナル強度Ｊ及びプローブＢにおけるシグナル強度は下記の式で表される。
【００４０】
Ｊ＝Ａ  ｘ＋Ａ’ｙ
Ｋ＝Ｂ’ｘ＋Ｂ  ｙ
（ここで、ｘ及びｙは、核酸Ａと核酸Ｂの相対量として表される。）
つまり、上記連立方程式の解ｘ、ｙを得ることにより、核酸Ａ、核酸Ｂの量比がわかることになる。
【００４１】
上述では、２種類の核酸（核酸Ａ及び核酸Ｂ）に対して説明したが、核酸の種類が３種類以上存在した場合においても同様に適用可能である。
【００４２】
また、多くのハイブリダイゼーションは、洗浄時のストリンジェンシーの違いによって、配列依存的にハイブリダイゼーション効率が変わるため、同一のマイクロアレイを、ストリンジェンシーを変更しながら複数回洗浄し、その都度検出することにより、検出回数に応じた個数の連立方程式が作成することもできる。よって、同一のマイクロアレイにおけるストリンジェンシーの異なる検出結果が多いほど、結果に客観性が得られる。
【００４３】
次に、第３の工程では、相同性の高い配列を有する核酸の存在比が不明な検体をマイクロアレイに供し、ハイブリッドを検出し、第２の工程で作製した数式に検出結果を代入し、検体中の相同性の高い配列を有する核酸の存在比を算出する。
【００４４】
具体的には、相同性の高い配列を有する核酸の存在比が不明な検体のプローブＡの検出結果を上述の式のＪに代入し、プローブＢの検出結果を式のＫに代入し、ｘ及びｙを求めることにより、核酸Ａ及び核酸Ｂの存在比を算出することが可能となる。
【００４５】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００４６】
例として、マウスのｍｉＲＮＡ配列である、mmu-miR-23aとmmu-miR-23bのマチュア配列のオリゴＤＮＡの存在比率を推定する数式を作成する。
【００４７】
（１）検体調製
Sanger instituteのmiRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/)によると、mmu-miR-23a及びmmu-miR-23bの配列は以下のとおりである。
【００４８】
mmu-miR-23a（配列番号１）：aucacauugccagggauuucc
mmu-miR-23b（配列番号２）：aucacauugccagggauuacc
これらの配列は、１塩基の違いしかないため、完全相補なプローブを設計し、核酸マイクロアレイに搭載した場合、単に検体をハイブリしただけでは、互いのプローブに互いの標的となる検体がクロスハイブリしてしまい、それぞれの量比を測定することは不可能である。
【００４９】
まず、ＤＮＡ自動合成装置により、表１の合成オリゴＤＮＡを合成し、１μｇ／μｌの濃度に調製した。
【００５０】
[表１]
2008035801.tif 000003
次に、表２に従い、検体Ａと検体Ｂを調製した。
【００５１】
[表２]
2008035801.tif 000004
調製した検体Ａ及び検体Ｂを、ULYSIS Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit（Kreatech社製）を用いて、表３の通りに混合、標識し、標識化サンプルＬ−検体ＡとＬ−検体Ｂを作製した。Labeling buffer及び、ULS labeling reagentは、キットに添付のものを使用した。
【００５２】
[表３]
2008035801.tif 000005
Ｌ−検体Ａ及びＬ−検体Ｂを、８５℃で１５分間加熱し、その後氷上で急冷した。Ｌ−検体Ａ、Ｌ−検体Ｂを、Sephadex G25 column(Amersham Bioscience製)のプロトコールに従って精製した。およそ２５μｌの精製液から１μｌを新しいチューブに分取し、Milli-Q  を９９９μｌ加えて、１０００μｌとした。希釈液から２０μｌの液を新しいチューブに分取し、Milli-Qを１００μｌ、２０×ＳＳＣ溶液を１５μｌ、２％  ＳＤＳ溶液を１５μｌ加え、Ｈ−Ｌ−検体Ａ、Ｈ−Ｌ−検体Ｂを作製した。
【００５３】
（２）マイクロアレイの作製
＜プローブの調製＞
まず、表４の配列のプローブとなるオリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成装置により合成した。
【００５４】
[表４]
2008035801.tif 000006
mmu-miR-23a_asは、上述のmmu-miR-23a-tに対して完全相補配列であり、mmu-miR-23b_asは、上述のmmu-miR-23b-tに対して完全相補配列である。
【００５５】
合成の際、最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）を該オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基が導入された５’−O−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。
【００５６】
次いで、それらオリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、５’末端ビニル化オリゴヌクレオチド（以下、プローブ）を調製した。
【００５７】
＜中空繊維束薄片の製造＞
図１に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図１中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
【００５８】
まず、直径０．３２ｍｍの孔が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦横各１２列で合計１４４個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板２枚を準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維（三菱エンジニアリングプラスチック社製  カーボンブラック１質量％添加）を１本づつ、通過させた。
【００５９】
Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
【００６０】
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
【００６１】
次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン４２７６、コロネート４４０３）の総重量に対し、２．５質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
【００６２】
ゲル充填中空繊維配列体の製造時に、表５に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を調製した。
【００６３】
[表５]
2008035801.tif 000007
次に、プローブを含むゲル前駆体重合性溶液をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の端部をこの溶液中に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を７０℃とし、３時間かけて重合反応を行った。
【００６４】
このようにしてプローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
【００６５】
次に得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．５ｍｍの薄片シート（ＤＮＡマイクロアレイ）を５０枚得た。
【００６６】
（３）ハイブリダイゼーション操作
（１）で調製したＨ−Ｌ−検体Ａ及びＨ−Ｌ−検体Ｂを、７０℃で２分間、熱した後に、10,000rpmで２分間遠心処理を行い、ハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーションは、５０℃、遮光条件下で１６時間行った。洗浄は、２ｘＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ、５０℃で４０分間洗浄後、２ｘＳＳＣ、５０℃で１０分間洗浄した。
【００６７】
検出は、冷却ＣＣＤカメラ方式の蛍光検出装置を用いて、ハイブリダイゼーション後のマイクロアレイの各プローブスポットを画像化及び数値化した。結果は表６に示した。
【００６８】
[表６]
2008035801.tif 000008
次に、上記検出後のマイクロアレイを再度、２ｘＳＳＣ、５５℃で３０分間洗浄し、再検出に供した。得られた数値は、バックグラウンドシグナルを減算すると、表７の通りとなった。
【００６９】
[表７]
2008035801.tif 000009
（４）未知検体の存在比の推測方法
上記の実験結果より、mmu-miR-23a及びmmu-miR-23bの配列を含むが、存在比が不明な検体Ｃは、下記の連立方程式（式Ｉ）で、量比（x及びy）が推測できる。
【００７０】
[式Ｉ]
2008035801.tif 000010
検体のハイブリ結果を検出後、ＩとＪの値を上記の数式に当てはめることにより、ｘとｙの数値が算出される。このｘとｙの比率が、mmu-miR-23a-tとmmu-miR-23b-tの量比となる。
【００７１】
また、検体は、下記の連立方程式（式ＩＩ）でも量比が推測できる。
【００７２】
[式ＩＩ]
2008035801.tif 000011
検体のハイブリ結果を検出後、ＫとＬの値を上記の数式に当てはめることにより、ｘとｙの数値が算出される。このｘとｙの比率が、mmu-miR-23a-tとmmu-miR-23b-tの量比となる。
【００７３】
（５）推測値の実証
上述の連立方程式の整合性を確認するために、モデル検体（検体Ｃ及び検体Ｄ）を用いて測定した。検体Ｃ及び検体Ｄは、表８に従い調製した。
【００７４】
[表８]
2008035801.tif 000012
調製した検体Ｃ及び検体Ｄを、上述の（１）と同様の方法で標識、精製し、Ｈ−Ｌ−検体Ｃ、Ｈ−Ｌ−検体Ｄを作製した。これらのサンプルは、mmu-miR-23a-tとmmu-miR-23b-tの量比が、１：３及び、１：１であるので、これらのサンプルを用いて得られる推定量比は、ｘ：ｙ＝１：３および、ｘ：ｙ＝１：１に近い値が得られるものと考えられる。
【００７５】
Ｈ−Ｌ−検体Ｃ及びＨ−Ｌ−検体Ｄを、７０℃で２分間熱した後に、１００００ｒｐｍで２分間遠心処理を行い、ハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーションは、５０℃、遮光条件下で１６時間行った。洗浄は、２ｘＳＳＣ，  ０．２％  ＳＤＳ、５０℃で４０分間洗浄後、２ｘＳＳＣ、５０℃で１０分間洗浄した。
【００７６】
検出は、冷却ＣＣＤカメラ方式の蛍光検出装置を用いて、ハイブリダイゼーション後のマイクロアレイの各プローブスポットを画像化及び数値化した。結果は表９に示した。
【００７７】
[表９]
2008035801.tif 000013
検出後、同一のマイクロアレイを再度、２ｘＳＳＣ、５５℃で３０分間洗浄し、再検出に供した。
【００７８】
得られた数値は、バックグラウンドシグナルを減算すると、表１０の通りとなった。
【００７９】
[表１０]
2008035801.tif 000014
表９及び表１０で得られた結果を式Ｉ及び式ＩＩの連立方程式のＩ、Ｊ、Ｋ及びＬに代入し、ｘ及びｙを求めた（表１１及び表１２）。
【００８０】
[表１１]
2008035801.tif 000015
[表１２]
2008035801.tif 000016
即ち、H-L-検体Cにおいては、mmu-miR-23a-t：mmu-miR-23b-tは、５０℃洗浄時の推定値でおよそ１：３、５５℃洗浄時の推定値でおよそ１：３となった。
【００８１】
また、H-L-検体Dにおいては、mmu-miR-23a-t：mmu-miR-23b-tは、５０℃洗浄時の推定値でおよそ１：１、５５℃洗浄時の推定値でおよそ１：１となった。
【００８２】
これらの推定値は、H-L-検体C及びH-L-検体Dにおける、mmu-miR-23a-tとmmu-miR-23b-tの混合比、１：３と１：１に一致した（表８）。
【００８３】
よって、本方法を用いることにより、mmu-miR-23a-tとmmu-miR-23b-tの混合比を正確に推定することができた。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】中空繊維を配列するための冶具を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列番号５：mmu-miR-23aに完全相補な合成プローブ
配列番号６：mmu-miR-23bに完全相補な合成プローブ
【図１】
2008035801.tif 000017
【配列表】
2008035801000001.app