(57)【要約】【課題】半値幅ｗ１／２が１．０ｓ、すなわち標準偏差σが０．４ｓ程度のピークには、理論段数Ｎを算出する場合に、レスポンス５０ｍｓでは、十分には短くないことがわかった。【解決手段】本発明の特徴は、ピーク幅の時間に適正な検出レスポンスと、適正なデータ収集間隔を設定することにある。検出レスポンス及びデータ収集間隔が大き過ぎても小さ過ぎても、理論段数は低下するため、ピーク幅の時間に適正な検出レスポンスと、適正なデータ収集間隔を設定する必要がある。【選択図】図１
2008083040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともカラム、検出器とデータ処理装置を有する液体クロマトグラフ装置において、検出器の信号レスポンスが１０ｍｓ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項２】
ポンプ、注入装置、カラム、検出器とデータ処理装置を有する液体クロマトグラフ装置において、検出器の信号レスポンスが１０ｍｓ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項３】
少なくともカラム、検出器とデータ処理装置を有する液体クロマトグラフ装置において、検出器の信号レスポンスが１０ｍｓ以下であり、かつデータ処理の収集時間の間隔が１０ｍｓ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項４】
ポンプ、注入装置、カラム、検出器とデータ処理装置を有する液体クロマトグラフ装置において、検出器の信号レスポンスが１０ｍｓ以下であり、かつデータ処理の収集時間の間隔が１０ｍｓ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項５】
請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、
検出器フローセルの光路長体積が３μＬ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項６】
請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、
配管の内直径が０．１ｍｍ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項７】
請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、
サンプル注入量が３μＬ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項８】
請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、
カラム内直径が２ｍｍ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項９】
請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、
ポンプミキサ体積が３００μＬ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項１０】
請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、
カラム充填剤粒子直径が３μｍ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項１１】
請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、
デュエルボリュームが５００μＬ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項１２】
請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、
カラムがモノリス型であることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフ装置に関し、特に、高速分析を目的とした高速液体クロマトグラフ装置に好適な技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
高速液体クロマトグラフィの技術分野において、カラム充填剤の粒径の微細化が進められている。近年では、粒径２μｍ以下の充填剤を用いることによりクロマトグラム分析時間が１分間程度になっている。また、粒子型充填剤を用いないモノリスカラムも普及しており、同様に分析時間が１分間程度に実現されている。本技術に関連するものとして、特許文献１がある。
【０００３】
クロマトグラムのピーク保持時間ｔＲ（出現時間）が早くなるとそれに伴い、おおむね保持時間に比例してピークの幅が狭くなる。保持時間ｔＲが３０ｓになると、理論段数Ｎ（第１５改正日本薬局方：比例係数５．５４）が５，０００段の場合、ピークの半値幅ｗ１／２が１．０ｓになる。理論段数Ｎは、分離の良さを示すカラムの性能指数として広く用いられている。
【０００４】
【数１】
2008083040.tif 000003
【０００５】
ピークの波形が理想的に正規分布関数（ガウシアン）の形であるならば、理論段数Ｎは次のようになる。σはガウシアンの標準偏差である。
【０００６】
【数２】
2008083040.tif 000004
【０００７】
例えば、前述の標準偏差σは、０．４２ｓとなる。ちなみに式１の係数５．５４は、ガウシアンのピークの半値幅ｗ１／２と標準偏差σを関係付ける８ｌｏｇｅ２に由来がある。
理論段数Ｎは、検出信号のレスポンス（時定数τに相当）の影響を受けると、悪くなることは知られている。つまりピーク形状が交流回路の過渡現象的に指数関数を重畳しテーリングすると、半値幅ｗ１／２が広がり、理論段数Ｎが低下する。
【０００８】
一般に、ピーク波形の広がりは分散Ｖ（２次のモーメント）で解析する。指数関数を重畳したガウシアンは、指数的に修飾されたガウシアンＥＭＧ（Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇａｕｓｓｉａｎ）になる。その分散Ｖは次式で表される。
【０００９】
【数３】
2008083040.tif 000005
【００１０】
理論段数Ｎが時定数τにより１％影響を受けるのは、式３が二乗和のため時定数τが標準偏差σの１０％程度のところと言える。前述の例に沿って述べると、ピーク半値幅ｗ１／２が１．０ｓの場合、理論段数Ｎは時定数τが０．０４〜０．０５ｓの時に１％程度影響を受けると推定される。逆に言うと、時定数τを０．０４〜０．０５ｓにさえ設定しておけば、保持時間ｔＲが３０ｓ、真の理論段数Ｎが５，０００段のピークに対しては１％程度しか理論段数Ｎに影響を与えないと推定される。さらに言えば、日本薬局方の理論段数Ｎは、式１で表されるように半値幅ｗ１／２を用いて計算するため時定数τにより受ける影響の度合いは式３を用いて表現されるよりも少なく、結局１％も影響を受けないことが推定される。この議論は、真の理論段数Ｎを２倍の１０，０００段としても同様であり、時定数τを√２分の１小さく０．３ｓにすれば、１％も影響を受けないことになる。一般に、理論段数Ｎは、測定上の不確かさも小さくなく、１％の有意差を議論することは稀であり、実用上、ここまで小さな時定数τは要求されない。
【００１１】
まとめると、保持時間ｔＲが３０ｓ、ないしは半値幅ｗ１／２が１．０ｓのピークを対象にしている場合には、時定数τを０．０５ｓ、すなわち５０ｍｓに設定しておけば、それより小さな時定数τに設定する必要は特にないと考えられていた。
【００１２】
【特許文献１】特開平７−１０３９５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従来は、前述の背景技術の認識レベルであった。しかしながら実験を実施しているに従って、理論段数Ｎを算出する場合に、レスポンス５０ｍｓでは、半値幅ｗ１／２が１．０ｓ、すなわち標準偏差σが０．４ｓ程度のピークには、十分に短くないことがわかってきた。この推定原因は、次のようなものが幾つか考えられる。
【００１４】
（１）．データ収集間隔が適正ではないと、ピーク高さが正確に測定できない。
【００１５】
（２）．データ収集間隔が適正ではないと、ピーク半値幅が正確に測定できない。
【００１６】
（３）．データ収集間隔が適正ではないと、検出誤差（不確かさ）の影響を受ける。
【００１７】
（４）．レスポンスが適正ではないと、検出誤差（不確かさ）の影響を受ける。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の特徴は、ピーク幅の時間に適正な検出レスポンスと、適正なデータ収集間隔を設定することにある。検出レスポンス及びデータ収集間隔が大き過ぎても小さ過ぎても、理論段数は低下するため、ピーク幅の時間に適正な検出レスポンスと、適正なデータ収集間隔を設定する必要がある。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、より正確な理論段数を算出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
高速液体クロマトグラフ装置の高速化の手法から説明し、適正な検出レスポンスと、適正なデータ収集間隔を設定する形態を説明する。
【実施例１】
【００２１】
以下、図面を用いて、本発明の１実施例を説明する。
【００２２】
図１は、本発明のシステム構成例を示す。液体クロマトグラフ装置１は、分析機器モジュールのポンプ２、オートサンプラ（注入装置）３、カラムオーブン４、検出器５、およびデータ処理装置１０からなる。データ処理装置１０はシステム制御部６とデータ処理部７から構成され、システム制御部６は分析機器制御部８とパラメータ記憶部９からなる。分析時には、データ処理装置１０のシステム制御部６から命令が発せられ、各モジュールのポンプ２、オートサンプラ３、カラムオーブン４、検出器５に分析シーケンスの一連のパラメータ群が送信（ダウンロード）される。試料注入ごとにデータ処理部７は検出器５からの検出信号をデジタル受信し、クロマトグラム波形として一旦形成し、データ解析する。
【００２３】
図２は、本発明の流路構成例を示す。液体クロマトグラフ装置１は、溶離液１１ａを送液するポンプ１２ａと溶離液１１ｂを送液するポンプ１２ｂを送液系として具備する。本例では、二つの溶離液を高圧下のジョイント１３とミキサ１４で混合するいわゆる高圧グラジエント溶出法を用いている。オートサンプラ１５から試料を注入し、分析カラム１６（例えば、内径２ｍｍ、長さ５０ｍｍ、充填剤粒径２μｍ）に送り込む。試料中の各溶質が、分析カラム（固定相）１６内で溶離液（移動相）１１ａまたは溶離液（移動相）１１ｂにより分離展開される。各溶質は、移動相中にまたは固定相中に存在する分配比率の差異により、保持時間が異なる。各溶質の保持時間を安定させるためにカラムオーブン１７を用いて分析カラム１６を恒温する。分離展開された各溶質は保持時間に差異を持ちながら検出器１８のセル２０に到達し、廃液タンク１９に廃液する。
【００２４】
本発明の説明のため、検出からデータ処理までを時間分解能の視点から詳細に説明する。検出器５には、紫外（ＵＶ）検出器、可視（ＶＩＳ）検出器、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）、蛍光（ＦＬ）検出器、示差屈折率（ＲＩ）検出器、電導度検出器などが使用可能である。本例では代表的なＵＶ検出器を用い、光路長５ｍｍで光が透過する体積が０．９８μＬのフローセルを搭載する。吸光度を算出するために、レファレンス光量とサンプル光量をそれぞれに検出用フォトセルを用いて検出する。一次検出信号はアナログだが、速やかにそれぞれＡＤ変換する。一旦、吸光度を計算し信号処理上、ひとつ前のデジタル値と今回のデジタル値を一定の重み付け加重平均することを繰り返し処理することにより、時定数τ相当のレスポンス（キャラクタリスティックな応答時間）を有する検出信号を生成することができる。本システムの例では、レスポンスは０．０１，  ０．０２，
０．０５の選択が可能である。この検出信号をデータ処理装置１０に送り届ける検出データポイントの時間間隔をデータ収集間隔として定義する。本システムの例では、データ収集間隔１０，  ２０  ，５０，  １００ｍｓの選択が可能である。
【００２５】
ピーク幅σ（ｓ）に対し、適正なレスポンスτ（ｓ）をプロットしたものが図３である。両対数グラフを用いて、最適と推量される値を中心線（経験値）で表し、その上下限をそれぞれ√１０倍したものと、１／√１０倍したものを目安として線を引いた。
【００２６】
【数４】
2008083040.tif 000006
【００２７】
また、同様にピーク幅σ（ｓ）に対し、適正なデータ収集間隔ΔＤ（ｓ）をプロットしたものが図４である。その上下限も同様にそれぞれ√１０倍したものと、１／√１０倍したものを目安として線を引いた。
【００２８】
【数５】
2008083040.tif 000007
【００２９】
グラフの図３および図４においてピーク幅σを０．００１ｓから示したのは、次の理由による。液体クロマトグラフィの歴史を遡るとカラム充填剤の粒径が２０μｍから２μｍに一桁小さくなったことで、数十分間から数十秒間へと約二桁高速の分析ができるようになったと捉えることができる。現在、ピーク幅σで０．１〜１．０ｓ程度のピークを扱っているので、将来、同様な技術革新により高速化が進められると仮定すれば、ピーク幅σで０．００１〜０．０１ｓ程度のピークを対象にする可能性があるとの予測に基づいている。
【００３０】
図５にはレスポンスとデータ収集間隔をいずれも５０ｍｓと１０ｍｓに設定した時のクロマトグラム例を、表１には図５のクロマトグラム時の理論段数比較を示した。
【００３１】
【表１】
2008083040.tif 000008
【００３２】
速いピークの幅σが０．２６，  ０．３０，  ０．３７ｓの理論段数Ｎにおいては、レスポンスとデータ収集間隔それぞれで５０ｍｓから１０ｍｓへ設定を変更した場合、１０％程度の効果があることがわかる。
【００３３】
本発明は、液体クロマトグラフィの高速化の観点から、カラム充填剤の粒径を小さくし、カラムの長さＬ（カラム断面積を乗じるとカラム体積）を短くし、線速度ｕ（カラム断面積を乗じると流量）を引き上げていくという手法を採用する場合に有効である。高速化とは一言で言うと、非保持ピークの（溶出）時間ｔ０を最小化することであり、時間ｔ０が短くなれば、ピーク幅σ（ｓ）がそれに比例し、短くなる。実際は流量が１．０ｍｌ／ｍｉｎを中心として使用されるため、高速化では時間に関係するパラメータｔ０や、ピーク幅σ（ｓ）、のみならず、カラム体積、フローセル体積なども比例して小さくする必要がある。さもなければ、フローセル体積が無視できなくなり、ピーク幅に対する時定数の議論と同様に溶質の占める体積が広がりテーリングピークを生じてしまう。
【００３４】
例えば、先の実施例では、ピークの幅σが０．３ｓ程度であるので、流量１．０ｍｌ／ｍｉｎの場合、ピークの幅σは体積換算で５μＬとなり、フローセル体積０．９８μＬが影響することになり、体積の小さなフローセル（例えば、０．３μＬ）が必要となる。
【００３５】
配管系の内部体積もカラム外の広がりに影響するため無視できない。カラム外の広がり（分散σｅｘｔ２）は配管の内半径ｒの４乗に比例することが知られている。
【００３６】
【数６】
2008083040.tif 000009
【００３７】
ここでＬは配管長さ、Ｆは流量、ＤＥは拡散係数である。一般に、本例の場合、分散σｅｘｔ２を数十μＬ２程度に抑える必要があり、内径０．１ｍｍ、半径でｒ＝０．０５ｍｍ以下のチューブを用いることが望ましい（例：ベンゼンＤＥ＝１０−９ｍ２ｓ−１）。
【００３８】
また、配管で拡散するのみならず、配管接続部や流れの半径方向の形状が拡大したり縮小したりする構造の場合は、極めて大きく拡散することが知られている。このため、半径方向の寸法変化を極力小さくすることが必要である。
【００３９】
また、この時間及び体積の議論はモノリスカラムの場合でも全く同様の対応が必要になる。モノリスカラムは、一般に空隙率が高く、流量に対する負荷抵抗が低いため、圧力損失が比較的小さい。結局、充填剤カラムより流量を多く、または線速度を引き上げ送液し高速化を図ることとなる。
【００４０】
本発明の液体クロマトグラフ装置は、高速分析を目的としており、一定の長さのカラムに線速度を引き上げて高速化を図ることになる。カラムの長さは要請する理論段数によりおおよそ見出され、一般に液体クロマトグラフ装置の耐（上限）圧力値により線速度が求まり高速度の上限（分析時間の最小値）が決定される。
【００４１】
また現在、汎用的に使用されている液体クロマトグラフは流量がおよそ１ｍｌ／ｍｉｎを用いて使用されることが代表的であり、溶媒（移動相）使用量の観点からそれ以下で使用することが望ましい。流量１ｍｌ／ｍｉｎの要請も各種パラメータを規定するためには非常に重要なインプットで、流路内の体積最適化のみならずカラム内径の設定にも寄与する。
【００４２】
標準的な分離性能として要求される理論段数５，０００段を要請する時、保持時間３０ｓを例にとると、式１より標準偏差は０．４２ｓになった。ピークの時間区間（スタート点からエンド点）は標準偏差の８〜１０倍とすると３〜４ｓとなり、流量１ｍｌ／ｍｉｎ時の移動相体積約１００μＬに対応する。ピークの面積計算等をする場合には、ピークの形成ポイント数としてはスタート点からエンド点で３０点が必要であると言われており、時間分解能（検出レスポンスやデータ収集間隔）のみならずフローセルのキャラクタリスティックなサイズもピークの時間区間の１／３０倍の体積分解能が必要であると考えられる。また、カラム外の広がり（拡散）の観点からも、このスケールのピークには検出器フローセルの光路長体積が３μＬ以下であることが必要であると言える。流量１ｍｌ／ｍｉｎで標準偏差０．４２ｓのピークの場合、あまり微小過ぎても光量不足などの弊害もあるため０．０１μＬ（１０ｎＬ）以上が実用レベルであろう。
【００４３】
前述のカラム外の広がりに関連して、流路配管の内径にも注意が必要である。極力カラム外の広がりを発生させたくないとしても、流路配管には数百ｍｍは必要であり、ゼロにはできない。ピークのキャラクタリスティックな体積サイズが約５０μＬの場合、この１／１０倍以上のカラム外広がり、つまり約５μＬ以上が望ましくないと考えられる。汎用の液体クロマトグラフでは内径０．２５ｍｍのチューブが多用されていたが、０．２５ｍｍのチューブを数百ｍｍ使用していたのでは、５μＬ以下のカラム外広がりに抑えることはできない。層流の場合、拡散体積はチューブ断面積に比例するため、約１／６倍の拡散性能が獲得できる配管内直径が０．１ｍｍ以下のチューブを使用する必要がある。また、配管が細過ぎては過剰な圧力損失が発生するため、流量１ｍｌ／ｍｉｎで標準偏差０．４２ｓのピークの場合、０．０５ｍｍより細い内径のチューブを使用することはない。
【００４４】
本発明で対象にしているような要請理論段数とシステム圧力の制限下では、代表的な線速度として１０ｍｍ／ｓ程度を確保する必要がある。流量約１ｍｌ／ｍｉｎの設定で、線速度１０ｍｍ／ｓ程度を確保しようとすると、カラムの内径はおよそ２ｍｍ以下が必要となる。ここでは粒子充填型のカラムでは空隙率は５０〜６０％であることを用いている。一方、０．０５ｍｍ以下の内径カラムに流量約１ｍｌ／ｍｉｎを送液することは、充填剤の粒子直径やカラム長にも依存するが、一般的には使用困難な圧力損失を発生させてしまう。
【００４５】
経験則ではあるが、サンプル注入量の上限はカラム内径に依存する。特にアイソクラティック溶出の場合の非保持ピークが顕著であるが、サンプル注入量上限はカラム断面積に比例する。これはカラム入口の面積で一旦サンプル溶質を受け止めるためであろう。汎用的に用いられている内径４．６ｍｍカラムの時、サンプル注入量上限が１５μＬとすると、内径２．０ｍｍカラムの時、約３μＬとなる。もちろん、サンプル量が極端に少なすぎては、検出信号が得られ難くなることのみならず、ハンドリングも難しくなり吸引量のバラツキが著しく大きくなってしまう。このため、０．０１μＬ（１０ｎＬ）未満では実用性は低い。
【００４６】
カラム内容積が小さくなると、グラジエント溶出の遅れ（デュエルボリューム）が無視できなくなる。これはグラジエント溶出のタイムプログラムがカラム内容積に比例して時間短縮されるためである。流量約１ｍｌ／ｍｉｎの設定で分析（保持）時間が３０ｓとすると、デュエルボリュームはそれ相当の体積を超えてはならないため、５００μＬ以下が必要になる。但し現実的には配管系体積はゼロにはできないため、最小でも数μＬのデュエルボリュームは残ってしまう。
【００４７】
またこれに伴い、ポンプ用ミキサの容量も制限される。通常、配管系のデュエルボリュームは約２００μＬであるため、ミキサ容量としては３００μＬ以下の容量が必要である。ミキサ容量はグラジエント性能と相関するわけだが、流路内にミキサを組み入れなくとも前述のデュエルボリュームは存在し、ミキシングの作用は微小ながらも存在することにはなる。
【００４８】
前述のようにカラムには理論段数の要請がありカラム長を確保しなければならない。また一方、高速化の目的でそのカラム長のカラムに対し線速度を引き上げると圧力損失が増大してしまう。この分離性能と圧力損失の両方の性能側面に対し、ひとつの均衡案を与える充填剤が粒子直径３μｍ未満の充填剤である。
【００４９】
粒径３μｍ未満のカラムを用いる場合には、最適な線速度であれば理論段高さ８μｍ以下が得られ、５，０００段以上の理論段数を得るためには、約５０ｍｍのカラム長が必要となる。
【００５０】
流量  約１ｍｌ／ｍｉｎで線速度１０ｍｍ／ｓ程度になり、２５℃１００％メタノールの粘度移動相を送液する場合、圧力損失は３０ＭＰａ以下の良好に低い結果が得られる。
【００５１】
理論段数と圧力損失のもうひとつの均衡案は、モノリスカラムである。即ち、粒子直径２〜３μｍの充填剤を用いた場合の理論段高さを獲得しつつ、粒子型充填剤の数分の１倍の低い圧力損失が得られる。つまり、前述の実施例の条件であれば、１０ＭＰａ以下の圧力損失が得られることになる。
【００５２】
本発明は、高速液体クロマトグラフ装置に特に有効なものであるが、上記実施例に限定されるものではなく、その技術思想の範囲内において、種々変形可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の実施例を示すシステム構成図である。
【図２】本発明の実施例を示す流路構成図である。
【図３】本発明の実施例を説明するためのピーク幅に応じた正確な理論段数を得る最適なレスポンスを示す図。
【図４】本発明の実施例を説明するためのピーク幅に応じた正確な理論段数を得る最適なデータ収集間隔を示す図。
【図５】本発明の実施例を説明するためのクロマトグラム例を示す図。
【符号の説明】
【００５４】
１…高速液体クロマトグラフ、２…ポンプ、３…オートサンプラ、４…カラムオーブン、５…検出器、６…システム制御部、７…データ処理部、８…分析機器制御部、９…パラメータ記憶部、１０…データ処理装置、１１…溶離液、１２…ポンプ、１３…ジョイント、１４…ミキサ、１５…オートサンプラ、１６…分析カラム、１７…カラムオーブン、１８…検出器、１９…廃液タンク、２０…セル。
【図１】
2008083040.tif 000010
【図２】
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【図３】
2008083040.tif 000012
【図４】
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【図５】
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