(57)【要約】      （修正有）【課題】試薬キットやセンサーなどの用途に利用するための安定なＮＡＤＨデヒドロゲナーゼおよびその製造方法の提供。【解決手段】下記の理化学的性質を有する特定のアミノ酸配列からなるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。（ａ）２０Ｕ／ｍｌ以上の酵素濃度で８０℃、３０分間処理後も５０％以上の活性が残存する。（ｂ）２ｍＭの銀イオン、水銀イオン存在下で２５℃、３０分間処理後も６０％以上の活性が残存する。（ｃ）トリトンＸ−１００、ブリジ３５、ツイーン２０、スパン２０から選ばれる少なくとも１種の非イオン系界面活性剤存在下にて、２０％以上の活性の上昇が認められる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有するＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。
・  下記の反応を触媒する。
NADH + H+ + Acceptor(ox)  ⇒  NAD++ Acceptor(red)  
・  ２０Ｕ／ｍｌ以上の酵素濃度で８０℃、３０分間処理後も５０％以上の活性が残存する。
・  ２ｍＭの銀イオン、水銀イオン存在下で２５℃、３０分間処理後も６０％以上の活性が残存する。
【請求項２】
下記の理化学的性質を有することを特徴とする、請求項１記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。
・  トリトンＸ−１００、ブリジ３５、ツイーン２０、スパン２０から選ばれる少なくとも１種の非イオン系界面活性剤存在下にて、２０％以上の活性の上昇が認められる。
【請求項３】
下記の理化学的性質を有することを特徴とする、請求項１または２記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。
・  反応至適ｐＨ：７．５
・  反応至適温度：４０℃
・  ｐＨ安定性：６〜９で８０％以上活性残存
【請求項４】
アミノ末端の５残基のアミノ酸配列が、「Ala-Lys-Val-Leu-Tyr」であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。
【請求項５】
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれかに記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。
【請求項６】
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを含む試薬キット。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを含むセンサー。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子。
【請求項１０】
請求項９に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換体を培養することを特徴とするＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱や重金属に対して極めて安定なＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、その製造方法および用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（NAD(P)H:(acceptor)oxidoreductase:  EC1.6.99.-）は、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を電子供与体として、酸化型電子受容体（Acceptor(ox)）を還元型（Acceptor(red)）に変換する反応を触媒する酵素である。臨床診断の分野においては、血中あるいは尿中の物質を測定する際に、該物質に反応する脱水素酵素によりＮＡＤＨを生じさせ、その後の追随としてＮＡＤＨデヒドロゲナーゼにより酸化型色原体を還元型の色素に変換して検出する際に使用されている。
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、微生物、動物などに広く存在することが知られているが、例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia coli）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）などの微生物が生産するＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが報告されており、また、これらのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離し、遺伝子工学技術によってＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの大量生産が可能となることも知られている。
しかしながら、従来のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは重金属等の一般的な酵素の安定性に悪影響を与えるケミカルに対して安定なものが知られておらず、高度に安定なＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは得られていなかった。
【特許文献１】特開平１０−３０９１９２号公報
【特許文献２】特許第１７１５７９５号公報
【特許文献３】特許第１９７３４３４号公報
【非特許文献１】I.Mainsら，「Biochem.J.」,1980年,第191巻,p457-465
【非特許文献２】M.Nakanishiら，「J.Bio.Chem.」,2001年, 第276巻,第49号,p46394-46399
【非特許文献３】K.Itoら，「ActaCrystallograph.Sect.F Struct.Biol.Cryst.Commun.」,2005年, 第61巻,p399-402
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、産業上有用である、熱や重金属に対して極めて安定なＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、その製造方法および用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼに関する研究を進めた結果、偶然にではあるが熱や重金属に対して極めて安定なＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを得ることに成功し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、以下のような構成からなるものである。
［項１］
下記の理化学的性質を有するＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。
・  下記の反応を触媒する。
NADH + H+ + Acceptor(ox)  ⇒  NAD++ Acceptor(red)  
・  ２０Ｕ／ｍｌ以上の酵素濃度で８０℃、３０分間処理後も５０％以上の活性が残存する。
・  ２ｍＭの銀イオン、水銀イオン存在下で２５℃、３０分間処理後も６０％以上の活性が残存する。
［項２］
下記の理化学的性質を有することを特徴とする、項１記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。
・  トリトンＸ−１００、ブリジ３５、ツイーン２０、スパン２０から選ばれる少なくとも１種の非イオン系界面活性剤存在下にて、２０％以上の活性の上昇が認められる。
［項３］
下記の理化学的性質を有することを特徴とする、項１または２記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。
・  反応至適ｐＨ：７．５
・  反応至適温度：４０℃
・  ｐＨ安定性：６〜９で８０％以上活性残存
［項４］
アミノ末端の５残基のアミノ酸配列が、「Ala-Lys-Val-Leu-Tyr」であることを特徴とする、項１〜３のいずれかに記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。
［項５］
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる、項１〜４のいずれかに記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。
［項６］
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む、項１〜４のいずれかに記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ。
［項７］
項１〜６のいずれか１項に記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを含む試薬キット。
［項８］
項１〜６のいずれか１項に記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを含むセンサー。
［項９］
項１〜６のいずれか１項に記載のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子。
［項１０］
項９に記載の遺伝子を含むベクター。
［項１１］
項１０に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
［項１２］
項１１に記載の形質転換体を培養することを特徴とするＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの製造方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、熱や重金属に対して極めて安定なＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを創出することが可能となり、産業利用上有用なＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを供給することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明における「安定性」は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが十分に精製され、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、または２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中に溶解された状態で、酵素活性の一定時間における変化を残存率として表わし、指標としている。「十分に精製された」とは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ以外の夾雑タンパク質が見られない状態をいう。
【０００８】
本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質は、下記の理化学的性質を有するものであれば特に限定されない。
（ａ）下記の反応を触媒する。
NADH + H+ + Acceptor(ox)  ⇒  NAD++ Acceptor(red)  
（ｂ）２０Ｕ／ｍｌ以上の酵素濃度で８０℃、３０分間処理後も５０％以上の活性が残存する。
（ｃ）２ｍＭの銀イオン、水銀イオン存在下で２５℃、３０分間処理後も６０％以上の活性が残存する。
【０００９】
更に、下記の理化学的性質を有するものが挙げられる。
（ｄ）トリトンＸ−１００、ブリジ３５、ツイーン２０、スパン２０から選ばれる少なくとも１種の非イオン系界面活性剤存在下にて、２０％以上の活性の上昇が認められる。
更に、下記の理化学的性質を有するものが挙げられる。
（ｅ）反応至適ｐＨ：７．５
（ｆ）反応至適温度：４０℃
（ｇ）ｐＨ安定性：６〜９で８０％以上活性残存
【００１０】
更に、アミノ末端の５残基のアミノ酸配列が、「Ala-Lys-Val-Leu-Tyr」であるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００１１】
更に、配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが好ましい。アミノ酸配列の相同性は、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ等の市販の遺伝子解析ソフトウェアを利用した２種類の配列のｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈにより検索することができる。このようなＮＡＤＨデヒドロゲナーゼとしては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ等が例示され、特にバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが好適なものとして例示される。そのアミノ酸配列は配列表の配列番号２、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子は配列番号１でそれぞれ示される。これらはいずれも公共のデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪなどに記載されている。なお、配列番号２において、アミノ酸の表記は、アラニンを１として番号付けされている。
【００１２】
本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質であれば、野生型のものに限らず何らかの改変が施されたものであっても良い。改変としては、例えばアミノ酸を欠失、置換もしくは付加されたもの、分子間または分子内架橋が施されたもの、糖鎖やその他の官能基により化学修飾されたもの、あるいは、ヒスチジンタグが付与されたもの、各種融合タンパク質などが含まれるが、特に限定されない。
【００１３】
本発明はさらに、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む。本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が好適である。その遺伝子の配列は、配列番号１で示される。これは公共のデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪなどに記載されている。
【００１４】
後述の実施例にて記載したように、本発明者らは、バチルス・ズブチリスを遺伝子給源として用い、データベース上でエシェリヒア・コリーのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼと３１％の相同性を示すタンパク質をコードする遺伝子（ｙｖａＢ）について検討を進めた。結果として、ｙｖａＢが相同性から予想される通りＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードすることを見い出した。しかしながら、予期せぬことに、ｙｖａＢがコードするＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、２０Ｕ／ｍｌ以上の酵素濃度で８０℃、３０分間処理後も５０％以上の残存活性を示し、更には２ｍＭの銀イオン、水銀イオン存在下で２５℃、３０分間処理後も６０％以上の残存活性を示すことが判明した。常温菌であるバチルス・ズブチリスより、このような高い安定性を示す酵素が得られることは予想外であり、当業者が想定し得ない結果であった。また、ｙｖａＢがコードするＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、トリトンＸ−１００、ブリジ３５、ツイーン２０、スパン２０から選ばれる少なくとも１種の非イオン系界面活性剤存在下にて、２０％以上の活性の上昇が認められ、これも当業者が想定し得ない結果であった。
【００１５】
本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。ここでストリンジェントな条件とは、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドのＴｍから該Ｔｍより１５℃、好ましくは１０℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件をいう。具体的には、例えば一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液（例えば、×６ ＳＳＣ、×５ デンハルト、０．１％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ）中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件をいう。本発明において、配列番号１に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号２）と８０％以上の相同性を有するアミノ配列をコードする塩基配列は、前記のストリンジェントな条件下で配列番号１に記載の塩基配列とハイブリダイズする塩基配列に相当すると考えられる。
【００１６】
本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、さらに、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの発現を向上させるように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を変更したものを含み得る。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、あるいは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、あるいはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００１７】
本発明はさらに、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むベクター、さらには該ベクターで形質転換された形質転換体を含む。作製されたＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを生産する形質転換体となる。
【００１８】
ベクターとしてプラスミドを用いる場合、例えば、エシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００１９】
本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを生産する菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、ＰＣＲ法の利用により、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００２０】
本発明において、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を得る方法としては、例えば、遺伝子配列が未知のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ生産菌であれば、染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得ることでできる。
【００２１】
遺伝子配列が公知となっているものであれば、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのコードする遺伝子が増幅されるようなプライマーを作成した上で、ＰＣＲ法を用いて遺伝子を取得し、適当なベクターに連結することで、比較的容易にＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを得ることができる。
【００２２】
形質転換を行う宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリＷ３１１０  、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１  、エシェリヒア・コリＪＭ１０９  、エシェリヒア・コリＤＨ５αなどを用いることができる。得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカー発現する微生物を検索すればよい。
【００２３】
上記の方法により得られたＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読される。また、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定される。更に、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのアミノ末端のアミノ酸配列は、十分に精製されたＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを常法（エドマン分解法）により分析して決定される。
【００２４】
このようにして、一度選択されたＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する組換えベクターより、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ生産能を有する微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ生産能を有する微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などを用いることができる。
【００２５】
本発明はさらに、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体を培養することを含むＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの製造方法に関する。
【００２６】
例えば上記のようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のタンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００２７】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００２８】
培養温度は菌が成育し、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、例えば、エシェリヒア・コリを宿主として利用する場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが最高収量に達する適当な時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００２９】
培養物中のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤および界面活性剤を添加してＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００３０】
上記のようにして得られたＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを得ることができる。
【００３１】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。  
【００３２】
上記のようにして得られた精製酵素は、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。また、実際に使用する際は、その用途によって適宜緩衝液に溶解した状態で使用することができる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液などが選択される。また、粉末や溶液状態の酵素に、グルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを更に安定化することができる。
【００３３】
本発明の別の一形態は、安定なＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを含む試薬キットである。
【００３４】
本発明の別の一形態は、安定なＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを含むセンサーである。
【００３５】
上記各形態において、本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、検査薬組成物、並びに試薬キットやセンサーは、液状（水溶液、懸濁液等）、凍結乾燥粉末など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
【００３６】
さらに上記各形態において、本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、検査薬組成物、並びに試薬キットやセンサーは、その形態や使用方法に応じて、精製された状態であっても良いし、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤など種々の添加物が加えられていても良い。
【００３７】
本発明へのそれらの添加物の配合法は特に制限されるものではない。例えばＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを含む緩衝液に添加剤を配合する方法、添加剤を含む緩衝液にＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを配合する方法、あるいはＮＡＤＨデヒドロゲナーゼと安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。
【００３８】
含有される緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液などが挙げられる。該緩衝液のｐＨは５．０〜１０．０程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
【００３９】
また、さらに血清アルブミンを含有させてもよい。前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は０．０５〜０．５重量％であることが好ましい。
【００４０】
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などが挙げられる。特にＢＳＡが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは１〜８０％（重量比）、より好ましくは５〜７０％（重量比）の範囲で使用される。
【００４１】
一方、上記各形態において、本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、検査薬組成物、並びに試薬キットやセンサーは、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しない構成とすることもできる。
【００４２】
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分としては、例えばＢＳＡ等の生体由来物質が挙げられる。
【００４３】
緩衝剤としては、一般的に使用されるものであれば良く、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。緩衝剤としてさらに好ましくは、リン酸やトリスといった緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。
【００４４】
また、粉末組成物において、緩衝剤の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１．０％〜５０％であることが望ましい。
【００４５】
また、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼと緩衝剤から基本的に成る組成物に、アミノ酸、あるいは有機酸をさらに加えてもかまわない。また、これらを含有するものであれば、水性組成物、凍結乾燥物を問わない。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。実施例中、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの活性は、以下のように測定した。ＮＡＤＨは、オリエンタル酵母社より購入したものを使用した。その他の試薬は、ナカライテスク社より購入したものを使用した。
【００４７】
<ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性測定法>
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性は、２，４−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を基質とし、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ反応によるＤＣＰＩＰの還元を６００ｎｍにおけるＤＣＰＩＰの吸光度の減少で測定した。０．２ｍＭのＮＡＤＨを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２．８ｍｌを２５℃で５分間予備加温後、１．２ｍＭのＤＣＰＩＰ水溶液を０．１ｍｌ添加し、次いで、予め、酵素希釈液（２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））で希釈したＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ溶液０．１ｍｌを加え、反応を開始する。２５℃で１０秒毎に６００ｎｍの吸光度の減少を３〜４分間測定する（ΔＯＤｔｅｓｔ）。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液０．１ｍｌを加え、上記同様に操作を行って吸光度を測定した（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。得られた吸光度変化より、下記計算式に基づきＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの酵素活性を算出した。
尚、上記条件で１分間に６００ｎｍの吸光度を１．０減少させる酵素量を１単位（Ｕ）とする。
計算式
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝{ΔOD/min(ΔODtest−ΔODblank）×希釈倍率}／{1.0×0.1(ml)}＝ΔOD/min×10×希釈倍率
1.0：活性定義に基づいて定められた６００ｎｍにおける単位吸光度
【００４８】
実施例１ ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の作製
バチルス・ズブチリスを遺伝子給源として用い、データベース上でエシェリヒア・コリーのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼと３１％の相同性を示すタンパク質をコードする遺伝子（ｙｖａＢ）について検討を進めた。より具体的には、バチルス・ズブチリスＩＦＯ１４１４４（Tryptophan auxotroph of Marburg168：ＮＢＲＣより入手可能）のゲノムＤＮＡを、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−（東洋紡績製）を用いてプロトコール通りに抽出し、ＰＣＲの鋳型とした。プライマーは、配列表の配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチドおよび配列表の配列番号４記載の合成オリゴヌクレオチドを用い、ＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡績製）を使用し、プロトコール通りのサイクルで、ＡＢＩ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ製）にてＰＣＲを実施し、ｙｖａＢ遺伝子を取得した。更に、得られたＰＣＲ産物を、クローニングキットＴＡｇｅｔＣｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ（東洋紡績製）を用いて、そのプロトコールに従ってクローニング操作を行い、更に塩基配列を決定して、組換えプラスミド（ｐＢＳＵＤＡＤ１）を取得した。
得られたｐＢＳＵＤＡＤ１にてエシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡績製）を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリーＤＨ５α(ｐＢＳＵＤＡＤ１)を作成した。エシェリヒア・コリーＤＨ５α(ｐＢＳＵＤＡＤ１)を、ＬＢ培地にて３７℃で一晩培養したところ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの活性が確認された。
【００４９】
実施例２ ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの精製
実施例１で取得した形質転換体エシェリヒア・コリーＤＨ５α(ｐＢＳＵＤＡＤ１)を、１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養した。５０ｍｌのＴＢ培地を５００ｍＬ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンを終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加した。この培地に、エシェリヒア・コリーＤＨ５α(ｐＢＳＵＤＡＤ１)の培養液を１％（２ｍｌ）接種し、３７℃で６時間通気攪拌培養後、イソプロピル−β−D−チオガラクトシドを終濃度が０．１ｍＭになるように添加し、３７℃で更に１８時間通気攪拌培養を行った。培養終了より菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、超音波破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、４５℃、３０分間の加温処理後、セファデックスＧ−２５で脱塩処理を行った。更にＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、セファクリルＳ−３００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製），およびブルーセファロース（ＧＥヘルスケアバイオサオエンス製）の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ標品を得た。本方法により得られたこれらの標品は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、単一であることが確認された。
【００５０】
実施例３  ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの安定性評価
実施例２で取得したＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ精製標品の安定性を測定した。６０℃および８０℃で３０分間処理における残存活性と酵素濃度との関係について、それぞれデータを取得した。結果として、図１に示すように、８０℃、３０分間の処理でも２０Ｕ／ｍｌ以上の酵素濃度であれば５０％以上の残存活性を有することが確認された。
更に、各種金属存在下でのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの安定性を測定した。２ｍＭの金属塩存在下で２５℃、３０分間処理後の残存活性を調べた結果を、表１に示す。本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、銀（Ａｇ）や水銀（Ｈｇ）といった通常の酵素が失活し易い重金属の存在下で、高い安定性を示した。
【００５１】
表１は、本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの各種金属存在下における安定性評価結果を示す。
【００５２】
【表１】
2008073003.tif 000002
【００５３】
次に、界面活性剤存在下でのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの安定性を測定した。結果を表２に示す。本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、各種非イオン系界面活性剤の存在下で、２０％以上の活性の上昇が認められた。
このように、全く予期せぬことに、ｙｖａＢがコードするＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、２０Ｕ／ｍｌ以上の酵素濃度で８０℃、３０分間処理後も５０％以上の残存活性を示し、更には２ｍＭの銀イオン、水銀イオン存在下で２５℃、３０分間処理後も６０％以上の残存活性を示すことが判明した。常温菌であるバチルス・ズブチリスより、このような高い安定性を示す酵素が得られることは予想外であり、想定し得ない結果であった。また、ｙｖａＢがコードするＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、トリトンＸ−１００、ブリジ３５、ツイーン２０、スパン２０から選ばれる少なくとも１種の非イオン系界面活性剤存在下にて、２０％以上の活性の上昇が認められ、これも想定し得ない結果であった。
【００５４】
表２は、本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの各種界面活性剤存在下における安定性評価結果を示す。
【００５５】
【表２】
2008073003.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によって、安定なＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、およびその製造方法を提供し、安定なＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを供給することが可能となった。本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、例えば、臨床検査薬用原料酵素に適用することで、該試薬の性能向上に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、本発明のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの精製酵素標品の安定性評価結果を示す。
【図１】
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【配列表】
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