(57)【要約】      （修正有）【課題】脊椎動物生体内において、ＰＩ３キナーゼ依存性炎症性サイトカインの合成を阻害する新たな阻害剤及び阻害方法を提供すること、特に、細胞性免疫応答を抑制する抑制剤及び抑制方法、並びに液性免疫応答を賦活させる賦活剤及び賦活方法と提供すること。【解決手段】生体にＬｉイオンを投与することにより、炎症性サイトカインの合成を阻害する。これにより、細胞性免疫応答を抑制し、免疫関与炎症性疾患（immune-mediated inflammatory disorders (I.M.I.D.)）の治療が可能になる。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物の生体内におけるＰＩ３キナーゼ依存性炎症性サイトカインの合成を阻害する阻害剤であって、  Ｌｉイオンを有効成分として含有することを特徴とする阻害剤。
【請求項２】
前記サイトカインがＩＬ−１２であることを特徴とする請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
注射又は経口投与により投与されることを特徴とする請求項１または２に記載の阻害剤。
【請求項４】
脊椎動物における細胞性免疫応答の抑制剤であって、  Ｌｉイオンを有効成分として含むことを特徴とする抑制剤。
【請求項５】
注射又は経口投与により投与されることを特徴とする請求項４に記載の抑制剤。
【請求項６】
脊椎動物における液性免疫応答の賦活剤であって、  Ｌｉイオンを有効成分として含有することを特徴とする賦活剤。
【請求項７】
注射又は経口投与により投与されることを特徴とする請求項６に記載の賦活剤。
【請求項８】
ＰＩ３キナーゼ依存性炎症性サイトカインの合成に起因する疾患の治療剤であって、  Ｌｉイオンを有効成分として含有することを特徴とする治療剤。
【請求項９】
前記サイトカインがＩＬ−１２であることを特徴とする請求項８に記載の治療剤。
【請求項１０】
注射又は経口投与により投与されることを特徴とする請求項８または９に記載の治療剤。
【請求項１１】
細胞性免疫応答／液性免疫応答の比が増加することにより生じる疾患の治療剤であって、  Ｌｉイオンを有効成分として含有することを特徴とする治療剤。
【請求項１２】
前記疾患が、病原性大腸菌の増殖に起因する疾患、免疫関与炎症性疾患（immune-mediated inflammatory disorders (I.M.I.D.)）、習慣性流産、遅延型過敏症を基盤とする臓器特異的自己免疫疾患、肝障害、または動脈硬化であることを特徴とする請求項１１に記載の治療剤。
【請求項１３】
注射又は経口投与により投与されることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の治療剤。
【請求項１４】
脊椎動物の生体内における病原性大腸菌の増殖を抑制する抑制剤であって、Ｌｉイオンを有効成分として含有することを特徴とする抑制剤。
【請求項１５】
注射又は経口投与により投与されることを特徴とする請求項１２に記載の抑制剤。
【請求項１６】
ヒト以外の脊椎動物において、ＰＩ３キナーゼ依存性炎症性サイトカイン合成を阻害する阻害方法であって、  Ｌｉイオンを前記脊椎動物に投与する工程を含むことを特徴とする阻害方法。
【請求項１７】
前記サイトカインがＩＬ−１２であることを特徴とする請求項１６に記載の阻害方法。
【請求項１８】
注射又は経口投与により、前記Ｌｉイオンを前記脊椎動物に投与することを特徴とする請求項１６または１７に記載の阻害方法。
【請求項１９】
ヒト以外の脊椎動物において、細胞性免疫応答を抑制する抑制方法であって、  Ｌｉイオンを前記脊椎動物に投与する工程を含むことを特徴とする抑制方法。
【請求項２０】
注射又は経口投与により、前記Ｌｉイオンを前記脊椎動物に投与することを特徴とする、請求項１９に記載の抑制方法。
【請求項２１】
ヒト以外の脊椎動物において、液性免疫応答を賦活する賦活方法であって、  Ｌｉイオンを前記脊椎動物に投与する工程を含むことを特徴とする賦活方法。
【請求項２２】
注射又は経口投与により、前記Ｌｉイオンを前記脊椎動物に投与することを特徴とする請求項２１に記載の賦活方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  脊椎動物生体内においてＰＩ３キナーゼ依存性炎症性サイトカインの合成を阻害する阻害剤及び阻害方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  脂質リン酸化酵素の一つであるフォスフォイノシタイド３（ＰＩ３）キナーゼは、細胞内情報伝達分子の一つであるフォスファチジルイノシトールをリン酸化する活性を有しており、リン酸化によって多くの細胞の機能を調節している。一方、動物の異物に対する防御機構である免疫応答は、細胞性および液性免疫応答という二つの機構からなり、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のうち、Ｔｈ１が活性化されれば細胞性免疫応答が，Ｔｈ２が活性化されれば液性免疫応答が誘導されると考えられているが、これらの機構の両方において樹状細胞が重要な役割を果たしている。【０００３】  樹状細胞は刺激を受けるとインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を初めとするサイトカインを発現・分泌する。サイトカインは免疫系の細胞を含む各種細胞の機能を制御する生理活性物質であり、インターロイキンのほかインターフェロンやケモカインなども含む。これらのうち、炎症性サイトカインであるＩＬ−１２は、Ｔ細胞に作用して細胞性免疫応答を開始する役割を担っている。【０００４】  このＩＬ−１２の樹状細胞における発現が、ＰＩ３キナーゼの活性によって負に制御されていることが最近明らかとなった（非特許文献１を参照）。また、ＰＩ３キナーゼの下流のキナーゼであるＡｋｔの基質となる蛋白質の一つであるＧＳＫ３βは、リン酸化されると、それ自身の有するキナーゼ活性が不活性化される。最近、ＧＳＫ３βは単球において、ＩＬ−１２の発現を正に調節していることが報告された（非特許文献２を参照）。従って、ＰＩ３キナーゼの活性化は、ＧＳＫ３βのリン酸化を通じて、ＩＬ−１２の発現の抑制に帰結する。【非特許文献１】Fukao, T., Tanabe, M., Terauchi, Y., Ota, T., Matsuda, S., Asano, T., Kadowaki, T., Takeuchi, T. and Koyasu, S. (2002) “PI3K-mediated negative feedback regulation of IL-12 production in dendritic cells.” Nat. Immunol.3:875-881.
【非特許文献２】M. Martin, K. Rahani, R. S. Jope, S. M. Michalek, Nat. Immunol. 6, 777 (2005).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  このような状況において、脊椎動物生体内において、ＩＬ−１２などのＰＩ３キナーゼ依存性炎症性サイトカインを調節することにより、細胞性免疫応答と液性免疫応答のバランスを調節することができ、さらにこのバランスの調節により、免疫系の関与する疾患の治療が可能であると考えられるようになった。【０００６】  そこで、本発明は、脊椎動物生体内において、ＰＩ３キナーゼ依存性炎症性サイトカインの合成を阻害する新たな阻害剤及び阻害方法を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  細菌が宿主細胞に感染すると、多くの場合細胞内のＰＩ３キナーゼが長期間にわたって活性化される。ところが、大腸菌のうち下痢や腸炎等の原因となる病原性大腸菌の一種である腸管病原性大腸菌（enteropathogenic Escherichia coli、ＥＰＥＣ）は、株化された樹状細胞と共に培養すると、樹状細胞内のＰＩ３キナーゼ活性を速やかに不活性化する。そこで、ＥＰＥＣのｅｓｐＨ遺伝子座に変異を導入したＥｓｐＨ機能欠損変異株を作製し、このｅｓｐＨ変異株、または野生株を、株化樹状細胞と共培養した。その結果、野生株を感染させた樹状細胞ではＰＩ３キナーゼ活性の抑制が見られたのに対し、ｅｓｐＨ変異株の場合ではＰＩ３キナーゼの不活化が起こらないことが分かった（実施例１）。次に、マウス骨髄から単離した樹状細胞（bone marrow-derived dendritic cell、ＢＭＤＣ）の初代培養細胞に対して同様の共培養実験を行ったところ、野生株はＢＭＤＣのＰＩ３キナーゼ活性の低下をもたらし、ＩＬ−１２の高い発現が持続する一方、ｅｓｐＨ変異株ではリン酸化抑制は低下し、ＩＬ−１２の発現亢進も低下した（実施例２）。これらのことから、ＥｓｐＨ蛋白質が、樹状細胞においてＰＩ３キナーゼ活性を抑制することにより、ＩＬ−１２の発現を亢進することが示された。【０００８】  次に、マウスに対して感染性を有する病原性大腸菌Citrobacter rodentiumの野生株あるいはｅｓｐＨ変異株を、マウスに経口投与して大腸への感染を調べたところ、野生株を用いると炎症が誘発され、菌の増殖・定着が見られたのに対し、ｅｓｐＨ変異株を用いた場合は感染の度合いが低かった（実施例３）。さらに、ＰＩ３キナーゼ遺伝子を欠損させたノックアウトマウスに対してCitrobacter rodentium野生株またはｅｓｐＨ変異株を感染させたところ、野生型マウスに感染させた場合のような、ｅｓｐＨ変異の有無による感染の差が見られなくなった（実施例４）。加えて、ノックアウトマウス由来の骨髄（樹状細胞を含む）を移植されたマウスを用いた同様の感染実験においても、ノックアウトマウスに感染させた場合と同様の表現型が認められた（実施例５）。一方、ノックアウトマウス由来のＴ細胞に対する分化誘導実験から、Ｔ細胞によるケモカインの分泌はＰＩ３キナーゼによって制御されていることが分かった（実施例６）。以上から、ＥｓｐＨ蛋白質が、ＰＩ３キナーゼの抑制による樹状細胞のＩＬ−１２発現の亢進を介して、宿主動物の細胞性免疫応答を誘導する作用を有していることが明らかになった。【０００９】  続いて、単離樹状細胞にLiClまたはSB216763を添加してＧＳＫ３βを阻害すると、ＩＬ−１２の発現が低下した（実施例７）。そこで、マウスにC. rodentiumを感染させて、３日後に飲用水にLiCO3を添加したところ、６日目には細菌感染の症状が低減するとともに、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の発現が抑制された（実施例８）。ＩＦＮ−γは、細胞性免疫応答を増強する機能を有するＴｈ１細胞において、ＩＬ−１２によって発現誘導されるため、これらの実験結果から、培養細胞においてのみならず生体内においても、Ｌｉイオンの投与によりＩＬ−１２の発現が抑制されることが明らかになった。さらに、ＩＦＮ−γは、Ｔｈ１細胞の分化・増殖に中心的な役割を果たすことから、Ｌｉイオンが、炎症��サイトカインの産生及びマウスの細胞性免疫応答を抑制し、液性免疫応答を賦活させていることが示された。従って、Ｌｉイオンを生体に投与することによって、生体内における細胞性免疫応答を抑制し、細菌による感染を抑制し得ることが示された。これらの新しい知見に基づき、発明者らは、以下の発明の完成に至った。【００１０】  すなわち、本発明に係る、脊椎動物の生体内におけるＰＩ３キナーゼ依存性炎症性サイトカインの合成を阻害する阻害剤は、Ｌｉイオンを有効成分として含有することを特徴とする阻害剤であって、サイトカインはＩＬ−１２であってもよく、あるいは注射又は経口投与により投与されてもよい。【００１１】  また、本発明に係る、脊椎動物における細胞性免疫応答の抑制剤は、Ｌｉイオンを有効成分として含む抑制剤であって、注射又は経口投与により投与されてもよい。【００１２】  また、本発明に係る、脊椎動物における液性免疫応答の賦活剤は、Ｌｉイオンを有効成分として含有することを特徴とする賦活剤であって、注射又は経口投与により投与されてもよい。【００１３】  また、本発明に係る、ＰＩ３キナーゼ依存性炎症性サイトカインの合成に起因する疾患の治療剤は、Ｌｉイオンを有効成分として含有することを特徴とする治療剤であり、サイトカインはＩＬ−１２であってもよく、あるいは注射又は経口投与により投与されてもよい。【００１４】  また、本発明に係る、細胞性免疫応答／液性免疫応答の比が増加することにより生じる疾患の治療剤は、Ｌｉイオンを有効成分として含有することを特徴とする治療剤であり、疾患は、病原性大腸菌の増殖に起因する疾患、免疫関与炎症性疾患（immune-mediated inflammatory disorders (I.M.I.D.)）、習慣性流産、遅延型過敏症を基盤とする臓器特異的自己免疫疾患、肝障害、または動脈硬化であってもよく、あるいは、注射又は経口投与により投与されてもよい。【００１５】  また、本発明に係る、脊椎動物の生体内における病原性大腸菌の増殖を抑制する抑制剤は、Ｌｉイオンを有効成分として含有することを特徴とする抑制剤であり、注射又は経口投与により投与されてもよい。【００１６】  また、本発明に係る、ヒト以外の脊椎動物において、ＰＩ３キナーゼ依存性炎症性サイトカイン合成を阻害する阻害方法は、Ｌｉイオンを脊椎動物に投与する工程を含むことを特徴とする阻害方法であって、サイトカインはＩＬ−１２であってもよく、あるいは注射又は経口投与によりＬｉイオンを投与してもよい。【００１７】  また、本発明に係る、ヒト以外の脊椎動物において、細胞性免疫応答を抑制する抑制方法は、Ｌｉイオンを投与する工程を含むことを特徴とする抑制方法であって、注射又は経口投与により、Ｌｉイオンを投与してもよい。【００１８】  また、本発明に係る、ヒト以外の脊椎動物において、液性免疫応答を賦活する賦活方法は、Ｌｉイオンを投与する工程を含むことを特徴とする賦活方法であって、注射又は経口投与により、Ｌｉイオンを投与してもよい。
【発明の効果】
【００１９】  本発明により、ＰＩ３キナーゼの新規阻害剤及びその利用方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】  以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、 J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) や、 F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. などの、当該技術分野における標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれらを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。【００２１】  なお、本発明の目的、特徴、利点、及びアイデアは、本明細書の記載により当業者には明らかであり、本明細書の記載に基づき、当業者が本発明を再現することは容易である。以下に記載された具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すための例示又は説明として示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。【００２２】＝＝＝病原性大腸菌由来のＥｓｐＨ蛋白質＝＝＝  ＥＰＥＣを含む多くのグラム陰性病原細菌は、ＩＩＩ型分泌装置（type III secretion system、ＴＴＳＳ）を通して様々なエフェクター分子を宿主動物の細胞内部へ導入し、細胞の性質に変化を与える。ＥＰＥＣや腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia coli、ＥＨＥＣ）などの腸管接着性細菌は、腸管の上皮細胞に接着して、微絨毛を破壊する（Ａ／Ｅ（attaching and effacing）病変）が、このＡ／Ｅ病変はＴＴＳＳを介して分泌されるエフェクター分子によって引き起こされるものであり、それらエフェクター分子の遺伝子の多くは、ＬＥＥ（locus of enterocyte effacement、腸管付着性遺伝子群）と呼ばれる病原遺伝子群に属している。本発明の有効成分であるＥｓｐＨ蛋白質も、ＬＥＥの産物の一つとして知られていたものである（Xuanlin Tu, Israel Nisan, Chen Yona, et al. (2003)  “EspH, a new cytoskeleton-modulating effector of enterohaemorrhagic and enteropathogenic Escherichia coli.” Molecular Microbiology, 47(3), 595-606）。【００２３】  ＬＥＥはＥＰＥＣやＥＨＥＣのほか、ＥＰＥＣとほとんど同じＡ／Ｅ病原因子をもち、他の動物に対しても感染性を有する病原性大腸菌、例えばマウスにも感染性のあるCitrobacter rodentiumにも存在している（Wanyin Deng, Yuling Li, Bruce A. Vallance, and B. Brett Finlay (2001) "Locus of Enterocyte Effacement from Citrobacter rodentium: Sequence Analysis and Evidence for Horizontal Transfer among Attaching and Effacing Pathogens." Infection and Immunity, 69(10), 6323-6335.）。このマウスに対するＥＰＥＣと言えるCitrobacter rodentiumやその変異株をマウスに感染させることにより、Ａ／Ｅ病変について解析するモデル実験の実施が可能となっている。【００２４】  従って、本発明に用いられるＥｓｐＨ蛋白質としては、実施例に記載のように、病原性大腸菌のうちCitrobacter rodentiumに由来し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有している蛋白質や、ＥＰＥＣに由来し、配列番号２に示すアミノ酸配列を有している蛋白質を利用できるが、その他の、保存性の高いＬＥＥを有していて同様のＡ／Ｅ変異を引き起こす病原性大腸菌、例えばＥＨＥＣに由来するものも同様に用いることができる。【００２５】＝＝＝ＥｓｐＨ蛋白質によるＰＩ３キナーゼの阻害＝＝＝  実施例１、２に示すように、ＥｓｐＨ蛋白質は、ＰＩ３キナーゼに対する阻害活性を有するため、ＥｓｐＨ蛋白質は、ＰＩ３キナーゼを阻害するのに利用できる。ここで、ＰＩ３キナーゼの阻害は、ＥｓｐＨ蛋白質のＰＩ３キナーゼに対する阻害活性を利用するものであれば、ＥｓｐＨ蛋白質がどのような形でなされてもよい。例えば、ＥｓｐＨ蛋白質の全体を用いても、ＥｓｐＨ蛋白質の一部からなる蛋白質を用いても構わないが、最低限、ＥｓｐＨ蛋白質の活性中心は必要であると考えられる。この場合、ＥｓｐＨ蛋白質の阻害活性を用いる反応系は、in vitroでもin vivoでもよく、例えば、試験管内の再構成系や細胞抽出物内でも、あるいは組織培養や個体中の細胞内でも、反応系として利用できる。この阻害作用は、ＥｓｐＨ蛋白質がＰＩ３キナーゼを直接的に阻害してもよいし、あるいはＥｓｐＨ蛋白質が、ＰＩ３キナーゼにシグナルを伝える上流の他の分子の機能を調節し、その調節された分子の機能によって間接的にＰＩ３キナーゼを阻害してもよい。【００２６】  このように、ＥｓｐＨ蛋白質は、ＰＩ３キナーゼの阻害剤として有用である。ここで、ＰＩ３キナーゼの阻害剤は、どのような形状でもよく、ＥｓｐＨ蛋白質のＰＩ３キナーゼに対する阻害活性を阻害しないものであれば、どのような添加剤を含有してもよい。【００２７】  なお、細胞に対するＥｓｐＨ蛋白質の投与方法としては、ＥｓｐＨ蛋白質をコードする遺伝子をプラスミドやウイルスベクター等の発現ベクターに組み込み、細胞に形質導入することや、ＨＩＶウイルスのＴＡＴ蛋白質の細胞膜透過ドメイン（Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg）との融合蛋白質を作製し、細胞に投与すること、感染時にＥｓｐＨ蛋白質を導入できるＥＰＥＣ等の細菌を感染させること、などが挙げられる。【００２８】  ＥｓｐＨ蛋白質を導入する対象となる細胞としては、ＰＩ３キナーゼを含有する細胞であれば何でもよく、ＥｓｐＨ蛋白質はその細胞に対するＰＩ３キナーゼの阻害剤として有効に機能するが、とりわけ樹状細胞が好適である。この場合は樹状細胞の炎症性サイトカイン発現を亢進させることができるので、個体内の樹状細胞にＥｓｐＨ蛋白質を含有させることにより、後述するように、個体内で免疫応答を調節したり、アレルギー等の疾患に対する治療薬を提供できるようになるからである。【００２９】＝＝＝ＥｓｐＨ蛋白質による炎症性サイトカイン分泌の合成促進＝＝＝  ＰＩ３キナーゼの抑制は、ＰＩ３キナーゼ依存性炎症性サイトカインの合成を促進することができる。ここで、ＥｓｐＨ蛋白質を導入する対象となる細胞としては、前述の樹状細胞が好適な例であるが、その他炎症性サイトカイン分泌がＰＩ３キナーゼ依存的に制御されている細胞、例えば、単球やマクロファージ（例えば、Guha, M. and Mackman, N. (2002) “The phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway limits lipopolysaccharide activation of signaling pathways and expression of inflammatory mediators in human monocytic cells.” J. Biol. Chem. 277:32124-32132. を参照）、サルモネラ菌が感染した上皮細胞（例えば、Huang, F. C., Li, Q. and Cherayil, B. J. (2005) “A phosphatidyl-inositol- 3-kinase-dependent anti-inflammatory pathway activated by Salmonella in epithelial cells.” FEMS Microbiol. Lett. 243:265-270. を参照）、さらにＴ細胞（実施例６）、などのサイトカイン分泌細胞をも対象とすることができる。【００３０】  合成が促進される炎症性サイトカインとしては、樹状細胞の場合であれば主にＩＬ−１２であるが、その他の炎症性サイトカイン、例えばＴ細胞から分泌されるケモカインの合成も促進される（実施例６）。また、上述のマクロファージから分泌される腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor、ＴＮＦ）や組織因子（Tissue factor、ＴＦ）、あるいは、サルモネラ菌の感染などによりToll-like 受容体を介して刺激された上皮細胞から分泌されるケモカインやサイトカインなどについても、ＰＩ３キナーゼの阻害によりそれらの合成を促進することができる。【００３１】  このように、ＥｓｐＨ蛋白質は、炎症性サイトカインの合成を促進する促進剤として有用である。ここで、炎症性サイトカイン合成の促進剤は、どのような形状でもよく、ＥｓｐＨ蛋白質のＰＩ３キナーゼに対する阻害活性を阻害しないものであれば、どのような添加剤を含有してもよい。【００３２】  さらに、樹状細胞でのＩＬ−１２の合成促進の結果として、ＩＬ−１２によって炎症性サイトカイン合成が調節される細胞でのサイトカイン合成を促進することもできる。例えばＥｓｐＨ蛋白質を投与した樹状細胞の存在下では、樹状細胞からのＩＬ−１２分泌が亢進し、その結果Ｔ細胞が分泌するサイトカイン、例えばＩＦＮ−γのＴ細胞での合成が促進される。【００３３】  このように、ＥｓｐＨ蛋白質は、ＥｓｐＨ蛋白質を投与した樹状細胞の存在下で、Ｔ細胞におけるサイトカイン合成を促進する促進剤としても有用である。ここで、Ｔ細胞におけるサイトカイン合成の促進剤は、どのような形状でもよく、ＥｓｐＨ蛋白質のＰＩ３キナーゼに対する阻害活性を阻害しないものであれば、どのような添加剤を含有してもよい。【００３４】  なお、例えば樹状細胞において、ＥｓｐＨ蛋白質によってＰＩ３キナーゼを阻害する場合、ＩＬ−１２の発現亢進が生じることが望ましくないときは、ＩＬ−１２遺伝子が欠損した樹状細胞を用いたり、あるいはＩＬ−１２の阻害剤を樹状細胞に投与することによって、ＩＬ−１２の発現亢進を回避しながらＰＩ３キナーゼを阻害することもできる。【００３５】＝＝＝ＥｓｐＨ蛋白質による免疫応答の調節＝＝＝  炎症性サイトカイン、なかでもＩＬ−１２は強力な細胞性免疫応答の賦活化能を有することから、実施例３、４に示すように、ＥｓｐＨ蛋白質は細胞性免疫応答の賦活剤としても有用であり、脊椎動物個体への投与により、炎症性サイトカインの発現の亢進を介して細胞性免疫応答を増強できる。それに加えて、脊椎動物においては、細胞性免疫応答と液性免疫応答という二つの免疫応答機構のバランスが互いに保たれるため、ＥｓｐＨ蛋白質は液性免疫応答の抑制剤として利用することもできる。【００３６】  その際、免疫応答を調節する目的に対してもっとも効果的になるように、ＥｓｐＨ蛋白質の用量や剤形を適宜選択すればよい。例えば、個体に対し、ＥｓｐＨ蛋白質自体を投与してもよいし、あるいはＥｓｐＨ蛋白質をコードする遺伝子を投与してもよい。個体に対してＥｓｐＨ��白質を投与する場合の投与方法は特に限定されないが、たとえば塗布、散布、注射、感染体の感染などでもよい。また遺伝子を用いる場合の導入方法も、一般的に生体内に遺伝子を導入して発現させる方法でよく、たとえば発現ベクターを投与する方法でもよい。【００３７】  以上のように本発明は、ＥｓｐＨ蛋白質を利用することにより、動物の免疫応答を調節することのできる調節剤、及び調節のための方法を提供することができる。【００３８】＝＝＝ＥｓｐＨ蛋白質の疾患治療における利用＝＝＝  アレルギー反応は、ある抗原に対し、過剰な液性免疫応答が生じた結果として起きる疾患である。従って、本発明に従いＥｓｐＨ蛋白質を投与することにより、液性免疫応答を抑制することができるので、アレルギー疾患の治療を行うことができる。【００３９】  例えば皮膚アレルギーの場合、皮下に存在しアレルギーの原因となっている樹状細胞にＥｓｐＨ蛋白質を送達できる剤型、例えば軟膏にすれば、本発明は皮膚アレルギーに対する抗アレルギー剤を提供できる。あるいはアレルギー反応の形態によっては、その他の一般的な投与方法と剤型を用いることもできる。なおこのような液性免疫応答の抑制を実施する際に、細胞性免疫応答の亢進に伴う炎症などの発症が望ましくない場合は、併せて樹状細胞における反応より下流の反応に効果がある対症的な抗炎症剤を投与することでその問題を回避することもできる。【００４０】  本発明はさらに、癌の治療のための治療薬を提供する。例えば、癌免疫療法においては、樹状細胞は癌抗原を提示するように調節されて癌患者に投与される。ここで、患者に投与される樹状細胞に、ＥｓｐＨ蛋白質を導入しておくことにより、樹状細胞移植後、ＩＬ−１２発現を亢進させ、癌特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の産生を増強することができる。【００４１】＝＝＝Ｌｉイオンによる炎症性サイトカインの発現抑制とその利用＝＝＝  脊椎動物（ヒトでもヒト以外の脊椎動物でもよい）の細胞におけるＰＩ３キナーゼのシグナル伝達経路において、Ｌｉイオンは、ＰＩ３キナーゼの下流に作用し、ＩＬ−１２などの炎症性サイトカインの発現を抑制する（実施例７）。従って、Ｌｉイオンは、ＰＩ３キナーゼ依存性炎症性サイトカインの発現に起因する疾患の治療に有効である。【００４２】  ＩＬ−１２などの炎症性サイトカインは強力な細胞性免疫応答の賦活化能を有することから、Ｌｉイオンは細胞性免疫応答の抑制剤及び液性免疫応答の賦活剤として有効であると考えられ、実際に脊椎動物生体内において、細胞性免疫応答の抑制機能及び液性免疫応答の賦活機能を有し、病原性細菌の増殖を抑制する（実施例８）。【００４３】  ＰＩ３キナーゼ依存性炎症性サイトカインや細胞性免疫応答が関与し、細胞性免疫応答／液性免疫応答の比が高い疾患として、例えば、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎やクローン病）、リウマチ性関節炎、多発性硬化症などの免疫関与炎症性疾患（immune-mediated inflammatory disorders (I.M.I.D.)）(Vizcarra C., J Infus Nurs. vol.26, pp 319-25, 2003; Williams JP and Meyers JA., Am J Manag Care. suppl, pp.S664-81, 2002）の他、遅延型過敏症を基盤とする臓器特異的自己免疫疾患、肝障害、動脈硬化などが挙げられ、Ｌｉイオンはこれらの疾患の治療薬として有用である。また、習慣性���産の患者において、細胞性免疫応答／液性免疫応答の比が高いことが流産の原因だと考えられており、Ｌｉイオンは、流産の抑制にも有効に作用しうると考えられる。【００４４】  Ｌｉイオンの形態や剤形は特に限定されないが、リチウム塩溶液の形で投与することが好ましく、例として塩化リチウム溶液、硫酸リチウム溶液、水酸化リチウム溶液、炭酸リチウム溶液などが挙げられる。【００４５】  Ｌｉイオンを脊椎動物に投与する際の投与方法は、特に限定されないが、例えば、Ｌｉイオンを飲用水，食餌，錠剤等に含有させて経口投与してもよく、あるいは生体内で細菌感染の抑制や液性免疫応答の賦活を求められる部位にＬｉイオンを局所的に到達させることのできる方法、例えばＬｉイオンを含有する注射液を細菌感染部位やその近傍へ注射することによって、局所投与してもよい。
【実施例】
【００４６】  以下に、実施例及び図を用いて本発明の実施の態様をより詳細に説明する。【００４７】＜実施例１＞＝＝＝腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）と株化樹状細胞との共培養実験＝＝＝  株化されたミエロイド系樹状細胞であるＤＣ２．４にＥＰＥＣを感染させたときの、樹状細胞におけるＰＩ３キナーゼ活性を、ＰＩ３キナーゼのリン酸化反応の基質であるＡｋｔ蛋白質のリン酸化を指標として調べ、ＥｓｐＨ蛋白質によってＰＩ３キナーゼ活性が阻害されることを示す。【００４８】［共培養］株化樹状細胞ＤＣ２．４（Dr. Kenneth Rock of Dana-Farber Cancer Instituteから供与された）を、１０％ウシ胎児血清（SIGMA）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen）中で３７℃・５％ＣＯ２にて培養した。一方、ＥＰＥＣ株Escherichia coli 2348/69（東京大学医科学研究所笹川研究室から供与）またはそのＴＴＳＳ変異株（東京大学医科学研究所笹川研究室から供与）、さらに非病原性大腸菌であるMC1064（東京大学医科学研究所笹川研究室から供与）を、それぞれＬＢ培地（10g/1l Polypepton（大五栄養化学株式会社）、5g/1l BactoTM Yeast Extract（BD）、5g/1l NaCl（Wako）、1.2ml/1l 4N-NaOH（Wako））で一晩培養した後、ＤＭＥＭ培地（SIGMA）で1:10に希釈し、さらに３７℃で２時間培養した。６穴培養プレートに移した培養細胞に対し、感染多重度（multiplicity of infection、ｍｏｉ）が１００となるよう上記細菌の培養液をそれぞれ添加して、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃にてさらに３時間培養した。【００４９】［ウェスタンブロッティング］細菌感染から所定の時間経過後の培養細胞の一部をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、それぞれＳＤＳ試料可溶化溶液で可溶化して５分間煮沸した。これらの試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動してからＰＶＤＦ転写膜（BIORAD）上に転写した。転写膜は５％スキムミルク及び０．０５％Tween-20含有トリス緩衝液（ＴＢＳ）でブロッキング処理の後、０．０５％Tween-20含有ＴＢＳで１０分間３度洗浄した。一次抗体として、抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Cell Signaling）を５％ＢＳＡ含有ＴＢＳで５００倍希釈してから、４℃にて一晩、上記の転写膜に対して結合させた。コントロールとして、抗α-チューブリン抗体（SIGMA）をＴＢＳで１０００倍に希釈し、室温にて同様に転写膜に結合させた。その後、ＴＢＳで２０００倍に希釈した二次抗体（SIGMA）で３７℃・1時間転写膜を処理し、転写膜上のリン酸化Ａｋｔ蛋白質をECL(登録商標)ウエスタンブロッティング検出試薬（Amersham Biosciences）で検出した。【００５０】［ｅｓｐＨ変異株の作製と共培養実験］まず、ＥｓｐＨ蛋白質の機能が低下したＥＰＥＣ変異体を準備した。変異体は、hypomorphでもamorphでもよいが、ここでは、ｅｓｐＨ遺伝子に欠損を導入したamorphを作製した（方法の詳細は、Matsuzawa, T., Kuwae, A., Yoshida, S., Sasakawa, C. and Abe, A. (2004) “Enteropathogenic Escherichia coli activates the RhoA signaling pathway via the stimulation of GEF-H1.” EMBO J. 23:3570-3582.を参照）。得られたｅｓｐＨ変異株を使用し、野生株を用いた前述の場合と同様にして、ＤＣ２．４細胞に対する共培養実験を実施した。ｅｓｐＨ変異株に感染した細胞に対して、前述の方法でウェスタンブロッティングを実施して、リン酸化Ａｋｔ蛋白質を検出した。なお、ここでは、細菌感染が樹状細胞刺激になっているため、特に樹状細胞を刺激する処理はしていないが、リポ多糖やCpG-DNAなどのToll様受容体リガンドなどを投与して、樹状細胞を刺激してもよい。【００５１】［結果］樹状細胞に非病原性大腸菌を感染させるとＡｋｔ蛋白質リン酸化が漸次増大した（図１ａ）。しかし、野生型のＥＰＥＣを同様に感染させると、リン酸化Ａｋｔが急速に減少して３時間以内にほぼ消失した（図１ｂの右側）。一方、ＴＴＳＳによる分泌機能を欠失した変異株を用いるとこのようなリン酸化の抑制が起こらなかった（図１ｂの左側）ことから、このリン酸化抑制がＴＴＳＳが関与する因子によるものであることが示唆された。そこでｅｓｐＨ遺伝子を欠損させた変異株を同様にして用いると、リン酸化の低減がやはり消失した（図１ｃ右）。なおａ、ｂでは、非病原性大腸菌やＥＰＥＣのＴＴＳＳ変異株が貪食されることによる副次的な変化を避けるため、貪食を阻害できるサイトカラシンＤを添加した。サイトカラシンＤの非存在下（ｃ）でも同様の結果が得られた。【００５２】  これらの結果より、樹状細胞における、ＥＰＥＣによるＰＩ３キナーゼ活性の抑制は、ＥｓｐＨ蛋白質の作用によることが分かると同時に、樹状細胞にＥｓｐＨ蛋白質を導入することにより、樹状細胞内でＰＩ３キナーゼ活性が阻害されることが示された。従って、ＥｓｐＨ蛋白質は、ＰＩ３キナーゼ阻害剤として有用であることが明らかになった。【００５３】＜実施例２＞＝＝＝ＥＰＥＣと骨髄由来樹状細胞との共培養実験＝＝＝  次に、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の初代培養に対して実施例１と同様にＥＰＥＣを感染させた時の、ＩＰ３キナーゼ活性及びＩＬ−１２発現を調べた。初代培養樹状細胞にＥｓｐＨ蛋白質を投与すると、株化樹状細胞の場合と同様に細胞内のＩＰ３キナーゼが抑制され、さらにＩＬ−１２が合成されることを示す。【００５４】［骨髄細胞の単離と共培養］B10.D2マウスの大腿骨および脛骨の骨髄から、注射針を装着した注射器で細胞を採取し、６穴培養プレート中の10ng/ml顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、PEPROTECH EC）を含有するＲＰＭＩ１６４０完全培地へ移して培養を開始した。培養開始後２日目および４日目に培地を交換して、顆粒状細胞を除去した。６日目に、軽く付着していた細胞を穏やかなピペッティング操作で回収し、N418磁気ビーズ及びセルソーター (Myltenyi Biotec)を用いて、ＣＤ１１ｃ発現細胞をＢＭＤＣとして分離した。分離されたＢＭＤＣを用いて、実施例１の株化樹状細胞の場合と同様に、ＥＰＥＣと共培養し、以下の分析を行った。【００５５】［細胞及び核の形態観察］感染させた細胞をカバーガラス上に移し、４％パラフォルムアルデヒド含有ＰＢＳを用いて室温で２０分間固定した。アクチンの検出のため、rhodamine-phalloidin（Molecular Probe）をＴＢＳに１００倍希釈し３７℃で一時間静置して標識を実施した。またＤＮＡの検出のため、ＴＯ−ＰＲＯ−３（Molecular Probe）をＴＢＳに１００倍希釈し３７℃で一時間静置して核染色を実施した。細胞を共焦点顕微鏡で観察し、アクチンの検出によって細胞の形態の画像を、またＤＮＡの検出により細胞および感染細菌の核の画像を得た。【００５６】［リン酸化測定］ 培養した細胞の一部に対して、実施例１と���様のウェスタンブロッティングを実施して、Aktリン酸化の程度を指標として、ＰＩ３キナーゼの活性化を調べた。【００５７】［サイトカイン発現測定］培養細胞からISOGEN ＲＮＡ抽出試薬(NIPPON GENE)を用いて全ＲＮＡを単離し、５μｇの全ＲＮＡを鋳型として用い、ReverTra Ace ｃＤＮＡ合成キット(TOYOBO)を使用してｃＤＮＡを合成した。これをさらに鋳型として用い、Light Cycler (登録商標)2.0 ＰＣＲ装置(Rosch)を使用して、以下のプライマー対を使用し、下記の反応条件によるリアルタイムＰＣＲを実施することにより、ＩＬ−１２に対するｍＲＮＡ（IL-12p40）の発現量の相対的定量化を行った：  p40 forwardプライマー：CAGAAGCTAACCATCTCCTGGTTTG（配列番号６）；  p40 reverseプライマー：CCGGAGTAATTTGGTGCTCCACAC（配列番号７）；  反応条件：９５℃で０．５分間変性後、９５℃１０秒−５７℃３０秒−７２℃３０秒のサイクルを４５回。【００５８】［ｅｓｐＨ変異株を用いた共培養および測定］実施例１に記載したＥＰＥＣのｅｓｐＨ変異株を使用して、上記と同様にＢＭＤＣとの共培養実験を実施した。得られた感染細胞について、免疫蛍光染色及びリン酸化測定を、上記のそれぞれの方法で行った。【００５９】［結果］骨髄から単離したＢＭＤＣの初代培養細胞について、ＥＰＥＣの野生株で見られたＰＩ３キナーゼ活性の抑制が、ｅｓｐＨ変異株では低減した（図２ｃ）。また、細菌感染によるＩＬ−１２発現の増大は、野生株の場合は感染後２時間以降も持続したのに対し、ＴＴＳＳ変異株およびｅｓｐＨ変異株では３時間以内に低下した（図２ｄ）。これらの結果から、実施例１と同様、樹状細胞にＥｓｐＨ蛋白質を導入することにより、樹状細胞内でＰＩ３キナーゼ活性が阻害され、ＩＬ−１２合成が促進されることが示された。【００６０】  なお、ＥＰＥＣまたはその変異株の感染を観察すると、野生型細菌は細胞の表面に付着して微小コロニーを形成する（図２ａ上段およびｂ）のに対し、ＴＴＳＳ変異細菌株は細胞に貪食され（図２ａ下段）、ｅｓｐＨ変異株を共培養した場合は、野生型同様、貪食されず、微小コロニーを形成する（図２ａ中段）ことから、ｅｓｐＨ変異株が野生型同様細胞に感染することはできること、従って、ｅｓｐＨ変異株の表現型は、ＥＰＥＣが細胞に感染できないからではないこと、も示された。【００６１】＜実施例３＞＝＝＝Citrobacter rodentiumのマウスへの感染実験＝＝＝  本実施例では、Citrobacter rodentiumをマウス個体に感染させてマウスの免疫応答を調べることにより、ＥｓｐＨ蛋白質をマウスに投与することによってマウスの細胞性免疫応答を亢進させることができることを示す。【００６２】［経口感染と結腸の感染測定］BALB/c系統のマウスをクレアジャパンから、またB10.D2系統のマウスを日本エスエルシーから入手し、到着したすべてのマウスを東京大学医科学研究所内の動物飼育施設において東京大学策定のガイドラインに従って一週間飼育した。Citrobacter rodentium EX-33株（以下C.rodentiumと略記、東京大学医科学研究所笹川研究室から供与）を一晩３７℃で培養し、その２００μｌ（一頭当たり２〜３×１０８ コロニー形成単位（ｃｆｕ）相当量）を、飼養にてそれぞれのマウスに経口投与して感染させた。所定の期間飼育を継続した後に屠殺し、直腸から４．５ｃｍ分の遠位結腸を切除し���ＰＢＳによる洗浄で糞便ペレットを除去した。組織の重量測定および肉眼観察の後、ポッターエルベージェム型デジタルホモジェナイザー(AS ONE)でホモジェナイズした。ホモジェネートを冷ＰＢＳで段階的に希釈のうえ、マッコンキー寒天培地（DIFCO LABORATORIES）上に接種した。プレート上に生じたコロニーの数を計数し、マウス１匹当たりのｃｆｕを算出して感染の程度の指標とした。一方、感染後１２日目に同様に摘出した組織を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、薄切して、ヘマトキシリンエオジンにより組織染色して顕微鏡観察を行った。【００６３】［ＩＦＮ−γの定量］感染後１２日目のマウスの腸間膜から、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞を注射針を用いて単離した。穏やかに懸濁した後１００μｍメッシュを通して組織片を除去してから、ＲＰＭＩ１６４０培地中に移して、３７℃にて培養を開始した。続いて、ＭＬＮ細胞を細菌溶解液３７℃で７２時間にわたって刺激した。培養上清中のマウスＩＦＮ−γの含有量を、Quantikine M ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を使用して測定した。【００６４】［C.rodentiumのｅｓｐＨ変異株の作製］C.rodentiumについて、以下のようにしてｅｓｐＨ遺伝子の変異株を作製した。変異体は、hypomorphでもamorphでもよいが、ここでは、ｅｓｐＨ遺伝子が欠損したamorphを作製した。【００６５】  まず、C. rodentium の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマー対を用いて、下記反応条件によるＰＣＲを実施することによってｅｓｐＨ遺伝子の上流部分に対応するＤＮＡ断片（ｅｓｐＨ−５）を増幅した：  espH-5 forwardプライマー：AACTGCAGAAGAGGAGCACTCGT（配列番号２）；  espH-5 reverseプライマー：GCGTCGACCATGATACATCTCCC（配列番号３）；  反応条件：９４℃で２分間変性後、９４℃６０秒−５８℃６０秒−７２℃１２０秒のサイクルを３０回。【００６６】  同様にして、ｅｓｐＨ遺伝子の下流部分に対応するＤＮＡ断片（ｅｓｐＨ−３）を、以下のプライマー対および反応条件でのＰＣＲにより増幅した：  espH-3 forwardプライマー：GCGTCGACCCTTTGTCAGGCATG（配列番号４）；  espH-3 reverseプライマー：GCTCTAGAAATCTGCTCCTGCCG（配列番号５）；  反応条件：９４℃で２分間変性後、９４℃６０秒−５８℃６０秒−７２℃１２０秒のサイクルを３０回。【００６７】  得られたｅｓｐＨ−５から制限酵素PstI切断部位とSalI切断部位との間のＤＮＡ断片を、またｅｓｐＨ−３からSalI切断部位とXbaI切断部位間のＤＮＡ断片を、それぞれ対応する制限酵素による切断処理で切り出した。これら二つのＤＮＡ断片を互いにXbaI部位で連結し、連結されたＤＮＡ断片をショ糖感受性自殺ベクターpCACTUS（東京大学医科学研究所笹川研究室から供与）のクローン化部位に挿入した。挿入されたｅｓｐＨ由来のＤＮＡ断片は、ｅｓｐＨ遺伝子によりコードされるＥｓｐＨ蛋白質の１０番目から１７１番目までを欠失させる変異を有している。【００６８】  こうして得られた組み換え体発現ベクター、pCACTUS-espHを、エレクトロポレーション法によりC.rodentiumに導入した。形質転換株を５μg/mlトリメトプリム存在下のＬＢプレート上で一晩培養し、pCACTUS-espHが導入された菌を選択した。pCACTUSベクターはその複製部位が温度感受性のため、３０℃以上では複製できず、結果として宿主大腸菌のゲノムへ組み込まれることが知られている。これを利用して、選択された菌を４２℃で一晩培養することでpCACTUS-espHのゲノムへの導入を誘導した。こうして、C.rodentiumのｅｓｐＨ遺伝子部位にpCACTUS-espH全体を組み込ませた。次にpCACTUSのショ糖感受性を利用して、ゲノムに組み込まれたpCACTUS-espHを再びゲノムの外に脱落させた。この作業において、pCACTUS-espHの遺伝子が組み込まれたゲノムは元の状態に戻るが、この時、一定の確率でｅｓｐＨ変異遺伝子が安定に組み込まれた状態になってしまうゲノムも存在する。そこで、最終的に得られたコロニーからゲノムを取り出し、これを鋳型としてespH-5 forwardプライマーおよびespH-3 reverseプライマーを用いたＰＣＲを、９４℃で２分間変性後、９４℃６０秒−５８℃６０秒−７２℃１２０秒のサイクルを３０回の条件で行い、増幅したＤＮＡ断片を電気泳動し、それぞれのＰＣＲ産物の長さを比較することで、ｅｓｐＨ変異遺伝子が安定にゲノムに組み込まれた菌の同定を行った。この結果得られた複数の菌をさらに培養し、もう一度ＰＣＲ法を用いて遺伝子の変異を確認し、C.rodentiumのｅｓｐＨ変異株を得た。この変異株は、ＥｓｐＨ蛋白質の機能が欠損した表現型を示した。【００６９】［ｅｓｐＨ変異株による感染および測定］こうして得られたC.rodentiumのｅｓｐＨ変異株を使用して、上記と同様にしてBALB/cマウスに対する感染実験を実施した。得られた感染マウスに対して、結腸への細菌感染の測定、組織観察およびサイトカイン定量を、上記のそれぞれの方法で実施した。【００７０】［結果］C.rodentiumの野生株はマウス結腸に感染すると８日以内に急速に増殖し（図３ａの黒色縦棒）、組織の重量が増加した（図３ｂの白丸）。これに対しｅｓｐＨ変異株では結腸内の菌数が野生型より少なく、組織の重量増加の程度も小さかった（図３ａ白色縦棒、図３ｂ黒丸）。【００７１】  マウス結腸の肉眼観察では、野生株の感染では腸内の固形糞便が消失して全体が浮腫状となっており、組織病理学的観察でも感染部位の病変が認められた（図３ｃ左）のに対し、ｅｓｐＨ変異株の場合は固形糞便を含有する健康な結腸が観察され、組織像にも病変を認めなかった（図３ｃ右）。従って、ｅｓｐＨ蛋白質が、細菌の増殖を促進し、感染部位の病変を引き起こしていると考えられる。【００７２】  さらにＭＬＮでのサイトカインを定量すると、感染前には未検出だったＩＦＮ−γが感染後に顕著に発現していたが、変異株ではほとんど発現が起こらなかった（図３ｄ）。ＩＦＮ−γは、細胞性免疫応答を増強する機能を有するＴｈ１細胞において、ＩＬ−１２によって発現誘導され、Ｔｈ１細胞の分化・増殖に中心的な役割を果たすことから、ＥｓｐＨ蛋白質が、マウスの細胞性免疫応答を増強していることが示された。【００７３】  以上より、マウス結腸に感染させたC.rodentiumが分泌するＥｓｐＨ蛋白質が、マウスの細胞性免疫応答を亢進していることが明らかとなり、ＥｓｐＨ蛋白質が、細胞性免疫応答の賦活剤として有効であることがわかった。【００７４】＜実施例４＞＝＝＝C.rodentiumのＰＩ３キナーゼノックアウトマウスへの感染実験＝＝＝  本実施例では、遺伝的に細胞性免疫に比べて液性免疫応答が優位であるため、C.rodentium感染の効果が生じないことが知られているBALB/cマウスの遺伝的バックグラウンドを有するＰＩ３キナーゼノッ��アウトマウスに対し、C.rodentiumを感染させ、その効果を調べる。これにより、BALB/cマウスにおける液性免疫応答の優位性にＰＩ３キナーゼが関与しており、ＰＩ３キナーゼを阻害することにより、液性免疫応答を抑制できること、さらに、マウスにおいても、ＥｓｐＨ蛋白質の機能がＰＩ３キナーゼを通じて発揮されるため、ＥｓｐＨ蛋白質の投与により、ＰＩ３キナーゼが阻害され、その結果として生じる下流のイベントが起きること、を示す。【００７５】［ノックアウトマウスの作製］ＰＩ３キナーゼのｐ８５α調節サブユニットの欠損したマウスを以下の方法で作製した（詳細は、Terauchi, Y., Tsuji, Y., Satoh, S.et al. (1999) “Increased insulin sensitivity and hypoglycemia in mice lacking the p85a subunit of phosphoinositide 3-kinase.” Nature Genetics 21:230-235. を参照）。すなわち、ｐ８５αをコードする遺伝子Pik3r1を、マウスＤ３ゲノムライブラリーから単離した。そのエクソン１Ａの両側の制限酵素PstI切断部位間に、ネオマイシン耐性遺伝子を含むカセットを挿入した。こうして作製したｐ８５α欠損遺伝子を、ＥＳ細胞に相同組み替えにより導入して、得られたｐ８５α(+/-)ＥＳ細胞を用いてＰＩ３キナーゼのノックアウトマウスを作製した。得られたノックアウトマウスをBALB/cマウスに12代の戻し交配をすることにより、ノックアウトマウスの遺伝的バックグラウンドをBALB/cのものに置換した。こうして作製された、変異ｐ８５α遺伝子に関しホモ接合であるマウス個体は、ＰＩ３キナーゼ機能の欠損した表現型を示し、ここではｐ８５αノックアウトマウスと記載する。また、変異ｐ８５α遺伝子のヘテロ接合個体は、その表現型においては、野生型マウスと同様に、正常なＰＩ３キナーゼ機能を有し、ここではｐ８５αヘテロザイゴートと記載する。【００７６】［感染実験］野生型BALB/cマウスおよびｐ８５αノックアウトマウスに対して、C.rodentium野生株またはそのｅｓｐＨ遺伝子欠損型変異株を用いて、実施例３と同様の感染実験を実施した。そして感染マウスの各々について、実施例３に記載した方法で、感染菌数の測定、摘出した結腸の組織重量測定、並びにそれらの肉眼的及び組織学的観察を実施した。【００７７】［結果］BALB/cマウスの遺伝的バックグラウンドを有するｐ８５αノックアウトマウスに対してC.rodentiumの野生株を感染させたところ、野生型B10.D2マウスへの感染と同程度の高い感染を示した（図４）。この結果は、BALB/cマウスにおいて液性免疫応答が優位であることに、ＰＩ３キナーゼが関与していることを示しており、ｅｓｐＨ蛋白質によってＰＩ３キナーゼを阻害することにより、液性免疫応答を抑制できることがわかった。【００７８】  一方、ノックアウトマウスに対してC.rodentiumのｅｓｐＨ変異株を感染させたところ、実施例３の場合に見られたようなｅｓｐＨ遺伝子の変異による感染性の低下がここでは見られなかった（図４）。また、摘出した結腸の観察においても、ｅｓｐＨ変異の有無にかかわらず、野生型マウス（図４ｃ左）よりもノックアウトマウス（図４ｃ右）の方が高い感染を示していた。これらのことから、マウスの個体においても、ＥｓｐＨ蛋白質の標的がＰＩ３キナーゼであることが確認された。【００７９】＜実施例５＞＝＝＝C.rodentiumの骨髄移植キメラマウスへの感染実験＝＝＝  野生型マウスに��８５αノックアウトマウスの骨髄を移植したキメラマウスに対し、C.rodentiumによる感染実験を行うことにより、C.rodentiumのもつＥｓｐＨ蛋白質の標的は骨髄由来の細胞、特に樹状細胞であることを示す。【００８０】［骨髄移植］ BALB/cの遺伝的背景を持つ、実施例４に記載の方法で作製したｐ８５αノックアウトマウスあるいはｐ８５αヘテロザイゴートマウスの大腿骨の骨髄から、実施例２に記載の方法で細胞を採取した。赤血球を塩化アンモニウム溶液により溶血させて除去し、１０７個の骨髄細胞を０．１５ｍｌのＰＢＳに懸濁した。一方、別のｐ８５αヘテロザイゴートマウスに、４．５ＧｙのＸ線をＸ線照射装置（日立メディコ社製）で照射した後、上記の骨髄細胞懸濁液のいずれかを静脈内投与した。【００８１】［感染実験］こうして得られた２種類の骨髄移植キメラマウスに対して、実施例３と同様にして、C.rodentiumによる感染実験を実施した。それぞれの感染マウスに対して、実施例３に記載の方法で、細菌感染の測定及び組織観察を実施した。【００８２】［結果］致死量の紫外線照射により骨髄の細胞はすべて死滅するため、ｐ８５αヘテロザイゴートマウスにノックアウトマウスの骨髄を移植したキメラマウスにおいては、樹状細胞も含めて骨髄の細胞はほとんどすべてがノックアウトマウス由来の細胞となる。このようなキメラマウスへの感染実験を行ったところ、ノックアウトマウス自体の場合と同様に野生型マウスよりも高い感染性を有しており（図５ａ、ｂ）、野生型マウスなら生じない結腸での感染による病変も認められた（図５ｃ）。これらのことから、C.rodentiumのもつＥｓｐＨ蛋白質の標的は骨髄由来の細胞であることが確認され、実施例１、２などから、少なくとも樹状細胞がその標的であることがわかる。従って、ＥｓｐＨ蛋白質を発現させる対象の細胞として、樹状細胞が好適であることが示された。【００８３】＜実施例６＞＝＝＝ノックアウトマウス由来のＴ細胞に対する分化誘導実験＝＝＝  マウス個体から単離したＴ細胞を分化誘導することにより、Ｔ細胞から分泌されるケモカインmacrophage inflammatory protein-2（ＭＩＰ−２）の発現が、Ｔ細胞内のＰＩ３キナーゼによって制御されていることを示す。【００８４】［マウス脾臓細胞の単離と刺激］実施例4に記載の方法で作成したｐ８５αヘテロザイゴートマウスおよびｐ８５αノックアウトマウスからそれぞれ脾臓細胞を分離し、赤血球を塩化アンモニウム溶液による溶血処理で除去した。抗ＣＤ４抗体マイクロビーズ（第一化学薬品）を用いて、AutoMACS(登録商標)セルソーター（Miltenyi Biotec）を使用してＣＤ４＋Ｔ細胞を分離し、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。これらの培養細胞に、抗ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体（共に10 μg/ml、B-Dファーミンジェン）、もしくはPhorbol myristate acetate（PMA、50 ng/ml、Calbiochem）及びIonomycin（1 μg/ml、Calbiochem）をそれぞれ同時添加することにより刺激を与えた。刺激開始から４８時間後に培養上清を回収し、上清に含まれるＭＩＰ−２の濃度を、抗ＭＩＰ−２抗体（R&D Systems）を使用したＥＬＩＳＡにて測定した。【００８５】［結果］ＰＩ３キナーゼの欠損したノックアウトマウス由来の培養Ｔ細胞では、分化誘導剤の添加によりＭＩＰ−２の発現が亢進し、抗体による��激の場合は、より顕著に亢進が起こった（図６左）。これに対し、野生型マウス由来のＴ細胞を用いた実験では、分化誘導剤ではＭＩＰ−２の発現の亢進が見られず、抗体刺激の場合も、発現亢進の程度はノックアウトマウスの場合よりは小さかった（図６右）。【００８６】  このことから、ＰＩ３キナーゼはＴ細胞におけるケモカイン発現を抑制する作用を有しており、従ってＴ細胞は、そのＰＩ３キナーゼ活性を阻害することによりケモカイン分泌を亢進させる対象として好適であることが分かった。    なお、Ｔ細胞においてケモカイン発現を亢進させるためには、Ｔ細胞内でＰＩ３キナーゼ活性を阻害できる方法であれば、どのような方法でも構わない。ＥｓｐＨ蛋白質を発現させることは、その実施態様の一例となる。【００８７】＜実施例７＞＝＝＝ＧＳＫ３β阻害剤によるＢＭＤＣにおけるサイトカイン発現の抑制＝＝＝  本実施例では、単離した樹状細胞において、ＧＳＫ３βを阻害することによって、ＰＩ３キナーゼ依存性炎症性サイトカインの発現が抑制されることを示す。【００８８】［培養実験］骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、実施例２に記載した方法で野生型マウスから単離した。次に、実施例１と同様にして、単離したＢＭＤＣを野生型又はｅｓｐＨ変異型のＥＰＥＣと共培養して感染させた。感染細胞の全溶解液について、抗リン酸化Ser9−ＧＳＫ３β抗体（Cell Singnaling社）を用いたウェスタンブロッティングにより、ＧＳＫ３βのリン酸化レベルを測定した。一方、単離したＢＭＤＣを、10μＭのＧＳＫ３β阻害剤SB216763（シグマ社）または5mMのLiClで１時間前処理した後、1μg/mlのLPS溶液で２４時間刺激した。刺激後の培養上清に含まれるＩＬ−１２の含有量を、抗マウスＩＬ−１２p70に特異的なELISAキット（R&D Systems社）を用いて定量した。【００８９】［結果］図７Ａに示すように、ＥＰＥＣの野生株に感染させたＢＭＤＣでは、リン酸化ＧＳＫ３βの脱リン酸化が急速に進行した（上段左）のに対し、ｅｓｐＨ変異株に感染させた場合は、脱リン酸化が生じなかった（上段右）。また、図７Ｂに示すように、LPS刺激により活性化したＢＭＤＣにおいて、SB216763またはLiClの添加によってＧＳＫ３βの活性を阻害すると、ＩＬ−１２の生産量が低減した。【００９０】  従って、樹状細胞において、ＧＳＫ３βを阻害することによって、炎症性サイトカインの発現が抑制できることが明らかになった。【００９１】＜実施例８＞＝＝＝ＬｉイオンによるマウスへのC. rodentiumの感染の抑制＝＝＝  本実施例では、病原性大腸菌に感染させたマウスにＬｉイオンを投与することにより、炎症性サイトカインの生産が抑制され、感染による症状が低減することを示す。【００９２】［細菌感染実験］野生型B10.D2マウスを、実施例３に記載の方法でC. rodentiumで経口感染させた。感染の３日後に、３群に分けたマウスのうち１群を屠殺して、糞塊を除いた結腸の重量を測定した。一方、残りの２群の一方に与える飲用水を30 mM LiCO3含有水と交換して実験群とし、他方には再処理水を投与して対照群とし、それぞれさらに３日間飼育を継続した。感染後６日目に実験群及び対照群のマウスを屠殺し、結腸重量を測定した。結腸組織の一部を実施例３に記載の方法で固定し、凍結切片を作成してヘマトキシリンエオジンに���り組織染色して顕微鏡観察を行った。【００９３】［感染性及びサイトカインの測定］残りの組織試料について、実施例３に記載の方法で、ホモジェナイズ後にマッコンキー寒天培地上で平板培養した。生じたコロニーを計数することにより、マウス結腸内の付着細菌数を決定した。一方、経口感染の６日後のマウスから、実施例３に記載の方法で、ＭＬＮ細胞を単離した。単離したＭＬＮ細胞を試験管内でC. rodentium溶解液によって刺激し、生産されたＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ法によって定量した。【００９４】［結果］感染後６日目における実験群及び対照群のマウスから摘出した結腸の観察像を、図８Ａ及びＢに示す。また、感染後０，３，６日目の結腸の重量を、図８Ｃに折れ線グラフで示す。これらから分かるように、LiCO3を投与した実験群のマウスでは、投与しなかった対照群のマウスよりも結腸における細菌感染の症状が低減していた。また結腸に感染した細菌数も、LiCO3を投与した実験群のマウスでは、図８Ｄの棒グラフに示すように、対照群に対して有意に減少していた。さらに、実験群のマウスでは、図８Ｅの棒グラフに示すように、リンパ節細胞におけるＩＦＮ−γの発現量が対照群よりも低減していた。ＩＦＮ−γは、細胞性免疫応答を増強する機能を有するＴｈ１細胞において、炎症性サイトカインのＩＬ−１２によって発現誘導されるため、本実験の結果から、実施例７の培養細胞においてだけでなく、生体内においても、Ｌｉイオンの投与によりＩＬ−１２の発現が抑制されることが明らかになった。さらに、ＩＦＮ−γは、Ｔｈ１細胞の分化・増殖に中心的な役割を果たすことから、Ｌｉイオンが、炎症性サイトカインの産生及びマウスの細胞性免疫応答を抑制し、液性免疫応答を賦活させていることが示された。【００９５】  以上からＬｉイオンは、生体内において、炎症性サイトカインの産生を抑制する免疫調節効果を有し、細胞性免疫応答の抑制剤、液性免疫応答の賦活剤、及び病原性細菌の増殖を抑制する抑制剤として有効であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明の実施例１における、ＥＰＥＣまたはその変異株の株化樹状細胞との共培養実験の結果を表す図である。ａ〜ｃの上部に示した菌株に感染した後、所定の時間（Ｈ表示）経過した細胞における、リン酸化Ａｋｔ蛋白質（各上段）、および内部標準としてαチューブリン（ａ、ｂの下段）の量が、それぞれウェスタンブロッティングによるバンドの濃淡として示されている。
【図２】本発明の実施例２における、ＥＰＥＣまたはその変異株の骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）との共培養実験の結果を表す図である。ａおよびｂでは、左上隅に示したマウス系統から採取されたＢＭＤＣに、左端に表示した菌株（ｂでは野生株）をそれぞれ感染させて培養したものを、アクチン（左列）またはＤＮＡ（中列）をそれぞれ可視化して顕微鏡観察した画像、そしてそれらを重ね合せた画像（右列）が示されている。細菌はＤＮＡの可視化によって画像中では小斑点状に現されている。ｃでは、野生株または変異株に感染後のＢＭＤＣにおけるリン酸化Ａｋｔ量の変動が、図１と同様にして示されている。ｄでは、感染後所定の時間（Ｈ表示）経過後の細胞について、サイトカイン発現（ＩＬ−１２p40ｍＲＮＡの量）の相対的な測定結果が示されており、黒色、斜線、白色の縦棒がそれぞれ野生株、ＴＴＳＳ変異株、およびｅｓｐＨ変異株による感染を表している。
【図３】本発明の実施例３における、C. rodentiumまたはその変異株のB10.D2マウスへの感染実験の結果を表す図である。ａでは、経口感染から所定日数経過後の結腸での感染の程度が示されており、黒色および白色の縦棒はそれぞれ野生株または変異株の細菌数（ｃｆｕ）を表している。ｂでは、感染から所定日数経過後に摘出した結腸の組織重量の変化の様子が示されており、白丸と黒丸はそれぞれC.rodentium野生株とｅｓｐＨ変異株を表している。ｃでは、野生株（左）または変異株（右）に感染後１２日目に摘出した結腸の肉眼的（上段）または病理組織学的（下段）観察結果が示されており、各下段の左側パネル内の四角枠の領域がさらに拡大されて右側に示されている。ｄでは、未感染または各菌株に感染したマウスの腸間膜リンパ節におけるＩＦＮ−γの産生量が示されている。
【図４】本発明の実施例４における、C. rodentiumまたはその変異株のＰＩ３キナーゼノックアウト（ＫＯ）BALB/cマウスまたは野生型BALB/cマウスへの感染実験の結果を表す図である。ａとｂでは、C.rodentium野生株（黒色縦棒）またはｅｓｐＨ変異株（白色縦棒）に感染したマウスの結腸について、感染細菌数（ａ）および組織重量（ｂ）が示されている。ｃとｄでは、野生株（ｃ）または変異株（ｄ）に感染した、野生型（左）またはノックアウト（右）マウスから摘出した結腸の観察結果が示されており、図３ｃと同様に、肉眼的観察像（上段）、病理組織学的観察像（下段左）およびその部分拡大図（下段右）がそれぞれ示されている。
【図５】本発明の実施例５における、C. rodentiumの骨髄キメラマウスへの感染実験の結果を表す図である。C.rodentium野生株に感染したキメラマウスの、細菌数（ａ）および組織重量（ｂ）の経時変化、さらに感染後１２日目に摘出された結腸の観察結果（ｃ）、がそれぞれ示されている。ｐ８５αヘテロザイゴートマウスにｐ８５αノックアウトマウスの骨髄を移植したキメラマウスへの移植実験の結果は、ａ、ｂでは白色縦棒で、またｃでは左半分に示されており、他方、ヘテロザイゴートマウスにヘテロザイゴートマウスの骨髄を移植したキメラマウスを用いた場合の結果は、a、ｂでは黒色縦棒、ｃでは右半分に示されている。ｃでは、図３ｃと同様に、肉眼的観察像（上段）、病理組織学的観察像（下段左）およびその部分拡大図（下段右）がそれぞれ示されている。
【図６】本発明の実施例６における、ＰＩ３キナーゼに関するノックアウトマウスまたはヘテロザイゴートマウス由来のＴ細胞に対する分化誘導実験の結果を表す図である。ｐ８５αノックアウトマウス（ＰＩ３ＫＫＯ）またはｐ８５αヘテロザイゴートマウス（ＰＩ３ＫＨＴ）の脾臓由来のＴ細胞について、薬物無添加で培養した場合（−）、２種類の抗体（α−ＣＤ３及びα−ＣＤ２８）、または２種類の分化誘導剤（ＰＭＡ及びionomycin）を同時添加した場合の、それぞれ４８時間後に、細胞が培養上清中に分泌したケモカイン（ＭＩＰ−２）を定量した結果が縦軸に示されている。
【図７】本発明の実施例７における、ＧＳＫ３β阻害剤を添加したＢＭＤＣの培養実験の結果を表す図である。Ａでは、野生型又はｅｓｐＨ変異型のＥＰＥＣに感染した後、所定の時間（Ｈ表示）経過したＢＭＤＣにおける、リン酸化Ａｋｔ蛋白質（各上段）、および内部標準としてαチューブリン（ａ、ｂの下段）の量が、それぞれウェスタンブロッティングによるバンドの濃淡として示されている。Ｂでは、LPS刺激により活性化したＢＭＤＣにおけるサイトカイン発現（ＩＬ−１２p70蛋白質の量）のＥＬＩＳＡ法による測定結果が示されており、刺激しなかった場合（ＮＴ）、及び刺激に先立ってSB216763（ＳＢ）またはLiCl（LiCl）を添加した場合若しくは添加しなかった場合（−）の結果を表している。
【図８】本発明の実施例８における、C. rodentiumに感染させたB10.D2マウスへのＬｉイオンの投与実験の結果を表す図である。Ａ及びＢでは、LiCO3を投与しなかった対照群（Ａ）又は投与した実験群（Ｂ）のマウスの結腸について、それぞれ肉眼的（上段）または病理組織学的（下段）観察結果が示されており、各下段の左側パネル内の四角枠の領域がさらに拡大されて右側に示されている。Ｃでは、感染から所定日数経過後にマウスから摘出した結腸の組織重量の変化の様子が示されており、黒色，灰色，白色の丸印はそれぞれ投与前、対照群，実験群のマウスの結果を表している。Ｄ及びＥでは、実験群(+)又は対照群(-)のマウスについて、結腸に感染した細菌数(cfu)（Ｄ）、及び単離した腸間膜リンパ節によるＩＦＮ−γの産生量(pg/ml)（Ｅ）を示しており、＊は有意差（p<0.05）があることを表している。
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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