(57)【要約】【課題】腸管でのＩｇＡ抗体産生向上による腸管免疫力増強作用を有する、安全な天然由来の食品素材としての乳酸菌（植物性乳酸菌）を利用した腸管免疫力増強剤を提供すること。【解決手段】高いＩｇＡ抗体産生向上作用を有し、腸管免疫力増強作用を有するラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌、好ましくは、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１０６として寄託されている乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株を有効成分として含有する腸管免疫力増強剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高いＩｇＡ抗体産生向上作用を有し、腸管免疫力増強作用を有するラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌を有効成分として含有する腸管免疫力増強剤。
【請求項２】
上記乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１０６）である請求項１に記載の腸管免疫力増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管でのＩｇＡ抗体産生を向上させることにより感染抵抗性を高めるなどの腸管免疫力増強作用を有する乳酸菌ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を含有する腸管免疫力増強剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腸管粘膜は、常に無数のウイルス、細菌、寄生虫、病原性抗原や食物抗原にさらされており、これらの異物抗原から生体を守るシステムとして腸管免疫系は発達してきた。しかし、大きな手術を行なった後や病後などは腸管免疫力が一時的に低下し、外部からの異物侵入に対する抵抗力が弱り、感染症にかかるリスクが増大することが知られている。加齢と共に腸管免疫力が徐々に低下した老人や腸管免疫系の発達が不十分な幼児も同様のリスクを背負っている。
【０００３】
腸管免疫力を評価する指標としては、Ｔ細胞の増殖能、免疫グロブリンＡ（以下、ＩｇＡ抗体という）の産生量、細胞が生産する種々の働きをもつペプチド、サイトカイン量などが知られている。これらの中でもＩｇＡ抗体は、細菌やウイルスの中和、組織への細菌の付着の抑制などに重要な役割を果たしている。従って、 ＩｇＡ抗体量の増加は腸管免疫力向上の有力な指標となる。上記した感染予防や治療において、ＩｇＡ抗体量を高く保つ作用を有する製剤、ＩｇＡ抗体の生産力を高めることができる製剤の開発が強く望まれている。
【０００４】
腸管免疫力を向上させる食品成分として、乳酸菌、麹カビ或いは酵母などの食用微生物やそれらの細胞壁成分、又は、シイタケなど担子菌類の多糖類、特にβグルカン類などが知られている。これらの中で最近プロバイオティックスとして注目される乳酸菌による免疫賦活力に注目した食品素材も数多く提案されている。乳酸菌の属も多岐に渡り、ラクトコッカス属に着目したもの（特許文献１）、エンテロコッカス属に着目したもの（特許文献２）、ラクトバチルス属に着目したもの（特許文献３、特許文献４）など様々である。しかしながら、特許文献１では、ＩｇＡ抗体産生量の増加が重要な指標になると指摘しておきながら直接的な定量を実施していないのでその効果が明確でない。また、特許文献２では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＬ−１２産生しか評価していないし、特許文献３では、ＩｇＡ抗体産生能を評価しているもののパイエル板を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を行なっているに過ぎず、特許文献４では、ＩＬ−１２に加えてＩＦＮγ、亜硝酸イオン濃度を指標としているが、生体内で免疫賦活効果を示すのかどうかは各文献では明らかにされていない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで効果を示したものは生体で必ず効果を示すと仮定しても、特許文献４では、乳酸菌全般の効果として免疫力増強作用があるとしているのにガセリ菌とカゼイ菌各１菌株しか試験していない、カゼイ菌全般に効果があるとしているが、寄託した菌株での評価しかしていない、さらに、イネ科穀物との組み合わせによる相乗効果についてもオートミール以外の素材との組み合わせについては一切示していないなど、不備な点が多い。そこで、ＩｇＡ抗体産生能などを指標としたｉｎ  ｖｉｖｏでの試験結果に基づいた腸管免疫力増強作用を有する安全な機能性素材、特に乳酸菌由来製剤の開発が切望されている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−８８３６２号公報
【特許文献２】特開２００４−４１０９９号公報
【特許文献３】特開２００４−３５７５３５号公報
【特許文献４】特開２００６−６９９９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＩｇＡ抗体産生向上による腸管免疫力増強作用を有する、安全な天然由来の乳酸菌（植物性乳酸菌）を有効成分として含有する腸管免疫力増強剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成すべく種々検討した結果、パン酵母から分離したラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に属する乳酸菌を含有する製剤が、高いＩｇＡ抗体産生向上作用を有し、上記目的を達成するものであることを見出し、本発明に到達した。
本発明は、高いＩｇＡ抗体産生向上作用を有し、腸管免疫力増強作用を有するラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌を有効成分として含有する腸管免疫力増強剤を提供するものである。
また、本発明は、前記乳酸菌がラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１０６）である腸管免疫力増強剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の腸管免疫力増強剤を構成するラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌は、高いＩｇＡ抗体産生向上作用を有し、該作用によって腸管免疫力増強作用をもたらす。それゆえ、この乳酸菌を含有する製剤を摂取することにより、免疫力の低い幼児期や加齢や病後の免疫力が低下している状態での腸管免疫力を増強し、細菌の感染に対する抵抗力をつけることが可能になる。本発明の腸管免疫力増強剤は、食経験のある天然食品素材から分離した乳酸菌由来であるので安全性にも優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
前記乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−２１１０６である。
【００１０】
乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株の菌学的性質を下記に示す。
ＭＲＳ液体培地（ＤＩＦＣＯ社）を用いて、３０℃、１８時間培養したときの菌の形態
（１）菌の形態  桿菌
（２）グラム染色  陽性
（３）運動性  なし
（４）胞子  なし
（５）カタラーゼ  なし
（６）通性嫌気性
（７）ブドウ糖の代謝  ５０％以上乳酸に転換する
（８）生育温度範囲  １５℃、３０℃および３５℃では生育を認めるが、４５℃では生育を認めない
（９）乳酸発酵  ホモ型
（１０）乳酸の旋光性  ＤＬ
（１１）炭水化物の発酵性  グリセロールは陽性、Ｄ-アラビノースは陰性、Ｌ-アラビノースは陽性、リボースは陽性、Ｄ-キシロースは陰性、ガラクトースは陽性、グルコース
は陽性、フルクトースは陽性、マンノースは陽性、ラムノースは陽性、マンニトールは陽性、ソルビトールは陽性、αメチルＤグルコシドは陰性、アミグダリンは陽性、エスクリンは陽性、サリシンは陽性、セロビオースは陽性、マルトースは陽性、ラクトースは陽性、メリビオースは陽性、シュクロースは陽性、トレハロースは陽性、イヌリンは陰性、メレジトースは陽性、ラフィノースは陽性、スターチは陰性、グルコン酸は陽性。
【００１１】
乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株は、食経験が豊富な素材（パン酵母）から分離したものであるため、腸管免疫力を増強させる製剤に安全に利用することができる。
【００１２】
乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株は、そのままあるいは必要に応じて薬学的に許容される種々の担体、賦形剤、その他の添加剤、その他の成分を配合して製剤化することによって、腸管免疫力増強剤とすることができる。また、該腸管免疫力増強剤は、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株を用いて発酵させた種々の動植物性物質をベースとしてもよい。
【００１３】
本発明の腸管免疫力増強剤は、高いＩｇＡ抗体産生向上作用を有するラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌、特に好ましくは上記の本発明のラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株を有効成分として含有するものである。
【００１４】
本発明の腸管免疫力増強剤で用いられる上記の高いＩｇＡ抗体産生向上作用を有するラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌は、その作用メカニズムは限定されず、結果的にＩｇＡ抗体産生が向上し、該ＩｇＡ抗体産生向上による腸管免疫力増強作用を有するものであればよい。
ここで、「高いＩｇＡ抗体産生向上作用を有する」とは、好ましくは、腸管免疫力増強剤を摂取する前後において、統計的に有意水準５％でＩｇＡ抗体産生が向上される状態をいう。
【００１５】
乳酸菌のＩｇＡ抗体産生向上作用の評価は、以下の方法により評価することが好ましい。
乳酸菌をＭＲＳ培地等で培養し、この培養した乳酸菌を０．１〜２０質量％含む飼料をマウスに一定期間摂取させる。摂取後、マウス（乳酸菌添加群）を解剖し、小腸パイエル板細胞を取り出す。この小腸パイエル板細胞を培養し、培養上清を回収する。回収した培養上清中のＩｇＡ抗体産生量をＥＬＩＳＡ法により測定する。同様にして、乳酸菌を含まない飼料を摂取させたマウス（乳酸菌無添加群）のＩｇＡ抗体産生量を測定する。乳酸菌添加群のＩｇＡ抗体産生量と乳酸菌無添加群のＩｇＡ抗体産生量とを比較して、乳酸菌のＩｇＡ抗体産生向上作用を評価する。
【００１６】
本発明の腸管免疫力増強剤中の乳酸菌の含有量は、ＩｇＡ抗体産生を向上しうる量であればいかなる量であってもよく、使用形態、腸管免疫力増強剤の剤形、投与又は摂取する者の症状や年齢性別などによって適宜変化させることができる。本発明の腸管免疫力増強剤を経口投与又は摂取させる場合には、１人１日当たりの投与量又は摂取量が１ｍｇ〜２０ｇとなるように含有させることが好ましい。
【実施例】
【００１７】
次に本発明をさらに具体的に説明するために実施例を挙げるが、本発明は、以下の実施例に制限されるものではない。
【００１８】
実施例１
（使用した乳酸菌）
鉄砲漬け、ゴーヤ漬け、キムチなどの漬物やイーストなど、日本人の食経験が豊富な植物性素材から単離された植物性乳酸菌の中から桿菌であること、同様の性状をもたらすものが複数菌株見つかること、通常の培地で増殖性が高いことなどを基準に、表１に示す代表的な３１菌株を選抜した。表１に示すＡＹＡは、本発明のラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株である。
【００１９】
【表１】
2008201708.tif 000002
【００２０】
（乳酸菌試料の調製）
１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドを含むＭＲＳ（ｄｅ  Ｍａｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐｅ）培地を用い、表１に示した各乳酸菌株を３７℃で４８時間培養した。その後、遠心分離によって集菌し、滅菌水で３回洗浄した後、滅菌水に懸濁し、１２１℃で３０分間オートクレーブ処理し、これらを凍結乾燥して乳酸菌試料をそれぞれ得た。
【００２１】
（乳酸菌の一次スクリーニング：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験によるＩｇＡ抗体産生向上作用の評価）
１．パイエル板細胞の調製
ＢＡＬＢ／ｃマウスから小腸を採取し、パイエル板細胞を回収する。このパイエル板を磨り潰し、セルストレイナーを通し細胞のみを回収する。回収した細胞を、日本水産製のウシ胎児血清：ＦＣＳ（Ｆｏｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）を５質量％添加したＲＰＭＩ培地１０ｍｌで２回洗浄し、最終的に５質量％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ培地１ｍｌに懸濁する。細胞数を計測し３×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように希釈し、各ウエル１００μｌずつ９６穴プレートにまく。
２．乳酸菌との共培養
５質量％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ培地で各乳酸菌試料を２００μｇ／ｍｌになるように調製し、その内１００μｌを上で準備した９６穴プレートに加え、ＣＯ2インキュベーターで７日間培養する。対照区として５質量％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ培地１００μｌのみを対照ウエルに加え、同時に処理する。
３．ＩｇＡ定量
培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法により上清中のＩｇＡ抗体量を定量し、乳酸菌フリーの対照区の値と比較した。
４．実験結果
実験結果を図１に示した。一連の実験を３回繰り返し、ＡＹＢ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ＡＹＡ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ＯＹＣ−９４（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）が強いＩｇＡ抗体産生向上作用を示すことがわかった。
【００２２】
実施例２及び比較例１〜４
表２に示す、ＡＹＡ（実施例２）、ＡＹＢ（比較例１）、ＯＹＣ−９４（比較例２）、ＯＹＣ−１０５（比較例３）及びＬ．ＧＧ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、入手先：ＡＴＣＣ）（比較例４）について、これらをマウスに経口投与した場合のＩｇＡ抗体産生向上作用を次のように評価した。
【００２３】
【表２】
2008201708.tif 000003
【００２４】
１．飼料の調製
各乳酸菌について、実施例１の（乳酸菌試料の調製）で示す方法と同様にして乳酸菌試料をそれぞれ調製した。この乳酸菌試料を下記に示す配合の基礎飼料（ＡＩＮ−９３（米国国立栄養研究所によるマウス・ラットを用いた栄養研究のための標準精製飼料）をベースとした飼料）に５質量％になるように混合し、乳酸菌入り飼料を調製した。対照群として乳酸菌無添加の基礎飼料も調製した。基礎飼料の原料は、全てオリエンタル酵母工業株式会社製のものを使用した。飼料は、乳酸菌試料の混合後、加水し筒状に成形することで得た。
２．動物実験スケジュール
５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの体重を測定し、体重を指標として層別連続無作為化法を用いて各群６匹ずつの群分けを行なった。群分け後、上記１で調製した基礎飼料及び乳酸菌入り飼料の摂取を開始した。なお、体重測定に先立ち順化処理（１週間）を行ったが、この間にはいずれのマウスにも基礎飼料を自由摂取させた。
乳酸菌入り飼料の摂取開始後２８日目にマウスを解剖し、小腸パイエル板細胞を回収した。その後、これを５質量％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ培地で７日間培養し、培養上清を回収した。上清中のＩｇＡ抗体量をＥＬＩＳＡ法により定量した。
一方、回収した小腸パイエル板細胞をＦＡＣＳ（フローサイトメーター）で解析し、ＩｇＡ陽性細胞の割合を算出した。
３．実験結果
摘出した小腸パイエル板細胞を培養した上清のＩｇＡ抗体量を測定した結果を図２に示す。また、小腸パイエル板細胞をＦＡＣＳにより分離し、ＩｇＡ陽性細胞存在率を算出した結果を図３に示す。ダネット法により統計解析を行ったところ、ＩｇＡ抗体量については、いずれの群でも対照群（無添加）に対する有意差はつかなかった（有意水準５％）が、ＡＹＡを含む飼料を摂食した群（実施例２）で非常に高いＩｇＡ抗体産生能が認められた。また、ＡＹＡを含む飼料を摂食した群（実施例２）及びＯＹＣ−１０５を摂食した群（比較例３）で、ＩｇＡ陽性細胞の割合が対照群（無添加）に比べて有意に高い値を示した。このことから、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１０６）を含有する腸管免疫力増強剤が、高いＩｇＡ抗体産生向上作用を有することが証明された。
【００２５】
（基礎飼料の配合）
カゼイン                    ２０．０質量％
コーンスターチ              ５０．５質量％
シュークロース              １０．０質量％
ラード                      １０．０質量％
セルロースパウダー            ５．０質量％
ＡＩＮ−９３ミネラル混合      ３．５質量％
ＡＩＮ−９３ビタミン混合      １．０質量％
【００２６】
次に、本発明の腸管免疫力増強剤の実施例を示す。
【００２７】
実施例３（錠剤）
実施例１の（乳酸菌試料の調製）で示す      ５  ｇ
方法で調製したＡＹＡの乳酸菌試料
トウモロコシデンプン                    １０  ｇ
乳糖                                    ４０  ｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム      ８  ｇ
微結晶セルロース                        ２７  ｇ
ポリビニルピロリドン                      ７  ｇ
ステアリン酸マグネシウム                  ３  ｇ
合計                              １００  ｇ
乳酸菌試料に微結晶セルロース、トウモロコシデンプン、乳糖、カルボキシメチルセルロースカルシウムを混合し、次いでポリビニルピロリドンの水溶液を結合剤として加えて常法により顆粒化する。これに滑沢剤としてステアリン酸マグネシウムを加えて混合した後、１錠１００ｍｇの錠剤に打錠する。
【００２８】
実施例４（硬カプセル剤）
実施例１の（乳酸菌試料の調製）で示す    １０  ｇ
方法で調製したＡＹＡの乳酸菌試料
微結晶セルロース                        ５５  ｇ
トウモロコシデンプン                    ２５  ｇ
乳糖                                    ３０  ｇ
ポリビニルピロリドン                      ４  ｇ
ステアリン酸マグネシウム                  １  ｇ
合計                              １２５  ｇ
上記成分を常法により顆粒化した後、ゼラチン硬カプセルに充填する。
【００２９】
実施例５（散剤）
実施例１の（乳酸菌試料の調製）で示す    ５０  ｇ
方法で調製したＡＹＡの乳酸菌試料
微結晶セルロース                      ６００  ｇ
トウモロコシデンプン                  ３００  ｇ
ポリビニルピロリドン                    ５０  ｇ
合計                            １０００  ｇ
上記成分を混合し、常法により散剤とする。
【００３０】
実施例６（顆粒剤）
実施例１の（乳酸菌試料の調製）で示す    １０  ｇ
方法で調製したＡＹＡの乳酸菌試料
乳糖                                  １３０  ｇ
トウモロコシデンプン                    ８７  ｇ
ポリビニルピロリドン                      ８  ｇ
Ｌ−メントール                          １５  ｇ
軽質無水ケイ酸                            ５  ｇ
合計                              ２５５  ｇ
上記の処方で、乳酸菌試料、乳糖、トウモロコシデンプン及びポリビニルピロリドン水溶液を混合し、造粒機にて攪拌下加熱造粒する。冷却後、粒度５００μｍ以下に篩分けし、Ｌ−メントールを加えた後、無水ケイ酸を加え、混合し分包（１. ０ｇ）して顆粒剤とする。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験（一次スクリーニング）における、各乳酸菌とパイエル板細胞の共培養物上清中のＩｇＡ抗体量を測定した結果を示す図である。
【図２】実施例２及び比較例１〜４のｉｎ  ｖｉｖｏ試験における、各乳酸菌を摂食したマウスから摘出した小腸パイエル板細胞を培養した上清中のＩｇＡ抗体量の測定結果を示す図である。
【図３】実施例２及び比較例１〜４のｉｎ  ｖｉｖｏ試験における、各乳酸菌を摂食したマウスから摘出した小腸パイエル板細胞に含まれていたＩｇＡ陽性細胞の割合（ＩｇＡ陽性細胞存在率）を示す図である。
【図１】
2008201708.tif 000004
【図２】
2008201708.tif 000005
【図３】
2008201708.tif 000006