(57)【要約】      （修正有）【課題】対象となる標的細胞（例えばＴ細胞、骨髄細胞、上皮細胞、肝細胞など）において遺伝子すなわち外因性核酸配列を発現することができる新規なベクターおよびウイルスベクターが提供される。【解決手段】ベクターの核酸成分としては、修飾された配列セグメントを有する１以上の天然のプロモーター／エンハンサー領域、１以上の非天然のプロモーター／エンハンサーまたは非天然のプロモーターの遺伝子もしくは遺伝子セグメント、および天然のウイルスターミネーターもしくはプロセシングシグナルまたはそのセグメントが含まれる。ウイルスベクターは、表面またはエンベロープ上に吸着成分を有するウイルスまたはウイルス部分を含み、一つはパッケージング細胞系のためのものであり、他は標的細胞への送達のためのものである。ベクターまたはウイルスベクターを増やすための新規な方法も提供される。【選択図】図８
2008301826.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の外因性遺伝子または外因性遺伝子配列を、目的の標的細胞に送達し且つ発現するプロセスであって、該プロセスは、以下：
１）
Ａ）ウイルスベクター、ウイルスベクター核酸、またはウイルスベクター核酸配列を含有する核酸構築物を含む組成物であり、外因性遺伝子または外因性遺伝子配列を、目的の標的細胞において発現し得る組成物であって、該組成物は、以下：
ｉ）少なくとも１つの配列が、１つ以上のネイティブなプロモーター／エンハンサーの不活性化を導く非レトロウイルス配列で置換されている該１つ以上のネイティブなプロモーター／エンハンサー領域、
ｉｉ）１つ以上のネイティブでないプロモーター／エンハンサーまたはネイティブでないプロモーターの遺伝子もしくは遺伝子セグメント、および
ｉｉｉ）ネイティブなウイルスベクターターミネーターもしくはプロセシングシグナルもしくはそのセグメント、またはその両方、
を含む１つ以上の核酸成分をさらに含む、組成物と、
Ｂ）目的の標的細胞とを
提供する工程：および
２）該組成物Ａ）を該目的の標的細胞Ｂ）に導入し、所望の外因性遺伝子または外因性遺伝子配列を送達し発現させる工程を包含する、プロセス。
【請求項２】
前記目的の標的細胞は肝臓、肺、腎臓、脳、筋肉、骨髄、上皮細胞、あるいはＴ細胞由来の細胞を含む請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
前記提供する工程１）の前記組成物Ａ）がさらに、ｉｖ）ネイティブでないターミネーターを含む、請求項１記載のプロセス。
【請求項４】
前記提供する工程１）の、前記組成物Ａ）における前記ウイルスベクター、ウイルスベクター核酸、またはウイルスベクター核酸配列を含有する核酸構築物がレトロウイルスからなる、請求項１記載のプロセス。
【請求項５】
前記提供する工程１）の、前記組成物Ａ）における前記ターミネーター、もしくは前記プロセシングシグナル、またはその両方が、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項１記載のプロセス。
【請求項６】
前記提供する工程１）の、前記組成物Ａ）は前記ウイルスベクターのターミネーターのセグメントもしくは前記プロセシングシグナルのセグメント、またはその両方を含む、請求項１記載のプロセス。
【請求項７】
前記提供する工程１）の、前記組成物Ａ）における前記１つ以上のネイティブでないプロモーターが、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｒＲＮＡからなる群より選択されるか、または上述の任意の組合せである、請求項１記載のプロセス。
【請求項８】
前記提供する工程１）の、前記組成物Ａ）は、前記ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｒＲＮＡ遺伝子の１つ以上の遺伝子または遺伝子セグメントの配列をさらに含む、請求項７記載のプロセス。
【請求項９】
前記ｓｎＲＮＡが、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｕ１０、およびＵ１１からなる群より選択されるか、または上述の任意の組合わせである、請求項７または８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記レトロウイルスはパッケージング細胞株から生成される請求項４記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え核酸技術の分野に関し、ならびにより詳細には、新規なベクターおよびウイルスベクター、このようなベクターおよびウイルスベクターを増殖するための独特なパッケージング細胞株に関し、ならびにそれらを生成するためのプロセスに関する。
【０００２】
本出願において引用または同定される、全ての特許、特許出願、特許公報、科学文献などは、本発明が関与する技術水準をより十分に記載するために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
ウイルスおよび核酸ベクターは、核酸配列を細胞に送達するための手段を提供し、ならびにこれらは、遺伝子療法の適用において広範に使用される。有効な遺伝子療法に重要なことは、標的細胞において、外因性核酸の効率の良い発現を確立する能力である。標的細胞における外因性核酸の発現は、外因性核酸が取込まれた形態またはエピソーム形態のいずれかにある場合、行われ得る。エピソーム状態における発現は、標的細胞において行われ得るが、大部分の場合における発現は、ごく制限された期間の間、持続する。対照的に、取込まれた状態における外因性核酸の発現は、非常により長い期間の間、維持され得る。
【０００４】
あるウイルスは、標的細胞において、外因性核酸の安定な発現を効率よく移入および／または確立するその能力のために、遺伝子療法におけるベクターとしての使用に特に重要であった。ウイルスの各特定のファミリーは、ウイルスベクターへの開発のために特定の利点を付与するエレメントを保有し得るが、各ウイルスファミリーはまた、ヒト遺伝子移入の生存可能な手段としてのその使用を制限する生来の特徴を含む。
【０００５】
レトロウイルスは、それらが、ウイルス配列の安定な取込みを確立し得るので、ウイルスベクターへの開発のための中心であった。現在のレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖエレメントがプラスミドまたは変異されたウイルスを介してトランスで提供される、パッケージング細胞から生成され得る。これらのベクターは、７．５〜８．０ｋｂまでの配列を形質導入し得る。それにもかかわらず、レトロウイルスのいくつかの内因性の特徴は、ウイルスベクターとしてのそれらの使用を妨げ、そして安全で効率の良いベクターを生成するためにそれらを改変する努力は、ウイルスベクターの低い収率、または標的細胞における外因性遺伝子の効率の悪い発現を導いた。［Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ、Ｊ．ＲおよびＬａｎｄ、Ｈａｒｔｍｕｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第７巻：遺伝子移入および発現プロトコル、１９９１、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、ＷＦ  Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ．Ｃ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）］；Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．、Ａｎｎ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７−８３８：Ｍｕｚｙｅｚｋａ、Ｎ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９（１９９２）；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：７９３−８０１（１９９４）；およびＢｅｒｌｉｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３９−６６（１９９２）］上述の本および刊行物の内容は、本明細書中に参考として援用される。例えば、レトロウイルスベクターにおいて、内部プロモーター／エンハンサーによって指向される発現のレベルは、おそらく転写調節ユニット間の相互作用の結果として、隣接ＬＴＲによって、５０倍まで抑制され得ることが実証された、［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第７巻：遺伝子移入および発現プロトコル：Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ（１９９１）、前出；Ｅｍｅｒｍａｎ，Ｍ．およびＴｅｍｉｎ，Ｈ．Ｍ．、Ｃｅｌｌ  ３９：４５９−４６７（１９８４）；Ｅｍｅｒｍａｎ，Ｍ．およびＴｅｍｉｎ，Ｈ．Ｍ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．６：７９２−８００（１９８６）；Ｅｍｅｒｍａｎ，Ｍ．およびＴｅｍｉｎ，Ｈ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９３８１−９３９６（１９８６）］。上述の本および刊行物はまた、本明細書中に参考として援用される。この抑制を克服し、そして外因性核酸の最大の発現を達成するための試みは、プロウイルスにおける３’ＬＴＲのＵ３領域内の、プロモーターおよびエンハンサー配列の欠失によってなされた［Ｙｕ，Ｓ．Ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３１９４−３１９８（１９８６）；Ｈａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２４０６−２４１０（１９８７）；Ｙｅｅ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ���Ａ  ８４：５１９７−５２０１（１９８７）］。上述の刊行物の全ては、本出願中に参考として援用される。Ｕ３領域は、ポリアデニル化シグナルを含むので、この領域内の任意の欠失は、発生期のｍＲＮＡのプロセシングを排除し得る。ポリアデニル化のような、３’ＲＮＡプロセシングの不在下で、新規に転写されるｍＲＮＡは非常に不安定であり、それゆえ、迅速な分解に供される。このことは、プロウイルスｍＲＮＡが、このような欠失を保有するレトロウイルスＤＮＡでトランスフェクトされたパッケージング細胞株において検出可能でなかったという観察を説明する（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｊ．Ｐ．およびＴｅｍｉｎ，Ｈ．Ｍ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：１９７−１２０１［１９８７］、本明細書中に参考として援用される）。３’ＬＴＲから下流の部位への外因性ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの付加は、パッケージング細胞株においてウイルスｍＲＮＡレベルを増加するための試みにおいて使用されてきた。いくつかの問題が、この方法の使用において生じる。外因性ポリアデニル化シグナルは、パッケージング細胞および標的細胞において、レトロウイルスベクターＲＮＡ中に存在しないさらなるＵ５およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを伴う、延長されたウイルスｍＲＮＡを生じる。この余分な配列は、ウイルスベクターＲＮＡの逆転写の間、鋳型の分子間移入および分子内移入の両方を立体的に妨げ得ないのみでなく、パッケージングされ得るＲＮＡのサイズ制限に起因して、ウイルスベクターに挿入され得る外因性の核酸配列のパッケージング効率およびサイズをまた、減少し得る（Ｗｈｉｔｃｏｍｂ，Ｊ．Ｍ．およびＨｕｇｈｅｓ，Ｓ．Ｈ．［１９９２］Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：２７５−３０６、本明細書中に参考として援用される）。逆転写が生じる場合において、外因性ポリアデニル化シグナルは、逆転写の間に喪失され、そしてこれはそれ自身のポリアデニル化シグナルを含まない内部遺伝子から転写されるｍＲＮＡのポリアデニル化のために使用され得ない。
【０００６】
細胞ゲノムにランダムに取込まれ得るレトロウイルスのようなウイルスベクターは、細胞遺伝子の構造および機能を破壊する可能性を有する。このようなランダムに取込まれるウイルスベクター内の転写エレメントは、ガン遺伝子およびプログラム細胞死を誘発する遺伝予のような、潜在的に有害な遺伝子を活性化し得る［Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．、Ｈａｒｂｅｒｓ，Ｋ，Ｓｃｈｎｉｅｋｅ  Ａら、Ｃｅｌｌ  ３２：２０９−２１６（１９８３）；Ｆｕｎｇ，Ｙ．Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３４１２−３４２２（１９８１）；Ｎｅｅｌ，Ｂ．Ｇ．ら、Ｃｅｌｌ  ２３：３２３−３３４（１９８１）；Ｐａｙｎｅ，Ｇ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ  ２３：３１１−３２２（１９８３）；Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）］。最後に言及した本および上述の刊行物は、本明細書中に参考として援用される。ＬＴＲの転写活性の除去は、取込まれたウイルスベクターによる非所望の遺伝子活性化の危険性を減少または排除し得るが、外因性核酸のプロモーター／エンハンサーはなお、取込みの部位の近くの細胞性遺伝子を活性化するために作用し得る。
【０００７】
あるウイルスは遺伝子移入についての有用な特性を保有するが、それらの使用は、ヘルパーウイルスを必要とすることによって、または標的細胞への外因性核酸の安定な移入を提供し得ないことによって、制限される。例えば、ある欠陥ウイルスは、必要とされるパッケージング成分を提供するパッケージング細胞において増殖され得るが、ヘルパーウイルスの使用を必要とする。しかし、このようなウイルスベクター増殖の安全な使用を保証するために、混入するヘルパーウイルスは、除去されなくてはならず、およびウイルスベクター産物は、任意の混入するヘルパーウイルスの存在について、広範囲な安全性を試験されなくてはならない。本発明は、ヘルパー細胞を必要することなく、ウイルスベクターの増殖のために使用され得る、ウイルス変態のための組成物を提供することによって、これらの制限を克服する。
【０００８】
宿主ゲノムに取込むウイルスベクターの能力は、標的細胞において外因性核酸の安定な発現を確立するための明確な利点を提供する。特定の部位で取込む能力は、取込まれたベクターについての、細胞性遺伝子構造および機能を変化する減少された可能性を提供することによって、さらなる利点である。しかし、取込まれるウイルス（例えば、レトロウイルス）とは異なり、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、細胞ゲノムの特定の領域、すなわち、ヒト第１９染色体のｑ１３−ｔｅｒ領域に取込み得ることが実証されている［Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９１）；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １０：８３１−８３４（１９９１）、両方の刊行物の内容は、本明細書中に参考として援用される］。この特異的な取込みは、ＡＡＶの反転された末端反復およびＲｅｐ機能によって指向される［（Ｋｏｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２１１−２２１５（１９９０）、本明細書中に参考として援用される］。このような特異的な取込みは、ＡＡＶを、ウイルスベクターとしての使用のための魅力的な候補にするが、既存のＡＡＶベクターは、標的細胞ゲノムにおいて特定の部位で取込み得ない。遺伝子療法についての、ＡＡＶベクターの使用を妨げる他の特徴は、内部遺伝子のサイズ制限、大量にウイルスを増殖することの困難さ、およびヘルパーウイルスの自由な混入の危険性であり、これらの全ては、ＡＡＶ複製の内因的な機構から生じる。
【０００９】
複製を媒介するウイルスエレメントを、異なるウイルスから取込むことによって、各ウイルスからの特定の利点を駆動するウイルスベクターが、各ベクターと関連する制限を克服するために、作製され得る。例えば、ＡＡＶから他のウイルスベクター系への部位特異的取込み機能の移入は、遺伝子移入についての有用な特性を有し得るが、任意の取込む能力を欠損するウイルスベクターにおいて、このような特性を提供し得る。
【００１０】
遺伝子送達の目的において、ウイルスベクターは、標的細胞に対してネイティブであるウイルスから、または標的細胞に対してネイティブでないウイルスから、開発され得る。一般に、ネイティブなウイルスベクターよりもネイティブでないウイルスベクターを使用することが所望される。ネイティブなウイルスベクターは、標的細胞について天然の親和性を保有し得るが、このようなウイルスは、標的細胞における増殖について、より優れた可能性を保有するので、より大きな危険性を提出する。この点に関して、ヒト細胞における増殖のために本来設計されていない動物のウイルスベクターは、ヒト細胞への遺伝子送達について有用であり得る。しかし、遺伝子送達において使用するための、このような動物ウイルスベクターの十分な収量を得るために、ネイティブな動物パッケージング細胞における生成を行うことが必要である。しかし、この方法において、生成されるウイルスベクターは、通常、エンベロープの一部としてまたはヒト細胞に屈性を提供し得るカプシドの一部としてのいずれかで、任意の成分を欠損する。例えば、非ヒトウイルスベクター（例えば、ＭＭＬＶのような狭宿主性マウスレトロウイルス）の生成のための現在の実施は、マウスパッケージング細胞において生成される。ヒト細胞屈性について必要とされる別の成分が、提供されなければならない。
【００１１】
非ウイルス核酸複合体は、遺伝子送達について有意な利点を提供し得るが、これらの利点は、非特異的な結合成分に依存する非ウイルス核酸複合体の使用によって、実現されておらず、かつ実現され得ない。本発明は、核酸とタンパク質成分との間の特異的な複合体形成を提供することによって、これらの制限を克服し、ここでは遺伝子移入についての有用な特性を提供するタンパク質分子の結合が、核酸構築物の規定された領域に局在化され得る。核酸構築物における特異的な結合タンパク質のこのような局在化は、生物学的活性に関与するか、またはこれを提供する構築物における領域セグメントの任意の干渉を、減少または排除し得る。本発明はまた、それらの同族の結合部位からのこのような特異的な結合タンパク質の制御された置換を提供し、ここではこのような置換は、生物学的機能の任意の潜在的な干渉を除去し得るか、または細胞において有用な機能を提供し得るタンパク質を放出し得る。
【発明の要旨】
【００１２】
本発明は、所望の遺伝子および遺伝子配列を送達および発現するための系において使用するための、新規なベクターおよびウイルスベクターを提供する。１つのこのような新規なベクターは、目的の標的細胞において外因性遺伝子または外因性核酸配列を発現し得ることが示される。ベクターは、ウイルスベクター、ウイルスベクター核酸、またはウイルスベクター核酸配列を含む核酸構築物を含む。ベクターは以下の核酸成分：ｉ）少なくとも１つの配列セグメントが改変されている１つ以上のネイティブなプロモーター／エンハンサー領域、（ｉｉ）１つ以上のネイティブでないプロモーター／エンハンサーまたはネイティブでないプロモーターの遺伝子もしくは遺伝子セグメント、および（ｉｉｉ）ネイティブなウイルスベクターターミネーターもしくはプロセシングシグナルもしくはそのセグメント、またはその両方、を含む。
【００１３】
本発明はまた、その表面またはエンベロープにおいて少なくとも２つの吸着成分を有する、ウイルスまたはウイルス部分を含む新規なウイルスベクターを提供する。一方の吸着成分は、ベクターについてパッケージング細胞株に指向され、および他方の吸着成分は、ベクターを送達するについて、標的細胞への吸着のためである。
【００１４】
さらに、本発明によって提供されるものは、表面またはエンベロープにおいて少なくとも２つの成分が見出されるウイルスまたはそのウイルス部分を含む、新規なウイルスベクターである。第１の成分は、ウイルスに対してネイティブであるが、第２の成分は、一般に、ウイルスベクターに対してネイティブでなく、およびさらに、目的の標的細胞に対して吸着し得るが、同じウイルスベクターについてネイティブな細胞に対して吸着し得ないことによって、特徴づけられる。
【００１５】
本発明はなおさらに、以下の群から選択される新規なベクターを提供する：（ｉ）ウイルスベクター、（ｉｉ）ウイルス核酸、および（ｉｉｉ）核酸構築物。ベクターは、セグメントをコードするネイティブでない核酸配列を含み、セグメントは、標的細胞のゲノムに取込まれ得、およびベクター自身は、標的細胞において第１の核酸を生成および導入し得る。第１の核酸に関して、第１の核酸はそれ自身、第１の核酸の部分を含む第２の核酸を生成し得る。第２の核酸は、取込みセグメントを含み、そして生じ得る場合として、外因性遺伝子または外因性核酸配列を、それ自身発現し得る。
【００１６】
また、本発明によって提供されるものは、（ｉ）ウイルス核酸およびウイルスベクターパッケージング成分を含むウイルスベクター、（ｉｉ）ウイルス核酸、および（ｉｉｉ）核酸構築物からなる群より選択される、新規な第１のベクターである。パッケージング細胞に導入される場合、第１のベクターは（ａ）第２のウイルスベクター、（ｂ）ウイルス核酸、および（ｃ）第２の核酸構築物からなる群より選択される第２のベクターを生成し得、各群のメンバーのそれぞれは、目的の標的細胞において外因性遺伝子または外因性核酸配列を発現し得る。第１のベクターは、パッケージング細胞において、第２のベクターを生成し得、およびパッケージング細胞は、第２のウイルス核酸についての１つ以上のパッケージング成分を提供し得る。この独特なベクターにおいて、第２のウイルス核酸もしくは第２の核酸構築物が、第１の（ｉ）ウイルス核酸もしくは第１の（ｉｉｉ）核酸構築物とは構造的に異なる。あるいは、第２のウイルスベクターについての１つよりも多いパッケージング成分が、第１のウイルスベクターのパッケージング成分（ｉｉ）とは異なり得る。さらなる代替として、構造的差異の両方の種類またはセットが、同じベクターにおいて存在し得る。すなわち、第２のウイルス核酸もしくは第２の核酸構築物は、第１のものとは異なるか、および／または第２についてのパッケージング成分は、第１のものとは異なり得る。
【００１７】
本発明はまた、任意の上述のベクターまたはウイルスベクターを増殖するための新規なパッケージング細胞株に関し、最後に言及した第１のベクターを含む。従って、本発明のパッケージング細胞株は、ウイルスベクターの表面またはエンベロープに少なくとも２つのパッケージング成分を提供する。他のウイルスベクターを増殖するための他のパッケージング細胞株がまた、提供される。これらにおいて、細胞株は、ウイルスベクター成分に対してネイティブでないが、ウイルスベクター核酸に対してネイティブである。パッケージング細胞株は、その膜または表面において１つ以上の吸着成分を発現する。このような吸着成分は、ベクターのネイティブでない成分への吸着のためであり、およびレセプターまたは結合パートナーを広範に含む。
【００１８】
本発明の任意の新規なウイルスベクターまたはベクター核酸を生成するためのプロセスがまた、本開示において意図されおよび提供される。これらのプロセスにおいて、所望されるベクターは、ウイルスベクターまたはウイルス核酸を生成するのに十分なまたは適切な条件下で、適切なパッケージング細胞に導入される。
【００１９】
本発明によってさらになお提供されるものは、ヘルパーウイルスから独立してウイルスベクターを増殖するための、新規なおよび独特のパッケージング細胞株である。このようなパッケージング細胞株において、ウイルスベクターは、核酸成分および非核酸成分を含む。ウイルスベクターの核酸成分の配列は、細胞株のゲノムに安定に取込まれる。ウイルスベクターの非核酸成分の配列は、種々の手段によって、パッケージング細胞株に導入される。これらの手段としては、一過性の発現、エピソーム発現、安定に取込まれる発現、または上述の手段の任意の組み合わせが挙げられ得る。
【発明の詳細な記述】
【００２０】
以下の定義は本発明および本願の開示の理解に有用である。
【００２１】
定義
異種ベクター：
少なくとも１種の非ネイティブ（非天然の）（Ｎｏｎ−Ｎａｔｉｖｅ）ベクター成分からなりそして外因性核酸を細胞に伝達することができそして細胞中で外因性核酸の発現を容易にすることができる非ウィルス性の特定の複合体を含む、ウィルスベクター又は非ウィルスベクター。外因性ベクターは、外因性遺伝子又は外因性核酸の発現を妨害する機能性ネイティブセグメントを含む。ネイティブのセグメントは、妨害が低減又は除去されそして／又はネイティブの終結／ＲＮＡプロセッシングが保持される修飾をされている。
【００２２】
非ネイティブのベクター成分：
生物学的系から誘導された核酸配列、又は変更又は修飾されたネイティブの要素で、異種ベクターの成分を形成する。該成分はシス又はトランスの態様で直接的に又は間接的にイン  ビトロ又はイン  ビボで機能又は仲介して、１）関係する標的細胞中の異種ベクターの外因性遺伝子又は外因性核酸の発現（終結シグナルを含む）；２）組込み；および３）増殖、産出およびアッセンブリーを与えるか又は引き起こす。
【００２３】
発現カセット（又は、外因性核酸配列若しくは外因性遺伝子の発現）：
外因性遺伝子発現又は外因性核酸配列若しくはセグメントの発現に必要な全ての要素を含む核酸配列であり、関係する標的細胞中で発現させる目的で、ベクター中に挿入される。かかる要素はネイティブベクター成分および非ネイティブベクター成分の両方又はそれらの組み合わせ包含し、非ネイティブのプロモーター／エンハンサーに対応する遺伝子又は遺伝子セグメントを含み得る外因性核酸又は外因性遺伝子の発現のための修飾された又は非修飾のプロモーター／エンハンサー配列、修飾された又はネイティブのウィルス性プロモーター／エンハンサー、および終結、ＲＮＡプロセッシング、ポリアデニル化およびＲＮＡ移送のためのシグナルを含む。
【００２４】
シス効果：
ベクター核酸の一つの機能セグメントにより、ベクター核酸の別の遠位の機能に及ぼされる効果。
【００２５】
異種ウィルスベクター
本発明は、細胞へ遺伝子を伝達するために有用な性質、即ち、１）パッケージング細胞内での効率的な増殖、および２）該細胞内での外因性核酸の安全且つ効率的な発現、を有する異種ベクターのための組成物および使用法を提供する。これらの利点は、ウィルスにこのような性質の一つ又はそれ以上を与えることができる非ネイティブのベクター成分の使用によって達成される。
【００２６】
ウィルスベクター中の外因性核酸の発現は、非ネイティブのプロモーター／エンハンサー誘導性外因性核酸発現の機能を妨害するウィルスベクターネイティブプロモーター／エンハンサー活性のために、多くの場合非効率的である（ＥｍｍｅｒｍａｎおよびＴｅｍｉｎ、１９８６年、その内容は、参照用に本願に含める）。この妨害を、ウィルスベクターネイティブプロモーター／エンハンサーを除去することにより除く努力は、修飾部位から遠位の部位で起こるシス効果を生じさせる。かかるシス効果は、終結および／又はＲＮＡプロセッシングの損失又は低減を引き起こし、それは外因性核酸の発現の低減又は減少、およびパッケージング細胞における効率的な増殖能力を大きく減少又は除去させる。３’ＬＴＲから下流の部位に非天然のポリアデニル化シグナルを加えることが、失われた機能を回復するために用いられた（ＤｏｕｇｈｅｒｔｙおよびＴｅｍｉｎ、１９８７年、参照用に本願に含める）。かかる方法はいくつかの重要な観点で制限される。この外因性ポリアデニル化シグナルは、パッケージング細胞および標的細胞内のレトロウィルスベクターＲＮＡに存在しないＵ５およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列を付加した長いウィルスｍＲＮＡを生じる結果となる。この余分の配列は、ウィルスベクターＲＮＡの逆転写中に鋳型の分子内および分子間伝達の両方を立体的に妨害し得るだけでなく、パッケージング効率と、パッケージングできるＲＮＡのサイズの制限のためにウィルスベクターに挿入出来る外因性核酸配列のサイズを減少させ得る（ＷｈｉｔｃｏｍｂおよびＨｕｇｈｅｓ，１９９２年、参照用に本願に含める）。逆転写が起こる場合、外因性ポリアデニル化シグナルは、逆転写の間に失われ、そしてそれ自体のポリアデニル化シグナルを含まない外因性遺伝子から転写されたｍＲＮＡのポリアデニル化に使用できない。
【００２７】
本発明の別の側面は、当業界における上記の制限を、置換、付加、変異又はそれらの組み合わせを含めた多様の手段により、ネイティブのプロモーター／エンハンサーセグメントに修飾を施すことにより、克服することである。本発明はこれらの制限を、一つの特徴において、ベクター中でかかるシス効果を減少させるか又は除くことが示されたベクターのネイティブのプロモーター／エンハンサーセグメントの人工的再構築を与えることにより、克服する。この再構築又は修飾は、本発明に従って、例えば、外因性ベクター核酸配列を、ベクターウィルス機能のかかる回復又は改良さえもすることができる非ネイティブのベクター成分で置き換えることにより実施される。この再構築は、ウィルスベクタープロモーター／エンハンサー配列を、非ネイティブのベクター成分で置き換えて、変異ＬＴＲを有するウィルスベクターを与えることにより達成される。ここでネイティブのプロモーター／エンハンサー機能は、非ネイティブのプロモーター／エンハンサー機能の妨害を除くように不活化される。この場合、ウィルスベクターは、活性なネイティブの終結機能と、パッケージング細胞内のウィルスベクターＲＮＡの発現のためおよび標的細胞内の外因性核酸の発現のためのネイティブのＲＮＡプロセッシング機能とを完全に保持する。
【００２８】
このように、本発明は、ウィルスベクター、ウィルスベクター核酸、又はウィルスベクター核酸配列を有する核酸構築物を含むベクターを提供する。該ベクターは、関係する標的細胞内で外因性遺伝子又は外因性核酸配列を発現することができ、該ベクターは核酸成分を含む。後者の核酸成分は（ｉ）少なくとも一つの配列セグメントが修飾されている、一つ又はそれ以上のネイティブプロモーター／エンハンサー領域、（ｉｉ）一つ又はそれ以上の非ネイティブのプロモーター／エンハンサー又は非ネイティブのプロモーターの遺伝子若しくは遺伝子セグメント、および（ｉｉｉ）ネイティブのウィルスベクターターミネーター又はプロセッシングシグナル若しくはそのセグメント、又は両方を含む。更に、前記のウィルスベクターは、更に非ネイティブのターミネーター又は二つ以上の修飾された配列セグメントを含む。
【００２９】
かかる修飾はいろいろな形態を取り得る。例えば、ネイティブ配列セグメントは、ベクターの一つ又はそれ以上のプロモーター／エンハンサー領域で非ネイティブ配列セグメントによって置き換えることができる。更に、置換体はほぼ同じ大きさであることができる。別の観点では、修飾は、点変異、欠失、挿入、および置換、又はこれらのいずれかの組み合わせで表される群のメンバーから選ばれた変異を含むことができる。
【００３０】
一つの好ましい観点では、ウィルスベクターはレトロウィルスである。別の観点では、ターミネーター又はプロセッシングシグナル又は両者は、場合によって、ポリアデニル化シグナルを含むことができる。更に、かかるウィルスベクターはウィルスベクターターミネーターのセグメント又はプロセッシングシグナルのセグメント又は両者を含むことができる。更に、一つ又はそれ以上のプロモーター／エンハンサーの機能は、本発明のウィルスベクターにおいては低減、阻害又は除去されているであろう。
【００３１】
一つ又はそれ以上の非ネイティブのプロモーターに関しては、これらのプロモーターは、ポリアデニル化シグナルを欠いたＲＮＡを生成することができる。本発明に従って、多くの非ネイティブのプロモーターを使用できる。簡単に例によると、かかる非ネイティブのプロモーターはｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡ、又はこれらの組み合わせにより表される遺伝子の群から選ぶことができる。
【００３２】
本発明の別の観点では、前記のウィルスベクターは更に、一つ又はそれ以上のｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ若しくはｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子若しくは遺伝子セグメント配列を含む。ｓｎＲＮＡは文献によく記載されており、そして例えば、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｕ１０およびＵ１１、又はこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選ばれたメンバーを含む。
【００３３】
上記のウィルスベクターにおいて、一つ又はそれ以上の非ネイティブのプロモーターの遺伝子若しくは遺伝子セグメント配列は、修飾されることができるか、又は修飾されているであろう。かかる修飾は多くの形体を取ることができ、一つ又はそれ以上の非ネイティブのプロモーターの遺伝子配列を外因性遺伝子又は外因性核酸配列で置換するか、又は該非ネイティブのプロモーターの遺伝子配列に該外因性遺伝子又は外因性核酸配列を付加することが含まれる。
【００３４】
これらの目的に有用な非ネイティブのベクター成分には、ベクター中の非ネイティブの核酸配列が含まれる。かかる核酸配列は生物学的系から誘導するか、化学的に合成するか、又は組換えＤＮＡ法により若しくはかかる方法の組み合わせにより製造できる。かかる配列は置き換えられたベクターウィルス配列とほぼ同じ大きさであることができる。従って、かかる配列は、長さがほぼ２からほぼ１８８塩基又は塩基対、又はそれ以上の範囲にわたることができる。かかる配列は、プロモーターおよび／又はエンハンサー配列のようなウィルスベクターの領域中の一つ又はそれ以上の配列を置き換えるために、又は能力がシス効果を引き起こすその他のネイティブの配列を置き換えるために、使用出来る。かかる置換は慣用の組換え法により実施でき（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年を参照、その教科書の内容を参照用に本願に含める）、プラスミド中に二本鎖ＤＮＡとして存在するウィルスベクター核酸ゲノム又はそのフラグメントに対して便利に行うことができる。
【００３５】
レトロウィルスのようなベクター中のシス効果の再構築を与えるための修飾は、例えば、プラスミド中に存在するレトロウィルスベクターゲノム、即ちベクター核酸構築体、の３’ＬＴＲ領域のＵ３領域での置換によって達成できる。レトロウィルスベクターの増殖は、かかるプラスミドをパッケージング細胞に導入することにより進行することができ、ここでウィルスベクターゲノムの転写体が生成されそして標的細胞への形質導入後に逆転写される。これらのプロセスの結果、ベクタープラスミド中の３’ＬＴＲにされた修飾は、増殖されたレトロウィルスベクターの５’ＬＴＲに存在するであろう。
【００３６】
再構築は、本発明の教示に従って、ベクタープラスミドに含まれるレトロウィルスベクタープロウイルスＤＮＡ（ｐＥＮＺ−１で表される）において、３’ＬＴＲの修飾により達成された。プロモーター／エンハンサー領域からの３つの別個の配列を、ほぼ同じ大きさの非ネイティブの配列で置き換えた。３’ＬＴＲのエンハンサー領域からの１８８塩基対の配列を、バクテリアｎｅｏ遺伝子から誘導された１８８塩基対の関連しない配列で置き換えた。プロモーター領域内の二つの別個の配列、即ち一方は２塩基そして他方は６塩基、を同じ大きさの核酸セグメントで置き換えた。このプロウイルスＤＮＡ構築体をパッケージング細胞（ＧＰ＋Ｅ−８６又はＰＡ３１７）に導入すると、Ｇ４１８抵抗の転写により測定して１０６までのタイターでレトロウィルスベクターが生成した。これを図１および２に示す。
【００３７】
従って、本発明は下記からなる群から選ばれた第１のベクターをも提供する：（ｉ）ウィルス核酸およびウィルスベクターパッケージング成分を含むウィルスベクター、（ｉｉ）ウィルス核酸、および（ｉｉｉ）核酸構築体。ここで、パッケージング細胞に導入した場合、第１のベクターは下記からなる群から選ばれた第２のベクターを生成することができる：（ａ）第２のウィルスベクター、（ｂ）ウィルス核酸、および（ｃ）第２の核酸構築体。それぞれは、関連する標的細胞に外因性遺伝子又は外因性核酸配列を発現することができる。第１のベクターはパッケージング細胞内で第２のベクターを生成することができ、そして該パッケージング細胞は第２のウィルス核酸用に一つ又はそれ以上のパッケージング成分を与えることができる。第２のウィルス核酸又は第２の核酸構築体は、構造的に第１の（ｉ）ウィルス核酸又は第１の（ｉｉｉ）核酸構築体と異なるか、又は第２のウィルスベクター用の一つより多くのパッケージング成分は、第１のウィルスベクターパッケージング成分（ｉｉ）と異なるか、又は両方の構造的相違がこの第１のベクターに存在し得る。一つの側面では、第１のベクターはレトロウィルスを含み、そして第２のベクターはアデノ−関連ウィルス（ＡＡＶ）を含む。
【００３８】
上述の構造的相違に関して、これらの相違は、下記の群から選ばれた相違を含めた多くの形体を含むか又はとる：核酸の化学的性質、核酸の形体、核酸の大きさ、および機能要素、又は前記のいずれかの組み合わせ。核酸の化学的性質に関して、第２のウィルス核酸又は第２の核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡから成る群、又はＲＮＡおよびＤＮＡとして表される群のメンバーから選ばれ、そして（ｉ）ウィルス核酸又は（ｉｉｉ）核酸構築体は、要素間に構造的相違を与えるために、該群の異なるメンバーを含む。核酸の形体に関しては、第２のウィルス核酸又は第２の核酸は、一本鎖、二本鎖および部分的に二本鎖からなる群から選ばれ、そして（ｉ）ウィルス核酸又は（ｉｉｉ）核酸構築体は、要素間に構造的相違を付与するために、該群の異なるメンバーを含む。核酸の形体に関しては、第２のウィルス核酸又は第２の核酸は、（ｉ）ウィルス核酸又は（ｉｉｉ）核酸構築体のセグメントを含む。機能要素に関しては、第２のウィルス核酸又は第２の核酸は、一つ又はそれ以上のプロモーター、一つ又はそれ以上のエンハンサー領域、組込みセグメントおよびターミネーター、又は前記のいずれかの部分若しくはセグメント若しくは組み合わせを含み、そして（ｉ）ウィルス核酸又は（ｉｉｉ）核酸構築体は、それらの間に構造的相違を付与するために、該群の異なるメンバーを含む。
【００３９】
本発明の好ましい側面において、第１のベクターはレトロウィルスを含み、そして第２のベクターはアデノ−関連ウィルスを含む。別の好ましい側面において、第１のベクターはアデノ−関連ウィルスを含み、そして第２のベクターはレトロウィルスを含む。
【００４０】
レトロウィルスベクターは、非ネイティブのプロモーター用の核酸配列を用いて再構成することもできる。
【００４１】
もっぱら増殖能力が喪失した再構成されていない修飾されたレトロウィルスベクターと比較して、前に記載したシス効果の再構成は、ウィルスベクターに、ａ）外因性核酸を最高のレベルで発現する能力、および／又はｂ）パッケージング細胞内で効率的に増殖する能力を与える。更に、ウィルスベクタープロモーター／エンハンサー機能の不活性化の結果、かかる異種ベクターウィルスは遺伝子伝達系への安全使用の性質を持つことができる。例えば、該異種ベクターは、ポリアデニル化ＲＮＡの転写を命令することができない非ネイティブのプロモーターを含む場合、かかるベクターは、ベクターのランダムな組込みの結果、ポリメラーゼＩ−依存性、ポリメラーゼＩＩ−依存性又はポリメラーゼＩＩＩ−依存性プロモーターを利用する細胞遺伝子からのポリアデニル化ｍＲＮＡ又は非ポリアデニル化ｍＲＮＡの発現を活性化する能力を大きく低減されるか又は失われる。本発明は、外因性核酸の発現のための非ネイティブのプロモーター／エンハンサーを使用することにより、異種ベクターを安全に使用するための追加の組成物を提供する。ここで該プロモーター／エンハンサーは、ポリアデニル化ｍＲＮＡの発現を活性化するためのポリ（Ａ）シグナル配列を与える能力が欠けている。かかる異種ベクター中の外因性核酸の発現のための非ネイティブのプロモーター／エンハンサーの使用は、安全なウィルスベクターを与えることができる。ここで該ウィルスベクターは、ウィルスベクターネイティブプロモーター／エンハンサー又は非ネイティブのプロモーター／エンハンサーによる細胞遺伝子のポリアデニル化ｍＲＮＡ合成を活性化する能力が、著しく減少又は除去されている。
【００４２】
外因性核酸の安全な発現を与えるベクター中の非ネイティブの要素は、生物学的系から誘導することができ、そしてポリアデニル  化ＲＮＡの転写を命令しないプロモーター／エンハンサーと共存性のプロセッシングシグナルとを含むことができる。これらのプロモーター／エンハンサーは、リボソームＲＮＡ、伝達ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、例えばＵ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、Ｕ１０およびＵ１１、のような細胞ＲＮＡ要素の合成をもたらすＲＮＡポリメラーセＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるような要素を含む。これらの細胞ＲＮＡ要素の配列は本発明の実施に有用であり、ここで該要素は、遺伝子発現の抗感作（アンチセンス、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）調節、リノザイム活性、外因性遺伝子又は外因性核酸の発現のための感作（ｓｅｎｓｅ）配列等のような生物学的機能を与えることができるＲＮＡ配列を有するキメラＲＮＡ分子を形成するのに使用できる。
【００４３】
生物学的活性を与えるためのかかる配列は、細胞ＲＮＡ遺伝子若しくは遺伝子セグメントに、細胞ＲＮＡ遣伝子若しくは遺伝子セグメントの配列のいくつか又は全てを部分的に又は完全に置換することにより、又はかかる配列をＲＮＡ遺伝子配列に付加することにより、挿入することができる。組換えＤＮＡの方法を使用することにより、かかるキメラ分子は、細胞ＲＮＡ要素のクローン配列を利用し、そして外因性遺伝子若しくは遺伝子セグメント又は外因性核酸のＲＮＡ転写のための配列をコードすることにより、形成することができる。核酸キメラは全て又は部分的に、化学的に合成することができるであろう。かかるキメラＲＮＡ分子の合成を与える核酸配列は、プラスミドに存在する二本鎖異種ベクターＤＮＡに、上記の組換えＤＮＡの方法により、都合よく挿入することができる。かかるＲＮＡ組成物の発現を与える異種ベクターを図５、６および７に表示する。
【００４４】
細胞ＲＮＡ遺伝子若しくは遺伝子セグメントと外因性遺伝子若しくは外因性核酸をコードする配列との間に形成されたかかるキメラを使用するために、細胞ＲＮＡ遺伝子の修飾はカセット機能を向上させることになり得る。例えば、アンチセンスＲＮＡとＵＩｓｎＲＮＡとの間に形成されたキメラ分子においては、触媒機能の喪失および／又は輸送性の喪失および／又はタンパク質相互作用の喪失を伴ってＵ１ｓｎＲＮＰ複合体を与えることができるＵＩｓｎＲＮＡのかかる修飾は、更に細胞内にアンチセンス機能を発現させることができる。かかる性質を与えることができる修飾は、欠失、付加から、又はかかる分子の配列の一つ又はそれ以上の塩基の変更から得られ得る。かかる修飾されたＵ１系は、変更された塩基配列、即ちプラスミドｐＨＳＤ−４に存在するＵ１ＲＮＡ転写体の４−位置でのＣからＴへの変更、を含むＵ１分子から製造された（Ｍａｎｓｅｒ，Ｔ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，Ｒ．Ｃｅｌｌ２９：２５７−２６４（１９８２年）、その内容を参照用に本願に含める）。このＵ１は、各々がＨＩＶ−１標的配列に対抗して向けられた３つの異なるアンチセンス配列の各々を有するキメラ分子を形成するのに使用された。置換は（ｐＨＳＤ−４に存在する）Ｕ１の転写された領域の一部分を各アンチセンス配列で置き換えることにより行われた。
【００４５】
かかるキメラ分子は、レトロウィルスのような異種ベクターに挿入して、標的細胞内のかかるキメラアンチセンス分子への伝達および発現をもたらすことができる。ベクタープロモーター活性が無く、そしてウィルスベクター配列による又は外因性核酸によるペプチド生成が欠如すると、標的細胞内に非ネイティブのタンパク質が生成されず、従って免疫応答の可能性が除かれる。（Ｒｏｙ−Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ外の“Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｍｍｕｎｅ  Ｄｏｗｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＳＩＤＲ）”米国特許出願第 号、１９９７年２月２８日出願、を参照されたい。その内容を本願に参照用に含める。）
【００４６】
かかる免疫遺伝学的に沈黙したベクターは、造血幹細胞のような細胞へのエクス  ビボ遺伝予伝達に特に有用であろう。これらの細胞のウィルスインフェクション処理は、これらのベクターを、感染ウィルスに対して命令されるアンチセンス（リノザイムを含む）およびセンスＲＮＡのような、生物学的に活性なＲＮＡの伝達に使用する利益を受けることができる。例えば、ＨＩＶ−１（およびある種の白血病ウィルス）のような病気の治療は、ＨＩＶ−１インフェクションに対抗して命令されるＣＤ４＋細胞源を提供する手段として、かかる配列を造血幹細胞に遺伝子伝達することで利益を受けることができる。この目的の細胞は、脊髄又はドナーの循環細胞のような自己源から、又は胎児索状組織血液のような異種源から誘導できる。かかる細胞は成長させそして下記に記載された手順に従ってかかるベクターを用いて転写することができる：Ｎｏｌｔａ外、１９９５年、Ｂｌｏｏｄ  ８６：１０１−１１０；Ｘｕ外、Ｂｌｏｏｄ  ８６：１４１−１４６（１９９５年）；Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ外、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：２５６６−２５７２（１９９６年）；およびＷｅｌｌ外、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：５１２−５２０（１９９５年）。前記の刊行物を参照用に本願に含める。これらの手順は自己血清およびストローマを利用することができる。このように処理した細胞を、以前に部分的又は完全な切除をした患者に投与することができる。
【００４７】
上記のように構成した免疫遺伝学的に沈黙した異種ベクターは、イン  ビボ遺伝子伝達に利用することもできる。肝臓、肺、腎臓、脳、筋肉、上皮組織のような組織およびその他のエクス  ビボ手順に容易に従わない組織は、かかるウィルスベクターを血液流に投与することにより、又は組織若しくは器官に直接注射することにより、ねらう（ｔａｒｇｅｔ）ことができる。かかる処理の手順は外の方法と組み合わせて使用できる。
【００４８】
ウィルス変態
本発明は、適当に構築されたパッケージング細胞内で又は標的細胞内で、本願に記載したいろいろなエレメントが元のベクターと異なるウィルスベクター核酸又はウィルスベクターに、又は第２のウィルスベクターにでも伝搬することができるベクター又はウィルスベクター、又は異なる若しくは第２のウィルスベクターのウィルスベクターゲノムを産出することができる、又は異なる若しくは第２のウィルスベクターのゲノムに実質的に似た核酸を産出することができるベクター又はウィルスベクター用の組成物およびその使用法を提供する。ウィルス変態のかかるプロセスは、核酸配列が一つ又はそれ以上の非ネイティブの配列を挿入することにより修飾したウィルスベクターにより仲介することができる。かかる修飾した核酸成分を適当に構築したパッケージング細胞に導入すると、元のベクターからかかる第２のウィルスベクターを増殖することができ、又は、標的細胞へのその導入は、標的細胞ゲノムへの組込みを含めて、第２のウィルスベクターの核酸又は元のベクターに見られる性質以外の性質をもつウィルスベクター核酸を産出することができる。組成物もまたパッケージング細胞に与えられ、該パッケージング細胞は、該パッケージング細胞に本来ない成分を挿入することにより、修飾されて、ウィルス変態させることができる。ウィルス変態用の組成物は、欠陥ウィルスベクターの産出に有用であり、ここでかかるウィルスは、ヘルパーウィルスに対する要件なしで増殖することができ、そして外因性核酸を標的細胞のゲノムに組込むための性質を与えるのにも有用であり得る。
【００４９】
あるウィルスは遺伝子伝達に有用な性質を有するが、それらの用途は、ウィルスベクター産出のためのヘルパーウィルスの要件、又は外因性核酸を標的細胞へ安定して伝達する能力が無いこと、又は外因性核酸を標的細胞ゲノムの好ましい部位に組込む能力が無いことにより、制限される。例えば、ある欠陥ウィルスはパッケージング細胞内で増殖でき、必要なパッケージング成分を与えるが、ヘルパーウィルスの使用を必要とする。かかるウィルスベクター調製物の安全な使用を確保するために、ヘルパーウィルスの混入を除かなければならず、そしてウィルスベクターは混入ヘルパーウィルスの存在について強力に安全性をテストしなければならない。本発明はこれらの制限を、ヘルパーウィルスについての制限なく第２のウィルスベクターの増殖に使用できるウィルス変態用の組成物を与えることにより克服する。
【００５０】
本発明の新規且つ有用なウィルスベクターの中で一つは、表面又はそのエンベロープに少なくとも二つの吸着性成分を有するウィルス又はウィルス部分を含み、一方の成分はベクターのパッケージング細胞株への吸着用、そして他方の成分はベクターを標的細胞に伝達するための吸着用である。前述の成分の両方はウィルスベクターにネイティブ（生得）であるか、又は両方はウィルスベクターにネイティブでないか、又はある場合は一方の成分がネイティブでありそして他方の成分はネイティブでないものであることができる。少なくとも一つの成分がウィルスベクターにネイティブの場合は、成分の一つはエコトロピック（環境栄養性）又はアンフォトロピック（両栄養性）であることができる。かかる非ネイティブの成分は当業界で知られそして多くの形体を取ることができる。これらには、例によると、ヒト免疫欠陥ウィルス（ＨＩＶ）、肝炎Ｂウィルス（ＨＢＶ）、肝炎Ｃウィルス（ＨＣＶ）、ヘルペス  シンプレックス（Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ）ウィルス（ＨＳＶ）、およびベスチキュラー  ストマチス（Ｖｅｓｔｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｓ）ウィルス、およびそれらの一部分、またはこれらの組み合わせから成る群から選ばれたまたは誘導されたメンバーのいずれも含む。ＨＩＶまたはその一部分の場合、非ネイティブの成分はｇｐ１２０を含むことができる。ＨＢＶまたはＨＣＶの場合、非ネイティブの成分は表面抗原を含む。ウィルスベクターの一つ又は他の成分又は両方の成分は、タンパク質、オリゴー又はポリペプチド、糖タンパク質、融合ペプチド、組換えペプチド、改変タンパク質、又は前記のいずれかの組み合わせから成る群のメンバーから選ぶことができる。
【００５１】
好ましい観点では、上記のウィルスベクターは変異レトロウィルスのようなレトロウィルスを含む。
【００５２】
ベクター変態を与えることができるベクターもまた、元のベクターから誘導されたベクターに組込み性を与えるために使用できる。あるウィルスは遺伝子伝達に有用な性質を有するが、それらの使用は、標的細胞に組込むおよび／又は安定に留まる能力が無いことで制限され、そしてかかるウィルスは限られた期間、外因性核酸の発現をもたらすことができるだけである。ウィルス変態用の組成物は、元のベクターが組込み能力を欠いている場合、第２のベクターを標的細胞ゲノムに安定に組込む性質を与えることにより、外因性核酸を安定に発現させることができる。かかる性質は、ベクター又はウィルスベクターの非ネイティブ成分により、ベクター又はウィルスベクターに与えることができる。ここで、かかる性質は他のウィルス又は他の生物学的系から又は合成して誘導することができる。
【００５３】
ウィルス変態はパッケージング細胞又は標的細胞内で、該細胞に、開始ベクター（又は第１のウィルスベクター）の核酸を導入することにより進行することができ、ここで該核酸はウィルスベクターの成分、ウィルスベクター核酸、又は核酸構築物、又はその成分である。該核酸のパッケージング細胞又は標的細胞内での増殖は、第１のウィルスベクターに関連しないウィルスベクター（第２ウィルスベクター）に生得の（ネイティブの）性質を有する核酸を直接的に又は間接的に生成することができる。ここで、第２のウィルスベクターの核酸は第１のウィルスベクターの核酸と、ｉ）複合性、ここで核酸は長いか又は短い、ｉｉ）化学的性質、ここで核酸は一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ又は部分的に一本鎖そして部分的に二本鎖のいずれかであることができる、およびｉｉｉ）プロモーター／エンハンサー、組込み配列、および終結、プロセッシング配列の機能において相違するか、又は相違はパッケージング表面成分にある。第２のベクター核酸の性質は、第２のベクターパッケージングの必要な成分を与えるように構築されたパッケージング細胞内の第２のベクターのパッケージングをもたらすことができる。或いは、標的細胞内でこのように生成されたかかる第２のウィルスベクターの核酸は、該細胞のゲノムに挿入される性質を有することができる。
【００５４】
本発明の実施に有用なウィルスベクターは、植物、バクテリア、動物およびヒトウィルスから誘導するかことができ、ここでこれらのウィルスは該開始ベクターウィルスに非ネイティブの成分により修飾することができる。かかる成分は通常他のウィルスから誘導することができるが、他の生物学的系から誘導するか、合成することもできる。かかる核酸には、ウィルス増殖、組込み機能およびウィルス成分の遺伝子発現を与える核酸配列が含まれるが、これに必ずしも限定されない。これらには、レトロウィルスのＬＴＲ配列、レトロウィルスのインテグラーゼタンパク質、レトロウィルスの逆転写酵素、ＡＡＶのＩＴＲ配列、ＡＡＶのレプ（ｒｅｐ）遺伝子、キャップ遺伝子、および有用な機能を与えることができるその他の成分が含まれる。
【００５５】
ウィルス変態を開始するのに使用されるウィルスベクター、即ち第１ウィルスベクター、の核酸配列は、組換えＤＮＡの方法により便利に構築できる。この方法において、非ネイティブのベクター成分をベクター核酸配列に挿入することができる。
【００５６】
本発明の実施用のパッケージング細胞は、通常開始ベクターおよび第２のベクターの両方から誘導された核酸配列を導入することにより製造できる。かかる核酸配列は、パッケージング成分、ポリメラーゼ又は他の必要な酵素を含む第２のベクター成分の合成、および第２の核酸の合成をもたらすことができる。かかる核酸配列は、組込まれた状態又はエピゾーム状態のかかる細胞に存在し得る。
【００５７】
ウィルス変態に利用できるウィルスベクターには、モロニーネズミ白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）のようなレトロウィルスが含まれる。レトロウィルス（ベクター、ベクター核酸、又は核酸構築物）は、ＡＡＶ  ＩＴＲの配列を該レトロウィルスベクター核酸配列に挿入することにより修飾して、ＡＡＶのような第２のウィルスベクターを増殖することができる。かかるベクターはパッケージング細胞内のレトロウィルスベクターＲＮＡの合成を命令することができ、そしてパッケージング細胞株はＡＡＶ  ＤＮＡの合成のために逆転写をもたらすことができる。外因性核酸はＡＡＶ  ＩＴＲがフランクした領域に存在する。レトロウィルスベクター核酸は、ｐｐｔ配列セグメント機能（又は他の機能）を不活化することにより更に修飾することができ、このようにして、第２ベクター（例えばＡＡＶ）の一本鎖ＤＮＡコピーを提供する手段として、逆転写後に第２のＤＮＡ鎖の合成を取り除く。これは、ｐｐｔ配列の欠失により、又はこの特許のどこかに記載された方法により、レトロウィルスｐｐｔ配列をＡＡＶ  ＩＴＲ配列の一つ若しくはＡＡＶレプ配列で置き換えることにより、遂行できる。ＡＡＶレプ（ｒｅｐ）およびキャップ核酸配列はパッケージング細胞に、レトロウィルス核酸成分の一部として与えるか、或いはかかる配列をプラスミド、又は細胞ゲノムに挿入した又はパッケージング細胞内にエピゾーム状態若しくは一時的状態で存在する他の核酸実在物に、別々に供給することができる。
【００５８】
本発明は更に、表面又はそのエンベロープに少なくとも二つの成分を有するウィルス又はウィルス部分を含み、第１の成分はウィルスにネイティブであり、そして第２の成分は３つの特性によって特徴づけられる。第１に、第２の成分は該ウィルスベクターに非ネイティブである。第２に、目的の標的細胞に吸着することができる。第３に、該第２成分はウィルスベクターに対してネイティブの細胞に吸着することができない。好ましい側面では、ウィルスベクターはレトロウィルスである。適した又は適当なレトロウィルスは文献で充分特徴づけられており、多くの変更形を取ることができる。単に例によると、かかるレトロウィルスは、ネズミ白血病ウィルス、ヒト免疫欠陥ウィルス、ヒトＴ細胞白血病ウィルスおよびギボンサル（Ｇｉｂｂｏｎ  ａｐｅ）白血病ウィルス、又は前記のいずれかの組み合わせから成る群のメンバーから選ぶことができる。
【００５９】
上記のウィルスベクター中の非ネイティブの成分は、多くの形体を取ることができ、それらの全ては文献に充分に記載されている。これらには、下記から成る群から選ばれた又は誘導されたメンバーが含まれる：ヒト免疫欠陥ウィルス（ＨＩＶ）、肝炎Ｂウィルス（ＨＢＶ）、肝炎Ｃウィルス（ＨＣＶ）、ヘルペス  シンプレックス（Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ）ウィルス（ＨＳＶ）、およびベスチキュラー  ストマチス（Ｖｅｓｔｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｓ）ウイルス（ＶＳＶ）、およびそれらの一部分、またはこれらの組み合わせ。ＨＩＶの場合、誘導されたメンバーはｇｐ１２０を含むことができる。別の例では、非ネイティブの成分はＨＢＶ又はＨＣＶ表面抗原を含むことができる。
【００６０】
本発明は、Ｔ細胞、肝臓細胞、脊髄細胞および上皮細胞から成る群から選ばれたメンバーのいずれか、又は前記のいずれかの組み合わせを含む、多くの有用な標的細胞を考える。
【００６１】
本発明はまた、（ｉ）ウィルスベクター、（ｉｉ）ウィルス核酸、および（ｉｉｉ）核酸構築物から成る群から選ばれたベクターを提供する。該ベクターは、標的細胞のゲノムに組込むことができるセグメントをコードする非ネイティブの核酸配列を含み、そして該ベクターは標的細胞中で第１の核酸を生成又は導入することができ、該第１の核酸は、第１の核酸の一部分を含む第２の核酸を生成することができ、該第２の核酸は組み込みセグメントを含みそして外因性遺伝子又は外因性核酸配列を発現することができる。一つの側面では、このベクターはウィルスベクターを含むことができ、そして組込みセグメントは該ウィルスベクターに非ネイティブであることができる。該ベクターはウィルス核酸をも含むことができ、そして組込みセグメントは該ウィルスベクターに非ネイティブであることもできる。好ましい一つの態様では、ウィルスベクターはアデノウィルスを含む。別の態様では、第１の核酸はレトロウィルスを含み、そして第２の核酸はアデノー関連ウィルス（ＡＡＶ）を含む。更に別の態様では、第１の核酸はＡＡＶを含み、そして第２の核酸はレトロウィルスを含む。更にまた、第２の核酸配列はレトロウィルスＬＴＲ又はＡＡＶを含む。
【００６２】
本発明は、本願で開示した又は以下に請求したウィルスベクター又はウィルスベクター核酸のいずれかを製造する方法をも提供する。かかる方法は典型的には、かかるベクターを供給し、そしてそれを、該ウィルスベクター又は該ウィルスベクター核酸を生成する条件下でパッケージング細胞に導入するステップを含む。一つの側面では、核酸構築物はプロモーター／エンハンサー領域で、非ネイティブプロモーター中で修飾することができる。今記載した方法の他の側面では、核酸構築物は、該パッケージング細胞株のゲノムに安定に組込むことができる。核酸構築物をかかる方法に使用した場合、該構築物をエピゾームにより又は一時的発現により修飾することができることを見過ごしてはならない。
【００６３】
本発明はまた、ヘルパーウィルスと無関係に（独立して）ウィルスベクターを増殖するためのパッケージング細胞株を提供する。該ウィルスベクターは核酸成分と非核酸成分とを含むことができる。該ウィルスベクター核酸成分の配列は細胞株のゲノムに安定に組み込みことができ、そして該ウィルスベクターの非核酸成分の配列は、一時的発現、エピゾーム発現、安定に組込まれた発現、又は前記のいずれかの組み合わせから成る群から選ばれた手段により、パッケージング細胞株に導入される。
【００６４】
この目的のためのパッケージング細胞は、開始ベクター（レトロウィルス）から生成した転写体の逆転写を与えるために、レトロウィルス逆転写酵素配列を含むように調製できる。
【００６５】
ウィルス変態による第２のベクターの生成をもたらすウィルスベクターの例は、例７、８および９、並びに図８、９および１０に提示される。ＡＡＶＩＴＲおよびＡＡＶレプのための配列は、ベクター構築物に含まれるＭＭＬＶレトロウィルスベクター配列に挿入される。パッケージング細胞は、マウス３Ｔ３細胞から、レトロウィルスベクター転写体およびＡＡＶキャップ用の配列の逆転写をもたらしてＡＡＶウィルスベクターパッケージングを与えるために、該細胞にトロウィルス逆転写配列を安定に挿入することにより調製される。開始レトロウィルス核酸成分（プラスミドに存在する）をかかるパッケージング細胞に導入した後、レトロウィルスベクターゲノムの逆転写で、二つのＡＡＶＩＴＲ配列を含む一本鎖レトロウィルスＤＮＡが生成し、該ニつのＡＡＶＩＴＲ配列はほぼ４．５ｋｂで分離され、ここでそれらはＡＡＶレプ遺伝子および外因性核酸の配列をフランクする。かかるＤＮＡコピーは、ＡＡＶＩＴＲ配列およびＡＡＶレプ機能のために複製されて、ＡＡＶレプ配列および外因性核酸配列を含むＡＡＶベクター配列を生成する。キャップタンパク質およびＡＡＶパッケージングシグナルの存在により、かかるＡＡＶベクターウィルスのパッケージングがもたらされる。
【００６６】
本発明はまた、本願で開示又は請求した本発明のウィルスベクターのいずれかを増殖するためのパッケージング細胞株を提供する。かかるパッケージング細胞株は、例えば、ウィルスベクターの表面又はエンベロープ用の少なくとも二つのパッケージング成分を与えることができる。該パッケージング細胞株内では、細胞株はウィルスベクターにネイティブのものであることができる。該ウィルスベクター自体は、好ましい側面では、レトロウィルスを含むことができる。本発明のパッケージング株に使用する細胞株は、当業界で知られた多くの形体を取ることができ、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｕ９３７、Ｈ９および２９３、又は前記のいずれかの組み合わせからなる群から選ばれたメンバーのいずれも含む。
【００６７】
他の側面では、パッケージング細胞株内の表面又はエンベロープ成分の両方用の配列は、パッケージング細胞株のクロモゾーム内に安定に組み込まれる。更に、表面又はエンベロープ成分の配列は、パッケージング細胞株のクロモゾーム内に安定に組み込むことができ、そして別の表面又はエンベロープ成分の配列を一時的に発現することができる。更に、該エンベロープ成分の配列を該パッケージング細胞株のクロモゾーム内に安定に組み込むことができ、そして表面成分の配列を一時的に発現することができる。他の側面では、パッケージング細胞株内の表面又はエンベロープ成分の両方の配列を一時的に発現することができる。
【００６８】
本発明はまた、本願で開示又は請求した他のウィルスベクターを増殖するためのパッケージング細胞株を提供する。かかる場合、細胞株はウィルスベクター成分に非ネイティブのものであることができるが、ウィルスベクター核酸にネイティブのものであることができる。パッケージング細胞株はその膜上で又はその表面上で、ベクターの非ネイティブ成分に吸着するための受容体又は結合パートナーを発現する。
【００６９】
ウィルス変態はまた外因性核酸が細胞ゲノムに組込まれるようにすることができる。第２のベクター核酸が宿主ゲノムに組込む能力は、標的細胞での外因性核酸の安定な発現を確立するために明確な利益を与える。しかし、いくつかのウィルスはこの性質を欠くが、ある種の細胞への親和性、ヒト又は動物組織での安定性、核酸の標的細胞への効率的な伝達のような、遺伝子伝達に有用な他の性質を有する。本発明はウィルスベクター用の組成物およびその使用法を提供し、該ウィルスベクターは、ウィルス変態用の組成物を介して、外因性核酸を標的細胞に組み込ませることができる。かかる組成物は組込みが標的細胞ゲノムの好ましい部位で起こるようにすることができる。
【００７０】
ウィルスベクター保有の組込み性は、非ネイティブ成分をウィルスベクターゲノムに挿入することにより構築することができる。かかる有用な成分には、組込みシグナル配列および第２構造のようなある種のベクター核酸構造を含む、ある種の核酸配列の実体（エンティティー）が含まれる。これらの目的に有用な非ネイティブ成分には、レトロウイルスＬＴＲ、逆転写酵素および、標的細胞内のランダム部位で組込みさせることができるインテグラーゼのような核酸配列が含まれる。ウィルスベクターはまた、標的細胞内の好ましい部位で組込みさせることができる非ネイティブ成分を用いて修飾することができる。かかる配列にはＩＴＲ配列およびＡＡＶから誘導されたレプ遺伝子が含まれる。これらは、レトロウイルスを含むいろいろなウィルスベクターに供給できる。
【００７１】
好ましい部位での組込みを与える非ネイティブ成分を含むウィルスベクターは、上記の組換えＤＮＡの方法によって構築できる。このためにレトロウイルスベクターのようなウィルスベクターは、該レトロウイルス核酸成分に二つのＩＴＲ配列を組込むことにより修飾することができ、ここで、細胞内のベクターＲＮＡの逆転写の後に該ＩＴＲ配列は外因性核酸を含む配列をフランクするであろう。ＡＡＶレプ機能用の配列はまた、かかるレトロウイルスベクターゲノムに組込むか、或いはこれらの配列を別個のエンティティー、例えばウィルス又はプラスミドのような核酸構築物、に供給することができる。逆転写酵素の二本鎖生成物中にＡＡＶＩＴＲが存在しそして細胞中にＡＡＶレプ機能が存在すると、標的細胞ゲノム中への部位特定組込み能力を与えることができる。このプロセスを図１０、１１および１２に示す。上記のプロセスは、逆転写酵素反応の一本鎖ＤＮＡ生成物の生成を介して行うことができる。これは上記のように、第２の鎖ＤＮＡ合成の開始に関連するレトロウイルスゲノムの領域、即ちｐｐｔ配列、の不活化により達成される（図１１および１２）。
【００７２】
多重栄養性（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｐｉｃ）ウィルスベクター
遺伝子伝達系は当業界で知られている。例えば、Ｒａｂｂａｎｉ外の米国特許出願第０８／５７４，４４３号、１９９５年１２月１５日出願、を参照されたい。その内容を本願に参照用に含める。
【００７３】
遺伝子伝達の目的で、ウィルスベクターを、標的細胞にネイティブのウィルスから、又は標的細胞に非ネイティブのウィルスから発生させることができる。一般に、ネイティブウィルスベクターよりも非ネイティブウィルスベクターを使用するほうが望ましい。ネイティブウィルスベクターは標的細胞への天然の親和性を有するが、かかるウィルスは標的細胞内で増殖する可能性があるので、よりおおきい危険性を与える。これに関して、動物ウィルスベクターは、自然にヒト細胞内で増殖するように設計されていないが、ヒト細胞への遺伝子伝達に有用であり得る。しかしながら、遺伝子伝達の使用のために、かかる動物ウィルスベクターを充分な産出量で得るためには、ネイティブ動物パッケージング細胞内でこのような製造を実施することが必要である。しかしながら、この方法で製造したウィルスベクターは通常、エンベロープの一部又はヒト細胞に屈性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を与えることができるカプシッドの一部としての成分を欠く。例えば、環境栄養性マウスレトロウイルス様のＭＭＬＶのような非ヒトウィルスベクターの製造のための現在の実施法では、マウスパッケージング細胞株内で製造される。高いタイターを生成するが、このベクターは標的細胞への親和性を欠いていた。或いは、アンフィトロピック（ａｍｐｈｉｔｒｏｐｉｃ）ベクターを使用できるが、タイターはずっと低いであろう。
【００７４】
本発明は、従来技術におけるこの制限を、新規なウィルスベクター用の組成物および使用法、並びにそれらの製造法を提供することにより克服する。ここで、かかるベクターは、標的細胞およびパッキング細胞の両方に屈性を与えることができる少なくとも二つの表面成分を含む。これらのウィルスベクターに少なくとも二つのかかる成分が存在すると、該ベクターウィルスがパッケージング細胞内で効率的に増殖する能力と遺伝子を標的細胞へ効率的に伝達する能力のそれぞれ独立した能力を与えることができる。パッケージング細胞への親和性は、増殖されたベクターウィルスのパッケージング細胞に再感染しそして増殖の繰り返しサイクルを受ける能力により、高収率での増殖をもたらす。
【００７５】
ウィルスの表面に存在し得る多様の化合物は本発明の目的に使用でき、これらはウィルスエンベロープ又はカプシッドタンパク質から、或いは動物、植物又はヒト細胞に対する親和性を有しそしてウィルスベクター表面に挿入できるその他の生物学的系から誘導されたタンパク質から、誘導することができる。この目的に有用なかかる化合物には、かかるタンパク質又はその一部分の天然アミノ配列からなるタンパク質分子が含まれる。かかるタンパク質又はフラグメントは全体に又は部分的に修飾されることができる。多重栄養性ウィルスベクターの表面に存在することができるタンパク質は、ベクターウィルスにネイティブのタンパク質又はそのフラグメントと、該ウィルスに非ネイティブのタンパク質又はそのフラグメントとの間に形成されたキメラ分子であり得る。
【００７６】
多栄養性ベクターのタンパク質は該ウィルスベクターにネイティブ又は非ネイティブであることができる。有用なネイティブタンパク質には、レトロウイルス環境栄養性（エコトロピック）および両栄養性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）、多栄養性（ｐｏｌｙｔｒｏｐｉｃ）又は異種栄養性（ｘｅｎｏｔｒｏｐｉｃ）のエンブ（ｅｎｖ）タンパク質が含まれる。ヒト細胞への遺伝子伝達に有用な非ネイティブタンパク質には、ヒトウィルスからのエンベロープタンパク質の全て、例えばＣＤ４＋細胞に屈性を与えることができるＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２から誘導されたｇｐ１２０、Ｔ細胞に屈性を与えることができるＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩのエンブタンパク質、肝臓細胞に屈性を与えることができる肝炎Ｂウィルス（ＨＢＶ）のエンベロープタンパク質が含まれる。ヒト細胞に屈性を与えることができるＨＡのようなインフルエンザからのエンベロープタンパク質もまた有用である。ＥＢＶからのエンベロープタンパク質もまたヒトＢ細胞に屈性を与えることができる。
【００７７】
多重栄養性ベクターは、かかる成分を合成させるパッケージング細胞内で便利に製造できる。これらの成分はかかるパッケージング細胞内でウィルスエンベロープに挿入するであろう。かかる化合物を合成させる核酸配列は、１種又はそれ以上のプラスミドにあり、そしてかかるプラスミドはパッケージング細胞内に導入できる。かかる核酸構築物はエピゾーム状態で存在するか、又はパッケージング細胞のゲノムに組込まれるか、又はエピゾーム状態および組込まれた状態の両方の組み合わせで存在することができる。パッケージングは本願で開示された方法およびプロセスによって実施できる。
【００７８】
多重栄養性ベクターはレトロウイルスのようなウィルスから製造でき、ここでそれらはウィルスエンベロープ中に２種又はそれ以上の化合物を含み、該化合物は該ウィルスにネイティブであり、例えばＭＭＬＶの環境栄養性エンブタンパク質、およびＭＭＬＶの両栄養性、多栄養性又は異種栄養性エンブ（ｅｎｖ）タンパク質が含まれる。かかる多重栄養性ベクターのパッケージングは上記の組成により実施できる。ベクターのウィルスエンベロープ中に環境栄養性エンブタンパク質が存在すると、マウス細胞から誘導されたパッケージング細胞中での該ウィルスベクターの効率的な増殖をもたらすことができ、そして両栄養性、多栄養性又は異種栄養性エンブタンパク質はヒト細胞への伝達をもたらすことができる。
【００７９】
例えば、環境栄養性エンブタンパク質と、両栄養性、多栄養性又は異種栄養性エンブタンパク質との両方を含む多栄養性レトロウイルスベクターを生成することができるパッケージング細胞は、３Ｔ３細胞のようなマウスパッケージング細胞から製造できる。かかるパッケージング細胞は、該細胞に、パッケージング成分、即ちｇａｇおよびｐｏｌ、をコードする配列を含む１種又はそれ以上のプラスミドを導入することにより、構築できるであろう。パッケージング成分を高度に発現する細胞株を選びそしてクローニングできる。引き続くプロウィルスベクターＤＮＡのかかるパッケージング細胞株内への導入は、多重栄養性ベクターの製造を開始させることができる。
【００８０】
ウィルスが、ウィルスエンベロープ中に２種又はそれ以上の化合物を含むレトロウイルスであり、その少なくとも一つはＭＭＬＶの環境栄養性エンブタンパク質のように該ウィルスにネイティブであり、そして少なくとも一つの化合物は該ウィルスベクターに非ネイティブであるが標的細胞に対する親和性を有するような、多重栄養性ウイルスベクターもまた製造できる。かかる非ネイティブ化合物は別のウィルスエンベロープから誘導することができ、そしてさらに標的細胞に対する親和性を与える。例えば、ネイティブの環境栄養性エンブタンパク質と、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のような非ネイティブタンパク質の両方を含む多栄養性レトロウイルスベクターを生成することができるパッケージング細胞は、修飾３Ｔ３細胞のようなマウスパッケージング細胞内で製造できる。かかる多重栄養性ウィルスベクターは、上記のように、両栄養性、多栄養性又は異種栄養性エンブタンパク質の核酸配列の代わりに、ｇｐ１２０の製造用の核酸配列を用いて製造できる。増殖した多重栄養性ベクターのウィルスエンベロープ中に環境栄養性エンブタンパク質が存在すると、マウス細胞から誘導されたパッケージング細胞内の上記ウィルスベクターの効率的な増殖をもたらすことができ、そしてｇｐ１２０タンパク質はＣＤ４＋ヒト細胞への伝達をもたらすことができる。丁度上に記載しように、多重栄養性ベクターは該ウィルスベクターにネイティブでも非ネイティブでもよい。有用なネイティブタンパク質には、レトロウイルス環境栄養性および両栄養性、多栄養性又は異種栄養性エンブタンパク質が含まれる。ヒト細胞への遺伝子伝達に有用な非ネイティブタンパク質には、ヒトウィルスからのエンベロープタンパク質の全て、例えば、Ｔ細胞に屈性を与えることができるＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩのエンブタンパク質、肝臓細胞に屈性を与えることができる肝炎Ｂウィルス（ＨＢＶ）のエンベロープタンパク質が含まれる。ヒト細胞に屈性を与えることができるＨＡのようなインフルエンザからのエンベロープタンパク質もまた有用である。ＥＢＶからのエンベロープタンパク質もまたヒトＢ細胞に屈性を与えることができる。前記の成分の全ては同様に増殖することができる。
【００８１】
本発明はまた、上記ウイルスエンベロープまたはウイルスキャプシド中に、そのウイルスに対してネイティブでないが標的細胞に対してはネイティブな少なくとも１つの成分を含むウイルスベクターの組成物およびその使用法に関する。そのような成分は標的細胞受容体のリガンドであってもよい。該ウイルスベクター（本明細書では単一細菌親和性（ｍｏｎｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルスベクターと称する）の効率的な増殖は、当該ウイルスにネイティブであり、かつ、その細胞表面にネイティブでないウイルス成分の受容体を含むように改変されたパッケージング細胞を用いて行うことができる。
【００８２】
単一細菌親和性ウイルスベクターは従って、標的細胞へ効率的に伝達する多細菌親和性ベクターと同じ利点を有する。これらベクターはその標的細胞にネイティブなウイルスと同様に効果的な吸着を示す。しかしながら、これらのベクターにはネイティブなウイルスによって引き起こされるヒトへの望ましくない危険がない。従って、ＭＭＬＶのごとき動物のレトロウイルスのようなベクターウイルスは、そうした危険がない状態で、ネイティブなウイルスベクターの有利さを提供することができる。従って、例えば、単一細菌親和性は、動物のウイルスにネイティブでない広範にわたる化合物のいずれかのウイルスエンベロープ中またはウイルス表面への取り込みによってヒト細胞への遺伝子伝達に利用される動物ウイルスを提供することができ、そのような化合物はあるタイプの細胞に向性を与える。ネイティブなパッケージング細胞のアフィニティにネイティブな化合物を欠く単一細菌親和性ウイルスは、そのようなパッケージング細胞に対して行う改変によって効率的に増殖させることができる。従って、ウイルスベクターに対してネイティブなパッケージング細胞の表面には、ウイルス表面に存在するかまたはウイルスエンベロープに随伴するネイティブでない成分に対応する１または複数のコグネイト細胞を導入することができる。またはその代替アプローチとして、ＨＩＶ（ｇｐ  １２０）からｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのような成分をパッケージングする全配列を提供することによって、動物ウイルスをパッケージングするヒト細胞を発生させることができる。
【００８３】
単一細菌親和性ウイルスベクターの製造には、化合物自身をウイルス表面に提示し得るか、あるいはウイルスエンベロープに随伴できるウイルスベクターにネイティブでない多様な化合物を使用することができ、それらは、エンベロープタンパク質またはウイルスや他の生物系から誘導できる動物、植物もしくはヒト細胞にアフィニティを与えるタンパク質から誘導することができる。そのような化合物としては、ウイルスから誘導されるリガンド、細胞から誘導されるタンパク質リガンドおよび、細胞膜と融合することができるタンパク質やペプチドを挙げることができる。この目的に有用なそうした化合物としては、そのようなタンパク質またはその一部が該タンパク質の全アミノ酸配列からなるタンパク質分子またはそのようなタンパク質もしくはそのフラグメントが一部改変された配列を含むタンパク質分子がある。
【００８４】
単一細菌親和性ウイルスベクターの増殖はパッケージング細胞において好都合に行うことができる。このパッケージング細胞は、ウイルスベクターにネイティブであるかまたは、単一細菌親和性ウイルスの受容体として作用できる１または複数のネイティブでない成分を導入することによって該細胞が改変されているウイルスベクターに存在するリガンドにネイティブである。従って、単一細菌親和性動物ウイルスベクターは、例えば、ヒト細胞に対する向性を与えるネイティブでないリガンドを含んでいてもよい。上記ベクターは、単一細菌親和性ウイルスに存在するネイティブでないリガンドに対応する受容体をその表面に持つよう改変されたウイルスベクターにネイティブなパッケージング細胞で増殖させることによって増殖させることができる。そのような受容体は、該受容体を合成する核酸配列を取り込むことによってパッケージング細胞に導入することができる。そのような核酸配列は（細胞ゲノムに）取り込まれた細胞かもしくはエピソーム状態の細胞に存在していてもよい。単一細菌親和性ウイルスベクターの増殖は、ネイティブでない化合物を含む、ウイルスベクター核酸およびパッケージング成分の核酸配列をもつ細胞（ネイティブもしくはネイティブでない細胞）へ導入することによって進めることができる。ネイティブでない化合物において、発現はエピソーム状態または取り込まれた状態で存在するこれら配列から進行させることができる。
【００８５】
例えば、ＭＭＬＶのごときレトロウイルスベクターのような単一細菌親和性ウイルスベクターは、特定タイプのヒト細胞ならびに改変されたマウスパッケージング細胞に対する向性を与えるネイティブでない成分（ｇｐ  １２０のような）を含むように作ることができる。そのようなベクターは、細胞表面のＣＤ４およびＣＣＲ−５受容体タンパク質をコードする核酸配列の取り込みによって改変されたマウス３Ｔ３細胞から誘導される改変パッケージング細胞に対すると同様、ＣＤ４＋ヒト細胞に対する向性をもっている筈である（Ｍａｄｄｏｎ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４７：３３，１９８６、引用により本明細書に組み入れる）。ベクター産生は、例えば、本明細書の別の箇所に記載の逆パッケージング法により、該細胞のゲノムにベクター核酸配列をコードする核酸配列を安定に組み込むことによって行うことができる。増殖は、上記レトロウイルスのパッケージング成分を合成する核酸配列をそのような細胞に導入することによって開始することができる。そのような核酸配列としてはｇｐ  １２０の配列があるが、ネイティブなｅｎｖタンパク質、すなわち、ＭＭＬＶにネイティブな生態向性（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）もしくは両性向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）のタンパク質の配列は含まれない。そのような配列は、本明細書の別の箇所に記載したようにパッケージング成分を最大まで合成するように増幅できるプラスミドに存在していてもよい。
【００８６】
パッケージングシステム
一般に、ウイルスベクター（ヘルパーウイルスなし）の増殖は、パッケージング成分の核酸配列が細胞ゲノムへ安定に組み込まれたパッケージング細胞中で進行し、そのような細胞株にウイルスの核酸をコードする核酸が導入される。この系においては、パッケージング成分を利用できる可能性はパッケージングを制限する要素であり、それは低力価をもたらすか、またはパッケージング成分に関連する核酸配列の継続的な安定性を損なってしまい、ウイルス産生が不可能なパッケージング細胞を与えることになる。
【００８７】
これらの制限を克服するため、本発明は、ヘルパーウイルスを使用しないでパッケージング成分を効率よく合成し、さらに遺伝子フラグメントのｃＤＮＡを使用することによって、あるいはパッケージング成分をコードする配列をもつプラスミドの重複配列を減少させる方法によって、組替えコンピーテントウイルスの出現につながり得る組み替えが起こる蓋然性を減少もしくは排除する新規な逆パッケージングシステムの方法および組成物を提供するものである。
【００８８】
本発明によって提供されるそのような組成物はパッケージング細胞からなり、その細胞においては、ウイルスベクター核酸成分の産生をコードする核酸配列が細胞のゲノム中に安定に組み込まれている。パッケージング細胞はさらに、必要なパッケージングの全成分を提供する。そのような逆パッケージングシステムを使用すれば、パッケージング成分の合成を最適にすることで、他のパッケージングシステムの制限を克服することができる。これはトランスフェクト後にパッケージング成分を増幅発現することにより、あるいは、以下詳細に述べる組成物および方法により達成することができる。
【００８９】
パッケージング成分をコードする１またはそれ以上の核酸構築物を導入することにより、ベクター核酸をコードする配列が細胞ゲノムへ安定に組み込まれているパッケージング細胞のパッケージング成分の最適な発現を達成することができる。そのような成分は該ベクターにネイティブあってもネイティブでなくてもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、そのフラグメントまたはその修飾体から誘導することができる。そのようなパッケージング成分をコードする核酸構築物は、１または複数コピーの状態でパッケージング細胞株に存在していてもよい。
【００９０】
逆パッケージング組成物は、核酸増幅を用いることによってウイルスベクターパッケージング成分の最適な合成を提供することができる。そのような増幅は上記のようなパッケージング成分を発現させる非常に効率的なプロモーターと併用することができる。ベクターウイルスパッケージング成分の核配列を増幅するのに有用な要素としては、ＳＶ４０ウイルスの複製起点（ＳＶ４０  ｏｒｉ）およびエプスタインバーウイルスの複製起点（ＥＢＶ  ｏｒｉ）がある。これらの要素はベクター成分の発現配列を含むプラスミドやその他の核酸物質を増幅する作用をすることができる。ＳＶ４０によって複製が制御されるプラスミドまたはその他の核酸物質を使用する配列増幅は、パッケージング細胞中でトランス作用Ｔ抗原を発現させることによって行うことができる。一方、ＥＢＶによって複製が制御されるプラスミドまたはその他の核酸物質を使用する増幅は、ＥＢＮＡの発現によって行うことができる。増幅によりベクターウイルスをパッケージングする性質をもった細胞はＥＢＶ  ｏｒｉおよびＥＢＮＡを使用して実現する（ｒｅａｌｉｚｅｄ）ことができる。
【００９１】
例えば、核酸増幅を利用する逆パッケージング細胞の組成物は、効率よくかつ安定にウイルスベクター核酸を産生するパッケージング細胞がＳＶ４０  ｏｒｉまたはＥＢＶ  ｏｒｉを含有する１または複数の核酸構築物（核酸構築物はパッケージング成分を合成する）でトランスフェクトされる以外は、ウイルスベクターの逆パッケージングについて上記した通りの方法で製造することができる。トランス作用Ｔ抗原もしくはＥＢＮＡタンパク質は、前記核酸構築物でトランスフェクトする前に細胞に存在する配列から作ることができる。またこれらのタンパク質は、該核酸構築物に存在していてもよい。
【００９２】
逆パッケージングシステム組成物およびその使用法によれば、ウイルスベクター核酸をコードする核酸セグメント間で起こり得る組み替え（こうした組み替えは複製コンピーテントウイルスを生じさせることがある）を大きく減少させるかまたは排除することができる。これは、パッケージング細胞におけるそのようなセグメント２個の間のウイルスゲノム重複領域を除くことによって行われる。
【００９３】
そのような組み替えが生じる可能性を顕著に減少させるか排除し、かつ、レトロウイルスベクターを増殖させる上記の逆パッケージングおよび／または増幅組成物と併用することができるパッケージングシステムの一例を挙げると、これは、ＬＴＲ配列が含まれていないｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのレトロウイルス配列をクローニングすることによって作ることができる。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ配列は、ｃＤＮＡ製品から作り、プラスミドのような核酸構築物にクローニングすることができる。そのような配列はすべて、該配列が１またはそれ以上のプロモーターから発現できる同じプラスミドにクローニングできる。該配列はまた、ウイルスパッケージング成分に必要な配列をすべて提供する２以上の該プラスミドが要求され、かつ、各プラスミドの発現に少なくとも１つのプロモーターが必要な２以上のプラスミドにクローニングすることができる。
【００９４】
ネイティブでない種々のプロモーター／エンハンサー要素は、アデニル化信号と共に使用してｃＤＮＡ発現を起こすことができる。極めて効率のよい、かつ構成性もしくは誘導性のプロモーター／エンハンサーが使用できる。プロモーター／エンハンサーとしては、メタロチオネンプロモーター／エンハンサーおよび伸長因子（ＥＦ）プロモーター／エンハンサーのような、細胞遺伝子から誘導されたプロモーター、またはＣＭＶ  Ｅｌａ遺伝子のプロモーター／エンハンサーを含むＣＭＶ初期プロモーター／エンハンサーのようなウイルスから誘導されたプロモーター、コグネートポリメラーゼの発現がパッケージング細胞で樹立できるＴ３やＴ７、ＳＰ６のごときバクテリオファージから誘導されたプロモーターがあるが、これらの例示には限定されない。メタロチオネンプロモーター／エンハンサーのごときプロモーター／エンハンサーを使用すれば、パッケージング細胞におけるベクター成分の発現を誘導することができる。
【００９５】
レトロウイルスのパッケージングに適当な細胞は、ベクター核酸の発現配列を含み、かつ、ベクター核酸を産生する安定にトランスフェクトされた細胞株を選択できるプラスミドでトランスフェクトすることができる。レトロウイルスベクターは、この細胞株を、プラスミドのような、パッケージング成分を発現させる１またはそれ以上の核酸構築物でトランスフェクトすることによって作ることができる。レトロウイルスベクターの増殖は、パッケージング成分を与えるプラスミドで一過性にトランスフェクトするか安定にトランスフェクトすることによって行うことができる。
【００９６】
ウイルス非特異性核酸複合体（ＮＶＳ複合体）
本発明は、遺伝子送達における非ウイルスベクター使用に重要な利点を提供することができるウイルス非特異性核酸複合体（ＮＶＳ複合体）組成物およびその使用法を提供する。そのようなＮＶＳ複合体は、核酸成分および、核酸構築物における１またはそれ以上の特異的核酸配列と結合する１またはそれ以上の特異的結合タンパク質からなる。遺伝子送達非ウイルス核酸複合体用の従来の組成物は、核酸成分とポリペプチドもしくはポリカチオンポリマー脂質との間の非特異的複合体に依存していた。そうした多様な物が使用されているが、その場合、核酸配列との結合は非特異的であるか、および／またはイオン性である。しかしながら、核酸に対するそのような非特異的結合はそのような核酸の機能、例えば、転写、組込み、細胞および／または核への移行と干渉し得ること、かつ、傷害性を含む他の干渉作用を生じ得ることが分かっている。
【００９７】
非ウイルス性核酸複合体は遺伝子送達に重要な利点を提供することができるが、従来、配列非特異的結合成分に依存する非特異的核酸複合体の使用によってこれらの利点が認識されたことはなく、また認識できていない。本発明は、特定の核酸配列と遺伝子伝達に有用な性質を与えるタンパク質分子の結合を核酸構築物の規定領域に局在化できるタンパク質成分との間に特異的複合体を形成させることによって、これらの制限を克服したものである。核酸構築物においてそのように特異的結合タンパク質を局在化することで、生物学的活性を与える核酸成分領域との干渉を減少させ、または排除することができる。本発明はまた、そのような特異結合性タンパク質をそのコグネイト結合部位と制御置換することも提供する。そのような置換は生物学的機能と干渉する可能性を排除することができ、あるいは、細胞の有用な機能を提供できるタンパク質を放出することができる。
【００９８】
本発明は、細胞へ導入する際、生物学的機能、すなわち、遺伝子発現、転写、翻訳、取込み、細胞内移行、細胞におけるタンパク質産生、細胞における核酸産生あるいは細胞における核酸もしくはタンパク質との干渉が可能である、ウイルス非特異性核酸複合体（ＮＶＳ複合体）組成物およびその使用法を提供するものである。本発明は、ベクター核酸成分中のコグネイト核酸配列に結合してその構築物を以下１）〜６）のうち１または複数の性質をもたらすことができる、特異結合性タンパク質を用いることによって非ウイルスベクターに重要な利点を提供することができる。１）標的細胞への結合、２）細胞への核酸成分導入の提供、３）細胞内の部位に局在化させる、４）細胞ＤＮＡに取り込む信号を提供する、５）細胞内でベクター核酸を複製および／または発現させるための酵素活性を提供する、６）インビボ、インビトロ両方において核酸成分が分解するのを防御する。本発明においては、該ベクター核酸の生物学的活性を実質的に妨害することなく、上記のうち１または複数の性質を提供することができる。
【００９９】
本発明は、ベクター核酸成分の特異的核酸配列を認識でき、従って生物学的機能を与える核酸成分の配列から特異的タンパク質結合領域を分離する能力を与えることができる特異結合性タンパク質を使用することによって、核酸とポリペプチド、脂質間の非特異的もしくはイオン結合に依存している非ウイルス複合体によりも利点が多い。従って、核酸成分の生物学的機能を実質的に妨害することなく、１または複数の上記性質を提供することができる。そのような特異的配列は、プロモーター配列のごとき遺伝子発現カセットの１要素あるいはその１部ではないが、プロモーター配列が使用されるならば、その場合これら配列は転写には関与せずペプチドを結合する機能だけに関係する。該配列からの転写は、そのようなプロモーター配列からすぐ下流にある逆方向核酸セグメントもしくは逆方向ヌクレオチドを用いて、制限または排除することができる。
【０１００】
ＮＶＳ複合体の特異結合性タンパク質はさらに、直接もしくは間接に、融合や共役により、または複合体形成により、天然、非天然、修飾、非修飾のオリゴーもしくはポリペプチド；天然、非天然、修飾、非修飾のオリゴ糖もしくは多糖類；多分子複合体；不活化ウイルス；脂質；およびリガンド類を含む他の分子と付着・結合（ａｔｔａｃｈ）することができる。そのような成分は、ポリメラーゼ活性のごとき酵素活性をもっていてもよく、また移行および取り込みを含む何らかの生物学的機能をもつタンパク質を持っていてもよい。本発明のＮＶＳ複合体は、植物、ヒトおよび他のほ乳類の細胞を含む真核細胞および原核細胞に核酸を送達することができる。
【０１０１】
以下、本発明の実施に有用な特異結合性タンパク質分子およびそのコグネイト核酸配列を例示する。
バクテリオファージλリプレッサー
ＴＡＴＣＡＣＣＧＣ
ＡＴＡＧＴＧＧＣＧ；
バクテリオファージ４３４リプレッサー
ＡＣＡＡＧＡＡＡＡ
ＴＧＴＴＣＴＴＴＴ；
大腸菌のトリプトファンリプレッサー
ＧＴＡＣＴＡＧＴＴＡ
ＣＡＴＧＡＴＣＡＡＴ；
大腸菌のＭｅｔ  Ｊリプレッサー
ＡＧＡＣＧＴＣＴ
ＴＣＴＧＣＡＧＡ；
大腸菌のｌａｃリプレッサー
ＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴ
ＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡ；
ショウジョウバエのエングレイルド遺伝子調節タンパク質
ＴＡＡＴ
ＡＴＴＡ；
Ｍａｔα２酵母リプレッサータンパク質
ＧＡＴＧＴＡＡＴＴ
ＧＴＡＣＡＴＴＡＡ；
大腸菌のＣＡＰ遺伝子活性化因子
ＡＡＡＡＧＴＧＴＧＡＣＡＴ
ＴＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＴＡ；
ＧＡＬ４酵母転写活性化因子
ＣＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧ
ＧＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣ；
Ｅ２パピローマウイルス転写調節因子
ＡＣＣＧＡＣＧＴＣＧＧＴ
ＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＡ；
酵母ＧＣＮ４転写調節因子
ＡＴＧＡＴＣ
ＴＡＣＴＡＧ；
ｚｉｆ２６８ネズミ遺伝子調節因子
ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ
ＣＧＣＡＣＣＣＧＣ；
グルココルチコイド受容体転写モジュレーター
ＣＡＧＡＡＣＡＴＣ
ＧＴＣＴＴＧＴＡＧ；
ＴＦＩＩＤ転写開始因子
ＴＡＴＡＴＡＡＡ
ＡＴＡＴＡＴＴＴ．
【０１０２】
コグネイト配列は核酸構築物の一部であってもよく、また１または複数の該配列がどの部位に存在していてもよい核酸構築物において１または複数の部位に存在してもよい。従って、そのようなコグネイト核酸配列の数は、ヌクレアーゼ耐性を含む１または複数の目的を達成するようアレンジすることができる。さらに、反復配置にそのような配列の複数コピーが存在することは、核酸と結合タンパク質との間に所望の結合定数を与えることができる。２以上のそうした配列は１つの核酸成分に存在して２以上の異なる種類の特異結合性タンパク質を随伴してもよい。
【０１０３】
制御された方法で解離できるタンパク質／核酸相互作用によりＮＶＳ複合体に有用な性質を与えることができる。従って例えば、結合したタンパク質と核酸成分の生物学的機能との何らかの干渉を排除する手段として、解離可能な特異結合性タンパク質を核酸成分のコグネイト配列に結合させておいてもよく、ＮＶＳ複合体と標的細胞の接触後であるが生物学的機能の発現前に、解離を誘発する分子に該細胞の複合体を曝すことができる。大腸菌ｌａｃリプレッサーおよびそのコグネイト配列のようなタンパク質は、適切な糖類すなわちＩＰＴＧのようなインデューサーによって解離を行うことができる点で有用である。追加の機能を与える核酸と結合するために必要な他の成分、例えば、ＲＮＡポリメラーゼや逆転写酵素のようなタンパク質をもっているような複合体は、誘発されたリリースがＮＶＳベクターによって与えられる機能をさらに改善するので好ましい。
【０１０４】
特異結合性タンパク質は化学的修飾により、または標的細胞に対する核酸移行に有用な性質を与えることができる種々のリガンドを付けることによって改変することができる。本発明に利用することができるそのようなリガンドまたは化学的修飾はいかなる化学分子であっても、また天然でも合成でもよく、分子量２０，０００を超える高分子ならびに分子量より小さい分子を含む。リガンドは高分子および低分子いずれであってもよい。利用できる高分子としては、ペプチドおよびタンパク質を含む種々の天然および合成ポリマー、核酸、多糖類、脂質、ポリカチオン、ポリアニオンおよび混合ポリマーを含む合成ポリマーがある。低分子としては、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、単糖類、オリゴ糖および、ポリアニオン、ポリカチオン、脂質および混合ポリマーを含む合成ポリマーがある。低分子はさらにモノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、オリゴ糖、単糖類、脂質、糖類およびその他の天然物、合成物を含む。
【０１０５】
リガンドおよび化学的改変を利用し、以下の有用な性質を与えることにより細胞への核酸移行を提供することができる。１）標的細胞への結合、２）核酸成分を細胞に導入する、３）細胞内の部位に局在化させる、４）細胞ＤＮＡに取り込む信号の提供、５）細胞内でベクター核酸を複製および／または発現させるための酵素活性の提供、６）インビボでもインビトロにおいても核酸成分が分解するのを防御するタンパク質。
【０１０６】
利用できる細胞標的体としては以下を例示できる。
細胞表面成分およびエピトープに対する抗体
ウイルス、細胞表面成分にアフィニティをもつウイルス成分フラグメントのウイルス成分。これにはＴ４リンパ球のＣＤ４＋受容体に結合するＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のｇｐ  １２０タンパク質のようなタンパク質が含まれる（Ｌｅｖｅｒ  １９９５  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１：１４９、引用によりこの内容を本明細書に組み入れる）。
【０１０７】
細胞表面にアフィニティをもつリガンド。これにはホルモン、レクチン、ペプチドおよびタンパク質、オリゴ糖および多糖類が含まれる。使用できるそのような２つのリガンドは、例えば、アシアロ糖タンパク質受容体に結合するアシアロオロソムコイド（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６９８５、引用によりこの内容を本明細書に組み入れる）およびトランスフェリン細胞受容体と結合するトランスフェリンである（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９２  ８９：６０９９，引用によりこの内容もまた本明細書に組み入れる）。
【０１０８】
細胞表面へ非特異的に結合するポリリジンのようなポリカチオン類（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，ＵＳＰ  ５，１６６，３２０（引用によりこの内容全文を本明細書に組み入れる））。特異結合性タンパク質の機能は核酸の電荷が中和されると改善できる。
【０１０９】
ｅ）造血細胞やその他の細胞と結合するフィブロネクチンのようなマトリックスタンパク質（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：７２７７、引用によりこの内容を本明細書に組み入れる）。
【０１１０】
細胞取り込みを行う物質としてはアデノウイルスのような不活化ウイルス（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２１２２；Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８８５０）；インフルエンザウイルスの血球凝集タンパク質およびそれから誘導されるペプチドフラグメント、ヘマグルチニンＨＡ−２  Ｎ末端ｆｕｓｏｇｅｎｉｃペプチド（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：７９３４）がある。前掲文献の各内容は引用により本明細書に組み入れるものとする。
【０１１１】
細胞の場所を与える物質としては以下を例示できる。
ヒストン類のような核タンパク質
ｓｎＲＮＡ  Ｕ１およびＵ２のような核酸スピーシーズ（公知の方法、例えば、Ｐｅｒｇｏｌｉｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願Ｎｏ．４９１，９２９、出願日１９８３年５月５日、引用によりその内容を本明細書に組み入れる、に従って結合タンパク質にコンジュゲートさせることができる。）；これらは細胞質タンパク質を随伴して核に局在化する（Ｚｉｅｖｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｔｅｒｅａｕｊ，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２５：１、引用によりその内容を本明細書に組み入れる）。
【０１１２】
細胞核酸に組み込みを行う物質としては以下を例示できる。
ＤＮＡに核酸を取り込む機能をもつタンパク質。これらにはインテグラーゼ特異的リコンビナーゼ類（Ａｒｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８６  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５：４３３、引用により組み入れる）がある。
【０１１３】
および
５）ベクター核酸配列を複製する作用をもつ核酸ポリメラーゼのような物質。これらは逆転写酵素、大腸菌から誘導されるようなＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７バクテリオファージ、およびその他のウイルス、原核および真核細胞系。
【０１１４】
６）インビボおよびインビトロ両方において核酸成分が分解しないように保護する物質。共有または非共有法により特異結合性タンパク質に直接または間接に化学的な改変またはリガンドを融合、付着または共役させて上記のような性質を与えることができる。従って、特異結合性タンパク質またはそのフラグメントは、リガンドやそのフラグメントのようなタンパク質と融合させることができ、融合タンパク質は両方のタンパク質によって与えられる性質をもったキメラ分子となる。そのような融合分子は、組み替えＤＮＡ法または化学的合成によって作ることができる。３個以上のタンパク質またはそのフラグメントが融合してキメラタンパク質分子を生成できるような融合タンパク質も作ることができる。そのようなタンパク質は、タンパク質を構成する各成分の有用な性質を含んでいてもよく、また１またはそれ以上の該配列は機能を与えるポリペプチド配列間のコネクターとしても作用することができる。直接結合によるタンパク質リガンドと特異結合性タンパク質の共有結合は、特異結合性タンパク質の反応性部位に直接または間接の化学的付着を含む、当業界で実施される方法によって実現することができる。そのような共有付着は間接的であってもよく、その場合特異結合性タンパク質はタンパク質に付着させた後、次いで有用な機能を与える化合物またはタンパク質との付着により改変することができる。利用できる非共有法としては、特異結合性タンパク質を改変して、抗原ー抗体相互反応、受容体ーリガンド相互作用、疎水性相互作用による、ポリイオン相互作用を含む、有用な分子の直接または間接および／または特異的または非特異的結合がある。従って、特異結合性タンパク質は抗体に結合する本来の性質を含んでいてもよく、また抗体によって結合され得る化合物を含むように付着されていてもよい。そのような抗体は次いで、有用な機能を与えるタンパク質またはその他の化合物に付着させて改変することができる。特異結合性タンパク質はまた、アビジンやストレプトアビジンのようなタンパク質と結合できるビオチンのようなリガンドを含むように改変することもできる。ＮＶＳ複合体の核酸成分はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡとの組合せ、例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラのようなキメラ核酸であってもよい。ＮＶＳ複合体の核酸成分は１本鎖、２本鎖または３本鎖であってよい。核酸成分は円形、線状または分岐状であっても、何らかのＤＮＡまたはＲＮＡの形態をとってもよい。核酸成分は２本鎖領域および１本鎖領域の両方を含むことができる。核酸成分のすべてまたはその一部は改変された核酸または核酸類似体からなっていてもよい。核酸成分のすべてまたはその一部は化学的または酵素的方法によって作ることができる。
【０１１５】
特異結合性タンパク質によって認識される核酸配列は、１または複数コピーの核酸成分中に存在していてもよい。１または複数の異なる種類の特異結合性タンパク質を結合させるため、核酸成分中に１種類以上のそのようなコグネイト配列が存在していてもよい。コグネイト配列の複数コピーは、１または複数のタンデム配置のように、互いに近接して存在していてもよく、該配列はまた核酸成分全体のサイトに存在することもできる。
【０１１６】
ＮＶＳ複合体の核酸成分における生物活性領域は、ＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡやリボザイムのような）のコード、またはタンパク質に翻訳できるＲＮＡのコードを特定することができる。ＮＶＳ複合体における生物活性領域は、分子内核酸配列とのハイブリダイゼーション、分子ＤＮＡへの取り込み、終始配列、プライマー部位およびプロモーター部位の配列を含むことができる。
【０１１７】
ＮＶＳ複合体は、例えば、生物学的機能細胞を与えることができる核酸配列およびｌａｃリプレッサータンパク質の結合を提供できるｌａｃインデューサー領域（Ｌａｃ  ｉ）のような特異結合性タンパク質によって認識されるコグネイト核酸配列を含むプラスミドのような核酸成分を用いて作ることができる。ｌａｃインデューサー領域の配列は、複数コピーのｌａｃリプレッサータンパク質領域を結合できるように、複数のコピーとして含まれていてもよい。ｌａｃリプレッサーによる生物活性のいかなる干渉をも回避するため、ｌａｃインデューサー配列の複数コピーを、生物学的機能を与える配列から離れているプラスミドの領域に配置することができる。こうした目的のためのｌａｃリプレッサータンパク質は、遺伝子伝達に有用な性質を与えるように改変することができる。従ってｌａｃリプレッサーは、標的細胞にアフィニティを与えるタンパク質と共役、融合または複合体形成を行って標的細胞に対する結合を与えるように改変することができる。従って、ＣＤ４＋細胞に付着する性質をもつＨＩＶ−１から誘導されたｇｐ  １２０タンパク質または肝細胞に対するアフィニティを与えるＨＢＶの表面抗原のようなタンパク質を用いることができる。Ｓａｔｔｅｎｔａｕ，Ｑ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．Ａ．，Ｃｅｌｌ  ５２：６３１−６３３（１９８８）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＷＳ．；Ｈｅｐａｎｄｎａｖｉｖｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｆｉｅｌｄ，ＢＮ（ｅｄ．），Ｖｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，１９８９；ｐａｇｅｓ  ２１３７−２１６９，引用により本明細書に組み入れる。
【０１１８】
ＮＶＳ複合体は付加機能を与えるために二種以上の特異結合性タンパク質を含むこともできる。ＮＶＳ複合体は、ｌａｃリプレッサー結合のコグネイト配列の局在化した複数コピーに加えて、例えば、バクテリオファージ４３４リプレッサーおよびバクテリオファージλリプレッサーのような他の特異結合性タンパク質を複数コピー含む核酸成分の追加領域を存在させて、前記のように構築することができる。これらの配列もまた核酸成分中に含まれていてもよく、それら配列は生物学的機能を与える核酸配列から離れた部位に存在する。４３４リプレッサーは、Ｕ１  ＲＮＡのような核局在化物質との共役、融合または複合体形成を行うことによって改変することができ、λリプレッサーは細胞ゲノムへの取り込みを助けるため、インテグラーゼと共役することによって改変することができる。Ｏｒａｉｇｉｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６３：８２９−８３７（１９９０）、引用によりこの内容を本明細書に組み入れる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１９】
実施例１
無関係な配列置換を使用することによる異種ベクター（レトロウイルスベクター）におけるＵ３プロモーターＩエンハンサーの不活化から生じたｃｉｓ作用の再構成
ＬＴＲプロモーターおよびエンハンサーを不活化した異種ベクター（レトロウイルスベクター）を作り、ポリアデニル化機能を再構成した。プラスミド（ｐＥＮＺ１）に存在するレトロウイルスベクター配列（図１）に対して置換を行った。ＰＣＲストラテジーによって細菌のＮｅｏ遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）配列から誘導された１８８塩基対により、ＬＴＲ  Ｕ３エンハンサーの１８８塩基対ＤＮＡフラグメントを置換した。プロモーターの２領域、すなわち、２塩基対の１つと６塩基対の１つとをそれぞれ、オリゴヌクレオチド媒介部位特異的突然変異誘発によって同じサイズの制限酵素認識配列で置換した。除去した元のネイティブな配列およびネイティブでない置換配列を図２に示す。
【０１２０】
エンハンサーおよびプロモーター領域の置換は、メーカーの指示（ＵＳＢおよびＡＢＩ）に従ったこれら領域のＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【０１２１】
全Ｎｅｏ配列をこの異種ベクター配列に組み込んだ。異種ベクター（レトロウイルスベクター）はパッケージング細胞株（ＰＡ３１７およびＧＰ＋Ｅ−８６）をベクターＤＮＡ構築物でトランスフェクトすることにより作った。３Ｔ３細胞の形質導入力価測定Ｎｅｏトランスダクタントで、増殖した異種ベクター（レトロウイルスベクター）のアッセイを行った。ｍｌあたり導入粒子１０６個までの力価が得られた。
【０１２２】
実施例２
ネイティブでないポリアデニル化信号（マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子）を含む不活化プロモーター／エンハンサーをもつレトロウイルスベクター
レトロウイルスベクター核酸配列の外側領域にＮｅｏ遺伝子を含むプラスミドに存在する異種ベクターレトロウイルスの核酸配列は、実施例１に記載のごとく、３’エンハンサーの１８８塩基対領域を細菌Ｎｅｏ遺伝子から誘導された１８８塩基対で置換することにより改変することができる（図３）。同じ方法により、このプロモーター配列は、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子から誘導されたステムループプロセシング信号の配列で置換することができる。これらの改変を含むレトロウイルスベクターは、パッケージング細胞をこのプラスミドベクターでトランスフェクトし、プロデューサー細胞株を選択することによって作ることができる。そのようなレトロウイルスベクターは、標的細胞へ外因性核酸を送達するのに使用することができ、外因性核酸から発現されたｍＲＮＡは、ネイティブでないマウスヒストンＨ２ｋＡ６１４ステムループプロセシング信号およびレトロウイルスＡＡＴＡＡ要素両方の下流にある要素を用いてポリアデニル化することができる。
【０１２３】
実施例３
ネイティブでないポリアデニル化信号（除去された，ＡＡＴＡＡおよびｍＲＮＡ不安定化要素をもつヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子）を含む不活化プロモーター／エンハンサーをもつレトロウイルスベクター
３’ＬＴＲプロモーターおよびエンハンサーが不活化されている異種ベクター（レトロウイルスベクター）を構築することができ、内因性レトロウイルスポリアデニル化部位を使用する。プラスミド（ｐＥＮＺ−１）に存在するレトロウイルスベクター核酸配列に対して不活化を与えるための改変をほどこす。プロモーター／エンハンサーとＡＡＴＡＡＡ要素から上流の内因性レトロウイルスポリアデニル化信号を含むＬＴＲ領域を効率のよい外因性ポリアデニル化信号の一部で置換した。この方法で、レトロウイルス下流のＡＡＴＡＡＡ要素を用いることによりベクターｍＲＮＡをポリアデニル化することができる。ここで、除去されたＡＡＴＡＡＡおよびｍＲＮＡ不安定化要素をもつヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子からのポリアデニル化プロセシグ信号を使用し、プロモーターおよびエンハンサー配列両方に伸びる３’Ｕ３領域を置換することができる（図４）。この場合にはレトロウイルスＡＡＴＡＡＡ要素を使用する。
【０１２４】
実施例４
ｐｏｌ  Ｉによって認識されるプロモーター／エンハンサーを使用する異種ベクターレトロウイルスからのキメラＲＮＡの転写
実施例１に記載のごとく、アンチセンスＲＮＡおよびｒＲＮＡからなるキメラ分子を転写する外因性核酸配列を送達する異種ベクターレトロウイルスを構築することができる（図５）。Ｎｅｏのような配列は、プロデューサー細胞の選択を与えるプラスミドでは異種ベクター配列の外に存在していてもよい。このベクター構築物は、パッケージング細胞をトランスフェクトして異種ベクターレトロウイルスを作るのに使われる。異種ベクターレトロウイルスは、標的細胞の形質導入に使用される。標的細胞のポリメラーゼＩは、取り込まれた異種ベクターＤＮＡからキメラＲＮＡを合成する。
【０１２５】
実施例５
ｐｏｌ  ＩＩＩによって認識されるプロモーター／エンハンサーを使用する異種ベクターレトロウイルスからのキメラＲＮＡの転写
アンチセンスＲＮＡおよびｔＲＮＡからなるキメラ分子を転写する外因性核酸配列を送達する異種ベクターレトロウイルスは、実施例１に記載されているように構築することができる（図６）。Ｎｅｏのような配列は、プロデューサー細胞を選択するプラスミドでは異種ベクター配列の外側領域に存在していてもよい。このベクター構築物は、パッケージング細胞をトランスフェクトして異種ベクターレトロウイルスを作るのに使われる。異種ベクターレトロウイルスは、標的細胞の形質導入に使用される。標的細胞のポリメラーゼＩＩＩは、取り込まれた異種ベクターＤＮＡからキメラＲＮＡを合成する。
【０１２６】
実施例６
転写物がポリアデニル化されていないｐｏｌ  ＩＩによって認識されるプロモーター／エンハンサーを使用する異種ベクターレトロウイルスからのキメラＲＮＡの転写
アンチセンスＲＮＡおよびｓｎＲＮＡ分子Ｕ１からなるキメラ分子を転写する外因性核酸配列を送達するための異種ベクターレトロウイルスは、実施例１に記載されているように構築することができる（図７）。Ｎｅｏのような配列は、プロデューサー細胞を選択するプラスミドでは異種ベクター配列の外側領域に存在していてもよい。
【０１２７】
このベクター構築物は、パッケージング細胞をトランスフェクトして異種ベクターレトロウイルスを作るのに使われる。異種ベクターレトロウイルスは、標的細胞の形質導入に使用される。標的細胞のポリメラーゼＩＩは、取り込まれた異種ベクターＤＮＡからキメラＲＮＡを合成する。
【０１２８】
実施例７
ＡＡＶから誘導されるネイティブでないベクター成分を含む異種ベクターレトロウイルスからのＡＡＶベクターウイルスの増殖
レトロウイルスベクターＤＮＡ構築物は、２つのＡＡＶＩＴＲ配列を含む様に構築することができる。その１つはプライマー結合部位のすぐ下流に挿入され、もう一方は、細胞での逆転写後ＩＴＲ配列が約４．５ｋｂ離れるように第２ストランドのＤＮＡ合成（ｐｐｔ）のレトロウイルス起点からすぐ上流の位置に挿入される（図８）。外因性核酸はＡＡＶＩＴＲ配列間に挿入してもよい。
【０１２９】
ＡＡＶキャップタンパク質配列および逆転写酵素機能のレトロウイルス配列はｐＢＲ３２２のようなプラスミドに挿入する。これらの配列は、伸長因子（ＥＦ）のような構成性細胞遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下に発現する。
【０１３０】
レトロウイルスベクターＤＮＡ構築物およびキャップと逆転写酵素を含むプラスミドはパッケージング細胞をトランスフェクトするのに用いられる。異種ベクターＲＮＡの転写生成物を逆転写すると２本鎖レトロウイルスベクターＤＮＡが得られる。ｒｅｐ生成物は、ｒｅｐ配列および外因性核酸がＡＡＶＩＴＲ配列によってフランキングされている１本鎖ベクターＤＮＡの合成を媒介することができる。キャップタンパク質が存在すると、ＡＡＶウイルスベクターのパッケージングが起こる。
【０１３１】
実施例８
ｐｐｔ機能が不活化されており、かつ、ＡＡＶから誘導されたネイティブでないベクター成分を含む異種ベクターレトロウイルスからのＡＡＶベクターウイルスの増殖
レトロウイルスベクターＤＮＡ構成体を、２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むように構成することができ、そこで、この１つは、プライマー結合部位から隣接する下流の部位に挿入され、及び他は、ｐｐｔ配列が欠失された部位に挿入される。ＡＡＶ  ｒｅｐ配列を、これらのＩＴＲ配列の間の部位に挿入することができる（図９）。また、外因性核酸もこれらのＡＡＶ  ＩＴＲ配列の間に挿入することができる。
【０１３２】
ＡＡＶ  ｃａｐタンパク質及びレトロウイルス逆転写酵素機能のための配列をプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２に挿入する。これらの配列は、構造性の細胞遺伝子のプロモーター／エンハンサー、例えば、延長因子（ＥＦ）の制御下に発現する。
【０１３３】
レトロウイルスベクターＤＮＡ構成体並びに、ｃａｐ及び逆転写酵素配列を含むプラスミドを用いて、細胞を同時にトランスフェクションするか、又は連続してトランスフエクションする。転写物の異種ベクタ−ＲＮＡを逆に転写し、異種ベクターＤＮＡを生じさせ、この異種ベクターＤＮＡは、ｐｐｔ配列を欠くため１本鎖である。この逆転写の１本鎖ＤＮＡ生成物において、これらのＡＡＶ  ＩＴＲは、約４．５ｋｂによって分離され、及びそれらは、ｒｅｐ配列及び外因性核酸の側面に位置する。このｒｅｐ生成物は、１本鎖ベクターＤＮＡの合成を媒介することができ、そこで、ｒｅｐ配列及び外因性核酸は、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列によって側面を守られる。このｃａｐタンパク質の存在は、ＡＡＶウイルスのパッケージングを提供する。
【０１３４】
実施例９
ｐｐｔ配列が欠失され及びＡＡＶ  ＩＴＲ配列がＰＢＳ部位の側面に位置する、異種ベクターレトロウイルスからのＡＡＶベクターウイルスの増殖
異種ベクター（レトロウイルスベクター）ＤＮＡ構成体を、プライマー結合部位（ＰＢＳ）の側面に位置する２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むように構成することができる（図１０）。これらのｐｐｔ配列を除去し及びＡＡＶｒｅｐ配列をその場所に挿入する。挿入したｒｅｐ配列及びその下流のＩＴＲ配列の間に、外因性核酸を挿入することができる。
【０１３５】
ＡＡＶ  ｃａｐタンパク質及びレトロウイルス逆転写酵素機能のための配列をプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２に挿入する。これらの遺伝子は、構造性の細胞遺伝子のプロモーター／エンハンサー、例えば、延長因子（ＥＦ）の制御下に発現することができる。
【０１３６】
レトロウイルスベクターＤＮＡ構成体並びに、ｃａｐ及び逆転写酵素機能のための配列を含むプラスミドを用いて、細胞を同時にトランスフエクションするか、又は連続してトランスフェクションする。転写物の異種ベクターＲＮＡを逆に転写し、異種ベクターＤＮＡを生じさせ、この異種ベクターＤＮＡは、ｐｐｔ配列を欠くため１本鎖である。このｒｅｐ生成物は、１本鎖ベクターＤＮＡの合成を媒介することができ、そこで、ｒｅｐ配列及び外因性核酸は、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列によって側面を守られ、そこで、これらのＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、約４．５ｋｂによって分離される。このｃａｐタンパク質の存在は、ＡＡＶウイルスベクターのパッケージングを提供する。
【０１３７】
実施例１０
外因性核酸のＡＡＶ支配された組込みを供給する、異種ベクター（レトロウイルスベクター）
異種ベクター（レトロウイルスベクター）を、２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むように構成することができ、そこで、この１つは、プライマー結合部位から隣接する下流の部位に挿入され、及び他は、第２の鎖のＤＮＡ合成のためのレトロウイルスの起点からちょうど上流の部位（ｐｐｔ）に挿入される（図１１）。これらのＡＡＶ  ｒｅｐ配列を、２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列の間の部位に挿入する。外因性の核酸を、これらのＩＴＲ配列の間に挿入することができる。異種ベクター（レトロウイルスベクター）を、レトロウイルスパッケージング細胞、例えば、本特許明細書中に記載したものの中で作出する。これらのレトロウイルスベクターを用いて標的細胞を形質導入し、そこで、このベクターＲＮＡは逆転写を受け、２本鎖ＤＮＡを生じる。異種ベクターから発現されたＡＡＶ  ＩＴＲ及びｒｅｐ生成物は、１本鎖ベクターＤＮＡの合成を媒介することができ、そこで、ｒｅｐ配列及び外因性核酸が、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列によって側面を守られる。また、ＡＡＶ  ｒｅｐも、ヒト標的細胞の１９番染色体のｑ１３．４−ター領域のための部位特異性を用いた組込みにおいて機能する。
【０１３８】
実施例１１
外因性核酸のＡＡＶ支配された組込みを提供する、ｐｐｔを欠失させた異種ベクター（レトロウイルスベクター）
異種ベクター（レトロウイルスベクター）を、２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むように構成することができ、そこで、この１つは、プライマー結合部位から隣接する下流の部位に挿入され、及び他は、第２の鎖のＤＮＡ合成のためのレトロウイルスの起点からちょうど上流の部位（ｐｐｔ）に挿入される（図１２）。これらのＡＡＶ  ｒｅｐ配列を、２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列の間の部位に挿入する。外因性核酸を、これらのＩＴＲ配列の間に挿入することができる。かかる異種ベクター（レトロウイルスベクター）を、レトロウイルスパッケージング細胞、例えば、本特許明細書中に記載したものの中で作出する。これらのレトロウイルスベクターを用いて、標的細胞を形質導入し、そこで、このベクターＲＮＡは逆転写を受け、ｐｐｔ配列の欠失のため、１本鎖異種ベクターＤＮＡを生じる。異種ベクターから発現されたＡＡＶ  ＩＴＲ及びｒｅｐ生成物は、１本鎖のベクターＤＮＡの合成を媒介することができ、そこで、ｒｅｐ配列及び外因性核酸が、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列によって側面を守られる。また、ＡＡＶ  ｒｅｐも、ヒト標的細胞の１９番染色体のｑ１３．４−ター領域のための部位特異性を用いた組込みにおいて機能する。
【０１３９】
実施例１２
ｐｐｔを欠失させ及びＰＢＳ部位の側面に位置する、外因性核酸のＡＡＶ支配された組込みを提供する、異種ベクター（レトロウイルスベクター）
異種ベクター（レトロウイルスベクター）を、プライマー結合部位（ＰＢＳ）の側面に位置する２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むように構成することができる（図１３）。これらのｐｐｔ配列を除去し及びＡＡＶ  ｒｅｐ配列をその場所に挿入する。このｒｅｐ配列とその下流のＩＴＲ配列の間に、外因性核酸を挿入することができる。かかる異種ベクター（レトロウイルスベクター）を、レトロウイルスパッケージング細胞、例えば、本特許明細書中に記載したものの中で作出する。これらのレトロウイルスベクターを用いて、標的細胞を形質導入し、そこで、このベクターＲＮＡは逆転写を受け、これらのｐｐｔ配列の欠失のために、１本鎖異種ベクターＤＮＡを生じる。逆転写の１本鎖ＤＮＡ生成物において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ｒｅｐ配列及び外因性核酸の側面に位置する。異種ベクターから発現されたＡＡＶ  ＩＴＲ及びｒｅｐ生成物は、１本鎖ベクターＤＮＡの合成を媒介することができる。また、ＡＡＶ  ｒｅｐも、ヒト標的細胞の１９番染色体のｑ１３．４−ター領域のための部位特異性を用いた組込みにおいて機能する。
【０１４０】
実施例１３
イクスビボ形式において、ＨＩＶ−１に向けたキメラアンチセンスＲＮＡをＣＤ３４細胞に送達するための、異種ベクターの使用
レトロウイルスベクターを例６に記載したように調製することができ、このベクターは、Ｕ１  ｓｎＲＮＡ及びＨＩＶ−１に向けたアンチセンス配列より構成されるキメラＲＮＡのための配列を含む。ＬＴＲのプロモーター及びエンハンサー領域を例１に記載したように不活化することができる。このベクターを、他の異種核酸を含まないようにして、何らタンパク質を産生させないように構成することができる。
【０１４１】
患者からの骨髄収集物から間質培養物を確立することができる。細胞を、ＩＭＤＭ培地中、３〜５×１０５細胞／ｍｌの濃度で平板培養する。間質層の発生後、間質細胞を放射線照射し及びＴ−２５ベントキャップフラスコ当り、１０％の自己由来の血清を含むＩＭＤＭ中で、使用の前日に、５×１０５細胞で平板培養する。
【０１４２】
間質培養物の十分な確立の後、患者血液のロイカフェレーシスを始めることができる。患者は、ロイカフェレーシスを受け、次いで造血増殖因子ＧＣＳＦを、通常の方法によって注入する。ロイカフェレーシスの前に、３００ｍｌの血液を抜き取り及び無菌の血清を通常の方法によって調製し、血漿を収集し及び白血球を標準フィコール分離法によって精製する。ロイカフェレーシス収集物を更に、フィコールーハイパークエ密度勾配遠心分離によって精製して、赤血球及び好中球からＰＢＭＣを分離する。バクスターイソレックス法を用いて、ＣＤ３４＋抗原を発現する細胞（幹細胞）を高めることができる。これらの細胞をバクスターカラムから組織培養バッグ中に溶出させる。細胞の表現型（ＣＤ３４＋マーカーの存在）は、拡張に先立ちフローサイトメトリーによって評価する。
【０１４３】
カラムからの細胞を、細胞を含まず、因子を含まない、１０％の自己由来の血清を追加した増殖培地中で、支持層として自己由来の間質細胞を用いて拡張させる。間質は、４回目の継代まで用いない。この時、成熟したマクロファージ以外の、ほとんどの造血細胞を、根絶することができる（Ｎｏｌｔａ，Ｊ．Ａ．等、１９９５年、この明細書に参考のため記載する）。自己由来の血清をろ過滅菌し及びマイコプラズマ、細菌及び真菌を含まないことを測定することができる。
【０１４４】
これらの細胞を、組織培養バッグ中で７２時間増殖させる。若干の患者からの細胞を、ＧＣＳＦの存在しない状態で増殖させ、及び残る患者からの細胞をＧＣＳＦの存在下に増殖させる。形質導入の前に、試料のＣＤ３４＋の強化された細胞を、アンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡ／細胞の、ＰＣＲ及びＲＴ／ＰＣＲを用いる定量のために除去する。
【０１４５】
形質導入するベクターを、適切な契約者によって、ＦＤＡに認証される材料として作製することができる。ベクターは、高タイター（１ｍｌ当り１０４〜１０６個のコロニー形成単位）の上清のパッケージング細胞系、ＰＡ３１７からなる。この上清は、病原体及びヘルパーウイルスを含まない。
【０１４６】
細胞を形質導入培地中、１ｍｌ当り１０５の濃度で再懸濁させる。これらの細胞を、不活化した３’ターミナルＬＴＲ及びキメラＵ１／ＨＩＶ−１アンチセンスの生成のための配列を有するＭＭＬＶ構成体（上述）を用いて、形質導入する。吸着後、新鮮培地を添加し及び細胞を１週間３７℃で増殖させる。すべての段階で、アリコートを保管することができる。
【０１４７】
ＣＤ３４＋強化した細胞の試料を、この時、アンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡ／細胞の、ＰＣＲ及びＲＴ／ＰＣＲを用いる定量のために除去する。これらの形質導入された細胞を１週間培地中、３７℃で増殖させる。形質導入された細胞の数を１週間の終わりに測定する。表現型分析のための試料を調製する。グラム染色のための試料、及び好気性細菌と嫌気性細菌並びに真菌のための微生物培養物は、注入に先立ち得られる。
【０１４８】
形質導入した細胞を収集し、通常の塩水中で３回洗浄し及び通常の塩水中に再懸濁する。最終的な細胞調製物を小板フィルターによってろ過し及び注入のための輸血パック中に移す。標準の無菌技術を用いた静脈内のカテーテル法を行う。注入は、５×１０８細胞／ｋｇ体重以上では行わない場合がある。注入する細胞の総容量は、１０ｍｌ／ｋｇ体重以上でない。総容量の１〜５％の量の最初の試験注入の後、細胞をその後の６０〜１２０分間にかけて注入する。注入中、患者の急性及び亜急性毒性について観察しながら、細胞懸濁液を５分毎に緩徐にかき混ぜる。
【０１４９】
患者の、Ｕ１／アンチセンスＲＮＡを発現するＣＤ４＋細胞の産生を、記載したようなＲＴ−ＰＣＲ（Ｌｉｕ，Ｄ．等、１９９７年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、印刷中、参考なため内容を記載する）によって、及び血清ウイルス濃度並びにＣＤ４＋細胞の計数について監視する。
【０１５０】
多くの明らかな変形は、本発明の上記詳細な説明及び例の観点から、当業者に連想されると確信する。かかるすべての変形は、本発明の範囲及び意図によって、特に次の請求の範囲によって規定されるように、十分に包含されている。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】プラスミドｐＥＮＺ１に存在するレトロウイルスベクター配列に対する、全体の置換ストラテジーを記載する。
【図２】プラスミドｐＥＮＺ１から除去された野生型３’ＬＴＲのネイティブな配列、およびそれを置換えたネイティブでない改変された３’ＬＴＲの配列を示す。改変された配列は、太字斜体によって示される。
【図３】不活性化されたプロモーター／エンハンサーおよびネイティブでないポリアデニル化シグナル（マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子）を有するレトロウイルスベクターについての、全体の置換ストラテジーを示す。
【図４】ＡＡＴＡＡＡおよびｍＲＮＡ不安定化エレメントが除去された、ヒト遺伝子（Ｇ−ＣＳＦ）からのポリアデニル化プロセシングシグナルが３’Ｕ３  ｓｎＲＮＡの領域を置換えるために使用される、異種レトロウイルスベクターについての、全体の置換ストラテジーを示す。
【図５】アンチセンスＲＮＡおよびｒＲＮＡから構成されるキメラ分子を転写する外因性核酸を送達するための、異種レトロウイルスベクターを構築するための全体のストラテジーを示す。
【図６】アンチセンスＲＮＡおよびｒＲＮＡから構成されるキメラ分子を転写する外因性核酸を送達するための、異種レトロウイルスベクターを構築するための全体のストラテジーを示す。
【図７】アンチセンスＲＮＡおよびｒＲＮＡから構成されるキメラ分子を転写する外因性核酸を送達するための、異種レトロウイルスベクターを構築するための全体のストラテジーを示す。
【図８】２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲを含むレトロウイルスベクターＤＮＡ構築物の構築を説明し、それによって一方の配列が、プライマー結合部位の下流の密接する部位に挿入され、そして他方の配列が、２本鎖合成のためのレトロウイルスの起点（ｐｐｔ）の直ぐ上流の部位に挿入される。
【図９】２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含有するレトロウイルスベクターＤＮＡ構築物の構築を説明し、それによって一方の配列が、プライマー結合部位の下流の密接する部位に挿入され、そして他方の配列が、ｐｐｔ配列が欠失された部位に挿入される。
【図１０】プライマー結合部位（ＰＢＳ）に隣接する２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含む、異種ベクター（レトロウイルスベクター）ＤＮＡ構築物の構築を説明する。
【図１１】２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含む異種ベクター（レトロウイルスベクター）の構築を説明し、それによって一方の配列が、プライマー結合部位の下流の密接する部位に挿入され、そして他方の配列が、２本鎖合成のためのレトロウイルスの起点（ｐｐｔ）の直ぐ上流の部位に挿入される。
【図１２】２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含む異種ベクター（レトロウイルスベクター）の構築を説明し、それによって一方の配列が、プライマー結合部位の下流の密接する部位に挿入され、そして他方の配列が、２本鎖合成のための元来のレトロウイルスの配列（ｐｐｔ）を置換えるために挿入される。
【図１３】プライマー結合部位（ＰＢＳ）に隣接する２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含む異種ベクター（レトロウイルスベクター）の構築を説明する。ｐｐｔ配列は除去され、およびＡＡＶ  ｒｅｐ配列は、その部位に挿入される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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