(57)【要約】【課題】ダニアレルギー性疾患に関するＤｅｒ  ｆまたは、Ｄｅｒ  ｐファミリー以外の新規アレルゲンタンパク質、およびそれを用いた診断薬、予防薬および治療薬等を提供する。【解決手段】本発明のタンパク質はダニ虫体抽出物に含まれ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると分子量約１５ｋＤａを示し、等電点電気泳動法により測定すると約５．５付近に等電点を示し、ＩｇＥと交差反応を示す特徴を有している。上記タンパク質をＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳによって解析したところグループ２のダニアレルゲンと相同性を示す新規アレルゲンであった。本発明から、新規ダニアレルゲンタンパク質、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、当該タンパク質を認識する抗体が得られ、それらを用いることでダニアレルギー性疾患の診断薬、予防薬および治療薬等を提供することができる。【選択図】図１
2008035790.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダニ由来のタンパク質であって、以下の(ａ)〜（ｃ）に記載のタンパク質：
（ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が約１５ｋＤａである；
（ｂ）等電点が約５．５である；および
（ｃ）アレルゲン活性を有する。
【請求項２】
配列番号１および２に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
グループ２ダニアレルゲンに属することを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ダニ由来のタンパク質であって、以下の（ｄ）または（ｅ）に記載のタンパク質：
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、かつアレルゲン活性を有するタンパク質；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質。
【請求項５】
請求項４に記載のタンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項６】
下記の（ｆ）または（ｇ）のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載のポリヌクレオチド：
（ｆ）配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｇ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号４に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５または６に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを用いることを特徴とする請求項４に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項９】
請求項５または６に記載のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体を用いることを特徴とする請求項４に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質と結合することを特徴とする抗体。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質に含まれるペプチドであって、
ダニアレルギー患者由来のＴ細胞を増殖させる活性を有することを特徴とするペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１２に記載のペプチドを用いることを特徴とする、当該タンパク質に特異的に結合しかつ当該タンパク質のアレルゲン活性を阻害する阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載のスクリーニング方法を行なうために用いられるキットであって、
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１２に記載のペプチドを含有することを特徴とするキット。
【請求項１６】
請求項１４に記載のスクリーニング方法により得られた阻害物質を含有することを特徴とするダニアレルギー性疾患用薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項１１に記載の抗体を含有することを特徴とするダニアレルギー性疾患用薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１２に記載のペプチドを含有することを特徴とするダニアレルギー性疾患用薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１２に記載のペプチドを含有することを特徴とするダニアレルギー性疾患の診断キット。
【請求項２０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１２に記載のペプチドと、生体から採取された試料とを反応させることにより、ダニアレルギー性疾患の発症または発症の可能性を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダニ（Dermatophagoides farinae等）に由来する新規なアレルゲンタンパク質、および当該アレルゲンタンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに当該アレルゲンタンパク質が含まれるダニアレルギー性疾患の予防または治療薬をはじめとする当該ダニアレルゲンタンパク質の代表的な利用例に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ダニ（Dermatophagoides farinae、Dermatophagoides pteronyssinus等）はアトピー性皮膚炎やアレルギー性鼻炎、喘息などの深刻なアレルギー性疾患を引き起こす原因となっている（例えば非特許文献１、２、３、４参照）。ダニは家中に偏在するため、ダニを生活環境から除去することはきわめて困難であり、そしてアレルギー患者はいつもそのアレルゲンにさらされている。そしてそのような絶え間無い暴露が、時間経過とともにアレルギー症状をさらに悪化させる。
【０００３】
アレルゲンによって感作されアレルギーを発症してしまった患者に対しては、抗ヒスタミン剤などの副作用を有する対症療法剤を用いた一時的な解決策に依存せざるを得ないのが実状である。このため、アレルギー患者は、抗ヒスタミン剤等の薬剤を使用し続けない限り発症を繰り返すことになり、財政的にも、肉体的にも大きな負担を強いられる。また、上記薬剤の使用を中止するとリバウンドによる症状の悪化も懸念されるという問題をも抱えている。このようにダニに対するアレルギーは、慢性的となり、そして治療することが困難である。
【０００４】
上記の対症療法剤に代わるアレルギーの治療方法として減感作療法が注目を浴びている。減感作療法とはアレルゲンを少しずつ投与し、患者の免疫を慣れさせてアレルギーを治療する手法である。しかしながら、現行の減感作療法では、ダニに含まれる無数のタンパク質をまとめて抽出し、患者に投与する方法が主流である。このためアレルゲン以外にもたくさんのタンパク質を患者に注射することになり、過剰な免疫応答による、アナフィラキシーショックなどの副作用を引き起こすことや、異物が大量に体内に入り込んだことで、別のアレルギーを発症してしまうことがある。そこで、アレルゲンとなるタンパク質を、遺伝子工学などの手法により特定し、合成ペプチドやＤＮＡワクチンとして用いることで副作用がなく、特定のアレルギーを選択的に治療する方法が試みられている。例えば、ダニアレルゲンであるＤｅｒ  ｆファミリーまたはＤｅｒ  ｐファミリータンパク質をコードする遺伝子を用いてＤＮＡワクチンとして投与するという方法が知られている（非特許文献５参照）。
【非特許文献１】Ｐｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ  ＴＡＥ，  Ｃｈａｐｍａｎ  ＭＤ：  Ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅｓ，  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ，  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ８０：  ７５５−７７５  （１９８７）
【非特許文献２】Ｌｉｎ  ＫＬ，  Ｈｓｉｅｈ  ＫＨ，  Ｔｈｏｍａｓ  ＷＲ，  Ｃｈａｎｇ  ＢＬ，  Ｃｈｕａ  ＫＹ：  Ａｌｌｅｒｇｅｎｓ，  ＩｇＥ，  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ，  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ，  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｒ  ｐ  ５  ａｌｌｅｒｇｅｎ，  ｃＤＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  ａｎｄ  ＩｇＥ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ９４：  ９８９−９９６  （１９９４）
【非特許文献３】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｒｅｐｏｒｔ：  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ａｎｄ  ａｓｔｈｍａ：  ａ  ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｐｒｏｂｌｅｍ．  ＷＨＯ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，  ６６：  ７６９−７８０  （１９８８）
【非特許文献４】Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅ  ＪＳ，  Ｖａｎ  Ｓｗｉｅｔｅｎ  Ｐ，  Ｊａｎｓｅ  ＨＭ，  Ａａｌｂｅｒｓｅ  ＲＣ：  Ｓｋｉｎ  ｔｅｓｔｓ  ａｎｄ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ＰＩ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ  ｂｏｄｙ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ＰＩ．  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ８１：  ８８４−８９５  （１９８８）
【非特許文献５】Ｎａｃｋｓｕｎｇ  ＫＳ，  Ｓｏｏｎ  ＳＫ，  Ｊａｅｃｈｕｎ  Ｌｅｅ，  Ｓｏｈｙｕｎｇ  Ｋｉｍ，  Ｔａｉ  ＪＹ：  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｈｏｕｓｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ｏｎ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｏｕｓｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ  ａｌｌｅｒｇｙ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ，  ４：４  （２００６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これまで同定されたダニアレルゲンタンパク質以外のアレルゲンによってアレルギー反応が誘発される場合も多く見られる。よってこれまでに同定され単離されたダニアレルゲンタンパク質を用いた減感作療法では、ダニアレルギー患者によっては、十分な効果を得ることができない場合があった。かかる問題点を解決するためには、これまでに単離されたダニアレルゲンタンパク質以外の新規ダニアレルゲンタンパク質を取得する必要がある。
【０００６】
そこで本発明は、これまでに知られていないダニアレルゲンタンパク質であって、ダニアレルギー患者由来の血清と高頻度に反応するダニアレルゲンタンパク質を提供することを目的とした。さらに本発明は、上記ダニアレルゲンタンパク質を含むダニアレルギー性疾患の予防または治療薬等の当該ダニアレルゲンタンパク質の代表的な利用例を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、コナヒョウダニ（Dermatophagoides farinae（「D. farinae」ともいう））抽出物の二次元免疫染色解析によって、ダニアレルギー性疾患を示す患者（「ダニアレルギー患者」ともいう）の血清中ＩｇＥ抗体と高頻度に反応するスポットを検索した結果、観測分子量が約１５キロダルトン（ｋＤａ）、等電点が約５．５であるタンパク質に高いアレルゲン活性があることを初めて見出した。さらに、本発明者らはプロテオーム技術及び遺伝子工学的手法を用い、当該新規アレルゲンタンパク質の部分構造を解明して、ダニｃＤＮＡライブラリーからそれをコードする遺伝子のクローニングに成功した。そして、本発明者らは遺伝子組換え技術を用いて当該アレルゲンタンパク質を組換えタンパク質として発現させ、当該組換えタンパク質がダニアレルギー患者血清ＩｇＥと反応することを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明にかかるタンパク質は、
ダニ（例えばDermatophagoides farinae等）由来のタンパク質であって、以下の(ａ)〜（ｃ）に記載のタンパク質である：
（ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が約１５ｋＤａである；
（ｂ）等電点が約５．５である；および
（ｃ）アレルゲン活性を有する。
【０００９】
また本発明にかかるタンパク質は、配列番号１および２に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするものであってもよい。
【００１０】
また本発明にかかるタンパク質は、グループ２ダニアレルゲンに属するものであってもよい。
【００１１】
また本発明にかかるタンパク質は、
アレルゲン活性を有するダニ（例えば、Dermatophagoides farinae等）に含まれるタンパク質であって、以下の（ｄ）または（ｅ）に記載のタンパク質である：
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質。
【００１２】
上記本発明にかかるタンパク質は、ダニアレルギー患者血清ＩｇＥと高頻度に反応する新規アレルゲンタンパク質である。よって上記タンパク質によれば、新規のダニアレルギー性疾患の治療薬、予防薬および診断薬を提供することができる。
【００１３】
一方、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記タンパク質をコードすることを特徴としている。
【００１４】
また本発明にかかるポリヌクレオチドは、下記の（ｆ）または（ｇ）のいずれかであることを特徴とするポリヌクレオチドであってもよい：
（ｆ）配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｇ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号４に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１５】
一方、本発明にかかるベクターは、上記のポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。
【００１６】
また本発明にかかるタンパク質の生産方法は、上記ベクターを用いることを特徴としている。
【００１７】
また本発明にかかる形質転換体は、上記ポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
【００１８】
また本発明にかかるタンパク質の生産方法は、上記形質転換体を用いることを特徴としている。
【００１９】
上記本発明にかかるポリヌクレオチド、ベクター、形質転換体、またはタンパク質の生産方法によれば、上記本発明にかかるタンパク質を、遺伝子工学的手法を用いて大量かつ簡便に生産することができる。よって、本発明はダニアレルギー性疾患の治療や診断に対して有効である。
【００２０】
また本発明にかかる抗体は、上記本発明にかかるタンパク質と結合することを特徴としている。本発明にかかる抗体によれば、抗原抗体反応を利用することによって、上記本発明にかかるタンパク質の検出、および当該タンパク質の分離精製を行なうことができる。また上記本発明の抗体を、患者に投与することによって、ダニアレルギー性疾患用の抗体医薬として利用することができる。
【００２１】
また本発明にかかるペプチドは、上記本発明にかかるタンパク質に含まれるペプチドであって、ダニアレルギー患者由来のＴ細胞を増殖させる活性を有することを特徴としている。上記本発明にかかるペプチドは、本発明にかかるタンパク質の一部分、特にＴ細胞によって特異的に認識されるエピトープを含んでいるので、アレルゲンとして作用する。したがって、本発明にかかるポリペプチドは、ダニアレルギー性疾患の診断薬や治療薬として有効である。特に、上記ペプチドは不要なタンパク質が含まれていないために、当該ペプチドはアナフィラキシーショック等の副作用が少ないダニアレルギー性疾患用治療薬に利用することができる。
【００２２】
また本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記ペプチドをコードすることを特徴としている。上記本発明にかかるポリヌクレオチドによれば、上記本発明にかかるペプチドを、遺伝子工学的手法を用いて大量かつ簡便に生産することができる。よって、本発明はダニアレルギー性疾患の治療や診断に対して有効である。
【００２３】
また本発明にかかるスクリーニング方法は、上記本発明にかかるタンパク質またはペプチドを用い、当該タンパク質に特異的に結合し、かつ当該タンパク質のアレルゲン活性を阻害する阻害物質（例えば抗体等）をスクリーニングする方法である。上記スクリーニング方法によれば上記阻害物質を取得することができる。上記阻害物質は、本発明にかかるタンパク質（すなわち新規ダニアレルゲンタンパク質）のアレルゲン活性を阻害することができるために、当該阻害物質はダニアレルギー性疾患の治療薬として利用され得る。
【００２４】
また本発明にかかるキットは、上記本発明にかかるスクリーニング方法を行なうために用いられるキットであって、上記本発明にかかるタンパク質または上記本発明にかかるペプチドを含有することを特徴としている。上記本発明にかかるキットによれば、上記阻害物質を簡便に取得することが可能となる。
【００２５】
また本発明にかかるダニアレルギー性疾患用薬学的組成物は、上記本発明にかかるスクリーニング方法により得られた阻害物質を含有することを特徴としている。上記阻害物質は、既述の通り、本発明にかかるタンパク質（すなわち新規ダニアレルゲンタンパク質）のアレルゲン活性を阻害することができるために、当該阻害物質はダニアレルギー性疾患の治療薬または予防薬として有効である。
【００２６】
また本発明にかかるダニアレルギー性疾患用薬学的組成物は、上記本発明にかかる抗体を含有することを特徴としている。上記本発明にかかる抗体は、既述の通り、本発明にかかるタンパク質（すなわち新規ダニアレルゲンタンパク質）と特異的に結合することができるために、アレルゲンとＴ細胞との結合を阻害することができる。よって、当該抗体はダニアレルギー性疾患の予防または治療薬または予防薬として有効である。
【００２７】
また本発明にかかるダニアレルギー性疾患用薬学的組成物は、上記本発明にかかるタンパク質またはペプチドを含有することを特徴としている。上記本発明にかかるタンパク質またはペプチドは減感作療法に好ましく適用され得る。よって、上記本発明にかかるタンパク質またはペプチドはダニアレルギー性疾患の予防または治療に有効である。
【００２８】
また本発明にかかるダニアレルギー性疾患の診断キットは、上記本発明にかかるタンパク質またはペプチドを含有することを特徴としている。
【００２９】
また本発明にかかるダニアレルギー性疾患の発症または発症の可能性を検出する方法は、上記本発明にかかるタンパク質またはペプチドと、生体から採取された試料とを反応させることにより、ダニアレルギー性疾患の発症又は発症の可能性を検出することを特徴としている。
【００３０】
上記本発明にかかるタンパク質またはペプチドはダニアレルゲンタンパク質である。したがって、上記タンパク質またはペプチドを用いることによって、ダニアレルギー性疾患の発症または発症の可能性を診断（検出）することができる。特に本発明にかかるタンパク質またはペプチドは新規ダニアレルゲンタンパク質であるため、従来公知のダニアレルゲンタンパク質を用いた診断では検出することができなかった患者に対して、ダニアレルギー性疾患であるか否かを診断（検出）することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明にかかるタンパク質は、ダニアレルギー患者血清ＩｇＥと高頻度に反応する新規アレルゲンタンパク質である。よって上記タンパク質は、新規のダニアレルギー性疾患の治療薬、予防薬および診断薬を提供することができる。
【００３２】
よって本発明は、ダニアレルギー性疾患の治療、予防、診断において特に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下に、本発明を詳細に説明する。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００３４】
（１）本発明にかかるタンパク質
ダニアレルゲンにおいては、Ｄｅｒ  ｆファミリーおよびＤｅｒ  ｐファミリーの主要抗原が同定され詳細に研究されているが、その他のアレルゲンに関しては、未だ充分なされていない。そこで、本発明者らは、ダニに含まれるアレルゲンの網羅的解析を目指して、コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）虫体抽出物を２次元電気泳動により展開した後、ウェスタンブロット法によってダニアレルギー患者血清ＩｇＥと特異的かつ高頻度に反応するスポットを検索した。その結果、分子量約１５ｋＤａで、等電点約５．５付近のスポットに高いアレルゲン活性が存在することを発見した。
【００３５】
上記スポットのアミノ酸シークエンス解析をＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて行ない、ホモロジー検索をしたところ、家畜の皮膚炎ダニや貯蔵食品に生息するコナダニやニクダニのグループ２アレルゲンに相同性を示す全くの新規タンパク質であった。
【００３６】
また、本発明にかかるタンパク質をコードするＤＮＡを単離するため、ダニから精製した全ＲＮＡを用いてダニｃＤＮＡライブラリーを構築した。当該タンパク質の保存配列から縮重プライマーを設計し、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。増幅産物についてシークエンス解析を行なった。上記で決定された塩基配列を基にプライマーの設計を行ない、ＲＡＣＥ法によって全長ＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡは、開始コドンおよび終始コドンを含みそのＯＲＦは５５４塩基対（ｂｐ）であった。また、ＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳの解析で得られたアミノ酸配列から推定される塩基配列と相同性を示す塩基配列が、上記全長ＤＮＡにおいて確認された。
【００３７】
本発明は上記新規知見によって完成されたものである。なお本発明にかかるタンパク質はダニ、特にコナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）から見出されたものであるが、本発明はこれに限定されるものではなく、その他のダニ（例えば、Dermatophagoides pteronyssinus、Acarus siro、Blomia tropicalis、Dermatophagoides microceras、Euroglyphus maynei、Glycyphagus domesticus、Lepidoglyphus destructor、Tyrophagus putrescentiae、Psoroptes ovis）に由来するタンパク質をも包含する。
【００３８】
本発明にかかるタンパク質は以下(ａ)〜（ｃ）の、物理化学的性質または、生物活性を持つ。
（ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が約１５ｋＤａである。
（ｂ）等電点が約５．５である。
（ｃ）アレルゲン活性を有する。
【００３９】
本発明のタンパク質の物理化学的性質（分子量および等電点）は、公知のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法および等電点電気泳動法を実施した後、ゲル内のタンパク質を染色することによって調べられ得る。染色法は従来公知の方法を採用することができるが、例えば、クマシー染色法や銀染色法等が挙げられる。
【００４０】
ここで「タンパク質の分子量は、約１５ｋＤａである」とは、タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供した場合において、１４〜１６ｋＤａ（より詳細には１４．５〜１５．５ｋＤａ）範囲内にバンドが検出されるタンパク質であることを意味する。
【００４１】
また「タンパク質の等電点は、約５．５である」とは、タンパク質を等電点電気泳動に供した場合において、等電点が５．０〜６．０（より詳細には５．２〜５．７）範囲内にスポットが検出されるタンパク質であることを意味する。
【００４２】
また本明細書中において「アレルゲン活性」とは、肥満細胞上のＩｇＥと結合し、アトピー性の人に即時型アレルギー反応を引き起こす活性のみならず、単に血清中のＩｇＥと結合する活性をも含むものとする。したがって、例えば、あるタンパク質におけるアレルゲン活性の有無は、ＩｇＥの結合性を調べればよく、それを調べる方法として、具体的には、ウェスタンブロットやＥＬＩＳＡ等の公知の方法を挙げることができる。
【００４３】
また、本発明の一実施形態にかかるタンパク質はトリプシンで酵素消化が行なわれると、下記の部分アミノ酸配列（そのアミノ酸を配列番号１および２に示す）を生じることを特徴とする。換言すれば、本発明のタンパク質は下記のアミノ酸配列を含むタンパク質である。なお上記トリプシンによる当該タンパク質の酵素消化は公知の方法により行われ得る。
【００４４】
（配列番号１）―Ｔｙｒ―Ｓｅｒ―Ｔｙｒ―Ａｓｎ―Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ａｌａ―Ｖａｌ―Ｘａａ―Ｐｒｏ―Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｌｙｓ―、および
（配列番号２）―Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｇｌｙ―Ａｓｐ―Ａｓｎ―Ｇｌｙ―Ｘａａ−Ｖａｌ―Ｃｙｓ―Ｘａａ―Ｌｙｓ
なお上記アミノ酸配列１および２において、ＸａａはＬｅｕまたはＩｌｅを示す。
【００４５】
また本発明の一実施形態にかかるタンパク質のアミノ酸配列と、８種類のグループ２ダニアレルゲン（Pso_o_2、Lep_d_2、Gly_d_2.02、Gly_d_2.01、Tyr_p_2、Eur_m_2、Der_p_2、Der_f_2）のアミノ酸とを比較した。その結果を図５に示す。図５においてグループ２のダニアレルゲン（Pso_o_2、Lep_d_2、Gly_d_2.02、Gly_d_2.01、Tyr_p_2、Eur_m_2、Der_p_2、Der_f_2）のアミノ酸と、本発明のタンパク質（図５において「ＤＦＡ２２」と表記する）のアミノ酸とが完全に一致した箇所にはアスタリスク「＊」を記載した。またグループ２ダニアレルゲンに保存されている６つのＣｙｓ配列を四角囲みで示した。図５の結果によれば、本発明のタンパク質は、グループ２ダニアレルゲンタンパク質に保存されている６つのＣｙｓ配列を含んでいることが分かった。よって、本発明のタンパク質は、グループ２ダニアレルゲンに属するということが推察された。なお、図５において記載したPso_o_2、Lep_d_2、Gly_d_2.02、Gly_d_2.01、Tyr_p_2、Eur_m_2、Der_p_2、Der_f_2のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３に記載されている。また、Pso_o_2は家畜皮膚炎ダニPsoroptes ovis由来のダニアレルゲンであり、詳細については「Temeyer et al.，J Med Entomol 39:384-391, 2002」を参照のこと。Lep_d_2は貯蔵穀類ダニLepidoglyphus destructor由来のダニアレルゲンであり、詳細については「Varela et al.，Eur J Biochem 225:93-98, 1994」を参照のこと。Gly_d_2.02とGly_d_2.02は貯蔵穀類ダニGlycophagus demesticus由来のダニアレルゲンであり、詳細については「Gafvelin et al.，J Allergy Clin Immunol 107:511-518, 2001」を参照のこと。Tyr_p_2は貯蔵穀類ダニTyrophagus putrescentiae由来のダニアレルゲンであり、詳細については「Eriksson et al.，Eur J Biochem 251:443-447, 1998」を参照のこと。Eur_m_2は屋内塵中ダニEuroglyphus maynei由来のダニアレルゲンであり、詳細については「Smith et al.，Int Arch Allergy Immunol 118:15-22, 1999」を参照のこと。Der_p_2は屋内塵中ダニDermatophagoides farinae由来のダニアレルゲンであり、詳細については「Chua et al.，Int Arch Allergy Appl Immunol 91:118-123, 1990」を参照のこと。Der_f_2は屋内塵中ダニDermatophagoides farinae由来のダニアレルゲンであり、詳細については「Yuuki et al.，Arerugi 39:557-561, 1990」を参照のこと。
【００４６】
グループ２ダニアレルゲンは当初、屋内塵中ダニＤ．  ｆａｒｉｎａｅからMe1(17 kD, pI 8.0, Haida et al.,J Allergy Clin Immunol 75:686-692, 1985)、DF2(15 kD, pI 7.8-8.3, Yasueda et al.,Int Arch Allergy Appl Immunol 81:214-223, 1986)およびAg19/20(14.5 kD, pI 8.0, Holck et al.,Allergy 41:408-417, 1986)として、また、D. pteronyssinusからDpX(18-20 kD, pI 5-7, Lind, J Allergy Clin Immunol 76:753-761, 1985)およびDP2(Yasueda et al.,Int Arch Allergy Appl Immunol 81:214-223, 1986)として、各々単離同定された。これらは異なる分子量または等電点を示す成分群であったが、それぞれDer_f_2およびDer_p_2として統一され、対応するｃＤＮＡがクローニングされた(Yuuki et al.,Arerugi 39:557-561, 1990およびChua et al.,Int Arch Allergy Appl Immunol 91:118-123, 1990)。その後、数〜十数ヶ所程度の塩基配列が異なる遺伝子多型の存在が明らかとなり、タンパク質分子としての多様性を説明する根拠とされた（Chua et al.,Clin Exp Allergy 26:829-37, 1996,Smithet al.,Int Arch Allergy Immunol 124:61-63, 2001,Piboonpocanun et al.,Clin Exp Allergy 36:510-516, 2006）。その後、上記のPso_o_2、Lep_d_2、Gly_d_2.02、Gly_d_2.01、Tyr_p_2、Eur_m_2が同定され、グループ２のダニアレルゲンとして分類された。
【００４７】
上記グループ２のダニアレルゲンは、ダニアレルギー性疾患患者のおよそ８０％が感作しているとされており、Der_f_1やDer_p_1を含むグループ１ダニアレルゲンとともに重要なアレルゲンであると認識されている。また、ＩｇＥ結合に関与するＢ細胞エピトープ（Takai et al.,Mol Immunol 34:255-261, 1997）や、Ｔ細胞増殖に関わるＴ細胞エピトープ（Joost van Neerven et al.,J Immunol 151:2326-2335, 1993）が報告されている。
【００４８】
ダニ体内における上記グループ２のアレルゲンの生理学的役割は依然として明らかではないが、アミノ酸配列の相同性、Der_f_2のタンパク質立体構造のＸ線解析（Johannessen et al.,FEBS Lett 579:1208-1212, 2005）およびＮＭＲ解析（Ichikawa et al.,J Biochem 137:255-263, 2005）、ならびにDer_p_2のＮＭＲ解析（Mueller et al.,Biochemistry 37:12707-12714, 1998,Derewenda et al.,J Mol Biol 318:189-197, 2002）から、ＭＤ−２型脂質認識ドメインと構造類似性が高いことが明らかとなった。当該ドメインをもつタンパク質としては、ほ乳類のＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４と協同してＬＰＳ応答に不可欠でＬＰＳのＬｉｐｉｄ  Ａに結合するＭＤ−２（Miyake,Trends Microbiol 12:186-192, 2004）や、Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  Ｃ２型疾患に関与してコレステロールに結合するＮＰＣ２（Vanier et al.,Biochim Biophys Acta 1685:14-21, 2004）が知られている。
【００４９】
また本発明のタンパク質の一実施形態としては、例えば、以下の（ｄ）または（ｅ）に記載のタンパク質が挙げられる。
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、かつアレルゲン活性を有するタンパク質；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質。
【００５０】
上記「１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されていることを意味する。このような変異タンパク質は、上述したように、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在する変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００５１】
なお、本発明にかかるタンパク質は、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００５２】
また、本発明にかかるタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００５３】
また、本発明にかかるタンパク質は、後述する本発明にかかるポリヌクレオチド（すなわち本発明のタンパク質をコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内で発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された場合であってもよい。
【００５４】
他の実施形態において、本発明にかかるタンパク質は、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明のタンパク質の付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、タンパク質のＮ末端に付加され得る。
【００５５】
本発明にかかるタンパク質は、例えば、融合されたタンパク質の精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）にＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、タンパク質の最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。
【００５６】
また本発明は、上記本発明にかかるタンパク質に含まれるペプチドであって、ダニアレルギー患者由来のＴ細胞を増殖させる活性を有するペプチドをも包含する。すなわち、上記ペプチドは、本発明のタンパク質の部分断片であって、特にＴ細胞によって特異的に認識されるエピトープ（以下「Ｔ細胞エピトープ」という）を含むものである。上記ペプチドのことを本明細書においては「部分ペプチド」と称する。
【００５７】
上記「ダニアレルギー患者由来のＴ細胞を増殖させる活性」とは、ダニアレルギー性疾患患者（「ダニアレルギー患者」）由来の末梢血単核細胞群（Ｔ細胞が多く含まれる）を、上記部分ペプチドの存在下で培養したときに、該末梢血単核細胞群のＤＮＡ合成速度を、上記部分ペプチドの非存在下で培養した末梢血単核細胞群の２倍を越える速度、より好ましくは５倍以上の速度にする活性のことを意味する。
【００５８】
上記部分ペプチドを同定する際には、まず本発明にかかるタンパク質のオーバーラップペプチドを合成する。ここで「オーバーラップペプチド」とは、本発明にかかるタンパク質（例えば、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質）のアミノ酸配列に基づき、Ｎ末端からＣ末端に至る全アミノ酸残基をカバーするペプチドのことである。かかるオーバーラップペプチドは、市販されているペプチド自動合成装置により容易に合成することができる。これらのオーバーラップペプチドの中から、少なくとも一つのＴ細胞エピトープを含むペプチドを同定すればよい。
【００５９】
またＴ細胞エピトープを同定するためには、ダニアレルギー患者の末梢血リンパ球から、本発明にかかるタンパク質を特異的に認識し、増殖応答するＴ細胞ラインを樹立する必要がある。一般に、患者毎に反応するＴ細胞エピトープが異なるため、患者毎にＴ細胞ラインを樹立することが望ましい。
【００６０】
Ｔ細胞ラインを樹立するためには、通常患者の末梢血リンパ球を本発明にかかるタンパク質の存在下、７日間程度培養して抗原刺激によりＴ細胞を活性化し、さらに、活性化Ｔ細胞を、抗原と抗原提示細胞と共に７日間培養することを数回繰り返して抗原刺激することにより、抗原特異的Ｔ細胞ラインを作製することができる。
【００６１】
しかしながら、Ｔ細胞が増殖因子のIL−2の存在下でよく増殖している場合は、抗原刺激は最初だけにすることが好ましい。Ｔ細胞ラインを数度抗原刺激すると、増殖率の高いＴ細胞が選択的に取れ、Ｔ細胞エピトープを含むペプチドを同定する場合において、エピトープによっては十分な増殖応答を示さない場合が生じるからである。
【００６２】
なお、抗原刺激に使用する本発明にかかるタンパク質としては、ダニから取得した天然型のものが最も望ましいが、組換えタンパク質、あるいはオーバーラップペプチドの混合物も好適に使用できる。上記本発明にかかるタンパク質は、大腸菌で発現させ精製したものが利用され得る。
【００６３】
また、上記で使用する抗原提示細胞としては、Ｔ細胞ラインと同一人の末梢血リンパ球を、マイトマイシンＣ処理あるいは放射線照射して増殖能力を失わせたものが望ましい。しかし、採血回数が多くなるため、Epstein−Barr  virus（EBV）を自己のＢリンパ球に感染させトランスフォーメーションを起こさせたものは、in vitroで増殖し続けリンパ芽球様細胞株（Ｂ細胞株）となるため、このＢ細胞株を抗原提示細胞として用いてもよい。Ｂ細胞株の樹立方法は既に確立されている［組織培養の技術第二版、187-191 頁、日本組織学会編（1988.8.10）］。
【００６４】
それぞれの患者固有のＴ細胞ラインが認識する、Ｔ細胞エピトープを含むペプチドは以下のようにして同定される。ここで「認識する」という意味は、Ｔ細胞レセプターが抗原エピトープ（MHC 分子を含めて）と特異的に結合し、その結果、Ｔ細胞が活性化されることを意味し、活性化の状態は、リンホカインの産生や、ＤＮＡの合成をブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）や [ 3Ｈ] チミジンの取込み量を指標として測定することにより観察される。例えば、Ｔ細胞ラインとマイトマイシンＣ処理した同一人のＢ細胞株とを、９６穴平底プレートに播種し、オーバーラップペプチドと共に混合培養し、 [ 3Ｈ] チミジンの取込み量（cpm ）を液体シンチレーションカウンターで測定する。その際、 [ 3Ｈ] チミジンの取込みは、個々の培養系で異なるため、例えば、個々のペプチドに対するＴ細胞ラインの [ 3Ｈ] チミジン取込み量（cpm）を、抗原を添加していないコントロールの [ 3Ｈ] チミジン取込み量（cpm ）で除した数（stimulation index: SI ）が２以上のものを上記ペプチドと同定する。
【００６５】
次に本発明にかかるタンパク質の調製方法を説明する。本発明の一実施形態にかかるタンパク質は、従来既知の方法を用いてコナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）から精製することができる。例えば、コナヒョウヒダニをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）等の緩衝液に懸濁し超音波等の方法により破砕する。破砕方法は超音波に限らず、リゾチームによって細胞膜を破壊しても良い。その後、遠心分離し上清を回収する。得られた上清から、ＩｇＥを用いたアフィニティー精製、タンパク質の荷電を利用したイオン交換クロマトグラフィー、タンパク質の分子量を利用したゲルろ過クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーを用いて、精製することができる。また、精製されたタンパク質溶液を適当な緩衝液に透析することで不要な塩を除去することもできる。上記のタンパク質の精製工程は、タンパク質の分解を抑えるために低温で行なうのが適しており、温度は４℃が特に適している。また、上記の精製に用いる緩衝液には、タンパク質の立体構造を安定に保つためＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）等の還元剤を加えても良いし、タンパク質の分解を防ぐためにアプロチニンやロイペプチン等のプロテアーゼインヒビターを加えても良い。
【００６６】
本発明にかかるタンパク質または部分ペプチドの化学的な合成には、通常市販のタンパク質（ペプチド）合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質（ペプチド）の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質（ペプチド）を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質または部分ペプチドを取得する。
【００６７】
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質（ペプチド）合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００６８】
部分ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明の部分ペプチドもしくは本発明のタンパク質を構成し得る部分ペプチドまたはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  および  Ｍ．Ａ．  Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド  シンセシス  （Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ  ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、  丸善（株）  （１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明  および榊原俊平、生化学実験講座  １、  タンパク質の化学ＩＶ、  ２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発  第１４巻  ペプチド合成  広川書店
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明にかかる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドまたは部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００６９】
また本発明にかかるタンパク質は、遺伝子工学的手法を用いて組換えタンパク質として生成可能である。上記生成方法としては、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、後に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。
【００７０】
（２）本発明にかかるポリヌクレオチド
本発明にかかるポリペプチドは、上記本発明にかかるタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドのことである。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００７１】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００７２】
また本発明にかかるポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【００７３】
本発明はさらに、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００７４】
このような変異体としては、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。
【００７５】
本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。
【００７６】
本発明にかかるポリヌクレオチドの一実施形態は、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、下記の（ｆ）または（ｇ）のいずれかであることを特徴としている：
（ｆ）配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｇ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号４に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００７７】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００７８】
上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行なうことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ  塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ  ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％  牛血清アルブミン、０．１％  フィコール、０．１％  ポリビニルピロリドン）が挙げられる。
【００７９】
本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。またＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００８０】
本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明にかかるポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【００８１】
あるいは、本発明にかかるポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行ない、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明にかかるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００８２】
（３）本発明にかかる抗体
本発明は、本発明にかかるタンパク質と特異的に結合する抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明にかかる抗体は、本発明にかかるタンパク質を発現する生物材料を選択する際に有用である。また本発明にかかるタンパク質を含む粗溶液から、当該タンパク質を精製する際にも有用である。
【００８３】
「抗体」は、種々の公知の方法（例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎ら、「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）に従えば作製することができる。より具体的には以下の通りである。
【００８４】
例えば、本発明にかかるタンパク質のモノクローナル抗体を作製する際には、まずモノクローナル抗体産生細胞を作製する。本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。従来公知の方法を使用して、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることができる。なおモノクローナル抗体産生ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法（例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法）に従って行なうことができる。
【００８５】
また本発明にかかるタンパク質のポリクローナル抗体を作製する際には、例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に対して、抗体産生が可能な部位に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００８６】
ここで本明細書中で使用される場合、用語「本発明にかかるタンパク質と特異的に結合する抗体」は、本発明にかかるタンパク質抗原に特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去される。また、細胞のFcレセプターと結合することがないため、当該ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントと細胞間の非特異的結合がほとんど生じない。（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３）（本明細書中に参考として援用される））。従って、これらのフラグメントが好ましい。
【００８７】
さらに、本発明にかかるタンパク質のペプチド抗原に結合し得るさらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて２工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、本発明にかかるタンパク質と特異的に結合する抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、本発明にかかるタンパク質と特異的に結合する抗体に結合する能力が本発明にかかるポリペプチド抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、本発明にかかるポリペプチドと特異的に結合する抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなる本発明にかかるポリペプチドと特異的に結合する抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。
【００８８】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明にかかる抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、本発明にかかるポリペプチド結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。
【００８９】
このように、本発明にかかる抗体は、少なくとも、本発明にかかるタンパク質を認識する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよいといえる。すなわち、本発明にかかるタンパク質を認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。
【００９０】
つまり、本発明の目的は、本発明にかかるタンパク質を認識する抗体を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００９１】
（４）本発明にかかるタンパク質またはポリヌクレオチドの利用
（４−１）ベクター
本発明は、本発明にかかるタンパク質を生成するために使用されるベクターを提供する。本発明にかかるベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【００９２】
本発明にかかるベクターは、上述した本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００９３】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明にかかるポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明にかかるポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００９４】
上記ベクターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８）、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどを利用することができる。
【００９５】
また本発明において利用可能なプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
【００９６】
また本発明にかかるベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点などを付加することができる。また、必要に応じて、本発明のポリヌクレオチドにコードされたタンパク質と他のタンパク質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼおよびプロテインＡ）との融合タンパク質として発現させることも可能である。このような融合タンパク質は、適当なプロテアーゼを使用して切断することによって、それぞれのタンパク質に分離することができる。
【００９７】
本発明にかかるベクターには、少なくとも１つの選択マーカーが含まれていることが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、および大腸菌や他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００９８】
上記選択マーカーを用いれば、本発明にかかるポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明にかかるタンパク質を融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明にかかるタンパク質をＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
【００９９】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、例えば、大腸菌、昆虫細胞、動物細胞などの従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【０１００】
大腸菌の具体例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ６０：１６０（１９６８））、ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ９：３０９（１９８１））、ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １２０：５１７（１９７８））、およびＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４１：４５９（１９６９））などが用いられる。
【０１０１】
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。
【０１０２】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）を昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【０１０３】
このように、本発明にかかるベクターは、少なくとも、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１０４】
つまり、本発明の目的は、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得したベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１０５】
（４−２）形質転換体または細胞
本発明は、上述した本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体または細胞を提供する。ここで「形質転換体」とは、組織または器官だけでなく、生物個体を含むことを意味する。
【０１０６】
形質転換体または細胞の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物を挙げることができる。
【０１０７】
本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む形質転換体は、当該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドが発現し得るように宿主細胞中に導入することにより得ることができる。
【０１０８】
宿主へのポリヌクレオチドの導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。また、ポリヌクレオチドを直接細胞または組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。
【０１０９】
ポリヌクレオチドが宿主に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行なうことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行なえばよい。
【０１１０】
ＰＣＲ増幅産物については、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行ない、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行ない、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【０１１１】
上記形質転換体を作製し、有性生殖あるいは無性生殖、または培養等することにより、上記形質転換体内で本発明にかかるタンパク質を生産することができるため、上記タンパク質を容易に大量調製することが可能となる。
【０１１２】
このようにして得られた、本発明にかかるベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することができる。例えば、宿主が大腸菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃、好ましくは３７℃、で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０〜４０℃、好ましくは３７℃、で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
【０１１３】
（４−３）タンパク質の生産方法
本発明は、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）を生産する方法を提供する。
【０１１４】
一実施形態において、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）の生産方法は、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。
【０１１５】
本実施形態の１つの局面において、本実施形態にかかるタンパク質（または部分ペプチド）の生産方法は、上記ベクターを無細胞タンパク質合成系に用いることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットを用いればよい。好ましくは、本実施形態にかかるタンパク質（または部分ペプチド）の生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。
【０１１６】
本実施形態の他の局面において、本実施形態にかかるタンパク質（または部分ペプチド）の生産方法は、組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明にかかるポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記タンパク質を精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態にかかるタンパク質（または部分ペプチド）の生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【０１１７】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたタンパク質を精製する方法は、用いた宿主、精製されるタンパク質の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のタンパク質を精製することが可能である。
【０１１８】
本実施形態にかかるタンパク質（または部分ペプチド）の生産方法は、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）を含む細胞または組織の抽出液から当該タンパク質（または部分ペプチド）を精製する工程をさらに包含することが好ましい。タンパク質（または部分ペプチド）を精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【０１１９】
別の実施形態において、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）の生産方法は、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）を天然に発現する細胞または組織から当該タンパク質（または部分ペプチド）を精製することを特徴とする。本実施形態にかかるタンパク質（または部分ペプチド）の生産方法は、上述した抗体またはオリゴヌクレオチドを用いて本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）を天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態にかかるタンパク質（または部分ペプチド）の生産方法は、上述したタンパク質（または部分ペプチド）を精製する工程をさらに包含することが好ましい。
【０１２０】
さらに他の実施形態において、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）の生産方法は、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）を化学合成することを特徴とする。当業者は、本明細書中に記載される本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）のアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）を化学合成できることを、容易に理解する。
【０１２１】
以上のように、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）を生産する方法によって取得されるタンパク質（または部分ペプチド）は、天然に存在する変異タンパク質であっても、人為的に作製された変異タンパク質であってもよい。
【０１２２】
変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５（１９９５）参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、またはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いることによって、変異タンパク質を作製することができる。変異タンパク質の作製には市販のキットを利用してもよい。
【０１２３】
このように、本発明にかかるタンパク質（部分ペプチド）の生産方法は、少なくとも、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）のアミノ酸配列、または本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。
【０１２４】
つまり、本発明の目的は、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）の生産方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１２５】
（４−４）検出器具
本発明は、種々の検出器具をも提供する。本発明にかかる検出器具は、本発明にかかるポリヌクレオチドもしくはそのフラグメントが基板上に固定化されたもの、または、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）もしくは抗体が基板上に固定化されたものであり、種々の条件下において、本発明にかかるポリヌクレオチドおよびタンパク質（または部分ペプチド）の発現パターンの検出または測定などに利用することができる。
【０１２６】
一実施形態において、本発明にかかる検出器具は、本発明にかかるポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドが基板上に固定化されていることを特徴とする。本実施形態の好ましい局面において、本実施形態にかかる検出器具は、いわゆるＤＮＡチップである。本明細書中で使用される場合、用語「ＤＮＡチップ」とは、合成したオリゴヌクレオチドを基板上に固定化した合成型ＤＮＡチップを意味するが、これに限定されず、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡを基板上に固定化した貼付け型ＤＮＡマイクロアレイもまた包含する。ＤＮＡチップとしては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブ（すなわち、本発明にかかるオリゴヌクレオチド）を基板（担体）上に固定化したＤＮＡチップが挙げられる。
【０１２７】
プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する公知の方法（例えば、ＳＡＧＥ法（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法）（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１２６８，１９９７；Ｃｅｌｌ  ８８：２４３，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：３００，１９９７；米国特許第５，６９５，９３７号）等が挙げられるがこれらに限定されない）によって決定することができる。
【０１２８】
なお、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして、合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フィトリオグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基板上でオリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合は、アレイ機を用いて基板上に張り付ければよい。
【０１２９】
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置してポリヌクレオチドの検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なるポリヌクレオチドを並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基板上に固定化してＤＮＡチップを構成してもよい。
【０１３０】
本実施形態にかかる検出器具に用いる基板の材質としては、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを安定して固定化することができるものであればよい。上記した基板以外には、例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されない。基板の形態も特に限定されないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。本実施形態の好ましい局面において、本実施形態にかかる検出器具は、種々の生物またはその組織もしくは細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーを標的サンプルとする検出に用いられる。
【０１３１】
他の実施形態において、本発明にかかる検出器具は、本発明にかかるポリペプチドまたは抗体が基板上に固定化されていることを特徴とする。本実施形態の好ましい局面において、本実施形態にかかる検出器具は、いわゆるプロテインチップである。
【０１３２】
本明細書中で使用される場合、用語「基板」は、目的物（例えば、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質）を担持することのできる物質が意図され、用語「支持体」と交換可能に使用される。好ましい基板（支持体）としては、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ）、固相（例えば、ガラスチューブ、試薬ストリップ、ポリスチレン製のマイクロタイタープレートまたはアミノ基結合型のマイクロタイタープレート）などが挙げられるが、これらに限定されない。目的物をこれらの基板に固定化する方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：５１９−５２０（１９９２）（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０１３３】
本実施形態にかかる検出器具に用いる基板の材質としては、ポリペプチドまたは抗体を安定して固定化することができるものであればよい。上記した基板以外には、例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されない。基板の形態も特に限定されないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。
【０１３４】
上記の方法以外のタンパク質（ポリペプチド）または抗体を基板上に固定化する方法としては、例えば、ニトロセルロース膜やＰＤＶＦ膜にタンパク質（ポリペプチド）や抗体をドットブロットの要領でスポットする物理吸着法、または、タンパク質（ポリペプチド）や抗体の変性を軽減するために、スライドガラス上にポリアクリルアミドのパッドを接合して、これにタンパク質（ポリペプチド）や抗体をスポットする方法が挙げられる。さらに、タンパク質（ポリペプチド）や抗体を基板表面に吸着させるだけでなく、強固に結合させるため、アルデヒド修飾ガラスを利用した方法（Ｇ．ＭａｃＢｅａｔｈ，Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９，１７６０（２０００））を用いることもできる。また、基板上でのタンパク質（ポリペプチド）の配向を揃えて固定化する方法としては、オリゴヒスチジンタグを介して、ニッケル錯体で表面修飾した基板へ固定化する方法（Ｈ．Ｚｈｕ，Ｍ．Ｂｉｌｇｉｎ，Ｒ．Ｂａｎｇｈａｍ，Ｄ．Ｈａｌｌ，Ａ．Ｃａｓａｍａｙｏｒ，Ｐ．Ｂｅｒｔｏｎｅ，Ｎ．Ｌａｎ，Ｒ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｂｉｄｌｉｎｇｍａｉｅｒ，Ｔ．Ｈｏｕｆｅｋ，Ｔ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｄｅａｎ，Ｍ．Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，２１０１（２００１））を用いることができる。
【０１３５】
本実施形態の好ましい局面において、本実施形態にかかる検出器具は、種々の生物またはその組織もしくは細胞からの抽出液を標的サンプルとする検出に用いられる。
【０１３６】
このように、本発明にかかる検出器具は、少なくとも、本発明にかかるポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、または本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）もしくは当該タンパク質（または部分ペプチド）と結合する抗体が支持体上に固定化されていればよいといえる。また、本発明にかかる検出器具は、本発明にかかるポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、または本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）もしくは当該タンパク質（または部分ペプチド）と結合する抗体が固定化されている基板を備えていればよいといえる。すなわち、これらの支持体（基板を含む）以外の構成部材を備える場合も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１３７】
つまり、本発明の目的は、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）または本発明にかかるポリヌクレオチド、あるいは本発明にかかる抗体に結合するポリペプチドを検出する器具を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の支持体の種類、固定化方法に存するのではない。したがって、上記支持体以外の構成部材を包含する検出器具も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１３８】
（４−５）本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）を用いた抗体の精製
本発明で精製される抗体としては、動物に抗原を免疫することにより得られた抗血清、動物に抗原を免疫し免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌するモノクローナル抗体、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などいかなるものでもよい。また、抗体のＦｃ領域を融合させた融合タンパク質なども本発明では抗体として含まれる。また上記抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。その抗体については、「（３）抗体」の記載を適宜参照できる。
【０１３９】
本発明にかかる抗体の精製方法は、例えば本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）を固定した担体を用いたクロマトグラフィーにより達成される。本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）が固定化される担体としては、アガロース、アクリル系合成樹脂のポリマー等があげられ、好ましくはアクリル酸エステルのポリマーがあげられる。そのほか市販のアフィニティー担体を適宜選択の上使用すればよい。例えば、HiTrap NHS-activated HP columns （Amersham Bioscience Corp製）、CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs（Amersham Bioscience Corp製）が利用可能である。また、高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と表記する）システムを使用する場合は、一般に市販されているＨＰＬＣシステムであれば、いかなるものでもよい。例えば、ＬＣ−６Ａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）などがあげられる。固定化の方法については、担体に応じて適宜最適な方法を適用すればよい。
【０１４０】
（５）本発明にかかるスクリーニング方法およびスクリーニングキット
本発明にかかるタンパク質は、アレルゲン活性を有するので、当該タンパク質の活性を阻害する化合物は、例えば、ダニアレルギー性疾患の予防または治療薬として使用できる。したがって、本発明にかかるタンパク質は、本発明にかかるタンパク質の活性を阻害する化合物のスクリーニングのための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明にかかるタンパク質を用いることによって、本発明のタンパク質（または部分ペプチド）と特異的に結合し且つ当該タンパク質のアレルゲン活性を阻害する化合物（以下、適宜「阻害剤」と称する）のスクリーニング方法や、本発明にかかるタンパク質とＩｇＥとの結合を阻害する抗体のスクリーニング方法などを提供する。
【０１４１】
本発明にかかるスクリーニング方法においては、上記した本発明にかかるタンパク質にＩｇＥを接触させた場合と、上記した本発明にかかるタンパク質にＩｇＥおよび試験化合物または抗体を接触させた場合における、当該タンパク質に対するＩｇＥの結合量を測定して比較する。
【０１４２】
本発明にかかるスクリーニング方法としての具体例としては、例えば、ＩｇＥを本発明のタンパク質に接触させた場合と、ＩｇＥおよび試験化合物または抗体を当該タンパク質に接触させた場合における、ＩｇＥの当該タンパク質に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、ＩｇＥと当該タンパク質との結合を阻害する化合物または抗体のスクリーニング方法を挙げることができる。
【０１４３】
本発明にかかるスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。まず、本発明にかかるスクリーニング方法に用いる本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）としては、上記の本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）を含有するものであれば何れのものであってもよい。例えば、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターで形質転換された形質転換体を用いて本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）を大量発現した後、精製された本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）が適している。ＩｇＥは検出のために適当な化合物等で標識されているのが好ましい。標識化合物としては、例えば放射性同位元素（例、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕、〔３２Ｐ〕、〔３５Ｓ〕など）、蛍光物質〔例、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなど〕、酵素（例、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、発光物質（例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）、ビオチン等を用いることができる。
【０１４４】
具体的には、ＩｇＥと本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）との結合を阻害する化合物のスクリーニングを行なうには、まず本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）をマルチプレート表面に固相化する。固相化の方法としては、例えばサンドイッチ法のように抗体を用いてプレート表面に固相化する等の公知の方法を用いることができる。当該プレートに、一定量の標識したＩｇＥと試験化合物または抗体を混ぜた溶液を加える。溶液に用いるバッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのタンパクと化合物または抗体との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のＩｇＥを加えた試料も用意する。反応温度は特に制限されるものではないが、生体内に近い温度（例えば、２０〜４０℃）が好ましい。反応後、適量の同バッファーで洗浄した後、プレート上に残存するＩｇＥを計測する。計測方法はＩｇＥに標識した化合物を計測すればよく、例えば、ＩｇＥを放射性同位元素や酵素で標識していれば、それぞれ液体シンチレーションカウンターや酵素活性を測定することによって計測することができる。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【０１４５】
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。抗体としては、本発明のタンパク質とＩｇＥとの結合を特異的に阻害するのであれば、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも良い。
【０１４６】
一方、本発明にかかるスクリーニング用キットは、本発明にかかるタンパク質または部分ペプチドを含有するものである。また本発明にかかるタンパク質もしくは部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するものであってもよい。本発明にかかるスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明にかかるタンパク質のアレルゲン活性を阻害する化合物である。
【０１４７】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物または抗体はダニアレルギー性疾患の予防または治療薬などの医薬として有用である。
【０１４８】
（６）本発明にかかる薬学的組成物
本発明にかかる薬学的組成物（ダニアレルギー性疾患用治療薬または予防薬）の一実施形態としては、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）が有効成分として含まれているものが挙げられる。上記薬学的組成物をダニアレルギー性疾患の減感作治療へ適用することによって、ダニアレルギー性疾患の症状を治療または予防することができる。
【０１４９】
また本発明にかかる薬学的組成物は、既述の阻害剤、または本発明にかかる抗体（特に本発明にかかるタンパク質または部分ペプチドとＩｇＥとの結合を阻害する抗体）を含有するものであってもよい。上記阻害剤または本発明にかかる抗体は、本発明にかかるタンパク質または部分ペプチドのアレルゲン活性を阻害するものである。よって、本発明にかかる抗体や阻害剤を含有する薬学的組成物を、ダニアレルギー患者に投与すれば、本発明にかかる抗体や阻害剤が、体内に侵入したダニアレルゲンのＩｇＥエピトープをトラップし、肥満細胞または好塩基球上のＩｇＥ分子架橋形成を阻害することができ、ダニアレルギー性疾患の症状を改善することができる。
【０１５０】
本発明にかかる薬学的組成物についてさらに詳しく説明すると、本発明にかかる薬学的組成物の一実施形態としては、例えば、本発明にかかるペプチドまたは抗体を０．０１％（ｗ／ｗ）〜１００％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．０５％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは０．５％（ｗ／ｗ）〜５．０％（ｗ／ｗ）含んでなる。本発明にかかる薬学的組成物は、当該ペプチドまたは抗体単独の形態はもとより、それ以外に生理的に許容される、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、マンニトール、プルランなどの担体、賦形剤、免疫助成剤、安定剤、さらには必要に応じてステロイドホルモンやクロモグリク酸ナトリウムなどの抗炎症剤や抗ヒスタミン剤、抗ロイコトリエン剤、抗タキキニン剤を含む１種または２種以上の他の薬剤と組み合わせた組成物としての形態を包含する。さらに、本発明の薬学的組成物は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、本発明にかかるペプチドまたは抗体を、例えば、１日当たりの用量またはその整数倍（４倍まで）またはその約数（１／４０まで）に相当する量を含有し、投与に適する物理的に分離した一体の剤形にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、口腔剤、シロップ剤、乳剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、注射剤などが挙げられる。
【０１５１】
本発明の薬学的組成物は、ダニアレルギー性疾患の治療、改善または予防を目的に、経口、経皮、点鼻、点眼または注射投与される。ヒトにおける投薬量は、投与の目的や方法、症状によっても異なるが、通常、対象者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人１日当たり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜１０ｍｇを目安に、毎日１回〜毎月１回の頻度で、約１〜６ヶ月間、通常、用量を増やしながら反復投与される。
【０１５２】
（７）本発明にかかる診断キットおよびその利用＞
本発明は、ダニアレルギー性疾患の診断キット（検出キット）には、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）を含むことを特徴としている。本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）と被験者の血清との結合性（反応性）をＥＬＩＳＡ法等で検討することによって、被験者血清中にダニアレルゲンに対するＩｇＥ抗体が存在するか否かを判断することができ、被験者がダニアレルギー性疾患である（またはダニアレルギー性疾患を発症する可能性がある）か否かを検出（診断）することができる。
【０１５３】
なお本発明にかかる診断キット（検出キット）に含まれる本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）は、一種類に限定されるものではなく、複数種類のタンパク質またはペプチドを包含するものであってもよい。例えば、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）の他に、ダニアレルゲンタンパク質（公知のＤｅｒ  ｆファミリータンパク質、Ｄｅｒ  ｐファミリータンパク質等）が含まれていてもよい。複数のダニアレルゲンタンパク質に対する被験者の反応を検出することによって、より正確にダニアレルギー性疾患（またはその可能性）を検出（診断）することができる。
【０１５４】
さらに、他のアレルゲンタンパク質（例えばスギ花粉アレルゲンなど）が本発明にかかる診断キット（検出キット）に含まれていてもよい。複数のアレルゲンタンパク質に対する被験者の反応を検出することによって、アレルギー症状の原因を正確かつ網羅的に検出することができる。
【０１５５】
また、本発明にかかる診断キットには、ＥＬＩＳＡ法を行なうために必要な試薬（２次抗体、発色試薬等）、プレート（９６ウェルプレート等）等が含まれていてもよい。またウェスタンブロット法を行なうために必要なメンブレン、電気泳動用ゲル、電気泳動装置、ブロッティング装置、ブロッティング用試薬等が含まれていてもよい。上記構成が含まれることによって、上記診断（検出）をさらに簡便に行なうことができる。
【０１５６】
また本発明にかかる診断キットは、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）が基板上に固定化されている検出器具が含まれている態様であってもよい。当該実施態様にかかる検出器具は、いわゆるプロテインチップである。
【０１５７】
本明細書中で使用される場合、用語「基板」は、目的物（例えば、ペプチドまたはタンパク質等）を担持することのできる物質が意図され、用語「支持体」と交換可能に使用される。好ましい基板（支持体）としては、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ）、固相（例えば、ガラスチューブ、試薬ストリップ、ポリスチレン製のマイクロタイタープレートまたはアミノ基結合型のマイクロタイタープレート）などが挙げられるが、これらに限定されない。目的物をこれらの基板に固定化する方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：５１９−５２０（１９９２）（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０１５８】
本実施態様にかかる検出器具に用いる基板の材質としては、ペプチドを安定して固定化することができるものであればよい。上記した基板以外には、例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されない。基板の形態も特に限定されないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。
【０１５９】
上記の方法以外のペプチドを基板上に固定化する方法としては、例えば、ニトロセルロース膜やＰＤＶＦ膜にポリペプチドや抗体をドットブロットの要領でスポットする物理吸着法、または、ポリペプチドや抗体の変性を軽減するために、スライドガラス上にポリアクリルアミドのパッドを接合して、これにペプチドをスポットする方法が挙げられる。さらに、ペプチドを基板表面に吸着させるだけでなく、強固に結合させるため、アルデヒド修飾ガラスを利用した方法（Ｇ．ＭａｃＢｅａｔｈ，Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９，１７６０（２０００））を用いることもできる。また、基板上でのペプチドの配向を揃えて固定化する方法としては、オリゴヒスチジンタグを介して、ニッケル錯体で表面修飾した基板へ固定化する方法（Ｈ．Ｚｈｕ，Ｍ．Ｂｉｌｇｉｎ，Ｒ．Ｂａｎｇｈａｍ，Ｄ．Ｈａｌｌ，Ａ．Ｃａｓａｍａｙｏｒ，Ｐ．Ｂｅｒｔｏｎｅ，Ｎ．Ｌａｎ，Ｒ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｂｉｄｌｉｎｇｍａｉｅｒ，Ｔ．Ｈｏｕｆｅｋ，Ｔ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｄｅａｎ，Ｍ．Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，２１０１（２００１））を用いることができる。
【０１６０】
このように、本発明にかかかる診断キットには、少なくとも、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）が含まれていればよいといえる。その他にダニアレルギー性疾患の診断に必要な構成を備える場合も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１６１】
＜本発明にかかる検出方法＞
本発明はダニアレルギー性疾患の発症又は発症の可能性を検出する方法（以下「本発明にかかる検出方法」という）を提供する。本発明にかかる検出方法は、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）と生体から採取された試料（たとえば被験者の血清、被験動物の血清等）と反応させる工程（反応工程）を含むことを特徴としている。本発明にかかるタンパク質（部分ペプチド）と試料（被験者の血清等）との結合性（反応性）をＥＬＩＳＡ法等で検討することによって、試料（被験者の血清等）中にダニアレルゲンに対するＩｇＥ抗体が存在するか否かを判断することができ、被験者がダニアレルギー性疾患を発症している（またはその可能性）を検出（診断）することができる。
【０１６２】
当該反応工程を行なう方法は特に限定されるものではなく、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロット法、ドットブロット法等公知の方法を適宜選択の上、適用可能である。例えば、ＥＬＩＳＡ法を採用する場合は、マイクロタイタープレート上に本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）を固定し、試料（被験者の血清等）をアプライして反応させればよい。なお試料（被験者の血清等）は、適当な濃度になるように緩衝液（リン酸緩衝液等）で希釈して使用することが好ましい。試料（血清）の濃度が高すぎると本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）と非特異的に結合するからである。本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）の固定量、反応温度、反応時間等の反応条件については、適宜検討の上、設定すればよい。なお、試料（被験者の血清等）と反応させるのは、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）に限定されるものではなく、その他のダニアレルゲンタンパク質や、その他公知のアレルゲンタンパク質等と反応させてもよい。したがって、上記マイクロタイタープレート上に固定する物質は、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）のみならず、その他のダニアレルゲンタンパク質や、その他公知のアレルゲンタンパク質等であってもよい。
【０１６３】
また本発明にかかる検出方法には、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）と試料（被験者の血清等）中に含まれるＩｇＥ抗体との結合を検出する検出工程が含まれていることが好ましい。本発明にかかるタンパク質（部分ペプチド）に結合した試料（被験者の血清等）中に含まれるＩｇＥ抗体に、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ等で標識した２次抗体（抗ヒトＩｇＥ抗体）を結合させ、さらに標識した酵素によって発色する基質を加え発色させることによって、本発明にかかるタンパク質（または部分ペプチド）と試料（被験者の血清等）中に含まれるＩｇＥ抗体との結合を容易かつ定量的に検出することができ、被験者がダニアレルギー性疾患である（またはその可能性がある）か否かを判断することができる。なお検出工程は、放射性同位体標識した２次抗体を用いても良く、また検出感度を向上させるべく２次抗体に対する抗体（３次抗体）を用いてもよい。なお検出には、適宜市販の抗体、および検出用試薬を適宜選択の上、利用すればよい。
【０１６４】
上記反応工程、検出工程には、当該工程に必要な操作（例えば、未反応の血清抗体等を反応系から除去する洗浄操作、マイクロタータープレートと抗体との非特異的な結合を防止するブロッキング操作等）が含まれていてもよい。また本発明にかかる検出方法には、生体（被験者、被験動物等）から採血する工程、採血した血液から遠心分離により血清を調製する血清調製工程等が含まれていてもよい。なお、ＥＬＩＳＡ法の具体的な方法については、実施例の記載を適宜援用することが可能である。
【０１６５】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１６６】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【０１６７】
以下に示す実施例において使用した試薬は、特記しない限り、ナカライテスク株式会社、和光純薬工業株式会社、シグマ社、ディコフ社等から購入した市販のものを使用した。また、制限酵素等の遺伝子工学用試薬はタカラバイオ株式会社、東洋紡績株式会社、インビトロジェン社等から購入し、販売者の指示に従って使用した。
【０１６８】
＜実施例１＞  ダニ虫体抽出物のプロテオーム解析
（１）ダニ虫体抽出物の調製
コナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）をマウス・ラット・ハムスター用粉末飼料（オリエンタル酵母工業株式会社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）と襖の混合培地（７：３）中で湿度７５％、２５℃において３０日間培養した。その後、ダニ培養物を飽和食塩水に懸濁して遠心分離し、その上清を含む浮遊物を濾過した。濾紙上（Ｔｏｋｙｏ  Ｒｏｓｈｉ  Ｋａｉｓｈａ、Ｌｔｄ．１１０  ｍｍ）に回収されたダニ虫体は、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１６９】
ダニ虫体を０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ｍｏｎｏｉｏｄｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、５ｍＭ  ＥＰＮＰを含むリン酸緩衝液、ｐＨ７．２中で乳鉢を用いてすり潰した後、−８０℃で一晩凍結させた。その後凍結乾燥を行ったものをダニ虫体抽出物として以下の実施例に用いた。ダニ虫体抽出物は使用するまで−８０℃で保存した。
【０１７０】
ダニ虫体抽出物３．６ｇを溶解バッファー（５Ｍ  尿素、２Ｍ  チオ尿素、２％  ＣＨＡＰＳ、２％ＳＢ  ３−１０、１％ＤＴＴ、２％  Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）３６ｍｌに溶解し、４００００×ｇで１０分間遠心分離し不溶性成分を除去した。その後、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を終濃度２０％となるように加え、氷上で１．５時間静置した。静置後、３５００ｒｐｍ、０℃で３０分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿を氷冷アセトン１０ｍｌで洗浄した。洗浄後、３５００ｒｐｍで２０分、０℃で遠心分離し、上清を捨て、沈殿に氷冷ジエチルエーテルを加え十分懸濁した。再度３５００ｒｐｍ、０℃で２０分間遠心分離し、上清を捨て、遠心減圧乾固させた。得られたタンパクを溶解バッファーに溶解し、十分懸濁し、タンパク濃度を測定後、使用するまで−８０℃で保存した。ＴＣＡ沈殿処理したダニ虫体抽出物のタンパク濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いてＢＳＡ換算タンパク濃度として算出した。
【０１７１】
（２）ダニ虫体抽出物の２次元電気泳動
ＴＣＡ沈殿処理後、溶解バッファーに溶解したダニ虫体抽出物（１００μｇタンパク質）を全量が５００μｌとなるように溶解バッファーに溶かし、二次元ゲル電気泳動による分離および解析を藤村ら（Ｆｕｊｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｉｎｔ．  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３３、  １２５−１３５）の方法に従って行った。一次元目はＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ  ｇｅｌ  ｐＨ３−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を使用し、ＭｕｌｔｉｐｈｏｒII水平型電気泳動装置（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）で２０℃、約１２時間電気泳動を行なった。ゲルを平衡化バッファー（Ａ）（尿素１４．４ｇ、グリセロール１５．１２５ｇ、１０％  ＳＤＳ  ８ｍｌ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ  ６．８）  ８ｍｌ、ＤＴＴ  ２００ｍｇ／４０ｍｌ  超純水）中で１５分間振盪した後、平衡化バッファー（Ｂ）（尿素１４．４ｇ、グリセロール１５．１２５ｇ、１０％  ＳＤＳ  ８ｍｌ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ６．８）  ８ｍｌ、ヨードアセトアミド３．６ｇ、ブロモフェノールブルー０．００５ｇ／４０ｍｌ  超純水）中で１５分間振とうを行ないシステイン残基にカルバミドメチル化を行なった。二次元目は９〜１８％ポリアクリルアミドグラジエント平板ゲルを使用し、２０℃、８０Ｖで１６〜１８時間電気泳動を行なった。ゲル内の全タンパク質は銀染色によって可視化した。その結果を図１に示す。
【０１７２】
（３）ダニアレルゲンタンパク質の検出
ダニアレルゲンタンパク質をウェスタンブロット法により検出した。２次元電気泳動を行なった後に、ゲル内のタンパク質を６０Ｖ，６時間でＰＶＤＦメンブレンに転写させ，ブロッキングバッファー（５％  スキムミルク，１％  ＢＳＡ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）中に４℃で一晩ブロッキングした。その後，ＰＢＳＴ（ＰＢＳ，０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で５分×１回，１０分×１回洗浄した。洗浄後、メンブレンを、０．０２％  アジ化ナトリウム／ＰＢＳ中に４℃で保存した。メンブレンをＰＢＳＴで洗浄した後、ダニアレルギー性疾患患者血清を希釈バッファー（５％スキムミルク，１％  ＢＳＡ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）で１０倍希釈させた溶液に浸して、４℃で一晩振とうさせた。上記ダニアレルギー性疾患患者血清は、ハウスダストまたはダニに対する皮内反応陽性の検体から採取した血液を遠心分離して得られた上清を用いた。その後、ＰＢＳＴで５分×１回，１０分×３回，５分×１回洗浄した。洗浄後、ビオチン化ヤギ抗−ヒトＩｇＥ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む希釈バッファーで１万倍希釈した溶液に浸し、室温で１時間振盪させた。メンブレンを洗浄した後、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ社）１５．３７５ｍｌをメンブレン上に滴下して５分静置し、Ｈｙｐｅｒ  ｆｉｌｍ  ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ社）に露光させて、ダニアレルゲンタンパク質である陽性スポットを検出した。
【０１７３】
検出された陽性スポットのうち、分子量約１４〜１５ｋＤａ、等電点約５．５の成分が７７．５％の頻度で患者血清に反応することがわかった。上記成分を「ＤＦＡ２２」と命名した。
（４）質量分析法によるダニアレルゲンタンパク質の同定
ＤＦＡ２２のタンパク質はＱ−ＴＯＦ型ｎａｎｏ−ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ（Applied  Biosystems社、QSTAR（登録商標）XL Hybrid LC/MS/MS System）によって同定した。すなわち、ウェスタンブロットの結果と比較し、二次元電気泳動後のゲルから目的の陽性スポットと一致する部位をメスで切り出し、１ｍｍ３程度に切り刻み、３０ｍＭ  フェリシアンカリウム／１００ｍＭ硫酸ナトリウム等量混合液を加えてゲルが黄色になるまで激しく振とうした。溶液を除去し、超純水でゲルが透明になるまで洗浄した。１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムを加え１０分間の強振とうを２回行ない、アセトニトリルを加え１０分間強振とうを行ない、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムを加え１０分間強振とうを行ない、アセトニトリルを加え１０分の強振とうを２回行ない、完全にゲルが白くなるまで脱水した。遠心濃縮機で２０分間ゲルを乾燥させ、トリプシン溶液（１０ｎｇ／μｌトリプシン、４０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、１０％アセトニトリル）をゲルに加え、室温で４５分インキュベートした。トリプシン消化バッファー（４０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、１０％アセトニトリル）をゲルの半分程度加え、３７℃で１６時間程度インキュベートした。その後、５％ＴＦＡを加えて２０分間強振とうを行ない、５％ＴＦＡ／５０％アセトニトリルを加えて２０分間の強振とうを３回行ない、ペプチドを抽出した。遠心濃縮器で１０μｌ程度まで抽出液を濃縮した。脱塩はＺｉｐＴｉｐ  Ｃ１８（日本ミリポア社製）を用いて行なった。
【０１７４】
ＱＳＴＡＲ（登録商標）  ＸＬ  Ｓｙｓｔｅｍ（Applied  Biosystems社製）に付属されているマニュアルに従って、ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅでｓｅｘ  ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉＰＤ１（ＭＷ＋Ｈ＝８２９．５３９３；ＢＡＣＨＥＭ社）とヨウ化セシウム（ＭＷ＋Ｈ＝１３２．９０４９）とを用いてキャリブレーションした。高濃度に濃縮し脱塩したべプチドをＧＥＬｏａｄｅｒ  Ｔｉｐｓ  を用いてＮａｎｏＴｉｐ（Ｓｉｇｍａ社）にアプライし、先端にサンプルを集めた。装置にセットした後、適切な電圧（９００〜１２００Ｖ）でＴＯＦ  ＭＳスペクトルを得た。明瞭なピークを与える多価イオンはさらにｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅでＭＳ／ＭＳ解析を行なった。得られたＭＳ／ＭＳスペクトルをＢｉｏＡｎａｌｙｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Applied  Biosystems社製）を用いて解析した。
【０１７５】
その結果を図２に示した。図２（Ａ）はＤＦＡ２２を質量分析に供した時のピークを示す図であり、図中に記載されたイオン分子量は各々のイオン群の代表値である。また、図２（Ｂ）はＤＦＡ２２のトリプシン消化によって生じたペプチドの推定アミノ酸配列と、そのモノアイソトピック分子量とを示す図である。
【０１７６】
図２の結果から、７３９．４２９６（Ｍ＋２Ｈ）および６２３．３５６８（Ｍ＋２Ｈ）の多価イオンペプチドについて、それぞれ、
配列番号１：ＹＳＹＮＶＰＡＶ（ＬまたはＩ）ＰＮ（ＬまたはＩ）Ｋ、および配列番号２：Ｖ（ＬまたはＩ）ＧＤＮＧ（ＬまたはＩ）ＶＣ（ＬまたはＩ）Ｋからなるアミノ酸配列が推定された。図２（Ｂ）に示されているアミノ酸配列であって、配列番号１および２以外のアミノ酸配列を配列番号２８〜３２に示した。当該アミノ酸配列について、ＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータバンク）のＢｌａｓｔ検索により全生物種を対象に相同性検索を行なったところ、グループ２ダニアレルゲンと相同性が高いことがわかったが、既知のダニアレルゲンタンパク質とは完全に一致することはなく、新規のダニアレルゲンタンパク質であった。
【０１７７】
なお、同様の手法で、分子量約１６ｋＤａ、等電点７〜９の複数の成分が公知のダニアレルゲンＤｅｒ  ｆ  ２であることが確認された（図１中黒矢印で示す）。
＜実施例２＞  ＤＦＡ２２の全長遺伝子配列の決定
（５）ダニ由来ｃＤＮＡライブラリーの作成
D.farinaeの全ＲＮＡを調製するため、１８０℃、１２時間乾熱滅菌した乳鉢にD.farinae虫体２ｇ（−８０℃凍結保存状態）、適量の液体窒素、トリゾール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 社製）２０ｍｌを入れ、石英砂により粉状になるまで破砕した。６０℃に保温しておいた５ｍｌのトリゾールを加え、３０秒間激しく攪拌し、１５分、６０℃でインキュベートして、遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１分間、４℃）を行なった。１．５ｍｌマイクロチューブに上清を１ｍｌずつ分注し、５分室温でインキュベートした後、各チューブに２００μｌずつクロロホルムを加え、エマルジョンになるまで激しく攪拌した。３分間室温でインキュベートし、遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）して、２層に分かれた上層部分を別のマイクロチューブにとり、５００μｌのイソプロパノールを加えて１０分間室温で静置した。遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）後、上清を除き、残存した沈殿に３００μｌの氷冷した４Ｍ塩化リチウムを加え、ピペッティングにより溶解し、遠心分離（６５００ｒｐｍ、５分間、室温）した。上清を除き、沈殿物に２００μｌの０．５％  ＳＤＳ−ＴＥｂｕｆｆｅｒと２００μｌのクロロホルムを加え、激しく攪拌した後、遠心分離（６５００ｒｐｍ、１０分間、室温）して、上層の水層部分を別のマイクロチューブにとった。その水層部分に１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量のエタノールを加え、５分間−８０℃で静置した。遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）して、上清を除いた沈殿（ＲＮＡ）に７５％エタノールを加えてリンスして遠心分離（１４０００ｒｐｍ、２分間）して得た沈殿を風乾した後、ＤＥＰＣ処理水に溶解し、全ＲＮＡサンプルとした。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（ｓｕｐｅｒ）ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、メーカーの指示通り使用して、ｍＲＮＡを精製した。ｃＤＮＡはＢＤ  ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｓ社製）を用いて、合成された。
【０１７８】
（６）ＰＣＲ法による遺伝子の増幅
ＤＦＡ２２遺伝子をＰＣＲ法によって増幅するため、ＭＳ／ＭＳ解析で得られたアミノ酸配列（配列番号１：ＹＳＹＮＶＰＡＶ（ＬまたはＩ）ＰＮＬ（ＬまたはＩ）Ｋ、および配列番号２：Ｖ（ＬまたはＩ）ＧＤＤＧ（ＬまたはＩ）ＶＧ（ＬまたはＩ）Ｋ）と、D.farinaeのｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅを考慮して縮重プライマーを設計した。
【０１７９】
５’ＲＡＣＥ用は、Ｓｐｏｔ２２  Ｒ  ＬＬ（配列番号１４：ＴＴＩＡＲＲＣＡＤＣＣＮＡＣＩＡＲＤＣＣＲＴＣ）、Ｓｐｏｔ２２  Ｒ  ＬＩ（１５：ＴＴＩＡＲＲＣＡＤＣＣＩＡＣＤＡＴＤＣＣＲＴＣ）、Ｓｐｏｔ２２  Ｒ  ＩＬ（配列番号１６：ＴＴＤＡＴＲＣＡＤＣＣＩＡＣＩＡＲＤＣＣＲＴＣ）、Ｓｐｏｔ２２  Ｒ  ＩＩ（配列番号１７：ＴＴＤＡＴＲＣＡＤＣＣＩＡＣＤＡＴＤＣＣＲＴＣ）、Ｓｐｏｔ２２  Ｒ  ｎｅｓｔｅｄ（配列番号１８：ＡＣＮＡＩＤＣＣＲＴＣＲＴＣＤＣＣＮＡＩＩＡＣ）とし、３’ＲＡＣＥ用はＳｐｏｔ２２  Ｆ（配列番号１９：ＴＡＹＷＳＩＴＡＹＡＡＹＧＴＩＣＣＮＧＣＨＧ）、Ｓｐｏｔ２２  Ｆ  ｎｅｓｔｅｄ  ＬＬ（配列番号２０：ＣＣＩＧＣＨＧＴＨＹＴＮＣＣＩＡＡＹＹＴＩＡＡＲ）、Ｓｐｏｔ２２  Ｆ  ｎｅｓｔｅｄ  ＩＬ（配列番号２１：ＣＣＩＧＣＨＧＴＨＡＴＨＣＣＩＡＡＹＹＴＩＡＡＲ）、Ｓｐｏｔ２２  Ｆ  ｎｅｓｔｅｄ  ＬＩ（配列番号２２：ＣＣＩＧＣＨＧＴＨＹＴＩＣＣＩＡＡＹＡＴＨＡＡＲ）、Ｓｐｏｔ２２  Ｆ  ｎｅｓｔｅｄ  ＩＩ（配列番号２３：ＣＣＩＧＣＨＧＴＨＡＴＨＣＣＩＡＡＹＡＴＨＡＡＲ）とした。合成したｃＤＮＡをテンプレートとして用い、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９６００  （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、  Ｎｏｒｗａｌｋ、  ＣＴ、  ＵＳＡ）により増幅させた。
【０１８０】
反応液組成は以下の通りである。
５’ＲＡＣＥ：ＴａＫａＲａ  Ex  ｔａｑＴＭ  （５ｕｎｉｔｓ／μｌ）  ０．５μｌ、１０×ＥｘＴａｑＴＭ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  （２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ）  ４μｌ、Ｔｅｍｐｌｅｔｅ  ５’ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ２．５μｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ  （１０×）  ５μｌ、５’ＲＡＣＥ用  Ｐｒｉｍｅｒ  （１０μＭ）  １μｌ、ＭｉｌｌｉＱ  ３２μｌ。
３’ＲＡＣＥ：ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  ｔａｑＴＭ  （５  ｕｎｉｔｓ／μｌ）０．５μｌ、１０×Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  （２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）  ４μｌ、Ｔｅｍｐｌｅｔｅ  ３’ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ２．５μｌ、３’ＲＡＣＥ用  Ｐｒｉｍｅｒ  （１０μＭ）  １μｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ  （１０×）  ５μｌ、ＭｉｌｌｉＱ  ３２μｌ。
【０１８１】
反応条件は、９４℃×５ｍｉｎ、［９４℃×１ｍｉｎ、５２℃×３０ｓｅｃ、７２℃×５０ｓｅｃ］×３５ｃｙｃｌｅｓ、７２℃×７ｍｉｎとした。
【０１８２】
（７）ＰＣＲ産物のクローニング
ＰＣＲ産物の一部をとり、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  （１０ｎｇ／μｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）１μｌ、１０×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  １．５μｌ、Ｔ４リガーゼ（３Ｗｅｉｓｓ  ｕｎｉｔｓ／μｌ）１μｌを加えて１５℃で一晩インキュベートした。この溶液１５μｌにコンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α）１００μｌを加え、５分間氷冷後、４２℃で３０秒インキュベートし、直ちに氷上に戻し２分静置した。次に、ＳＯＣ培地を５００μｌ加え３７℃で１時間振盪培養した。この菌体懸濁液にあらかじめ１００ｍＭ  ＩＰＴＧ  ４０μｌ、２０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌ  ４０μｌをスプレッドしておいたＬＢプレート培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン）にまき、３７℃、１２時間培養した。形成されたコロニーをＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン）５ｍｌで３７℃、１２ｈｒ振盪培養し、得られた培養液からＲａｐｉｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＲＬＩＧＥＮ社）を用いてプラスミドを精製した。挿入断片の塩基配列をＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００−Ａｖａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて決定した。
【０１８３】
５’ＲＡＣＥと３’ＲＡＣＥから得られたオーバーラップした配列を全長遺伝子として取得するために、５’ＲＡＣＥ産物の末端配列（Ｓ２２  ａｌｌ  Ａｐａ  １  Ｆ（配列番号２４：ＧＴＣＧＧＧＣＣＣＡＣＧＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＧ））と３’ＲＡＣＥのアダプター配列（Ｓ２２  ａｌｌ  Ｓａｃ  １  Ｒ（配列番号２５：ＣＣＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣ））とをプライマーとし、３’ＲＡＣＥ用のｃＤＮＡをテンプレートとして全長遺伝子を取得した。ＰＣＲ産物をゲル抽出により精製し、ＡｐａＩ、ＳａｃＩで消化して、ｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒに挿入して、塩基配列を確認した。
【０１８４】
その結果、ＤＦＡ２２遺伝子は開始コドンと終止コドンを含み、そのｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅが５５４ｂｐからなる塩基配列であることが明らかになった（配列番号５）。また、この塩基配列を翻訳して得られる推定アミノ酸配列（配列番号３）はＭＳ／ＭＳ解析で得られた上記２配列（配列番号１および２で示されるアミノ酸配列）およびＭＳ解析で観察されたトリプシン消化断片の分子量と理論的に一致する配列を含んでいた（図２（Ｂ）、モノアイソトピックイオン分子量７５６．６３６１、８５１．５５２７、９７９．５２５６、１１７５．２７５０、１２４４．６６４０、１４７７．８１０６）。また、理論分子量１５５２４．９７および理論等電点５．４５はいずれも二次元電気泳動で観察されたものとほぼ同等であった。ただし、天然型タンパク質はシグナル配列などが切断除去されている可能性がある。なお、配列番号５に示される塩基配列の第６８〜４９９位までの塩基配列（すなわち開始コドンから終止コドンまでを含む塩基配列）を、ＤＦＡ２２をコードするポリヌクレオチドとして配列番号４に示した。
【０１８５】
またＤＦＡ２２のアミノ酸配列と、８種類のグループ２ダニアレルゲン（Pso_o_2、Lep_d_2、Gly_d_2.02、Gly_d_2.01、Tyr_p_2、Eur_m_2、Der_p_2、Der_f_2）のアミノ酸とを比較した結果を図５に示す。図５においてグループ２のダニアレルゲン（Pso_o_2、Lep_d_2、Gly_d_2.02、Gly_d_2.01、Tyr_p_2、Eur_m_2、Der_p_2、Der_f_2）のアミノ酸と、ＤＦＡ２２のアミノ酸とが完全に一致した箇所にはアスタリスク「＊」を記載した。またグループ２ダニアレルゲンに保存されている６つのＣｙｓ配列を四角囲みで示した。その結果、グループ２ダニアレルゲンに特徴的な６つのＣｙｓ残基の位置が一致していた。これらのアレルゲンはＭＬタンパク質と立体構造が類似していることが報告されている（Ｓ．  Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３７、  ２５５−２６３  （２００５））。ＤＦＡ２２と最も相同性が高いタンパク質はｓｈｅｅｐ  ｓｃａｂ  ｍｉｔｅ（Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ  ｏｖｉｓ）のＰｓｏ  ｏ  ２であり、６１．５％の相同性であった（図４参照のこと）。図４は、ＤＦＡ２２および従来公知のグループ２ダニアレルゲンの分類を示す系統樹である。
＜実施例３＞組み換えＤＦＡ２２タンパク質の発現
（８）大腸菌発現ベクターへのサブクローニング
ＤＦＡ２２を、大腸菌シャペロンの一種であるトリガーファクター（ＴＦ）融合タンパク質（Ｎ末端にＨｉｓ×６、ＴＦとＤＦＡ２２の間にｔｈｒｏｎｂｉｍ消化部位）として発現させるため、Ｓ２２  ＥＸＰ  Ｆ  Ｎｄｅ１（配列番号２６：ＡＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＣＡＡＡＴＴＴＴＴＧＴＧＣＡＴＣＴＴ）およびＳ２２  ＥＸＰ  Ｒ  Ｘｈｏ１（配列番号２７：ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＣＧＧＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＡＴ）の塩基配列からなる遺伝子組換え用のオリゴＤＮＡプライマーを作製した。上記プライマーを用いダニ由来ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅を行なった。ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＣｏｌｄ  ＴＦ  ＤＮＡベクター（タカラバイオ社製）に連結させた後に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳへトランスフォーメーションした。ＬＢプレート培地（１５μｇ／ｍｌカナマイシン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）上に生育した形質転換体をＬＢ液体培地（１５μｇ／ｍｌカナマイシン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）で３７℃にて培養し、ＯＤ６００＝０．５に達した時点で培養液を１５℃に冷却し、３０分間静置した。その後、終濃度１．０ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し１５℃で２４時間培養して、ＴＦ融合タンパク質として発現させた。
（９）銀染色による組換えＤＦＡ２２の検出
その後、菌体成分を破砕し遠心分離を行なった。その後、上清のみの試料と、上清にｔｈｒｏｍｂｉｎを加えた試料とをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、銀染色によってタンパク質を検出した。その結果を図３（Ａ）に示した。図３（Ａ）によれば、ＤＦＡ２２は可溶性画分に存在することが確認された。また、ｔｈｒｏｍｂｉｎによる酵素消化でＴＦ部分を切り離したところ、理論分子量約１６．２ｋＤ（Ｎ末端付加配列０．７３ｋＤを含む）に相当する組換えＤＦＡ２２の遊離確認された（図３（Ａ）レーン５矢印部参照）。
（１０）ウェスタンブロット法による組換えＤＦＡ２２、およびダニアレルギー性疾患患者血清ＩｇＥとの結合の検証
ＤＦＡ２２がダニアレルゲンタンパク質であるかを１次抗体にダニアレルギー性疾患患者血清ＩｇＥを用いて調べた。組み換えＤＦＡ２２タンパク質を発現誘導した後の菌体成分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、セミドライ式転写装置によって、ゲルよりＰＶＤＦ膜（メタノールに数秒浸した後、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／２０ｍＭグリシン／２０％メタノールで平衡化したもの）に転写した。ＰＶＤＦ膜は、ブロッキングバッファー（５％スキムミルク、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）中にて１時間室温で振とうした。患者血清を同溶液で３０倍に希釈したもので膜を４℃で一晩振とうした。その後の操作は、二次元電気泳動と同様の条件で行った。
【０１８６】
その結果を図３（Ｂ）に示した。図３（Ｂ）によれば、ＤＦＡ２２タンパク質はダニアレルギー性疾患患者血清ＩｇＥと結合することが明らかになり、ダニアレルゲンタンパク質であることが確認された（図３（Ｂ）レーン４、５、６およびレーン５矢印部参照）。
【産業上の利用可能性】
【０１８７】
本発明は、アレルギー性疾患を示す患者に対して高頻度に反応する新規ダニアレルゲンタンパク質およびその代表的な利用例を提供する。よって本発明は、ダニアレルギーの研究において奏効するものであるため、例えば、アレルギー治療薬や予防薬の開発や、アレルギー診断の分野において利用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】ダニ虫体抽出物を２次元電気泳動に供した後に、ダニ全タンパク質を銀染色法により検出を行なった結果を示す図である。
【図２】（Ａ）はＤＦＡ２２を質量分析に供した時のピークを示す図であり、（Ｂ）はＤＦＡ２２のトリプシン消化によって生じたペプチドの推定アミノ酸配列を示す図である。
【図３】（Ａ）はＤＦＡ２２を発現させた大腸菌の菌体破砕上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分画し、ゲル内のタンパク質を銀染色によって染色した結果を示す図であり、（Ｂ）はＤＦＡ２２とダニアレルギー性疾患患者血清ＩｇＥとの交差反応をウェスタンブロットによって調査した結果を示す図である。
【図４】ＤＦＡ２２および従来公知のグループ２ダニアレルゲンの分類を示す系統樹を示す図である。
【図５】ＤＦＡ２２のアミノ酸配列と、８種類のグループ２ダニアレルゲン（Pso_o_2、Lep_d_2、Gly_d_2.02、Gly_d_2.01、Tyr_p_2、Eur_m_2、Der_p_2、Der_f_2）のアミノ酸とを比較した結果を示す図である。
【図２】
2008035790.tif 000003
【図４】
2008035790.tif 000004
【図５】
2008035790.tif 000005
【図１】
2008035790.tif 000006
【図３】
2008035790.tif 000007
【配列表】
2008035790000001.app