(57)【要約】【課題】  納豆菌新規遺伝子である蛋白質分解酵素阻害蛋白遺伝子を分離すること、さらに既存の納豆菌や、該遺伝子を改良して、より優れた蛋白質分解酵素阻害活性を有する納豆菌又は枯草菌を含むバシラス属の細菌、又は大腸菌、又は酵母等を育種すること、さらにこれら微生物を用いて、蛋白質分解酵素阻害蛋白含有組成物を効率良く製造すること、さらに、システインプロテアーゼに起因する疾患の予防、又は治療に利用する方法を提供すること。【解決手段】  新規蛋白質分解酵素阻害蛋白、それをコードする遺伝子、当該遺伝子を組換えた形質転換体、当該蛋白質を含有する組成物の製造方法、並びに、システインプロテアーゼに起因する疾患の予防又は改善剤を提供するものである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（a）、（b）又は（c）に示す蛋白質。
（a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、且つ蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質。
（c）前記（a）又は（b）の蛋白質のアミノ酸配列の全部、又は一部と80％以上相同であるアミノ酸配列からなり、且つ蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードするDNA。
【請求項３】
下記の（a）、（b）、又は（c）に示すDNA。
（a）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むDNA。
（b）配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質をコードするDNA。
（c）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号1〜321の塩基配列からなるDNAの一部から作製したプローブとなりうる塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のDNAを含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターが導入され、蛋白質分解酵素阻害活性が増強された形質転換体。
【請求項６】
請求項２又は３に記載のDNA上流の転写活性が遺伝子組換え又は、突然変異誘導によって高められ、蛋白質分解酵素阻害活性が増強された形質転換体。
【請求項７】
形質転換体が、納豆菌（Bacillus subtilis natto）、及び枯草菌(Bacillus subtilis)を含むバシラス（Bacillus）属の細菌、大腸菌（Escherichia coli）、並びに酵母から選ばれた微生物であることを特徴とする請求項５又は６に記載の微生物。
【請求項８】
請求項７に記載の微生物の培養物であって、当該微生物が生産する蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質。
【請求項９】
請求項７に記載の微生物を培養し、培養物から蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする、蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質の製造方法。
【請求項１０】
納豆菌が生産する蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質を含有することを特徴とする蛋白質含有組成物。
【請求項１１】
納豆菌培養物を用いることを特徴とする請求項１０に記載の蛋白質含有組成物の製造方法。
【請求項１２】
請求項１又は８に記載の蛋白質、或いは請求項１０に記載の蛋白質含有組成物を有効成分として含有することを特徴とする、システインプロテアーゼに起因する疾患の予防又は改善剤。
【請求項１３】
システインプロテアーゼに起因する疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項１２に記載の予防又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質分解酵素阻害蛋白（システインプロテアーゼインヒビター）、及びその利用に関する。さらに詳細には、納豆菌に由来する蛋白質分解酵素（システインプロテアーゼ）阻害活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、また、既存の納豆菌や、新規蛋白質分解酵素阻害蛋白（システインプロテアーゼインヒビター）遺伝子の発現を増強した宿主細胞、特に納豆菌、枯草菌を含むバシラス属細菌、大腸菌、又は酵母、並びに、これらの微生物を用いて高濃度の蛋白質分解酵素阻害蛋白を効率良く製造する方法とその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆菌は、蒸煮大豆を発酵することで納豆を生産する能力を有し、古来より食用微生物としてその安全性が確認されている。
納豆は醗酵食品としての美味しさだけでなく、その生理活性機能や健康機能も同時に注目されている。
【０００３】
納豆の生理活性機能として、その抗菌作用が報告されている。例えば、納豆水抽出物のピロリ菌への抗菌作用（特許文献１）や、納豆菌が生産するジピコリン酸による抗菌作用の利用（非特許文献１）や、in vitroでSalmonella Enteritidis及び大腸菌O-157（Escherichia coli O-157）の増殖抑制、ニワトリ（in vivo）におけるCampylobacter及びClostridium perfringensの発育抑制（非特許文献２）が報告されている。
また、納豆の健康機能としては、食品の中でも特にビタミンK2を多く含むことが知られており、例えば、第４訂食品成分表によれば納豆中のビタミンK2量は納豆100gあたり864μg含まれているが、そのビタミンK2量をさらに増強させ、骨粗鬆症の予防として骨強化作用を期待した納豆菌とそのビタミンK2高含有納豆の報告（特許文献２）がある。
このように、従来納豆にはさまざまな生理活性機能や健康機能があることが知られていたが、それらをさらに増強させた納豆の開発が望まれていた。
【０００４】
一方、システインプロテアーゼ（Cysteine protease）は、チオールプロテアーゼとも称するSH基が活性中心に存在するプロテアーゼの総称である。植物由来システインプロテアーゼとしては、パパイン（Papain）、フィシン（Ficin）、ブロメライン（Bromelain）、キモパパイン（Chymopapain）、動物由来システインプロテアーゼとしては、カテプシンB（Cathepsin B）、カテプシンK（Cathepsin K）、カテプシンS（Cathepsin S）、カテプシンL（Cathepsin L）、カルパイン（Calpain）等が知られている。特にカテプシンLは破骨細胞において他のカテプシンよりも圧倒的に高活性であり、骨コラーゲンの分解に深く関わっている事が報告（非特許文献３）されており、特にこのカテプシンLを阻害することによって、骨粗鬆症予防・改善効果がさらに期待できる。
【０００５】
システインプロテアーゼインヒビターを利用することにより、骨粗鬆症の予防・治療や、抗菌作用などの効果が得られることが報告されている（例えば、特許文献３、特許文献４、特許文献５）。その他にもシステインプロテアーゼインヒビターの効果として、歯周病予防・治療剤（例えば、特許文献６、特許文献７）や、SARS coronavirusの感染予防（例えば、非特許文献４）や、デオドラント剤としての利用（例えば、特許文献８）などの報告がある。また、システインプロテアーゼが関与する疾患（例えば、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症、末梢神経のニューロパシー、白内障、炎症、アレルギー、劇症肝炎、高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、前立腺肥大症、癌の増殖、転移など）の予防・改善剤としても、システインプロテアーゼインヒビターの有効性が期待できる。
【０００６】
以上から、従来から知られている納豆菌による生理活性機能や健康機能について、それらをさらに増強するために、納豆菌由来の新規なシステインプロテアーゼインヒビターの発見が望まれていた。
【０００７】
【非特許文献１】酒井重男、食の科学、2001年、09月、第283巻、24-35頁
【非特許文献２】藤田昭二、鶏卵肉情報、1998年、08月、第28巻、第15号、76-78頁
【非特許文献３】Kakegawa Hら、FEBS レター（FEBS Letter）、1993年、04月、第321巻、第2-3号、247-250頁
【非特許文献４】Huang ICら、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリ（Journal of Biological Chemistry）、2006年、02月、第281巻、第6号、3198-3203頁
【特許文献１】特開2003-113098号公報
【特許文献２】特開2000-287676号公報
【特許文献３】特表2005-537326号公報
【特許文献４】特開2005-213260号公報
【特許文献５】特表2006-501143号公報
【特許文献６】特開2003-335648号公報
【特許文献７】特開2004-143127号公報
【特許文献８】特開2002-308749号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明では、新規なシステインプロテアーゼインヒビター遺伝子を分離することや、既存の納豆菌や、該遺伝子を改良して、より優れた蛋白質分解酵素阻害活性を有する納豆菌又は枯草菌を含むバシラス属の細菌、大腸菌、又は酵母等を育種することや、これら微生物を用いて、システインプロテアーゼインヒビター含有組成物を効率良く製造することや、システインプロテアーゼに起因する疾患の予防、又は治療に利用する方法を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
納豆菌の新規有効物質を見出すために、納豆菌が持つ遺伝子から推測する方法がある。納豆菌はそのほとんどの遺伝子が、類縁菌である枯草菌と相同であるため、納豆菌が有する機能もまた推定可能である。枯草菌のゲノム情報はデータベース（例えば、パスツール研究所 枯草菌データベース：http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/）を参照することができる。
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究する過程で、納豆菌のゲノム配列を解読し、枯草菌には存在しない、これまで未知の塩基配列情報を対象に相同性検索を行った結果、システインプロテアーゼインヒビターと相同性のある新規遺伝子を納豆菌ゲノム中に発見した。そして、該遺伝子によりコードされる蛋白質は、システインプロテアーゼ、その中でも特にカテプシンLに対して高い阻害活性を有することを見出し、係る知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は次の通りである。
（１）下記の（a）、（b）又は（c）に示す蛋白質。
（a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、且つ蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質。
（c）前記（a）又は（b）の蛋白質のアミノ酸配列の全部、又は一部と80％以上相同であるアミノ酸配列からなり、且つ蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質。
（２）請求項１記載の蛋白質をコードするDNA。
（３）下記の（a）、（b）、又は（c）に示すDNA。
（a）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むDNA。
（b）配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質をコードするDNA。
（c）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号1〜321の塩基配列からなるDNAの一部から作製したプローブとなりうる塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質をコードするDNA。
（４）（２）又は（３）に記載のDNAを含むベクター。
（５）（４）に記載のベクターが導入され、蛋白質分解酵素阻害活性が増強された形質転換体。
（６）（２）又は（３）に記載のDNA上流の転写活性が遺伝子組換え又は、突然変異誘導によって高められ、蛋白質分解酵素阻害活性が増強された形質転換体。
（７）形質転換体が、納豆菌（Bacillus subtilis natto）、及び枯草菌(Bacillus subtilis)を含むバシラス（Bacillus）属の細菌、大腸菌（Escherichia coli）、並びに酵母から選ばれた微生物であることを特徴とする（５）又は（６）に記載の微生物。
（８）（７）に記載の微生物の培養物であって、当該微生物が生産する蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質。
（９）（７）に記載の微生物を培養し、培養物から蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする、蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質の製造方法。
（１０）納豆菌が生産する蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質を含有することを特徴とする蛋白質含有組成物。
（１１）納豆菌培養物を用いることを特徴とする（１０）に記載の蛋白質含有組成物の製造方法。
（１２）（１）又は（８）に記載の蛋白質、或いは（１０）に記載の蛋白質含有組成物を有効成分として含有することを特徴とする、システインプロテアーゼに起因する疾患の予防又は改善剤。
（１３）システインプロテアーゼに起因する疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする（１２）に記載の予防又は改善剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、納豆菌由来の蛋白質分解酵素阻害機能を有する新規蛋白質が提供される。さらに、所定の微生物に対して、当該蛋白質分解酵素阻害活性を付与し、増強させることができる。さらに、遺伝子組換えや、突然変異誘導などによって育種された微生物を用いて蛋白質分解酵素阻害蛋白含有組成物を効率良く製造する方法が提供される。さらに、システインプロテアーゼに起因する疾患の予防、又は改善に利用する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
（１）納豆菌の蛋白質分解酵素（システインプロテアーゼ）阻害蛋白遺伝子の取得
本発明者らは、納豆菌から新規な蛋白質分解酵素阻害蛋白（システインプロテアーゼインヒビター）遺伝子を取得する方法について、鋭意研究を行った結果、納豆菌ゲノムを解読することで、これまで未知の納豆菌特異的な塩基配列を見出した。
【００１４】
該塩基配列情報からORFを抽出し、システインプロテアーゼインヒビターに相同なORFを取得した。このORFをベクターにライゲーションし、次いでこれを大腸菌又は、納豆菌などへ形質転換した。この形質転換株を用いて発現した蛋白が、システインプロテアーゼ阻害活性を有することを確認することで、目的のシステインプロテアーゼインヒビター遺伝子を納豆菌遺伝子から分離する方法を採った。
この方法によって、納豆菌における蛋白質分解酵素阻害蛋白（システインプロテアーゼインヒビター）をコードする遺伝子（以下、cprIと称する）の解明に初めて成功した。該遺伝子の全塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００１５】
CprI蛋白のアミノ酸配列（配列表の配列番号２参照）をBLAST検索した結果、シャガス病原菌〔Trypanosoma  cruzi〕由来のChagasin（相同性23%）や、赤痢アメーバ〔Entamoeba histolytica〕由来のamoebiasin（相同性32%）、トリパノゾーマ ブルセイ〔Trypanosoma brucei〕（相同性24%）、リーシュマニア メジャー〔Leishmania major〕（相同性24%）、リーシュマニア メキシカーナ〔Leishmania mexicana〕（相同性28%）等とホモロジーを見出せた。
【００１６】
ところが、どの相同性上位の候補も相同性が低く、さらに同属のバシラス属とは相同性があるものが確認できなかった。つまりCprIは、バシラス属細菌を含めて全く新規なシステインプロテアーゼインヒビターであると言える。
なお、アミノ酸配列から推定されるCprI蛋白の分子量は、約１２．５ｋＤａと推定された。
【００１７】
また、納豆菌ゲノム上では、以前に本発明者らが発見し出願したシステインプロテアーゼ（cprE）遺伝子（特願2005-323057号明細書）が、cprI遺伝子の上流に位置し、且つオペロンを形成していることが確認できた。このことから、CprI蛋白はCprEの機能調節に働くものと推察できた。
【００１８】
本発明者らは、cprI遺伝子を大腸菌発現用ベクターにクローニングした大腸菌形質転換株から精製したCprI蛋白は、各種蛋白質分解酵素（システインプロテアーゼ）に対して阻害活性があることを見出し、該遺伝子が納豆菌の蛋白質分解酵素（システインプロテアーゼ）阻害活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であることが確認され、本発明を完成するに至った。
【００１９】
（２）本発明の蛋白質
請求項1に記載の本発明の蛋白質は、下記の（a）、（b）又は（c）に示すものである。
（a）配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（b）配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、且つ蛋白質分解酵素（システインプロテアーゼ）活性を有する蛋白質。
（c）前記（a）又は（b）の蛋白質のアミノ酸配列の全部、又は一部と80％以上相同であるアミノ酸配列からなり、且つ蛋白質分解酵素阻害活性（システインプロテアーゼ）を有する蛋白質。
【００２０】
配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質CprIは、上記したように、既知のシステインプロテアーゼインヒビターのアミノ酸配列とある程度の相同性を有するものの、何れも低いことがわかった。さらに、同属であるバシラス属についての相同性は確認できなかったことから、この蛋白質はバシラス属細菌において全く新規な蛋白であると考えられる。
【００２１】
この蛋白質は、（a）配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質であってもよいが、（b）配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、且つ蛋白質分解酵素（システインプロテアーゼ）活性を有する蛋白質、或いは、（c）前記（a）又は（b）の蛋白質のアミノ酸配列の全部、又は一部と80％以上相同であるアミノ酸配列からなり、且つ蛋白質分解酵素阻害活性（システインプロテアーゼ）を有する蛋白質、即ち（a）の蛋白質と実質的に同一の蛋白質であってもよい。
【００２２】
かかる（b）及び（c）の蛋白質は、例えば部位特異的変異法によって、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列となるように塩基配列を改変することにより取得できる。また、従来より知られている突然変異処理によっても取得することができる。取得方法の詳細は、後述する。
【００２３】
（３）本発明のDNA
次に、本発明のDNAは、請求項1記載の蛋白質をコードするDNAであってもよく、或いは請求項3に記載の如く、下記の（a）、（b）、又は（c）に示すDNAであってもよい。
（a）配列表の配列番号1に記載の塩基配列を含むDNA。
（b）配列表の配列番号1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ蛋白質分解酵素（システインプロテアーゼ）阻害活性を有する蛋白質をコードするDNA。
（c）配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号1〜321の塩基配列からなるDNAの一部から作製したプローブとなりうる塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ蛋白質分解酵素（システインプロテアーゼ）阻害活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【００２４】
即ち、コードされる蛋白質の蛋白質分解酵素（システインプロテアーゼ）阻害活性が完全に損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加、或いは、逆位された蛋白質をコードするものであってもよい。
【００２５】
さらには、cprIと実質的に同一の蛋白質をコードするDNAは、例えば部位特異的変異法によって、特定のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加、或いは逆位となるように塩基配列を改変することによっても取得することができる。また、上記のような改変されたDNAは、従来より知られている突然変異処理によっても取得することができる。
【００２６】
尚、本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、配列表の配列番号1に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして、サザン・ハイブリダイゼーション法、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法等を利用することにより得られるものである。さらに詳細には、PCR法によって合成したDNAや、コロニー又はプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブレンを0.7〜1.0M 塩化ナトリウム存在下65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液（SSC溶液の組成は150mM 塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム）を用い65℃でメンブレンを洗浄することで同定できるポリヌクレオチドである。
【００２７】
ハイブリダイゼーションは、例えば、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、1992年、第2版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）」に記載の方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとしては、詳細には、配列表の配列番号1に示した塩基配列と相同性が60%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは99%以上のポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２８】
さらに、一般的に蛋白質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間で僅かに異なることが知られているので、実質的に同一の蛋白質をコードするDNAは、納豆菌の変異体、変種から得ることも可能である。
【００２９】
（４）cprI遺伝子を組換えた形質転換体の取得
次に、本発明の蛋白質分解酵素（システインプロテアーゼ）阻害活性が増強された形質転換体の取得方法について説明する。
cprI遺伝子を高発現させる宿主としては、納豆菌や枯草菌を含めたバシラス属細菌、又は大腸菌、又は酵母など酵素生産に一般的に用いる宿主を親株とすることができる。例えば、納豆菌MIZ1（Bacillus subtilis natto MIZ1）株（以下、MIZ1株と称する場合もある）を用いることができる。本菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はFERM ABP-10437である。
【００３０】
プラスミドベクターとしては、各宿主細胞で複製可能であるプラスミドであれば利用可能である。例えば、納豆菌を宿主とした場合ではpWH1520｛モビテック（Mo Bi Tec）製｝を用いることができる。pWH1520は大腸菌とバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）とのシャトルベクターであり、大腸菌ではアンピシリン(ampicilline)耐性マーカーを利用し、枯草菌などのバシラス属細菌ではテトラサイクリン（tetracycline）耐性マーカーを利用することができる。さらに、マルチクローニングサイトの上流にはXylose isomerase（XylA）の転写領域と、Xylose-dependent repressor（XylR）がクローニングされている。通常培養条件では、XylRによってxylAの転写が阻害されているが、キシロース（Xylose）存在下では、XylRの調節機構が外れ、XylAプロモーターの転写が誘導される。この転写機構を利用して、目的遺伝子の発現を厳密にコントロール、且つ強力に発現誘導させることができる。
【００３１】
即ち、MIZ1株を宿主として、pWH1520のマルチクローニングサイトにcprI遺伝子を転写調節領域と同方向に挿入したプラスミドベクターを保持させた遺伝子組換え株を利用することができる。
その他にも、枯草菌などのバシラス属細菌と大腸菌のシャトルベクターであるpHY300PLK（タカラバイオ製）や、枯草菌多コピーベクターpUB110も同様に利用可能である。
【００３２】
大腸菌を宿主とした場合では、例えば、大腸菌BL21株（タカラバイオ製）を宿主として、pCold TF DNAベクター（タカラバイオ製）などが利用可能である。pCold TF DNAベクターは、マルチクローニングサイトに挿入した遺伝子をHisタグを付加した状態でコールドショックにより発現誘導できるベクターである。該ベクターのマルチクローニングサイトにcprI遺伝子を転写調節領域と同方向に挿入したプラスミドベクターを保持させた遺伝子組換え株を利用することができる。
【００３３】
上記のような、遺伝子組換え法による目的遺伝子の高発現株の取得だけでなく、突然変異の誘導による高発現株の取得もまた利用可能である。該方法については、親株を薬剤処理またはUV照射などにより突然変異を誘導させ、スクリーニングを効率化することができる。
【００３４】
薬剤処理法として、例えばニトロソグアニジンを使用する方法がある。即ち、5mlのLB培地に納豆菌を植菌し、37℃で一晩培養させ、その培養液の2%を100mlのLB培地に植菌し3時間培養する。続いて集菌し、50mM Tris-HCl buffer (pH7.0)で2回洗浄する。その後、50mM Tris-HCl buffer (pH7.0) 4mlで懸濁し、終濃度200μg/mlのニトロソグアニジン溶液を添加し、30℃で1時間処理する。続いて集菌し、50mM Tris-HCl buffer(pH7.0)5ml及びLB培地5mlでそれぞれ2回ずつ洗浄し、最後にLB培地5mlを添加し37℃で3時間培養させ、適量をスクリーニング培地に植菌し、目的遺伝子の高発現株を取得する。
【００３５】
また、培養条件、培地の種類及びその他の遺伝子組換え技術は、バシラス属細菌に用いる一般的な方法を用いることができ、例えば、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、1992年、第2版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ・プレス・ニューヨーク（Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY）」などが参考になる。
【００３６】
（５）本発明の蛋白質CprIおよびそれを含有する組成物
上記のようにして取得される形質転換体によって、CprI蛋白は親株よりも多く生産される。したがって、本発明により得られた蛋白質分解酵素（システインプロテアーゼ）阻害活性が増強された形質転換体の培養菌体を破砕することにより、蛋白質分解酵素阻害蛋白（システインプロテアーゼインヒビター）含有組成物を得ることができる。
詳細には、たとえば適当な栄養合成培地にて20〜45℃で形質転換体を培養して、その培養物から遠心分離などにより菌体を回収したのち、フレンチプレス細胞破砕機やビーズ式細胞破砕機、超音波細胞破砕機などを使用して細胞を破砕（ホモジナイズ）することにより、該蛋白質含有組成物を取得できる。さらに好ましくは、LB培地（表1参照）にて37℃で培養した菌体を回収して、フレンチプレス細胞破砕機により菌体を破砕し、その遠心上清から蛋白質分解酵素蛋白（システインプロテアーゼインヒビター）含有組成物を取得できる。
一方、形質転換体の細胞外にCprIが漏洩される場合は、培養液をそのまま蛋白質分解酵素阻害活性を有する蛋白質含有組成物とすることができる。
【００３７】
また、形質転換されていない納豆菌でも、上記と同様に培養することによって、細胞内にCprI蛋白を蓄積させることができる。したがって、上記の方法で培養物を破砕することによって、CprI蛋白含有組成物を得ることができる。
【００３８】
このときの培地容量を増加させて、納豆菌などの微生物菌体量を高濃度で得ることもできる。工業的にシステインプロテアーゼインヒビター含有組成物を生産する場合、数L〜数kL又は、それ以上の容量で培養することで、高濃度の蛋白を得ることができる。
【００３９】
このようにして得られた蛋白質CprIまたはそれを含有する組成物は、蛋白質分解酵素（システインプロテアーゼ）阻害剤として、デオドラントなどの化粧品分野、病原菌殺菌剤としての農業分野などで利用可能である。
これらの商品形態としてはクリーム、スプレー、錠剤、歯磨き粉などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの製造にあたっては、賦形剤、増量剤、増粘剤、酸化防止剤、安定化剤など通常用いられる添加物を使用することができる。
【００４０】
また、当該蛋白質又はそれを含有する組成物は、骨粗鬆症、歯周病、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症、末梢神経のニューロパシー、白内障、炎症、アレルギー、劇症肝炎、高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、前立腺肥大症、癌の増殖、転移などのシステインプロテアーゼに起因する疾患の予防・改善剤としても利用可能である。
これらの剤形としては、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤、液剤等とすることができる。製剤化にあたっては、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、表面活性剤等の賦形剤ないしは希釈剤などを使用することができる。
【００４１】
このようにして得られるシステインプロテアーゼに起因する疾患の予防・改善剤の投与量は、当該製剤の投与方法、投与形態、投与する患者の症状に応じて適宜選択される。一般には、CprI蛋白量としての一日成人一人当たり、1〜20,000mg、特に200〜1,000mg程度となる範囲で投与するのが好ましい。なお、当該投与は一日３〜４回に分割して行なっても良い。
【００４２】
その他にも、蛋白質分解酵素（システインプロテアーゼ）阻害活性が増強された株を用いて醗酵させた納豆などの食品としての形態もまた利用可能である。
【実施例】
【００４３】
以下に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００４４】
実施例１（大腸菌cprI発現株の作製）
（1）基本条件
cprI遺伝子を高発現させる宿主として大腸菌BL21株を用い、これにcprI遺伝子をpCold TF DNAベクターにクローニングしたものを保持した遺伝子組換え株を利用した。
尚、特に記載しない限り、培養条件、培地及びその他の遺伝子組換え技術は、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、2版（1992）、Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY」の記載に従った。また、基本的な培養は、以下の表1に示す組成のLB培地を用いて行った。
【００４５】
【表１】
2008035786.tif 000002
【００４６】
納豆菌の染色体DNAは、市販のキットを使用して調製した。さらに、PCRによるDNA断片の増幅には、Ex Taq（タカラバイオ製）を使用し、反応条件は、Ex Taqに添付のマニュアルに従った。
大腸菌の形質転換等は、大腸菌BL21株コンピテントセル（タカラバイオ製）に添付のマニュアルに従った。
【００４７】
（2）ベクター構築
ベクター構築に用いた各DNA断片の作製概略を以下に示した。
MIZ1株のcprI遺伝子の増幅には、SalIサイトを付加したプライマー1（配列表の配列番号3に記載）及びPstIサイトを付加したプライマー2（配列表の配列番号4に記載）を使用した。
それぞれのプライマーは、cprI遺伝子領域をDNA Sequencer(ABI PRISM 3700 DNA Analyzer:PE Applied Biosystems製)を用いて塩基配列を決定し、設計したものをシグマ・アルドリッチ・ジャパン社にて受注合成した。
まず、MIZ1株の全DNAを鋳型にし、プライマー1（配列表の配列番号3に記載）及びプライマー2（配列表の配列番号4に記載）を用いてcprI遺伝子を増幅した（DNA断片1）（図1参照）。
続いて、上記DNA断片をベクターに挿入したが、その概略は図2に示した。即ち、DNA断片1をSalＩ及びPstIで処理した。得られたDNA断片１をpCold TF DNAのマルチクローニングサイト上のSalI及びPstIサイトに導入し、プラスミドpCold-cprIを保持した大腸菌BL21株を得た（図2参照）（以降、BL21-cprI株と称する場合もある）。そのプラスミドDNAとpCold-cprIが同じであることが、分子量及び、塩基配列を決定することで確認された。
【００４８】
実施例２（大腸菌cprI発現株（BL21-cprI株）からのCprI蛋白の精製）
（1）CprI蛋白の抽出
BL21-cprI株のシステインプロテアーゼ阻害活性の測定は、以下の方法に従った。即ち、BL21-cprI株を100mlのLB液体培地入りの坂口フラスコで培養し、濁度を分光光度計で測定した（OD660は波長660nmでの濁度、A520は波長520nmでの吸光度を意味する）。
OD660≒0.05、37℃で振とう培養を開始し、4時間後に15℃に冷却し、30分間静置した。その後、15℃で振とう培養をすることでCprIの発現を誘導させ、さらに24時間培養を続けた後に集菌した菌体を、50mlの10mM リン酸Na(pH7.0)溶液で2回洗浄した。
その後、10mlの10mM リン酸Na(pH7.0)溶液に懸濁し、フレンチプレス細胞破砕機で菌体を破砕した。5000rpm、10分間で残渣（debris）を取り除き、さらに40000rpm、30分間で細胞壁画分を取り除いた上清を、粗蛋白溶液とした。
【００４９】
（2）CprI蛋白の精製
得られた粗蛋白溶液は、Ni-NTAカラム（Ni-NTA Spin Kit : キアゲン製）を用いて精製し、適宜、脱塩・濃縮操作をした後、等量の100％グリセロールを添加し、CprI蛋白溶液とした。
【００５０】
（3）CprI蛋白の分子量
（2）で精製したCprI蛋白を、5〜20%SDSポリアクリルアミドゲル（アトー製）を用いて、プロテインマーカーPageRuler Prestained Protein Ladder（ペイジルーラー  プレステインド  プロテイン  ラダー：ファーメンタス製）と共に電気泳動を行った。泳動後、Simply Blue SafeStain（シンプリーブルーセイフステイン：インビトロジェン製）で染色を行った。
結果は図３に示す通りであり、CprI蛋白は約70kDaであることが判った。但し、TFタグ、Hisタグなどとの融合蛋白であるため、CprI自身のSDS-PAGEでの分子量は約１８kDaであると推定される。プロテインマーカーの分子量は、上から170、130、100、72、55、40、33、24、17、11kDaの順である。
【００５１】
参考例（納豆菌cprE発現株の作製及びシステインプロテアーゼの取得）
納豆菌のシステインプロテアーゼ高発現株を構築し、システインプロテアーゼ酵素を取得した。
（1）基本条件
本発明者らによる特願2005-323057号明細書に記載された、納豆菌由来のシステインプロテアーゼ（CprE）をコードする遺伝子cprEを高発現させる親株として、納豆菌MIZ1株を用いた。プラスミドベクターとして、pWH1520を用いた。
【００５２】
（2）ベクター構築
ベクター構築に用いた各DNA断片の作製概略を以下に示した。
なお、MIZ1株のcprE遺伝子の増幅には、SpeIサイトを付加したプライマー3（配列表の配列番号5に記載）及びSmaIサイトを付加したプライマー4（配列表の配列番号6に記載）を使用した。
まず、MIZ1株の全DNAを鋳型にし、プライマー3（配列表の配列番号5に記載）及びプライマー4（配列表の配列番号6に記載）を用いてcprE遺伝子を増幅した（DNA断片2）（図4参照）。
続いて、上記DNA断片をベクターに挿入したが、その概略は図5に示した。即ち、DNA断片2をSpeI及びSmaIで処理した。得られたDNA断片２を、pWH1520のマルチクローニングサイト上のSpeI及びSmaIサイトに導入し、プラスミドpWH-cprEを得た（図5参照）。
【００５３】
（3）形質転換
プラスミドpWH-cprEのプラスミドDNAをDonor DNAとして、MIZ1株へ形質転換した。形質転換株の選抜は、テトラサイクリン（tetracycline）10μg/mlを添加したLB培地で37℃、18時間培養することにより行った。得られた形質転換株バシラス・サチリスcprE1（Bacillus subtilis cprE1）株（以下、cprE1株と称する場合もある）は、そのプラスミドDNAとpWH-cprEが同じであることが、分子量及び、塩基配列を決定することで確認された。
【００５４】
（4）納豆菌由来システインプロテアーゼCprEの取得
Bacillus subtilis cprE1株を100mlのLB液体培地入りの坂口フラスコで培養し、濁度を分光光度計で測定した（OD660は波長660nmでの濁度、A520は波長520nmでの吸光度を意味する）。OD660≒0.05、37℃で振とう培養を開始し、OD660≒0.5で終濃度2%のキシロースを添加し、さらにOD660≒2.0まで培養を続けた後に集菌した菌体を、50mlの10mM リン酸Na(pH7.0)溶液で2回洗浄した。
その後、5mlの10mM リン酸Na(pH7.0)溶液に懸濁し、フレンチプレス細胞破砕機で菌体を破砕した。5000rpm、10分間で残渣（debris）を取り除き、さらに40000rpm、30分間で細胞壁画分を取り除いた上清を、CprE粗蛋白溶液とした。
【００５５】
実施例３（精製CprI蛋白のシステインプロテアーゼ阻害活性）
（1）納豆菌由来システインプロテアーゼCprEへの阻害活性
100mM Tris-HCl buffer (pH7.0)溶液に、1%(w/w) AZOCOLL Substrate（カルビオケム（CALBIOCHEM）製）、10mM L-システイン、2mM PMSF（Phenylmethylsulfonyl Fluoride）、2mM EDTA（Ethylenediamine Tetraacetic Acid）（全て終濃度）を添加し、AZOCOLL基質溶液とした。700μl AZOCOLL基質溶液と、終濃度100μg/ml CprE粗蛋白溶液（参考例の(4)で調製したもの）、実施例２の（2）で調製した適量のCprI蛋白溶液を混合し、さらに100mM Tris-HCl buffer (pH7.0)を加えて1mlに調整した。得られた混合溶液を、37℃で30分間インキュベートし、遠心して得た上清をA520で測定した。
このようにして、CprI蛋白溶液各濃度のシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した結果を図6に示す。何れもCprI蛋白溶液を添加しないサンプルの酵素活性を100%として比較した。
その結果、IC５０（50％阻害濃度）＝0.03μMとなり、CprIがシステインプロテアーゼCprEの活性を著しく阻害することが分かった。
【００５６】
（2）パパイン、及びフィシンへの阻害活性
100mM Tris-HCl buffer (pH7.0)溶液に、1%(w/w) AZOCOLL Substrate、10mM L-システイン（全て終濃度）を添加し、AZOCOLL基質溶液とした。700μlAZOCOLL基質溶液と、10μl 酵素液{1Uパパイン（Papain:シグマ製）、又は67mUフィシン（Ficin:シグマ製）}、実施例２の（2）で精製した適量のCprI蛋白溶液を混合し、さらに100mM Tris-HCl buffer (pH7.0)を加えて1mlに調整した。得られた混合溶液を、37℃で30分間インキュベートし、遠心して得た上清をA520で測定した。
このようにして、CprI蛋白溶液各濃度のシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した結果を図7（パパイン）、図8（フィシン）に示す。何れもCprI蛋白溶液を添加しないサンプルの酵素活性を100%として比較した。
その結果、パパインに対するIC５０＝120.55μM、フィシンに対するIC５０＝11.19μMとなり、CprIがこれらの酵素の活性を阻害することが分かった。
【００５７】
（3）カテプシンへの阻害活性
DMSOを溶媒とした400μM Z-Phe-Arg-MCA・HCl（ペプチド研究所製）を基質溶液とし、340mM 酢酸ナトリウム／60mM 酢酸／4mM disodium EDTA／8mM Dithiothreitol (pH5.5)（全て終濃度）を緩衝溶液とした。各々適量の酵素に実施例２の（2）で精製した適量のCprI蛋白溶液を添加し、0.1% Brij（カルビオケム（CALBIOCHEM）製）で500μlに調整した酵素溶液と、上記緩衝溶液250μlとの混合溶液を１分間プレインキュベートした。その後、250μlの基質溶液を添加して30℃で10分間反応を行った後、0.2mM E-64（ペプチド研究所製）を添加することにより反応を停止し、続いて、分光蛍光光度計（RF-5300：島津製作所製）により波長を測定（励起370nm、蛍光460nm）した。
なお酵素は、1mU/mlカテプシンL｛バイオモル（BIOMOL）製｝、24mU/mlカテプシンS｛カルビオケム（CALBIOCHEM）製｝、1.6mU/mlカテプシンK｛カルビオケム（CALBIOCHEM）製｝、1mU/mlカテプシンB｛バイオモル（BIOMOL）製｝の4種を使用した。
CprI蛋白溶液各濃度のシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した結果を図9（カテプシンL）、図10（カテプシンS）、図11（カテプシンK）、図12（カテプシンB）に示す。何れもCprI蛋白溶液を添加しないサンプルの酵素活性を100%として比較した。
その結果、カテプシンLに対するIC５０＝0.71μM、カテプシンSに対するIC５０＝59.12μM、カテプシンKに対するIC５０＝38.38μM、カテプシンBに対するIC５０＝59.24μMであった。以上から、CprI蛋白は各カテプシンに対して一様に阻害活性を有し、特にカテプシンLには非常に強い（他カテプシンの100倍程度）阻害活性を有することが分かった。
【００５８】
実施例４（納豆菌CprI発現株の作成）
（1）基本条件
納豆菌を宿主として、ベクターpWH1520にcprI遺伝子をクローニングしたベクターを保持させた株を構築した。
【００５９】
（2）ベクター構築
ベクター構築に用いた各DNA断片の作製概略を以下に示した。
なお、MIZ1株のcprI遺伝子の増幅にはSpeIサイトを付加したプライマー5（配列表の配列番号７に記載）及びSmaIサイトを付加したプライマー6（配列表の配列番号８に記載）を使用した。
まず、MIZ1株の全DNAを鋳型にし、プライマー5（配列表の配列番号７に記載）及びプライマー6（配列表の配列番号８に記載）を用いてcprI遺伝子を増幅した（DNA断片3）（図１３参照）。
続いて、上記DNA断片をベクターに挿入したが、その概略は図１４に示した。即ち、DNA断片3をSpeＩ及びSmaIで処理した。得られたDNA断片３を、pWH1520のクローニングサイトのSpeI及びSmaIサイトに導入し、宿主が納豆菌MIZ1株であり、プラスミドpWH-cprIを保持した組換え株を得た（図１４参照）（以降、MIZ2株と称する場合もある）。本菌は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はFERM ABP-10644である。
該株が保持するプラスミドDNAとpWH-cprIが同じであることが分子量及び、塩基配列を決定することで確認された。
【００６０】
（3）MIZ2株の粗蛋白溶液の抽出
MIZ2株を100mlのLB液体培地入りの坂口フラスコで培養し、濁度を分光光度計で測定した（OD660は波長660nmでの濁度、A520は波長520nmでの吸光度を意味する）。OD660≒0.05、37℃で振とう培養（500rpm）を開始し、OD660≒0.5で終濃度2%のキシロースを添加し、さらにOD660≒2.0まで培養を続けた後に集菌した菌体を、50mlの10mM リン酸Na(pH7.0)溶液で2回洗浄した。
その後、5mlの10mM リン酸Na(pH7.0)溶液に懸濁し、フレンチプレス細胞破砕機で菌体を破砕した。5000rpm、10分間の遠心分離で残渣（debris）を取り除き、さらに40000rpm、30分間の遠心分離で細胞壁画分を取り除いた上清を、MIZ2株粗蛋白溶液とした。このMIZ2株粗蛋白溶液には、CprI蛋白が含まれていると推定される。
なお、MIZ2株の代わりにMIZ1株を用いたこと以外は上記と同様にして、MIZ1株粗蛋白溶液を得た。
【００６１】
（4）MIZ2株粗蛋白溶液のシステインプロテアーゼ阻害活性
100mM Tris-HCl buffer (pH7.0)溶液に、1%(w/w) AZOCOLL Substrate（カルビオケム（CALBIOCHEM）製）、10mM L-システイン、2mM PMSF（Phenylmethylsulfonyl Fluoride）、2mM EDTA（Ethylenediamine Tetraacetic Acid）（全て終濃度）を添加し、AZOCOLL基質溶液とした。700μl AZOCOLL基質溶液と、終濃度100μg/ml CprE粗蛋白溶液（参考例の（4）で調製したもの）、（3）で調製した適量のMIZ2株粗蛋白溶液もしくはMIZ1株粗蛋白溶液を混合し、さらに100mM Tris-HCl buffer (pH7.0)を加えて1mlに調整した。得られた混合溶液を、37℃で30分間インキュベートし、遠心して得た上清をA520で測定した。
このようにして、MIZ1株粗蛋白溶液のシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した結果、250μl（1.25mg蛋白）まで酵素活性は100%残存したままであり、阻害活性は認められなかった。
一方、MIZ2株粗蛋白溶液のシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した結果を図15に示す。何れもMIZ2株粗蛋白溶液を添加しないサンプルの酵素活性を100%として比較した。CprEに対するIC５０＝552.56μgであった。
【００６２】
（実施例５）蛋白生産
MIZ2株由来のシステインプロテアーゼインヒビターを大量に生産するために、ミニジャー（三ツワ理化学工業製；KMJ−5A）を用いて、1LのLB培地で回転数を500r.p.m.に設定して37℃で培養した後、遠心分離することで菌体を取得した。
その結果、システインプロテアーゼインヒビター含有組成物を約200mg得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】実施例１のDNA断片作製の概略図である。
【図２】実施例１で構築したベクターを示す図である。
【図３】実施例２のSDS-PAGE電気泳動結果を示す図である。
【図４】実施例３のDNA断片作製の概略図である。
【図５】実施例３で構築したベクターを示す図である。
【図６】CprE酵素活性の残存率とCprI蛋白量（μM）との関係を示す図である。
【図７】パパイン酵素活性の残存率とCprI蛋白量（μM）との関係を示す図である。
【図８】フィシン酵素活性の残存率とCprI蛋白量（μM）との関係を示す図である。
【図９】カテプシンL酵素活性の残存率とCprI蛋白量（μM）との関係を示す図である。
【図１０】カテプシンS酵素活性の残存率とCprI蛋白量（μM）との関係を示す図である。
【図１１】カテプシンK酵素活性の残存率とCprI蛋白量（μM）との関係を示す図である。
【図１２】カテプシンB酵素活性の残存率とCprI蛋白量（μM）との関係を示す図である。
【図１３】実施例４のDNA断片作製の概略図である。
【図１４】実施例４で構築したベクターを示す図である。
【図１５】CprE酵素活性の残存率とMIZ2株粗蛋白溶液（μg）との関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図３】
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【配列表】
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