(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸を高感度に検出することができる新規な検出方法等を提供する。【解決手段】カチオン性基及びπ共役系平面構造を同一分子上に有する有機化合物（カチオン性有機化合物と略す）が核酸２重鎖構造上に結合したときには隣り合うカチオン性有機化合物分子間に相互作用が生じ、その相互作用によりカチオン性有機化合物の核酸２重鎖構造上への結合と解離が平衡関係から結合安定状態へ偏ることにより、カチオン性有機化合物が核酸２重鎖と結合した状態を保った状態で固体表面上へ取り出すことを可能にし、形態測定あるいは導電性測定による核酸２重鎖の特異的検出方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を検出する方法であって、
核酸２重鎖と、カチオン性基及びπ共役系平面構造を同一分子上に有する有機化合物とを結合させる結合工程と；
前記結合工程によって得られた結合体を固体表面に固定化させる固定化工程と；
前記結合工程に用いられた溶媒を除去する抽出工程と；
前記固定化工程によって得られた固定化物の検出を行う工程と；
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記検出を行う工程が、電気的計測を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出を行う工程が、形態計測を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記検出を行う工程が、走査プローブ顕微鏡による計測を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記固定化工程が、前記結合工程によって得られた結合体を１対以上の電極対を有する電極基板上に配置することを含み、それにより、前記固定化工程と前記検出工程の電気的計測とが同時に行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記結合体が、Ｊ会合体を形成している、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記カチオン性基及びπ共役系平面構造を同一分子上に有する有機化合物が、下記一般式（Ｉ）：
Ｘ−（Ｙ−Ｚ）ｎ        （Ｉ）
（式中、ｎは１〜１２、Ｘは少なくとも４つのピロール環を有する部位、Ｙは連結基或いはＸとＺの間の直接結合、Ｚはカチオン性基である）
を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記カチオン性基及びπ共役系平面構造を同一分子上に有する有機化合物が、π共役系平面構造として分子構造上にポルフィリン又はポルフィリン誘導体のいずれかを有する化合物である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
試料中の標的核酸に核酸プローブをハイブリダイズさせて核酸２重鎖を形成させるハイブリダイゼーション工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
核酸を検出する装置であって、
核酸２重鎖とカチオン性基及びπ共役系平面構造を同一分子上に有する有機化合物とを結合させる反応部と；
前記結合手段によって得られた結合体を固定化させる固定化基板と；
前記固定化基板に固定化された固定化物を検出する検出器と；
を含んでなる、核酸検出装置。
【請求項１１】
前記検出器が、電気的計測によるものである、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記検出器が、形態計測によるものである、請求項１０に記載の装置。
【請求項１３】
前記検出器が、走査プローブ顕微鏡である、請求項１０に記載のいずれかの装置。
【請求項１４】
前記固定化基板が、１対以上の電極対を有する電極基板である、請求項１１に記載の装置。
【請求項１５】
前記電極基板の電極対をなす２つの電極間の距離が１ナノメートル〜１マイクロメートルである、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記電極基板の電極対が傾斜蒸着法により形成されている、請求項１４又は１５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのハイブリッド形成体のような核酸２重鎖を検出する手法に関し、特にπ共役系平面構造を有する有機化合物を使用して核酸２重鎖の剛直性または導電性を高めて形態的または電気的に検出する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子解析は、遺伝子の変異解析、一塩基多型、遺伝子発現頻度解析などに利用されており、医療分野における臨床診断、創薬、薬理ジェノミックス、法医学、生物学に限らず、考古学、環境化学の研究などにおいても用いられるようになっている。
【０００３】
従来、ハイブリダイゼーション法に基づく遺伝子解析においては、標的核酸と配列の相補的なプローブ核酸とを相互作用させ、標的核酸を抽出し、標的核酸の有無、あるいは存在量を解析しているが、多くの場合、標的核酸の量は極めて少ないため、数分子から数千分子レベルでの検出を可能にする高感度な分析法が必要である。
【０００４】
核酸２重鎖を簡易且つ迅速に検出する方法として、蛍光性のインターカレータを用いる検出法や、カチオン性色素化合物を用いる方法がある。
【０００５】
しかしながら、ハイブリッドした塩基対に挿入するインターカレータを用いる方法は、次のような課題を有する。インターカレータの塩基対に対する挿入比率には限界があり、インターカレータの増加による感度の向上が難しい。また、インターカレータの挿入比率は塩基対の配列パターンに影響するため定量性が低い。さらに、水溶液中でのインターカレータのハイブリッド複合体（核酸２重鎖）への挿入と脱離とは平衡関係にあるため、試料中の脱離状態のインターカレータ及び１重鎖核酸と結合したインターカレータが存在し、これらが蛍光測定時のバックグラウンドノイズになることによって核酸２重鎖検出のS/Nが低くなることなどの検出特性への影響がある。
【０００６】
これらの課題に対して、検出特性の向上について研究開発がなされている（特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００７】
また、インターカレータではなく、塩基対上のリン酸基と結合するカチオン性色素化合物を用いる検出方法が提案されている（特許文献３参照）。カチオン性色素化合物は、らせん状の２重鎖を形成している塩基対上の全てのリン酸基に結合可能であること、脱離状態のカチオン性色素や１重鎖核酸と結合したカチオン性色素化合物との識別が容易であることから、インターカレータを用いる前記の検出方法よりも簡易、迅速且つ高感度な検出が可能である。
【特許文献１】特開２００１−１３１４７号公報
【特許文献２】特開２００６−１５３６３９号公報
【特許文献３】特表２００７−５０４４５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
インターカレータやカチオン性色素化合物を用いる従来の標的核酸の検出方法は、いずれも、水溶液中でハイブリダイゼーションした部分（核酸２重鎖）と結合した色素を分光学的に計測することに基づく検出方法である。上述のように、低濃度領域での標的核酸の検出特性の改善が進められているものの、従来技術においては水溶液中での検出であるため、標的核酸の少量化及び低濃度化への対応は限界に近づいていると考えられる。
【０００９】
本発明は、上記の課題の解決を目的とするものであり、核酸プローブとそれに相補的な標的核酸とのハイブリットのような核酸２重鎖を簡易、迅速且つ高感度に検出するために、先に本発明者らが開発したカチオン性色素化合物（特許文献３）を応用して、水溶液中での検出によらず、核酸２重鎖構造を固体表面に取り出して検出する新規な検出方法及び装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、カチオン性基及びπ共役系平面構造を同一分子上に有する本発明の有機化合物は、核酸２重鎖と結合すると、極めて安定な結合体を形成し、その状態を保ったままで固体表面上へ取り出すことが可能であるため、固体表面上での核酸２重鎖の高精度の特異的検出が可能になることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
本発明は、核酸を検出する方法であって：核酸２重鎖と、カチオン性基及びπ共役系平面構造を同一分子上に有する有機化合物とを結合させる結合工程と；前記結合工程によって得られた結合体を固体表面に固定化させる固定化工程と；前記結合工程に用いられた溶媒を除去する抽出工程と；前記固定化工程によって得られた固定化物の検出を行う工程と；を含んでなる方法を提供する。
【００１２】
本発明の１つの態様において、検出工程は、電気的計測及び／又は形態計測を含むことができる。また、本発明の１つの態様において、本発明の検出工程は、走査プローブ顕微鏡による計測を行うことを含む。
【００１３】
また、本発明の１つの態様において、前記固定化工程は、前記結合工程によって得られた結合体を１対以上の電極対を有する電極基板上に配置することを含み、それにより、前記固定化工程と前記検出工程の電気的計測とが同時に行われる。
【００１４】
また、本発明の１つの態様において、前記結合体はＪ会合体を形成する。
【００１５】
また、本発明の１つの態様において、前記カチオン性基及びπ共役系平面構造を同一分子上に有する有機化合物は、下記一般式（Ｉ）：
Ｘ−（Ｙ−Ｚ）ｎ        （Ｉ）
（式中、ｎは１〜１２、Ｘは少なくとも４つのピロール環を有する部位、Ｙは連結基或いはＸとＺの間の直接結合、Ｚはカチオン性基である）
を有する。さらに、１つの態様において、カチオン性基及びπ共役系平面構造を同一分子上に有する本発明の有機化合物は、π共役系平面構造として分子構造上にポルフィリン又はポルフィリン誘導体のいずれかを有する。
【００１６】
また、１つの態様において、本発明の方法は、試料中の標的核酸に核酸プローブをハイブリダイズさせて核酸２重鎖を形成させるハイブリダイゼーション工程をさらに含む。
【００１７】
さらに、本発明は、核酸を検出する装置であって：核酸２重鎖とカチオン性基及びπ共役系平面構造を同一分子上に有する有機化合物とを結合させる反応部と；前記結合手段によって得られた結合体を固定化させる固定化基板と；前記固定化基板に固定化された固定化物を検出する検出器と；を含んでなる、核酸検出装置を提供する。
【００１８】
本発明の１つの態様において、前記検出器は、電気的計測によるものである。また、他の態様において、前記検出器は、形態計測によるものである。本発明の１つの態様において、前記検出器は走査プローブ顕微鏡である。
【００１９】
本発明の１つの態様において、前記固定化基板は、１対以上の電極対を有する電極基板である。また、１つの態様において、前記電極基板の電極対をなす２つの電極間の距離は１ナノメートル〜１マイクロメートルである。１つの態様において、前記電極基板の電極対は傾斜蒸着法により形成される。
【００２０】
本発明の１つの態様において、前記反応部にて、試料中の標的核酸に核酸プローブをハイブリダイズさせ、核酸２重鎖が形成される。
【００２１】
用語の定義
本発明の明細書及び特許請求の範囲において用いられる用語「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその類縁体である天然または非天然のポリヌクレオチドのいずれでもよく、より詳しくは、塩基配列間の相補性に基づく２重鎖を形成可能である限り、あらゆるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体もしくはそれら類縁体も含む。
【００２２】
本発明の明細書及び特許請求の範囲において用いられる用語「核酸２重鎖」とは、前記の核酸として定義される同種又は異種の核酸により形成された２重らせん状の核酸構造物を意味する。
【００２３】
前記核酸２重鎖は、それ自身が検出対象物であってもよいし、生体成分、生体関連物質、及びその他の低分子物質または高分子物質のような検出対象物の一部であってもよい。例えば、核酸２重鎖は、それらに限定されないが、他の核酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドとの連結体でもよいし、或いはホルモン、酵素、蛋白質、オリゴペプチド、ポリサッカライドなどの高分子物質のほか、薬剤、ステロイド、糖などの低分子物質との複合体でもよい。そのような検出対象物を含む試料の種類は、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類動物から分離、採取した血液、尿、汗、組織片、臓器片、毛髪などの生体試料が挙げられ、それら検出対象物はin vitro又はex vivoのいずれで検出されてもよい。
【００２４】
［発明の詳細な説明］
核酸が存在する溶液中にカチオン性基及びπ共役系平面構造を同一分子上に有する有機化合物（以下、便宜的に「カチオン性有機化合物」と略す）を添加すると、２重鎖を形成した核酸に対してのみカチオン性有機化合物が結合体を形成する。したがって、本発明のカチオン性有機化合物によれば、適当な配列を有する核酸プローブを用いることにより、特定の配列を有する核酸を特異的に検出することが可能になる。
【００２５】
図１に、カチオン性有機化合物が結合した状態の２重鎖の模式図を示す。カチオン性有機化合物は、各カチオン性基を介して核酸２重鎖のアニオン性基（典型的には各リン酸基）のような負電荷部位にイオン結合し得るので、核酸（例えばＤＮＡ）を芯線としてその周囲をらせん状に被覆した芯鞘構造をとることができる。そのような芯鞘構造の鞘部分を構成するとカチオン性有機化合物はπ共役平面を積み重ねた状態であるπスタックにより安定な結合体を形成する。このときの核酸２重鎖と結合したカチオン性有機化合物は、π共役平面の垂直軸を水平方向にずらしてスタックし、核酸２重鎖を鞘状に覆う。この状態においてはイオン結合の結合／解離の平衡が結合状態に傾き、核酸２重鎖のアニオン性基との結合を保持した状態で核酸２重鎖を水溶液中から固体表面上に抽出することが可能になる。すなわち、本発明のカチオン性有機化合物によれば、核酸２重鎖を固体表面上に抽出することができるため、極めて高感度で核酸を検出することが可能になる。
【００２６】
更に、形態的計測を行う上では、核酸２重鎖及び２重鎖を形成していない核酸は、基板上で糸まり状またはランダムコイル状にうねった多様な形態で固定化されるために形態による識別が難しいとされていたところ、本発明のカチオン性有機化合物は、核酸２重鎖と剛直で嵩高な結合体を形成するため、核酸試料を、剛直な棒状の形態を有する嵩高な形態で基板上に固定できるので、形態による識別が可能になる。
【００２７】
また、電気的計測を行う上では、核酸２重鎖のみでは約10-9 Sｃｍ-1と導電性が低いため検出が難しいとされていたところ、本発明のカチオン性有機化合物は、核酸２重鎖と極めて導電性の高い結合体を形成するため、核酸２重鎖を電気的に計測することが可能になる。ある態様においては、本発明のカチオン性有機化合物と核酸２重鎖との結合体は、核酸２重鎖と比較して３桁から４桁導電性が向上するが、これは、本発明のカチオン性有機化合物と核酸２重鎖とがＪ会合体を形成しているためだと考えられる。
【００２８】
本発明において、核酸２重鎖と結合体を形成させる好ましいカチオン性有機化合物は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物群である。すなわち、そのカチオン性有機化合物は、π共役系平面構造部位Ｘと、これに連結する少なくとも１つのカチオン性基Ｚとを有し、以下の一般式で表すことができる：
Ｘ−（Ｙ−Ｚ）ｎ        （Ｉ）
（式中、ｎは１〜１２、Ｘはπ共役系平面構造部位、Ｙは連結基あるいはＸとＺとの間の直接結合、Ｚはカチオン性基）。
【００２９】
以下、上式中の各構造部分について具体的に説明する。
【００３０】
π共役系平面構造部位Ｘは、平面性を有する環状基、又は縮合環を有する芳香族基でよいが、特に、窒素原子を含む複素多環構造の芳香族基であることが好ましい。
【００３１】
図２に、好ましいカチオン性有機化合物の分子構造を例示する。また、水溶性が確保できることを条件として、Ｘの平面性は２次元的に大きく拡がっていることが好ましい。またＸは、そのような複素多環構造を母体とし、各種の置換基を有していてもよい。特に複素多環構造としては、少なくとも４つのピロール環を有する構造、例えば、ポルフィリンあるいはポルフィリン誘導体、フタロシアニンあるいはフタロシアニン誘導体が好ましく、中心金属は有っても無くてもよい。
【００３２】
そのようなＸの特性として、隣接する２つ以上の分子がπ電子による相互作用を有し、スタック構造をとることが好ましい。とりわけ、そのようなスタック構造としては、各Ｘ部位の２次元的に拡がった平面構造部分の垂直軸を水平方向にずらして積み重ねたスタック構造、即ち、Ｊ会合体を形成することが好ましい。Ｊ会合体を形成すると導電性が飛躍的に向上し、核酸試料の電気的計測を極めて高精度かつ高感度に行うことができるためである。
【００３３】
図３に、本発明に好ましく用いることのできるカチオン性有機化合物の１例を示す。ポルフィリン誘導体ＴＭＡＰ（5,10,15,20-tetrakis(4-trimethylammoniophenyl)porphyrin tetratoluene-4-sulfonate）は、Ｊ会合体を形成することにより、核酸２重鎖との結合が安定した。また、核酸２重鎖のみでは絶縁体に近い導電性が、このポルフィリン誘導体とこのようなＪ会合体を形成させた場合には導電性が３桁から４桁向上した。なお、スタック構造が形成したことは紫外可視吸収分光法により、吸収ピーク波長の長波長方向へのシフトから確認することができる。
【００３４】
カチオン性基Ｚは、図２に例示するように、カチオン性の官能基を表す。そのようなカチオン性基は、−Ｎ，−Ｃ，−Ｓ，−Ｐ，−Ｏの各オニウムに代表される。ここで言うオニウムとはホスホニウム［Ｒ３ＰＲ’］＋、オキソニウム［Ｒ２ＯＲ’］＋、ヨードニウム［ＲＩＲ’］＋、スルホニウム［Ｒ２ＳＲ’］＋などの化学式で示される物質である。カチオン性基としては、特に４級（テトラアルキル）アンモニウム基が好ましい。置換された４級アンモニウム基としては、一般式；−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は−（ＣＨ2）ｍＣＨ3であって、ｍは０〜２０、好ましくは０〜１０（０の場合はＨとなる）、より好ましくは０〜４である）が挙げられる。また、他の置換４級アンモニウム基としては、例えば、一般式；−Ｎ+Ｒ１Ｒ２（Ｃ2Ｈ4Ｏ）ｑＲ３（式中、ｑは１〜４である）で表されるポリエチレングリコールが挙げられる。また、前記Ｚの数は、１つのＸ当たり１〜１２個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは、それら各範囲において２個以上の場合である。これは、２個のＺが核酸２重鎖の２つのリン酸基と結合した場合、核酸２重鎖とカチオン性有機化合物の相対距離は１個のＺで結合する場合よりも近接することになり、カチオン性有機化合物間のスタックがより安定するためである。
【００３５】
例えば、Ｘがポルフィリンである場合、図２のポルフィリンにおいて１，４，７，１０の位置の４ヶ所のメソ位について、すべてにカチオン性基Ｚが結合する場合、ｎは４となり、対称関係あるいは鏡像関係にあるメソ位の２ヶ所に結合する場合、ｎは２となる。また、図２のポルフィリンにおいて、２，３，５，６，８，９，１１，１２の位置の８ヶ所のベータ位について、すべてにカチオン性基Ｚが結合する場合、ｎは８となる。さらに、図２のポルフィリンにおいて、メソ位とベータ位のすべてにカチオン性基が結合する場合、ｎは１２となる。
【００３６】
Ｙは、上記Ｘと上記Ｚとを繋げるための連結基であり、置換基を有してもよい炭素、酸素及び／又は窒素原子を含んでなる骨格主鎖ないし環状構造を有する。但し、Ｙは、任意の要素であり、ＸはＺと直接結合してもよい。図２に、好ましい連結基Ｙを示す。
【００３７】
Ｙは、ＸとＺとの物理的距離を好適化する役割を担う。ＸとＺとの距離の間の最適化とは、Ｘから伸びたＺ間の距離を調節すること、通常なら核酸のリン酸基間のピッチと対応することが好ましいと考えられ、これはＸの大きさにも依存する。例えば、図２に示したようにＸが比較的大きなものでは、好都合なことに複数ある官能基Ｚの結合部位が核酸のリン酸基ピッチに近い距離を持つことがあり、このような場合、連結基Ｙは不要であるか又は比較的短いものでよいと考えられる。典型的な連結基には、フェニレン基、アルキレン基又はそれらの組み合わせ等がある。
【００３８】
上記の観点及び合成の容易性を考慮すると、Ｘが４つの官能基Ｚとメソ位で結合したポルフィリンの例では、連結基Ｙは１つのフェニレン基であることが好ましい。ポルフィリンの例では、８つのベータ位に前記のような−Ｙ−Ｚ基をさらに結合させてもよい。またアルキレン基にはＸのスタック構造を安定させ、また溶媒への溶解度を向上させる効果があり、その主鎖炭素数は０〜１００、好ましくは０〜２０である。当業者であれば、Ｘの大きさとカチオン性基Ｚの位置等に適したあらゆる種類の連結基Ｙ及びカチオン基並びにそれらの結合位置や個数を定法により設計して合成することができる。
【００３９】
連結基Ｙが芳香族、縮合環又はヘテロ環のような拡がりを持つ構造を有すると、これらがＸの共役系面に対して立体角を有する場合があり、Ｘがリン酸基を有する塩基対間にインターカレートすることを防ぐ立体障害物として役立つため、好ましい。本発明者の検討によれば、特に好ましいと考えられる態様のカチオン性有機化合物には、ポルフィリンの４つあるメソ位に連結基Ｙとして各々１つのフェニレン基を有し、且つそれらのうち２つの隣接するフェニレン基にカチオン性基Ｚが結合した構造のものが含まれる。
【００４０】
カチオン性有機化合物の具体例としては、一般的に入手し易いものとして、ポルフィリンのメソ位にフェニレン基をもち、更にそのフェニレン基にカチオン性基Ｚとして４級アンモニウム基を持つものが好ましい。ポルフィリンから伸びる連結基Ｙとしては、カチオン性基Ｚが組み込まれたフェニレン基、又は単一のフェニレン基、或いはフェニレン基とカチオン性基Ｚとの間に更なるアルキレン基（一部にアルコキシ残基又はアミド残基を有してもよい）等を有するものが好ましい。これらの連結基Ｙは核酸２重らせん構造にカチオン性基Ｚがイオン結合したとき、Ｘ平面に回転などの自由度を与えることによりπ共役を形成し易くする。カチオン性有機化合物は市販のものを利用するか、または合成により得ることができる。本発明のカチオン性有機化合物は、本発明の属する技術分野において一般的な合成手法を用いて合成することができ、例えば、ポルフィリン骨格を有するカチオン性有機化合物の一般的合成手法を記載した文献として、The Porphyrin Handbook; Kadish, K. M., Smith, K. M., Guilard, R., Eds.; Academic Press: San Diego, 2000; Vol. 1を挙げることができる。
【００４１】
本発明では、上記のカチオン性有機化合物を、以下のようにして使用する。
【００４２】
上記のカチオン性有機化合物は、反応水溶液中において、少なくともカチオン性基の正電荷で、核酸２重らせん構造の表面上の負電荷部分にイオン結合し且つ／又は静電的に結合し、こうして２重らせんに沿って互いに隣接した少なくとも２分子のカチオン性有機化合物間の相互作用が結合体を安定化させると考えられる。
【００４３】
図１に、核酸２重鎖へカチオン性有機化合物が結合した結合体を示す。同図においてカチオン性有機化合物は、各カチオン性基を介して核酸２重鎖のアニオン性基（典型的には各リン酸基）のような負電荷部位にイオン結合し得るので、核酸（例えばＤＮＡ）を芯線としてその周囲をらせん状に被覆した芯鞘構造をとることができる。そのような芯鞘構造の鞘部分を構成するとカチオン性有機化合物はスタック（積み重ねられた状態になること）により安定な結合体を形成する。この状態においてはイオン結合の結合/解離の平衡が結合状態に傾き、核酸２重鎖のアニオン性基との結合を保持した状態で核酸２重鎖を水溶液中から固体表面上に抽出することが可能になる。
【００４４】
核酸はハイブリッドを形成したもの及びしていないものともに水溶液中では凝集しており、基板上に固定化したときもその凝集した形態が保持される。基板上で核酸を伸張した状態で固定するための方法には、ブロア法（文献S.Tanaka,et al.,Jpn.J.Appl.Phys., 40(4B),  L407(2001)参照）、傾斜ドロップ法（文献A.t.Woolley,et al.,Nano Lett.,1, 345(2001)参照）、Langmuir-Blodgett(LB)膜の引き上げ法（文献M.Shimomura,et al.,Synthetic Metals,133,473(2003)参照）、高分子による表面改質法（文献H.Nakano,et al.,Nano Lett.,2,475(2002)参照）などが報告され、いずれの方法でもあるいは別の方法を適用してよい。それぞれの方法は核酸と水溶液を分離して抽出する方法が異なり、ブロア法は水溶液にガスを吹き付けて除去する方法、傾斜ドロップ法は基板を傾斜させて水溶液を重力で除去する方法、LB膜引き上げ法はLB膜を形成した後に基板を液面に対して垂直に引き上げてLB膜を表面張力で基板表面に固定する方法、高分子による表面改質法は基板表面に核酸との結合を強固にする官能基をもつ高分子膜を形成して水溶液の除去を容易にする方法である。
また、一般に核酸２重鎖は、固体表面上ではランダムコイル状の形態を示すことが知られている（H.G.Hansma, I.Rvenco, K.Kim and D.E.Laney Nucleic Acids Res. 24,713-720, (1996)参照）。一方、π共役平面をもつカチオン性有機化合物と結合した核酸２重鎖結合体は、剛直で嵩高い形態を示す。この剛直で嵩高い形態は、螺旋状の芯鞘構造において互いに規則的に隣接したカチオン性有機化合物間のπ電子による相互作用に依拠するものであると考えられる。従って、π共役平面をもつカチオン性有機化合物と結合した２重鎖は凝集し難い剛直な状態になるために、２重鎖を形成していない核酸が示す糸まり状やランダムコイル状の形態と容易に識別できる。更に、基板上へ伸張した状態で固定するのが容易であり、水溶液からの抽出方法に特に留意する必要がないという利点がある。
【００４５】
核酸２重鎖の形態は、蛍光分光顕微鏡や走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）により計測することができる。分光的な方法では、核酸２重鎖とカチオン性有機化合物の結合により生じる紫外可視吸収ピークのシフト、蛍光ピークのシフトや円二色性ピークを利用できる。一方、走査型プローブ顕微鏡は、プローブ先端と物体表面との相互作用を利用して、物体表面の形状や電気特性などの性質を画像化する顕微鏡であり、原子間力やトンネル電流を利用する原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）や走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）は、オングストローム〜ナノメートルのオーダーの微小構造体の形態の検出に優れており、好適である。一般に、走査型プローブ顕微鏡は、生体材料のような柔らかい材料の計測が難しいとされているところ、本発明のカチオン性有機化合物は、核酸二重鎖と剛直な結合体を形成するため、走査型プローブ顕微鏡による形態測定に適している。
【００４６】
核酸２重鎖の導電性は、高感度の検出装置を用いても検出が難しいが、核酸２重鎖にカチオン性有機化合物が結合した場合は、導電性が３桁から４桁高くなる。一般に核酸２重鎖は、水溶液と分離された固体表面上ではほぼ絶縁体であることが知られており、カチオン性有機化合物が核酸２重鎖と結合して結合体となったときに、隣り合うカチオン性有機化合物のπ電子相互作用により導電性が形成されると考えられ、固体表面上の電気特性を電極で測定することより、核酸２重鎖を形成しているか否かが判別可能となる。
【００４７】
本発明に適用できる検出方法としては、サザンハイブリダイゼーションに代表されるような、核酸プローブと標的核酸とのハイブリッドを検出するハイブリダイゼーション法が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件下に共存させたカチオン性有機化合物は、形成されたハイブリッド核酸（核酸２重鎖）を覆って螺旋状鞘構造を形成し、固体表面上に抽出したときに、導電性が観測される。ハイブリッド（２重鎖）を形成しない場合、つまりＤＮＡが１重鎖のままであれば、螺旋状芯鞘構造は形成されないので、導電性は現れない。
【００４８】
ハイブリダイゼーション反応を行う方法又は装置は、好ましくは、反応溶液を加熱する工程又は手段を有し、必要に応じて冷却工程又は手段をも有し得る。すなわち、反応溶液の加熱により、例えば２重鎖ＤＮＡを解離して１重鎖とし、次にこれを相補的なＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ得る。このようなハイブリダイゼーション反応において、カチオン性有機化合物は共存してもよいし、そのハイブリダイゼーション後に添加してもよい。
【００４９】
核酸プローブとしては、生物試料から抽出したＤＮＡを制限酵素で切断し、電気泳動などによる分離などで精製したＤＮＡ断片、あるいは化学合成したＤＮＡのいずれをも用い得る。核酸プローブ配列は、周知の配列決定法に従いあらかじめ決定しておくことが好ましい。
【００５０】
導電性の測定において本発明の方法又は装置では、電極の形状が重要である。上記の核酸２重鎖とカチオン性有機化合物の結合体は固体基板上の一対の電極と接触させて行う。導電性の測定においては、固体基板上にあらかじめ電極間距離が所定の範囲内に固定して作製された少なくとも一対の電極を有する検出プレートを準備することが必要である。目的の核酸２重鎖を導電性により識別して検出することから、電極間の絶縁が保持されており、且つ、導電性を高感度で検出するために、このときの電極間の距離は、１nmから１μmであることが望ましい。より好ましくは１０nm〜１００nmである。電極対の間隔が１０ｎｍより狭いときは、電極自体のマイグレーションや電極間の電子ホッピングが発生して、試料のないブランクの状態でも電流が検出されてしまう。逆に、電極対の間隔が１μmより離れると、10-6Sｃｍ-1から10-4Sｃｍ-1の導電体について電流を検出することが困難になる。
【００５１】
ナノメートルオーダーの電極間距離を有する上記電極対を作製する方法は、現在も多くの方法が検討されており、本発明においては、公知の電極作製法を利用することができる。例えば、ナノプリンティング法や蒸着法が文献で知られているが、電極の形状や電極間の距離の制御は難しく、再現性が低いという問題がある。本発明においては、電極間の距離を１nmから100nmという短い距離で制御することができるため、傾斜蒸着法が好ましい（Y. Naitho, K. Tsukagoshi, K. Murata, W. Mizutani, e-J. Surf. Sci. Nanothch., 1, 41(2003)参照）。傾斜蒸着法は、基板上に電極対の一方となる電極をマスクを用いた電極材料の蒸着により先に作製し、次に、すでに作製した該電極の基板の斜め上方向から次の電極を作製する電極材料を蒸着することにより、先に作製した電極のエッジ部分がマスクとなり、電極材料が蒸着されない部分を作製する方法である。この方法は、10-４Pa以上の高真空下で蒸着を行うことにより、蒸着材料の蒸気の基板に向かう直進性が向上するため、先に形成した電極形状に依存せずに、均等な間隔で対となる電極の作製を制御することが容易である。傾斜蒸着法で形成された電極は電極対を形成する片側の電極の高さが高くなることから、容易に識別される。
【００５２】
本発明においては、電極を形成するための固体基板として、核酸２重鎖とカチオン性有機化合物の結合体よりも導電性が低い材料を用い、特に、絶縁体を用いることが好ましい。また、表面がフラットであることが望ましく、特に、分子レベルでフラットな平面が得られるマイカが適する。また、他の好適な材料として、ガラス、表面を酸化処理したシリコンウェハ、ポリマーなどが挙げられる。
【００５３】
上記の電極は、検出プレートとして、固体表面上にあらかじめ１対または複数対配置されていることが望ましい。あらかじめ電極が配置されたプレートを用いると、ハイブリッドした核酸２重鎖を基板上へ固定化すると、同時に電極への接触が形成されるため、固定化工程と検出工程の電気的計測とを同時に行うことができ、工程が一つ少なくなる。特に、複数対配置されている場合は、複数のサンプルのハイブリダイゼーションを同時に測定することが可能であり、測定の効率化と測定時間の短縮が可能である。
【００５４】
図４に、１対の電極を配置したもの、図５に、複数対の電極を配置したものを示す。個々の電極の形状は、カチオン性有機化合物が結合した２重鎖ＤＮＡと接極するための電極対を形成する側の一方の端部と、発生した電流を電流計測器へ取り出すためのプローブを接続する面からなるもう一方の端部により形成される。
【００５５】
更に、上記電極は、電極対の片側をあらかじめ固体表面に配置しておいて、対になるもう一方の電極を走査プローブ顕微鏡のプローブを利用することが可能である。また、走査型プローブ顕微鏡の２つ以上のプローブを用いて電極対を形成することも可能である。
【実施例】
【００５６】
核酸結合体の形態計測
核酸２重鎖試料として合成ＤＮＡ（Poly（dA）/Poly(dT)，50mers、アマシャムファルマシアバイオテク社製、濃度25 A260units、対イオンがナトリウム塩のもの）を用いた。上記ＤＮＡを、Milli-Q（登録商標）装置で精製した水を１２０℃で２０分間殺菌処理したもので0.125 unitsに調整し、１日間静置した後、劈開したマイカ基板上にこれを10μLを滴下した。これを１分間静置した後に、窒素ブロワーで水溶液を除去した。得られたマイカ基板上でのＤＮＡ試料を原子間力顕微鏡（AFM）によって測定した。
【００５７】
図６に、２重鎖ＤＮＡのみを固定した試料の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で観測された像及び断面高さを示す。このときの形態像はランダムコイル状を示し、また、マイカ基板上での高さは0.20-0.21nmであった。
【００５８】
次に、カチオン性有機化合物としてフルカ社製の5,10,15,20-テトラキス（4-トリメチルアンモニオフェニル）ポルフィリン テトラトルエン-4-スルホナート）（以下、TMAPと記す）の粉体を4×10-6mol/Lの水溶液に調整した。これをPoly(dA)/Poly(dT)の0.25unit.と等量混合し、室温で１日間静置後、劈開したマイカ基板上に10μLを滴下した。これを１分間静置した後に、窒素ブロワーで水溶液を除去した。
【００５９】
図７に、ポルフィリン誘導体カチオン性有機化合物と結合した２重鎖ＤＮＡ結合体を固定した試料の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で観測された像と断面高さを示す。このときのAFMによる形態像は剛体状を示し、マイカ基板上での高さは0.48-0.49nmであった。核酸２重鎖のみの場合（約０．２ｎｍ）と比べ、核酸２重鎖が本発明のカチオン性有機化合物と結合することにより２〜３倍嵩高くなるため、検出のＳ／Ｎが高くなり、識別が容易になる。
【００６０】
また、図７の結果により、カチオン性有機化合物を、核酸２重鎖と結合した状態を保った状態で固体表面上へ取り出すことが可能であることが確認された。カチオン性有機化合物が核酸２重鎖に結合するときは螺旋構造を形成し、隣り合うカチオン性有機化合物分子間に相互作用が生じ、その相互作用により、カチオン性有機化合物と核酸２重鎖とが結合安定状態へ偏るためであると考えられる。また、マイカ基板の表面での核酸２重鎖とカチオン性有機化合物との結合体の高さは、核酸２重鎖の高さの２倍以上になっていることから、核酸２重鎖とカチオン性有機化合物の芯鞘構造が形成されていることが推定された。カチオン性有機化合物は共存してもよいし、そのハイブリダイゼーション後に添加してもよい。
【００６１】
核酸結合体の電気的計測
次に、図４および図８に示すように大同化学工業製の熱酸化膜付きのシリコンウェハ基板上に傾斜蒸着法で100nmの間隔の電極対を形成した。図８に示すように、傾斜蒸着法による電極対の作製は、サンユー電子製の真空蒸着装置SVC-700を用いて温度200℃、真空度10-４Paに制御して、基板上に電極対の一方となる高さ30ナノメートルのAu電極をマスクを用いて作製し、次に、先に作製した電極のエッジ部分をマスクとして電極対の間隔が１００ナノメートルとなるように基板の角度を調整して、先に作製した該Au電極の基板の斜め上方向から対となるAu電極を蒸着した。このときの電極間の距離は走査型電子顕微鏡で確認した。
【００６２】
この電極対を用いて、発生した電流を電極からプローブにより電流計測器に取り出して、導電性を測定した。図９に、本発明のカチオン性有機化合物が結合した状態の２重鎖ＤＮＡを導電性により検出する測定プロセスの模式図を示す。
【００６３】
電気的計測の測定結果を図１０〜図１２に示す。図１０は、電気化学的計測の結果の一例であり、マイカ基板上に形成した１００ナノメートルの間隔をもつ電極間での電流電圧曲線を測定した結果である。試料なしのブランク（◇印）、ポルフィリン誘導体カチオン性有機化合物（ＴＭＡＰ）のみ（＊印）、２重鎖ＤＮＡのみ（○印）及びポルフィリン誘導体カチオン性有機化合物（ＴＭＡＰ）と結合した２重鎖ＤＮＡ結合体（△印）のそれぞれの試料をマイカ基板上に調製したときの電流と電圧との関係を測定したところ、ポルフィリン誘導体カチオン性有機化合物と結合した２重鎖ＤＮＡのみが１ボルト印加時に５×１０-10アンペアの導電性を示した。
【００６４】
各々の試料については次のように調製した。ブランクは熱酸化膜付きシリコンウェハ基板上の電極に無処理のまま試料としたものである。ＴＭＡＰのみの試料は、6×10-6 mol/LのTMAP溶液のみを10μL添加して基板上に固定したものであり、２重鎖ＤＮＡのみの試料は、50mer鎖のPoly(dA)poly(dT)の0.2unit水溶液を基板上に固定したものである。また、２重鎖ＤＮＡ結合体の試料は、50mer鎖のPoly(dA)poly(dT)の0.2unit水溶液に6×10-6mol/LのTMAP溶液を添加して結合体を形成させ基板上に固定したものである。
【００６５】
計測結果からは、カチオン性有機化合物のみのときには導電性は１ボルト印加時に電流値10-13アンペアオーダーであり、電極だけのブランク及び核酸２重鎖のみのときには導電性は１ボルト印加時に電流値10-14アンペアオーダーであるが、核酸２重鎖にカチオン性有機化合物を結合して結合体にすることにより、導電性が１ボルト印加時に電流値10-11アンペアオーダーとなり、核酸２重鎖のみに較べて３桁から４桁向上することが分かる。即ち、核酸２重鎖のみでは電気伝導度が約10-9Sｃｍ-1と低く、絶縁体に近いのに対して、核酸２重鎖とカチオン性有機化合物の結合体とすることで導電性は約10-5Sｃｍ-1となり３桁から４桁向上するため、電気的計測によって固体表面上での核酸２重鎖の検出が容易に検出できる。
【００６６】
図１１は、ポルフィリン誘導体カチオン性有機化合物と結合した２重鎖ＤＮＡ結合体を試料としたときの電流の経時変化を示す。このときの２重鎖ＤＮＡ結合体試料は、50mer鎖のPoly(dA)poly(dT)の0.2unit水溶液に6×10-6mol/LのTMAP溶液を添加して基板上に固定したものである。試料に１Ｖの電圧を連続的に印加して電流を測定し、初期を除いて400秒経過しても導電性が変化しないことから、イオン伝導ではなく電子伝導が発生していることを確認した。
【００６７】
さらに、図１２はポルフィリン誘導体カチオン性有機化合物と結合した２重鎖ＤＮＡ結合体を試料としたときの電流-電圧曲線の温度依存性を示した図である。このときの試料は、50mer鎖のPoly(dA)poly(dT)の0.2unit水溶液に6×10-6mol/LのTMAP溶液を添加して基板上に固定したものである。この図によると、高温になるほど導電性が向上していることがわかる。
【００６８】
これらの結果から、カチオン性有機化合物間のπスタックを電子が移動することにより、導電検出を可能にすることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、カチオン性有機化合物が結合した状態の２重鎖ＤＮＡ（２重鎖ＤＮＡ結合体）を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明に好ましく用いるカチオン性有機化合物の分子構造を例示した図である。
【図３】図３は、本発明に好ましく用いるカチオン性有機化合物の１例を示した図である。
【図４】図４は、カチオン性有機化合物が結合した状態の２重鎖ＤＮＡ結合体を導電性により検出する電極形状を例示した模式図である。
【図５】図５は、本発明のカチオン性有機化合物が結合した状態の２重鎖ＤＮＡを導電性により検出する複数の電極部を有する検出プレートを例示した模式図である。
【図６】図６は、２重鎖ＤＮＡのみを固定した試料の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で観測された像及び断面高さを示す図である。
【図７】図７は、ポルフィリン誘導体カチオン性有機化合物と結合した２重鎖ＤＮＡ結合体を固定した試料の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で観測された像と断面高さを示す図である。
【図８】図８は、電極間距離を示す走査型電子顕微鏡（SEM）像である。
【図９】図９は、本発明のカチオン性有機化合物が結合した状態の２重鎖ＤＮＡを導電性により検出する測定プロセスを例示した模式図である。
【図１０−１】図１０−１は、試料なしのブランク（◇印）、ポルフィリン誘導体カチオン性有機化合物（ＴＭＡＰ）のみ（＊印）、２重鎖ＤＮＡのみ（○印）及びポルフィリン誘導体カチオン性有機化合物（ＴＭＡＰ）と結合した２重鎖ＤＮＡ結合体（△印）のマイカ基板上の電流-電圧曲線を示す図である。
【図１０−２】図１０−２は、図１０−１の拡大図である。
【図１１】図１１は、ポルフィリン誘導体カチオン性有機化合物と結合した２重鎖ＤＮＡ結合体を試料としたときの印加電圧１ボルトでの電流値の経時変化を示す図である。
【図１２】図１２は、ポルフィリン誘導体カチオン性有機化合物と結合した２重鎖ＤＮＡ結合体を試料としたときの電流-電圧曲線の80Kから室温（300K）までの温度特性を示す図である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１２】
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