(57)【要約】【課題】真核細胞及び原核細胞、好ましくは植物細胞及び無傷の植物における高効率遺伝子発現システムを提供することを本発明の課題とする。【解決手段】上記課題は、a)発現される所望のコード配列を挿入するためのエンドヌクレアーゼ制限部位の上流のRB47結合部位ヌクレオチド配列；及び、b)RB47結合部位と結合するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；を含むことを特徴とする、所望の分子を発現するための発現カセットを提供することによって解決された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)発現される所望のコード配列を挿入するためのエンドヌクレアーゼ制限部位の上流のRB47結合部位ヌクレオチド配列；及び
b)RB47結合部位と結合するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とする、所望の分子を発現するための発現カセット。
【請求項２】
更に前記RB47結合部位ヌクレオチド配列の上流に、操作できるように連結されかつ位置した、プロモーター配列を含む、請求の範囲第１項記載の発現カセット。
【請求項３】
前記プロモーター配列が、psbA遺伝子に由来する、請求の範囲第２項記載の発現カセット。
【請求項４】
前記コード配列が、前記psbA遺伝子に対してヘテロである、請求の範囲第３項記載の発現カセット。
【請求項５】
前記カセットが、プラスミド又はウイルスを含む、請求の範囲第１項記載の発現カセット。
【請求項６】
更にRB60をコードするヌクレオチド配列を含み、かつこれに操作できるように連結されている、請求の範囲第１項記載の発現カセット。
【請求項７】
前記RB47結合ポリペプチドが、RB47、RB47前駆体及びヒスチジン修飾されたRB47からなる群から選択される、請求の範囲第１項記載の発現カセット。
【請求項８】
a)発現される所望のコード配列の挿入のためのエンドヌクレアーゼ制限部位の上流のRB47結合部位ヌクレオチド配列；及び
b)該RB47結合部位へのRB47の結合を調節するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、所望の分子を発現するための発現カセット。
【請求項９】
前記調節ボリペプチドがRB60である、請求の範囲第８項記載の発現カセット。
【請求項１０】
色素体内において所望の真核生物分子を発現するための発現カセットであって、目的の真核生物導入遺伝子に対して操作できるように連結された適切なプロモーターを含み、ここで、該真核生物分子が抗体を含む、発現カセット。
【請求項１１】
前記プロモーターが同種プロモーターである、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項１２】
前記プロモーターがpsbAプロモーターである、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項１３】
さらに５’ＵＴＲを含む、請求項１０または１１に記載の発現カセット。
【請求項１４】
前記５’ＵＴＲがさらにRB47結合部位配列を含む、請求項１３に記載の発現カセット。
【請求項１５】
前記色素体が葉緑体を含む、請求項１０または１１に記載の発現カセット。
【請求項１６】
前記抗体が単鎖抗体または二量体抗体である、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項１７】
前記発現カセットがさらにルシフェラーゼ酵素をコードする、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項１８】
前記プロモーターが真核生物プロモーターである、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項１９】
複製起点をさらに含む、請求項１０または１１に記載の発現カセット。
【請求項２０】
選択マーカーをさらに含む、請求項１０または１１に記載の発現カセット。
【請求項２１】
請求項１０に記載の発現カセットを含む、細胞。
【請求項２２】
前記細胞が植物細胞または藻類細胞である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
前記植物細胞が色素体またはミトコンドリアを含む、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
前記色素体が葉緑体を含む、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記細胞が、Chlamydomonas reinhardtii細胞である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２６】
目的の真核生物タンパク質を産生する方法であって、以下：
請求項１０に記載の発現カセットを用いて、色素体を形質転換する工程、
細胞を増殖させる工程、および、
該タンパク質を回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、ここで、前記色素体が植物細胞内、または藻類細胞内に含まれる、方法。
【請求項２８】
前記形質転換が、インビトロ、インビボ、または、エキソビボにおいて生じる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロモーターが異種プロモーターである、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項３０】
前記プロモーターが、細菌プロモーター、バクテリオファージプロモーター、Ｔ３プロモーター、または、Ｔ７プロモーターである、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項３１】
前記プロモーターが構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターである、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項３２】
色素体内で導入遺伝子を発現するためのＤＮＡ構築物であって、該ＤＮＡ構築物は、目的の遺伝子に操作できるように連結された、色素体内で機能的であるプロモーターを含み、ここで、該導入遺伝子は、抗体をコードする遺伝子を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項３３】
非植物、非色素体の真核生物ポリペプチドを含む、色素体。
【請求項３４】
非植物、非色素体の真核生物ポリペプチドである、治療用ポリペプチドを含む、色素体。
【請求項３５】
非植物、非色素体の真核生物ポリペプチドを色素体内で産生する方法であって、以下：
ａ）該ポリペプチドを発現し得る構築物を用いて、細胞の色素体を形質転換する工程；および、
ｂ）該形質転換した色素体を含む該細胞を、該ポリペプチドをコードするＤＮＡが発現して、該色素体内で該ポリペプチドを産生する条件下で、増殖させる工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
転写の５’から３’方向に、以下の成分を含有する、色素体発現カセット：
ａ）色素体で機能的なプロモーター；
ｂ）色素体での翻訳のために機能的な５’リーダー配列；
ｃ）非植物、非色素体の真核生物ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；および、
ｄ）３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。
【請求項３９】
請求項３８に記載の色素体発現カセットであって、ここで、前記ＤＮＡ配列が脊椎動物ポリペプチドまたは哺乳動物ポリペプチドをコードする、色素体発現カセット。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項３８に記載の色素体発現カセット。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが単鎖抗体である、請求項４０に記載の色素体発現カセット。
【請求項４２】
前記色素体が植物色素体または藻類色素体である、請求項３８に記載の色素体発現カセット。
【請求項４３】
前記５’リーダー配列が、色素体のリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）を含む５’非翻訳領域（ＵＴＲ）である、請求項４０に記載の色素体発現カセット。
【請求項４４】
請求項３８に記載の色素体発現カセットを含む、細胞、
【請求項４５】
請求項４４に記載の細胞を含む、藻類または植物、あるいは、これらの子孫。
【請求項４６】
請求項３８に記載の色素体発現カセットであって、ここで、前記リボゾーム結合部位が、藻類色素体、植物色素体、細菌、バクテリオファージ、藻類ファージ、および、合成的に操作したリーダー配列からなる群から選択される供給源に由来するリーダー配列部位に由来する、色素体発現カセット。
【請求項４７】
請求項３８に記載の構築物を含む、藻類色素体。
【請求項４８】
請求項３８に記載の色素体を含む、藻類微生物または藻類、あるいはこれらの子孫。
【請求項４９】
Chlamydomonasreinhardtiiである、請求項４８に記載の藻類。
【請求項５０】
前記プロモーター、ＲＢＳを含む５’リーダー、および、転写終結領域を含む３’ＵＴＲが、同種植物または藻類の種の色素体ゲノム由来である、請求項３８に記載の色素体発現カセット。
【請求項５１】
前記同種配列がｐｓｂＡ遺伝子座由来である、請求項５０に記載の色素体発現カセット。
【請求項５２】
前記プロモーター、ＲＢＳを含む５’リーダー、および、転写終結領域を含む３’ＵＴＲが、前記色素体のゲノム内に導入された場合に、遺伝子組換えによる相同遺伝子との置換を可能にする長さである、請求項５０に記載の色素体発現カセット。
【請求項５３】
前記置換される相同遺伝子がｐｓｂＡ遺伝子である、請求項５２に記載の色素体発現カセット。
【請求項５４】
非植物、非色素体のポリペプチドを色素体内で産生する方法であって、以下：
ａ）細胞の色素体を請求項３８に記載の構築物で形質転換する工程；
ｂ）該形質転換した色素体を含む該細胞を、ＤＮＡ配列が発現して該色素体内で該ポリペプチドを産生する条件下で、増殖させる工程、
を包含する、方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、ここで、前記リボゾーム結合部位が、色素体、細菌、バクテリオファージ、藻類ファージ、および、合成的に操作したリーダー配列からなる群から選択される供給源に由来するリーダー配列由来である、方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法によってポリペプチドを産生する、形質転換された色素体を含む、真核生物細胞。
【請求項５７】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項３４に記載の色素体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【化１】
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【背景技術】
【０００２】
【化２】
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【０００３】
【化３】
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【０００４】
【化４】
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【０００５】
【化５】
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この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
【特許文献１】米国特許第5,234,834号
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下を提供する。
【０００７】
【化６】
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【０００８】
【化７】
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【０００９】
【化８】
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【００１０】
【化９】
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【００１１】
【化１０】
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【００１２】
【化１１】
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【００１３】
【化１２】
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【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
【化１３】
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【００１５】
【化１４】
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【００１６】
【化１５】
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【００１７】
【化１６】
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【００１８】
【化１７】
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【００１９】
【化１８】
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【００２０】
【化１９】
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【００２１】
【化２０】
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【００２２】
【化２１】
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【００２３】
【化２２】
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【００２４】
【化２３】
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【００２５】
【化２４】
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【００２６】
【化２５】
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【００２７】
【化２６】
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【００２８】
【化２７】
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【００２９】
【化２８】
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【００３０】
【化２９】
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【００３１】
【化３０】
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【００３２】
【化３１】
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【００３３】
【化３２】
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【００３４】
【化３３】
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【００３５】
【化３４】
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【００３６】
【化３５】
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【００３７】
【化３６】
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【００３８】
【化３７】
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【００３９】
【化３８】
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【００４０】
【化３９】
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【００４１】
【化４０】
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【００４２】
【化４１】
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【００４３】
【化４２】
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【００４４】
【化４３】
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【００４５】
【化４４】
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【００４６】
【化４５】
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【００４７】
【化４６】
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【００４８】
【化４７】
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【００４９】
【化４８】
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【００５０】
【化４９】
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【００５１】
【化５０】
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【実施例】
【００５２】
【化５１】
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【００５３】
【化５２】
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【００５４】
【化５３】
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【００５５】
【化５４】
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【００５６】
【化５５】
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【００５７】
【化５６】
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【００５８】
【化５７】
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【００５９】
【化５８】
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【００６０】
【化５９】
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【００６１】
【化６０】
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【００６２】
【化６１】
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【００６３】
【化６２】
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【００６４】
【化６３】
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【００６５】
【化６４】
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【００６６】
【化６５】
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【００６７】
【化６６】
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【００６８】
【化６７】
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【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｂは、残基１−４８８までのＲＢ６０の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２４１３までの対応する核酸配列と共に示され、この塩基１６−１６１４は、ＲＢ６０配列をコードしている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１０に示されている。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｂは、残基１−４８８までのＲＢ６０の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２４１３までの対応する核酸配列と共に示され、この塩基１６−１６１４は、ＲＢ６０配列をコードしている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１０に示されている。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ  ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ  ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ  ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図４】図４は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含むＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入のための領域、ＲＢ４７コード領域、ＲＢ６０コード領域、並びに転写終結点（ＴＳ）を含み複製起点及び選択マーカーが隣接している３’側フランキング領域を含む、発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、実施例４Ａに更に説明されている。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｂは、ヒスチジンタグをつけたＲＢ４７分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示していて、これは配列番号：１４としても示されている。
【図５Ｂ】図５Ａ−５Ｂは、ヒスチジンタグをつけたＲＢ４７分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示していて、これは配列番号：１４としても示されている。
【図６】図６は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、ＲＢ４７コード領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｅに更に説明されている。
【図７】図７は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇに更に説明されている。
【図８】図８は、実施例４Ｇ１）において更に説明されている本発明の構築物によって発現された破傷風菌毒素の１本鎖抗体のウェスタンブロットである。
【図９】図９は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、翻訳終止コドンＴＡＡを含んでいる細菌のルシフェラーゼＡ及びＢタンパク質のコード配列の挿入のための領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇ２）に更に説明されている。
【図１０】図１０は、葉緑体中で発現された細菌性ルシフェラーゼタンパク質の蓄積を示しており、実施例４Ｇ２）に更に説明されている。
【図１１】図１１は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、二量体ＩｇＡ（ｄＩｇＡ）の異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇ３）に更に説明されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2008073059.tif 000076
【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2008073059.tif 000080
【図６】
2008073059.tif 000081
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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