(57)【要約】【課題】  動物細胞内での相互作用をクロスリンク法を用いて検出する手段の提供。【解決手段】  クロスリンク剤となりうる非天然型アミノ酸に特異的な原核生物由来のＴｙｒＲＳ変異体と、前記ＴｙｒＲＳ変異体の存在下で前記非天然型アミノ酸と結合可能な原核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡと、所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の蛋白質遺伝子と、を動物細胞中で発現させ、前記蛋白質のナンセンス変異の位置に前記非天然型アミノ酸を取り込ませて非天然型アミノ酸組み込み蛋白質を発現させる第１工程、前記動物細胞に特定波長の光を照射する第２工程、蛋白質間相互作用の有無を検出する第３工程、を有することを特徴とする蛋白質間相互作用の検出方法である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロスリンク剤となりうる非天然型アミノ酸に特異的な原核生物由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体と、前記チロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体の存在下で前記非天然型アミノ酸と結合可能な原核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡと、所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の蛋白質遺伝子と、を動物細胞中で発現させ、前記蛋白質のナンセンス変異の位置に前記非天然型アミノ酸を取り込ませて非天然型アミノ酸組み込み蛋白質を発現させる第１工程、
前記動物細胞に特定波長の光を照射する第２工程、
蛋白質間相互作用の有無を検出する第３工程、
を有することを特徴とする蛋白質間相互作用の検出方法。
【請求項２】
クロスリンク剤となりうる非天然型アミノ酸が、ベンゾフェノン骨格を有するものである請求項１に記載の蛋白質間相互作用の検出方法。
【請求項３】
クロスリンク剤となりうる非天然型アミノ酸が、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニンである請求項１又は２に記載の蛋白質間相互作用の検出方法。
【請求項４】
蛋白質間相互作用が、チロシンキナーゼ型レセプターの相互作用である請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛋白質間相互作用の検出方法。
【請求項５】
蛋白質間相互作用が、上皮成長因子受容体の相互作用である請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質間相互作用の検出方法。
【請求項６】
チロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体が由来する原核生物が大腸菌である請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋白質間相互作用の検出方法。
【請求項７】
サプレッサーｔＲＮＡが由来する原核生物が、バチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）である請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質間相互作用の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロスリンク法を用いた動物細胞内の蛋白質間相互作用の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質中の所望の位置のアミノ酸残基を、通常の蛋白質合成に関わる２０種類以外のアミノ酸（非天然型アミノ酸）で置換した、非天然型アミノ酸組み込み蛋白質（以下、「アロ蛋白質」という）は、蛋白質の機能・構造解析のための有効な手段となり得る。
【０００３】
本発明者らは、近年、大腸菌や無細胞蛋白質合成系で開発されてきたアロ蛋白質の生産を、動物細胞内で可能にすることに成功した（特許文献１）。すなわち、本発明者らは、ナンセンスコドンに割り当てられ、非天然型アミノ酸に特異的なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ａａＲＳ」という）変異体にのみ認識され、宿主の動物細胞内のａａＲＳには認識されない（orthogonal tRNA）サプレッサーｔＲＮＡを開発し、かかるサプレッサーｔＲＮＡと非天然型チロシン誘導体に特異的な変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素と所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の蛋白質遺伝子を動物細胞中で発現させることによって、非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の生産を、動物細胞内で可能にすることに成功した。
【０００４】
ところで、蛋白質−蛋白質相互作用の存在を検出する手段としては、従来免疫沈澱法が用いられてきた。しかしながら、免疫沈澱法には、以下のような問題点があった。（１）蛋白質間相互作用が弱い結合力に基づくものである場合、いずれかの蛋白質に対して抗体を作用させた場合、蛋白質間の相互作用が切れて解離してしまう場合がある。（２）細胞内での蛋白質間の相互作用を免疫沈澱法により検出する場合、まず細胞から蛋白質を抽出する必要がある。蛋白質が細胞内の異なったコンパートメント内に存在していて、相互作用が実際には生じていない場合であっても、抽出操作をすることによって細胞外で初めて相互作用をする場合がある。したがって、免疫沈澱法では細胞内で相互作用していない場合についても検出してしまう可能性がある。このため、蛋白質間相互作用を免疫沈澱法を用いて検出する場合の精度は、必ずしも高いものではなかった。
【０００５】
蛋白質間相互作用を検出するために免疫沈澱法を用いる問題点を解消するために、クロスリンク法がある。クロスリンク法は、細胞内で相互作用をしている蛋白質とクロスリンク剤とを、細胞に紫外線を照射することによって共有結合させる方法である。したがって、蛋白質間相互作用が弱い結合力に基づくものであっても、共有結合という強い結合力で蛋白質を結合させるため、いずれかの蛋白質に対して抗体を作用させたときに蛋白質が解離してしまうことがない。また、細胞内で共有結合させるため、細胞からの抽出操作を行った後でも、細胞内で相互作用をしている蛋白質のみを検出することができる。
【０００６】
Ｓｃｈｕｌｔｚらは、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（以下、「ｐＢｐａ」）を特異的に認識するメタノコッカス  ヤナシー（Methanococcus jannaschii）のチロシルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＴｙｒＲＳ」という）の変異体を、メタノコッカス  ヤナシー由来のサプレッサーチロシルｔＲＮＡとともに、大腸菌内で発現させた。このＴｙｒＲＳ変異体はこのｔＲＮＡのみをアミノアシル化し、このｔＲＮＡは内因性ａａＲＳによっては認識されない。このように、ｐＢｐａは大腸菌のアンバーコドンに割り当てられ、培地中にｐＢｐａを加え、該大腸菌を３６５ｎｍの光に３０分間晒すことにより、ｐＢｐａがクロスリンク剤として共有結合したグルタチオンＳトランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」という）２量体が生成した（非特許文献１）。このように、非天然型アミノ酸であるｐＢｐａを原核生物である大腸菌に組み込み、クロスリンク法によってその蛋白質の相互作用を検出することができ、クロスリンク法は免疫沈殿法に代わる手段として利用することが可能となった。
【特許文献１】国際公開２００４／０３９９８９号パンフレット
【非特許文献１】Chin, J.W., Martin, A.B., King, D.S., Wang, L., & Schultz, P.G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 99, 11020-11024 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、動物細胞にクロスリンク法を適用できれば、たとえば上皮成長因子（以下、「ＥＧＦ」という）の受容体（以下、「ＥＧＦＲ」という）の相互作用等のシグナル伝達系等の解析が可能となり、その有用性は高い。
しかしながら、動物細胞は、原核生物と比べて細胞内がきわめて複雑であり、免疫沈澱法等の既存の手法では、上記（２）等の問題点が強く現れてしまう。さらに、非特許文献１に記述されているＳｃｈｕｌｔｚらの方法は、原核生物に用いられる方法であり、動物細胞にそのまま適用することはできない。
【０００８】
したがって、本発明は、動物細胞内での相互作用をクロスリンク法を用いて検出する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明は、
クロスリンク剤となりうる非天然型アミノ酸に特異的な原核生物由来のＴｙｒＲＳ変異体と、前記ＴｙｒＲＳ変異体の存在下で前記非天然型アミノ酸と結合可能な原核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡと、所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の蛋白質遺伝子と、を動物細胞中で発現させ、前記蛋白質のナンセンス変異の位置に前記非天然型アミノ酸を取り込ませて非天然型アミノ酸組み込み蛋白質を発現させる第１工程、
前記動物細胞に特定波長の光を照射する第２工程、
蛋白質間相互作用の有無を検出する第３工程、
を有することを特徴とする蛋白質間相互作用の検出方法である。
クロスリンク剤となりうる非天然型アミノ酸が、ベンゾフェノン骨格を有するものであることが好ましい。
クロスリンク剤となりうる非天然型アミノ酸が、ｐＢｐａであることが好ましい。
蛋白質間相互作用が、チロシンキナーゼ型レセプターの相互作用であることが好ましい。
蛋白質間相互作用が、ＥＧＦＲの相互作用であることが好ましい。
チロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体が由来する原核細胞が大腸菌であることが好ましい。
サプレッサーｔＲＮＡが由来する原核細胞が、バチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、動物細胞内での蛋白質間相互作用を、容易かつ確実に検出することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
まず、第１工程について説明する。
（非天然型アミノ酸）
本発明の方法に用いられる非天然型アミノ酸は、クロスリンク剤となり得るものであり、具体的には、ベンゾフェノン骨格を有するアミノ酸であることが好ましく、ｐＢｐａであることが特に好ましい。クロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸はそれ自体で生理活性を有する非天然型アミノ酸であり、蛋白質の部位特異的ラベルの標的部位ともなるので、クロスリンク剤となり得るアロ蛋白質は、蛋白質機能・構造解析の材料として有用であり、また創薬のターゲットともなる可能性がある。
【００１２】
（ＴｙｒＲＳ変異体）
本発明で用いられるＴｙｒＲＳ変異体は、アミノ酸として、クロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸を特異的に認識し、かつｔＲＮＡとして、併用するサプレッサーｔＲＮＡを特異的に認識して、該非天然型アミノ酸が結合したサプレッサーｔＲＮＡを生成させることができる原核生物由来のＴｙｒＲＳの変異体である。原核生物としては、大腸菌等を挙げることができ、そのなかでもＫ１２株、Ｂ株が好ましい。
大腸菌等の原核生物由来のＴｙｒＲＳ（野生型）は、動物細胞のチロシンｔＲＮＡと反応せず、同様に、原核生物由来のチロシンｔＲＮＡは動物細胞のＴｙｒＲＳと反応しない。
【００１３】
大腸菌のＴｙｒＲＳ（野生型）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
本発明に用いられるＴｙｒＲＳ変異体は、例えば、すでに知られている他のＴｙｒＲＳとチロシルＡＭＰの複合体との３−Ｄ構造データ（例えば、Brickら、J.Mol.Bioｌ.、第２０８巻（１９８８）ｐ．８３に記載されている３−Ｄ構造データ）から得られるチロシルＡＭＰを認識する位置を参照した上で、配列番号１の配列の中で、クロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸を認識する変異を導入すべき位置を推定して、周知の部位特異的に変異を導入する方法により、得ることができる。
そして、クロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸がｐＢｐａである場合には、ＴｙｒＲＳ変異体としては、この配列の中で、少なくとも、３７位のチロシン、１８２位のアスパラギン酸、１８３位のフェニルアラニンと１８６位のロイシンを他のアミノ酸で部位特異的に置換して、ｐＢｐａへの特異性を付与した変異体が挙げられる。
【００１４】
さらに好ましくは、３７位のチロシン及び１８２位のアスパラギン酸がグリシンに置換され、かつ１８３位のフェニルアラニンがチロシンに置換されているか又は１８６位のロイシンがアラニンもしくはメチオニンに置換されたものを用いることができる。これらの変異によりｐＢｐａへの特異性が高められる。
【００１５】
次に、これらの変異体を製造する方法としては、公知の遺伝子操作技術により行なうのが好ましい。例えば、目的のアミノ酸の位置をコードする塩基配列を改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したプライマーを用いて、改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したＤＮＡを増幅させて、増幅させたＤＮＡ断片を結合させて、全長のａａＲＳ変異体をコードするＤＮＡを得て、これを大腸菌などの宿主細胞を用いて発現させることにより簡便に製造することができる。この方法において使用するプライマーとしては２０〜７０塩基、好ましくは２０〜５０塩基程度である。このプライマーは改変前の元の塩基配列とは１〜３塩基がミスマッチとなるので、比較的長いもの、例えば２０塩基以上のものを使用するのが好ましい。
【００１６】
（サプレッサーｔＲＮＡ）
上記ＴｙｒＲＳ変異体と組み合わせて使用される、サプレッサーｔＲＮＡは、通常の２０種類のアミノ酸に割り当てられたコドンではないナンセンスコドンに割り当てられ、かつ、上記非天然型アミノ酸に特異的なＴｙｒＲＳ変異体にのみ認識され、宿主の通常のａａＲＳには認識されない（orthogonal tRNA）という要件を備え、かつ動物細胞中で発現しなければならない。
ここで、ナンセンスコドンとしては、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、ＵＧＡ（オパール）が挙げられるが、ＵＡＧ（アンバー）コドンを用いることが好ましい。
【００１７】
一般に、真核細胞でのｔＲＮＡの発現は、ｔＲＮＡコーディング配列内の２つの内部プロモーターを必要とし、そのコンセンサス配列は、ボックスＡ、ボックスＢとして知られている。
バチルス  ステアロサーモフィラスのサプレッサーチロシンｔＲＮＡは、原核生物由来であるが、そのサプレッサーチロシンｔＲＮＡ配列内にボックスＢとボックスＡを内部に有しており（M.Sprinzlら、Nucleic Acids Research 17, 1-172(1989)）、なんら改変を加えなくても動物細胞内で発現させることができると考えた。
【００１８】
そして実際に、バチルス  ステアロサーモフィラス由来のサプレッサーチロシンｔＲＮＡを改変せずに動物細胞で導入するためのベクターにクローン化して動物細胞に導入したところ、動物細胞中での発現が確認された。そして、上記大腸菌のＴｙｒＲＳ変異体と組み合わせて、サプレッション活性を示すことを確認した。
すなわち、ボックスＡ配列とボックスＢ配列を有した形で、サプレッサー活性を保持できる原核生物のサプレッサーｔＲＮＡは、上記大腸菌由来のＴｙｒＲＳ変異体と組み合わせて、動物細胞内でサプレッサー活性を有することができることを見出した。
【００１９】
本発明に用いられるサプレッサーｔＲＮＡは、上記チロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体の存在下で非天然型アミノ酸と結合可能なバチルス属由来のサプレッサーｔＲＮＡだけでなく、マイコプラズマ属又はスタフィロコッカス属真性細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡも挙げられる。これらのｔＲＮＡの配列については、http://medlib.med.utah.edu/RNAmods/trnabase/またはhttp://www.staff.uni-bayreuth.de/~btc914/search/に記載されている。
これらは、原核生物中で機能するサプレッサーｔＲＮＡの配列を有し、かつ内部に動物細胞において認識される２つの内部プロモーターコンセンサス配列を有し、上記ＴｙｒＲＳ変異体の存在下でクロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡである。ここで、「原核生物中で機能するサプレッサーｔＲＮＡの配列を有する」とは、原核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡであって、サプレッサーｔＲＮＡとして機能するための、ナンセンスコドン（通常アンバーコドン（ＵＡＧ））に相補的なアンチコドン及び立体構造（Ｌ型構造部分）を保持していることを意味する。また、「内部に動物細胞において認識される２つの内部プロモーター配列を有する」とは、ボックスＡのコンセンサス配列とボックスＢのコンセンサス配列を内部に含むことを意味する。また、「上記ＴｙｒＲＳ変異体の存在下でクロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸と結合可能」とは、ＴｙｒＲＳ変異体により特異的に認識されてクロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸と結合することができるサプレッサーｔＲＮＡであり、通常チロシンと結合するチロシンｔＲＮＡ由来のサプレッサー変異体である。
【００２０】
バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌チロシンｔＲＮＡ由来のサプレッサーｔＲＮＡの例としては、バチルス  ステアロサーモフィラスのチロシンｔＲＮＡ由来のサプレッサーｔＲＮＡ、バチルス  ズブチリス（Bacillus subtilis）のチロシンｔＲＮＡ由来のサプレッサーｔＲＮＡ（http://medlib.med.utah.edu/RNAmods/trnabase/、登録番号DY1540；E.F.Wawrousekら、(1984)J.Biol.Chem. 259,3694-3702参照）、マイコプラズマ  カプリコラム（Mycoplasma capricolum）のチロシンｔＲＮＡ由来のサプレッサーｔＲＮＡ（http://medlib.med.utah.edu/RNAmods/trnabase/、登録番号DY1140；Y.Andachiら、(1987) Proc. Natl. Acd. Sci. USA 84, 7398-7402参照）、スタフィロコッカス  アウレウス（Staphylococus aureus）のチロシンｔＲＮＡ由来のサプレッサーｔＲＮＡ（http://medlib.med.utah.edu/RNAmods/trnabase/、登録番号DY1480；C.Green、(1993)J.Bacteriol. 175, 5091-5096参照）が挙げられ、好ましくはバチルス  ステアロサーモフィラスのチロシンｔＲＮＡ由来のサプレッサーｔＲＮＡが用いられる。
【００２１】
（ＴｙｒＲＳ変異体、サプレッサーｔＲＮＡの動物細胞中での発現）
ＴｙｒＲＳ変異体を動物細胞中で発現させるためには、いかなる公知の発現系でも用いることができ、例えば市販のｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology,3,133(1990)）、ｐＡＧＥ１０３[J.Biochem.101,1307(1987)]などを用いることができる。また、サプレッサーｔＲＮＡはいかなる公知の大腸菌クローニング用ベクターを用いても動物細胞内で発現させることができる。例えば、ｐＢＲ３２２（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75,3737-3741(1978)）などを用いることができる。
【００２２】
ＴｙｒＲＳ変異体については、必要に応じて、誘導発現可能なベクターを用いることができ、たとえば、クロンテック社、インビトロジェン社などから市販されている、テトラサイクリン応答プロモーターを用いることができる。
細胞へのベクターの導入方法としては、例えば、電気穿孔法（Nucleic,Acids Res.15,1311-1326(1987)）、リン酸カルシウム法（Mol.Cell Biol. 7,2745-2752(1987)）、リポフェクション法（Cell 7,1025-1037(1994);Lamb,Nature Genetics 5,22-30(1993)）などが挙げられる。
【００２３】
（非天然型アミノ酸を組み込ませるための蛋白質）
本発明で非天然型アミノ酸を組み込ませる蛋白質の種類は、限定されるものではなく、発現可能ないかなる蛋白質でもよく、異種の組換え蛋白質でもよい。例えば、タンパク質の種類として、いわゆるシグナル伝達関連タンパク質、受容体、増殖因子、細胞周期関連因子、転写因子、翻訳因子、輸送関連タンパク質、分泌タンパク質、細胞骨格関連タンパク質、酵素、シャペロン又は癌、糖尿病若しくは遺伝病等を含む疾患関連タンパク質などが挙げられる。これらタンパク質は相互作用によってその機能を果たすものであり、本発明に用いることができる。
【００２４】
本発明において非天然型アミノ酸を組み込ませる位置にナンセンスコドン（サプレッサーｔＲＮＡがアンバーサプレッサーのときはアンバーコドン）を導入することが必要であり、これによりこのナンセンスコドン（アンバーコドン）部位に特異的に非天然型アミノ酸を組み込むことができる。
【００２５】
蛋白質に部位特異的に変異を導入する方法としては、周知の方法を用いることができ、特に限定されないが、Gene 152,271-275(1995)、Methods Enzymol.100,468-500(1983)、Nucleic Acids Res.12,9441-9456(1984)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492(1985)、「細胞工学別冊「新細胞工学実験プロトコール」、秀潤社、２４１−２４８頁（１９９３）」に記載の方法、または「QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit」（ストラタジーン社製）を利用する方法などに準じて、適宜実施することができる。
【００２６】
本発明は動物細胞内で発現させることができるので、これまで、大腸菌や無細胞蛋白質系では、発現しない、あるいは発現量が低い、または活性型となるための翻訳後の修飾を受けることができないような蛋白質へ、非天然型アミノ酸を取りこませることができる。このような蛋白質としては、当業者には種々のものが知られているが、例えば、ヒトＥＧＦＲ等のチロシンキナーゼ型レセプターの細胞外ドメイン（Cell,110,775-787(2002)）、ヒトGroucho/TLE1蛋白質（Structure 10,751-761(2002)）、ラット筋肉特異的キナーゼ（Structure 10.1187-1196(2002)）などについて、アロ蛋白質を合成することができるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明の方法においては、動物細胞内でアロ蛋白質を発現させるので、糖鎖と結合した糖蛋白質に非天然型アミノ酸を組みこませることもできる。特に、無細胞蛋白質系における糖鎖付加のパターンが、本来のパターンと異なるようなタイプの糖蛋白質の場合には、本発明の動物細胞内での系は、目的の（本来の）パターンの糖鎖が付加されたアロ蛋白質を得るための有効な手段と考えられる。
【００２７】
（宿主）
本発明に用いられる、宿主の動物細胞としては、遺伝子組換え系が確立されている、哺乳類細胞が好ましい。有用な哺乳動物宿主細胞系の実例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）とＣＯＳ細胞を含む。より特有な例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１系(ＣＯＳ-７,ATCC CRL 1651)；ヒト胚腎臓系(２９３又は懸濁培養での増殖用にサブクローンした２９３細胞、J.Gen Virol.,36:59(1977))；チャイニーズハムスター卵巣細胞/-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；マウスセルトーリ細胞(ＴＭ４，Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ATCC CCL 75)；ヒト肝臓細胞(Hep G2, HB 8065)；及びマウス乳癌(MMT 060562, ATCC CCL51)を含む。これらの宿主は、各々発現系が確立されており、適切な宿主細胞の選択は、当業者の技術範囲内である。
これらは、例えば、Molecular Cloning 第３版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)などに記載された方法に準じて行なうことができる。
【００２８】
次に、アロ蛋白質が発現する様子を、図１に従って説明する。図１の枠は、動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）の細胞膜を表している。細胞内（枠の内側）では、原核生物型サプレッサーtRNAとＴｙｒＲＳ変異体がそれぞれの発現系から発現している。クロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸（たとえばｐＢｐａ）は培地（枠の外側）中に加えられる。
培地中のクロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸は、細胞自身の働きで細胞内に取り込まれ、ＴｙｒＲＳ変異体の働きによってサプレッサーｔＲＮＡに結合する。その後、クロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸は、サプレッサーｔＲＮＡによってリボソーム上に運ばれて、ナンセンス・コドン（ここでは，UAGコドン）の翻訳に用いられる。所望の位置にクロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸を含有する蛋白質を生産するためには、蛋白質の遺伝子の該当位置のコドンをＵＡＧに置換した後に、この遺伝子を細胞内で発現させる。
【００２９】
こうして、動物細胞内において、目的の位置にクロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸が組み込まれた目的のアロ蛋白質を発現させることができる。
すなわち、（Ａ）ＴｙｒＲＳ変異体であって、クロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸に対する特異性が高められたＴｙｒＲＳ変異体を動物細胞内で発現させる発現ベクターと、（Ｂ）上記ＴｙｒＲＳ変異体の存在下で上記クロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸と結合可能な、バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡを、上記動物細胞内で発現させる発現ベクターと、（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の蛋白質遺伝子とを有する動物細胞を、その動物細胞の増殖に適した培地（例えば、ＣＨＯ細胞の場合、Opti-MEM I (Gibco BRL社)など）に目的のクロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸を添加した培地で、適当な条件でインキュベートする。例えば、ＣＨＯ細胞の場合は、３７℃程度の温度で、２４時間程度、インキュベートする。培地内のクロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸の添加量は、０．１−３ｍＭ程度、好ましくは０．３ｍＭ程度とする。
【００３０】
次に第２工程について説明する。
上記により動物細胞内で発現したアロ蛋白質が、その動物細胞内で他の蛋白質と相互作用をしている場合、その動物細胞に特定波長の光を照射することにより、該アロ蛋白質に取り込まれたクロスリンク剤となり得る非天然型アミノ酸が、該他の蛋白質と共有結合を形成する。例えば、クロスリンク剤がベンゾフェノン骨格を有する場合、特定波長の光の照射により、ベンゾフェノン中のカルボニル結合が開裂して、カルボニル結合を構成する炭素原子が、相互作用する他の蛋白質と共有結合する。このように、クロスリンク法を用いることにより、アロ蛋白質と該他の蛋白質とが強固な共有結合を形成するため、細胞抽出操作を行った後も、両タンパク質が解離することがなく、両蛋白質間の相互作用を容易に検出することができる。このため、原核生物と比べてきわめて複雑な細胞構造を有する動物細胞において、動物細胞に特有な、例えばチロシンキナーゼ型レセプターの相互作用、より具体的にはＥＧＦＲの相互作用等の検出を容易に行うことができる。
【００３１】
照射する光の波長は、クロスリンク剤によって異なるが、紫外領域の波長であることが好ましく、クロスリンク剤がベンゾフェノン骨格を有するものである場合、３５０〜３８０ｎｍであることがより好ましく、さらにクロスリンク剤がｐＢｐａである場合、３６０〜３７０ｎｍであることが特に好ましい。照射時間に特に制限はないが、たとえば３０秒〜１時間が好ましい。照射は、たとえば、細胞を適当な緩衝液で洗浄した後、氷浴上で行うことが好ましい。
【００３２】
第３工程は、蛋白質間相互作用の有無を検出する工程であり、ウェスタンブロット法等公知の検出方法を用いることができる。例えば、細胞を緩衝液で溶解した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜等に移した後、適当な一次抗体、二次抗体を用いて検出することができる。
【００３３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
（ＥＧＦによるシグナル伝達機構中のＥＧＦＲとＧｒｂ２の相互作用の検出）
増殖に関わる細胞内シグナル伝達は、ＥＧＦの投与によって引き起こすことができる。ＥＧＦは、細胞膜に局在するＥＧＦＲに特異的に結合する。ＥＧＦが結合した受容体は、自身のチロシンを活性化（自己リン酸化）する。この状態は、細胞にとっていわゆる興奮状態であり、細胞の増殖へとつながる信号が一気にリレーされていく。通常、ＥＧＦＲから増殖までのリレーは、１段階ではなく、代表的には、ＥＧＦ→ＥＧＦＲ→Ｇｒｂ２→ＳＯＳ→Ｒａｓ→ＭＥＫ→ＭＡＰＫ→細胞増殖、という段階を経る。
本実施例では、ＥＧＦＲとＧｒｂ２の相互作用の検出を行った。
【００３５】
（方法）
材料
ｐＢｐａはＢａｃｈｅｍ  ＡＧから、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体はシグマ社から、抗ＨＡ抗体はロシュ・ダイアグノスティクス社から、抗ＥＧＦＲ抗体はサンタクルズバイオテクノロジー（Santa  Cruz  Biotechnology）社から、ＥＧＦＲ１０６８位のリン酸化チロシンに対する抗体はセルシグナリングテクノロジー（cell  signaling  technology）社から購入した。また、二次抗体として、ＨＲＰ（Horseradish  Peroxidase）標識抗マウス抗体及び抗ウサギＩｇＧ抗体を、アマシャム  バイオサイエンス社から購入した。
【００３６】
部位特異的変異導入とプラスミド構築
ｐＢｐａを特異的に認識する大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体（ＥｃｐＢｐａＲＳ）の遺伝子は、大腸菌由来の野生型ＴｙｒＲＳの部位特異的変異によって構築し、変異プライマーを使ったＰＣＲ法で増幅した。Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインとリガンドペプチドの結合構造に基づいて、ｐＢｐａの導入位置として、リガンド結合部位に近接し、かつ結合を阻害しないと予想される位置（Ｌｅｕ１１１）を選択し、アンバーコドンに置換した。より具体的には、ヒトのｇｒｂ２の１１１位のロイシンコドンを、Quick Change site-directed mutagenesis kit（ストラタジーン社）を用いて、アンバーコドンに変換した（ｇｒｂ２（Ａｍ１１１））。ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）を野生型大腸菌ＴｙｒＲＳ及びＥｃｐＢｐａＲＳのＣ末端に付加した。一方、野生型ｇｒｂ２及びｇｒｂ２（Ａｍ１１１）遺伝子のＣ末端にはＦＬＡＧ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付加した。野生型、変異型のｇｒｂ２、ＴｙｒＲＳ遺伝子、及びＥＧＦＲ遺伝子は、細胞中で発現させるため、それぞれｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクター（インビトロジェン社）でクローンされた。サプレッサーｔＲＮＡのプラスミドは既知の方法により調製した（特許文献1）。
【００３７】
トランスフェクション
テトラサイクリンリプレッサーを構造的に生産するＴ−ＲＥＸ−ＣＨＯ（インビトロジェン社）は、９０ｍｍディッシュ中で９０％コンフルエンスに増殖し、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯプラスミドとサプレッサーｔＲＮＡ発現プラスミドを、Ｇｉｂｃｏ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地（インビトロジェン社）中ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００試薬を用いて、トランスフェクトした。トランスフェクションから４時間後に、２０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）と１μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むセーラムフリーのＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地に培地交換した。ｐＢｐａは、１ｍＭの濃度で培地に加えた。さらに１２時間インキュベーションした後、細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで３７℃で５分間処理した。
【００３８】
ウェスタンブロット
ウェスタンブロットは、以下の手順で行った。細胞を、緩衝液Ａ（３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、５ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％デオキシコレートナトリウム、プロテアーゼインヒビターカクテル１００倍希釈（ナカライテスク））中で溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜に移した。蛋白質を、抗体でプロービングした後、ＥＣＬ plus immunodetection system（アマシャム  バイオサイエンス社）で検出した。膜を２種類の抗体で検出する場合には、２％のＳＤＳ及び０．７％の２−メルカプトエタノールを含む６２．５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）で、３０分間５５℃で処理して最初の抗体をはがした後、もう一方の抗体を作用させて検出した。バンド強度は、イメージアナライザーＬＡＳ−１０００プラス（富士写真フイルム社）を用いて測定した。
【００３９】
免疫沈殿とクロスリンク
免疫沈澱では、細胞を、ＥＧＦ処理後、ｐＨ７．２のphosphate-buffered saline（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１ｍＭのオルトバナデートを含む緩衝液Ａに溶解させた。得られた抽出物を、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（シグマ社）にリンクしたアフィニティゲルとともに４℃で２時間インキュベートし、ゲル上でトラップされた蛋白質を、ＦＬＡＧペプチド（シグマ社）によって溶出させた。光クロスリンクでは、ＰＢＳ中のこれらの細胞を培養皿を氷上に置き、ハンディ型の８Ｗ−ランプ、ＵＶＰ（アップランド社）を用いて２．５ｃｍの距離から、３６５ｎｍの光を照射した。照射後すぐに、細胞溶解物を緩衝液Ａに懸濁し、ＰＴＰ１Ｂフォスファターゼ（カルビオケム社、ＥＭＤ  Bioscience）で、３０℃３０分間処理した。
【００４０】
（結果）
Ｇｒｂ２へのｐＢｐａの部位特異的結合
Ｇｒｂ２はアダプター蛋白質であり、ＥＧＦＲに結合し、Ｒａｓ蛋白質に細胞外シグナルを仲介する。レセプターとこのＧｒｂ２との相互作用には、Ｇｒｂ２のＳＨ２領域が関係し、この領域はＥＧＦ刺激でリン酸化されるレセプターＹ１０６８に直接結合する。Ｇｒｂ２のＳＨ２領域の３次構造は、リガンドペプチドと複合体を形成しており、Ｘ線結晶解析及びＮＭＲで決定されている。ｐＢｐａにより置換されるアミノ酸残基は、結合リガンドの近くにあるが、結合を阻害しない残基である。結晶構造に基づいて、我々は置換位置としてロイシン１１１位を選択した。
ＣＨＯ細胞におけるＧｒｂ２へのｐＢｐａの部位特異的結合の結果を図２に示す。Ｇｒｂ２（Ａｍ１１１）の発現は抗ＦＬＡＧ抗体、ＴｙｒＲＳの発現は抗ＨＡ抗体で行った。野生型ＴｙｒＲＳ、サプレッサーｔＲＮＡ及びｇｒｂ２（Ａｍ１１１）を導入したレーン２ではＧｒｂ２（Ａｍ１１１）が生成されたが、その発現量は野生型Ｇｒｂ２（レーン１）に比べ低いものであった。また、このアンバーサプレッションは、ＴｙｒＲＳとサプレッサーｔＲＮＡの発現に依存していた（レーン２、３）。ｐＢｐａの培地中への添加とともに、野生型ＴｙｒＲＳにかえてＥｃｐＢｐａＲＳを細胞で発現させたときには、Ｇｒｂ２（Ａｍ１１１）の発現が確認された（レーン７）。なお、レーン４、５、６より、Ｇｒｂ２（Ａｍ１１１）の発現は、ＥｃｐＢｐａＲＳとサプレッサーｔＲＮＡに加えて、培地中へのｐＢｐａの供給にも依存することが確認された。これらの知見から、ｐＢｐａがＧｒｂ２（Ａｍ１１１）のアンバーの位置に導入されたことが示された。
【００４１】
（ＥＧＦＲに結合するＧｒｂ２）
共沈澱法によるＧｒｂ２とＥＧＦＲとの結合の解析結果を図３に示す。まず、得られた細胞抽出液をウエスタンブロットで検出した（図３ａ）。なお、一次抗体は抗ＥＧＦＲ抗体を使用した。図３ａより、１５０ｋＤａ、１７０ｋＤａの２つの異なる分子量をもつバンドが検出されたが（図３ａ、レーン１〜４）、１５０ｋＤａの分子量のバンドは、ＣＨＯ細胞内で過剰発現されることに由来する副産物である。また、この抽出液を免疫沈澱した後、ウエスタンブロットで検出した結果を図３ｂ、ｃ、ｄに示す。ＥＧＦ処理によって１７０ｋＤａのＥＧＦＲとＧｒｂ２の共沈澱が促進され、共沈澱産物においてＥＧＦＲのＴｙｒ１０６８がリン酸化されていることが確認された。一方、１５０ｋＤａの副産物は、ＦＬＡＧタグで免疫沈澱され、Ｔｙｒ１０６８がリン酸化されるものの、ＥＧＦの処理とは無関係に生じている（図３ｂ、ｃ、レーン１、２）。Ｇｒｂ２（ｐＢｐａ１１１）を発現させたときも、Ｇｒｂ２と同様に、Ｇｒｂ２（ｐＢｐａ１１１）とＥＧＦＲの共沈澱及びＥＧＦＲのＴｙｒ１０６８のリン酸化が確認された（図３ｂ、ｃ、レーン３、４）。以上から、Ｇｒｂ２（ｐＢｐａ１１１）は、ＥＧＦＲ上のリン酸化Ｔｙｒ１０６８との結合能力を保持し得ることが確認された。
【００４２】
（Ｇｒｂ２（ｐＢｐａ１１１）とＥＧＦＲとのクロスリンク）
Ｇｒｂ２とＥＧＦＲとのクロスリンクの解析結果を図４に示す。Ｇｒｂ２（ｐＢｐａ１１１）を発現させた細胞では約２００ｋＤａの位置に単一のバンドが検出されたが（図４ａ、ｂ、レーン８、９）、野生型のＧｒｂ２を発現させた細胞ではバンドは検出されなかった（図４ａ、ｂ、レーン１〜５）。このバンドは、次の理由から、Ｇｒｂ２（ｐＢｐａ１１１）とＥＧＦＲのクロスリンク複合体であると結論された。第１に、分子質量がＥＧＦＲ（１７０ｋＤａ）とＧｒｂ２（２５ｋＤａ）の質量の合計に相当する。第２に、このバンドの検出が光照射とｐＢｐａの存在に依存している。第３に、この産物は抗ＦＬＡＧ抗体のみならず、抗ＥＧＦＲ抗体によっても検出された。
副産物である１５０ｋＤａＥＧＦＲは、Ｇｒｂ２（ｐＢｐａ１１１）とクロスリンクしなかった。この副産物は細胞表面で適切に発現せず、たとえＥＧＦ独立性のＹ１０６８がリン酸化されていてもＧｒｂ２と結合することはできなかったと考えられる。そして、この副産物とＧｒｂ２との共免疫沈澱は、細胞抽出物の調製又は抗体とのインキュベーションの間に起きた非生理的結合によるものであったと考えられる。したがって、本方法は、細胞環境で形成された天然複合体を特異的に検出するのに有用である。ＥＧＦＲとＧｒｂ２との相互作用は、ＥＧＦ依存的である。すなわち、ＥＧＦＲとＧｒｂ２は、最初から構造体を形成しているのではなく、ＥＧＦの刺激に対してＥＧＦＲの特定部位がリン酸化され、これにＧｒｂ２が結合する。ＥＧＦ刺激がないときにはクロスリンクは生じず、細胞内の一連のシグナル伝達があって初めてクロスリンクが生じるのである。このことから、クロスリンクが細胞内の正しい現象をよく反映していることがわかる。
【００４３】
サプレッサーｔＲＮＡと加工されたアミノ酸特異性を有するａａＲＳ変異体のペアは、大腸菌細胞、酵母、哺乳動物細胞中で発現し、蛋白質に結合するアミノ酸のレパートリーが広がった。この技術は、ｐＢｐａを含むＧＳＴ分子の間を大腸菌中で光クロスリンクするためにすでに用いられている。本実施例の結果は、チロシンリン酸化に依存して互いに相互作用する細胞シグナル蛋白質に関係し、そして遺伝コード拡張に伴う生体内クロスリンクが哺乳動物細胞内のいろいろな蛋白質−蛋白質相互作用に適用し得るということを示唆している。
クロスリンク蛋白質複合体は共有結合のため安定であり、細胞抽出中の解離はありえない。この利点により、共免疫沈澱によっては検出されないような、蛋白質間の一瞬の又は弱い相互作用によって形成された複合体を分離することができる。さらに、共有結合は光に晒した細胞中で形成されるため、細胞抽出中又は抗体とインキュベーション中に起こる間違った相互作用が排除できる（例えば１５０ｋＤａのＥＧＦＲ副産物）。これらの利点は、細胞シグナル伝達経路を研究する上で有用である。
蛋白質クロスリンクは、巨大分子複合体内である蛋白質の位置を他の蛋白質の位置に対して決定するのに利用されてきている。２つの蛋白質のクロスリンクの形は、介在的要因なしで、複合体中のこれらの蛋白質間の直接的な接触を示す。クロスリンク剤となるアミノ酸の部位特異的結合は、相互作用する蛋白質の近くにある蛋白質のその部位を正確に特定することができる。２量体の境界から離れているＧＳＴのある位置にｐＢｐａが結合していると、クロスリンクは起こらないという報告がされてきた。本実施例によれば、リガンドペプチドを持つＧｒｂ２の結晶構造に基づいてｐＢｐａが結合するためのＧｒｂ２の位置を選択した。Ｇｒｂ２とＥＧＦＲとの間のクロスリンクは、Ｇｒｂ２の１１１位の残基がレセプターと相互作用する境界に位置することを確証した。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の検出方法は、免疫沈殿法が有する問題点を解消し、動物細胞内での蛋白質間相互作用の検出を高精度で行うことができる。例えば、シグナル伝達系の相互作用やガン遺伝子産物に対する相互作用等動物細胞特有の相互作用の検出に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】アロ蛋白質が発現する様子を示す模式図である。
【図２】ＣＨＯ細胞におけるＧｒｂ２へのｐＢｐａの部位特異的結合の結果を示す。
【図３】共沈澱法によるＧｒｂ２とＥＧＦＲとの結合の解析結果を示す。
【図４】Ｇｒｂ２とＥＧＦＲとのクロスリンクの解析結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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