(57)【要約】【課題】酸化チタン粒子の超音波や紫外線により励起される触媒活性を十分に発揮しながら、その血中滞留性および癌細胞への集積性を向上できる、酸化チタン複合体粒子およびその分散体の提供。【解決手段】この酸化チタン複合体粒子は、酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を介してノニオン性の水溶性高分子を結合したものである。この複合体粒子は、超音波や紫外線の照射により細胞毒となり、癌細胞等の殺対象となる細胞を効率良く殺傷することができる。【選択図】図１
2008201797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化チタン粒子と、
該酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を介して結合されてなる、ノニオン性の水溶性高分子と
を含んでなる、抗腫瘍剤。
【請求項２】
前記水溶性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、およびデキストランからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
前記官能基が、カルボン酸またはアミンにより与えられ、該カルボン酸またはアミンが、前記水溶性高分子の少なくとも末端に修飾されてなる、請求項１または２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
前記官能基が、カルボン酸またはアミンにより与えられ、該カルボン酸またはアミンが、前記水溶性高分子と共に共重合体を形成してなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
前記官能基が、リンカーとしてのポリカルボン酸により与えられる、請求項１または２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
前記官能基が、リンカーとしてのポリアミンにより与えられる、請求項１または２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
前記官能基を備えたリガンド分子をさらに含んでなり、該リガンド分子により、該酸化チタン粒子の表面に前記水溶性高分子が結合されてなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項８】
前記リガンド分子が、プロトカテク酸、没食子酸、メチルドーパ、４−アミノサリチル酸、およびキナ酸からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項７に記載の抗腫瘍剤。
【請求項９】
−２０〜＋２０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１０】
２０〜２００ｎｍの粒子径を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１１】
超音波の照射を受け、該照射により細胞毒となる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１２】
さらに溶媒を含み、前記抗腫瘍剤が分散されてなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１３】
前記溶媒が、水系溶媒である、請求項１２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤の製造方法であって、
非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基で修飾されたノニオン性の水溶性高分子とを分散させ、
得られた分散液を８０〜２２０℃で加熱して、酸化チタン複合体粒子を得ること
を含んでなる、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤の製造方法であって、
非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を備えたリガンド分子と、ノニオン性の水溶性高分子とを分散させ、
得られた分散液を８０〜２２０℃で加熱して、酸化チタン複合体粒子を得ること
を含んでなる、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤の製造方法であって、
非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、ポリカルボン酸とを分散させ、
得られた分散液を８０〜２２０℃で加熱して、前記ポリカルボン酸が結合された酸化チタン粒子の分散液を得、
該分散液に前記官能基で修飾されたノニオン性の水溶性高分子を添加して、ｐＨ８〜１０の水溶液中で反応させて、前記酸化チタン複合体粒子を得ること
を含んでなる、方法
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤の製造方法であって、
非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、ポリアミンとを分散させ、
得られた分散液を８０〜２２０℃で加熱して、前記ポリアミンが結合された酸化チタン粒子の分散液を得、
該分散液に前記官能基で修飾されたノニオン性の水溶性高分子を添加して、ｐＨ８〜１０の水溶液中で反応させて、前記酸化チタン複合体粒子を得ること
を含んでなる、方法。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤の製造方法であって、
非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を備えたリガンド分子とを分散させ、
得られた分散液を８０〜２２０℃で加熱して、前記リガンド分子が結合された酸化チタン粒子の分散液を得、
該分散液にノニオン性の水溶性高分子を添加して、前記抗腫瘍剤を得ること
を含んでなる、方法。
【請求項１９】
前記非プロトン系溶媒が、ジメチルホルムアミド，ジオキサン、およびジメチルスルホキシドからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化チタン粒子の表面を水溶性高分子で修飾した酸化チタン複合体粒子、その分散液、およびそれらの製造方法に関するものである。この酸化チタン複合体粒子は、超音波や紫外線等の照射を受けて細胞毒となることができるため、癌細胞等の細胞を殺傷する殺細胞剤、あるいは患部に超音波を照射することにより行われる超音波癌治療を促進するための超音波癌治療促進剤として利用可能である。
【背景技術】
【０００２】
酸化チタンはｐＨ６前後に等電点を有すると言われている。このため、酸化チタン粒子は中性付近の水系溶媒中では凝集を生じてしまい、これを均一に分散させることは極めて難しい。そのため、酸化チタン粒子を水系の分散媒に均一に分散させるため、今まで種々の試みがなされてきた。
【０００３】
ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を分散剤として添加して、分散媒中における酸化チタン粒子の分散性を向上させることが知られている（特許文献１（特開平２−３０７５２４号公報）および特許文献２（特開２００２−６０６５１号公報）参照）。
【０００４】
一方、近年、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に用いる担体として、極めて高い分散性の金属微粒子や半導体微粒子が求められている。このような目的のために、微粒子にＰＥＧを結合させる手法も知られている。例えば、金属微粒子あるいは半導体微粒子にチオール基を介してＰＥＧを結合させることが知られている（特許文献３（特開２００３−８０９０３号公報）および特許文献４（特開２００４−３００２５３号公報）参照）。
また、金属微粒子、金属酸化物微粒子、あるいは半導体微粒子にメルカプト基または３官能のシラノール基を介してＰＥＧを結合させることも知られている（特許文献５（特開２００１−２０００５０号公報）。しかしながら、これらの技術は、酸化チタン粒子への応用には適さない。これは、チオール基やメルカプト基は酸化チタンに安定に結合することができず、また、３官能のシラノール基にあっては相互に三次元的に縮合重合して重合物で酸化チタン粒子の表面を覆い尽くしてしまい酸化チタンの触媒活性を低下させてしまうおそれがあるためである。
【０００５】
また、酸化チタン微粒子に、ポリアクリル酸等の親水性高分子を、カルボキシル基を介してエステル結合させた、表面改質酸化チタン微粒子も知られている（特許文献６（ＷＯ２００４／０８７５７７）参照）。この技術は、ポリアクリル酸等といったアニオン性ポリマーの使用を念頭としたものである。
【０００６】
更に、２〜３ｍｍ粒度の酸化チタンに３５ないし４２ｋＨｚの超音波照射を行い、ヒドロキシラジカルを発生させることにより有機物を分解させる技術も提案されている（例えば、特許文献７（特開２００３−２６４０６号公報）参照）。
【０００７】
ところで、ＴｉＯ２等の金属酸化物の表面にエンジオールリガンドを結合させて、ナノ粒子の光学特性を変える技術が知られているが（例えば、非特許文献１（T.Rajh, et al., J. Phys. Chem. B 2002, 106, 10543-10552）参照）、この技術はポリマーを金属酸化物に結合させる技術ではない。
【０００８】
【特許文献１】特開平２−３０７５２４号公報
【特許文献２】特開２００２−６０６５１号公報
【特許文献３】特開２００３−８０９０３号公報
【特許文献４】特開２００４−３００２５３号公報
【特許文献５】特開２００１−２０００５０号公報
【特許文献６】ＷＯ２００４／０８７５７７
【特許文献７】特開２００３−２６４０６号公報
【非特許文献１】T.Rajh, et al., J. Phys. Chem. B 2002, 106, 10543-10552
【発明の開示】
【０００９】
本発明者らは、今般、酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を介して、ノニオン性の水溶性高分子を結合させることにより、酸化チタン粒子の超音波や紫外線により励起される触媒活性を十分に発揮させながら、その血中滞留性および癌細胞への集積性を向上できるとの知見を得た。
【００１０】
したがって、本発明は、酸化チタン粒子の超音波や紫外線により励起される触媒活性を十分に発揮させながら、その血中滞留性および癌細胞への集積性を向上できる、酸化チタン複合体粒子およびその分散体の提供をその目的としている。すなわち、本発明の酸化チタン複合体粒子によれば、殺対象が癌細胞の場合にあっては、超音波や紫外線による癌の治療効果を著しく向上することができる。そのため、本発明の酸化チタン複合体粒子は、患部に超音波を照射することにより行われる超音波癌治療を促進するための超音波癌治療促進剤としても利用可能である。
【００１１】
そして、本発明による酸化チタン複合体粒子は、
酸化チタン粒子と、
該酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を介して結合されてなる、ノニオン性の水溶性高分子と
を含んでなるものである。
【００１２】
また、本発明による分散液は、上記酸化チタン複合体粒子と、該粒子が分散される溶媒とを含んでなるものである。
【００１３】
さらに、本発明の第一の態様による、酸化チタン複合体粒子の製造方法は、
非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基で修飾されたノニオン性の水溶性高分子とを分散させ、
得られた分散液を８０〜２２０℃で加熱して、酸化チタン複合体粒子を得ること
を含んでなる。
【００１４】
本発明の第二の態様による、酸化チタン複合体粒子の製造方法は、
非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を備えたリガンド分子と、ノニオン性の水溶性高分子とを分散させ、
得られた分散液を８０〜２２０℃で加熱して、酸化チタン複合体粒子を得ること
を含んでなる。
【００１５】
本発明の第三の態様による、酸化チタン複合体粒子の製造方法は、
非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、ポリカルボン酸とを分散させ、
得られた分散液を８０〜２２０℃で加熱して、前記ポリカルボン酸が結合された酸化チタン粒子の分散液を得、
該分散液に前記官能基で修飾されたノニオン性の水溶性高分子を添加して、ｐＨ８〜１０の水溶液中で反応させて、前記酸化チタン複合体粒子を得ること
を含んでなる。
【００１６】
本発明の第四の態様による、酸化チタン複合体粒子の製造方法は、
非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、ポリアミンとを分散させ、
得られた分散液を８０〜２２０℃で加熱して、前記ポリアミンが結合された酸化チタン粒子の分散液を得、
該分散液に前記官能基で修飾されたノニオン性の水溶性高分子を添加して、ｐＨ８〜１０の水溶液中で反応させて、前記酸化チタン複合体粒子を得ること
を含んでなる。
【００１７】
本発明の第五の態様による、酸化チタン複合体粒子の製造方法は、
非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を備えたリガンド分子とを分散させ、
得られた分散液を８０〜２２０℃で加熱して、前記リガンド分子が結合された酸化チタン粒子の分散液を得、
該分散液にノニオン性の水溶性高分子を添加して、前記酸化チタン複合体粒子を得ること
を含んでなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
酸化チタン複合体粒子およびその分散体
本発明による酸化チタン複合体粒子は、酸化チタン粒子と、ノニオン性の水溶性高分子とを含む。図１に、酸化チタン複合体粒子の一例を示す。図１に示されるように、酸化チタン複合体粒子は、酸化チタン粒子１の表面にノニオン性の水溶性高分子２が結合されたものである。酸化チタン粒子１と水溶性高分子２との結合は、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を介して形成される。すなわち、これらの官能基は酸化チタンとの間で強固な結合を形成するため、酸化チタン粒子の高い触媒活性にかかわらず水溶性高分子の結合を保持することが可能である。なお、本発明における結合形態は、血中滞留性確保の観点から、体内への投与後２４〜７２時間後に分散性が確保されている程度の結合形態であればよい。もっとも、生理条件での分散安定性に優れ、かつ超音波や紫外線照射後もポリマーの遊離が無く正常細胞へのダメージが少ない点で、共有結合であるのが望ましい。
【００１９】
カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基は、３官能シラノール基のような相互に三次元的に縮合重合して重合物で酸化チタン粒子の表面を覆い尽くしてしまう官能基とは異なり、官能基同士で重合することが無いため、図１に示されるように酸化チタン粒子の表面に剥き出しの部分を多く確保することができると考えられる。その結果、表面が重合体で覆われることによって起こりうる失活を抑制しつつ、酸化チタン粒子の触媒活性を十分に発揮させることができる。
【００２０】
そして、酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子はノニオン性であるため、電荷を帯びることなく、酸化チタン粒子の分散が困難とされる中性付近の水系溶媒中であっても、水和により酸化チタン複合体粒子を高度に分散させることができる。また、水溶性高分子は無電荷であるため、血中タンパク質が静電気的に吸着しにくくなるので、細網内皮系への取り込み、腎排泄、肝臓取り込み等を回避しやすくなり、目的部位（腫瘍）に到達できるに足る血中滞留性を確保することができる。しかも、無電荷の水溶性高分子を用いることで、癌細胞表面に高密度に到達しやすく、癌細胞への集積性にも優れる。したがって、本発明の酸化チタン複合体粒子は、高い分散性および高い血中滞留性を維持しながら生体内を運搬させて、癌細胞に効率良く集積させることができる。このため、本発明の酸化チタン複合体粒子は、点滴等を介した全身投与に適しており、表層から深部に至るまでの広範囲の癌の治療に特に適する。
【００２１】
本発明の好ましい態様によれば、上記官能基がジオール基であるのが好ましく、より好ましくはエンジオール基であり、さらに好ましくはα−ジオール基である。これらの官能基を用いることで、優れた酸化チタン粒子への水溶性高分子の結合を実現することができる。
【００２２】
本発明のより好ましい態様によれば、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基は、これらの官能基を備えたリガンド分子により与えられ、該リガンド分子により、該酸化チタン粒子の表面に前記水溶性高分子が結合されてなるのが好ましい。好ましいリガンド分子は環状分子であり、これにより酸化チタン粒子への水溶性高分子の結合強度がさらに向上される。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、リガンド分子は、水溶性高分子に結合する、カルボキシル基およびアミノ基から選択される少なくとも１種の官能基をさらに含んでなるのが好ましい。この態様によれば、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基が酸化チタン粒子への強固な結合を実現すると同時に、カルボキシル基および／またはアミノ基が水溶性高分子との強固な結合を実現することができる。その結果、特に優れた酸化チタン粒子への水溶性高分子の結合を実現することができる。  
【００２４】
ジオール基を含むリガンド分子の好ましい例としては、水溶性や二酸化チタンへの結合性の観点から、プロトカテク酸、没食子酸、メチルドーパ、キナ酸、およびそれらの組合せが挙げられる。リガンド分子の他の例としては、カフェ酸、３，４−ジヒドロベンズアルデヒド、３，４−ジヒドロベンゾイックアッシドエチルエステル、３，４−ジヒドロキシベンジルアルコール、３，４−ジヒドロキシ−３−シクロブテン−１，２−ジオーネ、ＤＬ−３，４−ジヒドロキシマンデリックアッシド、３−メトキシカテコール、２，３−ジヒドロキシナフタレン、ＤＬ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アラニン、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチルアルコール、２，３−ジヒドロキシピリジン、２，３−ジヒドロキシキノザリン等が挙げられる。
【００２５】
サリチル酸基を含むリガンド分子の好ましい例としては、水溶性や二酸化チタンへの結合性の観点から、４−アミノサリチル酸が挙げられる。
【００２６】
リン酸基を含むリガンド分子の好ましい例としては、水溶性や二酸化チタンへの結合性の観点から、アミノメチルホスホン酸、ホスフォノカルボン酸、３−ホスフォノアラニンが挙げられる。リン酸基を含むリガンド分子の他の例としては、１−アミノプロピルホスホン酸、３−アミノプロピルホスホン酸、１−アミノエチルホスホン酸、２−アミノエチルホスホン酸、３−ホスフォノプロピオン酸、２−アミノエチルジハイドロゲンホスフェイト、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピルジハイドロゲンホスフェイト、Ｏ−ホスフォノセリン、２−ホスフォグリセリン酸等が挙げられる。
【００２７】
本発明に用いる水溶性高分子は、ノニオン性を有する水溶性高分子であれば限定されないが、好ましくは水酸基および／またはポリオキシアルキレン基を有する高分子が挙げられる。そのような水溶性高分子の好ましい例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、デキストランあるいはそれらのコポリマーが挙げられ、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストランであり、さらに好ましくはポリエチレングリコールである。水溶性高分子の好ましい重合度は、３４〜５００であり、より好ましくは３４〜５０である。
【００２８】
本発明の好ましい態様によれば、水溶性高分子としてポリエチレングリコールを、官能基としてカルボキシル基を用いるのが好ましい。この態様において、ポリエチレングリコールとカルボキシル基の分子量比が１５０００：２０〜４０００００：２０であるのが好ましく、より好ましくは１５０００：２０〜４００００：２０であり、ポリエチレングリコールの分子量は１５００〜４００００であるのが好ましく、より好ましくは１５００〜４０００である。
【００２９】
本発明の好ましい態様によれば、カルボキシル基および／またはアミノ基の官能基が、カルボン酸および／またはアミンにより与えられるのが好ましい。この場合、カルボン酸またはアミンが水溶性高分子の少なくとも末端に修飾されてなるのが好ましいが、より好ましくはカルボン酸またはアミンが水溶性高分子と共に共重合体を形成してなる。これにより、酸化チタン粒子と水溶性高分子とが強固に結合されることができる。すなわち、官能基で修飾されたノニオン性水溶性高分子として、カルボン酸またはアミンと水溶性高分子との共重合体を使用可能である。これらの共重合体は、酸化チタン粒子の表面においてリンカーとして強固に結合するとともに、カルボキシル基およびアミノ基の数を多くすることができるので、酸化チタンとの結合に関与していない官能基の残基に蛍光色素や生体由来高分子等の機能性物質を結合させることができる。このような共重合体の好ましい例としては、マレイン酸−ポリエチレングリコール系共重合体が挙げられる。
【００３０】
本発明の別の好ましい態様によれば、カルボキシル基および／またはアミノ基の官能基が、リンカーとしてのポリカルボン酸またはポリアミンにより与えられるのが好ましい。これらの高分子化合物は、酸化チタン粒子の表面においてリンカーとして強固に結合するとともに、カルボキシル基およびアミノ基の数を多くすることができるので、酸化チタンとの結合に関与していない官能基の残基に蛍光色素や生体由来高分子等の機能性物質を結合させることができる。好ましいポリカルボン酸の例としては、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸、アクリル酸−マレイン酸共重合体、アクリル酸−スルフォン酸共重合体が挙げられる。また、好ましいポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、およびポリアリルアミンが挙げられる。さらに、カルボキシル基およびアミノ基の両方を有しているものも用いることができ、好ましい例としては、ポリオルニチン、ポリリジン等のポリアミノ酸が挙げられる。
【００３１】
本発明の好ましい態様によれば、ポリカルボン酸またはポリアミンで形成されたリンカーと水溶性高分子とを結合する第二のリンカーとして、カルボキシル基およびアミノ基から選択される少なくとも１種の官能基と化学結合を形成する官能基を有する、ポリカルボン酸またはポリアミン以外の化合物をさらに含んでなるのが好ましい。すなわち、ポリカルボン酸またはポリアミンで形成されたリンカーに第二のリンカーを結合させ、この第二のリンカーに水溶性高分子を結合させることも可能である。この第二のリンカーは、例えば生体分子同士を異なる官能基同士で結合する際に用いられるヘテロバイファンクショナルなクロスリンカーなどが考えられる。第二のリンカーの具体例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−［α−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸、Ｎ−［ε−マレイミドカプロン酸］ヒドラジド、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸、Ｎ−［κ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酪酸ヒドラジド・ＨＣｌ、３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド、Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３´−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル  Ｓ−アセチルチオアセテート、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオネート、スクシンイミジル  ３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル  ヨードアセテート、Ｎ−スクシンイミジル［４−イオドアセチル］アミノベンゾエート、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート、スクシンイミジル６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノネート］、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α［２−ピリジルジチオ］トルエン、Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］−スルホスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノネート、スルホスクシンイミジル６−［３´−（２−ピリジルチチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノネート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ���ロキシスルホ−スクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート、Ｎ−［ε−トリフルオロアセチルカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル等が挙げられる。また、第二のリンカーはさらに他のリンカー同士が結合されるような複数種類のリンカーから構成されてもよい。
【００３２】
本発明の好ましい態様によれば、水溶性高分子にリンカーまたは第二のリンカーと結合可能な官能基として、カルボキシル基およびアミノ基以外の官能基を結合させておき、リンカーとの強固な結合を確保することもできる。そのようなカルボキシル基およびアミノ基以外の官能基の例としては、カルボハイドレイト基、スルフィド基、スクシンイミド基、マレイミド基、カルボジイミド基、およびヒドラジド基が挙げられる。
【００３３】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタンとの結合に関与していないカルボキシル基および／またはアミノ基の残基に、生体由来高分子が結合されるのが好ましい。例えば、酸化チタン複合体粒子に抗体等の生体素子を付与すれば、癌細胞へのターゲッティング性能を更に高めることも可能である。
【００３４】
本発明の好ましい態様によれば、リガンド分子と水溶性高分子とを結合する第二のリンカーとして、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基と化学結合を形成する官能基を有する、ポリオール、ポリリン酸、ポリカルボン酸、およびポリアミン以外の化合物をさらに含んでなるのが好ましい。すなわち、リガンド分子に含まれることができるジオール基、サリチル酸基、リン酸基、カルボキシル基、またはアミノ基（以下、第一のリンカーともいう）に第二のリンカーを結合させ、この第二のリンカーに水溶性高分子を結合させることも可能である。この第二のリンカーは、例えば生体分子同士を異なる官能基同士で結合する際に用いられるヘテロバイファンクショナルなクロスリンカーなどが考えられる。第二のリンカーの具体例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−［α−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸、Ｎ−［ε−マレイミドカプロン酸］ヒドラジド、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸、Ｎ−［κ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酪酸ヒドラジド・ＨＣｌ、３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド、Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３´−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル  Ｓ−アセチルチオアセテート、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオネート、スクシンイミジル  ３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル  ヨードアセテート、Ｎ−スクシンイミジル［４−イオドアセチル］アミノベンゾエート、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート、スクシンイミジル６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノネート］、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α［２−ピリジルジチオ］トルエン、Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］−スルホスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノネート、スルホスクシンイミジル６−［３´−（２−ピリジルチチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノネート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート、Ｎ−［ε−トリフルオロアセチルカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル等が挙げられる。また、第二のリンカーはさらに他のリンカー同士が結合されるような複数種類のリンカーから構成されてもよい。
【００３５】
本発明の好ましい態様によれば、水溶性高分子に第一のリンカーまたは第二のリンカーと結合可能な官能基として、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基以外の官能基を結合させておき、リンカーとの強固な結合を確保することもできる。そのような他の官能基の例としては、カルボハイドレイト基、スルフィド基、スクシンイミド基、マレイミド基、カルボジイミド基、およびヒドラジド基が挙げられる。
【００３６】
本発明の好ましい態様によれば、リガンド分子の酸化チタンとの結合に関与していない官能基の残基に水溶性高分子を結合することができる。その結合形態は特に限定されない。上記残基への結合の好ましい例としては、アゾ基を含むポリエチレングリコールとリガンド分子のカルボキシル基を用いたグラフト重合による結合が挙げられるが、それ以外にも、フェノール性水酸基、ビニル基、芳香族環等に対するグラフト重合による結合等も挙げられる。上記残基への結合の他の好ましい例としては、スクシンイミド基を含むポリエチレングリコールとリガンド分子のアミノ基を用いた結合が挙げられるが、それ以外にもカルボハイドレイト基、スルフィド基、スクシンイミド基、マレイミド基、カルボジイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基およびヒドラジド基等の反応性官能基を用いた結合も挙げられる。なお、リガンド分子と水溶性高分子とは、第二のリンカーによって間接的に結合されてもよい。
【００３７】
本発明の好ましい態様によれば、水溶性高分子のリガンド分子との結合に関与していない残基に、蛍光色素や生体由来高分子が結合されるのが好ましい。例えば、酸化チタン複合体粒子に抗体等の生体素子を付与すれば、癌細胞へのターゲッティング性能を更に高めることも可能である。そのような生体由来高分子の結合形態は特に限定されない。上記残基への結合の好ましい例としては、アゾ基を含むポリエチレングリコールとリガンド分子のカルボキシル基を用いたグラフト重合による結合が挙げられるが、それ以外にも、フェノール性水酸基、ビニル基、芳香族環等に対するグラフト重合による結合等も挙げられる。上記残基への結合の他の好ましい例としては、スクシンイミド基を含むポリエチレングリコールとリガンド分子のアミノ基を用いた結合が挙げられるが、それ以外にもカルボハイドレイト基、スルフィド基、スクシンイミド基、マレイミド基、カルボジイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基およびヒドラジド基等の反応性官能基を用いた結合も挙げられる。なお、リガンド分子と水溶性高分子とは、第二のリンカーによって間接的に結合されてもよい。
【００３８】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン粒子が、アナターゼ型酸化チタンまたはルチル型酸化チタンであるのが好ましい。紫外線や超音波の照射による触媒活性を利用する場合にはアナターゼ型酸化チタンが好ましく、化粧料のように高い屈折率等の性質を利用する場合にはルチル型酸化チタンが好ましい。
【００３９】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる酸化チタン複合体粒子は２０〜２００ｎｍの粒子径を有し、より好ましくは５０〜２００ｎｍであり、さらに好ましくは５０〜１５０ｎｍである。この粒径範囲であると、癌腫瘍への到達を目的として患者の体内に投与されると、ドラッグデリバリーシステムのように、ＥＰＲ効果により癌組織に効率的に到達して蓄積される。そして、上述の通り、４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚの超音波や紫外線の照射によりラジカル種の特異的生成が起こる。したがって、超音波や紫外線の照射により高い効率で癌組織を殺傷することができる。
【００４０】
本発明の別の好ましい態様によれば、酸化チタン複合体粒子が５０ｎｍ未満（例えば数ｎｍ）の粒子径を有する場合、見かけ上のサイズを大きくしてＥＰＲ効果を得ることもできる。すなわち、５０〜１５０ｎｍの粒子径を有する二次粒子の形態を有するように半導体粒子同士を多官能リンカーで連結する等の方法にて結合されることで、ＥＰＲ効果により高い癌治療効果を実現することができる。本発明のさらに別の好ましい態様によれば、ＥＰＲ効果を利用するため、リポソームのような薬剤封入体の中に、酸化チタン複合体粒子を包摂させることもできる。
【００４１】
本発明において半導体粒子の粒子径は、動的光散乱法により測定することができる。具体的には、粒径分布測定装置（ゼータサイザーナノ、マルバーンインスツルメント社製）を用いて、キュミュラント解析で得られる  Z-average sizeで示される値として得ることができる。
【００４２】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン複合体粒子が、−２０〜＋２０ｍＶのゼータ電位を有するのが好ましく、より好ましくは−１０〜＋１０ｍＶであり、さらに好ましくは−５〜＋５ｍＶであり、最も好ましくは−３〜＋３ｍＶである。この範囲内であると、酸化チタン複合体粒子が全体として電荷を殆ど帯びないことになるので、ノニオン性の水溶性高分子の使用による、血中滞留性および癌細胞への集積性の向上効果を最大限発揮させることができる。
【００４３】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン複合体単位重量あたりの、カルボキシル基あるいはアミノ基のモル数が、１×１０−９〜１×１０−４ｍｏｌ／ｇであるのが好ましく、より好ましくは１×１０−９〜１×１０−６ｍｏｌ／ｇである。この範囲内であると、酸化チタン複合体粒子の触媒活性を十分に発揮させながら、血中滞留性および癌細胞への集積性を向上できる。
【００４４】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン複合体粒子単位重量あたりの、水溶性高分子の結合量が、０．３〜１．０ｇ／ｇであるのが好ましく、分散性の観点からより好ましくは０．３〜０．５ｇ／ｇである。この範囲内であると、酸化チタン複合体粒子の触媒活性を十分に発揮させながら、血中滞留性および癌細胞への集積性を向上できる。
【００４５】
本発明に使用可能な酸化チタン複合体粒子は、単一種類の酸化チタン複合体粒子のみならず、複数種類の半導体粒子の混合物あるいは複合物も包含する。具体例としては、酸化チタン複合体粒子と酸化鉄ナノ粒子との複合物、酸化チタン複合体粒子と白金との複合物、およびシリカ被覆された酸化チタン等が挙げられる。
【００４６】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン複合体粒子が、溶媒に分散されて分散液の形態とされてなるのが好ましい。これにより、酸化チタン複合体粒子を、点滴、注射、塗布等の種々の方法により、患者の体内に効率的に投与することができる。分散液の液性は限定されず、ｐＨ３〜１０の広範囲にわたって高い分散性を実現可能である。なお、体内投与における安全性の観点から、分散液は、ｐＨ５〜９であるのが好ましく、より好ましくは５〜８、特に中性の液性を有するのが好ましい。また、本発明の好ましい態様によれば、溶媒は水系溶媒であるのが好ましく、さらに好ましくはｐＨ緩衝液または生理食塩水である。水系溶媒の好ましい塩濃度は２Ｍ以下であり、体内投与における安全性の観点から２００ｍＭ以下がより好ましい。酸化チタン複合体粒子は分散体に対して、０．００１〜１質量％以下含有されることが好ましく、より好ましくは０．００１〜０．１質量％である。この範囲内であれば、投与後、２４〜７２時間後に患部（腫瘍）に効果的に粒子を蓄積させることが可能となる。すなわち、患部（腫瘍）に粒子濃度が蓄積しやすくなるとともに、血中での粒子の分散性も確保されて凝集隗が形成しにくくなるため、投与後に血管の閉塞などの二次的弊害を招くおそれも無い。
【００４７】
本発明の酸化チタン複合体粒子は、点滴、注射、塗布等の種々の方法により、患者の体内に投与することができる。特に静脈または皮下による投与経路で用いられることが、粒子の大きさによるＥＰＲ効果と、血中の滞留性を利用して、所謂ＤＤＳ的な治療により、患者の負担を軽減する観点から好ましい。そして、体内に投与された酸化チタン複合体粒子は、ドラッグデリバリーシステムのように、癌組織に到達して蓄積される。
【００４８】
本発明の酸化チタン複合体粒子は、超音波あるいは紫外線の照射を受け、該照射により細胞毒となることができる。この酸化チタン複合体粒子は、体内に投与され、超音波照射を受け、該照射により細胞毒となることで、細胞を殺傷することができるが、体内に限らず、試験管内においても殺対象である細胞を殺傷することができる。本発明において、殺対象は特に限定されないが、癌細胞であるのが好ましい。すなわち、本発明による酸化チタン複合体粒子によれば、超音波や紫外線の照射により活性化して癌細胞を殺傷することができる。また、酸化チタン複合体粒子は、フラーレンや色素等の光増感剤ではないため、患者に投与後の治療段階において光過敏症の問題を生じることがなく、安全性が極めて高い。
【００４９】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン複合体粒子が蓄積された癌組織に超音波処理が行われる。使用する超音波の周波数は、４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚが好ましく、より好ましくは６００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、さらに好ましくは１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚである。超音波の照射時間は治療対象である癌組織の位置および大きさを考慮して適宜決定されるべきであり、特に限定されない。こうして、患者の癌組織を超音波により高い効率で殺傷して、高い癌治療効果を実現することができる。超音波は生体内の深部に外部より到達させることが可能で、本発明の酸化チタン複合体粒子と併せて用いることにより、非侵襲の状態で生体内深部に存在するような患部やターゲット部位の治療が実現できる。さらに、患部やターゲット部位に本発明の酸化チタン複合体粒子が集積することにより、周辺の正常細胞に悪影響を及ぼさない程度の微弱な超音波で本発明の酸化チタン複合体粒子を集積させた局所のみに作用させることができる。
【００５０】
ところで、これらの半導体粒子が超音波の照射により活性化して細胞を殺傷する効果は、超音波照射によりラジカル種を生成させることにより得ることができる。すなわち、これらの半導体粒子が与える生物的殺傷効果はラジカル種の質的・量的な増加にあると考えられる。その理由は以下の通り推察されるが、以下の理由はあくまで仮説であって、本発明は何ら下記説明に限定されるものではない。すなわち、超音波照射のみでは系中には過酸化水素とヒドロキシルラジカルが発生するが、本発明者らの知見によれば、酸化チタンなどの半導体粒子の存在下では、過酸化水素及びヒドロキシルラジカルの生成が促進される。また、これら半導体粒子の存在下、特に酸化チタンの存在下では、スーパーオキサイドアニオンと一重項酸素の生成が促進されるように見受けられる。これらラジカル種の特異的生成は、ナノメートルオーダーの微粒子を用いた場合、超音波照射時の周波数が４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚの範囲、好ましくは６００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲、より好ましくは１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲で顕著に観察される現象であると考えられる。
【００５１】
製造方法
本発明の第一の態様による製造方法によれば、本発明の酸化チタン複合体粒子は、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基で修飾されたノニオン性の水溶性高分子を酸化チタン粒子に結合させることにより、製造することができる。この方法による酸化チタン複合体粒子の製造は、例えば、非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基で修飾されたノニオン性水溶性高分子とを分散させ、得られた分散液を８０〜２２０℃で、例えば１〜１６時間、加熱することにより行うことができる。本発明のより好ましい態様によれば、官能基で修飾されたノニオン性水溶性高分子として、カルボン酸またはアミンと水溶性高分子との共重合体を用いるのが好ましく、より好ましくは、マレイン酸−ポリエチレングリコール系共重合体が挙げられる。
【００５２】
本発明の第二の態様による製造方法によれば、本発明の酸化チタン複合体粒子は、酸化チタン粒子と、リガンド分子と、ノニオン性の水溶性高分子とを同時に分散させて互いに結合させることにより、製造することができる。この方法による酸化チタン複合体粒子の製造は、例えば、非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を備えたリガンド分子と、ノニオン性の水溶性高分子とを分散させ、得られた分散液を８０〜２２０℃で、例えば１〜１６時間、加熱して、酸化チタン複合体粒子を得ることにより行うことができる。
【００５３】
本発明の第三の態様による製造方法によれば、本発明の酸化チタン複合体粒子は、先ず酸化チタン粒子をカルボキシル基を有するリンカーで修飾しておき、酸化チタン粒子に結合されたリンカーの残基に水溶性高分子を結合させることにより、製造することができる。この方法による酸化チタン複合体粒子の製造は、例えば、非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、ポリカルボン酸とを分散させ、得られた分散液を８０〜２２０℃で加熱して、前記ポリカルボン酸が結合された酸化チタン粒子の分散液を得、該分散液に前記官能基で修飾されたノニオン性の水溶性高分子を添加して、ｐＨ８〜１０の水溶液中で反応させて、前記酸化チタン複合体粒子を得ることにより行うことができる。本発明のより好ましい態様によれば、ポリカルボン酸として、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸、アクリル酸−マレイン酸共重合体、アクリル酸−スルフォン酸共重合体を用いるのが好ましく、より好ましくはポリアクリル酸である。これにより、酸化チタン粒子の表面にリンカーを強固に形成することができる。また、上記官能基で修飾されたノニオン性の水溶性高分子の官能基がアミノ基であるのが好ましい。
【００５４】
本発明の第四の態様による製造方法によれば、本発明の酸化チタン複合体粒子は、先ず酸化チタン粒子をアミノ基を有するリンカーで修飾しておき、酸化チタン粒子に結合されたリンカーの残基に水溶性高分子を結合させることにより、製造することができる。この方法による酸化チタン複合体粒子の製造は、例えば、非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、ポリアミンとを分散させ、得られた分散液を８０〜２２０℃で加熱して、前記ポリアミンが結合された酸化チタン粒子の分散液を得、該分散液に前記官能基で修飾されたノニオン性の水溶性高分子を添加して、ｐＨ８〜１０の水溶液中で反応させて、前記酸化チタン複合体粒子を得ることにより行うことができる。本発明のより好ましい態様によれば、ポリアミンとして、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、およびポリアリルアミンを用いるのが好ましく、より好ましくはポリエチレンイミンである。これにより、酸化チタン粒子の表面にリンカーを強固に形成することができる。また、上記官能基で修飾されたノニオン性の水溶性高分子の官能基がスクシンイミド基であるのが好ましい。
【００５５】
本発明の第五の態様による製造方法によれば、本発明の酸化チタン複合体粒子は、先ず酸化チタン粒子をリガンド分子で修飾しておき、酸化チタン粒子に結合されたリガンド分子の残基に水溶性高分子を結合させることにより、製造することができる。この方法による酸化チタン複合体粒子の製造は、例えば、非プロトン系溶媒中に、酸化チタン粒子と、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を備えたリガンド分子とを分散させ、得られた分散液を８０〜２２０℃で、例えば１〜１６時間、加熱して、前記リガンド分子が結合された酸化チタン粒子の分散液を得、該分散液にノニオン性の水溶性高分子を添加して、前記ポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子を得ることにより行うことができる。
【００５６】
上述の各好適態様において、溶媒として、非プロトン系溶媒が用いられている。これは、プロトン系溶媒を使用した場合には、例えば脱水によるエステル結合の形成等の結合反応時に反応を阻害し、高い分散性の実現が困難になるおそれがあるためである。なお、好ましい非プロトン系溶媒の例としては、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、およびジメチルスルホキシドが挙げられる。
【００５７】
本発明の好ましい態様によれば、ポリカルボン酸またはポリアミンが結合された酸化チタン粒子の分散液を得た後、該分散液にノニオン性の水溶性高分子を添加する前に、リンカーと水溶性高分子とを結合するための第二のリンカーを添加して反応させ、第二のリンカーをポリアミンに結合させることも可能である。この第二のリンカーはカルボキシル基およびアミノ基から選択される少なくとも１種の官能基と化学結合を形成する官能基を有する、ポリカルボン酸またはポリアミン以外の化合物であり、その具体例は前述した通りである。
【００５８】
本発明の好ましい態様によれば、リガンド分子が結合された酸化チタン粒子の分散液を得た後、該分散液にノニオン性の水溶性高分子を添加する前に、リンカーと水溶性高分子とを結合するための第二のリンカーを添加して反応させ、第二のリンカーをリガンド分子に結合させることも可能である。この第二のリンカーはジオール基、サリチル酸基、リン酸基、カルボキシル基、およびアミノ基から選択される少なくとも１種の官能基と化学結合を形成する官能基を有する、ポリオール、ポリリン酸、ポリカルボン酸、およびポリアミン以外の化合物であり、その具体例は前述した通りである。
【００５９】
本発明の好ましい態様によれば、上記各好適態様において、ポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子と未結合親水性高分子とを分離し、光触媒性酸化チタン微粒子を精製するのが好ましい。
【実施例】
【００６０】
例１：酸化チタン粒子へのマレイン酸型ポリエチレングリコールの導入
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器ＭＩＤＳＯＮＩＣ２００（カイジョー社製）を用いて２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、分散液０．１ｍｌを石英測定セルに仕込み、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は２０．２ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００６１】
次に、ポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（平均分子量；３３６５９−日本油脂製）１ｇに水５ｍｌを添加して、加水分解後、凍結乾燥を行った。反応終了後、凍結乾燥物をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液５ｍｌに溶解させポリエチレングリコール溶液２００ｍｇ／ｍｌを調製した。得られたポリエチレングリコール溶液１．８７５ｍｌを、２７．７２５ｍｌのDMFに溶液に加え、先に調製したアナタ−ゼ型酸化チタンゾル０．９ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学社製）に溶液を移し変え、１５０℃で５時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１０ｍｌを添加してポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子（ＴｉＯ２／ＰＥＧ）の分散液とした。さらに、ＨＰＬＣ［ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ（アマシャム・バイオサイエンス社製）、カラム：ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャム・バイオサイエンス社製）、移動相：リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ］に付したところ、素通り画分にＵＶ吸収のピークが確認され、この画分を回収した。この分散液を蒸留水で０．０１％水溶液に希釈し、分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにＴｉＯ２／ＰＥＧの分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。キュミュラント解析の結果、分散粒径は４５．４ｎｍ、ゼータ電位は１．１ｍＶであった。
【００６２】
例２：ポリアクリル酸結合酸化チタン微粒子へのポリエチレングリコールの導入
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、石英測定セルに分散液０．１ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は２０．２ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００６３】
この酸性酸化チタンゾル０．６ｍｌをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で２０ｍｌとなるよう調整して分散させ、平均分子量５０００のポリアクリル酸（和光純薬社製）０．３ｇを溶解したＤＭＦ１０ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学社製）に溶液を移し変え、１５０℃で５時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで反応液を冷却し、反応液に対して２倍量のイソプロパノールを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１．５ｍｌの水を加えてポリアクリル酸結合酸化チタン微粒子の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１００倍に希釈し、分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリアクリル酸結合酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は５３．６ｎｍ、ゼータ電位は−４５．０８ｍＶであった。
【００６４】
次に、０．５（ｗ／ｖ）％になるように超純水で調製したこの分散液５ｍｌに対して０．８Ｍ  １−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリドを２５０μｌおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを２５０μｌ加えて、攪拌しながら室温で１時間反応させた。５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化した脱塩カラムＰＤ−１０（アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社製）を用いてゲル濾過を行って溶液交換し、その後に５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて全量を９．５ｍｌとした。この回収した溶液に対して、２０ｍｇ／ｍｌに調整したポリエチレングリコール誘導体（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ３０−Ｔ（日本油脂社製））の水溶液２．５ｍｌを添加し、６時間、室温にて穏やかに攪拌した。この溶液をＶＩＶＡＰＯＲＥ７５００（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ社製）を用いて１ｍｌ容量になるまで濃縮を行い、さらにこの濃縮液をＨＰＬＣ［ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ（アマシャム・バイオサイエンス社製）、カラム：ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャム・バイオサイエンス社製）、移動相：リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ］に付したところ、素通り画分にＵＶ吸収のピークが確認され、この画分を回収した。回収した画分の分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルに回収画分０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。キュミュラント解析の結果、分散粒径は８０．７ｎｍ、ゼータ電位は−６．３２９ｍＶであった。このことから、ポリアクリル酸結合酸化チタン微粒子へのポリエチレングリコールの導入により作製されたＴｉＯ２／ＰＥＧ表面電荷の減少が確認された。
【００６５】
例３：ポリエチレンイミン結合酸化チタン微粒子へのポリエチレングリコールの導入
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、石英測定セルに分散液０．１ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は２０．２ｎｍであった。
【００６６】
得られた酸化チタンゾル３ｍｌを２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に分散させ、平均分子量１００００のポリエチレンイミン（和光純薬社製）４５０ｍｇを溶解したＤＭＦ１０ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学社製）に溶液を移し変え、１５０℃で５時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで反応液を冷却し、反応液に対して２倍量のアセトンを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１．５ｍｌの水を加えてポリエチレンイミン結合酸化チタン微粒子の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１００倍に希釈し、分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレンイミン結合酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は５７．５ｎｍ、ゼータ電位は４７．５ｍＶであった。
【００６７】
次に、この分散液５ｍｌを５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化した脱塩カラムＰＤ−１０を用いてゲル濾過を行い、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶液交換した。この回収した溶液に対して、２０ｍｇ／ｍｌに調整したポリエチレングリコール誘導体（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＣＳ（日本油脂社製））の水溶液２．５ｍｌを添加し、６時間、室温にて穏やかに攪拌した。この溶液をＶＩＶＡＰＯＲＥ７５００（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ社製）を用いて１ｍｌ容量になるまで濃縮を行い、さらにこの濃縮液をＨＰＬＣ［ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ（アマシャム・バイオサイエンス社製）、カラム：ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャム・バイオサイエンス社製）、移動相：リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ］に付したところ、素通り画分にＵＶ吸収のピークが確認され、この画分を回収した。回収した画分の分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルに回収画分０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。キュミュラント解析の結果、分散粒径は５７．６ｎｍ、ゼータ電位は２１．１ｍＶであった。このことから、ポリエチレンイミン結合酸化チタン微粒子へのポリエチレングリコールの導入により作製されたＴｉＯ２／ＰＥＧ表面電荷の減少が確認された。
【００６８】
例４：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の光触媒活性の評価
例１〜３で得られた各ＴｉＯ２／ＰＥＧ分散液を、固形成分が０．０１（ｗ／ｖ）％になるようにＰＢＳで希釈した。メチレンブルー三水和物（和光純薬）を５μＭになるように先に調製したＴｉＯ２／ＰＥＧを含むＰＢＳ溶液に添加した。攪拌しながら、これらの溶液に波長３４０ｎｍの紫外光を５Ｊ／ｃｍ２になるように照射し、６６０ｎｍにおける波長の吸収を紫外−可視光分光光度計により測定した。そして、紫外線を照射しない試料の吸光度を１００％とした場合における、各試料におけるメチレンブルーの分解にともなう吸光度の相対量（％）をメチレンブルー分解率（％）として算出した。結果を図２に示す。図２に示される通り、紫外線を照射した全ての試料においてメチレンブルーの分解にともなう吸光度の減少が認められた。このことから、実施例１〜３で得られたＴｉＯ２／ＰＥＧが光触媒活性を保持していることは明らかである。
【００６９】
例５：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の塩強度安定性の評価
０．０１〜２Ｍの異なる塩化ナトリウムを含む水溶液に例１で得られたＴｉＯ２／ＰＥＧを含む分散液を終濃度０．０２５％になるように添加し、１時間室温にて静置した。その後、ゼータサイザーナノＺＳにて例１と同様に平均分散粒径の測定を行った。結果を図３に示す。図３に示される通り、系中の塩濃度が０．０１から２Ｍの間はほとんど平均分散粒径の変化は認められず、安定した分散性を示すことが明らかになった。
【００７０】
例６：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子のｐＨ安定性の評価
５０ｍＭの、異なるｐＨを有する以下の緩衝液を調製した。
ｐＨ３：グリシン塩酸緩衝液
ｐＨ４および５：酢酸緩衝液
ｐＨ６：２−モルフォリノエタンスルホン酸緩衝液
ｐＨ７および８：２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝液
ｐＨ９：ホウ酸緩衝液
ｐＨ１０：グリシン水酸化ナトリウム緩衝液
これらの緩衝液に、例１で得られたＴｉＯ２／ＰＥＧを含む分散液を終濃度０．０２５（ｗ／ｖ）％になるように添加し、１時間室温にて静置した。その後、ゼータサイザーナノＺＳにて例１と同様に平均分散粒径の測定を行った。結果を図４に示す。ｐＨが３から１０の間で粒径の変化はほとんど認められず、安定した分散性を示すことが明らかになった。
【００７１】
例７：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の血清入り培地中での分散安定性の評価
１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）に対して、例１で得られたＴｉＯ２／ＰＥＧを含む分散液、およびシリカコート酸化チタン微粒子ＳＴＳ２４０（石原産業、分散粒径５２ｎｍ）を終濃度０．０２５％になるようにそれぞれ添加し、１時間および２４時間、室温にて静置した。その後、ゼータサイザーナノＺＳにて例１と同様に平均分散粒径の測定を行った。結果を図５に示す。２４時間静置後、ＴｉＯ２／ＰＥＧの平均分散粒径の変化はほとんどないが、酸化チタン粒子（Ａ）は大きく変化した。さらに７２時間静置後において、シリカコート酸化チタン微粒子ＳＴＳ２４０は沈殿を形成したが、ＴｉＯ２／ＰＥＧの平均分散粒径は８０ｎｍであった。このことから、ＴｉＯ２／ＰＥＧの血清入り培地中での分散安定性を確認した。
【００７２】
例８：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の均一性（透明度）の評価
０．１Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液を用いて、例１で得られたＴｉＯ２／ＰＥＧを含む分散液を終濃度０．１％になるように調整し、１時間室温にて静置した。また、酸化チタン微粒子としてＰ２５（日本アエロジル）を０．１Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液を用いて、同様に終濃度０．１％になるように調整し、１時間室温にて静置した。その後、シャーレに５ｍｌ移し上方から撮影し、確認した。その結果を図６に示す。図中右側に示されるＰ２５水溶液に対して、図中左側に示されるＴｉＯ２／ＰＥＧを含む分散液は明らかに透明度が高く、均一に分散していることが確認された。また、分光光度計（ＵＶ−１６００、島津製作所）を用いて波長６６０ｎｍにおける吸光度の測定を行った結果、Ｐ２５水溶液は吸光度が１を大きく上回り測定不能であったのに対して、ＴｉＯ２／ＰＥＧを含む分散液は吸光度が０．０４２であり、また沈殿の形成は起きていなかった。更に、これらの溶液を室温暗所にて２週間静置した後に、同様に波長６６０ｎｍにおける吸光度の測定を行った結果、Ｐ２５水溶液は吸光度が１を大きく上回り測定不能であったのに対して、ＴｉＯ２／ＰＥＧを含む分散液は吸光度が０．０５２であった。このことから、水溶液中においてＴｉＯ２／ＰＥＧの分散液が透明度の高い、均一な分散性を示し、かつ安定していることが明らかになった。
【００７３】
例９：細胞毒性の評価
例１で得られたＴｉＯ２／ＰＥＧを含む分散液を、固形分が１．０％になるように１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）で調製した。培養ガン細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を、１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）で３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で培養し、５．０×１０４  細胞数／ｍｌとなるように調製した。これを再度２０時間同条件で培養した。この細胞培養液に、上記ＴｉＯ２／ＰＥＧを含む分散液を終濃度で０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％になるように９６穴プレート上で調整し、２００μｌの試験用細胞培養液とした。この試験用細胞培養液を３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で２０時間培養した後、それぞれ１００μｌを用いてＣｅｌｌｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により生細胞由来の発光反応を行い、イメージアナライザＬＡＳ−３０００ＵＶｍｉｎｉ（富士フィルム社製）を用いてその発光量測定を行うことで細胞毒性の評価を行った。そして、何も添加していないコントロールの培養細胞における発光量を１００％とした場合における、各試料における発光量の相対量（％）を生存率（％）として算出した。その結果を図７に示す。図７に示される通り、どの分散液濃度においても同等の発光量、すなわち同等の生存率を確認したことから、この濃度域のＴｉＯ２／ＰＥＧを含む分散液は細胞毒性が認められないことが明らかになった。
【００７４】
例１０：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子への蛍光色素標識
例１より得られたＴｉＯ２／ＰＥＧの分散液２ｍｌに対して、０．８Ｍ  １−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリドを２５０μｌおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを２５０μｌ加えて、攪拌しながら室温で１時間反応させた。１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した脱塩カラムＰＤ−１０（アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社製）を用いてゲル濾過を行って溶液交換し、その後に１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて全量を９．５ｍｌとした。そこへ、ジメチルスルホキシドに溶解させた１００ｍＭ  ５−アミノフルオレセイン（ＮＣＩ社製）を５μｌ加え、遮光下で攪拌しながら室温で１時間反応させた。次に、０．１Ｍのエタノールアミン（和光純薬工業社製）水溶液を５００μｌ加え、遮光下で攪拌しながら室温で３０分間反応させた。この溶液を１００ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．５）で平衡化した脱塩カラムＰＤ−１０を用いてゲル濾過を行って溶液交換し、未反応の５−アミノフルオレセインを分離することにより、蛍光色素標識ＴｉＯ２／ＰＥＧを含む分散液得た。この分散液および５−ａｍｉｎｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光強度を蛍光強度測定計Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＣＦ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した結果、蛍光色素標識ＴｉＯ２／ＰＥＧを含む分散液において５−アミノフルオレセインにして１．８５μＭに相当する蛍光強度が確認された。また、乾燥重量を測定し、この分散液における酸化チタン微粒子の固形分濃度は０．３２（ｗ／ｖ）％であった。このことから、ＴｉＯ２／ＰＥＧの単位重量あたりのカルボキシル基含量を求めた。その結果、前記分散液のカルボキシル基／酸化チタン微粒子量比は、５．８ｘ１０−７（ｍｏｌ／ｇ）であった。
【００７５】
例１１：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子と超音波照射による細胞殺傷試験
例１より得られたＴｉＯ２／ＰＥＧを、終濃度０．０５％となるようにＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）に分散させ、この溶液を、１ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を含む、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１／１０量添加して、試験溶液を調製した。上記得られた試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で１分間超音波を照射して、細胞の殺傷率（％）の測定を行なった。比較のため、同様の試験をＴｉＯ２／ＰＥＧを使用しない場合についても同様の測定を行った。その結果を図８に示す。図８に示される通り、ＴｉＯ２／ＰＥＧを使用しない場合にはわずかにしか認められなかった細胞の殺傷率が、ＴｉＯ２／ＰＥＧを使用することで極めて高くなった。したがって、ＴｉＯ２／ＰＥＧの存在下での超音波照射により細胞を高い効率で殺傷できることが確認された。
【００７６】
例１２：二酸化チタンゾルの作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらにバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性二酸化チタンゾルを調製した。この二酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器ＭＩＤＳＯＮＩＣ２００（カイジョー製）を用いて２００Ｈｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、分散液０．１ｍｌを石英測定セルに仕込み、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は２０．２ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００７７】
例１３：二酸化チタン粒子へのポリエチレングリコールの導入
ポリエチレンオキシドがアゾ基を介して複数結合した重合開始剤ＶＰＥ−０２０１（高分子開始剤分子量Ｍｎ＝約１．５万〜３万：和光純薬工業製）１ｇに水１０ｍｌを添加して、ポリエチレンオキシド重合開始剤溶液１００ｍｇ／ｍｌを調整した。また、リガンド分子としてプロトカテク酸（分子量Ｍｎ＝１５４．１２：和光純薬工業製）０．１５４１２ｇにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業製）溶液１０ｍｌを添加して、プロトカテク酸溶液１００ｍＭを調製した。例１２で得られたアナタ−ゼ型二酸化チタンゾル０．２５ｍｌを５．７５ｍｌのＤＭＦに溶液に加え、得られたプロトカテク酸溶液１．５ｍｌ、ポリエチレンオキシド重合開始剤溶液３ｍｌを添加後、攪拌して混合した。その後、水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、８０℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、反応後の溶液１ｍｌに対してリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ：ｐＨ７．４）を９ｍｌ添加してＰＢＳ希釈溶液を調整した。その希釈溶液２．５ｍｌを脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いてＰＢＳ溶液３．５ｍｌで回収して有機溶媒を除去した酸化チタン複合体粒子の分散液を得た。
【００７８】
作製した酸化チタン複合体粒子の分散粒径を、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス製）を用いて測定した。ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により測定したところ、作製したポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子の平均粒径は２７．３ｎｍであった。また、同様の条件でゼータサイザーナノＺＳを用いてゼータ電位を測定したところ、作製したポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子のゼータ電位は−９．２７ｍＶであった。
【００７９】
例１４：プロトカテク酸結合二酸化チタン微粒子へのポリエチレングリコールの導入
リガンド分子としてプロトカテク酸（分子量Ｍｎ＝１５４．１２：和光純薬工業）０．１５４１２ｇにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業）溶液１０ｍｌを添加して、プロトカテク酸溶液１００ｍＭを調製した。例１２で得られたアナタ−ゼ型二酸化チタンゾル０．２５ｍｌを９．２５ｍｌのＤＭＦに溶液に加え、調製したプロトカテク酸溶液０．５ｍｌを添加後、攪拌して混合した。その後、水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学社製）に溶液を移し変え、１５０℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、反応液に対して２倍量のイソプロパノール２０ｍｌを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１０ｍｌの５０ｍＭホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９）を加えて０．５（ｗｔ／ｖｏｌ）％プロトカテク酸結合二酸化チタン微粒子の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１０倍に希釈し、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにプロトカテク酸結合二酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。その結果、分散粒径は３０．３ｎｍ、ゼータ電位は−２２．６ｍＶであった。
【００８０】
次に、ポリエチレンオキシドがアゾ基を介して複数結合した重合開始剤ＶＰＥ−０２０１（高分子開始剤分子量Ｍｎ＝約１．５万〜３万：和光純薬工業製）１ｇに水１０ｍｌを添加して、ポリエチレンオキシド重合開始剤溶液１００ｍｇ／ｍｌを調整した。先に得られた０．５（ｗｔ／ｖｏｌ）％プロトカテク酸結合二酸化チタン溶液４ｍｌに、調製したポリエチレンオキシド重合開始剤溶液３ｍｌと５０ｍＭホウ酸緩衝液３ｍｌを添加後、攪拌して混合した。その後、水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、６０℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、反応後の溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して溶液交換した酸化チタン複合体粒子の分散液を得た。作製した酸化チタン複合体粒子の分散粒径を、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス製）を用いて、測定した。ゼータ電位測定セルに酸化チタン複合体粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により測定したところ、作製した酸化チタン複合体粒子の平均粒径は４２．２ｎｍであった。また、同様の条件でゼータサイザーナノＺＳを用いてゼータ電位を測定したところ、作製した酸化チタン複合体粒子のゼータ電位は−１０．８ｍＶであった。
【００８１】
例１５：没食子酸結合二酸化チタン微粒子へのポリエチレングリコールの導入
リガンド分子として没食子酸（分子量Ｍｎ＝１７０．１：和光純薬工業製）０．１７０１ｇにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業製）溶液１０ｍｌを添加して、没食子酸溶液１００ｍＭを調製した。例１２で得られたアナタ−ゼ型二酸化チタンゾル０．２５ｍｌを９．２５ｍｌのＤＭＦに溶液に加え、調製した没食子酸溶液０．５ｍｌを添加後、攪拌して混合した。その後、水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、１５０℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、反応液に対して２倍量のイソプロパノール２０ｍｌを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１０ｍｌの水を加えて０．５（ｗｔ／ｖｏｌ）％没食子酸結合二酸化チタン微粒子の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１０倍に希釈し、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルに没食子酸結合二酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。その結果、分散粒径は３２．６ｎｍ、ゼータ電位は−３６．０ｍＶであった。
【００８２】
次に、ポリエチレンオキシドがアゾ基を介して複数結合した重合開始剤ＶＰＥ−０２０１（高分子開始剤分子量Ｍｎ＝約１．５万〜３万：和光純薬工業製）１ｇに水１０ｍｌを添加して、ポリエチレンオキシド重合開始剤溶液１００ｍｇ／ｍｌを調整した。先に得られた０．５（ｗｔ／ｖｏｌ）％没食子酸結合二酸化チタン溶液４ｍｌに、調製したポリエチレンオキシド重合開始剤溶液３ｍｌと塩酸で調製した水溶液（ｐＨ５．５）３ｍｌを添加後、攪拌して混合した。その後、水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、６０℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、反応後の溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いて水３．５ｍｌで回収して溶液交換した酸化チタン複合体粒子の分散液を得た。作製した酸化チタン複合体粒子の分散粒径を、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス製）を用いて、測定した。ゼータ電位測定セルに酸化チタン複合体粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により測定したところ、作製した酸化チタン複合体粒子の平均粒径は４２．５ｎｍであった。また、同様の条件でゼータサイザーナノＺＳを用いてゼータ電位を測定したところ、作製した酸化チタン複合体粒子のゼータ電位は−２０．０ｍＶであった。
【００８３】
例１６：ポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子のポリマー結合量評価
蒸留水に以下の粒子を固形成分が０．２（ｗ／ｖ）％になる様に分散して、サンプルを得た。
・ＴｉＯ２／ＰＥＧ（Ａ）：例１４により作製した酸化チタン複合体粒子
・ＴｉＯ２／ＰＥＧ（Ｂ）：３３ｍｇ／ｍｌのポリエチレンオキシド重合開始剤溶液を用いたこと以外は例３と同様にして作製した酸化チタン複合体粒子
・ＴｉＯ２／ＰＥＧ（Ｃ）：例１５により作製した酸化チタン複合体粒子
・ＴｉＯ２／ＰＥＧ（Ｄ）：３３ｍｇ／ｍｌのポリエチレンオキシド重合開始剤溶液を用いたこと以外は例４と同様にして作製した酸化チタン複合体粒子
【００８４】
この水溶液５ｍｌに対してアセトン（和光純薬工業製）２０ｍｌと５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を０．５ｍｌ加えて十分に撹拌し、沈殿を形成させ、さらに、遠心分離後に上澄を除去した。この沈殿に蒸留水を５ｍｌ加えて混合し、アセトンおよび５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を上記と同様に加えて遠心分離を行う作業を３回繰り返した。つぎに得られた沈殿に蒸留水を５ｍｌ加え、この溶液を蒸留水で平衡化した脱塩カラムＮＡＰ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いてゲル濾過による脱塩を行った。セラミック製の蒸発皿に移し、電熱乾燥器を用いて１００℃１６時間乾燥を行い、乾燥粉末とした。得られた乾燥粉末を用いて示差熱熱重量同時測定装置（ＥＸＳＴＡＲ６３００：ＳＩＩ製）により、空気中にて１００℃で３０分間加熱後、６００℃で３０分間加熱し、重量変化を測定した。その結果を表１に示す。１００℃にて完全に水分を除去した後、６００℃までの重量変化はポリエチレングリコールの燃焼によると考えられ、これらから、それぞれの酸化チタン複合体粒子の単位チタン量あたりのポリマー結合量が示された。
【００８５】
【表１】
2008201797.tif 000003
【００８６】
例１７：二酸化チタン粒子へのメチルドーパ結合ポリエチレングリコールの導入
ポリエチレンオキシドがアゾ基を介して複数結合した重合開始剤ＶＰＥ−０４０１（高分子開始剤分子量Ｍｎ＝約２．５万〜４万：和光純薬工業製）１ｇに水１０ｍｌを添加して、ポリエチレンオキシド重合開始剤溶液１００ｍｇ／ｍｌを調整した。また、リガンド分子としてメチルドーパ（３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２−メチル−Ｌ−アラニン；分子量Ｍｎ＝２１１．２；東京化成工業製）２１１ｍｇに水１０ｍｌを添加して、メチルドーパ溶液１００ｍＭを調整した。メチルドーパ溶液とポリエチレンオキシド重合開始剤溶液を混合し、メチルドーパの終濃度が１０ｍＭ、またポリエチレンオキシドの終濃度が５０ｍｇ／ｍｌとなるように混合水溶液を１０ｍｌ作製した。その後、水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、６０℃で１６時間加熱を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、溶液をすべてナスフラスコに移し替えて一晩凍結乾燥を行い、メチルドーパ結合ポリエチレンオキシドの粉末を５１０ｍｇ得た。この粉末にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業）６ｍｌを添加して混合し、さらにＤＭＦ中でこの混合溶液が終濃度４０（ｖ／ｖ）％、例１２で得られたアナタ−ゼ型二酸化チタンゾルが終濃度で固形成分０．２％となるよう調整し、反応溶液とした。この反応溶液を水熱反応容器のＨＵ−５０に溶液を移し変え、８０℃で１６時間加熱反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１０ｍｌを添加して酸化チタン複合体粒子の分散液とした。
【００８７】
さらに、得られた分散液をＨＰＬＣに以下の条件で付したところ、素通り画分にＵＶ吸収のピークが確認され、この画分を回収した。
・装置：ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）
・カラム：ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）
・移動相：リン酸塩緩衝溶液（ｐH７．４）
・流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
この分散液を蒸留水で０．０１％水溶液に希釈し、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は３７．４ｎｍ、ゼータ電位は−５．３ｍＶであった。
【００８８】
例１８：キナ酸結合二酸化チタン微粒子へのポリエチレングリコールの導入
リガンド分子としてキナ酸（分子量Ｍｎ＝１９２．２：ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）０．１９２２ｇにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業製）溶液１０ｍｌを添加して、キナ酸溶液１００ｍＭを調製した。例１２で得られたアナタ−ゼ型二酸化チタンゾル０．２５ｍｌを９．２５ｍｌのＤＭＦに溶液に加え、調製したキナ酸溶液０．５ｍｌを添加後、攪拌して混合した。その後、水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、１５０℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、反応液に対して２倍量のイソプロパノール２０ｍｌを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１０ｍｌの水を加えて０．５（ｗｔ／ｖｏｌ）％キナ酸結合二酸化チタン微粒子の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１０倍に希釈し、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにキナ酸結合二酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。その結果、分散粒径は２９．３ｎｍであった。
【００８９】
次に、ポリエチレンオキシドがアゾ基を介して複数結合した重合開始剤ＶＰＥ−０４０１（高分子開始剤分子量Ｍｎ＝約２．５万〜４万：和光純薬工業製）１ｇに水１０ｍｌを添加して、ポリエチレンオキシド重合開始剤溶液１００ｍｇ／ｍｌを調整した。先に得られた０．５（ｗｔ／ｖｏｌ）％キナ酸結合二酸化チタン溶液４ｍｌに、調製したポリエチレンオキシド重合開始剤溶液３ｍｌと５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９）３ｍｌを添加後、攪拌して混合した。その後、水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、８０℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、反応後の溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して溶液交換した酸化チタン複合体粒子の分散液を得た。作製したポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子の分散粒径を、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス製）を用いて、測定した。ゼータ電位測定セルに酸化チタン複合体粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により測定したところ、作製した酸化チタン複合体粒子の平均粒径は１７８ｎｍであった。また、同様の条件でゼータサイザーナノＺＳを用いてゼータ電位を測定したところ、作製した酸化チタン複合体粒子のゼータ電位は−２０．０ｍＶであった。
【００９０】
例１９：アミノメチルホスホン酸結合二酸化チタン微粒子へのポリエチレングリコールの導入
リガンド分子としてアミノメチルホスホン酸（分子量Ｍｎ＝１１１．０４：シグマ製）０．１１１ｇにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業製）溶液１０ｍｌを添加して、アミノメチルホスホン酸溶液１００ｍMを調整した。例１２で得られたアナタ−ゼ型二酸化チタンゾル０．２５ｍｌを９．２５ｍｌのＤＭＦに溶液に加え、調製したアミノメチルホスホン酸溶液０．５ｍｌを添加後、攪拌して混合した。その後、水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、１５０℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、反応液に対して２倍量のイソプロパノール２０ｍｌを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１０ｍｌの水を加えて０．５（ｗｔ／ｖｏｌ）％アミノメチルホスホン酸結合二酸化チタン微粒子の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１０倍に希釈し、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルに没食子酸結合二酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。その結果、分散粒径は３０．５ｎｍ、ゼータ電位は−３０．０ｍＶであった。
【００９１】
次に、ポリエチレンオキシドがアゾ基を介して複数結合した重合開始剤ＶＰＥ−０２０１（高分子開始剤分子量Ｍｎ＝約１．５万〜３万：和光純薬工業製）１ｇに水１０ｍｌを添加して、ポリエチレンオキシド重合開始剤溶液１００ｍｇ／ｍｌを調整した。先に得られた０．５（ｗｔ／ｖｏｌ）％アミノメチルホスホン酸結合二酸化チタン溶液４ｍｌに、調製したポリエチレンオキシド重合開始剤溶液３ｍｌと塩酸で調製した水溶液（ｐＨ５．５）３ｍｌを添加後、攪拌して混合した。その後、水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学社製）に溶液を移し変え、６０℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、反応後の溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して溶液交換した酸化チタン複合体粒子の分散液を得た。作製した酸化チタン複合体粒子の分散粒径を、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス製）を用いて、測定した。ゼータ電位測定セルに酸化チタン複合体粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により測定したところ、作製した酸化チタン複合体粒子の平均粒径は５０．０ｎｍであった。また、同様の条件でゼータサイザーナノＺＳを用いてゼータ電位を測定したところ、作製した酸化チタン複合体粒子のゼータ電位は−２０．０ｍＶであった。
【００９２】
例２０：４−アミノサリチル酸結合二酸化チタン微粒子へのポリエチレングリコールの導入
リガンド分子として４−アミノサリチル酸（分子量Ｍｎ＝１５３．１４：ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）０．１５３１４ｇにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業製）溶液１０ｍｌを添加して、４−アミノサリチル酸溶液１００ｍＭを調製した。例１２で得られたアナタ−ゼ型二酸化チタンゾル０．２５ｍｌを９．２５ｍｌのＤＭＦに溶液に加え、調製した４−アミノサリチル酸溶液０．５ｍｌを添加後、攪拌して混合した。その後、水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、１５０℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、反応液に対して２倍量のイソプロパノール２０ｍｌを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１０ｍｌの水を加えて０．５（ｗｔ／ｖｏｌ）％４−アミノサリチル酸結合二酸化チタン微粒子の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１０倍に希釈し、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルに４−アミノサリチル酸結合二酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。その結果、分散粒径は３２．７ｎｍであった。
【００９３】
次に、この分散液５ｍｌを５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いてゲル濾過を行い、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶液交換した。この回収した溶液に対して、２０ｍｇ／ｍｌに調整したポリエチレングリコール誘導体（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＣＳ（日本油脂製））の水溶液２．５ｍｌを添加し、６時間、室温にて穏やかに攪拌した。この溶液をＶＩＶＡＰＯＲＥ７５００（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ社製）を用いて１ｍｌ容量になるまで濃縮を行った。
【００９４】
さらに、この濃縮液をＨＰＬＣに以下の条件で付したところ、素通り画分にＵＶ吸収のピークが確認され、この画分を回収した。
・装置：ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）
・カラム：ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）
・移動相：リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）
・流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
回収した画分の分散粒径およびゼータ電位をゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス製）を用いて、測定した。ゼータ電位測定セルに酸化チタン複合体粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により測定したところ、作製した酸化チタン複合体粒子の平均粒径は４５．９ｎｍであった。また、同様の条件でゼータサイザーナノＺＳを用いてゼータ電位を測定したところ、作製した酸化チタン複合体粒子のゼータ電位は−２．０ｍＶであった。
【００９５】
例２１：ポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子の塩強度安定性の評価
０．０１〜０．５Ｍの異なる塩化ナトリウムを含む水溶液に例１３で得られた酸化チタン複合体粒子を含む分散液を終濃度０．０２５％になるように添加し、１時間室温にて静置した。その後、ゼータサイザーナノＺＳにて実施例１と同様に平均分散粒径の測定を行った。結果を図９に示す。図９に示されるように、系中の塩濃度が０．０１から０．２５Ｍの間はほとんど平均分散粒径の変化は認められず、安定した分散性を示すことが明らかになった。
【００９６】
例２２：酸化チタン複合体粒子のｐＨ安定性の評価
下記の通り５０ｍＭの異なるｐＨを持つ緩衝液を作成し、終濃度０．０２５（ｗ／ｖ）％になるように、例１５で得られた酸化チタン複合体粒子を含む分散液を添加し、1時間室温にて静置した。
・ｐＨ５：酢酸緩衝液
・ｐＨ６：２−モルフォリノエタンスルホン酸緩衝液
・ｐＨ７およびｐＨ８：２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝液
・ｐＨ９：ホウ酸緩衝液
その後、ゼータサイザーナノＺＳにて例１２と同様に平均分散粒径の測定を行った。結果を図１０に示す。図１０に示されるように、ｐＨが５から９の間で粒径の変化はほとんど認められず、安定した分散性を示すことが明らかになった。
【００９７】
例２３：酸化チタン複合体粒子のタンパク質溶液中での分散安定性の評価
１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ製）に対して、例１５で得られた酸化チタン複合体粒子を含む分散液を終濃度０．０２５％になるように添加し、１時間、２４時間および７２時間、室温にて静置した。その後、ゼータサイザーナノＺＳにて例１と同様に平均分散粒径の測定を行った。結果を図１１に示す。図１１に示されるように、７２時間静置後において、酸化チタン複合体粒子の粒径の変化はほとんど認められず、安定した分散性を示すことが明らかになった。
【００９８】
例２４：酸化チタン複合体粒子の光触媒活性の評価
例１３〜例１５で得られた酸化チタン複合体粒子を固形成分が０．０１（ｗ／ｖ）％になる様にＰＢＳで希釈した。メチレンブルー三水和物（和光純薬製）を５μＭになる様に先に調製した酸化チタン複合体粒子を含むＰＢＳ溶液に添加した。攪拌しながら、本溶液に波長３４０ｎｍの紫外光を５Ｊ／ｃｍ２になるように照射し、６６０ｎｍにおける波長の吸収を紫外−可視光分光光度計により測定した。結果を図１２に示す。図１２に示されるように、紫外線を照射しないサンプルが１００％とした場合、照射したサンプルは、全ての試料でメチレンブルーの分解にともなう吸光度の減少が認められた。このことから、例１３〜例１５で得られた酸化チタン複合体粒子が光触媒活性を保持していることは明らかである。
【００９９】
例２５：二酸化チタン粒子への４−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコールの導入
ポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（平均分子量；３３６５９−日本油脂製）１ｇに水５ｍｌを添加して加水分解した。こうして得られた溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学製）を、超純水を用いてそれぞれ濃度が５０ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍＭとなるように混合しながら調整した。調整した溶液に４−アミノサリチル酸（分子量Ｍｎ＝１５３．１４：ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を濃度１００ｍＭになるよう混合して４ｍｌの溶液を得た。この溶液を室温にて７２時間振とう撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液を透析膜であるスペクトラ／ポア  ＣＥ  透析用チューブ（分画分子量＝３５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移して超純水４ｌに対して室温にて２４時間で透析を行った。透析後にすべてナスフラスコに移し替えて一晩凍結乾燥し、得られた粉末に４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業）を添加して混合し、４−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコール溶液とした。
【０１００】
次にＤＭＦを用いて４−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコール溶液が終濃度２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％、例１２で得られたアナタ−ゼ型二酸化チタンゾルが終濃度で固形成分０．２５％となるよう調整し、２．５ｍｌの反応溶液とした。この反応溶液を水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、８０℃で６時間加熱反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１ｍｌを添加してポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子の分散液とした。さらに、ＨＰＬＣ：ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、カラム：ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、移動相：リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ］に付したところ、素通り画分にＵＶ吸収のピークが確認され、この画分を回収した。この分散液を蒸留水で０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％水溶液に希釈して７２時間静置後、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルに酸化チタン複合体粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は４９．５ｎｍ、ゼータ電位は０．１９６ｍＶであった。
【０１０１】
例２６：酸化チタン複合体粒子への１４Ｃ標識カテコール結合
例２５で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水に分散して固形成分１％とした。次に、１４Ｃ標識カテコールを超純水で１０ｍＭのモル濃度に調整した。酸化チタン複合体粒子１％溶液に対して１４Ｃ標識カテコール溶液を等量混合し、ＰＢＳ緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で最終的に酸化チタン複合体粒子と１４Ｃ標識カテコール溶液がそれぞれ終濃度で１０倍希釈になるように調整した。調整した溶液をそれぞれ恒温器に移して４０℃に設定し、３時間結合反応を行った。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、それぞれの溶液について増大が認められたため、１４Ｃ標識カテコールが結合したと考えられた。
【０１０２】
さらに、この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応のカテコールを除去した。回収した溶液を超純水で０．０１重量％の固形分濃度に希釈した後、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、例１２と同様に平均分散粒径の測定を行った。その結果、分散粒径は３５．７ｎｍであった。これらから、１４Ｃ標識カテコール結合酸化チタン複合体粒子の作製を確認した。
【０１０３】
例２７：血中滞留性および腫瘍集積性に関する動物試験
例２６で得られた１４Ｃ標識カテコール結合酸化チタン複合体粒子を固形分濃度が０．０５重量％となるようＰＢＳ緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で調整し、試験溶液を得た。ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の背中にヒト膀胱癌由来細胞Ｔ−２４を接種（２．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ、５０μｌ）し、腫瘍形成を行った腫瘍マウス（９〜１０週齢）を用意した。試験溶液１００μｌをシリンジにより尾静脈投与を行った。投与後、経時的に臓器採取および採血を行い、測定サンプルとした。測定サンプルは炭素化後に加速器質量分析法によって放射能測定を行った。その結果、投与８時間後と４８時間後における濃度比は０．２９で、血中滞留性が高いことが示された。また、表２に示されるように腫瘍における濃度と正常細胞（筋肉）における濃度の比（Ｔ／Ｎ比）は、２４時間後において２．５６となり、腫瘍蓄積性が高いことが確認された。
【０１０４】
【表２】
2008201797.tif 000004
【０１０５】
例２８：酸化チタン複合体粒子へのカテコール結合
例２５で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水で１重量％の固形分濃度に希釈した。次に、カテコールを超純水で１０ｍＭのモル濃度に調整した。酸化チタン複合体粒子１重量％溶液に対してそれぞれのカテコール溶液を等量ずつ混合し、ＰＢＳ緩衝溶液リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で最終的に酸化チタン複合体粒子とカテコール溶液がそれぞれ終濃度で１０倍希釈になるように調整した。調整した溶液をそれぞれ恒温器に移して４０℃に設定し、３時間結合反応を行った。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、それぞれの溶液について増大が認められたため、カテコールが結合したと考えられた。
さらに、この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応のカテコールを除去した。これらからカテコール結合酸化チタン複合体粒子の作製を確認した。
【０１０６】
例２９：二酸化チタン粒子への４−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコールの導入
ポリエチレングリコールの片末端イソシアネート基修飾体（平均分子量；２００００、ＳＵＮＢＩＯ製）および４−アミノサリチル酸（分子量Ｍｎ＝１５３．１４：ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）がそれぞれ終濃度３ｍＭとなるように、ジメチルホルムアミドを用いて調整し、２ｍｌの反応溶液を得た。この反応溶液を７０℃で２４時間加熱反応を行った。得られた溶液をエバポレーターを用いてジメチルホルムアミドの除去を行った。除去を確認した後、超純水を２０ｍｌ添加し、水溶液とした。得られた水溶液を透析膜であるスペクトラ／ポア  ＣＥ  透析用チューブ（分画分子量＝３５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移して超純水４ｌに対して室温にて２４時間で透析を行った。透析後にすべてナスフラスコに移し替えて一晩凍結乾燥し、得られた粉末に２．５ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業）を添加して混合し、４−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコール溶液を得た。
【０１０７】
４−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコール溶液に対して、例１２で得られたアナタ−ゼ型二酸化チタンゾルが固形成分２％となるようジメチルホルムアミドを用いて調整した溶液を等量混合し、２．５ｍｌの反応溶液を得た。この反応溶液を水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、１５０℃で１６時間加熱反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１ｍｌを添加してポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子の分散液とした。さらに、ＨＰＬＣ：ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、カラム：ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、移動相：リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ］に付したところ、素通り画分にＵＶ吸収のピークが確認され、この画分を回収した。この分散液を蒸留水で０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％水溶液に希釈して１時間静置後、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は１５２ｎｍであった。
【０１０８】
例３０：安全性に関わる単回投与試験
例２５で得られた酸化チタン複合体粒子を、固形分濃度がそれぞれ、１重量％、０．５重量％および０．０５重量％となるようＰＢＳ緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で調整し、試験溶液を得た。それぞれの濃度の試験溶液に対して、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）を５匹ずつ用意した。ヌードマウス一匹につき試験溶液１００μｌをシリンジにより尾静脈投与を行った。投与後、２４時間において観察を行った結果、死亡したマウスは０匹であった。これらから、単回投与試験による酸化チタン複合体粒子の安全性を確認した。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】本発明の酸化チタン複合体粒子の一例を示す図であり、１は酸化チタン粒子を、２はノニオン性の水溶性高分子を示す。
【図２】例４において測定された、例１〜３で得られた各ＴｉＯ２／ＰＥＧ分散液を用いた場合におけるメチレンブルーの分解率（％）を示す図である。
【図３】例５において測定された、例１で得られたＴｉＯ２／ＰＥＧの平均分散粒径と、分散液中の塩化ナトリウム濃度との関係を示す図である。
【図４】例６において測定された、例１で得られたＴｉＯ２／ＰＥＧの平均分散粒径と、分散液のｐＨとの関係を示す図である。
【図５】例７において測定された、ＴｉＯ２／ＰＥＧと、酸化チタン粒子との、室温で１時間および２４時間静置した後における、平均分散粒径を示す図である。
【図６】例８において撮影された、０．１Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で処理され１時間室温にて静置された後の、酸化チタン微粒子分散液と、例１で得られたＴｉＯ２／ＰＥＧを含む分散液との画像である。図中右側に酸化チタン微粒子分散液が入ったシャーレが示され、図中左側にＴｉＯ２／ＰＥＧを含む分散液が入ったシャーレが示される。
【図７】例９において測定された、例１で得られたＴｉＯ２／ＰＥＧ分散液を用いた場合における、ＴｉＯ２／ＰＥＧ濃度と細胞の生存率（％）との関係を示す図である。
【図８】例１０において測定された、例１より得られたＴｉＯ２／ＰＥＧを使用した場合と使用しなかった場合とにおける、細胞の殺傷率（％）を示す図である。
【図９】例２１において測定された、例１３で得られたポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子の平均分散粒径と、分散液中の塩化ナトリウム濃度との関係を示す図である。
【図１０】例２２において測定された、例１５で得られたポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子の平均粒径と、分散液のｐＨとの関係を示す図である。
【図１１】例２４において測定された、例１５で得られたポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子と、時間との関係を示す図である。
【図１２】例２５において測定された、例１３〜例１５で得られた各ポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子に本溶液に波長３４０ｎｍの紫外光を５Ｊ／ｃｍ２になるように照射した場合の、メチレンブルーの分解にともなう吸光度の減少、すなわちメチレンブルーの分解率を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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