(57)【要約】【課題】本発明の目的は、単一生体分子等を固定できる微粒子等を１個ずつμｍオーダーの間隔で基板等に規則正しく、高速かつ安価に配置することに関する。【解決手段】  本発明は、所定確率で微粒子等を含む液滴を基板等に配置し、所定位置における微粒子等の存在を判定し、基板等の所定位置に微粒子等を配置することに関する。より具体的には、例えば、計測の対象となる単一の分子を保持する単一の微粒子を、光透過性を持つ基板上に規則正しく複数配置する方法である。単一生体分子を固定した金属微粒子を含んだ液滴をインクジェット法により基板上に吐出し、固定する。また、吐出される液滴内に含まれる微粒子の数を０.１ 個〜１以下になるように微粒子を含む溶液の濃度を調整する。また、暗視野顕微鏡法を用いて、基板上に吐出された液滴中内の微粒子の個数を実時間で計測する。また、基板はＸＹ方向に駆動が可能であり、基板の任意の領域に液滴を吐出できる。【選択図】図１
2008249446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子を含む溶液を準備し、
溶液の液滴を基板の所定位置に吐出し、
基板の所定位置における微粒子の存在を判定し、
微粒子を基板の所定位置に配置する微粒子配置方法であって、
吐出される液滴に含まれる微粒子の数が０.１ 〜１個となるように、微粒子を含む溶液の濃度を調整する方法。
【請求項２】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
インクジェット方式により、溶液の液滴を基板の所定位置に吐出することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２記載の微粒子配置方法であって、
前記インクジェット方式が、ノズルの先端への電圧引火によることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
前記液滴の体積が、フェムトリットル程度であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
基板の所定位置における微粒子の個数を計測することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
光を用いた計測法により、基板の所定位置における微粒子の存在を判定することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
暗視野顕微鏡法により、基板の所定位置における微粒子の存在を判定することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
前記基板が、光透過性を持つことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
前記基板が、ガラス、又は石英ガラスであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
液滴を基板の所定位置に吐出し、当該基板を所定距離移動し、当該基板の新たな位置に液滴を吐出することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
基板の所定位置における微粒子の存在を判定し、当該所定位置に微粒子が存在しなかった場合に、再度、当該所定位置に液滴を吐出することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
前記微粒子が、１本鎖オリゴＤＮＡを保持していることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
前記微粒子が、核酸，タンパク質，糖鎖，糖脂質，ペプチド、又はオリゴを保持していることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
前記微粒子が、その直径が５〜１００ｎｍである金属微粒子であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
前記微粒子が、基板に、格子状に配置されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
基板に配置された微粒子の間隔が、０.１ 〜１０μｍであることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
前記微粒子が、前記基板に１０の５〜１０乗個配置されていることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
ステッピングモータ，エンコーダ付きステッピングモータ，リニアモータ，エンコーダ付きリニアモータ、又はピエゾにより、前記基板を移動させることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
ビオチンとストレプトアビジンとの結合により、前記微粒子が前記基板に保持されていることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１記載の微粒子配置方法であって、
化学的な共有結合により、前記微粒子が前記基板に保持されていることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０何れかの方法により作成された、基板の所定位置に微粒子が配置されたデバイス。
【請求項２２】
基板を保持する手段と、
基板の所定位置に、微粒子を０.１〜１個含む液滴を吐出する手段と、
基板の所定位置における微粒子の存在を判定する手段と、を含み、
請求項１〜２０何れかの方法により、
基板の所定位置に微粒子が配置されたデバイスを作成する、デバイス作成装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微粒子を基板の所定位置に配置する微粒子配置方法に関する。例えば、単一の生体分子を保持した単一の微粒子の基板上への配列方法、これを用いて作製したデバイス、及びその作製装置に関する。より具体的には、例えば、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸の塩基配列を解読するためのデバイスの製造方法に係わる。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの塩基配列を解読する作業は、ＤＮＡシーケンスと呼ばれる。現在、ＤＮＡシーケンシングは、巧妙なＤＮＡ断片調整法であるサンガー法と、キャピラリー電気泳動法とを組み合わせた方法が広く普及している。しかし、テーラーメイド医療などの観点から、安価かつ簡便な新規ＤＮＡシーケンシング技術の開発が世界的に進められている。次世代シーケンシングの代表的な方法としてParallel bead assay法、Sequence by ligation 法などを挙げることができる。それらの技術の中でも、非特許文献１，２にみられるように、単分子シーケンシング方式は、ＤＮＡの分子数までカウントすることが可能であると同時に、コストの面でもＰＣＲを用いないため安価であり、期待されている。
【０００３】
単分子シーケンス方式においては、非特許文献３にあるように、基板にＤＮＡなどをランダムに固定して、その塩基配列を決定する方法が提案されている。分析すべき試料DNA断片を基板表面に１分子ずつランダムに固定し、ほぼ１塩基ずつ伸張させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定するものである。
【０００４】
一方、ナノ粒子、特に金属ナノ粒子、あるいは金属微粒子は、ナノ材料として期待されている。非特許文献４に報告されているように、一般に結晶を持つ材料は、周りを同種の原子で囲まれているほうがエネルギー的には低く安定になる。反対に、隣に原子が存在しない表面などでは、結合のために伸ばした原子の手が結合相手を見つけられず不安定な状態になる。即ち、表面に存在する原子はエネルギー的にバルク中よりも高い状態になるので、金属粉末は内部のエネルギーに対して表面積の割合が大きくなると不安定になる。次第にサイズを小さくしてナノレベルに到達することで、バルクでは考えられない様々な物性が予測されるようになってきている。
【０００５】
また、１分子蛍光は微弱であるが、近年、蛍光の増強法として、金表面にエバネッセント波をカップルさせると表面プラズモン波が発生することが知られている。非特許文献５などには、この表面プラズモン波を用いた１分子蛍光の増強が報告されている。更に、孤立したナノ粒子である金微粒子に蛍光分子を固定すると、金微粒子近傍に強力な電磁場が発生し、蛍光発光が１０倍以上増強される。
【０００６】
また、１本鎖オリゴＤＮＡ分子を１個の金微粒子上に固定する方法が、特許文献６に報告されている。オリゴＤＮＡと金微粒子を混合し、オリゴＤＮＡ末端の官能基を金微粒子表面上に共有結合させる。この後、ゲル電気泳動を行い、１本の１本鎖オリゴＤＮＡを固定した金微粒子を選択的に回収する。この方法により１本の１本鎖オリゴＤＮＡを固定した金微粒子を調整することが可能である。
【０００７】
また、インクジェット技術を用いて製造したオリゴＤＮＡマイクロアレイが販売されている。スライドガラス上にヌクレオチド合成試薬を正確な位置に順次スポットすることにより、スライド上でホスホアミダイト反応を行う。これを６０回繰り返すことにより、スライドガラス上で６０塩基長のオリゴをin situ 合成する。スライドガラス上に異なる塩基配列からなるスポットを４万以上形成することが可能である。スポット径は２０μｍである。この技術については非特許文献７に述べられている。
【０００８】
一方、現在実用化されているインクジェット方式（ピエゾ方式やサーマル方式）では４ピコリットル（直径２０μｍ程度の球体積に相当）を下回るような微小量の液体の吐出は困難であった。しかし、特許文献１にあるように、近年超微細径のノズルを用いることで超微細径の流体液滴の吐出が可能となってきている。これらの技術革新により、従来技術と比較して１／１０００以下であるフェムトリットル（直径１μｍ程度の球体積に相当）の超微細液滴の吐出が可能となっている。この技術により、安定分散した金属ナノ粒子ペーストをインクとして用い、ガラス基板やポリイミド基板上に数μｍ幅の金属微細配線の直接描画が報告されている。
【０００９】
また、ｎｍ程度の金属微粒子を簡便に観察する手段として暗視野顕微鏡法を挙げることができる。暗視野顕微鏡は、非特許文献８に詳しく説明されている。暗視野顕微鏡法は、試料へ斜めから光を照射して、生じた散乱光や反射光を観察する方法である。この方法では、明視野顕微鏡とは逆に、視野の背景が黒く抜け、試料が光って見える。また、通常の光学顕微鏡に暗視野コンデンサーを挿入するだけでこの方法が実現できる。物体表面や内部の微細な構造の観察には不向きであるが、可視光の波長よりも小さな物体の存在を高いコントラストで観察することが可能である。暗視野顕微鏡法によれば直径２０ｎｍのべん毛線維もはっきりと観察可能である。高輝度照明を用いて屈折率の高い直径４ｎｍの金属微粒子を検出することも可能である。ただし、タンパク質からなる生体超分子を溶液中で観察する場合、直径１５ｎｍ程度が限界である。
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−１６５５８７
【非特許文献１】Nature,vol437,pp376,2005
【非特許文献２】Science, vol309, pp1728, 2005
【非特許文献３】Proc.Natl.Acad.Sci.USA, vol.100(7), pp3960, 2003
【非特許文献４】『金属ナノ粒子ペーストのインクジェット微細配線』、pp.3, シーエムシー出版、2006
【非特許文献５】Physical Review Letters, vol97, pp017402, 2006
【非特許文献６】Nano Lett, vol1, pp32, 2001
【非特許文献７】『ラボマニュアル  ＤＮＡチップとリアルタイムＰＣＲ』、pp46, 講談社サイエンティフィク、２００６
【非特許文献８】『限界に迫る生物顕微鏡』、pp17，学会出版、1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本願発明者が鋭意検討した結果、次のことが判明した。
【００１２】
上述したように、従来の単分子シーケンス方式では、分析すべき試料ＤＮＡ断片分子が基板面にランダムに固定される。それ故、例えば、ＤＮＡ分子同士の間隔が平均１μｍになるように調整した場合、分子間の距離が１μｍより大きな場合もあれば、１μｍより近接する場合も存在する。従って、ＤＮＡ分子が基板面にランダムに固定される場合、DNA分子同士の平均間隔より細かな間隔で蛍光像を検出する必要がある。平均間隔１μｍでランダムに固定されたＤＮＡ分子を互いに分離して検出するためには、基板面に換算して、１μｍの数１０分の１間隔で計測する必要がある。つまり、ＤＮＡ分子がランダムに固定されている場合とＤＮＡ分子が格子状に規則正しく理想的に固定されている場合とを比較すると、前者では計測に数１００倍の画素数が必要になる。高画素数の２次元センサは低画素数のそれよりも高価である為、検出系の２次元センサのコストを低減させるために、ＤＮＡ分子を基板に１μｍ程度の間隔で規則正しく固定することが望まれる。
【００１３】
また、金微粒子を基板上に規則正しく配置する方法として、ＥＢ法が考えられる。電子線により、１μｍ間隔で１０−１００ｎｍ程度の大きさのレジストを除去し、その露出面を官能基で修飾し、金微粒子と共有結合させる方法である。しかし、ＥＢ法は電子線で一筆書きするものであるため、スループットの向上が難しく、また、コストがかかるという問題も予想される。ＥＢ法を、金微粒子を規則正しく固定した基板の量産に用いることは困難と考えられる。従って、低コストで金微粒子を基板上に規則正しく効率よく配置する方法が求められた。
【００１４】
計測の対象となる単一生体分子を固定した金属微粒子を１個ずつμｍオーダーの間隔で基板上に規則正しく、高速かつ安価に配置する方法は報告されていない。
【００１５】
本発明の目的は、単一生体分子等を固定できる微粒子等を１個ずつμｍオーダーの間隔で基板等に規則正しく、高速かつ安価に配置することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、所定確率で微粒子等を含む液滴を基板等に配置し、所定位置における微粒子等の存在を判定し、基板等の所定位置に微粒子等を配置することに関する。
【００１７】
より具体的には、例えば、計測の対象となる単一の分子を保持する単一の微粒子を、光透過性を持つ基板上に規則正しく複数配置する方法である。単一生体分子を固定した金属微粒子を含んだ液滴をインクジェット法により基板上に吐出し、固定する。また、吐出される液滴内に含まれる微粒子の数を０.１個 〜１以下になるように微粒子を含む溶液の濃度を調整する。また、暗視野顕微鏡法を用いて、基板上に吐出された液滴中内の微粒子の個数を実時間で計測する。また、基板はＸＹ方向に駆動が可能であり、基板の任意の領域に液滴を吐出できる。
【００１８】
デバイス作成装置では、例えば、基板の上方から基板に対して微粒子を吐出し、基板の下方から微粒子の個数および有無を暗視野顕微鏡により計測する。基板は、ＸＹ方向に任意に駆動できる。得られた微粒子数の情報から、微粒子が固定されていない領域に対して再度インクジェット法により液滴を吐出する。これを繰り返すことにより、最終的に基板上に計測の対象となる単一の分子を保持する単一微粒子を基板上に規則正しく複数配置できる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、微粒子等をμｍオーダーの間隔で基板等に高速かつ安価に配置できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。尚、図面はもっぱら発明の理解に用いるものであり、権利範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２１】
本実施例では、単一生体分子を固定した金微粒子を基板上に規則正しく複数配置する方
法、これを用いて作製したデバイス、及び、このデバイス作製装置について、図１を用いて説明する。
【００２２】
本実施例の微粒子配置方法は、微粒子を含む溶液を準備し、溶液の液滴を基板の所定位置に吐出し、基板の所定位置における微粒子の存在を判定し、微粒子を基板の所定位置に配置する。
【００２３】
また、本実施例のデバイス作製装置は、計測の対象となる単一の分子を保持する微粒子を保持できる基板を２次元方向に任意の距離に移動させる手段と、基板上に微粒子を１個ずつ配置する手段と、基板上において微粒子の存在・非存在あるいは個数を計測する手段と、基板これら手段を統合して制御し、基板上の異なる位置に複数の微粒子を１個ずつ規則正しく複数配置する手段とを有する。
【００２４】
また、微粒子を基板上に配置する方法が、インクジェット方式によるものであり、超微細径のノズルの先端への電圧引火によって、微粒子を含む流体液滴を基板に吐出する。
【００２５】
また、基板が光透過性である。
【００２６】
また、基板上に吐出された流体液滴に含まれる微粒子の存在・非存在あるいは個数を、暗視野顕微鏡法により計測する手段を有する。
【００２７】
また、流体液滴を１液滴基板上に配置するごとに、基板を一定距離移動させ、基板の新たな位置に再び流体液滴を吐出する動作を繰り返すことにより、複数の微粒子を１個ずつ基板上の異なる位置に規則正しく複数配置する手段を有する。
【００２８】
また、暗視野顕微鏡法によって微粒子の存在が検出されなかった位置にノズルが位置するように基板を移動させ、再度流体液滴を吐出する。
【００２９】
また、暗視野顕微鏡法によって基板上に微粒子の存在が検出されるまで連続して流体液滴の吐出を繰り返し、微粒子の存在が検出された場合に、基板を一定距離移動させる動作を繰り返すことにより、基板上の異なる位置に複数の微粒子を１個ずつ規則正しく配置する。
【００３０】
また、基板を移動させる手段が、ステッピングモータあるいはピエゾにより構成される手段である。
【００３１】
また、インクジェット方式の超微細径のノズルより吐出される流体液滴の体積がフェムトリットル程度であり、ノズルの直径が０.５から１.５μｍ程度である。
【００３２】
また、インクジェット方式の超微細径のノズルを複数に配置し、ノズルによる流体液滴の吐出を独立に制御する。
【００３３】
また、ビオチンとストレプトアビジンとの結合や、化学的な共有結合により、微粒子を基板に配置している。
【００３４】
本装置では、インクジェット方式のノズル１０１，光透過性を持つ基板１０２，暗視野顕微鏡用対物レンズ１０４，暗視野観察用光源１０８，ダイクロイックミラー１０９，
２次元センサカメラ１０５，制御ＰＣ１０６，ステージ駆動モータ１１０，任意波形発生装置１１１，高電圧アンプ１０７，圧力調整器１１２から構成される。本実施例ではノズル１０１，暗視野顕微鏡用対物レンズ１０４，２次元センサカメラ１０５が同一光軸上に配置される。また、暗視野観察用光源１０８は光軸に対して垂直に配置される。
【００３５】
制御ＰＣ１０６からの吐出信号は任意波形発生装置１１１に送られる。任意波形発生装置１１１で発生した電圧は高電圧アンプ１０７を通して、ノズル１０１内の電極へと伝えられる。ノズル１０１内の溶液は帯電し、基板に対して液滴１０３が吐出される。
【００３６】
インクジェット方式のノズル１０１の直径は０.０１μｍ 〜２５μｍである。ノズル
１０１はフェムトリットル、つまり直径０.１μｍから１.５μｍの流体である液滴１０３を基板１０２に対して吐出することができる。暗視野顕微鏡用対物レンズ１０４は暗視野観察用光源１０８からの照明光を金微粒子の結像には用いず、金微粒子によって散乱された光だけを結像させる。そのために、暗視野顕微鏡用対物レンズ１０４は開口絞り機構を持つ。照明光が直接暗視野顕微鏡用対物レンズ１０４に入射しないように、開口絞りを適切な調整する。また、本実施例において暗視野観察用光源１０８はハロゲンランプを用いたが、これを水銀ランプ，キセノンランプ、更にはレーザー光を観察用光源として用いることができる。
【００３７】
制御ＰＣ１０６からの吐出信号は任意波形発生装置１１１に送られる。任意波形発生装置１１１で発生した電圧は高電圧アンプ１０７を通して、ノズル１０１内の電極へと伝えられる。ノズル１０１内の溶液は帯電し、基板に対して液滴１０３が吐出される。なお、本実施例では、吐出された液滴１０３に含まれる金微粒子の個数は平均０.１ 個である。これはノズル１０１に充填する金微粒子溶液の濃度を調整することにより達成される。また、金微粒子はノズル１０１内の水溶液内で均一に分散している。
【００３８】
本実施例では１個の液滴１０３を基板１０２に対して吐出する度に、基板１０２を一定間隔ごとに移動させる。これは制御ＰＣ１０６によりステージ駆動モータ１１０を駆動させることにより達成される。基板１０２を駆動させた後、制御ＰＣ１０６は吐出信号を任意波形発生装置１１１に送る。任意波形発生装置１１１で発生した電圧は高電圧アンプ
１０７を通して、ノズル１０１内の電極へと伝えられる。ノズル１０１内の溶液は帯電し、基板に対して液滴１０３が吐出される。より具体的に説明するために図２を用いて以下に説明する。ノズル２０１から液滴２０２，２０３，２０４が連続的に吐出される。基板２０５は液滴２０２，２０３，２０４の吐出毎に一定の間隔分駆動される。液滴２０２，２０３，２０４内には金微粒子２０６が含まれる。また、金微粒子２０６には単一の１本鎖オリゴＤＮＡが固定されている。これにより、単一の１本鎖オリゴＤＮＡを固定した単一の金微粒子２０６を基板２０５上に配置することが可能となる。この実施例では基盤
２０６が駆動するが、必ずしもこの構成に限定されるわけではなく、インクジェットのノズル２０１が移動してもよい。
【００３９】
また、図３に単一の１本鎖オリゴＤＮＡを固定化した金微粒子を含んだ液滴の乾燥工程について説明する。基板３０４上に吐出された液滴３０１内には金微粒子３０３が含まれている。金微粒子３０３には単一の１本鎖オリゴＤＮＡ３０２が固定されている。吐出された液滴３０１はフェムトリットルの体積であり、直径は１μｍ程度である。また、金微粒子３０３の直径は１ｎｍから１００ｎｍの範囲にある。液滴３０１は基板３０４に着弾し、液滴の３０１乾燥が基板３０４上で速やかに進行する。乾燥時における液滴３０１のキャピラリー・フォースより液滴３０１と基板３０４の接点に金微粒子３０３は引き寄せられる。このキャピラリー・フォースの効果により基板３０１上に複数の金微粒子３０３を規則正しく配列させることができる。
【００４０】
また、基板３０４はチオール基で基板表面が修飾されており、金微粒子３０３は基盤
３０４表面に共有結合される。本実施例では金とチオール基の反応を用いたが、反応はこれに限定されるものではなく、金とアミノ基、マレイミド基とアミノ基、ビオチンとストレプトアビジンなどの公知の各種結合法を用いてもよい。
【００４１】
また、金微粒子３０３と液滴３０１との体積比は１：１０００以下であり、インクジェットのノズルに充填される金微粒子溶液の濃度は極めて薄い。具体的には３センチ・ポアズ（水の粘度は１センチ・ポアズ）以下である。従ってインクジェット方式による微粒子ペースト法で問題となるノズルの目詰まりなどの問題は本実施例においては発生しない。
【００４２】
このようにして液滴１０３吐出、基板１０２の移動についての動作を繰り返すことにより、複数の液滴１０３を基板１０２上に吐出し、配置することが可能となる。また、この基板１０２の移動の間隔は０.１ から１００μｍの範囲で制御することができる。本実施例の場合、間隔を１μｍに設定した。
【００４３】
上記方法により、基板１０２上には４×１０7 の個数の液滴１０３を配置する。ノズル１０３に与える電気信号の周波数は１０ｋＨｚのオーダーであるので、基板１０２上に液滴１０３を４×１０7 個配置するために必要な時間は約１時間と見積もられる。また、この周波数を更に高速化することにより、基板作製に要する時間を短縮することも可能である。
【００４４】
ノズル１０１に充填された溶液内の金微粒子の濃度が決まっている場合（液滴１０３あたりに含まれる金微粒子の個数が決まっている場合）、液滴１０３に含まれる金微粒子の個数はポアソン分布に従う。よって、ノズル１０１に充填する微粒子溶液の濃度を調整することにより、吐出される液滴１０３に含まれる微粒子の数を確率的に制御することが可能である。ポアソン分布の式は
ｐ（ｘ）＝λ／ｘ！・exp（−λ）
（λ：１液滴に含まれる微粒子の平均個数，ｘ：１液滴に含まれる微粒子の個数）
で与えられる。１液あたり平均０.１個の金微粒子が含まれる液滴１０３を多数基板上に吐出した場合、１個の金微粒子が基板１０２上に配置される確率は９.０％である。同様に０個，２個，３個の確率は９０.５％，０.５％，０.０％と見積もられる。この確率分布を表１に示す。この確率分布によれば、吐出される液滴１０３の９９.５％はその内部に金微粒子を１個保持するか、しないかのいずれかの状態となる。
【００４５】
【表１】
2008249446.tif 000003
【００４６】
吐出された液滴１０３内に金微粒子の個数を計測する方法として暗視野顕微鏡法を用いる。暗視野顕微鏡法を用いて液滴１０３内の金微粒子の存在・非存在を正確に判定することができる。また、１個の金微粒子と２個、あるいは複数個以上凝集してしまった金微粒子を区別することが可能である。光の波長よりも小さいナノメートルオーダーの金微粒子からの散乱光強度はレイリー散乱で説明される。レイリー散乱光強度は、金微粒子凝集物の直径の２乗に比例する。従って、２個の金微粒子凝集物からは単一金微粒子の４倍の散乱光が発せられる。同様に３個の金微粒子凝集物からは単一金微粒子の９倍の散乱光が発せられる。従って、輝点の散乱光強度を計測することにより、暗視野顕微鏡法を用いて金微粒子の個数を正確に判定することができる。
【００４７】
また、液滴内１０３内に０.１ 〜１個の金微粒子を含む具体的な濃度は、金微粒子の濃度は、金微粒子の大きさにも依存するが、１０-6〜１０-15％ｗ／ｖの範囲に含まれる。
【００４８】
暗視野顕微鏡法を行う場合、具体的には暗視野観察用光源１０８からの照明光をダイクロイックミラー１０９で光軸方向に反射し、暗視野顕微鏡用対物レンズ１０４を通して基板１０２を照明する。液滴１０３内に微粒子が存在する場合、散乱光が発生し、暗視野顕微鏡用対物レンズ１０４で集光され、金微粒子の像が２次元センサカメラ１０５上に決像する。液滴１０３内に微粒子が存在しない場合、散乱光は発生せず、２次元センサカメラ１０５上では光が検出されない。この方法を用いることで、ノズル１０１から液滴１０３が吐出された直後にリアルタイムで基板１０２上における液滴１０３内の金微粒子の個数を検出することができる。基板１０２上には４×１０7 個の液滴１０３が配置される。これを基板１０２上への第１回目の金微粒子の配置とする。また、各々の液滴１０３における金微粒子の個数についての情報は制御ＰＣ１０６により記録される。
【００４９】
更に、制御ＰＣ１０６は基板１０２上の金微粒子が存在していない領域をノズル１０１直下に移動させ、電圧をノズル１０１に加えることで液滴１０３を基板１０２上に再配置する。ここで、以前に配置された液滴１０３は既に蒸発しているため、液滴１０３に対して基板１０２の状態は液滴１０３が初めて吐出される状態と同一である。液滴１０３の吐出した後、暗視野顕微鏡用対物レンズ１０４により基板１０２上の微粒子の個数を検出する。その後基板１０２を１μｍ移動させ、液滴１０３の吐出を繰り返す。これにより、基板１０２上への第２回目の金微粒子の配置を行う。
【００５０】
この液滴１０３の配置を第１０回まで回繰り返すことにより、基板１０２上で金微粒子を配置したい４×１０7 個の位置の６０.１％について１個の金微粒子を配置することができる。同様に０個，２個，３個の確率は３６.８％，３.０％，０.１％である。この確率分布を表２に示す。なお、この配置の回数は１０回に限定されるものではなく、任意に設定可能である。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
また、本実施例では単体のノズル１０１を用いたが、複数のノズルを並列化することにより、複数の個所あるいは複数の基板について並列に複数の液滴を配置することもできる。
【００５３】
また、本実施例では、基板１０２に１個の液滴１０３を配置した後に、基板１０２を移動させ、基板１０２の異なる位置に液滴１０３を吐出し、配置したが、次のようにしても良い。
【００５４】
基板１０２上の目的となる位置について、ノズル１０１より連続して液滴１０３の吐出を行う。１個の金微粒子が暗視野顕微鏡用対物レンズ１０４により検出・確認されると同時に、制御用ＰＣ１０６は任意波形発生装置１１１への出力を停止する。次に制御用ＰＣ１０６は基板１０２を１μｍ駆動させ、再び液滴１０３の吐出を開始する。これらの動作を繰り返し行うことで、単一生体分子を固定した金微粒子を基板上に規則正しく複数配置することができる。
【００５５】
本実施例により、単一生体分子を固定した金属微粒子を１個ずつμｍオーダーの間隔で基板上に規則正しく、高速かつ安価に配置できる。これにより、蛍光測定に必要な２次元センサの画素数を従来と比較して１０倍から、３０倍以下、更には数１００倍以下へと減らすことができる。従って、計測のスループットの大幅な向上を達成できる。また、２次元センサに必要なコストを低減することができる。また、金微粒子の１分子蛍光増強効果により、蛍光測定のＳ／Ｎを増加させ、データの信頼性を高めることが可能となる。従って、計測のスループットの大幅な向上，コストダウン，データの信頼性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実施例の基本構成を示す模式図。
【図２】実施例における、基板上への液滴の吐出方法についての説明図。
【図３】実施例における、基板上への単一１本鎖オリゴＤＮＡを固定した１個の金微粒子の固定法についての説明図。
【符号の説明】
【００５７】
１０１，２０１  インクジェットのノズル
１０２，２０５，３０４  基板
１０３，２０２，２０３，２０４，３０１  液滴
１０４  暗視野顕微鏡用対物レンズ
１０５  ２次元センサカメラ
１０６  制御ＰＣ
１０７  高電圧アンプ
１０８  暗視野観察用光源
１０９  ダイクロイックミラー
１１０  ステージ駆動モータ
１１１  任意波形発生装置
１１２  圧力調整器
２０７，３０２  単一１本鎖１本鎖オリゴＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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