(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚老化防止効果を有する化合物を有効成分とする皮膚老化防止剤と、これを含む化粧料及び皮膚外用剤を提供する。【解決手段】ビタミンＥと類似構造を有するトリプレニルフェノール化合物、特に、下記式で表されるオルニプラビンを有効成分とする皮膚老化防止剤と、これを含む化粧料及び皮膚外用剤。2008201688.tif 000011【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）、一般式（II）及び式（III）で表される化合物からなる群より選択された少なくとも１つのトリプレニルフェノール化合物を有効成分とする皮膚老化防止剤。
【化１】
2008201688.tif 000008
（式中ｎは１〜１０の整数を表し、Ｒは、以下に示すものである。）
【化２】
2008201688.tif 000009
【請求項２】
前記一般式（Ｉ）中、ｎが２〜７であることを特徴とする請求項１記載の皮膚老化防止剤。
【請求項３】
下記式で表されるトリプレニルフェノール化合物を有効成分とする皮膚老化防止剤。
【化３】
2008201688.tif 000010
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の皮膚老化防止剤を含む化粧料。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の皮膚老化防止剤を含む皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚老化防止剤並びに、これを含む化粧料及び皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、加齢や紫外線等の外部刺激によって、皮膚の老化が進行することはよく知られている。皮膚の老化は、外観を損なうだけでなく、特に紫外線照射等の長期間にわたる外部刺激は、皮膚を損傷させ、ひいては細胞の変異を誘発し、癌などの疾患を引き起こす可能性もある。このため、種々の分野で皮膚の老化防止剤についての開発が行われている。
このような例としては、紫外線吸収効果や、シワ、張り、たるみ防止効果などを奏する化合物に関するものがある（例えば、特許文献１〜３）。
【０００３】
一方、微生物が多岐にわたる生理活性物質を生成することが知られている。例えば、ビタミンＥと類似構造を有するトリプレニルフェノール化合物は、特定の糸状菌から得られるものであり、重要な生理活性を有するものが知られている。このトリプレニルフェノール化合物の生理活性としては、血栓溶解促進作用や、血管新生抑制作用といった生体に重要な現象に対する生理活性作用や、腎炎治療作用などの疾患に対する治療効果が確認されている（例えば、特許文献４〜６）。
【特許文献１】特開２００３−０２６５６０号公報
【特許文献２】特開２００２−２１２０２６号公報
【特許文献３】特開２０００−１１９１２５号公報
【特許文献４】特開２００２−６５２８８号公報
【特許文献５】特開２００３−８８３９７号公報
【特許文献６】特開２００４−２２４７３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、トリプレニルフェノール化合物について皮膚老化防止効果は、これまでに確認されていない。
従って、本発明の目的は、皮膚老化防止効果を有するトリプレニルフェノール化合物と、これを含む化粧料及び皮膚外用剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の皮膚老化防止剤は、下記一般式（Ｉ）、一般式（II）及び式（III）で表される化合物からなる群より選択された少なくとも１つのトリプレニルフェノール化合物を有効成分とするものである。
【０００６】
【化１】
2008201688.tif 000002
【０００７】
式中ｎは１〜１０の整数を表し、Ｒは、以下に示すものである。
【０００８】
【化２】
2008201688.tif 000003
【０００９】
特に、下記式で表されるトリプレニルフェノール化合物を有効成分とする皮膚老化防止剤が好ましい。
【００１０】
【化３】
2008201688.tif 000004
【００１１】
本発明の化粧料及び皮膚外用剤は、上記皮膚老化防止剤を含むものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、皮膚老化防止効果を有するトリプレニルフェノール化合物と、これを含む化粧料及び皮膚外用剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の皮膚老化防止剤は、上記一般式（Ｉ）、一般式（II）及び式（III）で表される化合物からなる群より選択された少なくとも１つのトリプレニルフェノール化合物を有効成分として含むものである。
皮膚老化には種々の原因があると考えられているが、特に紫外線照射による皮膚老化に対して、本トリプレニルフェノール化合物は予防ないしは抑制効果を発揮することができる。
【００１４】
ここで上記一般式（Ｉ）中、ｎは皮膚老化防止効果の観点から、好ましくは、ｎは２〜７の整数を表す。
中でも、皮膚老化防止効果の観点から、上記一般式（Ｉ）中、ｎは３である下記のトリプレニルフェノール化合物が皮膚老化防止効果の観点から好ましい。このようなトリプレニルフェノール化合物は、特に、オルニプラビンと呼ばれ、紫外線照射による皮膚老化に対して優れた防止ないしは抑制効果を奏することができる。
【００１５】
【化４】
2008201688.tif 000005
【００１６】
本発明にかかるトリプレニルフェノール化合物は、有機化学合成手法によって得てもよく、例えば、同様のプレニルフェノール単位を有する化合物から誘導することもできるが、糸状菌を培養して、その代謝物から得ることが好ましい。本発明のトリプレニルフェノール化合物を糸状菌から得る方法は、例えば、特開２００２−６５２８８号公報及び特開２００４−２２４７３７号公報等に詳細に記載されている。
【００１７】
本発明にかかるトリプレニルフェノール化合物を生成するために使用される糸状菌としては、スタキボトリス属を選択することができ、好ましくはスタキボトリス属の糸状菌が選択される。特に好ましい生産菌は、スタキボトリス・ミクロスポラ（Stachybotrys microspora）などであり、より好ましくはスタキボトリス・ミクロスポラ（S. microspora）ＩＦＯ３００１８株であるが、本発明は、この菌に限定されるものではない。
基本培地は、以下組成を示すＡ培地が好ましいが、本発明はこの組成の培地に限定されるものではない。Ａ培地：グルコース２０ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸二カリウム３ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇを１リットルの精製水に溶解し、塩酸あるいは水酸化ナトリウムでｐＨを５．５に調整する。
【００１８】
培地には、目的とするトリプレニルフェノール化合物の構造に応じて、適切なアミノ酸、アミノアルコール又はアミンなどの有機アミン化合物を培地に添加する。これにより目的とするトリプレニルフェノール化合物を選択的に得ることができる。添加する有機アミン化合物としては、目的とするトリプレニルフェノール化合物の構造に応じて適宜選択することができ、例えばオルニプラビンを得るには、Ｌ−オルニチンを添加すればよい。
有機アミン化合物の添加濃度は、０．５から２ｍｇ／ｍｌが望ましいが、本発明はこの濃度に限定されるものではない。
【００１９】
有機アミン化合物の添加時期は、培養初期、例えば培養開始直後とすることができる。培養温度は２５℃が最適であるが、この温度に限定されるものではない。培養時間は、有機アミン化合物添加後３から６日で充分な生産量が得られる。通気攪拌条件は、５００ｍｌ容の三角フラスコに１００ｍｌのＡ培地を入れ、適当な通気栓をした場合、１８０ｒｐｍの旋回培養で得られる条件が適当である。ジャーファーメンターを用いる場合、これに相当する条件が望ましい。
【００２０】
また有機アミン化合物の添加時期については、生成されるトリプレニルフェノール化合物の生産効率の観点から、培養中期とすることが好ましい。
培養中期に添加アミン化合物を添加する場合には、前記糸状菌の培養工程が、アミン化合物の含有量が０．５質量％以下の制限培地による第１の培養工程と添加アミン化合物を含有している生産用培地による第２の培養工程と、を含むことが好ましい。
第１の培養工程で使用する培地として、アミン化合物の含有量が０．５質量％に制限された制限培地を用いるので、第２の培養工程に移る培養中期以降に、従来よりも大量の中間体化合物を得ることができる。またこのように中間体化合物を大量に生成してから、有機アミン化合物を含む生産用培地による第２の培養工程を実行することにより、効率よく且つ選択性よく目的とするトリプレニルフェノール化合物を得ることができる。なお、本明細書において「アミン化合物」とは、特に断らないかぎり、添加アミン化合物も包含する。
【００２１】
制限培地中に含有可能なアミン化合物は、制限培地での糸状菌成育のための窒素源、成育促進因子、あるいはトリプレニルフェノール化合物前駆体の生産促進因子として作用する。添加の形態としては、酵母エキス、ブイヨン、ペプトン、トリプトン、ソイビーンミール、ファーマメディア、コーンスティープリカー、魚肉エキス等の天然の混合物として、あるいは精製化合物として利用することができる。天然の混合物は多種のアミン化合物を含有するため、制限培地ではその量を制限することが好ましい。この場合、制限培地の全容量に対して０．５質量％以下、菌の生育、生産量及び生産の選択性の観点から好ましくは、０．０１〜０．５質量％、更に好ましくは０．１質量％〜０．３質量％とすることができる。０．５質量％を超える場合には、目的とする化合物以外のものが同時に生成されて選択性に劣り、生産効率も下がる場合があり、好ましくない。一方、０．０１質量％未満では、糸状菌の活性に劣る場合があり好ましくない。また、精製化合物をアミン化合物として添加する場合は、生産に用いる糸状菌の成育とトリプレニルフェノール化合物前駆体の生産が良好に起こる範囲の量と種類が用いられる。
【００２２】
培養中期以降の第２の培養工程では、添加アミン化合物を含有している生産用培地が用いられる。ここで「培養中期」とは、第１の培養工程を確実に継続させるための培養開始からの所定期間、好ましくは培養開始後２日目以降、更に好ましくは４日目以降とすることができる。この期間２日目以降であれば、目的とするトリプレニルフェノール化合物を得るための中間体化合物の量を充分量得ることができ、効率よくトリプレニルフェノール化合物を生成することができる。
【００２３】
第２の培養工程で用いられる生産用培地は、添加アミン化合物を含有する以外は、制限培地と同一の組成で構成することができる。このため、第２の培養工程における培養は、第１の培養工程で使用した制限培地に、添加アミン化合物を添加することによって実施してもよく、改めて調製した添加アミン化合物含有培地をそのまま添加してもよい。
【００２４】
添加アミン化合物は、例えば、オルニプラビンを得るにはＬ−オルニチンを、一般式（Ｉ）の化合物又は（II）の化合物を得るにはそれぞれ下記一般式（IV）又は（Ｖ）の化合物（式中Ｒ及びｎは前と同じである）を、式（III）の化合物を得るにはＬ−シスチンを、それぞれ培地に添加することにより選択的に生産することができる。
【００２５】
【化５】
2008201688.tif 000006
【００２６】
第２の培養工程での生産用培地に含有可能な添加アミン化合物は、目的とするトリプレニルフェノール化合物を得るために必要な量で培地中に存在していればよく、培地の全容量の５質量％以下、生産量の観点から好ましくは０．０１質量％〜１質量％、更に好ましくは０．１質量％〜０．５質量％で用いられる。
【００２７】
制限培地及び生産用培地には、上記成分に加えて、微生物による化合物の生成を促進するためなどを目的として、上記微生物の培養に通常用いられている合成培地の添加成分を含む。本制限培地に添加可能な添加成分としては、例えばグルコース、シュークロース、デキストリン、動物油、植物油などの栄養源、ビタミン類、例えば塩素、硝酸、硫酸、リン酸、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、及びその他のイオンを生成しうる無機塩類を挙げることができる。
【００２８】
無機塩類のうち、特に金属イオンを生成しうる無機塩類、生成物の生産量の増大や生産効率の観点から、好ましく制限培地に添加することができる。このような金属イオンとしては、マグネシウムイオン、コバルトイオン、鉄イオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン等を挙げることができる。
これらの金属イオンの添加量は、生成物の生産量や菌の生育の観点からそれぞれ培地の全容量に対して、マグネシウムイオンの場合には硫酸マグネシウム７水和物として０．００１質量％〜０．５質量％（より好ましくは０．０１質量％〜０．１質量％）、コバルトイオンの場合には塩化コバルト６水和物として０．００００１質量％〜０．０１質量％（より好ましくは０．０００１質量％〜０．００５質量％）、鉄イオンの場合には硫酸鉄（II）７水和物として０．０００１質量％〜０．１質量％（より好ましくは０．０００５質量％〜０．０５質量％）、カルシウムイオンの場合には塩化カルシウム２水和物として０．００００１質量％〜０．１質量％（より好ましくは０．０００１質量％〜０．０５質量％）、カリウムイオンの場合にはリン酸二カリウムあるいは硝酸カリウムとして０．００２質量％〜２質量％（より好ましくは０．０５質量％〜０．５質量％）、ナトリウムイオンの場合にはリン酸二ナトリウムあるいは硝酸ナトリウムとして０．００２質量％〜２質量％（より好ましくは０．０５質量％〜０．５質量％）、とすることができる。
上記無機塩類及び金属イオンは、これらを単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２９】
制限培地による第１の培養工程は、効率よく目的とするトリプレニルフェノール化合物を得るために充分な量の中間体化合物が得られる培養中期まで継続する。第２の培養工程は、生成されたトリプレニルフェノール化合物の量が最大のときに培養を停止することによって終了する。第２の培養工程の期間は、微生物の状態及び培養系の大きさによって異なるが、一般に１日〜５日、生産量の観点から好ましくは１〜３日間である。
【００３０】
本発明の製造方法における第１及び第２の培養工程は、通常、上記培地を用いて静置培養または振盪培養による。振盪培養を適用する場合には、真菌の培養で通常適用される速度で行えばよく、例えば高崎科学社製、ＴＢ−２５Ｓ（振幅７０ｍｍ）のロータリーシェイカーであれば、５００ｍｌ容のフラスコ中１００ｍｌの培地量とした場合に３０ｒｐｍ〜２４０ｒｐｍ、好ましくは１６０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍとすることができる。
また第１及び第２の培養工程における培養温度は、種々の温度における真菌の生育条件に応じて適宜設定することができるが、一般に４〜５０℃、好ましくは１５〜３７℃、より好ましくは２０〜３０℃、最も好ましくは室温（２５℃）である。またそれぞれ用いられる培地のｐＨは、一般に３〜９、好ましくは５〜６とすることができる。
【００３１】
なお、第１及び第２の培養工程よりも前に、微生物による生成能を安定化させるために、予備培養工程を設けてもよい。予備培養工程で用いられる培地は、微生物を維持するために用いられる通常の生育培地であってもよい。
【００３２】
得られたトリプレニルフェノール化合物は、分離工程において培養物から分離される。分離は、通常の回収・精製手段であればいずれであってもよく、液体クロマトグラフィー、溶媒抽出、結晶化等を挙げることができる。生成物の回収・精製は、回収効率の観点から２段階以上の多段階で行うことが好ましい。
これらの回収・精製方法においては、トリプレニルフェノール化合物が脂溶性であることを利用して、溶媒等を選択することが好ましい。
トリプレニルフェノール化合物を培養物から回収・精製する際には、予め培養物から菌体を除去することが好ましい。その際には、培養物にメタノールなどの溶媒を加えて菌体内のトリプレニルフェノール化合物を抽出し、その後の菌体の除去には、濾過等を用いればよい。
【００３３】
本発明の皮膚老化防止剤における上記トリプレニルフェノール化合物の配合量は、剤型等によって異なるが、一般に、０．０１質量％〜５０質量％、皮膚老化防止効果の観点から好ましくは０．１質量％〜１０質量％とすることができる。
【００３４】
上記の皮膚老化防止剤は、紫外線による皮膚老化に対して効果的な防止ないしは抑制効果を有するので、紫外線に照射による皮膚老化に対して効果的な化粧料や、皮膚外用剤として好ましく使用することができる。
従って、本発明の化粧料は、上記皮膚老化防止剤を含むものである。また、本発明の皮膚外用剤は、上記皮膚老化防止剤を含むものである。
本発明の化粧料及び皮膚外用剤における上記皮膚老化防止剤の配合量は、上述の皮膚老化防止剤の効果を損なわない範囲で添加可能であり、各種剤型に応じて適宜選択可能である。
【００３５】
本化粧料及び皮膚外用剤には、上記皮膚老化防止剤に加えて、本皮膚老化防止剤の効果を損なわない範囲で各種の添加剤を含有することができる。このような各種成分としては、水性成分、油性成分、粉末成分、界面活性剤（乳化剤）、保湿剤、増粘剤、色剤、香料、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、防腐剤、あるいは紫外線防御剤、抗炎症剤、美白剤等の成分を挙げることができ、これらを１種又は２種以上を配合することができる。これらの配合剤の配合量は、一般的に用いられる範囲であればよく、当業者であれば適宜選択可能である。
【００３６】
水性成分としては、例えば水（精製水）、低級アルコール（エタノール、プロパノール、イソプロパノール）等が挙げられる。
油性成分としては、例えば高級脂肪酸類（ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、およびそれらのエステル等）、高級アルコール類（セタノール、ラノリンアルコール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール等）及びワックス類（固形パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、セレシンワックス、ポリエチレンワックス、蜜ロウ、木ロウ、カルナウバロウ、キャンデリラロウ等）、天然又は合成油状物質（コレステロール、スクワラン、流動パラフィン、ラノリンまたはその誘導体、オリーブ油、椿油、綿実油、オレイルアルコール、ヒマシ油、ワセリン、アジピン酸ジエトキシエチルエステル、シリコンオイル、弗素オイル等）が挙げられる。
【００３７】
粉末成分としては、例えばアルミニウム粉末、酸化チタン粉末、酸化亜鉛粉末、酸化鉄粉末、アクリル粉体、シリカビーズ、タルク、セリサイト等が挙げられる。
界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンモノオレエート、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ステアリン酸アルミニウム、オクチルドデカノール、親油型モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸プロピレングリコール等が挙げられる。
【００３８】
保湿剤としては、例えばグリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、ジグリセリン、トリグリセリン、ソルビット及びその誘導体、ポリエチレングリコール等の多価アルコール、グルコース、マルトース、マルチトール、ショ糖、フルクトース、スレイトール、エリスリトール、ソルビット、澱粉分解糖、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、加水分解コラーゲン、カルボキシメチルキチン等が挙げられる。
【００３９】
増粘剤としては、例えばカルボキシビニルポリマー、ＣＰゼリー、カルボキシメチルセルロース、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、ポリ酢酸ビニルエマルジョン、ポリビニルアルコール、ベントナイト、ビーガム、合成ヘクトライト等が挙げられる。
抗酸化剤としては、例えばジブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、トコフェロールピロ亜硫酸ナトリウム、ソジウムビサルフェート、酢酸トコフェロール、ビタミンＥ、ローズマリーエキス等が挙げられる。
【００４０】
ｐＨ調整剤としては、例えばクエン酸、乳酸、酒石酸、燐酸等が挙げられる。キレート剤としては、例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、チオグリコ−ル酸、チオ乳酸、チオグリセリン等が挙げられる。
防腐剤としては、例えばｐ−オキシ安息香酸のメチル、エチル、プロピル、ブチルエステル（それぞれメチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンと呼ばれている）、ｏ−フェニルフェノール、デヒドロ酢酸及びその塩、ｐ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｏ−クロル−ｍ−キシレノール等が挙げられる。
【００４１】
紫外線防御剤としては、例えばアスコルビン酸又はその誘導体、イソフェルラ酸又はその塩、オキシベンゾン又はその誘導体、ｐ−アミノ安息香酸又はその誘導体、ウロカニン酸又はその誘導体、コウジ酸、ジベンゾイルメタン又はその誘導体、ｐ−メトキシ桂皮酸又はその誘導体、微粒子酸化チタン、微粒子酸化亜鉛、微粒子酸化鉄等が挙げられる。
【００４２】
抗炎症剤としては、例えばグリチルレチン酸またはその誘導体、グリチルリチン酸またはその誘導体、ビサボロール、ゲラニイン、マロニエ抽出物、アロエ抽出物等が挙げられる。
【００４３】
美白剤としては、例えばパンテテイン−Ｓ−スルフォン酸、イソフェルラ酸、アスコルビン酸及びその燐酸マグネシウム塩、アルブチン、コウジ酸、リノール酸、トラネキサム酸、エスクリン、ビタミンＡ酸、レチノール等が挙げられる。
【００４４】
本発明の化粧料及び皮膚外用剤の剤型には特に制限はなく、通常医薬部外品、化粧品などに用いられているもの、例えばクリーム、乳液、オイル、ローション、パック、軟膏などを挙げることができる。
【実施例】
【００４５】
以下に本発明の実施例について、オルニプラビンを例に説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００４６】
［実施例１］
［１］オルニプラビンの合成
Stachybotrys microspora ＩＦＯ３００１８株（財団法人発酵研究所）の胞子を種培養用培地１００ｍｌの入った５００ｍｌ容三角フラスコに接種し、ロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍ，２５℃で４日間にわたり種培養を行った。種培養用培地は、グルコース（４％）、大豆ミール（０．５％）、乾燥ブイヨン（０．３％）、粉末酵母エキス（０．３％）を水に溶かし、ＨＣｌを用いてｐＨ５．８に調製し、消泡剤ＣＢ４４２（０．０１％）（０．１ｇ／ｍｌアセトン溶液を１ｍｌ／Ｌ添加）（日本油脂化学，日本）を加え、培養器に１００ｍｌずつ分注後、オートクレーブ（１２１℃，１５ｍｉｎ）を行ったものを使用した。
【００４７】
この培養液５ｍｌを、本培養培地１００ｍｌの入った５００ｍ１容三角フラスコに接種し、ロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍ，２５℃で５日間にわたり本培養を行った。
本培養用培地（制限培地）は、スクロース（５％），粉末酵母エキス（０．１％），ＮａＮＯ３（０．３％）、Ｋ２ＨＰＯ４（０．１％）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．０５％）、ＫＣ１（０．０５％）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．０００２５％）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．００１５％）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．０００６５％）を水に溶かし、ＨＣｌを用いてｐＨ５．８に調製し、消泡剤ＣＢ４４２（０．０１％）（０．１ｇ／ｍｌアセトン溶液を１ｍｌ／Ｌ添加）（日本油脂化学，日本）を加え培養器に１００ｍｌずつ分注後、オートクレーブ（１２１℃，１５ｍｉｎ）を行ったものを使用した。
接種した日を培養０日目とし、培養４日目（９６時間後）に１００ｍｇのＬ−オルニチンを培地に添加して生産用培地とし、培養を継続した。それから約２４時間後にメタノールを２００ｍｌ添加して、培養を終了した。その後、ロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍ，２５℃で約３時間にわたり振盪して抽出を行った。
【００４８】
培養物の上清を２−ブタノンで抽出した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固した。得られた油状残渣を、ＭｅＯＨで約１００ｍｇ／ｍｌに溶解して、LiChrolut（登録商標）ＲＰ−１８固相抽出カラムに通して、Inertsil ＰＲＥＰ−ＯＤＳカラム（３０×２５０ｍｍ；ＧＧＬサイエンス（日本、東京））での分取ＨＰＬＣに供試した。８０％の水性ＭｅＯＨ中の５０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて、そのカラムを４０℃で２５ｍｌ／分の速度で展開し、保持時間３４〜３９分で溶出された分画から、本実施例にかかるオルニプラビン（ＳＭＴＰ−７）を得た。
【００４９】
［２］皮膚老化防止効果確認
ＳＭＴＰ−７（オルニプラビン）を、高濃度（５０ｍｇ／ｍｌ、１回の塗布量として１ｍｇ：試料Ａ）又は低濃度（１０ｍｇ／ｍｌ、１回の塗布量として０．２ｍｇ：試料Ｂ）で生理食塩水：ポリエチレングリコール４００（１：５）（以下、「溶媒」）に添加して、各液体試料を調製した。ヘアレスマウス（２７匹、Ｈｏｓ：ＨＲ−１、三協ラボサービス）を、ＵＶ未照射／薬剤未塗布（Ｉ群；７匹）、ＵＶ照射／溶媒塗布（II群；６匹）、ＵＶ照射／試料Ａ塗布（III群；７匹）及びＵＶ照射／試料Ｂ塗布（IV群；７匹）の４つに分けた。試料塗布群については、２０週間にわたって毎日薬剤を塗布した。また、ＵＶ照射については、塗布部位に週３回のＵＶ−Ｂ照射（０．３ｍＷ／ｃｍ２、３分、合計０．９ｍＪ／ｃｍ２）とした。紫外線照射前には、薬剤を拭き取り、照射後に所定量塗布した。試験終了後、皮膚の切片を作成してＨＥ染色を行い、表皮の肥厚、炎症性細胞の浸潤、肥満細胞の増加の観点から、病理組織学的解析を行った。結果を表１及び図１に示す。
【００５０】
表１は表皮の肥厚についてまとめたものである。表１に示されるように、本実施例の皮膚老化防止剤を含む試料Ａ及びＢを塗布した場合（III群及びIV群）には、溶媒のみを塗布したII群と比較して表皮肥厚の防止効果が認められた。特に、溶媒塗布群（II群）のマウスでは、表皮の肥厚が明らかであるのに対して、本実施例のマウス（III群及びIV群）では、溶媒塗布群と比較して表皮の肥厚が軽減した。
特に、本実施例の皮膚老化防止剤を高濃度（５０ｍｇ／ｍｌ）で含む試料Ｂを塗布したIV群では、表皮の肥厚が大幅に抑制されており、溶媒塗布群（II群）との差異は明らかであった（図１）。このIV群のマウスでは、炎症細胞浸潤もなく、肥満細胞の増加も認められず、未塗布群（II群）と比較して皮膚老化防止効果は顕著であった。
従って、本実施例の皮膚老化防止剤は、皮膚老化を予防する効果を有し、高濃度にすることによってより顕著に皮膚老化を防止することができた。
【００５１】
【表１】
2008201688.tif 000007
【００５２】
［実施例３］
下記成分を常法に従って配合し、皮膚老化防止剤を含有の軟膏を得る。
（１）ＳＭＴＰ−７                            ０．０１質量％
（２）サラシミツロウ                          ８質量％
（３）ステアリルアルコール                    ３質量％
（４）コレステロール                          ３質量％
（５）白色ワセリン                            残部
本実施例の軟膏を使用することによって、皮膚老化を軽減し、また予防することができる。
【００５３】
［実施例４］
下記成分を常法に従って配合して、皮膚老化防止剤を含有するクリーム剤を得る。
（１）ＳＭＴＰ−７                            ０．０１質量％
（２）白色ワセリン                          ２５質量％
（３）ステアリルアルコール                  ２０質量％
（４）プロピレングリコール                  １２質量％
（５）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０      ４質量％
（６）モノステアリン酸グリセリル              １質量％
（７）パラオキシ安息香酸メチル                ０．１質量％
（８）パラオキシ安息香酸プロピル              ０．１質量％
（９）精製水                                  残部
本実施例のクリーム剤を使用することによって、皮膚老化を軽減し、また予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の実施例にかかる表皮肥厚の効果を示すグラフである。
【図１】
2008201688.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月2日(2007.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
［２］皮膚老化防止効果確認
ＳＭＴＰ−７（オルニプラビン）を、低濃度（１０ｍｇ／ｍｌ、１回の塗布量として０．２ｍｇ：試料Ａ）又は高濃度（５０ｍｇ／ｍｌ、１回の塗布量として１ｍｇ：試料Ｂ）で生理食塩水：ポリエチレングリコール４００（１：５）（以下、「溶媒」）に添加して、各液体試料を調製した。ヘアレスマウス（２７匹、Ｈｏｓ：ＨＲ−１、三協ラボサービス）を、ＵＶ未照射／薬剤未塗布（Ｉ群；７匹）、ＵＶ照射／溶媒塗布（II群；６匹）、ＵＶ照射／試料Ａ塗布（III群；７匹）及びＵＶ照射／試料Ｂ塗布（IV群；７匹）の４つに分けた。試料塗布群については、２０週間にわたって毎日薬剤を塗布した。また、ＵＶ照射については、塗布部位に週３回のＵＶ−Ｂ照射（０．３ｍＷ／ｃｍ２、３分、合計０．９ｍＪ／ｃｍ２）とした。紫外線照射前には、薬剤を拭き取り、照射後に所定量塗布した。試験終了後、皮膚の切片を作成してＨＥ染色を行い、表皮の肥厚、炎症性細胞の浸潤、肥満細胞の増加の観点から、病理組織学的解析を行った。結果を表１及び図１に示す。