(57)【要約】【課題】生体関連物質などの物質を厳密に検出・精製・反応・解析する場合、及び生体関連物質を利用して厳密に検出・精製・反応・解析する場合における、支持体表面と対象物質との相互作用のうち、対象物質の実効濃度を変化させる相互作用量を解析する方法を提供すること。【解決手段】支持体に表面処理を施し、固定化物質を表面に固定化させ、少なくとも２種類以上の、固定化物質を有する支持体を作製する工程、及び各固定化物質を有する支持体に対して対象物質を含む溶液を接触させ、該固定化物質と該対象物質の相互作用挙動を速度論的に解析し、比較する工程を含む、固定化物質を有する支持体との相互作用に影響を受ける対象物質の実効濃度の解析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体に表面処理を施し、固定化物質を表面に固定化させ、少なくとも２種類以上の、固定化物質を有する支持体を作製する工程、及び各固定化物質を有する支持体に対して対象物質を含む溶液を接触させ、該固定化物質と該対象物質の相互作用挙動を速度論的に解析し、比較する工程を含む、固定化物質を有する支持体との相互作用に影響を受ける対象物質の実効濃度の解析方法。
【請求項２】
表面処理が、少なくとも２種以上の表面処理を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固定化物質及び／又は対象物質が生体関連物質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
生体関連物質が、抗体又は抗体の一部である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
表面処理が、ヒドロゲルによる被覆を含む、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
表面処理が、自己組織化膜又は疎水性ポリマーによる被覆を含む、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
対象物質を含む溶液を連続的に流すことにより接触させる、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
速度論的解析が下記式１を用いた差分方程式を利用した解析方法である、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【化１】
2008116341.tif 000014
（式中、（ｎ）はｔ＝ｎの時の値を表す。
Rは、対象物質の結合量(Signal)を示す。
θ1は、対象物質が同速度で結合できる領域全てに対する実際の被覆率を示す。（この時結合した対象物質を一次対象物質と呼ぶ。）
θ2は、一次対象物質に影響を受けるために一次対象物質とは異なる速度で結合する範囲における対象物質の被覆率を示す。（この時結合した対象物質を二次対象物質と呼ぶ。）
ka は、結合速度定数（ka1、ka2はそれぞれθ1、θ2に関するそれぞれの結合速度定数）を示す。
kdは、解離速度定数（kd1、kd2はそれぞれθ1、θ2に関するそれぞれの解離速度定数）を示す。
ｃは、 遊離対象物質濃度を示す。
Rmaxは、その条件下における対象物質の最大結合量を示す。
Δtは、測定インターバルを示す。
ｔは、対象物質の接触時間を示す。）
【請求項９】
速度論的に解析する工程が、近接場光を利用した解析方法又は水晶発振子マイクロバランス法（QCM）を利用した解析方法である、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
近接場光を利用した解析方法が表面プラズモン共鳴（SPR）解析である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項1から１０の何れかの解析を行うことによって選択される最適な条件下において、支持体に固定化された固定化物質に対して対象物質を含む溶液を接触させる工程を含む、該対象物質を検出、及び／又は精製、及び／又は反応、及び／又は解析する方法。
【請求項１２】
請求項１から１０の何れかの解析を行うことによって導かれる最適な表面処理を施した支持体表面に固定化された該固定化物質に対して、対象物質を含む溶液を接触させる工程を含む、該対象物質を検出、及び／又は精製、及び／又は反応、及び／又は解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質と支持体表面との相互作用量を解析する方法に関する。特に、本発明は、物質を検出・精製・反応・解析する際に、その対象物質（以後、対象物質と呼ぶ）と相互作用し得る物質を固定化している（以後、固定化される物質を、固定化物質と呼ぶ）支持体表面と該対象物質との相互作用量を解析する方法、及び、これにより得られた適切な条件、及び／又は適切な表面処理工程を含む検出・精製・反応・解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体関連物質などの物質を厳密に検出・精製・反応・解析する場合、及び生体関連物質を利用して厳密に検出・精製・反応・解析する場合、その対象物質と相互作用し得る物質を支持体の表面に固定化し、それを利用する方法が行われている。この方法は固定化物質が固相化されているために洗浄などのB/F分離操作が容易なだけでなく、支持体表面を適切に選択することで該対象分子を標識化することなく直接検出することや、該表面特有の反応性を利用することが可能であるため、非常に有用性が高い。特に、相互作用の状態を支持体表面の物性変化から解析する方法は、感度、安定性、繰り返し解析が可能であることなどの理由により、特に有用性が高い。
【０００３】
ところが該支持体自体が該対象分子と相互作用する場合、本来の対象物質と固定化物質との相互作用挙動とは異なる挙動を示すために、条件が不適切になる、厳密な解析が行えない、という問題が生じる。このような問題に対して、従来は固定化物質を固定化しない表面において該支持体に対する該対象物質の非特異的吸着を評価するのみで、該対象物質の実効濃度を変化させる相互作用量の評価は行われていなかった。また、異なる２種類以上の表面を用いたそれぞれの表面における相互作用挙動の解析は従来から行われていたが、それらの結果を比較して、支持体表面と対象物質との相互作用量を求める方法は行われていなかった。（特許文献１、非特許文献１）
【０００４】
【特許文献１】特開2003-156434号公報
【非特許文献１】Langmuir,19,4351-4357(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、固定化物質と対象物質の間の相互作用挙動に影響を及ぼす支持体表面と対象物質との相互作用のうち、対象物質の実効濃度を変化させる相互作用量の評価は行われていなかった。そのため、実際の検出・精製・反応・解析において、想定している実行濃度と異なるために濃度などの適切な条件を選択することができなかった。また、誤った解釈により誤った検出、解析結果を生じている、という問題があった。
【０００６】
従って、本発明の課題は、生体関連物質などの物質を厳密に検出・精製・反応・解析する場合、及び生体関連物質を利用して厳密に検出・精製・反応・解析する場合における、支持体表面と対象物質との相互作用のうち、対象物質の実効濃度を変化させる相互作用量を解析する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、２種類以上の支持体表面における対象物質の相互作用挙動を速度論的に解析し、比較することによって、支持体表面と対象物質の相互作用における該対象物質の実効濃度を解析できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明によれば、支持体に表面処理を施し、固定化物質を表面に固定化させ、少なくとも２種類以上の、固定化物質を有する支持体を作製する工程、及び各固定化物質を有する支持体に対して対象物質を含む溶液を接触させ、該固定化物質と該対象物質の相互作用挙動を速度論的に解析し、比較する工程を含む、固定化物質を有する支持体との相互作用に影響を受ける対象物質の実効濃度の解析方法が提供される。
【０００９】
好ましくは、表面処理は、少なくとも２種以上の表面処理を含む。
【００１０】
好ましくは、固定化物質及び／又は対象物質は生体関連物質である。
好ましくは、生体関連物質は、抗体又は抗体の一部である。
好ましくは、表面処理工程のうちの少なくとも一種は、ヒドロゲルによる被覆である。
好ましくは、表面処理工程のうちの少なくとも一種は、自己組織化膜又は疎水性ポリマーによる被覆である。
【００１１】
好ましくは、対象物質を含む溶液を連続的に流すことにより接触させる。
【００１２】
好ましくは、速度論的解析は下記式１を用いた差分方程式を利用した解析である。
【化１】
2008116341.tif 000002
【００１３】
（式中、（ｎ）はｔ＝ｎの時の値を表す。
Rは、対象物質の結合量(Signal)を示す。
θ1は、対象物質が同速度で結合できる領域全てに対する実際の被覆率を示す。（この時結合した対象物質を一次対象物質と呼ぶ。）
θ2は、一次対象物質に影響を受けるために一次対象物質とは異なる速度で結合する範囲における対象物質の被覆率を示す。（この時結合した対象物質を二次対象物質と呼ぶ。）
ka は、結合速度定数（ka1、ka2はそれぞれθ1、θ2に関するそれぞれの結合速度定数）を示す。
kdは、解離速度定数（kd1、kd2はそれぞれθ1、θ2に関するそれぞれの解離速度定数）を示す。
ｃは、 遊離対象物質濃度を示す。
Rmaxは、その条件下における対象物質の最大結合量を示す。
Δtは、測定インターバルを示す。
ｔは、対象物質の接触時間を示す。）
【００１４】
好ましくは、速度論的に解析する工程は、近接場光を利用した解析方法又は水晶発振子マイクロバランス法（QCM）を利用した解析方法である。
好ましくは、近接場光を利用した解析方法は表面プラズモン共鳴解析である。
【００１５】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の解析方法を行うことによって選択される最適な条件下において、支持体に固定化された固定化物質に対して対象物質を含む溶液を接触させる工程を含む、該対象物質を検出、及び／又は精製、及び／又は反応、及び／又は解析する方法が提供される。
【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の解析方法を行うことによって導かれる最適な表面処理を施した支持体表面に固定化された該固定化物質に対して、対象物質を含む溶液を接触させる工程を含む、該対象物質を検出、及び／又は精製、及び／又は反応、及び／又は解析する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、支持体表面と該対象物質の相互作用量のうち、該対象物質の実効濃度を変化させる相互作用量を解析するために、該支持体表面を含む２種類以上の表面において固定化物質と対象物質の間の相互作用挙動を速度論的に解析し、それらを比較して解析するため、該相互作用の種類によらず簡便に解析する方法を提供することができる。
【００１８】
また、本発明によれば支持体表面と解析対象物質との間の相互作用量を見積もることにより、固定化物質と対象物質との間の厳密に解析された相互作用量に基づいて、濃度など適切な条件で検出・精製・反応・解析を行うことができる。また、その情報に基づいて適切な支持体の表面処理を選択することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の方法は、支持体に固定化した物質（固定化物質）に対して該固定化物質に対して相互作用し得る物質（対象物質）を含む溶液を接触させ、該対象物質の検出、精製、反応、解析を行う方法における、支持体表面と対象物質の相互作用における該対象物質の実効濃度の解析方法であって、支持体に表面処理を施し、固定化物質を表面に固定化させ、少なくとも２種類以上の、固定化物質を有する支持体を作製する工程、及び各固定化物質を有する支持体に対して対象物質を含む溶液を接触させ、該固定化物質と該対象物質の相互作用挙動を速度論的に解析し、比較する工程を含むことを特徴とする。本発明の方法では、２種類以上の支持体表面における該対象物質の相互作用挙動を速度論的に解析し、比較することによって、支持体表面と該対象物質の相互作用量のうち、該対象物質の実効濃度を変化させる相互作用量を見積もることができる。
【００２０】
対象物質の実効濃度とは、対象物質が固定化物質と実際に相互作用している濃度のことをいい、これは仕込んだ対象物質濃度とは異なる場合がある。例えば対象物質が支持体表面と静電的効果などによって反発する場合、対象物質は固定化物質と接触できる空間から一部排除されることによって、その実効濃度が仕込んだ濃度より低くなる。また、逆に両者の間に引力が存在する場合、逆の現象によってその実効濃度が高くなる。更に、固定化物質と接触できる空間における対象物質そのものの濃度は変化しなかった場合においても、対象物質の一部が固定化物質と相互作用することができなくなった場合、その実効濃度が低くなったと考えることができる。このような実効濃度の変化は、通常は無視されることが多く、そのために解析結果の誤った解釈や非効率的な反応など、大きな問題を生じている場合がある。例えば物質同士の支持体表面における結合・解離挙動からその結合速度定数や解離速度定数を導き出す場合、これらの物性値は計算上、実効濃度に直接影響を受けるため、実効濃度が仕込んだ濃度と異なる場合、誤った物性値が導かれることが分かっている。
【００２１】
本解析方法では、検出、精製、反応、解析の対象である対象物質と相互作用し得る物質を支持体に固定化して、その固定化物質と対象物質との相互作用によって検出、精製、反応、解析をする際の支持体と対象物質との相互作用量を解析することを目的とする。
【００２２】
このような対象物質と固定化物質との組み合わせとしては相互作用し得る物質同士であれば限定はされない。生体関連物質は相互作用の挙動が非常に重要であり、かつより詳細の相互作用制御が重要となるため、固定化物質と対象物質のうちどちらか片方、もしくはその両方が生体関連物質であることが好ましい。生体関連物質としてはタンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖やこれらの複合体や誘導体、また細胞、ウイルスなどを挙げることができる。タンパク質とその相互作用物質の組み合わせとしては、抗体と抗原、酵素と基質、レセプターとリガンド、膜チャネルとリガンドなどを挙げることができる。核酸を含んだ組み合わせとしては、核酸同士、核酸と核酸誘導体、アプタマーと呼ばれる結合性核酸とその結合対象が挙げられる。糖鎖を含んだ組み合わせとしては、糖鎖とレクチンなどの糖鎖認識タンパク質などを挙げることができる。細胞を含んだ組み合わせとしては細胞同士、細胞表層物質とその結合物質、細胞と細胞結合性化合物などを挙げることができる。ウイルスを含んだ組み合わせとしてはウイルスと細胞、ウイルスと抗ウイルス抗体、ウイルスの表層に提示されたペプチドとその結合物質などを挙げることができる。また、その他の組み合わせとして、薬剤とその標的物質、ホルモン性化合物とその作用物質などの低分子化合物と生体関連物質の組み合わせも挙げることができる。
【００２３】
また更に好ましくはこの組み合わせとして抗体、もしくはその一部とその抗原が挙げられる。
【００２４】
相互作用の種類としては疎水性相互作用、静電的相互作用、水素結合、配位結合、共有結合やこれらの複合的相互作用である生化学的結合などが挙げられる。
【００２５】
前記の固定化物質を固定化する支持体は、速度論的解析が行える支持体であれば特に限定はされず、形状も限定はされないが、平面、粗面、粒子、微粒子、棒状などを挙げることができる。
【００２６】
検出・精製・反応・解析の操作は固定化物質と対象物質との相互作用に基づく反応であれば限定はされない。
【００２７】
例えば、検出は、固定化物質と相互作用する対象物質を直接検出するのでも良く、固定化物質と相互作用する対象物質と相互作用する物質を間接的に検出するのでも良く、対象物質と同様に固定化物質と相互作用を示す物質を用いて競合的に検出するのでも良い。また、対象物質を含む溶液を固定化物質に接触させている際に検出するのでも良く、対象物質を接触させた後の状態において検出するのでもよい。
【００２８】
例えば、精製は、固定化物質と相互作用を示す対象物質の精製に用いても良く、固定化物質と相互作用する対象物質以外の混在物質の精製に用いても良い。
【００２９】
例えば、反応は、固定化物質と対象物質の直接の反応でも良く、固定化物質と対象物質が結合している状態における別の物質に対しての反応でも良く、固定化物質と対象物質が結合していない状態における別の物質に対しての反応でも良い。
【００３０】
例えば、解析は、固定化物質と相互作用する対象物質を直接解析するのでも良く、固定化物質と相互作用する対象物質と相互作用する物質を間接的に解析するのでも良く、対象物質と同様に固定化物質と相互作用を示す物質を用いて競合的な相互作用を解析するのでも良い。また、対象物質を含む溶液を固定化物質に接触させている際に解析するのでも良く、固定化物質を接触させた後の状態を解析するのでも良い。
【００３１】
支持体表面の表面処理方法は、検出・精製・反応・解析の操作における処理表面を含んだ２種類以上の方法を用いていれば特に限定はされない。また、本表面処理は実施者が自ら処理操作を施しても良く、また他者によって表面処理を施された支持体を用いても良く、これらの混合でも良い。表面処理操作は支持体の少なくとも一部が施されていれば良いが、好ましくは解析が行われる表面全てにおいて処理が行われることが良い。
【００３２】
２種類以上の表面処理に関して、これらの処理表面は互いに物性が異なっていることが好ましい。
【００３３】
また、処理表面として少なくとも一種がヒドロゲルで被覆されていることがより好ましい。また、処理表面として少なくとも一種が自己組織化膜もしくは疎水性ポリマーで被覆されていることが好ましい。
【００３４】
ヒドロゲルとしては、特許第2815120号公報（4ページ目、右段4行目〜31行目）に記載されている物質を好ましく利用することができる。具体的にはアガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールなどを使用することができる。特に、ポリエチレングリコール誘導体、デキストラン誘導体、特にカルボキシメチル誘導体は生理活性維持の観点から好ましく用いられる。
【００３５】
これらのヒドロゲルはタンパク質などの生体関連物質の非特異的吸着が非常に少なく、また固定化物質の固定化能にも優れているため、検出・精製・反応・解析用の支持体表面として適しているが、その一方、対象物質との間に静電的、もしくは物理的・空間的に相互作用を持ちやすいため、その相互作用量を解析することが非常に重要である。
【００３６】
本発明で言う自己組織化膜とは、外からの細かい制御を加えていない状態で、膜形成分子そのものがもつ物性によって形成される一定の秩序をもつ組織をもった単分子膜やＬＢ膜などの超薄膜のことを言う。この自己組織化により、非平衡な状況で長距離にわたって秩序がある構造やパターンが形成される。
【００３７】
チオールやジスルフィド類などの含硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。
【００３８】
例えば、自己組織化膜は、含硫黄化合物により形成することができる。含硫黄化合物によって金表面に自己組織化膜を形成することは、例えば、Journal of American Chemical
Society, 105, 4481-4483(1983) Nuzzo RGら(p4482, 右段5行目)、Journal of American
Chemical Society, 109, 3559-3568(1987)Porter MDら（p3567, 右段62行目）、Langmuir, 4, 365-385(1988)Troughton EBら(p377 右段18行目)、などに記載されている。また、非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、Whitesides教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Langmuir,17,2841-2850（p2847左段27行目）, 5605-5620（p5616,右段1行目）, 6336-6343 （p6341,右段26行目）(2001)）。本発明において、自己組織化膜形成分子は前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。
【００３９】
自己組織化膜を構成する分子としては、Ｘ−Ｒ−Ｙ、及び／又はＹ1−Ｒ1−Ｚ−Ｒ2−Ｙ2で示される化合物を２種類以上混合して使用することができる。以下、Ｘ、Ｒ（以下、Ｒという場合には、Ｒ1及びＲ2を包含する）、Ｙ（以下、Ｙという場合には、Ｙ1及びＹ2を包含する）、Ｚについて説明する。
【００４０】
Ｘ及びＺは支持体表面、例えば金属に対する結合性を有する基である。Ｘは、具体的には、チオール（−SH）、ニトリル（−CN）、イソニトリル、ニトロ（−NO2）、セレノール（−SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−COSH、−CSSH）が好ましく用いられ、Ｚは、具体的には、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、スルフィド（−Ｓ−）、ジセレニド（−Ｓｅ−Ｓｅ−）、セレニド（−Ｓｅ−）が好ましく用いられる。
【００４１】
Ｙは非特異的な吸着を抑制するための官能基ＹAと、特定物質を結合するための官能基ＹBの混合物であることが好ましい。ＹAは水酸基、ポリエチレングリコール基、ホスホリルコリン基、単糖、オリゴ糖、ポリオールなどを用いることができ、水酸基及び／又はポリエチレングリコール基であることがより好ましい。ＹBは特定物質に直接又は活性化後結合でき、具体的にはカルボキシル、アミノ、アルデヒド、マレイミド、ヒドラジノ、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、ヒドロキシル、又はビニル基などを用いることができ、カルボキシル基であることがより好ましい。また、Ｙ1、Ｙ2は、同一の官能基であっても、異なる官能基であってもよい。
【００４２】
本発明において非特異吸着抑制の対象となる物質は、固定化物質を固定する工程では固定化物質以外の物質を指し、対象物質を接触させる工程では、対象物質以外の物質の吸着抑制が求められる。具体的には、薬物（医薬品、抗生物質、麻薬など）、界面活性剤、脂質、タンパク質、抗体、核酸（DNA、RNA）、多糖類などを挙げることができる。
【００４３】
Ｒはアルキル鎖であることが好ましく、場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含んでいても良い。また、Ｒ1、Ｒ2は、同一であっても、異なっていてもよい。
【００４４】
アルキル鎖の長さは４原子以上２３原子以下であることが好ましく、好ましくは４原子以上１８原子以下であることが好ましく、更に好ましくは６原子以上１６原子以下が良い。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。
【００４５】
２種類以上の自己組織化膜形成分子の主鎖原子数はそれぞれ異なることが好ましい。更に好ましくは、最長の主鎖原子数と最短の主鎖原子数の差が２原子以上であることが良い。ここで主鎖とは、自己組織化膜形成分子において、ＸからＹ、もしくはＺからＹまでの距離が最も長い原子鎖を指す。
【００４６】
有機分子Ｘ−Ｒ−Ｙの具体例としては、10-カルボキシ-1-デカンチオール、11-ヒドロ
キシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオール、7−カルボキシ−１−へプタンチオール、16-メルカプトヘキサデカン酸などが挙げられる。有機分子Ｙ1−Ｒ1−Ｚ−Ｒ2−Ｙ2の具体例としては4,4'-ジチオジブチル酸、11,11'-チオジウンデカン酸などが挙げられる。
【００４７】
本発明において疎水性ポリマーとは、水に対する溶解度が２０重量％以下であるモノマーを５０重量％以上含むポリマーであることが指標として考えられる。
【００４８】
疎水性ポリマー膜を形成するモノマーの２５℃の水に対する溶解度は、新実験化学講座基本操作１（丸善化学、１９７５）に記載されている方法で測定することができる。この方法で測定すると上記本発明におけるモノマーの２０℃の水に対する溶解度は、例えば２−エチルヘキシルメタクリレートで０．００重量％、スチレンで０．０３重量％、メチルメタクリレートで１．３５重量％、ブチルアクリレートで０．３２重量％、ブチルメタクリレートで０．０３重量％である。本発明における疎水性ポリマー膜としての水に対する溶解度の指標としては、１０重量％以下であることがより好ましく、１重量％以下であることが更に好ましい。
【００４９】
本発明で用いられる水に対する溶解度が２０重量％以下であるモノマーの具体例としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができ、スチレン、メタクリル酸メチル、メタクリル酸ヘキサフルオロプロパン、酢酸ビニル、アクリロニトリルなどが挙げられる。疎水性ポリマー化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００５０】
本発明では、前述の水に対する溶解度が２０重量％以下であるモノマーと共に、水に対する溶解度が２０重量％以上であるモノマーを共重合したポリマー化合物を併用してもよい。
【００５１】
水に対する溶解度が２０重量％以上であるモノマーの具体例としては、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸、アクリル酸、アリルアルコール等が挙げられる。
【００５２】
疎水性ポリマー膜は、水に対する溶解度が２０重量％以下である上記モノマーを５０重量％以上含むことがより妥当性が高く、水に対する溶解度が２０重量％以下であるモノマーを７５％以上含むことが更に妥当性が高い。
【００５３】
疎水性ポリマーの支持体表面への被覆は常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００５４】
これらの自己組織化膜、疎水性ポリマー被覆膜は、ヒドロゲル被覆表面と比較して、静電的や物理的・空間的な相互作用が少ない。一方、ヒドロゲル被覆表面と比較して生体関連物質の非特異的吸着抑制能や、固定化物質を大量に固定化する性能に劣る場合がある。
【００５５】
固定化物質の固定化方法としては、前記解析工程において該固定化物質が解離すると、対象物質と固定化物質の相互作用信号のノイズとなるために、前記固定化工程において解離しにくい強固な結合が好ましい。具体的には解離速度定数kdissが1.0×10-4[1/s]より小さいことが好ましく、更に好ましくは、前記支持体表面上の官能基と共有結合することが良い。
【００５６】
該対象物質を含む溶液を該固定化物質に接触させる工程では、該対象物質が該固定化物質と相互作用しうる方法であれば特に限定はされない。具体的には表面処理を施した解析表面上に流路を形成させてそこに該対象物質を含んだ溶液を流すいわゆるコンティニアスフロー方式、同じく解析表面上の流路に該溶液を注入し該溶液が解析表面に接触している状態で流れを止め、場合によって異なる溶液を流す、いわゆるストップトフロー方式、解析表面上に液を溜めて接触させるバッチ方式、支持体自体を該溶液に漬けて反応させるディップ方式などが挙げられる。
【００５７】
また、該対象物質の消費量が少なく速度論的解析もしやすいことから、コンティニアスフロー方式がより好ましく、更に好ましくは該対象物質の濃度が一定の溶液を流しつづける方式が選択される。
【００５８】
速度論的解析工程では経時的に2点以上の測定データを用いた解析であればその解析方法は特に限定はされないが、より好ましくは3点以上、更に好ましくは10点以上の測定データを用いた解析が選択される。また、測定方式は各時点において反応を止めて解析するのでも構わないが、より好ましくは反応にできる限り影響を与えずにリアルタイムで測定しそのデータを解析する方法が選択される。
【００５９】
該速度論的解析は、該対象物質と該固定化物質の相互作用による変化を解析していれば特に限定はされないが、該対象物質の該固定化物質への結合・解離の解析、該対象物質による該固定化物質の構造変化の解析、該固定化物質による該対象物質の構造変化の解析、該対象物質と該固定化物質との相互作用によるこれらと異なる別の物質の構造変化の解析などを挙げることができ、より好ましくは該対象物質の該固定化物質への結合・解離状態を解析することが好ましい。
【００６０】
また、測定方法は該支持体自体、もしくは該支持体表面近傍における物性変化を測定することが好ましい。特に支持体表面の物性変化を感度高く計測する方法として、近接場光を利用した解析方法、もしくはQCM（Quartz Crystal Microbalances）を利用した解析が好ましい。一般的に利用される蛍光と近接場光を利用した解析方法としては近接場光蛍光法やSPR（表面プラズモン共鳴）蛍光法などを用いることができる。
【００６１】
速度論的解析を行う上での測定方法は検出、精製、反応、解析を行う際の対象物質の状態と同一であることが好ましく、このことから一般的には蛍光などの標識をせずに測定できる方法が好ましい。具体的にはSPR解析、漏洩モード測定、ローカル・プラズモン・共鳴分析、グレーティング・カップルド・レゾナンス分析、二面偏波式干渉分析、表面増強ラマン散乱測定やQCMなどを挙げることができる。本発明においては、簡便かつ高感度に経時的な相互作用量を監視することが可能なSPR解析を使用することが好ましい。
【００６２】
SPR解析などのプラズモンを利用した解析が可能な表面としては、金属表面を挙げることができる。金属表面を構成する金属としては、例えば、SPRバイオセンサー用を考えた場合、SPRが生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記支持体への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。なお、本発明における表面処理操作は本金属表面の表面に更に処理を施すことを指す。
【００６３】
金属を薄膜として利用する場合、膜厚は任意であるが、例えば、SPRバイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。また、金属の形態は各解析法に適した形態をとることができ、ナノ微粒子やその平面配置構造、ナノオーダーの凹凸を有する粗面でも良く、またナノホール構造をとっていても良い。
【００６４】
金属の薄膜などの特定構造形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００６５】
金属膜を用いる場合、支持体上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が支持体に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む。
【００６６】
SPR解析や二面偏波式干渉分析、近接場光蛍光法やSPR蛍光法などの支持体の光学的に透明な材料が好ましい測定方法の場合、一般的なＢＫ７等の光学ガラスの他、合成樹脂、具体的にはシクロオレフィンポリマー、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレートを使用することができる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００６７】
速度論的解析のための測定は市販の測定装置をそのまま利用することができ、例えばSPR解析の場合、GEヘルスケア社（Biacore社）製、Biacore3000, 2000, 1000, A100, T100, S51, X, Jや株式会社モリテックス社製、SPR-670、SPR-MACS、東洋紡績株式会社製MulriSPRinter、GWC Technologies社製SPR Imagerなどを挙げることができる。また、コーニング社製Epic System、Farfield Scientific社製AnaLight、株式会社アルバック社（株式会社イニシアム社）製AFFINIXなどを利用することができる。また、特許公報特開2006-194624 段落25〜段落62に記載の装置を利用することもできる。
【００６８】
該速度論的解析における測定データの数値解析は該速度論的解析における測定方法や測定対象に応じて適切な方法を利用することができる。特に、該対象物質の該支持体への結合・解離状態を該対象物質の実際の結合量をリアルタイムで測定する場合、次の式２で表されるLangmuirの等温式、もしくはその展開式を用いて解析する方法が好ましく選択される。
【００６９】
【化２】
2008116341.tif 000003
θ： 対象物質の全固定化サイトに対する被覆率
t ： 対象物質の接触時間
ka ： 結合速度定数
kd : 解離速度定数
c : 遊離対象物質濃度
【００７０】
また、本式はその条件下における対象物質の最大結合量Rmaxを用いて式３のように表すことができる。
【化３】
2008116341.tif 000004
R ：対象物質の結合量
Rmax: その条件下における対象物質の最大結合量
【００７１】
また、式２のような微分方程式を利用した解析ではなく、差分方程式を利用した解析を行っても良い。その場合の差分方程式は式４のようになる。
【００７２】
【化４】
2008116341.tif 000005
Δt  : 測定インターバル
θ(n): t=n×Δt の時の対象物質の全固定化サイトに対する被覆率
R(n): t=n×Δt の時の対象物質の結合量
他の記号は式２及び式３の記号と同義である。
【００７３】
Langmuirの等温式の展開式とは式２〜４を元にして、解析対象の物性に応じて改変された式のことを指す。例えば遊離対象物質濃度（実効濃度）が仕込んだ濃度cの何分の一かもしくは何倍かになる場合、cの代わりにα×c'（α：比例定数、 c'：仕込み対象物質濃度）を代入した式を利用することができる。また、遊離対象物質濃度が時間tの変数、C'(t)の場合、cの代わりにC'(t)を代入した式を利用することができる。
【００７４】
更に、展開式として該対象物質が二価であり、固定化物質及び／又は対象物質のどちらかの可動性が高くかつそれらが結合できる範囲に存在する場合は、次の式５を好ましく利用することができる。
【００７５】
【化５】
2008116341.tif 000006
【００７６】
記号の説明
θ1：その条件下における対象物質の最大結合量に対する対象物質の結合率
θ2 ：結合している対象物質のうち二価で結合している割合
ka1 ：θ1として結合する対象物質の結合速度定数
kd1 ：θ1として解離する対象物質の解離速度定数
ka2 ：θ2として結合する対象物質の結合速度定数
kd2 ：θ2として解離する対象物質の解離速度定数
他の記号は式２及び式３の記号と同義である。
【００７７】
更に、結合・解離挙動を解析する式として、更に好ましくは式１に示した差分方程式を利用した解析する方法が選択される。本式を利用した解析方法は、既に結合した対象物質が後から接触する対象物質の結合速度を抑制することを考慮に入れた式である。そのため、本式は固定化物質の固定化密度が比較的高い場合に好ましく利用することができる。更に好ましくは、本式は自己組織化膜、もしくは疎水性ポリマーで被覆された表面における解析に利用することができる。
【００７８】
速度論的解析の結果を比較する工程において、具体的には速度論的解析から得られた物性値を比較しても良く、得られた物性値を別の解析に用いても良く、また2種類以上の表面における速度論的解析から得られる物性値群の中で値の大きく外れる表面種を抽出しても良いとする。また、経時的に得られるデータそのもの同士を比較して算出したデータを用いて速度論的解析を行っても良い。
【００７９】
本発明における検出、精製、反応、解析の操作は、本発明の解析方法を行うことによって選択される最適な条件を用いて行うことができる。具体的には本発明で示す解析によって特定の処理表面における対象物質の実効濃度が低下していることが示された場合、最適濃度と比較してこの低下分を補正するような濃度で検出、精製、反応、解析の操作を行うことができる。また、解析において該解析によって得られた実効濃度を用いて解析することができる。
【００８０】
本発明における検出、精製、反応、解析の操作は、本発明の解析方法を行うことによって選択される最適な表面処理を用いて行うことができる。具体的には2種類以上の表面において解析した結果、対象物質の実行濃度が際立って外れている表面以外を用いて検出、精製、反応、解析の操作を行うことや、解析した結果、対象物質の実効濃度が最適となった表面を用いて検出、精製、反応、解析の操作を行うことが挙げられる。
【００８１】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８２】
装置／試薬（特に明記のないものは製品をそのまま使用した。）
Biacore3000：ビアコア株式会社製
GST： SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.製 (1mg/ml)：GST (1-218): sc-4033, Lot#D0805：製品をSodium Acetate(pH5.0)で0.01mg/mlに調製した。
Anti-GST IgG QED bioscience, Inc.製（Lot. GST10PX402）：monoclonal antibody, Catalog Number 18803, 1.0mg/ml：製品をHBS-Pで11nMに調製した。
【００８３】
HBS-P buffer：ビアコア株式会社製：使用前に外圧を下げて脱気を１時間行ってから使用した。
0.4M EDC：ビアコア株式会社製
0.1M NHS：ビアコア株式会社製
Sulfo-NHS：PIERCE製（Prod# 24510）：純水で0.1Mに調製したものを用いた。
1M Ethanol amine：ビアコア株式会社製(pH8.5)
1M H(OC2H4)4-NH2：日本乳化剤株式会社製 JNA-08201（Lot.No-Z202T0）：HClでpH9.0に純水で1Mに調製した。
Sodium acetate pH4.5：ビアコア株式会社製
10mM Gly（pH1.5）：ビアコア株式会社製
10mM NaOH：1M NaOHを純水で希釈
CM5被覆金チップ：ビアコア株式会社製
SAM被覆金チップ：下記の手順で作製した。
【００８４】
実験操作：
SAM被覆金チップの作製
金チップ（ビアコア株式会社製）に12分間UVを照射する。80%エタノール（20%純水）中に11-Hydroxy-1-undecanethiol（4.5mM）及び16-Mercaptohexadecanoic acid （0.5mM）を含むSAM被覆溶液に金チップを浸漬させて40℃で1時間静置する。エタノール、純水の順で流し洗いを行う。窒素で洗浄液を吹き飛ばす。（純水中で遮光保存）
【００８５】
固定化物質（GST）の固定化
（ｉ）CM5のGST固定化
Biacore3000を用いて下記の溶液を上から順に（a→c）CM5と反応させる。
a. 0.4M EDC + 0.1M NHS  50％混合溶液 ：7分(70μl)
b. 0.01mg/ml GST in HBS-P  Manual Inject（固定量151.3RU）
c. 1M Ethanolamine (pH8.5)：7分(70μl)
【００８６】
（ii）CM5のEthanolamineマスク（negative control）
Biacore3000を用いて下記の溶液を上から順に（a→b）CM5と反応させる。
a. 0.4M EDC + 0.1M NHS  50％混合溶液：7分(70μl)
b. 1M Ethanolamine (pH8.5)：7分(70μl)
【００８７】
（iii）SAMのGST固定化
Biacore3000を用いて下記の溶液を上から順に（a→d）SAMと反応させる。
a. HBS-P buffer（平衡化）：30分〜(300μl〜)
b. 0.4M EDC + 0.1M SNHS  50％混合溶液：30分(300μl)
c. 0.01mg/ml GST in HBS-P  Manual Inject（固定化量167.0RU）
d. 1M H(OC2H4)4-NH2 (pH9.0)：30分(300μl)
【００８８】
（iv） SAMのEthanolamineマスク（negative control）
Biacore3000を用いて下記の溶液を上から順に（a→c）SAMと反応させる。
a. HBS-P buffer（平衡化）：30分〜(300μl〜)
b. 0.4M EDC + 0.1M SNHS  50％混合溶液：30分(300μl)
c. 1M H(OC2H4)4-NH2 (pH9.0)：30分(300μl)
【００８９】
各抗体の結合量測定
Biacore3000を用いて対象物質として抗GST抗体を上記の各膜に流して反応させた。反応条件は下記のi〜viに従った。
【００９０】
反応条件：
i： HBS-P：3分(30μl)（平衡化）
ii： 抗体溶液：10分(100μl)（抗体の結合）
iii：HBS-P：10分(30μl)（抗体の解離）
iv： 10mM Gly-HCl : 1分(10μl)（結合抗体の解離・洗浄）
v：  10mM NaOH：1分(10μl)（結合抗体の解離・洗浄）
vi： HBS-P：15分(150μl)（平衡化）
【００９１】
カーブフィッティングは以下の手法を用いた。
Curve Fittingとは理論式を実測値に近づくように理論式中の各パラメータを変化させ、最も実測値に近くなるパラメータの値を決定していく手法である。その時、一般的に理論値（式から導き出される）と実測値の差の二乗を、全ての点において足し合わせ、その和が最も小さくなるように理論計算式の各種パラメータを変化させていく。本式を式６に示す。
【００９２】
【化６】
2008116341.tif 000007
【００９３】
対象物質の結合量Rを時間tの関数として式に変換できれば、その各時間tにおける理論Rを算出することで、上記の式６の値を最小とするような各種パラメータを決定することができる。ただし、式の変換が不可能、もしくは非常に困難である場合は、微分方程式を展開せずに、差分方程式を利用することができる。差分方程式を利用すると初期条件（例えばR(0)）から帰納的に計算することにより、全てのRを求めることが可能になる。例を式７に示す。
【００９４】
【化７】
2008116341.tif 000008
【００９５】
式６を用いて実際にCurve Fittingを行う場合、手計算で行うことは実質的に不可能であり、何らかのソフトウェアを利用する必要がある。本実施例においては、Microsoft社Excelのアドインに登録されている『ソルバーアドイン』というマクロを用いてCurve Fittingを行った。この際、式６が最小になるように未知数（例えば式４におけるka, kd, Rmax）の最適化を行う。
【００９６】
CM5にGSTを固定化した表面において得られる相互作用を示すデータ一群（以後センサグラムと呼ぶ）からGSTを固定しなかった表面において得られるセンサグラムを引いて（各時点のデータの引き算をして）GSTと抗GST抗体との相互作用挙動センサグラムをグラフで示した。
【００９７】
得られた相互作用挙動センサグラムに対して式５を用いてカーブフィッティングを行い、未知パラメータであるka1, kd1, ka2, kd2, Rmaxを算出した。ただしΔtは1[秒]とした。なお、適切な式の選択に関して、今回の対象物質が二価の抗体であること、CM5が非常に水溶性の高いヒドロゲルであり、固定化された固定化物質（GST）の可動性が高いと考えられることから式５を選択した。
【００９８】
本解析により得られたCM5における相互作用センサグラムとそのフィッティングカーブを図１に、さらにそこから得られたka1, kd1, ka2, kd2, Rmaxを表1.に示す。
図１における実測値の実験条件：
固定化物質：GST（〜150RU）
対象物質：IgG（11nM〜300nM）
接触時間：10分
【００９９】
【表１】
2008116341.tif 000009
【０１００】
CM5と同様に、SAMにGSTを固定化した表面において得られるセンサグラムからGSTを固定しなかった表面において得られるセンサグラムを引いてGSTと抗GST抗体との相互作用挙動センサグラムをグラフで示した。
【０１０１】
得られた相互作用挙動センサグラムに対して式1.を用いてカーブフィッティングを行ったグラフを図２に、そこから得られる未知パラメータka1, kd1, ka2, kd2, Rmaxを表２に示した。
図２における実測値の実験条件
固定化物質：GST（〜150RU）
対象物質：IgG（11nM〜300nM）
接触時間：10分
【０１０２】
【表２】
2008116341.tif 000010
【０１０３】
CM5とSAMの比較とCM5中の抗体濃度の分配係数
上記のようにCM5とSAMに固定化したGSTに対するIgGの結合速度定数ka1、解離速度定数kd1を求めた。それぞれの値を表３に示した。
【０１０４】
【表３】
2008116341.tif 000011
【０１０５】
表３から分かるように、リガンド固定化膜によって結合速度定数が異なる。CM5の結合定数ka1はSAMのおよそ1/10となり、解離速度定数kd1はほぼ同じ値となった。本来は両条件における速度定数ka1は等しいはずであるであるため、今回のFitting Curveの式では組み込んでいない現象が起こっていると考えられる。
【０１０６】
式５に示したようにka1は濃度cとの積（ka1×c）で計算式に含まれるために、ka1が1/2になった場合とcが1/2になった場合の計算値（R）は等しくなる。そのことから、式５においては実効濃度cを流路に流した濃度（cf）と等しいと見なしたためにka1がSAMにおける値より小さくなったが、実際は実効濃度cが流路中濃度cfより小さく、ka1はSAMにおける値と等しいと考えるべきである。
【０１０７】
本仮説のような実効濃度低下を生じさせる原因として、静電的な反発力と物理的な反発力が想定できる。抗体IgGの一般的なpIは5.8〜7.3であり、今回使用したバッファーのpHは7.4であることから抗体は若干負に帯電しており、それがCMDのカルボン酸由来の負電荷と反発していると考えられる。また、抗体IgGは比較的嵩高いタンパク質であるために、一般的なタンパク質と比べると物理的な反発力は大きい可能性はある。このことから、仮説の妥当性は高いと考えられる。
【０１０８】
CM5中のIgG濃度の分配係数
上記の仮説に基き、αを分配係数として定義し、式５のθ1の式において、cの代わりにα×cfと置き換えた式を立てた（式５’）。
【０１０９】
【化８】
2008116341.tif 000012
【０１１０】
更に、ka1、kd1に対してSAMにおいて求められた値を代入し変数をα、ka1、kd1、RmaxとしてCurve Fittingを行った所、良好なFitting Curveが得られた（図３）。
【０１１１】
【表４】
2008116341.tif 000013
【０１１２】
表４に示したように分配係数αは12.6％となった。このことは、CM5中においてIgG濃度は流路中の12.6％に低下していることを表している。このように、2種類の表面処理を施した表面を用いて解析を行い、その結果を比較することから、支持体表面と対象物質との間の相互作用量のうち、該対象物質の実効濃度を変化させる相互作用量を見積もることができた。
【０１１３】
この解析結果は支持体表面と対象物質との間の相互作用を見積もる方法として従来行われてきた、固定化物質がない表面における解析と比較する解析法では得られない結果であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、CM5における相互作用センサグラム（太字）とそのフィッティングカーブ（細字）を示す。
【図２】図２は、SAMにおける相互作用センサグラム（太字）とそのフィッティングカーブ（細字）を示す。
【図３】図３は、実効濃度低下を考慮にいれたCM5のBivalent Fitting Curveを示す。
【図１】
2008116341.tif 000015
【図２】
2008116341.tif 000016
【図３】
2008116341.tif 000017