(57)【要約】      （修正有）【課題】4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩の製造方法の提供。【解決手段】アミノ基供与体の存在下、アセトアルデヒドとL-スレオニンから下記式 (Ｉ)2008109924.tif 000018に示す4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの生成反応を触媒する生体触媒を、アミノ基供与体を含む水性溶媒中で、アセトアルデヒドとL-スレオニンと接触させて、4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離する工程を含む、4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩の製造方法。【選択図】図１３
2008109924.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ基供与体の存在下、アセトアルデヒドとL-スレオニンから下記式（I）に示す4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生成する反応を触媒する生体触媒を、アミノ基供与体を含む水性溶媒中で、アセトアルデヒドとL-スレオニンと接触させ、
4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離する工程を含む、4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩の製造方法。
【化１】
2008109924.tif 000016
【請求項２】
生体触媒がスレオニン・デアミナーゼを含む請求項１の方法。
【請求項３】
生体触媒がアルドラーゼを含む請求項１または２の方法。
【請求項４】
生体触媒がアミノトランスフェラーゼを含む請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項５】
アミノ基供与体がL-アミノ酸の群から選ばれる請求項１〜４のいずれかの方法。
【請求項６】
生体触媒がL-スレオニンからα-ケトブタン酸を生成するスレオニン・デアミナーゼ、アセトアルデヒドとα-ケトブタン酸から4-ヒドロキシ−3-メチル-2-ケトペンタン酸を生成するアルドラーゼ、および、アミノ基供与体の存在下、4-ヒドロキシ−3-メチル-2-ケトペンタン酸から4-ヒドロキシ−L-イソロイシンを生成するアミノトランスフェラーゼを含む請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項７】
生体触媒がL-スレオニンからα-ケトブタン酸を生成するスレオニン・デアミナーゼ、アセトアルデヒドとα-ケトブタン酸から4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ケトペンタン酸を生成するアルドラーゼ、および、アミノ基供与体の存在下、4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ケトペンタン酸から4-ヒドロキシ-L-イソロイシンを生成するアミノトランスフェラーゼを含む細菌である請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項８】
スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼのうち少なくとも一種の活性を増強するために、細菌が改変された請求項７の方法。
【請求項９】
スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、および/またはアミノトランスフェラーゼの発現を増加させることにより、スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼの活性が増強される請求項８の方法。
【請求項１０】
スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼおよび/またはアミノトランスフェラーゼの発現が、当該スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼおよび/またはアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現制御配列を改変するか、または当該スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼおよび/またはアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数を増加させることで増加する請求項９の方法。
【請求項１１】
スレオニン・デアミナーゼが、エシェリヒア属に属する細菌から単離される、請求項７〜１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
スレオニン・デアミナーゼが、L-イソロイシンによるフィードバック阻害がない請求項１１の方法。
【請求項１３】
アルドラーゼが、アルドラーゼのhpcH/hpaIファミリーに属するアルドラーゼである請求項７〜１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
アルドラーゼが、エシェリヒア (Escherichia)、アースロバクター(Arthrobacter)、ノボスフィンゴビウム(Novosphingobium)から成る群から選ばれた細菌から単離される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
アミノトランスフェラーゼが、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼに属するアミノトランスフェラーゼである請求項７〜１４のいずれかの方法。
【請求項１６】
分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼがエシェリヒア (Escherichia) とバチルス（Bacillus）から成る群から選ばれた細菌から単離される請求項１５の方法。
【請求項１７】
細菌が細菌培養物、細胞、または、処理した細胞である、請求項７〜１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンが、少なくとも(2S,3S,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン、(2S,3R,4R)-4-ヒドロキシイソロイシン、(2S,3S,4R)-4-ヒドロキシイソロイシン、および (2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシンからなる群から選択される少なくとも一つである請求項１〜１７のいずれかの方法。
【請求項１９】
アミノ基供与体の存在下、L-スレオニンからα-ケトブタン酸を生成する反応およびα-ケトブタン酸からα-アミノブタン酸を生成する反応を触媒する第一生体触媒をアミノ基供与体を含む水性溶媒中でL-スレオニンと接触させ、
アセトアルデヒドとα-ケトブタン酸から4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ケトペンタン酸を生成する反応および4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ケトペンタン酸から下記式(I)に示す4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生成する反応を触媒する第二生体触媒を、アミノ基供与体と第一生体触媒の反応生成物を含む水性溶媒中で、アセトアルデヒドと接触させ、
4-ヒドロキシ-L-イソロイシンを単離する工程を含む、4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩の製造方法。
【化２】
2008109924.tif 000017
【請求項２０】
第一生体触媒は、L-スレオニンからα-ケトブタン酸を生成するスレオニン・デアミナーゼと、アミノ基供与体の存在下α-ケトブタン酸からα-アミノブタン酸を生成するアミノトランスフェラーゼとを含む第一細菌であり;第二生体触媒は、アセトアルデヒドとα-ケトブタン酸から4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ケト-ペンタン酸を生成するアルドラーゼと、アミノ基供与体の存在下、4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ケトペンタン酸から4-ヒドロキシ-L-イソロイシンを生成するアミノトランスフェラーゼとを含む第二細菌である請求項１９の方法。
【請求項２１】
スレオニン・デアミナーゼとアミノトランスフェラーゼのうち、
少なくとも1種の活性を増強するために、第一細菌が改変され、また、アルドラーゼとアミノトランスフェラーゼのうち、少なくとも一種の活性を増強するために、第二細菌が改変される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびグルタミン酸輸送体のうち、少なくとも1種の活性を増強するために、第一細菌がさらに改変される請求項２１の方法。
【請求項２３】
グルタミン酸輸送体の活性を増強するために、第二細菌がさらに改変される請求項２１の方法。
【請求項２４】
スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび/またはグルタミン酸輸送体の発現を増加させることで、スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび/またはグルタミン酸輸送体の活性が増強される請求項２１〜２３のいずれかの方法。
【請求項２５】
スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、アミノトランスフェラーゼ
、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび/またはグルタミン酸輸送体の発現を、当該スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび/またはグルタミン酸輸送体をコードする遺伝子の発現制御配列の改変によるか、または当該スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび/またはグルタミン酸輸送体をコードする遺伝子のコピー数を増加させることで増加する請求項２４の方法。
【請求項２６】
スレオニン・デアミナーゼがエシェリヒア属(Escherichia)に属する細菌から単離される請求項２０〜２５のいずれかの方法。
【請求項２７】
スレオニン・デアミナーゼがL-イソロイシンによるフィードバック阻害がない請求項２６の方法。
【請求項２８】
アルドラーゼが、アルドラーゼのhpcH/hpaIファミリーに属するアルドラーゼである請求項２０〜２７のいずれかの方法。
【請求項２９】
当該アルドラーゼが、エシェリヒア (Escherichia)、アースロバクター (Arthrobacter)、およびノボスフィンゴビウム(Novosphingobium)から成る群から選ばれた細菌から単離される請求項２８の方法。
【請求項３０】
アミノトランスフェラーゼが、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼに属するアミノトランスフェラーゼである請求項２０〜２９のいずれかの方法。
【請求項３１】
分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、エシェリヒア (Escherichia)とバチルス（Bacillus）から成る群から選ばれた細菌から単離される請求項３０の方法。
【請求項３２】
α-ケトブタン酸の異化を防ぐために第一および第二細菌がさらに改変される請求項２０〜３１のいずれかの方法。
【請求項３３】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を減少させることで、α-ケトブタン酸の異化を防ぐ請求項３２の方法、
【請求項３４】
aceE遺伝子のアテニュエート（減弱）発現によってピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を減少させる請求項３３の方法。
【請求項３５】
細菌が細菌培養物、細胞、または処理した細胞である、請求項２０〜３４のいずれかの方法。
【請求項３６】
4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンが、(2S,3S,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン、(2S,3R,4R)-4-ヒドロキシイソロイシン、(2S,3S,4R)-4-ヒドロキシイソロイシン、および (2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシンからなる群から選択される少なくとも一つである請求項２９〜３５のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物産業、詳しくは4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、コロハ（フェヌグリーク）種子 (Trigonella foenum-graecum L.leguminosae) から抽出、精製できるアミノ酸である。4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、興味深いインスリン分泌性活性を示すが、これは、単離潅流ラット膵臓およびヒトの膵島の両者で実証されているように、その促進効果がミディアム中の血漿グルコース濃度に明白に依存するからである (Sauvaire, Y.ら, Diabetes, 47: 206-210, (1998)) 。そのようなグルコース依存性は、２型糖尿病[非インスリン依存性糖尿病、（NIDD) mellitus (NIDDM)]の治療に現在使用されている唯一のインスリン分泌活性薬であるスルホニル尿素(Drucker, D. J., Diabetes 47: 159-169, (1998)) では確認されていない。その結果、低血糖症が依然として、スルホニル尿素治療の通常望ましくない副作用である。(Jackson, J., and Bessler, R. Drugs, 22: 211-245; 295-320, (1981); Jennings, A. ら. Diabetes Care, 12: 203-208, (1989))。またグルコース耐性の改善も知られている。（(Am. J. Physiol. Endocrinol., Vol. 287, E463-E471, 2004) 。このグルコース代謝増強活性とその医薬品と健康食品への応用の可能性が報告された(特開平6-157302号公報)。
【０００３】
植物にのみ発見されている4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、その特定インスリン分泌性作用のために、様々な程度のインスリン耐性に関連するインスリン分泌不全を特徴とする疾病である、２型糖尿病の治療用の可能性を秘めた新規分泌促進剤と見なしてもよい(Broca, C. ら, Am. J. Physiol. 277 (Endocrinol. Metab. 40): E617-E623, (1999))
。
【０００４】
フェヌグリーク（コロハ）抽出液中のジオキシゲナーゼ活性を利用する鉄、アスコルビン酸、２−オキシグルタル酸、酸素に依存するイソロイシンの酸化法が4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造法として、報告されている(Phytochemistry, Vol. 44, No. 4, pp. 563-566, 1997) 。しかし、この方法は、20mM以上のイソロイシン濃度で酵素活性が基質で阻害され、この酵素が同定されていなく、酵素は植物の抽出液から誘導され、たやすく大量に得られなく、かつ、この酵素が安定でないために、4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造法として不充分である。
【０００５】
光学的に純粋な(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-Ｌ-イソロイシンが全収率39%で得られる効率的な8工程合成が開示されている。この合成の重要な工程は、ethyl 2-methylacetoacetateをGeotrichum candidum でethyl (2S,3S)-2-methyl-3-hydroxybutanoate に生物変換すること、および不斉Strecker 合成を含む (Wang, Q. ら, Eur. J. Org. Chem., 834-839 (2002)) 。
【０００６】
短い6工程で立体化学を完全に制御した(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシンの化学酵素的合成も発表されているが、最終工程は市販のEupergit C(E-PAC)上固定化ペニシリン・アシラーゼGを使用したN-phenylacetyl lactone誘導体の加水分解による酵素的分割である(Rolland-Fulcrand, V. ら, J. Org. Chem., 873-877 (2004)) 。
【０００７】
しかし、現在、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の酵素的アミノ基転移反応により、あるいは他の原料から別の酵素的転化により4−ヒドロキシ−Ｌ−イソ
ロイシンを生成する報告はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明が解決しようとする課題は、工業的に利用できる4−ヒドロキシ−L−イソロイシン(遊離および塩の両形態を含むことを意味し、“4HIL”と呼ぶこともある；以下同様)を製造する方法を如何に提供するかである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、4HILの前駆体である、4−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケトペンタン酸(遊離および塩の両形態を含むことを意味し、“HMKP”と呼ぶこともある；以下同様)を取得するのにアルドール反応を使用し、アミノトランスフェラーゼによりそれ（前駆体）を4HILに変換する方法に注目し、E．コリ由来のMhpEアルドラーゼ(App1. Environ. Microbio1., Vo1.64, No.10, 4093-4094,1998) および杉山ら報告のアルドラーゼ (WO2004-018672) の使用を検討した。しかしHMKP の生成量は常に1μM未満であり、アミノ基転移反応に使用するには不充分であった。そこで、さらに検討の結果、それぞれ、脱アミノ、アルドール反応とアミノ基転移反応に向いた酵素の発見に至った。本発明に基づけば、連続的にあるいは同時に3つの反応をすべて導ける新しい微生物を提案できる。すなわち、本発明によれば、これらの生体触媒は、簡便に4-ヒドロキシ-L-イソロイシンを製造する方法を提供するのに使用できる。
【００１０】
従って、本発明の目的はアセトアルデヒドと、L-スレオニン(遊離および塩の両形態を含む意味に使用、以下同様)を細菌を使用して、細菌性デアミナーゼで脱アミノ化して生成した、α−ケトブタン酸(遊離および塩の両形態を含む意味に使用、以下同様)とのアルドール反応によってHMKPを生成する酵素的方法を提供することを含む。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、アセトアルデヒドと、L-スレオニンの脱アミノ反応で生成したα−ケトブタン酸との細菌性アルドラーゼによるアルドール反応で生成した、HMKPへの細菌性アミノトランスフェラーゼによるアミノ基転移により、4HILを生成する酵素的方法を提供することを含む。
【００１２】
なお、さらに、本発明の目的は、アセトアルデヒドと、L-スレオニンの脱アミノ反応で生成したα−ケトブタン酸との細菌性アルドラーゼによるアルドール反応で生成したHMKPへの、アミノトランスフェラーゼ活性を増強するよう改変された細菌性アミノトランスフェラーゼ、特に分枝鎖アミノ酸用アミノトランスフェラーゼによるアミノ基転移により、4HILを生成する酵素的方法を提供することを含む。
【００１３】
更に、本発明の目的は、脱アミノ化、アルドール反応、および、アミノ基転移の三つの工程で4HILを生成する酵素的方法を提供することを包む。
【００１４】
すなわち、本発明は少なくとも下記の内容を含む。
[1] アミノ基供与体の存在下、アセトアルデヒドとL-スレオニンから下記式(I)に示す4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生成する反応を触媒する生体触媒を、アミノ基供与体を含む水性溶媒中で、アセトアルデヒドとL-スレオニンと接触させ、
4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離する工程を含む、4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩の製造方法。
【００１５】
【化１】
2008109924.tif 000003
【００１６】
[2] 生体触媒がスレオニン・デアミナーゼを含む [1]の方法。
【００１７】
[3] 生体触媒がアルドラーゼを含む [1] または [2]の方法。
【００１８】
[4] 生体触媒がアミノトランスフェラーゼを含む[1]〜[3]のいずれかの方法。
【００１９】
[5] アミノ基供与体がL-アミノ酸の群から選ばれる1〜4のいずれかの方法。
【００２０】
[6] 生体触媒がL-スレオニンからα-ケトブタン酸を生成するスレオニン・デアミナーゼ、アセトアルデヒドとα-ケトブタン酸から4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ケト-ペンタン酸を生成するアルドラーゼ、および、アミノ基供与体の存在下、4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ケトペンタン酸から4-ヒドロキシ−L-イソロイシンを生成するアミノトランスフェラーゼを含む[1]〜[5]のいずれかの方法。
【００２１】
[7] 生体触媒がL-スレオニンからα-ケトブタン酸-を生成するスレオニン・デアミナーゼ、アセトアルデヒドとα-ケトブタン酸から4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ケト-ペンタン酸を生成するアルドラーゼ、および、アミノ基供与体の存在下、4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ケトペンタン酸から4-ヒドロキシ−L-イソロイシンを生成するアミノトランスフェラーゼを含む細菌である[1]〜[5]のいずれかの方法。
【００２２】
[8] スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼのうち少なくとも一つの活性を増強するために、細菌が改変された[7]の方法。
【００２３】
[9] スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、および/またはアミノトランスフェラーゼの発現を増加させることにより、スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼの活性が増強される[8]の方法。
【００２４】
[10] スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼおよび/またはアミノトランスフェラーゼの発現が、当該スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼおよび/またはアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現制御配列を改変するか、または当該スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼおよび/またはアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数を増加させることで増加する[9]の方法。
【００２５】
[11] スレオニン・デアミナーゼが、エシェリヒア属に属する細菌から分離される[7]〜[10]のいずれかの方法。
【００２６】
[12] スレオニン・デアミナーゼが、L-イソロイシンによるフィードバック阻害がない[11]の方法。
【００２７】
[13] アルドラーゼが、アルドラーゼのhpcH/hpaIファミリーに属するアルドラーゼである[7]〜[12]のいずれかの方法。
【００２８】
[14] アルドラーゼが、エシェリヒア(Escherichia)、アースロバクター(Arthrobacter)、ノボスフィンゴビウム(Novosphingobium)から成る群から選ばれた細菌から単離される、[13]の方法。
【００２９】
[15] アミノトランスフェラーゼが、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼに属するアミノトランスフェラーゼである[7]〜[14]のいずれかの方法。
【００３０】
[16] 分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼがエシェリヒア(Escherichia)とバチルス（Bacillus）から成る群から選ばれた細菌から単離される[1５]の方法。
【００３１】
[17] 細菌が細菌培養物、細胞、または、処理した細胞である、 [7]〜[16]のいずれかの方法。
【００３２】
[18]   4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンが、少なくとも(2S,3S,4S)-4−ヒドロキシイソロイシン、(2S,3R,4R)-4−ヒドロキシイソロイシン,(2S,3S,4R)-4−ヒドロキシイソロイシン、および (2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシンからなる群から選択された少なくとも一つである [1]〜[17]のいずれかの方法。
【００３３】
[19]  アミノ基供与体の存在下、L -スレオニンからα-ケトブタン酸を生成する反応およびα-ケトブタン酸からα-アミノブタン酸を生成する反応を触媒する第一生体触媒をアミノ基供与体を含む水性溶媒中でL-スレオニンと接触させ、
アセトアルデヒドとα-ケトブタン酸から4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ケトペンタン酸を生成する反応および4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ケトペンタン酸から下記式(I)に示す4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生成する反応を触媒する第二生体触媒をアミノ基供与体と第一生体触媒の反応生成物を含む水性溶媒中でアセトアルデヒドと接触させ、
4-ヒドロキシ−L-イソロイシンを単離する工程を含む、4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩の製造方法。
【００３４】
【化２】
2008109924.tif 000004
【００３５】
[20] 第一生体触媒は、L-スレオニンからα-ケトブタン酸を生成するスレオニン・デアミナーゼとアミノ基供与体の存在下α-ケトブタン酸からα-アミノブタン酸-を生成するアミノトランスフェラーゼ-を含む第一細菌であり；第二生体触媒は、アセトアルデヒドとα-ケトブタン酸から4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ケトンのペンタン酸を生成するアルドラーゼと、アミノ基供与体の存在下、4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ケト-ペンタン酸から4-ヒドロキシ−L-イソロイシンを生成するアミノトランスフェラーゼとを含む第二細菌である[19]の方法。
【００３６】
[21] スレオニン・デアミナーゼおよびアミノトランスフェラーゼのうち、少なくとも1種の活性を増強するために、第一細菌が改変され、また、アルドラーゼとアミノトランスフェラーゼのうち、少なくとも一種活性を増強するために、第二細菌が改変された、[20]の方法。
【００３７】
[22] グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびグルタミン酸輸送体のうちの少なくとも1種の活性を増強するために、第一細菌がさらに改変された[21]の方法。
【００３８】
[23]  グルタミン酸輸送体の活性を増強するために、第二細菌がさらに改変された[21]の方法。
【００３９】
[24] スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび/またはグルタミン酸輸送体の発現を増加させることで、スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび/またはグルタミン酸輸送体の活性が増強される[21]〜[23]のいずれかの方法。
【００４０】
[25] スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび/またはグルタミン酸輸送体の発現を、当該スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび/またはグルタミン酸輸送体をコードする遺伝子の発現制御配列の改変によるか、または当該スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび/またはグルタミン酸輸送体をコードする遺伝子のコピー数を増加させることで増加する[24]の方法。
【００４１】
[26] スレオニン・デアミナーゼがエシェリヒア属に属する細菌から単離される[20]〜[25]のいずれかの方法。
【００４２】
[27] スレオニン・デアミナーゼがL-イソロイシンによるフィードバック阻害がない[26]の方法。
【００４３】
[28] アルドラーゼが、アルドラーゼのhpcH/hpaIファミリーに属するアルドラーゼである[20]〜[27]のいずれかの方法。
【００４４】
[29] 当該アルドラーゼが、エシェリヒア(Escherichia)、アースロバクター(Arthrobacter)、ノボスフィンゴビウム(Novosphingobium)から成る群から選ばれた細菌から単離される[28]の方法。
【００４５】
[30] アミノトランスフェラーゼが、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼに属するアミノトランスフェラーゼである[20]〜[29]のいずれかの方法。
【００４６】
[31] 分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼがエシェリヒア(Escherichia)とバチルス（Bacillus）から成る群から選ばれた細菌から単離される[30]の方法。
【００４７】
[32] α-ケトブタン酸の異化を防ぐために第一および第二細菌がさらに改変される[20]〜[31]のいずれかの方法。
【００４８】
[33]ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を減少させることで、α -ケトブタン酸の異化を防ぐ[32]の方法、
【００４９】
[34] aceE遺伝子のアテニュエート（減弱）発現によってピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を減少させる[33]の方法。
【００５０】
[35] 細菌が細菌培養物、細胞、処理した細胞である、[20]〜[34]のいずれかの方法。
【００５１】
[36]  4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンが、(2S,3S,4S)-4−ヒドロキシイソロイシン,(2S,3R,4R)-4−ヒドロキシイソロイシン、(2S,3S,4R)-4−ヒドロキシイソロイシン、および (2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシンからなる群から選択された少なくとも一つである [19]〜[35]のいずれかの方法。
【００５２】
本発明によれば、便利な製造法が従来知られていなかった4HILを産業上有用な様式で、製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本発明を以下詳細に記載する。
【００５４】
1.本発明の実施で使用できる一般的な定義および方法
本明細書では、用語「4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン」あるいは「4HIL」は、(2S,3S,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン、(2S,3R,4R)-4-ヒドロキシソロイシン、(2S,3S,4R)-4-ヒドロキシソロイシン、および (2S,3R,4S)-4−ヒドロキシイソロイシンからなる群から選択された単一の化合物あるいは二種以上のジアステレオマー混合物を指す。
【００５５】
明細書で使用する用語「細菌」は、酵素を生成する細菌、突然変異体、および目的とする酵素活性が存在するか、または、増強されたかかる細菌の遺伝子組み換え体等を含む。
【００５６】
「遺伝子の発現を増加する」という語句は、遺伝子の発現が非改変菌株、例えば野生型菌株より高いことを意味する。そのような改変の例は、細胞１個当たりの発現された遺伝子のコピー数を増加させること、遺伝子の発現レベルを増加させることなどを含む。発現された遺伝子のコピー数の量は、例えば、染色体のDNAの制限後、遺伝子配列に基づいたプローブを用いたサザンブロッティング、蛍光in situハイブリッド法（FISH）等で測定する。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量的RT-PCRなどを含む様々な既知の方法で測定することができる。遺伝子によってコードされたタンパク質の量は、SDS-PAGE後イムノブロッティング法検定(ウェスタンブロッティング分析)等を含む既知の方法で測定することができる。
【００５７】
「タンパク質をコードするDNAによる細菌の形質転換」とは、細菌にDNAを例えば、従来の方法で導入することを意味する。このDNAの形質転換は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現の増加をもたらし、細菌の細胞中のタンパク質の活性を増強することになる。形質転換の方法は、従来報告されたすべての既知の方法を含む。例えば、細胞のDNAに対する浸透性を増加させるために塩化カルシウムで受容体細胞を処理する方法がエシェリヒア・コリK-12株について報告されており、使用できる。(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)). 
【００５８】
遺伝子発現を増強する方法は遺伝子コピー数を増加させることを含む。本発明の細菌中で機能できるベクターへ遺伝子を導入すれば、遺伝子のコピー数が増加する。そのような目的のために、好ましくは多コピーベクターが使用できる。多コピーベクターは、pBR322、pMW119、pUC19、pET22b等が例示される。
【００５９】
遺伝子発現の増強も、例えば相同的組み換え、または、Mu組込みなどにより細菌の染色体へ、遺伝子の多数のコピーを導入することで達成できる。例えば、Mu組込み1回の実行
で、細菌の染色体中に遺伝子のコピーが3個まで導入できる。
【００６０】
遺伝子のコピー数を増加させることも、細菌の染色体のDNAへ遺伝子の多数のコピーを導入することにより達成できる。細菌の染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入するためには、多数のコピーが存在する配列を染色体のDNA中の標的として使用して、相同的組み換えを実行する。染色体のDNAに多数のコピーを持つ配列は、反復DNAまたは転位因子の末端にある逆方向反復を含むが、これらに制限されない。さらに、米国特許番号5,595,889に開示のように、トランスポゾンに遺伝子を組み入れて、それを染色体のDNAへ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させることも可能である。
【００６１】
遺伝子発現を増強することも、本発明のDNAを強力なプロモーターの制御下におけば達成できる。例えば、Ptac プロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、λファージのPRまたはPLプロモーターはすべて有効なプロモーターであることが知られている。強力なプロモーターは遺伝子コピーの増加と組み合わせて使用できる。
【００６２】
代わりに、プロモーターの効果は、例えば、プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増加するよう、プロモーターに変異を導入して増強できる。更に、リボソーム結合部位(RBS)と開始コドン間のスペーサ中のいくつかのヌクレオチド、特に開始コドンのすぐ上流配列の置換がmRNA翻訳能力に深く影響することが知られている。例えば、開始コドンに先行する3箇のヌクレオチドの性質によって発現レベルに20倍の範囲があることが見出されている(Gold ら, Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui ら., EMBO J., 3, 623-629, 1984)。以前に、rhtA23変異は、ATG開始コドンに対して−1の位置でGをAに置換することであると報告されている(1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biologyと共催の第17回 International Congress of Biochemistry and Molecular Biology San Francisco, California August 24-29, 1997, 抄録番号 457).
【００６３】
さらに、細菌の染色体上の遺伝子のプロモーター領域にヌクレオチド置換を導入することも可能であって、これによりプロモーター機能がより強められる。発現制御配列の変更は、例えば、国際公開WO 00/18935 および特開平1-215280号に開示されているように温度敏感なプラスミドを使用して行う遺伝子置換と同様に実行可能である。
【００６４】
プラスミドDNAの調製方法は、DNAの消化と連結、形質転換、プライマーとしてオリゴヌクレオチドの選択など、または、当業者に既知の他の方法を含むが、これらに限定されない。これらの方法は、例えばSambrook, J., Fritsch, E..F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載されている。
【００６５】
2. 本発明の製造法
本発明の製造法では、アミノ基供与体の存在下、アセトアルデヒドとL-スレオニン
から下記式(I) に示される4-HILを生成する活性を有する生体触媒の存在下、アミノ基供与体、アセトアルデヒド及びL-スレオニンを水性溶媒中に加えることにより、4-HILを生成する。
【００６６】
【化３】
2008109924.tif 000005
【００６７】
すなわち、製造法は３工程の酵素反応:(1) L-スレオニンからα−ケトブタン酸を生成する酵素的脱アミノ化、(2)アセトアルデヒドとα−ケトブタン酸からHMKPを生成する酵素的アルドール反応の工程および(3)HMKPから酵素的アミノ基転移反応で4HILを生成する工程を含む。
【００６８】
この製造法で使用する生体触媒は、L-スレオニンからα−ケトブタン酸を生成する工程（下記反応式（II））を媒介するデアミナーゼ活性がある酵素（スレオニン・デアミナーゼ）；アセトアルデヒドとα−ケトブタン酸から4−ヒドロキシ-3-メチル-2-ペンタン酸を生成する工程(下記の化学反応式(III))を媒介するアルドラーゼ活性がある酵素(アルドラーゼ)を含む酵素と、HMKPから4HILを生成する工程(下記の化学反応式(IV))を媒介するアミノ基転移反応活性がある酵素(アミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ)とを含む複合酵素である。あるいは、生体触媒はこれらの酵素を組込んだ細菌である。
【００６９】
【化４】
2008109924.tif 000006
【００７０】
本発明のプロセスの第一段階で、「脱アミノ化」とは、L-スレオニンのようなアミノ酸からアミノ基(-NH2)が除去され、例えば、α-ケトブタン酸のようなケト-化合物が生成する反応を意味する。
【００７１】
本発明で、脱アミノ化は、例えばスレオニン・デアミナーゼのようなデアミナーゼで引き起こされるか、触媒される脱アミノ反応を意味する。
【００７２】
E.コリには、ilvA遺伝子がコードする生合成酵素およびtdcB遺伝子がコードする分解酵素の2種類のスレオニン・デアミナーゼ (デヒドラターゼ) が見出されている。生合成酵素はイソロイシンの生合成経路の一部である。異化酵素はスレオニン分解経路の一部である。生合成酵素はL-スレオニンを脱アミノ化するが、L-セリンの脱アミノ化の程度はより低い。スレオニン・デアミナーゼ(デヒドラターゼ)の触媒活性は、補因子/56,000Da鎖1molとして存在するピリドキサール燐酸の存在に全く依存する。スレオニン・デアミナーゼ(デヒドラターゼ)は、ピリドキサール燐酸依存酵素のファミリーに属している。この群は次のものを含む:セリン・デヒドラターゼEC:4.2.1.13(P20132)、スレオニンデヒドラターゼEC:4.2.1.16(THD1_E．コリ)、トリプトファンシンターゼβ鎖EC:4.2.1.20(スイス:P00932)、スレオニンシンターゼ EC:4.2.99.2(スイス:P04990)、システインシンターゼEC:4.2.99.8(P11096)、シスタチオニン・ベータ-シンターゼ EC:4.2.1.22(スイス:P35520)、1-アミノサイクロプロパン-1-カルボン酸デアミナーゼEC:4.1.99.4(スイス:P76316)。酵素
活性の主要な生理的調節物質は、活性剤としてのL-バリンおよびアロステリック（allosteric）阻害剤としてのL-イソロイシを含む。
【００７３】
特に、細菌のスレオニン・デアミナーゼが好ましい。当該酵素的脱アミノ化は、単離されたスレオニン・デアミナーゼ、スレオニン・デアミナーゼ活性を含む粗酵素溶液により、あるいは、スレオニン・デアミナーゼ活性を持つ細菌を、L-スレオニンを含む培地で培養することで行なうことができる。プロセスを単純化して4HILの生成コストを減らすために、本方法の培養液に基質を直接添加するのが非常に好ましい。そのような細菌の例は、後に詳細に記載するが、かかるスレオニン・デアミナーゼ活性があるどんな細菌も、本発明で使用可能になる。これらの細菌は特にBacillus subtilis (P37946 Swiss-Prot DB), Corynebacterium glutamicum (Q8NRR7 in TrEMBL DB), Escherichia coli (P04968 in Swiss-Prot DB), Salmonella typhimurium ( P11954 in Swiss-Prot DB), Shigella flexneri ( P05792 Swiss-Prot DB), Yersinia pestis ( Q8Z9V3 in TrEMBL DB)を含む。それらの中で、エシェリヒア・コリ由来のスレオニン・デアミナーゼが望ましい。
【００７４】
スレオニン・デアミナーゼを特徴づけるのに使用するタンパク質の配列は、COG1171に分類されている。さらに、スレオニン・デアミナーゼに属するタンパク質は、EC 4.3.1.19に分類されている。
【００７５】
本発明の細菌系スレオニン・デアミナーゼは、L-スレオニンから2-オキソブタン酸およびアンモニアを形成する反応を触媒することができる酵素である。触媒反応は、恐らく最初に水の脱離が起こり、次いで生成物の異性化とC-N結合の切断を伴う加水分が関与するであろう。
【００７６】
大多数の微生物由来のスレオニン・デアミナーゼが既知でり、これらのデアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列が開示されている。
【００７７】
ilvA遺伝子は、エシェリヒア・コリ由来スレオニン・デアミナーゼであるIlvAタンパク質（同意語は、B3772、Ile、IlvA、スレオニン・デヒドラターゼ(生合成)およびL-スレオニン・ヒドロ-リアーゼ(脱アミノ化)を含む)をコードする。ilvA遺伝子は、E.コリK-12株の染色体上のilvD とilvY との間に位置する。ilvA遺伝子のヌクレオチド配列は既知である。(ヌクレオチドの位置:3953354〜3954898;GenBank登録番号NC_000913.2 GI:49175990)(配列番号1) 。ilvA遺伝子のヌクレオチド配列とilvA遺伝子によりコードされたIlvAタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１と配列番号2に示されている。
【００７８】
他の微生物由来のスレオニン/デアミナーゼをコードする、未注釈の遺伝子は、スレオニン・デアミナーゼをコードする既知の遺伝子への相同性により、次いで遺伝子によってコードされたタンパク質の活性の評価で同定できる。
【００７９】
二個のアミノ酸配列間の相同性は、よく知られた方法、例えば、3つのパラメーター：スコア、同一性および類似性を計算する、コンピュータ・プログラムBLAST 2.0を使用して、決定することができる。
【００８０】
したがって、E.コリ由来のilvA遺伝子は、遺伝子の既知のヌクレオチドの配列に基づいて調製されたプライマーを利用するPCR (ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）; 参照： White, T.J. ら, Trends Genet., 5, 185 (1989)) で取得できる。他の微生物由来のスレオニン・デアミナーゼをコードする遺伝子は、同様に取得できる。
【００８１】
特に、遺伝子ilvAによってコードされた、生合成の酵素として分類できるスレオニン・デアミナーゼが望ましい。望ましいスレオニン・デアミナーゼは、そのようなスレオニン
・デアミナーゼがL-スレオニンから2-オキソブタン酸およびアンモニアを生成する反応を触媒する特徴を共有する限り、配列番号2に示すアミノ酸配列に関して80%以上、好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上相同性を持っていればよい。
【００８２】
酵素の野生型でなく、L-イソロイシンによるフィードバック阻害がないスレオニン・デアミナーゼを使用するのが好ましい。
【００８３】
脱アミノ反応後、第2の工程であるアルドール反応は同時にまたは連続的に行うことができる。
【００８４】
本発明の製造法の第2工程で、「アルドール反応」は、α−ケトブタン酸のような対応するケト-化合物由来のエノレート・イオンがアセトアルデヒドのようなカルボニル化合物と反応して、β-ヒドロキシケトン、例えば4−ヒドロキシ-3-メチル-2-ケト-ペンタン酸(HMKP)を生成する反応を意味する。
【００８５】
本発明で、酵素的アルドール反応は、アルドラーゼによって引き起こされるか、触媒されるアルドール反応を意味する。
【００８６】
特に、細菌系アルドラーゼが好ましい。当該酵素的アルドール反応は、単離アルドラーゼ、アルドラーゼ活性を含む粗酵素溶液により、または、アルドラーゼ活性を持つ細菌をα−ケトブタン酸とアセトアルデヒドを含む培地で培養することで行なうことができる。そのような細菌の例は、後に詳細に記述するが、このようなアルドラーゼ活性がある限り、如何なる細菌も本発明において使用可能である。
【００８７】
本発明で、細菌系アルドラーゼは、アセトアルデヒドおよびα−ケトブタン酸からHMKPを生成する反応を触媒することができる酵素である。特に、かかるアルドラーゼが、アセトアルデヒドおよびα−ケトブタン酸からHMKPを生成する反応を触媒する特色を共有する限り、「HpcH/HpaIアルドラーゼファミリー」に分類できるアルドラーゼが好ましい。
【００８８】
従来、用語「HpcH/HpaIアルドラーゼファミリー」(HpcHファミリーがいわゆるHHEDアルドラーゼおよびHKPアルドラーゼを含む)は、2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼおよび4-hydroxy-2-oxovalerateアルドラーゼを含む。これらの酵素は炭水化物の輸送および代謝(異化作用)に関連する。
【００８９】
主な系統発生の血統を表わすタンパク質オーソログ・グループのクラスタ(Clusters of
Orthologous Groups (COGs)) は、完全なゲノム中にコードされたタンパク質配列を比較して区別した。各COGは、個々のタンパク質あるいは少なくとも三つの血統からのグループのパラログ（paralogs）から成り、このように古代の保存されたドメインに相当する(Tatusov, R.L.ら,Science, 278, 5338, 631-637 (1997); http://www.ncbi.nlm.nih.gov /COG)。
【００９０】
HpcH/HpaIアルドラーゼファミリーを特徴づけるのに使用するタンパク質配列は、COG3836(gnl|CDD|13153)(配列番号45 )に分類されている。
【００９１】
BLASTタンパク質探索のために、配列番号45のタンパク質配列を照会すると、2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼ(登録番号AAF12475、ZP_00501227、ZP_00467871など)、2-dehydro-3-deoxyglucarateアルドラーゼ(登録番号ABB11891、ZP_00687019、ZP_00425668など)およびいくつかの仮定タンパク質(登録番号AAN81241、YP_311186など)を含む、比較的高い相同性を共有する多くのタンパク質が得られるが、これらは、本発明によればHpcH/HpaIアルドラーゼファミリーに含まれる。
【００９２】
相同性の探索結果の分析の結果、HpcH/HpaIアルドラーゼファミリー(2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼおよび4-hydroxy-2-oxovalerateアルドラーゼ) のタンパク質と、2-dehydro-3-deoxyglucarateアルドラーゼ、例えばyhaF遺伝子(同意語、garL遺伝子)(配列番号3)によってコードされた、エシェリヒア・コリ(gi|49175990)由来の2-dehydro-3-deoxy-glucarateアルドラーゼのタンパクとの間に高度の相同性があることが明らかになった。yhaF遺伝子のヌクレオチドの配列およびyhaF遺伝子によってコードされたYhaFタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号3および配列番号4にそれぞれ示されている。さらなる実験で(実施例の項参照)、2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼ/ 4-hydroxy-2-oxovalerateアルドラーゼおよび2-dehydro-3-deoxyglucarateアルドラーゼの両者がα−ケトブタン酸およびアセトアルデヒドからHMKP生成のレギオ選択性反応を触媒することができることが証明された。2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼの例は、E. coli由来のyfaU遺伝子を含む。yfaU遺伝子は推定4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼ(同意語：HHEDアルドラーゼ)(配列番号5)をコードする。yfaU遺伝子ヌクレオチドの配列およびyfaU遺伝子によってコードされたYfaUタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号5 および配列番号6に示されている。
【００９３】
4-hydroxy-2-oxovalerateアルドラーゼ (NP_049233.1;gi:10957013)の例は、Novosphingobium aromaticivorans由来のbphF遺伝子を含む。BphF遺伝子は4-hydroxy-2-oxovalerateアルドラーゼ (配列番号7) をコードする。bphF遺伝子のヌクレオチドの配列およびbphF遺伝子によってコードされたBphFタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号7および配列番号8に示されている。
【００９４】
更に、本発明の発明者は、アースロバクター・シンプレクスAKU626(NBRC12069)株 (以下asiHPALと略記)由来アルドラーゼを精製して、本アルドラーゼのアミノ酸配列を決定した。更に、本発明の発明者は、このアルドラーゼのアミノ酸配列から推定された約30の塩基対のDNA分子も合成し、このDNA分子を使用して、PCRにより、asiHPALをコードするDNAの全長を単離、取得した。配列番号48のヌクレオチド配列でコードされたasiHPALのアミノ酸配列は配列番号 49に示されている。
【００９５】
したがって、本発明の目的では用語、「HpcH/HpaIアルドラーゼファミリー」は、2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼおよび4−hydroxy-2-oxovalerateアルドラーゼの他に、さらに2-dehydro-3-deoxyglucarateアルドラーゼおよびasiHPAL-アルドラーゼを含む。
【００９６】
アルドール反応に続いて、第3工程である、アミノ基転移反応プロセスに進むことができる。
【００９７】
本発明の製造法の第3 工程では、「アミノ基転移反応」は、アミノ基が、供与体化合物,例えばL−グルタミン酸またはL−グルタミン酸から、ケトン基を持つ受容体化合物、例えば４−ヒドロキシ-3−メチル−２−ケトペンタン酸などに転送される反応を意味する。
【００９８】
本発明では、「酵素的アミノ基転移反応」は、アミノトランスフェラーゼ(アミノ基転移酵素)、またはデヒドロゲナーゼ酵素が行うアミノ基転移反応を意味する。特に、細菌によるアミノトランスフェラーゼ(アミノ基転移酵素)が好まれる。当該酵素的アミノ基転移反応は、単離したアミノトランスフェラーゼ、アミノトランスフェラーゼ活性を含む粗酵素溶液により、あるいは、アミノトランスフェラーゼ活性を持つ細菌を、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケトペンタン酸を含む培地で培養することで行なうことができる。プロセスを単純化して、4HILの生成コストを減少させるために、本方法の培養液に基質を直接加えることが非常に好ましい。
【００９９】
本発明のアミノトランスフェラーゼは分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(BCAT)を含む。例えば、ilvE遺伝子によってコードされたアミノトランスフェラーゼ、tyrB 遺伝子によってコードされたaromatic aminotransferase、aspC遺伝子によってコードされたaspartate aminotransferase、avtA 遺伝子によってコードされたvaline-pyruvate aminotransferaseなどが例示される。分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(BCAT)が好ましい。
【０１００】
BCATを特徴づけるのに使用するタンパク質配列はCOG0115(配列番号47)に分類されている。また、BCATに属するタンパク質は、EC 2.6.1.42に分類されている。
【０１０１】
実際に、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、すべて広い基質特異性を示すので、大抵のものがアミノ基転位でHMKPを基質として使用することができると期待される。
【０１０２】
分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、Ｌ-グルタミン酸から、種々の(-ケト酸、例えば、(-ketoisovaleric acid、2-keto-3-methylvaleric acidおよび 2-keto-4-  methyl-pentanoic acidにアミノ基を転位させ、それぞれL-バリン、L-イソロイシンおよび L-ロイシンを生成する反応を触媒する。
【０１０３】
多数の微生物由来の分岐鎖アミノ酸のアミノトランスフェラーゼが知られていて、これらのアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチドの配列が開示されている。
【０１０４】
ilvE遺伝子は、エシェリヒア・コリ由来の分岐鎖アミノ酸のアミノトランスフェラーゼであるIlvEタンパク質 (同意語はB3770、IlvE、分岐鎖アミノ酸:2-oxoglutaric acidアミノトランスフェラーゼ、BCAT、アミノ基転移酵素B、ロイシンアミノ基転移酵素、バリン・アミノ基転移酵素, およびイソロイシン・アミノ基転移酵素; 以後ecoBCATと呼ぶことがある）をコードする。ilvE遺伝子は、エシェリヒア・コリK-12株の染色体上、ilvMとilvD遺伝子の間に位置する。ilvE遺伝子のヌクレオチド配列は公知である。(ヌクレオチドの位置: 3950507〜3951436; GenBank登録番号：NC_000913.2; gi: 49175990)(配列番号9)
。ilvE遺伝子のヌクレオチドの配列およびilvE遺伝子によってコードされるIlvEタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号9および配列番号10に示されている。
【０１０５】
ywaA遺伝子は、Bacillus subtilis由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする。ywaA遺伝子は、B.subtilis 168株の染色体上,dltEとlicHの間に位置する。ywaA遺伝子のヌクレオチド配列は公知である。(ヌクレオチドの位置: 3956412〜3957503; GenBank登録番号：NC_000964.2; gi: 50812173)(配列番号11) 。ywaA遺伝子のヌクレオチド配列およびywaAE遺伝子によってコードされるYwaAタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号11および配列番号12に示されている。
【０１０６】
他の微生物由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする、未注釈の遺伝子は、分岐鎖のアミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする既知の遺伝子との相同性、次いで遺伝子によってコードされたタンパク質の活性の評価で同定できる。
【０１０７】
二種のアミノ酸配列間の相同性は、よく知られた方法、例えば、3つのパラメーター：スコア、同一性および類似性を計算する、コンピュータ・プログラムBLAST 2.0を使用して、決定することができる。
【０１０８】
したがって、E.コリ由来のilvE遺伝子およびB.subtilis由来のywaA遺伝子は、遺伝子の既知のヌクレオチドの配列に基づいて調製されたプライマーを利用するPCR (polymerase 
chain reaction; 参照： White, T.J. ら., Trends Genet., 5, 185 (1989)) で得ることができる。他の微生物由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、同様に取得できる。
【０１０９】
細菌の菌株間でDNA配列に若干違いがあることがあるので、アルドラーゼあるいはBCATをコードする、使用すべき上記の遺伝子は配列番号1、3、5、7、9、11および48に示すヌクレオチド配列に限定されず、さらに配列番号1、3、5、7、9、11および48に示すものに類似のヌクレオチドの配列を含めてもよい。したがって、上記の遺伝子がコードするタンパク質変異体は、これらのタンパク質が当該反応を触媒する能力を維持する限り、配列番号2、4、6、8、10、12および49に示すアミノ酸配列全体に関して、80%以上、好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上類似性を有すればよい。
【０１１０】
さらに、上記の遺伝子は、機能的なタンパク質をコードする限り、配列番号1、3、5、7、9、11および48に示すヌクレオチドの配列、あるいはこれらのヌクレオチドの配列に基づいて調製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる変異体でもよい。「ストリンジェントな条件」とは、特定のハイブリッドが形成され、非特異性のハイブリッドは生成されない条件を含む。例えば、ストリンジェントな条件の例は、1×SSCおよび0.1%のSDS、好ましくは0.1×SSCおよび0.1%のSDSを含む溶液で60℃で1回、好ましくは2、3回洗浄することである。プローブの長さはハイブリッド形成条件によって、適切に選択出来、通常100 bpから1 kbpまでの範囲である。
【０１１１】
上記のスレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、およびアミノトランスフェラーゼ(あるいはデヒドロゲナーゼ)を組込む限り、生体触媒は、細菌(培養物、細菌の細胞、あるいは処置済み細胞を含む)、精製酵素、あるいは粗酵素のような任意の形態で使用することができる。本発明で使用される細菌の処置済み細胞の形態の例は、乾燥菌体、凍結乾燥菌体。界面活性剤あるいは有機溶媒処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的破砕処理物、溶剤処理物、菌体のタンパク質画分、菌体固定化物、およびプロセスした菌体である。アミノ基供与体の存在で、アセトアルデヒドおよびスレオニンから4HIL生成の活性があるいずれの細菌も使用することができる。
【０１１２】
細菌を本製造法で使用する場合、基質を含む培地のスレオニン・デアミナーゼ、および/またはアルドラーゼ、および/またはアミノトランスフェラーゼの活性を増強し、培地から生成4HILを単離するよう、かかる細菌を改変することができる。
【０１１３】
本発明の製造法の一態様では、細菌は、増幅および／または発現されたスレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、およびアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含む組み換え微生物である。
【０１１４】
本発明の製造法では、L−スレオニンは, スレオニン・デアミナーゼで脱アミノ化され、α−ケトブタン酸を生成し、さらに、アセトアルデヒドとα−ケトブタン酸がアルドラーゼで酵素的に反応させられ、またさらにBCATでアミノ基転移を起こす。
【０１１５】
これら三種の酵素が、増幅および発現されたスレオニン・デアミナーゼの遺伝子、アルドラーゼの遺伝子およびBCATの遺伝子を含む組み換え微生物中に生成され、蓄積される。
【０１１６】
細菌を生体触媒として使用する場合に、細菌は、少なくともこれらの酵素活性の一種を持つ限り、組み換え微生物または如何なる細菌でもよい、例えば、チゾサッカロマイセス属、アースロバクター属、ブレビバクテリウム属、キャンディダ属、コリネバクテリウム属、ミクロコッカス属、セルロモナス属、アクチノプラネス属、クロモバクテリウム属、ラネラ属、リゾビウム属、エルヴィニア属、ハンセヌラ属、トルロプシス属、クロエケラ
属、ロドトルラ属、パネラス属、ムコール属、デバリオミセス属、スポロボロミセス属、エシェリヒア属、サルモネラ属、フラボバクテリウム属、バチルス属、プロテウス属、または、ノボスフィンゴビウム属の細菌を例示できる。
【０１１７】
これらのうち、チゾサッカロマイセス属、キャンディダ属、アースロバクター属、ブレビバクテリウム属、エシェリヒア属、バチルス属、またはノボスフィンゴビウム属の細菌を使用することが好ましい.
【０１１８】
更に、本発明の一態様では、細菌はL-スレオニン生成細菌が好ましい。すなわち、L-スレオニン生成細菌は、複数の酵素:スレオニン・デアミナーゼ、アルドラーゼ、および/またはアミノトランスフェラーゼ(またはデヒドロゲナーゼ)を発現する組み換え細菌の親株になることができる。
【０１１９】
本明細書では、語句「L-スレオニン生成細菌」は、遺伝子操作したものでもよいL-スレオニンを生成できる細菌を意味する。L-スレオニン生成細菌を導くための親株の例は、エシェリヒア属を含むがこれに限定されない菌、例えばE.コリ TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)( 米国特許番号5,175,107, 米国特許番号5,705,371)、E.コリ 472T23/pYN7(ATCC 98081)(米国特許番号5,631,157)；E.コリNRRL-21593; E.コリ(米国特許番号5,939,307)；E.コリFERM BP-3756(米国特許番号5,474,918); E.コリ- FERM BP-3519およびFERM BP-3520(米国特許番号5,376,538); E.コリMG442(Gusyatinerら、Genetika、14、947-956 (1978)(ロシア語))およびE.コリVL643およびVL2055 EP 1149911A)などである。
【０１２０】
TDH-6株は、thrC遺伝子に欠失していて、また蔗糖同化性であり、ilvA遺伝子は漏出性突然変異を持つ。この菌株はまた、スレオニンまたはホモセリンの高濃度に対する耐性を付与するrhtA遺伝子に変異を持つ。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、突然変異体thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンの挿入により得られたプラスミドpVIC40を包含する。この変異体thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害に対してかなり脱感作したアスパルトキナーゼ・ホモセリン・デヒドロゲナーゼIをコードする。B-3996株は、受託番号RIA 1867として、1987年11月19日、the All-Union Scientific Center of Antibiotics
(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russian Federation) に寄託された。また、この菌株は1987年4月７日、受託番号VKPM B-3996として the Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1) に寄託された。
【０１２１】
E. コリVKPM B-5318(EP 0593792B)は、本発明のL-スレオニン生成細菌を導入するするための親株として使用してもよい。B-5318株はイソロイシンに関して原栄養体であり、また、温度感受性λファージC1レプレサーおよびPRプロモーターは、プラスミドpVIC40のスレオニン・オペロンの制御領域を置換する。VKPM B-5318株は、1990年5月3日、受託番号VKPM B-5318としてthe Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM)に寄託された。
【０１２２】
ここで、語句「エシェリヒア属に属する細菌」は、細菌が、微生物学の当業者に公知である分類によるエシェリヒア属に分類されていることを意味する。本発明で使用されるようなエシェリヒア属に属する細菌の例はエシェリヒア・コリ(E.コリ)含むが、これに限定されない。本発明で使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に限定されていないが、例えばF.C.Neidhardtらが記載した細菌(Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1)は、本発明に包含される。
【０１２３】
語句「バチルス属に属する細菌」は、細菌が、微生物学の当業者に公知である分類によ
るバチルス属に分類されていることを意味する。本発明で使用されるようなバチルス属に属する細菌の例はBacillus subtilis (B. subtilis) および Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens)を含むが、これらに限定されない。
【０１２４】
語句「Novosphingobium属に属する細菌」は、細菌が、微生物学の当業者に公知である分類によるNovosphingobium属に分類されていることを意味する。本発明で使用されるようなNovosphingobium属に属する細菌の例は、Novosphingobium aromaticivorans (N. aromaticivorans)、  Novosphingobium capsulatum (N. capsulatum) および Novosphingobium hassiacum (N. hassiacum)を含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
本明細書に述べた細菌のうち、株名がAKUから始まる菌株は、京都大学大学院農学部応用生命科学専攻発酵生理および醸造学研究室から取得出来る。
【０１２６】
株名がATCCから始まる菌株は、the American Type Culture Collection （ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）から取得できる。個々の菌株に対応する登録番号はATCCのカタログに記録されている http://www.atcc.org/commoin/catalog/bacterr/bacterialIndex.cfm)。
【０１２７】
株名がNRRLから始まる菌株はthe Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL) に保管されており、登録番号を利用して取得できる。個々の菌株に対応する登録番号はNRRLのカタログに記録されている（http://nrrl.ncaur.usda.gov/cgi-bin/usda）。
【０１２８】
株名がFERMから始まる菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305-8566 茨城県つくば市東1−1 つくば中央第6)（英名the International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken  305-8566 Japan)に保管されており、登録番号を利用して取得できる。
【０１２９】
株名がVKPMから始まる菌株は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny Proezd, 1)に保管されており、登録番号を利用して取得できる。個々の菌株に対応する登録番号はVKPMのカタログに記録されている:(http://www.vkpm.ru)。
【０１３０】
これらの細菌は、通常の培養方法で培養できる。培地は、天然あるいは合成のいずれでも、該細菌が効率的に培養でき、当該細菌が資化し得る炭素源・窒素源・無機塩源等を含んでいれば、培養に用いることができる。
【０１３１】
炭素源は、当該細菌が資化し得ることが必要なだけである。使用に適当な炭素源は、グルコース、フラクトース、シュークロース、およびマルトースのような糖類；澱粉、澱粉加水分解物および糖蜜；酢酸、乳酸、グルタミン酸などの有機酸；およびエタノール、プロパノールなどのアルコール類である。使用に適当な窒素源としては、当該細菌が資化できる限り、アンモニア；硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩；その他含窒素化合物；並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解物、大豆、大豆加水分解物、大豆粕および大豆加水分解物（前出）、各種発酵菌体およびそれらの消化物等を包含する。
【０１３２】
使用できる無機塩は、当該微生物が資化しうるかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄および硫酸マ
ンガンを含む。他に、カルシウム、亜鉛、ホウ素、銅、コバルト、およびモリブデンのような元素の塩類を微量加えてもよい。必要に応じてチアミン、ビオチンのようなビタミン；グルタミン酸、アスパラギン酸のようなアミノ酸；およびアデニン、グアニンのような核酸関連物質なども添加できる。
【０１３３】
培養は、振とう培養または深部通気かくはん培養などの好気的条件下で行われる。培養温度15〜37℃、培養時間10〜96時間で充分である。培地のpHは、5.O〜9.Oに保たれる。pHは、有機あるいは無機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、またはアンモニアで調整できる。
【０１３４】
本発明で使用するアミノ基供与体は、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、などの無機アンモニウム塩、尿素、並びにグルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシンのような種々のアミノ酸、および他の分岐鎖アミノ酸である。好ましいアミノ酸は、実際使用する細菌で簡単な予備試験で決めることができる。これらの内で、分岐鎖アミノ酸が反応効率および入手の観点から好ましい。バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸  およびこれらの塩が望ましい。これらの アミノ酸は、主としてL体の形態で本発明に利用されるので、L体の遊離酸または適当な塩の形態で使用されることが好ましい。アミノ基供与体の濃度は、0.01〜1,000g/L, 好ましくは1〜100g/Lである。
【０１３５】
本発明では、アセトアルデヒドの濃度は0.1〜50g/L, 好ましくは0.5〜 20g/Lである。アセトアルデヒド濃度は調製した溶液をF-キット・アセトアルデヒド(F-Kit Acetaldehyde(ロッシュ・ダイアグノスティック社製))で測定するか、あるいは単に試薬の純度に基づいた希釈・調製法で決定できる。
【０１３６】
本発明では、L-スレオニンの濃度は特定しない。しかし、アセトアルデヒド濃度に対して1/10〜10倍量が好ましい。L-スレオニン生成菌を生体触媒の宿主菌として用いる場合には、L-スレオニンの濃度は限定されないが、醗酵時間とグルコース濃度のような培養条件で決まる。
【０１３７】
反応に使用する溶媒は、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリス、あるいはその他の緩衝液等の水性溶媒；ならびに、メタノール、エタノールなどのアルコール類；酢酸エチルなどのエステル類；アセトンなどのケトン類；アセトアミドなどのアミド類；その他の有機溶媒；あるいは、一種以上のこれらを含有した水性溶媒でよい。必要に応じてTriton X-100やNonion HS204(NOF社製)などの界面活性剤、あるいは、トルエンやキシレンなどの有機溶媒を約0.1〜20g/Lの割合で添加できる。
【０１３８】
本製造法において用いられる細菌の濃度はO.1〜700g/1、好ましくは10〜300g/L(菌体(湿重量)基準)である。水性媒体に当該細菌、アミノ基供与体、アセトアルデヒドおよびα−ケトブタン酸を上記濃度で添加し、温度15〜60℃、好ましくは20〜50℃、pH5〜12、好ましくはpH7〜11の条件下で、10分〜80時間反応させ、4HILを製造することができる。
【０１３９】
本製造法において、4HIL を製造するために、生体触媒として用いられる細菌の初発培養液または途中に、アミノ基供与体、アセトアルデヒドおよびL-スレオニンを上記濃度で添加することができる。
【０１４０】
反応中に、反応基質と、反応触媒として用いられる細菌のほかに、上記のBCATを反応中の水性溶媒に添加することができる。このプロセスで、細菌を形質転換するのに、BCATを、コードする遺伝子を生体触媒として用いられている細菌に組み入れられるし、または、E.coliのような各種細菌あるいは昆虫細胞などの適当な宿主細胞にBCATをコードする遺伝子を組み入れ、形質転換体を得ることができる。その後BCATは、得られた形質転換体の菌
体、薗体処理物、あるいは、精製酵素または粗酵素の形態で使用できる。
【０１４１】
粗酵素溶液を使用して、4HILを生成する反応を行う場合、培養された微生物は遠心分離などで回収され、次に、細胞はアルドラーゼとアミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼを含む粗酵素溶液を調製するために破砕するか、あるいは、溶解させる。細胞を破砕するのに超音波破砕、フレンチ・プレスによる破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることが出来、一方細胞を溶解するために、卵白（胚乳）リゾチームあるいはペプチダーゼによる処置、あるいはこれらの適切な組み合わせのような方法が用いられる。精製酵素溶液を使用して、4HIL生成反応を行う場合、アルドラーゼとアミノトランスフェラーゼ、および／またはデヒドロゲナーゼを含む粗酵素溶液は、沈殿、濾過、カラムクロマトグラフィなどのような通常の技術で精製される。
【０１４２】
培養液から微生物の分離と回収および酵素溶液の調製は、遠心分離、超音波破砕、イオン交換樹脂法、沈澱法などのような既知の方法の組み合わせで普通行うことができる
【０１４３】
L-スレオニンからα−ケトブタン酸を酵素的脱アミノ化反応で取得するのに、意図する反応を触媒する任意のスレオニン・デアミナーゼを制限なく使用できる。
【０１４４】
HMKPを酵素的アルドール縮合により取得する場合、希望の反応を触媒するアルドラーゼであれば全く制限なく使用できる。好ましくは上記製造法の工程2に記述されているようなアルドラーゼを使用するアルドール反応を使用できる。かかるアルドラーゼは、アルドラーゼを含む精製酵素溶液の形態、沈殿、ろ過、カラムクロマトグラフィなどの通常技術により精製される、粗製酵素溶液の形態、あるいは、アルドラーゼを含む微生物の形態で使用できる。さらに、4-HILを基質にして、細菌から由来の酵素反応で生成した[特開平6-340578号公報]HMKPを含む反応液を使用することもできる。用いる４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケトペンタン酸の濃度はO.5〜700g/L、好ましくは10〜500g/Lである。
【０１４５】
単離BCATは、生体内、あるいは生体外で分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現し、次いで分取クロマトグラフィの使用で得られた酵素を単離すること、BCATおよび／またはアルドラーゼに対する抗体を精製し、His6タグ搭載の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする改変済の遺伝子を発現し、次いでpET発現システム(Novagen)を使用してニッケルカラムで単離することなどを含む従来の方法で取得できる。
【０１４６】
分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼおよび／またはアルドラーゼの活性は、例えば、Lee-Peng, F.C. et al (J Bacteriol. 139(2): 339-345 (1979)) が記載した方法で検知および測定できる。
【０１４７】
4HILの生成反応がBCATを含む粗酵素溶液あるいは精製酵素を使用して行われる場合、反応は、基質HMKPおよび粗酵素溶液あるいは精製酵素を含む反応溶液が、10℃〜60℃、好ましくは25℃〜45℃でpH 3〜1、好ましくはpH 6〜9に制御されている間に行うことができる。反応が進む限り基質HMKPを添加でき、必要なら、必要な量、必要な時間にわたって反応させることができる。
【０１４８】
「分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(BCAT)活性を増強するように改変された」の語句は、1つの細胞当たり活性が、非改変済の菌株, 例えば、野生型菌株のそれと比較した時により高いことを意味する。そのような改変の例は細胞1個当たりのBCAT分子の数を増加させてBCAT分子当たりの比活性を増加させることなどを含む。さらに、比較目的のために使用できる野生型菌株は、例えばエシェリヒア・コリK-12を含む。
【０１４９】
細菌細胞のBCAT活性は、BCATをコードする遺伝子の発現を増加させて増強することができる。細菌に由来するいずれのBCAT遺伝子も、本発明のBCAT遺伝子として使用できる。エシェリヒア属およびバチルス属に属する細菌に由来したBCAT遺伝子が好ましい。
【０１５０】
製造法の工程3で使用する生体触媒に任意に含まれていて、上記の反応式(IV)を媒介するアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼは、細菌内の一種酵素が働いて4HILを生成する場合でも、本発明の製造法を妨害しない。しかしながら、上記反応がデヒドロゲナーゼで媒介される場合には、ニコチンアミド-アデニンジヌクレオチド（NADH）又はニコチンアミド-アデニンジヌクレオチド・フォスフエイト（NADPH）を添加する必要があるので、反応液中にNADH又はNADPHが存在しないときは、上記の反応はアミノトランスフェラーゼによって媒介される。反応をデヒドロゲナーゼ反応条件(NADH又はNADPH存在で)で行うか、あるいは、アミノトランスフェラーゼ反応条件(NADH又はNADPH不在で)で行うかどうかの決定は、反応に採用する微生物を用いて最適条件を決めるための適当な予備テストを行って、当業者が容易に出来る。反応をデヒドロゲナーゼ反応条件で行う時には、使用するNADH又はNADPHの濃度は、O.05〜10mg/Lである。反応中に、グルコースデヒドロゲナーゼのような微生物由来の酵素を活性化して、反応により生成するNAD+やNADP+を再生する反応を併用するのが望ましい。
【０１５１】
製造法により生成された4HIL は、通常のアミノ酸の精製法で単離できる。遠心分離を用いて固形物を除いた反応液上清から4HILを単離するのに、例えば、イオン交換樹脂や膜、結晶化を用いた処理のような操作を組み合わせて使用できる。
【実施例】
【０１５２】
実施例により、以下、本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は、これらの実施例によって限定されない。
【０１５３】
[実施例１] Bacillus subtilis由来BCATのクローニングおよび効率的発現
Bacillus subtilis由来BCAT(bsuBCAT)は、his6-タグ誘導体としてpET発現システム(Novagen、Madison,USA)を使用して、クローンし、発現させた。
【０１５４】
pET-HT-YwaA-BSU プラスミドを構築するために、BCATアミノトランスフェラーゼをコードするBacillus subtilis 由来のywaA遺伝子(Berger, B.J ら, J Bacteriol., 185(8), 2418-31 (2003))を、Bacillus subtilis 168株の染色体のDNAを 鋳型として、プライマーP1（配列番号13)とプライマー2 (配列番号14)をそれぞれ「上流」および「下流」プライマーとして使用し、PCRによって増幅した。プライマーP1は、その5'-末端にNcoI制限部位およびヒスチジンをコードする6つのコドンを含み、プライマーP2はその5'-末端にNcoI 制限部位を含む。生じたPCRフラグメントは、NcoI制限酵素で消化し、前もって同じ制限酵素で処理したプラスミドpET-15(b+)と連結した。その後、オリゴヌクレオチドT7(Novagen、配列番号15)およびP2(配列番号14)をプライマーとして使用し、線形の連結DNAフラグメントをPCR増幅用の 鋳型として使用した。プラスミドpET-15(b+)のT7プロモーターの制御下でywaA遺伝子を含む、得られたPCRフラグメントは、XbaIとNotI制限酵素で消化され、前もって同じ制限酵素で処理したpET-22(b+)ベクターへ連結された。このようにして、プラスミドpET-HT-YwaA-BSUを得た。
【０１５５】
対応するタンパク質bsuBCAT、ハイブリッドhis6-タグしたタンパク質として発現された。標準誘導条件(1 mM IPTG: isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside,37℃で2〜3時間)下、pET-HT-YwaA-BSUからpET-システムで発現された時、全細胞タンパク質の可溶画分にB. subtilis由来のhis6-タグ-YwaAタンパク質が局在することが判明した。ハイブリッドhis6-タグ-bsuBCATはIMAC((Immobilized-Metal-Affinity-Chromatography、固定化金属親和性-クロマトグラフィ)で精製した。下記手順で行なわれた: 1) OD555=1に到達するまで、
E. コリB株BL21(DE3)[pET-HT-YwaA-BSU]細胞培養液200mlを4箇の500mlフラスコ中で培養した。his6-タグ-ywaAタンパク質の合成は、IPTGを最終濃度1mMまで添加し、2時間培養して誘導した。その後、細胞は遠心分離によって採取し、100mM NaCl溶液100mlで2度洗浄、再びペレット化し、緩衝液I (20mM Tris-HCl、500mM NaCl、1mM PMSF、10mMイミダゾール、5%(w/v)グリセロール; pH 8) 20mlに再懸濁し、さらにフレンチ・プレッシャーセルを一回通過させて破砕; 2) 生じた溶解物（ライセート）は遠心分離し、上清のタンパク質を1mlのHitrap(登録商標)(Pharmacia) カラムに供し；その後、カラムは、緩衝液Ｉ10mlで洗浄し、結合タンパク質は緩衝液II(20mM Tris-HC1,400mM イミダゾール、pH8)で溶出した。生じたYwaA調製物は、緩衝液III(20 mM 燐酸カリウム緩衝液pH7,1mM DTT,10μM PLP,10%(w/v)グリセロール)で平衡化した10m1のBioGe1 PlO(BioRad)カラムを用いゲル濾過して取得した。
【０１５６】
[実施例２]  Arthrobacter simplex AKU 626由来HMKP-アルドラーゼ (IFO 12069) (asiHPAL)の同定
１．asiHPALの精製
精製プロトコルは下記の手順を含む。
【０１５７】
工程1:一晩経過した細菌の培養液(34℃で12時間培養)1mlを用いて、5リットルのLBブロス培地[8X(1Ｌフラスコ中に375ml)]に接種した。細胞は約24時間最適温度で培養した。その後、細胞を4℃で遠心分離(16000×g)で採取し、1mM PMSF(フッ化フェニルメチルスルフォニル)を補充した緩衝液A[50mM KH2PO4 (KOHでpH 7.4に調節)]30mlに再懸濁した。
【０１５８】
工程2:細胞を、フレンチ・プレッシャー・セル(最高圧 P=2.5 psi) に3〜5回通して破砕し、次いで残骸断片を除くために遠心分離した。タンパク質調製液は、緩衝液Aで平衡化したセファデックスG-15カラム(2.6×28cm)に通した。
【０１５９】
工程3：陰イオン交換クロマトグラフィ(AEC 1)は、50mlのDEAE(ファストフロー)カラム(d=1.6cm)を補充したAKTAbasic100 システムを使用して行った。通常、工程2から得られたタンパク質調製液40〜50mlを緩衝液Aで平衡化したカラムに供した。溶出は、緩衝液A(10CV（カラム容積分10倍量）に0-0.5M NaClの直線濃度勾配をかけて流速2.5ml/分で行った。各10ml画分を集めた。活性画分は、合併し、「工程2」の内容に記載のように脱塩した。
【０１６０】
工程4:陰イオン交換FPLC(AEC 2)は、1.6mlの「Sourse15Q」カラム(Amersham Pharmacia
Biotech)を補充したAKTAbasic100 システムを使用して行った。工程3から得られたタンパク質調製液を、緩衝液Aで平衡化したカラムに供した。溶出は、緩衝液A(40CV（カラム容積分40倍量)）に0-0.5M NaClの直線濃度勾配をかけて、流速1ml/分で行った。各2ml画分を集めた。活性画分を合併した(表1および2)。
【０１６１】
工程5:疎水性相互作用クロマトグラフィ(Hydrophobic interaction chromatography, （HIC)は、1mlの「Resource PHE」カラム(Amersham Pharmacia Biotech)を補充したAKTAbasic100 システムを使用して行った。工程5から得られたタンパク質調製液の濃度は、0.8mg/mlに調節し、次いで、硫酸アンモニュウムを最終濃度が1.5 Mになるまで添加した。タンパク質溶液は、1.5Mの硫酸アンモニュウムを補充した緩衝液Aで平衡化したカラムに供した。溶出は緩衝液A(30CV（カラム容積分30倍量)に1.5M−0Mの硫酸アンモニュウムの直線濃度勾配をかけて、流速1ml/minで行った。各1mlの画分を集めた。活性画分を合併した(表1および2)。
【０１６２】
工程6:サイズ排除クロマトグラフィ(Size exclusion chromatography,SEC)は、SuperdexTM 200 HR 10/30A(Amersham Pharmacia Biotech)カラムを補充したAKTAbasic 100 シス
テムを使用して行った。工程5から得られたタンパク質調製液を、100mM NaClで補充した緩衝液Aで平衡化したカラムに供した。定組成の溶出は0.5ml/minの流速で行った。各1mlの画分を集めた。活性画分を合併した。(表1および2;図１)。表１は、asiHPALの精製を示す。表２は、クロマトグラフィの溶出パラメーターを示す。
【０１６３】
asiHPALの比活性は、次の組成 [100mMＬ-グルタミン酸 (pH 8、pH 8.0で調節), 100 mM
α−ケトブタン酸、100 mMアセトアルデヒド] 、1mM ZnCl2、および0.5μgの精製したHis-タグ-ywaAタンパク質 (実施例1で得たbsuBCAT)、および一定分量の溶出画分を用いた、bsuBCAT/asiHPAL二酵素系反応において、時間に依存する4HILの生成をHPLCで測定して求めた。反応はすべて37℃で行った。Bacillus subtilis由来アミノ酸アミノトランスフェレーズ(bsuBCAT)は、実施例1に記載されている。
【０１６４】
【表１】
2008109924.tif 000007
【０１６５】
【表２】
2008109924.tif 000008
【０１６６】
4HILの生成はHPLCを用いて検出した。HPLC分析は、下記の通り行った:分光蛍光計1100シリーズ (Agilent, USA) 搭載高圧クロマトグラフを (Waters, USA) 使用した。選択した検出波範囲は、励起波長250nm、発光波長の範囲320〜560nmであった。accq-タグ方法による分離はNova-PakTM C18 150 × 3.9 mm, 4μm (Waters, USA) カラムで +40℃で行った。試料の注入容積は5μlであった。アミノ酸誘導体の生成および分離はWaters 製造元の推奨 (Liu, H. ら, J. Chromatogr. A, 828, 383-395 (1998); Waters accq-tag chemistry package。 使用法マニュアル Millipore Corporation, pp.1-9 (1993))に基づいて行った。6-aminoquinolil-N-hydroxysuccinymidyl カーバメートによるアミノ酸誘導体を取得するのに、Accq-FluorTM(商標)（Waters,  USA)一式を使用した。accq-タグ方法による分析は濃縮Accqタグ溶離剤А(Waters,USA) を使用して行なった。溶液はすべてMilli-Q水を使用して調製し、標準液は+4℃で貯蔵した。
【０１６７】
SDS−PAGE (図2 , A)を使用してasiHPAL単量体の分子量を求めた。その平均値は27 kDaと見積もられた。天然asiHPALの分子量は、分子量タンパク質マーカー (シグマSigma社製)で較正したSuperdexTM 200 HR 10/30A(Pharmacia)カラム上で、分析用SECを使用して決定した(図2,B)。その平均値は186 kDaと見積もられた。したがって、asiHPALは六量体であると推定される。
【０１６８】
HMKPアルドラーゼの金属イオン依存性を調べた。asiHPAL活性がZn2+、Mg2+およびMn2+イオンに厳密に依存し、EDTAの存在で完全に妨害されることを確証した。したがって、asiHPAは、II型アルドラーゼに属すると推定された（表3）。表3は、asiHPALの活性が金属2+イオンに依存することを示す。
【０１６９】
【表３】
2008109924.tif 000009
【０１７０】
2． asiHPALのN-末端配列の決定。
2.1 asiHPALのウェスタンブロット
asiHPALは、trans-Blot SD 細胞 (Bio-Rad)を用いてSequi-Blot PVDF メンブレン(Bio-Rad)上に固定した。最適化ブロット条件:((Dunnの炭酸塩トランスファー・バッファー: メタノール不含10 mM NaCHO3, 3 mM Na2CO3、標準より厚手の濾紙/薄膜サンドイッチ６枚、開始電流5.5mA/cm2、トランスファー時間：1時間 )。
【０１７１】
2.2  N-末端配列の決定
asiHPALのN-末端の配列は、491cLC型 タンパク質シーケンサー（Protein Sequencer） (Applied Biosystems, USA)を使用して決定した。14 サイクル実施した。
【０１７２】
結果:
NH2-Pro-Phe-Pro-Val-Glu-Leu-Pro-Asp-Asn-Phe-Ala-Lys-Arg-Val...（配列番号46）
【０１７３】
測定したN-末端の配列をすべての既知タンパク質(BLAST services)と並べると、類似のN-末端配列を持つ単一のタンパク質が見つかった。これは、Brevibacterium linens BL2 (HHDE_BLI)(図 3)由来のHHDE-アルドラーゼ (2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼ) である。従って、この合致した酵素はType II アルドラーゼで、その天然基質, 2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidは、構造的に HMKPに類似している (事実、両者共C4の位置に水酸基、C2の位置にカルボニル基、C1の位置にカルボキシル基を持つ）。さらに、HHDE_BLIサブユニットのMw (分子量)は27 kDaであり、これは、実験的に得られたasiHPALのサブユニットのMw とよく一致する。さらに、Brevibacterium linensは、Arthrobacter simplexと密接に関係がある。
【０１７４】
したがって、Arthrobacter simplexから精製したasiHPALがBrevibacterium linens BL2由来のHHDEアルドラーゼの同族体であると推定できる。
【０１７５】
[実施例３]  E.コリ 由来のYfaUおよびYhaFアルドラーゼ
HHDE_BLIは、2種の機能的なサブグループ：2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼおよび4-hydroxy-2-oxovalerate アルドラーゼを組込む、いわゆるhpcH/hpaIアルドラーゼ・ファミリーの一部である。HHDE_BLI同族体をBLASTで簡易に検索すると、2-keto-3-deoxyglucarate アルドラーゼを含むサブグループもhpcH/hpaIアルドラーゼ系に属することが明らかになった。
【０１７６】
BLAST検索の結果に基づけば、2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼ
、4-hydroxy-2-oxovalerateアルドラーゼあるいは2-keto-3-deoxyglucarateアルドラーゼ・グループに属するいずれのタンパク質も、HMKPアルドラーゼとして利用できることが示唆された。
【０１７７】
この考えを証明するために、hpcH/hpaIアルドラーゼ系に属するE.coli由来の2種の酵素がHMKPアルドラーゼ活性を示す能力を試験した。推定上の2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼとして指定されたYfaU、および2-keto-3-deoxyglucarateアルドラーゼとして同定されたYhaFがある。しかし、本発明の発明者らは、E.coli菌株MG1655の粗細胞溶解物（ライセート）にHMKPアルドラーゼ活性を見出すことができなかった。したがって、調べた培養条件下のYfaUおよびYhaFの発現がかなり低いと思われた。
【０１７８】
YfaUとYhaFの発現レベルを増加させるために、有効なRBSで接合した強いプロモーターPtacを、yfaUとyhaF遺伝子のコード領域の上流に挿入した。
【０１７９】
1.MG1655[mhpD::attL-kan-attR-Ptac-RBS] 菌株の構築
kan-マーカーおよび有効なRBS付きPtacプロモーターを含む1.7kbのDNA断片を以下のように構築した。
【０１８０】
先ず、λattLとλattR部位で両側を挟まれたkan遺伝子を含むDNA断片は、プラスミドpMW118-(λattL-Kmr-λattR)を 鋳型として使い、オリゴヌクレオチドsvs45 (5-gct-ttc-aat-caa-ctg-gtg-ctg-aat-ttc-ctc-gca-cgc-cct-taa-gga-tga-agc-ctg-ctt-ttt-tat-act-aag-ttg-3’: 配列番号16) と PBglII (cgtacagatctgttacaggtcactaat: 配列番号17)をプライマーとして使い、PCRによって取得した。プライマーsvs45は、その5'-末端にmhpD 遺伝子の上流領域に相同で、EコリMG1655株の染色体にさらに組み込むのに必要な部分を含む。プライマーはその5'-末端にBglII部位を含む。プラスミドpMW118-(λattL-Kmr-λattR)
の構築は参照例に記載されている。
【０１８１】
その後、付着BglII部位を持つPtacプロモーターは、2種のオリゴヌクレオチドPtac5と Ptac3をアニールして得た。オリゴヌクレオチドPtac5の5'末端はキナーゼ反応によってアニールする前に燐酸化した。
【０１８２】
Ptac5 5’-pGATCTCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCG-3（配列番号18) 
Ptac3 5’-CGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGGGA-3’(配列番号19)
【０１８３】
その後、PCRで取得したDNA断片をBglII制限酵素で処理し、Ptacプロモーターで付着BglII部位に連結した。得られた混合物は、プライマーsvs45とsvs46 (5'-aga-acc-gat-aat-ggc-gac-ttt-acg-ctt-act-cat-atg-tat-atc-tcc-ttc-cgc-tca-caa-ttc-cac-aca-tta-tac-3':配列番号20)で行ったPCR反応の鋳型として用いた。プライマーsvs46はその5'-末端にmhpD 遺伝子の下流領域に相同で、E. コリ MG1655株の染色体にさらに組み込むのに必要な部分、およびその中間部に有効なRBSを含む。得られたDNA断片を常法のRed-integration法(Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000)) で MG1655の染色体に挿入した。その結果、mhpD遺伝子は除去され、mhpF とmhpE 遺伝子は人工制御領域下に置かれた(図4)。
【０１８４】
2. MG1655[attLΔyfaV-kan-attR Ptac-RBS- yfaU]株の構築
yfaU遺伝子のヌクレオチドの配列およびyfaU遺伝子でコードされたYfaUタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号5および配列番号6に示されている。kan-マーカーおよびPtac-RBS発現モジュールを含む1.8kbのDNA断片は、オリゴヌクレオチドSVS_81 (5'-taa-acg-ttc-ttt-aaa-ggg-att-gct-taa-taa-tgc-gtt-cat-atg-tat-atc-tcc-ttc-cgc-tca-caa-t
tc-cac-aca-3':配列番号21) および SVS_82 (5'-caa-ttt-gaa-acg-ccc-cta-cag-cca-cta-atc-act-ccg-ggc-gtt-gct-tga-agc-ctg-ctt-ttt-tat-act-aag-ttg-3’: 配列番号22)をプライマーとし、MG1655 [mhpD::attL-kan-attR-Ptac-RBS] 株の染色体DNAを 鋳型として使用して PCRで増幅された。その後、得られたDNA断片を常法のRed-integration法(Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000)) で MG1655の染色体に挿入した。その結果、MG1655[attLΔyfaV-kan-attR-Ptac-RBS- yfaU] 菌株が構築された(図5)。
【０１８５】
3. MG1655[attLΔyhaU-kan-attR Ptac-RBS- yhaF] 株の構築.
yhaF遺伝子のヌクレオチドの配列およびyhaF遺伝子でコードされたYhaFタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号3および配列番号:4に示されている。kan-マーカーおよびPtac-RBS発現モジュールを含む1.8kbのDNA断片は、オリゴヌクレオチドSVS_89
(5'-tgc-ggc-ttt-gaa-ttt-att-cgg-gaa-aac-atc-gtt-att-cat-atg-tat-atc-tcc-ttc-cgc-tca-caa-ttc-cac-aca-3': 配列番号23) および SVS_90 (5'-tcc-cca-taa-taa-taa-aaa-tca-gca-taa-gta-ccc-gag-gta-aat-aaa-tga-agc-ctg-ctt-ttt-tat-act-aag-ttg-3': 配列番号24) をプライマーとし、MG1655 [mhpD::attL-kan-attR-Ptac-RBS] 株染色体のDNAを 鋳型として使用して PCRで増幅された。その後、得られたDNA断片を常法のRed-integration法(Datsenko, K..A. and Wanner, B..L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000))で MG1655の染色体に挿入した。その結果、MG1655[attLΔyfaV-kan-attR-Ptac-RBS- yhaF] 株が構築された(図5) 。
【０１８６】
両方の酵素の増量は、対応する菌株の粗細胞溶解物タンパク質のSDS_PAGE分析で確認した(図6)。
【０１８７】
MG1655[attLΔyfaV-Km-attR Ptac-RBS- yfaU] およびMG1655[attLΔyhaU-Km-attR Ptac-RBS- yhaF]株の粗細胞溶解物（ライセート）中のHMKPアルドラーゼ活性を調べるために、次の処置を行った。
【０１８８】
1)一晩経過した細菌の培養液(37(Сで12時間培養) 50 μlを用いて、カナマイシン(100
μg/ml)を補充したLBブロス培地4mlに接種した。細胞は37(СでOD555=1に達するまで約1〜2時間培養する。その後、細胞を4℃で遠心分離(16000×g)により採取し、1mM PMSF(フッ化フェニルメチルスルフォニル)を補充した緩衝液A[50mM KH2PO4 ( KOHでpH 7.4に調節]30mlに再懸濁した。次いで、細胞は、4℃で常法通り超音波処理で破砕し、4℃で細胞の破砕残骸を遠心分離(16000×g)で除去した。
【０１８９】
2) 得られた粗細胞溶解物（ライセート）11μlを、Ｌ-グルタミン酸100mM (0.5M原液(NaOHでpH 7.4に調整)から希釈)、100mMケトブタン酸、100mMアセトアルデヒド、2mM MgCl2
(または MnCl2, またはZnCl2, または EDTA)および精製bsuBCAT(14μg)を含む反応混合物9μlに添加した。反応は37(Сで2時間培養に供された。4HILの合成は、TLCとHPLCの分析で試験した(図7; 表4)。表４は、MG1655[attLΔyfaV-Km-attR Ptac-RBS- yfaU] および
MG1655[attLΔyhaU-Km-attR Ptac-RBS- yhaF] 株の粗溶解物（ライセート）の持つHMKP-アルドラーゼ活性を HPLC 分析で行った調査を示す。
【０１９０】
【表４】
2008109924.tif 000010
【０１９１】
[実施例４] Novosphingobium aromaticivorans VKPM B-9294 株由来BphF HKP-アルドラーゼ
Novosphingobium aromaticivorans 由来BphFアルドラーゼ、つまり4-hydroxy-2-  oxovalerateアルドラーゼは、（所謂HHEDアルドラーゼおよび HKPアルドラーゼを包含する）hpcH/hpal ファミリーに属するので HMKPアルドラーゼとして使用できるかもしれない。
【０１９２】
この考えを証明するため、hpcH/hpal ファミリーに属するNovosphingobium aromaticivorans 由来のBphFアルドラーゼがHMKPアルドラーゼ活性を示す能力を試験した。しかし、本発明の発明者らは,Novosphingobium aromaticivorans VKPM B-9294 株の粗細胞溶解物（ライセート）にHMKPアルドラーゼ活性を検出来なかった。したがって、調べた培養条件下でBphFの発現がかなり低いと思われた。
【０１９３】
精製BphFタンパク質調製物を取得するために、Novosphingobium aromaticivorans VKPM
B-9294 株由来HKPアルドラーゼをコードするbphF遺伝子をDNAベクター中にクローンし、E.コリ MG1655株に導入し、取得したバイオマスからBphFアルドラーゼを精製した。
【０１９４】
1.Novosphingobium aromaticivorans VKPM B-9294 株由来 HKP-アルドラーゼをコードするbphF遺伝子のクローニング
先ず、Novosphingobium aromaticivorans VKPM B-9294株由来pNL1プラスミド[Romine, M. F. et all, Complete sequence of a 184-kilobase catabolic plasmid from Sphingomonas aromaticivorans F199  J. Bacteriol. 181 (5), 1585-1602 (1999)] の0.8kbのDNA断片を、オリゴヌクレオチドSVS_93 (5'-ggt-cac-aag-ctt-gta-ata-tag-agg-gcg-aca-atg-caa-aca-ccc-g-3': (配列番号25) および SVS_94 (5'-ggt-cac-gaa-ttc-tta-gac-tcc-gcc-ctg-cgc-ggc-gat-gc-3': (配列番号26) をプライマーとしてPCRを用いて増幅した。LB寒天プレートから得た、Novosphingobium aromaticivorans VKPM B-9294株の細胞培地一部を、PCR処理用の鋳型DNAのソースとして使用した。その結果、bphF遺伝子を含み、HindIIIとEcoRIの制限部位で挟まれたDNA断片が得られた。それをHindIII-EcoRI部位の間で、高コピー数プラスミド・ベクターpUC19 (シグマ社、アメリカ)にクローンした。このようにして、組み換えプラスミドpUC19-bphFを構築した(図9)。
【０１９５】
さらに、プラスミドpUC19-bphFをE.コリMG1655株へ導入した。得られた組み換え細胞MG1655[pUC19-bphF]を、アンピシリン(200μg/ml)とIPTG(1mM)を補充した、LBブロス3リットル、15×（1リットルフラスコ中に200ml)、に接種し、37℃ で12時間攪拌培養した。細胞は4℃ で遠心分離(16000g、20min)で採取し、使用時まで-70℃で保存した。得られたバイオマスをBphFアルドラーゼの精製に使用した。
【０１９６】
2. BphFアルドラーゼの精製
クロマトグラフィ処理は、すべてAKTAbasic100 システムを使用して行った。三種のアルドラーゼ(YhaF、YfaUおよびBphFアルドラーゼ)すべての精製に一律のクロマトグラフィのプロトコルを使用した。これは次の工程を包含した。凍結細胞を解凍し、1mM PMSF(フェニルメチルスルフォニル弗化物)を補充した緩衝液A [50mM KH2PO4(pH 7.4) KOHで調整]30mlに再懸濁した。精製プロトコルは下記の手順を含む。
【０１９７】
工程1: 細胞は、フレンチ・プレッシャー・セル(最高圧 P=2.5 psi) に3〜5回通して破砕し、次いで残骸断片を除くために遠心分離した。活性画分を合併し、緩衝液Aで平衡化したセファデックスG-15カラム(2.6×28cm)に通した。
【０１９８】
工程2:工程1から得られたタンパク質調製物50mlを緩衝液Aで平衡化したDEAE-Sepharose(ファストフロー)カラム(1.6×25cm)に供した。溶出は、緩衝液A(10CV（カラム容積分10倍量)）に0-0.5M NaClの直線濃度勾配をかけて、流速2.5ml/分で行った。各10ml画分を集めた。活性画分は、まとめて緩衝液Ｂ[10mM KH2PO4 (pH 7.0)、KOHで調節]で平衡化したセファデックスG-15カラム(2.6×28cm)でクロマトラフィにかけて脱塩した。
【０１９９】
工程3: 工程2 から得られたタンパク質調製物を、緩衝液Ｂで平衡化した1.6ml Sourse15Qカラムに供した。溶出は、緩衝液A（カラム容積分40倍量)に0-0.5M NaClの直線濃度勾配をかけて、流速1ml/分で行った。各2ml分画分を集めた。活性分画分を合併した。
【０２００】
工程4: (NH4)2SO4を1.5M濃度に達するまで、工程3から得られたタンパク質調製物に添加した。タンパク質沈殿物は遠心分離（16000  g、4℃）で集め、緩衝液Ｂに再懸濁した。
【０２０１】
工程5: 工程4から得られたタンパク質調製物を、緩衝液C[50 mM KH2PO4 (pH 7.4) KOHで調整, 100 mM NaCl, 10% (w/v) グリセロール]で平衡化したPD10脱塩カラム(Amercham,
Pharmacia, Biotech) で脱塩し、使用時まで-70℃で保存した。（図10）。
【０２０２】
[実施例５] エシェリヒア属MG1655株由来スレオニン・デアミナーゼ (TD)
精製TDタンパク質調製物を得るために、TDをコードする、エシェリヒア・コリMG1655株由来のilvA遺伝子をDNAベクターにクローンし、E.コリMG1655株へ導入し、得られたバイオマスからTDを精製した。
【０２０３】
1.スレオニン・デアミナーゼ(TD)をコードする、エシェリヒア属G1655株由来のilvA遺伝子のクローニング
エシェリヒア・コリMG1655株染色体DNA の1.5kbの断片を、オリゴヌクレオチドIlvA-5(5'-gtcacgcatatggctgactcgcaacccctgtccgg-3': 配列番号27)およびilvA-3(5'-cagtggatccttaacccgccaaaaagaacctgaac-3': 配列番号28)をプライマーとして、PCRで増幅した。LB寒天プレートから得たエシェリヒア・コリMG1655株の細胞培地の一部を、PCR処理用の鋳型DNAのソースとして使用した。その結果、ilvA遺伝子を含み、NdeIとBamHIの制限部位に挟まれたDNA断片が得られた。それをpET22(b+)ベクター(Novagen(ドイツ))のNdeI-BamHI部間にクローンした。このようにして、組み換えプラスミドpET-ilvAが構築された(図11)。
【０２０４】
2.エシェリヒア・コリMG1655株由来のスレオニン・デアミナーゼ(TD)の発現および部分的精製
プラスミドpET-ilvAをBL21(DE3)株(Novagen(ドイツ))に導入した。得られたBL(21)(DE3)[pET-ilvA]株を、アンピシリン(200μg/ml)」を補充した、LBブロス5×（1リットルフラスコ中に200ml)に接種し、37℃で2〜3時間、OD555=1に達するまで攪拌培養した。その後
、細胞培地にIPTGを添加して（最終濃度が1mMに達するまで）TDの発現を誘発し、次いで37℃ で3時間培養した。その後、細胞を4℃で遠心分離(16000 g、20分)で採取し、使用時まで-70℃で保存した。得られたバイオマスをTD の部分的精製に使用した。
【０２０５】
凍結細胞を解凍し、緩衝液A [50mM KH2PO4(pH 7.4) KOHで調整]40mlに再懸濁した。
細胞は、フレンチ・プレッシャー・セル (最高圧 P=2.5 psi) に2回通して破砕し、次いで残骸断片を除くために遠心分離(14000g、4℃、20分)した。得られたタンパク質調製物を、緩衝液Aで平衡化したセファデックスG-15カラム(1.6×25cm)に通した。
【０２０６】
工程1:工程1から得られたタンパク質調製物50mlを緩衝液Aで平衡化した1.6ml Sourse15Qカラムに供した。溶出画分（総容量、50ml）を集めた。
【０２０７】
工程2:(NH4)2SO4を4 M濃度に達するまで、工程1から得られたタンパク質調製物に添加した。タンパク質沈殿物は遠心分離（16000 g、4℃、15分）で集め、緩衝液Ｂ[50 mM KH2PO4 (pH 7.4) KOHで調整, 100 mM NaCl,1mM PLP]1 mlに再懸濁した。工程2で得られたタンパク質調製物を緩衝液C[50 mM KH2PO4 (pH 7.4) KOHで調整, 100 mM NaCl,1mM PLP, 10% (w/v) グリセロール]で平衡化したPD10脱塩カラム(Amercham, Pharmacia, Biotech) で脱塩し、使用時まで-70℃で保存した。（図11）。
【０２０８】
3. TD活性の検定
TDの活性は以下のように検定した。各反応混合物(20 μl)は、100mM L-グルタミン酸(1Mの原液から希釈、(pH 8)NaOHによって調整)、精製his6-タグ-YwaA 14 μg、種々の濃度のL-スレオニン(0〜500 mM)、およびTDタンパク質調製液45 μgを包含した。反応混合物は、37℃で2時間培養した。反応生成物は、TLC法で分析した。TLC 法を利用して、4-ヒドロキシイソロイシン、α-アミノブタン酸、L-グルタミン酸およびL-スレオニンの濃度を求めた。シリカゲル薄層板(10x15 cm)に一定量の(1-2μl) 反応液をスポットし、展開溶液(2-プロパノール: アセトン: アンモニア: 水 =100 : 100 : 25 : 16)で展開し、4HILはニンヒドリン試薬で検出した。
【０２０９】
[実施例６] AL/AT依存生物変換プロセスにおける4HIL収率の実験的研究
4HIL生物変換プロセスに関する実験的研究のため、YfaUとYhaFアルドラーゼをそれぞれ、E.コリ MG1655[attLΔyfaV-Km-attR Ptac-RBS- yfaU] および MG1655[attLΔyhaU-Km-attR Ptac-RBS- yhaF] 株の粗細胞溶解物（ライセート）から精製した。
精製プロトコルは下記の手順を含む。
【０２１０】
工程1:一晩経過した細菌の培養液(37℃ 12時間培養)1mlを用いて、LBブロス培地3リットルに接種した。細胞は37℃で約12時間培養する。その後、細胞を4℃で遠心分離(16000×g)で採取し、1mM PMSF（フッ化フェニルメチルスルフォニル）を補充した緩衝液A[50mM
KH2PO4 (KOHでpH 7.4に調節)]30mlに再懸濁する。
【０２１１】
工程2:細胞は、フレンチ・プレッシャー・セル(最高 P=2 psi)を3回通して破砕し、次いで破砕残骸を除くために遠心分離した。タンパク質調製液は、緩衝液Aで平衡化したセファデックス（Sephadex）G-15カラム(2.6×28cm)に通した。
【０２１２】
工程3：陰イオン交換クロマトグラフィは、50mlのDEAE(ファストフロー)カラム(d=1.6cm)付きAKTAbasic100 システムを使用して行った。通常、工程2から得られたタンパク質調製物40〜50mlを緩衝液Aで平衡化したカラムに供した。溶出は、緩衝液A(カラム容積分10倍量) に0-0.5M NaClの直線濃度勾配をかけて、流速2.5ml/分で行った。各10ml画分を集めた。
【０２１３】
活性画分を合併して、緩衝液 B （10 mM KH2PO4 (KOHでpH 7.0に調節))で平衡化したセファデックス（Sephadex）G-15 カラム(2.6 × 28 cm)に通した。
【０２１４】
工程4: 工程3から得られたタンパク質調製物は、緩衝液Bで平衡化したヒドロキシアパタイト（Hydroxylapatite）(Bio-Rad; DNA-Grade, Bio-Gel HTP)カラム(2.5 × 1.5 cm)に通した。流出した画分を集めた。
【０２１５】
工程5:陰イオン交換FPLCは、1.6mlの「Sourse15Q」カラム(Amersham Pharmacia Biotech)を補充したAKTAbasic100 システムを使用して行った。工程4から得られたタンパク質調製物を緩衝液Bで平衡化したカラムに供した。溶出は、緩衝液B（カラム容積分20倍量）に0-0.5M NaClの直線濃度勾配をかけて、流速1ml/分で行った。各2ml画分を集めた。活性分画分をまとめた。
【０２１６】
工程6:工程5から得たタンパク質調製物に(NH4)2SO4を1.5Mの濃度まで添加した。タンパク質沈殿物は遠心分離(16000  g,4℃,15分)で集め、緩衝液 Bに再懸濁した。
【０２１７】
工程6から得られたタンパク質調製物を実験に使用した(図8)。
【０２１８】
mhpFEのクローニング
上記のように、4HILの適切な生合成は、E.コリ-由来の MhpE アルドラーゼ (Appl. Environ. Microbiol., Vol. 64, No. 10, 4093-4094, 1998) を追加して使用した条件下で達成されなかった。mhpFE 遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号31に示されている。我々はE.コリ由来のmhpFE遺伝に対して、5'-cgaattcttatttgttgttgcgcagatcca-3'(配列番号 29)をセンス・プライマーとし、5'-cgaattcttatttgttgttgcgcagatcca-3'(配列番号 30)をアンチセンス・プライマーとして、標的遺伝子を増幅し、それをpET-21(a+)/Nhe-1EcoR1 ベクターに組み入れた。このプラスミドで形質転換した BL21/pET-21a(+)mhpFEを、 LB培地50 mLを注入した 500 mL坂口フラスコで振盪培養し、OD555=1に到達した時、0.5mM IPTGで標的タンパク質の発現を誘発した。
【０２１９】
可溶画分中での発現は、mhpEがmhpFと共に発現されたときだけ可能であった。このシステムで発現されたmhpFE上に標識が存在しなかったので、4HIL生産テストは細胞溶解物（ライセート）を使用するシステムで行なった。
【０２２０】
4HILの酵素的合成
精製YhaF、YfaUおよびbsuBCAT酵素を使用した、二工程生物変換プロセスで4HILの生成を検討するために、一連の反応混合物を調製した。各々20μlの容積であって、300mMアセトアルデヒド、100mMα−ケトブタン酸、100mMＬ-グルタミン酸(0.5M原液から希釈、（NaOHでpH 7.5に調節))、20mM KH2PO4/Na2HPO4緩衝液(0.2 M原液から希釈(pH 7))、2mM MgCl2、14μgの精製bsuBCAT、40μgの精製YfaU(あるいは120μgの精製YhaF)を含んでいた。各反応は37℃で4時間培養に供した。その後、4HIL濃度を常法通りHPLC分析で求めた(表5)。
【０２２１】
精製asiHPAL および bsuBCAT 酵素を使用して、二工程生物変換プロセスでの4HILの生成を検討するために、100mM Ｌ-グルタミン酸(1M原液から希釈、（NaOHでpH ８に調節))、100mMアセトアルデヒド、100mMα−ケトブタン酸、2mM ZnCl2,、14μgの精製bsuBCAT、および0.6μgの精製asiHPALを含む反応混合物（反応物容積20μl）を調製した。反応は37℃で2時間培養に供した。その後、4HIL濃度を常法通りHPLC分析で求めた(表5)。
【０２２２】
精製mhpFE および ecoBCAT 酵素を使用して二工程生物変換プロセスでの4HILの生成を検討するために、mhpFE.BL21(DE3)[pET-HT-ilvE-ECO]または BL21/pET-21a(+) mhpFE を発現するE. コリを上記の様式で標的タンパク質を発現するよう誘導し、培養液1 mLから
細菌を集め、洗浄した。その後細菌を200 μLの反応液(100 mMの アセトアルデヒド, 100
mMのα−ケトブタン酸, 100mMのL-グルタミン酸, 50mM 燐酸塩緩衝液(pH7))と反応させた。反応温度は30℃で、反応は一晩行われ、細胞溶解物（ライセート）は、反応前に超音波処理で得られた。反応に続いて、遠心分離(10,000rpm、5分)にかけて上清を得た。上清を、25倍に希釈しHPLCによるアミノ酸分析に供した。変換していないE. コリを対照として用いた(表5)。
【０２２３】
【表５】
2008109924.tif 000011
【０２２４】
HPLC分析は実施例2に記載のように行った。
表5は、精製YhaF、YfaU、asiHPALおよびbsuBCAT酵素を使用する二工程生物変換プロセスにおける4HIL生成の調査結果を示す。
【０２２５】
[実施例7]TD/HPAL/BCATの三酵素系反応。
三酵素系反応は以下のように行った。
【０２２６】
工程1.反応混合物A(80 μL)は、500mM L-スレオニン、200mM Ｌ-グルタミン酸 (1M原液(NaOHでpH 7.4に調整)から希釈)、精製his6-タグ-YwaA 234μg, TDタンパク質調製液76μgを含んでいた。対照反応混合物(IlvA-) は、TDタンパク質調製液を除く以外、同一の成分を含んでいた。反応混合物はすべて37℃で1時間培養した。
【０２２７】
工程2.反応混物を5組(A1は２組、およびA2〜A4)準備した。各々(10μl)は、4mM MgCl2(反応混合物A4には4mM ZnCl2)、400mMアセトアルデヒド、ならびに、反応混合物A1、A2、A3およびA4にそれぞれ対応するYhaF、YfaU、BphFおよびasiHPALアルドラーゼ調製物5μlを含んでいた。対照反応混合物(HPAL-)はアルドラーゼ調製物を除く以外、同じ成分を含んでいた。工程1から得られた10μlの反応混合物Aを各々A1〜A4および(HPAL-)反応混合物に添加した。工程1から得た10μlの対照反応混合物(IlvA-)を A1反応混合物に加えた。反応はすべて37℃ で1時間培養した。
【０２２８】
【表６】
2008109924.tif 000012
【０２２９】
4HILの濃度はHPLC 分析で決定した。HPLC 分析は実施例２の通り行った。
【０２３０】
2. 結果
E.コリ由来のスレオニン・デアミナーゼ(TD) (ilvA遺伝子によりコードされる)は、過
剰発現され、BL21(DE3)[pET-ilvA]株(図11)の粗抽出物から部分的に精製された。得られたタンパク質調製物のTD活性はTD/BCATの二酵素系反応で試験した。試料がTD活性を含まなかった場合、L-グルタミン酸およびL-スレオニンに対応するクロマトグラフィのゾーンが検知されただけである(図12およびレーン: 1、3、5、7)。分析された試料がTD活性を含むと、α−アミノブタン酸に対応する余分のゾーンが検知され、L-スレオニンのゾーンは完全に消失していた(図12 B、レーン: 2、4、6、8)。L-スレオニン約10 mmoleを37℃ 、2時間で分解させるのにTD調製物45μgで十分であった。(図12、レーン2)。
【０２３１】
4HILの生物変換プロセスをモデル化するのに、得られたTD調製物を用いた。TD、HPALおよびBCAの活性を連結する結果、生体外でアセトアルデヒド、L-スレオニンおよびL-グルタミン酸から4HILが合成される（表6)。表6は、TD/HPAL/BCATの三酵素系反応による、L-スレオニン、L-グルタミン酸およびアセトアルデヒドからの4HILの生合成を示す。
【０２３２】
さらに、得られた結果によれば、連続的にまたは同時に3種の反応をすべて導くことができる新しい微生物を使用する4HIL合成に関して次の推定スキームが提案できる(図13)。
【０２３３】
[参照例]  pMW118-(λattL-Kmr-λattR) プラスミドの構築. 
pMW118-(λattL-Kmr-λattR) プラスミドは、pMW118-attL-Tc-attR (WO2005/010175) プラスミドを基にして、テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子をpUC4K プラスミド由来のカナマイシン耐性マーカー遺伝子で置換することで構築された (Vieira, J. and Messing, J., Gene, 19(3): 259-68 (1982))。
【０２３４】
その目的のために、pMW118-attL-Tc-attR プラスミドの大きな EcoRI - HindIII 断片をpUC4K プラスミドの二つの断片：HindIII- PstI 断片 (676 bp)とEcoRI-HindIII 断片 (585 bp)に連結した。
【０２３５】
基本 pMW118-attL-Tc-attR は次の4個のDNA 断片の連結で得られた。
【０２３６】
1)  オリゴヌクレオチドP5 および P6 (配列番号33および34)をプライマーとして (これらのプライマーは、 BglII および EcoRI エンドヌクレアーゼに対する付属の認識部位を含む)を用いて、E. コリ W3350 (λプロファージを含む) 染色体の対応する領域をPCR増幅することで得た、attL (配列番号32)を搭載するBglII-EcoRI 断片 (114 bp)。
【０２３７】
2)  オリゴヌクレオチドP7 および P8 (配列番号: 36 および 37)をプライマーとして (これらのプライマーは、PstI および HindIII エンドヌクレアーゼに対する付属の認識部位を含んだ)を用いて、E. コリ W3350 (λプロファージを含む) 染色体の対応する領域をPCR増幅することで得た、attR (配列番号35)を搭載するPstI-HindIII断片 (182 bp)。
【０２３８】
3) pMW118-ter_rrnBの大きなBglII-HindIII断片(3916 bp)。プラスミド pMW118-  ter_rrnB は次の３個のDNA 断片の連結で得られた。
【０２３９】
1）pMW118をEcoRI 制限エンドヌクレアーゼで消化し、DNA ポリメラーゼIのクレノウ（Klenow）断片で処理し、ついでAatII制限エンドヌクレアーゼで消化する方法で得たpMW118のAatII-EcoRI断片を搭載する大きなDNA 断片 (2359 bp)    。
【０２４０】
2）アンピシリン耐性(ApR)bla 遺伝子を搭載するpUC19の小さなAatII-BglII 断片(1194 bp)は、オリゴヌクレオチドP7およびP8（配列番号38 および 39)をプライマー(これらのプライマーは、AatII と BglII ヌクレアーゼに対する付属の認識部位を含んだ)として使用して、pUC19プラスミドの対応する領域のPCR増幅によって得た。
【０２４１】
3）転写ターミネーターter_rrnB の小さなBglII-PstIpol 断片(363 bp)は、オリゴヌクレオチドP9およびP10(配列番号40および41)をプライマー(これらのプライマーは、BglIIとPstIのエンドヌクレアーゼに対する付属の認識部位を含む)として使用して、E. コリ MG1655染色体の対応する領域のPCR増幅によって得た。
【０２４２】
4) テトラサイクリン耐性遺伝子およびter_thrL 転写ターミネーターを搭載するpML-  Tc-ter_thrLの小さなEcoRI-PstI 断片(1388 bp)(配列番号42)。pML-Tc-ter_thrLプラスミは2工程で得られた。
【０２４３】
●  当該 pML-ter_thrL プラスミドは、pML-MCS プラスミド(Mashko, S.V. ら., Biotekhnologiya (ロシア語), 2001, no. 5, 3-20) をXbaI およびd BamHI制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いで、大きな断片(3342 bp)を、E. コリ MG1655 染色体の対応する領域を、オリゴヌクレオチドP11およびP12(配列番号43および44)をプライマー(これらのプライマーは、XbaI と BamHI エンドヌクレアーゼに対する付属の認識部位を含む)として使用してPCR増幅によって得た、ターミネーターter_thrL搭載のXbaI-BamHI 断片(68 bp)との連結で得た。
【０２４４】
●  pML-Tc-ter_thrL プラスミドは、pML-ter_thrL プラスミドをKpnI および XbaI制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いで、DNA ポリメラーゼIのクレノウ（Klenow）断片で処理し、テトラサイクリン耐性遺伝子を搭載するpBR322の、小さいEcoRI-Van91I 断片 (1317 bp)との連結で得た（pBR322はEcoRI および Van91I制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いで、DNA ポリメラーゼIのクレノウ（Klenow）断片で処理した）。
【０２４５】
[実施例８]4HILの生成のための菌株およびプラスミドの構築。
1a. BW25113 [mhpD::attB-PtacRBS;mhpF::cat;mhpE::Kn] 株の構築
工程1  先に構築したMG1655株[mhpD::attL-kan-attR-PtacRBS](実施例3、第1部)由来の人工オペロンPtacRBS-mhpF-mhpEを、P1vir駆動形質導入の使用でBW25113株に転移した。その後、kanマーカーをλの Xis function (WO05/010175) で切除し、その結果BW25113[mhpD::attB-Ptac-RBS]株 を生じた(図14)。
【０２４６】
工程2  その後、得られたBW25113[mhpD::attB-PtacRBS]株の染色体においてmhpE遺伝子をkan遺伝子に置換した(図15)。kan遺伝子の開始に対応するトリプレットATGをGTGトリプレットに置換した。kan遺伝子の発現は、mhpFとkanのORFの翻訳カップリングにより行なわれる(図15参照)。生じたBW25113株[mhpD::attB-PtacRBS;mhpE::Kn]株は、カナマイシンに対して100μg/mlまで耐性がある。
【０２４７】
工程3その後、得られたBW25113[mhpD::attB-PtacRBS;mhpE::Kn]株の染色体において、mhpF遺伝子を、強いT7A2プロモーターの制御下に置かれた、cat遺伝子を含むDNA座に置換した(図16)。生じたBW25113[mhpD::attB-PtacRBS;mhpF::cat;mhpE::Kn]株(S1株)はクロラムフェニコールに100μg/mlまで耐性があるが、cat遺伝子挿入でmhpF-kanの翻訳共役が損なわれたので、カナマイシンの存在に感受性がある(図16を参照)。
【０２４８】
1b. E.コリBW25113[mhpDFE::attB-PtacRBS-ywaA-kn]株の構築
部位特異的の組込み用に、L1/R1遺伝座で両側を挟まれたywaA構造遺伝子を含む1.2kbのDNA断片を取得するため、PCRを行った(図17)。オリゴヌクレオチドsvs145(配列番号54)およびsvs137(配列番号55)をプライマーとして用い、Bacillus subtilis 168株の染色体DNAを 鋳型として使用した。その後、cat遺伝子を、受容体S1株の染色体において、PCRで取得したL1-ywaA-R1 DNA断片に置換した。生じたBW25113[mhpDFE::attB-PtacRBS-ywaA-kn]株の約100のKnRクローンが得られた。
【０２４９】
L-グルタミン酸: 粗細胞溶解物（ライセート）中のα-ケトブタン酸のアミノトランスフェラーゼ活性を次のように検定した。反応混合物(20μl)は、各々50mM L-グルタミン酸
(1M原液(NaOHでpH 8に調整)から希釈)、20mM α-ケトブタン酸(Na+塩の1M原液から希釈)、および一定量の粗細胞溶解物（ライセート）μl lを含んでいた。反応混合物は37℃で約1時間培養した。TLC法で4-ヒドロキシ-L-イソロイシン、α-アミノブタン酸、およびL-グルタミン酸の濃度を測定した。一定量(1〜2 μl)の反応溶液をスポットした薄層のシリカゲル・プレート(10x15 cm)を溶媒(2-プロパノール: アセトン: アンモニア: 水=100: 100: 25: 16)で展開し、4HILをニンヒドリン試薬で検知した。図18から見られるように、L-グルタミン酸:α-ケトブタン酸アミノトランスフェラーゼ活性は、構築した菌株中で著しく増加していた。
【０２５０】
1c. YfaUアルドラーゼおよびYwaAアミノトランスフェラーゼの活性を1つの菌株中に組み合わせること
YfaUアルドラーゼの活性およびYwaAアミノトランスフェラーゼの活性を1つの菌株中に組み合わせた。下記手順で行なわれた(図19参照)。
【０２５１】
MG1655[yfaV::attB-PtacRBS-yfaU]株は、MG1655[yfaV::attL-kn-attR-  PtacRBS-yfaU]株 (実施例3、第２部)の染色体から、λのXis functionを用いて(WO05/010175)カナマイシン・マーカーを切除することで構築した。
【０２５２】
オリゴヌクレオチドsvs 62(配列番号51)およびsvs 45(配列番号16)をプライマーとして使用し、BW25113[mhpDFE::attB-PtacRBS-ywaA-kn]染色体を 鋳型として使用して、Ptac-ywaA発現モジュールを含む2kbのDNA断片をPCRで増幅した。その後、得られたDNA断片を、λのRed-ecombimnation functions (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000))を使用してMG1655[yfaV::attL-kn-attR-PtacRBS-yfaU]株の染色体へ組込みした。その結果、E.コリMG1655[yfaV::attL-kn-attR- PtacRBS-yfaU、mhpDFE::attB-PtacRBS-ywaA-kn] 株が構築された。生じた菌株は、BH1株と命名した。YfaUとYwaA酵素の共発現は、粗細胞溶解物（ライセート）中のHMKPアルドラーゼおよびBCATアミノトランスフェラーゼ活性の検定で確認した(データ不示)。
【０２５３】
2. MG1655(ΔaceE)株の構築
aceE遺伝子の切除は以下のように行った:CmマーカーおよびPtacプロモーターを含む1.8kbのDNA断片を、オリゴヌクレオチドI(配列番号56)およびII(配列番号57)をプライマーとして使用し、pMW118-attL-km-attR-  ter_rrnBプラスミドDNAを鋳型として使用して、PCRによって増幅した(上記参照例を参照)。得られたDNA断片を、上記のようにRed-integration法でMG1655染色体中に挿入した。その結果、MG1655(ΔaceA)株が構築された。
【０２５４】
3. MG1655(cat-PLgltS) 株の構築
PLプロモーターの制御下、上記したRed-integration法を用いてcat遺伝子およびgltS遺伝子を含むDNA断片(配列番号58)をMG1655に導入することで、MG1655(cat-PLgltS)株を取得した。
【０２５５】
4. MG1655(catPL-tacgdhA)株の構築
PL-tacプロモーターの制御下、上記したRed-integration法を用いてcat遺伝子およびgdhAg遺伝子を含むDNA断片(配列番号59)をMG1655に導入することで、MG1655(catPL-tacgdhA)株を取得した。
【０２５６】
5. pELAC-ilvAプラスミドの構築
Placプロモーター(配列番号60)を含むBglII-XbaI断片で、T7プロモーターを含むBglII-XbaI断片を置換することで、pET-ilvA(実施例5第1部参照)からpELAC-ilvAプラスミドを構
築した。
【０２５７】
6. pELAC-yhaFプラスミドの構築。
E.コリ由来yhaF遺伝子は、オリゴヌクレオチドyhaf5 (配列番号61) およびyhaf3(配列番号62)をプライマーとして使用し、MG1655株の染色体DNAを鋳型として使用して、PCRにより増幅された。これらのプライマーは、SalIIとHindIIIのエンドヌクレアーゼに対する付属の認識部位を含む。その後、得られたPCR断片を、予め同じ制限酵素で処理したpELAC-ilvAベクターにクローンした。
【０２５８】
7.二工程生物変換プロセス用菌株の構築
Cmでマークした発現モジュールPL-RBS-gltSを、P1vir駆動形質導入により、MG1655[cat-PLgltS]株からBH1株へ転移させた。次いで、Cmマーカーを、λのXis function (WO05/010175)を使用して切除した。生じた菌株をBH2株と命名した。
【０２５９】
Cmでマークした発現モジュールPL-tacgdhAを、P1vir駆動形質導入により、MG1655(Cm-PL-ta-gdhA)株からBH2株へ転移させた。次いで、Cmマーカーを、λのXis function (WO05/010175)を使用して切除した。生じた菌株をBH3株と命名した。
【０２６０】
CmでマークしたaceE遺伝子遺伝子欠失部をP1vir駆動形質導入によりMG1655[aceE::Cm]株からBH2株へ転移させた。生じた菌株をBH4株と命名した。
【０２６１】
CmでマークしたaceE遺伝子欠失部を、P1vir駆動形質導入によりMG1655[aceE::Cm]株からBH3株へ転移させた。生じた菌株をBH5株と命名した。
【０２６２】
ilvA遺伝子でコードされるスレオニン・デアミナーゼの活性を増加するために、BH1、BH2、BH4およびBH5株の細胞を、pET-ilvAプラスミドで形質転換した。生じた株は、それぞれBH1*、BH2*、BH4*およびBH5*と命名した。
yhaF遺伝子でコードされるHPAL活性の活性を増加させるために、BH4菌株の細胞をpELAC-yhaFプラスミドで形質転換した。生じた菌株は、BH5**と命名した。
上記の菌株の遺伝子特徴は表7に要約されている。
【０２６３】
【表７】
2008109924.tif 000013
【０２６４】
[実施例９]二工程生物変換プロセス
1. 二工程生物変換プロセス:工程1(アミノブタン酸/ケトブタン酸の生成) 
BH1*、BH2*、BH4*またはBH5*菌株を、各々37℃で約5〜6時間アンピシリン(150mg/l)を
補充したLBブロス200ml中で培養した。(欠失ΔaceEを含むBH4**およびBH5*は、酢酸ナトリウム (4g/l)の存在下で培養)。細胞は遠心分離で採取した。湿潤バイオマス0.15-0.18gを種々の濃度のグルタミン酸を補充した2mlの培地T5 [50mM Na2HPO4(リン酸でpH 7.4に調節)、2mM MgSO4、0.5Mスレオニン、酢酸塩4g/l、酵母抽出物2.5g/l、およびアンピシリン150mg/l]に再懸濁した。細胞は37℃で約14時間培養した。その後、細胞は遠心分離で採取した。得られた、α-アミノブタン酸およびα-ケトブタン酸の混合物を含有する培養ブロス(RM)は、使用時迄4℃で保存した。
【０２６５】
１．二工程生物変換プロセス:工程2 (4HILの合成)
工程I  BH4* 株を、アンピシリン(150mg/l)を補充したLBブロス200ml中、37℃で約5〜6時間培養した。細胞は遠心分離で採取し、数部(およそ1.5mlのバイアル中0.15gの湿潤バイオマス)に分割し、-70℃で使用時迄保存した。
【０２６６】
工程II  0.15g のBH4**株の冷凍バイオマスを工程I(2.1.2の内容参照)で得たRMブロス1mlに再懸濁した。その後、アセトアルデヒドを最終濃度が0.3Mになるまで添加した。細胞は37℃で約14時間培養した。
【０２６７】
3. 分析法
TLC法を適用して4HIL、α−アミノブタン酸、およびL-グルタミン酸の濃度を測定した。一定量(1〜2 μl)の反応溶液をスポットした薄層のシリカゲル・プレート(10x15 cm)を展開溶媒(2-プロパノール: アセトン: アンモニア: 水=100: 100: 25: 16)で展開し、アミノ酸をニンヒドリン試薬で検知した
【０２６８】
HPLC分析: アミノ酸は、Accq-タグ法(Waters,USA)を使用して測定した。
アミノ酸誘導体の合成および分離は製造元の推奨に基づいて行った。プロピオン酸およびα−ケトブタン酸の濃度は毛管電気泳動で測定した。
【０２６９】
4. 結果
表8に示したデータから見られるように、BH4*株を用いた生物変換(工程I)は次の結果をもたした:i) α−ケトブタン酸の蓄積、ii)プロピオン酸副生成物が5倍減少、iii) BH2*株に比してα−アミノブタン酸合成が2倍減少。このようにして、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性(ΔaceE)の不活性化で、α−ケトブタン酸のプロピオン酸エステルへの転換(脱カルボキシル反応) がかなりを減少した。残念ながら、α−アミノブタン酸の蓄積も減少した。
【０２７０】
この問題は、BH4*株にPL-tac-gdhAモジュールを導入することで解決された。BH5*株による生物変換では、α−アミノブタン酸の生成が3倍に増加し、α−ケトブタン酸の合成がわずかに減少した。
【０２７１】
グルタミン酸を100 mMだけ反応混合物に初発に仕込んだのに、α−アミノブタン酸が240 mM合成されたことは重要である。これは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GdhA)の作用でα−ケトブタン酸と(NH4)+から約140 mMのα−アミノブタン酸が、合成されたことを意味する。
【０２７２】
グルタミン酸の初発濃度依存性の生物変換プロセスでのα−アミノブタン酸の生成を検討した(図20)。得られたデータは、スレオニンとグルタミン酸の初発濃度の比率が(スレオニン: グルタミン酸=5:1)に等しかった時、最高の生成量に到達したことを示した。
【０２７３】
【表８】
2008109924.tif 000014
【０２７４】
生物変換プロセスの工程2をモデル化するために、BH4**株とBH5*株を使用した工程Iから得られたと培養ブロスのバイオマスを使用した(表9(図21))。4HIL(両異性体)の最終生成量は70 mMと評価された。このようにして二工程生物変換プロセスは、2種の菌株BH5*およびBH4**のバイオマスの使用で実現することができる。
【０２７５】
【表９】
2008109924.tif 000015
【０２７６】
配列の説明
1:ilvA、E.コリ・スレオニン・デアミナーゼ遺伝子
2:IlvA、E.コリ・スレオニン・デアミナーゼ
3:yhaF、E.コリ・アルドラーゼ遺伝子
4:YhaF、E.コリ・アルドラーゼ
5:yfaU、E.コリ・アルドラーゼ遺伝子
6:YfaU、E.コリ・アルドラーゼ
7:bphF、N.aromaticivoransアルドラーゼ遺伝子
8:BphF、N.aromaticivoransアルドラーゼ
9:ilvE、E.コリBCAT遺伝子
10:IlvE、E.コリBCAT
11:ywaA、B.subtilis BCAT遺伝子
12:YwaA、B.subtilis BCAT 
13:プライマーP1、ywaAの増幅用
14:プライマーP2、ywaAの増幅用
15: プライマー T7
16: プライマー svs 45, mhpD の上流の領域
17: プライマー PBglII
18: プライマー Ptac5
19: プライマー Ptac3
20: プライマーsvs 46、mhpD の下流の領域
21: プライマー svs 81, kan-マーカーおよび Ptac-PBS発現モジュールの増幅用
22: プライマー svs 82, kan-マーカーおよび Ptac-PBS発現モジュールの増幅用
23: プライマー svs 89, kan-マーカーおよび Ptac-PBS発現モジュールの増幅用
24: プライマー svs 90, kan-マーカーおよび Ptac-PBS発現モジュールの増幅用
25: プライマー svs 93, bphFの増幅用
26: プライマー svs 94, bphFの増幅用
27: プライマー ilvA-5, ilvAの増幅用
28: プライマー ilvA-3, ilvAの増幅用
29: センス・プライマー mhpFE, mhpFEの増幅用
30: アンチセンス・プライマー mhpFE, mhpFEの増幅用
31: mhpFE, E. コリ・アルドラーゼ 遺伝子
32: DNA断片, attL
33: プライマー P3, attLの増幅用
34: プライマー P4, attLの増幅用
35: DNA 断片, attR
36: プライマー P5, attRの増幅用
37: プライマー P6, attRの増幅用
38: プライマー P7, blaの増幅用
39: プライマー P8, blaの増幅用
40: プライマー P9, ter_rrnBの増幅用
41: プライマー P10, ter_rrnBの増幅用
42: Tc遺伝子および ter_thrLを含むDNA 断片
43: プライマー P11, ter_thrLの増幅用
44: プライマー P12, ter_thrLの増幅用
45: COG3836, HpcH/HpaIアルドラーゼファミリー配列の特徴
46: asiHPAL N-末端 配列
47: COG0115, BCAT の配列特徴
48: asiHPAL遺伝子, A. シンプレクス・ アルドラーゼ 遺伝子
49: asiHPAL, A. シンプレクス・アルドラーゼ
50: プライマー svs 61, 図 15に示す増幅用
51: プライマー svs 62, 図 15に示す増幅用
52: プライマー svs 98, 図 16に示す増幅用
53: プライマー svs 99, 図 16に示す増幅用
54: プライマー svs 145, 図17に示す増幅用
55: プライマー svs 137, 図17に示す増幅用
56: プライマー I, Cmマーカーおよび Ptacプロモーターの増幅用
57: プライマー II, Cmマーカーおよび Ptacプロモーターの増幅用
58: PL プロモーター制御下のcat遺伝子 および gltS遺伝子搭載の断片
59: PL プロモーター制御下のcat遺伝子 およびgdhA遺伝子搭載の断片
60: SalI および HindIIIで両側を挟まれたPlacプロモーターを含む断片
61: プライマー yhaf5, yhaFの増幅用
62: プライマー yhaf3, yhaFの増幅用
【産業上の利用可能性】
【０２７７】
本発明は、酵素的のプロセスまたは化学・酵素の組み合わせプロセスで、従来植物抽出酵素のみが報告されている4HILを製造する方法を提供する。本発明は、医薬品および薬剤製造の分野で非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２７８】
【図１】アースロバクター・シンプレクスAKU 626(IFO 12069)(写真)由来HMKPアルドラーゼの精製を示す。レーン:1,4  タンパク質分子量マーカー(Fermentas、リトアニア));2.粗細胞溶解物（ライセート）(45μg適用);3．asiHPAL調製物(0.5μg適用)。
【図２】HPALのオリゴマーの構造決定を示す: A- 較正済みSDS-PAGEゲルによるasiHPAL単量体のMwの測定; PageRuler TMタンパク質ラダー（Protein Ladder）(Fermentas,Lithuanai)を1組のタンパク質マーカーとして使用した。実験データ(黒円)をシグマ・プロット8ソフトウェアを使用して、線形回帰分析で当てはめた(黒線)。B- 分子量タンパク質マーカー (Molecular Weight Protein Markers (Sigma)シグマ社)で較正したSuperdexTM 200 HR 10/30A(Farmacia)カラムでSECによるasiHPALの未変性Mw値の決定。実験データ(黒円)をシグマ・プロット8ソフトウェアを使用して、線形回帰分析で当てはめた。
【図３】すべての既知のタンパク質で測定したN-末端の配列の配置を示す(BLASTサービス)。
【図４】MG1655[mhpD::attL-kan-attR-PtacRBS]株の構築を示す。
【図５】E.コリMG1655の染色体中で、人工PtacRBS発現モジュールによるyfaUとyhaFの遺伝子の調節部分の置換を示す。
【図６】Ptac-RBS発現モジュールの制御下、yfaUとyhaF遺伝子の発現を示す(写真)。レーン:1,4:Mwマーカー;2,5:MG1655の粗細胞溶解（ライセート）調製物(約20μg適用);3:MG1655-attLΔyfaV-km-attR PtacRBS-yfaの粗溶解（ライセート）調製物(約20μg適用);6:MG1655-attLΔyhaU-km-attR PtacRBS-yhaFの粗溶解（ライセート）調製物(約20μg適用)。
【図７】MG1655[attLΔyfaV-km-attR PtacRBS-yfaU]およびMG1655[attLΔyhaU-km-attR PtacRBS-yhaF]の粗細胞溶解物（ライセート）のHMKPアルドラーゼ活性のTLC 分析(写真)を使用した調査を示す。略字  4HIL:4-ヒドロキシイソロイシン; AABA:α-アミノブタン酸;GLU:L-グルタミン酸。展開剤:アセトン:イソプロピルアルコール:(NH4)OH:H2O=100:100:25:16.レーン(反応混合物2μl適用):1,2,3,4- MG1655;5,6.7,8- MG1655-attLΔyfaV-km-attR PtacRBS-yfaU;列9,10,11,12- MG1655-attLΔyhaU-km-attR PtacRBS-yhaF。
【図８】YfaUとYhaFアルドラーゼの精製を示す。A) 最終酵素調製液のSDS-PAGEゲル(写真)。レーン:1- Mｗタンパク質マーカー;2- YfaU調製液タンパク質10μg適用;3 - YhaF調製液タンパク質10μg適用。B) 精製工程。
【図９】組み換えプラスミドpUC19-bphFの構造を示す。
【図１０】BphFアルドラーゼの精製を示す(写真)。精製酵素は電気泳動にかけられ、クマシーブリリアントブルーR250(写真)で染色した。レーン:1- 指示分子量のマーカー、2- BphFタンパク質調製液10μg適用。
【図１１】E.コリ由来のスレオニン・デアミナーゼ(TD)のクローニングおよび発現を示す。A:pET-IlvAの組み換えプラスミドの構造;B:SDS/PAGE(写真)。ライン:1- TD調製物(9.5μgの全タンパク質適用)；2: 指示分子量のマーカー。
【図１２】TD/BCATの二酵素系反応のTLC分析を示す(写真)。TDタンパク質調製物の活性試験。ライン:1、3、5、7、9 −反応混合物は、それぞれ、0、50、100、200、500 mMのL-スレオニン、およびTD調製物を含んでいた。；ライン:2、4、6、8、10対照反応混合物は、TD調製物不含で、0、50、100、200、500 mMの L-スレオニンを含んでいた。
【図１３】三酵素系の反応におけるL-スレオニンとアセトアルデヒドから4HIL合成の推測スキームを示す。
【図１４】BW25113[mhpD::attB-PtacRBS]株の構築を示す。
【図１５】BW25113 [mhpD::attB-PtacRBS;mhpE::Kn]株の構築を示す。
【図１６】BW25113 [mhpD::attB-PtacRBS;mhpF::cat;mhpE::Kn]株の構築を示す。
【図１７】BW25113[mhpDFE::attB-PtacRBS-ywaA-kn]株の構築を示す。
【図１８】粗細胞溶解物（ライセート）中のYwaA活性のTLC分析を示す(写真)。略字  AABA  α−アミノブタン酸、Glu  グルタミン酸。レーン:1,2  BW25113[mhpDFE::attB-PtacRBS-ywaA-kn株の粗細胞溶解物（ライセート）を含む反応混合物1μl、それぞれ１時間、2時間培養;3,4  同様、但しBW25113 [mhpD::attB-PtacRBS;mhpF::cat;mhpE::Kn]株、の粗細胞溶解物（ライセート）を使用した。
【図１９】BH1株中にYfaUアルドラーゼおよびYwaAアミノトランスフェラーゼ活性を組み合わせるスキームを示す。
【図２０】生物変換プロセス(工程1)におけるα−アミノブタン酸生成に及ぼすグルタミン酸供給量の影響を示す。
【図２１】スレオニン、グルタミン酸およびアセトアルデヒドから4HILの二工程生合成を示す。A  二工程生物変換プロセスのスキーム；B  反応混合物のTLC分析(写真)。レーン:1 ―標準スレオニン；2  標準グルタミン酸；3  標準α―アミノブタン酸；4工程１、初発反応混合物(稀釈1: 10)；5  工程I、生物変換後の培養ブロス(稀釈1: 10)；6 工程II、最終培養ブロス(稀釈1: 10)；7  標準4HIL。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２０】
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【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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