(57)【要約】【課題】  従来の免疫測定用担体では、高感度の測定ができないという問題があり、免疫測定法の測定感度を向上できる免疫測定用担体を提供する。【解決手段】  抗体が結合したガラス担体において、官能基（Ａ）を担体の表面積を基準として５×１０-7ｍｏｌ／ｍ2〜１×１０-5ｍｏｌ／ｍ2有する担体と抗体とを、スペーサーアームの長さ（オングストローム）が５〜２５である二架橋性試薬（Ｂ）で結合することを特徴とする免疫測定用担体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体が結合したガラス担体において、官能基（Ａ）を担体の表面積を基準として５×１０-7ｍｏｌ／ｍ2〜１×１０-5ｍｏｌ／ｍ2有する担体と抗体とを、スペーサーアームの長さ（オングストローム）が５〜２５である二架橋性試薬（Ｂ）で結合することを特徴とする免疫測定用担体。
【請求項２】
（Ａ）がアミノ基、チオール基及びカルボキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基である請求項１に記載の免疫測定用担体。
【請求項３】
（Ｂ）がグルタルアルデヒドと直鎖アルキルジアミンを結合させてなる試薬である請求項１又は２に記載の免疫測定用担体。
【請求項４】
ガラス担体がすりガラスビーズである請求項１〜３のいずれかに記載の免疫測定用担体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の免疫測定用担体と測定対象物を含む検体とを反応させる工程、ペルオキシダーゼ標識抗体を反応させる工程、ルミノール及び過酸化水素溶液を用いて化学発光させる工程、並びに、発光強度を計測する工程を含んでなることを特徴とする免疫測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫測定用担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗原や抗体を不溶性担体に結合させた固相化免疫試薬が多くの免疫学的測定用試薬として利用されている。不溶性担体上に抗体を結合させる方法は、ガラスとモノクローナル抗体を化学的に結合させる方法（特許文献１及び２参照）、およびプラスチックに抗体を物理吸着させる方法（非特許文献１参照）等がある。
【特許文献１】米国特許第４２８０９９２号明細書
【特許文献１】米国特許第３６５２７６１号明細書
【非特許文献１】イー・エングバール、ジェー・ジョンソン、ピー・パールマン、「バイオキミカ バイオフィジカ アクタ」、１９７１年、251巻、427〜434頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし近年免疫測定法においては、更に測定感度を向上させる要求が高まっているが、上記の方法を用いた担体では大幅な感度の向上が望めない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するため鋭意検討した結果、不溶性担体上に抗体を結合させるための担体上の官能基の密度と担体と抗体との距離を特定の範囲内にすることで、大幅に感度が上昇することを見いだし本発明に到達した。
すなわち、本発明は、抗体が結合したガラス担体において、官能基（Ａ）を担体の表面積を基準として５×１０-7ｍｏｌ／ｍ2〜１×１０-5ｍｏｌ／ｍ2有する担体と抗体とを、スペーサーアームの長さ（オングストローム）が５〜２５である二架橋性試薬（Ｂ）で結合することを要旨とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の免疫測定用担体は、微量の抗原に対しての反応性が良くなるため、低濃度域での測定感度を向上させることができる。従って、本発明の免疫測定用担体は、高感度な測定を必要とする臨床検査薬等へ適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
ガラスの材質としては、ガラスであれば特に制限なく使用できるが、例えば、酸化物ガラス｛ケイ酸塩ガラス（ケイ酸ガラス、ケイ酸アルカリガラス、ソーダ石灰ガラス、カリ石灰ガラス、鉛ガラス、バリウムガラス、ホウケイ酸ガラス等）、非酸化物ガラス（カルコゲナイトガラス、ハロゲン化物ガラス、炭酸塩ガラス、硝酸塩ガラス等）、金属ガラス（ジルコニア、ニッケル、銅等からなるガラス）及び有機ガラス等（アクリルガラス、ポリカーボネート等）が挙げられる。これらのうち、官能基（Ａ）導入の容易さの観点から、酸化物ガラスが好ましく、さらに好ましくはケイ酸塩ガラス、特に好ましくはケイ酸ガラス（主要成分：ＳｉＯ2）、ケイ酸アルカリガラス（主要成分：Ｎａ2Ｏ−ＳｉＯ2）、ソーダ石灰ガラス（主要成分：Ｎａ2Ｏ−ＣａＯ−ＳｉＯ2）、カリ石灰ガラス（主要成分：Ｋ2Ｏ−ＣａＯ−ＳｉＯ2）、鉛（アルカリ）ガラス（主要成分：Ｋ2Ｏ−ＰｂＯ−ＳｉＯ2）、バリウムガラス（主要成分：ＢａＯ−ＳｉＯ2−Ｂ2Ｏ3）及びホウケイ酸ガラス（主要成分：Ｎａ2Ｏ−Ｂ2Ｏ3−ＳｉＯ2）、最も好ましくはソーダ石灰ガラス及びホウケイ酸ガラスである。
【０００７】
ガラス担体の形状としては、ビーズ状、試験管状、シャーレ状、チューブ状、トレイ状等が挙げられる。これらのうち、免疫学的測定法におけるＢ／Ｆ分離等の観点から、ビーズ状が好ましい。
【０００８】
ビーズの形状は、球状（真球状、楕円球状）、円盤状、棒状などが挙げられる。これらのうち、液中挙動等の観点から、球状が好ましく、さらに好ましくは真球状である。数平均ビーズ直径（ｍｍ）は、０．１〜２０が好ましく、さら好ましくは１〜１０、特に好ましくは２〜７である。
【０００９】
ガラス担体が試験管状の場合は、高さ（ｍｍ）が３０〜７０、底面の直径（ｍｍ）が１〜１０であることが好ましい。シャーレ状の場合は、高さ（ｍｍ）が５〜２０、底面の直径（ｍｍ）が１０〜４０であることが好ましい。チューブ状の場合は、高さ（ｍｍ）が１０〜５０であることが好ましく、トレイ状の場合は、高さ（ｍｍ）が５〜２０、底面が２０〜５０四方であることが好ましい。
【００１０】
ガラスビーズを使用する場合は、市場から入手しうるガラスビーズは通常表面が滑面であるが、測定値の再現性等の観点から、表面スリ加工（表面の艶消し加工）を実施した後、使用するのが好ましい。スリ加工は従来公知の方法等が適用でき、例えば、化学大辞典（共立出版株式会社、１９８９年刊行）第５巻９９９頁記載の物理的方法及び化学的方法等が挙げられる。これらのうち、物理的方法が好ましく、さらに好ましくは加圧空気による砂吹き付け（サンドブラスト）法及び砂掛け磨き（ブラシを水で湿して磨く）法、特に好ましくはサンドブラスト法である。
【００１１】
官能基（Ａ）としては、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基などが挙げられる。抗体との結合性及び二架橋性試薬との結合性等の観点から、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、エポキシ基が好ましく、さらに好ましくは、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、特に好ましくはアミノ基、チオール基である。
【００１２】
担体に官能基（Ａ）を導入する方法としては、化学吸着法でシランカップリング剤を用いて導入する方法（例えば、P．J． Robinsonら Biochim．Biophys．Acta, 242巻 1971年 p．659-661に記載の方法）等が挙げられる。
【００１３】
より具体的には、（Ａ）がアミノ基の場合、Ｎ−２（アミノエチル）３-アミノプロピルメチルジメトキシシランや３−アミノプロピルトリエトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を用いてガラス担体に化学吸着法で導入する方法等が挙げられる。（Ａ）がチオール基の場合、３-メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン等のチオール基を有するシランカップリング剤で導入できる。（Ａ）がエポキシ基の場合は、エポキシ基を有するシランカップリング剤を用いて導入できる。
【００１４】
担体へ導入する官能基（Ａ）の量（ｍｏｌ／ｍ2）は、免疫反応等の観点から、担体の表面積を基準として５×１０-7〜１×１０-5であり、好ましくは、７×１０-7〜８×１０-6、さらに好ましくは９×１０-7〜５×１０-6である。下限未満では、結合できる抗体量が少なくなり、上限を超える場合、抗原との反応性が低下する。
【００１５】
担体の表面積は、表面が滑面な担体の場合は計算で求める。すりガラスビーズの表面積は測定が困難なため、特開２００２-０９８７００号公報に記載の方法を用いて加工したすりガラスビーズを滑面のガラスビーズの表面積と仮定して求める。
【００１６】
導入する官能基（Ａ）の量は、使用するシランカップリング剤の使用量で制御できる。官能基量は、アミノ基の場合は、ニンヒドリン試薬を用いてＤＹＤＡ（ジケトヒドリンジリデン・ジケトヒドリンダミン）の吸光度を測定して求められ、チオール基の場合は、ＤＴＮＢ｛５,５’-ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）｝溶液をチオール基と反応させて生成される５−メルカプト-２-ニトロ安息香酸の吸光度を測定することで求められる。カルボキシル基の場合は、酸価測定で求められ、エポキシ基の場合は、エチレンジアミンを反応させ、反応したエチレンジアミンを前述したアミノ基の定量と同様の測定方法で測定することで求められる。
【００１７】
二架橋性試薬（Ｂ）は官能基（Ａ）と抗体のアミノ基あるいはカルボキシル基とを結合させるために用いる。二架橋性試薬（Ｂ）としては、（Ａ）がアミノ基の場合、アルデヒド｛ＧＡ（Glutaraldehyde）、ＯＡ（Oxalaldehyde）等｝、スクシンイミド｛ＤＳＧ（Disuccinimidyl glutarate）、ＤＳＰ（Dithiobis[succinimidyl propionate]）、ＤＳＳ（Disuccinimidyl suberate）、ＭＢＳ（m−Maleimidobenzyl−N−hydroxysuccinimide ester）、ＢＳ3（Bis［Sulfosuccinimidyl］suberate）等｝、イミド｛ＤＭＳ（Dimethyl suberimidate・2HCl）、ＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl］carbodiimide Hydrochloride）等｝等が使用できる。（Ａ）がチオール基の場合、スルフィド｛ＰＤＰＨ（3-[2-Pyridyldithio]propionyl hydrazide）、ＳＰＤＰ（N-Succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]propionate）、Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Sulfosuccinimidyl 6-［3’-(2-pyridyldithio)-propionamide］hexanoate）等｝、マレイミド｛ＢＭＨ（Bis-Maleimidohexane）、ＳＭＣＣ（Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate）等｝等が使用できる。（Ａ）がカルボキシル基の場合、イミド｛ＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl］carbodiimide Hydrochloride）等｝等が使用できる。また（Ａ）がエポキシ基の場合、カルボン酸｛ＥＭＣＡ（Ｎ-ε-Maleimidocaproic acid）、ＫＭＵＡ（Ｎ-κ-Maleimidoundecanoic acid）等｝等が使用できる。
【００１８】
さらに、両末端にアミノ基を有するジアミン及び／又は両末端にカルボキシル基を有するジカルボン酸と上記の二架橋性試薬とを反応させたものも二架橋性試薬（Ｂ）として用いることができる。ジアミンとしては、直鎖脂肪族ジアミン（尿素、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等）、芳香族ジアミン（ジアミノベンゼン、ジアミノフェノール、ジアミノメチルベンゼン等）等が挙げられる。ジカルボン酸としてはグルタル酸、アジピン酸、スベリン酸及びセバシン酸等が挙げられる。例えば官能基（Ａ）がアミノ基の場合、アミノ基にグルタルアルデヒド、エチレンジアミン、グルタルアルデヒド、抗体の順に結合させることができるが、この場合グルタルアルデヒドとエチレンジアミンとグルタルアルデヒドとの反応物が二架橋性試薬（Ｂ）となる。
【００１９】
スペーサーアームの長さ（オングストローム）は、反応性及び測定感度の観点から、５〜２５であり、好ましくは８〜２０、さらに好ましくは１２〜１８である。
スペーサーアームの長さとは、官能基（Ａ）と二架橋性試薬（Ｂ）と抗体との反応で形成した結合鎖のうち、二架橋性試薬（Ｂ）由来部分の結合鎖の長さである。
スペーサーアームの長さは、量子化学計算により求められる。該長さは、例えば、量子力学計算ソフトＣＡＣｈｅのＰＭ３法により算出できる。ＣＡＣｈｅシステムのＰＭ３法は、例えば富士通社製のＣＡＣｈｅ  ＷＯＲＫＳＹＳＴＥＭ５．０２を使用して計算することができる。該長さは、ＷｏｒｋＳｐａｃｅ上で計算したい分子構造を描き、ＰＭ３ｇｅｏｍｅｔｒｙで構造最適化することで算出できる。構造最適化においては、初期構造を基にして半経験的パラメータが選ばれ、分子のエネルギーと原子にかかる力が量子計算される。ＰＭ３法は計算に必要な積分を実験値から定めた半経験的分子軌道法の一種であり、真空中の部分電荷を求めることが出来る。上記ＰＭ３法は、「分子軌道法MOPACガイドブック、海文堂出版株式会社、1994年9月15日2訂版」等に記載の計算方法に基づくものである。
なお、市販の二架橋性試薬のスペーサーアームの長さは、試薬カタログに記載されている。
【００２０】
二架橋性試薬（Ｂ）としては、枝分かれがなく、（Ａ）、（Ｂ）及び抗体の結合形成に関与する官能基間で立体障害が起こらない等の観点から、オキサルアルデヒド及び／又はグルタルアルデヒドと直鎖脂肪族アルキルジアミンとを結合させてなる試薬が好ましい。
【００２１】
抗体としては、例えば、次の抗原に対する抗体等が挙げられる。
（１）タンパク質関連物質：ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ７２−４、ＣＡ５０、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ペプシノゲンＩ、ペプシノゲンＩＩ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＳＣＣ，ＫＭＯ１、ＮＳＥ、ＩｇＥ、特異ＩｇＥ、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＩＡＰ、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、ＣＲＰ、α２−ＭＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＭＭ、ミオグロビン、ミオシン、トランスフェリン、アポリポタンパク、糖タンパク、アルブミン、マイクロアルブミン、ヘモグロビン、グリコヘモグロビン、フルクトサミン、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＲＦ、リンパ球サブセット、ＬＥ細胞、抗サイログロブリン抗体、抗マイクロゾーム抗体及びＡＳＯ等。
【００２２】
（２）ホルモン関連物質：インスリン、ＨＧＣ、β−ＨＣＧ、成長ホルモン、ＴＳＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、プロラクチン、Ｔ３、Ｔ４、ＦＴ３、ＦＴ４、ＴＢＧ、Ｃ−ペプチド、Ｔ−Ｕｐｔａｋｅ、エストロゲン、ＨＰＬ、Ｅ２、コルチゾール、プロゲステロン、テストステロン及びソマトスタチン等。
（３）薬物関連物質：ジゴキシン、フェニトイン、フェノバルビタール及びテオフィリン等。
【００２３】
（４）感染症関連物質：真菌、連鎖球菌、大腸菌、結核菌、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、エイズウイルス、カンシダ、マイコプラズマ、トキソプラズマ、梅毒、マラリア原虫及び赤痢アメーバー等そのもの自体、並びにこれらに対する抗体及びこれらの代謝物等。
（５）環境・食品関連物質：環境ホルモン（エストラジオール等の性ホルモン、ペンタクロロフェノール、アトラジン、アラクロール、シマジン、メソミル、ドリン、アルディアルブ、ベミノル、ＰＣＢ、ダイオキシン及びＤＤＴ等）、農薬（スミチオン、α−ベンゾピエン、フェンバレレート及びメトリブジン等）、貝毒・藍藻毒（サキシトキシン、マイクロシスチン及びゴニオトキシン等）、及びカビ毒（アフラトキシン、オクラトキシン及びゼラレノン等）等。
これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよく、さらに抗体の分解物であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’又はＦａｂであってもよい。
【００２４】
本発明の免疫測定用担体は、官能基（Ａ）を導入した担体に、二架橋性試薬（Ｂ）と抗体とを化学反応させて得ることができる。すなわち、本発明の免疫測定用担体の製造方法としては、（Ａ）を導入した担体と二架橋性試薬（Ｂ）とを化学結合させて二架橋性試薬結合担体を得る工程（１）、及び二架橋性試薬結合担体と抗体とを化学結合させて免疫測定用担体を得る工程（２）を含む。
【００２５】
工程（１）は、従来公知の方法、例えば米国特許第４２８０９９２号明細書及び同第３６５２７６１号明細書に記載された方法等に準じて行うことができる。
【００２６】
工程（２）は、工程（１）と同様に従来公知の方法が適用できる。
【００２７】
シランカップリング剤を用いた化学吸着法の一例を以下に示す。１％のγ−アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液にすりガラスビーズを加え、１時間、２５℃で反応させ、反応後、水で洗浄する。次いで、２％のグルタルアルデヒド水溶液を加え、１時間、２５℃で反応させ、反応後、水で洗浄する。さらに抗体を２０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）を加え、１時間、２５℃で反応させ、反応後、抗体液を除去し、０．１％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に浸漬する。
【００２８】
本発明の免疫測定用担体の大きさとしては、免疫測定担体がビーズ状の場合は、ビーズ直径は測定対象物及び必要とする測定感度等により適宜選択することができ、この数平均直径（ｍｍ）は、０．１〜２０が好ましく、さらに好ましくは１〜１０、特に好ましくは２〜７である。この範囲であると、測定感度がさらに良好となる。試験管状、シャーレ状、チューブ状、トレイ状の場合の好ましい範囲は、前述したガラス担体と同様である。
【００２９】
本発明の免疫測定用担体は、従来公知の免疫測定用担体と同様に免疫測定に使用できる。免疫測定方法には、本発明の免疫測定用担体と測定対象物を含む検体とを反応させる工程、及びペルオキシダーゼ標識抗体を反応させる工程、ルミノール、過酸化水素溶液を用いて化学発光させる工程等が含まれる。免疫測定の方法は、発光を検出する方法であれば、特に限定はなく従来公知の方法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）が適用できる。本発明の免疫測定用担体は、適当な緩衝剤（リン酸緩衝液等のｐＨ緩衝剤等）、化学発光試薬等と組み合わせて免疫測定用キットとすることもできる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
【００３１】
実施例１  （Ａ）がアミノ基の場合の免疫測定用担体（Ａ−１）の作製
２０ｍｌポリエチレン瓶に０．２重量％のγ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液（ナカライテスク）１０重量部を仕込み、さらにガラスビーズ（（株）岡部製作所製、ケイ酸塩ガラス）を特開２００２-０９８７００の方法を用いて加工したすりガラスビーズ２２重量部を仕込み、１時間、２５℃で反応させた。反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水１５重量部を加えて、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作をさらに５回行って、アミノ基導入ガラスビーズを得た。次いで、２重量％のグルタルアルデヒド（和光純薬工業（株）製）水溶液１０重量部を仕込み、１時間、２５℃で反応させた。反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。脱イオン水１５重量部を加えて、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を１０回行って、グルタルアルデヒド結合ガラスビーズを得た。次に抗ＡＦＰモノクローナル抗体（Dako社製）を２０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）１０重量部を仕込み、２時間、２５℃で反応させた。反応後、抗ＡＦＰ抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズを作製した。これを１％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１５重量部に２〜８℃の冷蔵で、１２時間浸漬した後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。その後１５重量％のショ糖含有ＡＤＡ緩衝液１５重量部に２５℃で３時間浸漬させた後、ろ紙上で風乾させて、免疫測定用担体（Ａ−１）を得た。
【００３２】
実施例２  （Ａ）がアミノ基の場合の免疫測定用担体（Ａ−２）の作製
実施例１において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を０．２重量％から０．０２重量％とした以外、実施例１と同様にして、免疫測定用担体（Ａ−２）を得た。
【００３３】
実施例３  （Ａ）がアミノ基の場合の免疫測定用担体（Ａ−３）の作製
実施例１において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を０．２重量％から０．００２重量％とした以外、実施例１と同様にして、免疫測定用担体（Ａ−３）を得た。
【００３４】
実施例４  （Ａ）がアミノ基の場合の免疫測定用担体（Ａ−４）の作製
実施例１と同様にして、グルタルアルデヒド結合ガラスビーズを得た。このビーズに、さらに２重量％のエチレンジアミン水溶液１０重量部を加え、１時間、２５℃で反応させた。反応後、脱イオン水１５重量部を加えて反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を１０回行った。その洗浄後のガラスビーズを２重量％のグルタルアルデヒド水溶液１０重量部に加え、１時間、２５℃で反応させた。反応後、脱イオン水１５重量部を加えて反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を１０回行った後、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（Dako社製）を２０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）１０重量部を加え、２時間、２５℃で反応させた。反応後、抗ＡＦＰ抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズを作製した。これを１％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１５重量部に２〜８℃の冷蔵で、１２時間浸漬し、その後１５重量％のショ糖含有ＡＤＡ緩衝液１５重量部に２５℃で、３時間浸漬させ、乾燥させ、ろ紙上で風乾させて、免疫測定用担体（Ａ−４）を得た。
【００３５】
実施例５  （Ａ）がアミノ基の場合の免疫測定用担体（Ａ−５）の作製
実施例４において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を０．２重量％から０．０２重量％とした以外、実施例４と同様にして、免疫測定用担体（Ａ−５）を得た。
【００３６】
実施例６（Ａ）がアミノ基の場合の免疫測定用担体（Ａ−６）の作製
実施例４において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を０．２重量％から０．００２重量％とした以外、実施例４と同様にして、免疫測定用担体（Ａ−５）を得た。
【００３７】
実施例７  （Ａ）がアミノ基の場合の免疫測定用担体（Ａ−７）の作製
実施例１と同様にして、グルタルアルデヒド結合ガラスビーズを得た。このビーズに、さらに２重量％のへキサメチレンジアミン水溶液１０重量部を加え、１時間、２５℃で反応させた。反応後、脱イオン水１５重量部を加えて反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を１０回行った。その洗浄後のガラスビーズを２重量％のグルタルアルデヒド水溶液１０重量部に加え、１時間、２５℃で反応させた。反応後、脱イオン水１５重量部を加えて反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を１０回行った。その後、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（Dako社製）を２０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）１０重量部を加え、２時間、２５℃で反応させた。反応後、抗ＡＦＰ抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズを作製した。これを１％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１５重量部に２〜８℃の冷蔵で、１２時間浸漬し、その後１５重量％のショ糖含有ＡＤＡ緩衝液１５重量部に２５℃で、３時間浸漬させ、乾燥させ、ろ紙上で風乾させて、免疫測定用担体（Ａ−７）を得た。
【００３８】
実施例８  （Ａ）がアミノ基の場合の免疫測定用担体（Ａ−８）の作製
実施例７において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を０．２重量％から０．０２重量％とした以外、実施例７と同様にして、免疫測定用担体（Ａ−８）を得た。
【００３９】
実施例９  （Ａ）がアミノ基の場合の免疫測定用担体（Ａ−９）の作製
実施例７において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を０．２重量％から０．００２重量％とした以外、実施例７と同様にして、免疫測定用担体（Ａ−９）を得た。
【００４０】
実施例１０  （Ａ）がチオール基の場合の免疫測定用担体（Ａ−１０）の作製
２０ｍｌポリエチレン瓶に０．０２重量％３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン水溶液（東京化成工業（株）製）に１０重量部を仕込み、さらにガラスビーズ（（株）岡部製作所製、ケイ酸塩ガラス）を特開２００２-０９８７００の方法を用いて加工したすりガラスビーズ２２重量部を仕込み、１時間、２５℃で反応させた。反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水１５重量部を加えて、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作をさらに５回行って、チオール基導入ガラスビーズを得た。次いで８．０×１０-4ｍｏｌ／ｌのＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ (N-(4-Maleimidobutyryloxy)-sulfosuccinimide sodium salt)(同仁化学研究所製)水溶液１０重量部を仕込み、１時間、２５℃で反応させた。反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。脱イオン水１５重量部を加えて、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を１０回行って、スクシンイミド基結合ガラスビーズを得た。次に抗ＡＦＰモノクローナル抗体（Dako社製）を２０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）１５重量部を仕込み、２時間、２５℃で反応させた。反応後、抗ＡＦＰ抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズを作製した。これを１％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１５重量部に２〜８℃の冷蔵で、１２時間浸漬し反応液をアスピレーターで吸引除去した。その後１５重量％のショ糖含有ＡＤＡ緩衝液１５重量部に２５℃で３時間浸漬させた後、ろ紙上で風乾させて、免疫測定用担体（Ａ−１０）を得た。
【００４１】
実施例１１  （Ａ）がチオール基の場合の免疫測定用担体（Ａ−１１）の作製
実施例１０において、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳをＳｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ (N-(4-Maleimidoundecanoyloxy)-sulfosuccinimide sodium salt)(同仁化学研究所製)とした以外、実施例１０と同様にして、免疫測定用担体（Ａ−１１）を得た。
【００４２】
実施例１２  （Ａ）がチオール基の場合の免疫測定用担体（Ａ−１２）の作製
実施例１０において、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳをＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ (Sulfosuccinimidyl-6-[α-(2-pyridyldithio)toluamido]hexanoate) (同仁化学研究所製)とした以外、実施例１０と同様にして、免疫測定用担体（Ａ−１２）を得た。
【００４３】
比較例１  （Ａ）がアミノ基の場合の免疫測定用担体（Ｈ−１）の作製
実施例１において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を０．２重量％から１重量％とした以外、実施例１と同様にして、免疫測定用担体（Ｈ−１）を得た。
【００４４】
比較例２  （Ａ）がアミノ基の場合の免疫測定用担体（Ｈ−２）の作製
実施例１において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を０．２重量％から０．０００２重量％とした以外、実施例１と同様にして、免疫測定用担体（Ｈ−２）を得た。
【００４５】
比較例３  （Ａ）がチオール基の場合の免疫測定用担体（Ｈ−３）の作製
実施例１０において、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン水溶液の濃度を０．０２重量％から１重量％とした以外、実施例１０と同様にして、免疫測定用担体（Ｈ−３）を得た。
【００４６】
比較例４  （Ａ）がチオール基の場合の免疫測定用担体（Ｈ−４）の作製
実施例１０において、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン水溶液の濃度を０．０２重量％から０．０００２重量％とした以外、実施例１０と同様にして、免疫測定用担体（Ｈ−４）を得た。
【００４７】
＜測定感度の評価＞
実施例１〜１２及び比較例１〜４の免疫測定用担体（Ａ−１）〜（Ａ−１２）及び（Ｈ−１）〜（Ｈ−４）を用いて、以下の測定方法により測定し、測定感度を求めた。
測定は全自動酵素免疫測定装置｛スフィアライト１８０（オリンパス（株）製）｝を用いで行った。「ＡＦＰ測定用臨床検査薬｛三洋化成工業（株）製、商品名：スフィアライトＡＦＰ｝添付文書記載の方法」（ａ．免疫測定用担体1個が入った反応層に検体１０μＬ及び免疫反応用緩衝液１３０μＬを加え、３７℃、約7分間反応させる（第１反応）。ｂ．Ｂ／Ｆ分離、洗浄を行なう。ｃ．酵素標識抗体液１４０μＬを加えて、３７℃、７分間反応させる（第２反応）。ｄ．Ｂ／Ｆ分離、洗浄を行なう。ｅ．基質液７０μＬ及び過酸化水素液７０μＬを加える（酵素反応）。ｅ．発光量を測定する。）に準じて、標準ＡＦＰ溶液（ＡＦＰ濃度０及び５ｎｇ／ｍＬ）を測定した。得られた化学発光量を、表１に示した。なお、ＡＦＰ濃度０ｎｇ／ｍＬの溶液を用いた場合の発光量を、ブランクの発光量（Ｄ）とし、ＡＦＰ濃度５ｎｇ／ｍＬの溶液を用いた場合の発光量を、化学発光量（Ｃ）とした。また、化学発光量（Ｃ）を、ブランクの発光量（Ｄ）で除した値（Ｃ／Ｄ）を測定感度として表１に示した。
【００４８】
＜官能基（Ａ）の量の測定＞
（１）（Ａ）がアミノ基の場合
実施例１〜９および比較例１〜２で作製した免疫測定用担体を用いて以下の方法により（Ａ）の量を求めた。（Ａ）の量を表１に示した。
免疫測定用担体１０個を試験管にとり、脱イオン水１．０ｍｌを加える。Ｌ８５００形日立高速アミノ酸分析計用のニンヒドリン試薬（Ａ液）７．５ｍｌと緩衝液（Ｂ液）２．５ｍｌ（和光純薬工業（株））を混合した混合液２．０ｍｌを試験管に加えよく混合する。試験管をパラフィルムで蓋をし、沸騰水中で１５分間加熱し、加熱後５分間２０℃の冷水で冷却する。アミノ基とニンヒドリンを反応させて生成するＤＹＤＡ（ジケトヒドリンジリデン・ジケトヒドリンダミン）の５７０ｎｍの吸光度を測定し、ＤＹＤＡの分子吸光係数より免疫測定用担体１個あたりのアミノ基量を求める。
（２）（Ａ）がチオール基の場合
実施例１０〜１２および比較例３〜４で作製した免疫測定用担体を用いて以下の方法により（Ａ）の量を求めた。
免疫測定用担体１０個を試験管にとり、リン酸緩衝液３．０ｍｌを加える。２０±１０ｍｍＨｇの減圧度で気泡を発生しなくなるまで脱気する。ＤＴＮＢ（５,５’-ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））（和光純薬工業（株）製）を４０ｍｇをリン酸緩衝液１０ｍｌに溶解したＤＴＮＢ試薬を２０μｌ加え、混合する。試験管をパラフィルムで蓋をし、２時間振動攪拌する。チオール基にＤＴＮＢを反応させて生成する５−メルカプト-２-ニトロ安息香酸の４１２ｎｍの吸光度を測定し、５−メルカプト-２-ニトロ安息香酸の分子吸光係数より免疫測定用担体１個あたりのチオール基量を求める。
【００４９】
【表１】
2008249534.tif 000002
【００５０】
表１より（Ａ）の量を本発明の範囲にした実施例は、低濃度域の感度が上昇した。また特にスペーサーアームの長さが約１６オングストロームの場合（実施例５）に、比較例１（Ｈ−１）と比べて低濃度域の感度を約２倍以上上昇させることができた。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の免疫測定用担体を用いることで、低濃度域での測定感度を向上させることができる。従って、本発明の免疫測定用担体は、高感度な測定を必要とする臨床検査薬等へ適用でき、高感度な臨床検査が可能になる。