(57)【要約】【課題】有機溶媒中でも高い触媒活性を発現することができ、例えば、医薬品工業、食品工業、化粧品工業、有機化学工業分野等における物質生産に利用可能な有用な触媒を提供する。【解決手段】一般式（Ｉ）：2008308408.tif 000014（式中、ｍ及びｎは同一又は異なっていても良い１〜３０の整数を示し、ｏは、０又は１の整数を示す。）で示されるＮ−グルコノ−グルタミン酸エステル；その中間体化合物;それらの製造方法；一般式（Ｉ）で示されるＮ−グルコノ−グルタミン酸エステルで修飾された界面活性剤修飾酵素。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2008308408.tif 000009
（式中ｍ及びｎは同一又は異なっていても良い１〜３０の整数を示す。）
で示されるＮ−グルコノ−グルタミン酸エステル。
【請求項２】
ｍ及びｎの少なくともひとつが９である、請求項１記載のＮ−グルコノ−グルタミン酸エステル。
【請求項３】
ｍ＝ｎ＝９である、請求項１記載のＮ−グルコノ−グルタミン酸エステル。
【請求項４】
Ｎ−Ｄ−グルコノ−Ｌ−グルタミン酸ジ（１０−ウンデセニル）エステルである、請求項１記載のＮ−グルコノ−グルタミン酸エステル。
【請求項５】
一般式（II）
【化２】
2008308408.tif 000010
（式中、ｍ及びｎは請求項１と同義である。）
で示されるグルタミン酸エステルを、δ−グルコノラクトンと反応させる、請求項１記載の一般式（Ｉ）で示されるＮ−グルコノ−グルタミン酸エステルの製造方法。
【請求項６】
一般式（II）
【化３】
2008308408.tif 000011
（式中、ｍ及びｎは請求項１と同義である。）
で示されるグルタミン酸エステル。
【請求項７】
（Ａ）酸の存在下、グルタミン酸と、式：
【化４】
2008308408.tif 000012
（式中、ｍ及びｎは請求項１と同義である。）
のアルケノールを反応させた後、（Ｂ）塩基で処理する、請求項６記載の一般式（II）
【化５】
2008308408.tif 000013
（式中、ｍ及びｎは前記と同義である。）
で示されるグルタミン酸エステルの製造方法。
【請求項８】
請求項１記載の一般式（Ｉ）で示されるＮ−グルコノ−グルタミン酸エステルで修飾された界面活性剤修飾酵素。
【請求項９】
Ｎ−Ｄ−グルコノ−Ｌ−グルタミン酸ジ（１０−ウンデセニル）エステルで修飾された界面活性剤修飾酵素。
【請求項１０】
酵素がリパーゼである、請求項８又は９記載の界面活性剤修飾酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−グルコノ−グルタミン酸エステル、その製造中間体、それらの製造方法、及びこれを用いた界面活性剤修飾酵素に関する。本発明のＮ−グルコノ−グルタミン酸エステルは、界面活性剤修飾酵素の調製のための界面活性剤などとして使用される。
【背景技術】
【０００２】
精製酵素と界面活性剤とから調製される酵素と界面活性剤の複合体である界面活性剤修飾酵素は、例えば、医薬品工業、食品工業、化粧品工業、有機化学工業分野等における物質生産に利用可能な有用な触媒である。
【０００３】
酵素の多くは、水溶液中で安定であり、また水溶液中でその酵素活性を示す一方、その基質は有機溶媒のみに可溶であることがある。また、基質が水溶液中で不安定である場合もある。このような場合、有機溶媒中で酵素反応を行う必要があり、酵素を、有機溶媒中で実質的に懸濁した状態、即ち不均一触媒として使用せざるを得ない場合が多く、触媒効率が低いという問題がある。そこで、酵素と界面活性剤の複合体である界面活性剤修飾酵素を用いることにより、有機溶媒に可溶化した状態で酵素に触媒作用を発揮させることが行われており、未修飾の酵素を用いる場合よりも高活性が示される。
【０００４】
このような界面活性剤修飾酵素の調製のために用いられる界面活性剤の一つとして、Ｎ−Ｄ−グルコノ−Ｌ−グルタミン酸エステル類が、使用されることは、既に知られている（例えば特許文献１〜６、及び非特許文献１〜３参照）。しかしながら、これらの界面活性剤修飾酵素は、未修飾の酵素よりも高い活性を示すものの、工業的に満足できる程度の活性は得られていなかった。そのため、より高い活性を発現させる界面活性剤修飾酵素の調製のための界面活性剤が望まれていた。
【０００５】
そこで、先に挙げたＮ−Ｄ−グルコノ−Ｌ−グルタミン酸エステルのエステル構造を種々変換することも検討されており、各々の合成界面活性剤から調製した界面活性剤修飾酵素の活性を比較した結果、エステル部分がジオレイルの場合に活性が最も高いことが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。しかし、最適とされる合成界面活性剤を用いた場合においても、既存界面活性剤よりも２倍程度の活性向上が得られるにとどまり、実際の活性値に関しても満足な結果は得られていない。
【０００６】
【特許文献１】特開昭６４−８０２８２号公報
【特許文献２】特開平４−２３９８１号公報
【特許文献３】特開平６−２６９２８５号公報
【特許文献４】特開平９−１１８８４４号公報
【特許文献５】特開平１０−２４８５５８号公報
【特許文献６】特許第３２１８７９４号
【非特許文献１】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０，２２４４（１９９５）
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊａｐａｎ，２６（１），１０９（１９９３）
【非特許文献３】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６，５８３（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願発明者は、従来の界面活性剤修飾酵素よりも高い活性を有する界面活性剤修飾酵素の調製のための、工業的に好適な界面活性剤を提供することを目的として、界面活性剤であるＮ−グルコノ−グルタミン酸エステルのエステル部分の部分構造に着目し鋭意検討を行ったところ、末端に二重結合が存在する直鎖アルケニル基を有するＮ−グルコノ−グルタミン酸エステルを界面活性剤として用いた場合、それを用いて調製される界面活性剤修飾酵素の活性が特異的に著しく向上することを見出して、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、一般式（Ｉ）：
【化６】
2008308408.tif 000002
（式中、ｍ及びｎは同一又は異なっていても良い１〜３０の整数を示す。）
で示されるＮ−グルコノ−グルタミン酸エステルに関する。
【０００９】
本発明は、また一般式（II）
【化７】
2008308408.tif 000003
（式中、ｍ及びｎは前記と同義である。）
で示されるグルタミン酸エステルを、δ−グルコノラクトンと反応させる、上記一般式（Ｉ）で示されるＮ−グルコノ−グルタミン酸エステルの製造方法にも関する。
【００１０】
本発明は、また上記一般式（II）で示される中間体化合物であるグルタミン酸エステルにも関する。
【００１１】
本発明は、さらにまた、（Ａ）酸の存在下、グルタミン酸と、式：
【化８】
2008308408.tif 000004
（式中、ｍ及びｎは前記と同義である。）
のアルケノールを反応させた後、（Ｂ）塩基で処理する、上記一般式（II）で示されるグルタミン酸エステルの製造方法にも関する。
本発明は、更にまた、上記一般式（Ｉ）で示されるＮ−グルコノ−グルタミン酸エステルで修飾された界面活性剤修飾酵素にも関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の一般式（Ｉ）で示される化合物を用いて調製される界面活性剤修飾酵素は、有機溶媒中でも高い触媒活性を発現することができ、例えば、医薬品工業、食品工業、化粧品工業、有機化学工業分野等における物質生産に利用可能な有用な触媒である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明を以下に詳細に説明する。
本発明は、一般式（Ｉ）：
【化９】
2008308408.tif 000005
（式中、ｍ及びｎは同一又は異なっていても良い１〜３０の整数を示す。）
で示されるＮ−グルコノ−グルタミン酸エステルに関する。
【００１４】
上記式中、ｍ及びｎは同一又は異なっていても良い１〜３０の整数であるが、ｍは、好ましくは４〜１８の整数、更に好ましくは６〜１４の整数、ｎは、好ましくは４〜１８の整数、更に好ましくは６〜１４の整数である。更に好ましくは、ｍ及びｎの少なくともひとつが９であり、特に好ましくはｍ＝ｎ＝９である。
【００１５】
また、一般式（Ｉ）の化合物は、不斉炭素を含むが、本発明化合物は、いずれの光学異性体及びそのラセミ体をも包含する。ただし、原料化合物の入手のしやすさなどから、グルタミン酸エステルに由来する部分は好ましくはＬ体であり、グルコン酸に由来する部分は好ましくはＤ体である。
【００１６】
上記一般式（Ｉ）の化合物として、例えばＮ−グルコノ−グルタミン酸ジ（１１−ドデセニル)エステル、Ｎ−グルコノ−グルタミン酸ジ（１０−ウンデセニル）エステル、Ｎ−グルコノ−グルタミン酸ジ（９−デセニル）エステル、Ｎ−グルコノ−グルタミン酸ジ（８−ノネニル）エステルなどをあげることができ、特に好ましくはＮ−Ｄ−グルコノ−Ｌ−グルタミン酸ジ（１０−ウンデセニル）エステルをあげることができる。
【００１７】
本発明は、また、上記一般式（Ｉ）の化合物を合成するための中間体化合物である、一般式（II）
【化１０】
2008308408.tif 000006
（式中、ｍ及びｎは同一又は異なっていても良い１〜３０の整数を示す。）
で示されるグルタミン酸エステル化合物にも関する。
【００１８】
上記式中、ｍ及びｎは、上記式（Ｉ）の化合物におけるのと同義である。
【００１９】
また、一般式（II）の化合物も、不斉炭素を含むが、本発明化合物は、いずれの光学異性体及びそのラセミ体をも包含する。ただし、原料化合物の入手のしやすさなどから、好ましくはＬ体である。
【００２０】
上記一般式（II）の化合物として、例えばグルタミン酸ジ（１１−ドデセニル)エステル、グルタミン酸ジ（１０−ウンデセニル）エステル、グルタミン酸ジ（９−デセニル）エステル、グルタミン酸ジ（８−ノネニル）エステルなどをあげることができ、特に好ましくはＬ−グルタミン酸ジ（１０−ウンデセニル）エステルをあげることができる。
【００２１】
一般式（Ｉ）の化合物は、一般式（II）
【化１１】
2008308408.tif 000007
（式中、ｍ及びｎは前記と同義である。）
で示されるグルタミン酸エステルを、δ−グルコノラクトンと反応させることによって製造することができる。
【００２２】
上記工程において使用するδ−グルコノラクトンは、Ｄ体及びＬ体のいずれであってもよいが、入手のしやすさなどから、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンを好ましく用いることができる。
【００２３】
また、グルタミン酸エステルは、Ｄ体及びＬ体のいずれであってもよいが、入手のしやすさなどから、Ｌ−グルタミン酸エステルを好ましく用いることができる。
【００２４】
δ−グルコノラクトンの量は、グルタミン酸エステル１．０モルに対し、好ましくは１．０〜１０．０モル、更に好ましくは２．０〜３．０モルである。
【００２５】
本発明の上記工程は、有機溶媒の存在下又は非存在下において行われる。使用する溶媒としては、反応を阻害しないものならば特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール等のアルコール類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン化芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化脂肪族炭化水素類；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル等のカルボン酸エステル類；Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類；１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン等の尿素類；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類；ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等のエーテル類が挙げられるが、好ましくはアルコール類、更に好ましくはメタノール、エタノールである。なお、これらの溶媒は、単独又は二種以上を混合して使用しても良い。
【００２６】
前記溶媒の使用量は、グルタミン酸エステル１ｇに対して、好ましくは２〜５０ｍｌ、更に好ましくは５〜３０ｍｌである。
【００２７】
本発明の上記工程は、例えば、グルタミン酸エステル、δ−グルコノラクトン、及び必要であれば溶媒を混合して、撹拌しながら反応させる等の方法によって行われる。
【００２８】
その際の反応温度は、使用する溶媒によっても限定されるが、好ましくは４０〜１００℃、更に好ましくは５０〜８０℃であり、なお、その際の反応圧力は特に制限されない。
【００２９】
本発明の方法によって得られる一般式（Ｉ）で示されるＮ−グルコノ−グルタミン酸エステルは、反応終了後、例えば、濾過、抽出、濃縮、再結晶、晶析、カラムクロマトグラフィー等による一般的な方法によって単離・精製される。
【００３０】
また、上記一般式（II）の化合物は、（Ａ）酸の存在下、グルタミン酸と、式：
【化１２】
2008308408.tif 000008
（式中、ｍ及びｎは前記と同義である。）
のアルケノールを反応させた後、（Ｂ）塩基で処理することによって、製造することができる。
【００３１】
本発明の工程（Ａ）において使用されるグルタミン酸は、Ｄ体及びＬ体のいずれであってもよいが、入手のしやすさなどから、Ｌ−グルタミン酸を好ましく用いることができる。
【００３２】
本発明の工程（Ａ）において使用されるアルケノールの量は、グルタミン酸１モルに対して、好ましくは２．０〜１０．０モル、更に好ましくは２．０〜３．０モルである。
【００３３】
本発明の工程（Ａ）において使用する酸触媒としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸等の無機酸、及びｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸が挙げられるが、好ましくは塩酸、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸、更に好ましくは硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸が使用される。なお、これらの酸は水和物でもよく、また、単独又は二種以上を混合して使用しても良い。
【００３４】
本発明の工程（Ａ）において使用する酸触媒の量は、グルタミン酸に対して、好ましくは０．１〜５．０モル、更に好ましくは０．５〜１．５モルである。
【００３５】
本発明の工程（Ａ）は、溶媒の存在下又は非存在下において行われる。使用する溶媒としては、反応を阻害しないものならば特に限定されず、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン化芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化脂肪族炭化水素類；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル等のカルボン酸エステル類；Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン等のアミド類；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類；ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等のエーテル類が挙げられるが、好ましくは芳香族炭化水素類、更に好ましくはトルエン、キシレンが使用される。なお、これらの溶媒は、単独又は二種以上を混合して使用しても良い。
【００３６】
前記溶媒の使用量は、反応液の均一性や撹拌性により適宜調節するが、グルタミン酸１ｇに対して、好ましくは２〜５０ｍｌ、更に好ましくは５〜３０ｍｌである。
【００３７】
本発明の第一工程（Ａ）は、例えば、グルタミン酸、１０−ウンデセン−１−オールなどのアルケノール、酸触媒、及び必要であれば有機溶媒とを混合して、撹拌しながら反応させる等の方法によって行われる。
【００３８】
その際の反応温度は、使用する溶媒によっても限定されるが、好ましくは４０〜２００℃、更に好ましくは５０〜１５０℃であり、反応圧力は特に制限されない。
【００３９】
本発明の工程（Ｂ）に使用する塩基としては、例えば、トリエチルアミン等の有機塩基；炭酸カリウム、炭酸、水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の無機塩基が挙げられるが、好ましくは、トリエチルアミン、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、更に好ましくは炭酸カリウムが使用される。なお、これらの塩基は、単独又は二種以上を混合して使用しても良い。
【００４０】
本発明の工程（Ｂ）は、例えば、工程（Ａ）反応終了後に塩基あるいは塩基の水溶液を加え、室温にて撹拌させることにより行われる。
【００４１】
本発明の工程（Ｂ）に使用する塩基の量は生成物に対し１当量以上であれば特に限定されない。
【００４２】
本発明の工程によって得られる、一般式（II）で表されるグルタミン酸エステルは、反応終了後、例えば、濾過、抽出、濃縮、再結晶、晶析、カラムクロマトグラフィー等による一般的な方法によって単離・精製された後、次の一般式（Ｉ）で表される化合物の製造工程において使用することができる。
【００４３】
本発明の一般式（Ｉ）で示されるＮ−グルコノ−グルタミン酸エステルで修飾された界面活性剤修飾酵素は、修飾をする酵素の水溶液と、上記一般式（Ｉ）で表されるＮ−グルコノ−グルタミン酸エステルを含む有機溶液とからエマルジョンを形成させ、凍結乾燥することにより容易に調製可能である（例えば非特許文献３参照）。具体的には、溶媒（シクロヘキサンなどの有機溶媒を好ましく用いることができる）に溶解した一般式（Ｉ）で表される界面活性剤溶液を、緩衝液（リン酸緩衝液などを好ましく用いることができる）に溶解した所望の酵素の溶液に加え、ホモジナイザーなどを用いて乳化させ、凍結し、凍結乾燥する方法を用いることができる。酵素：一般式（Ｉ）で表される界面活性剤の割合は、例えば、１：１０〜２００（重量比）、好ましくは１：５０〜１００（重量比）である。
【００４４】
本発明の界面活性剤修飾酵素においては、一般式（Ｉ）で表される界面活性剤によって失活しない任意の酵素を用いることができる。このような酵素としては、加水分解酵素、転移酵素、付加酵素、異性化酵素などの酵素を上げることができる。
【００４５】
加水分解酵素としては、例えば、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ等が挙げられるが、好ましくは酵母又は細菌から単離可能な微生物のリパーゼ、更に好ましくはバルクホルデリア・セパシア（シュードモナス・セパシア）を起源とするリパーゼ（例えば、Amano PS(アマノエンザイム社製)等）及びカンジダ・アンタークティカ（Candida Antarctica）を起源とするリパーゼから選択される少なくとも１種が使用される。なお、これらの加水分解酵素は、天然の形又は固定化酵素として市販品をそのまま使用することができ、単独又は二種以上を混合して使用しても良い。又、市販品に含有している酵素固定化剤を予め除去して使用することもできる。
【００４６】
前記の加水分解酵素は、天然の形又は固定化酵素として市販されているものを、化学的処理又は物理的処理を行った後に使用することが望ましい。
【００４７】
上記のように調製した本発明の界面活性剤修飾酵素を有機溶媒中での酵素反応に用いる場合、界面活性剤修飾酵素を基質及び有機溶媒と混合して反応させるなどの、溶媒に可溶な酵素を用いる場合の通常方法を用いることができる。用いる有機溶媒の種類、使用量、酵素反応の条件などは、用いる酵素、基質の種類によって適宜選択することができる。
【００４８】
また、本発明の界面活性剤修飾酵素は、有機溶媒中、少量の水の存在下においても好ましく用いることができる。有機溶媒中飽和量の水が存在している系において、界面活性剤修飾酵素は有機溶媒に実質的に溶解した状態となり、よって有機溶媒中においてもその酵素活性を効率よく示すことができる。したがって、本発明の界面活性剤修飾酵素は特に、水の存在下で酵素活性を特に高く示す酵素と、水の存在下では不安定な基質との反応を、円滑に進行させることができる。例えば、水の存在下で特定の光学異性体に選択的に作用する酵素を用いて、水には不安定なラセミ体を基質とする場合には、酵素を本発明の界面活性剤修飾酵素として作用させることにより、ラセミ体が水により分解されることなく、特定の光学異性体のみに選択的に酵素による作用を受けさせることが可能である。
【実施例】
【００４９】
次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００５０】
実施例１（Ｎ−Ｄ−グルコノ−Ｌ−グルタミン酸ジ（１０−ウンデセニル）エステルの合成）
トルエン１０００ｍＬに、１０−ウンデセン−１−オール２３１ｇ（１．３６ｍｏｌ）、Ｌ−グルタミン酸１００ｇ（６８０ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸１４２ｇ（７４８ｍｍｏｌ）を加えて撹拌し、反応により生成する水分を除去しながら加熱還流下にて４時間反応させた。反応終了後、室温まで冷却した後、１０ｗｔ％炭酸カリウム水溶液を加え、室温にて１時間撹拌した。この溶液から水層を分液で除去し、有機層を１０ｗｔ％炭酸カリウム水溶液で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。次に得られた濃縮物に、メタノール６００ｍＬ及びＤ−グルコノ−δ−ラクトン１１４ｇ（６４２ｍｍｏｌ）を加え、撹拌しながら加熱還流下で４時間反応させた。反応終了後、撹拌を続けながら０℃まで冷却した。析出物を濾過後、減圧乾燥し、白色結晶としてＮ−Ｄ−グルコノ−Ｌ−グルタミン酸ジ（１０−ウンデセニル）エステル１２８ｇを得た（Ｌ−グルタミン酸基準の単離収率：３１．７％）。
【００５１】
なお、Ｎ−Ｄ−グルコノ−Ｌ−グルタミン酸ジ（１０−ウンデセニル）エステルの物性値は以下の通りであった。
1H-NMR(500MHz,δ(ppm),CDCl3):1.28(s,20H),1.37(tt,4H,J=6.7,6.7Hz),1.61(tt,4H,J=6.8,6.8Hz),2.04(tt,5H,J=6.7,6.7Hz),2.22(m,1H),2.40(m,2H),3.62-3.82(m,3H),4.05(t,2H,J=6.8Hz),4.07-4.17(m,2H),4.36(d,1H,J=2.7Hz),4.57(dt,2H,J=5.5,9.1Hz),4.95(ddt,2H,J=1.7,10.2,1.2Hz),4.99(ddt,2H,J=1.7,17.1,1.7Hz),5.81(ddt,2H,J=6.7,10.2,17.1Hz),7.66(d,1H,J=7.7Hz)
13C-NMR(500MHz,δ(ppm),CDCl3):25.7,25.86,25.91,27.0,28.5,28.6,28.9,29.13,29.14,29.29,29.30,29.42,29.46,29.51,29.55,30.4,32.80,33.81,51.7,63.8,65.1,66.2,70.7,71.9,73.0,74.2,114.12,114.16,139.15,139.23,172.1,172.9,173.1
MS(FAB+)m/z:629
【００５２】
実施例２（界面活性剤修飾酵素の調製）
シクロヘキサン１８ｍＬに、実施例１で調製したＮ−Ｄ−グルコノ−Ｌ−グルタミン酸ジ（１０−ウンデセニル）エステル１１３ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）を室温にて混合した。この混合溶液に、バルクホルデリア・セパシア（シュードモナス・セパシア）を起源とするリパーゼ（Ａｍａｎｏ Ｌｉｐａｓｅ ＰＳ（商品名）；アルドリッチ社製）２．０ｍｇを０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム水溶液と０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム水溶液からｐＨ７に調整）２ｍＬに混合した酵素溶液を加え、ホモジナイザー（１１，０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ）で乳化させた。得られた乳化物を液体窒素下凍結後、凍結乾燥し、白色粉末として界面活性剤修飾酵素１１５ｍｇを得た。
【００５３】
参考例１（２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル（ラセミ体混合物）の合成）
エタノール１０．０ｍＬ（１７１ｍｍｏｌ）に、２−アミノ３−フェニルプロピオン酸（ラセミ体混合物）２．００ｇ（１２．１ｍｍｏｌ）及び濃硫酸１．４２ｇ（１４．５ｍｍｏｌ）とを加え、撹拌しながら６０℃で４時間反応させた。反応終了後、得られた反応液を減圧濃縮した後、６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を加えて、反応液のｐＨを８．５に調整した。次いで、ｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍＬ及び水４ｍＬを加えて抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧濃縮し、無色液体として、２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル（ラセミ体混合物）２．３４ｇを得た（２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸（ラセミ体混合物）基準の単離収率：８９．０％）。
なお、２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル（ラセミ体混合物）の物性値は以下の通りであった。
1H-NMR(500MHz,δ(ppm),CDCl3):1.22(t,3H,J=7.1Hz),2.85(dd,1H,J=7.8,13.5Hz),3.06(dd,1H,J=5.4,13.5Hz),3.69(dd,1H,J=5.4,7.8Hz)、7.17-7.30(m、5H)
13C-NMR(500MHz,δ(ppm),CDCl3):14.2,41.2,55.9,60.8,126.7,128.5,129.3,137.4,175.0
MS(CI、i-C4H10)m/z:194(MH+)
元素分析；Ｃａｌｃｄ：Ｃ，６８．３７％；Ｈ，７．８２％；Ｎ，７．２５％
Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６６．２９％；Ｈ，７．６９％；Ｎ，７．０２％
【００５４】
実施例３（（Ｓ）−２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸、及び（Ｒ）−２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステルの合成）
水を飽和させたｔ−ブチルメチルエーテル１．０ｍＬに、参考例１で調製した２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル（ラセミ体混合物）１００ｍｇ（０．５１７ｍｍｏｌ）、実施例２で調製した界面活性剤修飾酵素５．０ｍｇを加え３０℃で反応させた。２４時間後、反応混合物にアセトン０．５ｍＬを加えて濾過し、（Ｓ）−２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸３７．０ｍｇを得た（２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル（ラセミ体混合物）基準の単離収率＝４３．３％）。
得られた（Ｓ）−２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸を常法により（Ｓ）−２−（２−フロイルアミノ）−３−フェニルプロピオン酸エチルエステルに誘導して、光学活性カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーを使用して光学純度を測定したところ９７．６％ｅｅであった。
【００５５】
また、界面活性剤修飾酵素による加水分解反応を受けずに反応母液に残存していた（Ｒ）−２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステルを常法により（Ｒ）−２−（２−フロイルアミノ）−３−フェニルプロピオン酸エチルエステルに誘導して、光学活性カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーを使用して光学純度を測定したところ９４．５％ｅｅであった。
なお、本反応におけるＥ値は２９９であった。
【００５６】
高速液体クロマトグラフィーの分析条件；（光学活性２−（２−フロイルアミノ）−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル）
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪ−Ｈ（０．４６ｃｍΦ×２５ｃｍ、ダイセル化学工業製）
溶媒：ヘキサン／イソプロピルアルコール（８／２（容量比））
流速  ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度  ：３０℃
波長  ：２２０ｎｍ
次に、得られた（Ｓ）−２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の物性値は以下の通りであった。
1H-NMR(500MHz,δ(ppm),CD3OD):3.12(dd,1H,J=8.0,14.5Hz),3.29(dd,1H,J=5.2,14.5Hz),3.99(dd,1H、J=5.2,8.0Hz),7.32-7.45(m,5H)
13C-NMR(500MHz,δ(ppm),CD3OD):39.2,58.9,130.5,132.0,132.2,138.0,176.8
MS(CI,i-C4H10)m/z:166(MH+)
元素分析；Ｃａｌｃｄ：Ｃ，６５．４４％；Ｈ，６．７１％；Ｎ，８．４８％
Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６１．３６％；Ｈ，６．６９％；Ｎ，７．９４％
また、得られた（Ｒ）−２−アミノ３−フェニルプロピオン酸エチルエステルの物性値は参考例１で示したものと同様であった。
上記の結果は、本発明の界面活性剤修飾酵素を水飽和有機溶媒中で用いたところ、リパーゼが（Ｓ）−２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステルを高度に選択的に加水分解したことを示しており、本発明の界面活性剤修飾酵素を用いることにより、酵素がその触媒活性を高度に発揮することができることが示された。
【００５７】
比較例１（（Ｓ）−２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸、及び（Ｒ）−２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステルの合成）
水を飽和させたｔ−ブチルメチルエーテル１．００ｍＬに、２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル（ラセミ体混合物）１００ｍｇ（０．５１７ｍｍｏｌ）、バルクホルデリア・セパシア（シュードモナス・セパシア）を起源とするリパーゼ（Ａｍａｎｏ Ｌｉｐａｓｅ ＰＳ（商品名）；アルドリッチ社製）２０．０ｍｇを加え、撹拌しながら３０℃で反応させた。１５６時間後、反応混合物にアセトン０．５ｍＬを加えて濾過し、（Ｓ）−２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸３６．１ｍｇ（２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル（ラセミ体混合物）基準の単離収率＝４２．２％）とリパーゼの混合物として得た。
【００５８】
（Ｓ）−２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸を常法により（Ｓ）−２−（２−フロイルアミノ）−３−フェニルプロピオン酸エチルエステルに誘導して、光学活性カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーを使用して光学純度を測定したところ９６．５％ｅｅであった。
（Ｒ）−２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステルを常法により（Ｒ）−２−（２−フロイルアミノ）−３−フェニルプロピオン酸エチルエステルに誘導して、光学活性カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーを使用して光学純度を測定したところ８９．５％ｅｅであった。
なお、本反応におけるＥ値は１７０であった。
【００５９】
高速液体クロマトグラフィーの分析条件；（光学活性２−（２−フロイルアミノ）−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル）
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪ−Ｈ（０．４６ｃｍΦ×２５ｃｍ、ダイセル化学工業製）
溶媒：ヘキサン／イソプロピルアルコール（８／２（容量比））
流速  ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度  ：３０℃
波長  ：２２０ｎｍ
また、（Ｓ）−２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の物性値は実施例１で示したものと同様であった。
（Ｒ）−２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステルの物性値は参考例１で示したものと同様であった。