(57)【要約】【課題】従来知られている尿酸オキシダーゼの阻害剤によって作用が阻害されない尿酸オキシダーゼ、さらに、該尿酸オキシダーゼを含む組成物、該尿酸オキシダーゼを用いた試料中の尿酸測定方法を提供すること。【解決手段】ハロゲン化物イオン、硝酸イオン、又はトリス緩衝液で作用が阻害されず、かつ、キサンチンで作用が阻害されない尿酸オキシダーゼ、その尿酸オキシダーゼの効率よい製造方法、該尿酸オキシダーゼを含む組成物、及び、該尿酸オキシダーゼを用いた試料中の尿酸の測定方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記特性を有する尿酸オキシダーゼ。
（１）酵素作用：酸素と水の存在下、尿酸に作用して、５−ヒドロキシイソウレア、過酸化水素、及び二酸化炭素を生成する作用を有する。
（２）阻害作用：ハロゲン化物イオン、硝酸イオン、及び／又はトリス緩衝液で（１）の作用が阻害されない。かつ、キサンチンで（１）の作用が阻害されない。
（３）至適ｐＨ：６．３〜７．８。
（４）至適温度：５５℃以上。
（５）作用適温の範囲：すくなくとも３０〜６０℃の範囲。
（６）安定性：安定化剤の非存在下、３０℃、１５分間で９８％以上の活性を保持する。
【請求項２】
６１０±２０ｎｍに吸収スペクトルが存在することを特徴とする、請求項１に記載の尿酸オキシダーゼ。
【請求項３】
Lysobacter sp. T-15株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０５６）由来であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の尿酸オキシダーゼ。
【請求項４】
下記（ａ）又は（ｂ）の何れかのアミノ酸配列からなる尿酸オキシダーゼ。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、尿酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
【請求項５】
ラッカーゼ活性を併せ持つ、請求項１から４のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼ。
【請求項６】
ビリルビンオキシダーゼ活性を併せ持つ、請求項１から５のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼ。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼを生産することを特徴とする微生物。
【請求項８】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０５６を有する、Lysobacter sp. T-15株。
【請求項９】
以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、かつ、尿酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１から６のいずれか1項に記載の尿酸オキシダーゼを生成蓄積させ、該培養物から該尿酸オキシダーゼを採取することを特徴とする尿酸オキシダーゼの製造方法。
【請求項１３】
請求項１から６のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼを含有する組成物。
【請求項１４】
請求項１から６のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼ又は請求項１３に記載の組成物を少なくとも含む、尿酸測定キット。
【請求項１５】
キサンチン、硝酸イオン、及びハロゲン化物イオンからなる群から選ばれる１以上の成分を含む試料において、請求項１から６のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼ、請求項１３に記載の組成物、又は請求項１４に記載の尿酸測定キットを用いて尿酸を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハロゲン化物イオン、硝酸イオン、又はトリス緩衝液で作用が阻害されず、かつ、キサンチンで作用が阻害されない尿酸オキシダーゼ、その製造方法、それを含有する組成物、それを用いた尿酸測定キット、及びそれを用いた試料中の尿酸を測定する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
痛風は壮年期以降の男性に多い炎症性関節疾患である。この痛風性関節炎は、尿酸の血中レベルが上昇し（高尿酸血症）、尿酸一ナトリウム一水和物の結晶形成が関節で起こった場合に生じる。また、尿酸は水溶性が低いために過剰に分泌されると（高尿酸尿）腎結石（尿酸結石）を起こす。重度の高尿酸血症及び痛風は腎機能不全にも関連している（非特許文献１〜３）。したがって、尿酸の血中及び尿中レベルの測定はこれらの疾患の鑑別診断に重要であり、現在一般に行われている生化学診断項目のひとつである。尿酸レベル測定試薬には尿酸オキシダーゼ（Ｕｒａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ、ウリカーゼ、Ｕｒｉｃａｓｅ、ＥＣ  １．７．３．３）を用いる酵素法が一般的である（特許文献１〜３）。
【０００３】
また、尿酸オキシダーゼは原核生物や真核生物に広く分布している酵素であるが、ヒトは進化における突然変異の結果、尿酸オキシダーゼを失い高尿酸血症を起こすようになったと考えられている（非特許文献４及び５）。そのため尿酸オキシダーゼは、ヨーロッパにおいて、重度の高尿酸血症を治療するために使用されている（非特許文献６）。
【０００４】
さらに、尿酸オキシダーゼは酸化染毛料やパーマネントウェーブの施術において、毛髪や皮膚の損傷をひき起こさない酸化剤として、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過炭酸ナトリウム、臭素酸ナトリウムなどの代わりにも使用される（特許文献４）。
【０００５】
尿酸オキシダーゼを得る方法としては、例えば、キャンディダ属（特許文献５）、ミクロコッカス属、ブレビバクテリウム属（特許文献６）、ストレプトミセス属（非特許文献７）、エンテロバクター属（特許文献７）、バチルス属（特許文献８及び９）に属する微生物を用いる方法等が知られている。
【０００６】
尿酸オキシダーゼの酵素反応は、現在では式１であることが知られている（非特許文献８）。生成物の５−ヒドロキシイソウレアはいくつかの非酵素的反応でアラントインにまで直ちに加水分解されるため、見かけの尿酸オキシダーゼの作用は、式２である。
尿酸＋Ｏ2＋Ｈ2Ｏ→ ５−ヒドロキシイソウレア＋Ｈ2Ｏ2（式１）
尿酸＋Ｏ2＋２Ｈ2Ｏ→ アラントイン＋Ｈ2Ｏ2＋ＣＯ2（式２）
【０００７】
尿酸オキシダーゼはプリンヌクレオチドの代謝に関与する酵素なので、この代謝経路中の物質であるキサンチンにより従来の尿酸オキシダーゼは強く酵素反応が阻害される（非特許文献９）。また、従来の尿酸オキシダーゼはＫＣｌやＮａＣｌなどによって酵素作用が阻害され、非特許文献１０では、汎用される緩衝液システムであるＴｒｉｓＨＣｌによって酵素反応が阻害される事が報告されている。これらのような従来の尿酸オキシダーゼ阻害剤のために、上記の尿酸レベル測定試薬、高尿酸血症治療薬及び酸化染毛料やパーマネントウェーブ用酸化固定剤組成物において、それらの原材料が制限されたり、効果が負の影響を受けたりする場合がある。例えば、従来の尿酸オキシダーゼを用いた尿酸レベル測定試薬においては、試料中にキサンチンが存在すれば測定値に負誤差が発生する。また、酵素を液状で保存する場合、一般的に酵素の安定性は塩濃度に比例して向上するので、ＫＣｌやＮａＣｌなどの塩を安定化剤として使用することは常法でり、保存液のｐＨを一定にするために緩衝液を用いる事は当然であるが、従来の尿酸オキシダーゼを使用する場合、それらの塩や緩衝剤の使用が制限される場合がある。したがって、ハロゲン化物イオン、硝酸イオン、又はトリス緩衝液で作用が阻害されず、かつ、キサンチンで作用が阻害されない尿酸オキシダーゼが求められていた。
【０００８】
尿酸オキシダーゼはかつて銅含有酵素として報告されたこともあるが（非特許文献１１及び１２）、いくつかのバクテリアや真核生物由来尿酸オキシダーゼの、結晶構造解析などの解析の結果、該酵素は銅含有酵素では無いと考えられるようになった（非特許文献１０，１３、http://br.expasy.org/enzyme/1.7.3.3）。
【０００９】
一方、マルチ銅オキシダーゼはラッカーゼ（ＥＣ  １．１０．３．２）、ビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．３．５）、アスコルビン酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．１０．３．３）、セルロプラスミン（ＥＣ  １．１６．３．１）、またはフェノキサジノンシンターゼ（Ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）などの銅を含有する一群の酸化酵素を指し、基質から電子を取り出し、分子状酸素を４電子還元して水を生成する反応を触媒する酵素である。マルチ銅オキシダーゼの特徴として、１）分子内に酵素活性に必要な４原子の銅を四面体配位構造に固定し、うち３原子の銅が三核銅クラスターを形成する、２）４原子銅の配位に関連するアミノ酸が非常に高く保存されている、３）６１０ｎｍ付近に吸収がある、などが挙げられる（非特許文献１３〜１５）。
【００１０】
そして、マルチ銅オキシダーゼの中で３つのドメインから構成されるマルチ銅オキシダーゼは、ラッカーゼタイプのマルチ銅オキシダーゼと呼ばれ、ラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、及びフェノキサジノンシンターゼなどが挙げられる（非特許文献１３〜１５）。
【００１１】
ラッカーゼは基質特異性の広い酵素として有名であるが、通常ベンゼンジオール（benzenediol）やポリフェノールを酸化する酵素として知られている（http://br.expasy.org/cgi-bin/nicezyme.pl?1.10.3.2）。その広い基質特異性の中で、特にビリルビンに高い基質特異性をもつラッカーゼタイプのマルチ銅オキシダーゼはビリルビンオキシダーゼ、アスコルビン酸に高い基質特異性をもつラッカーゼタイプのマルチ銅オキシダーゼはアスコルビン酸オキシダーゼとよばれる。ところが、現在までに尿酸に高い基質特異性をもつラッカーゼタイプのマルチ銅オキシダーゼは報告されていない。
【００１２】
【非特許文献１】Nephron, 1990, 56(3):317-321, Acute hyperuricemic nephropathy and renal failure after transplantation, Venkataseshan VS, Feingold R, Dikman S, Churg J.
【非特許文献２】Transplantation proceedings, 1992 Aug;24(4), 1391-1392, Cyclosporine-induced hyperuricemia after renal transplant: clinical characteristics and mechanisms, Ahn KJ, Kim YS, Lee HC, Park K, Huh KB.
【非特許文献３】Transplantation proceedings, 1992, Oct;24(5), 1773-1774, Hyperuricemia and gout in renal allograft recipients, Delaney V, Sumrani N, Daskalakis P, Hong JH, Sommer BG.
【非特許文献４】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1989, Dec;86(23):9412-9416, Urate oxidase: primary structure and evolutionary implications, Wu XW, Lee CC, Muzny DM, Caskey CT.
【非特許文献５】Journal of molecular evolution, Two independent mutational events in the loss of urate oxidase during hominoid evolution, 1992, Jan;34(1):78-84, Wu XW, Muzny DM, Lee CC, Caskey CT.
【非特許文献６】The Journal of pediatrics, 1982, Jan;100(1):152-155, Urate-oxidase prophylaxis of uric acid-induced renal damage in childhood leukemia, Masera G, Jankovic M, Zurlo MG, Locasciulli A, Rossi MR, Uderzo C, Recchia M.
【非特許文献７】Agric. Biol. Chem. 33、1282、(1969)
【非特許文献８】Biochemistry. 1997, Apr 22;36(16):4731-4738, Kinetic mechanism and cofactor content of soybean root nodule urate oxidase. Kahn K, Tipton PA.
【非特許文献９】The Journal of biological chemistry, 1953, Oct;204(2):613-621, The inhibition of uricase by xanthine. VAN PILSUM JF.
【非特許文献１０】Biochemistry,  1997, Apr 22;36(16):4731-4738, Kinetic mechanism and cofactor content of soybean root nodule urate oxidase, Kahn K, Tipton PA.
【非特許文献１１】The EMBO journal.1983, 2(12):2333-2339, Nodulin-35: a subunit of specific uricase (uricase II) induced and localized in the uninfected cells of soybean nodules.Bergmann H, Preddie E, Verma DP.
【非特許文献１２】Biochimica et biophysica acta, 1991, Jan 29;1076(2):203-208, Purification and molecular properties of urate oxidase from Chlamydomonas reinhardtii, Alamillo JM, Cardenas J, Pineda M.
【非特許文献１３】Nature structural biology, 1997, Nov;4(11):947-952, Crystal structure of the protein drug urate oxidase-inhibitor complex at 2.05 A resolution, Colloc'h N, el Hajji M, Bachet B, L'Hermite G, Schiltz M, Prange T, Castro B, Mornon JP.
【非特許文献１４】生化学、第７７巻、第２号、１４８−１５３、片岡邦重
【非特許文献１５】Cellular and molecular life sciences, 2005, Sep;62(18):2050-2066, Function and molecular evolution of multicopper blue proteins, Nakamura K, GO N.
【特許文献１】特開平６−７０７９８号公報
【特許文献２】特開２００２−１５９２９９号公報
【特許文献３】特開平９−７０２９９号公報
【特許文献４】特開平８−２１７６５２号公報
【特許文献５】特公昭４２−５１９２号公報
【特許文献６】特公昭４４−１４７８３号公報
【特許文献７】特公昭６０−１９９９０号公報
【特許文献８】特開昭６１−２８０２７２号公報
【特許文献９】特開平２−５３４８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、従来知られている尿酸オキシダーゼの阻害剤によって作用が阻害されない尿酸オキシダーゼ、即ち、ハロゲン化物イオン、硝酸イオン、及びトリス緩衝液で作用が阻害されず、かつ、キサンチンで作用が阻害されない新規な尿酸オキシダーゼを提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、該尿酸オキシダーゼを生産する微生物、該尿酸オキシダーゼをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体、該尿酸オキシダーゼの製造方法、該尿酸オキシダーゼを含む組成物、該尿酸オキシダーゼを用いた尿酸測定キット、並びに該尿酸オキシダーゼを用いた試料中の尿酸の測定方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、Lysobacter sp. T-15株が、ハロゲン化物イオン、硝酸イオン、又はトリス緩衝液で作用が阻害されず、かつ、キサンチンで作用が阻害されない尿酸オキシダーゼ活性をもつタンパク質を生産することを見出し、さらに、該タンパク質が既知の尿酸オキシダーゼとは全く異なる新規な酵素であることを見出した。さらに、本発明者らは、該尿酸オキシダーゼを利用した試料中の尿酸の測定方法、該尿酸オキシダーゼの製造方法を確立して、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下に関する。
【００１５】
＜１＞  下記特性を有する尿酸オキシダーゼ。
（１）酵素作用：酸素と水の存在下、尿酸に作用して、５−ヒドロキシイソウレア、過酸化水素、及び二酸化炭素を生成する作用を有する。
（２）阻害作用：ハロゲン化物イオン、硝酸イオン、及び／又はトリス緩衝液で（１）の作用が阻害されない。かつ、キサンチンで（１）の作用が阻害されない。
（３）至適ｐＨ：６．３〜７．８。
（４）至適温度：５５℃以上。
（５）作用適温の範囲：すくなくとも３０〜６０℃の範囲。
（６）安定性：安定化剤の非存在下、３０℃、１５分間で９８％以上の活性を保持する。
【００１６】
＜２＞  ６１０±２０ｎｍに吸収スペクトルが存在することを特徴とする、＜１＞に記載の尿酸オキシダーゼ。
＜３＞  Lysobacter sp. T-15株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０５６）由来であることを特徴とする、＜１＞又は＜２＞に記載の尿酸オキシダーゼ。
【００１７】
＜４＞  下記（ａ）又は（ｂ）の何れかのアミノ酸配列からなる尿酸オキシダーゼ。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、尿酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
＜５＞  ラッカーゼ活性を併せ持つ、＜１＞から＜４＞のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼ。
＜６＞  ビリルビンオキシダーゼ活性を併せ持つ、＜１＞から＜５＞のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼ。
【００１８】
＜７＞    ＜１＞から＜６＞のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼを生産することを特徴とする微生物。
＜８＞  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０５６を有する、Lysobacter sp. T-15株。
【００１９】
＜９＞  以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、かつ、尿酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
【００２０】
＜１０＞  ＜９＞に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
＜１１＞  ＜１０＞に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
＜１２＞  ＜１１＞に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に＜１＞から＜６＞のいずれか1項に記載の尿酸オキシダーゼを生成蓄積させ、該培養物から該尿酸オキシダーゼを採取することを特徴とする尿酸オキシダーゼの製造方法。
【００２１】
＜１３＞  ＜１＞から＜６＞のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼを含有する組成物。
＜１４＞  ＜１＞から＜６＞のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼ又は＜１３＞に記載の組成物を少なくとも含む、尿酸測定キット。
＜１５＞  キサンチン、硝酸イオン、及びハロゲン化物イオンからなる群から選ばれる１以上の成分を含む試料において、＜１＞から＜６＞のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼ、＜１３＞に記載の組成物、又は＜１４＞に記載の尿酸測定キットを用いて尿酸を測定する方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、従来知られている尿酸オキシダーゼの阻害剤によって阻害されない尿酸オキシダーゼ、即ち、ハロゲン化物イオン、硝酸イオン、又はトリス緩衝液で作用が阻害されず、かつ、キサンチンで作用が阻害されない新規な尿酸オキシダーゼが提供される。本発明の尿酸オキシダーゼを利用することによって、試料中の尿酸を測定することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明について、以下に具体的に説明する。
本発明で使用しうる試料とは、尿酸を含有するものであれば特に限定されないが、尿酸を含有する海水、天然水、飲料、廃液、研究用試料の他、生体試料、例えば、血漿、血清、尿などを挙げることができる。
【００２４】
本発明の尿酸オキシダーゼ活性とは、酵素ハンドブック（朝倉書店、１９８４年）やEnzyme nomenclature detabase（http://ca.expasy.org/enzyme/）などに記載される既知の尿酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．７．３．３）の触媒作用を指し、尿酸をその酸化物に変化させる反応の触媒作用を例示するができる。
【００２５】
本発明のラッカーゼ活性とは、酵素ハンドブックやEnzyme nomenclature detabaseなどに記載される既知のラッカーゼ（ＥＣ １．１０．３．２）の触媒作用を指し、syringaldazineや２'２−ａｚｉｎｏｂｉｓ−（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（以下、ＡＢＴＳということがある）をその酸化物に変化させる反応の触媒作用を例示するができる。
【００２６】
本発明のビリルビンオキシダーゼ活性とは、酵素ハンドブックやEnzyme nomenclature databaseなどに記載される既知のビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ １．３．３．５）の触媒作用を指し、ビリルビンをその酸化物に変化する反応の触媒作用を例示することができる。
【００２７】
本明細書において、単に「ビリルビン」と記載した場合は、直接型ビリルビン、間接型ビリルビン、及び総ビリルビンの全てを含む意味である。
【００２８】
本明細書中に記載するタンパク質濃度は、バイオラッド社のプロテインアッセイキットを用いて使用説明書記載の方法に従って測定し、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）をスタンダードとして算出した。
【００２９】
本発明の実験に使用した試薬類は、特に断らない限り、和光純薬工業社製、国産化学社製、シグマアルドリッチ社製など市販で容易に入手できるものである。また、実験に使用した組換えＤＮＡ実験酵素試薬（制限酵素など）、ベクターＤＮＡ、キット類は特に指摘しない限りタカラバイオ株式会社より購入したものである。
【００３０】
本発明における尿酸オキシダーゼ（以下、本発明の酵素という場合もある）は、少なくともハロゲン化物イオン、硝酸イオン、及び／又はトリス緩衝液で作用が阻害されず、かつ、キサンチンで作用が阻害されないなど、従来知られている尿酸オキシダーゼの阻害剤によって阻害されない尿酸オキシダーゼであればその起源は特に限定されるものではないが、好適には少なくともＣｌ-、Ｂｒ-、硝酸イオン、及び／又はトリス緩衝液で作用が阻害されず、かつ、キサンチンで作用が阻害されないなど既知の尿酸オキシダーゼ阻害剤によって阻害されない尿酸オキシダーゼの生産能を有する微生物の変種や変異株が挙げられ、Lysobacter属やその変異種が好ましく、最適にはLysobacter sp. T-15株、及びLysobacter sp. T-15株の変種や変異株が挙げられる。
【００３１】
Lysobacter sp. T-15株の菌学的性質を示すと次の通りである。
なお、本菌株の同定にあたっては、同定実験は微生物の分類・同定実験法およびMicrobiological Methods（Vol. 3）に準じて行い、実験結果をBergey's Manual of Systematic Bacteriology (Vol. 3)、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology、International Journal of Systematic BacteriologyおよびInternational Journal of Systematic Evolutionary Microbiologyに対比して同定を行った。
【００３２】
＜生育の特徴＞
（１）天平板培地における生育
細菌培養用の培地として汎用されているLB（Luria-Bertani）寒天培地、TSB（Trypticase soy broth）寒天培地にて生育するが、LB培地およびTSB培地を10倍希釈した1/10 LB寒天培地及び1/10 TSB寒天培地、あるいはR2A寒天培地（Difco社製）、NM-1培地（International Journal of Systematic Bacteriology, Microlunatus phosphovorus gen. nov., sp. nov., a new gram-positive polyphosphate-accumulating bacterium isolated from activated sludge, 1995, Vol.45, pp.17-22, Nakamura K, Hiraishi A, Yoshimi Y, Kawarasaki M, Matsuda K, Kamagata Y.参照）等の低栄養寒天培地でより良好に生育する。培養温度30℃、培養pH 7.0、好気条件下で良好に生育する。
【００３３】
（２）液体培地における生育
一様に生育するが、菌体濃度はOD (Optical Density) 600nm で 0.2 〜 0.4以下と低い値を示す。培養温度30℃、培養pH7.0、好気条件下で良好に生育する。
【００３４】
＜形態学的特徴＞
コロニーの形状は円形（直径2〜4 mm）であり、表面が滑らかで縁が丸く粘性がある。コロニーの色は黄色を呈する。また、不透明であり、光沢がある。滑走性は認められない。細胞形態は0.3〜0.5μm x 4〜7μmの長桿菌であり運動性はない。グラム染色試験は陰性を示す。Neisser染色試験は陽性を示す。
【００３５】
＜カタラーゼ／オキシダーゼ試験＞
カタラーゼ試験およびオキシダーゼ試験ともに陽性を示す。
【００３６】
＜化学分類指標の特徴＞
DNAのGC含量（GC mol% [HPLC]）は67%であり、主たるイソプレノイドキノンはユビキノン-8 (UQ-8）である。また、主たる脂肪酸組成は以下の通りである；iso-C15:0  50%, iso-C16:0  16%, C16:1  10%, iso-C17:1  5%, C16:0  5%, anteiso-C15:0  5%, iso-C11:0-3OH  5%, iso- or anteiso-C11:0  4%。
【００３７】
＜16S rRNA遺伝子に基づいた分子系統学的同定＞
Lysobacter sp.T-15株の16S rRNA遺伝子のほぼ全長（1471 bp）の塩基配列を決定し、国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）を対象として相同性検索を実施した。具体的には、米国NCBIが提供するBLAST（http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/）検索を実施した。その結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
2008109867.tif 000002
【００３９】
BLASTによる相同性検索の結果、Lysobacter sp. T-15株はGammaproteobacteria綱に属し、Lysobacter属もしくはThermomonas属に近縁な細菌種であることが明らかとなった。特に、Lysobacter sp. T-15株の16S rRNA遺伝子配列に最も高い相同性（98%）を示した最近縁種はLysobacter brunescensであった。
【００４０】
次に、Lysobacter sp. T-15株、Lysobacter属細菌種およびThermomonas属細菌種の系統関係を明らかにするため、16S rRNA遺伝子の塩基配列に基づいた分子系統樹を作成した（図１）。塩基配列のアライメントならびに近隣接合法による分子系統樹の作成は、ARB program package(http://www.arb-home.de/)を用いて行った。その結果、BLASTによる相同性検索の結果と同様に、Lysobacter sp. T-15株の最近縁種はLysobacter brunescensであり、16S rRNA遺伝子配列の相同性値は97.5%を示した。一方で、Lysobacter sp. T-15株と他の近縁種との相同性値は93.3〜95.9%と比較的低い値を示した。また、Lysobacter sp. T-15株はLysobacter brunescensと分子系統樹上で同一のクラスターを形成した（図１参照）。前述のDNAのGC含量、主たるイソプレノイドキノンおよび脂肪酸組成といった化学分類指標、ならびに種々の生理生化学的諸性質についても、Lysobacter sp. T-15株は多くの点でLysobacter brunescensに類似していたことから、Lysobacter sp. T-15株はLysobacter属に属する細菌種であると考えられる。しかしながら、以下に述べるように、Lysobacter sp. T-15株はいくつかの点で最近縁種Lysobacter brunescensとは異なる性質を示す：
【００４１】
（１）生育温度：Lysobacter brunescensは50℃で生育できるが、Lysobacter sp. T-15株は生育できない
（２）細胞形態：Lysobacter brunescensの細胞は7〜70μmと非常に長いが、Lysobacter sp. T-15株は4〜 7μm程度の長桿菌である。
（３）コロニーの形態：Lysobacter brunescensのコロニーは薄く広がるが、Lysobacter sp. T-15株は2〜4 mm程度の円形のコロニーを形成する。
（４）滑走性：Lysobacter brunescensは滑走性があるが、Lysobacter sp. T-15株では滑走性は認められない。
（５）寒天分解能：Lysobacter brunescensは寒天分解能を示すが、Lysobacter sp. T-15株では認められない。
（６）16S rRNA遺伝子配列：Lysobacter brunescensとLysobacter sp. T-15株の16S rRNA遺伝子の塩基配列は2.5%異なる。
【００４２】
以上の形態学的特徴、生理生化学的諸性質ならびに16S rRNA遺伝子に基づいた分子系統解析の結果から、Lysobacter sp. T-15株はLysobacter属に属するが、種レベルの帰属を推定することはできない新規微生物と考えられる。そこで、本検体Lysobacter sp. T-15株をLysobacter sp. T-15株と命名し、平成１８年１０月６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１  中央第６）に寄託した。受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−２１０５６である。
【００４３】
＜酵素作用＞
本発明の酵素の尿酸を基質として用いたときの触媒反応式は式１である。生成物の５−ヒドロキシイソウレアは、非酵素的にアラントインにまで酸化されるので、見かけ上の反応式は式２である。
【００４４】
本発明の酵素のベンゼンジオールを基質として用いたときの触媒反応式は式３である。
4 benzenediol + O2   →   4 benzosemiquinone + 2Ｈ2Ｏ（式３）
【００４５】
本発明の酵素のビリルビンを基質として用いたときの触媒反応式は式４である。生成物のビリベルジンは、条件によって、ビリルビンオキシダーゼ及び／又は空気酸化によってさらに無色の物質に変換される場合もある。
Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ＋ Ｏ2   →   ｂｉｌｉｖｅｒｄｉｎ ＋ Ｈ2Ｏ（式４）
【００４６】
＜尿酸オキシダーゼ活性測定法１＞
１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０（２５℃））０．０４ｍｌ、５ｍＭの尿酸を０．０２３ｍｌ、及び蒸留水０．９３７ｍｌからなる酵素活性測定溶液１ｍｌを層長１ｃｍの石英セル中で３７℃２分間予備加温した後、４０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０（２５℃））で適当な濃度に希釈した本発明の尿酸オキシダーゼ液２０μｌを加え酵素反応を開始する。反応開始後１分後から２分後までの２９３ｎｍにおける基質の吸光度差を測定する（Ａｓ）。盲検として蒸留水を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する（Ａｂ）。酵素活性１単位（１ユニット）は３７℃で１分間に１マイクロモルの尿酸を変化する酵素量、上記反応液中での尿酸のミリモル吸光係数は１２．６として、Ａｓ−Ａｂより酵素活性を求める。
【００４７】
＜尿酸オキシダーゼ活性測定法２＞
４０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０（２５℃））、１０Ｕ／ｍｌのペルオキシダーゼ、１．５ｍＭの４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、０．０４％のＮ，Ｎ’−ジメチルアニリン、１ｍＭの尿酸からなる酵素活性測定溶液１ｍｌを層長１ｃｍの石英セル中で３７℃２分間予備加温した後、４０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０（２５℃））で適当な濃度に希釈した本発明の尿酸オキシダーゼ液２０μｌを加え酵素反応を開始する。反応開始後１分後から２分後までの５６５ｎｍにおける基質の吸光度差を測定する（Ａｓ）。盲検として蒸留水を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する（Ａｂ）。酵素活性１単位（１ユニット）は３７℃で１分間に１マイクロモルの尿酸を変化する酵素量、上記反応液中でのキノンジイミン色素のミリモル吸光係数は２３．５６として、Ａｓ−Ａｂより酵素活性を求める。本明細書中では特に断らない限り、尿酸オキシダーゼ活性測定法２で尿酸オキシダーゼの活性を測定した。
【００４８】
＜ラッカーゼ活性測定法＞
１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５（２５℃））、５ｍＭのＡＢＴＳからなる酵素活性測定溶液１ｍｌを層長１ｃｍの石英セル中で３７℃２分間予備加温した後、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０（２５℃））で適当な濃度に希釈した本発明の酵素液２０μｌを加え酵素反応を開始する。反応開始後１分後から２分後までの４２０ｎｍにおける基質の吸光度差を測定する（Ａｓ）。盲検として蒸留水を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する（Ａｂ）。酵素活性１単位（１ユニット）は３７℃で１分間に１マイクロモルのＡＢＴＳを変化する酵素量、上記反応液中で増加する４２０ｎｍのミリモル吸光係数は３６として、Ａｓ−Ａｂより酵素活性を求める。
【００４９】
＜ビリルビンオキシダーゼ活性測定法＞
１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））０．１ｍｌ、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））で適当な濃度に希釈した本発明の酵素液０．０２ｍｌ、及び蒸留水０．８８ｍｌからなる酵素活性測定溶液１ｍｌを層長１ｃｍの石英セル中で３７℃１．５分間予備加温した後、基質として国際試薬（株）の干渉チェックＡビリルビンＦ（成分はビリルビン）を０．９％ＮａＣｌで２０ｍｇ／ｄｌに調製したものを２０μｌ添加して酵素反応を開始し、反応開始後１分後から２分後までの４５０ｎｍにおける基質の吸光度差を測定する（Ａｓ）。盲検として蒸留水を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する（Ａｂ）。酵素活性１単位（１ユニット）は３７℃で１分間に１マイクロモルのビリルビンを変化する酵素量、上記反応液中でのビリルビンＦのミリモル吸光係数は３６として、Ａｓ−Ａｂより酵素活性を求める。
【００５０】
＜アスコルビン酸オキシダーゼ活性測定法＞
アスコルビン酸オキシダーゼ活性測定溶液（０．５ｍＭのＬ−アスコルビン酸、０．４５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む９０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５（２５℃）））１ｍｌを層長１ｃｍの石英セル中で３０℃５分間予備加温した後、０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５（２５℃））で適当な濃度に希釈した本発明の酵素液０．１ｍｌを混和して酵素反応を開始し、反応開始後１分後から５分後までの２４５ｎｍにおけるＬ−アスコルビン酸の吸光度差を測定する（Ａｓ）。盲検として蒸留水を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する（Ａｂ）。この酵素液使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位（１ユニット）は３０℃で１分間に１マイクロモルのＬ−アスコルビン酸を変化する酵素量、上記反応液中でのＬ−アスコルビン酸のミリモル吸光係数は１０として、Ａｓ−Ａｂより酵素活性を求める。
【００５１】
＜阻害作用１＞
前記尿酸オキシダーゼ活性測定法２の酵素活性測定溶液中に、表２中に示した濃度でＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＢｒ、Ｎａ2ＳＯ4、ＮａＮＯ3またはＣＨ3ＣＯＯＮａを添加し、本発明の尿酸オキシダーゼとArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）の活性を測定した。無添加の場合を１００％としたときの相対値を表２に示した。表２で明らかなように、Arthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＢｒ、ＮａＮＯ3で濃度依存的に反応が阻害されるにもかかわらず、本発明の尿酸オキシダーゼは同条件では、反応が阻害されない特徴をもつことが分かった。
【００５２】
【表２】
2008109867.tif 000003
【００５３】
＜阻害作用２＞
前記尿酸オキシダーゼ活性測定法２の酵素活性測定溶液中に、１０ｍＭのＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ2ＳＯ4、およびＣＨ3ＣＯＯＮａを添加し、本発明の尿酸オキシダーゼとArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼ、Candida sp.由来尿酸オキシダーゼ（東洋紡社製）、およびBacillus sp.由来尿酸オキシダーゼ（東洋紡社製）の活性を測定した。無添加の場合を１００％としたときの相対値を表３に示した。表３で明らかなように、Arthrobacter globiformis由来、Candida sp.由来、およびBacillus sp.由来尿酸オキシダーゼはＮａＣｌ、ＫＣｌで反応が阻害されるにもかかわらず、本発明の尿酸オキシダーゼは同条件では、反応が阻害されない特徴をもつことが分かった。
【００５４】
【表３】
2008109867.tif 000004
【００５５】
＜阻害作用３＞
従来の尿酸オキシダーゼはキサンチンにより強く酵素反応が阻害されることが報告されている（非特許文献９）。前記尿酸オキシダーゼ活性測定法２の酵素活性測定溶液中に、１ｍＭのキサンチンを添加し、本発明の尿酸オキシダーゼとArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼの活性を測定した。無添加の場合を１００％としたときの相対値を表４に示した。表４から明らかなように、Arthrobacter globiformis由来、Candida sp.由来、およびBacillus sp.由来尿酸オキシダーゼはキサンチンで濃度依存的に反応が阻害されるにもかかわらず、本発明の尿酸オキシダーゼは同条件では、反応が阻害されない特徴をもつことが分かった。
【００５６】
【表４】
2008109867.tif 000005
【００５７】
＜阻害作用４＞
非特許文献１０では、汎用される緩衝液であるＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液によって従来の尿酸オキシダーゼの酵素反応が阻害される事が報告されている。前記尿酸オキシダーゼ活性測定法２の酵素活性測定溶液中のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）濃度を、表５中に示した濃度のＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に変更して本発明の尿酸オキシダーゼとArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼの活性を測定した。無添加の場合を１００％としたときの相対値を表５に示した。表５で明らかなように、Arthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼはＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液の濃度依存的に反応が阻害されるにもかかわらず、本発明の尿酸オキシダーゼは同条件では、反応が阻害されない特徴をもつことが分かった。
【００５８】
【表５】
2008109867.tif 000006
【００５９】
＜阻害作用５＞
本発明の尿酸オキシダーゼとArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼの、ＮａＣｌによる阻害反応のラインウェーバー・バーク逆数プロットによりＫｉ値を算出した。図３が本発明の尿酸オキシダーゼで図３がArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼのＮａＣｌによる阻害反応のラインウェーバー・バーク逆数プロットである。図２及び３中、白丸（○）は０ｍＭ、黒丸（●）は５０ｍＭ、白三角（△）は１００ｍＭ、黒四角（▲）は１５０ｍＭ、白四角（□）は２００ｍＭのＮａＣｌを示す。また、図２及び図３の各勾配をＮａＣｌ濃度に対してプロットした阻害反応のラインウェーバー・バーク逆数プロットの２次プロットを図４に示した。図４中、白丸（○）は本発明の尿酸オキシダーゼ、黒丸（●）はArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼを示す。図４より、本発明の尿酸オキシダーゼは実用上問題にならない程度の非常に弱い阻害をＮａＣｌによって受け、Ｋｉは約２００ｍＭであることが分かる。一方、Arthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼは実用上問題になる程度の強い阻害をＮａＣｌによって受け、Ｋｉは約５．７ｍＭであることが分かった。また、図２より本発明の尿酸オキシダーゼがＮａＣｌによって受ける阻害形式は拮抗形で、図３よりArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼがＮａＣｌによって受ける阻害形式は非拮抗形であり、お互いに異なることが明らかになった。図２及び図３中Vは反応速度を表し、[I]は阻害剤の濃度を表す。
【００６０】
＜至適ｐＨ（尿酸を基質とした場合）＞
本発明の酵素の尿酸に対する至適ｐＨを求めた。至適ｐＨを測定するための測定溶液は緩衝液を変化し、前記尿酸オキシダーゼ活性測定法２と同じ方法で求めた。図５に、緩衝液として、ｐＨ４．２からｐＨ５．２の範囲は酢酸−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．９からｐＨ７．４の範囲はリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．８からｐＨ１０．０の範囲はトリス−塩酸緩衝液を使用した場合の、尿酸に対する最大活性を１００％とした相対値を示した。本発明の酵素の尿酸に対して相対活性が８５％以上となるのはｐＨ６．３から７．８の間であり、至適pHは中性付近であった。
【００６１】
＜至適ｐＨ（ビリルビンを基質とした場合）＞
本発明の酵素の国際試薬（株）の干渉チェックＡビリルビンＣ及びビリルビンＦに対する至適ｐＨを求めた。至適ｐＨを測定するための測定溶液は１Ｍの各緩衝液０．１ｍｌ、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））で適当に希釈した酵素液０．０２ｍｌ、及び蒸留水０．７８ｍｌからなる酵素活性測定溶液１ｍｌを使用して上記ビリルビンオキシダーゼ活性測定法と同じ方法で酵素反応速度を求めた。ｐＨ変化に伴うビリルビンＣ及びビリルビンＦのミリモル吸光係数の変化は考慮しなかった。図６に、緩衝液として、ｐＨ３．３からｐＨ５．５の範囲は酢酸−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．８からｐＨ６．１の範囲はクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０からｐＨ７．４の範囲はリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５からｐＨ９．６の範囲はトリス−塩酸緩衝液を使用した場合のビリルビンＣ（図中、黒丸（●）印）またはビリルビンＦ（図中、白丸（○）印）に対する最大活性を１００％とした相対値を示した。本発明の酵素のビリルビンＣに対する至適ｐＨは５付近、ビリルビンＦに対する至適ｐＨは中性付近であった。
【００６２】
＜至適ｐＨ（ＡＢＴＳを基質とした場合）＞
本発明の酵素のＡＢＴＳに対する至適ｐＨを求めた。至適ｐＨを測定するための測定溶液は緩衝液を変化し、前記ラッカーゼ活性測定法と同じ方法で求めた。図７に、緩衝液として、ｐＨ３．２からｐＨ４．２の範囲は酢酸−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．８からｐＨ６．２の範囲はクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．３からｐＨ６．９の範囲はリン酸カリウム緩衝液を使用した場合の、ＡＢＴＳに対する最大活性を１００％とした相対値を示した。本発明の酵素のＡＢＴＳに対する至適ｐＨは４付近であった。
【００６３】
＜至適温度と作用温度の範囲＞
前記尿酸オキシダーゼ活性測定法１の活性測定法で、反応温度を２５から５８度まで変化して本発明の尿酸オキシダーゼの反応速度を測定した。その結果をアレニウスプロットして図８に示した。図８で明らかなように、本発明の尿酸オキシダーゼの至適温度は少なくとも５５℃以上であり、作用温度の範囲は少なくとも３０℃から６０℃であった。また、図８で明らかなように、アレニウスプロットは二相性を示し、活性化エネルギーは２５から３６．５℃の間は６２ｋＪ／ｍｏｌ、３９．５から５８℃の間は３７ｋＪ／ｍｏｌであった。図中Ｔは絶対温度を示す。
【００６４】
＜安定性＞
本発明の尿酸オキシダーゼを０．０３ｍｇ／ｍｌになるように４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０（２５℃））中に溶解し、各温度で１５分間熱処理した後の尿酸オキシダーゼの残存活性を前記尿酸オキシダーゼ活性測定法２に従って測定した。その結果を図９に示した。図９で明らかなように本発明の尿酸オキシダーゼは、安定化剤の非存在下、３０℃、１５分間で９８％以上の活性を保持する。
【００６５】
＜比活性＞
本発明の酵素の尿酸、ビリルビン、アスコルビン酸またはABTSを基質とした場合の反応速度を測定し、比活性(μmol/mim/mg)を算出して表６にまとめた。また、比較のためにラッカーゼタイプのマルチ銅オキシダーゼの尿酸、ビリルビン、アスコルビン酸、およびABTSを基質とした場合の比活性(μmol/mim/mg)も同時に示した。なお、表６中（ａ）はApplied and Environmental Microbiology, 2006, 72, 972-975、（ｂ）はThe Journal of biological chemistry, 2002, 277, 18849-18859、（ｃ）はBiochemistry, 1999, 38, 3034-3042、（ｄ）はJ. Microbiology, 2005, 43, 555-560から引用した値であり、＊はＶｍａｘであることを示す。表６で明らかなように本発明の酵素は尿酸オキシダーゼ活性、ラッカーゼ活性及びビリルビンオキシダーゼ活性を同時にもち、従来報告のあるラッカーゼタイプのマルチ銅オキシダーゼとは全く異なる特徴をもつ新規な酵素であることがわかった。
【００６６】
【表６】
2008109867.tif 000007
【００６７】
＜分子量＞
Lysobacter sp. T-15を培養し本発明の尿酸オキシダーゼを精製した場合、図１０のSDS−PAGEの写真で示されるように約３１０００と３２０００の分子量と測定され（レーン１の矢印）、Superdex 200 ppで分子量測定した場合、図１１で示されるように約１２０８００±１００００の分子量と推察された。配列番号２で表わされるアミノ酸配列をコードする本発明の尿酸オキシダーゼの遺伝子を含む組換え体プラスミドを含む形質転換体を培養し本発明の尿酸オキシダーゼを精製した場合、図１０のSDS−PAGEの写真で示されるように約６７０００の分子量と測定された（レーン２の矢印）。アミノ酸一次配列からの計算値は６４５１６であった。図中白丸（○）は酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を、黒丸（●）は分子量（ｋＤａ）を示す。
【００６８】
＜等電点＞
本発明の尿酸オキシダーゼの等電点はキャリアーアンホラインを用いた電気泳動法にて約ｐＨ５．２±０．５であった。
【００６９】
＜見かけのＫｍとＶmax＞
本発明の酵素の尿酸、国際試薬（株）の干渉チェックＡビリルビンＦ、アスコルビン酸及びＡＢＴＳに対する見かけのＫｍとＶmaxを測定した。上記の各酵素活性測定法に従い、各基質の酵素活性測定溶液中の濃度を、表７に示した各Ｋｍ値の１／１０倍から１０倍の間で５つ以上の異なる濃度になるように調製して、ラインウェーバー・バーク逆数プロットにより各見かけのＫｍ値とＶmax値を算出した。表７に、比較のためにBacillus subtilis由来ＣｏｔＡ（旭化成ファーマ株式会社製）、Arthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）、Trachderma tsunodae由来ビリルビンオキシダーゼ（宝酒造株式会社製）、Acremonium sp.由来アスコルビン酸オキシダーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）、及びTrametes versicolor由来ラッカーゼ（シグマ社製）の各見かけのＫｍ値とＶmax値もまとめて示した。なお、表中（ａ）はApplied and Environmental Microbiology, 2006, 72, 972-975、（ｂ）はThe Journal of biological chemistry, 2002, 277, 18849-18859、（ｃ）はBiochemistry, 1999, 38, 3034-3042、（ｄ）はJ. Microbiology, 2005, 43, 555-560、（ｄ）はJ. Microbiology, 2005, 43, 555-560から引用した値であり、±は僅かに反応することを示し、―は全く反応しないことを示す。表７で明らかなように、本発明の酵素は尿酸オキシダーゼ活性、ラッカーゼ活性及びビリルビンオキシダーゼ活性を併せもち、従来報告のある尿酸オキシダーゼはもとより、ラッカーゼタイプのマルチ銅オキシダーゼ、すなわち、ビリルビンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、及びラッカーゼとは全く異なる特徴をもつ新規な酵素であることがわかった。
【００７０】
【表７】
2008109867.tif 000008
【００７１】
＜一次配列＞
本発明の配列番号２のアミノ酸番号１から６６１で表される尿酸オキシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端側は、アミノ酸残基またはポリペプチド残基を含む場合であってもよく、そのアミノ酸残基としてはシグナルペプチドまたはＴ７タグ、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、Ｔｒｘタグ、ＣＢＤタグ、ＤｓｂＡタグ、ＧＳＴタグ、Ｎｕｓタグなどが挙げられる。
【００７２】
さらに、本発明の尿酸オキシダーゼを構成するアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸番号１から６６１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列番号２のアミノ酸番号１から６６１のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したものの均等物も含まれる。
【００７３】
本発明の配列番号２のアミノ酸番号１から６６１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、そのＮ末端側及びＣ末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであればよい。
【００７４】
さらに、本発明の尿酸オキシダーゼをコードするＤＮＡは、配列番号２のアミノ酸番号１から６６１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、アミノ酸番号１から６６１中の一部分からなる実質的になるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであってもよく、また酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したものの均等物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであってもよい。
【００７５】
ＤＮＡの供与体である微生物としては、少なくともハロゲン化物イオン、硝酸イオン、又はトリス緩衝液で作用が阻害されず、かつ、キサンチンで作用が阻害されないなど、従来知られている尿酸オキシダーゼの阻害剤によって阻害されない尿酸オキシダーゼを生産する生物であればなんら限定されるものではないが、好ましくはLysobacter sp. T-15及びLysobacter sp. T-15の変種や変異株が挙げられる。
【００７６】
本発明の尿酸オキシダーゼをコードするＤＮＡを組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＥＴ−３ａ、ｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−３２ａなどのｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、枯草菌を宿主とする場合にはｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母特にサッカロマイセス・セルビシエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３などが使用できる。このようなベクターを、本発明の尿酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの切断に使用した制限酵素で生成するＤＮＡ末端と、同じ末端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作成し、本発明の尿酸オキシダーゼをコードするＤＮＡ断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼ酵素により常法に従って結合させて本発明の尿酸オキシダーゼをコードするＤＮＡを目的のベクターに組み込むことができる。
【００７７】
プラスミドを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１ｔｒｘＢ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃｌ、エシェリヒア・コリ ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｏｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｏｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｔｕｎｅｒ、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが利用できる。また、微生物宿主がバチラス属に属する微生物の場合、バチラス・サチリス、バチラス・メガテリウムなど、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンス ＴＫ２４など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエ ＩＮＶＳＣ１などが使用できる。
【００７８】
また、本発明の尿酸オキシダーゼは公知の遺伝子操作手段により、本来の反応を触媒する性質を損なわないペプチドの変異をなしてもよく、このような変異体遺伝子は、本発明の尿酸オキシダーゼの遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は前出の部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡで置換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られる。かくして取得された人工変異された本発明の尿酸オキシダーゼ遺伝子をベクターに挿入して宿主微生物に移入させることによって変異体の本発明の尿酸オキシダーゼを発現させることが可能であり、優れた性質を有する変異体の本発明の尿酸オキシダーゼを製造することも可能である。
【００７９】
また、形質転換微生物により本発明の尿酸オキシダーゼを製造するに当たっては、該形質転換微生物を栄養培地で培養して菌体内または培養液中に本発明の尿酸オキシダーゼを産生せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ及び／または適当な界面活性剤などを添加して本発明の尿酸オキシダーゼの水溶液を濃縮するか、または濃縮することなく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度の良い本発明の尿酸オキシダーゼを得ることができる。
【００８０】
形質転換微生物の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。培養温度は微生物が発育し、本発明の尿酸オキシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくは、１０から４５℃程度、さらに好ましくは２０から３０℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、本発明の尿酸オキシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１２から４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、本発明の尿酸オキシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくはｐＨ６から８程度である。
【００８１】
本発明の尿酸オキシダーゼは主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すれば良い。抽出法を例示すればまず培養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液やトリス−塩酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの菌体破砕手段を適宜選択組み合わせて、粗製の本発明の尿酸オキシダーゼ液または本発明の尿酸オキシダーゼの封入体を得る。
【００８２】
封入体の本発明の尿酸オキシダーゼを可溶化する方法として、ｉｎ ｖｉｖｏでは大腸菌シャペロン遺伝子を共役発現して可溶性度を増大する方法、コールドショックプロテインベクター（宝バイオ社製）を用いる方法、形質転換体のペリプラズム領域に発現する方法などがある。ｉｎ ｖｉｔｒｏではメルカプトエタノール、尿素やグアニジンのような変性剤で封入体を完全にアンフォールディングした後、透析あるいは希釈により変性剤を除去してリフォールディングできる。この際、リフォールディング効率を上げるためにシクロアミロース、シクロデキストリン、界面活性剤、グルタチオン、アルギニンなどを使用しても良い。
【００８３】
粗製の本発明の酵素液から公知のタンパク質や酵素などの単離、精製手段を用いて精製酵素を得る。例えば、粗製の本発明の酵素液にアセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩などによる塩析法などを適用して目的酵素を沈殿させ、回収する。さらに、この沈殿物を必要に応じて透析、等電点沈殿を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いるカラムクロマトグラフィーなどにより精製する。また、これらの方法を適当に組み合わせることにより目的酵素の精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことができる。
【００８４】
これらの方法によって得られる酵素は安定化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、界面活性化剤などを加え、あるいは加えることなく、限外濾過濃縮、凍結乾燥などの方法により、液状または固形の本発明の尿酸オキシダーゼを得ることができ、また、適宜凍結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミンなどを０．５から１０％程度添加してもよい。
【００８５】
本発明により、ハロゲン化物イオン、硝酸イオン、又はトリス緩衝液で作用が阻害されず、かつ、キサンチンで作用が阻害されないなど、従来知られている尿酸オキシダーゼの阻害剤によって阻害されない尿酸オキシダーゼ活性をもつタンパク質を提供することができる。その結果、該酵素を含む組成物において該酵素以外の原料の制限が無くなり、簡便に該酵素を含む組成物や該酵素を用いた試料中の尿酸の酸化方法を提供することができることが見込まれる。
【００８６】
本発明の尿酸オキシダーゼを用いた尿酸測定試薬及び方法とは、本発明の尿酸オキシダーゼの作用により試料中尿酸を酸化する試薬及び方法である。
【００８７】
本発明の酵素を含有するキットとしては、本発明の酵素を含有するキットであれば特に限定されないが、例えば、尿酸測定試薬が挙げられる。これらの試薬やキットは液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品、又は液状品の乾燥品（加熱乾燥及び／又は風乾及び／又は減圧乾燥等による）として提供できる。液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品が好ましく、液状品、液状品の凍結乾燥品がより好ましく、液状品が最も好ましい。別の態様として、液状品の凍結物が好ましい場合もある。さらに別の態様としては、液状品の凍結乾燥が好ましい場合もある。
【００８８】
また、本発明の尿酸オキシダーゼを有効成分として含有する高尿酸血症治療薬、該医薬の高尿酸血症を治療するための使用、該医薬を用いた高尿酸血症の治療方法なども本発明の範囲である。
【００８９】
さらに、本発明の尿酸オキシダーゼを有効成分として含有する酸化剤、該酸化剤の酸化染毛料、パーマネントウェーブのための使用もまた本発明の範囲である。
【実施例】
【００９０】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されることはない。なお、実施例中、常法に従い、と記述した遺伝子操作技術は、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８２，１９８９）や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。
【００９１】
［実施例１］
＜培養＞
Lysobacter sp. T-15は次のような培地で培養した；１Ｌあたり、硫酸アンモニウム  ０．５ｇ、グルタミン酸ナトリウム  ０．５ｇ、コハク酸ナトリウム  ０．５ｇ、酢酸ナトリウム０．５ｇ、酵母エキス０．５ｇ、カザミノ酸  ０．５ｇ、チオ硫酸ナトリウム  ０．５ｇ、ＥＤＴＡ３Ｎａ  ２４．６６ｍｇ、硫酸鉄７水和物  ５．５５ｍｇ、硫酸マグネシウム７水和物  １２３．２５  ｍｇ、塩化カルシウム２水和物  １４．７ｍｇ、塩化ナトリウム  １１７ｍｇ、硫酸マンガン４水和物  ０．５５８ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物  ０．１４４ｍｇ、硝酸コバルト７水和物  ０．１４６ｍｇ、硫酸銅５水和物  ０．１２６ｍｇ、モリブデン酸ナトリウム２水和物  ０．１２１ｍｇ、硼酸  ０．１５５ｍｇ、ニコチン酸  １ｍｇ、チアミン  １ｍｇ、ビオチン  １ｍｇ、パラアミノ安息香酸  ０．５ｍｇ、ビタミンＢ１２  ０．０１ｍｇ、パントテン酸カルシウム  ０．５ｍｇ、ピリドキシン塩酸塩  ０．５ｍｇ、葉酸  ０．５ｍｇ。該培地をオートクレーブ滅菌（１１３℃２０分）してLysobacter sp. T-15を接種し、３０℃で好気的に２４時間培養した。培養終了後、培養物を７，０００ｒｐｍで２０分間遠心し集菌した。
【００９２】
［実施例２］
＜ＤＮＡの抽出＞
実施例１で培養したLysobacter sp. T-15の菌体の一部を５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１５％シュークロースを含む１ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液で３７℃、１０分処理した後、ＳＤＳを最終濃度０．２５％になるよう添加して菌体を溶解した。さらに等量のフェノール／クロロホルム＝１：１混合液を加え、３０分攪拌した後、１２，０００ｒｐｍで１５分遠心分離処理をして水層を回収した。回収した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムＤＮＡを、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ水溶液（ＴＥバッファー）２０ｍｌに溶解し、２０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを２００μｌ加え、３７℃で１時間保温し、混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフェノール／クロロホルム混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムＤＮＡを分離した。この染色体を５０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとクロロホルムの１対１混和液２０ｍｌを加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層２０ｍｌに３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌとエタノール５０ｍｌを加え、撹拌後−７０℃で５分間冷却した後、遠心分離（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体を７５％ エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作によりLysobacter sp. T-15のＤＮＡ標品約１ｍｇを得た。
【００９３】
［実施例３］
＜細胞抽出液の取得方法＞
実施例１で集菌した菌体を、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。
【００９４】
［実施例４］
＜本発明の尿酸オキシダーゼの精製法＞
実施例３で調製した粗酵素液は、そのまま１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＤＥＡＥ  ｓｅｐ．ＦＦ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着させた。１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で充分に洗浄した後、０及び０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度２０％になるように硫酸アンモニウム添加し、２０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ  ｓｅｐ．ＦＦ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着して２０及び０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＧ−２５（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）で脱塩した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ  ｓｅｐ．ＨＰ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着し、０及び０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分を１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＧ−２５で脱塩して１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０及び１００ｍＭの硫酸銅で平衡化したＣｈｅｌａｔｉｎｇ  ｓｅｐ．  ＦＦ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着し、０及び１Ｍのイミダゾールを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＧ−２５で脱塩した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したハイドロキシアパタイト（バイオラッド社製）に吸着し、０及び１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は０．１５Ｍを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｐ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）でゲルろ過した。図１１はこのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｐカラムクロマトグラフィーの結果である。得られた活性画分は図１０のSDS−PAGEの写真で示されるように約３１０００と３２０００の分子量と測定された（レーン１の矢印）。実施例５の精製結果をまとめて表８に示した。得られた酵素液は青色を呈し、その吸収スペクトルは図１２の様であった。
【００９５】
【表８】
2008109867.tif 000009
【００９６】
［実施例５］
＜本発明の酵素の部分アミノ酸配列決定＞
１Ｍウレア ｐＨ８に溶解した実施例４で得た本発明の酵素１ｍｇを、アミノペプチダーゼＬｙｓ−ＣもしくはＡｓｐ−Ｎで断片化した（３７℃１７時間）。断片は定法に従い０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−水系の逆相カラムクロマトグラフィーで分離精製しエドマン分解法にて部分アミノ酸配列を決定した。
【００９７】
［実施例６］
＜放射性ＤＮＡプローブの作製＞
実施例５で決定された本発明酵素の部分アミノ酸配列のうち、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸番号２９８から３０７に相当する配列を元に遺伝子クローニングに使用するオリゴヌクレオチドプローブを設計し、配列番号３で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを外部機関（ベックス社）に合成依託して作製した。完成したオリゴヌクレオチド２００ｎｇをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼバッファー（５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール）、及び７４０ｋＢｑ（キロベクレル）の［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（ＮＥＮ社販売）存在下、８．５ｕのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで３７℃、３０分間反応させ、ラジオアイソトープ32Ｐを取り込ませ放射性オリゴヌクレオチドプローブとした。
【００９８】
［実施例７］
＜本発明の酵素遺伝子含有ＤＮＡフラグメントの検定＞
実施例２で取得したLysobacter sp. T-15の染色体ＤＮＡ（１０μｇ）を各種制限酵素で切断し、１．５％アガロースゲル（タカラバイオ社製アガロースゲルＨ１４、４０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＥＤＴＡ）で１５０Ｖ、１．５時間電気泳動し、常法に従ってサザンブロッティングを行い、アガロースゲルからナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にＤＮＡを移行させた。
【００９９】
このメンブレンを風乾後、ナイロンメンブレン添付のマニュアルに従ってプレハイブリダイゼーションを行い、さらに実施例６で作製した放射性プローブを使用したハイブリダイゼーションを４５℃で１晩行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを５５℃の洗浄液（６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム〔１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ塩化ナトリウム，１５ｍＭクエン酸ナトリウム〕：メンブレン１００平方ｃｍ当り約５０ｍｌ）で１０分洗った後、メンブレンを自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルム（富士写真フィルム社製  Ｎｅｗ  ＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行った。
【０１００】
オートラジオグラフィー終了後、フィルムを現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティブバンドのサイズを観察した。その結果、ＸｈｏＩによる切断により約８ｋｂのＤＮＡフラグメント上に本発明の酵素の遺伝子が含有されることが明らかとなり、ＸｈｏＩで切断した染色体ＤＮＡの８ｋｂフラグメントから遺伝子ライブラリーを作成することとした。
【０１０１】
［実施例８］
＜遺伝子ライブラリーの作成＞
実施例２で取得したLysobacter sp. T-15の染色体ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＸｈｏＩで切断し、常法に従い約８ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離した。このＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＳａｌＩで切断しアルカリフォスファターゼ（以下ＢＡＰと略称）１ｕで切断末端を脱リン酸化した１μｇのｐＵＣ１１９と、ＤＮＡライゲーションキット（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）で連結させた。これを用いて、常法に従ってコンピテント細胞としたエシェリヒア・コリ・ＪＭ１０９（東洋紡績社製）をトランスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ（バクトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／ｌ）１．５％寒天平板培地にて一夜培養し、約２，０００個のアンピシリン耐性コロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。
【０１０２】
［実施例９］
＜本発明の酵素遺伝子含有クローンのスクリーニング＞
実施例８で得られた遺伝子ライブラリーを、ナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にレプリカし、このメンブレンに添付のマニュアルに従って菌体のＤＮＡを固定した。
【０１０３】
このＤＮＡを固定したメンブレンを  このメンブレンを風乾後、ナイロンメンブレン添付のマニュアルに従ってプレハイブリダイゼーションを行い、さらに実施例６で作製した放射性プローブを使用したハイブリダイゼーションを４５℃で１晩行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを５５℃の洗浄液（６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム〔１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ塩化ナトリウム，１５ｍＭクエン酸ナトリウム〕：メンブレン１００平方ｃｍ当り約５０ｍｌ）で１０分洗った後、メンブレンを自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルム（富士写真フィルム社製  Ｎｅｗ  ＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行った。オートラジオグラフィー終了後、フィルムを現像し、ポジティブシグナルを示すコロニーを１個確認した。
【０１０４】
［実施例１０］
＜組み換えプラスミドの抽出と酵素遺伝子塩基配列の決定＞
実施例９で選ばれたポジティブシグナルを示すコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地１．５ｍｌに植菌し３７℃で１６時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを抽出した。このプラスミドに挿入された染色体断片の塩基配列を外部機関（ＢＭＲ社）に依頼して解析したところ、実施例５で決定した本発明の酵素の部分アミノ酸配列をコードする構造遺伝子領域が確認された。この構造遺伝子領域と周辺の塩基配列を決定して本発明の酵素遺伝子の塩基配列とした。本発明の酵素遺伝子の塩基配列と、コードされるアミノ酸配列を配列番号１及び配列番号２にそれぞれ示した。
【０１０５】
［実施例１１］
＜遺伝子組換え酵素発現用プラスミド作製＞
配列番号４のＰＣＲ用プライマー（センス）と配列番号５のＰＣＲ用プライマー（アンチセンス）を合成依託して作製し、ＰＣＲで配列番号１のＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ溶液組成は、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ、１０倍濃縮のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液５μｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム２μｌ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ７．５μｌ、１０μｇ／ｍｌ  実施例２で取得したLysobacter sp. T-15の染色体ＤＮＡ  １０μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌ センスプライマー５μｌ、アンチセンスプライマー５μｌ、蒸留水１４．５μｌからなる。ＰＣＲ条件は、（１）９８℃１５秒、（２）６５℃２０秒、及び（３）７２℃６０秒からなるサイクルを１サイクルとして、これを３０サイクル行った。増幅したＰＣＲ産物はＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断して精製し、これをｐＥＴ−２１ａのＮｄｅＩとＢａｍＨＩの切断部位に挿入し、本発明の尿酸オキシダーゼ遺伝子が連結されたプラスミドを構築した。また、ＰＣＲ産物を定法により末端平滑化し、ｐＵＣ１１８とｐＵＣ１１９のＳｍａＩ切断部位に挿入し、本発明の尿酸オキシダーゼ遺伝子が連結されたプラスミドを構築した。ｐＥＴ−２１ａによって構築されたプラスミドは定法によってエシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。ｐＵＣ１１９によって構築されたプラスミドは定法によってエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９に形質転換した。
【０１０６】
［実施例１２］
＜形質転換大腸菌の培養とその細胞抽出液の調製＞
実施例１１で作成したプラスミドを導入したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）またはエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で培養し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．６になったときに培養温度を２４℃に低下してｌａｃプロモーター誘導剤である１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。その後、２４℃でさらに４時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。
【０１０７】
［実施例１３］
＜形質転換大腸菌からの本発明の尿酸オキシダーゼ精製法＞
実施例１２で調製した粗酵素液は、そのまま１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ  ｓｅｐ．ＢＢ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着させた。１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で充分に洗浄した後、０及び０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度２０％になるように硫酸アンモニウム添加し、２０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ  ｓｅｐ．ＦＦに吸着して２０及び０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＧ−２５で脱塩した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ  ｓｅｐ．  ＨＰに吸着し、０及び０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＧ−２５で脱塩した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したハイドロキシアパタイトに吸着し、０及び１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は０．１５Ｍを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｐでゲルろ過した。得られた活性画分は図１０のSDS-PAGEの写真で示されるように約６７０００の分子量と測定された（レーン２の矢印）。実施例１３の精製結果をまとめて表９に示した。
【０１０８】
【表９】
2008109867.tif 000010
【０１０９】
［実施例１４］
＜本発明の尿酸オキシダーゼを用いた尿酸の定量＞
１）本発明の尿酸オキシダーゼを用いた尿酸測定試薬の調製
本発明の尿酸オキシダーゼを用いた尿酸測定試薬として以下に示した試薬キットを調製した。
【０１１０】
１−１）試薬１
５０ｍＭ リン酸緩衝液  ｐＨ  ７．０
【０１１１】
１−２）試薬２
５０ｍＭ リン酸緩衝液  ｐＨ  ７．０
５Ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（シグマ社製）
０．０３％  ４−ＡＡ
０．０３％  ＤＡＯＳ(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, sodium salt)
１ｍＵ／ｍｌ  実施例１３にて調製した本発明の尿酸オキシダーゼ
【０１１２】
２）検量線の作成
日水製薬（株）のスイトロールＮを用いて０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｇ／ｄｌの検量線用尿酸標準液を調製し、日立７０８０形自動分析機を用いて測定した。日立７０８０形自動分析機の上記試薬の分析パラメーターは、２ポイントエンド測定、サンプル量４μｌ、試薬１は２１０μｌ、試薬２は７０μｌ、測定主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍとした。その結果、図１３に示すように尿酸濃度と吸光度の変化量はＲ2＝０．９９５０で直線状にプロットされ、吸光度変化測定で尿酸の定量が可能であった。
【０１１３】
［実施例１５］
＜本発明の尿酸オキシダーゼを用いた血清中尿酸測定試薬の調製、及び該測定試薬を用いた検体の測定値と、市販の血清中尿酸測定試薬（デタミナーＬ  ＵＡ（協和メデックス株式会社製））を用いた同検体の測定値との比較＞
【０１１４】
１）本発明の尿酸オキシダーゼを用いた血清中尿酸測定試薬の調製
本発明の尿酸オキシダーゼを用いた血清中尿酸測定試薬として以下に示した試薬キットを調製した。
１−１）試薬１
４０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ  ７．０
１０Ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ
０．０３％  ＤＡＯＳ
【０１１５】
１−２）試薬２
４０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ  ７．０
０．０３％  ４−ＡＡ
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ
１０Ｕ／ｍｌ  実施例１３にて調製した本発明の尿酸オキシダーゼ
【０１１６】
２）血清中尿酸の測定
日立７０８０形自動分析機を用いてヒト血清７０検体を上記試薬とデタミナーＬ  ＵＡキットを用いて測定した。日立７０８０形自動分析機の上記試薬の分析パラメーターは、Ｒａｔｅ−Ａ測定（２０−２４ポイント）、サンプル量４μｌ、試薬１は２１０μｌ、試薬２は７０μｌ、測定主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍとした。デタミナーＬ  ＵＡキットは添付文書に従って使用した。測定値はデタミナーＬ  ＵＡキット用のキャリブレータを用いた。測定結果の相関図を図１４に示したように、相関式がＹ＝１．０１Ｘ−０．５５、相関係数がＲ2＝０．９９２２であり、良好な相関が示された。これは本発明の尿酸オキシダーゼを用いた血清中尿酸測定試薬で、ヒト血清中の尿酸を精度良く測定できることを示している。
【０１１７】
［実施例１６］
＜本発明の酵素を用いたビリルビンＦ及びビリルビンＣの定量＞
１）本発明の酵素を用いたビリルビンＦ及びビリルビンＣ測定試薬の調製
本発明の酵素を用いたビリルビンＦ及びビリルビンＣ測定試薬として以下に示した試薬キットを調製した。
【０１１８】
１−１）試薬１
１００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ  ７．２
０．２％  コール酸ナトリウム
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ
【０１１９】
１−２）試薬２
１００ｍＭ リン酸緩衝液  ｐＨ  ７．２
０．０２％  ＴＸ−１００
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ
４Ｕ／ｍｌ  実施例１３にて調製した本発明の酵素
【０１２０】
２）検量線の作成
国際試薬（株）の干渉チェックＡビリルビンＦ及びビリルビンＣを０．９％ＮａＣｌ水で希釈した０、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｇ／ｄｌの検量線用標準液を、日立７０８０形自動分析機を用いて測定した。日立７０８０形自動分析機の上記試薬の分析パラメーターは、２ポイントエンド測定、サンプル量１０μｌ、試薬１は２００μｌ、試薬２は５０μｌ、測定主波長４５０ｎｍ、副波長５４６ｎｍとした。図中黒丸（●）はビリルビンＣ，白丸（○）はビリルビンＦを示す。その結果、図１５に示すようにビリルビンＦ及びビリルビンＣ濃度と吸光度の変化量はそれぞれＲ2＝０．９９９１、Ｒ2＝０．９９９６で直線状にプロットされ、波長４５０ｎｍの吸光度変化測定でビリルビンＦ及びビリルビンＣの定量が可能であった。
【０１２１】
［実施例１７］
＜本発明の酵素を用いた血清中総ビリルビン測定試薬の調製、及び該測定試薬を用いた検体の測定値と、市販の血清中総ビリルビン測定試薬（イアトロＴ−Ｂｉｌキット）を用いた同検体の測定値との比較＞
１）本発明の酵素を用いた血清中総ビリルビン測定試薬の調製
本発明の酵素を用いた血清中総ビリルビン測定試薬として以下に示した試薬キットを調製した。
【０１２２】
１−１）試薬１
１００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ  ７．２
０．２％  コール酸ナトリウム
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ
【０１２３】
１−２）試薬２
１００ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ  ７．２
０．０２％  ＴＸ−１００
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ
４Ｕ／ｍｌ  実施例１３にて調製した本発明の酵素
【０１２４】
２）血清中総ビリルビンの測定
日立７０８０形自動分析機を用いてヒト血清７０検体を上記試薬とイアトロＴ−Ｂｉｌキット（三菱化学イアトロン社製）を用いて測定した。日立７０８０形自動分析機の上記試薬の分析パラメーターは、２ポイントエンド測定（１５−３１ポイント）、サンプル量１０μｌ、試薬１は２００μｌ、試薬２は５０μｌ、測定主波長４５０ｎｍ、副波長５４６ｎｍとした。イアトロＴ−Ｂｉｌキットは添付文書に従って使用した。測定値はイアトロＴ−Ｂｉｌキット用のキャリブレータを用いて総ビリルビン濃度に換算した。測定結果の相関図を図１６に示したように、相関式がＹ＝０．９８Ｘ＋１．３８、相関係数がＲ2＝０．９３０であり、良好な相関が示された。これは本発明の酵素を用いた血清中総ビリルビン測定試薬で、ヒト血清中の総ビリルビンを精度良く測定できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明により、ハロゲン化物イオン、硝酸イオン、又はトリス緩衝液で作用が阻害されず、かつ、キサンチンで作用が阻害されないなど従来知られている尿酸オキシダーゼの阻害剤によって阻害されない尿酸オキシダーゼ、及びその尿酸オキシダーゼの効率よい製造方法が提供される。さらに、該尿酸オキシダーゼを含む組成物、該尿酸オキシダーゼを用いた試料中の尿酸の測定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、本検体Lysobacter sp. T-15株および近縁種の16S rRNA遺伝子配列に基づいた分子系統樹を示す。比較した遺伝子配列の長さは1466 bpであり、近隣接合法により分子系統樹を作成した。
【図２】図２は、本発明の尿酸オキシダーゼのＮａＣｌによる阻害反応のラインウェーバー・バーク逆数プロットを示す。
【図３】図３は、Arthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼのＮａＣｌによる阻害反応のラインウェーバー・バーク逆数プロットを示す。
【図４】図４は、図９及び図１０の各勾配をＮａＣｌ濃度に対してプロットした阻害反応のラインウェーバー・バーク逆数プロットの２次プロットを示す。
【図５】図５は、本発明の酵素の尿酸を基質にした場合の至適ｐＨを示す。
【図６】図６は、本発明の酵素のビリルビンＣとビリルビンＦを基質にした場合の至適ｐＨを示す。
【図７】図７は、本発明の酵素のＡＢＴＳを基質にした場合の至適ｐＨを示す。
【図８】図８は、本発明の尿酸オキシダーゼの反応速度と温度の関係を示す。
【図９】図９は、本発明の尿酸オキシダーゼの熱安定性を示す。
【図１０】図１０は、SDS-PAGEの結果を示す。レーン１、分子量マーカー。レーン２、Lysobacter sp. T-15を培養し精製した本発明の尿酸オキシダーゼ。レーン３、本発明の尿酸オキシダーゼの遺伝子を含む組換え体プラスミド形質転換体を培養し精製した本発明の尿酸オキシダーゼ。
【図１１】図１１は、Lysobacter sp. T-15を培養し精製した本発明の尿酸オキシダーゼのSuperdex 200 ppでのクロマトパーターン（Ｘ第１軸）と分子量マーカーを用いた検量線（Ｘ第２軸）を示す。
【図１２】図１２は、本発明の尿酸オキシダーゼの吸収スペクトルを示す。
【図１３】図１３は、本発明の尿酸オキシダーゼを用いた尿酸測定の検量線を示す。
【図１４】図１４は、本発明の尿酸オキシダーゼを用いた血清中尿酸測定試薬を用いてヒト血清７０検体を測定した測定値と、市販の血清中総ビリルビン測定試薬（デタミナーＬ  ＵＡキット）を用いて同検体を測定したの測定値との相関を示す。
【図１５】図１５は、本発明の酵素を用いたビリルビンＣとビリルビンＦの検量線を示す。
【図１６】図１６は、本発明の酵素を用いた血清中総ビリルビン測定試薬を用いてヒト血清７０検体を測定した測定値と、市販の血清中総ビリルビン測定試薬（イアトロＴ−Ｂｉｌキット）を用いて同検体を測定したの測定値との相関を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１０】
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【配列表】
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