(57)【要約】      （修正有）【課題】アルツハイマー病に関連する変異ＡＤ４タンパク質の提供。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）の変異ＡＤ４タンパク質と特異的に結合する抗体。（ａ）ヒトＡＤ４遺伝子の遺伝子産物である４４８アミノ酸残基からなるタンパク質においてアミノ酸残基１４１がイソロイシンであるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）該タンパク質において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、元のアミノ酸配列位置１４１におけるイソロイシンが、上記欠失により欠失していないアミノ酸配列からなり、かつアルツハイマー病の原因タンパク質であるタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の変異ＡＤ４タンパク質と特異的に結合する抗体であって、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fabフラグメント、Fvフラグメント、及び単鎖抗体からなる群より選択されることを特徴とする抗体。
（ａ）
2008035863.tif 000009
で示されるアミノ酸配列からなり、アミノ酸残基１４１がイソロイシンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、アミノ酸配列（ａ）における元のアミノ酸配列位置１４１におけるイソロイシンが、上記欠失により欠失していないアミノ酸配列からなり、かつアルツハイマー病の原因タンパク質であるタンパク質
【請求項２】
請求項１に記載の抗体を産生することのできるハイブリドーマ。
【請求項３】
患者におけるアルツハイマー病の発症の見込みを減少させるか又は発症を遅延させるための治療剤であって、（１）以下の（ａ）又は（ｂ）の変異ＡＤ４タンパク質をコードする遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを有する発現ベクター、（２）請求項１に記載の変異ＡＤ４タンパク質及び（３）請求項１に記載の変異ＡＤ４タンパク質と特異的に結合する抗体からなる群から選択されることを特徴とする治療剤。
(ａ)
2008035863.tif 000010
で表されるアミノ酸配列であって、アミノ酸残基１４１がイソロイシンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、アミノ酸配列（ａ）における元のアミノ酸配列位置１４１におけるイソロイシンが、上記欠失により欠失していないアミノ酸配列からなり、かつアルツハイマー病の原因タンパク質であるタンパク質
【請求項４】
（１）請求項１に記載の遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクター、（２）前記（１）の発現ベクターを有する宿主細胞、（３）請求項４に記載の変異ＡＤ４タンパク質及び（４）請求項４に記載の変異ＡＤ４タンパク質と特異的に結合する抗体からなる群から選択される治療剤を、薬学的に受容可能なキャリア又は希釈剤とともに含有することを特徴とする薬学的組成物。
【請求項５】
アルツハイマー病に罹る増大した見込みを検出するための診断剤であって、請求項１に記載の変異ＡＤ４タンパク質と特異的に結合するが、野生型ＡＤ４タンパク質とは特異的に結合しない抗体を有することを特徴とする診断剤。
【請求項６】
請求項１に記載の変異ＡＤ４の一部を、薬学的に受容可能なキャリア又は希釈剤と組み合わせて含有することを特徴とするペプチドワクチン。
【請求項７】
図13〜19に示すＡＤ４遺伝子配列を含むことを特徴とする単離されたDNA分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にアルツハイマー病に関連する変異ＡＤ４タンパク質の利用に関する。より詳細には、アルツハイマー病の診断および処置における使用のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（AD）は、1907年に初めて認識された、破壊的な神経変性性の進行性障害である（Alzheimer、Algemeine Zeitschrift fur Psychiatrie 64:146-148，1907）。ADは、高齢者における通常の疾患であり、かつ65歳を超える人々における痴呆の主な原因である。ADの罹患率は、それぞれ、75〜84歳の群については18.7％、そして80歳以上の群については47.2％の高さと見積もられる。
従って、世界中のほとんどの国において大きな罹患集団が存在する。
【０００３】
疾患の臨床的徴候は、代表的にはわずかな短期記憶の問題に始まる。疾患が進行するにつれて、記憶、言語、および方向の困難性は、個人が独立して機能する能力を妨げる点まで悪化する。可変性である他の徴候は、ミオクローヌスおよび発作を含む。記憶欠損の最初の徴候から死までのADの持続時間は、平均10年であるが、６〜８年から20年を超える範囲であり得る。ADは、しばしば、呼吸関連病による死を常にもたらす。
【０００４】
ADにおける病状は、もっぱら中枢神経系（CNS）に制限される。主な特徴は、アミロイド沈着（斑）および神経細線維もつれ（NFT）である。ADにおいては、アミロイドは、CNSの血管系に結合して見出され、そして実質における病巣沈着として見出される。アミロイドの主な分子成分は、Aβペプチドと呼ばれる高度に疎水性のペプチドである。このペプチドは、逆βプリーツシート構造の繊維に凝集してADアミロイドの複屈折性をもたらす。AβはADアミロイドの主要成分であるが、アミロイドに結合する他のタンパク質の部分的なリストは、α-1-アンチキモトリプシン（Abrahamら，Cell 52:487-501，1988）、カテプシンＤ（Cataldoら，Brain Res．513:181-192，1990）、非アミロイド成分タンパク質（Uedaら，Proc．Natl Acad.Sci．USA 90:11282-11286，1993）、アポリポタンパク質Ｅ（apoE）（Nambaら，Brain Res．541:163-166，1991;WisniewskiおよびFrangione，Neurosci．Lett．135:235-238，1992;Strittmatterら，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90:1977-1981，1993）、アポリポタンパク質Ｊ（Choi-Muraら，Acta Neuropathol．83:260-264，1992;McGeerら，Brain Res．579:337-341，1992）、熱ショックタンパク質70（Hamosら，Neurology 41:345-350，1991）、
【０００５】
補体成分（McGeerおよびRogers，Neurology 43:447-449，1992）、α2-マクログロビン（Straussら，Lab.Invest.66:223-230，1992）、インターロイキン-6（Straussら，Lab.Invest.66:223-230，1992）、プロテオグリカン（Snowら，Lab．Invest．58:454-458，1987）、および血清アミロイドＰ（Coriaら，Lab．Invest．58:454-458，1988）を包含する。周囲の多くの斑は、ジストロフィー性神経突起であり、これは、異常な繊維状構造を含む神経末端である。斑は、しばしば、免疫関連タンパク質（例えば、MHCクラスII糖タンパク質であるHLA-DR、HLA-DP、およびHLA-DQならびにMHCクラスＩ糖タンパク質、インターロイキン-2（IL-2）レセプター、およびIL-1）を発現する、星状細胞および活性化微小グリア細胞により取り囲まれる。AD神経病理学の他の主な特徴は、NFTの存在である。これらは、ニューロン細胞体に共に束ねられた異常な線維からなる。「ゴースト」NFTはまた、AD脳においても観察される。これはおそらく、死んだニューロンの位置のマークである。他の神経病理学的な特徴は、顆粒空胞変化（granulovacuolar change）、ニューロンの喪失、グリオーシス、および様々なLewy体の存在を包含する。
AD脳において、この疾患の破壊的プロセスが総量レベルで明らかである。ADの後期には、心室拡張および脳の萎縮が、磁気共鳴画像化により観察され得る。剖検において、広範なグリオーシスおよびニューロンの喪失が観察される。従って、剖検で観察されるアミロイド斑構造およびNFTは、ADの開始事象から遠く離れた、長い疾患プロセスの終了点である可能性が最も高い。また、剖検で残存する細胞は、正常な脳のものとは大いに異なる。ニューロン（これは、おそらく開始事象に関連する）は存在せず、そして他の細胞タイプ（例えば、活性化された微小グリア細胞および星状細胞）は正常な脳において観察されない遺伝子の発現パターンを有する。従って、鍵となるタンパク質および疾患の開始段階における遺伝子を同定するために生化学的方法を用いる試みは、これらの臨床的開始事象を実際に観察するのは不可能であるという事実により妨害される。むしろ、剖検でのAD脳の生化学的切片は、正常な脳と終末ステージの疾患の脳を比較することにより、病原経路を再構築することを試みるので、分子考古学に類似する。
【０００６】
実質的な証拠は、遺伝した遺伝子欠損がADに関与することを示唆している。多数の初期発症家系が記載された（Birdら，Ann．Neurol．23:25-31，1988;Birdら，Ann．Neurol．25:12-25，1989;Cookら，Neurology 29:1402-1412，1979;Feldmanら，Neurology 13:811-824，1960;Goudsmit，J.Neurol．Sci．49:79-，1981;HestonおよびWhite，Behavior Genet．8:315-331，1978;Martinら，Neurology 41:62-68，1991;Neeら，Arch．Neurol．40:203-208，1983;van Bogaeertら，Mschr．Psychait．Neurol．102:249-301，1940;Wheelan，Ann.Hum.Genet．23:300-309，1959）。（初期発症は、本明細書中で65歳より前の発症と定義される。）多数の後期発症AD症例を有する家族もまた記載された（Birdら，Ann．Neurol．25:12-25，1989;HestonおよびWhite，Behavior Genet．8:315-331，1978;Pericak-Vanceら，Exp.Neurol．102:271-279，1988）。さらに、双子研究により、一卵性双子は、二卵性双子よりも、それらのAD表現型においてより一致することが記録された（Neeら，Neurology 37:359-363，1987;[133]）。また、一致する双子の家族は、一致しない双子の家族よりも、ADの二次的症例を有する（Rapoportら，Neurology 41:1549-1553，1991）。
【０００７】
ADの遺伝的解剖は、疾患の複雑さおよびその診断の制限された精密度のために複雑であった。ADは高齢者においては普通であるので、家族における症例のクラスター化は、偶然により生じ得る。これは、同じ家系において共存する遺伝的および非遺伝的な症例での可能な混乱する非対立遺伝子の遺伝ヘテロ接合または病因的ヘテロ接合を示す。さらに、ADの臨床診断は、高齢者において普通な他の発狂疾患と混乱する。
複雑な遺伝的疾患の解明に関連する問題にもかかわらず、２つの原因となるAD遺伝子座および１つの危険度を変える遺伝子が同定された。第21染色体におけるアミロイド前駆体タンパク質（APP）遺伝子における変異は、初期発症（＜65歳）の常染色体優性ADを生じる（Goateら，Nature 349:704，1991）。第14染色体上に近年同定された遺伝子（AD3）における変異もまた、初期発症常染色体優性ADを生じる（Schellenbergら，Science 258:668，1992;Sherringtonら，Nature 375:754-760，1995）。後期発症ADについては、APOE遺伝子が遺伝的改変因子として同定されている（Strittmatterら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:1977，1993;Corderら，Science 261:921，1993;Corderら，Nat.Genet．7:180-184，1994;Benjaminら，Lancet 344:473，1994;Smithら，Lancet 344:473-474，1994）。
【０００８】
ADについての公知の遺伝子座は、すべてのADの症例を説明するわけではない。
例えば、AD症例のおよそ半分である後期発症ADは、APOE ε4対立遺伝子を有さない（Brousseauら，Neurology 342，1994;Kuusistoら，Brit．Med．J．309:636，1994;Tsaiら，Am.J.Hum.Genet．54:643，1994;Liddelら，J.Med.Genent．31:197，1994）。また、ボルガ・ドイツ人（VG）家系（Cookら，Neurology 29:1402，1979;Birdら，Ann.Neurol．23:25，1988;Birdら，Ann.Neurol．25:12，1989;Bird，Am.Hist.Soc.Germ.Russia J．49:1991:Birdら，Heterogeneity of Alzheimer's Disease，F.Bollerら編（Spring-Verlag，Heidelberg，1992）118-129頁）において、ADの高い発症率を有するいくつかの他の家族のように、公知のAD遺伝子座は可能な原因から除外されている（Schellenbergら，Science 258:668，1992;Lannfeltら，Nat.Genet．4:218-219，1993;van Duijnら，Am.J.Hum,Genet．55:714-727，1994;Schellenbergら，Science 241:1507，1988;Schellenbergら，Am.J.Hum.Genet．48:563，1991;Schellenbergら，Am.J.Hum.Genet．49:511-517，1991;Kaminoら，Am.J.Hum.Genet．51:998，1992;Schellenbergら，Am.J.Hum.Genet．53:619，1993;[13];Schellenbergら，Ann.Neurol．31:223，1992;Yuら，Am.J.Hum.Genet．54:631，1994）。新しい遺伝子の同定は、遺伝的決定因子の解明をかなり加えるべきであり、そして診断および処置に対する生化学的および遺伝的アプローチを可能にするべきである。
本発明は、新規な、以前に同定されていないAD遺伝子座、ADの診断および処置のための方法および組成物に関し、そしてさらに、他の関連する利点を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
簡潔には、本発明は、AD4（STM2としても知られる）遺伝子産物をコードする単離された核酸分子を提供する。１つの実施態様において、代表的な核酸分子は、図1Aおよび図1B（本明細書中、以下で図１という）に提供される。他の実施態様において、アルツハイマー病（統計的に有意な様式で）の可能性を増大させる変異AD4遺伝子産物をコードする核酸分子が提供される。このような変異の代表的な例示は、残基141でのアミノ酸置換である。ここで、例えば、イソロイシンはアスパラギンを置換し得る。
【００１０】
本発明の他の局面において、単離された核酸分子が提供される。この核酸分子は、(a)図１に示す単離された核酸分子またはその相補的配列、(b)高ストリンジェントな条件下で(a)の核酸分子と特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子、および(c)AD4遺伝子産物をコードする単離された核酸からなる群より選択される。本明細書中で利用する場合、このような配列に検出可能にハイブリダイズするが、同じ条件下でAD3遺伝子配列に有意にまたは検出可能にハイブリダイズしないならば、核酸分子がAD4遺伝子（または関連する配列）に「特異的に」ハイブリダイズずることを理解するべきである。他の局面において、ゲノム配列（例えば、図13〜19に示す配列）を含む単離されたDNA分子が提供される。
【００１１】
他の局面において、上記の核酸分子の１つに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターが提供される。適切なプロモーターの代表例は、組織特異的プロモーター、ならびにCMV I-Eプロモーター、SV40初期プロモーター、およびMuLV LTRのようなプロモーターを含む。関連する局面において、上記のような核酸分子の発現を指向し得るウイルスベクターが提供される。このようなウイルスベクターの代表的な例は、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターを含む。上記のベクターを有する宿主細胞（例えば、ヒト、イヌ、サル、ラット、またはマウス細胞）もまた提供される。
【００１２】
本発明の他の局面において、AD4遺伝子産物、ならびに12、13、または20アミノ酸よりも大きなAD4ペプチドを含む、単離されたタンパク質またはポリペプチドが提供される。１つの実施態様において、図２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。別の実施態様において、このタンパク質は、アルツハイマー病の可能性を増大させる変異AD4遺伝子産物である。このような変異は、残基141でのアミノ酸置換（例えば、アスパラギンからイソロイシンへの置換）を有する変異を含む。なおさらなる実施態様において、Ｎ末端、中間、またはカルボキシ末端親水性領域に由来するかまたはそこから選択される13〜20アミノ酸から構成されるAD4ペプチドが提供される。
【００１３】
本発明のなお別の局面において、上記のような核酸分子を含むかまたは発現するベクターを患者に投与して、それによりこの患者におけるアルツハイマー病の見込みを低減させるかまたはこれを発症するのを遅らせる工程を包含する、アルツハイマー病を処置または防止する方法が提供される。関連する局面において、上記のタンパク質を患者に投与して、それによりこの患者におけるアルツハイマー病の見込みを低減させるかまたはこれを発症するのを遅らせる工程を包含する、アルツハイマー病を処置または防止する方法を包含する。なお別の関連する局面において、上記のようなAD4タンパク質に特異的な抗体を患者に投与して、それによりこの患者におけるアルツハイマー病の見込みを低減させるか、またはこれを発症するのを遅らせる工程を包含する、アルツハイマー病を処置または防止するための方法が提供される。特定の実施態様において、上記の方法は、インビボ投与により達成され得る。
【００１４】
本発明により、上記のような核酸分子、ベクター、宿主細胞、タンパク質、または抗体を、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤とともに含む薬学的組成物が提供される。
本発明の他の局面において、AD4タンパク質、またはＮ末端、中間、もしくはカルボキシ末端の親水性領域に由来する独特のペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。本明細書中に利用される場合、抗体が検出可能にかつ10-7M以下（例えば、10-8M，10-9Mなど）のＫAで結合するが、AD3タンパク質に対しては検出可能には結合しない（または10-7Mより大きい（例えば、10-6M、10-5Mなど）アフィニティーを有する）場合、抗体は、AD4タンパク質について特異的であることを理解すべきである。このような抗体を産生し得るハイブリドーマもまた提供される。
【００１５】
本発明の他の局面において、高いストリンジェンシーの条件下でAD4遺伝子に特異的にハイブリダイズし得る（上記で規定のように）核酸プローブが提供される。１つの関連する局面において、このようなプローブは、図１に示すヌクレオチド配列またはその相補的配列のすくなくとも一部を含み、このプローブは高いストリンジェンシーの条件下で変異AD4遺伝子に特異的にハイブリダイズし得る。１つの特に好ましい局面において、非常に高いストリンジェンシーの条件下で、アミノ酸残基141がアスパラギンからイソロイシンへ変化する変異AD4遺伝子に特異的にハイブリダイズし得るプローブが提供される。他の関連する局面において、図13〜19のいずれかに示される核酸配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズし得るプローブが提供される。本発明の代表的なプローブは、一般に少なくとも12ヌクレオチド塩基長であるが、これらは、14、16、18塩基以上であり得る。本明細書中に開示される核酸分子のいずれかの全てまたは一部を特異的に増幅し得るプライマー対も提供される。
【００１６】
本発明の他の局面において、萎縮性アルツハイマー病の増大した見込みを有する患者を診断するための方法が提供される。この方法は、(a)患者から核酸を含む生物学的サンプルを得る工程、(b)核酸を、変異AD4遺伝子に特異的にハイブリダイズし得るプローブと、ハイブリダイゼーションを生じさせる条件下で充分な時間インキュベートする工程、および(c)ハイブリダイズしたプローブの存在を検出し、それによりこの患者が萎縮性アルツハイマー病の増大した見込みを有することを決定する工程、を包含する。他の局面において、(a)患者から核酸を含む生物学的サンプルを得る工程、(b)変異AD4遺伝子に関連する選択された核酸配列を増幅する工程、および(c)増幅した核酸配列の存在を検出し、それによりこの患者が萎縮性アルツハイマー病の増大した見込みを有することを決定する工程、を包含する方法が提供される。なお別の局面において、(a)患者由来の生物学的サンプルを、変異AD4タンパク質に特異的に結合する抗体と、このタンパク質へ抗体を結合させる条件下で充分な時間、接触させる工程、および(b)結合した抗体の存在を検出ずる工程、を包含する方法が提供される。適切な生物学的サンプルは、末梢血から、頬のスワブまたは脳組織から得た有核細胞を含む。
【００１７】
別の局面において、変異を含む変異AD4遺伝子産物の一部を、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物と組み合わせて含むペプチドワクチンが提供される。
なお別の局面において、生殖細胞および体細胞がAD4遺伝子を含むトランスジェニック動物が提供される。このAD4遺伝子は、この遺伝子の発現に有効なプロモーターに作動可能に連結されており、この遺伝子はこの動物またはこの動物の祖先に胚の段階で導入されている。１つの実施態様において、動物は、マウス、ラット、またはイヌである。他の実施態様において、AD4遺伝子は、上記のようにベクターから発現される。なお別の実施態様において、AD4遺伝子は変異AD4遺伝子産物をコードする。
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照の際、明らかになる。さらに、特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）をより詳細に記載する種々の参考文献が本明細書中に示され、従ってそれらの全体が参考として援用される。
【００１８】
（定義）
本発明を詳細に説明する前に、特定の用語を説明し、そして本明細書中以下に使用される略語を列記および定義することは、その理解にとって有益であり得る。
「遺伝マーカー」は、ゲノムにおいて識別可能で独特である染色体の任意のセグメントであり、そして集団において多型であり、それにより連鎖したDNA配列、遺伝子、および／または他のマーカーの遺伝についての情報を提供する。
「常染色体優性」は、形質が、非性染色体（常染色体）の１つにコードされ、かつヘテロ接合状態を有する個体について指示する表現型模写について優性であることを意味する。
【００１９】
「LODスコア」は、スコアされる一定の間隔で位置決めされる形質の見込みの遺伝学における標準的な尺度である。計算される確率の対数である。
「ベクター」は、AD4遺伝子、ならびに任意のさらなる目的の配列または遺伝子の発現を指向し得るアセンブリーをいう。ベクターは、目的の遺伝子に作動可能に連結された転写プロモーターエレメントを含まなければならない。ベクターは、デオキシリボ核酸（「DNA」）、リボ核酸（「RNA」）、またはこの２つの組合せ（例えば、DNA-RNAキメラ）のいずれかから構成される。必要に応じて、ベクターは、ポリアデニル化配列、１つ以上の制限部位、ならびに１つ以上の選択マーカー（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）を含み得る。さらに、選択した宿主細胞および用いたベクターに依存して、他の遺伝的エレメント（例えば、複製起点、さらなる核酸制限部位、エンハンサー、転写誘導性を与える配列、および選択マーカー）もまた、本明細書中に記載のベクターに組み込まれる。
【００２０】
略語：
AD、アルツハイマー病；APP、アミロイド前駆体タンパク質遺伝子；APLP1およびAPLP2、アミロイド前駆体様タンパク質；CNS、中枢神経系；DS、ダウン症候群；FAD、家族性AD；HCHWA-D、アミロイド症を有する遺伝性脳出血-ドイツ型；（Ｚmax）、最大LODスコア；NFT、神経細線維もつれ；STRP、短いタンデムな反復多型；Θ、組換え比；VG、ボルガ・ドイツ人；AD3、第14染色体の早期発症FAD遺伝子に与えられた名称；YAC、酵母人工染色体；EST、発現された配列タグ；PCR、ポリメラーゼ連鎖反応；RT-PCR、第１段階で逆転写酵素（RT）を用いてRNAがまずDNAに転写されるPCRプロセス；cDNA、RNA配列からDNA形態へのコピーにより作製された任意のDNA。
上記のように、本発明は、アルツハイマー病の検出および処置のための方法および組成物を提供する。これらの方法および組成物は、第１染色体に位置する遺伝子の発見に基づく。この遺伝子は、変異した場合、アルツハイマー病の確率を増大させる。AD4と称されるこの遺伝子は、第１染色体の1q31-42座に位置することが見出された。
【００２１】
AD4遺伝子の１つの形態は図１に開示されるが、本発明がそのように限定されないことを理解するべきである。特に、本発明の文脈においては、AD4遺伝子についての参照が、実質的に類似している図１に開示される遺伝子の誘導体、アナログ、または対立遺伝子変異体を含むことを理解すべきである。本明細書中で用いる場合、核酸分子は、以下の場合、「実質的に類似している」と考えられる：(a)ヌクレオチド配列が、記載される遺伝子のコード領域に由来し、そして配列の一部または上記の配列の対立遺伝子変異体を含む場合；(b)ヌクレオチド配列が、高いかまたは非常に高いストリンジェンシーの下で本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る場合（Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，1989）；または(c)DNA配列が、遺伝コードの結果として、(a)または(b)において定義されたDNA配列に対して縮重する場合。さらに、ゲノム配列は、コード領域または非翻訳領域のいずれかで、多型のみ、または挿入、欠失などを含み得る。さらに、AD4遺伝子は、相補的配列および非相補的配列の両方を含む（ただし、配列は他の点では本明細書に示す基準を満たす場合）。本発明の文脈において、高いストリンジェンシーは、適切なヌクレオチド配列がAD関連遺伝子由来のヌクレオチド配列および変異ヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズし得るような標準的なハイブリダイゼーション条件（例えば、65℃にて５×SSPE、0.5％SDS、またはその等価条件）を意味する。非常に高いストリンジェンシーは、ヌクレオチド配列が、AD関連遺伝子の単一の対立遺伝子に選択的にハイブリダイズし得ることを意味する。
【００２２】
AD4遺伝子は、ゲノムDNAまたはcDNAから単離され得る。YAC（酵母人工染色体）のようなベクター、λEMBL3、λgt10のようなバクテリオファージベクター、コスミド、またはプラスミドにおいて構築されたゲノムDNAライブラリーは、使用に適切である。バクテリオファージベクター、プラスミドなどにおいて構築されたcDNAライブラリーは、スクリーニングに適切である。このようなライブラリーは、当該分野で公知の方法および技術（Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，1989を参照のこと）を用いて構築され得るか、または市販の供給源（例えば、Clontech）から購入され得る。１つの実施態様において、AD4遺伝子は、ゲノムDNA、cDNA、もしくはライブラリーで実施されたPCRにより、またはゲノムDNAライブラリーもしくはcDNAライブラリーのプローブハイブリダイゼーションにより単離される。PCRのためのプライマーおよびハイブリダイゼーションスクリーニングのためのプローブは、本明細書中に示されるAD4のDNA配列に基づいて設計され得る。AD4遺伝子のDNA配列を図1Aおよび図1Bに示し；そして推定アミノ酸配列を図２に示す。
【００２３】
PCRのためのプライマーは、全長cDNAを単離するために、5'および3'の非翻訳領域における配列に由来するべきである。プライマーは、自己相補性配列を持たないだけでなく、それらの3'末端に相補的な配列を有さないべきである（プライマーダイマー形成を防ぐために）。好ましくは、プライマーは、約50％のGC含量を有し、そして制限部位を有する。プライマーは、cDNAにアニールし、そしてゲル電気泳動および染色により容易に可視化される産物を得るに充分なPCRサイクルが行われる。増幅されたフラグメントは精製され、そしてベクター（例えば、λgt10またはpBS(M13＋)）に挿入され、そして増幅される。ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーのスクリーニングに適切なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に提供される配列に基づいて設計され得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、20から30塩基長である。このようなオリゴヌクレオチドは、自動化合成により合成され得る。オリゴヌクレオチドは、レポーター分子（例えば、放射性核種（例えば、32Ｐ）またはビオチン）を用いて5'末端で都合よく標識され得る。ライブラリーは、ベクターに応じて、コロニーまたはファージとしてプレートされ、そして組換えDNAはナイロンメンブレンまたはニトロセルロースメンブレンに転写され得る。変性、中和、およびDNAのメンブレンへの固定に続いて、メンブレンを標識されたプローブとハイブリダイズする。メンブレンを洗浄し、そしてレポーター分子を検出する。ハイブリダイズするコロニーまたはファージを、単離および増殖する。候補クローンまたはPCR増幅したフラグメントは、任意の種々の手段によりAD4 DNAを含むように確証され得る。例えば、候補クローンは、第２のオーバーラップしないプローブとハイブリダイズされ得るか、またはDNA配列分析に供され得る。これらにおいて、本発明における使用に適切であるAD4遺伝子を含むクローンが単離される。
【００２４】
本明細書中に記載される核酸分子によりコードされるタンパク質の構造は、一次翻訳産物から、例えば、P/C GeneまたはIntelligenetics Suite（Intelligenetics，Mountain View，Calif.）の疎水性プロット関数を用いて、またはKyteおよびDoolittle（J.Mol.Biol．157:105-132，1982）により記載される方法に従って推定され得る。このような構造の１つは図４に示される。図４は、AD4遺伝子産物のハイドロパシープロットである。この図から明らかなように、このプロットは、細胞外ドメイン、３つの細胞外ループドメイン、３つの細胞内ドメイン、７つの膜貫通領域、および細胞内ドメインを有するタンパク質を示す。
【００２５】
本発明のAD4タンパク質は、酸性もしくは塩基性の塩の形態、または中性の形態であり得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元により改変され得る。さらに、種々の置換、欠失、または付加が、アミノ酸または核酸の配列に対してなされ得る。この正味の効果は、変異型または野生型のタンパク質の生物学的活性を保持するか、またはさらに増強もしくは減少することである。さらに、遺伝コードの縮重により、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列において著しい変化が存在し得る。
本明細書中に開示されるAD4タンパク質の他の誘導体は、他のタンパク質またはポリペプチドを伴うタンパク質の結合体を含む。これは、例えば、Ｎ末端またはＣ末端の融合タンパク質の合成により達成され得る。これは、AD4タンパク質の精製または同定を容易にするために添加され得る（米国特許第4,851,341号を参照のこと、Hoppら，Bio/Technology 6:1204，1988も参照のこと）。あるいは、AD4-βガラクトシダーゼまたはAD4-ルシフェラーゼのような融合タンパク質は、AD4タンパク質の同定、発現、および分析を補助するために構築され得る。
【００２６】
本発明のAD4タンパク質は、例えば、実施例５に記載される技術を含む広範囲の種々の技術を用いて構築され得る。さらに、変異は、天然の配列のフラグメントへの連結を可能にする制限部位により隣接する、変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより特定の座で導入され得る。連結後、得られる再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。
あるいは、オリゴヌクレオチド部位特異的（またはセグメント特異的）変異誘発手順は、必要とされる置換、欠失、または挿入によって変化した特定のコドンを有する、変化した遺伝子を提供するために用いられ得る。上記の変化を作製するための代表的な方法は、Walderら（Gene 42:133，1986）；Bauerら（Gene 37:73，1985）；Craik（BioTechniques，1985年１月，12-19）；Smithら（Genetic Engineering:Principles and Methods，Plenum Press，1981）；およびSambrookら（前出）に開示される。AD4タンパク質の欠失誘導体または短縮誘導体（例えば、可溶性細胞外部分）もまた、所望の欠失に隣接する便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することにより構築され得る。制限処理に続いて、突出がフィルインされ得、そしてDNAが再連結される。上記の変化を作製する代表的な方法は、Sambrookら（Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）に開示される。
【００２７】
本発明の核酸分子において作製される変異は、好ましくはコード配列のリーディングフレームを保持する。さらに、変異は、好ましくは、ハイブリダイズして、mRNAの翻訳に有害に作用する２次mRNA構造（例えば、ループまたはヘアピン）を生じ得る相補的領域を作製しない。変異部位が予め決定され得るが、変異の性質自体が予め決定される必要はない。例えば、所定の部位で変異の最適な特徴を選択するために、ランダムな変異誘発が標的コドンで行われ得、そして発現した変異体は表われる生物学的活性についてスクリーニングされる。あるいは、変異は、天然の配列のフラグメントへの連結を可能にする制限部位により隣接する、変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより特定の座に導入され得る。連結に続いて、得られる再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。
【００２８】
AD4タンパク質はまた、PCR変異誘発、化学的変異誘発（DrinkwaterおよびKlinedinst，PNAS 83:3402-3406，1986）の技術を利用して、強制的なヌクレオチドの誤った取り込み（例えば、LiaoおよびWise Gene 88:107-111，1990）により、またはランダムに変異誘発したオリゴヌクレオチドの使用（Horwitzら，Genome 3:112-117，1989）により構築され得る。アルツハイマー病タンパク質を構築するために特に好ましい方法は、以下の実施例により詳細に示される。
タンパク質は、他の方法の中でも、適切な宿主およびベクター系を培養することにより本発明の組換え翻訳産物を産生することにより単離され得る。次いで、このような細胞株由来の上清、またはタンパク質が上清中に排出されない場合のタンパク質封入体もしくは細胞全体は、所望のタンパク質を単離するために種々の精製手順により処理され得る。例えば、上清は、まず市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニット）を用いて濃縮され得る。濃縮に続いて、濃縮物は、例えば、適切な支持体に結合した抗タンパク質抗体のような、適切な精製マトリックスに適用され得る。あるいは、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂は、タンパク質を精製するために用いられ得る。さらにあるいは、１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）工程が、タンパク質をさらに精製するために用いられ得る。本発明のタンパク質を単離する他の方法は、当業者には周知である。
【００２９】
タンパク質は、本発明の文脈においては、他の（所望でない）タンパク質がSDS-PAGE分析、その後のクマシーブルー染色により検出されなければ、「単離された」とみなされる。他の実施態様において、所望のタンパク質は、他の（所望でない）タンパク質が、SDS-PAGE分析、その後の銀染色により検出されないように単離され得る。
本発明はまた、上記の遺伝子を発現し得るベクターを含む宿主細胞を培養することにより、上記の遺伝子の操作および発現を提供する。このようなベクターまたはベクター構築物は、AD4タンパク質をコードする、合成核酸分子またはcDNAに由来する核酸分子のいずれかを含む。この核酸分子は、適切な転写または翻訳の調節エレメントに作動可能に連結される。適切な調節エレメントは、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、昆虫、または植物の遺伝子を含む、種々の供給源に由来し得る。適切な調節エレメントの選択は、選択される宿主細胞に依存し、そして当業者により容易に達成され得る。調節エレメントの例は、以下を包含する：転写プロモーターおよびエンハンサー、またはRNAポリメラーゼ結合配列、転写ターミネーター、および転写開始シグナルを含むリボゾーム結合配列。
【００３０】
上記のAD4タンパク質のいずれかをコードする核酸分子は、広範囲の種々の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞により容易に発現され得る。宿主細胞は、細菌、哺乳動物、酵母もしくは他の真菌類、ウイルス、昆虫、または植物細胞を包含する。外来DNAを発現するためにこのような細胞を形質転換またはトランスフェクトするための方法は当該分野で周知である（例えば、Itakuraら，米国特許第4,704,362号；Hinnenら，Proc.Natl．Acad．Sci．USA 75:1929-1933，1978；Murrayら，米国特許第4,801,542号；Upshallら，米国特許第4,935,349号；Hagenら，米国特許第4,784,950号；Axelら，米国特許第4,399,216号；Goeddelら，米国特許第4,766,075号；およびSambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989を参照のこと;植物細胞については、CzakoおよびMarton，Plant Physiol．104:1067-1071，1994;およびPaszkowskiら，Biotech．24:387-392，1992を参照のこと）。
【００３１】
本発明を実施するに適切な細菌宿主細胞は、E.coll、B.subtilis，Salmonellatyphimurium、およびPseudomonas、streptomyces、およびStaphylococcus属内の種々の種、ならびに当業者に周知の多くの他の細菌種を包含する。細菌宿主細胞の代表例は、DH5α（Stratagene，Lajolla，California）を包含する。
細菌発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞において機能するプロモーター、１つ以上の選択可能な表現的マーカー、および細菌の複製起点を含む。代表的なプロモーターは、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースのプロモーター系(Changら，Nature 275:615，1978を参照のこと）、T7 RNAポリメラーゼプロモーター（Studierら，Meth.Enzymol．185:60-89，1990）、λプロモーター（Elvinら、Gene 87:123-126、1990）、trpプロモーター（NicholsおよびYanofsky，Meth．in Enzymology 101:155，1983）およびtacプロモーター（Rusellら，Gene 20:231，1982）を包含する。代表的な選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子のような、種々の抗生物質耐性マーカーを包含する。宿主細胞を形質転換するために適切な多くのプラスミドは当該分野で周知である。プラスミドは、特に、pBR322（Bollvarら，Gene 2:95，1977を参照のこと）pUCプラスミドであるpUC18、pUC19、pUC118、pUC119（Messing，Meth．in Enzymology 101:20-77，1983ならびにVieiraおよびMessing，Gene 19:259-268，1982を参照のこと）、ならびにpNH8A、pNH16a、pNH18a、およびBluescript M13（Stratagene，La Jolla，Calif.）を包含する。
【００３２】
本発明を実施するために適切な酵母および真菌の宿主細胞は、特に、Saccharomyces pombe、Saccharomyces cerevisiae、Pichia属またはKluyveromyces属、およびAspergillus属の種々の種（McKnightら，米国特許第4,935,349号）を包含する。酵母および真菌に適切な発現ベクターは、特に、酵母についてはYCp50（ATCC No．37419）、およびamdSクローニングベクターpV3（Turnbull，Bio/Technology 7:169，1989）、YRp7（Struhlら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76:1035-1039，1978）、YEp13（Broachら，Gene 8:121-133，1979）、pJDB249およびpJDB219（Beggs，Nature 275:104-108，1978）ならびにそれらの誘導体を包含する。
酵母における使用のために適切なプロモーターは、酵母解糖遺伝子（Hitzemanら，J.Biol.Chem．255:12073-12080，1980;AlberおよびKawasaki，J.Mol.Appl.Genet．1:419-434．1982）またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Youngら，Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals，Hollaenderら編，355頁，Plenum，New York，1982;Ammerer，Meth．Enzymol．101:192-201，1983）由来のプロモーターを包含する。真菌ベクターのために有用なプロモーターの例は、adh3プロモーター（McKnightら，EMBO J．4:2093-2099，1985）のようなAspergillus nidulasの解糖遺伝子に由来するプロモーターを包含する。発現ユニットはまた、転写ターミネーターを包含する。適切なターミネーターの例は、adh3ターミネーター（McKnightら，同書，1985）である。
【００３３】
細菌ベクターについてのように、酵母ベクターは一般に、選択マーカーを包含する。この選択マーカーは、形質転換体が選択されるのを可能にするために表現型アッセイが存在する優性形質を示す多くの遺伝子の１つであり得る。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を相補する選択マーカーであるか、抗生物質耐性を提供するか、または細胞が特定の炭素源を利用するのを可能にし、そしてleu2（Broachら，同書）、ura3（Botsteinら，Gene 8:17，1979）、またはhis3（Struhlら，同書）を包含する。別の適切な選択マーカーは、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を与えるcat遺伝子である。
真菌を形質転換するための技術は、文献において周知であり、そして例えば、Beggs（同書）、Hinnenら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75:1929-1933，1978）、Yeltonら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:1740-1747，1984）、およびRussell（Nature 301:167-169，1983）により記載されている。宿主細胞の遺伝型は、発現ベクター上に存在する選択マーカーにより相補される遺伝的欠損を含む。特定の宿主および選択マーカーの選択は、充分、当業者のレベル内である。
【００３４】
酵母の形質転換のためのプロトコルはまた、当業者に周知である。例えば、形質転換は、DNAと一緒に酵母のスフェロプラストの調製（Hinnenら，PNAS USA 75:1929，1978を参照のこと）またはLiClのようなアルカリ塩での処理（Itohら，J.Bacteriology 153:163，1983）のいずれかにより容易に達成され得る。真菌の形質転換は、Cullenら（Bio/Technology 5:369，1987）により記載されるポリエチレングリコールを用いて実施され得る。
ウイルスベクターは、上記のアルツハイマー病タンパク質をコードする、単離された核酸分子の発現を指向するプロモーターを含むウイルスベクターを包含する。広範囲の種々のプロモーターは、本発明の文脈において利用され得る。このようなプロモーターは、例えば、MoMLV LTR、RSV LTR、Friend MuLV LTR、アデノウイルスプロモーター（Ohnoら，Science 265:781-784，1994）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのプロモーター／エンハンサー、後期パルボウイルスプロモーター（Koeringら，Hum．Gene Therap．5:457-463，1994）、ヘルペスTKプロモーター、SV40プロモーター、メタロチオネインIIa遺伝子のエンハンサー／プロモーター、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター、およびサイトメガロウイルス即時後期プロモーターのようなプロモーターを包含する。本発明の特に好ましい実施態様においては、プロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、WO 91/02805;EP 0,415,731;およびWO 90/07936を参照のこと）である。適切な組織特異的プロモーターの代表例は、神経のエノラーゼプロモーター、血小板由来成長因子βプロモーター、骨形態形成タンパク質プロモーター、ヒトα-キメリンプロモーター、シナプシンＩプロモーター、およびシナプシンIIプロモーターを包含する。上記のプロモーターに加えて、他のウイルス特異的プロモーター（例えば、レトロウイルスプロモーター（上記のプロモーター、およびHIVプロモーターのようなプロモーターを含む））、肝炎、ヘルペス（例えば、EBV）、および細菌、真菌、または寄生虫（例えば、マラリア）に特異的なプロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫に感染した特定の細胞または組織を標的化するために利用され得る。
【００３５】
従って、本発明のAD4タンパク質は、例えば、ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第5,288,641号）、アデノウイルスベクター（例えば、WO 94/26914，WO 93/9191；Kollsら，PNAS 91(1):215-219，1994;Kass-Eislerら，PNAS 90(24):11498-502，1993;Guzmanら，Circulation 88(6):2838-48，1993;Guzmanら，Cir．Res．73(6):1202-1207，1993;Zabnerら，Cell 75(2):207-216，1993;Liら，Hum Gene Ther．4(4):403-409，1993;Caillaudら，Eur．J．Neurosci．5(10):1287-1291，1993;Vincentら，Nat.Genet．5(2):130-134，1993;Jaffeら，Nat.Gellet．1(5):372-378，1992;およびLevreroら，Gene 101(2):195-202，1991）、アデノ随伴ウイルスベクター（WO 95/13365;Flotteら，PNAS 90(22):10613-10617，1993）、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター（Koeringら，Hum．Gene Therap．5:457-463，1994）、ポックスウイルスベクター（PanicaliおよびPaoletti，PNAS 79:4927-4931，1982;およびOzakiら，Biochem．Biophys．Res．Comm．193(2):653-660，1993）およびレトロウイルス（例えば、EP 0,415,731;WO 90/07936;WO 91/0285，WO 94/03622;WO 93/25698;WO 93/25234;米国特許第5,219,740号；WO 93/11230;WO 93/10218）を含む種々のウイルスベクターから発現され得る。異なるウイルスまたは非ウイルス供給源由来の異なるエレメント（例えば、プロモーター、エンベロープ配列など）の混合物を含むウイルスベクターが同様に構築され得る。種々の実施態様において、ウイルスベクター自体またはウイルスベクターを含むウイルス粒子のいずれかは、下記の方法および組成物において利用され得る。
【００３６】
本発明を実施するに適切な哺乳動物細胞は、特に以下を含む：PC12（ATCC No.CRL1721）、N1E-115神経芽細胞腫、SK-N-BE(2)C神経芽細胞腫、SHSY5アドレナリン作動性神経芽細胞腫、NS20YおよびNG108-15マウスのコリン作動性細胞株、またはラットのF2後根神経節株、COS（例えば、ATCC No．CRL 1650または1651）、BHK（例えば、ATCC No．CRL 6281;BHK 570細胞株（アメリカンタイプカルチャーコレクションに受託番号CRL 10314の下で寄託された））、CHO（ATCC No．CCL 61）、HeLa（例えば、ATCC No．CCL 2）、293（ATCC No．1573;Grahamら，J．Gen．Virol．36:59-72，1977）およびNS-1細胞。他の哺乳動物細胞株は、本発明において使用され得る。これは、ラットHepI（ATCC No．CRL 1600）、ラットHepII（ATCC No．CRL 1548）、TCMK（ATCC No．CCL 139）、ヒト肺（ATCC No．CCL 75.1）、ヒト肝腫瘍（ATCC No．HTB-52）、Hep G2（ATCC No．HB 8065）、マウス肝臓（ATCC No．CCL 29.1）、NCTC 1469（ATCC No．CCL 9.1）、SP2/0-Ag14（ATCC No．1581）、HIT-T15（ATCC No．CRL 1777）、およびRINm 5AHT2B（OrskovおよびNielson，FEBS 229(1):175-178，1988）を包含する。
【００３７】
本発明の実施において使用するための哺乳動物発現ベクターは、クローン化された遺伝子またはcDNAの転写を指向し得るプロモーターを含む。好ましいプロモーターは、ウイルスプロモーターおよび細胞プロモーターを包含する。ウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター（Boshartら，Cell 41:521-530，1985）、サイトメガロウイルス即時後期プロモーター、SV40プロモーター（Subramaniら，Mol．Cell．Biol．1:854-864，1981）、MMTV LTR、RSV LTR、メタロチオネイン-1、アデノウイルスE1aを包含する。細胞プロモーターは、マウスメタロチオネイン-1プロモーター（Palmiterら，米国特許第4,579,821号）、マウスＶκプロモーター（Bergmanら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:7041-7045，1983;Grantら，Nucl.Acids Res．15:5496，1987）およびマウスＶHプロモーター（Lohら，Cell 33:85-93，1983）を包含する。プロモーターの選択は、少なくとも部分的には、所望される発現レベルまたはトランスフェクトされるべきレシピエント細胞株に依存する。
【００３８】
このような発現ベクターはまた、プロモーターの下流でかつ目的のペプチドまたはタンパク質をコードするDNA配列の上流に位置する一連のRNAスプライス部位を含み得る。好ましいRNAスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得られ得る。発現ベクターには、目的のコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルも含まれる。適切なポリアデニル化シグナルは、SV40由来の初期または後期のポリアデニル化シグナル（KaufmanおよびSharp、同書）、アデノウイルス５ EIB領域由来のポリアデニル化シグナル、およびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（DeNotoら，Nuc．Acids Res．9:3719-3730，1981）を包含する。発現ベクターは、非コードウイルスリーダー配列（例えば、プロモーターとRNAスプライス部位との間に位置するアデノウイルス２のトリパータイトリーダー）を包含し得る。好ましいベクターはまた、SV40エンハンサーおよびマウスIg重鎖エンハンサー（Gillies，Cell 33:717-728，1983）のようなエンハンサー配列を包含し得る。発現ベクターはまた、アデノウイルスVA RNAをコードする配列を包含し得る。適切な発現ベクターは、市販の供給源（例えば、Stratagene，La Jolla，Calif）から得られ得る。
【００３９】
クローン化されたDNA配列を含むベクター構築物は、例えば、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Wiglerら，Cell 14:725，1978;CorsaroおよびPearson，Somatic Cell Genetics 7:603，1981;GrahamおよびVan der Eb，Virology 52:456，1973）、エレクトロポレーション（Neumannら，EMBO J．1:841-845，1982）、またはDEAE-デキストラン媒介トランスフェクション（Ausubelら（編），Current Protocols in Molecular Biology，John WileyおよびSons，Inc.，NY，1987）により、培養された哺乳動物細胞に導入され得る。クローン化DNAを安定に組み込んだ細胞を同定するために、一般に、選択マーカーが目的の遺伝子またはcDNAとともに細胞中に導入される。培養された哺乳動物細胞における使用のために好ましい選択マーカーは、薬剤（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキセート）に対する耐性を与える遺伝子を包含する。
【００４０】
選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。好ましい増幅可能な選択マーカーは、DHFR遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子である。選択マーカーは、Thilly（Mammalian Cell Technology，Butterworth Publishers，Stoneham，MA、これは、本明細書中に参考として援用される）により概説される。
適切なベクターを含む哺乳動物細胞は、目的のDNA配列を発現し始めるためのある期間（代表的には１〜２日間）、増殖させられる。次いで、薬剤選択は、安定な様式においで選択マーカーを発現する細胞の増殖を選択するために適用される。増幅可能な選択マーカーを用いてトランスフェクトされた細胞に対して、増大したコピー数のクローン化された配列、それによる発現レベルの増大について選択するために、薬剤濃度を段階的な様式で増大させ得る。導入された配列を発現する細胞は、所望の形態または所望のレベルでの目的のタンパク質の産生について選択およびスクリーニングされる。次いで、これらの基準を満たす細胞は、産生のためにクローン化およびスケールアップされ得る。
【００４１】
哺乳動物細胞のトランスフェクションのためのプロトコルは当業者に周知である。代表的な方法は、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、レトロウイルス媒介トランスフェクション、アデノウイルス媒介トランスフェクション、およびプロトプラスト融合媒介トランスフェクション（Sambrookら、前出を参照のこと）を包含する。
当該分野で公知の多数の昆虫宿主細胞はまた、本明細書に照らして本発明において有用であり得る。例えば、昆虫細胞において異種DNA配列を発現するためのベクターとしてのバキュロウイルスの使用は、Atkinsonら（Pestic.SCi．28:215-224，1990）により総説されている。
【００４２】
当該分野で公知の多数の植物宿主細胞はまた、本明細書に照らして本発明において有用であり得る。例えば、植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのAgrobacterium rhizogenesの使用は、Sinkarら（J.Biosci．（Bangalore）11:47-58，1987）により総説されている。
AD4タンパク質は、上記の宿主／ベクター系を増殖（代表的には培養）させて、組換えアルツハイマー病タンパク質を発現させることにより調製され得る。組換えにより産生されたAD4タンパク質は、以下により詳細に記載されるようにさらに精製され得る。
本発明に関連する局面において、AD4タンパク質は、生殖細胞および体細胞がAD4遺伝子を含むトランスジェニック動物において発現され得る。このAD4遺伝子は、遺伝子の発現に有効なプロモーターに作動可能に連結され、非ヒトトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、イヌ、およびブタにおいてもまた発現され得る（Hammerら，Nature 315:680-683，1985，Palmiterら，Science 222:809-814，1983，Brinsterら，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 82:4438-4442，1985，PalmiterおよびBrinster Cell 41:343-345，1985および米国特許第5,175,3.83号、同第5,087,571号、同第4,736,866号、同第5,387,742号、同第5,347,075号、同第5,221,778号、および同第5,175,384号を参照のこと））。
【００４３】
簡略には、適切に配置された発現制御配列とともに発現される核酸分子を含む発現ベクターは、受精卵の前核に、例えば、マイクロインジェクションにより導入される。注入されたDNAの組込みは、組織サンプルからのDNAのブロット分析により検出される。導入されたDNAが動物の生殖細胞系列に組み込まれて、その結果、その動物の子孫に伝わることが好ましい。組織特異的発現は、組織特異的プロモーターの使用を通して、またはトランスジーンの調節された発現を可能にするメタロチオネイン遺伝子プロモーター（Palmiterら，1983，同書）のような誘導性プロモーターの使用を通して達成され得る。
本発明のベクターは、上記のようなAD4タンパク質の代わりに、またはそれに加えて、１つまたはいくつかの別のプロモーターのいずれかから、広範な種々のさらなる核酸分子を含有または発現し得る。例えば、ウイルスベクターは、リンホカインもしくはリンホカインレセプター、アンチセンス配列もしくはリボザイム配列、またはトキシンを発現し得る。リンホカインの代表例は、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、α-インターフェロン、β-インターフェロン、γ-インターフェロン、および腫瘍壊死因子、ならびにそれらの各々のレセプターを包含する。アンチセンス配列の代表例は、AD4タンパク質変異体の発現をブロックするアンチセンス配列を包含する。トキシンの代表例は、以下を包含する：リシン、アブリン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、サポリン、ゲロニン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン、Shigellaトキシン、およびPseudomonasエキソトキシンＡ。
【００４４】
本発明の他の局面において、変異AD4核酸配列の発現を特異的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド分子が、提供される（一般に、Hirashimaら，Molecular Biology of RNA:New Perspectives(M.InouyeおよびB．S．Dudock編，1987Academic Press，San Diego，401頁);Oligonucleotides:Antisense Inhibitors of Gene Expression(J.S．Cohen編，1989 MacMillan Press，London);SteinおよびCheng，Science 261：1004-1012(1993);WO 95/10607;米国特許第5,359,051号;WO 92/06693;およびEP-A2-612844を参照のこと)。簡略には、このような分子は、AD4変異を含む転写されたAD4変異mRNA配列の領域に相補的であり、かつこれとWatson-Crick塩基対を形成し得るように構築される。得られる２重鎖核酸は、その後のmRNAのプロセシングを妨害し、それによりタンパク質合成を防ぐ。
【００４５】
本発明の他の関連する局面において、リボザイム分子が提供される。ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、変異AD4遺伝子から転写されたmRNA分子を特異的に切断し得るリボザイムに取り込まれる（一般に、Kimら，Proc.Nat.Acad.Sci．USA 84:8788(1987);Haseloffら，Nature 234:585(1988)，Cech，JAMA 260:3030(1988);Jeffriesら，Nucleic Acids Res．17:1371(1989);米国特許第5,093,246号;米国特許第5,354,855号;米国特許第5,144,019号;米国特許第5,272,262号;米国特許第5,254,678号;および米国特許第4,987,071号を参照のこと）。本発明のこの局面に従って、リボザイムに取り込まれるアンチセンス配列は、AD4変異を含む転写された変異AD4 mRNAの領域に相補的であり、かつこれとWatson-Crick塩基対を形成し得る配列を包含する。従って、アンチセンス配列は、変異AD4 mRNAに対する特異的な触媒的リボザイム活性の送達のための標的化剤となる。
ここで、このような触媒活性は、mRNAを切断して、これがAD4タンパク質翻訳のためにその後にプロセシングされるのを不可能にする。
【００４６】
宿主細胞
上記のように、本発明のAD4タンパク質をコードする核酸分子（または関連する変異体を含有および/または発現するベクター）は、広範囲の種々の宿主細胞に容易に導入され得る。このような宿主細胞の代表例は、植物細胞、真核生物細胞、および原核生物細胞を包含する。好ましい実施態様において、核酸分子は、脊椎動物または温血動物（例えば、ヒト、マカーク、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ラット、ハムスター、マウス）由来の細胞、もしくは魚類の細胞、またはそれらの任意のハイブリッドに導入される。
【００４７】
本発明における使用のために好ましい原核生物宿主細胞は、E．coli．Salmonella、Bacillus、Shigella、Pseudomonas、Streptomycesおよび他の属を包含する。これらの宿主を形質転換するため、およびそれらにおいてクローン化された外来DNA配列を発現するための技術は、当該分野で周知である（例えば、Maniatisら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1982，これは、本明細書中に参考として援用される；またはSambrookら、前出を参照のこと）。細菌宿主においてクローン化されたDNA配列を発現するために用いられるベクターは、一般に、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性のための遺伝子）および宿主細胞において機能するプロモーターを含む。適切なプロモーターは、trp（NicholsおよびYanofsky，Meth．Enzymol．101:155-164，1983）、lac（Casadabanら，J.Bacteriol．143:971-980，1980）、およびλファージ（Queen，J.Mol.Appl.Genet．2:1-10，1983）プロモーター系を包含する。細菌を形質転換するために有用なプラスミドは、pUCプラスミド（Messing，Meth．Enzymol．101:20-78，1983;VieiraおよびMessing，Gene 19:259-268，1982）、pBR322（Bolivarら，Gene 2:95-113，19771）、pCQV2（Queen，同書）、およびそれらの誘導体を包含する。プラスミドは、ウイルスおよび細菌のエレメントの両方を含み得る。
【００４８】
好ましい真核生物細胞は、培養された哺乳動物細胞株（例えば、齧歯類またはヒト細胞株）、および酵母（例えば、Saccharomyces spp.、特にS.cerevisiae、Schizosaccharomyces spp.、またはKluyveromyces spp.）または糸状菌（例えば、Aspergillus spp.、Neurosporaspp.）の種を含む真菌細胞を包含する。酵母Saccharomyces cerevisiaeの株が特に好ましい。種々の原核生物および真核生物の宿主細胞においで組換えタンパク質を産生するための方法は、当該分野で一般に公知である（「遺伝子発現技術」，Methods in Enzymology，第185巻，Goeddel（編），Academic Press，San Diego，Calif.，1990を参照のこと；「酵母の遺伝学および分子生物学へのガイド」，Methods in Enzymology，GuthrieおよびFink（編），Academic Press，San Diego，Calif.，1991）も参照のこと）。一般に、宿主細胞は、高レベルで目的のタンパク質を産生するその能力、またはこのタンパク質の生物学的活性に必要なプロセシング工程のすくなくともいくつかを実施するためのその能力に基づいて選択される。このようにして、宿主細胞に導入されなくてはならないクローン化されたDNA配列の数は最小化され得、そして生物学的に活性なタンパク質の全収量は最大化され得る。
【００４９】
核酸分子（またはベクター）は、広範囲の種々のメカニズム（例えば、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Wiglerら，Cell 14:725，1978）、リポフェクション；遺伝子銃（CorsaroおよびPearson，Somatic Cell Gen．7:603，1981；GrahamおよびVan der Eb，Virology 52:456，1973）、エレクトロポレーション(Neumannら，EMBO J．1:841-845，1982)、レトロウイルス媒介トランスフェクション、アデノウイルス媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合媒介トランスフェクション、またはDEAE-デキストラン媒介トランスフェクション（Ausubelら（編），Current Protocols in Molecular Biology，John WileyおよびSons，Inc.，NY，NY，1987））を含む）により宿主細胞に導入され得る。
【００５０】
次いで、本発明のベクター構築物を含む宿主細胞は、上記のDNA分子を発現するように培養される。細胞は、選択された宿主細胞の増殖に必要とされる栄養素を含有する培養培地において標準的な方法に従って培養される。種々の適切な培地は当該分野で公知であり、そして一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、および無機質、ならびに特定の宿主細胞により必要とされ得る他の成分（例えば、増殖因子または血清）を含有する。増殖培地は、一般に、DNA構築物を含有する細胞を、例えば、DNA構築物上のもしくはDNA構築物で同時トランスフェクトされる選択マーカーにより相補される薬剤選択または必須栄養素の欠損により選択する。
【００５１】
酵母細胞に適切な増殖条件は、例えば、非アミノ酸窒素源または酵母抽出物であり得る窒素源、無機塩、ビタミン、および必須アミノ酸補充物を含有する、化学的に定義された培地において、４℃と37℃との間の温度（30℃が特に好ましい）で、培養する工程を包含する。培地のpHは、好ましくは、２より大きく８未満のpH、より好ましくはpH５〜６に維持される。安定なpHを維持するための方法は、緩衝化および一定のpH制御を包含する。pH制御のために好ましい薬剤は、水酸化ナトリウムを包含する。好ましい緩衝化剤は、コハク酸およびBis-Tris（Sigma Chemical Co.，St．Louis，Mo.）を包含する。酵母宿主細胞が異種タンパク質を過剰にグリコシル化する傾向のために、アスパラギンに関連するグリコシル化に必要とされる遺伝子に欠損を有する酵母細胞において本発明の核酸分子を発現することが好ましいかもしれない。このような細胞は、好ましくは、浸透圧安定化剤を含有する培地において増殖される。好ましい浸透圧安定化剤は、0.1Mと1.5Mとの間、好ましくは0.5Mまたは1.0Mである濃度で培地中に補充されたソルビトールである。
培養された哺乳動物細胞は、一般に、市販の血清含有培地または無血清培地において培養される。使用される特定の細胞株に適切な培地および増殖条件の選択は、十分に当業者のレベル内である。
【００５２】
抗体
上記のAD4タンパク質に対する抗体は、本明細書中に提供される開示を与えれば容易に調製され得る。このような抗体は、特定の実施態様において、変異AD4タンパク質でなく野生型AD4タンパク質を、野生型AD4タンパク質でなく変異AD4タンパク質を、特異的に認識し得るか、または野生型および変異AD4タンパク質の両方を同等に認識し得る。本発明の文脈において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメント（例えば、Fab、およびF(ab')2、Fv可変領域、または相補性決定領域）を包含することが理解される。上記のように、抗体は、10-7Ｍ以上、好ましくは10-8Ｍ以上のＫaで結合するならば、AD4タンパク質に対して特異的であることが理解される。モノクローナル抗体または結合パートナーのアフィニティーは、当業者により容易に決定され得る（Scatchard，Ann．N.Y．Acad．Sci．51:660-672，1949を参照のこと）。
【００５３】
簡略には、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物（例えば、ウマ、ウシ、種々の鳥類、ウサギ、マウス、またはラット）から当業者により容易に作製され得る。代表的には、AD4タンパク質または13〜20アミノ酸の独特のAD4ペプチド（好ましくは、グルタルアルデヒドを用いて架橋することによりキーホールリンペットヘモシアニンに結合される）は、動物を、腹腔内、筋肉内、眼内、または皮下注射を通して、Freund完全または不完全アジュバントのようなアジュバントで免疫するために利用される。何回かの追加免疫の後に、血清サンプルを回収し、そしてAD4タンパク質に対する反応性について試験する。特に好ましいポリクローナル抗血清は、バックグランドよりも少なくとも３倍大きい、これらのアッセイの１つにおいでシグナルを与える。一旦、動物の力価がタンパク質に対するその反応性についでプラトーに達したら、より大量の抗血清が、毎週採血するか、または動物を放血するかのいずれかにより容易に得られ得る。
モノクローナル抗体はまた、従来技術（米国特許第RE 32,011号、同第4,902,614号、同第4,543,439号、および同第4,411,993号（これらは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと；Monoclonal Antibodies，Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press，Kennett，McKearnおよびBechtol(編)，1980、ならびにAntibodies:A Laboratory Manual，HarlowおよびLane（編），Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988（これもまた本明細書中に参考として援用される）も参照のこと）を用いることにより容易に作製され得る。
【００５４】
簡略には、１つの実施態様において、ラットまたはマウスのような被験動物は、AD4タンパク質または上記のようなその部分を注射される。タンパク質は、得られる免疫応答を増大させるためにFreundの完全または不完全アジュバントのようなアジュバントと混合され得る。最初の免疫後の１〜３週の間で、動物は、別の追加免疫で再免疫され、そしてタンパク質に対する反応性について上記のアッセイを用いて試験され得る。一旦、動物が注入されたタンパク質に対するその反応性についてプラトーに達したら、動物を屠殺し、そして多数のＢ細胞を含有する器官（例えば、脾臓およびリンパ節）を採取する。
免疫化動物から得られる細胞は、ウイルス（例えば、エプスタイン-バーウイルス（EBV）（GlaskyおよびReading、Hybridoma 8(4):377-389，1989を参照のこと））でのトランスフェクションにより不死化され得る。あるいは、好ましい実施態様においで、採取された脾臓および／またはリンパ節細胞懸濁物は、モノクローナル抗体を分泌する「ハイブリドーマ」を作製するために適切なミエローマ細胞と融合される。適切なミエローマ株は、例えば、NS-1（ATCC No．TIB 18）およびP3X63-Ag 8.653(ATCC No．CRL 1580)を包含する。
【００５５】
融合後、細胞は、RPMI 1640またはDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）（JRH Biosciences，Lenexa，Kansas）のような適切な培地、ならびにウシ胎児血清（すなわち、Hyclone，Logan，UtahまたはJRH BiosciencesからのFBS）のようなさらなる成分を含有する培養プレートに配置され得る。さらに、培地は、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）（Sigma Chemical Co.，St．Louis，Missouri）のような、融合した脾臓およびミエローマ細胞の増殖を選択的に可能にずる試薬を含むべきである。約７日後、得られた融合細胞またはハイブリドーマは、AD4タンパク質に対して反応性である抗体の存在を決定するためにスクリーニングされ得る。広範囲の種々のアッセイは、本発明のタンパク質に対して反応性である抗体の存在を決定するために利用され得る。アッセイは、例えば、向流免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオ免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ドットブロットアッセイ、ウエスタンブロット、免疫沈降、阻害アッセイまたは競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ（米国特許第4,376,110号および同第4,486,530号を参照のこと；Antibosies:A Laboratory Manual，HarlowおよびLane（編），Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988も参照のこと）を包含する。数回のクローン希釈および再アッセイの後、AD4タンパク質に対して反応性である抗体を産生するハイブリドーマが単離され得る。
【００５６】
他の技術はまた、モノクローナル抗体を構築するために利用され得る（William D．Huseら，「Generation of a Large Combinational Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda」，Science 246:1275-1281，1989年12月を参照のこと;L.Sastryら，「Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies:Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library」，Proc.Natl.Acad．Sci．USA 86:5728-5732，1989年８月も参照のこと;Michelle Alting-Meesら，「Monoclonal Antibody Expression Libraries:A Rapid Alternative to Hybridomas」，Strategies in Molecular Biology 3:1-9，1990年１月も参照のこと;これらの参考文献は、組換え技術を通して抗体の産生を可能にするStratacyte，La Jolla，Californiaから入手可能な市販システムを記載する）。簡略には、mRNAは、Ｂ細胞集団から単離され、そしてλImmunoZap(H)およびλImmunoZap(L)ベクターにおいて重鎖および軽鎖免疫グロブリンcDNA発現ライブラリーを作製するために利用される。これらのベクターは、Fabフラグメントまたは抗体を形成するために個々にスクリーニングされ得るか、または同時発現され得る（Huseら，前出を参照のこと;Sastryら，前出も参照のこと）。ポジティブプラークは、続いで、E.coliからのモノクローナル抗体フラグメントの高レベル発現を可能にする非溶菌プラスミドに変換され得る。
【００５７】
同様に、抗体の部分またはフラグメント（例えば、FabまたはFvフラグメント）はまた、従来の酵素消化または組換えDNA技術を利用して、特異的に結合する抗体をコードする遺伝子の可変領域を取り込むために構築され得る。１つの実施態様において、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ由来の可変領域をコードする遺伝子は、可変領域に対するヌクレオチドプライマーを用いて増幅される。これらのプライマーは、当業者により合成され得るか、または市販の供給源から購入され得る。Stratacyte（La Jolla，Calif.）は、マウスおよびヒトの可変領域のためのプライマー（特に、ＶHa、ＶHb、ＶHc、ＶHd、ＣH1、ＶL、およびＣL領域のためのプライマー）を販売する。これらのプライマーは、重鎖または軽鎖の可変領域を増幅するために利用され得、次いでこれはベクター（例えば、それぞれ、ImmunoZAPTMHまたはImmunoZAPTML（Stratacyte））に挿入され得る。次いで、これらのベクターは、E.coli、酵母、または哺乳動物に基づく発現系に導入され得る。これらの技術を利用して、ＶHおよびＶLドメインの融合物を含有する大量の単鎖タンパク質が、産生され得る（Birdら，Science 242:423-426，1988を参照のこと）。さらに、このような技術は、「マウス」抗体を「ヒト」抗体に変化させるために、抗体の結合特異性を変化させずに利用され得る。
【００５８】
一旦、適切な抗体が得られたら、これらは、当業者に周知の多くの技術により、単離または精製され得る（Antibodies:A Laboratory Manual，HarlowおよびLane（編），Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988を参照のこと）。適切な技術は、ペプチドもしくはタンパク質アフィニティーカラム、HPLCもしくはRP-HPLC、プロテインＡもしくはプロテインＧカラムでの精製、またはこれらの技術の任意の組み合わせを包含する。
【００５９】
本発明の抗体は、多くの用途を有する。例えば、抗体は、このようなAD4タンパク質を有する細胞を選別するために、フローサイトメトリーにおいて利用され得る。簡略には、目的のタンパク質またはペプチドを細胞上で検出するために、細胞を、目的のタンパク質に特異的に結合する標識されたモノクローナル抗体とともにインキュベートし、その後結合した抗体の存在を検出する。これらの工程はまた、さらなる工程（例えば、結合していない抗体を取り除くための洗浄）を用いて達成され得る。本発明における使用に適切な標識は、当該分野で周知である。これは、特に、フルオロセインイソチオシアネート（FITC）、フィコエリトリン（PE）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、およびコロイド金を包含する。フローサイトメトリーにおける使用に特に好ましいのはFITCであり、これは、Keltkamp「抗体へのフルオレセインイソチオシアネートの結合I.結合条件の実験」，Immunology 18:865-873，1970の方法に従って精製抗体に結合され得る（Keltkamp，「抗体へのフルオレセインイソチオシアネートの結合II．再現可能な方法」，Immunology 18:875-881，1970；Goding，「蛍光色素との抗体の結合：標準法の改変」J．Immunol．Methods 13:215-226，1970も参照のこと）。
【００６０】
アッセイ
本発明の情況において有用なアッセイは、AD4タンパク質活性のアゴニストまたはアンタゴニストを検出するためのこれらのアッセイを包含する。他のアッセイは、ペプチドまたは有機分子ライブラリーをスクリーニングするために有用である。他のアッセイもなお、本発明における核酸分子および／またはペプチドを同定および／または単離するために有用であるか、あるいはアルツハイマー病の罹患の増大した可能性を有する患者を診断するために有用である。
【００６１】
Ａ．核酸ベースの診断試験
簡潔には、本発明の別の局面は、AD4遺伝子および／またはその変異体を検出するためのプローブおよびプライマーを提供する。この局面の１つの実施態様において、AD4遺伝子由来のRNAまたはDNAに特異的にハイブリダイズし得るプローブを提供する。本発明の目的のためには、プローブが高度または中程度のストリンジェンシー（Sambrookら、前出、を参照のこと）のいずれかの条件下でAD4遺伝子にハイブリダイズするが、AD3遺伝子に有意にまたは検出可能にハイブリダイズしない場合、プローブはAD4遺伝子DNAまたはRNAに「ハイブリダイズし得る」。好ましくは、プローブは、高いストリンジェンシー条件（例えば、５×SSPE、１×デンハルト溶液（Sambrookら、前出）、0.1％ SDS、65℃、および0.2×SSC、１×デンハルト溶液、0.1％ SDSの存在下、65℃での、過剰のプローブを除去するための少なくとも１回の洗浄）下で、適切なヌクレオチド配列にハイブリダイズするように利用され得る。本明細書中で特に提供されない限り、プローブ配列は、AD4遺伝子にハイブリダイズし得るが、AD3のような他の遺伝子由来のDNAまたはRNA配列にハイブリダイズし得ないように設計される。プローブは、例えば、患者から単離された生物学的サンプル中に存在する核酸にハイブリダイズするように用いられる。次いで、ハイブリダイズしたプローブを検出し、それにより所望の細胞性核酸の存在が示される。好ましくは、細胞性核酸を、ハイブリダイゼーションの前に、PCRのような増幅手順に供する。あるいは、AD4遺伝子を増幅し得、そして増幅産物をDNA配列決定に供し得る。AD4の変異体は、DNA配列解析により、または特定の対立遺伝子にハイブリダイズし得るに十分な条件下および時間での対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションにより検出され得る。代表的には、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄液は、テトラメチルアンモニウムクロリドなど（Sambrookら、前出、を参照のこと）を含有ずる。
【００６２】
本発明の核酸プローブは、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸）、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかから構成され得、そして約12ヌクレオチド長程度、通常約14〜18ヌクレオチド長であり得、そしてAD4遺伝子の完全な配列と可能な限り同じ大きさであり得る。プローブサイズの選択はプローブの用途にいくぶんか依存し、そして当業者の範囲内である。
適切なプローブを、当該分野で周知の技術を用いて構築および標識し得る。例えば、12塩基のより短いプローブは、合成的に作製され、そしてT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて32Pで標識され得る。好ましくは、約75塩基から1.5kb未満のより長いプローブは、例えば、［α-32P]dCTP、ジゴキシゲニン-dUTP、またはビオチン-dATPのような標識された前駆体の存在下でのPCR増幅により作製される。1.5kbを超えるプローブは、一般に、関連プローブを含有するプラスミドで細胞をトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を大量に増殖し、そしてトランスフェクトした細胞から関連配列を精製することにより最も容易に増幅される（Sambrookら、前出、を参照のこと）。
【００６３】
プローブを、種々のマーカーにより標識し得る。マーカーは、例えば、放射性マーカー、蛍光性マーカー、酵素性マーカー、色素発生性マーカーを含む。32Pの使用は、特に、特定のプローブを作製または標識するのに好ましい。
プローブがサンプル中のAD4 mRNAまたはDNAの存在を検出するために利用され得ることは本発明のこの局面の特徴である。しかし、核酸が限定された数のみで存在する場合には、関連配列を増幅してより容易に検出または入手し得ることが有益であり得る。
種々の方法を、選択された配列を増幅するために利用し得る。これらの方法は、例えば、RNA増幅（Lizardiら、Bio/Technology 6:1197-1202、1988；Kramerら、Nature 339:401-402、1989；Lomeliら、CI inical Chem．35(9):1826-1831、1989；米国特許第4,786,600号を参照のこと）、およびLCRまたはポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）を利用するDNA増幅（米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、および同第4,800,159号を参照のこと）（米国特許第4,876,187号および同第5,011,769号もまた参照のこと。これらは、切れやすい連結の使用を含む別の検出／増幅システムを記載する）、または十分に当業者のレベル内である他の核酸増幅手順を包含する。PCRに関しては、例えば、方法を、当該分野で公知のように改変し得る。PCRの転写の促進が、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列の１つの１次オリゴヌクレオチドへの組み込みにより達成され得、そして促進されたエミッター由来の産物の免疫酵素学的検出が、抗RNA:DNA抗体を用いて達成され得る（Blais、Appl．Environ．Microbiol．60:348-352、1994）。PCRはまた、逆ドット-ブロットハイブリダイゼーションと組み合わせて使用され得る（Iidaら、FEMS Microbiol．Lett．114:167-172、1993）。PCR産物はdUTPの1993）、そしてサンプルはPCR-遺伝子プローブ検出のために濾過抽出され得る（Bejら、Appl．Environ．Microbiol．57:3529-3534、1991）。
【００６４】
特定の好ましい実施態様において、PCR増幅をAD4 DNAを検出するために利用する。簡潔には、より詳細に以下に記載するように、DNAサンプルを、１本鎖DNAを生成するために95℃で変性する。次いで、特定のプライマーを、37℃〜70℃（これは、プライマー中のAT/GCの割合に依存する）で、１本鎖DNAにアニーリングする。プライマーを、テンプレートに対する反対の鎖を生成するために、72℃にてTaq DNAポリメラーゼを用いて伸長する。これらの工程は１回のサイクルを構成し、これは、選択された配列を増幅するために繰り返され得る。
別の好ましい実施態様において、LCR増幅を増幅のために利用する。LCRプライマーは、上流プライマーの5'塩基が所望の遺伝子中の唯一の塩基対にハイブリダイズし、AD4遺伝子を特異的に検出し得るように合成される。
別の好ましい実施態様において、プローブを、自動化された非同位体的ストラテジーで使用する。ここでは、標的核酸配列がPCRにより増幅され、次いで、所望の産物が比色定量的オリゴヌクレオチド連結アッセイ（OLA）により決定される（Nickersonら.Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:8923-8927、1990）。
【００６５】
選択された配列を増幅するためのプライマーは、AD4（AD3ではない）に対してより高度に特異的であり、そして標的配列とともに安定な２本鎖を形成する配列から選択されるべきである。プライマーはまた、特に3'末端において非相補的であるべきであり、それら自身または他のプライマーと二量体を形成するべきでなく、そしてDNAの他の領域と２次構造または２本鎖を形成するべきでない。一般に、約18〜20ヌクレオチドのプライマーが好ましく、そして当該分野で周知の技術を用いて容易に合成され得る。PCR産物、および他の核酸増幅産物は、当該分野で公知の技術を用いて定量され得る（Duplaaら、Anal. Biochem. 212:229-236 (1993: Higuchiら、Bio/Technology 11:1026-1030）。
特定の好ましい実施態様において、制限酵素解析を、変異AD4遺伝子を検出するために使用する。例えば、１つの実施態様において、AD4中のN141I変異は、Sau3AI制限部位を作出する。cDNA、ゲノムDNA、または増幅されたAD4 cDNAもしくはゲノムDNAが、Sau3AIで制限される。AD4遺伝子がN141I変異を含有する場合、コドン141を含有するSau3AIフラグメントまたは増幅産物は２つのより小さなフラグメントに切断される。切断は、アガロースまたはアクリルアミドゲルでの電気泳動により容易に検出され、そしてエチジウムブロミド蛍光またはAD4遺伝子フラグメントもしくはオリゴヌクレオチドを用いるプローブハイブリダイゼーションにより可視化される。
【００６６】
Ｂ．抗体ベースの診断試験
本発明のなお別の局面は、上記のように、診断試験におけるAD4遺伝子産物の検出のための抗体を提供する。種々のアッセイを、所望のタンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために利用し得る。例示的なアッセイが、Antibodies:A Laboratory Manual、HarlowおよびLane(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988により詳細に記載される。このようなアッセイの代表的な例は、向流免疫電気泳動（CIEP）、放射性免疫検定法、放射性免疫沈降、固相酵素免疫検定法（ELISA）、ドットブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、ならびにサンドイッチアッセイ、イムノスティック（immunostick）（ディップスティック（dipstick））アッセイ、同時免疫アッセイ、免疫クロマトグラフアッセイ、免疫濾過アッセイ、ラテックスビーズ凝集アッセイ、免疫蛍光アッセイ、バイオセンサーアッセイ、および微光（low-light）検出アッセイを包含する（米国特許第4,376,110号および同第4,486,530号を参照のこと；Antibodies:A Laboratory Manual、前出、もまた参照のこと）。
【００６７】
蛍光抗体試験（FA-試験）は、本発明のタンパク質の１つに結合し得る蛍光性標識した抗体を使用する。検出のために、蛍光顕微鏡を用いる肉眼による測定を技術者が行い、定性的な結果を得る。好ましい実施態様において、本アッセイは、組織サンプルおよび組織学的断片を試験するために用いられる。
ラテックスビーズ凝集アッセイにおいて、１つ以上の本発明のタンパク質に対する抗体をラテックスビーズに結合する。次いで、ラテックスビーズに結合された抗体を、抗体をサンプル中の所望のタンパク質に、存在するのであれば、結合させ得る条件下で、サンプルと接触させる。次いで、結果を肉眼で読み、定性的な結果を得る。好ましい実施態様において、この形式は、実地（on-site）試験の分野で使用され得る。
酵素免疫アッセイ（EIA）は、本発明により提供される抗体を利用し得る多数の異なるアッセイを包含する。例えば、異種間接EIAは、本発明の抗体と結合した固相およびアフィニティ精製した抗IgG免疫グロブリン調製物を使用する。好ましくは、固相は、ポリスチレンマイクロタイタープレートである。次いで、抗体および免疫グロブリン調製物を、抗体結合させ得る条件下で、サンプルと接触させる。この条件は当該分野において周知である。このようなアッセイの結果を肉眼で読み得るが、好ましくは、分光光度計（例えば、ELISAプレートリーダー）を用いて読み、定量的な結果を得る。
別の固相EIA形式は、アッセイの手順の間に磁石の手段により動かされ得るプラスチックコートした磁性金属ビーズを包含する。なお別の形式は、微光検出免疫アッセイ形式である。この高感度の形式において、適切に標識した結合した抗体により生成される光放出は自動的に定量される。好ましくは、反応をマイクロタイタープレートを用いて行う。
【００６８】
捕獲抗体サンドイッチ酵素アッセイにおいて、所望のタンパク質は、固相、好ましくはポリスチレンマイクロタイタープレートに結合した抗体と標識した抗体との間に結合される。好ましくは、結果を、ELISAプレートリーダーのような分光光度計を用いて測定する。
別の実施態様において、放射性トレーサーがEIAでの酵素媒介検出を代用して放射性免疫アッセイ（RIA）をもたらす。
連続アッセイ形式において、試薬を、捕獲抗体と段階的な様式でインキュベートさせ得る。最初に、試験サンプルを捕獲抗体とともにインキュベートする。洗浄工程後、標識した抗体とともにインキュベーションする。同時アッセイにおいては、連続アッセイに記載される２つのインキュベーション過程が組み合わされる。これは１回のインキュベーション過程および洗浄工程を排除する。
ディップスティック/イムノスティック形式は、固相がポリスチレンマイクロタイタープレートである代わりに、ポリスチレンのへらまたはディップスティックである以外は、本質的に免疫アッセイである。試薬は同じであり、そして形式は同時または連続のいずれかであり得る。
【００６９】
クロマトグラフ用ストリップ試験形式は、捕獲抗体および標識した抗体をクロマトグラフ用ストリップ上で乾燥する。このストリップは、代表的には、ニトロセルロースまたは酢酸セルロースと結合した多孔性のナイロンである。捕獲抗体は、通常、ストリップの一端で線として噴霧乾燥される。この端には、ストリップと接触している吸収物質が存在する。ストリップの他の端には、標識した抗体が膜中に吸収されることを防止する様式で、標識した抗体を沈着する。通常、抗体に結合される標識は、ラテックスビーズまたはコロイド状の金である。アッセイは、サンプルを標識した抗体の直ぐ近傍に適用することにより開始され得る。
【００７０】
免疫濾過/免疫濃縮形式は、大きな固相表面とサンプル/試薬の指向的な流れとを組み合わせる。これは、濃縮し、そして抗原の抗体への結合を促進する。好ましい形式においで、試験サンプルを標識した抗体とともにプレインキュベートし、次いで、繊維フィルター、ニトロセルロース膜などのような固相に適用する。固相はまた、捕獲抗体でコートしたラテックスまたはガラスビーズでプレコートされ得る。分析物の検出は、標準的な免疫アッセイと同じである。サンプル/試薬の流れは、下に存在する吸収物質の減圧または毛管作用のいずれかにより調整され得る。
閾値バイオセンサーアッセイは、大多数のサンプルを低コストでスクリーニングし得る、感度のよい、機器を備えたアッセイである。１つの実施態様において、このようなアッセイは、光に応答し得る電位差センサーの使用を包含し、ここで、反応は、捕獲抗体、架橋化抗体、およびウレアーゼ結合抗体による所望のタンパク質の結合に起因するpH変化の検出を含む。結合の際、pH変化を電位（マイクロボルト）に変換ずることで測定可能にする。アッセイは、代表的には、非常に小さな反応容量で行われ、そして非常に感度がよい。さらに、報告されたアッセイの検出限界は、１分あたり1,000分子のウレアーゼである。
【００７１】
Ｃ．他のアッセイ
膜貫通レセプターは多くの細胞伝達プロセスに関与し、そして新しい治療剤の同定および開発のための多数の薬理学的スクリーニングアッセイの標的であった。多くのこれらのスクリーニングアッセイは、組換えレセプターを発現する細胞株においてのリガンド誘導性の変化を探究する。いくつかの場合において２次メッセンジャーが直接アッセイされる一方で、他の場合においては、レセプターがレポーター遺伝子構築物を保有する細胞株中へトランスフェクトされる。この構築物の発現レベルは、レセプターの機能的活性化により（正または負に）影響され得る。多くの異なる２次メッセンジャー系の刺激の共通の結果の１つは、細胞内カルシウムのホメオスタシスにおける一過性の変化である。これは、種々の細胞内区画からのCa++放出または細胞外カルシウムの流入の結果であり得る。
【００７２】
カルシウムの過渡現象は、AD4遺伝子機能を特徴付けるための高感度および高選択性の方法を提供する。エクオリンレポーター構築物で先にトランスフェクトした細胞株における組換えAD4の発現は、AD4リガンドのスクリーニングおよび同定のために使用され得る。エクオリンは、Ca++結合の際に可視範囲の光の生成を伴って不可逆的反応を行う21kDaの光タンパク質である。エクオリン消費の部分的な割合が生理学的[Ca++]に比例するので、エクオリンは、何年もの間、細胞内カルシウムの感度のよい指標として使用されてきた。さらに最近になって、いくつかの異なるエクオリンcDNAが操作され、これにより、細胞質、核、および小胞体を含む異なる細胞内区画に対して、エクオリン発現の選択的標的化が可能である。これにより、種々の２次メッセンジャー結合経路/区画がスクリーニングされ得る。
従って、１つの実施態様において、変異AD4を発現する細胞株が、変異タンパク質機能を野生型AD4活性を擬似する様式で改変する化合物を同定するために利用され得る。
【００７３】
標識
AD4タンパク質、このようなタンパク質をコードする核酸分子、抗AD4タンパク質抗体、およびアゴニストまたはアンタゴニストを、上記および下記のように、例えば、蛍光分子、毒素、および放射性核種を含む種々の分子とともに標識し得る。蛍光分子の代表的な例は、フルオレセイン、フィコエリトリンのようなPhycobiliタンパク質、ホダミン（hodamine）、テキサスレッド、およびルシフェラーゼを含む。毒素の代表的な例は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（gelonin）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリシン、Shigella毒素、およびPseudomonasエンドトキシンAを含む。放射性核種の代表的な例は、Cu-64、Ga-67、Ga-68、Zr-89、Ru-97、Tc-99m、Rh-105、Pd-109、In-111、I-123、I-125、I-131、Re-186、Re-188、Au-198、Au-199、Pb-203、At-211、Pb-212、およびBi-212を含む。さらに、上記の抗体をまた、リガンド結合対の一方のパートナーに標識または結合し得る。代表的な例は、アビジン-ビオチン、およびリボフラビン-リボフラビン結合タンパク質を含む。
【００７４】
AD4タンパク質、このようなタンパク質をコードする核酸分子、抗AD4タンパク質抗体、およびアゴニストまたはアンタゴニストを、上記のように、先に説明した代表的な標識と結合または標識するための方法は、当業者によって容易に達成され得る（トリコテセン（Trichothecene）抗体結合体、米国特許第4,744,981号；抗体結合体、米国特許第5,106,951号；蛍光発光性物質および標識技術、米国特許第4,018,884号；診断および治療用の金属放射性核種標識タンパク質、米国特許第4,897,2:55号；および改良したキレート化動力学のための金属放射性核種キレート化化合物、米国特許第4,988,496号を参照のこと；Inman、Methods In Enzymology、第34巻、Affinity Techniques、Enzyme Purification；B部、JakobyおよびWilcheck（編）、Academic Press、New York、30頁、1974もまた参照のこと；WilcheckおよびBayer、「The Avidin-Biotin complex in BioanalyticalApplications」、Anal．Biochem．171:1-32、1988もまた参照のこと）。
【００７５】
薬学的組成物
上記のように、本発明はまた、種々の薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、上記のAD4タンパク質の１つ、核酸分子、ベクター、抗体、宿主細胞、アゴニスト、またはアンタゴニストを、薬学的もしくは生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤とともに含む。一般に、このようなキャリアは、用いる投与量および濃度がレシピエントに対して非毒性であるべきである。通常、このような組成物の調製は、治療剤と、緩衝液、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、低分子量（約10残基未満）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭化水素（グルコース、スクロース、またはデキストリンを含む）、キレート化剤（例えば、EDTA）、グルタチオン、ならびに他の安定化剤および賦形剤との組み合わせを必要とする。中性緩衝化生理食塩水または非特異的血清アルブミンと混合した生理食塩水は、例えば、適切な希釈剤である。
【００７６】
さらに、本発明の薬学的組成物を、種々の異なる経路で投与するために調製し得る。しかし、代表的には、頭蓋内経路が好ましい。さらに、本発明の薬学的組成物を、容器内に包装材とともに入れ得る。これは、このような薬学的組成物の使用についての使用説明書を提供する。一般に、このような使用説明書は、試薬濃度、ならびに特定の実施態様における賦形剤成分または希釈剤（例えば、水、生理食塩水、またはPBS）の相対的な量を記載する具体的な表現を含む。これは、薬学的組成物を再構成するために必要であり得る。
アルツハイマー病の治療または予防方法 
【００７７】
本発明はまた、アルツハイマー病を治療または予防するための方法を提供する。この方法は、ベクター（例えば、発現ベクター、ウイルスベクター、またはウイルス粒子含有ベクター）または核酸分子単独を、上記のように、患者に投与し、それによってアルツハイマー病の可能性を減少するかまたはアルツハイマー病の発病を遅延する工程を包含する。
同様に、治療用ペプチド、ペプチド擬似物、または小分子を、アルツハイマー病の発病を遅延するため、徴候を減少するため、または病気の進行を停止もしくは遅延するために用い得る。このような治療は、変異タンパク質、野生型および変異タンパク質を発現するトランスジェニック動物モデルで、またはインビトロアッセイ系で試験され得る。
【００７８】
１つのこのようなインビトロアッセイ系は、産生されたアミロイドタンパク質の量を測定する。簡潔には、例示によるように、AD4遺伝子産物およびアミロイドの両方を発現ずる細胞を、候補治療用分子の存在下で培養する。この細胞により発現されたAD4タンパク質は、野生型または変異タンパク質のいずれかであり得る。いずれの場合でも、産生されるアミロイドタンパク質の量を、候補治療物とともにまたは候補治療物を含まずに（コントロール）インキュベートした細胞から測定する。簡潔には、実施例によるように、細胞を、35S-メチオニンを含有する培地中で標識し、そして候補治療物の存在（非存在）下でインキュベートする。アミロイドタンパク質を、免疫沈降およびSDS-PAGE電気泳動によるかまたはELISAにより培養上清中で検出する。コントロールと比較したアミロイドタンパク質の統計学的に有意な減少は、アルツハイマー病の予防または治療における使用に適切な治療候補物を示す。
【００７９】
あるいは、アルツハイマー病タンパク質を発現するトランスジェニック動物を、候補治療物を試験するために用い得る。アミロイドタンパク質を測定するか、あるいは、動物が記憶障害または学習障害のような他の病気の徴候を示す場合、記憶または学習の増大を測定する。記憶および学習を、齧歯類において、Morrisの水迷路（water maze）（StewartおよびMorris、Behavioral Neuroscience、R．Saghal編（IRLPress、1993、107頁））およびＹ迷路（Britsら、Brain Res．Bull．6:71、1981）により試験する。治療物を、試験の前に動物に投与する。試行の応答時間を測定し、そして記憶および学習の改善を、時間を計測した試行における統計学的に有意な減少により示す。
【００８０】
上記のように、本発明は、患者に治療有効量の本明細書中に記載のアンタゴニストまたは薬学的組成物を投与することによりアルツハイマー病の治療または予防する方法を提供する。このような患者を、他の原因に起因し得ない痴呆または記憶および学習の喪失の症状に基づく臨床診断により同定し得る。さらに、患者をまた、磁気共鳴造影により決定されるように脳委縮の診断により同定する。
【００８１】
ADにおける認識挙動を、いくつかの試験の任意の１つにより測定し得る（Gershonら、Clinical Evaluation of Psychotropic Drugs：Principles and Guidelines、PrienおよびRobinson（編）、Raven Press，Ltd.、New York、1994、467頁）。１つのこのような試験、BCRSを設計して、認識機能のみを測定する：集中、最近の記憶、過去の記憶、方向性、機能化、および自己配慮（self-care）。この試験、ならびにWeschler Memory ScaleおよびAlzheimer's Disease-Associated -Scaleを、治療処置後の改善を測定するために使用し得る。アルツハイマー病における「改善」が、Weschler Memory Scale試験での正常性の傾向において統計学的に有意な差異が存在する場合に、存在する。例えば、処置した患者の言語運用の試験結果を、プラシーボグループのメンバーと、または同じ患者で行ったその後の試験との間で比較する。本発明における改善はまた、アルツハイマー病の発病の年齢の遅延を包含する。
【００８２】
当業者に明らかであるように、投与の量および頻度は、もちろん、処置される徴候の性質および重篤度、所望の応答、患者の状態などのような因子に依存する。代表的には、組成物を種々の技術により投与し得る。しかし、頭蓋内経路が、しばしば好まれる。
本発明の他の実施態様において、上記のAD4タンパク質をコードする核酸分子を含有もしくは発現するベクター、または核酸分子自体を、種々の別の技術により投与し得る。この技術は、例えば、ポリ（Ｌ-リジン）DNA複合体と結合したアシアロオソムコイド（ASOR）の投与（Cristanoら、PNAS 92122-92126、1993）、死アデノウイルスに結合したDNA（Curielら、Hum．Gene．Ther．3(2):147-154、1992）、サイトフェクチン媒介性誘導（DMRIE-DOPE、Vical、Cailf）、直接DNA注入（Acsadiら、Nature 352:815-818、1991）；DNAリガンド（Wuら、J．of Biol．Chem．264:16985-16987、1989）；リポフェクション（Felgnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413-7417、1989）；リポソーム（Pickeringら、Circ．89(1):13-21、1994；およびWangら、PNAS 84:7851-7855、1987）；マイクロプロジェクタイルボンバードメント（Williamsら、PNAS 88:2726-2730、1991）；およびAD4タンパク質自身をコードする核酸の、単独（VileおよびHart、Cancer Res．53:3860-3864、1993）のまたはPEG-核酸複合体を利用するかのいずれかでの直接送達を包含する。
以下の実施例を、制限するためにではなく、例示のために提供する。
【実施例】
【００８３】
実施例１
ボルガ・ドイツ人の家系由来のＡＤ遺伝子座の遺伝子マッピング ボルガ・ドイツ人の家系は、常染色体優性な早期に発症するアルツハイマー病（AD）を有する７つの血縁家族の群である。これらの家族はドイツ人の一団に由来し、彼らは、1760年代に、ロシアのボルガ河流域に移住した。VGは、周囲のロシア人集団と文化的に異なっていた。そして今世紀まで、明らかに遺伝子的に相対的に隔離されていた。1987年に、Birdおよび共同研究者は、早期に発症するADを有する５人のVGの家系を確認した（Birdら、Ann．Neurol．23:25-31，1988）。続いて、さらに２組の早期に発症するVGの家族が確認された（Birdら、Ann．Neurol．25:12-25，1989）。さらに、VGの家系と同様に、原因遺伝子を有するAPP遺伝子および第14染色体遺伝子座が除外されている、早期に発症する疾患を有する他の家族が確認された。これらの家族は、平均的な発症年齢が55歳から64歳の範囲である４組のスウェーデン人の家族、および平均的な発症が52歳と59歳である２組のオランダ人の家族を含む。７組のVGの家族は、ロシアのボルガ流域の３つの隣接する村の居住者の家系である。共通の祖先を探り出すことはできなかったが、150年の相対的な遺伝子の隔離に関連して考えられる独特の民族的起源から、これらの家族におけるADは、共通の遺伝的な始祖の結果であるようであることが示唆される。これらの家系におけるADの遺伝は、常染色体優性であるようである。これらの家族におけるADの発症は、51歳から65歳の範囲の平均的な発症年齢の家族に対して、40歳から81歳の範囲である（Birdら、前出、表１）。これらの家族のうちで、数多くの罹患被験体が、臨床的および神経病理学的の両方で広範に特徴付けられ、そして各家族の少なくとも１人の罹患した被験体が、剖検確認によりADと診断された。比較的早期の発症年齢を除いて、VGにおけるADは、典型的なADと臨床的および病理学的に区別できない。神経細線維もつれ、Ａβ神経炎斑、およびADに関連する他の変化が、複数の剖検で観察された。
表１．連鎖分析に用いたVGの家系
【００８４】
【表１】
2008035863.tif 000002
*剖検された１人の未患被験体を含む。
†括弧内の数字は、剖検材料から、パラフィンブロックまたは凍結脳のいずれかとして得られたDNAサンプルを示す。
【００８５】
VGの家系におけるADを担い得る遺伝子座は、以前には、遺伝子的にマッピングされていなかった。第21染色体および第14染色体のマーカー（AD3遺伝子座およびAPOE遺伝子座）を用いたVG家族の連鎖分析、ならびに変異分析から否定的な結果が得られた。さらに、VGの家系におけるADを担い得る遺伝子座は、APP遺伝子座でマーカーとともに共分離（cosegregate）せず、そしてAPP遺伝子において変異は検出されなかった。
連鎖分析を用いて、これらのVG家族においてADを引き起こす遺伝子座についてゲノムを精査した。DNAを、37人の罹患被験体を含む139人の個体由来のリンパ球芽様細胞株から調製した。連鎖についての示唆的な証拠が見出された場合、（凍結されたまたはバラフィン中に包埋されたかのいずれかの）剖検由来の組織を用いて、８人のさらなる罹患被験体（これらについては、他の組織は得られなかった）からDNAを調製した。すべての染色体上のマーカーを遺伝子型分類し、そしてロッドスコア法（Morton、Am．J．Hum．Genet．7:277，1955；Hodgeら、Am．J．Hum．Genet．35:1139，1983）を用いて分析した。ゲノムスクリーニングのために、常染色体優性の遺伝が年齢依存性の浸透度（penetrance）および０％の散発の比率であると仮定して、連鎖の証拠を評価した。ロッドスコアはまた、低い（１％）の浸透度モデルを用いてコンピューター処理した。このモデルは、危険性を有する個体の疾患状態についての仮定をせず、従って、連鎖に関する情報が主として罹患個体に由来することのチェックとして作用する（罹患個体においては、疾患遺伝子座の遺伝子型が、危険性を有する被験体の遺伝子型と比較して、より正確に知られている）。重要な対立遺伝子頻度が、VGにおいて評価された頻度より有意に低くない限り、公表されたマーカーの対立遺伝子頻度（ゲノムデータベース）を用いた。この場合、すべての被験体（罹患者、危険性を有する者、および配偶者）を用いて、VGの家系から得られた頻度を用いた。この慎重なアプローチをスクリーニングの間採用した。なぜなら、疾患と共分離する対立遺伝子の頻度の過少評価は、連鎖について偽陽性の証拠をもたらし得るからである（Ott、Am．J．Hum．Genet．51:283，1992）。しかし、このアプローチは、真の対立遺伝子頻度が仮定より低い場合、ロッドスコアを過少評価する。この研究では、162個の公開されて入手可能なマーカーを遺伝子型分類した。これらの中で、70個のSTRPマーカーは、20cM以上離れて、ヘテロ接合性（heterozygosity）値は、ほとんど0.70を超えていた。
【００８６】
本研究は、染色体1q31-42上に以前マッピングされなかったAD遺伝子座の存在を明らかにする。
第１染色体について最初の示唆的なロッドスコアが、マーカー、D1S103（Ｚmax＝1.79、θ＝0.10）およびD1S249（Ｚmax＝1.76、θ＝0.20）について得られた（表２）。これらは、約26cM離れている（図１）。続いて、55cMにまたがるこの領域における21個の他のマーカーを分析した（表２）。慎重なスクリーニング分析条件を用いて、連鎖についての有意な証拠（Ｚmax≧３．０）を、Ｄ１Ｓ４７９（Ｚmax＝4.40、θ＝0.11）を用いて得た。このロッドスコアは、初期の多くの分析により予測されるスコアと類似した。連鎖についての証拠のほとんどが、ＨＢおよびＲの家族に由来し、ポジティブなロッドスコアもまた、Ｗ、Ｈ、およびＨＤの家族について観察される（表３）。続いて、D1S479の112bpの対立遺伝子は、７家族のうちの５家族において、疾患とともに共分離し、これは共通の遺伝子の始祖と一致する。この領域における他のマーカーはまた、ロッドスコアが有意でない（例えば、D1S439、Ｚmax＝2.82、θ＝0.17；D1S320、Ｚmax＝1.87、θ＝0.14；D1S103、Ｚmax＝2.40、θ＝0.008；表２）にもかかわらず、ポジティブなスコアを与えた。
【００８７】
表２は、FADが第１染色体マーカーに連鎖されることを示す。遺伝子型分類を、例えばPCRのような従来の方法によって行った。D1S479についてのすべての遺伝子型を、２連で決定した。マーカー、D1S227、D1S320、D1S213、D1S439、D1S479、D1S225、およびD1S103について、遺伝子型を、パラフィンブロックまたは凍結脳の材料のいずれかに由来する、罹患被験体由来の８サンプルについて決定した（すべてのサンプルを、すべてのマーカーを用いて増幅したわけではない）。ロッドスコアを、コンピュータープログラムLIPED（Ott、Am．J．Hum．Genet.，26:588，1974）を用いて、年齢依存性の浸透度（Morton、Am．J．Hum．Genet.，7:277，1955）を仮定してコンピューター処理した。
【００８８】
表２  第１染色体マーカーへのＦＡＤの連鎖についてのロッドスコア*
【表２】
2008035863.tif 000003
*ロッドスコアは、D1S479を除いて、公表された対立遺伝子座の頻度を用いてコンピューター処理した。このマーカーについては、その112bpの対立遺伝子の対立遺伝子頻度は、群としてVG被験体に由来した。一方、他の対立遺伝子についての頻度は、公表された値（17）に由来した。
†Het.、ヘテロ接合型。
【００８９】
表３では、マーカーD1S479へのADの連鎖についての家族ロッドスコアを示す。
条件１および２は、それぞれ、VGおよびCEPHの対立遺伝子頻度の年齢依存性の浸透度であり；条件３および４は、それぞれ、VGおよびCEPHの対立遺伝子頻度を用いる散発性の補正機能の年齢依存性の浸透度である。Ｈ、ＨＢ、およびＲの家族について、最大のロッドスコアが、D1S479に関して得られた。他の家族について、最大のロッド値が、他のマーカーに関して得られた（ＨＤ；D1S103、Ｚmax＝1.75、θ＝0.001、条件４）、D1S249（ＫＳ；D1S412、Ｚmax＝1.20、θ＝0.10、条件２）、およびD1S439／D1S227（Ｗ；D1S227およびD1S439、Ｚmax＝0.78、θ＝0.001、条件４）。いずれの条件下でもWFL家族について、マーカーはポジティブではなかった。低い（１％）の浸透度モデル下では、Ｚmaxの値は、コントロールおよびVGの対立遺伝子の頻度について、それぞれ、3.04（θ＝0.10）および1.27（θ＝0.15）であった。
【００９０】
表３  D1S479へのＡＤの連鎖についての家族ロッドスコア
【表３】
2008035863.tif 000004
【００９１】
VG家系においで、遺伝子型は、サンプリングした被験体（例えば、図２の世代Ｉ〜IIIのすべての個体）に関連する多くの死亡した個体からは得られない。このデータが得られないという問題のために、マーカー対立遺伝子頻度は、連鎖分析の結果に影響し得る。用いたマーカーのほとんどについて、VG家族における対立遺伝子頻度は、コントロール由来の頻度と類似した。しかし、D1S479は、５組の家族（Ｈ、ＨＢ、ＨＤ、Ｒ、およびＷ）において、コントロールにおける0.04の頻度と比較して、罹患被験体において実質的により頻発した（罹患被験体において0.32、すべてのVG被験体において0.18）。密接に連鎖したマーカー対立遺伝子についての頻度のこのような増大は、予想される。VGの未患の配偶者に基づくコントロール頻度を112bpのD1S479対立遺伝子について用いた場合、D1S479についての最大のロッドスコアは、Ｚmax＝4.40（θ＝0.11）からＺmax＝6.29（θ＝0.10）に増大した（表３）。
【００９２】
連鎖分析は、この家系における表現型模写（phenocopy）（これらの家族において分離する主要な遺伝子以外の何かによって引き起こされる、非AD痴呆の症例またはAD）の存在により影響され得る。表現型模写は、連鎖を検出する能力を減少させ得、そして評価したθを増大させ得る（Cavalli-SforzaおよびKing、Am．J．Hum．Genet．38:599，1986）。表現型模写は、VGの家系における潜在的な問題である。なぜなら、これらの家族におけるADの発症年齢の範囲が82歳までの年齢（表１）に広がるからである。この範囲は、普通の遅く発症するADと重なる。
これらの家族における遅く発症したADの症例の存在を補正するために、表現型模写補正モデルを用いた（Schellenbergら、Am．J．Hum．Genet．53:619，1993）。このモデルは、被験体の発症年齢が上昇するにつれて、症例が表現型模写である可能性が増大すると仮定する。真の表現型模写が存在しない場合、このモデルは連鎖を検出する能力を減少させるという事実にもかかわらず、分析したすべてのマーカーについて、ロッドスコアは増大した（Margaritteら、Am．J．Hum．Genet．50:1231，1992）。D1S479について、Ｚmax値は、112bpの対立遺伝子についてコントロールおよびVG対立遺伝子頻度を用いて、それぞれ、6.29から6.51、および4.40から4.60に増大した。このモデルでは、D1S479の単一の家族についての最大のD1S479ロッドスコアは、Ｒ家族について、2.95（θ＝0.09）であった。これらの結果は、これらの家族におけるADの症例の少なくともいくらかはおそらく表現型模写であるという仮説を支持する。
【００９３】
ハプロタイプを、第１染色体のほぼ55cMにわたる23個のマーカーを用いてＲ家族について構築した（図７）。D1S439／D1S479とD1S306との間の共通するハプロタイプが、１人の罹患被験体を除き、すべてで観察された（IV−１、図７）。この個体は、全領域にわたる疾患ハプロタイプを共有せず、67歳の年齢（これは、家族の平均より、2SDよりも大きくはなれている）で発症し、そしてAPOE遺伝子座でε４／ε４遺伝子型を有した。このAPOE遺伝子型は、遅く発症するADの低い発症年齢と関連する（Corderら、Science 261:921，1993）。従って、この被験体は、表現型模写であり得る。他の家族では、共通する疾患ハプロタイプの明確な帰属は、データがないために、困難であった。そしてそのためには、多方面にわたる多数の分析を必要とする。しかし、D1S479については、112bpの対立遺伝子が、Ｈ、ＨＢ、ＨＤ、Ｗ、およびＲの家系において疾患とともに分離した。ＨＤ家族では、112bpの対立遺伝子を有していない１人の罹患被験体は、75歳の年齢で発症し、そしてAPOE遺伝子座でε３／ε４遺伝子型であった。しかし、発症年齢だけを、被験体が表現型模写であるかを明瞭に決定するために用い得なかった。ＨＢ家族では、75歳までに発症した被験体は、他のより若い罹患被験体と、D1S479の112bpの対立遺伝子を共有した。ＫＳ家族は、罹患被験体の誰もD1S479の112bpの対立遺伝子を有さなかった唯一のVGの家系である。この家族の分析は、発症年齢が遅く（64.8歳）、そして８人の罹患被験体のうち、３人はAPOEのε４／ε４ホモ接合体（57歳、58歳、および67歳の発症年齢）であり、そして４人はε４ヘテロ接合体（67歳、68歳、68歳および71歳の発症年齢）であったために複雑である。従って、ＫＳ家族は、異質性の集団試験では異質性を検出できなかったが、VGの家系での遺伝子的異質性の例であり得る。要約すると、VGの家系のほとんどのADとともに分離する同一の希少な対立遺伝子の発見により、多くの家族について共通の遺伝的な始祖の仮説が支持される。本明細書中に記載されるように、VG人患者由来の配列データにより、この仮説は確認される。
まとめると、これらのデータは、1q31-42でのAD遺伝子座の存在を示す。Ｒ家族における組換えの分析は、D1S225（図２におけるVI−３およびＶ−３の被験体）とD1S217（被験体IV−16）との間としての候補領域（14cMにわたる領域）を規定する（図８）。
【００９４】
実施例２
ＹＡＣを用いる第１染色体からのＡＤ４遺伝子のクローニング
第１染色体に由来するYACクローンを、CEPH−Genethonライブラリーから得、そして２つの異なる方法によってD1S229からD1S103にわたる領域について同定した。
第１の方法において、CEPH−GenethonのYACライブラリーを、PCRに基づくスクリーニングのために整列した。この一般的に入手可能なライブラリー（Bellanne-Chantelotら、Cell 70，1059-1068，1992）を、227枚の96ウェルプレートで21，792個のクローンとして、Glen Evans（Salk Institute）から得た。DNA合成のために、コロニーを、1.5mlの液体培地で別個に増殖させ、回収し、そしてプールした。スフェロプラストを、リチカーゼ（lyticase）での消化により作製した。DNAを、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出、および酢酸ナトリウムとエタノールとの添加による沈殿により精製した。再懸濁およびRNase処理後、DNAはPCR増幅に十分であった。
【００９５】
２次元のYACプールスキームは、PCRスクリーニングによる特定のYACの所在（address）の同定を可能にした（Amemiyaら、Nucl．Acids．Res．20:2559-2563，1992）。ライブラリーを、５セット（４×48および１×35のトレイ）に分割した。各セットの複製を作製した。５セットそれぞれの一方の複製を、第１次元目の基本的な水平プール（各プールは、単一の96ウェルプレート由来のすべてのクローンを表す）のために使用した。第２の複製は、第２次元目の基本的な垂直プール（特定のウェル位置（例えば、セット由来のプレートのＡ１）に由来するクローンを含むプール）のために使用した。各セット内でのプールをさらに合わせ、PCRスクリーニングを容易にした。各セットついて、水平プールを合わせ、４つの超水平プールを作製した。超水平プールのそれぞれは、12の連続したプレート（プレート１〜12、13〜24、25〜36、37〜48）由来のクローンを含有した。２次元目を合わせ、各セットについて８つの超垂直プールを作製した。超垂直プールのそれぞれは、セットにおける各列（Ａ、Ｂ、Ｃ、...など）由来のクローンを含有した。従って、ライブラリーの全体は、19の超水平プール（４×４セット＋３×１セット）および40の超垂直プール（８×５セット）に減少した。このようにして、２回のPCR（すなわち、超プールを用いた第１回目および基本プールを用いた第２回目）の後、候補クローンが見出され得る。多数の当たりが生じる場合、最終のPCRが必要である。
YACライブラリーを、図９に示すように、STS D1S320およびD1S479のプライマーを用いてスクリーニングした。このスクリーニングにより、以下のYACを得た：920e7、859b6、904f3。
【００９６】
第２の方法において、データデースを検索した。CEPH−Genethon INFOクローンデータベースは、遺伝子マーカーに関する情報およびCEPH−GenethoneYACライブラリーにおけるYACCのSTS内容を含む。このデータベースを、以下のマーカーを用いて検索した：D1S229、D1S227、D1S213、D1S479、D1S439、D1S225、D1S103、D1S495。同定されたYACは、以下の通りであった：857h3、934f2、957g10、881b8、913e10、810e5、921d12、865c8、920e7、859b6、736b6、746d7、748h9、748e2、753a5、753d8、753d9、753f9、753f12、753h3、757d8、759b10、757f9、761h10、767b1、767d1、767g1、769f11、786a8、786f11、820g5、824g8、824g9、824g11、826b3、826b5、831e4、849a7、856a7、880d12、897f9、899f1、899h1、920g1、904f3、915e8、922a10、933a8、958e10、978g10，および979f3。これらのYACのいくつかは、検索で用いたマーカーを含有する。そしていくつかは、データベース検索で使用したマーカーを含有するYACに連結される。合計で60個のYACを、組合わせた方法により同定した。
YAC DNAを各YACクローンから調製した。次いで、YAC DNAを、図９に示したプライマーを用いで増幅した。D1S229からD1S103までの領域を部分的に覆うYACのコンティグ地図（contig map）を構築した。
【００９７】
EST T03796（図10）を、ヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルの両方で、第14染色体AD遺伝子クローンに対して相同性を有する配列として、EST GenBankデータベースで同定した。オリゴヌクレオチドプライマー、EP1FおよびEP1R、ならびにKM7749およびKM7750を用いて、PCR増幅を行った（図11）。EST配列より、予想されるサイズは、約140bp（EP1FおよびEP1Rのプライマーについて）または190bp（KM7749およびKM7750のプライマーについて）であった。ヒトゲノムDNAを増幅した場合、1,300bpのバンドが観測された。同じプライマーを用いて、第１染色体のボルガ・ドイツ人の遺伝子領域由来のYACを増幅すると、YAC 921d12の４つの異なる単離物に由来する2.5kbのフラグメントを生じた。921d12の１つの単離物は、このフラグメントを生じなかった。しかしそれは、より小さく、そして2.5kbのフラグメントについて欠失していることが考えられた。YAC 921d12は、D1S439およびD1S479のマーカーを含有すると以前には示されていた。
さらに、Coriell Institute for Medical Researchから得た齧歯類−ヒトのハイブリッド細胞株のパネルもまた、同じプライマーを用いて増幅した。これらの細胞株は、齧歯類（マウスまたはハムスターのいずれか）のバックグラウンドに１つまたはいくつかのヒトの染色体を含有する。ヒトの第１染色体を含有する細胞のみが、2.5kbバンドを有した。
【００９８】
YAC 921d12由来のDNAを、EP1FおよびEP1Rのプライマー、続いてWWFおよびWWR（図11）を用いて増幅して、2.5kbフラグメントが生成した。この2.5kbフラグメントのDNA配列分析を、WWFおよびWWF1Lのプライマー（図２）を用いて行い、配列ELL1.1（図10）を得た；この配列は、その５'末端に、EST T03796の一部分を含有した。この2.5kbフラグメントをまた、WWRおよびWWR1Rのプライマーを用いて配列決定を行い、配列ELL1.2を得た：この配列はまた、T03796由来のDNA配列の一部分を含有した。YAC921d12由来の2.5kbバンドを再度増幅し、精製し、そして以下のプライマーを用いて配列決定した：WWF、WWF1L、WWRおよびWWR1R。これらのDNA分子の配列を図10に示す。このフラグメントにおいて、5'での119bpおよび3'での69bpは、EST配列と同一であった。さらに、スプライスアクセプターおよびドナーの配列を、EST配列の両接続部で観測した。このことは、介在配列が第１染色体の遺伝子のイントロンであることを示唆する。従って、EST T03796は、YAC 921d12上に存在し、そしてボルガ・ドイツ人のAD遺伝子の少なくとも一部を含有する候補である。
【００９９】
AD遺伝子をコードするcDNAを以下のようにして単離した。ウェルナー（Werner）症候群線維芽細胞cDNAライブラリーまたはB616ヒト脳cDNAライブラリー由来の百万個のクローンをプレーティングし、Duralonメンブラン（Stratagene）に移した。フィルターを、Church-Gilbertハイブリダイゼーション液（0.5Ｍリン酸ナトリウム、pH7.0、７％(w/v)SDS、１％(w/v)BSA）中で、65℃で、30分間プレハイブリダイズし、そしてEP1プライマーから増幅された140塩基対のPCR産物（EST T03796の140bp）あるいはKM7749およびKM7750プライマーから増幅された190bpのPCR産物の1500,000cpm／mlを用いてスクリーニングした。プローブを、ランダムプライム法（Boehringer-Mannheim）を用いて30分間標識し、そして取り込まれなかったヌクレオチドをMicrospin s-200 HRカラム（Pharmacia）により除いた。フィルターを16時間ハイブリダイズし、次いで65℃で２×SSC／0.1％SDS中で、その後0.1×SSC／0.1％SDS中で、それぞれ15分間洗浄した。オートラジオグラフを16時間曝露し、そして線維芽細胞ライブラリー由来の４つの１次候補および脳ライブラリー由来の５つの１次候補を単離した。これらの１次候補は、再スクリーニングに際して陽性であった。２番目の陽性物をＳＭ緩衝液中に拾い、そして公開されたプロトコル（Stratagene）を用いて保存した。
【０１００】
さらに、上記の線維芽細胞cDNAライブラリーの整列されたバージョンでの600,000個のクローン（Munroeら、Proc．Natl．Acad．Sci USA92:2209-2213，1995）を、PCR法を用いてスクリーニングした。EP1およびWW1のプライマー対を用いて、プレートプール（１〜48）をスクリーニングした。EP1プライマー対は、プレート11、17、および36で陽性であった。一方、WW1プライマーは、プレート17および36で陽性であった。PCRを行って、行および列の所在を決定した場合、２つの所在のみが決定された：プレート17のＣ７（両方のプライマー対）およびプレート17のＣ11（WW1のみ）。個々のウェルでの確認のPCRは、17Ｃ11についての産物のみを示した。両ウェルを３次スクリーニングのためにプレーティングし、そしてプラーク精製されたファージを得た。EP1 PCR産物を用いて、上記のスクリーニングを行った；陽性プラークを、17Ｃ11について単離し、そして上記のように保存した。最終的に精製された陽性プラークを、11、15Ａ、15Ｂ、およびＣ11、PS2−６、PS2−10、およびPS2−41と命名した。
次いで、第１染色体由来の配列を用いて、いくつかのcDNAライブラリーをスクリーニングした。長さが2.2kbの陽性クローンを単離し、そして配列決定した。
図１に示す配列は、PCRフラグメントの両端と明らかに重複していることを示す。
重複する配列を有するさらなるEST配列、およびさらなるcDNA配列を、ライブラリーをスクリーニングすることによりさらに得た。
【０１０１】
実施例３
罹患ＶＧ患者における変異 
RT-PCRを用いて、遺伝子全体を、罹患VG個体および未患個体の両方から増幅した。未患個体は、VG家族出身であり、そして非関連の家系に由来する。得られた配列を分析した。罹患個体では、コドン141でのヌクレオチドの変化（AAC→ATC）が存在し、その結果アスパラギンからイソロイシンへのアミノ酸変化（N141I）をもたらした。相応する年齢の未患個体のいずれにおいても、このような変化は見出せなかった。変化した領域でのアミノ酸配列は、未患個体ではＬＬＮＳＶＬＮＴＬＩＭＩＳＶＩＶＶＭＴＩであり、そして調べた罹患個体ではＬＬＮＳＶＬＩＴＬＩＭＩＳＶＩＶＶＭＴＩである。N141I変異を有する罹患被験体は、最初にスクリーニングした７組のVG家族の５組（Ｈ、ＨＢ、ＨＤ、Ｒ、Ｗ）で同定された。N141I変異を有するすべての被験体はまた、D1S479の112bp対立遺伝子（対立遺伝子Ｈ、図７）を有した。その後、２組のさらなるVG家族（ＥおよびＢＥ）を、N141I変異についてスクリーニングした。両方の家系において、罹患被験体は、N141I変異およびD1S479の112bp対立遺伝子を有した。合計で、N141I変異が、20人の罹患被験体で直接観察され、そしてさらなる６人のAD被験体で配偶者／子供遺伝子型から存在することが推定された；26人の被験体の発症年齢は、44歳から75歳の範囲であった。N141I変異はまた、23〜67歳の範囲の年齢の危険性を有する15人の被験体（罹患N141Iキャリアの家系）においても観察された。VG配偶者（ｎ＝17）は、N141I変異を有していなかった。スクリーニングしたさらなる集団は、84人の正常なコーカサス人、配偶者、67の晩期発症家族性FAD家族からの危険性を有する被験体および罹患被験体（ｎ＝223罹患被験体）、そしてAD診療集団からの48人の罹患散発性被験体を含んだ。
N141I変異に加えて、他に３つの変化が、ヌクレオチド436（Ｃ→Ｔ、被験体ＨＢ）、496（Ｃ→Ｔ、被験体ＨＤおよびＷ）、および628（Ｃ→Ｔ、被験体ＨＤおよびＷ）で同定された。これらの変化は、これらの部位でコードされるアミノ酸（それぞれ、アラニン、アスパラギン、およびヒスチジン）を変えなかった。
【０１０２】
実施例４
ＡＤ４遺伝子およびそのタンパク質産物の特徴付け
第１染色体由来のVGの配列を、記載のように、いくつかのクローンの配列から構築した。その配列を図１に示す。このDNA配列から推定されるアミノ酸配列を図２に示す。この配列と、第14染色体由来のAD3遺伝子の配列との比較により、配列相同性が示される。配列分析ソフトウエアのWisconsinパッケージのプログラムＧＡＰ（Ver．8.0.1−UNIX，1994年９月）を用いて構築された、タンパク質および遺伝子のアライメントを図３に示す。AD4遺伝子のアミノ酸配列は、AD3遺伝子産物に対して約67％の同一性を示す。AD4遺伝子産物のいくつかの注目すべき特徴を図５に示す。
【０１０３】
第１染色体のAD遺伝子によりコードされるタンパク質は、膜展開領域であると推定される７つの疎水性セグメント（図４）により判断されるように、膜タンパク質である。AD4タンパク質はまた、STM2ともいわれる。STM2について、すべての推定される膜貫通ヘリックスは、リジン残基によりカルボキシル末端でキャップされ、膜貫通ドメインのまさに末端、またはその末端の数残基以内のいずれかで見出される。N141I変異（親水性アスパラギン残基から疎水性イソロイシン残基への変化）は、予想される第１の膜貫通ドメインに直に隣接する位置にある。
【０１０４】
心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、および膵臓由来のヒトポリＡ＋mRNAの２μｇを含むノーザンブロット（Clontech）を、プローブとして、2.3kbのAD4 cDNAクローンを用いてハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションを、0.75Ｍ NaCl、0.05Ｍ NaH2PO4、５mM Na2EDTA、10×デンハルト液、100μｇ／mlサケ精子DNA、50％ホルムアミド、２％SDS中で、42℃で、18時間行った。フィルターを、0.1×SSC、0.1％SDSを用いて、65℃で洗浄した。種々のヒト組織由来のRNAのノーザンブロット分析は、サイズが約2.4kbおよび2.8kbである、２つのAD4関連の転写物を明らかにした。大きい方の転写物は、主として、胎盤、骨格筋および心臓で発現するようである。一方、小さい方の転写物は、心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋および腎臓で検出されるが、肺では検出されない。3'非翻訳領域由来の配列タグ部位（STS）を用いて、AD4が第１染色体に、そしてYAC 921d12にマッピングされることを確認した。観察された２つの転写物は、恐らく、オルターナティブポリアデニル化の結果である。なぜなら、２つの予想されるポリアデニル化シグナルが、３'非翻訳領域で、ヌクレオチド1834および2309で同定されたからである。ノーザンブロット分析由来のSTM2のメッセージのサイズ（2.4kbおよび2.8kb）は、全長のDNA配列から推定される2.3kbのサイズ、およびこの配列中で観察された第２のポリアデニル化部位により推定される1.8kbのサイズよりわずかに大きい。この見かけ上の不一致は、サイズマーカーの変則的な移動に起因し得る。これは、以前に、このタイプのノーザンブロットで観察されていた。
【０１０５】
STM2の正常な細胞機能は不明である。このタンパク質は、spe4（STM2に対する配列類似性を有ずるC.elegans遺伝子）に機能的に類似している場合、タンパク質の細胞質分配での役割を果たし得る。STM2での変異は、APPの細胞内のタンパク質移動を変化させ、そして最終的には、変化したAPPプロセシングおよびＡβ1-40またはＡβ1-42（アミロイドβタンパク質）の増加した産生を導く。この考えと一致して、AD3キャリア由来の繊維芽細胞株での最近の研究は、42位で終わるＡβの分泌が、非キャリア細胞株と比較して増加することを示した。あるいは、STM2は、Ｇタンパク質結合レセプターとして、またはイオンチャンネルとして機能し得る。
【０１０６】
実施例５
第１染色体上のＡＤ遺伝子のクローニング 
この遺伝子は、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーから、あるいはゲノムDNAまたはmRNAから得られ得る。本明細書中で提供される遺伝子のヌクレオチド配列を用いで、オリゴヌクレオチドを設計し得る。プライマーは、至適には、長さが18〜25ヌクレオチドであり、そして好ましくは50％を超えないＡＴ塩基対を含み、Ａで終わらず、そして自己相補的な領域を有するべきでない。
【０１０７】
オリゴヌクレオチドを、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーでのハイブリダイゼーションプローブとして用い得る。cDNAライブラリーについて、特定の起源（例えば、細胞株または組織のサンプル）由来のmRNAをcDNAに転写し、そして適切なベクター（例えば、λgt10、λZAP、pBS、またはpSPORT）に挿入する。（Sambrookら、Molecular Cloning，Cold Spring Harbor，1989、参照）。組換えベクターを適切な細菌株（例えば、DH5αまたはKW257）に導入し、そして細胞を増殖培地に播種する。あるいは、種々の起源由来のRNAを呈示するcDNAライブラリーを購入する（例えば、Clontech Laboratories）。いずれの場合でも、コロニー（プラスミドについて）またはプラーク（ファージについて）をニトロセルロース膜またはナイロン膜に移し、そしてハイブリダイゼーションのために調製する（Sambrook、前出）。オリゴヌクレオチドプローブを、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、32Ｐでその5'末端を標識する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を、プローブの長さおよびＧＣ含量について標準的な条件下で行う（Sambrookら、前出、参照）。
【０１０８】
AD4遺伝子を含むゲノムクローンの単離については、ゲノムライブラリーを、標準的な方法（Sambrookら、前出）により構築するか、または市販の供給源（Clontech、Stratagene、Research Genetics、およびGenome Systems）から入手する。ライブラリーを、ファージ、コスミド、P1、BAC、またはYAC中で構築し、そしてcDNAライブラリーについて記載したようにプローブする。ハイブリダイズするコロニーまたばファージを拾い、精製し、そしてDNA調製のために増殖する。
【０１０９】
全長の配列が、記載されたクローニング法およびスクリーニング法により得られない場合、全長の配列は、さらなるクローンをスクリーニングすることにより、RACE（FrohmanおよびMartin、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:8998-9002，1988）、連結アンカーPCR（Trouttら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:9823-9825，1992）、または他の類似する方法により得られ得る。クローンがAD4配列を含む確証は、そのクローンのDNA配列の決定および本明細書中で提供されるAD4の配列との比較により得られ得る。90％またはそれより多くの配列同一性は、そのクローンがAD4をコードすることを示す。いくつかのミスマッチは、多型またはDNA配列のエラーに起因し得る。
【０１１０】
実施例６
変異の検出 
AD4遺伝子における変異を、ヌクレオチド配列分析により決定し得る。末梢血細胞を、静脈穿刺および赤血球の低張（hypotonic）溶解により患者から得る。DNAまたはmRNAをこれらの細胞から単離し、そしてAD4遺伝子を増幅により単離する。オリゴヌクレオチドプライマーを、本明細書中で提供されるcDNA配列またはゲノム配列に基づいて選択する。Primer 2.2のようなコンピュータプログラム（これは、Whitehead/MIT Center for Genome Researchのwebサーバーから一般に入手可能である）は、オリゴヌクレオチドプライマーの選択の補助となる。mRNAを核酸の供給源として用いる場合、第１鎖のcDNAを標準的な方法により合成する。DNAの増幅を行い、そしてPCR産物のDNA配列を決定する。患者および正常コントロールから得られた配列の比較により、変異の同定が可能になる。
【０１１１】
さらに、AD4遺伝子におけるN141I変異は、Sau3AI制限部位を作出し、これは変異対立遺伝子の迅速なスクリーニングのために使用され得る。ゲノムDNAまたはcDNAは、Sau3AI制限部位について直接スクリーニングされ得るか、またはコドン141に隣接するプライマーを用いてPCRにより増幅され得る。DNAまたは増幅されたDNAをSau3AIで制限切断し、そして適切な割合のアガロースゲルで電気泳動する。Sau3AI部位の存在を、増幅された産物のエチジウムブロミド蛍光により、またはナイロン膜へのゲルの転移後のプローブハイブリダゼーションにより検出する。適切なプローブは、コドン141の近くの配列またはそれを含む配列を含有するオリゴヌクレオチドまたはDNAフラグメントである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの場合、コドン141をまたがらない、少なくとも24塩基が存在する。
【０１１２】
図12に示すように、N141I変異は、増幅後、検出可能である。約60〜100ngのゲノムDNAをそれぞれ40ngのプライマー、WWFおよびINTIR（イントロンのプライマー5'-GTGGGGCAGACGGAGAGAA-3'）、1.5mM MgCl2、および200μM dNTPを用いて増幅した。増幅を、95℃で３分間の最初のインキュベーション、その後94℃での45秒、60℃での45秒、および72℃での45秒の35サイクル、および72℃で10分間の最終インキュベーションにより行った。160bpのPCR産物（20μｌ中で）を10ＵのSau3AIで消化し、フラグメントを非変性12％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離した。フラグメントを、エチジウムブロミド染色により可視化した。
【０１１３】
N141I変異は、102bp、58bp、43bp、および15bp（示さず）のフラグメントをもたらす。一方、非キャリアは、102bpおよび58bpのフラグメントのみを有する。レーンは以下の通りである：１、危険性を有する、79歳；２、罹患、60歳で発症；３、危険性を有する、67歳；４、罹患、75歳で発症（表現型模写と推定される）；５、Boehringer Mannheim DNAサイズ標準Ｖ；６、罹患、52歳で発症；７、罹患、46歳で発症；８、罹患、49歳で発症。
【０１１４】
実施例７
ＡＤ４ゲノム領域のＤＮＡ配列の決定 
AD4遺伝子由来のDNAの2.5kbフラグメントを、プライマーWWFおよびWWRを用いてYAC 921d12DNAから増幅し、そしてニックトランスレーションにより放射性標識した（Sambrookら、前出）。このフラグメントにハイブリダイズするヒトゲノムクローンを、市販のライブラリー（Genome Systems P1ライブラリー）において同定した。ハイブリダイゼーションを、製造者の説明書に従って行った。AD4cDNAの5'末端および3'末端に特異的なプライマーを用いるPCR増幅により、P1クローン（Genome Systemsの命名法でクローン＃6004）がAD4遺伝子全体を有することが確認された。
P1クローン6004由来のDNAを剪断し、そしてSmaIでの消化および脱リン酸化により調製したM13mp18ベクターにサブクローン化した。ベクターをNovagen（カタログ＃69996-1）から購入し、そしてフラグメントを製造者の説明書に従いクローン化した。約1600個のクローンを単離した。インサートの配列を、製造者の説明書に従い、ABI373Aにおいて蛍光検出により決定した。データを、プログラムXgap（Staden，R．(1994)The Staden package、「Methods in molecular biology」A.M．GriffinおよびH.G．Griffin編、第25巻、９−170頁、Humana Press）を用いてアセンブリした。エキソンを、cDNA配列をアセンブリに組み入れることにより同定した。
AD4遺伝子の12エキソンの配列および隣接するイントロン配列を、図13〜19に示す。これらの配列におけるエキソンの相対的な位置を、表４に列記する。
【０１１５】
表４  ゲノムライブラリーにおけるエキソンの位置
【表４】
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【０１１６】
実施例８
患者ＤＮＡからの遺伝子の単離および多型の検出 
アルツハイマー病の処置は、神経変性の発症の前に開始される場合、より効果的である。しかし、現在の診断は、知覚機能の実質的な喪失後の患者を効果的に同定するにすぎない。基本的に、検出可能な原因を有さない老齢の患者における知覚機能の喪失が、アルツハイマー病の主要な指標である。この疾患の厳密な確認は、剖検によってなされる。アルツハイマー病の開始または進行を阻止する処置は、いずれも、より早期の診断がなされた場合、さらにより効果的である。
【０１１７】
AD4遺伝子の１つの優勢な変異は、アルツハイマー病の早期の発症を引き起こすことが知られている。この遺伝子における他の変異または同じ遺伝子ファミリーの他のメンバーにおける他の変異は、アルツハイマー病を引き起こし得るか、またはそれに寄与し得る。本発明者らは、本明細書中で、AD4遺伝子における変異を検出する方法を提供する。同じ技術により、この遺伝子ファミリーの他のメンバーにおける変異の検出が可能になる。
【０１１８】
12個のAD4エキソンを有する10個のフラグメントをPCR増幅するために用いた10対のオリゴヌクレオチドプライマーを、表５に列記する。DNAを、患者血液サンプルから単離し、そして個々のPCR反応を、Perkin-Elmer PCRキットを用いる各プライマー組を用いて、製造者の説明書に従い、Perkin-Elmer 9600PCR機械で、以下のサイクル条件で行った：92℃で２分間、92℃での20秒間、指示されたアニール温度での45秒間、および72℃での３分間の35サイクル、その後72℃での７分間。PCRフラグメントを、Sephracyl-500HR樹脂を有する96ウェル型スピンカラムでゲルろ過により精製する（Wang，Gan BoysenおよびHood，Anal．Biochem．226:85-90，1995）。変異を、表６に列記される各エキソンに特異的な配列決定プライマーを用いで、ABI373Aにおいて蛍光色素停止配列決定により検出する。多くの他の変異検出様式が、PCR増幅されたフラグメントを用いて可能である。
【０１１９】
診断試験は、アルツハイマー薬物による早期の介入のための、患者を標的する最終的な使用に加えて、いくつかの使用を有する。第１に、いずれものアルツハイマー薬物の臨床試験は、この疾患の傾向を与える遺伝子における対立遺伝子変化をモニターすることから利益を受ける。患者の遺伝背景は、この疾患の開始についての異なる機構と相関され得る：一つの疾患機構に対して効果的な薬物は、他の機構により引き起こされる疾患に対して効果的でなくてもよい。第２に、臨床試験が、異なる遺伝背景が薬物の効率と相関することを示す場合、診断は、適切な処置を選択するために用いられ得る。
【０１２０】
表５  エキソンフラグメントのＰＣＲのためのプライマー
【表５】
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【０１２１】
表６  ＰＣＲテンプレート由来のエキソンを配列決定するためのプライマー
【表６】
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【０１２２】
実施例９
ＳＴＭ２の発現
STM2の発現パターンを、ノーザンブロット分析により、多数の組織で調べた（図20）。プローブを、ADC22R2およびADC22L5のプライマーを用いて、STM2 cDNAクローンを増幅することにより作製した。同一のパターンが、DMO1018およびDMO1021、またはDMO1009およびDMO1014のプライマー対を用いて作製されたプローブで得られた。STM2に対応する2.4kbメッセージが、サンプリングした脳のすべての領域を含む、調べたすべての組織で観察された。（腎臓、肝臓および肺では、同じノーザンブロットのより長期の露光により、STM2が、これらの組織において低いレベルで存在することが示された；データは示さず）。高い発現レベルが、膵臓、心臓、および骨格筋で観察された。これらの３つの組織では、第２の2.8kbの転写物が観察された。STM2 cDNA配列から、２つの可能なポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド1834および2309で同定された（全クローン長、2167bp）。
【０１２３】
2.4kbおよび2.8kbの転写物が、異なる長さの3'UTRポリアデニル化変異体を表すかどうかを決定するために、RNAブロットを、3'UTR全体にまたがるプローブ、および第１のポリアデニル化部位後から始まるプローブを用いてハイブリダイズさせた。両方のプローブは、同一のパターンを与えた。このことは、第２のポリアデニル化部位のみが使用されたことを示す。
【０１２４】
STM2のホモログを同定する試みにおいて、肝臓および膵臓のcDNAを、STM2配列に基づく縮重プライマーを用いて増幅した。22個のM13組換えクローンを同定し、そして配列決定した。すべては、STM2に対応する。22個のクローンの７個は、cDNA配列中のヌクレオチド1327で始まる配列GAGATGGAAGACを有した。これは、以前に報告された配列（AGATGG|AAGAAGAC、ここで「|」は、エキソン９と10との接続を示す）よりも３bp短い。短い方の転写物は、フレームシフトを有することなく、ＥＭＥＥＤに対して１アミノ酸短い推定タンパク質（ＥＭＥＤ）をコードする。短い方の転写物は、エキソン10のオルターナティブスプライシングの結果であるようである。これは、スプライスアクセプター配列として用いられる最初のコードＡＧジヌクレオチドまたは多型を有する。これらの可能性を区別するために、RNAおよびDNAを、ＨＤ家族における正常な（非AD）VG被験体由来のリンパ芽球細胞株から調製した。両方の転写物が、エキソン９および10由来のEX103LおよびEX102Rのプライマーを用いるRT-PCR産物中に存在していた。しかし、同じ被験体由来のゲノムDNAのイントロン９からエキソン10への領域を配列決定した場合、ゲノム配列に対応する単一の配列が得られた。従って、２つの異なる転写物は、オルターナティブスプライシングに由来する。両方の転写物はまた、ともに、白血球、骨格筋、および１つの胎児脳ライブラリー（Clontech）中で観察され、長い方の転写物がより豊富であった。しかし、別の胎児脳ライブラリー（Stratagene）では、長い方の転写物のみが観察された。一方、包皮繊維芽ライブラリーにおいては、短い方の転写物のみが見出された。
【０１２５】
表７  ＲＮＡ分析のためのプライマー
【表７】
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【０１２６】
上記より、本発明の特定の実施態様が例示の目的のために本明細書中に記載されているが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲による以外には制限されない。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１Ａ】図1Aは、AD4遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｂ】図1Bは、AD4遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図２】図２は、AD4遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、AD3遺伝子産物に対する代表的なAD4遺伝子産物の配列アラインメントを示す。配列間の垂直線は、配列同一性を示す。配列間のコロンは、強い配列類似性を示す。配列間の点は、中程度の配列類似性を示す。いずれかの配列に挿入された点は、アラインメントのスコアを最大にするために配列に挿入されたギャップを示す。
【図４】図４は、AD4遺伝子産物のハイドロパシープロットを示す。このプロットは、この遺伝子産物の７つの推定の膜貫通領域が存在すること、および残基141での変異（アスパラギンからイソロイシン）を示す。
【０１２８】
【図５】図５は、202〜205位および251〜254位の４アミノ酸（KPGL）の保存配列を含む、代表的なAD4遺伝子産物の特定の配列特徴を示す。この各々は推定の膜貫通領域のＣ末端にあり、そしてヒトおよびマウスのAD3遺伝子産物において保存される。図５はまた、推定のグリコシル化部位（アスパラギン366）を示す。
【図６】図６は、ヒトAD3遺伝子産物と代表的なAD4遺伝子産物とを比較するドットプロットである。黒いブロックは、推定の膜貫通領域間の配列類似性を示す。
【図７】図７は、Ｒ家族における第１染色体マーカーの分離を示す家系樹を示す。各被験体の下の棒は、D1S238〜D1S235までの23個のマーカーを用いて構築された最小の組換えハプロタイプを示す（表２）。示した対立遺伝子（上から下）は、D1S249、D1S237、D1S479、D1S439、およびD1S225についてであり、ここで、Ａは公開された最大の対立遺伝子である。黒棒は、疾患とともに分離するハプロタイプを示す。他のハプロタイプは、異なる網またはマーキングの棒により示される。部分的に失われた棒は、遺伝子型でないマーカーを示す（被験体IV-15）。””記号は、相をあてはめることができなかった領域を示す。APOE遺伝子型を、ハプロタイプのすぐ上に、それぞれε3およびε4対立遺伝子である３および４とともに示す。組換え体は、被験体V-1およびV-3においてD1S479/D1S439とD1S225との間、および被験体IV-18におけるD1S306とD1S310間の疾患ハプロタイプに観察された（示さず）。IV-16において、D1S217とD1S237との間の組換えが存在する。第IV世代において第27染色体のD1S249とD1S237との間に合計４つの組換え（非疾患関連染色体上での３つ）が観察された。これらのマーカーの間の距離は12cMであり、そして４つの組換えが観察される機会は41％である。
【０１２９】
【図８】図８は、第１染色体マーカーの位置を示す。距離を、Kosambiマップ関数を使用してセンチモルガン（性別平均）で与える。３つのマップは、すべてがいくつかの共通の遺伝型を含むように、独立していない。
【図９】図９は、第１染色体の多型領域を増幅するために用いたプライマーの配列を示す。
【図１０】図10は、クローン788ilh5、EST T03796、およびクローンElll.1およびELL1.2のDNA配列を示す。
【図１１】図11は、AD4遺伝子配列のPCRまたは配列決定に用いたプライマーのDNA配列を示す。
【図１２】図12は、WWFプライマーおよびINTIRプライマーを用いて増幅したゲノムDNAの臭化エチジウム染色したゲルを示す。レーンは、以下である：１、危険性を有する、79歳；２、罹患、発症60歳；３、危険性を有する、67歳；４、罹患、発症75歳（推定の表現型模写）；５、Boehringer Mannheim DNAサイズ標準Ｖ；６、罹患、発症52歳；７、罹患、発症46歳；８、罹患、発症49歳。
【０１３０】
【図１３】図13は、AD4の部分的ゲノムDNA配列を示す。
【図１４】図14は、AD4の部分的ゲノムDNA配列を示す。
【図１５】図15は、AD4の部分的ゲノムDNA配列を示す。
【図１６】図16は、AD4の部分的ゲノムDNA配列を示す。
【図１７】図17は、AD4の部分的ゲノムDNA配列を示す。
【図１８】図18は、AD4の部分的ゲノムDNA配列を示す。
【図１９】図19は、AD4の部分的ゲノムDNA配列を示す。
【図２０】図20は、異なる組織におけるSTM2の発現パターンを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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