(57)【要約】【課題】セミIPNゲルおよびそれを用いた生体関連物質固定化マイクロアレイを提供する。【解決手段】モノマーと架橋剤とキャプチャープローブとの共重合により作製される網目構造体からなるゲルと、当該ゲルの構成成分とは共有結合しないポリマー成分とを含む、ゲル組成物、前記ゲル組成物が管状体の中空部に保持されているゲル保持管状体、前記ゲル組成物が基板上の区画に配置されたマイクロアレイ、並びに、以下の工程を順次含むマイクロアレイの製造方法を提供する：（ａ）複数本の管状体をそれらの長手方向が一致するように集束する工程、（ｂ）集束物の各管状体の中空部に、請求項１記載のゲルを保持する工程、ならびに、（ｃ）集束物を、管状体の長手方向と交叉する方向で切断する工程。【選択図】 図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノマーと架橋剤とキャプチャープローブとの共重合により作製される網目構造体からなるゲルと、当該ゲルの構成成分とは共有結合しないポリマー成分とを含む、ゲル組成物。
【請求項２】
モノマーが1成分または2成分から成る請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ポリマーが1成分または2成分から成る請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
ポリマーの少なくとも1成分が相転移温度を有するポリマーである請求項３記載の組成物。
【請求項５】
相転移温度を有するポリマーが、N-イソプロピルアクリルアミドである請求項４記載の組成物。
【請求項６】
ポリマーの少なくとも1成分が両イオン性ポリマーである請求項３記載の組成物。
【請求項７】
両イオン性ポリマーが、N,N-ジメチル（アクリルアミドプロピル）アンモニウムプロパンサルフォネイトである請求項６記載の組成物。
【請求項８】
ポリマーの少なくとも１成分と、モノマーの少なくとも１成分とが同一成分である請求項１または２記載の組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のゲル組成物が管状体の中空部に保持されているゲル保持管状体。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のゲル組成物が基板上の区画に配置されたマイクロアレイ。
【請求項１１】
区画が複数の溝または貫通穴で形成されている請求項１０記載のマイクロアレイ。
【請求項１２】
請求項９記載の管状体を複数本集束させた集束物を管状体の長手方向と交差する方向で切断して得られるマイクロアレイ。
【請求項１３】
以下の工程を順次含むマイクロアレイの製造方法：
（ａ）複数本の管状体をそれらの長手方向が一致するように集束する工程
（ｂ）集束物の各管状体の中空部に、請求項１記載のゲルを保持する工程、ならびに
（ｃ）集束物を、管状体の長手方向と交叉する方向で切断する工程。
【請求項１４】
モノマーと架橋剤とを含むゲル重合液と、当該ゲルの構成成分とは共有結合しないポリマー成分とを混合し、重合させることを特徴とするゲル組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノマーと架橋剤とキャプチャープローブとを共重合して作製される網目構造体ゲル中に、当該ゲルを構成する成分とは共有結合しないポリマー成分を含むゲル、及びそれを用いた生体関連物質固定化マイクロアレイに関する。該マイクロアレイは遺伝子発現解析等に使用される。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の分析手段として、特定のプローブを使用して所望の遺伝子の変異解析及び発現解析を一括して実施できるDNAマイクロアレイが開発されている。DNAマイクロアレイとしては、例えば、２次元表面上にフォトリソグラフィーを用いてキャプチャープローブを逐次的に合成されたマイクロアレイ（特許文献１）、予め合成されたキャプチャープローブが２次元表面上にスポッティングされたマイクロアレイ（特許文献２）、樹脂板等の基板に複数の溝又は貫通孔が形成され、それらの溝又は穴の内部にDNAを含むゲルが保持されたマイクロアレイ（特許文献３）、平面基盤上にDNA等を含むゲルのスポットが配置されたマイクロアレイ（特許文献４）等が知られている。本発明者らの一部も中空繊維の中空部にゲルを保持した中空繊維配列体を作製し、該配列体の繊維軸と交叉する方向で切断することにより得られるマイクロアレイを開発している（特許文献５）。
ゲルを使用したマイクロアレイ（特許文献３〜５参照）（ゲルマイクロアレイという）は、２次元表面にキャプチャープローブが固定されたマイクロアレイに比べて、一区画に固定化できるプローブ量が増加することから、ハイブリダイゼーション効率に優れたマイクロアレイといえる。
上記ゲルマイクロアレイは、検査の対象となる試料（以下、検体）がゲルの多孔質構造中で十分に拡散し、ゲル中のキャプチャープローブと反応することにより、高いハイブリダイゼーション効率を達成することができる。しかし、これまでに知られているゲルマイクロアレイでは、ゲルの多孔質構造の中を検体が十分に拡散できず、検査に使用できる領域はゲル表面に限定される場合もあった。
このため、ゲルの多孔質構造の有効細孔径を大きくし、検体の拡散を向上させる目的で、ゲルを構成するモノマーの種類の検討、モノマー濃度の検討等が行われている。例えば、特許文献６には、マイクロアレイに使用する好適なゲルとして、N,N-ジメチルアクリルアミドを２〜７質量％含むゲルを使用することにより、高いハイブリダイゼーション効率を得ることができると記載されている。また、N-イソプロピルアクリルアミド等の感温性ゲルを利用する方法も知られている（非特許文献１）。
さらにN-イソプロピルアクリルアミド等の感温性ゲルの体積変化を利用し、ハイブリダイゼーションの有無を検出する方法なども知られている（特許文献７）。
【特許文献１】米国特許第5405783号
【特許文献２】米国特許第5601980号
【特許文献３】特開2000-60554号
【特許文献４】米国特許第6682893号
【特許文献５】特開2000-270877号
【特許文献６】特許第3654894号
【特許文献７】特開2005-106533号
【非特許文献１】化学工学会第６９年会  I316：「DNAチップ構築のための感温性多孔質ゲルの応用」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、ゲルの濃度を下げて、ゲルの多孔質構造の有効細孔径を大きくする試みは、ゲルの強度が弱くなるため、基板表面や貫通孔にゲルを配置、保持した際、基板表面や貫通孔からゲルが脱落するという問題がある。従って、このような解決手段では、検体の拡散度を向上させ、かつ、ゲル強度を高めるという２つの課題を両者とも解決できるゲルを作製することは困難である。また、N-イソプロピルアクリルアミドのような相転移温度（LCST）を持つモノマーと架橋剤のみでゲル化させた場合、LCST以上の温度で重合した際、重合中に多孔質構造を形成し、不透明なゲルが形成される。このようなゲルは、有効細孔径は大きくなり、検体の拡散速度が速くなるが、例えば蛍光により検体を検出する際に、ゲル内部まで励起光が到達せず、ゲル全体の検体量をすべて検出することが極めて困難であった。またN-イソプロピルアクリルアミド（以下NIPAM）のようなLCSTを持つモノマーおよび持たないモノマーならびに架橋剤からなるゲルを用いた場合、相転移挙動が不十分であるため、十分な多孔質構造を有するゲルの構築は難しい。
そこで、本発明は上記課題を解決し得るゲル及びそれを用いたマイクロアレイを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記問題点を解決するために鋭意検討した結果、モノマーと架橋剤とキャプチャープローブとを共重合して作製されるゲルと、ゲル中に当該ゲルを構成する成分とは共有結合していないポリマー成分とを含むゲル組成物を作製することに成功した。また、本発明者は、モノマー、架橋剤およびキャプチャープローブを共重合して作製されるゲルと、ゲル中に当該ゲルを構成する成分とは共有結合しないポリマー成分とを含むゲル組成物を核酸のハイブリダイゼーションに使用すると、ハイブリダイゼーション時にはゲルのネットワーク構造が不均一となり、ゲルのポアサイズが拡大し、且つ検出時にはゲルのネットワークが均一に変化し、透明となることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）モノマーと架橋剤とキャプチャープローブとの共重合により作製される網目構造体からなるゲルと、当該ゲルの構成成分とは共有結合しないポリマー成分とを含む、ゲル組成物。
（２）モノマーが1成分または2成分から成る（１）記載の組成物。
（３）ポリマーが1成分または2成分から成る（１）又は（２）記載の組成物。
（４）ポリマーの少なくとも1成分が相転移温度を有するポリマーである（３）記載の組成物。
（５）相転移温度を有するポリマーが、N-イソプロピルアクリルアミドである（４）記載の組成物。
（６）ポリマーの少なくとも1成分が両イオン性ポリマーである（３）記載の組成物。
（７）両イオン性ポリマーが、N,N-ジメチル（アクリルアミドプロピル）アンモニウムプロパンサルフォネイトである（６）記載の組成物。
（８）ポリマーの少なくとも１成分と、モノマーの少なくとも１成分とが同一成分である（１）または（２）記載の組成物。
（９）上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載のゲル組成物が管状体の中空部に保持されているゲル保持管状体。
（１０）上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載のゲル組成物が基板上の区画に配置されたマイクロアレイ。
（１１）区画が複数の溝または貫通穴で形成されている（１０）記載のマイクロアレイ。
（１２）上記（９）記載の管状体を複数本集束させた集束物を管状体の長手方向と交差する方向で切断して得られるマイクロアレイ。
（１３）以下の工程を順次含むマイクロアレイの製造方法：
（ａ）複数本の管状体をそれらの長手方向が一致するように集束する工程、
（ｂ）集束物の各管状体の中空部に、（１）記載のゲルを保持する工程、ならびに
（ｃ）集束物を、管状体の長手方向と交叉する方向で切断する工程。
（１４）モノマーと架橋剤とを含むゲル重合液と、当該ゲルの構成成分とは共有結合しないポリマー成分とを混合し、重合させることを特徴とするゲル組成物の製造方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、網目構造体からなるゲルと、当該ゲルを構成する成分とは共有結合しないポリマー成分とを含むゲル組成物が提供される。本発明において、キャプチャープローブが含まれる網目構造体からなるゲルを使用した場合は、ハイブリダイゼーションにおける高温時には、添加したポリマーが疎水性相互作用によって基盤ゲルのネットワークを巻き込みながら収縮し、ゲルのネットワーク構造が不均一となりポアサイズが大きくなる部分が現れ、結果としてハイブリダイゼーション効率が高くなる。さらに、検出における室温時にはネットワークが均一に変化し、透明となるゲル及び生体関連物質マイクロアレイを得ることができ、検出感度が極めて高くなる。従って、本発明のゲル組成物は、ゲルの強度を維持しつつ、検体の拡散度を高めることができるため、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、モノマーと架橋剤との共重合により作製される網目構造体からなるゲル中に、ゲルを構成する成分とは共有結合しないポリマー成分を含むゲル組成物である。また、ゲル中にキャプチャープローブを共重合することもできる。
１．ゲル組成物（Semi-IPNゲル）
本発明のゲル組成物は、基盤となるゲル（以下、「基盤ゲル」という）中に、基盤ゲルとは共有結合しないポリマー成分を含むものである。「共有結合しない」とは、基盤ゲルとは性質が全く異なるために共有結合できないこと、および、性質は同一であって共有結合し得るポリマーであっても物理的または化学的条件により共有結合していないことの両者を意味する。
このようなゲル組成物の特徴は、基盤ゲルとポリマー成分とが独立にそれぞれの機能を発揮できる点にある。本発明のゲル以外にこのようなゲルとして相互貫入ポリマーネットワーク  (interpenetrating polymer network , IPN)が知られている。IPNとは、高分子網目の人為的な重なり合いを利用したポリマーブレンドの一種であり、一般には、IPNに使用されるゲルは互いに共有結合していない２つの架橋されたポリマーネットワークからなるゲルである。本発明において、ゲル組成物は、１つの成分は架橋されたポリマーネットワークであり、他の成分は線状ポリマーである。成分の一方だけが架橋されていることから、本発明のゲル組成物はセミIPN（以下semi-IPNと記す）と呼ぶことができる。
２．網目構造体
本発明のゲル組成物のうち網目構造体からなるゲルは、モノマーと架橋剤とを共重合して作製することができる。
網目構造体の構成成分として用いられるモノマーとしては、アクリルアミド、メタクリルアミド（methacrylamide）、Ｎ-メチルアクリルアミド（Ｎ-methlylacrylamide）、N,N-ジメチルアクリルアミド（N,N-dimethylacrylamide(DMAAm)）等が挙げられる。好ましくは、N,N-ジメチルアクリルアミド（N,N-dimethylacrylamide）、N-イソプロピルアクリルアミドが用いられる。本発明においては、これらのモノマー成分の１またはそれ以上の成分を使用することができ、１または２成分であることが好ましい。２成分のモノマーの場合は、DMAAmとNIPAMを使用することが好ましい。
「架橋剤」とは、エチレン性不飽和結合を２個以上持つ多官能性単量体である。例えばN,N'-メチレンビスアクリルアミド、N,N'-ジアリル（1,2-ヒドロキシエチレン）-ビスアクリルアミド、N,N'-シスタミン-ビスアクリルアミド、N-アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ポリエチレングリコールジメタクリレート等である。好ましくはN,N'-メチレンビスアクリルアミドが用いられる。
共重合反応に使用する架橋剤の量は、使用するモノマーの和に対し、モル比で８:２〜５００：１の範囲で添加するのが好ましい。
架橋剤のモル比が８：２より大きくなるとゲルネットワークが不均一化し、白濁が生じやすい。一方モル比が５００：１以下になるとゲルとしての構造が保てなくなってしまう。
重合開始剤は、重合反応の際にキャプチャープローブの分解が生じないものであればいずれも選択できる。好ましい開始剤は、2,2'-アゾビス〔2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン〕ジハイドロクロライド、ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）、ＫＰＳ（過硫酸カリウム）等である。また開始剤としてＡＰＳまたはＫＰＳを用いた場合、重合促進剤としてＴＥＭＥＤ（テトラメチルエチレンジアミン）を使用することも可能である。
重合温度はアゾ系の開始剤を用いた場合には４５℃以上が好ましい。またＡＰＳ、ＫＰＳを単独で用いた場合には５０℃以上が好ましい。ＡＰＳ、ＫＰＳにＴＥＭＥＤを使用した場合には室温から４０℃の範囲での重合が好ましい。
また、本発明において使用される網目構造体は、モノマーと、架橋剤と、キャプチャープローブとを共重合することにより得ることもできる。キャプチャープローブを共重合することにより、得られる網目構造体からなるゲルを後述のマイクロアレイに使用することが可能である。キャプチャープローブを共重合させるときの添加量は目的に応じて任意に調整できるが、ポリマーが基盤ゲル成分の総モル数に対して1/10以下が好ましい。重合条件は、上述のキャプチャープローブを添加しないゲルの重合条件と同一の条件を採用することができる。
本発明において「キャプチャープローブ」とは、検出又は測定の対象となる物質を捕獲するプローブを意味し、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、蛋白質、脂質等が挙げられる。これらのプローブは、市販品又は生細胞等から得ることができる。例えば、生細胞からのDNAの抽出は、Blinらの方法（Nucleic Acids Res.3.2303(1976)）等により、また、RNAの抽出は、Favaloroらの方法（Methods.Enzymol.65.718(1980)）等により実施することができる。
また、DNAとしては、鎖状若しくは環状のプラスミドDNA又は染色体DNAが用いられる。さらには、制限酵素若しくは化学的に切断したDNA断片、試験管内で酵素等により合成されたDNA又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
上記の通り、キャプチャープローブは、モノマー及び架橋剤との共重合反応により、ゲルの網目構造に固定することができる。よって、キャプチャープローブには共重合反応可能な不飽和官能基が導入されている（以下、修飾プローブという）。不飽和官能基としては、（メタ）アクリルアミド基、グリシジル基等が挙げられる。不飽和官能基は、キャプチャープローブの機能を損なわない限り、いずれの部位に導入されていても良い。たとえば、キャプチャープローブが核酸の場合、不飽和官能基は核酸の末端、鎖中のいずれに導入されていても良い。核酸の鎖の末端に導入されていることが好ましい。修飾プローブの製造方法に関しては、WO02/062817に記載のごとく製造することができる。
３．ポリマー
本発明のゲル組成物は、基盤ゲルに、それとは共有結合しないポリマーが挿入されている形態となっている。このため、ポリマーは、基盤ゲルの外に拡散してしまう可能性がある。そこで、本発明においては、基盤ゲルの構成成分を、ポリマーと同成分とすることにより、ポリマーと基盤ゲル成分との相互作用を利用し、ポリマーがゲル外部へ拡散することを抑制することが可能となる。
また、本発明のsemi-IPNゲル組成物の特徴はポリマー成分（線状ポリマー）の少なくとも１成分が相転移温度、すなわちLCST（Lower Critical Solution Temperature）を持つことにある。LCSTは下限臨界溶液温度とも呼ばれ、LCSTをもつポリマーはこの温度以上で相分離を引き起こし、不溶化して白濁するか沈殿する。ポリマーがLCSTを持つ誘導体としては、例えば、N-エチルアクリルアミド（N-Ethylacrylamide）、N-シクロプロピルアクリルアミド（N-Cyclopropylacrylamide）、N-イソプロピルアクリルアミド（N-isopropylacrylamide、N,N-ジエチルアクリルアミド（N,N-Diethylacrylamide）、N-メチル-N-エチルアクリルアミド（N-Methyl-N-Ethylacrylamide）、N-メチル-N-イソプロピルアクリルアミド（N-Methyl-N-Isopropylacrylamide）、N-メチル-N-n-プロピルアクリルアミド（N-Methyl-N-n-propylacrylamide）等が挙げられる。これらのうち、好ましくは、N-イソプロピルアクリルアミド（N-isopropylacrylamide）、N,N-ジエチルアクリルアミド（N,N-Diethylacrylamide）が用いられる。
また、本発明においては、ポリマー成分として両イオン性のポリマー（ベタインポリマー）を用いることもできる。このようなポリマーは分子内に第４アンモニウム塩基、オキソニウム塩基、スルホニウム塩基などを持つものであるが、本発明においてはN,N-ジメチル（アクリルアミドプロピル）アンモニウムプロパンサルフォネイト（以下DMAAPS）が好ましい。
本発明に用いられるLCSTを持つポリマーは、用いる溶液の塩濃度などによってLSCTが大きく変化する。特に、本発明において使用されるゲルは核酸検出などのマイクロアレイなどに用いられるため、ハイブリダイゼーション時のバッファー組成によってポリマーを選定することが重要となる。NIPAMなどは高い塩濃度領域ではLCSTが下がり、室温においても白濁してしまい、マイクロアレイには使用できなくなる。しかし低い塩濃度バッファーでは良好な相転移挙動を示す。
一方、DMAAPSは、両イオン性ポリマーであるため高い塩溶液中では分子が溶解する。したがって、用いるバッファー組成によってポリマー成分を選ぶことが可能になる。本発明においては、2ｘSSC以下の塩濃度（0.2%SDS添加）であればNIPAMポリマーを、２ｘSSCより大きい塩濃度（0.2%SDS添加）であればDMAAPSを用いることが好ましい。
本発明において、ポリマー成分は１成分もしくは２成分から選択することができる。特にポリマーにDMAAPSを用いた場合には、単独では塩溶液中で分子は溶解し、温度を上げても相転移しなくなる。従って、DMAAPSを用いる場合には、多成分として塩溶液中で溶解しなくなるLCSTをもつポリマー（好ましくはNIPAM）と共重合させることが好ましい。これにより、相転移温度を調整することが可能となる。ポリマーの添加量は、当業者が任意に設定することができ、例えばDMAAPSの場合は、共重合率は5mol%〜15mol%の範囲である。
ポリマー成分は、先に記したように塩濃度や温度の影響で相転移を起す成分である。従って、基盤ゲルとしてポリマーと同一成分のみ（１成分のみ）を用いると、基盤ゲル自体が相転移により収縮及び白濁をおこし、目的とするゲルが得られない。そこで、本発明においては、上記のモノマー成分（LCSTを持たない成分）と、ポリマーの作製に用いたモノマー成分との共重合ゲルを用いることが好ましい。共重合比は、ポリマーの作製に用いたモノマー成分が５０％以下であることが好ましい。
このように作製されたsemi-IPNゲル組成物は、LCST以上でポリマーが相転移により収縮する。この時、ポリマーは基盤ゲルの一部を巻き込むように収縮するため、基盤ゲルに粗密構造生じ、一部ポアサイズが大きくなる。例えば図１Aに示すように、相転移前の状態ではゲルの網目構造３０が規則的に配列されているとする。相転移後は、ポリマー１０は基盤ゲル２０を巻き込み、基盤ゲルに粗構造４０及び密構造４１を生じる（図１B)。その結果、粗構造４０によって、核酸等が内部へ拡散しやすくなる。
４．マイクロアレイ
本発明のゲル組成物は、キャプチャープローブを保持するゲルとして、遺伝子解析のツールとして使用される。例えば、上述のゲルを管状体の中空部に充填することによりゲル保持管状体が作製できる。その管状体は特開平3-47097号公報に記載のごとく、遺伝子変異を解析するためのツールとして使用できる。中空部へのゲルの保持は、キャピラリーゲル電気泳動に使用されるキャピラリーカラムを作製する要領で実施可能である。
また、本発明のゲル組成物は、マイクロアレイの構成部材としても使用できる。例えば、平面基板上に重合前又は重合開始直後のプローブを含むモノマー溶液を、予め定めた区画にスポッティングすることによりマイクロアレイを製造することができる（特表平6-507486号、米国特許5,770,721号公報参照）。区画が溝又は貫通穴により形成されている場合、それら溝又は貫通穴に、重合前又は重合開始直後のプローブを含むモノマー溶液を添加し、区画内で重合反応を実施することによりマイクロアレイを作製することができる（特開2000-60554号公報参照）。
さらに、本発明において、プローブ固定化ゲルを保持した管状体を複数本集束し（つまり、複数本を束ねて樹脂等により固定化する）、該集束物を管状体の長手方向に対して交差する方向で切断を繰り返すことにより、マイクロアレイを作製することができる（WO 00/5376号公報参照）。複数の管状体を集束した後、集束物の各中空部にゲルを保持しても良い。その場合、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を順次行うことによりマイクロアレイが製造できる。
（ａ）複数本の管状体をそれらの長手方向が一致するように集束する工程。
（ｂ）集束物の各管状体の中空部に、モノマー、架橋剤およびキャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を充填し、中空部内で所定の重合温度（例えば４０℃以下の重合温度）で共重合反応する工程。
この工程では、中空部に本発明のゲル組成物（キャプチャープローブを含むゲル組成物）を含むものを充填させることが好ましい。
（ｃ）  集束物の長手方向と交差する方向で切断する工程。
管状体としては、ガラス管、ステンレス管、中空繊維等が例示できる。加工性、取り扱いの容易さを考慮すると中空繊維を使用することが好ましい。なお、中空繊維としては、特に限定されるものではないが、例えば合成繊維、半合成繊維、再生繊維、天然繊維等が挙げられる。
本発明におけるゲルの重合温度は用いるポリマーの相転移温度以下で行うことが好ましい。好ましい温度範囲は４０℃以下である。４０℃より高い温度で行うと、重合中に相転移してしまい、白濁したゲルになってしまう。相分離した状態でゲル化すると、温度を低くしても透明には戻らなくなるため、上記の温度で重合させる。このような温度で重合を行うための開始剤としては、APS（過硫酸アンモニウム）にTEMED（テトラメチルエチレンジアミン）を添加したものや光分解型の開始剤などを用いることができる。
従来の固定化ゲルでは、ハイブリダイゼーションの効率を高くするためには、ゲルの濃度を下げて網目の有効細孔径を大きくしなければならなかった。このためゲル強度が不十分となり、高いハイブリダイゼーション効率を得ることは困難であった。しかし、本発明のゲルは、従来のゲルと異なり、ハイブリダイゼーション時にはゲルの感温性により、ネットワークが不均一となり、ポアサイズが拡大し（網目の有効細孔径が大きくなり）、ハイブリダイゼーション効率が高くなる。更に、検体の検出時にはゲルのネットワークが均一に戻って透明なゲルに変化し、蛍光検出の際の励起光をゲル全体に透過させることが可能であるため、検出感度が極めて高くなる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本実施例では、ゲルとしてベタインsemi-IPNゲル及びNIPAM semi-IPNゲルの２種類を用いた。
評価法として（１）光透過度、（２）水の透過度及び（３）マイクロアレイにおける評価を行った。
【参考例１】
【０００７】
（１）光透過度の測定法：
光透過度の測定は波長６００nmを用いて行った。ゲルは10×20mmにカットし、ハイブリダイゼーションバッファーが入っている透過度測定用の通常の角型セル（10mm×10mm）の内面に光路に対して垂直に立てて測定した。
（２）水の透過度の測定法：
水の透過係数は、ゲル複合膜を２つのセルではさみ、これに一方（上流側）から水圧をかけたときの水の透過量の経時変化を、下流側に取り付けたピペットで測定し、これから流速Vを求め、次式で定義される水の透過係数ｐを算出した。
V = p x ΔＰ/d・μ
（ΔＰ：ゲル膜にかかる圧力  d:ゲル膜の厚さ μ:水の粘度）
【実施例１】
【０００８】
NIPAM semi-IPNゲルの光透過度
表１に示すモル比で調整した重合液にNIPAMポリマーを０．５ｗｔ％添加し、開始剤としてAPSおよびTEMEDを用いて２０℃で１時間重合させることにより、semi-IPNゲルを作製した。
このゲルを２ｘSSC  0.2%SDSの塩溶液中に浸し、十分にゲル中の水を置換させた後、波長600nmでの室温での透過度を測定した。またその後温度を７０℃に昇温した後、同様に透過度を測定した。
その結果、透過度は室温では９０％以上あったものが、７０℃では１０％以下に落ち、ゲルは白濁した。
つまり、低温ではポリマーはゲル中に拡散し透明であったものが、相転移温度以上にしたことによりＮＩＰＡＭポリマーが収縮し、ゲルに粗密構造が現れたことで白濁したものと考えられる。
【表１】
2008013663.tif 000003
【実施例２】
【０００９】
ベタイン  semi-IPNの光の透過度
実施例１と同様のモル比で調整した重合液にNIPAM-co-DMAAPSポリマー(DMAAPS 共重合率10mol%)を０．５ｗｔ％添加し、開始剤としてAPSおよびTEMED用いて４０℃で１時間重合させることにより、semi-IPNゲルを作製した。
このゲルを６ｘSSC  0.2%SDSの塩溶液中に浸し、十分にゲル中の水を置換させた後、波長600nmでの室温での透過度を測定した。またその後温度を５０℃に昇温した後、同様に透過度を測定した。
その結果、透過度は室温では９０％以上あったものが、５０℃では１０％以下に落ち、ゲルは白濁した。
つまり６ｘSSC  0.2%SDSにおいても実施例１同様、低温ではポリマーはゲル中に拡散し透明であったものが、相転移温度以上にしたことによりNIPAM-co-DMAAPSポリマーが収縮し、ゲルに粗密構造が現れたことで白濁したものと考えられる。
【実施例３】
【００１０】
ベタインsemi-IPNの水の透過度
表２に示す組成で作製したsemi-IPNゲルに４０℃および７０℃にて水を透過することによって、透過係数を算出した。その結果、透明なゲルであった４０℃では透過係数  p=4.63x10-17 白濁した７０℃ではp=1.60x10-16となり高温時は低温時に比べて約3.5倍透過性が上昇することが分かった。
【表２】
2008013663.tif 000004
【比較例１】
【００１１】
DMAAm  NIPAM共重合ゲルの光の透過度
実施例１および２で用いたポリマーを添加せず、その他の組成は実施例２と同様にしてゲルを作製した。その後実施例２と同様にして光の透過度を測定した。
その結果、透過度は５０℃においても９０％程度と十分に白濁しなかった。
つまり相転移しやすいと考えられるポリマーを添加しなかったために高温で十分に相転移せず、目的とする構造（図１Ｂ）にならなかったと考えられる。
【実施例４】
【００１２】
DNAチップでの評価（NIPAM  semi-IPNのみ）
１．ＤＮＡマイクロアレイの製造
（１）プローブの調製
プローブとして、核酸の5'末端をビニル化した核酸（６５mer）を用いた（核酸１〜１０）。これら核酸は、以下の方法により合成した。
まず、オリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成装置により合成した。合成の際、最終段階で、アミノリンクTM（ＰＥバイオシステムズ社製）を該オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基が導入された5'-O-アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。次いで、それらオリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、5'末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製した。
核酸１：tcaccccagtggcccaggagaatcaatgagtatccttctcctgtcctgcaacaacatccatatcc（配列番号１）
核酸２：cagtgaggtaccctgagcccctttccacatgtgggctaaatacagtttacttgggtgacactgct（配列番号２）
核酸３：aactcatgaatcggatgtcaacagtgttcggtactaccccagtggggatgcttttgcttcggggt（配列番号３）
核酸４：tcgcgtccatgccctgagtccaccccggggaaggtgacagcattgcttctgtgtaaattatgtac（配列番号４）
核酸５：agcagccctgacccacctggctctctgctcatgtctacaagaatcttctatcctgtcctgtgcct（配列番号５）
核酸６：cccaactcggcccccaacactgagcatctccctcacaatttccatcccagacccccataataaca （配列番号６）
核酸７：acttcgctgtgagcgagtacaacaagggcagcaacgatgcgtaccacagccgcgccatacaggtg（配列番号７）
核酸８：attacaacatccagaaggagtcaaccctgcacctggtccttcgcctgagaggtggcatgcagatc（配列番号８）
核酸９：cacagcagcggcctctgaacttggacagcgaaaccattgcttcactacccatcggtgttcattta（配列番号９）
核酸１０：cctgagaatgtcactaggctctcagggtcttggcaccactcgcccaagttatatccaccagatta（配列番号１０）
（２）中空繊維束の作製
図２に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
まず、直径０．３２ｍｍの孔（５２）が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦横各１０列で合計１００個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板（５０）２枚を準備した。これらの多孔板（５０）を重ね合わせて、そのすべての孔（５２）に、ポリカーボネート中空繊維（５４）（三菱エンジニアリングプラスチック社製  カーボンブラック1質量％添加）を１本づつ、通過させた。
ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物（５６）で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
（３）ゲル充填中空繊維配列体の製造
表３に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を調製した。ゲル前駆体重合性溶液は氷中で保存した。
【表３】
2008013663.tif 000005
次に、プローブ核酸とゲル前駆体重合性溶液をウェルプレートに分注機にて混合し、デシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の端部をこの溶液中に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を３０℃とし、１時間かけて重合反応を行った。このようにしてプローブ核酸がゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
次に、得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．２５ｍｍの薄片シート（ＤＮＡマイクロアレイ）を５０枚得た。
（３）検体調整、ビオチン標識検体を用いたハイブリダイゼーション
マウスのRNAから逆転写反応でcDNAを合成した。次にcDNAをDNApolymeraseを用いてdsDNAを合成した。このdsDNAを鋳型としてaRNAを逆転写合成した。この際Biotin-UTPを取り込ませた。こうして得られたBiotin標識aRNAを断片化し、検体を調整した。
この検体を用いてチップのハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションバッファーは２ｘSSC  0.2%SDSを用い、６５℃、１６時間でハイブリダイゼーションを行った。その後２ｘSSC  0.2%SDSバッファーを用い６５℃で２０分洗浄を行った後、Streptavidin-Alexa647を用いて染色を行った。
（４）ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションシグナル検出
洗浄を施したマイクロアレイを、水を入れたシャーレに浸漬させて固定し、非共焦点レーザー顕微鏡（ジェノミックッソリューション社製）でハイブリダイゼーションシグナルを検出した。結果を表４に示す。
【表４】
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ＮＩＰＡＭポリマーを用いたsemi-IPNゲルを用いることによりハイブリダイゼーションのシグナル強度がＤＭＡＡｍ単独ゲルと比較して高くなった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ポリマーの相転移前後におけるゲルの網目構造の変化を示す模式図である。
【図２】配列固定器具を示した図である。
【符号の説明】
【００１４】
１０    ポリマー
２０    ゲル
３０    網目構造
４０    粗構造
４１    密構造
５０    多孔板
５２    孔
５４    中空繊維
５６    板状物
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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