(57)【要約】【課題】培養液の一部を回収して再度培養に用いて培養を行う馴化培養を、マイクロチップ内で簡便かつ効率よく培養を行う培養装置を提供する。【解決手段】微小な流路を用いて細胞培養を行う培養装置であって、細胞培養室と、前記細胞培養室に細胞及び該細胞の培養液を搬送する第１の流路と、第１の流路に接続された第２の流路と、前記第２の流路に設けられ前記細胞培養室の培養液の一部を収容するための液体収容室とを有し、前記細胞培養室の培養液の一部を前記液体収容室に回収した後、前記培養液を細胞培養室に戻して培養に用いる培養装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小な流路を用いて細胞培養を行う培養装置であって、細胞培養室と、前記細胞培養室に細胞及び該細胞の培養液を搬送する第１の流路と、第１の流路に接続された第２の流路と、前記第２の流路に設けられ前記細胞培養室の培養液の一部を収容するための液体収容室とを有し、前記細胞培養室の培養液の一部を前記液体収容室に回収した後、前記培養液を細胞培養室に戻して培養に用いることを特徴とする培養装置。
【請求項２】
前記第１の流路および第２の流路の少なくとも１つに接続してポンプとバルブが設けられ、前記ポンプとバルブの操作により、細胞培養室の培養液の一部を前記液体収容室に回収した後、細胞培養室に戻すことを特徴とする請求項１に記載の培養装置。
【請求項３】
前記第１の流路の断面積をＡ、第２の流路の断面積をＢとすると、前記断面積の比Ａ／Ｂが５＜Ａ／Ｂ＜１００００００であることを特徴とする請求項１または２に記載の培養装置。
【請求項４】
前記液体収容室は、前記細胞培養室からに回収された培養液を、加熱、濃縮、攪拌、濾過、混合、化学反応および生化学反応のうちの少なくとも１つの処理を行なうための処理手段を備えることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかの項に記載の培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養室を備えるマイクロチップ内において、細胞の馴化培養を行な培養装置に関する。より詳しくは、導入口、排出口および細胞培養室に接続する第１の流路に、さらに液体収容室を有する第２の流路を備えることで、細胞培養室からの培養液の回収と、回収した培養液の細胞培養室への再供給する培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の動物細胞、特に付着性細胞の培養法および培養技術には、細胞の培養をシャーレ、培養びん、試験管等を用いて底面に細胞を接着させながら行なう静置培養や、細胞の培養を坂口フラスコや培養器の中に投入したマグネチックスターラーや羽根車等による機械的な攪拌等で行なう培養や、細胞培養槽中の培養液を常に交換および循環させながら新鮮な培養液を供給しつづけると共に老廃物を系から除去することで培養効率を高める流通培養などがある。
【０００３】
特に、流通培養に関しては、細胞における物質生産や幹細胞の分化制御、マイクロチップ内細胞培養において特に有効である。マイクロチップとは数マイクロメートルから数百マイクロメートルの大きさを持った流路構造体やアレイ構造体を指すものであり、通常のシャーレやウェルを用いた培養法と比較して、用いる細胞や試薬の量を大幅に低減することが期待される。しかし、数ミリメートル幅の流路を有する流路型チップも通常のスケールの比較上においては小型チップとして取り扱うことができる。本発明においては簡便のため、ミリメートル幅の流路構造を有するものも含めてマイクロチップと呼ぶことにする。
【０００４】
マイクロチップは先述のように試薬等の使用量を低減できるとともに、流通培養を行なう際においては細胞が単位面積当たり多量の培地に触れることができるため、従来の培養方法に比べて全体濃度の均一性を向上させることができる。種々のマイクロチップについての概論や各論は、例えば、非特許文献１等で詳細に論じられている。マイクロチップを用いた細胞培養の一例としては、細胞を用いたバイオアッセイやエリスロポエチンやＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）等の各種リンフォカイン、糖蛋白質、抗体等のバイオ医薬品の生産、再生医療分野における幹細胞等の機能分化制御等への応用が期待される。
【０００５】
一方、歯車等を旋回しながら行なわれる細胞の攪拌培養において、培養槽から回収された培養液を細胞培養槽へ再流通するための装置に関する報告は以前よりすでになされている。例えば、特許文献１では、旋回培養を行ないながら細胞による物質生産を行なうためのバイオリアクターに関する報告がなされている。しかし、特許文献１は、攪拌翼を回転させながらの培養であり、非常に大容積の細胞培養室を用いることや、培養液を制御するためのポンプを複数備えなくてはならなかった。また細胞培養槽が巨大であることから老廃物等の細胞不活性因子の除去を可能にするような装置の開発が望まれていた。
【０００６】
また、特許文献２は、温度調節のためのヒーターを備え、かつ顕微鏡下で培養液を循環させながら供給し続ける動物細胞の流通培養を行なうための装置に関する報告がなされている。しかし、前記装置においては、細胞培養室から回収した培養液を再供給する際に、系外にある流通液貯蔵ビンに保管する必要がある。そのために、装置が複雑になることや、デッドボリューム、培養液の循環が装置内で完結していないことによる培養液の汚染等に課題が残されていた。
【特許文献１】特開平２−１１７３８８号公報
【特許文献２】特開昭６１―２４７３７２号公報
【非特許文献１】「マイクロ化学チップの技術と応用」、２００４年、丸善株式会社発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、この様な背景技術に鑑みてなされたものであり、細胞の培養を、新しい培養液に次々に交換して、細胞から出る老廃物等を全て除去するのではなく、細胞から分泌される成長因子等を一部液体収容室に回収して再度細胞培養室に供給することを特徴とする馴化培養を、マイクロチップ内で実現するための培養装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決する培養装置は、微小な流路を用いて細胞培養を行う培養装置であって、細胞培養室と、前記細胞培養室に細胞及び該細胞の培養液を搬送する第１の流路と、第１の流路に接続された第２の流路と、前記第２の流路に設けられ前記細胞培養室の培養液の一部を収容するための液体収容室とを有し、前記細胞培養室の培養液の一部を前記液体収容室に回収した後、前記培養液を細胞培養室に戻して培養に用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、マイクロチップ内で簡便かつ効率よく馴化培養を行なう培養装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る培養装置は、微小な流路を用いて細胞培養を行う培養装置であって、細胞培養室と、前記細胞培養室に細胞及び該細胞の培養液を搬送する第１の流路と、第１の流路に接続された第２の流路と、前記第２の流路に設けられ前記細胞培養室の培養液の一部を収容するための液体収容室とを有し、前記細胞培養室の培養液の一部を前記液体収容室に回収した後、前記培養液を細胞培養室に戻して培養に用いることを特徴とする。
【００１１】
前記第１の流路および第２の流路の少なくとも１つに接続してポンプとバルブが設けられ、前記ポンプとバルブの操作により、細胞培養室の培養液の一部を前記液体収容室に回収した後、細胞培養室に戻すことが好ましい。
【００１２】
前記第１の流路の断面積をＡ、第２の流路の断面積をＢとすると、前記断面積の比Ａ／Ｂが５＜Ａ／Ｂ＜１００００００であることが好ましい。
前記液体収容室は、前記細胞培養室からに回収された培養液を、加熱、濃縮、攪拌、濾過、混合、化学反応および生化学反応のうちの少なくとも１つの処理を行なうための処理手段を備えることが好ましい。
【００１３】
本発明は、マイクロチップ内で、簡便かつ効率よく細胞培養を行なうための培養装置に係る。本発明の培養装置は、細胞を培養する細胞培養室と、細胞及び該細胞の培養液の導入口と排出口、細胞培養室と前記導入口と排出口を連結し培養液を流すためのメインに使用される第１の流路と、第１の流路の途中かつ細胞培養室より上流側に配置されている第２の流路と、前記第２の流路に設けられ前記細胞培養室の培養液の一部を収容するための液体収容室を具備する。さらに第２の流路には培養液の回収および再供給を制御するためのバルブを備えるバルブ機構が連結されている。
【００１４】
以上のように流路内で培養液を回収・再供給するための機構を備えることで、細胞産生の成長因子等の再供給が可能になると共に、培養液の汚染やデッドボリューム等を低減出来る。また、細胞培養室から回収した培養液には不純物以外にも培養細胞によって生産された成長因子等が含まれていることが知られており、培養の効率化や幹細胞等の分化制御を行なう際に細胞外環境を構築する上においても非常に有効である。そのなかで、本発明における、マイクロチップ内で細胞培養を行なった際の培養液を回収し、不純物の除去等の適切な処理を施した後に、引き続きの培養に用いるという馴化培養という培養手法は極めて重要な培養法である。本発明ではマイクロチップ内でこのような馴化培養を行う培養装置を提供できる。
【００１５】
本発明において、培養装置で用いられる細胞は、動物細胞、植物細胞のいずれであって良く、また前記の細胞群をそのまま用いることもできるし、遺伝子改変等の操作を施した機能改変細胞も用いることができる。ここでいう機能改変細胞とは例えば、被験物資との接触により発現する候補遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子が連結された形質転換体を挙げることができ、これら形質転換体は常法により作製することができる。レポーター遺伝子としては、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発光タンパク質をコードするＤＮＡや、ホタルルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ等のルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素遺伝子などを具体的に挙げることができるが、これらの中でもＧＦＰ遺伝子等の蛍光性タンパク質をコードするＤＮＡが検出・確認の容易さからして好ましい。かかるＧＦＰには、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰ）、ＥＹＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＣＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＣＹＡＮ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（青色）、ＤｓＲｅｄ（赤色）等の蛍光波長の異なる誘導体が存在し、多重ラベルを行なうこともできる。ＧＦＰの利点は生細胞のままで簡単に解析できることであり、そのため経時的な観察が容易となる。本発明では、より好ましくは動物細胞が用いられ、浮遊性細胞または接着性細胞群から選択される。当該装置のアプリケーションの一例としては、細胞を用いたバイオアッセイやエリスロポエチンやＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）等の各種リンフォカイン、糖蛋白質、抗体等のバイオ医薬品の生産、再生医療分野における幹細胞等の機能分化制御等が挙げられ、それに応じて適当な細胞群が選択される。
【００１６】
物質生産に用いられる細胞種の一例としては、大腸菌、酵母、動物細胞群から適宜選択される。動物細胞の一例としては、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ細胞）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ハイブリドーマ、昆虫細胞株などを利用した物質生産が広く報告されている。物質生産において用いられる細胞群の選択に関しては、その目的によって適当な細胞群が選ばれる。一般に大腸菌や酵母は、動物細胞郡に比べて増殖速度が高く、取り扱いが容易であることからコスト面で有利である特徴が挙げられる。動物細胞群は大腸菌や酵母に比べてヒト型に近い複雑な翻訳後修飾能を有しており、生理活性を有するバイオ医薬品の生産を行なう際に利用される。動物細胞を用いた具体例としては、ＣＨＯ細胞やＢＨＫ細胞およびＨｅｐＧ２細胞の遺伝子組換え体による生産性の向上の検討や、モノクローナル抗体産生、蛋白質生産における糖鎖修飾制御等の検討がなされている。
【００１７】
また幹細胞等の機能性細胞の培養方法としても有効であることが報告されていて、ヒト幹細胞系においても生体外で培養する際に培養液を緩やかに置換しながら液の性状を急激に変化させない培養方法が有効であるとの報告もなされている（特開２０００−１８９１５７号公報）。前記の報告においては、ヒト造血系由来前駆細胞組成液を１日あたり少なくとも５０％交換される程度緩やかな速度で培養液培地中を循環させる流通培養が大きな特徴のひとつになっている。この方法を用いることによりヒト由来幹細胞が効率よく得られることが報告されている。
【００１８】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。
図１は、本発明の培養装置の一実施態様を示す斜視図である。図２は、図１に示す本発明の培養装置の平面図である。図１において、１０１は基板、１０２は導入口、１０３は排出口、１０４は細胞培養室、１０５は第１の流路、１０６は第２の流路、１０７は液体収容室、１０８はバルブ、１０９は孔である。
【００１９】
本発明の培養装置は、基板１０１と、基板１０１に細胞を培養する細胞培養室１０４と、細胞培養室１０４に細胞及び該細胞の培養液を搬送する第１の流路１０５と、第１の流路１０５に接続された第２の流路１０６と、第２の流路１０６に設けられ、前記細胞培養室１０４の培養液の一部を収容するための液体収容室１０７と、培養液の流通を制御するためのバルブ１０８を有する。そして、前記細胞培養室１０４の培養液の一部を前記液体収容室１０７に回収した後、前記培養液を再度、細胞培養室に戻して培養に用いる。
【００２０】
基板１０１の材質としては、培養液試料に対して耐性を有するものであれば特に制限はない。例えばシリコン等の半導体材料、ガラス材料、金属材料、樹脂材料等が挙げられる。さらに望ましくは倒立顕微鏡等での観察が可能な程度の光透過性を有し、清浄化、前処理等により基板の表面改質を行なうことのできる基材であることが望ましい。基板の洗浄はアルカリ洗浄、酸洗浄、水系溶剤洗浄、有機系溶剤洗浄、ＲＣＡ洗浄等のウエット洗浄や、紫外線照射、オゾン照射、酸素プラズマ照射等のドライ洗浄により行なう。
【００２１】
本発明における基板の表面改質とは、例えば、スライドガラスおよび石英基板等を固体基板として用いる場合に、予め、酸、プラズマ、オゾン、有機系溶剤、水系溶剤、界面活性剤等で処理する方法、シランカップリング等の処理により置換基を基板表面への導入する方法、表面自由エネルギーを制御する方法等のことである。本発明において、多孔質材料の基材は成形性の良いもの、滅菌処理が適用できるものおよび細胞毒性の低いもの等の中から選択される。更に具体的には、例えばセルロース、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリアクリルアミド、フッ素樹脂等の合成樹脂のポリマー、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料や金、チタン、ステンレス等の金属材料が挙げられる。本発明において用いられる培養液試料としては、基本的には細胞や薬剤等を懸濁させた細胞培養液、緩衝液等からなる水系の溶媒が用いられる。細胞培養液および緩衝液は既知の標準組成のものを適宜用いることができる。
【００２２】
本発明において、培養装置を構成する流路は、上下の基板を接着または接合して構成されたもので、それらの複数の基板により流路と、細胞培養室および液体収容室が形成されている。複数の基板によって流路と細胞培養室および液体収容室を形成するための１つの例としては、基板の対向面の一方または両方に形成された溝および貫通孔より流路が形成され、細胞培養室および液体収容室は流路につながり一方の基板を貫通した貫通孔として形成されている。その場合、上下の流路を構成する基板を接着または接合するだけですみ、製作が容易である。
【００２３】
本発明において、細胞培養室の底面は細胞接着を促進できる構成であればいかなる表面でもよく、物理的な吸着、化学的な吸着、生物学的な吸着、静電相互作用、疎水性相互作用等を促進する作用を有する表面状態であることが特に好ましい。その一例としてはフィブロネクチン、ポリリジン、ＲＧＤ、コラーゲン、ラミニン、細胞表面抗原に対する抗体、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、アルデヒド基、水酸基などの表面への導入が挙げられる。目的に応じて表面を適宜選択することができる。また、細胞培養室には温度調節のための素子が取り付けられていることが好ましく、微小なヒーター等の電気信号を熱に変換する電気熱変換体が、刺激を付与する手段として好適に用いられる。電気熱変換体としては、例えば、Ｔａ2Ｎ、ＲｕＯ2、Ｔａ、Ｔａ−Ａｌ合金などの金属、合金、金属化合物からなる発熱抵抗体を備えた電気熱変換体を用いることが出来る。前記の発熱抵抗体は公知の方法、例えばＤＣスパッタ法、ＲＦスパッタ法、イオンビームスパッタ法、真空蒸着法、あるいはＣＶＤ法等によって形成することができる。電気熱変換体は、微細孔の内部にあっても、微細孔の外部にあってもよく、また、基板の表面にあっても、基板内部に埋め込まれていても良い。例えば、プリント配線基板を用いて、これをヒーターとし、基板に貼り合わせることで、基板上の任意の場所を所定の温度に設定する電気熱変換体を例示することができる。他方、冷却についても、ペルチェ素子を同様に貼り合わせることで、基板上の任意の場所を所定の温度に設定する電気熱変換体を例示することができる。
【００２４】
また、細胞培養室の温度調節以外にも、細胞に対して処理を行なうための電極を別に設けておくことも出来る。その一例としては、細胞を補足するためのドライビンフォースを発生させるための電界や磁界等を発生させる装置や、エレクトロポレーションの細胞へ物質等の導入を行なうための電極等が挙げられる。ここでいう物質とは主に微粒子や生体分子または生体活性分子群、標識薬剤、等が挙げられる。微粒子は細胞に導入できるサイズを有する合成ポリマー、分解性のポリマー、ガラス類、金属、セラクミクス、磁性体、等から選択される。また、生体分子または生体活性分子群としては、核酸、蛋白質、糖類、脂質およびそれらの複合体から選択される生体分子が含まれ、更に詳しくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、ミトコンドリア、ウィルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプター、酵素、ペプチド、抗生物質，防腐剤，酵素阻害剤，解熱剤，消炎剤，増殖因子，抗増殖因子，トランキライザー、サイトカイン、ステロイド、エストロゲン等から選択することができる。標識薬剤とは、フルオレセイン、ＧＦＰ等の蛍光物質や蛍光物質を含む物質、半導体微粒子等から選択することができる。
【００２５】
本発明において、培養装置は少なくとも２系統の流路を備えていおり、細胞の培養を行うための第１の流路と、細胞培養室の培養液を回収および再供給するための第２の流路を有する。なお、本発明における第１の流路の幅および深さは、細胞の直径（１０μｍ以上３０μｍ以下）を考慮して設定される。液体収容室１０７は、細胞培養室１０４において細胞培養に用いられた培養液を一時的に回収するために配置されている。液体収容室に回収された培養液には細胞の生産するサイトカイン等の有用な活性物質も含まれている一方で、老廃物等の不活性物質も含まれているために、細胞培養室より回収された培養液に対して、加熱、濃縮、攪拌、濾過、混合、化学反応および生化学反応のうちの少なくとも１つの処理を行なうための処理手段を備えていることが好ましい。一例としては、流路を横切るようにフィルターを設けておいて回収培養液を濾過することで、不純物を取り除く機構を有する方法等が挙げられる。
【００２６】
本発明において、第１の流路は第２の流路に比べて流路の断面積が大きなものが選択される。具体的には、第１の流路の断面積をＡ、第２の流路の断面積をＢとすると、前記断面積の比Ａ／Ｂが５＜Ａ／Ｂ＜１００００００である範囲の値から選択され。さらに好ましくはＡ／Ｂが１００＜Ａ／Ｂ＜１０００００の範囲から選択される。前記の通り第１の流路の幅および高さは細胞の大きさから選択され、幅は数十から数百μｍ、高さは１００μｍ程度のものから選択することができる。また第２の流路は第１の流路に比して断面積の小さなものから選択されればよく、流路の高さおよび幅で規定されるものであるが、高さは一定で、流路の幅だけを制御することで簡便に作製することができる。
【００２７】
本発明においては、流路の少なくとも１つに接続してポンプとバルブが設けられ、前記ポンプとバルブの操作により、細胞培養室の培養液の一部を前記液体収容室に回収し後、第３の流路を通過して第１の流路から細胞培養室に戻すことができる。
【００２８】
本発明において用いられるバルブは流路幅を変化させることによる液抵抗を利用することを特徴とする。具体的には、第１の流路に比べて第２の流路の断面積が小さな構成になっている。かつ、大気に開放されているため培養液を搬送した場合、通常培養液は第１の流路を搬送される。第２の流路へ培養液を搬送する場合には、外部圧力を変化させることで行われる。
【００２９】
本発明で用いられるバルブは上記の液抵抗を利用するものであってもよいが、それに制限されず、既往の手法の中から所望のものを適宜用いることもできる。バルブの代表的なものとしては、マイクロアクチュエーターによるもの、刺激応答性ポリマーを用いるもの、流路内の表面自由エネルギーを用いるもの、あるいはバルブを用いるもの等が挙げられる。例えば、「マイクロ化学チップの技術と応用」、２００４年、丸善株式会社発行に記載されているバルブを用いることができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例により限定するものではない。
実施例１
図３は本発明の実施例１の培養装置を模式的に示す斜視図である。本実施例で用いられる基板３１０の底面基板には溝を形成させたスライドガラスを、上面基板３０１には導入口３０２および排出口３０３に貫通孔を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いて作製した。スライドガラスの加工はフォトリソグラフィーおよびメタル犠牲膜によりマスクをした上で、フッ酸によるウェットエッチングにより深さ１００μｍの構造体を形成した。第１の流路幅を５００μｍ、第２の流路幅を５μｍとした。
【００３１】
貫通孔を有するＰＤＭＳ構造体は市販のネガレジスト（ＳＵ−８；ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．）を用いてスライドガラス上にレジストによる鋳型を作成した。次に、ＰＤＭＳの前駆体を鋳型に流し込み、鋳型とプレポリマーをスライドガラスで挟んだ状態で９０℃で１時間オーブンにより加熱をすることでポリマーを固化させた。放冷後、鋳型からＰＤＭＳを剥離することでＰＤＭＳエラストマーを得た。この際に、鋳型からのＰＤＭＳエラストマーの剥離を容易にするために予め表面にフッ化物等の置換基をシランカップリング剤により導入することで撥水処理をしておいても良い。なお、ＰＤＭＳエラストマーを基材として用いた場合には、基板同士の接着は自発的に行なうことができる。ＰＤＭＳエラストマーとスライドガラスとの接着には酸素プラズマ（８０Ｗ，３０秒）による融着を用いることができる。
【００３２】
さらに、導入口、排出口およびコネクタ部にシリコーンチューブおよび導入口、排出口および液体収容室の先のコネクタ部に３箇所、３方コックを接続してバルブ部を有する流路とした。なお、本実施例における培養液搬送の駆動力としてｐｕｓｈ型のシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いた。
【００３３】
以下に（１）細胞培養工程、（２）細胞培養室からの培養液の回収工程、および（３）液体収容室から培養液の再供給工程について、図４Ａ乃至図４Ｃを用いて説明する。なお、ポンプと導入口の間に当然培養液等のタンクも備えることになるが、図面上においては省略する。
【００３４】
（１）細胞培養工程
図４Ａは、本発明の実施例１の培養装置における流路中の培養液の搬送状態を説明する説明図である。図４Ａでは、細胞および培養液を細胞培養室へ搬送する状態を示す。
【００３５】
シリンジポンプ４０１を導入口４０２に接続して第１の流路４０６内に細胞および培養液を送り込む。この際、コネクタ部４０９、４１０は大気に開放されている。細胞および培養液は主流路である第１の流路４０６、細胞培養室４０４、第１の流路を経て排出口４０３から系外へと排出される。
【００３６】
（２）細胞培養室からの培養液の回収工程
図４Ｂは、本発明の実施例１の培養装置における流路中の培養液の搬送状態を説明する説明図である。図４Ｂでは、細胞培養室の培養液の一部を液体収容室へ搬送する状態を示す。
【００３７】
第１の流路４０６に取り付けたバルブ部４０７、４０８を閉状態に、第２の流路４１１に取り付けたバルブ部４１２を開状態にする。傍流である第４の流路４１４の上流側にポンプ４０１を繋ぎ、ポンプ４０１を作動させることで、細胞培養室４０４に留まっている培養液の一部を、細胞培養室４０４、第２の流路４１１を経て液体収容室４０５へと収容される。
【００３８】
（３）液体収容室から培養液の再供給工程
図４Ｃは、本発明の実施例１の培養装置における流路中の培養液の搬送状態を説明する説明図である。図４Ｃでは、液体収容室の培養液を再度細胞培養室へ戻す状態を示す。
【００３９】
第１の流路に取り付けたバルブ部４０７、４０８を再び開状態にして送液を開始した後に液体収容室４０５の先のバルブ部４１２を開状態にする。液体収容室４０５に収容されていた培養液は、第３の流路４１３から搬送されてくる培養液と共に、第２の流路４１１、細胞培養室４０４を経て排出口４０３から系外へと排出される。この時、液体収容室４０５に収容されていた培養液は第１の流路４０６から搬送されてきた培養液と混ざり合ったものが細胞培養室へと運ばれていくことで馴化培養が実現される。また、液体収容室を複数個配置することでより長時間の送液や連続的な送液の装置として用いることも出来る。
【００４０】
実施例２
さらに、本実施例に示すようにして流路を配置し、検出器または分離装置を接続することで細胞培養室を含む反応槽からのサンプリング装置としても用いることが可能である。本実施例における培養装置の構成の概略を図５に示す。また、図６Ａ、Ｂは本実施例２の培養装置における流路中の培養液の搬送状態を説明する説明図である。
【００４１】
図に示す様に、通常は閉常態である傍流端に備えたバルブ部５０９、５１１を開くことで培養液の一部が反応槽５０７、第２の流路５０５、細胞培養室５０８を経てバルブ５１１から回収することができる。なお、バルブ部５０４は第１の流路中に配置してあるバルブであり、既往の手法の中から所望のものを適宜用いることもできる。具体的には、マイクロアクチュエーターによるもの、刺激応答性ポリマーを用いるもの、流路内の表面自由エネルギーを用いるものあるいはバルブを用いるもの等から適宜選択される。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の培養装置は、マイクロチップ内で簡便かつ効率よく培養を行うことができるので、物質の生産や再生医療等に代表される細胞利用技術に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の培養装置の一実施態様を示す斜視図である。
【図２】図１に示す本発明の培養装置の平面図である。
【図３】本発明の実施例１の培養装置を模式的に示す斜視図である。
【図４Ａ】本発明の実施例１の培養装置における流路中の培養液の搬送状態を説明する説明図である。
【図４Ｂ】本発明の実施例１の培養装置における流路中の培養液の搬送状態を説明する説明図である。
【図４Ｃ】本発明の実施例１の培養装置における流路中の培養液の搬送状態を説明する説明図である。
【図５】本発明の実施例２の培養装置を模式的に示す斜視図である。
【図６Ａ】本発明の実施例２の培養装置における流路中の培養液の搬送状態を説明する説明図である。
【図６Ｂ】本発明の実施例２の培養装置における流路中の培養液の搬送状態を説明する説明図である。
【符号の説明】
【００４４】
１０１  基板
１０２  導入口
１０３  排出口
１０４  細胞培養室
１０５  第１の流路
１０６  第２の流路
１０７  液体収容室
１０８  バルブ
１０９  孔
３０１  基板
３０２  導入口
３０３  排出口
３０４  細胞培養室
３０５  第１の流路
３０６  第２の流路
３０７  液体収容室
３０８  バルブ
３０９  コネクタ部（大気開放部）
３１０  基板
４０１  ポンプ
４０２  導入口
４０３  排出口
４０４  細胞培養室
４０５  液体収容室
４０６  第１の流路
４０７  バルブ
４０８  バルブ
４０９  コネクタ部（大気開放部）
４１０  コネクタ部（大気開放部）
４１１  第２の流路
４１２  バルブ
４１３  第３の流路
４１４  第４の流路
５０１  導入口
５０２  排出口
５０３  第１の流路
５０４  バルブ
５０５  第２の流路
５０６  バルブ
５０７  反応槽
５０８  細胞培養室
５０９  バルブ
５１０  バルブ
５１１  バルブ
６０１  ポンプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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