(57)【要約】【課題】生体試料中のニックβ２グリコプロテインＩを、試料中に同時に含まれると考えられるインタクトβ２グリコプロテインＩの量に影響を受けることなく、迅速かつ正確に測定することのできるニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法、及びそれに使用するモノクローナル抗体を提供する。【解決手段】第１のモノクローナル抗体は、β２グリコプロテインＩと反応しないが、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩとは反応し、第２のモノクローナル抗体は、β２グリコプロテインＩ、及びプロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩと反応する。前記免疫学的分析方法では、第１のモノクローナル抗体少なくとも１種類と、別種の第１のモノクローナル抗体又は第２のモノクローナル抗体を使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β２グリコプロテインＩと反応しないが、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩとは反応することを特徴とする、モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項２】
プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに反応する、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３】
プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に反応する、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項４】
β２グリコプロテインＩ、及びプロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩと反応することを特徴とする、モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項５】
プロテアーゼにより一部に開裂を受けた前記β２グリコプロテインＩが、β２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに開裂を受けたものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項６】
プロテアーゼが、プラスミン又は顆粒球エラスターゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を産生することを特徴とする、ハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを第１抗体として不溶性担体に固定化し、この固定化された第１抗体と被検試料とを接触させ、続いて、前記の第１抗体とは別種の請求項１に記載のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体、又は請求項４に記載のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体と接触させ、前記の固定化第１抗体とプロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩとの複合体と結合した前記第２抗体の前記標識からの信号、又は前記の固定化第１抗体とプロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩとの複合体と結合しなかった前記第２抗体の前記標識からの信号を検出することを特徴とする、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法。
【請求項９】
不溶性担体に固定化された請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント少なくとも１種類と、不溶性担体に固定化された請求項１に記載の別種のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント又は請求項４に記載のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント１種類と、被検試料とを接触させ、凝集反応を観察することを特徴とする、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法。
【請求項１０】
プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩを分析することを特徴とする、生体内凝固線溶異常の検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩ（以下、ニックβ２グリコプロテインＩと称することがある）に特異的に反応する各種の新規モノクローナル抗体及びその抗体フラグメント、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、ニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法、並びに生体内凝固線溶異常の検出法に関する。ニックβ２グリコプロテインＩは、生体内凝固線溶異常の予知マーカーとして有用である。
【０００２】
本明細書において、「ニックβ２グリコプロテインＩ」とは、プロテアーゼによりアミノ酸配列の一部に開裂を受けて２本のポリペプチド鎖からなるものの、それらがジスルフィド結合により結合しているβ２グリコプロテインＩを意味する。
また、本明細書においては、プロテアーゼによる開裂を受けていないβ２グリコプロテインＩを、前記の「ニックβ２グリコプロテインＩ」と区別する必要がある場合には、「インタクトβ２グリコプロテインＩ」と称することがある。従って、本明細書において、単に「β２グリコプロテインＩ」と称する場合には、特に断わらない限り、「インタクトβ２グリコプロテインＩ」を指すものとする。
【背景技術】
【０００３】
β２グリコプロテインＩは、５つの繰り返しドメイン構造（第Ｉドメイン〜第Ｖドメイン）を有する糖タンパク質であり、例えば、ヒトβ２グリコプロテインＩは、３２６個のアミノ酸からなり、分子量が約５０，０００である。インタクトβ２グリコプロテインＩは、血液中に約２００μｇ／ｍｌの濃度で存在し、陰性荷電リン脂質（例えば、カルジオリピン又はホスファチジルセリンなど）、ヘパリン、又はＤＮＡなどの負電荷物質と結合することができる。インタクトβ２グリコプロテインＩの生理的な機能としては、陰性荷電リン脂質への結合による内因系凝固反応の阻害作用、及び血小板膜上でのリン脂質依存性プロトロンビナーゼ活性の阻害作用を示すことから、凝固制御因子としての役割が示唆されている。
【０００４】
一方、β２グリコプロテインＩにおける第Ｖドメイン内の一部に、プロテアーゼにより開裂（例えば、ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、第３１７番目のリジン残基と第３１８番目のトレオニン残基との間での開裂、あるいは、第３１４番目のアラニン残基と第３１５番目のフェニルアラニン残基との間での開裂）を受けたニックβ２グリコプロテインＩは、前記の陰性荷電リン脂質との結合親和性が約１／１００に低下することが報告されている［Ｊ．Ｅ．Ｈｕｎｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９０巻，第２１４１頁〜第２１４５頁，（１９９３年）］。また、第３１７番目のリジン残基と第３１８番目のトレオニン残基との間での開裂は、プラスミンの作用により生じることが報告されている［大蔵ら，Ｂｌｏｏｄ，第９１巻，第４１７３頁〜第４１７９頁，（１９９８年）］。
このように、インタクトβ２グリコプロテインＩは、生体内で凝固制御因子としての役割を担っているが、様々な病態（例えば、癌、白血病、又は炎症など）において血管内凝固系が活性化されると、それに引き続き活性化される線溶系酵素であるプラスミンにより開裂を受け、陰性荷電リン脂質との結合親和性が低下し、ニックβ２グリコプロテインＩとして血中に遊離するものと考えられる。
【０００５】
また、全身性炎症性自己免疫疾患の一つである全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者の一部においては、陰性荷電リン脂質に結合したβ２グリコプロテインＩに対して反応する抗リン脂質抗体が血中に出現する。この抗リン脂質抗体の存在により、血管内皮細胞膜上において免疫複合体が形成されることで、補体系の活性化、ひいては全身炎症反応に発展する。炎症反応に伴い、局所で活性化された顆粒球より放出されたエラスターゼにより、β２グリコプロテインＩが開裂を受けることも考えられる。実際、前記のＪ．Ｅ．Ｈｕｎｔらの報告では、顆粒球エラスターゼの特異性に一致するβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメイン内の第３１４番目のアラニン残基と第３１５番目のフェニルアラニン残基との間での開裂が示されている。また、生体内においてはプラスミンだけでなく、顆粒球エラスターゼも線溶に関与している可能性が示唆されている［Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，第６巻，２５９頁，（１９９５年）］。
【０００６】
これらの事実及び報告から明らかなように、生体試料中のニックβ２グリコプロテインＩの存在の有無を検出するか、あるいは、その存在量を測定することができれば、生体内凝固線溶異常の有無又は程度を判断することができる。しかしながら、ニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法は、従来全く知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、生体試料中のニックβ２グリコプロテインＩを、前記試料中に同時に含まれると考えられるインタクトβ２グリコプロテインＩの量に影響を受けることなく、迅速かつ正確に測定することのできるニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法を提供することにある。また、本発明の課題は、前記免疫学的分析方法に用いることのできる新規モノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、並びに生体内凝固線溶異常の検出法を提供することにある。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、被検試料中のインタクトβ２グリコプロテインＩの干渉を受けることなく、患者由来の被検試料中のニックβ２グリコプロテインＩの量を特異的に、簡便かつ迅速に、ＥＩＡ法及び凝集法により測定することができる。これは、本発明により初めて可能になったものである。従って、本発明は生体内凝固線溶異常を把握するための有効な手段を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記の課題は、本発明による、β２グリコプロテインＩ（すなわち、インタクトβ２グリコプロテインＩ）と反応しないが、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩ（すなわち、ニックβ２グリコプロテインＩ）とは反応することを特徴とする、モノクローナル抗体（以下、「本発明による第１のモノクローナル抗体」と称することがある）又はその抗体フラグメントによって達成することができる。
また、本発明は、β２グリコプロテインＩ（すなわち、インタクトβ２グリコプロテインＩ）及びニックβ２グリコプロテインＩと反応することを特徴とする、モノクローナル抗体（以下、「本発明による第２のモノクローナル抗体」と称することがある）又はその抗体フラグメントに関する。
また、本発明は、前記モノクローナル抗体（すなわち、前記の本発明による第１のモノクローナル抗体、又は前記の本発明による第２のモノクローナル抗体）を産生することを特徴とする、ハイブリドーマに関する。
【００１０】
また、本発明は、本発明による第１のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを第１抗体として不溶性担体に固定化し、この固定化された第１抗体と被検試料とを接触させ、続いて、前記の第１抗体とは別種の本発明による第１のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体、又は本発明による第２のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体と接触させ、前記の固定化第１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ複合体と結合した前記第２抗体の前記標識からの信号、又は前記の固定化第１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ複合体と結合しなかった前記第２抗体の前記標識からの信号を検出することを特徴とする、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、不溶性担体に固定化された、本発明による第１のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント少なくとも１種類と、不溶性担体に固定化された、別種の本発明による第１のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント又は本発明による第２のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント１種類と、被検試料とを接触させ、凝集反応を観察することを特徴とする、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法に関する。
更に、本発明は、ニックβ２グリコプロテインＩを分析することを特徴とする、生体内凝固線溶異常の検出法に関する。
【００１２】
本明細書において、「ニックβ２グリコプロテインＩ」とは、前記のとおり、プロテアーゼによりアミノ酸配列の一部に開裂を受けて２本のポリペプチド鎖からなるものの、それらがジスルフィド結合により結合しているβ２グリコプロテインＩを意味する。具体的には、前記「ニックβ２グリコプロテインＩ」には、（１）プラスミンにより第Ｖドメインに開裂（ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、第３１７番目のリジン残基と第３１８番目のトレオニン残基との間で開裂）を受けたニックβ２グリコプロテインＩ（以下、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩと称することがある）、及び（２）顆粒球エラスターゼにより第Ｖドメインに開裂（ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、第３１４番目のアラニン残基と第３１５番目のフェニルアラニン残基との間で開裂）を受けたニックβ２グリコプロテインＩ（以下、Ｅ−ニックβ２グリコプロテインＩと称することがある）が含まれる。
【００１３】
また、本明細書において、β２グリコプロテインＩ（インタクトβ２グリコプロテインＩ及びニック２グリコプロテインＩの両方を含む）における「第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域」とは、ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、３２６個のアミノ酸から構成されるヒトβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２４１番目のアミノ酸残基からなる領域を意味する。
【００１４】
更に、β２グリコプロテインＩ（インタクトβ２グリコプロテインＩ及びニック２グリコプロテインＩの両方を含む）における「第Ｖドメイン」とは、ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、３２６個のアミノ酸から構成されるβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第２４２番目のアミノ酸残基〜第３２６番目のアミノ酸残基からなる領域を意味する。
【００１５】
なお、ニックβ２グリコプロテインＩにおける「第Ｖドメイン」は、その一部に開裂（ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、第３１７番目のリジン残基と第３１８番目のトレオニン残基との間での開裂、あるいは、第３１４番目のアラニン残基と第３１５番目のフェニルアラニン残基との間での開裂）を受け、ジスルフィド結合により結合した２本のポリペプチド鎖からなる。
一方、インタクトβ２グリコプロテインＩにおける「第Ｖドメイン」は、ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、３２６個のアミノ酸から構成されるβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第２４２番目のアミノ酸残基〜第３２６番目のアミノ酸残基からなる、開裂を受けていないドメインである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明による第１のモノクローナル抗体は、インタクトβ２グリコプロテインＩ（特には、ヒトインタクトβ２グリコプロテインＩ）とは反応せず、プロテアーゼ（特には、プラスミン又は顆粒球エラスターゼ）により一部（特には、第Ｖドメイン）に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩ［特には、プロテアーゼ（特には、プラスミン又は顆粒球エラスターゼ）により一部（特には、第Ｖドメイン）に開裂を受けたヒトβ２グリコプロテインＩ］とのみ反応する。
本発明による好ましい第１のモノクローナル抗体は、（１）インタクトβ２グリコプロテインＩとは反応せず、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩと反応し、しかも、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに反応する（以下、「本発明によるモノクローナル抗体１Ａ」と称することがある）か、あるいは、（２）インタクトβ２グリコプロテインＩとは反応せず、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩと反応し、しかも、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に反応する（以下、「本発明によるモノクローナル抗体１Ｂ」と称することがある）。
【００１７】
本発明によるモノクローナル抗体１Ａのエピトープは、ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメイン［例えば、ヒトニックβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第２４２番目のアミノ酸残基〜第３２６番目のアミノ酸残基からなる領域］に存在する。本発明によるモノクローナル抗体１Ａのエピトープとしては、非還元状態のインタクトβ２グリコプロテインＩ及び非還元状態のインタクトβ２グリコプロテインＩ第Ｖドメインにおいて分子内に隠れているが、還元状態のインタクトβ２グリコプロテインＩ及び非還元状態のインタクトβ２グリコプロテインＩ第Ｖドメインにおいて露出するエピトープであることが好ましい。本発明によるモノクローナル抗体１Ａとしては、後述する実施例で得られるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９を挙げることができる。
【００１８】
本発明によるモノクローナル抗体１Ｂのエピトープは、ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域［例えば、ヒトニックβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２４１番目のアミノ酸残基からなる領域］に存在する。本発明によるモノクローナル抗体１Ｂのエピトープとしては、立体構造依存的なエピトープ、すなわち、非還元状態のニックβ２グリコプロテインＩではエピトープの構造を保持し、還元状態のニックβ２グリコプロテインＩではエピトープの構造を保持しないエピトープであることが好ましい。本発明によるモノクローナル抗体１Ｂとしては、後述する実施例で得られるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を挙げることができる。
【００１９】
本発明による第２のモノクローナル抗体は、インタクトβ２グリコプロテインＩ（特には、ヒトインタクトβ２グリコプロテインＩ）、及びプロテアーゼ（特には、プラスミン又は顆粒球エラスターゼ）により一部（特には、第Ｖドメイン）に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩ［特には、プロテアーゼ（特には、プラスミン又は顆粒球エラスターゼ）により一部（特には、第Ｖドメイン）に開裂を受けたヒトβ２グリコプロテインＩ］と反応する。
【００２０】
本発明による第２のモノクローナル抗体のエピトープは、β２グリコプロテインＩ（インタクトβ２グリコプロテインＩ及びニック２グリコプロテインＩの両方を含む）の第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域［例えば、ヒトニックβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２４１番目のアミノ酸残基からなる領域］に存在することが好ましく、立体構造非依存的なエピトープ、すなわち、非還元状態のβ２グリコプロテインＩにおいても、還元状態のβ２グリコプロテインＩにおいても、エピトープとして機能するエピトープであることがより好ましい。本発明による第２のモノクローナル抗体としては、後述する実施例で得られるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３を挙げることができる。
【００２１】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、近年各方面で行われている細胞融合法で作成されたハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法により得ることができる。すなわち、ニックβ２グリコプロテインＩ（好ましくは、ヒトニックβ２グリコプロテインＩ）を抗原として使用し、種々のニックβ２グリコプロテインＩ、インタクトβ２グリコプロテインＩ、及び／又はそれらのフラグメントを用いてスクリーニングを実施することによって、本発明のモノクローナル抗体を産生する本発明のハイブリドーマを調製することができ、そのハイブリドーマから本発明のモノクローナル抗体を調製することができる。本発明のハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の調製は、常法、例えば、続生化学実験講座（日本生化学会編）又は免疫生化学研究法（日本生化学会編）に記載の方法に従って行うことができる。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体は、そのモノクローナル抗体を産生することのできる本発明のハイブリドーマ（例えば、マウス・ハイブリドーマ）を、例えば、適当な培地又は哺乳動物（例えば、マウス）の腹腔内で培養することにより製造することができる。
本発明のハイブリドーマは、一般的には、例えば、ニックβ２グリコプロテインＩで免疫した哺乳動物又は鳥類（例えば、マウス）の脾臓細胞と哺乳動物（例えば、マウス）のミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを、Ｎａｔｕｒｅ，第２５６巻，４９５頁（１９７５年）に記載の方法により細胞融合して製造することが可能である。詳細には、下記実施例に記載の方法によって製造することができる。
【００２３】
前記のハイブリドーマを培養することのできる培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｅａｇｌｅ'ｓ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ：以下、ＤＭＥと称する）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸、及び抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。
前記のハイブリドーマの培養は、培地中で行う場合には、例えば、５％ＣＯ2濃度及び３７℃の条件下で約３日間行う。あるいは、マウスの腹腔内で行う場合には、例えば、約１４日間行う。
【００２４】
このようにして製造された培養液又は哺乳動物の腹水から、例えば、タンパク質の単離・精製に一般的に用いられている方法により、本発明のモノクローナル抗体を分離・精製することが可能である。
そのような方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができる。
【００２５】
本発明の抗体フラグメントは、本発明のモノクローナル抗体のフラグメントであって、しかも、もとのモノクローナル抗体と同じ反応特異性を有する抗体フラグメントである。
すなわち、本発明による第１のモノクローナル抗体の抗体フラグメントは、インタクトβ２グリコプロテインＩとは反応せず、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩとのみ反応する。
また、本発明によるモノクローナル抗体１Ａの抗体フラグメントは、インタクトβ２グリコプロテインＩとは反応せず、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩとのみ反応し、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに反応する。
また、本発明によるモノクローナル抗体１Ｂの抗体フラグメントは、インタクトβ２グリコプロテインＩとは反応せず、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩとのみ反応し、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に反応する。
更に、本発明による第２のモノクローナル抗体の抗体フラグメントは、インタクトβ２グリコプロテインＩ、及びプロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩと反応する。
【００２６】
本発明の抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、又はＦｖ等が含まれる。これらのフラグメントは、例えば、本発明のモノクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タンパク質の分離・精製の常法に従って得ることができる。
【００２７】
このようにして得られた本発明による抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体及びその抗体フラグメントの内、本発明による第１のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントは、ニックβ２グリコプロテインＩとのみ特異的に結合する能力を有するので、例えば、（１）本発明による第１のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント２種類以上を用いることにより、あるいは、（２）本発明による第１のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント１種類以上と、本発明による第２のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント１種類以上と組み合わせて用いることにより、本発明による抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントは、ニックβ２グリコプロテインＩの各種の免疫学的分析方法の試薬として有用である。なお、本明細書において、前記「分析方法」には、分析対象物質の存在の有無を確認する検出方法と、分析対象物質の量を測定する定量方法の両方が含まれる。
【００２８】
例えば、本発明による第１のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを第１抗体として不溶性担体に固定化し、この固定化された第１抗体と被検試料とを接触させ、続いて、第１抗体とは別種の本発明による第１のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体、又は本発明による第２のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体と接触させると、前記の固定化第１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ複合体と結合した前記第２抗体又は前記の固定化第１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ複合体と結合しなかった前記第２抗体の前記標識からの信号を検出することができるので、本発明による抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントは、ニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法（サンドイッチ法）の試薬として有用である。
【００２９】
また、本発明による第１のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント少なくとも１種類と、別種の本発明による第１のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント又は本発明による第２のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント１種類とを不溶性担体に固定化し、これらの固定化したモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントと被検試料とを接触させると、被検試料中のインタクトβ２グリコプロテインＩとは凝集反応を起こさず、ニックβ２グリコプロテインＩとの間でのみ凝集反応を起こさせることができるので、本発明による抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントは、ニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法（凝集法）の試薬として有用である。
【００３０】
従って、本発明による抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを用いて、本発明の免疫学的分析方法を実施することができる。本発明の免疫学的分析方法に用いる被検試料は、ニックβ２グリコプロテインＩを含む可能性のある試料であれば特に限定されるものでないが、例えば、生体試料、特には血液、血漿、血清、又は尿、好ましくは血漿又は血清である。本発明の免疫学的分析方法においては、被検試料を前処理せずに（例えば、クロマトグラフィーの手法で、あらかじめインタクトβ２グリコプロテインＩとニックβ２グリコプロテインＩとを分離操作することなく）、そのまま使用しても、被検試料中に存在するインタクトβ２グリコプロテインＩの妨害を避けることができる。
【００３１】
サンドイッチ法を利用する本発明の免疫学的分析方法では、具体的には、本発明による第１のモノクローナル抗体（例えば、本発明によるモノクローナル抗体１Ａ又は本発明によるモノクローナル抗体１Ｂ）又はその抗体フラグメントを適当な不溶性担体に固定化する（第１抗体）。次に、不溶性担体と被検試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等］で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、未希釈の検体試料を加えて一定時間（たとえば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（１次反応）。続いて、前記第１次抗体として用いたモノクローナル抗体とは別種の本発明による第１のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体、又は本発明による第２のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体を加えて一定時間（たとえば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識抗体の量を定量する。その値から、被検試料中のニックβ２グリコプロテインＩの量を算出することができる。また、１次反応と２次反応とを同時に行うことも可能である。
【００３２】
本発明のサンドイッチ法による免疫学的分析方法に使用することのできる不溶性担体は特に限定されるものでなく、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子、その他ニトロセルロース、紙、アガロース及びこれらの組み合わせ等を例示することができる。
【００３３】
標識物質としては、酵素、蛍光物質、又は発光物質を使用するのが有利である。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、ルシフェリン等を使用することができる。
【００３４】
凝集反応を利用する本発明の免疫学的分析方法において、不溶性担体としては、一般に抗原抗体反応の凝集反応を利用する免疫学的分析方法において用いられる任意の不溶性担体を用いることができ、例えば、ラテックス粒子（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を挙げることができる。モノクローナル抗体を不溶性担体に固定化させるには、公知の方法、例えば、化学結合法（架橋剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）又は物理吸着法を用いることができる。こうして、モノクローナル抗体と不溶性担体との複合体（抗体／担体複合体）を形成し、これを本発明の免疫学的分析方法に用いることができる。
【００３５】
本発明の免疫学的測定方法（凝集法）においては、前記の不溶性担体に固定化した少なくとも２種のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント、すなわち、（１）本発明による第１のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント少なくとも１種類と、（２）別種の本発明による第１のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント又は本発明による第２のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント１種類とを使用するが、使用するモノクローナル抗体の各々のエピトープが互いに離れている方が凝集反応が起きやすい点で、本発明によるモノクローナル抗体１Ａ若しくはその抗体フラグメント、本発明によるモノクローナル抗体１Ｂ若しくはその抗体フラグメント、又は本発明による第２のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントの少なくとも２種を使用することが好ましい。
【００３６】
本発明の免疫学的測定方法（凝集法）においては、例えば、モノクローナル抗体を２種用いる場合には、或る１種のモノクローナル抗体を不溶性担体に固定化して調製した抗体／担体複合体を２種用いるか、あるいは、２種のモノクローナル抗体を或る１種の不溶性担体に固定化して調製した抗体／担体複合体を用いることができる。
また、モノクローナル抗体を３種用いる場合には、或る１種のモノクローナル抗体を不溶性担体に固定化して調製した抗体／担体複合体を３種用いるか、あるいは、３種のモノクローナル抗体を或る１種の不溶性担体に固定化して調製した抗体／担体複合体を用いることができる。更に、或る１種のモノクローナル抗体を不溶性担体に固定化して調製した抗体／担体複合体１種と、２種のモノクローナル抗体を或る１種の不溶性担体に固定化して調製した抗体／担体複合体１種との組み合わせを用いることもできる。
スライド板を用いる場合には目視的に、又は反応セルを用いる場合には特定の波長を用いて分光学的に凝集反応を測定し、被検試料中のニックβ２グリコプロテインＩ濃度を定量することができる。
【００３７】
ニックβ２グリコプロテインＩは、生体内凝固線溶異常の予知マーカーであるので、本発明の免疫学的分析方法を用いて、被検試料中に含まれるニックβ２グリコプロテインＩを検出することによって、あるいは、ニックβ２グリコプロテインＩの量を測定し、その測定値と健常人の平均値とを比較することによって、生体内凝固線溶異常の有無及び／又は程度を検出することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３９】
《実施例１：各種タンパク質の調製》
（ａ）インタクトβ２グリコプロテインＩの調製
β２グリコプロテインＩは、Ｅ．Ｐｏｌｚらの方法［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，第１１巻，２６５頁，（１９８０年）］に準じて行った。
すなわち、ヒト正常血漿３００ｍｌに終濃度１．３％となるように過塩素酸を添加し、４℃で１５分間処理した後に、遠心分離（５，０００×ｇ，１０分間）を実施した。遠心分離により得られた上清に、１／３容量の１Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加して中性に戻した後に、限外濾過により濃縮した。この濃縮液を、予め１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したヘパリン固定化ＨｉＴｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，スウェーデン）に充填し、１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にてカラムを洗浄した後に、１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）とを用いたグラジェント溶出法により、インタクトβ２グリコプロテインＩを溶出した。このインタクトβ２グリコプロテインＩは、ＮａＣｌ濃度が０．２０Ｍである画分付近に溶出された。ヒト正常血漿３００ｍｌより、精製インタクトβ２グリコプロテインＩ４．５ｍｇが得られた。
【００４０】
得られた精製インタクトβ２グリコプロテインＩを、以下に示すニックβ２グリコプロテインＩの調製のための原料及び抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原として、更には、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体の認識部位の同定に使用した。
【００４１】
（ｂ）Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩの調製
実施例１（ａ）で調製したインタクトβ２グリコプロテインＩ−３ｍｇを２０ｍＭ−ＮａＣｌ及び０．３ｍＭ−ＣａＣｌ2を含有する０．１Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）３ｍｌに溶解し、この溶解液にヒトプラスミン８６μｇを添加した。このときのインタクトβ２グリコプロテインＩとプラスミンとのモル比（インタクトβ２グリコプロテインＩ：プラスミン）は、５０：１であった。３７℃で２時間インキュベートした後に、予め１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したヘパリン固定化ＨｉＴｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，スウェーデン）に充填し、１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にてカラムを洗浄した後に、１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１Ｍ−ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）とを用いたグラジェント溶出法により、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩを溶出した。Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩは、ＮａＣｌ濃度が０．１５Ｍである画分付近に溶出され、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩ２．０ｍｇを得た。
【００４２】
得られたＰ−ニックβ２グリコプロテインＩを、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体作製のための免疫原として、また、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原として、更には、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体の認識部位の同定に使用した。
【００４３】
（ｃ）リコンビナント第Ｖドメイン及びインタクト第Ｖドメインの調製
ヒトβ２グリコプロテインＩをコードする全遺伝子配列を含むプラスミドｐＵＣ１１８−β２−ＧＰＩ上の第IVドメインと第Ｖドメインとの間のヒンジ領域に相当する箇所に、部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法により制限酵素ＨｉｎｄIIIの切断部位を導入した［松浦ら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第３巻，第１２１７頁〜第１２２１頁，（１９９１年）］。得られたプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断することにより生じる、ヒトβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメイン（第２４２番目のアミノ酸残基〜第３２６番目のアミノ酸残基からなる領域）をコードする領域の５'側に、活性化血液凝固Ｘａ因子による切断部位をコードするＤＮＡ断片をリンカーとして接続し、得られたＤＮＡ断片を酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の発現ベクターであるｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；米国）に挿入した。このようにして構築した第Ｖドメイン発現ベクターを、ｐＮＰＤ５と名付けた。この第Ｖドメイン発現ベクターｐＮＰＤ５において、前記活性化血液凝固Ｘａ因子による切断部位及び第Ｖドメインをコードする領域の５'側には、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の分泌シグナルが存在している［萩原ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１２１巻，第１２８頁〜第１３７頁，（１９９７年）］。
【００４４】
第Ｖドメイン発現ベクターｐＮＰＤ５を制限酵素ＢｇｌIIで切断し、直鎖状にしてからヒスチジン要求株である宿主ＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；米国）にトランスフォーメーションした。抗β２グリコプロテインＩ・ウサギポリクローナル抗体（Ｓｅｒｂｉｏ社；フランス）を用いたニトロセルロース膜ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングの結果、高効率に第Ｖドメインを発現する形質転換株ＧＳ１１５（ｐＮＰＤ５）を得た。
【００４５】
得られた形質転換株ＧＳ１１５（ｐＮＰＤ５）を、増殖培地［４％グリセロールを含むＢＭ培地［酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社）１０ｇ／リットル，肉ペプトン（Ｓｉｇｍａ社）２０ｇ／リットル，酵母窒素ベース（ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ；Ｄｉｆｃｏ社）６．７ｇ／リットル，Ｄ−ビオチン（ナカライテスク社）０．４ｍｇ／リットル，１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍｌ／リットル］］２リットル中で、６００ｎｍにおける吸光度が６０を示すまで増殖させた後に、誘導培地（３％メタノールを含むＢＭ培地）０．６６リットルに交換し、更に１３時間培養を続けることにより、Ｎ末端側に酵母由来の分泌シグナル及び活性化血液凝固Ｘａ因子による切断部位とが連結したβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメイン（以下、リコンビナント第Ｖドメインと称する）を培地中に発現させた。
【００４６】
遠心分離にて細胞画分を除去した後に、上清を、５０ｍＭ−ＮａＣｌ及び１ｍＭ−ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で６倍に希釈し、予め５０ｍＭ−ＮａＣｌ及び１ｍＭ−ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）にて平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）に充填した。充分にカラムを洗浄した後に、５０ｍＭ−ＮａＣｌ及び１ｍＭ−ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）と０．８Ｍ−ＮａＣｌ及び１ｍＭ−ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）とによるグラジェント溶出法により溶出した。目的の溶出フラクションを限外濾過により濃縮した後に、蒸留水に対して透析し、更には、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲカラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより、リコンビナント第Ｖドメインを精製した。
【００４７】
このようにして調製したリコンビナント第ＶドメインのＮ末端には、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の分泌シグナルと活性化血液凝固Ｘａ因子による切断部位とが存在する。これを除去するために、リコンビナント第Ｖドメインを１．３ｍＭ−ＣａＣｌ2、０．１Ｍ−ＮａＣｌ、及び０．１％アジ化ナトリウムを含有する６０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に溶解した後に、活性化血液凝固Ｘａ因子を３７℃で９時間作用させた。この際のリコンビナント第Ｖドメインに対する活性化血液凝固Ｘａ因子の質量比は１／５０であった。この分解物をＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲカラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより分離し、精製第Ｖドメインを得た。培養液１リットル当たり、第Ｖドメイン１００ｍｇが得られた。
この精製第Ｖドメインを、以下に示すニック第Ｖドメインの調製のための原料及び抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナルの認識部位の同定に使用した。なお、ここで調製した第Ｖドメインを、以下のニック第Ｖドメインと区別するために「インタクト第Ｖドメイン」と称することもある。
【００４８】
（ｄ）Ｐ−ニック第Ｖドメインの調製
実施例１（ｃ）で調製した第Ｖドメイン（インタクト第Ｖドメイン）１ｍｇを２０ｍＭ−ＮａＣｌ及び０．３ｍＭ−ＣａＣｌ2を含む０．１Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）３ｍｌに溶解し、これにヒト・プラスミン１４４μｇを添加した。この際の第Ｖドメインとプラスミンとのモル比（第Ｖドメイン：プラスミン）は５０：１であった。３７℃で２時間インキュベートした後に、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲカラムを用いた逆相ＨＰＬＣによりニック第Ｖドメインを分離、精製した。
このようにして調製したＰ−ニック第Ｖドメインを、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体の認識部位の同定に使用した。
【００４９】
《実施例２：ハイブリドーマの調製》
（ａ）免疫化した脾臓細胞の調製
前記実施例１（２）で得られたＰ−ニックβ２グリコプロテインＩ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝１．０）を等量のフロインド氏完全アジュバンドと乳化するまで混和し、その混合液０．１ｍｌをマウス腹腔内に投与することにより免疫を行った（第１回免疫）。３０日経過後に、そのマウスに前記と同様の方法で腹腔内に投与した（第２回免疫）。第２回免疫から、２１日経過後に、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩ溶液（Ａ２８０ｎｍ＝１．０）を等量の生理的食塩水で希釈し、その希釈液０．１ｍｌを、マウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後に、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、以下の工程に使用した。
【００５０】
（ｂ）細胞融合
無菌的に摘出した前記の脾臓を、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシャーレーに入れた。次に、脾臓を１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで還流して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。この脾細胞を５０ｍｌ遠心チューブに集めて５００×ｇで１０分間遠心した。こうして得たペレットにヘモライジング溶液（１５５ｍＭ−ＮＨ4Ｃｌ，１０ｍＭ−ＫＨＣＯ3，及び１ｍＭ−Ｎａ2ＥＤＴＡ；ｐＨ７．０）５ｍｌを加え、懸濁させた。０℃で５分間放置すると、懸濁液中の赤血球が破壊された。１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地１５ｍｌを加えてから遠心分離した。このようにして得た細胞ペレットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きている脾細胞数を測定した。
【００５１】
一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４（約２×１０7個）に前記脾臓細胞（１×１０8個）を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合し、遠心分離を行った（５００×ｇ，１０分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、３８℃に保温しておいた４０％ポリエチレングリコール４０００溶液０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブを手で、１分間穏やかに回転することによってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットとを混合させた。次に、３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を３０秒毎に１ｍｌずつ加えてチューブを穏やかに回転させた。この操作を１０回繰り返した後、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地２０ｍｌを加えて、遠心分離（５００×ｇ，１０分間）を行った。上清を除去した後、細胞ペレットを１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にアミノプテリン４×１０-7Ｍ、チミジン１．６×１０-5Ｍ、及びヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したもの）で、遠心法によって２回洗浄した後、前記ＨＡＴ培地４０ｍｌに懸濁した。
【００５２】
この細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに２００μｌずつ分注し、５％炭酸ガスを含む３７℃の炭酸ガス培養器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウェルの培地約１００μｌを除き、新たに前記のＨＡＴ培地１００μｌを加えることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択した。８日頃から１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０-5Ｍ及びヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、約１０日目に、後述するＥＬＩＳＡ法により、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
【００５３】
（Ｃ）ハイブリドーマの樹立
ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無をＥＬＩＳＡ法により測定した。９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに、前述の精製Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩ溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．０５；生理食塩水で希釈した）を５０μｌずつ分注し、２５℃で２時間放置した。次に、０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む生理食塩水（以下、トウィーン２０−生理食塩水と称する）で３回洗浄した後、各ウェルの培養上清５０μｌを加え、２５℃で１時間反応させた。
次に、トウィーン２０−生理食塩水で洗浄した後に、トウィーン２０−生理食塩水で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリン・ウサギＩｇＧ抗体（ダコ社；デンマーク）５０μｌを各ウェルに加えた。反応終了後、トウィーン２０−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、酵素基質溶液（０．５ｍＭ−４−アミノアンチピリン、１０ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水素水を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液；ｐＨ７．４）２００μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させ、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５４】
その結果、３８２ウェル中３ウェルに抗体産生が認められた。その３ウェル中の各ハイブリドーマを２４ウェルプレートに移し、１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地で４〜５日間培養した。その後、再度ＥＬＩＳＡ法によって抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体の産生の有無を確認してから、限界希釈法によりクローニングした。１０日後に、ＥＬＩＳＡ法によって抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結果、各ハイブリドーマにつき、２０〜４０個の抗体産生クローンが得られた。これらのクローンの中から、増殖の良い、抗体分泌能の高い、しかも安定なクローンを選び、前述と同様の方法により再クローン化を行い、本発明の抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＮＧＰＩ−２３、ハイブリドーマＮＧＰＩ−５９、及びハイブリドーマＮＧＰＩ−６０を樹立した。
これらのハイブリドーマ３種は、それぞれ工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年７月９日から寄託されている。ハイブリドーマＮＧＰＩ−２３の受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１６８９１であり、ハイブリドーマＮＧＰＩ−５９の受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１６８９２であり、そして、ハイブリドーマＮＧＰＩ−６０の受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１６８９３である。
【００５５】
《実施例３：モノクローナル抗体の製造》
（ａ）イン・ビトロ法
マウスハイブリドーマＮＧＰＩ−２３を、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地で３７℃にて５％二酸化炭素雰囲気中において７２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分間）した後、上清に固形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷下で３０分間攪拌した後、６０分間放置し、遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分）した後、得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。
【００５６】
透析物を、１０ｍＭリン酸緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）との間でグラジェント溶出法により行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物をヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通した。次に通過液を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出して、精製した本発明の抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３を得た。なお、本明細書においては、各ハイブリドーマの名称を、そのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の名称としても使用する。
ハイブリドーマＮＧＰＩ−５９及びハイブリドーマＮＧＰＩ−６０についても、ハイブリドーマＮＧＰＩ−２３と同様の前記操作をそれぞれ実施し、本発明のモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９及びモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を得た。
【００５７】
（ｂ）イン・ビボ法
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌを１０〜１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与し、投与後１４〜２０日目のマウス腹腔内にインビトロで増殖させたハイブリドーマＮＧＰＩ−２３、ハイブリドーマＮＧＰＩ−５９、及びハイブリドーマＮＧＰＩ−６０をマウス一匹あたり２×１０6細胞となるように接種した。
各ハイブリドーマにつき、一匹のマウスから約１０〜１５ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は、５〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製は、前記のイン・ビトロ法と同様の方法で行った（但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムを通す操作は、実施しなかった）。
【００５８】
《実施例４：モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスの同定》
本発明の抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９、及びモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０の免疫グロブリンクラスの同定は、オクテロニー免疫拡散法により行った。結果を表１に示す。
【表１】
2008301833.tif 000002
【００５９】
《実施例５：モノクローナル抗体の特異性》
（ａ）ＥＬＩＳＡ法
前記実施例１で調製したインタクトβ２グリコプロテインＩ、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩ、インタクト第Ｖドメイン、及びＰ−ニック第Ｖドメインを、１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに、抗原希釈液５０μｌずつを分注し、２５℃で２時間放置することで固定化した。次に、トウィーン２０−生理食塩水でウェルを３回洗浄した後、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９、及びモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０及び１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、各ウェルにモノクローナル抗体希釈液５０μｌずつを分注し、２５℃で１時間反応させた。対照試験は、各抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体の代わりに、ＳＰ２／０細胞をマウス腹腔に投与して採取した腹水を使用して実施した。
【００６０】
ウェルを洗浄した後、トウィーン２０−生理食塩水で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリン・ウサギＩｇＧ（ダコ社；デンマーク）の希釈液を５０μｌずつ各ウェルに加えた。反応終了後、トウィーン２０−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、酵素基質溶液（０．５ｍＭ  ４−アミノアンチピリン、１０ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水素水を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液；ｐＨ７．４）２００μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間発色反応させ、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。各モノクローナル抗体と各抗原との結合反応の結果を表２に示す。表２において、抗原（Ａ）はインタクトβ２グリコプロテインＩを示し、抗原（Ｂ）はＰ−ニックβ２グリコプロテインＩを示し、抗原（Ｃ）はインタクト第Ｖドメイン示し、抗原（Ｄ）はＰ−ニック第Ｖドメインを示し、「＋」は結合反応性を有することを示し、「−」は結合反応性がないことを示す。
【００６１】
【表２】
2008301833.tif 000003
【００６２】
表２の結果から明らかなように、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３は、インタクトβ２グリコプロテインＩ及びＰ−ニックβ２グリコプロテインＩに反応し、インタクト第Ｖドメイン及びＰ−ニック第Ｖドメインに反応しなかった。すなわち、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３は、インタクトβ２グリコプロテインＩ及びＰ−ニックβ２グリコプロテインＩにおける第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に反応することが判明した。
しかも、後述するように、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３は、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９又は抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０と組み合わせることによりサンドイッチ免疫測定法の構築が可能であることから、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９及び抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０とは異なる部位に反応する。
【００６３】
抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９は、インタクトβ２グリコプロテインＩ及びインタクト第Ｖドメインには反応せず、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩ及びＰ−ニック第Ｖドメインに反応した。すなわち、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９は、プロテアーゼ、特にはプラスミンにより開裂を受けたＰ−ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに特異的に反応することが判明した。
【００６４】
抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０は、インタクトβ２グリコプロテインＩ、インタクト第Ｖドメイン、及びＰ−ニック第Ｖドメインには反応せず、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩにのみ反応した。すなわち、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０は、プロテアーゼ、特にはプラスミンにより開裂を受けたＰ−ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメイン以外の領域、つまり、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に特異的に反応することが判明した。
【００６５】
また、各抗原を固相に固定化する際に、ヘパリン（濃度：３０μｇ／ｍｌ）、又は陰性荷電リン脂質であるカルジオリピン（濃度：１００μＭ）を共存させても、インタクトβ２グリコプロテインＩ及びインタクト第Ｖドメインに対する抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９及びＮＧＰＩ−６０の反応性は認められなかった。このことは、ヘパリン又は陰性荷電リン脂質のカルジオリピンが、β２グリコプロテインＩに結合することで誘導されるエピトープとは全く異なるエピトープを抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９及びＮＧＰＩ−６０が認識することを示している。
【００６６】
（ｂ）イムノブロット法
前記実施例１で調製したインタクトβ２グリコプロテインＩ、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩ、インタクト第Ｖドメイン、及びＰ−ニック第Ｖドメインを、非還元下あるいは還元下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて分画した後、ゲル中のタンパク質をニトロセルロースメンブレンに電気的に転写した。このメンブレンを、５％スキムミルク及び０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に２５℃で３０分間浸した後、一次抗体として各抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体であるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９、又はモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を２５℃で１時間反応させた。対照試験は、各抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体の代わりに、ＳＰ２／０細胞をマウス腹腔に投与して採取した腹水を使用して実施した。
【００６７】
０．０５％トウィーン−２０及び０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）でメンブレンを３回洗浄した後、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ・ヤギＩｇＧ抗体（バイオラッド社）を２５℃で１時間反応させた。前記と同様の方法でメンブレンを洗浄した後、５ｍＭ−ＭｇＣｌ2を含む０．１Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．５）に、ニトロブルーテトラゾリウム（終濃度＝０．３３ｍｇ／ｍｌ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート−ｐ−トルイジン（終濃度＝０．１７ｍｇ／ｍｌ）を加えた溶液を発色液として用いた。この発色液を２５℃で５〜１０分間反応させた。反応停止は、メンブレンを蒸留水で数回洗浄することにより行った。
非還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した後のイムノブロットの結果を表３に示し、還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した後のイムノブロットの結果を表４に示す。また、表３及び表４において、抗原（Ａ）はインタクトβ２グリコプロテインＩを示し、抗原（Ｂ）はＰ−ニックβ２グリコプロテインＩを示し、抗原（Ｃ）はインタクト第Ｖドメインを示し、抗原（Ｄ）はＰ−ニック第Ｖドメインを示し、「＋」は結合反応性を有することを示し、「−」は結合反応性がないことを示す。
【００６８】
【表３】
2008301833.tif 000004
【００６９】
【表４】
2008301833.tif 000005
【００７０】
表３の結果（すなわち、非還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した後のイムノブロットの結果）は、実施例５（ａ）で示した表２の結果（すなわち、ＥＬＩＳＡの結果）と一致する。すなわち、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３は、インタクトβ２グリコプロテインＩ及びＰ−ニックβ２グリコプロテインＩに反応し、インタクト第Ｖドメイン及びＰ−ニック第Ｖドメインに反応しなかった。すなわち、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３は、インタクトβ２グリコプロテインＩ及びＰ−ニックβ２グリコプロテインＩにおける第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に反応することが判明した。
【００７１】
抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９は、インタクトβ２グリコプロテインＩ及びインタクト第Ｖドメインには反応せず、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩ及びＰ−ニック第Ｖドメインに反応した。すなわち、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９は、プロテアーゼ、特にはプラスミンにより開裂を受けたＰ−ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに特異的に反応することが判明した。
【００７２】
抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０は、インタクトβ２グリコプロテインＩ、インタクト第Ｖドメイン、及びＰ−ニック第Ｖドメインには反応せず、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩにのみ反応した。すなわち、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０は、プロテアーゼ、特にはプラスミンにより開裂を受けたＰ−ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメイン以外の領域、つまり、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に特異的に反応することが判明した。
【００７３】
表４の結果（すなわち、還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した後のイムノブロットの結果）から明らかなように、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３は、インタクトβ２グリコプロテインＩ及びＰ−ニックβ２グリコプロテインＩに反応し、インタクト第Ｖドメイン及びＰ−ニック第Ｖドメインに反応しなかった。すなわち、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３は、インタクトβ２グリコプロテインＩ及びＰ−ニックβ２グリコプロテインＩにおける第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に存在する立体構造非依存的なエピトープに反応することが判明した。
【００７４】
抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９は、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩ及びＰ−ニック第Ｖドメインに反応するだけでなく、更に、非還元の状態では反応しなかったインタクトβ２グリコプロテインＩ及びインタクト第Ｖドメイン（表３参照）にも反応した。この結果より、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９は、非還元状態のインタクトβ２グリコプロテインＩ及びインタクト第Ｖドメインにおいては分子内に隠れているが、還元状態では露出するエピトープを認識していることが判明した。
【００７５】
抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０は、還元状態のインタクトβ２グリコプロテインＩ、還元状態のＰ−ニックβ２グリコプロテインＩ、還元状態のインタクト第Ｖドメイン、及び還元状態のＰ−ニック第Ｖドメインのいずれにも反応しなかった。すなわち、非還元状態で反応したＰ−ニックβ２グリコプロテインＩ（表３参照）にも、還元状態では反応しなかった。この結果より、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０は、非還元状態でのみ、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩにおける第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に構成される立体構造依存的なエピトープを認識していることが判明した。
【００７６】
《実施例６：酵素免疫測定法によるニックβ２グリコプロテインＩの測定》
ナカネ及びカワオイ［ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２２巻，第１０８４頁〜第１０９１頁（１９７４年）］の方法に準じて、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３及びＮＧＰＩ−５９に結合させた。この酵素標識抗体を用いてニックβ２グリコプロテインＩのサンドイッチ酵素免疫測定を以下のようにして行った。
【００７７】
すなわち、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を２０μｇ／ｍｌの濃度で含有する５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）１００μｌを９６ウェルＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに入れて、２５℃で２時間放置した。そのプレートをトウィーン２０−生理食塩水で３回洗浄した。このようにして抗体を感作したプレートのウェルに、正常血漿に前記実施例１（ｂ）で調製したＰ−ニックβ２グリコプロテインＩを、１０００ｎｇ／ｍｌ、３１６ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、３２ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、及び３．２ｎｇ／ｍｌの濃度となるようにそれぞれ添加して調製した試料１００μｌを加え、２５℃で１時間反応させた。次に、トウィーン２０−生理食塩水で洗浄した後に、先に調製したペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ、及び２％ウシアルブミンを含む２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌを加え、２５℃で１時間反応させた。
【００７８】
続いて、トウィーン２０−生理食塩水でプレートを洗浄した後、酵素基質液［１ｍＭ−２，２'−アジノ−ジ（３−エチルベンツチアゾリンスルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び０．００２５％過酸化水素水を含む溶液；ｐＨ４．５］２００μｌずつを各ウェルに加え、２５℃で４０分間反応させた後に、各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ  Ａ４ｉ型；東ソー）で測定した。得られた検量線を図１に示す。
また、固相化抗体としてモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を用い、ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体としてモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９を用いた場合、及び固相化抗体としてモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９を用い、ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体としてモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３を用いた場合にも同様の検量線を得ることができた。
【００７９】
《実施例７：生体内凝固線溶異常をきたした患者群並びに健常人群におけるニックβ２グリコプロテインＩの測定》
実施例６で示した酵素免疫測定法（すなわち、固相化抗体としてモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を用い、ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体としてＮＧＰＩ−２３を用いた酵素免疫測定法）により、生体内凝固線溶異常をきたした患者群（２１例）、並びに健常人群（１０例）におけるニックβ２グリコプロテインＩ濃度を測定した。結果を図２に示す。健常人群のニックβ２グリコプロテインＩ濃度は、全例において４ｎｇ／ｍｌ以下であった。それに対して、生体内凝固線溶異常をきたした患者群のそれは、全例において３０ｎｇ／ｍｌ以上であった。
【００８０】
《実施例８：抗体と不溶性担体との複合体含有液の調製》
（ａ）不溶性担体上に１種類のモノクローナル抗体を担持する複合体含有液の調製
モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３（２．０ｍｇ／ｍｌ）を含有する水溶液２ｍｌと、ラテックス溶液（２％ポリスチレンラテックス，日本合成ゴム；粒径＝０．３１０μｍ）２ｍｌとを混合し、２時間撹拌して抗体をラテックス粒子上に固定化した。遠心分離（２０，０００×ｇ，２０分間）した後、沈殿を０．１％ウシアルブミン溶液に懸濁し、１時間撹拌した。再び、遠心分離（２０，０００×ｇ，２０分間）した後、沈殿を蒸留水に懸濁し、２時間撹拌した。こうしてモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／ラテックス複合体含有液を得た。
モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３の代わりに、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９又はモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を用いること以外は前記操作をそれぞれ繰り返すことにより、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／ラテックス複合体含有液、及びモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液を調製した。
【００８１】
（ｂ）不溶性担体上に２種類のモノクローナル抗体を担持する複合体含有液の調製
モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３及びモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９をそれぞれ１．０ｍｇ／ｍｌずつ含有する水溶液２ｍｌと、前記実施例８（ａ）で用いたラテックス溶液２ｍｌとを混合し、２時間撹拌して抗体をラテックス粒子上に固定化した。以下、前記実施例８（ａ）と同様の操作を行ない、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／ラテックス複合体含有液を調製した。
モノクローナル抗体の組み合わせを変更し、前記操作を繰り返すことにより、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液、及びモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液を調製した。
【００８２】
（ｃ）不溶性担体上に３種類のモノクローナル抗体を担持する複合体含有液の調製
モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９、及びモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０をそれぞれ０．６６ｍｇ／ｍｌずつ含有する水溶液２ｍｌと、前記実施例８（ａ）で用いたラテックス溶液２ｍｌとを混合し、２時間撹拌して抗体をラテックス粒子上に固定化した。以下、前記実施例８（ａ）と同様の操作を行ない、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液を調製した。
【００８３】
《実施例９：スライド凝集反応によるＰ−ニックβ２グリコプロテインＩの測定》
前記実施例８で調製した種々の抗体ラテックス複合体含有液又はそれらの混合液３０μｌと、正常血漿に実施例１（２）で調製したＰ−ニックβ２グリコプロテインＩを種々濃度で添加して調製した試料３０μｌとをスライドガラス上で混合し、揺動して３分後に凝集像を目視的に判定した。
【００８４】
結果を表５に示す。表５において、「＋」は凝集ありを、そして「−」は凝集なしを意味する。また、表５の「モノクローナル抗体／ラテックス複合体の種類」欄に示す「ＮＧＰＩ−２３」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／ラテックス複合体含有液を意味し；以下、同様に、「ＮＧＰＩ−５９」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／ラテックス複合体含有液を；「ＮＧＰＩ−６０」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液を；「ＮＧＰＩ−２３／ＮＧＰＩ−５９」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／ラテックス複合体含有液を；「ＮＧＰＩ−２３／ＮＧＰＩ−６０」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液を；「ＮＧＰＩ−５９／ＮＧＰＩ−６０」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液を；「ＮＧＰＩ−２３／ＮＧＰＩ−５９／ＮＧＰＩ−６０」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液を、それぞれ意味する。
【００８５】
また、同欄に示す「ＮＧＰＩ−２３＋ＮＧＰＩ−５９」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／ラテックス複合体含有液と、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／ラテックス複合体含有液との等量混合液を意味し；以下、同様に、「ＮＧＰＩ−２３＋ＮＧＰＩ−６０」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／ラテックス複合体含有液と、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液との等量混合液を；「ＮＧＰＩ−５９＋ＮＧＰＩ−６０」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／ラテックス複合体含有液と、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液との等量混合液を；「ＮＧＰＩ−２３＋ＮＧＰＩ−５９＋ＮＧＰＩ−６０」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／ラテックス複合体含有液と、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／ラテックス複合体含有液と、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液との等量混合液を意味する。
【００８６】
更に、同欄に示す「ＮＧＰＩ−２３＋ＮＧＰＩ−５９／ＮＧＰＩ−６０」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／ラテックス複合体含有液と、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液との１：２混合液を意味し；以下、同様に、「ＮＧＰＩ−５９＋ＮＧＰＩ−２３／ＮＧＰＩ−６０」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／ラテックス複合体含有液と、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液との１：２混合液を；「ＮＧＰＩ−６０＋ＮＧＰＩ−２３／ＮＧＰＩ−５９」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液と、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／ＮＧＰＩ−５９／ラテックス複合体含有液との１：２混合液を意味する。
【００８７】
【表５】
2008301833.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明によるモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ酵素免疫測定法により、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩの測定を行った検量線を示すグラフである。
【図２】本発明によるモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ酵素免疫測定法により、健常人（１０例）と生体内凝固線溶異常をきたした患者群（２１例）のニックβ２グリコプロテインＩ濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図１】
2008301833.tif 000007
【図２】
2008301833.tif 000008