(57)【要約】【課題】人間や動物の腸内で、簡便に且つ安定してＲＮＡｉを起こす。【解決手段】本発明の乳酸菌において二本鎖ＲＮＡを生成するキットは、ファージ由来のプロモーターを含むベクターを備えている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファージ由来のプロモーターを含むベクターを備えていることを特徴とする乳酸菌において二本鎖ＲＮＡを生成するキット。
【請求項２】
上記プロモーターが、Ｔ７プロモーターであることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項３】
ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡをさらに含んでいることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項４】
ファージ由来のプロモーターに二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡが作動可能に連結されたベクターを、含有していることを特徴とする乳酸菌。
【請求項５】
請求項４に記載の乳酸菌を含んでいることを特徴とする腸内寄生虫駆除用組成物。
【請求項６】
請求項４に記載の乳酸菌を含んでいることを特徴とする腸内疾患用治療組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌において二本鎖ＲＮＡを生成するキット及びその利用に関するものである。さらに詳しくは、二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを発現可能とした乳酸菌によって二本鎖ＲＮＡを生成するための、乳酸菌において二本鎖ＲＮＡを生成するキット及びそれを利用した技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡｉとは、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡ干渉）によって特定の遺伝子の発現を抑制する技術である。例えば、二本鎖ＲＮＡを細胞、組織、器官、個体等に導入することによりＲＮＡｉを引き起こすことができる。標的遺伝子のｍＲＮＡに二本鎖ＲＮＡがハイブリダイズすると当該ｍＲＮＡの分解が促進される。これにより、標的遺伝子の発現が抑制されるのである。
【０００３】
従来、遺伝子発現抑制法としては、アンチセンス法やリボザイム法等が知られていたが、これらの方法と比べて、ＲＮＡｉは遺伝子発現を抑制する効果が長時間持続することが判明してきた。
【０００４】
そのため、近年、ＲＮＡｉは分子生物学・細胞生物学研究において急速に広まりつつある。さらに、人間や動物にも適用できることが明らかになったことから、分子生物学における哺乳動物研究の新手法として脚光を浴びており、医薬品及び食品への応用が期待されている。
【０００５】
ＲＮＡｉの医薬品及び食品への応用として、（１）がん、高脂血症、糖尿病等の、特定の遺伝子の過剰な活性発現を原因とする疾患の治療に利用すること（例えば、特許文献１参照）、（２）人間や動物の体内に寄生している線虫や回虫等の寄生虫を、その生存に必要な遺伝子の発現を抑制することにより駆除すること等が提案されている。例えば、ｄｓＲＮＡをコードする遺伝子の発現ベクターを導入した大腸菌を、土壌生息性の線虫であるＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓに食べさせて、当該線虫の有する特定遺伝子の発現を抑制する方法も提案されている（非特許文献１参照）。
【０００６】
また、ＲＮＡｉを行なうための方法として、合成高分子やウイルスを二本鎖ＲＮＡ発現ベクターのキャリアとして細胞等に導入する方法や、動物の受精卵に二本鎖ＲＮＡ発現遺伝子を導入する方法等が報告されている。特許文献２には、キャリアとして細菌ミニ細胞を用いる方法が提案されている。
【特許文献１】特開２００６−２４６７８７号公報（２００６年９月２１日公開）
【特許文献２】特表２００５−５０５２９６号公報（２００５年２月２４日公表）
【非特許文献１】Lisa Timmons and Andrew Fire, Specific interference by ingested dsRNA, NATURE, 1998, vol. 395, 29 OCTOBER, p. 854
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来の方法では、人間や動物の腸内で、簡便に且つ安定してＲＮＡｉを起こすことが困難であるという問題を生じる。
【０００８】
例えば、非特許文献１に開示の、二本鎖ＲＮＡをコードする遺伝子を発現可能な大腸菌を用いる場合、人間や動物の腸内でＲＮＡｉを起こさせるために当該大腸菌を経口投与すると、当該大腸菌は腸内に到達することなく胃酸等により死滅してしまう確率が高い。また、大腸菌を経口投与することは安全性の面でも問題があり、特に、大量投与は困難であるため、腸内で効率よくＲＮＡｉを起こすことが困難である。一方、経口投与以外の方法により腸内に当該大腸菌を導入することは簡便ではない。よって、腸内でＲＮＡｉの効果を簡便且つ安定に得ることはできない。
【０００９】
また、特許文献１及び２に開示の、ウイルス、合成高分子又は細菌ミニ細胞をキャリアとする方法でも、胃酸等の影響により、当該キャリアを腸内に到達させることが困難であるため、腸内で安定してＲＮＡｉを起こすことはできない。
【００１０】
なお、ウイルスや合成高分子をキャリアとして用いる方法では、キャリア自体の安全性も問題となるため、そもそも人間や動物に投与することは好ましくない。また、細菌ミニ細胞は細菌細胞から核を除去したものであり、細菌細胞とは全く異なる物質である。そのため、細菌ミニ細胞をキャリアとして用いる方法では、当該キャリア自体は増幅せず、ＲＮＡｉによる効果を長時間安定して得ることができない。
【００１１】
そもそも、非特許文献１、特許文献１及び２のような従来のＲＮＡｉに関する報告からは、人間や動物の腸内でＲＮＡｉを起こすという課題すら想到し得ない。例えば、非特許文献１で適用した線虫は土壌生息性であり、土壌は人間や動物の腸内とは全く環境が異なる。そのため、非特許文献１から、腸内でＲＮＡｉを起こすという課題に想到することすら困難である。
【００１２】
本発明は、上記の問題点に鑑みて、上述のように全く新たな課題を解決するためになされたものであり、その目的は、人間や動物の腸内で簡便に且つ安定してＲＮＡｉを起こすために、乳酸菌において二本鎖ＲＮＡを生成させるキット及びこれらを利用した技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、本発明に係る乳酸菌において二本鎖ＲＮＡを生成するキットは、ファージ由来のプロモーターを含むベクターを備えていることを特徴としている。
【００１４】
本発明に係るキットでは、上記プロモーターは、Ｔ７プロモーターであることがより好ましい。
【００１５】
本発明に係るキットでは、ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡをさらに含んでいることがより好ましい。
【００１６】
また、本発明に係る乳酸菌は、ファージ由来のプロモーターに二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡが作動可能に連結されたベクターを、含有していることを特徴としている。
【００１７】
また、本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物は、上記の本発明に係る乳酸菌を含んでいることを特徴としている。
【００１８】
また、本発明に係る腸内疾患用治療組成物は、上記の本発明に係る乳酸菌を含んでいることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る乳酸菌において二本鎖ＲＮＡを生成するキットは、以上のように、ファージ由来のプロモーターを含むベクターを備えているので、人間や動物の腸内でも安定して且つ簡便にＲＮＡｉの効果を得ることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
＜１．本発明に係る乳酸菌において二本鎖ＲＮＡを生成するキット＞
本発明に係る乳酸菌において二本鎖ＲＮＡを生成するキット（以下、単に「キット」と表記する）は、ファージ由来のプロモーターを含むベクターを備えていればよい。
【００２１】
本発明に係るキットを用いれば、二本鎖ＲＮＡ（以下、「ｄｓＲＮＡ」と表記する。）を乳酸菌に生成させることができる。乳酸菌は、人間や動物に経口投与しても、生きたまま腸内に辿り着くことができる。よって、本発明に係るキットを用いれば、ｄｓＲＮＡを生成することができる乳酸菌を作製して、これを経口投与するだけで、人間や動物の腸内で安定してｄｓＲＮＡを生成することができる。これにより、例えば、ｄｓＲＮＡとして、腸内寄生虫の生育を阻害するｄｓＲＮＡ（寄生虫に対してＲＮＡｉ効果を発揮する長鎖ｄｓＲＮＡ）や、腸内疾患の原因タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制するｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡと呼ばれる、哺乳動物細胞に対してＲＮＡｉ効果を発揮する短鎖ｄｓＲＮＡ）を用いれば、腸内の寄生虫駆除や腸内疾患の治療を行なうことも可能となる。
【００２２】
従来、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを発現することが可能な乳酸菌に関する報告は無かった。これは、大腸菌等と比べ、乳酸菌を宿主細胞として用いた遺伝子操作および形質転換技術に関する知見が極めて少ないことが理由の一つとして挙げられる。また、従来、乳酸菌にｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを高発現させるためのプロモーターに関する報告は無く、数多く存在するプロモーターの中から、当該ＤＮＡを乳酸菌に高発現させることが可能なプロモーターを見出す指標は全く存在しなかった。実際に、本発明者らは、後述する実施例において、乳酸菌で使用可能なことが報告されているＥｍｒプロモーターを用いても、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡの発現を確認することができなかった。このように、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを乳酸菌に高発現させることが可能なプロモーターは、当業者の通常の創作能力によっても見出すことができなかった。しかし、本発明者らは、ファージ由来のプロモーターを用いれば、これが可能であることを見出した。
【００２３】
なお、本明細書において用語「ｄｓＲＮＡ」は、上述の通り二本鎖ＲＮＡを意図する。「ｄｓＲＮＡ」は、長鎖の２本鎖ＲＮＡを指して用いられる場合もあるが、本明細書ではｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ等の短鎖の２本鎖ＲＮＡをも含めて「ｄｓＲＮＡ」と表記する。
【００２４】
〔１−１．ベクターの構成〕
本発明に係るキットが備えるベクターは、ファージ由来のプロモーターを含むものであればよい。当該ベクターに含まれるファージ由来のプロモーターとしては、ファージに由来するプロモーターであれば限定されるものではなく、例えば、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター等を例示できる。中でもＴ７プロモーターが好ましい。Ｔ７プロモーターを用いれば、高い効率でｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを発現させることができ、さらに、Ｔ７プロモーターを用いれば、短鎖のｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡも長鎖のｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡも共に好適に発現させることができる。従来、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡの発現において、短鎖のものと長鎖のものとでは、適切なプロモーターは異なると考えられてきたが、本発明者らはＴ７プロモーターを用いれば、短鎖のｄｓＲＮＡでも、長鎖のｄｓＲＮＡでも好適に生成することができることを見出した。
【００２５】
本発明に係るキットが備えるベクターの種類は特に限定させるものではなく、当該ベクター中に導入されたファージ由来のプロモーターが作動可能であればよい。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００２６】
本発明に係るキットが備えるベクターは、ファージ由来のプロモーターの下流にｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを導入するための領域を設けていてもよく、キットの用途等に応じて予めｄｓＲＮＡを導入していてもよい。
【００２７】
ファージ由来のプロモーターの下流にｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを導入するための領域を設けておく場合、従来公知の制限酵素部位等を設けることにより、当該領域を形成すればよい。予めｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを導入しておく場合、当該ｄｓＲＮＡとしては、後述の、線虫等の駆除のためのｄｓＲＮＡ、腸内の疾患の原因となるタンパク質をコードするＤＮＡの発現を阻害するｄｓＲＮＡ等を例示できるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
本発明に係るキットが備えるベクターは、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡの下流、又は当該ＤＮＡを導入するための領域の下流にターミネーターを含んでもよい。ターミネーターとしては、特に限定されるものではなく、プロモーターの種類等に応じて適宜選択すればよい。例えばファージ由来のプロモーターとしてＴ７プロモーターを採用した場合、Ｔ７ターミネーターを採用することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２９】
本発明に係るキットは、ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡをさらに含んでいることが好ましい。ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼとファージ由来のプロモーターとの共発現系を構築することで、ｄｓＲＮＡの生成効率を向上させることができる。
【００３０】
ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼの種類としては、特に限定されるものではないが、上記ファージ由来のプロモーターの起源であるファージに、近い属種のファージに由来するＲＮＡポリメラーゼ、好ましくは同一種のファージに由来するＲＮＡポリメラーゼがよい。例えば、本実施例では、ファージ由来のプロモーターとしてＴ７プロモーターを採用し、ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼとして、Ｔ７由来のＲＮＡポリメラーゼを採用した。
【００３１】
本発明に係るキットに含まれる、ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの形態は、特に限定されるものではなく、種々の形態で含むことができる。例えば、ファージ由来のプロモーターを含むベクターに、さらにファージ由来のＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡが導入されていてもよいし、ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを含むベクターが別途備えられていてもよい。
【００３２】
このような本発明に係るキットが備えるベクターは、従来公知の制限酵素及び／又はリガーゼ等を用いる慣用的な手法によって作製することができる。
【００３３】
本発明に係るキットの構成は、ファージ由来のプロモーターを含むベクターを備える限り、特に限定されるものではなく、他の試薬や器具を含んでもよい。例えば、ベクターを安定的に保持するための試薬、バッファー等を含んでもよいし、当該ベクターにｄｓＲＮＡを導入するための制限酵素、リガーゼ等の試薬を含んでもよい。また、当該ベクターの宿主細胞である乳酸菌を含んでもよいし、当該ベクターを乳酸菌に導入するためのリン酸カルシウム、リポソーム等の試薬を含んでもよい。また、本発明に係るキットは、複数の異なる試薬を、適切な容量及び／又は形態で混合していてもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。
【００３４】
また、本発明に係るキットには、ベクターにｄｓＲＮＡを導入するための手順及び／又はｄｓＲＮＡを導入した後のベクターを乳酸菌に導入するための手順等を記載した指示書を含んでもよい。紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能なディスク又はＣＤ−ＲＯＭ等のような電子媒体に付されてもよい。
【００３５】
〔１−２．本発明に係るキットの使用方法〕
本発明に係るキットは、当該キットに備えられるベクターに、適宜選択したｄｓＲＮＡを導入して用いればよい。つまり、本発明に係るキットが備えるベクターには、使用者の目的に応じて様々なｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを挿入することができる。なお、予めベクターにｄｓＲＮＡが挿入されている場合は、そのまま乳酸菌に導入すればよい。
【００３６】
本発明に係るキットが備えるベクターにｄｓＲＮＡを挿入する場合、ｄｓＲＮＡの種類としては、特に限定されるものでない。例えば、ＲＮＡｉによって腸内寄生虫の駆除を行なう場合には、寄生虫の生育に必要なＤＮＡのｍＲＮＡにハイブリダイズするように設計したｄｓＲＮＡを生成するようにすればよい。
【００３７】
また、哺乳動物等の細胞におけるタンパク質遺伝子の発現を抑制するためには、当該タンパク質をコードするＤＮＡに由来するｍＲＮＡにハイブリダイズするように設計したｄｓＲＮＡを発現するようにすればよい。腸内疾患の原因タンパク質を標的として、当該原因タンパク質の遺伝子の発現を阻害することで、腸内疾患の治療が可能となる。
【００３８】
なお、上述した線虫等の寄生虫の駆除に用いるｄｓＲＮＡにおける、ＲＮＡの二本鎖領域の長さは、一般に４００〜１０００ｂｐの長さの長鎖ｄｓＲＮＡが採用されることが多い。また、哺乳動物等の細胞におけるタンパク質遺伝子の発現を抑制するためには、ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡの二本鎖領域の長さを２０〜３０ｂｐとした短鎖ｄｓＲＮＡが採用されることが多い。このようにｄｓＲＮＡにおける二本鎖領域のサイズは用途によって異なるが、本発明に係るキットによれば、上述のように、短鎖ｄｓＲＮＡでも長鎖ｄｓＲＮＡでも好適に、乳酸菌に生成させることができる。
【００３９】
本発明に係るキットが備えるベクターに、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを挿入する方法は限定されるものではなく、従来公知の制限酵素及び／又はリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って方法により行なえばよい。
【００４０】
ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡが導入されたベクター（以下、「ｄｓＲＮＡ発現ベクター」と表記する。）は、乳酸菌内に導入すればよい。ｄｓＲＮＡ発現ベクターの宿主細胞として用いる乳酸菌の種類は特に限定されるものではなく、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、 Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ、 Ｌ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ． ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ等の従来公知の乳酸菌を例示できる。中でも、Ｌ．  ｃａｓｅｉは、胃酸に対する抵抗力が強く、生きたまま腸内に届く確率が高いため、好ましい。
【００４１】
ｄｓＲＮＡ発現ベクターを、乳酸菌に導入する方法、即ち形質転換法は、特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００４２】
人間や動物等の被験体の腸内で、本発明に係る乳酸菌にｄｓＲＮＡを生成させるためには、ｄｓＲＮＡ発現ベクターが導入された本発明に係る乳酸菌を、当該被験体に経口投与すればよい。乳酸菌は胃酸に対して強い抵抗性を有しているので、生きたまま腸内に到達する。腸内に到達した乳酸菌は、例えば腸内の寄生虫に食べられ、寄生虫体内でＲＮＡｉを起こし、生育に必要なタンパク質遺伝子の発現を阻害することで寄生虫を駆除する。また、例えば、腸内で疾患を生じている細胞に取り込まれ、当該細胞内でＲＮＡｉを起こして、当該疾患の原因となるタンパク質遺伝子の発現を阻害することで腸内疾患を治療することができる。
【００４３】
なお、本発明に係るキットにより作製した乳酸菌の利用方法は、被験体への経口投与に限定されるものではない。また、乳酸菌は様々な生物に対して安全に腸内送達しうるので、様々な生物におけるＲＮＡｉの研究に用いることができる。
【００４４】
＜２．本発明に係る乳酸菌＞
本発明に係る乳酸菌は、ファージ由来のプロモーターにｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡが作動可能に連結されたベクターを、含有していればよい。換言すれば、本発明に係る乳酸菌は、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡがファージ由来のプロモーターによって発現可能なように、当該ＤＮＡと当該プロモーターとが連結されたベクターを含有していればよい。
【００４５】
ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡがファージ由来のプロモーターに作動可能に連結されているので、本発明に係る乳酸菌は、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを発現することができる。また、宿主細胞は乳酸菌であるので、胃酸に対して優れた耐性を有している。そのため、本発明に係る乳酸菌を人間や動物に経口投与しても、胃を通過して、生きたまま腸内に到達する。よって、本発明に係る乳酸菌によれば、人間や動物の腸内に簡便に導入することが可能で、且つ腸内で安定してＲＮＡｉ効果を得ることができる。
【００４６】
本発明に係る乳酸菌が備えるベクター及び宿主細胞としての乳酸菌に関する説明は、上述の本発明に係るキットの説明に準ずる。
【００４７】
本発明に係る乳酸菌は、従来公知の方法により作製することができる。例えば、まず、ファージ由来のプロモーター及びｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを、当該ＤＮＡが当該プロモーターによって作動可能に連結されるように、制限酵素及び／又はリガーゼを用いてベクターに導入することでｄｓＲＮＡ発現ベクターを構築する。そして、当該ｄｓＲＮＡ発現ベクターを電気穿孔法等によって乳酸菌に導入しても、本発明に係る乳酸菌を作製できる。また、本発明に係るキットを用いれば、ファージ由来のプロモーターを含むベクターが備えられているので、このような方法を極めて容易に行なうことができる。
【００４８】
＜３．本発明に係る乳酸菌の利用＞
本発明は、人間及び動物の腸内の寄生虫を駆除することができる腸内寄生虫駆除用組成物、及び腸内における癌等の疾患を治療するための腸内疾患用治療組成物を提供する。
【００４９】
〔３−１．本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物〕
本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物は、本発明に係る乳酸菌を含んでいればよい。
【００５０】
本明細書において「腸内寄生虫駆除用組成物」は、本発明に係る乳酸菌を含む組成物であって、人間や動物の腸内に寄生する線虫等の寄生虫を駆除する用途に用いる組成物を意図する。
【００５１】
本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物に含まれる乳酸菌としては、上述の本発明に係る乳酸菌であればよい。例えば、本発明に係る乳酸菌であって、腸内寄生虫の生育を阻害するｄｓＲＮＡを生成するように作製した乳酸菌を含めばよい。
【００５２】
腸内寄生虫の生育を阻害するｄｓＲＮＡとしては、腸内寄生虫の生育に必要なＤＮＡに由来するｍＲＮＡにハイブリダイズするように設計したものを用いればよい。このようなｍＲＮＡの配列は、当業者であれば容易に得ることができる。例えば、寄生性線虫の近縁種の線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）ではＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ εサブユニットのノックダウンは致死的な影響を及ぼすことが知られているので、当該サブユニットをコードするＤＮＡの配列に相補的な配列を有し、二本鎖領域が４００〜１０００ｂｐとなるようなｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを挿入してもよい。ｄｓＲＮＡにおける二本鎖領域の長さは、当該ｄｓＲＮＡがＲＮＡｉを起こしうる限り限定されるものではないが、例えば、線虫の生育を阻害する目的でＲＮＡｉを起こす場合、一般に４００〜１０００ｂｐ程度の長さの長鎖ｄｓＲＮＡがよく用いられる。ｄｓＲＮＡの配列は、駆除の対象とする線虫の種類に応じて適宜設計すればよい。対象の線虫は限定されるものではなく、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ａｓｃａｒｉｓ ｉｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ等の寄生性線虫、羊の腸内に寄生するＴｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ等を例示できる。例えば、本発明者らは、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓのＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ εサブユニットをコードするＤＮＡによりコードされるｍＲＮＡの配列に基づいてｄｓＲＮＡの配列を設計した。
【００５３】
本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物に含まれる乳酸菌の形態は、腸内でｄｓＲＮＡを生成可能である限り限定されるものではない。例えば、本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物は、本発明に係る乳酸菌を含有する培養液、当該培養液から菌体を回収して粗精製物又は精製物を含んでもよく、本発明に係る乳酸菌を凍結乾燥等により休眠状態としたものを含んでいてもよい。
【００５４】
本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物は、本発明に係る乳酸菌以外の組成を含んでもよい。本発明に係る乳酸菌以外の組成としては、人間、動物等の投与対象に対して害が少なく且つ当該乳酸菌の機能を損なわないものであれば限定されない。
【００５５】
例えば、本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物は、水、生理食塩水、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝化物質、安定化剤、抗酸化剤等のような補助物質を含み得る。
【００５６】
また、本発明に係る乳酸菌を経口投与しても、腸内まで生きたまま到達して、腸内の寄生虫駆除が有効に行なわれるので、本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物は経口投与用に調製されることが好ましい。つまり、本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物は、腸内にて腸内寄生虫を駆除するために好適に用いられる。
【００５７】
そして、本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物を、経口投与用に調製する場合、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチを含み得る。また、さらに結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合してもよい。
【００５８】
上述のように、本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物は経口投与用に調製されることが好ましいので、その形態としては錠剤、カプセル等の形態が好ましいがこれに限定されるものではない。
【００５９】
本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。また、本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００６０】
〔３−２．本発明に係る腸内疾患用治療組成物〕
本発明に係る腸内疾患用治療組成物は、上記の本発明に係る乳酸菌を含んでいればよい。以下に、本発明に係る腸内疾患用治療組成物の実施形態について説明するが、ここでは主に、上述の本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物との相違点について説明するものとし、ここに説明しない構成は、本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物の説明に準ずるものとする。
【００６１】
本明細書において「腸内疾患用治療組成物」は、本発明に係る乳酸菌を含む治療組成物であって、人間や動物の腸内疾患を治療の対象として用いる治療組成物を意図する。
【００６２】
本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物に含まれる乳酸菌としては、上述の本発明に係る乳酸菌であればよい。例えば、本発明に係る乳酸菌であって、腸内の疾患の原因となるタンパク質遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを生成するように作製した乳酸菌を含めばよい。
【００６３】
腸内の疾患の原因となるタンパク質遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡとしては、対象の疾患に応じて適宜設定したものを用いればよい。例えば疾患として大腸癌を対象とする場合、Ｋ−Ｒａｓ変異体タンパク質のｍＲＮＡにハイブリダイズするように設計したものを用いればよい。Ｋ−Ｒａｓ変異体タンパク質は、例えば、ヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０で高発現しているタンパク質であり、通常のヒト細胞が発現するＫ−Ｒａｓタンパク質の変異体である。具体的には、１２番目のコドンがＧＧＴ（グリシン）からＧＴＴ（バリン）に変異している。Ｋ−Ｒａｓ変異体ｍＲＮＡの配列は、当業者であれば容易に得ることができる。例えば、Ｋ−Ｒａｓ変異体ｍＲＮＡ配列の一例として、ＧｅｎＢａｎＫのａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ５４９６８が挙げられる。また、Matilde E. Lleonart, Santiago Ramon y Cajal, John D. Groopman and Marlin D. Friesen, Sensitive and specific detection of K-ras mutations in colon tumors by short oligonucleotide mass analysis, Nucleic Acids Research, 2004, vol.32, no.5 e53にもＫ−Ｒａｓ遺伝子の変異について開示されている。
【００６４】
また、本発明に係る治療用組成物が治療の対象とする腸内疾患はこれに限定されるものではなく、例えば、ウイルスの関与する腸内疾患が挙げられる。つまり、当該ウイルスの遺伝子発現を抑制することで、当該腸内疾患を治療することができる。ｄｓＲＮＡにおける二本鎖領域の長さは、当該ｄｓＲＮＡがＲＮＡｉを起こしうる限り限定されるものではないが、例えば、一般に哺乳動物細胞の中でＲＮＡｉを起こすために、２０〜３０ｂｐ程度の長さの短鎖ｄｓＲＮＡがよく用いられる。
【００６５】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された特許文献及び非特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００６６】
＜実施例１：実験材料の調製＞
〔プラスミド〕
本実施例では、乳酸菌に導入するプラスミドとしてｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄ及びｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｄｓＲＮＡ＿ＤＮＡｐｏｌＥを用いた。
【００６７】
（１）ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄ
まず、ｐＵＣＹＩＴ３５６Ｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＡＢ１１９５２７）に、ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子及び乳酸菌内での複製に必要なｒｅｐＢ遺伝子が導入されたベクター（ヤクルト株式会社中央研究所より供与された）に、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ遺伝子を導入した。次に、ＥｃｏＲＩ-ＢａｍＨＩサイトに、Ｔ７プロモーター、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ｔ７ターミネーターを導入した。当該ｓｈＲＮＡは、赤色蛍光蛋白質ＤｓＲｅｄ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＤＱ４９３８８８）のｍＲＮＡを標的とし、ＤｓＲｅｄコード領域の２７６-２９６位に相補的な配列を有するものである。
【００６８】
作製したｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄの配列を配列番号１に示し、その構造を図１に示す。図１はｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄの構造を模式的に示す図である。
【００６９】
図１に示すように、ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄはＴ７プロモーター、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ｔ７ターミネーターが導入されており、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡが、Ｔ７プロモーターにより作動可能となっている。
【００７０】
Ｔ７プロモーター、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ｔ７ターミネーターの、それぞれの塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列のうち、４０４２位〜４０５８位、４０５９位〜４１１３位、４１１４位〜４１６１位である。なお、４０３６位〜４０４１位はＥｃｏＲＩサイトであり、４１６２位〜４１６７位はＢａｍＨＩサイトである。また、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ遺伝子の塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列のうち１０６０位〜３７１４位である。なお、ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄの発現によって、得られるｓｈＲＮＡは配列番号２に示す塩基配列となる。
【００７１】
なお、同様にして、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネータの代わりに、エリスロマイシン耐性遺伝子（Ｅｍｒ）プロモーター及びｐｏｌｙＴを用い、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ遺伝子を導入しないベクターも作製した。得られたベクターを「Ｅｍｒベクター」と表記する。本実施例で用いたｐｏｌｙＴは、Ｔ（チミン）が６個連結したＴＴＴＴＴＴの配列を有するターミネーターである。Ｅｍｒプロモーターは、タンパク質遺伝子の転写を乳酸菌内で引き起こすことが知られているプロモーターである。
【００７２】
また、同様にして、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネータの代わりに、リポプロテイン（ＬＰＰ）プロモーター及びｒｒｎＣターミネーターを用い、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ遺伝子を導入しないベクターも作製した。得られたベクターを「ＬＰＰベクター」と表記する。なお、ＬＰＰプロモーター及びｒｒｎＣターミネーターは、大腸菌でよく用いられるｔＲＮＡ発現用のプロモーター及びターミネーターである。なお、Ｅｍｒプロモーター、ＬＰＰプロモーター、ｒｒｎＣターミネーターの配列をそれぞれ配列番号３〜５に示す。
【００７３】
（２）ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｄｓＲＮＡ＿ＤＮＡｐｏｌＥ
まず、ｐＵＣＹＩＴ３５６Ｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＡＢ１１９５２７）に、ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子及び乳酸菌内での複製に必要なｒｅｐＢ遺伝子が導入されたベクター（ヤクルト株式会社中央研究所より供与された）に、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ遺伝子を導入した。
【００７４】
次に、ＥｃｏＲＩ-ＢａｍＨＩサイトに、Ｔ７プロモーター、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ｔ７プロモーターを導入した。当該ｄｓＲＮＡは、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（線虫）が有するＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのεサブユニットＡのｍＲＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. Ｚ８１５２６）を標的とし、３５８８-４５６９位に相補的な配列を有するものである。
【００７５】
作製したｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｄｓＲＮＡ＿ＤＮＡｐｏｌＥの配列を配列番号６に示し、その構造を図２に示す。図２はｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｄｓＲＮＡ＿ＤＮＡｐｏｌＥの構造を模式的に示す図である。
【００７６】
図２に示すように、ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｄｓＲＮＡ＿ＤＮＡｐｏｌＥは、２つのＴ７プロモーターが、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを挟むように導入されており、当該２つのＴ７プロモーターによって、図２に示す矢印方向に、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡの転写が起こる。２つのＴ７プロモーターの塩基配列は、配列番号６に示す塩基配列のうち、４０４２位〜４０５８位、５０６１位〜５０７７位である。ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号６に示す塩基配列のうち４０５９位〜５０６０位である。なお、４０３６位〜４０４１位はＥｃｏＲＩサイトであり、５０７８位〜５０８３位はＢａｍＨＩサイトである。また、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ遺伝子の塩基配列は、配列番号６に示す塩基配列の１０６０位〜３７１１位である。
【００７７】
〔乳酸菌〕
乳酸菌として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉを用いた（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入した（ＡＴＣＣ２７１３９））。
【００７８】
〔エレクトロポレーションによるプラスミドの導入〕
本実施例では、Ｌ． ｃａｓｅｉに対するベクターの導入を、エレクトロポレーション法により行なった。
【００７９】
まず、ＭＲＳ液体培地２ｍｌに、Ｌ． ｃａｓｅｉのグリセロールストック２０μｌを加えて、終夜３７℃で静置培養した。次に、ＭＲＳ液体培地から１００μｌ採取して、１０ｍｌの新鮮なＭＲＳ液体培地に添加して培養した。次に、Ｌ． ｃａｓｅｉの対数増殖期に、ＭＲＳ液体培地から４ｍｌ採取して、２０００ｇ×５ｍｉｎで遠心して上清を取り除いた。得られた沈殿物に、１０％グリセロール溶液４０μｌを加えて懸濁させた。このグリセロール溶液に、導入するベクター（５００ｎｇ/μｌ）を１μｌ加えて、ピペッティングすることで攪拌した。
【００８０】
次に、キュベット（ＢＩＯＲＡＤ社製 ０．２ｃｍ）に溶液を移し氷上で５分間静置した後、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ （ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、１．５ｋＶ、２００Ω、２５μＦでエレクトロポレーションした。その後、すぐに、０．９ｍｌのＭＲＳ培地（＋Ｅｍ ２０μｇ/ｍｌ）を加えて３７℃で２時間培養した。次に、培養後のＭＲＳ培地をＭＲＳプレート（＋Ｅｍ ２０μｇ/ｍｌ)上に播いて、ＭＲＳプレートが乾かないようにタッパーの中に入れて３７℃静置培養した。２〜３日培養すると、コロニーが生えた。このようにして、ベクターの導入されたＬ． ｃａｓｅｉを得た。
【００８１】
なお、ベクターの導入の確認はコロニーＰＣＲにより行なった。まず、８連チューブに２×ＴＥ （２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０ ２ｍＭ ＥＤＴＡ １％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を１０μｌ入れた後、爪楊枝を用いてコロニーを軽くつつくことで菌体を採取して、上記２×ＴＥに懸濁させた。次に、９５℃で５分間インキュベートした後、卓上遠心機で５分間遠心して、上清１μｌを回収した。これをコロニーＰＣＲの鋳型として用いた。
【００８２】
次に、当該上清１μｌ（鋳型）に、Ｖｅｎｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．１μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、１０×Ｖｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒ １μｌ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに付属）、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ １μｌ、正鎖プライマー ０．２μｌ、逆鎖プライマー ０．２μｌ、超純水６．５μｌを混合して、全量を１０μｌとした。なお、正鎖プライマーの塩基配列を配列番号７に示し、逆鎖プライマーの塩基配列を配列番号８に示す。また、上記超純水とは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（ミリポア社製）を用いて精製した超純水であり、以下「Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ水」と表記する。
【００８３】
温度条件としては、９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル行なった。コロニーＰＣＲを行なった後、反応後の溶液５μｌを３％アガロースゲルによる電気泳動に供して、エチジウムブロマイド染色を行なうことによって、コロニーＰＣＲの結果を確認した。
【００８４】
コロニーＰＣＲの結果の例として、Ｅｍｒベクターを導入した場合のコロニーＰＣＲの結果を図３に示す。図３はＥｍｒベクターを導入して得たコロニーをコロニーＰＣＲに供した結果を示す図であり、レーン２〜４はベクターを導入したコロニーの結果を示す。最も左のレーンは分子量マーカーである。また、レーン１は、２本鎖ＤＮＡのサイズマーカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社  ２−Ｌｏｇ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ）を示す。当該コロニーＰＣＲでは、２６０ｂｐのＰＣＲ断片が得られればプラスミドが導入されたコロニーであることを示す。図３に示すように、レーン２〜４に供したコロニーから２６０ｂｐのＰＣＲ断片が確認できた。よって、Ｌ． ｃａｓｅｉにＥｍｒベクターが導入されたことが確認できた。同様に、ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄ、ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｄｓＲＮＡ＿ＤＮＡｐｏｌＥ等の他のベクターについても導入を確認できた。
【００８５】
＜実施例２：ドットブロットハイブリダイゼーションを用いた、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡの発現の確認＞
ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄ、Ｅｍｒベクター、ＬＰＰベクターのそれぞれのベクターが導入されたＬ． ｃａｓｅｉによる、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡの発現をドットブロットハイブリダイゼーションにより確認した。
【００８６】
まず、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡの発現をドットブロットハイブリダイゼーションにより確認する方法について図４を用いて説明する。図４はｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡの発現をドットブロットハイブリダイゼーションにより確認する方法の概要を模式的に示す図である。
【００８７】
図４に示すように、ドットブロットハイブリダイゼーションによるｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡの発現の確認では、ｓｈＲＮＡの二本鎖領域を構成するＲＮＡの一方に相補的な配列を有し、放射性標識されたプローブを用いる。ｓｈＲＮＡを高温（例えば、本実施例では６５℃）でインキュベートすると、図４に示すようにｓｈＲＮＡの二本鎖部分が解離する。そして、温度を下げたとき、放射性標識されたプローブが周囲に存在すると、図４に示すように、解離していた二本鎖ＲＮＡの一方の鎖にプローブが結合する。これをナイロン膜上で行なえば、図４の下段に示すようにナイロン膜上にスポットが形成される。つまり、スポットの形成が確認されればｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡの発現を確認できる。
【００８８】
〔プローブの放射性標識〕
次のようにしてドットブロットハイブリダイゼーションに用いるＤＮＡプローブの放射性標識を行なった。なお、当該ＤＮＡプローブの塩基配列を配列番号９に示す。
【００８９】
まず、１０×ＢＡＰ ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ、ＤＮＡプローブ（５０ ｐｍｏｌ） １μｌ、ＢＡＰ（ＴＯＹＯＢＯ社製） ０．５μｌ、残部をＭｉｌｌｉ‐Ｑ水として混合して、全量１００μｌとした。これを３７℃で３０分間静置した後、フェノール処理を２回、エタノール沈殿を２回行ない、次に減圧乾燥することで、脱リン酸化（ＢＡＰ処理）を行なった。減圧乾燥の後は２ｐｍｏｌ／μｌになるように超純水で溶解して、ＤＮＡプローブ溶液を得た。
【００９０】
次に、脱リン酸化したＤＮＡプローブを５’末端標識した。まず、上記ＤＮＡプローブ溶液４μｌ（ＤＮＡプローブ８ｐｍｏｌ分）、１０×ｋｉｎａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １．５μｌ、γ−３２Ｐ ｌａｂｅｌｅｄ ＡＴＰ １μｌ、Ｔ４ ｋｉｎａｓｅ （ＴＯＹＯＢＯ社製） １μｌ、Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ水 ７．５μｌを混合した。次に、この混合物を３７℃で１時間静置した後、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．（Ａｄｅｌｐｈｉａ， Ｎ．Ｊ．））で夾雑物を除去することで、プローブを精製した。次に、放射能を測定することで標識を確認した。
【００９１】
〔ＲＮＡの抽出〕
各ベクターを導入したＬ． ｃａｓｅｉからの全ＲＮＡの抽出は、次の方法で行なった。
【００９２】
まず、爪楊枝を用いてＬ． ｃａｓｅｉのコロニーをつつくことで菌体を採取して２ｍｌのＭＲＳ培地（＋Ｅｍ ２０μｇ／ｍｌ）に植菌した。終夜３７℃で培養した後、５０ｍｌのＭＲＳ培地（＋Ｅｍ ２０μｇ／ｍｌ）に移して、再度培養した。Ａ６００が０．６〜１．０になったところで集菌して、集菌した菌体に０．３ｍｌのＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ガラスビーズ（０．１７ｍｍ）０．１ｇを加えた。次に、室温で２〜３分間ボルテックスを用いて攪拌した後に、０．７ｍｌのＴＲＩＺＯＬを加えた。
【００９３】
次に、１５℃〜３０℃で、５分間インキュベートして、０．２ｍｌのクロロホルムを加えた。次に、１５秒間ボルテックスで攪拌した後、１５℃〜３０℃で２〜３分間インキュベートした。これを１２０００ｇ、４℃で１５分間遠心して、水相（上層）を別のチューブに回収した。そして、当該チューブに０．５ｍｌのイソプロパノールを加えて、１２０００ｇ １０ｍｉｎ ４℃で遠心した後、上清を取り除き、７５％ ＥｔＯＨ １ｍｌで洗浄した。これを７５００ｇ、４℃で５分間遠心してＥｔＯＨを取り除き、５〜１０分間減圧乾燥した。
【００９４】
〔ドットブロットハイブリダイゼーション〕
各ベクターを導入したＬ． ｃａｓｅｉから抽出した全ＲＮＡを、次のようにしてドットハイブリダイゼーションに供した。
【００９５】
まず、抽出した全ＲＮＡを７Ｍ Ｕｒｅａ １０％ ＰＡＧＥで電気泳動した。ＢＰＢが流れきる寸前で泳動を止め、目的の位置のゲルを切り出した。
【００９６】
例として、ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄを導入したＬ． ｃａｓｅｉから抽出した全ＲＮＡを電気泳動した結果を図５に示す。図５は、ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄを導入したＬ． ｃａｓｅｉの全ＲＮＡを電気泳動した結果を示す図であり、レーン１はｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄを導入したＬ． ｃａｓｅｉを用いた結果を示し、レーン２はネガティブコントロールとしてｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄの内、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡが導入されていないベクター（ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７）が導入されたＬ． ｃａｓｅｉを用いた場合の結果を示す。
【００９７】
図５に示すように、複数のバンドが確認された。そこで、本実施例では、ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄを導入したＬ． ｃａｓｅｉを用いた場合、Ｂ、Ｃ、Ｄの領域のゲルを切り出した。ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７を導入したＬ． ｃａｓｅｉの場合、Ａの領域のゲルを切り出した。
【００９８】
切り出したゲルからのＲＮＡの回収は、次のように行なった。まず、ゲルを１．５ｍｌチューブに入れ、さらに２ｍＭ ＥＤＴＡの水溶液を４００μｌ程度加え、室温で２時間振騰した。その後、ゲルを取らない様に上記水溶液のみを別のチューブに取り、エタノール沈殿法によりＲＮＡを回収した。
【００９９】
次に、回収したＲＮＡの溶液を、ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社 Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）に３μｌずつ滴下して風乾させた。その後、ＵＶクロスリンカー（波長２５４ｎｍ、Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ社（ドイツ）製  クロスリンカー（ＢＬＸ−２５４））を用いて紫外線を４８０ｍＪ／ｃｍ２照射した。滴下した量は、図５のＡ、Ｃ、Ｄの領域のゲルから抽出したＲＮＡは５０ｎｇであり、Ｂの領域のゲルから抽出したＲＮＡは５０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇとした。また、ポジティブコントロールとして、人工的に合成した配列番号２に示すｓｈＲＮＡを、５ｐｇ、５０ｐｇ、５００ｐｇ、５ｎｇの量で滴下した。
【０１００】
紫外線の照射後のナイロン膜を、１ｍｌのプレハイブリダイゼーション溶液（５×Ｄｅｎｈｅｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、３．６Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に浸漬させることで３７℃、１時間洗浄した。
【０１０１】
次に、ナイロン膜を、２ｍｌハイブリダイゼーション溶液（６×ＮＥＴ（０．９Ｍ ＮａＣｌ、９０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６ｍＭ ＥＤＴＡ）に、使用直前に１０％ＳＤＳを６０μｌ、２００，０００ｃｐｍのＤＮＡプローブを加えた溶液）に浸漬させて、６５℃で１８時間インキュベートした。次に、室温で３×ＳＳＣを用いて１５分間洗浄した。この洗浄を４回繰り返した。その後、ナイロン膜を感光して結果を確認した。
【０１０２】
〔ドットハイブリダイゼーションの結果〕
ドットハイブリダイゼーションの結果を図６に示す。図６はドットハイブリダイゼーションの結果を示す図であり、Ａ〜Ｄは、上記図５の電気泳動で切り出したゲルの位置に対応している。また、Ｂ−５０ｎｇ、Ｂ−１００ｎｇ、Ｂ−２００ｎｇと付したスポットは、図５のＢの領域から抽出したＲＮＡを、それぞれの量でナイロン膜に滴下した結果を示している。また、上段の４つのスポットは、上記ポジティブコントロールの結果を示している。
【０１０３】
図６に示すように、Ａの位置ではスポットが確認されず、Ｂの位置にスポットが検出された。このことから、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡが発現していることが確認できた。つまり、ｓｈＲＮＡを生成する乳酸菌の作製に成功した。
【０１０４】
同様に、Ｅｍｒベクター又はＬＰＰベクターを導入したＬ． ｃａｓｅｉを用いて、ドットブロットハイブリダイゼーションを行なった結果を図７に示す。図７はＥｍｒベクター又はＬＰＰベクターを導入したＬ． ｃａｓｅｉを用いて、ドットブロットハイブリダイゼーションを行なった結果を示す図であり、ＤがＥｍｒベクターを導入したＬ． ｃａｓｅｉを用いた結果を示し、ＥがＬＰＰベクターを導入したＬ． ｃａｓｅｉを用いた結果を示す。Ａ及びＢはポジティブコントロールであり、ｓｈＲＮＡを抽出してドットハイブリダイゼーションに供した結果である。また、Ｃはネガティブコントロールであり、上述のｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７を用いた場合の結果を示す。
【０１０５】
図７に示すように、Ｅｍｒプロモーター及びＬＰＰプロモーターでは、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡの発現を確認することができなかった。
【０１０６】
＜実施例３：ＲＴ−ＰＣＲによるｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡの発現の確認＞
本実施例では、ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｄｓＲＮＡ＿ＤＮＡｐｏｌＥを導入したＬ． ｃａｓｅｉの細胞内における、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのεサブユニットＡのｍＲＮＡを標的としたｄｓＲＮＡを、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）により確認した。
【０１０７】
具体的には、ＲＴ-ＰＣＲにより、ｄｓＲＮＡのセンス鎖・アンチセンス鎖の両方が形成されているか否かを調べた。ＲＴ−ＰＣＲは次のようにして行なった。
【０１０８】
まず、実施例２に記載の方法と同様にして、Ｌ． ｃａｓｅｉから全ＲＮＡを抽出した。次に、抽出した全ＲＮＡ０．２５μｇ及び正鎖プライマー又は逆鎖プライマー１０ｐｍｏｌを混合し、さらに全量が１２μｌとなるまでＭｉｌｌｉ‐Ｑ水を加えて、よく攪拌して、ＲＮＡサンプルとした。次に、ＲＮＡサンプルを、６５℃で５分間インキュベートした後、急冷した。なお、プライマーの配列を配列番号１０及び１１に示す。配列番号１０が正鎖プライマーの配列であり、配列番号１１が逆鎖プライマーの配列である。
【０１０９】
次に、ＲＮＡサンプルに、５×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ４μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２μｌ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １μｌ、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ １μｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を加えた。次に、これをよく攪拌して、４２℃で６０分間インキュベートして、さらに、８５℃で５分間インキュベートすることで逆転写を行なった。
【０１１０】
つまり、本実施例では、ＲＮＡサンプルを、上記正鎖プライマー、逆鎖プライマーのそれぞれにより逆転写を行ない、これにより得られたものをＰＣＲ用反応液とした。
【０１１１】
次に、ＰＣＲ用反応液１０μｌに、ＫＯＤ ｄａｓｈ ０．５ μｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ（上記ＫＯＤ ｄａｓｈに付属）、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ １μｌ、正鎖プライマー１０ｐｍｏｌ、逆鎖プライマー １０ｐｍｏｌを混合して、Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ水を加えて全量を５０μｌとした。
【０１１２】
ＲＴ−ＰＣＲを行なう装置として、ＲｅｖｅｒＴｒａ‐ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いた。温度条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で２秒間、７４℃で２０秒間を３０サイクル行なった。ＲＴ−ＰＣＲを行なった後、３％アガロースゲルによる電気泳動を行ない、エチジウムブロマイド染色によって結果を確認した。この結果を図８に示す。
【０１１３】
図８は、ＲＴ‐ＰＣＲの結果を示す図であり、レーン４はＲＮＡサンプルを正鎖プライマーで逆転写を行なって得たＰＣＲ反応液をＲＴ−ＰＣＲに供した結果を示し、レーン５はＲＮＡサンプルを逆鎖プライマーで逆転写を行なって得たＰＣＲ反応液をＲＴ−ＰＣＲに供した結果を示す。なお、レーン１〜３はポジティブコントロールであり、それぞれ、ＲＮＡサンプルの代わりに１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇのｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｄｓＲＮＡ＿ＤＮＡｐｏｌＥをＰＣＲ反応液に混合して、ＲＴ−ＰＣＲに供した結果を示す。また、レーン６及び７はネガティブコントロールである。具体的には、レーン６は、実施例２に記載のｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７を導入したＬ． ｃａｓｅｉから抽出したＲＮＡを、正鎖プライマーで逆転写したＲＮＡサンプルを用いた結果、レーン７は、当該ＲＮＡを逆鎖プライマーで逆転写したＲＮＡサンプルを用いた結果を示している。
【０１１４】
図８に示すように、レーン４及び５にｄｓＲＮＡ由来のＰＣＲ産物が確認された。このことから、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡのセンス鎖・アンチセンス鎖共に発現していることが確認できた。
【０１１５】
〔大腸菌と乳酸菌とのｄｓＲＮＡの発現量の比較〕
実施例１に記載の方法と同様にして、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＴ１１５（ＤＥ３）株、岡山大学理学部 作部保次博士から供与された。）にｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｄｓＲＮＡ＿ＤＮＡｐｏｌＥを導入した。次に、実施例２に記載の方法と同様にして、Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＴ１１５（ＤＥ３）から全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡの内０．２５μｇを用いて、上述の方法と同様に、正鎖プライマーを用いて逆転写した上で、ＲＴ−ＰＣＲを行なった。この結果を、ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｄｓＲＮＡ＿ＤＮＡｐｏｌＥを導入したＬ． ｃａｓｅｉから得た全ＲＮＡを用いて、正鎖プライマーで逆転写を行ない、ＲＴ−ＰＣＲを行なった結果（上記図８のレーン４の結果に相当）と比較した。この結果を図９に示す。図９はＥ． ｃｏｌｉ ＨＴ１１５（ＤＥ３）とＬ． ｃａｓｅｉとのｄｓＲＮＡの発現量を比較した結果を示す図であり、レーン２はＥ． ｃｏｌｉ ＨＴ１１５（ＤＥ３）を用いた結果を示し、レーン３はＬ． ｃａｓｅｉを用いた結果を示す。また、レーン１はポジティブコントロールであり、ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｄｓＲＮＡ＿ＤＮＡｐｏｌＥを発現させて得られるｄｓＲＮＡを精製してＲＴ−ＰＣＲに供した結果を示し、レーン４及び５はそれぞれ、ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｄｓＲＮＡ＿ＤＮＡｐｏｌＥを導入しなかったＥ． ｃｏｌｉ ＨＴ１１５（ＤＥ３）及びＬ． ｃａｓｅｉを用いた結果を示す。
【０１１６】
次に、レーン２及び３のバンド強度をＩｍａｇｅＪ ｐｒｏｇｒａｍ Ｖｅｒ．１．３４ｓ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｕ．Ｓ．Ａ．， ＵＲＬ；http://rsb.info.nih.gov/ij/）によって測定して比較した。Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＴ１１５（ＤＥ３）を用いた結果を示すレーン３の強度は、Ｌ． ｃａｓｅｉを用いた結果を示すレーン２のバンド強度の２２％に過ぎなかった。この結果は、ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｄｓＲＮＡ＿ＤＮＡｐｏｌＥを導入したＬ． ｃａｓｅｉによるｄｓＲＮＡの発現効率が極めて高いことを示している。
【０１１７】
＜実施例４：ｓｈＲＮＡによるＲＮＡｉの確認＞
本実施例では、実施例２で構築したｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄ由来のｓｈＲＮＡによるＲＮＡｉを確認した。
【０１１８】
まず、ｓｈＲＮＡとしては実施例２で得たＬ．  ｃａｓｅｉ由来のものを使用した。具体的には図５のＢの位置に示されるバンドに含まれるＲＮＡをゲルから抽出したものを用いた。
【０１１９】
次に、得られたＲＮＡ１１５ｎｇ及びＤｓＲｅｄのｍＲＮＡ１００ｎｇを、ＣＨＯ細胞に導入した。当該ＣＨＯ細胞はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より得た（製品名：Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞）。また、ＲＮＡの細胞内導入については、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（登録商標）  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、これに添付の取扱説明書に従って行なった。
【０１２０】
ＲＮＡを導入したＣＨＯ細胞を室温で２４時間、培養した後、ＤｓＲｅｄの蛍光を確認した。結果を図１０に示す。図１０は、実施例２で得たＬ．  ｃａｓｅｉ由来のｓｈＲＮＡによるＲＮＡｉを確認した結果を示す図である。図１０の（ａ）はＬ．  ｃａｓｅｉ由来のｓｈＲＮＡの効果を示し、図１０の（ｂ）及び（ｃ）はそれぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールの結果である。ポジティブコントロールでは、実施例２で得たｓｈＲＮＡの代わりに、実施例２でポジティブコントロールとして合成したｓｈＲＮＡ１０ｎｇ用いた以外は本実施例に記載の方法と同じ方法を行なった。また、ネガティブコントロールでは、実施例２で得たｓｈＲＮＡを用いなかった以外は本実施例に記載の方法と同じ方法を行なった。図１０に示されるように、実施例２で得たＬ．  ｃａｓｅｉ由来のｓｈＲＮＡは、人工的に合成したｓｈＲＮＡと同等のＲＮＡｉ効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明に係るキットは、乳酸菌にｄｓＲＮＡを生成させることができる。このため、ｄｓＲＮＡを生成可能な乳酸菌を用いて、人間及び動物の腸内で安定してＲＮＡｉを起こすことができる。よって、本発明は、製薬産業、食品産業及びその関連産業に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】実施例において得たｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄの構造を模式的に示す図である。
【図２】実施例において得たｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｄｓＲＮＡ＿ＤＮＡｐｏｌＥの構造を模式的に示す図である。
【図３】実施例において得たＥｍｒベクターを導入して得たコロニーを、コロニーＰＣＲに供した結果を示す図である。
【図４】ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡの発現をドットブロットハイブリダイゼーションにより確認する方法の概要を模式的に示す図である。
【図５】実施例において得た、ｐＵＣＹＩＴ-Ｔ７-ｓｈＲＮＡ＿ＤｓＲｅｄを導入したＬ． ｃａｓｅｉの全ＲＮＡを電気泳動した結果を示す図である。
【図６】実施例で行なったドットハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図７】実施例において得たＥｍｒベクター又はＬＰＰベクターを導入したＬ． ｃａｓｅｉを用いて、ドットブロットハイブリダイゼーションを行なった結果を示す図である。
【図８】実施例で行なったＲＴ‐ＰＣＲの結果を示す図である。
【図９】実施例で行なった、Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＴ１１５（ＤＥ３）とＬ． ｃａｓｅｉとのｄｓＲＮＡの発現量を比較した結果を示す図である。
【図１０】実施例４で行なった、Ｌ．  ｃａｓｅｉ由来のｓｈＲＮＡによるＲＮＡｉを確認した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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