(57)【要約】      （修正有）【課題】喘息等の免疫アレルギー疾患の遺伝子情報に基づいた検査方法を提供する。【解決手段】ＩＬ−７様サイトカイン、thymic stromal lymphopoietin（TSLP）遺伝子上に存在する遺伝子多型を、特定の塩基配列を有するプローブ、プライマーを用いて分析し、該分析結果に基づいて免疫疾患特に喘息を診断する方法。また、ＴＳＬＰのlong isoformの発現量を指標にして、免疫疾患の発症リスク・罹病可能性、該疾患治療薬の効果を判定する方法、および該治療薬の候補物質をスクリーニングする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
thymic stromal lymphopoietin（TSLP）遺伝子の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて免疫疾患を検査する方法。
【請求項２】
一塩基多型が−８２位の塩基または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
−８２位の塩基と連鎖不平衡にある塩基が、−１９１４位、−８４７位、１１１７位、１４７９位および５９０１位から選ばれる塩基である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
免疫疾患がアレルギー疾患である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
アレルギー疾患が喘息である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
以下の群から選ばれる１又は２以上のプローブを含む免疫疾患の検査試薬：
（ａ）配列番号１の塩基配列において１６００番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ、
（ｂ）配列番号１の塩基配列において２６６７番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ、
（ｃ）配列番号１の塩基配列において３４３２番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ、
（ｄ）配列番号１の塩基配列において４６３０番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ、
（ｅ）配列番号１の塩基配列において４９９２番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ、
（ｆ）配列番号１の塩基配列において９４１４番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ。
【請求項７】
以下の群から選ばれる１又は２以上のプライマーを含む免疫疾患の検査試薬：
（ａ）配列番号１の塩基配列の１６００番目の塩基を含む領域を検出するためのプライマー、
（ｂ）配列番号１の塩基配列の２６６７番目の塩基を含む領域を検出するためのプライマー、
（ｃ）配列番号１の塩基配列の３４３２番目の塩基を含む領域を検出するためのプライマー、
（ｄ）配列番号１の塩基配列の４６３０番目の塩基を含む領域を検出するためのプライマー、
（ｅ）配列番号１の塩基配列の４９９２番目の塩基を含む領域を検出するためのプライマー、
（ｆ）配列番号１の塩基配列の９４１４番目の塩基を含む領域を検出するためのプライマー。
【請求項８】
thymic stromal lymphopoietin（TSLP）遺伝子のlong isoformの発現量を分析し、該分析結果に基づいて免疫疾患を検査する方法。
【請求項９】
long isoformの発現量が健常者と比較してより多い場合を免疫疾患の発症リスクが高い或いは羅病している可能性が高いと判定する、請求項８に記載の検査方法。
【請求項１０】
thymic stromal lymphopoietin（TSLP）遺伝子のlong isoformの発現量を、免疫疾患治療薬の存在下と非存在下とで比較する工程を含む、免疫疾患治療薬の効果を判定する方法。
【請求項１１】
候補物質の存在下と非存在下とにおいてthymic stromal lymphopoietin（TSLP）遺伝子のlong isoformの発現量を測定する工程、次いで、候補物質の存在下においてその発現量が抑制される場合に、当該候補物質を免疫疾患治療薬として選択する工程を含む、免疫疾患治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は喘息などの免疫疾患の検査方法及び該検査法に用られる検査試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本人成人の約3％および小児の約6％は、気管支喘息に罹患しているといわれている。この気管支喘息は、喘鳴、咳、息切れなどを伴う慢性の可逆的気道閉塞を臨床的特徴としている。該気管支喘息は、近年増加の一途をたどっている疾患の一つであり、その病態の解明などが待たれている。近年、かかる気管支喘息に関して、数多くの遺伝素因の同定が活発に行われている。
気管支喘息に関連する遺伝子としてＴ−ｂｅｔ遺伝子（特許文献１）、Ｉκβ関連蛋白遺伝子（特許文献２）、ＩＬ−１２Ｂ遺伝子プロモーター（特許文献３）、ＴＲＡＩＬ受容体遺伝子（特許文献４）、ＡＳＴＨ１遺伝子（特許文献５）、５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質遺伝子（特許文献６）、ＩＬ−４Ｒ遺伝子（特許文献７）などの多型をもとに気管支喘息の危険性を調べる方法が知られている。
【０００３】
一方、ＴＳＬＰはＩＬ−７様サイトカインで、Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化を誘導することが知られている（非特許文献１）。また、ＴＳＬＰの発現が喘息患者の気道で増加することも知られている（非特許文献２）。しかしながら、気管支喘息に関連するＴＳＬＰ遺伝子の多型は知られていなかった。
【特許文献１】特開2006-149276号公報
【特許文献２】特開2002-218997号公報
【特許文献３】特開2006-101847号公報
【特許文献４】特開2005-027595号公報
【特許文献５】特表2002-500895号公報
【特許文献６】特表2002-511242号公報
【特許文献７】特表2002-532073号公報
【非特許文献１】J Exp Med. 2005 Nov 7;202(9):1213-23
【非特許文献２】J Immunol. 2005 Jun 15;174(12):8183-90
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、喘息等の免疫疾患の発症リスクや発症の有無を正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、ＴＳＬＰ遺伝子上の一塩基多型が喘息などの免疫疾患の発症に深く関連することを発見した。そして、ＴＳＬＰ遺伝子上の多型を調べることにより免疫疾患の検査を正確に効率的に行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）  thymic stromal lymphopoietin（ＴＳＬＰ）遺伝子の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて免疫疾患を検査する方法。
（２）  一塩基多型が−８２位の塩基または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型である、（１）の方法。
（３）  −８２位の塩基と連鎖不平衡にある塩基が、−１９１４位、−８４７位、１１１７位、１４７９位および５９０１位から選ばれる塩基である、（２）の方法。
（４）  免疫疾患がアレルギー疾患である（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）  アレルギー疾患が喘息である、（４）の方法。
（６）  以下の群から選ばれる１又は２以上のプローブを含む免疫疾患の検査試薬：
（ａ）配列番号１の塩基配列において１６００番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ、
（ｂ）配列番号１の塩基配列において２６６７番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ、
（ｃ）配列番号１の塩基配列において３４３２番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ、
（ｄ）配列番号１の塩基配列において４６３０番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ、
（ｅ）配列番号１の塩基配列において４９９２番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ、
（ｆ）配列番号１の塩基配列において９４１４番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ。
（７）  以下の群から選ばれる１又は２以上のプライマーを含む免疫疾患の検査試薬：
（ａ）配列番号１の塩基配列の１６００番目の塩基を含む領域を検出するためのプライマー、
（ｂ）配列番号１の塩基配列の２６６７番目の塩基を含む領域を検出するためのプライマー、
（ｃ）配列番号１の塩基配列の３４３２番目の塩基を含む領域を検出するためのプライマー、
（ｄ）配列番号１の塩基配列の４６３０番目の塩基を含む領域を検出するためのプライマー、
（ｅ）配列番号１の塩基配列の４９９２番目の塩基を含む領域を検出するためのプライマー、
（ｆ）配列番号１の塩基配列の９４１４番目の塩基を含む領域を検出するためのプライマー。
（８）  thymic stromal lymphopoietin（TSLP）遺伝子のlong isoformの発現量を分析し、該分析結果に基づいて免疫疾患を検査する方法。
（９）  long isoformの発現量が健常者と比較してより多い場合を免疫疾患の発症リスクが高い或いは羅病している可能性が高いと判定する、（８）の検査方法。
（１０）  thymic stromal lymphopoietin（TSLP）遺伝子のlong isoformの発現量を、免疫疾患治療薬の存在下と非存在下とで比較する工程を含む、免疫疾患治療薬の効果を判定する方法。
（１１）  候補物質の存在下と非存在下とにおいてthymic stromal lymphopoietin（TSLP）遺伝子のlong isoformの発現量を測定する工程、次いで、候補物質の存在下においてその発現量が抑制される場合に、当該候補物質を免疫疾患治療薬として選択する工程を含む、免疫疾患治療薬のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の検査方法により、喘息等の免疫疾患の発症リスクや発症の有無を早期に判定することができるため、免疫疾患の早期発見や治療方針の迅速な決定ができるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
＜１＞本発明の検査方法
本発明の検査方法は、thymic stromal lymphopoietin（TSLP）遺伝子上の免疫疾患に関連する遺伝子多型を分析し、該分析結果に基づいて免疫疾患を検査する方法である。免疫疾患としては、特に限定されないが、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎などのアレルギー
疾患が好ましく、喘息がより好ましい。喘息には成人喘息、小児喘息、アトピー性喘息などが含まれる。本発明において、「検査」とは免疫疾患の発症リスクの検査及び発症の有無の検査を含む。
【０００９】
TSLP遺伝子としては、ヒトTSLP遺伝子が好ましく、例えば、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。なお、TSLP遺伝子の配列は人種の違いなどによって免疫疾患に関連する塩基以外の塩基において置換や欠失等が存在する可能性があるため、上記配列の遺伝子に限定されない。
【００１０】
遺伝子多型の種類は免疫疾患に関連するものである限り特に制限されず、一塩基多型（single nucleotide polymorphisms；SNPｓ）、及びＶＮＴＲ（Variable Number of Tandem Repeat）などを含む。その中では一塩基多型がより好ましい。
免疫疾患に関連するTSLP遺伝子の一塩基多型は特に制限されないが、好ましくは、−８２位（配列番号１の３４３２番目）の塩基またはこの塩基と連鎖不平衡にある塩基が挙げられる。ここで、「−８２位」とはTSLP遺伝子のLong isoformの翻訳開始点（配列番号１においては３５１４番目）を１として数えたときの位置を意味する。以下においても同様である。なお、例えば、「−８２位」の場合、該位置と翻訳開始点の間に挿入や欠失が起こった場合、番号が前後することも生じうるが、配列を比較して配列番号１の「−８２位」に相当する塩基も「−８２位」の塩基に含むものとする。その他の位置も同様である。
−８２位の塩基と連鎖不平衡である塩基としては、−１９１４位（配列番号１の１６００番目）の塩基、−８４７位（配列番号１の２６６７番目）の塩基、１１１７位（配列番号１の４６３０番目）の塩基、１４７９（配列番号１の４９９２番目）の塩基、５９０１位（配列番号１の９４１４番目）の塩基が挙げられる。
【００１１】
ヒト染色体上のTSLP遺伝子においては、（ａ）−１９１４位（配列番号１の１６００番目）の塩基にA（アデニン）＞G（グアニン）の多型（AとGの多型が存在し、Aがメジャーアレルであることを示す、以下同様）が存在する。
また、（ｂ）−８４７位（配列番号１の２６６７番目）にC（シトシン）＞T（チミン）の多型が存在する。
また、（ｃ）−８２位（配列番号１の３４３２番目）の塩基にC＞Tの多型が存在する。
また、（ｄ）１１１７位（配列番号１の４６３０番目）の塩基にC＞Tの多型が存在する。
また、（ｅ）１４７９（配列番号１の４９９２番目）の塩基にC＞Gの多型が存在する。
また、（ｆ）５９０１位（配列番号１の９４１４番目）の塩基にG＞Aの多型が存在する。
【００１２】
これらの塩基の多型を単独または組み合わせて解析することにより、免疫疾患を検査することができる。なお、TSLP遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
【００１３】
TSLP遺伝子の遺伝子多型の解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、肝細胞などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。遺伝子多型の解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００１４】
TSLP遺伝子の遺伝子多型の解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、PCR、ハイブリダイゼーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
シークエンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンスを行う場合、あらかじめ多型を含む断片をPCRなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００１６】
また、PCRによる増幅の有無を調べることによって解析することができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してPCRを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
また、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許2843586号明細書)、ICAN法（特開2002-233379号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
【００１７】
また、多型を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９２  Ｊａｎ  １；  １２（１）：  １３９−１４６．）が挙げられる。具体的には、まず、TSLP遺伝子の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００１８】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００１９】
次に、上記のような方法によって解析した多型に基いて、免疫疾患について検査を行う。
例えば、TSLP遺伝子の−８２位の塩基の多型に基いて判定する場合は、該塩基がTの場合、免疫疾患の発症リスクが高い、免疫疾患に罹患している可能性が高いなどと判定することができる。また、対立遺伝子の多型を含めて考慮してもよく、例えば、遺伝子型がTTの場合に、CTやCCの場合と比べて免疫疾患の発症リスクが高い、免疫疾患に罹患している可能性が高いなどと判定することができる。
なお、−１９１４位、−８４７位、１１１７位、１４７９位、および５９０１位の多型は−８２位の多型と連鎖不平衡にあるため、−８２位の代わりにこれらの中のいずれかの塩基の多型を解析してもよい。
【００２０】
本発明の検査法においては、TSLP遺伝子の多型に加え、他の遺伝子の多型を解析し、それらの遺伝子の多型の組合わせに基いて免疫疾患の検査を行ってもよい。他の遺伝子としては、T-bet遺伝子（特開2006-149276）、IL-12B遺伝子のプロモーター（特開2006-101847）、TRAIL受容体遺伝子（特開2005-027595）などが挙げられる。
【００２１】
また、本発明においては、TSLPにLong isoform（翻訳開始点は配列番号１の３５１４番目のＡ）とShort isoform（翻訳開始点は配列番号１の５２１５番目のＡ）の2種類の発現産物が存在し（図１Ｂ）、TSLPのLong isoformの発現がウイルス性の刺激に応答して誘導されることが示されたため、TSLPのLong isoformの発現量を指標にして喘息などの免疫疾患の検査をすることも可能である。例えば、TSLPのLong isoformの発現量が健常者と比較して多いとき、免疫疾患の発症リスクが高い、免疫疾患に罹患している可能性が高いなど
と判定することができる。Long isoformの発現を特異的に検出するためにはLong isoformに特異的な領域をRT-PCRやハイブリダイゼーションなどによって検出すればよいが、例えば、配列番号８，９のプライマーを使用して定量的RT-PCRを行えばよい。
【００２２】
また、本発明においては、TSLP遺伝子のlong isoformの発現量を、免疫疾患治療薬の存在下と非存在下とで比較し、免疫疾患治療薬の効果を判定することもできる。例えば、気道上皮細胞などに免疫疾患治療薬を添加し、poly(I:C)刺激時のlong isoformの誘導が免疫疾患治療薬非添加時と比べて抑制されるかを指標にして判定することができる。
また、本発明においては、候補物質の存在下と非存在下とにおいてTSLP遺伝子のlong isoformの発現量を測定し、候補物質の存在下においてその発現量が抑制される場合に、当該候補物質を免疫疾患治療薬として選択することにより、免疫疾患治療薬のスクリーニングを行うこともできる。例えば、気道上皮細胞などに候補物質を添加し、poly(I:C)刺激時のlong isoformの誘導が候補物質非添加時と比べて抑制されるかを指標にして免疫疾患治療薬をスクリーニングすることができる。
【００２３】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、免疫疾患を検査するためのプライマー又はプローブを含む検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、配列番号１の塩基配列において１６００番目の塩基（−１９１４位）を含む配列、又はその相補配列を有するプローブ、配列番号１の塩基配列において２６６７番目の塩基（−８４７位）を含む配列、又はその相補配列を有するプローブ、配列番号１の塩基配列において３４３２番目の塩基（−８２位）を含む配列、又はその相補配列を有するプローブ、配列番号１の塩基配列において４６３０番目の塩基（１１１７位）を含む配列、又はその相補配列を有するプローブ、配列番号１の塩基配列において４９９２番目の塩基（１４７９位）を含む配列、又はその相補配列を有するプローブ、配列番号１の塩基配列において９４１４番目の塩基（５９０１位）を含む配列、又はその相補配列を有するプローブが挙げられる。
これらのプローブは、各多型のいずれか一方に対応する配列を有する１種類のプローブを用いてもよいし、それぞれの多型に対応する配列を有する２種類のプローブを用いてもよい。
【００２４】
また、プライマーとしては、配列番号１の塩基配列の１６００番目の塩基の多型を判別することのできるプライマー、例えば、配列番号１の塩基配列の１６００番目の塩基を含む配列を有する領域を増幅することのできるプライマー；配列番号１の塩基配列の２６６７番目の塩基の多型を判別することのできるプライマー、例えば、配列番号１の塩基配列の２６６７番目の塩基を含む配列を有する領域を増幅することのできるプライマー；配列番号１の塩基配列の３４３２番目の塩基の多型を判別することのできるプライマー、例えば、配列番号１の塩基配列の３４３２番目の塩基を含む配列を有する領域を増幅することのできるプライマー；配列番号１の塩基配列の４６３０番目の塩基の多型を判別することのできるプライマー、例えば、配列番号１の塩基配列の４６３０番目の塩基を含む配列を有する領域を増幅することのできるプライマー；配列番号１の塩基配列の４９９２番目の塩基の多型を判別することのできるプライマー、例えば、配列番号１の塩基配列の４９９２番目の塩基を含む配列を有する領域を増幅することのできるプライマー；配列番号１の塩基配列の９４１４番目の塩基の多型を判別することのできるプライマー、例えば、配列番号１の塩基配列の９４１４番目の塩基を含む配列を有する領域を増幅することのできるプライマーが挙げられる。これらのプライマーは多型を含む領域（好ましくは５０〜１０００塩基の長さの領域）の両端に設定されたフォワードプライマーとリバースプライマーのプライマーセットであってもよい。
また、シークエンス解析や単鎖増幅に用いる場合、プライマーは多型の塩基の５０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーを用いることができる。この場合、上記領域の相補鎖を増幅するプライマーであってもよい。
また、増幅の有無を指標に検査する場合は、多型を含む領域の配列またはその相補配列を有するプライマーであって、それぞれの多型に対応するプライマーを用いてもよい。
このようなプライマーやプローブの長さは特に制限されないが、例えば、１０〜１００塩基のオリゴヌクレオチドが好ましく、１５〜５０塩基のオリゴヌクレオチドがより好ましい。なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメラーゼやハイブリダイゼ−ション用のバッファーなどを含むものであってもよい。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２６】
＜１＞多型分析
対象患者(被検者)
喘息を患う対象患者全員は、アメリカ胸部疾患学会（American Thoracic Society）の診断基準を用いて診断した（1962年）。アトピー性喘息の診断は、１種または複数のアレルゲンに対してプリックテスト陽性であるか一つ以上のRAST陽性であるかに基づいた(Hirota T. et. al., Functional haplotypes of IL-12B are associated with childhood atopic asthma. J Allergy Clin Immunol; 116, 789-795,2005)。コントロール（対照区）として、アトピー性関連疾患を持たない個人を母集団から、無作為に717人選んだ（年齢幅20-75歳、平均年齢49.2歳；男：女=2.64:1.0）。人種は全て日本人であり、理化学研究所遺伝子多型センター (The Institute of Physical and Chemical Research (RIKEN) , SNP Research center)における研究倫理委員会の規則に従って、全員から研究に参加することについて書面によるインファームドコンセント得た。
TSLPの遺伝的変異体が気管支喘息の感受性に関連するか評価するために、TSLP遺伝子多型の分析を行った。
【００２７】
連鎖不平衡マップの作製
対立遺伝子比較のために、コントロール検体12人、小児気管支喘息患者検体12人、および成人気管支喘息患者検体12人について、TSLP遺伝子の領域の遺伝子多型を見いだす目的で、最初のエクソンの上流約3kbpから最後のエクソンの下流約２kbpの遺伝子情報まで遺伝子解析装置を用いて解読した。その結果、19個のSNPが見いだされ、そのうち、マイナーアレル頻度が10％以上のSNPが7個（Long isoformの翻訳開始点から-1914番目（SNP2）、-847番目（SNP4）、-82番目（SNP5）、1117番目（SNP8）、1479番目（SNP10）、1560番目（SNP11）、5901番目（SNP17））同定された（表１）。
次に、それらのSNPs間の連鎖不平衡を検討するために、見いだされたSNPsをHaploview 3.2 program  (http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/).を用いて解析し|D'| と r2を得た。その結果、図１Ａおよび表2に示されるように、r2＞0.8を満たすTag SNPsとして、-82C＞T、1560C＞Gの2つを選出した。マーカーSNP6(1560C/G)以外のSNPs（SNP2、SNP4、SNP5、SNP8、SNP10、SNP17）は1つのブロックとして同様の挙動を示すことがわかった。
【００２８】
【表１】
2008109915.tif 000002
表１．24人の喘息患者と12人の健常人の比較により見出されたTSLP遺伝子における多型の位置と頻度
【００２９】
【表２】
2008109915.tif 000003
表２．７種類の多型の連鎖不平衡解析
【００３０】
SNPの検出
２つ（１４７９、−８２）のTag SNPsについて、TaqMan 法を用いた遺伝子変異の型決定（ジェノタイピング：genotyping）によって多型を検出した。すなわちlong isoform翻訳開始点から-82位のSNPについては下記のフォワードプライマー、リバースプライマーおよびTaqmanプローブを用いた。1560位のSNPについてはTaqManR SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いた。ジェノタイピングの具体的な手法はTaqMan system添付マニュアルに従った。
【００３１】
-82 forward primer  5'-GGCAAAACCTGGTGCTTGAG-3'（配列番号２）
-82 reverse primer  5'-CCACGAGTGTAAGAGATCTGTAAGG-3' （配列番号３）
-82 reporter 1      VIC labeled 5'-CACTGGCCCCTAAGG-3' （配列番号４）
-82 reporter 2      FAM labeled 5'-CACTGGCCTCTAAGG-3' （配列番号５）
【００３２】
成人喘息391人、小児喘息487人、アトピー性喘息453人、および非喘息コントロール群についてゲノタイピングを行った。それらについて、遺伝子多型の頻度、アレル頻度についてχ2検定を行い頻度差の有意性の検定を行った。
結果をそれぞれ、表３、４、５に示す。TSLP遺伝子におけるSNP5（−８２位）のアリル頻度において成人喘息群、小児喘息群およびアトピー性喘息群のそれぞれと、健常者群との間に顕著な有意差が認められた。
【００３３】
【表３】
2008109915.tif 000004
表３．TSLP遺伝子の多型と成人喘息との相関
【００３４】
【表４】
2008109915.tif 000005
表４．TSLP遺伝子の多型と小児喘息との相関
【００３５】
【表５】
2008109915.tif 000006
表５．TSLP遺伝子の多型とアトピー性喘息との相関
【００３６】
＜２＞TSLPの発現解析
図１Ｂに示されるように、TSLP遺伝子はLong isoformとShort isoformの2種類の転写産
物を生じることが本発明者らにより明らかにされた。これらの両isoformの発現の組織特異性及び刺激誘導性を定量的RT-PCRによって調べた。
【００３７】
定量的RT-PCR
組織または細胞からRNAeasy (QIAGEN, Valencia, CA) でtotalRNAを抽出した後、DNAse処理をしたtotal RNAを用いて、ランダムプライマーとオリゴdTプライマーの混合プライマーでcDNAの合成を行った。
TSLPのmRNA（Long isoform (Long), Short isoform (Short) およびその両方（common））の発現はSyberR GreenI dye (SYBERR Green) を用いた定量的なRT-PCRで解析した。すべての実験においてcDNAはヒトハウスキーピング遺伝子であるGAPDHを定量して補正した。PCRに用いたプライマーセットは以下の通りである。
【００３８】
TSLP-common,
5'-CTAAGGCTGCCTTAGCTATC-3' （配列番号６）
5'-AAGCGACGCCACAATCCTTG-3' （配列番号７）
TSLP-long 
5'-GATTACATATATGAGTGGGAC-3' （配列番号８）
5'-TTCATTGCCTGAGTAGCAT-3' （配列番号９）
TSLP-short
5'-CGTAAACTTTGCCGCCTATGA-3'（配列番号１０）
5'-TTCTTCATTGCCTGAGTAGCATTTAT-3' （配列番号１１）
GAPDH
5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'（配列番号１２）
5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'（配列番号１３）
【００３９】
図２Ａにヒト各組織におけるTSLP遺伝子の発現を示す。なお、ヒト各組織由来のcDNAはClonetech (Mountain View, CA)から購入した。その結果、TSLPは心臓、肝臓、肺、気管に多く発現が見られ、Short isoformが主に発現していることがわかった。
【００４０】
次に、正常気道上皮細胞(NHBE)、正常肺繊維芽細胞(NHLF)および正常肺平滑筋細胞(BSMC)を病原菌などの特有な分子群(PAMPs)で刺激し、刺激時のTSLP遺伝子の発現を調べた。PAMPsには100ng/ml LPS、10μg/ml poly (I:C)および1μg/ml MALP-2を用いた。刺激4時間後に細胞を回収し定量的RT-PCRを用いて発現解析した。その結果、NHBE細胞においてPoly
(I:C)刺激に応じてLong isoformが顕著に誘導された（図２Ｂ）。一方、Short isoformはPAMPsによって誘導を受けなかった。
【００４１】
なお、正常ヒト気道上皮細胞(NHBE)、正常ヒト肺繊維芽細胞(NHLF)および正常ヒト気道平滑筋細胞(BSMC)はCambrex 社(Walkersvill, MD)から購入して用いた。細胞の培養はCambrex 社で販売するそれぞれの細胞に対応する培地キットで行った。Poly (I:C)、LPSおよびPam3CSK4はInvivoGen（San Diego, CA）、MALP-2 はAlexis（Lausen, Switzerland)より購入して用いた。
【００４２】
次に、NHBE細胞におけるPAMP刺激時のTSLPの発現量の経時変化を調べた。PAMPsには200ng/ml Pam3CSK4、1μg/ml MALP-2、100ng/ml LPSおよび10μg/ml poly(I:C)を用いて、図３Ａに示す各時間に細胞を回収してTSLPのLong isoform, Short isoform および両方(common)の遺伝子発現をSyberR Green法を用いて定量的RT-PCRで検出した。各サンプルはGAPDHの発現量で補正した。実験は２回繰り返して行い、同様な結果が得られた。図３Ａより、Long isoformがpoly(I:C)刺激の4時間後に誘導されることがわかった。
【００４３】
次に、NHBE細胞におけるpoly(I:C)刺激時のTSLPの発現量をpoly(I:C)の濃度を変えて測
定した。NHBE細胞をpoly(I:C) (0.1 および10 μg/ml)で4時間刺激した。異なる4人に由来するNHBEを用いて上記と同様に定量的RT-PCRで検出した。値は平均± SEMで表した。その結果、１０μｇ／ｍｌのpoly(I:C)によってLong isoformが誘導されることがわかった（図３Ｂ）。
【００４４】
次に、NHBE細胞におけるpoly(I:C)刺激時のTSLPタンパク質量の変化を調べた。TSLPタンパク質の定量にはTSLP測定ELISAキット(R&D, Minneapolis, MN)を用いた。NHBE細胞 (1x104 cells / well，x3 wells) はpoly(I:C) (10μg/ml)で刺激後、4-24時間の培養上清中のTSLP濃度を測定した(図３Ｃ左)。また、NHBE細胞を 10μg/ml poly(I:C) あるいは100ng/ml LPS で 24 時間刺激した培養上清中のTSLPの定量を行った（図３Ｃ右）。実験は２回繰り返して行い、同様な結果が得られた。 値は 平均 ± SD、 アスタリスク (*)は 定量限界以下を示す (<15.6 pg/ml)。その結果、TSLPはタンパク質レベルでもpoly(I:C)によって誘導されることがわかった。
【００４５】
＜３＞プロモーター解析
TSLP遺伝子のプロモーター領域に存在するSNPのプロモーター活性への影響を調べるため、各アレルのプロモーターを作製し、レポーター遺伝子の発現を指標にプロモーター活性の評価を行った。
図４Ａの上段にTSLP遺伝子とSNPの配置を示す。図４Ａの下段に示されるように、Long isoformとShort isoformのプロモーター領域にあるSNPsを標的にレポーターコンストラクトを作製した。
ヒトTSLP-long isoform(-1041 to -12) と TSLP-short isoform (+842 to +1661)のプロモーター領域はヒト喘息患者と健常ボランティア由来のゲノムからリンカーを付加した下記のプライマーを用いてクローニングし(forwardとreverse primerにそれぞれKpnIおよびXhoIサイト)、遺伝子配列を確認した。その後レポーターベクターとしてpGL3-enhancer
vector (Promega, Madison WI) にプロモーター配列を組み換えてプロモーターアッセイに用いた。
TSLP-long promoter
5'- TGAGCTCAGGACAGCATCGT-3' （配列番号１４）
5'- CAATTCCACCCCAGTTTCAC-3' （配列番号１５）
TSLP-short promoter
5'-GGCTATTTCACTGCCTTGTC-3'（配列番号１６）
5'-GATTGAAGGTTAGGCTCTGG-3'（配列番号１７）
Long isoformでは-847位（SNP4）と-82位（SNP5）の多型を評価した。一方、Short isoformでは-585位（SNP8）と-223位（SNP10）の多型を評価した。なお、-585と-223という数字はShort isoformの翻訳開始点から数えた数字である。
TSLP-long isoformのプロモーターの変異体の作製にはGene Editor in vitro site-directed mutagenesis system (Q9280; Promega)を用いて、キットマニュアルに従って作製した。
-847C（Major）を-847T（Minor）に変換するには、5'-AGGTGCCCCTAGTCACCAAGAG-3' （配列番号１８）を用いた。一方、-82C（Major）を-82T（Minor）に変換するには5'-GAGCACTGGCCTCTAAGGCAGGCC -3'（配列番号１９）を用いた。また、-585C（Major）を-585T（Minor）に変換するには、5'- GAGTATCCTGCTATGTGCAGAACTCCG -3' （配列番号２８）を用いた。一方、-223C（Major）を-223G（Minor）に変換するには5'- GCTCTACTCAACCGTGACCTCTTCTCTC-3'（配列番号２９）を用いた。
【００４６】
レポーターベクターとウミシイタケ由来のルシフェラーゼベクター(pRL-TK)両方をNHBE細胞(5x104 細胞/12well plate)に遺伝子導入した(それぞれ500ng および10ng DNA/well)。24時間後、必要に応じて細胞を刺激してPromega社のキットマニュアルに基づいてDual Luciferase Reporter Assay Systemでルシフェラーゼ活性の測定を行った。プロモーター
活性はpRL-TKで補正して用いた。
【００４７】
すなわち、図４Ａに示すような500ngのTSLP レポーターコンストラクト、pGL3-TSLP-long isoform / Major type（-847C、-82C）あるいはpGL3-TSLP-long isoform / minor type（-847T、-82T）およびpGL3-TSLP-short isoform / Major type（-585C、-223C）あるいはpGL3-TSLP-short isoform / minor type （-585T、-223G）もしくはpGL3-enhancer control vector (Mock) をNHBE(5x104細胞)に遺伝子導入した。10ng pRL-TK ベクターもインターナルコントロールとして、それぞれのレポーターコンストラクトと同時に遺伝子導入した。24時間後に10μg/ml poly(I:C) で 4 時間刺激しNHBEのルシフェラーゼ活性を測定した。実験は３回繰り返して行い、同様な結果が得られた。値は 平均 ± SD を示す。その結果、図４Ｂに示されるように、Long isoformはMajor typeよりもminor typeの方がpoly(I:C)によって強く誘導されることがわかった。一方、Short isoformではMajor typeとminor typeで差は見られなかった。
【００４８】
次に、Long isoformの-847位（SNP4）と-82位（SNP5）うち、どちらがpoly(I:C)による誘導に重要かを調べるために、（-847C、-82C）、（-847T、-82C）、（-847C、-82T）、（-847T、-82T）の4種類のプロモーターコンストラクトを作製し、上記と同様にプロモーター活性を測定した。実験は２回繰り返して行い、同様な結果が得られた。値は 平均 ±
SD を示す。図４Ｃに示されるように、poly(I:C)による刺激時のプロモーター活性において、（-847T、-82T）と（-847C、-82T）に有意な差が見られたことから、−８４７位の多型がpoly(I:C)刺激時のTSLPのlong isoformの発現に影響を与えることがわかった。すなわち、−８４７位がＴのときに、−８４７位がＣのときと比べてpoly(I:C)刺激によって誘導されやすいことがわかった。
【００４９】
ビオチン化オリゴDNA沈降
次に、Long isoform のプロモーターの多型を含む領域に転写因子が結合するかどうかを調べるためにビオチン化オリゴDNA沈降を行った。すなわち、−８４７Ｃと−８４７Ｔの２本鎖オリゴヌクレオチド、−８２Ｃと−８２Ｔの２本鎖オリゴヌクレオチドを調製し、これらに対する転写因子の結合を評価した。
NHBE細胞からの核タンパク質の抽出は以下の通りに行った。1.5x106細胞をbuffer C'(20mM HEPES (pH 7.9), 420mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 0.2mM EDTA, 1mM dithiothreitol, 0.1% Nonidet P-40, 1mM Na2V03, 1mM NaF, 1mM sodium glycerophosphate, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride and Protease inhibitor mix ),で可溶化して回収後に氷冷下15分間静置した。その後、15000rmp, 4℃で15分間の遠心し上清を回収した。この上清に1:3になるようにbuffer D'(buffer C'からNaClを除いた溶液)を添加してビオチン化オリゴDNA沈降に供試した。
核タンパクサンプルには、下記のビオチン化2本鎖オリゴDNA（3 μg）と3 μg poly(dI-dC)を添加して4℃で反応させた。コントロールとしてはビオチン化2本鎖オリゴDNA（3 μg）のみ添加して4℃で反応させた。１時間後にストレプトアビジン-アガロースを添加して、ビオチン化2本鎖オリゴDNAとそれに結合する因子を回収した。ビオチン化オリゴDNA沈降したサンプルをSDS-PAGEで分離後、ウエスタンブロッティングし、抗AP1抗体(Oncogene, Sandiego, CA)または抗AP2α抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)を用いて検出した。
図５に示されるように、poly(I:C)刺激時に−８４７Ｔに特異的にＡＰ１が結合することがわかった。このことから、−８４７位がＴのときには刺激に応じてＡＰ１が結合し、Long isoformの転写が活性化されることが考えられた。
【００５０】
-847C oligo
5'- GGTGCCCCTAGCCACCAAGAG -3'（配列番号２０）
5'- CTCTTGGTGGCTAGGGGCACC -3'（配列番号２１）
-847T oligo
5'- GGTGCCCCTAGTCACCAAGAG -3'（配列番号２２）
5'- CTCTTGGTGACTAGGGGCACC -3'（配列番号２３）
-82C oligo
5'- TGGCCCCTAAGGCAGGCCTTACAG -3'（配列番号２４）
5'- CTGTAAGGCCTGCCTTAGGGGCCA -3'（配列番号２５）
-82T oligo
5'- TGGCCTCTAAGGCAGGCCTTACAG -3'（配列番号２６）
5'- CTGTAAGGCCTGCCTTAGGGGCCA -3'（配列番号２７）
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ヒトTSLPの連鎖不平衡マップと遺伝子の略図。（上）10%以上の頻度で見いだされるSNPs間の連鎖不平衡マップ。（下）TSLP遺伝子領域に存在する7SNPsと2つのisoformの略図。
【図２】ヒト組織ならびに細胞のTSLP遺伝子の発現を示す図。(A)ヒト正常組織のcDNAパネルを用いてTSLPのLong isoform (Long), Short isoform (Short) およびその両方（common）の発現を定量的RT-PCRで検出した。 (B) 正常気道上皮細胞(NHBE)、正常肺繊維芽細胞(NHLF)および正常肺平滑筋細胞(BSMC)を病原菌などの特有な分子群(PAMPs)で刺激し、TSLP遺伝子の発現を調べた。
【図３】Poly (I:C)刺激によるNHBEの活性化とTSLP遺伝子の発現を示す図。(A) NHBEの培養液中にPAMPsを添加した。PAMPsには200ng/ml Pam3CSK4、1μg/ml MALP-2、100ng/ml LPSおよび10μg/ml poly(I:C)を用いて、図に示す各時間に細胞を回収してTSLPのLong isoform, Short isoform および両方(common)の遺伝子発現を定量的RT-PCRで検出した。（B）NHBEをpoly(I:C) (0.1 および10 μg/ml)で4時間刺激し、定量的RT-PCRで検出した。（C）NHBEのTSLPタンパク質の産生をELISAを用いて調べた。(左) NHBE (1x104 cells / well，x3 wells) はpoly(I:C) (10μg/ml)で刺激後、4-24時間の培養上清中のTSLP濃度を測定した。（右）NHBEを 10μg/ml poly(I:C) あるいは100ng/ml LPS で 24 時間刺激した培養上清中のTSLPの定量を行った。
【図４】TSLP遺伝子の機能調節SNPの探索を示す図。(A)ヒトTSLP遺伝子の略図とTSLPレポーターコンストラクトを示す。(上)TSLP遺伝子とSNPの配置を示す。(下)Long isoformとShort isoformのプロモーター領域にあるSNPsを標的にレポーターコンストラクトを作製した。（B）図に示すような500ngのTSLP レポーターコンストラクトをNHBE(5x104細胞)に導入した。10ng pRL-TK ベクターもインターナルコントロールとして、それぞれのレポーターコンストラクトと同時に遺伝子導入した。24時間後に10μg/ml poly(I:C) で 4 時間刺激しNHBEの ルシフェラーゼ活性を測定した。（C）TSLP発現の調節性SNPの同定。Long isoformのプロモーター領域の各種1遺伝子変異体のレポーターコンストラクトを作製した。Long isoform のSNPの位置にある塩基-847／-82に対して、それぞれC/C、T/T、C/T、T/Cの4種類のレポーターコンストラクトを作製し、（B）と同様にプロモーター活性を測定した。
【図５】転写因子の調節性SNPへの結合を示す図（写真）。poly(I:C) (10 μg/ml)で4時間刺激、あるいは無刺激のNHBE (1.5x106細胞)の核タンパク質を抽出した。Long isoform のSNP周辺の配列である-847Cあるいは-847T、および-82Cあるいは-82Tのビオチン化2本鎖オリゴDNAと結合したタンパク質は、ストレプトアビジン-アガロースで沈殿し、それぞれSDS-PAGEでタンパク質を展開した。-847Cあるいは-847Tの結合タンパク質についてはanti-AP1抗体を用いて(左)、-82Cあるいは-82Tの結合タンパク質については anti-AP２α抗体（右）を用いてウエスタンブッティングで検出した。
【図１】
2008109915.tif 000007
【図２】
2008109915.tif 000008
【図３】
2008109915.tif 000009
【図４】
2008109915.tif 000010
【図５】
2008109915.tif 000011
【配列表】
2008109915000001.app