(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト由来の細胞に確実に強度の癌化形質を誘導するための手段の提供。【解決手段】ヒト由来の細胞中にｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０Ｔ抗原が存在する状態でＳｒｃを発現させることにより、前記細胞の癌化を誘導する、ヒト由来細胞の癌化誘導方法。例えば、トランスフェクションなどにより、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子、並びにｓｒｃ遺伝子を細胞に個別に又は同時に導入し、それらの遺伝子を細胞中で発現させることにより、その細胞を迅速かつ確実に癌化誘導する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の細胞中にｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０Ｔ抗原が存在する状態でＳｒｃを発現させることにより、前記細胞の癌化を誘導する、ヒト由来細胞の癌化誘導方法。
【請求項２】
ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子、並びにｓｒｃ遺伝子を前記細胞に導入する手順を含む請求項１記載の癌化誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト由来細胞の癌化誘導方法に関する。より詳細には、ヒト由来の細胞中にｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０  Ｔ抗原が存在する状態でＳｒｃを発現させることにより、前記細胞の癌化を誘導するヒト由来細胞の癌化誘導方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌（悪性腫瘍）は、体細胞に由来する細胞が浸潤性に異常増殖し、転移などする疾患であり、癌腫、肉腫、白血病、悪性リンパ腫などを含む。多くの患者が多種類の癌に罹患しており、その死亡率は現在においても非常に高い。そのため、治療剤（抗癌剤）及び治療方法の開発や、発症メカニズムなどに関する研究が種々進められている。
【０００３】
癌発症メカニズムの解明に関連して、正常細胞を癌化させる研究が行われている。ここで、本発明において、「細胞の癌化」とは、単に細胞を不死化させるのみならず、細胞に「外界からの制御を失って増殖する形質（癌化形質）」を誘導することを言うものとする。より具体的には、足場非依存性増殖能、増殖因子非依存性増殖能、接触阻害の喪失等の癌化形質を細胞に誘導することを指す。このうち、足場依存性増殖能の獲得は、後述する軟寒天培地コロニー形成能試験に応用されるもので、細胞の癌化形質の評価に特に汎用されている。
【０００４】
一般に、ヒト由来の細胞の癌化は、げっ歯類由来の細胞と比較して困難であることが経験的に知られている。例えば、げっ歯類の正常細胞では、２種類の癌原遺伝子（活性型ｒａｓ遺伝子及びＳＶ４０  Ｔ抗原遺伝子）を導入することにより、その癌化を充分に誘導できるのに対し、ヒトの正常細胞では、これらの２種類の癌原遺伝子を導入しても、癌化を誘導できないことが知られている。従来、ヒト正常細胞に癌化を誘導するためには、活性型ｒａｓ遺伝子及びＳＶ４０  Ｔ抗原遺伝子に加えた他の癌原遺伝子導入や、細胞の培養条件の再検討が必要と考えられていた。
【０００５】
このような状況下、近年になって、活性型ｒａｓ遺伝子及びＳＶ４０  Ｔ抗原遺伝子に加えて、さらにｈＴＥＲＴ（「ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」、テロメラーゼの触媒サブユニット、以下同じ）を発現させることにより、ヒト由来細胞においても癌化の誘導が可能となることが、Ｗｅｉｎｂｅｒｇらにより報告された（非特許文献１参照）。この結果は、ヒト由来の細胞においても、テロメラーゼによりテロメア長を維持してやれば、活性型ｒａｓ遺伝子及びＳＶ４０  Ｔ抗原遺伝子を導入することで癌化を誘導できることを示している。
【０００６】
しかしながら、本発明者らは、このｈＴＥＲＴと活性化型Ｒａｓ及びＳＶ４０  Ｔ抗原の導入による癌化誘導により、ヒト由来の正常繊維芽細胞に発現させることができる癌化形質は、げっ歯類由来の正常繊維芽細胞に活性化型Ｒａｓ及びＳＶ４０  Ｔ抗原を導入した場合に発現される癌化形質と比較して、極めて弱いものであることを明らかにした（非特許文献２参照）。
【０００７】
ここで、本発明に関連するタンパク質又は遺伝子について、以下説明する。
【０００８】
ｈＴＥＲＴ（ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）は、上述の通り、テロメラーゼの触媒サブユニットである。テロメアは、真核生物の染色体の末端部にある構造であり、染色体末端を保護する役割などを有する。テロメア長は細胞分裂の度に短縮するため、細胞の分裂可能回数はテロメア長によって規定される。一方、テロメラーゼは、細胞分裂によるテロメア長の短縮に拮抗して、テロメア長を維持する酵素である。テロメラーゼは、テロメア配列の鋳型となるＲＮＡ、及び、逆転写酵素を構成要素に含み、この逆転写酵素部分がｈＴＥＲＴである。
【０００９】
ＳＶ４０  Ｔ抗原は、ＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０）が産生する初期タンパク質である。ＳＶ４０はパポバウイルス科のウイルスで、アカゲザル腎細胞から分離された。このウイルスは、細胞への感染初期（ＤＮＡ合成が起きる前）に、初期タンパク質として、ラージＴ抗原及びスモールＴ抗原が産生される。ＳＶ４０  Ｔ抗原は、許容細胞（アフリカミドリザル腎細胞など）では溶解感染を起こすが、非許容細胞（マウス由来の細胞など）ではトランスフォーメーション（癌細胞などへの形質転換）を引き起こすことが知られている。
【００１０】
Ｓｒｃは、トリのラウス肉腫ウイルスの有する肉腫遺伝子ｖ−ｓｒｃ及び癌原遺伝子ｃ−ｓｒｃの遺伝子産物（タンパク質）であり、チロシンキナーゼをコードする。ｖ−ｓｒｃ由来のＳｒｃは強いトランスフォーミング活性を有し、活性化型Ｓｒｃとして知られている。また、シグナル伝達経路において、ＳｒｃはＲａｓタンパク質よりも上流に位置することが明らかにされている。
【００１１】
Ｒａｓタンパク質は、ｒａｓ遺伝子によってコードされている低分子量ＧＴＰ結合タンパク質であり、哺乳類では３種類（Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ）が知られている。点突然変異により、Ｒａｓタンパク質の１２、１３、６１番目のアミノ酸残基が置換されると、活性型となり、トランスフォーミング活性を持つようになることが知られている。
【非特許文献１】W.C.Hahn et al, “Creation of human tumour cells withdefined genetic elements.” letter, Nature, 29 July 1999
【非特許文献２】Akagi T, Sasai K, HanafusaH., “Refractory nature of normal human diploid fibroblasts with respect to oncogene-mediated transformation.” Proc NatlAcad Sci U.S.A ;100 (23): 13567-72 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述の通り、ヒト由来の正常細胞を癌化させる場合において、ｈＴＥＲＴの強制発現によりヒト由来の正常繊維芽細胞を不死化させた上で、活性型Ｒａｓタンパク質及びＳＶ４０  Ｔ抗原を導入した場合であっても、発現される癌化形質は、げっ歯類由来の正常繊維芽細胞の場合と比較して、非常に弱いものであった。
【００１３】
そこで、本発明は、ヒト由来の細胞に確実に強度の癌化形質を誘導するための手段を提供すること、を主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明では、ヒト由来の細胞中にｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０  Ｔ抗原が存在する状態でＳｒｃを発現させることにより、前記細胞の癌化を誘導する、ヒト由来細胞の癌化誘導方法を提供する。
【００１５】
例えば、トランスフェクションなどにより、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０  Ｔ抗原遺伝子、並びにｓｒｃ遺伝子を細胞に個別に又は同時に導入し、それらの遺伝子を細胞中で発現させることにより、その細胞を迅速かつ確実に癌化誘導できる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ヒト由来の細胞に確実に強度の癌化形質を誘導できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明に係る、ヒト由来細胞にｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０Ｔ抗原に加えてＳｒｃを発現させる癌化誘導方法を用いることにより、該ヒト由来の細胞に確実に強度の癌化形質を誘導することが可能である。この際、ヒト由来の細胞に誘導される癌化形質は、従来のヒト由来細胞にｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０  Ｔ抗原に加え、活性化型Ｒａｓを発現させる方法によって誘導される癌化形質に比べ、極めて強いものである。
【００１８】
上述したように、従来、ヒト正常細胞に癌化を誘導するためには、げっ歯類細胞において既に十分な癌化形質誘導能を示すことが明らかにされていた、活性型ｒａｓ遺伝子及びＳＶ４０  Ｔ抗原遺伝子を、該ヒト正常細胞に発現させた上で、さらに他の癌原遺伝子を導入したり、細胞の培養条件を見直すという試みがなされてきた。これにより、活性型ｒａｓ遺伝子及びＳＶ４０  Ｔ抗原遺伝子に加え、ｈＴＥＲＴを発現させることで、ヒト正常細胞にも癌化の誘導が可能となることが明らかにされた。しかしながら、この方法により誘導される癌化形質は十分なものではなかった。
【００１９】
本願発明者らは、このような正常細胞の癌化には活性型ｒａｓ遺伝子及びＳＶ４０  Ｔ抗原遺伝子の発現が必須であるという従来の前提を見直し、再度検討を行なうことにより、本発明に係る、ヒト由来細胞にｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０Ｔ抗原に加えてＳｒｃを発現させる癌化誘導方法を確立した。
【００２０】
現在までに、癌原遺伝子には、ｒａｓ遺伝子を含むＧＴＰ結合タンパク、ｍｙｃ遺伝子やｆｏｓ遺伝子に代表される転写因子、ｓｒｃ遺伝子やｋｉｔ遺伝子といったチロシンキナーゼ等、多数の遺伝子が同定されてきている。本願発明者は、これら多数の癌原遺伝子の中から、ｓｒｃ遺伝子が、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０  Ｔ抗原遺伝子との共発現により、ヒト由来細胞に強度の癌化形質を誘導できることを鋭意検討の結果見出した。
【００２１】
このように、本発明に係る癌化誘導方法は、単にヒト癌化誘導細胞の作出のための方法を提供するのみならず、ヒト正常細胞に十分な癌化を誘導するための最小限の遺伝子セットを明らかにするものであり、さらに以下の新規な技術的思想を提供するものである。
【００２２】
Ｓｒｃはシグナル伝達経路においてＲａｓタンパク質の上流に位置することが知られている。従って、Ｓｒｃ遺伝子の導入は、Ｒａｓの活性化を誘導すると考えられ、結果として従来の活性化型ｒａｓ遺伝子の導入と同様の効果をもたらすものとも考えられる。
【００２３】
しかしながら、ヒト由来細胞にｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０  Ｔ抗原に加え、活性化型Ｒａｓを発現させて誘導される癌化形質が比較的弱いものであるのに対して、Ｒａｓに変えてＳｒｃを発現させる本発明に係る方法を用いることにより、強い癌化形質を誘導できたことは、ＳｒｃがＲａｓタンパク質に関連するシグナル伝達経路とは異なる経路で、細胞の癌化誘導を促進していることを強く示唆するものである（図４参照）。
【００２４】
従って、本発明に係る癌化誘導方法は、ヒト由来の細胞における癌化誘導において、Ｒａｓタンパク質に関連する経路とは異なる未知の経路を解明するために役立てることが可能であり、様々なヒト由来の正常細胞を癌化させて、未知のシグナル伝達経路を解明し、新たな治療法及び治療薬の開発を行なうためにも寄与する。
【実施例１】
【００２５】
実施例１では、ヒト由来の繊維芽細胞にｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０  Ｔ抗原が存在する状態でＲａｓ又はＳｒｃを発現させた場合、該繊維芽細胞に誘導される癌化形質に関し、軟寒天内コロニー形成試験による検索を行なった。
【００２６】
軟寒天コロニー形成試験とは、正常細胞と異なり、接着せずに増殖する（足場非依存性増殖）ことが可能な形質転換細胞の特性を利用して、形質転換細胞を検出する試験である。
【００２７】
ラウス肉腫ウイルスｔｓＮＹ７２−４株のプロウイルスゲノムＤＮＡを含むプラスミドｐＸＤ−７２（文献１：Mayer BJ, Jove R, KraneJF, Poirier F, Calothy G, HanafusaH. J Virol. 1986 Dec;60(3):858-67.参照）からｖ−ｓｒｃ遺伝子（活性型Ｓｒｃ）（配列番号１参照）をＰＣＲにて増幅した後、レトロウイルスベクター ｐＣＸ４ｐｕｒ（文献２：Akagi T, Sasai K, Hanafusa H. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Nov 11;100(23):13567-72.参照）に挿入して発現ベクターｐＣＸ４ｐｕｒ／ｖ−ｓｒｃ ｔｓＮＹ７２を作製した。この発現ベクターを使って組み換えレトロウイルスを調製し、ＳＶ４０  Ｔ抗原（配列番号２参照）を発現させて不死化したラット正常繊維芽細胞（文献２参照）及びｈＴＥＲＴ（配列番号３参照）とＳＶ４０  Ｔ抗原を発現させて不死化したヒト正常繊維芽細胞（文献２参照）に感染させて活性型Ｓｒｃを発現する各々の細胞を樹立した。活性型Ｒａｓを発現する細胞の樹立及び組み換えレトロウイルスの産生ならびに感染方法については、文献２記載の方法に従った。
【００２８】
これらの細胞を用い、軟寒天培地コロニー形成能試験を行った結果を、図１に基づいて以下に説明する。なお、軟寒天培地コロニー形成能試験の手順は文献２の方法に従った。
【００２９】
まず、ラット繊維芽細胞においては、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現させて不死化したのみ（Ａ）では、軟寒天培地上にコロニー形成は認められず、ラット繊維芽細胞には癌化形質が誘導されなかった。一方、ＳＶ４０  Ｔ抗原とＲａｓを同時に発現させた場合（Ｃ）において、多数のコロニー形成が認められ、ラット繊維芽細胞に強い癌化形質が誘導されていることが確認された。これは、従来の知見と一致する結果である。
【００３０】
これに対して、ヒト繊維芽細胞においては、ｈＴＥＲＴとＳＶ４０  Ｔ抗原に加えＲａｓを発現させた場合においても、軟寒天培地上に形成されるコロニーは僅かであり、ヒト繊維芽細胞への癌化形質の誘導は軽微であった。なお、ｈＴＥＲＴとＳＶ４０  Ｔ抗原を発現させて不死化したのみの細胞（Ｂ）でも、癌化形質の誘導は極めて弱かった。
【００３１】
ところが、Ｒａｓに代えてＳｒｃを、ｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０  Ｔ抗原と同時発現させたヒト繊維芽細胞（Ｆ）では、多数のコロニー形成が確認された。このことは、ヒト繊維芽細胞において、ｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０  Ｔ抗原に加えて、Ｓｒｃを発現させることにより、顕著に癌化誘導が増強されることを示している。なお、ラット繊維芽細胞においても、Ｒａｓ（Ｂ）に比べて、Ｓｒｃ（Ｅ）を発現させた場合のほうが、コロニー形成は増加した。
【００３２】
以上、軟寒天培地コロニー形成能試験の結果をまとめると、ヒト繊維芽細胞においては、ｈＴＥＲＴとＳＶ４０  Ｔ抗原に加えＲａｓを発現させた場合（Ｄ）、癌化形質の誘導は軽微であるが、Ｒａｓに変えてＳｒｃを発現させることにより癌化形質の誘導を顕著に増強させることができた。
【実施例２】
【００３３】
実施例２では、ヒト由来の繊維芽細胞にｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０  Ｔ抗原が存在する状態でＲａｓ又はＳｒｃを発現させ場合に誘導される癌化形質に関し、造腫瘍能試験による検索を行なった。
【００３４】
造腫瘍能試験は、被検細胞をヌードマウスの皮下に移植して、腫瘍形成の有無、又は、形成される腫瘍の大きさを判定することより、該被検細胞の癌化形質の有無及び程度を判定する方法である。
【００３５】
実施例１で使用したヒト繊維芽細胞と同様の細胞を用い、造腫瘍能試験を行なった結果を、図２及び図３に基づいて説明する。なお、造腫瘍能試験の手順は文献２の方法に従った。
【００３６】
まず、図２において、ｈＴＥＲＴとＳＶ４０  Ｔ抗原を発現させて不死化したのみのヒト繊維芽細胞（Ａ）を移植した場合には、移植部位での腫瘍形成は認められなかった。これは、該ヒト繊維芽細胞には癌化形質が誘導されていないことを示している。
【００３７】
次に、ｈＴＥＲＴとＳＶ４０  Ｔ抗原に加えてＲａｓを発現させたヒト繊維芽細胞（Ｂ）を移植した場合には、移植部位に腫瘍の形成が認められた（図２中、符号ＴB参照）。しかし、形成された腫瘍は小型であり、該ヒト繊維芽細胞へ誘導された癌化形質が軽度であったことが分かる。
【００３８】
これに対して、Ｒａｓに代えてＳｒｃを、ｈＴＥＲＴとＳＶ４０  Ｔ抗原と同時発現させたヒト繊維芽細胞（Ｃ）では、移植部位に形成される腫瘍は顕著に大きく、該ヒト繊維芽細胞が強度の癌化形質を獲得していることが確認された。
【００３９】
図３は、移植部位に形成された腫瘍を移植後１週間、２週間、３週間において摘出し、その体積を測定してグラフに表示したものである。グラフ中、ＶA，ＶB，ＶCは、図２の（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）に対応する。それぞれ、ｈＴＥＲＴとＳＶ４０  Ｔ抗原を発現させて不死化したのみのヒト繊維芽細胞（ＶA）、ｈＴＥＲＴとＳＶ４０  Ｔ抗原に加えてＲａｓを発現させたヒト繊維芽細胞（ＶB）、Ｒａｓに代えてＳｒｃを、ｈＴＥＲＴとＳＶ４０  Ｔ抗原と同時発現させたヒト繊維芽細胞（Ｃ）が形成した腫瘍の体積をプロットしたものである。
【００４０】
Ｒａｓに代えてＳｒｃを発現させたヒト繊維芽細胞（Ｃ）では、ｈＴＥＲＴとＳＶ４０  Ｔ抗原に加えてＲａｓを発現させたヒト繊維芽細胞（Ｂ）の場合に比べて、移植部位に形成された腫瘍の成長速度が顕著に大きく、Ｓｒｃの発現により強い癌化形質が誘導されていることが確認された。
【００４１】
以上、造腫瘍能試験の結果をまとめると、ｈＴＥＲＴとＳＶ４０  Ｔ抗原に加えＳｒｃを発現させたヒト繊維芽細胞（Ｃ）は、ＲａｓをｈＴＥＲＴとＳＶ４０  Ｔ抗原と同時発現させた細胞（Ｂ）に比べ、強い癌化形質を有していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明に係る癌化誘導方法は、癌発症メカニズムの解明のため、様々なヒト正常細胞に癌化を誘導する際に利用することができ、特にＲａｓを介さない未知のシグナル伝達経路による細胞の癌化メカニズムの解明や、新たな創薬ターゲット分子の探索に有効に利用することができる。  
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明に係る癌化誘導法によりヒト由来細胞に誘導される癌化形質についての軟寒天培地コロニー形成能試験の結果を表す図である。
【図２】本発明に係る癌化誘導法によりヒト由来細胞に誘導される癌化形質についての造腫瘍能試験において、形成された腫瘍を示す図である。
【図３】造腫瘍能試験において、形成される腫瘍の経時的な大きさの変化を示すグラフである。
【図４】Ｓｒｃ及びＲａｓによる癌化形質発現のシグナル伝達経路を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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