(57)【要約】【課題】ヒトインフルエンザウイルスと区別して、トリインフルエンザウイルスを特異的、迅速かつ簡便に検出する方法及びこれに用いるイムノクロマトグラフ法用試験具を提供する。【解決手段】ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体を用いて、免疫学的測定法により、トリインフルエンザウイルスを検出する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体を用いて、免疫学的測定法により、試料中のトリインフルエンザウイルスを検出することを特徴とするトリインフルエンザウイルス検出方法。
【請求項２】
前記抗インフルエンザウイルス抗体が反応性を示すトリインフルエンザウイルス亜型のうち、少なくとも１つがトリインフルエンザウイルスＨ５亜型、Ｈ７亜型及びＨ９亜型からなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗インフルエンザウイルス抗体が、少なくともＨ３〜１５亜型のトリインフルエンザウイルスに反応性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗インフルエンザウイルス抗体が、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質に対する抗体である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗インフルエンザウイルス抗体が、トリインフルエンザウイルスの核タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端側から第４６位〜第１５９位の領域に存在するエピトープを認識する抗体である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗インフルエンザウイルス抗体が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８２２であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫学的測定法が、インフルエンザウイルスに対する第一及び第二の抗体を用い、標識された前記第一の抗体と固相に固定された前記第二の抗体とインフルエンザウイルスとを含む複合体を形成させる工程を含んでおり、且つ少なくとも前記第二の抗体が、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第一及び第二の抗体が、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫学的測定法が、イムノクロマトグラフ法である請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記イムノクロマトグラフ法が、前記第二の抗体が固定されたクロマト用膜担体において、当該第二の抗体と標識された前記第一の抗体とインフルエンザウイルスとを含む複合体を形成させる工程を含んでおり、且つ前記第二の抗体が、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
インフルエンザウイルスに対する第一及び第二の抗体を利用して試料中のトリインフルエンザウイルスを検出するためのイムノクロマトグラフ法用試験具であって、
前記試料を添加する試料添加部材と、
標識物質で標識された第一の抗体を担持する標識保持部材と、
第二の抗体が固定された判定領域を配置したクロマト用膜担体とを有し、
前記第一の抗体が、トリインフルエンザウイルスに反応性を示し、
前記第二の抗体が、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であることを特徴とするイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項１２】
前記標識物質が、不溶性粒状マーカーである請求項１１に記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項１３】
前記不溶性粒状マーカーが、着色合成高分子粒子又はコロイド状金属粒子である請求項１２に記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリインフルエンザウイルス検出方法及びトリインフルエンザウイルスを検出するためのイムノクロマトグラフ法用試験具に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、核タンパク質（ＮＰ）と膜タンパク質（Ｍ）の抗原性の違いによりＡ型、Ｂ型、及びＣ型に分類される。このうちのインフルエンザＡ型ウイルスは、さらにヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）のアミノ酸配列又は抗原性の違いにより、ＨＡはＨ１〜１５の１５種類、ＮＡはＮ１〜９の９種類に分類され、その組み合わせの数の亜型が存在する。この中で、ヒトを宿主としてヒトに感染する亜型は、Ｈ１〜３、Ｎ１〜２である。そして、インフルエンザＡ型ウイルス（Ｈ１〜３、Ｎ１〜２）及びインフルエンザＢ型ウイルス（以下、「ヒトインフルエンザウイルス」ということもある）が、毎年大流行を引き起こす、いわゆるインフルエンザ（ヒトインフルエンザ）の原因となるものである。
【０００３】
インフルエンザＡ型ウイルスはヒトだけでなく、多くの哺乳動物及び鳥類にも感染する。インフルエンザＡ型ウイルスが鳥類に感染して起きる鳥類の感染症が「トリインフルエンザ」であり、その原因となるトリインフルエンザウイルスには、Ｈ１〜１５、Ｎ１〜９のすべての亜型が確認されている。トリインフルエンザウイルスの多くは重篤な症状を示さないが、Ｈ５及びＨ７亜型のトリインフルエンザウイルスの中には、鳥に感染した場合に重篤な症状を示すものもある。これらは高病原性トリインフルエンザウイルスと呼ばれるものであり、ヒトへの感染の可能性が危惧されている。また、Ｈ９亜型のトリインフルエンザウイルスの中には、ウイルスに感染した家禽と接触したヒトへの感染、発病が報告されている例もあるため、ヒトでの感染の拡大が危惧されている。
【０００４】
現在、臨床ではインフルエンザウイルス抗原を迅速に検出するキットを用いてインフルエンザの診断が行われている。このような迅速診断キットとしては、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、イムノクロマトグラフ法を原理として用いたものが挙げられ、インフルエンザＡ型ウイルスのみを検出するもの（例えば、特許文献１参照）、インフルエンザＡ型ウイルスとインフルエンザＢ型ウイルスとをまとめて検出するもの、インフルエンザＡ型ウイルスとインフルエンザＢ型ウイルスとを別々に検出するものなどがある。
【０００５】
しかしながら、特許文献１の迅速診断キットは、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスであるかトリインフルエンザウイルスであるかを区別せず、インフルエンザＡ型ウイルスに属する広範囲のウイルスを検出するものである。従って、ヒトがインフルエンザの徴候を示した場合、それがトリインフルエンザウイルスによるものなのか、あるいはヒトインフルエンザウイルスによるものであるかを診断することができない。このためトリインフルエンザウイルスの迅速な診断法の開発が必要とされている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−６７９７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、ヒトインフルエンザウイルスと区別して、トリインフルエンザウイルスを特異的、迅速かつ簡便に検出する方法及びこれに用いるイムノクロマトグラフ法用試験具を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は上記目的を達成するために次の技術的手段を講じた。
トリインフルエンザウイルス検出方法に係る本発明は、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体を用いて、免疫学的測定法により、試料中のトリインフルエンザウイルスを検出することを特徴としている。
この検出方法によれば、ヒトインフルエンザウイルス（Ａ型（Ｈ１〜３亜型）及びＢ型）とは反応せず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応する抗インフルエンザウイルス抗体を用いているので、今まではヒト由来のインフルエンザウイルスであるかトリ由来のインフルエンザウイルスであるかを区別することなくインフルエンザＡ型ウイルスとしてしか検出できなかったのに比べ、ヒトインフルエンザウイルスとトリインフルエンザウイルスとを区別して、複数種の亜型のトリインフルエンザウイルスを検出することができる。
【０００９】
上記トリインフルエンザウイルス検出方法は、前記抗インフルエンザウイルス抗体が反応性を示すトリインフルエンザウイルス亜型のうち、少なくとも１つがトリインフルエンザウイルスＨ５亜型、Ｈ７亜型及びＨ９亜型からなる群から選ばれることが好ましい。トリインフルエンザウイルスＨ５亜型、Ｈ７亜型又はＨ９亜型は、過去にヒトへの感染が確認されたことがあるトリインフルエンザウイルスであり、ヒトでの感染拡大を引き起こす可能性があるからである。
上記トリインフルエンザウイルス検出方法において、前記抗インフルエンザウイルス抗体が、少なくともＨ３〜１５亜型のトリインフルエンザウイルスに反応性を示すものであってもよい。この場合、トリインフルエンザウイルスがＨ３〜１５亜型のものであれば広範囲に検出することができる。
【００１０】
上記トリインフルエンザウイルス検出方法において、前記抗インフルエンザウイルス抗体として、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質に対する抗体を用いることができ、また、トリインフルエンザウイルスの核タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端側から第４６位〜第１５９位の領域に存在するエピトープを認識する抗体を用いることもできる。
また、上記トリインフルエンザウイルス検出方法において、前記抗インフルエンザウイルス抗体が、受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０８２２であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１１】
さらに、上記トリインフルエンザウイルス検出方法は、前記免疫学的測定法が、インフルエンザウイルスに対する第一及び第二の抗体を用い、標識された前記第一の抗体と固相に固定された前記第二の抗体とインフルエンザウイルスとを含む複合体を形成させる工程を含んでおり、且つ少なくとも前記第二の抗体が、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であることが好ましい。
この場合、第一の抗体とトリインフルエンザウイルス（抗原）と第二の抗体とでいわゆるサンドイッチ構造を構築させることにより、試料中のトリインフルエンザウイルスを高感度で測定することができる。
【００１２】
前記第一及び第二の抗体が、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であることが好ましい。
この場合、第一及び第二の抗体の両方に前記抗インフルエンザウイルス抗体を使用することにより、感度及び特異性が上がり、検出精度が向上する。
【００１３】
前記免疫学的測定法が、イムノクロマトグラフ法であることが好ましい。操作が簡便で、特別な装置が不要であり、迅速に測定を行うことができるからである。
前記イムノクロマトグラフ法が、前記第二の抗体が固定されたクロマト用膜担体において、当該第二の抗体と標識された前記第一の抗体とインフルエンザウイルスとを含む複合体を形成させる工程を含んでおり、且つ前記第二の抗体が、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であることが好ましい。この場合、クロマト用膜担体において、第一抗体と抗原と第二抗体との複合体（サンドイッチ構造）が形成されるため、第一抗体の標識を認識することによりトリインフルエンザウイルスを検出することができる。
【００１４】
イムノクロマトグラフ法用試験具に係る本発明は、インフルエンザウイルスに対する第一及び第二の抗体を利用して試料中のインフルエンザウイルスを検出するためのイムノクロマトグラフ法用試験具であって、前記試料を添加する試料添加部材と、標識物質で標識された第一の抗体を担持する標識保持部材と、第二の抗体が固定された判定領域を配置したクロマト用膜担体とを有し、前記第一の抗体が、トリインフルエンザウイルスに反応性を示し、前記第二の抗体が、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であることを特徴としている。
このイムノクロマトグラフ法用試験具を使用すれば、ヒトインフルエンザウイルス（Ａ型（Ｈ１〜３亜型）及びＢ型）とは反応せず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応する抗インフルエンザウイルス抗体が用いられているので、ヒトがインフルエンザに感染した場合、その原因となるインフルエンザウイルスがトリ由来のものであるか否かを確認することができる。
【００１５】
上記イムノクロマトグラフ法用試験具において、前記標識物質が、不溶性粒状マーカーであることが好ましい。また、その中でも特に、着色合成高分子粒子又はコロイド状金属粒子であることが好ましい。これらを用いれは、判定領域での色の変化を肉眼で観察することにより、迅速且つ簡便に判定することが可能となる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ヒトインフルエンザウイルスとトリインフルエンザウイルスとを区別して、トリインフルエンザウイルスを特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
トリインフルエンザウイルス検出方法は、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体を用いて、免疫学的測定法により、試料中のトリインフルエンザウイルスを検出する方法である。
【００１８】
トリインフルエンザウイルス検出方法に用いられる抗体は、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体である。この抗インフルエンザウイルス抗体は、ヒトインフルエンザウイルス（Ａ型（Ｈ１〜３亜型）及びＢ型）とは反応せず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応するので、今までヒト由来かトリ由来かを区別することなくインフルエンザＡ型ウイルスを検出していたものを、ヒト由来かトリ由来かを区別してトリ由来のインフルエンザＡ型ウイルスを検出することができる。
【００１９】
抗インフルエンザウイルス抗体が反応性を示すトリインフルエンザウイルス亜型のうち、少なくとも１つがトリインフルエンザウイルスＨ５亜型、Ｈ７亜型及びＨ９亜型からなる群から選ばれることが好ましい。トリインフルエンザウイルスＨ５亜型、Ｈ７亜型又はＨ９亜型は、過去にヒトへの感染が確認されたことがあるトリインフルエンザウイルスであり、ヒトでの感染拡大を引き起こす可能性があるからである。
抗インフルエンザウイルス抗体が、少なくともＨ３〜１５亜型のトリインフルエンザウイルスに反応性を示すものであってもよい。この場合、トリインフルエンザウイルスがＨ３〜１５亜型のものであれば検出することができる。
抗インフルエンザウイルス抗体が、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質に対する抗体であることが好ましい。また、抗インフルエンザウイルス抗体として、トリインフルエンザウイルスの核タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端側から第４６位〜第１５９位の領域に存在するエピトープを認識する抗体を用いることも好ましい。
【００２０】
抗インフルエンザウイルス抗体の具体例として、ハイブリドーマＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ４Ｅ３により産生されるモノクローナル抗体（以下、「４Ｅ３」という）が挙げられる。当該ハイブリドーマは、大阪府立公衆衛生研究所により独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されたものであり、平成１８年２月２４日付で受領され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８２２が付与されている。このハイブリドーマは、マウス骨髄腫細胞由来株とマウスリンパ球との融合細胞であり、インフルエンザＡ型ウイルスＨ３〜１５亜型の核タンパク質（ＮＰ）に結合するモノクローナル抗体（４Ｅ３）を産生する。４Ｅ３は、例えばハイブリドーマＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ４Ｅ３を１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．２５％  ＮａＨＣＯ３を含むＲＰＭＩ  １６４０培地（ＳＩＧＭＡ  Ｒ６５４０）中、３７℃、５％  ＣＯ２にて培養し、産生された４Ｅ３を公知の方法にて回収及び精製することにより、製造することができる。
このモノクローナル抗体は、そのフラグメント、及びそのキメラ抗体及びヒト化抗体等の改変抗体並びに変異抗体を含む。これらのフラグメント、改変抗体又は変異抗体もまた、元の抗体と同様のトリインフルエンザウイルスの複数の亜型に対する特異性を有するものである。これらは、当業者により既知の手段又は方法により製造され得る。
【００２１】
免疫学的測定法（イムノアッセイ）は、抗体との結合能力を利用して物質を定量的に測定する方法であり、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、免疫放射定量測定（ＩＲＭＡ）法、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）法、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、均一系酵素免疫測定法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）法、免疫蛍光分析（ＩＦＭＡ）法、蛍光偏光法、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）法、化学発光酵素イムノアッセイ（ＣＬＥＩＡ）法、イムノクトロマトグラフ法を用いることができる。免疫学的測定法において用いられる上記抗インフルエンザウイルス抗体は、１種類でも２種類以上であってもよい。
【００２２】
試料は、インフルエンザウイルスが含まれる可能性があるものであればよく、例えば被疑患者からの涙、目脂、喀痰、唾液及び大便等の生体試料を、生理食塩水、リン酸緩衝液等の溶媒と混合したもの、被疑患者の患部（鼻腔、咽頭等）を清拭したガーゼ、スワブ等から前記の溶媒で洗浄又は抽出したもの、又は被疑患者の患部の前記溶媒による洗浄液であってもよい。
【００２３】
免疫学的測定法の中でも、インフルエンザウイルスに対する第一及び第二の抗体を用い、標識された前記第一の抗体と固相に固定された前記第二の抗体とインフルエンザウイルスとを含む複合体を形成させる工程を含む、サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法を用いることが好ましい。
ここで、少なくとも前記第二の抗体として、上述のヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体が使用されるが、前記第一及び第二の抗体が、前記抗インフルエンザウイルス抗体であることが好ましい。第一及び第二の抗体の両方に前記抗インフルエンザウイルス抗体を使用することにより、感度及び特異性が上がり、検出精度が向上する。
【００２４】
サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法には、ＩＲＭＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＩＦＭＡ法、イムノクロマトグラフ法等が含まれる。
第一の抗体に結合させる標識物質としては、放射性同位元素（１２５Ｉ、１４Ｃ、３２Ｐ等）、酵素（β−ガラクトシターゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光物質（フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体等）、不溶性粒状マーカー等が挙げられる。
第二の抗体を固定する固相の素材又は形状は、測定法に応じて適宜選択される。固相の素材としては、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリスチレン、スチレンン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレンン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン等の合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体、アガロースゲル、セルロース等の多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーン等の無機高分子化合物が挙げられる。これらは、さらにアミノ基、アミノアシル基、カルキシル基、アシル基、水酸基、ニトロ基等の官能基が導入されたものであってもよい。固相の形状としては、例えば、マイクロタイタープレート（ＥＬＩＳＡプレート）、ディスク等の平板状、ビーズ等の粒子状、試験管、チューブ等の管状、繊維状、膜状にすることができる。
【００２５】
サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法の中では、操作が簡便で、特別な装置が不要であり、迅速に測定を行うことができることから、イムノクトマトグラフ法が好ましい。
前記イムノクロマトグラフ法は、前記第二の抗体が固定されたクロマト用膜担体において、当該第二の抗体と標識された前記第一の抗体とインフルエンザウイルスとを含む複合体を形成させる工程を含んでおり、且つ前記第二の抗体が、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であることが好ましい。この場合、クロマト用膜担体において、第一抗体と抗原と第二抗体との複合体（サンドイッチ構造）が形成されるため、第一抗体の標識を認識することによりトリインフルエンザウイルスを検出することができる。
イムノクロマトグラフ法においても、上述の標識物質を使用することができるが、その中でも色を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できることから、不溶性粒状マーカーが好ましく用いられる。不溶性粒状マーカーは、イムノクロマトグラフ法で標識物質として使用されている粒子のうち、それ自身が色を呈する粒子のことであり、例えば、金コロイド、白金コロイド等のコロイド状金属粒子、顔料等で着色されたポリスチレンラテックス等の合成高分子粒子（着色合成高分子粒子）、重合染色粒子等が挙げられる。
【００２６】
図１は、本発明の１つの実施形態に係るイムノクロマトグラフ法用試験具の断面図である。このイムノクロマトグラフ法用試験具１は、表面に粘着層を有するプラスチック板からなる基材２上に、レーヨンの不織布からなる試料添加部材３と、ガラス繊維の不織布からなる標識保持部材４と、ニトロセルロースの多孔体からなるクロマト用膜担体５と、セルロースの不織布からなる吸収部材６とを備える。
【００２７】
基材２は、試料添加部材３や標識保持部材４等の上記部材を適切に配置するためのものであり、プラスチック以外にも紙、ガラス等の材質のものを用いることができる。
試料添加部材３には試料が添加される。試料としては上記免疫学的測定法で用いられる試料と同様のものを使用することができるが、鼻腔吸引液、鼻腔拭い液又は咽頭拭い液が好ましい。試料は、緩衝液等の適当な溶媒で希釈して添加してもよい。試料添加部材３としては、レーヨンの不織布以外にも、例えば、多孔質ポリエチレン、多孔質ポリプロピレン等の多孔質合成樹脂のシート又はフィルム、濾紙、綿布等のセルロース製の紙、織布又は不織布、ガラス繊維の不織布を用いることができる。
【００２８】
標識保持部材４は、試料添加部材３に接触して配置され、標識物質で標識された第一の抗体が担持されている。この第一の抗体は、試料中の測定対象と抗原抗体反応するものであり、ここではトリインフルエンザに反応性を示す抗体が使用される。トリインフルエンザに反応性を示す抗体であれば、１種類又は２種類以上を使用することができる。第一の抗体として、好ましくは４Ｅ３が使用される。また、４Ｅ３と他のトリインフルエンザに反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体を組み合わせて使用することもできる。
第一の抗体を標識する標識物質としては、上記サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法及びイムノクロマトグラフ法で用いられる標識物質と同様のものを使用することができる。その中でも色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できることから不溶性粒状マーカーが好ましく、その中でも特に着色合成高分子粒子又はコロイド状金属粒子が好ましい。
当該標識保持部材４は、標識された第一の抗体の懸濁液をガラス繊維の不織布に含浸せしめ、これを乾燥させること等によって作製することができる。なお、標識保持部材４としてガラス繊維の不織布が用いられているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類の布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布等も使用することができる。
【００２９】
クロマト用膜担体５は、標識保持部材４と間隔を介して配置され、測定対象と抗原抗体反応する第二の抗体が固定された判定領域５Ａを有する。第二の抗体は、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であり、好ましくは４Ｅ３である。
クロマト用膜担体５として、ニトロセルロースの多孔体を用いているが、試料に含まれる測定対象をクロマト展開可能で、かつ、上記判定領域５Ａを形成する第二の抗体を固定可能なものであればいかなるものであってもよく、他のセルロース（例えば、セルロースアセテート）の膜、ナイロン（例えば、カルボキシル基、アルキル基等を置換基として有してもよいアミノ基が導入された修飾ナイロン）の膜、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜等を使用することもできる。
吸収部材６は、クロマト用膜担体５と接触するように配置されており、過剰試料を吸収するためのものである。吸収部材６は、液体を速やかに吸収し、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、ポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を使用することができる。そして、試料添加部材３の一部及び吸収部材６の表面は、図１に示されるように透明シート７で覆われている。
【００３０】
本発明のイムノクロマトグラフ法用試験具１は、例えば以下のように作製することができる。まず、クロマト用膜担体５を基材２の中程に貼着し、当該クロマト用膜担体５のクロマト展開の開始点側（すなわち、図１の左側、以下「上流側」という）の末端と接触しないように間隔をあけて標識保持部材４を基材２の上流側に貼着する。そして、試料添加部材３の上流側部分を基材２の最上流側部分に貼着し、それと同時に当該試料添加部材３のクロマト展開の終了点側（すなわち、図１の右側、以下「下流側」という）部分を標識保持部材４及びクロマト用膜担体５の上流側部分の上面に載置するとともに、標識保持部材４とクロマト用膜担体５との間にある基材２に貼着する。また、クロマト用膜担体５の下流側部分の上面に吸収部材６の上流側部分を載置するとともに、当該吸収部材６の下流側部分を基材２の最下流側部分に貼着する。そして、試料添加部材３の下流側部分及び吸収部材６の表面を透明シート７で覆う。
【００３１】
かくして、試料を必要に応じて適当な溶媒と混合してクロマト展開可能な混合液とし、当該混合液に前記イムノクロマトグラフ法用試験具１の上流（試料添加部材３）側を浸すと、当該混合液は、試料添加部材３を通過して標識保持部材４において、標識された第一の抗体と混合される。
その際、前記混合液中にトリインフルエンザウイルス（抗原）が存在すれば、抗原抗体反応により標識保持部材４と第一の抗体とが結合して複合体が形成される。
この複合体は、クロマト用膜担体５中をクロマト展開されて判定領域５Ａに到達し、そこに固定された第二の抗体と抗原抗体反応して捕捉される。
このとき、標識物質として青色ラテックス粒子等の着色合成高分子粒子が使用されていれば、当該粒子の集積により判定領域５Ａが青色に着色するので、直ちにトリインフルエンザウイルスの存在を目視により確認することができる。
【００３２】
なお、クロマト用膜担体５は、判定領域を１つだけでなく２つ以上備えることも可能である。また、クロマト用膜担体５は、対照部を備えていてもよい。対照部を備える場合、標識保持部材４に、例えば、赤色ラテックス粒子で標識されたアビジンを保持し、クロマト用膜担体５の対照部に、アビジンと特異的に結合するビオチンを固定すればよい。また、アビジンとビオチンの組み合わせの代わりに、例えば、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）等のハプテンとそのハプテンを認識する抗体とを組み合わせて使用することができる。このとき、ハプテンとしては、測定に使用する試料中に存在しないハプテンを使用することが好ましい。
【００３３】
また、本発明のトリインフスエンザウイルス検出方法に用いられる抗インフルエンザウイルス抗体が反応性を示す亜型は、Ｈ１５亜型までに限定されるわけではなく、現在インフルエンザＡ型ウイルスの亜型として確認されているＨ１６亜型、さらには将来確認されるであろうＨ１７以降の亜型についても含まれる。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例、比較例及び試験例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例及び比較例のイムノクロマトグラフ用試験具に使用する抗体は、先に説明したハイブリドーマ（特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８２２）により産生されるモノクローナル抗体４Ｅ３、およびハイブリドーマＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １Ｃ１０により産生されるモノクローナル抗体（以下、「１Ｃ１０」という）である。当該ハイブリドーマは、大阪府立公衆衛生研究所により独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されたものであり、平成１８年２月２４日付で受領され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８２１が付与されている。
ここで、インフルエンザウイルスが感染したＭＤＣＫ細胞を用いて、酵素抗体法によりインフルエンザウイルスに対する４Ｅ３又は１Ｃ１０の反応性を調べた。９６ウェルマイクロプレートのウェルにおいてインフルエンザウイルスとＭＤＣＫ細胞を１２時間インキュベーションし、ＭＤＣＫ細胞にインフルエンザウイルスを感染させた。次に、感染したＭＤＣＫ細胞をエタノールで固定し、４Ｅ３を生産するハイブリドーマを培養して得られる上清又は１Ｃ１０を生産するハイブリドーマを培養して得られる上清と３０分間室温にてインキュベーションした。インキュベーション後、ＰＢＳで洗浄し、次にペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体を３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄し、ジアミノベンチジンを添加して抗マウス免疫グロブリン抗体を視覚化した。この方法では、ＭＤＣＫ細胞に感染させたインフルエンザウイルスと４Ｅ３又は１Ｃ１０の抗体とが結合した場合には抗マウス免疫グロブリン抗体の標識が検出されるが、結合しなかった場合には標識が検出されない。なお、インフルエンザウイルスとしては、表１に示したようにヒトから分離したインフルエンザＡ型ウイルス（１４種類）、トリから分離したインフルエンザＡ型ウイルス（１６種類）、インフルエンザＢ型ウイルス（５種類）を使用した。
その結果を表１に示す。表１において、ＭＤＣＫ細胞に感染させたインフルエンザウイルスと抗体との結合が認められたものを（＋）、結合が認められなかったものを（−）とした。
【００３５】
【表１】
2008083024.tif 000003
【００３６】
表１より、４Ｅ３はトリから分離されたインフルエンザＡ型ウイルスＨ３〜１５亜型に反応性を示すことが確認された。また、１Ｃ１０はトリから分離されたインフルエンザＡ型ウイルスＨ５亜型のみに反応性を示すことが確認された。
【００３７】
実施例１
標識物質で標識される第一の抗体及びクロマト用膜担体５に固定される第二の抗体として上述した４Ｅ３を使用し、以下の方法に従ってイムノクロマトグラフ用試験具１（以下、試験具という）を作製した。
まず、図１に示すように、ニトロセルロースメンブレンからなるクロマト用膜担体５の判定領域５Ａに、抗体塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した４Ｅ３を塗布し、５０℃で３０分間乾燥させた。
乾燥後のクロマト用膜担体５をブロッキング液（ＢＳＡを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に浸漬し、ブロッキングを行った。その後、洗浄液（ＳＤＳを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で洗浄し、４０℃で１２０分間乾燥させ、クロマト用膜担体５を得た。
【００３８】
次に、４Ｅ３を青色着色ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．３μｍ）に感作し、分散用緩衝液（ＢＳＡ及びシュークロースを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に懸濁し、４Ｅ３感作ラテックス粒子を作製した。感作する際の抗体の濃度は、１％ラテックス粒子１ｍＬに２００μｇ  ＩｇＧとなる濃度であった。この４Ｅ３感作ラテックス粒子を、ガラス繊維製パッドに添加後、真空乾燥機で乾燥させ、標識保持部材４を得た。
そして、このクロマト用膜担体５及び標識保持部材４を用いて、常法により、実施例１の試験具を得た。
【００３９】
試験例１
実施例１の試験具を用い、ヒトから分離されたインフルエンザウイルス（ヒトインフルエンザウイルス）に対する反応性を検討した。
（１）  本試験例では、下記の表２に示した１９種類のヒトインフルエンザウイルスを鶏卵培養し、得られたウイルスを生理食塩水で希釈したものをウイルス液として用いた。ウイルス液中のウイルス濃度はＨＡ価又はＦＦＵで表される。各ウイルス液中のウイルス濃度は、表２の通りである。ＨＡ価は、インフルエンザのもつ赤血球凝集能を利用したインフルエンザ定量法（赤血球凝集法）の単位で、感染性のあるウイルスの活性を示す基準であり、ＦＦＵ(focus forming unit)は、細胞に感染したウイルスを免疫染色することによって確認できるウイルス感染細胞数から算出されたウイルス数を表す単位である。なお、表２中のＨＡ価又はＦＦＵにおいて（−）と示されているのは、ＨＡ価又はＦＦＵが未測定であることを表している。
（２）  次に、検体抽出試薬（０．３ｗ／ｖ％  ＮＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）を含むリン酸緩衝液ｐＨ７．３）８００μＬに、所定濃度のウイルス液１５０μＬを加えて混合し、試料とした。
（３）  上記（２）で調製した試料約２００μＬをガラス試験管に滴下し、そこに上記方法で作製した試験具１の上流（試料添加部材３）側を入れて放置し、約１０分後に判定領域５Ａにおける呈色を肉眼で判定した。判定は、呈色が認められたものを（＋）、呈色が認められなかったものを（−）として評価した。これらの結果を表２に示す。
【００４０】
なお、比較例として、第一の抗体及び第二の抗体として上記１Ｃ１０を用い、それ以外は実施例１と同様にして試験具を作製した（比較例１）。また、第一の抗体として４Ｅ３、第二の抗体として１Ｃ１０を用い、それ以外は実施例１と同様にして試験具を作製した（比較例２）。
また、市販されているヒト用インフルエンザ検査キットであるポクテム  インフルエンザＡ／Ｂ（シスメックス）を比較例３とした。比較例１〜２については上記試験例１と同様にして評価を行った。比較例３については、キットに付属するマニュアルに従って評価を行った。これらの結果を表２に併せて示す。
【００４１】
【表２】
2008083024.tif 000004
【００４２】
表２から、実施例１、比較例１及び比較例２の試験具は、ヒトから分離されたインフルエンザウイルス（ヒトインフルエンザウイルス）とは全く反応しないことがわかった。これに対して、市販のヒト用インフルエンザ検査キットである比較例３は、試験したすべてのヒトインフルエンザウイルスに対して反応性を示した。
【００４３】
試験例２
次に、実施例１、比較例１〜３の試験具が、トリから分離されたインフルエンザウイルス（トリインフルエンザウイルス）と反応するかを検討した。
本試験例では、下記の表３に示した１７種類のヒトインフルエンザウイルスを鶏卵培養し、得られたウイルスを生理食塩水で希釈したものをウイルス液として用いた。各ウイルス液中のウイルス濃度は、表３の通りである。なお、表３中のＨＡ価又はＦＦＵにおいて（−）と示されているのは、ＨＡ価又はＦＦＵが未測定であることを表している。
【００４４】
【表３】
2008083024.tif 000005
【００４５】
表３から、実施例１の試験具は、試験したトリインフルエンザウイルス（Ｈ３〜１５亜型）すべてに対して反応性を示すことがわかった。これに対して、比較例１及び２の試験具は、トリインフルエンザウイルスＨ５亜型としか反応しなかった。比較例３の試験具（市販のヒト用インフルエンザ検査キット）は、試験したすべてのトリインフルエンザウイルスに対して反応性を示した。
試験例１及び試験例２の結果から、実施例１及び比較例１〜２の試験具は、ヒトインフルエンザウイルス（Ａ型（Ｈ１〜３亜型）及びＢ型）とは反応せず、トリインフルエンザウイルスに反応する抗インフルエンザウイルス抗体（４Ｅ３又は１Ｃ１０）を第二の抗体として用いているので、今までの試験具（比較例３）がヒト由来のインフルエンザウイルスであるかトリ由来のインフルエンザウイルスであるかを区別することなくインフルエンザＡ型ウイルスとして検出していたのに対して、ヒト由来かトリ由来かを区別してトリ由来のインフルエンザＡ型ウイルスを検出することができる。さらに、比較例１〜２の試験具ではトリインフルエンザウイルスＨ５亜型しか検出できないのに対し、実施例１の試験具に使用されている４Ｅ３はトリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応するので、トリインフルエンザウイルスの複数種の亜型を検出することができる。すなわち、実施例１の試験具を用いることで、トリインフルエンザウイルスの複数種の亜型を検出することが可能になる。
【００４６】
試験例３
実施例１、比較例１〜２の試験具を用い、２種類のトリインフルエンザウイルスＨ５亜型で希釈試験を行い、各試験具の感度を調べた。
本試験例では、トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ２（Ａ／Ｄｕｃｋ／ＨＫ／３４２／７８）及びＨ５Ｎ９（Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／７７３２／６６）を生理食塩水で希釈したものをウイルス液として用いた。具体的には、トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ２のウイルス液は、まず１．１×１０７ＦＦＵ／ｍＬのウイルス濃度となるウイルス液を調製し、さらにこれを段階希釈して下記の表４に記載のウイルス濃度となるウイルス液を調製した。トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ９のウイルス液は、まず１．３７５×１０６ＦＦＵ／ｍＬのウイルス濃度となるウイルス液を調製し、さらにこれを段階希釈して下記の表５に記載のウイルス濃度となるウイルス液を調製した。このウイルス液を用いて、上記試験例１と同様に試験を行った。トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ２の結果を表４に、トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ９の結果を表５に示す。
【００４７】
【表４】
2008083024.tif 000006
【００４８】
【表５】
2008083024.tif 000007
【００４９】
表４及び表５より、第一及び第二の抗体として４Ｅ３を使用した実施例１の試験具は、第二の抗体として１Ｃ１０を使用した比較例１及び２の試験具に比べて、トリインフルエンザウイルスＨ５亜型を感度よく検出できることがわかった。
【００５０】
試験例４
実施例１の試験具を用い、ヒトに感染したトリインフルエンザウイルスに対する反応性を検討した。
本試験例では、下記の表６に示した１０種類のトリインフルエンザウイルスに感染したヒトから咽頭拭い液を採取し、ＭＤＣＫ細胞に接種して４〜５日培養した。培養後、得られた培養液の上清を回収した。これをウイルス液として用い、上記試験例１と同様に試験を行った。また、比較例として、上記比較例３を用い、キットに付属するマニュアルに従って評価を行った。これらの結果を表６に併せて示す。
【００５１】
【表６】
2008083024.tif 000008
【００５２】
表６より、実施例１の試験具は、ヒトに感染したトリインフルエンザウイルスを検出することができることがわかった。
【００５３】
次に、第一の抗体として、２種類以上の抗インフルエンザ抗体を使用することが可能であるかを検討すべく、実施例２の試験具を作製した。
実施例２
第一の抗体として、４Ｅ３と１Ｃ１０とを等量ずつ使用し、それ以外は上記実施例１と同様にして、実施例２の試験具を得た。
【００５４】
試験例５
実施例１及び実施例２の試験具を用い、試験例３とは異なるトリインフルエンザウイルスＨ５亜型に対する試験具の感度を調べた。
本試験例では、トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ３（Ａ／Ｄｕｃｋ／ＨＫ／８２０／８０）を用い、生理食塩水で希釈してウイルス濃度３．４×１０６ＦＦＵ／ｍＬとした以外は、試験例３と同様に試験を行った。その結果を表８に示す。なお、各バンドは、青色の呈色度合いに応じて、「−」、「Ｗ」、「１＋」、「２＋」及び「３＋」の５段階に区別して判定した。「−」、「Ｗ」、「１＋」、「２＋」及び「３＋」は、出現したバンドを、ＴＲＳ３０００  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｔｒｉｐ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＤｏｔ社）で測定した場合に得られる測定値に基づいて、表７に記載の基準で設定した。表中のＲＯＤ値とは、バンドの測定値からニトロセルロースメンブレンの濃淡を測定した値をバックグラウンドとして差し引いた値である。ちなみに、青色のバンドを肉眼で確認することができるのは、「Ｗ」、「１＋」、「２＋」及び「３＋」である。
【００５５】
【表７】
2008083024.tif 000009
【００５６】
【表８】
2008083024.tif 000010
【００５７】
表８から、実施例１及び実施例２の試験具は、同程度の感度でトリインフルエンザウイルスを検出することができることがわかった。このことから、第一の抗体として４Ｅ３とトリインフルエンザウイルスに反応性を示す他の抗インフルエンザウイルス抗体との組み合わせで使用し、第二の抗体として４Ｅ３を使用した試験具でも、トリインフルエンザウイルスを検出することができることがわかる。なお、感度は実施例１の試験具の方がやや良い。
【００５８】
試験例６
免疫沈降法により、上記試験例で使用したモノクローナル抗体４Ｅ３及び１Ｃ１０が認識する抗原を特定した。
ウイルスとして、インフルエンザウイルスＨ３亜型であるＡ／Ｋｉｔａｋｙｕｓｙｕ／１５９／９３（Ｈ３Ｎ２）、及びインフルエンザウイルスＨ５亜型であるＡ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／７７３２／６６（Ｈ５Ｎ９）を使用した。
抗体として、上記４Ｅ３及び１Ｃ１０、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を認識する抗体である７３０４（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）、インフルエンザＢ型ウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を認識する抗体である４１０２７（Ｃａｐｒｉｃｏｎ社）、及びインフルエンザＡ型ウイルスＨ３亜型のヘマグルチニン（ＨＡ）を認識する抗体であるＦ４９（タカラバイオ（株））を使用した。
【００５９】
１．ウイルス感染
６ｗｅｌｌにコンフルエントになったＭＣＤＫ細胞に上記ウイルスを１時間感染させた。上清を除去し、分離用培地を１ｍＬ加えて一昼夜培養した。スクレーパーで細胞をチューブに回収し、遠心後、Ｃｏｌｄ  ＰＢＳ（−）で洗浄した。溶解液を加えてソニケーションして細胞を破砕し、そのままドライアイスで保存した。
２．標識及び免疫沈降
Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用し、このキット付属のマニュアルに従って標識及び免疫沈降を行った。ここでは、まずウイルスのタンパク質をビオチン化する。そして、ビオチン化ウイルスタンパク質、抗体及びプロテインＡ−セファロースを混合して、プロテインＡ−セファロース上に抗体と当該抗体に特異的に結合するビオチン化ウイルスタンパク質との複合体を形成させる。
３．電気泳動
上記セファロースに５０μＬの電気泳動バッファーを添加し、１００℃で３分間ボイルした。１０μＬずつサンプルをグラジェントゲル（５−２０％）にアプライし、３０ｍＡで９０分間電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した。電気泳動後のゲル中のタンパク質を、２５０ｍＡ、２時間でＰＶＤＦメンブレンに転写した。その後、５％スキムミルク・ＰＢＳ（−）でブロッキングし、メンブレンを３回洗浄した。１：１０００希釈したストレプトアビジン−ＰＯＤ溶液で３０分間反応させてメンブレンを洗浄し、４−クロロナフトール液で検出した。その結果を図２に示す。
【００６０】
図２から、４Ｅ３のＨ５ウイルスのところで出現したバンドが、７３０４（Ａ型インフルエンザの核タンパク質（ＮＰ）を認識する抗体）で出現したバンドと同じ位置であることから、４Ｅ３がトリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ９）の核タンパク質（ＮＰ）を認識する抗体であることが確認された。また、１Ｃ１０のＨ５ウイルスのところで出現したバンドが、Ｆ４９で出現したバンドと同じ位置であることから、１Ｃ１０がトリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ９）のヘマグルチニン（ＨＡ）を認識する抗体であることが確認された。
【００６１】
試験例７
上記試験例で使用したモノクローナル抗体である４Ｅ３が認識するエピトープを特定することを目的として以下のような実験を行った。
【００６２】
（１）遺伝子組換え核タンパク質（ＮＰ）の作製
大阪府立公衆衛生研究所から入手したヒトインフルエンザウイルス株（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４）を用いて、ヒトインフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させ、感染したＭＤＣＫ細胞を培養した。得られた培養上清からＱＩＡＧＥＮ  Ｍａｇｔｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ６ＧＣ（ＱＩＡＧＥＮ）及びＥＺ  Ｖｉｒｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ試薬（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてウイルス核酸を抽出した。そして、以下のプライマー（配列番号１及び２）を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により、抽出したウイルス核酸からヒトインフルエンザウイルスＮＰをコードする領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。
フォワードプライマー：5’-ATGGCGTCCCAAGGCACCAA-3’（配列番号１）
リバースプライマー：5’-TTAATTGTCGTACTCCTCTGCA-3’（配列番号２）
上記で増幅したヒトインフルエンザウイルスＮＰをコードする領域を含むＤＮＡ断片に、制限酵素（ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ）により切断される部位及び６つのヒスチジン残基をコードする配列を付加するために、以下のようなプライマー（配列番号３及び４）を用いてＰＣＲを行った。
フォワードプライマー：5’-ATGGTACCATGGCGTCCCAAGGCACCAA-3’（配列番号３）
リバースプライマー：5’-TAGAATTCTAGTGATGGTGATGGTGATGATTGTCGTACTCCTCTGCATT-3’（配列番号４）
ゆえに、本試験例で得られる遺伝子組換えＮＰはＣ末端に６個のヒスチジン残基が付加される。
【００６３】
大阪府立公衆衛生研究所から入手したトリインフルエンザウイルス株（Ｈ５Ｎ９／Ｏｎｔａｒｉｏ／７７３２／１９６６）感染細胞を培養し、得られた培養上清から上記と同様の方法でウイルス核酸を抽出した。そして、以下のプライマー（配列番号５及び６）を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により、抽出したウイルス核酸からトリインフルエンザウイルスＮＰをコードする領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。
フォワードプライマー：5’-ATGGCGTCTCAAGGCACCAAAC-3’（配列番号５）
リバースプライマー：5’-TTAATTGTCATATTCCTCTGCATTG-3’（配列番号６）
上記で増幅したトリインフルエンザウイルスＮＰをコードする領域を含むＤＮＡ断片に、制限酵素（ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ）により切断される部位及び６つのヒスチジン残基をコードする配列を付加するために、以下のようなプライマー（配列番号７及び８）を用いてＰＣＲを行った。
フォワードプライマー：5’-ATGGTACCATGGCGTCTCAAGGCACCAAAC-3’（配列番号７）
リバースプライマー：5’-TAGAATTCTAGTGATGGTGATGGTGATGATTGTCATATTCCTCTGCATTGTC-3’（配列番号８）
得られた各ＤＮＡ断片（制限酵素切断部位及び６つのヒスチジン残基をコードする配列を含む）を、真核細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ部位に組込み、野生型ヒトインフルエンザＮＰ発現ベクター及び野生型トリインフルエンザＮＰ発現ベクターを作製した。
【００６４】
次に、野生型ヒトインフルエンザＮＰ発現ベクターを制限酵素（ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ）で切断し、得られた断片を電気泳動した後、ヒトインフルエンザＮＰのＮ末端側１５９アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、並びに、Ｃ末端側３３９アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターとをコードする断片をそれぞれＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
同様にして、野生型トリインフルエンザＮＰ発現ベクターを制限酵素（ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ）処理し、得られた断片を電気泳動した後、トリインフルエンザＮＰのＮ末端側１５９アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、並びに、Ｃ末端側３３９アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターとをコードする断片をそれぞれ精製した。
【００６５】
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、トリインフルエンザＮＰのＮ末端側１５９アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、並びに、ヒトインフルエンザＮＰのＣ末端側３３９アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターとをコードする断片をライゲーションすることにより、キメラＮＰ１の発現ベクターを構築した。
同様にして、ヒトインフルエンザＮＰのＮ末端側１５９アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、並びに、トリインフルエンザＮＰのＣ末端側３３９アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターとをコードする断片をライゲーションすることにより、キメラＮＰ２の発現ベクターを構築した。
【００６６】
次に、野生型ヒトインフルエンザＮＰ発現ベクターを制限酵素（ＫｐｎＩおよびＡｐａＬＩ）で切断し、上記と同様にして、ヒトインフルエンザＮＰのＮ末端側４５アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、並びに、Ｃ末端側４５３アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターをコードする断片を精製した。
さらに、野生型トリインフルエンザＮＰ発現ベクターを制限酵素（ＫｐｎＩおよびＡｐａＬＩ）で切断し、上記と同様にして、トリインフルエンザＮＰのＮ末端側４５アミノ酸をコードするＤＮＡ断片とＣ末端側４５３アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターをコードする断片を精製した。
【００６７】
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、トリインフルエンザＮＰのＮ末端側４５アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、並びに、ヒトインフルエンザＮＰのＣ末端側４５３アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターをコードする断片をライゲーションすることにより、キメラＮＰ３の発現ベクターを構築した。
同様にして、ヒトインフルエンザＮＰのＮ末端側４５アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、並びに、トリインフルエンザＮＰのＣ末端側４５３アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターをコードする断片をライゲーションすることにより、キメラＮＰ４の発現ベクターを構築した。
【００６８】
上記のようにして作製した野生型ヒトインフルエンザＮＰ発現ベクター、野生型トリインフルエンザＮＰ発現ベクター、キメラＮＰ１発現ベクター、キメラＮＰ２発現ベクター、キメラＮＰ３発現ベクター及びキメラＮＰ４発現ベクターは、それぞれＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。そして、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、精製後の各発現ベクターをサル腎臓由来のＣＯＳ−７細胞に導入し、５％ＣＯ２インキュベーター内で４８時間培養し、各遺伝子組換えＮＰを発現させた。このうち、野生型ヒトインフルエンザＮＰ発現ベクターから得られた遺伝子組換えＮＰをｒ−Ｈｕｍａｎ  Ｆｌｕ  ＮＰ（配列番号９）とし、野生型トリインフルエンザＮＰ発現ベクターから得られた遺伝子組換えＮＰをｒ−Ａｖｉａｎ  Ｆｌｕ  ＮＰ（配列番号１０）とし、キメラＮＰ１発現ベクターから得られた遺伝子組換えＮＰをｒ−Ｃｈ１  Ｆｌｕ  ＮＰ（配列番号１１）とし、キメラＮＰ２発現ベクターから得られた遺伝子組換えＮＰをｒ−Ｃｈ２  Ｆｌｕ  ＮＰ（配列番号１２）とし、キメラＮＰ３発現ベクターから得られた遺伝子組換えＮＰをｒ−Ｃｈ３  Ｆｌｕ  ＮＰ（配列番号１３）とし、キメラＮＰ４発現ベクターから得られた遺伝子組換えＮＰをｒ−Ｃｈ４  Ｆｌｕ  ＮＰ（配列番号１４）とした。
【００６９】
図３は、ｒ−Ｈｕｍａｎ  Ｆｌｕ  ＮＰ（配列番号９）、ｒ−Ａｖｉａｎ  Ｆｌｕ  ＮＰ（配列番号１０）、ｒ−Ｃｈ１  Ｆｌｕ  ＮＰ（配列番号１１）、ｒ−Ｃｈ２  Ｆｌｕ  ＮＰ（配列番号１２）、ｒ−Ｃｈ３  Ｆｌｕ  ＮＰ（配列番号１３）、及びｒ−Ｃｈ４  Ｆｌｕ  ＮＰ（配列番号１４）のアミノ酸配列を模式的に示したものである。図３で示しているように、何れのアミノ酸配列も全長５０４残基であり、Ｃ末端のアミノ酸６残基（すなわちアミノ酸配列第４９９位から第５０４位）がヒスチジンになっている。
【００７０】
そして、ｒ−Ｈｕｍａｎ  Ｆｌｕ  ＮＰのアミノ酸配列第１位から第４９８位は、ヒトインフルエンザウイルスＮＰのアミノ酸配列の全長（４９８残基）に相当する。
ｒ−Ａｖｉａｎ  Ｆｌｕ  ＮＰのアミノ酸配列第１位から第４９８位は、トリインフルエンザウイルスＮＰのアミノ酸配列の全長（４９８残基）に相当する。
また、ｒ−Ｃｈ１  Ｆｌｕ  ＮＰのアミノ酸配列第１位から第１５９位は、トリインフルエンザＮＰのＮ末端側１５９アミノ酸に相当し、アミノ酸配列第１６０位から第４９８位は、ヒトインフルエンザＮＰのＣ末端側３３９アミノ酸に相当する。
ｒ−Ｃｈ２  Ｆｌｕ  ＮＰ  のアミノ酸配列第１位から第１５９位は、ヒトインフルエンザＮＰのＮ末端側１５９アミノ酸に相当し、アミノ酸配列第１６０位から第４９８位は、トリインフルエンザＮＰのＣ末端側３３９アミノ酸に相当する。
ｒ−Ｃｈ３  Ｆｌｕ  ＮＰ  のアミノ酸配列第１位から第４５位は、トリインフルエンザＮＰのＮ末端側４５アミノ酸に相当し、アミノ酸配列第４６位から第４９８位は、ヒトインフルエンザＮＰのＣ末端側４５３アミノ酸に相当する。
ｒ−Ｃｈ４  Ｆｌｕ  ＮＰのアミノ酸配列第１位から第４５位は、ヒトインフルエンザＮＰのＮ末端側４５アミノ酸に相当し、アミノ酸配列第４６位から第４９８位は、トリインフルエンザＮＰのＣ末端側４５３アミノ酸に相当する。また、参考までに、今回作製したｒ−Ｈｕｍａｎ  Ｆｌｕ  ＮＰ及びｒ−Ａｖｉａｎ  Ｆｌｕ  ＮＰ、並びに、下記の１２種類のヒトインフルエンザウイルス株由来ＮＰ及び下記の１２種類のトリインフルエンザウイルス株由来ＮＰのアミノ酸配列を図４〜図１３に示す。
【００７１】
ヒトインフルエンザウイルス株：
Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１１７／１９７７（Ｈ１Ｎ１）
Ａ／Ｊａｐａｎ／１７０／６２（Ｈ２Ｎ２）
Ａ／Ｋｉｔａｋｙｕｓｈｕ／１５９／９３（Ｈ３Ｎ２）
Ａ／Ｋｕｍａｍｏｔｏ／１／６５（Ｈ２Ｎ２）
Ａ／ＮｅｗＹｏｒｋ／５／２００４（Ｈ３Ｎ２）
Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）
Ａ／Ｋｉｅｖ／５９／７９（Ｈ１Ｎ１）
Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／１９８９（Ｈ３Ｎ２）
Ａ／Ｂｒａｚｉｌ／１１／１９７８（Ｈ１Ｎ１）
Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１５６８１／５９（Ｈ２Ｎ２）
Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）
Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９（Ｈ３Ｎ２）
【００７２】
トリインフルエンザウイルス株：
Ａ／Ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）
Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ａｓｔｒａｋａｎ／２６３／８２（Ｈ１４Ｎ８）
Ａ／ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／１９７７（Ｈ１３Ｎ６）
Ａ／ｐｉｎｔａｉｌ／Ａｌｂｅｒｔａ／４９／２００３（Ｈ１２Ｎ５）
Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／１９５６（Ｈ１１Ｎ６）
Ａ／ｐｉｎｔａｉｌｄｕｃｋ／ＡＬＢ／５８４／１９８４（Ｈ１０Ｎ６）
Ａ／ｓｈｏｒｅｂｉｒｄ／ＤＥ／２６１／２００３（Ｈ９Ｎ５）
Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／１９６８（Ｈ８Ｎ４）
Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｒ２８／０３（Ｈ７Ｎ７）
Ａ／ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１９７２（Ｈ６Ｎ５）
Ａ／ｂｌａｃｋｄｕｃｋ／ＮｅｗＹｏｒｋ／１８４／１９８８（Ｈ５Ｎ２）
Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／７７３２／１９６６（Ｈ５Ｎ９）
【００７３】
（２）反応性の比較
（１）で調製した遺伝子組換えＮＰを発現する各ＣＯＳ−７細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）によりシャーレから剥がし、各ＣＯＳ−７細胞をＰＢＳで洗浄した。洗浄後の各ＣＯＳ−７細胞を適量のＰＢＳ中に懸濁させ、細胞浮遊液を調製した。細胞浮遊液をスライドグラスに適量スポットし、風乾後アセトンで固定した。アセトン固定後のスライドグラスに４Ｅ３抗体液（１０μｇ／ｍｌの４Ｅ３、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を滴下し、スライドグラス上のＣＯＳ−７細胞と４Ｅ３とを反応させた。次に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１００倍希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ）をスライドグラスに滴下した。そして、蛍光顕微鏡下でスライドグラスを観察することにより、ＣＯＳ−７細胞で発現している各遺伝子組換えＮＰに対する４Ｅ３の反応性を調べた。
なお、対照として、４Ｅ３の代わりに抗Ｈｉｓタグ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ、ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。結果を図１４に示す。
【００７４】
図１４より、４Ｅ３は、ｒ−Ｈｕｍａｎ  Ｆｌｕ  ＮＰ、ｒ−Ｃｈ２  Ｆｌｕ  ＮＰ及びｒ−Ｃｈ３  Ｆｌｕ  ＮＰに反応せず、ｒ−Ａｖｉａｎ  Ｆｌｕ  ＮＰ、ｒ−Ｃｈ１  Ｆｌｕ  ＮＰ及びｒ−Ｃｈ４  Ｆｌｕ  ＮＰに反応することが分かった。すなわち、４Ｅ３は、トリインフルエンザウイルスＮＰのアミノ酸配列４６位〜１５９位を含む核タンパク質には反応性を示すが、含まない核タンパク質には反応性を示さないことが分かった。このことから、４Ｅ３がトリインフルエンザウイルスＮＰのＮ末端側の特定の領域（アミノ酸配列４６位〜１５９位）内に存在するエピトープを認識していると推定できる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明の１つの実施形態に係るイムノクロマトグラフ法用試験具の断面図である。
【図２】モノクローナル抗体４Ｅ３及び１Ｃ１０が認識する抗原を特定するための試験結果を示す図である。
【図３】ｒ−Ｈｕｍａｎ  Ｆｌｕ  ＮＰ、ｒ−Ａｖｉａｎ  Ｆｌｕ  ＮＰ、ｒ−Ｃｈ１  Ｆｌｕ  ＮＰ、ｒ−Ｃｈ２  Ｆｌｕ  ＮＰ、ｒ−Ｃｈ３  Ｆｌｕ  ＮＰ、及びｒ−Ｃｈ４  Ｆｌｕ  ＮＰのアミノ酸配列を模式的に示す図である。
【図４】ｒ−Ｈｕｍａｎ  Ｆｌｕ  ＮＰ及びｒ−Ａｖｉａｎ  Ｆｌｕ  ＮＰ、並びに、１２種類のヒトインフルエンザウイルス株由来ＮＰ及び１２種類のトリインフルエンザウイルス株由来ＮＰのアミノ酸配列第１位から第５０位を示す図である。
【図５】同じくアミノ酸配列第５１位から第１００位を示す図である。
【図６】同じくアミノ酸配列第１０１位から第１５０位を示す図である。
【図７】同じくアミノ酸配列第１５１位から第２００位を示す図である。
【図８】同じくアミノ酸配列第２０１位から第２５０位を示す図である。
【図９】同じくアミノ酸配列第２５１位から第３００位を示す図である。
【図１０】同じくアミノ酸配列第３０１位から第３５０位を示す図である。
【図１１】同じくアミノ酸配列第３５１位から第４００位を示す図である。
【図１２】同じくアミノ酸配列第４０１位から第４５０位を示す図である。
【図１３】同じくアミノ酸配列第４５１位から第５０４位を示す図である。
【図１４】各遺伝子組換えＮＰに対する４Ｅ３及び抗Ｈｉｓタグ抗体の反応性を比較した図である。
【符号の説明】
【００７６】
１    イムノクロマトグラフ法用試験具
２    基材
３    試料添加部材
４    標識保持部材
５    クロマト用膜担体
６    吸収部材
７    透明シール
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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