(57)【要約】【課題】生理活性物質を包括固定化した固体基板、及びその製造方法を提供すること。【解決手段】固体基板の表面に共有結合した、多糖類から構成される架橋ヒドロゲル内に生理活性物質を有している、固体基板。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体基板の表面に共有結合した、多糖類から構成される架橋ヒドロゲル内に生理活性物質を有している、固体基板。
【請求項２】
固体基板の表面に共有結合した、多糖類から構成される架橋ヒドロゲル内に生理活性物質が包括固定されている、固体基板。
【請求項３】
架橋ヒドロゲルが、２重結合を有する多糖類又はその誘導体と水溶性モノマーと水溶性開始剤を使用することにより形成される、請求項１又は２に記載の固体基板。
【請求項４】
２重結合を有する多糖類又はその誘導体が表面に結合した固体基板に、生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液を接触させて重合を行うことによって製造される、請求項１から３の何れかに記載の固体基板。
【請求項５】
生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液において、該水溶性モノマーの濃度が、１００ｍＭ以上１Ｍ以下である、請求項４に記載の固体基板。
【請求項６】
生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液において、該水溶性開始剤の濃度が、０．１ｍＭ以上２ｍＭ以下である、請求項４又は５に記載の固体基板。
【請求項７】
水溶性開始剤が過硫酸塩である、請求項４から６の何れかに記載の固体基板。
【請求項８】
水溶性モノマーがアミド構造、又はポリエーテル構造を含んでなる、請求項４から７の何れかに記載の固体基板。
【請求項９】
生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液が、重合促進剤をさらに含む、請求項４から８の何れかに記載の固体基板。
【請求項１０】
重合促進剤がβ−ジメチルアミノプロピオニトリル、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン、又は亜硫酸ソーダの何れかである、請求項９に記載の固体基板。
【請求項１１】
２重結合を有する多糖類又はその誘導体が、固体基板に共有結合したカルボキシル基含有多糖類又はその誘導体と、２重結合を有するアミンとの反応により生成したものである、請求項４から１０の何れかに記載の固体基板。
【請求項１２】
生理活性物質が蛋白質である、請求項１から１１の何れかに記載の固体基板。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れかに記載の固体基板を含むバイオセンサー。
【請求項１４】
表面プラズモン共鳴分析のために使用される、請求項１３に記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
２重結合を有する多糖類又はその誘導体が表面に結合した固体基板に、生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液を接触させて重合を行うことを含む、固体基板の表面に共有結合した多糖類から構成される架橋ヒドロゲル内に生理活性物質を有している固体基板の製造方法。
【請求項１６】
固体表面に結合した２重結合を有する多糖類又はその誘導体の、水中での膜厚が5nm以上500nm以下である、請求項１５に記載の固体基板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質を固定化した固体基板およびその製造方法に関する。より詳細には、本発明は、表面プラズモン共鳴分析などで使用するための、生理活性物質を固定化したセンサー用基板およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生理活性物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。そのような測定チップの具体例としては、SPRセンサー基板に生理活性物質を固定するための表面として使用されているBiacore CM5等のCMD（カルボキシメチルデキストラン）表面が挙げられる。しかしこの表面では、生理活性物質は共有結合（アミド結合）で固定されているため、固定されたタンパク等の失活を誘起する場合がある。
【０００６】
架橋されたヒドロゲル中に生理活性物質を封入するための手法は「包括固定法」と呼ばれ、1970年代より知られていた。例えば、特許文献２では、ヒドロゲルとしてシンナモイロキシエチルメタクリレートなどの合成ポリマーに、光照射することにより架橋ヒドロゲルを形成し、タンパクを包括固定する旨記載されている。本センサー表面を繰り返し使用する場合、生理活性物質を包括固定した表面が基板から剥離しないことが必要であるが、包括固定表面をセンサー表面に強固に結合する手法は限定されており、一般性の高い手法の開発が望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】特許第２８１５１２０号公報
【特許文献２】特開平５−１３３９２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、生理活性物質を包括固定化した固体基板、及びその製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、２重結合を有する多糖類又はその誘導体が表面に結合した固体基板に、生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液を接触させて重合を行うことによって、固体基板の表面に共有結合した架橋ヒドロゲル内に生理活性物質を固定できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
本発明によれば、固体基板の表面に共有結合した、多糖類から構成される架橋ヒドロゲル内に生理活性物質を有している、固体基板が提供される。
さらに本発明によれば、固体基板の表面に共有結合した、多糖類から構成される架橋ヒドロゲル内に生理活性物質が包括固定されている、固体基板が提供される。
【００１１】
好ましくは、架橋ヒドロゲルは、２重結合を有する多糖類又はその誘導体と水溶性モノマーと水溶性開始剤を使用することにより形成される。
好ましくは、本発明の固体基板は、２重結合を有する多糖類又はその誘導体が表面に結合した固体基板に、生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液を接触させて重合を行うことによって製造される。
【００１２】
好ましくは、生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液において、該水溶性モノマーの濃度は、１００ｍＭ以上１Ｍ以下である。
好ましくは、生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液において、該水溶性開始剤の濃度は、０．１ｍＭ以上２ｍＭ以下である。
【００１３】
好ましくは、水溶性開始剤は過硫酸塩である。
好ましくは、水溶性モノマーはアミド構造、又はポリエーテル構造を含んでなる。
好ましくは、生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液は、重合促進剤をさらに含む。
好ましくは、重合促進剤はβ−ジメチルアミノプロピオニトリル、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン、又は亜硫酸ソーダの何れかである。
【００１４】
好ましくは、２重結合を有する多糖類又はその誘導体は、固体基板に共有結合したカルボキシル基含有多糖類又はその誘導体と、２重結合を有するアミンとの反応により生成したものである。
好ましくは、生理活性物質は蛋白質である。
【００１５】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の固体基板を含むバイオセンサーが提供される。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、表面プラズモン共鳴分析のために使用される。
【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、２重結合を有する多糖類又はその誘導体が表面に結合した固体基板に、生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液を接触させて重合を行うことを含む、固体基板の表面に共有結合した多糖類から構成される架橋ヒドロゲル内に生理活性物質を有している固体基板の製造方法が提供される。
好ましくは、固体表面に結合した２重結合を有する多糖類又はその誘導体の、水中での膜厚は5nm以上500nm以下である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の固体基板においては、架橋ヒドロゲル内に生理活性物質が包含されているため、タンパク質などの生理活性物質を、活性が高い状態で固定することが可能である。また、本発明の固体基板においては、生理活性物質の包含のためのヒドロゲルの構成成分として多糖類を使用しているため、生理活性物質の失活抑制効果をさらに高めることが可能である。さらに、本発明の固体基板においては、固体基板上に多糖類を共有結合によって固定するため、長時間の測定や洗浄を行った場合でも、架橋ヒドロゲルが流出することがなく、膜厚の制御も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の固体基板では、固体基板の表面に共有結合した架橋ヒドロゲル内に生理活性物質を有している。ここで、本発明の固体基板の好ましい態様をより詳細に説明すると、架橋ヒドロゲル内に生理活性物質が包含された状態で、基板表面に固定化されている。より好ましくは、架橋ヒドロゲルが鳥かご状になり、生理活性物質が基板表面に固定化されている。よって、生理活性物質は架橋ヒドロゲル外に流出することなく基板表面に固定化される。以後、本発明の固体基板による生理活性物質の固定化方法を、「包括固定」と称する。
【００１９】
（１）基板
本発明の固体基板は、例えば、バイオセンサー用基板として用いることができる。本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサー では、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００２０】
本発明では、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２１】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２２】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２３】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００２４】
上記の基板は、測定ユニットの誘電ブロックに固定され、一体化されて測定チップを構成しており、この測定チップが交換可能に形成されていてもよい。
【００２５】
（２）架橋ヒドロゲル
本発明に使用可能な、架橋ヒドロゲルの構成成分である多糖類の水中での膜厚（生理活性物質を固定する前の、多糖類のみでの膜厚）は、好ましくは5nm以上500nm以下であり、より好ましくは、１０ｎｍ以上300ｎｍ以下である。膜厚が薄いと生理活性物質固定量が減少し、またセンサー表面の水和層が薄くなるため生理活性物質自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。膜厚が厚いと被検体物質が膜内に拡散する障害となり、また特にセンサー基板の架橋ヒドロゲル固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水中での多糖類の膜厚はＡＦＭ、エリプソメトリーなどで評価することができる。
【００２６】
本発明においては、架橋ヒドロゲルの構成成分として、多糖類を使用することで、夾雑物の非特異吸着を抑制することができる。本発明における多糖類としては、例えば、ゼラチン、アガロース、キトサン、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、澱粉、セルロース、又はこれらの誘導体、例えばカルボキシメチル誘導体、などが挙げられる。より具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等が挙げられる。本発明においては、カルボキシル基含有多糖類を使用することが好ましく、このカルボキシル基含有多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるＣＭＤ、ＣＭＤ−Ｌ、ＣＭＤ−Ｄ４０（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることができる。本発明で用いる多糖類の分子量は特に限定されないが、一般的には２００以上５００００００以下であることが好ましい。
【００２７】
上記した架橋ヒドロゲルの構成成分は、アミノプロピルトリエトキシシラン、又は自己組織化膜を介して基板に固定してもよいし、あるいはモノマーを含む溶液から直接基板上に形成させることもできる。
【００２８】
自己組織化膜とは、外からの細かい制御を加えていない状態で、膜材料そのものがもつ機構によって形成される一定の秩序をもつ組織をもった単分子膜やＬＢ膜などの超薄膜のことを言う。この自己組織化により、非平衡な状況で長距離にわたって秩序がある構造やパターンが形成される。自己組織化膜（SAMs）を用いた金属膜の被覆法は、ハーバード大のWhitesides教授らにより精力的に展開されており、その詳細は例えばChemical Review, 105, 1103-1169 (2005)に報告されている。金属として金を用いた場合、有機層形成化合物として一般式Ａ−１（一般式Ａ−１において、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）に示すアルカンチオール誘導体を用いることにより、Au-S結合とアルキル鎖同士のvan der Waals力に基づき、配向性を持つ単分子膜が自己組織的に形成される。自己組織化膜は、アルカンチオール誘導体の溶液中に金基板を浸漬するという極めて簡便な手法で作成される。
【００２９】
【化１】
2008249502.tif 000002
【００３０】
また、本発明において自己組織化膜はアミノ基を有していることが好ましい。一般式Ａ−１においてX=NH2である化合物を用いて自己組織化膜を形成させることで、アミノ基を有する自己組織化膜で金表面を被覆することが可能となる。
【００３１】
アミノ基を有するアルカンチオールは、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物（一般式Ａ−２）（一般式Ａ−２において、ｎは３から２０の整数を示す）でもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−３、Ａ−４）（一般式Ａ−３においてｎは３から２０の整数を示し、一般式４においてｎはそれぞれ独立に１から２０の整数を示す）と大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させた化合物でもよい。末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはジアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させてもよい。
【００３２】
【化２】
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【００３３】
A-2〜A-4のアルキル基の繰返し数は、3以上20以下が好ましく、さらに3以上16以下が好ましく、4以上8以下が最も好ましい。アルキル鎖が短いと自己組織化膜を形成しにくく、アルキル鎖が長いと水溶性が低下し、ハンドリングが困難になる。
【００３４】
本発明に用いるジアミンとしては、任意の化合物を用いることが可能であるが、バイオセンサー表面に用いる場合、水溶性ジアミンが好ましい。水溶性ジアミンとしては具体的に、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、１．４−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、４，４'−ジアモノビフェニル、４，４'−ジアミノジフェニルメタン、４，４'−ジアミノジフェニルケトン、４，４'−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミンが挙げられる。バイオセンサー表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物（一般式５）を用いることも可能である。本発明に用いるジアミンとしては、好ましくはエチレンジアミンまたは一般式Ａ−５（一般式Ａ−５において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）で表される化合物であり、より好ましくは、エチレンジアミンまたは1,2-ビス(アミノエトキシ)エタン（一般式Ａ−５において、n=2,m=1）である。
【００３５】
【化３】
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【００３６】
アミノ基を有するアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。バイオセンサー表面に用いる場合、他のアルカンチオールとしては、生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のWhitesides教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Langmuir,17,2841-2850, 5605-5620, 6336-6343 (2001)）。本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。非特異吸着抑制能に優れ、入手が容易であることから、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールとしては、水酸基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−６）あるいはエチレングルコールユニットを有するアルカンチオール（一般式Ａ−７）（一般式Ａ−６において、ｎは３から２０の整数を示し、一般式Ａ−７において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）を用いることが好ましい。
【００３７】
【化４】
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【００３８】
アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合、A-2〜A-4のアルキル基の繰返し数は、4以上20以下が好ましく、さらに4以上16以下が好ましく、4以上10以下が最も好ましい。また、A-6,A-7のアルキル基の繰返し数は、3以上16以下が好ましく、さらに3以上12以下が好ましく、3以上8以下が最も好ましい。
【００３９】
本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能であるが、アミノ基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には多糖類の結合量が低下し、親水性基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には非特異吸着抑制能が減少する。それゆえ、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールの混合比は、１／１〜１／１，０００，０００の範囲であることが好ましく、１／４〜１／１０，０００の範囲であることがより好ましく、１／１０〜１／１，０００の範囲であることがさらに好ましい。活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーと反応する場合の立体障害低減の観点から、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、親水性基を有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。
【００４０】
本発明で用いるアルカンチオールは、Northwestern大学のGrzybowski教授らによる総説（Curr. Org. Chem., 8, 1763-1797(2004).）およびその引用文献に基づいて合成された化合物を用いても良く、また市販の化合物を用いてもよい。これらの化合物は、同仁化学（株）、Aldrich社、SensoPath Technologies社、Frontier Scientific Inc.社等から購入可能である。本発明においてアルカンチオールの酸化生成物であるジスルフィド化合物は、アルカンチオールと同様に用いることが可能である。
【００４１】
（３）固体基板の製造方法
本発明の固体基板の製造方法においては、２重結合を有する多糖類又はその誘導体が表面に結合した固体基板に、生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液を接触させて重合を行うことで、生理活性物質を包含した架橋ヒドロゲルを形成することができる。
【００４２】
２重結合を有する２重結合を有する多糖類又はその誘導体は、固体基板に共有結合したカルボキシル基含有多糖類又はその誘導体と、２重結合を有するアミンとを反応させることにより生成することができる。ここで用いる２重結合を有するアミンとしては、２−アミノエチルメタクリレート、（メタ）アリルアミン，クロチルアミン等のＣ３〜６アルケニルアミン、アミノエチル（メタ）アクリレート等のアミノＣ２〜６アルキル（メタ）アクリレート、ビニルアニリン等の芳香環と１級アミノ基を有するモノマー、等を用いることが可能である。好ましくはアミノＣ２〜６アルキル（メタ）アクリレートであり、より好ましくはアミノエチルメタクリレートである。
【００４３】
本発明で用いる水溶性モノマーは、非イオン性モノマー、アニオン性モノマー、カチオン性モノマーのいずれを用いることも可能であるが、非イオン性モノマーを用いることが好ましい。
【００４４】
非イオン性モノマーとしては、アミド構造を有するもの、ヒドロキシル構造を有するもの、エステル構造を有するもの、ポリエーテル構造を有するものが挙げられる。なかでも、アミド構造、ポリエーテル構造を有するものが好ましく、より具体的には、アクリルアミド、Ｃ1-3 Ｎ−アルキル又はＣ1-3 Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、ポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ビニルホルムアミド、炭素原子４〜９個を有する環状基を含むＮ−ビニルラクタム、ビニルアルコール（酢酸ビニルの形で重合した後、加水分解することにより得られる）、エチレンオキシド、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート等が挙げられる。この中でも、アクリルアミド、Ｃ1-3 Ｎ−アルキル又はＣ1-3 Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、ポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
【００４５】
アニオン性モノマーとしては、エチレン系不飽和カルボン酸、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、フマル酸、クロトン酸、マレイン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸等が挙げられる。
【００４６】
カチオン性モノマーとしては、例えば、ジメチルジアリルアンモニウムクロリド、メチルビニルイミダゾリウムクロリド、２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、２−メチル−５−ビニルピリジン、ビニルアミン又は下記式
Ｈ2Ｃ＝ＣＲ1−ＣＯ−Ｘ2
（式中、Ｒ1 は水素原子又はメチル基であり、Ｘ2 は第一級、第二級又は第三級アミン官能基を少なくとも１つ又は第四級窒素原子を少なくとも１つもった直鎖又は分枝鎖Ｃ1-6 炭化水素基、又は式ＮＨＲ2 又は式ＮＲ2Ｒ3 の基であり、ここで、Ｒ2とＲ3は相互に独立して第一級、第二級又は第三級アミン官能基を少なくとも１つ又は第四級窒素原子を少なくとも１つもった直鎖又は分枝鎖Ｃ1-6炭化水素基である。）を有するモノマー等が挙げられる。
【００４７】
これらの水溶性モノマーは、単独で用いても良く、２種以上の異なるモノマーを含む混合物として用いても良い。
【００４８】
また、これらの水溶性モノマーは、生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液において、１０ｍＭ以上１０Ｍ以下の濃度に調整することが好ましく、５０ｍＭ以上２Ｍ以下がより好ましく、１００ｍＭ以上１Ｍ以下がさらに好ましい。
【００４９】
本発明で用いる水溶性開始剤としては、水溶性の過硫酸塩、過酸化物、アゾビス化合物等が使用できるが過硫酸塩が好ましい。具体的には、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム、過酸化水素、ｔ−ブチルパーオキシマレイン酸、２，２−アゾビス（２−ジアミノプロパン）ジハイドロクロライド、２，２−アゾビス［２−（５−メチル−２−イミダゾリ−２−ニル）プロパン］ジハイドロクロライド、２，２−アゾビス［２−（２−イミダゾリ−２−ニル）プロパン］ジハイドロクロライド、２，２−アゾビス｛２−メチル−Ｎ−［１，１−ビス（ヒドロキシメチル）−２−ヒドロキシエチル］プロピオンアミド｝、２，２−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］、２，２−アゾビス（２−メチル−プロピオンアミド）ジハイドレート等の化合物を好ましく用いることが可能であり、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムがより好ましい。
【００５０】
また、これらの水溶性開始剤は、生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液において、０．０１ｍＭ以上１００ｍＭ以下の濃度に調整することが好ましく、０．０５ｍＭ以上１０ｍＭ以下がより好ましく、０．１ｍＭ以上２ｍＭ以下がさらに好ましく、０．１ｍＭ以上１ｍＭ以下にすることがさらに好ましい。
【００５１】
これらの水溶性開始剤は、β−ジメチルアミノプロピオニトリル、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン、亜硫酸ソーダ等の重合促進剤と併用して用いることも好ましい。これらの重合開始剤を併用する場合、生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液において、０．１ｍＭ以上１Ｍ以下で添加することが好ましく、０．５ｍＭ以上１００ｍＭ以下がより好ましく、１ｍＭ以上１０ｍＭ以下がさらに好ましい。
【００５２】
（４）本発明で用いることができる生理活性物質
本発明において架橋ヒドロゲル内に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００５３】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００５４】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００５５】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
【００５６】
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤ
ＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００５７】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばビオチン結合性タンパク（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
【００５８】
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
これらの生理活性物質のうち、蛋白質を用いることが好ましく、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン類、カルモデュリン、又は抗体を用いることがより好ましい。
【００５９】
また、これらの生理活性物質は、生理活性物質と水溶性モノマーと水溶性開始剤を含む水溶液において、0.001mg/ml以上5mg/ml以下の濃度に調整することが好ましく、0.005mg/ml以上1mg/ml以下がより好ましく、0.05mg/ml以上0.5mg/ml以下がさらに好ましい。
【００６０】
一般に蛋白質などの生理活性物質は水溶液中で水分子が配位することで三次元構造を維持しているが、乾燥されると三次元構造を保持できず失活する。また、基板表面の親水性高分子中に担持されている場合には、乾燥されることで生理活性物質同士が接近し凝集が発生する。本発明の水素結合を形成しうる残基を有する化合物（以下化合物Ｓとする）は、水分子に代って生理活性物質の三次元構造を保持することで失活を抑制、または生理活性物質を被覆して立体効果で凝集を抑制する目的で使用することができる。
【００６１】
本発明において水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水溶液で基板上の生理活性物質を固定した層に添加することが好ましい。添加方法としては、生理活性物質との混合溶液として基板表面に塗布しても良く、生理活性物質を基板表面に固定した後オーバーコートなどによりして添加しても良い。化合物Ｓと生理活性物質との混合溶液として塗布した場合、生理活性物質の固定量ばらつきを抑えることもできる。化合物Ｓ水溶液は薄膜状態で基板に添加することが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【００６２】
化合物Ｓの塗布液濃度は塗布性、生理活性物質を含む層への浸透の問題がない範囲で特に限定されないが、０．１重量％以上５重量％以下であることが好ましい。また、塗布液は、塗布性、ｐＨ調整の観点で界面活性剤、緩衝剤、有機溶剤、塩などを添加してもよい。
【００６３】
水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、常温常圧で不揮発性のものが好ましく、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さいものが好ましく、さらに好ましくは１２００以上２００万以下であり、最も好ましくは１２００以上７万以下である。分子内に水酸基を含む化合物Ｓは糖類が好ましく、糖類は、単糖、多糖類でも良い。ｎ糖類の場合ｎが４以上１２００以下であることが好ましく、さらに好ましくはｎが２０以上６００以下である。
【００６４】
化合物Ｓの平均分子量が低いと基板表面で結晶化して、生理活性物質を固定した親水性高分子層の破壊および生理活性物質の三次元構造の破壊の原因となり、反対に平均分子量が高いと生理活性物質の基板への固定の障害となったり、生理活性物質を含む層に含浸できない、層分離を発生するなどの問題が発生する。
【００６５】
基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、デキストラン骨格、又はポリエチレンオキシド骨格を有することが好ましく、本発明の目的を達成する範囲において、どの置換基を使用してもよい。また、基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、解離性基を有しないノニオン性化合物であることが好ましい。また、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは水分子との親和性の高い化合物が好ましく、水とｎ-オクタノールとの分配係数ＬｏｇＰ値が１以上であることが好ましい。ＬｏｇＰ値は、ＪＩＳ規格のＺ７２６０−１０７（２０００）「分配係数（1-オクタノール/水）の測定―振とう法」などに記載の方法で測定することができる。
【００６６】
具体的な水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、ポリビニルアルコールなど多価アルコール類、コラーゲン、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク質、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、デンプン、セルロース、アルギン酸、デキストランなど多糖類、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド、プルロニックなどポリエチレンキシ-ポリプロピレンオキシド縮合物などのポリエーテル類、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０などの２種以上の残基から成る化合物、またはこれら化合物の誘導体および重合体などが挙げられる。多糖類、ポリエーテル類が好ましく、多糖類がより好ましい。具体的には、デキストラン、セルロース、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０が好ましく用いられる。さらに、特開２００６−１７０８３２に記載の不揮発性モノマー、不揮発性水溶性オリゴマーを用いることもできる。例えば不揮発性モノマーとしては水酸基が保護基で保護されていてもよいテトロース、ペントース、ヘプトース、ヘキトース及びそのグリコキシドでも良く、メチルグルコシドや水酸基が保護基で保護されていてもよいサイクリトール類でもよい。また不揮発性水溶性オリゴマーが、式（１）、（２）または（３） -[CH2-CH(CONH2)-]n- （１） -[CH2-CH2-O-]n- （２） -[CH2-CH(OH)-]n- （３）（式（１）〜（３）中、ｎは１０〜２００のいずれかの整数を示す。）で表されるオリゴマー、水酸基が保護基で保護されていてもよいｎ糖（但し、２≦ｎ≦１０）のオリゴ糖を用いることもできる。さらに、US２００３／０１７５８２７、DE２０３０６４７６A1に記載の糖類、例えば、トレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース、キシリトール、フルクトース、マニトール、グルコース、キシロール、マルトデキストラン、サッカロース、ポリビニルピロリドンなどを使用しても良い。また、これらの化合物Ｓは使用している親水性高分子の基本骨格と実質同一であることが好ましい。ここで、基本骨格とは、例えば、糖の環構造のことをいい、官能基や長さが異なっていても、環構造が同一であれば、実質同一であるという。
【００６７】
基板上の、水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓの含有量としては、平均分子量の比で、親水性高分子の平均分子量に対する前記化合物Ｓの平均分子量の割合が０．００５以上０．２以下であることが好ましい。割合がこれよりも低い場合は化合物Ｓが結晶化しやすく、高い場合は親水性高分子層への浸透が困難であり、この範囲内に設定することでこれらの問題を解消し、生理活性物質の失活抑制効果、凝集抑制効果をより高く得ることができる。
【００６８】
（５）本発明の固体基板の使用方法
上記のようにして生理活性物質を固定化した本発明の固体基板は、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００６９】
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００７０】
また、本発明により得られる、固体基板上に包括固定された生理活性物質の応用範囲は、センサーに限定されない。基板上に固定された生理活性物質を用いた化学反応、有用物質製造、有機溶媒中における酵素反応、食品、医療、アフィニティークロマトグラフィー、廃液処理、エネルギー製造、遺伝子工学等、多方面への応用展開が可能である。
【００７１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の固体基板は、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００７２】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００７３】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００７４】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００７５】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００７６】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００７７】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００７８】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００７９】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００８０】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００８１】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００８２】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００８３】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００８４】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００８５】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００８６】
本発明の固体基板を表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【００８７】
本発明のバイオセンサーは、例えば基板表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を導波路を用いて検出するバイオセンサーとして用いることができる。この場合、基板表面の導波構造物は、回折格子と場合によっては付加層とを有している、この導波構造物は、薄い誘電層からなる平面的な導波体から成る。導波体に集光された光線は全反射によりこの薄い層内に導かれる。この導かれる光波（以降モードと呼ぶ）の伝播速度は、Ｃ／Ｎの値をとる。ここでＣは、真空中での光速であり、Ｎは導波体内を導かれるモードの有効屈折率である。有効屈折率Ｎは、一面では導波体の構成により、他面では薄い導波層に隣接する媒体の屈折率により決まる。光波の伝導は、薄い平面層内のみでなく、別の導波構造物、特にストリップ状の導波体によっても行われる。その場合は、導波構造物はストリップ状のフィルムの形状にされる。有効屈折率Ｎの変化は、導波層に隣接する媒体の変化と導波層自身もしくは導波層に隣接する付加層の屈折率および厚さの変化とにより生じることがバイオセンサーにとって重要な要素である。
【００８８】
この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平６−２７７０３号公報４ページ４８行目から１４ページ１５行目および第１図から第８図に記載されている。
【００８９】
例えば、一つの実施形態として、薄層が平面状の導波路層が基材（たとえばパイレックス（登録商標）・ガラス）上に設けられている構造がある。導波路層と基材とは、一緒にいわゆる導波体を形成する。導波路層は、たとえば酸化物層（ＳｉＯ2，ＳｎＯ2、Ｔａ2Ｏ5，ＴｉＯ2，ＴｉＯ2-ＳｉＯ2，ＨｆＯ2，ＺｒＯ2，Ａｌ2Ｏ3，Ｓｉ3Ｎ4，ＨｆＯＮ，ＳｉＯＮ，酸化スカンジウムまたはこれらの混合物）、プラスチック層（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなど）、など多層の積層体が可能である。光線が全反射により導波路層内を伝播するには、導波路層の屈折率が隣接媒体（たとえば基材や後述の付加層）の屈折率より大でなければならない。基材もしくは測定物質に向いた導波路層表面もしくは導波路層体積内には、回折格子が配置されている。回折格子は、型押し、ホログラフィまたはその他の方法によって基板内に形成することができる。次いでより高い屈折率を有する薄い導波路膜を回折格子の上表面に被覆する。回折格子は導波路層への入射光線を集束したり、既に導波路層内を導かれているモードを放出したり、そのモードの一部を進行方向へ透過させ、一部を反射させたりする機能を持つ。導波路層は、格子域を付加層でカバーしておく。付加層は必要に応じて多層膜とすることができる。この付加層は、測定物質に含まれている物質の選択的検知を可能にする機能を持たせることができる。好ましい態様として付加層の最表面に、検知機能を持つ層を設けることができる。このような検知機能を持つ層として、生理活性物質を固定化し得る層を用いることができる。
【００９０】
別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表2007-501432）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。
【００９１】
回折格子導波路は、回折格子導波路の上層（検知領域）上の生理活性物質検出を可能にするために、入射光線、および反射光を検出して屈折特性の変化を検出する。この目的のため、１つまたはそれより多くの光源（例えば、レーザ、ダイオード）及び１つまたはそれより多くの検出器（例えば、分光計、ＣＣＤカメラまたはその他の光検出器）を用いることができる。屈折率変化を測定するための方法として、２つの異なる動作モード−分光法、及び角度法がある。分光法においては、入射光として広帯域ビームが回折格子導波路に送られ、反射光が集められて、例えば分光計で測定される。共鳴波長（ピーク）のスペクトル位置を観測することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。また、角度法においては、公称上単一波長の光がある範囲の照射角を生じるように集束されて、回折格子導波路内に向けられる。反射光がＣＣＤカメラまたはその他の光検出器によって測定される。回折格子導波路によって反射された共鳴角の位置を測定することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。
【００９２】
また、本発明により得られる固体基板上は、センサーに限定されない。基板上に固定された生理活性物質を用いた化学反応、有用物質製造、有機溶媒中における酵素反応、食品、医療、アフィニティークロマトグラフィー、廃液処理、エネルギー製造、遺伝子工学等、多方面への応用展開が可能である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００９３】
実施例１：基板１及び２の作成と評価
（１）基板の前処理及びAPS修飾
スライドガラスを1N NaOH水溶液に1晩以上浸漬させ、その後、超純水で洗浄し、1N HClに浸漬して超音波で10min間洗浄した。超音波洗浄後、超純水で洗浄してから攪拌洗浄を充分に行い、N2ブローで液滴を吹き飛ばした。
【００９４】
（0.1％  ３-アミノプロピルトリエトキシシラン( APS )の調液）
APSを0.1ｇ秤量し,エタノール/0.01mol HCl=90/10の混合溶媒で溶解し、０．１％のAPS溶液を調整した。
【００９５】
0.1％  APSの溶液を60℃のインキュベーターに入れ,あらかじめ15分保温した。前処理が終わったスライドグラスを0.1％  APS溶液に入れ,60℃のインキュベーター中で12分反応させた。
【００９６】
反応後,ディスポカップに入れた混合溶液（エタノール/超純水＝9/1）で、3回ため水洗浄した。洗浄後N2ブローし、APS修飾スライドガラスを90℃のインキュベーターで3時間加熱処理した。
【００９７】
（２）CMD(カルボキシメチルデキストラン)の活性エステル化
１重量%のCMD（名糖産業製：分子量100万、置換度0.59）溶液10g(カルボキシル基量：5×10-4mol)を溶解した後、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド２×１０-5Ｍ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５×１０-5Ｍ）を含む水溶液10mlを加え、室温で1時間攪拌した。
【００９８】
（３）CMDの基板への結合反応
（１）で成されたスライドガラスの上に、（２）で作成された活性エステル化されたCMD溶液を1ml滴下し、密閉式インナーカップを有するスピンコーター（Model408(特)、ナノテック社製）のインナーカップ回転中心に固定した。７０００ rpmで45 秒スピンコートすることで、基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で15分間反応させた後、1 N NaOH水溶液に30分浸漬し、超純水で5回洗浄することで、ＣＭＤ表面基板を作成した。AFMによる測定を行ったところ、超純水中での膜厚は200nmであった。
【００９９】
（４）架橋ヒドロゲルによる基板の修飾
CMDが結合したスライドガラス上に、EDC(0.4M)とHODbht（3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine）（2.8M）を１／１で混合した０．１M炭酸ナトリウム溶液を、溶液調整後速やかに、１５０μl滴下した。スライドガラス全面に溶液をいきわたらせるため、シーロンフイルムを乗せ、乾燥を防ぐため、蓋をして室温で５分間静置した。
【０１００】
超純水で洗浄、窒素ブローし、次いで、スライドガラス上に、６ｍMの2-アミノエチルメタクリレート（０．１M炭酸ナトリウム水溶液）を１５０μl滴下し、シーロンフイルムを乗せて室温で5分間静置した。その後、超純水で洗浄し、窒素ブローした。
【０１０１】
スライドガラスにエタノールアミン（Biacore）を150μｌ滴下し、シーロンフイルムを乗せて室温で5分間静置し、超純水で洗浄、N2ブローした。
【０１０２】
（４−２）包括固定用タンパク溶液の調液
溶液A（アクリルアミド（和光純薬社製）0.1g、PBSバッファ（ｐH7.4）2.2gの混合溶液）300μl、溶液B（2.5mg/mlのAvidin-FITC（SIGMA社製：pH7.4））30μl、溶液C（３-ジメチルアミノプロピオニトリル（和光純薬社製）3μlとＰＢＳバッファ  177μlの混合溶液）6μl、を混合し、２分間窒素バブリングした後、溶液D（過硫酸カリウム（和光純薬社製）3mgにＰＢＳバッファ  0.5gを加えたもの）6μl加え、混合したものを溶液Eとした。
【０１０３】
（４−３）架橋ヒドロゲルの形成、及びタンパク質の固定
基板上に溶液Eを80μlを滴下し、相対湿度100％、室温、遮光下で１時間静置した後、１００μlの超純水で１０回洗浄した。これを基板１とした。
【０１０４】
溶液Eに対して、アクリルアミド溶液（溶液A）をＰＢＳバッファに置換した溶液（溶液F）を用いて、基板１と同様の操作を行った。これを基板２とした。
【０１０５】
（５）アナライト結合
上記で得られたタンパク質を固定化した表面上に、0.1mg/mlのATTO-680-Biotin（SIGMA社）溶液を接触させ、室温・遮光下で５分間反応させた後、１００μlの超純水で１０回洗浄した。
【０１０６】
（６）基板に固定化されているAvidin-FITCの結合能の測定
基板１、基板２、およびバックグランド（タンパク未修飾部分）の、473nm および535nm における２次元蛍光像を、FLA8000（富士写真フイルム）を用いて測定し、その基板１及び基板２の蛍光強度からバックグラウンドの蛍光強度を差し引き、基板に固定化されているAvidin-FITCの結合能を算出した。結果を以下の表１に示す。
【０１０７】
【表１】
2008249502.tif 000006
【０１０８】
アクリルアミドを含む基板１からは、アクリルアミドを含まない基板２と比較して、Avidin-FITCに基づく473nmの蛍光、およびATTO-680-Biotinに基づく535nmの蛍光が、いずれも５倍程度観察されることが確認された。このことから、本手法によりAvidin-FITCの包括固定が可能なこと、および、包括固定されているAvidin-FITCのbiotinとの結合能が失われていないことが証明された。
【０１０９】
実施例２：基板３及び４の作成と評価
（１）基板の前処理
センサーチップ上に金膜のみが形成されている表面として、Biacore社センサーチップAuを用いて実験を行った。センサーチップAuを12分間、UVオゾン処理を行った後、6-Amino-1-octanethiol, hydrochloride（同仁化学社製）の1mM水溶液に40℃１時間浸漬し、超純水で5回洗浄した。
【０１１０】
（２）CMD(カルボキシメチルデキストラン)の活性エステル化
1重量%のCMD（名糖産業製：分子量100万、置換度0.59）溶液10g(カルボキシル基量：5×10-4mol)を溶解した後、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド２×１０-5Ｍ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５×１０-5Ｍ）を含む水溶液10mlを加え、室温で1時間攪拌した。
【０１１１】
（３）CMDの基板への結合反応
（１）で成された基板の上に、（２）で作成された活性エステル化されたCMD溶液を1ml滴下し、密閉式インナーカップを有するスピンコーター（Model408(特)、ナノテック社製）のインナーカップ回転中心に固定した。７０００ rpmで45 秒スピンコートすることで、アミノ基を有する基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で15分間反応させた後、1 N NaOH水溶液に30分浸漬し、超純水で5回洗浄することで、ＣＭＤ表面基板を作成した。AFMによる測定を行ったところ、超純水中での膜厚は200nmであった。
【０１１２】
（４）架橋ヒドロゲルによる基板の修飾
CMDが結合したスライドガラス上に、EDC(0.4M)とHODbht（2.8M）を１／１で混合した０．１M炭酸ナトリウム溶液を、溶液調整後速やかに、１５０μl滴下した。スライドガラス全面にいきわたらせるため、シーロンフイルムを乗せ、乾燥を防ぐため、蓋をして室温で５分間静置した。
【０１１３】
超純水で洗浄、窒素ブローし、次いで、スライドガラス上に、約６ｍMの2-アミノエチルメタクリレート（０．１M炭酸ナトリウム水溶液）を１５０μl滴下し、シーロンフイルムを乗せて室温で5分間静置した。その後、超純水で洗浄し、窒素ブローした。
【０１１４】
スライドガラスにエタノールアミン（Biacore）を150μｌ滴下し、シーロンフイルムを乗せて室温で5分間静置し、超純水で洗浄、N2ブローした。
【０１１５】
（４−２）包括固定用タンパク溶液の調液
溶液A（アクリルアミド（和光純薬社製）0.1g、ＰＢＳバッファ（ｐH7.4）2.2gの混合溶液）300μl、溶液B（2.5mg/mlのAvidin-FITC（SIGMA社製：pH7.4））30μl、溶液C（３-ジメチルアミノプロピオニトリル（和光純薬社製）3μlとＰＢＳバッファ  177μlの混合溶液）6μl、を混合し、２分間窒素バブリングした後、溶液D（過硫酸カリウム（和光純薬社製）3mgにＰＢＳバッファ  0.5gを加えたもの）6μl加え、混合したものを溶液Eとした。
【０１１６】
（４−３）架橋ヒドロゲルの形成、及びタンパク質の固定
基板上に溶液Eを80μlを滴下し、相対湿度100％、室温、遮光下で１時間静置した後、１００μlの超純水で１０回洗浄した。これを基板３とした。
【０１１７】
溶液Eに対して、アクリルアミド溶液（溶液A）をＰＢＳバッファに置換した溶液（溶液F）を用いて、基板３と同様の操作を行った。これを基板４とした。
【０１１８】
（５）Biacore測定
基板３をビアコア３０００（ビアコア社製）にセットし、流速10μl/minでHBS-Nをランニングバッファーとして用いて実験した。0.01mg/mlのATTO 680 Biotin（分子量836）を５分間接触させた場合の結合量は、380RUとなった。
【０１１９】
基板４をビアコア３０００（ビアコア社製）にセットし、流速10μl/minでHBS-Nをランニングバッファーとして用いて実験した。0.1mg/mlのBiotin HRP（分子量４万）を５分間接触させた場合の結合量は、185RUとなった。
【０１２０】
Biotinの低分子量誘導体であるATTO 680 Biotin（分子量836）を用いた場合には380RUの結合が観察されたにもかかわらず、Biotinのタンパク誘導体であるATTO 680 Biotin（分子量４万）を用いた場合には185RUの結合しか観察されなかった。このことは本発明において、タンパクを包括固定している網目構造を、低分子は透過できるのに対し、タンパクは透過できないことを示している。上記の結果を表２に示す。
【０１２１】
【表２】
2008249502.tif 000007