(57)【要約】【課題】Ｅ．コリ菌株によって工業的規模で異種のタンパク質を発酵培地中で製造するための方法であって、該タンパク質が高収率で発酵培地中に分泌され、かつ異種のタンパク質が更なる後処理なくして発酵培地から直接的に精製することができる方法を提供する。【解決手段】ｌｐｐ遺伝子中又はｌｐｐ遺伝子のプロモーター領域に突然変異を有し、かつシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合されている異種のタンパク質をコードする遺伝子を有するＥ．コリ菌株を、工業的規模で、Ｃａ2+イオンを４ｍｇ／ｌより高い濃度で含有するか又はＭｇ2+イオンを４８ｍｇ／ｌより高い濃度で含有する発酵培地中で発酵させ、その際、該Ｅ．コリ菌株が、異種のタンパク質を発酵培地中に分泌し、かつ該タンパク質を発酵培地から分離することを特徴とする方法によって解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵培地中でＥ．コリ菌株によって異種タンパク質を製造する方法において、ｌｐｐ遺伝子中もしくはｌｐｐ遺伝子のプロモーター領域中に突然変異を有し、かつシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合されている異種タンパク質をコードする遺伝子を有するＥ．コリ菌株を、工業的規模において、Ｃａ2+イオンを４ｍｇ／ｌより高い濃度で含有する又はＭｇ2+イオンを４８ｍｇ／ｌより高い濃度で含有する発酵培地中で発酵させ、その際、該Ｅ．コリ菌株が、その異種タンパク質を発酵培地中に分泌し、そして該タンパク質を発酵培地から分離することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、ｌｐｐ遺伝子中の突然変異が、ｌｐｐ遺伝子中もしくはｌｐｐ遺伝子のプロモーター領域中の１個以上のヌクレオチドの置換、欠失もしくは挿入であって、ｌｐｐ遺伝子がもはや発現されないもしくは僅か少しだけ発現されることとなるもの、又はＬｐｐタンパク質の機能の低下を伴うＬｐｐタンパク質のアミノ酸配列の改変をもたらすものであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法において、ｌｐｐ遺伝子中の突然変異が、配列番号２の位置７７のアルギニン残基のシステイン残基との交換をもたらすもの（ｌｐｐ１突然変異体）であるか、又は配列番号２の位置１４のグリシン残基のアスパラギン酸残基との交換をもたらすもの（ｌｐｐ３突然変異体）であるか、又はｌｐｐ遺伝子自体におけるもしくはｌｐｐ遺伝子のプロモーター領域における少なくとも１個のヌクレオチドの欠失に基づき、細胞が、ペリプラズム性のタンパク質について高められた漏出性を有することとなるものであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項記載の方法において、異種タンパク質が、真核生物のタンパク質であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項記載の方法において、該タンパク質が、１つ以上のジスルフィド結合を有するか又は機能形において二量体もしくは多量体として存在することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４記載の方法において、真核生物のタンパク質が、抗体もしくは抗体フラグメント、サイトカイン、成長因子、プロテインキナーゼ又はタンパク質ホルモンであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項４から６までのいずれか１項記載の方法において、抗体フラグメントが、工業的規模で、１ｇ／ｌより高い細胞外収率で製造されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項記載の方法において、シグナルペプチドをコードする遺伝子が、Ｅ．コリのｐｈｏＡ遺伝子もしくはｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列をコードする遺伝子又は配列番号３を有するシグナル配列をコードする遺伝子の群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項５から８までのいずれか１項記載の方法後に、複数の種々のサブユニットからなるタンパク質を分泌させる方法において、産生されるべきタンパク質のサブユニットの遺伝子の５′末端が、読み枠内で、タンパク質排出のためのシグナル配列の３′末端と結合されており、その際、タンパク質の異なるサブユニットの遺伝子が、異なるシグナル配列と結合されていることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか１項記載の方法において、発酵を、５ｌより高い容量を有する発酵器中で、特に有利には５０ｌより高い容量を有する発酵器中で実施することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法において、Ｃａ2+イオンを４ｍｇ／ｌより高く最大で５０００ｍｇ／ｌまでの濃度で、有利には１０ｍｇ／ｌ〜５０００ｍｇ／ｌの濃度で、特に有利には４０ｍｇ／ｌ〜５０００ｍｇ／ｌの濃度で含有する又はＭｇ2+イオンを、４８ｍｇ／ｌより高く最大で５０００ｍｇ／ｌまでの濃度で含有する又はＣａ2+イオンとＭｇ2+イオンとを前記濃度で含有する発酵培地を使用することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法において、発酵培地が、最少塩培地であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法において、発酵を、２４〜７２時間の時間にわたって実施することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポタンパク質−突然変異を有するエシェリキア・コリ菌株を使用した異種タンパク質の発酵的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質医薬品（医薬タンパク質／バイオロジクス）に関する市場は、近年に大きく成長している。その際、特に重要なタンパク質医薬品は、真核生物のタンパク質、とりわけ哺乳動物タンパク質及びヒトのタンパク質である。重要な医薬タンパク質の例は、サイトカイン、成長因子、プロテインキナーゼ、タンパク質ホルモン及びペプチドホルモン並びに抗体及び抗体フラグメントである。医薬タンパク質の製造コストが依然として非常に高いことに基づき、効率化されたことで廉価となったその製造のための方法及び系が絶え間なく探求されている。
【０００３】
一般に、組み換えタンパク質は、哺乳類細胞培養と微生物系のいずれかにおいて製造される。微生物系は、こうすることで組み換えタンパク質がより短時間でかつ少ないコストで製造できるという利点を、哺乳類細胞培養に対して有している。組み換えタンパク質の製造のためには、従ってとりわけ細菌が適している。その非常によく調査された遺伝学及び生理学と、短い発生時間と、容易な取り扱いに基づき、グラム陰性の腸内細菌であるエシェリキア・コリは、目下、組み換えタンパク質の製造のために最も頻繁に使用される生物である。Ｅ．コリでは、組み換えタンパク質は、通常は、種々の様式で製造することができる：
１．  可溶性タンパク質として細胞内産生；
２．  封入体（"インクルージョンボディー"）として細胞内産生；
３．  ペリプラズムへの分泌。
【０００４】
ペリプラズムでの標的タンパク質の集積は、細胞内産生に対して種々の利点を有する：
１）分泌された標的タンパク質のＮ末端アミノ酸残基が、必ずしもメチオニンである必要はなく、産物の天然の開始アミノ酸と同一であってよいこと、
２）ペリプラズムもしくは発酵培地におけるプロテアーゼ活性が、細胞質中よりも明らかに低いこと、
３）場合により必要となるジスルフィド結合の形成が、酸化条件下で、かつペリプラズム性のシャペロンによって可能となること
である。
【０００５】
Ｅ．コリは、タンパク質を細胞質膜を通じてペリプラズムへと輸送するための種々の系を有する。組み換えタンパク質の分泌的製造のためには、最も頻繁に、Ｓｅｃ系が使用される。その際、所望のタンパク質の遺伝子を、通常Ｅ．コリからＳｅｃ装置を利用して排出されるようなタンパク質（例えばＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、ＳｔＩＩ、Ｌｐｐ、ＭａｌＥ）のシグナル配列と機能的に結合させる。しかしながら、異種のシグナル配列、例えば同様にＥ．コリのＳｅｃ装置によって認識されるα−ＣＧＴアーゼ−シグナル配列も使用することができる（ＥＰ０４４８０９３号）。Ｓｅｃ系の場合に、タンパク質は、折り畳まれていない状態で細胞質膜を通じて輸送され、引き続きペリプラズムで初めて折り畳まれる。
【０００６】
組み換えタンパク質の製造方法は、その際常に、２つの部分に分かれる。第一の部分は、粗産物をもたらす発酵である。粗産物とは、この場合には、組み換えタンパク質と、更にくわえて不純物となる宿主固有のタンパク質とを含有する発酵成果物を指す。製造方法の第二の部分は、粗産物から出発する組み換えタンパク質の精製を含む。
【０００７】
組み換えタンパク質の労力と費用は、発酵直後に組み換えタンパク質と並んで宿主タンパク質を含む混合物として存在する粗産物の製造コストの他に、実質的に、所望の組み換えタンパク質へと粗産物を精製するコストによっても決められる。精製は、たいていの場合に、クロマトグラフィー法による複数の段階を介して行われる。その際、部分的に免疫原となるか又は毒性がある不純物としての宿主タンパク質の除去精製が重要な役割を担う。この場合に、ペリプラズム産生のような細胞内産生は、以下の欠点を有する：
１．  細胞を分解せねばならないこと
２．  標的タンパク質を多くの宿主タンパク質から精製せねばならないこと
である。
【０００８】
細胞内産生では、標的タンパク質がしばしば部分的に誤った折り畳みで存在する結果にもなる。
【０００９】
従って特に、Ｅ．コリにおける組み換えタンパク質のための製造方法であって、標的タンパク質が高収率でかつ正しい折り畳みで発酵培地に直接分泌される方法が好ましい。
【００１０】
文献においては、一連のＥ．コリ菌株とＥ．コリ菌株を用いた一連の方法が開示されており、それによって組み換えタンパク質の発酵培地への分泌が達成される（Ｓｈｏｋｒｉ他著のＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０（２００３），６５４−６６４；Ｍｅｒｇｕｌｈａｏ他著のＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２３（２００５），１７７−２０２、ＣｈｏｉとＬｅｅ著のＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４（２００４），６２５−６３５を参照）。
【００１１】
ＥＰ０３３８４１０号及びＥＰ０４４８０９３号では、発酵培地中での大量のタンパク質分泌を示すＥ．コリの"分泌突然変異体"の製造及び使用が開示されている。好適なＥ．コリ−分泌突然変異体の製造のための出発菌株としては、特にｍｉｎＡ突然変異及び／又はｍｉｎＢ突然変異を有する細胞（例えばＤＳ４１０）又は外膜の１種もしくは複数種のタンパク質に突然変異を有する細胞（例えばＢＷ７２６１）を使用することができる。これらの細胞は、更に、例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンでの処理によって突然変異誘発手順に供された。引き続き、その際例えば細胞壁活性物質のＤ−シクロセリンに対する耐性についての選択が行われるか、又は改善されたタンパク質分泌についてのスクリーニングが、分泌可能なデンプン分解性酵素であるα−シクロデキストリン−グリコシル−トランスフェラーゼ（αＣＧＴアーゼ）を指標タンパク質として使用した場合のアミロペクチン−アズール−寒天培地におけるハロー形成の分析によって行われる。前記のようにして作製された分泌突然変異体を用いて、異種タンパク質、例えばαＣＧＴアーゼもしくはヒルジン誘導体が、２４０ｍｇ／ｌもしくは２．６３ｇ／ｌの細胞外収率で製造することができた。前記の分泌突然変異体の大きな欠点は、突然変異誘発とスクリーニングとによる費用のかかる製造手順にある。更に、その製造は、無指向性の突然変異誘発段階を含み、それは所望の突然変異の他に、不所望な突然変異ももたらすことがある。
【００１２】
ＥＰ０４９７７５７号は、生物学的に活性な、従って正しく折り畳まれた異種タンパク質を培養培地中に分泌するＥ．コリ菌株の製造方法において、Ｅ．コリ菌株を突然変異誘発剤で処理し、バクテリオファージＴ７に対する耐性によって、外膜に改変を有する突然変異体を探し、そして"培地中へのタンパク質分泌"の特性について試験する方法を記載している。係る菌株で培地中に達成されるタンパク質収率は、しかしながら非常に低い（５ｍｇ／ｌ未満）。ここではまた、他の欠点は、係る菌株の費用がかかりかつ再現性に乏しい製造にある。
【００１３】
先行技術に記載されたアプローチは、以下の欠点の少なくとも１つを有する：
ａ）産生系を用いて、同種のタンパク質又はまったく特定のタンパク質しか細胞外で十分に高い収率で製造できないこと、又は
ｂ）系が原則的に種々のタンパク質の製造のために適している場合に、それによって今まで経済的観点から低い収率しか達成されなかったこと、又は
ｃ）培養に引き続き、例えば標的タンパク質と融合相手との開裂のような更なる工程を行わねばならず、これは、後処理を費用のかかるものにすること、又は
ｄ）タンパク質を発酵培地中に高い収率で分泌できる分泌菌株の作製が、費用のかかる突然変異誘発法及びスクリーニング法によってのみ可能であること
である。
【００１４】
その他に、原則的に、いわゆる"漏出性（Ｌｅａｋｙ）"菌株の使用の可能性がある。その菌株とは、Ｅ．コリ又はサルモネラ菌の突然変異体であって、外膜に欠陥を有し、従ってペリプラズム性タンパク質を部分的に発酵培地中に放出する突然変異体を表す。それは、非特異的な機構である（ＬａｚｚａｒｏｎｉとＰｏｒｔａｌｉｅｒ著（１９８１）、Ｊ．Ｂａｃｔ．１４５，１３５１−５８）。係る"漏出性"突然変異体の一例は、外膜に改変されたリポタンパク質部分を有する菌株（例えばｌｐｐ突然変異体）である（Ｈｉｒｏｔａ他著（１９７７年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，１４１７−２０；ＹｅｍとＷｕ著（１９７８年）、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３３，１４１９−２６；Ｓｕｚｕｋｉ他著（１９７８年）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６７，１−９）。
【００１５】
ｌｐｐ突然変異体が、細胞固有のペリプラズム性タンパク質、例えばアルカリ性ホスファターゼＰｈｏＡ又はＲＮアーゼＩを発酵培地中に放出することは知られている。係る菌株は、ＥＤＴＡ、種々の界面活性剤及び色素に対して極めて感受性である（Ｆｕｎｇ他著（１９７８年）、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３３，１４６７−７１；Ｓｕｚｕｋｉ他著（１９７８年）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６７，１−９；Ｈｉｒｏｔａ他著（１９７７年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，１４１７−２０）。
【００１６】
Ｅ．コリのｌｐｐ突然変異体を工業的規模で異種タンパク質の製造のために使用することは、今まで記載されていない。それどころか、常に、ｌｐｐ突然変異体にも属するＥ．コリの"漏出性"菌株は十分に頑強でなく、従って大工業的培養のためには適していないことが指摘されている（ＥＰ０３５７３９１号；ＷａｎとＢａｎｅｙｘ著（１９９８年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓ．Ｐｕｒｉｆ．１４，１３−２２；Ｓｈｏｋｒｉ他著（２００３年）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０：６５４−６４；Ｒａｙ他著（２００２年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓ．Ｐｕｒｉｆ．２６，２４９−５９）。
【００１７】
ここで僅かな文献において、ｌｐｐ突然変異体の研究室規模での使用は、この菌株の純粋な特性決定の枠を超えている。ここで、Ｅ．コリのｌｐｐ欠失突然変異体は、その特性に基づきペリプラズム性タンパク質を部分的に発酵培地中に放出し、開裂可能なシグナルペプチドを有する排出タンパク質をコードする潜在的な毒性遺伝子を病原性微生物からハロー形成スクリーニングを介して同定するためのツールとして使用された（Ｇｉｌａｄｉ他著（１９９３年）、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７５，４１２９−３６）。異種の標的タンパク質は、その際、Ｅ．コリ固有のペリプラズム性のアルカリ性ホスファターゼとの融合タンパク質として作製され、そして融合タンパク質として発酵培地中に分泌された。
【００１８】
他のアプローチでは、Ｅ．コリのマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とペディオコッカス・アシジラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）由来のバクテリオシンであるペディオシンＡｃＨ（ＰａｐＡ）とからなる融合タンパク質を、Ｅ．コリのｌｐｐ挿入突然変異体を使用して細胞外集積させることが記載されている（Ｍｉｌｌｅｒ他著（１９９８年）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４，１４−２０）。ここでもまた、異種の標的タンパク質は、細胞固有のタンパク質との融合タンパク質として培養培地中に分泌された。
【００１９】
両方の刊行物は、融合タンパク質を振盪フラスコ中で研究室規模において複雑かつ高価な研究室用培地（例えばルリア−ベルタニブロス）中で製造することを記載している。
【００２０】
更に、Ｋａｎａｍｏｒｉ他（１９８８年、Ｇｅｎｅ ６６，２９５−３００）、Ｍｏｒｉｓｈｉｖａ他（１９９４年、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７３，１９３−２０４）及びＵＳ５２２３４８２号には、ｌｐｐ突然変異体のＪＥ５５０５（Ｓｕｚｕｋｉ他著（１９７８年）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６７，１−９）を、最大７０個のアミノ酸から比較的容易に合成されている真核生物のポリペプチドの細胞外製造のために使用することが開示されている。それぞれ培養に使用される最少塩培地Ｍ９ＣＡは、更に、カザミノ酸の補給と共に高価な錯体成分を含有する。発酵工程では、経済的な方法にとっては関心が持たれない最大５０ｍｇ／ｌといった低い細胞外産物収率のみを達成できるにすぎず、これは恐らく前記の発酵条件下で該菌株の頑強性が不足していることに起因する。
【００２１】
更に、ｌｐｐ突然変異体が、外膜のベシクルを切り離すこと（ＭｃＢｒｏｏｍとＫｕｅｈｎ著、２００５年５月１２日、２．２．４章、Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｉｎ Ａ．Ｂｏｅｃｋ，Ｒ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ，Ｊ．Ｂ．Ｋａｐｅｒ，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｔ．Ｎｙｓｔｒｏｅｍ，Ｋ．Ｅ．Ｒｕｄｄ，ａｎｄ Ｃ．Ｌ．Ｓｑｕｉｒｅｓ（ｅｄ．），ＥｃｏＳａｌ−Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．［Ｏｎｌｉｎｅ．］ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｃｏｓａｌ．ｏｒｇ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）、そして発酵培地中に放出されたタンパク質がこのベシクル中に包含されていること（ＫｅｓｔｙとＫｕｅｈｎ著（２００４年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２０６９−７６）が記載されている。それによって、該タンパク質は、ジスルフィド結合形成の通常の過程と、複雑なタンパク質の折り畳みのためにペリプラズムで必要とされるペリプラズム性の異性体化系から免れる。従って、平均的な当業者は、複雑な異種のタンパク質の場合に誤った又は不完全な折り畳みに導かれるということから出発する。
【００２２】
融合タンパク質としてのタンパク質の産生も正しく折り畳まれていないタンパク質の産生も望ましくない。それというのも、標的タンパク質の労力のかかる高価な後処理が必要となるからである。このように、融合タンパク質の場合には、所望の標的タンパク質は、費用をかけて、特定の化学薬品又は酵素によって融合相手から開裂させ、精製せねばならない。誤って折り畳まれたタンパク質の場合には、面倒な変性手順と再フォールディング手順が必要となる。
【特許文献１】ＥＰ０４４８０９３号
【特許文献２】ＥＰ０３３８４１０号
【特許文献３】ＥＰ０４９７７５７号
【特許文献４】ＥＰ０３５７３９１号
【特許文献５】ＵＳ５２２３４８２号
【非特許文献１】Ｓｈｏｋｒｉ他著、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０（２００３），６５４−６６４
【非特許文献２】Ｍｅｒｇｕｌｈａｏ他著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２３（２００５），１７７−２０２
【非特許文献３】ＣｈｏｉとＬｅｅ著、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４（２００４），６２５−６３５
【非特許文献４】ＬａｚｚａｒｏｎｉとＰｏｒｔａｌｉｅｒ著（１９８１）、Ｊ．Ｂａｃｔ．１４５，１３５１−５８
【非特許文献５】ＹｅｍとＷｕ著（１９７８年）、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３３，１４１９−２６
【非特許文献６】Ｓｕｚｕｋｉ他著（１９７８年）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６７，１−９
【非特許文献７】Ｆｕｎｇ他著（１９７８年）、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３３，１４６７−７１
【非特許文献８】Ｈｉｒｏｔａ他著（１９７７年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，１４１７−２０
【非特許文献９】ＷａｎとＢａｎｅｙｘ著（１９９８年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓ．Ｐｕｒｉｆ．１４，１３−２２
【非特許文献１０】Ｒａｙ他著（２００２年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓ．Ｐｕｒｉｆ．２６，２４９−５９
【非特許文献１１】Ｇｉｌａｄｉ他著（１９９３年）、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７５，４１２９−３６
【非特許文献１２】Ｍｉｌｌｅｒ他著（１９９８年）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４，１４−２０
【非特許文献１３】Ｋａｎａｍｏｒｉ他（１９８８年）、Ｇｅｎｅ ６６，２９５−３００
【非特許文献１４】Ｍｏｒｉｓｈｉｖａ他（１９９４年）、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７３，１９３−２０４
【非特許文献１５】ＫｅｓｔｙとＫｕｅｈｎ著（２００４年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２０６９−７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の課題は、Ｅ．コリ菌株によって工業的規模で異種のタンパク質を発酵培地中で製造するための方法であって、該タンパク質が高収率で発酵培地中に分泌され、かつ異種のタンパク質が更なる後処理なくして発酵培地から直接的に精製することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
前記課題は、ｌｐｐ遺伝子中又はｌｐｐ遺伝子のプロモーター領域に突然変異を有し、かつシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合されている異種のタンパク質をコードする遺伝子を有するＥ．コリ菌株を、工業的規模で、Ｃａ2+イオンを４ｍｇ／ｌより高い濃度で含有するか又はＭｇ2+イオンを４８ｍｇ／ｌより高い濃度で含有する発酵培地中で発酵させ、その際、該Ｅ．コリ菌株が、異種のタンパク質を発酵培地中に分泌し、かつ該タンパク質を発酵培地から分離することを特徴とする方法によって解決される。
【００２５】
高い収率とは、その際、培養の終わりに発酵培地中で、有利には５００ｍｇ／ｌより高いタンパク質濃度を有利には有することを表し、あるいは既に良好な収率で産生できるタンパク質の場合には、目下の技術水準により製造できるその１１０％より高い収率を表す。
【００２６】
ｌｐｐ遺伝子中に突然変異を有するＥ．コリ菌株は、文献に記載されている（Ｈｉｒｏｔａ他著（１９７７年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，１４１７−２０；ＹｅｍとＷｕ著（１９７８年）、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３３，１４１９−２６）。
【００２７】
更に、当業者には、任意のＥ．コリ菌株からｌｐｐ突然変異体を作製する方法は知られている。塩基配列において、ｌｐｐ野生型遺伝子の配列とは突然変異に基づき相違しているＤＮＡ配列は、ｌｐｐアレルとも呼称する。文献で同義語として使用されるｌｐｐ遺伝子についての名称は、ｍｌｐＡ又はｌｐｏである。
【００２８】
ここで、ｌｐｐアレルは、例えばＰ１−ファージによる遺伝子導入によって、又は接合によって、ｌｐｐ突然変異を有する菌株からｌｐｐ野生株に移入させることができ、その際、ｌｐｐ野生型遺伝子はｌｐｐアレルと交換される。
【００２９】
更に、当業者には、ｌｐｐアレルの作製のための他の方法は知られている。係るｌｐｐアレルは、一般に、簡素化のため、まずインビトロで作製され、そして引き続き細胞の染色体中に組み込まれ、それによって本来存在していたｌｐｐ野生型遺伝子が交換され、こうしてｌｐｐ突然変異体が作製される。ｌｐｐ遺伝子のアレルは、例えば出発材料としてｌｐｐ野生型遺伝子のＤＮＡを用いて非特異的又は狙いを定めた突然変異誘発によって製造することができる。ｌｐｐ遺伝子内部又はｌｐｐ遺伝子のプロモーター領域内部の非特異的な突然変異は、例えば化学剤、例えばニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸などによって及び／又は物理的方法及び／又は規定の条件下で実施されるＰＣＲ反応によって作製することができる。ＤＮＡ断片内の特定部位に突然変異を挿入するための方法は公知である。ここで、例えばｌｐｐ遺伝子及びそのプロモーター領域を含むＤＮＡ断片中の１つ以上の塩基の交換は、ＰＣＲによって好適なオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して実施することができる。
【００３０】
記載された方法によってインビトロで作製されたｌｐｐアレルは、簡単な標準的方法によって、宿主細胞の染色体中に、ｌｐｐ野生型遺伝子／プロモーターの代わりに組み込むことができる。これは、例えばＬｉｎｋ他（１９９７年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６２２８−３７）において記載された、染色体突然変異を遺伝子中に相同組み換えの機構によって組み込むための方法によって実施できる。全ｌｐｐ遺伝子又はその一部の染色体内欠失の挿入は、例えばλ−Ｒｅｄ レコンビナーゼ系を用いて、ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ（２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６６４０−５）によって記載された方法に従って可能である。
【００３１】
Ｅ．コリのｌｐｐ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）は、配列番号２の配列を有するＬｐｐタンパク質をコードしている。その際、最初の６０個のヌクレオチドは、Ｌｐｐタンパク質のペリプラズムへの分泌を制御し、かつこの移行過程の間に再び開裂されるシグナルペプチドをコードしている。ｌｐｐ遺伝子のプロモーター領域は、ＩｎｏｕｙｅとＩｎｏｕｙｅ（１９８５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３，３１０１−１０）で定義されている。
【００３２】
ｌｐｐ遺伝子中の突然変異は、有利にはｌｐｐ遺伝子中又はｌｐｐ遺伝子のプロモーター領域中の１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は挿入であって、ｌｐｐ遺伝子がもはや発現されないもしくは僅か少しだけ発現されるか、又はＬｐｐタンパク質の機能の低下を伴うＬｐｐタンパク質のアミノ酸配列の改変をもたらすものである。
【００３３】
突然変異に基づき低減されたｌｐｐ遺伝子の発現は、本発明の範囲では、細胞において、野生型菌株Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ：２７３２５）の細胞と比較してＬｐｐタンパク質量が最大で８０％しか検出できない場合を指す。これは、例えば抗Ｐａｌ抗体を用いたＬｐｐタンパク質の免疫学的定量化によって行うことができる（Ｃａｓｃａｌｅｓ他著（２００２年）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４，７５４−９）。
【００３４】
更に、当業者には、Ｌｐｐタンパク質の機能の低下を測定するための種々の方法は知られている。ここで、例えば発酵培地中に遊離される指標タンパク質である"アルカリ性ホスファターゼ"の活性の測定によって測定可能なＥ．コリのペリプラズム性のタンパク質の発酵培地中での出現（漏出性）か、界面活性剤、ＥＤＴＡ又は規定の色素に対する高められた感受性か、又は抗生物質であるグロボマイシンに対する高められた耐性か、又はＬｐｐタンパク質の低減された機能の示唆としての電子顕微鏡写真におけるいわゆる泡（Ｂｌｅｂ）形成の観察が用いられる（Ｈｉｒｏｔａ他著（１９７７年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，１４１７−２０；ＹｅｍとＷｕ著（１９７８年）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３３，１４１９−２６；Ｚｗｉｅｂｅｌ他著（１９８１年）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５，６５４−６５６）。
【００３５】
本発明の範囲における、細胞内のＬｐｐ機能の低下は、有利には、ｌｐｐ遺伝子中もしくはｌｐｐ遺伝子のプロモーター領域中の突然変異に基づき、細胞固有のペリプラズム性のタンパク質である"アルカリ性ホスファターゼ"の全活性の少なくとも１０％が発酵の間に細胞から発酵培地中に遊離した場合か、又はグロボマイシンに対する細胞の耐性が、ｌｐｐ野生型菌株のＷ３１１０と比較して２倍だけ高められている場合を指す。
【００３６】
特に、ｌｐｐ遺伝子中の突然変異であって、配列番号２の位置７７のアルギニン残基をシステイン残基で交換した突然変異体（ｌｐｐ１突然変異体）と、配列番号２の位置１４のグリシン残基をアスパラギン酸残基で交換した突然変異体（ｌｐｐ３突然変異体）とが好ましい。
【００３７】
同様に、ｌｐｐ遺伝子自体における又はｌｐｐ遺伝子のプロモーター領域における少なくとも１つのヌクレオチドの欠失に基づき、細胞がペリプラズム性のタンパク質について高められた漏出性を示すこととなる突然変異が好ましい。
【００３８】
その際、高められた漏出性とは、細胞が発酵の後に、Ｅ．コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）菌株より高い濃度のペリプラズム性のタンパク質、例えばアルカリ性ホスファターゼを栄養培地中に有することを表す。
【００３９】
ｌｐｐ突然変異体中で製造可能なタンパク質は、異種のタンパク質である。異種のタンパク質とは、Ｅ．コリＫ１２株のプロテオームに属さない、すなわち天然の全タンパク質装備に属さないタンパク質を表す。天然でＥ．コリＫ１２株中に存在する全てのタンパク質は、Ｅ．コリＫ１２の公知のゲノム配列（Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３）から誘導することができる。更に、本発明の範囲における"異種のタンパク質"という概念は、Ｅ．コリのタンパク質との融合タンパク質を含まない。
【００４０】
その際、異種のタンパク質は、それぞれの異種のタンパク質について特徴的な比活性もしくはその作用（機能）の５０％より高く、有利には７０％より高く、特に有利には９０％より高くを示す。
【００４１】
異種の、特に有利には真核生物のタンパク質であって１つ以上のジスルフィド結合を有するタンパク質又は異種の、特に有利には真核生物のタンパク質であってその機能形では二量体又は多量体として存在するタンパク質が好ましい。真核生物のタンパク質のための例は、抗体及びそのフラグメント、サイトカイン、成長因子、プロテインキナーゼ並びにタンパク質ホルモンである。
【００４２】
本発明による方法によって、異種のタンパク質であってその機能形において二量体もしくは多量体として存在する、すなわち四次構造を有し、かつ複数の同一の（同種の）サブユニット又は非同一の（異種の）サブユニットから構成されているタンパク質を、高収率で正しい活性な二量体もしくは多量体の構造において発酵培地から、単量体のタンパク質鎖が分泌のためのシグナルペプチドと結合されており、かつＳｅｃ形によってペリプラズムに輸送される場合に得ることができる。それは、ホモダイマーもしくはホモマルチマーでも、ヘテロダイマーもしくはヘテロマルチマーの場合にも、従ってサブユニットのタンパク質鎖がそのアミノ酸配列において異なるタンパク質の場合にもうまくいく。その際、特に好ましいのは、多くの種々のタンパク質鎖から構成されているタンパク質、従ってヘテロダイマーもしくはヘテロマルチマーである。そのことが全く予測されなかったのは、係るタンパク質の場合に、個々のタンパク質鎖が、Ｓｅｃ系によってまず、互いに無関係にペリプラズムに輸送されるはずであり、そこで通常は、ペリプラズム性の酵素及びシャペロンの共作用下で正しい二次構造、三次構造及び四次構造に折り畳まれもしくは会合されるからである。ここで、当業者は今まで、発酵培地中でのタンパク質の遊離は、係る複雑なフォールディング過程及び会合過程によって妨害され、かつ係るタンパク質を機能形で分泌することは従って特に困難であるということから出発していた。
【００４３】
多くのタンパク質サブユニットから構成される特に重要なタンパク質のクラスは、抗体である。抗体は、研究、診断において、かつ療法剤としても広範囲で使用されるので、特に効率的でかつ工業的規模で可能な製造方法が必要である。
【００４４】
抗体では、全長抗体と抗体フラグメントで区別される。全長抗体は、４つのタンパク質鎖と、２つの同一の重鎖と、２つの同一の軽鎖とからなる。種々の鎖は、ジスルフィド結合によって互いに結合されている。各重鎖は、可変領域（ＶH）と定常領域とから構成され、後者は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ドメインＣＨ２とＣＨ３とを含みかつＦｃ領域とも呼称される重鎖の領域は、抗原結合に関与せず、例えば補体系の活性化のような他の機能を有する。各軽鎖は、可変領域（ＶL）と定常領域とから構成され、後者はドメインＣLを含む。重鎖のアミノ酸配列に依存して、抗体（免疫グロブリン）は、５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分類される。全長抗体という概念とは、軽鎖がそれぞれドメインＶL及びＣLを含み、かつ重鎖が実質的にドメインＶH−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３から構成されているあらゆる抗体であって、従って該抗体が特異抗原を結合できる特性の他に、他の機能（例えば補体系の活性化）を実行できる抗体を表す。
【００４５】
更に、抗体フラグメントは、単に全長抗体の一部から、通常は抗原結合部位を一緒に含む部分からなる。抗体フラグメントのための例は、とりわけ、ｉ）軽鎖がそれぞれドメインＶL及びＣLを含み、かつ重鎖がそれぞれドメインＶH及びＣＨ１を含むＦａｂフラグメント、ｉｉ）原則的にＦａｂフラグメントであるが、ＣＨ１ドメインのＣ末端に更に１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂ′フラグメント、又はｉｉｉ）２つのＦａｂ′フラグメントがＣＨ１ドメインのＣ末端にあるシステイン残基によってジスルフィド結合を介して互いに結合されているＦ（ａｂ′）2フラグメントである。
【００４６】
抗体フラグメントの製造のためには、既にＥ．コリが使用されているが、その製造はその際、細胞質かペリプラズムのいずれかで実施された。両方の場合において、Ｅ．コリ細胞を分解せねばならず、かつ抗体フラグメントを残りのＥ．コリのタンパク質から分離せねばならない。
【００４７】
ＵＳ６２０４０２３号及びＥＰ０３９６６１２号は、Ｆａｂフラグメントの細胞外製造を記載している。収率は、１リットルあたり数ミリグラムの範囲にある。Ｂｅｔｔｅｒ他（１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，４５７−６１）は、キメラのＦａｂ′−及びＦ（ａｂ′）2−抗体フラグメントを、Ｅ．コリ菌株Ｗ３１１０ａｒａ-を用いて細胞外で製造することを記載している。また、その際に達成される２００〜７００ｍｇ／ｌの収率は、工業的規模では経済的な方法のためには低すぎる。
【００４８】
全長抗体は、Ｅ．コリにおいて今まではもっぱら、ペリプラズムにおいて正しい四次構造で製造することができた（ＷＯ０２／０６１０９０号）。抗体を得るためには、その際、細胞を分解することが必要である。その収率は、最大で１５６ｍｇ／ｌと非常に低かった。８８０ｍｇまでのより高い収率は、抗体鎖の他に、ｄｓｂタンパク質もしくはＦｋｐＡのようなペリプラズム性のフォールディング補助因子をプラスミドで同時発現させた場合にのみ達成された。該抗体は、多くの他のＥ．コリのタンパク質から精製せねばならなかった。
【００４９】
本発明の範囲での試みにおいて、驚くべきことに、Ｅ．コリのｌｐｐ突然変異体を抗体フラグメントの製造のために使用した場合に、工業的規模で、１ｇ／ｌより高い細胞外収率が得られることが示された。好ましい抗体フラグメントは、その際、Ｆａｂ、Ｆａｂ′及びＦ（ａｂ′）2フラグメント、特に有利にはＦａｂフラグメントである。
【００５０】
更に、全長抗体の製造に際しても、本発明による方法によって、正しく折り畳まれた機能的な細胞外の抗体が高い収率で得られることは驚くべきことであった。好ましい全長抗体は、その際、ＩｇＧクラス及びＩｇＭクラスの抗体、特にＩｇＧクラスの抗体である。
【００５１】
細胞質からペリプラズムへのタンパク質の分泌のためには、生産されるべきタンパク質の遺伝子の５′末端が、タンパク質排出のためのシグナル配列の３′末端と読み枠内で（ｉｎ ｆｒａｍｅ）結合されていることが必要である。そのために、原則的には、Ｅ．コリにおいて標的タンパク質の移行をＳｅｃ装置によって可能とするあらゆるシグナル配列の遺伝子が適している。以下の種々のシグナル配列は、先行技術において記載されており、例えば以下の遺伝子：ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＴ、ｌａｍＢ、ｍａｌＥ、スタフィロコッカスのプロテインＡ、ＳｔＩＩなどのシグナル配列である（ＣｈｏｉとＬｅｅ（２００４年））。有利には、Ｅ．コリのｐｈｏＡ遺伝子及びｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列が好ましく、特に配列番号３の配列を有するクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｍ５ａ１由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列が好ましい。
【００５２】
シグナル配列と組み換え標的タンパク質の遺伝子とからなる少なくとも１つの融合物を含むＤＮＡ分子の製造は、当業者に公知の方法に従って行われる。
【００５３】
ここで、標的タンパク質の遺伝子を、まずＰＣＲによってプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用して増幅させ、それを引き続き通常の分子生物学的技術によって、シグナルペプチドの配列を含みかつ標的タンパク質の遺伝子と同様に作製されたＤＮＡ分子と、読み枠内融合（ｉｎ ｆｒａｍｅ Ｆｕｓｉｏｎ）、すなわちシグナル配列と標的タンパク質の遺伝子を含む通しの読み枠が生ずるように結合させることができる。選択的に、上述の両方の機能的断片を含む全ＤＮＡ分子を遺伝子合成によって製造することもできる。前記のシグナル配列−組み換え遺伝子融合物を、次いで、ベクター、例えばプラスミド中に導入することもでき、又は直接的に公知の方法に従って宿主細胞の染色体中に組み込むこともできる。有利には、シグナル配列−組み換え遺伝子融合物はプラスミドに導入される。
【００５４】
複数の種々のサブユニットからなるタンパク質を、細胞質からペリプラズムへと分泌させるためには、産生されるべきサブユニットのそれぞれの遺伝子（標的遺伝子）の５′末端を、読み枠内で、タンパク質排出のためのシグナル配列の３′末端と結合させる必要がある。その際、異なるサブユニットの遺伝子を異なるシグナル配列と結合させることなどが可能である。異なるシグナル配列との結合が好ましく、特に、１つのサブユニットをＥ．コリのｐｈｏＡ遺伝子もしくはｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列と結合させることが好ましく、かつ第二のサブユニットを配列番号３の配列を有するクレブシエラ・ニューモニアエ由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列と結合させることが好ましい（ＥＰ０４４８０９３号）。
【００５５】
個々のサブユニットのシグナル配列−標的遺伝子融合物を、次いで、ベクター、例えばプラスミド中に導入することもでき、又は直接的に公知の方法に従って宿主細胞の染色体中に組み込むこともできる。その際、個々のサブユニットのシグナル配列−標的遺伝子融合物を、別々であるが、互いに和合性のプラスミドにクローニングすることができ、又は該融合物を１つのプラスミドにクローニングすることもできる。その際、遺伝子融合物は、１つのオペロンにまとめることができ、又は該融合物を、それぞれ別個のシストロンで発現させることもできる。ここでは１つのオペロンにまとめることが好ましい。まさに、両方の遺伝子構築物を、１つのオペロンにまとめることができ、又はそれぞれ別個のシストロンで、宿主細胞の染色体中に組み込むこともできる。ここでも１つのオペロンにまとめることが好ましい。
【００５６】
有利には、シグナル配列と、分泌されるべきタンパク質をコードする組み換え遺伝子とからなるＤＮＡ発現構築物は、Ｅ．コリ中で機能的な発現シグナル（プロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、リボソーム結合部位、ターミネーター）を備えている。
【００５７】
プロモーターとしては、当業者に公知のあらゆるプロモーター、例えば一方では誘導可能なプロモーター、例えばｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ａｒａプロモーター又はｔｅｔプロモーター又はそれらから誘導される配列が適している。他方では、構成的プロモーター、例えばＧＡＰＤＨプロモーターを使用することによって持続的な発現を行うこともできる。しかしながら、通常は、産生されるべき組み換えタンパク質の遺伝子と結合されたプロモーターを使用することもできる。
【００５８】
産生されるべきタンパク質のためのこの発現構築物（プロモーター−シグナル配列−組み換え遺伝子）を、次いで、当業者に公知の方法を使用してｌｐｐ突然変異を有する細胞中に導入する。
【００５９】
それは、例えばベクター上で、例えばプラスミド上で、例えば公知の発現ベクターの誘導体、例えばｐＪＦ１１８ＥＨ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３又はｐＥＴ上で行われる。プラスミドのための選択マーカーとしては、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又は別の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が適している。
【００６０】
従って本発明によれば、有利には、組み換え遺伝子が、Ｅ．コリ中で活性のシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合されており、有利には更にＥ．コリ中で機能的な発現シグナルが、有利にはプロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、リボソーム結合部位及びターミネーターが設けられているＥ．コリ菌株が使用される。それは、有利には既に上述した発現シグナルである。
【００６１】
発現プラスミドで形質転換された細胞の培養（発酵）は、工業的規模で、通常の当業者に公知の発酵法に従ってバイオリアクター（発酵器）中で行われる。
【００６２】
発酵は、有利には、通常のバイオリアクター、例えば撹拌槽、気泡塔型発酵器又はエアリフト型発酵器中で行われる。特に撹拌槽型発酵器が好ましい。その際、工業的規模とは、臨床試験のためにもしくは医薬タンパク質を含有する医薬品の認可後に患者に使用するために十分な量で医薬タンパク質を製造するための発酵器のサイズである。従って有利には、５ｌより大きい容量を有する発酵器、特に有利には５０ｌより大きい容量を有する発酵器である。
【００６３】
発酵に際して、タンパク質産生菌株の細胞を、液体培地中で１６〜１５０時間の期間にわたり培養し、その際、種々のパラメータ、例えば栄養物質の供給、酸素分圧、ｐＨ値及び培養の温度が絶えず調節され、かつ厳密に制御される。培養の時間は、有利には２４〜７２時間である。
【００６４】
発酵培地としては、原則的に当業者に公知の、微生物の培養のためのあらゆる通常の培地が該当する。
【００６５】
その際、複合培地又は、規定の割合の複合成分、例えばペプトン、トリプトン、酵母エキス、蜜ろう又はコーンスティープリカーが添加された最少塩培地を用いることができる。その際、Ｃａ2+イオンを４ｍｇ／ｌ〜最大で５０００ｍｇ／ｌ、特に有利には１０ｍｇ／ｌ〜５０００ｍｇ／ｌ、殊に有利には４０ｍｇ／ｌ〜５０００ｍｇ／ｌの濃度で含有するか又はＭｇ2+イオンを４８ｍｇ／ｌより高くないし最大で５０００ｍｇ／ｌの濃度で含有する培地が好ましい。特に、Ｃａ2+イオンとＭｇ2+イオンとを上述の濃度で含有する培地が好ましい。
【００６６】
医薬タンパク質（医薬活性タンパク質）の製造のためには、化学的に定義された塩培地、従って完全培地に対して厳密に定義された基質組成を有する培地が好ましい。感受性の微生物は、係る培地中では増殖しない又はゆっくりと増殖することは知られている。従って、ｌｐｐ突然変異を有し、並びにＥ．コリ中で機能的なシグナルペプチドをコードするシグナル配列と読み枠内で結合されている異種タンパク質をコードする遺伝子を有するＥ．コリ菌株を、Ｃａ2+イオン及びＭｇ2+イオンを含有する定義された塩培地中で増殖させることで、多量の異種タンパク質がその塩培地中に分泌されることは予想外であり驚くべきことであった。
【００６７】
前記方法において、ｌｐｐ突然変異を有し、並びにＥ．コリ中で機能的なシグナルペプチドをコードするシグナル配列と読み枠内で結合されている異種タンパク質をコードする遺伝子を有するＥ．コリ菌株は、ｌｐｐ突然変異を有さない菌株に匹敵する短い発酵時間で匹敵する高い細胞密度まで増殖し、その際に多量の異種タンパク質をその塩培地中に分泌する。その際、特に、Ｃａ2+イオンを４ｍｇ／ｌ〜最大で５０００ｍｇ／ｌ、特に有利には１０ｍｇ／ｌ〜５０００ｍｇ／ｌ、殊に有利には４０ｍｇ／ｌ〜５０００ｍｇ／ｌの濃度で含有するか又はＭｇ2+イオンを４８ｍｇ／ｌより高くないし最大で５０００ｍｇ／ｌの濃度で含有する塩培地が好ましい。特に、Ｃａ2+イオンとＭｇ2+イオンとを上述の濃度で含有する塩培地が好ましい。
【００６８】
発酵のために最重要な炭素源としては、原則的に、細胞によって利用可能なあらゆる糖、糖アルコール又は有機酸もしくはそれらの塩を使用することができる。その際、グルコース、ラクトース又はグリセリンを使用することが好ましい。特に、グルコース及びラクトースが好ましい。また複数の種々異なる炭素源を組み合わせて供給することも可能である。その際、炭素源は、発酵の開始時に完全に発酵培地中に仕込むこともでき、又は開始時には炭素源を全く仕込まないかもしくは一部のみを仕込み、発酵の過程において炭素源を追加供給してもよい。その際、特に、炭素源の一部を仕込み、そして一部を供給する実施態様が好ましい。特に、炭素源を、１０〜３０ｇ／ｌの濃度で仕込み、濃度が５ｇ／ｌ未満に落ち込んだら供給を開始し、そして濃度が５ｇ／ｌ未満に保持されるように構成することが好ましい。
【００６９】
培養中の酸素分圧（ｐＯ2）は、有利には１０〜７０％飽和である。有利には、ｐＯ2は、３０〜６０％飽和であり、特に有利にはｐＯ2は、４５〜５５％飽和である。
【００７０】
培養のｐＨ値は、有利にはｐＨ６〜ｐＨ８である。有利には、ｐＨ値は、６．５〜７．５で調整され、特に有利には培養のｐＨ値は、６．８〜７．２に保持される。
【００７１】
培養の温度は、有利には１５〜４５℃である。２０〜４０℃の温度範囲が好ましく、特に２５〜３５℃の温度範囲が好ましく、殊に３０℃が好ましい。
【００７２】
上記の条件下で、ｌｐｐ突然変異を有し、並びにＥ．コリ中で機能的なシグナルペプチドをコードするシグナル配列と読み枠内で結合されている異種タンパク質をコードする遺伝子を有するＥ．コリ菌株は、短い発酵時間で生産規模で、すなわち５ｌより大きい作業容量を有する発酵器において通常の細胞密度にまで増殖し、その際、多量の異種タンパク質をその発酵培地中に分泌する。
【００７３】
粗産物からの分泌されたタンパク質の精製は、通常の当業者に公知の精製法、例えば先行技術において知られた方法によって行うことができる。通常は、第一段階において、遠心分離又は濾過のような分離法によって、細胞と分泌された標的タンパク質とを分離する。標的タンパク質を、次いで、例えば限外濾過によって濃縮し、次に沈降、クロマトグラフィーもしくは限外濾過のような標準的方法によって更に精製することができる。特に、その場合に、既に正しく折り畳まれたタンパク質の本来のコンフォメーションを利用する親和性クロマトグラフィーのような方法が好ましい。
【００７４】
次の実施例は、本発明を更に説明するために用いられるものである。
【００７５】
使用される全ての分子生物学的方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子合成、ＤＮＡの単離及び精製、制限酵素、クレノウ断片及びリガーゼによるＤＮＡの改変、形質転換などは、当業者に公知のように、文献に記載されるように、又はその都度製造元に推奨されるようにして実施した。
【実施例】
【００７６】
実施例１：Ｅ．コリ野生株からの染色体ｌｐｐ欠失突然変異体の作製
Ｅ．コリ野生株Ｗ３１１０（米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）：２７３２５）のｌｐｐ欠失突然変異体をλ−レコンビナーゼを用いて作製するために、ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒの方法（２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６６４０−５）に従って実施した。その際、まずポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、プライマーとしてオリゴヌクレオチドｌｐｐ１（配列番号４）とｌｐｐ２（配列番号５）を使用し、かつ鋳型としてプラスミドｐＫＤ３（大腸菌ストックセンター（ＣＧＳＣ）：７６３１）を使用して、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有し、かつｌｐｐ遺伝子の上流領域もしくは下流領域のそれぞれ５０塩基対から隣接されている直鎖状ＤＮＡ断片を作製した。
【００７７】
菌株Ｗ３１１０を、まずプラスミドｐＫＤ４６（ＣＧＳＣ：７７３９）で形質転換した。こうして得られたＷ３１１０ ｐＫＤ４６の、ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒの指示に従って製造されたコンピテント細胞を、ＰＣＲにより作製された直鎖状のＤＮＡ断片で形質転換した。Ｗ３１１０の染色体中にｌｐｐ遺伝子の位置でクロラムフェニコール耐性カセットを組み込んだことに対する選択を、２０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢアガープレート上で実施した。前記のようにして、ｌｐｐ遺伝子がほぼ完全にクロラムフェニコール耐性遺伝子と交換された細胞が得られた。染色体中の正しい位置で組み込みが行われたことは、ＰＣＲによってオリゴヌクレオチドｐｙｋＦ（配列番号６）とｙｎｈＧ２（配列番号７）を使用し、かつ鋳型としてクロラムフェニコール耐性細胞の染色体ＤＮＡを使用して確認した。
【００７８】
その細胞から、プラスミドｐＫＤ４６を記載された手順（ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ）に従ってキュアリングし、前記のように作製された菌株を、Ｗ３１１０ｌｐｐ：：ｃａｔと呼称した。菌株Ｗ３１１０ｌｐｐ：：ｃａｔの染色体からのクロラムフェニコール耐性カセットの除去は、ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒによる刊行物に従って、ＦＬＰ−レコンビナーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＣＰ２０（ＣＧＳＣ：７６２９）を用いて実施した。最後に前記手順により得られたクロラムフェニコール感受性のＷ３１１０のｌｐｐ欠失突然変異体を、Ｗ３１１０Δｌｐｐと呼称した。
【００７９】
実施例２：Ｅ．コリ野生株からの染色体ｌｐｐ１突然変異体の作製
菌株Ｗ３１１０の染色体中のｌｐｐ野生型遺伝子とｌｐｐ１アレルとの交換は、相同組み換えによって実施した。そのために、以下のように実施した：
遺伝子合成によって、ｌｐｐ１アレルと、ｌｐｐ野生型遺伝子の３′側にあるＤＮＡ領域の約２００塩基対とを有するＤＮＡ分子（配列番号８）を製造した。更に、このＤＮＡ分子は、両末端に、それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩのためのそれぞれ１つの切断部位を有する。そのｌｐｐ１アレルは、配列番号８の塩基８〜２４５を含む。ｌｐｐ野生型遺伝子（配列番号１）との差異において、ｌｐｐ１アレルは、ｌｐｐ遺伝子の位置２２９に塩基置換（ＣからＴ）を有し、それは未処理のＬｐｐタンパク質において位置７７のアルギニン残基のシステイン残基への交換をもたらす。遺伝子合成によって作製された配列番号８を有するＤＮＡ分子を、完全に制限酵素ＢａｍＨＩによって切断した。クローニングベクターｐＫＯ３（Ｌｉｎｋ他著（１９９７年）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６２２８−３７；Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００ Ｌｏｎｇｗｏｏｄ Ａｖｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ ０２１１５）を、まず同様に制限酵素ＢａｍＨＩによって切断した。前記のように直鎖化されたプラスミドを、後に該ベクターの再ライゲーションを回避するために、引き続きアルカリ性ホスファターゼで処理した。前記のようにして切断されたＤＮＡ分子を互いにライゲーションした。こうして作製されたプラスミドを、ｐＫＯ３−ｌｐｐ１と呼称した（図１）。菌株Ｗ３１１０を、ＣａＣｌ2法によってプラスミドｐＫＯ３−ｌｐｐ１で形質転換し、その際、アンピシリンを用いてプラスミド保有細胞について選択した。ｌｐｐ野生型遺伝子とｌｐｐ１アレルとの引き続いての交換は、相同組み換えの機構を介して、Ｌｉｎｋ他（１９９７）に記載される手順に従って行った。前記の交換が正確な塩基で染色体中の正しい位置で行われたことは、染色体のｌｐｐ領域を、ＰＣＲによってオリゴヌクレオチドｐｙｋＦ（配列番号６）とｙｎｈＧ２（配列番号７）を使用し、かつ誤認されたｌｐｐ１突然変異体の染色体ＤＮＡを鋳型として使用してまず増幅させ、そして引き続きそのＰＣＲ産物を同一のオリゴヌクレオチドと一緒に配列決定することによって調べた。
【００８０】
最後に前記のように作製されたＷ３１１０のｌｐｐ１突然変異体を、Ｗ３１１０ｌｐｐ１と呼称した。
【００８１】
実施例３：Ｅ．コリ野生株からの染色体ｌｐｐ３突然変異体の作製
ｌｐｐ１突然変異体と同様にｌｐｐ遺伝子中に１つの点突然変異のみを有するＷ３１１０の染色体ｌｐｐ３突然変異体を作製する際に、実施例２と同様に実施したが、配列番号８を有するＤＮＡ断片の代わりに、同様に遺伝子合成によって製造された配列番号９を有するＤＮＡ分子を使用したことが異なる。このＤＮＡ分子は、ｌｐｐ３アレル（塩基２１１〜４４７）と、ｌｐｐ野生型遺伝子の５′側にあるＤＮＡ領域の約２００塩基対とを有する。更に、このＤＮＡ分子は、両末端に、それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩのためのそれぞれ１つの切断部位を有する。ｌｐｐ３アレルは、配列番号１との差異において、ｌｐｐ遺伝子の位置４１に塩基置換（ＧからＡ）を有し、これは、まだ処理されていないＬｐｐタンパク質において位置１４のグリシン残基のアスパラギン酸残基への交換をもたらす。それぞれＢａｍＨＩで切断されたプラスミドｐＫＯ３と、ｌｐｐ３アレルを有するＤＮＡ分子のＤＮＡ断片のライゲーションによって作製されたプラスミドｐＫＯ３−ｌｐｐ３（図２）を、前記のように菌株Ｗ３１１０中に形質転換した。Ｌｉｎｋ他による手順によって、最後に菌株Ｗ３１１０ｌｐｐ３が得られた。菌株の調査は、実施例２に記載されるように実施した。
【００８２】
実施例４：ｌｐｐ突然変異体による１０ｌ規模でのシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼの発酵的製造
配列番号１０を有し、クレブシエラ・ニューモニアエＭ５ａ１由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）遺伝子を有するＤＮＡ断片（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｍ１５２６４）を、遺伝子合成によって製造した。このＤＮＡ断片を、発現ベクターｐＪＦ１１８ｕｔ（図３）中にクローニングした。該ベクターは、ＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養収集館（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）で番号ＤＳＭ１８５９６として寄託されている。ｐＪＦ１１８ｕｔは、公知の発現ベクターｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の誘導体であり、β−ラクタマーゼ遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子の他に、さらに同様にプラスミド上に存在するＬａｃＩｑ遺伝子産物によって再始動されかつ例えばＤ−ラクトースもしくはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のようなインデューサーによってスイッチオンすることができるｔａｃプロモーターをも有する。プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔを、制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に切断し、かつそれぞれ直鎖状ＤＮＡ断片の５′末端で突出した塩基を、Ｓ１ヌクレアーゼで分解した。前記のようにして予備調製されたベクターＤＮＡ分子を、ＣＧＴアーゼを含むＤＮＡ断片（配列番号１０）とＴ４−リガーゼを使用してライゲーションした。菌株ＤＨ５αを、ライゲーションバッチでＣａＣｌ2法に従って形質転換し、その際、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によってプラスミド保有細胞について選択した。アンピシリン耐性形質転換体から、再びプラスミドを単離し、そして制限分析によって調査した。前記のようにして作製された、ＣＧＴアーゼ遺伝子の発現がｔａｃプロモーターの制御下にあるプラスミドを、ｐＣＧＴと呼称した（図４）。
【００８３】
シクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼの１０ｌ規模での製造のために、菌株Ｗ３１１０Δｌｐｐ、Ｗ３１１０ｌｐｐ１及びＷ３１１０ｌｐｐ３を、それぞれプラスミドｐＣＧＴでＣａＣｌ2法によって形質転換した。プラスミド保有細胞についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって実施した。
【００８４】
製造は、１０ｌの撹拌槽型発酵器中で実施した。
【００８５】
６ｌの発酵培地ＦＭ４（１．５ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4；５ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4；０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ；０．１５ｇ／ｌのＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、０．０７５ｇ／ｌのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ；１ｇ／ｌのＮａ3クエン酸塩×２Ｈ2Ｏ；０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ；１ｍｌ／ｌの微量元素溶液（０．１５ｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ；２．５ｇ／ｌのＮａ3ＢＯ3；０．７ｇ／ｌのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ；０．２５ｇ／ｌのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ；１．６ｇ／ｌのＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ；０．３ｇ／ｌのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ）；５ｍｇ／ｌのビタミンＢ1；３ｇ／ｌのフィトン；１．５ｇ／ｌの酵母エキス；１０ｇ／ｌのグルコース；１００ｍｇ／ｌのアンピシリン）で満たされた発酵器に、１：１０の比率で、一晩同じ培地中で培養された前培養を植えた。発酵の間に、３０℃の温度に調整し、そしてｐＨ値をＮＨ4ＯＨもしくはＨ3ＰＯ4を計量供給することによって７．０の値に一定に保った。グルコースは、発酵にわたって計量供給され、その際、発酵培地中の最大グルコース濃度を１０ｇ／ｌ未満にすることに努めた。発現の誘導は、対数増殖期の終わりにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭで添加することによって実施した。
【００８６】
７２時間の発酵後に、試料を取りだし、細胞を発酵培地の遠心分離によって分離し、発酵上清中のＣＧＴアーゼ含有率を以下の活性試験によって測定した：
試験バッファー：５ｍＭのトリス塩酸バッファー（＞ｐＨ６．５）、５ｍＭのＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ
基質：試験バッファー（ｐＨ６．５）中の１０％のＮｏｒｅｄｕｘ溶液
試験バッチ：１ｍｌの基質溶液＋１ｍｌの遠心分離され、場合により希釈された培養上清（５分、１２０００ｒｐｍ）＋３ｍｌのメタノール
反応温度：４０℃
【００８７】
酵素試験：
・  溶液を予熱する（約５分、４０℃で）。
【００８８】
・  酵素溶液を基質溶液に添加する；迅速に混合する（渦ミキサ（Ｗｈｉｒｌ−Ｍｉｘｅｒ））。
【００８９】
・  ４０℃で３分間インキュベートする。
【００９０】
・  酵素反応をメタノールの添加によって停止させる；迅速に混合する（渦ミキサ）。
【００９１】
・  バッチを氷上で冷却する（約５分間）。
【００９２】
・  遠心分離（５分、１２０００ｒｐｍ）をし、そして澄明な上清をピペットで取り出す。
【００９３】
・  生じたＣＤをＨＰＬＣによって分析する。
【００９４】
酵素活性：Ａ＝Ｇ*Ｖ１*Ｖ２／（ｔ*ＭＧ）（ユニット／ｍｌ）
Ａ＝活性
Ｇ＝ＣＤの含有率（ｍｇ／ｌ）＝試験バッチ：単位表面×１０4／標準溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）／単位表面
Ｖ１＝試験バッチにおける希釈係数（前記のように実施した場合：Ｖ１＝５）
Ｖ２＝試験で使用する前の培養上清の希釈係数；非希釈の場合：Ｖ２＝１
ｔ＝反応時間（分）
ＭＧ＝分子量（ｇ／モル）（ＣＤ＝９７３ｇ／モル）
１ユニット＝１マイクロモルの産物／分
【００９５】
前記のように測定されたＣＧＴアーゼ活性から、発酵上清中に存在するＣＧＴアーゼの量を計算することができる。その際、１５０Ｕ／ｍｌのＣＧＴアーゼ活性は、約１ｇ／ｌのＣＧＴアーゼタンパク質に相当する。
【００９６】
第１表は、それぞれ達成されたシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ収率を示している。
【００９７】
第１表：７２時間の発酵後の発酵上清中でのシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ収率
【表１】
2008073046.tif 000002
【００９８】
実施例５：ｌｐｐ突然変異体による１０ｌ規模でのヒルジン誘導体の発酵的製造
ヒルジンは、６５個のアミノ酸を有するポリペプチドであり、天然に薬用蛭から単離された。この実施例においては、Ｎ末端アミノ酸配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒルジン誘導体の発酵的製造を記載する。
【００９９】
ヒルジン誘導体の製造のために、菌株Ｗ３１１０Δｌｐｐ、Ｗ３１１０ｌｐｐ１及びＷ３１１０ｌｐｐ３を、まずそれぞれプラスミドｐＣＭＴ２０３でＣａＣｌ2法によって形質転換した。プラスミド保有細胞についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって実施した。
【０１００】
プラスミドｐＣＭＴ２０３は、アンピシリンに対する耐性のための遺伝子の他に、とりわけＣＧＴアーゼ−シグナル配列の３′末端で読み枠内で融合されているヒルジン誘導体の構造遺伝子をも有する。ＣＧＴアーゼ−シグナル配列−ヒルジン−融合物の発現は、ｔａｃプロモーターの制御下にある。プラスミドｐＣＭＴ２０３は、ＥＰ０４４８０９３号Ｂ１に記載されている。
【０１０１】
ヒルジン誘導体の１０ｌ規模での製造は、実施例４に記載される方法と同様にして、菌株Ｗ３１１０Δｌｐｐ／ｐＣＭＴ２０３、Ｗ３１１０ｌｐｐ１／ｐＣＭＴ２０３及びＷ３１１０ｌｐｐ３／ｐＣＭＴ２０３を用いて実施した。７２時間の発酵後に、試料を取りだし、引き続き細胞を発酵培地の遠心分離によって分離し、そして発酵上清中のヒルジン含有率を、Ｃｈａｎｇ（１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１０８３９−４３）に記載されるようなトロンビン−不活性化試験によって測定した。その際、１６０００のアンチトロンビン（ＡＴ）ユニット／ｍｌのヒルジン活性は、約１ｇ／ｌのヒルジン−タンパク質に相当する。第２表は、それぞれ達成された発酵上清中でのヒルジン収率を示している。
【０１０２】
第２表：７２時間の発酵後の発酵上清中のヒルジン収率（ＡＴ−Ｕ／ｍｌ及びｇ／ｌ）
【表２】
2008073046.tif 000003
【０１０３】
実施例６：ｌｐｐ突然変異体による１０ｌ規模でのインターフェロンα２ｂの発酵的製造
更なる医薬品として関心が持たれる、Ｅ．コリのｌｐｐ突然変異体によって細胞外で製造できるタンパク質は、インターフェロンα２ｂである。インターフェロンα２ｂ遺伝子のための発現ベクターの作製において、以下のように実施した：
配列番号１１を有し、ＥＰ０２２０７１４号に記載されるＣＧＴアーゼ−シグナル配列（配列番号３）とインターフェロンα２ｂのための遺伝子とからなる遺伝子融合物を有するＤＮＡ断片を、遺伝子合成によって製造した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、そして同じ制限酵素で切断されている発現ベクターｐＪＦ１１８ｕｔとライゲーションした。このクローニングから得られた、インターフェロンα２ｂ遺伝子の発現がｔａｃプロモーターの制御下にあるプラスミドを、ｐＩＦＮ（図５）と呼称した。
【０１０４】
インターフェロンα２ｂの製造のために、菌株Ｗ３１１０Δｌｐｐ、Ｗ３１１０ｌｐｐ１及びＷ３１１０ｌｐｐ３を、まずそれぞれプラスミドｐＩＦＮでＣａＣｌ2法によって形質転換した。プラスミド保有細胞についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって実施した。
【０１０５】
インターフェロンα２ｂの１０ｌ規模での製造は、実施例４に記載される方法と同様にして、菌株Ｗ３１１０Δｌｐｐ／ｐＩＦＮ、Ｗ３１１０ｌｐｐ１／ｐＩＦＮ及びＷ３１１０ｌｐｐ３／ｐＩＦＮを用いて実施した。７２時間の発酵後に、試料を取りだし、引き続き細胞を発酵培地の遠心分離によって分離し、発酵上清中のインターフェロンα２ｂ含有率を測定した。このために、発酵上清中のタンパク質を電気泳動によりＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で分離させ、そしてイムノブロットにおける抗インターフェロン特異抗体による検出によって以下のように定量化した：
１μｌの上清を、サンプルバッファーと混合した（２×Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−サンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＬＣ２６７６）：０．１２５Ｍのトリス塩酸（ｐＨ６．８）、４％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）のグリセリン、０．００５％（ｖ／ｖ）のブロモフェノールブルー、５％のβ−メルカプトエタノール）。更に、定義された量のインターフェロンα２ｂを、スタンダードとして一緒に施与した。タンパク質の変性を、１００℃に５分間加熱し、氷上で２分間冷却し、そして遠心分離することによって実施した。それらのタンパク質を、電気泳動によって、１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＮＰ０３４１）中で、１×ＭＥＳ含有ランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＮＰ０００２）を用いて分離させた（電気泳動パラメータ：２００Ｖで４０分間）。イムノブロットによる検出と定量化を、以下の仕様に従って実施した：
【０１０６】
湿式ブロッティング法での転写：
モジュール：Ａｍｅｒｓｈａｍ：Ｈｏｅｆｅｒ ＴＥ ２２ Ｍｉｎｉ Ｔａｎｋ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｕｎｉｔ、コード番号：８０−６２０４−２６。
【０１０７】
メンブレン：ニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，ＢＡ８５，硝酸セルロース（Ｅ），０．４５μｍの細孔サイズ）
Ｗｈａｔｍａｎフィルタとニトロセルロースメンブレンを、適切な大きさに切断し、そして発泡物品（スポンジ）で転写バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＬＣ３６７５）に気泡なく染み込ませた。
【０１０８】
積層の構成：黒い格子、カソードとの接続、各３ｍｍ厚を有する２つのスポンジ、Ｗｈａｔｍａｎペーパー、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、ＮＣメンブレン、Ｗｈａｔｍａｎ、６ｍｍ厚を有する１つのスポンジ、白い格子、アノードとの接続
転写条件：Ｉ＝２００ｍＡの一定の電流、Ｕ＝無制限、運転時間６０分
【０１０９】
プレハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で３０分間振り動かす。
【０１１０】
一次抗体のハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー＋０．１５μｇ／ｍｌ（→３．７５μｇ）の抗ヒトＩＦＮ抗体（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ，Ｂｉｏｚｏｌを経由した  カタログ番号：５００−Ｐ３２Ａ）中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で９０分間又は一晩振り動かす。
【０１１１】
洗浄
１×ＰＢＳと一緒に室温で１０秒間振り動かし、バッファーを捨てる。
１×ＰＢＳと一緒に室温で１５分間２回振り動かし、バッファーを捨てる。
【０１１２】
二次抗体のハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー＋２５μｌ（１：１０００）のヤギ抗ウサギＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｏｚｏｌを経由した  カタログ番号４０５０−０５）中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で６０分間振り動かす。
【０１１３】
洗浄
１×ＰＢＳと一緒に室温で１０秒間振り動かし、バッファーを捨てる。
１×ＰＢＳと一緒に室温で１５分間２回振り動かし、バッファーを捨てる。
【０１１４】
化学発光による検出
Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号２０１５２００）を準備する：Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔルミノール／エンハンサー溶液とＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ安定ペルオキシド溶液とを１：１の比率で混合する：ニトロセルロースメンブレン当たり３ｍｌ。
【０１１５】
ブロットを室温でＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質と一緒に５分間インキュベートし、過剰の水気を切り、メンブレンをラップフィルムで覆って、直ちにＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｘ−ＯＭＡＴ）を載せ、２分間暴露し、現像し、そして固定する。シグナルが弱い場合に、暴露をより長時間にわたり繰り返す。
【０１１６】
バッファー
プレハイブリダイゼーションバッファー：１×ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳
１０×ＰＢＳ：１００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１．５ＭのＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７．５、０．５％のＴｒｉｔｏｎ１００
１×ＰＢＳ：１０×ＰＢＳを完全脱塩水で１：１０希釈したもの
【０１１７】
定量化
定量的評価は、Ｂｉｏｒａｄ社製のＧＳ−８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒでイムノブロットをスキャンすることによって、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ １−Ｄ分析ソフト（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、施与されたスタンダードと比較することによって実施した。
【０１１８】
第３表において、前記のように測定された発酵上清中のインターフェロンα２ｂの収率を示す。
【０１１９】
第３表：７２時間の発酵後の発酵上清中でのインターフェロンα２ｂの収率
【表３】
2008073046.tif 000004
【０１２０】
実施例７：ｌｐｐ突然変異体による１０ｌ規模でのＦａｂ抗体フラグメントの発酵的製造
Ｅ．コリのｌｐｐ突然変異体を用いて、機能的なＦａｂ抗体フラグメントを細胞外で製造することもできる。その際、該細胞は、ドメインＶLとＣLとを含む軽鎖の相応のフラグメント及びドメインＶHとＣＨ１とを含む重鎖の相応のフラグメントを同時に合成し、次いでペリプラズム中に分泌し、最後には発酵培地中に分泌せねばならない。細胞質の外で、その際、両方の鎖の機能的なＦａｂフラグメントへの会合が行われる。
【０１２１】
本実施例は、良好に特徴付けられた抗リゾチーム抗体Ｄ１．３のＦａｂフラグメントの製造を記載する。
【０１２２】
抗リゾチームＦａｂフラグメントの遺伝子のクローニングと発現のための出発ベクターとして、プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔを使用した。このプラスミド中に、２つの連続した工程において、抗リゾチームＦａｂフラグメントの重鎖（ＶH−ＣH１−ドメイン）もしくは軽鎖（ＶL−ＣL−ドメイン）についての両方の読み枠を、それぞれシグナル配列を含めてクローニングした。そのために以下のように実施した：
配列番号１２を有するＤＮＡ断片（重鎖）を、遺伝子合成によって製造し、そして該ＤＮＡ断片は、Ｅ．コリのｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列と、Ｆａｂフラグメントの重鎖（ＶH−ＣＨ１）のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。この読み枠直後に６個のヒスチジンコドンが引き続き、従って融合タンパク質のＣ末端を形成している。このヒスチジンタグによって、後に完全に会合されたＦａｂフラグメントの簡単な精製が親和性クロマトグラフィーによって可能となる。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、そして同じ制限酵素で切断されている発現ベクターｐＪＦ１１８ｕｔとライゲーションした。このクローニングから得られた、重鎖のための遺伝子の発現がｔａｃプロモーターの制御下にあるプラスミドを、ｐＨＣ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ（図６）と呼称した。
【０１２３】
配列番号１３を有するＤＮＡ断片（軽鎖）を、同様に遺伝子合成によって製造し、そして該ＤＮＡ断片は、ＣＧＴアーゼのシグナル配列（配列番号３）と、Ｆａｂフラグメントの軽鎖（ＶL−ＣL）のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。このＤＮＡ断片を、まず、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、引き続き同じ制限酵素で切断されているベクターｐＨＣ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍとライゲーションした。こうして得られたプラスミドを、ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ（図７）と呼称した。前記のようにして、重鎖と軽鎖についてのそれぞれの読み枠からなる、ｔａｃプロモーターの制御下にある人工オペロンを作製した。
【０１２４】
従って、インデューサー（例えばＩＰＴＧ）の添加によって、両方の遺伝子の同期発現が可能である。
【０１２５】
抗リゾチームＦａｂフラグメントの製造のために、菌株Ｗ３１１０Δｌｐｐ、Ｗ３１１０ｌｐｐ１及びＷ３１１０ｌｐｐ３を、それぞれプラスミドｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍでＣａＣｌ2法によって形質転換した。プラスミド保有細胞についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって実施した。
【０１２６】
抗リゾチームＦａｂフラグメントの１０ｌ規模での製造は、実施例４に記載される方法と同様にして、菌株Ｗ３１１０Δｌｐｐ／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、Ｗ３１１０ｌｐｐ１／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ及びＷ３１１０ｌｐｐ３／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍを使用して実施した。７２時間の発酵後に、試料を取りだし、引き続き細胞を発酵培地の遠心分離によって分離した。
【０１２７】
発酵上清からの抗リゾチームＦａｂフラグメントの精製は、Ｓｋｅｒｒａ（１９９４年、Ｇｅｎｅ １４１，７９−８４）に記載される親和性クロマトグラフィーによって実施した。
【０１２８】
精製された抗リゾチームＦａｂフラグメントの定量化並びに活性の測定は、抗原としてリゾチームを用いたＥＬＩＳＡ試験（Ｓｋｅｒｒａ，１９９４年、Ｇｅｎｅ １４１，７９−８４）によって実施した。
【０１２９】
第４表において、それぞれ２０ｍｌの発酵上清から７２時間の発酵後に単離することができた機能的な抗リゾチームＦａｂフラグメントの収率を列記する。
【０１３０】
第４表：７２時間の発酵後の発酵上清中での抗リゾチームＦａｂフラグメントの収率
【表４】
2008073046.tif 000005
【０１３１】
実施例８：実施例８：ｌｐｐ突然変異体による１０ｌ規模での全長抗体の発酵的製造
Ｅ．コリのｌｐｐ突然変異体を用いて、機能的な全長抗体を細胞外で製造することもできる。Ｆａｂフラグメントの製造と同様に、該細胞は、抗体の軽鎖と重鎖を同時に合成し、次いでペリプラズム中に分泌し、最後には発酵培地中に分泌せねばならない。次いで、細胞質の外で、両方の鎖の機能的な全長抗体への会合が行われる。
【０１３２】
本実施例は、抗組織因子（αＴＦ）ＩｇＧ１−抗体の製造を記載している。
【０１３３】
抗αＴＦ抗体の遺伝子のクローニングと発現のための出発ベクターとして、プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔを使用した。このプラスミド中に、２つの連続した工程において、抗αＴＦ抗体の重鎖もしくは軽鎖についての両方の読み枠を、それぞれシグナル配列を含めてクローニングした。そのために以下のように実施した：
配列番号１４を有するＤＮＡ断片（重鎖）を、遺伝子合成によって製造し、そして該ＤＮＡ断片は、Ｅ．コリのｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列と、抗αＴＦ抗体の重鎖のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。このＤＮＡ断片を、まず、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、そして同じ制限酵素で切断されている発現ベクターｐＪＦ１１８ｕｔとライゲーションした。このクローニングから得られた、重鎖のための遺伝子の発現がｔａｃプロモーターの制御下にあるプラスミドを、ｐＨＣ−Ａｎｔｉ−ＴＦ（図８）と呼称した。
【０１３４】
配列番号１５を有するＤＮＡ断片（軽鎖）を、同様に遺伝子合成によって製造し、そして該ＤＮＡ断片は、ＣＧＴアーゼのシグナル配列（配列番号３）と、抗αＴＦ抗体の軽鎖のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。このＤＮＡ断片を、まず、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、引き続き同じ制限酵素で切断されているベクターｐＨＣ−Ａｎｔｉ−ＴＦとライゲーションした。こうして得られたプラスミドを、ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ（図９）と呼称した。前記のようにして、重鎖と軽鎖についてのそれぞれの読み枠からなる、ｔａｃプロモーターの制御下にある人工オペロンを作製した。従って、インデューサー（例えばＩＰＴＧ）の添加によって、両方の遺伝子の同期発現が可能である。
【０１３５】
抗αＴＦ抗体の製造のために、菌株Ｗ３１１０Δｌｐｐ、Ｗ３１１０ｌｐｐ１及びＷ３１１０ｌｐｐ３を、それぞれプラスミドｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦでＣａＣｌ2法によって形質転換させた。プラスミド保有細胞についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって実施した。
【０１３６】
抗αＴＦ抗体の１０ｌ規模での製造は、実施例４に記載される方法と同様にして、菌株Ｗ３１１０Δｌｐｐ／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ、Ｗ３１１０ｌｐｐ１／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ及びＷ３１１０ｌｐｐ３／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦを用いて実施した。７２時間の発酵後に、試料を取りだし、引き続き細胞を発酵培地の遠心分離によって分離した。
【０１３７】
発酵培地中に分泌された抗αＴＦ抗体の定量化を、ＥＬＩＳＡ試験での活性測定によって、抗原（コーティング）として可溶性の組織因子を用い、かつ二次抗体としてペルオキシダーゼとコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＦ（ａｂ′）2−フラグメントを用いて、Ｓｉｍｍｏｎｓ他（２００２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３，１３３−４７）に記載されるようにして実施した。
【０１３８】
第５表において、前記のように測定された、機能的な抗αＴＦ抗体の収率を列記する。
【０１３９】
第５表：７２時間の発酵後の発酵上清中での抗αＴＦ抗体の収率
【表５】
2008073046.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、実施例２からのベクターｐＫＯ３−ｌｐｐ１を示している。
【図２】図２は、実施例３からのベクターｐＫＯ３−ｌｐｐ３を示している。
【図３】図３は、実施例４からのクローニングベクターｐＪＦ１１８ｕｔを示している。
【図４】図４は、実施例４からのＣＧＴアーゼ−発現プラスミドｐＣＧＴを示している。
【図５】図５は、実施例６からのインターフェロンα２ｂ発現プラスミドｐＩＦＮを示している。
【図６】図６は、実施例７からのプラスミドｐＨＣ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍを示している。
【図７】図７は、実施例７からのＦａｂ発現プラスミドｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍを示している。
【図８】図８は、実施例８からのプラスミドｐＨＣ−Ａｎｔｉ−ＴＦを示している。
【図９】図９は、実施例８からの抗ＴＦ抗体発現プラスミドｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦを示している。
【符号の説明】
【０１４１】
ｔａｃ ｐ／ｏ  ｔａｃ−プロモーター／オペレーター、  ｃｍＲ  クロラムフェニコール耐性、  ｌｐｐ１  アミノ酸交換Ａｒｇ７７Ｃｙｓ（Ｒ７７Ｃ）をもたらす塩基置換を有するｌｐｐ１アレル、  ｌｐｐ３  アミノ酸交換Ｇｌｙ１４Ａｓｐ（Ｇ１４Ｄ）をもたらす塩基置換を有するｌｐｐ３アレル、  Ｍ１３Ｏｒｉ  Ｍ１３−複製起点、  ｓａｃＢ  バシラス由来のレバンスクラーゼ遺伝子、  ｒｅｐＡ  ｐＳＣ１０１−複製起点、温度感受性、  ｒｒｎＢ  ターミネーター、  ｂｌａ  β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、  ＣｏｌＥ１  ＣｏｌＥ１−複製起点、  ＴｃＲ  テトラサイクリン耐性遺伝子、  ｌａｃＩｑ  ｔａｃプロモーターのリプレッサー、  ｃｇｔ−ＳＰ  ＣＧＴアーゼのシグナルペプチド、  ＣＧＴａｓｅ  ＣＧＴアーゼ遺伝子、  ＳＤ  シャイン−ダルガノ配列、  ＩＦＮａｌｐｈａ２ｂ  インターフェロンα２ｂ遺伝子、  ｏｍｐＡ−ＳＰ  ｏｍｐＡ−シグナルペプチド、  （ＶＨ）−ＣＨ１  ドメインＶＨ及びＣＨ１とＣ末端Ｈｉｓタグを有する重鎖のフラグメントのための読み枠、  （ＶＬ）−ＣＬ  ドメインＶＬ及びＣＬを有する軽鎖のフラグメントのための読み枠、  Ｈｉｓ−Ｔａｇ  Ｆａｂフラグメントの重鎖のＣ末端のＨｉｓタグ、  ＨＣ（Ａｎｔｉ−ＴＦ）  抗ＴＦ抗体の重鎖の読み枠、  ＬＣ（Ａｎｔｉ−ＴＦ）  抗ＴＦ抗体の軽鎖の読み枠
【図１】
2008073046.tif 000007
【図２】
2008073046.tif 000008
【図３】
2008073046.tif 000009
【図４】
2008073046.tif 000010
【図５】
2008073046.tif 000011
【図６】
2008073046.tif 000012
【図７】
2008073046.tif 000013
【図８】
2008073046.tif 000014
【図９】
2008073046.tif 000015
【配列表】
2008073046000001.app