(57)【要約】【課題】血小板を、他の血球成分や血液中の夾雑物からより明確に区別して測定することができる血小板測定用試薬を提供することを課題とする。【解決手段】血小板を染色するための色素としてカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素を含有する血小板測定用試薬により、上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板を染色するための色素としてカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素を含有する血小板測定用試薬。
【請求項２】
ｐＨが６．０〜１１．０である請求項１に記載の血小板測定用試薬。
【請求項３】
浸透圧が１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇである請求項１又は２に記載の血小板測定用試薬。
【請求項４】
色素の透過性を促進するための染色促進剤をさらに含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の血小板測定用試薬。
【請求項５】
前記染色促進剤がカチオン界面活性剤である請求項４に記載の血小板測定用試薬。
【請求項６】
前記色素が、血小板を脂質粒子から識別可能に染色する請求項１〜５のいずれか１項に記載の血小板測定用試薬。
【請求項７】
前記色素が、血小板を破砕赤血球から識別可能に染色する請求項１〜５のいずれか１項に記載の血小板測定用試薬。
【請求項８】
測定時のｐＨを一定に保つための緩衝剤を含有する第１試薬と、血小板を染色するための色素を含有する第２試薬とを含み、該色素がカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素である血小板測定用試薬キット。
【請求項９】
カプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種である血小板を染色するための色素と検体とを混合して測定用試料を調製し、
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定し、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて血小板を検出する
ことを含む血小板測定方法。
【請求項１０】
前記測定用試料が、フローサイトメータのフローセルに導入され、フローセル内を流れる測定用試料中の細胞に光が照射される請求項９に記載の血小板測定方法。
【請求項１１】
検出された血小板をさらに計数する請求項９又は１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板測定用試薬、試薬キット並びに測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの血液は、赤血球、白血球及び血小板の各種血球成分を含む。このうち血小板は、直径２〜３μｍの無核の細胞であり、正常なヒトの血液中には１５万〜３５万個／μｌが存在する。
しかし、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの血小板減少症や急性白血病などの疾患に罹患すると、血液中の血小板数が減少することが知られている。一般に、血液中の血小板数が１００００個／μｌより低くなると、輸血の必要性があると判断される。したがって、血小板数を迅速にかつ正確に測定することは、臨床現場において重要である。
【０００３】
従来知られた血小板測定の方法の一つは、電気抵抗を利用した方法である。これは、血小板を含む試料が２つの電極間を通過する際の電気インピーダンスのパルスを測定し、これをヒストグラム化して解析する方法である。しかし、電気抵抗を利用する方法では、検体によっては充分な測定精度が得られないという問題があった。
【０００４】
そこで、血小板の表面抗原に特異的な標識抗体を用いて、血小板の数を測定する方法が知られている（American Journal of Clinical Pathologists (2001):115, p.460-464；非特許文献１）。この方法は、精度が高い方法として知られているが、抗原抗体反応を用いる測定は、一般に、結果が得られるまでに長時間を要することが知られており、輸血の要否を判断するなどの緊急を要する臨床現場における血小板測定方法として用いるには、あまり適切でない。
【０００５】
血液中の細胞、すなわち白血球、網状赤血球、赤血球などの血球をフローサイトメトリの原理を用いて迅速に測定する方法が、従来知られている。このような測定方法として、例えば、特開平１０−２８２０９４号（特許文献１）には、全血試料中の網状赤血球、赤血球及び血小板の計数及び同定の方法、並びにその方法に用いる試薬組成物が開示されている。この特許文献１の方法では、カチオン性色素、特にオキサジン７５０を含む試薬混合物で網状赤血球を染色し、フローサイトメトリを用いて散乱光及び吸収光を測定し、これらの散乱光及び蛍光をパラメータとして網状赤血球を計数し、赤血球及び血小板と区別している。
【０００６】
また、特許第２６１３２５０号（特許文献２）には、赤色光を吸収する蛍光染料を含む試薬を未溶解の全血と接触させることを含む、未溶解の全血中の白血球を赤血球及び血小板から識別する方法が開示されている。赤色光を吸収する蛍光染料としてオキサジン染料を用い、これが白血球を染色するので、フローサイトメトリを用いた測定により、赤血球及び血小板から白血球を区別できることが記載されている。
【０００７】
さらに、特許第３４８５４３６号（特許文献３）には、少なくとも１つの網状赤血球を特異的に染色する色素と、白血球を特異的に染色する色素とからなる網状赤血球測定用試薬が開示されている。この特許文献にも、オキサジン系色素が白血球を特異的に染色できることが記載されている。
【０００８】
血小板の測定においては、血液中に出現する破砕赤血球や脂質などが、そのサイズが血小板と類似しているために、測定上の夾雑物として影響を与えることが知られている。特に、輸血の必要性があるような血小板数が低い検体での測定は、これらの夾雑物の影響がより大きくなる。しかしながら、上述した特許文献１〜３には、このような夾雑物の影響を抑えて、血小板をより高い精度で測定することについては記載されていない。
【０００９】
【特許文献１】特開平１０−２８２０９４号公報
【特許文献２】特許第２６１３２５０号公報
【特許文献３】特許第３４８５４３６号公報
【非特許文献１】American Journal of Clinical Pathologists (2001):115, p.460-464
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の現状に鑑み、本発明は、フローサイトメトリを用いる測定方法において、血小板を、他の血球成分や脂質粒子などの血液中の夾雑物からより明確に区別して測定することができる血小板測定用試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、血小板を染色するための色素としてカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素を含有する血小板測定用試薬である。
【００１２】
また、本発明は、測定時のｐＨを一定に保つための緩衝剤を含有する第１試薬と、血小板を染色するための色素を含有する第２試薬とを含み、該色素がカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素である血小板測定用試薬キットでもある。
【００１３】
本発明は、カプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種である血小板を染色するための色素と検体とを混合して測定用試料を調製し、
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定し、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて血小板を検出する
ことを含む血小板測定方法でもある。
【００１４】
今回、血小板染色用として見出された特定のオキサジン色素が、血小板と脂質粒子などの夾雑物とが区別可能な程度に血小板を特異的に染色できることは、今まで知られていなかった。このオキサジン色素は、血小板を蛍光染色することにより、フローサイトメトリで測定する際に血小板の蛍光強度を強くすることができる。これにより、血小板と脂質粒子などの夾雑物とを区別することができる。
なお、本明細書において、血液中の「夾雑物」とは、血小板の測定に影響を与え得る血液中の成分のことであり、脂質粒子、破砕赤血球などを含む。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の血小板測定用試薬を用いることにより、血小板の検出を妨げ得る夾雑物を含む検体であっても、このような夾雑物や血液中の他の血球成分の影響を抑えて、血小板をより高い精度でかつ迅速に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明者らは、フローサイトメトリを用いる測定方法において、血小板を、他の血球成分や脂質粒子などの血液中の夾雑物からより明確に区別して測定することができる血小板測定用試薬を得るために１００種類以上の色素を用いて研究を重ねた結果、ある特定のオキサジン色素が血小板を特異的に染色できることを見出して、本発明を完成した。本発明の血小板測定用試薬は、血小板を染色するための色素を含む。該色素は、血小板を特異的に染色することができる色素であり、カプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素である。該色素は、血小板を脂質粒子から識別可能に染色することができるものが好ましい。カプリブルーとしては、例えば次の式：
【化１】
2008111718.tif 000002
で表されるカプリブルーＧＯＮが挙げられる。ナイルブルーとしては、例えば次の式：
【００１７】
【化２】
2008111718.tif 000003
（式中、Ｘ-はＣｌ-又は１／２ＳＯ42-）
で表されるナイルブルーが挙げられる。ブリリアントクレシルブルーとしては、例えば次の式：
【００１８】
【化３】
2008111718.tif 000004
で表されるブリリアントクレシルブルーＡＬＤが挙げられる。これらの色素は、市販されており、例えば、カプリブルーＧＯＮはクロマ社から、ナイルブルーは東京化成、シグマ−アルドリッチ社から、ブリリアントクレシルブルーＡＬＤはシグマ−アルドリッチ社からそれぞれ入手することができる。
【００１９】
また、上記の血小板を染色するための色素は、さらに血小板を破砕赤血球から識別可能に染色できることがわかった。
【００２０】
上記の血小板を染色するための色素は、色素の種類によっても異なるが、検体と混合したときに０．０１〜５ｐｐｍとなる濃度で試薬に含まれることが好ましく、より好ましくは０．０５〜２．０ｐｐｍ程度である。特に、血小板を染色するための色素としてカプリブルーＧＯＮを用いて血小板を脂質粒子から識別する場合は０．１〜５．０ｐｐｍが好ましく、０．２〜２．０ｐｐｍがより好ましい。さらに、カプリブルーＧＯＮを用いて血小板を破砕赤血球から識別する場合は０．１〜２．０ｐｐｍが好ましく、０．２〜１．０ｐｐｍがより好ましい。ナイルブルーを用いる場合は０．０５〜５．０ｐｐｍが好ましく、０．１〜２．０ｐｐｍがより好ましい。さらに、ナイルブルーを用いて血小板を破砕赤血球から識別する場合は０．０５〜２．０ｐｐｍが好ましく、０．１〜１．０ｐｐｍがより好ましい。ブリリアントクレシルブルーＡＬＤを用いて血小板を脂質粒子から識別する場合は０．１〜５．０ｐｐｍが好ましく、０．５〜２．０ｐｐｍがより好ましい。さらに、ブリリアントクレシルブルーＡＬＤを用いて血小板を破砕赤血球から識別する場合は０．２〜５．０ｐｐｍが好ましく、０．５〜２．０ｐｐｍがより好ましい。
このような濃度範囲であれば、血小板と、他の血球成分及び夾雑物との区別がより良好になるので好ましい。
【００２１】
血小板測定用試薬は、ｐＨを一定に保つための緩衝剤を含有することができる。緩衝剤は、数ｍＭ〜１００ｍＭ程度の濃度で含有され得る。緩衝剤としては、通常用いられるものであれば特に限定されないが、例えばカルボン酸塩類、リン酸塩、グッドバッファー、タウリン、トリエタノールアミンなどを所望のｐＨに応じて用いることができる。
【００２２】
血小板測定用試薬は、ｐＨが６．０〜１１．０の範囲が好ましく、より好ましくは７．０〜１０．０、さらに好ましくは８．０〜９．５の範囲である。ｐＨが上記の範囲より低すぎる場合、赤血球が脆弱化して溶血しやすくなり、夾雑物である破砕赤血球の量が増加する可能性がある。また、ｐＨが上記の範囲より高すぎる場合、赤血球膜上の酸性官能基が解離してカチオン性である該色素と結合しやすくなり、破砕赤血球の非特異的染色が増加する場合がある。
【００２３】
血小板測定用試薬は、浸透圧が１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇが好ましく、より好ましくは２００〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇである。このような範囲の浸透圧であれば、生理的浸透圧により近いので、赤血球の低張溶血などを防ぐことができる。
上記の浸透圧を保つために、本発明の血小板測定用試薬は、浸透圧補償剤を含有することができる。浸透圧補償剤としては、通常用いられるものを用いることができ、例えばプロピオン酸などのアルカリ金属塩、グルコース、マンノースなどの糖類を挙げることができる。また、ＮａＣｌのようなアルカリ金属ハロゲン化物やアルカリ土類金属ハロゲン化物も用いることができる。上記の浸透圧補償剤は、１種又は２種以上を用いることができる。なお、上記の緩衝剤を用いて、試薬の浸透圧を上記の範囲に調整できる場合には、浸透圧補償剤は用いなくてもよい。
【００２４】
血小板測定用試薬は、色素の細胞への透過性を促進するための染色促進剤を含むことができる。染色促進剤としては、界面活性剤などが挙げられ、特にカチオン界面活性剤が好ましい。好ましいカチオン界面活性剤は、次の式（Ｉ）：
【００２５】
【化４】
2008111718.tif 000005
【００２６】
（式中、Ｒ11は炭素数８〜１２のアルキル基であり；Ｒ12、Ｒ13及びＲ14は同一又は異なって、炭素数１〜６のアルキル基であり；Ｙ-はアニオンである）
で表されるものである。
上記の式（Ｉ）において、炭素数８〜１２のアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれであってもよく、例えばオクチル基、デシル基、ラウリル基、セチル基、ミリスチル基などが挙げられる。
炭素数１〜６のアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれであってもよく、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル及びヘキシル基が挙げられる。なかでも、メチル又はエチル基が好ましい。
Ｙ-のアニオンとしては、臭素イオン又は塩素イオンが好ましい。
【００２７】
上記の式（Ｉ）の好ましいカチオン界面活性剤は、デシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＯＴＡＢ）、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド（ＬＴＡＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＭＴＡＢ）などが挙げられる。これらのカチオン界面活性剤は、１種又は２種以上を用いてもよい。
【００２８】
上記のカチオン界面活性剤は、血小板測定用試薬を検体と混合したときに、血小板の染色を促進することができ、赤血球の溶血を引き起こさない程度の濃度で試薬中に含有されるのが好ましい。そのような濃度は、カチオン界面活性剤の種類により異なるが、通常、５０〜２００００ｐｐｍ程度である。例えば、ＤＴＡＢを用いる場合、試薬中の濃度は、５００〜３０００ｐｐｍ程度が好ましい。また、例えばＬＴＡＣを用いる場合、試薬中の濃度は１００〜５００ｐｐｍ程度が好ましい。
【００２９】
血小板測定用試薬は、上記の成分以外に、例えば、２−ピリジルチオ−１−オキシドナトリウム、β−フェネチルアルコールなどの防腐剤を含んでいてもよい。
【００３０】
血小板測定用試薬は、上記の色素、並びに任意成分である緩衝剤、浸透圧補償剤、染色促進剤、防腐剤などを適切な溶媒に上記の適切な濃度で溶解することにより製造することができる。溶媒としては、これらの成分を安定に溶解することができるものであれば特に限定されず、水、水溶性有機溶媒などが挙げられる。水溶性有機溶媒としては、エタノール、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール又はこれらの混液を用いることができる。
上記の各成分を溶媒に溶解する順序としては特に限定されず、任意の順序で溶解させることができる。また、上記の各成分をそれぞれ別々に適切な溶媒にあらかじめ溶解させておき、用時に各溶液を混合して試薬を使用することもできる。このような形態も、本発明の範囲内である。例えば、上記の色素が水溶液中で不安定な場合には、色素を水溶性有機溶媒に溶解しておき、使用時に他の成分を含有する水溶液と混合して使用することができる。
【００３１】
このようにして製造した血小板測定用試薬は、検体と混合して反応させて測定用試料を調製することにより、検体に含まれる可能性がある血小板を染色することができる。本明細書において、検体とは、生体、特にヒトを含む哺乳動物から採取した血液（全血、多血小板血漿（ＰＲＰ）など）、骨髄液、また、これらを緩衝液などの適当な溶液で希釈することにより得られる試料などを意味する。
【００３２】
血小板測定用試薬と検体との混合比（容量比）は、試薬：検体＝１００：１〜１０００：１が好ましい。また、該試薬と検体との反応温度は、２５〜５０℃程度が好ましく、より好ましくは３５〜４５℃程度であり、反応時間は、色素の種類により異なるが、１０秒〜５分程度が好ましく、より好ましくは２０秒〜２分程度、さらに好ましくは２０秒〜６０秒程度である。
【００３３】
次いで、上記のようにして調製した測定用試料に光を照射して、測定用試料中の細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定する。光を照射するための装置としては、フローサイトメータが好ましい。フローサイトメータを用いる場合、該測定用試料は、フローサイトメータのフローセルに導入され、フローセル内を流れる測定用試料中の細胞に光が照射されることとなる。
用いるフローサイトメータの光源は特に限定されず、上記の色素の励起に好適な波長（例えば６００〜６８０ｎｍ付近）の光源を用いることができる。光源としては、例えば、赤半導体レーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザなどが挙げられる。特に半導体レーザは気体レーザに比べて非常に安価であり、好適である。
【００３４】
上記のようなフローサイトメータにおいて光を照射することにより細胞から発せられる散乱光は、前方散乱光（受光角度０〜２０°付近）又は側方散乱光（受光角度９０°付近）のいずれでもよい。また、前方散乱光としては、前方低角散乱光（受光角度１〜５°付近）又は前方高角散乱光（受光角度６〜２０°付近）のいずれでもよい。散乱光は、細胞の大きさに関する情報を反映するパラメータであることが知られている。
【００３５】
上記のようなフローサイトメータにおいて光を照射することにより細胞から発せられる蛍光については、使用する色素に応じて適当な受光波長を選択することができる。
【００３６】
上記のようにして得られた散乱光及び蛍光に基づいて、スキャッタグラムを作成することにより、血小板と、その他の血球成分及び脂肪粒子などの夾雑物とを区別して、血小板を検出することができる。このようにして検出された血小板を計数することもできる。血小板の検出及び／又は計数には、適切な解析用ソフトウェアを用いることが好ましい。
【００３７】
本発明の別の観点において、測定時のｐＨを一定に保つための緩衝剤を含有する第１試薬と、血小板を染色するための色素を含有する第２試薬とを含み、該色素がカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素である血小板測定用試薬キットが提供される。
該第１試薬における緩衝剤は、上記と同様のものを用いることができる。
これらの第１試薬及び第２試薬は、上記の緩衝剤及び血小板を染色するための色素をそれぞれ適切な溶媒に溶解したものであってよい。
【００３８】
上記の血小板測定用試薬キットは、本発明の測定用試薬に任意に含有され得る成分である浸透圧補償剤、染色促進剤、防腐剤などをさらに含有していてもよい。これらの成分は、上記の第１試薬又は第２試薬に含有されていてもよいし、これら以外の試薬成分としてキットに含有されていてもよい。
【００３９】
血小板測定用試薬キットの各試薬と、検体とを混合することにより、測定用試料を調製することができる。本発明の測定用試薬キットの各試薬と検体とを混合する順序としては、特に限定されない。これらの混合比（容量比）は、試薬キットの各試薬の合計：検体＝１００：１〜１０００：１が好ましい。
測定用試料を調製し、散乱光及び蛍光を測定し、これらに基づいて血小板を検出する方法については、上記と同様のことが当てはまる。
【００４０】
本発明は、さらに、カプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種である血小板を染色するための色素と検体とを混合して測定用試料を調製し、
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定し、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて血小板を検出する
ことを含む血小板測定方法でもある。
【実施例】
【００４１】
本発明を、以下の実施例に従ってより詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１〜３及び比較例１〜１２
次の組成の血小板測定用試薬を製造した。
（１）色素液
血小板を染色するための色素                                      以下に記載の濃度
エチレングリコール                                              １Ｌ
（２）希釈液
トリシン（緩衝剤）                                              １．８ｇ
ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド（ＬＴＡＣ）              ０．１５ｇ
精製水                                                          １Ｌ
（ｐＨ９．０、浸透圧２００ｍＯｓｍ／Ｋｇ・Ｈ2Ｏに調整）
【００４２】
血小板を染色するための色素として、次に示す色素を次に示す濃度で用いた。括弧内には、試薬と検体とが混合された時の最終濃度を示した。これらの色素の化学式は、図１に示すとおりである。
実施例
１  カプリブルーＧＯＮ（クロマ社製）              ２０．５ｐｐｍ（０．４ｐｐｍ）
２  ナイルブルークロリド（東京化成社製）          ２０．５ｐｐｍ（０．４ｐｐｍ）
３  ブリリアントクレシルブルーＡＬＤ（シグマ社製）  ５１．２５ｐｐｍ（１ｐｐｍ）
比較例
１    アズールＡ（シグマ社製）                      １０２．５ｐｐｍ（２ｐｐｍ）
２    アズールＤ（シグマ社製）                      １０２．５ｐｐｍ（２ｐｐｍ）
３    アズールＣ（シグマ社製）                      １０２．５ｐｐｍ（２ｐｐｍ）
４    メチレンブルーＮＮＸ（シグマ社製）            １０２．５ｐｐｍ（２ｐｐｍ）
５    クレシルバイオレットアセテート（シグマ社製）  １０２５ｐｐｍ（２０ｐｐｍ）
６    ベーシックグリーン５（東京化成社製）          １０２５ｐｐｍ（２０ｐｐｍ）
７    メチレンブルー（シグマ社製）                  １０２．５ｐｐｍ（２ｐｐｍ）
８    ニューメチレンブルー（Ｃｒｏｍａ社製）        １０２５ｐｐｍ（２０ｐｐｍ）
９    トルイジンブルー（東京化成社製）              １０２．５ｐｐｍ（２ｐｐｍ）
１０  オキサジン７５０（ナカライ社製）              １０２．５ｐｐｍ（２ｐｐｍ）
１１  オキサジン１（Ｅｘｃｉｔｏｎ社製）            １０２５ｐｐｍ（２０ｐｐｍ）
１２  オキサジン４（Ｅｘｃｉｔｏｎ社製）            １０２５ｐｐｍ（２０ｐｐｍ）
【００４３】
得られた希釈液１ｍＬをチューブに分注して４０℃の水槽で加温した。
これに、得られた色素液２０μＬ及び検体として健康なヒトの全血５μＬを添加して４０℃で２５秒間反応させ、６３３ｎｍの励起光源を有するフローサイトメータの検出部に導き、測定用試料中の細胞に励起光を照射し、該細胞から発せられる散乱光信号及び蛍光信号を検出し、得られた信号を解析して測定用試料中の血小板を測定した。
【００４４】
これらの測定により得られたスキャッタグラムを、図１−１、１−２及び１−３に示す。スキャッタグラム１は縦軸に前方散乱光強度、横軸に蛍光強度をとったものであり、スキャッタグラム２はスキャッタグラム１の縦軸をlogに変換したものである。スキャッタグラム２において、血小板が出現する領域を実線で示した。
図１の結果から、血小板を染色するための色素としてカプリブルー、ナイルブルー又はブリリアントクレシルブルーを用いる場合、他の色素を用いた場合と比べて、血小板の蛍光強度が強く、他の血球成分とより良好に区別できることがわかる。また、血液中に脂質粒子などの夾雑物が混入している場合、スキャッタグラム上では蛍光強度の低い位置に夾雑物の集団が出現することから、血小板を染色するための色素としてカプリブルー、ナイルブルー又はブリリアントクレシルブルーを用いることにより、血小板と夾雑物とを区別できることがわかる。
【００４５】
実施例４：カプリブルーの適切な濃度の検討
ここでは、実施例１の血小板測定用試薬において、カプリブルーＧＯＮを、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が０．１〜５．０ｐｐｍとなるように色素液に含有させた。それ以外は実施例１と同様にして、血小板の測定を行った。検体として、健康なヒトの全血、破砕赤血球含有血液、及び脂質含有血液をそれぞれ用いた。
【００４６】
得られたスキャッタグラムを図２に示す。スキャッタグラム１は縦軸に前方散乱光強度、横軸に蛍光強度をとったものであり、スキャッタグラム２はスキャッタグラム１の縦軸をlogに変換したものであり、スキャッタグラム３はスキャッタグラム２の血小板出現領域の周辺を拡大したものである。スキャッタグラム３において、血小板が出現する領域を実線で示した。この結果から、カプリブルーＧＯＮが０．１〜５．０ｐｐｍである場合に、夾雑物として脂質が存在しても、血小板をより明確に区別できることがわかる。さらに、カプリブルーＧＯＮが０．１〜２．０ｐｐｍである場合に、夾雑物として破砕赤血球が存在しても、血小板をより明確に区別できることがわかる。
【００４７】
実施例５：ナイルブルーの適切な濃度の検討
ここでは、実施例２の血小板測定用試薬において、ナイルブルークロリドを、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が０．０５〜５ｐｐｍとなるように色素液に含有させた。それ以外は実施例２と同様にして、血小板の測定を行った。検体として、健康なヒトの全血、破砕赤血球を増加させた破砕赤血球含有血液、及び脂質含有血液をそれぞれ用いた。
【００４８】
得られたスキャッタグラムを図３−１及び３−２に示す。スキャッタグラム１は縦軸に前方散乱光強度、横軸に蛍光強度をとったものであり、スキャッタグラム２はスキャッタグラム１の縦軸をlogに変換したものであり、スキャッタグラム３はスキャッタグラム２の血小板が出願する領域周辺を拡大したものである。スキャッタグラム３において、血小板が出現する領域を実線で示した。この結果から、ナイルブルークロリドが０．０５〜５．０ｐｐｍである場合に、夾雑物として脂質が存在しても、血小板をより明確に区別できることがわかる。また、ナイルブルークロリドが０．０５〜２．０ｐｐｍである場合に、夾雑物として破砕赤血球が存在しても、血小板をより明確に区別できることがわかる。
【００４９】
実施例６：ブリリアントクレシルブルーの適切な濃度の検討
ここでは、実施例３の血小板測定用試薬において、ブリリアントクレシルブルーＡＬＤを、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が０．１〜１０ｐｐｍとなるように色素液に含有させた。それ以外は実施例３と同様にして、血小板の測定を行った。検体として、健康なヒトの全血、破砕赤血球含有血液、及び脂質含有血液をそれぞれ用いた。
【００５０】
得られたスキャッタグラムを図４−１及び４−２に示す。スキャッタグラム１は縦軸に前方散乱光強度、横軸に蛍光強度をとったものであり、スキャッタグラム２はスキャッタグラム１の縦軸をlogに変換したものであり、スキャッタグラム３はスキャッタグラム２の血小板出現領域の周辺を拡大したものである。スキャッタグラム３において、血小板が出現する領域を実線で示した。この結果から、ブリリアントクレシルブルーＡＬＤが０．１〜１０．０ｐｐｍである場合に、夾雑物として脂質が存在しても、血小板をより明確に区別できることがわかる。また、ブリリアントクレシルブルーＡＬＤが０．２〜２．０ｐｐｍである場合に、夾雑物として破砕赤血球が存在しても、血小板をより明確に区別できることがわかる。
【００５１】
実施例７：本願の測定方法と従来の方法（免疫染色方法）との比較
本願の測定方法と、免疫染色を用いる従来技術の方法との相関関係を調べるために、本実施例を行った。
＜免疫染色による血小板の測定＞
従来技術の方法として、American journal of Clinical Pathologists (2001):115, p.460-464に記載される国際血液学標準化委員会（ＩＣＳＨ）により推奨される標準的な方法に従って血小板の数の測定を行った。この方法は、血小板の表面抗原に特異的な抗体を用いる免疫染色に基づく。すなわち、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＣＤ４１ａ抗体（ベクトンデッキンソン社製）５μＬ、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ６１抗体（ベクトンデッキンソン社製）５μＬ及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４、和光社製）１００μＬをチューブに分注した。ここに、検体（血液）５μＬを加え、静かに攪拌した。暗所で、室温にて１５分間インキュベートした。ここにＰＢＳを４．８５ｍＬ加え、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ（ベクトンデッキンソン社製）で測定し、血小板の測定結果（ａ）及び赤血球の測定結果（ｂ）を得た。さらに、ここで用いた全血を、自動血球計数装置ＸＥ−２１００（シスメックス社製）を用いて測定して赤血球数（ｃ）を求め、最終的に、次の計算式を利用して、従来の方法を使用した場合の血小板数を算出した。
血小板数＝赤血球数（ｃ）×（血小板の測定結果（ａ）／赤血球の測定結果（ｂ））
【００５２】
＜本発明の測定方法＞
ここでは、実施例１の血小板測定用試薬において、カプリブルーＧＯＮを、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が１．２ｐｐｍとなるように色素液に含有させた。また、実施例２の血小板測定用試薬において、ナイルブルークロリドを、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が０．５ｐｐｍとなるように色素液に含有させた。これら以外は、それぞれ実施例１及び２と同様にして、免疫染色に用いたのと同じ血液を検体として用いて血小板を検出し、血小板数を算出した。
【００５３】
免疫染色法を用いて得られた血小板数に対して本発明の測定方法を用いて得られた血小板数をプロットしたグラフを図５に示す。図５（Ａ）は、本発明の方法としてカプリブルーＧＯＮを用いた場合の結果であり、図５（Ｂ）は、本発明の方法としてナイルブルークロリドを用いた場合の結果を示す。
これらの結果から、本発明の方法は、従来の免疫染色を用いる方法と比較しても結果のばらつきが少なく、良好な相関関係を示すことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１−１】種々のオキサジン色素を含む試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。
【図１−２】種々のオキサジン色素を含む試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。
【図１−３】種々のオキサジン色素を含む試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。
【図２】カプリブルーの濃度を種々に変更した本発明の血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。
【図３−１】ナイルブルーの濃度を種々に変更した本発明の血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。
【図３−２】ナイルブルーの濃度を種々に変更した本発明の血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。
【図４−１】ブリリアントクレシルブルーの濃度を種々に変更した本発明の血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。
【図４−２】ブリリアントクレシルブルーの濃度を種々に変更した本発明の血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。
【図５】本発明の方法により測定された血小板数と、従来の方法により測定された血小板数との相関関係を示すグラフである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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