(57)【要約】      （修正有）【課題】高度不飽和脂肪酸の生合成において機能する、新規な脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子、およびそれを用いた脂肪酸を含有する油脂の製造方法の提供。【解決手段】モルティエレラ（Mortierella）由来の、特定のアミノ酸配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素、およびそれをコードする遺伝子、並びにこれを使用した高度不飽和脂肪酸または該脂肪酸を含む油脂の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素をコードする核酸。
【請求項２】
配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項３】
配列番号：２に示す塩基配列を有する核酸。
【請求項４】
配列番号：１に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素をコードする核酸。
【請求項５】
配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素をコードする核酸。
【請求項６】
配列番号：２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸と、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、脂肪酸鎖長延長酵素をコードする核酸。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸によりコードされた脂肪酸鎖長延長酵素。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項１０】
発現ベクターである請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項９又は10に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
脂肪酸を生合成する能力を有する請求項11に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
微生物である、請求項11に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
モルティエレラ（Mortierella）属微生物である請求項13に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項11〜14のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養し、所望により、培養物から脂肪酸又は脂肪酸含有油脂を採取することを含んで成る脂肪酸又は脂肪酸含有油脂の製造法。
【請求項１６】
請求項１〜７の何れか１項に記載の核酸の全部又は一部を含んで成り、脂肪酸生産性宿主細胞に導入された場合に、当該宿主細胞の生来の脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子から転写されたmRNAに対して抑制作用を有するRNAを転写生成するベクター。
【請求項１７】
請求項16に記載のベクターにより形質転換された、脂肪酸生産性宿主細胞。
【請求項１８】
モルティエレラ（Mortierella）属微生物である請求項17に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項17又は18に記載の宿主細胞を培養し、所望により、培養物から、炭素数が16又は18の脂肪酸に富む脂肪酸また当該脂肪酸を含む油脂を採取することを特徴とする、炭素数が16又は18の脂肪酸に富む脂肪酸また当該脂肪酸を含む油脂の製造方法。
【請求項２０】
請求項８に記載の脂肪酸鎖長延長酵素の製造方法において、請求項11に記載の宿主細胞を培養し、所望により、培養物から当該酵素を採取することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度不飽和脂肪酸の生合成において機能する新規な脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子及びその利用、に関する。
【背景技術】
【０００２】
高度不飽和脂肪酸の生合成は、例えば、図１に示されるように、脂肪酸鎖長鎖長延長酵素による２個ずつの炭素原子の付加による鎖長の延長と、脂肪酸鎖への二重結合の導入により行なわれる。脂肪酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子はヒト、マウス、線虫、微生物などからクローニングされている。微生物においては、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidurans）、フサリウム（Fusarium）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）及びモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）の脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子がクローニングされている。
【０００３】
モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）については、Parker-Barnes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol.97, No.15, p.8254-8289 (2000)）(GenBank AF206662）、及び特表平2002-523098号公報に脂肪酸鎖長延長酵素「GLELO」が記載されており、この酵素は、３個又は４個の二重結合を含み18個の炭素原子を有する高度不飽和脂肪酸であるγ−リノレン酸（GLA；18:3n-6）及びステアリドン酸（STA；18:4n-3）に基質特異性を有し、これらの脂肪酸を炭素原子が２個増加した対応する脂肪酸であるジホモ−γ−リノレン酸（DGLA；20:3n-6）及びエイコサテトラエン酸（ETA；20:4n-3）に転換する。
【０００４】
モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）については更に、特表平2002-523098号公報に記載されており、GenBank AF268031に脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子「MAELO」（Mukerji P. et al.）が登録されている。この酵素は、長鎖飽和脂肪酸を鎖長延長すると考えられている。
【０００５】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol.97, No.15, p.8254-8289 (2000)
【非特許文献２】GenBank AF268031（Mukerji P. et al.）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の従来技術に鑑み、既知の脂肪酸鎖長延長酵素とは異なる基質特異性を有し、従って異なる脂肪酸の鎖を延長する脂肪酸鎖長延長酵素及びそれをコードする遺伝子、並びにそれらの用途を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するため、本発明者らは種々検討を重ねた結果、モルティエレラ・アルピナから、新しい基質特異性を有する脂肪酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成した。
【０００８】
従って本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素をコードする核酸；配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードする核酸；配列番号：２に示す塩基配列を有する核酸；配列番号：１に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素をコードする核酸；配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素をコードする核酸；配列番号：２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸と、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、脂肪酸鎖長延長酵素をコードする核酸；並びに前記いずれかの核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、を提供する。
【０００９】
本発明はまた、前記の何れかの核酸によりコードされた脂肪酸鎖長延長酵素を提供する。
本発明は更に、前記のいずれかの核酸を含んでなるベクター、例えば発現ベクター；前記のベクターにより形質転換された宿主細胞、例えば脂肪酸を生合成する能力を有する宿主細胞を提供する。職種は、例えば微生物、例えばモルティエレラ（Mortierella）属微生物である。
【００１０】
本発明は更に、前記の宿主細胞を培養し、所望により、培養物から脂肪酸又は脂肪酸含有油脂を採取することを含んで成る脂肪酸又は脂肪酸含有油脂の製造法を提供する。
本発明はまた、前記何れかの核酸の全部又は一部を含んで成り、脂肪酸生産性宿主細胞に導入された場合に、当該宿主細胞の生来の脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子から転写されたmRNAに対して抑制作用を有するRNAを転写生成するベクター；及び当該ベクターにより形質転換された、脂肪酸生産性宿主細胞を提供する。当該宿主細胞は、例えばモルティエレラ（Mortierella）属微生物である。
【００１１】
本発明はまた、上記の宿主細胞を培養し、所望により、培養物から、炭素数が16又は18の脂肪酸に富む脂肪酸また当該脂肪酸を含む油脂を採取することを特徴とする、炭素数が16又は18の脂肪酸に富む脂肪酸また当該脂肪酸を含む油脂の製造方法を提供する。
本発明は更に、前記の脂肪酸鎖長延長酵素の製造方法において、前記の宿主細胞を培養し、所望により、培養物から当該酵素を採取することを含んで成る方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
遺伝子
本発明の遺伝子は、典型的には、配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
しかしながら、一般に、酵素は、その活性に必須でない領域において修飾されていても本来の酵素の活性を維持することができることが知られている。従って、本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列において、１〜複数、例えば１〜数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つ配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する酵素と同様の脂肪酸鎖長延長活性を維持しているタンパク質、及びそれをコードする遺伝子、即ち核酸を提供する。
【００１３】
更に、90％以上のアミノ酸の同一性を有するタンパク質は同等な活性を有する蓋然性が高いことが知られている。従って、本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して90％以上の配列の同一性を有す、且つ配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する酵素と同等の脂肪酸鎖長延長活性を有するタンパク質、及びそれをコードする遺伝子、即ち核酸を提供する。
なお、アミノ酸配列の同一性％は、例えばGenetyx-Mac  Ver.11.2.0ソフトウエア（株式会社ゼネティックス）により計算することができる。
【００１４】
更に、あるタンパク質をコードする核酸に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるタンパク質は、同等の活性を有する蓋然性が高いことが知られている。従って、本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：２に示す塩基配列を有する核酸、に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされており、且つ配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する酵素と同等の脂肪酸鎖長延長活性を有するタンパク質、及びそれをコードする遺伝子、即ち核酸を提供する。本発明において、核酸のハイブリダイゼーションにおける「高ストリンジェント」条件とは、例えば、amersham pharmacia biotech社製AlkPhos DIRECTキットのマニュアルに従い、ハイブリダイゼーション温度、洗浄温度ともに55℃である。
【００１５】
本発明の遺伝子は、例えば、モルティエレラ属微生物、例えばモルティエレラ・アルピナ種から常法に従ってクローニングすることができる。その具体的な方法を実施例１に記載する。
また、本発明の、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードする核酸、例えば、配列番号：１に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素をコードする核酸、及び配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素をコードする核酸は、例えば当業界でよく知られている、部位特定変異誘発などの常法により得ることができる。
【００１６】
本発明の脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の利用形態
本発明の遺伝子は、例えば、宿主に導入することにより、脂肪酸鎖長延長酵素の製造のために使用することができる（使用形態Ｉ）。また、宿主細胞に本発明の遺伝子を導入して発現せしめ、その宿主に基質脂肪酸を供給することにより、鎖が延長された脂肪酸を製造することができる（使用形態II）。
【００１７】
あるいはまた、それ自体が脂肪酸合成能を有する宿主に導入することにより、特定の脂肪酸の生産を増強するために用いることができる。後者の場合として、本発明の脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子を発現させることにより当該酵素の活性を増強することにより、より長い鎖長の脂肪酸の生産を増強する場合（使用形態III ）と、人為的に導入した本発明の遺伝子により、宿主が生来的に有する当該遺伝子の発現をRNAレベルで抑制することにより、当該酵素の基質となる脂肪酸を蓄積させる場合（使用形態IV）とがある。
【００１８】
使用形態Ｉ及びIIのベクター及び宿主
宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Escherichia）属に属する細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli）、バシルス（Bacillus）属微生物、例えばバシルス.スブシルス（Bacillus subtilis）など従来公知の宿主細胞を用いることができる。
【００１９】
真核細胞としては、脂肪酸合成能を有する必要はなく、例えば真核微生物、好ましくは酵母または糸状菌が使用できる。酵母としては例えばサッカロミセス.セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等のサッカロミセス（Saccharomyces）属酵母が挙げられ、また糸状菌としては、例えばアスペルギルス.オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス.ニガー（Aspergillus niger）等のアスペルギルス（Aspergillus）属微生物、及びペニシリウム（Penicillium）属微生物、モルティエレラ（Mortierella）属微生物、等が挙げられる。さらに動物細胞または植物細胞も宿主細胞として使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
【００２０】
本発明の発現ベクターはそれらを導入すべき宿主の生物種に依存したプロモーターおよびターミネーター等の発現制御領域、及び複製起点等を含有する。細菌用、特に大腸菌における発現ベクターのプロモーターとしては、従来公知のプロモーター、例えばtrcプロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター等が使用できる。また、酵母用プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼ、trpC等のプロモーターが使用できるが、これらのプロモーターに限定されるものではない。また動物細胞用プロモーターとしてはウイルス性プロモーター、例えばSV40アーリープロモーター、SV40レートプロモーター等が使用される。発現ベクターの作成は制限酵素、リガーゼ等を用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主細胞の形質転換も従来公知の方法に従って行うことができる。
【００２１】
植物の発現ベクターの構築は、例えばアグロバクテリウムを用いる場合にはpBI121などのバイナリーベクターを、パーティクルガンを用いる場合にはpUC19などの大腸菌ベクターを用いることができる。さらに、当該植物の発現ベクターで形質転換された植物細胞を例えば抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を用いて選抜し、適切な植物ホルモン等の条件を用いて再分化させ、脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子で形質転換された植物体を得ることができる。
【００２２】
発現ベクターによって形質転換された宿主細胞又は形質転換植物体を培養又は栽培し、培養物等から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により目的とする脂肪酸鎖長延長酵素タンパク質を回収、精製することができる。
使用態様III のベクター及び宿主
宿主としては、脂肪酸、好ましくは高度不飽和脂肪酸の実質的な生産能（即ち、採取可能な量で脂肪酸を生合成する能力）を有する宿主であればよい。この要件を満たす宿主細胞を、前記使用態様Ｉ及びIIで記載した宿主から選択すればよい。また、ベクターとしては、使用態様III のための上記の宿主に適合するものであればよく、例えば使用態様Ｉ及びIIで使用できるベクターから選択すればよい。
【００２３】
微生物宿主が好ましく、採取可能な量で脂肪酸を生合成可能な微生物としては、例えば、モルティエレラ（Mortierella）属、コニディオボラス（Conidiobolus）属、フィチウム（Pythium）属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペニシリウム（Penicillium）属、クラドスポリウム（Cladosporium）属、ムコール（Mucor）属、フザリウム（Fusarium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ロードトルラ（Rhodotorula）属、エントモフトラ（Entomophthora）属、エキノスポランジウム（Echinosporangium）属、サプロレグニア（Saprolegnia）属、クリプテコデニウム（Crypthecodenium）属、スラウトキトリウム（Thrautochytrium）属、シゾキトリウム（Schizochytrium）属、ウルケニア（Ulkenia）属、ジャポノキトリウム（Japonochytrium）属又はハリフォトリス（Haliphthoros）属に属する微生物を挙げることもできる。
【００２４】
モルティエレラ（Mortierella）属モルティエレラ（Mortierella）亜属に属する微生物では、例えばモルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）、モルティエレラ・フィグロフィラ（Mortierella hygrophila）、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）等を挙げることができる。具体的にはモルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）IFO8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）IFO8571、モルティエレラ・フィグロフィラ（Mortierella hygrophila）IFO5941、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等の菌株を挙げることができる。
【００２５】
使用態様IVのベクター及び宿主
使用態様IVにおける宿主は、使用態様III について記載したものを使用することができる。ベクターは、使用態様III の場合と同様であるが、使用態様IVにおいては、ベクターでは、ベクターに挿入された脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子その部分がプロモーター及びターミネーターに対して逆方向に挿入されている。そして、この遺伝子又はその部分が転写されて生成するmRNAが、宿主細胞に生来的に存在する脂肪酸鎖長延長酵素の転写により生成するmRNAに対して干渉（interference）し切断すると考えられる（RNAi法）。本発明においては、その具体例を実施例３に記載する。
【００２６】
宿主の入手可能性
上記の菌株はいずれも、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（NBRC）（旧・大阪市の財団法人醗酵研究所（IFO）より移管）、及び米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection, ATCC）及び、Centrralbureau voor Schimmelcultures（CBS）からなんら制限なく入手することができる。
【００２７】
培養
本発明に使用される菌株を培養する為には、まず入手した菌の保存菌株を調製する必要がある。保存菌株の調製法として、まずは、胞子形成培地を作成する。胞子形成培地は、硝酸ナトリウム、リン酸一水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、硫酸第一鉄および糖類の全てあるいは一部成分から成る培地を調製し、pHを4〜7の範囲、好ましくは5〜6.5の範囲に調製する。この調製培地に、寒天を加えて加熱滅菌した後、冷却し固化させたものを胞子形成培地として用いる。胞子形成培地は、菌糸増殖および胞子形成が成されれば特に制限は無いが、pHを胞子形成に適した範囲である4〜7に調製することを特徴とする。
【００２８】
具体的な例としては、Czapek寒天培地（硝酸カリウム 2g/L、リン酸一水素ニカリウム 1g/L、硫酸マグネシウム・七水和物 0.5g/L、塩化カリウム 0.5g/L、硫酸第一鉄・七水和物 0.01g/L、サッカロース 30g/L、寒天 13g/L）に塩酸又は硫酸を加えてpH6.0に調製した培地が挙げられる。もう一つの例としては、Czapek-dox寒天培地（硝酸カリウム 2g/L、リン酸一水素ニカリウム 1g/L、硫酸マグネシウム・七水和物 0.5g/L、塩化カリウム 0.5g/L、硫酸第一鉄・七水和物 0.01g/L、グルコース 30g/L、寒天 13g/L）に塩酸又は硫酸を加えてpH6.0に調製した培地が挙げられる。
【００２９】
このような方法で試験管内に斜面培地（スラント培地）あるいはシャーレに平板培地（プレート培地）を作成し、この培地に菌糸あるいは胞子を接種して、好気条件下で固体培養する。培養温度は0〜40℃、好ましくは10〜35℃、より好ましくは15〜30℃に維持して増殖と胞子形成を図る。培養温度は、途中で変更してもよく、例えば、25℃にて増殖させた後、5℃にて培養する方法ができる。
【００３０】
胞子形成を確認した後、固体培養菌糸に滅菌水を添加し、常法にて攪拌して胞子懸濁液を得る。添加する滅菌水への添加物には特に制限無く、純水のままでもよいが、界面活性剤、無機塩類などを添加することもでき、また予め調製した生理食塩水を用いても良い。攪拌の方法としては、外部から固体培養容器に力を加えても良いし、予め滅菌したブラシなどで菌糸に直接力を与えても良い。
【実施例】
【００３１】
次に、実施例により本発明を更に具体的に記載する。
実施例１. 脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子のクローニング
これまでに報告されている機能未知なELOホモログのアミノ酸配列情報に基づきデジェネレートプライマーを作製した。すなわち、図３に示す相同性比較から矢印のアミノ酸配列情報を基に、下記のプライマーを作成した。
【化１】
2008073030.tif 000002
【００３２】
上記のプライマーを用いて、以下のPCRを行った。
cDNA library                1μl
10×Buffer                  5μl
2.5 mM dNTP                 4μl
100 μM ELOlike F1 or R1    2μl
100 μM M13 F or R          0.5μl
ExTaq                       0.25μl
H2O                                
Total                      50μl
【００３３】
PCRは、94℃にて２分間の前インキュベーション、94℃にて１分間−50℃にて１分間−72℃にて１分間の30サイクルの増幅、及び72℃にて10分間の後インキョベーション、により行った。ELOlike F1とM13R2とのペア、及びELOlike R1とM13Fとのペアでそれぞれ得られた約420bp及び670bpの断片をTAクローニング（Novagen社、pT7Blue T-vector）し、塩基配列を決定したところELOホモログと相同性を示した。得られたELO遺伝子配列の情報よりプライマーELOlikeF3（5’-CACTCTCAATCACACTCGCACG-3’）（配列番号：３)とELOlikeR3（5’-CATGTTCCCAGCAATGGTCAAG-3’）(配列番号：４）を作製した。ELOlikeF3はELO遺伝子の開始コドンのすぐ上流域を含み、ELOlikeR3は終止コドンを含むプライマーである。
【００３４】
モルティエレラ・アルピナ（M. alpina）1S-4のcDNA ライブラリー1 μl、Takara EX Taq 10 x Buffer 5 μl、2.5 mM dNTP 4 μl、100 μM ELOlikeF3 0.5 μl、100 μM ELOlikeR3 0.5 μl、Takara EX Taq 0.25 μl、滅菌水38.75 μlから成る計50 μlの反応液を以下の条件でPCRに供した。94℃にて２分間、続いて、94℃にて１分間、55℃にて１分間、72℃にて１分間の3ステップを20サイクル行い、最後に72℃にて10分間の反応を行った。得られたPCR産物を市販のベクターpT7Blue T-Vector (Novagen社)に連結し、プラスミドpM3ELO10を構築した。
【００３５】
このプラスミド中にクローニングされた脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の塩基配列を配列番号：２に示し、この塩基配列から推定される、脂肪酸鎖長延長酵素のアミノ酸配列を配列番号：１に記載する。このアミノ酸配列と、既に知られているアスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidurans）、フサリウム（Fusarium）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）及びモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）の脂肪酸鎖長延長酵素のアミノ酸配列との間の配列同一性はおよそ30〜40％である。
【００３６】
また、本発明の脂肪酸鎖長延長酵素のアミノ酸配列と、Parker-Barnes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol.97, No.15, p.8254-8289 (2000)）(GenBank AF206662）に記載の脂肪酸鎖長延長酵素「GLELO」、及びGenBank AF268031に記載の脂肪酸鎖長延長酵素「MAELO」（Mukerji P. et al.）のアミノ酸配列との間の配列同一性はそれぞれ約29％及び約25％である。
従って、本発明の脂肪酸鎖長延長酵素は全く新規な酵素である。
【００３７】
実施例２. 酵母宿主における発現
発現ベクターの構築
発現ベクターを構築するために、実施例１でクローニングしたモルティエレラ・アルピナ（M. alpina）1S-4株のELO遺伝子の増幅を行った。まず、2つのプライマーELOlikeYExF1（5’-ACT GAATTC ATG GAG TCT GGA CCA ATG CC-3’（配列番号：５）（下線がEcoRI認識部位であり、「ATG」が開始コドンである）とELOlikeYExR1（5’-GAGCGAAGA GTCGAC T TTA CTG AGC C-3’（配列番号：６）（下線がSalI認識部位であり、「TTA」が終止コドンの相補配列である）を作製した。
【００３８】
pM3ELO10 10 ng、Takara EX Taq 10 x 緩衝液５μl、2.5 mM dNTP 4 μl、100 μM ELOlikeYExF 10.5 μl、100 μM ELOlikeYExR1 0.5 μl、Takara EX Taq 0.25 μl、及び滅菌水38.75 μlから成る計50 μlの反応液を以下の条件でPCRに供した。94℃にて１分間、続いて、94℃にて１分間、55℃にて１分間、72℃にて１分間の3ステップを20サイクル行い、最後に72℃にて10分間の反応を行った。得られたPCR産物をEcoRIとSalIで処理し、同じくEcoRIとSalIで処理したpYE22m（Ashikari et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 30:515-520）に連結して、ELO遺伝子の酵母発現用ベクターpYM3ELO20を構築した。
【００３９】
酵母の形質転換法
宿主株サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）EH1315（Ashikari et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 30:515-520）を5 mlのYPD培地（グルコース2%、酵母エキス1%、ペプトン2%）で30℃、12時間試験管振とう培養を行った。これを500 mlのYPD培地に全量植菌し、同じく30℃で振とう培養を行った。600 nmの吸光度が1.4になるまで培養し、菌体を4000 x gで集菌後、80 mlの滅菌水にけん濁した。さらに、10 x TE 緩衝液(100 mM Tris、10 mM EDTA、pH 7.5)を10 ml、10 x 酢酸リチウム緩衝液(1 M 酢酸リチウム)を10 ml加えて30℃で45分ゆっくり振とうした。
【００４０】
その後、１Mのジチオスレイトール(DTT)を2.5 ml添加してさらに15分振とうした。氷冷した滅菌水で２回洗浄した後、氷冷した１Mソルビトールで1回菌体を洗浄した。最終的に0.5 mlの１Mソルビトールに菌体を懸濁した。菌体40 μlとpYM3ELO20 １μl（100 ng相当）を混合し、バイオラッド社のジーンパルサーによりエレクトロポーレーションを行った。その際、0.2 cmギャップのキュベットを用い、1.5 kV、25 μF、200 Ωの条件で行った。1 Mソルビトール1 mlにけん濁し、1 Mソルビトール入りのトリプトファンを含まないSC培地に塗布し、30℃で5日間培養した。
【００４１】
なお、SC培地の組成は、グルコース2%、Yeast Nitrogen Base w/o amino acids and ammonium sulfate (Difco社)0.17%、硫酸アンモニウム0.5%、寒天2%、ウラシル0.002%、アデニン0.002%、チロシン0.003%、メチオニン0.001%、アルギニン0.002%、ヒスチジン0.002%、リジン0.004%、トリプトファン0.004%、スレオニン0.005%、イソロイシン0.006%、ロイシン0.006%、フェニルアラニン0.006%である。その結果、16株のELO遺伝子発現酵母（ELO1株〜ELO16株）を取得した。
【００４２】
結果（形質転換体の脂肪酸組成分析）
（１）ベクターpYE22mを形質転換したコントロール株3株（C1、C2、C3株）とELO遺伝子発現酵母（ELO1株〜ELO16株）をYPD培地で、28℃、300 rpm、3日間振とう培養した。集菌後、菌体の総脂肪酸をメチルエステル化し、GLCによる脂肪酸組成分析を行った。結果を下記表１に示す。その結果、ELO7株とELO8株では16:1n-7が減少し、18：1n-7と20:1の割合が増加していたことから本酵素遺伝子が炭素鎖長16の脂肪酸を炭素鎖長18あるいは20の脂肪酸へと変換する脂肪酸鎖長延長酵素をコードしていると予測した。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
（２）ELO7株とELO8株の再現性をみるために、コントロールC1株を対照として、3連で上と同様の条件で菌体を培養し菌体の脂肪酸組成分析を行った。その結果を、下記表２に示す。ELO7株とELO8株の脂肪酸組成を比較すると、ELO8株の方がより16:1n-7が減少し、18：1n-7と20:1の割合が増加していることが確認できた。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
（３）そこで、コントロールのC1株とELO8株を用いて、以下の脂肪酸添加実験を行った。ラフィノース２%、yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate 0.17%、硫安アンモニウム0.5%、tergitol type NP-40 1%、ヒスチジン20 μg/ml、ロイシン60 μg/ml、各種脂肪酸メチルエステル0.05%を含む培地15 mlに菌体を植菌し、28℃、300 rpm、3日間振とう培養した。集菌後、菌体の総脂肪酸をメチルエステル化し、GLCによる脂肪酸組成分析を行った。結果を下記表３〜表８に示す。
【００４７】
【表３】
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【００４８】
【表４】
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【００４９】
【表５】
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【００５０】
【表６】
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【００５１】
【表７】
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【００５２】
【表８】
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【００５３】
添加実験１では、添加脂肪酸として15:0、16:0、17:0、18:0、20:0、16:1n-7、18:2n-6、18:3n-6の各種メチルエステルを用いた。前記（１）及び（２）の場合の栄養培地の時と比べて、今回は合成培地であり、脂肪酸メチルエステルを添加しない場合も脂肪酸組成に顕著な変化が見られた。つまり、炭素鎖16の脂肪酸の割合が減少し、炭素鎖18と20の脂肪酸の割合が増加した。また、16:1n-7が鎖長延長された18:1n-7や、奇数鎖脂肪酸19:1も増加した。
【００５４】
脂肪酸添加で顕著に結果がでたのは、16:1n-7と18:2n-6であり、それぞれ効率よく鎖長延長され、18:1n-7と20:2n-6へと変換された。一方で、18:3n-6はほとんど鎖長延長されなかった。添加実験２では、添加脂肪酸として18:3n-3、MA、DGLA、AA、EPA、DHA、18:4n-4、18:2n-9(他のn-9系脂肪酸を含む混合物)を用いた。この中で顕著に結果が現れたのは、18:3n-3であり、効率よく20:3n-3へと鎖長延長された。
【００５５】
考察
脂肪酸を添加しない実験から、炭素鎖16の脂肪酸を18さらに20へと鎖長延長することが分かった。さらに、16:1n-7と18:1n-9を鎖長延長することから一価の不飽和脂肪酸も基質にする。また、脂肪酸添加実験では、16:1n-7、18:2n−6と18:3n−3を良好な基質とする。このことから、不飽和脂肪酸の場合、カルボキシル末端側最初の二重結合がΔ9であることが好ましい。しかしながら、16:1n-7や18:3n−3は1S-4株にはほとんどなく、16:1n-7や18:3n−3の鎖長延長された産物はほとんど検出されない。
【００５６】
また、酵母での発現実験で問題となるのは、Δ9 デサチュラーゼの活性が強いために、たとえ16:0が効率よく鎖長延長されてもすぐに不飽和化されるために脂肪酸組成に大きく反映されてこない。以上、酵素レベルの機能解析と1S-4内での役割は異なる可能性がある。そこで次に、RNAiによる本酵素の遺伝子発現抑制を行った。
【００５７】
実施例３. RNAiによる遺伝子発現抑制
ベクターの構築
ベクターpBluescript KS+にヒストンプロモーターとtrp Cターミネーターを挿入したベクター（pBIKSMaEx）にPCR産物を入れていくという方法でRNAi用ベクターを構築した（図２を参考）。
（１）プライマーELOlikeRNAiF1（5’-ACTAGATCTATGGAGTCTGGACCAATGCC-3’（配列番号：７）（下線部はBglII認識部位）とELOlikeRNAiR1（5’-GAGCCATGGGCGTGCGAATGCCTCGAGGG-3’（ハ配列番号：８）（下線部はNcoI及びXhoI認識部位）を作製し、最初のPCR反応に用いた。
【００５８】
pM3ELO10 10 ng、Takara EX Taq 10 x Buffer 5 μl、2.5 mM dNTP 4 μl、100 μM ELOlikeRNAiF1 10.5 μl、100 μM ELOlikeRNAiR1 0.5 μl、Takara EX Taq 0.25 μl、及び滅菌水38.75 μlから成る計50 μlの反応液を以下の条件でPCRに供した。94℃にて１本間、続いて、94℃にて１分間、55℃にて１分間、72℃にて１分間の3ステップを20サイクル行い、最後に72℃にて10分間の反応を行った。得られたPCR産物をBglIIとNcoIで処理し、ベクターpBIKSMaExのBamHIとNcoIにライゲーションした。
【００５９】
（２）次に、（１）で作製したベクターをEcoRIで処理し、pUC18のEcoRIへ連結した。（次のステップでXhoI処理するが、pBluescript KS+にXhoIサイトがあるため、XhoIサイトがないpUC18に入れ替える必要が生じた。）
（３）次に、ELOlikeRNAiF2（5’-GCACCATGGAGTCTGGACCAATGCC-3’（配列番号：９）（下線部はNcoI認識部位）とELOlikeRNAiR2（5’-CGCTCGAGGTAAAGGCATAGTAGCAG-3’（配列番号：10）（下線部はXhoI認識部位）を作製した。pM3ELO10 10 ng、Takara EX Taq 10 x 緩衝液５μl、2.5 mM dNTP ４μl、100 μM ELOlikeRNAiF2 10.5 μl、100 μM ELOlikeRNAiR2 0.5 μl、Takara EX Taq 0.25 μl、及び滅菌水38.75 μlから成る計50 μlの反応液を以下の条件でPCRに供した。
【００６０】
94℃にて１分間、続いて、94℃にて１分間、55℃にて１分間、72℃にて１分間の3ステップを20サイクル行い、最後に72℃にて10分間の反応を行った。得られたPCR産物をNcoIとXhoIで処理し、上記（２）で作製したベクターのNcoIとXhoIに連結した。
（４）上記（３）で作製したベクターをEcoRIで処理して、プロモーター、RNAiコンストラクト及びターミネーターを含む領域を切り出し、pDura5（Takeno et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2004) 65:419-425）のEcoRIサイトに連結し、RNAi用ベクターpDu5M3ELOi30を構築した。
【００６１】
形質転換法
モルティエレラ・アルピナ（M. alpina）1S-4の形質転換はバイオラッドのパーティクルデリバリーシステムを用いて行った。モルティエレラ・アルピナ（M. alpina）1S-4のウラシル要求性株の胞子（約108個）を直径90 mmプレートで作製したウラシルを含まないSC培地に塗布し、pDu5M3ELOi30を1.1 ミクロンのタングステン粒子にコーティングした。真空度28インチHg、ヘリウム圧1,100 psi、標的距離６cmの条件で、タングステン粒子をプレート上の胞子に2回打ち込み、28℃で4日間培養した。約30個の得られた形質転換体を新しいSC培地に移した。1%グルコース、0.5%酵母エキス、0.005%Triton X-100、2%Agarから成る寒天プレートに個々の菌体を移し、28℃で3日間静置培養した後、菌体の脂肪酸組成を分析した。また、並行して、2%グルコース、1%酵母エキスからなる培地10 mlに植菌し、28℃、300 rpm、4日間試験管振とう培養した。
【００６２】
結果と考察
寒天プレート培養
30株の形質転換体のうち、1株（A-13株）だけユニークな脂肪酸組成を持つものがあった。つまり、pDura5を形質転換したコントロール株（#13株）の脂肪酸組成と比較すると、A-13株では16:0が多くできており、それに伴って、16:1n-7が増加し、新たに16:2n-4、16:3n-4、18:1n-7が生成した。結果を下記表９に示す。このことから、本酵素の役割は、16:0を18:0に変換することであり、16:0が蓄積することで、新たなn-4/n-7系脂肪酸ができたものと考えられる。
【００６３】
【表９】
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【００６４】
液体培養
コントロール株（#13株）とA-13の液体培養の結果を、下記表１０に示した。寒天培地の時ほど顕著な変化はなかった。A-13で16:0と16:1n-7がやや多いという結果であった。これは、他の鎖長延長酵素遺伝子発現による相補、コンストラクトの脱落など考えられるが、培養条件での変化が発現抑制に何らかの影響を与えているようである。
【００６５】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、高度不飽和脂肪酸生合成経路の１例を示す。
【図２】図２は、実施例３で使用した、RNAi用ベクター中の、脂肪酸鎖長延長遺伝子挿入領域の構造を示す。
【図３】図３は、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidurans）、フサリウム（Fusarium）及びニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）の脂肪酸鎖長延長酵素のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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