(57)【要約】【課題】安全性に優れた局所的な前立腺癌の治療に有用な手段を提供する。前立腺癌と類似の癌に対しても、局所的な治療に有用な手段を提供する。【解決手段】ポリエチレングリコールを有効成分として含有する局所的な癌治療剤。ポリエチレングリコールが、数平均分子量1000〜10000の範囲である。ポリエチレングリコールの含有濃度が0.1〜50質量%の範囲である。癌が前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、および大腸癌から選ばれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコールを有効成分として含有する局所的な癌治療剤。
【請求項２】
ポリエチレングリコールが、数平均分子量1000〜10000の範囲である請求項1に記載の癌治療剤。
【請求項３】
ポリエチレングリコールの含有濃度が0.1〜50質量%の範囲である請求項1または2に記載の癌治療剤。
【請求項４】
癌が前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、および大腸癌から選ばれる請求項1〜3のいずれかに記載の癌治療剤。
【請求項５】
1回または複数回、患部に直接、局所投与される、請求項1〜4のいずれかに記載の癌治療剤。
【請求項６】
複数回投与が1〜10日の間隔で行われる請求項5に記載の癌治療剤。
【請求項７】
癌細胞が融合して多核細胞を形成するに有効な量および有効な頻度で投与する請求項5または6に記載の癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエチレングリコールを有効成分とする癌治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では前立腺癌の罹患率が増加している。前立腺がんは比較的増殖速度が遅いため、アンドロゲン遮断療法で保存的に治療することが多い。この療法は非侵襲であるが、高価である点、心血管イベントの発症率が増加する点、治療を継続しているとこの治療に抵抗性を示すホルモン抵抗性癌が出現してくる点が問題となっている。
【０００３】
ホルモン抵抗性癌は増殖速度が早いことと、有効な治療がないため前立腺がんの治療において最も大きな問題となっている。そのためほとんどの泌尿器科専門医は、限局性前立腺癌に対しては手術や放射線のような積極的な治療を選択する。しかし、このような治療法は尿失禁、出血、放射線障害などの副作用があることと、前立腺がん患者は高齢者がほとんどであるため、体力的な観点と、合併症の観点から、このような積極的な治療が選択できないケースが多く存在する。
【０００４】
本発明者らはより安全な限局性前立腺がんの治療法の確立が非常に重要であると考えた。
【０００５】
ポリエチレングリコール(PEG)は、HO-(CH2-CH2-O)n-Hのようにエチレングリコールのポリマー構造をしていると知られている。PEGは無毒性であるので、数々の技術に応用される。例えば、PEGは、下剤や皮膚クリームの基礎化合物として用いられる。PEGを疎水性分子と結合させると、非イオン性の洗浄用の界面活性剤を得て、そして、化粧品の乳化剤に使うことができる。さらに、インターフェロンαやfilgrastimのPEG化は、臨床技術に応用される。バイオテクノロジーにおいて、PEGはDNAの導入や細胞融合の技術に用いられる。最近、PEGは薬物輸送システム(DDS)に用いられる。このシステムにおいて、薬剤の安定性は、内部状態、そして水溶性を改良する。
【０００６】
本発明者らはPEGの化学治療剤としての機能に焦点をあてた。これまでの研究で、PEG (8000)がアゾキシメタン処理したラットモデルで腫瘍形成や異常型陰窩病巣（ACF）を減少することが報告されている。化学的治療効果の根底となるメカニズムは、(1)PEGは化学炎症を防止することによって化学創傷を保護する、(2)PEG は浸透性の薬剤であるため糞便量が増加する、(3)PEGはアポトーシスを誘導するということなどが考えられている。PEGはげっ歯類の腸管癌のモデルの中で浸透性薬剤として使われているが、PEGによる主要な抗腫瘍効果は浸透圧によるものと考えられている。疫学的な実験結果から、植物性繊維のより多量の摂取はヒト大腸癌のリスクを減少しうることが示唆されているため、食物繊維や飲料水は糞便の水分量を増大することにより、ヒトやげっ歯類において腸管発癌を予防していると推測されたためである。しかし、げっ歯類の腸管癌のモデルにおいて、５％のPEG400は糞便重量を増大させたけれども、ACFの数をわずかに減少させたにすぎなかったことから、本発明者らは糞便中の水分含有量の増大のみではPEGの抗腫瘍効果を説明するのに十分でないと考えている。(非特許文献1〜3参照)
【非特許文献１】FEBS Letters 496(2001)143-146
【非特許文献２】Cancer Research 59, 5143-5147, October15, 1999
【非特許文献３】Carcinogenesis vol.20 no.5 pp915-918, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、安全性に優れた局所的な前立腺癌の治療に有用な手段を提供することを目的とする。さらに本発明は、前立腺癌と類似の癌に対しても、局所的な治療に有用な手段を提供することを目的とする。
【０００８】
ところで、PEGは異なるタイプの細胞を融合するために長く使われてきた。実際に、様々な細胞が、30％から50％の濃度で細胞融合されることが示されている。しかしながら、詳細な分子メカニズムは未だに解明されていないままである。
【０００９】
そこで、本発明者らは、PEGの細胞融合誘導剤としての機能に焦点をあて、細胞融合の結果としてのアポトーシスが誘導されるかどうかを調査した。細胞融合の観点から見ると、PEGによる細胞融合で多核化したヒト大腸癌細胞株HT29細胞は、原因は明記されていないが、培養から消失するということが報告されている。また多核細胞の観点から見ると、放射線照射、ドキソルピシンまたはドセタキセルの投与によって多核化細胞を誘導されるが、それらの細胞は速やかにアポトーシスまたは細胞死をもたらすことが報告されている。本発明者らは、多核化した細胞がアポトーシス起こすのではないかと仮説を立て研究を行った。また、PEGのような低毒性な細胞融合誘導剤は多核化細胞を誘導するために大変有用であると考えた。
【００１０】
そこで、ヒト前立腺癌の細胞系列として確立されているPC-3細胞に高密度の細胞下でPEG1000を処理する実験を行った。その結果、PEGは低濃度（0.5％、1％）にも関わらず36時間で細胞融合を介したアポトーシスが誘導されることを見いだした。そこで、さらに本発明者らは、PC-3細胞をヌードマウスに埋め込み、形成された腫瘍に0.5％のPEG溶液を注入したところ、腫瘍容量はPBSを注入したグループと比較して腫瘍増殖が抑制された。さらに、本発明者らはPEG注入の後36時間で腫瘍を摘出し、H&E染色及びTUNEL染色及びssDNA免疫染色を行い、腫瘍内部を観察した。腫瘍内部にはPEG溶液が存在していたと思われる間隙が存在し、その周囲に多核化したアポトーシス細胞を観察した。これらの結果に基づいて、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ポリエチレングリコールを有効成分として含有する局所的な癌治療剤に関する。
【００１２】
本発明の癌治療剤においては、(1)ポリエチレングリコールが、数平均分子量1000〜10000の範囲であること、(2)ポリエチレングリコールの含有濃度が0.1〜50質量%の範囲である、(3)癌が前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、および大腸癌から選ばれることができる。
【００１３】
さらに本発明の癌治療剤は、(4)1回または複数回、患部に直接、局所投与されること、(5)複数回投与が1〜10日の間隔で行われること、(6)癌細胞が融合して多核細胞を形成するに有効な量および有効な頻度で投与することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、生体に対する安全性が比較的高い化学物質であるポリエチレングリコールを用いて、より安全性の高い局所的な前立腺癌の治療に有効な癌治療剤を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ポリエチレングリコールを有効成分として含有する局所的な癌治療剤に関する。本発明の癌治療剤に含有されるポリエチレングリコールは、後述のように、癌細胞が融合して多核細胞を形成し、それによって癌細胞のアポトーシスを誘導することで癌細胞を死滅させる物である。従って、本発明の癌治療剤が局所的に投与されることによって、癌細胞が細胞融合を生じるのに適したポリエチレングリコールであることが好ましい。そのような観点から、本発明の癌治療剤に含有されるポリエチレングリコールは、数平均分子量が1000〜10000の範囲であることが適当である。さらに、扱の易さ、特に水溶性になり易いことを考慮すると、分子量は小さいことが好ましく、その点で、数平均分子量は1000〜5000の範囲であることがより適当である。
【００１６】
後述の実施例で示されるように、癌細胞を含む患部に局所投与されたポリエチレングリコールは、癌細胞を細胞融合するために、比較的長い時間、細胞に隣接した位置に留まることが好ましい。また、ポリエチレングリコールは生体に対する安全性が比較的高い化学物質であることが知られている。このような観点から、本発明の癌治療剤に含まれるポリエチレングリコールの含有濃度は、例えば、0.1〜50質量%の範囲であることが適当であり、0.5〜30質量%の範囲であることが好ましい。
【００１７】
本発明の癌治療剤のポリエチレングリコール以外の成分は、例えば、溶媒である水、さらには、必要に応じて、pH緩衝剤、安定剤、殺菌剤等を添加することもできる。
【００１８】
本発明の癌治療剤を適用するに適した癌は、本発明の癌治療剤が、癌細胞が融合して多核細胞を形成し、それによって癌細胞のアポトーシスを誘導することで癌細胞を死滅させるものであることを勘案すると、一定の部位に癌細胞が集中して存在する、または局在する癌であり、そのような癌としては、例えば、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌等を挙げることができる。特に、前立腺癌は、確定診断のため前立腺に6から12針生検し、組織を採取するため、その際にPEGを注入することができると考えられる。また前立腺癌は高齢者に多く発病するが、ほとんどの高齢者は前立腺肥大症に罹患しているので、仮に誤って正常細胞にアポトーシスを誘導してしまったとしても影響が少ないことが予想される。ゆえに本発明の癌治療剤を適用して、所望の治療効果を挙げるのに適した癌である。
【００１９】
本発明の癌治療剤は、1回または複数回、患部に直接、局所投与、特に注入されることで用いられる。1回の投与量は、0.5質量%のポリエチレングリコールを含有する癌治療剤を前立腺癌に投与する場合、例えば、0.1〜10mLとすることができる。前立腺癌以外の癌に投与する場合、癌部の大きさなどを考慮して、投与量は適宜変更できる。また、投与箇所は、1箇所に限らず、上記投与量を複数の箇所に分けて投与することもできる。
【００２０】
本発明の癌治療剤は、複数回に分けて投与することが好ましく、複数回投与の場合、1〜10日の間隔で行われることができる。複数回投与により、癌細胞が融合して多核細胞の形成をより促進でき、より高い治療効果を得ることができる。特に、本発明の癌治療剤は、癌細胞が融合して多核細胞を形成するに有効な量および有効な頻度で投与することが好ましい。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００２２】
材料および方法の説明
薬剤および化合物
ダルベッコ修正イーグル培地（DMEM）およびウシ胎仔血清（FCS）は、GIBCO（アメリカ）から購入した。PEG1000はMERCK（ドイツ）から得た。MEBCYTOアポトーシス・キットはMEDICAL＆BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD（日本）から得た。プロピディウム・イオダイド（PI）は、SIGMA-ALDRICH（アメリカ）から得た。ヘキスト33258溶液はDOJINDO（日本）から得た。
【００２３】
細胞培養
アンドロゲン非感受性の前立腺癌細胞系統、PC-3はＡＴＣＣから購入した。PC-3ストック細胞は、10％の加熱不活化したウシ胎児血清と１％ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO（アメリカ））を含んだDMEMにより37℃で培養した。
【００２４】
PEG1000による細胞融合を経た多核細胞の誘導
本発明者らは、PC-3細胞について細胞融合手順の２つのプロトコールを採用した。
融合プロトコール-1
１  細胞をトリプシン処理により回収し、そして、1ｘ106細胞を10及び35％のPEG1000 1mLで懸濁し、1分間室温で反応
２  無血清DMEM 9mLで希釈し、10分室温で反応
３  細胞を遠心分離によって集め、PBSで2度洗浄
４  細胞を10mLの培養液で懸濁し、100ｍｍ培養皿上に細胞を接種
【００２５】
融合プロトコール-2
１  細胞をトリプシン処理により回収し、そして、1ｘ106細胞を0.5、1及び35％のPEG1000 0.1mLで懸濁し、１分間室温で反応
２  無血清DMEM 0.9mLで希釈し、10分室温で反応
３  細胞を遠心分離によって集め、PBSで2度洗浄
４  細胞を10mLの培養液で懸濁し、100ｍｍ培養皿上に細胞を接種
【００２６】
H.E染色
１  融合プロトコール-1に従って細胞を処理
２  10cm培養皿の中でカバーガラス上に接種
３  24、48および72時間の後、カバーガラスを取り除き、H.E染色により細胞を染色した。
４  顕微鏡によって全細胞数と多核細胞数を数えた。1000細胞を3回数え、多核細胞のパーセンテージを求めた。
2つ以上の核を持つ細胞がこの研究での多核細胞であると定義することとした。
【００２７】
ヘキスト33258染色
１  融合プロトコール-2に従って細胞を処理
２  10cm培養皿に接種
３  34、36および38時間の後、細胞をトリプシン処理し、非接着性細胞も含めて回収
４  PBSで洗浄
５PBS  300μＬを細胞に加えた後、1％グルタルアルデヒド700μＬを加え、よく混合し、一晩反応
６  細胞を遠心分離機にかけた後、上澄みを除去
７  PBS 0.05mLを細胞ペレットに加えて、よく混合
８  これらのサンプル0.01mLにヘキスト33258溶液を0.002mL加え、光学顕微鏡で核が断片化した細胞や核が濃縮したようなアポトーシス変化を起こしている細胞を観察した。細胞を100個数えその中に存在する多核細胞およびアポトーシス細胞のパーセンテージを出し、この操作を5回行い、平均値を算出した。
【００２８】
フローサイトメトリー分析
１  MEBCYTOアポトーシス・キットによってPEGによるアポトーシスの誘導効果を検討した。
２  融合プロトコール-2に従って細胞を処理
３  10cm培養皿に接種
４  36時間の後、トリプシン処理し、細胞を回収
５  PBSで洗浄
６  結合緩衝液 85μＬを加えた後、AnnexinV-FITC 0.01mL、及びPI 0.005mLを加え、よく混合し、暗所において15分間室温で反応
７  結合緩衝液 0.04mLを加えた培養の後、488ｎｍで励起光を放射するシングルレーザーを用いたフローサイトメトリーにより細胞サンプルを測定
８  FL-2AおよびFL-2Wグラフにおいて任意に巨大細胞を選択
９  選択した細胞がAnnexinVによって染色されるかどうかを検討した。
【００２９】
細胞増殖分析
プロトコール-1
１  10cm培養皿の中で未処理細胞（1×106細胞）を接種し、一晩細胞を培養
２  培地にPEG溶液（最終PEG濃度は0.5％）を加えた。
３  24、36、48、72時間後に細胞を回収し、トリパンブルーによって細胞を染色し、生細胞を数えた。
【００３０】
プロトコール-2
１  融合プロトコール-2に従って細胞を処理（PEG濃度は0.5％）
２  10cm培養皿の中で未処理細胞（１×106細胞）を接種
３  24、34、36、38時間後に細胞を回収し、トリパンブルーによって細胞を染色し、生細胞を数えた。
【００３１】
30分間のPEG処理による多核細胞の検出
プロトコール-1
１  細胞融合プロトコール2に従い、細胞を処理した（PEG濃度は、0％、0.5％、1％）
２  10cm培養皿に1×105細胞濃度の細胞を接種
３  34、36、38時間の後、細胞をトリプシン処理し、細胞を回収
４  PBSで洗浄
５  細胞ペレットにPBS 0.03mL添加し、細胞を浮遊させる。
６  1％グルタルアルデヒド 0.07を添加
７  細胞をよく混合し、一晩反応
８  細胞を遠心分離機にかけた後、上澄みを除去
９  細胞ペレットにPBS 0.05mLを加え、よく混合
１０  細胞浮遊液0.01mLに0.002mLのヘキスト33258溶液を添加
１１  光学顕微鏡によって多核細胞及びアポトーシス細胞を観察した。細胞を100個数えその中に存在する多核細胞およびアポトーシス細胞のパーセンテージを出し、この操作を5回行い、平均値を算出した。
【００３２】
プロトコール-2
１  細胞融合プロトコール-2に従い、30分間細胞を処理した（PEG濃度は、0％、0.5％、１％）
２  1×105細胞濃度で10cm培養皿のカバーガラス上に細胞を接種
３  34、36、38時間の後、カバーガラスを取り除き、15分間、100％エタノールで細胞を固定
４  PI溶液（PBS中に50ug／mLのPIおよび100ug／mLのRNaseを加えたもの）で細胞を染色
５  遮光下で37℃、30分間細胞を反応
６  光学顕微鏡で多核化形成の細胞を観察した。細胞を100個数えその中に存在する多核細胞およびアポトーシス細胞のパーセンテージを出し、この操作を5回行い、平均値を算出した。
【００３３】
腫瘍へのPEG注入による腫瘍発育の抑制
１  BALB/c-nu/nuマウスの皮下にPC-3を5×106個注入
２  7日後、皮下に形成した腫瘍を確認
３  形成した腫瘍にPBSあるいは0.5％のPEG溶液を0.2mL週1回または2回注入した。腫瘍体積を測定し、PBS注入群とPEG注入群または週1回PEG注入群と週2回PEG注入群とを比較した。腫瘍容積は（長軸）×（短軸）2×0.52で求めた。
【００３４】
H.EおよびTUNEL染色によるPEG処理腫瘍の多核化およびアポトーシス性細胞の検出
１  PBSあるいはPEG溶液を注入した後、36および38時間で腫瘍を除去
２  10％のホルマリン中性緩衝液（和光  pH 7.4）によって腫瘍を固定
３  腫瘍をパラフィン包埋し、サンプルを薄切し、脱パラフィン化
４  H&E染色
５  サンプルを薄切し、脱パラフィン化した後、0.85％ NaClで5分間処理
６  1×PBSによってサンプルを５分間洗浄
７  4％パラホルムアルデヒド（PFA）によって15分間細胞を固定
８  1×PBSによって洗浄し、プロテイナーゼKを含んだPBS（終末濃度は１／500）0.1mLでそのサンプルを処理した。プロテイナーゼＫバッファーは100mMトリス塩酸（pH 8.0）および50ｍM EDTAから構成される。
９  １×PBSでサンプルを洗浄
１０  ４％PFAで5分間固定
１１  PBSで再洗浄
１２  0.1mLのEguilibrationバッファーによってサンプルを処理
１３  rTdT反応ミックス 0.1mLにより37℃、60分間の条件で細胞を処理した。rTdT反応ミックスは、0.098mLのEguilibrationバッファー、0.001mLにビオチン付加されたヌクレオチド・ミックスおよび0.001mLのrTdT酵素から構成される。
１４  2×SCCによってサンプルを処理
１５  1×PBSで２回洗浄した
１６  0.3％のH2O2を含んだ10mMトリス（pH 7.5）でサンプルを処理
１７  １×PBSによってサンプルを２度洗浄
１８  Streptavidin HSPを含んだPBS溶液（１：500）で処理
１９  PBSでそれを2度洗浄
２０  DAB溶液 0.01mLによってサンプルを反応させた。DAB溶液は、DAB基質20×緩衝液 0.005mL、MilliQ水 0.095mL、DAB20×クロマジェン0.005mLおよび過酸化水素20×緩衝液  0.005mLから構成される。
２１  1分間後、サンプルを水で10分間洗浄
２２  エタノールとキシレンによって処理し、被覆
２３  顕微鏡によってサンプルを観察
【００３５】
結果
PEG1000による細胞融合を経た多核化細胞の発生
図1Aは、35％PEGで処理した細胞像を示した。矢印は多核細胞を示した。図1Bは多核細胞の出現頻度を示した。多核細胞の出現頻度は、24時間後ではPEG濃度依存的に増加する傾向にあった。多核細胞の最大出現頻度は、35％PEG処理を行ったときの４％であった。また多核細胞は48時間後に減少傾向を認めた。
【００３６】
PEG1000による多核化およびアポトーシス細胞の発生
図2A、Cは、多核細胞、核化断片および核濃縮細胞像を示した。図2B、Dにその出現頻度を示した。図２Bに示すとおり、多核細胞の出現頻度は、34〜36時間でPEG濃度依存的に増加し、36〜38時間の間で減少していた。
次に、図2Dにアポトーシス細胞の出現頻度を示した。そのアポトーシス細胞の出現頻度は、34〜36時間でPEG濃度依存的に増加し、36〜38時間の間で減少していた。さらに、多核細胞由来のアポトーシス性細胞の発生はおよそ60％であった（データなし）。
【００３７】
フローサイトメトリーによるアポトーシス誘導の検出
図3AはアネキシンV、PIで染色した細胞像を示した。図3BはPEG未処理の細胞をフローサイトメトリーで解析した結果を示した。図3Cは0.5％のPEGで処理の細胞をフローサイトメトリーで解析した結果を示した。PEG未処理群と比較し、PEG処理群で細胞集団が右にシフトしていることがわかった。アネキシンＶ陽性、PI陰性細胞は、0.5%PEG処理により全細胞数の16.3％であり、そのような細胞はPEG投与量依存的で増加していた。図3D（PEG未処理群）、E（0.5％PEG処理群）は任意に巨大細胞のみを選択し、フローサイトメトリーで解析した結果を示した。未処理群と比較し、0.5％PEG処理群で巨大細胞が２．６倍増加し、その細胞のほとんどがアネキシンＶ陽性を示した。
【００３８】
細胞増殖測定
図4Aはプロトコール-1での細胞増殖曲線を示した。この条件下ではPEGは細胞増殖に影響しなかった。
図4Bはプロトコール-2での細胞増殖曲線を示した。この条件下では36時間後で処理時間依存的に生細胞が減少した。
【００３９】
30分で処理したPEGによる多核細胞の検出
図5A、Bはプロトコール-1にしたがって処理した36時間後の細胞像を示した。矢印は多核細胞を示した。矢印は多核細胞を示した。図5C、Dは36時間および38時間後の多核細胞の出現頻度を示した。多核細胞の出現頻度は、36時間後で最大40％に増加し、38間後に減少していた。本発明者らは細胞膠着の可能性を考えたので、図6A、Bはプロトコール-2にしたがって処理した36時間後の細胞像を示した。矢印は多核細胞を示した。図6Cは36時間および38時間後の多核細胞の出現頻度を示した。接着した細胞のみではあるが、多核細胞の出現頻度は最大14％を示し、38時間後には減少した。
【００４０】
ヌードマウスに埋入したPC-3の形成腫瘍でのPEG注入
BALB/c-nu/nuマウスの皮下にPC-3細胞を移植し、7日後に皮下腫瘍の形成を認めたため、形成した腫瘍に0.2mLのPBSまたは0.5%のPEGを週1回または2回注入した。図7はマウスの体重変化を示した。PEG溶液を注入しても体重減少は認めなかった。図8のA、B、C、DはそれぞれPBS週1回注入群、0.5％PEG週1回注入群、PBS週２回注入群、0.5％PEG週2回注入群の各腫瘍の体積増加曲線を示した。PBS注入群と比較し、PEG注入群で腫瘍増殖抑制効果が観察された。図8Eは各群での腫瘍体積変化の比較をグラフに示したが、腫瘍増殖抑制効果は、注入回数に依存して増強していた。図9AはPEG溶液注入後36時間で腫瘍を摘出し、H&E染色を行った組織像を示した。腫瘍内部に間隙を認め、その周囲に多核細胞が多く出現していた。図9B、Dはそれぞれ図Aの連続切片でのTUNEL及びssDNAの免疫染色像を示した。図９C、Eはそれぞれの拡大像を示した。図9Aで観察された間隙の周囲の細胞にTUNEL及びssDNA陽性を認めた。なおPBS注入群においてもTUNEL陽性細胞は存在したが、ssDNA陽性細胞は認めず、腫瘍増殖に伴う虚血性変化によるものと考えられた。加えて、PEG注入後38時間後の組織ではTUNEL及びssDNA陽性細胞は認めなかった。
【００４１】
考察
ポリエチレングリコール（PEG）は、化学予防特性をもつと知られている。いくつかの報告では、PEG8000がACFを誘導するアゾキシメタンを減少するということを示している。これらの報告書では、PEGは浸透剤であるので、ACFの減少が糞便の水分の増加を結論づけていた。しかしながら、本発明者らは、アグリテーション効果がPEGの抗癌特性を説明することについて十分であるとは考えない。これまでの報告書において、PEGはアポトーシスを誘導することが示されていたため、本発明者らは、PEGにより誘導するアポトーシスがこの矛盾を説明しうると考えた。
【００４２】
一方で、PEGはとても有名な細胞融合物質として知られている。興味深いことに、ヒト大腸がん細胞株HT29細胞においてPEGによる細胞融合を介した多核細胞は培養していると消えてしまうことが報告されている。さらに、放射線や抗がん剤は多核細胞を誘導し、アポトーシスまたは細胞死を引き起こすことが報告されている。本発明者らは、細胞融合を経た多核細胞はアポトーシスを誘導するという仮説を立てた。これまでの報告でも、細胞融合の効果が考慮されていたが、PEG濃度が30〜50％と高濃度でないと細胞融合が効率よく誘導されないとされていたため、可能性は低いと考えられていた。本発明者らは、PEG溶液量を減少させ、効率よく細胞を密着させることにより、低濃度のPEGでも細胞融合を起こし、アポトーシスを誘導することが出来るのではないかと考えた。
【００４３】
まず、本発明者らは、一般に用いられている細胞融合プロトコールに従い、PEG1000がPC-3細胞で細胞融合を経た多核細胞をPEG濃度依存的に誘導することを示した。興味深いことに、多核細胞の出現頻度は、24時間と48時間の間で減少した。本発明者らは、多核細胞の消失はPEGによってアポトーシスが誘導された結果であると考えた。しかしながら、その出現頻度はとても低く、PEGによるアポトーシスの検出はこの状況下ではとても困難であると考えた。一般的に、細胞融合は細胞密度が高く、細胞同士が密着しているときに起こりやすいと考えられている。それゆえに、PEG溶液0.1mLにより細胞を処理することを試した。さらに、非接着細胞にも多核細胞が存在すると考えたため、培地中の全細胞を回収し実験を行うことにした。このような条件下では、多核細胞の出現頻度は３倍に増加した。興味深いことに、その出現頻度は36時間後増加し、そして38時間後に減少していることを見出した。ここでアポトーシス細胞の出現頻度を検討してみると多核細胞の出現頻度と同様の動向を示した。この結果から、PEGで誘導した多核細胞はアポトーシスをもたらしているのではないかということが示唆された。また細胞融合した細胞の中でアポトーシスを起こしている細胞は、全アポトーシス細胞の60％を示した。一般的に、細胞融合した細胞は巨大細胞を形成すると考えられるため、本発明者らは、巨大な細胞で核が断片化したものや核濃縮像を持つものを融合細胞由来のアポトーシスと考えた。
【００４４】
次に、フローサイトメトリーを用い、PEGによるアポトーシス誘導を検討した。一般的に、アネキシンVがアポトーシスの一つのマーカーであることは知られている。従って、アネキシンV陽性およびPI陰性の細胞は初期のアポトーシス性細胞と考えることができる。図3B、Cに示すように未処理群と比較しPEG処理によってアポトーシスが誘導されていることを示した。このアポトーシスが多核細胞由来であるかどうかを検討するため、本発明者らは任意に巨大細胞のみを選択し、その細胞がアネキシンVに陽性を示すかどうかを検討した。図３D、Eに示すとおり、PEG処理によって巨大細胞が増加しており、巨大細胞はアネキシンVに染色されていた。この結果より、巨大細胞（多核細胞）がアポトーシスを起こしていることが示唆された。
【００４５】
次に、本発明者らは、PEGによる細胞増殖における影響を検討した。培地へPEG溶液を加えた状態では、低濃度のPEGは細胞増殖に影響を与えなかった。他方、本発明者らが細胞融合プロトコール-2に従ってPEGにより細胞ペレット処理したとき、36時間後に細胞はPEG濃度および作用時間依存的に細胞死を引き起こした。これらの結果は、細胞密度が低い状態では、PEGは細胞増殖に影響しないが、細胞密度が高い状態では細胞死を誘導することを示した。さらに、本発明者らがPEGで細胞を30分間処理したとき、多核細胞の発生率は36時間後では約40％に増加することを見出した。これらの結果より、本発明者らは、腫瘤を形成するような限局性腫瘍にPEGを注入したならば、PEGの抗腫瘍効果を発揮させるのに有効ではないかと考えた。以前の報告で、ヘマント K.ロイらもHT-29細胞で、PEGがアポトーシスを誘導するのではないかと考え、同様の実験をしたが、PEGのアポトーシス誘導効果を実証できなかったと報告している。しかし本発明者らは、彼らが培地中にPEG溶液を添加する方法を用いていたため、アポトーシス誘導を検出できなかったのではないかと考えた。
【００４６】
最後に、本発明者らはヌードマウスの皮下に前立腺がん細胞を移植し、形成された腫瘍内にPEGを注入し、PEGの抗腫瘍効果を検討した。本発明者らは、移植7日後に皮下に形成した腫瘍を観察したため、形成した腫瘍に0.2mLのPBSあるいは0.5％のPEGを注入した。図8は、腫瘍容積の変化を、7日目のものと比較したものを示した。PBS注入群と比較し、PEG注入群において腫瘍増殖抑制効果が認められ、その効果は、注入回数依存的に増強していた。また、これらのマウスは、その期間中に体重の減少を示さなかったため、PEGによるマウス個体への副作用はほとんどないと考えられた。PEGによる腫瘍内部での変化を検討するために、PEG注入後36時間で腫瘍を摘出し、H&E染色によってサンプルを染色し、顕微鏡で観察した。腫瘍内部にはいくつかの間隙を認め、その間隙周囲にいくつかの多核細胞が出現していたため、本発明者らは、その間隙にPEG溶液が存在していたのではないかと考えた。ここで本発明者らは腫瘍内部でのアポトーシス変化を確認するため、TUNEL染色及びssDNAの免疫染色を行った。図9B、Dに示すように間隙周囲に陽性細胞が存在し、拡大像で多核細胞が陽性を示していることを確認した。（図9C、E）PBS注入群においてもTUNEL陽性細胞は存在していたが、腫瘍が増大することで生ずるネクローシス変化と考えられた。また興味深い点としてPEG注入38時間後のサンプルでは、TUNEL染色及びssDNA陽性細胞は認めなかった。すなわちPEGによって誘導された多核細胞は36から38時間の間にアポトーシスに陥り、速やかに死滅することが推測され、その結果として腫瘍増殖抑制効果を示すことが考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によれば、癌治療剤の分野に有用である。またDNA損傷を伴う他の抗がん剤や放射線療法と違い、細胞融合という細胞の形態を変化させるだけでアポトーシスを誘導させるため、治療に対し抵抗性を示すことが少ないのではないかということが推測される。加えて細胞環境が密接でないとPEGによるアポトーシス誘導効果は認められないため、仮に誤って血管内に注入したとしても影響が少ないことが予想させる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】PEG1000による細胞融合を経た多核化細胞の発生試験結果を示す。Aは、35％PEGで処理した細胞像を示す。矢印は多核細胞を示す。Bは多核細胞の出現頻度を示す。
【図２】PEG1000による多核化およびアポトーシス細胞の発生試験結果を示す。A、Cは、多核細胞、核化断片および核濃縮細胞像を示す。B、Dにその出現頻度を示す。
【図３】フローサイトメトリーによるアポトーシス誘導の検出試験結果を示す。AはアネキシンV、PIで染色した細胞像を示す。BはPEG未処理の細胞をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。Cは0.5％のPEGで処理の細胞をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。D（PEG未処理群）、E（0.5％PEG処理群）は任意に巨大細胞のみを選択し、フローサイトメトリーで解析した結果を示す。
【図４】細胞増殖測定試験結果を示す。Aはプロトコール-1での細胞増殖曲線を示す。Bはプロトコール-2での細胞増殖曲線を示す。
【図５】30分で処理したPEGによる多核細胞の検出結果を示す。A、Bはプロトコール-1にしたがって処理した36時間後の細胞像を示す。C、Dは36時間および38時間後の多核細胞の出現頻度を示す。
【図６】30分で処理したPEGによる多核細胞の検出結果を示す。A、Bはプロトコール-2にしたがって処理した36時間後の細胞像を示す。Cは36時間および38時間後の多核細胞の出現頻度を示す。
【図７】ヌードマウスに埋入したPC-3の形成腫瘍でのPEG注入試験結果を示す(図7〜10)。マウスの体重変化を示す。
【図８−１】A、B、C、DはそれぞれPBS週1回注入群、0.5％PEG週1回注入群、PBS週２回注入群、0.5％PEG週２回注入群の各腫瘍の体積増加曲線を示す。Eは各群での腫瘍体積変化の比較をグラフに示す。
【図８−２】A、B、C、DはそれぞれPBS週1回注入群、0.5％PEG週1回注入群、PBS週２回注入群、0.5％PEG週２回注入群の各腫瘍の体積増加曲線を示す。Eは各群での腫瘍体積変化の比較をグラフに示す。
【図９】AはPEG溶液注入後36時間で腫瘍を摘出し、H&E染色を行った組織像を示す。B、Dはそれぞれ図Aの連続切片でのTUNEL及びssDNAの免疫染色像を示す。C、Eはそれぞれの拡大像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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