(57)【要約】【課題】  抗原抗体反応を利用した免疫クロマトグラフィー用の検査用具において、試験溶液を試験片の縁と下カバーの縁との間に形成されている隙間へ漏らすことがなく、検出感度が高い免疫クロマトグラフィー検査用具を提供する。【解決手段】  試験溶液滴下窓と検査結果検出窓とが設けられた上カバーと、試験片設置ガイドが設けられた下カバーと、試験片とから成り、上カバーと下カバーとの間に試験片が収納されている免疫クロマトグラフィー検査用具において、上下カバーの内面の接触角が水に対して６０°〜１５０°であることを特徴とし、上下カバーの内面に撥水処理が施されていることが好ましい免疫クロマトグラフィー検査用具とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験溶液滴下窓と検査結果検出窓とが設けられた上カバーと、試験片設置ガイドが設けられた下カバーと、試験片とから成り上カバーと下カバーとの間に試験片が収納されている免疫クロマトグラフィー検査用具において、上下カバーの内面の接触角が水に対して６０°〜１５０°であることを特徴とする免疫クロマトグラフィー検査用具。
【請求項２】
上下カバーの内面に撥水処理が施されていることを特徴とする請求項１に記載の免疫クロマトグラフィー検査用具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出感度を向上させた免疫クロマトグラフィー検査用具に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、細菌の検査には抗原抗体反応を利用した検査方法が実施されており、抗原抗体反応を利用する方法が数多く提案されてきた。（例えば、特許文献１〜６参照。）。これらの方法は、採取した検体と抗体を含んだ試験溶液とを混合し多孔質膜に染み込ませるだけで抗原の有無や量を知ることができる簡便性に優れた方法であり、一般的には免疫クロマトグラフィーとも呼ばれ、その同定・定量の原理も開示されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
一般的な免疫クロマトグラフィー法では二つの抗体を用いて検体の検出を行う。第一の抗体は、試験溶液中や多孔質膜から成る略短冊状の試験片の一端で試験溶液が滴下される部分に存在し、その抗体はラテックス粒子や金コロイド粒子といったもので標識されている（以下、標識抗体と称する。）。滴下された試験溶液中に検出対象の検体が存在すると標識抗体が検体を認識して標識抗体と検体とが結合する。この検体と標識抗体との複合体が毛細管現象により標識抗体が含まれていた端とは反対側の端に取り付けられている濾紙等からなる吸収体へ向かって流れる。その流れる過程で、検体と標識抗体との複合体が、多孔質膜の中程に存在する第二の抗体（以下、補足抗体と称する。）により認識・補足され、その結果として検出部に可視シグナルとして多孔質膜上に現れ検出されるのである。
【０００４】
上記のような一般的な免疫クロマトグラフィー法で用いられる試験片は、取り扱いを容易とするようにデバイスカセットと呼ばれるポリスチレンやポリプロピレン等の上下カバーの間に挟まれて収納されている。より具体的には、試験片設置ガイドが設けられた下カバーに試験片が設置され、試験溶液を試験片に滴下するための滴下窓と多孔質膜から成る試験片の中程に現れる検査結果を確認するための検出窓とが設けられた上カバーで蓋をされた一体構成となっている。
【０００５】
試験片の寸法は小さい方が検査結果を鮮明に確認できるが、試験片の寸法に合わせてカバーも小さくすると検査時に操作が困難になるという問題がある。そこで取り扱いを容易とするために、試験片を収納するカバーの寸法は試験片の寸法よりも一回り以上大きいことが一般的となっており、そのため、試験片の縁と下カバーの縁との間に隙間が形成されてしまう。上カバーの滴下窓から試験片に滴下された試験溶液は、多孔質膜から成る試験片中を吸収体へ向かって流れていく過程で試験片の縁と下カバーの縁との間に形成されている隙間へ漏れてしまうことがある。こうなってしまうと、たとえ滴下窓に検査に必要な量だけ試験溶液が滴下されても試験溶液が多孔質膜から成る試験片を設計通りに流れないので試験溶液が検査に充分には用いられないことになる。その結果、検査の誤差が大きくなってしまうという問題になっていた。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，５９１，６４５号公報
【特許文献２】米国特許第４，８５５，２４０号公報
【特許文献３】米国特許第４，４３５，５０４号公報
【特許文献４】米国特許第４，９８０，２９８号公報
【特許文献５】特開昭６１−１４５４５９号公報
【特許文献６】特開平６−１６０３８８号公報
【非特許文献１】Ｓｅ−Ｈｗａｎ  Ｐａｅｋ，  Ｓｅｕｎｇ−Ｈｗａ  Ｌｅｅ，  Ｊｏｕｎｇ−Ｈａｗａｎ  Ｃｈｏ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ−Ｓａｎｇ  Ｋｉｍ，  「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒａｐｉｄ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｓｓａｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ」，  ２２，  ５３−６０，  ２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫クロマトグラフィー用の検査用具において、試験溶液を試験片の縁と下カバーの縁との間に形成されている隙間へ漏らすことがなく、検出感度が高い免疫クロマトグラフィー検査用具を提供することを課題とする。
【０００８】
本発明者等は前記課題を解決するために鋭意検討した結果、滴下された試験溶液が多孔質膜から成る試験片中を吸収体へ向かって流れていく過程で、試験片の縁と下カバーの縁との間に形成されている隙間へ漏らさずに、試験溶液を多孔質膜から成る試験片へ吸収させ検出部へ導くことができれば検出の感度を高めることが可能なことに着目し、上下カバーの内面に撥水性を持たせることにより検出感度を向上させることができることを見出して本発明を完成した。
【０００９】
即ち本発明は、試験溶液滴下窓と検査結果検出窓とが設けられた上カバーと、試験片設置ガイドが設けられた下カバーと、試験片とから成り、上カバーと下カバーとの間に試験片が収納されている免疫クロマトグラフィー検査用具において、上下カバーの内面の接触角が水に対して６０°〜１５０°であることを特徴とし、上下カバーの内面に撥水処理が施されていることが好ましい免疫クロマトグラフィー検査用具である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る免疫クロマトグラフィー検査用具は、カバーの滴下窓から試験片に滴下された試験溶液を試験片の縁と下カバーの縁との間に形成されている隙間へ漏らさずに試験片の検出部へ導くことができ、検出感度を向上させることが可能な免疫クロマトグラフィー検査用具である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明に係る免疫クロマトグラフィー法に用いる検査用具について詳細に説明する。本発明に係る免疫クロマトグラフィー検査用具は、試験溶液滴下窓と検査結果検出窓とが設けられた上カバーと、試験片設置ガイドが設けられた下カバーと、上下カバーの間に収納されている試験片とから成る。
【００１２】
本発明に係る免疫クロマトグラフィー検査用具を構成するカバーの材質は、試験片を保持する程度の硬さや強度を持つものであれば特に限定せず用いることができるが、一度の検査で使い捨てられることを考慮すると、コスト的には樹脂が好ましく、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ），ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ），ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）などの汎用プラスチックが適している。
【００１３】
本発明に係る免疫クロマトグラフィー検査用具を構成するカバーの内面の接触角は、水に対して６０°〜１５０°であることを特徴とする。水に対する接触角が６０°未満であるとカバーの滴下窓から試験片に滴下された試験溶液が多孔質膜から成る試験片中を吸収体へ向かって流れていく過程で、試験片の縁と下カバーの縁との間に形成されている隙間へ漏れてしまい、試験溶液が多孔質膜にうまく吸収されず、検査の誤差が大きくなってしまう。水に対する接触角が１５０°を超えても撥水処理の効果はそれ以上期待できない。特に好ましくは、８０°〜１３０°である。
【００１４】
本発明に係る免疫クロマトグラフィー検査用具を構成するカバーの内面の接触角を水に対して６０°〜１５０°とするための手段としては、カバーを製造する金型の表面を研磨し滑沢にすることで成型されたカバー表面の粗さを抑えたり、既に成型されたカバーの試験片に面する側を研磨するなどして表面の粗さを小さくするなどの方法が考えられるが、処理の効率を考慮すると撥水剤を筆やスプレーで塗布する方法が好ましい。撥水剤としては、シリコーン系やワックス系やフッ素系のものなど、樹脂に撥水性を付与するものであれば特に限定せずに使用することができる。
【実施例】
【００１５】
「特異抗体の作製」
ミュータンス連鎖球菌としてストレプトコッカス・ミュータンス（ATCC25175菌株）を培養し、ホルムアルデヒド水溶液で生育を停止させた。この菌の分散液をそのままマウスに免疫し、KohlerとMilsteinによる細胞融合によるハイブリドーマの樹立法に基づいて樹立したハイブリドーマを培養し、その培養液を限界希釈法によりスクリーニングして得た抗体を、抗体によっては後述する標識を行って以下に示す精製抗体を各二種類ずつ得た。
【００１６】
「ＳＭ１抗体」…ストレプトコッカス・ミュータンスに対する捕捉抗体
「ＳＭ２抗体」…ストレプトコッカス・ミュータンスに対する標識抗体
【００１７】
「特異抗体への標識」
ＳＭ２抗体には粒径４０ｎｍの金コロイドを標識した。金コロイドは市販品（British Biocell International社製）のものを使用し、ウシ血清アルブミン（商品名：ＢＳＡ、シグマケミカルカンパニー社製）１％、非イオン性界面活性剤（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０、シグマケミカルカンパニー社製）１％を添加したリン酸緩衝液で抗体濃度０．１μｇ／ｍＬとなるように希釈した。
【００１８】
「試験片の作製」
多孔質膜としてニトロセルロースメンブレン（商品名：HiFlow Membrane HF075、日本ミリポア社製）を幅５ｍｍ×長さ７５ｍｍ×厚さ約０．４ｍｍの長方形に切り出した。ストレプトコッカス・ミュータンスに対する捕捉抗体であるＳＭ１抗体を１％ウシ血清アルブミン含有５０ｍＭりん酸緩衝液に１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した。この抗体液を前記ニトロセルロースメンブレンの中央部に長手方向と直角にマイクロピペットで凡そ１μｇ／ｃｍとなるように塗布し含浸させた。このニトロセルロースメンブレンの一端に重なるように、幅５ｍｍ、長さ３０ｍｍ、厚さ１．５ｍｍの形状の濾紙（商品名：CFSP223、日本ミリポア社製）を吸収体として固定した。また吸水体と反対側の端に金コロイドを標識したＳＭ２抗体の保持体として５ｍｍ×２０ｍｍのポリプロピレン製マトリクス（商品名：クイックリリース コンジュゲートパッド、日本ミリポア社製）を固定し、そこに金コロイドを標識したＳＭ２抗体を３０μｌ滴下した。その後３７℃で２時間乾燥したものを試験片とし、検査直前までデシケーター中に保管した。
【００１９】
「免疫クロマトグラフィー検査用具の作製」
表１に示した材質から成る、試験溶液滴下窓と検査結果検出窓とが設けられた幅１９ｍｍ×長さ８３ｍｍ×厚さ２ｍｍの上カバーと、試験片設置ガイドが設けられた幅１９ｍｍ×長さ８３ｍｍ×厚さ２ｍｍの下カバーとに分割された箱型カバーをの内面の前面に、撥水スプレー（商品名：ｄｕｆｉｘ  超強力防水スプレー、ヘンケルジャパン株式会社製）を塗布して室温で１時間放置した。その後、下カバーに設けられた試験片設置ガイドに沿って下カバーに試験片を設置し、上カバーで蓋をして免疫クロマトグラフィー検査用具とした。
【００２０】
「接触角の測定」
接触角計（ＣＡ−Ｄ型，協和界面科学株式会社製）を用いて、カバー内面の水に対する接触角を測定した。なお、測定は液滴法を用いてθ/２法で解析した。
【００２１】
「抗体反応の有無の確認」
１．５０ｍＭりん酸緩衝液中に、ストレプトコッカス・ミュータンス菌数が１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ、７．５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ、５．０×１０５ＣＦＵ／ｍＬとなるように調整した後、このストレプトコッカス・ミュータンス菌溶液２５０μＬを特開２００２−３５７５９９に開示されている方法で処理した。これを試験溶液とした。
２．この試験溶液を３００μＬ、検査用具の試験溶液滴下窓から滴下し、試験片に試験溶液を染み込ませ、１５分後に検査結果検出窓を目視することにより、抗体反応の強度を評価した。抗体反応の強度は、＋＋：強く反応、＋：反応あり、±：僅かに反応あり、−：反応なし、で評価した。
【００２２】
検査終了後、上カバーを外し、試験片の縁と下カバーの縁との間に形成されている隙間への試験溶液の漏れを観察した。
【００２３】
比較例として、撥水処理を施さないポリスチレンから成るカバーを用い、上述した方法で接触角の測定，抗体反応の強度の確認，試験溶液の漏れの観察を行った。
表１
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【００２４】
表１から明らかなように、カバー内面に撥水処理を施し接触角が水に対して６０°〜１５０°の範囲にある実施例は、ストレプトコッカス・ミュータンス菌数の量が５．０×１０５ＣＦＵ／ｍＬと少なくても抗体反応が確認でき、試験溶液の漏れもなかったのに対し、カバー内面に撥水処理を施さず接触角が水に対して５０°の比較例は試験溶液の漏れがあり、ストレプトコッカス・ミュータンス菌数の量が５．０×１０５ＣＦＵ／ｍＬの場合には抗体反応が確認できない結果となった。これより、カバー内面に撥水処理を施すなどしてカバー内面の接触角を水に対して６０°〜１５０°である免疫クロマトグラフィー検査用具は、滴下された試験溶液を漏らさずに試験片の検出部へ導くことができ、検出感度が高いことが分かる。