(57)【要約】【課題】バキュロウイルス発現系における目的タンパク質の高発現が可能な改変ポリヘドリンプロモーター、該改変ポリヘドリンプロモーターを含むバクミド変異体、及び、該バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法を提供する。【解決手段】バースト配列を２以上８以下含む改変ポリヘドリンプロモーターである。また、前記改変ポリヘドリンプロモーターと、バキュロウイルスＤＮＡと、ｍｉｎｉＦレプリコンと、トランスポゾンの付着部位と、を含むバクミド変異体である。  更に、バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法であって、大腸菌中で、前記バクミド変異体と、目的タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、トランスポゼースとにより、目的タンパク質発現バクミドを得る工程と、前記目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入する工程と、を含む目的タンパク質の製造方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バースト配列を２以上８以下含むバキュロウイルス遺伝子発現系用の改変ポリヘドリンプロモーター。
【請求項２】
前記バースト配列が配列番号１のポリヌクレオチドである請求項１に記載の改変ポリヘドリンプロモーター。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の改変ポリヘドリンプロモーターと、バキュロウイルスＤＮＡと、ｍｉｎｉＦレプリコンと、トランスポゾンの付着部位と、を含むバクミド変異体。
【請求項４】
前記バキュロウイルスＤＮＡは、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ又はＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡである請求項３に記載のバクミド変異体。
【請求項５】
バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法であって、
大腸菌中で、請求項３又は請求項４に記載のバクミド変異体と、目的タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、トランスポゼースとにより、目的タンパク質発現バクミドを得る工程と、
前記目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入する工程と、
を含む目的タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変ポリヘドリンプロモーター、バクミド変異体及び目的タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バキュロウイルス遺伝子発現系は、真核生物である昆虫由来の細胞中で組換えタンパク質を生産するため、糖鎖付加、リン酸化などの翻訳後修飾が行われるため、活性を有する組換えタンパク質の大量生産に適している。
組換えタンパク質の高発現のためには高いプロモーター活性を有する発現用プロモーターが必要である。バキュロウイルス遺伝子発現系においては、バキュロウイルス由来の強力なポリヘドリンプロモーターが発現用プロモーターとして広く利用されており、その機能と構造についてはいくつかの報告がなされている（例えば、非特許文献１〜２参照）。
【０００３】
一方、さらに効率よく組換え遺伝子の発現を行うために、カイコ発現系に利用されるカイコガ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）をＢＡＣ（Bacterial Artificial Choromosome）クローン化できるＢｍＮＰＶシャトルベクター（バクミド）が開発され、大腸菌体内でのクローニングや組換えウイルスの構築を迅速に行うことができるようになった（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００４−１７３５０７号公報
【非特許文献１】J. Virol., 1994, Vol.68, p7746−7756.
【非特許文献２】J. Virol., 1999, Vol.73, p3404−3409.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、バキュロウイルス遺伝子発現系においても、目的タンパク質の発現効率が十分であるとは言い難かった。
本発明は、バキュロウイルス遺伝子発現系における目的タンパク質の高発現が可能な改変ポリヘドリンプロモーター、該改変ポリヘドリンプロモーターを含むバクミド変異体、及び、該バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の態様は、バースト配列を２以上８以下含むバキュロウイルス遺伝子発現系用のバクミド発現系用の改変ポリヘドリンプロモーターである。前記バースト配列は配列番号１のポリヌクレオチドであることが好ましい。
【０００６】
本発明の第２の態様は、前記改変ポリヘドリンプロモーターと、バキュロウイルスＤＮＡと、ｍｉｎｉＦレプリコンと、トランスポゾンの付着部位と、を含むバクミド変異体である。前記バキュロウイルスＤＮＡは、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ又はＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡであることが好ましい。
【０００７】
また、本発明の第３の態様は、バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法であって、大腸菌中で、前記バクミド変異体と、目的タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、トランスポゼースとにより、目的タンパク質発現バクミドを得る工程と、前記目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入する工程と、を含む目的タンパク質の製造方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、バキュロウイルス遺伝子発現系における目的タンパク質の高発現が可能な改変ポリヘドリンプロモーター、該改変ポリヘドリンプロモーターを含むバクミド変異体、及び、該バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の改変ポリヘドリンプロモーターは、バースト配列を２以上８以下含んでおり、バキュロウイルス遺伝子発現系用であることを特徴とする。天然型のポリヘドリンプロモーターは当初より１つのバースト配列を含むが、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターはバースト配列を２以上８以下含むので、バキュロウイルス遺伝子発現系に用いた場合に良好なプロモーター活性を達成することができる。
本発明におけるポリヘドリンプロモーターとは、バキュロウイルス、特に、核多角体ウイルス（ＮＰＶ：Nucleopolyhedrovirus）が、感染細胞の核内に生成するタンパク質であるポリヘドリンの遺伝子発現を調節しているプロモーターを意味する。
【００１０】
ポリヘドリンプロモーターの塩基配列のうち、転写開始点から翻訳開始点までの約５０ｂｐの領域内は一般にバースト配列と呼ばれ、バキュロウイルス由来の転写活性化因子である最後期転写因子１（ＶＬＦ１）と相互作用するシス・エレメントとしてポリヘドリンプロモーターの活性化に必須である（例えば、Virology, 1998, Vol. 248, p131−138.参照）。
本発明におけるバースト配列は、ＶＬＦ１と相互作用しうるポリヌクレオチドであればよいが、ＶＬＦ１との相互作用と転写活性化の観点から、ポリヘドリンプロモーターの塩基配列のうち、転写開始点から翻訳開始点までの約５０ｂｐの領域内に含まれるポリヌクレオチドであることが好ましく、下記表１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド（配列番号１）であることがより好ましい。
【００１１】
【表１】
2008301792.tif 000002
【００１２】
本発明の改変ポリヘドリンプロモーターが含むバースト配列の数は２以上８以下であるが、プロモーター活性向上の点から、より好適なバースト配列の数は、バキュロウイルス遺伝子発現系に応じて適宜選択することができる。例えば、ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡを含むバクミド変異体を用いる場合、含まれるバースト配列の数としては、２以上５以下であることが好ましく、２以上３以下であることがより好ましい。また、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡを含むバクミド変異体を用いる場合、含まれるバースト配列の数としては、２以上５以下であることが好ましい。
【００１３】
本発明の改変ポリヘドリンプロモーターは、転写活性化の観点から、バースト配列を転写開始点の下流かつ翻訳開始点の上流に含むものであることが好ましい。
また、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターは、転写活性化の観点から、バースト配列をタンデムリピートで含むことが好ましい。バースト配列をタンデムリピートで含むとは、２つ以上のバースト配列を連続して含むことを意味するが、バースト配列間にはスペーサーとなる塩基配列を含むことができる。バースト配列間に含まれる塩基数としては、転写活性化の観点から、６残基以下であることが好ましい。
【００１４】
本発明においては、バースト配列を転写開始点の下流かつ翻訳開始点の上流にタンデムリピートで含むことにより、より効率的にプロモーター活性を上昇させることができ、より好ましい。
【００１５】
本発明の改変ポリヘドリンプロモーターは、バースト配列を１つ含む天然型のポリヘドリンプロモーターを鋳型とした一般的なＰＣＲによって作製することができる。
特にバースト配列を３つ以上含む改変ポリヘドリンプロモーターの場合は、相同な粘着末端を形成する異なる２つの制限酵素を利用する方法を好ましく用いることができる。この方法では２つの異なるコンパチブルな制限酵素の認識部位を、バースト配列の上流と下流とにそれぞれ配置し、これらの制限酵素による酵素処理とライゲーションを繰り返すことにより、より効率的に多数のバースト配列を含む改変ポリヘドリンプロモーターを作製することができる。これら２つの異なるコンパチブルな制限酵素としては、例えば、ＸｂａＩとＳｐｅＩの組合せを挙げることができる。
【００１６】
本発明のバクミド変異体は、前記改変ポリヘドリンプロモーターと、バキュロウイルスＤＮＡと、ｍｉｎｉＦレプリコンと、トランスポゾンの付着部位とを含むことを特徴とする。前記改変ポリヘドリンプロモーターを含むことで、本発明のバクミド変異体を用いた目的タンパク質発現系における発現効率を向上させることができる。
【００１７】
バキュロウイルスＤＮＡとしては、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ又はＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡであることが好ましい。ＢｍＮＰＶ ＤＮＡとＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡは本発明のバクミド変異体の使用目的によって適宜選択可能である。
ここでＢｍＮＰＶは、蚕の幼虫、蚕の蛹および蚕の培養細胞に感染して、感染細胞の核内に多角体をつくるカイコガ核多角体病ウイルス（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus）を意味し、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡは、ＢｍＮＰＶのＤＮＡ配列を意味する。
またＡｃＭＮＰＶは、オートグラファ・カルフォルニカ多角体病ウイルス（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus）を意味し、ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡは、ＡｃＭＮＰＶのＤＮＡ配列を意味する。
【００１８】
ｍｉｎｉＦレプリコンは、大腸菌ＤＨ５αＦ’ＩＱより分離したプラスミド由来の配列であって複製に必要な領域を意味する。このｍｉｎｉＦレプリコンは、例えばＦ’レプリコンから得ることができる。このｍｉｎｉＦレプリコンの構造は、例えば特開２００４−１７３５０７号公報に開示されている。
【００１９】
トランスポゾン（Ｔｎ）の付着部位とは、ドナープラスミド（デスティネーションベクター）内のトランスポゼース認識配列に挟まれた外来遺伝子（発現目的遺伝子）を、転位酵素トランスポゼースによりバクミド内の標的部位に挿入させるための配列である。トランスポゾンの付着部位としては、Ｔｎ７の付着部位ｍｉｎｉ−ａｔｔＴｎ７、Ｔｎ３の付着部位およびＴｎ４の付着部位などが挙げられる。このトランスポゾン（Ｔｎ）の付着部位は、例えば、ｌａｃＺ遺伝子（例えば、ｌａｃＺα遺伝子）に含まれている。
【００２０】
この他、ベクターの構造の確認及び選別のために、種々のマーカー配列及び選択用配列等の補助配列を含んでもよい。外来遺伝子がバクミド上に挿入されたことを確認するために利用されるマーカー配列としては、例えば、ＬａｃＺ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、薬剤耐性遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を挙げることができる。目的とする構造のベクターを選択するための選択用配列としては、薬剤耐性遺伝子、例えば、カナマイシン耐性遺伝子やアンピシリン耐性遺伝子などを挙げることができる。これらの補助配列は、当業者により適宜選択することができる。
【００２１】
改変ポリヘドリンプロモーター、ｍｉｎｉＦレプリコン、バキュロウイルスＤＮＡ及びトランスポゾンの付着部位から構成されたバクミド変異体の基本骨格は、公知の方法で作製することができ、例えば特開２００４−１７３５０７号公報や、Biochemical and Biophysica Research Communications 326 (2005) 564-569などに記載されている。
【００２２】
本発明のバクミド変異体は、目的タンパク質を製造する際の製造効率をより向上させるため、ウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも１つを欠損していてもよい。
ウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも１つを欠損させる方法としては、相同組換え系を利用した方法であり、例えば、国際公開第２００７／０２９３６０号明細書に記載の方法及びそれを適宜変更した方法を挙げることができる。
【００２３】
本発明の目的タンパク質の製造方法は、大腸菌中で前記バクミド変異体と、目的タンパク質をコードする配列（以下、「発現目的遺伝子」ということがある）を含むポリヌクレオチドと、トランスポゼースとにより、目的タンパク質を発現するバクミドを得る工程を含む。
発現目的遺伝子を含むポリヌクレオチドは、トランスポゼース認識部位に挟まれた発現目的遺伝子を含むドナープラスミドであることが好ましい。これによりλリコンビネーション系を用いた相同組換え系（例えば、J. Bacteriology, 1998, p.2063-2071参照）により、前記バクミド変異体に発現目的遺伝子を効率よく組換えることができる。
【００２４】
本発明における発現目的遺伝子は、昆虫由来の分泌シグナル配列を更に含んでいてもよい。これにより目的タンパク質を昆虫細胞外に分泌させることができる。
昆虫由来の分泌シグナル配列としては、公知の分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができるが、分泌効率の観点から、カイコ脳神経ペプチドホルモンＢｏｍｂｙｘｉｎ由来の分泌シグナル配列ｂｘ、またはフェノール酸化酵素由来の分泌シグナル配列ｐｐａｅのいずれかであることが好ましい。
【００２５】
本発明においては、上記で得られた目的タンパク質発現バクミドを、昆虫由来の細胞に導入する工程を含む。
上記目的タンパク質発現バクミドを導入（感染）する昆虫由来の細胞としては、昆虫個体の細胞であっても、確立した細胞株であってもよく、目的等に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
昆虫の種類としては、本発明のバクミド変異体が感染しうる昆虫であれば特に制限はない。具体的には、例えば、本発明のバクミド変異体がＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡを含む場合、スポドプテラ・フルギペルタ（Spodoptera frugiperda）及びイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）を挙げることができる。また、本発明のバクミド変異体がＢｍＮＰＶ ＤＮＡを含む場合、カイコガ（Bombyx mori）を挙げることができる。
【００２７】
また、確立された細胞株としては、例えば、カイコガに由来するＢｍ５細胞及びＢｍＮ４細胞、スポドプテラ・フルギペルタに由来するＳｆ細胞、並びに、イラクサギンウワバに由来するＴｎ細胞等を挙げることができる。
【００２８】
目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入する方法としては、公知の方法を適用することができる。
例えば、確立された細胞株に導入する場合には、細胞を培養している培地に直接添加することで、目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入することができる。また、カイコガ個体の細胞に導入する場合には、カイコガの幼虫個体又はカイコガの蛹に目的タンパク質発現バクミドを含む溶液を直接接種することで導入することができる。
【００２９】
本発明においては、昆虫由来の細胞によって生成された目的タンパク質を回収する回収工程を更に設けることが好ましい。
目的タンパク質の回収としては、特に制限なく公知の方法を適用することができる。このような回収工程には、例えば、Ｈｉｓタグ及びＦｌａｇタグのようなタグや、発現した目的タンパク質に対する抗体などを用いる方法や、イオン交換カラム及びアフィニティカラムなどによる精製方法など、公知の手段を用いることができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、実施例中の％は特記しない限り、質量基準である。尚、市販のキットを使用した場合には、特記しない限り添付の取り扱い説明書にしたがって操作を行った。
【００３１】
（実施例１）
ｐＤＥＳＴ８（インビトロジェン社製）を鋳型とし、下記表２に示したＰＣＲプライマーセット（ｐｏｌｈ−Ｆ：配列番号２及びｐｏｌｈ−Ｒ：配列番号３）と、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製）を用いて、９５℃  ２分の後、９５℃  ３０秒、５５℃  ４０秒、６８℃  １分３０秒を３０サイクル、の条件でＰＣＲを行い、２つのバースト配列をタンデムリピートで有する改変ポリヘドリンプロモーターを含むポリヌクレオチドを得た。
また、ｐＤＥＳＴ８（インビトロジェン社製）を鋳型とし、下記表２に示したＰＣＲプライマーセット（配列番号４及び５）と、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、９５℃  ２分の後、９５℃  ３０秒、５５℃  ４０秒、７２℃  ８分を３２サイクル、の条件でＰＣＲを行い、ｐＤＥＳＴ８のデスティネーションベクター部分を増幅した。
上記で得られたポリヌクレオチドとｐＤＥＳＴ８のデスティネーションベクター部分とを、制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIIIでそれぞれ処理し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーション処理を行い、バースト配列を２つ含む改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターｐＤＢ２を得た。
【００３２】
【表２】
2008301792.tif 000003
【００３３】
（実施例２）
実施例１で得られたｐＤＢ２を鋳型とし、上記表２に示したＰＣＲプライマーセット（ｐｏｌｈ−Ｆ：配列番号２及びｐｏｌｈ−Ｒ：配列番号３）と、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、９５℃  ２分の後、９５℃  ３０秒、５５℃  ４０秒、６８℃  １分３０秒を３０サイクル、の条件でＰＣＲを行い、２つのバースト配列をタンデムリピートで有する改変ポリヘドリンプロモーターを含むポリヌクレオチドを得た。
得られたポリヌクレオチドを制限酵素ＳｐｅＩとＨｉｎｄIIIとで処理したものと、ｐＤＢ２を制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄIIIとで処理したものを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーション処理を行い、バースト配列を３つタンデムリピートで有する改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターｐＤＢ３を得た。
【００３４】
（実施例３）
実施例２において、ｐＤＢ２の代わりにｐＤＢ３を用いた以外は実施例２と同様にして、バースト配列を５つ含む改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターｐＤＢ５を得た。
【００３５】
（比較例１）
実施例２において、ｐＤＢ２の代わりにｐＤＢ５を用いた以外は実施例２と同様にして、バースト配列を９つ含む改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターｐＤＢ９を得た。
【００３６】
（比較例２）
実施例２において、ｐＤＢ２の代わりにｐＤＢ９を用いた以外は実施例２と同様にして、バースト配列を１７含む改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターｐＤＢ１７を得た。
【００３７】
（実施例４）
＜発現目的遺伝子のデスティネーションベクターへの組換え＞
得られたｐＤＢ２、ｐＤＢ３及びｐＤＢ５を用いて、シロイロナズナ由来β―グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（インビトロジェン社、品番：11791-020）を常法に従いゲートウェイ・クローニング（登録商標、インビトロジェン社）により組換えた。
【００３８】
＜発現目的遺伝子のバクミド変異体への組換え＞
上記によりＧＵＳ酵素遺伝子を組換えたｐＤＢ２、ｐＤＢ３及びｐＤＢ５をＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（登録商標、インビトロジェン社）を用いてＡｃＭＮＰＶバクミド（インビトロジェン社）に挿入して、改変ポリヘドリンプロモーターを有し、目的タンパク質としてＧＵＳ酵素を発現するバクミド変異体をそれぞれ構築した。
【００３９】
＜発現目的遺伝子の発現＞
上記により得られたＧＵＳ酵素遺伝子を組換えたバクミド変異体を、それぞれＴｎ細胞に感染させて、９６時間培養した。細胞を超音波処理により破砕後、発現させたＧＵＳ酵素を遠心分離により精製した。
次いで発現させたＧＵＳ酵素の活性を、ｐ−ニトロフェニル−β−グルクロニドを基質として３７℃で反応させ、１分間に１μmolのｐ−ニトロフェノールを遊離する活性を１ユニットとして測定した。タンパク質濃度はブラッドフォード法を基礎とするプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を用いて、ウシ血清アルブミンを標準として測定した。
Ｔｎ細胞にバクミド変異体を感染させて、発現させたＧＵＳ酵素の活性を測定した結果を図１に示した。
【００４０】
また、上記により得られたＧＵＳ酵素遺伝子を組換えたバクミド変異体を、それぞれＳｆ細胞に感染させて、１２時間、３６時間、７２時間、１２０時間培養した。発現したＧＵＳ酵素の活性を、上記と同様にして測定した結果を表３に示した。
【００４１】
（比較例３）
実施例４において、ｐＤＢ２、ｐＤＢ３及びｐＤＢ５の代わりに、上記で得られたｐＤＢ９及びｐＤＢ１７を用いた以外は実施例４と同様にしてＧＵＳ酵素遺伝子を発現するバクミド変異体をそれぞれ作製した。得られたバクミド変異体を用いて実施例４と同様にして、ＧＵＳ酵素を発現させ、発現させたＧＵＳ酵素の活性を測定した。
結果を図１及び表３に示した。
【００４２】
（比較例４）
ｐＤＢ２、ｐＤＢ３及びｐＤＢ５の代わりに、ＧＵＳ酵素遺伝子を組換えたｐＤＥＳＴ８を用いた以外は実施例４と同様にしてＧＵＳ酵素遺伝子を発現するバクミド変異体を作製した。得られたバクミド変異体を用いて実施例４と同様にして、ＧＵＳ酵素を発現させ、発現させたＧＵＳ酵素の活性を測定した。尚、ｐＤＥＳＴ８はバースト配列を一つだけ有している。
結果を図１及び表３に示した。
【００４３】
【表３】
2008301792.tif 000004
【００４４】
図１から、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターを含む目的タンパク質発現バクミドを用いることで、効率よく目的タンパク質を製造できることが分かる。
また表３より、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターを含む目的タンパク質発現バクミドを用いることで、効率よく目的タンパク質を製造できることに加え、生産速度も向上することが分かる。また、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターを用いることで、目的タンパク質発現の立ち上がりが早くなることが分かる。尚、コントロールには野生型バクミドを感染させたＳｆ細胞を用いた。
【００４５】
（実施例５）
ヒト胃由来ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社製）を鋳型とし、下記表４に示したＰＣＲプライマーセット（配列番号６及び配列番号７）と、Ｔａｋａｒａ  ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いて、９４℃  ３分の後、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、７２℃  １分３０秒を３５サイクル、７２℃  ５分、の条件でＰＣＲを行い、ヒト−α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼ（α４ＧｎＴ）遺伝子を含むポリヌクレオチドを得た。
上記で得られたポリヌクレオチドとpBlueBacHis2-GFPuv（Biotechnol. Prog., 1999, Vol.15, p283-286）とを、制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩでそれぞれ処理し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてライゲーション処理を行い、ＧＦＰｕｖ−α４ＧｎＴ融合遺伝子を含むプラスミドを得た。
【００４６】
得られたプラスミドを鋳型とし、下記表４に示したＰＣＲプライマーセット（配列番号８及び配列番号７）と、Ｔａｋａｒａ  ＥｘＴａｑを用いて、９４℃  ３分の後、９４℃  ３０秒、６２℃  ４０秒、７２℃  １分３０秒を３０サイクル、７２℃  ５分、の条件でＰＣＲを行い、ｂｘ−ＧＦＰｕｖ−α４ＧｎＴ融合遺伝子を含むポリヌクレオチドを得た。このポリヌクレオチドをＴＯＰＯクローニングによりｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。
【００４７】
そして、上記プラスミドに含まれるｂｘ−ＧＦＰｕｖ−α４ＧｎＴ融合遺伝子を常法に従ってゲートウェイ・クローニングによりｐＤＢ５に組換えた。得られたｐＤＢ５を特開２００４−１７３５０７号公報に記載の方法によって調製したＢｍＮＰＶバクミドにＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムを用いて組み込むことにより、ｂｘ−ＧＦＰｕｖ−α４ＧｎＴ融合遺伝子を発現するバクミド変異体を作製した。
【００４８】
【表４】
2008301792.tif 000005
【００４９】
得られたバクミド１μｇをカイコガの幼虫（四齢）へ注射器で導入した。７日後、常法によりカイコガの幼虫の体液から発現したタンパク質を回収し、遠心分離にて不溶物を除去した。このタンパク質溶液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、常法に従いタンパク質を分離した。このゲルに紫外線を照射することによりｂｘ−ＧＦＰｕｖ−α４ＧｎＴ融合タンパク質に含まれるＧＦＰｕｖタンパク質を励起し、蛍光を測定した。
結果を図２に示した。
【００５０】
（比較例５）
ｐＤＢ５の代わりにｐＤＥＳＴ８を用いた以外は実施例５と同様にしてｂｘ−ＧＦＰｕｖ−α４ＧｎＴ融合遺伝子を発現するバクミド変異体を作製した。このバクミド変異体を用いた以外は実施例５と同様にして、ｂｘ−ＧＦＰｕｖ−α４ＧｎＴ融合タンパク質を発現させ、発現したｂｘ−ＧＦＰｕｖ−α４ＧｎＴ融合タンパク質を蛍光により検出した。
結果を図２に示した。
【００５１】
図２から、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターを含む目的タンパク質発現バクミドを用いることで、効率よく目的タンパク質を製造できることが分かる。
【００５２】
また、ｐＤＢ５の代わりにｐＤＢ１７を用いた以外は実施例５と同様にしてｂｘ−ＧＦＰｕｖ−α４ＧｎＴ融合遺伝子を発現するバクミド変異体を作製した。このバクミド変異体を用いた以外は実施例５と同様にして、ｂｘ−ＧＦＰｕｖ−α４ＧｎＴ融合タンパク質を発現させたところ、融合タンパク質に由来する蛍光はほとんど検出できなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】Ｔｎ細胞を用いたＧＵＳ酵素発現の結果を示すグラフである。
【図２】カイコ幼虫を用いたｂｘ−ＧＦＰｕｖ−α４ＧｎＴ融合タンパク質発現の結果を示す電気泳動図である。
【図１】
2008301792.tif 000006
【図２】
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【配列表】
2008301792000001.app