(57)【要約】      （修正有）【課題】血液凝固因子の一つである、フォンビルブランド因子に特異的に結合して、その分解を阻害する新規ペプチド、及びその使用方法、並びに、フォンビルブランド因子切断酵素活性阻害剤、及び一次止血血栓形成促進剤を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有し、フォンビルブランド因子への結合活性を有するペプチド。また、ヒトADAMTS13タンパク質のアミノ酸配列の一部であって、特定のアミノ酸配列において、N末端側に1〜22個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなるか、又はC末端側に1〜3個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子への結合活性を有するペプチド。上記ペプチドを含有する薬剤は、フォンビルブランド因子切断酵素活性阻害剤や、一次止血血栓形成促進剤として用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチド。
（ａ）配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチド。
（ｂ）配列番号1のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子（von Willebrand factor; vWF）への結合活性を有するペプチド。
（ｃ）ヒトADAMTS13タンパク質のアミノ酸配列の一部であって、配列番号1のアミノ酸配列において、N末端側に1〜22個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなるか、又はC末端側に1〜3個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子への結合活性を有するペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチド。
（ａ）配列番号2のアミノ酸配列を有するペプチド。
（ｂ）配列番号2のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子への結合活性を有するペプチド。
（ｃ）ヒトADAMTS13タンパク質のアミノ酸配列の一部であって、配列番号2のアミノ酸配列において、N末端側に1〜2個のアミノ酸が付加したアミノ酸からなるか、又はC末端側1〜12個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子への結合活性を有するペプチド。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）配列番号3のアミノ酸配列を有するペプチド。
（ｂ）配列番号3のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子への結合活性を有するペプチド。
【請求項４】
請求項1、2又は3に記載のペプチドをコードするDNA。
【請求項５】
請求項1、2又は3に記載のペプチドを発現する発現ベクター。
【請求項６】
請求項5に記載の発現ベクターを保持する細胞。
【請求項７】
請求項1、2又は3に記載のペプチドを含有するフォンビルブランド因子切断酵素活性阻害剤。
【請求項８】
請求項1、2又は3に記載のペプチドを含有する一次止血血栓形成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フォンビルブランド因子（von Willebrand factor; vWF）に特異的に結合して分解を阻害する新規ペプチド、及びその使用方法、並びに、フォンビルブランド因子切断酵素活性阻害剤、及び一次止血血栓形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
出血が起こると、血液成分が固まり、止血血栓を形成して出血を最小限にとどめようとする防御機構（止血機構）が作動する。
【０００３】
このような止血機構には様々な因子が関与しており、その一つの因子にフォンビルブランド因子（von Willebrand factor; vWF）がある。vWFは、血管内皮細胞及び骨髄巨核球で産生されるタンパク質であり、血小板血栓を形成し（一次止血血栓形成）、その部位において凝固血栓の成長を促す（二次止血血栓形成）という、止血に重要な役割を担っている（例えば、非特許文献1参照）。具体的には、vWFは、血小板の内皮下組織（例えば、コラーゲン）への粘着に際し、血小板膜受容体とコラーゲンとの結合に必要な糊となったり、VIII因子を安定化して運搬する働きをしたりする。
【０００４】
一方、生体内には、血管内における、このような血小板血栓の形成を防止するために、vWFを分解して重合体（マルチマー）サイズを減じる働きをする酵素ADAMTS13(a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 motifs 13)が存在する（例えば、非特許文献２参照）。
【非特許文献１】Fujimura Y, Titani K: Structure and function of von Willebrand factor. In Haemostasis and Thrombosis. Bloom Al, et al, ed. Churchill Livingstone., 379-395 (1994)
【非特許文献２】Soejima K, et al, Anovel human metalloprotease synthesized in the liver and secreted into the blood: possibly, the von Willebrand factor-cleaving protease?, J Biochem, 130, 475-480 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、フォンビルブランド因子の分解を抑制すれば、止血や凝固に役立つのではないかと考えられた。
【０００６】
本発明は、フォンビルブランド因子に特異的に結合して分解を阻害する新規ペプチド、及びその使用方法、並びに、フォンビルブランド因子切断酵素活性阻害剤、及び一次止血血栓形成促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下の実施例に示す通り、本発明者らは、ADAMTS13タンパク質においてフォンビルブランド因子と強く結合する部位を同定したところ、その部位に対応するペプチドがADAMTS13によるvWFの切断を阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明にかかるペプチドは、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチドであることを特徴とする。  
（ａ）配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチド。  
（ｂ）配列番号1のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子（von Willebrand factor; vWF）への結合活性を有するペプチド。  
（ｃ）ヒトADAMTS13タンパク質のアミノ酸配列の一部であって、配列番号1のアミノ酸配列において、N末端側に1〜22個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなるか、又はC末端側に1〜3個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子への結合活性を有するペプチド。
【０００９】
また、本発明にかかるペプチドは、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチドであることを特徴とする。  
（ａ）配列番号2のアミノ酸配列を有するペプチド。  
（ｂ）配列番号2のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子への結合活性を有するペプチド。  
（ｃ）ヒトADAMTS13タンパク質のアミノ酸配列の一部であって、配列番号2のアミノ酸配列において、N末端側に1〜2個のアミノ酸が付加したアミノ酸からなるか、又はC末端側1〜12個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子への結合活性を有するペプチド。
【００１０】
さらに、本発明にかかるペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドであることを特徴とする。  
（ａ）配列番号3のアミノ酸配列を有するペプチド。  
（ｂ）配列番号3のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子への結合活性を有するペプチド。
【００１１】
また、本発明にかかるDNAは、前記のペプチドをコードすることを特徴とする。  
さらに、本発明にかかる発現ベクターは、前記ペプチドを発現することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明にかかる細胞は、前記発現ベクターを保持することを特徴とする。この細胞は、例えば、大腸菌のような原核生物でも、酵母のような単細胞真核生物でも、昆虫や哺乳類などの培養細胞でもよい。  
さらに、本発明にかかるフォンビルブランド因子切断酵素活性阻害剤、及び一次止血血栓形成促進剤は、前記ペプチドを含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、フォンビルブランド因子に特異的に結合して分解を阻害する新規ペプチド、及びその使用方法、並びに、フォンビルブランド因子切断酵素活性阻害剤、及び一次止血血栓形成促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１５】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１６】
＝＝＝フォンビルブランド因子結合ペプチド＝＝＝
本発明において、フォンビルブランド因子に特異的に結合して分解を阻害するペプチドは、主に3種類見出された。
【００１７】
1つ目のフォンビルブランド因子結合ペプチドは、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチドである。  
（ａ）配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチド。  
（ｂ）配列番号1のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子（von Willebrand factor; vWF）への結合活性を有するペプチド。  
（ｃ）ヒトADAMTS13タンパク質のアミノ酸配列の一部であって、配列番号1のアミノ酸配列において、N末端側に1〜22個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなるか、又はC末端側に1〜3個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子への結合活性を有するペプチド。
【００１８】
上記ペプチドは、化学合成によって合成してもよいし、そのペプチドをコードするDNAを用いて、以下に記載のようにペプチドを発現させることによって合成してもよい。
【００１９】
上記ペプチドをコードするDNAとしては、そのペプチドのアミノ酸配列よりコドン表を用いて作成された配列を有するDNAを用いればよい。なお、これらのDNAを得るには、そのDNA配列を有するクローンが含まれるゲノムライブラリーやcDNAライブラリーをスクリーニングしてもよく、そのDNA配列を有する生物種のゲノムやRNAを用いてPCRやRACE法等で増幅してもよく、これらを組み合わせてもよい。また、上記DNAは化学合成によって作製してもよい。
【００２０】
上記ペプチドとしては、例えば、RPDITFTYFQPKPRQ（配列番号1）、RPDITFTYFQPKPRQAWV（PP1、配列番号4）等が挙げられる。  
2つ目のペプチドは、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチドである。  
（ａ）配列番号2のアミノ酸配列を有するペプチド。  
（ｂ）配列番号2のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子への結合活性を有するペプチド。  
（ｃ）ヒトADAMTS13タンパク質のアミノ酸配列の一部であって、配列番号2のアミノ酸配列において、N末端側に1〜2個のアミノ酸が付加したアミノ酸からなるか、又はC末端側1〜12個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子への結合活性を有するペプチド。
【００２１】
なお、これらのペプチド、及びこれらのペプチドをコードするDNAの合成方法は、前述の通りである。
【００２２】
上記ペプチドとしては、例えば、RHMCRAIGESFIMKRGDSFLDGTR（PP2、配列番号2）等が挙げられる。
【００２３】
さらに、3つ目のペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドである。  
（ａ）配列番号3のアミノ酸配列を有するペプチド。  
（ｂ）配列番号3のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加したアミノ酸配列からなり、フォンビルブランド因子への結合活性を有するペプチド。  
これらのペプチド、及びこれらのペプチドをコードするDNAの合成方法は、前述の通りである。  
上記ペプチドとしては、例えば、PSLLEDGRVEYRVALTEDRLPRLE（PP3、配列番号3）等が挙げられる。
【００２４】
＝＝＝フォンビルブランド因子結合ペプチドの有用性＝＝＝
（１）フォンビルブランド因子切断酵素活性阻害剤
フォンビルブランド因子（vWF）切断酵素は、別名ADAMTS13（a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 motifs 13）ともいう。
【００２５】
実施例1に示すように、フォンビルブランド因子に特異的に結合するペプチドをスクリーニングすると、図1に示されるようなペプチドが単離される。ここで、Epitope 1近傍の場合、669番目よりN端側及び685番目よりC端側が欠失しているペプチドが単離されていることから、特異的結合に必要な領域は670番目から684番目であると考えられる。従って、以下、670番目から684番目までの領域をEpitope 1と呼ぶ。同様に、Epitope 2及びEpitope 3近傍の場合も、特異的結合に必要な領域は、それぞれ484番目から507番目及び618番目から641番目と特定できるため、これらの領域をそれぞれEpitope 2及びEpitope 3と呼ぶ。これらのEpitopeに対応するペプチドは、フォンビルブランド因子に特異的に結合するため、フォンビルブランド因子結合ペプチドとして機能し得る。
【００２６】
さらに、実施例より、配列番号2、3、及び4に記載するペプチドは、フォンビルブランド因子と結合し、ADAMTS13の活性を阻害する、すなわち、フォンビルブランド因子切断酵素活性を阻害する（図2を参照のこと）。従って、本発明のペプチドは、フォンビルブランド因子切断酵素活性阻害剤として用いることができる。
【００２７】
これらの阻害活性を有するペプチドは、Epitope 1〜3に対応するため、Epitope 1〜3のいずれかに結合するペプチドであれば、ADAMTS13の活性を阻害すると考えられる。従って、配列番号1からなるペプチド、及び、ヒトADAMTS13タンパク質のアミノ酸配列の一部であって、配列番号1のアミノ酸配列において、N末端側に1〜22個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなるか、又はC末端側に1〜3個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなるペプチド、並びに、配列番号2のアミノ酸配列において、N末端側に1〜2個のアミノ酸が付加したアミノ酸からなるか、又はC末端側1〜12個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなるペプチドも、実施例に示すようにvWFに特異的に結合し、vWFとADAMTS13との結合を阻害することによって、ADAMTS13（フォンビルブランド因子切断酵素）活性を阻害すると考えられる。
【００２８】
本発明のフォンビルブランド因子切断酵素活性阻害剤は、例えば、フォンビルブランド因子やフォンビルブランド因子切断酵素の機能を研究するのに用いることができる。
【００２９】
（２）血栓症モデル動物
フォンビルブランド因子（vWF）は、2,050アミノ酸残基からなる1種類のサブユニット複数個がジスルフィド結合し、多重体（マルチマー）構造を形成している。正常の生体内においては、このような多重体構造を有するvWFは、適宜、ADAMTS13によって分解されている。
【００３０】
以下の実施例に示すように、フォンビルブランド因子結合ペプチドは、ADAMTS13によるvWFの切断を阻害する（図3を参照のこと）。これは、フォンビルブランド因子結合ペプチドの投与により、vWFの多重体構造を分解することができなくなり、その結果、vWF依存性の血小板血栓形成を促進することを意味する。従って、フォンビルブランド因子結合ペプチドを動物体内で存在させることにより、血栓症モデル動物を作製することができる。ここで、モデル動物の対象となる脊椎動物としては、ヒト以外の脊椎動物ならば特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等が挙げられる。
【００３１】
血栓症モデル動物を作製する方法は、特に限定されず、例えば、血栓症を発症させる量で、かつ、致死に至らない範囲の量の、フォンビルブランド因子結合ペプチドを、ヒト以外の脊椎動物に投与すればよいが、最も好ましい方法は、フォンビルブランド因子結合ペプチドを発現するトランスジェニックマウスを作製することである。  
なお、血栓症モデル動物に対し、血管強化薬（例えば、アドレノクロム、フラボノイド、ビタミンC、エタンシラート、エストロゲン）、凝固促進薬（例えば、ビタミンK、精製蛇毒製剤）、抗線溶薬（例えば、抗プラスミン薬）、血液製剤等の投与を組み合わせれば、より効率よく血栓症を生じさせることができる。  
上記の方法によって作製した血栓症モデル動物は、例えば、抗凝血薬、血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬等の新規薬剤をスクリーニングするのに有用である。
【００３２】
（３）一次止血血栓形成促進剤
（３−１）薬理作用
前述の通り、外傷等によって血管内皮が損傷されると、血小板が損傷部位に粘着・凝集し、一次止血血栓形成が行われる。ここで、血管内皮細胞で産生され、血漿へと分泌されるタンパク質の一つがフォンビルブランド因子（vWF）である。vWFは、血小板膜上の受容体と損傷によって露出した血管内のコラーゲンとを結合させ、血小板の粘着を誘導する（一次止血血栓形成）。  
本発明のフォンビルブランド因子結合ペプチドは、ADAMTS13によるvWFの切断を阻害する（図3を参照のこと）。これは、フォンビルブランド因子結合ペプチドの投与により、vWFの多重体構造を分解することができなくなり、その結果、vWF依存性の血小板血栓形成を促進することを意味する。従って、本発明のフォンビルブランド因子結合ペプチドを含有する薬剤は、一次止血血栓形成促進剤として用いることができる。
【００３３】
ここで、一次止血血栓形成を促進することが必要な症状・疾患としては、例えば、通常の結紮によって止血困難な小血管、毛細血管及び実質臓器から出血した場合（例えば、外傷に伴う出血、手術中の出血、骨性出血、膀胱出血、抜歯後の出血、鼻出血及び上部消化管からの出血等）等が挙げられる。  
止血をする際は、本発明の薬剤の投与の他に、血管強化薬（例えば、アドレノクロム、フラボノイド、ビタミンC、エタンシラート、エストロゲン）、凝固促進薬（例えば、ビタミンK、精製蛇毒製剤）、抗線溶薬（例えば、抗プラスミン薬）、血液製剤等の投与を組み合わせれば、より効率よく止血することができる。
【００３４】
（３−２）上記薬剤の製造方法
上記薬剤は、本発明のペプチドを含有しているものであればよい。本発明のペプチドの製造方法は、前述の通りである。  
本発明の薬剤に用いられ得る薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質を用いてもよく、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等を含有してもよい。さらに必要に応じて、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量含有してもよい。また、剤形としては、経口剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、シロップ剤、徐放性錠・カプセル・顆粒剤、カシュー剤、咀嚼錠剤又はドロップ剤等が、注射剤は、例えば、溶液性注射剤、乳濁性注射剤、又は固形注射剤等が、外用剤は、例えば、撤布粉剤、ローション、軟膏・クリーム、スプレー、テープ剤等が挙げられる。
【００３５】
（３−３）上記薬剤の投与量及び投与方法
上記薬剤の投与量は、年齢、体重、適応症又は投与経路によって異なるが、上記作用が発揮でき、かつ、生じる副作用が許容し得る範囲内であれば特に限定されない。なお、本発明の薬剤を血液中に注射すると、全身の凝固系を亢進させて致死的な結果を招く恐れがあるため、適宜投与量を調節することが好ましい。  
また、上記薬剤の投与経路は、上記薬剤が出血部位に送達される投与経路であれば、特に限定されないが、例えば、外傷による出血の場合は局所投与が好ましい。  
投与方法は、上記薬剤が出血部位に送達される方法であれば、特に限定されないが、例えば、ヒト又はヒト以外の脊椎動物において、外傷による出血が認められた場合は、上記薬剤をそのまま噴霧するか、灌注するか、撒布すればよい。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を用いて、以上に説明した実施態様を具体的に説明するが、これは例示であって、本発明をこの実施例に限定するものではない。
【００３７】
＜実施例１：ADAMTS13タンパク質のエピトープ解析＞
フォンビルブランド因子（vWF）への結合に関与するADAMTS13タンパク質のエピトープを同定するために、以下の実験を行なった。
【００３８】
（１）ADAMTS13エピトープライブラリーの作製
ADAMTS13 cDNAは第一製薬株式会社から入手した。ADAMTS13エピトープライブラリーは、公知の文献（Kuwabara I, Maruyama H, Mikawa YG, Zuberi RI, Liu FT, Maruyama IN. Efficient epitope mapping by bacteriophage lambda surface display. Nat Biotechnol 1997 ; 15: 74-8.,  Kuwabara I, Maruyama H, Kamisue S, Shima M, Yoshioka A, Maruyama IN. Mapping of the minimal domain encoding a conformational epitope by lambda phage surface display: factor VIII inhibitor antibodies from haemophilia A patients. J Immunol Methods 1999; 224: 89-99., . Moriki T, Kuwabara I, Liu FT, Maruyama IN. Protein domain mapping by lambda phage display: the minimal lactose-binding domain of galectin-3. Biochem Biophys Res Commun 1999; 265: 291-6.,  Hagiwara H, Kunihiro S, Nakajima K, Sano M, Masaki H, Yamamoto M, Pak JW, Zhang Y, Takase K, Kuwabara I, Maruyama IN, Machida M. Affinity selection of DNA-binding proteins from yeast genomic DNA libraries by improved lambda phage display vector. J Biochem (Tokyo) 2002; 132: 975-82. ）に基づいて作製した。具体的には、以下の通りである。
【００３９】
まず、pcDNA3.1 myc-His(Invitrogen, Carlsbad, Ca)にADAMTS13 cDNA全長を挿入した。その後、このベクターをDNase I(タカラバイオ株式会社)でランダムに分解し、T4 DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）でその末端を平滑末端にした。この平滑末端にSfi Iアダプターをライゲーションした後、2.0%のアガロースゲル電気泳働(NuSieve; FMC、Rockland, ME)を行い、DNA断片を分画した。100bpから200bpにわたる各DNA断片を含むアガロースを切断し、ゲル抽出用キット(Qiagen Tokyo)を用いてこれらのDNA断片を精製し、精製後のDNAをλfooDcベクターのSfi Iサイトに挿入した。その後、これらのベクターをMaxPlax (Epicentre Technologies, Madison, WI)でパッケージングした後、Escherichia coli strain Q447に感染させて、ファージライブラリーを作製した。  
その結果、1.1×107pfu(plaque forming unit)のファージライブラリーを得た。
【００４０】
（２）アフィニティー選択及びDNA配列決定
i）アフィニティー選択
上記（1）の方法によって作製したファージライブラリーには、ADAMTS13プラスミド由来の様々なペプチドを発現するファージが存在する。そのため、これらファージのvWFへの結合性について、アフィニティー選択を行った。なお、アフィニティー選択は、公知の文献（Kuwabara I, Maruyama H, Mikawa YG, Zuberi RI, Liu FT, Maruyama IN. Efficient epitope mapping by bacteriophage lambda surface display. Nat Biotechnol 1997 ; 15: 74-8.,  Kuwabara I, Maruyama H, Kamisue S, Shima M, Yoshioka A, Maruyama IN. Mapping of the minimal domain encoding a conformational epitope by lambda phage surface display: factor VIII inhibitor antibodies from haemophilia A patients. J Immunol Methods 1999; 224: 89-99.,  Moriki T, Kuwabara I, Liu FT, Maruyama IN. Protein domain mapping by lambda phage display: the minimal lactose-binding domain of galectin-3. Biochem Biophys Res Commun 1999; 265: 291-6. ）を参考にした。具体的には、以下の通りである。
【００４１】
まず、7.5μg/mlヒトvWF（Haematologic Technologies, Inc., River Road, VT）含有PBS（0.1％sodium azide含有）をマイクロタイタープレートに入れ（50μl/well）、4℃で一晩インキュベートした。
【００４２】
その一方で、CY培地（Casamino Acid 10g、Yeast Extract 5g、NaCl 3g、KCl 2g、Distilled water to 1000 ml (pH 7.0)）に、上記（１）の方法によって作製したファージとE. coli TG1を入れ（10μl/ml）、37℃で3〜6時間培養し、プロテアーゼ阻害剤（Pierce, Rockford, IL）を加えた。その後、ポリエチレングリコール（分子量8000）を入れてファージを沈殿させ、沈殿したファージをbinding buffer (5%スキムミルク、0.25％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.1％Tween-20、及び0.1％アジ化ナトリウム含有PBS)で懸濁した。ここで、ADAMTS13は亜鉛型メタロプロテアーゼであるため、その作用を発揮するにはBa2+又はCa2+等の二価陽イオンが必要になる。そこで、ADAMTS13とvWFとの結合に二価金属陽イオンが関与していないかを調べるために、5%スキムミルクの代わりに5mMEDTA含有BSA又は5mMEDTAを含有していないBSAを用いて、同様の実験を行った。次に、ファージ懸濁液を、ヒトvWFをコートした上記マイクロタイタープレートに入れ、4℃で一晩インキュベートした。
【００４３】
その後、binding bufferで3回洗浄し、buffer-1 (5%スキムミルク及び0.5% Tween20含有PBS)で2回洗浄し、buffer-2 (10mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM MgSO4、0.2M NaCl及び10mM CaCl2)で1回洗浄し、最後に、コラゲナーゼ（Sigma, Tokyo）を用いてマイクロタイタープレートに結合したファージをプレートから剥離した（以下、これらの実験方法を「パニング」という）。なお、得られたファージのタイターは、X-galを含む培地にこれらのファージをE.coli JM105に感染させることによって測定した。パニングは、白色のプラークの数が全体のプラークの数の90％以上になるまで繰り返した（計4回）。  
その結果、vWFに特異的に結合するファージクローンが12個得られた。
【００４４】
ii）エピトープマッピング
上記i)に記載の方法によって得られたファージクローン12個について、挿入されたADAMTS13 DNA断片の塩基配列を調べた。  
その結果、図1に示すように、4個のクローンはADAMTS13スペーサドメインのC末端側に、8個のクローンはADAMTS13システインリッチドメインのN末端とC末端の中央にマッピングされた。  
これより、ADAMTS13アミノ酸配列のうち、ヒトvWFと特異的に結合する部位は、R670PDITFTYFQPKPRQ684（Epitope 1、配列番号1）とR484HMCRAIGESFIMKRGDSFLDGTR507（Epitope 2、配列番号2）であることが分かった。
【００４５】
iii）ペプチドを添加したパニング
さらに、Epitope 1及びEpitope 2以外の、vWFに特異的に結合するペプチドがあるかどうかを調べた。実験方法は、上記「i）アフィニティー選択」に記載の「binding buffer」の中に「終濃度が0.5mMになるように合成したPP1（配列番号4）を加えた」以外は、上記「i）アフィニティー選択」に記載の方法と同様である。また、PP1（配列番号4）に対応するペプチドは合成によって作製した（Toray  Research  Center, Kamakura,  Japan）。  
その結果、vWFに特異的に結合するファージクローンが12個得られた。
【００４６】
さらに、これらのファージクローン12個について、挿入されたADAMTS13 DNA断片の塩基配列を調べたところ、図１に示すように、12個のクローン全てがADAMTS13スペーサドメインのN末端とC末端の中央にマッピングされた。  
これより、ADAMTS13アミノ酸配列のうち、ヒトvWFと特異的に結合する新たな部位はP618SLLEDGRVEYRVALTEDRLPRLE641（Epitope 3、配列番号3）であることが明らかになった。
【００４７】
（３）エピトープ解析
ADAMTS13アミノ酸配列上で、Epitope 1、Epitope 2及びEpitope 3の結合部位を解析するために、Epitope 1（配列番号1）に対応するペプチドをPP1(配列番号4)と、Epitope 2に対応するペプチドをPP2（配列番号2）と、Epitope 3に対応するペプチドをPP3（配列番号3）とし、様々な組合せのエピトープペプチドを添加してパニングを行った。実験方法は、上記「iii）ペプチドを添加したパニング」に記載の方法と同じである。また、PP2（配列番号2）及びPP3（配列番号3）に対応するペプチドは合成によって作製した（Toray Research Center, Kamakura, Japan）。コントロールには、ペプチドを添加しないもの（PP(-)）とPP1のアミノ酸配列を逆転させたペプチド（PP1R）を添加したものを用いた。結果は、表1に示す通りである。
【表１】
2008301776.tif 000002
【００４８】
表１に示す通り、PP1を上記binding bufferに加えると、PP3を発現するファージクローンの数が増えた。また、PP3を上記binding bufferに加えると、PP1を発現するファージクローンの数が増えた。一方、PP2及びPP1Rを上記binding bufferに加えても、ファージクローンの発現には影響がなかった。また、合成ペプチドを上記binding bufferに入れないと、PP1及びPP2を発現するファージクローンの数は元に戻った。さらに、PP1, PP2及びPP3を上記binding bufferに加えても、ファージクローンの発現には影響がなかった。
【００４９】
これより、ADAMTS13アミノ酸配列のうち、ヒトvWFと特異的に結合する部位は異なるが、Epitope 1、Epitope2及びEpitope 3のエピトープは相互に複雑に重なり合っていること、及びPP1の結合部位はEpitope 3の部位を露出させ、PP3の攻撃を受けやすくすることが示された（図1を参照のこと）。
【００５０】
＜実施例２：合成ペプチド添加によるADAMTS13プロテアーゼ活性阻害の評価＞
前述したように、ADAMTS13タンパク質は、フォンビルブランド因子（vWF）を特異的に切断する酵素である。実施例1において、ADAMTS13タンパク質内におけるvWF結合部位が同定できたので、本実施例では、合成ペプチドのADAMTS13プロテアーゼ活性阻害の効果を調べた。
【００５１】
なお、組換えADAMTS13タンパク質は、文献（Uchida T, Wada H, Mizutani M, Iwashita M, Ishihara H, Shibano T, Suzuki M, Matsubara Y, Soejima K, Matsumoto M, Fujimura Y, Ikeda Y, Murata M; Research Project on Genetics of Thrombosis.  Identification of novel mutations in ADAMTS13 in an adult patient with congenital thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood 2004; 104: 2081-3.）を参考にして作製した。
【００５２】
発現ベクターは、FuGENE6 (Roche Molecular Biochemicals. Indianapolis, IN)を用いて、pcDNA3.1 myc-His にADAMTS13 cDNAを挿入して作製した。この発現ベクターをHEK293細胞に導入し、10%FBS及びペニシリン・ストレプトマイシン含有DMEM培地で培養した。24時間培養した後、培地を無血清のOPTI-MEM1培地(Invitrogen)へ交換し、さらに48時間培養した。その後、遠心分離によって細胞を回収した。得られた組換えADAMTS13タンパク質の量を、ELISA（American Diagnostica, Stamford, CT）で測定した。
【００５３】
次に、FRETS-VWF73（VWF73ペプチドの切断部位の両側に蛍光基と消光基を導入した化学合成基質）アッセイキット（Peptide Institute, Osaka, Japan）を用いて、合成ペプチドのADAMTS13プロテアーゼ活性阻害の効果を調べた。
【００５４】
まず、FRETS-VWF73アッセイを行うために、合成ペプチド（PP1、PP2、PP3）を反応用バッファーに溶かし、合成ペプチドの希釈系列を作製した。次に、上記方法によって作製した組換えADAMTS13タンパク質（以下、「r-ADAMTS13」という）と、希釈系列（0, 25, 50, 75, 100, 125μM）を作製した合成ペプチドとを混合し、この混合液にFRETS-VWF73（終濃度4μM）を加え、蛍光を測定した（Kokame K, Nobe Y, Kokubo Y, Okayama A, Miyata T. FRETS-VWF73, a first fluorogenic substrate for ADAMTS13 assay. Br J Haematol 2005; 129: 93-100.）。結果は、図2の通りである。
【００５５】
全ての合成ペプチドが、終濃度25〜125μMの範囲でADAMTS13によるFRETS-VWF73の切断を阻害した。阻害活性は、PP2＞PP3＞PP1の順で弱くなっていた。  
ここで、vWF多重体（マルチマー）構造の分解は、電気泳動を用いれば視覚的に見ることができる。そこで、PP1及びPP3については、SDSアガロースゲル電気泳動を用いて、vWFが多重体構造を有しているかについて検討を行った（マルチマー解析）。
【００５６】
まず、BaCl2と1.5Mの尿素を含む低イオン強度の緩衝液（5mM Tris-EDTA pH8.0）の中で、0.4μg/ml組換えADAMTS13を含む培地と、希釈系列を作製した合成ペプチド（PP1及びPP3）と、15μg/ml精製vWFとを37℃で16時間反応させた。その後、EDTA（終濃度10mM）を添加して反応を停止した後、SDSアガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動後、泳動物をPVDF膜にトランスファーし、一次抗体として抗vWFポリクローナル抗体（Dako Japan, Kyoto）を、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ラビットIgG抗体（Sigma）を、発色にはBCIP/NBTを用いて、ウエスタンブロット法を行った。結果は、図3の通りである。
【００５７】
一般に、ADAMTS13プロテアーゼ活性が低いものはvWF多重体構造が温存され、一方、ADAMTS13プロテアーゼ活性が高いものはこの構造が消失することが知られている。図3に示す通り、PP3の濃度を高くしていくにつれ、ADAMTS13によるvWFの切断は阻害された。また、PP1はPP3ほど強くないが、PP1の濃度を高くしていくにつれ、ADAMTS13によるvWFの切断は阻害されることが分かった。
【００５８】
＜実施例３：vWFに対する合成ペプチドのアフィニティー測定＞
カルボキシルデキストランを金膜表面にコートしているCM-5センサーチップにvWFを共有結合で固定化し、vWFと合成ペプチドとの相互作用を、表面プラズモン共鳴現象を利用したBIAcore 2000システム（BIACORE, Tokyo）（25℃に設定）を用いて調べた。具体的には、以下の通りである。
【００５９】
まず、CM-5センサーチップを75mg/ml 1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodi-imide (EDC)と11.5mg/ml N-hydroxysuccinimide (NHS)の1:1混合物で7分間活性化させた。次に、CM-5センサーチップの上に、vWF(240μg/ml)を25℃で10μl/分の流速で2分間注入した。CM-5センサーチップ上のマトリックスに残存する活性基を、1.0Mエタノールアミン/HCl（pH8.5）で7分間ブロッキングした。CM-5センサーチップ上に固定化したvWFは、表面濃度1.76ng/mm2であった。
【００６０】
一方、合成ペプチド溶液の希釈系列（50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39μM）をHBS-Nバッファー（10mM Hepes, pH7.4, 150mM NaCl）で作製し、10μl/分の流速で注入した。各溶液を注入した後、次の注入を行う前の1分間、100mM NaOHを用いて結合しているペプチドを剥離した。解離定数は、BIAevaluation software (version 2.1)を用いて測定した。結果は、図4及び表2に示す通りである。
【表２】
2008301776.tif 000003
【００６１】
合成ペプチドとvWFとのアフィニティーを調べた結果、合成ペプチドPP1、PP2、及びPP3は、コントロールのペプチド（PP1R）に比べて、強いアフィニティーを有していることが分かった。また、vWFに対するアフィニティーは、PP3＞PP2＞PP1の順で弱くなっていた（図4、表2）。  
これより、本発明のペプチドは、vWFに強く結合することが明らかになった。また、これらのペプチドは、ADAMTS13によるvWFの切断を阻害することが明らかになった。  
以上より、本発明のペプチドは、vWFへの結合に重要な役割を果たすことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の一実施例において、ADAMTS13(a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 motifs 13)の構造及びvWF（von Willebrand factor;フォンビルブランド因子）に結合するエピトープを表わした図である。
【図２】本発明の一実施例において、合成ペプチドのADAMTS13プロテアーゼ活性阻害の効果を調べた図である。
【図３】本発明の一実施例において、合成ペプチドによるvWF重合体の切断の阻害効果を示した図である。ウエスタンブロット法の結果を示す。
【図４】本発明の一実施例において、vWFに対する合成ペプチドのアフィニティーを調べた図である。表面プラズモン共鳴を用いて、合成ペプチドとvWFとの解離定数を測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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