(57)【要約】【課題】  薬剤を特異的に体内に送達できるビヒクルおよびそれを使った製剤を提供すること。【解決手段】  カチオン化ウイルスエンベロープベクターからなる癌治療用薬剤送達ビヒクルおよびそのビヒクル内に薬剤が封入されてなる製剤を提供する。ウイルスエンベロープベクターは、例えば、センダイウイルス由来のＨＶＪ−Ｅであり、カチオン化は、ヒアルロン酸導入カチオン化ゼラチン、またはポリエチレングリコール導入カチオン化ゼラチンを、ウイルスエンベロープベクターに結合させてなされ得る。封入される薬剤は、核酸、核酸配列を含むベクター、タンパク質医薬、または低分子化合物の医薬などである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸および/またはポリエチレングリコールが結合したカチオン化ゼラチンと、ウイルスエンベロープベクターとを含む、癌治療用薬剤送達ビヒクル。
【請求項２】
前記ウイルスエンベロープベクターが、センダイウイルス由来のＨＶＪ−Ｅである、請求項１記載の癌治療用薬剤送達ビヒクル。
【請求項３】
請求項１または2に記載の癌治療用薬剤送達ビヒクル中に癌治療用薬剤が封入されてなる製剤。
【請求項４】
前記癌治療用薬剤が、低分子化合物、核酸、核酸を含むプラスミドベクター、およびタンパク質医薬からなる群より選択される、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
前記癌治療用薬剤が、抗腫瘍剤である請求項３または４に記載の製剤。
【請求項６】
前記抗腫瘍剤が、シクロホスファミド、メクロレタミン、カルバジルキノン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、ニムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、ダカルバジン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、５−フルオロウラシル、フトラフール、フロクスウリジン、シタラビン、アンシタビン、テガフール、ドキシフルリジン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシン、クロモマイシンＡ3、シネルビンＡ、アクラシノマイシンＡ、アドリアマイシン、ペプロマイシン、シスプラチン、ミトキサントロン、エピルビシン、ピラルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、シスプラチン、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン、ミトタン、ポルフィリン、およびタキソールからなる群より選択される少なくとも１種である請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
前記癌治療用薬剤が、ホウ素含有化合物である請求項４に記載の製剤。
【請求項８】
前記ホウ素含有化合物が、メルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）またはｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）である、請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）に用いるための請求項７または８の製剤。
【請求項１０】
悪性胸膜中皮腫、または肝臓癌から選択される1種の治療に用いられる請求項９記載の製剤。
【請求項１１】
請求項１または２のいずれかに記載の癌治療用薬剤送達ビヒクルの製造方法であって、
（ａ）ウイルスを不活性化する工程、および
（ｂ）不活性化された該ウイルスから得られるウイルスエンベロープベクターを、ヒアルロン酸および/またはポリエチレングリコール、カチオン化剤、およびゼラチンによってカチオン化する工程、
を包含する方法。
【請求項１２】
請求項１または２のいずれかに記載の癌治療用薬剤送達ビヒクルの製造方法であって、
（ａ）ウイルスを不活性化する工程、および
（ｂ）不活性化された該ウイルスから得られるウイルスエンベロープベクターに、ヒアルロン酸および/またはポリエチレングリコールが結合したカチオン化ゼラチンを接触させる工程、
を包含する方法。
【請求項１３】
前記ウイルスエンベロープベクターが、センダイウイルス由来のＨＶＪ−Ｅである、請求項１１または１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療用薬剤送達ビヒクルおよびその製造方法、ならびにそれを用いた製剤に関する。より詳細には、本発明は、ウイルスエンベロープベクターを用いた癌治療用薬剤送達ビヒクルおよびその製造方法ならびにそれを用いた製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の特定部位に主に遺伝子導入などを行う為に、ウイルスおよび非ウイルス（合成）法を用いた導入方法が開発されている。例えば、アデノウイルスなどに由来するウイルスベクターを用いた遺伝子導入やリポソームなどを用いた遺伝子導入が知られているが、ウイルスベクターでは病原性の懸念や毒性などの問題があり、非ウイルスベクターでは導入効率が悪いという問題がある。
【０００３】
このような問題点を解決する為に、センダイウイルスが有する優れた膜融合能に着目し、センダイウイルスを不活性化しエンベロープを利用することにより、病原性や毒性などの問題を解消したＨＶＪ エンベロープベクター （ＨＶＪ−Ｅ）が開発されている（特許文献１）。このＨＶＪ−Ｅでは、膜融合を利用して、目的物を細胞質へ直接的に導入することができるため、目的物が分解されにくく、その機能が保持されやすいと考えられている。従って、例えば、蛋白質導入によるアレルギー性鼻炎の治療やsiRNAによる癌治療に有効であり得る。
【０００４】
ＨＶＪエンベロープベクターの欠点としては、このベクターが、末梢のリンパ球をのぞくほとんどすべての細胞と融合することである。ＨＶＪ−Ｅの送達特異性を高める為に、ＨＶＪ−Ｅのさらなる改変による標的化ベクター開発、およびそれを用いた遺伝子あるいは薬剤送達システムの開発もなされている（非特許文献１）。
【特許文献１】ＷＯ  ０１／５７２０４
【非特許文献１】Ｍｉｍａら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ２００６ Ａｐｒ；５（４）：１０２１−８.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＨＶＪ−Ｅを用いた薬剤送達システムについては、その生体内挙動、目的部位への確実な薬剤の送達手法やメカニズムについての詳細は明らかではない部分もある。既に開発されているＨＶＪ−Ｅのさらなる改変による標的化ベクター、およびそれを用いた遺伝子あるいは薬剤送達システムでは、投与経路を限定して送達を確実する場合もある。したがって、所望の薬剤の生体内挙動を制御し、効率的かつ特異的にまた、簡易に薬剤送達を行うようなシステムの開発が強く望まれる。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、所望の薬剤を所望の細胞または組織に特異的に送達する為の送達システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、以下に示す癌治療用薬剤送達ビヒクルおよびその製造方法を提供することにより上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ヒアルロン酸および/またはポリエチレングリコールが結合したカチオン化ゼラチンと、ウイルスエンベロープベクターとを含む癌治療用薬剤送達ビヒクルを提供する。
【０００９】
上記ウイルスエンベロープベクターは、センダイウイルス由来のＨＶＪ−Ｅであり得る。
【００１０】
本発明はまた、上記の癌治療用薬剤送達ビヒクル中に薬剤が封入されてなる製剤を提供する。
【００１１】
上記薬剤は低分子化合物、核酸、核酸を含むプラスミドベクター、およびタンパク質医薬からなる群より選択され得る。
【００１２】
上記薬剤は、抗腫瘍剤であり得る。
【００１３】
上記抗腫瘍剤は、シクロホスファミド、メクロレタミン、カルバジルキノン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、ニムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、ダカルバジン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、５−フルオロウラシル、フトラフール、フロクスウリジン、シタラビン、アンシタビン、テガフール、ドキシフルリジン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシン、クロモマイシンＡ3、シネルビンＡ、アクラシノマイシンＡ、アドリアマイシン、ペプロマイシン、シスプラチン、ミトキサントロン、エピルビシン、ピラルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、シスプラチン、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン、ミトタン、ポルフィリン、タキソールからなる群より選択される少なくとも１種であり得る。
【００１４】
上記癌治療用薬剤は、ホウ素含有化合物であり得る。
【００１５】
前記ホウ素含有化合物は、メルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）またはｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）であり得る。
【００１６】
上記ホウ素含有化合物を含む製剤は、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）に用い得る。
【００１７】
前記製剤は、悪性胸膜中皮腫または肝臓癌から選択される1種の治療に用いられ得る。
【００１８】
本発明はまた、上記のいずれかに記載の癌治療用薬剤送達ビヒクルの製造方法であって、
（ａ）ウイルスを不活性化する工程、および
（ｂ）不活性化された該ウイルスから得られるウイルスエンベロープベクターを、ヒアルロン酸および/またはポリエチレングリコール、カチオン化剤、およびゼラチンによってカチオン化する工程、を包含する方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、上記のいずれかに記載の癌治療用薬剤送達ビヒクルの製造方法であって、
（ａ）ウイルスを不活性化する工程、および
（ｂ）不活性化された該ウイルスから得られるウイルスエンベロープベクターに、ヒアルロン酸および/またはポリエチレングリコールが結合したカチオン化ゼラチンを結合させる工程、を包含する方法を提供する。
【００２０】
上記ウイルスエンベロープベクターは、センダイウイルス由来のＨＶＪ−Ｅであり得る。
【発明の効果】
【００２１】
本発明を適用することによって、癌治療用薬剤を安全にかつ高特異的に、複数のまたは任意の投与経路で所望の細胞または組織に送達することができる送達システムを提供することができる。また、本発明の癌治療用薬剤送達ビヒクルは、それ自体で癌抑制作用、および／または免疫増強作用がある為、封入される薬剤の作用と相俟って、非常に高い効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２３】
本明細書において使用される用語を説明する。本明細書において「ウイルス」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをゲノムとして有する、感染細胞内だけで増殖する感染性の微小構造体をいう。ウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびヘパドナウイルス科からなる群より選択される科に属するウイルスが挙げられる。本明細書において好ましく使用されるウイルスは、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属する、センダイウイルス（「ＨＶＪ」（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ））である。センダイウイルスのゲノムは，約１５５００塩基長のマイナス鎖ＲＮＡである。ウイルス粒子にはエンベロープがあり、直径１５０〜３００ｎｍの多形性を示す。
【００２４】
本明細書において「（ウイルス）エンベロープ」とは、例えば、センダイウイルス などの特定のウイルスに存在するヌクレオキャプシドの周囲を取り囲む脂質二重層を基本とする膜構造をいう。エンベロープは、通常、細胞から出芽によって成熟するウイルスにみられる。エンベロープは、概してウイルス遺伝子によりコードされたスパイクタンパク質からなる小突起構造物と宿主由来の脂質とからなる。また、「ウイルスエンベロープベクター」とは、ウイルスエンベロープ中に外来遺伝子を封入したベクターを指すが、本明細書においては、外来遺伝子を封入していない場合も、薬剤を運ぶことができるという意味で、ウイルスエンベロープベクターと言う。
【００２５】
本明細書においてウイルスの「不活性化」とは、ウイルス（例えば、センダイウイルス ）ゲノムが不活性化されることをいう。不活性化されたウイルスは、複製機能は損なわれているが、ウイルス融合能力は保持されたままである。
【００２６】
本明細書において、癌治療用薬剤送達ビヒクルとは、ウイルスエンベロープ内部に癌治療用薬剤を封入し得るものを指し、好適には、ウイルスエンベロープの膜の外側が、カチオン化されている状態のものを指す。本発明の癌治療用薬剤送達ビヒクルは、それ自体で癌抑制作用、および／または免疫増強作用がある為、このビヒクルを用いた製剤は、封入される薬剤の作用と相俟って、非常に高い癌抑制効果を有する。
【００２７】
本明細書において「カチオン化」とは、ある対象に正電荷を与えることをいい、ここでは、ウイルスエンベロープを形成する膜の外側に正電荷を帯びるように調製すること、あるいはそのように調製されるように正電荷を与える材料の状態を指す。具体的には、ヒアルロン酸結合（導入）カチオン化ゼラチン（ＣＧ−ＨＡ）、またはポリエチレングリコール結合（導入）カチオン化ゼラチン（ＣＧ−ＰＥＧ）などのカチオン性ポリマーを、ウイルスエンベロープの膜の外側に接触させること、あるいはそのようなカチオン性ポリマーの状態を指す。ここで、接触の結果、特に限定はされないが、例えば静電気的結合が達成され得る。また、静電気的結合の様式を取らない場合であっても、何らかの作用で膜の外側表面にカチオン性ポリマーが接触したまま保持されている状態を、本明細書では、「結合」という。
【００２８】
ここで、「カチオン化ゼラチン」（ＣＧ）は、比較的低分子量（例えば、約３，０００から約５，０００）のゼラチンを、例えば、ゼラチンに存在するカルボキシル基に直接結合する反応基を有したカチオン化剤で処理することにより得られる。ここで、カチオン化剤は、ゼラチンに存在するカルボキシル基に結合し得る反応基と陽イオンを生じうる基を有する化合物であり、限定はされないが、エチレンジアミンが挙げられる。ゼラチン中のカルボキシル基に例えばエチレンジアミンを反応させて、アミド結合を生じさせ、アミノ基を有するゼラチンとすることで、カチオン化ゼラチンを得ることができる。
【００２９】
本明細書の、「ヒアルロン酸結合（導入）カチオン化ゼラチン」（ＣＧ−ＨＡ）は、カチオン化ゼラチンに、さらにヒアルロン酸を反応させて得られる。限定はされないが、ヒアルロン酸の糖還元末端とアミノ基間の反応を生じさせることによって得ることができる。
【００３０】
本明細書の、「ポリエチレングリコール結合（導入）カチオン化ゼラチン」（ＣＧ−ＰＥＧ）は、カチオン化ゼラチンに、ポリエチレングリコールを反応させることによって得られる。ＣＧ−ＨＡおよびＣＧ−ＰＥＧをウイルスエンベロープに付加することで、特定の、特に癌細胞への高親和性またはステルス化作用がある。
【００３１】
また、本発明では、ヒアルロン酸結合（導入）カチオン化ゼラチンまたはポリエチレングリコール結合（導入）カチオン化ゼラチンによりカチオン化されたウイルスエンベロープベクター内に所望の癌治療用薬剤が封入されてなる製剤も提供される。
【００３２】
ここで、所望の癌治療用薬剤としては、限定はされず、公知の薬剤のいずれでもよい。その中には、いわゆる遺伝子治療に用いられ得る特定機能を有するタンパク質をコードするようなＤＮＡやＲＮＡ、特定機能を有するタンパク質をコードしないＤＮＡやＲＮＡ、またはそれらを含むベクターなど；各種タンパク質（例えば抗原、抗体、酵素を含むタンパク質医薬など）；中性子捕捉療法に用いられ得るホウ素含有化合物；抗腫瘍剤などが含まれる。
【００３３】
ホウ素含有化合物としては、限定はされないが、現在、ホウ素中性子捕捉療法に好適に用いられているものの他、少なくとも1以上のホウ素リガンドを結合したデンドリマーであるホウ素リガンド結合デンドリマー（特開２００６−９６８７０）などの公知のホウ素含有化合物が含まれる。ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）は、現在注目を集めている癌治療法である。ホウ素中性子捕捉療法では、ホウ素１０同位体（１０Ｂ）を含むホウ素化合物をガン細胞に取り込ませ、低エネルギーの中性子線（たとえば熱中性子）を照射して、細胞内で起こる核反応により局所的にガン細胞を破壊する。この治療方法では、１０Ｂを含むホウ素化合物をガン組織の細胞に選択的に蓄積させることが、治療効果を高める上で重要であるため、ガン細胞に選択的に取り込まれるホウ素化合物が開発されている。
【００３４】
これまでに、ＢＮＣＴに用いる薬剤として基本骨格にホウ素原子またはホウ素原子団を導入したホウ素含有化合物が合成されている。実際の臨床で用いられている薬剤としては、ｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）やメルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）がある。このうち、ＢＳＨはナトリウム塩の形で主に脳腫瘍の治療に用いられ、その有用性が確認されている（たとえば、Ｉ．Ｍ．Ｗｙｚｌｉｃら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９２，３３，７４８９−７４９０，Ｗ．Ｔｊａｒｋ，Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．，２０００，６１４−６１５，３７−４７；Ｋ．Ｉｍａｍｕｒａら、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９９７，７０．３１０３−３１１０；Ａ．Ｓ．Ａｌ−Ｍａｄｈｏｒｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００２，４５，４０１８−４０２８；Ｆ．Ｃｏｍｐｏｓｔｅｌｌａら、Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｔｈｅｒ．，２００２，８１−８４；Ｓ．Ｂ  Ｋａｈｌら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２，２２３；Ｊ．Ｃａｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，４０，３８８７−３８９６；Ｈ．Ｌｉｍら、Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｔｈｅｒ．，２００２，３７−４２。）
【００３５】
抗腫瘍剤としては、限定はされないが、例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、カルバジルキノン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、ニムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、ダカルバジン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、５−フルオロウラシル、フトラフール、フロクスウリジン、シタラビン、アンシタビン、テガフール、ドキシフルリジン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシン、クロモマイシンＡ3、シネルビンＡ、アクラシノマイシンＡ、アドリアマイシン、ペプロマイシン、シスプラチン、ミトキサントロン、エピルビシン、ピラルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、シスプラチン、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン、ミトタン、ポルフィリン、およびタキソールからなる群より選択される少なくとも１種またはその組み合わせが挙げられる。
【００３６】
また、本発明においては、必要に応じて、適宜、癌治療用薬剤と他の薬剤等と組み合わせて、１つの癌治療用薬剤送達ビヒクル内に含ませることも可能である。他の薬剤としては、限定はされないが、中枢神経系用薬（例えば、全身麻酔剤、催眠鎮静剤、抗不安剤、抗てんかん剤、解熱鎮痛消炎剤、興奮剤、覚せい剤、抗パーキンソン剤、精神神経用剤、総合感冒剤、その他の中枢神経系用薬など）；末梢神経用剤（例えば、局所麻酔剤、骨格筋弛緩剤、自律神経剤、鎮けい剤など）；感覚器官用薬（例えば、眼科用剤、耳鼻科用剤、鎮暈剤など）；循環器官用薬（例えば、強心剤、不整脈用剤、利尿剤、血圧降下剤、血管収縮剤、血管拡張剤、高脂血症用剤、その他の循環器官用薬など）；呼吸器官用薬（例えば、呼吸促進剤、鎮咳剤、去痰剤、鎮咳去痰剤、気管支拡張剤など）；消化器官用薬（例えば、制吐剤、整腸剤、健胃消化剤、制酸剤、利胆剤、その他の消化器官用薬など）；ホルモン剤（例えば、脳下垂体ホルモン剤、唾液腺ホルモン剤、甲状腺、副甲状腺ホルモン剤、蛋白同化ステロイド剤、副腎ホルモン剤、男性ホルモン剤、混合ホルモン剤、その他のホルモン剤など）；泌尿生殖器官および肛門用薬（例えば、泌尿器官用剤、生殖器官用剤、子宮収縮剤、痔疾用剤、他の泌尿生殖器管、肛門用薬など）；外皮用薬（例えば、外皮用殺菌消毒剤、創傷保護剤、化膿性疾患用剤、鎮痛．鎮痒．収斂．消炎剤、寄生性皮膚疾患用剤、皮膚軟化剤、毛髪用剤、その他の外皮用剤など）；歯科口腔用剤；その他の個々の器官系用薬；ビタミン剤（例えば、ビタミンＡ剤、ビタミンＤ剤、ビタミンＢ剤、ビタミンＢ剤、ビタミンＣ剤、ビタミンＥ剤、ビタミンＫ剤、混合ビタミン剤、その他のビタミン剤など）；滋養強壮薬（例えば、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、蛋白アミノ酸製剤、臓器製剤、乳幼児用剤、その他の滋養強壮剤など）；血液および体液用薬（例えば、血液代用剤、止血剤、血液凝固阻止剤、その他の血液．体液用剤など）；その他の代謝性医薬品（例えば、臓疾患用剤、解毒剤、習慣性中毒用剤、痛風治療剤、酵素製剤、糖尿病用剤、他に分類されない代謝性薬など）；細胞賦活用剤（例えば、クロロフィル製剤、色素製剤、その他の細胞賦活用剤など）；アレルギー用薬（例えば、抗ヒスタミン剤、刺激療法剤、非特異性免疫原製剤、その他のアレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、生薬、漢方製剤、その他の生薬漢方処方に基づく製剤など）；抗生物質製剤（例えば、グラム陽性菌またはグラム陰性菌に作用する薬剤、グラム陽性菌マイコプラズマに作用する薬剤、グラム陽性又は陰性リケッチアに作用する薬剤、抗酸菌に作用する薬剤、カビに作用する薬剤、その他の抗生物質製剤など）；化学療法剤（例えば、サルファ剤、抗結核剤、合成抗菌剤、抗ウィルス剤、その他の化学療法剤など）；生物学的製剤（例えば、ワクチン、トキソイド類、血液製剤類、生物学的試験用製剤類、その他の生物学的製剤、抗原虫剤、駆虫剤など）；調剤用薬（例えば、賦形剤、軟膏基剤、溶解剤、着色剤、その他の調剤用剤など）；ならびに麻薬（例えば、あへんアルカロイド系麻薬、コカアルカロイド系製剤、合成麻薬など）が含まれる。
【００３７】
本発明の製剤は、ヒト用途でも使用され得るが、その他の宿主を対象として使用されてもよい。
【００３８】
本発明の癌治療用薬剤送達ビヒクルを製造する方法は、（ａ）ウイルスを不活性化する工程、（ｂ）不活性化された該ウイルスから得られるウイルスエンベロープベクターを、ヒアルロン酸および／またはポリエチレングリコール、カチオン化剤、およびゼラチンによってカチオン化する工程、を含む。ウイルスエンベロープベクターをカチオン化する工程は、例えば、ヒアルロン酸および／またはポリエチレングリコールが結合したカチオン化ゼラチンを、ウイルスエンベロープベクターに結合させることである。ヒアルロン酸および／またはポリエチレングリコールが結合したカチオン化ゼラチンは、最も一般的には、ゼラチンのカルボキシル基に直接結合する反応基を有したカチオン化剤でゼラチンを処理して得られるカチオン化ゼラチンと、様々な分子量の混合体であるヒアルロン酸またはポリエチレングリコールとを結合させることにより得られる。
【００３９】
ウイルスは、本発明の癌治療用薬剤送達ビヒクル作成前に、適宜増殖させて使用する。例えば、ＨＶＪを例にとれば、ニワトリの受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織への持続感染系（培養液中にトリプシンなどの加水分解酵素を添加する）を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたものおよびこれらの変異株のすべてが本発明で使用可能である。また、他の方法で入手可能なウイルス（例えば、ＨＶＪ）も使用することが可能である。組換え型ＨＶＪ（Ｈａｓａｎ Ｍ．Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７８、２８１３〜２８３０、１９９７年またはＹｏｎｅｍｉｔｓｕ Ｙ．ら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８、９７０〜９７３、２０００年）なども使用可能である。ＨＶＪとして何れのものでも良いが、Ｚ株（例えば、寄託番号ＡＴＣＣ ＶＡ ２３８８またはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＳＰＡＦＡＳから販売されているものが使用できる）またはＣａｎｔｅｌｌ株（例えば、Ｍ．Ｄ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、５６、１７５〜１８４、１９８１年に記載されたものまたはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＳＰＡＦＡＳから販売されているものが使用できる）がより望ましい。
【００４０】
ウイルス（例えばＨＶＪ）を不活性化する方法は特に限定はされない。このような方法には、加熱処理（例えば、６０℃、１時間）、紫外線照射、フェノール、ホルマリンのような化学物質による化学薬剤処理、凍結融解、アルキル化剤による処理などの公知の方法が挙げられる。
【００４１】
ウイルス不活性化の評価は、例えばＨＶＪの場合には、ＨＶＪの培養細胞に対する感染の有無で行う。例えば、不活性化処理の後、サル腎細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞へ感染を行うことで評価ができる。ＨＶＪの一段増殖が感染後１２〜１８時間に起こるので、感染後の細胞を１８〜２４時間インキュベートした後にアセトン／メタノール固定してＨＶＪ感染によって細胞に発現されるＨＶＪのＦタンパク質の有無をＦタンパク質に対する抗体を用いて免疫染色を行うことができる。即ち、ＨＶＪを可溶化し、遠心によって膜成分を分離した後、得られた膜成分をイオン交換クロマトグラフィーにかけることによりＦタンパク質を得る（Ｙｏｓｈｉｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８１年、および Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，２０００年によった）。次にこのＦ蛋白をフロイントアジュバンドとともにウサギに免疫して、Ｆ蛋白に対する抗血清（ウサギの抗Ｆタンパク質ポリクローナル抗体：一次抗体）を得る。固定化した細胞をこの一次抗体で処理した後、二次抗体処理する。この二次抗体処理後、蛍光顕微鏡下で検鏡し、ＨＶＪの不活性化を評価することができる。不活性化処理のウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープの膜機能に及ぼす影響については不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープのＨＡ活性を指標とすることができる。ＨＡ活性は通常の方法で測定できる。不活性化ＨＶＪエンベロープ懸濁液をウェルプレートに添加した後、段階希釈することでサンプルの希釈系列を作製する。これの凝集反応の有無を検定する。凝集反応が失われるサンプル系列のサンプル量とそのウェルの希釈倍率の逆数からＨＡ活性を求める。
【００４２】
不活性化されたウイルス（例えば、ＨＶＪ）は、カラムクロマトグラフィーまたは限外濾過、またはその組み合わせなどの方法により精製する。カラムクロマトグラフィーとして弱陰イオン交換体（第３級アミンであるＤＥＡＥなどの交換基が結合）または強陰イオン交換体（第４級アミンであるＱＡＥなどが交換基として結合）のいずれも使用できる。さらにゲル濾過担体を用いたカラムクロマトグラフィーも使用できる。
【００４３】
不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープを、ヒアルロン酸結合（導入）カチオン化ゼラチンまたはポリエチレングリコール結合（導入）カチオン化ゼラチンでカチオン化することにより、本発明の癌治療用薬剤送達ビヒクルが得られる。この癌治療用薬剤送達ビヒクルは、様々な薬剤を封入するのに有用である。典型的には、本発明の癌治療用薬剤送達ビヒクルと薬剤とを混合することによって、本発明の癌治療用薬剤送達ビヒクル中に薬剤が封入されてなる製剤を得ることができる。
【００４４】
あるいは、得られる不活性化ウイルス（例えばＨＶＪ）を「ウイルスエンベロープベクター」として、薬剤とともに混合し、薬剤を封入したウイルスエンベロープベクター複合体にヒアルロン酸結合（導入）カチオン化ゼラチンまたはポリエチレングリコール結合（導入）カチオン化ゼラチンを結合させてカチオン化することにより、本発明の癌治療用薬剤送達ビヒクル中に薬剤が封入されてなる製剤が得られる。
【００４５】
ウイルスエンベロープベクターのカチオン化は、限定はされないが、ヒアルロン酸結合（導入）カチオン化ゼラチンまたはポリエチレングリコール結合（導入）カチオン化ゼラチンとウイルスエンベロープベクターとの接触によりなされ、好ましくは静電気的な結合が形成され得る。
【００４６】
カチオン化ゼラチンは、例えば、比較的低分子量のゼラチンとエチレンジアミンなどのカチオン化剤をゼラチン中のカルボキシル基とエチレンジアミンのアミノ基とが反応する条件下で、緩衝液中にて混合し、25℃から40℃の間程度の温度で、ＥＤＣ（エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）の存在下で一晩反応させることによって得られる。得られる高分子を透析後乾燥することもできる。
【００４７】
ヒアルロン酸結合（導入）カチオン化ゼラチンは、限定はされないが、例えば上記のようにして得られたカチオン化ゼラチンと、各種分子量のヒアルロン酸とを炭酸バッファー溶液に添加する。次に混合物を触媒存在下において、保存することで、糖還元末端とカチオン化ゼラチンのアミノ基を反応させる。得られた産物を透析後乾燥し、ヒアルロン酸結合（導入）カチオン化ゼラチンを作製する。ここで、各種分子量のヒアルロン酸は、分子量約180万程度のヒアルロン酸を、例えばオートクレーブで熱分解し、透析して精製することにより、得られる。ヒアルロン酸結合カチオン化ゼラチン精製のためには、ヒアルロン酸として、5,000から100万程度の分子量のものが使用可能であり、分子量ならびにカチオン化率をパラメーターとして、各分子量のヒアルロン酸を分離し、使用することができる。カチオン化率は、ゼラチンのカルボキシル基に対して導入されるアミノ基の割合であり、5-50%が好ましい。
【００４８】
ヒアルロン酸とカチオン化ゼラチンとの量比は、モル比で、１０：１から１：１０が好ましく、より好ましくは、２：１から１：２である。
【００４９】
本発明において好適に用いられ得る別の例として、ポリエチレングリコール結合（導入）カチオン化ゼラチンがある。限定はされないが、例えば上記のようにして得られたカチオン化ゼラチンと、各種分子量のポリエチレングリコールとを炭酸バッファー溶液に添加する。次に混合物を触媒存在下において、保存することで、ポリエチレングリコール末端のアルデヒド基とカチオン化ゼラチンのアミノ基を反応させる。得られた産物を透析後乾燥し、ポリエチレングリコール結合（導入）カチオン化ゼラチンを作製する。ここで、各ポリエチレングリコールの分子量は約１０ｋDa（キロダルトン）から１００ｋDaである。更なる態様においては、各PEG分子の分子量が約１０ｋDaから４０ｋDaである。更なる態様においては、各PEG分子の分子量が約１２ｋDaである。更なる態様においては、各PEG分子の分子量が約２０ｋDaである。適したPEG分子は、Shearwater Polymers, Inc. およびEnzon, Inc. より入手可能であり、SS-PEG、NPC-PEG、アルデヒド-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC、SC-PEG、トレシル化 mPEG (US 5,880,255)、またはオキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシミド-PEG (US 5,122,614)から選択することができるが、このポリエチレングリコール酸結合カチオン化ゼラチン精製のための好適な分子量のポリエチレングリコールは、1,000から10万程度のものが使用可能であり、分子量ならびにポリエチレングリコールの導入率（1-20%）をパラメーターとして、各分子量のポリエチレングリコールを分離し、使用している。導入率は、ポリエチレングリコールが、カチオン化ゼラチンのアミノ基に対してどのくらいの割合で導入されているかを示す指標である。ポリエチレングリコールとカチオン化ゼラチンとの量比は、モル比で、１０：１から１：１０が好ましく、より好ましくは、２：１から１：２である。
【００５０】
上記のようにして得られるヒアルロン酸結合（導入）カチオン化ゼラチン、またはポリエチレングリコール結合（導入）カチオン化ゼラチン（以下、まとめて「各種ポリマー」ともいう）を、ウイルスエンベロープベクターに結合させる。ウイルスエンベロープベクターは、上記のように、薬剤を封入する前後のいずれの状態でもよい。各種ポリマーとHVJ-Eとの配合比は、５μg対１ HAUから１μg対５HAU、より好ましくは、250μg対500 HAUを基本とし、以下の工程を行う。すなわち、各種ポリマーを、PBSなどを溶媒として、10 mg/ml 〜50 mg/ml程度の濃度とし、これに、HVJ-Eストックを加えピペッティングを行う 。さらに、例えばPBSなどの緩衝液を加え、一定時間氷上静置することで作製する。
【００５１】
ウイルスエンベロープベクターあるいは癌治療用薬剤送達ビヒクルへの薬剤の取り込みは、具体的には、薬剤を溶媒に溶解して溶液とし、この溶液とウイルスエンベロープベクター溶液とを混合することによって得られうる。薬剤取り込みの際には、界面活性剤を好適に用いることもできる。薬剤がシスプラチンである場合を例にとれば、各種ポリマーを結合したあるいは未結合のウイルスエンベロープベクターに、２（ＨＡＵ）：１（μg）から１（ＨＡＵ）：２（μg）程度の割合になるように、薬剤溶液を混合する。次に、界面活性剤を含む緩衝液を加え、遠心分離した後、上清を除去して、薬剤封入製剤を得る。
【００５２】
ウイルスエンベロープベクターへのホウ素含有化合物の取り込みは、ホウ素含有化合物を溶媒に溶解して溶液とし、この溶液とウイルスエンベロープベクター溶液とを混合することによって得られうる。ホウ素含有化合物取り込みの際には、界面活性剤を好適に用いることもできる。ホウ素含有化合物がＢＳＨである場合を例にとれば、各種ポリマーを結合したあるいは未結合のウイルスエンベロープベクターに、ホウ素量換算で、２（ＨＡＵ）：１（μgB）から１（ＨＡＵ）：２（μgB）程度の割合になるように、ホウ素含有化合物溶液を混合する。次に、界面活性剤を含む緩衝液を加え、遠心分離した後、上清を除去して、ＢＳＨ封入ウイルスエンベロープベクターを得る。
【００５３】
このようなホウ素含有化合物製剤は、そのままあるいは薬学的に許容できるキャリアーと混合して、特に、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）に好都合に用いられうる薬剤として有用である。
【００５４】
また、本発明の製剤は、広く、そのままあるいは薬学的に許容できるキャリアーと混合して、遺伝子治療、免疫療法、化学療法、放射線療法、通常の薬剤投与などに好都合に用いられうる。本発明の製剤は、特に、悪性胸膜中皮腫や骨肉腫瘍の治療、または肝臓転移抑制の為に有用である。
【００５５】
治療は、任意の適当な投与経路で、薬剤が標的部位に蓄積するような方法で、本発明の薬剤を封入した製剤を投与することによって行われる。封入される薬剤は、腫瘍に濃縮することが好ましい。薬剤封入製剤は一度に投与することもできるし、順次投与することもできる。製剤の投与を必要に応じて繰り返すことができる。所望であれば、腫瘍を外科的に可能な程度に除去した後、残りの腫瘍を本発明の製剤を使って破壊する。
【００５６】
ホウ素含有化合物封入製剤の場合の治療は、任意の適当な投与経路で、ホウ素含有化合物が標的腫瘍中に蓄積するような方法で、ホウ素含有化合物を封入した送達ビヒクルを投与することによって行われる。化合物は放射線照射前に腫瘍に濃縮することが好ましく、放射線照射前の腫瘍：血液比が約2:1 または少なくとも1.5 ：1であると有利である。ホウ素含有化合物封入製剤は一度に投与することもできるし、順次投与することもできる。腫瘍内に化合物が望ましく蓄積した後、その部位に有効量の低エネルギー中性子を照射する。皮膚を通してその部位を照射することができるし、あるいはその部位を照射前に完全にあるいは部分的に暴露することもできる。ホウ素含有化合物の投与とそれに続く放射線照射を必要に応じて繰り返すことができる。所望であれば、腫瘍を外科的に可能な程度に除去した後、残りの腫瘍を本発明の複合体を使って破壊する。もう1 つの態様として、患者に適当量のホウ素 含有化合物を投与し、天然に存在する中性子放射物質である252カリフォルニウムの有効量で照射する。これは腫瘍中に挿入し、適当な時間に取り出すことが好ましい。
【００５７】
本発明の製剤の投与の為に、適切な賦形剤、アジュバント、および／または薬学的に受容可能なキャリアーと混合して、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。特に好ましく用いられ得るキャリアーには、限定はされないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水等が含まれる。本発明の一実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアーは薬学的に不活性である。
【００５８】
本発明の薬剤の投与は、経口および非経口でなされ得る。非経口投与の場合、動脈内（例えば、頚動脈を介する）、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内へなされうる。
【００５９】
製剤は、散剤 、顆粒剤 、細粒剤 、ドライシロップ剤 、錠剤 、カプセル剤 、注射剤 、液剤などのいずれの形態にもなり得る。また、その剤型に応じ、製剤学的に公知の手法により、適切な賦形剤 ；崩壊剤；結合剤；滑沢剤；希釈剤；リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤緩衝剤；等張化剤；防腐剤；湿潤剤；乳化剤；分散剤；安定化剤；溶解補助剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；単糖、二糖および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー）、などの医薬品添加物と適宜混合または希釈・溶解することにより調剤することができる。等張性および化学的安定性を増強するこのような物質は、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性である。
【００６０】
処方および投与のための技術は、例えば、日本薬局方の最新版および最新追補、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ」（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最終版に記載されている。
【００６１】
本発明の製剤は、目的の薬剤が意図する目的を達成するのに有効な量で含有される薬剤であり、「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識され、薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。治療的有効用量の決定は十分に当業者に知られている。
【００６２】
治療的有効量とは、投与により疾患の状態を軽減する薬剤の量をいう。このような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、複合体の投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用する複合体の種類等により適宜選択される。
【００６３】
ヒトに本発明の薬剤を投与する場合、１被験体あたり、４００〜４００，０００ＨＡＵ相当の、好ましくは１，２００〜１２０，０００ＨＡＵ相当の、より好ましくは４，０００〜４０，０００ＨＡＵ相当の薬剤が投与され得る。
【００６４】
本明細書において「ＨＡＵ」とは、ニワトリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をいう。１ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当する（Ｏｋａｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｋｅｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ４，２０９−２１３、１９６１）。上記の量は、例えば、１日１回から数回投与することができる。正確な用量は、治療されるべき患者の疾患状態の重症度（例えば、腫瘍のサイズおよび位置；患者の年齢、体重、および性別；投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性／応答）などに応じて決定される。
【００６５】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されない。
【実施例１】
【００６６】
（１）ＨＶＪの増殖
ＨＶＪの種ウイルスを、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）の受精卵を使って増殖させ分離・精製したＨＶＪ（Ｚ種）を細胞保存用チューブに分注し、１０％ＤＭＳＯを加えて液体窒素中に保存し、調製した。受精直後のニワトリ卵を入荷し、インキュベーター（ＳＨＯＷＡ−ＦＵＲＡＮＫＩ Ｐ−０３型；約３００鶏卵収容）に入れ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で１０〜１４日飼育した。暗室内で、検卵器を用いて、胚の生存および気室と漿尿膜を確認した。ポリペプトン溶液（１％ポリペプトン、０．２％ＮａＣｌを混合し、１ＭＮａＯＨでｐＨ７．２に調整してオートクレーブ滅菌し、２℃〜６℃保存したもの）で種ウイルス（液体窒素から取り出したもの）を５００倍に希釈し、２℃〜６℃に置いた。卵をイソジンおよびアルコールで消毒し、ウイルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希釈した種ウイルス０．１ｍｌを２６ゲージの針付き１ｍｌシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入した。溶かしたパラフィン（融点５０〜５２℃）をパスツールピペットを用いて孔の上に置きこれをふさいだ。卵をインキュベーターに入れ、３４〜３６．５℃、湿度４０％以上の条件で３日飼育した。次に、接種卵を一晩２℃〜６℃に置いた。翌日、卵の気室部分をピンセットで割り、１８ゲージの針を付けた１０ｍｌシリンジを漿尿膜の中に入れて、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、２℃〜６℃に保存した。
（２）ＨＶＪの濃縮
上記（１）で得られたＨＶＪ含有漿尿液（ＨＶＪ含有のニワトリ卵の漿尿液を集め２℃〜６℃にて保存）の約１００ｍｌを広口の駒込ピペットで約５０ｍｌの遠心チューブ２本に入れ、低速遠心機で３，０００ｒｐｍ、１０分、２℃〜６℃で遠心し（ブレーキはオフ）、卵の組織片を除去した。遠心後、上清を３５ｍｌ遠心チューブ４本（高速遠心用）に分注し、アングルローターで２７，０００ｇ、３０分遠心した。上清を除き、沈殿にＢＳＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ；オートクレーブし、２℃〜６℃保存）（ＢＳＳのかわりにＰＢＳでも可能）をチューブ当たり約５ｍｌ加え、そのまま２℃〜６℃で一晩静置した。広口の駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし、１本のチューブに集め、同様にアングルローターで２７，０００ｇ、３０分遠心した。上清を除き、沈殿にＢＳＳを約１０ｍｌ加え、同様に２℃〜６℃で一晩静置した。広口の駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし、低速遠心機で３，０００ｒｐｍ、１０分、２℃〜６℃で遠心し（ブレーキはオフ）、除ききれなかった組織片やウイルスの凝集塊をのぞいた。上清を新しい滅菌済みチューブに入れ、ＨＶＪ濃縮液として２℃〜６℃で保存した。このＨＶＪ濃縮液０．１ｍｌにＢＳＳを０．９ｍｌ加え、分光光度計で５４０ｎｍの吸光度を測定し、ウイルス力価を赤血球凝集活性（ＨＡＵ）に換算した。５４０ｎｍの吸光度１がほぼ１５，０００ＨＡＵに相当した。ＨＡＵは融合活性とほぼ比例すると考えられる。
【００６７】
（３）ＨＶＪ濃縮液の調製
さらにショ糖密度勾配を用いたＨＶＪの精製も必要に応じて行い得る。具体的には、実施例１で得られたＨＶＪ懸濁液を６０％、３０％のショ糖溶液（滅菌済み）を重層した遠心チューブにのせ、６２，８００×ｇで１２０分間密度勾配遠心を行う。遠心後、６０％ショ糖溶液層上に見られるバンドを回収する。回収したＨＶＪ懸濁液をＢＳＳもしくはＰＢＳを外液として２℃〜６℃で透析を一晩行い、ショ糖を除去する。すぐに使用しない場合はＨＶＪ懸濁液にグリセロール（オートクレーブ滅菌）と０．５Ｍ ＥＤＴＡ液（オートクレーブ滅菌）をそれぞれ最終濃度が１０％と２〜１０ｍＭになるように加えて−８０℃で穏やかに凍結し、最終的に液体窒素中で保存する（凍結保存はグリセロールと０．５Ｍ ＥＤＴＡ液の代わりに１０ｍＭ ＤＭＳＯでも可能）。
【実施例２】
【００６８】
（ＨＶＪの紫外線照射による不活性化）
精製、濃縮したＨＶＪに、９９ｍＪ／ｃｍ２で、紫外線照射を行った。エッペンドルフチューブにチューブあたり１０，０００ＨＡＵ分ずつ分注し、１５，０００ｒｐｍ、１５分遠心し、沈殿を−２０℃で保存した。
【００６９】
次に、ＨＶＪの不活性化の評価を行った。不活性化処理後、ＨＶＪをサル腎細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞へ３７℃で１時間感染を行い、ＨＶＪ感染後１２〜１８時間してから、細胞を３７℃で、炭酸ガス存在下で１８〜２４時間インキュベートした後にアセトン／メタノール固定してＨＶＪ感染によって細胞に発現されるＨＶＪのＦタンパク質の有無をＦタンパク質に対する抗体を用いて免疫染色を行った。即ち、ＨＶＪを界面活性剤ＮＰ−４０（ノニルフェノキシポリエトキシエタノール）によって可溶化し、遠心によって膜成分を分離した後、得られた膜成分をイオン交換クロマトグラフィーにかけることによりＦタンパク質を得た（Ｙｏｓｈｉｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８１年、および Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，２０００年によった）。次にこのＦ蛋白をフロイントアジュバンドとともにウサギに４度免疫して、Ｆ蛋白に対する抗血清（ウサギの抗Ｆタンパク質ポリクローナル抗体：一次抗体）を得た。固定化した細胞をこの一次抗体で一時間処理した後、ＦＩＴＣで標識したブタの抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（二次抗体）で一時間処理した。この二次抗体処理後、蛍光顕微鏡下で検鏡し、ＨＶＪの不活性化を評価することができる。不活性化処理のウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープの膜機能に及ぼす影響については不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープのＨＡ活性を指標とすることができる。ＨＡ活性は通常の方法で測定できる。不活性化ＨＶＪエンベロープ懸濁液を９６ウェルプレート（丸底）の３つのウェルに対して、それぞれ５０、４０、３０μｌ添加した後、ＰＢＳ（−）（Ｍｇイオン、Ｃａイオンを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）で２段階希釈することでサンプルの希釈系列を作製する。そこにＰＢＳ（−）で０．５％ニワトリ赤血球溶液を添加して２℃〜６℃で２時間インキュベーション後、凝集反応の有無を検定する。凝集反応が失われるサンプル系列のサンプル量とそのウェルの希釈倍率の逆数からＨＡ活性を求めた。
【実施例３】
【００７０】
（不活性化ＨＶＪのカラムクロマトグラフィーおよび限外濾過による精製）
（１）カラムクロマトグラフィーによる精製
予め１５Ｌの緩衝液１（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（直径２０ｃｍ、ベッド高さ１５ｃｍ、ベッド容量４７１０ｍｌ）に実施例２で得られた不活性化ＨＶＪ液を５０ｍＬ／分の流速でフィードした。次に１０Ｌの緩衝液１（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、２５Ｌの緩衝液２（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３５０ｍＭ ＮａＣｌ）を順にカラムに通じた。不活性化ＨＶＪは濃縮液フィード時にカラム樹脂に吸着し、一方、不活性化ＨＶＪ濃縮液中の不純物の大部分は緩衝液１，２によって樹脂から洗い出される。２５Ｌの緩衝液３（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６５０ｍＭ ＮａＣｌ）を通じるとほぼ同時にＨＶＪが樹脂から溶出するので、カラム画分の採取を始めた。ＵＶ吸収チャート（λ＝２８０ｎｍ）上に不活性化ＨＶＪのピークが現れ、ベースラインに復帰するまでの間に７８２９ｍＬの画分を得た。この画分に抗生物質を添加した。画分の分取完了後も緩衝液の通液を継続し、最後に２０Ｌの緩衝液４（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ）をカラムに通じた。
【００７１】
（２）限外濾過による精製
上記実施例３（１）の工程で得られたカラム画分を１０Ｌボトルに入れ、給液用チューブと循環用チューブを取り付けたキャップを締めた。給液用チューブはペリスタポンプを経由してＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製 ＵＦＰ−５００−Ｅ−５Ａ限外濾過モジュール入口へ、循環用チューブは循環量調整バルブ経由でモジュール出口へ、それぞれ接続した。ポンプを運転し、モジュールの出口側圧力を４０〜８０ｋＰａに保ちながら循環量調整バルブを絞って濃縮を行い、６０〜７０ｍＬ／分の排液を排出した。循環液量約６００ｍＬとなった後、ボトルを５００ｍＬボトルに、モジュールをＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製 ＵＦＰ−５００−Ｅ−４Ａに交換して濃縮を継続した。上記と同様に約１０ｍＬ／分の排液を排出して循環液量約６０ｍＬとなった後で６０ｍＬの緩衝液５（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２％ マンニトール）を添加し、更に濃縮を継続して循環液量を約６０ｍＬとした（Ｂｕｆｆｅｒ交換）。更にＢｕｆｆｅｒ交換を２回行った後、循環液量は７９ｍＬであった。５ｍＬディスポシリンジに循環液を採り、シリンジ先端にディスクフィルタ（ＣＯＲＮＩＮＧ製Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ、φ＝２６ｍｍ、０．４５μｍ）を取付け、手動にて滅菌濾過を実施した。
【実施例４】
【００７２】
（カチオン化ゼラチンの製造）
分子量５，０００の低分子量ゼラチンと、ゼラチン中のカルボキシル基に対して５０モル当量のエチレンジアミンを加え、０．１  Ｍ  ｐＨ５のリン酸バッファー溶液に添加し、EDC存在下３７度一晩反応させた。透析後乾燥し、カチオン化ゼラチンを作製した。
【実施例５】
【００７３】
（ヒアルロン酸結合（導入）カチオン化ゼラチンの製造）
実施例４にて作製したカチオン化ゼラチンと各種分子量のヒアルロン酸とを０．２ＭｐＨ９．７炭酸バッファー溶液に添加し、ＮａＣＮＢＨ３存在下３７度３日間保存することで、糖還元末端とカチオン化ゼラチンのアミノ基を反応させた。透析後乾燥し、ヒアルロン酸結合（導入）カチオン化ゼラチンを作製した。作製したカチオン化ゼラチンと各種分子量のヒアルロン酸とを０．２Ｍ  ｐＨ９．７炭酸バッファー溶液に添加し、NaCNBH3存在下３７度３日間保存することで、糖還元末端とカチオン化ゼラチンのアミノ基を反応させた。透析後乾燥し、ヒアルロン酸結合（導入）カチオン化ゼラチンを作製した。各種分子量のヒアルロン酸は、分子量約180万程度のヒアルロン酸を、オートクレーブで熱分解し、透析して精製することにより、得られた。ここでは、分子量が5,000のヒアルロン酸と3,100のカチオン化ゼラチンを１：１の割合で配合した。
【実施例６】
【００７４】
（ポリエチレングリコール結合（導入）カチオン化ゼラチンの作製法；
実施例４で作製したカチオン化ゼラチンと各種分子量のポリエチレングリコールとを０．２ＭｐＨ９．７炭酸バッファー溶液に添加し、ＮａＣＮＢＨ３存在下３７度１時間保存することで、ポリエチレングリコール末端のアルデヒド基とカチオン化ゼラチンのアミノ基を反応させた。透析後乾燥し、ポリエチレングリコール結合（導入）カチオン化ゼラチンを作製した。ここで、各ポリエチレングリコールの分子量は約１０ｋDa（キロダルトン）から１００ｋDaである。分子量ならびにポリエチレングリコールの封入率（1-20%）をパラメーターとして、各分子量のポリエチレングリコールを分離し、使用した。ここでは、初期設定として分子量が5,000のPEGと3,100のカチオン化ゼラチンを、1:1、5:1、10:1の割合で配合した。
【実施例７】
【００７５】
（ポリマー結合−ＨＶＪ−Ｅの調製）
実施例４、５、および６で得られた各種ポリマーと、実施例１で得られたHVJ-Eとの配合比を、それぞれ250 μg対500 HAUを基本とし、以下の工程を行った。各種ポリマー溶液（溶媒はPBS）を20 mg/ml, 50 μL作製し、HVJ-Eストック500 HAU/10μL4検体分40μLを加えピペッティングを行う (全量で90 μL)。さらにPBS 110μlを加え(total 200 μL)、30 min氷上静置することで、各種ポリマーが結合したＨＶＪ−Ｅを調製した。
【実施例８】
【００７６】
（マウス毒性の評価）
実施例１で得られたＨＶＪ−Ｅと、実施例７で得られたポリマー結合−ＨＶＪ−Ｅを用いて、マウス毒性試験を行った。ＨＶＪ−Ｅと、各種ポリマー結合-HVJ-E製剤（CG 1,000 mg: 2,000 HAU）をPBSに溶かし、最終容量を200 mLとして、正常C57/BL6マウスにそれぞれ心腔内投与し、投与後1週間以上生存したマウスの個体数より、その生存率を算出した。その結果を表１に示す。
【表１】
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表１では、各種ポリマー-HVJ-Eの100%生存の最大耐容量がHVJ-E、CG-HVJ-E、CG-PEG-HVJ-E、CG-HA-HVJ-Eで、1,500、2,000、2,500、2,500HAUであり、実施例１で得られたHVJ-Eと実施例４で得られたCG-HVJ-Eに比し、実施例５および６でそれぞれ得られたPEG化あるいはヒアルロン酸を配合したポリマー結合HVJ-Eでは、毒性の軽減が認められた。
【実施例９】
【００７７】
（血球凝集抑制効果の評価）
実施例１で得られたＨＶＪ−Ｅと実施例７で得られたポリマー結合−ＨＶＪ−Ｅ懸濁液(CG 250 mg: 500 HAU)を、２倍ずつ段階希釈することでサンプルの希釈系列を作製し、150 mLをウェルプレートに添加した後、これの凝集反応の有無を検定した。試料20 μlを 96穴マイクロタイタープレートに加え、ヒトから採血して得た1mlの血液を生理食塩水49mlに懸濁した試験液90 μlを添加し、室温で2時間静置後、肉眼で赤血球凝集 活性がみられる最小濃度を判定した。凝集反応が失われるサンプル系列のサンプル量とそのウェルの希釈倍率の逆数からＨＡ活性を求めた。この結果、実施例１で得られたＨＶＪ−Ｅに比し、実施例７で得られたポリマー結合−ＨＶＪ−Ｅは、いずれもインビトロにおいて、約２倍の血球凝集抑制作用を認めた。
【実施例１０】
【００７８】
（薬剤の封入）
含有されるホウ素原子換算で、PBSを溶媒として、１７，２４０μgB/mlのBSHを調製した。この溶液を使用し、実施例７で得られた各種ポリマー結合HVJ-EとBSHとの配合比を、1,500 HAU対BSH 1,000 μgBとして製剤を作製した。1本当たり10,000 HAUの各種ポリマー結合HVJ-Eに6666.7 μgB (386.7 μl)のBSHを加え、十分にピペッティングを行った。次に３％TritonX-100/TE バッファー溶液を40 μlを加え、Vortex後、5 min氷上静置し、遠心分離１５０００ｒｐｍ／４ｄｅｇｒｅｅ／５ｍｉｎを行った。BSＳ溶液を１．０  ｍｌを加え、ボルテックスし、遠心分離１５０００ｒｐｍ／４ｄｅｇｒｅｅ／５ｍｉｎ後、上清を除去し、精製した。
【実施例１１】
【００７９】
（ルシフェラーゼ導入効率の評価）
ＣＤ４４を発現するＬＭ８Ｇ５（マウス骨肉腫細胞株：RIKEN CELL BANKから購入したLM8をin vivo selectionし樹立した肝転移高発現株）を、１×１０４細胞／０．２ｍＬ／ウェル（２４ウェルプラスチックプレート）となるよう１０％牛胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０培養液に懸濁し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で培養した。２０〜２４時間培養後、ＨＶＪ−Ｅによる遺伝子導入の測定に供した。同様に、ＣＴ２６（ヒト大腸がん細胞株；ATCCから購入）を１×１０４細胞／０．２ｍＬ／ウェル（２４ウェルプラスチックプレート）となるよう１０％牛胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０培養液に懸濁し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で培養した。２０〜２４時間培養後、ＨＶＪ−Ｅによる遺伝子導入の測定に供した。
【００８０】
上記実施例１で得られたＨＶＪ−Ｅと、実施例７で得られた各種ポリマー結合ＨＶＪ−Ｅの懸濁液（溶媒はPBS）２０μＬに２ｍｇ／ｍＬ硫酸プロタミン溶液（ＰＢＳ）を５μＬ添加、混合し、氷上で５分間静置した。続いて、ルシフェラーゼ遺伝子をコードしたプラスミッドＤＮＡ（ｐＧＬ３）溶液５μＬ（１０μｇ）を添加、混合し、更に２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＰＢＳ（−））を３μＬ添加、混合後、１５０００回転／分（１９５００×Ｇ）、２℃〜６℃にて１０分〜１５分間遠心した。上清を除去した後、沈澱を３０μＬのＰＢＳ（−）で懸濁した。この懸濁液に１ｍｇ／ｍＬ硫酸プロタミン溶液（ＰＢＳ）５μＬを添加、混合した。この混合液８μＬ（ウェル当り）を前もって準備（培養）しておいたＬＭ８Ｇ５細胞またはＣＴ２６細胞に添加した。
【００８１】
添加の２０〜２４時間後、ルシフェラーゼ発現量をルシフェラーゼ測定キット（Ｐａｃｋａｒｄ社製、ＬｕｃＬｉｔｅ、Ｎｏ．６０１６９１１）を用いて測定した。発光量の測定は、ルミノメータ（Ｔｕｒｎｅｒ社製、ＴＤ−２０ｅ ＬＵＭＩＮＯＭＥＴＥＲ）にて測定した。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、ＨＶＪエンベロープを用いて、ＬＭ８Ｇ５において、特に遺伝子のような生体高分子を導入することができることが実証された。この傾向は、ヒアルロン酸導入化カチオン化ＨＶＪ−Ｅで顕著であった。
【実施例１２】
【００８２】
（ＨＪＶ−Ｅの腫瘍細胞への親和性評価）
実施例１１と同様の方法により、ＬＭ８Ｇ５細胞を保持した。これとは別に実施例１で得られたＨＶＪ−Ｅと、実施例７で得られた各種ポリマー結合ＨＶＪ−Ｅとに、それぞれ蛍光色素Ｑｄｏｔ６５５（Ｑｄ）を封入した。封入は実施例１０と同様の方法にて行った。ＬＭ８Ｇ５細胞とそれぞれのウイルスエンベロープベクターとを１時間常温で接触させ、洗浄した後、２４時間培養し、細胞への結合を蛍光顕微鏡で観察することで、それぞれのウイルスエンベロープベクターの腫瘍細胞への親和性を検討した。その結果、特に、ヒアルロン酸導入化カチオン化ＨＶＪ−Ｅにおいて、腫瘍細胞との強い親和性が認められた。
【実施例１３】
【００８３】
（インビトロにおけるＢＳＨ封入ＨＶＪ−Ｅベクター製剤を用いたＢＮＣＴ照射実験）
実施例１０で得られた各種ＢＳＨ封入ＨＶＪ−Ｅベクターを、マウス骨肉腫細胞株ＬＭ８Ｇ５およびヒト悪性胸膜中皮腫細胞株ＭＥＳＯ−１培養液にそれぞれ添加し、１０分放置後、直接中性子を1時間照射後、細胞を1週間培養し、細胞増殖抑制効果の有無を調べた。その結果、図２に示すように、いずれの細胞においても、中性子照射により、ホウ素濃度依存的に、細胞増殖抑制効果があることがわかった。
【実施例１４】
【００８４】
（インビボにおけるＢＳＨ封入ＨＶＪ−Ｅベクター製剤を用いたＢＮＣＴ照射実験）
実施例１０で得られた各種ＢＳＨ封入ＨＶＪ−Ｅベクターの抗腫瘍効果を、マウス骨肉腫細胞株肝転移モデルを使って調べた。まず、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに、１×１０６個のＬＭ８Ｇ５細胞を、第０日において上腸間膜静脈接種した。第８日目に、マウスに各種ＢＳＨ封入ＨＶＪ−Ｅベクター、またはコントロールとしてＢＳＨのみ（PBS溶解）を心腔内に導入した。導入されたＢＳＨの量は、ホウ素１０Ｂ換算で、それぞれ１，０００であった。このマウスを１日飼育した後、それぞれ中性子を照射（条件）することで処理した。照射は、１日、６０分ずつ行った。第11日目にマウスを犠牲死させ、処置後、それぞれのマウスから肝臓を取り出し、肝臓の重量を計測することで、本発明のＢＳＨ封入ＨＶＪ−Ｅベクターの治療効果を調べた。その結果、図３に示すように、いずれのＢＳＨ封入ＨＶＪ−Ｅベクターにおいても、中性子照射により、抗腫瘍効果があることがわかったが、特にＰＥＧ導入カチオン化ＨＶＪ−Ｅにおいて、強い抗腫瘍細胞効果が認められた。
【００８５】
次に、実施例１０で得られた各種ＢＳＨ封入ＨＶＪ−Ｅベクターの抗腫瘍効果を、マウス胸膜炎モデルを使って調べた。まず、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに、5×１０６個のＭＥＳＯ−１細胞を、第０日においてマウス右胸腔内注入した。第7から14日目に、マウスに各種ＢＳＨ封入ＨＶＪ−Ｅベクター、またはコントロールとしてＢＳＨのみを胸腔内に注入した。導入されたＢＳＨの量は、ホウ素１０Ｂ換算で、それぞれ１，０００であった。このマウスを1日飼育した後、それぞれ中性子を照射（条件）することで処理した。照射は、１日、60分ずつ行った。第8から15日目にマウスを犠牲死させ、処置後、それぞれのマウスを開胸してそれぞれの胸膜の状態を調べることで、本発明のＢＳＨ封入ＨＶＪ−Ｅベクターの治療効果を調べた。その結果、いずれのＢＳＨ封入ＨＶＪ−Ｅベクターにおいても、中性子照射により、抗腫瘍効果があることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ポリマー結合ＨＶＪ−Ｅのルシフェラーゼ遺伝子導入効率の検討結果を示すグラフである。
【図２】ＢＳＨを封入したポリマー結合ＨＶＪ−Ｅを使って、インビトロで中性子を照射した場合の腫瘍の増殖率を示す。
【図３】ＢＳＨを封入したポリマー結合ＨＶＪ−Ｅを使って中性子捕捉療法を行った際の肝転移抑制効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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