(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫吸着壁固定相（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ）の形成方法の提供。【解決手段】免疫吸着壁固定相の形成方法に関する。この種の方法は一部不完全な二段階の重合反応法で、固定相に一つの支持性ゲル層１０と一つの堆積ゲル層１１を含む。この種の方法の主要な特性は、重合反応システム中の温度変化とアクリルアミド単量体の濃度分布の不一致が、固定相表面上に免疫吸着剤１１ｂをはめ込ませることである。ここに紹介する三種の異なる固定相の形成方法には、前結合ステップ、後結合ステップ、そして連続性共重合ステップを包括する。結合活性テストの結果は、中分子量の毒素、β２ミクログロブリン共に、調合された固定相で除去されることを表示している。【選択図】図５
2008073223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のステップを包括する：
一つの支持性ゲル層を形成し、
大量の免疫吸着剤を含む堆積溶液を支持性ゲル層のトップ側に注入し、
堆積溶液がまだ未重合状態を保持している時に、免疫吸着剤の沈殿過程を完成させ、
免疫吸着剤内に安定的に不一致な単量体濃度分布を確立し、
残された堆積溶液を重合状態に転換し、そのうえ
流し去られた未重合部分が、表面に免疫吸着剤を有する堆積ゲル層を形成することを特徴とする免疫吸着壁固定相の形成方法。
【請求項２】
免疫吸着剤内に安定的に不一致な単量体濃度分布を確立するステップに関するものを指し、下記のステップを包括する、
一部の上清液を除去したのち、希釈用緩衝液で残留した堆積溶液の表面を洗い流すことを特徴とする請求項１記載の免疫吸着壁固定相の形成方法。
【請求項３】
堆積ゲル層が形成された後、免疫吸着剤を回収し、回収された免疫吸着剤を使用して、もう一つの免疫吸着壁を構成することを特徴とする請求項１記載の免疫吸着壁固定相の形成方法。
【請求項４】
免疫吸着剤が支持基質と抗体の複合物であることを特徴とする請求項１記載の免疫吸着壁固定相の形成方法。
【請求項５】
下記のステップを包括する：
一つの支持性ゲル層を形成し、
大量の支持基質を含む堆積溶液を支持性ゲル層のトップ側に注入し、
堆積溶液がまだ未重合状態を保持している時に、支持基質の沈殿過程を完成させ、
支持基質内に安定的に不一致な単量体濃度分布を確立し、
残された堆積溶液を重合状態に転換して、表面に支持基質を有する堆積ゲル層を形成し、そのうえ、
大量の抗体が暴露された支持基質上に結合することを特徴とする免疫吸着壁固定相の形成方法。
【請求項６】
支持基質内に安定的に不一致な単量体濃度分布を確立させ、
一部の上清液を除去したのち、希釈用緩衝液で残留した堆積溶液の表面を洗い流すことを特徴とする請求項５記載の免疫吸着壁固定相の形成方法。
【請求項７】
未結合の抗体を回収し、回収された抗体を使用して、もう一つの免疫吸着壁を構成することを特徴とする請求項５記載の免疫吸着壁固定相の形成方法。
【請求項８】
未重合状態とは堆積溶液が重合の抑制された温度、重合状態とは堆積溶液が重合を起し始める温度であることを特徴とする請求項１及び請求項５記載の免疫吸着壁固定相の形成方法。
【請求項９】
支持性ゲル層と堆積ゲル層が共にポリアクリルアミドゲルで、支持性ゲル層のアクリルアミド濃度が堆積ゲル層のアクリルアミド濃度より高いことを特徴とする請求項１及び請求項５記載の免疫吸着壁固定相の形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血液透析の補助である毒素除去形態（ｍｏｄａｌｉｔｙ）の形成方法に関するもので、さらに明確に言うと免疫吸着壁固定相の形成方法である。
【背景技術】
【０００２】
腎機能が退化したり喪失すると、尿毒症患者は血液透析治療に頼って、蓄積された毒素を除去する事で延命しなければならない。しかし、血液透析は全ての腎臓の生理機能を代替することができないため、長期の透析患者は常に様々な合併症を発症し、特に血液透析では、ある種中分子量の毒素、例えば竈２ミクログロブリン（β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、竈−２Ｍ）の除去ができないため、結果、透析品質が非常に悪化し、よく治療寿命が短縮される。
【０００３】
免疫吸着剤は一種、混合物中から抗原を分離する物質である。免疫吸着剤はペースト状支持基質とすでに知られている抗体を結合させて調合する、混合物が固定装填（ｓｅｔｔｌｅｄ）された免疫吸着剤のカラムを流れる時、抗原は抗体と結合する。多くの研究員がすでに高選択性と親合性の免疫吸着剤を用いて竈２ミクログロブリンの除去にトライしている（Ｍｏｇｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｖａｌｌａｒ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。しかし、免疫吸着剤と血液間には互換性がないため、これらの方法は長期の臨床診療中に実施することが不可能なようである（Ｖａｌｌａｒ  Ｌ，１９９６）。
【０００４】
前記した免疫吸着剤を直接使用する問題を解決するため、免疫吸着壁を血液透析フィルターと合わせて使用し補助的毒素除去形態として採用することを提案する。免疫吸着壁は免疫分離法と免疫吸着法の原理を結合させた概念で、患者の血液中に蓄積されたある種の毒素を除去することができる（Ｙａｎｇ  ＴＨ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。免疫吸着壁は２つの部分を包括する：第一部分は免疫分離バリア（ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）で、血液と毒素除去形態間の生物互換性を改善する、第二部分は固定相で、免疫吸着作用により毒素を除去することができる。理論上、免疫吸着壁を血液透析循環（ｃｉｒｃｕｉｔ）中に併入することができ、交錯する血流（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ）が固定相の表面を流れる時に、血中の毒素を除去することができる。一項簡単な実験的モードでは、しっかり装填された免疫吸着剤でその実行可能性が研究された、しかし、免疫吸着壁の発展は免疫吸着剤の有効利用に極めて明らかな阻害を受け、固定相を形成することができなかった。
【０００５】
ポリアクリルアミドゲル（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）は一種のよく用いられる、電気泳動基質で、アクリルアミド単量体と適当な双機能のクロスリンキング剤単量体との重合作用により形成される。ポリアクリルアミドゲルは化学不活性、最小の拡散作用があり、そのため免疫吸着壁固定相用基質として第一選択の媒体である。
【０００６】
上記の説明によると、現在の免疫吸着壁固定相の形成方法は、免疫吸着剤の使用を高め、また免疫吸着壁固定相の形成を最適化して改善する必要がある。この固定相がその他の血液浄化方法で除去できない、ある種の毒素が引き起こす難しい問題の解決に用いられる事を望む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は免疫吸着壁固定相の形成方法を提供して、血液中のある種の毒素を除去するものである。本発明中、一つの一部不完全な二段階の重合作用法を採用し、表面に免疫吸着剤をはめ込む新固定相を形成するものである。
【０００８】
本発明の第一実施例は支持性ゲル層を形成するステップを包括し、大量の免疫吸着剤を含む堆積溶液（ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を支持性ゲル層のトップ側に注入し、堆積溶液がまだ未重合状態を保持している時に、免疫吸着剤の沈殿作用の過程を完成して、免疫吸着剤内の単量体濃度を安定的に不一致にさせ、残った堆積溶液を重合状態に転換させる。再に未重合部分を流しさると、表面に免疫吸着剤を持つ堆積ゲル層が残る。このほか、免疫吸着剤内に不一致単量体濃度を確立するステップには、まだ一部の上清液を除去したのち、希釈用緩衝液で残留した堆積溶液の表面を洗い流すステップを包括する。免疫吸着剤は支持基質と抗体の複合物となることができる。
【０００９】
本発明の第二実施例は一つの後結合（ｐｏｓｔ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ）ステップで、従来のペースト状の免疫吸着剤を調合する前結合（ｐｒｅ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ）ステップに代わって用いられる。この方法は一つの支持性ゲル層を形成するステップを包括し、大量の支持基質を含む堆積溶液を支持性ゲル層のトップ側に注入して、堆積溶液がまだ未重合状態を保持している時に、支持基質の沈殿作用過程を完成して、支持基質内の単量体濃度を安定的に不一致にさせ、残った堆積溶液を重合状態に転換させて、表面に支持基質を有する堆積ゲル層を形成し、また多数の抗体を現れた支持基質と結合させる。このほか、支持基質内に不一致単量体濃度を確立するステップは、さらに一部の上清液を除去したのち、希釈用緩衝液で残留した堆積溶液の表面を洗い流すステップを包括する。
【００１０】
本発明の第三実施例中、水で洗い流された免疫吸着剤はさらに回収される。この方法は支持性ゲル層の形成ステップを包括し、大量の免疫吸着剤を含む堆積溶液を、支持性ゲル層のトップ側に注入し、堆積溶液がまだ未重合状態を保持している時に、免疫吸着剤の沈殿作用の過程を完成させて、免疫吸着剤内の単量体濃度を安定的に不一致にさせ、残った堆積溶液を重合状態に転換させて、未重合の部分を流しさり、表面に免疫吸着剤を有する堆積ゲル層を形成させ、また流し去った免疫吸着剤を回収する。このほか、免疫吸着剤内に不一致単量体濃度を確立するステップがさらに一部の上清液を除去したのち、希釈用緩衝液で残留した堆積溶液の表面を洗い流すステップを包括する。洗い流された免疫吸着剤を回収するステップには、回収した免疫吸着剤の使用も包括し、すでにもう一つの免疫吸着壁を構成している。
【００１１】
支持性ゲル層と堆積ゲル層の基質はいずれもポリアクリルアミドである。支持性ゲル層のアクリルアミド濃度は堆積ゲル層のアクリルアミド濃度と比べてさらに高く、２層間に一種の分子篩（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｅｖｉｎｇ）効果を確立する。ある種の因子、例えば低温、抑制剤の添加等は、重合作用を抑制し、未重合状態が出現する。またある種の因子、例えば高温や、誘発剤或いは触媒等の添加は、重合作用を引き起して重合状態が現れる。
【００１２】
本考案が提供する固定相は支持性ゲル層と堆積ゲル層を包括し、上記の部分は不完全な二段階の重合作用が形成するポリアクリルアミドを基礎とする。この種の方法の主要な特性は、重合反応システム中の温度変化及び重合作用システム内部のアクリルアミド単量体の不一致な濃度分布により、固定相表面上に免疫吸着剤をはめ込ませるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
請求項１の発明は、下記のステップを包括する：
一つの支持性ゲル層を形成し、
大量の免疫吸着剤を含む堆積溶液を支持性ゲル層のトップ側に注入し、
堆積溶液がまだ未重合状態を保持している時に、免疫吸着剤の沈殿過程を完成させ、
免疫吸着剤内に安定的に不一致な単量体濃度分布を確立し、
残された堆積溶液を重合状態に転換し、そのうえ
流し去られた未重合部分が、表面に免疫吸着剤を有する堆積ゲル層を形成することを特徴とする免疫吸着壁固定相の形成方法としている。
請求項２の発明は、免疫吸着剤内に安定的に不一致な単量体濃度分布を確立するステップに関するものを指し、下記のステップを包括し、
一部の上清液を除去したのち、希釈用緩衝液で残留した堆積溶液の表面を洗い流すことを特徴とする請求項１記載の免疫吸着壁固定相の形成方法としている。
請求項３の発明は、堆積ゲル層が形成された後、免疫吸着剤を回収し、回収された免疫吸着剤を使用して、もう一つの免疫吸着壁を構成することを特徴とする請求項１記載の免疫吸着壁固定相の形成方法としている。
請求項４の発明は、免疫吸着剤が支持基質と抗体の複合物であることを特徴とする請求項１記載の免疫吸着壁固定相の形成方法としている。
請求項５の発明は、下記のステップを包括する：
一つの支持性ゲル層を形成し、
大量の支持基質を含む堆積溶液を支持性ゲル層のトップ側に注入し、
堆積溶液がまだ未重合状態を保持している時に、支持基質の沈殿過程を完成させ、
支持基質内に安定的に不一致な単量体濃度分布を確立し、
残された堆積溶液を重合状態に転換して、表面に支持基質を有する堆積ゲル層を形成し、そのうえ、
大量の抗体が暴露された支持基質上に結合することを特徴とする免疫吸着壁固定相の形成方法としている。
請求項６の発明は、支持基質内に安定的に不一致な単量体濃度分布を確立させ、
一部の上清液を除去したのち、希釈用緩衝液で残留した堆積溶液の表面を洗い流すことを特徴とする請求項５記載の免疫吸着壁固定相の形成方法としている。
請求項７の発明は、未結合の抗体を回収し、回収された抗体を使用して、もう一つの免疫吸着壁を構成することを特徴とする請求項５記載の免疫吸着壁固定相の形成方法としている。
請求項８の発明は、未重合状態とは堆積溶液が重合の抑制された温度、重合状態とは堆積溶液が重合を起し始める温度であることを特徴とする請求項１及び請求項５記載の免疫吸着壁固定相の形成方法としている。
請求項９の発明は、支持性ゲル層と堆積ゲル層が共にポリアクリルアミドゲルで、支持性ゲル層のアクリルアミド濃度が堆積ゲル層のアクリルアミド濃度より高いことを特徴とする請求項１及び請求項５記載の免疫吸着壁固定相の形成方法としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は免疫吸着壁固定相の形成方法を提供し、血液中のある種の毒素を除去するものである。本発明中、一つの一部不完全な二段階の重合作用法を採用し、表面に免疫吸着剤をはめ込む新固定相を形成するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の第一実施例のフローチャート図、図１から図５を参照のこと。本発明の第一実施例は下記のステップにより構成される。まず、図１中に示すように、一つの支持性ゲル層１０を形成する。次に図２中に示すように大量の免疫吸着剤１１ｂを含む堆積溶液１１ａを支持性ゲル層１０のトップ側に注入する。第三、堆積溶液１１ａが未重合状態を保持している時に、図３に示すように免疫吸着剤１１ ｂの沈殿過程が完成する。第四、図４に示すように免疫吸着剤内に単量体の濃度不一致分布が安定的に確立する。第五、残留した堆積溶液１１ａが重合状態に転換する。最後に、重合でない部分を流しさると図５に示すように表面に免疫吸着剤１１ｂを有する堆積ゲル層１１が形成される。そのうえ、免疫吸着剤内に単量体の濃度不一致を安定的に確立するステップには、さらに堆積溶液１１a部分の一部の上清液を除去したのち、希釈用緩衝液で残留した堆積溶液１１a表面を洗い流すことを包括する。支持性ゲル層１０と堆積ゲル層１１はいずれもポリアクリルアミドである。支持性ゲル層１０のアクリルアミド濃度は堆積ゲル層１１より高い。未重合状態とは堆積溶液１１ａが重合が抑制される温度にあることを指す。重合状態とは堆積溶液１１ａが重合を起し始める温度にあることを指す。
【００１６】
本発明の第二実施例のフローチャート図、図６から図１１を参照のこと。一つの後結合過程を用いて、従来のペースト状免疫吸着剤で調合する前結合過程に代える。本発明の第二実施例は下記のステップにより構成される。まず、図６に示すように、一つの支持性ゲル層２０を形成する。その次に、大量の支持基質２１ｂを含む堆積溶液２１ａを、図７に示すように支持性ゲル層２０のトップ側に注入する。第三、堆積溶液２１ａが未重合状態を保持している時に、図８に示すように支持基質２１ｂの沈殿過程を完成させる。第四、図９に示すように支持基質２１ｂ内に単量体の濃度分布の不一致を安定的に確立される。第五、残留した堆積溶液２１ａが重合状態に転換すると共に、重合していない部分を流しさり、図１０に示すように表面に支持基質２１ｂを有する堆積ゲル層２１を形成する。最後に、暴露した支持基質２１ｂ上に大量の抗体２１cが結合する。そのうえ、支持基質２１ｂ内に単量体濃度不一致のステップが安定的に確立され、さらに堆積溶液２１ａ部分の一部の上清液を除去したのち、希釈用緩衝液で残留した堆積溶液2１a表面を洗い流すことを包括する。
【００１７】
本発明の第三実施例中、堆積ゲルが形成された後、洗い流された免疫吸着剤は全て回収される。回収された免疫吸着剤はもう一つの免疫吸着壁の構成に用いられる。
【００１８】
下記の説明の特殊範例は本発明の記述のために用いられるもので、その範例は性質を説明するが、本発明に対する制限を構成するものではない。
【００１９】
範例１：一部不完全な二段階重合作用法により、固定相を形成する前結合のステップとする。
【００２０】
材料：Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（２９：１）溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から購入）の調合：２９グラムのアクリルアミド及び１.０グラムのビスアクリルアミドを水に加えて溶解させ総体積を１００ ｍＬとする。Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ（１０％, ｗ／ｖ） （Ｓｉｇｍａから購入）を重合作用の誘発剤（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）とし、使用直前に新鮮な溶液を調合する。Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ） （Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から購入）を重合過程中に加えて触媒（ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ）とし、事前処理は必要ない。免疫吸着剤はラビットＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ） （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から購入）と抗竈２ミクログロブリン（β−２Ｍ）抗体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋから購入）から調合する。このようにして調合した免疫吸着剤は０.０２％のNａN3 （Ｍｅｒｃｋ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）と０.１５ＭのＮａＣｌ （ｐＨ値７.４） （ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）を含む１０ ｍＭリン酸ナトリウム塩の緩衝液中に溶け、４℃で保存される。ヒトβ−２M溶液は研究報告によると、血液透析患者の尿液中から分離されたものである（Ｖａｌｌａｒ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。β−２Ｍ値は酵素免疫分析セット（ＢｉｏＣｈｅｃｋ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から購入）で確認する。再生緩衝液は０.３ M （ｐＨ値２.８）のｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）である。
【００２１】
方法：第一実施例中、固定相は支持性ゲル層（単量体の総濃度をT% = １５%とする）及び堆積ゲル層（Ｔ％＝７.５％）を包括し、２つの層は共に固定の免疫吸着剤を有して、壁が薄い直径２５ミリメートルのガラス管内に成型される。本発明は一種二段階の重合作用法である。第一段階は高い含有量のアクリルアミドによる重合作用で、より局限的な支持性ゲル層を形成する。支持性ゲルを形成する５ ｍＬのａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（２９：１）重合溶液（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ＝１５％）の重合作用は２０μＬのａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ（ｗ／ｖ=１０％）と５μＬのＮ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）を含む触媒剤システムである。第二段階の開始において、反応システムの温度は氷水のバスで低下させ、同時に０℃を保持する。そして、２ｍＬの免疫吸着剤を含む低アクリルアミド含有量の重合溶液（堆積溶液）を支持性ゲル層のトップ側に加える。堆積溶液は５ｍＬのａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（２９：１）重合溶液（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ＝ ７.５％）、２０μＬのａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ（ｗ／ｖ=１０％）、及び５μＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’− ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）を包括する。第一実施例の免疫吸着剤はＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂとラビット抗β−２Ｍ抗体が結合して生じる複合物である。反応システムの温度を０℃に保持しているため、ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ重合溶液の重合作用を抑制することができる。そのため、堆積溶液は未重合状態が保持され、免疫吸着剤の沈殿作用を完成させることができる。そして、一部の上清液を除去したのち、希釈用ＰＢＳ緩衝液で残留した堆積溶液の表面を洗い流す。続いて、反応システムが室温（ｃ. ３０℃）に戻ると次に堆積溶液の重合作用が開始する。そこで、抗ヒトβ−２Ｍの免疫吸着剤とアクリルアミドが共重合して堆積ゲル層を形成する。実際には事前に希釈されているため、残留した堆積溶液の上層部分が重合せず、内部が完全に重合したら、さらに再生溶液で未重合部分を洗い流す。それにより免疫吸着剤を固定相の表面にはめ込むことができる。脱水と微生物汚染を防止するため、固定相の表面には０.０２％のＮａＮ3を含むＰＢＳを付着させる。
【００２２】
結合活性テスト：調合された固定相は続いて吸着力テストを行なう。３７℃の時竈−２M濃度が１８０ μｇ／ｍＬ、ｐＨ値７.４のリン酸塩緩衝液３ ｍＬを加える。第０、１、２、３、４及び第５時間後に、それぞれ２０・・・の上清液サンプル（ｎ＝３）を収集する。続いて、ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ溶液で３回洗い流して、固定相の結合活性を再生させる。繰り返し三回、吸着−脱着を循環する。全免疫吸着循環と定量分析は全て同じ操作条件下で行う。
【００２３】
図１２に表示するのは、第一実施例が提供する免疫吸着壁の結合活性テストの結果である。β−２Ｍ値は時間と共に急速に減少し、おおよそ３時間後に飽和に達し、徐々にｃａ. １０μｇ／ｍＬまで減少する。そのため、まだ免疫吸着剤の活性を保有していることを表し、固定相のβ−２Ｍを除去する、優れた能力が証明できる。
【００２４】
範例２：一部不完全な二段階の重合作用方式により固定相を形成する後結
合の過程とする。
【００２５】
第二実施例中、固定相の形成にはまだこの種の二段階重合作用法が採用されている。しかし、ラビット抗−竈２ミクログロブリン（β−２Ｍ）抗体は開始しても、まだＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂと結合しない。そしてＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂが単独ではめ込まれた完成した固定相であり、そして竈−２M抗体が再び完成した固定相表面のＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂと結合する。
【００２６】
方法：第二実施例中、支持性ゲルを形成する５ｍＬのａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（２９：１）重合溶液（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ＝１５％）の重合反応は、２０μＬのａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ｗ／ｖ＝１０％）と５μＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’− ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）を含む触媒剤システムである。続いて、反応システムの温度は氷水バスにより下げられると共に０℃を保持する。そして、０.３グラムのCNＢr活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを含む堆積溶液を支持性ゲル層のトップ側へ加える。堆積溶液は５ｍｌのａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（２９：１）重合溶液（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ＝７.５％）、２０μＬのａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ（ｗ／ｖ=１０％）、及び５μＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’− ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）を包括する。この堆積溶液は未重合状態（０℃）に保存され、CNＢr活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂの沈殿作用を完成させる。そのため、堆積溶液は未重合状態が保持され、免疫吸着剤の沈殿作用を完成させることができる。そして、一部の上清液を除去したのち、希釈用ＰＢＳ緩衝液で残留した堆積溶液の表面を洗い流す。続いて、反応システムが室温に戻ると、堆積溶液が重合反応を開始する。その結果、表面にＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂがはめ込まれた固定相が形成される。続いて竈−２M抗体を固定相表面に加え、それとCNＢr活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを結合させる。そして、０.１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８.０）を加えて結合反応を中断させる。最後に、固定相表面を０.１Mの酢酸緩衝液（ｐＨ４.０）と０.１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８.０）で交互に洗い流す。少なくとも３サイクル繰り返すと固定相が形成され、後結合ステップを完成させることができる。
【００２７】
このほか、固定相のＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂのはめ込みが完了すると、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂの活性化作用も完成する。
【００２８】
結合活性テスト：続いて、調合された固定相の吸着力テストを行なう。３７℃の時に竈−２M濃度が１８０μｇ／ｍＬ、ｐＨ値７.４のリン酸塩緩衝液３ ｍＬを加える。第０、１、２、３、４及び第５時間後に、各２０・・・の上清液サンプル（ｎ＝３）を収集する。続いて、ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ溶液で３回洗い流して、固定相の結合活性を再生させる。吸着−除去サイクルを三回繰り返す。全ての免疫吸着の循環と定量分析は、全て同じ操作条件下で行う。
【００２９】
図１３に第二実施例が提供する免疫吸着壁の結合活性テストの結果を表示する。同様に、β−２Ｍ値（濃度）は時間と共に急速に減少し、おおよそ３時間後、飽和に達し、その後cａ. １０μｇ／ｍＬまで次第に減少する。そのため、まだ免疫吸着剤は活性を保有していることを表し、同時に固定相のβ−２Ｍ除去の優れた能力を証明している。
【００３０】
範例３：免疫吸着壁固定相製作の連続共重合の方法。
【００３１】
第三実施例中、免疫吸着剤の利用率を高めるため、水で洗い流された免疫吸着剤はさらに回収される。また共重合反応が連続的に進み、３つ連続した免疫吸着壁が製造される。
【００３２】
方法：第三実施例の方面では、支持性ゲルを形成する５ｍＬのａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（２９：１）重合溶液（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ＝１５％）の重合反応は、２０μＬのａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ（ｗ／ｖ=１０％）と５μＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’− ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）を含む触媒剤システムである。そして、反応システムの温度は氷水バスで低下させると共に０℃を保持する。２ｍＬの免疫吸着剤を含む低含有アクリルアミド重合溶液（堆積溶液）を支持性ゲル層のトップ側に加える。堆積溶液は５ｍＬのａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（２９：１）重合溶液（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ＝７．５％）、２０μＬのａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ（ｗ／ｖ=１０％）、及び５μＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’− ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）を包括する。続いて、一部の上清液を除去したのち、希釈用ＰＢＳ緩衝液で残留した堆積溶液の表面を洗い流し、反応システムが室温（c.３０℃）に戻る。こうなると、堆積溶液の重合反応が自然に発生し、さらに多孔の堆積ゲル層が形成される。内部が一旦完全に重合したら、中性リン酸緩衝液 （前記の第一実施例に関連するステップ中に記載）で未重合部分を洗い流す。免疫吸着剤の洗い流しは、強弱pH値の緩衝液で広範に洗い流され、その後４℃中に保存されて、後続の回収ステップの使用に供される。最後に、完全なステップで免疫吸着剤の必要量を補うと共に、上記ステップを重複して、さらなる免疫吸着壁が製作される。第三実施例中では、抗ヒトβ−２Ｍ免疫吸着剤を使用して３つ連続した免疫吸着壁が作られ、またシリアルナンバー１−３が標示される。調合された免疫吸着壁にはＰＢＳ緩衝液が付き、脱水を防止すると共に４℃に保存する。
【００３３】
このほか、第二実施例中では結合する抗体がなく、また回収すると共にもう一つの免疫吸着壁の製作に利用することができる。
【００３４】
結合活性テスト：続いて、調合された免疫吸着壁の免疫吸着力テストを行う。３７℃の時に竈−２Ｍの濃度がおおよそ３０μｇ／ｍＬ、ｐＨ値７.４のリン酸塩緩衝液１ｍＬを加える。第０、０.１６、０.３３、０.５及び第１時間後に、各２０μＬの上清液サンプルを収集する。酵素連結免疫分析法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）で竈−２Ｍ連続時間変化を分析する。図１４は免疫吸着テストの竈−２Ｍ値（濃度）の連続時間変化である。一般的に、３つの免疫吸着壁（番号１−３）の移動型態（ｒｅｍｏｖａｌ  ｐａｔｔｅｒｎ）はいずれもとても似ており、低下した竈−２Ｍ濃度の平均値は２６.６６から１６.６８μｇ／ｍＬである。
【００３５】
本発明の免疫吸着壁固定相の形成方法は主に二段階重合反応である。このほか、ポリアクリルアミドから出る毒素で免疫吸着剤が傷つけられるのを防ぐために、最も重要な鍵となるステップは第二段階であり、故意に免疫吸着剤上の堆積溶液表面で希釈を行なう。緩衝液が免疫吸着剤上の堆積溶液表面を洗い流す時、アクリルアミド濃度分布の不一致が生じる。このようにすると、内部の重合反応が進行する時、単量体濃度が相対的に低い状態下では、上部のアクリルアミドと免疫吸着剤は共重合しない。本発明が提供する固定相によると、毒素はただちに固定相の表面と接触し、非常に小さい或いは障害がない状況下で、暴露した免疫吸着剤の配位体と飽和するまで結合する。そのうえ、固定相の不連続の多孔構造が重要な分子篩効果を起すため、一種必要な成分の漏れや損失を防止することができる。もう一方で、CNＢr活性化の支持基質と抗体が結合するステップは、固定相上でCNＢr活性化がはめ込まれたキャリア蛋白（第二実施例を参照）が完成した後、完了することができる。このほか、調合中に流された免疫吸着剤や抗体は、収集して回収用とすることができる（第三実施例を参照）。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明に基づく第一実施例のフローチャート図である。
【図２】本発明に基づく第一実施例のフローチャート図である。
【図３】本発明に基づく第一実施例のフローチャート図である。
【図４】本発明に基づく第一実施例のフローチャート図である。
【図５】本発明に基づく第一実施例のフローチャート図である。
【図６】本発明に基づく第二実施例のフローチャート図である。
【図７】本発明に基づく第二実施例のフローチャート図である。
【図８】本発明に基づく第二実施例のフローチャート図である。
【図９】本発明に基づく第二実施例のフローチャート図である。
【図１０】本発明に基づく第二実施例のフローチャート図である。
【図１１】本発明に基づく第二実施例のフローチャート図である。
【図１２】本発明に基づく第一実施例が提供する免疫吸着壁の結合活性テスト結果の図表である。
【図１３】本発明に基づく第二実施例が提供する免疫吸着壁の結合活性テスト結果の図表である。
【図１４】本発明に基づく第三実施例が提供する免疫吸着壁の結合活性テスト結果の図表である。
【符号の説明】
【００３７】
１０、２０  支持性ゲル層
１１  堆積ゲル層
１１ａ、２１ａ  堆積溶液
１１ｂ  免疫吸着剤
２１ｂ  支持基質
２１ｃ  抗体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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