(57)【要約】【課題】本発明は、vWF特異的切断酵素の単離同定を目的とする。【解決手段】下の特徴を有する単離された蛋白質分解酵素：(i)  フォンビルブラント因子(von Willebrand Factor：以下、vWFと称することがある)の８４２Tyr−８４３Metの結合を切断し得る；(ii)  部分配列としてLeu-Leu-Val-Ala-Valのアミノ酸配列を含有するポリペプチド鎖よりなる；(iii)  還元あるいは非還元条件下のSDS−PAGEにおいて１０５〜１６０kDaあるいは１６０〜２５０kDaの分子量を有する；ならびに(iv)  ヒト血漿由来である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特徴を有する単離された蛋白質分解酵素：
(i)  フォンビルブラント因子(von Willebrand Factor：以下、vWFと称することがある)の８４２Tyr−８４３Metの結合を切断し得る；
(ii)  部分配列としてLeu-Leu-Val-Ala-Valのアミノ酸配列を含有するポリペプチド鎖よりなる；
(iii)  還元あるいは非還元条件下のSDS−PAGEにおいて１０５〜１６０kDaあるいは１６０〜２５０kDaの分子量を有する；ならびに
(iv)  ヒト血漿由来である。
【請求項２】
成熟型蛋白質のＮ末端側部分配列としてAla-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu-Leu-Leu-Val-Ala-Valのアミノ酸配列を含有するポリペプチド鎖よりなる、請求項１に記載の単離された蛋白質分解酵素。
【請求項３】
成熟型蛋白質のＮ末端側部分配列として、配列番号３または７で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド鎖よりなる、請求項１または２に記載の単離された蛋白質分解酵素。
【請求項４】
組換え蛋白質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された蛋白質分解酵素。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された蛋白質分解酵素をコードする単離されたDNA。
【請求項６】
請求項５記載のDNAを含むことを特徴とするベクター。
【請求項７】
請求項６記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質分解酵素を含有して成る医薬品組成物。
【請求項９】
過剰量のvWF高分子マルチマーの生成に起因する血小板凝集の抑制に適用される、請求項８に記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
疾病が血栓性血小板減少性紫斑病である請求項９記載の医薬品組成物。
【請求項１１】
請求項５記載のDNAまたは当該DNAのアンチセンスDNAを含有して成る医薬品組成物。
【請求項１２】
請求項５記載のDNAまたは当該DNAのアンチセンスDNAを含有して成る血栓性血小板減少性紫斑病に対する診断薬。
【請求項１３】
コーンのエタノール分画のフラクションIを出発材料とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛋白質分解酵素の調製方法であって、（a）出発材料として、前記蛋白質分解酵素活性が濃縮されているコーンのエタノール分画のフラクションＩを用い、該コーンのエタノール分画のフラクションIをDEAEクロマトグラフィーに供し、該蛋白質分解酵素が濃縮された分画を得る工程；および
（b）(a)の工程で得られた濃縮分画をSDS-PAGEに供し、泳動分離後に前記蛋白質分解酵素活性が高い画分を回収する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、医療用医薬品の分野に係る血漿蛋白質に関する。詳細には、血液凝固に関与するフォンビルブラント因子(von Willebrand Factor：以下、vWFと称することがある)の特異的切断酵素に関する。本願発明で提供されるvWF切断酵素により血栓性血小板減少性紫斑病(thrombotic thrombocytopenic purpura : 以下、TTPと称することがある)等の当該酵素の欠損または低下に起因する疾病患者への補充療法の可能性が拓かれる。加えて、新規な抗血小板血栓薬としての利用も見込まれる。
【背景技術】
【０００２】
vWFは、血管内皮細胞や骨髄巨核球で産生され、２０５０アミノ酸残基(モノマー約２５０kDa)からなる単一サブユニットがＳ−Ｓ結合にて結ばれたマルチマー構造(分子量５００〜２０,０００kDa)を持って存在している止血因子である。血中濃度は約１０μｇ/ｍｌで、一般に高分子量のものほど比活性が高い。
【０００３】
vWFには２つの大きな止血因子としての機能があり、１つは血液凝固第VIII因子と結合し、これを安定化させるキャリアー蛋白質としての働き、もう１つは傷害血管壁の血管内皮細胞下組織に血小板を粘着・凝集させ、血小板血栓を形成する機能である。
【０００４】
血栓性血小板減少性紫斑病は、全身の体組織細動脈と毛細血管に血小板血栓を生じる疾患であり、今日の医療技術の進歩にもかかわらず、当該疾患での関連死亡率は１９７１〜１９９１年にかけて約３倍に増加している。病理学的に、TTPは血管内皮細胞障害や血管内血小板凝集によって惹き起こされると考えられており、免疫組織学的には生じた血小板血栓中に多量のvWFの存在が認められ、vWFがこの成因に大きな役割を果たしていると考えられている。TTP患者のvWFのマルチマー構造は正常もしくは高分子量が優位となっており、特に通常では見られない超高分子量のvWF(unusually large vWF multimer：ULvWFM)や高分子量vWF重合体 (large vWF multimer：LvWFM)が、高ずり応力下での血小板凝集の促進と微小血栓形成に大きな役割を果たしていることが推察される。一方で、vWFは健常人の循環血液中で高ずり応力下、vWF切断酵素(vWF-cleaving protease)の作用により８４２Tyr−８４３Metの位置で分解を受けることが知られていた。したがって、TTPは血漿中の当該酵素活性が何らかの原因で低下して、ULvWFM〜LvWFMが増加して血小板凝集が亢進し、血管内に血小板血栓が形成されるためというシナリオが描かれている。
【０００５】
最近、Ｆｕｒｌａｎら(非特許文献１および特許文献１を参照)、Ｔｓａｉら(非特許文献２を参照)によりvWF特異的切断酵素の測定法が考案され、TTPでは、事実この酵素活性が低下していることが報告された。そして前記報告の著者等は当該酵素が血漿中のメタロプロテアーゼであることを示し、部分精製したことを報告したが、当該酵素を特定化するようなアミノ酸配列の決定等には至らずそれ以来進展がない。
【０００６】
【特許文献１】特表２０００−５０８９１８号公報
【非特許文献１】Ｂｌｏｏｄ, ｖｏｌ. ８７, ４２２３−４２３４：１９９６
【非特許文献２】Ｂｌｏｏｄ, ｖｏｌ. ８７, ４２３５−４２４４：１９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、vWF特異的切断酵素の単離同定を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ｖＷＦ特異的切断酵素の先天的欠損患者および後天性の当該酵素に対する抗体陽性患者の治療法として、現在まで血漿交換療法が施されており、当該酵素の精製品または遺伝子組換え体等純品による補充療法の確立が望まれる。家族性TTP患者は、先天的にｖＷＦ特異的切断酵素が欠損しており、非家族性では後天的に当該酵素に対する自己抗体の産生が原因と報告されている。したがって、家族性TTP患者には、本酵素の補充療法が望ましく(現実には血漿投与が行われている)、非家族性では、血漿交換による自己抗体の除去と本酵素の補充が必要である。さらに、本酵素の利用は新規な抗血小板血栓薬としての応用も見込まれる。
【０００９】
しかし、vWF切断酵素は、前述のごとくＦｕｒｌａｎら(Ｂｌｏｏｄ, ｖｏｌ. ８７, ４２２３−４２３４：１９９６、特表２０００−５０８９１８)、Ｔｓａｉら(Ｂｌｏｏｄ, ｖｏｌ. ８７, ４２３５−４２４４：１９９６)により、血漿中のメタロプロテアーゼであることが示唆され、部分精製したこと、そしてその比活性において血漿から１,０００〜１０,０００倍濃縮されたと報告されているが、この条件下でもなお、これ以来現在までおよそ５年間に渡って、その蛋白質のアミノ酸配列など本酵素本体の性状解析には進展が無く、未だ本酵素に関しての具体的、生化学的情報は一切得られていない。これは、Ｆｕｒｌａｎらの報告にもあるように、目的蛋白質が巨大であることが示唆されており、これに伴う、様々な問題点が考えられる。例えば、様々な相互作用分子やコファクターの存在など、本酵素の存在様式の多様性が想定され、精製法の複雑化、さらには、精製ステップでの非特異的な相互作用による分離能の低下などから、Ｆｕｒｌａｎらの血漿画分からの精製法では本酵素の単離同定に至るには大きな困難性が立ちふさがっていたことが推察された。
【００１０】
上述の状況の下、本願発明者等はvWF切断酵素の単離同定を達成するべく、鋭意研究を重ねた結果、従来報告のなかった所望のｖＷＦ切断酵素の精製単離に成功し、その成熟型蛋白質のアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードする遺伝子を同定するに至った。
【００１１】
本願発明のvWF切断酵素は、vWFの８４２Tyr−８４３Metの結合を切断し得る性状を有し、一態様として還元あるいは非還元条件下のSDS-PAGEにおいて１０５〜１６０kDaまたは１６０〜２５０kDaの分子量を有することが例示され、部分配列としてLeu-Leu-Val-Ala-Valを含有するポリペプチド鎖よりなり、より好適にはAla-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu-Leu-Leu-Val-Ala-Valの成熟型蛋白質のＮ末端側アミノ酸部分配列を含有するポリペプチド鎖よりなる。そして、下記の性状によって特徴付けられる新規な物質である。
【００１２】
1)vWF切断活性
本願発明酵素は、切断断片のＮ末端配列解析の結果、８４２Tyr−８４３Metのペプチド結合を切断する。
【００１３】
2)ゲル濾過による分画
ＦＩペーストを出発材料とした場合、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分画を行なうと、分子量が１５０kDa〜３００kDaのサイズにほとんどの活性が回収されるが、実際に得られる本発明中の活性物質の一例では電気泳動で１０５〜１６０kDa程度の分子量を示すことから、二量体等の形成あるいは他の分子と結合しやすい可能性のある物質、または易分解性、あるいは糖鎖付加の不均一性を有しうる物質である。
【００１４】
3)硫安沈澱
例えば、ＦＩペーストを出発原料とした場合、粗精製画分中で３３％飽和硫安で本酵素の大部分は沈殿画分として回収される。
【００１５】
4)SDS-PAGE
例えば、ヒトプール血漿を原料としたＦＩペーストあるいはクリオプレシピテート由来の本酵素は、SDS-PAGEにおいて、主に、分子量マーカーの１０５kDa〜１６０kDa程度の分子サイズを示す。そして、配列番号１５の核酸配列を基に、４４５番目以降atgの開始コドンから４７２６番目以下のtgaまでの終結コドンを含んだフレームで表されるアミノ酸配列を遺伝子組換え技術を用いて発現させた場合、宿主により多少の分子サイズは異なるものの、概ね、分子量マーカーの１６０kDa〜２５０kDa程度の分子サイズを示す。そして、このサイズのものは、ヒト健常者及び一部のＴＴＰ患者の血漿中にも認められる。また、この酵素は、遺伝子のクローニングの際に認められたalternative splicing産物（配列番号16〜21）などの存在、糖鎖付加などの翻訳後修飾の違い、あるいは精製工程中での分解に起因すると思われる複数の分子種がヒト血漿中では存在する。さらに、本酵素は、非還元下のSDS-PAGE後、活性を有する状態で回収可能である。
【００１６】
5)アミノ酸配列分析
単離されたポリペプチド断片のアミノ酸配列の解析の結果、部分アミノ酸配列としてLeu-Leu-Val-Ala-Valの配列を有し、成熟型蛋白質のＮ末端側アミノ酸配列として、Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu-Leu-Leu-Val-Ala-Valの配列を有するポリペプチド鎖より例示されることが明らかとなった。そしてさらには、現在のバイオインフォーマティクスの方法（BIOINFORMATICS: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins edited by Andreas D. Baxevanis and B. F. Francis Ouellette）により、前記部分配列を基に、データベースサーチにより、信頼性高く、本アミノ酸配列をコードする核酸配列の同定を行うに至った。具体的には、プログラムtblastnによりゲノムでのデータベースサーチを行った結果、本願発明の酵素をコードしていると推察される染色体クローン（AL158826）が同定され、さらに、EST（Expressed Sequence Tag）データベースとの照合により、目的酵素の一部分及び上記ゲノムによりコードされるポリペプチドの一部と推察されるクローン（AI346761及びAJ011374）を同定した。これを基にｖＷＦ切断酵素としての活性部位として配列番号３または７に示すアミノ酸配列を同定した。
【００１７】
配列としてゲノムから想定されるGCT  GCA  GGC  GGC  ATC  CTA  CAC  CTG  GAG  CTG  CTG  GTG  GCC  GTG、より好適にはＥＳＴによりそのトランスクリプトームが確認されている部分としてのCTG  CTG  GTG  GCC  GTGが得られた。そして、得られた塩基の配列解析、アミノ酸への推定からモチーフ解析を行い、本願発明の酵素の一つの候補として、メタロプロテアーゼドメインを有していることが推察できた。上記知見により、さらにより具体的な当該酵素の一つとしてのポリペプチド鎖の配列を開示できるに至った。また、酵素は一般的にそのアミノ酸配列の一部の置換あるい欠失、挿入、点変異の導入等でその活性が変化することが知られている(血液凝固第VII因子の改変体；副島ら特開２００１−６１４７９)。それで、本願発明の酵素においてもこれらと同様に１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されるなどの改変操作で、より最適化された酵素の作製が可能である。
【００１８】
さらなる本酵素蛋白質の大量調製を行い、Ｎ末端から２９個のアミノ酸配列を決定した。そのアミノ酸配列を配列番号８に示す。この結果は、バイオインフォーマティクスを用いて推定された配列番号３または７記載の配列とほぼ一致しており、唯一異なったのは２７位のアミノ酸が、配列番号３または７記載のものがGluであるのに対して、今回のＮ末端配列解析ではArgであった点であるが、これは遺伝子多型（ポリモルフィズム）と考えられた。これにより、本酵素はその成熟体としてＮ末端に配列番号３または７記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖からなることが確認された。そこで、本酵素をコードする遺伝子断片を以下の手順でクローニングした。
【００１９】
配列番号７中の核酸配列に依拠し、図９中の下線部位で示される核酸配列を基に、センスプライマー（配列番号９）及びアンチセンスプライマー（配列番号１０）を作製し、プライマーで挟まれた部分の遺伝子を増幅した。その断片をクローニング後、塩基配列を確認した。当該断片をプローブとし、ノーザンブロット解析により、本酵素遺伝子の発現部位を確認した。その結果、本酵素遺伝子は肝臓で特徴的に発現していることが確認された。これにより、ヒト肝臓cDNAライブラリーを購入し、RACE法（Rapid Amplification of cDNA Ends）を用いて、本酵素をコードする遺伝子を同定した。これらの結果、配列番号１５に示されるポリＡ付加サイトまでのおよそ５キロベースのmRNA（cDNA）の配列を同定した。
【００２０】
この遺伝子配列から推定されたアミノ酸配列により、本酵素はプレプロ配列を有し、ディスインテグリンドメイン、メタロプロテアーゼドメイン等を有するADAM（A Disintegrin And Metalloprotease）ファミリー、特にTSP-1（トロンボスポンジンType-１）ドメインを有するADAM-TSファミリーに属するものであると推察された。最終的に、一部の核酸配列に挿入・欠失を生じたものを含めて、成熟体であるプレプロ配列が切断された以降のＮ末端にそれぞれ配列番号３および７に示される配列を有する配列番号１６から２１に示されるアイソフォームが同定された。したがって、本願発明の酵素の要件としては、vWFを８４２Tyr-８４３Metで切断し、かつアミノ酸の部分配列としてLeu-Leu-Val-Ala-Valの配列を有するものとして表されるものである。
【００２１】
本願発明のvWF切断酵素は大略以下の方法によって調製され得る。
本願発明における当該酵素の活性測定法の特徴は、短時間に活性の有無の評価が可能な点にある。Ｆｕｒｌａｎら（Blood, vol. 87, 4223−4234：1996  特表２０００−５０８９１８）の報告では、抗vWF抗体を用いたウェスタンブロット法によるvWF切断パターンの解析で行われるため、フィルターへのトランスファーなど時間を要する。より具体的には、基質であるvWFとの酵素反応に２４時間、さらにその電気泳動に１７時間、フィルターへのトランスファーに３時間その後の抗vWF抗体を用いた検出反応が続くもので少なくとも計４５時間程度を要する。これに比し、本願発明者等の行った活性測定は、基質であるvWFとの酵素反応に１６時間、さらにその電気泳動および検出に２時間の計１８時間で完了し、３分の１弱の時間短縮が可能である。これに伴い、精製工程の時間短縮が可能となり、本酵素の活性失活を低減できる。したがって、精製効率がＦｕｒｌａｎらの方法より向上しており、その結果、精製度の向上につながっている。
【００２２】
さらに、上述のアッセイ系を用いて、出発材料の検討を行って、従来Ｆｕｒｌａｎらが報告したクリオプレシピテートよりもＦＩペースト中に本酵素活性が濃縮されていることを見出した。これを出発材料とし、前述の迅速な活性測定系を組み合わせることにより、本酵素の単離同定が可能となった。具体的な態様として、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせる精製法を適用し前記活性測定系を組み合わせる。
【００２３】
より具体的には、ＦＩペーストをバッファーにて可溶化し、これをゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分画する。本酵素活性はゲル濾過のサイズマーカーから推定して分子量１５０kDa〜３００kDaの溶出位置に分画され、この後、３３％飽和硫安にて沈殿濃縮せしめる。この行程を計３回行い、３回目のゲル濾過の活性画分をプールしたものを50mMTris-HCl pH7.1にNaCl 50mM添加したバッファーで４℃一晩透析した後、陰イオン交換クロマトグラフィー（DEAE）にかけ、0.25M のNaClにてステップワイズに溶出する。本願発明の酵素を単離同定するための方法として、鋭意研究した結果、驚くべきことに、非還元下のSDS-PAGE後、活性を有するバンドとして回収可能であることを見いだした。これをもとにさらに大量調製するために、精製・濃縮された画分をSDS-PAGEの原理を利用したバイオフォレーシスに供した。これにより、泳動分離された画分でvWF切断活性を有する画分を分取した。この段階までの比活性を概算するとおよそ３０,０００〜１００,０００倍近い精製度を達成したことになる。さらに、これを効率よく複数回に渡り迅速に行うことにより、現在のアミノ酸配列分析の限界である０.５ピコモル程度のサンプルが取得できた。これにより、アミノ酸配列分析が可能になった。つまりは、最終工程としてSDS-PAGEの原理に基づいた分離精製（バイオフォレーシス）が重要なステップであり、それは本願発明に至るまでの鋭意研究の結果得られた知見に基づくものである。
【００２４】
Ｆｕｒｌａｎらの報告では、１０,０００倍近い比活性の向上を達成したにも拘わらず、本酵素の本質的な単離同定に至らなかったのは、精製中の失活等あるいは、各種液体クロマトグラフィーに属する分離方法では、本酵素のように巨大蛋白質で様々な他の蛋白質との相互作用が可能と考えられる分子では、単離同定まで達するのが困難であったためであろうと考えられる。さらに、本酵素の血漿中での含量が微量であることが想定され、本願発明の手法が確立されるのを待たねばならなかったのである。さらに、この方法を用いることにより、遺伝子組み換え体も精製可能である。
【００２５】
本願発明により得られた知見に基づき、得られた配列を基に調製されるペプチドもしくは蛋白質を抗原に、通常の免疫方法（Current Protocols in Molecular Biology、Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J.McCAFFERTY et al.あるいはANTIBODY ENGINEERING second edition Edited by Carl A. K. BORREBAECK ）によってモノクローナルおよびポリクローナル抗体等の作製あるいはこれらのヒト型抗体の作製が可能となる。あるいは、ファージディスプレイ技術を利用した抗体作製技術（Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Edited by Brian K. Kay et al.、Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J.McCAFFERTY et al.あるいはANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl A. K. BORREBAECK）により当該蛋白質と結合する抗体の作出が可能である。あるいは、これらの技術に基づき、本酵素に対する自己抗体陽性であるTTP患者検体からの本酵素活性の中和抗体もしくは単なる結合抗体の単離も可能である。そして、これらの抗体を用いることで、例えばTTPなどの疾患の診断及び治療への応用が可能となる。
【００２６】
さらには、得られたゲノムあるいはESTの配列を基に通常の方法（Molecular Cloning 2nd edition）により、本願発明の酵素をコードするcDNAやゲノム遺伝子をクローニングすることが可能である。さらに、バイオインフォーマティックな解析（BIOINFORMATICS: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins edited by Andreas D. Baxevanis and B. F. Francis Ouellette）により、これと相同な他動物種の当該蛋白質のクローニングも可能となり、その遺伝子を通常の方法（Gene Targeting: A Practial Approach First Edition  Edited by A.L.Joyner、Teratocarcinomas and embryonic stem cell  a practical approachなど）によって遺伝子破壊することにより、TTP様モデル動物の作出が可能となる。とりわけマウス由来の本蛋白質をコードする遺伝子配列を同定することにより、この遺伝子のノックアウトマウスの作出が可能となる。これにより、先天的TTPなどの疾患モデルマウスが作製できる。
【００２７】
さらには、通常の方法（J. Sambrook et al.著 Molecular Cloning 2nd edition、またはCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGYなど）により、これらの遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に形質転換し、当該酵素の遺伝子組み換え産物を調製することが可能である。この時、組み込む遺伝子は、必ずしも当該蛋白質の全域をコードした遺伝子である必要はなく、用途に応じてドメインで定義されるような当該蛋白質の一部分の発現も含まれる。
【００２８】
例えば、本願発明のポリヌクレオチドを形質導入、トランスフェクション、およびトランスフォーメーションの公知の技術を用いて宿主細胞中に導入する。ポリヌクレオチドは単独または他のポリヌクレオチドと共に導入される。このような他のポリヌクレオチドは、独立して導入されるか、同時導入されるか、または本発明のポリヌクレオチドと合わせて導入される。
【００２９】
このように、例えば本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞中に選択マーカーをコードする他の別のポリヌクレオチドで、例えば哺乳動物細胞中、同時トランスフェクションおよび選択についての標準的技術を用いてトランスフェクションする。この場合、ポリヌクレオチドは一般的に宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれるであろう。
【００３０】
別法として、ポリヌクレオチドを宿主中の増殖用選択マーカーを含有するベクターと結合させてもよい。ベクター構築物は前記技術により宿主細胞中に導入される。一般に、プラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウム沈殿物、または荷電脂質との複合体などのDNAとして導入される。エレクトロポレーションもポリヌクレオチドを宿主中に導入するために用いられる。ベクターがウイルスの場合、これはin vitroでパッケージされるか、またはパッケージング細胞中に導入され、パッケージされたウイルスを細胞中に導入する。
【００３１】
本発明のこの態様にしたがって、ポリヌクレオチドを産生し、ポリヌクレオチドを細胞中に導入するのに適した広範囲に及ぶ技術は当業界で周知であり慣例的である。このような技術は、Sambrookら（前掲）に記載され、これはこれらの技術を詳述した多くの標準的実験マニュアルを説明するものである。本発明のこの態様に関して、ベクターは、例えばプラスミドベクター、一本または二本鎖ファージベクター、一本または二本鎖RNAまたはDNAウイルスベクターである。このようなベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくはDNAとして、DNAおよびRNAの細胞中への導入について周知の技術により細胞中に導入される。ベクターは、ファージおよびウイルスベクターの場合、好ましくは、感染および形質導入について周知の技術によりパッケージされたまたは封入されたウイルスとして細胞中に導入される。ウイルスベクターは複製受容または複製欠陥のいずれであってもよい。
【００３２】
ベクターのうち好ましいものは、ある点において、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現するベクターである。一般に、このようなベクターは、発現されるポリヌクレオチドと操作可能に結合した宿主中の発現に有効なシス−作用制御領域を含む。適当なトランス−作用ファクターは（例えば、シグナルペプチダーゼあるいはフーリンなどの翻訳後のプロセッシングに関与する酵素群など）、宿主細胞中に導入される際、宿主により供給されるか、補足ベクターにより供給されるかまたはベクターそれ自身により供給されるかのいずれかである。
【００３３】
この点に関して好ましい一態様において、ベクターは特異的発現を提供する。このような特異的発現は、誘発性発現またはある型の細胞でのみ発現するか、または誘発性かつ細胞特異性なものである。誘発性ベクターの中で特に好ましいのは、操作が簡単な環境因子、例えば温度および栄養添加物により発現を誘発できるベクターである。原核および真核細胞宿主における使用についての構成および誘発可能な発現ベクターを含む本発明のこの態様に適した種々のベクターは、周知であり、当業者により慣例的に用いられるものである。
【００３４】
遺伝子操作した宿主細胞は、通常の栄養培地中で培養でき、これは、特にプロモーターの活性化、形質転換体の選択または遺伝子の増幅に適するように修飾される。一般に発現のために選択された宿主細胞について今までに用いられている温度、pHなどの培養条件は、当業者に明らかなように、本発明のポリペプチドの発現に適しているであろう。
【００３５】
非常に多種の発現ベクターを本発明のポリペプチドの発現に用いることができる。このようなベクターは、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えばバクテリアプラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、バクロウイルス、シミアンウイルス40（「SV40」）などのパポバウイルス、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス由来のベクター、およびその組み合わせ由来のベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント由来のもの、例えばコスミッドおよびファージミッドを包含し、これらはすべて本発明のこの態様にしたがって発現に用いられる。一般に、宿主においてポリペプチドを発現するため、ポリヌクレオチドの維持、増殖または発現に適したいかなるベクターもこの点に関して発現に用いることができる。適当なDNA配列は種々の周知の慣例技術よりベクター中に挿入される。一般に、発現用DNA配列は、DNA配列および１またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを有する発現ベクターの開裂により発現ベクターに結合させ、次に制限フラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて一緒に結合させる。この目的に用いることができる制限およびライゲーション法は当業者には周知であり、慣例的である。この点に関して、また当業者に周知であり慣例的である別の技術を用いた発現ベクターの構築に適当な方法は、Sambrookら（前掲）に非常に詳しく説明されている。
【００３６】
発現ベクター中のDNA配列を、例えば、プロモーターを含む適当な発現調整配列に操作可能に結合させ、mRNA転写を方向付ける。このようなプロモーターの代表例は、ごく僅かの周知のプロモーターを列挙すると、ファージラムダPLプロモーター、大腸菌lac、trp、trcおよびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモーターおよびレトロウイルスLTRのプロモーターを包含する。記載していない多くのプロモーターが本発明のこの態様における使用に適し、周知であり、本明細書の考察および実施例により説明されたようにしてより容易に用いられると考えられる。一般に、発現構築物は、転写開始または終止部位、および転写された領域に、翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。構築物により発現された成熟転写物のコーディング部分は翻訳されるポリペプチドのほぼ末端に位置する開始および終止コドンに翻訳開始AUGを含む。加えて、構築物は、発現を調節し、引き起こす調節領域を含む。一般に、多くの通常実施されている方法にしたがって、このような領域は、レプレッサー結合部位およびエンハンサーなどの転写を調節することにより作用する。
【００３７】
増殖および発現用ベクターは、選択マーカーを含む。このようなマーカーは増殖に適しているか、またはベクターはこの目的のために付加的なマーカーを含有する。この点に関して、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特質を提供するために好ましくは１またはそれ以上の選択マーカー遺伝子を含む。好ましいマーカーは、真核細胞培養について、ジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、あるいは大腸菌および他のバクテリアの培養に関して、テトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を含む。本明細書に記載するような適当なＤＮＡ配列を含むベクター、ならびに適当なプロモーターまたは調節配列を、所望のポリペプチドの発現に適した種々の周知の技術を用いて適当な宿主中に導入する。
【００３８】
適当な宿主の代表例は、大腸菌、ストレプトマイセスおよびサルモネラ・チフィムリウム細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ドロソフィラS2およびスポドプテラSf9細胞などの昆虫細胞；CHO、COSおよびBowes黒色腫細胞など、さらにはSP2/0など接着性、浮遊性いずれの動物細胞および植物細胞を包含する。種々の発現構築物に対する宿主は周知であり、当業者は本発明の開示により本発明のこの態様にしたがってポリペプチドを発現するための宿主を容易に選択できる。
【００３９】
より詳細には、本発明は組換え構築物、例えば１またはそれ以上の前記配列を含む発現構築物も包含する。構築物は、ベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクターであって、その中に本発明の配列が挿入されているものを含む。配列を正または逆の順序に挿入する。この点に関して好ましい具体例において、構築物はさらに、例えば配列に操作可能に結合したプロモーターなどを含む調節配列を有する。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、本発明における使用に適した多くの商業上入手可能なベクターがある。
【００４０】
以下の商業的に入手可能なベクターを例示のために記載する。細菌においての使用に好ましいベクターはQiagenから入手可能なpQE70、pQE60、pQE-9；Stratageneから入手可能なpBSベクター、ファージスクリプトベクター、ブルースクリプトベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；Pharmaciaから入手可能なptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5である。好ましい真核細胞ベクターは、Stratageneから入手可能なpWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG;およびPharmaciaから入手可能なpSVK3、pBPV、pMSG、pSVLである。これらのベクターは、本発明の態様にしたがって用いるために、当業者に利用可能な商業上入手可能であり、かつ周知のベクターを単に例示として列挙したものである。例えば本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖または発現に適した他のプラスミドまたはベクターも本発明のこの態様において宿主にて用いることができる。
【００４１】
プロモーター領域は、例えば候補プロモーターフラグメント；すなわちプロモーターを含有するフラグメントを導入するための制限部位（複数）の下流のクロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「CAT」）転写単位などのプロモーター領域を欠くリポーター転写単位を含有するベクターを用いて所望の遺伝子から選択できる。周知のように、cat遺伝子の上流の制限部位でプロモーター含有フラグメントのベクター中に導入すると、標準CATアッセイにより検出可能なCAT活性の産生を引き起こす。この目的に適したベクターは周知で容易に入手可能である。２つのこのようなベクターはpKK232-8およびpCM7である。したがって、本発明のポリヌクレオチドの発現用プロモーターは、周知で容易に入手可能なプロモーターだけでなく、前記技術により、リポーター遺伝子を用いて容易に得られるプロモーターも包含する。
【００４２】
そのうち、本発明にしたがってポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適した公知の細菌プロモーターは、大腸菌lacIおよびlacZプロモーター、T3およびT7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPR、PLプロモーターおよびtrp、trcプロモーターである。そのうち、この点に関して適当な公知の真核細胞プロモーターは、サイトメガロウイルス（「CMV」）即時型プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、レトロウイルスLTRのプロモーター、例えばラウス肉腫ウイルス（「RoSV」）のプロモーター、およびメタロチオネイン−Ｉプロモーターなどのメタロチオネインプロモーターを包含する。
【００４３】
宿主細胞における発現についての適当なベクターおよびプロモーターの選択は、公知方法であり、発現ベクター構築、ベクターの宿主細胞中への導入および宿主における発現に必要な技術は当業界で慣例の技術である。本発明はまた前記構築物を有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞などのより高等な真核細胞、または酵母細胞などのより低級な真核細胞、あるいは宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞とすることができる。
【００４４】
構築物の宿主細胞中への導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質−媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法により行うことができる。このような方法は、多くの標準実験室マニュアル、例えば、Sambrookらの本に記載されている。
【００４５】
宿主細胞中の構築物は常法で用いることができ、組換え体配列によりコードされる遺伝子産物を生じる。別法として、本発明中の部分ポリペプチドは通常のペプチド合成機により合成できる。成熟蛋白質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞において適当なプロモーターの調節下で発現できる。また、細胞を含まない翻訳系を用い、本発明のDNA構築物由来のRNAを用いてこのような蛋白質を産生することもできる。原核および真核宿主について用いる適当なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrookら（前掲）に記載されている。
【００４６】
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点、下流構造配列の転写を方向付けるために高度に発現された遺伝子由来のプロモーター、およびベクターに接触させた後ベクターを含有する細胞の単離を行うための選択マーカーを含む。そのうち、適当なプロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼ（「PGK」）、α−ファクター、酸ホスファターゼ、および熱ショック蛋白質などの糖分解酵素をコードする遺伝子から誘導できるものである。選択マーカーは大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびエス・セレビシエのtrp1遺伝子を包含する。
【００４７】
高等な真核細胞による本発明のポリペプチドをコードするDNAの転写はエンハンサー配列をベクター中に挿入することにより増加させてもよい。エンハンサーは、所定の宿主細胞型においてプロモーターの転写活性を増加させるように作用する、通常、DNAのシス−作用エレメントである。エンハンサーの例は、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、βアクチンエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーなどを包含する。
【００４８】
本発明のポリペプチドのヘテロローガスな構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチドは一般に標準的技術を用いて、これが発現用プロモーターに操作可能に結合するようにベクター中に挿入される。ポリペプチドは転写開始部位が適当にリボソーム結合部位の５’に位置するように配置される。リボソーム結合部位は発現されるポリペプチドの翻訳を開始するAUGに対して５’である。一般に、開始コドン、通常はAUGで始まり、リボソーム結合部位と開始AUGの間にある他のオープンリーディングフレームは存在しない。また、一般に、ポリペプチドの末端に翻訳終止コドンがあり、転写領域の３’末端に適切に配置されたアデニル化シグナルおよび転写終止シグナルが存在する。
【００４９】
翻訳された蛋白質の小胞体のルーメン中、細胞質隙中または細胞外環境への分泌については、適当な分泌シグナルが発現されたポリペプチド中に組み込まれている。シグナルはポリペプチドに対して内因性であるかまたはヘテロローガスなシグナルであってもよい。
【００５０】
さらには、シグナル配列に続くプロ配列に関しても内因性のものであっても良いし、その他のヘテロローガスなもの（例えば他のメタロプロテアーゼのプレ／プロ配列など）を用いても良い。
【００５１】
ポリペプチドは例えば融合蛋白質などの修飾された形態で発現され、分泌シグナルだけでなく、付加的なヘテロローガスな機能領域も包含する。したがって、例えば付加的アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域は、精製中またはそれに続く操作および保存中、宿主細胞における安定性および保存性を向上させるためにポリペプチドに添加される。また、ある領域をポリペプチドに付加して精製を促進してもよい。このような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去してもよい。ペプチド部をポリペプチドに付加し、分泌または排出を誘起するか、または安定性を向上させるかまたは精製を容易にすることは、当業界で周知の慣例的技術である。
【００５２】
本発明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの増殖、維持または発現に適当な原核宿主は、大腸菌、バチルス・サチリスおよびサルモネラ・チフィムリウムを包含する。種々のシュードモナス、ストレプトマイセスおよびスタフィロコッカスがこの点で適当な宿主である。さらにまた、この点に関して当業者に公知の多数の他の宿主も用いうる。代表的であるが制限的でない例として、細菌の用途に有用な発現ベクターは、選択可能なマーカーおよび周知のクローニングベクターpBR322（ATCC37017）の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミド由来の細菌の複製起源を含みうる。このような市販のベクターは、例えばpKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals、ウプサラ、スウェーデン）およびGEM1（Promega Biotec，マディソン、ウイスコンシン州、米国）を包含する。これらのpBR322「主鎖」セクションを、適当なプロモーターおよび発現させる構造配列と合す。
【００５３】
適当な宿主株の形質転換および宿主株の至適細胞濃度への増殖後、選択されたプロモーターを適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学誘発因子）により誘発させ、細胞をさらなる期間培養する。細胞を典型的には遠心分離により収穫し、物理的または化学的手段により破砕し、得られた粗抽出物をさらに精製する。蛋白質の発現に用いた微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤を含むいずれか都合のよい方法で破砕することができ、このような方法は当業者には周知である。
【００５４】
種々の哺乳動物細胞培養系はまた、発現にも用いることができる。哺乳動物発現系の例は、Gluzmanら、Cell 23：175(1981)に記載されているサル腎臓線維芽細胞のCOS-6系統を包含する。適合性ベクターの発現能を有する他の細胞系は、例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、ヒト腎臓293およびBHK細胞系を包含する。さらには、浮遊系の細胞株であるSP2/0等のミエローマも用いることが出来る。
【００５５】
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、および発現に必要な５’フランキング非転写配列を含む。あるいはSV40スプライス部位、およびSV40ポリアデニル部位由来のDNA配列は、これらのタイプの所望の非形質転換転写遺伝子エレメントについて用いられる。この点に関して、例えば、CAG系の発現ベクター（H. Niwa et al., Gene, 108, 193-199, (1991)）等が挙げられる。
【００５６】
また、当該酵素の遺伝子配列を基に通常の方法により、プローブやプライマーあるいはアンチセンス(アンチセンス技術は、アンチセンスDNAまたはRNAにより、あるいは三重らせんの形成により、遺伝子発現を制御するのに用いることができる。アンチセンス技術は、例えば、Okano，Ｊ.、Neurochem.、56：560(1991)；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION，CRC Press，BocaRaton，FL(1988)に記載されている。三重らせんの形成は、例えば、Leeら、Nucleic Acids Research 6：3073(1979)；Cooneyら、Science 241:456(1988)；およびDervanら、Science 251:1360(1991)において考察されている。方法はポリヌクレオチドの相補ＤＮＡまたはRNAに対する結合に基づく。)をデザインすることによって、遺伝子診断あるいは遺伝子治療が可能となる。
【００５７】
例えば患者からの細胞をex vivoでポリペプチドをコードするDNAまたはRNAなどのポリヌクレオチドで遺伝子操作し、その遺伝子操作をした細胞を次にポリペプチドで処置すべき患者に提供する。例えば、細胞を本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターを用いてex vivoで遺伝子操作できる。このような方法は当業界で周知であり、本発明におけるその使用は本明細書の記載から明らかである。同様に、in vivoでのポリペプチドの発現に関して、当業界で公知の手順により細胞をin vitroで操作する。例えば、本発明のポリヌクレオチドを前記のように複製欠陥レトロウイルスベクターにおける発現用に操作する。ついで、レトロウイルス発現構築物を単離し、パッケージング細胞中に導入し、そのパッケージング細胞が対照となる遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生するように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入する。これらのプロデューサー細胞を、in vitroにて細胞を操作し、in vivoにてポリペプチドを発現させるために患者に投与する。このような方法によるこれらおよび他の本発明のポリペプチドの投与法は本発明の教示により当業者には明らかである。
【００５８】
前記したレトロウイルスプラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、例えば、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルスを包含するが、これに限定されない。このようなベクターはポリペプチドの発現に関して１またはそれ以上のプロモーターを含む。用いられる適当なプロモーターは、レトロウイルスLTR；SV40プロモーター；およびMillerら、Biotechniques 7:980-990(1989)に記載されているCMVプロモーター、または他のプロモーター（例えば、ヒストン、RNAポリメラーゼＩＩＩおよびβ−アクチンプロモーターを包含するがこれに限定されない真核細胞プロモーターなどの細胞プロモーター）を包含するが、これに限定されない。用いられる他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（TK）プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターを包含するが、これに限定されない。適当なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者には自明である。
【００５９】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適当なプロモーターの制御下にある。用いることのできる適当なプロモーターは、アデノウイルスメジャーレイトプロモーターなどのアデノウイルスプロモーター；またはCMVプロモーターなどのヘテロローガスプロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（「RSV」）プロモーター；MMTプロモーター、メチタルチオネインプロモーターなどの誘導プロモーター；熱ショックプロモータ；アルブミンプロモーター；ApoAIプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスLTR（前記修飾レトロウイルスLTRを包含する）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターを包含するが、これに限定されない。プロモーターはまたポリペプチドをコードする遺伝子を制御するネイティブプロモーターであってもよい。レトロウイルスプラスミドベクターをパッケージング細胞系の形質導入に用いて、プロデューサー細胞系を形成する。
【００６０】
トランスフェクションされるパッケージング細胞の例は、PE501、PA317、Y-2、Y-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、YCRE、YCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、およびMiller、Human Gene Therapy １：5-14頁(1990)に記載されているDAN細胞系を包含するが、これに限定されない。
【００６１】
ベクターはパッケージング細胞中に当業界で公知の手段により形質導入される。このような手段は、エレクトポレーション、リポソームの使用、およびCaPO4沈降を包含するが、これに限定されない。別法として、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソーム中に封入するか、または脂質と結合させ、宿主に投与する。プロデューサー細胞系は、ポリペプチドをコードする核酸配列（複数）を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。このようなレトロウイルスベクター粒子を用いて、真核細胞をin vitroまたはin vivoのいずれかで形質導入する。
【００６２】
形質導入された真核細胞はポリペプチドをコードする核酸配列を発現する。形質導入されてもよい真核細胞は胚幹細胞、胎生期癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含するが、これに限定されない。
【００６３】
本発明の蛋白質分解酵素、該蛋白質分解酵素に対する抗体、該分解酵素のアンタゴニスト、阻害剤、アゴニスト、活性調節剤等を生理食塩水、緩衝液等で希釈して製剤化し、医薬組成物を得ることができる。製剤のpHは体液のpHに近い弱酸性から中性域のpHが望ましく、その下限は5.0〜6.4が望ましく、その上限はｐＨ6.4〜7.4が望ましい。また、凍結乾燥形態等の長期間保存可能な形態で提供することもでき、この場合使用時に水、生理食塩水、緩衝液等で所望の濃度になるように溶解して使用することができる。
【００６４】
本発明の製剤は、通常医薬品に用いられる薬理的に許容される添加剤（例えば担体、賦形剤、希釈剤等）、安定化剤または製薬上必要な成分を含有していてもよい。安定化剤としては、グルコース等の単糖類、サッカロース、マルトース等の二糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、塩化ナトリウム等の中性塩、グリシン等のアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（プルロニック）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トゥイーン）等の非イオン系界面活性剤、ヒトアルブミン等が例示され、１〜10w/v％程度が添加されていることが好ましい。
【００６５】
本発明の医薬組成物は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射等により有効量で投与することができ、１回または数回に分けて投与される。その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、１回あたり、0.001mg〜100mgが好ましい。
【００６６】
また、本発明の蛋白質分解酵素をコードするDNAのセンスDNAまたはアンチセンスDNAも同様にして製剤化し、医薬組成物を得ることができる。
【００６７】
さらに、本発明は、本願発明のペプチド、蛋白質、DNAを投与して、心筋梗塞、脳梗塞における血小板血栓抑制、動脈硬化症の抑制、PTCAにおける再狭窄や再塞栓・梗塞の防止、PTCRにおける再塞栓の防止、HUSやO-157が原因となる血小板血栓の予防の方法をも含む。さらに、本発明は、心筋梗塞、脳梗塞における血小板血栓抑制、動脈硬化症の抑制、PTCAにおける再狭窄や再塞栓・梗塞の防止、PTCRにおける再塞栓の防止、HUSやO-157が原因となる血小板血栓の予防のための医薬の製造における本願発明のペプチド、蛋白質、DNAの使用をも含む。
【００６８】
さらに、本願発明のペプチドまたは蛋白質をリード物質としてアミノ酸を改変することにより、本願発明酵素の活性を変化させた分子を調製することが可能である。メタロプロテアーゼドメイン内の活性中心近傍のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換する等して不活性化された変異体の作製などによって得られるアンタゴニストの作製、または分子認識部位と触媒部位を分離もしくはその一部もしくは両方を変化させることにより得られる変異体分子などが例示される。
【００６９】
また、本願発明中に述べられているvWF切断活性の評価系を利用することによりアンタゴニスト・アゴニストの作出が可能である。例えば、有効なアンタゴニストとは、小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチド等で本発明のポリペプチドと結合し、これによりその活性を抑制または消失させるもので抗体を包含する。
【００７０】
また、同様に前記vWF切断活性の評価系を利用することにより、vWFを切断し得る化合物をスクリーニングすることも可能である。この際、被験化合物の切断活性を前記評価系を用いて評価すればよい。
【発明の効果】
【００７１】
本願発明によりもたらされた知見により、血栓性血小板減少性紫斑病等の当該酵素の欠損に起因する疾病患者への補充療法の可能性が拓かれる。遺伝子のクローニング及び、血清、血漿からの効率的な精製法の確立が可能となる。とりわけ今回の情報により、得られた塩基配列をもとに、遺伝子組み換え化が可能となり、従来困難であった本願発明の酵素の安定的な生産、供給が可能となり、TTPの患者への当該酵素の補充療法、あるいは新規な抗血小板薬として心筋梗塞、脳梗塞における血小板血栓抑制、動脈硬化症の抑制、PTCAにおける再狭窄や再塞栓・梗塞の防止、PTCRにおける再塞栓の防止、HUSやO-157が原因となる血小板血栓の予防への応用が可能となる。また、本酵素をコードする遺伝子あるいは当該酵素に対する抗体を用いた診断及び治療が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】
以下に、実施例に従って本願発明を詳説するが、本願発明はこれら実施例に何等限定されるものではない。
【００７３】
実施例１
(vWFの調製)
vWFは、セファクリルS-500HR(アマシャムファルマシア)の2.6×90 cmカラムにより、血漿クリオ画分2gを20 mLのバッファー(0.01% Tween-80 / 50 mM Tris-HCl / 100mM NaCl pH 7.4)に溶解したものをゲル濾過することにより調製した。流速は2 mL / min.でフラクションは6 mLづつ回収した。vWFは、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトvWF抗体(DAKO社製)を用いたウェスタンブロット法により確認し、高分子量vWF画分をプールした。これを後述するアガロース電気泳動法を利用したマルチマー解析に供した。
【００７４】
本来、vWFは図１に示されるようにvWFモノマー分子が、Ｎ末端、Ｃ末端同士で重合し、マルチマー構造をとっており、vWF特異的切断酵素により図中に示されるような限定分解を受けることが知られている。解析の結果、図２に示されるように、精製したvWFは健常人血漿中のそれと同等程度のアガロース電気泳動上でのマルチマーパターンを示した（図中のラダーがマルチマー構造を有するvWFの泳動パターンで、上位の方がより重合が進んだvWFであることを示す）。これにより、本質的にvWFを分解する夾雑物を含まないvWFを調製することができ、この画分は後述するvWF切断活性を測定する際の基質として使用した。
【００７５】
実施例２
(vWF切断反応)
vWF切断活性のアッセイは、終濃度10mMの塩化バリウムを加えたサンプルを37℃で5分間プレインキュベートし、プロテアーゼの活性化を行った。50ｍLのファルコンチューブにバッファー(15〜20ｍLの1.5M Urea / 5mM Tris-HCl pH8.0)を入れた。次にミリポア社製のメンブレンフィルター(0.025μm)を浮遊させ、50μLのvWF基質溶液を加えて混合した活性化サンプルを100μL添加した。37℃のインキュベーターに一晩静置して翌日フィルターから回収した。回収したサンプルを、以下のSDS-PAGEの項に示すvWFの切断パターンにより評価した。
【００７６】
SDS-PAGE
SDS-5%ポリアクリルアミドゲルを自家調製し使用した。vWF切断活性のアッセイ項で述べたサンプル10μLに、SDS泳動バッファー(還元剤2-メルカプトエタノール存在下または不在下)2μLを加え3分間煮沸したものを泳動サンプルとした。30mAで1時間電気泳動したのち、ゲルはCBB染色を利用したGel Code Blue Stain Reagent(PIERCE社)にて染色した。活性の有無の解釈は図１に示されるように還元下、非還元下での切断断片の出現及び切れ残る残存断片の有無で評価される。より具体的には、後述する「実施例３」の項、図３を参照されたい。
【００７７】
アガロース電気泳動法を利用したマルチマー解析
ゲルの作製、電気泳動
375 mM Tris-HCl(pH6.8)にLow Gelling Temperature(シグマ TypeVII)を1.4%になるように加え電子レンジで加熱し完全に溶解した後、0.1% SDSを加え、一旦56℃になるように保った。ゲル型に流し4℃で一晩冷やし固めた(Running gel)。翌日、375 mM Tris-HCl(pH6.8)にHigh Gelling Temperature(SeaKem)を0.8%になるように混じ、電子レンジで煮沸溶解した後、一旦56℃に保った(Stacking gel)。前日に調製したゲルは端から１０ｃｍを残し切り取った。切り取ったところに上述のゲルを流し込み、4℃で3時間以上流し固めた。vWF切断活性のアッセイ項で述べたサンプルに、パイロニンYを加え、非還元、煮沸をせずに調製後、SDS-PAGEバッファーを用いて10mA、24時間以上泳動した。
【００７８】
ウェスタンブロット
電気泳動後、ゲルを転写緩衝液(0.005%SDS、50mMリン酸緩衝液pH7.4)に10分間浸し、転写装置を用いて4℃、0.5Aで一晩ニトロセルロース膜に転写した。ブロット液(5%スキムミルク、PBS)でブロッキングを30分した後、ブロット液で1000倍希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトvWF抗体(DAKO社製)と6時間以上反応させた。この後ブロット液にて3回、PBSにて1回洗浄してペルオキシダーゼの基質反応液であるコニカイムノステインHRP-1000(コニカ社製)で発色を行った。本アッセイを用いて確認された精製vWFは、分解を受けたものではなく十分、本願発明中で利用された基質として用いるに値することが確認された（図２）。
【００７９】
実施例３
(ｖＷＦ切断酵素の調製)
血漿をコーンのエタノール分画に供し、出発血漿、クリオプレシピテート、フラクションＩ(FI)上清及びペーストの４つの画分について、タンパク量を等しくした場合のvWF切断活性の高いもの(比活性の高いもの)を選定した。図３に示すごとく本酵素活性はFIペーストで最も活性が高かった。この切断断片のＮ末端配列解析を行ったところ、クリオ、FIペースト由来の活性本体は842Tyr-843Metのペプチド結合を切断することが判った。そこで、これ以降FIペーストを主な精製の出発原料とした。
【００８０】
FIペーストの可溶化
FIペーストは12gずつに小分けし凍結保存した。使用する前日に４℃に出して融解させ、翌日、可溶化バッファー(0.05% アザイド、50 mM Tris-HCl pH7.4、100 mM NaCl)を10 mg/mLになるよう、120mL加え37℃で２時間攪拌した。10000rpmで10分間遠心した後、上清を回収し、プレフィルター、5.0μmフィルター、0.8μmフィルターの順でろ過したものを可溶化サンプルとした。図４に可溶化サンプルのSDS-PAGEを示す。
【００８１】
ｖＷＦ切断酵素のゲルろ過クロマトグラフィー
可溶化したF１ペーストを、セファクリルS-300HR（アマシャムファルマシア）の5×90cmカラムにかけ、1回目のゲルろ過を行った。可溶化バッファーと同じ0.05% Azaid、50 mM Tris-HCl pH7.4、100 mM NaCl(以後溶出バッファー)を用い、流速は5 mL/min.、分取はサンプルアプライ後600mL目から、フラクションは10 mLづつ回収した。フラクションはvWF切断反応後、SDS-PAGEで活性を確認した。酵素活性のあったフラクションをプールし、これに、終濃度33％飽和となるよう飽和硫安を少量ずつ滴下した。これをさらに一晩4℃に静置した。翌日10000rpm、10分遠心し、目的の活性画分を沈殿として回収した。以上の可溶化・ゲルろ過・硫安沈澱の操作を５バッチ行い、−20℃で凍結保存した。
【００８２】
１回目のゲルろ過によって得られた硫安沈殿物2〜3バッチ分を、溶出バッファー50mLに溶解し１回目と同様セファクリルS-300HRカラム(5×90cm)に通液し、２回目のゲルろ過を行った。溶出バッファー、条件、操作等については１回目と同様である。フラクションはvWF切断反応後、SDS-PAGEで活性を確認した。活性のあったフラクションをプールし、硫安沈澱を同様に行った。この操作を２回実施した。
【００８３】
２回目のゲルろ過によって得られた硫安沈殿物２回分を、溶出バッファー50mLに溶解し、１、２回目と同様、セファクリルS-300HRカラム(5×90cm)にかけ、３回目のゲルろ過を実施した。溶出バッファー、条件、操作等については１、２回目と同様である。得られたフラクションは、vWF切断反応後、SDS-PAGEで活性を確認したのちプールした。図５にフラクションのSDS-PAGE及びvWF切断活性のSDS-PAGEを示す。ゲル濾過のパターンと活性のデータよりフラクション３７番から４７番に渡って本酵素が溶出されてきていることが確認できた。この溶出位置は、別途行った高分子量ゲル濾過マーカー（アマシャムファルマシア）の溶出実験から、分子量として推定１５０kDa〜３００kDaに相当することが示唆された。この段階では、まだかなりの夾雑物が大量に存在していることが明らかとなった。
【００８４】
DEAE陰イオン交換クロマトグラフィー
ゲルろ過を３回かけて得られたプールフラクションを、50mM Tris-HCl、50mM NaCl pH7.1バッファーで一晩透析した。透析後、ハイトラップDEAEファストフローセファロースカラム(ファルマシア)5mLを用い、陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、さらなる精製及び濃縮を行った。平衡化及び洗浄バッファーは50mM Tris-HCl pH7.1にて行い、溶出は0.25MのNaClで溶出させた。流速は5 mL/min、フラクションは5mLずつ５本回収しプールした。図６に溶出フラクションのSDS-PAGE及びvWF切断活性のSDS-PAGEを示す。活性の測定のSDS-PAGEから、かなり効率よく溶出画分にvWFを切断する活性を有する本酵素が濃縮されていることが明らかとなった。
【００８５】
SDS-PAGEを利用した分画
DEAE陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製・濃縮されたサンプル5 mlをさらに、分子量カット１０,０００Daのセントリコン（アミコン社製）にて０．５ｍＬまで濃縮し、SDS-PAGEを利用したアトー社製バイオ・フォレーシスIIIにより、本酵素の単離を行った。Laemmli法(Nature, vol. 227, 680-685 : 1970)に従い、泳動槽用緩衝液を調製し、ポリアクリルアミド8％ゲルにて展開し、泳動画分を回収した。図７に回収画分のSDS-PAGEを示す。回収バッファーは50 mM Tris-HCl、10％グリセロール pH 8.8を用いた。図７からも理解されるように、本願発明の当該工程は高分離能を有する分離法であることが判る。図８に電気泳動によってさらに精製した画分の活性の確認及び活性画分のSDS-PAGEを示す。本酵素はSDS-PAGE後も活性を有する分子として回収することができ、この段階で、比活性として血漿中での本酵素活性を1とした場合、血漿の平均的なタンパク含量（60mg/ml）から推定して、３０,０００〜１００,０００倍の精製度に達したことが推定された。
【００８６】
実施例４
（部分アミノ酸配列の決定）
単離した本酵素の部分アミノ酸配列を決定した。バイオフォレシスにて単離された本酵素を常法により、SDS-PAGE後、PVDF膜へトランスファーし、風乾したのち、PEアプライドバイオシステムズ社のオートプロテインシークエンサー492にて、解析を行った。その結果、上記条件で単離した本願発明のvWF切断酵素の一態様は、分子量がSDS-PAGEにおいて還元下105〜160kDaの範囲にあるポリペプチド鎖よりなり、部分配列としてLeu-Leu-Val-Ala-Valを、好適にはAla-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu-Leu-Leu-Val-Ala-Valを有することが明らかとなった。
【００８７】
バイオインフォーマティクスを利用した単離酵素の推定
現在は、バイオインフォーマティクスの技法を用いることで、今まで蓄積されたデータベースとの照合により、実質的な遺伝子のクローニングなしに当該ポリペプチドをコードする全塩基配列の推定が可能となっている（BIOINFORMATICS: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins edited by Andreas D. Baxevanis and B. F. Francis Ouellette）。上述した手法により決定されたアミノ酸部分配列（Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu-Leu-Leu-Val-Ala-Val）を基に、プログラムtblastnによりデータベースサーチを行った結果、ゲノムでのデータベースサーチにより、本酵素をコードしていると推察される染色体クローン（AL158826）が同定され、さらに、EST（Expressed Sequence Tag）として目的酵素の一部分及び上記ゲノムによりコードされるポリペプチドの一部と推察されるクローン（AI346761及びAJ011374）を同定した。これをもとにvWF切断酵素としての活性部位として配列番号３もしくは７に示すアミノ酸配列を推定した。
【００８８】
実施例５
（遺伝子の同定）
以下、全ての合成プライマーはグライナージャパン（株）に依頼した。さらに、遺伝子組換えに関する試薬類は、特に断りのない限り、TAKARA、TOYOBOおよびNew England Biolabs社製を用いた。
【００８９】
ノザンブロットプローブ用遺伝子断片の調製
センスプライマー（配列番号９）及びアンチセンスプライマー（配列番号１０）を作製し、正常ヒト組織由来cDNAの混合物であるUniversal QUICK-CloneTM cDNA（CLONTECH社製）を鋳型として、TAKARA LA Taq with GC rich  bufferにてPCR反応し、プライマーで挟まれた部分の遺伝子を増幅し、その断片をInvitrogen社製TOPO TA cloningTMキットにてクローニングした。数個のクローンから配列番号６記載の塩基配列を有するものを単離した。
このクローン化DNAからEcoRI消化によりベクター部分を取り除き、アガロース電気泳動により分離・精製し、ノザンブロットのプローブ調製用の鋳型とした。
【００９０】
ノザンブロット
上述により調製された遺伝子断片を鋳型として、[α-32Ｐ]dCTP（Amersham pharmacia 社製）およびBcaBESTTMラベリングキット（TAKARA社製）により、放射性プローブを調製した。そして、Human 12-lane Mutiple Tissue Northern BlotsTM（CLONTECH社製）フィルターを用いて、Molecular Cloning 2nd edition  pp 9.52-9.55記載の方法により、ハイブリダイズし、オートラジオグラフィーにより検出した。図１０に示されるように、本酵素をコードするmRNAの発現部位は、主に肝臓であることが確認された。そして、そのmRNAのサイズは、４.４キロベース以上に及ぶことが明らかとなった。
【００９１】
本酵素コード遺伝子の単離・同定
ノザンブロットの結果、mRNAの主要発現部位は肝臓であることが確認されたため、正常ヒト肝臓由来のPoly A+ RNA及びMarathon-ReadyTMcDNA （CLONTECH社製）を用いて、RACE法により本酵素遺伝子の単離・同定を行った。
【００９２】
より具体的には、５’RACEとして正常ヒト肝臓由来Marathon-ReadyTM cDNA を用いて、製品マニュアルに基づき、添付のAP-1プライマーと図１１に示すGene Specific Primer (GSP)プライマー群から最上流のプライマー１位のものを除き、アンチセンスプライマーを任意に選択し（配列番号１１〜１３）、1st PCRを行い、さらにその内側のAP-2と図１１中の1st PCRで用いたプライマーより内側の位置のアンチセンスプライマーにてnested PCR（2nd PCR）を行ったのち、TA cloningを実施した。出現したコロニーから常法により遺伝子を調製し（Molecular Cloning 2nd edition pp 1.25-1.28）、自動DNAシークエンサーにて核酸配列の解読を行った。シークエンシングに用いたプライマーは、PCRに用いたプライマーあるいはそれより内部のプライマーを用いて行った。さらには、逐次解読後の配列を基に設定した。
【００９３】
３’RACEは、正常ヒト肝臓由来のPoly A+ RNAから、3’-Full RACE Core Set  （TAKARA社製）を用いて、添付マニュアルに基づき、添付のオリゴdTプライマーにて逆転写反応を行った後、図１１中のプライマー２の位置のセンスプライマー（配列番号１４）と添付のオリゴdTプライマーでのPCRで増幅したバンドをアガロース電気泳動により分離、そして抽出後TA cloningを行った。出現したコロニーから遺伝子を調製し、自動DNAシークエンサーにて核酸配列の解読を行った。シークエンシングに用いたプライマーは、逐次解読後の配列を基に設定した。
【００９４】
実施例６
（全長cDNAを含むベクターの調製１）
当該蛋白質をコードしているcDNAを例えば制限酵素サイトとしてXhoIを付加し、開始コドンを含むセンスプライマー１（配列番号２２）及びSalIサイトを付加した終結コドンを含むアンチセンスプライマー２（配列番号２３）を用いて（図１２参照）、前出の正常ヒト肝臓由来Marathon-ReadyTMcDNAを鋳型として、TAKARA LA Taq with GC rich  bufferにて一段階PCRの後、前出のTA cloningを行い、その全長を自動DNAシークエンサーにて確認した。
【００９５】
実施例７
（全長cDNAを含むベクターの調製２）
当該蛋白質をコードしているcDNA（配列番号１５）の内部配列中で１点のみで切断する制限酵素サイトAccI及びAvrIIを見い出した。これを利用して、図１２に示すように、全長cDNAを３つのフラグメントに分割し、それぞれにセンスプライマー１（配列番号２２）及びアンチセンスプライマー３（配列番号２４）で挟まれたフラグメント（フラグメント１）、センスプライマー４（配列番号２５）及びアンチセンスプライマー５（配列番号２６）で挟まれたフラグメント（フラグメント２）そして、センスプライマー６（配列番号２７）及びアンチセンスプライマー２（配列番号２３）で挟まれたフラグメント（フラグメント３）を設定し、前出の正常ヒト肝臓由来Marathon-ReadyTMcDNAを鋳型として、TAKARA LA Taq with GC rich  bufferにてそれぞれPCRの後、前出のTA cloningを行い、その全長を自動DNAシークエンサーにて確認した。さらに、前出のTAクローニングキットに含まれるpCR2.1ベクターをセルフライゲーションしたものを、XhoI/HindIIIで切断後、XhoI/AccI/AvrII/HindIIIを含むリンカー（配列番号２８及び２９に示す合成DNAをアニールさせたもの）をライゲーションし、上述の３つのフラグメントを逐次、常法によりライゲーションしてこれらのフラグメントを結合して全域を含むcDNAを調製した（図１３参照）。
【００９６】
実施例８
（全長cDNAを含む発現ベクターの調製：動物細胞宿主系）
実施例６または７で得られたDNAをXhoI/SalIにて制限酵素消化し、例えばpCAGベクター（Niwa, H., et al. Gene vol.108, 193-199）中のSalIサイトにライゲーションし、その挿入向きと全長配列を自動DNAシークエンサーにて確認した。
【００９７】
実施例９
（全長cDNAを含む発現ベクターの動物細胞への形質転換）
実施例８で調製した動物細胞用発現ベクターを293細胞（ヒト胎児腎細胞株）、Hela細胞及びHepG2細胞を用いて、以下の手順でトランスフェクトした。まず初めにトランスフェクションの２４時間前に1〜3×105個／35mm dishで細胞を捲き、その翌日に上記発現ベクターを１μg当たり2μlのPolyamine Transfection ReagentであるTransIT（TAKARA社製）をとり、Opti-MEM等の無血清培地100μlに添加して、試薬添付文書に従い、DNAとのコンプレックスを調製後、準備しておいた前記各種細胞へ滴下し、２〜８時間インキュベーションし、その後、培地交換し、さらにその３日後G418添加選択培地に交換した。これからさらに３日毎に培地交換を行い、安定発現株を作出した。一例として、C末端にFLAGエピトープタグを含むものの一時発現を図14に示す。検出は抗FLAG-M2抗体（コダック社製）を用いたウエスタンブロット法により、抗マウスIg-アルカリフォスファターゼ酵素標識抗体系で染色して行った。この実施例に示すcDNAを用いた組換え発現体は、還元下250kDa程度の分子サイズを示した。そして、この分子サイズは、ヒト健常人血漿中にも存在することが認められた（後述する実施例14の図18）。また、この酵素は、遺伝子のクローニングの際に認められたalternative splicing産物（配列番号6〜21）などの存在、糖鎖付加などの翻訳後修飾の違い、あるいは精製工程中での分解に起因すると思われる複数の分子種がヒト血漿中では存在することが確認されている（後述する実施例14の図17及びGerritsenら、Blood vol.98, 1654-1661 (2001)  記載 ）。
【００９８】
次に、組み換え体のvWF切断活性を実施例２に示した方法で確認した（図15）。これらの結果、本願発明のヒト血漿由来酵素及び遺伝子組換え産物は、同じvWFの切断活性を示すことが確認された。
【００９９】
実施例１０
（部分cDNAを含む発現ベクターの調製：大腸菌宿主系）
一例として当該蛋白質のメタロプロテアーゼドメイン領域をコードしている部分cDNAを、例えば制限酵素サイトとしてNcoIを付加し、開始コドンを含むセンスプライマー（配列番号３０）及びHindIIIサイトを付加した終結コドンを含むアンチセンスプライマー（配列番号３１）を用いて、前出の正常ヒト肝臓由来Marathon-ReadyTMcDNAを鋳型として、もしくは実施例６または７で得られたcDNAを鋳型として、TAKARA LA Taq with GC rich  bufferにてPCRの後、NcoI/HindIIIにて消化、大腸菌発現用ベクターである例えば、pUT1 (Soejima et al., J. Biochem. (Tokyo) vol.130, 269-277 (2001)）のNcoI/HindIII消化物とライゲーションし、常法により、大腸菌コンピテントセルJM109にトランスフォーメーションした。形成したコロニー群から数クローンをとり、それらから遺伝子を調製したのち、そのプラスミドベクターのインサート部位の核酸配列が配列番号３２と同等あるいは本質的に配列番号３３で表されるポリペプチドをコードしている遺伝子であることを自動DNAシークエンサーにて確認した。
【０１００】
実施例１１
（部分cDNAを含む発現ベクターの大腸菌菌体内発現）
実施例１０により構築した発現ベクターを導入した宿主大腸菌を50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地200ml中に30℃一晩前培養し、それを8リットルのLB培地を含むファーメンターに播種し、600nmの濁度が0.2〜0.5になるまで30℃にて培養した。その後、終濃度1mMとなるようにイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシドを添加して、さらに一晩培養し、当該蛋白質のメタロプロテアーゼドメイン領域の発現を誘導した。そして、培養した大腸菌を遠心機にて（30分4℃）集菌した。
【０１０１】
続いて、集菌した大腸菌ペレットを蒸留水にて再懸濁し、終濃度0.6mg/mlのリゾチームを添加して、室温30分撹拌後、一晩4℃に静置し、菌体を破砕した。そして、さらに超音波処理後、遠心機にて（20分4℃）遠心分離し、ペレットを回収し、これを50mMトリス10mM EDTA 1% トライトンX-100 pH8.0にて再懸濁した。この遠心分離、超音波処理、再懸濁操作を数回繰り返したのち、ペレットを蒸留水に再懸濁し、同様に遠心分離、超音波処理、再懸濁操作を数回繰り返し、インクルージョンボディーを回収した。このインクルージョンボディは、抗体作製の際の抗原として用いられた。
【０１０２】
実施例１２
（他動物種ホモログ遺伝子の単離）
配列番号１５記載の核酸配列をプローブとして、GenomeNet WWW server(http://www.genome.ad.jp/)においてプログラムBLASTNにより、ホモロジーサーチを行った結果、マウス染色体１０番にマップされる染色体クローン AC091762及びAC090008が得られた。この配列を基に、配列番号３４に示す本酵素のマウスホモログを推定した。この配列から新たにプライマーを設計し、前述したヒトｖＷＦ切断酵素コード遺伝子の単離同定で行った手法により、ノザンブロット解析を行い、ヒトと同様、肝臓で特異的に発現していることを確認した。さらに、正常マウス肝臓由来のPoly A+ RNA及びMarathon-ReadyTMcDNA （CLONTECH社製）を用いて、ヒト同様、RACE法により本酵素遺伝子の単離・同定を行った。その結果、配列番号３５、３６に示す本酵素のマウスホモログの遺伝子配列が決定された。
【０１０３】
決定されたこのマウスホモログ部分配列を基に、前出のマウス染色体１０番の５’側のExon/Intron構造を決定し、これを基に常法（Gene Targeting: A Practial Approach First Edition  Edited by A.L.Joyner、Teratocarcinomas and embryonic stem cell  a practical approachなど）に従い、ノックアウト（ノックイン）マウス作出用のターゲッティングベクター作製が可能となり，遺伝子変異マウスの作製が可能となった。また、さらには、本蛋白質を常法により組換え発現させることも可能である。
【０１０４】
実施例１３
（抗体の作製及びその抗体を用いた本酵素の検出系の構築）
マウス・ウサギに常法により（Current Protocols in Molecular Biology：  Chapter 11 immunology、Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J.McCAFFERTY et al.あるいはANTIBODY ENGINEERING second edition Edited by Carl A. K. BORREBAECKなど）、ヒト血漿より部分精製した抗原タンパク、あるいはその一部のアミノ酸配列を有する合成ペプチド（一つの例として、本酵素のアイソフォームの一つのＣ末端領域のペプチド配列（配列番号３７）Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-Ser）を場合によっては至適なキャリアー物質（KLH等）に結合させたもの（KLHを付加しやすくするためにCysをN末端あるいはC末端などに付加したもの）、上述の遺伝子組換えタンパク質またはそれをコードする遺伝子を導入した発現ベクターを投与し、モノクローナル抗体発現ハイブリドーマの確立及びポリクローナル抗体（抗血清）の作出を行った。
【０１０５】
続いて、上記種々の方法により調製された抗体を用いて、常法により（Current Protocols in Molecular Biology：  Chapter 10 analysis of proteins、Chapter 11 immunologyなど）、本酵素のウエスタンブロット法による検出を行った。具体的には、遺伝子組み換え体の発現の確認として、実施例９に示す手順で得られた組み換え体発現293細胞の培養上清の非還元状態でのSDS-PAGEを行った後、PVDF膜への転写後、マウス、ウサギ等の抗血清により確認した（図16）。その結果、分子サイズとして１６０〜２５０kDaの範囲に本酵素由来と想定されるバンドが検出された。そして、次に、原料血漿等と組換え体での本酵素の検出を非還元下で行ったところ、１０５〜１６０kDaあるいは１６０〜２５０kDaにバンドが確認された（図17）。また、組換え蛋白質を免疫して確立したモノクローナル抗体（Clone No. CPHSWH-10）においても同様な組換え体由来のバンドが検出できた。
【０１０６】
さらに、本酵素のアイソフォームの一つのＣ末端領域のペプチド配列（配列番号３７）Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-SerをKLHに結合したものを免疫原として得られたペプチド抗体により、還元条件下、健常人血漿、TTP患者血漿あるいは、組み換え体培養上清中から本酵素の検出を行ったところ、一部のTTP患者血漿では明瞭ではないが、概ね２５０kDa程度の本酵素由来のシグナルと想定されるバンドが確認された（図18）。
【０１０７】
またさらには、得られた抗体を組み合わせることで構築される酵素免疫測定法(ELISA)により、組換えタンパク質の培養上清レベルでの濃度依存的な検量線が作製できた（図19）。ＥＬＩＳＡとしては以下の記述により例示されることができる。得られたマウス抗vWF切断酵素抗体をNunc社製Maxisorpプレートに固相化し、vWF切断酵素一時発現293細胞の培養上清を1/1、1/2、 1/4希釈したもの（0として、Mock上清）を100μｌ／ウェルで反応させ、例えば37℃１時間後、0.05％Tween20/TBSでプレートを洗浄後、ウサギ抗vWF切断酵素抗体を例えば100倍希釈濃度で100μｌ／ウェルで反応させ、例えば37℃１時間後、0.05％Tween20/TBSでプレートを洗浄後、さらにパーオキシダーゼ標識抗ウサギIg抗体（BioRad社製）を例えば1000倍希釈濃度で100μｌ／ウェルで反応させ、例えば37℃１時間後、0.05％Tween20/TBSでプレートを洗浄後、発色基質TMBZを用いて一定時間の発色反応後、停止液として1 M硫酸にて反応を停止させて、450nmの吸光度を測定する。これを応用することで、様々な検体での本酵素の定量が可能となった。
【０１０８】
実施例１４
（抗体を用いた本酵素の精製）
得られた抗体を適当な固定化担体に結合させることでアフィニティーカラムを作製し、当該酵素の精製に供した。アフィニティーカラムの調製には、チッソ社製NHS活性化セルロファインを用いて、添付文書に従い抗体を固定化した。これにより調製した約１ｍｌの膨潤担体を用いて、実施例９に示す当該酵素の２９３細胞を宿主とした遺伝子組換え体の発現培養上清をアプライしたのち、50mM Tris-HCl 0.1M NaCl pH7.5（以下TBS）でカラムを洗浄後、尿素を含んだ0.1MグリシンpH3バッファーで溶出した。溶出された画分を1M Tris-HCl pH8.5にて中和し、TBSに対して透析した。得られた精製酵素のSDS-PAGEを図２０に示す。また、得られた精製画分にvWFを切断する活性が存在することも確認された。そして、この組換え酵素により断片化されたvWFの切断点は、その断片のN末端アミノ酸配列解析から842Tyr-843Metの位置であることが確認された。また、実施例１３に示される方法により作製されたモノクローナル抗体を用いても同様に精製に供することが可能なクローン（Clone No. CPHSWH-7.2および10など）が確立された。
【０１０９】
続いて精製された本酵素の部分アミノ酸配列を決定した。常法により、SDS-PAGE後、PVDF膜へトランスファーし、風乾したのち、PEアプライドバイオシステムズ社のオートプロテインシークエンサー492にて解析を行った。その結果、部分N末端配列としてAla-Ala-Gly-Gly-Ile-を有することが明らかとなった。この配列は、遺伝子構造から推定された当該酵素の成熟体のＮ末端配列に一致した。
【０１１０】
実施例１５
（抗体による本酵素活性の中和）
前述の家兎ポリクローナル抗体によるvWF切断酵素の中和活性を評価した。遺伝子組換えvWF切断酵素1〜10μｇ／ｍｌ（ブラッドフォード法にて概算）に対して、正常家兎血清、Ｃ末端領域のペプチド配列（配列番号３７）Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-SerをKLHに結合したものを免疫原として得られた家兎抗血清、および実施例７、８に示す発現ベクターにより発現された蛋白質により免疫誘導された抗血清のそれぞれを体積比1対1あるいは５倍希釈した抗血清を1対1で予め３７℃で1時間反応させた後、前述した方法でvWFの切断活性を評価したところ、図２１に示すごとく蛋白質により免疫誘導された抗血清で本酵素の阻害活性（アンタゴニスト活性）を有するものが調製された（メタロプロテアーゼのインヒビターであるEDTAをコントロールとした。）。このことは、単に中和抗体の作製が可能であるという知見のみならず、vWF切断酵素に対する自己抗体陽性の後天的TTP患者様のモデルを構築できる可能性も示唆している。
【０１１１】
実施例１６
（C末端削除改変体の構築）
図２２に示すストラテジーにより、実施例６，または７により得られた全長のvWF切断酵素遺伝子クローニングベクター（pCR2.1vWFCP）を利用して、C末端より逐次ドメインを欠失させた変異体（T1135stop、W1016stop、W897stop、T581stop、Q449stop：それぞれの数字は開始コドンATGのコードするMetから終結コドンまでのアミノ酸の残基数を示し、FLAGエピトープ（DNA配列:gactacaaggacgatgacgataagtga（配列番号４７）、アミノ酸配列：Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys（配列番号４８））を付加した部位を示す。この際に用いたプライマーは以下の通りであり、SはセンスプライマーをASはアンチセンスプライマーを示す。Stu I-S（配列番号３８）、Acc I-S（配列番号３９）、Avr II-S（配列番号４０）、Q449stop-AS（配列番号４１）、T581stop-AS（配列番号４２）、W897stop-AS（配列番号４３）、W1016stop-AS（配列番号４４）、T1135stop-AS（配列番号４５）、Full length-AS（配列番号４６））遺伝子を調製し、実施例８、９同様の方法により、pCAG発現ベクターに組み込み、Hela細胞にその発現ベクターを遺伝子導入した。図２２上部の制限酵素地図下に示すプライマー対を用いてPCRフラグメント(A)から(F)を得て、各PCRフラグメントをpCR2.1vWFCPにライゲーションした。さらに、Stu I/Sal I消化し、フラグメント(A)および(B)をStu I/Sal I消化してライゲーションした。また、Acc I消化し、フラグメント（C）をAcc I消化してライゲーションした。さらに、Avr II/Sal I消化し、フラグメント(D)、(E)および(F)をAvr II/Sal I消化してライゲーションした。その結果、Ｃ末端からW897位まで欠失した変異体においても、定性的ではあるが活性を有することが明らかになった。こういったアプローチにより、様々な機能ドメインの同定が可能になり、当該ドメインを含む酵素活性を有しない分子のデザインを行うことでアンタゴニストの設計あるいはその逆にアゴニストの設計が可能になると考えられる。
【０１１２】
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】vWFのマルチマー構造とｖＷＦ切断酵素による切断点を示す図である。
【図２】vWFのマルチマー解析の結果(アガロース電気泳動)を示す写真である。
【図３】血漿各画分のｖＷＦ切断活性を還元条件下のSDS-PAGE（５％ゲル）で確認した結果を示す写真である。
【図４】フラクション１(F1)ペースト可溶化サンプルの非還元下のSDS-PAGE（５％ゲル）の泳動写真である。
【図５Ａ】F1ペースト可溶化サンプルを出発原料として３回のゲル濾過クロマトグラフィーに通液後のｖＷＦ切断酵素画分の解析結果(ゲル濾過クロマトグラフィーのチャート、ならびに非還元下でのSDS-PAGE及び還元条件下でのvWF切断活性のSDS-PAGE)を示す写真であり、図５Ａはゲル濾過クロマトグラフィーのチャートを示す。
【図５Ｂ】F1ペースト可溶化サンプルを出発原料として３回のゲル濾過クロマトグラフィーに通液後のｖＷＦ切断酵素画分の解析結果(ゲル濾過クロマトグラフィーのチャート、ならびに非還元下でのSDS-PAGE及び還元条件下でのvWF切断活性のSDS-PAGE)を示す写真であり、図５Ｂは非還元下でのフラクションのSDS-PAGEの結果を示す。
【図５Ｃ】F1ペースト可溶化サンプルを出発原料として３回のゲル濾過クロマトグラフィーに通液後のｖＷＦ切断酵素画分の解析結果(ゲル濾過クロマトグラフィーのチャート、ならびに非還元下でのSDS-PAGE及び還元条件下でのvWF切断活性のSDS-PAGE)を示す写真であり、図５Ｃは還元条件下でのvWF切断活性のSDS-PAGEの結果を示す。
【図６Ａ】ゲル濾過クロマトグラフィー回収画分をDEAE陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製したvWF切断酵素画分の解析結果(ゲル濾過クロマトグラフィーのチャート、ならびに非還元下でのSDS-PAGE及び還元条件下でのvWF切断活性のSDS-PAGE)を示す写真であり、図６Ａはゲル濾過クロマトグラフィーのチャートを示す。
【図６Ｂ】ゲル濾過クロマトグラフィー回収画分をDEAE陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製したvWF切断酵素画分の解析結果(ゲル濾過クロマトグラフィーのチャート、ならびに非還元下でのSDS-PAGE及び還元条件下でのvWF切断活性のSDS-PAGE)を示す写真であり、図６Ｂは非還元下での溶出フラクションのSDS-PAGE（８％ゲル）の結果を示す。
【図６Ｃ】ゲル濾過クロマトグラフィー回収画分をDEAE陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製したvWF切断酵素画分の解析結果(ゲル濾過クロマトグラフィーのチャート、ならびに非還元下でのSDS-PAGE及び還元条件下でのvWF切断活性のSDS-PAGE)を示す写真であり、図６Ｃは還元条件下でのvWF切断活性のSDS-PAGEの結果を示す。図６Ｃ中の３本のバンドは、図５Ｃと同様にインタクトなvWF分子（切れのこり）、vWF切断断片、vWF切断断片を示す。
【図７】DEAE陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製・濃縮したｖＷＦ切断酵素画分をバイオフォレーシスに基づくSDS-PAGE（非還元下）によってさらに精製した時の泳動画分を示す写真である。
【図８Ａ】vWF切断酵素画分をバイオフォレーシスに基づくSDS-PAGEによってさらに精製した画分のvWF切断酵素活性の確認及び活性画分の還元下でのSDS-PAGEの泳動写真であり、図８ＡはvWF切断酵素活性の非還元下でのSDS-PAGEの結果を示す。
【図８Ｂ】vWF切断酵素画分をバイオフォレーシスに基づくSDS-PAGEによってさらに精製した画分のvWF切断酵素活性の確認及び活性画分の還元下でのSDS-PAGEの泳動写真であり、図８Ｂは活性画分の還元下でのSDS-PAGEの結果を示す。
【図９】vWF切断酵素遺伝子の同定に関し、ノザンブロットプローブ用遺伝子断片の増幅に用いたプライマーを示す図である。
【図１０】vWF切断酵素遺伝子の同定に関し、ノザンブロットのオートラジオグラフィーを示す写真である。図１０Ａは当該蛋白質分解酵素コード遺伝子をプローブとして用いた場合の結果、図１０Ｂはβアクチンプローブ（RNAコントロール）を用いた場合の結果を示す。
【図１１】vWF切断酵素遺伝子の同定に関し、RACE反応に用いたプライマーの位置と配列を示す図である。
【図１２】全長cDNAクローニング用に設計したプライマーの位置を示す図である。
【図１３】全長cDNAを含むベクターの構築手順を示す図である。
【図１４】各種細胞株での発現を示す写真である（抗FLAG抗体を用いた還元条件下のウエスタンブロット；Mockは遺伝子を発現ベクターへ逆向きに挿入したもの）。図１４中、各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。レーン１  Mock（宿主：293細胞）、レーン２  vWF切断酵素 cDNA＋FLAG（宿主：293細胞）、レーン３  Mock（宿主：HepG2細胞）、レーン４  vWF切断酵素 cDNA＋FLAG（宿主：HepG2細胞）、レーン５  Mock（宿主：Hela細胞）、レーン６  vWF切断酵素 cDNA＋FLAG（宿主：Hela細胞）
【図１５】組換え発現酵素の活性測定を示す写真である(非還元下のSDS-PAGEによるvWF切断の確認；Mockは遺伝子を発現ベクターへ逆向きに挿入したもの)。図１５中、各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。レーン１  Mock（宿主：Hela細胞）、レーン２  vWF切断酵素発現上清（宿主：Hela細胞）、レーン３  Mock（宿主：HepG2細胞）、レーン４  vWF切断酵素発現上清（宿主：HepG2細胞）、レーン５  Mock（宿主：293細胞）、レーン６  vWF切断酵素発現上清（宿主：293細胞）、レーン７  Mock（宿主：BHK細胞）、レーン８  vWF切断酵素発現上清（宿主：BHK細胞）、レーン９  Mock（宿主：COS細胞）、レーン１０  vWF切断酵素発現上清（宿主：COS細胞）、レーン１１  Mock（宿主：CHO細胞）、レーン１２  vWF切断酵素発現上清（宿主：CHO細胞）
【図１６】本酵素に対して確立された抗体によるウエスタンブロットを示す写真であり、293細胞を宿主とした組換えvWF切断酵素を用いた各種抗血清でのウェスタンブロットを示す写真である。図１６中、各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。レーン１  マウス抗血清（精製タンパク質を投与して調製）、レーン２  ウサギ抗血清（発現ベクターをウサギ皮下に投与して調製）、レーン３：未処理ウサギ抗血清、レーン４  ウサギ抗血清（部分合成ペプチドをKLHコンジュゲートしたものを投与して調製）
【図１７】本酵素に対して確立された抗体によるウエスタンブロットを示す写真であり、vWF切断酵素全長のcDNA投与により得られたウサギ抗血清を用いてヒト血漿由来各種サンプルと組換え発現体の検出を示す写真である。図１７中、各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。レーン１  ヒト血漿クリオ由来部分精製サンプル、レーン２  ヒト血漿由来精製vWF切断酵素、レーン３  ヒトプール血漿のFIペーストのゲルろ過サンプル、レーン４  組換えvWF切断酵素（宿主：293細胞）、レーン５  組換えvWF切断酵素（宿主：Hela細胞）
【図１８】本酵素に対して確立された抗体によるウエスタンブロットを示す写真であり、vWF切断酵素の部分合成ペプチドを免疫して得られたウサギ抗血清を用いた健常人血漿及びTTP患者血漿中のvWF切断酵素並びに遺伝子組換えvWF切断酵素の確認を示す写真である。図１８中、各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。レーン１  ヒトプール血漿のFIペーストのゲルろ過サンプル、レーン２  健常人血漿１、レーン３  健常人血漿２、レーン４  健常人血漿３、レーン５  TTP患者血漿１、レーン６  TTP患者血漿２、レーン７  組換えvWF切断酵素（宿主：293細胞）、レーン８  組換えvWF切断酵素（宿主：Hela細胞）
【図１９】vWF切断酵素に対して調製された抗体を用いたELISAを示す図である。
【図２０】抗体を用いたアフィニティー精製vWF切断酵素各画分の還元下でのSDS-PAGE（銀染色）を示す写真である。図２０中、各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。レーン１  アプライ培養上清（10倍希釈）、レーン２  素通り画分、レーン３  洗浄画分、レーン４  溶出画分
【図２１】抗体を用いた中和活性能の評価（非還元下のvWF切断活性のSDS-PAGE）を示す写真である。図２１中、各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。レーン１  vWF切断酵素液：正常家兎血清＝１：１、レーン２  vWF切断酵素液：正常家兎血清（５倍希釈）＝１：１、レーン３  vWF切断酵素液：ペプチド免疫家兎血清＝１：１、レーン４  vWF切断酵素液：ペプチド免疫家兎血清（５倍希釈）＝１：１、レーン５  vWF切断酵素液：組換え蛋白免疫家兎血清＝１：１、レーン６  vWF切断酵素液：組換え蛋白免疫家兎血清（５倍希釈）＝１：１、レーン７  vWF切断酵素液：10mM EDTA＝１：１、レーン８  vWF切断酵素液：バッファーのみ＝１：１、レーン９  バッファー（vWF切断酵素なし）：バッファー＝１：１
【図２２】C末端ドメイン欠失分子種の発現ベクター構築図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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