(57)【要約】【課題】採取フロートを含むチューブにおける遠心分離による抗体のポジティブセレクションまたはネガティブセレクションによってサンプル流体から稀な細胞を分離する。【解決手段】採取フロートは、軸方向通路、およびサンプル流体内に沈殿するとともにターゲット成分の層を拡張させる密度を有する。抗体は、好ましくは、マイクロビーズのような微粒子キャリアに結合され、ターゲット成分または汚染成分を微粒子キャリアに付着させる。ポジティブセレクションにおいて、微粒子キャリアは、フロートの軸方向の通路において回収される。【選択図】図１
2008301835.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル材料から成分を採取する方法であって、
前記サンプルから採取されるべきサンプル成分の層を受容すると共に延伸させる通路を備えた集束装置を有するサンプリング容器内にサンプル材料を用意するステップと、
前記サンプル中の少なくとも一つの物質との結合親和性を有している少なくとも一つの抗体を前記サンプリング容器内に用意すると共に、前記抗体を前記サンプルと混合させるステップと、
前記サンプルの成分を分離させると共に、ターゲット成分を前記サンプルから前記通路に押し込むのに十分な慣性力で、前記容器およびサンプルを遠心分離するステップとを備えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプルからターゲット成分、特に、ターゲット細胞を分離する方法に向けられる。より詳細には、本発明は、ポジティブまたはネガティブ分離および遠心分離によって生物学的サンプルからターゲット細胞を分離する方法に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
この分野において、生物学的流体、特に、血液から様々な構成要素を分離する多数の方法が知られている。例えば、血液成分の分析には、プラスマから細胞を分離すると共に、細胞密度に従って様々な細胞を層に分離させる非凝固全血の遠心分離が一般に含まれる。遠心分離の後に、プラスマの断片はサンプルから取り除かれる。血液の採集は、しばしば真空チューブ内で実行され、細胞の分離は、採集チューブの遠心分離によって達成される。チューブは、プラスチック材料により形成されているセパレータ本体を含み得て、セパレータ本体は、遠心分離ステップの間に血液サンプル中に形成された成分の層の上にセパレータが沈殿することを可能にする比重を備えている。セパレータは、遠心分離された血液サンプル中の定形化された、または、定形化されていない成分の断片の混合を防止する。また、セパレーターは、分離および分析のために遠心分離層を安定化させる。
【０００３】
血液サンプルから細胞を回収する他の方法は、遠心分離に先立ってサンプルを含み、遠心分離チューブに配置される中空インサートを用いる。インサートは、透明プラスチック材により形成され、遠心分離チューブ内に嵌め込まれる。インサートは、サンプルをインサートの孔部に押し込むように遠心分離されると、チューブ内を摺動する。サンプルから採取されるべき細胞は、インサートの孔部に集まり、それにより、構成要素の比重に応じて分離する要素の層を形成する。インサートの孔部は、層厚さに比較して層を延伸させる寸法を有しており、インサートのないチューブでは、層はそのように形成することはない。孔部に生じた層は、皮下注射器あるいは他のカニューレを用いて、孔部から分化されると共に除去され得る。この方法および装置の例は、Ｌｅｖｉｎｅらに付与された特許文献１に開示されている。
【０００４】
サンプルから構成要素を分離する他の方法および装置は、Ｌｅｖｉｎｅらに付与された特許文献２に開示されている。この装置は、遠心分離に先立ってチューブに配置される一つまたはそれ以上の境界作成体を用いる。遠心分離された際、作成体はチューブ内を摺動し、遠心分離中に重量によって分離する構成要素層の境界を明確化する。チューブ内に液体または気体を注入するために、エラストマキャップを通してカニューレがチューブに挿入される。注入された物質は、遠心分離されたサンプルをチューブから搾り出すために、延伸分離されたサンプルおよび境界作成体をチューブの一端に移動させる。
【０００５】
生物学的サンプルから成分を分離させる他の方法は、それに結合された抗原を有する常磁性のマイクロビーズを用いる。サンプルはマイクロビーズと混ぜ合わされ、構成要素をマイクロビーズに結合させるように培養される。その後、サンプルは磁気分離される。この種の方法の例は、Ｉｒｓｃｈらに付与された特許文献３に開示されている。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，３９３，６７４号公報
【特許文献２】米国特許第５，７０７，８７６号公報
【特許文献３】米国特許第５，９１６，８１８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの従来の方法は、それらの意図された目的には概ね有効であった。しかしながら、引き続き、生物学的サンプルから細胞を分離するための改善された方法への要請が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はサンプル、特に、生物学的サンプルから細胞を分離させる方法に向けられる。従って、本発明の主たる目的は、生物学的サンプルから特定の構成要素を採取するための方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、先の方法によって得ることができるものよりも高い濃度の生物学的流体から特定の要素を分離させる方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の更なる目的は、低レベルの汚染要素をもった生物学的流体から選択された細胞を採取する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の更に他の目的は、採取される稀な細胞が単核の細胞から実質的に遊離している生物学的流体から稀な細胞を採取する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、サンプル中のターゲット細胞への親和性をもった抗体のコーティングを有する微粒子キャリアを用いて、生物学的サンプルから稀な細胞を採取する方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の更なる目的は、白血球への親和性をもった抗体でコートされたマイクロビーズを用いて、生物学的サンプルからターゲット要素を採取する方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、サンプル中の少なくとも一つの成分への親和性を有する結合材とサンプルを組み合わせた後に、軸方向の孔部を有するフロートが存在する状態でサンプルを遠心分離することにより、生物学的サンプルからターゲット成分を分離させる方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の更に他の目的は、ターゲット成分へのポジティブまたはネガティブセレクションを有する微粒子キャリアが存在する状態でサンプルを遠心分離することにより、生物学的サンプルからターゲット成分を採取する方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、白血球への親和性を有する抗体を含んでいる相当量のキャリア微粒子とサンプルを混合することにより、生物学的サンプルからターゲット細胞を採取する方法を提供することにあり、粒子は、サンプルから白血球を取り除くために、白血球の密度よりも大きな密度を有している。
【００１７】
本発明の更なる目的は、ターゲット成分への親和性を有している抗体を含んでいる相当量のキャリアビーズとサンプルを混合することにより、生物学的サンプルからターゲット細胞を採取する方法を提供することにあり、ビーズは、サンプルからターゲット細胞を取り除くために、白血球の密度よりも小さい密度を有している。
【００１８】
本発明の更に他の目的は、サンプルからターゲット細胞を分離させると共に、ターゲット細胞を検出する方法を提供することにあり、ターゲット細胞または汚染細胞への親和性を有するキャリアビーズとサンプルを混合させることにより、ターゲット細胞が分離される。
【００１９】
本発明の目的および利点は、基本的に、サンプル材料から成分を採取する方法を提供することによって達成される。この方法は、サンプルから採取されるべきサンプル成分の層を受容すると共に延伸させる通路を備えた集束装置を有するサンプリング容器内にサンプル材料を用意するステップと、サンプル中の少なくとも一つの物質との結合親和性を有している少なくとも一つの抗体をサンプリングレセプタクル内に用意すると共に、抗体をサンプルと混合させるステップと、サンプルの成分を分離させると共に、ターゲット成分をサンプルから貫通路に押し込むのに十分な慣性力で、容器およびサンプルを遠心分離するステップとを備える。
【００２０】
これらの本発明の目的、利点および他の顕著な特徴は、添付図面および以下の発明の実施の形態を考慮することによって明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、生物学的サンプルからターゲット成分、特に、ターゲット細胞を採取する方法に向けられている。より詳細には、本発明は、採取された稀な細胞中に存在する少数の汚染細胞により、生物学的サンプルから稀な細胞を採取する方法に向けられている。
【００２２】
好ましい実施形態において、ターゲット成分を採取する方法は、遠心分離中にターゲット成分を分離させるか、または、増強させるのを支援するように、サンプルの成分と結合可能な少なくとも一つの結合剤を利用する。結合剤はターゲット成分あるいは一つまたはそれ以上の汚染成分への親和性を有するように選択された抗体であるとよい。本発明の好ましい実施形態では、抗体のような親和性結合剤が、サンプルからのターゲット成分の分離および採集を増強するために採取される成分と互換性を有する粒子サイズおよび密度をもった微粒子キャリア上のコーティングとして提供される。以下により詳しく述べられる発明の実施形態では、微粒子キャリアは、サンプルの汚染要素の密度よりも小さいか、または、大きい密度を有し得る。
【００２３】
更なる実施形態では、この方法は、生物学的サンプル、特に、非凝固全血サンプルからの稀な細胞、特に、腫瘍細胞の採取に向けられている。この方法は、血液サンプルから、幹細胞や胎児細胞のような様々な他の種類の細胞を回収するために使用可能である。
【００２４】
一実施形態において、この方法は、生物学的サンプルを遠心分離にかけ、サンプルは、抗体または微粒子キャリア表面に結合された他の親和性結合材を有する微粒子キャリアと混合される。遠心分離ステップは、好ましくは、遠心分離採取装置を用いる。抗体は、好ましくは、微粒子キャリアの表面上のコーティングとして提供される。好ましい実施形態において、微粒子キャリアは、適切な非反応性プラスチック樹脂により形成された相当量のマイクロビーズである。適切なプラスチック樹脂の例には、ポリスチレン、ポリジビニルベンゼンおよびポリ塩化ビニルが含まれる。
【００２５】
本発明の方法にて用いるマイクロビーズは、この分野において知られている様々な方法によって製造され得る。本発明の実施形態において、マイクロビーズは、およそ０．０５〜７μｍの範囲の粒子サイズを有しており、一般には、およそ４〜５μｍの粒子サイズを有する。
【００２６】
プラスチックマイクロビーズのような微粒子キャリアは、ターゲット成分のエンリッチ化、特に、稀な細胞のエンリッチ化を可能にするようにサンプルの様々な成分を補完する密度を有している。一実施形態では、微粒子キャリアが、腫瘍細胞のようなターゲット成分への結合親和性を有する抗体を含む。更なる実施形態では、他の親和性結合剤が使用され得る。遠心分離の後には、腫瘍細胞は、一般に、血小板／プラスマ領域の界面に、より高密度である大多数の白血球の上に集められると考えられていた。採取された腫瘍細胞は、一般に、高い濃度の汚染単核細胞を有している。腫瘍細胞は必ずしも細胞層同士間の界面に集中させられるわけではなく、他の干渉する細胞からの著しい汚染なしで回収することは困難であることが判っている。本発明の一実施形態では、微粒子キャリアが白血球の密度よりも低い密度を有し、その結果、微粒子キャリア、および、キャリアに捕捉されるか、または、結合された腫瘍細胞が白血球層上に集められる。
【００２７】
本発明の第１の実施形態において、ターゲット成分を採取すると共にエンリッチする方法は、ターゲット成分と結合可能な結合剤とサンプル流体とを接触させ、構成要素の層を広げると共にターゲット成分をエンリッチさせることができる装置によってサンプルを遠心分離するステップを含むポジティブセレクション方法である。その後、ターゲット成分は採取され得て、公知の方法により成分を同定すると共に培養するために更に処理され得る。適切な同定方法の例には、フローサイトメトリおよび分子核酸増幅が含まれる。
【００２８】
一実施形態において、遠心分離は、図１および図２に示される遠心分離装置１０を用いて行われる。図示された実施形態の装置１０は、好ましくはガラスや、プラスチックのような他の透明材料により形成されているチューブ１２のような容器を含む。チューブ１２は閉鎖された底端部１４および開放された頂端部１６を有している。チューブ１２を閉じるために、栓１８が開放された頂端部１６に嵌め込まれる。栓１８は、好ましくは、カニューレ、針または他の刺通具によって貫通され得る適切なエラストマ材料またはラバー材料により形成される。栓１８は、チューブ１２の頂端部１６で適度な摩擦嵌合を形成する外寸をもった実質的に円柱状の本体部２０を有する。栓１８の上端からは、肩部２１が、チューブ１２の頂端部１６と係合するように径方向の外方に延出している。
【００２９】
チューブ１２は、サンプル流体の遠心分離に適した全長および径を有する。一実施形態において、チューブ１２は、およそ７５ｍｍの全長、およそ４０ｍｍの内径、および、およそ０．９ｍｌの容量を有する。
【００３０】
図１に示されるように、チューブ１２内には、フロート２２が配置される。フロート２２は、チューブ１２内にぴったりと嵌り込む寸法に形成されており、サンプルの遠心分離の間、チューブ１２の全長に沿って摺動する。図示された実施形態において、フロート２２は、チューブ１２の内側表面を補完する円筒形状を有する外側スリーブ２４を含む。外側スリーブ２４は、好ましくは、遠心分離の間に僅かに変形し得るビニル樹脂のような柔軟材料により形成される。外側スリーブ２４は、フロート２２がチューブ１２内で摺動可能となるように遠心力に応じて拡縮可能である。柔軟材料は、外側スリーブ２４がチューブ１２の内側表面と適度に接触して遠心力のもとでチューブ１２内を摺動可能となるように、静止条件下で元の形状および寸法に戻る。チューブ１２の内側表面には、フロート２２のスライド移動を支援すべくシリコン系潤滑剤が施されてもよい。
【００３１】
フロート２２は、軸方向通路、すなわち、貫通路を形成する孔部２８を有する内側スリーブ２６を含んでいる。内側スリーブ２６は、接合剤または他の適切な方法によって外側スリーブ２４に結合されている。内側スリーブ２６は、遠心分離中に実質的に歪みを生じないように、遠心分離中に寸法的に安定である剛体材料により形成されている。軸方向の孔部２８は、遠心分離中にサンプル材の断片を広げるのに適した全長および径を有する。本発明の一実施形態では、軸方向の孔部２８が、およそ１．２６５ｍｍの内径、および、およそ４．０ｍｍの全長を有している。内側スリーブ２６は、好ましくは、サンプルの成分に干渉しないポリスチレンのようなプラスチックにより形成される。フロート２２は、細胞の断片を分離させると共に広げることができる適切な遠心分離装置の典型となるように意図されている。遠心分離中に稀な細胞の断片を分離するのに使用可能な他の装置が存在することは理解されよう。適切な装置は、一般に、構成要素の層の分離を可能にするために、遠心分離中に構成要素の層を延伸させる通路あるいは収縮領域を含む。
【００３２】
フロート２２は、チューブ１２に嵌り込む寸法に形成されており、遠心分離中に、サンプル流体の選択された密度の層同士の間に沈殿し、ターゲット成分を軸方向の孔部２８に押し込むようにチューブ１２内を摺動する。フロート２２の軸方向の孔部２８は、ターゲット成分の実質的部分を採集するのに適した内部容積を有している。フロートの内部容積および直径は、ターゲット成分の層を効果的に広げる。この種の細胞採取装置の一例は、ここではその全体に参考により組み入れられているＬｅｖｉｎｅらに付与された特許文献１に開示されている。
【００３３】
フロート２２は、ターゲット成分およびサンプルを補完する密度を有するものとして選択され、その結果、フロート２２がサンプルの所定位置に沈殿することを可能にすることによって、ターゲット成分は軸方向の孔部２８に集まる。本発明の一実施形態において、フロート２２は、遠心分離の後に、生じたプラスマ層と赤血球層との間に沈殿する密度を有している。この実施形態において、通常プラスマ層と赤血球層との間の界面に集まる稀な細胞は、それらを採集可能な軸方向の孔部２８に集まる。
【００３４】
サンプルは、様々な構成要素を層に分離させるのに十分な速度で遠心分離される。遠心分離装置は、およそ４００Ｇからサンプル流体に応じて８００Ｇの遠心力を生じる速度に達し得る。本実施形態において、遠心分離機は、１，０００Ｇ以上の力を生じ得る。
【００３５】
本発明の方法は、成分、特に、稀な細胞を採取するためのポジティブセレクションあるいはネガティブセレクションの何れであってもよい。ポジティブセレクション法では、サンプル流体が、ターゲット成分への親和性を有する少なくとも一つの抗体と混合される。ネガティブセレクションは、白血球および／または赤血球のような、汚染細胞に親和性を有する抗体とサンプルを混合する。特殊共役や錯体の形式をとる適切なネガティブセレクション抗体試薬は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．やＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏＴｅｃｈ  ＧｍｂＨから市販されている。非誘導抗体は、Ｐｈａｒｍａｇｅｎ  Ｉｎｃ．のような他の出所から市販されている。そして、結果的な混合物は、採取フロート装置を用いて、エンリッチされたターゲット成分を採取するために遠心分離される。遠心分離に先立って、サンプルは、この分野において知られたターゲット成分の分離を促進させる密度勾配媒体と組み合わされてもよい。
【００３６】
一実施形態におけるポジティブセレクション採取法は、ターゲット成分への親和性をもった抗体のコーティングを備えた微粒子キャリアを利用する。好ましい実施形態において、微粒子のキャリアは、採取されるべき稀な細胞、特に、腫瘍細胞への結合親和性を有する抗体のコーティングを備えた相当量のプラスチック製マイクロビーズである。
【００３７】
マイクロビーズの密度およびフロートの密度は、フロートの軸方向の孔部にマイクロビーズを集めるべく調整される。ポジティブセレクション採取法は、およそ０．０５〜７μｍ、一般には、４〜５μｍの粒子サイズ、および、白血球よりも小さい密度を有するマイクロビーズを用いる。マイクロビーズは、およそ１．００〜１．０５の範囲、好ましくは、およそ１．０２〜１．０３の密度を有していてもよい。マイクロビーズおよび捕捉される稀な細胞は、サンプルおよびフロートが遠心分離された際に、それらがフロート内に集中させられるような密度を有する。フロートは、稀な細胞が通常沈殿する遠心分離の後に、サンプル内でフロートが沈殿するような適切な密度を有する。この実施形態において、マイクロビーズは、白血球および赤血球の遠心分離層上に浮くよう十分に軽い。フロートは、好ましくは、マイクロビーズを採取するために、白血球層および赤血球層上に浮かぶ密度を有する。
【００３８】
マイクロビーズは、ターゲット成分、特に、稀な細胞に非反応である適切な材料により形成されている。適切な材料は、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、ポリスルフォンや、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートおよびポリエステルのようなフッ素系または塩素系樹脂を含んでいる。粒子サイズは、ターゲット成分およびフロートの内径に応じて変化させることができるが、一般には、およそ４〜５μｍである。市販されているマイクロビーズの多くは、マイクロビーズの表面に結合させられた抗原を有している。抗体は、直接、または、中間結合剤を介してマイクロビーズの表面に結合させることができる。抗体でコートされたマイクロビーズの適切なものは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨから市販されている。適切なマイクロビーズの例は、ＭＡＣＳ  ＣＤ  ２７という商標のもとでＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから市販されている。
【００３９】
ポジティブセレクション法における抗体は、稀な細胞への結合親和性を有しており、サンプルから採取されるべきターゲットとなる稀な細胞に応じて選択される。採取されるべき稀な細胞には、腫瘍細胞、胎児細胞等が含まれる。微粒子キャリアに結合され得る腫瘍細胞の例は、上皮起始であってもよく、限局性または非限局性であってもよい。腫瘍細胞は、膀胱、脳、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、直腸および胃のものであってもよい。また、腫瘍細胞は、線維肉腫やまたは横紋筋肉腫のような肉腫、リンパ系または骨髄系の造血腫、黒色腫、奇形癌、神経芽細胞腫あるいは神経膠腫であってもよい。
【００４０】
マイクロビーズは、好ましくは、ターゲットである有効な量の稀な細胞と結合する選択された抗体を相当量含むのに十分な表面積を有する。サンプルと結合したマイクロビーズの量は、抗体の親和性、サンプル中の稀な細胞の濃度、サンプルの特性、および、サンプルの体積により変化させることができる。
【００４１】
本発明の方法は、様々な体液、特に、非凝固血液から、稀な細胞を採取するのに用いると適切である。稀な細胞内容について分析され得る他の流体には、尿、唾液、リンパ液、脊髄分泌液、精液、羊水、腔液および組織抽出物が含まれる。
【００４２】
この方法は、遠心分離チューブ１２およびフロート２８を用いて実行される。好ましい実施形態において、チューブ１２は、真空引きされるか、あるいは、大気常態値よりも低い内部圧力で不活性ガスにより満たされる。テストされるべきサンプルは、二重穿刺針またはカニューレを有する移送装置によって一次採集チューブから移送される。針は、チューブ１２の栓を貫通することにより、移送装置からチューブまで延在する。チューブ１２内の低圧は、流動性サンプルをチューブ１２に引き込む。この分野において知られているように、遠心分離された際にサンプル中にバンド形成を保つために、チューブ１２内にチキソトロピーのゲルが備えられ得る。成分の分離および識別を促進するために、色素等の様々な他の分離剤がチューブ１２に加えられてもよい。抗体を含むマイクロビーズは、チューブ１２内に供され、静かな振動または攪拌によって流動性サンプルと混ぜ合わされる。サンプルは、その後、ターゲット成分をマイクロビーズと結合させるように培養される。
【００４３】
チューブ、フロートおよびサンプルは、サンプルの構成要素を層に分離させると共にフロートの軸方向の孔部にマイクロビーズと捕捉されたターゲット成分を押し込むのに必要な長さの時間だけ十分な速度で遠心分離される。サンプルは、層の分離を生じさせるのに十分な遠心分離力を提供する速度で遠心分離され得る。チューブは、ゆっくりと停止され、遠心分離機から取り外される。そして、針またはカニューレは栓を貫通し、マイクロビーズを含んでいるサンプルを取り除くように軸方向の孔部に挿入される。採取されたサンプルは、この分野において知られている様々なプロセスにより、更に処理および分析される。一実施形態において、採取された細胞は、フローサイトメトリを用いて分析される。稀な細胞あるいは他のターゲット成分は、公知の手法により、マイクロビーズおよび結合している抗体から洗浄および分離され得る。結果的な採取された稀な細胞は、従来の多くの方法と比較して非常にエンリッチ化され、実質的に低い赤血球および白血球の汚染レベルを有する。
【００４４】
本発明の第２実施形態において、この方法は、稀な細胞のエンリッチ化のためのネガティブセレクション法である。稀な細胞は、赤血球または白血球のような稀ではない汚染細胞と結合可能な結合剤を用いてエンリッチ化される。
【００４５】
好ましい実施形態において、結合剤は、一つまたはそれ以上の白血球および／または赤血球と結合可能であるか、あるいは、細胞の表面抗原と結合する。結合剤は、白血球を凝集させるか、または、白血球を赤血球に結合させることができる抗体であってもよい。結果としてのより大きくより高密度である粒子は、遠心分離中に、稀ではない細胞から分離され得る。稀ではない細胞と結合可能であり、それを捕捉することができる適切な抗体には、抗ヒト抗体が含まれる。白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）と結合するように用いることができる適切な抗体の例には、ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ５，ＣＤ７，ＣＤ８，ＣＤ１１ａ，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１１ｃ，ＣＤ１４，ＣＤ１５，ＣＤ１６，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２８，ＣＤ３６，ＣＤ４２ａ，ＣＤ４３，ＣＤ４４，ＣＤ４５，ＣＤ４５Ｒ，ＣＤ４５ＲＡ，ＣＤ４５ＲＢ，ＣＤ４５ＲＯ，ＣＤ５７およびＣＤ６１のような白血球ＣＤ抗体が含まれる。使用可能な他の結合剤は、抗ヒトＣＤ４５、抗ヒトＣＤ１９、抗ヒトＣＤ１４および抗ヒトＣＤ３の混合物を含む。
【００４６】
好ましくは、抗体は、先の実施形態のように、マイクロビーズの表面に結合させられる。ネガティブセレクション法におけるマイクロビーズは、サンプルおよびターゲット成分に適した粒子サイズを有する。一般に、粒子サイズは、およそ０．０５〜７μｍの範囲、好ましくは、およそ４〜５μｍの範囲にある。この実施形態において、ビーズは、好ましくは、白血球の密度よりも大きな密度を有し、より好ましくは、およそ１．０７〜１．０９ｇ／ｍｌ、一般的には、およそ１．０８〜１．０９ｇ／ｍｌの範囲の密度を有する。この方式では、マイクロビーズが遠心分離中に沈下し、稀な細胞は、赤血球または白血球の層上に沈殿する。フロートは、稀な細胞がそれらを除去し得るフロートの軸方向の孔部に沈殿するように、稀ではない細胞の層上に浮かぶような密度を有している。
【００４７】
ネガティブセレクション採取法は、上述のポジティブセレクションと同様である。サンプル流体はチューブ内に供され、稀ではない細胞抗体を含んでいるマイクロビーズと混ざり合わされる。培養後に、混合物を含んでいるチューブは、層に分離させると共に、稀な細胞が回収され得るフロートの軸方向の孔部に稀な細胞を集合させるのに十分な時間だけ培養・遠心分離される。
【００４８】
本発明の更なる実施形態において、この方法は、２種類の異なる成分を捕捉するために異なる親和性結合剤を有する２種類のマイクロビーズを利用する。一実施形態では、腫瘍細胞のような稀な細胞への親和性を備えた親和性結合剤を有する相当量の第１のマイクロビーズがサンプルと混合される。第１のマイクロビーズは、白血球および赤血球から分離するための密度を有している。第１のマイクロビーズは、先の実施形態のポジティブセレクションのマイクロビーズと実質的に同様の粒子サイズ、密度および親和性結合剤を有している。また、白血球への親和性を備えた親和性結合剤を有する相当量の第２のマイクロビーズがサンプルと混合される。第２のマイクロビーズは、稀な細胞から、白血球、赤血球あるいはそれらの組み合わせを分離するための密度を有している。結果としての混合物は、第１のマイクロビーズおよび捕捉された稀な細胞が、それらを回収し得る軸方向の通路に沈殿するように、フロートと共に遠心分離される。第２のマイクロビーズは、先の実施形態のネガティブセレクション法と実質的に同様の粒子サイズ、密度および親和性結合剤を有している。この方式では、赤血球および／または白血球のような汚染細胞をターゲット細胞および第１のマイクロビーズから分離させるべく、遠心分離中に第１のマイクロビーズから分離する。第１のマイクロビーズは、ターゲット細胞の回収のためにフロートの軸方向の通路に集められるような粒子サイズおよび密度を有している。
【００４９】
図３を参照するに、遠心分離装置３０の他の実施形態が示されている。装置３０は、サンプルからの分離後の様々な細胞操作に特に適するものである。例えば、稀な細胞は、サンプルから分離されると共に、装置３０による様々な検出および分析処理プロセスに供され得る。この実施形態において、装置３０は、略直方体形状の中空容器３２を含んでいる。容器３２は、長手方向長さおよび幅を有する正面壁３４および反対側の背面壁３６を含む。対向し合う側壁３８および底壁４０は、開放キャビティ４２を形成するように正面壁３４と背面壁３６との間に延在する。容器３２は、キャビティ４２を閉鎖する栓４６を受け入れる開放端４４を含む。容器３２は、好ましくは、ガラスまたはプラスチックのような透明材料により形成される。
【００５０】
容器３２は、ターゲット成分の分析に適切な体積の生物学的サンプルを受容するような寸法に形成されている。容器３２は、一般に、およそ８〜１０ｍｌ、好ましくは、およそ９ｍｌの体積を有する。図示された実施形態において、容器３２の側壁３８は、正面壁３４を介してターゲット成分を視覚化、検出および分析するのに十分に薄い厚さのキャビティ４２を画成する寸法を有する。適切な検出および分析方法の例には、サンプル中の細胞を視覚化する顕微鏡検査が含まれる。容器３２は、一般には、およそ７〜８ｃｍの全長、および、およそ３〜４ｃｍの幅を有する。側壁３８は、キャビティ４２がおよそ３〜６ｍｍ、好ましくは、およそ４ｍｍの厚さを有するような寸法に形成されている。
【００５１】
容器３２は、先の実施形態と同様の仕方で長手方向次元において容器３２内を摺動可能な移動可能フロート４８を含む。フロート４８は、容器３２のキャビティ４２に嵌り込む寸法に形成されており、容器３２の内部寸法に応じた外部寸法を有する。フロート４８は、図３〜図５に示されるように、実質的に平坦な底面５４を備えたベース５０を有している。ベース５０は、傾斜した先端５６および傾斜した後端５８を含む。ベース５０の上面には、複数のリブ６０が接合されている。
【００５２】
図５に示されるように、リブ６０は、ベース５０の長手方向次元に関して長手方向に延在する。リブ６０は、隣り合うリブ同士の間でベース５０の長さ方向に延びるチャネル６２を形成すべく対をなすように整列されている。リブ６０は、容器３２の内側表面に対して密に適合する高さを有している。チャネル６２は、遠心分離中に、層を分離させると共に延伸させるような寸法に形成されている。
【００５３】
この実施形態では、容器３２内に、血液サンプルのような生物学的サンプルが載置される。ターゲット成分用の親和性結合剤を有する相当量のマイクロビーズ６４は、サンプルと混合される。そして、先の実施形態のように、容器３２は、フロート４８の長手方向チャネル６２においてマイクロビーズ６４を捕捉されたターゲット成分と共に採集すべく遠心分離される。その後、マイクロビーズ５２および捕捉されたターゲット成分は、この分野において知られている顕微鏡検査法によって容器３２内のターゲット成分を視覚化することにより分析され得る。
【００５４】
図５に示される実施形態において、遠心分離の後の血液サンプルは、赤血球の層６６、顆粒球細胞断片層６８、単核細胞断片７０、プラスマ断片７２および血小板／プラスマ境界７４に分離する。ポジティブセレクション法では、マイクロビーズ６４がターゲット化合物への親和性を有しており、チャネル６２に集まる。代わりに、ネガティブセレクション法では、マイクロビーズ６４が白血球および／または赤血球への親和性を有していてもよい。チャネル６２は、リブ６０同士の間に形成され、容器３２の頂壁３４によって囲まれる。傾斜した先端５６および傾斜した後端５８は、フロート４８が容器３２を通って摺動する際に、チャネル６２を通してサンプルを方向転換させる。マイクロビーズ６４は、顕微鏡検査やこの分野において知られている他の分析手法によって頂壁３４を介してマイクロビーズ６４を視覚化することができるように、容器３２の頂壁３４に近接してチャネル６２の薄い層に保持される。好ましくは、容器３２の正面壁３４は、円筒状容器に通常まつわる光学的歪みを防止するように実質的に平坦とされる。
【００５５】
〔実施例〕
この実施例は、ネガティブセレクションによるサンプルから採取された腫瘍細胞と、ネガティブセレクションによらずにサンプルからの採取された腫瘍細胞とを比較するものである。採取分離は、０，５０および５００の培養された前立腺腫瘍ＰＣ−３細胞が混入された６．０ｍｌｓの新鮮に集められた全血について比較された。商標ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐの下でＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．から得られる抗体カクテルが、血液サンプルの各々と混合され、室温で２０分間培養された。調節血液サンプルは、抗体処理無しで用意された。抗体カクテルは、望まれない白血球を取り除くためにネガティブセレクションを提供した。
【００５６】
血液サンプルは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから得られた、採取フロートおよび２ｍｌｓのＰＯＬＹＭＯＲＰＨＰＲＥＰ（商標）密度メディアを含んでいる１６×１００のＰＥＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブの密度メディアの上で層になった。サンプルは、約６５０ｇの割合で２０℃で３０分間、揺動式バケット遠心分離機内で遠心分離された。調節サンプルは、採取フロート内において腫瘍細胞をもった白血球の存在を示した。抗体処理は、非常に減じられた白血球母集団と共に採取フロートに集められた腫瘍細胞を実証した。腫瘍細胞は、採取フロートから取り除かれた。フローサイトメトリは、腫瘍細胞の約９０％の回収を実証した。
【００５７】
本発明を例示するために様々な実施形態が選択されたが、特許請求の範囲において定義されるような発明の範囲を逸脱することなく、当業者によって様々な変更および追加がなされ得ることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】チューブ内に位置決めされたフロート部材を示す本発明の一実施形態における遠心分離チューブの断面図である。
【図２】遠心分離後の図１のチューブを示す断面図である。
【図３】本発明の他の実施形態における遠心分離チューブの斜視図である。
【図４】図３の実施形態のフロートの上面図である。
【図５】図４の５−５線についてのフロートの側部断面図である。
【符号の説明】
【００５９】
１０，３０  遠心分離装置
１２  チューブ
２２  フロート
２４  外側スリーブ
２６  内側スリーブ
２８  孔部
３２  中空容器
４２  キャビティ
４８  フロート
５０  ベース
５２，６４  マイクロビーズ
６０  リブ
６２  チャネル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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