(57)【要約】【課題】RNAの分解度を測定し、RNAの品質を検査する方法およびその方法に用いるデバイスの提供。【解決手段】RNA試料から短鎖分画を抽出し、分解指標核酸プローブを搭載した核酸アレイを用いて、短鎖分画に含まれる核酸の中から分解指標核酸由来の核酸断片を検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
RNA試料から所定の範囲の核酸長を有するRNA分画を抽出し、前記RNA分画に含まれる核酸の中から、前記所定の範囲の核酸長よりも長い鎖長を有するRNAに由来する核酸断片を検出することを含む、前記RNA試料の分解度を測定する方法。
【請求項２】
核酸断片の検出がハイブリダイゼーション法によるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
分解指標核酸プローブが搭載されたRNA分解度測定用核酸アレイ。
【請求項４】
分解指標核酸プローブが、ハウスキーピングジーン、18SリボゾーマルRNAおよび28SリボゾーマルRNAからなる群から選択される少なくとも１つの核酸用のプローブである、請求項３記載のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸の完全性を調べる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
RNAは分解酵素や、熱、アルカリ、凍結融解などによって、極めて分解されやすい物質である。医学・生物学の分野において、多くの当業者がRNA研究の重要性を認識しているが、RNAの不安定さがRNA研究の結果に不確実性を内包させる要因であることも周知の事実である。
そのため、RNAの分解を阻害するための試薬や方法が多く開発されているが、分解の全く進んでいないサンプルを用いて検討を行うことは困難を極める。一方、検査や実験に用いるRNAの品質を確認する手法も多く開発されている。例えば、ラットにおける28SリボゾーマルRNAと18ＳリボゾーマルRNAの安定性に差があること（非特許文献1）を利用した、それらの量的な比率を指標とする手法が、現在多くの真核生物種のRNA完全性を評価する手法として用いられている。また、低数度のRNAに特異的な核酸をオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することによってRNA完全性を評価する方法（特許文献１）が公表されている。
【０００３】
近年、生体試料を基にした解析手法やデバイスが多く開発されている。生体試料の中でも、核酸の配列やその量的比率は、さまざまな生物種において調べられている。核酸の配列や量的比率を調べる手法は、PCRやノーザンハイブリダイゼーション、核酸アレイなど、多々存在する。その中でも核酸アレイは、ハイスループットな手法として注目を集めている。
【０００４】
核酸アレイとは、担体上に多数の核酸プローブを高密度に、互いに混ざり合うことのないようにそれぞれ独立に固定化したものである。核酸アレイ上に搭載される核酸プローブは、その塩基配列と相補である配列を含む核酸分子をハイブリダイゼーションによってキャプチャーするためのセンサーとして機能する。
従来の核酸アレイは、表面加工を施したガラスやシリコンなどの担体上に、核酸プローブを固定化したものが利用されているが、近年ではゲル担体など、他の手法による担体の改質も行われている。
【０００５】
具体的な核酸アレイの製造方法としては、あらかじめ調製した核酸をスライドガラスやシリコンなどの基板に固定する方法と、基板上で直接合成する方法とが知られている。
例えば、基板上で核酸を合成する光リソグラフィー法では、光照射で選択的に除去される保護基を有する物質を使い、フォトリソグラフィー技術と固相合成技術を組み合わせて、微小なマトリックスの所定の領域（反応部位）に選択的にDNAを合成（マスキング）する方法によって核酸アレイを作製することができる。
【０００６】
また、あらかじめ調製した核酸を基板に固定化する方法としては主にスポッティング法が挙げられる。これは、あらかじめPCRや人工的な合成によって別途作製したプローブDNAを含む溶液を、スポッターまたはアレイヤーという特別の装置で数nlから数plの微小体積でチップ表面に並べ、基板上の特定領域にDNAを固定する技術である。あらかじめ末端に共有結合のための官能基を導入して調製された核酸を、表面処理した基板上の目標の位置にスポットして固定化するために、スポッターにはマイクロプレートに分注されたサンプルの一定量を数10μm〜数100μmの大きさで、目標として定められた位置に定量的にスポットできる性能が必要である。スポット方式としては、ピン先端の固相への機械的な接触によるピン（あるいはペン）方式、インクジェットプリンターの原理を利用したインクジェット方式、スポッター内に加熱によって泡（バブル）を生じさせてその圧を利用してサンプルを噴出させるバブルジェット（登録商標）方式、毛細管によるキャピラリー方式などが用いられることが多く、スポット処理した後は、必要に応じてＵＶ照射によるクロスリンク形成、表面のブロッキング、洗浄等の後処理が行われる。また、表面処理した固相に共有結合で固定化させるため、プローブとして用いられる核酸は末端に官能基としてアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、ビオチン等が導入されていることが多く、一方、基板の表面処理はアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有する各種シランカップリング剤で処理されていることが多い。
【０００７】
またこの他に、中空繊維配列体を用いたマイクロアレイの製造方法が開発されている。この方法では、貫通孔基盤を合成高分子から成る複数本の中空繊維を繊維軸方向に規則正しく配列させた中空繊維配列体を用いてマイクロアレイを製造する。この製法の一つの特徴としては、この中空繊維配列体の各中空繊維中空部にプローブとなる核酸を固定化しておき、この中空繊維配列体を繊維軸方向と垂直な方法で薄片化することで、同一ロットから同じ仕様のマイクロアレイ製品を大量に製造することが出来る（特許文献２）。
【０００８】
ハイブリダイゼーション技術を利用した核酸検出方法とは、例えば、核酸アレイに固定されている核酸プローブに対して、検査対象となる核酸試料を配列特異的にハイブリダイズさせ、配列特異的に形成したハイブリッドを蛍光物質等により検出し、複数の核酸プローブに対応する試料中の塩基配列を含む分子を、定量的又は定性的に調べる方法である。この方法は、複数の塩基配列に関する発現量又は特定の塩基配列の配列自体等の解析に利用される。
【０００９】
核酸を検出する際、通常は、予め設定した適切な条件下でハイブリダイゼーション反応を実施し、次いで洗浄工程により、アレイ表面に残存した核酸試料又はその他不要物の除去を行い、核酸プローブと特異的なハイブリッドを形成している核酸試料を検出する。核酸プローブは、配列解析、機能解析等、検出対象となる所望の核酸の有する塩基配列と相補又は同一に設計されることが多い。核酸プローブとしては、cDNA等の比較的長鎖の核酸、短鎖の合成オリゴ核酸等が使用される。合成オリゴ核酸を核酸プローブとして使用する場合、ヒトやマウスなど、遺伝子情報の知見が蓄積している生物については、それらの塩基配列情報を用い、各配列の相同性や機能などに着目した上で、合成オリゴ核酸の配列を設計し、核酸プローブを作製することが可能である。
【００１０】
このような核酸アレイは遺伝子発現、遺伝子多型等の遺伝子解析に供することが出来、生命現象の機構解明等の研究用途から疾病等の診断・治療、遺伝子の型を判別して行う品種判別等への応用が期待される。
【００１１】
近年、核酸の中でも、特にマイクロRNA（miRNA）を検出するための核酸アレイの販売、または受託解析サービス等が各社から提供され始めた。
miRNAは15〜25塩基の短い１本鎖RNAで、このmiRNAがmRNAの３末端のUTR領域に結合することで、様々な翻訳制御を行っていることが報告されている。miRNAの発見は1993年に始めて報告されているが（非特許文献２）、miRNAが上記のように翻訳制御機構において大きな役割をなしていることが発見されたのは、2001年である（非特許文献３、非特許文献４）。当初、miRNAは線虫、酵母などから発見されてきたが、現在はヒトやマウスで数百個発見されている。これらの配列は公知であり、公共のDBにアクセスすることにより、配列情報等を取得することができる（非特許文献５、非特許文献６）。いくつかのmiRNAは、機能（翻訳抑制機能）が解明されているが、多くのmiRNAの機能は不明である。
これまでに、miRNAの発現レベルは、ノーザンブロット解析や、クローニングなどの手法によって検索されてきたが、よりハイスループットな手法として、miRNA検出用のマイクロアレイが開発されてきている。
【００１２】
マイクロアレイを用いてmiRNAを検出するためには、標識効率を向上させる目的で、余分な鎖長のRNA分画を排除する必要がある。また、クロスハイブリダイゼーションを抑制する目的で、予めTotal RNAからmiRNAを含む200塩基以下程度の短鎖のRNA分画のみを分取し、それを標識してハイブリダイゼーションに供する必要がある。
短鎖RNAを分画するためのキットやプロトコールは、Ambion、Invitrogenなどの複数の企業から提供されている。例えば、短鎖RNAを分画するための手法としては、ゲルを用いて電気泳動した後、核酸の移動度に従って、短鎖RNAをゲルから切り出す分画方法、シリカゲルメンブレンやグラスファイバーで作製されたカラム等を用いた手法、アクリルアミドゲルの通過にかかる時間差によって、短鎖RNAのみを抽出する方法が知られている。
【００１３】
しかしながら、上記のような方法で精製された短鎖RNAは、分画操作の過程でRNAにどの程度のダメージが与えられたのかを確認することが困難である。また、Total RNAから短鎖RNAを分画する際に、何らかの事情で分解が進むと、本来は短鎖分画には含まれないはずの比較的長いRNAが分解されて短鎖になったことにより、長鎖RNA由来のRNA断片が短鎖分画に混入することも考えられる。そして、混入した長鎖RNA由来のRNA断片が、miRNA検出用プローブ群にクロスハイブリダイズすることにより、正確な検出結果を得ることができないおそれがある。しかし、現時点ではこのような事象に対する対策が取られていない。
【００１４】
Total RNAの品質を確認する方法としては、Total RNAを電気泳動した後に、28S リボゾーマルRNA由来のバンドと18SリボゾーマルRNA由来のバンドの濃度比（28S/18S比）を確認する方法が一般に用いられることが多い。しかし、短鎖RNA中には、28SリボゾーマルRNAや、18SリボゾーマルRNAが含まれないため、分画後に、28S/18S比を用いて短鎖RNAの分解の指標を得ることは出来ない。すなわち、この28S/18S比を用いるRNAの品質確認方法は、Total RNAの品質検査には採用できるものの、短鎖RNAやmRNAの品質検査には適用することができない。さらに、この比率は、加齢や、組織の種類などによっても変わるため、きわめて経験的な数値であるといえる。したがって、上記濃度比を確認する方法は、RNAの品質を確認するための有効な手法にはなりえない。
また、RNAの品質を確認する別の方法として、RNA試料への含有量の少ないRNAをPCRにより増幅し、それを定量する方法が知られている。しかし、この方法は、当該RNAに由来するシグナルが検出されない場合をRNA分解が進んでいることの指標とするものであるため、十分な信頼性が維持できないと考えられる。
【００１５】
さらに、電気泳動で確認したサンプルにおいて分解が確認されなかった場合でも、そのことは、続くアレイ実験のために行う数段階の工程を経たRNAが分解していないという保証とはならない。したがって、RNA試料の電気泳動では、アレイ実験から得られる最終的な出力データ中に、どの程度Total RNA分解の影響が包含されうるのかを検証することが出来ない。ここで、Total RNAの分解の影響とは、本来長鎖分画に含まれる配列が分解して短鎖化することにより短鎖分画に混入し、これらの内、miRNA検出用プローブと相同性が高いために、クロスハイブリダイゼーションを起こし、本来得られないはずのシグナルが検出されてしまうことを指す。
【特許文献１】特表平１０−５０５２４３号公報
【特許文献２】特許第３４８８４５６号公報
【非特許文献１】Biochem.J. 115(91)., 91-94, 1969
【非特許文献２】Cell 75(3)., 843-854, 1993
【非特許文献３】Cell 107(7)., 823-826, 2001
【非特許文献４】Cell 116(2)., 89-92, 2004
【非特許文献５】URL:http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/rnd/biocomp/DB1.HTM#RNADB
【非特許文献６】URL:http://www.ambion.com/techlib/resources/miRNA/mirna_list.html
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上記のように、RNAの品質は、それを用いた実験を行う上で非常に重要な要素であるにも関わらず、正確な検査手段が無かった。
本発明は、生物学的な実験において、その材料となるRNAの品質を検査することを可能にするRNAの分解度を測定する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、ハイブリダイゼーションの結果から、RNA試料の分解がどの程度進んでいるのかを確認するプローブ（分解指標核酸プローブ）を搭載することにより、RNA試料の分解度を確認できる核酸アレイを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、上記課題を解決するために、分解されていない状態では長鎖分画に含まれるRNAの塩基配列を元にして分解指標核酸プローブを設計し、これを核酸アレイに搭載し、短鎖分画を元とした試料核酸を核酸アレイに対してハイブリダイズさせた。その結果、分解指標核酸プローブのシグナルの有無によって、試料核酸の分解度を確認できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１８】
（１）RNA試料から所定の範囲の核酸長を有するRNA分画を抽出し、前記RNA分画に含まれる核酸の中から、前記所定の範囲の核酸長よりも長い鎖長を有するRNAに由来する核酸断片を検出することを含む、前記RNA試料の分解度を測定する方法。
ここで、核酸断片はハイブリダイゼーション法により検出することができる。
（２）分解指標核酸プローブが搭載されたRNA分解度測定用核酸アレイ。
本発明において、分解指標核酸プローブは、ハウスキーピングジーン、18SリボゾーマルRNAおよび28SリボゾーマルRNAからなる群から選択される少なくとも１つの核酸用のプローブである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、RNAの分解度を測定することが可能となり、RNAの品質を検査することが可能となった。
また、本発明により、RNA試料の分解度を測定できる核酸アレイを得ることができた。
【００２０】
本発明により、例えばハウスキーピングジーンなど、生体内に普遍的に、かつ多量に発現している核酸を、分解指標核酸プローブとして分解度の測定の指標として使用することが可能となった。
本発明により、Total RNAなどのRNA試料の電気泳動等を行わなくても、試料核酸の分解度を確認することが可能となった。
【００２１】
また、本発明の一態様において、本来長鎖分画に含まれる核酸が短鎖核酸分画に混入したと考えられるRNA試料由来のデータを除外することが可能となった。例えば、アレイシステムによるmiRNA検出結果のバリデーションを行うことが可能となった。また、短鎖RNAのハイブリダイゼーション結果がどの程度信頼性をもった結果となるのかを判断することが可能となった。
【００２２】
また、本発明の一態様において、miRNAなどの短鎖RNA分子をキャプチャーするプローブのシグナル強度を用いることによって、RNA分解度を相対的に定量化できることが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、RNA試料に含まれるRNAであって、分解されていない状態ではRNA試料の長鎖分画に含まれるRNA（以下、「分解指標核酸」ともいう）の分解を指標に用いて、RNA試料の分解度を測定する方法に関する。本発明の一態様を、図１を用いて説明する。本発明では、まず、RNA試料から短鎖側に属する所定の範囲の核酸長を有するRNA分画（以下、「短鎖分画」ともいう）を抽出する。RNA試料に分解が生じていると、分解が生じなければ本来長鎖分画に含まれているはずのRNA（分解指標核酸）由来の分解断片が短鎖分画に混入している。
次に、短鎖分画に含まれる核酸の中から、分解指標核酸に由来する核酸断片を、分解指標核酸プローブを用いて検出することにより、RNA試料の分解度を測定する。本発明の方法では、短鎖分画における分解指標核酸に由来する核酸断片の存在は、もとのRNA試料で分解が生じていることを意味する。
【００２４】
また、本発明は、分解指標核酸の塩基配列をもとに設計した分解指標核酸プローブが搭載された核酸アレイに関する。当該アレイは、上記方法に使用することができる。すなわち、RNA試料から抽出される短鎖分画を当該アレイに対してハイブリダイズさせ、分解指標核酸プローブのシグナルの有無によって、RNA試料の分解度を確認することができる。ここで、分解指標核酸プローブは、本来は短鎖分画に含まれないRNAに対するプローブであるため、当該プローブシグナルが検出されることは、RNAの分解によって短鎖分画に混入したRNA断片の存在を意味する。そして、プローブシグナルの強さは、RNA試料の分解度に関連する。
【００２５】
１．RNA試料
本発明において、RNA試料は分解度の測定対象となる試料を意味する。本発明において、RNA試料から抽出される短鎖分画がハイブリダイズに用いられる。
本発明において、RNA試料は、Total RNAでもよいし、mRNAでもよい。
【００２６】
RNA試料の由来は、特に限定されないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サルなどを挙げることができる。RNA試料は、これらの生体由来の臓器、組織、細胞、体液等から取得することができる。
Total RNAの取得方法およびmRNAの取得方法は、公知の方法に従って行うことができる。Total RNAの取得方法の一例を後述する。mRNAは、細胞溶解液からオリゴdTカラムを用いて取得することができる。また、Total RNAから抽出することもできる。
【００２７】
また、本発明において、RNA試料は、所定の範囲の核酸長を有するRNA試料でもよい。
所定の範囲の核酸長を有するRNA試料は、公知の方法に従って取得することができる。
【００２８】
（Total RNAの取得方法）
前述の通り、本発明では、Total RNAなどのRNA試料から抽出される短鎖分画を用いてRNA試料の分解度を測定する。したがって、Total RNAの製造手法は、短鎖分画に含まれる核酸を含有した状態で抽出できる手法またはキットであれば特に限定されず、当業者であれば、公知の方法から適宜選択することができる。本発明において、RNA試料は、例えば、AGPC法やそれに準じた手法によって組織や培養細胞などから、それぞれの特性に合わせて抽出されたものであることが望ましい。
【００２９】
また、取得したRNA試料は、品質を確認することができる。例えば、RNA試料がTotal RNAである場合は、Total RNA抽出後に、分光光度計を用いてA260/A280の値を計算した上で、核酸の純度を確認することが望ましい。その際、A260/A280の値が1.6以上であることが望ましい。
【００３０】
なお、RNA試料には、後述の補正用コントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブに対応する検体を添加してもよい。このように調製したRNA試料も、短鎖分画の抽出に使用することができる。
【００３１】
２．短鎖分画の抽出
本明細書において、短鎖分画とは、所定の範囲の核酸長を有するRNA分画を意味し、生物由来のRNA試料中に含まれる比較的短い範囲の核酸長を有する核酸群を指す。
【００３２】
短鎖分画は、RNA試料から、シリカゲルメンブレンやグラスファイバーを用いたカラム、もしくは電気泳動によって分画することが可能である。分画方法によって、短鎖分画に含まれる核酸の有する核酸長の範囲は異なる。
【００３３】
分画は、例えばTotal RNAから行う場合、電気泳動等では40塩基以下の分画を短鎖分画として抽出することが可能である。また、カラム等による分画の場合、200塩基以下の分画を再現性よく抽出し、短鎖分画として用いることが可能である。電気泳動の場合は、時間や電流、電圧値、ゲルの濃度などの変更により、上記の分画限界を変更することが可能である。また、カラムの場合は、核酸サンプル中の塩濃度、EtOHの含有率等を変更することにより、分画限界を変更することが可能である。
【００３４】
短鎖分画は、比較的短い範囲の核酸長を有する核酸を含むため、例えば、miRNAの検出に適している。
【００３５】
３．分解指標核酸に由来する核酸断片の検出
（１）分解指標核酸
本発明において、分解指標核酸は、分解されていない状態では長鎖分画に含まれるRNAである。言い換えると、分解指標核酸は、本来は短鎖分画に含まれない核酸長を有するRNAである。
【００３６】
RNA試料が分解されると、様々な核酸断片が生じ、分画指標核酸に由来する核酸断片も生じる。本発明において、短鎖分画中に存在する分解指標核酸に由来する核酸断片を検出することによって、RNA試料の分解度を測定することができる。
例えば、本発明のアレイを用いてRNA試料の分解度を測定する場合は、本発明の核酸アレイには、上記核酸断片を標的とする分解指標核酸プローブを搭載しておく。この分解指標核酸プローブは、分解指標核酸の塩基配列を基に設計することができる。RNA試料の分解度は、前記プローブからのシグナルを指標に用いて測定することができる。
【００３７】
本発明において、分解指標核酸は、完全長の配列が、短鎖分画を抽出する際の分画限界に比較して、十分に長い配列を有する核酸であることが望ましい。ここで、「分画限界」とは、短鎖分画を抽出するに当たり、その残渣としての長鎖分画と短鎖分画とを分画する核酸長を言う。
また、分解指標核酸は、内在性であり、且つどのような種類の組織においても普遍的かつ多量に存在している核酸配列が望ましい。
例えば、GAPDHや、β-Actin、Cyclophilin-B、G-6-PDH、HPRT、PBGDなどに代表されるハウスキーピングジーンや、18S ribosomal RNA、28S ribosomal RNAなど、比較的長いリボゾーマルRNAの配列が望ましい。これらの分子の配列情報は、NCBIなどのデータベースから入手することができる。また、3'末端配列がpolyAにより構成される、ハウスキーピングジーンなどの核酸配列から分解指標核酸を作製するのであれば、polyA RNAの分解度を測定することも可能である。
【００３８】
また、分解指標核酸プローブの標的となる核酸断片としては、分解が起きた際には、一定の割合で短鎖分画に混入する長さの配列であることが望ましい。
【００３９】
（２）検出方法
本発明において、分解指標核酸に由来する核酸断片は、ハイブリダイゼーション法、RT-PCR法などの公知の方法によって検出することができる。
本発明において、好ましい検出方法は、ハイブリダイゼーション法である。
【００４０】
（３）ハイブリダイゼーション法
本発明において、ハイブリダイゼーション法は、分解指標核酸に由来する核酸断片を検出できる方法であれば、公知の方法を用いることができる。例えば、プローブを固定化した核酸アレイ、メンブレンなどを用いた方法を挙げることができる。
【００４１】
（標識方法）
本発明において、核酸アレイ上のプローブまたはメンブレン上のプローブと反応させる短鎖分画に含まれる核酸または分解指標核酸由来の核酸断片を予め標識する。
標識に関しては、短鎖分画に含まれる核酸（例えば、miRNA）と分解指標核酸由来の核酸断片とが、理論上同じ程度に標識できる方法であれば、どのような方法でも適用が可能である。
【００４２】
ここで、Poly(A)ポリメラーゼ等を用いて核酸の3'末端部分を延長させる技術を介在した標識方法を採用する場合、仮に分解指標核酸プローブをハウスキーピングジーンなどのmRNAから設計し、且つ、設計位置が3'UTRなどのpolyA tail近傍で設計すると、分解指標核酸プローブのシグナルが恒常的に高いシグナル強度で検出される可能性が考えられるため注意が必要である。
【００４３】
PlatinumBright (Kreatech社)などのULS（Universal Linkage System）技術を用いて行われる標識方法はRNAの種類を問わないことから、miRNAプローブや、分解指標核酸プローブの検出に際しては望ましい形態である。この手法は、グアニン塩基に依存した標識方法であるため、標識される核酸にはグアニン塩基が１つ以上含まれる必要がある。したがって、どのようなプローブを設計する際にも、少なくともシトシン塩基を１つ以上含む（つまり、標的核酸にグアニン塩基が１つ以上含まれる）ように設計することが望ましい。
【００４４】
（ハイブリダイゼーションの条件）
短鎖核酸試料のハイブリダイゼーション条件は、核酸アレイ上またはメンブレン上に固定化されたプローブや、その標的となる短鎖分画に含有される核酸の配列によって異なるが、例えば、ナトリウムイオン濃度としては、50mMから1200mMの範囲内で、SDSやTweenなどの界面活性剤、ホルムアミドやベタインなどのクロスハイブリダイゼーションを防ぐための添加剤、サケ精子由来のDNAや牛血清由来のアルブミンなどのブロッキング剤を含むものが望ましい。
ハイブリダイゼーション時の温度は、核酸試料溶液の組成にもよるが、基本的には37℃から75℃程度の範囲内であることが望ましい。
【００４５】
（分解指標核酸プローブ）
本発明において、分解指標核酸プローブは、前記分解指標核酸に由来する核酸断片とハイブリッドを形成するものである。したがって、分解指標核酸プローブは、分解指標核酸の塩基配列から設計することができる。
【００４６】
miRNAプローブなどの短鎖分画プローブ群と、分解指標核酸プローブは同一条件下（例えば、同一のアレイ上）で評価を行うために、配列設計に際しては、分解指標核酸プローブの長さや、Tmなどのパラメータが、定量化対象となる短鎖分画プローブ群内でのばらつきの範囲内におさまることが望ましい。また、分解指標核酸プローブは、分解指標核酸中の任意の部位とハイブリダイズできるように、分解指標核酸の全長配列に対して網羅的に設計してもよい。
【００４７】
分解指標核酸プローブを設計する際には、短鎖分画内には存在しない配列で作成することが望ましい。例えばmiRNA検出用のアレイに分解指標核酸プローブを搭載する場合は、少なくともmiRNAの何れとも相同性の低い配列で設計することが望まれる。可能であれば、その他の短鎖RNA、例えば5SrRNA、5.8SrRNA、U1snRNA、U2snRNA、U3snRNA、U4snRNA、U5snRNA、U6snRNA、各種tRNAなどの配列に対して相同性の低い配列で設計することが望ましい。
【００４８】
設計したプローブは、市販のDNA自動合成装置により合成することができる。また、DNAの合成委託サービスを利用して製造することもできる。また、プローブは、5’末端ビニル化などの所定の修飾を施してもよい。5’末端ビニル化オリゴヌクレオチドは、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基が導入された5’-O-アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを合成し、無水メタクリル酸を反応させることで調製することができる。
【００４９】
（検出方法）
ハイブリダイゼーションのシグナルは、標識物質に適した方法で検出することができる。例えば、蛍光強度の検出は、冷却CCDカメラ方式の蛍光検出装置を用いて行うことができる。また、放射活性の検出は、オートラジオグラフィー、りん光発光等により行うことができる。
【００５０】
（４）核酸アレイ
本明細書において、核酸アレイは、複数の区画にオリゴヌクレオチド、cDNA等のキャプチャープローブ（以下、「プローブ」ともいう）を固定し、遺伝子の発現パターンのモニタリング、新規遺伝子のスクリーニング、遺伝子変異、多型の検出等を行うことができるデバイスを意味する。また、核酸アレイは、複数の核酸塩基配列に関する発現量又は特定の核酸塩基配列の配列自体を解析するためにも利用される。
核酸アレイを用いるハイブリダイゼーション法は、核酸アレイに固定されている複数の核酸プローブに対応する核酸試料中の標的核酸を、一度に定量的または定性的に調べる方法である。核酸プローブの標的となる核酸を検出するためには、まず、核酸プローブに対して検査対象となるRNA試料を配列特異的にハイブリダイズさせ、次に、個々の核酸プローブの配列特異的に形成したハイブリッドを、核酸試料に施した蛍光物質やそれに類する物質等に由来するシグナルにより検出すればよい。
【００５１】
核酸アレイの形態は様々なものが知られている。例えば、光リソグラフ技術を利用して、基板上に高密度でプローブを固定した核酸アレイ、ガラス基板等にスポッティングによりプローブを固定した核酸アレイ等が知られている。また、繊維型核酸アレイも知られている（特許第３５１０８８２号公報参照）。
【００５２】
本発明において、核酸アレイとしては、基板に複数の貫通孔が存在し、それら貫通孔にはゲルを介してプローブが固定されている核酸アレイが好適に使用される。そのような核酸アレイとしては、特開２０００−６０５５４号に記載の核酸アレイや、繊維型核酸アレイが例示できる。
【００５３】
以下に、繊維型核酸アレイについてより詳細に説明する。繊維型核酸アレイは、例えば、下記のａ）〜ｄ）の工程を経て作製することができる。
ａ）複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように配列し配列体を製造する工程。
ｂ）前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程。
ｃ）核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を該ブロック体の各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、核酸プローブを含むゲル状物を中空部に保持する工程。
ｄ）中空繊維の長手方向と交叉する方向で、切断してブロック体を薄片化する工程。
【００５４】
中空繊維材料としては、例えば、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系中空繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系中空繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系中空繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系中空繊維、ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリレート系中空繊維、ポリビニルアルコール系中空繊維、ポリ塩化ビニリデン系中空繊維、ポリ塩化ビニル系中空繊維、ポリウレタン系中空繊維、フェノール系中空繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系中空繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系中空繊維等が挙げられる。
【００５５】
上記中空繊維は、その長手方向が同一となるように３次元に配列される。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平１１−１０８９２８号公報参照）が挙げられる。また、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ねあわせ、それらの孔部に、中空繊維を通過させ、２枚の多孔板の間隔を開き、２枚の多孔板間の、中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させ硬化させる方法（特開２００１−１３３４５３号公報参照）が挙げられる。
【００５６】
次に、配列体はその配列が乱れないように包埋される。包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法、繊維同士を熱融着により接着する方法等が挙げられる。
次に、包埋された配列体の各中空繊維の中空部に、核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入し、中空部内で重合反応を行う。これにより中空部にゲルが保持され、ゲルには核酸プローブが固定される。
【００５７】
ゲル前駆体溶液としては、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の一種類以上と、架橋性モノマーとしてメチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等を含むものである。予め核酸プローブの末端を不飽和官能基で修飾しておけば、核酸プローブの末端を介してゲル前駆体と共重合することにより、ゲルの構成に核酸プローブが化学結合する（特開２００４−１６３２１１号公報参照）。
【００５８】
次に、中空繊維の長手方向と交叉する方向で、切断してブロック体を薄片化する。ここで作製された薄片は、核酸アレイとして使用できる。核酸アレイの厚みは、０．１ｍｍ〜１ｍｍ程度である。切断は、例えばミクロトーム、レーザー等により行うことができる。
【００５９】
上述の核酸アレイでは、中空繊維の中空部、すなわち核酸アレイの貫通孔中のゲルにプローブが固定されている。よって、プローブは、３次元構造体に固定されているため、プローブはある空間内に固定されていることとなる。プローブの固定されているこの周辺環境は、空間自由度を有し、さらには異なる種類のプローブは物理的な隔壁を隔てて固定されている。よって、上記核酸アレイは、平面基板上に高密度にプローブが固定されている核酸アレイと異なり、そこに搭載されたプローブはプローブとして十分に機能し、さらに隣接する種類の異なるプローブとの非特異的反応はない。したがって、プローブは、リンカー、スペーサー等のハイブリダイゼーションに関与しない余分な配列を結合する必要なく設計され、核酸アレイに固定することが可能である。
【００６０】
本発明において、プローブとして、短鎖分画に含まれる核酸を検出するためのプローブ（短鎖分画プローブ）および分解指標核酸プローブのほかに、シグナルを補正するためのコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブなどを搭載してもよい。コントロールプローブまたはネガティブコントロールプローブと、検査対象のRNAとのクロスハイブリダイゼーションが生じないように、前記プローブの配列は、検査対象のRNA配列と相同性の低いものを選択することが好ましい。このようなプローブは、例えば、検査対象とは異なる種に由来するRNAから設計することができる。相同性の値は、BLASTなどの公知ツールを用いて算出することができる。実際にクロスハイブリダイゼーションが生じないことは、本発明の方法を実施する前に確認しておくことが好ましい。
【００６１】
（５）判断基準
搭載された分解指標核酸プローブは、miRNAプローブなどの短鎖分画プローブ群と同様の方法で検出され、相対的に定量化されることが望ましい。
本発明において、RNA試料の分解の判断基準としては、分解指標核酸プローブのシグナル強度を指標とすることが望ましい。分解指標核酸プローブのシグナル強度が高ければ、その分、長鎖のRNAが分解されて短鎖分画に混入していると判断することができる。
【００６２】
検出結果から得られた分解指標核酸プローブのシグナル強度が非常に高い場合は、同アレイによって得られたデータを棄却するためのひとつの判断基準とすることができる。
【００６３】
本発明の別の態様において、予めRNA試料を様々な条件下で処理することにより、分解度の異なるRNA試料を作製し、このときの分解指標核酸プローブの強度を処理条件毎に比較することにより、処理条件とシグナル強度との関係を測定することもできる。
【００６４】
処理の手法としては、例えば、RNase、2価の陽イオン、凍結融解等を挙げることができ、それらの手法で複数の条件（例えば、時間、温度もしくは回数）別にRNA試料を処理する。また、市販のfragmentation bufferを用いてRNA試料を処理してもよい。次に、処理をしたRNA試料を元にして、短鎖分画を抽出、標識し、続いて、各条件別に複数枚の該分解指標核酸プローブが搭載された核酸アレイにハイブリダイズし、当該プローブのシグナル強度を比較する。これにより、RNA試料の分解度合いによってどの程度のシグナル増強が認められるかを確認することができる。また、RNA試料の分解度とシグナル強度との関係を示す検量線を引くことも可能である。
この場合、分解の度合いは、一定量（一定ユニット）のRNase存在下における処理時間や、断片化バッファーを用いた際の反応時間・温度、もしくは凍結融解の繰り返し回数等で表現することが可能となり、得られた検量線を元にして帰納的に分解の進行程度が未知であるTotal RNAの分解度をこれらのパラメーターを用いて表現することが可能である。
【００６５】
また、本発明の別の態様において、RNA試料から短鎖分画を抽出するための分画操作の成否を確認することもできる。本態様では、分画限界以上の長さとなるように人工的に設計した配列を含むRNAを、分解指標核酸として用いることができる。このようなRNAは、インビトロトランスクリプションなどによって合成することができる。そして、短鎖分画の抽出元となるRNA試料に分解指標核酸を添加し、当該核酸プローブとのハイブリッドを検出することにより、分画操作の成否を確認することができる。この場合、分解指標核酸プローブは、その人工合成RNAの配列を設計元とすることも可能である。
【００６６】
また、本発明の別の態様において、miRNAなどの短鎖RNA分子をキャプチャーするプローブのシグナル強度を用いることによって、RNA分解度を相対的に定量化することができる。もともと鎖長の短いmiRNAなどの短鎖RNA分子は分解されにくいため、シグナル強度はほぼ一定に保たれる傾向にある。したがってこの短鎖RNA分子のシグナル強度を指標に用いることで、RNA分解度を相対的に測定することが可能である。
【実施例１】
【００６７】
以下に、実施例により本発明をより具体例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６８】
（１）分解指標核酸プローブの設計
分解指標となる核酸プローブを設計するために、NCBIのウェブサイトから、Mouse 18S rRNAと、Mouse 28S rRNAの配列を得た。
本配列を元にして、下表の計１７種類の核酸を合成した（配列番号１〜１７）（表１）。設計に際しては、各核酸プローブのGC含量がある程度均一になるように留意し、また、各核酸プローブが、分解指標核酸の全長配列に対して均等に配置されるように設計した。これは、RNAが5'末端から、もしくは3'末端から、もしくは配列内部から切断されるため、場合によっては、どのような方法で切断されているのかが確認できるようにするためである。例えば、分解の多くが3'末端から起きる場合は、より5'末端よりのプローブが相対的に大きなシグナルを示す可能性が考えられるためである。逆に、分解の多くが5'末端から生じる場合は、より3'末端よりのプローブが相対的に大きなシグナルを示す可能性が考えられるためである。
【表１】
2008035779.tif 000002
【００６９】
（２）miRNAプローブ、及びコントロールプローブの設計
次に、Sanger Instituteのウェブサイトから、マウスのmature miRNA配列を１１種類得て、その配列を元にしてプローブを合成した（配列番号１８〜２８）（表２）。また、補正用コントロールプローブ（配列番号２９〜３４）、及びネガティブコントロールプローブ（配列番号３５〜３７）を合成した（表２）。補正用のコントロールプローブについては、ランダムな配列を設計した上で、Blast検索により、マウス生体由来のRNAとは相同性の低い配列を選んだ。また、ネガティブコントロールとしては、酵母由来のYLR377C遺伝子より設計した配列を元に設計した。事前にネガティブコントロールプローブがマウス生態由来のRNAと適切な条件下でクロスハイブリダイゼーションを生じないことを確認した。
【表２】
2008035779.tif 000003
【００７０】
（３）核酸アレイの作製
これらのオリゴDNA３７種類を用い、以下の手順で核酸アレイを作製した。
まず、プローブとなるオリゴヌクレオチドをDNA自動合成装置により合成した。
合成の際、最終段階で、アミノリンクTM（PEバイオシステムズ社製）を該オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基が導入された5’-O-アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。
次いで、それらオリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、5’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製した。
【００７１】
（４）中空繊維束薄片の製造
図２に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図２中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
まず、直径０．３２ｍｍの孔１１が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦横各１２列で合計１４４個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板２１を２枚準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維３１（三菱エンジニアリングプラスチック社製  カーボンブラック1質量%添加）を１本づつ、通過させた。
Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物４１で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
【００７２】
次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）の総重量に対し、２．５質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
ゲル充填中空繊維配列体の製造時に、表３に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を調製した。
【表３】
2008035779.tif 000004
【００７３】
次に、プローブ核酸を含むゲル前駆体重合性溶液をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の端部をこの溶液中に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を７０℃とし、３時間かけて重合反応を行った。
このようにしてプローブ核酸がゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
次に得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．５ｍｍの薄片シート（DNAマイクロアレイ）を５０枚得た。
【００７４】
（５）検体の作製
次に、核酸アレイのシグナル強度を補正するための６種類のコントロール検体（Cont1, 2, 4, 5, 6, 7）、及び分画が正しく行われていることを確認するための、１種類の長鎖検体（ssYLＲ377C 300b）の混合物を含む検体溶液を、下記表４に示す濃度で作製した。
【表４】
2008035779.tif 000005
６種類のコントロール検体は、上記で作製した補正用コントロールプローブ（補正用コントロール１，２，４，５，６および７）と完全相補であるオリゴDNAを作製したものを用いた。また、長鎖検体は、前述のネガティブコントロールプローブ全て（Negative control １，２および３）に対応するYLR377C遺伝子の300bからなる配列をPCR法により増幅し、増幅後にエキソヌクレアーゼ処理により、一本鎖化したものを用いた。なお、PCR法の際は、プライマーセットの中の一方のプライマーの5'末端をリン酸化して用いた。
【００７５】
（６）実験サンプルの調製
実験に用いるTotal RNAは、マウスの脳より、AGPC法により抽出したTotal RNA（１μg/μl）を用いた。
このTotalRNAをモデル的に分解するために、Fragmentation Buffer（Ambion社製）を用いて、以下の表５に示す各条件で断片化反応を行った。
【表５】
2008035779.tif 000006
その後、BioAnalyzer（アジレント社製）を用い、所定の方法で電気泳動を行い、Total RNAの分解を確認した。電気泳動の結果を図３に示す。断片化時間が増えるに伴い、電気泳動における移動度が早いものが増えていることがわかる。
【００７６】
次に、断片化反応を行ったTotal RNA 12.5μｇ中に、上記の検体溶液を10μｌ添加し、総量が50μｌになるように調製した。その後、RNeasy MinElute（キアゲン社製）を用い、以下の方法により、200b以下の短鎖核酸を分取した。
まず、上記で調製した50μｌの溶液に対し、250μｌのBufferRLTを入れ、30秒間攪拌した後、240μｌのエタノールを入れ、再度よく攪拌した。合計540μｌのサンプルを、RNeasy MinEluteのカラムに入れ、およそ10000×gで1分間遠心操作を行い、短鎖核酸のみが通過したカラム通過液を得た。次に、カラム通過液に対し、760μｌのエタノールを入れ、よく攪拌したものを、上記と同様の方法で、三回に分けて新しいRNeasy MinEluteのカラムに通過させ、カラムに短鎖核酸を吸着させた。そして、上述のカラムを、キットに添付のBuffer RPE 600μｌで洗浄後、600μｌのエタノールで三回洗浄し、最後にカラムを乾燥させた。乾燥させたカラムに対し、20μｌの水を滴下し、およそ10000×gで2分間遠心操作を行い、短鎖核酸を溶出した。
【００７７】
（７）短鎖分画の標識
短鎖分画に含まれる核酸の標識は、Platinum Bright : Nucleic Acid Labeling Kit(KREATECH社製)を用い、キット記載のプロトコールに従って行った。すなわち、上記（６）で得られた短鎖分画の16μｌを標識反応に供し、その後キット添付のカラムを用いて精製した。
【００７８】
（８）ハイブリダイゼーション
上記（７）の標識RNAに対し、20×SSC及び２％SDS溶液を各15μｌ混合し、液量が150μｌとなるように水を混合した。即ち、最終的な組成が２×SSC、0.2％SDSとなるように標識短鎖核酸溶液を調製した。標識短鎖核酸溶液を上記（３）および（４）で作製した核酸アレイに接触させ、溶液が蒸発しないように密封状態で、50℃で１６時間反応を行った。
【００７９】
（９）核酸アレイの洗浄
ハイブリダイゼーション反応終了後、２×SSC、0.2％SDS溶液１ｍｌに核酸アレイを浸漬することにより洗浄を行い、その後洗浄液を廃棄した。この工程を４０分間で４０回行うことにより、核酸アレイを洗浄した。次に、２×SSC溶液１ｍｌ中に核酸アレイを浸漬することにより洗浄を行い、その後、洗浄液を廃棄した。この工程を１０分間で１０回行うことにより、核酸アレイをさらに洗浄した。
【００８０】
（１０）核酸アレイの検出
検出は、冷却CCDカメラ方式の蛍光検出装置を用いて、ハイブリダイゼーション後の核酸アレイの各プローブスポットを画像化及び数値化した。
【００８１】
（１１）データの解析
数値化したアレイ検出結果を、図４に示す。
上記（６）の断片化反応を行わなかったTotal RNAについては、該分解指標核酸プローブスポットのシグナル強度は検出されないか、もしくは検出されても非常に弱いシグナルであった。これに対し、断片化反応の時間が長くなるに伴い、該分解指標核酸プローブ（18S rRNA及び28S rRNA）のシグナル強度が有意に増大することが示された（図４参照）。即ち、断片化されたRNA分子が、短鎖分画に移行することによって、該分解指標核酸プローブのシグナルが増強したといえる。
したがって、本発明の方法によって、RNAの分解度を測定できることが示された。
【００８２】
一方で、もともと鎖長の短いmiRNAをキャップチャーするプローブ（miRNAプローブ）のシグナル強度は変化がないか、もしくは若干シグナル強度が弱くなった（図４参照）。
よって、例えば、もともと短鎖であるRNA分子用プローブのシグナル強度を、補正の指標として用いることもできる。例えば、miRNAプローブのシグナル強度を用いて分解指標核酸プローブのシグナル強度を例えば割り算などの演算をすることにより、分解度を相対的に定量化することが可能となる。
したがって、本発明の方法により、miRNAなどの短鎖RNA分子をキャプチャーするプローブのシグナル強度を用いることによって、RNA分解度を相対的に定量化できることが示された。
【００８３】
また、本発明の方法は、例えば、ハウスキーピングジーンなど、生体内に普遍的且つ相対的に多量に発現しているものであれば分解度を測定する目安として使用することが可能であるため、Total RNAだけでなく精製したmRNA試料の品質検査に有用である。従来RNAの品質評価に用いられてきた18SリボゾーマルRNA、28SリボゾーマルRNAは、polyA tailを指標にして精製したRNAには含まれないため、従来の指標を用いて精製後の試料の品質評価を行うことが困難であった。本発明の方法は、ハウスキーピングジーンなども分解指標核酸に用いることができるため、精製後の試料における品質評価を行うことが可能となる。
【００８４】
また、本発明の方法は、核酸アレイを用いなくとも、ハイブリダイゼーションを検出できる方法である限りにおいては、他の公知の手法を用いることも可能である。
具体的な解析方法については特に限定しないが、例えばノーザンブロッティング法を用いる場合は、分解度を調べるRNA試料から短鎖分画を抽出し、任意の種類、濃度のゲルを用いて電気泳動を行った後、ナイロンメンブレンなどに電気泳動後のサンプルを転写し、メンブレンに対して標識を行った分解指標核酸プローブをハイブリダイゼーションした際に、複数のサンプル間で極端にシグナル強度の高く出るようなレーンに関しては、サンプルの分解が進んでいることが容易に判断できる。
【００８５】
また、RNA分解条件ごとに、シグナル強度との関係を示す検量線を引くことが可能である。そして、分解度が未知であるサンプルを上記と同様にハイブリダイズし、分解指標核酸プローブスポットのシグナル強度を測定する。、測定したシグナル強度を検量線に当てはめることで、RNAの分解度を、例えば、「４０℃断片化における所要時間」という形式で表現することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】本発明の一態様を示す概略図である。
【図２】中空繊維束を製造するための配列固定器具を示す図である。
【図３】電気泳動によりTotal RNAの分解を示す図である。
【図４】実施例におけるアレイの結果を示す図である。
【符号の説明】
【００８７】
１１・・・・孔
２１・・・・多孔板
３１・・・・中空繊維
４１・・・・板状物
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
配列番号１〜３７：プローブ
【図１】
2008035779.tif 000007
【図２】
2008035779.tif 000008
【図３】
2008035779.tif 000009
【図４】
2008035779.tif 000010
【配列表】
2008035779000001.app