(57)【要約】【課題】乳酸合成能力を有する微生物を用いた乳酸の製造方法において、乳酸の収量を効率的に向上させることを課題とする。【解決手段】乳酸合成能力を有する微生物を、葉酸を含む培地を用いて培養する乳酸の製造方法、及び葉酸を含む乳酸製造用培地を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸合成能力を有する微生物を培養する発酵によって乳酸を製造するための培地であって、葉酸又は葉酸前駆体を１０μｇ／Ｌ以上７０μｇ／Ｌ以下含む乳酸製造用培地。
【請求項２】
サトウキビの圧搾汁を含む請求項１に記載の乳酸製造用培地。
【請求項３】
微生物が酵母である請求項１又は２に記載の乳酸製造用培地。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の乳酸製造用培地を用いる乳酸の製造方法。
【請求項５】
乳酸合成能力を有する微生物を培養する発酵によって乳酸を製造する方法であって、葉酸又は葉酸前駆体を１０μｇ／Ｌ以上７０μｇ／Ｌ以下含む培地を用いる乳酸の製造方法。
【請求項６】
微生物が酵母である請求項５に記載の乳酸の製造方法。
【請求項７】
酵母がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母である請求項８に記載の乳酸の製造方法。
【請求項８】
酵母が、乳酸脱水素酵素遺伝子が導入された酵母である請求項６又は７に記載の乳酸の製造方法。
【請求項９】
乳酸脱水素酵素遺伝子が、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子である請求項８に記載の乳酸の製造方法。
【請求項１０】
Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子である請求項９に記載の乳酸の製造方法。
【請求項１１】
Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子の発現を可能とするプロモーターの下流に導入されている請求項９又は１０に記載の乳酸の製造方法。
【請求項１２】
Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入されている請求項９〜１１のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項１３】
微生物を２５〜３７℃の培地中で培養する請求項５〜１２のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を培養する発酵によって乳酸を製造するための培地ならびに微生物を培養する発酵による乳酸の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境問題の悪化が懸念される中、持続可能な資源循環型社会の構築が求められており、素材分野でも生物資源由来の材料を用いたグリーンプラスチックと呼ばれる工業原料の生産が盛んに行われている。それらの中でも乳酸を原料とするポリ乳酸は、優れた性質を持つポリマーとして注目され、次世代の素材として期待が集まっている。
【０００３】
原料となる乳酸は、主にショ糖、グルコース、でんぷん等を炭素源とする、発酵法によって製造されてきた。しかしながら、現段階では、生産量や生産収率などに多くの課題が残っており、ポリマー原料としての乳酸を市場に安定供給できるまでには至っていない。
【０００４】
酵母を用いた乳酸の発酵生産では、酵母を培養する培地として一般的に知られているＹＰＡＤ培地（非特許文献１）やＹＰＡＤに含まれている酵母エキス、ペプトンを、過剰に添加した培地で、培養を行うことにより、乳酸の生産量及び生産収率が向上することは良く知られている。しかしながらこのような培地における乳酸生産では、培地のコストが問題となっていた。
【０００５】
そこで、安価な培地を用いた乳酸製造に効果的な培地成分の検討が行われている。これまでに、乳酸生産性を向上させる培地成分としては、ニコチン酸（非特許文献２）や、脂肪酸（特許文献1および非特許文献３、４参照。）が提案されている。これらは、ニコチン酸は、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈ）が必要とする補酵素であるNADHの前駆体であることが、また脂肪酸は、乳酸生産時に酵母中の不飽和脂肪酸含有量が低下することが知られており、これらを添加することによって、培地中の炭素源あたりの乳酸生産収率を向上させているものである。
【０００６】
しかしながら、これらの方法を用いても、産業的に必要とされる乳酸の生産収率には至っておらず、培地価格も高価格のままである。また、酵母エキスやペプトンを用いることによって、乳酸生産後の生成過程の煩雑化など、実用化への課題が多く残っている。
【０００７】
従って、より効果的に乳酸の生産収率を向上させる方法が望まれている。
【特許文献１】特開２０００−３７１８５号公報
【非特許文献１】「メソッド  イン  イースト  ジェネティクス（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｖｏｌｕｍｅ１９４、１９９１年、１２〜１８頁
【非特許文献２】アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、７１、２７８９（２００５）
【非特許文献３】ジャーナル  オブ  バイオサイエンス  アンド  バイオエンジニアリング（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、９９、５１２（２００５）
【非特許文献４】アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、６９、１４９９（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、微生物を培養する発酵によって、乳酸を、低コスト且つ高い乳酸生産効率（対糖収率）で製造することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、乳酸合成能力を持つ酵母を用いた乳酸発酵において、葉酸を培地に添加することにより、高い対糖収率で乳酸を製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、乳酸合成能力を有する微生物を培養する発酵によって乳酸を製造するための培地であって、葉酸又は葉酸前駆体を１０μｇ／Ｌ以上７０μｇ／Ｌ以下含む乳酸製造用培地である。
【００１１】
本発明の乳酸製造用培地の好ましい態様は、サトウキビの圧搾汁を含むものである。
【００１２】
また、本発明の乳酸製造用培地の好ましい態様は、乳酸合成能力を有する微生物が酵母である。
【００１３】
また、本発明は、上記本発明の乳酸製造用培地を用いる乳酸の製造方法である。
【００１４】
さらに、本発明は、乳酸合成能力を有する微生物を培養する発酵によって乳酸を製造する方法であって、葉酸又は葉酸前駆体を１０μｇ／Ｌ以上７０μｇ／Ｌ以下含む培地を用いる乳酸の製造方法である。
【００１５】
本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様は、微生物が酵母である。より好ましい態様は、該酵母がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母である。
【００１６】
また、本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様は、酵母が、乳酸脱水素酵素遺伝子が導入された酵母である。また、本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様は、該乳酸脱水素酵素遺伝子が、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子である。また、本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様は、該Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子である。
【００１７】
また本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様は、上記Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子の発現を可能とするプロモーターの下流に導入されている。また、本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様は、Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入されている。
【００１８】
また、本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様は、微生物を２５〜３７℃の培地中で培養する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、微生物を培養する発酵によって、乳酸を、低コスト且つ高い乳酸生産効率で製造することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、乳酸合成能力を有する微生物を培養する発酵によって乳酸を製造するための培地であって、葉酸又は葉酸前駆体を１０μｇ／Ｌ以上７０μｇ／Ｌ以下含む乳酸製造用培地である。
【００２１】
本発明の乳酸製造用培地に含まれる葉酸又は葉酸前駆体の濃度は、１０μｇ／Ｌ以上７０μｇ／Ｌ以下である。好ましくは、培地中に葉酸又は葉酸前駆体を２０μｇ／Ｌ〜６０μｇ／Ｌ含むものであり、より好ましくは３０μｇ／Ｌ〜５０μｇ／Ｌ含むものである。
【００２２】
本発明の乳酸製造用培地に含まれる葉酸は、ビタミンM、ビタミンB9、プテロイルグルタミン酸とも呼ばれ、水溶性ビタミンに分類される生理活性物質である。葉酸は、微生物内で種々の還元を受け、ジヒドロ葉酸を経てテトラヒドロ葉酸に変換された後、主にＣ１代謝に関与する補酵素として作用する。
【００２３】
本発明の乳酸製造用培地において、葉酸は、葉酸を含有する天然物として含まれていても良い。葉酸を含有する天然物としては、緑黄色野菜をはじめ、サトウキビ、甜菜、キャッサバ、トウモロコシ等が挙げられ、これらのなかでもサトウキビを好ましく用いることができる。
【００２４】
また、葉酸は前躯体の形で培地中に含まれていてもよい。ここでいう葉酸の前駆体とは、培養中に微生物内または培養液中で葉酸に変換されるものをいう。葉酸の前躯体としては、例えばパラアミノ安息香酸や、テトラヒドロ葉酸、などが挙げられ、これらのなかでもパラアミノ安息香酸を好ましく用いることができる。
【００２５】
葉酸の培地への添加時期は、培養前でも培養開始後でもよく、添加回数も１回でも２回以上であっても良い。
【００２６】
本発明の乳酸製造用培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源および／又は無機塩類等を発酵原料として含んでいてもよい。また、本発明の乳酸製造用培地は、動植物煮出し汁、土壌や腐植質の抽出液等の天然物をほぼそのままの組成で利用する天然培地、市販されている化学品から調製される合成培地、合成培地に天然物を添加した半合成培地のいずれを用いても良い。
【００２７】
上記の炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有するデンプン、デンプン加水分解物、サトウキビやトウモロコシの圧搾汁、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、また酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなどを使用することができる。
【００２８】
これらの炭素源のなかでも、サトウキビの圧搾汁が好ましい。サトウキビの圧搾汁を例えば８０００ｒｐｍで遠心後、上澄を例えばヴィヴァフロー５０（ＶＩＶＡＦＬＯＷ）（サルトリウス・エー・ジー・バイオテクノロジー（Ｓａｔｏｒｉｕｓ ＡＧ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製）でろ過した透過液を用いることが、特に好ましい。サトウキビは、フィルター処理や、オートクレーブ処理などによって滅菌することができ、オートクレーブの回数は、一回でも複数回でも良い。また、サトウキビの中には葉酸が含まれている場合があり、上記の葉酸を含む天然物としてこれを添加して使用することもできる。サトウキビの圧搾汁は、特に微生物として酵母を用いる場合に、好ましい炭素源として用いることができる。
【００２９】
また、上記の窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硫酸アンモニウム等の硫酸塩類、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００３０】
また、上記の無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。
【００３１】
本発明において、使用する微生物が栄養要求性である場合、すなわち微生物が生育するために特定の栄養素を必要とする場合には、本発明の乳酸製造用培地は、その栄養素または該栄養素を含む物質もしくは該栄養素に変換される物質を含むことが好ましい。
【００３２】
微生物が栄養要求性である場合の必要とする栄養素の具体例としては、メチオニン、チロシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン、アスパラギン酸、バリン、セリン、アルギニン、ウラシル、アデニン、リシン、トリプトファン、ロイシン、ヒスチジン等が知られている。例えば、微生物が酵母である場合は、酵母が要求する栄養素は、ヒスチジン、ロイシン、リジン、トリプトファン、ウラシル、アデニンである。
【００３３】
栄養要求性を示す微生物が有する遺伝子型としては、メチオニン要求性：ｍｅｔ１、ｍｅｔ２、ｍｅｔ３、ｍｅｔ４、ｍｅｔ５、ｍｅｔ６、ｍｅｔ７、ｍｅｔ８、ｍｅｔ１０、ｍｅｔ１３、ｍｅｔ１４、ｍｅｔ２０、チロシン要求性：ｔｙｒ１、イソロイシン、バリン要求性：ｉｌｖ１、ｉｌｖ２、ｉｌｖ３、ｉｌｖ５、フェニルアラニン要求性：ｐｈａ２、グルタミン酸要求性：ＧＬＵ３、トレオニン要求性ｔｈｒ１、ｔｈｒ４、アスパラギン酸要求性：ａｓｐ１、ａｓｐ５、セリン要求性：ｓｅｒ１、ｓｅｒ２、アルギニン要求性：ａｒｇ１、ａｒｇ３、ａｒｇ４、ａｒｇ５、ａｒｇ８、ａｒｇ９、ａｒｇ８０、ａｒｇ８１、ａｒｇ８２、ａｒｇ８４、ウラシル要求性：ｕｒａ１、ｕｒａ２、ｕｒａ３、ｕｒａ４、ｕｒａ６、アデニン要求性：ａｄｅ１、ａｄｅ２、ａｄｅ３、ａｄｅ４、ａｄｅ５、ａｄｅ６、ａｄｅ８、ａｄｅ９、ａｄｅ１２、ＡＤＥ１５、リシン要求性：ｌｙｓ１、ｌｙｓ２、ｌｙｓ４、ｌｙｓ５、ｌｙｓ７、ｌｙｓ９、ｌｙｓ１１、ｌｙｓ１３、ｌｙｓ１４、トリプトファン要求性：ｔｒｐ１、ｔｒｐ２、ｔｒｐ３、ｔｒｐ４、ｔｒｐ５、ロイシン要求性：ｌｅｕ１、ｌｅｕ２、ｌｅｕ３、ｌｅｕ４、ｌｅｕ５、ヒスチジン要求性：ｈｉｓ１、ｈｉｓ２、ｈｉｓ３、ｈｉｓ４、ｈｉｓ５、ｈｉｓ６、ｈｉｓ７、ｈｉｓ８などが主に利用されている。
【００３４】
本発明の乳酸生産用培地に含まれる上記炭素源、窒素源、無機塩類、栄養素等の各成分は、培養開始時に一括して添加してもよいし、培養中分割してあるいは連続的に添加することもできる。また、消泡剤も必要に応じて使用する。
【００３５】
本発明の乳酸生産用培地の好ましい具体的な例として、表１に示す組成の培地（以下、ＭＭＦ３と略すことがある）、表２に示す組成の培地（以下、ＣＭＦ４培地と略すことがある）等があげられる。
【００３６】
【表１】
2008301766.tif 000002
【００３７】
【表２】
2008301766.tif 000003
【００３８】
ＭＭＦ３培地は、次のように調製することができる。例えば、表１に示された栄養素のうちビタミン類、金属塩についてはそれぞれフィルター処理により滅菌を、それ以外については、糖、アミノ酸及び核酸、無機塩類のグループに分け、グループごとにオートクレーブ処理により滅菌し、室温以下まで冷却した後、表１に示す濃度となるように調製する。葉酸は、フィルターろ過により滅菌し必要量を添加することができる。
【００３９】
ＣＭＦ４培地は、次のように調製することができる。例えば、まず、サトウキビの圧搾汁を８０００ｒｐｍで遠心後、上澄を例えばヴィヴァフロー５０（ＶＩＶＡＦＬＯＷ）（サルトリウス・エー・ジー・バイオテクノロジー（Ｓａｔｏｒｉｕｓ ＡＧ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製）でろ過し、サトウキビ圧搾汁ろ過液を調製しておく。次に、表２に示すアミノ酸、核酸及び硫酸アンモニウムをそれぞれオートクレーブにより処理して滅菌し、室温以下まで冷却した後、サトウキビ圧搾汁ろ過液と合わせ、表２に示す濃度となるように調製する。葉酸は、フィルター処理によって滅菌し、必要量を添加することができる。
【００４０】
本発明の乳酸生産用培地において使用される微生物としては、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌や乳酸菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００４１】
これらの微生物のうち、酵母が好適である。酵母としては、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母が挙げられる、さらにこのなかでも（Ｇｅｎｕｓ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母とサッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母が挙げられる。
【００４２】
本発明の乳酸生産用培地において使用される乳酸合成能力を有する微生物としては、乳酸脱水素酵素（乳酸合成素酵素）を有する微生物、乳酸脱水素酵素が導入された微生物等を用いることができる。例えば、乳酸脱水素酵素遺伝子が導入された酵母、大腸菌、コリネ型細菌や乳酸菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞及び昆虫細胞等が挙げられる。乳酸菌は、乳酸脱水素酵素遺伝子を導入せずに乳酸合成能力を有する微生物としてそのまま使用することができる。
【００４３】
本発明において、乳酸脱水素酵素を遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）とは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸を乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）に変換する活性を持つ乳酸脱水素酵素をコードしている遺伝子である。
【００４４】
乳酸脱水素酵素は、微生物の種類に応じてもしくは微生物内においても各種同族体が存在する。また、本発明において使用される微生物が有する又は微生物に導入される乳酸脱水素酵素には、天然由来の乳酸脱水素酵素の他、化学合成的あるいは遺伝子工学的手法で人工的に合成された乳酸脱水素酵素も包含される。  まず、天然由来の乳酸脱水素酵素としては、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来のもの、ウシ、カエルもしくはヒトなどの哺乳類を含む高等真核生物由来の乳酸脱水素酵素遺伝子にコードされるタンパク質からなる酵素を挙げることができる。これらのうち、カエル由来の乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子としては、アオガエル科（Ｒｈａｃｏｐｈｏｒｉｄａｅ）、アカガエル科（Ｒａｎｉｄａｅ）、アマガエル科（Ｈｙｌｉｄａｅ）、ジムグリガエル科（Ｍｉｃｒｏｈｙｌｉｄａｅ）、ヒキガエル科（Ｂｕｆｏｎｉｄａｅ）、クサガエル科（Ｈｙｐｅｒｏｌｉｉｄａｅ）、スキアシガエル科（Ｐｅｌｏｂａｔｉｎａｅ）、スズガエル科（Ｄｉｓｃｏｇｌｏｓｓｉｄａｅ）、コモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するｌｄｈ遺伝子が挙げられ、これらの中でもコモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するｌｄｈ遺伝子を用いることが好ましい。コモリガエル科に属するカエルの中でも、入手が容易であるゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来の乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子、特にＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であることがさらに好ましい。具体的には、特に好ましいｌｄｈ遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列を有するｌｄｈ遺伝子である。
【００４５】
また、本発明において微生物に導入されるｌｄｈ遺伝子には、遺伝的多型性や、変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。ここでいう遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいい、例えば、部位特異的変異導入用キット（Mutan-K（タカラバイオ社製））を用いる方法や、ランダム変異導入用キット（BD Diversify PCR Random Mutagenesis（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いる方法などがある。
【００４６】
さらに、酵素活性が強化された乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡが導入された微生物を用いることが好ましい。酵素活性が強化された乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡとしては、例えば、部位特異的変異導入法を用いた変異手法によって得られる酵素活性が強い乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡや、強力なプロモーターの支配下に乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡなどを挙げることができる。
【００４７】
本発明の乳酸の製造方法は、乳酸合成能力を有する微生物を培養する発酵によって乳酸を製造する方法であって、葉酸又は葉酸前駆体を１０μｇ／Ｌ以上７０μｇ／Ｌ以下含む培地を用いる製造方法である。
【００４８】
また、本発明の乳酸の製造方法は、前記の、葉酸又は葉酸前駆体を１０μｇ／Ｌ以上７０μｇ／Ｌ以下含む本発明の乳酸製造用培地を用いる製造方法である。
【００４９】
本発明の乳酸の製造方法において用いる葉酸又は葉酸前駆体は、前記前記本発明の乳酸生産用培地において使用されるものと同様である。葉酸は、葉酸そのものであっても、葉酸を含有する天然物を用いても、葉酸の前駆体であってもよい。
【００５０】
本発明の乳酸の製造方法は、葉酸又は葉酸前駆体を１０μｇ／Ｌ以上７０μｇ／Ｌ以下の濃度含む培地を用いる。前記本発明の乳酸生産用培地において使用されるものと同様に、好ましくは、葉酸又は葉酸前駆体の濃度を２０μｇ／Ｌ〜６０μｇ／Ｌ、より好ましくは３０μｇ／Ｌ〜５０μｇ／Ｌとする。
【００５１】
本発明の乳酸の製造方法において使用される微生物は、前記本発明の乳酸生産用培地において使用されるものと同様に、乳酸合成能力を有する微生物であって、乳酸脱水素酵素（乳酸合成素酵素）を有する微生物、乳酸脱水素酵素が導入された微生物等を用いることができる。微生物としては、前記と同様に、具体的には、酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられ、これらのなかでも酵母が好ましい。
【００５２】
本発明の乳酸の製造方法に用いられる微生物として酵母を用いる場合には、乳酸脱水素酵素（Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；乳酸合成酵素）をコードする遺伝子を遺伝子組み換え等の手法を用いて導入した酵母を用いることができるが、酵母が既に目的とする乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を有している場合は、必ずしも該遺伝子を導入する必要はない。
【００５３】
本発明の乳酸の製造方法で使用する酵母としては、乳酸脱水素酵素遺伝子を導入しうる酵母が好ましく、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属又はクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母が挙げられる。好ましくは、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であって、具体的には、ＮＢＲＣ１０５０５株、ＮＢＲＣ１０５０６株が好ましい。
【００５４】
酵母に導入する乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子としては、前記本発明の乳酸生産用培地において使用されるものと同様に、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来のもの、ウシ、カエルもしくはヒトなどの哺乳類を含む高等真核生物由来の乳酸脱水素酵素遺伝子を挙げることができる。これらのうち、カエル由来の乳酸脱水素酵素遺伝子としては、アオガエル科（Ｒｈａｃｏｐｈｏｒｉｄａｅ）、アカガエル科（Ｒａｎｉｄａｅ）、アマガエル科（Ｈｙｌｉｄａｅ）、ジムグリガエル科（Ｍｉｃｒｏｈｙｌｉｄａｅ）、ヒキガエル科（Ｂｕｆｏｎｉｄａｅ）、クサガエル科（Ｈｙｐｅｒｏｌｉｉｄａｅ）、スキアシガエル科（Ｐｅｌｏｂａｔｉｎａｅ）、スズガエル科（Ｄｉｓｃｏｇｌｏｓｓｉｄａｅ）、コモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するｌｄｈ遺伝子が挙げられ、これらの中でもコモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するｌｄｈ遺伝子を用いることが好ましい。コモリガエル科に属するカエルの中でも、入手が容易であるゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来の乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子、特にＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であることがさらに好ましい。具体的には、特に好ましい乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子としては、配列番号１に示す塩基配列を有するＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子である。
【００５５】
酵母への乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子の導入は、該遺伝子を遺伝子組み換え等の手法を用いて行うことができる。乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）を酵母に導入する方法としては、例えば、ｌｄｈ遺伝子をクローニングし、クローニングした該遺伝子を組み込んだ発現ベクターを酵母に形質転換する方法、クローニングした該遺伝子を染色体上の目的箇所に相同組換えで挿入する方法等が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００５６】
本発明で使用するｌｄｈ遺伝子をクローニングする方法としては特に制限はなく、既知の手法を用いることができる。例えば、既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法や、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。また、既知のタンパク質情報に基づき化学合成的又は遺伝子工学的に合成する方法も可能である。
【００５７】
クローニングしたｌｄｈ遺伝子を組み込む発現ベクターとしては、酵母で汎用的に利用される発現ベクターを用いることができる。酵母で汎用的に利用される発現ベクターとしては、酵母細胞内での自立的複製に必要な配列、大腸菌細胞内での自立的複製に必要な配列、酵母選択マーカー及び大腸菌選択マーカーを有しており、また、組み込んだｌｄｈ遺伝子を発現させるために、その発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター又はエンハンサー等のいわゆる調節配列をも有していることが望ましい。
【００５８】
ここで、酵母細胞内での自立的複製に必要な配列とは、例えば、酵母の自立複製開始点（ＡＲＳ１）とセントロメア配列の対もしくは酵母の２μmプラスミドの複製開始点であり、大腸菌内での自立的複製に必要な配列とは、例えば、大腸菌のＣｏｌＥ１複製開始点である。また、酵母選択マーカーとしては、ＵＲＡ３又はＴＲＰ１等の栄養要求性相補的遺伝子もしくはＧ４１８耐性遺伝子又はネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられ、大腸菌の選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。調節配列としては、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＧＡＰＤＨターミネーターが挙げられる。しかしながら、発現ベクターはこれらに限定されるものではない。
【００５９】
上記Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、発現ベクターの該遺伝子を発現可能にするプロモーターの下流に導入することが好ましい。得られたｌｄｈ遺伝子発現ベクターを、後述する方法により酵母に形質転換することにより、ｌｄｈ遺伝子を酵母に導入することができる。
【００６０】
また、Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ｐｄｃ１遺伝子）のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入することが好ましい。ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子をプロモーターの下流に相同組み換えで挿入する方法としては、ｌｄｈ遺伝子の上流及び下流に、導入目的箇所に相同的な部分を付加するようにデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片を後述する方法により酵母に形質転換する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、形質転換株の選択を容易にするために、上記ＰＣＲ断片には酵母選択マーカーが含まれることが好ましい。
【００６１】
ここで用いるＰＣＲ断片を調整する方法は、例えば、下記（１）〜（３）のステップ１〜３の工程により行うことができる。その概略を図１に示す。
【００６２】
（１）ステップ１：ｌｄｈ遺伝子の下流にターミネーターがつながったプラスミドを鋳型とし、プライマー１，２をセットとしてｌｄｈ遺伝子及びターミネーターを含む断片をＰＣＲで増幅する。プライマー１は、導入目的箇所の上流側に相同的な配列４０ｂｐ以上を付加するようデザインし、プライマー２は、ターミネーターより下流のプラスミド由来の配列をもとにデザインする。好ましくは、プライマー１に付加する導入目的箇所の上流側に相同的な配列は、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ｐｄｃ１遺伝子）の上流に相同的な配列である。
【００６３】
（２）ステップ２：酵母選択マーカーを持つプラスミド、例えばｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２６等を鋳型として、プライマー３，４をセットとして酵母選択マーカーを含む断片をＰＣＲで増幅する。プライマー３は、ステップ１のＰＣＲ断片のターミネーターより下流の配列と相同性のある配列が３０ｂｐ以上を付加するようにデザインし、プライマー４には、導入目的箇所の下流側に相同的な配列４０ｂｐ以上を付加するようデザインする。好ましくは、プライマー４に付加する導入目的箇所の下流側に相同的な配列は、ｐｄｃ１遺伝子の下流に相同的な配列である。
【００６４】
（３）ステップ３：ステップ１，２で得られたＰＣＲ断片を混合したものを鋳型とし、プライマー１，４をセットとしてＰＣＲを行うことにより、両末端に導入目的箇所の上流側及び下流側に相同的な配列が付加された、ｌｄｈ遺伝子、ターミネーター及び酵母選択マーカーを含むＰＣＲ断片が得られる。好ましくは、前記ＰＣＲ断片は、両末端にｐｄｃ１遺伝子の上流及び下流に相同的な配列が付加された、ｌｄｈ遺伝子、ターミネーター及びマーカー遺伝子を含むＰＣＲ断片である。
【００６５】
上記で得られたｌｄｈ遺伝子発現ベクターまたはＰＣＲ断片を酵母に導入するには、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクションまたはエレクトロポレーション等の方法を用いることができる。具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法やプロトプラスト法等がある。
【００６６】
得られた形質転換株の培養方法としては、例えば、「M.D. Rose et al.,"Methods In Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)」等に記載されている既知の方法を用いることができる。ｌｄｈ遺伝子発現ベクター又はＰＣＲ断片が導入された酵母は、発現ベクター又はＰＣＲ断片が有する酵母選択マーカーによって、栄養非添加培地又は薬剤添加培地で培養することにより選択することができる。
【００６７】
本発明のｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を培養することにより、培地中に乳酸を製造することができる。
【００６８】
導入する発現ベクターを酵母内に保持させるのであれば、選択マーカーによる選択圧をかけた培地を用いることが好ましい。培地としては、例えば、ベクターの持つ選択マーカーに符号するアミノ酸を除去した合成培地などが挙げられる。特に好ましい培地は、炭素源としてグルコースを１〜１０％、窒素源としてYeast Nitrogen Base without amino acid（DIFCO社製）を０．６７％含有し、適切なアミノ酸を添加した合成培地である。
【００６９】
本発明の乳酸の製造方法において、微生物の培養は、振とう培養もしくは撹拌培養などで行うことができる。さらに、培養形態として、回分培養、半回分培養、連続培養などで行うことができる。酸素供給条件は特に限定されるものではないが、好気的条件下あるいは微好気条件下で行うことができる。培養温度は摂氏２５〜３５度がよく、培養時間は、通常２４時間〜５日間である。培養中の培養液のｐＨは２．５〜５．０に保持することが望ましく、このｐＨの調整は、アルカリ溶液、アンモニア、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム等を用いて行うことができる。
【００７０】
本発明の乳酸の製造方法において、葉酸の培地への添加は、培養前でも培養開始後でもよく、また葉酸の添加回数は１回でも２回以上であってもよい。また、上記炭素源、窒素源、無機塩類、栄養素等の各成分は、培養開始時に一括して添加してもよいし、培養中分割してあるいは連続的に添加することもできる。また、消泡剤も必要に応じて使用してもよい。
【００７１】
乳酸の製造に際しては、まず、本発明の酵母を前培養し、前培養液を新しい培地に移して本培養することにより、培養液中に乳酸を製造することができる。培養温度は、菌株の増殖が実質的に阻害されず乳酸を生産し得る範囲であれば特に制限されるものでないが、好ましくは摂氏２０〜４０度の範囲の温度であり、より好ましくは摂氏２５〜３７度の範囲の温度であり、さらに好ましくは摂氏３０〜３４度である。培養には、静置、撹拌または振とうのいずれの方法も採用し得る。
【００７２】
上記のような条件で培養することにより、培地中に１〜２０％の乳酸を得ることができる。得られた乳酸の測定法に特に制限はないが、例えば、ＨＰＬＣを用いる方法や、Ｆ-キット（ロシュ社製）を用いる方法などがある。
【００７３】
本発明において、乳酸脱水素酵素活性とは、ピルビン酸とＮＡＤＨを乳酸とＮＡＤ＋に変換する活性を示す。また限定されるわけではないが、乳酸脱水素酵素活性は比活性を指標として比較できる。すなわち、ｌｄｈ遺伝子導入方法及び遺伝的バックグラウンドが同じ酵母を同条件で培養し、培養菌体から抽出したタンパク質を用いてＮＡＤＨの減少に伴う３４０ｎｍにおける吸光度の変化を測定する。その際に、室温において１分間当たりに１μｍｏｌのＮＡＤＨを減少させる酵素量を１単位（Ｕｎｉｔ）と定義する事により、乳酸脱水素酵素の比活性は式（１）であらわせる。ここで、Δ３４０は１分間あたりの３４０ｎｍの吸光度の減少量、６．２２はＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数である。
【００７４】
【数１】
2008301766.tif 000004
【００７５】
得られた培養液中の乳酸は、従来から知られている方法によって、精製することができる。例えば、微生物を遠心分離した発酵液をｐＨ１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着、洗浄した後、溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとしてから蒸留する方法、カルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などがある。
【００７６】
また培地中の葉酸濃度は、例えば以下に示す条件でHPLCにより測定できる。
【００７７】
カラム：TSK-GEL ODS−８０TM ４．６×２５０ｍｍ
移動相：A＝０．３％リン酸水溶液、B=アセトニトリル
検出方法：電気伝導度
温度：５０℃
【実施例】
【００７８】
以下、上記ｌｄｈとしてカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子、酵母としてサッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を選定して具体的な実施形態を示し、本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７９】
（参考例１： 乳酸合成能力を持つ酵母の造成）
ｌｄｈ遺伝子として、配列番号１に示す塩基配列を有するゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のｌｄｈ遺伝子を使用した。ｌｄｈ遺伝子のクローニングはＰＣＲ法により行った。ＰＣＲには、ゼノプス・レービスの腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（STRATAGENE社製）より付属のプロトコールに従い調製したファージミドＤＮＡを鋳型とした。
【００８０】
ＰＣＲ増幅反応には、KOD-Plus polymerase（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記のように付属のプロトコールに従い調整したファージミドＤＮＡを５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びKOD-Plus polymeraseを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号２，３）は、５末端側にはＳａｌＩ認識配列、3末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【００８１】
ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をT4 polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて行った。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ｌｄｈ遺伝子が挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従い行った。
【００８２】
上記ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、定法に従いｌｄｈ遺伝子を含む断片を精製した。得られたｌｄｈ遺伝子を含む断片を、図２に示す発現ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法でプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断することにより、ｌｄｈ遺伝子が挿入された発現ベクターを選抜した。以後、このようにして作成したｌｄｈ遺伝子を組み込んだ発現ベクターをｐＴＲＳ１０２とする。
【００８３】
得られた発現ベクターｐＴＳ１０２を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号４，５）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ｌｄｈ遺伝子及びＧＡＰＤＨターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（図１のステップ１に相当）。ここで配列番号４は、ｐｄｃ１遺伝子の上流６５ｂｐに相同性のある配列が付加されるようデザインした。
【００８４】
次に、プラスミド酵母選択用マーカーを持つプラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号６，７）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＴＲＰ１遺伝子を含む１．２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。ここで、配列番号７は、ｐｄｃ１遺伝子の下流６５ｂｐに相同性のある配列が付加されるようデザインした。
【００８５】
それぞれのＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた各１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号：４，７）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、ｌｄｈ遺伝子、ＧＡＰＤＨターミネーター及びＴＲＰ１遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。
【００８６】
上記のＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、酵母サッカロミセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換し、トリプトファン非添加培地で培養することにより、ｌｄｈ遺伝子が染色体上のｐｄｃ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【００８７】
上記のようにして得られた形質転換株が、ｌｄｈ遺伝子が染色体上のｐｄｃ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号７，８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記ｌｄｈ遺伝子が染色体上のｐｄｃ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、Ｂ２株とする。
【００８８】
（比較例１：葉酸を添加しないＭＭＦ３培地を用いたＬ−乳酸生産性テスト）
表１に示した最小合成培地（以下、ＭＭＦ３と略す）１０ｍＬを試験管に取り、そこに参考例１において作成した少量のＢ２株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前々培養）。次に、ＭＭＦ３培地１００ｍＬを５００ｍｌ容三角フラスコにいれ、各前々培養液をそれぞれ全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前培養）。続いて、ＭＭＦ３培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養開始から２４時間後の前培養液をそれぞれ全量植菌した。培養は攪拌速度（１２０ｒｐｍ）、通気量（０．１Ｌ／ｍｉｎ）、温度（３０℃）、ｐＨ（ｐＨ５）を一定にして行った（本培養）。本培養開始後１０時間毎の培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、下記に示す条件でＨＰＬＣによりＬ−乳酸の生産量を測定した。測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図３に、乳酸生産収率（対糖収率：培地中に投入した炭素源あたりの乳酸生産量）を表３に示した。
【００８９】
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ（島津社製）
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM ＥＤＴＡ・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【００９０】
（実施例１：葉酸を添加したＭＭＦ３培地を用いたＬ−乳酸生産性テスト１）
比較例１と同様に前培養液まで調製し、葉酸１０μｇとＭＭＦ３培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例１と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図３に、乳酸生産収率（対糖収率）を表３に示した。
【００９１】
（実施例２：葉酸を添加したＭＭＦ３培地を用いたＬ−乳酸生産性テスト２）
比較例１と同様に前培養液まで調製し、葉酸３０μｇとＭＭＦ３培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例１と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図３に、乳酸生産収率（対糖収率）を表３に示した。
【００９２】
（実施例３：葉酸を添加したＭＭＦ３培地を用いたＬ−乳酸生産性テスト３）
比較例１と同様に前培養液まで調製し、葉酸４０μｇとＭＭＦ３培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例１と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図３に、乳酸生産収率（対糖収率）を表３に示した。
【００９３】
（実施例４：葉酸を添加したＭＭＦ３培地を用いたＬ−乳酸生産性テスト４）
比較例１と同様に前培養液まで調製し、葉酸５０μｇとＭＭＦ３培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例１と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図３に、乳酸生産収率（対糖収率）を表３に示した。
【００９４】
【表３】
2008301766.tif 000005
【００９５】
比較例１、実施例１〜４の結果、葉酸非添加条件下（比較例１）では乳酸の生産収率が４０．２％であるのに対し、葉酸を添加条件下（実施例１〜４）では乳酸の生産収率（対糖収率）が向上した。特に、葉酸３０μｇ／Ｌ添加条件下（実施例３）では、乳酸の生産収率は５７．３％まで向上した。葉酸の添加が乳酸の生産収率向上に効果的であった。
【００９６】
（比較例２：葉酸を添加しないＣＭＦ４培地を用いたＬ−乳酸生産性テスト）
参考例１において作製したＢ２株を用いて、次のように、葉酸を添加した培地を用いた乳酸発酵試験を行った。
【００９７】
表２に示した組成の培地（以下、ＣＭＦ４培地と略す）１０ｍＬを試験管に取り、そこに少量のＢ２株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前々培養）。次に、ＣＭＦ４培地１００ｍＬを５００ｍｌ容三角フラスコにいれ、各前々培養液をそれぞれ全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前培養）。続いて、ＣＭＦ４培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養開始から２４時間後の前培養液をそれぞれ全量植菌し、攪拌速度（１２０ｒｐｍ）、通気量（０．１Ｌ／ｍｉｎ）、温度（３０℃）、ｐＨ（ｐＨ５）を一定にして培養を行った（本培養）。本培養開始後１０時間毎の培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、比較例１と同様の方法でＨＰＬＣによりＬ−乳酸量を測定した。測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図４に、乳酸生産収率（対糖収率）を表４に示した。
【００９８】
（実施例５：葉酸を添加したＣＭＦ４培地を用いたＬ−乳酸生産性テスト１）
比較例２と同様に前培養液まで調製し、葉酸１０μｇとＣＭＦ４培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例１と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図４に、乳酸生産収率（対糖収率）を表４に示した。
【００９９】
（実施例６：葉酸を添加したＣＭＦ４培地を用いたＬ−乳酸生産性テスト２）
比較例２と同様に前培養液まで調製し、葉酸３０μｇとＣＭＦ４培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例１と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図４に、乳酸生産収率（対糖収率）を表４に示した。
【０１００】
（実施例７：葉酸を添加したＣＭＦ４培地を用いたＬ−乳酸生産性テスト３）
比較例２と同様に前培養液まで調製し、葉酸４０μｇとＣＭＦ４培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例１と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図４に、乳酸生産収率（対糖収率）を表４に示した。
【０１０１】
（実施例８：葉酸を添加したＣＭＦ４培地を用いたＬ−乳酸生産性テスト４）
比較例２と同様に前培養液まで調製し、葉酸５０μｇとＣＭＦ４培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例１と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図４に、乳酸生産収率（対糖収率）を表４に示した。
【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
比較例２、実施例５〜８の結果、葉酸非添加条件下（比較例２）では乳酸の生産収率が６５．３％であるのに対し、葉酸を添加条件下（実施例５〜８）では乳酸の生産収率（対糖収率）が向上した。特に、葉酸を３０μｇ／Ｌまたは５０μｇ／Ｌ添加した条件下（実施例５、７）では、乳酸の生産収率は７１％まで向上した。葉酸の添加が乳酸の生産収率向上に効果的であった。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明によれば、乳酸合成能力を持つ微生物を用いた乳酸の発酵生産において、乳酸生産量（対糖収率）が向上し、効率的に乳酸を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、ｐｄｃ１遺伝子プロモーター下流にｌｄｈ遺伝子を導入する方法を説明する概略図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる酵母発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【図３】図３は、ＭＭＦ３培地における葉酸の添加による乳酸生産量増加効果を表すグラフである。横軸は培養時間、縦軸はＬ−乳酸の生産量を表す。
【図４】図４は、ＣＭＦ４培地における葉酸の添加による乳酸生産量増加効果を表すグラフである。横軸は培養時間、縦軸はＬ−乳酸の生産量を表す。
【配列表フリーテキスト】
【０１０６】
配列番号１―カエル由来Ｌ-乳酸脱水素酵素：ＤＮＡ
配列番号２―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
2008301766.tif 000007
【図２】
2008301766.tif 000008
【図３】
2008301766.tif 000009
【図４】
2008301766.tif 000010
【配列表】
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