(57)【要約】【課題】励起光の観察光路への入射を妨げ、励起光と蛍光をより正確に分離できる蛍光キューブおよびその蛍光キューブを備えた蛍光顕微鏡を提供する事を目的とする。【解決手段】  本発明の上記課題は、蛍光試料に対応する励起光を透過する励起フィルタと、可視光を含む波長領域で高反射率を有するミラーと、前記励起光を反射し、かつ前記蛍光試料からの蛍光を透過するダイクロイックミラーと、前記蛍光を透過する吸収フィルタを含んで構成されることを特徴とする蛍光キューブによって達成される。【選択図】  図１
2008111914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光試料に対応する励起光を透過する励起フィルタと、
前記励起フィルタを透過した前記励起光をダイクロイックミラーに入射するように反射する全反射ミラーと、
前記励起光を反射し、かつ前記蛍光試料からの蛍光を透過するダイクロイックミラーと、
前記蛍光を透過する吸収フィルタを含んで構成されることを特徴とする蛍光キューブ。
【請求項２】
前記ミラーは、前記励起フィルタを透過した前記励起光を前記ダイクロイックミラーに４５度より小さい入射角度で入射するように反射することを特徴とする請求項１に記載の蛍光キューブ。
【請求項３】
蛍光試料に対応する励起光を透過する励起フィルタと、
前記励起光を反射して前記蛍光試料からの蛍光を透過する分光特性を有する２つのダイクロイックミラーと、
前記蛍光を透過する吸収フィルタを含んで構成されることを特徴とする蛍光キューブ。
【請求項４】
前記２つのダイクロイックミラーにおける励起光の入射角度は等しいことを特徴とする請求項３に記載の蛍光キューブ。
【請求項５】
請求項１から請求項４の何れかに記載の蛍光キューブを備えることを特徴とする蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光顕微鏡の技術分野に係り、特に、励起光と蛍光の高分離能を有する蛍光キューブおよび前記蛍光キューブを備えた蛍光顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光顕微鏡は、観察したい試料内の特定の蛍光物質に光源からの励起光を照射する事により特定の蛍光物質を励起させて生じる蛍光を観察する為に用いる。ここで生じる蛍光は、非常に強度が微弱である為に蛍光以外の光を取り除く工夫がなされている。
【０００３】
以下で一般的な蛍光顕微鏡の全体構成図およびその原理について図４を参照しながら述べる。
一般的な蛍光顕微鏡では、白色光を発生する光源1（例えば水銀ランプ）からの光をコレクタレンズ2で集光し、落射投光管光学系４の中の開口絞り３の位置に結像させた後、視野絞り５で照明光が調節され、蛍光キューブＦに導かれる。この蛍光キューブＦのなかに備えられた特定のスペクトルを選択的に透過させる励起フィルタによって、試料中の蛍光物質を励起させる励起光のスペクトルを選択する。その後、励起光を反射し蛍光を透過するように設計されたダイクロイックミラー8で励起光を反射させ、対物レンズ9を経由し、ステージ10上の試料11に照射させる。そして、ステージ10上の試料11においては、その特有の励起光スペクトルに対応する試料中の蛍光物質が励起され、特定の波長を有する蛍光を発する。試料11から発生した特有の波長を有する蛍光は、対物レンズ9を経由して、ダイクロイックミラー8を透過し、吸収フィルタ12を透過する。吸収フィルタ12では、試料11から発した蛍光の波長以外の光を除去することによって、ダイクロイックミラー８を透過してしまった漏れ光をカットする。そして、特有の波長を有する蛍光は、結像レンズ13で集光されて像を結び、撮像素子14において、その蛍光の像を記録あるいは観察することができる。なお、一般的には励起光よりも蛍光の方が波長は長い。
【０００４】
図５では、図４における従来の蛍光キューブ内の励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタのそれぞれの位置関係を示している。
図５では、蛍光キューブＦ内において励起フィルタに対して垂直に励起光が入射するように励起フィルタ7を配置し、その後、試料に対して垂直に励起光を入射させる為にダイクロイックミラーに対し45度で励起光が入射するようにダイクロイックミラー8を配置し、また、吸収フィルタに対して垂直に蛍光が入射するように吸収フィルタ12を配置することを示している。ここで、各フィルタを光に対して垂直に配置するのは、光の選択あるいは遮断効率を良くし、適切な光の波長の選択を行うためである。一般に光学フィルタは光線が垂直に入射するときに最適な効果を発揮するように設計され、斜め方向から光が入射する場合では、垂直に光が入射した場合に比べ、選択あるいは遮断する波長特性が変化する。これは一般に各フィルタが誘電体多層膜からなる干渉フィルタで構成されているからである。誘電体多層膜からなる干渉フィルタは光の干渉効果を利用して光の反射と透過の特性を制御しているため、干渉フィルタに入射する光の角度によって特性が変化する。これは誘電体多層膜中の実効的な屈折率がP偏光とS偏光で異なること、また、角度により誘電体多層膜中の光路長が変化するためである。基本的にはこの変化量は垂直入射からの角度をθとするとcos(θ)に比例するため、垂直に近い場合は変化が小さく、角度が大きくなるにしたがって急速に変化する特徴を持つ。
【０００５】
このことによる従来の蛍光キューブの問題点について図６を参照しながら述べる。
図６では、照明光16が励起フィルタ7を垂直に透過することで観察したい試料の蛍光物質に対応した励起光が選択される。そして、ダイクロイックミラー8に４５度の入射角で入射する事によって大部分の励起光は、試料に向けて反射される。一方で、一部の励起光15は、ダイクロイックミラー8を透過することで直進し、蛍光キューブ内壁面の反射防止膜6にぶつかり散乱光を生じる。この散乱光は、本来、吸収フィルタ12に垂直に入射した場合に吸収フィルタ12で遮光されるべき波長領域の光であるにも関わらず、吸収フィルタ12に斜めから入射することによって、吸収フィルタ12の遮光する波長領域が短波長側に変化してしまい、散乱光が、吸収フィルタ12を透過してしまう。したがって、吸収フィルタ12を透過した散乱光が、観察光路上に入射することで蛍光像の背景を明るくしコントラストを劣化させてしまう。このように微弱な蛍光を観察する場合には無視できない効果をあらわしてしまうと言う問題が生じる。
【０００６】
この問題を、蛍光キューブＦ内の各フィルタ7、12およびダイクロイックミラー8での遮光および反射と透過について透過率と波長の観点から図７のグラフを用いてさらに説明する。
【０００７】
図７では、縦軸に透過率(％)、横軸に波長（nm）をとっており、例として、実線を励起フィルタ7、一点鎖線をダイクロイックミラー8、鎖線を吸収フィルタ12として、それぞれに対する光の透過率と波長の関係を表している。ただし、ここでは光が各フィルタ7、12に垂直に入射し、ダイクロイックミラー8には４５度の角度で入射した場合を想定していることを注意されたい。
【０００８】
図７では、試料内の蛍光物質を励起させる励起光の波長領域を波長ｋからｍの範囲として選択できるような励起フィルタ7を用いる。また、ダイクロイックミラー8は、波長ｌ以下の光を反射し、波長ｌ以上の光を透過するような物を用いる。ここで、ダイクロイックミラー8の透過率／波長変位曲線上に透過率が波長によって変わらない領域Ｃが生じるが、これは、ダイクロイックミラー8を透過する励起光のＰ偏光とＳ偏光の透過率が異なっている為に生じる。このP偏光とS偏光の透過率の差異は、干渉フィルタであるダイクロイックミラー8に励起光が45度の角度をもって入射することに起因している。そして、波長ｍ以上の波長領域にある光を選択的に透過させ、波長ｍ以下である光を遮光する吸収フィルタ12を用いる。この時、試料から発する蛍光は波長ｍ以上となることを想定している。したがって、励起光よりも蛍光の方が、波長が長くなる為に励起フィルタ7と吸収フィルタ12で励起光（波長領域ｋ〜m）と蛍光(波長領域ｍ以上)の分離が可能となる。
【０００９】
従来の蛍光キューブでは、光源からの光が励起フィルタ７によって波長領域ｋからｍまでの励起光のみが抽出される。次に、励起フィルタ7で選択された励起光が、ダイクロイックミラー8に入射する訳であるが、ここでは、波長領域ｌ以上の光が透過し、それ以外の波長領域ｌ以下の光を反射する事になる。つまり、励起フィルタ7を透過した励起光の領域Ａに当たる部分がダイクロイックミラー8で反射され、一方で領域Ｂに当たる部分が、ダイクロイックミラーを透過する事になる。この領域Ｂの部分が、図６でも上述したように蛍光像の背景を明るくする原因となる。
【００１０】
領域Ｂに当たる透過光は、蛍光キューブ内の反射防止膜で散乱され、その散乱光が吸収フィルタ12に入射することになる。このとき垂直方向から入射するならば、遮光する波長領域は波長ｍ以下であるので、この散乱光は吸収フィルタ12によって遮光される。しかし、散乱光が、吸収フィルタ12に斜めから入射する時は、吸収フィルタの見掛けのコート厚が変わり、そのことにより透過する波長領域が短波長側にシフトすることで領域Ｂにある波長の光を透過してしまう。この事で試料から発した微弱な蛍光を鮮明に観察できなくなる。
【００１１】
この問題の解決方法として、ダイクロイックミラー8における光の透過率を設計で調節して、励起光をほぼ完全に反射させて透過させないようにすることで上記の問題を解決できる場合がある。例えば、ダイクロイックミラー8のコート層数を増加する事が挙げられる。しかし、この方法は、ダイクロイックミラー8の原価を高くする事やコート層の増加によりダイクロイックミラーに反りが生じる事で経済的および技術的な困難がある。また、反射波長帯が狭くなることで用いる励起光の波長を制限されたり、励起光の反射率が低くなる事で光の利用効率が悪くなったりしてしまう等の問題がさらにここで生じてしまう。この視点による発明として特許文献１がある。
【００１２】
また、特許文献２では、偏光顕微鏡の偏光キューブにおいてハーフミラーでの反射特性を高めた構成が開示されている。以下に図８を参照して、この簡単な構成および原理を述べる。
【００１３】
図８の偏光顕微鏡の偏光キューブＰは、光源からの光16を特定の振動面を持つ直線偏光にする為の偏光子19、偏光子19を透過した直線偏光をハーフミラー21に向けて反射する全反射ミラー20、偏光子19を透過した直線偏光を試料に向けて反射し、且つ、試料に入射する事によって振動面の方向が変化した偏光を透過させるハーフミラー21、反射防止膜6、特定の振動面を持つ光のみを通して直線偏光にする検光子22によって構成される。
【００１４】
上記公報に開示された発明と、以下に説明する本発明では形態上の類似が見られるが、利用される光学素子が、それぞれ、励起フィルタと偏光子、ダイクロイックミラーとハーフミラー、吸収フィルタと検光子、という全く異なる光学素子によって構成されているために、課題や効果も大きく異なっている。
【００１５】
なお、特許文献３においても本発明との形態上の類似が見られるが、利用される光学素子がホログラムなどの回折光学素子を使った構成であり、課題や効果も大きく異なっている。
【特許文献１】特開２００６−３８９４０公報
【特許文献２】特表平７−５０１６３３公報
【特許文献３】特開２００３−１５０５1公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従来の励起フィルタとダイクロイックミラーと吸収フィルタ、反射防止膜で構成した蛍光キューブでは、蛍光キューブのダイクロイックミラーで反射せずに透過した励起光が、蛍光キューブ内で散乱され、その散乱光が吸収フィルタを透過し、観察光路へ入射することで蛍光像の背景が明るくなり、試料から発する微弱な蛍光が鮮明に観察しにくいという問題があった。したがって、本発明では、励起光と蛍光の高分離能を有し、励起光の反射効率を高め、観察光路に透過する励起光を少なくする蛍光キューブを提供する事および前記蛍光キューブを蛍光顕微鏡に備える事を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の上記課題は、蛍光試料に対応する励起光を透過する励起フィルタと、前記励起フィルタを透過した前記励起光をダイクロイックミラーに入射するように反射する全反射ミラーと、前記励起光を反射し、かつ前記蛍光試料からの蛍光を透過するダイクロイックミラーと、前記蛍光を透過する吸収フィルタを含んで構成されることを特徴とする蛍光キューブによって達成される。このとき、前記ミラーは、前記励起フィルタを透過した前記励起光を、前記ダイクロイックミラーに45度より小さい入射角度で入射するように反射することが望ましい。この様に配置することによって、Ｐ偏光とＳ偏光の透過率の違いによる分離特性の低下を抑えることが出来る。
【００１８】
また、上記課題は、蛍光試料に対応する励起光を透過する励起フィルタと、前記励起光を反射し、かつ前記蛍光試料からの蛍光を透過する分光特性をもつ２つのダイクロイックミラーと、前記蛍光を透過する吸収フィルタを含んで構成されることを特徴とする蛍光キューブによっても達成される。このとき、２つのダイクロイックミラーにおける励起光の入射角度は等しいことが望ましい。
【００１９】
また上記の何れかに記載の蛍光キューブを備えることによってＳＮ比の優れた蛍光顕微鏡が提供される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によればダイクロイックミラーを透過してしまう励起光が観察光路に入射する事を妨げることができる。したがって、従来から問題となっていたダイクロイックミラーを透過した励起光により背景コントラストが明るくなってしまうことを解消することができる。この事により、背景コントラストが暗くなり、試料から発する蛍光をより鮮明に観察できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明では、励起光が観察光路に入射することを妨げる事を目的として、励起光と蛍光の高分離性能を有する蛍光キューブおよび前記蛍光キューブを備えた蛍光顕微鏡を提供する。
【００２２】
以下では、図面を参照ながら本発明の実施例について説明する。
【実施例１】
【００２３】
図１では、本発明の実施態様の一つとして、励起光の分離特性の高く、励起光が観察光路に入射しないような蛍光キューブの構成例を示している。なお、本発明では、蛍光キューブＦ内で複数のミラーを用いて励起光の分離特性を高めるとするが、図１における本実施態様では、例として2枚のミラーを用い、第一の反射部材23としてダイクロイックミラーあるいは全反射ミラーを用い、第二の反射部材24としてダイクロイックミラーを用いるものとする。
【００２４】
以下に、本発明である励起光の分離効率の高い蛍光キューブＦの構成と原理を述べる。
図１の蛍光キューブＦにおいて第二の反射部材24で励起光の分離特性を高めるために、励起フィルタ７を透過した特定の波長を有する励起光16を第一の反射部材23、例えばダイクロイックミラーあるいは全反射ミラーで反射させ、第二の反射部材24、例えばダイクロイックミラー、に45度より小さい角度で入射させる。第二の反射部材24では、45度より小さい角度で励起光が入射する事によって励起光のＰ偏光とＳ偏光の透過率の違いが生じにくくなり、その結果より良い分離特性を得ることが出来る。また、第二の反射部材24を透過した一部の励起光15が、45度より小さい入射角で吸収フィルタ12に入射する事で、吸収フィルタ12への入射角の違いによる透過波長の短波長側へのシフトが起こりにくく、より効率的に遮光する事が可能となる。
【００２５】
ここで、上記の第一の反射部材23と第二の反射部材24の配置について補足する。従来型の蛍光キューブにおいては、1枚のダイクロイックミラーによって励起光を反射させるために、配置角度の自由度がなかった。しかし、本発明の実施における構成例では第一の反射部材と第二の反射部材の二つによって反射をさせるために配置角度に自由度がある。図１に示される構成例のように、第一の反射部材23によって上方に反射させた後に第二の反射部材24によって下方に反射させる構成では、第一の反射部材に対する入射角度と第二の反射部材に対する入射角度の和が４５度になればよい。つまり、第一の反射部材に対する入射角度を４５度に近くすることによって、第二の反射部材に対する入射はほぼ垂直に構成できる。すなわち、第一の反射部材を全反射ミラーとし第二の反射部材をダイクロイックミラーとした場合は、第二の反射部材への入射角度を小さくなるように構成することによって、本発明の効果をより発揮することが出来る。また、第一の反射部材と第二の反射部材の両方をダイクロイックミラーとした場合は、両者の入射角度を均等になるように構成することによって、発明の効果を高めることも出来る。
【００２６】
以上を、本発明の蛍光キューブＦ内の各フィルタ7、12および第二の反射部材24における遮光および反射と透過について透過率と波長の観点から図２のグラフを用いて説明し、従来の蛍光キューブである図７と比較を行うことにする。
【００２７】
図７では、図７と同様に縦軸に透過率(％)、横軸に波長（nm）をとっており、例として、実線を励起フィルタ７、一点鎖線を試料へむけて励起光を反射する第二の反射部材24、鎖線を吸収フィルタ12として、それぞれに対する光の透過率と波長の関係をグラフとして表している。ただし、ここでは光が各フィルタ7、12に垂直に入射した場合を想定していることを注意されたい。
【００２８】
図２では、励起光の波長領域を波長ｋからｍの範囲として選択できるような励起フィルタ7を用いる。また、第二の反射部材24では、波長ｌ以下の光を反射し、波長ｌ以上の光を透過するような物を用いる。ここで、第二の反射部材24としてダイクロイックミラーを用いると透過率／波長変位曲線上に透過率が波長によって変わらない領域Ｃが生じるが、これは、ダイクロイックミラーを透過する励起光のＰ偏光とＳ偏光の透過率が異なっている為に生じる。しかし、本発明ではダイクロイックミラー24に励起光が45度より小さい角度で入射することによって、図７と比較して、領域Ｃで示される部分は少なく抑えられる。
【００２９】
本発明の実施による蛍光キューブＦでは、光源からの光が励起フィルタ7によって波長領域ｋからｍまでの励起光のみが抽出される。次に、励起フィルタ7で選択された励起光が、第一の反射部材である全反射ミラーやダイクロイックミラーで反射されて第二の反射部材24であるダイクロイックミラーに入射する。このとき、上述の領域Ｃが少なくなった結果として、励起フィルタの透過率を示す領域とダイクロイックミラーの透過率を示す領域の交差領域Ｂは少なくなる。つまり、励起光と観察光をより正確に分離することが出来ている。
【００３０】
また、この領域Ｂに対応する光量が、吸収フィルタ12を透過すると蛍光像の背景を明るくしてしまう原因となるが、本発明の実施の構成例では、ほぼ垂直に近い角度で吸収フィルタ12に入射することで、設計どおりにほぼ完全に遮光される。
【００３１】
以上により、励起光の分離特性が良くなり、さらに透過した励起光が吸収フィルタ12で遮光されやすくなる。結果的に、観察光路への励起光の入射を妨げることで背景コントラストは暗くなり蛍光の観察がしやすくなる。
【００３２】
ここで本実施態様では、蛍光キューブＦ内に複数のミラーを配置する事で励起光の反射効率を高めることの例として第一の反射部材23を全反射ミラーやダイクロイックミラーとしたが、これらに限定する訳ではなく、同等の試料に向けて励起光を全反射し、第二の反射部材24に対して45度より小さい角度で励起光を入射すると言う役割を果たすミラーであれば何でも構わない、且つ、ミラーを何枚用いても構わない。また、第二の反射部材24に関しても、例としてダイクロイックミラーとしたが、これと同等な役割を果たすものであれば何でも構わない。
【実施例２】
【００３３】
本実施態様では、実施例１で述べた本発明の蛍光キューブＦを備えた蛍光顕微鏡について、図３を参照しながら説明する。
本発明の蛍光キューブを備えた蛍光顕微鏡では、白色光を常に発生する光源1（例えば水銀ランプ）から発する照明光をコレクタレンズ2で集光し、落射投光管光学系４の中の開口絞り３の位置に結像させた後に、視野絞り５で照明光が調節され、本発明の実施例１によって説明された蛍光キューブＦに導かれる。
【００３４】
蛍光キューブＦに入射された後は、実施例１に述べられているように、照明光の中から励起フィルタ7で特定のスペクトルを選択的に透過させる。その後、励起光を第一の反射部材23で反射させて第二の反射部材24に45度より小さい角度で励起光を入射させる。そして、第二の反射部材24では、試料にむけて大部分の励起光を反射される。その後、励起光は対物レンズ9を透過し、ステージ10上の試料11に入射する。そして、ステージ10上の試料11においては、特定の励起光スペクトルに対応する試料中の蛍光物質が励起され、特定の波長を有する蛍光を発する。試料11から発生した蛍光は、対物レンズ9とダイクロイックミラー8を再び透過し、吸収フィルタ12を透過する。吸収フィルタ12では、試料11から発した蛍光の波長以外の励起光を除去する。そして、蛍光は、結像レンズ13で集光されて像を結び、撮像素子14で像を記録あるいは観察することができる。
【００３５】
以上のように、励起光と蛍光の高分離能および高い励起光の反射率を有する蛍光キューブとそれを備える蛍光顕微鏡を記載した。本発明は、特定の実施形態としての参考例を記載してきたが、様々な修正および変化を発明の範囲や概念の域を超えることなく、これらの実施形態に対して施すことができるのは明らかである。したがって、本明細書および図は、限定的な意味では無く、具体例としてみなされるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の一つの実施態様として、励起フィルタと複数のミラーとして2枚のミラーと吸収フィルタから構成される励起光の反射効率を高めた蛍光キューブを示している。
【図２】本発明の一実施態様として、図６で示した本発明の蛍光キューブにおける励起フィルタ、第二の反射部材、吸収フィルタにおけるそれぞれの励起光の透過率と波長の関係を表しているグラフである。
【図３】本発明の一実施態様として、図６で示した本発明の蛍光キューブを備えた蛍光顕微鏡の全体構成図である。
【図４】一般的な蛍光顕微鏡の全体構成を示している。
【図５】一般的な蛍光顕微鏡に備えられている蛍光キューブの構成を示している。
【図６】一般的な蛍光顕微鏡に備えられている蛍光キューブにおけるダイクロイックミラーでの励起光の反射と透過および励起光の吸収フィルタの透過を示している。
【図７】一般的な蛍光顕微鏡に備えられている蛍光キューブにおける励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタにおけるそれぞれの光の透過率と波長の関係を表しているグラフである。
【図８】偏光顕微鏡に備えられている偏光キューブ内の構成を変化させ、ダイクロイックミラーにおける励起光の反射効率を高めた図である。
【符号の説明】
【００３７】
１・・・光源
２・・・コレクタレンズあるいはコリメータレンズ
３・・・落射投光管光学系
４・・・開口絞り
５・・・視野絞り
Ｆ・・・蛍光キューブ
６・・・反射防止膜
７・・・励起フィルタ
８・・・ダイクロイックミラー
９・・・対物レンズ
１０・・・ステージ
１１・・・試料
１２・・・吸収フィルタ
１３・・・結像レンズ
１４・・・撮像素子
１５・・・ダイクロイックミラーを透過した励起光
１６・・・照明光
Ａ・・・ダイクロイックミラーにおいて励起光を反射する領域
Ｂ・・・ダイクロイックミラーにおいて励起光を透過する領域
Ｃ・・・励起光のＰ偏光とＳ偏光に透過率の違いによって生じる透過率が一定になる領域
Ｐ・・・偏光キューブ
１９・・・偏光子
２０・・・全反射ミラー
２１・・・ハーフミラー
２２・・・検光子
２３・・・第一の反射部材
２４・・・第二の反射部材
【図１】
2008111914.tif 000003
【図２】
2008111914.tif 000004
【図３】
2008111914.tif 000005
【図４】
2008111914.tif 000006
【図５】
2008111914.tif 000007
【図６】
2008111914.tif 000008
【図７】
2008111914.tif 000009
【図８】
2008111914.tif 000010