(57)【要約】【課題】核酸等の対象化合物を合成可能であり、かつ合成された該対象化合物のみを、その分子を破壊することなく分離し、高収率で得ることができる対象化合物合成用基材の提供。【解決手段】本発明の核酸合成用基材は、ケトピメリン酸構造を末端に有するリンカーが基材に結合されてなり、前記リンカーを介して前記基材に対象化合物を合成可能である。前記リンカーが、中性条件下で切出し可能であるのが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケトピメリン酸構造を末端に有するリンカーが基材に結合されてなり、前記リンカーを介して前記基材に対象化合物を合成可能であることを特徴とする対象化合物合成用基材。
【請求項２】
リンカーが、中性条件下で切出し可能である請求項１に記載の対象化合物合成用基材。
【請求項３】
リンカーの切出しが、ヒドラジン含有溶液中で行われる請求項２に記載の対象化合物合成用基材。
【請求項４】
下記式（１）で表される請求項１から３のいずれかに記載の対象化合物合成用基材。
【化１】
2008201742.tif 000012
【請求項５】
核酸合成用であって、式（１）で表される請求項４に記載の対象化合物合成用基材の末端水酸基と、ヌクレオシドのデオキシリボースにおける水酸基とが脱水縮合反応して得られ、下記式（２）で表される請求項１から３のいずれかに記載の対象化合物合成用基材。
【化２】
2008201742.tif 000013
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸等の対象化合物を合成可能であり、かつ合成された該対象化合物のみを、その分子を破壊することなく分離可能な対象化合物合成用基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の固相（自動）合成は、２０年以上も前から行われており、自動合成装置もその時点で販売されていたが、現在でも、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ等、機能性人工核酸の蛍光標識等の修飾のため、より緩やかな条件で核酸を得ることができる核酸原料（アミダイド）及びＣＰＧ等の固相担体の改良が行われている。
前記核酸の固相合成は、例えば、ヌクレオシドを結合させた固相担体（例えば、ＣＰＧ）に、核酸原料（アミダイド）を縮合反応させていくことにより行われるが、このとき、前記固相担体にリンカーを導入し、該リンカーを介して前記固相担体に核酸を合成する。また、合成後に、前記リンカーを切り出すことにより、前記核酸のみを分離して回収している。
【０００３】
しかし、前記リンカーの切出しは、通常、塩基性条件（アンモニア処理）で行われるため、得られる合成物（核酸）の分子が破壊してしまうことがあるという問題があった。例えば、濃アンモニア水を用いた強塩基性条件で、前記リンカーの切出しを行うと（非特許文献１参照）、前記分子の破壊が顕著となる。
また、弱塩基性条件で、切出し可能なリンカーとして、下記構造を有するものが報告されているが（非特許文献２参照）、この場合でも、ｐＨ＝１０のアルカリ水溶液が必要であり、かつ環境への負荷が大きいパラジウム（Ｐｄ）を用いて、予めアリル基の脱保護を行うことが必要であり、実用的ではなかった。
【化３】
2008201742.tif 000002
【０００４】
したがって、核酸等の対象化合物を合成可能であり、かつ合成された該対象化合物のみを、その分子を破壊することなく切出し可能なリンカーを有する対象化合物合成用基材は、未だ提供されていないのが現状であり、更なる開発が望まれている。
【０００５】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ２５，３６２９−３６３５（１９９７）
【非特許文献２】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ２４，２７９３−２７９８（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来における前記問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、核酸等の対象化合物を合成可能であり、かつ合成された該対象化合物のみを、その分子を破壊することなく分離し、高収率で得ることができる対象化合物合成用基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するための手段としては、後述する付記に列挙した通りである。即ち、
本発明の対象化合物合成用基材は、ケトピメリン酸構造を末端に有するリンカーが基材に結合されてなり、前記リンカーを介して前記基材に対象化合物を合成可能であることを特徴とする。
該対象化合物合成用基材においては、前記リンカーの末端における前記ケトピメリン酸構造にて、前記リンカーの切出しを容易に行うことができ、合成対象となる前記対象化合物のみを、その分子を破壊することなく、前記対象化合物合成用基材から分離し、回収することができる。このため、前記対象化合物が、例えば、核酸である場合、回収された核酸は、例えば、ＰＣＲ用プライマー、配列決定用プライマー、ハイブリダイゼーション用プローブ、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ等の各種機能性核酸として、好適に使用することができる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、従来における問題を解決することができ、核酸等の対象化合物を合成可能であり、かつ合成された該対象化合物のみを、その分子を破壊することなく分離し、高収率で得ることができる対象化合物合成用基材を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（対象化合物合成用基材）
本発明の対象化合物合成用基材は、ケトピメリン酸構造を末端に有するリンカーが基材に結合されてなり、前記リンカーを介して前記基材に対象化合物を合成可能である。
【００１０】
−対象化合物−
前記対象化合物とは、合成対象となる化合物を意味し、前記リンカーを介して前記基材に結合されて生成される。
前記対象化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、核酸が好適に挙げられる。
【００１１】
−基材−
前記基材としては、その形状、構造、大きさ、材料（材質）などについては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記基材としては、例えば、固相レジンが挙げられ、ＣＰＧ（controlled  pore  glass）、ポリマーサポートなどが好ましい。
前記基材は、市販品であってもよいし、適宜合成してもよい。
【００１２】
−リンカー−
前記リンカーは、前記基材と前記対象化合物とを連結する機能を有する。
前記リンカーとしては、βーケトエステル構造を末端に有する限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、４−ケトピメリン酸が好適に挙げられる。
【００１３】
本発明の前記対象化合物合成用基材においては、前記リンカーが、中性条件下にて切出し可能であるのが好ましい。この場合、前記対象化合物のみを、該対象化合物にダメージを与えることなく（該対象化合物の分子を破壊することなく）、前記基材及び前記リンカーから分離して得ることができる点で、有利である。
前記中性条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ｐＨが、６〜８であるのが好ましい。
前記ｐＨが、６未満あるいは８を超えると、得られる対象化合物にダメージを与える（該対象化合物の分子を破壊する）ことがある。
【００１４】
前記リンカーを切り出す方法としては、該リンカーにおける分子の化学結合を切断することができる限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヒドラジン含有溶液中で行うのが好ましい。
前記ヒドラジン含有溶液におけるヒドラジンの濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１Ｍ以上が好ましく、０．５Ｍ以上がより好ましい。
前記濃度が、０．１Ｍ未満であると、前記リンカーの切出しを充分に行うことができないことがある。
前記ヒドラジン含有溶液としては、ヒドラジンを含む限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヒドラジン−酢酸緩衝溶液が好適に挙げられる。
【００１５】
前記対象化合物が核酸である場合、前記リンカーと前記核酸とは、核酸における２’位にてβ−ケトエステル結合により結合されているのが好ましい。この場合、エステル結合における酸素原子間の結合が容易に切断され、前記対象化合物合成用基材から核酸のみを分離することができる。
【００１６】
本発明の前記対象化合物合成用基材の具体例としては、例えば、下記式（１）で表されるものが好適に挙げられる。
【化４】
2008201742.tif 000003
【００１７】
また、前記対象化合物合成用基材が、核酸合成用である場合には、前記式（１）で表される対象化合物合成用基材の末端水酸基と、ヌクレオシドのデオキシリボースにおける水酸基とが脱水縮合反応して得られ、下記式（２）で表されるものが好適に挙げられる。
【化５】
2008201742.tif 000004
【００１８】
前記対象化合物合成用基材の合成方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後述する実施例に記載の方法などにより好適に合成することができる。
前記対象化合物合成用基材を用いた前記対象化合物の合成方法としては、特に制限はなく、合成対象となる化合物の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、前記対象化合物が前記核酸である場合、ジエステル法、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイト法等に、固相法を組み合わせた従来の核酸合成方法が挙げられるが、後述する実施例に記載の方法などにより好適に合成することができる。
前記核酸合成は、例えば、従来の核酸自動合成装置を用いて行うことができる。
【００１９】
本発明の前記対象化合物合成用基材は、核酸等の前記対象化合物のみを、その分子を破壊することなく容易に分離可能である。このため、前記対象化合物を高収率で得ることができ、回収された前記対象化合物が、例えば、核酸である場合、該核酸は、例えば、ＰＣＲ用プライマー、配列決定用プライマー、ハイブリダイゼーション用プローブ、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ等の各種機能性核酸として、好適に使用することができる。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明は下記実施例に何ら限定されるものではない。
【００２１】
（実施例１）
−対象化合物合成用基材の作製−
前記対象化合物としてのＤＮＡの合成用基材を、以下の合成スキームに従って作製した。
【００２２】
【化６】
2008201742.tif 000005
【００２３】
＜Ｘの合成＞
前記リンカーとしての４−ケトピメリン酸３４８ｍｇ(２ｍｍｏｌ)を、２０ｍＬの脱水ジクロロメタンに懸濁し、２塩化オキサリル６８６μＬ及びジメチルフォルムアミド６．２μＬを加え室温で一晩攪拌した。得られた溶液を減圧濃縮した後、残渣に脱水トルエンを加えて減圧濃縮した。残渣を脱水ジクロロメタン２０ｍＬに溶解し、トリアゾール６９１ｍｇ及びジイソプロピルエチルアミン８７０μＬを加え、室温で１５分間攪拌した。この溶液に５’ジメトキシトリチルチミジン１．０９ｇを加え３時間攪拌した。得られた溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド５７５ｍｇ及び６−ヒドロキシヘキシルアミン５８６ｍｇを加え、一晩攪拌した。この溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。そして、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール１：０→９：１）にて精製し、目的物Ｘを７０９ｍｇ（４４％）得た。
【００２４】
＜Ｙの合成＞
前記基材としてのｇｅｎｏｇｌａｓｓ−ＰＧ−２００−γ−ａｍｉｎｏレジン０．５ｇ(ＮＨ２  １０μｍｏｌ)を、脱水ピリジン５ｍＬに懸濁し、無水コハク酸１００ｍｇ及びジメチルアミノピリジン１２ｍｇを加え、一晩室温にて穏やかに攪拌した。次いで、レジンをろ過により回収し、メタノール及びジクロロメタンで洗浄した。得られたレジンに、合成した目的物Ｘを４００ｍｇ加え、脱水アセトニトリルに懸濁し、減圧濃縮する操作を３回行った。残渣に、脱水アセトニトリル５ｍＬ、ＨＣＴＵ２０７ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン２０７μＬ、及びジメチルアミノピリジン６１ｍｇを加え、２時間室温にて穏やかに攪拌した。続いて脱水メタノール５００μＬを加え、１時間室温にて穏やかに攪拌した。その後、レジンをろ過により回収し、メタノール及びジクロロメタンで洗浄し、目的物Ｙ（ＤＮＡ合成用基材）を得た。
【００２５】
−核酸の固相合成−
前記対象化合物としてのＤＮＡの固相合成を行った。
まず、核酸合成用アミダイドＩＩＩａ、ＩＩＩｇ、及びＩＩＩｃを以下のようにして合成した。
【化７】
2008201742.tif 000006
【００２６】
＜Ｉａ、Ｉｇ、Ｉｃの合成＞
Ｎメチルアミノ酪酸塩酸塩７．６８ｇ（５０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬの水に溶かし、ＮａＨＣＯ３４．２０ｇ（５０ｍｍｏｌ）を加え、１０分間攪拌した。この溶液に炭酸９−フルオレニルメチルスクシンイミジル１３．４９ｇ（４０ｍｍｏｌ）、アセトニトリル１００ｍＬ、及び硫酸水素テトラブチルアンモニウム０．１４ｇ（０．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間攪拌した。溶液を減圧濃縮した後、塩化メチレンで希釈し、水で洗浄した。塩化メチレン溶液を減圧濃縮し、脱水アセトニトリルで２回共沸した後、脱水塩化メチレンで共沸した。残渣を２００ｍＬの脱水塩化メチレンに溶かし、０℃でＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド４．１３ｇ（２０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。不溶物をろ過した後、減圧濃縮し、残渣Ａを得た。
デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＧ、又はｄＣ、２０ｍｍｏｌ）を脱水ピリジンで懸濁し、減圧濃縮する操作を３回行った。残渣を１００ｍＬの脱水ピリジンで懸濁し、０℃でトリメチルクロロシラン８．４５ｍＬ（６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した後、再び０℃に冷却し、本溶液を残渣Ａに導入した。反応混合物を、室温で２時間攪拌した。氷冷下２０ｍＬの水を加え、室温で一晩攪拌した。本溶液を塩化メチレンで希釈し、水で洗浄した。塩化メチレン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール１９：１→４：１）にて精製し、目的物Ｉａ  ６．９１ｇ（６０％）、Ｉｇ  ９．４３ｇ（８０％）、Ｉｃ  ８．８０ｇ（８０％）を得た。
【００２７】
【化８】
2008201742.tif 000007
【００２８】
＜ＩＩａ、ＩＩｇ、ＩＩｃの合成＞
Ｉａ、Ｉｇ、又はＩｃ、１０ｍｍｏｌを脱水ピリジンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を５０ｍＬの脱水ピリジンに溶解し、氷冷下４，４’−ジメトキシトリチルクロリド３．３６ｇ（１０．５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて４時間攪拌した。続いてメタノール１０ｍＬを加え、３０分攪拌した。溶液を減圧濃縮し、塩化メチレンで希釈し、水で洗浄した。塩化メチレン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９８：２→９：１）にて精製し、目的物ＩＩａ  ７．９２ｇ（９１％）、ＩＩｇ  ８．３５ｇ（９４％）、ＩＩｃ  ７．６４ｇ（９０％）を得た。
【００２９】
【化９】
2008201742.tif 000008
【００３０】
＜ＩＩＩａ、ＩＩＩｇ、ＩＩＩｃの合成＞
ＩＩａ、ＩＩｇ又はＩＩｃ、５ｍｍｏｌを脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２０ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン３０．５ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン１．０５ｍＬ（６．０ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト１．２３ｍＬ（５．５ｍｍｏｌ）の５ｍＬ塩化メチレン溶液を１５分以上かけ滴下した。混合溶液を０℃（ＩＩａ、ＩＩｃ）又は室温（ＩＩｇ）で２時間攪拌した。続いてメタノール５ｍｌを加え、３０分攪拌した。溶液を減圧濃縮し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。酢酸エチル溶液を減圧濃縮し、残渣を２５ｍＬの酢酸エチルに溶解し、−３０℃で５００ｍＬのヘキサンに１５分以上かけ滴下した。不溶物をろ過し、冷ヘキサンで洗浄し、濾物から減圧下溶媒を除くことにより、目的物ＩＩＩａ  ５．２２ｇ（９７％）、ＩＩＩｇ  ５．２２ｇ（９６％）、ＩＩＩｃ  ４．７０ｇ（９４％）を得た。
【００３１】
【化１０】
2008201742.tif 000009
【００３２】
上述した合成スキームに従って作製したＤＮＡ合成用基材（目的物Ｙ）、並びにＤＮＡ原料として、市販品のチミジンアミダイド、及び以上により合成したｄＡアミダイド（ＩＩＩａ）、ｄＧアミダイド（ＩＩＩｇ）、及びｄＣアミダイド（ＩＩＩｃ）を用い、ＤＮＡ自動合成機（「Ｈ８−Ｆ」；ジーンワールド社製）により、ＤＭＴｒｄＴＧＡＣＴを合成し、ＤＮＡ合成レジンを作製した。合成サイクルは、改良せずにそのまま用いることで、平均合成効率９８％以上の収率で合成することができた。
【００３３】
＜リンカーの切出し＞
得られたＤＮＡ合成レジンに、０．０１Ｍ  ＤＢＵアセトニトリル溶液５ｍＬを１時間かけて流した後、アセトニトリル、水で洗浄した。
次いで、０．５Ｍヒドラジン一水和物含有酢酸／ピリジン＝２／３（ｖ／ｖ）溶液１００μＬを、３０分間かけて流し、溶液を回収した。続いて、このＤＮＡ合成レジンを、５０ｍＭトリエチルアミン−酢酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）１ｍＬで洗浄し、該洗浄液も合わせて回収した。この溶液及び洗浄液を、ＯＰＣカラム（アプライドバイオシステム社製）を用いて定法に従い、３質量％トリフロロ酢酸を用いて脱ＤＭＴｒを行い、２０体積％アセトニトリル水溶液によりＤＮＡ含有溶液Ａを回収した。
【００３４】
また、対照として、通常アミダイド（ｂｅｎｚｏｙｌ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｄＡ  アミダイド、ｂｅｎｚｏｙｌ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｄＣ  アミダイド、ｉｓｏｂｕｔｙｒｌ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｄＧ  アミダイト）及びＴレジンを用い、定法に従ってｄＧＡＣＴを合成した。
ＨＰＬＣを用いて、ＤＮＡ含有溶液Ａ（図１Ａ）及びｄＧＡＣＴ（図１Ｂ）を比較した結果、主生成物が一致することが判った。
なお、ＤＮＡ含有溶液Ａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２Ａに、ＨＨｃｏｓｙスペクトルを図２Ｂに、それぞれ示す。
【００３５】
また、前記リンカーの切出しを行った後のＤＮＡ合成レジンを、スクリューキャップドチューブに回収し、２８質量％アンモニア水５００μＬを加え、５５℃にて８時間加熱することにより、前記ヒドラジン含有溶液による前記リンカーの切出しを行うと、９０％以上のＤＮＡが回収されていることが確認された。
【００３６】
本発明の好ましい態様を付記すると、以下の通りである。
（付記１）  ケトピメリン酸構造を末端に有するリンカーが基材に結合されてなり、前記リンカーを介して前記基材に対象化合物を合成可能であることを特徴とする対象化合物合成用基材。
（付記２）  リンカーが、中性条件下で切出し可能である付記１に記載の対象化合物合成用基材。
（付記３）  中性条件が、ｐＨが６〜８である付記２に記載の対象化合物合成用基材。
（付記４）  リンカーの切出しが、ヒドラジン含有溶液中で行われる付記２から３のいずれかに記載の対象化合物合成用基材。
（付記５）  ヒドラジン含有溶液におけるヒドラジンの濃度が、０．１Ｍ以上である付記４に記載の対象化合物合成用基材。
（付記６）  リンカーが、４−ケトピメリン酸である付記１から５のいずれかに記載の対象化合物合成用基材。
（付記７）  対象化合物が、核酸である付記１から６のいずれかに記載の対象化合物合成用基材。
（付記８）  核酸とリンカーとが、核酸における２’位にてβ−ケトエステル結合により結合される付記７に記載の対象化合物合成用基材。
（付記９）  下記式（１）で表される付記１から６のいずれかに記載の対象化合物合成用基材。
【化１１】
2008201742.tif 000010
（付記１０）  核酸合成用であって、式（１）で表される付記９に記載の対象化合物合成用基材の末端水酸基と、ヌクレオシドのデオキシリボースにおける水酸基とが脱水縮合反応して得られ、下記式（２）で表される付記７から８のいずれかに記載の対象化合物合成用基材。
【化１２】
2008201742.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の対象化合物合成用基材は、核酸等の前記対象化合物を生成及び分離可能で、該対象化合物のみを高収率で得ることができ、該対象化合物が核酸である場合、例えば、ＰＣＲ用プライマー、配列決定用プライマー、ハイブリダイゼーション用プローブ、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ等の各種機能性核酸として、好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例１におけるＤＮＡ含有溶液ＡのＨＰＬＣ解析結果である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、通常アミダイド及びＴレジンを用い、定法に従って合成したｄＧＡＣＴのＨＰＬＣ解析結果である。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例１におけるＤＮＡ含有溶液Ａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例１におけるＤＮＡ含有溶液のＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図１Ａ】
2008201742.tif 000014
【図１Ｂ】
2008201742.tif 000015
【図２Ａ】
2008201742.tif 000016
【図２Ｂ】
2008201742.tif 000017