(57)【要約】【課題】マイクロ流体チップによるＲＮＡ分子からの分離、洗浄、濃縮、回収などの操作を可能とし、従来の煩雑で毒性試薬を用いる生化学的方法に代替して、ＲＮＡなどの生体分子を簡便でかつ迅速に抽出することができる方法を提供すること。【解決手段】流路に狭小部を有する液体流路に、検体として塊状の立体構造を有する生体分子を変性させた変性生体分子を含む液体を加圧下で流すとともにその液体の流れ方向と逆向きの力を、電界を印加することにより作用させ、狭小部で変性生体分子を捕捉することを特徴とする検体の捕捉方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路に狭小部を有する液体流路に、検体として塊状の立体構造を有する生体分子を変性させた変性生体分子を含む液体を加圧下で流すとともにその液体の流れ方向と逆向きの力を、電界を印加することにより作用させ、狭小部で変性生体分子を捕捉することを特徴とする検体の捕捉方法。
【請求項２】
生体分子がＲＮＡまたはタンパク質である請求項１に記載の検体の捕捉方法。
【請求項３】
狭小部の流路幅が０．０１〜５０μｍである請求項１または２に記載の検体の捕捉方法。
【請求項４】
液体流路の断面積が、狭小部の流路の断面積の２〜３０倍である請求項１〜３のいずれかに記載の検体の捕捉方法。
【請求項５】
流路に狭小部を有する液体流路に、検体として塊状の立体構造を有する生体分子を変性させた変性生体分子を含む液体を加圧下で流すとともにその液体の流れ方向と逆向きの力を、電界を印加することにより作用させ、狭小部で変性生体分子を捕捉した後、その液体の圧力および／または電界を調節し、狭小部で捕捉されている変性生体分子を解放することを特徴とする検体の捕捉ないし解放方法。
【請求項６】
狭小部で変性生体分子を解放する際に用いる液体が前記変性生体分子を含む液体とは異なる液体である請求項５に記載の検体の捕捉ないし解放方法。
【請求項７】
生体分子がＲＮＡまたはタンパク質である請求項５または６に記載の検体の捕捉ないし解放方法。
【請求項８】
狭小部の流路の幅が０．０１〜５０μｍである請求項５〜７のいずれかに記載の検体の捕捉ないし解放方法。
【請求項９】
液体流路の断面積が、狭小部の流路の断面積の２〜３０倍である請求項５〜８のいずれかに記載の検体の捕捉ないし解放方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体の捕捉方法に関する。さらに詳しくは、例えば、人体などから取り出された組織や血液からＲＮＡ、タンパク質などの生体分子を捕捉することができる検体の捕捉方法、および生体分子を捕捉ないし解放することができる検体の捕捉ないし解放方法に関する。本発明の方法は、生体分子の分離装置、抽出装置、生成装置、濃縮装置などに好適に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
人体から取り出した組織や血液などに含まれているＤＮＡを分析する方法は、ヒトの遺伝子情報を把握することができ、また、生活習慣病や遺伝病の診断、オーダーメード医療にも適用することができるほか、血液などに含まれている病原菌やウイルスのＤＮＡを取り出して特定することにより、感染症の診断にも応用することができるので、近年、注目されている。
【０００３】
精製されたＤＮＡの検出は、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法などを用いて特定配列を持つＤＮＡだけを増幅する方法を利用することによって行なうことができる。このような方法を用いるには、採取した細胞やウイルスが含まれうる液体から、ＤＮＡに有害な物質を除外し、細胞膜やウイルス壁を破砕してＤＮＡを取り出し、その後の反応や検出を阻害する物質を除外し、ＰＣＲやＬＡＭＰ法に適したＤＮＡ濃度、塩濃度、ｐＨなどを調整する前処理が必要である。
【０００４】
前処理は、試薬の混合、反応およびＤＮＡの回収処理を繰り返すことによって行なわれる。ＤＮＡの回収処理としては、ＤＮＡの濃縮、分離、ＤＮＡのみを残した溶液の交換、溶液の交換によるＤＮＡの洗浄などがある。この回収処理においては、介在物が存在する溶液から、できるだけ選択的にＤＮＡのみを１ヵ所に集めて他の介在物と分離して回収することが必要である。その際、ＤＮＡを１まとめにした状態で溶液内に移動させるか、またはこれとは逆に溶液を移動させることにより、溶液の交換や洗浄を行なうことができれば、より簡単に前処理を行なうことができる。このようなＤＮＡの回収を行う方法として、遠心分離法、磁気ビーズを用いてＤＮＡを絡め取った磁気ビーズを磁石により移動させる方法などがある。
【０００５】
遠心分離法を採用した場合、遠心分離後の上澄み、中間層および沈殿物の分取は、人手によって行なわれるため、その操作が煩雑であるのみならず、サンプルが微量であるときには、その操作が困難である。
【０００６】
磁気ビーズを用いてＤＮＡを絡め取った磁気ビーズを磁石により移動させる方法は、チップ上で実施することができるが、磁場の移動が煩雑であるとともに、集めたＤＮＡを次の処理のために再度、溶液中に解放することが困難である。
【０００７】
そこで、チップ上に形成した簡単な機構を用いて、流路を流れるタンパク質や種々の試薬などを含む液体からＤＮＡを選択的に捕捉してＤＮＡの回収や濃縮を行い、また捕捉されたＤＮＡを簡単な操作で放出し、次の処理に用いることができる方法として、ＤＮＡが含まれている液体を流すことができる流路の狭い部分とその狭い部分を有する流路に前記液体を移動させる圧力差をその液体に印加し、液体が移動する方向と反対の方向にＤＮＡを移動させる電界を液体に印加するＤＮＡのトラップ・リリース方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００８】
この方法によれば、狭小部をもつ微細な流路中にＤＮＡを注入し、圧力流れとこれに対向する直流電場を同時に印加すると、ＤＮＡが狭小部近傍で捕捉され、濃縮されるという現象がみられる。
【０００９】
しかし、この方法は、マイクロメートルオーダーの比較的大きな生体物質に対して適用することができるが、ＲＮＡのようなナノメートルオーダーの小さい分子を捕捉することが困難である。
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−２１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、マイクロ流体チップによるＲＮＡ分子などの生体分子の分離、洗浄、濃縮、回収などの操作を可能とし、従来の煩雑で毒性試薬を用いる生化学的方法に代替して、ＲＮＡなどの生体分子を簡便でかつ迅速に抽出することができる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、
（１）流路に狭小部を有する液体流路に、検体として塊状の立体構造を有する生体分子を変性させた変性生体分子を含む液体を加圧下で流すとともにその液体の流れ方向と逆向きの力を、電界を印加することにより作用させ、狭小部で変性生体分子を捕捉することを特徴とする検体の捕捉方法、
（２）流路に狭小部を有する液体流路に、検体として塊状の立体構造を有する生体分子を変性させた変性生体分子を含む液体を加圧下で流すとともにその液体の流れ方向と逆向きの力を、電界を印加することにより作用させ、狭小部で変性生体分子を捕捉した後、その液体の圧力および／または電界を調節し、狭小部で捕捉されている変性生体分子を解放することを特徴とする検体の捕捉ないし解放方法、および
（３）狭小部で変性生体分子を解放する際に用いる液体が前記変性生体分子を含む液体とは異なる液体である前記（２）に記載の検体の捕捉ないし解放方法
に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、従来の誘電泳動では捕捉することが困難であるＲＮＡ分子などの生体分子を捕捉することができる。したがって、マイクロ流体チップによるＲＮＡ分子などの生体分子の分離、洗浄、濃縮、回収などの操作を可能とし、従来の煩雑で毒性試薬を用いる生化学的方法に代替して、ＲＮＡなどの生体分子を簡便でかつ迅速に抽出することができる。
【００１４】
また、本発明によれば、生体分子の大きさの選択性があるので、その大きさに応じた生体分子を抽出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
従来、狭小部をもつ微細な流路中にＤＮＡを注入し、圧力流れとこれに対向する直流電場を同時に印加すると、ＤＮＡが狭小部近傍で捕捉され、濃縮される現象が見出されている（例えば、特開２００４−２１７号公報参照）。
【００１６】
これに対して、本発明では、検体として、塊状の立体構造を有する生体分子を変性させた変性生体分子が用いられている点に特徴がある。例えば、検体を含む液体を加圧下で流し、その液体の流れ方向と逆向きの力を、電界を印加することにより作用させ、狭小部で検体を捕捉する方法において、蛍光感度を維持しつつ、コンパクトな塊状の生体分子としてＲＮＡを変性することにより、ＲＮＡを捕捉することができる。
【００１７】
このＲＮＡの捕捉には、液体流路の内壁近傍と流路の中央との２つの主要な捕捉パターンがあり、ＲＮＡ分子の大きさに対応した捕捉が可能な液体の圧力の下限値が存在することから、従来の誘電泳動とは異なる新しい捕捉メカニズムが働いていると考えられる。
【００１８】
本発明の検体の捕捉方法は、細胞または組織からの煩雑なトータルＲＮＡの抽出を迅速かつ簡便に行うことができるツールの実現に道を開くとともに、細胞中で発現している未知のＲＮＡの回収への応用が期待される。
【００１９】
本発明の検体の捕捉方法によれば、流路に狭小部を有する液体流路に、検体として塊状の立体構造を有する生体分子を変性させた変性生体分子を含む液体を加圧下で流し、その液体の流れ方向と逆向きの力を、電界を印加することにより作用させることにより、狭小部で変性生体分子が捕捉される。
【００２０】
流路に狭小部を有する液体流路は、通常、チップ内で形成させることができる。そのチップの一例を図１に示す。図１は、本発明の検体の捕捉方法に用いることができるチップの一実施態様を示す概略説明図である。
【００２１】
図１に示される狭小部１を有する液体流路２は、例えば、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン樹脂で形成させることができる。
【００２２】
狭小部１の形状は、特に限定されないが、変性生体分子の捕捉効率を高める観点から、矩形などの形状であることが好ましい。狭小部１は、液体流路２において、テーパ３を設けることによって形成することができる。このテーパ３がなす角度αは、狭小部１において流路が詰まることを回避する観点および回収する生体分子が損傷することを回避する観点から、好ましくは６０〜１２０°、より好ましくは７５〜１０５°、より一層好ましくは８０〜１００°、さらに好ましくは８５〜９５°、特に好ましくは９０°である。
【００２３】
図１では、流路に狭小部１が１ヵ所だけ設けられている実施態様が示されているが、本発明では、狭小部が設けられる個数に特に限定がなく、例えば、特開２００４−２１７号公報に記載されているように、２〜５個の複数個であってもよい。また、本発明においては、図１に示された実施態様以外にも、例えば、特開２００４−２１７号公報の図１〜７に記載されている態様で実施することもできる。
【００２４】
なお、狭小部１は、流路の垂直方向または水平方向のみに狭くなっている狭小部であってもよく、あるいは垂直方向および水平方向のいずれの方向においても狭くなっている狭小路であってもよい。また、狭小路１は、流路の幅を変えるのではなく、例えば、特開２００４−２１７号公報の図４の中段の図に示されているように、その流路にビーズなどの液体の流れを妨げる障害物を詰めることによって狭小路１が形成されていてもよく、あるいは特開２００４−２１７号公報の図４の下段の図に示されているように、多孔質膜や多孔質の物質を流路に形成することによって狭小路１が形成されていてもよい。
【００２５】
図１に示されるチップにおいては、狭小部１を通過した生体分子を一気に液体流路２に戻すために狭小部１を通過した後の液体流路２にはテーパが設けられておらず、急峻な角度をなしているが、必要により、テーパが設けられていてもよい。
【００２６】
液体流路２の幅（円形の場合には直径。以下同じ）ｄは、狭小部１の縦断面積に応じて決定することができる。  液体流路２の幅ｄは、狭小部１の縦断面積が２〜３０倍、好ましくは１０〜２０倍となるように設定することが望ましい。通常、液体流路２の幅ｄは、異物が詰まるのを防止するとともに、その作製を容易にする観点から、好ましくは１０〜３００μｍ、より好ましくは３０〜２００μｍ、さらに好ましくは５０〜１５０μｍ、特に好ましくは９０〜１１０μｍである。
【００２７】
狭小部１の孔径ｑは、使用する生体分子の種類によって異なるので、一概には決定することができないため、その生体分子の種類に応じて適宜決定することが好ましい。通常、狭小部１の孔径ｑは、異物が詰まるのを防止するとともに、その作製を容易にする観点から、好ましくは０．０１〜５０μｍ、より好ましくは１〜３０μｍ、より一層好ましくは３〜２０μｍ、さらに好ましくは５〜１５μｍである。
【００２８】
なお、変性生体分子の捕捉効果は、変性生体分子の大きさなどによって異なる。変性生体分子の捕捉量は、液体流路の流路径やその形状を変更したり、あるいは印加する電界の電圧や電流を変更することにより、容易に調節することができる。また、液体流路の内径やその形状を変更したり、あるいは印加する電界の電圧や電流を変更することにより、捕捉することができる変性生体分子の大きさを変更することができる。
【００２９】
検体として、塊状の立体構造を有する生体分子を変性させた変性生体分子が用いられる。生体分子としては、例えば、ＲＮＡ、タンパク質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＲＮＡとしては、例えば、トータルＲＮＡ、レボゾームＲＮＡマーカー、ＲＮＡラダーマーカー、スモールＲＮＡラダーマーカーなどが挙げられる。
【００３０】
変性生体分子としては、例えば、ホルムアルデヒドおよびグリオキザールからなる群より選ばれた少なくとも１種でＲＮＡが変性された変性生体分子、ＲＮＡを８０〜１００℃の温度に保持することによってＲＮＡが熱変性された変性生体分子、タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳという）で変性した変性生体分子などが挙げられる。この変性により、塊状の立体構造を有する生体分子が線状に解きほぐされる。
【００３１】
生体分子を変性する方法としては、例えば、ＲＮＡと、ホルムアルデヒド、グリオキザールなどとを溶媒の存在下で混合する方法、ＲＮＡを溶媒の存在下で８０〜１００℃の温度に保持する方法、溶媒の存在下でタンパク質をＳＤＳで変性する方法などが挙げられる。これらの方法のなかでは、ＲＮＡとホルムアルデヒドとを溶媒の存在下で混合する方法およびＲＮＡとホルムアミドとホルムアルデヒドとを溶媒の存在下で混合する方法は、ＲＮＡを十分に変性させる観点から好ましい。
【００３２】
ＲＮＡ分子とホルムアルデヒドとを溶媒の存在下で混合する場合、ホルムアルデヒドの量は、ＲＮＡを十分に変性させるとともに、変性させたＲＮＡの安定性を高める観点から、ＲＮＡ１００重量部あたり、好ましくは２６０〜２６００重量部、より好ましくは１０００〜１５００重量部である。また、ホルムアミドとホルムアルデヒドとを併用する場合、ホルムアミドの量は、ＲＮＡを十分に変性させるとともに、変性させたＲＮＡの安定性を高める観点から、通常、ホルムアルデヒド１ｍｇあたり、好ましくは１〜１０μＬ、より好ましくは２〜５μＬである。
【００３３】
ＲＮＡとホルムアルデヒドと必要によりホルムアミドとを溶媒の存在下で混合する際の温度は、例えば、好ましくは１０〜３０℃程度、より好ましくは１５〜２０℃程度である。また、ＲＮＡとホルムアルデヒドと必要によりホルムアミドとを溶媒の存在下で混合する際、ＲＮＡとホルムアルデヒドと必要によりホルムアミドとの混合物におけるＲＮＡの濃度は、ＲＮＡなどの生体分子を十分に変性させるとともに、変性させたＲＮＡなどの生体分子の安定性を高める観点から、通常、好ましくは０．２〜１０μｇ／μＬ、より好ましくは１〜３μｇ／μＬである。なお、溶媒として、例えば、水をはじめ、緩衝液などを用いることができる。
【００３４】
ホルムアルデヒドは、通常、その水溶液であるホルマリンとして用いることができる。ホルマリン中のホルムアルデヒドの濃度は、特に限定されないが、通常、３５〜４０％程度であることが好ましい。
【００３５】
生体分子の変性は、例えば、生体分子と、ホルムアルデヒドおよび／またはホルムアミドとを混合した後、得られた混合物を好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃の温度で、好ましくは５〜３０分間程度、より好ましくは１０〜１５分間程度加熱することによって行なうことができる。加熱終了後は、その混合物を５℃以下の冷水で急冷した後、好ましくは５〜３０分間程度、より好ましくは１０〜１５分間程度保持することにより、変性生体分子が得られる。
【００３６】
変性生体分子を含む液体は、変性生体分子の濃度が所望の濃度となるように、例えば、超純水などの水で希釈することによって得ることができる。希釈後の液体における変性生体分子の濃度は、特に限定されないが、通常、０．０５〜０．５μｇ／μＬ程度であることが好ましい。
【００３７】
なお、変性生体分子は、例えば、核酸用インターカレータ色素を用いてラベリングしてもよい。
【００３８】
次に、変性生体分子を含む液体を加圧下で液体流路２に流す。図１に示されるチップでは、変性生体分子を含む液体は、リザーバ４から導入され、矢印Ａ方向で液体流路２に流れ、ウエステ５から排出される。液体への圧力は、リザーバ４およびウエステ５の少なくとも一方に圧力源と接続された管と接続し、圧力源によって加圧することにより、調節することができる。
【００３９】
溶液を加圧下で液体流路２に流すとともに、溶液に電界を印加する。図１に示されるチップでは、矢印Ａで示される液体の流れ方向と逆向きの力を、矢印Ｂで示される方向から液体に電界を印加することにより作用させる。より具体的には、電界は、リザーバ４およびウエステ５に電極などを配設し、変性生体分子を含む液体を加圧してリザーバ４からウエステ５に向けて矢印Ａ方向に送液するとともに、リザーバ４に正の電圧、ウエステ５に負の電圧を加えることによって生じさせることができる。
【００４０】
これにより、リザーバ４から導入された変性生体分子を含む液体のうち変性生体分子が狭小部１で捕捉される。
【００４１】
溶液に加える圧力は、生体分子の種類や液体流路の形状、大きさなどによって異なるので、一概には決定することができないことから、その生体分子の種類や液体流路の形状、大きさなどに応じて適宜決定することが好ましい。
【００４２】
溶液に加える圧力の下限値は、その変性生体分子を十分に捕捉する観点から、例えば、変性生体分子に用いられるＲＮＡが、レボゾームＲＮＡマーカーである場合には２５ｈＰａであり、ＲＮＡラダーマーカーである場合には１００ｈＰａであり、スモールＲＮＡマーカーである場合には２００ｈＰａであることが好ましい。溶液に加える圧力の上限値は、ＲＮＡを安定して回収する観点から、例えば、変性生体分子に用いられるＲＮＡが、レボゾームＲＮＡマーカーである場合には２００ｈＰａであり、ＲＮＡラダーマーカーである場合には２５０ｈＰａであり、スモールＲＮＡマーカーである場合には３００ｈＰａであることが好ましい。
【００４３】
変性生体分子を含む液体の送液の終了後には、電極間の電界を強めるか、または液体の圧力を弱めるか、あるいは液体が流れる方向を逆転させて矢印Ｂ方向に流れるようにするか、または電極間の電界の向きを逆転させて矢印Ａ方向に流れるようにすることにより、リザーバ４で濃縮された変性生体分子を回収することができる。また、液体を矢印Ａ方向に送液し、その圧力を高めるか、あるいは矢印Ｂ方向の電界を弱めるかまたは電界を矢印Ａ方向に反転させることにより、ウエステ５から濃縮された変性生体分子を回収することができる。
【００４４】
溶液に加える電界は、印加する電圧によって決定することができる。印加する電圧は、変性生体分子の種類や液体流路の形状、大きさなどによって異なるので一概には決定することができない。印加する電圧は、通常、５〜１０００Ｖの範囲から選択される。
【００４５】
液体に印加される電界と液体に加える圧力を調節することにより、矢印Ａ方向に流れる変性生体分子を選択的に狭小部１およびその近傍に捕捉することができる。このとき、溶液中の捕捉されない物質は、電界または液体の圧力によって流れ去るので、変性生体分子を回収したり、その濃縮をすることができる。また、変性生体分子が捕捉されている状態で液体が流れるので、その液体を他の液体に交換して流すことにより、捕捉されている変性生体分子を洗浄することができる。
【００４６】
また、狭小部１で変性生体分子を捕捉した後、変性生体分子が解放されるように液体の圧力および／または電界を調節することにより、捕捉した変性生体分子を解放することができる。より具体的には、液体流路２の狭小部１で捕捉された変性生体分子は、印加する電界および液体の圧力の少なくとも一方を調節することにより、液体の入り口側または出口側に放出することができる。これにより、変性生体分子を容易に回収することができる。
【００４７】
捕捉した変性生体分子を解放する際に用いる液体として、前記変性生体分子を含む液体とは異なる液体を用いることができる。このように変性生体分子を含む液体とは異なる液体を用いた場合には、捕捉した変性生体分子を解放する際に用いる液体とは異なる液体に変性生体分子を放出することができる。
【００４８】
また、本発明においては、特開２００４−２１７号公報の図５に示されるように、変性生体分子の捕捉量を増大させるために、複数のチップを並列に接続してもよい。
【００４９】
また、異なる大きさの変性生体分子を異なるチップに捕捉するために、変性生体分子を捕捉することができる狭小部の大きさが異なるチップを直列に接続してもよい。このように接続することにより、大きさが異なる変性生体分子を異なるチップで捕捉することができる。この方法は、変性生体分子の分析やフィルタリングにも応用することができる。
【００５０】
本発明においては、さらに、特開２００４−２１７号公報の図７に記載の実施態様に示されているように、各部材を配設することにより、血液、細胞、菌類、血清中で薄められているウイルス中のＲＮＡを濃縮することができるので、チップ上でＲＮＡを高感度で検出することができる。
【００５１】
以上に述べたように、本発明によれば、液体から変性生体分子を捕捉し、必要に応じて解放することができる。
【００５２】
したがって、チップ上で変性生体分子を取り出すための前処理の溶液から変性生体分子のみを回収することができ、変性生体分子を残して緩衝液などを交換したり、非常に薄められた変性生体分子を濃縮することができるので、その検出感度を高めたり、チップ上で取り扱いやすい液量に調節したりすることが容易となる。また、ＲＮＡを利用したタンパク質の合成や、ＲＮＡを用いた分析法、ＲＮＡを用いたデバイスの開発において、溶液中のＲＮＡのみを一時的に固定することができることは、溶液の交換、ＲＮＡのマニュピレーション、ＲＮＡの観察などを容易にするため、種々の波及的効果を期待することもできる。
【実施例】
【００５３】
次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００５４】
（１）チップ
図１に示される形状の液体流路２が形成されているポリジメチルシロキサン(以下、ＰＤＭＳという)製のシートをカバーガラスに貼り付けてチップとした。このとき、図１に示される液体流路２の幅ｄ：１００μｍ、高さ１０μｍ、テーパ３のなす角度を９０度とし、狭小部１における孔径ｑを１０μｍとした。また、電気浸透流を抑制するために流路の内壁をポリビニルピロリドンで保護して実験を行った。
【００５５】
（２）実験装置
実験装置として、図２に示される実験装置を用いた。図２は、実施例で用いられた実験装置の概略説明図である。図２には、実験装置として、倒立落射蛍光観察装置（蛍光顕微鏡）〔オリンパス(株)製、光源：超高圧水銀ランプ、レンズ：ＵＰｌａｎＡｐｏ  ４０倍Ｎ.Ａ．０．８５、フィルタ：Ｕ−ＭＷＢＶ〕３１が用いられている。
【００５６】
電源装置２２として、直流安定化電源〔菊水電子工業(株)製、品番：ＰＭＣ５００−０．１Ａ〕を用い、ＣＣＤカメラ２３として、ＣＣＤカメラ〔フローウェル（ＦＬＯＷＥＬ）社製、品番：ＡＤＴ−３３Ｃ〕を用いる。
【００５７】
シリンジ２４の開口部（図示せず）は、導管を介して圧力計２５に接続され、その導管は、チップ２１の内部空間に接続されている。変性生体分子２６は、蛍光顕微鏡３１で観察され、その画像がＣＣＤカメラ２３で捉えられる。
【００５８】
電源装置２２によって電圧が白金電極２７に印加され、電界が発生する。圧力計２５では、シリンジ２４を用いて加えた圧力が計測される。ガラス板２８は、白金電極２７と導管とチップ２１を密閉するために用いられる。図１に示される流路が形成されているＰＤＭＳシート２９は、カバーガラス３０と自発的に接着され、チップ２１となる。
【００５９】
（３）ＲＮＡ
ＲＮＡとして、シグマ・アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）社製のリボソームＲＮＡ(１８ｓ＋２８ｓ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  ｃａｌｆ  ｌｉｖｗｅｒ)、ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製のＲＮＡラダーマーカー(Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＲＮＡ  Ｍａｒｋｅｒｓ，  ０．１−１ｋｂ)、またはバイオダイナミック・ラボラトリー・インク（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．）社製の商品名：Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ２（２０ｂ−１００ｂ)を用いた。
【００６０】
（４）サンプルの調製
１．ＲＮＡの濃度調節
タカラバイオ(株)製の濃度調整キットを用いて、変性時のＲＮＡの濃度を２μｇ／μＬに調節した。
【００６１】
２．ホルムアルデヒド変性
前記で濃度が調節されたＲＮＡ５．０μＬ、１０×ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液）０．７μＬ、３７％ホルマリン２．３μＬ、およびホルムアミド６．６μＬをよく混合した。次に、６０℃で１５分間加熱し、氷水で急冷した後、１０分間保持することにより、変性ＲＮＡを得た。
【００６２】
３．ラベリング
モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）社製の核酸用インターカレータ色素（品番：ＰＯＰＯ３）を超純水で２５万倍に希釈し、その希釈液で変性ＲＮＡを染色した後、−２０℃で一晩放置し、ラベリングされた変性ＲＮＡを得た。
【００６３】
４．サンプルの調製
０．６％ポリビニルピロリドン５０μＬ、０．５×ＴＢＥ（トリスホウ酸−エチレンジアミン四酢酸緩衝液）40μＬ、およびラベリングされた変性ＲＮＡ１０μＬを加え、緩やかに混合した。
【００６４】
（５）実験
図１に示されるリザーバ４からサンプルを投入し、図２に示される圧力計２５を見ながらシリンジ２４で液体に加える圧力を段階的に設定した後、リザーバ４と廃液用リザーバ間に設けられた白金電極２７，２７間の電圧を電源装置２２で変化させながら、蛍光顕微鏡３１でチップ２１の狭小部を観察し、変性ＲＮＡの捕捉領域を探索した。
【００６５】
その結果を図３に示す。図３は、送液される液体の圧力が１００ｈＰａのときのレボソームＲＮＡマーカー（５ｋｂと２ｋｂ）の代表的な捕捉パターンおよびその遷移を示す顕微鏡写真である。
【００６６】
最初に変性ＲＮＡの捕捉が見られるのは、図３（ａ）に示されているように、印加電圧が１００Ｖのときであり、液体流路の両内壁部に変性ＲＮＡが捕捉されている。
【００６７】
次に、さらに印加電圧を高めると、変性ＲＮＡの捕捉領域が若干成長する。図３（ｂ）および（ｃ）に見られるように、印加電圧が１５０Ｖから１７５Ｖに高められると、突然、液体流路の中央部に捕捉点が出現する。
【００６８】
さらに印加電圧を２００Ｖに高めると、図３（ｄ）に見られるように、内壁の捕捉点が完全に消え、中央の捕捉領域が成長するとともに、捕捉された変性ＲＮＡの形状が球形から長楕円形状に変化し、右方に尾が現れている。また、捕捉領域の中心点が若干左方の圧力の高い側にシフトしていることがわかる。
【００６９】
印加電圧が２２５Ｖに高められたとき、図３（ｅ）に示されるように、変性ＲＮＡが捕捉された領域が中央流線上で左方に引き伸ばされ、２ヵ所に分離していることがわかる。
【００７０】
さらに印加電圧を３００Ｖに高めると、図３（ｆ）に示されるように、左側の変性ＲＮＡの捕捉領域が消滅し、右側の捕捉領域が左方にシフトしながら若干成長する。印加電圧を４００Ｖに高めた場合には、図３（ｇ）に示されるように、電気力がドラッグフォースと拮抗し、捕捉された変性ＲＮＡの分子の数が少なくなり、さらに印加電圧を５００Ｖに高めると、図３（ｈ）に示されるように、捕捉された変性ＲＮＡの領域が完全に消滅していることがわかる。
【００７１】
以上の結果から、液体流路に変性生体分子を含む液体を加圧下で流しつつ、電圧を印加し、その電圧を高めていくと、まず液体流路の内壁近傍に変性生体分子が捕捉され、ある電圧のときに急激に狭小部の中央部分で変性生体分子が捕捉されることがわかる。
この捕捉された変性生体分子は、安定しており、電圧が高くなるとともに、圧力が高い側にその捕捉された領域が成長するが、さらに電圧が高くなると捕捉領域が伸び、ついには消滅することがわかる。
【００７２】
なお、この捕捉領域の遷移で、印加された電圧が低い内壁近傍での変性生体分子の捕捉パターンは、ラダーマカー（１００ｂから１ｋｂ）とスモールＲＮＡマーカー（２０ｂから１００ｂ）では出現しないが、狭小部の中央部分で捕捉されたものについては、レボソームＲＮＡマーカーと同じパターンを示す。
【００７３】
図４は、実施例１で得られた変性されたＲＮＡが捕捉された領域を示す説明図である。図４において、各プロットは、変性生体分子の捕捉が確認されたときの液体の圧力と印加された電圧の組み合わせに対応している。実線Ａで囲まれた領域は、レボソームＲＮＡマーカーが捕捉された領域を示す。実線Ｂおよび一点鎖線Ｃで囲まれた領域は、それぞれ、ＲＮＡラダーマーカーおよびスモールＲＮＡマーカーが捕捉された領域である。また、各領域において、破線で示された領域は、未確認ではあるが、液体の圧力が高く、電圧がより高い領域にも変性生体分子の捕捉領域があると考えられる。
【００７４】
図４では、３種類のＲＮＡマーカーが捕捉された領域が１つの図に示されているが、この図に示された結果から、大きさがもっとも大きいレボソームＲＮＡマーカーが捕捉された領域が最も広く、大きさがもっとも小さいスモールＲＮＡマーカーが捕捉された領域が最も狭いことから、大きさが大きい分子が捕捉される領域が、大きさが小さい分子が捕捉される領域を包含することがわかる。つまり、ＲＮＡ分子の大きさが小さいほど捕捉される条件が厳しくなり、その捕捉される領域が、液体の高圧側でかつ高電圧側にシフトしていることがわかる。
【００７５】
図４において、各境界線の傾きは、分子に作用するドラッグフォースと電気力との比に相当する。また、それぞれのマーカーは、捕捉可能な液体の圧力に下限値を有し、その下限値は、レボソームＲＮＡマーカーでは２５ｈＰａ、ＲＮＡラダーマーカーでは１００ｈＰａ、スモールＲＮＡマーカーでは２００ｈＰａとなっている。
【００７６】
このことは、ＲＮＡが捕捉されるには、ＲＮＡ分子の大きさに選択性があることを明確に示しており、捕捉可能な液体の圧力の下限値を利用して所定の大きさのＲＮＡを選択して抽出することができることを示している。
【００７７】
次に、従来の誘電泳動法との相違点について、簡単に説明する。
第１の相違点は、本発明の方法では、捕捉パターンが印加電圧によって遷移することであり、主として低電圧時の流路内壁と流路中央部の２つに顕著な捕捉パターンが存在することである。
【００７８】
本発明における捕捉パターン遷移については、おおむね、次のように理解することができる。つまり、捕捉パターン遷移は、流体中を移動する荷電分子に作用するドラッグフォースと印加電界による電気力とのバランスに起因すると考えられる。浸透流を抑えた微小平板流は、レイノルズ数が１以下の層流であるから、その速度分布は、液体流路の内壁面でゼロ、流路の中心部で最大となる放物線で与えられ、液体中のＲＮＡ分子が受けるドラッグフォースは、ストークス抵抗で近似され、図５に示されるように流路の断面に対して放物線状に変化する。
【００７９】
なお、図５（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、荷電粒子に作用する力のバランス点の移動を示す概略説明図である。
【００８０】
図５において、向かって左向きの矢印は、一様な電界による電気力、右向きの矢印は、ドラッグフォースを示す。図５（ａ）に示されるように、電気力が小さい場合には、力のバランス点が流路内壁近傍にあり、電界の増加とともに中央に移動する。
【００８１】
液体流路で移動するＲＮＡ分子に対し、印加電界をゼロから徐々に増加させていくと、電気力は流路断面に対して一様であるから、まず、図５（ａ）に示されるように、液体流路の内壁近傍に力のバランス点ａが現れる。次に、図５（ｂ）に示されるように、荷電粒子に作用する電気力の増加とともにバランス点ｂが流路中心に向かって移動し、最後には、図５（ｃ）に示されるように、流路中心線上がバランス点ｃとなる。これ以上印加電界を増加させると電気力がドラッグフォースよりも大きくなり、バランス点が消滅する。
【００８２】
また、第２の相違点は、現状の誘電泳動では難しいナノオーダーサイズのＲＮＡ分子を捕捉することができる点にある。殊に、１００ｂ以下のスモールＲＮＡを捕捉することができることは、この捕捉現象には、ブラウン運動の外乱に影響されない、力のバランス点への大きな復元力が存在していることを示唆している。
【００８３】
本発明において、予備実験として上記と同じチップを用いて、トータルＲＮＡの抽出液から非変性のままのＲＮＡの捕捉を試みたが、まったく捕捉することができなかった。このことから、コンパクトな塊状ＲＮＡ分子が変性されると複雑な三次元構造が解きほぐされ、流体力学的な大きさと形状に変化し、その結果、抵抗係数も大きくなることがわかる。
【００８４】
したがって、保有する総電荷が変わらずに、トータルのドラッグフォースが大きくなるため、ドラッグフォースと電気力の比が図５（ｂ）の捕捉の境界線ｂ−ｂの傾きよりも大きくなり、捕捉することが可能になったものと考えられる。
【００８５】
第３の相違点は、上述したように、ＲＮＡのサイズごとに捕捉可能な液体の圧力の限界が存在することから、流体力学的な力が関与していることである。
【００８６】
以上のことから、ＲＮＡ分子の流体力学的性状が、その捕捉に顕著に反映しており、誘電泳動法とは異なる何らかの流体力学的な力が関与する捕捉のメカニズムが働いているものと考えられる。
【００８７】
以上説明したように、本発明によれば、従来の誘電泳動では困難であるＲＮＡ分子などの生体分子を捕捉することができる。また、本発明の方法によれば、生体分子の大きさの選択性があるので、その大きさに応じた生体分子を抽出することができる。
【００８８】
なお、捕捉することができる生体分子の最小の大きさは、１００ｂ以下のスモールＲＮＡが捕捉されていることから、２０ｂレベルのマイクロＲＮＡを捕捉することができると考えられる。また、チップ上で捕捉された生体分子をそのまま回収する技術と組み合わせることにより、様々なＲＮＡ分子の混合溶液であるトータルＲＮＡ抽出液から所望のＲＮＡを抽出することができる。
【００８９】
したがって、本発明によれば、細胞や組織からの所望の生体分子の簡便な抽出ツールの実現に道を開くとともに、細胞中で発現している配列不明な未知のＲＮＡの回収への応用が期待される。また、本発明によって同時に得られた捕捉パターン遷移をはじめとする数多くの知見は、荷電生体高分子の捕捉現象の解明に大いに寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明の検体の捕捉方法に用いることができるチップの一実施形態を示す概略説明図である。
【図２】本発明の実施例で用いられた実験装置の概略説明図である。
【図３】本発明の実施例におけるＲＮＡの捕捉パターンおよびその遷移を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図４】本発明の実施例１で得られた変性されたＲＮＡが捕捉された領域を示す説明図である。
【図５】本発明における荷電粒子に作用する力のバランス点の移動を示す概略説明図である。
【符号の説明】
【００９１】
１  狭小部
２  液体流路
３  テーパ
４  リザーバ
５  ウエステ
２１  チップ
２２  電源装置
２３  ＣＣＤカメラ
２４  シリンジ
２５  圧力計
２６  変性生体分子
２７  （白金）電極
２８  ガラス板
２９  流路が形成されているＰＤＭＳシート
３０  カバーガラス
３１  蛍光顕微鏡
【図１】
2008116318.tif 000002
【図２】
2008116318.tif 000003
【図３】
2008116318.tif 000004
【図４】
2008116318.tif 000005
【図５】
2008116318.tif 000006