(57)【要約】【課題】小型マイクロアレイを簡便に作製、取り扱い、使用することができるマイクロアレイ用基板を提供すること。【解決手段】基板に少なくとも１つ以上のアレイ形成部が配置されていて、前記アレイ形成部が、基板から個別に取り出すことが出来ることを特徴とするマイクロアレイ用基板であって、好ましくは前記アレイ形成部の面積が、０．０１〜４ｃｍ２であり、前記アレイ形成部の周囲に一部を残して連続する切れ込みが基板を貫通して形成されているマイクロアレイ用基板であり、該マイクロアレイ用基板を用いて、アレイ形成部にアレイを作製した後、アレイ形成部を基板から切り離すことによって小型マイクロアレイを作製するマイクロアレイ用基板の使用方法。【選択図】 図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板に少なくとも１つ以上のアレイ形成部が配置されていて、前記アレイ形成部が、基板から個別に取り出すことが出来ることを特徴とするマイクロアレイ用基板。
【請求項２】
前記アレイ形成部の面積が、０．０１〜４ｃｍ２である請求項１記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項３】
前記アレイ形成部の周囲にミシン目状の切れ込みが形成されている請求項１又は２記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項４】
前記アレイ形成部の周囲に一部を残して連続する切れ込みが基板を貫通して形成されている請求項１又は２記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項５】
前記アレイ形成部の周囲に溝が形成されていている請求項１又は２記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項６】
前記溝部分の厚みが、０．０５〜０．５ｍｍである請求項５記載のマイクイロアレイ用基板。
【請求項７】
基板の材質がプラスチックである請求項１〜６いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項８】
基板の形態が、スライドガラス形状又はフィルム状である請求項１〜７いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか記載のマイクロアレイ用基板を用いて、アレイ形成部にアレイを作製した後、アレイ形成部を基板から切り離すことによって小型のマイクロアレイを作製することを特徴とするマイクロアレイ用基板の使用方法。
【請求項１０】
前記アレイの形成が、スライド状基板及び／又はマルチウェルプレート状基板上へのアレイ作製用アレイヤーを用いて行われる請求項９記載のマイクロアレイ用基板の使用方法。
【請求項１１】
前記アレイの形成が、生理的活性物質を特異的に捕捉する物質をアレイ形成部に固定する工程を含む請求項９又は１０記載のマイクロアレイ用基板の使用方法。
【請求項１２】
前記生理的活性物質を特異的に捕捉する物質が、核酸鎖、タンパク質、ペプチド、及び糖鎖から選ばれる少なくとも１種である請求項１１記載のマイクロアレイ用基板の使用方法。
【請求項１３】
前記生理的活性物質を特異的に捕捉する物質が、薬物候補物質である請求項１１記載のマイクロアレイ用基板の使用方法。
【請求項１４】
請求項１〜８いずれか記載のマイクロアレイ用基板を用いて作製された小型マイクロアレイ。
【請求項１５】
請求項９〜１３いずれか記載のマイクロアレイ用基板の使用方法により作製された小型マイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイ用基板及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な遺伝子解析技術が開発され、生命機能の解明に拍車がかかっている。医療において各種疾患と動的に対応する遺伝子多型のデータベースを構築できれば、ターゲットとなる疾患関連遺伝子群の同定が可能となり、さらにはカスタムメイド治療や新しいドラッグデザインによる新薬の開発などを進めることができると考えられている。こうした中で、非常にスモールスケールな抽出、反応、検出など行えるマイクロアレイや、多数の遺伝子、あるいは多数の試料を同時に測定できるということで、遺伝子多型解析の最有力技術としてＤＮＡチップのようなマイクロチップが注目されている。
【０００３】
また、近年網羅的な発現解析や遺伝子多型解析の基礎的な研究により、医療、食品、農業など様々な分野でのターゲットを絞ったＤＮＡマイクロアレイの開発が盛んに行われている。例えば、Ｙａｓｔ  Ｏｌｉｇｏ  Ｃｈｉｐ  ６Ｋ（ＤＮＡチップ研究所株式会社製）などが挙げられる。これらのようなターゲットを絞ったマイクロアレイは網羅的なものと比較し検査数が少なく、従来のスライド状基板の大きさを必要としない。つまり、現状一般的に使われているスライド状基板は、その大きさには網羅的解析のような数万種類の検査には適しているが、数十〜百種類のターゲットを絞った解析には不適当である。そこで、上記網羅的解析に用いられる量よりさらにスモールスケールな微小マイクロアレイが開発されている。（非特許文献１参照）
【０００４】
マイクロアレイ基板を小型化することにより、微小空間での反応を行うことができ、１回あたりの反応液量、サンプル量を抑えることができる。また、反応液の温度管理が行いやすく、固相表面上での反応の温度コントロールができる。このことにより、ＰＣＲ反応装置のような微小空間の精密な温度コントールデバイスが利用可能になり、ＤＮＡチップの可能性が更に広がる可能性が示唆されている。
【０００５】
しかし、この小型のマイクロアレイ基板は従来のスライド状マイクロアレイ基板等の形状に比較して、小さい形状のため取り扱いが難しく、また一般的にマイクロアレイの作製に用いられるアレイヤー装置でのアレイ位置決め及び基板の固定が難しい。そのため、現状として精度のよいアレイを作製することができない。
【非特許文献１】久原哲、梶江慎一、浅岡広彰著「DNAチップ活用テクノロジーと応用」シーエムシー出版、２００６年９月
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、小型マイクロアレイを簡便に作製、取り扱い、使用することができるマイクロアレイ用基板を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の通りである。
（１）基板に少なくとも１つ以上のアレイ形成部が配置されていて、前記アレイ形成部が、基板から個別に取り出すことが出来ることを特徴とするマイクロアレイ用基板。（２）前記アレイ形成部の面積が、０．０１〜４ｃｍ２である（１）記載のマイクロアレイ用基板。
（３）前記アレイ形成部の周囲にミシン目状の切れ込みが形成されている（１）１又は（２）記載のマイクロアレイ用基板。
（４）前記アレイ形成部の周囲に一部を残して連続する切れ込みが基板を貫通して形成されている（１）又は（２）記載のマイクロアレイ用基板。
（５）前記アレイ形成部の周囲に溝が形成されていている（１）又は（２）記載のマイクロアレイ用基板。
（６）前記溝部分の厚みが、０．０５〜０．５ｍｍである（５）記載のマイクイロアレイ用基板。
（７）基板の材質がプラスチックである（１）〜（６）いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
（８）基板の形態が、スライドガラス形状又はフィルム状である（１）〜（７）いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
（９）（１）〜（８）いずれか記載のマイクロアレイ用基板を用いて、アレイ形成部にアレイを作製した後、アレイ形成部を基板から切り離すことによって小型のマイクロアレイを作製することを特徴とするマイクロアレイ用基板の使用方法。
（１０）前記アレイの形成が、スライド状基板及び／又はマルチウェルプレート状基板上へのアレイ作製用アレイヤーを用いて行われる（９）記載のマイクロアレイ用基板の使用方法。
（１１）前記アレイの形成が、生理的活性物質を特異的に捕捉する物質をアレイ形成部に固定する工程を含む（９）又は（１０）記載のマイクロアレイ用基板の使用方法。
（１２）前記生理的活性物質を特異的に捕捉する物質が、核酸鎖、タンパク質、ペプチド、及び糖鎖から選ばれる少なくとも１種である（１１）記載のマイクロアレイ用基板の使用方法。
（１３）前記生理的活性物質を特異的に捕捉する物質が、薬物候補物質である（１１）記載のマイクロアレイ用基板の使用方法。
（１４）（１）〜（８）いずれか記載のマイクロアレイ用基板を用いて作製された小型マイクロアレイ。
（１５）（９）〜（１３）いずれか記載のマイクロアレイ用基板の使用方法により作製された小型マイクロアレイ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のマイクロアレイ用基板によれば、小型マイクアレイを簡便に作製、取り扱い、使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
図１は、本発明の実施の一形態におけるマイクロアレイ用基板の説明図である。マイクロアレイ用基板２はスライド状基板であり、内部にアレイ形成部である小型マイクロアレイ用基板１が配置してあり一枚のスライドを成している。
【００１０】
この時、マイクロアレイ用基板２の内部には、小型マイクロアレイ用基板１が1つ以上入れ込むことが可能であり、本発明の実施形態では、アレイ形成部形状寸法を幅２ｍｍ×長さ２０ｍｍとし、スライド状基板1枚につき9個取り可能になるように設定した例で説明する。アレイ形成部の面積としては、０．０１〜４ｃｍ２であることが好ましい。
【００１１】
また、アレイ形成部１の片面または両面には、ＤＮＡを固定することのできる機能を有している。具体的には、表面にアルデヒド基を化学的に配し、DNAのアミノ基との反応により固定化することができる。また、PMBN（特開２００６−１８７２７０号、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ））を基板表面にコートすることにより、表面の活性化された活性エステル基により固定化することができる。DNA以外には、タンパク質、ペプチド、糖鎖、脂質などの生理活性物質を固定化することのできる機能を有してもよい。また、これら生理活性物質を特異的に捕捉する物質を固定化してもよい。
【００１２】
図１のスライド状基板２は、スライドガラス等に代表される標準的なスライド状であり、幅２５．４ｍｍ×長さ７５．１ｍｍ×厚さ１ｍｍものである。
本発明はマイクロアレイ用基板の寸法に限定はなく、また、スライド状以外にも、フィルム、マイクロタイタープレートなどを用いても行うことできる。
【００１３】
本発明のマイクロアレイ用基板の材質は、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス担体のものに比べて安価で提供することができるという観点からプラスチック材料であることが好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００１４】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、ＤＮＡ鎖の検出反応におけるバックグランドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることができる。これらの中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、担体の材料として好ましく用いられる。
【００１５】
図２は、本発明の実施の形態による小型マイクロアレイ８の作製工程を示す説明図である。図２（ａ）は、マイクロアレイ用基板であるスライド状基板２にアレイ形成部１が配置された状態を示す図、およびアレイ形成部拡大図である。図２（ｂ）は、マイクロアレイ作製のアレイヤー装置での処理を示す図である。図２（ｃ）はアレイ形成部１に生理活性物質等を点着により基板表面に結合させた状態を示す図、およびアレイ形成部拡大図である。図２（ｄ）は、個々の小型マイクロアレイを打ち抜いた状態を示す図及び拡大図である。
【００１６】
図２（ａ）では、スライド状基板2内部の個々のアレイ形成部１に対し、幅２ｍｍ×長さ２０ｍｍの形状に合わせて、個々のアレイ形成部１がスライド状基板２に留まるよう保持するためのゲート部３を残して、アレイ形成部１の外形から約１ｍｍの幅で全周にわたり貫通部４を形成した状態を示している。
【００１７】
アレイ形成部周囲が前記形状に限らず、小型マイクロアレイ基板１の外形に容易に切り取り可能なミシン目状の切れ込みでもよい。また、溝の加工が施してあり、その部分が切り取りやすく肉薄な部分を形成してもよい。溝部分の厚みとしては０．０５〜０．５ｍｍであることが好ましい。
【００１８】
切断用の切れ込み、又は溝の加工はスライド状基板２をドリル等による切削加工により作製することができる。また、プラスチック金型による射出成形等による成形方法でも作製することができる。
【００１９】
また、小型マイクロアレイ基板１を保持しているゲート部３は、十分な強度を確保し、アレイヤー装置６によるアレイ処理時の搬送、位置決め時の押さえ圧力やアレイ処理圧に耐えられるようゲート部３の幅やその配置が適宜設計される。
【００２０】
この状態でスライド状基板２をマイクロアレイヤー装置６にセットし、個々のアレイ形成部１の表面に生理活性物質等の点着によるアレイ７を作製する。また、アレイ７は、その使用目的によりスライド状基板２を裏返して再度セットすること等により、各々のアレイ形成部１の裏面に対しても可能である。また、マイクロアレイヤー装置６以外に印字発行機等を用いることにより、アレイ形成部１に文字やバーコード等を印字することができる。
【００２１】
図２（ｃ）は、小型マイクロアレイ基板１の表面へのアレイ７を作製が完了したスライド状基板２を示したものである。このスライド状基板２から個々の小型マイクロアレイ基板１を、切り取り、打ち抜き等の手段によって、図２（ｄ）に示すようにこの小型マイクロアレイ８として使用することができる。
【００２２】
本発明によれば、スライド状基板中に複数のアレイ形成部を埋設し、その片面または両面には、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、糖鎖などの生理活性物質を固定化する機能有し、さらに、小型マイクロアレイ基板形状にあわせて脱落を防止するためのゲートを残して抜き打ち加工したので、既存のマイクロアレイヤー装置をそのまま、あるいは最小限の改造で利用でき、容易に小型マイクロアレイ基板表面へのマイクロアレイの作製及び情報の印字が可能となる。また、アレイ作製及び搬送、保存等、スライド状基板のまま行うことができ生産性が向上し、また使用時に容易に抜き取り、使用できるため作製されたアレイの信頼性が向上する。
【００２３】
従って、小型マイクロアレイの作製において、容易に小型マイクロアレイ基板表面に既存マイクロアレイヤーでアレイ作製可能とし、スライド状基板のまま容易に搬送、保存を行うことで取り扱いを容易にする小型マイクロアレイ及びその作製方法を提供できる。
【実施例】
【００２４】
（複数のアレイ形成部を有する基板の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂で成形したプラスチック製スライド基板を切削装置により、図１に示したスライド状基板２のように表面加工を施した。スライド状基板2内部の個々のアレイ形成部１に対し、幅２ｍｍ×長さ２０ｍｍの形状に合わせて、個々のアレイ形成部１がスライド状基板２に留まるよう保持するためのゲート部３を残して、アレイ形成部１の外形から約１ｍｍ幅で全周にわたり貫通部４を形成した状態である。
【００２５】
（ＰＭＢＮコート基板の作製）
加工したスライド状基板２をエタノール洗浄後、表面をＰＭＢＮ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、ＰＭＢＮコート基板を作製した。
【００２６】
（プライマー固定）
５’末端がアミノ基で修飾された、各菌２３ＳリボゾームＤＮＡ配列特異なオリゴＤＮＡ鎖を０．２５Ｍ 炭酸バッファー（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。これら溶液をマイクロアレイヤー装置（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い、１００μｍ径クロスカットピンでアレイ形成部の表面上にスポットした。オリゴＤＮＡをスポットした基板を、８０℃で一時間加熱して、オリゴＤＮＡ（プライマー）を固定化させた。通常のマイクロアレイヤー装置で小型マイクロアレイ基板にスポットによるプライマーの固定化を行うことは、その小型な形状のため位置あわせが難しく極めて困難である。この問題点に対し、本発明のスライド状の基板を用いることで容易に位置あわせを行うことができ、基板内に配置した小型マイクロアレイ表面に対しプライマーの固定化を行うことができる。本実施例では、９個の小型マイクロアレイを配置したスライド状基板を用いた。本発明のスライド状に複数マイクロアレイを配置することができるため、１度のスポット処理で複数個の小型マイクロアレイを作製することができ、スポット処理の生産性の向上を行うことができる。また、スライド状基板のため輸送、検査、保存等の取り扱いが行いやすい。スポットおよび固定化させた大腸菌検出用プライマーの鎖配列を下記に示す。
黄色ブドウ球菌（ＳＡ）：agtaggataggcgaagcgtgcgatt 
大腸菌（ＥＣＯ）： ctgatatgtaggtgaagcgacttgctcg 
緑濃菌（ＰＡ）： gttaatcgacgcagggttagtcggtt 
サルモネラ菌（ＳＡＬ）： tgtgtgttccaggtaaatccggttc 
ポジティブコントロール（ＰＯＳ）：gacagccaggatgttggcttagaagcagc 
スライド状基板２から個々の小型マイクロアレイ基板１を打ち抜きによって切り離した。
【００２７】
（菌の培養）
以下に掲げる菌株の培養を行った。
使用した菌株名
黄色ブドウ球菌： Staphylococcus aureus ATCC 25923
大腸菌：Escherichia coli ATCC 25922
緑膿菌：Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
サルモネラ菌：
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis IID 604
寒天培地を用い、37℃、一昼夜(14-18時間)行った。培地はインスタント培地である"普通ブイヨン栄研"を用い、液体培地は" 普通ブイヨン栄研"の指示量を脱塩水に溶かし、寒天培地はそれに1.6%の寒天を加え、それぞれオートクレーブ後、使用した。
【００２８】
（２３ＳリボゾームＤＮＡの抽出）
上記菌培養における１つのコロニーを、２００μｌのＰＢＳ（−）中に分散させ、ＤＮＡ抽出キット（Invitrogen）を用い、３μｌのＤＮＡ抽出液を得た。
（ＰＣＲによる２３ＳリボゾームＤＮＡ鎖増幅反応）
２３ＳリボゾームＤＮＡのユニバーサルプライマーを用い、ＰＣＲ反応により２３ＳリボゾームＤＮＡの増幅をおこなった。
ＰＣＲ による増幅に使用プライマーの配列を下記に示す。
プライマー配列：
センス：５‘−gacagccaggatgttggcttagaagcagc
アンチセンス：下記を同量混合したものを用いた。
５‘−ggaatttcgctaccttaggaccgttatagttacg
５‘−ggaatttcgctaccttaggatggttatagttacc
ＰＣＲバッファー２５μＬ中に上記プライマー各々を１２．５pmol、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、Ｃｙ３標識ｄＵＴＰ、０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（ タカラバイオ株式会社製Ex Taq）を溶解させ、サーマルサイクラーにより、熱変性９５℃１分、アニーリング７５℃２分、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃５分のヒートサイクルで、１０サイクル行い、ＰＣＲ産物を得た。
【００２９】
（ハイブリダイゼーション）
PCR反応を行ったPCRチューブに上記プライマーを固定した小型マイクロアレイ基板をいれ、９５℃１分、６５℃６０分の条件におき、基板表面上のプライマーとのハイブリダイゼーションを行った。基板をチューブから取り出し、PBSTで３回洗浄を行った。
【００３０】
蛍光スキャナー（ScanArray パーキンエルマー社製）によりスポットの蛍光強度を測定した。各々の菌から抽出したDNA溶液について、基板上に固定した上記プライマー各々のスポット蛍光強度について比較を行った。
【００３１】
スポットの蛍光強度の比較を表１に示す。
【００３２】
【表１】
2008249439.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明のマイクロアレイ用基板の一実施形態の模式平面図（（ａ）マイクロアレイ用基板、（ｂ）小型マイクロアレイ）
【図２】本発明のマイクロアレイ用基板による小型マイクロアレイの作製工程を示す概略図
【符号の説明】
【００３４】
１  アレイ形成部（小型マイクロアレイ用基板）
２  マイクロアレイ用基板（スライド状基板）
３  ゲート部
４  貫通部
６  マイクロアレーヤー装置
７  アレイ
８  小型マイクロアレイ
【図１】
2008249439.tif 000004
【図２】
2008249439.tif 000005