(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍起源の細胞種及び又は組織の同定を目的とする。【解決手段】すべての腫瘍細胞は、抗癌活性を有するキノン部位阻害剤によって特徴的に阻害される、タンパク質ジスルフィド−チオール交換活性を有する細胞表面ユビキノン（ＮＡＤＨ）オキシダーゼタンパク質の独特のファミリー（ＥＣＴＯ−ＮＯＸタンパク質）のうちの１種以上のメンバーを発現する。種々の細胞又は組織起源の癌は、種々のｔＮＯＸ（腫瘍特異的ＮＡＤＨオキシダーゼ（ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＮＡＤＨ  ｏｘｉｄａｓｅ））癌アイソフォーム又はアイソフォームの組合せを発現し、これらのタンパク質を循環中に放出する。アイソフォームのパターン及び分子量に基づく情報を取得することにより、癌の検出及び起源の診断が可能となる。相対的なｔＮＯＸ量は、腫瘍の程度に比例しており、治療に対する反応及び疾患進行についての信頼できる尺度を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルにおいてＥＣＴＯ−ＮＯＸ癌特異的ｔＮＯＸアイソフォームタンパク質を検出する方法であって、
（ａ）生体サンプルからＥＣＴＯ−ＮＯＸ癌特異的ｔＮＯＸアイソフォームタンパク質を濃縮するステップと、
（ｂ）濃縮されたＥＣＴＯ−ＮＯＸ癌特異的ｔＮＯＸタンパク質を等電点によって分離するステップと、
（ｃ）等電点によって分離されたＥＣＴＯ−ＮＯＸ癌特異的ｔＮＯＸタンパク質を大きさによって分離するステップと、
（ｄ）分離されたＥＣＴＯ−ＮＯＸ癌特異的ｔＮＯＸアイソフォームタンパク質を、細胞表面ＮＡＤＨオキシダーゼと特異的に結合する抗体を用いて検出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記濃縮するステップがニッケルアガロースとの結合によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血清又は血漿からｔＮＯＸタンパク質を濃縮する前記ステップが、エタノール沈殿によるものであるか、又は硫安沈殿によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記濃縮されたＥＣＴＯ−ＮＯＸ癌特異的ｔＮＯＸタンパク質を還元剤と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記濃縮されたタンパク質を分離するステップが等電点電気泳動によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記大きさによって分離するステップがドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、受託番号ＰＴＡ−４２０６としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されたハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体１２．１である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記検出するステップが、汎アイソフォーム抗ｔＮＯＸ一本鎖可変領域（ＳｃＦｖ）抗体と、前記一次抗体に特異的である検出可能な二次抗体とを用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳｃＦｖ抗体が、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
検出可能な前記抗体が酵素法、発色法、化学発光法、放射線検査法、磁気法又は蛍光法によって検出される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記一次抗体がＳタグ付き組換え抗体であり、検出可能な抗Ｓ特異的二次抗体を結合するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出可能な二次抗体がアルカリホスファターゼと連結しており、結合が、発色性アルカリホスファターゼ基質の存在下で検出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
スキャン及びコンピュータで実行されるアルゴリズムによって癌特異的ｔＮＯＸアイソフォームを定量化するステップをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素法がアルカリホスファターゼ法である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素法が西洋ワサビペルオキシダーゼ法である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ｔＮＯＸ特異的前記抗体が認識タグを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
認識タグがＳタグ、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ又はＮＵＳタグであり、検出可能な二次抗体が前記タグと特異的に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体サンプルが、腫瘍性状態を有している疑いのある患者から得た細胞、血清、血漿、尿、唾液又は生検組織である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
癌の個々の起源を診断する方法であって、６４、６６及び／又は６８ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォームの存在を乳癌と、５４ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォームを非小細胞肺癌と、５２及び４０．５ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォームを小細胞肺癌と、等電点の異なる２種の７５ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォームを前立腺癌と、９４ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォームを子宮頸癌と、４３及び５２ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォームを結腸癌と、又は４０．５、５２及び約８０ｋＤａのアイソフォームを卵巣癌と関連付けるステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
[0001]本願は、双方ともに２００６年９月１日に出願され、双方とも、本開示内容と矛盾のない限り、参照により本明細書に組み込まれる米国仮出願第６０／８２４，３９８号及び米国仮出願第６０／８２４，３３３号の利益を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
[0002]本発明の分野は、タンパク質生化学の領域であり、特に、腫瘍及び病変細胞の診断に関し、具体的には、一般的な腫瘍に特徴的な細胞表面マーカーの特定のアイソフォーム及び特定の種類の癌を示す特定のパターンのタンパク質発現に関する。特定のアイソフォームの検出は特異的抗体の使用による。
【０００３】
[0003]ＥＣＴＯ−ＮＯＸタンパク質と呼ばれる（細胞表面ＮＡＤＨオキシダーゼ（ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ＮＡＤＨ  ｏｘｉｄａｓｅｓ）のために）、独特な、増殖に関連している、タンパク質ジスルフィド−チオール交換活性を有する細胞表面ヒドロキノン又はＮＡＤＨオキシダーゼのファミリーがある（１，２）。ｔＮＯＸと呼ばれる（腫瘍関連（ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）のために）、ＥＣＴＯ−ＮＯＸファミリーのうちの１種のメンバーは、癌細胞の表面及び癌患者の血清に特異的である（３，４）。ｔＮＯＸタンパク質の存在は、いくつかのヒト腫瘍組織（乳癌、前立腺癌、神経芽腫、結腸癌及び黒色腫）について実証されており（５）、血清分析によってヒト癌とのより広い関連が示唆されている（６，７）。
【０００４】
[0004]ＮＯＸタンパク質は、形質膜脂質二重層の外側に固定されたエクトプロテインである（８）。ＮＯＸタンパク質は、エクトプロテインのその他の例（シアリル及びガラクトシルトランスフェラーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶなど）に特徴的なように放出される。それらは、培養細胞の培養上清中で（５）、及び患者の血清中で（６，７）可溶型であると思われる。癌患者から得たｔＮＯＸの血清型は、膜結合型が示すのと同程度の薬物反応性を示す。薬物反応性ｔＮＯＸ活性は、白血病、リンパ腫又は固形腫瘍（前立腺、胸部、結腸、肺、膵臓、卵巣、肝臓）を有する患者をはじめとする種々のヒト癌患者の血清において見られる（６，７）。ｔＮＯＸタンパク質の極度の安定性及びプロテアーゼ耐性（９）が、癌患者の血清中に容易に検出可能なレベルに蓄積するその能力を説明するのに役立ち得る。対照的に、薬物反応性ＮＯＸ活性がないことが、健常なボランティアの血清において（６，７）、又は腫瘍以外の障害を有する患者の血清において見られている。
【０００５】
[0005]細胞表面ｔＮＯＸの癌特異性の基礎は決定されていないが、この概念はいくつかの系統の証拠によって強力に支持されている。薬物反応性ｔＮＯＸ活性は、非形質転換ヒト及び動物の細胞及び組織の形質膜にないことが厳密に調べられている（３）。ｔＮＯＸタンパク質は、膜貫通結合ドメインを欠き（１０）、低ｐＨでの短時間の処理によって細胞表面から放出される（９）。健常なボランティア又は癌以外の疾患を有する患者から得られた血清では薬物反応性ｔＮＯＸ活性は検出されていない（６，７）。抗原供給源として健常なボランティア又は癌以外の障害を有する患者から得た非形質転換細胞及び組織又は血清を用いる場合には、いくつかのｔＮＯＸ抗血清によって、ウェスタンブロット解析又は免疫沈降を用いて、３４ｋＤａ（細胞表面型のｔＮＯＸの１種のプロセシングされた分子量）の免疫反応性バンドが同定されている（５，１０，１１）。健常なボランティア又は癌以外の障害を有する患者から得た非形質転換細胞及び組織又は血清を用いる場合には、ウェスタンブロット解析又は免疫沈降で、３４ｋＤａの免疫反応性バンドは存在しない（５，１０，１１）。これらの抗血清としては、モノクローナル抗体（５）、正常細胞及び腫瘍細胞に由来する細胞表面ＮＡＤＨオキシダーゼと反応する一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、発現されたｔＮＯＸに応じて作製されるポリクローナル抗血清（１１）及び保存された、ｔＮＯＸのアデニンヌクレオチド結合領域に対するポリクローナルペプチド抗血清（１１）が挙げられる。
【０００６】
[0006]ｔＮＯＸ  ｃＤＮＡはクローニングされている（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２０７８８１；１１；米国特許公報第２００３−０２０７３４０  Ａ１号）。オープンリーディングフレームから導かれた分子量は、７０．１ｋＤａであった。機能的モチーフは、キノン結合部位、アデニンヌクレオチド結合部位及び位置指定突然変異誘発に基づいて、可能性のあるタンパク質ジスルフィド−チオール交換部位としてＣＸＸＸＸＣシステイン対を含む（１１）。入手可能なゲノム情報によると（１２）、ｔＮＯＸ遺伝子はＸ染色体上に位置し、複数のエクソン（１３個）を含む。多くのスプライス変異体ｍＲＮＡ及び発現されたタンパク質があることが知られている。
【０００７】
[0007]ブタペスト条約の条項に従い、２００２年４月４日、腫瘍ＮＡＤＨオキシダーゼ特異的モノクローナル抗体ＭＡＢ  １２．１を産生するハイブリドーマ細胞株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，２０１０８に寄託された。この寄託物は、受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２０６によって特定される。この寄託物は、ＡＴＣＣ保管場所において寄託日時から３０年間、最新の依頼から５年間又は特許の有効期間の間のうち、より長い期間、制限をもって維持され、寄託物がその期間の間に生育不能になった場合には置き換えられる。このモノクローナル抗体は、参照により本明細書に組み込まれる、２００６年５月３０日に発行された米国特許第７，０５３，１８８号に記載されている。
【０００８】
[0008]癌はヒトの健康にとって深刻な脅威となるため、また、癌が多大な経済費用をもたらすため、当技術分野では、癌の存在をアッセイするための、有効で、経済的で、かつ、技術的に簡単な系が長年必要とされている。
【０００９】
（本発明の概要）
[0009]本発明は、ｔＮＯＸ（腫瘍特異的ＮＡＤＨオキシダーゼ（ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＮＡＤＨ  ｏｘｉｄａｓｅ）のために）として知られる汎癌（ｐａｎ−ｃａｎｃｅｒ）抗原の特定のアイソフォームの存在について生体サンプルを分析する方法を提供する。本方法は、２次元ゲル電気泳動及び汎癌ｔＮＯＸ抗原に特異的な抗体及び特定の種類の癌を特徴付ける種々のアイソフォームを用いる免疫ブロッティングを必要とする。具体的に示されるように、約４−６ｍｇのタンパク質を分析用にロードする。
【００１０】
[0010]本発明は、癌の、及び癌起源（胸部、卵巣前立腺など）の細胞種又は組織の存在の指標として、特定の癌特異的血清又は血漿ｔＮＯＸアイソフォームを検出する方法を提供する。ｔＮＯＸアイソフォームは、ｔＮＯＸ特異的モノクローナル抗体（ＭＡＢ）（米国特許第７，０５３，１８８号）を用い、すべての細胞表面ＮＯＸタンパク質（年齢に関連した、また正常細胞及び腫瘍特異的なＮＡＤＨオキシダーゼの双方）を認識する一本鎖可変領域（ＳｃＦｖ）断片、又はｔＮＯＸに対して作製されたポリクローナル血清を用いる検出を用い、その分子量及び等電点に基づいて同定される。まず、生体サンプル、望ましくは、血清サンプルから、ＥＣＴＯ−ＮＯＸタンパク質をニッケル−アガロースと結合させ、次いで、溶出することにより濃縮する。ボルテックス処理することによって、ニッケル−アガロースからタンパク質を放出させた後、タンパク質を、等電点電気泳動によって１次元で、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって２次元で分離する。本明細書において具体的に示されるように、等電点電気泳動ステップは３から１０のｐＨ範囲にわたるものであり、大きさによる分離は１０％ポリアクリルアミドゲルによるものである。ほとんどの癌特異的ｔＮＯＸアイソフォームは、ｐＨ４．４及び５．４の間の極めて狭い範囲に等電点を示すが、分子量は３４から１３６ｋＤａで異なる。具体的に示される２Ｄゲルシステムでは、癌特異的アイソフォームは、第Ｉ象限（相対的に高い分子量の物質）及び第ＩＶ象限（低い分子量物質、特に、３４及び４３ｋＤａアイソフォーム）に位置する。ＩｇＧ重鎖（第ＩＩ象限及びＩｇＧ軽鎖（第ＩＩＩ象限）は、ＳｃＦｖ抗体と交差反応し、ローディングコントロールとして働く。すべてのｔＮＯＸアイソフォームがないことは、癌がないことを示し、ｔＮＯＸアイソフォームが存在することは癌が存在することを示す。血清サンプル中に存在する特定の分子量又はアイソフォームの特定の組合せは、細胞種又は組織の癌の起源の指標を提供する。本方法は癌の存在を調べるだけでなく、本発明の方法は、起源の組織に関する診断情報も提供する。目下のところ、これらの特定の機能を備えるその他の汎癌（ヒト癌のすべての形）試験はない。
【００１１】
[0011]本発明は、ヒトを含む哺乳類において腫瘍を調べる方法を提供し、前記方法は、生体サンプルにおいて癌の存在を検出するステップを含む。本発明は、例えば、血清、血漿、尿、唾液又は生検材料における、腫瘍の程度の尺度を含む、腫瘍の評価のためのさらなる情報をさらに提供する。
【００１２】
[0012]また、特定の（原発）癌と関連するｔＮＯＸの個々のアイソフォームも本発明の範囲内にある。約６４、６６及び／又は６８ｋＤａという見かけの分子量を有するｔＮＯＸタンパク質は、乳癌と関連しており、約４０．５及び５２ｋＤａの２種のｔＮＯＸタンパク質は、小細胞肺癌と関連しており、約４０．５、５２及び８０ｋＤａのｔＮＯＸタンパク質は卵巣癌を特徴付け、７５α及び７５βと呼ばれる約７５ｋＤａの２種のｔＮＯＸアイソフォームは前立腺癌と関連しており、約９４ｋＤａのｔＮＯＸタンパク質は子宮頸癌と関連しており、約４３及び５２ｋＤａのｔＮＯＸタンパク質は結腸癌に特徴的であり、約５４ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォームは非小細胞肺癌と関連している。患者が癌を有している疑いがある場合には、生体サンプル、有利には、血清サンプルを調製することができ、本発明の２Ｄゲル電気泳動／免疫学的分析を行うことができる。陽性結果は癌の存在を示し、特徴的なタンパク質の検出によって、上記に示される、特定のタンパク質と特定の癌の起源との関連性に準じて、その患者における癌の原発発生について推定することが可能となる。
【００１３】
[0013]本発明の方法はまた、治療の成功を反映するＮＯＸアイソフォームの量の減少によって、治療に対する反応を評価するために、又再発疾患の早期検出（反映されるｔＮＯＸ特異的アイソフォームの増加又は再発を評価するために適用できる。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
[0028]本発明の癌診断システムは、ヒト血清におけるタンパク質の分離のために２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動技術を利用して、癌特異的アイソフォームパターン並びに癌の存在、腫瘍の種類、疾患重篤度及び治療反応を示す組成物を作製する。本プロトコールは、癌の存在及び疾患重篤度を示すために分離される、少なくとも２０種の癌特異的ｔＮＯＸアイソフォームの検出のために設計されている。この明細書では、特定の癌を反映するｔＮＯＸアイソフォームを検出するための、アイソフォーム分離性２次元ゲル電気泳動プロトコールとそれに続く免疫分析のプロセスを示す。
【００１５】
[0029]２次元ゲル電気泳動は、互いに直交して置かれる２次元で移動させることによって分離し、免疫ブロッティングによってｔＮＯＸアイソフォームを同定する。第１次元では、等電点電気泳動（ＩＥＦ）によってアイソフォームを電荷（ｐＩ）に従って分離する。次いで、第２次元では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアイソフォームを大きさ（Ｍｒ）に従って分離する。次いで、汎癌特異的抗体調製物を用いるさらなる分析のために、アイソフォームをニトロセルロースメンブレン上にブロッティングする。
【００１６】
[0030]ウサギを免疫して、抗腫瘍スルホニル尿素（［Ｍｏｒｒeら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２４０、１１−１７頁）及びカプサイシンによって阻害される（Ｍｏｒｒeら、（１９９５）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１８３１−１８３５頁）ＮＡＤＨオキシダーゼ活性を示し、（３Ｈ）−ＬＹ１８１９８４と結合可能な、ＨｅＬａ細胞の増殖による培養上清の３３．５ｋＤａの成分に対する血清を調製した。これらの抗血清は、ウェスタンブロットで、ＨｅＬａ細胞由来の３４ｋＤａのｔＮＯＸタンパク質と、またカプサイシンによって阻害可能なＮＡＤＨオキシダーゼ活性が濃縮されたＦＰＬＣ分離物由来の物質の６８ｋＤａ及び１３６ｋＤａの多量体バンドと交差反応した。免疫前血清との反応性は観察されなかった。
【００１７】
[0031]癌患者及び腫瘍障害を有する動物の形質膜ｔＮＯＸ並びに尿及び血清中のその放出型に特異的な抗体は、例えば、ＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするための、又はヒトもしくは動物から得たサンプルにおいて腫瘍障害を検出もしくは診断するためのプローブとして有用である。抗体（又はｔＮＯＸを認識する抗体に特異的である二次抗体）は、補因子、阻害剤、蛍光物質、化学発光物質、磁性粒子又はその他の検出可能なシグナルを提供する物質と結合させることができる。適した標識としては、それだけには限らないが、放射性核種、酵素、基質、磁性粒子などが挙げられる。このような検出可能な部分（標識）の使用を記載する米国特許としては、それだけには限らないが、中でも、第３，８１７，８３７号、同３，８５０，７５２号、同３，９３９，３５０号、同３，９９６，３４５号、同４，２７７，４３７号、同４，２７５，１４９号、同４，３３１，６４７号、同４，３４８，３７６号、同４，３６１，５４４号、同５，４４４，７４４号、同４，４６０，５６１号、同４，６２４，８４６号、同４，３６６，２４１号、同５，７１６，５９５号が挙げられる。治療計画における使用のために、本発明の抗体を治療用放射性核種、化学療法薬、リボ核酸分解物質又は毒素と結合させることができる。中でも、米国特許第５，５４１，２９７号、同６，３９５，２７６号を参照されたい。本発明は、以下の限定されない実施例によってさらに理解され得る。
サンプル調製は以下の通りに実施する。
血清ｔＮＯＸタンパク質濃縮及び富化（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）
１．０．５ｍｌの微量遠心チューブにニッケルアガロースビーズ４０μｌを加える
ａ．ビーズを振盪してペレットを破壊し、完全に溶液にする
ｂ．使用前にチップを約２ｍｍ切断除去する
２．ビーズを洗浄する
ａ．４００μｌの脱イオン蒸留Ｈ２Ｏを加えてチューブを満たす
ｂ．チューブをボルテックス処理し、ビーズを２−３秒間完全に混合する
ｃ．チューブを１，０００ｇで３０秒間遠心分離する
ｄ．チューブをホルダー中に垂直に設置し、ビーズを沈降させる
ｅ．水／エタノール上清を廃棄する
３．ビーズに４００μｌの血清を加える
４．チューブを２−３秒間ボルテックス処理してペレットを完全に破壊する
５．振盪機上、水平面上で４℃で一晩、チューブをインキュベートする
タンパク質精製
１．チューブ（上記）を１，０００ｇで３０秒間遠心分離する
２．上清を廃棄する
３．上記のように脱イオン蒸留Ｈ２Ｏでビーズを３回洗浄する
第１次元（等電点電気泳動、ＩＥＦ）を以下の通りに実施する
ストリップ再水和
１．再水和溶液を調製／解凍する
ａ．使用の直前に溶液に１％ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加える（０．０１４ｇ／１．４ｍｌ）
２．アガロースが結合しているサンプルに１５０μｌの再水和溶液を加える
３．チューブを７５分間ボルテックス処理する
４．冷凍庫からイモビラインドライストリップ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐｓ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を取り出し、ストリップを５分間（しかし、使用前に１０分を越えないこと）室温に平衡化する。
５．黒色のマジックペンでストリップのプラスチックバッグにラベルをつける。
６．サンプルを１，０００ｇで１分間遠心分離してビーズをペレットにする。
７．チューブをホルダー中に垂直に設置し、ペレットを完全に沈降させる。
８．７ｃｍのドライストリップあたり１２５μｌのサンプル（上清）を水平トレイにロードする。
９．ドライストリップを、ゲル面を下にしてサンプルの上に設置する
１０．必要に応じて、数回、ストリップを注意深く持ち上げてサンプルに出し入れすることによってサンプルがストリップ中に均等に広がることを保証する。
１１．サンプルがストリップのある領域中に濃縮する場合には、ピペッティングによってサンプルを再分配する。
１２．ピペットチップでドライストリップ上に穏やかに押し付けることによって気泡を除去する。
１３．ふたをトレイ上に置き、トレイを湿潤ペーパータオルとともにプラスチックバッグ中に入れる。
１４．バッグを密閉する。
１５．サンプルを水平面上で室温で一晩（１２−２４時間の間）再水和させ、ストリップにサンプルを吸収させる。
代替のサンプル調製
１．再水和溶液を調製／解凍する
ａ．使用前に溶液に１％ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加える（．０１４ｇ／１．４ｍｌ）（還元剤との接触）
２．１本の微量遠心チューブあたり１３５μｌの再水和溶液を加える
３．１本の微量遠心チューブあたり１５μｌの血清を加える
４．チューブを１５分間ボルテックス処理する
５．冷凍庫からイモビラインドライストリップ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を取り出し、ストリップを５分間（しかし、１０分間を越えないこと。）ＲＴに平衡化する
６．ストリップのプラスチックバッグにラベルをつける
７．７ｃｍのドライストリップ１つあたり１２５μｌのサンプルを水平トレイにロードする。
８．ドライストリップを、ゲル面を下にしてサンプルの上に設置する
９．必要に応じて、数回、ストリップを注意深く持ち上げてサンプルに出し入れすることによってサンプルがストリップ中に均等に広がることを保証する。
１０．サンプルがストリップのある領域中に濃縮する場合には、ピペッティングによってサンプルを再分配する。
１１．ピペットチップでドライストリップ上に穏やかに押し付けることによって気泡を除去する。
１２．ふたをトレイ上に置き、トレイを湿潤ペーパータオルとともにプラスチックバッグ中に入れる。
１３．バッグを密閉する。
１４．サンプルを水平面上でＲＴで一晩再水和させ、ストリップにサンプルを吸収させる。
ａ．１２−２４時間の間
１５．ストリップの等電点電気泳動に続く。
ストリップの等電点電気泳動
１．ＩＰＧｐｈｏｒ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を作動させる
２．トレイからストリップを取り出し、ティッシュペーパーで両側を吸い取ることによって過剰のサンプルをストリップから注意深く除去する。
３．以下のように、ストリップをマニフォールドフォーカシングトレイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に置く
ａ．ゲル面を上にする
ｂ．プラス（酸性）の末端が裏を向く
ｃ．ストリップを整列させる
ｄ．金属ストリップの間（その結果、電極が金属ストリップに合い、接触する）
４．ストリップ１つあたり２つのペーパーウィック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，＃８０−６４９９−１４）を用いる
５．ウィックをウィック１つあたり１５０μｌの蒸留水で湿らせる。
６．ウィックをゲルの陽極末端及び陰極末端上に置く（約０．３ｃｍ）。
７．ウィック上であるがゲルからは離して（必ず、突起部分（ｐｒｏｎｇ）が金属プレート上にあるようにする）電極を置き、固定する。
８．ドライストリップカバー液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，＃１７−１３３５−０１）でストリップを覆い、全レーン及びストリップの横のレーンを満たす
９．装置を閉じる
１０．IＰＧｐｈｏｒ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をアンペア数最大５０μＡｍｐｓで用い、２０℃でＩＥＦを実施する。必要に応じて、実施を中断し、ウィックを取り替え、ダイフロントが消失するまで実施を続ける。
【００１８】
【表１】
2008111824.tif 000002
第２次元（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は以下の通りに実施する。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの調製
１．使用前に、プレートを洗浄し、石鹸及び温水で十分にこすり洗う。
２．蒸留水ですすぐ
３．プレートを風乾させるか、メタノールに浸漬したティッシュペーパーで拭く。
４．プレートをプロテイン−プラスマルチゲルキャスティングチャンバー（Ｐｒｏｔｅａｎ−ｐｌｕｓ  Ｍｕｌｔｉ−Ｇｅｌ  Ｃａｓｔｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ）中で組み立てる
５．ねじを確実に十分に堅く締める。
６．その後ＡＰＳ及びＴＥＭＥＤを加える前にゲル溶液を脱気する
７．脱気したゲル溶液を、気泡の形成が起こらないようゲルプレート中に注意深く注ぐ。
８．ゲルがガラスプレートの上部から約３ｃｍである時点で注ぐことを停止する。
９．蒸留水で穏やかにゲルを覆う。
１０．プラスチックラップで覆う。
１１．少なくとも１時間ゲルを重合させる
ＩＥＦストリップの平衡化
１．ストリップをトレイから取り出し、Ｗｈａｔｍａｎフィルターペーパー上に置いて過剰のオイルを除去する。
２．ストリップの両面をティッシュペーパーで吸い取って過剰のオイルを除去する。
３．ストリップをゲル面を上にして平衡化プレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中に入れ、凍結又は平衡化させる。凍結した場合は、プレートをプラスチックラップに包み、−８０℃で保存する。次いで、ストリップを解凍し、その後、平衡化させる（ストリップは解凍されると透明である）。
ａ．平衡化：ストリップをストリップ１つあたり約１．５ｍｌの平衡化バッファーで覆う。
４．室温で２５分間振盪する
２次元ゲルのローディング及びランニング
１．約３ｃｍ×０．５ｃｍに切断したＷｈａｔｍａｎ  ３ＭＭクロマトグラフィーペーパー上に１０μｌの標準を加えることによってマーカーを調製する。
２．平衡化バッファーをデカントする。
３．ＳＤＳランニングバッファーでストリップを覆い、過剰の平衡化バッファーをすすいで除去する。
４．ストリップから平衡化バッファーを除去する。
５．ステップ３及び４を繰り返す。
６．ストリップを２次元ゲルのバックプレート上にゲル面を外側にして注意深く置く。
７．室温で１％低融点アガロースでストリップを覆い、確実にゲルの下に気泡が形成されないようにする。
８．マーカーをゲルストリップ塩基性末端の隣に挿入し、マーカーが確実にゲルストリップと同一平面になる（ｆｌｕｓｈ）ようにする
アガロースはマーカーを乱さないように十分に冷却しなければならない
９．アガロースを固化させる
１０．２次元にロードされる各ストリップについて続ける
１１．ゲルをちょうつがい側（ｈｉｎｇｅｄ  ｓｉｄｅ）を下にしてドデカ（Ｄｏｄｅｃａ）タンクに入れる
１２．すべてのゲルをタンクに入れた後、ＳＤＳ２次元電気泳動が１３℃、２５０ボルトで１時間３５分であることによって、確実にゲル全体に及ぶようにする。
ウェスタンブロッティング及び銀染色
タンパク質のトランスファー
１．パイレックス（Ｐｙｒｅｘ）トレイ（ゲルをはめ込むのに十分に大きい）にトランスファーバッファーを満たす
２．Ｂｉｏ−Ｒａｄトランスブロットセルに、ゲル１つあたり２つのスポンジを入れる
３．タンクをトランスファーバッファーで満たしてスポンジにトランスファーバッファーを十分に染み込ませる
４．ゲルをドデカタンクから取り出し、所望の大きさに切断する
５．予め切断したトランスファーメンブレンをトランスファーバッファーに浸す
６．トランスファーカセットを以下のように組み立てる
ａ．黒色面を下にする
ｂ．トランスファーバッファーに浸したスポンジ
ｃ．フィルターペーパー
ｄ．ゲル
ｅ．ニトロセルロースメンブレン−一度ゲル上に置いたらメンブレンを動かなさない
ｆ．フィルターペーパー
ｇ．スポンジ
７．ゲルとメンブレンの間のすべての気泡が除かれていることを確実にする
８．トレイを、トレイの黒色面（ゲル面）をタンクの黒色側にしてトランスブロットタンクに入れる
９．４℃、１００ボルトで６０分間トランスファーする。
全タンパク質を可視化するための銀染色（任意）。
１．５０ｍｌの銀染色固定液（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｉｘ）を容器に入れ、２５μｌの３７％ホルムアルデヒドを加える
２．ゲルを溶液中に入れ、１時間振盪させてタンパク質を固定する
３．銀染色固定液を注意深く除去する
ａ．ゲルの端のみをつかむ
４．５０ｍｌの銀染色洗浄液（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎ−Ｗａｓｈ）でゲルを覆い、２０分間振盪する。
５．銀染色洗浄液溶液を除去する
６．５０ｍｌの銀染色前処理液（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎ−Ｐｒｅｔｒｅａｔ）を加え、手動で１分間振盪する。
７．銀染色前処理液を注意深く除去する
ａ．ゲルの端のみをつかむ
８．蒸留水中で２０秒間ゲルを注意深くすすぐ。
ａ．蒸留水を除去する
ｂ．すすぎをさらに２回繰り返す
９．５０ｍｌの銀染色浸透液（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎ−ｉｍｐｒｅｇｎａｔｅ）でゲルを覆い、２０分間振盪する。
１０．蒸留水中で２０秒間ゲルを注意深くすすぐ。
ａ．蒸留水を除去する
ｂ．１回繰り返す
１１．５０ｍｌの銀染色現像液（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎ−Ｄｅｖｅｌｏｐ）でゲルを覆う
ｃ．ゲルを振盪し、スポットが現像されるのを見守る
１２．蒸留水中で２０秒間ゲルを注意深くすすぐ。
ｄ．蒸留水を除去する
ｅ．すすぎをさらに２回繰り返す
１３．５０ｍｌの銀染色固定液でゲルを覆う
１４．ゲルを１０分間振盪してタンパク質を固定する。
ブロットの免疫学的解析は以下の通りに実施する。
一次抗体
１．メンブレンをトランスファーから取り出す
２．メンブレンをポンソー（Ｐｏｎｃｅａｕ）−Ｓで、バックグラウンドが赤色になるまで染色する。
３．ポンソー（Ｐｏｎｃｅａｕ）−Ｓを除去する（再利用のために瓶に戻す）
４．メンブレンを水ですすぎ、ラベルをつける。
５．メンブレンをスキャンする
６．メンブレンをＴＴＢＳで洗浄してすべてのポンソー−Ｓを除去する
７．トレイに（メンブレンを覆うのに十分な）５％ミルクを加え、室温で２０分間ブロッキングする
８．一次抗体溶液（ＮＴＩ  ＳｃＦｖ  ＭＡＢ１２．１（登録商標）：ＴＴＢＳ−１：１５０）を容器中に調製する
９．ミルクを除去する
１０．ＴＴＢＳ中ですすいで過剰のミルクを除去する
１１．メンブレンを、一次抗体溶液を入れた容器に入れる
１２．４℃で一晩インキュベートする
二次抗体
１．一次抗体を除去する
２．メンブレンを３回洗浄する
ｉ．ＴＴＢＳでメンブレンを覆う
ii．室温で１０分間穏やかに振盪する
３．二次抗体溶液（ＮＴＩ  抗Ｓ：ＴＴＢＳ−１：５，０００）を調製する
４．二次抗体溶液でメンブレンを覆う
５．４℃で４時間インキュベートする。
発色及びスキャン
１．二次抗体溶液を除去する
２．上記のようにメンブレンを洗浄する
３．ウェスタンブルー（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｕｅ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｓ３８４１）でメンブレンを覆う
４．発色させる
５．水中ですすぐことによって発色を停止する
６．メンブレンを乾燥させる
前記のプロトコールに用いた溶液を以下に示す。
第１次元用溶液
（再水和バッファーｐＨ７（２５ｍｌ））：
７Ｍ尿素（ＦＷ６０．０６）−１０．５ｇ
２Ｍチオ尿素（ＦＷ７６．１２）−３．８ｇ
２％ＣＨＡＰＳ−０．５ｇ
０．５％ａｓｂ−１４  −０．１２５ｇ
０．５％Ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ−３３０μｌ（４０％Ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ）
０．５％ＩＰＧバッファー−１２５μｌ
ブロモフェノールブルー−３ｍｇ
−蒸留水２０ｍｌに尿素及びチオ尿素を溶解する。
ＣＨＡＰＳ、ＡｓＢ−１４、Ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ、ＩＰＧバッファー及びブロモフェノールブルーを加える
蒸留水で２５ｍｌまで満たす
−１．４ｍｌに分注し、−８０℃で保存する
−使用前に１％ＤＴＴ  −１４ｍｇ（０．０１４ｇ）を加える
第２次元用溶液
（Ｔｒｉｓバッファー（１．５Ｍ、ｐＨ８．８）（１０００ｍＬ））：
Ｔｒｉｓ塩基（ＦＷ１２１．１）−３６．３３ｇ
−約１５０ｍＬの蒸留水にＴｒｉｓを溶解する。
ＨＣｌでｐＨを８．８に調整し、蒸留水で２００ｍｌの総容積にする。
−  ４℃で保存する
（平衡化バッファー（４００ｍＬ））：
１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８．８−２６．８ｍＬ
尿素（６０．０６）−１４４ｇ
グリセロール（１００％）−１２０ｍＬ（１５０ｇ）
ＳＤＳ−１０ｇ
ブロモフェノールブルー−微量（ピペットチップで加える）
−水を加えて４００ｍＬとする
−分注し、−２０℃で保存する
（２Ｄ  アクリルアミドゲル）
３７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８
アクリルアミド／ピペラジンジアクリリル（４０％Ｔ／２．５％Ｃ）
０．１２％（ｖ／ｖ）ＴＥＭＥＤ
０．０５５％（ｖ／ｖ）過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）
％Ｔ＝２Ｄアクリルアミドゲル中のアクリルアミドとピペラジンジアクリリルの総パーセント
％Ｃ＝架橋剤（ピペラジンジアクリリル）のパーセンテージ
プロテアン（Ｐｒｏｔｅａｎ）ＩＩゲルの形成（２０×２０、１ｍｍ厚）
【００１９】
【表２】
2008111824.tif 000003
（ゲルバッファー）
試薬                            量
１．８７５Ｍ  Ｔｒｉｓ          ２２．７ｇ
水                              １００ｍｌまで満たす
ｐＨ８．８に調整する            濃ＨＣｌを用いる
−バッファーは４℃で２週間しか保存しない
（アクリルアミド保存液−４０％  Ｔ／２．５％  Ｃ）
試薬                              量
アクリルアミド                    ３９ｇ
ピペラジン                        １ｇ
ジアクリルアミド
水                                １００ｍｌまで満たす
フィルター（０．４５μｍ）、４℃で２週間しか保存しない。
（１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ））
試薬                              量
１０％ＡＰＳ                      ０．１ｇ
水                                １ｍｌまで満たす
使用毎に新たな１０％過硫酸アンモニウムを作製する
（１０×  ＳＤＳランニングバッファー（４Ｌ））：
Ｔｒｉｓ（ＦＷ７５．０７）−７５．６９ｇ
グリシン（ＦＷ１２１．１４）−３６０．３４ｇ
ＳＤＳ−２０ｇ
蒸留水                        ４Ｌまで満たす
室温で保存する
（アガロース溶液（１％））：
−  １．５ｇのアガロースを秤量し、１５０ｍｌのＳＤＳランニングバッファーを加え、溶解するまで加熱する。
１％低融点アガロース            １．５ｇ低融点アガロース
１×ＳＤＳランバッファー        １５０ｍｌまで満たす
アガロースが沸騰し、十分に溶解するまで加熱する
１５０μｌの０．０５％ブロモフェノールブルーを加える
４℃で保存する
（ブロッティング及び銀染色用溶液）
（ウェスタントランスファーバッファー（４Ｌ））：
トリズマ塩基              １２．１２ｇ
グリシン                  ５７．６ｇ
メタノール                ８００ｍｌ
ＳＤＳ                    ３ｇ
水                        ４Ｌまで満たす
（銀染色固定液）
５０％メタノール          ５００ｍｌ
１２％酢酸                １２０ｍｌ
蒸留水                    １Ｌまで満たす
（銀染色エタノール）
５０％エタノール          ５００ｍｌ
蒸留水                    １Ｌまで満たす
（銀染色前処理液）
０．０４％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３−５Ｈ２Ｏ    ０．０４ｇ
蒸留水                            ２００ｍｌまで満たす
（銀染色浸透液）
０．４％ＡｇＮＯ３                ０．４ｇ
０．０２８％ホルムアルデヒド      １５０μｌの３７％ホルムアルデヒド
蒸留水                            ２００ｍｌまで満たす
（銀染色現像液）
１２％Ｎａ２ＣＯ３                  １２ｇ
０．０１９％ホルムアルデヒド      １００μｌの３７％ホルムアルデヒド
２％プレトリート                  ４ｍｌ
蒸留水                            ２００ｍｌまで満たす
（３７％ホルムアルデヒド）
３７％ホルムアルデヒド            ３７ｍｌホルムアルデヒド
蒸留水                            １００ｍｌまで満たす
（ブロッキングバッファー（５％ミルク））
５％ミルク                        ５ｇミルク
０．２％Ｎ３Ｎａ                  ０．２ｇＮ３Ｎａ
蒸留水                            １００ｍｌまで満たす
（１０×ＴＴＢＳ（４Ｌ））
１００ｍＭトリズマ                ４８．４ｇ
１．５Ｍ  ＮａＣｌ                ３５０．６ｇ
０．５％Ｔｗｅｅｎ２０            ２０ｇ
３８００ｍｌの脱イオン蒸留Ｈ２Ｏにトリズマ及びＮａＣｌを加える
ＨＣｌを用いてｐＨを８．０に調整する
Ｔｗｅｅｎ２０を加える
蒸留水で４Ｌまで満たす
【実施例】
【００２０】
[0032]実施例１．プールした血清
【００２１】
[0033]癌患者（胸部、卵巣、肺及び結腸）からプールした血清からＮＯＸが富化された血清タンパク質（約４−６ｍｇ）を、２−Ｄゲル電気泳動によって分離し、Ｓタグを保持する組換え抗ＥＣＴＯ−ＮＯＸ抗体（一本鎖可変領域ＳｃＦｖ）と、それに続いて、ウェスタンブルーＮＢＴアルカリホスファターゼ基質とともにアルカリホスファターゼ結合型抗Ｓによって検出したところ、癌血清中に存在するが（図１）、非癌患者又は健常なボランティアの血清には存在しないいくつかのタンパク質が得られた。ｔＮＯＸタンパク質は血清からニッケルアガロース沈殿によって、富化及び濃縮された。このステップの結果、分析前に約９０％の血清タンパク質が除去される。
【００２２】
[0034]ｔＮＯＸ又はＥＣＴＯ−ＮＯＸに特異的な血清を用いる場合、通常、希釈は１：１０から１：１０００であり、モノクローナル抗体（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４２０６として寄託されたハイブリドーマによって産生される１２．１）は、１：１００−１：１０，００、望ましくは、約１：１００であり、又は同ハイブリドーマの増殖から得た腹水液は、約１：１０−約１：１０００、望ましくは、約１：１００であり得る。
【００２３】
[0035]実施例２．種々の癌を有する患者から得た血清の分析
【００２４】
[0036]全部で８種の種々のプールされた癌血清から組み合わされた結果は、図１と同様であり、２−Ｄゲルの象限Ｉについてのすべての知見が図２に要約されている。いくつかのさらなるｔＮＯＸタンパク質が、象限ＩＶに局在しており、知見のすべてが図３に要約されている。
【００２５】
[0037]実施例３．卵巣癌患者血清の分析
【００２６】
[0038]卵巣癌を有する患者から得た血清に適用した場合に、図４におけるように、２−Ｄゲル分析によって、約８０及び４０．５ｋＤａの卵巣癌特異的ｔＮＯＸタンパク質が象限Ｉ及びＩＶ中に得られた（図４）。
【００２７】
[0039]実施例４．小細胞肺癌患者血清の分析
【００２８】
[0040]小細胞肺癌を有する患者の血清に適用した場合に、図５におけるように、２−Ｄゲル分析は、象限ＩＶ中に４０．５ｋＤａのｔＮＯＸタンパク質を、また象限Ｉ中に５２ｋＤａのｔＮＯＸタンパク質を含んでいた（図５）。
【００２９】
[0041]実施例５．非小細胞肺癌患者血清の分析
【００３０】
[0042]非小細胞肺癌を有する患者から得た血漿に適用した場合に、図１と同様な２−Ｄゲル分析は、象限Ｉ中、５４ｋＤａに非小細胞癌特異的ｔＮＯＸアイソフォームを示した（図６）。
【００３１】
[0043]実施例６．乳癌患者血清の分析
【００３２】
[0044]乳癌を有する患者から得た血清に適用した場合に、図１と同様な２−Ｄゲル分析は、象限Ｉ中に６８ｋＤａの乳癌特異的ｔＮＯＸタンパク質を示した（図７）。
【００３３】
[0045]実施例７．前立腺癌患者血清の分析
【００３４】
[0046]前立腺癌を有する患者から得た血清に適用した場合に、図１と同様な２−Ｄゲル分析は、７５ｋＤａ（図８））でｐＨ５．８（α）及び５．２（β）という等電点の前立腺癌特異的ｔＮＯＸアイソフォームを示した。β型は、血漿を用いた場合に最も顕著であり、前立腺癌患者の血清中では稀にしか存在しない。
【００３５】
[0047]実施例８．子宮頸癌患者血清の分析
【００３６】
[0048]子宮頸癌を有する患者から得た血清に適用した場合に、図１と同様な２−Ｄゲル分析は、９４ｋＤａに子宮頸癌特異的ｔＮＯＸアイソフォームを示した（図９）。
【００３７】
[0049]実施例９．結腸癌患者血清の分析
【００３８】
[0050]結腸癌を有する患者から得た血清に適用した場合に、図１と同様な２−Ｄゲル分析は、４３及び５２ｋＤａに結腸癌特異的ｔＮＯＸアイソフォームを示した（図１０）。
【００３９】
[0051]実施例１０．癌特異的アイソフォーム
【００４０】
[0052]癌の各種類について、ｔＮＯＸアイソフォーム（卵巣、胸部、子宮頸部、結腸、非小細胞肺、前立腺  小細胞肺）又は癌の起源の組織又は細胞種に特異的なｔＮＯＸアイソフォームの組合せがあるようである（図１４）。
【００４１】
[0053]実施例１１．未知起源の癌の場合の患者血清の分析
【００４２】
[0054]図１１の２−Ｄゲルは、原発腫瘍が未知であった癌を有する患者に由来するものである。４０．５、５２及び約８０ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォームの存在が、原発癌が卵巣癌であることを示す。
【００４３】
[0055]実施例１２．プールされた正常血清の分析
【００４４】
[0056]２５人を超えるランダムに選択された外来患者の血清及び健常なボランティアの血清では、２−Ｄゲルの象限Ｉ及びＩＶの両方とも、ｔＮＯＸアイソフォームがなく（図１２）、これにより、ｔＮＯＸタンパク質は非癌患者又は健常なボランティアの血清にはないという先の知見が確認された。
【００４５】
[0057]実施例１３
【００４６】
[0058]本発明の診断戦略では、ヒト血清の１次元及び２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離を組合せて、癌特異的アイソフォームパターン並びに癌の存在、腫瘍の種類、疾患重篤度及び治療反応を示す組成物を作製する。癌の存在及び疾患重篤度を示す、少なくとも２０種の癌特異的ｔＮＯＸアイソフォームが分離される。本システムは、ニッケル−アガロース沈殿を用いてＥＣＴＯ−ＮＯＸタンパク質を大半のアルブミン及びその他の血清タンパク質から分離する濃縮ステップからなる。検出には、ヒト起源のすべての既知のＥＣＴＯ−ＮＯＸアイソフォームと交差反応する組換え一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を用いる。この抗体はまた、二次抗体Ｉ（抗Ｓ）と反応するＳタグを有する。ｓｃＦｖ抗体は、２００６年９月１日に出願された米国仮出願６０／８２４，３９８及び以下に記載されている。
【００４７】
[0059]腫瘍細胞特異的ｔＮＯＸ  ＮＡＤＨオキシダーゼに対して作製されたモノクローナル抗体は、ｓｐ−２骨髄腫細胞において産生されたが、このモノクローナル抗体は、７２時間後に脾臓細胞との融合に用いたｓｐ−２骨髄腫細胞の増殖を低下させた。この現象は多量の抗体を産生することを困難にした。この問題を克服するために、抗体ｃＤＮＡの重鎖及び軽鎖の抗原結合性可変領域（Ｆｖ領域）のコード配列をクローニングし、Ｓタグコード配列の上流で１つのキメラ遺伝子に連結した。可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインからなる抗体のＦｖ部分は、元の抗体の結合特異性及び親和性を維持できる（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら、１９９０．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１２６２−１３６７頁）。
【００４８】
[0060]組換え抗体のために、免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（Ｖｌ）の可変領域をコードするｃＤＮＡは、縮重プライマーを用いることによってクローニングされる。哺乳類免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、超可変相補性決定領域（ＣＤＲｓ）に隣接する保存領域を含む。縮重オリゴプライマーセットは、これらの領域がＰＣＲを用いて増幅されることを可能とする（Ｊｏｎｅｓら  １９９１．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：８８−８９頁；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら  １９９１．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：２４７１−２４７６頁）。組換えＤＮＡ技術は、ポリペプチドリンカーによって２種の断片を共有結合させることによって可変断片の安定化を容易にした（Ｈｕｓｔｏｎら  １９８８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３頁）。ＶＬ又はＶＨのいずれかは、一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ）のＮＨ２末端ドメインを提供し得る。リンカーは、タンパク質分解に耐え、タンパク質凝集を最小にするよう設計されなくてはならない。リンカー長及び配列は、柔軟性並びにＳｃＦｖ及び抗原との相互作用に寄与し、制御する。最も広く用いられるリンカーは、柔軟性のためのグリシン（Ｇｌｙ）及びセリン（Ｓｅｒ）残基、並びに可溶性のためのグルタミン酸（Ｇｌｕ）及びリジン（Ｌｙｓ）のような荷電残基からなる配列を有する（Ｂｉｒｄら  １９８８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６頁；Ｈｕｓｔｏｎら  １９８８、前掲）。
【００４９】
[0061]全ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９頁及びＧｏｕｇｈ（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７６：９３−９５頁から改変した以下の手順によって、ｔＮＯＸ特異的モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞から単離した。細胞を培地から回収し、４５０×ｇで１０分間遠心分離することによってペレットにした。１０容積の氷冷ＰＢＳを用いてペレットを穏やかに再懸濁し、再度、遠心分離した。上清を廃棄し、等容積のＰＢＳを用いて細胞を再懸濁した。使用前に、細胞ペレット１ｇあたり、変性溶液（０．３６ｍｌの２−メルカプトエタノール／５０ｍｌのグアニジウム保存溶液−４Ｍグアニジニウムチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．５％サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ））１０ｍｌを加え、穏やかに混合した。酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０、２Ｍを１ｍｌ）、１０ｍｌのフェノール飽和水及び２ｍｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）混合物を各添加の後、逐次加えた。この溶液を反転することによって完全に混合した。この溶液を１０秒間激しく振盪し、氷上で１５分間冷却し、次いで、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を移し、等容積の２−プロパノールを加え、−２０℃に一晩置いてＲＮＡを沈殿させた。１２，０００×ｇで１５分間、ＲＮＡをペレットにし、２−３ｍｌの変性溶液及び２容積のエタノールを用いてこのペレットを再懸濁した。この溶液を−２０℃に２時間置き、次いで、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離した。７０％エタノール、次いで、１００％エタノールで、ＲＮＡペレットを洗浄した。１２，０００×ｇで５分間遠心分離した後、このペレットをＲＮａｓｅ不含水（ＤＥＰＣ処理水）を用いて再懸濁した。単離されたＲＮＡ量を分光光度法で測定し、２８０ｎｍ及び２６０ｎｍの吸光度から算出した。
【００５０】
[0062]ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ単離キットはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから購入した。全ＲＮＡを６５℃で５分間加熱した後、全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにアプライした。アプライする前に、ＲＮＡサンプルを、５００μｌの１０×サンプルバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５Ｍ  ＮａＣｌ）と混合した。ＲＮＡサンプルを、２秒毎に１滴という速度でカラムを通過させた。溶出物をプールし、カラムに再アプライし、再度精製した。予め加熱した溶出バッファー（６５℃）をアプライし、ｍＲＮＡを溶出し、氷上に置いた１．５ｍｌの遠心チューブ中に回収した。ＯＤ２６０でｍＲＮＡ量を測定した（１ＯＤユニット＝４０μｇのＲＮＡ）。４×１０８個の細胞から得られた全ＲＮＡ及びｍＲＮＡの量は、それぞれ、１３２８μｇ及び２８μｇであった。
【００５１】
[0063]ＤＥＰＣ処理水に溶解したｍＲＮＡ（１−２μｇ）を、ｃＤＮＡ合成に用いた。３つの異なる日に単離したｍＲＮＡを、第１鎖ｃＤＮＡ合成のためにプールした。ｃＤＮＡ合成キットは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。ｍＲＮＡ（１．５μｇ／５μｌのＤＥＰＣ処理水）を、６５℃で１０分間加熱し、氷上で直ちに冷却した。ＭｕＬＶ逆転写酵素を含むプライムされた第１鎖混合物（１１μｌ）及び反応のための適当なバッファーを、ｍＲＮＡサンプルと混合した。ＤＴＴ溶液（０．１Ｍを１μｌ）及びＲＮａｓｅ不含水（１６μｌ）もこの溶液に加えた。この混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
【００５２】
[0064]ＰＣＲには軽鎖及び重鎖のための縮重プライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いた。ＰＣＲ合成は、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いることによって０．５ｍｌ微量遠心チューブにおいて１００μｌ反応容積で実施した。すべてのＰＣＲ合成は、２μｌのセンス及びアンチセンスプライマー（２０ｐモル／μｌ）、鋳型として１μｌの第１鎖ｃＤＮＡ、２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μｌのＶｅｎｔポリメラーゼ（２ユニット／μｌ）、１０μｌの１０×ＰＣＲバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５℃でｐＨ８．８、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、８２μｌのＨ２Ｏを含んでいた。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。すべてのＰＣＲプロフィールは、９４℃で１分の変性、５５℃で１分のアニーリング及び７２℃で１分の伸長からなっていた。このシークエンスを３０回反復し、最終サイクルでは、７２℃で６分伸長した。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ製のＱＩＡＥＸ  ＩＩゲル抽出キットを用いて精製した。重鎖及び軽鎖コード配列のＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分析したところ、それぞれ、約３４０塩基対（ｂｐ）長及び３２５ｂｐ長であった。
【００５３】
[0065]アガロースゲル電気泳動（１％アガロースゲル）によって全ＲＮＡ又はＤＮＡを分析した。アガロース（５０ｍｌのＴＡＥバッファー、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中０．５ｇ）を電子レンジで２分間加熱して融解し、アガロースを均一に分散させた。この溶液を室温に冷却し、エチジウムブロマイド（０．５μｇ／ｍｌ）を加え、装置に注ぎ入れた。各サンプルを、６×ゲルローディングバッファー（水中、０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノールＦＦ、４０％（ｗ／ｖ）スクロース）と混合した。ＴＡＥバッファーをランニングバッファーとして用いた。電圧（１０ｖ．ｃｍ）を６０−９０分間印加した。
【００５４】
[0066]重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡの適当な大きさに従って、ＵＶ照射下、ゲルからバンドを切り出し、切り出したゲルを、１８ゲージニードルを取り付けた１ｍｌのシリンジに入れた。ゲルを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに押し出した。各シリンジの注射筒を２００μｌのバッファー飽和フェノール（ｐＨ７．９±０．２）で洗浄した。混合物を十分に遠心分離し、−７０℃で１０分間凍結した。この混合物を５分間遠心分離し、上部の水相を新しいチューブに移した。この水相をフェノール／クロロホルム（１：１）で再度抽出した。５分間遠心分離した後、上部の水相をきれいなチューブに移し、クロロホルム抽出を実施した。上部の水相に酢酸ナトリウム（３Ｍを１０容積）及び２．５容積の氷冷エタノールを加えて−２０℃で一晩ＤＮＡを沈殿させた。
【００５５】
[0067]精製した重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをプラスミドｐＳＴＢｌｕｅ−１ベクターに連結し、ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にトランスフェクトした。重鎖及び軽鎖ＤＮＡを含むコロニーを、青色及び白色コロニー選択によってスクリーニングし、ＰＣＲ分析によって確認した。標準技術を用いて、重鎖及び軽鎖ＤＮＡを単離し、配列決定した。表２Ａ及び２Ｂは、ＳｃＦｖの重鎖及び軽鎖ＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。
【００５６】
[0068]ＰＣＲ増幅及び単一のＳｃＦｖ遺伝子の組み立ては、Ｄａｖｉｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１６５−１６９頁に従った。単一のＰＣＲ合成において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子を保持するプラスミドｐＳＴＢｌｕｅ−１を、４種のオリゴヌクレオチドプライマーすべてと組合せた。最初のＰＣＲ合成に続いて、１／１０の最初のＰＣＲ産物を回収し、プライマーａ（ＶＨセンスプライマー）とプライマーｄ（ＶＬアンチセンスプライマー）のみを含む第２のＰＣＲ反応混合物に加えた。第２のＰＣＲ合成の産物は単一のＳｃＦｖ遺伝子を生じた。単一のＳｃＦｖ遺伝子をプラスミドｐＴ−Ａｄｖ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に連結した。ＳｃＦｖ遺伝子を保持するｐＴ−Ａｄｖを、ＤＮＡ配列決定に用いた。
【００５７】
[0069]ＰＣＲによって、完全ＳｃＦｖ遺伝子を、ＶＨ、ＶＬ及びリンカー遺伝子から組み立て、単一のＳｃＦｖ遺伝子を得た（表２Ａ及び２Ｂ）。リンカーをコードするＤＮＡ配列は４５ヌクレオチド長であり
（ＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴ；配列番号６）、これは１５アミノ酸からなるペプチドに翻訳される
（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ；配列番号５）。ＰＣＲ増幅のためのプライマーは表２Ａ及び２Ｂに示されている。ＳペプチドをＳｃＦｖのＣ末端と連結した［ＳｃＦｖ（Ｓ）］。Ｓペプチドは、ウェスタンブロット解析のためのアルカリホスファターゼと結合しているＳタンパク質と結合する。ＳペプチドのＤＮＡ配列は
ＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣ（配列番号７）であり、これはＳペプチド（ＬｙｓＧｌｕＴｈｒＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓＰｈｅＧｌｕＡｒｇＧｌｎＨｉｓＭｅｔＡｓｐＳｅｒ；配列番号８）に翻訳される。
【００５８】
[0070]組換えＳｃＦｖ（Ｓ）を大腸菌(E. coli)で発現させた。まず、ＰＣＲ増幅によって、Ｓペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを、ＳｃＦｖ  ＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端と連結した。Ｓペプチドを組み込むことにより、アルカリホスファターゼと結合しているＳ−タンパク質によって、発現されたＳｃＦｖタンパク質を検出することが可能となる。次いで、ｔＮＯＸ特異的ＳｃＦｖ（Ｓ）コード配列を、大腸菌におけるタンパク質発現のために設計されたプラスミドであるプラスミドｐＥＴ−１１ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）にサブクローニングした。ＰＣＲ増幅のために、２種のプライマーを設計して、エンドヌクレアーゼ制限部位（ＮｄｅＩ及びＮｈｅＩ）並びにＳペプチド残基を含有するＳｃＦｖ（Ｓ）のＯＲＦを増幅した。
【００５９】
[0071]プラスミドｐＥＴ−１１ａ及びＳｃＦｖ（Ｓ）のＯＲＦを制限酵素ＮｄｅＩ及びＮｈＩを用いて消化し、連結してプラスミドｐＥＴ１１−ＳｃＦｖ（Ｓ）を得た。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＥＴ１１−ＳｃＦｖ（Ｓ）を用いて形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地において３７℃で１２時間増殖させた。０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し、４時間インキュベートすることによってＳｃＦｖを発現させた。細胞を回収し、Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌ（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，ＳＬＭ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）（２０，０００ｐｓｉで３回の通過）を用いて溶解させた。細胞抽出物を１０，０００×ｇで２０分間遠心分離した。ＳｃＦｖの変性封入体を含有するペレットを回収した。ＳｃＦｖの封入体の再生は、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｆｏｌｄｉｎｇ  ＆  Ｄｅｓｉｇｎ  １：２１−２７頁に準じた。
【００６０】
【表３】
2008111824.tif 000004
【００６１】
【表４】
2008111824.tif 000005
【００６２】
【表５】
2008111824.tif 000006
【００６３】
【表６】
2008111824.tif 000007
【００６４】
[0072]クローニング、ＤＮＡ単離、増幅及び精製のための標準技術、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応のための標準技術並びに種々の分離技術は、当業者には公知であり、よく用いられている。多くの標準技術が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗｕ（編）（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８，Ｐａｒｔ  Ｉ；Ｗｕ（編）（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８；Ｗｕら（編）（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００及び１０１；Ｇｒｏｓｓｍａｎ及びＭｏｌｄａｖｅ（編）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５；Ｍｉｌｌｅｒ（編）（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｏｌｄ及びＰｒｉｍｒｏｓｅ（１９８１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ；Ｓｃｈｌｅｉｆ及びＷｅｎｓｉｎｋ（１９８２）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｇｌｏｖｅｒ（編）（１９８５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ第Ｉ及びＩＩ巻，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ（編）（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｓｅｔｌｏｗ及びＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ（１９７９）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，第１−４巻，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｆｉｔｃｈｅｎら（１９９３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：７３９−７６４頁；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖら（１９９３）  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ並びにＡｕｓｕｂｅｌら（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹに記載されている。略語及び命名法は、用いられている場合には、当技術分野で標準と考えられ、本明細書において引用されたものなどの専門雑誌においてよく用いられている。抗体ワクチンは、Ｄｉｌｌｍａｎ  Ｒ．Ｏ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９（８）：８３３−８４１頁に記載されている。Ｄｕｒｒａｎｔ  Ｌ．Ｇ．ら（２００１）Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １；９２（３）：４１４−２０頁及びＢｈａｔｔａｃｈａｒｙａ−Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  Ｍ，（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｆｅｂ；３（１）：６３−９頁には、抗イディオタイプ抗体が記載されている。本明細書に詳細に記載されているか否かにかかわらず、本発明を実施するのに有用な多数の手順が、分子生物学、生化学、免疫学及び医薬の当業者には周知である。
【００６５】
[0073]本明細書に記載されるｔＮＯＸアイソフォームタンパク質と特異的に反応する、モノクローナル、ポリクローナル抗体、ペプチド特異的抗体又は一本鎖組換え抗体及び前記のうちいずれかの抗原結合断片は、当技術分野で公知の方法によって作製できる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＧｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｅｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照のこと。
【００６６】
[0074]本願に引用される参照文献はすべて、本開示内容と矛盾がない限りは、参照により本明細書に組み込まれる。このような参照文献は、本発明と関連する当分野技術を反映する。
【００６７】
[0075]本明細書に提供される実施例は例示目的であって、本明細書において特許請求される本発明の範囲を制限しようとするものではない。当業者に思い浮かぶ、示された抗体、エピトープ、精製法、診断法、予防法、処理法及びその他の方法の変形例はいずれも、本発明の範囲内に入るものとする。
【００６８】
（参考文献）
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９．  ｄｅｌ  Ｃａｓｔｉｌｌｏ−Ｏｌｉｖａｒｅｓ，  Ａ．，  Ｃｈｕｅｈ，  Ｐ．−Ｊ．，  Ｗａｎｇ，  Ｓ．，  Ｓｗｅｅｔｉｎｇ，  Ｍ．，  Ｙａｎｔｉｒｉ，  Ｆ．，  Ｓｅｄｌａｋ，  Ｄ．，  Ｍｏｒｒe，  Ｄ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｏｒｒe，  Ｄ．Ｍ．  （１９９８）  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３５８：  １２５−１４０．
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Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：  ３７３２−３７４１．
１２．  Ｂｉｒｄ，  Ｃ．  （１９９９）  Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅ  ８７５Ｈ３  （ｐａｒｔ  ｏｆ  ＡＰＫ１  ａｎｔｉｇｅｎ）  ｔｏ  ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｔ  ＮＣＢＩ．    （Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＡＬ０４９７３３）．
１３．  Ｂｒａｍａｎ，  Ｊ．，  Ｐａｐｗｏｒｔｈ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅｒ，  Ａ．  （１９９６）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５７：  ３１−４４．
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１６．  Ｍｏｒｒe，  Ｄ．Ｊ．，  Ｋｉｍ，  Ｃ．，  Ｐａｕｌｉｋ，  Ｍ．，  Ｍｏｒｒe，  Ｄ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｆａｕｌｋ，  Ｗ．Ｐ．  （１９９７）  Ｊ．    Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ  ２９：  ２６９−２８０
１７．  Ｍｏｒｒe，  Ｄ．Ｊ．，  Ｂｒｉｄｇｅ，  Ａ．，  Ｗｕ，  Ｌ．−Ｙ．  ａｎｄ  Ｍｏｒｒe，  Ｄ．Ｍ．  （２０００）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ６０：  ９３７−９４６．
１８．  Ｋｏｚａｋ  Ｍ．  （１９７８）  Ｃｅｌｌ．  １５：  １１０９−２３．
１９．  Ｋｏｚａｋ，  Ｍ．  （１９８９）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０８：  ２２９−２４１．
２０．  Ｔａｔｙａｎａ，  Ｖ．，  Ｂｏｒｕｋｈｏｖ，  Ｓ．Ｉ．  ａｎｄ  Ｈｅｌｌｅｎ  Ｃ．  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：  ８５４−８５９．
２１．  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｌｄｅｎ，  Ａ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，  Ａ．  Ａ．  （１９９９）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３１：  ８７−１０６．
２２．  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｙ．，  Ｉｓｈｉｈａｒａ，  Ｄ．，  Ｓａｓａｋｉ，  Ｍ．  Ｎａｋａｇａｗａ，  Ｈ．，  Ｈａｔａ，  Ｈ．，  Ｔｓｕｎｏｄａ，  Ｔ．，  Ｗａｎｔａｎａｂｅ，  Ｍ．，  Ｋｏｍａｔｓｕ，  Ｔ．，  Ｏｔａ，  Ｔ．，  Ｉｓｏｇａｉ．  Ｔ．，  Ｓｕｙａｍａ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｓｕｇａｎｏ，  Ｓ．  （２０００）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６４：  ２８６−２９７．
２３．  Ｋｏｚａｋ，  Ｍ．  （１９８７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：  ８１２５−８１４８.
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、ニッケルアガロース沈殿と、それに続く免疫ブロット解析によって濃縮された、癌（胸部、卵巣、肺及び結腸）患者からプールされた血清の調製物から得られたＥＣＴＯ−ＮＯＸが富化された血清タンパク質の、分析用２−Ｄゲル電気泳動の結果を提供する。１次元での分離は等電点電気泳動によって行い、２次元での分離はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３から１０のｐＨ範囲にわたるＡｍｐｈｏｌｙｔｅｓ及び１０％ポリアクリルアミドゲルを用いる）によって行った。解釈目的で、ゲルは、中央の非反応性アルブミン（アルブミン）で象限Ｉ−ＩＶに分割されている。検出は、Ｓタグを保持する組換え抗ｔＮＯＸ一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）抗体（ＭＡＢ  ｌ２．ｌ  ｓｃＦｖ）と、それに続いて、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｕｅ  ＮＢＴ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、カタログ番号Ｓ３８４１又は同等製品）とともにアルカリホスファターゼ結合型抗Ｓ（Ｎｏｖａｇｅｎカタログ＃６９５９８−３又は同等製品）を用いて行った。反応性タンパク質は赤味を帯びた青色に見える。
【図２】図２は、図１の診断システムを用いて同定された象限Ｉに位置するｔＮＯＸアイソフォームの一般化した分析用２−Ｄゲルマップの結果を示す。
【図３】図３は、図１の診断システムを用いて同定された象限ＩＶに位置する推定ｔＮＯＸアイソフォームの一般化した分析用２−Ｄゲルマップの結果を示す。
【図４】図４は、卵巣癌を有する患者から得た血清の２−Ｄゲルに由来する象限ＩＶにわたる、分析用２−Ｄゲル電気泳動及びｔＮＯＸ特異的抗体を用いる免疫ブロッティングの結果を示す。４０．５、５２及び約８０ｋＤａの卵巣癌ｔＮＯＸアイソフォームが矢印で印をつけられている。
【図５】図５は、小細胞肺癌を有する患者から得た血清の同一２−Ｄゲルに由来する象限Ｉ及びＩＶのみを示す以外は図１においてと同様に、分析用２−Ｄゲル電気泳動及びｔＮＯＸ特異的抗体を用いる免疫ブロッティングの結果を示す。これらの血清は、４０．５ｋＤａ及び５２ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォーム（矢印）を両方とも含み、これは、この癌を有する患者から得た血清に特有である。
【図６】図６は、分析用２−Ｄゲル電気泳動及びｔＮＯＸ特異的抗体を用いる免疫ブロッティングの結果を提供する。この図は、非小細胞肺癌を有する患者から得た血清の２−Ｄゲルに由来する象限Ｉ及び象限ＩＶのみを示す以外は図１においてと同様である。この血清は、非小細胞肺癌に特有の５４ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォーム（矢印）を含む。
【図７】図７は、分析用２−Ｄゲル電気泳動及びｔＮＯＸ特異的抗体を用いる免疫ブロッティングの結果を提供する。この図は、乳癌を有する患者から得た血清の２−Ｄゲルに由来する象限Ｉ及び象限ＩＶのみを示す以外は図１においてと同様である。この血清は、乳癌に特有のアイソフォームの一つである６８ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォーム（矢印）を含む。
【図８】図８は、分析用２−Ｄゲル電気泳動及びｔＮＯＸ特異的抗体を用いる免疫ブロッティングの結果を提供する。この図は、前立腺癌を有する患者から得た血清の２−Ｄゲルに由来する象限Ｉのみを示す以外は図１においてと同様である。前立腺癌患者から得た血漿及び血清は、それぞれ、ｐＨ５．８（α）及びｐＨ５．２（β）の等電点の特有の７５ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォーム（矢印）を含む。
【図９】図９は、分析用２−Ｄゲル電気泳動及びｔＮＯＸ特異的抗体を用いる免疫ブロッティングの結果を提供する。この図は、子宮頸癌患者から得た血清の２−Ｄゲルの象限Ｉのみを示す以外は図１においてと同様である。これらの血清は、子宮頸癌に特有の９４ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォームを含む（矢印）。
【図１０】図１０は、分析用２−Ｄゲル電気泳動及びｔＮＯＸ特異的抗体を用いる免疫ブロッティングの結果を提供する。この図は、結腸癌患者から得た血清の２−Ｄゲルの象限Ｉのみを示す以外は図１においてと同様である。この血清は、結腸癌に特有の５２及び４３ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォームを含む（矢印）。
【図１１】図１１は、分析用２−Ｄゲル電気泳動及びｔＮＯＸ特異的抗体を用いる免疫ブロッティングの結果を提供する。この図は、未知の原発癌を有する患者から得た血清の２−Ｄゲルに由来する象限Ｉ及び象限ＩＶのみを示す以外は図１においてと同様である。この血清は、４０．５、５２及び約８０ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォームを含む。この分析に基づく診断は、原発癌は卵巣起源のものであるということである。
【図１２】図１２は、血液癌に特有の低等電点の４３ｋＤａのｔＮＯＸアイソフォームを示す非ホジキンスリンパ腫を有する患者から得た血清の分析用２−Ｄゲル電気泳動及びｔＮＯＸ特異的抗体を用いる免疫ブロッティングの結果を示す。
【図１３】図１３は、分析用２−Ｄゲル電気泳動及びｔＮＯＸ特異的抗体を用いる免疫ブロッティングの結果を提供する。この図は、２５名を超える、無作為な、癌以外の障害を有する患者から得たプールした血清、又は健常なボランティアから得た血清及び血漿の２−Ｄゲルに由来する象限Ｉ及び象限ＩＶのみを示す以外は図１においてと同様である。象限Ｉ及びＩＶは両方ともｔＮＯＸアイソフォームがない。
【図１４】図１４は、普通に存在する癌に特有の特定のｔＮＯＸアイソフォームを要約する図である。
【図３】
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【図１４】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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