(57)【要約】      （修正有）【課題】アグレカナーゼ蛋白およびそれらをコードするヌクレオチド配列ならびにそれらの製造方法、アグレカンの分解により特徴づけられる症状の治療のためのアグレカナーゼ酵素の阻害剤および該酵素に対する抗体を開発する方法を提供する。【解決手段】特定の配列を有するＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子、それによりコードされるアグレカナーゼ蛋白、前記ＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞を培養し精製するヒトアグレカナーゼ蛋白の製造方法、該アグレカナーゼ活性の阻害剤およびそれに対する抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３に示すＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子。
【請求項２】
配列番号：１に示すヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６までのＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子。
【請求項３】
ａ）配列番号：３の配列、
ｂ）配列番号：１のヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６まで、
自然発生的なヒト対立遺伝子配列、および
ａ）およびｂ）と同等な縮重コドン配列
からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子。
【請求項４】
発現制御配列に作動可能に結合された請求項１のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項５】
発現制御配列に作動可能に結合された請求項２のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項６】
請求項１のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
請求項２のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
下記工程：
（ａ）請求項１記載のＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞を培養し；次いで
（ｂ）アグレカナーゼ蛋白を培地から回収し精製する
を含む、精製ヒトアグレカナーゼ蛋白の製造方法。
【請求項９】
下記工程：
（ａ）請求項２記載のＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞を培養し；次いで
（ｂ）アグレカナーゼ蛋白を培地から回収し精製する
を含む、精製ヒトアグレカナーゼ蛋白の製造方法。
【請求項１０】
配列番号：４のアミノ酸配列を含む精製アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む精製アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項１２】
下記工程：
（ａ）請求項１記載のＤＮＡ分子で形質転換された細胞を培養し；次いで
（ｂ）配列番号：４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを培地から回収し精製する
により製造される精製アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項１３】
下記工程：
（ａ）請求項２記載のＤＮＡ分子で形質転換された細胞を培養し；次いで
（ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを培地から回収し精製する
により製造される精製アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１０の精製アグレカナーゼ蛋白に結合する抗体。
【請求項１５】
配列番号：４に示すアグレカナーゼまたはそのフラグメントを用いることを特徴とするアグレカナーゼの阻害剤を開発する方法。
【請求項１６】
配列番号：２に示すアグレカナーゼまたはそのフラグメントを用いることを特徴とするアグレカナーゼの阻害剤を開発する方法。
【請求項１７】
三次元構造分析を特徴とする請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
コンピューターにより援助されるドラッグデザインを特徴とする請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
アグレカナーゼに結合してアグレカンの蛋白分解を阻害するペプチドを含む、アグレカナーゼの蛋白分解活性を阻害するための組成物。
【請求項２０】
アグレカナーゼ活性を阻害する有効量の化合物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるアグレカンの開裂を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規アグレカナーゼ分子をコードするヌクレオチド配列、アグレカナーゼ蛋白およびそれらの製造方法を見出したことに関する。さらに本発明は、アグレカナーゼ酵素の阻害剤ならびに抗体にも関する。これらの阻害剤および抗体は、骨関節炎を包含する種々のアグレカナーゼ関連症状の治療に有用でありうる。
【背景技術】
【０００２】
アグレカンは関節軟骨の主要細胞外成分である。それは軟骨に圧縮性および可塑性といった機械的特性を与える原因である。アグレカンの損失は関節疾患において関節軟骨の分解に関連している。骨関節炎は少なくとも３０００万人のアメリカ人がかかっている衰弱性疾患である（非特許文献１）。骨関節炎は、関節軟骨の分解およびその結果生じる慢性の痛みにより人生の質を著しく低下させる。骨関節炎プロセスの初期の重要な特徴は細胞外マトリックスからのアグレカンの損失である（非特許文献２）。それゆえアグレカンの大きな糖含有部分が細胞外マトリックスから失われ、軟骨の生化学的特徴が失われる。
【０００３】
「アグレカナーゼ」と呼ばれる蛋白分解活性はアグレカンの開裂の原因であり、それゆえ骨関節炎および炎症性関節疾患に関連した軟骨の分解において役割を果たしていると考えられる。ヒトの骨関節炎の軟骨におけるアグレカン分解の原因酵素を同定するための研究が行なわれてきた。アグレカンの球間ドメイン中に２つの酵素開裂部位が同定された。１つ（Ａｓｎ３４１−Ｐｈｅ３４２）は数種類の既知金属プロテアーゼにより開裂されることが観察された（非特許文献３、非特許文献４）。ヒト滑液中に見出され、ＩＬ−１により誘導される軟骨アグレカンの開裂により生じるアグレカンフラグメントはＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４結合の開裂によるものであり（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）、そのことは上記既知酵素がインビボにおいてアグレカン開裂に関与していないことを示す。
【０００４】
最近、"Disintegrin-like and Metalloprotease with Thrombospondin type 1 motif"（ＡＤＡＭ−ＴＳ）ファミリーに属する２つの酵素、アグレカナーゼ−１（ＡＤＡＭＴＳ−４）およびアグレカナーゼ−２（ＡＤＡＭＴＳ−１１）が同定され、それらはＩＬ−１により刺激された軟骨により合成され、適切な部位でアグレカンを開裂する（非特許文献８、非特許文献９）。これらの酵素は骨関節炎のヒトの関節軟骨により合成される可能性がある。Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４結合においてアグレカンを開裂でき、骨関節炎においてアグレカン開裂に貢献している可能性のあるＡＤＡＭ−ＴＳファミリーの他の関連酵素が存在するとも考えられる。
【非特許文献１】MacLean et al. J. Rheumatol 25:2213-8 (1998)
【非特許文献２】Brandt, KD. and Mankin HJ. Pathogenesis of Osteoarthritis, in Textbook of Rheumatology, WB Saunders Company, Philadelphia, PA pgs. 1355-1373. (1993)
【非特許文献３】Flannery, CR et al. J. Biol. Chem 267:1008-14. (1992)
【非特許文献４】Fosang, AJ et al. Biochemical J. 304:347-351. (1994)
【非特許文献５】Sandy, JD, et al. J Clin Invest 69:1512-1516. (1996)
【非特許文献６】Lohmander LS, et al. Arthritis Rheum 36:1214-1222. (1993)
【非特許文献７】Sandy JD et al. J Biol Chem. 266:8683-8685 (1991)
【非特許文献８】Tortorella MD, et al Science 284:1664-6. (1999)
【非特許文献９】Abbazade, I, et al. J Biol Chem 274: 23443-23450. (1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アグレカンを開裂しうるアグレカナーゼ蛋白の同定、アグレカナーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列、およびアグレカナーゼの製造方法等を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、アグレカンを開裂しうる新規なアグレカナーゼ蛋白およびそれをコードするヌクレオチド配列を同定し、さらに該酵素の製造方法等を開発し、本発明を完成させるに至った。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、アグレカナーゼの蛋白分解活性をブロックするアグレカナーゼの阻害剤を開発する方法も提供され、これらの阻害剤および抗体を種々のアッセイおよび関節軟骨の分解により特徴づけられる症状の処置のための治療に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、アグレカンを開裂しうるアグレカナーゼ蛋白の同定、アグレカナーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列、およびアグレカナーゼの製造方法に指向される。これらの酵素は蛋白分解性のアグレカナーゼ活性を有するものとして特徴づけられると考えられる。さらに本発明は、これらの酵素ならびにこれらの酵素に対する抗体を含む組成物を包含する。さらに、本発明は、アグレカナーゼの蛋白分解活性をブロックするアグレカナーゼの阻害剤を開発する方法を包含する。これらの阻害剤および抗体を種々のアッセイおよび関節軟骨の分解により特徴づけられる症状の処置のための治療に用いてもよい。
【０００９】
本発明のアグレカナーゼ分子のヌクレオチド配列を配列番号：３に示す。もう１つの具体例において、本発明のアグレカナーゼ分子のヌクレオチド配列を配列番号：１のヌクレオチド＃１から＃３７６６までに示す。もう１つの具体例において、本発明のヌクレオチド配列は配列番号：１のヌクレオチド＃１０８６（ＴＣＧ）から＃３３９６（ＣＧＣ）までである。さらに本発明は、配列番号：１に示す配列と同等な縮重コドン配列ならびにアグレカナーゼ活性を示すそのフラグメントを包含する。
【００１０】
本発明の単離アグレカナーゼ分子のアミノ酸配列は配列番号：４に示す配列を含む。単離アグレカナーゼ分子のアミノ酸配列は配列番号：２に示す配列を含む。さらに本発明はアグレカナーゼ活性を示す分子をコードするアミノ酸配列のフラグメントを包含する。
【００１１】
配列番号：３あるいは配列番号：１のヌクレオチド＃１から＃３７６６までまたは配列番号：１のヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６を含む配列番号：１のＤＮＡ配列で形質転換した細胞を培養し、次いで、それぞれ配列番号：４または配列番号：２に示すアミノ酸配列により特徴づけられる蛋白を培地から回収し精製することにより、同時に産生される他の蛋白性物質を実質的に含まないヒトアグレカナーゼ蛋白またはそのフラグメントを得てもよい。哺乳動物細胞における生産のためには、ＤＮＡ配列は、アグレカナーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列の５’側にあり、インフレームでつながっている適当なプロペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。
【００１２】
本発明は、さらなるアグレカナーゼ分子を得る方法、この方法により得られるＤＮＡ配列およびそれによりコードされる蛋白を包含する。完全長配列を単離する方法は、配列番号：３または配列番号：１のヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６までに示すアグレカナーゼ配列を用い、当業者に知られた標準的方法を用いてスクリーニング用プローブを設計することを含む。
【００１３】
他の種がヒトアグレカナーゼ酵素に対して相同的なＤＮＡ配列を有すると考えられる。それゆえ、本発明は、他のアグレカナーゼ分子をコードするＤＮＡ配列を得るための方法、それらの方法により得られるＤＮＡ配列、およびそれらのＤＮＡ配列によりコードされる蛋白を包含する。この方法は、本発明のヌクレオチド配列またはその部分を用い、標準的な方法を用いて他の種由来の対応遺伝子またはコーディング配列またはそれらのフラグメントを探してライブラリーをスクリーニングすることを含む。よって、本発明は他の種由来のＤＮＡ配列を包含し、それらはヒトアグレカナーゼに相同的であり、ヒト配列を用いて得ることができる。本発明は、アグレカナーゼ蛋白の機能的フラグメント、およびかかる機能的フラグメントをコードするＤＮＡ配列、ならびに他の関連蛋白の機能的フラグメントも包含しうる。かかるフラグメントが機能する能力を、アグレカナーゼ蛋白のアッセイに関して説明された生物学的アッセイにおいて蛋白をアッセイすることにより調べることができる。
【００１４】
配列番号：３あるいは配列番号：１のヌクレオチド＃１から＃３７６６までを含むかまたは配列番号：１のヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６までを含む配列番号：１のＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養し、次いで、培地からアグレカナーゼ蛋白を回収し精製することにより、本発明のアグレカナーゼ蛋白を製造してもよい。１の具体例において、蛋白は配列番号：４のアミノ酸配列または配列番号：２のアミノ酸＃１から＃７７０までを含む。精製された発現蛋白は、同時産生される他の蛋白性物質ならびに他の汚染混入物質を実質的に含まない。回収された精製蛋白は、アグレカンを開裂する蛋白分解性のアグレカナーゼ活性を示すと考えられる。よって、本発明の蛋白は、アグレカン分解分子の存在を調べるアッセイにおいてアグレカン蛋白分解活性を示す能力によりさらに特徴づけられる。これらのアッセイまたはその開発は当業者の知識の範囲内である。かかるアッセイは、アグレカン基質をアグレカナーゼ分子と接触させ、次いで、アグレカンフラグメントの生成をモニターすることを含む（例えば、Hughes et al., Biochem J 305:799-804 (1995); Mercuri et al, J. Bio Chem. 274:32387-32395 (1999)参照）。
【００１５】
もう１つの具体例において、本発明は、アグレカナーゼの阻害剤を開発する方法およびそれにより得られる阻害剤を包含する。これらの阻害剤はアグレカンの開裂を防止する。該方法は、アグレカナーゼおよびアグレカンの三次元構造に基づいて結合部位を決定し、次いで、結合部位と反応する分子を開発することを含む。候補分子を阻害活性に関してアッセイする。アグレカナーゼ分子の阻害剤を開発するためのさらなる標準的方法は当業者に知られている。阻害剤のアッセイは、アグレカンと阻害剤の混合物をアグレカナーゼ分子と接触させ、次いで、例えば、アグレカナーゼの開裂部位である可能性のある部位における開裂により生じたアグレカンフラグメントを検出し測定することによりアグレカナーゼ阻害を測定することを含む。
【００１６】
それゆえ、本発明のもう１つの態様は、治療上有効量のアグレカナーゼ阻害剤を医薬上許容される担体中に含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
軟骨においてアグレカナーゼにより媒介されるアグレカンの分解は骨関節炎および他の炎症性疾患に関連している。それゆえ、本発明のこれらの組成物を、アグレカンの分解および／またはアグレカナーゼのアップレギュレーションにより特徴づけられる疾病の治療に用いてもよい。これらの症状の治療またはそれらの予防に組成物を用いてもよい。
【００１８】
本発明は、アグレカンの分解により特徴づけられる症状に苦しむ患者を治療し、あるいはかかる症状を予防する方法を包含する。本発明のこれらの方法は、アグレカナーゼ酵素の蛋白分解活性を阻害するアグレカナーゼ阻害剤を含む有効量の組成物をかかる治療を必要とする患者に投与することを含む。
【００１９】
本発明のさらなる態様はアグレカナーゼ蛋白の発現をコードするＤＮＡ配列である。かかる配列は、５’から３’の方向に、配列番号：１のヌクレオチド＃１から＃３７６６までを含むかまたはヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６までを含む配列番号：１あるいは配列番号：３に示されるヌクレオチドの配列、ならびに遺伝学的コードの縮重を除き配列番号：１および配列番号：３のＤＮＡ配列と同一であり、アグレカナーゼ蛋白をコードするＤＮＡ配列を包含する。さらに本発明は、ストリンジェントな条件下で配列番号：１および配列番号：３のＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションし、アグレカンを開裂する能力を有する蛋白をコードするＤＮＡ配列を包含する。好ましいＤＮＡ配列はストリンジェントな条件下（T. maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982)参照）でハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列を包含する。かかるＤＮＡ配列が、配列番号：３あるいは配列番号：１のヌクレオチド＃１から＃３７６６までを含むかまたはヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６までを含む配列番号：１に示される配列に対して少なくとも約８０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドをコードすることが一般的に好ましい。結局、配列番号：１または配列番号：３の対立遺伝子変種または他の変種は、かかるヌクレオチド変化がペプチド配列の変化を生じさせるか否かにかかわらず、そのペプチド配列がアグレカナーゼ活性をやはり有している場合には、本発明に包含される。また本発明は、アグレカナーゼ活性を保持しているポリペプチドをコードする配列番号：１に示すＤＮＡ配列のフラグメントも包含する。
【００２０】
本発明のＤＮＡ配列は、例えば、細胞集団中のアグレカナーゼをコードするｍＲＮＡを検出するためのプローブとして有用である。よって、本発明は、アグレカナーゼに関連した遺伝学的疾患、あるいはアグレカナーゼが誤って転写または発現される細胞、器官または組織の疾患を包含する疾患の検出または診断方法を包含する。ＤＮＡ配列は後で説明する遺伝子治療に適用されるベクターの製造にも有用でありうる。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、発現制御配列に作動可能に結合された上記ＤＮＡ配列を含むベクターを包含する。これらのベクターを、本発明のアグレカナーゼ蛋白の新規製造方法に用いてもよく、該方法において、発現制御配列に作動可能に連結されたアグレカナーゼ蛋白をコードするＤＮＡ配列で形質転換された細胞系を適切な培地で培養し、アグレカナーゼ蛋白を回収し精製する。原核細胞および真核細胞の両方である多くの既知細胞を発現用宿主細胞としてこの方法に用いることができる。ベクターを遺伝子治療に適用してもよい。かかる使用において、エクスビボにおいてベクターを患者の細胞中にトランスフェクションしてもよく、次いで、細胞を患者に再導入してもよい。別法として、インビボにおいて標的化されたトランスフェクションによりベクターを患者に導入してもよい。
【００２２】
本発明のさらなる態様はアグレカナーゼ蛋白またはポリペプチドである。かかるポリペプチドは、配列番号：２または４に示す配列、自然発生的な対立遺伝子変種を包含する配列番号：２または４のアミノ酸配列の変種、ならびに蛋白がアグレカナーゼ分子に特徴的なアグレカン開裂能を保持している他の変種を包含するアミノ酸配列を有することにより特徴づけられる。好ましいポリペプチドは、配列番号：２または４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドを包含する。結局、配列番号：２または４の配列の対立遺伝子変種または他の変種は、かかるアミノ酸の変化が突然変異、化学的変化、あるいはＤＮＡ配列の変化により誘導されたか否かにかかわらず、ペプチド配列がやはりアグレカナーゼ活性を有する場合には、本発明に包含される。また本発明は、アグレカナーゼ蛋白の活性を保持する配列番号：２または４のアミノ酸配列のフラグメントも包含する。
【００２３】
本発明の精製蛋白を用い、抗体製造の分野において知られた方法を用いて、アグレカナーゼおよび／または他のアグレカナーゼ関連蛋白に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を得てもよい。よって、本発明は、アグレカナーゼまたは他の関連蛋白に対する抗体も包含する。抗体はアグレカナーゼまたは関連蛋白の検出および／または精製に、あるいはアグレカナーゼの効果を阻害または防止するのに有用でありうる。本発明のアグレカナーゼまたはその部分を用いて、アグレカナーゼに特異的に結合する抗体を得てもよい。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明のヒトアグレカナーゼは配列番号：３に示すヌクレオチド配列を含む。もう１つの具体例において、本発明のヒトアグレカナーゼは配列番号：１のヌクレオチド＃１から＃３７６６までまたはヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６までを含む。ヒトアグレカナーゼ蛋白配列は配列番号：４に示すアミノ酸配列を含む。もう１つの具体例において、ヒトアグレカナーゼ蛋白配列は配列番号：２のアミノ酸＃１から＃７７０までを含む。標準的な方法を用いて、配列番号：３あるいはヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６までを含む配列番号：１の配列を用いて完全長配列をスクリーニングするためのプローブを設計して、さらなる本発明のアグレカナーゼの配列を得てもよい。
【００２５】
本発明のアグレカナーゼは、配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列を含み、アグレカン開裂能を有するポリペプチドを包含する。
【００２６】
培地から回収されたアグレカナーゼ蛋白を、同時に産生された他の蛋白性物質および存在する他の汚染混入物質から単離することにより精製する。単離され精製された蛋白を、アグレカン基質を開裂する能力により特徴づけてもよい。ここに提供されるアグレカナーゼ蛋白は、配列番号：３あるいは配列番号：１のヌクレオチド＃１から＃３７６６までを含むかまたはヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６までを含む配列番号：１の配列に類似した配列によりコードされ、自然発生的に修飾が加えられ（例えば、ポリペプチドのアミノ酸変化を生じさせうるヌクレオチド配列の対立遺伝子変種）、あるいは人工的に処理加工された因子も包含する。例えば、合成ポリペプチドは配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸残基の連続した配列を完全に複製したものであってもよく、あるいは部分的に複製したものであってもよい。これらの配列は、一次構造、二次構造、三次構造、または四次構造ならびにコンホーメーション上の特徴をアグレカナーゼ分子と共有することによって、それらの共通した生物学的特性を有するものであってもよい。例えば、蛋白の構造およびコンホーメーションを有意に修飾することなく、多くの保存的アミノ酸置換が可能であり、かくして生物学的特性も維持されることが知られている。例えば、保存的アミノ酸置換はリジン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）およびヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）のごとき塩基性側鎖を有するアミノ酸間であってもよく；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）のごとき酸性側鎖を有するアミノ酸間であってもよく；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）およびチロシン（ＴｙｒまたはＹ）のごとき電荷のない極性側鎖を有するアミノ酸間であってもよく；アラニン（ＡｌａまたはＡ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）およびシステイン（ＣｙｓまたはＣ）のごとき無極性側鎖を有するアミノ酸間であってもよい。よって、ネイティブなアグレカナーゼのこれらの修飾体および欠失体を、自然発生的なアグレカナーゼの生物学的に活性のある代用品として用いてもよく、治療プロセスにおけるポリペプチドの阻害剤の開発に用いてもよい。アグレカナーゼおよびアグレカナーゼ変種の両方ならびにその阻害剤を実施例に記載のアッセイに供することにより、アグレカナーゼ変種がアグレカナーゼの生物学的活性を維持しているかどうかを容易に調べることができる。
【００２７】
ここに記載のアグレカナーゼ蛋白の配列の他の特別な変異は糖鎖付加部位の修飾を包含する。これらの修飾はＯ−結合またはＮ−結合糖鎖付加部位を包含する。例えば、糖鎖付加の不存在またはごくわずかな糖鎖付加が、アスパラギン結合糖鎖付加部位におけるアミノ酸置換または欠失から生じる。アスパラギン結合糖鎖付加認識部位は、適切な細胞の糖鎖付加酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列はアスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリンのいずれかであり、Ｘは通常いずれかのアミノ酸である。糖鎖付加認識部位の１番目または３番目のアミノ酸位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換または欠失（および／または２番目の位置におけるアミノ酸欠失）は修飾されたトリペプチド配列において糖鎖付加を起こさない。さらに、アグレカナーゼ関連蛋白の細菌での発現は、糖鎖付加部位が未修飾のままであっても糖鎖付加されていない蛋白を生じさせるであろう。
【００２８】
また本発明は、他の蛋白性物質をコードするＤＮＡ配列に結合しておらず、アグレカナーゼ蛋白の発現をコードしている新規ＤＮＡ配列を包含する。これらのＤＮＡ配列は配列番号：１または３に５’から３’方向に示した配列ならびにストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件下（T. Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), pages 387 to 389参照）でそれにハイブリダイゼーションし、アグレカナーゼの蛋白分解活性を有する蛋白をコードする配列を包含する。これらのＤＮＡ配列は、配列番号：１のＤＮＡ配列を含む配列ならびにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれにハイブリダイゼーションし、アグレカナーゼに関して開示された他の活性を維持している蛋白をコードする配列も包含する。
【００２９】
同様に、配列番号：１のヌクレオチド＃１から＃３７６６までを含むかまたはヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６までを含む配列番号：１の配列あるいは配列番号：３の配列によりコードされるアグレカナーゼ蛋白あるいは配列番号：２または４のアミノ酸配列を含むアグレカナーゼ蛋白をコードするが、遺伝学的コードの縮重または対立遺伝子変異（アミノ酸の変化を生じさせてもよく、生じさせなくてもよい、種の集団中における自然発生的な塩基変化）によりコドン配列が異なっているＤＮＡ配列もまたここに記載された新規因子をコードする。コードされるポリペプチドの活性の増大、半減期の延長または生産性の向上のために点突然変異または誘発された修飾（挿入、欠失および置換を包含）により生じた配列番号：３あるいは配列番号：１のヌクレオチド＃１から＃３７６６までを含むかまたはヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６までを含む配列番号：１のＤＮＡ配列の変種もまた本発明に包含される。
【００３０】
本発明のもう１つの態様は、アグレカナーゼ蛋白の新規製造方法を提供する。本発明の方法は、既知の調節配列の制御下にある本発明のアグレカナーゼ蛋白をコードするＤＮＡ配列で形質転換された細胞系を培養することを含む。精製蛋白は同時産生される他の蛋白ならびに他の汚染混入物質を実質的に含まない。
【００３１】
適切な細胞系はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のごとき哺乳動物細胞であってもよい。適切な哺乳動物細胞系ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、生成物の製造および精製のための方法の選択は当該分野において知られている。例えば、Gething and Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981)あるいはKaufman et al, Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759 (1985)またはHowley et al, U.S. Patent 4,419,446参照。実施例記載のもう１つの適当な哺乳動物細胞系はサルＣＯＳ−１細胞系である。哺乳動物ＣＶ−１も適切でありうる。
【００３２】
細菌細胞も宿主として適する。例えば、E. coliの種々の株（例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）はバイオテクノロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。B. subtilis、Pseudomonas、他の枯草菌等の種々の株をこの方法に使用してもよい。細菌細胞における蛋白の発現のために、アグレカナーゼのプロペプチドをコードするＤＮＡは一般的には必要ない。
【００３３】
当業者に知られた多くの酵母細胞株も本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。さらに、所望ならば、昆虫細胞を本発明の方法において宿主細胞として用いてもよい。例えば、Miller et al, Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986) およびその中で引用された文献参照。
【００３４】
本発明のもう１つの態様は、これらの新規アグレカナーゼポリペプチドの発現方法に使用されるベクターを提供する。好ましくは、ベクターは本発明の新規因子をコードする上記ＤＮＡ配列全体を含む。さらに、ベクターはアグレカナーゼ蛋白配列の発現を可能にする適切な発現制御配列を含む。あるいはまた、上記の修飾配列を含むベクターも本発明の具体例である。さらに、配列番号：３または配列番号：１またはアグレカナーゼ蛋白をコードする他の配列を操作して混成アグレカナーゼ分子を発現させることもできる。よって、本発明は、別のアグレカナーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に正しい読み取り枠で連結された配列番号：３あるいは配列番号：１のヌクレオチド＃１から＃３７６６までを含むかまたはヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６までを含む配列番号：１に由来するフラグメントを含むアグレカナーゼ蛋白をコードするキメラＤＮＡ分子を包含する。
【００３５】
ベクターを細胞系の形質転換法に用いてもよく、さらにベクターは、選択された宿主細胞中で複製および発現を指令しうる、本発明のＤＮＡコーディング配列に作動可能に結合した選択された調節配列を含む。かかるベクター用の調節配列は当業者に知られており、宿主細胞に応じて選択できる。かかる選択は常套的であり、本発明の一部を形成しない。
【００３６】
骨関節炎のごとき種々の症状はアグレカンの分解により特徴づけられることが知られている。それゆえ、アグレカンを開裂する本発明のアグレカナーゼ蛋白はアグレカナーゼの阻害剤の開発に有用でありうる。それゆえ本発明は、アグレカナーゼ阻害剤を含む組成物を提供する。アグレカン基質と阻害剤との混合物を用いるスクリーニングアッセイにおいてアグレカナーゼ（アグレカンに接触させる）を用いて阻害剤を開発してもよい。組成物は骨関節炎およびアグレカンの分解を示す他の症状の治療に使用できる。
【００３７】
さらに本発明は、アグレカナーゼの検出に使用でき、アグレカナーゼの蛋白分解活性を阻害するために使用してもよい抗体を包含する。
【００３８】
本発明の治療方法は、局所的に、全身的に、あるいはインプラントまたはデバイスとして局部的にアグレカナーゼ阻害剤組成物を投与することを含む。アグレカナーゼ蛋白の作用を修飾する種々の因子、病気の部位、疾病の重さ、患者の年齢、性別、食事療法、炎症の程度、投与期間および他の臨床的因子を考慮して医師により投与規則が決定されよう。一般的には、全身または注射投与を最小限に有効な用量で開始し、次いで、正の効果が観察されるまで、前もって決められた期間中用量を増加させていく。その後、生じる可能性のある悪影響を考慮しつつ、対応して効果が実際に漸増するレベルまで用量を漸増する。最終組成物への他の既知因子の添加もまた用量に影響しうる。
【００３９】
定期的に疾病の進行を評価することにより経過を観察することができる。例えば、Ｘ線、ＭＲＩあるいは他のイメージング装置、滑液分析、および／または臨床試験により経過を観察することができる。
【００４０】
下記実施例は、ヒトアグレカナーゼおよび他のアグレカナーゼ関連蛋白の単離および特徴づけ、ヒト蛋白の取得、ならびに組み換え法による蛋白の発現における本発明の実施を説明する。
【実施例１】
【００４１】
ＤＮＡの単離
データベーススクリーニングアプローチを用いて潜在的な新規アグレカナーゼファミリーのメンバーを同定した。アグレカナーゼ−１（Aggrecanase-1）（Science 284:1664-1666 (1999)）は少なくとも６個のドメイン：シグナル、プロペプチド、触媒ドメイン、ディスインテグリン、ｔｓｐおよびｃ−末端を有する。触媒ドメインはプロテアーゼ活性に関与する亜鉛結合シグナチャー領域、ＴＡＡＨＥＬＧＨＶＫＦおよび「ＭＥＴターン」を含む。亜鉛結合領域中の多くの位置で置換を行なってもプロテアーゼ活性が生じるが、ヒスチジン（Ｈ）およびグルタミン酸（Ｅ）残基が存在しなければならない。アグレカナーゼ−１のスロンボスポンジンドメインも基質の認識および開裂に重要なドメインである。新規アグレカナーゼファミリーのメンバーの我々の分類を決定するのはこれら２つのドメインである。アグレカナーゼ−１ ＤＮＡ配列の蛋白配列を用い、ＴＢＬＡＳＴＮを用いてヒトＥＳＴｓに焦点を当ててＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴｓを検索した。得られた配列は潜在的なファミリーのメンバーの完全長配列を同定するための出発点であった。本発明のアグレカナーゼのヌクレオチド配列は、アグレカナーゼ−１（ＡＤＡＭＴＳ４）の触媒ドメインおよび亜鉛結合モチーフに対して相同性を示す１のＥＳＴ（ＡＡ５８８４３４）を含む。
【００４２】
このヒトアグレカナーゼ配列を、プラスミドベクターｐＥＤ６−ｄｐｃ２中に構築されたｄＴ−プライムドｃＤＮＡライブラリーから単離した。Clonetchから購入したヒト精巣ＲＮＡからｃＤＮＡを作成した。本発明のアグレカナーゼを単離するためのプローブを、データベース検索により得られた配列から得た。プローブの配列は下記のとおりであった：
5'-GGTCAAATCGCGTCAGTGTAAATACGGG-3'
ＤＮＡプローブを３２Ｐで放射性標識し、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション／洗浄条件下でヒト精巣ｄＴ−プライムドｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、ヒト候補＃８の配列を含むクローンを同定した。
【００４３】
５００００個のライブラリー形質転換体を、プレート１枚あたり約５０００個の形質転換体となるように、１０枚のプレートに撒いた。高いストリンジェンシーの条件下で、標準的なハイブリダイゼーションバッファー（１Ｘ Ｂｌｏｔｔｏ［２５Ｘ Ｂｌｏｔｔｏ＝ｄＨ２Ｏ中５％脱脂乾燥乳、０．０２％アザイド］＋１％ ＮＰ−４０＋６Ｘ ＳＳＣ＋０．０５％ピロリン酸）中において形質転換体コロニーのニトロセルロースレプリカを３２Ｐ標識ＤＮＡプローブにハイブリダイゼーションさせた（６５℃で２時間振盪）。ハイブリダイゼーションから２時間後、放射性標識ＤＮＡプローブを含むハイブリダイゼーション溶液を除去し、高いストリンジェンシー条件下（３Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸、室温で５分；次いで、２．２Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸、室温で１５分；次いで、２．２Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸、６５℃で１〜２分）でフィルターを洗浄した。フィルターをサランラップで包み、Ｘ線フィルムに一晩さらした。オートラジオグラフを得て、種々のシグナル強度の陽性ハイブリダイゼーション形質転換体を確認した。これらの陽性クローンを拾い、選択培地（Ｌ−ブロスに１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したもの）で１２時間増殖させ、低い密度（プレート１枚あたり約１００個のコロニー）でプレートに撒いた。高いストリンジェンシーの条件下で、標準的なハイブリダイゼーションバッファー（１Ｘ Ｂｌｏｔｔｏ［２５Ｘ Ｂｌｏｔｔｏ＝ｄＨ２Ｏ中５％脱脂乾燥乳、０．０２％アザイド］＋１％ ＮＰ−４０＋６Ｘ ＳＳＣ＋０．０５％ピロリン酸）中においてコロニーのニトロセルロースレプリカを３２Ｐ標識プローブとハイブリダイゼーションさせた（６５℃で２時間振盪）。ハイブリダイゼーションから２時間後、放射性標識ＤＮＡプローブを含むハイブリダイゼーション溶液を除去し、高いストリンジェンシー条件下（３Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸、室温で５分；次いで、２．２Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸、室温で１５分；次いで、２．２Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸、６５℃で１〜２分）でフィルターを洗浄した。フィルターをサランラップで包み、Ｘ線フィルムに一晩さらした。オートラジオグラフを得て、陽性ハイブリダイゼーション形質転換体を確認した。精製ハイブリダイゼーション陽性クローンの細菌ストックを作成し、プラスミドＤＮＡを単離した。ＤＮＡインサートの配列を決定し、配列番号：１のヌクレオチド＃１０８６（ＴＣＧ）から＃３３９６（ＣＧＣ）までに示す。この配列はAmerican Type Culture Collection 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USAにＰＴＡ−２２８４として寄託されている。ｃＤＮＡインサートはハイブリダイゼーションに使用したＤＮＡプローブの配列を含んでいた。次いで、この単離配列の５’（プライム）および３’（プライム）配列をＲＡＣＥプロトコルを用いて抽出した。完全に決定された配列を配列番号：１のヌクレオチド＃１から＃３７６６までに示す。
【００４４】
得られたヒト候補＃８配列を公になっているデータベース中の数個のＥＳＴｓと並置比較する。候補＃８はＡＤＡＭＴＳ７および６に対して相同性を示す。本発明のアグレカナーゼは亜鉛結合シグナチャー領域、「ＭＥＴターン」、およびｔｓｐ１型モチーフを含むが、シグナルおよびプロペプチド領域ならびにｃ−末端スペーサー領域を失っている。候補＃８を新規アグレカナーゼファミリーのメンバーであると考えたのはこれらの判断基準による。
【００４５】
本発明のアグレカナーゼ配列を用いて単離配列を含む完全長クローンをさらにスクリーニングするためのプローブを設計することができる。
【００４６】
ＥＳＴ８の完全長バージョンの５Ｐ（シグナルおよびプロペプチド）および３Ｐ（Ｃ−末端スペーサー領域）末端を、Clontech Marathon cDNA Amplification Kitを用いるＲＡＣＥ ＰＣＲにより決定した。精巣および胃のMarathon cDNAソースをＲＡＣＥ反応の基質として用いた。反応に使用した５Ｐ ＲＡＣＥプライマーは、
ＧＳＰ−１  AGTCTAGAAAGCTGGTGATGTAGTCACGGC
および
ＧＳＰ−２  TAGATGCATATGTCATAGCGTGTGATGAGCACTGC（ＮｓｉＩ部位を含む）
であった。
Marathon cDNA Amplification Kit用の利用者マニュアル中の指示に従って、ClontechのAdvantage-2 PCR Kitを用いて入れ子（nested）ＲＡＣＥ反応をセットアップした。ＧＳＰプライマー使用量は、反応混合物１μｌあたり各プライマー０．２ｐｍｏｌ／μｌであった。ＧＳＰ１プライマーをＰＣＲの第１ラウンドに使用し、ＧＳＰ２プライマーを入れ子反応に使用した。入れ子ＲＡＣＥ反応の生成物をＮｓｉＩ（ＧＳＰ２プライマーに対し）およびＮｏｔＩ（Clontech kit中に提供され、入れ子ＲＡＣＥ ＰＣＲに使用したＡＰ２プライマーに対し）で消化し、ＮｓｉＩおよびＮｏｔＩで切断したＣＳ２＋ベクター中に連結した。連結された生成物を、Life TechnologiesからのElectroMAX DH10B細胞中に形質転換した。
【００４７】
クローン化されたＲＡＣＥ生成物を低い密度（プレート１枚あたり約３００個のコロニー）でプレートに撒いた。高いストリンジェンシーの条件下で、標準的なハイブリダイゼーションバッファー（１Ｘ Ｂｌｏｔｔｏ［２５Ｘ Ｂｌｏｔｔｏ＝５％脱脂乾燥乳、０．０２％アザイド］＋１％ ＮＰ−４０＋６Ｘ ＳＳＣ＋０．０５％ピロリン酸）中においてコロニーのニトロセルロースレプリカを３２Ｐ標識プローブとハイブリダイゼーションさせた（６５℃で２時間振盪）。候補８−１の５Ｐ末端における配列をＤＮＡプローブとして使用した：
CTCGAGTCTGGGAAGCACCGTTAACATCC
【００４８】
２時間後、ハイブリダイゼーション溶液（１ｘ１０６ｃｐｍ ３２Ｐ標識ＤＮＡプローブを含むハイブリダイゼーションバッファー）を除去し、高いストリンジェンシー条件下（３Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸、室温で５分；次いで、２．２Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸、室温で１５分；次いで、２．２Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸、６５℃で１〜２分）でフィルターを洗浄した。フィルターをサランラップで包み、Ｘ線フィルムに一晩さらした。オートラジオグラフを得て、種々のシグナル強度の陽性ハイブリダイゼーション形質転換体を確認した。これらの陽性クローンを拾い、選択培地（Ｌ−ブロスに１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したもの）で１２時間増殖させた。プラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ配列分析に送った。候補８−１よりも５Ｐ配列に対して作成された（made to sequence more 5P than candidate 8-1）プローブを用いてハイブリダイゼーションの第２ラウンドを行なった。５Ｐ ＲＡＣＥ生成物からＤＮＡプローブ配列を推定した。第２のプローブ配列は下記のとおりであった：
GAAGGCGATCTCATAGCTCTCCAGACT
クローン化されたＲＡＣＥ生成物を再びプレートに撒き、more５Ｐプローブを用いたこと以外は同じハイブリダイゼーションプロトコルを行なった。精巣および胃両方のｃＤＮＡから得られた５Ｐ ＲＡＣＥ生成物に由来するコンセンサス配列から開始Ｍｅｔを推定した。使用した３Ｐ ＲＡＣＥプライマーは、
ＧＳＰ１  GCTCTAGACTGGTCTGAGTGCACCCCCAGCT
および
ＧＳＰ２  GTCCTTTGCAAGAGCGCAGACCAC
であった。
ClontechからのAdvantage GC-2 PCR Kitを用いて入れ子ＲＡＣＥ反応をセットアップした。使用したＣＧｍｅｌｔ量を５０μｌの反応液あたり５μｌとし、使用ＧＳＰプライマー量を０．２ｐｍｏｌ／μｌの各ＰＣＲプライマー／μｌ反応混合物とした以外は、Marathon cDNA Amplification Kit用の利用者マニュアル中の指示に従って反応をセットアップした。ＧＳＰ１プライマーをＰＣＲの第１ラウンドに使用し、ＧＳＰ２を入れ子反応に使用した。製造者の指示に従ってAdvanTAge PCR Cloning Kitを用いて入れ子ＲＡＣＥ反応からの生成物をｐＴ−Ａｄｖベクター中に連結した。連結された生成物を、Life TechnologiesからのElectroMAX DH10B細胞中に形質転換した。クローン化されたＲＡＣＥ生成物を低い密度（プレート１枚あたり約３００個のコロニー）でプレートに撒いた。高いストリンジェンシーの条件下で、標準的なハイブリダイゼーションバッファー（１Ｘ Ｂｌｏｔｔｏ［２５Ｘ Ｂｌｏｔｔｏ＝５％脱脂乾燥乳、０．０２％アザイド］＋１％ ＮＰ−４０＋６Ｘ ＳＳＣ＋０．０５％ピロリン酸）中においてコロニーのニトロセルロースレプリカを３２Ｐ標識プローブとハイブリダイゼーションさせた（６５℃で２時間振盪）。候補８−１の３Ｐ末端における配列をＤＮＡプローブとして用いた：
GCACTGTGCAGAGCACTCACCCCA
２時間後、ハイブリダイゼーション溶液（１ｘ１０６ｃｐｍ ３２Ｐ標識ＤＮＡプローブを含むハイブリダイゼーションバッファー）を除去し、高いストリンジェンシー条件下（３Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸、室温で５分；次いで、２．２Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸、室温で１５分；次いで、２．２Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸、６５℃で１〜２分）でフィルターを洗浄した。フィルターをサランラップで包み、Ｘ線フィルムに一晩さらした。オートラジオグラフを得て、種々のシグナル強度の陽性ハイブリダイゼーション形質転換体を確認した。これらの陽性クローンを拾い、選択培地（Ｌ−ブロスに１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したもの）で１２時間増殖させた。プラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ配列分析に送った。精巣および胃両方のｃＤＮＡから得られた３Ｐ ＲＡＣＥ生成物に由来するコンセンサス配列から停止コドンを推定した。
【００４９】
塩基対１３３２から１５１７まで（本明細書では開始Ｍｅｔ（ＡＴＧ）のＡを塩基対＃１とする）を除いて、完全長のＥＳＴ８配列を確認した。公のデータベースの検索により、ＡＤＡＭＴＳ１０と呼ばれるＥＳＴ８部分配列が明らかとなった。我々は、合成オリゴヌクレオチドを用いて我々のＥＳＴ８の連続した領域（塩基対１３３２から１５１７まで）を構築するためにこの部分クローンからの配列を用いた。
【００５０】
ＥＳＴ８の完全長配列（配列番号：３）はハイブリダイゼーション陽性候補８−１、ＥＳＴ８を表す公に利用可能な配列、およびClontechの精巣および胃のｃＤＮＡからのＰＣＲ生成物に由来するコンセンサス配列であった。最終的なＥＳＴ８発現構築物を、４つのＥＳＴ８の特別なフラグメントから集めた。塩基対１〜１３４２からのＥＳＴ８の５Ｐ部分を、胃および精巣のｃＤＮＡのプールからＰＣＲ増幅し、フラグメント１と命名する。下記のプライマーを用いた：
５Ｐ ＰＣＲプライマー  AAATGGGCGAATTCCCACCATGGCTCCCGCCTGCCAGATCCTCCG（８塩基対のリンカー（ＡＡＡＴＧＧＧＣ）およびＥｃｉＲＩクローニング部位（ＧＡＡＴＴＣ）およびＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣ）を開始Ｍｅｔの上流に含む）
および
３Ｐ ＰＣＲプライマー  CCGAGTCTAGAAAGCTGGTGATGTAG（ＸｂａＩ部位（ＴＣＴＡＧＡ）を含む）。
標準的な消化条件を用いてこのＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化した。遺伝子の次の部分であるフラグメント２を、合成オリゴヌクレオチドを用いて構築した。合成フラグメントはＸｂａＩ部位からＢｓｒＦＩ部位までであり、ＥＳＴ８の塩基対１３３３から１５１７までであった。合成オリゴヌクレオチドは下記の配列からなっていた：
トップ配列は  CTAGACTCGGGCCTGGGGCTCTGCCTGAACAACCGACCCCCCAGACAGGACTTTGTGTACCCGACAGTGGCACCGGGCCAAGCCTACGATGCAGATGAGCAATGCCGCTTTCAGCATGGAGTCAAATCGCGTCAGTGTAAATACGGGGAGGTCTGCAGCGAGCTGTGGTGTCTGAGCAAGAGCAAからなり；
ボトム配列は  CCGGTTGCTCTTGCTCAGACACCACAGCTCGCTGCAGACCTCCCCGTATTTACACTGACGCGATTTGACTCCATGCTGAAAGCGGCATTGCTCATCTGCATCGTAGGCTTGGCCCGGTGCCACTGTCGGGTACACAAAGTCCTGTCTGGGGGGTCGGTTGTTCAGGCAGAGCCCCAGGCCCGAGTからなっていた。
ＥＳＴ８の次の部分であるフラグメント３はＢｓｒＦＩからＳｐｈＩまでのフラグメントであり、候補８−１から消化されたものであった。これはＥＳＴ８の完全長バージョンの塩基対１５１８から２７８３までの塩基対であった。フラグメント４と呼ばれるＥＳＴ８の３Ｐ部分（塩基対２６６３から３３１４まで）をＰＣＴ増幅した。下記のプライマーを用いた：
５Ｐ  GGGTTGTAGGGAACTGGTCGCTCTG（フラグメント３中に存在しており、ＳｐｈＩ部位の上流）
および
３Ｐ  AAATGGGCCTCGAGCCCTAGTGGCCCTGGCAGGTTTTGC（８塩基対のリンカー（ＡＡＡＴＧＧＧＣ）および停止コトン（ＴＡＧ）の下流のＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）を含む）
標準的な消化条件を用いてこのＰＣＲ生成物をＳｐｈＩおよびＸｈｏＩで消化した。これら４つの説明されたフラグメント、すなわち５Ｐフラグメント１（ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ）、内部フラグメント２（ＸｂａＩ／ＢｓｒＦＩ）、内部フラグメント３（ＢｓｒＦＩ／ＳｐｈＩ）、および３Ｐフラグメント４（ＳｐｈＩ／ＸｈｏＩ）をＣｏｓ発現ベクターｐＥＤ６−ｄｐｃ２（ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化されている）中に連結することにより、ＥＳＴ８の完全長バージョンを構築した。最終構築物は、連結中に破壊されるＸｈｏＩクローニング部位中に変異を有していた。これはＥＳＴ８コーディング配列に影響せず、構築物中に残った。
【実施例２】
【００５１】
アグレカナーゼの発現
ネズミ、ヒトまたは他の哺乳動物のアグレカナーゼ関連蛋白を製造するために、慣用的な遺伝子操作法により、それをコードするＤＮＡを適切な発現ベクター中に移し、哺乳動物細胞あるいは昆虫細胞培養系を包含する他の好ましい真核宿主または原核宿主中に導入する。生物学的に活性のある組み換えヒトアグレカナーゼのための発現系は、安定に形質転換された哺乳動物細胞、昆虫、酵母または細菌細胞であると考えられる。
【００５２】
当業者は、配列番号：３の配列あるいは配列番号：１のヌクレオチド＃１から＃３７６６までを含むかまたはヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６までを含む配列番号：１の配列あるいはアグレカナーゼ関連蛋白をコードする他のＤＮＡ配列あるいは他の修飾配列ならびにｐＣＤ（Okayama et al., Mol. Cell Biol., 2:161-170 (1982)）、ｐＪＬ３、ｐＪＬ４（Gough et al., EMBO J., 4:645-653 (1985)）およびｐＭＴ２ ＣＸＭのごとき既知ベクターを用いて、哺乳動物発現ベクターを構築することができる。
【００５３】
哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２ ＣＸＭはｐ９１０２３（ｂ）（Wong et al., Science 228:810-815, 1985）の誘導体であり、テトラサイクリン耐性遺伝子のかわりにアンピシリン耐性遺伝子を含み、さらにｃＤＮＡクローンの挿入用にＸｈｏＩ部位を含むという点でｐ９１０２３（ｂ）とは異なる。ｐＭＴ２ ＣＸＭの機能的エレメントは説明されており（Kaufman, R.J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689-693）、アデノウイルスＶＡ遺伝子、７２ｂｐのエンハンサーを含むＳＶ４０複製開始点、５’スプライス部位およびアデノウイルス後期ｍＲＮＡｓ上に存在するアデノウイルス三分節リーダー配列の大部分を含むアデノウイルス主要後期プロモーター、３’スプライスアクセプター部位、ＤＨＦＲインサート、ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位（ＳＶ４０）、ならびにE. coli中での増殖に必要なｐＢＲ３２２配列を含む。
【００５４】
American Type Culture Collection 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USAに受託番号ＡＴＣＣ６７１２２として寄託されているｐＭＴ２−ＶＷＦをＥｃｏＲＩ消化することによりプラスミドｐＭＴ２ ＣＸＭを得る。ＥｃｏＲＩ消化によりｐＭＴ２−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡインサートが削除され、直鎖状のｐＭＴ２が生じ、これを連結してE. coli HB101またはDH-5の形質転換に使用してアンピシリン耐性とすることができる。慣用的な方法によりプラスミドｐＭＴ２ ＤＮＡを調製することができる。次いで、ループアウト／イン突然変異法（Morinaga, et al., Biotechnology 84:636 (1984)）を用いてｐＭＴ２ ＣＸＭを構築する。これによりｐＭＴ２のＳＶ４０複製開始点およびエンハンサー配列に近いＨｉｎｄＩＩＩ部位に対して１０７５番目から１１４５番目の塩基が除去される。さらに、下記配列をヌクレオチド１１４５のところに挿入する：
5' PO-CATGGGCAGCTCGAG-3'
この配列は制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩの認識部位を含む。ｐＭＴ２３と命名されたｐＭＴ２ＣＸＭの誘導体は制限エンドヌクレアーゼＲｓｔＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩの認識部位を含む。プラスミドｐＭＴ２ ＣＸＭおよびｐＭＴ２３ ＤＮＡを慣用的な方法により得てもよい。
【００５５】
ｐＭＴ２１から誘導されたｐＥＭＣ２β１も本発明の実施に適する可能性がある。ｐＭＴ２１は以下の２つの修飾を経てｐＭＴ２から誘導される。上記のごとく、ＥｃｏＲＩ消化によりｐＭＴ−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡインサートが切除されて、直鎖状のｐＭＴ２が得られ、これを連結してE. coli HB 101またはDH-5を形質転換してアンピシリン耐性とするために使用することができる。慣用的な方法によりプラスミドｐＭＴ２ ＤＮＡを得ることができる。
【００５６】
以下の２つの修飾によりｐＭＴ２１をｐＭＴ２から誘導する。先ず、ｃＤＮＡクローニングのためのＧ／Ｃテイリングから伸長した１９個のＧ残基を含む、ＤＨＦＲｃＤＮＡの７６塩基対の５’非翻訳領域を欠失させる。この工程において、ＸｈｏＩ部位を挿入してＤＨＦＲのすぐ上流に下記配列：
5' -CTGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGAGCCATCATG-3'
PstI               Eco RI XhoI
を得る。
【００５７】
次いで、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩでの消化、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでの処理、そしてＣｌａＩリンカー（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）への連結により、ユニークなＣｌａＩ部位を導入する。これにより、２５０塩基対の断片がアデノウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ）領域から欠失されるが、ＶＡＩ ＲＮＡ遺伝子の発現または機能は阻害されない。ｐＭＴ２１をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を得るために用いる。
【００５８】
ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩでの消化により、ＥＭＣＶリーダーの一部がｐＭＴ２−ＥＣＡＴ１［S. K. Jung et al., J. Virol, 63: 1651〜1660 (1989)］から得られ、これは２７５２塩基対のフラグメントである。このフラグメントをＴａｑＩで消化し、５０８塩基対のＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメントを得、これを低融点アガロースゲル上の電気泳動により精製する。下記配列：
5'-CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTT
TaqI
GAAAAACACGATTGC-3'
XhoI
を有する５’ＴａｑＩ突出末端および３’ＸｈｏＩ突出末端を用いて６８塩基対のアダプターおよびその相補鎖を合成する。
この配列は、ヌクレオチド７６３ないし８２７由来のＥＭＣウイルスリーダー配列に合致する。さらにこの配列は、ＥＭＣウイルスリーダー内の位置１０におけるＡＴＧがＡＴＴに変化しており、ＸｈｏＩ部位が後に続いている。ｐＭＴ２１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント、ＥＭＣウイルスのＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメント、および６８塩基対のオリゴヌクレオチドアダプターＴａｑＩ−１６ｈｏＩアダプターの３つを連結してベクターｐＥＭＣ２β１を得る。
【００５９】
このベクターは、ＳＶ４０複製開始点ならびにエンハンサー、アデノウイルス大後期プロモーター、アデノウイルス三分節リーダー配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小型のハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルならびにアデノウイルスＶＡＩ遺伝子、ＤＨＦＲならびにβ−ラクタマーゼマーカーおよびＥＭＣ配列を含み、哺乳動物細胞における高レベルの所望ｃＤＮＡの発現の指令に適当に関連している。
【００６０】
ベクターの構築はアグレカナーゼ関連ＤＮＡ配列の修飾を包含してもよい。例えば、コーディング領域の５’および３’末端上の非コーディングヌクレオチドを除去することにより、アグレカナーゼのｃＤＮＡを修飾してもよい。欠失された非コーディングヌクレオチドを、発現に有益であることが知られている他の配列で置換してもよく、置換しなくてもよい。これらのベクターを、アグレカナーゼ関連蛋白の発現にとり適当な宿主細胞中に形質転換する。さらに、アグレカナーゼをコードするプロペプチド配列を欠失させ、他のアグレカナーゼ蛋白の完全なポリペプチドをコードする配列で置きかえることにより、配列番号：３あるいは配列番号：１のヌクレオチド＃１から＃３７６６までを含むかまたはヌクレオチド＃１０８６から＃３３９６までを含む配列番号：１の配列あるいはアグレカナーゼ関連蛋白をコードする他の配列を処理加工して、成熟アグレカナーゼ関連蛋白を発現させることができる。
【００６１】
当業者は、コーディング配列に隣接している哺乳動物の調節配列を除去するかまたは細菌の配列に置き換えて、細菌細胞による細胞内または細胞外発現用の細菌ベクターを作成することにより、配列番号：３または配列番号：１の配列を処理加工することができる。例えば、コーディング配列をさらに処理加工することができる（例えば、他の既知リンカーに連結する、あるいはその非コーディング配列を欠失させるかまたは他の既知方法によりそのヌクレオチドを変化させることができる）。次いで、T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5230〜5233 (1980)に記載されたような方法を用いて、修飾されたアグレカナーゼ関連コーディング配列を既知細菌ベクター中に挿入することができよう。次いで、この典型的な細菌ベクターを細菌宿主細胞中に形質転換し、それによりアグレカナーゼ関連蛋白を発現させる。細菌細胞においてアグレカナーゼ関連蛋白を細胞外発現させるための方法については、欧州特許公開ＥＰＡ１７７,３４３参照。
【００６２】
昆虫細胞における発現を目的として、昆虫ベクターの構築を行うために同様の処理加工を行うことができる［例えば、公開された欧州特許出願第１５５,４７６号記載の方法参照］。酵母細胞による本発明因子の細胞内または細胞外発現のための酵母の調節配列を用いて、酵母ベクターを構築することもできる［例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８６／００６３９および欧州特許出願公開ＥＰＡ１２３,２８９号記載の方法参照］。
【００６３】
高レベルの本発明アグレカナーゼ関連蛋白を哺乳動物細胞において製造する方法は、異種アグレカナーゼ関連遺伝子の多数のコピーを有する細胞の構築を包含する。異種遺伝子を増幅可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子に連結し、Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601〜629 (1982)の方法により、メトトレキセート（ＭＸＴ）濃度を上昇させていって増加した遺伝子コピーを有する細胞を該マーカー関して選択できる。このアプローチを種々の異なる細胞タイプに使用することができる。
【００６４】
例えば、リン酸カルシウム共沈ならびにトランスフェクション、エレクトロポーレーションまたはプロトプラスト融合をはじめとする種々の方法により、アグレカナーゼ関連蛋白の発現を可能にする他のプラスミドの配列と作動するように結合された本発明のアグレカナーゼ関連蛋白に関するＤＮＡ配列を含むプラスミドと、ＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３［Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol., 2: 1304 (1982)］とを、ＤＨＦＲ欠損細胞ＤＵＫＸ−ＢＩＩ中に同時に導入することができる。ＤＨＦＲを発現する形質転換体を、透析されたウシ胎児血清を含むアルファ培地における増殖に関して選択し、次いで、Kaufman et al.,Mol.Cell.Biol.,5:1750(1983)記載のごとく、ＭＴＸ濃度を増加させていった場合（例えば順次、０.０２、０.２、１.０、ついで５μＭのＭＴＸ）の増殖による増幅について選択を行う。形質転換体をクローン化させ、生物学的に活性のあるアグレカナーゼの発現を、上記アッセイによりモニターする。アグレカナーゼ蛋白の発現はＭＴＸ耐性レベルの増加に伴って増加するはずである。［３５Ｓ］メチオニンまたはシステインでのパルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当該分野で知られた標準的方法を用いて、アグレカナーゼポリペプチドを特徴づける。同様の方法により他の関連アグレカナーゼ関連蛋白を製造することができる。
【００６５】
一例において、配列番号：３に示す本発明のアグレカナーゼ遺伝子を発現ベクターｐＥＤ６（Kaufman et al., Nucleic Acid Res. 19:44885-4490 (1990)）中にクローン化する。リポフェクション（LF2000, Invitrogen）によりＣＯＳおよびＣＨＯ ＤＵＫＸ Ｂ１１細胞を本発明のアグレカナーゼ配列で一時的にトランスフェクションする（＋／−別個のペＤ６プラスミド上のＰＡＣＥの同時トランスフェクション）。興味ある遺伝子：（ａ）活性のアッセイのために馴化培地を得るための遺伝子、および（ｂ）３５−Ｓ−メチオニン／システイン代謝標識のための遺伝子、のそれぞれについて２つの同じ系でトランスフェクションを行なう。
【００６６】
１日目にウェル上にて培地をＤＭＥ（ＣＯＳ）またはアルファ（ＣＨＯ）培地＋１％熱不活性化ウシ胎児血清＋／−１００にμｇ／ｍｌヘパリン交換して活性アッセイ用に集める。４８時間後（４日目）に馴化培地を活性アッセイ用に集める。
【００６７】
３日目に２系のウェルをＭＥＭ（メチオニン不含／システイン不含）培地＋１％熱不活性化ウシ胎児血清＋１００μｇ／ｍｌヘパリン＋１００μＣｉ／ｍｌ ３５Ｓ−メチオニン／システイン（Redivue Pro mix, Amersham）に交換する。３７℃で６時間インキュベーションした後、馴化培地を集め、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動させる。オートラジオグラフィーにより蛋白を可視化させる。
【実施例３】
【００６８】
発現されたアグレカナーゼの生物学的活性
上記実施例２で得られた発現されたアグレカナーゼ関連蛋白の生物学的活性を測定するために、細胞培養物から蛋白を回収し、同時生成された蛋白性物質ならびに他の汚染混入物質からアグレカナーゼ関連蛋白を単離することにより精製する。精製蛋白を上記アッセイによりアッセイしてもよい。当業者に知られた標準的な方法を用いて精製を行なう。
【００６９】
銀染色（Oakley, et al. Anal. Biochem. 105:361 (1980)）されたＳＤＳ−ＰＡＧＥアクリルアミド（Laemmli, Nature 227:680 (1970)）およびイムノブロット（Towbin, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 76:4350 (1979)）のごとき標準的な方法を用いて蛋白の分析を行なう。
【００７０】
上の説明は本発明の目下好ましい具体例を詳細に説明するものである。本発明の実施にあたり、これらの説明を考慮して多くの修飾およびバリエーションが当業者によりなされると考えられる。それらの修飾およびバリエーションは添付した請求の範囲内にあると確信する。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、医薬品の開発等の分野において利用可能である。
【配列表】
2008301813000001.app