(57)【要約】      （修正有）【課題】S.pneumoniaeのゲノムを特徴付ける必要性およびこの生物のポリヌクレオチドの提供。【解決手段】単離された核酸。ならびに、コンピュータ読み出し可能な媒体であって、特定の配列で表記されたヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント、または特定の配列に表記されたヌクレオチド配列と少なくとも95％同一なヌクレオチド配列を、該媒体上に記録されて有する、媒体；またはコンピュータ読み出し可能な媒体であって、特定の配列のフラグメントのいずれかひとつ、またはその縮重変異体を、該媒体上に記録されて有する、媒体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、
（ａ）表１に示されたポリヌクレオチドのアミノ酸の配列のいずれかをコードするヌクレオチド配列；または
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチド
を含む、核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、請求項１の（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、
ここで、該ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズしない、核酸分子。
【請求項３】
請求項１の（ａ）におけるアミノ酸を有するポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子。
【請求項４】
請求項３に記載の単離された核酸分子であって、前記ポリペプチドのエピトープ保有部分が、表２に列挙されたアミノ酸配列を有する、核酸分子。
【請求項５】
請求項１に記載の単離された核酸分子をベクターに挿入する工程を包含する、組換えベクターを作製するための方法。
【請求項６】
請求項５に記載される方法によって生成される組換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載される組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を包含する、組換え宿主細胞を作製する方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法によって作製される組換え宿主細胞。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドを生成するための方法であって、その異種ポリペプチドを発現するのに好ましい条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載される方法により作製されるポリペプチド。
【請求項１１】
単離されたポリペプチドであって、表１に記載されるポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列からなる群より選択される配列に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１２】
表２に示されたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのエピトープのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド抗原。
【請求項１３】
請求項９に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【請求項１４】
請求項１１に記載のポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１６】
ワクチンであって、
（１）表１で同定されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドからなる群より選択される
１以上のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチド；および
（２）薬学的に受容可能である、希釈剤、担体、または賦形剤
を含み、ここで、該ポリペプチドが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属にメンバーに対し、動物において防御抗体を惹起するのに十分な量で存在する、
ワクチン。
【請求項１７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属にメンバーにより動物において引き起こされる感染を予防するかまたは弱毒化する方法であって、
請求項１１に記載のポリペプチドを該動物に投与する工程
を包含し、ここで、該ポリペプチドは、該感染を予防または弱毒化するのに効果的な量で投与される、方法。
【請求項１８】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓペプチドをコードするサンプル中における1以上の核酸配列をアッセイにするのに関連して、生物学的サンプルにおいてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの核酸を検出するための方法であって、
（ａ）ハイブリダイゼーションが生じるような条件下で該サンプルを1以上の上述したような核酸プローブと接触させる工程；および
（ｂ）該生物学的サンプルにおいて存在する1以上のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ核酸配列に対する該1以上の核酸プローブのハイブリダイゼーションを検出する工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
動物から得た生物学的サンプル中でＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ核酸を検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応を使用して該サンプル中の1以上のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ核酸配列を増幅する工程；および
（ｂ）該増幅したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ核酸を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項２０】
動物から得た生物学的サンプル中でＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ抗体を検出するためのキットであって、
（ａ）固体支持体に結合している請求項１２に記載のポリペプチド；および
（ｂ）検出手段
を備える、キット。
【請求項２１】
動物から得た生物学的サンプル中でＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ抗体を検出するための方法であって、
（ａ）請求項１２に記載のポリペプチドと該サンプルを接触させる工程；および
（ｂ）抗体−抗原複合体を検出する工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、とりわけStreptococcus  pneumoniaeのヌクレオチド配列、コンティグ(contig)、ORF、フラグメント、プローブ、プライマー、およびそれに関連したポリヌクレオチド、その配列によりコードされるペプチドおよびポリペプチド、ならびにそのポリヌクレオチドおよび配列の使用（例えば、とりわけ、発酵、ポリペプチド生産、アッセイ、および薬剤の開発）に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Streptococcus  pneumoniaeは、1881年に最初に単離されてから、最も広範に研究された微生物の１つである。多くの調査の目的は、重要な科学的発見を導くことであった。1928年、Griffithは、熱で死滅させたカプセル化pneumococcus、および任意のカプセルを構成的に欠失した生存株を、マウスに同時に注射した場合に、非カプセル化株は、熱で死滅させた株と同じカプセル型を有するカプセル化pneumococciに変換され得たことを観察した。後に、この「形質転換原理」の本質、または遺伝情報のキャリアは、DNAであることが示された  (Avery,  O.T.ら、J.Exp.Med.,  79:137-157  (1944))。
【０００３】
S.pneumoniaeに関する多数の刊行物にも拘わらず、その毒力に関する多くの疑問はいまだ答えられておらず、そしてこの病原体は、重篤なヒト疾患（特に、地域社会獲得性肺炎）の主要な原因因子のままである（Johnston,  R.B.ら、Rev.Infect.Dis.  13(補遺６):  S509-517  (1991)）。さらに、開発途上国において、pneumococcusは、肺炎球菌肺炎由来の５歳未満の多数の子供の死亡原因である。肺炎球菌疾患の発生率は、２歳未満の乳児および60歳より上の人々において最も高い。Pneumococciは、子供における細菌性髄膜炎および中耳炎の２番目に最も頻繁な原因（Haemophilus  influenzae  b型の次）である。H.influenzae  b型に対する結合体ワクチンの最近の導入により、肺炎球菌性髄膜炎は、ますます顕著になりそうである。S.pneumoniaeは、成人における地域社会獲得性肺炎の最も重要な病因学的因子であり、そしてNeisseria  meningitidisの次の２番目に最も一般的な細菌性髄膜炎の原因である。
【０００４】
S.pneumoniaeを処置するために一般に処方される抗生物質は、ベンジルペニシリンであるが、このおよび他の抗生物質に対する耐性が時折見出される。ペニシリンに対するpneumococcusの耐性は、そのペニシリン結合タンパク質における変異から生じる。感受性株によって引き起こされる無併発性の肺炎球菌肺炎において、ペニシリンでの処置は、開始が遅すぎない限り、通常は上首尾である。エリスロマイシンまたはクリンダマイシンは、ペニシリンに対して過敏症である患者における肺炎を処置するために使用され得るが、これらの薬物に対して耐性である株が存在する。広スペクトルの抗生物質（例えば、テトラサイクリン）もまた効果的あり得るが、テトラサイクリン耐性株は希ではない。抗生物質の有効性にも拘わらず、過去40年におけるpneumococcus菌血症の致死率は、25％と29％との間で安定したままである（Gillespie,  S.H.ら、J.Med.Microbiol.  28:237-248  (1989)）。
【０００５】
S.pneumoniaeは、多くの健康な個体によって上気道において保有される。pneumococcusの付着が、ヒト咽頭上皮細胞に存在する、フィブロネクチンにおけるジサッカライドレセプターによって媒介されることが示唆されている（Anderson,  B.J.ら、J.Immunol.  142:2464-2468  (1989)）。pneumococcusが鼻咽頭から肺に転位し、それによって肺炎を引き起こすか、または血液に移動して、菌血症または敗血症を生じる機構は、ほとんど理解されていない（Johnston,  R.B.ら、Rev.Infect.Dis.  13  (補遺６):S509-517  (1991)）。
【０００６】
種々のタンパク質がS.pneumoniaeの病原性に関与することが示唆されているが、それらの内のわずかしか毒性因子として実際に確認されていない。pneumococciは、粘膜表面で宿主防御に干渉し得るIgA1プロテアーゼを産生する（Kornfield,  S.J.ら、Rev.Inf.Dis.  3:521-534  (1981)）。S.pneumoniaeはまた、ノイラミニダーゼ（宿主糖脂質およびガングリオシドに由来するシアル酸を切断することによって上皮細胞への付着を促進し得る酵素）を産生する。部分的に精製されたノイラミニダーゼが、マウスにおいて髄膜炎様徴候を誘導することが観察された；しかし、この知見の信頼性は疑問視された。なぜなら、使用されたノイラミニダーゼ調製物に、おそらく細胞壁産物が混入していたからである。ノイラミニダーゼ以外の他のpneumococcusのタンパク質は、pneumococcusの上皮および内皮細胞への付着に関与する。これらのpneumococcusタンパク質は、いまだ同定されていない。最近、Cundellらは、ペプチド透過酵素が上皮および内皮細胞へのpneumococcusの接着性を調整し得ることを報告した。しかし、これらの透過酵素が接着物として直接機能するか、またはそれらがpneumococcusの接着物の発現を調整することによって接着を増強するかは、不明である（DeVelasco,  E.A.ら、Micro.Rev.  59:591-603  (1995)）。その病原性を決定する毒性因子のより良好な理解が、ヒトにおける肺炎球菌疾患の破壊的影響に対処するために発達される必要がある。
【０００７】
皮肉なことに、DNAの発見におけるS.pneumoniaeの顕著な役割にも拘わらず、この生物の分子遺伝学に関してはほとんどわかっていない。S.pneumoniaeゲノムは、１つの環状の共有結合的に閉じた二本鎖DNAおよびいわゆる可変性アクセサリーエレメント（例えば、プロファージ、プラスミド、トランスポゾンなど）の集合からなる。S.pneumoniaeのほとんどの物理的特徴およびほとんど全ての遺伝子が不明である。同定されたわずかなものの内のほとんどが物理的にマッピングされていないし、詳細に特徴付けられてもいない。この生物の２、３の遺伝子だけが配列決定されている（例えば、現在版のGENBANKおよび他の核酸データベース、および本明細書中の他所に示されたもののようなS.pneumoniaeのゲノムに関連する参考文献を参照のこと）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
S.pneumoniae感染によって媒介されるか、または悪化される疾患の病因が、S.pneumoniae遺伝子のプログラムされた発現を含むこと、ならびに、遺伝子およびその発現パターンの特徴付けが、この生物およびその宿主相互作用の我々の理解に劇的に役立つことは明らかである。S.pneumoniae遺伝子およびゲノム機構の知識は、疾患病因の我々の理解を改善し、そして疾患を予防し、好転させ、停止し、そして逆転する改善された方法および新規の方法を導く。さらに、S.pneumoniaeの特徴付けられた遺伝子およびゲノムフラグメントは、とりわけ、S.pneumoniae感染を検出するための試薬、特徴付けるための試薬、そして制御するための試薬を提供する。S.pneumoniaeのゲノムを特徴付ける必要性およびこの生物のポリヌクレオチドの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によって以下が提供される：
（１）コンピュータ読み出し可能な媒体であって、配列番号１〜391で表記されたヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント、または配列番号１〜391に表記されたヌクレオチド配列と少なくとも95％同一なヌクレオチド配列を、該媒体上に記録されて有する、媒体。
（２）コンピュータ読み出し可能な媒体であって、表２および３に表記された配列番号１〜391のフラグメントのいずれかひとつ、またはその縮重変異体を、該媒体上に記録されて有する、媒体。
（３）請求項１に記載のコンピュータ読み出し可能な媒体であって、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、ランダムアクセスメモリー（RAM）、読出し専用メモリー（ROM）、およびCD-ROMからなる群から選択される、媒体。
（４）請求項３に記載のコンピュータ読み出し可能な媒体であって、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、ランダムアクセスメモリー（RAM）、読出し専用メモリー（ROM）、およびCD-ROMからなる群から選択される、媒体。
（５）商業的に重要なStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントを同定するためのコンピュータに基づくシステムであって、以下の要素：
(a)  配列番号１〜391のヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント、または配列番号１〜391のヌクレオチド配列と少なくとも95％同一なヌクレオチド配列を含むデータ記憶手段；
(b)  (a)のデータ記憶手段のヌクレオチド配列に対して標的配列を比較して、相同な配列を同定するための検索手段；および
(c)  (b)の該相同な配列を入手するための検索手段、
を包含する、システム。
（６）商業的に重要なStreptococcus  pneumoniaeゲノムの核酸フラグメントを同定するための方法であって、配列番号１〜391に表記されたヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント、または配列番号１〜391のヌクレオチド配列と少なくとも95％同一なヌクレオチド配列を含むデータベースを、標的配列と比較して、該標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子を入手する工程であって、該標的配列が、ランダムには選択されない、工程を包含する、方法。
（７）Streptococcus  pneumoniaeゲノムの発現調整フラグメントを同定するための方法であって、配列番号１〜391に表記されたヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント、または配列番号１〜391のヌクレオチド配列と少なくとも95％同一なヌクレオチド配列を含むデータベースを、標的配列と比較して、該標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子を入手する工程であって、該標的配列が、遺伝子発現を調節することが知られている配列を含む、工程を包含する、方法。
（８）単離された、タンパク質をコードする、Streptococcus  pneumoniaeゲノムの核酸フラグメントであって、表２および３に表記された配列番号１〜391のフラグメントのいずれかひとつ、またはその縮重変異体のヌクレオチド配列からなる、フラグメント。
（９）表２および３に表記された配列番号１〜391のStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントのいずれかひとつ、またはその縮重変異体を含む、ベクター。
（１０）Streptococcus  pneumoniaeゲノムの単離されたフラグメントであって、作動可能に連結されたオープンリーディングフレームの発現を調整し、ここで該フラグメントは、表２および３に表記されたオープンリーディングフレームのいずれかひとつ、またはその縮重変異体に対して5'側にある、長さが約10から200塩基のヌクレオチド配列からなる、フラグメント。
（１１）請求項８に記載のStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントのいずれかひとつを含む、ベクター。
（１２）請求項８に記載のStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントのいずれかひとつを含むように改変された、生物。
（１３）請求項１０に記載のStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントのいずれかひとつを含むように改変された、生物。
（１４）核酸分子の発現を調節するための方法であって、該核酸分子に、配列番号１〜391ならびに表２および３に表記されたStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントのいずれかひとつ、またはその縮重変異体に対して5'側である、約10から100塩基のヌクレオチド配列からなる核酸分子を、共有結合により付着させる工程を包含する、方法。
（１５）配列番号１〜391ならびに表２および３のStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントのいずれかひとつのホモログをコードする、単離された核酸分子であって、ここで該核酸分子は、以下の工程：
(a)  配列番号１〜391ならびに表２および３のいずれかにより規定される標的配列（そのフラグメントを含む）をプローブとして用いて、ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングする工程；
(b)  該標的配列にハイブリダイズする配列を含む該ライブラリーのメンバーを同定する工程；
(c)  工程(b)において同定された該メンバーから該核酸分子を単離する工程、
を包含する方法により作製される、核酸分子。
（１６）配列番号１〜391ならびに表２および３のStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントのいずれかひとつのホモログをコードする、単離されたDNA分子であって、ここで該核酸分子は、以下の工程：
(a)  生物から生産されるmRNA、DNAまたはcDNAを単離する工程；
(b)  核酸分子を増幅する工程であって、該核酸分子のヌクレオチド配列が、該増幅をプライムするために、該Streptococcus  pneumoniaeゲノムの該フラグメントに由来する増幅プライマーに相同である、工程；
(c)  工程(b)において作製された、該増幅配列を単離する工程、
を包含する方法により作製される、DNA分子。
（１７）配列番号１〜391ならびに表２および３に表記されたStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントのいずれかによって、または該フラグメントの縮重変異体によってコードされる、単離されたポリペプチド。
（１８）請求項１７に記載のポリペプチドのいずれかひとつをコードする、単離されたポリヌクレオチド分子。
（１９）請求項１７に記載のポリペプチドのいずれかひとつに選択的に結合する、抗体。
（２０）宿主細胞中でポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程：
(a)  異種の核酸分子を含む宿主を、該異種の核酸分子が発現されて該タンパク質を生産する条件下でインキュベートする工程であって、該異種の核酸分子のヌクレオチド配列は、配列番号１〜391ならびに表２および３に表記されたStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントのいずれかひとつからなる、工程；および、
(b)  該タンパク質を単離する工程、
を包含する、方法。
【００１０】
発明の要旨
本発明は、Streptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントの配列決定に基づく。生じた一次ヌクレオチド配列は、配列番号１〜391に提供される。
【００１１】
本発明は、当業者により容易に使用、分析、および解釈され得る形態で、Streptococcus  pneumoniaeゲノムの数百のコンティグのヌクレオチド配列（これらは、以下の表に列挙され、そして本明細書に提示される配列表に示されている）およびそれらの代表的なフラグメントを提供する。１つの実施態様においては、本発明は、配列番号１〜391に示されるヌクレオチド配列に対応する一次配列情報の連続群として提供される。
【００１２】
本発明はさらに、配列番号１〜391のヌクレオチド配列に少なくとも95％同一であるヌクレオチド配列を提供する。
【００１３】
配列番号１〜391のヌクレオチド配列、それらの代表的なフラグメント、または配列番号１〜391のヌクレオチド配列に少なくとも95％同一であるヌクレオチド配列が、その使用を容易にするために種々の媒体において提供され得る。本実施態様の１つの適用として、本発明の配列は、コンピューター読み出し可能な媒体に記録される。このような媒体は、磁気記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ）；光学的記憶媒体（例えば、CD-ROM）；電気的記憶媒体（例えば、RAMおよびROM）；およびこれらのカテゴリーのハイブリッド（例えば、磁気／光学的記憶媒体）を包含するが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明はさらに、データ記憶手段に記憶された本明細書中に記載の配列情報を含むシステム、特にコンピューターに基づくシステムを提供する。このようなシステムは、Streptococcus  pneumoniaeゲノムの商業的に重要なフラグメントを同定するために設計される。
【００１５】
本発明の別の実施態様は、特定の構造的または機能的な属性を有するStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントに関する。本発明のStreptococcus  pneumoniaeゲノムのこのようなフラグメントは、ペプチドをコードするフラグメント（以後、オープンリーディングフレームまたはORFという）、作動可能に連結したORFの発現を調整するフラグメント（以後、発現調整フラグメントまたはEMFという）、およびサンプル中のStreptococcus  pneumoniaeの存在を診断するために用いられ得るフラグメント（以後、診断フラグメントまたはDFという）を包含するがこれらに限定されない。
【００１６】
表１〜３に開示するStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメント中のORFおよびORFの５’に見出されるEMFはそれぞれ、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で用いられ得る。例えば、配列は、サンプル中の特定の微生物の存在を検出または決定するための診断プローブまたは増幅プライマーとして、宿主におけるまたはポリペプチド（例えば、本発明のORFによりコードされるポリペプチド、特に薬理学的活性を有するポリペプチド）の産生における遺伝子発現を選択的に制御するために用いられ得る。
【００１７】
本発明はさらに、本発明のStreptococcus  pneumoniaeゲノムの１つ以上のフラグメントを含有する組換え構築物を包含する。本発明の組換え構築物は、Streptococcus  pneumoniaeのフラグメントが挿入されているベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）を含有する。
【００１８】
本発明はさらに、本発明のStreptococcus  pneumoniaeゲノムの任意の単離フラグメントを含有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、高等真核生物宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）、下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）または原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。
【００１９】
本発明はさらに、本発明のORFによりコードされる単離ポリペプチドおよびタンパク質に関する。当業者に周知の種々の方法が、本発明の任意のポリペプチドおよびタンパク質を得るために日常的に利用され得る。例えば、比較的短い、単純なアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドおよびタンパク質が、市販の自動ペプチド合成機を用いて容易に合成され得る。本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、天然にタンパク質を産生する細菌細胞から精製され得る。さらに別の代替法は、本発明のポリペプチドおよびタンパク質をそれらの発現を改変された細胞から精製することである。
【００２０】
本発明はさらに、本発明のStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントのホモログおよび本発明のORFによりコードされるタンパク質のホモログを得る方法を提供する。特に、本明細書に開示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をプローブまたはプライマーとして用い、そしてPCRクローニングおよびコロニー／プラークハイブリダイゼーションのような材料を用いることにより、当業者はホモログを入手し得る。
【００２１】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドおよびタンパク質に選択的に結合する抗体を提供する。このような抗体は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方を包含する。
【００２２】
本発明はさらに、上記抗体を産生するハイブリドーマを提供する。ハイブリドーマは、特定のモノクローナル抗体を分泌し得る不死化細胞株である。
【００２３】
本発明はさらに、本発明のORFの１つまたはそのホモログを発現する細胞由来の試験サンプルを同定する方法を提供する。このような方法は、サンプルがORFまたはそれから産生される産物を含有するか否かを当業者が決定し得る条件下で、試験サンプルを、本発明の１つ以上の抗体とともに、あるいは本発明の１つ以上のDFとともにインキュベートする工程を包含する。
【００２４】
本発明の別の実施態様では、上記アッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。
【００２５】
特に、本発明は、密に詰めた状態で以下を含む１つ以上の容器を収納するための区画されたキットを提供する：(a)本発明の抗体のうちの１つまたはDFの内の１つを含む第１の容器；および(b)以下の内の１つ以上を含む１つ以上の他の容器：洗浄試薬、結合している抗体またはハイブリダイズしたDFの存在を検出し得る試薬。
【００２６】
本発明の単離されたタンパク質を用いて、本発明はさらに、本発明のORFの１つによりコードされるポリペプチドまたはタンパク質に結合し得る薬剤を入手および同定する方法を提供する。特に、このような薬剤は、さらに以下に記載のように、抗体、ペプチド、炭水化物、薬学的薬剤などを包含する。このような方法は、以下の工程を包含する：(a)薬剤を、本発明のORFの１つによりコードされる単離されたタンパク質と接触させる工程；および(b)この薬剤が該タンパク質に結合するか否かを決定する工程。
【００２７】
本発明のStreptococcus  pneumoniaeのゲノム配列は、この微生物をもいい手研究する全ての研究室および種々の商業的目的に対して非常に価値がある。Streptococcus  pneumoniaeゲノムの多くのフラグメントは、GenBankまたはタンパク質データベースに対する類似性の調査により直ちに同定され、そしてStreptococcus  pneumoniae研究者に直ちに価値があり、そしてタンパク質の産生または遺伝子発現の制御について直ちに商業的価値がある。
【００２８】
細菌および他のゲノムの多数のゲノム配列を解明するための方法論および技術は、染色体機構を分析および理解する可能性を大いに増大する。特に、配列決定されたコンティグおよびゲノムが、染色体の構造および機能を分析するための手段を開発するためのモデルを提供する。これには、ゲノムDNAの大きなセグメントの中の遺伝子、調節エレメントの構造、位置、および間隔を同定するための能力、潜在的な工業的応用性を有する遺伝子の同定、および比較ゲノム系統発生学および比較分子系統発生学を行うための能力が包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
実施態様の詳細な説明
本発明は、Streptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントの配列決定およびその配列の分析に基づく。フラグメントを配列決定することにより作成した一次ヌクレオチド配列が、配列番号１〜391に提供される。（本明細書で使用される「一次配列」とは、IUPAC命名システムにより表されるヌクレオチド配列をいう。）
前記のStreptococcus  pneumoniaeポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列に加えて、本発明は、当業者に容易に使用され、分析され、そして解釈され得る形態で配列番号１〜391のヌクレオチド配列、またはそれらの代表的なフラグメントを提供する。
【００３０】
本明細書で使用される「配列番号１〜391に示されるヌクレオチド配列の代表的なフラグメント」とは、公に入手可能なデータベース内に現在表示されていない配列番号１〜391の任意の部分をいう。本発明の好ましい代表的なフラグメントは、Streptococcus  pneumoniaeオープンリーディングフレーム（ORF）、発現調整フラグメント（EMF）およびサンプル中のStreptococcus  pneumoniaeの存在を診断するために使用され得るフラグメント（DF）である。好ましい代表的なフラグメントの制限されない同定例は表１〜３に提供される。以下で詳細に議論するように、ルーチンのクローニング、合成、配列決定およびアッセイ方法と共に、配列番号１〜391および表１〜３に提供される情報により、当業者は、広範な種々のStreptococcus  pneumoniaeタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを包含する、目的の全ての「代表的なフラグメント」をクローン化しそして配列決定し得る。
【００３１】
本明細書に開示される配列番号１〜391の配列は、非常に正確であるが、配列決定技術は完全ではなく、そして比較的希な場合には、本発明のフラグメントまたは配列のさらなる調査は、配列番号１〜391に開示されるヌクレオチド配列に存在するヌクレオチド配列の誤りを明らかにし得る。しかし、一旦本発明が利用可能とされると（すなわち、一旦配列番号１〜391および表１〜３の情報が利用可能となると）、配列番号１〜391中の希な配列決定の誤りを解決することは、当該技術分野の範囲内である。本開示は、任意の記載されるコンティグ群またはそれらの部分が、ルーチンの技術の簡単な適用により容易に得られ得るに十分な配列情報を入手可能にする。このようなポリヌクレオチドのさらなる配列決定は、当該技術分野において至る所で使用されている手動および自動化配列決定方法を用いて同様の手法で実施し得る。ヌクレオチド配列編集ソフトウエアは、公に入手可能である。例えば、Applied  Biosystem（AB）のAutoAssemblerは、ヌクレオチド配列の視覚検査の間に補助として使用され得る。このようなルーチンの技術を使用することにより、潜在的な誤りは、容易に同定され得、次いで正確な配列が、ルーチンの性質のさらなる配列決定の努力を、潜在的な誤りを含む領域に向けることにより、確認され得る。
【００３２】
たとえ配列番号１〜391中の非常に希な配列決定の誤りの全てが訂正されたとしても、得られるヌクレオチド配列は、依然として配列番号１〜391のヌクレオチド配列と少なくとも95％同一であり得、ほぼ全てが配列番号１〜391のヌクレオチド配列と少なくとも99％同一であり得、そして大多数が配列番号１〜391のヌクレオチド配列と少なくとも99.9％同一であり得る。
【００３３】
本明細書中の他で議論するように、本発明のポリヌクレオチドは、DNAをクローニングおよび配列決定するための、周知のおよび標準的手法のルーチンの適用により容易に得られ得る。ライブラリーを得るためおよび配列決定のための詳細な方法は、例えば、以下に提供される。本発明のポリヌクレオチドをクローニングするためおよび得るためのS.  pneumoniaeゲノムDNAを調製するために使用され得る広範な種類のStreptococcus  pneumoniae株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）のような承認された寄託機関から公に入手可能である。本発明は、本明細書中に開示される配列および他の情報により実施可能であるが、本発明の配列表のDNAを提供したS.pneumoniae株は、当業者に便利なように、ATCCに寄託されている。さらに便利なように、同一の株由来のS.pneumoniaeゲノムDNAのライブラリーもまた、ATCCに寄託されている。S.pneumoniae株は、1996年10月10日に寄託され、そして寄託番号55840を与えられ、そしてcDNAライブラリーは、1996年10月11日に寄託され、そして寄託番号97756を与えられた。ライブラリーのゲノムフラグメントは、Sau3A1部分消化により生成された15kb〜20kbのフラグメントであり、そしてそれらは、周知のλ由来のベクターであるλDASH  II（Stratagene,  La,  Jolla,  CA)中のBamHI部位に挿入される。寄託の用意は、本主題における発明者または譲受人のいかなる権利の放棄でもない。
【００３４】
異なるStreptococcus  pneumoniae株由来のゲノムのヌクレオチド配列は、多少異なる。しかし、全てのStreptococcus  pneumoniae株のゲノムのヌクレオチド配列は、対応する部分において、配列番号１〜391に提供されるヌクレオチド配列と少なくとも95％同一である。ほぼ全てが少なくとも99％同一であり、そして大多数が99.9％同一である。
【００３５】
従って、本発明は、さらに、配列番号１〜391のヌクレオチド配列と少なくとも95％、好ましくは99％、そして最も好ましくは99.9％同一であるヌクレオチド配列を、当業者に容易に使用され、分析されそして解釈され得る形態で提供する。
【００３６】
ヌクレオチド配列が、配列番号１〜391のヌクレオチド配列と少なくとも95％、少なくとも99％、または少なくとも99.9％同一であるか否かを決定する方法は、日常的であり、そして当業者に容易に利用可能である。例えば、PearsonおよびLipman、Proc.Natl.Acad.Sci.USA  85:2444(1988)に記載の周知のファスタアルゴリズム（fasta  algorithm）が、ヌクレオチド配列の同一性のパーセントを得るために使用され得る。BLASTNプログラムもまた、互いに比較したポリヌクレオチドの同一性スコアを得るために使用され得る。
【００３７】
コンピューター関連の実施態様
配列番号１〜391に提供されるヌクレオチド配列、それらの代表的なフラグメント、または配列番号１〜391のポリヌクレオチド配列と少なくとも95％、好ましくは少なくとも99％、および最も好ましくは少なくとも99.9％同一であるヌクレオチド配列は、それらの使用を容易にするために種々の媒体中で「提供され」得る。本明細書中で使用されるように、提供されるとは、単離された核酸分子以外の製品について言及し、これは本発明のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１〜391に提供されるヌクレオチド配列）、それらの代表的なフラグメント、または配列番号１〜391のポリヌクレオチドと少なくとも95％、好ましくは少なくとも99％および最も好ましくは少なくとも99.9％同一であるヌクレオチド配列を含む。このような製品は、Streptococcus  pneumoniaeゲノムの大部分およびその一部分（例えば、Streptococcus  pneumoniaeオープンリーディングフレーム（ORF））を、Streptococcus  pneumoniaeゲノムまたはそのサブセットの試験には直接適用できない（それが、天然かもしくは精製された形態で存在するため）手段を用いて、当業者がこの製品を試験することを可能にする形態で提供する。
【００３８】
本発明の実施態様の１つの適用において、本発明のヌクレオチド配列は、コンピューター読み取り可能媒体に記録され得る。本明細書で使用される「コンピューター読み取り可能媒体」とは、コンピューターにより直接読み取られ得、そしてアクセスされ得る任意の媒体をいう。このような媒体には、磁気記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ）；光学記憶媒体（例えば、CD-ROM）；電気記憶媒体（例えば、RAMおよびROM）；ならびにこれらのカテゴリーのハイブリッド（例えば、磁気／光学記憶媒体）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、現在公知のコンピューター読み取り可能媒体が、その上に本発明のヌクレオチド配列を記録しているコンピューター読み取り可能媒体を含む製品を作り出すために、どのように使用され得るかを、容易に理解し得る。同様に、開発され得るさらなるコンピューター読み取り可能媒体がまた、その上に本発明のヌクレオチド配列を記録している類似の製品を作り出すためにどのように使用され得るかは、当業者に明らかである。
【００３９】
本明細書で使用される「記録された」とは、コンピューター読み取り可能媒体に情報を記憶するプロセスをいう。当業者は、本発明のヌクレオチド配列の情報を含む製品を生成するために、コンピューター読み取り可能媒体に情報を記録する、現在公知の任意の方法を容易に採用し得る。種々のデータ記憶構造体が、その上に本発明のヌクレオチド配列を記録しているコンピューター読み取り可能媒体を作り出すために、当業者に利用可能である。データ記憶構造体の選択は、一般的には記憶した情報にアクセスするために選択される方法に基づく。さらに、種々のデータプロセッサープログラムおよびフォーマットが、本発明のヌクレオチド配列の情報をコンピューター読み取り可能媒体に記憶するために使用され得る。配列の情報は、市販の入手可能なソフトウエア（例えば、WordPerfectおよびMicroSoft  Word）でフォーマットされたワードプロセッシングテキストファイルに表され得るかまたは、データベースアプリケーション（例えば、DB2、Sybase、Oracleなど）に記憶された、ASCIIファイルの形態で表され得る。当業者は、その上に本発明のヌクレオチド配列の情報を記録しているコンピューター読み取り可能媒体を得るために、任意の数のデータプロセッサー構造フォーマット（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を容易に適応させ得る。
【００４０】
コンピューターソフトウエアは、公的に入手可能であり、これにより、当業者がコンピューター読み取り可能媒体に提供された配列情報にアクセスすることが可能となる。従って、コンピューター読み取り可能形態に、配列番号１〜391のヌクレオチド配列、それらの代表的なフラグメント、または配列番号１〜391の配列と少なくとも95％、好ましくは少なくとも99％、そして最も好ましくは少なくとも99.9％同一のヌクレオチド配列を提供することにより、本発明は、当業者が広範な種々の目的のために提供された配列情報に日常的にアクセスすることを可能にする。
【００４１】
以下の実施例は、Sybaseシステム上でBLAST（Altschulら、J.Mol.Biol.215:403-410(1990)）およびBLAZE（Brutlagら、Comp.Chem.17:203-207(1993)）検索アルゴリズムを行うソフトウエアが、Streptococcus  pneumoniae由来および他の生物由来の両方のORFまたはタンパク質に対する相同性を含むStreptococcus  pneumoniaeゲノム内のオープンリーディングフレーム（ORF）を同定するためにどのように使用されたかを示す。本明細書中に記載されるORFには、商業的に重要なタンパク質（例えば、発酵反応に使用される酵素）の生産および商業的に有用な代謝産物の生産に有用なStreptococcus  pneumoniaeゲノムの、タンパク質をコードするフラグメントがある。
【００４２】
本発明は、さらにシステム、特に本明細書中に記載される配列情報を含むコンピューターベースのシステムを提供する。このようなシステムは、とりわけStreptococcus  pneumoniaeゲノムの商業的に重要なフラグメントを同定するために設計される。
【００４３】
本明細書中で使用される「コンピューターベースのシステム」とは、本発明のヌクレオチド配列の情報を分析するために使用されるハードウエア手段、ソフトウエア手段、およびデータ記憶手段をいう。本発明のコンピューターベースのシステムの最小のハードウエア手段は、中央演算処理装置（CPU）、入力手段、出力手段、およびデータ記憶手段を備える。当業者は、現在利用可能なコンピューターベースのシステムのいずれかが、本発明における使用に適切であることを、容易に理解し得る。
【００４４】
上記のように、本発明のコンピューターベースのシステムは、その中に記憶された本発明のヌクレオチド配列を有するデータ記憶手段および必要なハードウエア手段ならびに検索手段を支持しかつ行うためのソフトウエア手段を備える。
【００４５】
本明細書中で使用される「データ記憶手段」とは、本発明のヌクレオチド配列情報を記憶し得るメモリ、またはその上に本発明のヌクレオチド配列情報を記録している製品にアクセスし得るメモリアクセス手段をいう。
【００４６】
本明細書で使用される「検索手段」とは、標的配列または標的構造モチーフを、データ記憶手段内に記憶された配列情報と比較するために、コンピューターベースのシステムで実行される１つまたはそれ以上のプログラムをいう。検索手段は、特定の標的配列または標的モチーフにマッチする本発明のゲノム配列のフラグメントまたは領域を同定するために使用される。種々の既知のアルゴリズムが、公に開示され、そして検索手段を実行するための種々の市販のソフトウエアが、本発明のコンピューターベースのシステムに使用されおよび使用され得る。このようなソフトウエアの例には、MacPattern（EMBL）、BLASTNおよびBLASTX（NCBIA）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、相同性検索を実行するための利用可能なアルゴリズムまたは実行ソフトウエアパッケージのいずれかが、本発明のコンピューターベースのシステムにおける使用に適応され得ることを容易に認識し得る。
【００４７】
本明細書中で使用される「標的配列」とは、６個またはそれ以上のヌクレオチドあるいは２個またはそれ以上のアミノ酸の任意のDNAまたはアミノ酸配列であり得る。当業者は、標的配列が長くなれば、標的配列がデータベース中にランダムな事例として存在する可能性が少なくなることを容易に認識し得る。標的配列の最も好ましい配列の長さは、約10個〜100個のアミノ酸、または約30個〜300個のヌクレオチド残基である。しかし、商業的に重要なフラグメント（例えば、遺伝子発現およびタンパク質プロセッシングに関連する配列フラグメント）の検索が、より短い長さであり得ることが十分に認識される。
【００４８】
本明細書中で使用される「標的構造モチーフ」、または「標的モチーフ」とは、任意の合理的に選択される配列または配列の組み合わせをいい、ここでこの配列は、標的モチーフの折りたたみに際し形成される３次元構造に基づいて選択される。当該分野で公知の種々の標的モチーフがある。タンパク質標的モチーフは、酵素活性部位およびシグナル配列を包含するが、これらに限定されない。核酸標的モチーフは、プロモーター配列、ヘアピン構造、および誘導性発現エレメント（タンパク質結合配列）を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
入力手段および出力手段のための種々の構造フォーマットが、本発明のコンピューターベースのシステムにおいて情報を入力および出力するために使用され得る。出力手段のための好ましいフォーマットは、標的配列または標的モチーフに対する多様な相同性の程度を処理してStreptococcus  pneumoniaeゲノム配列のフラグメントをランク付ける。このような提示は、当業者に種々の量の標的配列または標的モチーフを含む配列のランク付けを提供し、そして同定したフラグメントに含まれる相同性の程度を同定する。
【００５０】
種々の比較手段が、標的配列または標的モチーフをデータ記憶手段と比較して、Streptococcus  pneumoniaeゲノムの配列フラグメントを同定するために使用され得る。本実施例において、Altschulら、J.Mol.Biol.215:403-410(1990)に記載されるBLASTおよびBLAZEアルゴリズムを実行するソフトウエアの実行がStreptococcus  pneumoniaeゲノム内のオープンリーディングフレームを同定するために使用された。当業者は、公に入手可能な相同性検索プログラムのいずれかが、本発明のコンピューターベースのシステムのための検索手段として使用され得ることを容易に認識し得る。当業者に公知であり得る適切なシステムもまた、当然、この観点から使用され得る。
【００５１】
図１は、本発明のこの局面の実施態様の例示である、コンピューターシステムのブロック図を提供する。コンピューターシステム102は、バス104に連結したプロセッサー106を備える。メインメモリ108（好ましくはランダムアクセスメモリ、RAMとして実行される）および種々の２次的記憶装置110（例えば、ハードドライブ112および取り外し可能な媒体記憶装置114）もまた、バス104に連結される。取り外し可能な媒体記憶装置114は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、CD-ROMドライブ、磁気テープドライブなどを表し得る。その中に記録されたコントロールロジックおよび／またはデータを含む取り外し可能な記憶媒体116（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、磁気テープなど）は、取り外し可能な媒体記憶装置114に挿入され得る。コンピューターシステム102は、一旦それが取り外し可能な媒体記憶装置114に挿入されると、取り外し可能な媒体記憶装置114から制御ロジックおよび／またはデータを読み取るための適切なソフトウエアを備える。
【００５２】
本発明のヌクレオチド配列は、周知の様式で、メインメモリ108、任意の二次的記憶装置110、および／または取り外し可能な記憶媒体116に記憶され得る。実行中に、ゲノム配列にアクセスおよびゲノム配列をプロセッシングするためのソフトウエア（例えば、検索ツール、比較ツールなど）が、オペレーティングシステム、ハードウエアシステムおよびソフトウエアプログラム（単数または複数）の要求および操作パラメーターに従って、メインメモリ108中に存在する。
【００５３】
生化学的実施態様
本発明の他の実施態様は、Streptococcus  pneumoniaeゲノムの単離フラグメントに関する。本発明のStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントは、ペプチドをコードするフラグメント（本明細書中以下、オープンリーディングフレーム(ORF)）、作動可能に連結されたORFの発現を調整するフラグメント（本明細書中以下、発現調整フラグメント(EMF)）、およびサンプル中のStreptococcus  pneumoniaeの存在を診断するために用いられ得るフラグメント（本明細書中以下、診断用フラグメント(DF)）を含むが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書中で用いられる「単離された核酸分子」または「Streptococcus  pneumoniaeゲノムの単離されたフラグメント」は、組成物に通常含まれている化合物の数をその組成物から減じる精製手段に供した、特定のヌクレオチド配列を保有する核酸分子をいう。特に、この用語は、配列番号１〜391に記載の配列を有する核酸分子、上述のそれらの代表的なフラグメント、および上述のそれらと少なくとも95％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは少なくとも99.9％配列上同一であるポリヌクレオチドをいう。
【００５５】
種々の精製手段が、本発明の単離されたフラグメントを生成するために用いられ得る。これらは、電荷、溶解度、または大きさに基づいて溶液の構成要素を分離する方法を包含するが、これらに限定されない。
【００５６】
１つの実施態様において、Streptococcus  pneumoniae  DNAは、酵素的に剪断されて、長さ15〜20kbのフラグメントを生成し得る。次いで、これらのフラグメントを用いて、以下の実施例に記載のようにそれらをλクローンに挿入することにより、Streptococcus  pneumoniaeライブラリーを生成する。次いで、例えば、ORF（例えば、表１〜３に列挙されるORF）に隣接するプライマーが、配列番号１〜391に示されるヌクレオチド配列情報を用いて生成され得る。次いで、周知の日常的なPCRクローニング技術を用いて、Streptococcus  pneumoniaeゲノムDNAのλDNAライブラリーからORFを単離し得る。従って、配列番号１〜391の利用可能性、表１、２、および３中の情報、および上述の方法を用いる配列番号１〜391の配列の解析により容易に得られ得る情報が考えられると、当業者は、本開示により、本発明のORF含有フラグメントまたは他の核酸フラグメントを単離することが可能になる。
【００５７】
本発明の単離された核酸分子は、一本鎖DNAおよび二本鎖DNA、ならびに一本鎖RNAを含むが、これらに限定されない。
【００５８】
本明細書中で用いられる「オープンリーディングフレーム」(ORF)は、終止コドンを含まないアミノ酸の一連のトリプレットのコドンを意味し、タンパク質に翻訳可能な配列である。
【００５９】
表１、２、および３は、本発明のStreptococcus  pneumoniaeゲノムコンティグにおけるORFを列挙する。これらは、生物特異的二次Markov確率遷移行列を用いるGeneMarkソフトウェアにより、推定コード領域として同定された。他の基準は、周知の解析方法（例えば、本明細書中に考察される方法）に従って、より包括的か、より限定的か、またはより選択的なリストを作成するために用いられ得ることが理解される。
【００６０】
表１は、本発明のStreptococcus  pneumoniaeコンティグにおけるORFを記載し、このORFは、1997年10月にGenbankを通じて入手可能なS.  pneumoniaeヌクレオチド配列に95％またはそれ以上同一（BLAST分析による）である少なくとも50塩基の連続領域に及ぶ。
【００６１】
表２は、本発明のStreptococcus  pneumoniaeコンティグにおけるORFを記載し、このORFは、表１に示されておらず、そしてBLASTP確率スコアが0.01またはそれ以下で、1997年10月にGenbankを通じて入手可能なポリペプチド配列と適合する。
【００６２】
表３は、本発明のStreptococcus  pneumoniaeコンティグにおけるORFを記載し、このORFは、BLASTP分析により、1997年10月にGenbankを通じて入手可能なポリペプチド配列と有意に適合しない。
【００６３】
各表において、第１欄および第２欄は、それぞれコンティグ番号およびコンティグ内のORF番号によりORFを同定している。第３欄は、ORFの最初のヌクレオチド（実際には、ORFの直前にある終止コドンの第１のヌクレオチド）を示し、これは、コンティグ鎖の5'末端から数える。第４欄の「停止（nt)」は、ORFの3'末端を規定する終止コドンの最後のヌクレオチドを示す。
【００６４】
表１および２において、第５欄は、Genbankを通じて入手可能な最も密接に適合する配列についての参照を列挙する。これらの参照番号は、命名(denominators)に精通している当業者により通常用いられる、データベース登録番号である。命名法の記載は、National  Center  for  Biotechnology  Informationから入手可能である。表１および２の第６欄は、適合配列の遺伝子名称を示す。第７欄は、BLAST同一度スコアを提供し、そして第８欄は、ORFと相同遺伝子との比較からのBLAST類似度スコアを示す。そして第９欄は、BLAST同定分析により同定された最高評価セグメント対のヌクレオチドの長さを示す。
【００６５】
表に記載の各ORFは、「開始(nt)」(5')および「終止(nt)」(3')ヌクレオチド位置番号によって規定される。これらの位置番号は、各ORFの境界をいい、そして順鎖または逆鎖がコード鎖であるか、およびリーディングフレームのコード配列が含まれるか否かに関して配向を提供する。「開始」位置は最初の三塩基のヌクレオチドであり、ちょうどORFの5'の開始コドンをコードする、そして「終止」位置は、次のインフレームの終止コドン（すなわち、ORFの3'末端での終止コドン）をコードする最後の三塩基のヌクレオチドである。当業者は、表中に記載の各ORF内の好ましいフラグメントが、最初および最後の３ヌクレオチドを除く線引きされた「開始」から「終止」位置の全体の配列を含む各ORFのフラグメントを含むことを理解する。なぜなら、これらは終止コドンをコードするからである。従って、表中にORFとして示されるが、３つの(3)5'ヌクレオチドおよび３つの(3)3'ヌクレオチドを欠くポリヌクレオチドは、本発明に含まれる。当業者はまた、各ORF内のフラグメントが、ポリペプチドコード配列を含むポリヌクレオチドフラグメントであることが特に好ましいことを理解する。本明細書中で定義される「コード配列」は、最初のインフレームのATG（メチオニンをコードする三塩基）で開始し、そして3'終止コドンをコードする三塩基の前の最後のヌクレオチドで終結するORF内のフラグメントを含む。全体のコード配列を含むフラグメント、およびＮ末端メチオニンについてのコード配列を除いて全体のコード配列を含むフラグメントが好ましい。当業者は、Ｎ末端メチオニンが、翻訳後プロセシングの間にしばしば除去され、そしてATGを欠くポリヌクレオチドが、遺伝的に操作されたタンパク質の産生または使用において有利であり得るＮ末端融合タンパク質の産生を容易にするために使用され得ることを理解する。もちろん、遺伝子コードの縮重のために多くのポリヌクレオチドが所定のポリペプチドをコードし得る。従って、本発明はさらに、本明細書中の表１〜３に記載のORP内のコード配列によってコードされるポリペプチド配列自身をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌレオチドを含む。さらに、前述のポリヌクレオチドに少なくとも95％、好ましくは少なくとも99％、および特に好ましくは、少なくとも99.9％同一のポリヌクレオチドの配列が、本発明によって意図される。
【００６６】
本明細書中上記および他に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはまた、表１〜３に示されるORPによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に少なくとも約95％、好ましくは少なくとも97％、およびなおより好ましくは99％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとして、本発明によって提供される。
【００６７】
２つのポリペプチド配列の同一度パーセントおよび類似度パーセントの概念は、当該分野において十分理解されている。例えば、３つのアミノ酸位置（例えば１位、３位、および５位）が異なる10アミノ酸長の２つのポリペプチドは、70％の同一度パーセントを有するとされる。しかし、同じ２つのポリペプチドが、例えば５位のアミノ酸部分が同一ではなくても「類似」であれば（すなわち、同様の生化学的特徴を有していれば）、80％の類似度パーセントを有すると考えられる。ヌクレオチド配列類似性またはアミノ酸配列類似性の分析のための多くのプログラム（例えば、fastaおよびBLAST）は、特に適合領域の同一度パーセントを出力パラメーターとして列挙する。従って、例えば、本明細書中の表１および２は、各ORFおよびその列挙された関連物の最高評価セグメント対の同一度パーセントを列挙する。相同性検索のために用いられるアルゴリズムおよび基準に関するさらなる詳細を以下に示し、そしてこれは、以下に示す引用により強調される関連文献に記載される。
【００６８】
他の基準は、表中に記載されるタイプのより包括的かつより独占的な表を作成するために用いられ得ることが理解される。当業者が理解するように、狭い範囲および広い範囲の両方の検索が有用である。従って、当業者は、表１〜３に列挙される以外のStreptococcus  pneumoniaeゲノムのコンティグにおけるORFを容易に同定し得る。このORFとしては、例えば、本発明のコンピューターベースシステムを用いて確認可能なORFに加え、重複するかまたは同定ORFの対向鎖によりコードされるORFが挙げられる。
【００６９】
本明細書中で用いられる「発現調整フラグメント」(EMF)は、作動可能に連結されたORFまたはEMFの発現を調整する一連のヌクレオチド分子を意味する。
【００７０】
本明細書中で用いられるように、配列は、EMFの存在により配列の発現が変化する場合、「作動可能に連結された配列の発現を調整する」とされる。EMFは、プロモーター、およびプロモーター調整配列（誘導性エレメント）を包含するが、これらに限定されない。EMFの１つのクラスは、特定の調節因子または生理学的事象に応じて、作動可能に連結されたORFの発現を誘導するフラグメントである。
【００７１】
EMF配列は、表１〜３に示されるORFへの近接度により、Streptococcus  pneumoniaeゲノムのコンティグ内で同定され得る。表１〜３の任意のORFに由来する遺伝子間セグメントまたはその遺伝子間セグメントのフラグメント（長さ約10〜200ヌクレオチド）は、天然に連結されたORF配列で見出されるのと同じ様式で、作動可能に連結されたORFの発現を調整する。本明細書中で用いられる「遺伝子間セグメント」は、本明細書中に記載される２つのORF間にあるStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントをいう。EMFはまた、既知のEMFを本発明のコンピューターベースシステムにおいて標的配列または標的モチーフとして用いて、同定され得る。さらに、これら２つの方法が組み合わされ得、一緒に用いられ得る。
【００７２】
EMFの存在および活性は、EMF捕捉ベクターを用いて確認され得る。EMF捕捉ベクターは、マーカー配列に連結されたクローニング部位を含有する。マーカー配列は、抗生物質耐性または補足栄養要求性因子のような同定可能な表現型をコードする。この同定可能な表現型は、EMF捕捉ベクターが適切な条件下で適切な宿主内に配置されるとき、同定またはアッセイされ得る。上記のように、EMFは、作動可能に連結されたマーカー配列の発現を調整する。種々のマーカー配列のより詳細な記載を以下に示す。EMFであると思われる配列は、EMF捕捉ベクター中のマーカー配列の上流にある１つまたはそれ以上の制限部位の３つのリーディングフレームの全てにおいてクローニングされる。次いで、このベクターは、公知の手順を用いて適切な宿主に形質転換され、そして形質転換宿主の表現型が、適切な条件下で試験される。上記のように、EMFは、作動可能に連結されたマーカー配列の発現を調整する。
【００７３】
本明細書中に用いられる「診断用フラグメント」(DF)は、Streptococcus  pneumoniae配列に選択的にハイブリダイズする一連のヌクレオチド分子を意味する。DFは、Streptococcus  pneumoniaeゲノムのコンティグ内の独特の配列を同定することにより、容易に同定され得る。この同定は、例えば、周知のコンピューター解析ソフトウェアを用いること、および増幅またはハイブリダイゼーション選択性を決定する適切な診断フォーマットにおいて、DF配列からなるプローブまたは増幅プライマーを生成し、そして試験することにより行われる。
【００７４】
本発明の範囲内にある配列は、本明細書中に記載の特定の配列に限定されず、それらの対立遺伝子変異体および種変異体もまた含む。対立遺伝子変異体および種変異体は、配列番号１〜391に示される配列、それらの代表的なフラグメント、または配列番号１〜391と少なくとも95％、好ましくは99％、そして最も好ましくは99.9％同一であるヌクレオチド配列と、同じ種の別の単離体由来の配列とを比較することにより、通常決定され得る。さらに、コドン可変性を適応するために、本発明は、本明細書中に開示の特定のORFと同様に、同じアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。言い換えれば、ORFのコード領域では、１つのコドンの同じアミノ酸をコードする別のコドンへの置換が、明確に意図される。本明細書中に開示される任意の特定の配列は、特定のフラグメント（例えば、ORF）の両方向（すなわち、配列の両鎖）での再配列決定により、読み誤りについて容易にスクリーニングされ得る。あるいは、エラースクリーニングは、問題となるフラグメントの一部または全てをプローブまたはプライマーとして用いることにより単離されたStreptococcus  pneumoniae起源の対応ポリヌクレオチドを配列決定することにより、行われ得る。
【００７５】
本発明の好ましいDFは、表１〜３に示されるORF内の、少なくとも約17、好ましくは少なくとも約20、そしてより好ましくは少なくとも約50の連続するヌクレオチドを含む。最高に好ましいDFは、それらが由来するORFの配列を含むポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。特異的なハイブリダイゼーションは、本明細書中他に規定されるストリンジェントな条件下でも起こる。
【００７６】
表１、２、および３に開示されるStreptococcus  pneumoniaeゲノムのORF、およびORFの5'側に見出されるEMFのそれぞれは、多数の用途においてポリヌクレオチド試薬として用いられ得る。例えば、配列は、サンプルにおける特定の微生物（特にStreptococcus  pneumoniae）の存在を検出するために、診断用プローブまたは診断用増幅プライマーとして用いられ得る。この点において特に好ましいのは、表３のORFのような、他の生物に由来の既に特徴づけられた配列とは適合せず、従ってStreptococcus  pneumoniaeに対して最も高度に選択的であると思われるORFである。また特に好ましいのは、Streptococcus  pneumoniaeの株間を識別するために用いられ得るORF、特に医学的に重要な株（例えば、薬剤耐性株）を識別するORFである。
【００７７】
さらに、本発明のフラグメントは、広範に記載されているが、三重ヘリックス形成、またはアンチセンスDNAまたはRNAを介して、遺伝子発現を制御するために用いられ得る。これらの両方法は、ポリヌクレオチド配列のDNAまたはRNAへの結合に基づく。三重ヘリックス形成は、DNAからのRNA転写の遮断を最適に生じ、一方アンチセンスRNAハイブリダイゼーションはmRNA分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする。本発明の配列からの情報は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチドを設計するために用いられ得る。これらの方法における使用に適したポリヌクレオチドは、通常20〜40塩基の長さであり、そして三重ヘリックス形成については転写に関与する遺伝子の領域、またはアンチセンス阻害についてはmRNA自身に相補的であるように設計される。両技術とも、モデル系において有効であることが示されており、そして必要な技術は周知であり、通例の手順を包含する。三重ヘリックス技術は、一般に、例えば、Leeら,  Nucl.  Acids  Res.  6:3073(1979)；Cooneyら,  Science  241:456  (1988)；およびDervanら,  Science  251:1360  (1991)に記載されている。アンチセンス技術は、一般に、例えば、Okano,  J.  Neurochem.  56:  560  (1991)  およびOligodeoxynucleotide  as  Antisence  Inhibitor  of  Gene  Expression,  CRC  Press,  Boca  Raton,  FL  (1988)に記載されている。
【００７８】
本発明は、本発明のStreptococcus  pneumoniaeゲノムフラグメントおよびコンティグの１つ以上のフラグメントを含む組換え構築物をさらに提供する。本発明の特定の好ましい組換え構築物は、Streptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントが順方向または逆方向で挿入されたベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を含む。本発明のORFの１つを含むベクターの場合では、ベクターは、ORFに作動可能に連結された調節配列（例えばプロモーターを包含する）をさらに含み得る。本発明のEMFを含むベクターについて、ベクターは、EMFに作動可能に連結されたマーカー配列または異種ORFをさらに含み得る。
【００７９】
多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、そして本発明の組換え構築物の生成のために市販される。以下のベクターは、一例として示される。有用な細菌ベクターは、以下を含む：ファージスクリプト、ψX174、pBluescript  SK、pBS  KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（Stratageneより入手可能）；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmaciaより入手可能）。有用な真核生物ベクターは、以下を含む：pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG（Stratageneより入手可能）；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL（Pharmaciaより入手可能）。
【００８０】
プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特に著名な細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、およびtrcを含む。真核生物プロモーターは、CMV最初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来LTR、およびマウスメタロチオネインＩを含む。適切なベクターおよびプロモーターは、十分に当業者の水準内にある。
【００８１】
本発明は、本発明のStreptococcus  pneumoniaeゲノムフラグメントおよびコンティグの単離フラグメントのいずれかを含有する宿主細胞をさらに提供し、ここでこのフラグメントは、公知の方法を用いて宿主細胞に導入されている。宿主細胞はまた、高等真核生物宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）、または原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のORFを含む組換え構築物）は、当該分野で標準的な種々の十分に確立された技術により、宿主中に導入され得る。この技術としては、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE、デキストラン媒介トランスフェクション、およびエレクトロポレーションが挙げられる。これらの技術は、例えば、Davis,  L.ら,  BASIC  METHODS  IN  MOLECULAR  BIOLOGY  (1986)に記載されている。
【００８３】
本発明のStreptococcus  pneumoniaeゲノムフラグメントおよびコンティグのフラグメントの１つを含有する宿主細胞は、単離フラグメントによりコードされる遺伝子産物を生産するために従来の様式で用いられ得る（ORFの場合）か、またはEMFの制御下で異種タンパク質を生産するために用いられ得る。本発明は、本発明の核酸フラグメントまたは本発明の核酸フラグメントの縮重変異体によりコードされる単離ポリペプチドをさらに提供する。「縮重変異体」とは、ヌクレオチド配列が本発明の核酸フラグメント（例えば、ORF）とは異なるが、遺伝コードの縮重によって同一のポリペプチド配列をコードするヌクレオチドフラグメントを意図する。
【００８４】
本発明の好ましい核酸フラグメントは、表２および３に示される、タンパク質をコードするORFである。
【００８５】
当該分野で公知の種々の方法が、本発明の単離ポリペプチドまたはタンパク質のいずれかを得るために利用され得る。最も簡単には、アミノ酸配列は、市販のペプチド合成機を用いて合成され得る。これは、小ペプチドおよびより大きなポリペプチドのフラグメントを生成する際に特に有用である。合成により最も容易に得られ得るこのような短いフラグメントは、例えば、以下にさらに考察するように、天然ポリペプチドに対する抗体を生成する際に有用である。
【００８６】
別の方法では、ポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチドまたはタンパク質を天然に生産する細菌細胞から精製される。当業者は、ポリペプチドおよびタンパク質を単離するための周知の方法を容易に用い得、細菌株により天然に生産されるか、または他の方法により生成される本発明のポリペプチドまたはタンパク質を単離および精製し得る。この点において用いられ得る単離および精製のための方法は、免疫クロマトグラフィー、HPLC、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫アフィニティークロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するように改変された細胞から精製され得る。本明細書中で用いられるように、細胞は、その細胞が、遺伝子操作を通じて、通常生産しないまたは低レベルでしか生産しないポリペプチドまたはタンパク質を生産するようにされる場合、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するように改変されたとされる。当業者は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質の１つを生産する細胞を生成するために、真核生物細胞または原核生物細胞に組換え配列または合成配列のいずれかを導入し発現させるための手順を容易に採用し得る。
【００８８】
任意の宿主／ベクター系が、本発明の１またはそれ以上のORFを発現させるために用いられ得る。これらは、真核生物宿主（例えば、HeLa細胞、CV-1細胞、COS細胞、およびSf9細胞）、ならびに原核生物細胞（E.  coliおよびB.  subtilis）を含むが、これらに限定されない。最も好ましい細胞は、特定のポリペプチドまたはタンパク質を通常発現しない細胞またはポリペプチドまたはタンパク質を天然には低レベルでしか発現しない細胞である。
【００８９】
本明細書中で用いられる「組換え」は、組換え（例えば、微生物性または哺乳動物）発現系由来のポリペプチドまたはタンパク質を意味する。「微生物の」は、細菌または真菌（例えば、酵母）の発現系で作製された組換えポリペプチドまたはタンパク質をいう。産物として、「組換え微生物性」は、天然の内因性物質を含まず、そして関連の天然グリコシル化を伴わないポリペプチドまたはタンパク質を定義する。ほとんどの細菌培養物（例えば、E.  coli）において発現されたポリペプチドまたはタンパク質は、グリコシル化修飾を含まない。酵母において発現されたポリペプチドまたはタンパク質は、哺乳動物細胞において発現されたポリペプチドまたはタンパク質とは異なるグリコシル化パターンを有する。
【００９０】
「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーをいう。一般に、本発明により提供されるポリペプチドおよびタンパク質をコードするDNAセグメントは、Streptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカー、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、微生物性オペロンまたはウイルス性オペロン由来の調節エレメントを含む組換え転写単位において発現され得る合成遺伝子を提供する。
【００９１】
「組換え発現ベヒクルまたはベクター」は、DNA（RNA）配列からポリペプチドを発現させるためのプラスミドまたはファージまたはウイルスまたはベクターをいう。発現ベヒクルは、以下の（１）から（３）のアセンブリを含む転写単位を含み得る：（１）宿主における遺伝子発現に必要な遺伝子調節エレメント、これは、所望のポリペプチドの適切な発現に十分なレベルで転写を開始および維持させるに必要なエレメントを包含する、そして例えば、プロモーター、および必要に応じてエンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを含む；（２）構造配列またはコード配列（これは、mRNAに転写され、そしてタンパク質に翻訳される）；および（３）適切なシグナル（所望のコード領域の開始点で翻訳を開始させ、そしてその末端で翻訳を終結させる）。酵母発現系または真核生物発現系において使用するための構造単位は、好ましくは、リーダー配列（宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にする）を含む。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配列なしで発現される場合、それは、Ｎ末端メチオニン残基を含み得る。この残基は、最終産物を提供する発現組換えタンパク質から後で切断されるかもしれずまたはされないかもしれない。
【００９２】
「組換え発現系」は、組換え転写単位を染色体DNAに安定に組み込んだ宿主細胞または組換え転写単位を染色体外に有する宿主細胞を意味する。細胞は、原核生物または真核生物であり得る。本明細書中で定義される組換え発現系は、発現されるべきDNAセグメントまたは合成遺伝子に連結された調節エレメントを誘導して、異種ポリペプチドまたはタンパク質を発現する。
【００９３】
成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞において発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物由来のRNAを用いてこのようなタンパク質を生産するために用いられ得る。原核生物宿主および真核生物宿主に用いる適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookら,  MOLECULAR  CLONING;A  LABORATORY  MANUAL,  第２版,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  New  York  (1989)に記載されており、この開示の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用されている。
【００９４】
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および選択マーカー（宿主細胞の形質転換を可能にし、例えば、E.  coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.  cerevisiae  TRP1遺伝子である）、および高発現遺伝子由来のプロモーター（プロモーター下流構造配列の転写を導く）を含む。このようなプロモーターは、とりわけ解糖系酵素（例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)）、αファクター、酸性ホスファターゼ、またはヒートショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは、翻訳タンパク質の細胞周辺腔または細胞外培地への分泌を導き得るリーダー配列と、適切な相で組み立てられる。所望により、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現組換え産物の安定化または簡便な精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【００９５】
細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的プロモーターと作動可能な読み取り相にある適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築される。ベクターは、１つまたはそれ以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含み、ベクターの維持を確実にし、そして所望であれば、宿主内での増幅を提供する。
【００９６】
形質転換のための適切な原核細胞宿主は、E.  coli、B.  subtilis、Salmonella  typhimuriumの株、およびPsudomonas属、およびStreptomyces属内の種々の種を包含する。他のものもまた、選択事項として用いられ得る。
【００９７】
代表的であるが非限定的な例として、細菌での使用のための有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322（ATCC  37107）の遺伝エレメントを含む市販のプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌複製起点を含み得る。このような市販のベクターは、例えばpKK223-3（Pharmacia  Fine  Chemicals,  Uppsala,  Swedenから入手可能）およびGEM1（Promega  Biotec,  Madison,  WI,  USAから入手可能）を包含する。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせられる。
【００９８】
適切な宿主株の形質転換および宿主株の適切な細胞密度への増殖後、選択されたプロモーターは、誘導性である場合、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により脱抑制または誘導され、そして細胞は、さらなる期間培養されて、誘導された遺伝子産物を発現する。その後、典型的には、細胞を集め（一般に遠心分離による）、破砕（一般に物理的手段または化学的手段による）して発現タンパク質を放出させ、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
【００９９】
種々の哺乳動物細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現させるために用いられ得る。哺乳動物発現系の例は、サル腎臓線維芽細胞のCOS-7系統（Gluzman,  Cell  23:175  (1981)に記載）、および適合性ベクターを発現させ得る他の細胞系統（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞系統）を包含する。
【０１００】
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、およびまた任意の必要な、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびアクセプター部位、転写終結配列、および5'隣接非転写配列を含む。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えば、SV40複製起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位は、必要とされる非転写遺伝エレメントを提供するために用いられ得る。
【０１０１】
細菌培養物において生産される組換えポリペプチドおよびタンパク質は、通常、細胞ペレットからの最初の抽出、次いで１回またはそれ以上の塩析、水性イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィー工程により単離される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、任意の好都合な方法により破砕され得る。この方法としては、例えば、凍結解凍の繰り返し、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用が挙げられる。必要に応じて、タンパク質再折り畳み工程が、成熟タンパク質の立体配座を完成させる際に用いられ得る。最後に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、最終精製工程のために用いられ得る。
【０１０２】
本発明は、本明細書中に記載されたのと実質的に等価である単離されたポリペプチド、タンパク質、および核酸分子をさらに包含する。本明細書中で用いられる「実質的に等価である」とは、１つまたはそれ以上の置換、欠失、または付加により参照配列とは異なるが、その正味の効果が参照配列と問題の配列との間で不利な機能相違を生じさせない、核酸およびアミノ酸の両方の配列（例えば、変異体配列）をいう。本発明の目的のために、等価な生物学的活性および等価な発現特徴を有する配列は、実質的に等価であるとみなされる。等価物を決定する目的では、成熟配列の短縮は、考慮されるべきではない。
【０１０３】
本発明は、Streptococcus  pneumoniaeの他の株から、本発明のStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントのホモログおよび本発明のORFによりコードされるタンパク質のホモログを得る方法をさらに提供する。本明細書中で用いられるように、Streptococcus  pneumoniaeの配列またはタンパク質は、本発明のStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントの１つまたは本発明のORFの１つによりコードされるタンパク質に対し有意な相同性を有する場合、Streptococcus  pneumoniaeフラグメントのホモログまたはコンティグのフラグメントまたは本発明のORFの１つによりコードされるタンパク質のホモログとして定義される。特に、本明細書中に開示の配列をプローブまたはプライマーとして用い、そしてPCRクローニングならびにコロニー／プラークハイブリダイゼーションのような技術を用いることにより、当業者はホモログを入手し得る。
【０１０４】
本明細書中で用いられるように、２つの核酸分子またはタンパク質は、この２つが85％より高い配列（アミノ酸または核酸）相同性を有する領域を含有する場合、「有意な相同性を有する」とされる。この点において好ましいホモログは、90％より高い相同性を有する配列である。特に好ましいホモログは、93％以上の相同性を有するホモログである。中でも、特に好ましいホモログは、95％以上の相同性を有するホモログである。これらの中で非常に特に好ましいのは、97％以上の相同性を有するホモログであり、そしてこれらの中でさらにより特に好ましいのは、99％以上の相同性を有するホモログである。これらの中で最も好ましいホモログは、99.9％以上の相同性を有するホモログである。相同性の尺度の中で、同一であることが、この点において特に好ましいことが理解される。
【０１０５】
配列番号１〜391において示されるヌクレオチド配列、または配列番号１〜391のヌクレオチド配列と少なくとも95％、特に少なくとも99％、特に少なくとも99.5％同一のヌクレオチド配列に由来する領域特異的プライマーまたはプローブは、DNA合成およびPCR増幅を開始させるために、ならびにホモログをコードするクローン化DNAを含むコロニーを同定するために用いられ得る。本発明のこの局面に適切な方法は周知であり、そして多くの刊行物に詳細に記載されている（例えば、Innisら,  PCR  PROTOCOLS,  Academic  Press,  San  Diego,  CA  (1990)）。
【０１０６】
配列番号１〜391、または配列番号１〜391の配列と上述の同一度を有するヌクレオチド配列に由来するプライマーを用いる場合、当業者は、高いストリンジェンシー条件（例えば、6X  SSPCおよび50％ホルムアミド中で50〜60℃でアニールし、そして0.5X  SSPC中で50〜65℃で洗浄する）を用いることにより、プライマー配列に対して75％より高い相同性の配列のみが増幅されることを認識する。より低いストリンジェンシー条件（例えば、5X  SSPCおよび40〜45％ホルムアミド中で35〜37℃でハイブリダイズし、そして0.5X  SSPC中で42℃で洗浄する）を用いることにより、プライマー配列に対して40〜45％より高い相同性の配列もまた増幅される。
【０１０７】
配列番号１〜391、または配列番号１〜391に配列と上述の同一度を有するヌクレオチド配列に由来するDNAプローブを、コロニー／プラークハイブリダイゼーションのために用いる場合、当業者は、高いストリンジェンシー条件（例えば、5X  SSPCおよび50％ホルムアミド中で50〜65℃でハイブリダイズし、そして0.5X  SSPC中で50〜65℃で洗浄する）を用いることにより、プローブに対して90％より高い相同性の領域を有する配列が得られ得、より低いストリンジェンシー条件（例えば、5X  SSPCおよび40〜45％ホルムアミド中で35〜37℃でハイブリダイズし、そして0.5X  SSPC中で42℃で洗浄する）を用いることにより、プローブに対して35〜45％より高い相同性の領域を有する配列が得られることを認識する。
【０１０８】
任意の生物は、その生物が、このようなタンパク質を天然に発現し、そしてそれをコードする遺伝子を含有する限り、本発明のホモログの供給源として用いられ得る。ホモログを単離するための最も好ましい生物は、Streptococcus  pneumoniaeに密接に関連している細菌である。
【０１０９】
本発明の組成物の使用例  
表１および２に提供する各ORFは、公知の遺伝子またはポリペプチドに対する相同性により機能で同定される。その結果、当業者は、本発明のポリペプチドを、ポリペプチドの推定同定のタイプに一致して、商業目的、治療目的、および工業目的のために使用し得る。このような同定によって、当業者は、Streptococcus  pneumoniae  ORFを使用して、同定が行われる公知のタイプ配列と同様の様式で、例えば、特定の糖供給源を発酵するか、または特定の代謝産物を産生することが可能になる。本発明のこの局面の例示となる種々の総説が利用可能であり、以下の酵素の工業的利用に対する総説が挙げられる。例えば、BIOCHEMICAL  ENGINEERING  AND  BIOTECHNOLOGY  HANDBOOK、第２版、Macmillan  Publications,  Ltd.  NY  (1991)  およびBIOCATALYSIS  IN  ORGANIC  SYNTHESIS,  Tramperら編、Elsevier  Science  Publishers,  Amsterdam,  The  Netherlands  (1985)。本発明のこの局面および他の局面を例示する多様な使用例を、以下に考察する。
【０１１０】
１．生合成酵素
中間代謝および高分子代謝、小分子の生合成、細胞プロセスおよび他の機能に関与する触媒反応を媒介するのに関与するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、代謝の中間産物の分解に関与する酵素、中心中間代謝に関与する酵素、呼吸（好気呼吸的および嫌気呼吸の両方）に関与する酵素、発酵に関する酵素、ATPプロトンモーター力変換（proton  motor  force  conversion）に関与する酵素、広範な調節機能に関与する酵素、アミノ酸合成に関与する酵素、ヌクレオチド合成に関与する酵素、補因子およびビタミン合成に関与する酵素を包含し、工業的生合成のために使用され得る。
【０１１１】
Streptococcus  pneumoniaeに存在する種々の代謝経路は、絶対的な栄養要求性に基づいて、ならびに表１〜３および配列番号１〜391に同定される種々の酵素を試験することによって同定され得る。
【０１１２】
特に重要なものは、中間代謝産物の分解および非高分子代謝に関与するポリペプチドである。このような酵素としては、アミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびカタラーゼが挙げられる。
【０１１３】
タンパク質分解酵素は、別のクラスの商業的に重要な酵素である。タンパク質分解酵素は、亜麻および他の植物繊維を加工することを含む多くの工業プロセスにおいて、果汁の抽出、清澄化、および脱ペクチン化（depectinization）において、植物油の抽出において、ならびに単細胞性の果実を与えるための果実および植物の浸軟において、使用が見出される。食物工業において使用されるタンパク質分解酵素の詳細な総説は、Romboutsら、Symbiosis  21:79  (1986)  およびVoraganら、BIOCATALYSTS  IN  AGRICULTURAL  BIOTECHNOLOGY,  Whitakerら編、American  Chemical  Society  Symposium  Series  389:  93  (1989)に提供される。
【０１１４】
糖代謝は、Streptococcus  pneumoniaeの一次代謝の重要な局面である。糖（例えば、特に、グルコース、ガラクトース、フルクトース、およびキシロース）分解に関与する酵素は、工業的発酵において使用され得る。商業的な視点から重要な糖転換酵素のいくつかは、グルコースイソメラーゼのような糖イソメラーゼを含む。他の代謝酵素は、ケトグロン酸（KGA）を生成するグルコースオキシダーゼのように商業的使用を見出している。KGAは、Kruegerら、Biotechnology  6(A)、Rhineら編、Verlag  Press,  Weinheim,  Germany  (1984）に記載されるような、Reichstein's手順を用いるアスコルビン酸の商業的生産における中間産物である。
【０１１５】
グルコースオキシダーゼ（GOD）は、市販されており、そして精製形態および固定化形態でビールの脱酸素化のために使用されている。例えば、Hartmeirら、Biotechnology  Letters  1:21  (1979）を参照のこと。最も重要なGODの適用は、グルコン酸の工業規模の発酵である。界面活性剤、布地、革、写真、医薬、食物、飼料、およびコンクリート工業において使用されるグルコン酸の市場。例えば、Bigelisら、GENE  MANIPULATIONS  AND  FUNGIの357頁〜；Benettら編、Academic  Press,  New  York  (1985)に記載されている。工業的適用に加えて、GODは、近年、スターチおよびセルロースの水和物（hydrosylates）由来のシロップを分析するバイオテクノロジーにおいて、体液中のグルコースの定量測定のための薬剤における適用を見出している。この適用は、例えば、Owusuら、Biocheml.  et  Biophysica.  Acta.  872:83  (1986）に記載されている。
【０１１６】
今日、世界で使用されている主要な甘味料は、テンサイおよびサトウキビ由来の糖である。工業的酵素の分野において、グルコースイソメラーゼプロセスは、今日、市場において最も大きな拡張を示す。初めに、可溶性酵素が使用され、その後、固定化酵素が開発された（Kruegerら、Biotechnology,  The  Textbook  of  Industrial  Microbiology,  Sinauer  Associated  Incorporatred,  Sunderland,  Massachusetts  (1990)）。今日、グルコースから生成された高フルクトースシロップの使用は、固定化酵素を用いる断然最大の工業的商業である。これらの酵素の工業的使用の総説は、Jorgensen,  Starch  40:307  (1988)により提供されている。
【０１１７】
プロテイナーゼ（例えば、アルカリセリンプロテイナーゼ）は、界面活性剤添加物として使用され、従って工業分野で使用される最も大量の微生物酵素の規模の容量の１つを示す。それらが工業的に重要であるので、工業的プロセスにおけるこれらの酵素の使用に関する公開情報および未公開情報が非常に多く存在する。（Faultmanら、Acid  Proteases  Structure  Function  and  Biology,  Tang,  J.,編、Plenum  Press,  New  York  (1977)  およびGodfreysら、Industrial  Enzymes,  MacMillan  Publishers,  Surrey,  UK  (1983）およびHepnerら、Report  Industrial  Enzymes  by  1990,  Hel  Hepner  &  Associates,  London（1986））。
【０１１８】
別のクラスの本発明の商業的に使用できるタンパク質は、例えば、Macraeら、Philosophical  Transactions  of  the  Chiral  Society  of  London  310：227（1985）およびPoserke,  Journal  of  the  American  Oil  Chemist  Society）  61:1758  (1984)に記載されている微生物のリパーゼである。リパーゼの主な使用は、脂質および油脂工業における、容易に入手可能なトリグリセリドのリパーゼで触媒される分子内エステル化を用いた中和グリセリドの産生についてである。リパーゼの適用としては、洗浄手順の過程における織物からの脂質の除去を容易にするための界面活性添加物としての使用が挙げられる。
【０１１９】
複雑な有機分子の合成における重要な工程に対する触媒としての酵素の使用、および特に微生物酵素の使用は、非常に速い速度で流行を獲得している。最も重要な１つの分野は、キラルな中間産物の調製である。キラルな中間産物の調製は、広い範囲の合成化学者、特に新規な医薬、農薬、芳香剤、および調味料の調製に従事する合成化学者の関心の的である。（Daviesら、Recent  Advances  in  the  Generation  of  Chiral  Intermediates  Using  Enzymes,  CRC  Press,  Boca  Raton,  Florida  (1990)を参照のこと）。酵素により触媒される以下の反応は、有機化学者の関心の的である：カルボン酸エステル、リン酸エステル、アミド、およびニトリルの加水分解、エステル化反応、トランスエステル化反応、アミドの合成、アルカノンおよびオキソアルカネートの還元、アルコールのカルボニル化合物への酸化、スルフィドのスルホキシドへの酸化、およびアルドール反応のような炭素結合形成反応。
【０１２０】
本発明のORFの１つによりコードされる酵素の使用を、生体内変換および有機合成について考慮する場合、単離された酵素とは対照的に微生物を用いる利点およびそれぞれの不利益を考慮する必要が時々ある。一方では全細胞系を用い、または他方では単離された部分的に精製された酵素を用いる損得は、Budら、Chemistry  in  Britain  (1987)、127頁により詳細に記載されている。
【０１２１】
アミノトランスフェラーゼは、アミノ酸の生合成および代謝に関与する酵素であり、アミノ酸の触媒的な生産に有用である。酵素系に基づく微生物の使用の利点は、アミノトランスフェラーゼ酵素が、L-アミノ酸のみの立体選択的合成を触媒し、そして一般に、一様に高い触媒速度を保持することである。アミノ酸生産のためにアミノトランスフェラーゼを使用する記載は、Roselle-David,  Methods  of  Enzymology  136  :479  (1987）によって提供されている。
【０１２２】
本発明のORFによってコードされる有用なタンパク質の別のカテゴリーは、核酸合成、核酸修復、および核酸組換えに関与する酵素を包含する。
【０１２３】
２．抗体の生成
本明細書中で記載するように、本発明のタンパク質およびそれらの相同物は、現在、他のタンパク質に適用されている当該分野において公知の多様な手順および方法において使用され得る。本発明のタンパク質は、タンパク質に選択的に結合する抗体を生成するために、さらに使用され得る。このような抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体のフラグメント、およびヒト化形態のいずれかであり得る。
【０１２４】
本発明は、本発明のタンパク質の１つに選択的に結合する抗体、およびこれらの抗体を産生するハイブリドーマをさらに提供する。ハイブリドーマは、特異的なモノクローナル抗体を分泌し得る不死化細胞株である。
【０１２５】
一般的に、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに所望の抗体を産生し得るハイブリドーマを調製する技術（Campbell,  A.  M.,  MONOCLONAL  ANTIBODY  TECHNOLOGY：LABORATORY  TECHNIQUES  IN  BIOCHEMISTRY  AND  MOLECULAR  BIOLOGY,  Elsevier  Science  Publishers,  Amsterdam,  The  Netherlands  (1984)；St.  Grothら、J.Immunol.  Methods  35  :  1-21  (1980)、KohlerおよびMilstein、Nature  256:495-497  (1975)）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、Immunology  Today  ４:72（1983）、Coleら、MONOCLONAL  ANTIBODIES  AND  CANCER  THERAPY,  Alan  R.  Liss,  Inc.  (1985）の77-96頁）は、当該分野において周知である。抗体を産生することが公知の任意の動物（マウス、ウサギなど）を、偽遺伝子ポリペプチドで免疫し得る。免疫のための方法は、当該分野において周知である。このような方法は、ポリペプチドの皮下注入および腹腔内注入を包含する。当業者は、免疫に使用される本発明のORFによってコードされるタンパク質の量が、免疫される動物、ペプチドの抗原性、および注入の部位に基づいて変化することを理解する。
【０１２６】
免疫原として使用されるタンパク質は、タンパク質の抗原性を増加するために
アジュバント中で修飾および投与され得る。タンパク質の抗原性を増加させる方法は、当該分野において周知であり、そして抗原と異種タンパク質（例えば、グロブリンまたはガラクトシダーゼ）との結合、または免疫の間のアジュバントの封入によることを包含するが、これらに限定されない。
【０１２７】
モノクローナル抗体については、免疫動物由来の脾臓細胞が取り出され、ミエローマ細胞（例えば、SP2/0-Ag14ミエローマ細胞）と融合されて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞となる。
【０１２８】
当該分野において周知の多くの方法の任意の１つが、所望の特徴を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定するために使用され得る。これらは、ELISAアッセイを用いるハイブリドーマのスクリーニング、ウェスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイ（Lutzら、Exp.  Cell  Res.  175:109-124  (1988)）を包含する。
【０１２９】
所望の抗体を分泌するハイブリドーマは、クローン化され、そして当該分野で公知の手順（Campbell,  A.M.,  Monoclonal  Antibody  Technology：Laboratory  Techniques  in  Biochemistry  and  Molecular  Biology,  Elsevier  Science  Publishers  Amsterdam,  The  Netherlands  (1984)）を用いてクラスおよびサブクラスが決定される。
【０１３０】
単鎖抗体の産生について記載されている技術（米国特許第4,946,778号)は、本発明のタンパク質に対する単鎖抗体を産生するために適応され得る。
【０１３１】
ポリクローナル抗体については、抗体を含有する抗血清は、上記の手順の１つを用いて、免疫した動物から単離され、そして所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングされる。
【０１３２】
本発明は、さらに、検出可能な標識形態で上記抗体を提供する。抗体を、放射性同位体、親和標識（例えば、ビオチン、アビジンなど）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、FITCまたはローダミンなど）、常磁性原子などの使用によって直接標識し得る。このような標識を達成するための手順は、当該分野において周知であり、例えば、Sternbergerら、J.  Histochem.  Cytochem.  18:315  (1970)；Bayer,  E.  A.ら、Meth.  Enzym.  62:308(1979)；Engval,  E.ら、Immunol.  109:129  (1972)；Goding,  J.  W.  J.  Immunol.  Meth.  13:215  (1976））を参照のこと。
【０１３３】
本発明の標識抗体を、インビトロ、インビボ、およびインサイチュアッセイに使用し、Streptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントが発現される細胞または組織を同定し得る。
【０１３４】
本発明は、さらに、固体支持体上に固定化された上記抗体を提供する。このような固体支持体の例としては、プラスチック（例えば、ポリカーボネート）、複雑な炭水化物（例えば、アガロースおよびセファロース(sepharose)）、アクリル樹脂（例えば、ポリアクリルアミド）、およびラテックスビーズが挙げられる。抗体をこのような固体支持体に結合させる技術は、当該分野において周知である（Weir,  D.M.ら、「Handbook  of  Experimental  Immunology」第４版、Blackwell  Scientific  Publications,  Oxford,  England,  第10章  (1986)；Jacoby,  W.D.ら、Meth.  Enzym.  34  Academic  Press,  N.Y.  (1974））。本発明の固体化抗体は、インビトロ、インビボ、およびインサイチュアッセイに、ならびに本発明のタンパク質のイムノアフィニティー精製に使用され得る。
【０１３５】
３．診断アッセイおよびキット
本発明は、さらに試験サンプル中での本発明のORFの１つ、またはそれらの相同物の発現を、本発明のDF、または抗体の１つを用いて、同定する方法を提供する。
【０１３６】
詳細には、このような方法は、試験サンプルを、本発明の１つ以上の抗体、または１つ以上のDFとインキュベートする工程、およびDFまたは抗体の試験サンプル内の成分への結合をアッセイする工程を包含する。
【０１３７】
DFまたは抗体と試験サンプルとをインキュベートする条件は、変化する。インキュベーション条件は、アッセイに用いられる形式、用いる検出方法、およびアッセイにおいて使用されるDFまたは抗体のタイプまたは性質に依存する。当業者には、一般的に利用可能なハイブリダイゼーション、増幅、または免疫学的アッセイ形式の任意の１つが、本発明のDFまたは抗体を用いることに容易に適応され得ることを認識する。このようなアッセイの例は、Chard,  T.,  An  Introduction  to  Radioimmunoassay  and  Related  Techniques,  Elsevier  Science  Publishers,  Amsterdam,  The  Netherlands  (1986)；Bullock,  G.R.ら、Techniques  in  Immunocytochemistry,  Academic  Press,  Orlando,  FL  第１巻（1982）、第２巻（1983）、第３巻（1985)；Tijssen,  P.,  Practice  and  Theory  of  Enzyme  Immunoassays：Laboratory  Techniques  in  BiochemistryおよびMolecular  Biology,  Elsevier  Science  Publishers,  Amsterdam,  The  Netherlands  (1985）に見出され得る。
【０１３８】
本発明の試験サンプルは、細胞、細胞のタンパク質抽出物、または細胞の膜抽出物、または生体液（例えば、疸、血液、血清、血漿、または尿）を含む。上記の方法において使用される試験サンプルは、アッセイ形式、検出方法の性質、およびアッセイされるべきサンプルとして使用される組織、細胞、または抽出物に基づいて変化する。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製するための方法は、当該分野において周知であり、そして利用する系と適合するサンプルを得るために容易に適応され得る。
【０１３９】
本発明の別の実施態様において、本発明のアッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。
【０１４０】
具体的には、本発明は、密封容器中に、（a）本発明のDFまたは抗体の１つを含有する第１の容器；および（b）洗浄試薬、結合DFまたは結合抗体の存在を検出し得る試薬を１つ以上含有する１つ以上の他の容器を含む１つ以上の容器を受けるための区分されたキットを提供する。
【０１４１】
詳細には、区分されたキットは、別々の容器中に試薬を含む任意のキットを含む。このような容器は、小さなガラス容器、プラスチック容器、またはプラスチック片および紙片を含む。このような容器で、一方の区分から他方の区分に試薬を効率的に移すことが可能になり、その結果サンプルと試薬が相互に混入せず（cross-contaminated）、そして各容器の薬剤および溶液は、一方の区分から他方の区分に定量形式で添加され得る。このような容器は、試験サンプルを受け入れる容器、アッセイにおいて使用される抗体を含む容器、洗浄試薬（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、Tris緩衝液など）を含む容器、および結合抗体または結合DFを検出するために使用される試薬を含む容器を含む。
【０１４２】
検出試薬のタイプは、標識核酸プローブ、標識二次抗体、あるいは、一次抗体が標識されている場合、標識抗体と反応し得る酵素試薬または抗体結合試薬を含む。当業者は、本発明の開示されるDFおよび抗体が、当該分野において周知の確立されたキット形式の１つにキットに容易に組み込まれ得ることが、容易に認識する。
【０１４３】
４．結合剤についてのスクリーニングアッセイ
本発明の単離されたタンパク質を用いて、本発明はさらに、本発明のORFの１つによってコードされるタンパク質、またはフラグメントならびに本明細書中で記載するStreptococcus  pneumoniaeフラグメントおよびコンティグの１つに結合する薬剤を得るための方法および同定するための方法を提供する。
【０１４４】
一般的に、このような方法は以下の工程を包含する：
（ａ）薬剤を、本発明のORFの１つによってコードされる単離されたタンパク質、または単離されたStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントと接触させる工程；および
（ｂ）薬剤が上記タンパク質または上記フラグメントに結合するか否かを決定する工程。
【０１４５】
上記アッセイにおいてスクリーニングされた薬剤は、ペプチド、炭水化物、ビタミン誘導体、または他の製剤であり得るがこれらに限定されない。薬剤は、ランダムに選択およびスクリーニングされ得るか、あるいはタンパク質モデリング技術を用いて合理的に選択または設計され得る。
【０１４６】
ランダムスクリーニングについては、薬剤（例えば、ペプチド、炭水化物、製剤など）は、ランダムに選択され、そして本発明のORFによってコードされるタンパク質に結合するそれらの能力についてアッセイされる。
【０１４７】
あるいは、薬剤は、合理的に選択または設計され得る。本明細書で使用されるように、薬剤は、薬剤が特定のタンパク質の配置に基づいて選択される場合、「理論的に選択または設計される」という。例えば、当業者は、現在利用可能な手順を、合理的に設計された抗ペプチドペプチド（例えば、Hurbyら、Application  of  Synthetic  Peptides：Antisense  Peptides,  「Synthetic  Peptides,  A  User's  Guide,  W.H.Freeman,  NY（1992),  289-307頁、およびKaspczakら、Biochemistry  28：9230-8（1989）を参照のこと）、製剤などを生成するために特異的なペプチド配列に結合し得るペプチド、または製剤などを生成することに容易に適応させ得る。
【０１４８】
前述に加えて、本発明の薬剤の１つのクラスは、広範に記載されるように、本発明のORFまたはEMFの１つへの結合により遺伝子発現を制御するために使用され得る。上記のように、このような薬剤は、ランダムにスクリーニングまたは合理的に設計／選択され得る。ORFまたはEMFを標的化することで当業者は、配列特異的な薬剤またはエレメント特異的な薬剤を設計して発現制御の同じEMFに依存する単一のORFまたは複数のORFのいずれかの発現を調節することが可能になる。
【０１４９】
DNA結合薬剤の１つのクラスは、ハイブリダイズするかまたはDNAまたはRNAへの結合により三重ヘリックスを形成する塩基残基を含む薬剤である。このような薬剤は、典型的なリン酸ジエステル、リボ核酸骨格に基づき得、または塩基付着能力を有する種々のスルフヒドリル誘導体またはポリマー誘導体であり得る。
【０１５０】
これらの方法における使用に適切な薬剤は、通常、20〜40塩基を含み、そして転写に関与する遺伝子の領域（三重ヘリックス。Leeら、Nucl.Acids  Res.  6  :3073  (1979)；Cooneyら、Science  241:456  (1988)；およびDervanら、Science  251：1360（1991）を参照のこと）、またはmRNA自体（アンチセンス。Okano,  J.Neurochem.  56:560  (1991)；Oligodeoxynucleotides  as  Antisense  Inhibitors  of  Gene  Expression,  CRC  Press,  Boca  Raton,  FL  (1988)）に相補的になるように設計される。三重ヘリックス形成は、最適にはDNAからのRNAの転写の阻止（shut-off）を生じ、一方アンチセンスRNAハイブリダーゼーションは、mRNA分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする。両方の技術が、モデル系において有効であることが示されている。本発明の配列中に含まれる情報は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチド、ならびに他のDNA結合薬剤を設計するために使用され得る。
【０１５１】
５．薬学的組成物およびワクチン
本発明はさらに、Staphylococcus  pneumoniaeまたは別の関連生物体の、インビボまたはインビトロでの、増殖および病原性を調節するために使用される製剤を提供する。本明細書で使用されるように、「製剤」は、薬学的組成物を提供するための公知の技術を用いて処方され得る物質の組成物として定義される。本明細書で使用されるように「本発明の製剤」は、本発明のORFによってコードされるタンパク質に由来する製剤、または本明細書で記載のアッセイを用いて同定される薬剤をいう。
【０１５２】
本明細書中で使用されるように、製剤は、製剤が問題の生物体の増殖速度、分裂速度、または生存力を減少する場合、「Streptococcus  pneumoniaeまたは関連生物体の、インビボおよびインビトロでの、増殖および病原性を調節する」といわれる。本発明の製剤は、多くの様式で生物体の増殖および病原性を調節し得るが、しかし、作用の基礎となる機構を理解することは、本発明の製剤の使用の実施のために必要ではない。いくつかの製剤は、重要なタンパク質に結合し、従ってタンパク質の生物学的活性をブロックすることにより増殖または病原性を調節するが、別の薬剤は生物体の外表面の成分に結合し得、付着をブロックするかまたは身体の天然の免疫系にさらに作用しやすい生物体を与え得る。あるいは、製剤は、本発明のORFの１つによってコードされるタンパク質を含み得、そしてワクチンとして作用し得る。外膜成分に基づくワクチンの開発および使用は、当該分野において周知である。
【０１５３】
本明細書中で使用されるように、「関連生物体」は、その増殖が、本発明の製剤の１つによって調節され得る任意の生物体をいう広い用語である。一般的に、このような生物体は、ワクチンとして使用される製剤またはタンパク質の標的であるタンパク質の相同物を含む。このように、関連生物体は、細菌である必要はなく、真菌類またはウイルス病原体であり得る。
【０１５４】
本発明の製剤および組成物は、簡便な様式（例えば、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻内、または皮内経路）で投与され得る。薬学的組成物は、特定の徴候の処置および／または予防に有効である量で投与される。一般的に、薬学的組成物は、少なくとも約１mg/kg体重の量で投与され、そしてほとんどの場合、薬学的組成物は、１日当たり約１g／kg体重を超えないで投与される。ほとんどの場合において、投薬量は、投与経路、徴候などを考慮して、毎日、約0.1mg/kg〜約10g/kg体重である。
【０１５５】
本発明の薬剤は、天然の形態で使用され得るか、または化学誘導体を形成するために修飾され得る。本明細書中で使用されるように、分子は、通常は分子の一部分ではない付加的な化学部分を含有する場合、別の分子の「化学誘導体」であるといわれる。このような部分は、分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善し得る。あるいは、この部分は分子の毒性を減少し得、分子の任意の非所望の副作用を排除または弱めるなどし得る。このような効果を媒介し得る部分は、他の情報源の中でも本明細書中でいずれかに引用されるREMINGTON'S  PHARMACEUTICAL  SCIENCES  (1980)に開示されている。
【０１５６】
例えば、このような部分は、機能的誘導体の免疫学的特徴（例えば、所定の抗体に対する親和性）を変化し得る。免疫調節活性におけるこのような変化は、適切なアッセイ（例えば、競合型イムノアッセイ）によって測定される。このようなタンパク質特性（例えば、酸化還元安定性、熱安定性、生物学的半減期、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、またはキャリアとともにまたはマルチマーへ凝集する傾向）の改変はまた、この方法において達成され得、そして当業者に周知の方法によってアッセイされ得る。
【０１５７】
本発明の薬剤の治療効果は、任意の適切な手段（例えば、吸入、静脈内、筋肉内、皮下、腸、または非経口）によって患者に薬剤を提供することによって得られ得る。生物の増殖が、制御されるべき血液および組織内で有効濃度を達成するように、本発明の薬剤を投与することが好ましい。有効な血液濃度を達成するために、好ましい方法は、注入によって薬剤を投与することである。投与は、連続注入、または単回または複数回注入によって行われ得る。
【０１５８】
本発明の薬剤の１つを患者に与える際、投与される薬剤の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、総合的医療条件、以前の治療歴などのような因子に依存して変わる。一般に、レシピエントに約１pg/kg〜10mg/kg(患者の体重)の範囲の薬剤の用量を与えるのが好ましいが、より低いまたはより高い用量が投与され得る。治療に有効な用量は、本発明の薬剤または別の薬剤の組み合わせを使用することにより、減少し得る。
【０１５９】
本明細書中で使用されるように、２つまたはそれ以上の化合物または薬剤は、(1)各化合物の生理学的効果、または(2)各化合物の血清濃度のいずれかが同時に測定され得る場合、互いに「組み合わせて」投与されるといわれる。本発明の組成物は、他の薬剤の投与と同時に投与され得るか、その前に投与され得るか、またはその後で投与され得る。
【０１６０】
本発明の薬剤は、レシピエント被験者に標的生物の増殖速度(上記のように定義されている)を低下させるに十分な量で与えられることが意図される。
【０１６１】
本発明の薬剤の投与は、「予防用」または「治療用」のいずれかのためであり得る。予防用で投与される場合、この薬剤は、生物増殖を表す任意の症候の前に投与される。この薬剤の予防用の投与は、結果として起こるいずれの感染の発症の速度を防ぐか、弱めるか、または減少させるのに有用である。治療用に投与される場合、この薬剤は感染の症候の発症(または発症後にすぐ)時に与えられる。この化合物の治療用の投与は、感染の病理的症候を弱めるに役に立つか、または回復の速度を増加させるに役立つ。
【０１６２】
本発明の薬剤は、薬学的に受容可能な形態および治療用に有効な濃度で被験体、例えば、哺乳類、または患者に投与される。組成物は、その投与がレシピエント患者に耐えられ得るならば、「薬学的に受容可能」であるといわれる。投与される量が生理学的に有意であるならば、このような薬剤は「治療的に有効な量」で投与されるといわれる。薬剤は、その存在がレシピエント患者の生理学に検出可能な変化を生じるなら、生理学的に有意である。
【０１６３】
本発明の薬剤は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って処方され得、それによって、これらの物質、またはこれらの機能的誘導体は、薬学的に受容可能なキャリアビヒクルと混合して組み合わせられる。他のヒトタンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)を含む適切なビヒクルおよびそれらの処方は、例えば、REMINGTON'S  PHARMACEUTICAL  SCIENCES,  第16版、Osol,  A.編、Mack  Publishing,  Easton  PA(1980)に記載されている。有効な投与に適切な薬学的に受容可能な組成物を形成するために、このような組成物は、適切な量のキャリアビヒクルと共に有効量の１つ以上の本発明の薬剤を含有する。
【０１６４】
さらなる薬学的な方法は、作用の継続期間を制御するために使用され得る。制御放出調製物は、１種以上の本発明の薬剤と複合体化するか、または吸収するポリマーの使用により達成され得る。制御される送達は、高分子(例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはプロタミン、硫酸塩)を用いて処方し、そして処方中の高分子および薬剤の濃度を調整することを含む種々の周知の技術により、および放出の所望の時間経過をなし遂けるために操作され得る取り込み方法の適切な使用により、なし遂けられ得る。制御放出調製物によって作用の継続期間を制御する別の可能な方法は、本発明の薬剤をポリマー性物質(例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ(乳酸)またはエチレンビニルアセテートコポリマー)の粒子に取り込むことである。あるいは、これらの薬剤をポリマー性粒子に取り込む代わりに、これらの物質は、例えば、コアセルベーション技術により、または例えばヒドロメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセルとそれぞれ界面重合により調製したマイクロカプセルに取り入れ、またはコロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)に、またはマクロエマルジョンに取り入れられ得る。このような技術は、REMINGTON'S  PHARMACEUTICAL  SCIENCES(1980)に開示されている。
【０１６５】
本発明はさらに、本発明の薬学的組成物の１種以上の成分で充填される１種以上の容器を含む薬学的なパックまたはキットを提供する。このような容器と関連するのは、薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を統制する政府機関によって定められた形態の通知であり、この通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の機関による認可を反映する。
【０１６６】
さらに、本発明の薬剤は他の治療用化合物と組み合わせて使用され得る。
【０１６７】
６．メガ塩基のDNA配列決定のためのショットガンアプローチ
本発明はさらに、大きな配列がランダムなショットガンアプローチを用いて配列決定され得ることを示す。以下の実施例に詳細に記載されているこの手順は、配列決定するプロトコルの開始の前に、重複サブクローンまたは隣接するサブクローンを単離および分類する前払いのコストを削減した。
【０１６８】
本発明のある局面は、以下の実施例でより詳細に記載されている。これらの実施例は、例示によって提供される。当業者が本願の開示を読むと明らかであるように、本発明の他の局面および実施態様が、本発明者らにより意図される。
【０１６９】
実施例
ライブラリーおよび配列決定
１．ショットガン配列決定確率の分析
ゲノムの全体の配列決定へのショットガンアプローチのためのストラテジーの全容は、ポアソン分布に関する方程式LanderおよびWaterman(LandermanおよびWaterman,  Genomics  2:231(1988))の応用に基づく。この処理によれば、ヌクレオチド中のサイズＬの配列中の任意の所定の塩基が、ヌクレオチド中の決定されたランダムな配列の特定の量ｎ後に配列決定されない確率P０は、方程式P０＝ｅ−ｍ、ここで、ｍはL/ｎ(倍数の範囲)により計算され得る。例えば、2.8  Mbのゲノムについては、2.8  Mbの配列がランダムに生成されている場合、ｍ＝１である(１Ｘ範囲)。この時点では、P０＝ｅ−１＝0.37である。任意の所定の塩基が配列決定されていない確率は、配列全体Ｌの任意の領域が決定されていない確率と同じであり、そしてそれゆえ、この確率はいまだ決定されていない配列全体の割合に等しい。従って、１倍の範囲では、ヌクレオチド中のサイズＬの約37％のポリヌクレオチドが配列決定されていない。14Mbの配列が生成される場合、範囲は2.8  Mbについて５Ｘであり、そして配列未決定の割合は0.0067または0.67％まで下がる。2.8  Mb配列の５Ｘ範囲は、410  bpの平均配列読み取り長さを有する挿入物末端の両方由来の約17,000のランダムなクローンを配列決定することにより達成され得る。
【０１７０】
同様に、全ギャップ長さＧが方程式Ｇ＝Le−ｍにより決定され、そして平均ギャップサイズｇが方程式ｇ＝L／ｎに従って決定される。従って、５Ｘ範囲は、長さ2.8  Mbのポリヌクレオチドの配列中で平均して約82  bpサイズの240ギャップを残す。
【０１７１】
上記処理は、本質的にLanderおよびWaterman,  Genomics  2:231(1988)の処理である。
【０１７２】
２．ランダムライブラリーの構築
実際の配列決定の間に上記のランダムモデルに近似するために、クローン化されたゲノムフラグメントのほぼ理想に近いライブラリーが必要とされる。以下のライブラリー構築手順は、この目的を達成するために開発された。
【０１７３】
Streptococcus  pneumoniae  DNAをフェノール抽出により調製する。1.0mlの300mMの酢酸ナトリウム、10mM  TrisHCl、1mM  Na-EDTA、50％グリセロール中に200μgのDNAを含有する混合物を、２分間35Kpaに調整した窒素流を伴う噴霧器（IPI  Medical  Products）を通して処理する。音波処理されたDNAをエタノール沈澱させ、そして500μlのTE緩衝液に再溶解する。
【０１７４】
平滑末端を作り出すために、100μlアリコートの再懸濁されたDNAを、５単位のBAL31ヌクレアーゼ(New  England  BioLabs)で200μlのBAL31緩衝液中において、30℃で10分間消化する。消化されたDNAをフェノール抽出し、エタノール沈澱させ、100μlのTE緩衝液に再溶解し、次に、1.0％の低融点アガロースゲルによる電気泳動によりサイズ分画する。サイズ1.6〜2.0  kbのDNAフラグメントを含有する断片をゲルから切断し、LGTアガロースを融解させ、そして得られた溶液をフェノール抽出して、アガロースをDNAから分離する。DNAをエタノール沈澱させ、そしてベクターへの連結のために20μlのTE緩衝液に再溶解する。
【０１７５】
２段階連結手順を、97％の挿入物(そのうち、99％以上は単一の挿入物であった)を有するプラスミドライブラリーを産生するために使用する。第１の連結混合物(50μl)は、２μgのDNAフラグメント、SmaIで切断しかつ細菌アルカリホスホターゼで脱リン酸化した２μgのpUC18  DNA(Pharmacia)、および10単位のT4リガーゼ(GIBCO/BRL)を含有し、そして14℃で４時間インキュベートした。次いで、連結混合物をフェノール抽出し、エタノール沈澱させ、そして沈澱したDNAを20μlのTE緩衝液に溶解し、1.0％の低融点アガロースゲル上で電気泳動する。梯子状の不連続のバンドを、臭化エチジウム染色およびUV照射により観察し、そして挿入物(I)、ベクター(v)、v＋i、v＋2i、v＋3iなどとしてサイズにより同定した。v＋I  DNAを含有するゲルの部分を切断し、そしてv＋I  DNAを回収し、20μlのTEに再懸濁する。続いて、このv＋I  DNAを、推薦された緩衝液条件下、直鎖状v＋I、４種のdNTPそれぞれ500μM、および９単位のT4ポリメラーゼ(New  England  BioLabs)を含有する反応混合物(50μl)において37℃で５分間のT4ポリメラーゼ処置により、末端平滑化する。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、修復された直鎖状v＋Iを20μlのTEに溶解した。環状を生成するための最終の連結を、５μlの直鎖状v＋iおよび５単位のＴ4リガーゼを含有する50μlの反応物において、14℃で一晩行った。翌日、70℃で10分の後、反応混合物を−20℃で保存する。
【０１７６】
この２段階手順により、二重挿入物キメラ(＜１％)または遊離ベクター(＜３％)による汚染が最小限の単一挿入物プラスミド組換え体の分子的にランダムな収集物を得る。
【０１７７】
ランダムさからの偏差は、宿主中のDNA増殖から生じ得るため、全ての組換え機能および制限機能が欠損したE.  coli宿主細胞(A.  Greener,  Strategies  3(1):5(1990))を、再配列、欠失および制限によるクローンの損失を防ぐために使用する。さらに、形質転換された細胞を抗生物質拡散プレート上に直接プレートして、最も迅速に増殖する細胞の扱いおよび選択を可能にする通常のブロース回収相を避ける。
【０１７８】
プレーティングを以下のように行った。100μlのアリコートのEpicurian  Coli  SURE  II  Supercompetent  Cells(Stratagene  200152)を氷上で解凍し、そして氷上で冷却したファルコン2059チューブに移す。1.7μlアリコートの1.42Mβ-メルカプトエタノールをこのアリコートの細胞に加え、最終濃度25mMとする。細胞を氷上で10分間インキュベートする。１μlアリコートの最終連結物をこの細胞に加え、そして氷上で30分間インキュベートする。細胞に42℃で30秒間の加熱パルスを与え、そして氷上に戻して２分間放置する。液体培地中の増殖(outgrowth)を、任意の所定の形質転換された細胞の優先的増殖を最小限にするためにこのプロトコルから除去する。代わりに、形質転換混合物を、５mlのSOB寒天の底部層(５％SOB寒天：培地リットルあたり、20ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、0.5ｇのNaCl、1.5％のDifco  Agar)を含有する栄養分に富むSOBプレートに直接プレートする。５mlの底部層は、SOB寒天100mlあたり、0.4mlの50mg/mlアンピシリンで補充する。15mlのSOB寒天の上層を1mlのX-Gal(２％)、1mlのMgCl2(１M)、および1mlのMgSO4/100mlSOB寒天で補充する。15mlの上層をプレーティングの直前に注ぐ。本発明者らの力価は、約100コロニー／10μlアリコート形質転換である。
【０１７９】
サイズをいとわずに、全てのコロニーをテンプレート調製のために採集した。従って、「毒性」DNAまたは有害遺伝子生成物に起因するクローンの損失だけがこのライブラリーから欠失され、それにより、ギャップ数が予想された数に対して僅かな増加を生じる。
【０１８０】
３．ランダムなDNA配列決定
高品質の二本鎖DNAプラスミドテンプレートを、Advanced  Genetic  Technology  Corp.  （Gaithersburg、MD）との協力で開発した「沸騰ビーズ」方法（Adamsら、Science  252：1651（1991）；Adamsら、Nature  355：632（1992））を用いて調製する。プラスミド調製を、96ウェルフォーマットで、細菌増殖から最終のDNA精製までのDNA調製の全段階について行う。テンプレート濃度を、Hoechst  DyeおよびMillipor  Cytofluorを用いて決定する。DNA濃度は調整しないが、低収率のテンプレートは、可能な場合に同定し、そして配列決定しない。
【０１８１】
テンプレートもまた、Streptococcus  pneumoniaeλゲノムライブラリーから調製する。増幅ライブラリーをベクターλGEM-12（Promega）中に構築し、そして未増幅のライブラリーをλDASH  II(Stratagene)において構築する。詳細には、未増幅のλライブラリーについては、Streptococcus  pneumoniae  DNA(＞100kb)を、50μgのDNA、1X  Sau3AI緩衝液、20単位Sau3AIを含有する反応混合物(200μl)で23℃で６分間部分的に消化する。消化されたDNAをフェノール抽出し、そして0.5％の低融点アガロースゲルで２Ｖ／ｃｍで７時間電気泳動する。15〜25kbのフラグメントを切り出し、そして最終容量６μl中に回収する。１μlのフラグメントを１μlのDASH  IIベクター(Stratagene)とともに推薦された連結反応で使用する。１パッケージング反応あたり１μlの連結混合物を、Gigapack  II  XL  Packaging  Extract（Stratagene  #227711）とともに推薦されたプロトコルに従って使用する。ファージを、(500μlの推薦されたSM緩衝液で希釈し、そしてクロロホルムで処理した後に)このパッケージング混合物からの増幅なしで直接プレートする。収率は約2.5×103pfu/μlである。増幅されたライブラリーを、λGEM12ベクターが使用されることを除いて本質的に上記のように、調製する。パッケージング後、約3.5×104pfuを限定的NM539宿主にプレートする。溶解物を2mlのSM緩衝液中に採集し、そして７％ジメチルスルホキシド中で凍結して貯蔵する。ファージ力価は約１×10９pfu/mlである。
【０１８２】
液体溶解物(100μl)を、（未増幅ライブラリーから）ランダムに選択されたプラークから調製し、そしてT7ベクターおよびT3ベクターに特異的なプライマーを用いてテンプレートを長範囲PCRにより調製する。
【０１８３】
配列決定反応を、M13正方向(M13-21)プライマーおよびM13逆方向(M13RP1)プライマーについて（Adamsら、Nature  368:474(1994)Applied  Biosystems  PRISM  Ready  Reaction  Dye  Primer  Cycle  Squencing  KitsとともにAB  Catalyst  LabStationを用いて、プラスミドおよび／またはPCRテンプレートについて実施する。ダイターミネーター配列決定反応を、Applied  Biosystems  Ready  Reaction  Dye  Terminator  Cycle  Sequencing  キットを使用するPerkin-Elmer  9600  Thermocyclerでのλテンプレートについて実施する。T7プライマーおよびSP6プライマーを使用してλGEM-12ライブラリーからの挿入物の末端を配列決定し、そしてT7プライマーおよびT3プライマーを使用してλDASH  IIライブラリーからの挿入物の末端を配列決定する。配列決定反応を、８個体により平均で１日あたり14回のAB  373  DNA  Sequencerを使用して実施する。全ての配列決定反応を、AB  373のStretch改変を用いて、主に、34cmのウェルから読み取り距離を用いて、分析する。全体の配列決定成功率はほぼ同じであり、M13-21配列およびM13RP1配列について約85％であり、そしてダイターミネーター反応について65％である。平均の使用可能な読み取り長さは、M13-21配列について485bpであり、M13RP1配列について445bpであり、そしてダイターミネーター反応について375bpである。
【０１８４】
Richardsら、AUTOMATED  DNA  SEQUENCING  AND  ANALYSIS、M.D.Adams、C.Fields、J.C.Venter編、Academic  Press、London、（1994）の第28章は、λクローンおよびコスミドクローンのショットガンアセンブリ計画におけるコンティグの順序づけを容易にする配列決定テンプレートの両端由来の配列を使用する価値を記載する。本発明者らは、M13-21（正方向）プライマーと比較してM13RP1（逆方向）プライマーで実施した配列決定反応のためのより短い読み取り長に対して、両端配列決定の望ましさ（テンプレートの総数を減らすことによるコストの低減を含む）を考慮する。テンプレートの約半数は、両端から配列決定される。ランダム逆方向配列決定反応は、首尾良い正方向配列決定反応に基づいて行われる。いくつかのM13RP1配列は、準方向化された様式で得られる。M13-21：コンティグの末端で外側に向かう配列が特異的にコンティグを順序づける努力におけるM13RP1配列決定のために選択される。
【０１８５】
４．自動化サイクル配列決定のプロトコール
配列決定を、ABI  Catalyst  ロボットおよびABI373自動化DNAシークエンサーを用いて実施する。このCatalystロボットは、公に入手可能な洗練されたピペッティングおよび温度制御ロボットであり、これは、DNA配列決定反応のために特に開発されている。Catalystは、予め少量に分けたテンプレート、およびデオキシ-ならびにジデオキシヌクレオチド、熱安定性TaqDNAポリメラーゼ、蛍光標識された配列決定プライマー、および反応緩衝液からなる反応混合物を組み合わせる。反応混合物およびテンプレートを96ウェルの熱サイクリングプレートのウェル中に合わせる。30の連続するサイクルの線形増幅(即ち、１つのプライマー合成)工程を、変性、プライマーとテンプレートのアニーリング、および伸長即ちDNA合成を含めて実施する。熱サイクリングプレート上のゴムガスケットを有する加熱されたふたは、油重層の必要性なしに蒸発を防ぐ。
【０１８６】
２つの配列決定プロトコールを用いる：１つは色素標識プライマーであり、第２番目は色素標識ジデオキシ鎖ターミネーターである。ショットガン配列決定は、４つのターミネーターヌクレオチドの各々に対するプライマーである４つの色素標識配列決定プライマーの使用を含む。ダイプライマーの各々は、異なる蛍光色素で標識し、４つの個々の反応を、電気泳動、検出、および塩基呼び出しのために373 DNA Sequencer中の１つのレーンに組み合わせることを可能にした。ABIは、現在、配列決定に必要なすべてのテンプレート以外の試薬を含むバルクパッケージ中の予め混合された反応混合物を供給している。配列決定は、プラスミドテンプレートは一般により長い使用可能な配列を与えるが、プラスミドおよびPCR生成テンプレートの両方をほぼ等しい厳密さを有するダイプライマーおよびダイターミネーターの両方とともに用いてなされ得る。
【０１８７】
ABI 373 Sequencerあたり１日あたり32の反応を行い、そして１日あたり960の試料になる。電気泳動は、製造者のプロトコールに従って、一晩行い、そしてデータを12時間にわたって収集する。電気泳動および蛍光検出の後、ABI 373は、自動的にレーン追跡および塩基呼び出しを実施する。レーン追跡は肉眼で確認した。各配列の電気泳動図(または蛍光レーントレース)を肉眼で検査しそして品質を評価した。低品質の引かれてつらなる配列は除き、そして配列自身は、ソフトウェアを介してSybaseデータベースにロードした(毎日８mmテープにアーカイブ記録した)。先導ベクターポリリンカー配列は、ソフトウェアプログラムにより自動的に除かれた。標準のABI 373からの配列の平均編集長は、約400bpであり、そして配列決定反応に用いられたテンプレートの品質に大部分依存する。Stretch  Linersに転用されたABI  373  Sequencerは、蛍光検出の前により長い電気泳動路を提供し、そして平均の使用可能な塩基数を500〜600bpまで増加させる。
【０１８８】
情報科学
１．データ管理
大規模配列決定ラボ用の多くの情報管理システムが開発されている(概説について、例えば、Kerlavageら、Proceedings of the Twenty-Sixth Annual Hawaii International Conference on System Sciences, IEEE Computer Society Press, Washington D.C.,585(1993)を参照のこと)。配列データを収集およびアセンブルするために用いたシステムは、Sybaseリレーショナルデータベース管理システムを用いて開発され、そしてデータフローを可能な限りに自動化しそしてユーザーエラー(user  error)を低減するように設計された。このデータベースは、テンプレート調製からゲノムの最終分析までの全操作の間に収集されたすべての情報を記憶し、そして相関付けた。ABI 373 Sequencerの生の出力は、Macintoshプラットホームに基づき、そして選択されたデータ管理システムは、Unix（登録商標）プラットホームに基づいたので、生データおよび分析結果を、最少のユーザー努力で、継ぎ目なくデータベース中に流させる、種々の複数ユーザーの、クライアントサーバーアプリケーションを設計および実行する必要があった。
【０１８９】
２．アセンブリ
数千の配列フラグメントの迅速および正確なアセンブリのために開発されたアセンブリエンジン(TIGR Assembler)を用いてコンティグを生成した。TIGRアセンブラーは、ゲノムのフラグメントを同時にクラスター化およびアセンブルする。104以上のフラグメントをアセンブルするために必要な速度を得るために、アルゴリズムは、12bpオリゴヌクレオチドサブ配列の寄せ集めの表(hash table)を作り、可能な配列フラグメント重複のリストを作成する。フラグメントの各々に対する可能な重複の数は、どのフラグメントが反復要素になりそうであるかを決定する。単一のシード配列フラグメントから始めて、TIGRアセンブラーは、現在のコンティグを、オリゴヌクレオチドの内容に基づき最もマッチするフラグメントを付加する試みにより拡張する。このコンティグおよび候補フラグメントを、最適間隙のアラインメントを提供するSmith-Watermanアルゴリズムの改変版(Waterman, M.S.,Methods in Enzymology 164：765(1988))を用いて並べる。コンティグは、マッチする品質について厳格な規準が満たされる場合にのみフラグメントにより拡張される。マッチする規準は、重複の最小長さ、マッチしない末端の最大長さ、およびマッチする最小百分率を含む。これらの規準は、最小区域の領域におけるアルゴリズムにより自動的に低下し、そして可能な反復要素の領域で高められる。各フラグメントに対する可能な重複の数は、どのフラグメントが反復要素になりそうであるかを決定する。反復要素の境界を示すフラグメントおよび可能なキメラフラグメントは、しばしば、アラインメントの末端で部分的なミスマッチに基づいてはねのけられ、そして現在のコンティグから排除される。TIGRアセンブラーは、各テンプレートの両末端からの配列決定と組になったクローンサイズ情報を利用するよう設計されている。それは、同じテンプレートの２つの末端からの配列フラグメントが、上記コンティグにおいて、互いに向かって照準し、そして塩基対の特定の範囲内に位置される(与えられたライブラリーについて既知のクローンサイズ範囲を基に各クローンについて規定され得る)するという束縛を増強する。
【０１９０】
このプロセスは、配列番号１〜391によって表される391個のコンティグを生じた。
【０１９１】
３．遺伝子の同定
Streptococcus  pneumoniaeゲノムの推定コード領域は、最初、最少長さのORFを見出すブログラムGeneMarkを用いて規定された。推定されるコード領域配列は、少なくとも95％の同一性で50以上のヌクレオチドの重複を同定するBLASTN検索方法を用いて、GenBank(1997年10月)からのすべてのStreptococcus  pneumoniaeヌクレオチド配列のデータベースに対する検索に用いた。これらのORFを、マッチするヌクレオチド配列とともに表１に示す。このようなマッチのないORFは、タンパク質配列に翻訳され、そしてSwiss-prot、PIRおよびGenPeptデータベースを組み合わせることにより生成された既知のタンパク質の過多でないデータベースと比較した。0.01以下のBLASTP確率でデータベースタンパク質とマッチしたアミノ酸のORFを表２に示す。この表はまた、データベースにおいて最も緊密にマッチすることに基づいて割り当てた機能を列挙する。これらのレベルでデータベース中のタンパク質またはヌクレオチド配列とマッチしないORFを表３に示す。
【０１９２】
応用例
１．Streptococcus  pneumoniaeタンパク質に対する抗体の産生
実質的に純粋なタンパク質あるいはポリペプチドを、当該分野で公知の任意の方法によって、トランスフェクションあるいは形質転換された細胞から単離する。タンパク質はまた、E  .  coliのような原核発現系で組み換え産生され得るか、あるいは、化学合成され得る。最終調製物中のタンパク質濃度は、例えば、Amicon濾過装置での濃縮によって、1mlあたり数マイクログラムのレベルに調整される。次に、タンパク質に対するモノクローナルあるいはポリクローナルの抗体が、以下のように調製され得る。
【０１９３】
２．ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体の産生
記載のように同定および単離された任意ペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体が、Kohler,  G.およびMilstein,  C.,  Nature  256:495  (1975)の古典的な方法あるいはその変法に従って、マウスハイブリドーマから調製され得る。簡単に述べれば、マウスに、数週間にわたって、数マイクログラムの選択タンパク質を繰り返し接種する。次に、そのマウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。脾細胞は、ポリエチレングリコール法によってマウスミエローマ細胞と融合され、過剰の非融合細胞は、アミノプテリン含有の選択培地（HAT培地）で、その系を増殖して破壊する。うまく融合された細胞を希釈し、希釈物の一部を、マイクロタイタープレートウェルに播種して培養増殖を継続する。抗体産生クローンを、基本的にEngvall,  E.,  Meth.  Enzymol.  70:419(1980)に記載のELISA、およびその変法のようなイムノアッセイ法によって、ウェルの上清中の抗体を検出して同定する。選択されたポジティブクローンを増殖して、それらのモノクローナル抗体産物を、使用のために回収し得る。モノクローナル抗体産生の詳細な方法は、Davis,  L.ら、Basic  Methods  in  Molecular  Biology  Elsevier,  New  York.  21-2章(1989)に記載されている。
【０１９４】
３．免疫によるポリクローナル抗体の産生
１つのタンパク質の異種エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗血清は、上記の発現タンパク質で適切な動物を免疫することによって調製され得、それは、免疫原性を増大するように修飾されないか、あるいは修飾され得る。有効なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主の種の両方に関連する多くの因子に影響される。例えば、低分子はその他のものより免疫原性に劣る傾向があり、キャリアおよびアジュバントの使用を必要とし得る。さらに、宿主動物は、低力価抗血清をもたらす不十分なあるいは過剰の抗原投与量によって、接種部位および投与量に対する応答が異なる。複数皮内部位へ投与された少投与量(ngレベル)の抗原が、最も確実であるようである。ウサギに対する有効な免疫プロトコルは、Vaitukaitis,  J.ら、J.  Clin.  Endocrinol.  Metab.  33:988-991  (1971)に認められ得る。
【０１９５】
追加免疫注射が定期的な間隔で与えられ得、例えば、既知濃度の抗原に対する寒天での二重免疫拡散法によって、半定量的に測定される場合に、それらの抗体力価が降下し始めるときに、抗血清が回収され得る。例えば、Handbook  of  Experimental  Immunology、  Wier,  D.編  Blackwell(1973)のOuchterlony,  O.ら、19章を参照のこと。抗体のプラトー濃度は、通常0.1から0.2  mg/ml血清（約12  M）の範囲である。抗血清の抗原に対する親和性は、例えば、Manual  of  Clinical  Immunology、第二版、RoseおよびFriedman編、Amer.  Soc.  For  Microbiology,  Washington,  D.C.(1980)中のFisher,  D.第42章に記載されているように、競合結合曲線を作製して決定される。
【０１９６】
いずれかのプロトコルに従って調製された抗体調製物は、生物学的試料中の抗原を有する物質の濃度を測定する、定量的イムノアッセイに有用であり；これはまた、生物学的試料中の抗原の存在を同定するために、半定量的あるいは定性的に使用される。さらに、抗体は、当該分野で公知の肺炎球菌疾患の種々の動物モデルにおいて、潜在的なワクチン標的としての抗体を作製するために用いるタンパク質を評価する手段、あるいは潜在的な免疫療法試薬または免疫予防試薬として抗体を評価する手段として、有用である。
【０１９７】
4．PCRプライマーの調製およびDNA増幅
表１〜３、および配列番号１〜391に記載のようなStreptococcus  pneumoniaeゲノムの種々のフラグメントが、本発明に従って、様々な使用のためのPCRプライマーを調製するために使用され得る。PCRプライマーは、その長さは好ましくは少なくとも15塩基であり、より好ましくは少なくとも18塩基である。プライマー配列を選択するとき、プライマー対は、ほぼ同じG/C比を有し、従って融解温度はほぼ同じであることが好ましい。この例のPCRプライマーおよび増幅DNAは、以下の実施例で用いられる。
【０１９８】
5．ORFに対応するDNA配列からの遺伝子発現
表１〜３に記載されているStreptococcus  pneumoniaeゲノムのフラグメントは、従来技術によって発現ベクターに導入される。哺乳動物、酵母、昆虫、あるいは細菌の発現系で、タンパク質の翻訳を指向する発現ベクター中にクローン化配列を移入する技術は、当該分野で周知である。商業的に入手可能なベクターおよび発現系は、Stratagene（La  Jolla,  California）、Promega（Madison,  Wisconsin）、およびInvitrogen（San  Diego,  California）を含む種々の供給業者から、入手可能である。必要であれば、発現を増大し、そして適切なタンパク質折り畳みを促進するために、配列のコドンの前後関係およびコドンペアリングが、本明細書に参考として援用されている、Hatfieldらの米国特許第5,082,767号に説明されているように、特定の発現生物について最適化され得る。
【０１９９】
下記は、Streptococcus  pneumoniaeゲノムフラグメントのクローン化ORFからのポリペプチドを生成する例示的な１つの方法として提供される。細菌ORFは、一般に、ポリA付加シグナルを欠如している。付加シグナル配列は、例えば、BglIおよびSalI制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いてpSG5（Stratagene）からスプライシングによりポリA付加配列を取り出し、それを真核生物発現系での使用のための哺乳動物発現ベクターpXT1（Stratagene）へ取り込んで、構築物に付加され得る。pXT1は、LTRおよびモロニーマウス白血病ウイルス（Moloney  Murine  Leukemia  Virus）のgag遺伝子の一部を含む。構築物中にLTRを配置することは、有効で安定なトランスフェクションを可能にする。ベクターは、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝子を含む。Streptococcus  pneumoniae  DNAは、Streptococcus  pneumoniae  DNAに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて細菌ベクターからPCRよって得られ、5'プライマーに取り込まれたPstI、および対応Streptococcus  pneumoniae  DNA  3'プライマーの5'末端にBglIIについての制限エンドヌクレアーゼ配列を含み、これは、Streptococcus  pneumoniae  DNAが、ポリA付加配列が後続するように配置されることを確実にするように取り計らう。得られたPCR反応物から得られた精製フラグメントは、PstIで消化され、エキソヌクレアーゼで平滑末端化され、BglIIで消化され、精製され、pXT1に連結されて、そしてここで、ポリA付加配列および消化BglIIを含む。
【０２００】
連結された産物は、製品仕様書に概説されている条件下で、リポフェクチン（Lipofectin）（Life  Technologies,  Inc.,  Grand  Island,  New  York）を使用して、マウスNIH  3T3細胞へトランスフェクションされる。トランスフェクションされた細胞を600  ug/ml  G418（Sigma,  St.  Louis,  Missouri）中で増殖後に、ポジティプなトランスフェクション物を選択する。そのタンパク質は、好ましくは上清中に放出される。しかし、タンパク質が膜結合ドメインを有するときは、タンパク質は、さらに細胞内に保持されるか、あるいは、発現が細胞表面に制限され得る。トランスフェクションされた産物の精製および位置づけることが必要であり得るので、推定されたStreptococcus  pneumoniae  DNA配列から合成された、合成15マーペプチドを、マウスに注射して、Streptococcus  pneumoniae  DNAにコードされるポリペプチドに対して抗体を生成する。
【０２０１】
代替的あるいは抗体産生が不可能なときに、Streptococcus  pneumoniae  DNA配列はさらに、真核発現発現ベクターに取り込まれて、例えば、グロビン融合物として発現される。次に、グロビン部分に対する抗体が、キメラタンパク質を精製するために使用される。対応プロテアーゼ切断部位が、グロビン部分とStreptococcus  pneumoniae    DNA配列にコードされるポリペプチドとの間で、後者が簡単なプロテアーゼ消化によって、形成物から遊離し得るように操作される。グロビンキメラを生成するための１つの有用な発現ベクターは、pSG5（Stratagene）である。このベクターは、ウサギグロビンをコードする。ウサギグロビン遺伝子のイントロンIIは、発現された転写物のスプライシングを促進し、そして構築物に取り込まれたポリアデニル化シグナルは、発現レベルを増加させる。これらの技術は、分子生物学の当業者に周知である。標準的な方法は、本明細書の他に引用されているDavisらのような方法教本に公開されていて、多くの方法は、Stratagene,  Life  Technologies,  Inc.,あるいはPromegaからの技術援助見本から入手可能である。本発明のポリペプチドはまた、インビトロ発現TM翻訳キット（Stratagene）のような、インビトロ翻訳系を用いて産生され得る。
【０２０２】
本発明は、明快さおよび理解を目的にいくぶん詳細に記載されてきたが、当業者は、形態および細部の多様な改変が、本発明の真の範囲を逸脱することなくなされ得ることを正しく理解する。
【０２０３】
上記引用の全特許、特許出願、および刊行物は、これにより参考として援用されている。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表２−１６】
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【表２−１７】
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【表２−１８】
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【表２−１９】
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【表２−２０】
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【表２−２１】
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【表２−２２】
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【表２−２３】
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【表２−２４】
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【表２−２５】
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【表２−２６】
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【表２−２７】
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【表２−２８】
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【表２−２９】
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【表２−３０】
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【表２−３１】
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【表２−３２】
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【表２−３３】
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【表２−３４】
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【表２−３５】
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【表２−３６】
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【表２−３７】
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【表２−３８】
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【表２−３９】
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【表２−４０】
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【表２−４１】
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【表２−４２】
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【表２−４３】
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【表２−４４】
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【表２−４５】
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【表２−４６】
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【表２−４７】
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【表２−４８】
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【表２−４９】
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【表２−５０】
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【表２−５１】
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【表２−５２】
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【表２−５３】
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【表２−５４】
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【表２−５５】
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【表２−５６】
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【表２−５７】
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【表２−５８】
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【表２−５９】
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【表２−６０】
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【表２−６１】
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【表２−６２】
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【表２−６３】
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【表２−６４】
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【表２−６５】
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【表２−６６】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】図１は、本発明のコンピューターに基づくシステムを実行するために用いられ得るコンピューターシステム（102）のブロック図である。
【図２】図２は、本発明のStreptococcus  pneumoniaeゲノムのコンティグを収集、アセンブル、編集、および注釈するために用いられるデータフローおよびコンピュータープログラムを示す模式図である。MacintoshおよびUnix（登録商標）  platformの両方が、主としてKerlavageら,Proceedings  of  the  Twenty-Sixth  Annual  Hawaii  International  Conference  on  System  Sciences,  585,  IEEE  Computer  Society  Press,  Washington  D.C.  (1993)に記載されるようにAB373および377配列のデータファイルを扱うために用いられる。Factura(AB)は、配列ファイルの自動的なベクター配列除去および末端トリミングのために設計されたMacintoshプログラムである。プログラムLoadisはMacintosh  platform上で作動し、そしてFacturaにより配列ファイルから抽出された特徴データをUnix（登録商標）に基づくStreptococcus  pneumoniaeリレーショナルデータベースに移す。コンティグ（およびゲノム配列全体）のアセンブリは、配列検索用のUnix（登録商標）ユーティリティーであるExtrseqを用いてSQLデータベースから特定の配列ファイルのセットを検索すること、およびそれらの関連する特徴を検索することによって達成される。得られた配列ファイルは、seq_filterにより処理され、２％よりも多い不明瞭なヌクレオチドを有する配列部分が取り除かれる。配列ファイルを、数千の配列フラグメントの迅速で正確なアセンブリーのためにThe  Institute  for  Genomic  Research  (TIGR)で設計されたアセンブリーエンジンであるTIGR  Assemblerを用いてアセンブリした。このアセンブリ工程により作成されたコンティグの収集は、lassieプログラムを有するデータベースにロードされる。オープンリーディングフレーム（ORF）の同定は、zorfまたはGenMarkでコンティグを処理することにより達成される。ORFは、GenBank由来のS.pneumoniae配列に対して検索され、そしてAltschulらJ.Mol.Biol.215:  403-410  (1990)に記載されるBLASTNおよびBLASTPプログラムを用いて全てのタンパク質配列に対して検索される。ORF決定および類似性検索工程の結果を、データベースにロードした。以下に記載のように、決定および検索のいくつかの結果を表１〜３に示す。  （配列表）
【数１−１】
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【数１−２】
2008035865.tif 000097
【数１−３】
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【数１−４】
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【数１−５】
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【数１−６】
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【数１−７】
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【数１−８】
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【数１−９】
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【数１−１０】
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【数１−１１】
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【数１−１２】
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【数１−１４】
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【数１−１５】
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【数１−１６】
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【数１−１７】
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【数１−１８】
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【数１−１９】
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【数１−２０】
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【数１−２１】
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【数１−２３】
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【数１−３１】
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【数１−３３】
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【数１−４４】
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【数１−５６】
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【数１−５７】
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【数１−５８】
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【数１−６５】
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【数１−６６】
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【数１−６７】
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【数１−６８】
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【数１−６９】
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【数１−７０】
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【数１−８１】
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【数１−９２】
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【数１−１０５】
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【数１−１０６】
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【数１−１３１】
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【数１−１３２】
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【数１−１３３】
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【数１−１３４】
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【数１−１３５】
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【数１−１４３】
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【数１−１４４】
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【数１−１４５】
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【数１−１４６】
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【数１−１６８】
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【数１−１２９９】
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【図１】
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【図２】
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