(57)【要約】【課題】精度管理が容易で、生体の免疫能をより正確かつ簡便に評価することができる免疫能の評価方法等を提供する。【解決手段】生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比を指標として、前記生体の免疫能を評価する。あるいは、生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率を指標として、前記生体の免疫能を評価する。生体から単離された直後の末梢血単核細胞におけるナチュラルキラー活性との相関性を有する値を基準値として採用することが好ましい。ＣＤ４＋細胞に特異的な抗体とＣＤ８＋細胞に特異的な抗体とを含む免疫能評価用キット、並びに、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体を含む免疫能評価用キットも提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比を指標として、前記生体の免疫能を評価することを特徴とする免疫能の評価方法。
【請求項２】
生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率を指標として、前記生体の免疫能を評価することを特徴とする免疫能の評価方法。
【請求項３】
ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比あるいはＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率を、予め設定された基準値と比較することにより、前記生体の免疫能を評価することを特徴とする請求項１又は２に記載の免疫能の評価方法。
【請求項４】
前記基準値は、生体から単離された直後の末梢血単核細胞におけるナチュラルキラー活性との相関性を有する値であることを特徴とする請求項３に記載の免疫能の評価方法。
【請求項５】
請求項１に記載の免疫能の評価方法に用いるための免疫能評価用キットであって、ＣＤ４＋細胞に特異的な抗体と、ＣＤ８＋細胞に特異的な抗体とを含むことを特徴とする免疫能評価用キット。
【請求項６】
さらにＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体を含むことを特徴とする請求項５に記載の免疫能評価用キット。
【請求項７】
請求項２に記載の免疫能の評価方法に用いるための免疫能評価用キットであって、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体を含むことを特徴とする免疫能評価用キット。
【請求項８】
さらにＣＤ４＋細胞に特異的な抗体とＣＤ８＋細胞に特異的な抗体と含むことを特徴とする請求項７に記載の免疫能評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫能の評価方法及び免疫能評価用キットに関し、さらに詳細には、精度管理が容易で生体の免疫能をより正確かつ簡便に評価することができる免疫能の評価方法、及び該方法に用いるための免疫能評価用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内にウイルスや細菌などの抗原（非自己）が侵入したり、生体内でがん細胞が発生した場合には、生体は抗原やがん細胞を排除するために多様な生体反応を引き起こす。この抗原等に対して起こる一連の生体反応が免疫応答であり、その強さ、すなわち免疫能がいわゆる抵抗力に直接関連している。すなわち、ヒトの免疫能を正確に評価することは、感染症や発ガンを予防する上での指標として極めて重要である。この免疫能については、生体の免疫応答が複雑であるために多方面から評価する必要がある。
【０００３】
ヒトの免疫能の評価方法としては、被検者の末梢血から得た免疫担当細胞のナチュラルキラー活性（ＮＫ活性）を指標とする方法が従来から広く採用されている。具体的には「細胞障害性試験」と呼ばれる手法で行われており、被検者から採取した末梢血を遠心分離して得た末梢血単核細胞をエフェクター細胞とし、該エフェクター細胞を標的となるがん細胞（ターゲット細胞）と接触させ、ターゲット細胞に対する細胞障害性を細胞内に取り込ませた51Ｃｒ等の遊離をもって評価するものである。
【０００４】
一方で、細胞障害性試験については、精度管理の難しさと操作の煩雑さが指摘されている。すなわち測定結果のばらつきが大きく、複数の条件を設定して試験を行う必要がある。そもそも細胞障害性試験で得られたＮＫ活性の値が被検者の免疫能を正しく反映しているのか、との指摘さえある。また、51Ｃｒ等の放射性物質を用いることが多く、専用の取扱い施設が必要となり、かつ作業者の安全性にも不安が残る。このような背景の下、ヒトの免疫能をより正確かつ簡便に評価するための技術開発が進められている。特許文献１には、殺細胞活性分子であるグラニュライシン、パーフォリン、あるいはグランザイムＢの免疫担当細胞における発現量を指標として、被検者の免疫状態を確認する方法が開示されている。
【０００５】
なお臨床検査の現場において、検査体制が整っている施設では採血後ただちに細胞障害性試験を行うことができるが、そうでない施設では外部の検査機関に試験を依頼することになる。この際、採血から試験開始までに２４時間以上経過していることも少なくない。
【特許文献１】特開２００１−２４９１２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述のように、ヒトの免疫能を正確に把握するためには、多方面から評価する必要がある。そのためには、従来とは異なった方面から免疫能を評価する方法であって且つ精度管理が容易な技術が求められる。本発明の目的は、精度管理が容易で、生体の免疫能をより正確かつ簡便に評価することができる免疫能の評価方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、従来の細胞障害性試験における精度管理の難しさの一要因として、採血から試験開始までの経過時間が影響しているのではないかと考えた。すなわち、細胞障害性試験はターゲット細胞に対する細胞障害性を直接みるものであり、エフェクター細胞の成育状態（例えば、保存状態）が試験結果に影響することが予想された。そこで、採血からの経過時間とＮＫ活性との関係について実際に実験を行って調査した。その結果、時間の経過とともにＮＫ活性が減少しており、しかもその減少の度合いが予想を上回るほど大きいものであることを確認した。検体によっては２４時間経過時で５０％以下まで減少している例も見られた。さらに、検体ごとの減少度合いのばらつきが大きく、外挿も困難であった。これにより、従来の細胞障害性試験によるＮＫ活性をもって免疫能を正確に評価するためには、採血直後の新鮮な検体を用いて試験を行う必要があることが強く示唆された。
【０００８】
そこで本発明者らは、採血からある程度の時間が経過した検体を用いても正確な免疫能の評価ができる技術の開発を目指し、鋭意研究を行った。その結果、末梢血単核細胞の表面抗原の違いによる亜分類に着目することにより、採血からの時間経過の影響を受けず、且つばらつきも小さい免疫能の評価方法を確立することに成功した。さらに、該評価方法を簡便に行うためのキットを構築し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
【０００９】
請求項１に記載の発明は、生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比を指標として、前記生体の免疫能を評価することを特徴とする免疫能の評価方法である。
【００１０】
また請求項２に記載の発明は、生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率を指標として、前記生体の免疫能を評価することを特徴とする免疫能の評価方法である。
【００１１】
免疫担当細胞は、発現している表面抗原の種類によって亜分類されている。表面抗原の種類としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２５等があり、ＣＤ４を発現している細胞（ＣＤ４＋細胞）はヘルパーＴ細胞、ＣＤ８を発現している細胞（ＣＤ８＋細胞）はキラーＴ細胞、ＣＤ４とＣＤ２５の両方を発現している細胞（ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞）は制御性Ｔ細胞に相当する。そして、本発明の免疫能の評価方法では、生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比（請求項１）、あるいはＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率（請求項２）を指標として、生体の免疫能を評価する。本発明の免疫能の評価方法では、表面抗原の種類によって分類された特定の細胞集団の数比をもって評価するので、検体となる末梢血単核細胞が生きてさえおればよく、その成育状態の影響を受けない。そのため、末梢血単核細胞が生きている限りにおいて採血から試験開始までの経過時間の影響を受けることはなく、精度管理が容易で、外部の検査機関にて試験を行う場合でも正確に免疫能の評価を行うことができる。さらに、末梢血単核細胞の分類については、例えばフローサイトメトリーによって簡単に行うことができるので、操作が簡便であり、多数の検体を一度に処理することができる。またさらに、放射性物質を使う必要がないので、専用の施設も不要である。
【００１２】
なお、「ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比」は、例えば「ＣＤ４＋細胞の数／ＣＤ８＋細胞の数」やその逆数「ＣＤ８＋細胞の数／ＣＤ４＋細胞の数」をもって表現することができる。あるいは、単に「ＣＤ４＋細胞の数：ＣＤ８＋細胞の数」で表現してもよい。同様に、「末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率」は、例えば、「ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数／末梢血単核細胞の全数」で表現することができる。これらは、いずれもフローサイトメトリーによって簡単に測定および算出することができる。
【００１３】
請求項３に記載の発明は、ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比あるいはＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率を、予め設定された基準値と比較することにより、前記生体の免疫能を評価することを特徴とする請求項１又は２に記載の免疫能の評価方法である。
【００１４】
本発明の免疫能の評価方法では、予め基準値を設定しておき、ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比あるいはＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率を当該基準値と比較して免疫能を評価する。かかる構成により、より正確に免疫能の評価を行うことができる。
【００１５】
請求項４に記載の発明は、前記基準値は、生体から単離された直後の末梢血単核細胞におけるナチュラルキラー活性との相関性を有する値であることを特徴とする請求項３に記載の免疫能の評価方法である。
【００１６】
細胞障害性試験によるナチュラルキラー活性（ＮＫ活性）測定については、試験を採血直後に行えば、その測定結果は生体の免疫状態を正確に反映していると考えられる。そして本発明の免疫能の評価方法では、基準値として生体から単離された直後の末梢血単核細胞におけるＮＫ活性との相関性を有する値を採用する。かかる構成により、さらに正確に免疫能の評価を行うことができる。
【００１７】
請求項５に記載の発明は、請求項１に記載の免疫能の評価方法に用いるための免疫能評価用キットであって、ＣＤ４＋細胞に特異的な抗体と、ＣＤ８＋細胞に特異的な抗体とを含むことを特徴とする免疫能評価用キットである。
【００１８】
本発明は上述の免疫能の評価方法に用いるための免疫能評価用キットにかかるものであり、ＣＤ４＋細胞に特異的な抗体とＣＤ８＋細胞に特異的な抗体とを含む。本発明の免疫能評価用キットによれば、生体から単離した末梢血単核細胞の集団をフローサイトメトリーに供する際にＣＤ４＋細胞ならびにＣＤ８＋細胞の分類を簡便に行うことができる。その結果、「ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比」をきわめて簡便に測定および算出することができる。
【００１９】
請求項６に記載の発明は、さらにＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体を含むことを特徴とする請求項５に記載の免疫能評価用キットである。
【００２０】
かかる構成により、「末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率」をもきわめて簡便に測定および算出することができる免疫能評価用キットが提供される。
【００２１】
請求項７に記載の発明は、請求項２に記載の免疫能の評価方法に用いるための免疫能評価用キットであって、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体を含むことを特徴とする免疫能評価用キットである。
【００２２】
本発明は上述の免疫能の評価方法に用いるための免疫能評価用キットにかかるものであり、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体とを含む。本発明の免疫能評価用キットによれば、生体から単離した末梢血単核細胞の集団をフローサイトメトリーに供する際にＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の分類を簡便に行うことができる。その結果、「末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率」をきわめて簡便に測定および算出することができる。
【００２３】
請求項８に記載の発明は、さらにＣＤ４＋細胞に特異的な抗体とＣＤ８＋細胞に特異的な抗体と含むことを特徴とする請求項７に記載の免疫能評価用キットである。
【００２４】
かかる構成により、「ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比」をもきわめて簡便に測定および算出することができる免疫能評価用キットが提供される。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の免疫能の評価方法によれば、末梢血単核細胞が生きている限りにおいて採血から試験開始までの経過時間の影響を受けることはなく、精度管理が容易で、外部の検査機関にて試験を行う場合でも正確に免疫能の評価を行うことができる。さらに、末梢血単核細胞の分類については、フローサイトメトリーによって簡単に行うことができるので、操作が簡便であり、多数の検体を一度に処理することができる。またさらに、放射性物質を使う必要がないので、専用の施設も不要である。
【００２６】
本発明の免疫能の評価用キットによれば、本発明の免疫能の評価方法をきわめて簡便に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の免疫能の評価方法の１つの様相は、生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比を指標として、前記生体の免疫能を評価する免疫能の評価方法である。また、本発明の免疫能の評価方法の他の様相は、生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率を指標として、前記生体の免疫能を評価する免疫能の評価方法である。
【００２８】
本発明の免疫能の評価方法では、生体から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を検体とする。ＰＢＭＣの単離方法としては、公知の方法をそのまま用いることができ、例えば、ヘパリン採血した全血を比重遠心分離に供することにより、単離することができる。採血からＰＢＭＣを単離するまでの時間については、ＰＢＭＣが生存状態で保持できる条件下で血液が保存されていれば特に制限はなく、採血直後にＰＢＭＣを単離することは必須でない。むしろ作業性を考慮すると、採血した血液を適切な条件下で一旦保存し、その後にＰＢＭＣを単離することが好ましい。血液の保存方法としては、臨床検査の分野で採用されている方法がそのまま適用でき、例えば、ヘパリン共存下で室温保存または冷蔵保存することができる。
【００２９】
本発明の免疫能の評価方法では、単離されたＰＢＭＣの集団における「ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比」あるいは「ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率」といったパラメータを指標とする。これらのパラメータについては、例えば、単離したＰＢＭＣをフローサイトメトリーに供することにより、容易に得ることができる。この際、ＰＢＭＣの各表面抗原に特異的な抗体とＰＢＭＣの集団とを接触させることにより、ＰＢＭＣを表面抗原の種類に従って分類する。すなわち、ＣＤ４＋細胞に特異的な抗体とＣＤ８＋細胞に特異的な抗体とを用いることにより、ＣＤ４＋細胞の数の比率（％）とＣＤ８＋細胞の数の比率（％）を測定することができ、「単離されたＰＢＭＣの集団におけるＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比」を得ることができる。また、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体を用いることにより、「単離されたＰＢＭＣの集団におけるＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率（％）」を測定することができる。なお、これらの抗体についてはすでに取得されており、市販もされている。ケーラーとミルシュタインの方法等の公知技術で自家調製してもよい。
【００３０】
好ましい実施形態では、上記した「ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比」あるいは「ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率」を、予め設定された基準値と比較することにより、生体の免疫能を評価する。すなわち、生体から単離された直後のＰＢＭＣ、換言すれば、採血直後のＰＢＭＣを検体とする場合には、細胞障害性試験によるＮＫ活性をもって生体の免疫能を正確に評価することができる。そこで、正確な免疫能を反映しているＮＫ活性との相関性を有する基準値を採用することにより、本発明による免疫能の評価をきわめて正確に行うことができる。当該基準値は、採血直後のＰＢＭＣを用いてＮＫ活性と各パラメータ（ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比、並びに、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率）の測定を行い、ＮＫ活性と各パラメータとの相関データから選択すればよい。例えば、２０％のＮＫ活性に相当する各パラメータの値を基準値として採用すればよい。なお、ＮＫ活性と各パラメータとは負の相関を示すので、２０％のＮＫ活性に相当する基準値を仮にＡとするとき、「ＮＫ活性２０％以上」の状態であれば各パラメータはＡ以下の値を示す。
【００３１】
上記基準値については、多数の被検者から収集した値を元に設定すれば、ユニバーサルな値となり、集団検診等の際に有用である。一方、被検者ごとに固有の基準値を設定してもよく、この際には、当該被検者の免疫能をモニタリングするのに有用である。
【００３２】
本発明の免疫能測定用キットの１つの様相は、ＣＤ４＋細胞に特異的な抗体とＣＤ８＋細胞に特異的な抗体とを含むものである。また、本発明の免疫能測定用キットの他の様相は、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体を含むものである。当該抗体はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体のいずれでもよいが、より特異性の高いモノクローナル抗体が好ましい。これらの抗体の形状については特に限定はなく、溶液状でもよいし凍結乾燥品でもよい。また、抗体以外の試薬類、例えば、ＰＢＭＣ単離用の試薬（Ficoll-paque液など）、各種の緩衝液、遠心用チューブ等をさらに含むものでもよい。なお、ＣＤ４＋細胞に特異的な抗体、ＣＤ８＋細胞に特異的な抗体、およびＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体、の計３種の抗体を含むキットであれば、「ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比」と「ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率」の両パラメータの測定に対応可能であり、特に好ましい。
【００３３】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
１．細胞障害性試験によるＮＫ活性測定の基礎的検討
（１）エフェクター細胞の調製
文書により同意を得た健常人ボランティア８名から、安静時静脈血３５ｍＬをヘパリン入り採血管にて無菌的に採取し、５ｍＬずつ６本に分注した。そのまま室温にて静置し、０時間後（採血直後）、２時間後、５時間後、８時間後、１１時間後、および２４時間後に比重遠心分離に供し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収した。ＰＢＭＣの回収は以下の手順によった。
【００３５】
まず、各時間経過後（０〜２４時間）に１，５００Ｇで５分間遠心した後、バフィーコード部分を別の遠心管に回収し、ＲＰＭＩ１６４０で希釈した。パスツールピペットにてFicoll-paque液（ファルマシア社）を３〜４ｍＬ重層し、２０℃、４００Ｇで１５分間遠心し（アクセル・ブレーキなし）、Ficoll-paque液層の上に分離したＰＢＭＣ層をチューブに回収した。回収したＰＢＭＣをＰＢＳ（−）で希釈し、４℃、４５０Ｇで６分間遠心した。上清除去後、１０％仔ウシ血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０に浮遊させ、４℃、４００Ｇで５分間遠心した。上清除去後、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０に再浮遊させ、４×１０6個／ｍＬの細胞濃度になるようにＰＢＭＣを浮遊させた（エフェクター細胞浮遊液）。
【００３６】
（２）ターゲット細胞の調製
１１９ｇのＨＥＰＥＳ、５４．４ｇのＮａＣｌ、３．７３ｇのＫＣｌ、４．０７ｇのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏを８００ｍＬの精製水に溶解後、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整し、精製水にて全量１，０００ｍＬとした。この溶液をフィルター滅菌し、バッファーＡ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、９３ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）を調製した。また、１１９ｇのＨＥＰＥＳ、５４．４ｇのＮａＣｌ、３．７３ｇのＫＣｌ、４．０７ｇのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、２．９４ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、１８．０ｇのグルコースを８００ｍＬの精製水に溶解後、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整し、精製水にて全量１，０００ｍＬとした。この溶液をフィルター滅菌し、バッファーＢ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、９３ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）を調製した。
【００３７】
３９３ｍｇのＤＴＰＡ（Titriplex V）を１０ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨに溶解し、１００ｍＭ ＤＴＰＡ溶液を調製した。次に、１．５２ｍＬの原子吸光用Ｅｕ溶液（１，０００μｇ／ｍＬ）、７．９８ｍＬのバッファーＡ、及び０．５ｍＬの１００ｍＭ ＤＴＰＡ溶液を混和し、ＨＣｌ又はＮａＯＨにてｐＨを７．４に調整してＥｕ−ＤＴＰＡ溶液を調製した。一方、５．０ｍｇのデキストラン硫酸（ファルマシア社）を１．０ｍＬのバッファーＡに溶解し、デキストラン硫酸溶液を調製した。そして、２５〜２７μＬのＥｕ−ＤＴＰＡ溶液と１００μＬのデキストラン硫酸溶液を混和し、バッファーＡにて全量を１ｍＬとしてラベリングバッファーを調製した。
【００３８】
Ｔ−７５フラスコにて継代培養されたＫ−５６２細胞浮遊液を１５ｍＬ容チューブに移し、４℃、４００Ｇで５分間遠心した。上清除去後、３．０ｍＬのバッファーＡを加えて再浮遊させ、１．５ｍＬ容マイクロチューブ２本に分けて４℃、２，３００Ｇで３０秒間遠心した。上清除去後、バッファーＡを用いて１．５ｍＬ容マイクロチューブ１本にまとめ、４℃、２，３００Ｇで３０秒間遠心した。上清除去後、１．０ｍＬのラベリングバッファーで再浮遊させ、１５ｍＬ容チューブに移し、氷中で２０分間インキュベートした。この間、５分ごとに穏やかに撹拌した。
【００３９】
インキュベート終了後、４℃に冷却したバッファーＢを３．０ｍＬ加え、氷中で５分間インキュベートした。１．５ｍＬ容マイクロチューブ３本に分けて、４℃、２，３００Ｇで３０秒間遠心した。上清除去後、バッファーＢを用いて１本にまとめ、４℃、２，３００Ｇで３０秒間遠心した。再度、バッファーＢにて４℃、２，３００Ｇで３０秒間洗浄遠心した。さらに、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を用いて４℃、２，３００Ｇで３０秒間洗浄遠心を２回行い、再浮遊させて氷中で３０分間静置した。さらに、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を用いて同様に洗浄遠心を２回行った後、５×１０4個／ｍＬの細胞濃度となるように浮遊させた（ターゲット細胞浮遊液）。
【００４０】
（３）ＮＫ活性の測定
ターゲット細胞浮遊液を９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注した。その上に、上記（１）で調製したエフェクター細胞浮遊液を「エフェクター細胞：ターゲット細胞」が「４０：１」または「２０：１」の比率となるように分注した。そのままプレートを５％ＣＯ2、３７℃の条件下で４時間静置した。４時間経過後、プレートのまま室温、３５０Ｇで５分間遠心した。遠心後の上清２０μＬを測定用プレートに移し、増強試薬１００μＬを分注して、放出されたＥｕ3+の量（１／１０量）をラベルカウンターにて測定した（測定値Ａ）。別途、エフェクター細胞浮遊液の代わりに１００μＬの１％トリトンＸ−１００溶液を添加したウェル（Total、測定値Ｂ）と、１００μＬの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を添加したウェル（Back、測定値Ｃ）も設定し、同時測定した。Totalはターゲット細胞を全て人工的に破壊した場合のＥｕ3+放出値、Backはターゲット細胞からの自然Ｅｕ3+放出値を測定するためのものである。
【００４１】
以下の式（Ｉ）によりＮＫ活性（％）を算出した。
｛（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）｝×１００        （Ｉ）
【００４２】
（４）結果
第１表ならびに図１に結果を示す。第１表と図１において、ａ〜ｈはぞれぞれ同一被検者由来の検体を示している。第１表において、各数値はＮＫ活性の測定値（％）、かっこ内の数値は０時間を１００とした場合の相対値である。図１は、ＮＫ活性と経過時間との関係を表すグラフである。すなわち、いずれの検体の場合も、採血後からＰＢＭＣの分離までに要した時間が長いほどＮＫ活性の値が減少していた。また、その減少度合いは検体によってばらつきが大きかった。例えば、２４時間経過後に５０％以下まで減少した検体（検体ｆ，ｇ）がある一方で、７５％程度に留まった検体（検体ｅ）もあり、外挿によって採血直後（０時間経過後）のＮＫ活性を推定することは困難であった。
以上より、細胞障害性試験によるＮＫ活性は、採血後からＰＢＭＣの分離までに要した時間が長いほど減少し、採血直後に測定しないと生体の正しい免疫能を反映しないことが示された。
【００４３】
【表１】
2008249367.tif 000003
【００４４】
２．フローサイトメトリーによる免疫担当細胞の亜分類
文書により同意を得た健常人ボランティア３０名を被検者とし、上記１と同様の手順で採血直後（０時間経過後）のＮＫ活性を測定した。このＮＫ活性測定値は採血直後のＰＢＭＣを用いて測定したものであるから、被検者の免疫能を正確に反映していると考えられた。
【００４５】
一方、採血直後（０時間経過後）におけるＰＢＭＣを、８種の表面抗原にそれぞれ特異的なモノクローナル抗体で染め分け、フローサイトメトリーに供して全ＰＢＭＣ数に対する各細胞の数の比率（％）を測定した。表面抗原８種の内訳は、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）、キラーＴ細胞（ＣＤ８＋）、単球（ＣＤ１４＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ１６＋・ＣＤ５６＋）、ＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋・ＣＤ１６＋・ＣＤ５６＋）、および制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋）とし、ＣＤ４＋細胞の数のＣＤ８＋細胞の数に対する比（ＣＤ４＋／ＣＤ８＋）を加えた９項目について検討した。結果を第２表に示す。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
第２表に示す結果を元に、縦軸にＮＫ活性（４０：１）、横軸に各項目の値をプロットしたグラフ（全９種）を作成した。その結果、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋と、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の全ＰＢＭＣ数に対する比率（％）（以下、単に「ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋」と略記する。）の２項目が、ＮＫ活性に対して高い負の相関を示した。図２は、ＮＫ活性とＣＤ４＋／ＣＤ８＋との関係を示すグラフである。ＣＤ４＋／ＣＤ８＋については、回帰式「Ｙ＝４０．５０６−９．４１５Ｘ」、相関係数「０．８００」が得られた。図３は、ＮＫ活性とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との関係を示すグラフである。ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋については、回帰式「Ｙ＝４９．７９５−１．３６Ｘ」、相関係数「０．７１８」が得られた。
以上より、採血直後において、ＮＫ活性とＣＤ４＋／ＣＤ８＋とは高い相関性を示し、ＮＫ活性に代わってＣＤ４＋／ＣＤ８＋を測定することで、免疫能の評価を行えることが示された。同様に、採血直後において、ＮＫ活性とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋とは高い相関性を示し、ＮＫ活性に代わってＣＤ４＋・ＣＤ２５＋を測定することで、免疫能の評価を行えることが示された。
【００４８】
なお得られた回帰式によれば、ＮＫ活性２０％（Ｙ＝２０）に対応するＣＤ４＋／ＣＤ８の値（Ｘ）は２．１７８、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋の値（Ｘ）は２１．９１％となる。したがって、通常、ＮＫ活性の値が２０％以上であるときに免疫能が正常と評価している場合には、ＣＤ４＋／ＣＤ８の値が２．１７８以下、あるいはＣＤ４＋・ＣＤ２５＋の値が２１．９１％以下という基準で同様の評価を行うことができる。
【００４９】
ＣＤ４＋／ＣＤ８＋とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との関係についても検討した。図４は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との関係を示すグラフである。ＣＤ４＋／ＣＤ８＋とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋とは高い正の相関を示した（相関係数０．８１５）。
【００５０】
３．同一個体における各パラメータの検討
文書により同意を得た健常人ボランティア２名を被検者とし、温熱ストレスをかける直前、並びに、かけた直後、３時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後に採血し、直ちに上記１と同様の手順でＰＢＭＣを採取した。温熱ストレスとして、遠赤外線全身加温装置を用い、６０分間全身加温を負荷した。この負荷により、被検者２名の直腸温度は３９℃まで上昇した。
【００５１】
採取したＰＢＭＣを直ちに上記１と同様手順の細胞障害性試験と上記２と同様手順のフローサイトメトリーに供し、ＮＫ活性（４０：１）、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋、及びＣＤ４＋・ＣＤ２５＋を測定した。得られた測定値を元に、ＮＫ活性とＣＤ４＋／ＣＤ８＋との相関性、並びに、ＮＫ活性とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との相関性を検討した。結果を図５と図６に示す。図５（ａ）は一方の被検者におけるＮＫ活性とＣＤ４＋／ＣＤ８＋との関係を示すグラフ、図５（ｂ）は一方の被検者におけるＮＫ活性とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との関係を示すグラフである。図６（ａ）は他方の被検者におけるＮＫ活性とＣＤ４＋／ＣＤ８＋との関係を示すグラフ、図６（ｂ）は他方の被検者におけるＮＫ活性とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との関係を示すグラフである。図５，６に示すように、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋はいずれもＮＫ活性と強い負の相関を示した。特に、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋についてはいずれの個体でも相関係数が０．９７以上であり、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋とＮＫ活性とはほぼ同一視できることが示された。
以上より、同一個体においてＣＤ４＋／ＣＤ８＋あるいはＣＤ４＋・ＣＤ２５＋の変動を調べることにより、免疫能の変動を正確に把握できることが示された。
【００５２】
なお、図５（ａ）のグラフから回帰式「Ｙ＝２８．２８４−４．９８３Ｘ」、図５（ｂ）のグラフから「Ｙ＝３２．９２４−０．９７４Ｘ」が得られた。これらの式からＮＫ活性２０％（Ｙ＝２０）に相当する各パラメータ値（Ｘ）を計算すると、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋は１．６６２、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋は１３．２７となる。これらのパラメータ値は、図５の被検者に固有の基準値となり得る。同様に、図６（ａ）のグラフから回帰式「Ｙ＝７１．１９９−２７．２６４Ｘ」、図６（ｂ）のグラフから「Ｙ＝５５．５２１−１．７７９Ｘ」が得られた。これらの式からＮＫ活性２０％（Ｙ＝２０）に相当する各パラメータ値（Ｘ）を計算すると、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋は１．８７８、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋は１９．９７となる。これらのパラメータ値は、図６の被検者に固有の基準値となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＮＫ活性と経過時間との関係を表すグラフである。
【図２】ＮＫ活性とＣＤ４＋／ＣＤ８＋との関係を示すグラフである。
【図３】ＮＫ活性とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との関係を示すグラフである。
【図４】ＣＤ４＋／ＣＤ８とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との関係を示すグラフである。
【図５】（ａ）は一方の被検者におけるＮＫ活性とＣＤ４＋／ＣＤ８＋との関係を示すグラフ、（ｂ）は一方の被検者におけるＮＫ活性とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との関係を示すグラフである。
【図６】（ａ）は他方の被検者におけるＮＫ活性とＣＤ４＋／ＣＤ８＋との関係を示すグラフ、（ｂ）は他方の被検者におけるＮＫ活性とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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