(57)【要約】【課題】熱処理によって変性したスギ花粉アレルゲン(ＣｒｙＪ１)を検出および定量しうるＥＬＩＳＡ法を提供する。【解決手段】ＣｒｙＪ１のＮ末端配列を抗原として作成された抗ＣｒｙＪ１モノクローナル抗体０２６または精製ＣｒｙＪ１を抗原として作成された抗ＣｒｙＪ１ポリクローナル抗体のいずれかを用いる単抗体ＥＬＩＳＡ法およびこれら抗体の両方を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により上記課題が解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱処理によって変性したスギ花粉アレルゲン(ＣｒｙＪ１)を検出および定量するためのＥＬＩＳＡ法であって、ＣｒｙＪ１のＮ末端配列を抗原として作成された抗ＣｒｙＪ１モノクローナル抗体０２６または精製ＣｒｙＪ１を抗原として作成された抗ＣｒｙＪ１ポリクローナル抗体のいずれかを用いることを特徴とする単抗体ＥＬＩＳＡ法。
【請求項２】
熱処理によって変性したスギ花粉アレルゲン(ＣｒｙＪ１)を検出および定量するためのＥＬＩＳＡ法であって、ＣｒｙＪ１のＮ末端配列を抗原として作成された抗ＣｒｙＪ１モノクローナル抗体０２６および精製ＣｒｙＪ１を抗原として作成された抗ＣｒｙＪ１ポリクローナル抗体の両方を用いることを特徴とするサンドイッチＥＬＩＳＡ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱処理によって変性したスギ花粉アレルゲン(ＣｒｙＪ１)を検出および定量するためのＥＬＩＳＡ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、カビ、アレルゲン、ウイルス等の生理活性を有する粒子を不活性化する付加機能をもつ家電用空調機器が開発されてきており、搭載されている除菌ユニットの除菌効果を定量的に評価する必要性が生じている。
本発明者は、特に除菌ユニットの除アレルゲン性能の評価方法として、スギ花粉アレルゲンＣｒｙＪ１の酵素免疫抗体法(ＥＬＩＳＡ)による検出法を検討した。
【０００３】
ＣｒｙＪ１の高感度検出法として、抗ＣｒｙＪ１モノクローナル抗体によるＥＬＩＳＡ法が既に知られている。
単抗体ＥＬＩＳＡ法によれば、次のようにしてＣｒｙＪ１を検出する：(１)ＣｒｙＪ１を含む溶液をマイクロプレートの各穴に加えてＣｒｙＪ１をプレートに固定し、(２)プレートの洗浄後、抗ＣｒｙＪ１抗体の溶液を加えて反応させ、(３)プレートの洗浄後、酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体の溶液を加えて反応させ、(４)プレートの洗浄後、基質溶液を加えて静置し、そして(５)反応を停止させて吸光度を測定する。
【０００４】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法によれば、次のようにしてＣｒｙＪ１を検出する：(１)固相用の第１の抗ＣｒｙＪ１抗体の溶液をマイクロプレートの各穴に加えて該抗体をプレートに固定し、(２)プレートの洗浄後、ＣｒｙＪ１を含む溶液を加えて反応させ、(３)プレートの洗浄後、酵素標識した第２の抗ＣｒｙＪ１抗体の溶液を加えて反応させ、(４)プレートの洗浄後、基質溶液を加えて静置し、そして(５)反応を停止させて吸光度を測定する。
【０００５】
現在、抗ＣｒｙＪ１抗体として、日本国内で以下の抗体が入手可能である。
【表１】
2008249458.tif 000002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、除菌ユニットによる除アレルゲンメカニズムには、フィルターによる濾過の他に、空気イオンによるもの、ラジカルによるもの、熱や乾燥によるものなど様々であり、このような方法により変性あるいは分解したスギ花粉アレルゲン(ＣｒｙＪ１)が、ＥＬＩＳＡ法によって適切に評価できるかどうかは不明である。そこで、本発明者は、熱処理によって変性したＣｒｙＪ１のＥＬＩＳＡによる評価方法について検討し、該変性ＣｒｙＪ１を検出および定量しうるＥＬＩＳＡ法を構築しようとした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、種々検討した結果、ＣｒｙＪ１のＮ末端配列を抗原として作成された抗ＣｒｙＪ１モノクローナル抗体０２６(ｍＡｂ０２６)および精製ＣｒｙＪ１を抗原として作成された抗ＣｒｙＪ１ポリクローナル抗体(ｐＡｂ)が、熱処理によって変性したＣｒｙＪ１と結合し、これらの抗体を用いて、該変性ＣｒｙＪ１を検出および定量しうるＥＬＩＳＡ法を構築できることを見い出した。
【０００８】
即ち、本発明は、熱処理によって変性したスギ花粉アレルゲン(ＣｒｙＪ１)を検出および定量するためのＥＬＩＳＡ法であって、ｍＡｂ０２６またはｐＡｂのいずれかを用いることを特徴とする単抗体ＥＬＩＳＡ法を提供するものである。
また、本発明は、熱処理によって変性したスギ花粉アレルゲン(ＣｒｙＪ１)を検出および定量するためのＥＬＩＳＡ法であって、ｍＡｂ０２６およびｐＡｂの両方を用いることを特徴とするサンドイッチＥＬＩＳＡ法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．未変性ＣｒｙＪ１溶液の調製
精製スギ花粉抗原(株式会社林原生物化学研究所；コード ＨＢＬ-Ｃ-１)をＰＢＳに目的濃度になるように溶解し、この溶液を未変性ＣｒｙＪ１溶液とした。
【００１０】
２．未変性ＣｒｙＪ１のサンドイッチＥＬＩＳＡによる分析
固相用抗体(ｍＡｂ０１３)をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌとなるように希釈した。この希釈溶液を、９６穴マイクロプレートの各穴に１００μｌずつ加え、プレートシールで上面をシールし、室温で２時間静置した。次いで、固相抗体溶液を除去し、ブロッキング緩衝液(StartingBlock Blocking Buffers；PIERCE社製)を各穴に３００μｌずつ加え、１０秒後にプレートからブロッキング緩衝液を除去した。試料溶液(各濃度に調整した未変性ＣｒｙＪ１溶液)および対照溶液(ＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ)を各穴に１００μｌずつ加え、プレートシールで上面をシールし、室温で２時間静置した。次いで、試料溶液および対照溶液を除去し、各穴をＴｗｅｅｎ-２０含有ＰＢＳ(２５０μｌ)で３回洗浄した。ＨＲＰ標識抗体(ｍＡｂ０５３)をＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎで１,０００倍希釈し、各穴に１００μｌずつ加え、プレートシールで上面をシールし、室温で２時間静置した。次いで、ＨＲＰ標識抗体溶液を除去し、各穴を０.１％Ｔｗｅｅｎ-２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。基質溶液[１０ｍｇのオルトフェニレンジアミンを３０ｍｌの１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ４.５)に溶解させ、２５μｌの過酸化水素水を加えて調製した溶液]を各穴に１００μｌずつ加え、５分間静置した。次いで、各穴に２Ｎ硫酸を１００μｌずつ加え、３０分以内に吸光度(４９２ｎｍ)を測定した。
この分析の結果を図１に示す。図１から、２種類の抗ＣｒｙＪ１モノクローナル抗体によるサンドイッチＥＬＩＳＡの検出感度は、約１ｎｇ／ｍｌであることがわかる。
【００１１】
３．熱変性ＣｒｙＪ１溶液の調製
ガラスチューブ(口径１０ｍｍ)にスギ花粉(０.１ｇ)を入れ、シリコン栓で蓋をし、ボルテックスで撹拌し、スギ花粉をガラス表面に均一に吸着させた。このガラスチューブをオーブンに入れ、一定温度で一定時間にわたり熱処理した。０.１２５Ｍ ＮａＨＣＯ３(１ｍｌ)を加えて熱処理を停止し、氷冷した。この０.１２５Ｍ ＮａＨＣＯ３溶液を１.５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、シェーカーを用いて４℃で１時間撹拌した。次に、１０,０００ｘｇで１０分間遠心し、未溶解の花粉を沈殿させ、得られた上清を熱変性ＣｒｙＪ１溶液とした。
【００１２】
４．熱変性ＣｒｙＪ１のサンドイッチＥＬＩＳＡによる分析
未変性ＣｒｙＪ１溶液の代わりに、１００℃で３０秒、１分、３分、５分、１０分、３０分、１時間にわたり熱処理することによって得た熱変性ＣｒｙＪ１溶液を用いたことを除き、ｍＡｂ０１３およびｍＡｂ０５３を用いて上記２と同様の分析を行った。
この分析の結果を図２に示す。図２から、ＣｒｙＪ１を１００℃で３分以上にわたり熱処理したときには、ＣｒｙＪ１の抗原活性は著しく低下することがわかる。
【００１３】
５．熱変性ＣｒｙＪ１のＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分析
１００℃で３０秒、１分、３分、５分、１０分、３０分、１時間にわたり熱処理することによって得た熱変性ＣｒｙＪ１溶液を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した。
この分析の結果を図３に示す。図３において各レーンは次のように対応する：レーン１：熱処理なし、レーン２：３０秒間処理、レーン３：１分間処理、レーン４：３分間処理、レーン５：５分間処理、レーン６：１０分間処理、レーン７：３０分間処理、レーン８：１時間処理。図３から明らかなように、ＣｒｙＪ１に対応するタンパク質が全てのレーンにおいて観察され、ＣｒｙＪ１は、１００℃で１時間までの熱処理によって分解されないことがわかる。
即ち、上記４の結果と合わせると、ＣｒｙＪ１は、熱変性により抗原活性を失うが、タンパク質は残存しており、ｍＡｂ０１３およびｍＡｂ０５３を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡによっては、熱処理によるアレルゲン除去の評価を正確に行うことができないことを示す。
【００１４】
実施例１：熱変性ＣｒｙＪ１を認識できる抗体の検索
現在入手可能な４種類の抗ＣｒｙＪ１抗体について、単抗体ＥＬＩＳＡにより抗体の結合性を比較した。
未変性および熱変性ＣｒｙＪ１溶液を、９６穴マイクロプレートの各穴に５０μｌずつ加え、プレートシールで上面をシールし、室温で２時間もしくは４℃で終夜静置した。次いで、ＣｒｙＪ１溶液を除去し、０.１％Ｔｗｅｅｎ-２０含有ＰＢＳで３回洗浄し、０.１％Ｔｗｅｅｎ-２０含有ＰＢＳを各穴に２００μｌずつ加え、３０分間静置した。０.１％Ｔｗｅｅｎ-２０含有ＰＢＳを除去し、抗体溶液(ｍＡｂ０５３、ｍＡｂ０１３、ｍＡｂ０２６およびｐＡｂをＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎで１０μｇ／ｍｌとなるように希釈)を各穴に５０μｌずつ加え、プレートシールで上面をシールし、室温で４時間もしくは４℃で終夜静置した。次いで、抗体溶液を除去し、各穴を０.１％Ｔｗｅｅｎ-２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を０.１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１,０００倍希釈し、各穴に５０μｌずつ加え、プレートシールで上面をシールし、室温で４時間もしくは４℃で終夜静置した。次いで、抗体溶液を除去し、各穴を０.１％Ｔｗｅｅｎ-２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。上記基質溶液を各穴に２００μｌずつ加え、３０〜４０分間静置した。次いで、各穴に２Ｎ硫酸を５０μｌずつ加え、３０分以内に吸光度(４９２ｎｍ)を測定した。
この分析の結果を図４Ａ〜Ｄに示す。図４Ａ〜Ｄから、現在入手可能な４種類の抗ＣｒｙＪ１抗体のうち、ｍＡｂ０２６およびｐＡｂは熱変性ＣｒｙＪ１を認識できることがわかる。
【００１５】
実施例２：熱変性ＣｒｙＪ１の抗原活性の変化
１００℃で種々の時間にわたり熱処理したスギ花粉から抽出された熱変性ＣｒｙＪ１の抗原活性の変化を、上記２および実施例１に記載したようなサンドイッチＥＬＩＳＡおよび単抗体ＥＬＩＳＡによって調べた。サンドイッチＥＬＩＳＡにはｍＡｂ０１３／ｍＡｂ０５３を用い、単抗体ＥＬＩＳＡにはｍＡｂ０２６を用いた。熱変性ＣｒｙＪ１を０.１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。
この分析の結果を図５ＡおよびＢに示す。図５ＡおよびＢから、ｍＡｂ０１３／ｍＡｂ０５３のＣｒｙＪ１に対する結合性は、１００℃で１分の処理でほぼ失われたが、ｍＡｂ０２６は結合性を保持しており、ＳＤＳ-ＰＡＧＥの結果とよく一致した。
【００１６】
実施例３：熱変性ＣｒｙＪ１のサンドイッチＥＬＩＳＡ(ｍＡｂ０１３／ｍＡｂ０５３)による分析
種々の温度および時間で熱処理したスギ花粉から抽出された熱変性ＣｒｙＪ１を、ｍＡｂ０１３およびｍＡｂ０５３を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析した。
この分析の結果を図６に示す。図６から、処理温度が５０℃である場合には、抗原活性が比較的長い処理時間にわたり保持されるが、処理温度が１００℃、１５０℃、２００℃である場合には、温度が高くなるほど抗原活性は短い処理時間までしか保持されないことがわかる。
【００１７】
実施例４：熱変性ＣｒｙＪ１の単抗体ＥＬＩＳＡ(ｐＡｂ)による分析
１００℃で種々の時間にわたり熱処理したスギ花粉から抽出された熱変性ＣｒｙＪ１を、ｐＡｂを用いて単抗体ＥＬＩＳＡにより分析した。
この分析の結果を図７に示す。図７から、ｐＡｂを用いた場合には、比較的長い時間にわたり熱処理された熱変性ＣｒｙＪ１であっても検出可能であることがわかる。
【００１８】
実施例５：熱変性ＣｒｙＪ１の単抗体ＥＬＩＳＡ(ｍＡｂ０２６)による分析
１００℃で種々の時間にわたり熱処理したスギ花粉から抽出された熱変性ＣｒｙＪ１を、ｍＡｂ０２６を用いて単抗体ＥＬＩＳＡにより分析した。
この分析の結果を図８に示す。図８から、ｍＡｂ０２６を用いた場合には、１００℃で１０分未満の熱処理がなされた熱変性ＣｒｙＪ１を検出できることがわかる。
【００１９】
実施例６：熱変性ＣｒｙＪ１の２種類のサンドイッチＥＬＩＳＡ(ｍＡｂ０１３／ｍＡｂ０５３およびｐＡｂ／ｍＡｂ０２６)による分析
６０℃および１００℃で種々の時間にわたり熱処理したスギ花粉から抽出された熱変性ＣｒｙＪ１を用い、ｍＡｂ０１３／ｍＡｂ０５３を用いる場合には上記２と同様にして、また、ｐＡｂ／ｍＡｂ０２６を用いる場合には以下のようにして、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。
１次抗体(ｐＡｂ)をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌとなるように希釈した。この希釈溶液を、９６穴マイクロプレートの各穴に５０μｌずつ加え、プレートシールで上面をシールし、室温で２時間静置した。次いで、抗体溶液を除去し、ブロッキング緩衝液(StartingBlock Blocking Buffers；PIERCE社製)を各穴に３００μｌずつ加え、１０秒後にプレートからブロッキング緩衝液を除去した。試料溶液(各濃度に調整したＣｒｙＪ１溶液)および対照溶液(ＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ)を各穴に５０μｌずつ加え、プレートシールで上面をシールし、室温で１.５時間静置した。次いで、試料溶液および対照溶液を除去し、各穴をＴｗｅｅｎ-２０含有ＰＢＳ(２５０μｌ)で３回洗浄した。２次抗体(ｍＡｂ０２６)をＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎで１０μｇ／ｍｌとなるように希釈し、この希釈溶液を、各穴に５０μｌずつ加え、プレートシールで上面をシールし、室温で２時間静置した。次いで、抗体溶液を除去し、各穴をＴｗｅｅｎ-２０含有ＰＢＳ(２５０μｌ)で３回洗浄した。ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体をＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎで１０,０００倍希釈し、各穴に５０μｌずつ加え、プレートシールで上面をシールし、室温で１.５時間静置した。次いで、酵素標識抗体溶液を除去し、各穴を０.１％Ｔｗｅｅｎ-２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。上記基質溶液を各穴に１００μｌずつ加え、５分間静置した。次いで、各穴に２Ｎ硫酸を１００μｌずつ加え、３０分以内に吸光度(４９２ｎｍ)を測定した。
この分析の結果を図９ＡおよびＢに示す。図９ＡおよびＢから、ｐＡｂとｍＡｂ０２６を組み合わせることにより、熱変性ＣｒｙＪ１を特異的に検出できるサンドイッチＥＬＩＳＡを構築できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】未変性ＣｒｙＪ１のサンドイッチＥＬＩＳＡ(ｍＡｂ０１３／ｍＡｂ０５３)による分析結果を示すグラフである。
【図２】熱変性ＣｒｙＪ１のサンドイッチＥＬＩＳＡ(ｍＡｂ０１３／ｍＡｂ０５３)による分析結果を示すグラフである。
【図３】熱変性ＣｒｙＪ１のＳＤＳ-ＰＡＧＥ(電気泳動)による分析結果を示す図面代用写真である。
【図４】４種類の抗ＣｒｙＪ１抗体を用いて、単抗体ＥＬＩＳＡにより熱変性ＣｒｙＪ１との結合性を調べた結果を示すグラフである(Ａ：ｍＡｂ０５３；Ｂ：ｍＡｂ０１３；Ｃ：ｍＡｂ０２６；Ｄ：ｐＡｂ)。
【００２１】
【図５】熱変性ＣｒｙＪ１の抗原活性の変化を調べた結果を示すグラフである[Ａ：サンドイッチＥＬＩＳＡ(ｍＡｂ０１３／ｍＡｂ０５３)；Ｂ：単抗体ＥＬＩＳＡ(ｍＡｂ０２６)]。
【図６】熱変性ＣｒｙＪ１のサンドイッチＥＬＩＳＡ(ｍＡｂ０１３／ｍＡｂ０５３)による分析結果を示すグラフである。
【図７】熱変性ＣｒｙＪ１の単抗体ＥＬＩＳＡ(ｐＡｂ)による分析結果を示すグラフである。
【図８】熱変性ＣｒｙＪ１の単抗体ＥＬＩＳＡ(ｍＡｂ０２６)による分析結果を示すグラフである。
【図９】熱変性ＣｒｙＪ１の２種類のサンドイッチＥＬＩＳＡによる分析結果を示すグラフである(Ａ：ｍＡｂ０１３／ｍＡｂ０５３；Ｂ：ｐＡｂ／ｍＡｂ０２６)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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