(57)【要約】      （修正有）【課題】４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩の製造法の提供。【解決手段】アミノ基供与体の存在下、アセトアルデドとα−ケトブタン酸又はその塩から下記式（Ｉ）に示す４ＨＩＬ(４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン) の生成反応を触媒する活性を持つ生体触媒を、α−アミノブタン酸をアミノ基供与体とするアミノ基供与体の存在で、アセトアルデヒドとα−ケトブタン酸又はその塩と接触させ、４ＨＩＬを単離する工程からなる製造方法。2008073037.tif 000015【選択図】図１１
2008073037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性溶媒中で、アミノ基供与体の存在下、アセトアルデヒドとα−ケトブタン酸から4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生成する反応を触媒する生体触媒をアセトアルデヒドとα−ケトブタン酸と接触させ、
4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離する工程を含む、4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩の製造方法。
【請求項２】
生体触媒がアルドラーゼを含む請求項１の方法。
【請求項３】
生体触媒がアミノトランスフェラーゼを含む請求項１又は２の方法。
【請求項４】
生体触媒が、アセトアルデヒドおよびα−ケトブタン酸から4−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケトペンタン酸を生成するアルドラーゼと、α−アミノブタン酸の存在下、4−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケトペンタン酸から4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生成するアミノトランスフェラーゼとを含む請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項５】
生体触媒が、アセトアルデヒドおよびα−ケトブタン酸から4−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケトペンタン酸を生成するアルドラーゼと、α−アミノブタン酸の存在下、4−ヒドロキシ−３−メチルー２−ケトペンタン酸から4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生成するアミノトランスフェラーゼとを含む細菌である請求項１〜４のいずれかの方法。
【請求項６】
アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼの内、少なくとも1方の活性を増強するように細菌が改変されている請求項５の方法。
【請求項７】
アルドラーゼおよび/又はアミノトランスフェラーゼの発現を増加させることにより、アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼの活性が増強されている請求項６の方法。
【請求項８】
アルドラーゼおよび/又はアミノトランスフェラーゼの発現が、当該アルドラーゼおよび/又はアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現制御配列の改変によるか、又は当該アルドラーゼおよび/又はアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数の増加によって増加させられる請求項７の方法。
【請求項９】
アルドラーゼが、アルドラーゼのhpcH/hpaIファミリーに属するアルドラーゼである 請求項２〜８のいずれかの方法。
【請求項１０】
アルドラーゼが、エシェリヒア、アースロバクター、およびシュードモナスからなる群から選択された細菌から単離されたものである 請求項９の方法。
【請求項１１】
アミノトランスフェラーゼが、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼに属するアミノトランスフェラーゼである請求項３〜８のいずれかの方法。
【請求項１２】
分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、エシェリヒアおよびバチルスからなる群から選択された細菌から単離されたものである 請求項１１の方法。
【請求項１３】
細菌が細菌の培養物、細胞、あるいは処理した細胞である 請求項５〜８のいずれかの方法。
【請求項１４】
4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンが、 (2S,3S,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン、(2S,3R,4R)-4-ヒドロキシイソロイシン、(2S,3S,4R)-4-ヒドロキシイソロイシン、および (2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシンからなる群から選択される少なくとも一種である請求項１〜１３のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物産業、詳しくは4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、コロハ（フェヌグリーク）種子 (Trigonella foenum-graecum L.leguminosae) から抽出、精製できるアミノ酸である。4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、興味深いインスリン分泌性活性を示すが、これは、単離潅流ラット膵臓およびヒトの膵島の両者で実証されているように、その促進効果がミディアム中の血漿グルコース濃度に明白に依存するからである (Sauvaire, Y.ら, Diabetes, 47: 206-210, (1998))。そのようなグルコース依存性は、２型糖尿病[非インスリン依存性糖尿病、（NIDD) mellitus (NIDDM)]の治療に現在使用されている唯一のインスリン分泌活性薬であるスルホニル尿素(Drucker, D. J., Diabetes 47: 159-169, (1998)) では確認されていない。その結果、低血糖症が依然として、スルホニル尿素治療の通常望ましくない副作用である。(Jackson, J., and Bessler, R. Drugs, 22: 211-245; 295-320, (1981); Jennings, A. ら. Diabetes Care, 12: 203-208, (1989))。またグルコース耐性の改善も知られている。（(Am. J. Physiol. Endocrinol., Vol. 287, E463-E471, 2004) 。このグルコース代謝増強活性とその医薬品と健康食品への応用の可能性が報告された(特開平6-157302号公報)。
【０００３】
植物にのみ発見されている4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、その特定インスリン分泌性作用のために、様々な程度のインスリン耐性に関連するインスリン分泌不全を特徴とする疾病である、２型糖尿病の治療用の可能性を秘めた新規分泌促進剤と見なしてもよい(Broca, C. ら, Am. J. Physiol. 277 (Endocrinol. Metab. 40): E617-E623, (1999))
。
【０００４】
フェヌグリーク（コロハ）抽出液中のジオキシゲナーゼ活性を利用する鉄、アスコルビン酸、2-オキソグルタル酸、酸素に依存するイソロイシンの酸化法が4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造法として、報告されている((Phytochemistry, Vol. 44, No. 4, pp. 563-566, 1997)。しかし、この方法は、20mM以上のイソロイシン濃度で酵素活性が基質で阻害され、この酵素が同定されていなく、酵素は植物の抽出液から誘導され、たやすく大量に得られなく、かつ、この酵素が安定でないために、4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造法として不充分である。
【０００５】
光学的に純粋な(2S、3R、4S)-4-ヒドロキシイソロイシンが全収率39%で得られる効率的な8工程合成が開示されている。この合成の重要な工程は、ethyl 2-methylacetoacetateをGeotrichum candidum でethyl (2S,3S)-2-methyl-3-  hydroxybutanoate に生物変換すること、および不斉Strecker 合成を含む (Wang, Q. ら, Eur. J. Org. Chem., 834-839 (2002)) 。
【０００６】
短い6工程で立体化学を完全に制御した(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン の化学酵素的合成も発表されているが、最終工程は市販のEupergit C(E-PAC)上固定化ペニシリン・アシラーゼGを使用したN-phenylacetyl lactone誘導体の加水分解による酵素的分割である(Rolland-Fulcrand,V.ら, J. Org. Chem., 873-877 (2004))。
【０００７】
しかし、現在、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケトペンタン酸の酵素的アミノ基転移反応により、あるいは他の原料から別の酵素的転化により4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロ
イシンを生成する報告はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明が解決しようとする課題は工業的に利用できる4−ヒドロキシ−L−イソロイシン(遊離および塩の両形態を含むことを意味し、“4HIL”と呼ぶこともある；以下同様)を製造する方法を如何に提供するかである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、4HILの前駆体である、4−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケトペンタン酸(遊離および塩の両形態を含む意味をもつ。“HMKP”“と呼ぶこともある；以下同様) を取得するのにアルドール反応を使用し、アミノトランスフェラーゼによって4HILに変換する方法に着目し、E．コリ由来のMhpEアルドラーゼ (Appl. Environ. Microbiol., Vol. 64, No.10, 4093-4094,1998) および杉山ら報告のアルドラーゼ (WO2004-018672) の使用を検討した。しかしHMKP の生成量は常に1μM未満であり、アミノ基転移反応に使用するには不充分であった。そこで、さらに検討の結果、それぞれアルドール反応とアミノ基転移反応に向いた酵素の発見に至った。さらに、二酵素系反応で4HILの収率向上可能なアミノ基供与体を見出した。換言すれば、本発明によれば、最適な縦列（tandem）生体触媒およびアミノ基供与体を用いて、簡易に４−ヒドロキシ−L−イソロイシンを製造する方法を提供できる。
【００１０】
従って、本発明の目的は、アルドール反応およびアミノ基転移の２工程で4HILを生成する酵素的方法を提供することを含む。
すなわち、本発明は少なくとも下記の内容を含む。
【００１１】
[1]  水性溶媒中で、アミノ基供与体の存在下、アセトアルデヒドとα−ケトブタン酸から4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生成する反応を触媒する生体触媒をアセトアルデヒドとα−ケトブタン酸と接触させ、
4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離する工程を含む、4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩の製造方法。
【００１２】
[2]  生体触媒がアルドラーゼを含む [1]の方法。
[3]  生体触媒がアミノトランスフェラーゼを含む [1] 又は [2] の方法。
[4]  生体触媒が、アセトアルデヒドおよびα−ケトブタン酸から4−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケトペンタン酸を生成するアルドラーゼと、α−アミノブタン酸の存在下、4−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸から4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生成する、アミノトランスフェラーゼとを含む [1] 〜 [3] のいずれかの方法。
【００１３】
[5]  生体触媒が、アセトアルデヒドおよびα−ケトブタン酸から4−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケトペンタン酸を生成するアルドラーゼと、α−アミノブタン酸の存在下、4−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケトペンタン酸から4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生成する、アミノトランスフェラーゼとを含む細菌である[1]〜[4]のいずれかの方法。
【００１４】
[6]  アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼの内、少なくとも1方の活性を増強するように細菌が改変されている[5]の方法。
[7]  アルドラーゼおよび/又はアミノトランスフェラーゼの発現を増加させることにより、アルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼの活性が増強されている [6] の方法。
【００１５】
[8]  アルドラーゼおよび/又はアミノトランスフェラーゼの発現が、当該アルドラーゼ
および/又はアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現制御配列の改変によるか、又は当該アルドラーゼおよび/又はアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数の増加によって増加させられる、 [7]の方法
[9]  アルドラーゼが、アルドラーゼのhpcH/hpaIファミリーに属するアルドラーゼである[2]〜[8] のいずれかの方法。
【００１６】
[10]   アルドラーゼが、エシェリヒア、アースロバクター、およびシュードモナスからなる群から選択された細菌から単離されたものである[9]の方法。
[11]   アミノトランスフェラーゼが、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼに属するアミノトランスフェラーゼである[3]〜[8] のいずれかの方法。
【００１７】
[12]  分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、エシェリヒアおよびバチルスからなる群から選択された細菌から単離されたものである[11]の方法。
[13]  細菌が細菌の培養物、細胞、あるいは処理した細胞である[5]〜[8]のいずれかの方法。
【００１８】
[14]   4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンが、少なくとも(2S,3S,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン、(2S,3R,4R)-4-ヒドロキシイソロイシン、(2S,3S,4R)-4-ヒドロキシイソロイシン、および (2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシンからなる群から選択されたすくなくとも一つである[1]〜[13]のいずれかの方法。
【００１９】
本発明によれば、簡便な製造法が従来知られていなかった4HILを、産業上有用な方式で製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明を以下詳細に記述する。
1.本発明の実施に使用できる一般的な定義および方法
本明細書では、用語「4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン」あるいは「4HIL」は、(2S,3S,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン、(2S,3R,4R)-4-ヒドロキシイソロイシン、(2S,3S,4R)-4-ヒドロキシソロイシンおよび (2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシンからなる群から選択された一種の化合物あるいは二種以上のジアステレオマー混合物を意味する。
【００２１】
用語「4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン」、「4HIL」、「α−アミノブタン酸」、「α−ケトブタン酸」は、それぞれ、遊離型および塩型の両者を含む意味で使用する。
明細書で使用する用語「細菌」は、酵素を生成する細菌、突然変異体、および目的とする酵素活性が存在するか、又は、増強されたかかる細菌の遺伝子組み換え体等を含む。
【００２２】
「遺伝子の発現を増加する」、という語句は、遺伝子の発現が非改変菌株、例えば野生型菌株より高いことを意味する。そのような改変の例は、細胞１個当たりの発現された遺伝子のコピー数を増加させること、遺伝子の発現レベルを増加させることなどを含む。発現された遺伝子のコピー数の量は、例えば、染色体のDNAの制限後、遺伝子配列に基づいたプローブを用いたサザンブロッティング、蛍光in situハイブリッド法（FISH）等で測定される。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量的RT-PCRなどを含む様々な既知の方法で測定することができる。遺伝子によってコードされたタンパク質の量は、SDS-PAGE後イムノブロッティング法検定(ウェスタンブロッティング分析)等を含む既知の方法で測定することができる。
【００２３】
「タンパク質をコードするDNAによる細菌の形質転換」とは、細菌にDNAを例えば、従来の方法で導入することを意味する。このDNAの形質転換は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現の増加をもたらし、細菌の細胞中のタンパク質の活性を増強することに
なる。形質転換の方法は、従来報告されたすべての既知の方法を含む。例えば、細胞のDNAに対する浸透性を増加させるために塩化カルシウムで受容体細胞を処理する方法がエシェリヒア・コリK-12株について報告されており、使用できる(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970))。
【００２４】
遺伝子発現を増加させる方法、遺伝子コピー数を増加させることを包含する。本発明の細菌中で機能できるベクターへ遺伝子を導入すれば、遺伝子のコピー数が増加する。そのような目的のために、好ましくは多重コピー・ベクターが使用できる。多重コピー・ベクターは、pBR322、pMW119、pUC19、pET22b等で例示される。
【００２５】
遺伝子発現の増強も、例えば相同的組み換え、又は、Mu組込みなどにより細菌の染色体へ、遺伝子の多数のコピーを導入することで達成できる。例えば、Mu組込み1回の実行で、細菌の染色体中に遺伝子のコピーが3個まで導入できる。
【００２６】
遺伝子のコピー数を増加させることも、細菌の染色体のDNAへ遺伝子の多数のコピーを導入することにより達成できる。細菌の染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入するためには、多数のコピーが存在する配列を染色体のDNA中のターゲットとして使用して、相同的組み換えを実行する。染色体のDNAに多数のコピーを持つ配列は、反復DNA又は転位因子の末端にある逆方向反復を含むが、これらに制限されない。さらに、米国特許番号5,595,889に開示のように、トランスポゾンに遺伝子を組み入れて、それによって染色体のDNAへ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させることも可能である。
【００２７】
遺伝子発現の増強も、本発明のDNAを強力なプロモーターの制御下におけば達成できる。例えば、Ptac プロモーター、Placプロモーター、Ptrpプロモーター、Ptrcプロモーター、λファージのPR又はPLプロモーターはすべて有効なプロモーターであることが知られている。有効なプロモーターは遺伝子コピーの増加と組み合わせて使用できる。
【００２８】
あるいは、プロモーターの効果は、例えば、プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増加するよう、プロモーターへ変異を導入して増強できる。更に、リボソーム結合部位(RBS)と開始コドン間のスペーサー中のいくつかのヌクレオチド、特に開始コドンのすぐ上流配列の置換がmRNA翻訳能力に深く影響することが知られている。例えば、出発コドンに先行する3箇のヌクレオチドの性質によって発現レベルに20倍の範囲があることが見出されている(Gold ら, Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui ら, EMBO J., 3, 623-629, 1984)。以前に、rhtA23変異は、ATG開始コドンに対して−1の位置でGをAに置換することであると報告されている(抄録:1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biologyと共催の第17回 International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August24-29, 1997, 抄録番号457). 
さらに、細菌の染色体上の遺伝子のプロモーター領域へヌクレオチド置換を導入することも可能であって、これによりプロモーター機能がより強められる。発現制御配列の変更は、例えば、国際公開WO 00/18935 および特開平1-215280号に開示されているように温度敏感なプラスミドを使用して行う遺伝子置換と同様に実行可能である。
【００２９】
プラスミドDNAの調製方法は、DNAの消化と連結（ライゲーション）、形質転換、プライマーとしてオリゴヌクレオチドの選択など、又は、当業者に既知の他の方法を含むが、これらに制限されない。これらの方法は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載されている。
【００３０】
2. 本発明の製造法
本発明の製造法では、アミノ基供与体の存在下、アセトアルデヒドとα−ケトブタン酸から4-HILを生成する活性を有する生体触媒と共に、アセトアルデヒド及びα−ケトブタン酸を水性溶媒中に加えることにより、下記式(I)に示される、4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン（4-HIL）を生成する。
【００３１】
【化１】
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すなわち、本製造法は2工程の酵素反応:(1) アセトアルデヒドとα−ケトブタン酸からHMKPを生成する酵素的アルドール反応の工程および(2)HMKPから酵素的アミノ基転移反応で4HILを生成する工程を含む。本発明者等は、α-アミノブタン酸をアミノ基供与体として添加すると、反応工程(1)および(2)の反応効率を向上できることを見出した。すなわち、α−アミノブタン酸は、工程(2)の酵素的アミノ基転移反応でアミノ基供与体として使用され、それにより工程(1)で使用され、HMKPを形成するように反応の平衡も移動させるα−ケトブタン酸を生成する。
【００３２】
この製造法で使用する生体触媒は、アセトアルデヒドとα−ケトブタン酸から4−ヒドロキシ-3-メチル-2-ペンタン酸を生成する工程(下記の化学反応式(II))を媒介するアルドラーゼ活性がある酵素(アルドラーゼ)を含む酵素と、HMKPから4HILを生成する工程(下記の化学反応式(III))を媒介するアミノ基転移反応活性がある酵素(アミノトランスフェラーゼおよび/又はデヒドロゲナーゼ)とを含む複合酵素である。
【００３３】
【化２】
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本発明の製造法の第１工程で、「アルドール反応」は、α−ケトブタン酸のような対応するケトンの化合物由来のエノレート・イオンがアセトアルデヒドのようなカルボニル化合物と反応して、４-ヒドロキシケトン、例えば4−ヒドロキシ-3-メチル-2-ケトペンタン酸(HMKP)を生成する反応を意味する。
【００３４】
本発明で、酵素的アルドール反応は、アルドラーゼによって引き起こされるか、触媒されるアルドール反応を意味する。
特に、細菌系アルドラーゼが好ましい。当該酵素的アルドール反応は、単離アルドラー
ゼ、アルドラーゼ活性を含む粗酵素溶液により、又は、アルドラーゼ活性を持つ細菌をα−ケトブタン酸とアセトアルデヒドを含む培地で培養することで行なうことができる。そのような細菌の例は、後に詳細に記述するが、このようなアルドラーゼ活性がある如何なる細菌も、本発明において使用可能である。
【００３５】
本発明で、細菌系アルドラーゼは、アセトアルデヒドおよびα−ケトブタン酸からHMKPを生成する反応を触媒することができる酵素である。特に、かかるアルドラーゼが、アセトアルデヒドおよびα−ケトブタン酸からHMKPを生成する反応を触媒する特色を共有する限り、「HpcH/HpaIアルドラーゼファミリー」に分類できるアルドラーゼが好ましい。
【００３６】
従来、用語「HpcH/HpaIアルドラーゼファミリー」(HpcHファミリーがいわゆるHHEDアルドラーゼおよびHKPアルドラーゼを含む)は、2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼおよび4-hydroxy-2-oxovalerateアルドラーゼを含む。これらの酵素は炭水化物の輸送および代謝(異化作用)に関連する。
【００３７】
主な系統発生の血統を表わすタンパク質オーソログ・グループのクラスタ(Clusters of
Orthologous Groups ((COGs)) は、完全なゲノム中にコードされたタンパク質配列を比較して区別した。各COGは、個々のタンパク質あるいは少なくとも三つの血統からのグループのパラログ（paralogs）から成り、このように古代の保存されたドメインに相当する(Tatusov, R.L. ら, Science, 278, 5338, 631-637 (1997); http://www.ncbi.nih.gov/COG)。
【００３８】
HpcH/HpaIアルドラーゼファミリーを特徴づけるのに使用するタンパク質配列は、COG3836(gnl|CDD|13153)(配列番号14)に分類されている。
BLASTタンパク質検索のために、配列番号14のタンパク質配列を照会すると、2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidのアルドラーゼ(登録番号AAF12475、ZP_00501227、ZP_00467871など)、2-dehydro-3-deoxyglucarateアルドラーゼ(登録番号ABB11891、ZP_00687019、ZP_00425668など)およびいくつかの仮想タンパク質(登録番号AAN81241、YP_311186など)を含む、比較的高い相同性を共有する多くのタンパク質が得られるが、これらは、本発明によればHpcH/HpaIアルドラーゼファミリーに含まれる。
【００３９】
相同性検索結果の分析で、HpcH/HpaIアルドラーゼファミリー(2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼおよび4-hydroxy-2-oxovalerateアルドラーゼ)と、2-dehydro-3-deoxyglucarateアルドラーゼと、例えばyhaF遺伝子(同意語- garL遺伝子)(配列番号1)によってコードされた、エシェリヒア・コリ(gb|AAN82322.1)由来の2-dehydro-3-deoxyglucarateアルドラーゼとのタンパク質の間に高程度の相同性があることが明らかになった。yhaF遺伝子のヌクレオチドの配列およびyhaF遺伝子によってコードされたYhaFタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号1および配列番号2にそれぞれ示されている。さらなる実験で(実施例の項参照)、2,4-dihydroxy-hept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼ/4-hydroxy-2-oxovalerateアルドラーゼおよび2-dehydro-3-deoxyglucarateアルドラーゼの両者がα−ケトブタン酸およびアセトアルデヒドからHMKP生成のレギオ選択性反応を触媒することができることが証明された。
【００４０】
2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼの例は、E. コリ由来のyfaU遺伝子を含む。YfaU遺伝子は,推定4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼ(同意語：HHEDアルドラーゼをコードする)(配列番号3 )。yfaU遺伝子のヌクレオチドの配列およびyfaU遺伝子によってコードされたYfaUタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号3 および配列番号4に示されている。4-hydroxy-2- oxovalerateアルドラーゼの例は、シュードモナス・エスピー（KKS102株）由来のbphFを含む。bphF遺伝子は推定4-hydroxy-2-oxovalerateアルドラーゼ(同意語：HOV−アルドラーゼ)をコードする)(配列番号6)。
bphF遺伝子のヌクレオチドの配列およびbphF遺伝子によってコードされたBphFタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号5および配列番号6に示されている。
【００４１】
更に、本発明の発明者は、アースロバクター・シンプレクスAKU626(NBRC12069)株 (以下asiHPALと略記)由来アルドラーゼを精製して、このアルドラーゼのアミノ酸配列を決定した。更に、本発明の発明者は、このアルドラーゼのアミノ酸配列から推定された約30個の塩基対のDNA分子も合成し、このDNA分子を使用して、PCRにより、asiHPALをコードするDNAの全長を単離、取得した。配列番号7のヌクレオチド配列でコードされたasiHPALのアミノ酸配列は配列番号8に示されている。
【００４２】
したがって、本発明の目的では用語、「HpcH/HpaIアルドラーゼファミリー」は、2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼおよび4-hydroxy-2- oxovalerateアルドラーゼの他に、さらに2-dehydro-3-deoxyglucarateアルドラーゼおよびasiHPAL-アルドラーゼを含む。
【００４３】
アルドール反応に続いて、第2の工程である、アミノ基転移反応プロセスに進むことができる。
本発明の製造法の第2の工程では、「アミノ基転移反応」は、供与体化合物,例えばα−アミノブタン酸からケトン基を持つ受容体化合物、例えば４−ヒドロキシ-3−メチル−２−ケトペンタン酸などにアミノ基が転送される反応を意味する。
【００４４】
本発明では、「酵素的アミノ基転移反応」は、アミノトランスフェラーゼ(アミノ基転移酵素)あるいはデヒドロゲナーゼ酵素が行うアミノ基転移反応を意味する。特に、細菌によるアミノトランスフェラーゼ(アミノ基転移酵素)が好まれる。当該酵素的アミノ基転移反応は、単離されたアミノトランスフェラーゼ、アミノトランスフェラーゼ活性を含む粗酵素溶液により、あるいは、アミノトランスフェラーゼ活性を持つ細菌を、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケトペンタン酸を含む培地で培養することで行なうことができる。プロセスの単純化し、4HILの生成コストを減らすために、本方法の培養液に基質を直接加えることが非常に好ましい。
【００４５】
本発明のアミノトランスフェラーゼは分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(BCAT)を含む。例えば、ilvE遺伝子によってコードされたアミノトランスフェラーゼおよびywaA遺伝子によってコードされた分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼなどがその例である。
【００４６】
分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(BCAT)が好ましい。
BCATを特徴づけるのに使用するタンパク質配列はCOG0115(配列番号15)に分類されている。また、BCATに属するタンパク質は、EC 2.6.1.42に分類されている。
【００４７】
実際には、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、すべて広い基質特異性を示すので、大抵のものは、アミノ基転位で基質としてHMKPを使用することができると期待される。
【００４８】
分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは,Ｌ-グルタミン酸から、種々のα-ケト酸、例えば、α-ketoisovaleric acid、2-keto-3-methylvaleric acid及び2-keto-4-methyl-pentanoic acidにアミノ基を転位させ、それぞれL-バリン、L-イソロイシンおよび L-ロイシンを生成する反応を触媒する。
【００４９】
多数の微生物由来の分岐鎖アミノ酸のアミノトランスフェラーゼが知られていて、これらのアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチドの配列が開示されてい
る。
【００５０】
ilvE遺伝子は、エシェリヒア・コリ由来の分岐鎖アミノ酸のアミノ基転移酵素であるIlvEタンパク質(同意語はB3770、IlvE、分岐鎖アミノ酸:2-oxoglutaric acidアミノトランスフェラーゼ、BCAT、アミノ基転移酵素B、ロイシンアミノ基転移酵素、バリン・アミノ基転移酵素,およびイソロイシン・アミノ基転移酵素を包含）をコードする。ilvE遺伝子は、エシェリヒア・コリK-12株の染色体上のilvMとilvDの間に位置する。ilvE遺伝子のヌクレオチド配列は公知である。(ヌクレオチドの位置:3950507〜3951436;GenBank登録番号：NC_000913.2;gi:49175990)(配列番号9)。ilvE遺伝子のヌクレオチドの配列およびilvE遺伝子によってコードされたIlvEタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号9および配列番号10に示されている
ywaA遺伝子は、Bacillus subtilis由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする。ywaA遺伝子は、B.subtilis 168株の染色体上,dltEとlicHの間に位置する。ywaA遺伝子のヌクレオチド配列は公知である。(ヌクレオチドの位置:3956412〜3957503;GenBank登録番号：NC_000964.2;gi:50812173)(配列番号11)。ywaA遺伝子のヌクレオチド配列およびywaA遺伝子によってコードされるYwaAタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号11および配列番号12に示されている。
【００５１】
他の微生物由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする、未注釈の遺伝子は、分岐鎖のアミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする既知の遺伝子への相同性、次いで遺伝子によってコードされたタンパク質の活性の評価で同定できる。
【００５２】
二種のアミノ酸配列間の相同性は、よく知られた方法、例えば、三つのパラメーター：スコア、同一性および類似性を計算する、コンピュータ・プログラムBLAST 2.0を使用して、決定することができる。
【００５３】
したがって、E.コリ由来のilvE遺伝子およびB.subtilis由来のywaA遺伝子は、遺伝子の既知のヌクレオチドの配列に基づいて調製されたプライマーを利用するPCR (polymerase chain reaction;： White, T.J. ら., Trends Genet., 5, 185 (1989）を参照)で得ることができる。他の微生物由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、同様に取得できる。
【００５４】
細菌の菌株間でDNA配列に若干違いがあることがあるので、使用すべきアルドラーゼあるいはBCATをコードする、上記の遺伝子は配列番号1、3、5、7、9および11に示すヌクレオチド配列に制限されず、さらに配列番号1、3、5、7、9および11に示すものに類似のヌクレオチドの配列を含めてもよい。したがって、上記の遺伝子がコードするタンパク質変異型は、これらのタンパク質が前述の反応を触媒する能力を維持する限り、配列番号2、4、6、8、10および12に示アミノ酸配列全体に関して、80%以上、好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上類似していればよい。
【００５５】
さらに、上記の遺伝子は、機能的なタンパク質をコードする限り、配列番号1、3、5、7、9および11に示すヌクレオチドの配列、あるいはこれらのヌクレオチドの配列に基づいて調製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる変異体でもよい。「ストリンジェントな条件」とは、特定のハイブリッドが形成され、非特異性のハイブリッドは生成されない条件を包含する。例えば、ストリンジェントな条件の例は、1×SSCおよび0.1%のSDS、好ましくは0.1×SSCおよび0.1%のSDSを含む溶液で60℃で1回、好ましくは2、3回洗浄することである。プローブの長さはハイブリッド形成条件によって、適切に選択出来、通常100 bpから1 kbpまでの範囲である。
【００５６】
上記のアルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼ(あるいはデヒドロゲナーゼ)を組
込む限り、生体触媒は、細菌(培養物、細菌の細胞、あるいは処置済み細胞を含む)、精製酵素、あるいは粗酵素のような任意の形態で使用することができる。本発明で使用される細菌の処置した細胞の形態の例は、乾燥菌体、凍結乾燥菌体。界面活性剤あるいは有機溶媒処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的破砕処理物、溶剤処理物、菌体のタンパク質画分、菌体固定化物、およびプロセスした菌体である。アミノ基供与体の存在で、アセトアルデヒド、α−アミノブタン酸、およびα−ケトブタン酸から4HIL生成の活性があるいずれの細菌も使用することができる。
【００５７】
細菌を本製造法で使用する場合、基質を含む培地でのアルドラーゼおよび/又はアミノトランスフェラーゼの活性を増強し、培地から生成4HILを単離するよう、かかる細菌を改変することができる。
【００５８】
本発明の製造法の一態様では、細菌は、増幅および／又は発現されたアルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含む組み換え微生物である。
本発明の製造法では、アセトアルデヒドおよびα−ケトブタン酸がアルドラーゼによって酵素反応を受け、さらにBCATによってアミノ基転移されるが、両者[酵素]共、増幅および発現されたアルドラーゼおよびBCATの遺伝子を含む組み換え微生物中で生成され、蓄積されている。
【００５９】
細菌を生体触媒として使用する場合に、チゾサッカロマイセス属、アースロバクター属、ブレビバクテリウム属、キャンディダ属、コリネバクテリウム属、ミクロコッカス属、セルロモナス属、アクチノプラネス属、クロモバクテリウム属、ラネラ属、リゾビウム属、エルヴィニア属、ハンセヌラ属、トルロプシス属、クロエケラ属、ロドトルラ属、パネラス属、ムコール属、デバリオミセス属、スポロボロミセス属、エシェリヒア属、サルモネラ属、フラボバクテリウム属、バチルス属又はプロテウス属の細菌が例示できる。
【００６０】
これらのうち、チゾサッカロマイセス属、キャンディダ属、アースロバクター属、ブレビバクテリウム属、エシェリヒア属、又はバチルス属の細菌を使用することが好ましい。
具体的な例は: Schizosaccharomyces pombe, Arthrobacter simplex, Brevibacterium ammoniagenes, Candida utilis, Micrococcus luteus, Micrococcus flavus, Micrococcus roseus, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium aquaticum, Corynebacterium
paurometabolum, Arthrobactor globiformis, Arthrobactor sulfureus, Arthrobactor viscosus, Brevibacterium protophormiae, Brevibacterium acetylicum, Brevibacterium stationis, Brevibacterium fuscum, Cellulomonas fimi, Cellulomonas biazotea, Chromobacterium iodinum, Erwinia carotovora subsp. carotovora, Hansenula anomala, Hansenula miso, Candida stellata, Hansenula saturnus, Hansenula nonfermentans, Hansenula polymorpha, Torulopsis nitratophila, Candida guilliermondii, Candida lipolytica, Candida macedoniensis, Candida pseudotropicalis, Candida tropicalis var. lambica, Candida solani, Candida albicans, Kloeckera africana , Kloeckera japonica, Rhodotorula mucilaginosa, Panellus serotinus , Mucor racemosus f.sp. racemosus, Mucor lamprosporus, Mucor petrinsularis, Debaryomyces vanrijiae, Sporobolomyces roseus, Escherichia コリ K12, Salmonella typhimurium, Flavobacterium ferrugineum, Bacillus subtilis, および Proteus mirabilisである。
【００６１】
これらの中で好ましい例は、Brevibacterium ammoniagenes, Arthrobacter simplex, Micrococcus luteus, Micrococcus flavus, Corynebacterium glutamicum, Escherichia コリ K12, Bacillus subtilis, およびErwinia carotovora subsp. carotovoraである。
【００６２】
これらの細菌は、通常の培養方法で培養できる。培地は、天然あるいは合成のいずれでも、該細菌を効率的に培養させることができ、当該細菌が資化し得る炭素源・窒素源・無
機塩源等を含んでいれば、培養に用いることができる。
【００６３】
炭素源は、当該細菌が資化し得ることが必要なだけである。使用に適当な炭素源は、グルコース、フラクトース、シュークロース、およびマルトースのような糖類；澱粉、澱粉加水分解物および糖蜜；酢酸、乳酸、グルタミン酸などの有機酸；およびエタノール、プロパノールなどのアルコール類である。使用に適当な窒素源としては、当該細菌が資化できる限り、アンモニア；硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩；その他含窒素化合物；並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解物、大豆、大豆加水分解物、大豆粕および大豆加水分解物（前出）、各種発酵菌体およびそれらの消化物等を包含する。
【００６４】
使用してもよい無機塩は、当該微生物が資化できる限り、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄および硫酸マンガンを含む。他に、カルシウム、亜鉛、ホウ素、銅、コバルト、およびモリブデンのような元素の塩類を微量加えてもよい。必要に応じてチアミン、ビオチンのようなビタミン；グルタミン酸、アスパラギン酸のようなアミノ酸；およびアデニン、グアニンのような核酸関連物質なども添加してよい。
【００６５】
培養は、振とう培養又は深部通気かくはん培養などの好気的条件下で行われる。培養温度15〜37℃、培養時間10〜96時間で充分である。培地のpHは、5.O〜9.Oに保たれる。pHは、有機あるいは無機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、又はアンモニアで調整できる。
【００６６】
下記の化学式（IV）のα−アミノブタン酸（2‐アミノブタン酸）を、HMKPから4HILを生成する酵素的アミノ基転移工程でアミノ基供与体として用いる。
【００６７】
【化３】
2008073037.tif 000005
α−アミノブタン酸に加えて、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素などの無機アンモニウム塩、並びにグルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシンのような種々のアミノ酸、および他の分岐鎖アミノ酸を追加のアミノ基供与体として添加できる。これらのアミノ酸は、主としてL体の形態で本発明に利用されるので、L体の遊離酸又は適当な塩の形態で使用されることが好ましい。α−アミノブタン酸の濃度は10〜3,000 mM、好ましくは50〜1,000mMである。α−ケトブタン酸の濃度は、α−アミノブタン酸濃度の5〜50%であるのが望ましい。
【００６８】
本発明では、アセトアルデヒドの濃度は10〜3,000 mM、好ましくは50〜1,000mMである。アセトアルデヒド濃度は調製した溶液をF-キット・アセトアルデヒド(F-Kit Acetaldehyde(ロッシュ・ダイアグノスティック社製)で測定するか、あるいは単純に試薬の純度に基づいた希釈・調製法で決定できる。
【００６９】
反応に使用する溶媒は、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリス、あるいはその他の緩衝液等の水性溶媒；ならびに、メタノール、エタノールなどのアルコール類；酢酸エチルなどのエステル類；アセトンなどのケトン類；アセトアミドなどのアミド類；その他の有機溶媒；あるいは、一種以上の上記成分を含有した水性溶媒でよ
い。必要に応じてTriton X-100やNonion HS204(NOF社製)などの界面活性剤、あるいは、トルエンやキシレンなどの有機溶媒を約0.1〜20g/Lの割合で添加できる。
【００７０】
本製造法において用いられる細菌の濃度はO.1〜700g/L、好ましくは10〜300g/L(菌体(湿重量)基準)である。水性媒体に当該細菌、アミノ基供与体、アセトアルデヒドおよびα−ケトブタン酸を上記濃度で添加し、温度15〜60℃、好ましくは20〜50℃、pH5〜12、好ましくはpH7〜11の条件下で、10分〜80時間反応させ、4HILを製造することができる。
【００７１】
本製造法において、4HIL を製造するために、生体触媒として用いられる細菌の初発培養液又は途中に、アミノ基供与体、アセトアルデヒドおよびα−ケトブタン酸を上記濃度で添加することができる。
【００７２】
反応中に、反応基質と、反応触媒として用いられる細菌のほかに、上記のBCATを反応中の水性溶媒に添加することができる。このプロセスで、細菌を形質転換するために、BCATをコードする遺伝子を生体触媒として用いる細菌に組み入れることができるし、又は、E.コリのような各種細菌あるいは昆虫細胞などの適当な宿主細胞にBCATをコードする遺伝子を組み入れ形質転換体を得ることができる。次いでBCATは、得られた形質転換体の菌体、薗体処理物、又は、精製酵素又は粗酵素などの形態で使用できる。
【００７３】
粗酵素溶液を使用して4HILの生成反応を実施する場合、培養した微生物は遠心分離操作などで回収され、次に、細胞はアルドラーゼとアミノトランスフェラーゼおよび／又はデヒドロゲナーゼを含む粗酵素溶液を調製するために破砕するか、あるいは、溶解させる。細胞を破砕するのに超音波破砕、フレンチ・プレスによる破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることが出来、一方細胞を溶解するために、卵白（胚乳）リゾチームあるいはペプチダーゼによる処置、あるいはこれらの適切な組み合わせのような方法が用いられる。精製酵素溶液を使用して、4HILの生成反応を実施する場合、アルドラーゼとアミノトランスフェラーゼ、および／又はデヒドロゲナーゼを含む粗酵素溶液は、沈殿、濾過、カラムクロマトグラフィなどのような通常の技術で精製される。
【００７４】
培養液から微生物の分離と回収および酵素溶液の調製は、遠心分離、超音波破砕、イオン交換樹脂法、沈澱法などのような既知の方法の組み合わせで普通行うことができる。
単離したBCATは、生体内、あるいは生体外で分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現し、次いで分取クロマトグラフィの使用で得られた酵素を単離すること、BCATおよび／又はアルドラーゼに対する抗体を精製し、His6タグを持つ分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼおよび／又はアルドラーゼをコードする改変済の遺伝子を発現し、次いでpET発現システム(Novagen)を使用してニッケルカラムで単離することなどを含む従来の方法で取得できる。
【００７５】
分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼおよび／又はアルドラーゼの活性は、例えば、Lee-Peng, F.C. ら (J Bacteriol. 139(2): 339-345 (1979)) が記載した方法で検知および測定することができる。
【００７６】
4HILの生成反応がBCATを含む粗製酵素溶液あるいは精製酵素を使用して行われる場合、反応は、基質HMKPおよび粗製酵素溶液あるいは精製酵素を含む反応溶液が、10℃〜60℃、好ましくは25℃〜45℃でpH 3〜1、好ましくはpH 6〜9に制御されている間に実施できる。反応が進む限り基質は、添加でき、必要なら、必要な量、必要な時間にわたって反応させることができる。
【００７７】
本製造法で生成した4HIL は、通常のアミノ酸精製法で単離できる。例えば、遠心分離を用いて固形物を除いた反応液上清から4HILを単離するのに、イオン交換樹脂又は膜、お
よび晶析を用いた処理のような操作を組み合わせて使用できる。
【実施例】
【００７８】
実施例により、以下に本発明をさら詳細に記載する。しかし、本発明は、これらの実施例によって限定されない。
【００７９】
実施例１  HPAL/BCAT二酵素系反応における4HIL収率の計算
HPAL/BCAT二酵素系反応の平衡濃度は、図1に表わし数学的モデルを使用して計算した。このモデルは七つの非線形の代数方程式のシステムより成り、これで3種類の合成プロセスのすべての反応物の平衡濃度を計算することができた(図1)。ΔG'0値はすべてT=25℃とpH=7で求め、[Mushkambarov N.  N., Analytical biochemistry, volume 3, ロシアで発行, 1996, ISBN 5-88037-017-8]に記載された方法に基づいて計算した。
【００８０】
実施例２ 4HILの二工程HPAL/BCAT依存の酵素的合成の実際
精製bsuBCATおよびecoBCATアミノ基転移酵素ならびに精製YhaF、YfaU、BphFおよびasiHPALアルドラーゼをHPAL/BCAT二酵素系反応で使用した。これらの酵素の精製は以下に記載する。
【００８１】
1. エシェリヒア・コリおよびバチルス・ズブチリス由来BCATのクローニング、発現、および精製
エシェリヒア・コリ由来のBCAT(ecoBCAT)を、his6-タグ誘導体としてpET発現システム((Novagen, Madison, WI, USA) を使用して、クローンし、発現させた。
【００８２】
PET-HT-IlvE-ECO プラスミドを構築するために、E.コリ由来のilvE遺伝子を、E. コリ MG1655株の染色体のDNAをテンプレートとして、プライマーP1（配列番号16)とプライマーP2(配列番号17)をそれぞれ「上流」および「下流」プライマーとして使用し、PCRで増幅した。プライマーP1はその5'-末端にNcoI制限部位およびヒスチジンをコードする6つのコドンを含み、プライマーP2はその5'-末端にBamHI制限部位を含む。生じたPCRフラグメントは、NcoIとBamHIの制限酵素（restrictases）で消化し、予め同一の制限酵素で処理したベクターpET-15(b+)に結合（ライゲート）した。このようにしてプラスミpET-HT-IlvE-
ECO を得た。
【００８３】
標準誘導条件(1 mM IPTG: isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside,37℃で2〜3時間)下、pET-HT-IlvE-ECO からpET-システムで発現された時、全細胞タンパク質の可溶画分にhis6-タグ-IlvE-ECO タンパク質が局在することが判明した。ハイブリッド・タンパク質はIMAC((Immobilized-Metal-Affinity-Chromatography、固定化金属親和性-クロマトグラフィ)で精製した。下記手順で実施した: 1) OD555=1に到達するまで、E. コリ.B株BL21(DE3)[pET-HT-IlvE-ECO]細胞培養液200mLを4箇の500mLフラスコ中で培養した。His6-タグ-ilvEタンパク質の合成は、IPTGを最終濃度1mMまで添加し、2時間培養して誘導した。その後、細胞は遠心分離によって採取し、100mM NaCl溶液100mLで2度洗浄、再びペレット化し、緩衝液I 20mL (20mM Tris-HCl、500mM NaCl、1mM PMSF、10mMイミダゾール、5%(w/v)グリセロール; pH 8) に再懸濁し、さらにフレンチ圧力セルに一回通過させて破砕し; 2) 生じた溶解液（ライセート）は遠心分離し、上清のタンパク質を1mLのHitrap(登録商標)(Pharmacia) カラムに供し；その後、カラムは、緩衝液Ｉ 10mLで洗浄し、結合タンパク質は緩衝液II(20mM Tris-HC1,400mM イミダゾール、pH8)で溶出した。生じたi1vE調製物は、緩衝液III(20 mM 燐酸カリウム緩衝液pH7,1mM DTT,10μM PLP,10%(w/v)グリセロール)で平衡化した10mLのBioGel PlO(BioRad)カラムを用いゲル濾過して取得した。
【００８４】
Bacillus subtilis由来のBCAT(bsuBCAT)は、his6-タグ誘導体としてpET発現システム(Novagen、Madison,USA)を使用して、クローンし、発現させた。
pET-HT-YwaA-BSU プラスミドを構築するために、BCATアミノトランスフェラーゼをコードするBacillus subtilis 由来のywaA遺伝子(Berger, B.J. ら, J Bacteriol., 185(8), 2418-31 (2003))を、Bacillus subtilis 168株の染色体のDNAをテンプレートとし、プライマーP3（配列番号18)とプライマーP4(配列番号19)をそれぞれ「上流」および「下流」プライマーとして使用し、PCRによって増幅した。プライマーP3は、その5'-末端にNcoI制限部位およびヒスチジンをコードする6つのコドンを含み、プライマーP4はその5'-末端にNcotI 制限部位を含む。生じたPCRフラグメントは、NcoI制限酵素で消化し、予め同じ制限酵素で処理したプラスミドpET-15(b+)と連結した。その後、オリゴヌクレオチドT7(Novagen、配列番号20)およびP4(配列番号19)をプライマーとして使用し、線形の連結（ライゲート）DNAフラグメントをPCR増幅用のテンプレートとして使用した。プラスミドpET-15(b+)のT7プロモーターの制御下でywaA遺伝子を含む、得られたPCRフラグメントは、XbaIとNotI制限酵素で消化し、予め同じ制限酵素で処理したpET-22(b+)ベクターへ連結した。このようにして、プラスミドpET-HT-YwaA-BSUを得た。
【００８５】
対応するタンパク質bsuBCATは、ハイブリッドhis6-タグしたタンパク質として発現された。標準誘導条件(上記参照)下、pET-HT-YwaA-BSUからpET-システムで発現された時、全細胞タンパク質の可溶画分にB. subtilis由来のhis6-タグ-YwaAタンパク質が局在することが判明した。ハイブリッドhis6-タグ-YwaAは上記のように精製した。
【００８６】
E.コリのBL21(DE3)[pET-HT-ilvE-ECO]とBL21(DE3)[pET-HT-ilvE-BSU]株の粗細胞溶解物(ライセート)中のhis6-タグ酵素の活性を2時間の発現誘導後に測定した。
BCATアミノトランスフェラーゼの比活性は、前記酵素により触媒された反応：α-keto-前駆体 + グルタミン酸 = α-アミノ酸 + α-ケトグルタミン酸の正反応パラメーターVmaxの測定により評価した。反応条件: 100mM K2HPO4、100mMＬ-グルタミン酸、pH 7.4(KOH添加で調節); 20mM α-ケト-前駆体;タンパク質2.5〜10 μg/反応当たり；温度：37℃。
【００８７】
アミノ基転移反応の初速度(V０)は、検知可能な反応生成物(アミノブタン酸、イソロイシン、ロイシン、バリン)の時間に依存する生成を定量的TLC分析(展開剤：n-プロパノール:アセトン:NH3:H2O = 25: 25: 6: 2)で測定した。BCAT アミノトランスフェラーゼの比活性のデータは表1に示す。
【００８８】
2.エシェリヒア・コリ由来のYfaUおよびYhaFアルドラーゼのクローニング、発現、および精製
HHDE_BLIは、二つの機能的なサブグループ：2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼおよび4-hydroxy-2-oxovalerate アルドラーゼを組込む所謂hpcH/hpaIアルドラーゼファミリーの一部である。HHDE_BLI同族体をBLASTで簡易な検索を行うと、2-keto-3-deoxyglucarate アルドラーゼを含むサブグループもhpcH/hpaIアルドラーゼ系に属することが判明した。 
【００８９】
BLAST検索の結果によれば、2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼ、4-hydroxy-2-oxovalerateアルドラーゼ、又は2-keto-3-deoxyglucarateアルドラーゼ・グループに属するいずれのタンパク質も、HMKPとして利用できることが示唆された。
【００９０】
この考えを証明するために、hpcH/hpaIアルドラーゼ系に属するE.コリ由来の二つの酵素がHMKPアルドラーゼ活性を示す能力を試験した。推定2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acidアルドラーゼとして指定（assign）されているYfaU、および2-keto-3-deoxyglucarateアルドラーゼとして同定されているYhaFである。しかし、本発明者らは、E.コリMG1655株の粗細胞溶解物（ライセート）にHMKPアルドラーゼ活性を見出すことができなかった。したがって、検討した培養条件下で、YfaUおよびYhaFの発現がかなり低いと思われた。
【００９１】
YfaUとYhaFの発現レベルを増加させるために、有効なRBSで接合した強いプロモーターPtacを、yfaUとyhaFの遺伝子のコード領域の上流に挿入した。
【００９２】
2.1．MG1655 [mhpD::attL-kan-attR-Ptac-RBS] 株の構築
Kan-マーカーおよび有効なRBS搭載Ptacプロモーターを含む1.7kbのDNA断片を以下のように構築した。
【００９３】
まず、λattLとλattR部位で両側を挟まれたkan遺伝子を含むDNA断片は、プラスミドpMW118-(λattL-Kmr-λattR)をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドsvs45 (配列番号21) と PBglII (配列番号22)をプライマーとして用い、PCRで取得した。プライマーsvs45は、その5'-末端に、mhpD 遺伝子の上流領域に相同（homologous）であって、E.コリ MG1655株の染色体にさらに組み込むのに必要な部分を含んでいる。プライマーBglIIはその5'-末端にBglII部位を含む。プラスミドpMW118-  (λattL-Kmr-λattR)の構築は参照例に記載されている。
【００９４】
その後、付着BglII部位を持つPtacプロモーターを、二種のオリゴヌクレオチドである、Ptac5（配列番号23)と Ptac3（配列番号24)をアニールして得た。オリゴヌクレオチドPtac5の5'末端は、キナーゼ反応でアニールする前に燐酸化した。
【００９５】
その後、PCRで取得したDNA断片は、BglII制限酵素で処理し、Ptacプロモーターで付着BglII部位に連結した。得られた混合物は、プライマーsvs45とプライマーsvs46（配列番号25)で行ったPCR反応のテンプレートとして用いた。プライマーsvs46はその5'-末端にmhpD
遺伝子の下流領域に相同であって、E.コリ MG1655株の染色体にさらに組み込むのに必要な部分、および有効なRBSをその中間部に含む。得られたDNA断片を常法のRed-integration法(Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000)) で MG1655の染色体に挿入した。その結果、mhpD遺伝子は除去され、mhpF とmhpE 遺伝子は人工調節領域の制御下に置かれた(図2)。
【００９６】
2.2 MG1655 [attLΔyfaV-kan-attR Ptac-RBS- yfaU]株の構築
yfaU遺伝子のヌクレオチドの配列およびyfaU遺伝子でコードされたYfaUタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号3および配列番号4に示されている。Kan-マーカーおよびPtac-RBS発現モジュールを含む1.8kbのDNA断片は、オリゴヌクレオチドSVS_81 (配列番号26) および SVS_82 (配列番号27)をプライマーとし、MG1655 [mhpD::attL-kan-attR-Ptac-RBS] 株の染色体のDNAをテンプレートとして使用して PCRで増幅された。その後、得られたDNA断片を常法のRed-integration法(Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000)) で MG1655の染色体に挿入した。その結果、MG1655[attLΔyfaV-kan-attR-Ptac-RBS-yfaU]株が構築された(図3)。
【００９７】
2.3. MG1655 [attLΔyhaU-kan-attR Ptac-RBS- yhaF] 菌株の構築
yhaF遺伝子のヌクレオチドの配列およびyhaF遺伝子がコードしたYhaFタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号1および配列番号2に示されている。Kan-マーカーおよびPtac-RBS発現モジュールを含む1.8kbのDNA断片は、オリゴヌクレオチドSVS_89 (配列番号28) および SVS_90 (配列番号29)をプライマーとし、MG1655 [mhpD::attL-kan-attR-Ptac-RBS] 株の染色体のDNAをテンプレートとして使用してPCRで増幅された。その後、得られたDNA断片を常法のRed-integration法(Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000)).で MG1655の染色体に挿入した。その結果、MG1655[attLΔyfaV-kan-attR-Ptac-RBS- yhaF] 株が構築された(図3)。
【００９８】
MG1655 [attLΔyfaV-Km-attR Ptac-RBS-yfaU] およびMG1655 [attLΔyhaU-Km-attR Pta
c-RBS-yhaF] 株の粗製細胞溶解物（ライセート）中のHMKPアルドラーゼ活性を調べるために、次の手順で行った。
【００９９】
1) 一晩経過の細菌の培養液 (37℃で12時間培養) 50 μlを用いて、カナマイシン (100
μg/mL) を補充したLBブロス培地4mLに接種した。細胞は37℃でOD555=1に達するまで1〜2時間培養した。その後、細胞を4℃で遠心分離(16000×g)で採取し、1mM PMSF(フッ化フェニルメチルスルフォニル)を補充した緩衝液A[50mM KH2PO4 ( KOHでpH 7.4に調節) ] 30mLに再懸濁した。細胞は、4℃で常法通り超音波処理で破砕し、4℃で細胞の破砕残骸を遠心分離(16000×g)で除去した。
【０１００】
2) 得られた粗製細胞溶解物（ライセート）llμlを、100mMＬ-グルタミン酸 (0.5M原液から希釈(NaOHでpH 7.4に調整))、100mMケトブタン酸、100mMアセトアルデヒド、2mM MgCl2 (又は MnCl2, 又はZnCl2, 又は EDTA)精製したbsuBCAT(14μg)を含む反応混合物9μlに添加した。反応は37℃で2時間培養に供された。4HILの合成は、TLCとHPLCの分析で試験した(表２)。
【０１０１】
4HIL生物変換プロセスの実験的研究のため、YfaUとYhaFアルドラーゼをそれぞれ、E. コリ MG1655[attLΔyfaV-Km-attR Ptac-RBS- yfaU] および MG1655[attLΔyhaU-Km-attR Ptac-RBS- yhaF] 株の粗製細胞溶解物（ライセート）から精製した。
【０１０２】
2.4. 下記の手順を含む精製プロトコル
工程1:
一晩経過した細菌の培養液(37℃ 12時間培養)1mLを用いて、LBブロス培地3リットルに接種した。細胞は約12時間37℃で培養する。その後、細胞を4℃で遠心分離(16000×g)で採取し、1mM ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルフォニル）で補充した緩衝液A[50mM KH2PO4 (KOHでpH 7.4に調節)]30mLに再懸濁する。
工程2:
細胞は、フレンチプレス・セル(最高 P=2 psi )に3回通して破砕し、次いで破砕残骸を除くために遠心分離した。タンパク質調製液は、緩衝液Aで平衡化したセファデックス（Sephadex ）G-15カラム(2.6×28cm)に通した。
【０１０３】
工程3：陰イオン交換クロマトグラフィは、50mLのDEAE(ファストフロー)カラム(d=1.6cm)搭載AKTAbasic100 システムを使用して行った。通常、工程2から得られたタンパク質調製物40〜50mLを緩衝液Aで平衡化したカラムに供した。溶出は、緩衝液A(カラム容積の10倍量、CV10)) に0-0.5M NaClの直線濃度勾配をかけて、流速2.5mL/分で行った。各10mL分画分を集めた。
【０１０４】
活性画分をまとめて緩衝液 B (10 mM KH2PO4(KOHでpH 7.0に調節))で平衡化したセファデックス（Sephadex）G-15 カラム(2.6 × 28 cm)に通した。
工程4: 工程3から得られたタンパク質調製物は、緩衝液 Bで平衡化したヒドロキシアパタイト（Hydroxylapatite）(Bio-Rad; DNA-Grade, Bio-Gel HTP) カラム(2.5 × 1.5 cm)に通した。流出した画分を集めた。
【０１０５】
工程5: 陰イオン交換FPLC(AEC 2)は、1.6mLの「Sourse15Q」カラム(Amersham Pharmacia Biotech)で補充したAKTAbasic100 システムを使用して行った。工程4 から得られたタンパク質調製物を緩衝液Bで平衡化したカラムに供した。溶出は、緩衝液B(CV20（カラム容積の20倍量)に0-0.5M NaClの直線濃度勾配をかけて、流速1mL/分で行った。各2mL分画分を集めた。活性分画分をまとめた。
【０１０６】
工程6:工程5から得たタンパク質調製物に(NH4)2SO4を1.5Mの濃度まで添加した。
タンパク質沈殿物は遠心分離(16000×g、4℃, 15 分)で集め、緩衝液 Bに再懸濁した。
工程6から得られたタンパク質調製物を実験に使用した(図4)。
【０１０７】
3. Novosphingobium aromaticivorans VKPM B-9294 株由来のBphF HKP-アルドラーゼ
Novosphingobium aromaticivorans 由来のBphFアルドラーゼ、つまり4-hydroxy-2-oxovalerateアルドラーゼは、（所謂HHEDアルドラーゼおよび HKPアルドラーゼを包含する）bpcH/hpal ファミリーに属するので HMKPアルドラーゼとして使用できる。
【０１０８】
この考えを証明するため、bpcH/hpal ファミリーに属するNovosphingobium aromaticivorans 由来のBphFアルドラーゼがHMKPアルドラーゼ活性を示す能力を試験した。しかし、本発明の発明者らは、Novosphingobium aromaticivorans VKPM B-9294 株の粗細胞溶解物（ライセート）にHMKPアルドラーゼ活性を検出できなかった。したがって、調べた培養条件下でBphFの発現がかなり低いと思われた。
【０１０９】
精製BphFタンパク質調製物を取得するために、Novosphingobium aromaticivorans VKPM
B-9294 株由来のHKPアルドラーゼをコードするBphF遺伝子をDNAベクター中にクローンし,E.コリ MG1655株に導入し、BphFアルドラーゼは、取得したバイオマスから精製された。
【０１１０】
3.1.Novosphingobium aromaticivorans VKPM B-9294 株由来の HKP-アルドラーゼをコードするBphF遺伝子のクローニング
先ず、Novosphingobium aromaticivorans VKPM B-9294株由のpNL1プラスミド[Romine, M. F. ら, Complete sequence of a 184-kilobase catabolic plasmid from Sphingomonas aromaticivorans F199 J. Bacteriol. 181 (5), 1585-1602 (1999)] の0.8kbのDNA断片を、オリゴヌクレオチドSVS_93 (配列番号30) および SVS_94 (配列番号31) をプライマーとしてPCRを用いて増幅した。LB寒天プレートからNovosphingobium aromaticivorans VKPM B-9294株の細胞培地一部を、PCR処理用テンプレートDNAの起源（ソース）として使用した。その結果、bphF遺伝子を含み、HindIIIとEcoRIの制限部位で挟まれたDNA断片が得られた。それをHindIII-EcoRI部位の間で、高コピー数プラスミド・ベクターpUC19 (シグマ社、アメリカ)にクローンした。このようにして、組み換えプラスミドpUC19-bphFを構築した(図5)。
【０１１１】
さらに、プラスミドpUC19-bphFをE.コリMG1655株へ導入した。得られた組み換え細胞MG1655[pUC19-bphF]を、アンピシリン(200μg/mL)とIPTG(1mM)で補充した、LBブロス3リットル、15×（1リットルフラスコ中に200m)、に接種し、12時間37℃で攪拌培養した。細胞は4℃で遠心分離(16000g、20min)で採取し、使用時まで-70℃で保存した。得られたバイオマスをBphFアルドラーゼの精製に使用した。
【０１１２】
3.2. BphFアルドラーゼの精製
クロマトグラフィ処理は、すべてAKTAbasic100 システを使用して行った。3種アルドラーゼ(YhaF、YfaUおよびBphFアルドラーゼ)の精製すべてに一律のプロトコルを使用した。これは次の工程を包含した。凍結細胞を解凍し、1mM PMSF(フェニルメチルスルフォニル弗化物)で補充した緩衝液A [50mM KH2PO4(pH 7.4) KOHで調整]30mLに再懸濁した。精製プロトコルは下記の手順を含む。
【０１１３】
工程1: 細胞は、フレンチプレス・セル(最高 P=2.5 psi) に3〜5回通して破砕し、次いで残骸破片を除くために遠心分離した。活性画分を集め、緩衝液Aで平衡化したセファデックスG-15カラム(2.6×28cm)に通した。
【０１１４】
工程２:工程1から得られたタンパク質調製物50mLを緩衝液Aで平衡化したDEAE-Sepharose(ファストフロー)カラム(1.6×25cm)に供した。溶出は、緩衝液A(10CV（カラム容積の10
倍量)）に0-0.5M NaClの直線濃度勾配をかけて、流速2.5mL/分で行った。各10mL分画分を集めた。活性分画分は、まとめて緩衝液Ｂ[10mM KH2PO4 (pH 7.0)、KOHで調節]で平衡化したセファデックスG-15カラム(2.6×28cm)でクロマトラフィにかけて脱塩した。
【０１１５】
工程3: 工程2 から得られたタンパク質調製物を緩衝液Ｂで平衡化した1.6mL Sourse15Qカラムに供した。溶出は、緩衝液A（カラム容積の40倍量)に0-0.5M NaClの直線濃度勾配をかけて、流速1mL/分で行った。各2mL分画分を集めた。活性分画分を合併した。
【０１１６】
工程4: (NH4)2SO4を1.5M濃度に達するまで、工程3から得られたタンパク質調製物に添加した。タンパク質沈殿物は遠心分離（16000g、4℃）で集め、緩衝液Ｂに再懸濁した。
工程5: 工程4から得られたタンパク質調製物を緩衝液C[50 mM KH2PO4 (pH 7.4) KOHで調整, 100 mM NaCl, 10% (w/v) グリセロール]で平衡化したPD10脱塩カラム(Amercham, Pharmacia, Biotech) で脱塩し、使用時まで-70℃で保存した。（図6）。
【０１１７】
4．Arthrobacter simplex AKU 626由来のHMKP-アルドラーゼ (IFO 12069) (asiHPAL)の精製 
精製プロトコルは下記の手順を含む。
【０１１８】
工程1:一晩経過した細菌の培養液(34℃で12時間培養)1mLを用いて、5リットルのLBブロス培地[8X(1Ｌフラスコ中に375mL)]に接種した。細胞は約24時間最適温度で培養した。その後、細胞を4℃で遠心分離(16000×g)で採取し、1mM PMSF(フッ化フェニルメチルスルフォニル)を補充した緩衝液A[50mM KH2PO4 (KOHでpH 7.4に調節)]30mLに再懸濁した。
【０１１９】
工程2:細胞を、フレンチプレス・セル(最高 P=2.5 psi) に3〜5回通して破砕し、次いで残骸破片を除くために遠心分離した。タンパク質調製液は、緩衝液Aで平衡化したセファデックスG-15カラム(2.6×28cm)に通した。
【０１２０】
工程3：陰イオン交換クロマトグラフィ(AEC 1)は、50mLのDEAE(ファストフロー)カラム(d=1.6cm)を補充したAKTAbasic100 システムを使用して行った。通常、工程2から得られたタンパク質調製液40〜50mLを緩衝液Aで平衡化したカラムに供した。溶出は、緩衝液A(10CV（カラム容積の10倍量)）に0-0.5M NaClの直線濃度勾配をかけて流速2.5mL/分で行った。各10mL分画分を集めた。活性分画分は、合併し、「工程2」のアイテムに記載のように脱塩した。
工程4:陰イオン交換FPLC(AEC 2)は、1.6mLの「Sourse15Q」カラム(Amersham Pharmacia
Biotech)で補充したAKTAbasic100 システムを使用して行った。工程3から得られたタンパク質調製液を、緩衝液Aで平衡化したカラムに供した。溶出は、緩衝液A(40CV（カラム容積の40倍量)）に0-0.5M NaClの直線濃度勾配をかけて、流速1mL/分で行った。各2mL分画分を集めた。活性分画分を合併した(表3および4)。
【０１２１】
工程5:疎水性相互作用クロマトグラフィ(Hydrophobic interaction chromatography, HIC)は、1mLの「Resource PHE」カラム(Amersham Pharmacia Biotech)で補充したAKTAbasic100 システムを使用して行った。工程5から得られたタンパク質調製液は、0.8mg/mLに調節し、次いで、硫酸アンモニュウムを最終濃度が1.5 Mになるまで添加した。タンパク質溶液は、1.5Mの硫酸アンモニュウムで補充した緩衝液Aで平衡化したカラムに供した。溶出は緩衝液A(30CV（カラム容積の30倍量))に1.5M―0Mの硫酸アンモニュウムの直線濃度勾配をかけて流速1mL/minで行った。各1mLの分画分を集めた。活性分画分を合併した(表3および4)。
【０１２２】
工程6:サイズ排除クロマトグラフィ(Size exclusion chromatography,SEC)はSuperdexTM200 HR 10/30A(Amersham Pharmacia Biotech)カラムで備えたAKTAbasic 100 システムを
使用して行った。工程5から得られたタンパク質調製液を、100mM NaClで補充した緩衝液Aで平衡化したカラムに供した。定組成溶出は0.5mL/minの流速に下げて行った。各1mLの分画分を集めた。活性分画分を合併した(表3および4)。
【０１２３】
asiHPALの比活性は、次の組成 [100mMＬ-グルタミン酸 (pH 8、pH 8.0で調節), 100 mMα−ケトブタン酸、100 mMアセトアルデヒド]、1mM ZnCl2、および0.5μgの精製したHis-標識-bsuBCATタンパク質（Bacillus subtilis由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）、および一定分量の溶出画分を用いたbsuYwaA/ asiHPALの二酵素系反応において、時間に依存する4HILの生成をHPLCで測定して求めた。反応はすべて37℃で行った。
【０１２４】
asiHPAL単量体の分子量をSDS−PAGE (図5, A) を使用して求めた。その平均値は27 kDaとして測定された。天然asiHPALの分子量は、分子量タンパク質マーカー (シグマSigma社) 製で較正したSuperdexTM 200 HR 10/30A (Pharmacia) カラムで、分析用SECを使用して決定した(図７,B)。その平均値は186 kDaとして測定された。したがって、asiHPALは六量体であると推測される。
【０１２５】
HMKPアルドラーゼの金属イオン依存性を検討した。asiHPAL活性がZn2+、Mg2+およびMn2+イオンに厳密に依存し、EDTAの存在で完全に妨害されることを確証した。したがって、asiHPALは、II型アルドラーゼに属すると推定された。（表5） 
グルコーズ10 g/L、K2HPO4 3 g/L, MgSO4・7H2O 0.2 g/L,ペプトン 15 g/L、酵母エキス1 g/L、食塩2 g/Lを含み、pH 7に調整した5ｍL量の培地を種々の細菌で接種し、28℃で１〜２日間振とう培養した。
【０１２６】
5．4HILの合成
精製YhaF、YfaUおよびbsuBCAT酵素を使用した、2工程生物変換プロセスでの4HILの生成を検討するために、反応混合物のセットを準備した。各々20μlの容積であり、300mMアセトアルデヒド、100mM α−ケトブタン酸、100mMＬ-グルタミン酸(0.5M原液から希釈、（NaOHでpH 7.5に調節))、20mM KH2PO4/Na2HPO4緩衝液 (0.2 M原液から希釈(pH 7))、2mM Mg
Cl2、精製bsuBCAT14μg、精製YfaU40μg (あるいは精製YhaF120μg)を含有した。各反応は37℃で4時間培養に供した。その後、4HIL濃度を常法通りHPLC分析で求めた(表6)。  
【０１２７】
精製asiHPALおよびbsuBCAT酵素を使用して、2−工程生物変換プロセスでの4HILの生成を検討するために、100mMＬ-グルタミン酸(1M原液から希釈、（NaOHでpH ８に調節))、100mMアセトアルデヒド、100mM α−ケトブタン酸、2mM ZnCl2、精製bsuBCAT 14μg、および精製asiHPAL 0.6μgを含む反応混合物（反応物容積20μl）を調製した。反応は37℃で2時間培養に供した。その後、4HIL濃度を常法通りHPLC分析で測定した(表6)。
【０１２８】
精製mhpFE およびecoBCAT酵素を使用して2−工程生物変換プロセスでの4HILの生成を検討するために、mhpFE[BL21/pET-21a(+) mhpFE およびBL21(DE3)  [pET-HT-ilvE- ECO]を発現するE. コリを上記の様に標的タンパク質を発現するよう誘導し、培養液1 mLから集菌し、洗浄した。その後細菌を反応液200μL (100 mMアセトアルデヒド、100 mM α−ケトブタン酸、100mM L-グルタミン酸、50mM燐酸塩緩衝液(pH7))と反応させた。反応温度30oCで、反応は一晩行われ、細胞溶解物（ライセート）は、反応前に超音波処理で得られた。反応に続いて、遠心分離(10,000rpm、5分)にかけて上清を得た。上清を、25倍に希釈し、HPLCによるアミノ酸分析に供した。未転換E. コリを対照として用いた (表６)。  HPLC分析は下記のように行った。
【０１２９】
6．4HIL生成の検出
4HILの生成はHPLCを用いて検出した。HPLC分析は、下記の通り行った:分光蛍光計1100シリーズ (Agilent, USA)搭載の高圧クロマトグラフを(Waters,USA)使用した。選択した
検出波範囲は、励起波長250nm、発光波長の範囲320〜560nmであった。accq-タグ方法による分離は、Nova-PakTM C18 150 × 3,9 mm, 4μm (Waters, USA) カラムにより、+400℃で行った。試料の注入容積は5μlであった。アミノ酸誘導体の生成および分離はWaters 製造元の推奨(Liu, H. ら, J. Chromatogr. A, 828, 383-395 (1998); Waters accq-tag chemistry package. 使用法マニュアル Millipore Corporation, pp.1-9 (1993))に基づいて行った。
【０１３０】
6-aminoquinolil-N-hydroxysuccinymidyl carbamateによるアミノ酸誘導体を取得するのに、Accq-FluorTM(商標)（Waters, USA)一式を使用した。accq-タグ方法による分析は濃縮Accqタグ溶離剤А(Waters, USA) を使用して行なった。溶液はすべてMilli-Q水を使用して調製し、標準液は+4℃で貯蔵した。
【０１３１】
7．二種の酵素の検定
I型HPAL/BCATの二酵素系反応は以下のように行った。各反応混合物(20μl)は、100mM α-アミノブタン酸(1M原液から希釈(pH8) NaOHで調整)、20 mM α-ケトブタン酸 (1M原液から希釈)、300ｍMアセトアルデヒド、1mM ZnCl2 (MgCl2又は MnCl2, 又は EDTA)、精製bsuBCAT(あるいはecoBCAT) 14μgおよび精製YhaF(あるいはYfaU)(あるいはBphF)アルドラーゼ10μgを含んでいた。79μgのasiHPAL調製物の全タンパク質をasiHPAL/BCAT二酵素系反応に使用した。反応混合物はすべて3時間、37℃で培養した。4HILの最終濃度は上記のようにHPLC分析で測定した。
【０１３２】
II型HPAL/BCATの二酵素系反応は以下のように行った。各反応混合物(20μl)は、100mM L-グルタミン酸(1M原液から希釈(pH8) NaOHで調整)、100 mM α-ケトブタン酸（1M原液から希釈)、300mMアセトアルデヒド、1mM ZnCl2(又はMgCl2又は MnCl2,又は EDTA)、精製bsuBCAT(あるいはecoBCAT) 14μgおよび精製YhaF(あるいはYfaU)(あるいはBphF)アルドラーゼ10μgを含んでいた。79μgのasiHPAL調製物の 全タンパク質をasiHPAL/BCAT二酵素系反応に使用した。反応混合物はすべて3時間、37℃で培養した。4HILの最終濃度は上記のようにHPLC分析で測定した。（表8）。
【０１３３】
実施例3．４HILの生物変換プロセスにおける平衡濃度の計算
二工程アルドラーゼ／トランスアミナーゼ依存４HIL合成プロセスには主要な形式を二種考慮する（図８）。二つの化学平衡から成り、負の総括ΔG’0値 (約 -5kJ/mol)を持つI型プロセスでは、α-アミノブタン酸がHMKPアミノ化用の唯一のアミノ 基供与体として用いられる。少なくとも四つの化学平衡を含み（一種のアミノ 基供与体使用の場合）I型プロセスの綜合ΔG’0値と同一の値を持つII型では、α-アミノブタン酸とは異なる任意のアミノ基供与体（又は複数のアミノ基供与体）（例えばグルタミン酸、アラニン等）が使用される。
【０１３４】
４HILの最高収率に到達するには、どのHPAL/BCAT-依存の生物変換プロセスを選択しなければならないかを把握するためには、各々の型の反応混合物中の4HILおよびHMKPの平衡濃度を計算しなければならない。
【０１３５】
HMKPアルドール縮合反応
アセトアルデヒド/α-ケトブタン酸アルドール縮合反応における基質の初期濃度に依存するHMKPの平衡濃度を計算した。我々はアセトアルデヒド/α-ケトブタン酸アルドール縮合反応のみが起きるものとした。更に、計算はすべてT=25℃、pH=7で測定したΔG'0値に基づく(実施例1参照)。従って、我々の結論は、化学的アルドール縮合プロセスではなく「生理学的」反応条件下の酵素的触媒作用にのみに正しく成立する。得られた結果から、基質濃度1Mの場合でさえ、HMKPの収率は52%(表7、図9))を超えない。アセトアルデヒド濃度が約0.3Mで アルドラーゼ(トランスアミナーゼ)の活性阻害が起きたので、「実際的な
」HMKP収率の上限は、30%とみなしてよい。両方のHPAL/BCAT依存の生物変換プロセス共、4HILの収率がHMKP収率の上限を超過することができないので、「実際的な」4HILの上限収率を30%と見積もることができる。もちろん、この見積もりはHMKPの立体異性体生成を考慮していない。
【０１３６】
実施例4   HPAL/BCAT依存生物変換プロセスの分析
生物変換プロセスの型式および初期反応物濃度に依存する4HILの理論的収率を計算した(図10)。与えられたアセトアルデヒドおよびα-ケトブタン酸（α-アミノブタン酸)の初期濃度で、I型生物変換プロセスの4HIL収率はII型プロセスの約3倍量である。しかもI型生物変換プロセスの4HIL収率は、同一のアセトアルデヒドとケトブタン酸初期濃度 (比較には、図9参照)で、アルドール縮合反応のHMKP収率とほぼ同一である。これは、I型4HIL生物変換プロセスがアセトアルデヒドとα-アミノブタン酸の直接な縮合と形式的に等価であることを意味する。
【０１３７】
実施例5. HPAL/BCAT依存の生物変換プロセスでの4HIL収率に関する実験的研究   最適のHPAL/BCAT酵素縦列の探索
I型とII型の二酵素系反応を、4HI生物変換プロセスの二つの型のモデルに使用した。HPAL/BCATの組み合わせ16対について調べた。表8に見られる通り、生物変換プロセスの型式に関係なくbsuBCATをHPATとして活用すると、4HILの生成は最高に達した。面白いことに、試験したBCATの「効率」(最終的4HIL生成で評価)およびα-ケトブタン酸と三種の分枝鎖アミノ酸ケト−先駆体のアミノ化速度比率の間に相関性がある(表9)。これは次のように系統的に説明できる。α-ケトブタン酸とKMV(KIV、KIC)のBCAT触媒によるアミノ化の速度比が大きければ大きい程、このアミノ基転移酵素を使用してより多くの4HIL生成を達成できる。
【０１３８】
理論的な予測どおりに、最高の4HIL生成はYhaF、YfaUおよびBphFアルドラーゼを使用するI型生物変換プロセスで達成された。得られた結果によれば、次の4HIL合成の推定スキームを提案できる(図11)。第１工程では、BCATの発現の結果、α-ケトブタン酸から生成したα-アミノブタン酸が蓄積する。第2工程では、外来のアセトアルデヒドの存在下、HPALおよびBCATの共発現が4HILの合成を引き起こす結果になる。
【０１３９】
[参照例]  pMW118-(λattL-Kmr-λattR) プラスミドの構築
pMW118-(λattL-Kmr-λattR) プラスミドは、pMW118-attL-Tc-attR (WO2005/010175) プラスミドを基にして、テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子をpUC4K プラスミド由来のカナマイシン耐性マーカー遺伝子で置換して構築された (Vieira, J. and Messing, J., Gene, 19(3): 259-68 (1982))。
【０１４０】
その目的のために、pMW118-attL-Tc-attR プラスミドの大きな EcoRI-HindIII 断片をpUC4K プラスミドの二つの断片：HindIII- PstI 断片 (676 bp)とEcoRI-HindIII 断片 (585 bp)に連結した。 
【０１４１】
基本pMW118-attL-Tc-attR は次の4個のDNA 断片の連結で得られた。
1)  オリゴヌクレオチドP5 および P6 (配列番号33および34)をプライマーとして (これらのプライマーは、 BglII および EcoRI エンドヌクレアーゼに対する付属の認識部位を含んだ)を用いて、E. コリ  W3350 (λプロファージを含んだ) 染色体の対応する領域をPCR増幅することで得た、attL (配列番号32)を搭載するBglII-  EcoRI 断片 (114 bp)。
2)  オリゴヌクレオチドP7 および P8 (配列番号36 および 37)をプライマーとして (これらのプライマーは、PstI および HindIII エンドヌクレアーゼに対する付属の認識部位を含んだ)を用いて、E. コリ W3350 (λプロファージを含んだ) 染色体の対応する領域をPCR増幅することで得た、attR (配列番号35)を搭載するPstI-HindIII断片 (182 bp) 。
3) pMW118-ter_rrnBの大きなBglII-HindIII断片(3916 bp)。プラスミド pMW118-  ter_rrnB は次の３個のDNA 断片の連結で得られた。
【０１４２】
・  pMW118をEcoRI 制限エンドヌクレアーゼで消化し、DNA ポリメラーゼIのクレノウ（Klenow）断片で処理し、ついでAatII制限エンドヌクレアーゼで消化する方法で得たpMW118のAatII-EcoRI断片を搭載する大きなDNA 断片 (2359 bp)。
【０１４３】
・  アンピシリン耐性(ApR)bla 遺伝子を搭載するpUC19の小さなAatII-BglII 断片(1194 bp)は、オリゴヌクレオチドP9およびP10（配列番号38 および 39)をプライマー(これらのプライマーは、AatII と BglII ヌクレアーゼに対する付属の認識部位を含んだ)として使用して、pUC19プラスミドの対応する領域のPCR増幅によって得た。
【０１４４】
・  転写ターミネーターter_rrnB の小さなBglII-PstIpol 断片(363 bp)は、オリゴヌクレオチドP11およびP12(配列番号40と41)をプライマー(これらのプライマーは、BglIIとPstIのエンドヌクレアーゼに対する付属の認識部位を含んだ)として使用して、E. コリ MG1655染色体の対応する領域のPCR増幅によって得た。
4) テトラサイクリン耐性遺伝子およびter_thrL 転写ターミネーターを搭載するpML-Tc-ter_thrLの小さなEcoRI-PstI 断片(1388 bp)(配列番号42 )。pML-Tc-ter_thrLプラスミドは2工程で得た。
【０１４５】
当該 pML-ter_thrL プラスミドは、pML-MCS プラスミド(Mashko, S.V. ら., Biotekhnologiya (ロシア語), 2001, no. 5, 3-20) をXbaI およびd BamHI制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いで、大きな断片(3342 bp)を、E. コリ MG1655 染色体の対応する領域を、オリゴヌクレオチドP13およびP14(配列番号43と44)をプライマー(これらのプライマーは、XbaI と BamHI エンドヌクレアーゼに対する付属の認識部位を含んだ)として使用してPCR増幅によって得た、ターミネーターter_thrL搭載のXbaI-BamHI 断片(68 bp)との連結で得た。
【０１４６】
pML-Tc-ter_thrL プラスミドは、pML-ter_thrL プラスミドをKpnI および XbaI制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いで、DNA ポリメラーゼ Iのクレノウ（Klenow）断片で処理し、テトラサイクリン耐性遺伝子を搭載するpBR322の、小さいEcoRI-Van91I 断片 (1317 bp)との連結で得た（pBR322はEcoRI および Van91I制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いで、DNA ポリメラーゼ Iのクレノウ（Klenow）断片で処理した）。
【０１４７】
【表１】
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【０１４８】
【表２】
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【０１４９】
【表３】
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【０１５０】
【表４】
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【０１５１】
【表５】
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【０１５２】
【表６】
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【０１５３】
【表７】
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【０１５４】
【表８】
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【０１５５】
【表９】
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【０１５６】
配列の説明
1: yhaF, E. コリ アルドラーゼ゛ 遺伝子
2: YhaF, E. コリ アルドラーゼ
3: yfaU, E. コリ アルドラーゼ 遺伝子
4: YfaU, E. コリ アルドラーゼ
5: bphF, Pseudomonas sp. アルドラーゼ 遺伝子 
6: BphF, Pseudomonas sp. アルドラーゼ
7: asiHPAL 遺伝子, A. simplex アルドラーゼ 遺伝子
8: asiHPAL, A. simplex アルドラーゼ 
9: ilvE, E. コリ BCAT 遺伝子
10: IlvE, E. コリ BCAT
11: ywaA, B. subtilis BCAT 遺伝子
12: YwaA, B. subtilis BCAT
13: asiHPAL N-terminal 配列
14: COG3836, HpcH/HpaI アルドラーゼファミリー配列の特徴
15: COG0115, BCAT配列の特色
16: プライマー P1, ilvEの増幅用
17: プライマー P2, ilvE の増幅用：  
18: プライマー P3, ywaA の増幅用 
19: プライマー P4, ywaA の増幅用 
20: プライマー T7
21: プライマー svs 45, mhpDの上流領域 
22: プライマー PBglII
23: プライマー Ptac5
24: プライマー Ptac3
25: プライマー svs 46, mhpDの下流領域
26: プライマー svs 81, カン-マーカーおよびPtac-PBS 発現モジュール増幅用
27: プライマー svs 82, カン-マーカーおよびPtac-PBS 発現モジュール増幅用
28: プライマー svs 89, カン-マーカーおよびPtac-PBS 発現モジュール増幅用
29: プライマー svs 90, カン-マーカーおよびPtac-PBS 発現モジュール増幅用
30: プライマー svs 93, bphFの増幅用
31: プライマー svs 94, bphF の増幅用 
32: DNA fragment, attL
33: プライマー P5, attLの増幅用
34: プライマー P6, attLの増幅用
35: DNA 断片, attR
36: プライマー P7, attRの増幅用
37: プライマー P8,  attRの増幅用
38: プライマー P9, blaの増幅用
39: プライマー P10, blaの増幅用
40: プライマー P11, ter_rrnBの増幅用
41: プライマー P12, ter_rrnBの増幅用
42: Tc 遺伝子 および ter_thrLを含むDNA断片
43: プライマー P13, ter_thrLの増幅用
44: プライマー P14, ter_thrLの増幅用
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】HPAL/BCAT二酵素系反応における4HIL収率の計算用数学的モデルを示す。
【図２】MG1655[mhpD::attL-kan-attR-PtacRBS]株の構築を示す。
【図３】E.コリMG1655の染色体においてyfaUとyhaFの遺伝子の調節部分の、人工PtacRBS発現モジュールによる置換を示す。
【図４】YfaUとYhaFアルドラーゼの精製を示す。A) 最終酵素調製液(写真)のSDS-PAGEゲル。レーン:1 ―Mｗタンパク質マーカー;2 ―YfaU調製液タンパク質10μg注入;3 ―YhaF調製液タンパク質10μg注入。B) 精製工程。
【図５】組み換えプラスミドpUC19-bphFの構造を示す。
【図６】BphFアルドラーゼの精製を示す。精製された酵素は電気泳動にかけられ、クマシーブリリアントブルーR250(写真)で染色した。レーン:1 ―指示分子量のマーカー、2―  BphFタンパク質調製液10μg注入。
【図７】HPALオリゴマーの構造決定を示す。A―  較正済みSDS-PAGEゲルによるasiHPAL単量体のMwの測定。PageRuler TMタンパク質ラダー（Protein Ladder）(Fermentas,Lithuanai)を1組のタンパク質マーカーとして使用した。実験データ(黒円)をシグマ・プロット8ソフトウェアを使用して、線形回帰分析で当てはめた(黒線)。B-分子量タンパク質マーカー (Molecular Weight Protein Markers (Sigma)シグマ社)で較正したSuperdexTM 200 HR 10/30A(Farmacia)カラムでSECによるasiHPALの未変性Mw値の決定。実験データ(黒円)を、シグマ・プロット8ソフトウェアを使用して、線形回帰分析で当てはめた。
【図８】二つの型式のアルドラーゼ/アミノ基転移酵素依存の4HIL合成プロセスを示す。
【図９】アセトアルデヒドおよびα-ケトブタン酸のアルドール縮合反応におけるHMKPの理論的収率を示す。平衡反応物濃度％は、表2記載の反応A、B、およびCに対して計算。略字:KB  α-ケトブタン酸；AL  アセトアルデヒド。
【図１０】アルドラーゼ/トランスアミネーゼ依存の4HIL生物変換プロセス(I型およびII型)の理論的な4HIL収率を示す。平衡反応物濃度％は、下記原料反応混合物に対して計算。I型:A-100mMアセトアルデヒド、100mM α-アミノブタン酸、20mM α-ケトブタン酸;B-300mMアセトアルデヒド、300mM α-アミノブタン酸、20mM α-ケトブタン酸;C- 1Mアセトアルデヒド、1M α-アミノブタン酸、20mM α-ケトブタン酸II型:D-100mMアセトアルデヒド、100mM α-ケトブタン酸; 100mMグルタミン酸;E-300mMアセトアルデヒド、300mM α-ケトブタン酸; 300mMグルタミン酸F-1Mアセトアルデヒド、1M α-ケトブタン酸; 1Mグルタミン酸 略字:AL  アセトアルデヒド; :KB  α-ケトブタン酸；AB    α-アミノブタン酸；KG  ケトグルタル酸；GLU  グルタミン酸。
【図１１】ケトブタン酸とアセトアルデヒドからの4HIL合成の推測スキームを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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