(57)【要約】【課題】分子生物学研究の分野において実施される部位特異的変異導入において、新規な方法を提供する。【解決手段】２本鎖環状DNA分子に対して部位特異的に変異を導入する方法であって、（１）２本鎖環状DNA分子を鋳型にして３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いてPCRをすること。（２）前期鋳型として用いた２本鎖環状 DNA分子を選択的に分解すること。（３）前記PCR増幅産物に対してリン酸化酵素とDNA結合酵素を同時に作用させて自己環状化させること、を含む方法およびそのためのキット。【選択図】図１
2008109875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２本鎖環状DNA分子に対して部位特異的に変異を導入する方法であって、次のステップ含む方法。
（１）２本鎖環状DNA分子を鋳型にして３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いてPCRをすること。
（２）前期鋳型として用いた２本鎖環状 DNA分子を選択的に分解すること。
（３）前記PCR増幅産物に対してリン酸化酵素とDNA結合酵素を同時に作用させて自己環状化させること。
【請求項２】
PCRの反応サイクルが１５サイクル以下である請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１において、各ステップ間を連続的におこなう請求項１記載の方法。
【請求項４】
２本鎖環状 DNA分子に由来するDNAを選択的に分解する手段が制限酵素によってなされる請求項１記載の方法。
【請求項５】
制限酵素がDpnIである請求項４記載の方法。
【請求項６】
２本鎖環状 DNA分子に対して部位特異的に変異を導入するための試薬キットであって、次の構成を含む試薬キット
（ａ）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ、
（ｂ）リン酸化酵素
（ｃ）DNA結合酵素
（ｄ）制限酵素
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野において、簡便で確実な部位特異的変異導入方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
部位特異的変異導入法は、DNAの、特にプラスミドにクローニングされたDNAの特定の位置に、置換、欠失、挿入といった変異を導入する方法であり、今日の分子生物学の分野においては、たんぱく質の機能解析や機能性核酸の機能部位の特定などにおいて、大変有用な手段として用いられている。
【０００３】
たとえば、遺伝子の特定の位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したり、欠失させたりした後、その遺伝子の機能の変化を調べることにより、そのアミノ酸残基がその遺伝子において、どのような役割を担っていたかを推測することができる。また、遺伝子発現研究においては、プロモーターやエンハンサーといった遺伝子発現制御領域の、どの塩基が転写因子と相互作用しているかを調べるといったことに、部位特異的変異導入法が用いられている。
【０００４】
部位特異的変異導入法としては、これまでに、様々な原理に基づく方法が開発されている（非特許文献１〜３、特許文献１）。これらの部位特異的変異導入法に共通する原理は、まず鋳型となるプラスミドに対し変異を含むプライマーをアニールさせ、次にDNAポリメラーゼを作用させることにより変異を含むDNA鎖をインビトロにて合成し、最後に大腸菌を形質転換することにより、変異を含むクローンを分離することである。
【非特許文献１】Kunkel, T. A.（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488.
【非特許文献２】Hashimoto-Gotoh, T. et al. （1995） Gene 152, 271.
【特許文献１】WO97/20950ストラタジーン社
【非特許文献３】Weiner MP, et al.（1994）Gene. Dec 30;151(1-2):119-23.
【０００５】
ここで、各方法を比較評価する上でポイントとなるのが、［１］変異導入効率の高さ、［２］導入できる変異の種類、［３］目的以外の変異が入らないこと、［４］手法の簡便さ、などである。ここで、［１］変異導入効率とは、最終的に大腸菌を形質転換して得られるクローンの内、変異が入っているクローン（変異体）が占める割合のことであり、当然ながら、高いほど変異体をスクリーニングする手間が省けるため、この効率を高めるために様々な工夫が各方法で採用されている。たとえば、Kunkelらの方法では、鋳型となるプラスミドに予めウラシルを導入することにより、鋳型として利用したプラスミドと、インビトロで合成した変異を含むDNA鎖とを区別し、変異導入効率の向上を図っている。また、Weiner MPらの方法やWO02/38789では、大腸菌で調製した鋳型プラスミドがメチル化されていることを利用して、メチル化DNA特異的な制限酵素で処理することにより、これを分解し、変異導入効率を高めている。何れの方法においても、これらの工夫により、50〜90％の変異導入効率が得られている。
【特許文献２】WO02/38789
【０００６】
しかしながら、これらの［１］〜［４］の観点で各方法を評価すると、いずれの方法も、それぞれ長所・短所があり、得手不得手がある。
【０００７】
たとえば、Kunkelらの方法は、先に述べたように、鋳型となるプラスミドに予めウラシルを導入することにより、インビトロで合成した変異を含むDNA鎖と区別し、変異導入効率の向上を図っている。しかしながら、ウラシルを導入するためには、特殊な大腸菌を用いる必要があり、また、本方法ではM13ファージミド等の一本鎖DNA ファージの複製起点をもつプラスミドを用いてシングルストランドDNAを調製する必要もあり、手法の簡便さの観点からみると、かなり煩雑な手法となっている。
【０００８】
Hashimoto-Gotohらの方法は、Oligonucleotide-directed Dual Amber法に基づく方法である。この方法では、カナマイシン耐性遺伝子上に二重のアンバー変異を持つプラスミドが大腸菌MV1184株のようなサプレッサーフリー（sup0）の宿主に導入された場合には、その形質転換体はカナマイシン耐性を示すことができない性質を利用している。これにより、鋳型プラスミドに由来するクローンの出現を排除し、変異導入効率を上げている。しかしながら、本方法も、使用できるプラスミドに制限があり、さらにサプレッサーフリー（sup0）の大腸菌宿主を使用する必要があることから、汎用性・簡便性の観点からは難がある方法となっている。
【０００９】
WO97/20950ストラタジーン社の方法は、「QuikChange」の製品名にてストラタジーン社より市販されているキットに採用されている方法である。本方法では、互いに相補的な２本の変異導入プライマーを用いて変異を含むDNA鎖を合成した後、メチル化されたDNAに特異的に作用する制限酵素DpnIにて鋳型プラスミドを分解した後、大腸菌の形質転換に供するものである。この方法は、使用できるプラスミドや大腸菌の種類に制限はなく、極めて汎用性の高い方法である。また、操作的にも２ステップで済むことから、極めて簡便な方法となっている。しかしながら、本方法では、数塩基の置換、欠失、挿入については高い変異導入効率が得られるが、数十塩基の欠失や挿入については適用できない、あるいは、極端に変異導入効率が落ちるという難点がある。
【００１０】
Weiner MPらの方法は、いわゆるインヴァースPCR（Ｉｎｖｅｒｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法に基づく方法である。本方法では、まず、変異を含むプライマーを用いてインヴァースPCRを行い、変異を含むDNA鎖の合成を行う。次に、DNAリガーゼにてPCR産物の自己環状化（セルフライゲーション）を行い、最後に、制限酵素DpnIにて鋳型プラスミドを消化し、大腸菌の形質転換に供するものである。本方法も、使用できるプラスミドや大腸菌の種類に制限はなく、極めて汎用性の高い方法である。また、WO97/20950ストラタジーン社の方法と異なり、数塩基の置換、欠失、挿入に加え、数十、数百ベースの領域を欠失させた欠失変異体をも作製することができる。さらに、特定位置を20種類のアミノ酸に置換したMutant clone collections を作製できるといった特長もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、インヴァースPCR法に基づく変異導入方法は、こういった多くの長所の反面、［１］PCRの際のポリメラーゼが誤った塩基を取り込むことによって、目的とした変異以外の変異（目的外変異：2nd-site mutation）が挿入される可能性が他の方法と比較して高い、［２］サイズの大きいプラスミドでは全長が増幅できない、［３］プライマーのリン酸化が必要、［４］操作が比較的多段階となり煩雑、といった欠点があった。そのため、これらの短所がなく、さらに簡便な方法が求められていた。
【００１２】
非特許文献４では、こういった短所を克服するため、PCR酵素に極めて忠実性の高い酵素である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNA ポリメラーゼであるVent DNA ポリメラーゼを使用することにより、目的外変異（2nd-site mutation）の挿入を低減させると共に、PCR産物をブラントエンド（平滑末端）にすることにより、PCR後、リン酸化酵素（ポリヌクレオチドキナーゼ）とDNA結合酵素（ＤＮＡリガーゼ）を反応させることにより、自己環状化が簡便におこなえる系を報告している。しかしながら、本系ではPCRを２５サイクル実施することから、依然目的外変異が入る可能性が高く、さらに、PCR反応後、変異の入ったPCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動にて分離し、ゲルから目的のバンドを切り出して精製する必要があり依然煩雑な操作となっていた。さらに、本方法は、最短でも２日間を要する方法であった。
【非特許文献４】Nucleic Acids Res. 1991 May 25;19(10):2785. A simple and rapid method for generating a deletion by PCR.  Imai Y, Matsushima Y, Sugimura T, Terada M.）
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、インヴァースPCR法に基づく変異導入方法において、PCRの際の目的外変異挿入の可能性が極めて低く、かつ簡便な変異導入方法を開発し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、（１）２本鎖環状 DNA分子に対して部位特異的に変異を導入する方法であって、［１］２本鎖環状DNA分子を鋳型にして３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いてPCRをすること、［２］前期鋳型として用いた２本鎖環状 DNA分子を選択的に分解すること、［３］前記PCR増幅産物に対してリン酸化酵素とDNA結合酵素を同時に作用させて自己環状化させること、のステップ含む方法である。また、本発明は、（２）２本鎖環状 DNA分子に対して部位特異的に変異を導入するための試薬キットであって、［１］３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ、［２］リン酸化酵素、［３］DNA結合酵素、［４］制限酵素、を含む試薬キットである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、インヴァースPCR法に基づく部位特異的変異導入方法において目的外変異の挿入される可能性を極めて低く抑えながら、従来の方法に比べて確実、迅速、簡便に変異導入を実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼとは、DNAの３’端から５’端方向にDNA鎖を端から消化し、削る活性を有するDNAポリメラーゼである。一般的に、ＰＣＲ法に用いられる酵素は大きく２種類に分けられる。１つがＰＣＲ法開発当初から使用されているＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに代表される３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼであり、もう１つが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（ＤＮＡ校正活性）を有するＤＮＡポリメラーゼである。前者は、PolＩ型ＤＮＡポリメラーゼ、後者はα型ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれることもある。本発明での、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼには、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｕｌｔｉｍａ  ＤＮＡポリメラーゼなどのそれ自身が単独で該活性を有するものや、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ等の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを混合して調製したＫＯＤ  Ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＥＸ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄ  ＤＮＡポリメラーゼなども含まれる。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの特徴は、その忠実度（フィデリティ）が高いことである。すなわち、ＤＮＡ合成の際に誤った塩基を取り込む頻度が極めて低く、鋳型に対して忠実にその相補鎖を合成することができる。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの持つもう一つの特徴は、それを用いて増幅したDNA断片の末端が平滑末端（Ｂｌａｎｔ Ｅｎｄ）となることである。これにより、DNA断片の端をもう一方の端と連結し、自己環状化（セルフライゲーション）することが可能となる。これに対し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ等のPolＩ型酵素は、忠実度が低く、ＤＮＡポリメラーゼ反応中に誤った塩基を取り込む可能性がある。また、増幅したDNA断片の３’末端はｄＡの突出末端となっていることから、自己環状化はそのままではできない。本発明で使用するDNAポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ高忠実度のＤＮＡポリメラーゼであればなんでもよく特に限定されない。
【００１７】
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）とは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて目的DNA断片を短時間に増幅する技術であり、増幅したい鋳型と、増幅したい領域をはさみ込むように設計した１組２本のプライマー用いてサーマルサイクリング反応を行い、目的DNAを指数関数的に増幅することにより行う。本発明では、ＰＣＲ法の中でも、特にインヴァースＰＣＲ法といわれる方法を実施する。インヴァースＰＣＲ法とは、環状DNA（プラスミドなど）を鋳型として、逆方向に（外側に）設定した2種類のプライマーを用いてＰＣＲを行い、プラスミド全周の増幅を行う手法である。ただし、本発明においては、欠失変異体を調製したいような場合には、プラスミド全周ではなく、その一部を欠いてＰＣＲを実施する場合もある。
【００１８】
リン酸化酵素とは、リン酸基を付加する酵素であり、本発明では、ＤＮＡにリン酸基を付加するポリヌクレオチドキナーゼを指す。この酵素により、リン酸化されたＤＮＡは、その後のＤＮＡ結合酵素の基質となることができる。分子生物学の分野では、Ｔ４ファージ由来のＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼが一般的であるが、本発明では、ＤＮＡの５´端にリン酸基を付加できる酵素であればよく、特に由来に制限はない。
【００１９】
ＤＮＡ結合酵素とは、ＤＮＡ同士を連結させる酵素であり、分子生物学の分野では、Ｔ４ファージ由来のＴ４ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌由来の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Pyrococcus furiosus 由来のPfu DNA リガーゼ等が知られているが、本発明では、５´端リン酸化されたＰＣＲ増幅産物の５´端と３´端とを連結できればよく、特にこれらに限定されない。本発明でのＰＣＲ増幅産物は、平滑末端（ブラントエンド）になっているので、好ましくは、平滑末端同士が効率よく連結できるＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用する。
【００２０】
自己環状化（セルフライゲーション）とは、ＤＮＡ分子間ではなく、同一のＤＮＡ分子内で、その５´端と３´端とを連結して環状化させることである。本発明では、これにより、ＰＣＲ増幅産物は環状プラスミドとなり、大腸菌へ移入（形質転換）することが可能となる。大腸菌に移入されたプラスミドは、適切な抗生物質を含む寒天培地上で大腸菌コロニーを形成することから、変異体の単離が可能となる。
【００２１】
鋳型として利用した２本鎖環状 DNA分子に由来するDNAを選択的に分解するステップは、目的とする変異の入っていない鋳型を分解して、変異体の選抜を容易にする目的で行うものである。鋳型として利用した２本鎖環状 DNA分子に由来するDNAを選択的に分解する方法としては、鋳型ＤＮＡとＰＣＲ反応で合成されたＤＮＡ鎖が実質的な違いを有して区別できるようにする必要があり、その方法としては、（１）鋳型ＤＮＡにおいてチミン（dTTP）の代わりにウラシル（dUTP）を入れ、それをウラシル-DNAグリコシラーゼ(UNG)にて処理・分解する方法。（２）メチル化されたプラスミドＤＮＡを鋳型にして、それをメチル化ＤＮＡ特異的な制限酵素等を用いて処理・分解する方法、などがある。（１）の方法において、鋳型ＤＮＡにおいてチミン（dTTP）の代わりにウラシル（dUTP）を入れる方法としては、dUTPase をコードする遺伝子（dut）と ウラシルDNA グリコシラーゼをコードする遺伝子（ung）が欠損しているCJ236 系統の大腸菌を用いてインビボにてＤＮＡを調製する方法や、ＰＣＲ反応等のＤＮＡ合成反応の際にチミン（dTTP）の代わりにウラシル（dUTP）を用いたインビトロの方法などがある。また、（２）のメチル化されたプラスミドＤＮＡを得る方法としては、メチラーゼを有する一般的な大腸菌にてプラスミドＤＮＡを調製するインビボの方法に加えて、単離したプラスミドにインビトロでメチラーゼを作用させることによってもメチル化されたプラスミドＤＮＡを得ることができる。
【００２２】
メチル化ＤＮＡを特異的に分解する方法としては、メチル化ＤＮＡ特異的な制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）が有効であるが、メチル化ＤＮＡを不活化する他の酵素であってもよい。本発明においては、メチル化ＤＮＡ特異的な制限酵素としては、ＤｐｎＩが好適であるが、NanII，NmuDＩ及びNmuEＩなどメチル化ＤＮＡ特異的な制限酵素であれば特に制限はなく、DpnＩのアイソシゾマーである必要もない。本発明の一実施形態においては、鋳型プラスミドＤＮＡは、damメチル化された２本鎖ＤＮＡであり、それを消化させるのに用いられる制限酵素は DpnＩである。
【００２３】
インヴァースPCR法に基づく変異導入方法において、ＰＣＲにおけるサーマルサイクリング反応のサイクル数は、反応に要する時間の問題のみでなく、目的箇所以外の変異（２nd-site Mutation）の導入頻度に影響するため、大変重要なファクターである。すなわち、ＰＣＲ反応においては、たとえ高忠実度のＤＮＡポリメラーゼを用いたとしても、極低い頻度ながらＰＣＲエラーとして誤った塩基が取り込まれ、その結果、鋳型とは異なった塩基配列となることがある。この誤った塩基が取り込まれる可能性は、当然ながらポリメラーゼ反応を繰りかえせば繰り返す程に高くなるので、ＰＣＲ反応におけるサイクル数は少ない程、目的外変異が導入される可能性を少なくできる。ただし、少ないサイクル数では、増幅産物が十分に得られず、そのために形質転換に用いても大腸菌コロニーが得られないことが起こりうる。本発明では、各ステップの反応条件を至適化することにより反応の効率化を図り、少ないＰＣＲサイクル数でも大腸菌コロニーを得ることができるようになっている。すなわち。本発明においては、サイクル数を１５サイクル以下にしても十分なコロニーを得ることができ、故にＰＣＲエラーとして誤った塩基が取り込まれる可能性を最小限にすることができる。
【００２４】
また、本発明の特徴の一つは、各反応ステップを実質的に連続的に行うことができることにある。すなわち、本発明においては、反応ステップは、（１）２本鎖環状DNA分子を鋳型にして３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いてPCRをすること、（２）前期鋳型として用いた２本鎖環状 DNA分子を選択的に分解すること、
（３）前記PCR増幅産物に対してリン酸化酵素とDNA結合酵素を同時に作用させて自己環状化させること、の3ステップよりなるが、これらのステップの間は、試薬を単に添加するか、あるいは、反応液の一部を別容器に移した後に、試薬を追加するだけである。つまり、アガロースゲル電気泳動等によりＰＣＲ産物を分離精製したり、エタノール沈殿等によりバーファー置換をすることなくステップを進めることが可能である。  従来の方法（Nucleic Acids Res. 1991 May 25;19(10):2785. A simple and rapid method for generating a deletion by PCR.  Imai Y, Matsushima Y, Sugimura T, Terada M.）（非特許文献４）では、これらの操作が必須であったために、反応ステップが煩雑なばかりでなく、反応所要時間も2日を要した。一方、本発明においては、約3時間にて形質転換までの反応を終えることができる。
【００２５】
本発明の一つの態様は、２本鎖環状 DNA分子に対して部位特異的に変異を導入するための試薬キットであって、次の構成を含む試薬キットである。
（ａ）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ、
（ｂ）リン酸化酵素
（ｃ）DNA結合酵素
（ｄ）制限酵素
【００２６】
本発明の上記試薬キットは、さらに必要により、DNAポリメラーゼ用の反応バッファー、などを含む。またリン酸化酵素、DNA結合酵素、制限酵素は、各々別チューブに入っていてもよく、あるいは、予め混合された形状にて構成されていてもよい。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１  種々のサイズのプラスミドをターゲットとした場合の変異導入効率の評価
3.3kb〜11.3kbのプラスミドサイズである5種類のヒトcDNAクローン(東洋紡FLJ cDNA Clone: Code No. FLJ-101)を対象に、1塩基置換、3塩基欠失、6塩基挿入の変異導入を試みた。反応は以下のように行った。即ち、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するKOD-Plus-（東洋紡）を取り扱い説明書に従い、添付の１０ｘバッファーを１ｘ濃度、硫酸マグネシウム溶液を1.2ｍＭ、ｄＮＴＰｓを０．2ｍＭ、KOD-Plus-（東洋紡）を１Ｕ、フォワード側PCRプライマーおよびリバース側プライマーをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、鋳型プラスミドを５０ng、最終液量は５０μｌになるようにPCR反応液を調製した。ＰＣＲは以下の条件で実施した。即ち、反応機器は、アプライドバイオシステムズ社製のGeneAmp PCR system 9600を使用し、熱変性反応９４℃・2分の後、熱変性反応９８℃・１０秒、アニール・伸長反応６８℃・X分をXサイクル行った。ここで、Xは、対象とするプラスミドのサイズ１ｋｂ当たり1分あるいは1サイクルに設定した。例えば、3.3kbのサイズのプラスミドに対しては、熱変性反応９４℃・2分の後、熱変性反応９８℃・１０秒、アニール・伸長反応６８℃・３．５分を４サイクル、11.3kbのサイズのプラスミドに対しては、熱変性反応９４℃・2分の後、熱変性反応９８℃・１０秒、アニール・伸長反応６８℃・11.5分を１２サイクルで行った。次に、鋳型プラスミドを消化するために、PCR反応終了後の反応液に制限酵素DpnIを１０units加え、37℃にて1時間インキュベートした。次に、PCR産物のセルフライゲーションを行うために、DpnI処理したPCR反応液２μｌ、滅菌蒸留水７μｌ、Ligation high(東洋紡)５μｌ、T4  Polynucleotide kinase１μｌ（＝5units）の反応液（最終液量は１５μｌ）を調製し、良く攪拌した後、16℃にて1時間インキュベートを行った。最後に、この反応液１０μｌおよび大腸菌DH５α（東洋紡）１００μｌを用いて、定法に従って、大腸菌の形質転換を行い、LB培地（アンピシリンを含む）に適当量をまいた。次に、変異導入効率を見積もるため、形質転換体のコロニーからランダムに各１２個ずつプラスミドを調製し、それらをシーケンシングして、目的の変異が入っているクローンの割合の評価を行った。その結果を表１に示す。この結果から本発明の方法によれば、3.3kb〜11.3kbのプラスミドにおいて、特にサイズの影響をうけることなく、平均84％の割合で目的の変異体を得ることができた。
【００２９】
【表１】
2008109875.tif 000003
【００３０】
実施例２  大きな欠失導入およびＨｉｓ-tag挿入における他方法との性能比較
7.3kbのプラスミドFLJ32066を対象に、本発明の方法およびWO9720950の方法にて90塩基の欠失、および6ｘHisに対応する18塩基の導入を行った。本発明の方法は、実施例１記載の反応組成、反応方法にて実施した。一方、WO9720950の方法については、ストラタジーン社より市販されているキット「QuikChangeＩＩ」を、その取り扱い説明書に従って実施した。変異導入率の評価は、実施例１と同様に、形質転換体のコロニーからランダムに各１２個ずつプラスミドを調製し、それらをシーケンシングして、目的の変異が入っているクローンの割合を算出した。その結果を表２に示す。この結果から、本発明の方法によれば、90塩基の欠失や6ｘHisに対応する18塩基の導入など、他の方法では困難な変異についても、高い変異導入効率で実施しうることが判明した。
【００３１】
【表２】
2008109875.tif 000004
【００３２】
実施例３  目的外変異（2nd site-mutation ）の挿入頻度の評価
プラスミドpAK119M（全長を対象に、本発明の方法およびWO9720950の方法にて変異導入（一塩基置換）を行った。なお、本プラスミドpAK119Mはこの一塩基置換により、その形質転換体（コロニー）は青色を呈するようになることから、変異が入った形質転換体の割合を簡便に評価できるものである。本発明による変異導入は、実施例１の方法と同様に、但し、PCRは8サイクルにて実施した。一方、WO9720950の方法については、ストラタジーン社より市販されているキット「QuikChangeＩＩ」を、その取り扱い説明書に従って実施した。変異導入操作後、形質転換を行い、０．０１％ Ｘ−ｇａｌを含むLB培地（アンピシリンを含む）に適当量をまいた。その結果、何れの方法においても、90％以上の変異導入効率が得られた。次に、各方法における目的外変異（2nd site-mutation ）の挿入頻度の評価を行うため、各方法により得られた変異体（青色を呈するコロニー）から２４クローンづつをランダムに選び、プラスミドを調製した後、2000bpの領域のシーケンシングを行った。その結果、本発明による、実際に解析した48000塩基（＝２４クローンｘ2000bp）の内、目的以外の変異はわずか1塩基であり、目的外変異の入る頻度は非常に低いことが確認できた。これは、non-PCR法であるWO9720950の方法と比較しても、同等以上の結果であった。
【００３３】
【表３】
2008109875.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の方法は従来の変異導入方法に比べて、極めて簡便に、また確実に変異導入を行うことができる。さらに、従来の方法では困難であった、数十ｂｐに及ぶ欠失変異体や挿入変異体の作成も可能である。この特長は、タンパク質の機能解析やDNAの機能性配列領域の解析等において大変有用であり、研究開発の迅速化を通じて、基礎研究、産業利用研究を問わず、変異導入を実施するものに経済的に多大の利益をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明による変異導入方法のフローを示す図である。
【図１】
2008109875.tif 000006