(57)【要約】      （修正有）【課題】非ヒト哺乳類動物の胚発生の過程で起こる不活性Ｘ染色体の再活性化の生物的意義を検討するために有用な変異アリルを有するモデル非ヒト哺乳類動物の提供。【解決手段】対合する二本の性染色体のうち一方のＸ染色体が、Ｘｉｓｔ遺伝子を恒常的に発現する恒常活性型アリルを有する非ヒト哺乳類動物を、モデルヒト哺乳類動物とする。該モデルヒト哺乳類動物は、不活性化Ｘ染色体の再活性化が恒常的に阻害され、恒常的に前記Ｘ染色体は恒常的に不活性型となる。このようなモデル非ヒト哺乳類動物は、例えば、下記非ヒト哺乳類動物ＡおよびＢを交配することによって得られる。Ａ：発現プロモーター、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列、転写終結配列およびＣｒｅリコンビナーゼの認識配列を５’側からこの順序で含むカセットが、Ｘｉｓｔ遺伝子の上流側に配置されたＸ染色体を有する非ヒト哺乳類動物。Ｂ：Ｃｒｅ酵素を発現する非ヒト哺乳類動物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対合する二本の性染色体のうち一方のＸ染色体が、Ｘｉｓｔ遺伝子を恒常的に発現する恒常活性型アリルを有することを特徴とする、恒常不活性化Ｘ染色体を有するモデル非ヒト哺乳類動物。
【請求項２】
前記Ｘ染色体において、Ｘｉｓｔ遺伝子の上流側に、外来性の発現プロモーターが機能的に配置されている、請求項１記載のモデル非ヒト哺乳類動物。
【請求項３】
前記発現プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーターおよびＥＦ１αプロモーターからなる群から選択された少なくとも一つのプロモーターである、請求項２記載のモデル非ヒト哺乳類動物。
【請求項４】
非ヒト哺乳類動物が、げっ歯類動物である、請求項１から３のいずれか一項に記載のモデル非ヒト哺乳類動物。
【請求項５】
げっ歯類動物が、マウスである、請求項４記載のモデル非ヒト哺乳類動物。
【請求項６】
以下の非ヒト哺乳類動物ＡとＢとを交配することにより得られる、請求項１から５のいずれか一項に記載のモデル非ヒト哺乳類動物。
Ａ：発現プロモーター、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列、転写終結配列およびＣｒｅリコンビナーゼの認識配列を５’側からこの順序で含むカセットが、Ｘｉｓｔ遺伝子の上流側に機能的に配置されたＸ染色体を有する非ヒト哺乳類動物
Ｂ：Ｃｒｅ酵素を発現する非ヒト哺乳類動物
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のモデル非ヒト哺乳類動物の製造方法であって、以下の非ヒト哺乳類動物ＡとＢとを交配する工程を含むことを特徴とする製造方法。
Ａ：発現プロモーター、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列、転写終結配列およびＣｒｅリコンビナーゼの認識配列を５’側からこの順序で含むカセットが、Ｘｉｓｔ遺伝子の上流側に機能的に配置されたＸ染色体を有する非ヒト哺乳類動物
Ｂ：Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する非ヒト哺乳類動物
【請求項８】
前記発現プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーターおよびＥＦ１αプロモーターからなる群から選択された少なくとも一つのプロモーターである、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
前記転写終結配列が、ポリＡ付加シグナル配列である、請求項７または８記載の製造方法。
【請求項１０】
前記非ヒト哺乳類動物が、Ｃｒｅリコンビナーゼ認識配列の間であって、転写終結配列の上流に、さらに前記選択マーカーを有する、請求項７から９のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、恒常的に再活性化が阻害された恒常不活性化Ｘ染色体を有するモデル非ヒト哺乳類動物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は、性染色体によってオスとメスとに性別が分類されており、ヒトを含む哺乳類においては、対合する二本の性染色体の組み合わせが、Ｘ染色体とＹ染色体との組み合わせであるか（Ｘ／Ｙ、オス）、二本のＸ染色体であるか（Ｘ／Ｘ、メス）によって性別が分類されている。そして、哺乳類動物のメスについては、二本のＸ染色体のうち、一方のＸ染色体は不活性化されている。この不活性化は、オスとメスとの間における遺伝子量補償を行うためのメカニズムであり、これによって、常染色体の遺伝子発現量とＸ染色体の遺伝子発現量との比について、オスとメスとの性差が解消される。すなわち、オスは、遺伝情報に富むＸ染色体を一本しか有しておらず、Ｘ染色体連鎖遺伝子は構成的にヘミ接合の状態であるが、メスは、前記Ｘ染色体を二本有するため、メスにおける常染色体の遺伝子発現量に対するＸ染色体の遺伝子発現量の割合は、オスの割合の二倍となり、差が生じてしまう。そこで、一方のＸ染色体を不活性化することによって、メスのＸ染色体連鎖遺伝子の大部分が機能的にヘミ接合となり、常染色体の遺伝子発現量とＸ染色体の遺伝子発現量との比を補償する調整が行われている。
【０００３】
このＸ染色体の不活性化には、Ｘ染色体不活性化センター（Ｘ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｅｎｔｅｒ：Ｘｉｃ）のＸ染色体連鎖非コード遺伝子であるＸｉｓｔ遺伝子が重要な役割を果たしていることが知られている。このＸｉｓｔ遺伝子の転写物は、タンパク質をコードしない非コードＲＮＡ（機能性ＲＮＡ）である。この非コードＲＮＡは、将来不活性化される一方のＸ染色体から発現し、そのＸ染色体の全域にわたってシスに結合することによって、不活性化を引き起こす。これに対して、活性化状態である他方のＸ染色体では、Ｘｉｓｔ遺伝子は発現されることなく安定に抑制される。
【０００４】
Ｘ染色体不活性化には、父性Ｘ染色体が選択的に不活性化されるタイプ（インプリント型不活性化）と、由来に関わらずランダムに不活性化されるタイプ（ランダム型不活性化）とが知られる。前者は、通常、胎盤等の胚体外組織と呼ばれる細胞群に特異的に見られるものであり、それ以外の胎仔の全ての組織は、通常、後者のタイプを示す。例えば、マウスの場合、着床前の４細胞期ごろから各割球で「インプリント型不活性化」が起こる。そして、胚盤胞の時期になると、細胞は、将来、胎盤等の胚体外組織になる細胞と、胎仔本体になる胚体組織の細胞とに分化する。この分化において、前記胚体外組織の細胞では、前記インプリント型不活性化が安定に維持される。一方、生殖細胞を含む胚体組織細胞の起源となる内部細胞塊（ＩＣＭ）では、それまでインプリント型不活性化していた父性Ｘ染色体が、いったん「再活性化」される。そして、その後、ＩＣＭの細胞群では、細胞分化にともなって、今度は、由来にかかわらずランダムに一方のＸ染色体が不活性化される「ランダム型不活性化」が起こる。このようにランダムな不活性化を経た細胞群のうち、胚体組織細胞では、体細胞分裂を通じて、このランダム型不活性化が安定に維持される。他方、ランダムな不活性化を経た細胞群のうち、将来の生殖細胞（卵子）になる始原生殖細胞においても、体細胞と同様にランダム型不活性化が生じる。しかし、これらの始原生殖細胞では、さらに、胎生期の生殖巣（将来の卵巣）で減数分裂に入る前に、それまで不活性であったＸ染色体は再活性化され、その活性を維持したまま次世代へと伝えられることわかっている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
【０００５】
また、前述のように、Ｘ染色体の不活性化および再活性化は、細胞分化と密接な関係があることが知られている。他方、受精卵は、分化における全能性を有しているが、さらに、核の全能性を再獲得する能力も有することも報告されている。これは、すでに分化を終了した（すなわち全能性を消失した）体細胞の核を、脱核した卵に移植することによって、体細胞が全能性を再獲得したことから確認されている。これは、全能性を消失した細胞に特異的なゲノム修飾を、未分化細胞のゲノム修飾パターンに書き換えることによって、全能性や多分化能性が再獲得されていると考えられており、この機構は、一般に「リプログラミング」と呼ばれている。このような全能性の再獲得に関与するリプログラミングの研究は、例えば、再生医療等における課題である幹細胞の未分化能維持や分化制御機能の解明に役立つ研究として、極めて重要である。そして、このようなリプログラミングが可能であるＩＣＭや生殖細胞等の細胞において、前述のように、分化に関与するＸ染色体の再活性化が生じていることから、再活性化の意義を明らかにしていくことは、ひいてはリプログラミングを検討する上でも非常に有効であると考えられる。
【０００６】
しかしながら、このようにＸ染色体について、インプリント型不活性化が再活性化されることの意義は、明らかとなっていない。
【非特許文献１】Ｍａｋ，Ｗ．，Ｎｅｓｔｅｒｏｖａ，Ｔ．Ｂ．，ｄｅ  Ｎａｐｏｌｅｓ，Ｍ．，Ａｐｐａｎａｈ，Ｒ．，Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．，Ｏｔｔｅ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ  Ｂｒｏｃｋｄｏｒｆｆ，Ｎ．（２００４）．“Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｔｅｒｎａｌ  Ｘ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，６６６−６６９．
【非特許文献２】Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｏｔｔｅ，Ａ．Ｐ．，Ａｌｌｉｓ，Ｃ．Ｄ．，Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．ａｎｄ  Ｈｅａｒｄ，Ｅ．（２００４）．“Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  Ｘ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅａｒｌｙ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，  ６４４−６４９．
【非特許文献３】Ｍｏｎｋ，Ｍ．ａｎｄ  ＭｃＬａｒｅｎ，Ａ．（１９８１）．“Ｘ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｆｏｅｔａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ．”Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．６３，７５−８４．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、非ヒト哺乳類動物の胚発生の過程で起こる不活性化Ｘ染色体の再活性化の生物的意義を検討するために有用なモデル非ヒト哺乳類動物の提供を目的とする。より具体的には、恒常的に不活性化したＸ染色体を有するモデル非ヒト哺乳類動物、すなわち、不活性化Ｘ染色体の再活性化が恒常的に阻害されたモデル非ヒト哺乳類動物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明のモデル非ヒト哺乳類動物は、対合する二本の性染色体のうち一方のＸ染色体が、Ｘｉｓｔ遺伝子を恒常的に発現する恒常活性型アリルを有することを特徴とする、恒常不活性化Ｘ染色体を有するモデル非ヒト哺乳類動物である。
【０００９】
本発明のモデル非ヒト哺乳類動物の製造方法は、本発明のモデル非ヒト哺乳類動物の製造方法であって、以下の非ヒト哺乳類動物ＡとＢとを交配する工程を含むことを特徴とする。
Ａ：発現プロモーター、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列、転写終結配列およびＣｒｅリコンビナーゼの認識配列を５’側からこの順序で含むカセットが、Ｘｉｓｔ遺伝子の上流側に機能的に配置されたＸ染色体を有する非ヒト哺乳類動物
Ｂ：Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する非ヒト哺乳類動物
【発明の効果】
【００１０】
本発明らは、鋭意研究の結果、哺乳類動物の胚発生過程で生じる不活性化Ｘ染色体の再活性化を解明するためには、不活性化Ｘ染色体の再活性化が恒常的に阻害されたモデル哺乳類動物、すなわち、恒常的に不活性化したＸ染色体を有するモデル哺乳類動物が有用であるとの知見を得た。そこで、Ｘ染色体の不活性化を担うＸｉｓｔ遺伝子を恒常的に発現させることで、恒常的にＸ染色体が不活性化したモデル非ヒト哺乳類動物を得るに到った。このような本発明のモデル非ヒト哺乳類動物であれば、不活性化Ｘ染色体の再活性化が恒常的に阻害されるため、Ｘ染色体の不活性化が維持される。このため、本発明のモデル非ヒト哺乳類動物は、例えば、ＩＣＭや生殖細胞を含む胚体組織細胞の発生や分化、分化過程におけるゲノム修飾等に対する再活性化の影響や役割の解明に使用する実験ツールとして非常に有用である。なお、本発明のモデル非ヒト哺乳類動物のように、恒常的にＸ染色体を不活性化する系（恒常的に不活性化Ｘ染色体の再活性化を阻害する系）、ならびに、そのような系を再活性化の意義を解明するためのツールとして使用すること等は、全く報告されておらず、このような系は本発明者らがはじめて見出したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のモデル非ヒト哺乳類動物は、前述のように、対合する二本の性染色体（Ｘ／Ｘ、Ｘ／Ｙ）のうち一方のＸ染色体が、Ｘｉｓｔ遺伝子を恒常的に発現する恒常活性型アリルを有することを特徴とする、恒常不活性化Ｘ染色体を有するモデル非ヒト哺乳類動物である。オスが有する一本のＸ染色体が恒常活性化型Ｘｉｓｔアリルを持つ場合、Ｘ染色体は不活性化し、胎生致死となるため、本発明のモデル非ヒト哺乳類動物は、通常、メス（Ｘ／Ｘ）である。本発明のモデル非ヒト哺乳類動物がメスの場合は、一方のＸ染色体におけるＸｉｓｔ遺伝子が恒常的に発現し、これによって、そのＸ染色体の不活性化が恒常的維持されていればよい。
【００１２】
なお、本発明は、胚発生の過程における再活性化の意義を解明するためのツールとして、恒常的に再活性化が阻害され、恒常的に不活性化Ｘ染色体が維持されるモデル動物が有用であるとの着想を得た点が一つの特徴である。そして、さらに、Ｘｉｓｔ遺伝子を恒常的に発現させることで、モデル動物におけるＸ染色体の不活性化を恒常的に維持できることを見出した点がもう一つの特徴である。したがって、本発明においては、Ｘｉｓｔ遺伝子を恒常的に発現できればよく、そのような恒常活性型アリルの構造や作製方法については、何ら制限されるものではない。
【００１３】
本発明のモデル非ヒト哺乳類動物は、前記Ｘ染色体において、Ｘｉｓｔ遺伝子の上流側に、外来性の発現プロモーターが機能的に配置されていることが好ましい。このようにＸｉｓｔ遺伝子の上流であって、Ｘｉｓｔ遺伝子の発現を機能的に制御可能な箇所に、外来性の発現ベクターを配置することによって、Ｘｉｓｔ遺伝子の恒常的な発現をより確実に実現することができる。なお、本発明において「機能的に配置」とは、それが意図する機能を発揮しうる状態で配置されていることを意味する。
【００１４】
前記発現プロモーターとしては、例えば、哺乳類動物の細胞において機能するものであれば特に制限されないが、一般的に高発現プロモーターと呼ばれているものが好ましい。このような高発現プロモーターとしては、例えば、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター等があげられ、中でもＣＡＧプロモーターが好ましい。前記ＣＡＧプロモーターは、通常、サイトメガロウィルスのエンハンサー配列、ニワトリβ−アクチンプロモーター配列およびウサギβ−グロビンのエクソン配列を含む合成プロモーターとして知られている。
【００１５】
本発明において、非ヒト哺乳類動物は、特に制限されず、Ｘ染色体の不活性化ならびに再活性化を示すあらゆる哺乳類動物があげられる。具体例としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等のげっ歯類動物やサルやウシ等があげられる。なお、後述する実施例においては、モデルマウスを作製しているが、これには限定されず。他の哺乳類動物に関しても、当業者が過度の試行錯誤を伴うことなく、本発明の非ヒト哺乳類動物を作製することができる。
【００１６】
本発明のモデル非ヒト哺乳類動物は、Ｘ染色体の恒常的な不活性化のために、恒常活性型アリルによってＸｉｓｔ遺伝子を恒常的に発現させることを特徴とする。このため、前述のように、Ｘｉｓｔ遺伝子を恒常的に発現させる方法自体は何ら制限されない。したがって、本発明のモデル非ヒト哺乳類動物の製造方法は、特に制限されないが、例えば、以下のような方法により製造することができる。
【００１７】
すなわち、本発明のモデル非ヒト哺乳類動物の製造方法は、以下の非ヒト哺乳類動物ＡとＢとを交配する工程を含むことを特徴とする。
Ａ：発現プロモーター、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列、転写終結配列およびＣｒｅリコンビナーゼの認識配列を５’側からこの順序で含むカセットが、Ｘｉｓｔ遺伝子の上流側に機能的に配置されたＸ染色体を有する非ヒト哺乳類動物
Ｂ：Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する非ヒト哺乳類動物
【００１８】
前記非ヒト哺乳類動物Ａは、発現プロモーターの下流であり且つＸｉｓｔ遺伝子の上流に転写終結配列を有しているため、前記発現プロモーターの制御下で転写が開始されても、転写終結配列より下流に位置するＸｉｓｔ遺伝子の転写は起こらない。すなわち、非ヒト哺乳類動物Ａは、Ｘｉｓｔ遺伝子を恒常的に発現しない恒常不活性型アリルを有している。このように、非ヒト哺乳類動物Ｘの前記Ｘ染色体からは、Ｘｉｓｔ遺伝子産物である非コードＲＮＡが転写されないため、前記Ｘ染色体は、不活性化することなく、恒常的に活性化を維持することとなる。そして、このような非ヒト哺乳類動物ＡとＣｒｅリコンビナーゼを発現する非ヒト哺乳類動物Ｂとを交配した場合、Ｃｒｅ認識配列で挟まれた領域とＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子とを持つ子孫においては、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現により、Ｃｒｅ認識配列の間で組換えが生じ、転写終結配列を含むＣｒｅ認識配列で挟まれた領域が除去される。このため、前記子孫においては、外来性の前記発現プロモーターによりＸｉｓｔ遺伝子が恒常的に発現することになり、結果的に、恒常的に再活性化が阻害された、恒常不活性化Ｘ染色体を有するモデル非ヒト哺乳類が得られる。なお、このようなＣｒｅリコンビナーゼとＣｒｅリコンビナーゼの認識配列とを利用した組換えは、従来公知の方法に基づいて行うことができる。
【００１９】
本発明の非ヒト哺乳類動物の製造方法について、マウスを例にあげて説明する。なお、本発明は、この例に限定されない。
【００２０】
（１）Ｘｉｓｔ遺伝子転写能欠損アリルの作製
まず、マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における内在性Ｘｉｓｔ遺伝子座（標的遺伝子座）に、相同組換えによって、発現プロモーターを含むカセットを導入して、Ｘｉｓｔ遺伝子が転写されないアリルを作製する。
【００２１】
前記発現プロモーターを含むカセットとしては、例えば、発現プロモーター、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列、転写終結配列およびＣｒｅリコンビナーゼの認識配列を５’側からこの順序で含むカセットがあげられる。発現プロモーターは、前述と同様であり、中でもＣＡＧプロモーターが好ましい。Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列としては、特に制限されないが、例えば、従来公知のｌｏｘＰ配列があげられる。また、前記ＥＳ細胞への前記カセットの導入を確認できることから、前記Ｃｒｅ認識配列の間であって、前記転写終結配列の上流に、さらに、選択マーカーをコードする配列を有することが好ましい。選択マーカーとしては、特に制限されず、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、および、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
【００２２】
このカセットを含むベクターを、従来公知の方法に基づいてＥＳ細胞に導入し、ＥＳ細胞のゲノムにおけるＸｉｓｔ転写開始点を含むプロモーター領域の相同組換えを行う。そして、導入細胞の培養を行い、選択マーカーの発現株を選択する。この選択マーカーの発現株が、相同組み換えにより前記カセットが導入された変異アリル（以下、「ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリル」という）を有する組換えＥＳ細胞株である。前記選択マーカーが、例えば、薬剤耐性マーカーの場合には、薬剤耐性株を選択すればよい。このＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルを有する組換えＥＳ細胞株では、Ｘｉｓｔ遺伝子の上流にカセット内の転写集終結配列が存在するため、Ｘｉｓｔ遺伝子は転写されない。このため、Ｘｉｓｔ遺伝子の転写産物である非コードＲＮＡによって、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルを有するＸ染色体が不活性化されることはない。
【００２３】
（２）恒常的にＸｉｓｔ遺伝子を発現するアリルの作製
つぎに、得られた組み換えＥＳ細胞株を胚盤胞へ注入した後、これを偽妊娠マウスの子宮に戻し、誕生したキメラマウスを交配に用いることによって、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルを持つマウスが得られる（オス  ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／Ｙ；  メス  ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／＋）。そして、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／Ｙのオス（または、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／Ｘのメス）を、Ｃｒｅ組み換え酵素を発現するトランスジェニックマウスのメス（またはオス）と交配させる。前記交配による受精卵が、例えば、母親よりＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルを受け継いだ場合、胚の細胞では、発現したＣｒｅリコンビナーゼの触媒作用によってＣｒｅ認識配列で挟まれた転写終結配列（ならびに選択マーカー配列）を含む領域が除去される。このようにＸｉｓｔ遺伝子の転写を抑制していた転写終結配列が除去されるため、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルは、Ｘｉｓｔ遺伝子がＣＡＧプロモーターによって恒常的に発現される変異アリル（以下、「ＸｉｓｔＣＡＧアリル」という）へと不可逆的に転換される。このようにして、ＸｉｓｔＣＡＧアリルに関してヘテロ接合体の変異型のメスが得られる。このようにして本発明の非ヒト哺乳類動物（本実施形態においてはモデルマウス）を得ることができる。このモデルマウスは、Ｘｉｓｔ遺伝子を恒常的に転写するため、転写物である非コードＲＮＡによって、ＸｉｓｔＣＡＧアリルを有するＸ染色体は、恒常的に不活性化され、再活性化されることはない。
【００２４】
通常のメスでは、前述のように、体細胞において、ランダムに不活性化が生じるため、その不活性型は５０：５０となる。これに対して、前述のＸｉｓｔＣＡＧアリルは、恒常的に活性型のＸｉｓｔとして機能するため、これを有するＸ染色体は、常に（恒常的に）不活性化する。したがって、本発明の一形態であるＸｉｓｔＣＡＧアリルに関してヘテロ接合体となるメスでは、不活性化様式が、５０：５０ではなく１００：０のバイアスが生じることになる。
【００２５】
本発明のモデル非ヒト哺乳類動物の使用方法は、例えば、Ｘ染色体における再活性化に関するあらゆる研究に実験ルールとして使用でき、その用途は何ら制限されない。以下に、本発明のモデル非ヒト哺乳類動物の使用方法の一例をあげるが、本発明は、これに限定されるものではない。
【００２６】
Ｘ染色体連鎖遺伝子の突然変異には、しばしば、神経疾患や精神遅延等の原因になるものが知られている。例えば、ＭｅＣＰ２という遺伝子は、メチル化されたＤＮＡに結合し、遺伝子発現制御に関わるタンパク質をコードするが，ヒトにおいては、この遺伝子欠損が、Ｒｅｔｔ症候群という神経疾患の原因であることがわかっている。Ｒｅｔｔ症候群と診断される患者のほとんどが女性であるが、これは、男性の場合、Ｘ染色体を１本しか持たないため、そのＸ染色体がＭｅＣＰ２の機能を欠損した場合、機能的なＭｅＣＰ２タンパク質が作られず、胎生致死となるためと考えられる。しかしながら、女性の場合、一方のＸ染色体だけがこの欠損を持つのであれば，ランダム型Ｘ染色体不活性化のおかげで、理論的には、体を構成する細胞の半数では機能的なＭｅＣＰ２タンパク質が作られないものの、残りの半数の細胞では、機能的なＭｅＣＰ２タンパク質が作られることになる。実際には、ＭｅＣＰ２の変異の重篤さに応じて細胞の生存能が影響を受けるため、不活性化様式にある程度のバイアスがかかると思われるが、いずれにしろ、機能的なＭｅＣＰ２タンパク質を作ることが出来ない細胞だけでなく、前記タンパク質を作ることが出来る細胞も十分に存在する。このため、ＭｅＣＰ２変異ヘテロ接合体の女性は、その影響を受けつつも、男性のような胚性致死とはならずに誕生すると考えられる。このように、Ｘ連鎖遺伝子の変異による病気が女性だけに認められ、男性には認められないというケースは決して珍しくないと思われるが、これは、以上のような理由によると考えられる。しかしながら、女性の全細胞において、正常なＸ染色体が常に不活性化され、ある遺伝子に欠損をもつＸ染色体が活性状態を維持していると仮定した場合、理論上は、その遺伝子の欠損を持つ男性と同様の表現型を示すと考えられる。しかしながら、遺伝子の種類によって、この理論通りの現象が生じているのか否かは不明である。以上のような現象を検証する際に、本発明のモデル非ヒト哺乳類動物は、非常に有用なツールになる。
【００２７】
以上のような現象を検証する際に、本発明のモデル非ヒト哺乳類動物は、非常に有用なツールになる。その理由について、本発明のモデル非ヒト哺乳類動物が、前述のようなＸｉｓｔＣＡＧアリルを有するモデルマウスであることを例にあげて、図９を用いてさらに説明する。図９には、前記ＸｉｓｔＣＡＧアリルを有する動物を用いた交配の概略の一例を示す。
【００２８】
図９に示すように、ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を導入したヒト疾患モデルマウスのヘテロ接合体メス（Ｘｍｕｔ／Ｘ）と、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／Ｙのオスを交配する。この交配によって、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えが起こり、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルは、Ｘｉｓｔ遺伝子を恒常的に発現するＸｉｓｔＣＡＧアリルに転換され、このアリルを有するＸ染色体は、恒常的に不活性となる。したがって、胚の全細胞において、恒常的に、ＸｉｓｔＣＡＧアリルを有するＸ染色体を不活性化し、且つ、疾患遺伝子に変異を持つＸ染色体（Ｘｍｕｔ）を活性な状態で維持する子孫（Ｘｍｕｔ／Ｘ）を得ることができる。このようなＸｍｕｔ／ＸｉｓｔＣＡＧとＸｍｕｔ／Ｙとを比較すれば、例えば、前述のように理論通りの現象が生じているか否かという点を検証することができる。
【００２９】
［実施例］
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
【実施例１】
【００３０】
以下の方法によって恒常活性型Ｘｉｓｔアリルを作製した。
【００３１】
（１）Ｘｉｓｔ遺伝子の転写能を欠損したＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルの作製
マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における内在性Ｘｉｓｔ遺伝子座（標的遺伝子座）に、相同組換えによって、ＣＡＧプロモーターを含むカセットを導入して、Ｘｉｓｔ遺伝子が転写されないアリルを作製した。
【００３２】
まず、ＣＡＧ−Ｐａｃカセットを有する遺伝子ターゲティングベクターを準備した。前記ＣＡＧ−Ｐａｃカセットは、ＣＡＧプロモーター、および、前記ＣＡＧプロモーター制御下に、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子（Ｐａｃ：ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子）とＥＣＦＰ遺伝子との融合遺伝子ならびにポリＡ付加シグナル（ｐｏｌｙＡ（ｐＡ））をｌｏｘＰ配列で挟んだ領域（ＰａｃＥＣＦＰｐＡ）を有するカセットである。そして、このベクターを用いて、マウスＥＳ細胞のゲノムにおけるＸｉｓｔ転写開始点を含むプロモーター領域の相同組換えを行い、ピューロマイシン耐性株を選択することにより、前記カセットと置換したＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルを有する組換えＥＳ細胞株を得た。この相同組換えに関する概略を図１に示す。同図において、（Ａ）は、ゲノムの遺伝子座とターゲティングベクターの部分的な領域を示す概略図であり、ｅｘｏｎは、Ｘｉｓｔ遺伝子のｅｘｏｎを示し、（Ｂ）は、前記カセットにより相同組換えして得られたＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルの部分的な領域を示す概略図である。このＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルにおいては、ＣＡＧプロモーターに由来する転写は、Ｐａｃ下流のポリＡ付加シグナルによって止められるため、Ｘｉｓｔ遺伝子の配列が転写されることはない。また、前記カセット内にＥＣＦＰ遺伝子を配置し、細胞の蛍光観察によりＥＣＦＰの発現を観察することで、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルで機能的なＸｉｓｔの転写が起こらなくとも、ＣＡＧプロモーター自体は活性を維持していることを確認することができる。
【００３３】
（２）恒常的にＸｉｓｔ遺伝子を発現するＸｉｓｔＣＡＧアリルの作製
つぎに、得られた組み換えＥＳ細胞株を胚盤胞へ注入した後、これを偽妊娠マウスの子宮に戻し、誕生したキメラマウスを交配に用いることによって、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルを持つマウスを得た（オス  ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／Ｙ；  メス  ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／＋）。そして、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／Ｙのオスを、Ｃｒｅ組み換え酵素を発現するトランスジェニックマウスのメスと交配させた。前記交配による受精卵が、父親よりＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルを受け継いだ場合、胚の細胞では、発現したＣｒｅリコンビナーゼの触媒作用によってｌｏｘＰ配列で挟まれたＰａｃ−ｐＡ部分が除去される。このため、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルは、Ｘｉｓｔ遺伝子がＣＡＧプロモーターによって恒常的に発現されるＸｉｓｔＣＡＧアリルへと不可逆的に転換される。このようにして、ＸｉｓｔＣＡＧアリルに関してヘテロ接合体の変異型のメスを得た。
【００３４】
（３）遺伝子型の確認
得られたメスの遺伝子型を、サザンブロッティングによって確認した。具体的には、ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した後、電気泳動に供し、常法に基づいてプローブで断片の検出を行った。このサザンブロッティングは、プローブとして、Ｘｉｓｔ遺伝子第１エクソン（ｅｘｏｎ１）内の０．６ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩゲノム断片（ＢＥ０．６）を使用した。また、コントロールとして、Ｘｉｓｔ遺伝子が野生型アリルであるメスについても同様にサザンブロッティングを行った。なお、図２（Ａ）に、マウスＥＳ細胞における野生型の内在性Ｘｉｓｔ遺伝子座、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリル、および、ＸｉｓｔＣＡＧアリルの概略ならびにそれぞれのＲ−Ｒ断片の長さを示す。同図（Ａ）に示すように、前記プローブで野生型とＸｉｓｔＣＡＧアリルの検出を行った場合、前記野生型アリルについては約４．４ｋｂに、ＸｉｓｔＣＡＧアリルであれば約２．４ｋｂに、それぞれバンドが検出されることとなる。
【００３５】
サザンブロッティングの結果を、図２（Ｂ）のオートラジオグラフィー写真に示す。前述のように、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現し且つ野生型Ｘｉｓｔアリルを有するメス（＋／＋；Ｃｒｅ）と、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルを有するオス（ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／Ｙ）とを交配させたことから、得られる変異型メスの遺伝子型は、＋／ＸｉｓｔＣＡＧと考えられる。そこで、得られた変異型のメスと野生型のメスについてサザンブロッティングを行った結果、図２（Ｂ）のオートラジオグラフィー写真に示すように、変異型のメスからは、二つのバンド、すなわち、野生型Ｘｉｓｔアリル由来のＸｉｓｔ遺伝子とＸｉｓｔＣＡＧアリル由来のＸｉｓｔ遺伝子とが検出された。この結果から、得られたメスのＸ染色体は、野生型アリルとＸｉｓｔＣＡＧアリルとを有していることが確認できた。
【実施例２】
【００３６】
前述のように、ＸｉｓｔＣＡＧ２ＬアリルからはＸｉｓｔ遺伝子が転写されないため、このアリルを持つＸ染色体が不活性化されることはないと考えられる。これに対して、ＸｉｓｔＣＡＧアリルからは恒常的にＸｉｓｔ遺伝子が発現されるため、このアリルを持つＸ染色体は、必ず不活性化することが期待される。それぞれのアリルを持つＸ染色体が、期待通りの挙動を示すかについて、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を用いて調べた。
【００３７】
＜ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルの評価＞
（１）Ｘｉｓｔ遺伝子の発現解析
ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／＋の１３．５日胚より樹立した線維芽細胞（ＭＥＦ）について、発現されているＸｉｓｔ遺伝子が、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルと野生型Ｘｉｓｔアリルのいずれに由来するかをＲＴ−ＰＣＲにより確認した。
【００３８】
ＲＴ-ＰＣＲにおいては、野生型Ｘｉｓｔアリルとして、制限酵素ＰｖｕＩＩ認識部位の多型を持つものを利用した。図３（Ａ）に、野生型アリルとＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルの概略を示す。このような野生株を使用して、ＰＣＲ産物をＰｖｕＩＩで消化することにより、前記ＰＣＲ産物が、どちらのアリルから発現されたＲＮＡに由来するかを判断することができる。すなわち、同図（Ａ）に示すように、Ｘｉｓｔ遺伝子が野生株由来の場合、ＰＣＲ産物はＰｖｕII  認識部位を有するため、ＰｖｕIIにより切断が起こり、他方、Ｘｉｓｔ遺伝子が、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリル由来の場合は、ＰｖｕII認識部位を有さないため、ＰｖｕＩＩによる切断は生じないこととなる。
【００３９】
同図（Ｂ）に、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／＋のゲノム（ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌへテロ接合体のメス胚線繊維芽細胞由来）より増幅したゲノムＰＣＲ産物のＰｖｕＩＩ消化物（図においてレーン１）、ＲＴ−ＰＣＲ産物のＰｖｕII消化物（図においてレーン２、３）の電気泳動写真を示す。同図（Ｂ）に示すように、ゲノムＰＣＲ産物をＰｖｕＩＩ消化したものでは、野生株に由来するＰｖｕＩＩで切断されるものと、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌに由来するＰｖｕＩＩで切断されないものとが、それぞれ検出された。一方、ＲＴ‐ＰＣＲ産物は、全て、ＰｖｕII消化によって切断され、未切断のものは確認されなかった。つまり、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／＋のＭＥＦで発現されるＸｉｓｔは、すべて野生型アリルに由来することが証明された。このことから、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／＋のＭＥＦでは、ＸｉｓｔＣＡＧ２ＬアリルからＸｉｓｔが発現されることはないことが確認された。
【００４０】
（２）内在性Ｘ連鎖遺伝子の発現解析
ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／＋のＭＥＦ（繊維芽細胞）における内在性Ｘ連鎖遺伝子の発現パターンを確認した。
【００４１】
Ｘ染色体連鎖遺伝子５個について、野生型Ｘ染色体とＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルを持つ変異Ｘ染色体との間で制限酵素認識部位に多型が確認されている。したがって、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／＋のＭＥＦについてＲＴ−ＰＣＲならびにＰＣＲ産物の制限酵素処理を行い、その切断パターンから、前記ＭＥＦにおけるＸ染色体連鎖遺伝子５個が、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルと野生型Ｘｉｓｔアリルのいずれに由来するかを確認した。なお、５つの遺伝子（Ｇ６ｐｄ、Ｈｐｒｔ、Ｒｂｍ３、Ｆｍｒ１、Ｚｆｐ２６１）について、それぞれ常法に基づいてＲＴ-ＰＣＲを行った。
【００４２】
図４（Ａ）は、Ｘ染色体における各Ｘ連鎖遺伝子の位置を示す概略図である。同図において「＊」を付した遺伝子は、Ｇ６ｐｄはＤｒａＩ、ＨｐｒｔはＨｉｎｆＩ、Ｒｂｍ３はＤｄｅＩによって、それぞれＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌを有するＸ染色体上のアリルが切断され、Ｆｍｒ１はＲｓａＩ、Ｚｆｐ２６１はＤｄｅＩによって、それぞれ野生型Ｘｉｓｔを有するＸ染色体上のアリルが切断される。したがって、各制限酵素処理による切断の有無により、野生型および変異型のいずれからこれらの遺伝子が発現しているかを確認できる。これらの結果を、図４（Ｂ）に示す。同図（Ｂ）は、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／＋のゲノムＤＮＡより増幅したＰＣＲ断片（図においてレーン１）、ＲＴ−ＰＣＲ産物の制限酵素処理断片（図においてレーン２、３）の電気泳動写真を示す。
【００４３】
同図（Ｂ）に示すように、各レーン２および３において、Ｇ６ｐｄ、ＨｐｒｔおよびＲｂｍ３は、制限酵素処理によって切断が確認された。これらのＧ６ｐｄ、ＨｐｒｔおよびＲｂｍ３については、前述のように、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌを有するＸ染色体上のアリルが切断されることから、同図（Ｂ）の結果（切断あり）より、これらの遺伝子は、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌを有するＸ染色体に由来することがわかった。また、同図（Ｂ）に示すように、各レーン２および３において、Ｆｍｒ１およびＺｆｐ２６１は、制限酵素処理によって切断が確認されなかった。これらのＦｍｒ１およびＺｆｐ２６１については、前述のように、野生型Ｘｉｓｔを有するＸ染色体上のアリルが切断されることから、同図（Ｂ）の結果（未切断）より、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌを有するＸ染色体に由来することがわかった。このように、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／＋のＭＥＦは、野生型Ｘ染色体からではなく、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌを有するＸ染色体からの発現が認められた。この結果から、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌを有するＸ染色体は、Ｘｉｓｔを発現しておらず、これに伴って、不活性化することなく常に活性を維持していることがわかる。
【００４４】
（３）Ｘ染色体の複製時期の解析
不活性化Ｘ染色体は、Ｓ期のごく後半に複製されることが知られている（後期複製）。そこで、ＭＥＦに、一定時間ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を取り込ませた後、アクリジンオレンジで染色することによって、Ｘ染色体の複製時期を調べた。この方法によれば、不活性化したＸ染色体は、その全域にわたって暗く見える結果となる。なお、解析に用いたＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／＋のＭＥＦにおいては、野生型Ｘ染色体が９番染色体と動原体で融合したロバートソン型転座を持ったものを利用したので、野生型Ｘ染色体とＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌを持つ変異Ｘ染色体のどちらが不活性化しているかを、その形態によって顕微鏡により区別できるように設定してある。
【００４５】
この顕微鏡写真の結果を図５に示す。そして、この結果を基づいて、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌが活性の細胞、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌが不活性の細胞、二本のＸ染色体が活性の細胞、二本のＸ染色体が不活性の細胞をカウントした。この結果を、図５の表に示す。同図に示すように、９５％の細胞において野生型Ｘ染色体が不活性化していることが確認された。このことから、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌを持つ変異Ｘ染色体は、不活性化されることはないと解される。
【００４６】
＜ＸｉｓｔＣＡＧアリルの評価＞
（１）Ｘｉｓｔ遺伝子の発現解析
前述のように、ＸｉｓｔＣＡＧ２ＬアリルのｌｏｘＰ配列に挟まれたＰａｃ−ｐＡ断片をｃｒｅリコンビナーゼによって除去したことから、得られたＸｉｓｔＣＡＧアリルを持つＸ染色体は、Ｘｉｓｔが恒常的に発現され、結果的に常に不活性化するＸ染色体であると推測される。そこで、ＭＥＦで発現したＸｉｓｔ遺伝子の由来を確認した。なお、特に示さない限り、前述のＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルの評価と同様とした。
【００４７】
ＸｉｓｔＣＡＧ／＋の１３．５日胚より樹立したＭＥＦについて、発現されているＸｉｓｔ遺伝子が、ＸｉｓｔＣＡＧアリルと野生型Ｘｉｓｔアリルのいずれに由来するかをＲＴ−ＰＣＲにより確認した。この結果を図６に示す。なお、同図（Ａ）には、野生型アリルとＸｉｓｔＣＡＧアリルの概略を示し、同図（Ｂ）には、ＸｉｓｔＣＡＧ／＋のゲノム（ＸｉｓｔＣＡＧへテロ接合体のメス胚線繊維芽細胞由来）より増幅したゲノムＰＣＲ産物のＰｖｕＩＩ消化物（図においてレーン１）、ＲＴ−ＰＣＲ産物のＰｖｕII消化物（図においてレーン２、３）の電気泳動写真を示す。ゲノムＰＣＲ産物をＰｖｕＩＩ消化したものでは、野生株に由来するＰｖｕＩＩで切断されるものと、ＸｉｓｔＣＡＧに由来するＰｖｕＩＩで切断されないものとが、それぞれ検出された。一方、ＲＴ‐ＰＣＲ産物は、ＰｖｕII消化によって切断されるものはなかった。つまり、ＸｉｓｔＣＡＧ／＋のＭＥＦで発現されるＸｉｓｔは、野生型アリルではなく、ＸｉｓｔＣＡＧアリルに由来することが証明された。このことから、ＸｉｓｔＣＡＧ／＋のＭＥＦでは、ＸｉｓｔＣＡＧアリルは恒常的にＸｉｓｔを発現することが確認された。
【００４８】
（２）内在性Ｘ連鎖遺伝子の発現解析
前述のＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルの評価と同様にして、前述ＸｉｓｔＣＡＧ／＋のＭＥＦにおける内在性Ｘ連鎖遺伝子の発現パターンを確認した。この結果を、図７に示す。同図（Ａ）は、前記図４（Ａ）と同じであり、同図（Ｂ）は、ＸｉｓｔＣＡＧ／＋のゲノムＤＮＡより増幅したＰＣＲ断片（図においてレーン１）、ＲＴ−ＰＣＲ産物の制限酵素処理断片（図においてレーン２、３）の電気泳動写真を示す。
【００４９】
同図（Ｂ）に示すように、各レーン２および３において、Ｇ６ｐｄ、ＨｐｒｔおよびＲｂｍ３は、制限酵素処理によって切断が確認されなかった。これらのＧ６ｐｄ、ＨｐｒｔおよびＲｂｍ３については、前述のように、ＸｉｓｔＣＡＧを有するＸ染色体上のアリルが切断されることから、同図（Ｂ）の結果（未切断）より、これらの遺伝子は、野生株Ｘｉｓｔを有するＸ染色体に由来することがわかった。また、同図（Ｂ）に示すように、各レーン２および３において、Ｆｍｒ１およびＺｆｐ２６１は、制限酵素処理によって切断が確認された。これらのＦｍｒ１およびＺｆｐ２６１については、前述のように、野生型Ｘｉｓｔを有するＸ染色体上のアリルが切断されることから、同図（Ｂ）の結果（切断）より、野生型Ｘｉｓｔを有するＸ染色体に由来することがわかった。このように、ＸｉｓｔＣＡＧ／＋のＭＥＦは、ＸｉｓｔＣＡＧを有するＸ染色体からではなく、野生型Ｘ染色体からの発現が認められた。この結果から、ＸｉｓｔＣＡＧを有するＸ染色体は、Ｘｉｓｔを発現し、これに伴って、常に不活性化を維持していることがわかる。
【００５０】
（３）Ｘ染色体の複製時期の解析
前述のＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルの評価と同様にして、ＸｉｓｔＣＡＧアリルを有するＸ染色体の複製時期を確認した。この結果を示す顕微鏡写真を図８に示す。そして、この結果を基づいて、ＸｉｓｔＣＡＧが活性の細胞、ＸｉｓｔＣＡＧが不活性の細胞、二本のＸ染色体が活性の細胞、二本のＸ染色体が不活性の細胞をカウントした。この結果を、図８の表に示す。同図に示すように、９０％以上の細胞において、変異Ｘ染色体が後期複製を示していた。このことから、ＸｉｓｔＣＡＧアリルに関してヘテロ接合体の細胞においては、ＸｉｓｔＣＡＧアリルが恒常的にＸｉｓｔを発現しており、これを有する全ての変異Ｘ染色体を、全ての細胞で不活性化していることがわかった。
【００５１】
以上のように、１３．５日マウス胚に由来する胚線維芽細胞において、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルを持つＸ染色体からはＸｉｓｔ遺伝子が転写されておらず、このアリルを持つＸ染色体は不活性化されていないことが確認された。他方、ＸｉｓｔＣＡＧアリルを持つＸ染色体からは、恒常的にＸｉｓｔ遺伝子が発現されるため、このアリルを持つＸ染色体は、不活性化していることが確認された。この結果から、例えば、内部細胞塊や始原生殖細胞においても、ＸｉｓｔＣＡＧアリルから恒常的に誘導されるＸｉｓｔによって、不活性化したＸ染色体の再活性化が阻害されていると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のモデル非ヒト哺乳類動物によれば、恒常的に不活性化Ｘ染色体の再活性化が生じることなく、不活性化が維持される。このため、本発明のモデル非ヒト哺乳類動物は、例えば、ＩＣＭや生殖細胞を含む胚体組織細胞の発生や分化、分化過程におけるゲノム修飾等に対する再活性化の影響や役割の解明に使用する実験ツールとして非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、本発明の一実施例における相同組換えの一例を示す図であり、（Ａ）は、ゲノムの遺伝子座とターゲティングベクターの部分的な領域を示す概略図であり、（Ｂ）は、相同組換えにより得られたＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルの部分的な領域を示す概略図である。
【図２】図２（Ａ）は、本発明の前記実施例について。マウスＥＳ細胞における野生型の内在性Ｘｉｓｔ遺伝子座、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリル、および、ＸｉｓｔＣＡＧアリルの概略を示す図であり、図２（Ｂ）は、サザンクロッティングのオートラジオグラフィーを示す写真である。
【図３】図３（Ａ）は、本発明のその他の実施例における、野生型アリルとＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌアリルの概略を示す図であり、図３（Ｂ）は、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／＋のゲノムと、ＲＴ−ＰＣＲ産物のＰｖｕII消化物の電気泳動写真である。
【図４】図４（Ａ）は、本発明のさらにその他の実施例における、Ｘ染色体の各Ｘ連鎖遺伝子の位置を示す概略図であり、図４（Ｂ）は、ＸｉｓｔＣＡＧ２Ｌ／＋のゲノムとＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【図５】図５は、本発明のさらにその他の実施例における、細胞染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図６】図６は、本発明のさらにその他の実施例における、野生型アリルとＸｉｓｔＣＡＧアリルの概略を示す図であり、図３（Ｂ）は、ＸｉｓｔＣＡＧ／＋のゲノムと、ＲＴ−ＰＣＲ産物のＰｖｕII消化物の電気泳動写真である。
【図７】図７（Ａ）は、本発明のさらにその他の実施例における、Ｘ染色体の各Ｘ連鎖遺伝子の位置を示す概略図であり、図７（Ｂ）は、ＸｉｓｔＣＡＧ／＋のゲノムとＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【図８】図８は、本発明のさらにその他の実施例における、細胞染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図９】図９は、本発明の実施形態の一例であり、ＸｉｓｔＣＡＧアリルを有する動物を用いた交配の概略の一例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008109885.tif 000009
【図８】
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【図９】
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