(57)【要約】【課題】蛍光アッセイの実施方法を提供する。【解決手段】本発明によれば、フィルターを、i) ウェルを含む本体 (上記アッセイを実施するウェルを、上記フィルターを感光性素子と励起光源に位置させるような方法で励起光に暴露させる)、および ii) 感光性素子 (上記フィルターを該感光性素子表面の少なくとも感光性面に適用する)から選ばれた少なくとも1つのコンポーネントと一体化させ、放出し得るすべての光を上記感光性素子によって検出する。また、本発明は、上記方法を実施するのに適する装置、およびその製造方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光源による励起後に放出させ得るすべての光を測定することによって検出することを含み、少なくとも1種の薬剤を本体のウェル中の検体と接触させ、前記薬剤を前記検体に接触させせた後、前記ウェルを励起光に暴露して、放出させ得るすべての光を検出することからなるアッセイの実施方法において、
フィルターを、i) 励起光を遮断し放出光を透過するフィルターを含む上記本体 (前記アッセイを実施する前記ウェルを、前記フィルターを感光性素子と前記励起光源との間に位置させるような方法で励起光に暴露させる)、および ii) 感光性素子 (前記フィルターを該感光性素子表面の少なくとも感光性面に適用する)から選ばれた少なくとも1つのコンポーネントと一体化させ；そして、放出させ得るすべての光を前記感光性素子によって検出することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記アッセイを、ウェルを構成する壁を含み、その表面の少なくとも1部上に前記本体中に組み込ませた感光性素子を備え、且つ前記フィルターを前記感光性素子と前期内壁表面間に備えたウェル中で実施し；前記本体中に一体化させた前記感光性素子を読み取る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
使用する前記フィルターが吸収性フィルターである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
吸収性フィルター用の吸収性材料として、半導体材料または金属の層を使用する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記半導体材料として、ゲルマニウム、ガリウムリンおよび(多)結晶性シリコンから選ばれた材料を使用する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記吸収性フィルターが１つの吸収性層を含む、請求項３〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ウェルのアレーを使用し、そのウェルのすべてを励起光で同時に照射し、感光性素子のすべてを読み取る、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
光ダイオードを、前記ウェルの底部表面の少なくとも50%を覆う感光性素子として使用する、請求項１〜７のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
CCDを、感光性素子として使用する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記アッセイが、基質または反応生成物としてのNADPHまたはATPに関与する反応を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ウェルを備えた本体を含むアッセイ実施用の装置であって、該本体が、励起光を遮断し放出光を通過せしめるフィルターを備えている装置。
【請求項１２】
前記ウェルが、ウェルを構成する壁を含み、その表面の少なくとも1部上に、前記本体中に組込んだ感光性素子を備え、且つ前記フィルターを前記感光性素子と前記内壁の表面間に備えている、請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
前記フィルターが吸収性フィルターである、請求項１１または１２記載の装置。
【請求項１４】
励起光に対する吸収性フィルターが半導体材料または金属の層である、請求項１１〜１３のいずれか１項記載の装置。
【請求項１５】
前記半導体材料が、ゲルマニウム、ガリウムリンおよび(多)結晶性シリコンから選ばれた材料である、請求項１４記載の装置。
【請求項１６】
前記吸収性フィルターが１つの吸収性材料層を含む、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の装置。
【請求項１７】
感光性素子が、前記ウェルの底部表面の少なくとも50%を覆う光ダイオードである、請求項１０〜１６のいずれか1項記載の装置。
【請求項１８】
感光性素子がCCDである、請求項１０〜１６のいずれか１項記載の装置。
【請求項１９】
IC技術を使用して製造した感光性素子に非晶質シリコンの層を儲け、該非晶質シリコン層を処理して(多)結晶性シリコンを生成させることを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれか１項記載の装置の製造方法。
【請求項２０】
1000℃の温度に達せさせるために、前記処理を、レーザーを用いて、前記非晶質シリコンが吸収する波長で実施する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記非晶質シリコンを、400 nm未満の波長および50〜500 mJ/cm2で処理する、請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、励起光源による励起後に放出させ得るすべての光を測定することによって検出することを含み、少なくとも1種の薬剤を本体のウェル中の検体と接触させ、前記薬剤を前記検体に接触させせた後、前記ウェルを前記励起光に暴露させて、放出させ得るすべての光を検出することからなるアッセイの実施方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
そのような方法は、とりわけ蛍光系アッセイの実施において一般に知られている。これらのアッセイとしては、とりわけ、イムノアッセイまたはエンザイムアッセイがある。第１の場合、蛍光基でラベル化したあるいはキレート化ラベル、例えば、希土類金属イオンの1種(ユーロピウムのような)を有する抗体または抗原がしばしば使用され、これらは、適切なアジュバントまたはアジュバント混合物を添加した後に蛍光を発し得る。エンザイムアッセイの場合には、基質またはその転化生成物が蛍光性であり得る。また、補因子、とりわけ、NAD(H)、NADP(H)またはATPのような補酵素を測定することも可能である。実施する反応次第で、これらは、消費されるかまたは生成する。これらの方法は、ウェルのアレー中で実施して、１つの濃度または数種の濃度の1検体または数検体の並行測定を行い得る。測定を実施するためには、上記のウェルを励起光で照射し、放出光を光電子倍増器のような感光性素子によって検出する。励起光が上記感光性素子に達するのを適切に阻止するためには、放出光を励起ビームとある角度で測定するかまたは干渉フィルターのような励起光を遮断するフィルターを使用するような適切な対策を講じる。
そのようなアッセイ実施方法は、比較的費用高であり、上記のウェルから影響を受けない距離を置いた上記感光性素子を含むかなり大きい装置を必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、これらの欠点を少なくともある程度解決する上述の種類の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この目的において、本発明に従う方法は、i) 励起光を遮断し放出光を透過するフィルターを含む上記本体 (上記アッセイを実施する上記ウェルを、上記フィルターを感光性素子と上記励起光源との間に位置させるような方法で励起光に暴露させる)、および ii) 感光性素子 (上記フィルターを該感光性素子表面の少なくとも感光性面に適用する)から選ばれた少なくとも1つのコンポーネントと一体化させ；そして、放出させ得るすべての光を上記感光性素子によって検出することを特徴とする。
この方法において、測定装置の大きさを制限し且つ上記感光性素子を上記ウェルのより近くに置くことができる。
上記装置の大きさをさらに制限するために、また、さらに小さなスペースしか必要とせず且つ必要に応じて極めて多数のアッセイを本発明に従う方法の極めて好ましい実施態様に従って実施し得るような方法を提供するためには、上記のアッセイを、ウェルを構成する壁を含み、その表面の少なくとも1部上に、上記本体中に組込んだ感光性素子を備え、且つ上記フィルターを上記感光性素子と内壁表面間に備えたウェル中で実施し、上記本体中に一体化させた感光性素子を読み取る。
上記感光性素子とフィルターを上記ウェルを含む本体中に一体化させることにより、上述の目的は達成され、しかも、測定を行うのに必要なコンポーネントを配列させることのようなさらなる問題も著しく簡素化される。そのような方法は、広範な小型化を可能にし、それによってとりわけ光配列問題を増やすこともなく、また、実施し得るアッセイ数を増大させる。これらのアッセイは、経済的に実施できる。本発明に従う1つのアッセイは、とりわけエネルギー透過性の蛍光、リン光系のアッセイである。本出願においては、用語“ウェル”は、ウェルの底部も含む。
【０００５】
使用するフィルターは、干渉フィルターであり得るが、吸収性フィルターを使用するのが好ましい。
そのようなフィルターは、より容易に且つ低コストで適用し得る。
吸収性フィルター用の吸収性材料としては、半導体材料または金属を使用するのが好ましい。
そのような材料が有し得る(可能性のある)反射特性以外に、半導体材料と金属は、吸収性も有し得る。組合せにおいて、励起光の極めて良好な排除を得ることができる。
重要な好ましい実施態様によれば、上記半導体材料は、ゲルマニウム、ガリウムリンおよび(多)結晶性シリコンから選定する。
本質として、そのような材料自体は、測定を混乱させ得る蛍光性を有さない。
これらの材料は、多くの汎用放出波長において優れた光学特性を有する。この点、NAD(P)HおよびATPの検出に適するのは、とりわけ(多)結晶性シリコンである。このシリコンは、比較的短波長の励起光を適切に遮断し、放出光を十分に透過させる。
上記吸収性フィルターは、好ましくは、1つの吸収性層を含む。
このことは、とりわけ干渉フィルターと比較して、著しいコスト節減をもたらす。干渉フィルターは、所定の屈折率と厚さを有する多数の層を良好な形成条件下において適用する必要がある。
有利には、ウェルのアレーを使用し、ウェルのすべてを励起光で同時に照射し、上記感光性素子のすべてを読み取る。
この方法において、例えば、10,000回のアッセイを同時に実施し処理することが可能である。
【０００６】
第１の好ましい実施態様によれば、光ダイオードを、上記ウェルの底部表面の少なくとも50%を覆う上記感光性素子として使用する。
光ダイオードはあまり感光性ではないものの、上記ウェルに対するその近接性が、後の実施例において理解できるように、適切な測定を可能にする。
別の実施態様によれば、CCDを、上記感光性素子として使用する。
この使用は、低めの放出レベルの測定を実施するのを可能にする。
重要な応用においては、上記アッセイは、基質または反応生成物としてのNADH、NADPHまたはATPに関与する反応を含む。
また、本発明は、上述のアッセイを実施する装置にも関し、該装置は、内壁を有するウェルを備えた本体を含み、その内壁表面の少なくとも1部上に、上記本体中に組み込んだ感光性素子を備え、上記感光性素子と上記内壁表面間の上記本体が励起光を遮断し放出光を通過せしめるフィルターを備え、上記ウェルを励起光に暴露させ、上記フィルターは上記感光性素子と上記励起光源との間に位置し、放出し得るすべての光を上記感光性素子によって検出するものである。
請求項１２〜１８は、好ましい実施態様を記載しており、それら実施態様の利点は、本質的に、本発明に従う方法の実施に関して上述した利点である。
【０００７】
最後に、本発明は、そのような装置の製造方法に関し、該方法は、IC技術を使用して製造した感光性素子に非晶質シリコンの層を備えさせ、この非晶質シリコン層を処理して(多)結晶性シリコンを形成させることを特徴とする。
上記チップ技術からの技法の使用は、本体上または本体中に超高密度のウェルを経済的に製造することを可能にする。
1000℃の温度に達せさせるために、処理は、好ましくは、レーザーを使用して、上記非晶質シリコンが吸収する波長で実施する、さらに詳細には、上記非晶質シリコンを、好ましくは、400 nm未満の波長および50〜500 mJ/cm2で処理する。
この方法は、上述の補酵素/補因子についての測定を実施するのに吸収性フィルターをとりわけ適するようにする特性を有する極めて簡単な吸収性フィルターの製造方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を添付図面および実施例に関連して説明する。
【実施例】
【０００９】
NAD(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)の蛍光生成物NADHへの転換率を測定することによってモニターし得る酵素反応が存在する。NADHは、340 nmの波長(ピーク)で光を吸収し、450 nmで最高の放出を示す。紫外線励起光を最適に遮断し、NADHの蛍光を適切に透過させるためには、本発明に従う好都合な選択は、結晶性シリコンである。図１に示すように、結晶性シリコンの吸収係数(A)は、低目の波長(λ)に対して極めて鋭敏に低下している。十分な光子が検出可能な信号に対して通過できるのを担保するためには、結晶性シリコンの層を厚過ぎないようにする必要がある。当該技術において一般に公知の方法を使用し、シリコンを基体に適用することによって、半導体回路を製造し得る。しかしながら、そのようなシリコン層は非晶質であり、一方、意図する用途は結晶性シリコンを必要とする。非晶質シリコンは、Ishihara R.等が開示しているようなエキシマレーザーで処理することによって結晶性とすることができる。(Jpn. J. Appl. Phys. 34, Vol. 1, No. 4A, pp. 1759-1764 (1995))。非晶質シリコンが多くの光を強力に吸収するという事実は、結晶化に要する温度を容易に達成し得ることのみならず、シリコン層の下の感光性素子がUV線による処理中に劣化しないことも確実にする。
上記結晶性シリコン層の適切な厚さを決定し、その光学特性が意図する目的に適切であるかどうかを試験するためには、75 nmの厚さを有する非晶質シリコン層を、LPCVD(低圧化学蒸着)を使用してガラス基体に適用する。このようにして生成させた層を、100パルスのエキシマ光(XMR 5121 Laser Planarisation System、波長 = 308 nm；パルス当りのエネルギー = 100〜600 mJ；パルス時間 = 66 ns (FWHM)；最高平均出力 = 150 W；ピーク容量 = 10 MW) (XMR社、米国サンタクララ)に、290 mJ/cm2または540 mJ/cm2のエネルギーで供する。走査電子顕微鏡は、上記最低のエネルギーで生成させた結晶性シリコンが約1ミクロンの粒度を有し、一方、上記高めのエネルギーでは、粒度は約5ミクロンであったことを示していた。
【００１０】
各フィルム層の光学特性(透過性および吸収性)を、プログラムTFCalc (Thin Film Design Software、バージョン2.9、米国オレゴン州ポートランド、W. Harvest LaneのSoftware Spectra社)を使用してシミュレートし、測定を、較正型Hamamatsu S1226ダイオード(Hamamatsu Photonics K.K.、日本の浜松市)を使用して実施した。UVでの測定において、365 nmに調整したアルゴンレーザー(モデル2020-05、Spectra Physics社、米国マウンテンビュー)を、240 mWm-2の出力で使用した。上記小粒度および大粒度を有する各シリコン層の結果を、それぞれ、図２aおよび２bに示している。計算結果と測定結果に優れた相関があることが理解できる。このようにして製造した基体は、意図する目的に必要な光学特性を有する。ウェルのアレーを製造するには、各ウェルを、例えば、フォトレジスト技術を使用して形成させ得る。各ウェルの寸法は、例えば、200μm×200μm×4μmである。勿論、先ずウェルを有する基体を製造し、次いでこの基体にフィルターを備えさせることも可能である。感光性素子をこの基体に組込まない場合には、フィルターは、ウェルを有していない反対面に位置させることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】非晶質Siおよび結晶性Siの波長に対してプロットした吸収係数を示す。
【図２ａ】小粒子を有する多結晶性シリコン層の計算および測定透過度を示す。
【図２ｂ】大粒子を有する多結晶性シリコン層の計算および測定透過度を示す。
【図１】
2008298795.tif 000002
【図２ａ】
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【図２ｂ】
2008298795.tif 000004