(57)【要約】【課題】抗体のような測定対象物質をセンサーに固定化することなく極めて高い感度で蛍光検出する。【解決手段】光導波路の一表面に形成された金属膜と、金属膜の上に形成された不撓性膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームをプリズムに通し、該光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、該表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されたことによって発生する蛍光を検出する手段において、不撓性膜に対して反対のプリズム面に磁性物質を誘引することが可能なユニットを設置する【選択図】図１
2008249361.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光導波路と、該光導波路に形成された金属膜と、金属膜の上に形成された不撓性膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを光導波路に通し、該光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、該表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されたことによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えてなる表面プラズモンセンサーにおいて、不撓性膜に対して反対の光導波路面に磁性物質を誘引することが可能なユニットを有することを特徴とする表面プラズモンセンサー。
【請求項２】
該不撓性膜の膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にあることを特徴とする請求項２に記載の表面プラズモン蛍光センサー。
【請求項３】
検体を含む試料と、磁気粒子で標識された測定対象物質（A）を特異的に認識する第一の蛋白質（X）および上記表面プラズモンセンサーで検出可能な蛍光色素により修飾された測定対象物質を認識する第二の蛋白質（Y）を同時にまたは段階的に作用させX、AおよびYの複合体を形成させる工程、および前記工程において生じたX、AおよびY複合体を磁力によってセンサー表面に集める工程を含み、該X、AおよびY複合体を請求項１に記載の表面プラズモンセンサーにおいて測定することを特徴とする分析方法。
【請求項４】
磁気粒子の粒径が１０〜１００ｎｍの範囲にあることを特徴とする請求項2に記載の分析方法。
【請求項５】
分析対象物を特異的に認識する蛋白質が抗体であることを特徴とする請求項2-3に記載の測定方法。
【請求項６】
分析対象物を特異的に認識する第一の蛋白質および第二の蛋白質の両方または一方がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項2〜請求項4に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモンの発生を利用して試料中の物質を分析する表面プラズモンセンサーおよび免疫学的測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオ測定等において、高感度かつ簡易な測定法として蛍光法が広く用いられている。この蛍光法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する検出対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのときの蛍光を検出することによって検出対象物質の存在を確認する方法である。検出対象物質が蛍光体でない場合には、蛍光体で標識されて検出対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物質の存在を確認することも広く行われている。
【０００３】
図２は、上記の標識された物質を用いる蛍光法を実施するセンサーの一例を概略表示するものである。この蛍光センサーは一例として試料１に含まれる測定対象物質２を検出するためのものであり、基板３には測定対象物質２と特異的に結合する抗体４が塗布されている。そしてこの基板３上に設けられた試料保持部５の中において試料１が流され、次いで同様に蛍光体１０で標識された測定対象物質２と特異的に結合する抗体６が流される。その後、基板３の表面部分に向けて光源７から励起光８が照射され、光検出器９により蛍光検出がなされる。このとき、光検出器９によって所定の蛍光が検出されれば、上記６と測定対象物質２との結合、すなわち試料１中における測定対象物質２の存在を確認できることになる。
【０００４】
なお以上の例では、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは蛍光体１０で標識された抗原２と特異的に結合する抗体６であるが、この抗体６は抗原２と結合しなければ流されてしまって基板３上に存在し得ないものであるから、この抗体６の存在を確認することにより、間接的に検出対象物質２の存在が確認されることとなる。
【０００５】
しかしながら、図２に示したような従来の蛍光センサーでは、基板と試料との界面における励起光の反射光／散乱光や、検出対象物質以外の不純物／浮遊物Ｍ等による散乱光がノイズとなるため、せっかく光検出器を高性能化しても蛍光検出におけるＳ／Ｎは向上しないのが実情であった。
【０００６】
これに対する解決法として、例えば非特許文献１に示されるようなエバネッセント蛍光法、つまりエバネッセント波を用いる蛍光法が提案されている。この蛍光法を実施する蛍光センサーの一例を図３に概略的に示す。なおこの図３において、図２中の構成要素と同等の構成要素には同番号を付し、それらについての説明は特に必要のない限り省略する（以下、同様）。
【０００７】
この蛍光センサーにおいては、前述の基板３に代わるものとしてプリズム（誘電体ブロック）１３が用いられ、そして光源７からの励起光８は、このプリズム１３と試料１との界面で全反射する条件で、プリズム１３を通して照射される。この構成においては、励起光８が上記界面で全反射するとき該界面近傍に染み出すエバネッセント波１１により測定対象物質２と特異的に結合する抗体６に標識された蛍光体１０が励起される。そして蛍光検出は、試料１に対してプリズム１３と反対側（図中では上方）に配された光検出器９によってなされる。
【０００８】
この蛍光センサーにおいては、基板としてプリズムを用いた場合、励起光８は図中の下方に全反射するので、上方からの蛍光検出において、励起光が蛍光検出信号に対するバック・グラウンドとなってしまうことがない。さらに、エバネッセント波１１は上記界面から数百ｎｍの領域にしか到達しないので、試料中の不純物／浮遊物Ｍからの散乱を殆ど無くすことができる。そのため、このエバネッセント蛍光法は、従来の蛍光法と比べて（光）ノイズを大幅に低減でき、検出対象物質を１分子単位で蛍光測定できる方法として注目されている。
【０００９】
また、上記のエバネッセント波を用いる蛍光法において特許文献２では、プリズムの代わりに光を透過させる基板として光導波路を用いている。この場合、励起光成分は光導波路を全反射しながら進行するので、上方および／又は下方からの蛍光検出において励起光成分が蛍光検出信号に対するバック・グラウンドとなってしまうことがない。
【００１０】
また、さらに高感度で蛍光測定できるセンサーとして、図４に示すような表面プラズモン増強蛍光センサーも知られている。この表面プラズモン増強蛍光センサーは、例えば特許文献１に記載があるもので、図３の蛍光センサーと比べると基本的に、プリズム１３の上に金属膜２０が形成されている点が異なる。すなわち、このような金属膜２０が形成されていることにより、励起光８が照射されたときこの金属膜２０中に表面プラズモンが生じ、その電場増幅作用によって蛍光が増幅されるようになる。あるシミュレーションによると、その場合の蛍光強度は１０００倍程度まで増幅されることも判っている。
【００１１】
しかし、上述のような表面プラズモン増強蛍光センサーにおいては、非特許文献２に示されているように、試料中の蛍光体と金属膜とが接近し過ぎていると、蛍光体内で励起されたエネルギーが蛍光を発生させる前に金属膜へ遷移してしまい、蛍光が生じないという現象（いわゆる金属消光）が起こり得る。
【００１２】
この金属消光に対処するために非特許文献２には、金属膜の上にＳＡＭ（自己組織化膜）を形成し、それにより試料中の蛍光体と金属膜とをこのＳＡＭの厚さ以上離間させることが提案されている。なお図４でも、このＳＡＭに番号２１を付けて示してある。また非特許文献３では、この金属消光に関連して、表面プラズモンにより増強された蛍光強度の、金属膜からの距離に対する依存性が検討されている。
【００１３】
ところで、これまで述べてきた測定方法では、いずれの場合においても、測定対象物質を特異的に認識する物質をセンサー基板表面に固定化する必要がある。測定対象物質を特異的に認識する物質を利用した測定方法の例としては、抗体を用いた免疫学的測定方法が知られている。例えば免疫学的測定方法を、表面プラズモンセンサーを用いて行う場合、抗体をセンサー表面にあらかじめ固定化しておく必要が有る。抗体を固定化する方法としては、非特許文献４に記載されている物理吸着による固定化方法ならびに共有結合を形成させることによる固定化方法などが用いられる。
【００１４】
一般に、抗体などの測定対象物質を特異的に認識する物質を固定化した場合、固相−液相での反応形式となるため、反応効率が著しく低下してしまうことや、結合定数が低下してしまうことが知られている。このことから、検出感度の低下や、反応時間が長時間必要であるなどの問題がある。さらに、異なる測定対象物質に対しては、それぞれに特異的な抗体を固定化する必要があり、センサーの汎用性の向上を妨げる要因でもある。
【特許文献１】特許第３５６２９１２号公報
【特許文献１】特許第３３２１４６９号公報
【非特許文献１】「バイオイメージングでここまで理解る」p.104-113  楠見明弘他著  羊土社
【非特許文献２】W.Knoll他、Analytical Chemistry（Anal.Chem.）75(2003)  p.2610
【非特許文献３】W.Knoll他、Colloids and Surfaces. A.（Colloids Surf. A）, 171(2000) p.115
【非特許文献４】「Immunoassay」p.129-163  J. P. Gosling他著  Oxford University Press
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
抗体を代表とする測定対象物質を特異的に認識する物質を固定化した場合、固相−液相での反応による反応効率の著しい低下や、結合定数の低下が懸念される。このことから、検出感度の低下や、反応時間が長時間必要であるなどの問題がある。さらに、異なる測定対象物質に対しては、それぞれに特異的な抗体を固定化する必要があり、センサーの汎用性の向上を妨げる要因でもある。
【００１６】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、抗体などの測定対象物質を特異的に認識する物質をセンサーに固定化することなく、極めて高い感度で検出することができる表面プラズモンセンサーを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の表面プラズモンセンサーは、光導波路と、該光導波路の一表面に形成された金属膜と、金属膜の上に形成された膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にある不撓性膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームをプリズムに通し、該プリズムと金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、該表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されたことによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えてなる表面プラズモンセンサーにおいて、不撓性膜に対して反対の光導波路面に磁性物質を誘引することが可能なユニットを有することを特徴としている。
【００１８】
ここで、上記の「不撓性」とは、表面プラズモンで増強された蛍光検出を普通に行っているうちに膜厚が変わってしまうほどに変形することが無い程度の剛性を備えていることを意味する。前記不撓性膜の膜厚は、１０〜１００ｎｍの範囲であることが好ましい。また、前記不撓性膜としては、ポリマーからなるものが好適に用いられる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明による表面プラズモンセンサーは、励起光を透過させる材料からなる光導波路の表面に形成された金属膜で試料を保持し、金属膜表面に不撓性膜を形成し、前記光導波路から励起光を入射させて、前記試料中に含まれる物質を、表面プラズモンによって増強された金属膜表面に染み出すエバネッセント波によって励起し、この励起により物質が発した蛍光を検出する表面プラズモン蛍光法において、該不撓性膜に対して反対のプリズム面に磁性物質を誘引することが可能なユニットを設置することによって、磁性物質および前記表面プラズモンセンサーで検出可能な蛍光物質で標識した測定対象物質を、予め測定対象物質を特異的に認識する物質を固定化することなくセンサー表面に集めることができる。
【００２０】
これにより、試料液の金属膜に接する部分では、磁性物質および該表面プラズモンセンサーで検出可能な蛍光物質で標識された測定対象物質又はその複合体の濃度が高くなるので、蛍光強度が短時間で大きく変化し、そこで、測定対象物質を短時間で高感度に分析可能となる。特に抗原−抗体反応を利用して試料中の物質を検出する場合、抗体（または抗原）をセンサー上に固定化する必要が無いため、反応効率が向上し、極めて高い感度で検出することが可能となるとともに、反応時間の短縮が可能となる。また、抗体（または抗原）を予め固定化する必要が無いため、センサーの汎用性も向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２２】
本発明の表面プラズモンセンサーは、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、金属膜の上に形成された膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にある不撓性膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを光導波路に通し、該光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、該表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されたことによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えてなる表面プラズモンセンサーにおいて、不撓性膜に対して反対の誘電体ブロック面に磁性物質を誘引することが可能なユニットを有することを特徴としている。
【００２３】
図１は、本発明の表面プラズモン蛍光検出方法の実施に利用される表面プラズモンセンサー（以下、単にセンサーという）を示す概略側面図である。図示の通りこのセンサーは、励起光８を発する半導体レーザ等の光源７と、上記励起光８を透過させる材料からなり、この励起光８が一端面から入射する位置に配された光導波路１２と、この光導波路１２の一表面１２ａに形成された例えば金、銀等からなる金属膜２０と、この金属膜２０の上に形成されたポリマーからなる不撓性膜３１と、光導波路１２の一表面１２ｂに設置された磁石４１と、光導波路１２と反対側から不撓性膜３１に液体状試料１が接するように該試料１を保持する試料保持部５と、この試料保持部５の上方に配された光検出器（蛍光検出手段）９とを備えてなるものである。
【００２４】
なお図１では、光源７が、励起光８を、光導波路１２と金属膜２０との界面に向けて、全反射条件を満たすように光導波路１２を通して入射させるように配置されている。つまりこの光源７自体が、光導波路１２に対して励起光８を上述のように入射させる入射光学系を構成している。しかしこのような構成に限らず、励起光８を上述のように入射させるレンズやミラーなどからなる入射光学系を、光源７とは別途設けるようにしても何ら支障はない。
【００２５】
磁石４１としては、アルニコ磁石、フェライト磁石、ＭＫ鋼、ＫＳ鋼、サマリウムコバルト磁石、ネオジム磁石などの永久磁石のほか、電磁石を用いることも可能である。
【００２６】
なお、金属の近傍に存在する蛍光体分子は、金属へのエネルギー移動により消光を起こす。エネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。そして前述した非特許文献３にも述べられているように、金属膜の場合は、金属と蛍光分子との間の距離は少なくとも 数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。従って不撓性膜３１の膜厚の下限値は１０ｎｍとすることが好ましい。
【００２７】
一方、蛍光体分子は、表面プラズモンによって増強された、金属膜表面に染み出したエバネッセント波によって励起される。エバネッセント波の到達範囲（金属膜表面からの距離）は高々波長程度であり、その電界強度は金属膜表面からの距離に応じて指数関数的に急激に減衰することが知られている。実際、波長８０８ｎｍの近赤外光では、エバネッセント波の染み出しが生じているのは、波長（８０８ｎｍ）程度であり、１００ｎｍを超えるとその電界強度が急激に減衰する。蛍光体分子を励起する電界強度は大きいほど望ましいので、効果的な励起を行なうためには、金属膜表面と蛍光体分子との距離を１００ｎｍより小さくすることが望ましい。従って、不撓性膜３１の膜厚の上限値は１００ｎｍとすることが好ましい。
【００２８】
以下、上記構成の表面プラズモンセンサーによる試料分析について説明する。分析対象物質２を含む試料液１、分析対象物質２を特異的に認識する物質４および上記センサーで検出可能な蛍光体１０で標識された分析対象物質２を特異的に認識する物質６は、は、上記不撓性膜に接触する状態で試料保持部５に配置される。ここで、分析対象物質２を特異的に認識する物質４は磁性体５１で標識されており、磁気的相互作用によって分析対象物質２および分析対象物質２を特異的に認識する物質４および６の複合体がセンサー表面に濃縮される。
【００２９】
試料分析に際しては、シリンドリカルレンズ１５の作用で上述のように集束する光ビーム８が金属膜２０に向けて照射される。蛍光体１０は、表面プラズモンによって増強された、金属膜表面に染み出したエバネッセント波によって励起され蛍光を発する。この蛍光強度に基づいて試料液１中の物質２を定量分析することができる。
【００３０】
また、上述のように分析対象物質２を特異的に認識する物質４は磁性体５１で標識されているが、ここで用いられる磁性体としては磁性微粒子が挙げられるが、その粒径は、上述したようなエバネッセント波の到達範囲から１nmから１００ｎｍとすることが好ましい。
【００３１】
分析対象物質２を特異的に認識する物質４としては、例えば分析対象物質２が１本鎖核酸の場合、該１本鎖核酸と相補的に結合する１本鎖核酸が、分析対象物質２がタンパク質等の場合、該分析対象物質２に対する抗体が挙げられる。
【００３２】
上述のように、分析対象物質２を特異的に認識する物質４は磁性体５１で標識されており、センサーに固定されていないため、測定対象物質との反応は液相で進行する。また、磁気的相互作用によって、試料液１の金属膜２０に接する部分では分析対象物質２の濃度が高くなることから、該分析対象物質２を短時間内で高感度に分析可能となる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明の実施例および比較例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３４】
（実施例１）＜ビオチン化抗体の調製＞
抗ＣＲＰ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社クローンＮｏ．Ｍ７０１２８９）のビオチン化は、市販のキット（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ−ＳＨ，同仁化学研究所社製）を用いて行った。
【００３５】
（実施例２）＜磁気ビーズ標識抗体の調製＞
ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（Ａｄｅｍｔｅｃｈ  ＳＡ社，粒径０．２μｍ）および先に調製したビオチン化抗ＣＲＰ  抗体を、結合バッファー（Ｔｒｉｓ−Ｃｌを５ｍＭ，ＥＤＴＡを０．１ｍＭ，ＮａＣｌを０．５ｍＭ含有）中で２時間時反応させることにより、磁気ビーズ標識抗ＣＲＰ抗体を調製した。磁石による回収および洗浄を繰り返し、未結合の抗体を除去した後、非特異吸着防止のためＢＳＡを用いてブロッキングを行った。
【００３６】
（実施例３）＜蛍光標識抗体の調製＞
最終濃度が0.6 mg/mL IRDye800CW-NHS (LI-COR社)および0.5 mg/mL抗CRP抗体(Fitzgerald, #701289 )となるように炭酸バッファ(pH9.2)に溶解させ、室温で30分間反応させた。次に、PBS(pH7.4)で平衡化した脱塩カラム（PIERCE社）に反応液を移し、PBS(pH7.4)で未反応の  IRDye800CW-NHSを除去することで、IRDye800CW標識抗CRP抗体を得た。
分光光度計（Ultraspec, GE Healthcare）を用いて280 nmおよび780 nmの吸光度を測定し、抗体1分子に対する蛍光色素の標識率（D/P比）を2.4と決定した。
【００３７】
（実施例４）＜センサー＞
ゼオネクス製の基板（光導波路。屈折率 1.50）の表面に金膜５０nmをスパッタにて形成した。さらに、金膜上にポリスチレン系のポリマー膜（屈折率 1.59）２０nmをスピンコートにて形成した。センサーのポリマー膜が上部となるように、センサースティックのポリマー膜上部にウェル状の反応容器（φ５ｍｍ×１１ｍｍ（Ｈ））を設置し、反応に用いた。
【００３８】
（実施例５）＜ＣＲＰの検出＞
（実施例４）で作製したセンサー上の反応ウェルに、タンパク量として０．１μｇ／ｍＬ （１ｎＭ）の磁気ビーズ標識抗体溶液５０μＬ、０．５μｇ／ｍＬ（１ｎＭ）の蛍光色素標識抗体溶液５０μＬおよび表１に記載の濃度のＣＲＰを含む試料５０μＬを加え、室温で１５分間インキュベートし、抗原―抗体複合体を形成させた。センサースティック下部から磁石を接触させ、反応溶液中に含まれる抗原―抗体複合体をセンサー表面に集めた。これに光導波路に通し、該光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で励起光を入射することで発生した蛍光を、富士フイルム社製LAS-1000を用いて測定した。結果を表１に示した。
【００３９】
（比較例１）
（実施例４）で作製したセンサー上の反応ウェルに、１０ μｇ／ｍＬ （１ｎＭ）の抗ＣＲＰ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社クローンＮｏ．Ｍ７０１２８９）５０μＬを添加し、室温で２時間インキュベートした。抗体溶液を除去し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄し、1％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングを行うことによって、抗ＣＲＰ抗体が固相化されたセンサースティックを作成した。
【００４０】
（比較例２）
（比較例１）で作製したセンサースティック上の反応ウェルに、０．５μｇ／ｍＬ（１ｎＭ）の蛍光色素標識抗体溶液５０μＬおよび表１に記載の濃度のＣＲＰを含む試料５０μＬを加え、室温で１５分間インキュベートした。これにプリズムに通し、該プリズムと金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で励起光を入射し、発生した蛍光を、富士フイルム社製LAS-1000を用いて測定した。結果を表１に示した。
【００４１】
表１に示すように本発明によれば、抗原抗体反応を液層で行えるため、固相での反応と比較して反応効率が向上する。これにより測定感度の向上が可能となるとともに、反応時間の短縮が可能となる。また、抗体を予め固定化する必要が無いため、汎用性の向上が可能となる。
【表１】
2008249361.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の蛍光検出方法を実施可能な表面プラズモンセンサーを示す概略側面図
【図２】従来の蛍光センサーの一例を示す概略側面図
【図３】従来の蛍光センサーの別の例を示す概略側面図
【図４】従来の蛍光センサーのさらに別の例を示す概略側面図
【符号の説明】
【００４３】
１    試料
２    抗原
４    分析対象物質を特異的に認識する第一の物質
５    試料保持部
６    分析対象物質を特異的に認識する第二の物質
７    光源
８    光ビーム
９    光検出器
１０    蛍光体
１２    光導波路
１３    プリズム
２０    金属膜
３１    不撓性膜
４１    磁石
５１    磁性体
【図１】
2008249361.tif 000004
【図２】
2008249361.tif 000005
【図３】
2008249361.tif 000006
【図４】
2008249361.tif 000007