(57)【要約】【課題】メダカの神経細胞又はグリア細胞で発現可能なプロモーターを提供する。【解決手段】Ubiquitin C-terminal Hydrolase L1（UCHL1）遺伝子、Tyrosine Hydroxylase（TH）遺伝子、Growth Associated Protein 43（GAP43）遺伝子およびProteolipid protein 1（PLP1）遺伝子からなる群から選ばれるメダカ由来遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片。【選択図】図１
2008035735.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ubiquitin C-terminal Hydrolase L1（UCHL1）遺伝子、Growth Associated Protein 43（GAP43）遺伝子、Tyrosine Hydroxylase（TH）遺伝子、およびProteolipid protein 1（PLP1）遺伝子からなる群から選ばれるメダカ由来遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片
。
【請求項２】
以下の（a）または（b）のDNAを含む請求項1に記載のDNA断片：
（a）配列番号１の塩基配列からなるメダカ由来Ubiquitin C-terminal Hydrolase L1遺伝子のプロモーター領域を含むDNA又はその相補鎖；
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA。
【請求項３】
以下の（a）または（b）のDNAを含む請求項1に記載のDNA断片：
（a）配列番号２の塩基配列からなるメダカ由来Growth Associated Protein 43遺伝子の
プロモーター領域を含むDNA又はその相補鎖；
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA。
【請求項４】
以下の（a）または（b）のDNAを含む請求項1に記載のDNA断片：
（a）配列番号３の塩基配列からなるメダカ由来Tyrosine Hydroxylase遺伝子のプロモー
ター領域を含むDNA又はその相補鎖；
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA。
【請求項５】
以下の（a）または（b）のDNAを含む請求項1に記載のDNA断片：
（a）配列番号４又は２９の塩基配列からなるメダカ由来Proteolipid protein 1遺伝子のプロモーター領域を含むDNA又はその相補鎖；
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA。
【請求項６】
神経細胞及び／又はグリア細胞において遺伝子発現を促進する活性を有する請求項１〜５のいずれかに記載のDNA断片。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のDNA断片を含むベクター。
【請求項８】
異種遺伝子が該DNA断片の転写制御下にある請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項７または８に記載のベクターを導入することによって形質転換された細胞。
【請求項１０】
請求項７または８に記載のベクターを導入することによって形質転換されたトランスジェニックメダカ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の神経細胞またはグリア細胞において任意の遺伝子発現を有する活性のある核酸配列、それを含むプラスミドベクター、およびトランスジェニック動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物は受精後の１細胞から細胞分裂によって細胞数を増やし、その個体の生命維持に必要な多種多様な細胞種に分化し、組織・器官を形成している。神経細胞がその他の細胞に比べて著しく異なる点は、一部の幹細胞を除いて、最終分裂を終えた神経細胞は２度と細胞分裂をしないという点にある。また、他の器官の細胞と異なり、機能・形態の面から高度に分化しているため、いろいろな神経細胞が脳・神経系には存在する。そして、発生期において、これらの神経細胞が神経突起を伸長し、機能的回路形成を形成する至り、その生物個体に固有の精神・神経活動を可能にする。グリア細胞は神経細胞とともに、脳・神経系を構成する細胞種である。一般に、脊椎動物のグリア細胞は次の４種に分類される。第一に、オリゴデンドロサイトは中枢性グリア細胞の一種で、神経軸索の被膜となり伝達速度を早める跳躍伝導を可能にする。この被膜は髄鞘（ミエリン）と呼ばれる。第二に、シュワン細胞は、末梢のオリゴデンドロサイトに相当するグリア細胞である。第三に、アストロサイトは中枢神経系において毛細血管と神経細胞の間を取り持つ形で栄養すると考えられている。第四に、マイクログリア細胞は、上記３種のグリア細胞とは起源が異なり、中胚葉に由来する細胞であると言われている。マイクログリアは神経系において食作用を持つマクロファージのような役割を果たすと考えられている。  グリア細胞は少なくとも上記の分類に従えば４種類あることになるが、それぞれの細胞種に対して、お互いを区別しうるマーカーと呼ばれる特異的な遺伝子発現が認められる。すなわち、例えばオリゴデンドロサイトにおいてはPLP1遺伝子や、CNP1遺伝子、アストロサイトにおいてはGFAP遺伝子などである。したがって、ゲノムDNAの遺伝子の上流にある転写調節領域は、特
定のグリア細胞でのみ活性化するように仕組まれていることになる。
【０００３】
それぞれの神経細胞は機能的に分化しているということは、個々の細胞が発現している蛋白質が異なるということに他ならない。これは生物個体の発生の過程で、自律的にあるいは成熟後においても外界からの刺激に応じて細胞は状態を変化させる。このような細胞種に特異的な蛋白質の発現をもたらしているのは、その蛋白質をコードしている遺伝子の遺伝子発現機構に依存する。真核生物の場合、種に固有なゲノムDNA上にマッピングされ
ている個々の遺伝子には、それぞれに少なくとも一つの発現調節ユニットを構成しうる転写調節領域が存在する。この転写調節領域のＲＮＡポリメラーゼの結合領域を中核プロモーターといい、正に調節する領域のことをエンハンサー、負に調節する領域のことをサイレンサー（あるいはデハンサー）という。
【０００４】
我々ヒトの脳の中にある神経細胞の数は想像の域を出ない。さらに、その多数の神経細胞内には、機能的・形態的に区別すると何種類の細胞があるのかも分からない。しかし、例えば、特定の神経機能、たとえばヒトの大脳新皮質において、神経伝達物質としてグルタミン酸を利用する神経細胞の場合は、選択的に神経細胞内のシナプス小胞にグルタミン酸を蓄積するためのグルタミン酸トランスポーターや、神経伝達物質を合成・分解するための必須酵素を持たなければならない。逆にいうと、その必要な蛋白質をコードしている遺伝子のゲノムDNAの上流にある転写調節領域は、その細胞でのみ活性化するように仕組
まれていなければならない。したがって、ある遺伝子に着目すると、その遺伝子を発現している神経細胞集団を一種類の神経細胞集団とみなすことができる。
【０００５】
これまでの医学・生物学研究によってある細胞に固有に発現している遺伝子の発現調節機構を利用し、その遺伝子を任意の遺伝子に置換することによって、生きた個体中の特定の細胞において任意の遺伝子を発現させることが可能になる。その一つの方法は、トランスジェニックである。トランスジェニック個体では、プロモーターの下流に任意の遺伝子を配置した発現プラスミドベクターを遺伝子組換え技術によって構築し、受精卵あるいは胚細胞に導入する。導入されたプラスミドベクターは、その原理は未だに不明であるがある確率でゲノムに挿入される。一般にはすべての細胞において同様にプラスミドベクターがゲノムに挿入されるわけではなく、個体中の一部細胞のみが異種遺伝子を持ついわゆるキメラになる。もし生殖系列細胞のゲノムにプラスミドベクターが挿入されると、その子孫は異種遺伝子を遺伝することになり、トランスジェニック系統として維持することができる。この手法には、ゲノムのどこに異種遺伝子が挿入されるかということを人為的に調節できないこと、プラスミドベクターを構築する際に、ある細胞種に特異的に転写活性を有するプロモーター配列をあらかじめ特定した上で、当該種のゲノムDNAより取得しなけ
ればならないなどの欠点があるが、プロモーター配列さえ特定できれば、幅広い動物種に適用可能な技術である。
【０００６】
トランスジェニック技術には上記のようなプラスミドベクターを構成しうるプロモーター活性を有するゲノム断片を用いる方法以外に、Bacterial Artificial Chromosome (BAC)を用いた長いゲノム断片を用いる方法がある。ゲノムより調製された長いゲノム断片
（通常100 kb〜300 kb）をインサートとして持つBACライブラリ中には、目的とする遺伝
子座を含むクローンが存在する。当該クローンに含まれるインサートはゲノムと相同であり、かつ十分な長さを保有するため、目的遺伝子の遺伝子発現に必要な調節領域をすべて、すなわちプロモーター活性を有する核酸配列も含まれていると考えられる。そこで、大腸菌の中で相同組換えを行い、適当な抗生物質等で相同組換えの起こったクローンを選択することによって標的遺伝子座を任意に改変したBACベクターを構成することができる。
こうして作成された改変BACベクターを受精卵・あるいは胚細胞に導入することによって
トランスジェニック動物を作成することが可能である。
【０００７】
哺乳動物では胚性幹（ES）細胞が発見されるに至り、ジーンターゲッティングが可能になった。全能性を保持し、なおかつ増殖しうるES細胞において、相同性組換えが起こった細胞を選択することにより、目的の異種遺伝子を特定のゲノム部位に挿入することが可能になった。そして、その相同組換えが起こったＥＳ細胞を宿主であるマウス胚に移植することにより、ゲノム中の任意の場所に異種遺伝子を挿入した遺伝子組換え個体を作成することが可能になった。マウスではすでに複数のＥＳ細胞が樹立され、特定の遺伝子座を他の遺伝子に交換するノックインマウス、特定の遺伝子座を破壊するノックアウトマウスが作成され、医学・生物学研究に用いられている。しかし、技術的問題、倫理的問題によってヒトES細胞を用いた研究はまだ基礎研究の段階であり、臨床応用へは到っていない。また、他の脊椎動物においては、ES細胞そのものが樹立されていない場合が多く、ジーンターゲッティング技術は実現されていないのが現状である。
【０００８】
創薬研究・開発において臨床試験の前に実験動物を用いた試験は不可欠である。しかしながら、マウスやウサギのような実験動物で試験できるリード化合物の数は飼育数の制限のためごく限られた範囲でしか行なわれない。従来は培養細胞、ショウジョウバエや線虫その他の下等生物を用いて一次スクリーニングを行うこともある。しかし、これらの生物はあまりにもヒトとかけ離れている。そこで、発明者らは、創薬スクリーニングにおける第一次スクリーニングのためのモデル生物としてヒトと同じ脊椎動物であるメダカ個体を用いたシステムの構築を目指している。メダカは色素欠損系統が存在し、内部臓器を生きたままで観察できるというマウスには無い大きな利点がある。したがって、例えばパーキンソン病のような神経疾患に対する新規治療薬の開発において、蛍光蛋白質を用いて特定
の臓器・組織・細胞をイメージングした遺伝子改変（トランスジェニック）メダカを作成することにより、ハエや線虫といった下等生物ではなく脊椎動物でありながら、生きたままの状態で、多数の治療薬の候補となる化合物の評価や、人体に危険を及ぼす可能性のある化合物の毒性評価を迅速に行なうことが可能になるであろう。そのためには、メダカで作動する細胞種特異的プロモーターが望まれる。多生物種ですでに知られているプロモーターを利用することは可能かもしれない。しかしながら、プロモーターは種間において相同性が低く、他種のプロモーターがメダカで作動する保証がないし、実際に動かないことがある。また、メダカゲノムに由来するメダカで作動するプロモーターは哺乳類に比べてまだほとんど知られていない。また、現在の科学では、組織特異的転写の分子メカニズムが解明されていないため、ゲノム中のどの配列をプロモーターとして用いれば個体内の臓器・組織特異的に遺伝子を発現させることができるのかは不明である。このように、メダカを新世代実験動物として医学・創薬開発へ用いるためには、数多くの技術的に解決しなければならない問題がある。
【０００９】
Ubiquitin Carboxyl-terminal Hydrolase L1 (UCHL1、PGP9.5、Parkinson Disease 5 (PARK5)とも呼ばれる)遺伝子は、神経系において特異的に発現が認められる遺伝子の一つ
である。本蛋白質は、パーキンソン病の原因遺伝子の一つとして知られている蛋白質で、他のパーキンソン病原因遺伝子とともに、ユビキチン−プロテアソーム蛋白質分解経路およびレヴィー小体のような封入体形成に関与すると考えられている。UCHL1の機能として
は、単量体では、ポリユビキチンの分解によりモノユビキチンの生成を促進することにより、ミスフォールディングした標的蛋白質のユビキチン化を促進し、結果として蛋白質分解を促進し、封入体形成を抑制するということが知られている。その一方で、二量体ではポリユビキチン化することによって封入体形成を促進するという相反する機能をもつことが知られている（非特許文献１、２，３）
【非特許文献１】The Ubiquitin pathway in Parkinson’s disease, E. Leroy et al., Nature 395:451-452 (1998)
【非特許文献２】Structural basis for conformational plasticity of the Parkinson's disease-associated ubiquitin hydrolase UCH-L1, C. Das et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 103:4675-4680 (2006)
【非特許文献３】The UCH-L1 gene encodes two opposing enzymaticx activities that affect a-synuclein degradation and Prkinson’s disease susceptibility. Y. Liu et al. 111:209-218 (2002)
【００１０】
Tyrosine hydroxylase(TH)遺伝子も、神経系とくにカテコールアミン作用性神経細胞で発現が認められる遺伝子である。カテコールアミン作用性神経細胞はいくつかのクラスに分類できるが、主にドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリンを神経伝達物質として用いる神経細胞種である。これらの神経細胞で、TyrosineからL-dopaを合成するのに必要な酵素がTHである。パーキンソン病では、主として黒質・線条体におけるドーパミンの著しい減少、および前頭葉皮質視床下部におけるノルアドレナリンの減少が認められる。
【００１１】
Growth Associated Protein 43(GAP43)遺伝子は発生期あるいは再生期に発現し、その
遺伝子産物は伸長中の神経軸索の先端部に局在すると考えられている。GAP43は古くから
神経軸索の伸長やシナプス形成と関連があることは指摘されてきたが、生体内における機能はまだ不明な点が多い。少なくともこれまでの知見では、Protein Kinase Cによってリン酸化され、成長円錐の細胞骨格Actin蛋白質の安定性を変えることで、軸索伸長を制御
していると考えられている（非特許文献4）。
【非特許文献４】Protein Kinase C and the regulation of the actin cytoskeleton, C. Larsson, Cell.Signal., 18: 276-284 (2006)
【００１２】
Proteolipid protein 1（PLP1）は上記で述べたように、哺乳類では中枢性グリア細胞
の１種であるオリゴデンドロサイトに特有の遺伝子であると考えられている。したがって、PLP1のオリゴデンドロサイトにおける発現は、ゲノム中のPLP1遺伝子上流にあると考えられるプロモーターによってオリゴデンドロサイト細胞でのみ発現し、その他の細胞では発現しないように制御されている。逆にいうと、このPLP1遺伝子プロモーターのプロモーター領域を同定・取得すれば遺伝子工学技術を用いて任意の遺伝子をオリゴデンドロサイトでのみ発現させることが可能となる。PLP1の機能はあまり良く分かっていないが、少なくとも膜蛋白質の一種で、二量体あるいは三量体を形成していることが知られている。また、他の蛋白質に比べて発現量が非常に多く、ミエリン蛋白質の50％を占めるといわれている。一方、PLP1遺伝子はヒトの白質ジストロフィーの一種であるPelizaeus-Merzbacher
病(PMD)の原因遺伝子であることが知られている。PMDは脱ミエリンによって引き起こさ
れる家族性の疾患で、PLP1の種々のアミノ酸変異によって引き起こされることが報告されている。PLP1変異は、オリゴデンドロサイトにおいてERストレスを誘発し、脱ミエリンひいては細胞死を引き起こす。その結果、頭部回転、眼振、手足の痙攣・萎縮、パーキンソン症状などを呈し、多くの場合２０歳までの間に死亡する重篤な神経疾患の一つである（非特許文献５、OMIM312080(NCBI), http:www.ncbi.nlm.gov/）。
【非特許文献５】Overexpression of the myelin proteolipid protein leads to accumulation of cholesterol and proteolipid protein in endosome/lysosomes: implications for Pelizaeus-Merzbacher disease. M.Simons et al.,J.Cell.Biol.157: 327-336 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、メダカの神経細胞又はグリア細胞で発現可能なプロモーターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題に鑑み検討を重ねた結果、メダカ神経系に発現する３つの蛋白質をコードする遺伝子UCHL1, TH, GAP43、さらにメダカオリゴデンドロサイトに発現する蛋白質をコードする遺伝子PLP1を同定し、ゲノム解析によりこれらの遺伝子の5’上流に位
置する神経細胞・グリア細胞に特徴的な転写調節活性を有する転写調節核酸配列を見出した。そして、実際にこれらの領域がメダカ個体内で特定の神経細胞・グリア細胞に異種遺伝子を発現させ得る活性を有することを証明した。
【００１５】
本発明は、特定の神経細胞・グリア細胞において任意の遺伝子発現を有する活性のある核酸配列、それを含むプラスミドベクター、およびトランスジェニックメダカに関する。１．  Ubiquitin C-terminal Hydrolase L1（UCHL1）遺伝子、Tyrosine Hydroxylase（TH）遺伝子、Growth Associated Protein 43（GAP43）遺伝子およびProteolipid protein 1（PLP1）遺伝子からなる群から選ばれるメダカ由来遺伝子のプロモーター領域を含むDNA
断片。
２．  以下の（a）または（b）のDNAを含む項1に記載のDNA断片：
（a）配列番号１の塩基配列からなるメダカ由来Ubiquitin C-terminal Hydrolase L1遺伝子のプロモーター領域を含むDNA又はその相補鎖；
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA。
３．  以下の（a）または（b）のDNAを含む項1に記載のDNA断片：
（a）配列番号２の塩基配列からなるメダカ由来Growth Associated Protein 43遺伝子の
プロモーター領域を含むDNA又はその相補鎖；
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA。
４．  以下の（a）または（b）のDNAを含む項1に記載のDNA断片：
（a）配列番号３の塩基配列からなるメダカ由来Tyrosine Hydroxylase遺伝子のプロモー
ター領域を含むDNA又はその相補鎖；
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA。
５．  以下の（a）または（b）のDNAを含む項1に記載のDNA断片：
（a）配列番号４又は２９の塩基配列からなるメダカ由来Proteolipid protein 1遺伝子のプロモーター領域を含むDNA又はその相補鎖；
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA。
６．  神経細胞及び／又はグリア細胞において遺伝子発現を促進する活性を有する項１〜５のいずれかに記載のDNA断片。
７．  項１〜５のいずれかに記載のDNA断片を含むベクター。
８．  異種遺伝子が該DNA断片の転写制御下にある項７に記載のベクター。
９．  項７または８に記載のベクターを導入することによって形質転換された細胞。
１０．  項７または８に記載のベクターを導入することによって形質転換されたトランスジェニックメダカ。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、メダカの神経細胞、グリア細胞で発現可能なプロモーターを初めて取得できた。本発明のプロモーターは、メダカに特に好適であるが、メダカ以外の魚類にも適用可能である。
【００１７】
本発明のプロモーターを用いることで、任意の異種遺伝子をメダカの神経細胞、グリア細胞で高発現することができ、トランスジェニックメダカを容易に得ることができるようになった。
【００１８】
例えばメダカとして透明なメダカを使用し、該プロモーターにGFP、YFPなどの蛍光蛋白質、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を連結することで、生きた個体内の細胞を視覚的に観察することができ、薬物候補化合物を含む生理活性物質の神経系に対する作用をリアルタイムで観察することができる。  
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
神経細胞・グリア細胞で発現の認められる遺伝子のプロモーターを同定し・取得することができれば、トランスジェニック技術を用いて任意の遺伝子をメダカ個体において発現させることが可能になる。そこで、本発明者らは、神経系に特徴的な遺伝子としてUCHL1
、TH，GAP43の３遺伝子、グリア細胞、主としてオリゴデンドロサイトに特徴的な遺伝子
としてPLP1遺伝子に着目した。
【００２０】
メダカ由来のUCHL1遺伝子（配列番号２５）、TH遺伝子（配列番号２６）、GAP43遺伝子（配列番号２７）、PLP1遺伝子（配列番号２８）の塩基配列を各々配列表に示す。
【００２１】
本明細書において、「メダカプロモーター」とは、メダカにおいてプロモーターとして作用する能力（プロモーター機能）を有するDNA断片のことである。「プロモーター」は
、魚類、特にメダカなどの小型硬骨魚類において遺伝子発現を促進する活性を有するDNA
断片を意味する。プロモーターは、DNAを鋳型としてmRNA合成酵素（転写）を開始するDNA上の特定塩基配列を意味する。具体的には、メダカ由来のUCHL1遺伝子、GAP43遺伝子、TH遺伝子およびProteolipid protein 1（PLP1）遺伝子のプロモーターおよびその改変体が
挙げられる。該プロモーター改変体は、魚類、特にメダカなどの小型硬骨魚類においてプロモーター活性を有するプロモーター改変体を意味し、具体的には、以下のものが挙げられる：
（a）配列番号１〜４、２９のいずれかの塩基配列からなるDNA又はその相補鎖
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配列が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA
（c）（a）又は（ｂ）の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA。
【００２２】
ストリンジェントな条件としては、具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０，２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２３】
本発明の1つの実施形態におけるプロモーターは、配列番号１〜４、２９記載の塩基配
列からなるDNAにおいて、１もしくは複数のDNAが欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつ、メダカプロモーターとして作用する能力を有するDNAである。本
発明のメダカプロモーターには、配列番号１〜４、29記載の塩基配列の３’または５’末端あるいは内部に、翻訳効率を上げる塩基配列などを付加したものや、３’または５’末端をプロモーター活性が有る限り、欠失したものが含まれる。
【００２４】
本発明の「ベクター」は、上記プロモーターをクローニングベクターあるいはプロモーターを欠損したレポーターベクターに導入したものであり、例えば大腸菌由来の一般的なクローニングベクターとしてpBluescriptII, レポーターとしてルシフェラーゼを持つpGL3 Basic (Promega社)、レポーターとして蛍光蛋白質を持つpEGFPベクター（Clontech社）などが挙げられる。
【００２５】
ベクターはそれぞれの魚類の宿主細胞に応じて選択する。本発明のプロモーターをベクターに導入する方法は、通常の遺伝子をベクターに導入する方法に従う。
【００２６】
本発明の「トランスジェニックメダカ」とは、上記ベクターに異種遺伝子を組み込み、メダカの受精卵に導入することで得ることができる。ベクターに代えて、本発明のプロモーターに異種遺伝子を発現可能に連結して遺伝子構築物を作製し、該遺伝子構築物を同様にメダカの受精卵に導入することでトランスジェニックメダカを得ることもできる。
【００２７】
本発明で得られたトランスジェニックメダカは、寄託機関の寄託対象生物に含まれていないので、本出願人により分譲可能な状態に維持されている。
【００２８】
メダカとしては、特に限定されないが、メダカSTII系統が、本来メダカの持つ色素（黒色、白色、虹色）を欠損する透明メダカの系統で、個体内の細胞で発現する蛍光蛋白質のシグナルを容易に観察することができるために好ましい。
【００２９】
本発明のベクターを宿主細胞に導入する形質転換法としては、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いる方法あるいはパーティクルガン法などを挙げることができる。
【００３０】
本発明のプロモーターに必要なエレメントを決定し、必須のエレメント以外の部分を改変したプロモーターを作製することができる。
【００３１】
本発明のプロモーター上にあるエレメント部位を決定する方法としては、例えばJoseph
Sambrook,David W. Russell Molecular Cloning 第３版のChapter13に書かれているデリーション法やPCRを用いて長さを調節したプロモーターを作製し、メダカ細胞等に形質転
換後、目的の条件でのプロモーター活性をレポーター遺伝子を用いて調査する方法がある。さらに詳細にエレメント配列を決定する場合は、Joseph Sambrook,David W. Russell Molecular Cloning 第３版のChapter13に書かれているようにプロモーター上にDNA変異を
導入して、またはPCR法を利用した変異の導入により、上記と同様に、メダカ細胞等に形
質転換後、プロモーター活性を調査し、もっとも重要なエレメント配列を決定する方法が挙げられる。
【００３２】
本発明のプロモーターの改変は、プロモーターのエレメントをタンデムに接続するなどの種々の方法により行うことができ、活性が変化したプロモーターを得ることができる。
【００３３】
本発明のプロモ−ターに接続することが好ましい遺伝子としては、蛍光タンパク質（緑色蛍光蛋白質（GFP）、黄色蛍光蛋白質（YFP）、青色蛍光蛋白質（BFP）、赤色蛍光蛋白
質（RFP）など）、エクオリン、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ 、β−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ノパリンシンターゼ、オクタピンシンターゼなどが挙げられるが、定性的測定を行なう場合には肉眼的な観察が容易である点で蛍光蛋白質、定量的測定を行う場合にはルシフェラーゼが好ましい。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例に従いより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
メダカUCHL1遺伝子のcDNAクローニング
メダカUCHL1遺伝子は未だ誰もクローニングしていないため、遺伝子配列・アミノ酸配
列は未知であった。また、各種臓器・ステージに由来するcDNAライブラリも存在しないため、ライブラリースクリーニングによって目的の遺伝子をクローニングすることは困難であった。そこで、本発明者らは、in silicoクローニング法を戦略として用いることにし
た。すでに報告のあるあるいは予測されている他種生物のUCHL1相同遺伝子配列をNCBI遺
伝子データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）、およびEnsembl遺伝子データベース(http://www.ensembl.org/index.html)より取得した。取得できた配列ヒト、マウス、ラ
ット、アフリカツメガエル、フグ、ミドリフグ、ゼブラフィッシュのUCHL1遺伝子オルソ
ログの核酸および遺伝子産物のアミノ酸配列、比較を行なった。そこで、マウスUCHL1の
アミノ酸配列を問い合わせ配列として用いて、TBLASTNプログラムによりWhole Genome Shotgunにより作成されたメダカゲノムデータベース（http://medaka.utgenome.org/、2004/06assemble）の検索を行なった。対象としたデータベースは不完全で、短いwhole genome shotgun (WGS)配列どうしを接続したcontig-scaffold配列であり、chromosome番号まで整理されていないものである。また、配列シーケンスの信頼性が低いため、予測だけでは本当の遺伝子配列は取得できない。そのため、実際に予測した遺伝子がメダカ細胞において発現しているかどうかをもって正しい配列を検証しなければならない。その結果、候補としてscaffold3270の−鎖にメダカUCHL1遺伝子がコードされていることが予測された。Scaffold3270上に予測したUCHL1遺伝子のエクソンをマッピングした。この予測に基づき以下のプライマーを設計し(Tm=60 oC, Primer3 software, http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)、OligoDNAを合成した(Operon社)。
【００３５】
Primer #P380:  5’-CGACAACATTGTGCCCATTA-3’（配列番号５）
Primer #P381:  5’-CCATAAGAAGCCTGAAGAACG-3’ （配列番号６）
メダカHd-rR系統より１０種類の臓器（脳・鰓・心臓・肝臓・腎臓・脾臓・腸・骨格筋・
精巣・卵巣）を取り出し、mRNAを精製した（mRNA purification kit, Amarsham社）。精
製されたmRNAを鋳型として、逆転写酵素を用いて一本鎖相補鎖DNA(1ststrand cDNA)を作
成した（1ststrand cDNAsynthesis kit, Amersham社）。以上はAmarsham社より提供され
たプロトコルにしたがって行なった。RT-PCRの反応組成・反応プログラムは以下のとおりである。
<RT-PCR反応組成＞
ExTaq (50 Unit)             0.05μl (final 2.5 Unit)
10X ExTaq buffer            1 μl
dNTP (2.5mM each)           0.8 μl
Primer #P380 (3.2pM)        0.5 μl (final 0.32 pM)
Primer #P381 (3.2 pM)       0.5 μl (final 0.32 pM)
Template cDNA(0.2 μg/μl)  1 μl (final 0.2 μg/reaction)
QW                          6.15 μl
TOTAL                       10 μl
<反応プログラム＞
STEP1  94 oC  5 min
STEP2  94 oC  30 sec
STEP3  60 oC  10 sec
STEP4  72 oC  90 sec        (STEP2-4: 30 サイクル)
STEP5  72 oC  7 min
STEP6  10 oC  ∞
RT-PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離したところ、脳および卵巣に目的のサイズのバンドを確認した。生殖系列の細胞は各種遺伝子が高発現していることは哺乳類等でも良く知られているが、脳由来の産物と卵巣由来の産物が同じものであるかどうかを確認するため、ゲルよりそれぞれの反応産物を抽出・精製した（Mini-elute kit, QIAGEN社）。精製したPCR産物をTA-cloning法によってpGEM-Teasyベクター（Promega社）にクローニングした。こうして作成されたプラスミドベクターをMini-prep kit (QIAGEN社)を用いて調製した。取得した遺伝子配列が予測したUHCL1であることを検証するために、精製した
プラスミドベクターを鋳型とし、DyeTerminator法を用いてDNAシーケンシングを行なった（BigDyeTerminator, ABI3130, AppliedBiosystemns社)。その結果、得られた核酸配列は脳由来・卵巣由来どちらとも同じ配列であった。また、アミノ酸配列は220アミノ酸から
構成され、類似性からこの遺伝子はメダカにおけるUCHL1相同遺伝子であると考えられた
。また、当該scaffoldのUCHL1遺伝子座の前後の遺伝子座を同様に検討したところ、メダ
カUCHL1遺伝子座の上流にはAnnexinA5遺伝子座が、下流にはMKIAA1102遺伝子座があるこ
とが判明した。ヒト・マウスなど他種生物においてもUCHL1遺伝子の上流にはAnnexinA5遺伝子、下流にMKIAA1102遺伝子が配置されていることから、取得した遺伝子がメダカUCHL1相同遺伝子であることを示唆している。メダカUCHL1遺伝子配列（配列番号２５）を図１
に示す。
メダカＴＨ遺伝子のcDNAクローニング
UCHL1遺伝子と同様に、メダカTH遺伝子をin silicoで予測した。マウスTHアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いて、TBLASTNプログラムによりメダカゲノムデータベースの
検索を行なった(http://medaka.utgenome.org/、2004/06assemble)。その結果、scaffold14721の−鎖にTH遺伝子座があることが分かった。予測したTH遺伝子の各エクソンをscaffold14721にマッピングし、蛋白質をコードする領域をすべて含むと思われる領域をRT-PCRで増幅するために、以下のプライマーを設計し(Tm=60 oC, Primer3 software, http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)、OligoDNAを合成した(Operon社)。
【００３６】
Primer #P439:  5’-CTCCCAAAGATGCCTCAGTC-3’ （配列番号７）
Primer #P440:  5’-ACTTCAGGGTCAAAGGATGG-3’ （配列番号８）
RT-PCR, TA-cloning, DNAシーケンシングはUCHL1と同様に行ない、脳および腎臓（副腎を含む）での発現が認められた。これは哺乳類と同様の発現パターンであった。メダカTH蛋白質は489アミノ酸から構成され、多種生物との比較から当該蛋白質がメダカにおけるTH
相同遺伝子であると考えられた。また、当該scaffoldのTH遺伝子座の前後の遺伝子座を検
討したところ、メダカTH遺伝子座の下流にはIGF-2遺伝子座があることが判明した。他種
生物においてもTH遺伝子の下流にはIGF-2遺伝子が配置されていることから、本遺伝子が
メダカTH相同遺伝子であることを示唆している。メダカTH遺伝子配列（配列番号２６）を図２に示す。
メダカGAP43遺伝子のcDNAクローニング
UCHL1, THと同様に、GAP43遺伝子をin silicoで予測した。GAP43遺伝子はヒト・マウス・金魚等で報告があったが、不完全なものであり、かつ各GAP43遺伝子配列の種差間が大
きく、メダカGAP43遺伝子全配列を予測することは困難であった。しかし、マウスGAP43アミノ酸配列を問い合わせ配列として用いて、TBLASTNプログラムによりメダカゲノムデー
タベースの検索を行なった(http://medaka.utgenome.org/、2004/06assemble)ところ、GAP43部分配列と思われる遺伝子座をscaffold10963の−鎖に見出した。そこで、実際に神経系でGAP43遺伝子が発現しているかどうかを検証するために、予測したメダカGAP43遺伝子のエキソンをscaffold10963にマッピングし、以下のプライマーを設計し(Tm=60 oC, Primer3 software, http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)、OligoDNAを合成した(Operon社)。
【００３７】
Primer #P317:  5’-AATGAGGATGCAGACCAGAAGA -3’（配列番号９）
Primer #P320:  5’-CAGGGCTTTTGGCTTGGTTT-3’ （配列番号１０）
RT-PCR, TA-cloning, DNAシーケンシングはUCHL1, THと同様に行なったが、鋳型として用いたDNAはメダカHd-rR系統の孵化後の稚魚(受精後8-10日)から調製したｍＲＮＡを元に合成した1st strand cDNAを用いた。その結果、予測したGAP43遺伝子の部分配列が発生期メダカにおいて実際に発現していることが明らかになった。しかし、第一メチオニンと思われる配列が存在しないこと、他種生物との比較から考えて、当該配列は第一エキソンを含まないことは明白であった。というのは、GAP43遺伝子は膜局在化のためのパルミトイル
化シグナルをＮ末端に持ち、それは第一エキソンにコードされている。残り１３アミノ酸（３９塩基）のような短い配列はTBALSTNプログラムでは予測できないため、scaffold10963の上流配列を探したところ、約５ｋｂ上流に以下の配列を見出した。
【００３８】
5’-ATGCTGTGCTGCATAAGAAGAACCAAACCGGTGGAGAAA-3’   （配列番号１１）  
当該配列の3’末端はgtであり、AA/gtの間でRNA スプライシングが起こることが予想された。このパルミトイル化シグナルが第一エキソンにあるという遺伝子構造はヒトやマウスで同様であることから、当該遺伝子座がメダカGAP43であると考えられた。ちなみに、ヒ
トではこの第一エキソンは第二エキソンとは約５０Ｋｂ離れている。メダカゲノムはヒトとほぼ同じ遺伝子セットを持っているにもかかわらず、そのサイズは800 Mb  （ヒトは約4分の1）と非常に小さい。これはイントロンの長さおよび、CpGアイランドやリピート構
造の量、転写調節領域の長さなどに由来すると考えられている。メダカにおけるGAP43相
同遺伝子配列（配列番号２７）を図３に示す。
メダカPLP1遺伝子のcDNAクローニング
上記UCHL1, TH, GAP43と同様に、メダカPLP1遺伝子を in silicoで予測した。ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、フグ、ミドリフグ、のPLP1相同遺伝子の核酸および遺伝子産物のアミノ酸配列、比較を行なった。PLP1遺伝子はこれらの動物種間で良く保存された遺伝子であった。そこで、ゼブラフィッシュPLP1のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いて、TBLASTNプログラムによりメダカゲノムデ
ータベース（http://medaka.utgenome.org/、2004/06 assemble）の検索を行なった。そ
の結果、scaffold1287の＋鎖にメダカPLP1遺伝子がコードされていることが予測された。そこで、Scaffold1287上に予測したPLP1遺伝子のエクソンをマッピングした。メダカPLP1遺伝子は７エクソンから構成され、第一メチオニンを含む第一エキソンは、メチオニン１アミノ酸のみをコードすることが明らかになった。このエキソン／イントロンの構成は多種生物とまったく同じであった。以上の予測に基づき、メダカPLP1遺伝子を実際にクローニングするために、以下のプライマーを設計し(Tm=60 oC, Primer3 software, http://fr
odo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)、OligoDNAを合成した(Operon社)。
【００３９】
Primer #KS001:  5’-TGAACGCATCATCCAGACAT-3’ （配列番号１２）
Primer #KS002:  5’-CCTGTAGATCCCAAGGTGGA-3’ （配列番号１３）
RT-PCR, TA-cloning, DNAシーケンシングはUCHL1, THと同様に行ない、脳および卵巣に目的のサイズのバンドを確認した。得られたRT-PCR産物は予測したPLP1遺伝子と完全に一致した。PLP1蛋白質のアミノ酸配列は245アミノ酸から構成され、類似性からこの遺伝子は
メダカにおけるPLP1相同遺伝子であると考えられた。メダカPLP1遺伝子配列（配列番号２８）を図４に示す。
神経プロモーターの取得
実際にメダカ脳・神経系で発現している３つの遺伝子UCHL1，TH，GAP43を実際に同定することができたので、次にこれらの遺伝子発現をもたらす調節領域をメダカゲノムより同定・取得した。
【００４０】
UCHL1プロモーターの同定・取得は以下のようにして行なった。発明者らによって第一
メチオニンを含むコード領域をすべて含むUCHL1遺伝子が同定された。したがって、この
第一メチオニンの直上は５‘非翻訳領域が続いている。さらにその上流には転写調節領域が含まれていなければならない。さらに、すでに解析したように、UCHL1遺伝子の上流約4.4 kbにはAnnexinA5遺伝子が逆向きに配置されているため、UCHL1遺伝子のプロモーター
は長くともこの4.4 kbの間にあると考えられる。しかも、この配列中にはAnnexinA5のプ
ロモーターも同時に含まれなければならない。発現プラスミドベクター構築のために利用できる制限酵素部位を考え、上流4.4 kbのうち約2 kbの領域をプロモーターを含む領域と判断し、以下のプライマーを設計し(Tm=60 oC, Primer3 software, http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)、OligoDNAを合成した(Operon社)。
【００４１】
Primer: #P387: 5’-GGTACCAATAAAAATGGCAAACGGTGATTA-3’ （配列番号１４）
Primer: #P388: 5’-CCATGGTTTCAAATTTTAGTAACTAATGGG-3’ （配列番号１５）
後の発現ベクターへのサブクローニングのために、上流（＋鎖）のプライマーにはKpnI（GGTACC）を付加し、下流（−鎖）のプライマーにはNcoI（CCATGG）をそれぞれ付加した。メダカHd-rR系統（♂）よりゲノムDNAを調製し（Dneasy tissue kit, QIAGEN社）これを
鋳型として、上記プライマーを用いてGenomicDNA-PCRを行いゲノム断片をクローニングした。クローニング方法はcDNAのクローニングと同様に行い、一度pGEM-TeasyベクターにＴＡクローニングしてDNAシーケンシングにより標的配列であることを確認した。以上によ
り、1915 bpのUCHL1プロモーターを取得した。以下、当該塩基配列のことをpUCHL1-2.0k
と呼び、その塩基配列（配列番号１）を図５に示す。
【００４２】
UCHL1と同様に、TH遺伝子に関しても第一メチオニンを含むcDNAが同定されたので、第
一メチオニンの上流配列はTH遺伝子の5’非翻訳領域およびプロモーターが含まれていな
ければならない。しかしscaffold14721上において、TH遺伝子の上流約2 kbのところに塩
基配列が不明の配列（ギャップ）があるためこれ以上の長い配列を取得することができなかった。また、このギャップ前後の配列は信頼性が低くプライマーを設計してもＰＣＲ産物を得ることが出来なかった。そこで、信頼できる配列で、かつ、最も長いもので、発現ベクター構成に用いる制限酵素部位を内部に持たないように、以下のプライマーを設計し(Tm=60 oC, Primer3 software, http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)、OligoDNAを合成した(Operon社)。
【００４３】
Primer: #P389: 5’-GAGCTCATCCATCCTTCCTCTTG -3’（配列番号１６）
Primer: #P368: 5’-AAGCTTTGGGAGGAGTGCGCG-3’   （配列番号１７）
後の発現ベクターへのサブクローニングのために、上流（＋鎖）のプライマーにはSacI（GAGCTC）を付加し、下流（−鎖）のプライマーにはHindIII(AAGCTT)をそれぞれ付加した
（下線部分）。UCHL1プロモーターの取得と同様にして、GenomicDNA-PCRにより1452 bpのTHプロモーターを取得した。以下、当該塩基配列をpTH-1.5kと呼び、その塩基配列（配列番号２）を図６に示す。
【００４４】
同様に、GAP43遺伝子に関しても第一メチオニンを含むcDNAが同定されたので、第一メ
チオニンの上流配列はGAP43遺伝子の５‘非翻訳領域およびプロモーターが含まれていな
ければならない。Scaffold10963のGAP43遺伝子座の2.4 kb上流には、THと同様に、ゲノムシーケンスの不備のためギャップがあり、これ以上長い配列の取得は困難であった。また2.4 kbの塩基配列そのものが信頼できず、プライマーを設計してもPCR産物を得ることが
出来なかった。そこで、信頼できる配列で、かつ、最も長いもので、発現ベクター構成に用いる制限酵素部位を内部に持たないように、以下のプライマーを設計し(Tm=60 oC, Primer3 software, http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)、OligoDNAを合成した(Operon社)。
【００４５】
Primer: #P396: 5’-GAGCTCATGGTGAAAGACAAATACAG -3’ （配列番号１８）
Primer: #P395: 5’-AAGCTTAGTTGGACTTGTAGTATCCTCC-3’（配列番号１９）
後の発現ベクターへのサブクローニングのために、上流（＋鎖）のプライマーにはSacI（GAGCTC）を付加し、下流（−鎖）のプライマーにはHindIII(AAGCTT)をそれぞれ付加した(下線部分)。上記プロモーターの取得と同様にして、GenomicDNA-PCRにより1023 bpのGAP43プロモーターを取得した。以下、当該塩基配列をpGAP43-1.0kと呼び、その塩基配列（配列番号３）を図７に示す。
メダカ由来PLP1プロモーターの取得
実際にメダカ脳内で発現しているPLP1遺伝子を同定することができたので、次にこれらの遺伝子発現をもたらす調節領域をメダカゲノムより同定・取得することを行なった。
【００４６】
PLP1プロモーターの同定・取得は以下のようにして行なった。発明者らによって第一メチオニンを含むコード領域をすべて含むPLP1遺伝子が同定された。したがって、この第一メチオニンの直上は5’非翻訳領域が続いているはずである。さらにその上流には転写調
節領域が含まれていなければならない。発現プラスミドベクター構築のために利用できる制限酵素部位を考え、約1.7Kbおよび、約4.0Kbという長さの異なる転写調節領域を取得することにした。そこで、以下のプライマーを設計し(Tm=60 oC, Primer3 software, http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)、OligoDNAを合成した(Operon社)。
【００４７】
Primer: #KS005: 5’-GGTACCTGTGTGTACAGGGGTTGCATGT-3’（配列番号２０）
Primer: #KS007: 5’-GGTACCGATGCGCGTCAGAAAATGAGAT-3’（配列番号２１）
Primer: #KS008: 5’-CCATGGCTGGATGATGCGTTCAGGCG-3’  （配列番号２２）
#KS005／#KS008によって1.7KbのゲノムDNA断片が、#KS007／#KS008によって4.0Kbのゲノ
ム断片が増幅される。後の発現ベクターへのサブクローニングのために、上流（＋鎖）のプライマーにはそれぞれKpnI（GGTACC）を付加し、下流（−鎖）のプライマーにはNcoI（CCATGG）をそれぞれ付加した（下線部分）。
上記プロモーターの取得と同様にして、GenomicDNA-PCRにより1723bp及び3970bpのPLP1プロモーターを取得した。以下、当該塩基配列のことをそれぞれpPLP-1.7k, pPLP-4.0kと呼び、その配列（配列番号２９，４）を図８、図９に示す。
【００４８】
従来、プロモーターの持つ細胞種特異性を調べるためには、各種の神経系に由来する培養細胞を用いて検証する場合が多いが、それでは不十分である。神経細胞由来あるいはグリア細胞由来の癌細胞は個体内の正常な細胞とは異なるからである。したがって、特定の培養細胞でそのプロモーターが機能したとしても、個体内の特定の細胞集団で発現可能かどうかは不明である。したがって、当該プロモーターが本当に個体内の特定の神経細胞あ
るいはグリア細胞で作動するかどうかを検証するには、実際に個体において、しかも一過的な発現ではなく、ゲノムに挿入されたトランスジェニックでなければならない。そこで、トランスジェニックメダカを作成するために、以下の発現ベクターの構築を行った。
【００４９】
個体における組織特異性を調べるためのレポーター遺伝子にはいくつかの選択肢が考えられるが、発明者らの目標とするメダカを用いた創薬スクリーニングシステムの開発という点を鑑み、また、生きた個体内における神経細胞・グリア細胞の可視化という観点からも蛍光蛋白質を用いるのが良いと考えた。そこで、本実施例において、pUCHL1-2.0kにはDsRedExpress、pTH-1.5kにはGMAS-mCherry、pGAP43-1.0kにはEGFPという異なる局在性・波長特性をもつ蛍光蛋白質をレポーターとして用いることにした。さらに、塩基配列長の異なる２種類のPLP1プロモーターに対して、赤色蛍光蛋白質DsRedExpressをレポーターとして用いることにした。
【００５０】
UCHL1プロモーターの下流でレポーター遺伝子を発現するプラスミドベクターを以下の
ようにして作成した。赤色蛍光蛋白質DsRedExpress（Clontech社）の蛋白質をコードする領域を含む配列をNcoI／XbaI部位で切断し、pGL3 Basicベクター（Promega社）のルシフ
ェラーゼ遺伝子と置換した。また、マルチクローニングサイト（MCS）の内部の制限酵素
配列を欠損させるために、最も５‘側のKpnI部位、および３’側のNcoI部位に上記でクローニングしたpUCHL1-2.0kをサブクローニングした。pGL3 Basicベクターにはリードスル
ーによる非特異的転写を抑制するためにMCSの上流にはTranscription pose site(TPS)と
してPolyA付加シグナルを含む配列が含まれている。そこで、この上流にあるNotI部位を
アダプターリンカーライゲーションによってMluI部位に置換し、さらにSalI部位をSacI部位に置換した。このプラスミドベクターをMluI／SacIによって制限酵素切断し、得られた(MluI)-TPS-MCS-DsRedExpress-pA-(SacI)断片をpBluescriptII-SK(+)-I-SceIファージミ
ドベクター（Dr.Widtblottより分与）のKpnI部位を同様にMluI部位に置換したものをMluI／SacI部位に置換したベクターバックボーンにサブクローニングした。I-SceIはホーミングエンドヌクレアーゼの一つで、その認識配列をベクターに向かい合わせに挿入しておくと、トランスジェニック動物を作成する際にゲノムへの挿入効率が向上するという報告があるため用いた。構築したUCHL1プロモーターの下流でDsRedExpressレポーター遺伝子を
発現するプラスミドベクターをpUCHL1:DsRedExpress (pBluescriptII-SK(+)-I-SceI)と呼び、その構造を図１０に示す。この発現プラスミドベクターを大腸菌DH5αにトランスフ
ォーメンションし、QIAprep Mini kit（QIAGEN社）を用いて精製した。
【００５１】
前記発現プラスミドベクターpUCHL1:DsRedExpress (pBluescriptII-SK(+)-I-SceI；識
別のための表示、「polUCHL1-2.0k:DsRedExpress」)は、２００６年７月２７日に独立行
政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、同センターから受領番号FERM
AP-20975を付与された。
【００５２】
THプロモーターの下流でレポーター遺伝子を発現するプラスミドベクターを以下のようにして作成した。可溶性蛋白質である赤色蛍光蛋白質mCherryを膜局在型にするために、GAP43遺伝子の膜局在化シグナルを用いることにした。ラットGAP43の膜局在化シグナル(GAP43 membrane associated sequence, GMAS)を用いた緑色蛍光蛋白質はClontech社からmemEGFPとして市販されているが、メダカにおいてラットの膜局在化シグナルが正常に作用するかどうかが不明であったため、メダカに由来するGAP43膜局在化シグナルを用いること
にした。なぜなら、GAP43アミノ酸配列において膜局在化シグナルを比較したところ、哺
乳類（２０アミノ酸）と魚類（２１アミノ酸）で異なっていたからである。各脊椎動物GAP43蛋白質の膜局在化シグナルを比較したものを図１１に示す。Hs＝ヒト、Mm＝マウス、Rn＝ラット、Xl＝アフリカツメガエル、Gf＝金魚、Dr＝ゼブラフィッシュ、Tn＝ミドリフ
グ、Ol＝メダカを意味している（配列番号30〜35）。両生類以下は２１アミノ酸から構成され、５番目のアミノ酸は哺乳類ではM（メチオニン）であるが、魚類では共通してI（イ
ソロイシン）である。同様に、１０番目のアミノ酸は哺乳類でQ（グルタミン）であるの
に対して、魚類では共通してP（プロリン）である。膜局在型mCherry蛍光蛋白質を作成するために、以下のプライマーを設計し、OligoDNAを合成した(Operon社)。
【００５３】
Primer #A001:5’-AAGCTTATGCTGTGCTGCATAAGAAGAACCAAACCGgtggagaaaaatgaggatgcagaccagaagattATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’ （配列番号２３）
Primer #P405: 5’-TCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’ （配列番号２４）
後のサブクローニングのために、5’（上流）プライマーにはHindIII(AAGCTT)を、3’（
下流）プライマーにはXbaI(TCTAGA)をそれぞれ付加した（下線部分）。
pRESTB-mCherry(Dr.Roger Y. Tsienより分与)を鋳型として、上記プライマーを用いてPCR産物を一度pGEM-Teasyベクターにクローニングし、Mini-prepした後、上記下線に示した
ようにプライマーに内在するユニークなHindIII／XbaI部位で制限酵素切断した。この断
片を、pGL3 BasicベクターのMCS内のHindIII部位と、ルシフェラーゼ遺伝子の3’側にあ
るXbaI部位でルシフェラーゼ遺伝子を置換した。DNAシーケンシングによって正しく構成
されているかを確認した。以下、作成したレポーターベクターをpGMAS-mCherry Basicベ
クターと呼ぶ。pGMAS-mCherry BasicベクターのMCSのSacI／HindIII部位に上記で作成し
たpTH-1.5kをサブクローニングした。構築したTHプロモーターの下流でGMAS-mCherryをレポーターとして発現する発現プラスミドベクターをpTH-1.5k:GMAS-mCherryと呼び、その
構造を図１２に示す。この発現プラスミドベクターを大腸菌DH5αにトランスフォーメン
ションし、QIAprep Mini kit（QIAGEN社）を用いて精製した。
【００５４】
前記発現プラスミドベクターpTH-1.5k:GMAS-mCherry（識別のための表示、「polTH-1.5k:GMAS-mCherry」）は、２００６年７月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、同センターから受領番号FERM AP-20974を付与された。
【００５５】
GAP43プロモーターの下流でレポーター遺伝子を発現するプラスミドベクターを以下の
ようにして作成した。レポーター遺伝子として、上記２種のレポーターとは異なる緑色蛍光蛋白質遺伝子EGFPを選択した。上記と同様に、pGL3 Basicベクターのルシフェラーゼ遺伝子をNcoI／XbaI部位でEGFPに置換したものを作成した。以下、それをpEGFP Basicベク
ターと呼ぶ。pEGFP BasicベクターをMCS内のScaI／HindIII部位で制限酵素切断し、上記
で作成したpGAP43-1.0kをサブクローニングした。構築したGAP43プロモーターの下流でEGFPをレポーターとして発現する発現プラスミドベクターをpGAP43-1.0k:EGFPと呼び、その構造を図１３に示す。この発現プラスミドベクターを大腸菌DH5αにトランスフォーメン
ションし、QIAprep Mini kit（QIAGEN社）を用いて精製した。
【００５６】
前記発現プラスミドベクターpGAP43-1.0k:EGFP(識別のための表示、「polGAP43-1.0k:EGFP」)は、２００６年７月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、同センターから受領番号FERM AP-20972を付与された。
【００５７】
神経細胞特異的プロモーターを用いた発現ベクターの構築と同様に、長さの異なる２種類のPLP1プロモーターの下流でレポーター遺伝子を発現するプラスミドベクターを以下のようにして作成した。レポーター遺伝子として赤色蛍光蛋白質DsRedExpressを選択した。上記で取得したPLP1プロモーターをpBluescriptII-SK(+)-I-SceIベクターMCS内にあるKpnI/NcoI部位においてサブクローニングした。構築した発現プラスミドベクターを以下それぞれ、pPLP-1.7k:DsRedExpress, pPLP-4.0k:DsRedExpressと呼び、その構造を図１４に示す。これらの発現プラスミドベクターを大腸菌DH5αにトランスフォーメンションし、QIAprep Mini kit（QIAGEN社）を用いて精製した。
【００５８】
前記発現プラスミドベクターpPLP-4.0k:DsRedExpress(識別のための表示、「polPLP-4.0k:DsRedExpress」)は、２００６年７月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生
物寄託センターに寄託し、同センターから受領番号FERM AP-20973を付与された。
【００５９】
上記で作成したメダカ神経細胞特異的プロモーターおよびグリア細胞特異的プロモーターの下流でレポーター遺伝子を発現する発現ベクターを用いて、トランスジェニックメダカ系統の作成と樹立を行なった。メダカSTII系統は本来メダカの持つ色素（黒色、白色、虹色）を欠損する透明メダカの系統で、個体内の細胞で発現する蛍光蛋白質のシグナルを容易に観察することができる実験用メダカである（名古屋大学・若松教授より分与）。具体的には以下のとおりである。親メダカは循環型水槽(IWAKI pomp社)において２７℃、14時間の明期、10時間の暗期によるライトサイクル下で飼育した。性成熟したメダカSTIIをペアリングし、産卵したメダカ受精卵を採卵し、氷冷したハンクス液に入れ、発生の進行を一時的に止めた。卵塊を形成する付着糸を実体顕微鏡下でピンセットを用いて丁寧に取り除き、一個一個ばらばらにした。未受精および未成熟卵はこの時点で取り除いた。注入する発現ベクター溶液は以下のように調製した。UCHL1, PLP1に関してはI-SceI認識部位
を持つベクターを用いているため、ホーミングエンドヌクレアーゼI-SceIを含む組成、他２種については含まない組成の注入溶液を用いた。
【００６０】
pUCHL1-2.0k:DsRedExpress, pPLP-4.0k:DsRedExpress
Vector DNA, 10ng/μl
I-SceI buffer (ロシュ社), 0.5X
I-SceI（ロッシュ社）, 5 Unit
フェノールレッド（Sigma社、cell culture grade, 0.02%）
pTH-1.5k:GMAS-mCherry, およびpGAP43-1.0k:EGFP
Vector DNA, 30ng/μl
K2PO4(pH8.0), 0.1M 
フェノールレッド（Sigma社、cell culture grade）, 0.02%）
ガラス電極（外径1.0mmφ, 内径0.85 mmφ ハーバード社）に注入DNA溶液を充填し、気泡を取り除いた後、マイクロインジェクター（フェムトジェット、エッペンドルフ社）に接続し、実体顕微鏡下(オリンパス社)で１−２細胞期のメダカ受精卵内の細胞に0.2 pl〜0.5 pl注入した。DNA注入の終わった受精卵はembryonic solution (0.03% Red Sea Salt溶
液)に移し、28℃でインキュベーションした。発生の進んだ胚（Ｆ０）において注入した
発現プラスミドベクターに由来する蛍光蛋白質のシグナルを実体顕微鏡下（MZ-FLIII,ラ
イカ社）で観察し、ディジタルCCDカメラ（DP70, オリンパス社）で記録した。一次スク
リーニングとして、Ｆ０個体群の中で蛍光蛋白質の発現が認められたものだけを抽出し、次世代のために飼育した。
【００６１】
成長したＦ０個体を個別に野生型の相手と交配し、得られた受精卵（Ｆ１）を個別に採卵した。もし、交配したＦ０個体の生殖系列細胞のゲノムに注入した発現ベクターが挿入されていれば、二次スクリーニングとしてＦ１個体を蛍光顕微鏡下で観察することにより、ある割合で（１細胞期にゲノムに挿入された場合５０％）蛍光蛋白質を発現する個体が得られるはずである。その結果、いずれの系統も生殖系列を介したトランスジェニック個体を得ることができた。以下同様にＦ１トランスジェニック個体を飼育し、野生型と交配しＦ２系統を得た。得られたトランスジェニック個体の♂は精巣を取り出し、凍結保存を行なうと同時に、さらに世代交代を行なうことでその系統を維持している。
【００６２】
得られたトランスジェニック個体はいずれも中枢神経系神経細胞において発現が認められた。図１５にpUCHL1-2.0k:DsRedExpress, pTH-1.5k:GMAS-mCherry, pGAP43-1.0k:EGFP
系統における、蛍光実体顕微鏡下において生きたメダカ個体中で神経細胞をイメージングしたものを示す。pUCHL1-2.0k:DsRedExpressは大脳・間脳・中脳・後脳・および脊髄の一部の神経細胞、特に視床下部の下葉中央部の神経細胞に強いシグナルが認められた。さら
に、脳・神経系の他に骨格筋および生殖腺細胞でもDsRedExpressの赤色蛍光蛋白質のシグナルが認められた。生殖腺細胞での発現はRT-PCRの結果から予想されたものではあったが、骨格筋での発現は予想されたものではなかった。pTH:GMAS-mCherry系統は、大脳・間脳・中脳・後脳・脊髄の一部の神経細胞に強いシグナルが認められ、その他の器官ではシグナルは認められなかった。特に、中脳前部の神経核（Nucleus pretectalis superficialis pars prvocellaris）における発現が特徴的であるが、それ以外にも散在性に小型の神
経細胞においてレポーター遺伝子の発現が認められた。pGAP43-1.0k:EGFP系統は、最も発現している神経細胞の数が多い系統で、大脳から脊髄までほとんどの神経細胞で発現が認められ、とくに手綱核において強い発現が認められたが、その他の器官では発現が認められなかった。
【００６３】
得られたグリア細胞イメージングトランスジェニックメダカは発生初期から中枢性グリア細胞原基において発現が認められた。また、PLP1プロモーターは上流1.7Kbであっても
プロモーター活性は有しており、また組織特異性も認められたが、その転写活性は非常に弱かった。しかし、上流4.0Kbをプロモーターとして用いることで、十分量の遺伝子発現
を促進する活性を有することが明らかになった（図１５）。以上のことから、pPLP-4.0k
の塩基配列の5’側の2.3kbにはグリア細胞での転写活性を強力に活性化するエンハンサー配列が含まれると考えられた。
【００６４】
以上のように、発明者らはメダカゲノムよりUCHL1, TH, GAP43, PLP1各遺伝子の上流にあるプロモーター領域を取得し、実際にそれらがメダカ個体内において神経およびグリア細胞に特異的なプロモーターとして機能することを証明するに到った。本発明は、メダカを用いた創薬スクリーニングシステムにおいて「生きた個体内の特定の細胞をイメージングするための技術」を提供する。また、神経細胞は再生可能な他の細胞と異なり、種々の化学物質・毒・環境ホルモン等によって他影響を受けやすい。したがって、本発明における実施例で示したような生きた個体内で神経細胞あるいはグリア細胞をイメージングしたメダカは「生きた化学物質の評価系」にも応用可能である。さらに、本実施例で用いた蛍光蛋白質の代わりに、任意の遺伝子をメダカ個体内の特定の神経細胞およびグリア細胞で発現させることは容易である。より定量性のあるレポーターを選択することで、「メダカ個体内における神経細胞およびグリア細胞の機能や細胞内外の生理活性物質の活性評価」を行なうことにも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】メダカUCHL1遺伝子配列とアミノ酸配列
【図２】メダカTH遺伝子配列とアミノ酸配列
【図３】メダカGAP43遺伝子配列とアミノ酸配列（部分）
【図４】メダカPLP1遺伝子とアミノ酸配列
【図５】メダカ神経細胞特異的遺伝子発現プロモーター（pUCHL1-2.0k）
【図６】メダカ神経細胞特異的遺伝子発現プロモーター（pTH-1.5k）
【図７】メダカ神経細胞特異的遺伝子発現プロモーター（pGAP43-1.0k）
【図８】メダカグリア細胞特異的遺伝子発現プロモーター(pPLP-1.7k)
【図９】メダカグリア細胞特異的遺伝子発現プロモーター(pPLP-4.0k)
【図１０】メダカ神経細胞遺伝子発現プロモーターを用いたレポーターベクター(pUCHL1-2.0k:DsRedExpress)
【図１１】脊椎動物種間におけるGAP43膜局在化シグナル配列の比較
【図１２】メダカ神経細胞遺伝子発現プロモーターを用いたレポーターベクター(pTH-1.5k:GMAS-mCherry)
【図１３】メダカ神経細胞遺伝子発現プロモーターを用いたレポーターベクター(pGAP43-1.0k:EGFP)
【図１４】メダカグリアプロモーターを用いたレポーターベクター(pPLP-1.7k:DsRedExpress, pPLP-4.0k:DsRedExpress)
【図１５】３種のメダカ神経細胞遺伝子発現プロモーターおよびグリア細胞遺伝子発現プロモーターを用いて作成した神経細胞およびグリア細胞イメージングトランスジェニックメダカ系統
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年9月5日(2006.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
前記発現プラスミドベクターpUCHL1:DsRedExpress (pBluescriptII-SK(+)-I-SceI；識
別のための表示、「polUCHL1-2.0k:DsRedExpress」)は、２００６年７月２７日に独立行
政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、同センターから受託番号FERM
P-20975を付与された。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
前記発現プラスミドベクターpTH-1.5k:GMAS-mCherry（識別のための表示、「polTH-1.5k:GMAS-mCherry」）は、２００６年７月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、同センターから受託番号FERM P-20974を付与された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
前記発現プラスミドベクターpGAP43-1.0k:EGFP(識別のための表示、「polGAP43-1.0k:EGFP」)は、２００６年７月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、同センターから受託番号FERM P-20972を付与された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
前記発現プラスミドベクターpPLP-4.0k:DsRedExpress(識別のための表示、「polPLP-4.0k:DsRedExpress」)は、２００６年７月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、同センターから受託番号FERM P-20973を付与された。