(57)【要約】【課題】プロバイオティクスは消化効果や延命効果など健康にとても有益であるが、そのほとんどは製造工程、輸送、保管、摂取時に死滅してしまう。さらには、酸性の高濃度の塩分条件下では生存出来ない。最終的には、生きた菌が本来持っている良い効果現状で最大限に引き出されていない現状がある。【解決手段】キサンタンとキトサンの高分子混合体を使ってマイクロカプセル化し、プロバイオティクスを包み込むことで苛酷な環境下での生存能力を高めることができる。重量比やｐＨの条件を変えることで安定性も変わるため、特定の条件で製造することが重要である。乳酸菌のＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉと酵母菌のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉをペット用乳酸菌として使用すると、消化管疾患が改善し、特に食欲増進、下痢の減少、軟便の向上、嘔吐の減少につながる効果がある。【選択図】図４
2008013534.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロバイオティクスを生きたまま高分子混合体に包み込む製法。
【請求項２】
プロバイオティクスとして乳酸菌・酵母菌を生きたまま高分子混合体に包み込む製法。
【請求項３】
プロバイオティクスとしてＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の乳酸菌・Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母菌を生きたまま高分子混合体に包み込む製法。
【請求項４】
プロバイオティクスとしてＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉを生きたまま高分子混合体に包み込む製法。
【請求項５】
プロバイオティクスを生きたまま、キサンタン・キトサン高分子混合体に包み込む製法。
【請求項６】
プロバイオティクスを生きたまま、ｐＨ２〜７の範囲でキサンタン（重量比が約０．２〜２％）・キトサン（重量比が約０．１〜１．０％）の高分子混合体に包み込む製法。
【請求項７】
プロバイオティクスを生きたまま、ｐＨ４．１５でキサンタン（重量比が約１．２５％）・キトサン（重量比が約０．４％）の高分子混合体に包み込む製法。
【請求項８】
プロバイオティクスを生きたまま与えることは、ペットの消化管疾患を改善する手法の一つ。
【請求項９】
プロバイオティクスとして酵母菌を生きたまま与えることは、ペットの消化管疾患を改善する手法の一つ。
【請求項１０】
プロバイオティクスとして乳酸菌を生きたまま与えることは、ペットの消化管疾患を改善する手法の一つ。
【請求項１１】
プロバイオティクスとして乳酸菌・酵母菌を生きたまま与えることは、ペットの消化管疾患を改善する手法の一つ。
【請求項１２】
プロバイオティクスとしてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母菌を生きたまま与えることは、ペットの消化管疾患を改善する手法の一つ。
【請求項１３】
プロバイオティクスとしてＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の乳酸菌を生きたまま与えることは、ペットの消化管疾患を改善する手法の一つ。
【請求項１４】
プロバイオティクスとしてＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の乳酸菌・Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母菌を生きたまま与えることは、ペットの消化管疾患を改善する手法の一つ。
【請求項１５】
プロバイオティクスとして酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉを生きたまま与えることは、ペットの消化管疾患を改善する手法の一つ。
【請求項１６】
プロバイオティクスとして乳酸菌Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉを生きたまま与えることは、ペットの消化管疾患を改善する手法の一つ。
【請求項１７】
プロバイオティクスとして乳酸菌Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ・酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉを生きたまま与えることは、ペットの消化管疾患を改善する手法の一つ。
【請求項１８】
キサンタン・キトサンの高分子で包含された状態で生きたままプロバイオティクスを使用することは、ペットの消化管疾患を改善する手法の一つ。
【請求項１９】
プロバイオティクスを生きたまま与えることは、犬・猫・ウサギ・モルモット・鳥類の消化管疾患を改善する手法の一つ。
【請求項２０】
プロバイオティクスを生きたまま与えることは、ペットの食欲増進、下痢の減少、嘔吐の減少、体臭防止、便通改善、腹部膨満等を助ける手法の一つ。
【請求項２１】
抵抗性の高い乳酸菌生成の工程は次に挙げたとおり。
▲１▼低ｐＨ値、且つ、高濃度の塩存在下での培養。
▲２▼次に、▲１▼で生き残った細菌を鶏に与える。
▲３▼その後、鶏の排泄物から乳酸菌を単離する。
▲４▼最後に、人の細胞腺より分離した乳酸菌を培養し、
▲５▼人間の細胞線に粘着した乳酸菌を分離する。
【請求項２２】
抵抗性の高い乳酸菌生成の工程は次に挙げたとおり。
▲１▼低ｐＨ値、且つ、高濃度の塩存在下での培養。
▲２▼次に、▲１▼で生き残った細菌を鶏に与える。
▲３▼その後、鶏の排泄物から乳酸菌（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属）を単離する。
▲４▼最後に、人の細胞腺より分離した乳酸菌を培養し、
▲５▼人間の細胞線に粘着した乳酸菌を分離する。
【請求項２３】
抵抗性の高い乳酸菌生成の工程は次に挙げたとおり。
▲１▼低ｐＨ値、且つ、高濃度の塩存在下での培養。
▲２▼次に、▲１▼で生き残った細菌を鶏に与える。
▲３▼その後、鶏の排泄物から乳酸菌（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｐｃｃｕｓ属）を単離する。
▲４▼最後に、人の細胞腺より分離した乳酸菌を培養し、
▲５▼人間の細胞線に粘着した乳酸菌を分離する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明はペット用プロバイオティクスに関するものである。
【背景分野】
【０００２】
【特許文献１】  米国特許Ｎｏ．５，９６８，５６９はプロバイオティクスを含むゲル化したでんぷん細胞間質のペットフードを示すものであり、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属とＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ属について公開している。
【特許文献２】  米国特許Ｎｏ．６，５５１，６３３はラクターゼと乳糖を含むペット用の牛乳を主成分とするパウダーに関して公表している。また米国特許Ｎｏ．５，９６８，５６９もプロバイオティクスに関するものである。
【特許文献３】  米国特許Ｎｏ．６，７８０，４４７はソルビン酸と微生物（生きているもの、または死んでしまったもの）を含む動物用食品であることを公開している。Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉを含む非常に多種の微生物について公表している。
【特許文献４】  米国特許Ｎｏ．６，８２７，９５７は内部がやわらかく、外部にはプロバイオティクスを含む固い殻となっている動物用食品の製造方法を公開したもので、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属について公表されている。
【特許文献５】  米国特許Ｎｏ．６，８３５，３９７はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉとＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃを含む多種のプロバイオティクスを含むカプセル化された酵母について公表している。
【特許文献６】  米国公開特許申請番号２００３／００４９２４０はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属とＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を用いたヘリコバクター感染症を治療する方法について公開している。
【特許文献７】  米国公開特許申請番号２００４／０１９７３５２は、微生物の数々の菌種を含む、またクレアチンと血液中の尿素窒素を減少させるプレバイオティクス成分について公開している。
【非特許文献１】  上述とともに関係した手法と制限される前述の例が、実例として挙げられ、あくまで唯一の手法とは限らないことを示唆している。そして、ある論述の他の手法、制限範囲は文献や研究により明白となる。
【発明の開示】
【０００３】  キサンタンとキトサンの高分子混合体に包み込むペット用のプロバイオティクスの製法を具体化したものである。それらのプロバイオティクスは酵母菌ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属と乳酸菌を含む。プロバイオティクスは酵母菌を示す。プロバイオティクスは乳酸菌を示す。酵母菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属を示す。乳酸菌とはＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属を示す。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母菌とはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉａｓｅ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、または通称Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉを示す。乳酸菌とはＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉを示す。キサンタンの濃度は重量比が０．２〜２％、キトサンの濃度はｐＨ２〜７の範囲で重量比が０．１〜１％である。キサンタンの濃度は０．１２５％で、キトサンの濃度はｐＨ４．１５で重量比が０．４％である。
【０００４】  主張はペットの下痢、嘔吐、体臭、超過ガスを減少させる方法の一つとしてカプセルに包まれたプロバイオティクスを与えることであることを含む。またペットの食欲不振、下痢、軟便、消化不良、嚥下運動などの問題を減少させる方法の一つとしてカプセル化に包まれたプロバイオティクスを与えることを含む。プロバイオティクスはＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉとＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉを示している。プロバイオティクスはキサトサンとキトサン高分子混合体で包み込まれており、またペットは犬を示す。
【０００５】  主張内容を分かりやすく説明をするための手法、方法などを用いているが、その範囲には制限されない。上記主張では、上記に記載されている一つまたは複数の問題が減少・解消されたと明記されているが、別の主張では、別の問題に対する向上があったことを示している。
【０００６】  上記の説明の他に、参考文献や図、下記の説明により主張を更に明確にしている。
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  プロバイオティクスはもともと人や動物の消化管に住んでいる良性の菌である。プロバイオティクスは人用のサプリメントとしても認められている。抗生物質治療による消化器への副作用があった場合や、旅行などによる継続したストレスに悩む患者に対して、消化器の問題を解消するため、プロバイオティクスを勧める医師もいる。最近医療業界において、プロバイオティクスはワクチンの効果を助け、病気の予防を助け、免疫力を高める重要な作用があると認識し始めた。また食品業界では、プロバイオティクスは人の健康維持のための機能性食品における主要製品であると考えている。家畜生産者たちの間では、プロバイオティクスは抗生物質に比べ、豚、牛、乳牛、鶏にとって、より健康的に成長を促す物質であると考えられているが、ただ単に動物の成長を促すものばかりでなく、腸管に由来する病原菌等からの感染を大幅に減少させるものであるとも認識されている。多くの研究者たちは犬、猫、またモルモットなどの小動物ペットにプロバイオティクスがもたらす効果に魅了され、プロバイオティクスのメカニズムの研究をし、数々のジャーナルにおいて研究成果を公表している。
今日では、ペットフード製造者たちはプレミアム・ペットフードにプロバイオティクスを配合しているし、またプロバイオティクスはカプセルやチュアブル錠剤形式でも販売されるようになった。しかし、ペットオーナーたちにはプロバイオティクスに対する情報がまだ少なく、ペットにもたらす様々な効果が良く認知されていないため、疑い深くプロバイオティクスを積極的に使用しようとはしていないようである。プロバイオティクスは栄養補助食品としてまた強力なニュートラシューティカル製品として人や家畜のヘルスケアに取り入れられているが、ペットオーナーたちには、消化効果や延命効果があるなどプロバイオティクスがペットの健康にとても有益であるという情報がまだ良く伝わっていないのかもしれない。
【０００８】  ではプロバイオティクスはどのようにしてペットに良い効果をもたらすのだろうか？  プロバイオティクスはペットの消化管を通り、消化管表面に付着し細胞分裂する。プロバイオティクスが細胞分裂をして成長すると、ペットが食べたフードを分解し酸性物質を生成し、その酸性条件下では、消化管の病原菌が生息しづらい環境になる。幾種かのプロバイオティクスは、病原菌に対して毒素を分泌し、病原菌を減少させる。
またプロバイオティクスが消化管に付着すると免疫原となり、抗体生産能力を高めるため、病原菌感染への免疫力が高まる。プロバイオティクスが細胞分裂すると、消化管表面に広がり、一般的な感染経路とされる病原菌の消化管付着を防ぐ。プロバイオティクスが細胞分裂をしている最中は複雑な栄養素をペットが吸収しやすい単純栄養素へと消化する。この消化作用により生成された栄養素はペットの肉体を強くするだけでなく、通常消化不良とガスの過剰生成のどちらかによって生成された悪臭も減少する。故に、「生きた」プロバイオティクスがペットの消化管へ送られ、それら微生物が付着し、成長するようにしなければならない。ペットがプロバイオティクスの効果を実感するためには、プロバイオティクスを消化管に「生きたまま」到達させる必要があり、摂取時の生育条件が非常に重要な要素になる。
【０００９】  ペットに与えるプロバイオティクスに関してこの重要な２点をもつと詳しく見てみよう。（１）プロバイオティクスの生育条件（２）ペットの消化管に「生きたまま」到達するプロバイオティクス。これらの点を理解すれば、先の飼い主のペットがなぜプロバイオティクスの数々の効果を体験できたのかを見出すことができると思う。ペットショップに行くと、プロバイオティクス（特にプロバイオティクス発酵培養物）を配合している多種のペットフードが目に付くのではないかと思う。面白いことに、カナダのある科学者グループが「プロバイオティクス配合」と主張している１９社の市販ペットフード製品に関する大規模調査を行っている。この調査報告によると、いずれの商品にも表示されているプロバイオティクス品種すべてが含まれているものはなく、最もプロバイオティクスの含有量が高い商品でも１．８×１００，０００ＣＦＵ／ｇ（Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ  ｏｖｅｒ  ｗｅｉｇｈｔ，ｇ；一定重量に含まれる「生きた微生物」の数の表示単位）であった。詳細は文献を参照。
Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．，２００３，４４：２１２−２１５
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ａｒｔｉｃｌｅｒｅｎｄｅｒ．ｆｃｇｉ？ｔｏｏｌ＝ｐｕｂｍｅｄ＆ｐｕｂｍｅｄｉｄ＝１２６７７６８９）
動物がペットフードを食べると、ペットの体内において消化を促すさまざまな種類の酵素群が分泌される。これによって抵抗性の弱いプロバイオティクスはペットの消化器系において効果を及ぼす前に死滅してしまう。更にペットフードが消化管を通って行く際においては、プロバイオティクスは酸性で塩分の強い環境に耐えなければならない。しかし、ほとんどのプロバイオティクスはこのような過酷な環境の中で生存することはできず、有効性を失ってしまう。実際にプロバイオティクスの生存率はとても低いため、確実な効果を得るためには多量のプロバイオティクスを摂取することが必須となる。上記研究文献では、プロバイオティクスが効果的に作用するためには、人で１０，０００，０００，０００ＣＦＵ以上、動物で１，０００，０００，０００ＣＦＵ以上を毎日摂取する必要があると説明している。このことをカナダの科学者たちが調査した中で最もプロバイオティクス濃度が高かった市販製品に置き換えて考えるならば、毎日１０ｋｇ以上のペットフードを与えなければプロバイオティクスの効果は見られないことになる。このように考えると、先に例に挙げた飼い主がなぜあのような結果を得ることが出来たかヒントになるかと思う。故に、ペットオーナーがペットに与えるプロバイオティクスの適量を認識するならば、プロバイオティクスがペットの健康にもたらす素晴らしい効果を理解して頂けるのではないかと思う。
【００１０】  しかし、プロバイオティクスは生物活性を有するため、十分な量が存在し、管理し、輸送する場合、生育条件，生育過程，保管等の要素で生物活性を制限してしまうと種々の問題が発生する可能性がある。特に製造時に細胞が渇き凍りついてしまったり、フィード工程時に（高温、高圧力によって）、輸送・保管時に（温度差によって）、食した後に消化管によって（低ｐＨ値、胆汁酸塩によって）など、プロバイオティクスが死滅してしまう場面は多い。プロバイオティクスが良い効果をもたらすために決定的な要素はまず人や動物が高濃度の「生きた」微生物を摂取することにある。動物用食品の添加物として、また人用の機能食品としてプロバイオティクスは市販されているが、そのほとんどは製造工程、輸送、保管、摂取時などに死滅してしまっている（Ｃｉｎｔｏ−Ｃｒｕｃｅ  ａｎｄ  Ｇｏｕｌｄ，２００１）。最近脂質を使ってプロバイオティクスを包含した結果、プロバイオティクスの生存性が高まることが実証された（Ｐａｃｉｆｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。しかし、特にはマイクロキャリアーとして高分子混合体を使ってであるが、プロバイオティクスの包含に関しての情報や報告は比較的少ない。
【００１１】  製薬産業、化学産業、食品産業において、価値の高い成分を守り、確実に目的物質を輸送、常に一定量の摂取をコントロールする等の目的でマイクロカプセルを用いている。例えば、アルギン酸ナトリウム（デンプン、ペクチン、乳清タンパクとも組み合わせて）、アラビアゴム（アカシアゴムとして知られている）、カラギナン（ローストビーンガムとも組み合わせて）などの微小担体としての一成分の使用に限定され、乳化やその他特殊加工の技術を要する。しかし、それぞれのシステムには限界があるだけではなく、一般的に安定性が低い。例えば、アルギン酸塩はその単純性、低コスト、優れたバイオ互換性などの理由で最も一般的に使用される混合体であるが、ゲルの構造強度が低いために脱灰や酸性化の影響を受けやすい。高分子混合体を使用したマイクロカプセルは動物が食べる時やペットフード製造などの過酷な処理条件においてもプロバイオティクスを生きたまま保つことができる。よって保存期間が延長されると同時に、室温で保管できるようになれば輸送費なども削減にもつながる。
【発明が解決するための手段】
【００１２】  微生物のエキソ多糖類は高分子混合体として分類され、食品、薬品、工業製品などで広く使用されている（Ｍａｒｉｎ，１９９８）。他の担体とは異なり、微生物の高分子混合体は三次元構造を形成することができ、個々の分子間の交差部分を結合し安定させている。（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）．例えばキャベツの植物病原であるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓは細胞外に粘着する物質としてキサンタンガム生成し、細胞が宿主に粘着するのを助けたり、様々な環境因子から自己を保護する。つまり高分子混合体を使って微生物を包み込むことで苛酷な環境下での生存能力を高めることができる。
【００１３】  プロバイオティクスは消化管の病原菌が示す抗原への免疫反応を変化させることができるということが研究で明らかになっている。（Ｉｓｏｌａｕｒｉ  ２００３）。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ菌に感染させる以前にマウスにＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとＬ．ｃａｓｅｉを同時にまたは片方だけを与えた実験では、プロバイオティクスを与えたグループは〜１００％程度Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに感染されても生存できたが、そうでないものは＜２０％くらいの生存率であった。抗サルモネラ菌抗体の値はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ／Ｌ．ｃａｓｅｉを食べさせたマウスのほうが、血清と消化管粘膜においてより高かった。（Ｐｅｒｄｉｇｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）同じようにＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅを与えることでコレラ毒素に感染したマウスへのＩｇＡ免疫反応を引き起こし、（Ｙａｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、またＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧはロタウイルス由来の急性下痢の子供達の細胞でロタウイルスに選択的なＩｇＡ抗体を増やすことが判明している。（Ｋａｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）．細胞性、液性免疫反応は、ロタウイルス感染した子豚にＢ．ｌａｃｔｉｓ  ＨＮ０１９を与える実験にて実証されている（Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）
【００１４】  Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍをノトバイオティックマウスに与えたところ強い抗体反応が確認された。これはプロバイオティクスが抗原に特有の粘膜免疫反応を刺激し、粘膜以外の場所を保護することを示しています。インフルエンザウイルスで感染させる前にマウスにＢ．ｂｒｅｖｅを与えると抗インフルエンザ抗体ＩｇＧが増えたことが確認された。（Ｙａｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）．Ｌ．ｃａｓｅｉ菌を与えたマウスでは、緑膿菌に対する血清ＩｇＡ値が高まった。（Ａｌｖａｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）．Ｅ．ｃｏｌｉとロタウイルスに対するＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ抗体は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ  ＨＮ０１９を与えた子豚の糞便から発見された。（Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ，，２００１）．近年では、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａに感染したブロイラーにおいてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを与えることによる局部の細胞媒介免疫として、ＩＬ−２分泌の上昇、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシスト生成物が低くなったという結果がＤａｌｌｏｕｌ  ｅｔ  ａｌ．により，２００３年に証明された。しかし免疫反応に関してはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓとＢｉｏｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ以外の乳酸菌に関してはあまり報告がない。
【００１５】  プロバイオティクスを与えた鶏から糞便の選択
【００１６】  乳酸菌の種類の違いで、宿主に対する免疫系の刺激が異なる。プロバイオティクスが消化管面で付着し、コロニー形成することが、上記で紹介した微生物が効果を発揮するための第一条件となる。微生物が宿主へ効果的に付着するためには、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉを消化管のような低ｐＨ、低胆汁環境で成長させる必要がある。菌を選択する際には、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉを与え、アイメリア属の菌を接種していない鶏の糞から回収し、生存できた菌のみを分離することが重要である。糞は７日目、１４日目、１８日目、２１日目にＰ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉを与えた３羽の鶏から回収した。以下で同じような手法がオーシストの形成物から溶液を分けて実施されて、溶液は再懸濁され、水の代わりにリン酸緩衝生理食塩水中で浸した。慣習的に、コロニー形成数をカウントする為の微生物培養物は、微生物のシングルコロニーと区別され、鶏中のＰ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉのコロニーと関係があると示唆される。コロニー形成評価の為に、目的のコロニーがホモジナイズされた希釈系を、特定の多様な条件下（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉはＬＢ条件下、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．はＲＣＡ条件下、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐはＲｏｇｏｓａ条件下、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉはＭＲＳ条件下）で生育条件により詳細設定をして培養した。コロニー形成群を完全に回収した後、ＭＲＳから数百のシングルコロニーを単離させ、さらにＰ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ．を選択する為に、標準的な人や動物の消化管モデルとみなした、ｐＨ２、０．９％の胆汁を含む新しいＭＲＳに移した。そして、同様に、ｐＨ２、０．９％の胆汁を含む新しいＭＲＳに移し変えていくことを２回以上繰り返して、生存できたシングルコロニーがパルスフィールドゲル電気泳動法によって評価され、微生物菌株の確認の為にＡＰＩ生化学分析を実施した。なお、グリセロールストックし、マイナス７０℃で保存する前に、確認試験を実施した。
【００１７】  生体外細胞系のコロニー形成における菌株の選択
【００１８】  人の細胞系のＣａｃｏ−２やＨＴ２９に対するバクテリアの接着が動物内の乳酸菌と関係があることが確認された。（Ｂｒａｓｓａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｔｕｏｍｏｌａ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｉｎｅｎ  １９９８）．さらに、Ｃａｃｏ−２、ＨＴ２９細胞系を有するバクテリアとの共同培養により得られたｐＨ２、０．９％の胆液で生育可能な菌株の選択。Ｃａｃｏ−２、ＨＴ２９細胞系に対するバクテリア接着分子の検討は、顕微鏡検査によって確認され、少なくとも２回以上繰り返されている。さらに鶏内で免疫応答を活性化されたバクテリアをスクリーニングする為に、ｐＨ２、０．９％の胆液で生育可能であり、Ｃａｃｏ−２とＨＴ２９の細胞系に対して接着するバクテリアが、１ｇあたり１０億個という高濃度のプロバイオティクスを鶏に与えることで準備された。
【００１９】  Ｅ．ｍａｘｉｍａを接種した鶏への経口的に与えた菌株の選択
【００２０】  コロニー形成された宿主の免疫応答を活性化することが出来るＰ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ菌株の選択をする為に、細胞系に効果的に接着するバクテリアがバクテリアの餌中とＥ．ｍａｘｉｍａを接種した鶏中で再選択された。これらの生体内、生体外の菌株選択の方法により、動物内で免疫応答を活性化し、免疫促進作用のあるＰ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ菌株が得られるべきである。鶏が、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉの選択菌株を投与され、Ｅ．ｍａｘｉｍａのオーシストを接種し、大量のＥ．ｍａｘｉｍａの胞子形成オーシストに感染させる。サンプルの回収、免疫応答の検討をする為の分析、病気感染はどれも同じになった。回収サイクルは、免疫促進作用を有する菌株選択を確実にする為、再度繰り返された。
【００２１】  高分子混合体を使用し、乳酸菌をカプセルに包み込む
【００２２】  生きている犬や猫などのペットに使用する乳酸菌・酵母菌をキサンタンとキトサンの高分子混合体で包み込んで守る。キサンタンガムは水に溶けやすく、低濃度でも粘調性が強い多糖類ゴムである。また水分の蒸発に対し強膜を作り、さらには熱分解にも抵抗力ある。キチン質は、主にＮ−アセチルグルコサミン残基の側鎖のない連鎖から成っている多糖類である。キトサンは脱アセチル化されたキチン質であり、水処理、写真の感光乳剤、合成繊維や織物の染色効果、そして傷面治療等に使用される混合体である。
【００２３】  プロバイオティクスは重量比が０．５〜２．５％のキサンタンと重量比が０．２〜０．８％のキトサンを含む水溶液で包み込む。ｐＨ値は２．０〜７．０である。重量比が１．２５％のキサンタンと重量比が０．４％でｐＨが４．１５のキトサンの水溶液が一番好ましい。生きた微生物細胞は１ｍｌ毎に最大１０１０ＣＦＵの割合でカプセルに包み込む。
【００２４】  キサンタンとキトサンの混合体でプロバイオティクスを包み込むカプセルは微生物の生存性を確保する、犬や猫に与える量を一定に保つ、プロバイオティクスを食べさせる手助けになるなどの優れた点がある。キサンタンとキトサン混合体でカプセル化されたプロバイオティクスを犬や猫は拒まずに食べる。
【００２５】  発明者はプロバイオティクスを包み込むキサンタンとキトサンの水溶液での効能はキサンタン・キトサン混合体の形成によるものであると提唱する。水溶液に２つの異なった電荷を持つ高分子電解質を混ぜることにより、異なった電荷を持つ混合体はお互いに引き合うため、高分子電解質の複合体を形成するのである。至適ｐＨ値でキサンタンはマイナス電荷、キトサンはプラス電荷と結びつく。故に異なる電荷を持つ混合体は結びつき、安定した複合体であり、硬度のあるゲルとなるのである。高いｐＨ値では、キサンタンがイオン分解され、２つの混合体の結合は不安定になり、硬度のないカプセルとなってしまう。
【００２６】  図１はｐＨが２〜８の場合でのカプセルの強度をグラフ化したものである。カプセルは上述の適切な方法で作られた。カプセルの強度や構造度の強度はＴＡ．ＸＴ２ｉの５ｋｇの負荷と１ｍｍの距離を用いて、様々なｐＨ値において測定された。図１は、ｐＨを変化させた時にｐＨが３〜４の時、ｐＨが６〜８の時に強度が高くなる。図１のデータは上記のキサンタンとキトサン複合体の形成の理論ディスカッションと一致した。
【００２７】  図２はカプセルに包まれた、また包まれていない微生物が低い温度によってどのように影響されるかを示したものである。カプセルに包まれている微生物また包まれていないものも両方を０℃の温度に１時間放置した。カプセルに包んでいない方の生きた微生物の数は１０９．３ｃｆｕ／ｍｌから１０８．３ｃｆｕ／ｍｌに減少した。一方でカプセルに包んでいる微生物では１０９．３ｃｆｕ／ｍｌから１０９ｃｆｕ／ｍｌの減少にとどまった。図２はカプセルが低い温度から守る働きをするということを示している。
【００２８】  図３は微生物をカプセルに包んだ時と包まない時で、高温によってどのように影響されるかを示したものである。カプセルに包んだもの、包まないものの両方ともに６０℃の温度に１５０秒間放置した。カプセルに包んでいない方の生きた微生物の数は１０９ｃｆｕ／ｍｌから１０７ｃｆｕ／ｍｌに減少した。一方でカプセルに包んでいる微生物では１０９．３ｃｆｕ／ｍｌから１０８．９ｃｆｕ／ｍｌの減少にとどまった。図３はカプセルが高い温度から守る働きをするということを示している。
【００２９】  図４は微生物をカプセルに包んだ時と包まない時で低いｐＨ値によってどのように影響されるかを示したものである。カプセルに包んだもの、包まないものの両方ともにｐＨ２の範囲で０〜６０分間放置した。カプセルに包んでいない方の生きた微生物の数は３０分後には１０９ｃｆｕ／ｍｌから１０５．７ｃｆｕ／ｍｌに減少し、６０分後には１０５．５ｃｆｕ／ｍｌに減少した。一方でカプセルに包んでいる微生物では３０分、６０分後どちらも１０９．３ｃｆｕ／ｍｌから１０７．８ｃｆｕ／ｍｌの減少にとどまった。図４はカプセルが低いｐＨ値から守る働きをするということを示している。
【００３０】  典型的な面と実施例が以上の様に検討されてきたが、技術的手法の改訂、追加等がある。以下に示す、添付の特許請求範囲において、改訂、修正、追加がそれぞれの条項の本質の範疇において含まれることが意図される。
【発明の効果】
【００３１】  ビーグル、ダルメシアンの血統が混じった８歳になる黒の老犬レトリーバーに下記の観察のように与えた。症例：毎日嘔吐が見られ、体臭がひどく、過剰ガスや悪臭が観察された。
【００３２】  与え方：毎日マイトマックスカプセルをチーズ一切れにはさんで与えた。マイトマックスには４億個のＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉとＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉが含まれており、２００４年６月２１日〜２００４年７月４日の間与えた。マイトマックスはイマジリンテクノロジー社（メリーランド州）のゼラチンカプセル入りのプロバイオティクスの商標である。
【表１】
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【００３３】  表１はプロバイオティクスを犬に毎日与えることによって、嘔吐、体臭、過剰ガスを減少させるということを示している。
【００３４】  ８匹の１歳から１３歳で、それぞれ違った慢性の消化管疾患を持つチェサピークベイレトリーバーにマイトマックスを１日１カプセルを２８日間与えた。表２はその結果を示したものである。表２の犬の年齢は年であり、体重はポンドであらわされている。
【表２】
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【００３５】  表２は異なった性別と種別の犬にプロバイオティクス・カプセルを与えた結果、消化機能が向上したことを示す。特には食欲増進、下痢の減少、軟便の向上、嚥下運動問題の減少、嘔吐の減少などである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はｐＨ値範囲とカプセルの硬さの関係を示したものである。
【図２】  図２は低い温度で、カプセルに入れた場合と入れない場合でのプロバイオティクスの生存能力の関係について示したものである。
【図３】  図３は高い温度で、カプセルに入れた場合と入れない場合でのプロバイオティクスの生存能力の関係について示したものである。
【図４】  図４はカプセルに入れた場合と入れない場合でｐＨ２範囲にさらした時間との関係を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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