(57)【要約】      （修正有）【課題】鎮痒効果を有する化合物を効率的に評価、選別する方法、特にオピオイドレセプターが関与する中枢系の痒みに対して鎮痒作用を示す化合物をスクリーニングする方法、ならびに痒みの客観的な判定方法を提供する。【解決手段】μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターを発現することのできる培養細胞と化合物とをインキュベーションする工程、及び当該細胞におけるμオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を確認する工程を含む、化合物の鎮痒作用を評価する方法。モデル動物の利用を必要とせず、痒みの発症に関連するとされている分子の発現状態を直接観察することで、客観的な化合物の評価、あるいは痒みの程度の判定を行うことができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターを発現することのできる培養細胞と化合物とをインキュベーションする工程、及び当該細胞におけるμオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を確認する工程を含む、化合物の鎮痒作用を評価する方法。
【請求項２】
μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターを発現することのできる培養細胞がヒトの外胚葉系細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を、μオピオイドレセプターとκオピオイドレセプターをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗体を用いた抗体染色法を用いて確認する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を、μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターのそれぞれをコードするｍＲＮＡの発現量を測定して確認する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
患者から採取した皮膚組織におけるμオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を確認する工程を含む、痒みの度合いの判定方法。
【請求項６】
μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率をμオピオイドリセプターとκオピオイドリセプターをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗体を用いた抗体染色法を用いて確認する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
μオピオイドリセプター及びκオピオイドリセプターの発現比率を、μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターのそれぞれをコードするｍＲＮＡの発現量を測定して確認する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
μオピオイドレセプターとκオピオイドレセプターをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗体及び／又はμオピオイドレセプターとκオピオイドレセプターのそれぞれをコードする核酸と特異的にハイブリダイズする２種以上のＤＮＡを含むキット。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法において使用するための、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれかに記載の方法において使用するための、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、痒みを鎮める、あるいは抑制する作用（鎮痒作用）を有する化合物を、モデル動物の観察によらずに評価、選別する方法、並びに痒みの度合いの評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
痒み（そう痒）は、皮膚特有の感覚で、炎症を伴う様々な皮膚疾患において訴えられる症状の一つである。痒みは、悪性腫瘍、糖尿病、肝疾患、腎不全、腎透析、痛風その他の内科系疾患や寄生虫感染が原因となって生じる場合の他に、薬剤性や心因性で生じる場合もある。痒みは患者にとって不快な症状であり、重症の場合は患者が皮膚を強く引っ掻いて皮膚を掻破し、その結果感染症を招いたり、あるいは不眠となって患者のQOLの低下を招くこともしばしば見受けられる。
【０００３】
「痒み」が治療対象となる具体的な皮膚疾患としては、アトピー性皮膚炎、神経性皮膚炎、接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、自己感作性皮膚炎、毛虫皮膚炎、皮脂欠乏症、老人性皮膚そう痒、虫刺症、光線過敏症、蕁麻疹、痒疹、疱疹、膿痂疹、湿疹、白癬、苔癬、乾癬、疥癬、尋常性座瘡などが挙げられる。かかる疾患に伴う痒みの治療には、その原因となる基礎疾患の治療が必要であるが、対症療法的に痒みそのものを鎮める鎮痒あるいは止痒も、重要な対処法である。なお、本発明においては鎮痒と止痒は同義語として理解される。
【０００４】
鎮痒作用を有する薬物としては、従来抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、非ステロイド系抗消炎薬、局部麻酔薬などが主に用いられる。しかしこれらの薬物の中には、鎮痒作用の発現までに時間のかかることや、中枢神経抑制作用（眠気、倦怠感）、消化器系に対する障害などの副作用が問題となっている。中には長期使用における副腎機能低下やリバウンドなどの副作用が問題となる薬物もある。そのため、新たな鎮痒作用を有する薬物の開発が望まれている。
【０００５】
しかし、痒みは主観的な感覚であるため、その程度を数量的に客観的に評価することが難しい症状の一つであり、このことが患者における症状の客観的な評価、並びに薬物の鎮痒効果の評価を難しいものとしている。
【０００６】
痒みを訴えているヒトを直接用いること以外の薬物の鎮痒効果を評価する方法の代表例は、痒みを有するモデル動物を用意し、モデル動物の引っ掻き回数を指標にする方法である（例えば、特許文献１、特許文献２など）。これらの方法では、非ヒト動物の「行動」という評価基準を採用するが故の客観性、定量性等における問題は、依然として完全には解決されていない。
【０００７】
近年になって「痒み」発症の作用機序に関する研究が進展した結果、痒みは、末梢性の痒みと中枢性の痒みとに大別し得ることが提唱されている。末梢性の痒みは、皮膚表皮と真皮の境界部に存在する神経終末に作用して生じた痒みのインパルスが、求心性Ｃ繊維により伝達され脳に到達することで痒みとして認識されると考えられている。かかる痒みのメディエーターとしては、ヒスタミンの他にプロスタグランジン、セロトニン、インターロイキン６、トリプターゼ等がある。
【０００８】
一方の中枢性の痒みは近年、内因性のモルヒネ様オピオイドペプチドがメディエーターとなって中枢神経組織に作用することで認識されると考えられている。例えば、β−エンドルフィンやエンケファリンのような内因性オピオイドペプチドが痒みを惹起すること（非特許文献１）、モルヒネやオピオイド化合物を硬膜外や髄腔内に投与した場合の副作用として痒みが惹起されること（非特許文献２）等が報告されている。一方、モルヒネ投与によって惹起された痒みがモルヒネ拮抗薬であるナロキソンによって抑制されること（非特許文献３）、内因性オピオイドペプチドのレベル上昇によって惹起された強い痒みがオピオイド拮抗薬であるナルメフェンによって抑制されたこと（非特許文献４）等が報告されている。
【０００９】
これらの事実から、モルヒネ等のオピオイド系作動薬は痒みを惹起する作用があり、逆にその拮抗薬には鎮痒作用がある、すなわちモルヒネ等が結合するオピオイドレセプターであるμオピオイドレセプター（Mu Opioid Receptor、MOR）とそのアゴニスト、アンタゴニストが、痒みの発症と抑制に関与していると推察されている。また、オピオイドレセプターの一種であるκオピオイドレセプター（Kappa Opioid Receptor、KOR）に対する作動薬が鎮痒剤となることも報告されている（特許文献３）。
【００１０】
しかしながら、これらの知見は化合物とオピオイドレセプターとの結合と痒みの発症との関連の一端を報告しているに過ぎない。
【特許文献１】特開２００５−１４３５０２
【特許文献２】特開２００１−３２１０１６
【特許文献３】特開２００３−１２８５５４
【非特許文献１】B. FjellerActa, Dermato-Venereol., 61(suppl. 97), 1-34, 1981
【非特許文献２】J.H. Jaffe and W.R.Martin, Goodman and Gilman's Pharmacological Basis of Theraputics, Macmillan, New York, 1985
【非特許文献３】J. Bernstein et al., J. Invest. Dermatol., 78, 82-83, 1982
【非特許文献４】J.R. Thornton and M.S. Losowsky, Br. Med. J., 297, 1501-1504, 1988
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、鎮痒効果を有する化合物を効率的に評価、選別する方法、特にオピオイドレセプターが関与する中枢系の痒みに対して鎮痒作用を示す化合物をスクリーニングする方法、ならびに痒みの客観的な判定方法を提供することを課題とする発明である。
【００１２】
本発明者らは、オピオイドレセプターと痒みとの関係に着目し、痒みを訴えている患者の皮膚組織における表皮角化細胞のオピオイドレセプターについて鋭意研究を行った結果、オピオイドレセプターの発現バランスを指標として化合物の鎮痒作用を評価できることを見出し、以下の各発明を完成した。
【００１３】
（１）μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターを発現することのできる培養細胞と化合物とをインキュベーションする工程、及び当該細胞におけるμオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を確認する工程を含む、化合物の鎮痒作用を評価する方法。
【００１４】
（２）μオピオイドレセプター及びκオピオイドリセプターを発現することのできる培養細胞がヒトの外胚葉系細胞である、（１）に記載の方法。
【００１５】
（３）μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を、μオピオイドレセプターとκオピオイドレセプターをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗体を用いた抗体染色法を用いて確認する、（１）に記載の方法。
【００１６】
（４）μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を、μオピオイドレセプター及びκオピオイドリセプターのそれぞれをコードするｍＲＮＡの発現量を測定して確認する、（１）に記載の方法。
【００１７】
（５）患者から採取した皮膚組織におけるμオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を確認する工程を含む、痒みの度合いの判定方法。
【００１８】
（６）μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率をμオピオイドレセプターとκオピオイドリセプターをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗体を用いた抗体染色法を用いて確認する、（５）に記載の方法。
【００１９】
（７）μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を、μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターのそれぞれをコードするｍＲＮＡの発現量を測定して確認する、（５）に記載の方法。
【００２０】
（８）μオピオイドレセプターとκオピオイドレセプターをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗体及び／又はμオピオイドレセプターとκオピオイドレセプターのそれぞれをコードする核酸と特異的にハイブリダイズする２種以上のＤＮＡを含むキット。
【００２１】
（９）（１）〜（４）のいずれかに記載の方法において使用するための、（８）に記載のキット。
【００２２】
（１０）（５）〜（７）のいずれかに記載の方法において使用するための、（８）に記載のキット。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の方法は、モデル動物の利用を必要とせず、痒みの発症に関連するとされている分子の発現状態を直接観察することで、客観的な化合物の評価、あるいは痒みの程度の判定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
オピオイドレセプターには、μオピオイドレセプター（MOR）、δオピオイドレセプター（delta Opioid Receptor、DOR）およびκオピオイドレセプター（KOR)の３種類の存在が知られている。また、それぞれのレセプターには、それぞれを選択的に刺激する内因性オピオイドペプチドが存在する。MOR及びDORに対する内因性オピオイドペプチドは、β−エンドルフィン（βendorphin、βend）やエンケファリンであり、KORに対する内因性オピオイドペプチドはダイノルフィン（Dynorphin A、DynA）である。
【００２５】
前記の通り、MORの作動薬が痒みを惹起し、MORのアンタゴニストが鎮痒作用を示すこと、並びにKORの作動薬が鎮痒作用を示すことが知られているが、それぞれのオピオイドレセプターと内因性オピオイドペプチドが痒みの発症部位においてどの様に発現しあるいは作用しているかの報告はなかった。
【００２６】
本発明者らは、アトピー性皮膚炎に伴う痒みを訴えている患者において、PUVA治療を行う前と後での皮膚組織におけるオピオイドレセプターとそれぞれの内因性オピオイドペプチドの発現を調べ、正常な皮膚との比較を行った。ここに言うPUVA療法とは、紫外線治療の一種で、８−メトキシソラレン（8-methoxypsoralen）を外用または内服投与後に長波長紫外線（UVA）を照射する治療方法であり、アトピーや尋常性乾癬、難治性の湿疹などの治療を目的として採用される治療方法である。その作用機序としては、DNA 合成の抑制、ランゲルハンス細胞の抗原提示能の障害、角化細胞由来免疫抑制サイトカインの産生増強、T リンパ球の遊走抑制、NK 細胞の数の減少と活性低下などが報告されている。しかしながら、オピオイドレセプターの発現を作用機序とする考えは従来報告されていない。
【００２７】
その結果、１）正常な皮膚組織においては、MORとKORがほぼ同程度発現していること、２）PUVA治療前のアトピー性皮膚炎の患部皮膚組織ではMORは正常皮膚組織と同程度に発現しているのに対してKORの発現が著しく減少していること、３）患部に対してPUVA治療を行うことによってMORの発現量が有意に低下すること、４）正常な皮膚組織においてはMORの内因性作動薬であるβendとKORの内因性作動薬であるDynAがほぼ同程度発現していること、５）PUVA治療前のアトピー性皮膚炎の患部皮膚組織ではβ endは正常皮膚組織と同程度に発現しているのに対してDynAの発現が減少していること、６）患部に対してPUVA治療を行うことによってDynAの発現量が正常皮膚組織と同レベルにまで回復すること、等が確認された。
【００２８】
従って、MORとKORを発現している培養細胞と化合物とをインキュベートし、MORとKORの発現比率を確認することで、PUVA療法と同様の効果を与える化合物、すなわち鎮痒作用を有する化合物をスクリーニングすることが可能であると考えられる。
【００２９】
このスクリーニング方法において利用可能な培養細胞としては、MORとKORを発現することのできる細胞であれば特に制限はないが、例えばHaCaT、NHEK、NHEK-Adなどのヒトの外胚葉系細胞や神経系細胞の利用が好ましい。特に、皮膚組織を構成する細胞、さらに表皮の基底層にあるケラチノサイト（keratinocyte、角化細胞ともいう）の利用が好ましい。ケラチノサイトのインビトロにおける細胞培養条件は公知であり、本発明においても当業者に公知の方法でケラチノサイトをインビトロで培養すればよい。ケラチノサイト以外のヒトの細胞を利用する場合も、それぞれの細胞において好適な培養条件下で培養すればよく、その様な培養条件の設定は、当業者の通常の能力の範囲内の作業である。
【００３０】
外胚葉系細胞はそれ自身MORとKORを発現することのできる細胞であるが、外胚葉系細胞以外の細胞でも、MOR及びKORをそれぞれコードする遺伝子が組み込まれた適当なベクターで該細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞と化合物とをインキュベートして、形質転換細胞におけるMORとKORの発現比率を確認してスクリーニングを行ってもよい。  かかる方法において、MOR及びKORをそれぞれコードする遺伝子が発現可能である限り、宿主細胞の種類に制限はなく、ヒトやマウス等の動物細胞、カイコ等の昆虫細胞、酵母や大腸菌等の微生物細胞も利用可能である。また、MOR及びKORをそれぞれコードする遺伝子は公知であり、宿主細胞の形質転換に利用可能な発現ベクターも、宿主細胞の種類毎に多数公知である。これらを適宜組み合わせ、MORとKORの遺伝情報を基に組み換えベクターを調製し、宿主細胞を形質転換するまでの各種の操作や、当該操作において使用可能なベクターや宿主細胞等の選択は、当業者の通常の能力の範囲内の作業である。
【００３１】
培養細胞と化合物とのインキュベーションは、適当な溶液中で、好ましくは使用する培養細胞に好適な培地中で培養細胞と化合物とを共存させ、細胞が生存し得る条件下でインキュベーションすればよい。適当な溶液あるいは培地の選択は、当業者の通常の能力の範囲内の作業である。
【００３２】
培養細胞におけるMOR及びKORの発現比率の確認は、蛋白質レベル、それらをコードする核酸レベル、いずれのレベルにおける確認でもよい。蛋白質レベルの確認は、それぞれのリガンドに対するバインディングアッセイの測定結果を利用してもよいが、MORとKORそれぞれに特異的な抗体を用いた免疫抗体染色法によって各蛋白質を染色し、得られる光学的データから発現比率を確認してもよい。  MORとKORそれぞれに対する特異抗体は、それぞれの蛋白質あるいは抗原性フラグメントを免疫源とし、当業者に周知の方法によって調製した特異抗体を使用することができるが、特異的なモノクローナル抗体の利用、特にそれぞれ異なる標識化合物が付加された、免疫染色法に利用可能な形態の抗体であることが好ましい。
【００３３】
適当な標識化合物の種類や当該標識化合物が付加された抗体を用いて、細胞や組織に存在する蛋白質を検出し、その発現量を確認する方法は当業者に広く利用されている技術である。本発明においても、かかる公知ないし周知の方法を利用して、培養細胞内におけるMORとKORの発現比率を確認することができる。また、MORとKORを検出することのできる抗体はすでに市販もされており、例えばラビットで作製されたポリクローナル抗MOR抗体MOR-1 (H-80)（Santa cruz社）、ヤギで作製されたポリクローナル抗KOR抗体KOR-1 (N-19)（Santa cruz社）などがあり、また検出用蛍光標識２次抗体としては、Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG（インビトロジェン社）、あるいはCy3 donkey anti-goat IgG（Jackson ImmunoResearch社）等を利用することができる。
【００３４】
MORとKORの発現比率の確認は、それらをコードする核酸、典型的にはｍRNAの発現量を測定することでも行うことができる。ｍRNAの発現量は、MORとKORのそれぞれをコードするｍRNA中の特異的な塩基配列とハイブリダイズする塩基配列からなるDNAを用いたハイブリダイゼーション、RT-PCR、リアルタイムPCRその他の方法によって測定することができる。例えばMORについては、下記のプライマーセットを用いてPCRを行い、102bpの増幅断片を確認することでMORをコードするmRNAの発現量を定量することができる。
【００３５】
フォワードプライマー１：TCCACGGCCAATACAGTGGATA（配列番号１）
リバースプライマー２  ：TGAAGGTCGGAATGGCATGA（配列番号２）
またKORについては、下記のプライマーセットを用いてPCRを行い、113bpの増幅断片を確認することでKORをコードするmRNAの発現量を定量することができる。
【００３６】
以下の表に記載の塩基配列からなるプライマーを挙げることができる。
【００３７】
フォワードプライマー３：GTCATCTGTTGGCATCTCTGCAATA（配列番号３）
リバースプライマー４  ：GGTCCCACCAGGAGTAGTCATCA（配列番号４）
また、MOR、KORをコードするDNAの塩基配列を基に、上記以外の塩基配列からなる任意のプライマーセットを設計、調製し、PCRを行ってもよい。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法では、上記の方法によってMORとKORとを発現することができる培養細胞におけるMORとKORの発現比率の確認を、化合物と培養細胞とをインキュベーションする前後において行った結果、インキュベーション前の培養細胞と比べてインキュベーション後の培養細胞におけるKORの発現比率を高める化合物を、鎮痒作用を有する化合物として判定する。KORの発現比率を高めることのできる化合物は、KORの発現を促進させる機能を有する、MORの発現を抑制する機能を有する、あるいはその両方の機能を有する化合物として理解することができる。その様な化合物は、痒みを訴えている患者の患部に投与することで、鎮痒作用を示すことが期待される。
【００３９】
また、本発明の痒みの判定方法は、患者から採取された患部の皮膚組織を構成する細胞、特に外胚葉系細胞において上記に様にしてMORとKORの発現比率を確認することで、痒みの度合いを判定する方法である。この方法によって、例えばヒトの正常な皮膚組織におけるMORとKORの発現比率と比較してMORの発現比率がどれだけ高いかによって、客観的な痒みの程度を判定することができる。
【００４０】
また本発明は、上記の方法に利用可能なキットを提供する。このキットは、MORとKORとをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗体、及び／又はMORとKORのそれぞれをコードする核酸に対して特異的にハイブリダイズする２種以上のDNAを含む。
【００４１】
抗体は、先に説明したとおりの、MORとKORをそれぞれ特異的に認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体であって、それぞれ異なる標識化合物が付加された、免疫抗体染色法に利用可能な形態にある抗体であることが好ましい。その様な抗体の調製は、当業者に広く利用されている技術を用いて行うことができる。
【００４２】
MORとKORのそれぞれをコードする核酸に対して特異的にハイブリダイズする２種以上のDNAとは、MORとKORのそれぞれをコードするmRNA中の特異的な塩基配列とハイブリダイズする塩基配列からなるDNAである。この本発明のキットは、MORとKORのそれぞれをコードする核酸に対して特異的にハイブリダイズする異なる２種のDNA、すなわちMORをコードする核酸に対して特異的にハイブリダイズするDNAと、KORをコードする核酸に対して特異的にハイブリダイズするDNAを含んでいてもよい。また本発明のキットは、RT-PCRやリアルタイムPCR等の核酸の増幅を行うためのDNAのセット、すなわちMORをコードする核酸を特異的に増幅するための一組のプライマーDNAと、KORをコードする核酸を特異的に増幅するための一組のプライマーDNAとを含んでいてもよい。プライマーDNAの例としては、前述のフォワードプライマー１とリバースプライマー２の組み合わせ、フォワードプライマー３とリバースプライマー４の組み合わせなどを挙げることができるが、これらには限定されない。
【００４３】
また本発明のキットは、上記の抗体及び／又はDNAの他に、本発明の方法の実施に利用可能なあるいは好適な、任意の試薬、器具その他の要素を含んでいてもよい。
【００４４】
以下、非限定的な実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４５】
１）献体の準備
健常人の腹部皮膚を局所麻酔後に3 mmパンチを用いて採取することにより、健常検体を用意した。また、アトピー性皮膚炎患者の上腕、首、腹部などの患部皮膚を局所麻酔後に3 mmパンチを用いて採取することにより、痒みを有する部位より病変検体を用意した。さらに、ＰＵＶＡ療法を行った後の同患者の同患部から同様に皮膚検体を採取することにより、治療検体を用意した。いずれの献体も、4% パラホルムアルデヒド固定液で4時間、4度で固定し、その後、OCTコンパウンドに包埋し、液体窒素により凍結ブロックを作製し、−８０℃で保存した。
【００４６】
２）抗体の準備
次項以降で使用した抗体は次の通りである。
【００４７】
・抗MOR抗体：ラビットで作製されたポリクローナル抗体MOR-1 (H-80)、Cat. no. sc-15310（Santa cruz社）。
【００４８】
・抗KOR抗体：ヤギで作製されたポリクローナル抗体KOR-1 (N-19)、Cat. no. sc-7494（Santa cruz社）。
【００４９】
・MOR、KOR検出用蛍光標識２次抗体：Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG、Cat. no. A21206（インビトロジェン社）、Cy3 donkey anti-goat IgG、Cat. no. 705-165-147（Jackson ImmunoResearch社）。
【００５０】
・抗β-end抗体：ラビットで作成されたポリクローナル抗体Cat. no. AB5028（Chemicon社）。
【００５１】
・抗-DynA(1-17)抗体：ラビットで作成されたポリクローナル抗体Cat. no. T-4268（BACHEM社）。
【００５２】
・抗-DynA(1-8)抗体：ラビットで作成されたポリクローナル抗体Cat. no. T-4272（BACHEM社）。
【００５３】
・β-end、DynA検出用蛍光標識２次抗体：Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG、Cat. no. A21206（インビトロジェン社）。
【００５４】
２）免疫組織染色
１）の各保存検体からCM1850 cryostatを用いて5 μmの厚さで凍結切片を作製し、シランコートが施されたスライドグラスに貼り付けた。このスライドグラスをPBS(pH 7.4)で2回洗浄後、5% normal donkey serumと2% BSAを含むPBS（ブロッキング液）を組織サンプルの上にのせ、1時間、室温でインキュベーションを行った。１時間後、スライドからブロッキング液を除去し、次にブロッキング液で希釈した１次抗体を組織サンプルの上にのせ、一晩（約１６時間）、４度でインキュベーションを行った。翌日、スライドから１次抗体を除去し、PBSで３回洗浄後、ブロッキング液で希釈した検出用蛍光標識２次抗体を組織サンプルの上にのせ、1時間、室温でインキュベーションを行った。インキュベーション後、スライドから２次抗体を除去し、PBSで３回洗浄し、vectashield mounting mediumにより封入を行った。封入した標本を共焦点レーザー顕微鏡DMIRE2 (Leica社)を用いて観察し、写真撮影を行った。
【００５５】
その結果、健常検体では、MOR（図１）とKOR（図２）がほぼ同程度発現していることが確認された。またMORの内因性作動薬であるβ-end（図３）、及びKORの内因性作動薬であるDynA（図４）も、ほぼ同程度発現していた。一方、痒みを有する病変検体では、MOR（図５）は正常皮膚組織と同程度に発現しているのに対して、KOR（図６）の発現が著しく減少していた。またβ-end（図７）は正常皮膚組織と同程度に発現しているのに対して、DynA（図８）の発現は減少していた。また治療検体に対する観察の結果、PUVA治療を行うことによってMORの発現量が有意に低下すること（図９）、DynAの発現量が正常皮膚組織と同レベルにまで回復すること（図１２）が確認され、痒みの低減にはMORの発現抑制及び／又はDynAの発現回復（増加）が関与していることが示された。また、PUVA治療後のアトピー性皮膚炎患者の患部皮膚におけるKORの発現状態（図１０、赤色の発色がKORの発現を表す）、及びβ-endの発現状態（図１１、緑色の発色がβ−endの発現を表す）を観察した。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】健常人の皮膚におけるMORの発現状態を示す、共焦点レーザー顕微鏡による免疫組織染色観察の結果（写真）である。図中、緑色の発色がMORの発現を表している。
【図２】健常人の皮膚におけるKORの発現状態を示す、共焦点レーザー顕微鏡による免疫組織染色観察の結果（写真）である。図中、赤色の発色がKORの発現を表している。
【図３】健常人の皮膚におけるβ-endの発現状態を示す、共焦点レーザー顕微鏡による免疫組織染色観察の結果（写真）である。図中、緑色の発色がβ−endの発現を表している。
【図４】健常人の皮膚におけるDynAの発現状態を示す、共焦点レーザー顕微鏡による免疫組織染色観察の結果（写真）である。ａは抗DynA（1-17)抗体を用いた抗体染色写真を、ｂは抗DynA（1-8)抗体を用いた抗体染色写真をそれぞれ示す。いずれの図も、緑色の発色がDynAの発現を表している。
【図５】アトピー性皮膚炎患者の患部皮膚におけるMORの発現状態を示す、共焦点レーザー顕微鏡による免疫組織染色観察の結果（写真）である。図中、緑色の発色がMORの発現を表している。
【図６】アトピー性皮膚炎患者の患部皮膚におけるKORの発現状態を示す、共焦点レーザー顕微鏡による免疫組織染色観察の結果（写真）である。図中、赤色の発色がKORの発現を表している。
【図７】アトピー性皮膚炎患者の患部皮膚におけるβ-endの発現状態を示す、共焦点レーザー顕微鏡による免疫組織染色観察の結果（写真）である。図中、緑色の発色がβ−endの発現を表している。
【図８】アトピー性皮膚炎患者の患部皮膚におけるDynAの発現状態を示す、共焦点レーザー顕微鏡による免疫組織染色観察の結果（写真）である。ａは抗DynA（1-17)抗体を用いた抗体染色写真を、ｂは抗DynA（1-8)抗体を用いた抗体染色写真をそれぞれ示す。いずれの図も、緑色の発色がDynAの発現を表している。
【図９】PUVA治療後のアトピー性皮膚炎患者の患部皮膚におけるMORの発現状態を示す、共焦点レーザー顕微鏡による免疫組織染色観察の結果（写真）である。図中、緑色の発色がMORの発現を表している。
【図１０】PUVA治療後のアトピー性皮膚炎患者の患部皮膚におけるKORの発現状態を示す、共焦点レーザー顕微鏡による免疫組織染色観察の結果（写真）である。図中、赤色の発色がKORの発現を表している。
【図１１】PUVA治療後のアトピー性皮膚炎患者の患部皮膚におけるβ-endの発現状態を示す、共焦点レーザー顕微鏡による免疫組織染色観察の結果（写真）である。図中、緑色の発色がβ−endの発現を表している。
【図１２】PUVA治療後のアトピー性皮膚炎患者の患部皮膚におけるDynAの発現状態を示す、共焦点レーザー顕微鏡による免疫組織染色観察の結果（写真）である。ａは抗DynA（1-17)抗体を用いた抗体染色写真を、ｂは抗DynA（1-8)抗体を用いた抗体染色写真をそれぞれ示す。いずれの図も、緑色の発色がDynAの発現を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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