(57)【要約】【課題】グルコースセンサなどに、より適したグルコースデヒドロゲナーゼを取得する。【解決手段】種々のペニシリウム属菌がマルトース作用性の低い新規グルコースデヒドロゲナーゼを生産することを見出した。本発明はグルコースセンサなどに、より適したグルコースデヒドロゲナーゼを生産することを可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Penicillium rugulosum、Penicillium expansum、Penicillium jensenii、Penicillium clavigerum、Penicillium capsulatum、Penicillium velutinum、Penicillium janczewskii、Penicillium abeanum、Penicillium isariiforme、Penicillium raciborskii、Penicillium echinulatumvar.echinulatum、Penicillium lanosoviride、Penicillium palitans、Penicillium resticulosum、Penicillium solitum、Penicillium sacculum、Penicillium cyaneofulvum、Penicillium martensiiのうち少なくとも１種の微生物を、栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性、並びに、基質特異性および／または安定性を指標に、培養液から抽出・精製することにより得られうる、基質特異性および／または安定性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項２】
Penicillium rugulosumNBRC4683、Penicillium expansumNBRC5453、Penicillium jenseniiNBRC5747、Penicillium clavigerumNBRC5755、Penicillium capsulatumNBRC6059、Penicillium velutinumNBRC6061、Penicillium janczewskiiNBRC6103、Penicillium abeanumNBRC6239、 Penicillium isariiformeNBRC6393、Penicillium raciborskiiNBRC7676、 Penicillium echinulatumvar.echinulatum NBRC7687、Penicillium lanosovirideNBRC7728、Penicillium palitansNBRC7731、Penicillium resticulosumNBRC7734、Penicillium solitumNBRC7765、Penicillium sacculumNBRC8114、 Penicillium cyaneofulvumNBRC8140、Penicillium martensiiNBRC8142のうち少なくとも１種の微生物を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性、並びに、基質特異性および／または安定性を指標に、培養液から抽出・精製することにより得られうる、基質特異性および／または安定性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
請求項１または２に記載された微生物のうち少なくとも１種の微生物を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性、並びに、基質特異性および／または安定性を指標に、培養液から抽出・精製する工程を含むグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース濃度の測定方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
【請求項６】
請求項１または２に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペニシリウム属菌由来の新規グルコースデヒドロゲナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００３】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）あるいはピロロピノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．５．２（旧 ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼは安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のピロロピノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼは、基質特異性に乏しくマルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため、測定値の正確性を損ねる可能性があるという欠点がある。
【０００４】
糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼとして、文献１〜４に、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼについて報告されている。
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９６７  Ｊｕｌ  １１；１３９（２）：２６５−７６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９６７  Ｊｕｌ  １１；１３９（２）：２７７−９３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７−２７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８−３５
【０００５】
また、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼとして、特許文献１にはアスペルギルス・テレウス由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼが開示されている。本酵素は基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で優位である。熱安定性については５０℃１５分処理で８９％程度の活性残存率であり安定性（以下、耐熱性とも表記）についても優れているとされている。
【特許文献１】ＷＯ ２００４／０５８９５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、より実用面において有利な血糖センサー用酵素を提供することである。より具体的には、ペニシリウム属菌より、基質特異性に優れた新規グルコースデヒドロゲナーゼを取得、利用することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するために、100種のペニシリウム属菌について、スクリーニングを行った。その結果、１８種のアスペルギルス属菌がグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有することを見出し、本出願に至った。本発明によれば、ペニシリウム属菌より、新規のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨとも表記）を取得することが可能になる。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
[項１]
Penicillium rugulosum、Penicillium expansum、Penicillium jensenii、Penicillium clavigerum、Penicillium capsulatum、Penicillium velutinum、Penicillium janczewskii、
Penicillium abeanum、Penicillium isariiforme、Penicillium raciborskii、Penicillium echinulatumvar.echinulatum、Penicillium lanosoviride、Penicillium palitans、Penicillium resticulosum、Penicillium solitum、Penicillium sacculum、Penicillium cyaneofulvum、Penicillium martensiiのうち少なくとも１種の微生物を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性、並びに、基質特異性および／または安定性を指標に、培養液から抽出・精製することにより得られうる、基質特異性および／または安定性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼ。
[項２]
Penicillium rugulosumNBRC4683、Penicillium expansumNBRC5453、Penicillium jenseniiNBRC5747、Penicillium clavigerumNBRC5755、Penicillium capsulatumNBRC6059、Penicillium velutinumNBRC6061、Penicillium janczewskiiNBRC6103、Penicillium abeanumNBRC6239、 Penicillium isariiformeNBRC6393、Penicillium raciborskiiNBRC7676、 Penicillium echinulatumvar.echinulatum NBRC7687、Penicillium lanosovirideNBRC7728、Penicillium palitansNBRC7731、Penicillium resticulosumNBRC7734、Penicillium solitumNBRC7765、Penicillium sacculumNBRC8114、 Penicillium cyaneofulvumNBRC8140、Penicillium martensiiNBRC8142のうち少なくとも１種の微生物を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性、並びに、基質特異性および／または安定性を指標に、培養液から抽出・精製することにより得られうる、基質特異性および／または安定性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼ。
[項３]
項１または２に記載された微生物のうち少なくとも１種の微生物を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性、並びに、基質特異性および／または安定性を指標に、培養液から抽出・精製する工程を含むグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
[項４]
請求項１または２に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース濃度の測定方法。
[項５]
請求項１または２に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
[項６]
請求項１または２に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ペニシリウム属菌より、基質特異性に優れた新規のグルコースデヒドロゲナーゼを取得することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の一実施形態は、Penicillium rugulosum、Penicillium expansum、Penicillium jensenii、Penicillium clavigerum、Penicillum capsulatum、Penicillium velutinum、Penicillium janczewskii、Penicillium abeanum、Penicillium isariiforme、Penicillium raciborskii、Penicillium echinulatumvar.echinulatum、Penicillium lanosoviride、Penicillium palitans、Penicillium resticulosum、Penicillium solitum、Penicillium sacculum、Penicillium cyaneofulvum、Penicillium martensiiのうち少なくとも１種の微生物を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性、並びに、基質特異性および／または安定性を指標に、培養液から抽出・精製することにより得られうる、基質特異性および／または安定性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼである。
さらに好ましくはPenicillium rugulosumNBRC4683、Penicillium expansumNBRC5453、Penicillium jenseniiNBRC5747、Penicillium clavigerumNBRC5755、Penicillium capsulatumNBRC6059、Penicillium velutinumNBRC6061、Penicillium janczewskiiNBRC6103、Penicillium abeanumNBRC6239、 Penicillium isariiformeNBRC6393、Penicillium raciborskiiNBRC7676、 Penicillium echinulatumvar.echinulatum NBRC7687、Penicillium lanosovirideNBRC7728、Penicillium palitansNBRC7731、Penicillium resticulosumNBRC7734、Penicillium solitumNBRC7765、Penicillium sacculumNBRC8114、 Penicillium cyaneofulvumNBRC8140、Penicillium martensiiNBRC8142のうち少なくとも１種の微生物を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性、並びに、基質特異性および／または安定性を指標に、培養液から抽出・精製することにより得られうる、基質特異性および／または安定性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼである。
【００１１】
本願発明の別の一実施形態は、上記に例示された微生物のうち少なくとも１種の微生物を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性、並びに、基質特異性および／または安定性を指標に、培養液からグルコースデヒドロゲナーゼを抽出・精製する工程を含むグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法である。
【００１２】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法は以下の方法に従う。
＜試薬＞
５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１４ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液  または マルトース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．８ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００１３】
＜測定条件＞
反応試薬２．９ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式１に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
【００１４】
（式１）
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝÷（１６．３×０．１×１．０）
【００１５】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００１６】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、マルトース作用性に優れている。 
マルトース作用性とは、マルトースを脱水素する作用を意味し、マルトースを基質としたときの活性測定値（上記グルコース活性測定法において、１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液のかわりに１Ｍ  マルトース溶液を用いる）をグルコースを基質としたときの活性測定値で除したもので定義する。
グルコース測定の観点からは、マルトースに対する作用性は低いほうが好ましい。マルトースに対する作用性は、好ましくはグルコースに対して20％以下、より好ましくは10％以下である。
【００１７】
本発明で用いる微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手することができる。
【００１８】
微生物を培養する栄養培地としては、微生物が生育しかつ本発明に示すＧＤＨを生産しうるものであれば特に限定しないが、より好適には微生物の生育に必要な炭素源、無機窒素源及び／または有機窒素源を含有するものがよく、さらに好ましくは通気攪拌に適した液体培地であるのがよい。液体培地の場合、炭素源としては例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、蔗糖などが、窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスティープリカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、脱脂大豆、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等の無機塩、ビタミン類等）を含んでいてもよい。
【００１９】
培養方法は、当分野において知られている方法に従う。例えば上記栄養素を含む液体培地に微生物の胞子もしくは生育状態の菌体を植菌し、静置もしくは通気攪拌により菌体を増殖させるが、好ましくは通気攪拌により培養するのがよい。培養液のｐＨは好ましくは５〜９であり、さらに好ましくは６〜８である。温度は通常１４〜４２℃、より好ましくは２０℃〜４０℃で行うのがよい。通常は１４〜１４４時間培養を継続するが、好ましくは各々の培養条件においてＧＤＨの発現量が最大となる時点で培養を終了するのがよい。このような時点を見極める方策としては、培養液のサンプリングを行って培養液中のＧＤＨ活性を測定することでその変化をモニタリングし、経時的なＧＤＨ活性の上昇がなくなった時点をピークとみなして培養停止すればよい。
【００２０】
上記の培養液からＧＤＨを抽出する方法としては、菌体内に蓄積したＧＤＨを回収する場合にあっては遠心分離もしくはろ過等の操作によって菌体のみを集め、この菌体を溶媒、好ましくは水もしくは緩衝液に再懸濁する。再懸濁した菌体は公知の方法により破砕することで菌体中のＧＤＨを溶媒中に抽出することができる。破砕方法としては、溶菌酵素を用いることもでき、また物理的破砕方法を用いてもよい。溶菌酵素としては、真菌細胞壁を消化する能力を有するものであれば特に限定しないが、適用可能な酵素の例としてはシグマ社製「Ｌｙｔｉｃａｓｅ」等が挙げられる。また、物理的破砕の方法としては例えば超音波破砕、ガラスビーズ破砕、フレンチプレス等が挙げられる。破砕処理後の溶液は、遠心分離もしくはろ過により残渣を取り除いてＧＤＨ粗抽出溶液を得ることができる。また、菌体外に分泌されたＧＤＨを回収する場合にあっては、遠心分離もしくはろ過等の操作によって菌体を除いた培養液上清を粗抽出ＧＤＨとすればよい。
【００２１】
また本発明における培養方法としては固体培養によることもできる。好ましくは温度や湿度等を適宜制御の上で小麦等のふすま上に本発明のＧＤＨ生産能を有する真核微生物を生育させる。このとき、培養は静置により行ってもよく、また培養物を攪拌する等して混合してもよい。ＧＤＨの抽出は、培養物に溶媒、このましくは水もしくは緩衝液を加えてＧＤＨを溶解させ、遠心分離もしくはろ過により菌体やふすま等の固形物を取り除くことでなされる。
【００２２】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液から、ＧＤＨを精製する方法としては、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００２３】
これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
（ａ）タンパク質実験プロトコール第１巻 機能解析編，第２巻 構造解析編 （秀潤社） 西村善文，大野茂男 監修
（ｂ）改訂 タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製 （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 
編集
（ｃ）タンパク質実験の進めかた （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
あるいは以下に例示する方法によって進めることもできる。
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ  （ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ  （ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００２４】
上記精製されたＧＤＨ標品の部分アミノ酸配列を決定し、該部分アミノ酸配列を基に作製したプローブ又はプライマーを用いて、セルフクローニングあるいは他の微生物由来のＧＤＨをコードするＤＮＡをクローニングし、そのようにしてクローニングされたＤＮＡを種々の微生物に導入して、適宜培養・精製条件を決定してＧＤＨを採取することは、当業者が容易になしうることである。
なお、上記の方法により得られたＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読することができる。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定することができる。
【００２５】
さらに上記で得られたＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、上記に例示されたものにさらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
また、ＧＤＨをコードする遺伝子も同様に改変されうる。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換または挿入するための種々の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ,  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。  
また、上記で得られたＧＤＨ遺伝子は、さらに、ＧＤＨの発現を向上させる等の目的に応じて、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を変更したものを含みうる。
【００２６】
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。
【００２７】
その際、本発明の酵素、キットまたはセンサーには、さらに他の安定化剤などをＧＤＨの反応に特に悪い影響を及ぼさないような範囲で添加してもよい。本発明の安定化剤の配合法は特に制限されるものではない。例えばＧＤＨを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にＧＤＨを配合する方法、あるいはＧＤＨと安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。
【００２８】
共存できる緩衝液成分としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。該緩衝液のｐＨは５．０〜９．０程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
【００２９】
さらに必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤、塩、アミノ酸、糖、防腐剤などを添加しても良い。
【００３０】
本発明のＧＤＨは、液状（水溶液、懸濁液等）、粉末、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。また、グルコース測定を行なう際には、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーなどの種々の形態をとることができる。
【００３１】
凍結乾燥組成物中（センサー上も含む）においては、ＧＤＨ含有量は、酵素の起源によっても異なるが、通常は約５〜７０％（重量比）の範囲で好適に用いられる。酵素活性に換算すると、１０〜３０００Ｕ／ｍｇの範囲で好適に用いられる。
【００３２】
本発明のＧＤＨには、反応に影響を与える可能性のある添加物・混合物などの濃度を、影響を受けない程度まで低下させるか、実質的に共存させないことも可能である。例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などのアルブミンを実質的に共存させないことも可能である。
【００３３】
上記のようにして製造されうるグルコースデヒドロゲナーゼは、グルコース濃度の測定に用いることができる。
【００３４】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明のＧＤＨを含むグルコースアッセイキットである。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明のＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００３５】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明のＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。
【００３６】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、補酵素（フラビンなど）、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定される
【００３８】
＜実施例１＞
ペニシリウム属菌由来ＧＤＨの取得
ペニシリウム属菌１００種を独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入し、それぞれのＬ乾標本をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天を掻き取ることで回収し、５００ｍｌ容フラスコに入れた１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、２％グルコース、ｐＨ６．５  （以下非合成培地ともいう）５０ｍｌまたは０．２％  NH4NO3、０．３％ KH2PO4、０．２％  K2HPO4、０．２％  MgSO4・7H2O、５％  グルコース、ｐＨ６．５（以下合成培地ともいう）に植菌した。３０℃で３〜７日間培養し、培養終了後、培養液を遠心分離して得られた培養上清または菌体破砕液について、上述の活性測定法にしたがいＧＤＨ活性を測定した。その結果１００株中１８株においてＧＤＨ活性が確認された。表１に、各種ペニシリウム属菌由来ＧＤＨの培養力価を示す。
【００３９】
【表１】
2008035747.tif 000002
【００４０】
＜実施例２＞
基質特異性
実施例１で得た各粗酵素液を用いて、マルトース、ガラクトース、キシロースに対する作用性を調べた。活性測定は上述の活性測定法にしたがい、グルコースに対する活性を１００とし、各々の糖に対する相対活性値を示した。マルトースに対する作用性が極めて低い、新規グルコースデヒドロゲナーゼを確認した。表２に、各種ペニシリウム属菌由来ＧＤＨの基質特異性を示す。
【００４１】
【表２】
2008035747.tif 000003
【００４２】
＜実施例３＞
ペニシリウム属糸状菌由来ＧＤＨの取得
ＧＤＨ生産菌としてPenicillium rugulosumNBRC4683（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）を用い、それぞれのＬ乾標本をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌後に上記の菌糸懸濁液をそれぞれ投入、培養を開始した。培養条件は、温度３０℃、通気量２Ｌ／分、攪拌数３８０ｒｐｍで行った。培養上清を分子量１０，０００カットの限外ろ過用中空糸モジュールで１／１０量に濃縮し、濃縮液にそれぞれ硫酸アンモニウムを終濃度が６０％飽和（４５６ｇ／Ｌ）となるように添加、溶解した。続いて日立高速冷却遠心機で８０００ｒｐｍ１５分遠心し残渣を沈殿させたのち、上清をＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマト、脱塩を行って、精製ＧＤＨサンプルとした。
【００４３】
＜実施例４＞
粉末安定性
精製ＧＤＨサンプルより、酵素粉末を調製し、酵素粉末の安定性を調べた。粉末安定性は、25℃、湿度70%条件下で６時間処理した後、37℃、1week処理を行った酵素粉末の活性値を、吸湿処理及び37℃処理を行っていない粉末に対する残存率で示した。その結果を表３に示す。その結果、Penicillium rugulosum由来ＧＤＨはAspergillus terreus var. aureusに比べて、高い安定性を示すことが確認できた。
【００４４】
【表３】
2008035747.tif 000004
【００４５】
＜実施例５＞
グルコース電極におけるマルトース、ガラクトース作用性
乳鉢にカーボングラファイト０．５ｇをのせ、流動パラフィン０．３ｍＬを加えて乳棒で３０分練り、カーボンペーストを作製した。作製したカーボンペーストは白金電極上に練りこみ、さらに実施例１に従って作製した精製ＧＤＨ溶液（４００Ｕ／ｍＬ）を１０μＬ添加して室温で３０分風乾した。風乾した酵素電極上に透析用セルロース半透膜を被せ、プラスチック製のＯリングで半透膜を固定した。こうして作製したグルコース電極は、あらかじめ氷冷した５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に３０分浸漬した後使用した。２５℃に保温したキュベットに２０ｍｌの反応液を入れ、これにグルコース電極（作用極）、対極として白金電極、及び参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を浸し、＋０．３５Ｖの電圧を印加した。電流値が一定になった後にグルコースを添加し、これに応答する電流値をモニタリングした。基質としてグルコースを用いた時に観察された電流値を100としマルトースを基質に用いた時の相対値を示した。結果、Penicillium rugulosum由来ＧＤＨは電極においても、マルトース作用性が極めて低ことが確認された。表４に、Penicillium rugulosum由来ＧＤＨのグルコース電極におけるマルトース、ガラクトース作用性を示す。
【００４６】
【表４】
2008035747.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明において、ペニシリウム属菌株より、安定性に優れ、さらにマルトース作用性の低い、新規グルコースデヒドロゲナーゼを生産することをみだした。これら酵素は、グルコースセンサ等により適したものであると考えられる。