(57)【要約】【課題】周期的に振動する生体の観察像をぶれなく鮮明に取得する。【解決手段】周期的に振動する生体Ｐの振動の基準波形を記憶する記憶部４と、生体Ｐの観察像を取得する観察光学系３と、該観察光学系３による観察範囲を移動させる駆動部５と、記憶部４に記憶されている基準波形に基づいて、観察光学系３による観察範囲が生体Ｐの振動に一致する形態で移動するように駆動部５を制御する制御部６とを備える生体観察装置１を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
周期的に振動する生体の振動の基準波形を記憶する記憶部と、
生体の観察像を取得する観察光学系と、
該観察光学系による観察範囲を移動させる駆動部と、
前記記憶部に記憶されている基準波形に基づいて、前記観察光学系による観察範囲が生体の振動に一致する形態で移動するように前記駆動部を制御する制御部とを備える生体観察装置。
【請求項２】
生体の振動の基準波形を取得する波形取得部を備え、
前記記憶部が、前記波形取得部により取得された基準波形を少なくとも１周期分記憶し、
前記制御部が、前記記憶部に記憶されている基準波形を繰り返し使用して前記駆動部を制御する請求項１に記載の生体観察装置。
【請求項３】
前記波形取得部は、前記観察光学系による観察範囲が前記生体の振動の振幅より狭い場合に、前記観察範囲を生体の振動方向に移動させた各位置において振動波形を取得し、取得された複数の振動波形を合成して少なくとも１周期分の基準波形を生成する請求項２に記載の生体観察装置。
【請求項４】
前記波形取得部が、前記観察光学系による生体の観察範囲における特徴点の動きに基づいて基準波形を取得する請求項２に記載の生体観察装置。
【請求項５】
前記波形取得部が、生体の振動波形を複数周期分取得し、取得された複数周期の振動波形を平均して基準波形を取得する請求項２に記載の生体観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体を生きたまま（in vivo）観察する生体観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体を生きたまま顕微鏡で観察するする場合に、生体の呼吸や拍動等の振動によって観察像がぶれてしまい、鮮明な観察像による観察を行うことができないという不都合があった。これを解決するために、観察時に生体を押さえつけて固定するスタビライザを有する観察装置が考案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−３３８６３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、この観察装置においては、生体を光軸方向に押さえつけるので、生体の光軸方向に沿う振動を抑えることができ、観察光学系の焦点がずれる不都合を回避することができるものの、光軸に交差する方向の振動を高精度に抑えることができず、観察像がぶれてしまうという問題を解決することが困難である。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、周期的に振動する生体の観察像をぶれなく鮮明に取得することができる生体観察装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、周期的に振動する生体の振動の基準波形を記憶する記憶部と、生体の観察像を取得する観察光学系と、該観察光学系による観察範囲を移動させる駆動部と、前記記憶部に記憶されている基準波形に基づいて、前記観察光学系による観察範囲が生体の振動に一致する形態で移動するように前記駆動部を制御する制御部とを備える生体観察装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、基準波形に基づいて、制御部の作動により駆動部が駆動されることによって、観察光学系による観察範囲が、生体の振動に一致する形態で移動させられる。すなわち、生体は、周期的な振動を繰り返すので、予め記憶部に記憶しておいた基準波形通りに観察範囲を移動させることで、あたかも静止しているような生体の観察像を取得することが可能となる。これにより、観察光学系によって、ぶれのない鮮明な観察像を取得することができる。また、基準波形を予め記憶部に記憶しておくことにより、処理に要する時間を短縮して、観察範囲を生体の振動に精度よく追随させることができる。
【０００８】
上記発明においては、生体の振動の基準波形を取得する波形取得部を備え、前記記憶部が、前記波形取得部により取得された基準波形を少なくとも１周期分記憶し、前記制御部が、記憶部に記憶されている基準波形を繰り返し使用して前記駆動部を制御することとしてもよい。
このようにすることで、波形取得部の作動により生体の振動の基準波形が取得され、少なくとも１周期分の基準波形が記憶部に記憶される。そして、制御部は記憶されている基準波形を繰り返し使用して駆動部を制御することにより、周期的に振動する生体に対し観察範囲を長時間に渡って追随させることができる。また、記憶部の記憶容量を節約することができる。
【０００９】
また、上記発明においては、前記波形取得部は、前記観察光学系による観察範囲が前記生体の振動の振幅より狭い場合に、前記観察範囲を生体の振動方向に移動させた各位置において振動波形を取得し、取得された複数の振動波形を合成して少なくとも１周期分の基準波形を生成することとしてもよい。
観察光学系の倍率によっては、観察範囲が生体の振動の振幅より狭くなる場合が発生し、単一の観察範囲における生体の振動波形を取得しても、その観察範囲を生体の振動に同期させることが困難である。本発明によれば、観察範囲を生体の振動方向に移動させた各位置において振動波形を取得し、これらを合成して少なくとも１周期分の基準波形を生成することにより、生体の振動全体を含む基準波形を取得でき、観察範囲を生体の振動に容易に同期させて、鮮明な観察像を取得することが可能となる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記波形取得部が、前記観察光学系による生体の観察範囲における特徴点の動きに基づいて基準波形を取得することとしてもよい。
このようにすることで、生体の振動形態を十分に反映させた基準波形を容易に取得することができる。この場合に、観察範囲における観察像において、高輝度領域を特徴点として抽出し、その位置の時間変化を検出することにより基準波形を取得することができる。生体の観察像において高輝度領域が少ない場合には、励起光により蛍光を発生する蛍光ビーズのようなマーカを生体の表面に付着させることにより、当該蛍光ビーズを特徴点として容易に抽出することができる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記波形取得部が、生体の振動波形を複数周期分取得し、取得された複数周期の振動波形を平均して基準波形を取得することとしてもよい。
このようにすることで、生体の振動の不規則性を緩和して、全ての振動波形に、より一致させやすい基準波形を生成することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、周期的に振動する生体の観察像をぶれなく鮮明に取得することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の第１の実施形態に係る生体観察装置１について、図１〜図１０を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体観察装置１は、図１に示されるように、マウス等の試料Ｐを載置するステージ２と、該ステージ２上の試料Ｐの観察像を取得する観察光学系３と、ステージ２上に載置された試料Ｐの振動の基準波形を記憶する記憶部４と、該記憶部４に記憶されている基準波形に基づいて前記観察光学系３を駆動する駆動部５と、該駆動部５を制御する制御部６とを備えている。
【００１４】
観察光学系３は、試料Ｐからの反射光または蛍光のような光を集光する対物レンズ７と、該対物レンズ７により集光された光を結像させる結像レンズ８と、該結像レンズ８により集光された光を分岐するビームスプリッタ９と、該ビームスプリッタ９により分岐された光をそれぞれ撮影する２つのカメラ１０，１１と、一方のカメラ１０により撮影された画像を表示する表示部１２とを備えている。
【００１５】
また、他方のカメラ１１は、前記一方のカメラ１０より十分にフレームレートの高い高速度カメラ（以下、高速度カメラ１１と言う。）であり、該高速度カメラ１１により撮影された画像を処理する画像処理部１３に接続されている。画像処理部１３は、高速度カメラ１１により撮影された画像に基づいてステージ２上に載置された試料Ｐの振動の基準波形を生成し、前記記憶部４に記憶するようになっている。
【００１６】
駆動部５は、観察光学系３に備えられている対物レンズ７を、その光軸に直交する２方向（Ｘ，Ｙ方向）に移動させる超音波モータのようなアクチュエータ（図示略）と、その位置を検出するエンコーダのような位置検出器（図示略）とを備えている。前記制御部６は、記憶部４に記憶されている基準波形を目標値信号としてアクチュエータを駆動し、位置検出器により検出された対物レンズ７の位置をフィードバックして、誤差がゼロになるように制御するようになっている。
【００１７】
ここで、画像処理部１３による試料Ｐの振動の基準波形の生成方法について説明する。
基準波形を生成するには、まず、ステージ２上に試料Ｐを載置して、図２のフローチャートに示されるように、試料Ｐの画像を高速度カメラ１１（例えば、フレームレート１０００ｆｐｓ）によって取得し（ステップＳ１）、取得された画像を画像メモリ（図示略）に格納し（ステップＳ２）、各画像における高輝度領域を抽出してラベリングし（ステップＳ３）、ラベリングされた領域の重心位置を演算し（ステップＳ４）、その重心位置をメモリ（図示略）に記憶する（ステップＳ５）。そして、基準波形の生成に必要な数の画像が取得されるまで、ステップＳ１〜Ｓ５を繰り返す（ステップＳ６）。
【００１８】
一般に、高速度カメラ１１は露光時間が短く感度が低いので、画像が暗くなり、高輝度領域を明確に抽出することが困難である。そこで、試料Ｐの表面に蛍光ビーズ１４のような光を発する物質を付着させて撮影を行う。蛍光ビーズ１４としては、図３に示されるように、高速度カメラ１１の画素１５複数分に相当する大きさの球状体を使用することで、その重心位置を精度よく演算することができる。
【００１９】
高輝度領域の抽出は、例えば、取得された各画像を所定の閾値に基づいて２値化することにより、簡易に行うことができる。これにより、蛍光を発している蛍光ビーズ１４の占有する領域が抽出されるので、その重心位置を演算することによって、試料Ｐの特徴点を設定することができる。そして、このようにして各画像について設定された特徴点の時系列的な移動軌跡を基準波形として生成することができる。
【００２０】
さらに具体的には、図４（ａ）に太枠で示されるように、試料Ｐの振動の全振動範囲ＡＢ（符号Ａ，Ｂ間で振動している場合）の軌跡Ｑを含む観察範囲Ｒを観察している場合と、図５（ａ）に太枠で示されるように、全振動範囲ＡＢの一部のみを観察範囲Ｒとして観察している場合とに分けて説明する。
ここで、試料Ｐは、実際にはＸ，Ｙ、２方向に振動するが、説明を簡単にするために、試料ＰがＸ方向のみに振動し、Ｙ方向に振動しないものとして説明する。Ｘ，Ｙ、２方向に同時に振動する場合においても同様の手順で基準波形を生成することができる。
また、対物レンズ７の光軸に沿う方向（Ｚ方向）については、例えば、スタビライザを使用することにより、振動が抑制されているものとする。
【００２１】
まず、図４に示されるように、低倍率の対物レンズ７によって、全振動範囲ＡＢを含む観察範囲Ｒを観察する場合には、振幅の最小値Ａと最大値Ｂとの間の所定値（例えば、中間値）Ｍが３回以上含まれるような時間範囲で時系列データを取得して記憶する。次いで、図４（ｂ）に示されるように、最初に所定値Ｍとなる時刻ｔ１から３回目に所定値Ｍとなる時刻ｔ３までの時系列データを切り出す。これにより、１周期分の振動波形が切り出されるので、これを基準波形として記憶部４に記憶することができる。
【００２２】
次に、図５に示されるように、高倍率の対物レンズ７によって、振動範囲ＡＢの一部のみを観察する場合には、図６のフローチャートに示されるように、観察範囲Ｒの移動方向を示すフラグFlag_limitに０を入力して初期化し（ステップＳ１１）、最初の観察範囲Ｒ（例えば、観察範囲ＣＤ、以下、その最小値Ｃと最大値Ｄとを用いて観察範囲ＣＤとも言う。）に移動する（ステップＳ１２）。この観察範囲ＣＤにおいて、図５（ｂ）に示されるように、その最小値Ｃが３回以上含まれるような時間範囲で時系列データを取得して記憶する（ステップＳ１３）。次いで、最初に最小値Ｃとなる時刻ｔ１から３回目に最小値Ｃとなる時刻ｔ３までの時系列データを切り出す（ステップＳ１４）。これにより、観察範囲ＣＤの１周期分の振動波形が切り出されるので、これを一時的に記憶しておく（ステップＳ１５）。
【００２３】
次に、１周期分の振動波形に観察範囲ＣＤの最大値Ｄを越えている状態が存在するか否かが判定され（ステップＳ１６）、越えている状態が存在する場合には、図５に破線で示されるように、対物レンズをＸ方向に観察範囲Ｒの幅寸法分だけ１段階移動させる（ステップＳ１７）。ここでは、観察範囲ＤＥに移動させる。そして、以下、ステップＳ１３〜Ｓ１７が繰り返される。
【００２４】
図７に示される観察範囲ＦＧのように、時系列データの最大値Ｐｍａｘが観察範囲ＦＧの最大値Ｇに達しない場合、すなわち、ステップＳ１６において、１周期分の振動波形に観察範囲ＦＧの最大値Ｇを越えている状態が存在しないと判定された場合には、振動範囲ＡＢの一端Ｂに到達したものと判断し、基準波形の取得が終了したか否かを判定する（ステップＳ１８）。
【００２５】
そして、観察範囲Ｒの移動方向を反転するために、フラグFlag_limitに１を入力し（ステップＳ１９）、最初の観察範囲ＣＤから逆方向に観察範囲Ｒの幅寸法分だけ移動させた観察範囲ＨＣに移動させる（ステップＳ２０）。次いで、この観察範囲ＨＣにおいて、その最大値Ｃが３回以上含まれるような時間範囲で時系列データを取得して記憶する（ステップＳ１３）。次いで、最初に最大値Ｃとなる時刻ｔ１から３回目に最大値Ｃとなる時刻ｔ３までの時系列データを切り出す（ステップＳ１４）。
【００２６】
そして、当該観察範囲ＨＣについて１周期分の振動波形を切り出して一時的に記憶する（ステップＳ１５）。今度は、１周期分の振動波形に観察範囲ＨＣの最小値Ｈを下回っている状態が存在するか否かが判定され（ステップＳ１６）、下回っている状態が存在する場合には、対物レンズ７をＸ方向に観察範囲ＨＣの幅寸法分だけ移動させ（ステップＳ１７）、以下、ステップＳ１３〜Ｓ１７を繰り返す。
【００２７】
その後、図８の観察範囲ＩＪに示されるように、時系列データの最小値Ｐｍｉｎが観察範囲ＩＪの最小値Ｊに達しない場合、すなわち、ステップＳ１６において、１周期分の振動波形に観察範囲ＩＪの最小値Ｊを下回っている状態が存在しないと判定された場合には、振動範囲ＡＢの一端Ａに到達したものと判断し、基準波形の取得が終了したと判定して（ステップＳ１８）、処理を終了する。
【００２８】
これにより、試料Ｐの振動の全振動範囲ＡＢにわたる振動波形が、振動方向に複数に分割された状態で一時的に記憶されていることになるので、これらの振動波形を合成して、全振動範囲ＡＢにわたる振動波形を生成する。
具体的には、全ての隣接する観察範囲Ｒにおいて、一方の観察範囲Ｒの最小値の時刻と他方の観察範囲Ｒの最大値の時刻とが一致するように時間軸を調節する。
【００２９】
例えば、１周期分切り出された観察範囲ＣＤと観察範囲ＤＥにおいては、図９に示されるように、観察範囲ＣＤの最初に最大値Ｄとなる時刻ＴＤ１と、観察範囲ＤＥの最初に最小値Ｄとなる時刻ＴＤ２とがΔＴＤだけずれているので、領域ＤＥの時系列データをΔＴＤ分だけずらす処理を行い、観察範囲ＣＤと観察範囲ＤＥの振動波形を合成する。これを、全ての観察範囲Ｒについて実施することにより、図１０に示されるように、全振動範囲ＡＢにわたる振動波形が合成されるので、これを基準波形として記憶部に記憶する。
【００３０】
このようにして、試料Ｐの振動の基準波形が生成され記憶部４に記憶されるので、制御部６は、記憶部４に記憶された試料Ｐの振動の１周期分の基準波形を目標値信号として出力し、駆動部５のアクチュエータを追従させるよう制御する。制御部６は、記憶部４から読み出した目標値信号のピーク値が試料Ｐの振動の一端に一致するタイミングで、複数周期分の目標値信号を連続して出力する。
【００３１】
これにより、対物レンズ７が、試料Ｐの振動に同期して、その振動の方向および速さに一致する方向および速さで移動させられるので、カメラ１０により撮影される観察像は、あたかも振動せずに静止しているかのように見える。すなわち、本実施形態に係る生体観察装置１によれば、振動している試料Ｐの観察像を静止画のようにぶれなく鮮明に取得することができるという利点がある。
また、本実施形態に係る生体観察装置１によれば、予め記憶部４に試料Ｐの振動の基準波形を記憶しておくので、アクチュエータを制御する際の処理が容易であり、試料Ｐの振動に対して時間遅れなく正確に対物レンズ７を追従させることができる。
【００３２】
なお、本実施形態に係る生体観察装置１においては、対物レンズ７を駆動する駆動部５が超音波モータのようなアクチュエータを備えることとしたが、これに代えて、リニア駆動可能なボイスコイルモータ、リニアモータあるいはピエゾモータを採用してもよい。また、ＤＣモータのような回転モータにボールネジを組み合わせてリニア駆動を実現するようにしてもよい。
【００３３】
さらに、ステッピングモータを採用してもよい。この場合には、エンコーダ等の位置検出器からの信号をフィードバックすることなく、オープンループで制御することにしてもよい。
【００３４】
また、本実施形態においては、１周期分の振動波形を取得して基準波形として記憶部４に記憶することとしたが、これに代えて、複数周期分の振動波形を取得した後、これを平均して基準波形として記憶することとしてもよい。このようにすることで、生体からなる試料Ｐの振動の不規則性を緩和し、さらに精度よく対物レンズ７を試料Ｐの動的挙動に追従させることができる。
【００３５】
また、本実施形態においては、生体観察装置１において基準波形を生成させることとしたが、これに代えて、他の装置により生成した基準波形を記憶部４に記憶しておき、これに基づいて、対物レンズ７を駆動制御することとしてもよい。また、対物レンズ７の駆動制御に代えて、ステージ２を駆動制御することにしてもよい。また、観察光学系３に内蔵される他の光学部品を駆動制御することにより、観察範囲Ｒを移動させることとしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の一実施形態に係る生体観察装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の生体観察装置による試料の振動の基準波形の生成方法における時系列データの取得について説明するフローチャートある。
【図３】図２のフローチャートにおいて、試料の振動を明確化するために使用する蛍光ビーズを説明する図である。
【図４】図１の生体観察装置において、観察範囲に全振動範囲が含まれる場合の（ａ）蛍光ビーズの軌跡と観察範囲との関係、（ｂ）蛍光ビーズの動きの時系列データを示す図である。
【図５】図１の生体観察装置において、観察範囲に全振動範囲の一部のみが含まれる場合の（ａ）蛍光ビーズの軌跡と観察範囲との関係、（ｂ）蛍光ビーズの動きの時系列データを示す図である。
【図６】図５の場合の試料の振動の基準波形の生成方法を示すフローチャートである。
【図７】図５の観察範囲が蛍光ビーズの軌跡の一端に配置された場合を示す図である。
【図８】図５の観察範囲が蛍光ビーズの軌跡の一端に配置された場合を示す図である。
【図９】図６のフローチャートに従って取得された複数の画像に基づいて振動の基準波形を合成する処理を説明する図である。
【図１０】図９の合成処理により合成された振動の１周期分の基準波形の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００３７】
Ｐ  試料（生体）
Ｒ  観察範囲
１  生体観察装置
３  観察光学系
４  記憶部
５  駆動部
６  制御部
１１  高速カメラ（波形取得部）
【図１】
2008298860.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2008298860.tif 000010
【図９】
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【図１０】
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