(57)【要約】【課題】特定のリグニン誘導体を用いた眼疾患の予防・治療剤を提供する。【解決手段】（ａ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体、（ｂ）（ａ）記載のリグニン一次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体及び（ｃ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化して得られるリグニン三次誘導体、からなる群から選択される１種あるいは２種以上のリグニン誘導体を含有するものとする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体、
（ｂ）（ａ）記載のリグニン一次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体及び
（ｃ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化して得られるリグニン三次誘導体、
からなる群から選択される１種あるいは２種以上のリグニン誘導体を有効成分として含有する、眼疾患の予防・治療剤。
【請求項２】
前記フェノール化合物は１価のフェノール化合物である、請求項１に記載の予防・治療剤。
【請求項３】
前記フェノール化合物は、クレゾール又はバニリンである、請求項１又は２に記載の予防・治療剤。
【請求項４】
前記（ｃ）に記載のリグニン三次誘導体を有効成分として含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の予防・治療剤。
【請求項５】
前記フェノール化合物は、クレゾール又はバニリンである、請求項４に記載の予防・治療剤。
【請求項６】
前記リグニン含有材料は、タケである、請求項１〜５のいずれかに記載の予防・治療剤。
【請求項７】
前記眼疾患は、低酸素及び／又は低グルコースによる視神経細胞死関連眼疾患である、請求項１〜６のいずれかに記載の予防・治療剤。
【請求項８】
前記眼疾患は、小胞体ストレスによる視神経細胞死関連眼疾患である、請求項１〜７のいずれかに記載の予防・治療剤。
【請求項９】
前記眼疾患は、細胞内Ca2+濃度上昇による視神経細胞死関連眼疾患である、請求項１〜８のいずれかに記載の予防・治療剤。
【請求項１０】
前記眼疾患は、網膜疾患である、請求項１〜９のいずれかに記載の予防・治療剤。
【請求項１１】
前記眼疾患は、緑内障性視神経障害である、請求項１〜９のいずれかに記載の予防・治療剤。
【請求項１２】
（ａ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体、
（ｂ）（ａ）記載のリグニン一次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体及び
（ｃ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化して得られるリグニン三次誘導体、
からなる群から選択される１種あるいは２種以上のリグニン誘導体を有効成分として含有する、視神経保護剤。
【請求項１３】
前記視神経は、網膜神経節細胞を含む、請求項１２に記載の保護剤。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の視神経保護剤を含有する、栄養補助剤。
【請求項１５】
請求項１２又は１３に記載の視神経保護剤を含有する、眼疾患の予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグニン誘導体の利用に関し、特に、眼疾患の予防・治療剤及び視神経細胞保護剤への利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
網膜は外部からの光を受容するための視機能に関して重要な役割を果たしている。網膜は網膜色素上皮層、視神経線維層（ＯＦＬ）、神経細胞層、内網状層（ＩＰＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）、外網状層（ＯＰＬ）等の１０層から成る、厚さ０．１〜０．５ｍｍの組織である。内網状層には、アマクリン細胞という神経節細胞突起と対をなしてシナプスを形成する神経細胞が存在するが、光の照射開始時と終了時によく応答することから、この神経細胞は光強度の検出器として働くと考えられている。神経細胞層には、網膜のもっとも内側に位置する神経節細胞（以下「ＲＧＣ」とする。）が存在しており、運動視、周辺視、色覚、形態覚などに深く関与している。また、神経線維層には、網膜中心動静脈の分枝である網膜血管が走行しており、網膜神経細胞に酸素および栄養を供給する役割を担っている。
【０００３】
ところで、網膜血管が攣縮、血栓、動脈硬化等の要因により閉塞または狭窄すると網膜循環に障害が生じ、網膜神経細胞への酸素ならびに栄養の供給が閉ざされる。この網膜循環障害により酸素や栄養の供給が不足すれば、網膜神経細胞は死に至り、視神経障害が引き起こされる。視神経障害による症状としては、網膜静脈や網膜動脈が閉塞あるいは狭窄した網膜血管閉塞症、網膜剥離に至る可能性のある糖尿病網膜症、視機能障害が出現する虚血性視神経症がある。さらに黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病などの網膜疾患も網膜神経細胞死が発症に深く関与すると考えられている。
【０００４】
また、失明に至る眼疾患のひとつである緑内障は、網膜神経細胞のＲＧＣが選択的に障害を受け、視神経障害が起き、視野障害へと進行する。このことから、ＲＧＣ障害を予防あるいは最小限に抑えることが緑内障治療につながるといわれている（非特許文献１）。緑内障性視神経障害の詳細なメカニズムは未だ明らかではないが、眼圧上昇によって視神経が圧迫され、視神経萎縮が生ずることによる機械的障害説と、視神経乳頭の循環障害によって視神経萎縮が起ることによる循環障害説とがある。実際には、これら機械的障害と循環障害が複雑に関与していると考えられ、機械的障害および循環障害は、いずれも視神経軸索輸送障害を引き起こす。そして、この軸索輸送障害による神経栄養因子の供給途絶がＲＧＣ障害の一因になっていると考えられている（非特許文献２）。また、グルタミン酸は網膜内の神経伝達物質の一つであるが、何らかの原因によってこのグルタミン酸シグナルカスケードが過度に活性化することもＲＧＣ障害の一因であると考えられている（非特許文献３）。
【０００５】
このようにさまざまの眼疾患における病態には、プログラム化細胞死の一形態であるアポトーシスが関与することが解明されつつある。例えば、虚血−再灌流による網膜障害(非特許文献４)、網膜剥離(非特許文献５)、網膜色素変性症(非特許文献６，７)、網膜光障害(非特許文献８)、緑内障(非特許文献９，１０)などいずれもＲＧＣのアポトーシスが報告されている。視機能障害の原因は多様であるが、結果的に視機能障害は視覚情報ネットワークを構成している神経細胞のアポトーシスによる可能性が高いといえる。
【０００６】
これらのことから、網膜神経細胞に対して保護効果を有する物質は、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症およびレーベル病などの網膜疾患や視神経障害を伴う緑内障などの眼疾患の予防や治療に有用であることが期待される。
【０００７】
一方、リグニンは高等植物体の細胞壁を構成する主要成分として、また天然フェノール系高分子として知られている。天然リグニンは植物体から単に抽出操作のみで分離することができないことから、リグニンを得るためには、植物成分を何らかの方法で分解し、天然リグニン由来の誘導体として分離しなければならない。こうした天然リグニン由来のリグニン誘導体としては、クラフトリグニン、蒸煮爆砕リグニン、酢酸リグニンなど多種類のリグニン誘導体がある。この他には、植物体にフェノール化合物を添加し溶媒和させた後、酸を添加することにより得られるポリフェノール系化合物であるリグノフェノール系誘導体が知られている（特許文献１、２及び３）。特に、このリグノフェノールに関して、本発明者らは、カルボキシメチル化などの化学修飾を施した水溶性誘導体に種々の生理活性機能を見出している。例えば、リグノフェノールの水溶性誘導体は、活性酸素などの酸化ストレスによって引き起こされる非生理的細胞死の抑制、細胞保護作用を有することを見出し、アルツハイマー病やパーキンソン氏病などの神経疾患の予防や治療に有用であることを報告している（特許文献４）。
【特許文献１】特開平２−２３３７０１号公報
【特許文献２】特開平７−２０６６０１号公報
【特許文献３】特開平８−１４３５８７号公報
【特許文献４】特開２００４−２４３６７号公報
【非特許文献１】眼科，40, 251-273,1998
【非特許文献２】眼科，44, 1413-1416,2002
【非特許文献３】Surv. Ophthalmol. 48, S38-S46, 2003
【非特許文献４】J. Ocul. Pharmacol. Ther., 11, 253-259, 1995
【非特許文献５】Arc. Ophthalmol., 113, 880-886, 1995
【非特許文献６】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 974-978, 1994
【非特許文献７】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35, 2693-2699, 1994
【非特許文献８】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 37, 775-782, 1996
【非特許文献９】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36, 774-786, 1995
【非特許文献１０】Exp.EyeRes., 61, 33-44, 1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、酸化ストレスに対する細胞保護作用を有するリグノフェノール系誘導体が、視神経細胞に関して、またその細胞死によって生ずると考えられている網膜疾患や緑内障などの眼疾患に関して、いかなる作用を示すかについては検討されていない。
【０００９】
本発明は、リグノフェノール系誘導体の哺乳類の眼疾患の予防・治療剤及び視神経細胞保護剤としての用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、リグノフェノール系誘導体の細胞保護作用との関係について研究を深め、視神経細胞死抑制および網膜疾患や緑内障などの眼疾患に関する作用について鋭意研究を行った。その結果、リグノフェノール系誘導体は、ＲＧＣなどの網膜神経細胞の保護機能を有し、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症およびレーベル病に代表される網膜疾患や緑内障などの視神経障害を伴う眼疾患の予防又は治療剤として有用であることを見出し、本発明に至った。本発明によれば、以下の手段が提供される。
【００１１】
（１）（ａ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体、
（ｂ）（ａ）記載のリグニン一次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体及び
（ｃ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化して得られるリグニン三次誘導体、
からなる群から選択される１種あるいは２種以上のリグニン誘導体を有効成分として含有する、眼疾患の予防・治療剤。
（２）前記フェノール化合物は１価のフェノール化合物である、（１）に記載の予防・治療剤。
（３）前記フェノール化合物は、クレゾール又はバニリンである、（１）又は（２）に記載の予防・治療剤。
（４）前記リグニン誘導体は水溶性である、（１）〜（３）のいずれかに記載の予防・治療剤。
（５）前記（ｃ）に記載のリグニン三次誘導体を有効成分として含有する、（１）〜（４）のいずれかに記載の予防・治療剤。
（６）前記フェノール化合物は、クレゾール又はバニリンである、（５）に記載の予防・治療剤。
（７）前記リグニン含有材料は、木本類植物及び草本類植物から選択される１種あるいは２種以上のリグノセルロース系材料である、（１）〜（６）のいずれかに記載の予防・治療剤。
（８）前記リグニン含有材料は、タケである、請求項１〜７のいずれかに記載の予防・治療剤。
（９）前記眼疾患は、低酸素及び／又は低グルコースによる視神経細胞死関連眼疾患である、（１）〜（８）のいずれかに記載の予防・治療剤。
（１０）前記眼疾患は、小胞体ストレスによる視神経細胞死関連眼疾患である、（１）〜（９）のいずれかに記載の予防・治療剤。
（１１）前記眼疾患は、細胞内Ca2+濃度上昇による視神経細胞死関連眼疾患である、（１）〜（９）のいずれかに記載の予防・治療剤。
（１２）前記眼疾患は、網膜疾患である、（１）〜（９）のいずれかに記載の予防・治療剤。
（１３）前記眼疾患は、緑内障性視神経障害である、（１）〜（９）のいずれかに記載の予防・治療剤。
（１４）（ａ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体、
（ｂ）（ａ）記載のリグニン一次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体及び
（ｃ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化して得られるリグニン三次誘導体、
からなる群から選択される１種あるいは２種以上のリグニン誘導体を有効成分として含有する、視神経保護剤。
（１５）前記視神経は、網膜神経節細胞を含む、（１４）に記載の保護剤。
（１６）（１４）又は（１５）に記載の視神経保護剤を含有する、栄養補助剤。
（１７）（１４）又は（１５）に記載の視神経保護剤を含有する、眼疾患の予防・治療剤。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の予防・治療剤及び視神経保護剤は、リグニン含有材料から所定の手法により分離して得られるリグノフェノール系誘導体を含有している。これらのリグノフェノール系誘導体としては、以下の（ａ）〜（ｃ）のリグニン誘導体を挙げることができる。
【００１３】
本発明の視神経細胞保護剤及び予防・治療剤は、哺乳類又はその視神経細胞に適用することで、視神経細胞、特に視神経節細胞（ＲＧＣ）数や内網状層の厚み等の低下が誘導されても、この誘導作用に抗して視神経節細胞数や内網状層の厚みの低下を抑制することができる。このため、本発明の視神経細胞保護剤及び予防・治療剤は、こうした視神経細胞傷害等に基づく眼疾患の予防・治療に有効である。また、本発明の視神経細胞保護剤によれば、各種のアポトーシスの誘導に対して抵抗して視神経細胞を保護することができる。また、本発明の視神経細胞保護剤及び予防・治療剤においては、天然リグニンに由来する高分子としての立体構造が重要であると考えられる。したがって、天然リグニン由来の構造を高度に維持しているリグノフェノール系誘導体さらにこの誘導体がいずれも視神経細胞保護作用を有していると推測される。リグニン以下、これらのリグニン誘導体について説明し、さらに、本発明における用途について説明する。
【００１４】
（ａ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体、
（ｂ）（ａ）記載のリグニン一次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体及び
（ｃ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化して得られるリグニン三次誘導体
【００１５】
（リグニン一次誘導体）
本発明において用いるリグニン一次誘導体は、リグニン含有材料をフェノール化合物で溶媒和後、酸を添加し混合して得られるリグニンのフェノール化合物であるリグニン誘導体（以下、リグノフェノール系誘導体ともいう。）である。この反応過程によりリグニンのアリールプロパンユニットのベンジル位（側鎖Ｃ１位、以下、単にＣ１位という。）にフェノール化合物がグラフト（導入）されたリグニン誘導体を得ることができる。フェノール化合物は、そのフェノール性水酸基に対してオルト位あるいはパラ位にて前記Ｃ１位の炭素原子に結合する。この結果、１，１−ビス（アリール）プロパンユニットがリグニン中に形成される。この反応において、フェノール化合物は、前記Ｃ１位に対して選択的に導入されるため、出発原料であるリグニン含有材料におけるＣ１位における様々な結合を開放し、リグニンマトリックスの多様性を低減し、また、低分子量化することができる。さらに、この結果、従来のリグニンにはなかった各種溶媒への溶解性、熱流動性、熱可塑性など各種の特性を発現することが既に知られている。なお、ここで、フェノール化合物で溶媒和するとは、液体のフェノール化合物にリグニン含有材料を浸漬する等して溶媒和する他、液体あるいは固体のフェノール化合物を当該フェノール化合物が溶解する溶媒に溶解させたものをリグニン含有材料に適用後、溶媒を留去することでリグニン含有材料にフェノール化合物を収着することによっても達成することができる。
【００１６】
濃酸による炭水化物の膨潤に基づく組織構造の破壊と、フェノール化合物によるリグニンの溶媒和とを組み合わせてリグニンの不活性化を抑制しつつ、リグノセルロース系材料を炭水化物とリグノフェノール系誘導体とに分離する方法（特開平２−２３３７０１号）が知られている。また、これらの他、リグノフェノール系誘導体に関するより一般的な記載及びその製造プロセスについては、国際公開ＷＯ９９／１４２２３号公報、特開２００１−６４４９４号公報、特開２００１−２６１８３９号公報、特開２００１−１３１２０１号公報、特開２００１−３４２３５３号公報、特開２００２−１０５２４０号公報において記載されている（これらの特許文献に記載の内容は、全て引用により本明細書中に取り込まれるものとする）。
【００１７】
このプロセスによりリグノセルロース系材料からリグノフェノール系誘導体を得るシステムにおける構造変換プロセスの一例を以下に説明する。この構造変換プロセスは、リグノセルロース系材料を予めフェノール化合物で溶媒和しておいた上で、当該リグノセルロース系材料を酸と接触させることにより、リグニンのアリールプロパンユニットのリグニンの複合状態を緩和させ、同時に、天然リグニンのアリールプロパンユニットのＣ１位（ベンジル位）に選択的に前記フェノール誘導体をグラフティングさせ、リグノフェノール系誘導体を生成させ、同時にセルロースとリグノフェノール系誘導体とに分離できる。
【００１８】
リグノフェノール系誘導体は、それ自体、リグノセルロース系材料などのリグニン含有材料から反応、分離して得られるリグニン由来のポリマーの混合物である。このため、得られるポリマーにおける導入フェノール誘導体の量や分子量は、原料となるリグニン含有材料のリグニン構造および反応条件により変動する。
【００１９】
（リグニン含有材料）
本発明におけるリグニン含有材料には、天然リグニンを含有するリグノセルロース系材料を含む。リグノセルロース系材料は、木質化した材料、主として木材である各種材料、例えば、木粉、チップの他、廃材、端材、古紙などの木本類植物資源に付随する農産廃棄物や工業廃棄物を挙げることができる。また用いる木本類の種類としては、スギ、ヒノキなどの針葉樹、ブナなどの広葉樹等、任意の種類のものを使用することができる。さらに、ケナフ、ジュート、イネ、タケなどの各種草本類植物、それに関連するイネワラ、モミガラなどの農産廃棄物や工業廃棄物なども使用できる。本発明に用いる誘導体においては、木本類植物や草本類植物のいずれのリグノセルロース系材料も使用できるが、とくに、草本類植物に由来するリグノセルロース系材料を用いることが好ましい。さらに好ましくはタケである。タケ由来のリグノフェノール系誘導体は、特開２００４−２４４３６７号公報にも記載されるように高い細胞保護作用が認められている。また、タケは、資源的に確保が容易であるとともにタケの利用は竹林整備に有効であるというメリットもある。
【００２０】
（フェノール化合物）
フェノール化合物としては、少なくとも一つのフェノール性ＯＨ基を有する化合物であればよい。具体的には、１価のフェノール化合物、２価のフェノール化合物、または３価のフェノール化合物などを用いることができる。本発明においては、好ましくは１価のフェノール化合物を用いることができる。１価のフェノール化合物の具体例としては、１以上の置換基を有していてもよいフェノール、１以上の置換基を有していてもよいナフトール、１以上の置換基を有していてもよいアントロール、１以上の置換基を有していてもよいアントロキノンオールなどが挙げられる。２価のフェノール化合物の具体例としては、１以上の置換基を有していてもよいカテコール、１以上の置換基を有していてもよいレゾルシノール、１以上の置換基を有していてもよいヒドロキノンなどが挙げられる。３価のフェノール化合物の具体例としては、１以上の置換基を有していてもよいピロガロールなどが挙げられる。
【００２１】
また、フェノール化合物としては、アルデヒドフェノールを用いることができる。アルデヒドフェノールとしては、フェノール性ＯＨ基とアルデヒド基とをそなえていればよいが、たとえば、バニリン（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−ベンザルデヒド）、エチルバニリン（３−エトキシ−４−ヒドロキシ−ベンズアルデヒド）、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド等が挙げられる。なお、アルデヒドフェノールにおいても、フェノール性ＯＨ基の数に応じて、１価、２価又は３価のフェノール化合物として包括的に表現するものとする。
【００２２】
本発明の一次誘導体にあっては、こうしたフェノール化合物を１種又は２種以上組み合わせて用いることができるが、１価のフェノール化合物から選択される１種あるいは２種以上を用いることが好ましい。また、２価のフェノール化合物及び３価のフェノール化合物のうち、１種あるいは２種以上を用いることもできる。
【００２３】
なお、１価から３価のフェノール化合物が有していてもよい置換基の種類は特に限定されず、任意の置換基を有していてもよいが、好ましくは、電子吸引性の基（ハロゲン原子など）以外の基であり、例えば、炭素数が１〜４、好ましくは炭素数が１〜３の低級アルキル基含有置換基である。低級アルキル基含有置換基としては、例えば、低級アルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基など）、低級アルコキシ基（メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基など）である。また、アリール基（フェニル基など）の芳香族系の置換基を有していてもよい。また、水酸基含有置換基であってもよい。
【００２４】
本発明においては、好ましくはｐ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、２，６−ジメチルフェノール、２，４−ジメチルフェノール、２−メトキシフェノール（Ｇｕａｉａｃｏｌ）、２，６−ジメトキシフェノール等を用いることができ、より好ましくは、ｐ−クレゾール、フェノール、ｐ−エチルフェノールである。また、２価のフェノール化合物としては、レゾルシノール、カテコール、ホモカテコール、ハイドロキノン、１，３−ナフタレンジオール等を用いることが好ましく、より好ましくは、レゾルシノール、カテコールである。また、３価のフェノール化合物としては、好ましくは、ピロガロール、フロログルシノール、２−ヒドロキシ−ナフトキノン等を用いることができ、より好ましくは、ピロガロール、フロログルシノールである。
【００２５】
これらのフェノール化合物は、そのフェノール性水酸基に対してオルト位あるいはパラ位の炭素原子がリグニンのアリールプロパンユニットのＣ１位の炭素に結合することにより、１，１−ビス（アリール）プロパンユニットが形成されることになる。したがって、少なくとも１つの導入サイトを確保するには、オルト位及びパラ位のうち、少なくともひとつの位置に置換基を有していないことが好ましい。フェノール化合物のフェノール性水酸基のオルト位炭素原子が前記Ｃ１位に結合して形成されたユニットをオルト位結合ユニットといい、フェノール化合物のフェノール性水酸基のパラ位炭素原子が前記Ｃ１位に結合して形成されたユニットをパラ位結合ユニットという。オルト位結合ユニット及びパラ位結合ユニットの一例として、フェノール化合物として、ｐ−クレゾール及び２，６−ジメチルクレゾールを用いることができる。
【００２６】
以上のことから、本発明では、一次誘導体について、無置換フェノール誘導体の他、少なくとも一つの無置換のオルト位あるいはパラ位を有する各種置換形態のフェノール誘導体の１種あるいは２種以上を適宜選択して用いることができる。
【００２７】
オルト位結合ユニットとパラ位結合ユニットとは、例えば、後述するアルカリ処理工程において異なる機能を発現する。オルト位結合ユニットは、緩和なアルカリ処理により導入されたフェノール化合物におけるフェノール性水酸基を消失させるとともにアリールクマラン構造を当該ユニットにおいて生成し、強いアルカリ処理によりアリール基移動に伴って分子形態を変動させる。いずれにおいても、オルト位結合ユニットは、アルカリ処理による効率的なリグノフェノール系誘導体の低分子化に寄与する。一方、パラ位結合ユニットは、アルカリ処理によりアリールクマラン構造やその後の分子形態変動を生じず、当該ユニット部位における低分子化には寄与しない。
【００２８】
なお、オルト位結合ユニットを有するリグノフェノール系誘導体を得るには、少なくとも一つのオルト位（好ましくは全てのオルト位）に置換基を有していないフェノール化合物を用いる。また、少なくとも一つのオルト位（２位あるいは６位）が置換基を有さず、パラ位（４位）に置換基を有するフェノール化合物（典型的には、２，４位置換１価フェノール誘導体）が好ましい。最も好ましくは、全てのオルト位が置換基を有さず、パラ位に置換基を有するフェノール化合物（典型的には、４位置換１価フェノール化合物）である。したがって、４位置換フェノール化合物及び２，４位置換フェノール化合物を１種あるいは２種以上組み合わせて用いることができる。
【００２９】
パラ位結合ユニットを有するリグノフェノール系誘導体を得るには、パラ位に置換基を有していないフェノール化合物（典型的には、２位（あるいは６位）置換１価フェノール化合物）が好ましく、より好ましくは、同時に、オルト位（好ましくは、全てのオルト位）に置換基を有するフェノール化合物（典型的には２，６位置換１価フェノール化合物）を用いる。すなわち、２位（あるいは６位）置換フェノール化合物及び２、６位置換フェノールのうち１種あるいは２種以上を組み合わせて用いることが好ましい。
【００３０】
（酸）
リグニン含有材料と接触させる酸としては、特に限定しないで、リグノフェノール系誘導体を生成しうる範囲で各種無機酸や有機酸を使用することができる。したがって、硫酸、リン酸、塩酸などの無機酸の他、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ギ酸などを使用することができる。リグニン含有材料としてリグノセルロース系材料を使用する場合には、セルロースを膨潤させる作用を有していることが好ましい。例えば、６５重量％以上の硫酸（好ましくは、７２重量％の硫酸）、８５重量％以上のリン酸、３８重量％以上の塩酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ギ酸などを挙げることができる。好ましい酸は、６５重量％以上の硫酸（好ましくは、７２重量％の硫酸）、８５重量％以上（好ましくは９５重量％以上）のリン酸、トリフルオロ酢酸又はギ酸である。
【００３１】
リグニン含有材料中のリグニンを、リグノフェノール系誘導体に変換し、分離する方法としては各種方法が採用できる。一次誘導体を得る反応工程としては、例えば、リグニン含有材料に、液体状のフェノール化合物（上記で説明したもの、例えば、ｐ−クレゾール）を浸透させ、リグニンをフェノール誘導体により溶媒和させ、次に、リグノセルロース系材料に酸（上記で説明したもの、例えば、７２％硫酸）を添加し混合して、セルロース成分を溶解する（以下、一段法ともいう。）。この方法によると、リグニンが低分子化され、同時にその基本構成単位のＣ１位にフェノール化合物が導入されたリグノフェノール系誘導体がフェノール化合物相に生成される。このフェノール化合物相から、リグノフェノール系誘導体が抽出される。リグノフェノール系誘導体は、リグニン中のベンジルアリールエーテル結合が開裂して低分子化されたリグニンの低分子化体の集合体として得られる。また、他の反応工程としては、リグニン含有材料に、固体状あるいは液体状のフェノール化合物を溶解した溶媒（例えば、エタノールあるいはアセトン）を浸透させた後、溶媒を留去（フェノール誘導体の収着）した場合も、先の方法と同様、リグノフェノール系誘導体が生成される（以下、二段法ともいう）。
【００３２】
後段でカルボキシメチル化及び／又はアルカリ処理により、リグニン一次誘導体に水溶性を付与する。したがって、一次誘導体としては、有機溶媒区分のリグニン一次誘導体を分離抽出することが有効である。有機溶媒区分のリグニン一次誘導体を分離回収するには、一段法にあっては、液体のフェノール化合物相を、大過剰のエチルエーテルに加えて得た沈殿物を集めて、アセトンに溶解する。アセトン不溶部を遠心分離により除去し、アセトン可溶部を濃縮する。このアセトン可溶部を、大過剰のエチルエーテルに滴下し、沈殿区分を集める。この沈殿区分から溶媒留去し、リグニン一次誘導体を得る。なお、粗一次誘導体は、フェノール化合物相やアセトン可溶区分を単に減圧蒸留により除去することによって得ることができる。
【００３３】
また、二段法にあっては、生成したリグノフェノール系誘導体は、液体フェノール化合物にて抽出分離することができる。あるいは、全反応液を過剰の水中に投入し、不溶区分を遠心分離にて集め、脱酸後、乾燥する。この乾燥物にアセトンあるいはアルコールを加えてリグノフェノール系誘導体を抽出する。さらに、この可溶区分を１段法における場合と同様に、過剰のエチルエーテル等に滴下して、リグノフェノール系誘導体を不溶区分として得ることもできる。以上、一次誘導体の調製方法の具体例を説明したが、これらに限定されるわけではなく、これらに適宜改良を加えた方法で調製することもできる。
【００３４】
こうして得られるリグノフェノール系誘導体（一次誘導体）は、天然リグニン由来の高次構造を有していることから、視神経保護作用を発現すると考えられる。さらにリグノフェノール系誘導体を後述するアルカリ処理したりフェノール性ＯＨを修飾するなどの二次誘導体化することで視神経細胞保護剤及び眼疾患の予防・治療剤としての適用可能性や投与形態の選択自由度を向上させることができる。次に、一次誘導体をさらに処理して得られる二次及び三次誘導体について説明する。
【００３５】
（アルカリ処理による水溶性化）
アルカリ処理は、リグニン一次誘導体をアルカリと接触させることにより行う。好ましくは加熱する。アルカリ処理においては、オルト位結合ユニットにおいて、導入されたフェノール化合物のフェノキシドイオンによるＣ２位炭素の攻撃が生じる。すなわち、一旦この反応が生じれば、Ｃ２アリールエーテル結合が開裂する。例えば、緩和なアルカリ処理では、一次誘導体が第一のユニットを有する場合、当該導入フェノール誘導体の当該フェノール性水酸基が開裂し、生じたフェノキシドイオンが、Ｃ２アリールエーテル結合を構成するＣ２位を分子内求核反応的にアタックして、当該エーテル結合を開裂させて低分子化することができる。Ｃ２アリールエーテル結合の開裂により、リグニンの母核にフェノール性水酸基が生成されることになり、当該分子内求核反応により、導入フェノール核が、それが導入されたフェニルプロパン単位とクマラン骨格を形成した構造（アリールクマラン単位）が発現される。これらの結果、フェノール誘導体側にあったフェノール性水酸基が、リグニン母核側に移動したのと同様の状態となる。このため、オルト位結合ユニットを有するリグノフェノール系誘導体においては、このユニットの存在部位において（１）Ｃ２アリールエーテル結の開裂による低分子化、（２）アリールクマラン構造の発現、（３）Ｃ２アリールエーテル結合で結合されていたリグニン母核側におけるフェノール性水酸基が発現する。
【００３６】
当該アルカリ処理は、具体的には、リグニン一次誘導体をアルカリ溶液に溶解し、一定時間反応させ、必要であれば、加熱することにより行う。この処理に用いることのできるアルカリ溶液は、リグニン一次誘導体中の導入フェノール化合物のフェノール性水酸基を解離させることができるものであればよく、特に、アルカリの種類及び濃度、溶媒の種類等は限定されない。アルカリ下において前記フェノール性水酸基の解離が生じれば、隣接基関与効果により、クマラン構造が形成されるからである。アルカリ溶液としては特に限定しない。処理に供するリグニン誘導体が溶解するものであればよく、アルコールなどの適当な有機溶媒あるいは当該有機溶媒と水との混液であってもよい。例えば、ｐ−クレゾールを導入したリグニン一次誘導体では、水酸化ナトリウム溶液を用いることができる。例えば、アルカリ溶液のアルカリ濃度範囲は０．５〜２Ｎとし、処理時間は１〜５時間程度とすることができる。また、アルカリ溶液中のリグニン一次誘導体は、加熱されることにより、容易にクマラン構造を発現する。加熱に際しての、温度、圧力等の条件は、特に限定することなく適宜設定することができる。例えば、アルカリ溶液を１００℃以上（例えば、１４０℃程度）に加熱することによりリグニン一次誘導体の低分子化を達成することができる。さらに、アルカリ溶液を加圧下においてその沸点以上に加熱して一次誘導体の低分子化を行ってもよい。
【００３７】
なお、同じアルカリ溶液で同濃度においては、加熱温度が１２０℃〜１４０℃の範囲では、加熱温度が高い程、Ｃ２−アリールエーテル結合の開裂による低分子化が促進されることがわかっている。また、該温度範囲で、加熱温度が高い程、リグニン母体由来の芳香核由来のフェノール性水酸基が増加し、導入されたフェノール化合物由来のフェノール性水酸基が減少することがわかっている。したがって、低分子化の程度及びフェノール性水酸基部位のＣ１位導入フェノール化合物側からリグニン母体のフェノール核への変換の程度を、反応温度により調整することができる。すなわち、低分子化が促進され、あるいは、より多くのフェノール性水酸基部位がＣ１位導入フェノール誘導体側からリグニン母体へ変換されたアリールクマラン体を得るには８０〜１４０℃程度の反応温度が好ましい。
【００３８】
Ｃ１フェノール核の隣接基関与によるＣ２−アリールエーテルの開裂は、上述したようにアリールクマラン構造の形成を伴うが、リグノフェノール系誘導体の架橋体の低分子化は、必ずしもアリールクラマンが効率よく生成する条件下（１４０℃付近）で行う必要はなく、より高い温度（例えば１７０℃付近）で行うこともできる。この場合、一旦生成したクラマン環は開裂し、導入フェノール誘導体側にフェノール性水酸基が再生される結果、１４０℃処理物とは特性の異なるよりフェノール活性が高い素材を誘導することができる。本発明のリグニン誘導体としては、１５０℃以上１８０℃以下、好ましくは、１６０℃以上１８０℃以下、さらに好ましくは、約１７０℃でのアルカリ処理を採用することができる。
【００３９】
以上のことから、アルカリ処理における加熱温度は、特に限定されないが好ましくは８０℃以上２００℃以下である。８０℃を大きく下回ると、反応が十分に進行せず、２００℃を大きく越えると好ましくない副反応が派生しやすくなるからである。
【００４０】
クラマン構造の形成とそれに伴う低分子化のための処理の好ましい一例としては、０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液をアルカリ溶液として用い、１４０℃で加熱時間６０分という条件を挙げることができる。また、０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液をアルカリ溶液として用い、１７０℃で加熱時間６０分という条件を挙げることができる。
【００４１】
アルカリ処理して水溶性のリグニン二次誘導体を得る方法としては、アルカリ処理反応液を中和後、その水溶性区分を遠心分離等により分離採取し、これを透析等により脱塩し、凍結乾燥等する方法を採用することができる。脱塩後の液をそのまま水溶性リグニン二次誘導体含有組成物として用いることもできる。なお、アルカリ処理反応液中和後の水不溶性区分は、水不溶性リグニン二次誘導体として後述するカルボキシアルキル化三次誘導体の前駆体となる。水溶性リグニン二次誘導体は、重量平均分子量は７００以上１００００以下とすることが好ましく、より好ましくは、７００以上６０００以下である。また、水不溶性のリグニン二次誘導体の重量平均分子量は７００以上１００００以下、好ましくは７００以上６０００以下である。
【００４２】
（カルボキシアルキル化による二次誘導体化及び三次誘導体化）
一次誘導体及び、水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して、カルボキシアルキル基を導入することによりカルボキシアルキル化二次誘導体及び三次誘導体を得ることができる。カルボキシルアルキル基におけるアルキル基は、炭素数１〜５の直鎖あるいは分枝アルキル基であることが好ましく、より好ましくは、炭素数１〜３の直鎖アルキル基である。たとえば、メチル基、エチル基、プロピル基を用いることができる。カルボキシルアルキル基は、リグニン誘導体中のアルコール性あるいはフェノール性水酸基に導入される。カルボキシアルキル化は、一般に、アルカリ存在下に、モノハロゲノアルキルカルボン酸と反応させることにより達成することができる。リグニン誘導体のカルボキシアルキル化法は従来公知の各種方法を採用することができる。例えば、リグニン一次誘導体を、この誘導体を分散できるイソプロパノールなどの有機溶媒で分散し、その後、アルカリ水溶液を加え、必要に応じてさらにイソプロパノールなどの有機溶媒を加えて得られた不均一混合溶液をモノクロロ酢酸などのモノハロゲノ酢酸（カルボキシアルキル化剤）を添加し、攪拌等しながら反応させることができる。また、リグニン誘導体を予めアルカリ溶液に浸漬した後、この浸漬物を有機溶媒に分散して、その後反応させることもできる。なお、アルカリとしては、一般に用いられるアルカリ試薬でよいが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属化合物のような強アルカリが好適に用いられる。また、リグニン誘導体等を分散する有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン化物、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素類等が挙げられ、これらは単独であるいは２種以上混合して使用される。これらの中でも、アルコール類、ケトン類、エーテル類等の極性有機溶媒の１種又は２種以上の組合せが良く、さらに好ましくは、イソプロパノール、アセトン、１，４−ジオキサンが用いられる。
【００４３】
モノハロゲノアルキルカルボン酸は、次の一般式〔Ｉ〕で表わされるものが好ましく用いられる。
ＸＲＣＯＯＨ 〔Ｉ〕
（上式中、Ｘ及びＲはそれぞれ以下のものを表わす。
Ｘ：Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等のハロゲン原子、Ｒ：炭素数１〜５の直鎖及び分枝を有するアルキル基。）
上記化合物中、特にＸがＣｌ又はＢｒ原子で、炭素数が１〜３の直鎖アルキル基を有するものが好ましい。
【００４４】
上記モノハロゲノアルキルカルボン酸の使用量は、リグニン誘導体が備える水酸基量以上あれば良く、水酸基あたり、約１〜３モルであることが好ましい。モノハロゲノアルキルカルボン酸の添加方法としては、固体のまま及び／又はこの有機溶媒の溶液として、一括あるいは連続滴下で添加すれば良い。好ましいのは、有機溶媒の溶液として０．５〜３時間かけた連続滴下の方法であり、特に１〜２時間で連続滴下することが好ましい。また、モノハロゲノアルキルカルボン酸の添加終了後、その温度で０．５〜５時間（より好ましくは１〜４時間）反応を続けることが好適である。なお、モノハロゲノアルキルカルボン酸による反応にあたり、反応液を４０℃〜６０℃程度の範囲で加熱することが好ましい。
【００４５】
カルボキシアルキル化二次及び三次誘導体は、固形生成物の他、一部溶解した状態で得られる。固形生成物は、反応終了後、ろ過等により固形の生成物を分離採取し、この固形物を水に溶解させ、希鉱酸、例えば希塩酸、希硫酸等の酸で中性に中和した後、電気透析で脱塩し、凍結乾燥等して得ることができる。また、溶解生成物は、上記ろ液中の有機溶媒を留去し、溶解物を乾固させ、この乾固物を中和前の固形生成物に添加することにより、回収することができる。本発明においては、１価のフェノール化合物の一次誘導体をカルボキシアルキル化した二次誘導体が好ましい形態であり、より好ましくは、１価のフェノール化合物がクレゾール又はバニリンであり、さらに好ましくは、カルボキシメチル化された形態である。さらに、リグノセルロース材料としてタケを用いることが好ましい。また、１価のフェノール化合物の一次誘導体をアルカリ処理して得られた水溶性及び／又は水不溶性の二次誘導体のカルボキシメチル化した三次誘導体も好ましい形態であり、さらに、当該水溶性の二次誘導体をカルボキシメチル化したものが好ましく、より好ましくは、１価のフェノール化合物がクレゾールである形態であり、カルボキシメチル化された形態である。
【００４６】
（眼疾患予防・治療剤及び視神経細胞保護剤）
以上説明した本発明におけるリグニン誘導体、すなわち、上記した二次誘導体及び三次誘導体は、ヒトを含む哺乳動物の視神経細胞に、眼疾患の原因となりうる視神経細胞の細胞死への抵抗性を付与することができる。すなわち、網膜神経節細胞などの視神経細胞の細胞死抑制作用を発揮して視神経細胞を保護することができる。これにより、眼疾患の予防・治療剤として使用できるとともに、視神経細胞保護剤としても使用することができる。
【００４７】
こうしたリグニン誘導体における視神経細胞保護作用は各種の条件で視神経細胞死を誘導して、リグニン誘導体の細胞死抑制活性を測定することにより確認することができる。こうした視神経細胞の細胞死誘導条件としては、例えば、酸素及び／又はグルコース欠乏による視神経細胞死条件、tunicamycinによる小胞体ストレス誘導による視神経細胞死条件及びＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）などによる小胞体ストレス誘導及び／又は細胞内Ｃａ２+濃度上昇による視神経細胞死誘導条件などを用いることができる。したがって、本発明におけるリグニン誘導体は、こうした視神経細胞の細胞死に対する細胞保護剤としても用いることができるほかこうした視神経細胞死が原因となりうる眼疾患の予防・治療剤として用いることができる。
【００４８】
本発明におけるリグニン誘導体が有効な視神経細胞は、網膜神経節細胞、アマクリン細胞（無軸索細胞）、双極細胞、水平細胞、視細胞（光受容細胞）、インタープレキシフィルム細胞及びミューラー細胞（網膜グリア細胞）などが挙げられる。また、本発明におけるリグニン誘導体は、ヒトを含む動物に有効であるが、特に、ヒトを含む哺乳類に有効である。
【００４９】
本発明におけるリグニン誘導体が対象とする眼疾患は、ヒトを含む哺乳類の眼疾患であることが好ましい。本発明におけるリグニンが有効な眼疾患としては、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病等に代表される網膜疾患や緑内障などの視神経障害を伴う眼疾患が挙げられる。
【００５０】
本発明におけるリグニン誘導体は、必要に応じて、医薬として許容される添加剤を加え、単独製剤または配合製剤として汎用されている技術を用いて製剤化することができる。
【００５１】
本発明の眼疾患の予防・治療剤及び細胞保護剤は、非経口でも、経口でも投与することができる。非経口投与の剤型としては、点眼剤、注射剤、点鼻剤などが、経口投与の剤型としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、散剤などが挙げられ、汎用される技術を用いて製剤化することができる。
【００５２】
例えば、点眼剤であれば、添加物として、等張化剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、保存剤等を適宜配合することができる。また、ｐＨ調節剤、増粘剤、分散剤などを添加することにより、薬物を懸濁化させて、安定な点眼剤を得ることもできる。等張化剤としては、例えばグリセリン、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ソルビトール、マンニトール等を挙げることができる。緩衝剤としては例えば、リン酸、リン酸塩、クエン酸、酢酸、ε-アミノカプロン酸等を挙げることができる。ｐＨ調節剤としては、例えば塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ホウ酸、ホウ砂、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等を挙げることができる。可溶化剤としては、例えばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、マクロゴール４０００等を挙げることができる。増粘剤、分散剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース系高分子、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等を、また、安定化剤としては、例えばエデト酸、エデト酸ナトリウム等を挙げることができる。保存剤（防腐剤）としては、例えば汎用のソルビン酸、ソルビン酸カリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール等が挙げられ、これらの保存剤を組み合わせて使用することもできる。
【００５３】
点眼剤のｐＨは眼科製剤に許容される範囲内にあればよいが、４．０〜８．５の範囲が好ましく、また、浸透圧比を１．０付近に設定することが望ましい。また、注射剤には、溶液、懸濁液、乳濁液および用時液中に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤が包含され、例えば薬物を液中に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。
【００５４】
また、注射剤は、滅菌精製水及び等張化のための塩化ナトリウムなどを用いて調製することができる。
【００５５】
また、錠剤は、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、無水リン酸水素カルシウム、デンプン、ショ糖等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポピドン、デンプン、部分アルファー化デンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤；ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、デンプン、部分アルファー化デンプン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、含水二酸化ケイ素、硬化油等の滑沢剤；精製白糖、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン等のコーティング剤；クエン酸、アスパルテーム、アスコルビン酸、メントール等の矯味剤などを適宜選択して用い製剤化することができる。
【００５６】
投与量は症状、年令、剤型等によって適宜選択できるが、点眼剤であれば０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）のものを１日１回〜数回点眼すればよく、注射剤であれば通常１日０．１ｍｇ〜２５０ｍｇを１回または数回に分けて投与すればよい。また、経口剤であれば通常１日当り２５０ｍｇ〜２．５ｇを１回または数回に分けて投与することができる。必要により上記範囲外の量を用いることができる。
【００５７】
リグニン誘導体が非生理的細胞死抑制活性及び細胞保護活性を有することにより、これらのリグニン誘導体を非生理的細胞死抑制剤及び細胞保護剤などの試薬として使用することができる。例えば、各種培養細胞系へ直接投与することにより、不適切に誘導されるアポトーシスに対して細胞を保護することができる。これらの試薬の形態は特に限定されないが、例えば、粉末などの固形剤、又は有機溶剤若しくは含水有機溶剤に溶解した液体剤などを挙げることができる。通常、上記の化合物を試薬として用いて非生理的細胞死抑制作用及び細胞保護作用を発揮させるための効果的な使用濃度は、１０〜５０μＭであるが、適切な使用量は培養細胞系の種類や使用目的により異なり当業者が適宜選択可能である。また、動物に投与する場合、血中濃度１０〜１００μＭであることがこのましい。また、必要により上記範囲外の量を用いることができる。
【００５８】
さらに、本剤は、経口あるいは腸管経由の栄養補助材（食品）としても有用である。食品の形態は、従来公知の各種形態を採ることができる。また、食品添加物としても用いることができる。栄養補助食品として摂取する場合、好ましい摂取量としては、１日あたり２５０ｍｇ〜２．５ｇ程度であり、必要により上記範囲外の量を用いることができる。
【００５９】
また、本発明におけるリグニン誘導体は有効な視神経細胞保護活性を有していることから、これらの化合物をリード化合物として、非生理的細胞死抑制活性及び細胞保護活性を指標としてさらに有用な化合物を探索し、得ることができる。
【００６０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【実施例１】
【００６１】
（カルボキシメチル化リグノクレゾール及びカルボキシメチル化リグノバニリンの調製）
タケ（葉を除いた茎部）に含まれるリグニンの基本単位（フェニルプロパン単位、Ｃ9）に対し、フェノール化合物としてｐ−クレゾールまたはバニリン２モルをアセトンに溶解させた。各アセトン溶液をタケ粉末脱脂試料に一昼夜浸漬させた後、アセトンを完全に留去、風乾することにより、それぞれのフェノール化合物を脱脂試料に収着させた。これら収着試料に６８ｗｔ％硫酸（４ｍｌ／ｇ脱脂試料）を加えて３０℃、１時間、攪拌した。攪拌終了後、反応系を大過剰の水に投入し、反応系の硫酸濃度を１０％程度まで希釈した。この時生じる不溶解沈殿物を遠心分離にて分離し、硫酸と未反応のフェノール化合物を取除き、洗浄した後、五酸化リン上で減圧乾燥させた。完全に乾燥した不溶解沈殿物にアセトンを加え、一昼夜攪拌した。その後、不溶物を遠心分離にて取除いた。また、抽出物をエバポレーターで濃縮した後、大過剰のジエチルエーテルに滴下し、その不溶解沈殿物を遠心分離、洗浄し、リグノフェノール試料として、タケ由来のリグノクレゾール（重量平均分子量；７２００、ｐ−クレゾール導入量；２８ｗｔ％）およびリグノバニリン（重量平均分子量；５０５０、バニリン導入量；２９ｗｔ％）を得た。なお、フェノール化合物の導入量はＮＭＲ解析により測定した。
【００６２】
得られた各リグノフェノール試料（リグノクレゾールおよびリグノバニリン）１ｇを容器に取り、イソプロピルアルコール４ｇに分散させた。その後、この分散溶液に４０％水酸化ナトリウム水溶液６．２５ｇを加え、十分に静置した。静置後、さらにイソプロピルアルコール１２ｇを加え、撹拌し、容器内の溶液を不均一混合分散溶液にした。この分散溶液の温度を５０℃に維持し、別に調製したモノクロロ酢酸溶液（モノクロロ酢酸（リグノフェノール試料中の水酸基あたり約１．３ｍｏｌ）をイソプロピルアルコール４ｇに溶解させた溶液）を１時間かけて添加した。添加後、さらに５０℃で２時間攪拌し、反応させた。反応過程において反応系には水酸化ナトリウムを含むカルボキシメチル化誘導体の沈殿物が生じるため、反応終了後、この沈殿物をろ別した。沈殿物を水に溶解し、この溶液を１Ｎ塩酸にて中和し、さらにｐＨ２まで酸性化した。このとき生じた沈殿物を遠心分離にて分離、取り除いた後、上澄み液を透析にて脱塩した。脱塩した溶液を凍結乾燥し、カルボキシメチル化誘導体として、それぞれタケ由来のＣＭ化リグノクレゾール（試料１、重量平均分子量；５３３０、カルボキシメチル基量；１１．６ｗｔ％）およびＣＭ化リグノバニリン（試料２、重量平均分子量；４５００、カルボキシメチル基量；２０ｗｔ％）を得た。なお、カルボキシメチル基量はNMR解析及び水酸化テトラ-n-ブチルアンモニウムを用いた非水系電位差滴定により算出した。
【００６３】
このように得られたリグノフェノール系誘導体の視神経保護作用を検討すべく、（１）ＰＣ１２細胞を用いた低酸素・低グルコース（ＯＧＤ）誘導性の虚血様細胞死に対する作用、（２）PC１2細胞を用いたtunicamycin投与によって誘発される細胞死に対する作用、（３）ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮＭＤＡ投与による網膜障害モデルマウスに対する作用を試験した。
【実施例２】
【００６４】
（低酸素・低グルコース（ＯＧＤ）誘導性の虚血様細胞死に対する作用の評価）
酸素や栄養の供給が不足すれば、網膜神経細胞は死に至り、視神経障害が引き起こされることから、低酸素・低グルコース（ＯＧＤ）誘導性の虚血様細胞死に対する作用を試験した。
【００６５】
（評価方法）
ＰＣ１２細胞をコラーゲンコートされた２４ウェルプレート上に２×１０5細胞／ウェルとなるように播種し、１０％ウマ血清と５％牛胎仔血清を含有させたダルベッコ変法イーグル基礎培地にて２日間培養した。培養２日後、虚血様細胞死を誘導するため、低酸素・低グルコース（ＯＧＤ）処理を行った。低グルコース処理としては、培地をグルコースを含有しないダルベッコ変法イーグル基礎培地（溶媒）に交換し、あるいは、培地をＣＭ化リグノフェノール試料１または試料２（１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ）を添加したグルコースを含有しないダルベッコ変法イーグル基礎培地に交換し、その後、低酸素処理として雰囲気を９４％Ｎ2、５％ＣＯ２、１％Ｏ２条件に変更し、４時間培養した。ＯＧＤ処理後、１ｇ／１ グルコース、１％牛胎仔血清になるようにグルコースおよび牛胎仔血清を培地に加え、１８時間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。その後、CellQuanti-BlueTM Cell Viability Assay Kits (BioAssaySystems)を用いてレサズリン還元法により細胞の生存率を算出した。すなわち、培地にレサズリン溶液を加え、３時間インキュベートし、この各群の蛍光強度を測定（励起波長５３０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍ）した。濃青色のレサズリンは生存細胞によって還元されピンク色の蛍光を発するレゾルフィンに変換されるため、蛍光強度が生存細胞数に相関することから、ＯＧＤ処理を全く行なわなかった対照群の蛍光強度を対照群の細胞生存率（１００％）として、各群の蛍光強度との差から対照群に対する各群の生存率を算出した。ＯＧＤ処理のみを行った群を「溶媒群」として、ＯＧＤ処理と各ＣＭ化リグノフェノール試料の添加を行った群をそれぞれ「試料１群」および「試料２群」として比較した。その結果を図１のグラフに示す。なお、グラフ中の棒は各群の平均値を、誤差線は標準誤差を示す。
【００６６】
図１に示す結果から、細胞レベルにおいて、リグニン誘導体は網膜疾患や視神経障害を伴う眼疾患に深く関与する細胞死に対して濃度依存的に顕著に抑制する効果を有していることがわかる。
【実施例３】
【００６７】
（tunicamycin投与による小胞体ストレス誘導性細胞死に対する作用の評価）
tunicamycinは、ヌクレオシド系抗生物質であり、N-アセチルグルコサミンと類似した構造を有する。そのためtunicamycinは、糖供与体ウリジン２リン酸-Ｎ-アセチルグルコサミン (UDP-GlcNAc) からN-アセチルグルコサミンの転移酵素（ポリペプチド転移酵素あるいはO-GlcNAc転移酵素 (OGT)）やUDP-GlcNAcと結合し、酵素活性を阻害する。これにより、異常タンパク質が細胞の小胞体に過剰に蓄積され小胞体ストレスが惹起され、細胞死が誘発される。小胞体ストレス誘導によっても網膜障害は引き起こされることが知られていることから、tunicamycin投与によって誘発される細胞死に対する作用を試験した。（なお、このtunicamycin誘発細胞死に対して各種抗酸化剤、カルシウム拮抗剤などは効果を示さない（第２回岐阜脳科学研究会、講演要旨集、ｐ２５）。）
【００６８】
（評価方法）
ＰＣ１２細胞をコラーゲンコートされた９６ウェルプレート上に２×１０５細胞／ウェルとなるように播種し、１０％ウマ血清と５％牛胎仔血清を含有させたダルベッコ変法イーグル基礎培地にて２日間培養した。培養２日後、培地を１％牛胎仔血清を含有させたダルベッコ変法イーグル基礎培地（溶媒）に交換し、あるいは、培地をＣＭ化リグノフェノール試料１または試料２（１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ）を添加した１％牛胎仔血清を含有させたダルベッコ変法イーグル基礎培地に交換した。培地交換の１時間後、培地中のtunicamycin濃度が２μｇ／ｍｌになるようにリン酸緩衝液（０．１％ジメチルスルホキシド含有）で希釈しながらtunicamycinを投与し、２４時間培養（３７℃、５％ＣＯ２）し、tunicamycin処理を行った。その後、CellQuanti-BlueTM Cell Viability Assay Kits (BioAssay Systems)を用いて、レサズリン還元法により細胞の生死判定を行った。すなわち、培地にレサズリン溶液を加え、３時間インキュベートし、この各群の蛍光強度を測定した（励起波長５３０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍ）。濃青色のレサズリンは生存細胞によって還元されピンク色の蛍光を発するレゾルフィンに変換されるため、蛍光強度が生存細胞の数に相関する。このことから、tunicamycin処理を全く行なわなかった対照群の蛍光強度を対照群の細胞生存率（１００％）として、各群の蛍光強度との差から対照群に対する各群の生存率を算出した。tunicamycin処理のみを行った群を「溶媒群」として、tunicamycin処理と各ＣＭ化リグノフェノール試料の添加を行った群をそれぞれ「試料１群」および「試料２群」として比較した。その結果を図２のグラフに示す。なお、グラフ中の棒は各群の平均値を、誤差線は標準誤差を示す。
【００６９】
図２に示す結果から、細胞レベルにおいて、リグニン誘導体は網膜疾患や視神経障害を伴う眼疾患に深く関与する細胞死に対して濃度依存的に顕著に抑制する効果を有していることがわかる。
【実施例４】
【００７０】
（in vivo ＮＭＤＡ投与による小胞体ストレス誘導性細胞死に対する作用の評価）
Ｎ-メチル-Ｄ-アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）は、神経伝達物質であるグルタミン酸の受容体のひとつであるＮＭＤＡ受容体に結合することにより細胞内Ｃａ２＋濃度を上昇させ細胞死を誘導する。正常眼圧緑内障発症メカニズムはその下流においてＮＭＤＡ受容体が関与しており、ＮＭＤＡ拮抗剤であるメマンチンはアメリカにおいて正常眼圧緑内障の臨床試験段階にある（第２回岐阜脳科学研究会、講演要旨集、ｐ１５）。これらのことから、マウスの硝子体にＮＭＤＡを直接投与してｉｎ ｖｉｖｏ網膜障害モデルマウスを調製し、その網膜細胞に対する作用を試験した。
【００７１】
（評価方法）
ｄｄｙ系雄性マウス（体重；３６〜３９ｇ 、日本ＳＬＣ（株））に小動物用麻酔器（笑気ガス７０％、酸素ガス３０％環境下）を使い、イソフルランにて麻酔（麻酔導入時；２％イソフルラン、麻酔維持時；１％イソフルラン）を行った。その後、１０ｍＭ  Ｎ-メチル-Ｄ-アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）を含有する生理食塩水（ＮＭＤＡ溶媒）を注射針にてマウス硝子体内に投与 （ＮＭＤＡ投与量；２ｎｍｏｌ／ｅｙｅ）し、または、ＮＭＤＡ投与と同時にＣＭ化リグノフェノール試料１を含有する生理食塩液をマウス硝子体内に投与（ＮＭＤＡ投与量；２ｎｍｏｌ／ｅｙｅ、ＣＭ化リグノフェノール試料投与量；０．０１ｎｍｏｌ／ｅｙｅまたは０．１ｎｍｏｌ／ｅｙｅ）し、網膜障害モデルマウスを調製した。なお、網膜障害モデルマウスには抗炎症の目的でＮＭＤＡ直後にレボフロキサシン点眼液 （参天製薬株式会社）を点眼した。ＮＭＤＡ投与7日後に組織学的解析のために、マウスの眼を頸椎脱臼後に摘出した。摘出後、それぞれの眼に固定液である４％パラホルムアルデヒド溶液を硝子体内投与し、その溶液に４℃下で少なくとも２４時間以上浸した。パラフィン包埋、薄切し、ヘマトキシリン−エオジンで染色した病理組織切片６枚（４μｍ厚）を作製した。網膜神経障害を評価するサンプルは、１眼につき視神経乳頭部が入るように採取した６枚の切片のうち無作為に３枚の切片を選択し、組織学的解析に用いた。選択した切片について、視神経乳頭から３７５μｍ〜６２５μｍ間の網膜の写真撮影を行い、網膜における網膜神経節細胞 （ＲＧＣ） の数および内網状層（ＩＰＬ）の厚さを計測し、組織学的解析を行った。ＮＭＤＡ溶媒を投与して網膜神経障害を惹起させた群、ＮＭＤＡ溶媒と同時にＣＭ化リグノフェノール試料１を投与して網膜神経障害を惹起させた群をそれぞれ「ＮＭＤＡ溶媒群」、「試料１投与群」とした。これらの結果を全く処理を施していない「対照群」についての対応する計測値と比較した。写真撮影の結果を図３に、網膜におけるＲＧＣの数およびＩＰＬの厚さの計測結果をそれぞれ図４および図５のグラフに示す。なお、グラフ中の棒は各群の平均値を、誤差線は標準誤差を示す。
【００７２】
図３、図４、図５に示す結果から明らかなように、生体の網膜においてもリグニン誘導体は神経節細胞中の細胞数の減少及び内網状層の菲薄化を抑制する効果に優れていることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】低酸素・低グルコース誘導による各群の細胞生存率を示すグラフ
【図２】tunicamycin投与による各群の細胞生存率を示すグラフ
【図３】NMDA投与による各群のマウス網膜断面を示す顕微写真
【図４】NMDA投与による各群のマウス網膜の神経節細胞（ＲＧＣ）数を示すグラフ
【図５】NMDA投与によるマウス網膜の内網状層（ＩＰＬ）厚を示すグラフ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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