(57)【要約】【課題】本発明の目的はチップ作製にかかる労力、コスト、時間、資源を全体として下げることのできるバイオチップを提供することである。【解決手段】プローブ固相化反応アレイであって、前記アレイの基盤に線状に固相化されたプローブと、前記アレイに形成された線状の流路とを備え、前記線状に固相化されたプローブと前記線状の流路は、交するように配置されていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。また、本発明は、プローブ固相化反応アレイを製造するための方法であって、前記アレイの基盤にプローブを線状に固相化することと、前記固相化された線状プローブと交するように、前記アレイに流路を形成することとを含む方法を提供する。【選択図】      図１
2008134188.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ固相化反応アレイであって、
前記アレイの基盤に線状に固相化されたプローブと、
前記アレイに形成された線状の流路と、
を備え、前記線状に固相化されたプローブと前記線状の流路は、交するように配置されていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項２】
請求項1に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記線状に固相化されたプローブは、複数の異なる線状プローブが互いに並行した状態で配置されていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項３】
請求項1または2に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記アレイに形成された線状の流路は、線状の溝が形成された区画区切り基材によって形成されることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか1項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、基盤に直接固定化されていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか1項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、基盤に間接的に固定化されていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか1項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記線状に固相化されたプローブと前記線状の流路は、直交する配置であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか1項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、核酸、タンパク質、抗体または抗原からなるプローブ群から選択される一以上のプローブであることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか一項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、核酸プローブであることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項９】
プローブ固相化反応アレイを製造するための方法であって、
前記アレイの基盤にプローブを線状に固相化することと、
前記固相化された線状プローブと交するように、前記アレイに流路を形成することと、
を含む方法。
【請求項１０】
請求項9に記載の方法であって、
前記プローブは、複数の異なる線状プローブを互いに並行した状態に配置することを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項１１】
請求項9または10に記載の方法であって、前記アレイに形成される線状の流路は、線状の溝が形成された区画区切り基材によって形成することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法であって、前記プローブを基盤に直接固定化することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項9〜12のいずれか1項に記載の方法であって、前記プローブを基盤に間接的に固定化することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項9〜13のいずれか1項に記載の方法であって、前記線状に固相化するプローブと前記線状の流路は、直交する配置で形成することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項9〜14のいずれか1項に記載の方法であって、前記プローブは、核酸、タンパク質、抗体または抗原からなるプローブ群から選択される一以上のプローブであることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項9〜15のいずれか一項に記載の方法であって、前記プローブは、核酸プローブであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブ固相化反応アレイに関する。より詳細には、核酸およびタンパク質などの解析に使用するためのプローブ固相化反応アレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオチップと呼ばれる特定のバイオ分子や細胞等を大量かつ同時並行的に解析する手法が注目を浴びている。バイオチップとは、DNA、蛋白質、糖鎖糖のバイオ分子、あるいは細胞等を支持体上に固定化し、固定化されたバイオ分子等（プローブと称する）と、バイオ分子あるいはそれ以外の化合物（ターゲットと称する）とを接触させ、生じた特異的な相互作用を検出する生化学的な手法の中で、特に相互作用を大量かつ同時並行的に行うことによりハイスループットな検出／解析を可能にしたものである。具体的には、すでに遺伝子解析分野で広く利用されるようになってきた基板上に核酸を高密度に固定化し、ハイブリダイゼーションにより相補的な配列の存在を検出するDNAチップ（DNAマイクロアレイとも）や、今後利用の期待される蛋白質を固定化し相互作用を検出する蛋白質チップ（プロテイン・チップ）などがある。
【０００３】
バイオチップのタイプとしては，プローブの固定される支持体の形状で，平板状，ビーズ，キャピラリー／ファイバなどに分かれるが，これらの要素を組み合わせる（平板が区画に分かれている，平板に溝が切られている，ビーズが平板の所定の位置に固定されている，ビーズがキャピラリーの内部あるいは先端に固定されている，キャピラリーが束ねられている，あるいはさらに横断面でスライスされ平板状に加工されている等）ことも可能である．また微細加工技術を利用したmicrofluidic deviceと組み合すこともできる．この他，アレイ化した電極から構成されている，さらに記憶素子／発信装置等の機能を組み込んだエレクトロニクスデバイス化されているものもある．また多孔性の基体にプローブを固定し3次元的に相互作用を行うシステムも研究されている．プローブの種類としては，核酸，（ポリ）ペプチド，糖などが代表的である。
【０００４】
近年、このようなバイオチップを臨床、治験、創薬、検診などで用いようとする試みがなされている。Roche Molecular Systems社は2004年12月23日、DNAチップを使った初の臨床検査に対するFDA（米国食品医薬品局）の認可を得た。このバイオチップ「AmpliChip P450」はAffymetrix社製で18merから22merの8000種類以上のプローブが固定されている。このバイオチップを用いてシトクロムP450のうち、CYP2D6（34種類）とCYP2C19（2種類）の多型を調べることが可能である。
【０００５】
このように、研究段階で用いられていたバイオチップがより完成された形で臨床、治験、創薬、検診などで用いられるようになりつつあり、それにともない、より対象を絞ったフォーカス・アレイが求められるようになってきている。
【０００６】
フォーカス・アレイは数を絞ったアレイであり、今まで用いられていたような広域のスクリーニングを対象としたアレイとは異質なものである。しかしながら、検出系の都合などによりアレイの大きさは従来のものと同じであることが大半で、無駄な部分が多く、また価格もあまり下がらないのが現実である。
【０００７】
このような課題に対し、1枚のアレイを区画で区切り、それぞれに異なるサンプルを注入し検出を行うという試みがなされている。このような方法は、Affymetrix方式、Stanford方式双方で行われている。これにより省資源と低価格を同時に実現可能である。
【０００８】
ここで、バイオチップの製造方法としては大きく分けて2種類あり、それぞれAffymetrix方式、Stanford方式と呼ばれることがある。Affymetrix方式は、支持体上でプローブを逐次合成する技術であり、Affymetrix社に代表される半導体製造に用いられるフォトリソグラフィックな手法の転用、露光技術としてはマイクロミラーアレイ、液晶等のイルミネーションマトリックスの利用などがある。この手法は、DNAに限らず高密度ペプチドチップの作製にも利用可能であるが、あまり長いプローブは合成ステップ数が増え、合成収量が低下する懸念があり、装置的に大がかりで高価である。Affymetrix方式の場合、プローブの長さだけ合成手順を繰り返すことになる。例えばAffymetrixで用いている25merのプローブでは、フォトリソグラフィによる合成を25回繰り返すことになる。ただしこの工程には大がかりな設備と特定の施設が必要であり、さらに製品の性能維持が難しく、そのため非常に高価なものにならざるを得ない。また、検出方法やハイブリダイゼーション方法も独自の方法を用いているので、広く普及しているStanford方式アレイの処理装置や検出装置を利用できない。従って別途、設備購入のための出資が必要となり、この方式を利用できる人は非常に限られる。さらに、合成できるプローブ長に限界があるため、複雑な検出対象には向かない。
【０００９】
これに対しStanford方式は、XY軸方向に自由にスポッティング用のピンを駆動できるロボット型のアレイヤーを用いて別途調製済みのプローブを所定の位置に配置する技術であり、市販向けに装置化されたものが大学等の公立研究機関を中心に普及している。ピンの代わりにインクジェット、スタンプ等の手段を用いたものもある。上記のような理由により安価にバイオチップを作製するには、最も広く普及しているStanford方式が望ましい。しかしながらStanford方式では特定の位置にプローブ溶液を直接配置する必要があり、プローブ溶液の特性から、50〜100μm以下の直径をもつスポットを安定的に配置するのは極めて困難である。さらに、55,000種類のプローブを1枚の基板上に配置するには、スポッティングを少なくとも55,000回繰り返さなければならい。さらにピン、またはインクジェットのヘッドなどをプローブを換えるたびに洗浄することは非常に労力のかかる作業である。
【００１０】
しかし、上記のように1枚のアレイを区画に分ける区切りを配置するにあたり、より精度の高いスポッティングと正確に区画を配置する冶具が必要であり、作製工程が複雑になりがちで、期待通りの低コスト化が望めないのが現実である。
【００１１】
どちらの場合においても、チップ作製にかかる労力、コスト、時間、資源は膨大であり、今後の省力、省コスト、省時間、省資源へ向けて多くの課題が残されているのが現状である
【特許文献１】特開2000-135081号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
以上の状況を鑑み、本発明の目的はチップ作製にかかる労力、コスト、時間、資源を全体として下げることのできるバイオチップを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
詳しくは、プローブを1種類ずつ“点”でスポットせず、“線”状にスポットし、多数の検体を1枚のアレイで同時に見るために該線状スポットに対し交差するように区画区切りを配置し、その交点部分のプローブを用いて検出を行うより上記の課題を解決し目的を達成する手段を開発した。さらに詳しくは、線状にスポットする際にプローブを付着させた糸、板、棒などを用い、区画区切りとしては線状の溝を掘ったものを用い、両線状構造が直交するように密着させることによって作製されることを特徴とするバイオチップを完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明の一つの態様において、プローブが基盤に固相化されたプローブ固相化反応アレイであって、
前記アレイの基盤に線状に固相化されたプローブと、
前記アレイに形成された線状の流路と、
を備え、前記線状に固相化されたプローブと前記線状の流路は、交するように配置されていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１５】
また、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記線状に固相化されたプローブは、複数の異なる線状プローブが互いに並行した状態で配置されていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１６】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記アレイに形成された線状の流路は、線状の溝が形成された区画区切り基材によって形成されることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１７】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、基盤に直接固定化されていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１８】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、基盤に間接的に固定化されていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１９】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記線状に固相化されたプローブと前記線状の流路は、直交する配置であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００２０】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、核酸、タンパク質、抗体または抗原からなるプローブ群から選択される一以上のプローブであることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００２１】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、核酸プローブであることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００２２】
また、プローブ固相化反応アレイを製造するための方法であって、
前記アレイの基盤にプローブを線状に固相化することと、
前記固相化された線状プローブと交するように、前記アレイに流路を形成することと、
を含む方法を提供する。
【００２３】
さらに、上記方法であって、
前記プローブは、複数の異なる線状プローブを互いに並行した状態に配置することを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００２４】
さらに、上記方法であって、前記アレイに形成される線状の流路は、線状の溝が形成された区画区切り基材によって形成することを特徴とする方法を提供する。
【００２５】
さらに、上記方法であって、前記プローブを基盤に直接固定化することを特徴とする方法を提供する。
【００２６】
さらに、上記方法であって、前記プローブを基盤に間接的に固定化することを特徴とする方法を提供する。
【００２７】
さらに、上記方法であって、前記線状に固相化するプローブと前記線状の流路は、直交する配置で形成することを特徴とする方法を提供する。
【００２８】
さらに、上記方法であって、前記プローブは、核酸、タンパク質、抗体または抗原からなるプローブ群から選択される一以上のプローブであることを特徴とする方法を提供する。
【００２９】
さらに、上記方法であって、前記プローブは、核酸プローブであることを特徴とする方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明のプローブ固相化反応アレイは、アレイの基盤に線状に固相化されたプローブと、アレイに形成された線状の流路とを備え、線状に固相化されたプローブと前記線状の流路は、交するように配置されていることを特徴とする。
【００３１】
以下、本発明の一態様にかかるプローブ固相化反応アレイについて、反応部がキャピラリー形状のアレイを例にしてその一実施形態を説明する（図1）。
【００３２】
図1（右）は、本発明の一態様にかかるプローブ固相化反応アレイを上面から見た平面図である。プローブ固相化反応アレイ100は、透明なガラス製の基板102と区画区切り基材103を用いて製造されたプローブ固相化反応アレイの例である。
【００３３】
プローブ固相化反応アレイ100の基板102には、複数のプローブが線状に固相化されている。
【００３４】
ここで、本明細書において使用される「プローブ」は、解析する項目により、プローブとしてDNA、RNA等の核酸だけでなく、タンパク質およびその他の物質をプローブとして使用することができる。たとえば、ペプチド、抗原または抗体、あるいはその組み合わせを使用することができる。その場合、検出すべき標的物質に特異的に結合する物質をプローブとして使用する。たとえば、抗原をプローブと使用したときは、その抗原に特異的に結合する抗体を検出することができる。解析する項目により、キャピラリー毎に使用するプローブを変更し、所望のプローブを所望の配置で基盤に固定すればよい。使用するプローブは、当業者であれば解析項目に応じて容易に選択することが可能であろう。好ましいプローブは、核酸プローブである。
【００３５】
本明細書において使用される「核酸」の語は、天然に存在する種々のDNAおよびRNA、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびS-オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類似体などを指す。
【００３６】
また、上記「標的物質」の語は、プローブにより検出されるべき物質をいう。たとえば、核酸、タンパク質などが含まれ、より詳細には、ペプチド、抗原および抗体なども含まれる。一般的に、核酸プローブであれば、標的核酸に相補的な塩基配列を有するように設計される。また、標的物質が抗原であれば、該抗原に特異的に結合可能な抗体がプローブとして使用される。被検試料に含まれる被検核酸が標的配列が有する塩基配列を有している場合には、核酸プローブと標的配列の間にハイブリダイゼーションが生じる。したがって、このハイブリダイゼーションを検出することにより被検試料に含まれる核酸を解析することが可能である。ハイブリダイゼーションの検出はそれ自身公知の手段により行ってよい。
【００３７】
また、上記「被検試料」の語は、生物個体から採取した細胞、組織、臓器、血液、血清、リンパ液、組織、毛髪および耳垢などの生物試料を所望に応じて調製した試料や、人工的に合成または製造した物質を含む試験に供したい試料をいう。また、「被検試料」は必要に応じて、生物試料をホモジネートおよび抽出などの必要な任意の前処理を行って得た試料であってもよい。このような前処理は、対象となる生物試料に応じて当業者によって選択され得るであろう。
【００３８】
上記「個体」の語は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、及びサルを含む任意の哺乳動物、並びに植物および昆虫など哺乳動物以外の生物を示す。  解析項目の種類としては、プローブと標的物質のハイブリダイゼーションまたは結合を検出することによって解析を行うものであれば、どのような解析であってもよい。たとえば遺伝子発現頻度解析、遺伝子多型解析、タンパク質発現頻度解析またはこれらを組み合わせた解析などがあげられる。
【００３９】
上記基板102には、6種類のプローブを並行して配置されているが、プローブは、線状に配置されていれば、どのような形状（たとえば、長さ、向き、および形状）で配置されていてもよい。従って、図1（左）に示したように、必ずしも直線上に配置される必要はない。
【００４０】
また、線状プローブは、用途に合わせて種々の大きさに設定することができるが、実用的には幅が10μm〜数mm、深さ1μm〜500μm、長さ数mm〜100mm、キャピラリー間隔10μm〜数mm程度で充分である。
【００４１】
また、プローブ固相化反応アレイ100の区画区切り基材103には、流路が形成されている。アレイ100に形成される流路は、プローブ基板102に固相化された線状のプローブと交するように配置されていれば、どのような形状（たとえば、長さ、向き、および形状）で形成されていてもよい。また、流路は線状であるが、図1（中）に示したように、必ずしも直線上に配置される必要はない。また、流路は、キャピラリー形状に形成することができる。流路のサイズは、用途に合わせて種々の大きさに設定することができるが、実用的には幅が10μm〜数mm、深さ1μm〜500μm、長さ数mm〜100mm、キャピラリー間隔10μm〜数mm程度で充分である。ただし、反応の効率性を考えると、測定対象となるmRNA、またはmRNAから合成または逆転写したcDNAなどの核酸の拡散速度は毎秒数μmと遅いので、流路の空間の断面形状は、幅を広くしても深さは浅くするような扁平構造をとることにより、反応時間の短縮、試料の微量化、観察視野の増加等が期待できる。
【００４２】
また、流路と線状に配置されたプローブとが「交する」とは、流路もプローブも線状であるために、両者が交差するように配置されて少なくとも1つの交点を有するように配置することをいう。たとえば、図1に示したように、流路もプローブも直線状にして、互いに直交するように配置することができる。また、流路には開口部を設けられているが、通常、開口部は流路の末端に設けられることが好ましいであろう。
【００４３】
図2は、図1（右）に示した本発明のプローブ固相化反応アレイをプローブ107に沿って切断したときの断面図である。
【００４４】
以下、本発明のプローブ固相化反応アレイをその製造方法と共にさらに詳細に説明する。
【００４５】
本発明のプローブ固相化反応アレイは、たとえば図1（中央）に示したように、区画区切り基材を使用して、該区画区切り基材103に溝を形成することによって作製することができる。すなわち、基板102と同じ大きさの区画区切り基材103を用意し、区画区切り基材103にエッチングにより溝を形成する。次いで、基板102と区画区切り基材103を接合することによって、アレイに流路を形成することができる（図1および2）。
【００４６】
基板102にプローブを線状に固相化する方法を以下に説明する。
【００４７】
線状スポッティング  
Stanford方式のバイオチップにおいて、オリゴDNAを用いる場合の一般的な方法として、アミノ基で修飾されたオリゴDNAを基板上に固定化する方法がある。アミノ基で修飾されたオリゴDNAを結合できる基板は数多く市販されている（例えば、TaKaRa-Hubble Slide Glass、TaKaRa）。スポッティングは線状のスポッティング溶液で希釈されたアミノ基修飾オリゴDNAを基板に付着させるだけでよい。スポッティングは室温で行われる。点着後、基板に固相化されなかったオリゴDNAを除去し、スポットされた部分以外にターゲットが付着しないようにブロッキングを行う。
【００４８】
線状にスポットを行う方法としては、糸や板、棒などを用いてスタンピングのような物理接触によりスポットする方法の他、スポッティング液を微量ずつ飛ばして線状にスポットしたりしてもよいし、線状にマスキングし、その上からスポッティング液を付着させた後、マスクをはずすといった方法が考えられる。このとき、スポッティング液は液体である必要はなく、ゲルなどにプローブを含ませたものをスポットする方が乾燥などの影響を受けにくいために適していることもある。これらの方法はいずれもStanford方式でのバイオチップ作製方法であるが、マスキングを用いてAffymetrix方式で作製しても良い。
【００４９】
また、図1に示すように基板102に対し、線状スポット（プローブ）101が直交しているほうが作業効率がよく、自動化も容易である。検出したいサンプルが多い場合には、区画空間（溝）104の数を多くし、線状スポット（プローブ）101との交点である検出スポット（プローブ）105を多くすればよい（図4、図5参照）。
【００５０】
次に、線状スポッティング装置を使用して、図1（左）に示すように基板102に対してプローブ101を線状にスポッティングする場合を例にして説明する。図3には、糸を利用した線状スポッティング装置の概念図を示してある。線状スポッティング装置は、伸縮アーム202、207を持ち、その末端にはスポット・ストリング203が結合されている。このスポット・ストリング203は、伸縮アーム202、207の末端へ容易に着脱可能である。スポット・ストリング203が伸縮アーム（縮）202の末端へ結合した状態で、伸縮アーム（縮）202が基板201へスポットするために必要な長さまで伸長する。その際、不足するスポット・ストリング203は、スポット・ストリング・ストック205から補充され、補充される際にプローブ・ストックＩ206内を通過し、スポット・ストリング203へプローブが付着される（図4）。プローブ・ストックＩ206内には、スポッティング・バッファーに適正濃度に希釈されたプローブ分子が液体、ゲル状、もしくは何らかの吸湿体に保持された状態で保存されている。スポット・ストリング203は、スポットの形状、太さなどに応じて、天然繊維、合成繊維、ポリマーなどを使い分ける。プローブが付着されたスポット・ストリング203の乾燥を防ぐために、線状スポッティング装置のスポット・エリア、もしくは該線状スポッティング装置が設置されている部屋の湿度を適正に保っておくことが必要である。湿度は、スポットの形状、太さ、スポット・ストリング203の材質に応じて設定する。プローブが付着したスポット・ストリング（プローブ付着）208を基板201へ押し付けることによって線状のスポットを形成させる。その際、スポット・ヘッド204を稼動させるか、基板201を稼動させることによって密着させる（図5）。図5ではZ・Xステージ（Z=０）を上昇させ、Z・Xステージ（Z＞0）の状態にすることでスポット・ストリング（プローブ付着）208と基板201を接触させて、線状スポットを形成させている。密着させる圧力の調整は、スポットの形状、太さ、スポット・ストリング203の材質等に応じて調整が必要である。この際、スポット・ヘッド204を稼動させるか、基板201を稼動させることによって密着させる（図2−3）。密着させる圧力の調整は、スポットの形状、太さ、スポッ
ト・ストリング203の材質等に応じて調整が必要である。この際、密着させる圧力とともに、密着させておく時間が重要である。強く密着させすぎると、スポット・ストリング（プローブ付着）208の中心線付近の固相化量が低くなる恐れがある。しかし緩すぎると、スポット形状が不規則に波打ち乱れる恐れがある。また、スポット・ストリング203へプローブ・ストックＩ206からプローブを付着させた後の時間も重要である。スポット環境、特に湿度や気温、さらにはプローブの状態（溶液、ゲルなど）に依存するが、乾燥などによるスポット形状のバラツキを押さえるためにもできるだけすばやくスポッティングを行うことが望ましい。これらの要因をふまえて、本番の点着前にテストでスポットを行い、適正条件を求めておくことが重要である。スポットが終わった段階（図2−4）でスポット・ヘッド204を稼動させるか、Z・Xステージ（Z＞0）211を下降させることによってスポット・ストリング（プローブ付着）208と基板201を離し、不要になったスポット・ストリング（プローブ付着）208をたるまないように廃棄ストリング・ストック209で巻き取りながら伸縮アーム（伸）207を縮め、図3の初期状態へ戻す。同一のプローブを点着し続けるなら、廃棄ストリング・ストック209で巻き取らずに、スポット・ストリング・ストック205で巻き取り再利用することも可能である。ただし、実際に利用においてはコンタミネーションやスポットの均一性などを考慮し、1回ずつ廃棄することが望ましい。
【００５１】
また、プローブを線上に固定する手段は、上記の方法に限定されず、当業者に既知のいずれの方法を使用することもできる。たとえば、基板には、プローブを固相化するために適切な表面処理、たとえば、ポリＬリジン処理、アミノシラン処理および酸化膜処理等の表面処理を行うことが可能である。
【００５２】
さらに、固定化するプローブは、ビーズにあらかじめ固定化されたプローブを使用するなど、間接的に固定化されてもよい。この場合、プローブが固定化されたビーズを基板に固定化することとなる。このようなビーズに所望の核酸プローブを固相するためのプローブ供給手段は、基体の材料により、それ自身公知の何れかの手段を使用することができる。公知の手段を、立体状基体または粒状基体の曲面、特に球面に適用し得るように改良することが可能である。たとえば、曲面体に加工を施した基体上に核酸プローブを配するためには、光固相方式および点着方式の２つの手法を適宜組み合わせて用いることによって曲面の部分領域に対して定量的に核酸プローブを固相することが可能となる。上記ビーズを線上に固定する手段は、上記の方法に限定されず、当業者に既知のいずれの方法を使用することもできる。たとえば、上記線状スポッティング装置によって、プローブの代わりにプローブが固定化されたビーズを使用して固定化することができる。
【００５３】
一方、区画区切り基材103の流路を形成する方法を以下に説明する。
【００５４】
区画区切りによる分画  
チップ上を区切る区切りとしていくつか提案されている。Affymetrixのバイオチップ（Stanford方式のバイオチップにも適応可能）を格子状に区切るものがいくつか提案されているし（Zarrinkar、P. et al.、Arrays or Arrays for High-Throughput Gene Expression Profiling。 Genome Research 1256 (2001)）、溝状に加工された区切りも多く提案されている（特開平11-75812）。
【００５５】
例えば後者の溝状に加工された区切りは、PDMS（polydimethylsiloxan）素材により作製されたもので、PDMS素材の特徴としてはやわらかく、自己吸着性があり、特殊な接合プロセスを必要としないことがあげられる（図7）。このような素材でできた流路は、通常のガラス・スライドやシリコン基板上にスポットされたバイオチップに貼り付けるだけでよく、特殊な接合が必要ないため、容易に利用可能である。
【００５６】
PDMS素材の他にも、シリコンや金属、ガラス、プラスチック等でできた流路を接着剤などを用いて基板上に接合して流路を形成してもよい。また、くぼみを持ったシールを貼ることで流路を形成させることも可能である。ガラスやシリコンウエハ様の基板では、たとえば、フォトリソ−エッチングなどの技術により溝および貫通穴を形成することが可能である。また、プラスチック樹脂やゴムなどの場合には機械加工やモールド加工などにより溝および貫通穴を形成することが可能である。
【００５７】
さらに、本発明のプローブ固相化反応アレイは、上記線状プローブを持つ基板102に溝構造をもつ区画区切り基材103の区画区切りを交差するように貼り付けることによって作製される。線状プローブを持つ基板102に溝構造をもつ区画区切り基材103の区画区切りを交差するように貼り付けることによって、該線状プローブと該区画区切り基材103の区画区切りの溝構造の交点を生じさせる。この交点に生じたプローブのスポットが、検出スポット（プローブ）105として機能することとなる。そして、上記の通りに作製された本発明のプローブ固相化反応アレイにおけるハイブリダイゼーションは、基板102と区画区切り基材103の溝によって形成された区画空間（溝）104内で行われる。そして、該線状プローブのうち、流路に対応する部分のみが、検出スポット（プローブ）105として利用される。
【００５８】
本発明のプローブ固相化反応アレイは、プローブを1種類ずつ“点”でスポットせず、“線”状にスポットし、多数の検体を1枚のアレイで同時に見るために該線状スポットに対し交差するように区画区切りを配置し、その交点部分のプローブを用いて検出を行うより、チップ作製にかかる労力、コスト、時間、資源を全体として下げることのできるバイオチップを提供することができる。
【００５９】
また、2枚の基板の接合は、それ自身公知の手段により、プローブの固定の前または固定後に行われればよい。たとえば、核酸プローブを固定前に接合した場合には、光固相化法（たとえば特表平6-504997参照）を適用して核酸プローブを固定化するのが好ましい。たとえば、シリコン−石英ガラスの場合には、接着剤をスクリーン印刷機により印刷して接着すればよい。たとえば、シリコン−パイレックス（登録商標）ガラスの場合には、半導体プロセスで使用される陽極接合法により、高温および高電圧の下で接合を行えばよい。
【００６０】
上記の例では、基板102に溝を形成したが、区画区切り基材103でもよいし基板102と区画区切り基材103の両方に溝を形成していてもよい。また、基盤の材料として、プローブを固相化する基板102にはガラス製基板を使用し、溝を形成する区画区切り基材103にはPDMS素材を使用したが、これに限定されるものではなく、蓋として用いる基板にシリコン基板を使用し、溝を形成する基板にガラス製基板を使用してもよい。また、使用される2枚の基板を同じ材質としてもよい。また、観察の方向に透過性部材が配置されるように、使用する部材を決定してもよい。あるいは、プラスチック樹脂やゴムなどで形成された基盤を使用してもよい。また、これらの材質、ガラス、シリコン、プラスチック樹脂およびゴムなどの材質で形成された基盤を組み合わせて使用してもよい。また、上記の例では基盤として板状の基板を使用しているが、これに限定されるものではない。
【００６１】
このように形成したプローブ固相化反応アレイを使用して、それぞれの反応部に具備されるプローブに適した反応条件でハイブリダイゼーションが行われる。ハイブリダイゼーション条件は、たとえば、それぞれのキャピラリー毎に温度管理をしてもよい。また、全ての反応部を一定の温度に維持してイオン濃度および塩濃度によって至適反応条件を得てもよい。
【００６２】
本発明のプローブ固相化反応アレイは、Affymetrix方式およびStanford方式のバイオチップと同様に使用することができる。たとえば、本発明のプローブ固相化反応アレイを使用して、以下の実施例に示したように、ハイブリダイゼーションを検出することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明のプローブ固相化反応アレイを作成する方法およびその使用態様の一例を実施例によって説明する。
【００６４】
プローブ固相化反応アレイの作製  
オリゴDNAマイクロアレイの基板としてはHubble Slide Glass (TaKaRa)を用い、この基板に対するスポット推奨バッファーであるSolution I (TaKaRa)を用いてアミノ化オリゴ（プローブ・オリゴ）（SIGMA Genosis）を適正濃度へ希釈し、スポットを行った。スポット溶液の組成詳細を以下に示す。
【００６５】
スポット溶液  
5'−アミノ化オリゴ (23mer、100μM)    1μl  （final conc. 10μM）  
Solution I  （×4）                  2.5μl  
MilliQ                              6.5μl  
total                                10μl
スポット方法としては、上記スポット溶液を市販の糸ようじに含ませ、ガラス基板上に押し付ける形でスポッティングを行った。湿度は〜40%程度で、含ませたスポット溶液が乾燥しないように手早くスポッティングを行った。
【００６６】
スポット後の後処理は、Hubble Slide Glass (TaKaRa)の標準プロトコルに従った。以下にHubble Slide Glassの標準プロトコルの一部を示す。  
Hubble Slide Glass  −  DNAの固定化処理例  
1.  チップ作製装置にてアミノ基を付加したDNAをスライドガラスにスポットする。  
2.  スライドガラスを0.2% SDSで2分間洗浄する。  
3.  ミリQ水で2回洗浄する。  
4.  0.3N NaOHで5分間洗浄する。  
5.  ミリQ水で2回洗浄する。  
6.  沸騰水（ミリQ水）中で2分間煮沸する。  
7.  冷エタノール（4℃）に3分間浸漬する。  
8.  遠心または圧縮窒素ガス等で水分を除去し乾燥する。
【００６７】
TaKaRa - Hubble Slide Glass のサイズは、スライドガラスの標準的な大きさである1インチ×3インチ（25.4mm×76.2mm）、厚さ1.1mm±0.1mmである。一般的なグラスアレイ処理装置で利用可能である。スライドガラス上のスポット可能なエリアは図6（TaKaRaホームページより一部引用）に示す。
【００６８】
後処理の終わったマイクロアレイに、キャピラリ・ラバー（図3参照。詳細な寸法は図7を参照。OLYMPUS）をスポット・ラインと交差するように貼り付け（図1参照）、ハイブリダイゼーション溶液を流路へ流し込み、ハイブリダイゼーションを行った。マイクロアレイは事前に加熱（50℃）しておき、ハイブリダイゼーション溶液も加熱（50℃）してある。ハイブリダイゼーションのインキュベーション条件は50℃、3時間または1時間で、乾燥を防ぐため水を含ませた吸湿紙とともに、密閉可能な容器に入れインキュベーションを行った。ハイブリダイゼーション溶液の詳細な組成は以下のとおりである。
【００６９】
ハイブリダイゼーション溶液  
5'−Cy3修飾オリゴ (46mer、10nM)          1μl (10fmol)
5'−Cy5 修飾オリゴ  (23mer、10nM)        1μl (10fmol)
2×SSC、0。4% SDS Buffer                10μl
MilliQW                                  9μl
total                                    20μl
上記Cy3、Cy5修飾オリゴは、スポットされたプローブ・オリゴと特異的にハイブリダイゼーションするターゲット・オリゴである。
【００７０】
ハイブリダイゼーション反応の後、ハイブリダイゼーション溶液を吸引除去し、キャピラリ・ラバーをはがし、すばやく50℃に加温しておいた大過剰の洗浄溶液中に浸し、穏やかに5分間すすぐ。洗浄溶液の組成は以下のとおりである。
【００７１】
洗浄溶液  
0.1×SSC、0.1% SDS Buffer    大過剰 （50℃）。
【００７２】
続いて洗浄溶液を取り除くために、大過剰のMilliQW (室温) 中で穏やかに1分間すすいだ。MilliQWから取り出した後、遠心または圧縮窒素ガス等で水分を除去した。乾燥後、マイクロアレイ・スキャナー（GenePix 4000B (AXON)）を用いて検出した。PMTレンジは励起波長635nmでは700V、励起波長532nmでは600Vに設定した。
【００７３】
図4は、8連キャピラリ・ラバーを用いた結果で、図5は、同種のチップに対し20連キャピラリ・ラバーを用いた結果である。キャピラリ・ラバーは検体数に応じて使い分ければよい。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明のプローブ固相化反応アレイの一態様を示す図。
【図２】図1のプローブ固相化反応アレイの断面を示す図。
【図３】本発明のプローブ固相化反応アレイの製造方法の一態様を示す図。
【図４】本発明のプローブ固相化反応アレイの製造方法の一態様を示す図。
【図５】本発明のプローブ固相化反応アレイの製造方法の一態様を示す図。
【図６】本発明のプローブ固相化反応アレイの製造方法の一態様を示す図。
【図７】本発明のプローブ固相化反応アレイの製造方法の一態様として、20連キャピラリ・アレイ。
【図８】線状スポット・チップに8連キャピラリ・ラバーを適用した実施例の結果を示す図。
【図９】線状スポット・チップに20連キャピラリ・ラバーを適用した実施例の結果を示す図。
【図１０】TaKaRa - Hubble Slide Glass のスポットエリアを示す図。
【符号の説明】
【００７５】
101・・・線状プローブ
102、201・・・基板
103・・・区画区切り基材
104・・・区画空間（溝）
105、107、・・検出スポット（プローブ）
106・・・溶液出入口
202・・・光学ミラー
203・・・透化窓
204・・・レーザー/PMT
205・・・エアシリンダー
206・・・ガラス粒子
207・・・SiO2被覆
208・・・溶液出入口
202・・・光学ミラー
203・・・透化窓
204・・・レーザー/PMT
205・・・エアシリンダー
206・・・ガラス粒子
207・・・SiO2被覆
208
【図１】
2008134188.tif 000003
【図２】
2008134188.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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