(57)【要約】【課題】短時間で大量の培地を作製可能とし、且つ、培養による性状の変化が少ない魚類筋肉浸漬培地及びこれを利用した高いワクチン効果を有する魚病用ワクチンの提供を課題とする。【解決手段】培地は、新鮮な魚類から切出された魚類筋肉を約１ｃｍ角を粗切りし、得られた魚類筋肉の適当量を４℃に冷却された蒸留水の中に投入し、４℃で２４時間保持し、フィルターによって滅菌濾過することによって作製される液体のものである。この培地を用いて魚類病原細菌の分離を行うと、従来に比べて病原性の低下がほとんどない分離株を得ることができ、さらに該魚類病原細菌に対し、不活化処理を行うことにより、魚類の感染する可能性の高い冷水病等の感染を防止する高いワクチン効果の魚類用ワクチンが作製される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮の除去された魚類を粗切りして得られた魚類筋肉を低温の蒸留水に浸漬し、所定の時間経過後に、濾過滅菌して形成されることを特徴とする魚類筋肉浸漬培地。
【請求項２】
前記魚類筋肉は、
４℃の前記蒸留水に２４時間浸漬され、
０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過滅菌されることを特徴とする請求項１に記載の魚類筋肉浸漬培地。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載された魚類筋肉浸漬培地を利用して生成される魚病用ワクチンであって、
前記魚類筋肉浸漬培地を形成する際に原料として使用した同種の魚類が感染する魚病の原因となる魚類病原細菌を、前記魚類筋肉浸漬培地に所定量接種し、所定温度で培養することによって前記魚類病原細菌を増殖させ、得られた培養菌を不活化処理して形成されることを特徴とする魚病用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類筋肉浸漬培地、及び魚病用ワクチンに関するものであり、特に、大量製造が可能であって、且つ、魚類病原細菌の病原性を低下させることなく培養可能な魚類筋肉浸漬培地、及び該魚類筋肉浸漬培地を使用して形成される魚病用ワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、各種細菌等の試験及び研究開発においては、哺乳類由来等の培地が一般的に使用されている。この場合、試験及び研究開発を行う各研究機関では、市販されている培地をそのまま用いたり、或いは複数種類の市販の培地を所定比率で混合し、組合わせた所謂「自家配合」の培地が用いられている。
【０００３】
そして、係る培地を利用し、例えば、魚類の病気の原因となる魚類病原細菌を培養し、魚病を抑制するためのワクチン等の開発を行っている。魚類病原細菌自体の増殖が非常に旺盛な、これら成分からなる培地を利用する。しかしながら、係る増殖によって得られた魚類病原細菌（培養株又は分離株）は、培地に接種された元の魚類病原細菌（野生株）に比べ、対象となる魚類である宿主に対する病原性が低下することが知られている。すなわち、既存の培地は、前述したように哺乳類由来のものが多く存在し、本来の宿主とは異質の成分を含ものである。そのため、何代かに亘って培養を繰り返すうちに、魚類病原細菌自体の病原性等が大きく変化すると考えられる。
【０００４】
一方、上述した哺乳類由来の培地に代えて、魚類を原料とした培地の作製も行われている。例えば、従来のような、哺乳類由来の酵母エキスやペプトン等の比較的高価な原料を用いた培地の代替として、大量廃棄される魚類や貝類の臓物類等の水産廃棄物から、菌類発酵や菌類培地に利用可能な培地の開発も進められている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
さらに、魚類病原細菌による魚類に対する病気の感染を予防するための魚病用のワクチンは、上述した培地を利用して開発されている。一例を示すと、魚類冷水病原因菌において、増殖過程の中で対数比例的に菌の増殖が行われる対数増殖期の菌（不活化菌体）、或いはこれらから得られた有効成分を利用し、魚類冷水病を防ぐためのワクチンに関する技術等が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００６】
また、上記ワクチンとは異なる試みとして、魚類冷水病原因菌の菌体または該菌体に由来する菌体由来リポ多糖類と、魚類冷水病原因菌との複合体を形成し、魚類冷水病に対するワクチンを作製することも行われている（例えば、特許文献３参照）。
【０００７】
【特許文献１】特開平１１−５６３４５号公報
【特許文献２】特開２００４−２１０７６９号公報
【特許文献３】特開２００４−３５２６９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上述した哺乳類由来の培地やこれを利用して作製されたワクチンを使用する場合、以下に掲げる問題を生じる可能性があった。すなわち、既に説明したように、上記のような培地を使用した場合、元の魚類病原細菌（野生株）と培養を繰返した後の魚類病原細菌（培養株：分離株）とでは、その性状が異なり、特に宿主に対する病原性が著しく低下することがあった。したがって、十分なワクチン効果を享受することができなかった。
【０００９】
また、一般的な培地を製造する場合、その原料となる哺乳類の肉類や魚肉をミンチ状に擂り潰した状態にしていた。一般に、肉類や魚類には、当然のことながら、筋肉線維と大量の脂肪分が含まれている。したがって、ミンチ状に擂り潰した肉類等を水中に浸漬すると、切断された筋肉線維や大量の該脂肪分が水中に滲出することになる。そのため、この状態で一般的な孔径を有するメンブレンフィルター等で濾過滅菌の処理を行うと、これら切断された筋肉線維や脂肪分がメンブレンフィルターを目詰まりさせる要因となり、濾過滅菌が困難になる問題があった。その結果、大量の培地の製造は困難であった。そのため、大量に培地を必要とする状況には適していなかった。
【００１０】
さらに、特許文献１に示すような、培地を作製するための出発原料として、魚類や貝類の臓物等を用いるものは、主に廃棄物処理に係る問題を解消したり、水彩廃棄物を利用することによって、培地の作製コストを低下させる、換言すれば、経済性の向上を主目的とするものであった。そのため、培養株と野生株との性状変化を解消することを目的とするものではない。
【００１１】
一方、魚類病原細菌に対するワクチンの形成のために使用する培地は、従来から既知の培地（すなわち、哺乳類由来等のもの）が多く用いられていた。そのため、培養株と野生株との性状変化が必然的に発生していたものと考えられる。
【００１２】
そこで、本発明は上記実情に鑑み、濾過滅菌で大量の培地を作製可能とし、且つ、野生株と培養株との間の性状の変化が少ない魚類筋肉浸漬培地及びこれを利用した高いワクチン効果を有する魚病用ワクチンの提供を課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の課題を解決するため、本発明の魚類筋肉浸漬培地は、「表皮の除去された魚類を粗切りして得られた魚類筋肉を低温の蒸留水に浸漬し、所定の時間経過後に、濾過滅菌して形成される」ものから主に構成されている。
【００１４】
ここで、培地の原料となる魚類とは、例えば、アユやアマゴ等の河川に主に生息するもの、或いはブリやアジ等の海に主に生息するもののいずれであっても構わない。また、「粗切り」とは、例えば、約１ｃｍ四方のブロック状に魚類筋肉をカットしたものであり、係る魚類筋肉には、比較的多くの筋線維が依然として残存しているものである。すなわち、上述したミンチ状や摺り潰した状態のように魚類筋肉に含まれる筋線維が完全に粉砕されたものではない大きさにカットしたものを示すものであり、換言すれば、魚類筋肉を所謂「ぶつ切り」にしたものである。ここで、粗切りされた魚類筋肉からの成分のみの滲出を良好にするため、魚類の表面から鱗等を含む表皮、骨、及び内臓等の魚類筋肉以外のものが除去されている。
【００１５】
また、低温の蒸留水とは、例えば、一般的な冷蔵庫（家庭用または業務用）の冷蔵室に設定された温度（例えば、約４℃）で冷やされた無菌状態の蒸留水を使用することが可能である。なお、これらに魚類筋肉を浸漬後、密封して該冷蔵室内で保管することにより、所定温度で水温を保持した状態で、魚類筋肉に含まれる成分を蒸留水に滲出させることが可能となる。
【００１６】
さらに、濾過滅菌とは、上記処理によって蒸留水の中に魚類筋肉の必要成分が滲出した液体を濾過することにより、混入微生物の他、固形物として残存する魚類筋肉片等を除去するものである。これにより、魚類由来の培地が製造される。なお、培地として使用する場合は、このままの状態で使用することができる。また、作製直後に使用しない場合には、例えば、−８０℃で凍結処理を行うことにより、長期に亘って培地を保存することができ、さらに使用時には室温で解凍することにより、作製直後と同じ性能を発揮可能な培地として使用することができる。
【００１７】
したがって、本発明の魚類筋肉浸漬培地によれば、魚類を粗切りした比較的大きなサイズの魚類筋肉を蒸留水に浸漬することで、該魚類筋肉に含まれる脂肪分の滲出を必要最低限に抑えることができ、さらに従来のように、ミンチ状に磨砕された場合の魚類筋肉の細かい筋線維もほとんど存在しなくなる。その結果、濾過滅菌の際に使用するメンブレンフィルター等を使用した処理において、該脂肪分によるフィルターの目詰まりを防止することができる。これにより、濾過滅菌が容易となり、大量の培地を短時間で作製することができるようになる。
【００１８】
さらに、本発明の魚類筋肉浸漬培地は、上記構成に加え、「前記魚類筋肉は、４℃の前記蒸留水に２４時間浸漬され、０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過滅菌される」ものであっても構わない。
【００１９】
したがって、本発明の魚類筋肉浸漬培地によれば、上記条件によって培地を作製することが可能となる。ここで、４℃の蒸留水は、前述したように既存の冷蔵室で一般に設定可能な温度であるため、特別な設備を要することなく、魚類筋肉の浸漬した蒸留水を低温で保持することが可能である。また、浸漬時間を２４時間に設定することは、蒸留水と接する魚類筋肉の表面から滲出する成分が十分に蒸留水側に移動するために必要な時間であり、これ以上の浸漬時間は、培地作製に要する時間が長くなるだけである。すなわち、それ以上の長い時間を魚類筋肉の浸漬時間に割当てたとしても必要な栄養成分の大部分が既に滲出しているため、それ以上のメリットはほとんどない。一方、０．４５μｍのメンブレンフィルターは、培地作製において一般的に使用される滅菌処理用の濾過手段である。すなわち、本発明の魚類筋肉浸漬培地は、特別な設備を要することなく、既存の研究室等に備えられた設備や用具等を利用して、大量に培地を製造することが可能となるものである。すなわち、本発明の魚類筋肉浸漬培地は、作製容易性に加え、既存の設備をそのまま利用可能とする経済性にも優れている。
【００２０】
したがって、本発明の魚類筋肉浸漬培地により、魚類病原細菌の培養（例えば冷水病、せっそう病、エドワードジエラ病、ラクトコッカス病、及び細菌性腎臓病原因菌）を該培地を用いて効率的に行うことができる。
【００２１】
一方、本発明の魚病用ワクチンは、「上述した魚類筋肉浸漬培地を利用して生成される魚病用ワクチンであって、前記魚類筋肉浸漬培地を形成する際に原料として使用した同種の魚類が感染する魚病の原因となる魚類病原細菌を、前記魚類筋肉浸漬培地に所定量接種し、所定温度で培養することによって前記魚類病原細菌を増殖させ、得られた培養菌をホルマリン処理して形成される」ものである。
【００２２】
したがって、本発明の魚病用ワクチンは、魚類筋肉浸漬培地の原料として使用された同種の魚類についての魚病に対するワクチンが製造されるものである。ここで、魚病の一例として、アユの冷水病を例示することができる。すなわち、原料と同種の魚類についてのワクチンが形成されることにより、該ワクチンの効果を従来と比べて向上させることが可能となる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の効果として、魚類病原細菌の宿主と同じ魚類を由来として作製された培地を用いることから、野生株と同等またはそれに極めて近似する培養株（分離株）の培養及び分離が本発明の培地を利用することで可能となる。すなわち、本発明の培地を用いて単離された魚類病原細菌の培養株は、通常の培地（哺乳類由来等）で分離したものに比べ、強い病原性を示すことが示される。また、この培養株を不活化処理することによって魚病に対するワクチンを形成することができ、該ワクチンによる効果は通常の培地を用いて分離した場合と比べて、非常に高いワクチン効果を示すことが確認された。さらに、濾過滅菌が容易なため、大量の培地の作製を可能とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明の一実施形態である魚類用筋肉浸漬培地（以下、単に「培地」と称す）、及びこれを用いて作製した魚病用ワクチンの詳細について説明する。なお、本実施形態において、後述の実施例において示す魚類病原細菌の宿主となるアユ及びアマゴを培地の原料となる魚類として使用するものについて説明する。
【００２５】
まず、培地の作製について説明する。始めに、新鮮なアユ（或いはアマゴ）から魚類筋肉を切出す。具体的には、アユの鱗等の表皮、骨、及び臓物等の魚類筋肉以外の部位を予め除去し、得られた魚類筋肉３０ｇを約１ｃｍ角のブロック状に粗切り（所謂「ぶつ切り」）にする作業を行う。
【００２６】
そして、予め４℃の水温になるように冷却した蒸留水１リットルの入った容器の中に粗切りにした魚類筋肉を投入する。このとき、魚類筋肉全体が当該蒸留水に完全に水没するようにする。ここで、投入する魚類筋肉の重量（本実施形態においては３０ｇ）と、これに対して使用される蒸留水の必要量（本実施形態においては１リットル）との比率は、後述する実施例において分離する魚類病原細菌の栄養要求に応じて適宜決定することができる。なお、魚類筋肉の投入直後に、蒸留水との混合を良好に行うために、魚類筋肉と蒸留水と攪拌することを行ってもよい。なお、当然のことながら、蒸留水に対して魚類筋肉の比重が大きいため、係る攪拌を行っても所定時間の経過後には、魚類筋肉の固形物は容器の下方の沈殿し、容器の上方には蒸留水が存在するように分離することとなる。
【００２７】
そして、上記混合物の入った容器を密閉し、４℃に設定された冷蔵庫の冷蔵室に静置する。そして、係る状態を２４時間保持する。これにより、混合された魚類筋肉からは、蒸留水中に魚類筋肉に含まれる脂肪分等の各種成分が滲出（遊出）する。
【００２８】
２４時間経過後、冷蔵室から混合物の入った容器を取出し、０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過滅菌を行う。これにより、混合物中に含まれる微生物や固形物や不要な脂肪分等は該フィルターで除去され、フィルターを通過した液体の濾過水を本実施形態の培地とすることができる。なお、得られた培地は、必要な栄養成分等が既に含まれているため、濾過後すぐに使用することも可能である。一方、培地の使用をすぐに行わない場合には、−８０℃で該培地を凍結処理することにより、これを保存することができる。
【００２９】
次に、本実施形態の培地を用いた魚類病原細菌の分離手法について図１及び図２を用いて具体的に説明する。ここで、図１は魚類病原細菌の分離手法の概要を説明する説明図であり、図２は形成された冷水病原因菌４のコロニー６の一例を示す写真である。なお、魚類病原細菌としては、アユ冷水病を発生させる冷水病原因菌４の例について説明している。
【００３０】
まず、直径４７ｍｍの滅菌プレフィルター１を内側に置いた直径９０ｍｍの滅菌シャーレ２を準備する。そして、この滅菌シャーレ２の中に上述の処理によって調整された培地３を４ｍｌ投入する。そして、前述の滅菌プレフィルター１の上に予め分離対象の冷水病原因菌４（魚類病原細菌に相当）が捕捉された０．４５μｍメンブレンフィルター５を直接載置し、そのままの状態で当該魚類病原細菌４の培養に適する温度を維持する。これにより、冷水病原因菌４は、本実施形態の培地３を利用して０．４５μｍメンブレンフィルター５上で多数のコロニ６ーを形成することとなる（図２参照）。
【００３１】
ここで、分離対象の冷水病原因菌４を予め捕捉するための具体的方法について説明すると、まず、対象となる冷水病原因菌４に感染したアユの内臓を取出し、これを擂り潰し、細かく磨砕する。そして、上記によって調整した適当量の本実施形態の培地３と混合する。その後、この混合液（図示しない）を０．４５μｍメンブレンフィルター５で濾過する。これにより、冷水病原因菌４が捕捉される。そして、０．４５μｍメンブレンフィルター５上に残存する冷水病原因菌４を上記滅菌プレフィルター１上に置くものである。
【００３２】
このとき、通常の魚類病原細菌を分離する場合、寒天培地が一般的に用いられることがある。しかしながら、係る寒天培地は、融解した寒天とその他の培地成分とを混合して作製されるものであり、栄養成分が無変成する可能性もある。そして、そのような可能性のある培地を使用して魚類病原細菌を分離する場合、前述したように分離された株（分離株：培養株）と野生株との間の病原性等の各種特性が異なる可能性もある。したがって、本実施形態では、作製した培地３を利用し、かつ０．４５μｍメンブレンフィルター５上に捕捉した目的の魚類病原細菌（冷水病原因菌４）をそのまま滅菌プレフィルター１の上において直接培養し、分離する手法を採用している。
【００３３】
なお、形成されたコロニー６の一部を釣菌し、新たに分注しておいた培地３に接種することで分離株とすることができる（図示しない）。係る分離株は、増殖に最適な温度で培養を行う。ここで、培養完了の終期となる培養時間は、通常は定常期となった時点であるが、係る場合における菌濃度は、一般に１０８ＣＦＵ／ｍｌ以上になっている。
【００３４】
次に、上記分離によって得られた菌株は、不活化処理（例えば、０．３％となるようにホルマリンを添加）することによって、該魚類病原細菌に対する魚病用ワクチンとして使用することができる。
【００３５】
本実施形態の培地及び魚病用ワクチンの効果を以下に示す実施例に基づいて説明する。なお、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
（菌株の培養：アユ）
アユの魚類筋肉から作製された培地を利用し、以下に示す１）〜４）の四種類の菌株について本実施形態の培地を用いて培養を行った。
（１）供試菌株（培養温度／前培養／菌数測定用培地）：
１）冷水病原因菌（菌株名：ＣＳ−１／１５℃／改変サイトファーガ寒天培地）
２）せっそう病原因菌（菌株名：２７４／２０℃／ソイビン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地）
３）エドワードジエラ症原因菌（菌株名：ＡＴＣＣ１５９４７Ｔ／２０℃／ハートインフュージョン寒天培地）
４）ラクトコッカス症原因菌（菌株名：ＫＳ−７Ｃ／２５℃／ハートインフュージョン寒天培地）
【００３７】
（２）培養方法：前培養した上記の１）〜４）の各菌を約１白金耳をアユ由来の培地５ｍｌに接種し、所定温度で１），２）については、培養期間を３日間、３），４）については２日間に設定して培養を行った。その結果を下記の表１に示す。
【００３８】
【表１】
2008220262.tif 000002
【００３９】
上記表１から、すべての菌株において、１０８ＣＦＵ／ｍｌ以上の増殖が確認されたことから、本培地による供試菌株の増殖は、通常用いられている常用培地と同等性能を発揮することが確認された。
【実施例２】
【００４０】
（菌株の培養：アマゴ）
アマゴの魚類筋肉から作製された培地を利用し、以下に示す菌株について本実施形態の培地を用いて培養を行った。
（１）供試菌株（培養温度／前培養）：
細菌性腎臓病原因菌（１５℃／アユの魚類筋肉から作成された培地）
【００４１】
（２）培養方法：前培養した菌を１００倍に希釈した菌液０．１ｍｌをアマゴ由来の培地０．９ｍｌに接種し、所定温度で、培養期間を１０日間に設定して培養を行った。
【００４２】
（３）菌数測定結果：蛍光抗体法によって培養された菌数を計測した結果、培養液注の菌体は、いずれも１０８ｃｅｌｌ／ｍｌ以上であると確認され、係る結果から本培地による供試菌株の増殖は、通常用いられている常用培地と同等性能を発揮することが確認された。
【実施例３】
【００４３】
（冷水病原因菌の単離：アユ）
（１）培地：実施例１と同様
【００４４】
（２）冷水病原因菌の捕捉：−８０℃で凍結保存された冷水病に感染したアユ脾臓を無菌的に切出し、アユ由来の培地で約１０倍に希釈し、さらに同培地を用いて１０倍階段希釈を行った。
【００４５】
（３）メンブレンフィルター濾過：調製された希釈液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過後、当該メンブレンフィルターの細菌捕捉面を上にして滅菌フィルター内に設置した（図１参照）。その後、培養温度を１５℃に設定し、培養を行った。
【００４６】
（４）アユ冷水病原因菌の単離：メンブレンフィルター上に形成されたコロニー（図２参照）の中から、冷水病原因菌と思われるコロニーを釣菌し、新たに分注したアユ由来の培地に接種し、これを培養した。そして、培養後の菌液を検鏡・再培養等を行うことにより、雑菌混入のないことを確認した。また、ＰＣＲによって同定した結果、分離された分離菌株は、冷水病原因菌であることが同定された。なお、以降の本明細書中において、係る分離菌株を菌株Ａと称することとする。
【実施例４】
【００４７】
（せっそう病原因菌の単離：アマゴ）
（１）培地：実施例２と同様
【００４８】
（２）せっそう病原因菌の捕捉：−８０℃で凍結保存されたせっそう病に感染したアマゴの腎臓及び脾臓を無菌的に切出し、アマゴ由来の培地で約１０倍に希釈し、その後、さらに同培地を用いて１０倍階段希釈を行った。
【００４９】
（３）メンブレンフィルター濾過：調製された希釈液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過後、当該メンブレンフィルターの細菌捕捉面を上にして、滅菌フィルター内に設置した（図１参照）。その後、培養温度を２０℃に設定し、培養を行った。
【００５０】
（４）せっそう病原因菌の単離：メンブレンフィルター上に形成されたコロニー（図２参照）の中から、せっそう病原因菌と思われるコロニーを釣菌し、新たに分注したアマゴ由来の培地に接種し、これを培養した。そして、培養後の菌液を検鏡・再培養等を行うことにより、雑菌混入のないことを確認した。また、抗血清凝集試験による同定の結果、分離された分離菌株は、せっそう病原因菌であることが同定された。
【実施例５】
【００５１】
（冷水病感染実験）
（１）供試菌株／使用培地
菌株Ａ／アユ由来の培地
ＣＳ−１（段落番号００３７参照）／改変サイトファーガ液体培地
【００５２】
（２）供試菌株の培養：上記２つの菌株をそれぞれの培地で、培養温度を１５℃に設定し、３日間静置培養を行った。ここで、使用前の菌株数は、以下の表２に示すものであった。
【００５３】
【表２】
2008220262.tif 000003
【００５４】
（３）供試魚／供試尾数：アユ（平均体重３．６ｇ）／１実験区につき２０尾
【００５５】
（４）感染方法：飼育水で上記菌液をそれぞれ１０００倍（実験区１、実験区５）、１００００倍（実験区２、実験区６）、１０００００倍（実験区３、実験区７）、１００００００倍（実験区４、実験区８）に希釈し、その希釈菌液中にアユをそれぞれ２０尾投入し、通気しながら１時間浸漬した。
【００５６】
（５）感染後の飼育：水温約１５度に保持した飼育水を流水で注入し、飼育期間を２３日間にして飼育を行った。
【００５７】
（６）致死性：上記結果を下記の表３及び表４に示す。これによると、菌株Ａを用いた場合、実験区１〜実験区４のいずれにおいても、感染させたアユの死亡率は１００％であったのに対し、ＣＳ−１の場合、実験区５〜実験区８のおいて死亡率は３５％〜５５％の死亡率であった。これにより、本実施形態のアユ由来の培地によって培養された菌株Ａが菌株Ｂよりも強い致死性を示すことが確認された。
【００５８】
【表３】
2008220262.tif 000004
【表４】
2008220262.tif 000005
【実施例６】
【００５９】
（アユ冷水病ワクチン試験１）
（１）ワクチン作製：実施例１と同様の培地を用い、１５℃、３日間静置培養した菌株Ａの菌液に０．３％に調製されたホルマリンを添加し、４℃で２４時間保管したものを魚類用ワクチンとして作製した。このとき、ホルマリン添加前の菌株Ａの菌液の生菌数は６．５×１０８ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００６０】
（２）供試魚：アユ（平均体重０．８ｇ）
【００６１】
（３）ワクチン接種：１尾当たり、１０μｌを腹腔内に接種した。なお、対照区はワクチンの接種を行わない無処理とした。
【００６２】
（４）ワクチン感作期間：ワクチン接種後、１５日間流水中で飼育を行った。
【００６３】
（５）効果判定試験：菌株Ａを実施例１と同じ培地を用い１５℃、３日間静置培養した菌株Ａの菌液（生菌数：１．５×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を飼育水で１０００００倍に希釈し、その希釈液の中にアユ２５尾を投入し、通気して２時間浸漬した。その後、水温１５〜１６℃の飼育水を用いて２１日間飼育して、対照区との致死状況の比較によりワクチン効果を判定した。
【００６４】
（６）ワクチン効果：上記判定結果を表５に示す。これによると、対照区の累積死亡率が１００％に対し、ワクチンを接種したワクチン区の累積死亡率は８０％に低下し、さらにワクチン有効率（ＲＰＳ）は２０％であった。また、対照区の死亡率が６０％を初めて超えた時点でのワクチン有効率（ＲＰＳ６０）は８７．５％であり、非常に高いワクチン効率が得られることが係る判定から確認された。
【００６５】
【表５】
2008220262.tif 000006
【実施例７】
【００６６】
（アユ冷水病ワクチン試験２）
（１）ワクチン作製：実施例１と同様の培地を用い、１５℃、３日間静置培養した菌株Ａの菌液に０．３％に調製されたホルマリンを添加し、４℃で２４時間保管したものを魚類用ワクチンＣとして作製した。このとき、ホルマリン添加前の菌株Ａの菌液の生菌数は６．９×１０８ＣＦＵ／ｍｌであった。さらに、改変サイトファーガ液体培地を用い、１５℃、３日間静置培養したＣＳ−１の菌液に０．３％に調製されたホルマリンを添加し、４℃で２４時保管したものを魚類用ワクチンＤとして作製した。このとき、ホルマリン添加前の菌株Ｂの菌液の生菌数は７．０×１０７ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００６７】
（２）供試魚：アユ（平均体重４．２ｇ）
【００６８】
（３）ワクチン投与：総魚体重の１％量の配合飼料に対し、１ｍｌ／ｋｇ・日になるように作製した魚類用ワクチンＣ，Ｄをそれぞれに添加し、その全量を経口投与した。
【００６９】
（４）ワクチン投与期間：５日間ワクチンの投与を行い、その後２日間ワクチンの投与を休止する投与スケジュールを１サイクルとし、これを２サイクル行った。
【００７０】
（５）効果判定試験：ワクチン投与終了後２０日を経過した後、菌株Ａを実施例１と同じ培地を用いて、１５℃、３日間の静置培養した菌株Ａの菌液（生菌数：２．２×１０２ＣＦＵ／ｍｌ）を飼育水で１００００００倍に希釈し、魚類用ワクチンＣ，Ｄを投与したアユ３０尾を投入し、通気して１時間浸漬した（ワクチン１区、及びワクチン２区）。その後、水温１６．９℃〜１７．７℃の飼育水を用いて流水で２０日間飼育し、無投与の対照区との致死状況の比較によりワクチン効果を判定した。
【００７１】
（６）ワクチン効果：上記判定結果を表５に示す。これによると、各区においても累積死亡率はほぼ１００％に近い値を示した、しかしながら、魚類用ワクチンＣを利用したワクチン１区では、ＲＰＳ６０の値が４２．１％であるのに対し、魚類用ワクチンＤを利用したワクチン２区では、ＲＰＳ６０の値が５．３％を示した。係る結果から、本実施形態の培地を用いて作成された魚類用ワクチンＣは、高いワクチン効果を有することが確認された。
【００７２】
【表６】
2008220262.tif 000007
【００７３】
以上、本発明について好適な実施形態を挙げて説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではなく、以下に示すように、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、種々の改良及び設計の変更が可能である。
【００７４】
すなわち、本実施形態の培地、及び魚類用ワクチンにおいて、主として、アユの魚類筋肉を培地の材料として使用するものを示したが、これに限定されるものではなく、その他の魚類を利用するものであっても構わない。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】魚類病原細菌の分離手法の概要を示す説明図である。
【図２】形成された冷水病原因菌のコロニーの一例を示す写真である。
【符号の説明】
【００７６】
１  滅菌プレフィルター
２  滅菌シャーレ
３  培地
４  冷水病原因菌（魚類病原細菌）
５  ０．４５μｍメンブレンフィルター
６  コロニー
【図１】
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【図２】
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