(57)【要約】【課題】抗原抗体反応を利用した、ウイルスや細菌等の病原体への感染、妊娠の有無、血糖値など様々な測定項目を数分から数時間の短時間で検出あるいは定量する簡易イムノアッセイ法において、使用される体液等の検体に含まれる生体由来成分のアッセイへの影響を抑制する。【解決手段】１〜１０（v/v）％の濃度の哺乳動物の正常血清を含有し、ｐＨが４．５〜６．５の範囲である簡易イムノアッセイ用検体浮遊液により、体液等の検体に含まれる生体由来成分のアッセイへの影響を抑制することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１〜１０（v/v）％の濃度の哺乳動物の正常血清を含有し、ｐＨが４．５〜６．５の範囲である簡易イムノアッセイ用検体浮遊液。
【請求項２】
ｐＨが５．０〜６．０の範囲である請求項１に記載の簡易イムノアッセイ用検体浮遊液。
【請求項３】
哺乳動物の正常血清を３〜５（v/v）％含有する請求項１または請求項２に記載の簡易イムノアッセイ用検体浮遊液。
【請求項４】
簡易メンブレンイムノアッセイ用の検体浮遊液である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の簡易イムノアッセイ用検体浮遊液。
【請求項５】
ELISA、FIA、CLIAあるいはRIA用の検体浮遊液である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の簡易イムノアッセイ用検体浮遊液。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の検体浮遊液を用いる簡易イムノアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡易イムノアッセイ法を用いた検体の簡易検査法において、検体を浮遊し、希釈し、且つ検体中の被検出物と捕捉物質の間で抗原抗体反応をさせるために用いる検体浮遊液に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗原抗体反応や酵素反応等を利用した、ウイルスや細菌等の病原体への感染、妊娠の有無、血糖値など様々な測定項目を数分から数十分の短時間で検出あるいは定量する簡易検査試薬またはキットが開発されている。病原体構成蛋白質、ヒト繊毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血糖等が検出あるいは定量の対象である。簡易検査試薬の多くは、特別な設備を必要とせず操作も簡単で安価であるという特徴を有しており、例えば、妊娠診断のための簡易検査試薬はＯＴＣとして一般薬局で販売されている。また病原体への感染を測定する簡易検査試薬は、他の検査試薬と異なり、大病院や医療検査センター以外にも一般の病院や診療所で広く使用されている。特にインフルエンザウイルスについては、その感染の有無を患者が最初に訪れる医療機関で、患者から採取した検体についてその場で感染の有無や何型に感染しているかが判明すれば、症状が早期のうちに治療措置を施すことができるため、簡易検査試薬の医療における重要性は益々高まってきている。
【０００３】
このような検査を行う際に、ウイルスや細菌等の病原体の感染を体液等の検体又は該検体試料を希釈した溶液等を使用するケースが多いが、該検体試料中には生体由来の成分が多く含まれ、これが抗原抗体反応を利用した検査に影響を与えることが知られている（非特許文献１参照）。例えば、インフルエンザウイルス感染等の呼吸器感染症では、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液等を検体試料として検査を行うことがあるが、これらの検体試料中には生体由来成分として、ムチンに代表される粘性ムコ多糖類および血球成分が含まれる（非特許文献１参照）。さらに病原体や人体組織の構成物も含まれると考えられる。検体試料中のこれらの成分は検査に影響を与えることがあり、これはマトリックス効果と呼ばれることがある（非特許文献２参照）。マトリックス効果は大きく二つに分けることができる。一つは、偽陽性、もう一つは、偽陰性である。例えば、コロイド凝集法を測定原理として用いた検体の検査方法に用いる、検体を懸濁もしくは浮遊する検体浮遊液の組成物として、界面活性剤を含み、ｐＨが３〜８であることを特徴とする検体浮遊液組成物が知られている（特許文献１参照）。しかしながらこの方法を含む従来の方法では、偽陽性を低減する効果が述べられているが、偽陰性については示されておらず、前記のマトリックス効果の低減という観点からは十分な効果が得られていない。また検体浮遊液に検体を浮遊させて放置すると、時間の経過によって前記のマトリックス効果による偽陰性の発生が見られる場合がある。従って、偽陰性と偽陽性を合わせたマトリックス効果を低減し、より安定して高精度の診断を行なうことが求められている。
【０００４】
【非特許文献１】「南山堂医学大事典」（株）南山堂、（第１８版５刷）２００１年４月１０日、ｐ１７９２
【非特許文献２】HHA White Paper(U.S.Army Press Release, July 23,2002)
【特許文献１】特開２００６−８４３５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
抗原抗体反応を利用した、ウイルスや細菌等の病原体への感染、妊娠の有無、血糖値など様々な測定項目を数分から数時間の短時間で検出あるいは定量する簡易イムノアッセイ法において、使用される体液等の検体に含まれる生体由来成分のアッセイへの影響を抑制する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、特定の組成を有する検体浮遊液を使用することで、極めて良好な検査結果を得ることができることを見出し、本発明に至った。
即ち本発明は、１〜１０（v/v）％の濃度の哺乳動物の正常血清を含有し、ｐＨが４．５〜６．５の範囲である簡易イムノアッセイ用検体浮遊液である。更にｐＨは５．０〜６．０の範囲であることが好ましい。また、哺乳動物の正常血清を３〜５（v/v）％含有することが好ましい。更に本発明の検体浮遊液は、免疫学的特異反応による簡易メンブレンイムノアッセイ用の検体浮遊液やELISA用の検体浮遊液として好ましい。また本発明は、前記の検体浮遊液を用いる簡易メンブレンイムノアッセイ法である。
【発明の効果】
【０００７】
以上のように本発明の検体浮遊液を用いることにより、体液等の検体に含まれる生体由来成分の検査への影響を抑制し、検査で起こりうる偽陽性および偽陰性のいずれも著しく減らすことが可能となり、より高精度の診断ができるようになる。特に、検体と検体浮遊液を混合した後の時間の経過によって発生する偽陰性や、感度限界値に近い希釈率（希釈限界値）において発生する偽陰性など、検査における不確定な要素により発生しえる偽陰性を確実に抑制することができ、信頼性の高い簡易メンブレンアッセイ法及びキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
簡易イムノアッセイにおいて、生体由来の成分に起因する偽陽性および偽陰性の発生のメカニズムは単純ではないが、偽陽性の仮説としては、生体由来成分が非特異反応により固相化された捕捉物質に付着し、その位置で標識試薬の凝集が発生することによると考えられる。また、偽陰性の仮説としては、生体由来成分が非特異反応により被検出物に付着して、標識試薬または固相化された捕捉物質と被検出物との間の抗原抗体反応を阻害することによると考えられる。これらの偽陽性や偽陰性による誤診断を減少させる方法として、検体浮遊液のｐＨを前記の範囲に設定するとこれらの発生は減少するが、偽陽性の抑制は必ずしも十分ではなく、生体由来物質のマトリックス効果を総合的に抑制することはできない。本発明の検体浮遊液は、ｐＨが前記の範囲でありかつ哺乳動物の正常血清を含有しており、この存在によって、偽陽性も大幅に抑制され、相乗的に生体由来物質のマトリックス効果を抑制することができる。
【０００９】
＜検体浮遊液＞
本発明の簡易イムノアッセイ用検体浮遊液はｍ１〜１０（v/v）％の濃度の哺乳動物の正常血清を含有し、ｐＨが４．５〜６．５の範囲であることを特徴とする。
本発明において、“哺乳動物の正常血清”はウイルスや細菌に感染していない哺乳動物より採取した血清のことを言う。例えば、“感染血清”は本発明の“哺乳動物の正常血清”には含まれない。哺乳動物の正常血清は特に限定されるものではないが、例えば、ヒツジ、ヤギ、馬、牛、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳動物の正常血清を挙げることが出来る。中でも正常ウサギ血清が、容易に入手できる点で好ましい。哺乳動物の正常血清は市販されているものを適宜使用してもよく、また、従来知られている血清調製方法により哺乳動物から採取してもよい。市販物としては例えばフナコシ株式会社から入手可能である。
この哺乳動物の血清は、血清そのままでも脱脂処理したものでもどちらでも使用することができる。濃度は、その測定系を阻害しない濃度であることが必要で、その濃度範囲は１〜１０(v/v)％であり、さらに３〜５（v/v）％含有することが好ましい。１(v/v)％未満では前記の効果が得られず、１０(v/v)％を超えると固相化した捕捉物質と被検出物の抗原抗体反応および標識物質と被検出物の抗原抗体反応を阻害することがある。
【００１０】
本発明の検体浮遊液のｐＨの範囲は、その検査に用いられている測定原理により異なるが、４．５〜６．５の範囲内である必要があり、この範囲内において、検体に含まれる生体由来の成分が、本発明の検査に与える影響を抑制する効果を得ることができる。さらに好ましくはｐＨが５〜６の範囲である。ｐＨが４．５未満では、本発明で用いる抗体のような捕捉物質の活性が低下するので、被検出物の捕捉力が低下するので、本発明の効果を得ることができない。また、ｐＨが６．５を超えると生体由来の成分が検査に与える影響が大きくなり、偽陽性および偽陰性が発生する。
【００１１】
前記の本発明の検体浮遊液のｐＨを決定する緩衝剤の種類としては、ｐＨ４．５〜６．５の範囲に緩衝能を持つ試薬であれば特に限定されるものではないが、中でもGood's BufferでADA（N-(2-アセトアミド)イミノジ酢酸）またはMES（2-モルホリノエタンスルホン酸）がその性能および経済性の面から好ましい。
【００１２】
本発明の検体浮遊液は、前記の哺乳動物の正常血清のほかに、ブロッキング剤として用いられるBSAやカゼインなどのタンパク質成分、測定対象物の浮遊後の安定性に影響を与える可能性のあるKClやNaClなどの無機塩やアルギニン塩などの有機塩等、公知のものを添加することもできる。また、測定対象物に応じて、界面活性剤を添加することもできる。例えば、インフルエンザウイルスなどの場合、ウイルスを不活化、開裂させる目的で添加することができる。
【００１３】
＜簡易イムノアッセイ法＞
本発明において検体浮遊液とは、簡易イムノアッセイ法で用いる液体媒体を指し、被検出物を含み得る検体を浮遊させて希釈及び／又は抽出するための溶液であると同時に、検体中の被測定物と捕捉物質との間で抗原抗体反応を行わせるための場となる溶液である。ここで示す簡易イムノアッセイ法とは、簡易メンブレンイムノアッセイ法、ELISA（エンザイム・リンクト・イムノ−ソルベント・アッセイ：Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay）法およびELISAに類する方法を指す。そして本発明の検体浮遊液は、好ましくは簡易メンブレンイムノアッセイに用いられる。
【００１４】
簡易メンブレンイムノアッセイ法とは、メンブレンを備えた簡易的なアッセイ装置を用いて行う方法で、特別な設備を必要とせず、操作も簡単で大病院や医療検査センター以外の一般の病院や診療所で短時間で簡易的に行なうことのできる検査方法である。簡易メンブレンイムノアッセイ法は、２つに大別でき、１つはイムノクロマト法（あるいはラテラルフロー法）、もう１つはフロースルー法である。いずれの方法も、固相した捕捉物質を用いて、検体に含まれる被検出物を、抗原抗体反応によって捕捉し検出する方法であるが、前者は被検出物を含む試料をストリップ状のメンブレンの長手方向に展開するのに対し、後者はメンブレンの面に対して垂直方向に展開する方法である。これらの方法は公知の一般的方法を用いることができ、所謂標識試薬を用いたサンドイッチイムノアッセイ法等の方法で、被検出物を検出することができる。
【００１５】
ELISA法とは、抗原抗体反応を原理とし、抗体または抗原を酵素で標識することにより被検出物を高感度に分析する方法である。ELISA法には様々な方式があるが、いずれも捕捉物質を固相化したプラスチック製のプレート等を用意して被検出物を捕捉し、捕捉された被測定物を該酵素標識抗体または抗原で検出するものである。特に抗原蛋白質の検出方法として、検体中の抗原蛋白質或いは逆に特定の抗原蛋白質に結合する抗体を検出する分析方法として広く用いられている。複数の検体を同時にアッセイでき、数時間で結果を得られる検査方法である。ELISAに類する方法として、蛍光物質を標識に用いたFIA法（Fluorescence Immunoassay、蛍光免疫測定法）、発光物質を標識に用いたCLIA法（Chemiluminescence Immunoassay、化学発光免疫測定法）や放射性同位物質を標識に用いたRIA法（Radioimmunoassay、放射免疫測定法）等がある。
【００１６】
本発明の検体浮遊液は、前記のいずれの方法においても抗体および抗原による免疫学的特異抗原抗体反応を行う際の媒体として用いるものであり、特に被検出物を含み得る検体試料を浮遊させて希釈および／または抽出するための検体浮遊液として用いることができる。
本発明者等は、前記の簡易イムノアッセイにおいて、検体試料に含まれる生体由来の成分に起因する偽陽性や偽陰性の発生を極力抑制するという課題を解決するために鋭意検討した結果、検体浮遊液のｐＨを特定の範囲に設定し、かつ特定濃度の哺乳動物の正常血清を含有させることにより、検査において生体由来の物質の影響で発生する偽陽性及び偽陰性の発生のいずれも著しく抑制できることを見出し、本発明に到達した。
【００１７】
＜被検出物＞
本発明の簡易イムノアッセイ法で検出する被検出物としては、各種抗原および抗体を挙げることができる。好ましくは、病原微生物、バイオマーカー、ホルモン、環境ホルモンおよびそれらに対する抗体を挙げることができ、より好ましくは、呼吸器感染症、消化器感染症、循環器感染症を引き起こすウイルスおよび細菌、およびそれらに対する抗体、腫瘍マーカー、循環器系マーカー、糖尿病マーカー、骨代謝マーカーおよびこれらに対する抗体を挙げることができる。さらに好ましくは、インフルエンザウイルス抗原、アデノウイルス抗原、ＲＳウイルス抗原、ＨＡ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原、ＥＢＶ抗原、ＮＬＶ抗原等のウイルス抗原およびこれらに対する抗体、病原性大腸菌抗原、クラミジア・トラコマティス抗原、溶連菌抗原、肺炎球菌抗原、百日咳菌抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗原、レプトスピラ抗原、トレポネーマ・パリダム抗原、トキソプラズマ・ゴンディ抗原、ボレリア抗原、炭疽菌抗原、MRSA抗原等の細菌抗原およびこれらに対する抗体、マイコプラズマ脂質抗原、細菌等が産生する毒素抗原およびこれらに対する抗体を挙げることができ、さらに好ましくは、インフルエンザウイルス抗原、アデノウイルス抗原、RSウイルス抗原、ロタウイルス抗原、NV抗原、肺炎マイコプラズマ抗原、A群溶連菌抗原、肺炎球菌抗原、クラミジア抗原、病原性大腸菌抗原、カンピロバクター抗原等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１８】
＜検体＞
当然のことながら、前記の被検出物を実験的に培養したものを、生理食塩水等で希釈した試料では、本発明で課題としているような偽陰性や偽陽性は発生しない。本発明の簡易イムノアッセイに用いる検体としては、例えば全血、尿、便、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、咽頭ぬぐい液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、喀痰、鼓膜切開・貯留液、スワブ検体として収集された分泌物などを挙げることができる。これらの検体に含まれる成分としては、例えば、全血の場合、赤血球、白血球などの血球成分であり、各種ぬぐい液などの場合、検体に混在する生体成分が剥離または分解して凝集した細胞成分などがある。また、これらの試料中には、プロテオグリカン、糖脂質等の粘性物質をはじめ、様々な生体成分が含まれる場合やウイルスや細菌などの微生物が混在する場合がある。本発明の検体浮遊液は、上記のような検体の検体浮遊液として用いるものである。これらの成分は検査に利用している原理によっては、偽陽性および偽陰性のような非特異的な反応を誘導する場合がある。上記の成分による非特異的な反応も本発明の検体浮遊液の組成で抑制する対象となる。
【００１９】
＜捕捉物質＞
本発明の簡易イムノアッセイ法で、前記の被検出物を捕捉する捕捉物質としては、被検出物が抗原である場合は、それに対応した抗体、または実質的に同一の抗原抗体反応をする物質であればよく、被検出物が抗体である場合は、それに対応した抗原、または実質的に同一の抗原抗体反応をする物質であればよい。
【実施例】
【００２０】
実施例を用いて本発明を具体的に説明する。
（試料の作製）
１．モノクローナル抗体の作製
（１）抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製
精製Ａ型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。
得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原固相プレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。
取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水をそれぞれProteinAカラムクロマトグラフィー（アマシャム社製）を用いたアフィニティ精製によってＩｇＧを精製し、２種類の精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を得た。
【００２１】
（２）抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）
精製Ｂ型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol.256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）は、３７℃でインキュベーター中で維持し、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原固相プレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からProteinAカラムクロマトグラフィー（アマシャム社製）によってＩｇＧを精製し、２種類の精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を得た。
【００２２】
２．標識抗インフルエンザ抗体の作製
（１）ラテックス標識抗Ａ型インフルエンザ抗体の調製
抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体のうち１種類を５０ｍＭ ＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate；同仁化学社）緩衝液（ｐＨ６．０）溶液で透析後、赤色ポリスチレンラテックス粒子（粒径0.394μｍ, 表面修飾基はカルボキシル基；メルク社）と混合し、反応させた。次に、ＥＤＡＣ（N-(3-Dimethlaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride；Sigma社）を最終濃度０．１％になるように添加した後、２時間反応させた。洗浄後、最終浮遊液（5mMTris, 0.04(W/V)％ BSA（ウシ血清アルブミン））中に浮遊し、超音波分散装置（オリンパス社）にかけ、ラテックス粒子を分散させてラテックス標識抗Ａ型インフルエンザ抗体を調製した。
【００２３】
（２）ラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザ抗体の調製
抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体のうち１種類を５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）溶液で透析後、青色ポリスチレンラテックス粒子（粒径0.394μｍ, 表面修飾基はカルボキシル基；メルク社）と混合し、反応させた。次に、ＥＤＡＣを最終濃度０．１％になるように添加した後、２時間反応させた。洗浄後、最終浮遊液（5mMTris, 0.04(W/V)％ BSA（ウシ血清アルブミン））中に浮遊し、超音波分散装置（オリンパス社）にかけ、ラテックス粒子を分散させてラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザ抗体を調製した。
【００２４】
３．ラテックス標識抗体の乾燥化
（１）ラテックス標識抗体の混合
２．（１）、（２）で作製したラテックス標識抗Ａ型インフルエンザ抗体とラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザ抗体をラテックス濃度がそれぞれ等しくなるように希釈後、室温下で等量混合した。
（２）ラテックス標識抗体パッドの作製
３．（１）で作製したラテックス標識抗体を陽圧噴霧装置（ＢｉｏＪｅｔ；ＢｉｏＤｏｔ社）を用いてでリール状に巻いた幅１５ｍｍのセルロース不織布全面に噴霧した。噴霧後、５０℃の温風を１分間吹きつけ乾燥させ、ラテックス標識抗体パッドを作製した。
【００２５】
４．メンブレン固相用抗体の調製
（１）固相用抗Ａ型インフルエンザ抗体の調製
１．（１）で作製した精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体のうち標識に用いなかった方を、０．２２μｍろ過を行い、M.Q水で希釈して固相用抗Ａ型インフルエンザ抗体を調製した。
（２）固相用抗Ｂ型インフルエンザ抗体の調製
１．（２）で作製した精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体のうち標識に用いなかった方を、０．２２μｍろ過を行い、M.Q水で希釈して固相用抗Ｂ型インフルエンザ抗体を調製した。
【００２６】
５．インフルエンザウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置の作製
インフルエンザウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置は、図１及び図２に示すものと同様の構成のものを用いた。
メンブレンは、幅３ｃｍ ｘ 長さ１０ｃｍのニトロセルロースメンブレン（ミリポア社製）シートを用いた。その長軸側の一端（この端を上流端、反対側を下流端とする）から８ｍｍ離れたｄの位置に固相用抗Ａ型インフルエンザ抗体を陽圧噴霧装置（ＢｉｏＪｅｔ；ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて線状に塗布し、１２ｍｍ離れたｅの位置に固相用抗Ｂ型インフルエンザ抗体を陽圧噴霧装置（ＢｉｏＪｅｔ；ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて線状に塗布した。塗布後、４５℃の温風を１０分間吹き付けて乾燥した。
【００２７】
次に、部材を固定し、かつ強度を増すため、メンブレンの抗体塗布面（この面を上面とする）の反対側（この面を下面とする）にプラスチック製バッキングシート（ＢｉｏＤｏｔ社製）を接着した。
次に、３．（２）で作製したラテックス標識抗体パッドを幅１５ｍｍ ｘ 長さ１０ｃｍに切断し、メンブレンの上面に、メンブレンの上流端が２ｍｍ重なる様に配置して貼り付け、サンプル滴下パッドとした。
次に、幅３０ｍｍ ｘ 長さ１０ｃｍのセルロースろ紙（ワットマン社）をメンブレンの上面に、メンブレンの下流端と５ｍｍ重なる様に配置して貼り付け、サンプル吸収パッドとした。
次にサンプル滴下パッドの上流端の幅７ｍｍを除いて、上面全面を透明なプラスチックラミネート（Adhesive Research社）で被覆した。
最後に長軸方向に沿って、５ｍｍずつ切断し、図１及び図２に示すメンブレンアッセイ装置を作製した。
【００２８】
６．標識抗体装填試料ろ過フィルターの作製
図３に示した様なろ過用ノズルを用意し、ろ過用ガラスろ紙（アドバンテック東洋社）を円形（直径０．７ｃｍ）に打ち抜いてノズルの底面に装填し、標識抗体装填試料ろ過フィルターを作製した。
【００２９】
（参考例１）インフルエンザウイルスの検出(i)（ｐＨの偽陰性への影響）
（１）培養ウイルスの調製と希釈
孵化鶏卵により培養したＡ型およびＢ型のインフルエンザウイルスを生理的食塩水で１００倍希釈し、さらにそれを用いて、生理的食塩水で２倍段階希釈系列（１００倍〜１６００倍まで）を調製した。表２において、例えば“Ａ×１００”は、Ａ型インフルエンザウイルスを添加した溶液を１００倍に希釈した液を意味する
（２）メンブレンアッセイ法による検出
臨床的にインフルエンザウイルス感染が認められない患者より採取した鼻腔吸引液から滅菌綿棒を用いて検体を採取し、図４に示した様なチューブ内に分注した各検体浮遊液（組成を下表１に示す）０．４ｍＬ中に浮遊し、試験用試料を作製した。
この試験用試料に（１）で孵化鶏卵培養し、希釈した、Ａ型またはＢ型インフルエンザウイルスウイルス希釈液３０μLを添加し、チューブの先端に（試料の作製）６．で作製した標識抗体装填試料ろ過フィルターを装着した。
【００３０】
試験用試料全量をろ過用ノズルに通過させてろ過したろ過液をチューブに集めた後、（試料の作製）５．で作製したインフルエンザウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置のサンプル滴下パッド側を液に浸して展開を行った。１０分後、アッセイ装置を観察し、図１あるいは２のｄの位置に赤色の発色が認められた場合にはＡ型インフルエンザウイルス陽性、ｅの位置に青色の発色が認められた場合にはＢ型インフルエンザウイルス陽性、両方の位置に発色が認められない場合は陰性と判定した。
【００３１】
【表１】
2008014752.tif 000002
【００３２】
表１における略号は以下の組成を意味する。
Tx-100：TritonX-100(ポリエチレングリコール  モノ-p-イソオクチルフェニルエーテル)
PB-Na：ナトリウム燐酸バッファー
MES：2-モルホリノエタンスルホン酸
ADA：N-(2-アセトアミド)イミノジ酢酸
PIPES：ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)
MOPS：3-モルホリノプロパンスルホン酸
BSA：ウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin)
（３）結果
表１に記載の各浮遊液を用いた検出結果を下記表２にまとめる。
【００３３】
【表２】
2008014752.tif 000003
【００３４】
表２において、“＋”は明確な発色（陽性）を意味し、“−”は発色が全く見られない（陰性）を意味する。また、“±”は、判定部に何らかの発色が見られるが、明確な発色ではないため結果が不明であることを意味している。また、表２においてセルが着色されている箇所は、本来陽性（＋）と判定されるべきにも関わらず発色が見られない（−）“偽陰性”を意味する。
【００３５】
鼻腔吸引液を加えない浮遊液番号１(ｐＨ8.0）を用いた対照実験では、Ａ型インフルエンザウイルス培養液の１００、２００、４００及び８００倍希釈した試料は明確に陽性と判定され、１６００倍希釈した試料は陰性と判定された。これは８００倍を越える希釈濃度においてウイルスの検出限界となったためと考えられる。Ｂ型インフルエンザウイルス培養液においても希釈率４００倍を越えると検出限界となった。このような検出限界に近い希釈倍率において、検体浮遊液のｐＨを６．５以下にすることで、鼻腔吸引液由来のマトリックス効果による感度低下をかなり軽減できた（参考３、５〜１１）。しかしながら完全にマトリックス効果（偽陰性）を無くすことは出来なかった。
【００３６】
（実施例１）インフルエンザウイルスの検出(ii)（哺乳動物の正常血清の偽陰性への影響）
（１）培養ウイルスの調製と希釈
孵化鶏卵により培養したＡ型およびＢ型のインフルエンザウイルスを生理的食塩水で１００倍希釈し、さらにそれを用いて、生理的食塩水でＡ型ウイルス添加試料を８００倍に、Ｂ型ウイルス添加試料を４００倍にそれぞれ希釈した。
（２）メンブレンアッセイ法による検出
臨床的にインフルエンザウイルス感染が認められない患者より採取した鼻腔吸引液から滅菌綿棒を用いて検体を採取し、図４に示した様なチューブ内に分注した各検体浮遊液（表３）０．４ｍＬ中に浮遊し、試験用試料を作製した。この試験用試料に（１）で調製した孵化鶏卵培養ウイルス希釈液３０μLを添加し、チューブの先端に（試料の作製）６．で作製した標識抗体装填試料ろ過フィルターを装着した。この状態で５分間、１０分間、１５分間、３０分間静置した。
静置後ろ過を行い、ろ過液をそれぞれチューブに集めた後、（試料の作製）５．で作製したインフルエンザウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置のサンプル滴下パッド側を試料液に浸して展開を行った。１０分後、アッセイ装置を観察し、図１あるいは２のｄの位置に赤色の発色が認められた場合にはＡ型インフルエンザウイルス陽性、ｅの位置に青色の発色が認められた場合にはＢ型インフルエンザウイルス陽性、両方の位置に発色が認められない場合は陰性と判定した。
【００３７】
【表３】
2008014752.tif 000004
【００３８】
（３）結果
上述したように５分間、１０分間、１５分間、３０分間静置した試料の判定結果を表４に示す。
【表４】
2008014752.tif 000005
【００３９】
表４において、“＋”は明確な発色（陽性）を意味し、“−”は発色が全く見られない（陰性）を意味する。また、表４においてセルが着色されている箇所は、本来陽性（＋）と判定されるべきにも関わらず発色が見られない（−）“偽陰性”を意味する。
【００４０】
正常ウサギ血清（ＮＲＳ）を添加しない浮遊液番号６の浮遊液を用いた場合には、１０分以上静置した試料では、Ａ型及びＢ型いずれの場合にも生体由来成分に起因すると考えられる偽陰性が見られた（実験番号１（比較））。一方、哺乳動物の正常血清として正常ウサギ血清（ＮＲＳ）を１〜５(v/v)％添加した検体浮遊液を用いると、１０分以上静置した試料の検出で発生する偽陰性を抑制できることが明らかとなった（実験番号２〜４）。特に、ＮＲＳを３〜５(v/v)％添加した場合の抑制効果が強かった（実験番号３〜４）。
【００４１】
（実施例２）インフルエンザウイルスの検出(iii)（正常哺乳動物の偽陽性への影響）
臨床的にインフルエンザウイルス感染が認められない患者より採取した鼻腔吸引液から滅菌綿棒を用いて検体を採取し、図４に示した様なチューブ内に分注した検体浮遊液６及び１４（表３参照）０．４ｍＬ中に浮遊し、試験用試料を作製した。このチューブの先端に６．で作製した標識抗体装填試料ろ過フィルターを装着した。
【００４２】
試験用試料全量をろ過用ノズルに通過させてろ過したろ過液をチューブに集めた後、５．で作製したインフルエンザウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置のサンプル滴下パッド側を液に浸して展開を行った。１０分後、アッセイ装置を観察し、図１あるいは２のｄの位置に赤色の発色が認められた場合にはＡ型インフルエンザウイルス陽性、ｅの位置に青色の発色が認められた場合にはＢ型インフルエンザウイルス陽性、両方の位置に発色が認められない場合は陰性と判定した。判定結果を表５に示した。
【００４３】
【表５】
2008014752.tif 000006
【００４４】
表５において、“＋”は明確な発色（陽性）を意味し、“−”は発色が全く見られない（陰性）を意味する。また、表５においてセルが着色されている箇所は、本来陰性（−）と判定されるべきにも関わらず発色が見られた（＋）“偽陽性”を意味する。
【００４５】
正常ウサギ血清（ＮＲＳ）を含まない浮遊液６を用いた場合には、５検体のうち２検体が偽陽性を示した。一方、検体浮遊液に哺乳動物の正常血清として、正常ウサギ血清（NRS）を添加した浮遊液１４を用いた場合には、生体由来成分に起因するマトリックス効果（偽陽性）を抑制することができることが明らかとなった（実験番号６）。
【００４６】
（実施例３）インフルエンザウイルスの検出(iv)
（１）培養ウイルスの調製と希釈
孵化鶏卵により培養したA型およびB型のインフルエンザウイルスを生理的食塩水で１００倍希釈し、さらにそれを用いて、生理的食塩水で２倍段階希釈系列（１００倍〜１６００倍まで）を調製した。
（２）メンブレンアッセイ法による検出
臨床的にインフルエンザウイルス感染が認められない患者より採取した鼻腔吸引液から滅菌綿棒を用いて検体を採取し、図４に示した様なチューブ内に分注した各検体浮遊液（下表６に示す）０．４ｍＬ中に浮遊し、試験用試料を作製した。この試験用試料に（１）で調製した孵化鶏卵培養ウイルス希釈液３０μＬを添加し、チューブの先端に（試料の作製）６．で作製した標識抗体装填試料ろ過フィルターを装着した。この状態でそれぞれ０分、５分、１０分、１５分、３０分間静置した（表８）。
【００４７】
試験用試料はそれぞれ全量をろ過用ノズルに通過させてろ過したろ過液をチューブに集めた後、（試料の作製）５．で作製したインフルエンザウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置のサンプル滴下パッド側を液に浸して展開を行った。１０分後、アッセイ装置を観察し、図１あるいは２のｄの位置に赤色の発色が認められた場合にはＡ型インフルエンザウイルス陽性、ｅの位置に青色の発色が認められた場合にはＢ型インフルエンザウイルス陽性、両方の位置に発色が認められない場合は陰性と判定し、図１あるいは２のｄおよび/またはｅの位置に紫色の発色が認められる場合は偽陽性と判定した。
【００４８】
【表６】
2008014752.tif 000007
【００４９】
（３）結果
上記各希釈率のウイルスを含む試料（静置０分）を用いて得られた各検体浮遊液による希釈検出限界を表７に示した。また、検出限界に近い希釈率により希釈されたウイルスを含む各試料を５分、１０分、１５分、３０分間静置した後判定した結果を表８に示した。
また、実施例２で使用した臨床的にインフルエンザウイルス感染が認められない患者より採取した鼻腔吸引液を用いて、静置０分での偽陽性の発生を実施例２と同様の方法で検証した結果を表９に示した。
【００５０】
【表７】
2008014752.tif 000008
【００５１】
【表８】
2008014752.tif 000009
【００５２】
【表９】
2008014752.tif 000010
【００５３】
検体浮遊液のｐＨを６．５以下にすることで、鼻腔吸引液由来のマトリックス効果による感度低下すなわち偽陰性を軽減できたが、さらに、この条件に正常ウサギ血清を５(v/v)％添加することで、完全にマトリックス効果（偽陰性）を抑制できた（表７、実験番号１０）。
体液試料の浮遊後の安定性を、検出限界に近い希釈率で測定したところ、ｐＨ６．０、正常ウサギ血清５(v/v)％を添加した浮遊液を用いることで、完全にマトリックス効果（偽陰性）を抑制し、高感度、短時間で、高精度な検査が可能となることが明らかになった（表８、実験番号１４）。
また、孵化鶏卵培養インフルエンザウイルスを添加せずに試験したところ、ＮＲＳを添加することで、マトリックス効果（偽陽性）を抑制できた（表９、実験番号１６及び１８）。
ｐＨおよび哺乳動物の正常血清による効果は、どちらかでは不十分であり、両方を組み合わせることで、マトリックス効果（偽陰性及び偽陽性）を完全に抑制できることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置の平面図である。
【図２】図１のＩ−Ｉ’切断端面図である。
【図３】試料ろ過フィルターの構造である。
【図４】検体チューブの構造図である。
【符号の説明】
【００５５】
ａ：サンプル滴下パッド
ｂ：サンプル吸収パッド
ｃ：ニトロセルロースメンブレン
ｄ：抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体塗布ライン
ｅ：抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体塗布ライン
ｆ：バッキングシート
ｇ：ラミネート
ｈ：ろ過用ノズル
ｉ：ろ過用ガラスろ紙
ｊ：ラテックス標識パッド
ｋ：チューブ
【図１】
2008014752.tif 000011
【図２】
2008014752.tif 000012
【図３】
2008014752.tif 000013
【図４】
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