(57)【要約】【課題】遺伝子導入効率が高く細胞毒性が低いカチオン性脂質たりうるＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩ならびにそれを用いた遺伝子キャリアを提供する。【解決手段】下記の式（１）で表されることを特徴とするＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩、ならびにそれを用いた遺伝子キャリア。2008143844.tif 000015なお、式中、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＮＨ、およびＮＨＣＯのいずれか１を表し、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して炭素数１０〜２５のアルキル基またはアルケニル基を表す。【選択図】図２
2008143844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で表されることを特徴とするＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩。
【化１】
2008143844.tif 000012
なお、式（１）中、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＮＨ、およびＮＨＣＯのいずれか１を表し、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して炭素数１０〜２５のアルキル基またはアルケニル基を表す。
【請求項２】
請求項１記載のＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩において、下記の式（２）で表されることを特徴とするＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩。
【化２】
2008143844.tif 000013
なお、式（２）中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して炭素数１０〜２５のアルキル基を表す。
【請求項３】
請求項２記載のＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩において、下記の式（３）で表されるＮ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミンであることを特徴とするＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩。
【化３】
2008143844.tif 000014
【請求項４】
請求項１および２のいずれか１項に記載のＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩のいずれか一方または双方、ならびに脂質を構成成分として含む遺伝子キャリア。
【請求項５】
請求項３記載のＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩のいずれか一方または双方、ならびに脂質を構成成分として含む遺伝子キャリア。
【請求項６】
請求項５記載の遺伝子キャリアにおいて、前記脂質は１または複数種のリン脂質であることを特徴とする遺伝子キャリア。
【請求項７】
請求項６記載の遺伝子キャリアにおいて、前記リン脂質がジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）であることを特徴とする遺伝子キャリア。
【請求項８】
請求項７記載の遺伝子キャリアにおいて、Ｎ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミンとジラウロイルホスファチジルコリンのモル比が１：１であり、かつＮ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミンとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのモル比が１：１〜１：２であることを特徴とする遺伝子キャリア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入効率が高く細胞毒性が低い遺伝子キャリアを形成することができる新規なＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩ならびにそれを用いた遺伝子キャリアに関する。
【背景技術】
【０００２】
外因性の遺伝子を細胞内へ導入するトランスフェクションは、遺伝子操作、組替えタンパク質の生産、遺伝子治療などの分野における重要な技術であるが、高い遺伝子導入効率と安全性とを併せ持つ遺伝子キャリア（ベクター）の開発が大きな課題となっている。
高い遺伝子導入効率を有する遺伝子キャリアとして、ウイルスの持つ高い細胞感染性を利用したウイルスベクターが利用されていた。しかし、ウイルスベクターは、ウイルスのタンパク質に由来する免疫反応の誘導や、病原性の元となる増殖能を完全に除去する保証がないなどの問題点を有しており、現実に数例の副作用事例が報告されるに至り、その利用は敬遠されつつある。
そこで、ウイルスベクターを使用しないトランスフェクション法として、カチオン性脂質を構成成分とするカチオン性リポソームを遺伝子キャリアとして用いるトランスフェクション法、およびそれに用いられるポリアミン誘導体などのカチオン性脂質が提案されている（例えば、特許文献１、２参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開平２−２９２２４６号公報
【特許文献２】特開平４−１０８３９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ポリアミン系カチオン性脂質には、細胞毒性が認められるものがあるため、安全性の上で問題を有している。また、ポリアミン系カチオン脂質を構成成分とするカチオン性リポソームの多くは、遺伝子導入効率が低いという問題を未だ有している。
【０００５】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、遺伝子導入効率が高く細胞毒性が低いカチオン性脂質たりうるＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩ならびにそれを用いた遺伝子キャリアを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的に沿う第１の発明に係るＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩は、下記の式（１）で表されるＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩である。
【０００７】
【化１】
2008143844.tif 000003
【０００８】
なお、式（１）中、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＮＨ、およびＮＨＣＯのいずれか１を表し、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して炭素数１０〜２５のアルキル基またはアルケニル基を表す。
【０００９】
第１の発明に係るＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩において、下記の式（２）で表されるＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩であることが好ましい。
【００１０】
【化２】
2008143844.tif 000004
【００１１】
なお、式（２）中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して炭素数１０〜２５のアルキル基を表す。
【００１２】
第１の発明に係るＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体において、下記の式（３）で表されるＮ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミンおよびその塩であることがさらに好ましい。
【００１３】
【化３】
2008143844.tif 000005
【００１４】
第２の発明に係る遺伝子キャリアは、第１の発明に係るＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩のいずれか一方または双方、ならびに脂質を構成成分として含む。
【００１５】
第２の発明に係る遺伝子キャリアにおいて、前記Ｎ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体が、Ｎ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミンであることが好ましい。
【００１６】
第２の発明に係る遺伝子キャリアにおいて、前記脂質は１または複数種のリン脂質であってもよい。
【００１７】
第２の発明に係る遺伝子キャリアにおいて、前記リン脂質がジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）であることが好ましい。
【００１８】
第２の発明に係る遺伝子キャリアにおいて、Ｎ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミンとジラウロイルホスファチジルコリンのモル比が１：１であり、かつＮ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミンとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのモル比が１：１〜１：２であることがさらに好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
第１の発明に係るＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩は、従来用いられている遺伝子導入試薬に比べより高い効率で細胞内へ遺伝子を導入することができ、しかも細胞毒性が低い。また、Ｎ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体は、従来用いられているポリアミン系遺伝子導入試薬に比べ安価に合成することができ、化学的安定性にも優れるため、遺伝子導入試薬の製造および保存に要するコストを低減することができる。
【００２０】
上記の式（２）で表されるＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩は、比較的安価に市販されている原料を用いて合成されるため、より安価に製造することができる。
特に、上記の式（３）で表されるＮ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミンおよびその塩は、安価であるとともに、特に高い遺伝子導入効率を有している。
【００２１】
第２の発明に係る遺伝子キャリアにおいては、Ｎ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩のいずれか一方または双方、ならびに脂質を構成成分として含み、表面が正荷電を帯びているカチオン性リポソームを形成するため、ポリアニオンである遺伝子の封入効率に優れている。しかも、細胞への遺伝子導入効率が従来用いられている遺伝子導入試薬よりも高く、細胞毒性が低いという優れた効果を奏する。
【００２２】
第２の発明に係る遺伝子キャリアにおいて、Ｎ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体が、Ｎ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミンである場合には、製造コストが安価であるとともに遺伝子導入効率の高い遺伝子キャリアを得ることができる。
【００２３】
第２の発明に係る遺伝子キャリアにおいて、構成成分である脂質が１または複数種のリン脂質である場合には、生体親和性が高く安定性の高い遺伝子キャリア（カチオン性リポソーム）を形成することができる。特に複数種のリン脂質を構成成分とする場合には、リン脂質の種類および組成を適宜選択することにより、遺伝子や導入対象となる細胞等に応じて遺伝子キャリアの形状および大きさを変化させることができる。
【００２４】
第２の発明に係る遺伝子キャリアにおいて、リン脂質がＤＯＰＥおよびＤＬＰＣである場合には、特に遺伝子導入効率に優れた遺伝子キャリアを得ることができる。
【００２５】
第２の発明に係る遺伝子キャリアにおいて、Ｎ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミンとジラウロイルホスファチジルコリンのモル比が１：１であり、かつＮ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミンとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのモル比が１：１〜１：２である場合には、遺伝子導入効率が高く、かつ細胞毒性の低い遺伝子キャリアを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の一実施の形態に係る遺伝子キャリアにおいて、その構成成分として用いられ、前記式（１）で表されるＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体は、式（２）で表されるＮ１−（３，５−ジアルコキシベンジル）エタン−１，２−ジアミンである。このＮ１−（３，５−ジアルコキシベンジル）エタン−１，２−ジアミンは、式（４）で表される３，５−ジヒドロキシベンズアルデヒドを出発原料として、下式で表されるような合成経路により合成することができる。
【００２７】
【化４】
2008143844.tif 000006
【００２８】
なお、上記式（２）、（５）および（６）中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して炭素数１０〜２５のアルキル基を表す。
【００２９】
まず、３，５−ジヒドロキシベンズアルデヒドを、塩基の存在下でハロゲン化アルキルと反応させることにより、式（５）で表される３，５−ジアルコキシベンズアルデヒドを得る。このとき、アルキル基Ｒ１およびＲ２が同一のものである場合には、反応は一段階で行うことができるが、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ異なるものである場合には、過剰量の３，５−ジヒドロキシベンズアルデヒドをハロゲン化アルキルＲ１−Ｘと反応させ、モノアルコキシ置換体を単離した後にハロゲン化アルキルＲ２−Ｘと反応させる。また、３，５−ジアルコキシベンズアルデヒドの合成の際にＭＯＨ（Ｍはアルカリ金属を表す）等の強塩基を用いると、ベンズアルデヒドが不均化反応（カニツァロ反応）を起こし、安息香酸およびベンジルアルコールを生じるので、炭酸カリウム、炭酸セシウム等の弱塩基が用いられる。
【００３０】
次いで、３，５−ジアルコキシベンズアルデヒドを、還元剤の存在下で、一方のアミノ基が保護されたＮ，Ｎ’−エタン−１，２−ジアミンＹＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（Ｙは保護基を表す）と反応させることにより（還元的アミノ化）、式（６）で表される、一級アミノ基が保護されたＮ−（３，５−ジアルコキシベンジル）エタン−１，２−ジアミン誘導体を得る。還元的アミノ化に用いることができる還元剤としては、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢ（ＯＡｃ）３Ｈ、２−ピコリルボラン等が挙げられる。また、保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基等の、還元的アミノ化に用いられる還元剤によって分解（脱保護）されない任意の保護基を用いることができる。また、フタロイル（Ｐｈｔ）基で保護されたＰｈｔＮＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２を用いてもよい。
【００３１】
最後に、一級アミノ基が保護されたＮ１−（３，５−ジアルコキシベンジル）エタン−１，２−ジアミン誘導体の脱保護により、目的物であるＮ１−（３，５−ジアルコキシベンジル）エタン−１，２−ジアミンが得られる。脱保護反応の条件は、用いた保護機の種類によって適宜選択される。例えば、保護基としてＢｏｃ基を用いた場合には、脱保護は、Ｎ１−（３，５−アルコキシベンジル）エタン−１，２−ジアミン誘導体をジクロロメタン等の溶媒中でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）等の強酸と反応させることにより行われる。
【００３２】
Ｎ１−（３，５−ジアルコキシベンジル）エタン−１，２−ジアミンは、一級および二級アミノ基の一方または双方がプロトン化された塩として用いることもできる。遺伝子キャリアの形成およびその内部への遺伝子の封入を妨げず、細胞毒性等の成体への有害な作用を有しない任意の塩を用いることができるが、具体例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩等が挙げられる。
【００３３】
このようにして合成されたＮ１−（３，５−ジアルコキシベンジル）エタン−１，２−ジアミンおよびその塩のいずれか一方または双方を構成成分とする遺伝子キャリアは、他の構成成分である脂質とともにリポソーム（脂質二分子膜よりなる閉鎖小胞）を形成する。リポソームの調製方法としては、その構造（単層または多層膜）および大きさに応じて、任意の方法を用いることができる。例えば、Ｎ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体および脂質を所定の割合でクロロホルム等の溶媒に溶解した脂質溶液を、ナス型フラスコ等の容器に入れ、次いで、ロータリーエバポレータ等を用いて減圧下で溶媒を留去し、容器の器壁に脂質薄膜を形成させる。これにリン酸緩衝生理食塩水等の水性溶媒を加えて振とう膨潤させ、ボルテックスミキサー等により脂質薄膜を剥離させ、得られた懸濁液に超音波照射することにより調製される。なお、振とう膨潤以降の操作は、脂質薄膜の相転位温度よりも高い温度で行うことが好ましい。
あるいは、密閉可能なキャップを有するチューブに取った脂質粉末に水を加えた後、超音波照射または加熱処理（たとえば９０℃で１５分間）を行うことによってもリポソームを調製することができる。
【００３４】
遺伝子キャリアの構成成分として用いられる脂質としては、リポソームの形成、リポソーム内部への遺伝子の封入、および脂質交換、エンドサイトーシス等を介した細胞内への遺伝子導入を行うことができる任意の１または複数種類の脂質を用いることができる。脂質としては天然由来のものであっても、化学的に合成されたものであってもよく、脂肪酸トリグリセリド、リン脂質以外にも任意の構造を有する両親媒性化合物を用いることができる。
遺伝子キャリアの構成成分としては、特に、生体親和性が高く安定なリポソームを形成するリン脂質が好ましく、式（７）で表されるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および式（８）で表されるジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）の組み合わせがさらに好ましい。
【００３５】
【化５】
2008143844.tif 000007
【００３６】
遺伝子キャリアの構成成分であるＮ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体および脂質の組成は、脂質の構造および組み合わせ等に依存するため一義的に決定することは困難であるが、Ｎ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミン（以下、化合物（３）ともいう）、ＤＬＰＣ、およびＤＯＰＥを構成成分とする遺伝子キャリアの場合、化合物（３）とＤＯＰＥのモル比が１：０．４〜１：２．２の範囲内であり、かつ化合物（３）とＤＬＰＣのモル比が１：０．９〜１：１．１の範囲内である場合が好ましく、化合物（３）とＤＯＰＥとのモル比が１：１〜１：２の範囲内であり、かつ化合物（３）とＤＬＰＣのモル比が１：１である場合が最も好ましい。
【００３７】
遺伝子キャリアにより細胞内に導入することのできる遺伝子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡのキメラ核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド等いかなるものであってもよい。また、１本鎖、２本鎖、３本鎖のいずれであってもよく、プラスミドＤＮＡ等の環状のものであってもよい。
また、導入される遺伝子は、細胞内で発現してタンパク質を産生するものであってもよく、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド等の標的遺伝子の発現を抑制するものであってもよい。
これらの遺伝子の水性溶液をリポソーム溶液に添加し、たとえば激しく撹拌した後、一定時間インキュベーションすることによりリポソームの内部に封入することができる。
【００３８】
上記のようにして遺伝子が封入された遺伝子キャリアを細胞に接触させることで、遺伝子キャリアに含まれる遺伝子が細胞内に導入される。
ここで、細胞の種類は特に限定されず、真核細胞および原核細胞のいずれであってもよいが、真核細胞の方がより好ましい。真核細胞の種類についても特に制限されず、ほ乳類、は虫類、鳥類、両性類、魚類等の脊椎動物、昆虫等の非脊椎動物、植物、および酵母等の微生物由来の細胞等が挙げられる。また、たとえばガン細胞等の病変組織に由来する細胞であってもよい。
細胞への遺伝子導入は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）のいずれにおいても行うことができる。
【００３９】
遺伝子キャリアには、保存性を改善し、投与時の安定性を高めるために安定化剤および酸化防止剤の一方または双方を添加してもよく、薬物の送達部位の特異性や血中滞留性（いわゆるステルス性）を向上させるための表面修飾剤を添加してもよい。
【００４０】
安定化剤としては、膜流動性を低下させるコレステロールなどのステロール、あるいはグリセロール、シュクロースなどの糖類が挙げられる。
酸化防止剤としては、トコフェロール同族体すなわちビタミンＥなどが挙げられる。トコフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが、いずれの異性体も使用できる。
表面修飾剤としては、親水性高分子やグルクロン酸、シアル酸、デキストランなどの水溶性多糖類の誘導体が挙げられる。
【００４１】
親水性高分子としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、合成ポリアミノ酸、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどが挙げられる。その中でもポリエチレングリコールは血中滞留性を向上させる効果が顕著であるため最も好ましい。
【００４２】
また、親水性高分子は、長鎖脂肪族アルコール、ステロール、ポリオキシプロピレンアルキル、またはグリセリン脂肪酸エステル等の疎水性化合物と結合させた誘導体を用いることによって、疎水性化合物部位を遺伝子キャリア（例えばリポソーム）の膜へ安定に挿入することができる。そのことにより、遺伝子キャリア表面に親水性高分子を存在させることができる。用いることができる好ましい親水性高分子誘導体の具体例としては、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
【実施例】
【００４３】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
実施例１：Ｎ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミンの合成
（１）３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンズアルデヒドの合成
【００４４】
【化６】
2008143844.tif 000008
【００４５】
式（４）で表される３，５−ジヒドロベンズアルデヒド（１、０．５０ｇ、７．２４ｍｍｏｌ）、１−ブロモペンタデカン（５．２８ｍＬ、１８．１ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（５．００ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、６０℃で１８時間加熱した。室温まで冷却した後、水（５０ｍＬ）を加え３０分間撹拌した。懸濁液をろ過した後、残渣を水（２５ｍＬ）、メタノール（２５ｍＬ）、ヘキサン（２５ｍＬ）で洗浄した。残渣を真空乾燥した後にクロロホルム−エタノール混合溶媒（５０ｍＬ、１：１  ｖ／ｖ）に溶解し、環流温度まで加熱した。活性炭を加え１０分間環流を続けた後、活性炭を濾過によって除き、クロロホルムで洗浄した。ろ液をクロロホルム−エタノールで再結晶し、得た結晶をエタノールで洗浄した後に真空乾燥し標記化合物を得た（２．８０ｇ、７０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：９．８９（１Ｈ，ｓ，ＣＨＯ）、６．９８（２Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）、６．７０（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）、３．９８（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４，２×ＯＣＨ２）、１．７８（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝１３．８  ａｎｄ  ６．９，２×ＯＣＨ２ＣＨ２）、１．４８−１．４２（４Ｈ，ｍ，２×ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、１．３４−１．２２（４４Ｈ，ｂｒ  ｓ，２×Ｃ１１Ｈ２２）、０．８８（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９，２×ＣＨ３）。
【００４６】
（２）［２−{３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジルアミノ}−エチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成
【００４７】
【化７】
2008143844.tif 000009
【００４８】
式（５ａ）で表される３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンズアルデヒドと（２−アミノエチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１４５ｍｇ，０．９０ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン（１０ｍＬ）に溶解した後、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（２９０ｍｇ，１．３５ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。室温、窒素気流下で１８時間反応した後、重曹水で反応を停止させた。反応液をクロロホルムで抽出し、硫酸マグネシウムを用いて乾燥後、減圧蒸留し標記化合物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：６．４６（２Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）、６．３５（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）、５．１６（１Ｈ，ｂｒ  ｓ，ＮＨＣＯ２）、３．９１（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４，２×ＯＣＨ２）、３．７５（２Ｈ，ｓ，ＡｒＣＨ２）、３．２６（２Ｈ，ａｐｐ  ｑ，Ｊ＝１１．２  ａｎｄ  ５．６，ＣＨ２ＮＨＣＯ２）、２．７７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７，ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ２）、１．７７−１．７２（４Ｈ，ｍ，２×ＯＣＨ２ＣＨ２）、１．４５−１．４１（１３Ｈ，ｂｒ  ｓ，ＯＣ（ＣＨ３）３  ａｎｄ  ２×ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、１．３０−１．２５（４４Ｈ，ｂｒ  ｓ，２×Ｃ１１Ｈ２２）、０．８８（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９，２×ＣＨ３）。
【００４９】
（３）Ｎ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミンの合成
【００５０】
【化８】
2008143844.tif 000010
【００５１】
式（６ａ）で表される［２−{３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジルアミノ}−エチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルをトリフルオロ酢酸−塩化メチレン（１０：１，２０ｍＬ）に溶解し室温で１８時間撹拌した。溶媒を減圧蒸留にて除去した後、Ｎ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミンを得た（２１７ｍｇ，４０％  ３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンズアルデヒドからの２工程収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：６．４８（２Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）、６．４６（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）、５．２６（１Ｈ，ｂｒ  ｓ，ＮＨ）、４．０５（２Ｈ，ｓ，ＡｒＣＨ２ＮＨ）、３．８８（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４，２×ＯＣＨ２）、３．４２（２Ｈ，ｓ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２）、３．３５（２Ｈ，ｓ，ＣＨ２ＮＨ２）、１．７２（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．９，２×ＯＣＨ２ＣＨ２）、１．４２−１．３９（４Ｈ，ｍ，２×ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２），１．２９−１．２５（４４Ｈ，ｍ，２×Ｃ１３Ｈ２７）、０．８８（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９，２×ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：１６１．１、１６１．０、１３１．０、１０７．８、１０７．８、１０２．９、６８．３、６８．２、５８．６、５２．０、４３．１、３１．９、３１．９、３０．２、３０．２、２９．９、２９．９、２９．９、２９．８、２９．７、２９．７、２９．７、２９．７、２９．７、２９．７、２９．６、２９．６、２９．５、２９．４、２９．４、２９．３、２９．３、２９．１、２６．０、２５．９、２２．７、２２．７、１４．０、１４．０。
【００５２】
実施例２：プラスミドＤＮＡを封入した遺伝子キャリアの調製
実施例１で合成したＮ１−［３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンジル］エタン−１，２−ジアミン（化合物（３））、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファジルエタノールアミン）、ＤＬＰＣ（ジラウロイルホスファチジルコリン）の脂質粉末を、それぞれ０．１μｍｏｌ／１０μＬになるようにクロロホルム溶液に溶解した。このようにして得られたそれぞれの脂質溶液を、化合物（３）：ＤＯＰＥ：ＤＬＰＣ＝１：２：１（モル比、全脂質量：３．２μｍｏｌ）となるよう混合し、エバポレーターを用いて溶媒を減圧留去して脂質薄膜を形成させた。これにＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）（１ｍＬ）を加え、６０℃に加温し、超音波照射装置で分散させてリポソーム分散液を得た。次いで、ルシフェラーゼの遺伝子を組み込んだプラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３）８０μｇを溶解した水溶液１ｍＬを上記で調製されたリポソーム分散液と混合し、ボルテックスミキサーで激しく振とう撹拌することによりプラスミドＤＮＡを封入した遺伝子キャリアを調製した。
同様の方法により、化合物（３）、ＤＯＰＥ、およびＤＬＰＣのモル比が、それぞれ、１：１：１、１：０．４１．０．９１、１：０：１である遺伝子キャリアも調製した。
また、比較のために、カチオン性脂質として化合物（３）の代わりに下式で表される３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンゼンカルボキシキドアミドを用いて、４種類の異なるモル比を有する遺伝子キャリアを調製した。
【００５３】
【化９】
2008143844.tif 000011
【００５４】
実施例３：Ｈｅｐ  Ｇ２細胞への遺伝子の導入および遺伝子発現量のアッセイ
９６ウェルプレート（ファルコン社製）に１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＭＥＭ培地で１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したヒト肝細胞ガンＨｅｐ  Ｇ２細胞（日本癌研究バンクより入手可能）を１００μＬずつ播種し、実施例２で調製した８種類の遺伝子キャリア（プラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３）を含むリポソーム）を含む懸濁液５．０μＬを加えた。播取したＨｅｐ  Ｇ２細胞は１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルであり、プラスミドＤＮＡの添加量は、ウェルあたり０．２μｇである。得られた混合物をＣＯ２インキュベーターで４８時間培養後、新しい培地に交換した。さらに２４時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。細胞を溶解し、基質を添加してルシフェラーゼ活性（ルシフェラーゼによる基質の分解に伴う発光強度）をプレートリーダーにより測定した。細胞溶解液中の総タンパク質量を定量することでウェル間の規格化を行った。こうして各遺伝子キャリアについて得られた実験結果を図１に示す。
【００５５】
なお、図１において、横軸のＮｏ．１〜８は、実施例２で調製した８種類の遺伝子キャリアを用いた実験の結果を表し、用いたカチオン性脂質の種類および遺伝子キャリアの組成は図１中の表に示すとおりである。
横軸の「ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ」は、市販のポリアミン系のカチオン系脂質であるリポフェクトアミン２０００（商標名：インビトロジェン社）を構成成分とする遺伝子キャリアを用いて行った遺伝子導入実験の結果を表し、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は、カチオン性脂質を含まないリポソームによる遺伝子導入実験の結果を表す。
また、縦軸の「ＲＬＵ」は、相対光量ユニット（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔｓ）を意味する。
【００５６】
Ｎｏ．４および「ｃｏｎｔｒｏｌ」を除いて、基質の酵素分解に伴う蛍光が観測された。このことから、これらの実験系を除き、細胞内に導入された遺伝子が発現してルシフェラーゼが生成したことがわかる。また、カチオン性脂質として化合物（３）を用いた遺伝子キャリアは、３，５−ビス（ペンタデシルオキシ）ベンゼンカルボキシキドアミドを用いた遺伝子キャリアよりも、Ｎｏ．４を除いてより高い遺伝子導入効率を示すことがわかる。さらに、Ｎｏ．１および２については、「ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ」よりも高い蛍光強度が観測された。このことから、これらの実験系において使用した、化合物（３）、ＤＯＰＥおよびＤＬＰＣのモル比がそれぞれ１：１：１、および１：２：１である遺伝子キャリアによる遺伝子導入効率は、リポフェクトアミン２０００を用いた場合よりも高いことがわかる。
【００５７】
実施例４：細胞毒性のアッセイ
９６ウェルプレート（ファルコン社製）に１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＭＥＭ培地で１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したヒト肝細胞ガンＨｅｐ  Ｇ２細胞（日本癌研究バンクより入手可能）を１００μＬずつ播種し、実施例２で調製した８種類の遺伝子キャリア（プラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３）を含むリポソーム）を含む懸濁液５．０μＬを加えた。播取したＨｅｐ  Ｇ２細胞は１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルであり、プラスミドＤＮＡの添加量は、ウェルあたり０．２μｇである。得られた混合物をＣＯ２インキュベーターで４８時間培養後、新しい培地に交換し、さらに２４時間インキュベートした。Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社同仁化学研究所製）溶液をウェルあたり１０μＬ添加し、ＣＯ２インキュベーターで２時間呈色反応を行った後、４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、予め作成した検量線より生細胞数を求め、生存率を計算により求めた。
【００５８】
このようにして求めたＨｅｐ  Ｇ２細胞の生存率を図２に示す。なお、横軸のＮｏ．１〜８、「ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ」、および「ｃｏｎｔｒｏｌ」の意味は、実施例３と同様である。
図２から明らかなように、カチオン性脂質として化合物（３）を用いた場合（Ｎｏ．１〜４）における細胞の生存率は、リポフェクタミン２０００と同等またはそれ以上の高い値を示した。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】遺伝子キャリアの組成とＨｅｐ  Ｇ２細胞における遺伝子発現量との関係を示すグラフである。
【図２】遺伝子キャリアの組成とＨｅｐ  Ｇ２細胞の生存率との関係を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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