(57)【要約】【課題】抗ウイルス活性が高くて細胞毒性が低いアズキプロアントシアニジンベースの抗ウイルス剤と、そのような抗ウイルス剤を得るためのアズキ処理方法を提供すること。【解決手段】本発明の抗ウイルス剤は、アズキから抽出されたアズキプロアントシアニジン（ＡＰＡ）を含有するアズキ抽出成分と、ビタミンＣ、トコフェロール、システイン、グルタチオン、およびトリス・トリメチル・サイレーンの中から選ばれる１種または２種以上である還元剤とを有効成分として含有するものである。ＡＰＡは、アズキからＡＰＡを含有する可溶成分をエタノール水溶液に溶出させ、ＡＰＡ含有溶液と固形分とを遠心分離し、ＡＰＡ含有溶液をシリカゲル系吸着剤が充填されたカラムに通し、ＡＰＡを含有する目的画分を分取、スプレイドライ法または凍結乾燥法にて粉末化する、という方法で得ることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アズキから抽出されたアズキプロアントシアニジンを含有するアズキ抽出成分と、ビタミンＣ、トコフェロール、システイン、グルタチオン、およびトリス・トリメチル・サイレーンの中から選ばれる１種または２種以上である還元剤とを有効成分として含有する
ことを特徴とする抗ウイルス剤。
【請求項２】
前記アズキ抽出成分は、アズキを水またはアルコール抽出することによって得られた成分であり、２量体−１０量体のアズキプロアントシアニジンオリゴマーを５０％以上含有する
ことを特徴とする請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
前記アズキ抽出成分は、アズキ由来低分子フラボノイドと有機酸を２０％以下まで減少させたものである
ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項４】
前記アズキ抽出成分は、アズキを水洗して夾雑物を除去し、濃度５０％以下のアルコール水溶液にて１０−２０時間攪拌洗浄して低分子糖類およびサポニンを除去し、その後、新しい濃度５０％以下のエタノール水溶液にて２０−４０時間攪拌抽出し、固形分を遠心分離で除き、抽出液のアルコール成分を除去するため減圧濃縮後、濃縮液に存在する前記アズキプロアントシアニジンを含有する吸着成分をシリカゲル系吸着剤を充填したカラムに吸着させ、前記吸着成分を２０−５０％エタノール水溶液で溶出させることによって得られた成分であり、
前記アズキ抽出成分中には、２量体−１０量体のアズキプロアントシアニジンオリゴマーを５０％以上含有し、且つ、前記アズキ抽出成分中に含まれる低分子フラボノイドおよび有機酸を２０％以下に減少させてある
ことを特徴とする請求項１−請求項３のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
【請求項５】
前記シリカゲル系吸着剤は、シリカゲル表面に炭素数１−１８の直鎖炭化水素基を化学結合させることにより、前記シリカゲル表面を疎水化してなる疎水性シリカゲルである
ことを特徴とする請求項４に記載の抗ウイルス剤。
【請求項６】
前記還元剤が、ビタミンＣである
ことを特徴とする請求項１−請求項５のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
【請求項７】
飲食品、医薬品、化粧品、または貼付剤のいずれかに配合されている
ことを特徴とする請求項１−請求項６のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
【請求項８】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、疣贅ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ノーウォークウイルス、ロタウイルス、エコーウイルス、またはエンテロウイルスのいずれかに対し、抗ウイルス性を示す
ことを特徴とする請求項１−請求項７のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
【請求項９】
アズキを水洗後、２５−３５％エタノール水溶液に１０−２０時間攪拌浸漬した後、新たな２５−３５％エタノール水溶液で更に２０−４０時間攪拌浸漬することによりアズキプロアントシアニジンを含有する可溶成分を前記エタノール水溶液に溶出させ、得られたアズキプロアントシアニジン含有溶液と前記アズキプロアントシアニジン含有溶液以外の固形分とを遠心分離し、前記アズキプロアントシアニジン含有溶液については、シリカゲル系吸着剤が充填されたカラムに通して、アズキプロアントシアニジンを含有する目的画分を分取、スプレイドライ法、または凍結乾燥法により粉末化する
ことを特徴とするアズキの処理方法。
【請求項１０】
前記アズキプロアントシアニジン含有溶液以外の固形分については、アズキ系食品素材として利用する
ことを特徴とする請求項９に記載のアズキの処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス剤、およびアズキの処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、プロアントシアニジンを有効成分とする抗ＳＡＲＳウイルス剤は、既に提案されている（下記特許文献１参照。）。
また、このようなプロアントシアニジンを抽出するための植物体として、下記特許文献１においては、ブドウ、クランベリー、カカオ、リンゴ、小豆、柿、キャベツ、大麦、麦芽、クルミ、アーモンド、杉、桧、松、栃、樫、乾姜（カンキョウ）、茗荷（ミョウガ）、葉生姜（ハショウガ）等が開示されている（特許文献１：段落［００１３］）。
【特許文献１】特開２００５−３１４３１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ところで、上記のような植物体は、いずれもプロアントシアニジンを含有する植物体ではあるものの、工業的な生産性や経済性などをも考慮した場合、実用性の高い原料はある程度絞られてくる。そのため、現状で市販されているプロアントシアニジンは、ブドウ種子由来のものや松（フランス海岸松）由来のものなど、一部の限られた原料から抽出されたものばかりである。
【０００４】
しかし、ブドウ種子や松といった原料そのものは、ごく一般的な食品とは言い難いものばかりであるため、ブドウ種子由来の抽出物や松由来の抽出物では、それらを摂取することに抵抗感のある消費者も少なくない。
【０００５】
そこで、本件発明者らは、消費者が食品として受け入れやすい原料について検討し、その中でアズキに着目した。アズキであれば、日本で大量に生産、消費されている常用食品なので、比較的容易に原料を入手でき、また、消費者にとってはブドウ種子や松よりも、食品として受け入れやすいものと考えられる。
【０００６】
しかし、例えば、ブドウ種子からプロアントシアニジンを抽出する場合には、水による抽出で不純物が相応に少ないプロアントシアニジンを抽出できるのに対し、同様の方法でアズキからプロアントシアニジンを抽出しようとすると、以下のような問題が発生した。
【０００７】
まず、水による抽出では、アズキプロアントシアニジンに加えて、様々な不純物（糖類、サポニン、ルチンなど）が大量に抽出されるため、これらの不純物が原因でアズキ抽出物の抗ウイルス活性が期待するほど高くならない、という問題があった。
【０００８】
また、サポニンやルチンは、大量に摂取すると胃を刺激するなどの弊害があるので、これらの成分がアズキ抽出物に含有されているのは、あまり好ましいことではなかった。
さらに、本件発明者が実験的に確認したところ、アズキプロアントシアニジンは、抗ウイルス活性を示すだけではなく、僅かながら細胞毒性を示す傾向があるため、抗ウイルス剤として実用化するには、少しでも細胞毒性を低下させることが重要であった。
【０００９】
こうした背景の下、本件発明者は、アズキ抽出物中の不要な不純物を低減する方法、およびアズキプロアントシアニジンの細胞毒性をさらに低下させる方法について、鋭意検討を重ねた。その結果、特定の処理を行うことでアズキ抽出物中のアズキプロアントシアニジンの純度を高めることができること、さらに、特定の物質をアズキ抽出物と併用することで、アズキプロアントシアニジンの抗ウイルス活性が増強され、抗ウイルス剤としてきわめて有望なものとなることが判明した。
【００１０】
しかも、その特定の物質をアズキプロアントシアニジンと併用すれば、アズキプロアントシアニジンの細胞毒性を低下させることができることを見いだした。
本発明は、上記知見に基づいて完成されたものであり、その目的は、抗ウイルス活性が高くて細胞毒性が低いアズキプロアントシアニジンベースの抗ウイルス剤と、そのような抗ウイルス剤を得るためのアズキ処理方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
以下、本発明において採用した構成について説明する。
本発明の抗ウイルス剤は、アズキから抽出されたアズキプロアントシアニジンを含有するアズキ抽出成分と、ビタミンＣ、トコフェロール、システイン、グルタチオン、およびトリス・トリメチル・サイレーンの中から選ばれる１種または２種以上である還元剤とを有効成分として含有することを特徴とする。
【００１２】
このように構成される本発明の抗ウイルス剤において、前記アズキ抽出成分は、アズキを水またはアルコール抽出することによって得られた成分であり、２量体−１０量体のアズキプロアントシアニジンオリゴマーを５０％以上含有するものであると好ましい。
【００１３】
また、本発明の抗ウイルス剤において、前記アズキ抽出成分は、アズキ由来低分子フラボノイドと有機酸を２０％以下まで減少させたものであると好ましい。
また、本発明の抗ウイルス剤において、前記アズキ抽出成分は、アズキを水洗して夾雑物を除去し、濃度５０％以下のアルコール水溶液にて１０−２０時間攪拌洗浄して低分子糖類およびサポニンを除去し、その後、新しい濃度５０％以下のエタノール水溶液にて２０−４０時間攪拌抽出し、固形分を遠心分離で除き、抽出液のアルコール成分を除去するため減圧濃縮後、濃縮液に存在する前記アズキプロアントシアニジンを含有する吸着成分をシリカゲル系吸着剤を充填したカラムに吸着させ、前記吸着成分を２０−５０％エタノール水溶液で溶出させることによって得られた成分であり、前記アズキ抽出成分中には、２量体−１０量体のアズキプロアントシアニジンオリゴマーを５０％以上含有し、且つ、前記アズキ抽出成分中に含まれる低分子フラボノイドおよび有機酸を２０％以下に減少させてあると好ましい。
【００１４】
さらに、本発明の抗ウイルス剤において、前記シリカゲル系吸着剤は、シリカゲル表面に炭素数１−１８の直鎖炭化水素基を化学結合させることにより、前記シリカゲル表面を疎水化してなる疎水性シリカゲルであると好ましい。
【００１５】
また、本発明の抗ウイルス剤において、前記還元剤は、ビタミンＣであると好ましい。
また、本発明の抗ウイルス剤は、飲食品、医薬品、化粧品、または貼付剤のいずれかに配合されていると好ましい。
【００１６】
さらに、本発明の抗ウイルス剤は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、疣贅ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ノーウォークウイルス、ロタウイルス、エコーウイルス、またはエンテロウイルスのいずれかに対し、抗ウイルス性を示すものであると好ましい。
【００１７】
以下、本発明の抗ウイルス剤について、さらに詳しく説明する。
本発明の抗ウイルス剤は、有効成分として、アズキプロアントシアニジンを含有するアズキ抽出成分と還元剤とを含有している点に特徴がある。プロアントシア二ジンとしては、ブドウ種子やフランス海岸松の樹皮由来のものが広く知られているが、これらのものと比べ、アズキプロアントシアニジンは、分子組成が幾分異なり、抗ウイルス活性も若干強い。
【００１８】
このような有益な傾向が生じる理由は、様々な要因が複合的に影響している可能性があるので、一概には断定できないが、一つの要因としては、本発明において採用するアズキプロアントシア二ジンの調整法による影響が考えられる。
【００１９】
すなわち、本発明において採用した方法でアズキプロアントシア二ジンを調整すれば、糖類、高分子量プロアントシア二ジンが除かれ、２−１０量体のプロアントシア二ジン含有量が５０％以上に濃縮されるので、このことが抗ウイルス活性が増強される一因ではないかと考えられる。また、本発明において採用した方法でアズキプロアントシア二ジンを調整すれば、低分子フラボノイド、有機酸含有量が２０％以下に調整されるので、これらの非活性が上昇する。
【００２０】
高分子プロアントシア二ジンは比較的タンパク質凝集性が強く、やや強い細胞毒性を示す傾向がある。また、低分子フラボノイドは一般的に生理活性を持つものが多く、細胞毒性を持つものも多い。したがって、これらを減少させたことが非活性上昇の原因と考えられる。
【００２１】
そして更に、本発明の抗ウイルス剤においては、上記のようなアズキプロアントシアニジンと還元剤との併用によって、アズキプロアントシアニジンの抗ウイルス活性が３−５倍増強されるので、抗ウイルス剤としてきわめて有望なものとなる。
【００２２】
また、アズキプロアントシアニジンは高濃度では細胞毒性を示す傾向があるが、還元剤をアズキプロアントシアニジンと併用すれば、アズキプロアントシアニジンが示す細胞毒性は更に高い濃度によってのみ誘導される（細胞毒性を低下させることができる）。
【００２３】
なお、以上のような効果は、本件発明者らが実験を繰り返す中で確認した事実である。本件発明者らの知見によれば、アズキプロアントシアニジンを含有するアズキ抽出成分と還元剤とを併用したものは、マンガン・スーパーオキシド（Ｍｎ−ＳＯＤ）誘導作用と細胞増殖静止作用により、抗ウイルス作用を示すものと考えられる。
【００２４】
すなわち、Ｍｎ−ＳＯＤなどの抗酸化因子は、ウイルス感染で宿主細胞に誘発される酸化ストレス反応で産生されるスーパーオキサイドを中和することにより、抗ウイルス作用を発揮する。アズキプロアントシアニジンを含有するアズキ抽出成分および還元剤を併用した事による抗ウイルス作用の程度については、後述する本発明の実施形態の中で明らかにする。
【００２５】
ところで、還元剤としてビタミンＣを利用する場合、ビタミンＣ自体も高濃度では細胞障害を示す傾向があるが、アズキプロアントシアニジンと併用することで、ビタミンＣによる細胞障害は抑制される。
【００２６】
つまり、アズキプロアントシアニジンおよびビタミンＣは、どちらも単独では、高濃度での使用にいくらか問題があるが、両者を併用することにより、互いの問題を打ち消し合い、抗ウイルス剤としての効果を増強することができるのである。一般的な事実として、プロアントシア二ジンは、アルカリで分解され抗酸化能を喪失するが、ビタミンＣなどの還元剤の存在下にアルカリ分解を行うと、抗酸化能が失活しない。このことは、ビタミンＣなどがアルカリ分解反応下で、プロアントシア二ジンを酸化反応から保護していることを示しビタミンＣとフェノール性水酸基の直接的な相互作用が示唆される。
【００２７】
さて、以上説明したような抗ウイルス剤を製造するに当たって、アズキプロアントシアニジンを得るには、次のような処理方法で抽出すると好ましい。
すなわち、本発明のアズキの処理方法は、アズキを水洗後、２５−３５％エタノール水溶液に１０−２０時間攪拌浸漬した後、新たな２５−３５％エタノール水溶液で更に２０−４０時間攪拌浸漬することによりアズキプロアントシアニジンを含有する可溶成分を前記エタノール水溶液に溶出させ、得られたアズキプロアントシアニジン含有溶液と前記アズキプロアントシアニジン含有溶液以外の固形分とを遠心分離し、前記アズキプロアントシアニジン含有溶液については、シリカゲル系吸着剤が充填されたカラムに通して、アズキプロアントシアニジンを含有する目的画分を分取、スプレイドライ法、または凍結乾燥法により粉末化することを特徴とする。
【００２８】
本発明のアズキの処理方法において、前記アズキプロアントシアニジン含有溶液以外の固形分については、アズキ系食品素材として利用すると好ましい。
ちなみに、本発明の抗ウイルス剤は、最終的には、その使用目的に応じた形態に加工されればよい。代表的な例を挙げれば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等が挙げられる。
【００２９】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンナン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の壊剤、白糠、ステアリン、カカオバター等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイダルシリカ等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等が例示できる。
【００３０】
さらに錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ油、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン等の結合剤、ラミナランカンナン等の崩壊剤等が例示できる。
【００３１】
上記投与形態のうちでも、特に、液剤が好ましい。
上記投与形態にある各製剤中の有効成分である前記化合物の濃度は特に限定はないが、通常０．１−７０重量％程度とすればよい。
【００３２】
また、本発明の抗ウイルス剤の投与方法は、特に制限はなく、各種の製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じた方法で、静脈投与、輸液添加、ネブライザー法などで投与される。
【００３３】
本発明の抗ウイルス剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて適宜決定できるが、通常有効成分である前記化合物の量は、１日当たり体重１ｋｇ当たり約１００μｇ−２０ｍｇ程度とすればよい。また、抗ウイルス剤は１日に２−４回程度に分けて投与してもよい。
【００３４】
また、アズキをエタノール水溶液に浸漬した後、アズキプロアントシアニジン含有溶液とアズキプロアントシアニジン含有溶液以外の固形分とを分離したら、固形分については、アズキ加工品として有効利用を図ることができる。このアズキ加工品（固形分）は、いわゆるアク抜き処理が施されたアズキに相当するものなので、例えば、餡のようなかたちに加工することで、そのまま和菓子用の材料として販売することができ、さらには、饅頭や汁粉などのようなかたちに二次加工・三次加工した上で販売することができる。
【００３５】
したがって、ブドウ種子由来あるいは松由来のプロアントシアニジンとの比較において、プロアントシアニジンを抽出した後に廃棄物として処分せざるを得ない固形分を減らすことができる、という利点がある。また、餡を加工する立場から見れば、アク抜きと称して廃棄していた成分を、プロアントシアニジンの抽出原料として有効利用することができる、という利点がある。
【発明の効果】
【００３６】
以上説明した通り、本発明によれば、抗ウイルス活性が高くて細胞毒性が低いアズキプロアントシアニジンベースの抗ウイルス剤を提供することができる。また、そのような抗ウイルス剤を得るためのアズキ処理方法を提供することができる。プロアントシア二ジンとしてはブドウ種子やフランス海岸松の樹皮由来のものが広く知られ、多岐にわたる健康食品として使用されているが、本発明の抗ウイルス剤に含まれるアズキプロアントシアニジンは、ブドウ種子由来の市販品やフランス海岸松の樹皮由来の市販品と比べ分子組成が幾分異なり（多くの細胞毒性を示す低分子フラボノイド、有機酸が少ない）、抗ウイルス活性も若干強い。さらに、以下に述べるようにビタミンＣとの併用でその活性は増強される。また、本発明の抗ウイルス剤に含まれるプロアントシア二ジンはアズキを材料に得られたものであり、日常食品由来であることにも特徴がある。
【００３７】
一般に、ウイルスは、ウイルス種を問わず、ウイルス感染に伴って宿主細胞に酸化ストレスを誘導し（R. I．Morimotoら、in “Stress Protein in Biology and Medicine、R.  I. Morimotoら編、Cold Spring Harbor Lab. N.Y.” pp1、１９９０）、ウイルス増殖の場を得るが、本発明の抗ウイルス剤は、抗酸化因子誘導物質として機能するので、理を得た抗ウイルス剤の開発に発展すると考えられる。
【００３８】
アズキは最強の抗酸化因子を含有する食品としてアメリカ合衆国の食品農業省（ＦＤＡ）から折り紙つきの食品であり、当該食品より得たアズキプロアントシアニジンとビタミンＣとを併用することで、これらがＭｎ−ＳＯＤを誘導し、抗ウイルス作用を強く示すことはその応用開発に大きな期待が寄せられる。
【００３９】
ウイルスが発見されてから１００年、様々な病気がウイルス感染によって起こされることが明らかとなり、現在もなお多くの難病はウイルスが原因であるかもしれないと予想されている。一方、予防、治療に関しては、ワクチンが有効でないウイルス疾患に対して有効な治療薬は非常に限られており、開発も困難を極めている（茂田士郎、満屋浩明、編“ウイルス感染症との闘い−現状と２１世紀への展望”医薬ジャーナル社）。さらに、新興・再興ウイルス感染が危惧されている現状で、食品成分による非特異的なウイルス疾患の予防、治療方法の提供は重要な社会的寄与に値するものである。
【００４０】
また、アズキから得たプロアントシアニジンとビタミンＣとを併用したものが、Ｍｎ−ＳＯＤを誘導し抗ウイルス作用を示すことは、材料入手の容易さのみならず、ややもするとアク抜きと称して廃棄されているアズキ由来成分を有効利用する観点からも意義を持つ。非特異的なアズキプロアントシアニジンの抗ウイルス作用は幅広いウイルス疾患の予防、治療に有用と考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
（１）アズキの処理方法（抗ウイルス剤およびアズキ系食品素材の製造方法）
まず、所期の抗ウイルス剤を製造する方法について、具体的な一例を挙げて説明する。
アズキプロアントシアニジン（以下、ＡＰＡと略称する。）の抽出、分離に先立ち、ゴミ、泥などの夾雑物を除くために十分量の水で洗浄後、試みにアズキ１００ｇを３倍量（重量／容積比）の水、３０％エタノール水溶液、５０％エタノール水溶液により、室温（２２℃）で緩やかに４８時間攪拌し抽出した。
【００４２】
水抽出では、ＡＰＡと共に多量の糖質、サポニンが抽出され、以下の操作で純度の高いＡＰＡの分離が困難であるとともに、長時間の抽出では腐敗が懸念された。５０％エタノール水溶液抽出ではＡＰＡの収量が少なく適当でかった。したがって、ＡＰＡの収量が十分で、糖質の混入も比較的少なく、腐敗の危険性も避けられる３０％エタノール水溶液抽出法を用いることにした。
【００４３】
具体的には、水洗で汚れを取り除いたアズキ１００ｇを３倍量の３０％エタノール水溶液に縣濁し、室温で１６時間攪拌洗浄後、新しい５倍量の３０％エタノール水溶液で３６時間抽出し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ×１０分、２２℃）後の上清を抽出液とした。
【００４４】
最初の３０％エタノール水溶液抽出で５０−６０％のサポニン、少糖が取り除かれた。２回目の抽出液は上記遠心操作により固形物（膨潤したアズキ）を取り除き、上清を減圧によりアルコールを除去するために１／４に濃縮した。
【００４５】
なお、２回目の遠心操作により分離された固形物（膨潤したアズキ）は、いわゆるあく抜き処理が施されたアズキに相当するものとなるので、食品素材として利用することができ、例えば、餡などのアズキ加工品とすることができる。
【００４６】
一方、ＡＰＡの分離は、逆相シリカゲル担体（富士シリシア化学株式会社製、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ、ＯＤＳ）によるカラム（１．５５×１０ｃｍ）を用い、上清を吸着させた後、３カラム容量の水で洗浄した。この段階で抽出液中に残存するサポニン（最初の３０％アルコール水溶液で抽出されなかった）と少糖は除去される。次いで５カラム容量の３０％エタノール水溶液で溶出した。
【００４７】
最初の１カラム容量の溶出液には重合度の高いＡＰＡが溶出され、次の１カラム容量の溶出液に２−１０量体のＡＰＡ、更に次の１カラム容量の溶出液に２−１０量体のＡＰＡとルチンが溶出され、この２カラム容量分画をアズキＡＰＡとした。総計５カラム容量の３０％エタノール水溶液で洗浄後、７０％エタノール水溶液で溶出することにより、２カラム容量の画分に低分子フラボノイド、有機酸、アズキ色素が溶出される。
【００４８】
以上のように、逆相シリカゲル担体を用いることにより効率よく高分子ＡＰＡや低分子フラボノイド、有機酸を除去することが出来る。使用するシリカゲルは、特に限定されないが、シリカゲル表面に炭素数１−１８の直鎖炭化水素基を化学結合させることにより、シリカゲル表面を疎水化してなる疎水性シリカゲルを用いると好ましく、特にシリカ表面にオクタデシル基を化学結合したタイプ（Ｃ１８タイプ、ＯＤＳ）が保持の長さの点で良い。逆相シリカゲル担体の粒子径は特に限定されないが、一般的には、粒子径は小さい方が好ましいものと考えられ、例えば７５μｍから１５０μｍ程度の粒子径にすると好適である。ただし、この点は設備によっても最適な粒子径が変わり得るので、設備との関係で最適な粒子径を選択することが望ましい。
【００４９】
ＡＰＡは黄色がかった橙から褐色を呈することを指標に分画し、各分画の成分分析はシリカゲルの薄層（メルク社、ＴＬＣ，Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０Ｆ）あるいは３ＭＭ濾紙（ワットマン社）上でｎ−ブタノール：酢酸：水（６：２：１）で上昇法により展開し、既知の物質と比較検討した。発色は同量の１％  ＡｇＣｌ2と１％  Ｋ3Ｆｅ（ＣＮ）6を混合、噴霧し、フェノール性水酸基の存在で同定した（南川隆雄、吉田精一、著“高等植物の二次代謝研究法、学会出版センター、生物化学実験法１４）。
【００５０】
図１に吸着成分の３０％エタノール水溶液、７０％エタノール水溶液による溶出パターンの一例を示す。図１中の左図に吸着成分を水で洗浄した画分、３０エタノール溶出画分、７０%エタノール溶出画分の９種（２−１０）を得た。各画分の組成は、１はサポニン、オリゴ糖成分が主成分を占め、３は高分子ＡＰＡ、４−５はオリゴマーＡＰＡ、６−７はルチン、８−９は単純フラボノイド、有機酸、色素、を主成分とするものであった。４−５画分をプールし、ブドウ種子由来プロアントシア二ジン（グラビノ−ル）、フランス海岸マツ樹皮由来プロアントシア二ジン（ピクノジェノール）、ＡＰＡと同様に調製したペカンナッツ果皮由来プロアントシア二ジンと組成を比較した（図１中の右図）。ＡＰＡ画分は他のものと比べ高分子、低分子フェノール物質が少ないことが明らかとなった。
【００５１】
ＡＰＡによる抗ウイルス作用は、２量体−１０量体のアズキプロアントシアニジンオリゴマーに見られる。ただし、１量体、２量体では抗ウイルス作用が弱く、多量体（８量体以上）では抗ウイルス作用は強くなるが、タンパク質凝集能も高く細胞毒性を示す。したがって、より好ましくは、抗ウイルス作用を示すＡＰＡは３−７量体からなるオリゴマーが最適である。したがって、本法で得られたＡＰＡは、この知見に合致し有用と考えられる。この画分を凍結乾燥法あるいはスプレイドライ法により、標品（抗ウイルス剤）を得た。
【００５２】
次に、上記ＡＰＡの画分、上記ＡＰＡの画分とビタミンＣ（本発明でいう還元剤の一つに相当）の混合物、上記ＡＰＡの画分とグルタチオン（本発明でいう還元剤の一つに相当）の混合物、ビタミンＣ、グルタチオン、以上の５種を被検物質として、それらの被検物質について抗ウイルス活性と細胞毒性を測定した。
【００５３】
（２）抗ウイルス活性の検証
ウイルス力価の測定は、以下のようなプラーク形成法で行った。回収した培養上清を１％  ウシ血清アルブミンを加えたＰＢＡ（−）（Ｍｇ2+，Ｃａ2+を含まない０．０５Ｍリン酸緩衝液、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で１０倍階段希釈し、各０．２ｍｌずつをそれぞれのウエル（６ウエルプレート）に接種した。２５℃で６０分間感染させた後１．０％  メチルセルロースを加えたＤＭＥＭ（５％ウシ胎児血清含有）で４日間培養した。培養後、メチルセルロースを取り除き、細胞を２．５％  クリスタルバイオレット（３０％  エチルアルコール、１％  シュウ酸アンモニウム中）で染色し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄／脱色後、プラーク数の平均値（３個のウエル）から１ｍｌ中のウイルス量をＰＦＵ (Plaque Forming Unit)/ｍｌとして算出した[吉仲由之、山本直樹  （上田重晴、西野  敦、編“抗菌・抗カビの最新技術とDDSの実際、NTT社）、第２章、ｐｐ１４−２９、２００５]。
【００５４】
また、以上の方法を用いて被検物質のＩＣ50値（ＳＡＲＳ−ＣｏＶの増殖を５０％阻害する濃度（Inhibitory concentration、(μｇ／ｍｌ)）を求めた。
また、インフルエンザウイルス（Ａ型、ＰＲ８株）、ロタウイルス（１２型）の感染価測定は、同様に培養したＭＤＣＫ細胞、ＭＡ１０４細胞に０．１ＰＦＵ／ｍｌのウイルスを感染させ被検物質の存在下、非存在下における細胞変性効果（ＣＰＥ、ＣｙｔｏＰａｔｈｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ）を観察し、効果を判定した。
【００５５】
（３）被検物質の細胞毒性の測定法
被検物質の細胞毒性の測定は、以下の方法で行った。６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏ細胞（１ｗｅｌｌ当たり２．５ｍｌの培地、２×１０6個の細胞）に各検体を０、１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍｌ加え、３７℃で培養、４８時間後に全細胞を０．４ｍｌのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用のサンプルバッファーに回収し、全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマージー・ブリリアントブルーＲ２５０（ＣＢＢ）で染色／７％酢酸で脱色後、画像をＣＣＤカメラで撮影し画像解析ソフト（The Analytical Imaging System AIS. アマシャム／ファルマシア社）によりアクチンバンドの濃度を測定した。添加検体０μｇ／ｍｌを１（対照）とし、相対的な濃度より細胞障害の程度を測定した(Nakatsue,M.ら, Biochem. Biophys.Res.Commun.253:59,1998)。
【００５６】
測定結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
2008143840.tif 000002
表１から明らかなように、ＡＰＡ画分のみでは、５０％ウイルス増殖阻害濃度（ＩＣ50）が５μｇ／ｍｌ、９５％細胞生存濃度（ＣＶ95）が３００μｇ／ｍｌであるのに対し、０．３ｍＭのビタミンＣ存在下ではＩＣ50＝１μｇ／ｍｌ、ＣＶ95＝（＞５００）μｇ／ｍｌであり抗ウイルス活性の増強、細胞毒性の低下が見られた。ビタミンＣは１ｍＭでも抗ウイルス活性は認められず、２ｍＭ以上では細胞が死滅する。
【００５８】
同様の抗ウイルス活性の増強、細胞毒性の低下がグルタチオン存在下でも観察された。グルタチオン単独では１ｍＭ以上でも抗ウイルス活性、細胞障害も見られないが、ＡＰＡと共存することにより、ＡＰＡの抗ウイルス活性が増強された（ＩＣ50＝３μｇ／ｍｌ）。
【００５９】
さらに、ビタミンＣ、グルタチオンと同等の還元能を有するいくつかの還元剤について実験的に確認したところ、トコフェロール、システイン、トリス・トリメチル・サイレーンなども、ビタミンＣやグルタチオン同様の活性化を示すことが判明した。
【００６０】
このように、ＡＰＡとビタミンＣをはじめとする各種還元剤との併用は、それぞれ単独では細胞障害を示す濃度で、細胞障害を示さずに抗ウイルス作用を示す。以上の結果は、ＡＰＡとビタミンＣの共存で抗ウイルス作用が増強され、それぞれの細胞障害作用が緩和されることを示し実用化に有用である。また、３０ｍＭでも細胞障害を起こさないグルタチオンも共存することで抗ウイルス活性が増強されることが示された。
【００６１】
（４）製造例
（４．１）錠剤の製造例
常法により、１錠中組成が下記表２の通りとなる錠剤を製造した。
【００６２】
【表２】
2008143840.tif 000003
（４．２）注射剤の製造例
下記表３のような組成の注射剤を製造した。
【００６３】
【表３】
2008143840.tif 000004
上記パラベン類、メタ重亜硫酸ナトリウム及び塩化ナトリウムを攪拌しながら８０℃で上記の約半量の蒸留水に溶解する。得られた溶液を４０℃まで冷却し、アズキプロアントシアニジン、ビタミンＣ、次にポリエチレングリコール及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートをその溶液中に溶解した。次にその溶液に注射用蒸留水を加えて最終の容量に調製し、適当なフィルターペーパーを用いて滅菌濾過することにより滅菌して１ｍｌずつアンプルに分注し、目的とする注射剤を得た。
【００６４】
（４．３）予防、治療用鼻内噴霧剤の調製
アズキプロアントシア二ジンとビタミンＣを含有する鼻内噴霧剤を、生理食塩水（０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ水溶液）１ｍｌ当たりアズキプロアントシア二ジン５ｍｇ、ビタミンＣ３ｍｇを添加することにより調製した。
【００６５】
（４．４）予防、治療用鼻溶液組成物の製造例
以下の成分を含有する鼻内噴霧剤を調製する。
【００６６】
【表４】
2008143840.tif 000005
（４．５）飲料の製造例
次の配合によりアズキプロアントシア二ジン、ビタミンＣ含有飲料１０００ｍｌ（１０本分）を製造する。
【００６７】
【表５】
2008143840.tif 000006
（４．６）飲料の製造例
次の配合によりアズキプロアントシア二ジン、ビタミンＣ含有飲料を製造１０００ｍｌ（１０本分）を製造する。
【００６８】
【表６】
2008143840.tif 000007
（４．７）チューインガムの製造例
次の配合で常法によりアズキプロアントシア二ジン、ビタミンＣ含有チューインガム（３０個分）を製造する。
【００６９】
【表７】
2008143840.tif 000008
（４．８）ドロップスの製造例
次の配合で、アズキプロアントシア二ジン、ビタミンＣ含有ドロップスを製造する。
【００７０】
【表８】
2008143840.tif 000009
糖を水５．５リットルに溶解し、グルコース含有コーンシロップを添加し、十分に混合する。この時点で、いずれかの所望の色素を添加して、所用の色を付与してもよい。色素は、十分に溶解するものを使用する。
【００７１】
上記混合物を、１２５℃に加熱した蒸気ジャケットケトルに入れる。そこから、混合物を、ポンプで貯蔵容器に入れて、連読クッカーに供給する。
シロップがクッカーにおけるコイルを通過するうちに、１２５−１５０℃の温度に到達する。その後、スチーム真空イジェクターにより、真空度２８−２９インチＨｇに維持した受け入れケトルに薬６−７分間供給する。この間に、水含量が約１％以下に減少するまで水が除去され、溶融あめ基剤が形成される。次に、このあめ基剤を、ゆっくりと冷却する。
【００７２】
アズキプロアントシア二ジン、ビタミンＣ及びワイルドチェリー模倣フレーバー（粉末状）を、ポリエチレングリコールに添加し、得られた混合物を７０℃で加熱することにより流動化する。
【００７３】
得られた熱流動体混合物を、蒸気の溶融あめ基剤（温度を１００℃、またはそれよりわずかに低下させたもの）に、適当に混和させながら迅速に添加する。つぎに、全塊を、十分に混練した後、スピニングマシンに移し、ロゼンジ形成ダイに押し出す。別法として、アズキプロアントシア二ジン、ビタミンＣを添加した溶融あめ塊を、冷却テーブルに流し、冷却テーブル上で半固体の塊になるまで固化した後、薬剤の単位投与量を投薬するためのいずれか所望の形状に成形してもよい。
【００７４】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記の具体的な一実施形態に限定されず、この他にも種々の形態で実施することができる。
例えば、上記実施形態では、還元剤として、ビタミンＣを用いる例、グルタチオンを用いる例を示したが、生体内での還元能を有する還元剤であれば、ビタミンＣやグルタチオン以外の還元剤をアズキプロアントシアニジンと併用するようにしてもよい。そのような還元剤の具体例としては、例えば、トコフェロール、システイン、トリス・トリメチル・サイレーンなどを挙げることができる。
【００７５】
また、上記実施形態では、本発明の抗ウイルス剤を、飲食品や医薬品に配合する例を示したが、この他、化粧品や貼付剤などに本発明の抗ウイルス剤を配合しても良い。
また、本発明の抗ウイルス剤は、上記実施形態において例示したウイルス以外にも適用可能である。具体的には、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、疣贅ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ノーウォークウイルス、ロタウイルス、エコーウイルス、またはエンテロウイルスなどであれば、これらのウイルスに対し、本発明の抗ウイルス剤は抗ウイルス性を示すものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】アズキ抽出成分の薄層クロマトグラフィーによるクロマトグラムを示す参考図。
【図１】
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