(57)【要約】      （修正有）【課題】突然変異を有する薬剤耐性Ｂ型肝炎ウイルスに対して活性であるβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドの提供。【解決手段】β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグを投与することを含む、宿主においてラミブジン耐性ＨＢＶ（Ｍ５５２Ｖ）を治療するための方法。さらに、β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグを投与することを含む、ナイーブ宿主においてラミブジン耐性ＨＢＶ（Ｍ５５２Ｖ）突然変異が起こることを予防するための方法。（３−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグを投与することを含む、宿主においてＨＢＶ二重突然変異株（Ｌ５２８Ｍ／Ｍ５５２Ｖ）の出現を予防する及び／又は抑制するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
場合により医薬適合性の担体又は賦形剤中に、β−Ｌ−２’−デオキシチミジン又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグの有効量を含有する、薬剤耐性型ＨＢＶに感染した宿主の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
場合により医薬適合性の担体又は賦形剤中に、β−Ｌ−２’−デオキシシチジン又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグの有効量を含有する、薬剤耐性型ＨＢＶに感染した宿主の治療のための医薬組成物。
【請求項３】
場合により医薬適合性の担体又は希釈剤中に、式：
【化１】
2008273960.tif 000097
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、独立して水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｙは、ＯＲ３、ＮＲ３Ｒ４又はＳＲ３であり；
Ｘ１は、Ｈ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ハロゲン、ＯＲ５、ＮＲ５Ｒ６又はＳＲ５から成る群より選択され；及び
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立してＨ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、ジアルキルアミノアルキレン、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体である。］
の化合物又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグの有効量を含有する、ＤＮＡポリメラーゼ領域内の５５２コドンにおけるメチオニンからバリンへの突然変異を示す薬剤耐性型ＨＢＶに感染した宿主の治療のための医薬組成物。
【請求項４】
場合により医薬適合性の担体又は希釈剤中に、式：
【化２】
2008273960.tif 000098
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、独立して水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；及び
Ｒ３及びＲ４は、独立してＨ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、ジアルキルアミノアルキレン、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体である。］
の化合物又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグの有効量を含有する、ＤＮＡポリメラーゼ領域内の５５２コドンにおけるメチオニンからバリンへの突然変異を示す薬剤耐性型ＨＢＶに感染した宿主の治療のための医薬組成物。
【請求項５】
Ｒ３及び／又はＲ４がＨである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
Ｒ１及び／又はＲ２がＨである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
Ｒ１、Ｒ２又はＲ４の少なくとも１つが、式：
Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）
［式中、
Ｒ８は、アミノ酸の側鎖、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環であるか、又は場合によりＲ１０に結合して環構造を形成することができ；
Ｒ９は、水素、アルキル又はアリールであり；及び
Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素、アシル又はアルキルである。］
のアミノ酸残基である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記アミノ酸残基がＬ−バリニルである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
場合により医薬適合性の担体又は賦形剤中に、式：
【化３】
2008273960.tif 000099
の化合物又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグの有効量を含有する、ＤＮＡポリメラーゼ領域内の５５２コドンにおけるメチオニンからバリンへの突然変異を示す薬剤耐性型ＨＢＶに感染した宿主の治療のための医薬組成物。
【請求項１０】
場合により医薬適合性の担体又は賦形剤中に、式：
【化４】
2008273960.tif 000100
の化合物又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグの有効量を含有する、ＤＮＡポリメラーゼ領域内の５５２コドンにおけるメチオニンからバリンへの突然変異を示す薬剤耐性型ＨＢＶに感染した宿主の治療のための医薬組成物。
【請求項１１】
場合により医薬適合性の担体又は賦形剤中に、式：
【化５】
2008273960.tif 000101
の化合物又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグの有効量を含有する、ＤＮＡポリメラーゼ領域内の５５２コドンにおけるメチオニンからバリンへの突然変異を示す薬剤耐性型ＨＢＶに感染した宿主の治療のための医薬組成物。
【請求項１２】
場合により医薬適合性の担体又は賦形剤中に、式：
【化６】
2008273960.tif 000102
の化合物又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグの有効量を含有する、ＤＮＡポリメラーゼ領域内の５５２コドンにおけるメチオニンからバリンへの突然変異を示す薬剤耐性型ＨＢＶに感染した宿主の治療のための医薬組成物。
【請求項１３】
場合により医薬適合性の担体又は賦形剤中に、式：
【化７】
2008273960.tif 000103
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、独立して水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；及び
Ｒ３は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、ジアルキルアミノアルキレン、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体である。］
の化合物又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグの有効量を含有する、ＤＮＡポリメラーゼ領域内の５５２コドンにおけるメチオニンからバリンへの突然変異を示す薬剤耐性型ＨＢＶに感染した宿主の治療のための医薬組成物。
【請求項１４】
Ｒ３がＨである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
Ｒ１及び／又はＲ２がＨである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
Ｒ１又はＲ２の少なくとも１つが、式：
Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）
［式中、
Ｒ８は、アミノ酸の側鎖、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環であるか、又は場合によりＲ１０に結合して環構造を形成することができ；
Ｒ９は、水素、アルキル又はアリールであり；及び
Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素、アシル又はアルキルである。］
のアミノ酸残基である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記アミノ酸残基がＬ−バリニルである、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
場合により医薬適合性の担体又は賦形剤中に、式：
【化８】
2008273960.tif 000104
の化合物又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグの有効量を含有する、ＤＮＡポリメラーゼ領域内の５５２コドンにおけるメチオニンからバリンへの突然変異を示す薬剤耐性型ＨＢＶに感染した宿主の治療のための医薬組成物。
【請求項１９】
場合により医薬適合性の担体又は賦形剤中に、式：
【化９】
2008273960.tif 000105
の化合物又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグの有効量を含有する、ＤＮＡポリメラーゼ領域内の５５２コドンにおけるメチオニンからバリンへの突然変異を示す薬剤耐性型ＨＢＶに感染した宿主の治療のための医薬組成物。
【請求項２０】
場合により医薬適合性の担体又は賦形剤中に、式：
【化１０】
2008273960.tif 000106
の化合物又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグの有効量を含有する、ＤＮＡポリメラーゼ領域内の５５２コドンにおけるメチオニンからバリンへの突然変異を示す薬剤耐性型ＨＢＶに感染した宿主の治療のための医薬組成物。
【請求項２１】
場合により医薬適合性の担体又は賦形剤中に、式：
【化１１】
2008273960.tif 000107
の化合物又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグの有効量を含有する、ＤＮＡポリメラーゼ領域内の５５２コドンにおけるメチオニンからバリンへの突然変異を示す薬剤耐性型ＨＢＶに感染した宿主の治療のための医薬組成物。
【請求項２２】
１つ以上の他の抗ＨＢＶ薬の有効量をさらに含有する、請求項１から２１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記の他の抗ＨＢＶ薬が、３ＴＣ、ＦＴＣ、Ｌ−ＦＭＡＵ、ＤＡＰＤ、ＤＸＧ、ファンシクロビル、ペンシクロビル、ＢＭＳ−２００４７５、ビスｐｏｍ  ＰＭＥＡ（アデフォビル、ジピボキシル）、ロブカビル、ガンシクロビル、テノフォビル、Ｌｆｄ４Ｃ、フォスカルネット（ホスホノギ酸三ナトリウム）、イソプリノシン、レバミゾール、Ｎ−アセチルシスチン（ＮＡＣ）、インターフェロン、ペグ化インターフェロン、ＩＳＳ、リバビリン、ＰＣ１３２３又はポリアデンサイクリックポリウリジル酸から成る群より選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記の他の抗ＨＢＶ薬の少なくとも１つがインターフェロンである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記インターフェロンが、インターフェロンα、ペグ化インターフェロンα、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、ペグ化インターフェロンα−２ａ、ペグ化インターフェロンα−２ｂ、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（インターフェロンα−２ａ）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ａ）、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ）、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ｂ）、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンτ、インターフェロンω、コンセンサスインターフェロン、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１）、ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン）、ＲＥＢＩＦ（インターフェロンβ−１ａ）、ωインターフェロン、経口インターフェロンα、インターフェロンγ−１ｂ、ＳｕｐｅｒＦｅｒｏｎ（天然ヒトマルチサブタイプＩＦＮ−α）及びＨｕＦｅｒｏｎ（ヒトＩＦＮ−β）から成る群より選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記宿主が哺乳類である、請求項１から２５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記宿主がヒトである、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記１つ以上のほかの抗ＨＢＶ薬が、Ｌ−２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（ラミブジン）である請求項２２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年９月１３日出願の仮出願第６０／４１０，６７５号による優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、既知の抗ＨＢＶ薬に対して耐性を示すＢ型肝炎株の治療のための２’−デオキシ−β−Ｌ−デオキシヌクレオシド、ならびに免疫調節薬と２’−デオキシ−β−Ｌ−デオキシヌクレオシドによる併用療法を包含する。
【背景技術】
【０００３】
Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）は、ヒト癌の原因としてタバコに次いで第２位を占める。ＨＢＶが癌を引き起こす機序は不明であるが、直接腫瘍発現の引き金を引くか、あるいは慢性炎症、肝硬変及び感染に伴う細胞再生を通して間接的に腫瘍発現の引き金になりうると主張されている。
【０００４】
Ｂ型肝炎ウイルスは世界中で流行レベルに達している。宿主が感染に気づかない２−６ヶ月の潜伏期間後に、ＨＢＶ感染は、腹痛、黄疸及びある種の酵素の高い血中レベルを生じさせる、急性肝炎及び肝障害へと至ることがある。ＨＢＶは、急速に進行し、肝臓の大きな部分が破壊される、しばしば致死的な形態の疾患である劇症肝炎を引き起こしうる。患者は、典型的には急性ウイルス性肝炎から回復する。一部の患者では、しかしながら、長期間又は無期限に高レベルのウイルス抗原が血液中に残存し、慢性感染を引き起こす。慢性感染は慢性持続性肝炎を導きうる。慢性持続性ＨＢＶに感染している患者は発展途上国では極めて一般的である。慢性持続性肝炎は、疲労、肝硬変及び原発性肝癌である肝細胞癌を引き起こしうる。西欧先進工業国では、ＨＢＶ感染の高危険度群は、ＨＢＶ保菌者又は彼らの血液試料に接触した人々を含む。ＨＢＶの疫学は、事実上、後天性免疫不全症候群に非常に類似しており、そのことが、なぜＡＩＤＳ又はＨＩＶ関連感染を有する患者の間でＨＢＶ感染が一般的であるかを説明する。しかし、ＨＢＶはＨＩＶよりも接触感染性が高い。
【０００５】
現在まで、わずかの３つの薬剤だけが慢性ＨＢＶ感染の治療に関してＦＤＡによって承認されている：インターフェロンα、３ＴＣ（Ｅｐｉｖｉｒ、ラミブジン）及びアデフォビルジピボキシル（Ｈｅｐｓｅｒａ（登録商標）Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０００６】
【表１】
2008273960.tif 000002
【０００７】
（インターフェロンα）
製造形態のインターフェロンがＢ型肝炎を治療するために使用される。この治療は、約４ヶ月間の注射によるインターフェロンの投与を含む。
【０００８】
必ずしもすべての患者がインターフェロンに応答するわけではなく、時として再治療が必要である。臨床試験では、Ａ（インターフェロンα−２ｂ、組み換え型、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）ｆｏｒ  ＩｎｊｅｃｔｉｏｎによってＢ型肝炎を治療された患者の４５％だけが長期間にわたって血液中にＢ型肝炎ウイルスの証拠を有していなかった。さらに、大部分の患者は、重篤なインフルエンザ様症状、体重減少及びエネルギーと精力の欠如を生じさせるインターフェロン治療を耐容することが困難である。
【０００９】
（３ＴＣ）
３ＴＣ（Ｅｐｉｖｉｒ、ラミブジン）としても知られる、ＢＣＨ−１８９（２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン）の（−）鏡像異性体は、ＨＩＶとＨＢＶの両方に対して活性な抗ウイルス薬である。ＨＩＶ及びＨＢＶが複製するために必要な逆転写酵素の産生を阻止することによって働く、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）と呼ばれる薬剤のクラスに属する。３ＴＣはもともとＨＩＶの治療のために開発されたが、研究者達は３ＴＣがＢ型肝炎ウイルスに対しても作用することを発見した。１９９８年１２月に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）はＢ型肝炎ウイルス感染の治療のためのＥｐｉｖｉｒ  ＨＢＶを承認した。
【００１０】
３ＴＣはＨＢＶの複製を効率的に阻害するが、３ＴＣ治療中のウイルス除去の緩やかな動態（Ｎｏｗａｋ，Ｍ．，Ｓ．Ｂｏｎｈｏｅｆｆｅｒら、１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：４３９８−４４０２）及び自然発生ウイルスゲノムの変異性は、逆転写酵素（ＲＴ）ドメインに影響を及ぼす突然変異を担う薬剤耐性突然変異株の出現を導く（Ｍａｓｏｎ，Ｗ．Ｓ．，Ｊ．Ｃｕｌｌｅｎら、１９９８．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４５：１８−３２；Ｎａｆａ，Ｓ．，Ａｈｍｅｄら、２０００．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３２：１０７８−１０８８；Ｍｅｌｅｇａｒｉ，Ｍ．，Ｐ．Ｐ．Ｓｃａｇｌｉｏｎｉ及びＪ．Ｒ．Ｗａｎｄｓ．１９９８  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：６２８−６３３；Ｓｅｉｇｎｅｒｅｓ，Ｂ．，Ｃ．Ｐｉｃｈｏｕｄら、２０００．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８１：１２２１−１２３３）。治療された患者の約５０％が、３ＴＣによる３年間の治療後にウイルス耐性を発現する（Ｌｅｕｎｇ，Ｎ．Ｗ．，Ｃ．Ｌ．Ｌａｉら、２００１．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３３：１５２７−１５３２）。ヌクレオシド類似体に対する耐性は、ＨＢＶ  ＲＴのアミノ酸配列、特に触媒部位内のＹＭＤＤモチーフに変化を生じさせる、ポリメラーゼ遺伝子の核酸配列における置換に関連する。最も一般的なポリメラーゼ変異体は、触媒部位の突然変異（ｒｔＭ２０４Ｖ）と触媒部位変異体により高い複製能力を与えるＲＴのＢドメイン内の代償性突然変異（ｒｔＬ１８０Ｍ）を結び付けるｒｔＬ１８０ＭプラスＭ２０４Ｖ変化（ＨＢＶ薬剤耐性変異体についての最近の遺伝子型独立命名法（ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる）（Ｓｔｕｙｖｅｒ，Ｌ．Ｊ．，Ｓ．Ａ．Ｌｏｃａｒｎｉｎｉら、２００１．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３３：７５１−７５７）である（Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｉ．，Ｍ．Ｄｅｓｌａｕｒｉｅｒｓら、１９９８．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：１６７０−１６７７；Ｃｈａｙａｍａ，Ｋ．，Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉら、１９９８．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：１７１１−１７１６；Ｍｅｌｅｇａｒｉ，Ｍ．，Ｐ．Ｐ．Ｓｃａｇｌｉｏｎｉ及びＪ．Ｒ．Ｗａｎｄｓ．１９９８  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：６２８−６３３；Ｏｎｏ，Ｓ．Ｋ．，Ｎ．Ｋａｔｏら、２００１．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．１０７：４４９−４５５；Ｓｅｉｇｎｅｒｅｓ，Ｂ．，Ｓ．Ａｇｕｅｓｓｅ−Ｇｅｒｍｏｎら、２００１．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３４：１１４−１２２）。
【００１１】
（アデフォビルジピボキシル（Ｈｅｐｓｅｒａ））
２００２年９月２０日に、米国食品医薬品局は慢性Ｂ型肝炎の治療のためのアデフォビルジピボキシルを承認した。ＨＥＰＳＥＲＡ（商標）は、アデフォビルのジエステルプロドラッグであるアデフォビルジピボキシルについての商標名である。アデフォビルは、天然基質デオキシアデノシン三リン酸と競合することによって及びウイルスＤＮＡへのその組込み後にＤＮＡ鎖の終結を生じさせることによってＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＤＮＡポリメラーゼを阻害する、アデノシン一リン酸の非環式ヌクレオチド類似体である。アデフォビルジピボキシルの化学名は９−［２−［ビス［（ピバロイルオキシ）メトキシ］ホスフィニル］メトキシ］−エチル］アデニンである。アデフォビルは細胞キナーゼによって活性代謝産物、アデフォビルジホスフェートへとリン酸化される。例えば、ピリミジン及びプリン塩基のＮ−ホスホニルメトキシアルキル誘導体及び抗ウイルス作用を有するその治療組成物、と題する米国特許第５，６４１，７６３号及び同第５，１４２，０５１号参照。
【００１２】
（耐性ＨＢＶ株）
ラミブジンは、非天然Ｌ−ヌクレオシドと天然基質であるＤ−ヌクレオシドを識別することができる耐性株のウイルスの選択、特に単一突然変異株であるＹＭＤＤ突然変異株（Ｍ５５２Ｉ又はＭ５５２Ｖ）及びＬ５２８Ｍ、及び二重突然変異株（Ｌ５２８Ｍ／Ｍ５５２Ｖ）をしばしば生じさせる、ＨＢＶの治療のためのＬ−ヌクレオシドである。米国特許第６，２４２，１８７号及び同第６，２６５，１８１号；及び国際公開公報第ＷＯ０１／０４３５８号参照。また、Ａｈｍｅｄら、「Ｅａｒｌｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ」Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０００，３２（５），１０７８−１０８８；Ｏｎｏら、「Ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｌ５２８Ｍ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ−ｓｉｔｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００１年２月、１０７（４）、４４９−４５５；Ａｌｌｅｎ「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ」Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９８，７（６），１６７０−１６７７；Ｄａｓら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅａｌ  ｔｈｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ（３ＴＣ）  ａｎｄ  Ｅｍｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ（ＦＴＣ）」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００１年５月、７５（１０）、４７７１−４７７９；Ｄｅｌａｎｅｙ「Ｃｒｏｓｓ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｈｅｐａｄｎａｖｉｒａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｎｏｖｅｌ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｈｉｃｈ  Ｅｎｃｏｄｅ  Ｄｒｕｇ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ」Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００１年６月、４５（６）、１７０５−１７１３；Ｆｕ「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｕｔｓｉｄｅ  ｔｈｅ  ＹＭＤＤ  Ｍｏｔｉｆ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｉｎ  Ｌ−（−）−ＳｄｄＣ（３ＴＣ）Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９８，５５（１０）１５６７−１５７２；Ｆｕ「Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｌ−（−）−２’，３’−Ｄｉｄｅｏｘｙｔｈｉａｃｙｔｉｄｉｎｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ���ｉｒｕｓ  ｔｏ  Ｏｔｈｅｒ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９９，５７（１２），１３５１−１３５９；Ｇａｕｔｈｉｅｒ「Ｑｕａｎｔｉｔａｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ＹＭＤＤ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１９９９年１２月、１８０，１７５７−１７６２；Ｋｉｏｋｏ「ＹＭＤＤ  Ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｏｎ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：Ａ  Ｓｔｕｄｙ  ｂｙ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９９年３月、２９（３）、９３９−９４５；Ｋｉｏｋｏ「Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ−ｒｅｓｉｔａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｔｏ  ｏｔｈｅｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１９９９年６月、３（１２）、１６３５−１６４０；Ｚｏｕｌｉｍ「Ｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ：ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９８，２９，１５１−１６８；及びＹｉｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒａｌ  Ｈｅａｐｔ．，２０００年３月、７（２）、１６１−１６５も参照のこと。
【００１３】
ＨＢＶ感染患者に投与したラミブジン（毎日１００ｍｇ）の比較対照臨床試験において、ＹＭＤＤ突然変異型ＨＢＶの発生率は、１年間の治療後には１４−３２％であり、２−３年間の治療後には５８％にのぼった。突然変異型ウイルスは、ＹＭＤＤ突然変異のないラミブジン治療患者に比べて治療応答低下のデータに結びついていた。Ｏｎｏら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００１，１０７（４）、４４９−４５５。
【００１４】
ラミブジンを摂取しながらＨＢＶ複製が回復した患者から得たウイルス単離物の遺伝子型分析は、ラミブジンに対するＨＢＶ感受性の低下が、ＨＢＶポリメラーゼの触媒ドメインのＹＭＤＤモチーフにおけるメチオニンからバリン又はイソロイシンへの置換、及び５１５位又は５２８位（ＨＢＶの遺伝子型／サブタイプに依存して）におけるロイシンからメチオニンへの置換を生じさせる突然変異に関連することを示唆する。
【００１５】
現在、患者からのラミブジン耐性ＨＢＶ単離物に感染した細胞に対する抗ウイルス薬の活性を評価するために使用できる細胞ベースのＨＢＶ感染系は存在しない。アヒルＨＢＶ（ＤＨＢＶ）のインビトロモデルは、このモデルで使用した初代アヒル肝細胞が細胞培養中で数週間以上維持できないため、薬剤耐性突然変異を選択するには有用でないことが明らかになった。ウッドチャックのインビボモデルにおける薬剤耐性突然変異体の選択は、ウッドチャックにおけるラミブジン耐性突然変異体のスペクトルがＨＢＶ感染患者において特定されたものとマッチしないので、その適切さは疑わしい。
【００１６】
（インターフェロン）
インターフェロンは、免疫系を調節するため及び他の細胞機能を調整するために体内で自然に作られるタンパク質である。インターフェロンの主なクラスは、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンω及びインターフェロンτである。インターフェロンはインビボでの安定性を高めるように修飾することができ、そのような修飾は、ペグ化又は分子の安定性を高めるための他の手段を含む。
【００１７】
インターフェロンαクラスのインターフェロンの例は、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、ペグ化インターフェロンα−２ａ、ペグ化インターフェロンα−２ｂ、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（インターフェロンα−２ａ、Ｒｏｃｈｅ）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ａ、Ｒｏｃｈｅ）、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ｂ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、コンセンサスインターフェロン、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１）、ＶｉｒａｇｅｎによるＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓによるＡＬＢＵＦＥＲＯＮ、Ａｍａｒｉｌｌｏ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるＯｒａｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｐｈａ、及びＳｕｐｅｒＦｅｒｏｎ（天然ヒトマルチサブタイプＩＦＮ−α、Ｇｅｎｅｔｒｏｌ，Ｉｎｃ．）を包含する。
【００１８】
他の種類のインターフェロンは：インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンτ、インターフェロンω、Ａｒｅｓ−ＳｅｒｏｎｏによるＲＥＢＩＦ（インターフェロンβ−１ａ）、ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅによるＯｍｅｇａ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるインターフェロンγ−１ｂ、及びＨｕＦｅｒｏｎ（ヒトＩＦＮ−β、Ｇｅｎｅｔｒｏｌ，Ｉｎｃ．）を含む。
【００１９】
遺伝的に改変されたタンパク質、α−インターフェロンによる毎日の治療は有望であることが示された。ＨＢＶに対して患者を免疫するためにヒト血清由来のワクチンも開発されている。ワクチンは遺伝工学を通して生産された。ワクチンは有効であることが認められているが、慢性保菌者からのヒト血清の供給は限られており、またその精製工程は時間と費用がかかるので、ワクチンの生産には問題が多い。さらに、異なる血清から生産されるワクチンの各々バッチは、安全性を保証するためチンパンジーにおいて試験しなければならない。それに加えて、ワクチンは既にウイルスに感染している患者には役に立たない。
【００２０】
ウイルス性疾患、特にＨＢＶ及びＨＩＶに対するプリン及びピリミジンヌクレオシドの作用機構における必須のステップは、一、二及び三リン酸誘導体を生成するための、細胞及びウイルスキナーゼによる代謝活性化である。多くのヌクレオシドの生物活性種は、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素を阻害する、あるいは鎖の終結を引き起こす、三リン酸形態である。
【００２１】
ＨＢＶに対して活性を示す多くの合成ヌクレオチドが特定されている。前述したように、３ＴＣとして知られる、ＢＣＨ−１８９（２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン）の（−）鏡像異性体は、Ｂ型肝炎の治療に関して承認されている。米国特許第５，５３２，２４６号ならびにＢｉｏＣｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．によって出願された欧州特許出願第０  ４９４  １１９  Ａ１号参照。
【００２２】
ＰＭＥＡ又は（｛２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エトキシ｝メチルホスホン酸）とも称される、アデフォビル（９−｛２−（ホスホノメトキシ）エチル｝アデニン）も、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した患者の治療のために米国で承認されている。例えば、米国特許第５，６４１，７６３号及び同第５，１４２，０５１号参照。ＨＢＶを有する患者でのアデフォビル治療に対する抵抗性が認められている。
【００２３】
Ｌｉｏｔｔａらへの米国特許第５，８１４，６３９号及び同第５，９１４，３３１号において特許請求されている、β−２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン（「ＦＴＣ」）は、ＨＢＶに対して活性を示す。Ｆｕｒｍａｎら、「Ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ，  ａｎｄ  Ａｎａｂｏｌｉｃ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  （−）ａｎｄ（＋）Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ｃｉｓ−５−Ｆｌｕｏｒｏ−１−｛２−（Ｈｙｄｏｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−１，３−ｏｘａｔｈｉｏｌａｎｅ−５−ｙｌ｝−Ｃｙｔｏｓｉｎｅ」Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９２年１２月、２６８６−２６９２；及びＣｈｅｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，２６７（２０）、１３９３８−１３９４２参照。
【００２４】
米国特許第５，５６５，４３８号、同第５，５６７，６８８号及び同第５，５８７，３６２号（Ｃｈｕら）は、Ｂ型肝炎及びエプスタイン−バーウイルスの治療のための２’−フルオロ−５−メチル−β−Ｌ−アラビノフラノリルウリジン（Ｌ−ＦＭＡＵ）の使用を開示する。
【００２５】
ペンシクロビル（ＰＣＶ；２−アミノ−１，９−ジヒドロ−９−｛４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）ブチル｝−６Ｈ−プリン−６−オン）は、Ｂ型肝炎に対する活性が確立されている。米国特許第５，０７５，４４５号及び同第５，６８４，１５３号参照。
【００２６】
Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びＴｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．は、国際公開公報第ＷＯ９２／１８５１７号においてＢ型肝炎の治療のためのＬ−ＦＤＤＣ（５−フルオロ−３’−チア−２’，３’−ジデオキシシチジン）の使用を開示する。
【００２７】
ＨＢＶの治療のために開発された他の薬剤は、アデノシンアラビノシド、サイモシン、アシクロビル、ホスホノギ酸、ジドブジン、（＋）−シアニダノール、キナクリン及び２’−フルオロアラビノシル−５−ヨードウラシルを含む。
【００２８】
Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙへの米国特許第５，４４４，０６３号及び同第５，６８４，０１０号は、Ｂ型肝炎を治療するための鏡像異性的に純粋なβ−Ｄ−１，３−ジオキソランプリンヌクレオシドの使用を開示する。
【００２９】
Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＡＢ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ及びｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ（ＣＮＲＳ）によって出願された国際公開公報第ＷＯ９６／４０１６４号は、Ｂ型肝炎の治療のための多くのβ−Ｌ−２’，３’−ジデオキシヌクレオシドを開示する。
【００３０】
同じくＥｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＡＢ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ及びｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ（ＣＮＲＳ）によって出願された国際公開公報第ＷＯ９５／０７２８７号は、ＨＩＶ感染の治療のための２’−又は３’−デオキシ及び２’，３’−ジデオキシ−β−Ｌ−ペントフラノシルヌクレオシドを開示する。
【００３１】
Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．及びＬｉｐｉｔｅｋ，Ｉｎｃ．によって出願された国際公開公報第ＷＯ９６／１３５１２号は、抗腫瘍薬及び抗ウイルス薬としてのＬ−リボフラノシルヌクレオシドの製造を開示する。
【００３２】
国際公開公報第ＷＯ９５／３２９８４号は、免疫抑制薬としてのヌクレオシド一リン酸の脂肪エステルを開示する。
【００３３】
ドイツ特許第ＤＥ４２２４７３７号は、シトシンヌクレオシド及びそれらの製薬上の使用を開示する。
【００３４】
Ｔｓａｉらは、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９４，４８（７），１４７７−８１の中で、ミトコンドリアＤＮＡの細胞含量及び乳酸塩産生への抗ＨＩＶ薬、２’−β−Ｄ−Ｆ−２’，３’−ジデオキシヌクレオシド類似体の作用を開示している。
【００３５】
Ｇａｌｖｅｚ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．１９９４，３５（５），１１９８−２０３は、β−Ｄ−３’−アジド−２’−３’−ジデオキシ−５−フルオロシチジンの分子コンピューティングを述べている。
【００３６】
Ｍａｈｍｏｕｄｉａｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅｒａｃｈ  １９９１，８（１），４３−６は、β−Ｄ−３’−アジド−２’−３’−ジデオキシ−５−フルオロシチジンなどのＨＩＶ薬の定量的構造−活性関係の分析を開示する。
【００３７】
米国特許第５，７０３，０５８号は、ＨＩＶ又はＨＢＶの治療のための（５−カルボキシミド又は５−フルオロ）−（２’，３’−不飽和又は３’−修飾）ピリミジンヌクレオシドを開示する。
【００３８】
Ｌｉｎらは、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８８，３１（２），３３６−３４０においてβ−Ｄ−ヌクレオシドの様々な３’−アジド類似体の合成及び抗ウイルス活性を開示する。
【００３９】
Ｉｄｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．によって出願された国際公開公報第ＷＯ００／３９９８号は、置換６−ベンジル−４−オキソピリミジンを製造する方法及びＨＩＶの治療のためのそのようなピリミジンの使用を開示する。
【００４０】
Ｉｄｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．は、米国特許第６，３９５，７１６号、同第６，４４４，６５２号、同第６，５６６，３４４号及び同第６，５３９，８３７号において２’−デオキシ−β−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシド及びＨＢＶの治療におけるそれらの使用を開示する。場合により医薬適合性の担体中で、単独で又は組み合わせて投与した、生物活性２’−デオキシ−β−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシド（あるいはβ−Ｌ−ｄＮ又はβ−Ｌ−２’−ｄＮと称される）、あるいはβ−Ｌ−デオキシリボチミジン（β−Ｌ−ｄＴ）、β−Ｌ−デオキシリボシチジン（β−Ｌ−ｄＣ）、β−Ｌ−デオキシリボウリジン（β−Ｌ−ｄＵ）、β−Ｌ−デオキシリボグアノシン（β−Ｌ−ｄＧ）、β−Ｌ−デオキシリボアデノシン（β−Ｌ−ｄＡ）及びβ−Ｌ−デオキシリボイノシン（β−Ｌ−ｄＩ）を包含する、医薬適合性のその塩、エステル又はプロドラッグの有効量を投与することを含む、ヒト及び他の宿主動物におけるＢ型肝炎感染の治療のための方法が開示されている。前記活性化合物の５’及びＮ４（シチジン）又はＮ６（アデノシン）アシル化又はアルキル化誘導体、あるいは５’−リン脂質又は５’−エーテル脂質も開示された。
【００４１】
ｖｏｎ  Ｊａｎｔａ−Ｌｉｐｉｎｓｋｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，４１（１２）、２０４０−２０４６は、Ｂ型肝炎ポリメラーゼの阻害のための、３’−フルオロ修飾β−２’−デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸のＬ−鏡像異性体の使用を開示する。特に、３’−デオキシ−３’−フルオロ−β−Ｌ−チミジン（β−Ｌ−ＦＴＴＰ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−β−Ｌ−シチジン（β−Ｌ−ＦｄＣＴＰ）及び２’，３’−ジデオキシ−３’−β−Ｌ−５−メチルシチジン（β−Ｌ−ＦＭｅｔｈＣＴＰ）の５’−リン酸塩がＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼの有効な阻害剤として開示された。さらに、ｖｏｎ  Ｊａｎｔａ−Ｌｉｐｉｎｓｋｉらは、ＨＢＶ及びＤＨＢＶの内因性ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオシド阻害剤としてβ−Ｌ−チミジン（但しβ−Ｌ−２’−ｄＣではない）三リン酸の生物活性を開示する。しかし、特許請求されている非リン酸化形態ではなく、三リン酸化β−Ｌ−チミジンだけが評価されており、それらのβ−Ｌ−ヌクレオシドが細胞内で又はインビボでリン酸化されるかどうかについては前記論文中に記述がなく、あるいはより重要な点として、インビボでのβ−Ｌ−チミジンのリン酸化の効果に関する説明がない。このため、前記論文は、β−Ｌ−チミジンが細胞内で又はインビボで何らかのＢ型肝炎活性を有するかどうかを教示しない。国際公開公報第ＷＯ９６／１２０４号も参照のこと。
【００４２】
Ｊｏｈａｎｓｓｏｎらへの欧州特許出願第０  ３５２  ２４８  Ａ１号は、Ｂ型肝炎の治療のためのＬ−リボフラノシル化合物の使用を開示する。
【００４３】
Ｌｉｎら「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｒａｌ  Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  Ｌ−Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ａｇｅｎｔｓ」Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９５，５１（４），１０５５−１０６８は、β−Ｌ−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（β−Ｌ−ＩＵｄＲ、化合物７）がヘルペス感染及び様々な他のＤＮＡウイルスに対して活性であること、ＢＶｄＵ及びβ−Ｌ−ＢＶ−アラ−Ｕもヘルペスに対して活性であり、β−Ｌ−ＢＶ−アラ−Ｕは水痘−帯状疱疹ウイルスに対して活性であること、及び２’，３’−ジデオキシ−Ｌ−アザシチジンはＨＢＶに対して活性であると認められたことを論じている。
【００４４】
Ｉｄｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．への米国特許出願公開第２００３００８３３０６号は、ＨＢＶの治療のための２’−デオキシ−β−Ｌ−ヌクレオシドの３’−プロドラッグを開示する。国際公開公報第ＷＯ０１／９６３５３号も参照のこと。
【００４５】
Ｂｅａｕｃｈａｍｐへの米国特許第４，９５７，９２４号は、アシクロビルの様々な治療的エステルを開示する。
【００４６】
２００２年４月１７−２１日にスペインのマドリッドで開かれた欧州肝臓学会議（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ）において、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＳｕｈｎｅｌらは、β−Ｌ−２’−デオキシチミジンとアデフォビルの併用がインビトロでＨＢＶに対して付加的な抗ウイルス作用を生じることを示すポスターを提示した。
【００４７】
同じ会議で、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＤｅｌａｎｅｙらは、ラミブジン耐性ＨＢＶ、すなわちＬ５２８Ｍ（ｒｔＬ１８０Ｍ）又はＭ５５２Ｉ（ｒｔＭ２０４Ｉ）に単一突然変異を有するか又はＬ５２８Ｍ（ｒｔＬ５２８Ｍ）及びＭ５５２Ｖ（ｒｔＭ２０４Ｖ）に二重突然変異を有するＨＢＶの選択株がインビトロでＬ−ｄＴ及びＬ−ｄＣに交差耐性であることを指摘する口頭発表を行った。
【００４８】
インターフェロンによる治療を含む、Ｂ型肝炎感染のための治療は、ＬｏｋとＭｃＭａｈｏｎ，ＡＡＳＬＤ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ，ｐｐ．１２２５−１２４１（２００１）においても記述されている。１−（２−フルオロ−５−メチル−β−Ｌ−アラビノフラノシル）−ウラシル（Ｌ−ＦＭＡＵ）とＷＨＶ表面抗原ワクチンの抗ウイルス作用を検討するために、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）に慢性感染したイースタンウッドチャックをＨＢＶ感染のモデルとして使用した。Ｌ−ＦＭＡＵとワクチンの併用に結びつく体液性及び細胞性免疫は、自己制限ＷＨＶ感染において認められるものに類似した。Ｍｅｎｎｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７６（１１）：５３０５−５３１４（２００２）。
【００４９】
国際公開公報第ＷＯ９８／２３２８５号は、ペンシクロビル（又はファンシクロビルのようなそのバイオプレカーサー）及びα−インターフェロンの有効量又は予防量を患者に投与することを含む、ヒト又は動物患者におけるＢ型肝炎ウイルス感染の治療又は予防のための方法を開示する。
【００５０】
Ｂ型肝炎ウイルスに対して活性であると特定された抗ウイルス薬の例は次のものを包含する：
【００５１】
【表２】
2008273960.tif 000003
【００５２】
【表３】
2008273960.tif 000004
【００５３】
Ｍａｒｋ  Ｎｅｌｓｏｎ，ＭＤ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ２００１（Ｈｅｐ  ＤＡＲＴ  ２００１）２００１年１２月１６−２０日、Ｍａｕｉ，Ｈａｗａｉｉからの選択抜粋；アメリカ肝臓学会議（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）第５２回年次総会、２００１年１１月９−１３日、Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓからの選択抜粋；Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｗｅｅｋ  ２００１からのＢ型肝炎に関する報告；２００１年５月２０−２３日、Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ。
【００５４】
２００２年７月２５日公開の米国特許出願第２００２００９８１９９号は、ＨＢＶ及びＨＣＶの治療のための免疫刺激配列を開示する。
【００５５】
Ｔｈｅ  Ｒｅｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ及びＤｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡された米国特許第６，２２５，２９２号は、ＩＳＳ−ＯＤＮ（免疫刺激配列オリゴデオキシヌクレオチド）の免疫刺激作用を阻害するオリゴヌクレオチドならびにそれらの特定と使用のための方法を開示する。開示されているオリゴヌクレオチドは、治療上意図されるＩＳＳ−ＯＤＮのアジュバント活性ならびに遺伝子治療及び遺伝子免疫のために使用されるような組換え発現ベクターによって及ぼされる望ましくないＩＳＳ−ＯＤＮ活性を制御する上で有用である。前記オリゴヌクレオチドはまた、ＩＳＳ−ＯＤＮ含有微生物による宿主の感染に応答した炎症を低下させる、自己免疫疾患を制御する、及び抗原に対する宿主のＴｈ２型免疫応答を促進する上で有用な抗炎症作用を有する。前記特許はまた、前記発明のオリゴヌクレオチドの製薬上有用なコンジュゲート（抗原及び抗体などのコンジュゲートパートナーを含む）を包含する。
【００５６】
Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡された米国特許第６，５８９，９４０号は、免疫刺激オリゴヌクレオチド組成物を開示する。これらのオリゴヌクレオチドは免疫刺激性オクタヌクレオチド配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、免疫刺激ペプチド又は抗原と共に投与することができる。前記オリゴヌクレオチドの投与後の免疫応答を調節するための方法も開示される。さらに、免疫刺激作用を有するオリゴヌクレオチドを特定するためのインビトロでのスクリーニング方法が提供される。
【００５７】
Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡された米国特許第６，５６２，７９８号は、修飾シトシンを含む免疫刺激性ヘキサヌクレオチド配列を含む、免疫調節オリゴヌクレオチド組成物を開示する。これらのオリゴヌクレオチドは、免疫調節ペプチド又は抗原と共に投与することができる。修飾免疫刺激配列を含むオリゴヌクレオチドの投与後の免疫応答を調節する方法も開示される。
【００５８】
Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０３／０１４３１６  Ａ２号は、個体の免疫調節のための組成物及び方法を開示する。免疫調節は、３−６量体免疫調節オリゴヌクレオチドを含む免疫調節性ポリヌクレオチド／微小担体（ＩＭＯ／ＭＣ）複合体の投与によって実施される。前記ＩＭＯ／ＭＣ複合体は共有結合又は非共有結合のいずれでもよい。ＭＣ中に被包された３−６量体ＩＭＯを含有する免疫調節組成物も開示される。
【００５９】
Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０３／０００９２２  Ａ２号は、免疫調節化合物及びそれらの免疫調節化合物を使用した個体の免疫調節のための方法を開示する。
【００６０】
Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０２／０５２００２  Ａ２号は、免疫調節ポリヌクレオチド及びそれらの免疫調節ポリヌクレオチドを使用した個体の免疫調節のための方法を開示する。
【００６１】
Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０１／６８１４４Ａ２号及び同第ＷＯ０１６８１４３Ａ２号は、個体の免疫調節のための組成物及び方法を開示する。免疫調節は、免疫調節性ポリヌクレオチド／微小担体（ＩＭＰ／ＭＣ）複合体の投与によって実施される。前記ＩＭＰ／ＭＣ複合体は共有結合又は非共有結合のいずれでもよく、生分解性微小担体又はナノ担体に結合した少なくとも１つの免疫刺激配列を含むポリヌクレオチドを特徴とする。
【００６２】
Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０１／６８１１７  Ａ２号は、乳頭腫ウイルス感染の治療のための方法を開示する。免疫調節配列を含むポリヌクレオチドを、乳頭腫ウイルスに接触した又は感染した個体に投与する。前記ポリヌクレオチドは乳頭腫ウイルス抗原と共に投与しない。前記ポリヌクレオチドの投与は乳頭腫ウイルス感染の症状の改善をもたらす。
【００６３】
Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０１／６８０７８  Ａ２号は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の治療のための方法を開示する。免疫調節配列を含むポリヌクレオチドを、ＨＢＶ及び／又はＨＣＶに接触した又は感染した個体に投与する。前記ポリヌクレオチドはＨＣＶ又はＨＢＶ抗原と共に投与しない。前記ポリヌクレオチドの投与はＨＢＶ及び／又はＨＣＶ感染の症状の改善をもたらす。
【００６４】
Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０１／６８０７７  Ａ３号は、ウイルスによる感染の抑制、予防及び／又は治療の方法を開示する。免疫調節配列（「ＩＳＳ」）を含むポリヌクレオチドを、ウイルスに接触する危険度が高い、ウイルスに接触した又はウイルス感染している個体に投与する。ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドはウイルスのいかなる抗原も伴わずに投与する。ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの投与は、ウイルス感染の１つ以上の症状の発生率及び／又は重症度の低下をもたらす。
【００６５】
Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０１／１２２２３  Ａ２号は、第一抗原及び免疫刺激性ポリヌクレオチドの投与を含む、第二抗原に対する免疫応答を調節する方法を開示する。免疫応答の調節は一般にＴｈ１応答の刺激として現われる。
【００６６】
Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ００／２１５５６  Ａ１号は、免疫刺激ポリヌクレオチド及びｇｐ１２０などのＨＩＶ抗原を含有する抗ウイルス免疫調節組成物を開示する。オリゴヌクレオチド及び抗原組成物の投与後の免疫応答を調節するための方法も開示される。
【００６７】
Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ００／１６８０４  Ａ１号は、ＩｇＥ関連疾患を治療する方法及びその方法において使用するための組成物を開示する。前記方法は、アレルギー及びアレルギー関連疾患の治療において特に有用である。前記方法は一般に、ＩｇＥ阻害剤（抗ＩｇＥ抗体など）及び抗原及び／又は免疫刺激ポリヌクレオチド配列（ＩＳＳ）を投与することを含む。これらの併用方法は、アナフィラキシーなどの有害副作用を低減しながらより積極な治療を可能にすることなどの、有意の利点を提供する。
【００６８】
Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９９／６２９２３  Ａ２号は、修飾シトシンを含む免疫刺激性ヘキサヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを開示する。これらのオリゴヌクレオチドは、免疫調節ペプチド又は抗原と共に投与することができる。修飾免疫刺激配列を含むオリゴヌクレオチドの投与後の免疫応答を調節する方法も開示される。
【００６９】
Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９８／５５４９５  Ａ２号は、免疫刺激性オクタヌクレオチド配列を含む免疫刺激オリゴヌクレオチド組成物を開示する。これらのオリゴヌクレオチドは、免疫調節ペプチド又は抗原と共に投与することができる。前記オリゴヌクレオチドの投与後の免疫応答を調節するための方法も開示される。さらに、免疫刺激作用を有するオリゴヌクレオチドを特定するためのインビトロでのスクリーニング方法も開示される。
【００７０】
Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０３／０１５７１１  Ａ２号は、少なくとも２つの機能的及び構造的に定義されたドメインを有する免疫刺激核酸のクラスを開示する。このクラスの組合せモチーフ免疫刺激核酸は免疫応答を刺激し、癌、感染症及びアレルギー疾患などの様々な免疫関連疾患を治療するために有用である。前記核酸はまた、ナチュラルキラー細胞の活性化及び１型インターフェロンの産生を刺激する。
【００７１】
Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許第６，４０６，７０５号は、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有する免疫刺激オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）と非核酸アジュバントの相乗的組合せを使用する方法及び生成物を開示する。そのようなアジュバントの組合せは、抗原と共に又は単独で使用しうる。乳児における細胞性免疫の誘導のために少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有する免疫刺激オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）を使用する方法及び生成物も開示される。
【００７２】
Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許第６，３３９，０６８号は、ＣｐＧ−Ｎモチーフの除去及び場合によりＣｐＧ−Ｓモチーフの付加によって改善されうるＤＮＡワクチンベクターを開示する。さらに、高く且つ長期持続的な発現レベルのために、最適化ベクターは、免疫刺激ＣｐＧモチーフによって誘導されるサイトカインによって下方調節されないプロモーター／エンハンサーを含むべきである。免疫刺激のために使用するベクター及び方法がここで提供される。前記発明はまた、構築物中に存在するＣｐＧ−Ｎ及びＣｐＧ−Ｓモチーフを決定し、刺激性ＣｐＧ（ＣｐＧ−Ｓ）モチーフを除去して及び／又は中和ＣｐＧ（ＣｐＧ−Ｎ）モチーフを挿入して、それによって治療的ポリペプチドの高発現を与える核酸構築物を作製することにより、改善された遺伝子治療ベクターを提供する。
【００７３】
Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許第６，２３９，１１６号は、Ｔｈ１パターンの免疫活性化、サイトカイン産生、ＮＫ細胞溶解活性及びＢ細胞増殖を刺激することを含む、免疫応答を調節する非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸配列を開示する。前記配列は合成アジュバントとしても有用である。
【００７４】
Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許第６，２０７，６４６号は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸、及び被験者において免疫応答を刺激し、Ｔｈ１応答に対するＴｈ２応答を再指令するそれらの能力に基づく治療上の有用性を開示する。
【００７５】
Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許第６，１９４，３８８号は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、及び被験者において免疫応答を刺激するそれらの能力に基づく治療上の有用性を開示する。また、結合に関して非メチル化ＣｐＧ核酸を凌駕する、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含まない（すなわちメチル化ＣｐＧ配列又はＣｐＧ配列なし）オリゴヌクレオチドを被験者に投与することを含む、被験者において非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドによって開始される免疫系活性化に関連する疾患を治療するための治療法も開示される。さらに、アンチセンス治療における使用又はインビボでのハイブリダイゼーションプローブとしての使用のためのジヌクレオチドを含むメチル化ＣｐＧ、及び抗ウイルス療法としての使用のための免疫抑制オリゴヌクレオチドが開示される。
【００７６】
Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２００３００９１５９９  Ａ１号は、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有する免疫刺激オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）と非核酸アジュバントの相乗的組合せを使用する方法及び生成物を開示する。そのようなアジュバントの組合せは、抗原と共に又は単独で使用しうる。前記特許出願公開はまた、乳児における細胞性免疫の誘導のために少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有する免疫刺激オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）を使用する方法及び生成物に関する。
【００７７】
Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０３／０３１５７３  Ａ２号は、ＴＬＲ３を介して働く、免疫刺激性化合物、それらのアゴニスト及びアンタゴニストを特定し、特性付け、及び最適化するための組成物及び方法を開示する。
【００７８】
Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０３／０１２０６１  Ａ２号は、樹状細胞発現データベースに関する方法及び組成物を開示する。
【００７９】
Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０２／０６９３６９  Ａ２号は、ＣｐＧジヌクレオチドのＣ、Ｇ又はＣとＧのある種の置換にもかかわらず、ＣｐＧ核酸の免疫刺激特性を有する核酸を含む、ＣｐＧ様核酸と称される免疫刺激組成物を開示する。前記置換は、中でも特に、Ｃの代わりにメチル化Ｃ、Ｇの代わりにイノシン、及びＣｐＧの代わりにＺｐＹ［式中、Ｚはシトシン又はｄＳｐａｃｅｒであり、及びＹはイノシン、２−アミノプリン、ネブラリン又はｄＳｐａｃｅｒである］の交換を含みうる。また、ＣｐＧ様核酸を使用して被験者において免疫応答を誘導するための方法も開示される。前記方法は、感染症、アレルギー、喘息、癌、貧血、血小板減少症又は好中球減少症を有する又は発症する危険度が高い被験者の治療において有用である。
【００８０】
Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０１／９５９３５  Ａ１号は、免疫刺激性核酸を使用して免疫応答を誘導するための方法及び生成物を開示する。特に、前記免疫刺激性核酸はＴｈ２免疫応答を選択的に誘導する。前記発明は、Ｔｈ１免疫応答に関連する疾患を治療及び予防するため、あるいはＴｈ２免疫応答に感受性がある疾患を治療するためにＴｈ２環境を創出するために有用である。
【００８１】
Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０１／２２９９０  Ａ２号は、様々なウイルス性及び増殖性疾患の治療におけるＩＦＮ−「α」の臨床的有用性を拡大するための方法及び組成物を開示する。また、ＩＦＮ−「α」治療の効果を高め、ＩＦＮ−「α」治療に結びつく副作用を低減する方法も開示される。さらに、外因性ＩＬ−３又はＧＭ−ＣＳＦなしにインビトロで天然インターフェロン産生細胞（ＩＰＣ）の生存を維持するため及び活性化するための方法が提供される。
【００８２】
Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．に譲渡されたＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０１／２２９７２  Ａ２号は、免疫刺激性核酸組成物及び前記組成物を使用する方法を開示する。Ｔに富む核酸は、ポリＴ配列を含む及び／又は２５％以上のＴヌクレオチド残基を有する。ＴＧ核酸はＴＧジヌクレオチドを有する。Ｃに富む核酸は、少なくとも１つのポリＣ領域及び／又は５０％以上のＣヌクレオチドを有する。これらの免疫刺激性核酸は、ＣｐＧモチーフを含む核酸と同様に機能する。前記発明はまた、好ましいＣｐＧ核酸を包含する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００８３】
Ｂ型肝炎ウイルスが世界中で流行レベルに達しており、感染患者に深刻な、しばしば悲劇的な作用を及ぼすという事実に鑑みて、薬剤耐性ウイルス、すなわちラミブジン耐性ＨＢＶに感染したヒトを治療するための、宿主に対して低い毒性を有する、新しい有効な薬剤を提供することが強く求められている。
【００８４】
それ故、ヒト患者などの宿主におけるラミブジン耐性ＨＢＶ感染の治療及び／又は予防のための化合物、組成物及び方法を提供することが本発明の１つの目的である。
【００８５】
ヒト患者などのナイーブ宿主における耐性ＨＢＶ突然変異株、例えばＹＭＤＤ  ＨＢＶ（Ｍ５５２Ｖ）感染の予防のための化合物、組成物及び方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００８６】
薬剤耐性型ＨＢＶに感染した患者の治療のための化合物、組成物及び方法を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
【００８７】
ＨＢＶの治療及び／又は患者における耐性ＨＢＶ株の発現の抑制又は予防のための有効な併用療法組成物を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【００８８】
（発明の要旨）
β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド、特にβ−Ｌ−２’−デオキシシチジン及びβ−Ｌ−２’−デオキシチミジンは、薬剤耐性Ｂ型肝炎ウイルスの５５２（ＭからＶへ）コドン、すなわち逆転写酵素領域の２０４（ＭからＶへ）コドンに突然変異を有する薬剤耐性Ｂ型肝炎ウイルスに対して活性であることが発見された。この発見に基づき、β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグを投与することを含む、哺乳類、特にヒトなどの宿主においてラミブジン耐性ＨＢＶ（Ｍ５５２Ｖ）を治療するための方法が提供される。さらに、β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグを投与することを含む、哺乳類、特にヒトなどのナイーブ宿主においてラミブジン耐性ＨＢＶ（Ｍ５５２Ｖ）突然変異の発生を予防するための方法が提供される。また、β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグを投与することを含む、哺乳類、特にヒトなどの宿主においてＨＢＶ二重突然変異株（Ｌ５２８Ｍ／Ｍ５５２Ｖ）の出現を予防及び／又は抑制するための方法も提供される。
【００８９】
１つの実施態様では、本発明は、式（Ｉ）：
【００９０】
【化１２】
2008273960.tif 000005
［式中、
Ｒ１は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｒ２は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ２又はＣＨ２であり；及び
ＢＡＳＥは、場合により置換されていてもよいプリン又はピリミジン塩基である。］
のβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグ、並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体の使用を提供する。
【００９１】
好ましい実施態様では、ＸはＯである。
【００９２】
１つの実施態様では、前記アミノ酸残基は、式：
Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）
［式中、
Ｒ８は、アミノ酸の側鎖であって、その場合、プロリンにおけるように、Ｒ８は場合によりＲ１０に結合して環構造を形成することができ；あるいは、Ｒ８は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環成分であり、；
Ｒ９は、水素、アルキル（低級アルキルを含む）又はアリールであり；及び
Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素、アシル（Ｒ８に結合したアシル誘導体を含む）又はアルキル（メチル、エチル、プロピル及びシクロプロピルを含むがこれらに限定されない）である。］
及びそのすべての互変異性体及び立体異性体である。
【００９３】
本発明のもう１つの実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドは、式：
【００９４】
【化１３】
2008273960.tif 000006
［式中、
Ｒ１は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｒ２は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｙは、ＯＲ３、ＮＲ３Ｒ４又はＳＲ３であり；及び
Ｘ１及びＸ２は、Ｈ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ハロゲン、ＯＲ５、ＮＲ５Ｒ６又はＳＲ５から成る群より独立して選択され；及び
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立してＨ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル（特にシクロプロピル）、ジアルキルアミノアルキレン（特にジメチルアミノメチレン）、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体である。］
のβ−Ｌ−２’−デオキシプリン又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグ、並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体である。
【００９５】
１つの実施態様では、前記アミノ酸残基は、式：
Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）
［式中、
Ｒ８は、アミノ酸の側鎖であり、この場合、プロリンにおけるように、Ｒ８は場合によりＲ１０に結合して環構造を形成することができ；あるいは、Ｒ８は、アルキル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロ環成分であり、；
Ｒ９は、水素、アルキル（低級アルキルを含む）又はアリールであり；及び
Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素、アシル（Ｒ８に結合したアシル誘導体を含む）又はアルキル（メチル、エチル、プロピル及びシクロプロピルを含むがこれらに限定されない）である。］
並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体である。
【００９６】
本発明のもう１つの実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドは、式：
【００９７】
【化１４】
2008273960.tif 000007
［式中、
Ｒ１は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｒ２は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｙは、ＯＲ３、ＮＲ３Ｒ４又はＳＲ３であり；及び
Ｘ１は、Ｈ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ハロゲン、ＯＲ５、ＮＲ５Ｒ６又はＳＲ５から成る群より選択され；及び
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立してＨ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル（特にシクロプロピル）、ジアルキルアミノアルキレン（特にジメチルアミノメチレン）、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体である。］
のβ−Ｌ−２’−デオキシピリミジン又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグ、並びにそのすべての互変異性体並びに立体異性体である。
【００９８】
１つの実施態様では、前記アミノ酸残基は、式：
Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）
［式中、
Ｒ８は、アミノ酸の側鎖であり、この場合、プロリンにおけるように、Ｒ８は場合によりＲ１０に結合して環構造を形成することができ；あるいは、Ｒ８は、アルキル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロ環成分であり、；
Ｒ９は、水素、アルキル（低級アルキルを含む）又はアリールであり；及び
Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素、アシル（Ｒ８に結合したアシル誘導体を含む）又はアルキル（メチル、エチル、プロピル及びシクロプロピルを含むがこれらに限定されない）である。］
並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体である。
【００９９】
１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドは、式：
【０１００】
【化１５】
2008273960.tif 000008
［式中、
Ｒ１は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｒ２は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；及び
Ｒ３及びＲ４は、独立してＨ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル（特にシクロプロピル）、ジアルキルアミノアルキレン（特にジメチルアミノメチレン）、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体である。］
のβ−Ｌ−２’−デオキシシチジン又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグである。
【０１０１】
好ましい実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はＨである。
【０１０２】
１つの実施態様では、前記アミノ酸残基は、式：
Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）
［式中、
Ｒ８は、アミノ酸の側鎖であり、この場合、プロリンにおけるように、Ｒ８は場合によりＲ１０に結合して環構造を形成することができ；あるいは、Ｒ８は、アルキル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロ環成分であり、；
Ｒ９は、水素、アルキル（低級アルキルを含む）又はアリールであり；及び
Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素、アシル（Ｒ８に結合したアシル誘導体を含む）又はアルキル（メチル、エチル、プロピル及びシクロプロピルを含むがこれらに限定されない）である］
である。
【０１０３】
もう１つの好ましい実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はアミノ酸残基、特にＬ−バリニルである。
【０１０４】
１つの実施態様では、Ｒ３は水素であり、及びＲ４はジメチルアミノメチレンである。
【０１０５】
もう１つの実施態様では、Ｒ３は水素であり、及びＲ４はアセチルである。
【０１０６】
もう１つの実施態様では、Ｒ３は水素であり、及びＲ４はＬ−バリニルである。
【０１０７】
１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシシチジンは、式：
【０１０８】
【化１６】
2008273960.tif 000009
又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグである。
【０１０９】
もう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシシチジンは、式：
【０１１０】
【化１７】
2008273960.tif 000010
又は医薬適合性のその塩である。
【０１１１】
もう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシシチジンは、式：
【０１１２】
【化１８】
2008273960.tif 000011
［式中、
Ｒ２は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸プロドラッグであり；及び
Ｒ３及びＲ４は、独立してＨ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、ジアルキルアミノアルキレン、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸プロドラッグである。］
又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグである。
【０１１３】
さらにもう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシシチジンは、式：
【０１１４】
【化１９】
2008273960.tif 000012
又は医薬適合性のその塩である。
【０１１５】
さらにもう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシシチジンは、式：
【０１１６】
【化２０】
2008273960.tif 000013
又は医薬適合性のその塩である。
【０１１７】
もう１つの実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドは、式：
【０１１８】
【化２１】
2008273960.tif 000014
［式中、
Ｒ１は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；及び
Ｒ２は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；及び
Ｒ３は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル（特にシクロプロピル）、アシル、アセチル、ブチリル、ジアルキルアミノアルキレン（特にジメチルアミノメチレン）、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体である。］
のβ−Ｌ−２’−デオキシチミジン又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグ、並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体である。
【０１１９】
好ましい実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はＨである。
【０１２０】
１つの実施態様では、前記アミノ酸残基は、式：
Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）
［式中、
Ｒ８は、アミノ酸の側鎖であり、この場合、プロリンにおけるように、Ｒ８は場合によりＲ１０に結合して環構造を形成することができ；あるいは、Ｒ８は、アルキル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロ環成分であり、；
Ｒ９は、水素、アルキル（低級アルキルを含む）又はアリールであり；及び
Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素、アシル（Ｒ８に結合したアシル誘導体を含む）又はアルキル（メチル、エチル、プロピル及びシクロプロピルを含むがこれらに限定されない）である。］
並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体である。
【０１２１】
もう１つの好ましい実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はアミノ酸残基、特にＬ−バリニルである。
【０１２２】
１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシチミジンは、式：
【０１２３】
【化２２】
2008273960.tif 000015
又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグである。
【０１２４】
もう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシチミジンは、式：
【０１２５】
【化２３】
2008273960.tif 000016
又は医薬適合性のその塩である。
【０１２６】
もう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシチミジンは、式：
【０１２７】
【化２４】
2008273960.tif 000017
［式中、
Ｒ２は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸プロドラッグであり；及び
Ｒ３は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、ジアルキルアミノアルキレン、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸プロドラッグである。］
又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグである。
【０１２８】
さらにもう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシチミジンは、式：
【０１２９】
【化２５】
2008273960.tif 000018
又は医薬適合性のその塩である。
【０１３０】
さらにもう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシチミジンは、式：
【０１３１】
【化２６】
2008273960.tif 000019
又は医薬適合性のその塩である。
【０１３２】
好ましい実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドは、その逆のβ−Ｄ−鏡像異性体を少なくとも９０％含まない。
【０１３３】
もう１つの実施態様では、本発明は、開示する２’−デオキシ−β−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシド誘導体の塩、エステル又はプロドラッグのＨＢＶ治療量を投与することを含む、ＨＢＶに感染したヒトの治療のための方法を包含する。プロドラッグは、ここで使用するとき、インビボでの投与時に前記ヌクレオシドに変換される化合物を指す。非制限的例は、活性化合物の医薬適合性の塩（あるいは「生理的に許容される塩」とも称される）、５’及びＮ４（シチジン）又はＮ６（アデノシン）アシル化（Ｌ−バリニルなどのアミノ酸残基によるものを含む）又はアルキル化誘導体、あるいは活性化合物の５’リン脂質又は５’エーテル脂質を包含する。
【０１３４】
もう１つの実施態様では、前記２’−デオキシ−β−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシドは、１つ以上の他の２’−デオキシ−β−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシド又はＢ型肝炎ウイルスに対して活性を示す１つ以上の他の化合物と交互に又は組み合わせて投与される。
【０１３５】
ここで提供するβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド、特にβ−Ｌ−２’−ｄＣもしくはβ−Ｌ−２’−ｄＴ、又はこれらの化合物の医薬適合性の塩、エステル、リン酸塩もしくはプロドラッグの抗Ｂ型肝炎ウイルス活性は、これらのヌクレオシドの２つ以上を組み合わせて又は交互に投与することによって増強されうる。あるいは、例えば、ここで提供するβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドの１つ以上、特にβ−Ｌ−２’−ｄＣ又はβ−Ｌ−２’−ｄＴは、Ｂ型肝炎ウイルスに対して活性を示す１つ以上の他の化合物と組み合わせて及び／又は交互に投与することができる。非制限的例は、ＦＴＣ、Ｌ−ＦＭＡＵ、ＤＡＰＤ、ＤＸＧ、ファンシクロビル、ペンシクロビル、ＢＭＳ−２００４７５、ビスｐｏｍ  ＰＭＥＡ（アデフォビル、ジピボキシル）、ロブカビル、ガンシクロビル、テノフォビル、Ｌｆｄ４Ｃ、インターフェロン、ペグ化インターフェロン又はリバビリンを包含する。１つの実施態様では、ここで提供するβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド、特にβ−Ｌ−２’−ｄＣ又はβ−Ｌ−２’−ｄＴは、３ＴＣと組み合わせて及び／又は交互に投与することができる。
【０１３６】
１つの実施態様では、前記２’−デオキシ−β−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシドは、耐性又は野生型ＨＢＶ感染の治療のためにＴＨ１サイトカイン、特にインターフェロン、好ましくはインターフェロンγなどの１つの以上の免疫調節剤と交互に又は組み合わせて投与される。
【０１３７】
本発明の１つの実施態様では、前記免疫調節剤はタンパク質の形態で送達される。選択的実施態様では、前記免疫調節剤は、免疫調節因子タンパク質を発現する遺伝子又は遺伝子フラグメントの形態で送達される。本発明の１つの特定実施態様では、前記免疫調節剤は、その遺伝子又は遺伝子フラグメントの形態で送達され、前記送達はアデノウイルスによって仲介される。本発明の１つの特定実施態様では、前記免疫調節剤はインターフェロン（インターフェロンγなど）であり、その送達は、アデノウイルスによって仲介される遺伝子又は遺伝子フラグメントの形態である。
【０１３８】
インターフェロンα又はインターフェロンγなどのインターフェロンと組み合わせて及び／又は交互に投与されるβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドは、ヒトにおいてＢ型肝炎ウイルスに対する卓越した治療を提供する。１つの実施態様では、前記インターフェロンは、タンパク質の形態で、典型的には静脈内又は動脈内に直接投与される。本発明の選択的実施態様では、前記インターフェロンは、宿主によって発現されるその核酸、遺伝子又は遺伝子フラグメントの形態で投与される。前記インターフェロン核酸は、「裸で」、すなわちベクターなしで宿主に送達されうるか、あるいはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターを含むがこれに限定されない、ベクターによって送達されうる。
【０１３９】
１つの実施態様では、前記インターフェロンはインターフェロンα、場合によりペグ化インターフェロンαである。もう１つの実施態様では、前記インターフェロンαは、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、ペグ化インターフェロンα−２ａ、ペグ化インターフェロンα−２ｂ、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（インターフェロンα−２ａ、Ｒｏｃｈｅ）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ａ、Ｒｏｃｈｅ）、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ｂ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、コンセンサスインターフェロン、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１）、ＶｉｒａｇｅｎによるＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓによるＡＬＢＵＦＥＲＯＮ、Ａｍａｒｉｌｌｏ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるＯｒａｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｐｈａ、及びＳｕｐｅｒＦｅｒｏｎ（天然ヒトマルチサブタイプＩＦＮ−α、Ｇｅｎｅｔｒｏｌ，Ｉｎｃ．）を含むがこれらに限定されない群から選択される。選択的実施態様では、前記インターフェロンはインターフェロンγである。さらにもう１つの実施態様では、前記インターフェロンはインターフェロンβ、インターフェロンω又はインターフェロンτである。もう１つの実施態様では、前記インターフェロンは、Ａｒｅｓ−ＳｅｒｏｎｏによるＲＥＢＩＦ（インターフェロンβ−１ａ）、ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅによるＯｍｅｇａ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるインターフェロンγ−１ｂ、及びＨｕＦｅｒｏｎ（ヒトＩＦＮ−β、Ｇｅｎｅｔｒｏｌ，Ｉｎｃ．）を含むがこれらに限定されない群から選択される。
【０１４０】
一般に、交互療法（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）においては各々の薬剤の有効量を順次投与されるのに対し、併用療法では２つ以上の薬剤の有効用量を一緒に投与する。前記用量は、薬剤の吸収、不活性化、生体内分布、代謝及び排出速度ならびに当業者に既知の他の因子に依存する。用量値はまた、緩和すべき状態の重症度によっても異なることに留意すべきである。さらに、個々の被験者について、具体的な投与レジメン及びスケジュールは、個体の必要性及び組成物を投与する又は投与を監督する人の専門的判断に従って経時的に調整されるべきであることが了解されねばならない。適切な用量範囲の例は、学術文献及びＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅの中で見出すことができる。ここで述べる他の化合物についての適切な用量範囲の多くの例も、公表文献中に認められるか又は既知の手順を用いて特定しうる。これらの用量範囲は、所望効果を達成するために所望に応じて修正することができる。
【０１４１】
（発明の詳細な説明）
β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド、特にβ−Ｌ−２’−デオキシシチジン及びβ−Ｌ−２’−デオキシチミジンは、突然変異を有する薬剤耐性Ｂ型肝炎ウイルスに対して活性であること、及び特に、前記突然変異は、前記ウイルスの５５２（ＭからＶへ）コドン、すなわち逆転写酵素領域の２０４（ＭからＶへ）コドンにおける突然変異であることが発見された。この発見に基づき、β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグを投与することを含む、哺乳類、特にヒトなどの宿主においてラミブジン耐性ＨＢＶ（Ｍ５５２Ｖ）を治療するための方法を提供する。さらに、β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグを投与することを含む、哺乳類、特にヒトなどのナイーブ宿主においてラミブジン耐性ＨＢＶ（Ｍ５５２Ｖ）突然変異の発生を予防するための方法を提供する。また、β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグを投与することを含む、哺乳類、特にヒトなどの宿主においてＨＢＶ二重突然変異株（Ｌ５２８Ｍ／Ｍ５５２Ｖ）の出現を予防及び／又は抑制するための方法も提供する。
【０１４２】
もう１つの実施態様では、前記２’−デオキシ−β−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシドを、１つ以上の他の２’−デオキシ−β−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシド又はＢ型肝炎ウイルスに対して活性を示す１つ以上の他の化合物と交互に又は併用して投与する。一般に、交互療法においては各々の薬剤の有効量を順次投与するのに対し、併用療法では２つ以上の薬剤の有効用量を一緒に投与する。前記用量は、薬剤の吸収、不活性化及び排出速度ならびに当業者に既知の他の因子に依存する。用量値はまた、緩和すべき状態の重症度によっても異なることに留意すべきである。さらに、個々の被験者について、明細な投与レジメン及びスケジュールは、個体の必要性及び組成物を投与する又は投与を監督する人の専門的判断に従って経時的に調整されるべきであることが了解されねばならない。
【０１４３】
もう１つの実施態様では、本発明は、開示する２’−デオキシ−β−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシド誘導体のプロドラッグのＨＢＶ治療量を投与することを含む、ＨＢＶに感染したヒトの治療のための方法を包含する。プロドラッグは、ここで使用するとき、インビボでの投与時に前記ヌクレオシド又はその代謝産物に変換される化合物を指す。非制限的例は、活性化合物の医薬適合性の塩（あるいは「生理的に許容される塩」とも称される）、５’及び／又はＮ４（シチジン）及び／又はＮ６（アデノシン）アシル化（Ｌ−バリニルなどのアミノ酸残基によるものを含む）又はアルキル化誘導体、あるいは活性化合物の５’リン脂質又は５’エーテル脂質を包含する。
【０１４４】
本発明の好ましい実施態様は、場合により医薬適合性の担体中で、β−Ｌ−２’−デオキシアデノシン、β−Ｌ−２’−デオキシシチジン、β−Ｌ−２’−デオキシウリジン、β−Ｌ−２’−グアノシン、β−Ｌ−２’−デオキシイノシン及びβ−Ｌ−２’−デオキシチミジンから成る群より選択される１つ以上の２’−デオキシ−β−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシド誘導体、又はリン酸塩、５’及び／又はＮ６アルキル化又はアシル化誘導体を含む医薬適合性のそのプロドラッグ、又は医薬適合性のその塩の有効量を投与することを含む、ヒト又は他の宿主動物におけるＨＢＶ感染の治療のための方法である。本発明の化合物は、抗ＨＢＶ活性を有するか、又は抗ＨＢＶ活性を示す化合物へと代謝される。好ましい実施態様では、前記２’−デオキシ−β−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシドを実質的に単一異性体の形態で、すなわち少なくとも約９５％を指定立体配置で投与する。
【０１４５】
Ｉ．本発明によって定義される化合物
１つの実施態様では、本発明は、式（Ｉ）：
【０１４６】
【化２７】
2008273960.tif 000020
［式中、
Ｒ１は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｒ２は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ２又はＣＨ２であり；及び
ＢＡＳＥは、場合により置換されていてもよいプリン又はピリミジン塩基である。］
のβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグ、並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体の使用を提供する。
【０１４７】
好ましい実施態様では、ＸはＯである。
【０１４８】
１つの実施態様では、前記アミノ酸残基は、式：
Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）
［式中、
Ｒ８は、アミノ酸の側鎖であり、この場合、プロリンにおけるように、Ｒ８は場合によりＲ１０に結合して環構造を形成することができ；あるいは、Ｒ８は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環成分であり、；
Ｒ９は、水素、アルキル（低級アルキルを含む）又はアリールであり；及び
Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素、アシル（Ｒ８に結合したアシル誘導体を含む）又はアルキル（メチル、エチル、プロピル及びシクロプロピルを含むがこれらに限定されない）である。］
並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体である。
【０１４９】
最初のサブ実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）−アルキル（低級アルキルを含む）又はアリールであり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１５０】
２番目の実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）−低級アルキルであり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１５１】
３番目のサブ実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１５２】
４番目のサブ実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１５３】
５番目のサブ実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、Ｒ１０及びＲ１１の少なくとも１つは水素であり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１５４】
６番目のサブ実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、Ｒ８はアミノ酸側鎖であり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１５５】
７番目のサブ実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、Ｒ８は非極性アミノ酸側鎖であり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１５６】
サブ実施態様の非制限的例は、式（Ｉ）：
［式中、
（１）Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥはシトシンである。
（２）Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥは保護されたシトシンである。
（３）Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥはチミンである。
（４）Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＨ２）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、及びＢＡＳＥはシトシンである。
（５）Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＨ２）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、及びＢＡＳＥは保護されたシトシンである。
（６）Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＨ２）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、及びＢＡＳＥはチミンである。］
によって定義することができる。
【０１５７】
８番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）−アルキル（低級アルキルを含む）又はアリールであり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１５８】
９番目の実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）−低級アルキルであり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１５９】
１０番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１６０】
１１番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１６１】
１２番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、Ｒ１０及びＲ１１の少なくとも１つは水素であり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１６２】
１３番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、Ｒ８はアミノ酸側鎖であり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１６３】
１４番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、Ｒ８は非極性アミノ酸側鎖であり、Ｒ５及びＲ６の少なくとも１つは水素であり、及びＢはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１６４】
サブ実施態様の非制限的例は、式（Ｉ）：
［式中、
（１）ＸはＯであり、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥはシトシンである。
（２）ＸはＯであり、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥは保護されたシトシンである。
（３）ＸはＯであり、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥはチミンである。
（４）ＸはＯであり、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＨ２）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、及びＢＡＳＥはシトシンである。
（５）ＸはＯであり、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＨ２）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、及びＢＡＳＥは保護されたシトシンである。
（６）ＸはＯであり、Ｒ１及び／又はＲ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＨ２）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、及びＢＡＳＥはチミンである。］
によって定義することができる。
【０１６５】
１５番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＣ（Ｏ）−アルキル（低級アルキルを含む）又はアリールであり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１６６】
１６番目の実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＣ（Ｏ）−低級アルキルであり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１６７】
１７番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１６８】
１８番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１６９】
１９番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、Ｒ１０及びＲ１１の少なくとも１つは水素であり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１７０】
２０番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、Ｒ８はアミノ酸側鎖であり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１７１】
２１番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、Ｒ８は非極性アミノ酸側鎖であり、Ｒ５及びＲ６の少なくとも１つは水素であり、及びＢはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１７２】
サブ実施態様の非制限的例は、式（Ｉ）：
［式中、
（１）ＸはＯであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥはシトシンである。
（２）ＸはＯであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥは保護されたシトシンである。
（３）ＸはＯであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥはチミンである。
（４）ＸはＯであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＨ２）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、及びＢＡＳＥはシトシンである。
（５）ＸはＯであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＨ２）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、及びＢＡＳＥは保護されたシトシンである。
（６）ＸはＯであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＨ２）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、及びＢＡＳＥはチミンである。］
によって定義することができる。
【０１７３】
２２番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は独立してＣ（Ｏ）−アルキル（低級アルキルを含む）又はアリールであり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１７４】
２３番目の実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は独立してＣ（Ｏ）−低級アルキルであり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１７５】
２４番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は独立してＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１７６】
２５番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は独立してＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１７７】
２６番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は独立してＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、Ｒ１０及びＲ１１の少なくとも１つは水素であり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１７８】
２７番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は独立してＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、Ｒ８はアミノ酸側鎖であり、及びＢＡＳＥはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１７９】
２８番目のサブ実施態様では、ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は独立してＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＲ１０Ｒ１１）であり、Ｒ８は非極性アミノ酸側鎖であり、Ｒ５及びＲ６の少なくとも１つは水素であり、及びＢはシトシン、保護されたシトシン又はチミンである。
【０１８０】
サブ実施態様の非制限的例は、式（Ｉ）：
［式中、
（１）ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は独立してＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥはシトシンである。
（２）ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は独立してＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥは保護されたシトシンである。
（３）ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は独立してＣ（Ｏ）−メチルであり、及びＢＡＳＥはチミンである。
（４）ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は独立してＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＨ２）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、及びＢＡＳＥはシトシンである。
（５）ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は独立してＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＨ２）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、及びＢＡＳＥは保護されたシトシンである。
（６）ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は独立してＣ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｈ）（ＮＨ２）であり、Ｒ８はイソプロピルであり、及びＢＡＳＥはチミンである。］
によって定義することができる。
【０１８１】
もう１つの実施態様では、本発明は、式：
【０１８２】
【化２８】
2008273960.tif 000021
［式中、
Ｒ１は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｒ２は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｙは、ＯＲ３、ＮＲ３Ｒ４又はＳＲ３であり；及び
Ｘ１及びＸ２は、Ｈ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ハロゲン、ＯＲ５、ＮＲ５Ｒ６又はＳＲ５から成る群より独立して選択され；及び
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立してＨ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル（特にシクロプロピル）、ジアルキルアミノアルキレン（特にジメチルアミノメチレン）、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体である。］
のβ−Ｌ−２’−デオキシプリン又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグ、並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体の使用を提供する。
【０１８３】
１つの実施態様では、前記アミノ酸残基は、式：
Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）
［式中、
Ｒ８は、アミノ酸の側鎖であり、この場合、プロリンにおけるように、Ｒ８は場合によりＲ１０に結合して環構造を形成することができ；あるいは、Ｒ８は、アルキル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロ環成分であり、；
Ｒ９は、水素、アルキル（低級アルキルを含む）又はアリールであり；及び
Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素、アシル（Ｒ８に結合したアシル誘導体を含む）又はアルキル（メチル、エチル、プロピル及びシクロプロピルを含むがこれらに限定されない）である。］
並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体である。
【０１８４】
もう１つの好ましい実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はアミノ酸残基、特にＬ−バリニルである。
【０１８５】
１つの実施態様では、Ｒ３は水素であり、及びＲ４はジメチルアミノメチレンである。
【０１８６】
もう１つの実施態様では、Ｒ３は水素であり、及びＲ４はアセチルである。
【０１８７】
もう１つの実施態様では、Ｒ３は水素であり、及びＲ４はＬ−バリニルである。
【０１８８】
もう１つの実施態様では、本発明は、式：
【０１８９】
【化２９】
2008273960.tif 000022
［式中、
Ｒ１は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｒ２は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｙは、ＯＲ３、ＮＲ３Ｒ４又はＳＲ３であり；
Ｘ１は、Ｈ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ハロゲン、ＯＲ５、ＮＲ５Ｒ６又はＳＲ５から成る群より選択され；及び
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立してＨ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル（特にシクロプロピル）、ジアルキルアミノアルキレン（特にジメチルアミノメチレン）、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体である。］
のβ−Ｌ−２’−デオキシピリミジン又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグ、並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体の使用を提供する。
【０１９０】
１つの実施態様では、前記アミノ酸残基は、式：
Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）
［式中、
Ｒ８は、アミノ酸の側鎖であり、この場合、プロリンにおけるように、Ｒ８は場合によりＲ１０に結合して環構造を形成することができ；あるいは、Ｒ８は、アルキル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロ環成分であり、；
Ｒ９は、水素、アルキル（低級アルキルを含む）又はアリールであり；及び
Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素、アシル（Ｒ８に結合したアシル誘導体を含む）又はアルキル（メチル、エチル、プロピル及びシクロプロピルを含むがこれらに限定されない）である。］
並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体である。
【０１９１】
１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシピリミジンは、式：
【０１９２】
【化３０】
2008273960.tif 000023
［式中、
Ｒ１は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；
Ｒ２は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；及び
Ｒ３及びＲ４は、独立してＨ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル（特にシクロプロピル）、ジアルキルアミノアルキレン（特にジメチルアミノメチレン）、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体である。］
のβ−Ｌ−２’−デオキシシチジン又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグ、並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体である。
【０１９３】
好ましい実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はＨである。
【０１９４】
１つの実施態様では、前記アミノ酸残基は、式：
Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）
［式中、
Ｒ８は、アミノ酸の側鎖であり、この場合、プロリンにおけるように、Ｒ８は場合によりＲ１０に結合して環構造を形成することができ；あるいは、Ｒ８は、アルキル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロ環成分であり、；
Ｒ９は、水素、アルキル（低級アルキルを含む）又はアリールであり；及び
Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素、アシル（Ｒ８に結合したアシル誘導体を含む）又はアルキル（メチル、エチル、プロピル及びシクロプロピルを含むがこれらに限定されない）である。］
並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体である。
【０１９５】
もう１つの好ましい実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はアミノ酸残基、特にＬ−バリニルである。
【０１９６】
１つの実施態様では、Ｒ３は水素であり、及びＲ４はジメチルアミノメチレンである。
【０１９７】
もう１つの実施態様では、Ｒ３は水素であり、及びＲ４はアセチルである。
【０１９８】
もう１つの実施態様では、Ｒ３は水素であり、及びＲ４はＬ−バリニルである。
【０１９９】
１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシシチジンは、式：
【０２００】
【化３１】
2008273960.tif 000024
又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグである。
【０２０１】
もう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシシチジンは、式：
【０２０２】
【化３２】
2008273960.tif 000025
又は医薬適合性のその塩である。
【０２０３】
もう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシシチジンは、式：
【０２０４】
【化３３】
2008273960.tif 000026
［式中、
Ｒ２は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸プロドラッグであり；及び
Ｒ３及びＲ４は、独立してＨ、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、ジアルキルアミノアルキレン、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸プロドラッグである。］
又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグである。
【０２０５】
さらにもう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシシチジンは、式：
【０２０６】
【化３４】
2008273960.tif 000027
又は医薬適合性のその塩である。
【０２０７】
さらにもう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシシチジンは、式：
【０２０８】
【化３５】
2008273960.tif 000028
又は医薬適合性のその塩である。
【０２０９】
もう１つの実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドは、式：
【０２１０】
【化３６】
2008273960.tif 000029
［式中、
Ｒ１は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；及び
Ｒ２は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体であり；及び
Ｒ３は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル（特にシクロプロピル）、アシル、アセチル、ブチリル、ジアルキルアミノアルキレン（特にジメチルアミノメチレン）、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸誘導体である。］
のβ−Ｌ−２’−デオキシチミジン又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグ、並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体である。
【０２１１】
好ましい実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はＨである。
【０２１２】
１つの実施態様では、前記アミノ酸残基は、式：
Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｒ８）（Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）
［式中、
Ｒ８は、アミノ酸の側鎖であり、この場合、プロリンにおけるように、Ｒ８は場合によりＲ１０に結合して環構造を形成することができ；あるいは、Ｒ８は、アルキル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロ環成分であり、；
Ｒ９は、水素、アルキル（低級アルキルを含む）又はアリールであり；及び
Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素、アシル（Ｒ８に結合したアシル誘導体を含む）又はアルキル（メチル、エチル、プロピル及びシクロプロピルを含むがこれらに限定されない）である。］
並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体である。
【０２１３】
もう１つの好ましい実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２はアミノ酸残基、特にＬ−バリニルである。
【０２１４】
１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシチミジンは、式：
【０２１５】
【化３７】
2008273960.tif 000030
又は医薬適合性のその塩、エステルもしくはプロドラッグ、及びそのすべての互変異性体である。
【０２１６】
もう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシチミジンは、式：
【０２１７】
【化３８】
2008273960.tif 000031
又は医薬適合性のその塩である。
【０２１８】
もう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシチミジンは、式：
【０２１９】
【化３９】
2008273960.tif 000032
［式中、
Ｒ２は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸プロドラッグであり；及び
Ｒ３は、水素、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、ジアルキルアミノアルキレン、アシル、アセチル、ブチリル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、アミノ酸残基、一、二もしくは三リン酸又はリン酸プロドラッグである。］
又は医薬適合性のその塩、並びにそのすべての互変異性体及び立体異性体である。
【０２２０】
さらにもう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシチミジンは、式：
【０２２１】
【化４０】
2008273960.tif 000033
又は医薬適合性のその塩である。
【０２２２】
さらにもう１つの特定実施態様では、前記β−Ｌ−２’−デオキシチミジンは、式：
【０２２３】
【化４１】
2008273960.tif 000034
又は医薬適合性のその塩である。
【０２２４】
ＩＩ．定義
ここで使用するとき、「耐性ウイルス」の語は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、又はＭＴ２もしくはＭＴ４細胞を含むがこれらに限定されない定常細胞系において、天然ウイルスに比べて３倍以上、典型的には５倍以上のＥＣ５０の上昇を示すウイルスを指す。
【０２２５】
ここで使用するとき、Ｂ型肝炎及び関連状態の語は、抗ＨＢＶ抗体陽性及びＨＢＶ陽性状態、ＨＢＶによって引き起こされる慢性肝炎症、肝硬変、急性肝炎、劇症肝炎、慢性持続性肝炎及び疲労などのＢ型肝炎及び関連状態を指す。本発明の方法は、抗ＨＢＶ抗体又はＨＢＶ抗原陽性であるか又はＨＢＶに接触した個体において予防的に臨床疾病の進行を防ぐ又は遅延させるための２’−デオキシ−β−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシド誘導体の使用を包含する。
【０２２６】
生物活性ヌクレオシドの語は、ここで使用するとき、肝炎ビリオンでトランスフェクトした２．２．１５細胞において試験したとき１５μＭ以下のＥＣ５０を示すヌクレオシドを指す。
【０２２７】
ここで使用するとき、「実質的に純粋な」又は「実質上１つの光学異性体の形態の」の語は、そのヌクレオシドの単一鏡像異性体を少なくとも９５−９８％以上、好ましくは９９％−１００％含むヌクレオシド組成物を指す。好ましい実施態様では、開示する適応症のいずれかのためにβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドを実質的に純粋な形態で投与する。
【０２２８】
同様に、「単離された」の語は、そのヌクレオシドを少なくとも８５又は９０重量％、好ましくは９５−９８重量％、さらに一層好ましくは９９−１００重量％含み、残りは他の化学物質種又は鏡像異性体を含む化合物を指す。
【０２２９】
「実質的に純粋な形態」の語は、本明細書全体を通じて、その化合物の単一鏡像異性体を約９０％以上、又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上含む化合物を表わすために使用される。本明細書において特定立体配置（Ｄ又はＬ）のヌクレオシドに言及するときは、そのヌクレオシドを実質的に純粋な形態で投与すると想定する。
【０２３０】
「独立して」の語は、ここでは、独立して適用される変数が、適用ごとに独立して異なることを示すために使用される。それ故、Ｒ”ＸＹＲ”［式中、Ｒ”は「独立して炭素又は窒素である」］のような化合物においては、両方のＲ”が炭素であってもよく、両方のＲ”が窒素であってもよく、又は１個のＲ”が炭素であり、及び他方のＲ”が窒素であってもよい。
【０２３１】
「アルキル」の語は、ここで使用するとき、及び特に異なる規定がない限り、典型的には、Ｃ１−Ｃ１０、好ましくはＣ１−Ｃ６のようなＣ１−Ｃ１８の飽和直鎖、分枝又は環状、第一級、第二級又は第三級炭化水素を指し、特にメチル、トリフルオロメチル、ＣＣｌ３、ＣＦＣｌ２、ＣＦ２Ｃｌ、エチル、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、プロピル，イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ｔ−ペンチル、ネオペンチル、アミル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル及び２，３−ジメチルブチルを含む。この語は、置換及び非置換アルキル基の両方を包含する。アルキル基が置換されうる成分は、当業者に既知である、例えば、参照してここに組み込まれる、Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，第２版、１９９１において教示されるような、保護されていないか又は必要に応じて保護された、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、硫酸塩、ホスホン酸、リン酸塩又はホスホン酸塩から成る群より選択される。
【０２３２】
「低級アルキル」の語は、ここで使用するとき、及び特に異なる規定がない限り、置換及び非置換形態の両方を含む、Ｃ１−Ｃ４飽和直鎖、分枝、又は適宜に環状（例えばシクロプロピル）アルキル基を指す。本明細書において特に異なる記述がない限り、アルキルが適切な成分であるときは、低級アルキルが好ましい。同様に、アルキル又は低級アルキルが適切な成分であるときは、非置換アルキル又は低級アルキルが好ましい。
【０２３３】
「アリール」の語は、ここで使用するとき、及び特に異なる規定がない限り、フェニル、ビフェニル又はナフチルを指し、好ましくはフェニルを指す。この語は、置換及び非置換成分の両方を包含する。アリール基は、当業者に既知である、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，第２版、１９９１において教示されるような、保護されていないか又は必要に応じて保護された、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、硫酸塩、ホスホン酸、リン酸塩又はホスホン酸塩から成る群より選択される１つ以上の成分で置換されうる。
【０２３４】
「アシル」の語は、式−Ｃ（Ｏ）Ｒ’のカルボン酸エステル［前記エステル基の非カルボニル成分（すなわちＲ’）は、直鎖、分枝もしくは環状アルキル又は低級アルキル、メトキシメチルを含むアルコキシアルキル、アルクアリール、アラルキル又はアリールアルキル（ベンジル又は置換ベンジルを含む）、フェノキシメチルなどのアリールオキシアルキル、場合によりハロゲン（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）で置換されたフェニルを含むアリール、Ｃ１−Ｃ４アルキル又はＣ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ酸残基又はヘテロ芳香族から選択される。］を指す。前記エステル中のアリール基は、最適にはフェニル基を含む。アシルの語は特に、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、３−メチルブチリル、水素スクシニル、３−クロロベンゾイル、ベンゾイル、アセチル、ピバロイル、メシレート、プロピオニル、バレリル、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸及びオレイン酸を含むが、これらに限定されない。あるいは、メタンスルホニルを含むアルキル又はアラルキルスルホニル、一、二又は三リン酸エステル、トリチル又はモノメトキシトリチル、トリアルキルシリル（例えばジメチル−ｔ−ブチルシリル）又はジフェニルメチルシリルなどのスルホン酸エステルも包含される。「低級アシル」の語は、非カルボニル成分が低級アルキルであるアシル基を指す。
【０２３５】
ここで使用するとき、「プリン」又は「ピリミジン塩基」の語は、６−アルキルプリン及びＮ６−アルキルプリン、Ｎ６−アシルプリン、Ｎ６−ベンジルプリン、６−ハロプリン、Ｎ６−ビニルプリン、Ｎ６−アセチレンプリン、Ｎ６−アシルプリン、Ｎ６−ヒドロキシアルキルプリン、Ｎ６−チオアルキルプリン、Ｎ２−アルキルプリン、Ｎ４−アルキルピリミジン、Ｎ４−アシルピリミジン、４−ベンジルピリミジン、Ｎ４−ハロピリミジン、Ｎ４−アセチレンピリミジン、４−アシル及びＮ４−アシルピリミジン、４−ヒドロキシアルキルピリミジン、４−チオアルキルピリミジン、チミン、シトシン、６−アザシトシン、２−及び／又は４−メルカプトピリミジンを含む６−アザピリミジン、ウラシル、Ｃ５−アルキルピリミジン、Ｃ５−ベンジルピリミジン、Ｃ５−ハロピリミジン、Ｃ５−ビニルピリミジン、Ｃ５−アセチレンピリミジン、Ｃ５−アシルピリミジン、Ｃ５−ヒドロキシアルキルプリン、Ｃ５−アミドピリミジン、Ｃ５−シアノピリミジン、Ｃ５−ニトロピリミジン、Ｃ５−アミノピリミジン、Ｎ２−アルキルプリン、Ｎ２−アルキル−６−チオプリン、５−アザシトシン、５−アザウラシル、トリアゾロピリジン、イミダゾロピリジン、ピロロピリミジン及びピラゾロピリミジンを含むが、これらに限定されない。前記塩基上の酸素及び窒素官能基は、必要又は所望に応じて保護することができる。適切な保護基は当業者に周知であり、トリメチルシリル、ジメチルヘキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリチル、アルキル基、アセチル及びプロピオニルなどのアシル基、メタンスルホニル及びｐ−トルエンスルホニルを含む。
【０２３６】
好ましい塩基は、シトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−メチルウラシル、チミン、アデニン、グアニン、イノシン、キサンチン、２，６−ジアミノプリン、６−アミノプリン、６−クロロプリン及び２，６−ジクロロプリン、６−ブロモプリン、２，６−ジブロモプリン、６−ヨードプリン、２，６−ジヨードプリン、５−ブロモビニルシトシン、５−ブロモビニルウラシル、５−ブロモエテニルシトシン、５−ブロモエテニルウラシル、５−トリフルオロメチルシトシン、５−トリフルオロメチルウラシルを含む。
【０２３７】
ここで使用するとき、「アミノ酸残基」の語は、アラニル、バリニル、ロイシニル、イソロイシニル、プロリニル、フェニルアラニル、トリプトファニル、メチオニニル、グリシニル、セリニル、トレオニニル、システイニル、チロシニル、アスパラギニル、グルタミニル、アスパルトイル、グルタオイル、リシニル、アルギニニル及びヒスチジニルの、ラセミ混合物、すべての互変異性及び立体異性配置を含む、Ｌ又はＤ鏡像異性体又はその混合物を含むが、これらに限定されない。好ましいアミノ酸はＬ−立体配置であり、及び好ましいアミノ酸成分はＬ−バリニルである。
【０２３８】
ここで使用するアミノ酸の略語を表１に示す。
【０２３９】
【表４】
2008273960.tif 000035
2008273960.tif 000036
【０２４０】
「免疫調節剤」又は「免疫応答を調節する」の語は、ここで使用するとき、免疫刺激ならびに免疫抑制作用を含む、免疫応答を直接又は間接的に調節するケモカイン又はサイトカインを指す。免疫調節は主として免疫応答全体における定性的変化であるが、免疫調節に関連して定量的変化も起こりうる。免疫調節は、「Ｔｈ２型」免疫応答と異なり、「Ｔｈ１型」免疫応答へとシフトする免疫応答を含みうる。Ｔｈ１型応答は、典型的には細胞性免疫系（例えば細胞傷害性リンパ球）応答とみなされ、一方Ｔｈ２型応答は一般に「体液性」であるか又は抗体に基づく。Ｔｈ１型免疫応答は通常、抗原に対する「遅延型過敏症」反応によって特徴付けられ、生化学的レベルでは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２及びＴＮＦ−βならびにＩＦＮ−α及びＩＬ−６などのＴｈ１関連サイトカインの高レベルによって検出できるが、ＩＬ−６はＴｈ２型応答にも結びつくことがある。Ｔｈ１型免疫応答は一般に、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）の産生及び低レベル又は一過性の抗体産生に結びつく。Ｔｈ２型免疫応答は一般に、ＩｇＥ産生を含むより高いレベルの抗体産生、ＣＴＬ産生の欠如又は極微の産生、ならびにＩＬ−４などのＴｈ２関連サイトカインの発現に結びつく。従って、１つの実施態様における免疫調節は、例えば、治療なしの場合と比べて本発明の方法に従って治療した個体におけるＩＦＮ−γの上昇及び／又はＩｇＥ産生の低下によって認識されうる。
【０２４１】
免疫調節剤は、免疫応答に直接又は間接的に影響を及ぼすケモカイン又はサイトカインなどの分子を含むが、これらに限定されない。免疫調節剤の非制限的例は、ＴＨ１サイトカイン、特にインターフェロン、インターフェロン−α、精製インターフェロン−α、インターフェロン−α２ａ、インターフェロン−α２ｂ、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、コンセンサスインターフェロン、ペグ化インターフェロン、ペグ化インターフェロン−α、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン、インターロイキン−２及びインターロイキン−１２を包含する。１つの実施態様では、免疫調節剤はインターフェロン、例えばインターフェロン−γである。
【０２４２】
ここで使用する略語は以下を指すものとする：
ＡｄＩＦＮ    ウッドチャックインターフェロンγを発現するアデノウイルスベクター
ＡｄＲＦＰ    ウッドチャックインターフェロンγ遺伝子を含まないアデノウイルスベクター
ＣＣＣ  ＤＮＡ    共有結合閉環状ウイルス形態のＤＮＡ
ＤＮＡ    デオキシリボ核酸
ＦＴＣ    （−）−β−２’，３’−ジデオキシ−５−フルオロ−３’−チアシチジン
ＧＦＰ    緑色蛍光タンパク質
ＨＢＶ    Ｂ型肝炎ウイルス
ＩＦＮ    インターフェロン
Ｌ−ＦＭＡＵ    １−（２−フルオロ−５−メチル−β，Ｌ−アラビノフラノシル）チミン
Ｍ１，Ｍ２    それぞれ治療の開始後１ヶ月又は２ヶ月
ＰＣＮＡ    増殖細胞核抗原
ＰＣＲ    ポリメラーゼ連鎖反応
Ｐｆｕ    プラーク形成単位
ＲＦＰ    赤色蛍光タンパク質
ＲＩ    複製中間体
ＲＴ    逆転写酵素
ＴＵＮＥＬ    ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）仲介ｄＵＴＰニック末端標識アッセイ
ＷＨＶ    ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス
ここで使用するとき、「治療」は、臨床結果を含む、有益な又は所望の結果を得るためのアプローチである。本発明に関して、有益又は所望臨床結果は、検出可能又は検出不能の、１つ以上の症状の緩和又は改善、疾患の程度の軽減、疾患の状態の安定化（すなわち悪化させないこと）、疾患の拡大の予防、疾患の進行の遅延又は緩慢化、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的又は完全）を含むが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けない場合の予測生存期間と比較して生存を延長させることも意味しうる。
【０２４３】
「宿主」の語は、ここで使用するとき、細胞系及び動物を含む、その中でウイルスが複製することができる単細胞又は多細胞生物、好ましくはヒトを指す。あるいは、宿主は、その複製又は機能を本発明の化合物によって変化させうる、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの一部を担持することができる。宿主の語は、特に、感染細胞、ＨＢＶゲノムの全部又は一部でトランスフェクトした細胞、及び動物、特に霊長類（チンパンジーを含む）及びヒトを指す。本発明の大部分の動物適用において、宿主はヒト患者である。一部の症例における獣医学適用は、しかしながら、本発明によって明らかに予想される（チンパンジーなど）。
【０２４４】
ＩＩＩ．ヌクレオチド塩又はプロドラッグ製剤
「医薬適合性の塩、エステル又はプロドラッグ」の語は、本明細書全体を通じて、患者への投与後、直接又は間接的にβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドを提供する又はそれら自体が活性を示すヌクレオシド化合物の医薬適合性の形態（エステル、リン酸エステル、エステル又は関連する基の塩など）を表わすために使用される。医薬適合性の塩は、医薬適合性の無機又は有機塩基及び酸から誘導されるものを含む。医薬適合性のプロドラッグは、宿主において代謝されて、例えば加水分解又は酸化されて、本発明の化合物を形成する化合物を指す。プロドラッグの典型的な例は、活性化合物の官能成分上に生物学的に不安定な保護基を有する化合物を含む。プロドラッグは、酸化、還元、アミノ化、脱アミノ化、水酸化、脱水酸化、加水分解、脱加水分解（ｄｅｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ）、アルキル化、脱アルキル化、アシル化、脱アシル化、リン酸化、脱リン酸化して、活性化合物を生成することができる化合物を含む。本発明の化合物は、ＨＢＶ、特にラミブジン耐性ＨＢＶ（Ｍ５５２Ｖ）に対して抗ウイルス活性を有するか、又はそのような活性を示す化合物に代謝される。
【０２４５】
ここで使用するとき、「医薬適合性の塩又は複合体」の語は、親化合物の所望生物活性を保持し、及び最小限の、もし存在する場合は、有害な毒性作用を示す、β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドの塩又は複合体を指す。そのような塩の非制限的例は、（ａ）無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸水素酸、炭酸等）で形成される酸付加塩、及び酢酸、シュウ酸、ギ酸、フマル酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マレイン酸、サリチル酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ酸（ｐａｌｍｏｉｃ  ａｃｉｄ）、アルギン酸、ポリグルタミン酸、トシル酸（ｔｏｓｉｃ  ａｃｉｄ）、メタンスルホン酸、クエン酸、マロン酸、α−ケトグルタル酸、α−グリセロリン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸及びポリガラクツロン酸などの有機酸で形成される酸付加塩、（ｂ）ナトリウム、カリウム、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウム等のようなカチオン、あるいはＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、アンモニウム又はエチレンジアミンから生成される有機カチオンで形成される塩基付加塩、あるいは（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組合せ、例えばタンニン酸亜鉛等である。
【０２４６】
併用又は交互療法における使用のためにここで述べるヌクレオシド及び／又はここで述べる化合物のいずれもが、活性、バイオアベイラビリティー、安定性を高めるためあるいはさもなければそのヌクレオシドの特性を変化させるために、ヌクレオチドプロドラッグとして投与することができる。多くのヌクレオチドプロドラッグリガンドが既知である。一般に、ヌクレオシドの一、二又は酸リン酸塩のアルキル化、アシル化又は他の脂質親和性修飾はヌクレオチドの安定性を高める。リン酸成分上の１個以上水素を置換することができる置換基の例は、アルキル、アリール、ステロイド、糖類を含む炭水化物、１，２−ジアシルグリセロール及びアルコールである。多くは、Ｒ．ＪｏｎｅｓとＮ．Ｂｉｓｃｈｏｆｂｅｒｇｅｒ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，２７，１−１７に記述されている。これらのいずれもが、所望効果を達成するために開示するヌクレオシドと組み合わせて使用できる。
【０２４７】
１つの実施態様では、β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドの５’及び／又は３’−Ｏ位置及び／又はＮ４位置をアシル化、アルキル化又はリン酸化（一、二及び三リン酸エステルならびに安定化リン酸塩及びリン脂質を含む）する。１つの実施態様では、アシル基は、エステル基の非カルボニル成分が、直鎖、分枝もしくは環状アルキル、メトキシメチルを含むアルコキシアルキル、ベンジルを含むアラルキル、フェノキシメチルを含むアリールオキシアルキル、場合によりハロゲン、アルキル又はアルコキシで置換されたフェニルを含むアリール、メタンスルホニル、トリチル又はモノメトキシトリチルを含むアルキル又はアラルキルスルホニルなどのスルホン酸エステル、置換ベンジル、トリアルキルシリル、又はジフェニルメチルシリルから選択される、カルボン酸エステルである。アルキル基は直鎖、分枝又は環状でありえ、好ましくはＣ１−Ｃ１８である。
【０２４８】
β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドは、適切なエステル化剤、例えば酸ハロゲン化物又は無水物との反応によって医薬適合性のエステルに変換することができる。ヌクレオシド又はその医薬適合性のプロドラッグは、従来のように、例えば適切な塩基又は酸による処理によって医薬適合性の塩に変換することができる。エステル又は塩は、例えば加水分解によって、その親ヌクレオシドに変換することができる。活性化合物の修飾、特に５’及び／又は３’Ｏ位置及び／又はＮ４位置での修飾は、その活性種のバイオアベイラビリティー及び代謝速度に影響を及ぼすことができ、それ故活性種の送達の制御を提供しうる。好ましい修飾は、Ｌ−バリニルエステルを含む、３’−及び／又は５’−アミノ酸エステルである。
【０２４９】
活性ヌクレオシドはまた、参照してここに組み込まれる以下の参考文献中に開示されているように、５’−ホスホエーテル脂質又は５’−エーテル脂質としても提供されうる：
【０２５０】
【表５】
2008273960.tif 000037
【０２５１】
好ましくはヌクレオシド又は脂質親和性製剤の５’−ＯＨ位置で、共有結合によって本発明のヌクレオシドに組み込むことができる適切な脂質親和性置換基を開示する米国特許の非制限的例は、すべて参照してここに組み込まれる、米国特許第５，１４９，７９４号（１９９２年９月２２日、Ｙａｔｖｉｎら）；同第５，１９４，６５４号（１９９３年３月１６日、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）；同第５，２２３，２６３号（１９９３年６月２９日、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）；同第５，２５６，６４１号（１９９３年１０月２６日、Ｙａｔｖｉｎら）；同第５，４１１，９４７号（１９９５年５月２日、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）；同第５，４６３，０９２号（１９９５年１０月３１日、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）；同第５，５４３，３８９号（１９９６年８月６日、Ｙａｔｖｉｎら）；同第５，５４３，３９０号（１９９６年８月６日、Ｙａｔｖｉｎら）；同第５，５４３，３９１号（１９９６年８月６日、Ｙａｔｖｉｎら）；及び同第５，５５４，７２８号（１９９６年９月１０日、Ｂａｓａｖａら）を含む。本発明のヌクレオシドに結合することができる脂質親和性置換基又は脂質親和性製剤を開示する外国特許出願は、国際公開公報第ＷＯ８９／０２７３３号、同第ＷＯ９０／００５５５号、同第ＷＯ９１／１６９２０号、同第ＷＯ９１／１８９１４号、同第ＷＯ９３／００９１０号、同第ＷＯ９４／２６２７３号、同第ＷＯ９６／１５１３２号、欧州特許０  ３５０  ２８７号、同第９３９１７０５４．４号及び国際公開公報第ＷＯ９１／１９７２１号を含む。
【０２５２】
ヌクレオシドプロドラッグの非制限的な例は、以下の参考文献中に記述されている；
【０２５３】
【表６】
2008273960.tif 000038
2008273960.tif 000039
2008273960.tif 000040
【０２５４】
抗ＨＩＶ薬ＡＺＴのアルキルリン酸水素誘導体は、親ヌクレオシド類似体よりも毒性が低いと考えられる。
【０２５５】
【表７】
2008273960.tif 000041
2008273960.tif 000042
2008273960.tif 000043
有用なリン酸プロドラッグ基の一例は、「ＳＡＴＥ」とも称される、Ｓ−アシル−２−チオエチル基である。
【０２５６】
ＩＶ．併用又は交互療法
抗ウイルス薬による長期間の治療後にＨＢＶの薬剤耐性変異株が出現しうることが認識されてきた。薬剤耐性は、最も典型的には、ウイルス生活環において使用される酵素、ＨＢＶの場合最も典型的にはＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の突然変異によって起こる。最近、主成分薬剤によって引き起こされるものとは異なる突然変異を誘発する第二、第三、第四、等の抗ウイルス化合物を前記主化合物と組み合わせて又は交互に投与することによってＨＢＶ感染に対する薬剤の効果を持続、上昇又は回復できることが明らかにされた。あるいは、そのような併用又は交互療法によって薬剤の薬物動態、生体内分布又は他のパラメータを変化させることができる。用量は、各々の薬剤についての吸収、生体内分布、代謝及び排出速度ならびに当業者に既知の他の因子に依存する。用量値はまた、緩和すべき状態の重症度によっても異なることに留意すべきである。さらに、個々の被験者について、明細な用量レジメン及びスケジュールは、個体の必要性及び組成物を投与する又は投与を監督する人の専門的判断に従って経時的に調整されるべきであることが了解されねばならない。抗ＨＢＶ化合物に関する適切な用量範囲の例は、学術文献及びＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅの中に見出すことができる。ここで述べる他の化合物についての適切な用量範囲の多くの例も、公表文献中に認められるか又は既知の手順を用いて特定されうる。これらの用量範囲は、所望効果を達成するために所望に応じて修正することができる。
【０２５７】
一般に、併用療法においては２つ以上の薬剤の有効用量を一緒に投与するのに対し、交互療法では各々の薬剤の有効量を順次投与する。交互療法では、例えば、１つ以上の第一薬剤を、ウイルス感染を治療するために有効な量で有効な期間投与し、次に常套的な同様の治療においてそれらの第一薬剤に代わる１つ以上の第二薬剤を有効量で有効な期間投与する。一般に、併用療法は、ウイルスに対して同時に多数のストレスを誘導するので、典型的には交互療法よりも好ましい。
【０２５８】
ここで述べる実施態様のいずれかにおいて、本発明のβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドを、第二ヌクレオシド又は活性形態へとリン酸化される非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤と組み合わせて又は交互に投与する場合は、第二化合物が、インビボで本発明の選択β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドをリン酸化するものとは異なる酵素によってリン酸化されることが好ましい。キナーゼ酵素の例は、チミジンキナーゼ、シトシンキナーゼ、グアノシンキナーゼ、アデノシンキナーゼ、デオキシシチジンキナーゼ、５’−ヌクレオチダーゼ及びデオキシグアノシンキナーゼである。
【０２５９】
ここで提供するβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド、特にβ−Ｌ−２’−ｄＣ又はβ−Ｌ−２’−ｄＴ、あるいはこれらの化合物の医薬適合性のその塩、エステル、リン酸塩又はプロドラッグの、野生型又は耐性株ＨＢＶに対する抗Ｂ型肝炎活性は、これらのヌクレオシドの２つ以上を組み合わせて又は交互に投与することによって増強することができる。あるいは、例えば、ここで提供するβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド、特にβ−Ｌ−２’−ｄＣ又はβ−Ｌ−２’−ｄＴの１つ以上を、Ｂ型肝炎ウイルスに対して活性を示す１つ以上の他の化合物と組み合わせて又は交互に投与することができる。非制限的例は、ＦＴＣ、Ｌ−ＦＭＡＵ、ＤＡＰＤ、ＤＸＧ、ファンシクロビル、ペンシクロビル、ＢＭＳ−２００４７５、ビスｐｏｍ  ＰＭＥＡ（アデフォビル、ジピボキシル）、ロブカビル、ガンシクロビル、テノフォビル、Ｌｆｄ４Ｃ、フォスカルネット（ホスホノギ酸三ナトリウム）、イソプリノシン、レバミゾール、Ｎ−アセチルシスチン（ＮＡＣ）、インターフェロン、ペグ化インターフェロン、リバビリン、ＰＣ１３２３又はポリアデンサイクリックポリウリジル酸を包含する。１つの実施態様では、ここで提供するβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド、特にβ−Ｌ−２’−ｄＣ又はβ−Ｌ−２’−ｄＴを３ＴＣと組み合わせて及び／又は交互に投与することができる。
【０２６０】
Ｂ型肝炎ウイルスに対して活性であると特定され、それ故本発明の組成物と組み合わせて及び／又は交互に投与することができる薬剤の例は次のものを含む：
【０２６１】
【表８】
2008273960.tif 000044
【０２６２】
【表９】
2008273960.tif 000045
【０２６３】
入手源：
Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｗａｔｃｈ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｅｐａｔｉｓｉｓ  Ｂ．ｗｗｗ．ｈｅｐｂ．ｏｒｇ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．Ｍａｒｋ  Ｎｅｌｓｏｎ，ＭＤ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ２００１（Ｈｅｐ  ＤＡＲＴ  ２００１）２００１年１２月１６−２０日、Ｍａｕｉ，Ｈａｗａｉｉからの選択抜粋；アメリカ肝臓学会議（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）第５２回年次総会、２００１年１１月９−１３日、Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓからの選択抜粋；Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｗｅｅｋ  ２００１からのＢ型肝炎に関する報告；２００１年５月２０−２３日、Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ。
【０２６４】
１つの実施態様では、２’−デオキシ−β−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシドを、野生型又は耐性株ＨＢＶの治療のため、及び／又は耐性株ＨＢＶの発現の抑制又は予防のために、ＴＨ１サイトカイン、特にインターフェロン、好ましくはインターフェロンγなどの１つ以上の免疫刺激剤及び／又は免疫調節剤と交互に又は組み合わせて投与する。例えば、ここで前述したもの、ならびに：
【０２６５】
【表１０】
2008273960.tif 000046
2008273960.tif 000047
2008273960.tif 000048
欧州特許第４６８，５２０号；国際公開公報第ＷＯ９６／０２５５５号；同第ＷＯ９７／２８２５９号；同第ＷＯ９８／１６２４７号；同第ＷＯ９８／１８１１０号；同第ＷＯ９８／３７９１９号；同第ＷＯ０１／６８１１６号；ＰＣＴ／ＵＳ０１／０７８３９号；国際公開公報第ＷＯ９９／３３４８８号；同第ＷＯ９９／５１２５９号及び同第ＷＯ９９／６２９２３号に述べられているもののような、免疫刺激配列を使用しうる。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３６２７−３６３０；Ｋｒｉｅｇ（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７：６４−６５；米国特許第５，６６３，１５３号；同第５，７２３，３３５号；同第５，８４９，７１９号；及び同第６，１７４，８７２号も参照のこと。国際公開公報第ＷＯ９９／５６７５５号、国際公開公報第ＷＯ００／０６５８８号、国際公開公報第ＷＯ００／１６８０４号；国際公開公報第ＷＯ００／２１５５６号；国際公開公報第ＷＯ００／６７０２３号及び国際公開公報第ＷＯ０１／１２２２３号も参照のこと。
【０２６６】
ウッドチャックモデル及びトランスジェニックマウスにおいて、ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びインターロイキン１２を含むＴＨ１サイトカインの肝臓内発現は、非細胞溶解経路によってウイルス複製の阻害を誘導できることが示された。
【０２６７】
【表１１】
2008273960.tif 000049
【０２６８】
もう１つの実施態様では、ここで提供するβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド、特にβ−Ｌ−２’−ｄＣ又はβ−Ｌ−２’−ｄＴは、インターフェロンα又はインターフェロンγなどのインターフェロンと組み合わせて及び／又は交互に投与することができ、野生型又は耐性株のＢ型肝炎ウイルスに対して及び／又は耐性ＨＢＶの発現の予防又は抑制のために、ヒトにおいて卓越した治療法を提供する。１つの実施態様では、前記インターフェロンをタンパク質の形態で、例えば静脈又は動脈内に直接投与する。本発明の代替的実施態様では、前記インターフェロンを、宿主によって発現されるその核酸、遺伝子又は遺伝子フラグメントの形態で投与する。前記インターフェロン核酸は、「裸で」、すなわちベクターなしで宿主に送達されうるか、あるいはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターを含むがこれに限定されない、ベクターによって送達されうる。本発明の１つの特定実施態様では、免疫調節剤は遺伝子又は遺伝子フラグメントの形態で送達され、その送達はアデノウイルスによって仲介される。本発明の１つの特定実施態様では、前記免疫調節剤は、その遺伝子又は遺伝子フラグメントの形態で送達され、前記送達はアデノウイルスによって仲介される。本発明の１つの特定実施態様では、前記免疫調節剤はインターフェロン（インターフェロンγなど）であり、その送達は、アデノウイルスによって仲介される遺伝子又は遺伝子フラグメントの形態である。
【０２６９】
１つの実施態様では、前記インターフェロンは、インターフェロンα、場合によりペグ化インターフェロンαである。もう１つの実施態様では、前記インターフェロンは、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、ペグ化インターフェロンα−２ａ、ペグ化インターフェロンα−２ｂ、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（インターフェロンα−２ａ、Ｒｏｃｈｅ）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ａ、Ｒｏｃｈｅ）、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ｂ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、コンセンサスインターフェロン、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１）、ＶｉｒａｇｅｎによるＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓによるＡＬＢＵＦＥＲＯＮ、Ａｍａｒｉｌｌｏ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるＯｒａｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｐｈａ、及びＳｕｐｅｒＦｅｒｏｎ（天然ヒトマルチサブタイプＩＦＮ−α、Ｇｅｎｅｔｒｏｌ，Ｉｎｃ．）を含むがこれらに限定されない群から選択される。選択的実施態様では、前記インターフェロンはインターフェロンγである。さらにもう１つの実施態様では、前記インターフェロンはインターフェロンβ、インターフェロンω又はインターフェロンτである。もう１つの実施態様では、前記インターフェロンは、Ａｒｅｓ−ＳｅｒｏｎｏによるＲＥＢＩＦ（インターフェロンβ−１ａ）、ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅによるＯｍｅｇａ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるインターフェロンγ−１ｂ、及びＨｕＦｅｒｏｎ（ヒトＩＦＮ−β、Ｇｅｎｅｔｒｏｌ，Ｉｎｃ．）を含むがこれらに限定されない群から選択される。
【０２７０】
（免疫刺激配列）
ここで使用する「ＩＳＳ」又は「免疫刺激配列」の語は、インビトロ、インビボ及び／又はエクスビボで測定するとき測定可能な免疫応答を生じさせる、単独又はＭＣと複合したポリヌクレオチド配列を指す。測定可能な免疫応答の例は、抗原特異的抗体産生、サイトカインの分泌、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、Ｂリンパ球等のようなリンパ球個体群の活性化又は増殖を含むが、これらに限定されない。好ましくは、ＩＳＳ配列はＴｈ１型応答を選択的に活性化する。本発明における使用のためのポリヌクレオチドは少なくとも１個のＩＳＳを含む。ここで使用するとき、「ＩＳＳ」はまた、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドについての略記でもある。
【０２７１】
ＩＳＳを含むポリヌクレオチド（又はそのようなポリヌクレオチドを含む組成物）は、ここで開示する方法及び組成物において使用しうる。免疫調節ポリヌクレオチドは少なくとも１個のＩＳＳ又は多数のＩＳＳを含みうる。前記ＩＳＳは、ポリヌクレオチド内で隣接しうるか、又はポリヌクレオチド内の付加的なヌクレオチド塩基によって分離されうる。あるいは、多数のＩＳＳを個々のポリヌクレオチドとして送達しうる。
【０２７２】
ＩＳＳは当技術分野で記述されており、サイトカイン分泌、抗体産生、ＮＫ細胞活性化及びＴ細胞増殖などの、免疫応答の様々な局面を示す標準アッセイを用いて容易に特定されうる。例えば、国際公開公報第ＷＯ９７／２８２５９号；同第ＷＯ９８／１６２４７号；同第ＷＯ９９／１１２７５号；Ｋｒｉｅｇら（１９９５）；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９２）；Ｂａｌｌａｓら（１９９６）；Ｋｌｉｎｍａｎら（１９９７）；Ｓａｔｏら（１９９６）；Ｐｉｓｅｔｓｋｙ（１９９６ａ）；Ｓｈｉｍａｄａら（１９８６）；Ｊｐｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７７：８０８−８１６；Ｃｏｗｄｅｒｙら（１９９６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４５７０−４５７５；Ｒｏｍａｎら（１９９７）；及びＬｉｐｆｏｒｄら（１９９７ａ）参照。
【０２７３】
前記ＩＳＳは、６塩基又は塩基対以上の長さでありえ、一般に５’−シトシン、グアニン−３’配列を含み、好ましくは１５塩基又は塩基対以上、より好ましくは２０塩基又は塩基対以上の長さである。当技術分野で周知のように、５’−シトシン、グアニン−３’配列のシトシンはメチル化されていない。ＩＳＳはまた、５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｃ３’配列を含みうる。以下のポリヌクレオチド配列に示すように、ＩＳＳは５’−Ｔ、Ｃ、Ｇ−３’配列を含みうる（すなわち１つ以上を含みうる）。一部の実施態様では、ＩＳＳは、５’−Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ−３’配列（５’−ＣＧＴＴＣＧ−３’など）を含みうる。一部の実施態様では、ＩＳＳは、５’−Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ、プリン、プリン−３’配列を含みうる。一部の実施態様では、ＩＳＳは、５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン−３’配列（５’−ＡＡＣＧＴＴ−３’など）を含みうる。
【０２７４】
一部の実施態様では、ＩＳＳは、５’−プリン、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン−３’配列を含みうる。
【０２７５】
一部の実施態様では、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、およそ以下の長さ（塩基又は塩基対単位）：１０，０００；５，０００；２５００；２０００；１５００；１２５０；１０００；７５０；５００；３００；２５０；２００；１７５；１５０；１２５；１００；７５；５０；２５；１０のいずれか未満である。一部の実施態様では、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、およそ以下の長さ（塩基又は塩基対単位）：８；１０；１５；２０；２５；３０；４０；５０；６０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２５０；３００；３５０；４００；５００；７５０；１０００；２０００；５０００；７５００；１００００；２００００；５００００のいずれか以上である。あるいは、ＩＳＳは、１０，０００；５，０００；２５００；２０００；１５００；１２５０；１０００；７５０；５００；３００；２５０；２００；１７５；１５０；１２５；１００；７５；５０；２５；又は１０の上限及び８；１０；１５；２０；２５；３０；４０；５０；６０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；３００；３５０；４００；５００；７５０；１０００；２０００；５０００；７５００の独立して選択される下限［ただし、下限は上限未満である］を有するサイズ範囲のいずれかでありうる。
【０２７６】
一部の実施態様では、前記ＩＳＳは以下の配列：
【０２７７】
【化４２】
2008273960.tif 000050
のいずれかを含む。一部の実施態様では、前記免疫調節ポリヌクレオチドは、配列：
５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−Ｙ（配列番号１）
を含む。
【０２７８】
一部の実施態様では、前記ＩＳＳは以下の配列：
【０２７９】
【化４３】
2008273960.tif 000051
のいずれかを含む。
【０２８０】
一部の実施態様では、前記ＩＳＳは以下の配列：
【０２８１】
【化４４】
2008273960.tif 000052
2008273960.tif 000053
［式中、Ｂは５−ブロモシトシンである］のいずれかを含む。
【０２８２】
一部の実施態様では、前記ＩＳＳは以下の配列：
【０２８３】
【化４５】
2008273960.tif 000054
［式中、Ｂは５−ブロモシトシンである］のいずれかを含む。
【０２８４】
他の実施態様では、前記ＩＳＳは、配列：
【０２８５】
【化４６】
2008273960.tif 000055
【０２８６】
ＩＳＳ及び／又はＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは修飾を含みうる。ＩＳＳの修飾は、当技術分野において既知のいかなるものも包含するが、３’−ＯＨ又は５’−ＯＨ基の修飾、ヌクレオチド塩基の修飾、糖成分の修飾及びリン酸基の修飾に限定されない。そのような修飾の例を以下で述べる。
【０２８７】
ＩＳＳは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、ならびに一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ又は他の修飾ポリヌクレオチドでありうる。ＩＳＳは、前述したモチーフ内に存在するか又は前記モチーフを超えてもよい、１つ以上のパリンドローム領域を含んでもよく又は含まなくてもよい。ＩＳＳは、付加的なＲａｎｋｉｎｇ配列を含んでもよく、その一部をここで述べる。ＩＳＳは、天然に生じる又は改変された非天然塩基を含んでもよく、及び修飾糖、リン酸塩及び／又は末端を含みうる。例えば、リン酸修飾は、ホスホン酸メチル、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート（架橋又は非架橋）、ホスホトリエステル及びホスホロジチオエートを含むがこれらに限定されず、いかなる組合せでも使用しうる。他の非リン酸結合も使用しうる。前記オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート骨格を含みうる。２’−アルコキシ−ＲＮＡ類似体、２’−アミノ−ＲＮＡ類似体及び２’−アルコキシ−又はアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ及びここで述べるその他のもののような、当分野で既知の糖修飾も作製でき、いかなるリン酸修飾とも組み合わせうる。塩基修飾の例は、ＩＳＳのシトシンのＣ−５及び／又はＣ−６への電子求引性成分の付加（例えば５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ヨードシトシン）を含むが、これに限定されない。
【０２８８】
ＩＳＳは、酵素法、化学法、及びより大きなオリゴヌクレオチド配列の分解を含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の手法及び核酸合成装置を使用して合成することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７）；及びＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）参照。酵素的に構築するときは、個々の単位を、例えばＴ４ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼなどのリガーゼで連結することができる。米国特許第５，１２４，２４６号。オリゴヌクレオチドの分解は、米国特許第４，６５０，６７５号に例示されているように、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに接触させることを通して実施しうる。
【０２８９】
前記ＩＳＳはまた、従来のポリヌクレオチド単離手順を用いて単離することもできる。そのような手順は、共有ヌクレオチド配列を検出するためのゲノム又はｃＤＮＡライブラリーへのプローブのハイブリダイゼーション、共有構造特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング、及びポリメラーゼ連鎖反応による特定天然配列の合成を含むが、これらに限定されない。
【０２９０】
環状ＩＳＳは、単離するか、組換え法を通して合成するか、又は化学合成することができる。単離を通して又は組換え法を通して環状ＩＳＳを得る場合、そのＩＳＳは好ましくはプラスミドである。より小さな環状オリゴヌクレオチドの化学合成は、文献中で記述されているいずれかの方法を用いて実施できる。例えば、Ｇａｏら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２０２５−２０２９；及びＷａｎｇら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２３２６−２３３３参照。
【０２９１】
オリゴヌクレオチド及び修飾オリゴヌクレオチドを作製するための手法は当技術分野において既知である。ホスホジエステル結合を含む、天然に生じるＤＮＡ又はＲＮＡは、一般に、固形担体に結合した伸長するオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシ基に適切なヌクレオシドホスホルアミダイトを連続的に結合し、次に中間体亜リン酸トリエステルをリン酸トリエステルに酸化することによって合成される。ひとたび所望オリゴヌクレオチド配列が合成されれば、そのオリゴヌクレオチドを担体から取り出し、リン酸トリエステル基を脱保護してリン酸ジエステルにし、そのヌクレオシド塩基を、アンモニア水又は他の塩基を用いて脱保護する。例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９９３）「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ａｇｒａｗａｌ編集）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ；Ｗａｒｎｅｒら（１９８４）ＤＮＡ  ３：４０１及び米国特許第４，４５８，０６６号参照。
【０２９２】
ＩＳＳはまた、リン酸修飾オリゴヌクレオチドを含みうる。修飾リン酸結合又は非リン酸結合を含むポリヌクレオチドの合成も、当技術分野において既知である。総説については、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ（１９９７）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ：ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ」ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｄ．Ｊ．ＣｈａｄｗｉｃｋとＧ．Ｃａｒｄｅｗ編集）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ参照。本発明のオリゴヌクレオチド中の糖又は糖類似体成分に結合することができるリン誘導体（又は修飾リン酸基）は、一リン酸、二リン酸、三リン酸、アルキルホスホン酸、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等でありうる。前述したリン酸類似体の作製、及びヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドへのそれらの組込みも、それら自体、既知であり、ここで詳細に述べる必要はない。Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：１８４１−１８４８；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２３１８−２３２３；及びＳｃｈｕｌｔｚら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２９６６−２９７３。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成は、酸化工程を硫化工程に置き換えることを除いて、天然に生じるオリゴヌクレオチドについて前述したのと同様である（Ｚｏｎ（１９９３）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ」ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ａｇｒａｗａｌ編集）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．１６５−１９０）。同様に、ホスホトリエステル（Ｍｉｌｌｅｒら（１９７１）ＪＡＣＳ  ９３：６６５７−６６６５）、非架橋ホスホロアミデート（Ｊａｇｅｒら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：７２４７−７２４６）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート（Ｎｅｌｓｏｎら（１９９７）ＪＯＣ６２：７２７８−７２８７）及びホスホロジチオエート（米国特許第５，４５３，４９６号）などの他のリン酸類似体の合成も記述されている。他の非リンベースの修飾オリゴヌクレオチドも使用できる（Ｓｔｉｒｃｈａｋら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：６１２９−６１４１）。ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドはホスホジエステル骨格を有するものよりも免疫原性であり、宿主への注入後、分解に対してより抵抗性であると思われる。Ｂｒａｕｎら（１９８８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：２０８４−２０８９；及びＬａｔｉｍｅｒら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１０５７−１０６４。
【０２９３】
本発明において使用するＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド（唯一の又は主要糖成分としてリボースを含む）、デオキシリボヌクレオチド（主要糖成分としてデオキシリボースを含む）を含むことができ、あるいは、当技術分野において既知であるように、修飾糖又は糖類似体をＩＳＳに組み込むことができる。それ故、リボース及びデオキシリボースに加えて、糖成分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、及び糖「類似体」シクロペンチル基でありうる。糖はピラノシル又はフラノシル形態でありうる。ＩＳＳにおいては、糖成分は、好ましくはリボース、デオキシリボース、アラビノース又は２’−Ｏ−アルキルリボースのフラノシルであり、及び糖は、α又はβアノマー配置でそれぞれの複素環塩基に結合しうる。糖修飾は、２’−アルコキシ−ＲＮＡ類似体、２’−アミノ−ＲＮＡ類似体及び２’−アルコキシ−又はアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラを含むが、これらに限定されない。これらの糖又は糖類似体、及びそのような糖又は類似体が複素環塩基（核酸塩基）に結合しているそれぞれの「ヌクレオシド」の作製はそれら自体既知であり、そのような作製が特定実施例に関係しうる場合を除いて、ここで述べる必要はない。糖修飾はまた、ＩＳＳの製造において実施してもよく、及び何らかのリン酸修飾と組み合わせてもよい。
【０２９４】
ＩＳＳ中に組み込まれる複素環塩基又は核酸塩基は、天然に生じる主要プリン及びピリミジン塩基（すなわち、前述したように、ウラシル又はチミン、シトシン、アデニン及びグアニン）、ならびに前記主要塩基の天然及び合成修飾でありうる。
【０２９５】
当業者は、様々な複素環塩基及び様々な糖成分（及び糖類似体）を含む数多くの「合成」非天然ヌクレオシドが当技術分野において入手可能であること、及び本発明の他の判定基準を満たす限り、ＩＳＳは、天然に生じる核酸の主要な５つの塩基成分以外の１つ又はいくつかの複素環塩基を含みうることを認識する。好ましくは、しかしながら、ＩＳＳ中の複素環塩基は、プリンが９位で、ピリミジンが１位で、ピロロピリミジンが７位で及びピラゾロピリミジンが１位で、ＩＳＳの糖成分に結合している、ウラシル−５−イル、シトシン−５−イル、アデニン−７−イル、アデニン−８−イル、グアニン−７−イル、グアニン−８−イル、４−アミノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−３−イル基を含むが、これらに限定されない。
【０２９６】
ＩＳＳ及び／又はＩＭＰは、例えば共同出願の国際公開公報第ＷＯ９９／６２９２３号に述べられているように少なくとも１個の修飾塩基を含みうる。ここで使用するとき、「修飾塩基」の語は、「塩基類似体」と同義であり、例えば「修飾シトシン」は「シトシン類似体」と同義である。同様に、「修飾」ヌクレオシド又はヌクレオチドは、ここではヌクレオシド又はヌクレオチド「類似体」と同義であると定義される。塩基修飾の例は、ＩＳＳのシトシンのＣ−５及び／又はＣ−６への電子求引性成分の付加を含むが、これに限定されない。好ましくは、前記電子求引性成分はハロゲンである。修飾シトシンは、アザシトシン、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、５−ニトロシトシン、５−ヒドロキシシトシン、及び他の何らかのピリミジン類似体又は修飾ピリミジンを含みうるが、これらに限定されない。好ましい修飾ウラシルは、好ましくはハロゲンで、Ｃ−５及び／又はＣ−６において修飾され、及び５−ブロモウラシルなどのブロモウラシル、５−クロロウラシルなどのクロロウラシル、５−フルオロウラシルなどのフルオロウラシル、５−ヨードウラシルなどのヨードウラシル及びヒドロキシウラシルを含むが、これらに限定されない。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、２００１、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９：８０７−８１３も参照のこと。例えば、国際公開公報第ＷＯ９９／６２９２３号参照。塩基修飾の他の例は、６−チオ−グアニン、４−チオ−チミン及び４−チオウラシルを含むがこれらに限定されない、塩基への１つ以上のチオール基の付加を含む。さらに、一部のＩＭＰは、何らかのグアノシン残基の代わりに７−デアザグアノシンなどの修飾塩基、あるいは５’−ＣＧ−３’のシトシンを含む何らかのシトシン残基の代わりにＮ４−エチルシトシン又はＮ４−メチルシトシンから選択される修飾シトシンを含みうる。
【０２９７】
塩基修飾ヌクレオシドの作製、及び前記塩基修飾ヌクレオシドを前駆体として使用する修飾オリゴヌクレオチドの合成は、例えば米国特許第４，９１０，３００号、同第４，９４８，８８２号及び同第５，０９３，２３２号に述べられている。これらの塩基修飾ヌクレオシドは、化学合成によってオリゴヌクレオチドの末端又は内部に組み込むことができるように設計された。オリゴヌクレオチドの末端又は内部に存在するそのような塩基修飾ヌクレオシドは、ペプチド又は他の抗原の結合のための位置として使用できる。それらの糖成分に修飾を受けたヌクレオシドも記述されており（例えば米国特許第４，８４９，５１３号；同第５，０１５，７３３号；同第５，１１８，８００号；同第５，１１８，８０２号）を含むが、これらに限定されない）、同様に使用できる。
【０２９８】
本発明の方法において使用するＩＳＳは、ＩＳＳ−マイクロキャリア複合体として生産しうる。ＩＳＳ−マイクロキャリア複合体は、マイクロキャリア（ＭＣ）に結合したＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを含む。ＩＳＳ−ＭＣ複合体は、マイクロキャリアの表面に結合した（すなわちＩＳＳはＭＣ内に被包されていない）、マイクロキャリア内に吸着した（例えばＰＬＧＡビーズに吸着した）、あるいはＭＣ内に被包された（例えばリポソームの内部に組み込まれた）ＩＳＳを含む。
【０２９９】
微粒子（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズ）に結合したＩＳＳ含有オリゴヌクレオチドは、先に、インビトロで免疫刺激活性を有することが示されている（Ｌｉａｎｇら（１９９６）Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１１１９−１１２９）。しかし、最近の結果は、金、ラテックス及び磁性粒子に結合したＩＳＳ含有オリゴヌクレオチドが、ＩＳＳ含有オリゴヌクレオチドに応答して増殖する７ＴＤ１細胞の増殖を刺激する上で活性ではないことを示している（Ｍａｎｚｅｌら（１９９９）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．９：４５９−４６４）。
【０３００】
マイクロキャリアは、純水に可溶性ではなく、約５０−６０μｍ未満の大きさ、好ましくは約１０μｍ未満、より好ましくは約１０μｍ−約１０μｍ、２５ｎｍ−約５μｍ、５０ｎｍ−約４．５μｍ又は１．０μｎ−約２．０μｍの大きさである。マイクロキャリアは、球状、楕円体、杆状等のようないかなる形状でもよいが、通常は球状マイクロキャリアが好ましい。好ましいマイクロキャリアは、約５０ｍｎ、２００ｎｍ、１μｍ、１．２μｍ、１．４μｍ、１．５μｍ、１．６μｍ、１．８μｍ、２．０μｍ、２．５μｍ又は４．５μｍの大きさを有する。マイクロキャリアの「大きさ」は、一般に「設計サイズ」又は製造者が言明する所定粒径である。大きさは、平均又は最大直径などの直接測定される寸法であるか、又はろ過スクリーニング検定などの間接検定によって決定されうる。マイクロキャリアの大きさの直接測定は、典型的には、顕微鏡、一般に光学顕微鏡又は走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって、既知の大きさの粒子と比較して又はマイクロメーターを参照して実施される。製造工程の間にごくわずかな大きさの変動が生じるので、マイクロキャリアは、測定値が表示測定値±約５−１０％である場合は表示サイズであるとみなされる。大きさ特性はまた、動的光散乱によっても測定しうる。あるいは、マイクロキャリアの大きさはろ過スクリーニング検定によって測定しうる。粒子の少なくとも９７％が表示サイズの「スクリーン型」フィルター（すなわち、保持された粒子がフィルターの内部に蓄積する「デプス型フィルター」に対し、保持粒子がポリカーボネート又はポリエーテルスルホンフィルターなどのフィルター上に存在するフィルター）を通過する場合、マイクロキャリアは表示サイズ未満である。マイクロキャリア粒子の少なくとも約９７％が表示サイズのスクリーン型フィルターによって保持される場合、マイクロキャリアは表示サイズより大きい。それ故、約１０ｔｉｍ−約１０ｎｍの大きさの少なくとも約９７％のマイクロキャリアが１０μｎ細孔径のスクリーンフィルターを通過し、１０ｎｍスクリーンフィルターによって保持される。
【０３０１】
上記が指示するように、マイクロキャリアについての大きさ又はサイズ範囲への言及は、表示サイズ及び／又はサイズ範囲の近似変動及び近似値を暗黙のうちに包含する。これは、大きさ及び／又はサイズ範囲に言及するときの「約」の語の使用に反映され、「約」の言及を伴わない大きさ又はサイズ範囲への言及はその大きさ及び／又はサイズ範囲が厳密に正確であることを意味しない。
【０３０２】
マイクロキャリアは固相（例えばポリスチレンビーズ）又は液相（例えばリポソーム、ミセル又は油性及び水性乳剤中の油滴）でありうる。液相マイクロキャリアは、リポソーム、ミセル、油滴及び他の脂質又は油ベースの粒子を含む。他の好ましい液相マイクロキャリアは水中油型乳剤内部の油滴である。好ましくは、マイクロキャリアとして使用する水中油型乳剤は、スクアレンなどの生体適合性置換基を含む。液相マイクロキャリアは通常、非生分解性とみなされるが、液体マイクロキャリア製剤中に１つ以上の生分解性ポリマーを組み込むことによって生分解性液相マイクロキャリアを生産しうる。１つの好ましい実施態様では、マイクロキャリアは、水性ｐＨ緩衝液へのスクアレン、トリオレイン酸ソルビタン、ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）の乳化によって調製される水中油型乳剤中の油滴である。
【０３０３】
ＩＳＳ−マイクロキャリア複合体において使用するための固相マイクロキャリアは、生分解性材料又は非生分解性材料から作製でき、アガロース又は修飾アガロースマイクロキャリアを含でいてもよく又は除外してもよい。有用な固相生分解性マイクロキャリアは、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）及びそれらのコポリマー（ブロックコポリマーを含む）ならびにポリ（乳酸）とポリ（エチレングリコール）のブロックコポリマーなどの生分解性ポリエステル；３，９−ジエチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカン（ＤＥＴＯＳＵ）に基づくポリマーなどのポリオルトエステル；セバシン酸、ｐ−（カルボキシフェノキシ）プロパン又はｐ−（カルボキシフェノキシ）ヘキサンに基づくポリ（無水物）ポリマーなどのポリ無水物；グリシン又はアラニンなどのアミノ酸を組み込んだセバシン酸由来の（すなわちアミノ末端窒素を通してイミド結合によってセバシン酸に連結されている）モノマーに基づくポリ無水物ポリマーなどのポリ無水物イミド；ポリ無水物エステル；ポリホスファゼン、特にカルボン酸基の生成を通してポリマー骨格の分解を触媒しうる加水分解感受性エステル基を含むポリ（ホスファゼン）（Ｓｃｈａｃｈｔら（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１９９６：１０２）；及びポリ（乳酸−コ−リシン）などのポリアミドを含むが、これらに限定されない。ポリスチレン、ポリエチレン、ラテックス、金、及び強磁性又は常磁性材料を含むがこれらに限定されない、マイクロキャリアを製造するのに適した極めて多様な非生分解性材料も既知である。固相マイクロキャリアは、例えばアミン反応性架橋剤を使用した共有結合のためのアミン基の付加によって、ＩＳＳに結合するのに使用するための１つ以上の成分を組み込むように共有結合修飾しうる。
【０３０４】
ＩＳＳ−マイクロキャリア複合体は共有結合又は非共有結合のいずれで結合されていてもよい。共有結合ＩＳＳ−ＭＣ複合体は、直接結合されるか又は１個以上の原子の架橋成分（典型的には架橋剤の残基）によって結合されうる。ＩＳＳは、ＭＣへの結合を可能にする又は上昇させるように修飾されうる（例えば共有結合架橋のための遊離スルフヒドロリルの組込み又は疎水結合のための、脂質、ステロイド、コレステロールなどのステロール及びテルペンなどの疎水性成分の付加によって）が、静電的相互作用又は塩基対合（例えばＩＳＳの少なくとも一部とマイクロキャリアに結合した相補的オリゴヌクレオチドとの塩基対合によって）による非共有結合ＩＳＳ−ＭＣ複合体形成のためには非修飾ＩＳＳが使用しうる。ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、入手可能なヘテロ二官能性架橋剤（例えばアミン誘導体化マイクロキャリアと遊離スルフヒドリルを含むように修飾されたＩＳＳを共有結合するためのスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート又はそのスルホ誘導体）の使用などの当技術分野において既知の従来の手法を用いて、あるいは水中油型乳剤中の油滴などの疎水性マイクロキャリアへの結合を促進するためのコレステロールなどの化合物の添加によって（例えばＧｏｄａｒｄら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：４０４−４１０）、ＩＳＳ−ＭＣ複合体形成を促進するために固相マイクロキャリア又は他の化学成分に結合されうる。あるいは、当技術分野で既知であるような修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドは、ＩＳＳの末端又は内部位置に組み込むことができる。これらは、脱保護されたとき、マイクロキャリア又はマイクロキャリアへの結合を促進する成分上に存在しうる又はそれに結合しうる様々な官能基と反応性である、保護された官能基を含有しうる。非共有結合ＩＳＳ−ＭＣ複合体のある種の実施態様は、結合対の一方の成員がＩＳＳに結合しており、及びマイクロキャリアが結合対の他の成員で誘導体化されている（例えばビオチニル化ＩＳＳとストレプトアビジン誘導体化マイクロキャリアは結合して非共有結合ＩＳＳ−ＭＣ複合体を形成しうる）、結合対（例えば抗体とそのコグネイト抗原又はビオチンとストレプトアビジン又はアビジン）を利用する。
【０３０５】
静電結合によって結合された非共有結合ＩＳＳ−ＭＣ複合体は、典型的にはポリヌクレオチド骨格の高い負電荷を利用する。従って、非共有結合ＩＳＳ−ＭＣ複合体における使用のためのマイクロキャリアは、一般に生理的ｐＨ（例えば約ｐＨ６．８−７．４）で正に荷電している。前記マイクロキャリアは内在的に正電荷を有しうるが、通常は正電荷を持たない化合物から作られたマイクロキャリアは、正に荷電するように誘導体化しうるか又はさもなければ修飾しうる。例えば、マイクロキャリアを作製するために使用するポリマーを、第一級アミンなどの正荷電基を付加するように誘導体化しうる。あるいは、正に荷電した化合物を、製造の間にマイクロキャリアの製剤中に組み込みうる（例えば正荷電界面活性剤をポリ（乳酸）／ポリ（グリコール酸）コポリマーの製造の間に使用して、生じるマイクロキャリア粒子上に正電荷を付与しうる）。
【０３０６】
固相ミクロスフェアは、当技術分野で既知の手法を用いて作製しうる。例えば、乳剤−溶媒抽出／蒸発手法によって作製できる。一般に、この手法では、ポリ無水物、ポリ（アルキル−α−シアノアクリレート）及びポリ（α−ヒドロキシエステル）、例えばポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）及びポリ（カプロラクトン）などの生分解性ポリマーを、塩化メチレンなどの適切な有機溶媒に溶解して、乳剤の分散相（ＤＰ）を作成する。ＤＰを高速均質化によって乳化して、溶解した界面活性剤、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む過剰容量の水性連続相（ＣＰ）にする。ＣＰ中の界面活性剤は、分離した適切な大きさの乳剤滴の形成を確保するためである。次に有機溶媒をＣＰ中に抽出し、その後系の温度を上げて蒸発させる。固体のミクロ粒子を遠心分離又はろ過によって分離し、例えば凍結乾燥又は真空の適用によって乾燥した後、４℃で保存する。
【０３０７】
一般に、カチオンミクロスフェアを作製するためには、カチオン脂質又はポリマー、例えば１，２−ジオレオイル−１，２，３−トリメチルアンモンロプロパン（ＤＯＴＡＰ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）又はポリリシンを、これらの相への溶解度に応じて、ＤＰ又はＣＰのいずれかに添加する。
【０３０８】
乾燥ミクロスフェアの平均サイズ、サイズ分布及び表面電荷などの物理化学特性を測定しうる。サイズ特性は、例えば動的光散乱手法によって決定され、表面電荷はゼータ電位を測定することによって決定される。
【０３０９】
一般に、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、ＩＳＳと粒子を４℃で一晩、水中でインキュベートすることによってカチオンミクロスフェアに吸着させることができる。ミクロスフェアを、ＩＳＳ結合前と結合後に大きさ及び表面電荷に関して特徴付ける。選択バッチを、その後、ここで述べるように活性に関して評価しうる。
【０３１０】
ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、ウイルスへの接触前、接触中及び／又は接触後に投与しうる。ＩＳＳポリヌクレオチドはまた、ウイルスによる感染前、感染中及び／又は感染後に投与しうる。ＩＳＳポリヌクレオチドはまた、ウイルス感染の症状の発現前又は発現後に投与しうる。従って、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの投与は、ウイルスへの接触、ウイルスによる感染及び／又はウイルス感染による症状の発現に関して様々な時点で実施しうる。さらに、投与は１回以上でありうる。ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを多回投与する場合、ＩＳＳは、毎日、隔日、３日おき、４日おき、５日おき、６日おき、週に１回、２週間に１回、月に１回、又はさらに長い間隔（治療の経過中同じままであってもよく又は同じままでなくてもよい）などの、臨床医によって選択されるスケジュールで投与しうる。多回投与を行う場合、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の別々の投与として与えうる。必ずではないが、一般に、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの作用を可能にするには少なくとも約３日の間隔が必要である。
【０３１１】
ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドをウイルスに接触する危険度が高い（すなわち感染前）個体に投与するときは、ウイルスへの接触前約１４日以内、好ましくはウイルスへの接触前約１０日以内、より好ましくはウイルスへの接触前約７日以内、さらに一層好ましくはウイルスへの接触前約５回内にＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを投与する。一部の実施態様では、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドをウイルスへの接触の約３日前に投与する。
【０３１２】
さらなる実施態様では、ウイルスへの接触後であるが、症状の発現より前にＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを投与する。接触の時点がわかっているか又は疑われる場合は、好ましくは接触後約３日以内、より好ましくは接触後約１日以内、１２時間以内、６時間以内又は２時間以内にＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを投与する。
【０３１３】
もう１つの実施態様では、ウイルス感染の少なくとも１つの症状の発現後にＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを投与する。例えば、ウイルス感染の症状の発現後約２８、２１、１４、７、５又は３日以内にＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを投与する。しかし、症状を発現した感染個体の一部は、既に別の療法による１つ以上の治療処置を受けていることがある。そのような個体、あるいはそれらの症状の重要度を評価できなかった個体においては、感染後いかなる時点でもＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを投与しうる。
【０３１４】
さらに、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを用いる治療はまた、他の治療と組み合わせて又は「一次」治療の失敗後に使用する「二次」治療としても使用しうる。
【０３１５】
ＩＳＳポリヌクレオチドは、乾燥粉末、半固体又は液体製剤などの当技術分野で既知のいかなる形態にも製剤しうる。非経口投与のためには、ＩＳＳポリヌクレオチドは、特にＩＳＳポリヌクレオチドを徐放性デポー形態に製剤する場合は、固体又は半固体製剤も許容されうるが、好ましくは液体製剤として投与される。局所投与のためにはＩＳＳポリヌクレオチドを一般に液体又は乾燥粉末形態に製剤するが、半固体製剤も時として有用でありうる。
【０３１６】
ＩＳＳポリヌクレオチド製剤は、塩、緩衝剤、充填剤、オスモライト、抗酸化剤、洗浄剤、界面活性剤及び当技術分野で既知の他の医薬適合性の賦形剤などの付加的な成分を含有しうる。一般に、ＵＳＰ注射用蒸留水中で製造される液体ＩＳＳポリヌクレオチド製剤は、無菌、等張であり、約ｐＨ６．８−７．５のような生理的に許容されるｐＨにｐＨ緩衝される。
【０３１７】
ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、リポソーム、油／水乳剤又は徐放性デポー製剤などの送達媒体に製剤されうる。ポリヌクレオチドをそのような形態に製剤する方法は当技術分野において周知である。
【０３１８】
ＩＳＳ含有ポリヌクレオチド製剤はまた、当技術分野で周知のアジュバント及び免疫刺激性サイトカインなどの免疫調節剤を含みうるか又は排除しうる。
【０３１９】
適切な用量範囲又は有効量は、所望する症状の軽減及び／又はウイルス感染の抑制を提供する量であり、個々の呼吸器系ウイルス、ポリヌクレオチドのＩＳＳ配列、ポリヌクレオチドの分子量及び投与経路を含む多くの因子に依存する。用量は一般に、症状の重症度、患者に履歴等のような当技術分野で既知の様々なパラメータに従って医師又は他の保健医療専門家によって選択される。一般に、約２０塩基のＩＳＳ含有ポリヌクレオチドについては、用量範囲は、例えば約０．１、０．２５、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００又は５００μｍ／ｋｇなどの独立して選択される下限から、約６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００又は１０，０００μｍ／ｋｇの、下限よりも大きい、独立して選択される上限までから選択されうる。例えば、用量はおよそ以下のいずれかでありうる：０．１−１００μｍ／ｋｇ、０．１−５０μｍ／ｋｇ、０．１−２５μｍ／ｋｇ、０．１−１０μｍ／ｋｇ、１−５００μｍ／ｋｇ、１００−４００μｍ／ｋｇ、２００−３００μｍ／ｋｇ、１−１００μｍ／ｋｇ、１００−２００μｍ／ｋｇ、３００−４００μｍ／ｋｇ、４００−５００μｍ／ｋｇ、５００−１０００μｍ／ｋｇ、５００−５０００μｍ／ｋｇ、又は５００−１０，０００μｍ／ｋｇ。一般に、非経口投与経路は、長いＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの場合と同様に、感染組織へのより直接的な適用に比べてより高い用量のＩＳＳを必要としうる。
【０３２０】
ＩＳＳを含有するポリヌクレオチドは、全身（例えば非経口）又は局所（例えばトピカル）投与によって投与しうる。
【０３２１】
１つの実施態様では、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、呼吸粘膜（鼻道又は肺など）のように局所的に投与される。鼻咽道及び肺投与経路は、鼻内、吸入、経気管支及び経肺胞経路を含むが、これらに限定されない。ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、それ故、エーロゾル、噴霧状液体又は粉末の吸入によって投与しうる。ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの吸入による投与に適する装置は、ネブライザ、アトマイザ、気化器及び定量吸入器を含むが、これらに限定されない。ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを含む製剤を充填した又は前記製剤が入ったレザバーを使用するネブライザ、アトマイザ、気化器及び定量吸入器は、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの吸入送達における使用に適した多様な装置の一部である。呼吸粘膜に送達する他の方法は、点鼻薬などの液体製剤の送達を包含する。
【０３２２】
他の実施態様では、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを非経口的に投与する。非経口投与経路は、経皮、経粘膜及び直接注入を含むが、これらに限定されない。注入による非経口投与は、静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）及び皮内（ＩＤ）経路を含むがこれらに限定されない、いかなる非経口注入経路によっても実施しうる。
【０３２３】
経皮及び経粘膜投与は、例えば、担体（例えばジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ）の包含、電気インパルス（例えばイオン電気導入）又はそれらの組合せによって実施しうる。本発明に従って使用しうる経皮投与のための様々な装置が入手可能である。呼吸器ウイルスは、ＩＳＳポリヌクレオチドを送達する経路である気道の細胞に感染するので、吸入及び鼻内送達（前述）などの気道は、そのような経路を通しての送達は通常、非経口的全身投与経路とみなされるが、全身投与経路ではなく局所投与経路とみなす。
【０３２４】
ＩＶ、ＩＰ、ＩＭ及びＩＤ投与はボーラス又は持続注入投与によって実施しうる。ＳＣ投与については、投与は、ボーラス、持続注入によって、あるいは移植可能ミニポンプ（例えば浸透圧又は機械的ミニポンプ）又は徐放性移植片などの移植可能装置によって実施しうる。ＩＳＳポリヌクレオチドはまた、ＩＶ、ＩＰ、ＩＭ、ＩＤ及びＳＣ投与に適合させた徐放性製剤中でも送達されうる。吸入による投与は、好ましくは別個の用量で（例えば定量吸入器によって）実施されるが、ネブライザの使用を通して持続注入と同様の送達も実施しうる。経皮及び経粘膜経路による投与は、連続的又は拍動的でありうる。
【０３２５】
（他の薬剤）
ここで開示する方法及び組成物において使用できる他の治療薬は、Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ（Ｒｉｂａｐｈａｒｍ，Ｉｎｃ．）、Ｂ型肝炎免疫グロブリン（静脈内Ｎａｂｉ−ＨＢ、Ｎａｂｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＺＡＤＡＸＩＮ（商標）（サイモシンα１、ＳＣＶ−０７、ＳｃｉＣｌｏｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｔｈｅｒａｄｉｇｍ（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ）、抗Ｂ型肝炎超免疫製品（Ｃａｎｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ／Ｒｈｅｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、ＨＹＢ２０５５（Ｈｙｂｒｉｄｏｎ）、ＶｉｒｏＫｉｎｅ（ヒト抗ウイルスタンパク質、Ｇｅｎｅｔｒｏｌ，Ｉｎｃ．）、Ｌｅｖｏｖｉｒｉｎ（Ｒｉｂａｐｈａｒｍ，Ｉｎｃ．）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子−α、インターロイキン１−β、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ポリアデニル−ポリウリジン酸、サイモシンα、Ａｍｐｌｉｇｅｎ（登録商標）（Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｘ  ＢｉｏＰｈａｒｍｓ）、Ｐｏｌｙａｄｅｎｕｒ（商標）（ポリＡ：ポリＵ  ＲＮＡ、Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｘ  ＢｉｏＰｈａｒｍｓ）、Ｏｒａｇｅｎ（商標）（Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｘ  ＢｉｏＰｈａｒｍｓ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）（ＣｅｌｌＥｘＳｙｓ，Ｉｎｃ．）、治療用Ｂ型肝炎ワクチン（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ）、ＰＪ  Ｈｅｐ  Ｂ  ＤＮＡ予防ワクチン（Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、インターロイキン４、インターロイキン６、インターロイキン７、顆粒球コロニー刺激因子を含む。
【０３２６】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原ワクチンも、ここで開示する方法及び組成物において使用しうる。１つの実施態様では、ＦＴＣと表面抗原ワクチンなどのＢ型肝炎ウイルス抗原ワクチンを、場合によりインターフェロンなどのもう１つ別の治療薬と組み合わせて、Ｂ型肝炎ウイルス感染の治療又は予防のための有効量で組み合わせて又は交互に宿主に投与する。
【０３２７】
投与できる他のワクチンは、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）、Ｂ型肝炎ワクチン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）、ＰＪ  Ｈｅｐ  Ｂ  ＤＮＡ治療用ワクチン（Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｈｅｐａｖａｘ−Ｇｅｎｅ（登録商標）（ＤＮＡ組み換え型Ｂ型肝炎ワクチン、Ｂｅｒｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｇｒｏｕｐ）、Ｇｅｎ  Ｈ−Ｂ  Ｖａｘ（商標）（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｈｅｐａｔａｖａｘ−Ｂ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．）、Ｈｅｖａｃ  Ｂ（登録商標）（Ｐａｓｔｅｕｒ）、ＫＧＣ（登録商標）（Ｋｏｒｅａ  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｒｏｓｓ）、ＴＧＰ９４３（商標）（Ｔａｋｅｄａ  Ｃｈｅｍ，Ｊａｐａｎ）、Ｇｅｎ  Ｈｅｖａｃ  Ｂ（登録商標）（Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｂｉｏ−Ｈｅｐ−Ｂ（商標）／Ｓｃｉ−Ｂ−Ｖａｃ（商標）（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｅｎｅｒａｌ，Ｉｓｒａｅｌ）、ＡＧ−３（商標）、Ｈｅｐａｇｅｎｅ（商標）、Ｈｅｐａｃａｒｅ（商標）（Ｍｅｄｅｖａ，ＵＫ，Ｅｖａｎｓ  ＵＫ）を含む。
【０３２８】
Ｖ．遺伝子治療
本発明のもう１つの局面は、ＨＢＶを治療するために、種々の作用及び／又は相乗作用方法で、本発明のβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドと組み合わせて及び／又は交互に免疫調節剤を送達するインビボでの遺伝子治療法を使用することである。遺伝子治療法は、標的組織におけるその発現のために必要なプロモーター及び／又は他の何らかの遺伝子エレメントに作動可能に連結されうる免疫調節因子の発現を高めるための、動物、特にヒトなどの宿主への核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ）配列の導入に関する。そのような遺伝子治療及び送達手法及び方法は当技術分野において既知であり、例えば、国際公開公報第ＷＯ９０／１１０９２号、同第ＷＯ９８／１１７７９号；米国特許第５，６９３，６２２号、同第５，７０５，１５１号、同第５，５８０，８５９号；Ｔａｂａｔａ  Ｈ．ら（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９、Ｃｈａｏ  Ｊら（１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２、Ｗｏｌｆｆ  Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｂ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３（５）：４０５−４１１、Ｔｓｕｒｕｍｉ  Ｙ．ら（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４（１２）：３２８１−３２９０参照。
【０３２９】
遺伝子治療法において使用されるポリペプチドベクター構築物は、好ましくは宿主ゲノムに組み込まれず、また複製を可能にする配列も含まない構築物である。当業者に既知のいかなる強力なプロモーターも、ＤＮＡの発現を推進するために使用できる。
【０３３０】
ポリペプチド構築物は、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸等）の間質空隙への注入のような、注入可能な物質を動物の細胞に送達する何らかの方法によって送達しうる。ポリペプチド構築物は、医薬適合性の液体又は水性担体中で送達することができる。
【０３３１】
ポリペプチド構築物は、筋肉、皮膚、能、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、及び結合組織を含む、動物の体内の組織の間質空隙に送達することができる。組織の間質空隙は、間質液、器官組織の細網線維の中のムコ多糖類基質、血管壁又はチェンバー内の弾性線維、線維組織の膠原繊維、あるいは筋細胞を被鞘する結合組織内又は骨小腔内の前記と同じ基質を含む。それは、同様に循環中の血漿及びリンパチャネルのリンパ液によって占められる間隙である。ポリペプチド構築物は、注入によってこれらの細胞を含む組織内に好都合に送達されうる。それらは、好ましくは分化された持続性非分裂細胞に送達され、そこで発現されるが、送達及び発現は、例えば血液の幹細胞又は皮膚線維芽細胞のような分化されていない又はより不完全な分化細胞においても実施されうる。
【０３３２】
本発明のさらなる実施態様では、免疫調節因子を発現するように遺伝子操作された細胞をインビボで患者に投与する。そのような細胞は、患者又はＭＨＣ適合性ドナーから得ることができ、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞（例えばリンパ球）、脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞等を含みうるが、これらに限定されない。前記細胞を、組換えＤＮＡ手法を用いて免疫調節因子のポリペプチドのコード配列を導入するように遺伝子操作するか、あるいは、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、電気穿孔、リポソーム等の使用を含むがこれらに限定されない、形質導入（ウイルスベクター、好ましくは導入遺伝子を細胞ゲノムに組み込むベクターを使用する）又はトランスフェクション手法によって遺伝子操作する。免疫調節因子のコード配列を、免疫調節因子の発現、及び好ましくは分泌を達成するために強力な構成的又は誘導的プロモーターあるいはプロモーター／エンハンサーの制御下に置くことができる。免疫調節因子を発現し、及び好ましくは分泌する遺伝子操作された細胞を患者に対して全身的に、例えば循環中又は腹腔内に導入することができる。
【０３３３】
あるいは、前記細胞をマトリックスに組み込んで、体内に移植することができる、例えば遺伝子操作された内皮細胞をリンパ又は血管移植の一部として移植することができる。（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号；及びＭｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｗｉｌｓｏｎ，米国特許第５，４６０，９５９号参照）。
【０３３４】
投与する細胞が非自己由来又は非ＭＨＣ適合性細胞であるときは、導入細胞に対する宿主の免疫応答の発現を予防する周知の手法を用いて投与することができる。例えば、直接細胞外環境との成分交換を許容しながら、導入細胞が宿主免疫系によって認識されないようにする、被包された形態で細胞を導入しうる。
【０３３５】
免疫調節因子の発現のための核酸、その遺伝子又は遺伝子フラグメントを含む感染性ウイルス粒子で形質導入しうる真核細胞は、白血球、顆粒球、単球、マクロファージ、リンパ球（Ｔリンパ球及びＢリンパ球を含む）、全能幹細胞、及び腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ細胞）などの一次有核血液細胞；骨髄細胞；内皮細胞；上皮細胞；ケラチノサイト；幹細胞；幹細胞前駆細胞を含む幹細胞；線維芽細胞；間葉細胞；及び実質細胞などの一次細胞を含むが、これらに限定されない。
【０３３６】
１つの実施態様では、前記細胞を、細胞がその部位で治療薬として機能する特定部位に標的しうる。あるいは、前記細胞は特定部位に標的されない細胞でもよく、そのような細胞は全身性治療薬として機能する。
【０３３７】
形質導入は、例えば、患者から採取し、培養で増殖させた血液細胞などの宿主細胞に、免疫調節因子をコードする遺伝子を含む本発明に従った感染性ウイルス粒子を導入することにより、ＨＢＶの治療において使用しうる。細胞は、所望遺伝子を含む感染性ウイルス粒子による形質導入の前又は後に数を増大させうる。それ故、前記手順は、患者への注入後、形質転換細胞が患者の体内で免疫調節因子を生産するように実施される。
【０３３８】
形質導入細胞によって担持される遺伝子又は核酸は、特に免疫調節因子についての配列を含むが、前記細胞の治療効果を直接又は間接的に増強するいかなる配列も含みうる。形質導入細胞によって担持される遺伝子はまた、血友病の治療において有用な凝固因子をコードする遺伝子などの、その形質導入細胞が通常は有していない治療効果を及ぼすことを可能にする配列を含みうる。前記遺伝子は、治療効果を有する１つ以上の生成物をコードしうる。適切な遺伝子又は核酸の例は、ＴＮＦ、インターロイキン（インターロイキン１−１４）、インターフェロン（α、β、γ−インターフェロン）などのサイトカイン、Ｔ細胞受容体タンパク質及び免疫グロブリンのような抗体の抗原結合ドメインについてのＦｃ受容体をコードするものを含む。適切な遺伝子の付加的な例は、細胞が通常は「標的」しない体内の部位を「標的」するように細胞を修飾し、それによってその部位で細胞の治療特性を利用することを可能にする遺伝子を含む。例えば、ＴＩＬ細胞などの血液細胞を、例えば、細胞が選択抗原を認識することを可能にする、モノクローナル抗体のＦａｂ部分を細胞に導入することによって修飾できる。
【０３３９】
「ベクター」として知られる担体を用いて核酸を細胞に送達することが典型的であるが、必ずしもその必要はない。遺伝子治療において使用されるベクターの最も一般的な種類はウイルスである。ウイルスは細胞のＤＮＡに入り込むという独特の能力を有しているため、科学者達はウイルスを使用する。遺伝子治療におけるベクターとして使用されるウイルスは遺伝的に不能化される；それらは自ら増殖することができない。ほとんどの遺伝子治療の臨床試験は、所望遺伝子を送達するためにマウスレトロウイルスに頼る。ベクターとして使用される他のウイルスは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ポックスウイルス及びヘルペスウイルスを含む。
【０３４０】
例えば、患者から細胞を採取し、実験室で増殖させる。所望遺伝子を運搬するウイルスに細胞を接触させる。ウイルスは細胞に入り込み、所望遺伝子は細胞のＤＮＡの一部となる。細胞を実験室で増殖させ、その後患者の体内に戻す。この種の遺伝子治療は、「身体の外側」を意味する、エクスビボと呼ばれる。細胞は患者の身体の外側にありながら、遺伝子は患者の細胞内に移入される。他の試験では、ベクター又はリポソーム（脂肪粒子）を使用して所望遺伝子を患者の体内に送達する。この形態の遺伝子治療は、遺伝子が患者の体内で細胞に移入されるので、インビボと呼ばれる。
【０３４１】
遺伝子を体内に運搬するためにウイルスベクターを使用するとき、それらは意図する細胞よりも多くの細胞を変化させうる。もう１つの危険性は、その新しい遺伝子がＤＮＡ内の誤った位置に挿入されて、癌又は他の損傷を引き起こす可能性があることである。さらに、ＤＮＡを直接注入するとき又はリポソーム送達系を使用するとき、そのＤＮＡが生殖細胞に導入されて、遺伝性変化を生じさせる可能性がある。
【０３４２】
他の懸念は、移入された遺伝子が「過剰発現」されて、有害なほど多くの失われたタンパク質を生じうること；ウイルスベクターが炎症又は免疫反応を引き起こしうること；及びウイルスが患者から他の個体へ又は環境中へと伝播されうることの可能性を包含する。
【０３４３】
当技術分野で既知の多くのベクターが存在する。いかなる既知のベクターも本発明において使用できる。本発明の好ましい実施態様では、ベクターは、特定遺伝子送達のために特定細胞型を標的することができる。
【０３４４】
（アデノウイルスベクター）
いずれのアデノウイルスベクターも、免疫調節因子を発現及び／又は分泌するように細胞及び／又は細胞系をトランスフェクトするために使用できる。アデノウイルスは、線状二本鎖ＤＮＡゲノムを含む、エンベロープを持たないウイルスである。４０以上の血清型株のアデノウイルスが存在し、その大部分はヒトにおいて良性気道感染を引き起こすが、サブグループＣの血清型２又は５が主としてベクターとして使用される。その生活環は通常宿主ゲノムへの組込みを含まず、むしろ宿主細胞の核内でエピソームエレメントして複製し、その結果として挿入突然変異の危険性がない。野生型アデノウイルスゲノムは約３５ｋｂで、そのうち３０ｋｂまでが外来性ＤＮＡで置換されうる（Ｓｍｉｔｈ，１９９５、ＶｅｒｍａとＳｏｍｉａ，１９９７）。調節機能を有する４つの初期転写単位（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４）、及び構造タンパク質をコードする１個の後期転写産物が存在する。前駆ベクターは、Ｅ１又はＥ３遺伝子が不活性化されており、この欠失遺伝子はヘルパーウイルス、プラスミドによってトランスで供給されるか又はヘルパー細胞ゲノム中に組み込まれている（ヒト胚腎細胞、２９３系統、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，Ｓｍｉｌｅｙ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗ．Ｌ．及びＮａｉｍ，Ｒ．（１９９７）Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３６：５９−７２）。第二世代ベクターは、Ｅ２ａ温度感受性突然変異体（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｆ．，Ｌｉｔｓｋｙ，Ｌ．及びＷｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：１２１７−１２２９）又はＥ４欠失（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ，Ｄ．，Ｚａｂｎｅｒ，Ｊ．ら（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：２３０８−２４１６）をさらに使用する。最も新しい「ｇｕｔｌｅｓｓ」ベクターは、すべてヘルパーウイルスによってトランスで供給される必要なウイルス遺伝子である、逆方向末端反復配列（ＩＴＲｓ）及び導入遺伝子付近のパッケージング配列だけを含む（Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｍａｃｋ，Ｌ．Ｍ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｒ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１６４５−１６５０）。
【０３４５】
アデノウイルスベクターは、インビトロ及びインビボで標的細胞に形質導入する上で非常に効率的であり、高い力価（＞１０１１／ｍＬ）で生産できる。Ｅ１欠失ベクターを用いてラット脳において長期的な導入遺伝子発現を示したＧｅｄｄｅｓ，Ｂ．Ｊ．，Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｔ．Ｃ．，Ｌｉｇｈｔｍａｎ，Ｓ．Ｌ．及びＵｎｅｙ，Ｊ．Ｂ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：１４０２−１４０４）を除いて、前駆ベクターからのインビボでの導入遺伝子発現は一過性の傾向がある（Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．とＳｏｍｉａ，Ｎ．（１９９７）Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ−ｐｒｏｍｉｓｅｓ，ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：２３９−２４２）。静脈内注入後、投与したベクターの９０％が非免疫仲介機構によって肝臓で分解される（Ｗｏｒｇａｌｌ，Ｓ．，Ｗｏｌｆｆ，Ｇ．，Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｅ．及びＣｒｙｓｔａｌ  Ｒ．Ｇ．（１９９７）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：３７−４４）。その後、ウイルス感染細胞を排除するＣＤ８＋ＣＴＬ及び抗アデノウイルス抗体を生じさせるＩＦＮ−αを分泌するＣＤ４＋細胞を使用して、ＭＨＣクラスＩ制限免疫応答が起こる（Ｙａｎｇ，Ｙ．とＷｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５：２５６４−２５６９）。アデノウイルスベクターの変化は一部のＣＴＬエピトープを除去しうるが、認識されるエピトープは宿主のＭＨＣハプロタイプとは異なる（Ｓｐａｒｅｒ，Ｔ．Ｅ．，Ｗｙｎｎ，Ｓ．Ｇ．，Ｃｌａｒｋｅｔら（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：２２７７−２２８４．Ｊｏｏｓｓ，Ｋ．，Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．Ｊ．及びＷｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：２９４５−２９５４）。破壊されない細胞中の残りのベクターは、それらのプロモーターが不活性化されており（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ，Ｄ．，Ｚａｂｎｅｒ，Ｊ．ら（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：２３０８−２４１６）、残存する抗体がその後のベクターの投与を妨げる。
【０３４６】
一時的免疫抑制治療を含む免疫応答を回避するためのアプローチは、導入遺伝子の発現を延長させ、二次的遺伝子移入を達成することによって成功を収めた（Ｊｏｓｓ，Ｋ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．及びＷｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１５５５−１５６６；Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．，Ｍｅｕｓｅ，Ｌ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：４６８６−４６９１）。より介入性の低い方法は、宿主に紫外線不活性化ベクターを供給することによって経口耐性を誘導することであった（Ｋａｇａｍｉ，Ｈ．，Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９８）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：３０５−３１３）。しかし、宿主ではなくベクターを操作することが望ましい。複製欠損ベクターだけが使用されても、免疫系に提示される非常に低いレベルでウイルスタンパク質が発現される。最終的にウイルスコード配列を全く含まない「ｇｕｔｌｅｓｓ」ベクターに至る、より少ない遺伝子を含むベクターの開発は、肝組織における長期的なインビボでの導入遺伝子発現をもたらした（Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒ，Ｇ．，Ｍｏｒｒａｌ，Ｎ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８：１８０−１８３）。その大部分が分解されて免疫系に提示されることになる、アデノウイルスタンパク質内にパッケージングされた多量のＤＮＡの初期送達は、臨床試験のためにはまだ問題を引き起こす可能性がある。さらに、ヒト個体群はＭＨＣハプロタイプに関して不均質であり、個体群の一部は既にアデノウイルス株に接触している（Ｇａｈｒｙ−Ｓｄａｒｄ，Ｈ．，Ｍｏｌｉｎｉｅｒ−Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｖ．ら（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １００：２２１８−２２２６）。
【０３４７】
最近まで、アデノウイルスが宿主を標的する機序はよく理解されていなかった。組織特異的発現は、それ故、細胞プロモーター／エンハンサー、例えばミオシン軽鎖１プロモーター（Ｓｈｉ，Ｑ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．及びＷｏｒｔｏｎ，Ｒ．（１９９７）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：４０３−４１０）及び平滑筋ＳＭ２２ａプロモーター（Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｌｉｎ，Ｈ．ら（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １００：１００６−１０１４）を使用することによって、又は局所領域への直接送達（Ｒｏｍｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｓｈａｙａｎｉ，Ｖ．ら（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：１２４９−１２５８）によってのみ可能であった。アデノウイルス粒子の取り込みは、アデノウイルス内の線維コートタンパク質とＭＨＣクラスＩ分子（Ｈｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｋａｒａｙａｎ，Ｌ．ら（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６：２２９４−２３０６）及びコクサッキーウイルス−アデノウイルス受容体（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｊ．Ａ．ら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１３２０−１３２３）を包含する細胞受容体との初期相互作用を含む２段階工程であることが示された。アデノウイルス粒子のペントンベースタンパク質は、次に、受容体を介したエンドサイトーシスによるインターナリゼーションを可能にする、細胞表面ヘテロダイマーのインテグリンファミリーに結合する（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．，Ｍａｔｈｉａｓ，Ｐ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９）。大部分の細胞がアデノウイルス線維コートタンパク質についての一次受容体を発現するが、インターナリゼーションはより選択である（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｄ．とＬｅｍｏｉｎｅ，Ｎ．Ｒ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：４００−４０４）。ウイルスの取り込みを高める方法は、適切なインテグリンを発現するように標的細胞を刺激すること（Ｄａｖｉｓｏｎ，Ｅ．，Ｄｉａｚ，Ｒ．Ｍ．ら（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６２０４−６２０７）及び標的細胞型に特異性を有する抗体をアデノウイルスに複合すること（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｇ．Ｍ．ら（１９９７ｂ）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：７６６３−７６６９；Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｃ．Ｋ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｂ．Ｅ．ら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７：１４４７−１４５１）を含む。抗体の使用は、しかしながら、ベクターの生産の困難さ及び補体系を活性化する潜在的な危険性を上昇させる。受容体結合モチーフを線維コートタンパク質に組み込むことにより、Ｗｉｃｋｈａｍら（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．，Ｔｚｅｎｇ，Ｅ．ｒａ（１９９７ａ）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：８２２１−８２２９）は、損傷した内皮又は平滑筋細胞によって発現されるインテグリン又は多くの細胞型によって発現される硫酸ヘパリン受容体に結合するようウイルスに再指令することができた。
【０３４８】
いずれのアデノ関連ウイルスベクターも、免疫調節因子を発現及び／又は分泌するように細胞及び／又は細胞系統をトランスフェクトするために使用できる。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、ヘルパーウイルス、通常はアデノウイルスに依存して増殖する、非病原性ヒトパルボウイルスである。それらは、分裂及び非分裂細胞の両方に感染することができ、ヘルパーウイルスが存在しない場合は高い頻度で宿主ゲノムの特定位置（１９ｑ  １３−ｑｔｅｒ）に組み込まれる（Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｉｎｉｓｃａｌｃｏ，Ｍ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２１１−２２１５）。野生型ゲノムは、２個の遺伝子：ウイルス複製、構造遺伝子発現及び宿主ゲノムへの組込みを制御するタンパク質をコードするｒｅｐ、及びカプシド構造タンパク質をコードするｃａｐから成る一本鎖ＤＮＡ分子である。ゲノムのいずれかの末端にプロモーターを含む１４５ｂｐの末端反復配列（ＴＲ）が存在する。
【０３４９】
ベクターとして使用するとき、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は導入遺伝子及びその関連調節配列によって置換される。挿入物の全長は、野生型ゲノムの長さである４．７ｋｂを大きく超えることはできない（Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．（１９９５）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４９：８０７−８３８）。組換えベクターの生産は、ｒｅｐ及びｃａｐが、ヘルパーウイルス遺伝子産物（アデノウイルスゲノムからのＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４及びＶＡ  ＲＮＡ）と共に、トランスで提供されることを必要とする。従来の方法は、２個のプラスミド、すなわちベクターについての１個とｒｅｐ及びｃａｐについてのもう１個のプラスミドを、アデノウイルスに感染した２９３細胞にコトランスフェクトすることである（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｈａｎｇｅ，Ｌ．及びＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６３：３８２２−３８２８）。この方法は、しかしながら、面倒であり、収率が低く（＜１０４粒子／ｍｌ）、アデノウイルス及び野生型ＡＶＶによる汚染を生じやすい。低い収率の理由の１つは、アデノウイルス複製に対するｒｅｐ遺伝子産物の阻害作用である（Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｋ．Ａ．，Ｐｉｒａｉｎｏ，Ｓ．Ｔ．及びＷａｄｓｗｏｒｔｈ，Ｓ．Ｃ．（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：１８９７−１９０５）。より最近のプロトコールは、すべてのアデノウイルス構造遺伝子を除去し、ｒｅｐ耐性プラスミドを使用するか（Ｘｉａｏ，Ｘ．，Ｌｉ，Ｊ．及びＳａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：２２２４−２２３２）又は感染の前にｒｅｐ発現プラスミドを成熟ウイルスと組合わせ（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｋ．Ｊ．，Ｋｅｌｌｅｙ，Ｗ．Ｍ．，Ｂｕｒｄａ，Ｊ．Ｆ．及びＷｉｌｏｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：２０７９−２０８７）。
【０３５０】
ｒｅｐが存在しない場合は、ひとたび末端反復配列がわずかでも分解すれば、ＡＡＶベクターは、単一プロウイルスとして又は頭部から尾部までのコンカテマーとして、アトランダムにしか組み込まれない（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ，Ｅ．Ａ．及びＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：８４２９−８４３６）。ＡＡＶベクターへの関心は、長期的な導入遺伝子発現を可能にする、宿主ゲノムへのそれらの組込みによるものであった。血管上皮細胞（Ｍａｅｄａ，Ｙ．，Ｉｋｅｄａ，Ｕ．ら（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３５：５１４−５２１）、横紋筋（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｋ．Ｊ．，Ｊｏｏｓｓ，Ｋ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：３０６−３１６；Ｈｅｒｚｏｇ，Ｒ．Ｗ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：５８０４−５８０９）及び肝細胞（Ｓｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｏ．，Ｍｉａｏ，Ｃ．Ｈ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：２７０−２７５）への遺伝子導入が、導入遺伝子が異なる種に由来しないときは長期的な発現を伴うと、報告されている。ＡＡＶカプシドに対する中和抗体は検出可能でありうるが、ベクターの再投与を妨げず、プロモーター活性を遮断しない。免疫応答がそのように沈黙するのは、おそらくウイルスカプシドの単純さによるものである。ＡＡＶ抗体はヒト個体群に存在するので、これはさらに検討が必要である。限局ベクター送達による以外に特定細胞型を標的とする試みは為されていない。
【０３５１】
特に、参照してここに組み込まれる、米国特許第５，６９３，５３１号に開示されている、ＡＡＶｐ５ｎｅｏ；ｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ；ＴＲＦ１６９；ＬＺ１１；ｐＳＰ７２；ｐＳＰ７２ｎＬａｃＺ；ｐＡｄＲＳＶ４；ｐＡｄＲＳＶｎＬａｃＺ；ＡＡＶｒｎＬａｃ；ＳＶ４０；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ；ｐＳＶ４０ｏｒｉＡＡＶ１；及びｐＫＭＴ１１を含むアデノ関連ベクターが使用できる。
【０３５２】
（レトロウイルスベクター）
いずれのレトロウイルスベクターも、免疫調節因子を発現及び／又は分泌するように細胞及び／又は細胞系をトランスフェクトするために使用できる。レトロウイルスは、一本鎖ＲＮＡ分子をゲノムとして含むエンベロープで被包されたウイルスのクラスである。感染後、ウイルスゲノムは二本鎖ＤＮＡへと逆転写されて、そのＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれ、タンパク質として発現される。ウイルスゲノムは約１０ｋｂであり、少なくとも３つの遺伝子：ｇａｇ（コアタンパク質をコードする）、ｐｏｌ（逆転写酵素をコードする）及びｅｎｖ（ウイルスエンベロープタンパク質をコードする）を含む。ゲノムの各々の末端に、プロモーター／エンハンサー領域及び組込みに関わる配列を含むロングターミナルリピート（ＬＴＲ）が存在する。それに加えて、ｅｎｖ遺伝子にウイルスＤＮＡ（ｐｓｉ）及びＲＮＡスプライシング部位をパッケージングするために必要な配列が存在する。一部のレトロウイルスは、突然変異したとき癌を引き起こしうる癌原遺伝子を含むが、ベクターの生産においてはこれらは除去される。レトロウイルスはまた、細胞癌原遺伝子の近くに組み込まれて、ＬＴＲからの不適切な発現を推進することによって、又は腫瘍抑制遺伝子を破壊することによって、細胞を形質転換することができる。挿入突然変異誘発と称されるこの事象は、極めてまれではあるが、やはりレトロウイルスをベクターとして使用するときには起こりうる。
【０３５３】
レトロウイルスベクターは、最も頻繁には、マウスモデルにおけるベクター発現を可能にするマウス細胞及びヒト治療を可能にするヒト細胞の両方に感染することができる両栄養性ウイルスである、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）に基づく。そのウイルス遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）は、対象導入遺伝子で置換され、パッケージング細胞系においてプラスミド上で発現される。可欠遺伝子はパッケージング配列（ｐｓｉ）を持たないので、それらはビリオン粒子には含まれない。複製コンピテントレトロウイルスを生じさせる組換えを予防するために、ベクター骨格と相同なすべての領域を除去すべきであり、可欠遺伝子を少なくとも２つの転写単位によって発現させるべきである（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｄ．，Ｇｏｆｆ，Ｓ．及びＢａｎｋ，Ａ．（１９８８）Ａ  ｓａｆｅ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｏｎ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６２：１１２０−１１２４）。そのようにした場合でも、複製コンピテントレトロウイルスは低い頻度で発生する。
【０３５４】
必須領域は、５’及び３’ＬＴＲ、及び５’ＬＴＲの下流に位置するパッケージング配列を含む。導入遺伝子発現は、５’ＬＴＲ内のプロモーター／エンハンサー領域によって、あるいは選択的ウイルス（例えばサイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス）又は細胞（例えばβアクチン、チロシン）プロモーターによって推進されうる。突然変異分析は、ｇａｇコード配列全体及びそのすぐ上流領域までが、ウイルスのパッケージング又は導入遺伝子発現に影響を及ぼすことなく除去できることを示した（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．，Ｙｕ，Ｓ．Ｓ．ら（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：９９４−１００４）。しかし、導入遺伝子開始コドンの正確な位置づけ及び５’ＬＴＲの小さな変化が導入遺伝子発現に影響する（Ｒｉｖｉｒｅ，Ｉ．，Ｂｒｏｓｅ，Ｋ．及びＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．（１９９５）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：６７３３−６７３７）。形質転換細胞の特定を助けるため、ネオマイシン及びβガラクトシダーゼなどの選択マーカーを含めることができ、また内部リボソーム部位の付加によって導入遺伝子発現を改善することができる（Ｓａｌｅｈ，Ｍ．（１９９７）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：９７９−９８３）。レトロウイルスベクターの使用可能な運搬能力は約７．５ｋｂであり（Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．及びＳｏｍｉａ，Ｎ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：２３９−２４２）、ｃＤＮＡを使用する場合でも、一部の遺伝子については小さすぎる。
【０３５５】
レトロウイルスエンベロープは、標的細胞範囲を決定する特定細胞タンパク質と相互作用する。ｅｎｖ遺伝子又はその産物を変化させることは、細胞範囲を成功裏に操作する手段であることが明らかになった。アプローチにはエンベロープタンパク質と細胞受容体間の結合部位の直接修飾が含まれたが、これらのアプローチはその後のウイルス粒子のインターナリゼーションに干渉する傾向がある（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｄ．及びＬｅｍｏｉｎｅ，Ｎ．Ｒ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：４００−４０４）。ｅｎｖ遺伝子の一部をエリスロポエチンタンパク質（ＥＰＯ）からの１５０コドンで置換することにより、Ｋａｓａｈａｒａら（Ｋａｓａｈａｒａ，Ｎ．，Ｄｏｚｙ，Ａ．Ｍ．及びＫａｎ，Ｙ．Ｗ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１３７４−１３７６）は、ＥＰＯ受容対担持細胞を高い親和性で標的することができた。ストレプトアビジン架橋によって二次細胞特異的抗体に親和性を有するウイルス粒子にある抗体を連結することはウイルスの取り込みを改善するが、インターナリゼーションはウイルス分解へと導く傾向がある（Ｒｏｕｘ，Ｐ．，Ｊｅａｎｔｅｕｒ，Ｐ．及びＰｉｅｃｈａｃｚｙｋ，Ｍ．（１９８９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８６：９０７９−９０８３）。Ｎｅｄａら（Ｎｅｄａ，Ｈ．，Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．及びＷｕ，Ｇ．Ｙ．（１９９１）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６６：１４１４３−１４１４６）は、ウイルス粒子をラクトースで処理して、アシアロ糖タンパク質受容体を発現する細胞、主として肝細胞による取り込みを生じさせた。その後、おそらくエンドソーム膜とウイルスエンベロープの融合を可能にするエンドソームの酸性化のゆえに、効率的なウイルス導入遺伝子の発現が起こった。
【０３５６】
ウイルスはそれらの親和性が異なっており、それ故、シュードタイピングとして知られる手法で、ｅｎｖ遺伝子をもう１つ別のものに置き換えることによって宿主範囲を拡大することができる。水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質が、やはり超遠心分離によって精製したときより安定である、Ｍｏ−ＭＬＶ由来のベクター（Ｂｕｒｎｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｔ．ら（１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６５：２８５−２８９）に含められた。最近では、Ｑｉｎｇ（Ｑｉｎｇ，Ｋ．，Ｂａｃｈｅｌｏｔ，Ｔ．，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｐ．ら（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：５６６３−５６６７）は、最初にレトロウイルスエンベロープタンパク質についての細胞受容体を発現するアデノ関連ベクター（以下で論じる）でレシピエント細胞を処理することにより、数多くの細胞系への形質導入を改善した。
【０３５７】
レトロウイルスの組込み及びウイルス遺伝子の発現のための必要条件は、標的細胞が分裂中でなければならないことである。これは、遺伝子治療を、細胞を身体から取り出し、複製を刺激するように処理して、レトロウイルスベクターで形質導入した後、患者にもどす、インビボ又はエクスビボでの増殖細胞に限定する。エクスビボ細胞は、より高いウイルス力価及び増殖因子への暴露の故に、より効率的に形質導入することができる（Ｇｌｉｍｍ，Ｈ．，Ｋｉｅｍ，Ｈ．Ｐ．ら（１９９７）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：２０７９−２０８６）。さらに、エクスビボで処理した腫瘍細胞は、腫瘍塊に結合して、殺腫瘍作用を指令することができる（Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，Ｅ．Ｈ．及びＲａｍ，Ｚ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：５５−８５；Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ，Ｚ．，Ｗｅｌｔｚ，Ｃ．ら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  ８０：４０１−４１２）。
【０３５８】
レンチウイルスは、増殖及び非増殖細胞の両方に感染することができるレトロウイルスのサブクラスである。それらは、単純なレトロウイルスよりもかなり複雑であり、さらに６個のタンパク質、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ及びｖｉｆを含む。現在のパッケージング細胞系統は、シュードタイプｅｎｖ遺伝子、導入遺伝子構築物、及び構造及び調節遺伝子をトランスで供給するパッケージング構築物について別々のプラスミドを有する（Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．，Ｂｌｍｅｒ，Ｕ．ら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−２６７）。マーカー遺伝子を用いた初期の結果は有望であり、筋肉、肝臓及び神経組織において長期的なインビボ発現を示した（Ｂｌｍｅｒ，Ｕ．，Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．ら（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６６４１−６６４９；Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｈ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．，Ｇａｇｅ，Ｆ．Ｈ．及びＶｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１０３１９−１０３２３；Ｋａｆｒｉ，Ｔ．，Ｂｌｍｅｒ，Ｕ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７：３１４−３１７）。興味深いことに、導入遺伝子は、ＭｏＭＬＶベクターにおけるときと異なり、不活性化されない、内部で構築されるサイトメガロウイルスプローモーターによって推進される。これは、食塩水対照と等しい程度であった、ベクター注入に対する限られた免疫応答によるものであると考えられる（Ｂｌｍｅｒ，Ｕ．，Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．，Ｋａｆｒｉ，Ｔ．，Ｔｒｏｎｏ，Ｄ．，Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．及びＧａｇｅ，Ｆ．Ｈ．（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６６４１−６６４９）。
【０３５９】
使用するレンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）から誘導され、可欠調節遺伝子の一部を除去するために、安全性に関して評価されつつある。ｖｐｒ及びｖｉｆの突然変異体は、低い効率でニューロンに感染することができるが、筋又は肝細胞には感染することができない（Ｂｌｍｅｒ，Ｕ．，Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．，Ｋａｆｒｉ，Ｔ．，Ｔｒｏｎｏ，Ｄ．，Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．及びＧａｇｅ，Ｆ．Ｈ．（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６６４１−６６４９；Ｋａｆｒｉ，Ｔ．，Ｂｌｍｅｒ，Ｕ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７：３１４−３１７）。
【０３６０】
特定実施態様では、レトロウイルスベクターｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ、ｐＬＸＳＨ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＡＰＳＮ、ｐＦＢ及びｐＦＢ−Ｎｅｏを使用する。
【０３６１】
（単純ヘルペスウイルスベクター）
いずれの単純ヘルペスウイルスベクターも、免疫調節因子を発現及び／又は分泌するように細胞及び／又は細胞系をトランスフェクトするために使用できる。単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）はヒト神経親和性ウイルスであり、その結果として、ＨＳＶ−１を神経系への遺伝子導入のためのベクターとして使用することが主たる関心の対象となってきた。野生型ＨＳＶ−１ウイルスはニューロンに感染することができ、溶解生活環へと進むか又は潜伏状態で核内エピソームとして存続する。潜伏感染ニューロンは正常に機能し、免疫系によって拒絶されない。潜伏ウイルスは、転写的にはほとんど沈黙しているが、潜伏期の間機能することができるニューロン特異的プロモーターを有する。ＨＳＶ−１に対する抗体はヒト個体群において一般的であるが、脳炎などのヘルペス感染による合併症は非常にまれである。
【０３６２】
前記ウイルスゲノムは、１５２ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡ分子である。内部反復配列（ＩＲＬ及びＩＲＳ）によっていずれかの方向に連結される、長と短の２つのユニーク領域（ＵＬ及びＵＳと称される）が存在する。ユニーク領域の非リンカー末端に末端反復配列が存在する（ＴＲＬ及びＴＲＳ）。８１個までの遺伝子が存在し（Ｍａｒｃｏｎｉ，Ｐ．，Ｋｒｉｓｋｙ，Ｄ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１１３１９−１１３２０）、その約半分は細胞培養における増殖にとって必須ではない。ひとたびこれらの可欠遺伝子が欠失すれば、４０−５０ｋｂの外来性ＤＮＡがウイルス内におさまることができる（Ｇｌｏｒｉｏｓｏ，Ｊ．Ｃ．，ＤｅＬｕｃａ，Ｎ．Ａ．及びＦｉｎｋ，Ｄ．Ｊ．（１９９５）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４９：６７５−７１０）。ＨＳＶ−１遺伝子の３つの主要なクラスが特定されており、すなわち前初期（ＩＥ又はα）遺伝子、初期（Ｅ又はβ）遺伝子及び後期（Ｌ又はγ）遺伝子である。
【０３６３】
感受性細胞における感染後、溶解複製は遺伝子転写の一時的統合配列によって調節される。Ｖｍｗ６５（外皮構造タンパク質）は、初期遺伝子の産生を可能にするトランス活性化因子である前初期遺伝子（ＩＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ４７７）を活性化する。初期遺伝子は、ヌクレオチド代謝及びＤＮＡ複製についての遺伝子をコードする。周期全体は１０時間以内であり、常に細胞死をもたらす。
【０３６４】
潜伏の確立を導く分子事象は完全には解明されていない。潜伏期の遺伝子発現は、ゲノムＩＲＬ領域に位置する潜伏関連転写産物（ＬＡＴ）によって推進される。２個のＬＡＴ（２．０及び１．５ｋｂ）がＩＥ遺伝子ＩＣＰ０と反対方向に転写される。ＬＡＴは、潜伏からのＨＳＶ−１再活性化（Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｉ．，Ｓｐｉｖａｃｋ，Ｊ．Ｇ．ら（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８：５０５−５１１）及び潜伏の確立（Ｓａｗｔｅｌｌ，Ｎ．Ｍ．及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６６：２１５７−２１６９）において役割を果たす。ＬＡＴの発現を推進する２つの潜伏期活性プロモーターが特定されており（Ｍａｒｃｏｎｉ，Ｐ．，Ｋｒｉｓｋｙ，Ｄ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９３：１１３１９−１１３２０）、ベクター導入遺伝子発現のために有効であると考えられる。
【０３６５】
ＨＳＶ−１ベクターの生産のために２つの基本的アプローチ、すなわちアンプリコン及び組換えＨＳＶ−１ウイルスが使用されてきた。アンプリコンは、ｃｏｌ  Ｅ１  ｏｒｉ（大腸菌複製起点）、ＯｒｉＳ（ＨＳＶ−１複製起点）、ＨＳＶ−１パッケージング配列、前初期プロモーターの制御下の導入遺伝子及び選択マーカーを含む、細菌によって生産されるプラスミドである（Ｆｅｄｅｒｏｆｆ，Ｈ．Ｊ．，Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，Ｍ．Ｄ．，Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．及びＫｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ａ．（１９９２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８９：１６３６−１６４０）。アンプリコンを、欠失しているすべての構造及び調節遺伝子をトランスで提供するヘルパーウイルス（温度感受性突然変異株）を含む細胞系統にトランスフェクトする。ヘルパー及びウイルス粒子を含むアンプリコンの両方をレシピエントに送達する。より新しいアンプリコンは、プラスミドエピソームの維持のためにエプスタイン−バーウイルス由来配列を含む（Ｗａｎｇ，Ｓ．とＶｏｓ，Ｊ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０：８４２２−８４３０）。
【０３６６】
組換えウイルスは、トランスで提供される前初期遺伝子の１個、例えばＩＣＰ４の欠失によって複製欠損となる。それらは病原性が低く、脳組織における導入遺伝子発現を指令することができるが、培養中のニューロンに対しては毒性である（Ｍａｒｃｏｎｉ，Ｐ．，Ｋｒｉｓｋｙ，Ｄ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９３：１１３１９−１１３２０）。多くの前初期遺伝子の欠失は細胞毒性を実質的に低下させ、また野生型潜伏ウイルスでは沈黙するプロモーターからの発現を可能にする。これらのプロモーターは、長期的遺伝子発現を指令する上で有用でありうる。
【０３６７】
条件的複製突然変異株は、ある種の細胞系統においてのみ複製することができる。許容細胞系統はすべて、増殖中であり、ウイルス欠損を補う細胞酵素を供給するものである。突然変異株は、チミジンキナーゼ（Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．，Ｎａｅｇｅｌｅ，Ｊ．Ｒ．，ＯＭａｌｌｅｙ，Ｋ．Ｌ．及びＧｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１３９９−１４０３）、リボヌクレアーゼレダクターゼ（Ｋｒａｍｍ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｈａｓｅ，Ｍ．ら（１９９７）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：２０５７−２０６８）、ＵＴＰアーゼ、又は神経毒性因子ｇ３４．５（Ｋｅｓａｒｉ，Ｓ．，Ｒａｎｄａｚｚｏ，Ｂ．Ｐ．ら（１９９５）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ７３：６３６−６４８）を含む。
【０３６８】
（非ウイルスベクター）
ウイルスベクターはすべてある程度の免疫学的応答を誘導し、安全上の危険性（挿入突然変異誘発及び毒性の問題など）を有しうる。さらに、それらの容量は限られており、大規模生産は実施が困難でありうる。それ故、本発明の１つの実施態様では、製薬手法を使用して、ごくわずかなタンパク質しか必要とせず、実質上無限の容量を有し、感染又は突然変異誘発の可能性がなく、大規模生産が可能な、遺伝子導入の非ウイルス法を使用する。非ウイルスＤＮＡ導入の３つの方法、すなわち裸のＤＮＡ、リポソーム及び分子コンジュゲートが存在する。
【０３６９】
（裸の核酸）
裸のＤＮＡ又は核酸は、免疫調節剤を宿主に送達するために使用できる。例えば、プラスミドの形態で筋細胞に直接注入するか（Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，Ｍａｌｏｎｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．，Ｃｈｏｎｇ，Ｗ．，Ａｃｓａｄｉ，Ｇ．，Ｊａｎｉ，Ａ．及びＦｅｌｇｎｅｒ  Ｐ．Ｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８）又は金粒子に付着させて組織中に撃ち込む（Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．，Ｚｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒ，Ｐ．Ｒ．及びＹａｎｇ，Ｎ．Ｓ．（１９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４４５５−４４５９）ことによって送達できる。「裸の」核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡの語は、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン又は沈殿剤等を含む、細胞への侵入を助ける、促進する又は容易にするように働くいかなる送達媒体も持たない配列を指す。非常に効率的ではあるが、これは、インビボでは長期的に低いレベルの発現を生じうる。他の遺伝子治療手法と異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入することの１つの重要な利点は、細胞における免疫調節剤合成の一過性の性質である。試験は、非複製ＤＮＡ配列を細胞に導入して、６ヶ月までの期間、所望免疫調節剤の産生を提供できることを示した。この方法の単純さと持続的発現がＤＮＡワクチンの開発を導いた。従来の弱毒化及びタンパク質ベースのワクチンに比べて、それらは、既存の免疫、例えば母親からの移行抗体による既存免疫によって影響されず、比較的安価であり、単一プラスミド上で多くの病原体抗原を送達することができる（Ｍａｎｉｃｋａｎ，Ｅ．，Ｋａｒｅｍ、Ｋ．Ｌ．及びＲｏｕｓｅ，Ｂ．Ｔ．（１９９７）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７：１３９−１５４）。ＤＮＡワクチンは、既存のワクチンがない病原体（Ｌｅｋｕｔｉｓ，Ｃ．，Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｌｉｕ，Ｍ．Ａ．及びＬｅｔｖｉｎ，Ｌ．Ｎ．（１９９７）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５８：４４７１−４４７７）又は現行のワクチンが十分に有効でない病原体、例えばインフルエンザ（Ｍａｃｋｌｉｎ，Ｍ．Ｄ．，ＭｃＣａｂｅ，Ｄ．ら（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：１４９１−１４９６）のために開発中である。高度に保存された遺伝子を使用することにより、Ｕｌｍｅｒら（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．，Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１７４５−１７４９）は、２つの血清学的に異なるインフルエンザウイルス株に対してマウスを免疫することができた。ほとんどの場合、しかしながら、ＤＮＡワクチンは既存のワクチンよりも良好ではないことを示した（Ｍａｃｋｌｉｎ，Ｍ．Ｄ．，ＭｃＣａｂｅ，Ｄ．ら（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：１４９１−１４９６）。実際の免疫応答のタイプは、適切なサイトカインをコードする遺伝子の共形質転換によって制御でき（Ｘｉａｎｇ，Ｚ．とＥｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：１２９−１３５）、及びこの方法は、不十分な免疫応答を再指令する上で有用であることを明らかにするであろう（Ｍａｎｉｃｋａｎ，Ｅ．，Ｋａｒｅｍ、Ｋ．Ｌ．及びＲｏｕｓｅ，Ｂ．Ｔ．（１９９７）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７：１３９−１５４）。裸のＤＮＡの他の用途は、癌の免疫増強（以下で論じる、Ｃｏｒｒ，Ｍ．，Ｔｉｇｈｅ，Ｈ．，Ｌｅｅ，Ｄ．，Ｄｕｄｌｅｒ，Ｊ．ら（１９９７）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １５９：４９９９−５００４）、膵臓のインスリン機能の修復（Ｇｏｌｄｆｉｎｅ，Ｉ．Ｄ．，Ｇｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｔｓｅｎｇ，Ｈ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：１３７８−１３８２）及び側副血管発生の刺激（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．，Ｔｓｕｒｕｍｉ，Ｙ．ら（１９９６）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ７５：４８７−５０１）を含む。筋肉組織における遺伝子産物の発現は、コラゲナーゼ、パパベリンの同時投与及び虚血状態によって改善されうる（Ｂｕｄｋｅｒ，Ｖ．，Ｚｈａｎｇ，Ｇ．，Ｄａｎｋｏ，Ｉ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．及びＷｏｌｆｆ，Ｊ．（１９９８）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：２７２−２７６）。筋特異的プロモーター（Ｓｋａｒｌｉ，Ｍ．，Ｋｉｒｉ，Ａ．ら（１９９８）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：５１４−５２０）、及びポリＡ及び転写終結配列などの他の遺伝子内調節配列（Ｈａｒｔｉｋｋａ，Ｊ．，Ｓａｗｄｅｙ，Ｍ．ら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１２０５−１２１７）の使用も導入遺伝子発現を改善する。
【０３７０】
裸のポリペプチド注入に関して、ＤＮＡ又はＲＮＡの有効用量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。好ましくは、前記用量は約０．００５ｍｇ／ｋｇ−約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ−約５ｍｇ／ｋｇである。言うまでもなく、当業者が認識するように、この用量は注入組織部位によって異なる。核酸配列の適切且つ有効な用量は当業者によって容易に決定され、治療する状態及び投与経路に依存しうる。投与経路は、組織の間隙への注入の非経口経路によるか、又は特に肺又は気管支組織、咽喉又は鼻の粘膜への送達のためのエーロゾル製剤の吸入などの他の非経口経路も使用しうる。さらに、裸のポリペプチド構築物は、血管形成術の際に手技において使用されるカテーテルによって動脈に送達することができる。
【０３７１】
免疫調節剤はまた、当業者に周知の方法によって製造できるリポソーム製剤（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９及びＡｂｄａｌｌａｈ  Ｂ．ら（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ８５（１）１−７の中で教示されるもののような）中でも送達しうる。リポソームは、水溶液の分画を捕獲する脂質二重層である。ＤＮＡはカチオンリポソームの外表面に自然に付着し（その電荷によって）、これらのリポソームは細胞膜と相互作用する（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｋｕｍａｒ，Ｒ．ら（１９９４）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６９：２５５０−２５６１）。インビトロで一部の細胞系統の９０％までがトランスフェクトされうる。さもなければ陽イオン性のリポソームに小量の陰イオン性脂質を含めることにより、ＤＮＡをリポソームの内部表面に組み込むことができ、それによって酵素分解から保護することができる（Ｃｒｅｓｐｏら、１９９６、Ａｌｉｏ，Ｓ．Ｆ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５４：９−１３における引用）。エンドソームとしての細胞内への取り込みを促進するために、標的タンパク質、例えば抗ＭＨＣ抗体（Ｗａｎｇ，Ｃ．とＨｕａｎｇ，Ｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８４：７８５１−７８５５）、トランスフェリン（Ｓｔａｖｒｉｄｉｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｄｅｌｉｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｓ，Ｇ．ら（１９８６）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６４：５６８−５７２）及びセンダイウイルス又はそのＦタンパク質（Ｄｚａｕ，Ｊ．Ｖ．，Ｍａｎｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｒ．及びＫａｎｅｄａ，Ｙ．（１９９６）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９３：１１４２１−１１４２５）がリポソームに含有された。センダイウイルスは、付加的に、プラスミドＤＮＡがエンドソームから細胞質内へと逃げ込むことを可能にし、それによって分解を回避させる。ＤＮＡ結合タンパク質（２８ｋＤａの高速移動群１タンパク質）の含有は、プラスミドを核内へと運搬することによって転写を高める（Ｄｚａｕら（１９９７）Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９７年１１月６日；８０（９Ａ）：３３Ｉ−３９Ｉ）。
【０３７２】
分子コンジュゲートは、ＤＮＡ結合剤が接着したタンパク質又は合成リガンドから成る。リポソームと同様の手法を用いることによって細胞への送達を改善できる。標的タンパク質は、アシアロ糖タンパク質（Ｗａｇｎｅｒ，Ｅ．，Ｃｏｔｔｅｎ，Ｍ．，Ｆｏｉｓｎｅｒ，Ｒ．及びＢｉｒｎｓｔｉｅｌ，Ｍ．Ｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８８：４２５５−４２５９）、トランスフェリン（Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．及びＷｕ，Ｇ．Ｙ．（１９８９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６４：１６９８５−１６９８７）、ＩｇＡ重合体（Ｆｅｒｋｏｌ，Ｔ．，Ｋａｅｔｚｅｌ，Ｃ．Ｓ．及びＤａｖｉｓ，Ｐ．Ｂ．（１９９３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ９２：２３９４−２４００）及びアデノウイルス（Ｍａｄｏｎ，Ｊ．とＢｌｕｍ，Ｈ．Ｅ．（１９９６）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２４：４７４−４８１）を包含する。導入遺伝子発現は一過性の傾向があり、エンドソーム／リソソーム分解によって制限される。
【０３７３】
ＶＩ．医薬組成物
医薬適合性の担体又は賦形剤の存在下で、β−２’−デオキシ−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシド、例えばβ−Ｌ−２’−デオキシアデノシン、β−Ｌ−２’−デオキシシチジン、β−Ｌ−２’−デオキシウリジン、β−Ｌ−２’−デオキシグアノシン又はβ−Ｌ−２’デオキシチミジン又は医薬適合性のそのプロドラッグもしくは塩の有効量を患者に投与することにより、Ｂ型肝炎を含むここで述べる疾患のいずれかに罹患しているヒトを治療することができる。適切な経路によって、例えば、液体又は固体形態で、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下又は局所的に有効成分を投与することができる。
【０３７４】
活性化合物は、治療する患者において重大な毒性作用を引き起こすことなく、インビボでウイルス複製を阻害するための治療有効量の化合物を患者に送達するのに十分な量で、医薬適合性の担体又は賦形剤中に含有される。「阻害量」とは、例えばここで述べるようなアッセイによって測定したとき阻害作用を及ぼすのに十分な有効成分の量を意味する。
【０３７５】
前述した条件のすべてに関して化合物の好ましい用量は、約１−５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１−２０ｍｇ／ｋｇ体重／日、より一般的には１日当りレシピエントの体重キログラムにつき０．１−約１００ｍｇの範囲内である。医薬適合性のプロドラッグの有効用量範囲は、送達すべき親ヌクレオシドの重量に基づいて算定できる。プロドラッグ自体が活性を示す場合は、有効用量は、プロドラッグの重量を用いて前記のように算定するか、又は当業者に既知の他の手段によって算定することができる。
【０３７６】
化合物は、好都合には、単位投与剤型当り７−３０００ｍｇ、好ましくは７０−１４００ｍｇの有効成分を含むがこれらに限定されない、適切な単位投与剤型で投与される。通常は５０−１０００ｍｇの経口用量が好都合である。
【０３７７】
理想的には、有効成分は、約０．２−７０μＭ、好ましくは約１．０−１０μＭの活性化合物のピーク血漿中濃度を達成するように投与すべきである。これは、例えば、場合により食塩水中の、有効成分の０．１−５％溶液の静脈内注射によって達成されうるか、又は有効成分のボーラスとして投与されうる。
【０３７８】
薬剤組成物中の活性化合物の濃度は、薬剤の吸収、不活性化及び排出速度ならびに当業者に既知の他の因子に依存する。用量値はまた、緩和すべき状態の重症度によっても異なることに留意しなければならない。さらに、個々の被験者について、明細な投与レジメンは、個体の必要性及び組成物を投与する又は投与を監督する人の専門的判断に従って経時的に調整されるべきであること、及びここで述べる濃度範囲は単なる例示であり、特許請求される組成物の範囲又は実施を限定することを意図しないことが了解されねばならない。有効成分は１回で投与してもよく、又は様々な時間間隔で投与するいくつかの小用量に分割してもよい。
【０３７９】
活性化合物の好ましい投与方式は経口である。経口組成物は、一般に不活性賦形剤又は食用担体を含む。それらをゼラチンカプセルに納めるか又は錠剤に圧縮しうる。経口治療投与のために、活性化合物を賦形剤と共に組み込み、錠剤、トローチ又はカプセルの形態で使用することができる。製薬上適合性の結合剤及び／又は佐剤物質を組成物の一部として含めることができる。
【０３８０】
錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分又は同様の性質の化合物のいずれかを含みうる：微結晶セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ又はトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味料；あるいはペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジフレーバーなどの香味料。投与単位剤型がカプセルであるときは、前述した種類の物質に加えて、脂肪油などの液状担体を含有しうる。さらに、投与単位剤型は、投与単位の物理的形態を変化させる様々な他の物質、例えば糖、シェラック又は他の腸溶剤を含有しうる。
【０３８１】
本発明の化合物は、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブラート、チューインガム等の成分として投与することができる。シロップは、活性化合物に加えて、甘味料及びある種の防腐剤、染料及び着色剤及び香味料を含みうる。
【０３８２】
本発明の化合物又は医薬適合性のその誘導体又は塩は、所望作用を損なわない他の活性物質、あるいは、抗生物質、抗真菌薬、抗炎症薬、プロテアーゼ阻害剤、あるいは他のヌクレオシド又は非ヌクレオシド抗ウイルス薬などの、所望作用を補足する物質と混合することもできる。非経口、皮内、皮下又は局所適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分を含みうる：注射用蒸留水、塩類溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌薬；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張度の調整のための物質。非経口製剤は、ガラス又はプラスチックで作られたアンプル、使い捨て注射器又は多回用量バイアルに納められる。
【０３８３】
静脈内投与の場合は、好ましい担体は生理食塩水又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
【０３８４】
好ましい実施態様では、活性化合物を、移植片及びミクロ被包送達系を含む放出制御製剤などの、体内からの急速な排出に対して化合物を保護する担体と共に製造する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ酢酸などの生分解性生体適合性ポリマーが使用できる。そのような製剤の製造のための方法は、当業者には明白である。その材料も、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているものを入手できる。
【０３８５】
リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナルと共に感染細胞に標的されるリポソームを含む）も、医薬適合性の担体として好ましい。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号（その全体が参照してここに組み込まれる）に述べられているように、当業者に既知の方法に従って製造しうる。例えば、リポソーム製剤は、適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン及びコレステロール）を無機溶媒に溶解し、次にそれを蒸発させて、乾燥脂質の薄膜を容器の表面に残すことによって製造しうる。その後、活性化合物又はその一リン酸、二リン酸及び／又は三リン酸誘導体の水溶液を容器に導入する。次に容器を手で渦状に攪拌して、容器の側面から脂質物質を遊離させ、脂質凝集体を分散させて、それによってリポソーム懸濁液を生成する。
【０３８６】
ＶＩＩ．放出制御製剤
放出制御製剤に関するこの章で引用する米国特許第はすべて、その全体が参照してここに組み込まれる。
【０３８７】
ポリ乳酸の合成及び生分解性がＫｕｌｋａｒｎｉら（「Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｉ  ｆｏｒ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｉｍｐｌａｎｔｓ」，Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ，１９６６，９３，８３９）によって報告されて以来、生分解性ポリマーの分野は急速に発展した。送達装置のためのマトリックス材料として有用であると報告された他のポリマーの例は、ポリ無水物、ポリグリコリド及びポリラクチド−コ−グリコリドなどのポリエステル、ポリリシンなどのポリアミノ酸、ポリエチレンオキシドのポリマー及びコポリマー、アクリル末端ポリエチレンオキシド、ポリアミド、ポリウレタン、ポリオルトエステル、ポリアクリロニトリル及びポリホスファゼンを含む。例えば、Ｌａｎｇｅｒへの米国特許第４，８９１，２２５号及び同第４，９０６，４７４号（ポリ無水物）、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎへの同第４，７６７，６２８号（ポリラクチド、ポリラクチド−コ−グリコリド酸）、及びＴｉｃｅらへの同第４，５３０，８４０号（ポリラクチド、ポリグリコリド及びコポリマー）参照。また、組織接触物質及び制御放出担体としての光重合性生分解性ヒドロゲル（重合及び架橋することができる末端キャップされたモノマー又はオリゴマーである、生分解性モノマー又はオリゴマー伸長を有する親水性オリゴマーを含む重合及び架橋マクロマーのヒドロゲル）を述べる、Ｈｕｂｂｅｌｌへの米国特許第５，６２６，８６３号、及び薬剤送達のための放出制御物質及び組織治療薬剤としての使用のためのマルチブロック生分解性ヒドロゲルを対象とする、Ｆｏｃａｌ，Ｉｎｃ．によって出願された国際公開公報第ＷＯ９７／０５１８５号も参照のこと。
【０３８８】
生物由来の生分解性材料は周知であり、例えば、架橋ゼラチンがある。ヒアルロン酸は、架橋されて、生物医学適用のための分解性膨潤ポリマーとして使用されてきた（Ｄｅｌｌａ  Ｖａｌｌｅらへの米国特許第４，９５７，７４４号；「Ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，」Ｐｏｌｙｍ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．，１９９１，６２，７３１−７３５）。
【０３８９】
多くの分散系が、物質の担体として、特に生物活性化合物の担体として現在使用されているか、又は使用に向けて開発されつつある。医薬及び化粧品製剤のために使用される分散系は懸濁液又は乳剤のいずれかに分類されうる。懸濁液は、懸濁剤を使用して液体媒質中に分散させた、大きさ数ナノメートルから数百ミクロンまでにわたる固体粒子と定義される。固体粒子は、ミクロスフェア、マイクロカプセル及びナノスフェアを含む。乳剤は、界面活性剤及び脂質などの乳化剤の界面薄膜によって安定化された、１つの液体中のもう１つ別の液体の分散と定義される。乳剤製剤は、油中水型及び水中油型乳剤、マルチプルエマルジョン、ミクロエマルジョン、微小液滴及びリポソームを含む。微小液滴は、Ｈａｙｎｅｓに発行された米国特許第４，６２２，２１９号及び同第４，７２５，４４２号に定義されているように、内部に油相を含む球状脂質層から成る単層リン脂質小胞である。リポソームは、水不溶性極性脂質を水溶液と混合することによって製造されるリン脂質小胞である。不溶性脂質を水中で混合することによって生じる不都合なエントロピーは、捕獲された水溶液を含むリン脂質の同心閉鎖膜の高度に整列された構築物を生じる。
【０３９０】
Ｄｕｎｎらへの米国特許第４，９３８，７６３号は、非反応性水不溶熱可塑性ポリマーを、生体適合性水溶性溶媒に溶解して液体を生成し、その液体を体内に注入して、溶媒を消散させて固体移植片を生じさせることにより、インサイチューで移植片を形成するための方法を開示する。ポリマー溶液は注射器によって体内に注入することができる。移植片はその周囲の腔の形状をとることができる。選択的実施態様では、移植片は、溶媒を含まず、通常は硬化触媒の添加により適切な位置で硬化して固体を形成する反応性液体オリゴマーポリマーから形成される。
【０３９１】
多くの特許が、β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド又はそのヌクレオチド又は他の定義されたプロドラッグを投与するために使用できる薬剤送達システムを開示している。米国特許第５，７４９，８４７号は、電気穿孔によってヌクレオチドを生物の体内に送達するための方法を開示する。米国特許第５，７１８，９２１号は、ポリマーと薬剤がその内部に分散しているミクロスフェアを開示する。米国特許第５，６２９，００９号は、生物活性因子の制御放出のための送達系を開示する。米国特許第５，５７８，３２５号は、非線状親水・疎水性マルチブロックコポリマーのナノ粒子及びミクロ粒子を開示する。米国特許第５，５４５，４０９号は、生物活性因子の制御放出のための送達系を開示する。米国特許第５，４９４，６８２号は、イオン架橋された高分子マイクロカプセルを開示する。
【０３９２】
Ａｎｄｒｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．への米国特許第５，７２８，４０２号は、ヒドロゲル系製剤と混合した、活性薬剤、その塩、エステル又はプロドラッグを含有する内相と、胃での溶解に抗する被覆物を含有する外相を含む放出制御製剤を述べている。Ａｎｄｒｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．への米国特許第５，７３６，１５９号及び同第５，５５８，８７９号は、通路がインサイチューで形成される、ほとんど水溶性がない薬剤のための放出制御製剤を開示する。Ａｎｄｒｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．への米国特許第５，５６７，４４１号は、１日１回の放出制御製剤を開示する。米国特許第５，５０８，０４０号は、多粒子拍動性薬剤送達系を開示する。米国特許第５，４７２，７０８号は、拍動性粒子に基づく薬剤送達系を開示する。米国特許第５，４５８，８８８号は、薬剤を含有する内相と３，０００−１０，０００の平均分子量を有するポリエチレングリコールポリマーを含む外相を有する混合物を使用して作製できる放出制御錠剤を述べる。米国特許第５，４１９，９１７号は、ヒドロゲルから実質的にゼロに近い薬剤の放出速度を提供することができる、医薬適合性のイオン解離性化合物の有効量の使用に基づく、ヒドロゲルからの薬剤の放出速度の調節のための方法を開示する。米国特許第５，４５８，８８８号は、放出制御錠剤を開示する。
【０３９３】
Ｅｌａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｐｌｃへの米国特許第５，６４１，７４５号は、ミクロスフェア又はナノスフェアを形成するための生分解性ポリマー中に活性薬剤を含有する放出制御医薬製剤を開示する。生分解性ポリマーは、適切にはポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド又はポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチドとポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリドの混合物である。Ｅｌａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｐｌｃへの米国特許第５，６１６，３４５号は、有機酸と結合した活性化合物、及び主要な割合の医薬適合性の薄膜形成性水不溶性合成ポリマーと小さな割合の医薬適合性の薄膜形成性水溶性合成ポリマーを含有する、コアを取り巻く多層膜を含む、１日１回投与のための吸収制御製剤を述べる。米国特許第５，６４１，５１５号は、生分解性ナノ粒子に基づく放出制御製剤を開示する。米国特許第５，６３７，３２０号は、１日１回投与のための吸収制御製剤を開示する。米国特許第５，５８０，５８０号及び同第５，５４０，９３８号は、製剤及び神経疾患の治療におけるそれらの使用を対象とする。米国特許第５，５３３，９９５号は、受動的経皮装置と制御薬剤送達を対照とする。米国特許第５，５０５，９６２号は、放出制御医薬製剤を述べる。
【０３９４】
ＶＩＩＩ．活性化合物の製造
本発明のβ−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドは当技術分野において既知であり、Ｈｏｌｙ，Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９７２，３７（１２）４０７２−８７及びＭｏｌ．Ｐｈｙｓ．１９６７，３（４）３８６−９５によって開示された方法に従って製造することができる。
【０３９５】
Ｌ−リボース又はＬ−キシロースを出発物質として使用して、β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド（β−Ｌ−ｄＮ）を得るための一般工程を図１に示す。
【０３９６】
活性ヌクレオシドの一、二及び三リン酸誘導体は、公表されている方法に従い、記述されているように製造できる。一リン酸塩は、Ｉｍａｉら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９６９年６月、３４（６）１５４７−１５５０の手順に従って製造できる。二リン酸塩は、Ｄａｖｉｓｓｏｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８７、５２（９）１７９４−１８０１の手順に従って製造できる。酸リン酸塩は、Ｈｏａｒｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６５，８７（８）１７８５−１７８８の手順に従って製造できる。
【０３９７】
（β−Ｌ−ヌクレオシドのβ−Ｌ−５’誘導体の製造のための方法）
β−Ｌ−ヌクレオシドのβ−Ｌ−５’誘導体は、当技術分野において既知の何らかの手段によって、特に第一級アルコールをアシル成分で、すなわち無水物によって又はカップリング剤を使用して保護するための既知の方法によって作製することができる。非制限的例として、前記β−Ｌ−５’誘導体は、以下の連続反応：
【０３９８】
【化４７】
2008273960.tif 000056
に従って製造できる。
【０３９９】
好ましい実施態様では、前記５’誘導体はアミノアシル成分から誘導される。この工程のための鍵となる出発物質は、適切に置換されたβ−Ｌ−ヌクレオシドである。β−Ｌ−ヌクレオシドは、購入するか又はデオキシリボースなどのＬ−糖成分との標準カップリング反応を含む何らかの既知の手段によって製造することができる。アミノアシル誘導体は、好ましくはヌクレオシドの付加的な保護を伴わずに、アミノ酸をβ−Ｌ−ヌクレオシドに選択的にカップリングすることによって作製できる。カップリング反応は、カップリングを促進する適切なカップリング試薬を使用して実施することができる。カップリング試薬の一部の非制限的例は、トリフェニルホスフィン又は様々な種類のカルボジイミドを有する光延型試薬（例えばジイソプロピルアゾジカルボキシレート及びジエチルアゾジカルボキシレートなどのジアルキルアゾジカルボキシレート）である。
【０４００】
カップリング反応は、所望結果を達成する、すなわち分解を促進することなく又は過剰の副産物を生成することなく許容される速度で反応を進行させるのに適したいかなる温度でも実施できる。
【０４０１】
必要な温度を達成でき、及び反応成分を溶解することができるいかなる反応溶媒も選択することができる。非制限的例は、ヘキサン、シクロヘキサン、ジクロロメタン又はジクロロエタン、トルエン、アセトン、酢酸エチル、ジチアン、ＴＨＦ、ジオキサン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ピリジン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド、又はそれらの組合せなどのアルキル又はハロアルキル溶媒を含むがこれらに限定されない、非プロトン性溶媒である。
【０４０２】
スキーム１は、Ｌ−デオキシリボヌクレオシドから誘導されるβ−Ｌ−５’−アミノアシルヌクレオシドの製造の非制限的例である。
【０４０３】
【化４８】
2008273960.tif 000057
（β−Ｌ−ヌクレオシドのβ−Ｌ−３’誘導体の製造のための方法）
２’−デオキシヌクレオシドのβ−Ｌ−３’誘導体は、当技術分野において既知の何らかの手段によって、特に第二級アルコールをアシル成分で、すなわち無水物によって又はカップリング剤を使用して保護するための既知の方法によって作製することができる。非制限的例として、前記３’誘導体は、以下の連続反応：
【０４０４】
【化４９】
2008273960.tif 000058
に従って製造できる。
【０４０５】
あるいは、前記３’誘導体はアミノアシル成分から誘導される。この工程のための鍵となる出発物質は、適切に置換されたβ−Ｌ−ヌクレオシドである。β−Ｌ−ヌクレオシドは、購入するか又はＬ−糖成分との標準カップリング反応を含む何らかの既知の手段によって製造することができる。
【０４０６】
これらのアミノアシル誘導体は、最初に５’ヒドロキシルをアシル又はシリル保護基などの適切な酸素保護基で選択的に保護し、及び場合によりヘテロ環式又はヘテロ芳香族塩基中の遊離アミンを保護することによって作製できる。その後、遊離３’−ヒドロキシルをＮ保護α又はβアミノ酸にカップリングすることができる。
【０４０７】
その後、カップリングを促進する標準カップリング試薬を使用してβ−Ｌ−ヌクレオシドをアミノアシルにカップリングする。カップリング試薬の一部の非制限的例は、トリフェニルホスフィン又は様々な種類のカルボジイミドを有する光延型試薬（例えばジイソプロピルアゾジカルボキシレート及びジエチルアゾジカルボキシレートなどのジアルキルアゾジカルボキシレート）である。
【０４０８】
カップリング反応は、所望結果を達成する、すなわち分解を促進することなく又は過剰の副産物を生成することなく許容される速度で反応を進行させるのに適したいかなる温度でも実施できる。
【０４０９】
必要な温度を達成でき、及び反応成分を溶解することができるいかなる反応溶媒も選択できる。非制限的例は、ヘキサン、シクロヘキサン、ジクロロメタン又はジクロロエタン、トルエン、アセトン、酢酸エチル、ジチアン、ＴＨＦ、ジオキサン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ピリジン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド、又はそれらの組合せなどのアルキル又はハロアルキル溶媒を含むがこれらに限定されない、非プロトン性溶媒である。
【０４１０】
スキーム２は、Ｌ−デオキシリボヌクレオシドから誘導されるβ−Ｌ−３’−アミノアシルヌクレオシドの製造の非制限的例である。
【０４１１】
【化５０】
2008273960.tif 000059
（β−Ｌ−ヌクレオシドのβ−Ｌ−３’，５’−ビス−Ｏ−誘導体の製造のための方法）
β−Ｌ−ヌクレオシドのβ−Ｌ−３’，５’−ビス−Ｏ−誘導体は、当技術分野において既知の何らかの手段によって、特に第一級及び第二級アルコールをアシル成分で、すなわち無水物によって又はカップリング剤を使用して保護するための既知の方法によって生成することができる。非制限的例として、前記３’，５’−ビス−Ｏ−誘導体は、以下の連続反応：
【０４１２】
【化５１】
2008273960.tif 000060
に従って製造できる。
【０４１３】
好ましい実施態様では、前記３’，５’−ビス−Ｏ−誘導体はアミノアシル成分から誘導される。この工程のための鍵となる出発物質も、適切に置換されたβ−Ｌ−ヌクレオシドである。β−Ｌ−ヌクレオシドの３’，５’−ビス−Ｏ−誘導体は、購入するか又はデオキシリボースなどのＬ−糖成分との標準カップリング反応を含む何らかの既知の手段によって製造することができる。その後、遊離３’−及び５’ヒドロキシルをＮ保護α又はβアミノ酸にカップリングすることができる。カップリング反応は、カップリングを促進する適切なカップリング試薬を使用して実施できる。カップリング試薬の一部の非制限的例は、トリフェニルホスフィン又は様々な種類のカルボジイミドを有する光延型試薬（例えばジイソプロピルアゾジカルボキシレート及びジエチルアゾジカルボキシレートなどのジアルキルアゾジカルボキシレート）である。
【０４１４】
カップリング反応は、所望結果を達成する、すなわち分解を促進することなく又は過剰の副産物を生成することなく許容される速度で反応を進行させるのに適したいかなる温度でも実施できる。
【０４１５】
必要な温度を達成でき、及び反応成分を溶解することができるいかなる反応溶媒も選択できる。非制限的例は、ヘキサン、シクロヘキサン、ジクロロメタン又はジクロロエタン、トルエン、アセトン、酢酸エチル、ジチアン、ＴＨＦ、ジオキサン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ピリジン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド、又はそれらの組合せなどのアルキル又はハロアルキル溶媒を含むがこれらに限定されない、非プロトン性溶媒である。
【０４１６】
スキーム３は、Ｌ−デオキシリボヌクレオシドから誘導されるβ−Ｌ−３’，５’−ジアミノアシルヌクレオシドの製造の非制限的例である。
【０４１７】
【化５２】
2008273960.tif 000061
【０４１８】
（アミノアシル成分の伸長のための選択的方法）
表題化合物は、３’及び５’−ヒドロキシルをアシル基、特にアミノアシル基などの適切な誘導体と反応させることによって製造できる。ヌクレオシドをアミノアシル成分で誘導体化する場合は、さらに遊離アミンをＮ−保護α又はβアミノ酸にカップリングすることが望ましいと考えられる。カップリング反応は、カップリングを促進する適切なカップリング試薬を使用して実施できる。カップリング試薬の一部の非制限的例は、トリフェニルホスフィン又は様々な種類のカルボジイミドを有する光延型試薬（例えばジイソプロピルアゾジカルボキシレート及びジエチルアゾジカルボキシレートなどのジアルキルアゾジカルボキシレート）である。
【０４１９】
カップリング反応は、所望結果を達成する、すなわち分解を促進することなく又は過剰の副産物を生成することなく許容される速度で反応を進行させるのに適したいかなる温度でも実施できる。
【０４２０】
必要な温度を達成でき、及び反応成分を溶解することができるいかなる反応溶媒も選択できる。非制限的例は、ヘキサン、シクロヘキサン、ジクロロメタン又はジクロロエタン、トルエン、アセトン、酢酸エチル、ジチアン、ＴＨＦ、ジオキサン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ピリジン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド、又はそれらの組合せなどのアルキル又はハロアルキル溶媒を含むがこれらに限定されない、非プロトン性溶媒である。
【０４２１】
（ヘテロ芳香族又はヘテロ環式塩基の誘導体化のための選択的方法）
表題化合物は、場合によりヘテロ環式又はヘテロ芳香族塩基、例えばＮ４−シトシン、Ｎ６−アデニン又はＮ２−グアニン中の遊離アミノを保護することによって製造できる。例えば、以下の一般的プロトコールに従ってアミンをアシル成分又はジアルキルアミノメチレン成分によって保護することができる。
【０４２２】
【化５３】
2008273960.tif 000062
前記保護は、所望結果を達成する、すなわち分解を促進することなく又は過剰の副産物を生成することなく許容される速度で反応を進行させるのに適したいかなる温度でも実施できる。
【０４２３】
必要な温度を達成でき、及び反応成分を溶解することができるいかなる反応溶媒も選択できる。非制限的例は、ヘキサン、シクロヘキサン、ジクロロメタン又はジクロロエタン、トルエン、アセトン、酢酸エチル、ジチアン、ＴＨＦ、ジオキサン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ピリジン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド、又はそれらの組合せなどのアルキル又はハロアルキル溶媒を含むがこれらに限定されない、非プロトン性溶媒である。
【０４２４】
その後、遊離３’−ヒドロキシルをＮ−保護α又はβアミノ酸にカップリングすることができる。カップリング反応は、カップリングを促進する適切なカップリング試薬を使用して実施できる。カップリング試薬の一部の非制限的例は、トリフェニルホスフィン又は様々な種類のカルボジイミドを有する光延型試薬（例えばジイソプロピルアゾジカルボキシレート及びジエチルアゾジカルボキシレートなどのジアルキルアゾジカルボキシレート）である。
【０４２５】
カップリング反応は、所望結果を達成する、すなわち分解を促進することなく又は過剰の副産物を生成することなく許容される速度で反応を進行させるのに適したいかなる温度でも実施できる。
【０４２６】
必要な温度を達成でき、及び反応成分を溶解することができるいかなる反応溶媒も選択できる。非制限的例は、ヘキサン、シクロヘキサン、ジクロロメタン又はジクロロエタン、トルエン、アセトン、酢酸エチル、ジチアン、ＴＨＦ、ジオキサン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ピリジン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド、又はそれらの組合せなどのアルキル又はハロアルキル溶媒を含むがこれらに限定されない、非プロトン性溶媒である。
【０４２７】
選択的実施態様では、Ｎ４−又はＮ６−アシル誘導体はアミノアシル成分から誘導され、場合により遊離ヒドロキシルを保護し、次に適切な保護アミノエステルとの縮合反応に供して、必要に応じてヒドロキシル保護基を除去することによる、連続反応に従って製造することができる。
【０４２８】
（実施例）
融点は、Ｇａｌｌｅｎｋａｍｐ  ＭＦＢ−５９５−０１０Ｍ装置で開毛管において測定し、補正しない。紫外吸収スペクトルは、エタノール中Ｕｖｉｋｏｎ  ９３１（ＫＯＮＴＲＯＮ）分光光度計で記録した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＣ２５０又は４００分光計でＤＭＳＯ−ｄ６中、室温で測定した。化学変化はｐｐｍで表わし、ＤＭＳＯ−ｄ５は標準として２．４９ｐｐｍに設定する。プロトンの帰属を確認するために重水素交換、脱カップリング実験又は２Ｄ−ＣＯＳＹを実施した。シグナル多重度は、ｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｄｄ（二重項のダブレット）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｂｒ（広幅）、ｍ（多重項）で表わす。Ｊ値はすべてＨｚである。ＦＡＢ−質量スペクトルは、ＪＥＯＬ  ＤＸ  ３００質量分析計において陽イオン（ＦＡＢ＞０）又は陰イオン（ＦＡＢ＜０）モードで記録した。基質は３−ニトロベンジルアルコール（ＮＢＡ）又はグリセロールとチオグリセロールの混合物（ＧＴ）（５０：５０、ｖ／ｖ）であった。比旋光度は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ２４１分光旋光計（光路長１ｃｍ）で測定し、１０／ｄｅｇ  ｃｍ２／ｇの単位で表わす。元素分析は、「Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｄｕ  Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｅｓ  ｄｕ  ＣＮＲＳ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｄｅ  Ｖｅｒｎａｉｓｏｎ」（Ｆｒａｎｃｅ）によって実施された。元素記号又は関数で示された分析は、理論値±０．４％以内であった。Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ，製品番号５５５４）前被覆アルミニウムシート上で薄層クロマトグラフィーを実施し、紫外吸光とそれに続く１０％エタノール硫酸での焦化（ｃｈａｒｒｉｎｇ）及び加熱によって生成物の視覚化を実施した。カラムクロマトグラフィーは、大気圧下にＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（Ｍｅｒｃｋ，製品番号９３８５）で実施した。
【実施例１】
【０４２９】
２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンの立体特異的合成
【０４３０】
【化５４】
2008273960.tif 000063
１−（３，５−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｌ−キシロフラノシル）ウラシル（２）
ヒドラジン水和物（１．４ｍＬ、２８．７ｍｍｏｌ）を、ピリジン（６０ｍＬ）及び酢酸（１５ｍＬ）中の１−（２−Ｏ−アセチル−３，５−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｌ−キシロフラノシル）ウラシル１［参考文献：Ｇｌｓｓｅｌｉｎ，Ｇ．；Ｂｅｒｇｏｇｎｅ，Ｍ．−Ｃ．；Ｉｍｂａｃｈ，Ｊ．−Ｌ．，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  β−Ｌ−Ｘｙｌｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｓｅｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３年１０月−１１月、３０、１２２９−１２３３］（４．７９ｇ、９．６８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。前記溶液を室温で一晩攪拌した。アセトンを加えて（３５ｍＬ）、この混合物を３０分間攪拌した。反応混合物を減圧下で蒸発させた。生じた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液：ジクロロメタン中メタノールの段階的勾配（０−４％）］によって精製し、シクロヘキサン／ジクロロメタンから結晶化して、２（３．０ｇ、６８％）を得た：融点＝１１１−１１４℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．３５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９−７．４（ｍ，１１Ｈ，２Ｃ６Ｈ５ＣＯ，Ｈ−６），６．３８（ｄ，１Ｈ，ＯＨ−２’，ＪＯＨ−２’＝４．２Ｈｚ），５．７７（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ１’−２’＝１．９Ｈｚ），５．５５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ５−６＝８Ｈｚ），５．５４（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’，Ｊ３’−２’＝３．９Ｈｚ及びＪ３’−４’＝１．８Ｈｚ），４．８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），４．７（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’及びＨ−５”），４．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’）；ＭＳ：ＦＡＢ＞０（基質ＧＴ）ｍ／ｚ４５３（Ｍ＋Ｈ）＋，１０５（Ｃ６Ｈ５ＣＯ）＋；ＦＡＢ＜０（基質ＧＴ）ｍ／ｚ４５１（Ｍ−Ｈ）−，１２１（Ｃ６Ｈ５ＣＯ２）−，１１１（Ｂ）−；Ｃ２３Ｈ２０Ｎ２Ｏ８・Ｈ２Ｏについて算定した分析値：Ｃ、５８．０９；Ｈ、４．７６；Ｎ、５．９６。検出値：Ｃ、５７．７１；Ｈ、４．４２；Ｎ、５．７０。
【０４３１】
１−（３，５−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｌ−アラビノフラノシル）ウラシル（３）
無水ベンゼン−ＤＭＳＯ混合物（２６５ｍＬ、６：４、ｖ／ｖ）中の１−（３，５−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｌ−キシロフラノシル）ウラシル２（８ｇ、１７．７ｍＬ）の溶液に、無水ピリジン（１．４ｍＬ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１０．９ｇ、５３ｍｍｏｌ）及びジクロロ酢酸（０．７５ｍＬ）を加えた。生じた混合物を室温で４時間攪拌し、次に酢酸エチル（４００ｍＬ）で希釈して、メタノール（１４ｍＬ）中のシュウ酸（４．８ｇ、５３ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。１時間攪拌した後、前記溶液をろ過した。ろ液を飽和ＮａＣｌ溶液（２×５００ｍＬ）、３％ＮａＨＣＯ３溶液（２×５００ｍＬ）及び水（２×５００ｍＬ）で洗った。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、その後減圧下で蒸発させた。生じた残留物を、次に、無水ＥｔＯＨ−ベンゼン混合物（１４０ｍＬ、２：１、ｖ／ｖ）に溶解した。０℃のこの溶液にＮａＢＨ４（０．９６ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）を加えた。１時間攪拌した後、前記溶液を酢酸エチル（４００ｍＬ）で希釈し、その後ろ過した。ろ液を飽和ＮａＣｌ溶液（４００ｍＬ）及び水（４００ｍＬ）で洗った。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、その後減圧下で蒸発させた。生じた粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液：ジクロロメタン中メタノールの段階的勾配（０−３％）］によって精製し、アセトニトリルから結晶化して、３（５．３ｇ、６６％）を得た：融点＝１８２−１８３℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．３５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．０−７．５（ｍ，１１Ｈ，２Ｃ６Ｈ５ＣＯ，Ｈ−６），６．２３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ−２’），６．１５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ１’−２’＝４Ｈｚ），５．５４（ｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ５−６＝８．１Ｈｚ），５．３７（ｔ，１Ｈ，Ｈ−３’，Ｊ３’−２’＝Ｊ３’−４’，２．６Ｈｚ），４．７−４．６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’及びＨ−５”），４．５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），４．４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’）；ＭＳ：ＦＡＢ＞０（基質ＧＴ）ｍ／ｚ４５３（Ｍ＋Ｈ）＋，３４１（Ｓ）＋，１１３（ＢＨ２）＋，１０５（Ｃ６Ｈ５ＣＯ）＋；ＦＡＢ＜０（基質ＧＴ）ｍ／ｚ４５１（Ｍ−Ｈ）−，１２１（Ｃ６Ｈ５ＣＯ２）−，１１１（Ｂ）−；Ｃ２３Ｈ２０Ｎ２Ｏ８について算定した分析値：Ｃ，６１．０６；Ｈ，４．４６；Ｎ，６．１９。検出値：Ｃ，６０．８３；Ｈ，４．３４；Ｎ，６．２５。
【０４３２】
１−（３，５−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２−デオキシ−β−Ｌ−エリトロ−ペントフラノシル）ウラシル（４）
無水１，２−ジクロロエタン（１２０ｍＬ）中の１−（３，５−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｌ−アラビノフラノシル）ウラシル３（５．２ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化フェノキシチオカルボニル（４．７ｍＬ、３４．３ｍＬ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ、１２．５ｇ、１０２．６ｍｍｏｌ）を加えた。生じた溶液をアルゴン雰囲気下に室温で１時間攪拌し、その後減圧下で蒸発させた。残留物をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解し、この有機溶液を、順次、氷冷０．２Ｎ塩酸溶液（３×２００ｍＬ）及び水（２×２００ｍＬ）で洗い、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥して、その後減圧下で蒸発させた。前記粗物質を無水ジオキサンと共に数回共蒸発させ、この溶媒（１１０ｍＬ）に溶解した。生じた溶液に、アルゴン下でトリス−（トリメチルシリル）シランヒドリド（４．２ｍＬ、１３．７ｍｍｏｌ）及びα，α’−アゾイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、０．６ｇ、３．７６ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を加熱し、アルゴン下に１００℃で１時間攪拌して、その後室温に冷却し、減圧下で蒸発させた。この残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液：メタノールの段階的勾配（０−５％）］によって精製し、ＥｔＯＨから結晶化して、４（２．７８ｇ、５６％）を得た：融点＝２２３−２２５℃；Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．０−７．５（ｍ，１１Ｈ，２Ｃ６Ｈ５ＣＯ，Ｈ−６），６．２８（ｔ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝７Ｈｚ），５．５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１’及びＨ−５），４．６−４．４（ｍ，３Ｈ，Ｈ−４’，Ｈ−５’及びＨ−５”），２．６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２’及びＨ−２”）；ＭＳ：ＦＡＢ＞０（基質ＧＴ）ｍ／ｚ４３７（Ｍ＋Ｈ）＋，３３２５（Ｓ）＋；ＦＡＢ＜０（基質ＧＴ）ｍ／ｚ４３５（Ｍ−Ｈ）−，１１１（Ｂ）−；Ｃ２３Ｈ２０Ｎ２Ｏ７について算定した分析値：Ｃ，６３．３０；Ｈ，４．６２；Ｎ，６．４２。検出値：Ｃ，６２．９８；Ｈ，４．７９；Ｎ，６．４０。
【０４３３】
２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジン（β−Ｌ−ｄＣ）
無水１，２−ジクロロエタン（１２０ｍＬ）中の１−（３，５−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２−デオキシ−β−Ｌ−エリトロ−ペントフラノシル）ウラシル４（２．６６ｇ、６．１ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン下でＬａｗｅｓｓｏｎ試薬（１．７２ｇ、４．２６ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を還流下で２時間攪拌した。次に減圧下で溶媒を蒸発させ、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液：ジクロロメタン中の酢酸エチルの段階的勾配（０−８％）］によって精製して、４−チオ中間体を黄色の泡として得た。メタノール性アンモニア（あらかじめ−１０℃で飽和させ、しっかりと栓をしておく）（５０ｍＬ）中のこのチオ中間体（１．５ｇ、３．３１ｍｍｏｌ）の溶液をステンレス鋼製ボンベにおいて１００℃で３時間加熱し、その後０℃に冷却した。この溶液を減圧下で蒸発させた。生じた粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液：ジクロロメタン中のメタノールの段階的勾配（０−２０％）］によって精製した。最後に、適切な分画をプールし、Ｍｉｌｌｅｘ  ＨＶ−４（０．４５μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ユニットでろ過して、減圧下で蒸発させ、無水ＥｔＯＨから結晶化して、所望の２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジン（β−Ｌ−ｄＣ）を泡として得た（０．６ｇ、８０％）：融点＝１９８−１９９℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．７７（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６，Ｊ６−５＝７．４Ｈｚ），７．１０（ｂｒ  ｄ，２Ｈ，ＮＨ−２），６．１３（ｔ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝６．７Ｈｚ），５．６９（ｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ５−６＝７．４Ｈｚ），５．１９（ｄ，１Ｈ，ＯＨ−３’，ＪＯＨ−３’＝４．１Ｈｚ），４．９６（ｔ，１Ｈ，ＯＨ−５’，ＪＯＨ−５’−＝ＪＯＨ−５”＝５．２Ｈｚ），４．１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），３．７５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），３．５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’及びＨ−５”），２．０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），１．９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２”）；ＭＳ：ＦＡＢ＞０（基質ＧＴ）ｍ／ｚ２２８（Ｍ＋Ｈ）＋，１１２（ＢＨ２）＋；ＦＡＢ＜０（基質ＧＴ）ｍ／ｚ２２６（Ｍ−Ｈ）−；［α］２０Ｄ＝−６９（ｃ  ０．５２、ＤＭＳＯ）［市販されているＤ−鏡像異性体の塩酸塩に関しては［α］２０Ｄ＋７６＝（ｃ  ０．５５、ＤＭＳＯ）］。Ｃ９Ｈ１３Ｎ３Ｏ４について算定した分析値：Ｃ、４７．５７；Ｈ、５．７７；Ｎ、１８．４９。検出値：Ｃ、４７．３５；Ｈ、５．６８；Ｎ、１８．２９。
【実施例２】
【０４３４】
２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジン（β−Ｌ−ｄＣ）の立体選択的合成
【０４３５】
【化５５】
2008273960.tif 000064
２−アミノ−β−Ｌ−アラビノフラノ−［１’，２’：４，５］−オキサゾリン（５）
Ｌ−アラビノース（１７０ｇ、１．１３ｍｍｏｌ：Ｆｌｕｋａ、＞９９．５％、参照番号１０８３９）、シアナミド（１００ｇ、２．３８ｍｍｏｌ：Ｆｌｕｋａ、＞９８％、参照番号２８３３０）、メタノール（３００ｍＬ）及び６Ｍ−ＮＨ４ＯＨ（５０ｍＬ）の混合物を室温で３日間攪拌し、その後一晩−１０℃に保持した。生成物を吸引して収集し、メタノール及びエーテルで連続的に洗浄して、真空中で乾燥した。収量：分析上純粋な化合物５  １３０ｇ（６６．０％）、融点１７０−１７２℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ６．３５（ｂｒ  ｓ，２Ｈ，ＮＨ２），５．１５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．４５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ−３），４．７０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ−５），４．５５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−２，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．００（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ｈ−３），３．６５（ｍ，１Ｈ，Ｈ４），３．２５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５，Ｈ−５’）。
【０４３６】
Ｏ２，２’−アンヒドロ−β−Ｌ−ウリジン（６）
５０％エタノール水溶液（７４０ｍＬ）中の化合物５（９８．８ｇ、０．５７ｍｏｌ）及びメチルプロピオレート（９８ｍＬ：Ｆｌｕｋａ，＞９７％、参照番号８１８６３）の溶液を５時間還流し、その後冷却して、減圧下でもとの容積の半分に濃縮した。アセトン（６００ｍｌ）で沈殿させた後、生成物を吸引して収集し、エタノール及びエーテルで洗って、乾燥した。母液を部分的に濃縮し、濃縮物をアセトン（１０００ｍｌ）で沈殿させて、固体を吸引して収集し、アセトン及びエーテルで洗って、生成物のもう１つの収穫を得た。全体的収量：化合物６  ８０ｇ（６２％）、融点２３６−２４０℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ７．８７（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６，Ｊ＝７．４Ｈｚ），６．３５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝５．７Ｈｚ），５．９５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ＝７．４Ｈｚ），５．９０（ｄ，１Ｈ，ＯＨ−３’），５．２０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝５．７Ｈｚ），５．００（ｍ，１Ｈ，ＯＨ−３’），４．４４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ｈ−３’），４．０５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），３．２５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５，Ｈ−５’）。
【０４３７】
３’，５’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−Ｏ２，２’−アンヒドロ−β−Ｌ−ウリジン（７）
無水ピリジン（１２００ｍｌ）中の化合物６（７１．１ｇ、０．３１ｍｏｌ）の溶液に、０℃でアルゴン下に塩化ベンゾイル（８０．４ｍＬ，Ｆｌｕｋａ，ｐ．ａ．，参照番号１２９３０）を加えた。この反応混合物を、大気中の湿気を除去して室温で５時間攪拌し、エタノールを加えて反応を停止させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、生じた残留物をトルエン及び無水エタノールと共蒸発させた。次にこの粗混合物をエタノールで希釈し、沈殿物を吸引して収集し、エタノール及びエーテルで連続的に洗って、乾燥した。収量：化合物７  １２９ｇ（９５．８％）、融点２５４℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ８．１−７．４（ｍ，１１Ｈ，Ｃ６Ｈ５ＣＯ，Ｈ−６），６．５０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝５．７Ｈｚ），５．９０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ＝７．５Ｈｚ），５．８０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝５．８Ｈｚ），５．７０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−３’）４．９０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），４．３５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５，Ｈ−５’）。
【０４３８】
３’，５’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２’−クロロ−２’−デオキシ−β−Ｌ−ウリジン（８）
ジメチルホルムアミド（４６０ｍｌ）中の化合物７（６０．３ｇ、０．１３９ｍｏｌ）の溶液に、０℃で３．２Ｎ−ＨＣｌ／ＤＭＦ溶液（２０８ｍｌ、０℃の塩化アセチル４７．２ｍｌ（Ｆｌｕｋａ，ｐ．ａ．，参照番号００９９０）をメタノール２７．３ｍＬ及びジメチルホルムアミド１３３．５ｍＬに添加してインサイチューで調製した）を加えた。この反応混合物を、大気中の湿気を除去して１００℃で１時間攪拌し、冷却して、水（４０００ｍＬ）に注ぎ入れた。化合物８の沈殿物を吸引して収集し、水で洗って、エタノールから再結晶化した。結晶を収集し、低温エタノール及びエーテルで洗って、減圧下で乾燥した。収量：化合物８  ６０．６ｇ（９２．６％）、融点１６４−１６５℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ８．７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．１−７．３（ｍ，１１Ｈ，Ｃ６Ｈ５ＣＯ，Ｈ−６），６．１５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝４．８Ｈｚ），５．５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５，Ｈ−２’），４．６５（ｍ，４Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−４’，Ｈ−５’，Ｈ−５”）。
【０４３９】
３’，５’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２’−デオキシ−β，Ｌ−ウリジン（９）
無水トルエン（７２０ｍｌ）中の化合物８（６０．２８ｇ、０．１２８ｍｏｌ）、トリ−ｎ−ブチルチンヒドリド（９５ｍＬ：Ｆｌｕｋａ，＞９８％、参照番号９０９１５）及びアザビスイソブチロニトリル（０．５６８ｇ：Ｆｌｕｋａ，＞９８％、参照番号１１６３０）の混合物を、攪拌しながら５時間還流して、冷却した。固体を吸引して収集し、低温トルエン及び石油エーテルで洗った。ろ液を減圧下で濃縮し、石油エーテルで希釈して、化合物９のさらなる収穫を析出させた。収量：化合物９  ５４．２８ｇ（９７．２％）、融点２２０−２２１℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ８．９１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．１−７．５（ｍ，１１Ｈ，Ｃ６Ｈ５ＣＯ及びＨ−６），６．４３（ｑ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝５．７Ｈｚ及びＪ１’２”＝８．３Ｈｚ），５．７−５．６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３’及びＨ−５），４．８−４．６（ｍ，３Ｈ，Ｈ−５’，Ｈ−５”及びＨ−４’），２．８−２．７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），２．４−２．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２”）。
【０４４０】
３’，５’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２’−デオキシ−β−Ｌ−４−チオ−ウリジン（１０）
無水塩化メチレン（３９００ｍｌ）中の化合物９（６９ｇ、０．１５８ｍｏｌ）及びＬａｗｅｓｓｏｎ試薬（７４ｇ：Ｆｌｕｋａ，＞９８％、参照番号６１７５０）の溶液をアルゴン下で一晩還流した。溶媒を蒸発させた後、粗残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液：塩化メチレン中のメタノールの勾配（０−２％）］によって精製し、定量的収率で純粋な化合物１０（７３ｇ）を得た；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ９．５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．１−７．４（ｍ，１０Ｈ，Ｃ６Ｈ５ＣＯ），７．３２（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６，Ｊ＝７．７Ｈｚ），６．３０（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝５．６Ｈｚ及びＪ＝８．２Ｈｚ），６．２２（ｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ＝７．７Ｈｚ），５．６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），４．７（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’，Ｈ−５”），４．５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），２．８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），２．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２”）。
【０４４１】
２’−デオキシ−β−Ｌ−シトシン
あらかじめ−５℃で飽和させ、しっかりと栓をして、冷蔵庫で保存しておいたアンモニア（７３ｍＬ）で飽和させたメタノール中の化合物１０（７．３ｇ、０．０１６ｍｏｌ）の溶液を、ステンレス鋼製ボンベ中１００℃で３時間加熱した。慎重に冷却した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物の水溶液を酢酸エチルで洗い、蒸発乾固させた。そのような手順を化合物１０の他の９つの試料（各々７．３ｇ）（１０の総量＝７３ｇ）に関して実施した。１０の残留物を併合し、無水エタノールで希釈して、冷却し、２’−デオキシ−β−Ｌ−シトシンを結晶として得た。固液抽出法（酢酸エチル中で１時間還流）によって２’−デオキシ−β−Ｌ−シトシンの結晶から痕跡量のベンズアミドを除去した。収量：化合物６  ２８．７５ｇ（７８．６％）、融点１４１−１４５℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δｐｐｍ８．２２及び８．００（２  ｂｒ  ｓ，２Ｈ，ＮＨ２），７．９８（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６，Ｊ＝７．５９Ｈｚ），６．１２（ｔ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝６．５Ｈｚ及びＪ＝７．６Ｈｚ），５．８９（ｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ＝７．５９Ｈｚ），５．３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ−３’），５．１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ−５’），４．２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），３．８０（ｑ，１Ｈ，Ｈ−４’，Ｊ＝３．６Ｈｚ及びＪ＝６．９Ｈｚ），３．６−３．５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’，Ｈ−５”），２．２−２．０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−２”）；ＦＡＢ＜０，（ＧＴ）ｍ／ｅ２２６（Ｍ−Ｈ）−，１１０（Ｂ）−；ＦＡＢ＞０（ＧＴ）２２８（Ｍ＋Ｈ）＋，１１２（Ｂ＋２Ｈ）＋；［α］Ｄ２０−５６．４８（ＤＭＳＯ中  ｃ＝１．０８）；ＵＶ（ｐＨ７）λｍａｘ＝２７０ｎｍ（ε＝１００００）。
【実施例３】
【０４４２】
２’−デオキシ−β−Ｌ−チミジン（β−Ｌ−ｄＴ）の立体選択的合成
【０４４３】
【化５６】
2008273960.tif 000065
３’，５’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２’−デオキシ−５−ヨード−β−Ｌ−ウリジン（１１）
化合物９（１０５．８ｇ、０．２４２ｍｏｌ）、ヨウ素（７６．８ｇ：Ｆｌｕｋａ、＞９９．８％、参照番号５７６５０）、硝酸セリウムアンモニウム（ＣＡＮ）（６６．４ｇ：Ａｌｄｒｉｃｈ、＞９８．５％、参照番号２１，５４７−３）及びアセトニトリル（２５５０ｍｌ）の混合物を８０℃で３時間攪拌し、次のこの反応混合物を室温で冷却して、化合物１１（８６．８ｇ、６３．５％）を結晶化させた；融点１９２−１９４℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δｐｐｍ．８．３４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．２−７．２（ｍ，１１Ｈ，２Ｃ６Ｈ５ＣＯ，Ｈ−６），６．３１（ｑ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝５．５Ｈｚ及びＪ＝８．７Ｈｚ），５．５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），４．７（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’，Ｈ−５”），４．５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），２．７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），２．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２”）；ＦＡＢ＜０，（ＧＴ）ｍ／ｅ５６１（Ｍ−Ｈ）−，２３７（Ｂ）−；ＦＡＢ＞０（ＧＴ）５６３（Ｍ＋Ｈ）＋；［α］Ｄ２０＋３９．０５（ＤＭＳＯ中  ｃ＝１．０５）；ＵＶ（ＥｔＯＨ９５）νｍａｘ＝２８１ｎｍ（ε＝９０００），νｍｉｎ＝２５４ｎｍ（ｓ＝４０００），νｍａｘ＝２２９ｎｍ（ε＝３１０００）；Ｃ２３Ｈ１９ＩＮ２Ｏ７について算定した分析値：Ｃ，４９．１３Ｈ，３．４１  Ｎ，４．９８  Ｉ，２２．５７。検出値：Ｃ，４９．３１  Ｈ，３．５３  Ｎ，５．０５  Ｉ，２２．３６。
【０４４４】
３’，５’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２’−デオキシ−３−Ｎ−トルオイル−β−Ｌ−チミジン（１３）
ジイソプロピルエチルアミン（５３．６ｍｌ：Ａｌｄｒｉｃｈ、＞９９．５％、参照番号３８，７６４−９）を含む無水ピリジン（１５３０ｍｌ）中の化合物１１（８６．６ｇ、０．１５４ｍｏｌ）の溶液に、０℃で少しずつ、ｐ−トルオイルクロリド（４０．６ｍｌ：Ａｌｄｒｉｃｈ、＞９８％、参照番号１０，６６３−１）を加えた。この反応混合物を室温で２時間攪拌し、次に水を加えて反応を停止させ、反応混合物を塩化メチレンで抽出した。有機相を水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥して、蒸発乾固させ、粗３’，５’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２’−デオキシ−３−Ｎ−トルオイル−５−ヨード−β−Ｌ−チミジン（１２）を得て、それを、さらなる精製を行わずに次の工程のために使用することができる。
【０４４５】
トリエチルアミン（４．３ｍＬ）を含むＮ−メチルピロリジノン（１３７５ｍｌ：Ａｌｄｒｉｃｈ、＞９９％、参照番号４４，３７７−８）中の粗混合物１２、酢酸パリジウム（３．４４ｇ：Ａｌｄｒｉｃｈ、＞９９．９８％、参照番号３７，９８７−５）及びトリフェニルホスフィン（８．０ｇ：Ｆｌｕｋａ、＞９７％、参照番号９３０９２）の溶液を室温で４５分間攪拌した。次に、テトラメチルチン（４２．４ｍＬ：Ａｌｄｒｉｃｈ、＞９９％、参照番号１４，６４７−１）をアルゴン下に０℃で滴下した。１００−１１０℃で一晩攪拌した後、この反応混合物を水に注ぎ入れ、ジエチルエーテルで抽出した。その有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液：トルエン中酢酸エチルの段階的勾配（０−１０％）］によって精製し、化合物１３を泡として得た（４２．３ｇ、２工程について４８．３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δｐｐｍ．８．３−７．２（ｍ，１５Ｈ，２Ｃ６Ｈ５ＣＯ，１ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＣＯ，Ｈ−６），６．２９（ｔ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝７．０Ｈｚ），５．７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），４．７−４．５（ｍ，３Ｈ，Ｈ−５’，Ｈ−５”，Ｈ−４’），２．７−２．６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−２”）；ＦＡＢ＜０，（ＧＴ）ｍ／ｅ５６７（Ｍ−Ｈ）−，４４９（Ｍ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＣＯ）−，２４３（Ｂ）−，１２１（Ｃ６Ｈ５ＣＯＯ）−；ＦＡＢ＞０（ＧＴ）１１３７（２Ｍ＋Ｈ）５６９（Ｍ＋Ｈ）＋，３２５（Ｍ−Ｂ）−，２４５（Ｂ＋２Ｈ）＋，１１９（ＣＨ３Ｃ６Ｈ５ＣＯ）＋。
【０４４６】
２’−デオキシ−β−Ｌ−チミジン
あらかじめ−５℃でアンモニアで飽和させ、しっかりと栓をして、冷蔵庫で保存しておいたメタノール（１８５０ｍＬ）中の化合物１３（４２．３ｇ、０．０７４ｍｏｌ）の溶液を室温で２日間攪拌した。溶媒を蒸発させた後、残留物を水で希釈し、酢酸エチルで数回洗った。水層を分離し、減圧下で蒸発させて、この残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶離液：メチレン中メタノールの段階的勾配（０−１０％）］によって精製し、エタノールから結晶化して、２’−デオキシ−β−Ｌ−チミジン（１１．６２ｇ、６４．８％）を得た：融点＝１８５−１８８℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δｐｐｍ１１．３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．７０（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６），６．２（ｐｔ，１Ｈ，Ｈ−１’），５．２４（ｄ，１Ｈ，ＯＨ−３’，Ｊ＝４．２Ｈｚ），５．０８（ｔ，１Ｈ，ＯＨ−５’，Ｊ＝５．１Ｈｚ），４．２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），３．７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），３．５−３．６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’，Ｈ−５”），２．１−２．０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−２”）；ＦＡＢ＜０，（ＧＴ）ｍ／ｅ  ４８３（２Ｍ−Ｈ）−，３４９（Ｍ＋Ｔ−Ｈ）−，２４１（Ｍ−Ｈ）−，１２５（Ｂ）−；ＦＡＢ＞０（ＧＴ）２４３（Ｍ＋Ｈ）＋，１２７（Ｂ＋２Ｈ）＋；）＋；［α］Ｄ２０−１３．０（ＤＭＳＯ中  ｃ＝１．０）；ＵＶ（ｐＨ１）νｍａｘ＝２６７ｎｍ（ε＝９７００），νｍｉｎ＝２３４ｎｍ（ε＝２０００）。
【実施例４】
【０４４７】
β−Ｌ−ｄＣ５’−Ｌ−バリルエステルの化学合成
β−Ｌ−ｄＣアミノエステルの合成の説明的例として、最初に（ＣＨ３）３ＳｉＣｌを使用してβ−Ｌ−ｄＣのアミン基を保護することによってβ−Ｌ−ｄＣ５’−Ｌ−バリルエステルを合成する。保護されたβ−Ｌ−ｄＣは、Ｎ−Ｂｏｃ  Ｌ−バリンの添加によってエステル化を受ける。次のこのエステルを脱保護して、β−Ｌ−ｄＣ５’−Ｌ−バリルエステルを生成する。アミノ酸エステルを合成するための他の方法は、参照してここに組み込まれる、米国特許第５，７００，９３６号及び同第４，９５７，９２４号に開示されている。Ｌ−ｄＡ、Ｌ−ｄＣ、Ｌ−ｄＴ及びＬ−ｄＵのＬ−バリニル５’−Ｏ−エステルが本発明の好ましい実施態様である。
【０４４８】
【化５７】
2008273960.tif 000066
【実施例５】
【０４４９】
４Ｎ−ｍＭＴｒ−２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジン（１、図１）
β−Ｌ−ｄＣ（１ｇ；４．４０ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（４４ｍｌ）中にとった。トリメチルシリル基（ＴＭＳＣｌ、３．３４ｍｌ、２６．４ｍｍｏｌ）で一時的に保護し、次にｍＭＴｒＣｌ（３．３８ｍｇ、１１ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、５４０ｍｇ、４．４０ｍｍｏｌ）を加えた後、この反応混合物を室温で３日間攪拌した｛Ａ．Ｎｙｉｌａｓ；Ｃ．Ｇｌｅｍａｒｅｃ；Ｊ．Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９０，４６，２１４９−２１６４｝。炭酸水素ナトリウムで抽出した後、有機層を水で洗い、蒸発させて、ジオキサン（４０ｍＬ）中にとった。アンモニア水（８．５ｍｌ）を滴下し、この反応混合物を一晩攪拌した。すべての揮発性物質の蒸発後、固体残留物をシリカゲルカラム｛溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２中ＭｅＯＨの段階的勾配（０−１０％）｝で精製して、所望化合物１（１．０２ｇ、４６．５％）を泡として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ８．３９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ，Ｄ２Ｏ  交換可能），７．７０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４−６．８（ｍ，１４Ｈ，（Ｃ６Ｈ５）２Ｃ（Ｃ６Ｈ４）ＯＣＨ３），６．２３（ｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．０２（ｔ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝６．５Ｈｚ），５．１６（ｄ，１Ｈ，ＯＨ−３’，Ｊ＝３．８Ｈｚ，Ｄ２Ｏ  交換可能），４．９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ−５’，Ｄ２Ｏ  交換可能），４．１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），３．７（ｍ，４Ｈ，Ｈ−４’，ＯＣＨ３），３．５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’，Ｈ−５”），２．１−１．８（２ｍ，２Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−２”）；ＦＡＢ＜０，（ＧＴ）ｍ／ｅ  ４９８（Ｍ−Ｈ）−，３８２（Ｂ）−；２２６（Ｍ−ｍＭＴｒ）−；ＦＡＢ＞０（ＧＴ）５００（Ｍ＋Ｈ）＋，２７３（ｍＭＴｒ）＋；ＵＶ（ＥｔＯＨ９５）λｍａｘ＝２７９ｎｍ；λｍｉｎ＝２５０ｎｍ。
【実施例６】
【０４５０】
４Ｎ−ｍＭＴｒ−２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンの５’−Ｌ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）バリンエステル（２、図２）
無水ＤＭＦ（３４ｍｌ）中の化合物１（１ｇ、２．００ｍｍｏｌ）の溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、３７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）バリン（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、５８７ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、６６０ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）を連続的に加えた｛Ｌ．Ｍ．Ｂｅａｕｃｈａｍｐ；Ｇ．Ｆ．Ｏｒｒ；Ｐ．Ｄｅ  Ｍｉｒａｎｄａ；Ｔ．Ｂｕｒｎｅｔｔｅ；Ｔ．Ａ．Ｋｒｅｎｉｔｓｋｙ；Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９２，３，１５７−１６４｝。この溶液を室温で攪拌した。４０時間後、この反応物にさらなるＤＭＡＰ（３７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（５８７ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ、６６０ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）を添加して、室温で４０時間攪拌した。この混合物をろ過し、減圧下でろ液からＤＭＦを除去して、その残留物をシリカゲルカラム｛溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２中ＭｅＯＨの段階的勾配（０−１０％）｝でクロマトグラフィー分離して、所望化合物２（５１５ｍｇ、３７％）を泡として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ８．４４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ，Ｄ２Ｏ  交換可能），７．７−６．８（ｍ，１５Ｈ，，Ｈ−６及び（Ｃ６Ｈ５）２Ｃ（Ｃ６Ｈ４）ＯＣＨ３），．６．２６（ｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．０６（ｔ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝６．６Ｈｚ），５．７（ｂｓ，１Ｈ，ＯＨ−３’，Ｄ２Ｏ  交換可能），４．２−４．０（ｍ，３Ｈ，Ｈ−３’，Ｈ−４’及びＣＨ），３．８−３．９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’，Ｈ−５”），３．７（ｓ，３Ｈ，，ＯＣＨ３），２．０−１．９（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−２”，ＣＨ），１．３６（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ３）３Ｃ），０．８６（ｍ，６Ｈ，（ＣＨ３）２ＣＨ）；ＦＡＢ＜０，（ＧＴ）ｍ／ｅ１３９５（２Ｍ−Ｈ）−，６９７（Ｍ−Ｈ）−，４２５（Ｍ−ｍＭＴｒ）−，３８２（Ｂ）−；２１６（ＢｏｃＶａｌ−Ｈ）−；ＦＡＢ＞０（ＧＴ）３８４（Ｂ＋２Ｈ）＋，２７３（ｍＭＴｒ）＋；５７（ＣＨ３）３Ｃ）＋；ＵＶ（ＥｔＯＨ９５）λｍａｘ＝２７９ｎｍ；λｍｉｎ＝２４９ｎｍ。
【実施例７】
【０４５１】
β−Ｌ−シチジンヒドロクロリドの５’−Ｌ−バリンエステル（３、図１）
化合物２（５００ｍｇ、０．７１５ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍｌ）中のトリフルオロ酢酸の２０％溶液に溶解し、トリイソプロピルシラン（１．４７ｍｌ、７１．５ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温で１時間攪拌し、バリンエステルをＥｔ２Ｏ中でトリフルオロ酢酸塩として沈殿させた。数回水と共蒸発させた後、沈殿物を水（２ｍｌ）中にとり、ジオキサン（２０ｍｌ）中のＨＣｌの飽和溶液で処理して、減圧下で蒸発させた。この処理を３回繰り返して、所望化合物３を最終的にエーテル中で塩酸塩として沈殿させた（２０７ｍｇ、７３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ９．７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，１／２ＮＨ２，Ｄ２Ｏ  交換可能），８．６（ｂｒ  ｓ，４Ｈ，１／２ＮＨ２，ＮＨ３，Ｄ２Ｏ  交換可能），７．９８（ｄ，１Ｈ，，Ｈ−６  Ｊ＝７．８Ｈｚ），．６．１７（ｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．１１（ｐｔ，１Ｈ，Ｈ−１’），５．５（ｂｓ，＜１Ｈ，ＯＨ−３’，Ｄ２Ｏ  交換可能），４．４（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’，Ｈ−５”），４．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），４．２−４．０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−４’，ＣＨ），３．８−３．９，３．７（ｓ，３Ｈ，，ＯＣＨ３），２．３−２．１（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−２”，ＣＨ），０．９４（ｄｄ，６Ｈ，（ＣＨ３）２ＣＨ，Ｊ＝３．７及び６．６Ｈｚ）；ＦＡＢ＜０，（ＧＴ）ｍ／ｅ  ３６１（Ｍ＋Ｃｌ）−，３２５（Ｍ−Ｈ）−，１１６（Ｖａｌ−Ｈ）−，１１０（Ｂ）−；２１６（ＢｏｃＶａｌ−Ｈ）−；ＦＡＢ＞０（ＧＴ）６５３（２Ｍ＋Ｈ）＋，３２７（Ｍ＋Ｈ）＋；１１２（Ｂ＋２Ｈ）＋；）＋；｛α｝Ｄ２０−２８．５７（ＤＭＳＯ中  ｃ＝０．４９）；ＵＶ（ＥｔＯＨ９５）λｍａｘ＝２７２ｎｍ（ε  ８７００）；λｍｉｎ＝２５５ｎｍ（ε  ７６００）；ＨＰＬＣｒｔ＝８．３７分（１ｍｌ／分の流速で３０分にプログラムした２０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム中０−５０％ＣＨ３Ｎの勾配）。
【実施例８】
【０４５２】
Ｎ４−アセチル−２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジン（４、図２）
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（９．２ｍｌ）中のヌクレオシド、β−Ｌ−ｄＣ（４１５ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）の懸濁液に無水酢酸（２０７μｌ、２．２０ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を室温で２４時間攪拌した［Ｖ．Ｂｈａｔ；Ｂ．Ｇ．Ｕｇａｒｋａｒ；Ｖ．Ａ．Ｓａｙｅｅｄ，Ｋ．Ｇｒｉｍｍ；Ｎ．Ｋｏｓｏｒａ；Ｐ．Ａ．Ｄｏｍｅｎｉｃｏ；Ｅ．Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９８９，８（２），１７９−１８３］。減圧下でＤＭＦを除去した後、生じた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー｛溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２中１５％ＭｅＯＨ｝によって精製し、エタノールから結晶化して、所望化合物（３１０ｍｇ、６３％）を得た；ｒａｐ１２８−１７０℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ１０．８６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ，Ｄ２Ｏ  交換可能），８．３１（ｄ，１Ｈ，，Ｈ−６，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．１８（ｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ＝７．５Ｈｚ），６．０９（ｔ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝６．３Ｈｚ），５．２５（ｄ，１Ｈ，ＯＨ−３’，Ｄ２Ｏ  交換可能，Ｊ＝４．２Ｈｚ），５．０３（ｔ，１Ｈ，ＯＨ−５’，Ｄ２Ｏ  交換可能，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．１−４．２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），３．８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），３．４−３．６（ｍ，２Ｈ，２Ｈ，Ｈ−５’，Ｈ−５”），２．２−２．３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），２．０８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．０−１．９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２”）；ＦＡＢ＜０，（ＧＴ）ｍ／ｅ８０６（３Ｍ−Ｈ）−，５３７（２Ｍ＋Ｈ）−，３６０（Ｍ＋Ｇ−Ｈ）−，２６８（Ｍ−Ｈ）−，１５２（Ｂ）−；ＦＡＢ＜０（ＧＴ）８０８（３Ｍ＋Ｈ）＋，５３９（２Ｍ＋Ｈ）＋，３６２（Ｍ＋Ｇ＋Ｈ）＋，２７０（Ｍ＋Ｈ）＋，１５４（Ｂ＋２Ｈ）＋，１１７（Ｓ）＋；ＵＶ（Ｈ２Ｏ）λｍａｘ＝２９７ｎｍ（ε  ８３００）；λｍｉｎ＝２７０ｎｍ（ε  ３５００）；λｍａｘ＝２４５ｎｍ（ε  １４４００）；λｍｉｎ＝２２６ｎｍ（ε  ５８００）；［α］Ｄ２０−８１．３１（ＤＭＳＯ中  ｃ＝１．０７）。
【実施例９】
【０４５３】
Ｎ４−［（ジメチルアミノ）メチレン］−２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジン（５、図３）
対応するＤ鏡像異性体の製造のために開発された公表手順に従って表題化合物を製造した［Ｓ．Ｇ．ＫｅｒｒとＴ．Ｉ．Ｋａｌｍａｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９４，８３，５８２−５８６］。ＤＭＦ（４．８ｍｌ）中のＬ−ｄＣ（５００ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）の溶液をジメチルホルムアミドジメチルアセタール（２．８ｍｌ、２１．０８ｍｍｏｌ）で処理し、室温で一晩攪拌した。この溶液を減圧下で蒸発させ、エタノールと共蒸発させた。エタノール／エーテルから結晶化して、表題化合物（５０１．２ｍｇ、８１％）を明黄色結晶として得た。融点１７４−１７６℃（ｌｉｔ．：Ｄ鏡像異性体については１８８−１９０℃）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ８．６０（ｓ，１Ｈ，Ｎ＝ＣＨ），８．００（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６），６．１５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’），５．９６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５），５．２２（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ−３’），５．０１（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ−５’），４．２０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），３．８０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），３．５６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’及びＨ−５”），３．１５及び３．０２（２ｓ，３Ｈ及び３Ｈ，Ｎ（ＣＨ３）２），２．２２−１．９０（２ｍ，１Ｈ及び１Ｈ，Ｈ−２’及びＨ−２”）；ＦＡＢ＞０（ＧＴ）８４７（３Ｍ＋Ｈ）＋，５６５（２Ｍ＋Ｈ）＋，２８３（Ｍ＋Ｈ）；ＦＡＢ＜０，（ＧＴ）ｍ／ｚ５９９（２Ｍ＋Ｃｌ）−３１７（Ｍ＋Ｃｌ）−，１６５（Ｂ）−。
【実施例１０】
【０４５４】
３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジン（６、図４）
Ｌ−ｄＣから出発し、Ｄ鏡像異性体の製造のためにＢｒｅｉｎｅｒら［Ｒ．Ｇ．Ｂｒｅｉｎｅｒ；Ｗ．Ｒｏｓｅ；Ｊ．Ａ．Ｄｕｎｎ；Ｊ．Ｅ．Ｍａｅ  Ｄｉａｒｍｉｄ及びＪ．Ｂａｒｄｏｓ；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９０，３３、２５９６−２６０３］によって開発された手順に従って、１工程で表題化合物を合成した。氷酢酸（４．８ｍｌ）中のＬ−ｄＣ（７６５ｍｇ、３．３７ｍｍｏｌ）及び塩化アセチル（９６０μｌ、１３．４８ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１０分間攪拌し、次にクロロホルム（３．５ｍｌ）を加えて、２４時間攪拌を続けた。この溶液を減圧下で蒸発させ、エタノールと共蒸発させた。エタノールから結晶化して、所望化合物を７８％の収率で得た。融点１９２−１９３℃（ｌｉｔ：Ｄ鏡像異性体については１８７−１８９℃［Ｂｒｅｉｎｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９０，３３、２５９６−２６０３］）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ９．８及び８．７（２  ｂｒ  ｓ，＜３Ｈ，ＮＨ３＋，Ｄ２Ｏ  交換可能），８．０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６  Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．１８（ｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．０８（ｔ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝６．７Ｈｚ），５．２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），４．３−４．１（ｍ，３Ｈ，Ｈ−４’，Ｈ−５’，Ｈ−５”），２，４−２，５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−２”），２．０６及び２．０３（２  ｓ，６Ｈ，２  ＣＨ３）；ＦＡＢ＜０，（ＧＴ）ｍ／ｅ  ９６８（３Ｍ＋Ｃｌ）−，６５７（２Ｍ＋Ｃｌ）−，４３８（Ｍ＋Ｇ＋Ｃｌ）−，３４６（Ｍ＋Ｃｌ）−，３１０（Ｍ−Ｈ）−，１１０（Ｂ）−；５９（ＣＨ３ＣＯＯ）−；ＦＡＢ＞０（ＧＴ）６２３（２Ｍ＋Ｈ）＋，３１２（Ｍ＋Ｈ）＋，２０１（Ｓ）＋，１１２（Ｂ＋２Ｈ）＋，４３（ＣＨ３ＣＯ）＋；［α］Ｄ２０３６．２７（ＤＭＳＯ中  ｃ＝１．０２）；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ＝２７７ｎｍ（ε  ９９００）；λｍｉｎ＝２４６ｎｍ（ε  ５０００）。
【実施例１１】
【０４５５】
２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンの３’，５’−Ｌ−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）バリンジエステル（９、図５）
ＤＭＦ（３５ｍｌ）中のＮ４−［（ジメチルアミノ）メチレン］−２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジン（７、５００ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（１．３１ｇ、６．０３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（８６．５ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）（１．３６ｇ、７．０９ｍｍｏｌ）で処理し、室温で４０時間攪拌した。追加量のＢｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（６５５ｍｇ、３．０１ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４３．２ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（６８０ｍｇ、３．５５ｍｍｏｌ）を加え、この溶液をさらに２０時間攪拌した。減圧下で蒸発させた後、残留物をＣＨ２Ｃｌ２中にとり、水で数回抽出した。有機相をブライン（１００ｍｌ）で洗って、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で蒸発させて、８を粗物質として得、これをさらなる精製を行わずに次の工程のために使用した。残留物をジオキサン（１８ｍｌ）中にとり、２６％ＮＨ４ＯＨ水溶液で処理して、室温で１時間攪拌した。この溶液を減圧下で蒸発させ、残留物を、ＣＨ２Ｃｌ２中のＭｅＯＨの段階的勾配（０−５％）を用いてシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製し、表題化合物を得た（６９８．７ｍｇ、９から５８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ７．５８（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６），７．２９−７．１８（ｍ，４Ｈ，ＮＨ−Ｂｏｃ及びＮＨ２），６．２０（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’），５．７５（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５），５．２０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，Ｈ−３’），４．２９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’及びＨ−５”），４．１４（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，Ｈ−４’），３．８６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ−ＮＨ−Ｂｏｃ），２．３１−２．２１（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２’及びＨ−２”），２．１３−１．９８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ（ｉＰｒ）），１．３８及び１．３６（２ｓ，１８Ｈ，ｔＢｕ），０．８８及び０．８５（２  ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１２Ｈ，ＣＨ（ＣＨ３）２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ１７２．６７及び１７２．４６，１６６．４１，１５６．６４及び１５５．７０，１４１．３９，９５．４３，８５．７８，８２．０３，７９．１４，７５．５７，６４．９０，６０．３７及び６０．１１，３７．４０，３０．３３，２９．００，１９．８３−１９．１２；ＦＡＢ＞０（ＧＴ）６２６（Ｍ＋Ｈ）＋，１１２（Ｂ＋２Ｈ）＋，２５５（Ｍ−Ｂｏｃ）＋；ＦＡＢ＜０，（ＧＴ）ｍ／ｚ１２４９（２Ｍ−Ｈ）−，６２４（Ｍ−Ｈ）−。
【実施例１２】
【０４５６】
２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンヒドロクロリドの３’，５’−Ｌ−バリンエステル（１０、図５）
ジオキサン（３０ｍｌ）中の９（６７５ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）の溶液をジオキサン（３０ｍｌ）中の２６％ＨＣｌの溶液で処理し、室温で１時間５５分攪拌した。生じた白色懸濁液を減圧下で蒸発させた。白色固体残留物を極微量のＭｅＯＨ中にとり、エーテル中で沈殿させて、表題化合物１０を白色固体として得た。融点１８７℃（分解）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ９．７９（ｂｒ  ｓ、１Ｈ、１／２ＮＨ２）、８．７２（ｂｒ  ｓ、７Ｈ、１／２ＮＨ２及びＮＨ３＋）、８．０４（ｄ、１Ｈ、Ｈ−６）、６．２１（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−５）、６．１６（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−１’）、５．３９（ｍ、１Ｈ、Ｈ−３’）、４．５０−４．４０（ｍ、３Ｈ、Ｈ−４’、Ｈ−５’及びＨ−５”）、３．９０（２  ｂｒ．ｄ、２Ｈ、ＣＨ−ＮＨ３＋）、２．６３−２．５０（２ｍ、２Ｈ、Ｈ−２’及びＨ−２”）、２．２１（ｍ、２Ｈ、ＣＨ（ｉＰｒ））、１．０２−０．９４（ｍ、１２Ｈ、ＣＨ（Ｈ３）２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ１６９．５０及び１６８．９４、１６１．０２、１４８．５０、１４５．２６、９５．１８、８７．１９、８２．１５、７６．１４、６５．７７及び６５．５９、５８．１２及び５８．０７、３７．００、３０．１６、１９．２６−１８．５１；ＦＡＢ＞０（ＧＴ）４２６（Ｍ＋Ｈ）＋、１１２（Ｂ＋２Ｈ）＋；ＦＡＢ＜０、（ＧＴ）  ｍ／ｚ  ８８５（２Ｍ＋Ｃｌ）−、４６０（Ｍ＋Ｃｌ）；ＵＶ（Ｈ２Ｏ）λｍａｘ＝２７０ｎｍ（ε  ７６００）。
【実施例１３】
【０４５７】
２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンのＮ４−Ｂｏｃ−バリニルエステル（１３、図６）
無水ＴＨＦ（８０ｍｌ）中のＬ−ｄＣ（１．８０ｇ、７．９２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（８．８ｍｌ、６３．１４ｍｍｏｌ）の混合物をクロロトリメチルシラン（６ｍｌ、４７．２８ｍｍｏｌ）で処理し、室温で一晩攪拌した。ＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液（２６ｍｌ）及び水（１０ｍＬ）を加えて反応を停止させた。水層をＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機層を併合し、ブラインで洗って、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で蒸発させて、１１を含有する粗明黄色泡−油を得、それをさらなる精製を行わずに次の工程のために使用した。この残留物をＣＨ２Ｃｌ２（１０４ｍｌ）中にとり、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）バリン（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、１．７２ｇ、７．９０ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ、４．２０ｇ、９．５０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２．２ｍｌ、１５．７８ｍｍｏｌ）で処理し、室温で２日間攪拌した。この溶液をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で２回抽出した。有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で蒸発させて、１２を粗物質として得、それをさらなる精製を行わずに次の工程のために使用した。この残留物をジオキサン（８０ｍｌ）中にとり、２６％ＮＨ４ＯＨ水溶液で処理して、室温で６時間４５分攪拌した。この溶液を減圧下で蒸発させ、無水ＥｔＯＨと共蒸発させて、残留物を、ＣＨ２Ｃｌ２中のＭｅＯＨの段階的勾配（５−１０％）を用いてシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製し、表題化合物１３を泡として得た（１．６４ｇ、全体的収率４８．５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ１０．８８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−４），８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５），７．０６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ−ＮＨ−Ｂｏｃ），６．１５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’），５．３２（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ−３’），５．０９（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ−５’），４．２７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），４．０６（ｐｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ−ＮＨ−Ｂｏｃ），３．９１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），３．６３（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’及びＨ−５”），２３５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２”），２．０６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２’及びＣＨ（ＣＨ３）２），１．４３（ｓ，９Ｈ，ｔＢｕ），０．９２（ｐｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ（ＣＨ３）２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ１７４．４１，１６２．９４，１５６．４７，１５５．２４，１４６．１０，９６．０６，８８．７９，８７．１０，７９．０９，７０．７５，６１．７８，６１．５５，４１．７４，３０．６３，２９．０２，１９．９１及び１９．１０；ＦＡＢ＞０（ＧＴ）８５３（２Ｍ＋Ｈ）＋，４２７（Ｍ＋Ｈ）＋３１１（Ｂ＋２Ｈ）＋，２５５（Ｍ−Ｂｏｃ）＋；ＦＡＢ＜０，（ＧＴ）ｍ／ｚ８５１（２Ｍ−Ｈ）−，４２５（Ｍ−Ｈ）−，３０９（Ｂ）−。
【実施例１４】
【０４５８】
３’，５’−Ｎ４−トリバリル−２’−デオキシシチジン（１４、図７）
出発物質、３’，５’−Ｎ４−トリ（Ｂｏｃ−バリル）−２’−デオキシシチジンをＣＨ２Ｃｌ２に溶解したが、幾分かの不溶性物質が存在したため、試料をＰｅｒｌｉｔａでろ過した。これは、使用するＣＨ２Ｃｌ２の容量増加を生じさせた。次に、ＨＣｌ／ジオキサン試薬を攪拌しながら添加した。数秒以内にこの溶液中で幾分かの気泡が観察でき、その後混合物は混濁した。この混合物を室温で約１時間攪拌した。この時間中に、沈殿物はより結晶性になった。この混合物を速やかにろ過し、ろ過ケーキをＣＨ２Ｃｌ２で洗って、次にポンプ上で乾燥して、クリーム状の白色結晶０．１６ｇ（６９％）を得た。試薬及び条件を以下の表１においてより明瞭に示す：
【０４５９】
【表１２】
2008273960.tif 000067
【実施例１５】
【０４６０】
ジＢｏｃバリル−２’−ｄＣ及びジＢｏｃバリル−２’−ｄＵに関するＨＰＬＣアッセイ法
所望化合物を無水エタノールに溶解して、１．０ｍｇ／ｍＬ試料を作製した。次にこの溶液を、０．１６ｍｇ／ｍＬの濃度が得られるまで５０％ＭｅＯＨ及び５０％ＫＨ２ＰＯ４（０．０１５Ｍ、ｐＨ＝３．３０−３．５０）を含む溶液で希釈した。（注：使用したすべての溶媒は、使用前に脱気した。）その後直ちにこの溶液２０μＬをＷＡＴＥＲＳからのＨＰＬＣカラム（ＮＯＶＡＰＡＫ  Ｃ１８−４ｐｍ−３．９×１５０ｍｍ）に注入した。流速は１ｍＬ／分に設定し、カラム温度は３５℃に設定した。化合物を検出するため、波長検出は、１５分後のジ−Ｂｏｃ２’ｄＣについては２７５ｎｍ、ジ−Ｂｏｃ２’ｄＵについては２６０ｎｍ及び不純物については２０４ｎｍに設定した。カラムに、ポンプＡではＫＨ２ＰＯ４（０．０１５Ｍ、ｐＨ＝３．３０−３．５０、Ｈ３ＰＯ４１０％ｖ／ｖで調整）及びポンプＢではＨＰＬＣグレードのアセトニトリルを通した。勾配パターンを表２に示す。
【０４６１】
【表１３】
2008273960.tif 000068
【０４６２】
ＩＸ．活性化合物の薬物動態
ヒトＤＮＡポリメラーゼ及びミトコンドリア機能はインビトロでＬ−ｄＣによって影響を受けなかった。Ｌ−ｄＣは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄前駆細胞及びヒト及び他の非ヒト哺乳類由来の数多くの細胞系統に対して非細胞傷害性であった。
【０４６３】
抗ウイルス性ヌクレオシド及びヌクレオシド類似体は、ウイルス複製の間にウイルスポリメラーゼのレベルで細胞内三リン酸誘導体としてそれらの抗ウイルス作用を及ぼす。天然ヌクレオシド（Ｄ−デオキシシチジン及びＤ−チミジン）及び抗ウイルス性ヌクレオシド類似体（例えばラミブジン及びジドブジン）と同様に、Ｌ−ｄＣはリン酸化によって細胞内で活性化された。ヒト肝細胞においては、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）がＬ−ｄＣの５’一リン酸（ＭＰ）誘導体への用量依存的初期変換の役割を担った。次にＬ−ｄＣ−ＭＰは５’二リン酸（ＤＰ）形態へと変換され、その後それが、主要な細胞内５’三リン酸（ＴＰ）代謝産物へと変換された。Ｌ−ｄＣ−ＴＰレベルは、Ｌ−ｄＣ  １０μＭに暴露したＨｅｐＧ２細胞において２４時間目に７２．４μＭに達し（一次ヒト肝細胞では９０．１μＭ）、１５．５時間の細胞内半減期を有していた。一次培養中のＨｅｐＧ２細胞又はヒト肝細胞のＬ−ｄＣへの暴露はまた、第二のＴＰ誘導体、β−Ｌ−２’−デオキシウリジン５’三リン酸（Ｌ−ｄＵ−ＴＰ）を生成した。Ｌ−ｄＵ−ＴＰレベルは、Ｌ−ｄＣ  １０μＭに暴露したＨｅｐＧ２細胞において２４時間目に１８．２μＭに達した（一次ヒト肝細胞では４３．５μＭ）。
【０４６４】
一次ヒト肝細胞培養及びヒト肝細胞癌細胞系統（ＨｅｐＧ２）において、Ｌ−ｄＣの主要代謝産物はＬ−ｄＣ−ＴＰであった。これらの細胞のＬ−ｄＣへの暴露はまた、Ｌ−ｄＵ−ＴＰの形成も導いた。Ｌ−ｄＣ−ＴＰ及びＬ−ｄＵ−ＴＰは、試験した最高濃度である１００μＭの濃度まで、ヒトＤＮＡポリメラーゼα、β及びγを阻害しなかった。
【実施例１６】
【０４６５】
溶解度試験
天然デオキシリボシトシン（Ｄ−ｄＣ）、Ｌ−ｄＣの３’−バリニルエステル及びＬ−ｄＣの３’，５’−ジバリニルエステルの水への溶解度を比較した。表３に示すように、様々な周知の濃度のβ−Ｌ−ｄＣを連続的に注入してＨＰＬＣデータ（すなわち曲線下面積）を解析することにより、最初にＬ−ｄＣの溶解度を評価した。ＨＰＬＣは、流速１ｍＬ／分で１５分間にプログラムした２０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡｃ）中ＣＨ３ＣＮの０−２５％の勾配で、Ｎｏｖａ−Ｐａｃｋ  Ｃ１８カラム（３．９×１５０ｍｍ）で実施した。溶液の濃度対曲線下面積は、ｙ＝４１５００４９４７７ｘ−４３３４．４６８４５の線形関係を生じた（図８ａ）。
【０４６６】
【表１４】
2008273960.tif 000069
【０４６７】
これより、天然デオキシリボシトシン（Ｄ−ｄＣ）に関する飽和溶液を調製した；３つの試料をとり、ＨＰＬＣに注入した。この飽和溶液の濃度は１．０７、１．０８及び０．９６ｍｏｌ／Ｌと測定された；それ故、この飽和溶液は１．０３ｍｏｌ／Ｌ又は２７２ｇ／Ｌの平均飽和濃度を有していた。その結果を表４に示す。
【０４６８】
【表１５】
2008273960.tif 000070
【０４６９】
同様に、β−Ｌ−ｄＣの３’−バリニルエステルヒドロクロリドの水への溶解度を評価した。検量線は、表５に示すように、様々な濃度のβ−Ｌ−ｄＣの３’−バリニルエステルヒドロクロリドをＨＰＬＣに連続的に注入し、曲線下面積を測定することによって決定した。やはり、流速１ｍＬ／分で１５分間にプログラムした２０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡｃ）中ＣＨ３ＣＮの０−２５％の勾配で、Ｎｏｖａ−Ｐａｃｋ  Ｃ１８カラム（３．９×１５０ｍｍ）でＨＰＬＣを実施した。溶液の濃度対曲線下面積は、ｙ＝３１７６４２３９６３ｘ−３３０５１．６３の線形関係を生じた。
【０４７０】
【表１６】
2008273960.tif 000071
【０４７１】
これより、β−Ｌ−ｄＣの３’−バリニルエステルヒドロクロリドについての飽和溶液を試みた；しかし、飽和溶液は得られなかった。それ故、実験室で容易に入手可能なβ−Ｌ−ｄＣの３’−バリニルエステルヒドロクロリドの最大量を水に溶解した。３つの試料を収集し、ＨＰＬＣからの曲線下面積より、１．０１３、０．９９６及び１．０５９ｍｏｌ／Ｌの平均濃度を有すると決定した。その結果を表６に示す。
【０４７２】
【表１７】
2008273960.tif 000072
【０４７３】
３つの結果はすべて、検量線から算定した予測範囲内であり、これらの高濃度での化合物の完全な溶解度を指示し、この試料の飽和溶液は３つの試料の平均を上回ること、すなわち１．０２３ｍｏｌ／Ｌ又は４０８ｇ／Ｌより大きいことを示す。
【０４７４】
β−Ｌ−ｄＣの３’，５’−ジバリニルエステルヒドロクロリドの水への溶解度を評価した。検量線は、表７に示すように、様々な濃度のβ−Ｌ−ｄＣの３’，５’−ジバリニルエステルヒドロクロリドをＨＰＬＣに連続的に注入し、曲線下面積を測定することによって決定した。流速１ｍＬ／分で１５分間にプログラムした２０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡｃ）中ＣＨ３ＣＮの０−２５％の勾配で、Ｎｏｖａ−Ｐａｃｋ  Ｃ１８カラム（３．９×１５０ｍｍ）でＨＰＬＣを実施した。溶液の濃度対曲線下面積は、ｙ＝３１７６４２３９６３ｘ−３３０５１．６３の線形関係を生じた（図８ｂ）。
【０４７５】
【表１８】
2008273960.tif 000073
【０４７６】
これより、β−Ｌ−ｄＣの３’，５’−ジバリニルエステルヒドロクロリドについての飽和溶液を試みた；しかし、飽和溶液は得られなかった。それ故、実験室で容易に入手可能なβ−Ｌ−ｄＣの３’，５’−ジバリニルエステルヒドロクロリドの最大量を水に溶解した。３つの試料を収集し、ＨＰＬＣからの曲線下面積より、２．８、２．４及び２．４ｍｏｌ／Ｌの平均濃度を有すると決定した。その結果を表８に示す。
【０４７７】
【表１９】
2008273960.tif 000074
【０４７８】
３つの結果はすべて、検量線から算定した予測範囲内であり、これらの高濃度での化合物の完全な溶解度を指示し、この試料の飽和溶液は３つの試料の平均を上回ること、すなわち２．５ｍｏｌ／Ｌ又は１３３７ｇ／Ｌより大きいことを示す。
【０４７９】
同様に、β−Ｌ−ｄＣの５’−バリニルエステルヒドロクロリド（５．１ｍｏｌ／Ｌ又は１６６４ｇ／Ｌ以上）及びβ−Ｌ−ｄＣの３’，５’−ジアセチルエステルヒドロクロリド（３．３ｍｏｌ／Ｌ又は１１４８ｇ／Ｌ）に関する溶解度試験を実施した。その累積結果を表９に示す。
【０４８０】
【表２０】
2008273960.tif 000075
【０４８１】
ｌｏｇＰ試験−リン酸緩衝液
Ｄ−ｄＣ  約１．５ｍｇを、オクタノール−１（Ｂ）で飽和させた、一塩基リン酸カリウム溶液（２８．５ｍＬ）及び二塩基リン酸カリウム溶液（７１．５ｍＬ）の混合物から作製した、０．０２Ｍリン酸緩衝液（Ａ、１００ｍＬ、ｐＨ７．２）２．２ｍＬに溶解した。この溶液１ｍＬに、０．０２Ｍリン酸緩衝液（Ａ）で飽和させたオクタノール−１（Ｂ）１ｍＬを加えた。生じた混合物を振とうし、遠心分離した；表１０に示すように、各々の相から３つの試料を収集し、ＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣは、流速１ｍＬ／分で１５分間にプログラムした２０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡｃ）中０−２５％のＣＨ３ＣＮの勾配で、Ｎｏｖａ−Ｐａｃｋ  Ｃ１８カラム（３．９×１５０ｍｍ）で実施した。Ｄ−ｄＣのｌｏｇＰは−１．４１であることが認められた；それ故、Ｄ−ｄＣはオクタノールよりも水を好む。
【０４８２】
【表２１】
2008273960.tif 000076
【０４８３】
同様に、Ｌ−ｄＣ−３’−バリンエステルヒドロクロリド約１．５ｍｇを、一塩基リン酸カリウム溶液（２８．５ｍＬ）及び二塩基リン酸カリウム溶液（７１．５ｍＬ）の混合物から作製した、０．０２Ｍリン酸緩衝液（Ａ、１００ｍＬ、ｐＨ７．２）２．５ｍＬに溶解した。次にこの溶液をオクタノール−１（Ｂ）で飽和させた。この溶液１ｍＬに、０．０２Ｍリン酸緩衝液（Ａ）で飽和させたオクタノール−１（Ｂ）１ｍＬを加えた。生じた混合物を振とうし、遠心分離した；表１１に示すように、各々の相から３つの試料を収集し、ＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣは、流速１ｍＬ／分で１５分間にプログラムした２０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡｃ）中０−２５％のＣＨ３ＣＮの勾配で、Ｎｏｖａ−Ｐａｃｋ  Ｃ１８カラム（３．９×１５０ｍｍ）で実施した。
【０４８４】
【表２２】
2008273960.tif 000077
2008273960.tif 000078
【０４８５】
Ｌ−ｄＣ−３’−バリンエステルヒドロクロリドのｌｏｇＰは−１．５３であることが認められた；それ故、Ｌ−ｄＣ−３’−バリンエステルは、Ｄ−ｄＣよりも大きな度合でオクタノールよりも水を好む。
【０４８６】
Ｌ−ｄＣ−５’−バリンエステルヒドロクロリド及びＬ−ｄＣ−３’，５’−ジバリンエステルヒドロクロリドについてｌｏｇＰ値を算定した。その結果を表１２に示す。但し、Ｌ−ｄＣ−３’，５’−ジバリンエステルヒドロクロリドについてのｌｏｇＰ値はおそらく測定された値（−０．８６）よりも低いであろうことに留意しなければならない。実験中に、ジバリンエステルから３’−又は５’−モノバリニルエステルへ、さらにはＬ−ｄＣへの有意の変換が認められた。Ｌ−ｄＣ−３’，５’−ジバリンエステルヒドロクロリドの変換の５０％が水相で、及び１４％が有機相で検出された。この変換は、７のｐＨのリン酸緩衝液中でのこのエステルの不安定性によるものである（実施例１５及び１６参照）。
【０４８７】
【表２３】
2008273960.tif 000079
【０４８８】
ｌｏｇＰ試験−ＭｉｌｌｉＱ水
ジバリンエステルのモノエステル及びＬ−ｄＣへの変換を回避するために、リン酸緩衝液の代わりにＭｉｌｌｉＱ水（Ａ’）（ｐＨ７．２の代わりに６．５）を使用して代替的なｌｏｇＰ試験を実施した。ジバリニルエステルの塩酸塩形態だけが水中で考慮されうることに留意することが重要である。Ｌ−ｄＣ−３’，５’−ジバリニルエステルヒドロクロリド約１．５ｍｇを、オクタノール−１（Ｂ）で飽和させたＭｉｌｌｉＱ水（Ａ’、ｐＨ６．５）２．２ｍＬに溶解した。この溶液１ｍＬに、ＭｉｌｌｉＱ水（Ａ’）で飽和させたオクタノール−１（Ｂ）１ｍＬを加えた。生じた混合物を振とうし、遠心分離した；表１３に示すように、各々の相から３つの試料を収集し、ＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣは、流速１ｍＬ／分で１５分間にプログラムした２０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡｃ）中０−２５％のＣＨ３ＣＮの勾配で、Ｎｏｖａ−Ｐａｃｋ  Ｃ１８カラム（３．９×１５０ｍｍ）で実施した。これらの条件下で３’，５’−ジバリンのｌｏｇＰ’は−２．７２であることが認められ、リン酸緩衝液中の対イオンの強い作用を指示した。ジバリンのモノエステル又はＬ−ｄＣへの変換は、水相又は有機相のいずれにおいても認められなかった。
【０４８９】
【表２４】
2008273960.tif 000080
【０４９０】
同様に、Ｌ−ｄＣ−５’−バリニルエステルヒドロクロリド約１．５ｍｇを、オクタノール−１（Ｂ）で飽和させたＭｉｌｌｉＱ水（Ａ’、ｐＨ６．５）２．２ｍＬに溶解した。この溶液１ｍＬに、ＭｉｌｌｉＱ水（Ａ’）で飽和させたオクタノール−１（Ｂ）１ｍＬを加えた。生じた混合物を振とうし、遠心分離した；表１４に示すように、各々の相から３つの試料を収集し、ＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣは、流速１ｍＬ／分で１５分間にプログラムした２０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡｃ）中０−２５％のＣＨ３ＣＮの勾配で、Ｎｏｖａ−Ｐａｃｋ  Ｃ１８カラム（３．９×１５０ｍｍ）で実施した。これらの条件下で５’−バリンのｌｏｇＰは−２．７５であることが認められ、やはりリン酸緩衝液を使用したｌｏｇＰ試験で認められたものよりも低い値であった。
【０４９１】
【表２５】
2008273960.tif 000081
【０４９２】
これらの条件下で、Ｌ−ｄＣ−５’−バリニルエステルヒドロクロリドとＬ−ｄＣ−３’，５’−ジバリニルエステルヒドロクロリドのｌｏｇＰ’値は非常に類似している（表１５）。
【０４９３】
【表２６】
2008273960.tif 000082
【０４９４】
ｐＨ７．４での安定性試験
Ｌ−ｄＣ−３’−バリンエステルヒドロクロリドの各々の代謝産物の分解速度を算定した。７．４０のｐＨでのＬ−ｄＣ−３’−バリンエステルヒドロクロリドの半減期は、３７℃の０．２Ｍトリス−ＨＣｌ溶液中で７時間と測定された。これらの条件では、Ｌ−ｄＣ−３’−バリンエステルヒドロクロリドは単純にＬ−ｄＣに変換される。シトシンは検出されず、それ故、検出可能なグリコシド結合の切断は存在しなかった。
【０４９５】
同様に、Ｌ−ｄＣ−３’，５’−ジバリンエステルヒドロクロリドの各々の代謝産物の分解速度を算定した。７．４２のｐＨでのＬ−ｄＣ−３’，５’−ジバリンエステルヒドロクロリドの半減期は、３７℃の０．２Ｍトリス−ＨＣｌ溶液中で２．４時間と測定された。これらの条件において、Ｌ−ｄＣ−３’，５’−ジバリンエステルヒドロクロリドは部分的に３’−及び５’−バリニル−Ｌ−ｄＣへと加水分解され、それらは後程Ｌ−ｄＣへと変換される。シトシンは検出されず、それ故、検出可能なグリコシド結合の切断は存在しなかった（スキーム４、図９ａ及び９ｂ）。
【０４９６】
【化５８】
2008273960.tif 000083
【０４９７】
ｐＨ７．２０での安定性試験
７．２０のｐＨでのＬ−ｄＣ−３’，５’−ジバリンエステルヒドロクロリドの半減期は、２０ｍＭリン酸緩衝液中で２．２時間と測定された。これらの条件において、Ｌ−ｄＣ−３’，５’−ジバリンエステルヒドロクロリドは部分的に３’−及び５’−バリニル−Ｌ−ｄＣへと加水分解され、それらは後程Ｌ−ｄＣへと変換される。シトシンは検出されず、それ故、検出可能なグリコシド結合の切断は存在しなかった（スキーム５、図１０ａ及び１０ｂ）。
【０４９８】
【化５９】
2008273960.tif 000084
【０４９９】
ｐＨ４．５での安定性試験
４．５のｐＨでのＬ−ｄＣ−３’−バリンエステルヒドロクロリドの半減期は、２０ｍＭ酢酸緩衝液中で８．６日間と測定された。やはり、Ｌ−ｄＣ−３’−バリンエステルヒドロクロリドは単純にＬ−ｄＣに変換される。シトシンは検出されず、それ故、検出可能なグリコシド結合の切断は存在しなかった。
【０５００】
同様に、４．５１のｐＨでのＬ−ｄＣ−３’，５’−ジバリンエステルヒドロクロリドの半減期は、２０ｍＭ酢酸緩衝液中で４４時間と測定された。これらの条件において、Ｌ−ｄＣ−３’，５’−ジバリンエステルヒドロクロリドは部分的に３’−及び５’−バリニル−Ｌ−ｄＣへと加水分解され、それらは後程Ｌ−ｄＣへと変換される。シトシンは検出されず、それ故、検出可能なグリコシド結合の切断は存在しなかった（図１１ａ及び１１ｂ）。
【０５０１】
ｐＨ１．２での安定性試験
１．２のｐＨでのＬ−ｄＣ−３’−バリンエステルヒドロクロリドの半減期は、１３５ｍＭ  ＫＣｌ−ＨＣｌ緩衝液中で４８時間以上と測定された。シトシンは検出されず、それ故、検出可能なグリコシド結合の切断は存在しなかった。
【０５０２】
同様に、Ｌ−ｄＣ−５’−バリンエステルヒドロクロリドに関する安定性試験を実施した。この化合物は１．２のｐＨで完全に安定であり、２３時間まで他の代謝産物又は分解産物は検出されなかった。グリコシド結合の切断は、溶液中で２日間まで検出されなかった。
【０５０３】
Ｌ−ｄＣの３’，５’−ジアセチルエステルは、１．２のｐＨで１１．２時間の半減期を有することが認められた。これらの条件下でこの化合物は部分的に３’−又は５’−誘導体へと加水分解され、それらは後程Ｌ−ｄＣに変換された。グリコシド結合の切断は、溶液中で２日間まで検出されなかった。
【０５０４】
Ｌ−ｄＣの３’，５’−ジバリニルエステルは、これらの条件下で４８時間まで他の化合物が検出されなかったので、１．２３のｐＨで完全に安定であることが認められた。グリコシド結合の切断は、溶液中で２日間まで検出されなかった（図１２）。
【０５０５】
代替的に、Ｌ−ｄＣのＮ４位置をジメチルアミノメチレン又はアセチルでマスクしたとき、１．２のｐＨでのこの化合物の半減期は、それぞれわずかに２６分又は５０分である。
【０５０６】
カニクイザルにおけるＬ−ｄＣの単回投与のバイオアベイラビリティー
カニクイザルへのＬ−ｄＣのＩＶ及び経口投与後のＬ−ｄＣの薬物動態を測定した。この試験では、１０ｍｇ／ｋｇのトリチウム（［３Ｈ］）放射標識Ｌ−ｄＣを３匹のカニクイザルに単回ＩＶ用量として投与した。６週間のウォッシュアウト期間後、同じ３匹のサルに同一経口用量のＬ−ｄＣを投与した。投与前及び投与後０．２５、０．５、１、２、３、６、８及び２４時間目に薬物動態分析のための血液試料を採集した。投与前及び投与後以下の間隔：０−２、２−４、４−８及び８−１２時間、及びその後は投与後３３６時間まで１２時間間隔で、ｐａｎ  ｃａｔｃｈによって薬物動態分析のための尿試料を採集した。逆相高速液体クロマトグラフィー手法を用いて薬剤を検出し、濃度を測定した。血液及び尿中の薬剤濃度データを非モデリング数理法及び線形台形公式から導かれるＡＵＣによって分析した。
【０５０７】
Ｌ−ｄＣの静脈内投与。ＩＶ投与後のＬ−ｄＣの平均Ｃｍａｘは９５．７μＭであり、すべての動物に関して最も早い試料採取時点（投与後１５分）で生じた。Ｌ−ｄＣの血漿中濃度はＩＶボーラス後経時的に低下し、平均ｔ１／２は１．５９時間であった。ＩＶ投与後のＬ−ｄＣの総クリアランス（ＣＬ）及び腎クリアランス（ＣＬＲ）は、それぞれ平均０．５３Ｌ／時／ｋｇ及び０．４６Ｌ／時／ｋｇであった。１．２２Ｌ／ｋｇの分布の平均見かけ容積（Ｖｄ）は、Ｌ−ｄＣが有意の血管外組織分布を有することを指示した。
【０５０８】
尿排泄は速やかであり、投与用量の７１％が２時間以内に回収された。Ｌ−ｄＣは尿中で回収された用量の大部分（９４％）を占めた。腎クリアランス（０．４６Ｌ／時／ｋｇ）は総Ｌ−ｄＣクリアランスの８７％を占め、腎排泄が主要排出経路であることを示唆した。
【０５０９】
Ｌ−ｄＵが血漿及び尿中で検出され、ＩＶ投与後にＬ−ｄＣの代謝排出も起こることを示した。低レベルのＬ−ｄＵが、血漿中で検出限界（検出下限（ＬＬＯＤ）＝０．１μＭ）で検出された。Ｌ−ｄＵの腎排泄は尿中で回収された総用量の４．０％であった。Ｌ−ｄＵを除き、他の代謝産物は血漿中又は尿中で検出されなかった。
【０５１０】
Ｌ−ｄＣの経口投与。Ｃｍａｘは３．３８μＭであり、２．３３時間のＴｍａｘで起こった。Ｌ−ｄＣの血漿中濃度は二相的に低下し、平均末期ｔ１／２は２．９５時間であり、すべてのサルにおいて２４時間までに検出限界以下となった。Ｌ−ｄＣは胃腸管から吸収され、平均経口バイオアベイラビリティー（Ｆ）は１６．４％であった。
【０５１１】
Ｌ−ｄＵが血漿中及び尿中で検出され、経口投与後にＬ−ｄＣの代謝排出が起こることを示唆した。低レベルのＬ−ｄＵが、血漿中でＬＬＯＤで検出された。Ｌ−ｄＵを除き、他の代謝産物は血漿中又は尿中で検出されなかった。
【０５１２】
投与経口用量の約８．５％が１２時間以内に尿中で回収された。７２時間後に１５．５％±８％が回収された。Ｌ−ｄＣは尿中で回収された薬剤の大部分（〜６９％）を占めた。Ｌ−ｄＵの腎排泄は総回収用量の２９％を占めた。糞便は収集しなかった。
【０５１３】
表１６は、カニクイザルにおけるＬ−ｄＣのＩＶ及び経口投与に関する薬物動態結果の要約を示す。
【０５１４】
【表２７】
2008273960.tif 000085
【０５１５】
アカゲザルにおけるＬ−ｄＣの単回投与のバイオアベイラビリティー
アカゲザルにおける経口投与後のＬ−ｄＣの薬物動態を測定した。この試験では、１０ｍｇ／ｋｇの［３Ｈ］放射標識Ｌ−ｄＣを３匹のアカゲザルに単回経口用量として投与した。投与前及び投与後０．２５、０．５、１、２、３、６、８及び２４時間目に薬物動態分析のための血液試料を採集した。投与前及び投与後以下の間隔：０−２、２−４、４−８及び８−１２時間、及びその後は投与後３３６時間まで１２時間間隔で、ｐａｎ  ｃａｔｃｈによって薬物動態分析のための尿試料を採集した。逆相ＨＰＬＣ手法を用いて薬剤を検出し、濃度を測定した。血液及び尿中の薬剤濃度データを非モデリング数理法及び線形台形公式から導かれるＡＵＣによって分析した。
【０５１６】
平均ＡＵＣ０．２５→８及びＣｍａｘ値は、それぞれ１２．２ｍｇＭ．ｈ及び３．２３ｍｇＭであった。Ｃｍａｘは０．８３時間のＴｍａｘで生じた。平均ｔ１／２は３．３４時間であり、すべてのサルにおいて２４時間までに検出限界以下となった。平均腎クリアランスは０．２７３Ｌ／時／ｋｇであった。Ｌ−ｄＣを摂取したサルの血漿中で代謝産物は認められなかった。
【０５１７】
投与経口用量の約８．５％（Ｌ−ｄＣの経口バイオアベイラビリティー〜１６％）が８時間以内に尿中で回収された。４８時間後に１５％が回収された。Ｌ−ｄＣは尿中で回収された薬剤の大部分（〜７７％）を占めた。Ｌ−ｄＵの腎排泄は総回収用量の２３％であった。Ｌ−ｄＵを除き、他の代謝産物は検出されなかった。
【０５１８】
アカゲザルへの経口投与後のＬ−ｄＣに関するＡＵＣ及びＣｍａｘは、カニクイザルにおいて認められたのと同様であった。
【０５１９】
ラットにおけるＬ−ｄＣの単回投与のバイオアベイラビリティー
ラットにおけるＬ−ｄＣの薬物動態とバイオアベイラビリティーを測定した。この試験では、１０ｍｇ／ｋｇの［３Ｈ］放射標識Ｌ−ｄＣを３匹の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに単回ＩＶ用量として投与した。２番目の群の３匹の動物には同一経口用量のＬ−ｄＣを投与した。投与後０．１７、０．３３、０．５、１、２、３、６、８及び２４時間目に薬物動態分析のための血液試料を採集した。投与後８及び２４時間目に尿も採集した。逆相ＨＰＬＣ手法を用いて血漿中及び尿中で薬剤を検出し、濃度を測定した。データを非モデリング数理法及び線形台形公式から導かれるＡＵＣによって分析した。
【０５２０】
Ｌ−ｄＣの静脈内投与。平均ＡＵＣ０．２５→８値は３０．１ｍＭ．ｈであった。Ｌ−ｄＣのＣｍａｘは、すべての動物に関して最も早い試料採取時点（投与後１０分）で生じた。Ｌ−ｄＣの血漿中濃度はＩＶボーラス後二相的に低下し、平均ｔ１／２は１．２１時間であった。Ｌ−ｄＣのＣＬは平均１．４４Ｌ／時／ｋｇであった。２．５３Ｌ／ｋｇの平均Ｖｄは、Ｌ−ｄＣが有意の血管外組織分布を有することを指示した。Ｌ−ｄＣを摂取したラットの血漿中で代謝産物は認められなかった。
【０５２１】
Ｌ−ｄＣは尿中で回収された放射能の大部分を占めた。Ｌ−ｄＵが尿中で検出され、ＩＶ投与後にＬ−ｄＣの代謝排出が起こることを示唆した。
【０５２２】
Ｌ−ｄＣの経口投与。平均ＡＵＣ０．２５→８値は４．７７ｍＭ．ｈであった。平均Ｃｍａｘは１．５０ｍｇＭであり、１．０時間のＴｍａｘで生じた。Ｌ−ｄＣの血漿中濃度は、２．５２時間のｔ１／２で低下した。Ｌ−ｄＣは胃腸管からの取込みが限られており、平均経口バイオアベイラビリティー（Ｆ）は１５．４％であった。Ｌ−ｄＣの経口投与後にラットの血漿中で代謝産物は認められなかった。
【０５２３】
Ｌ−ｄＣは尿中で回収された放射能の大部分を占めた。Ｌ−ｄＵが血漿中及び尿中で検出され、経口投与後にＬ−ｄＣの代謝排出が起こることを示唆した。
【０５２４】
表１７は、ＩＶ及び経口Ｌ−ｄＣに関する薬物動態結果の要約を示す。
【０５２５】
【表２８】
2008273960.tif 000086
【０５２６】
ウッドチャックにおけるＬ−ｄＣの単回投与のバイオアベイラビリティー
ウッドチャックにおけるＬ−ｄＣの薬物動態とバイオアベイラビリティーを測定した。この試験では、１０ｍｇ／ｋｇ［３Ｈ］放射標識Ｌ−ｄＣを３匹のウッドチャックに単回ＩＶ用量として投与した。投与後２、５、１５及び３０分目及び１．０、１．５、２．０、３．０、４．０及び２４時間目に薬物動態分析のための血液試料を採集した。７日間のウォッシュアウト期間後、同じ動物に１０ｍｇ／ｋｇのＬ−ｄＣを単回経口用量として投与した。投与後１５及び３０分目及び１．０、１．５、２．０、３．０、４．０、８．０及び２４時間目に薬物動態分析のための血液試料を採集した。投与後２４時間にわたって尿を採集した。血漿中薬剤レベル、ＣＬ、ｔ１／２及びＦを測定した。薬剤レベルは、インライン放射能検出及びシンチレーション計数と共にＨＰＬＣ法を用いて測定した。
【０５２７】
Ｌ−ｄＣの静脈内投与。Ｌ−ｄＣの平均Ｃｍａｘは１１２μＭであり、すべての動物に関して最も早い試料採取時点（投与後２分）で生じた。Ｌ−ｄＣの血漿中濃度は、ＩＶボーラス後二相的に低下し、平均ｔ１／２は２．８５時間であった。Ｌ−ｄＣのＣＬは平均０．３９Ｌ／時／ｋｇであった。平均Ｖｄは１．１７Ｌ／ｋｇであった。Ｌ−ｄＣは尿中で回収された放射能の大部分を占めた。Ｌ−ｄＵが血漿中及び尿中で検出され、ＩＶ投与後にＬ−ｄＣの代謝排出が起こることを指示した。血漿中で間欠的に検出されたＬ−ｄＵのレベルはアッセイの定量限界か又はそれ以下であり、平均Ｃｍａｘは０．７５μＭであった。
【０５２８】
Ｌ−ｄＣの経口投与。平均Ｃｍａｘは１．３７μＭであり、３時間のＴｍａｘで生じた。Ｌ−ｄＣの血漿中濃度は、５．２２時間の平均ｔ１／２で低下した。Ｌ−ｄＣは胃腸管から吸収され、経口バイオアベイラビリティーは５．６０−１６．９％の範囲であり、平均９．５７％であった。Ｌ−ｄＣは尿中で回収された放射能の大部分を占めた。Ｌ−ｄＵが血漿中及び尿中で検出され、経口投与後にＬ−ｄＣの代謝排出が起こることを指示した。血漿中のＬ−ｄＵは定量限界に近く、平均Ｃｍａｘは０．１９μＭであった。
【０５２９】
表１８は、ＩＶ及び経口Ｌ−ｄＣに関する薬物動態結果の要約を示す。
【０５３０】
【表２９】
2008273960.tif 000087
2008273960.tif 000088
【０５３１】
Ｌ−ｄＣのプロドラッグのバイオアベイラビリティー
Ｌ−ｄＣ、Ｌ−ｄＣの５’−モノエステル、Ｌ−ｄＣのジバリンエステル及びＬ−ｄＣのジアセチルエステルを、Ｌ−ｄＴと共に及びＬ−ｄＴなしで、カニクイザルにおいて評価した。Ｌ−ｄＣのジバリンエステルをサルに経口投与したとき、用量の約７３％が吸収された。吸収されたＬ−ｄＣのジバリンエステルのうちで、９９％以上が速やかにＬ−ｄＣに変換され、血漿中で高濃度のＬ−ｄＣを生じ、検出可能なＬ−ｄＣのジバリンエステルは存在しなかった。Ｌ−ｄＣのジバリンエステルの経口投与後早期に低い血漿中濃度のＬ−ｄＣのモノバリンエステルが検出された。低い血漿中濃度のβ−Ｌ−２’−デオキシウリジン（Ｌ−ｄＵ）が間欠的に検出された。他の代謝産物は検出されなかった。その結果を表１９に示す。表に示されているように、Ｌ−ｄＣの３’，５’−ジバリルエステルとＬ−ｄＴの組合せがＬ−ｄＣの最大バイオアベイラビリティーを提供した。
【０５３２】
【表３０】
2008273960.tif 000089
【０５３３】
カニクイザルにおけるジバリン−Ｌ−ｄＣの単回投与のバイオアベイラビリティー
３匹の雄性非ナイーブカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に、滅菌９．０％食塩水に溶解した痕跡量のトリチウム（［３Ｈ−］）標識薬剤（２５０μＣｉ）と共に１０ｍｇ／ｋｇのジバリン−Ｌ−ｄＣを静脈内投与した。６週間のウォッシュアウト期間後、同じ３匹の動物に同一経口用量のジバリン−Ｌ−ｄＣを投与した。投与前（〜１８時間）及び投与後０．２５、０．５０、１、２、３、４、６、８及び２４時間目に血液試料をヘパリン添加管に採集した。投与後３３６時間まで０−２、２−４、４−８及び８−１２時間、及びその後は１２時間間隔で尿も採集した。液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）手法により、血漿中及び尿中で薬剤を定量した。ジバリン−Ｌ−ｄＣの投与後、Ｌ−ｄＣの血漿中濃度の時間経過を、非モデリング数理法及び線形台形公式から導かれる時間−濃度曲線下面積（ＡＵＣ）によって分析した。ジバル−Ｌ−ｄＣのＩＶ及びＰＯ投与後のＬ−ｄＣのバイオアベイラビリティー（Ｆ）を、Ｆ＝ＡＵＣｐｏ／ＡＵＣｉｖ×ｉｖ用量／ｐｏ用量として、Ｌ−ｄＣ  ＡＵＣから算定した。
【０５３４】
静脈内投与したジバリン−Ｌ−ｄＣは、静脈内投与後速やかにＬ−ｄＣに変換された。ジバリン−Ｌ−ｄＣは、１５分後（１．３９μＭ）及び３０分後（０．３６μＭ、３匹の動物のうち１匹）に血漿中で検出された［定量下限（ＬＬＯＱ）＝０．２３μＭ又は１００ｎｇ／ｍｌ］。ジバリン−Ｌ−ｄＣは投与３０分後に血漿中で検出されなかった。ジバリン−Ｌ−ｄＣの部分的脱エステル化形態であるβ−Ｌ−２’−デオキシシチジン−５’−バリンエステルが１５分後に血漿中で検出され（３．２３μＭ）、濃度は２時間目までに０．０８μＭに低下した（ＬＬＯＱ＝０．０３１μＭ又は１０ｎｇ／ｍｌ）。Ｌ−ｄＣは、静脈内投与後に血漿中に存在する薬剤の大部分を占めた。Ｌ−ｄＣに関する平均ＡＵＣ０．２５→８値は１９．８μＭ・ｈであった。Ｌ−ｄＣの平均ピーク血漿中濃度（Ｃｍａｘ）は２４．６μＭ（ＬＬＯＱ＝０．０８８μＭ又は２０ｎｇ／ｍＬ）であり、すべての動物において最も早い試料採取時点（投与後１５分）で生じた。Ｌ−ｄＣの血漿中濃度は二相的に低下し、平均ｔ１／２は１．７３時間であった。Ｌ−ｄＣの全身クリアランス（ＣＬ）及び分布の見かけ容積（Ｖｄ）は、それぞれ平均１．０１Ｌ／時／ｋｇ及び２．４６Ｌ／ｋｇであり、Ｌ−ｄＣが有意の血管外組織分布を有することを指示した。エクスビボでのヒト血漿タンパク質へのジバリン−Ｌ−ｄＣ及びＬ−ｄＣの結合は、それぞれ１３．３％±２．６％及び１９．７％±５．９％であった。ジバリン−Ｌ−ｄＣ及びＬ−ｄＣ遊離薬剤レベルへのヒト血漿タンパク質結合の影響は極微であり、結合部位置換を含む薬剤相互作用は予想されないことを示唆した。
【０５３５】
尿排泄は速やかであり、静脈内投与後２時間以内にジバリン−Ｌ−ｄＣの投与用量の５８±３％が排出された。Ｌ−ｄＣは尿中に排出された薬剤の大部分（〜９３％）を占めた。  Ｌ−ｄＵも血漿中及び尿中で検出された。これは、ジバリン−Ｌ−ｄＣの投与後にＬ−ｄＣの代謝排出も起こることを示唆した。低レベルのＬ−ｄＵが、３匹の動物のうち２匹において間欠的な時点で血漿中に０．２２μＭ−０．８８μＭの範囲の濃度で（ＬＬＯＱ＝０．２２μＭ又は５０ｎｇ／ｍＬ）検出された。３番目のサルにおいてはいずれの時点でも検出可能レベルのＬ−ｄＵは存在しなかった。Ｌ−ｄＵ及びジバリン−Ｌ−ｄＣの部分的脱エステル化形態であるβ−Ｌ−２’−デオキシシチジン−５’−バリンエステルの腎排泄は極微であり、それぞれ総回収用量の約２．５％及び３．７％を占めた。３匹の動物のうち１匹の尿中でＩＶ投与後２時間目にジバリン−Ｌ−ｄＣが検出され、これは回収用量の約０．１５％を占めた。
【０５３６】
血漿中及び尿中のモノバリンエステル及びＬ−ｄＵの両方の間欠的な低濃度の故に、これらの代謝産物の薬物動態分析を実施することは不可能であった。ジバリン−Ｌ−ｄＣのモノバリンエステルはジバリン−Ｌ−ｄＣからＬ−ｄＣへの変換における中間体であるので、その出現は予想外ではなかった。さらに、サル、ラット及びヒト一次肝細胞及びＨｅｐＧ２細胞の抽出物におけるインビトロでの細胞代謝試験は、Ｌ−ｄＣがＬ−ｄＵに直接脱アミノ化されるのではなく、Ｌ−ｄＣ一リン酸（−ＭＰ）がＬ−ｄＵ−ＭＰに変換され、それがＬ−ｄＵ二リン酸（−ＤＰ）及び三リン酸（−ＴＰ）へと活性化されるか、又はＬ−ｄＵへと代謝され、その後細胞外画分（血漿）において検出されることを明らかにした。Ｌ−ｄＵは非細胞傷害性であり（ＣＣ５０＞２００μＭ）、Ｌ−ｄＵ−ＴＰはＢ型肝炎ウイルスデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリメラーゼに対してインビトロで５．２６μＭのＩＣ５０を有していた（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１０章参照）。
【０５３７】
経口投与したジバリン−Ｌ−ｄＣも、経口投与後速やかにＬ−ｄＣに変換され、いずれの時点でも血漿試料中で検出不能であった（溶液中でのジバリン−Ｌ−ｄＣのＬＬＯＱ＝０．２３μＭ又は１００ｎｇ／ｍＬ）。ジバリン−Ｌ−ｄＣの部分的脱エステル化代謝産物、β−Ｌ−２’−デオキシシチジン−５’−バリンエステルが血漿中で３０分後と１時間後に０．０３４β−０．１０７βの範囲の濃度で（溶液中でのモノエステルのＬＬＯＱ＝０．０３１μＭ又は１０ｎｇ／ｍＬ）検出された。ジバリン−Ｌ−ｄＣは血漿中で検出されなかった。
【０５３８】
Ｌ−ｄＣは、ジバリン−Ｌ−ｄＣの経口投与後の血漿中薬剤レベルの大部分（Ｃｍａｘで＞９９％）を占めた。Ｌ−ｄＣについての平均ＡＵＣ０．２５→８値は１４．０μＭ．ｈであった。Ｌ−ｄＣのＣｍａｘは８．２６μＭであり（溶液中でのＬ−ｄＣのＬＬＯＱ＝０．０８８μＭ又は２０ｎｇ／ｍＬ）、ジバリン−Ｌ−ｄＣの投与後０．６７時間目に起こった。Ｌ−ｄＣの血漿中濃度は二相的に低下し、平均ｔ１／２は２．２８時間であった。ジバリン−Ｌ−ｄＣの投与後のＬ−ｄＣの平均経口バイオアベイラビリティーは、７２．７％±２２％であった。
【０５３９】
Ｌ−ｄＵも血漿中で検出され、ジバリン−Ｌ−ｄＣの経口投与後にＬ−ｄＣの代謝排出も起こることを示唆した。低レベルのＬ−ｄＵが、３匹の動物のうち２匹において３０分後から４時間後まで血漿中に０．２４μＭ−０．６６μＭの範囲の濃度で（溶液中でのＬ−ｄＵのＬＬＯＱ＝０．２２μＭ又は５０ｎｇ／ｍＬ）検出され、１匹の動物では８時間後にのみ０．３９μＭの濃度で検出された。
【０５４０】
経口投与後、ジバリン−Ｌ−ｄＣは胃腸管から速やかに吸収され、一次通過腸及び／又は肝代謝によってＬ−ｄＣに変換された。ジバリン−Ｌ−ｄＣあるいはＬ−ｄＣ代謝のいずれも、肝ミクロソーム酵素には関連していなかった。高用量レベルのジバリン−Ｌ−ｄＣの投与後、Ｌ−ｄＣのモノバリンエステルがＬ−ｄＣへの変換に先立って一過性に検出された。経口投与後、ジバリン−Ｌ−ｄＣは検出されなかった。間欠的な低血漿中レベルのＬ−ｄＵがアッセイ定量の下限又はそれ以下で検出された。Ｌ−ｄＵは、Ｌ−ｄＣの細胞取込み後にＬ−ｄＣの脱アミノ化によって形成された。
【０５４１】
投与経口用量の約３１±８％が４時間以内に尿中で回収された。７２時間後に３９±８％が回収された。Ｌ−ｄＣは尿中に排泄された薬剤の大部分（〜９５％）を占めた。Ｌ−ｄＵ及びジバル−Ｌ−ｄＣの部分的脱エステル化形態、β−Ｌ−２’−デオキシシチジン−５’−バリンエステルの腎排泄は極微であり、それぞれ総回収用量の約２．５％及び０．２％を占めた。ジバリン−Ｌ−ｄＣは尿中で検出されなかった。
【０５４２】
表２０は、ジバリン−Ｌ−ｄＣのＩＶ及び経口投与後のＬ−ｄＣに関する薬物動態結果の要約を示す。
【０５４３】
【表３１】
2008273960.tif 000090
【０５４４】
表２１は、ジバリン−Ｌ−ｄＣのＩＶ及び経口投与後のジバル−Ｌ−ｄＣ、Ｌ−ｄＣのモノバリン誘導体、Ｌ−ｄＣ及びＬ−ｄＵからの代謝産物形成の概要を示す。各代謝産物のＣｍａｘもまた認められる。
【０５４５】
【表３２】
2008273960.tif 000091
【０５４６】
３匹の雄性非ナイーブカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に、滅菌０．９％食塩水に溶解した痕跡量の［３Ｈ］標識薬剤（２５０μＣｉ）と共に１０ｍｇ／ｋｇのジバリン−Ｌ−ｄＣを経口投与した。投与前（〜１８時間）及び投与後０．２５、０．５０、１、２、３、４、６、８及び２４時間目に血液試料をヘパリン添加管に採集した。投与後３３６時間まで０−２、２−４、４−８及び８−１２時間、及びその後は１２時間間隔で尿を採集した。ＨＰＬＣ分析を用いて血漿中及び尿中で薬剤を定量した。ジバリン−Ｌ−ｄＣの投与後、Ｌ−ｄＣの血漿中濃度の時間経過を、非モデリング数理法及び線形台形公式から導かれる時間−濃度曲線下面積（ＡＵＣ）によって分析した。ジバル−Ｌ−ｄＣは、経口投与後速やかに吸収され、Ｌ−ｄＣに変換された。血漿試料のラジオ高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析は、回収された放射能の大部分がＬ−ｄＣであることを確認した。ジバリン−Ｌ−ｄＣは、１匹の動物においてのみ投与後１５分目に０．３５μＭの濃度で検出された。ジバリン−Ｌ−ｄＣの部分的脱エステル化形態であるβ−Ｌ−２’−デオキシシチジン−５’−バリンエステルは血漿中又は尿中で検出されなかった。投与経口用量の約２６％が８時間以内に尿中で回収された。７２時間後に３１％が回収された。Ｌ−ｄＣは尿中に排泄された薬剤の大部分（〜８９％）を占めた。Ｌ−ｄＵの腎排泄はわずかであり、回収用量の約１０％を占めた。ジバリン−Ｌ−ｄＣ又はその部分的脱エステル化形態及び他の代謝産物は尿中で検出されなかった。
【０５４７】
全体的薬物動態プロフィールは、同様のＣｍａｘ対ＡＵＣ比で明らかにされたように、薬物動態試験で測定された結果と同等であった。低レベルのＬ−ｄＵが３匹の動物のうち２匹の血漿中で検出され、平均Ｃｍａｘは０．３３μＭであった。３番目のサルの血漿ではＬ−ｄＵは検出されなかった。Ｌ−ｄＵのレベルは定量限界か又はそれ以下であり、薬物動態分析は不可能であった。
【０５４８】
ジバリン−Ｌ−ｄＣのインビトロ代謝
ヒト血漿におけるジバリン−Ｌ−ｄＣ及びその脱エステル化代謝産物の安定性及びタンパク質結合を測定するための試験を実施した。ジバリン−Ｌ−ｄＣをヒト血漿中３７℃でインキュベートし、２４時間までの様々な時点で試料を分析した（図１３）。２４時間目にジバル−Ｌ−ｄＣは検出不能であり、完全にＬ−ｄＣに変換された。２つの付加的な代謝産物（β−Ｌ−２’−デオキシシチジン−５’−バリンエステル及びβ−Ｌ−２’−デオキシシチジン−バリンエステル）も認められた。これらの代謝産物の一過性の性質は、それらがジバリン−Ｌ−ｄＣからＬ−ｄＣへの変換における中間体であることを指示した。３７℃のヒト血漿中でのジバリン−Ｌ−ｄＣのインビトロ半減期は約３９分と測定された。
【０５４９】
限外ろ過法を使用して、ジバリン−Ｌ−ｄＣ及びＬ−ｄＣの遊離レベルへのヒト血漿タンパク質結合の影響も検討した。ジバリン−Ｌ−ｄＣの血漿タンパク質結合は１３．３％±２．６％であった。Ｌ−ｄＣの血漿タンパク質への結合は１９．７％±５．９％であった。この試験は、ジバリン−Ｌ−ｄＣ及びＬ−ｄＣへのヒト血漿タンパク質結合の影響が極微であることを示しており、結合部位置換を含む薬剤相互作用が予想されないことを示唆する。
【０５５０】
Ｌ−ｄＣの代謝活性化及び細胞内プロフィール
ＨｅｐＧ２細胞及びヒト一次肝細胞を使用してＬ−ｄＣの細胞代謝を検討した。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析は、Ｌ−ｄＣが肝細胞において広くリン酸化されることを明らかにした。１０μＭ  Ｌ−ｄＣに２４時間暴露したＨｅｐＧ２細胞における主要代謝産物はＬ−ｄＣ−ＴＰであり、７２．４±１．８μＭに達した（表２３参照）。一次ヒト肝細胞では、２４時間目のＬ−ｄＣ−ＴＰ濃度は、ＨｅｐＧ２細胞におけるリン酸化のレベルと同様の、９０．１±３７μＭであった。肝細胞のＬ−ｄＣへの暴露は、第二の５’三リン酸誘導体、Ｌ−ｄＵ−ＴＰの活性化を導いた。１０μＭ  Ｌ−ｄＣに暴露したＨｅｐＧ２細胞において、Ｌ−ｄＵ−ＴＰレベルは２４時間目に１８．２μＭ（一次ヒト肝細胞では４３．５ｐＭ）に達した。一次ラット及びサル肝細胞では、Ｌ−ｄＣのリン酸化の程度がわずかにより低かった。
【０５５１】
【表３３】
2008273960.tif 000092
2008273960.tif 000093
【０５５２】
Ｌ−ｄＣ及びＬ−ｄＵのリン酸化誘導体に加えて、β−Ｌ−２’−デオキシリポヌクレオチド代謝産物の形成が認められた。１０μＭ  Ｌ−ｄＣに２４時間暴露したＨｅｐＧ２細胞及び一次肝細胞培養において、［３−Ｌ−２’−デオキシシチジン−５’−ジホスホコリン（Ｌ−ｄＣ−ＤＰ−コリン）をそれぞれ２５．６μＭ（２５．６−２５．７μＭの範囲）及び１２．３μＭ（８．８２−１５．８μＭの範囲）の濃度で検出した。
【０５５３】
１０μＭ［３Ｈ］Ｌ−ｄＣへのＨｅｐＧ２細胞の２４時間の暴露後に得た代謝産物プロフィールを図１４に示す。Ｌ−ｄＣ−ＴＰの見かけ細胞内半減期は１５．５±０．３４時間であり、これはウイルスリバウンド実験における薬剤撤収後の長期的な抗ウイルス活性と相関した。一次ヒト肝細胞で検出されたリン酸化パターンは、ＨｅｐＧ細胞を使用して得られたものと定性的及び定量的に類似した（図１５）。
【０５５４】
代謝活性化に関連する細胞キナーゼ
Ｄ−デオキシシチジン（ｄＣｙｄ）は、ｄＣｙｄ−５’−一リン酸（ｄＣＭＰ）への変換のためのサイトゾルｄＣｙｄキナーゼ（ｄＣＫ）及びミトコンドリアチミジンキナーゼ（ＴＫ２）の天然基質である。サイトゾルチミジンキナーゼ（ＴＫ１）及びＴＫ２は、Ｄ−チミジン（Ｔｈｄ）をＴｈｄ−５’−一リン酸（ＴＭＰ）への変換のための天然基質として利用する。Ｌ−ｄＣの初期リン酸化に関わる細胞キナーゼが、Ｌ−ｄＣと天然内因性Ｔｈｄ及びｄＣｙｄを用いた競合試験において特定された。Ｌ−ｄＣの細胞内リン酸化はｄＣｙｄによって用量依存的に低下したが、Ｔｈｄによっては低下しなかった。Ｌ−ｄＣの細胞内リン酸化の変化は、ＨｅｐＧ２細胞をＴｈｄとｄＣｙｄの両方又はｄＣｙｄ単独に暴露したときと同様であった。天然デオキシピリミジン、ｄＣｙｄだけによるＬ−ｄＣリン酸化の阻害は、ｄＣＫがＬ−ｄＣリン酸化に関与することを示唆した。
【０５５５】
Ｌ−ｄＣのリン酸化におけるこれらのピリミジンヌクレオシドキナーゼ活性の役割をキナーゼ欠損細胞系統においてさらに検討した。ｄＣＫ欠損細胞ではＬ−ｄＣのリン酸化代謝産物の量の有意の低下が存在した。しかし、ＴＫ１欠損細胞ではＬ−ｄＣリン酸化に有意差は認められなかった。これらのデータは前述した競合試験と一致し、ｄＣＫがＬ−ｄＣからＬ−ｄＣ−ＭＰへのリン酸化において決定的な役割を果たすことを指示した。
【０５５６】
ＨｅｐＧ２細胞のサイトゾル抽出物を酵素原として使用して、Ｌ−ｄＣ、Ｔｈｄ及びｄＣｙｄリン酸化に関する定常状態反応速度論は、見かけミカエリス−メンテン定数（Ｋｍ）及び最大初期速度（Ｖｍａｘ）値（Ｌ−ｄＣ：５．７５ｍＭのＫｍ及び１．１２ｍｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質のＶｍａｘ；Ｔｈｄ：４．０６ｍＭのＫｍ及び１．２６ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質のＶｍａｘ；ｄＣｙｄ：４．８５ｍＭのＫｍ及び２．１５ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質のＶｍａｘ）に示されるように同様であった。さらに、Ｌ−ｄＣ、Ｔｈｄ及びｄＣｙｄリン酸化の効率は、それらの対応するＶｍａｘ／Ｋｍ値（それぞれ０．１９、０．３１及び０．４４）によって定義されるように同様であった。
【０５５７】
さらに、Ｌ−ｄＣの細胞内リン酸化の程度を、ウッドチャック肝抽出物中の天然内因性基質、Ｔｈｄ及びｄＣｙｄのものと比較した。これは、慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染のウッドチャックモデルにおける抗ウイルス試験を裏付けるために実施した。Ｌ−ｄＣのリン酸化は内因性基質の場合と同様であった。さらに、Ｌ−ｄＣのリン酸化のレベルは、ヒト肝抽出物中のＬ−ｄＣ及び内因性基質のレベルと同等であった。
【０５５８】
Ｘ．薬剤耐性ＨＢＶに対する活性化合物の作用
β−Ｌ−２’−デオキシヌクレオシド、特にβ−Ｌ−２’−デオキシシチジン及びβ−Ｌ−２’−デオキシチミジンは、薬剤耐性ＨＢＶ（Ｍ５５２Ｖ）の強力で選択的な阻害剤である。ＹＭＤＤ突然変異（ＨＢＶポリメラーゼのチロシン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン酸ヌクレオチド結合遺伝子座におけるアミノ酸置換と定義される）を含むＨＢＶ組換え体を使用して、ラミブジン耐性ＨＢＶを発現する細胞系統を作製することができるが、これらのゲノムはしばしば、インビトロで野生型ＨＢＶよりも複製能力が低い（ＦｕとＣｈｅｎｇ，１９９８）。これらの組換え系は、耐性の問題を検討するための最良のアプローチを提供する。Ｏｎｏら、２００１が述べたアプローチに従って、そのような評価のための好ましい細胞系である、Ｈｕｈ−７肝細胞を用いた一過性トランスフェクションアッセイの使用を通して、ラミブジン耐性ＨＢＶ株（ＹＭＤＤ突然変異株）に対するＬｄＴの活性を測定することを試みた（ＩＮＤ６０，４５９号）。しかし、Ｈｕｈ−７細胞において、ＬｄＴは野生型ＨＢＶに対してさえも低い活性しか示さなかった。Ｈｕｈ−７細胞はラミブジンを極めて良好にリン酸化するが、ＬｄＴから活性三リン酸塩へのリン酸化は最小限にしか存在しなかった。これらの結果は、ＬｄＴ第２相試験終了会議に関する当局への提出試料の中に要約された（ＩＮＤ６０，４５９号；通し番号０２４）。それ故、Ｏｎｏらの系はこれらの薬剤の分析のためには適切でない。
【０５５９】
代替アプローチとして、突然変異ＨＢＶゲノムを一過性トランスフェクションによってＨｅｐＧ２細胞に導入した。これらの実験も、主としてこれらの細胞の低く且つ一定しないトランスフェクション能力のために、抗ウイルス効果に関して一貫した数値を得ることが不可能であり、同様に成功しなかった。
【０５６０】
ＬｄＴ及びＬｄＣに関する耐性の問題を検討するためのより適切な方法は、野生型ゲノムならびにそれぞれ５５２位と５１５位又は５２８位にラミブジン耐性突然変異を有する組換え型ＨＢＶウイルスを発現する安定なＨｅｐＧ２細胞系統を使用することによる。先に述べた方法と比較して、これらの安定な細胞系統は、良好なシグナル対ノイズ比と共に一貫したポリメラーゼ発現レベルを提供する。
【０５６１】
ラミブジン耐性突然変異型Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する薬剤ＬｄＴ（テルビブジン）及びＬｄＣのインビトロ活性を測定した。臨床環境においてラミブジン治療に対する耐性を付与すると判定されたＨＢＶの生物学的に関連する突然変異（ａｙｗサブタイプ）がポリメラーゼ遺伝子内に生じており、鍵となるＹＭＤＤ活性部位モチーフ内に認められる２つの単一突然変異、Ｍ５５２ＶとＭ５５２Ｉ、ならびに２つの二重突然変異、Ｌ５１５Ｍ／Ｍ５５２ＶとＬ５１５Ｍ／Ｍ５５２Ｉを含む。［ここで言及するＬ５１５Ｍ突然変異は、ＨＢＶ耐性試験でしばしば引用されるＢドメイン内のＬ５２６Ｍ又はＬ５２８Ｍ突然変異に等しい；番号付けの相違は、異なるＨＢＶ遺伝子型間での配列挿入／欠失を反映する］。
【０５６２】
試験材料及び方法
これらのラミブジン耐性突然変異型に対応する組み換え型ＤＮＡ構築物を、位置指定突然変異によって作製した。この試験系は、各々のトラスフェクトした突然変異型ゲノム、ならびに野生型対照ＨＢＶゲノムを担う安定な細胞系統を含んだ。ＬｄＴ（テルビブジン）及びＬｄＣの抗ウイルス活性を、対照薬剤、ラミブジン及びＰＭＥＡと共に、それぞれの試験細胞系統において突然変異型及び野生型ＨＢＶゲノムに対して測定した。
【０５６３】
ＬｄＴ（テルビブジン）及びＬｄＣは、Ｍ５５２Ｉ単一突然変異型あるいはＬ５１５Ｍ／Ｍ５５２Ｖ及びＬ５１５Ｍ／Ｍ５５２Ｉ二重突然変異型に対して最小限の活性を示したが、ＬｄＣはＬ５１５Ｍ／Ｍ５５２Ｖ突然変異型に対してＥＣ５０に達した。しかし、ラミブジンと異なり、両薬剤ともＭ５５２Ｖ突然変異型ＨＢＶゲノムに対してはほとんど完全な抗ウイルス活性を保持する。Ｍ５５２Ｖ突然変異はラミブジンに対して有意に耐性であり、ラミブジンに対する劇的な耐性発現のための主要経路におけるキー中間体であると思われる。ラミブジン治療患者では、Ｂ型肝炎患者におけるすべてのラミブジン耐性の６０−７０％を占めると報告されている（Ａｈｍｅｄら、２０００）、高度耐性Ｌ５１５Ｍ／Ｍ５５２Ｖ二重突然変異型の出現に先立って、Ｍ５５２Ｖ突然変異型が典型的には４−８週間で現われる（Ｇａｕｔｈｉｅｒら、１９９９）。
【０５６４】
これらの結果は、Ｍ５５２Ｖ突然変異型に対するＬｄＴ（テルビブジン）及びＬｄＣの活性が、患者におけるＹＭＤＤを介した抗ウイルス耐性の出現の重要な割合を抑制するのを助けるのであろうことを示唆する。現在の第ＩＩＢ相臨床試験においてＬｄＴ治療患者に関して認められたＨＢＶ複製のより良好な数量的抑制（ラミブジン摂取患者と比較して）と合わせて、これらの結果は、ＬｄＴに対するＹＭＤＤを介したＨＢＶ耐性はおそらくラミブジン治療で認められるよりも実質的に頻度が低いであろうことを示唆する。
【０５６５】
ＨＢＶ感染患者に投与したラミブジン（毎日１００ｍｇ）の対照臨床試験では、ＹＭＤＤ突然変異型ＨＢＶの発生率は、１年間の治療後で１４−３２％、２−３年間の治療後には５８％に上った。突然変異型ウイルスは、ＹＭＤＤ突然変異を伴わないラミブジン治療患者と比較して治療応答低下の証拠と結びついていた。
【０５６６】
ラミブジンを摂取しながらＨＢＶ複製が復活した患者から得たウイルス単離物の遺伝子型分析は、ラミブジンに対するＨＢＶ感受性の低下が、ＨＢＶポリメラーゼの触媒ドメインのＹＭＤＤモチーフにおけるメチオニンからバリン又はイソロイシンへの置換（５５２位）及び５１５位又は５２８位（ＨＢＶの遺伝子型／サブタイプに依存して）におけるロイシンからメチオニンへの置換を生じさせる突然変異に関連することを示唆する。
【０５６７】
現在のところ、患者からのラミブジン耐性ＨＢＶ単離物に感染した細胞に対する抗ウイルス薬の活性を評価するために使用できる細胞ベースのＨＢＶ感染系は存在しない。ＤＨＢＶのインビトロモデルは、このモデルにおいて使用される一次アヒル肝細胞が細胞培養では数週間以上維持できないため、薬剤耐性突然変異を選択するには有用でないことが明らかになった。ウッドチャックインビボモデルでの薬剤耐性突然変異型の選択に関しては、ウッドチャックにおけるラミブジン耐性突然変異型のスペクトルがＨＢＶ感染患者で特定されているものとマッチしないので、その適切性は疑わしい。
【０５６８】
ＹＭＤＤ突然変異を含むＨＢＶ組換え体を使用して、ラミブジン耐性ＨＢＶを発現する細胞系統を作製することができるが、これらのゲノムはしばしば、インビトロで野生型ＨＢＶよりも複製能力が低い（ＦｕとＣｈｅｎｇ，１９９８）。これらの組換え系は、耐性の問題を検討するための最良のアプローチを提供する。Ｏｎｏら、２００１が述べたアプローチに従って、そのような評価のための好ましい細胞系である、Ｈｕｈ−７肝細胞を用いた一過性トランスフェクションアッセイの使用を通して、ラミブジン耐性ＨＢＶ株（ＹＭＤＤ突然変異株）に対するＬｄＴの活性を測定することを試みた（ＩＮＤ６０，４５９号）。しかし、Ｈｕｈ−７細胞において、ＬｄＴは野生型ＨＢＶに対してさえも低い活性しか示さなかった。さらなる検討により、Ｈｕｈ−７細胞はラミブジンを極めて良好にリン酸化するが、ＬｄＴから活性三リン酸塩へのリン酸化は最小限にしか存在しないことが明らかにされた。これらの結果は、ＬｄＴ第２相試験終了会議に関する当局への提出試料の中に要約された（ＩＮＤ６０，４５９号；通し番号０２４）。それ故、Ｏｎｏらの系はこれらのタイプの薬剤の分析のためには適切でない。
【０５６９】
代替アプローチとして、突然変異ＨＢＶゲノムを一過性トランスフェクションによってＨｅｐＧ２細胞に導入した。これらの実験も、主としてこれらの細胞の低く且つ一定しないトランスフェクション能力のために、抗ウイルス効果に関して一貫した数値を得ることが不可能であり、同様に成功しなかった。
【０５７０】
ＬｄＴ及びＬｄＣに関する耐性の問題を検討するためのより適切な方法は、野生型ゲノムならびにそれぞれ５５２位と５１５位又は５２８位にラミブジン耐性突然変異を有する組換え型ＨＢＶウイルスを発現する安定なＨｅｐＧ２細胞系統を使用することによる。先に述べた方法と比較して、これらの安定な細胞系統は、良好なシグナル対ノイズ比と共に一貫したポリメラーゼ発現レベルを提供する。
【実施例１７】
【０５７１】
ラミブジン耐性の安定な細胞系統を作製するためのＨｅｐＧ２細胞のトランスフェクション
対照としてラミブジン及びアデフォビルと共に、突然変異型に対するＬｄＴ及びＬｄＣの活性を試験するために、ラミブジン耐性及び野生型ＨＢＶゲノムの形質を担う安定に形質転換された細胞を入手した。
【０５７２】
ＨｅｐＧ２増殖培地
ＥＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号ＭＴ１０−０１０−ＣＶ）
１０％ＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号ＭＴ３５−０１１−ＣＶ）
１×Ｌ−グルタミン（最終２ｍＭ）
１×ペニシリン−ストレプトマイシン（最終１００Ｉ．Ｕ．／１００μｇ／ｍｌ）
１×ピルビン酸ナトリウム（最終１ｍＭ）
１×可欠アミノ酸（ＮＥＡＡ、最終０．１ｍＭ）
ＨｅｐＧ２トランスフェクション培地
ＥＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号ＭＴ１０−０１０−ＣＶ）
１０％ＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号ＭＴ３５−０１１−ＣＶ）
１×Ｌ−グルタミン（最終２ｍＭ）
１×ピルビン酸ナトリウム（最終１ｍＭ）
１×ＮＥＡＡ（最終０．１ｍＭ）
ＨｅｐＧ２安定細胞系統増殖／選択培地
ＥＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号ＭＴ１０−０１０−ＣＶ）
１０％ＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号ＭＴ３５−０１１−ＣＶ）
１×Ｌ−グルタミン（最終２ｍＭ）
１×ペニシリン−ストレプトマイシン（最終１００Ｉ．Ｕ．／１００μｇ／ｍｌ）
１×ピルビン酸ナトリウム（最終１ｍＭ）
１×ＮＥＡＡ（最終０．１ｍＭ）
５００μｇ／ｍｌゲネチシン（Ｇ−４１８、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０１３１）
構築物
ｐＣＭＶ−ＷＴ（ａｙｗ）
ｐＣＭＶ−Ｍ５５２Ｖ
ｐＣＭＶ−Ｍ５５２Ｉ
ｐＣＭＶ−Ｌ５１５Ｍ／Ｍ５５２Ｖ
ｐＣＭＶ−Ｌ５１５Ｍ／Ｍ５５２Ｉ
ｐＣＭＶ−ｎｅｏ
すべての構築物は、ＣＭＶプロモーターの後にクローン化したＨＢＶゲノムを含む。点突然変異ポリメラーゼ遺伝子を含むＨＢＶプラスミドは、先に記述されているように（Ａｌｌｅｎら、１９９８）ｐＣＭＶ−ｈｂｖを親として、市販のキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ’ｓ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット、カタログ番号２００５１８−５）を使用した位置指定突然変異誘発によって誘導した。ｐＣＭＶｈｂｖ（Ｄｒ．Ｃ．Ｓｅｅｇｅｒ，Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの好意により提供された）は、過剰長ＨＢＶゲノムサブタイプａｙｗを含む。単一Ｌ５１５Ｍ突然変異を含む構築物は、この突然変異はラミブジンに対する極微の耐性しか付与しないと思われるので、作製しなかった；むしろこの突然変異は代償性突然変異として働く（Ｇａｕｔｈｉｅｒら、１９９９）
プラスミドｐＣＭＶ−ｎｅｏは、Ｇ４１８抗生物質（ネオマイシン）に対する耐性を付与するために使用した。このプラスミドは、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号６０８５−１）の骨格を有し、ＳＶ４０推進Ｋａｎｒ／Ｎｅｏｒ発現カセットを含むが、ＥＧＦＰ発現カセットを含まない。
【０５７３】
トランスフェクションのための細胞の作製：細胞を、ＨｅｐＧ２増殖培地３ｍＬ中２×１０５細胞／穴で、コラーゲン被覆した６穴プレート（Ｂｉｏｃｏａｔ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号３５−４４００）に植え付けた。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。
【０５７４】
Ｆｕｇｅｎｅ：ＤＮＡ複合体の作製：６穴コラーゲン被覆プレートの２つのウエルをトランスフェクトするために各々の構築物を使用した。対照は、ｐＣＭＶ−ｎｅｏ  ＤＮＡを含まないｐＣＭＶｈｂｖ野生型構築物を入れた１ウエルと、ｎｅｏＲプラスミドだけを入れた１ウエルを含んだ。細胞を、製造者の指示するプロトコールに従って３：１のＦｕｇｅｎｅ対ＤＮＡ比（Ｆｕｇｅｎｅ  ３μｌ＋超らせんプラスミドＤＮＡ１μｇ／穴）でＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ  カタログ番号１８１５０９１）でトランスフェクトした。簡単に述べると、Ｆｕｇｅｎｅ  ６μＬを、微量遠心分離管において無血清ＥＭＥＭ培地２００μｌ中に希釈した。次に、ｐＣＭＶｎｅｏ  ＤＮＡ０．２μｇと共にそれぞれのＨＢＶプラスミドＤＮＡ２μｇを添加した。この溶液を静かに混合し、その後室温で１５分間インキュベートした。
【０５７５】
細胞のトランスフェクション：６穴プレートを吸引し、ＨｅｐＧ２トランスフェクション培地２ｍｌを添加した。次に、溶液を均質に分散させるためにプレートを渦動させながら、Ｆｕｇｅｎｅ：ＤＮＡ複合体溶液を細胞に緩やかに加えた。そのプレートを３７℃で一晩インキュベートした。その翌日、ＨｅｐＧ２安定細胞系統増殖／選択培地を添加した。
【実施例１８】
【０５７６】
安定細胞系統コロニー及びサブクローンの選択
トランスフェクトした細胞を、別個のＧ４１８耐性コロニーが形成されるまで２週間半にわたって週に２回供給した。「クローナル」（いかなる他のコロニーとも接触していない）であると思われるコロニーをピペットの先端で６穴プレートから採取し、ＢＤ９６穴コラーゲンプレートにおいてＨｅｐＧ２安定細胞系統増殖／選択培地１５０μｌ中に入れた。各構築物につき１６コロニーを採取した。
【０５７７】
培地は３−４日ごとに交換した。培養上清１００μＬをＥＬＩＳＡによってＨＢｅＡｇの存在に関して試験することにより、ＨＢＶ発現コロニーを特定した（下記参照）。コラーゲン９６穴プレートにおける限界希釈によって陽性コロニーをサブクローニングし、２週間後にＥＬＩＳＡによって培養上清をスクリーニングした（培地は３−４日ごとに交換した）。陽性ウエルを増殖させ、凍結保存株を作製して、その後再び限界希釈によって細胞系統をサブクローニングし、２週間後にＥＬＩＳＡによって培養上清をスクリーニングした。
【実施例１９】
【０５７８】
安定なトランスフェクト細胞系統の試験
安定な細胞系統クローンを２つの試験によってウイルスゲノムの発現に関してスクリーニングした。最初のアッセイは、ウイルス複製と良好に相関するウイルスタンパク質マーカーである、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）の産生を測定する半定量的ＥＬＩＳＡアッセイであった。次に、高レベルのＨＢｅＡｇを産生する細胞系統を、内因性ポリメラーゼアッセイを使用して複製型ウイルスゲノムの産生に関して試験した。
【０５７９】
安定細胞系統培養上清のＨＢｅＡｇ−ＥＬＩＳＡ：捕獲抗体は、１０μｇ／ｍｌで使用したマウス抗ＨＢｅＡｇ  ｍＡｂであった。培養上清１００μｌを９６穴細胞培養プレートから直接使用した。検出抗体は、１０％ＦＣＳ／ＴＮＥ中１：３，０００希釈のポリクローナル（ウサギ）抗ＨＢｃ／ｅＡｇ抗体（ＤＡＫＯ、カタログ番号Ｂ０５８６）であった。展開させるためにペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１０，０００；Ｚｙｍｅｄ、カタログ番号８１−６１２０）を使用し、基質はクエン酸／リン酸緩衝液中のｏ−フェニレンジアミン（Ｚｙｍｅｄ、カタログ番号００−２００３）であった。Ｆｕｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）において４９０ｎｍで光学密度（Ｏ．Ｄ．）を読み取る前に、２Ｎ  Ｎａ２ＳＯ４で展開を停止させた。
【０５８０】
細胞溶解産物の内因性ポリメラーゼアッセイ（ＥＰＡ）：細胞を１２穴コラーゲンプレートで３−４日間、１００％の集密度まで増殖させ、サイトゾル溶解産物を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２％ＮＰ−４０  １ｍｌ中で調製した。ＥＰＡは基本的に記述されているように（Ｓｅｉｆｅｒら、１９９８）実施した。簡単に述べると、細胞内ＨＢＶヌクレオカプシドを、ポリクローナルウサギ抗ＨＢｃ／ｅＡｇ抗体（ＤａＫｏ、カタログ番号Ｂ０５８６）によって４℃で一晩細胞質溶解産物から免疫沈降させ、プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号１７−０７８０−０１）に固定化した。次に、固定化したカプシドを洗い、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、７５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  β−ＭＥ、０．５％ＮＰ−４０、１００μＭ低温ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰ及び５０ｎＭ  ３３Ｐ−ｄＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＮＥＧ  ６１２Ｈ）を含む５０μｌ反応容量中で内因性ポリメラーゼ反応を開始させ、３７℃で一晩インキュベートした。１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１３７３１９６）によって３７℃で１時間消化した後、３３Ｐ標識ＨＢＶ  ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出によって遊離させた。等容量の５Ｍ  ＮＨ４−アセテート及び２．５容の１００％ＥｔＯＨで核酸を最終的に沈殿させ、トリス−ホウ酸緩衝液中１％天然アガロースゲル上で分離した。ゲルを７％ＴＣＡで固定してその後乾燥するか、又は０．４Ｎ  ＮａＯＨ中、毛管移動によって室温で一晩、正に荷電したナイロン膜（Ｐａｌｌ  Ｂｉｏｄｙｎｅ  Ｐｌｕｓ、カタログ番号６０４０６）にブロットした。乾燥したゲル／膜を室温で一晩ホスホイメージャースクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に暴露し、その後走査して（Ｓｔｏｒｍ  ８６０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）ソフトウエアで数量化した。
【０５８１】
高いＨＢｅＡｇ発現ならびに複製型ゲノムの高レベル産生を有するとして選択されたクローナル細胞系統を以下のように命名した：
【０５８２】
【表３４】
2008273960.tif 000094
【実施例２０】
【０５８３】
抗ウイルス試験
ＬｄＴ（テルビブジン、Ｉｄｅｎｉｘ）、ＬｄＣ−ＨＣｌ（Ｉｄｅｎｉｘ）、ラミブジン（Ｍｏｒａｖｅｃ）及びＰＭＥＡ（Ｍｏｒａｖｅｃ）
ＰＭＥＡは、プロドラッグ、アデフォビルの活性成分である。
【０５８４】
１２穴ＢｉｏｃｏａｔコラーゲンＩプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３５−４５００に、５％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｉ．Ｕ．ペニシリン／１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｇ−４１８を含むＤＭＥＭ２ｍＬ中、０．５−１×１０６細胞／穴の密度で細胞を接種する。
【０５８５】
薬剤希釈溶液を１００％ＤＭＳＯ中で２００ｘ保存溶液として新鮮調製する。各々の実験について、各々の薬剤希釈溶液シリーズの４つのアリコートを使用時まで−２０℃で保存する。ひとたび細胞が集密に達すれば、薬剤希釈溶液１０μＬを新鮮ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ  ２ｍｌに添加して薬剤処置を開始する。従って、最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％を超えない。薬剤なしの対照ウエルにはＤＭＳＯ１０μｌだけを加える。細胞を１日おきに合計８日間、新鮮薬剤／培地２ｍＬで処理する。その後、１０日目に以下で述べるように細胞溶解産物を収集する：
培地を吸引し、細胞単層をＰＢＳ  １ｍＬで慎重に１回洗浄する。
【０５８６】
溶解産物緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．２％ＮＰ−４０）１ｍｌを加える。氷上で３０分から４時間保存する。
【０５８７】
溶解した細胞を採集する。１．５ｍｌ微量遠心分離管に移す。
【０５８８】
室温で５分間、１４，０００ｒｐｍで遠心して溶解産物を清澄化する。
【０５８９】
成長化した溶解産物を新鮮な管に移す。ドライアイス上で瞬間凍結し、内因性ポリメラーゼアッセイを基本的に前述したように継続する準備ができるまで−８０℃で保存する。
【０５９０】
Ｘｌｆｉｔソフトウエアを使用した曲線フィッティングによってホスホイメージャーデータからＥＣ５０を生成した。
【０５９１】
表２４は、ＬｄＴ及びＬｄＣならびにラミブジン及びＰＭＥＡ対照を、安定にトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞において発現される種々の突然変異型及び野生型ＨＢＶゲノムに対する活性を試験したときに得た結果を要約する。抗ウイルス活性を表２４ａに示す。種々の薬剤について得た野生型ウイルスに対するＥＣ５０値は、ＬｄＴについての平均ＥＣ５０値が本発明者らのこれまでの試験の大部分で認められた２００ｎＭ付近の典型的数値よりも高かったことを除いて、一般に文献で報告されている数値と良好に一致する。細胞培養中のＬｄＴの抗ウイルス活性は極めて変動的であり、細胞培養アッセイにおけるＬｄＴの効力は臨床状況で患者において認められる効果の予測にはならないと思われる。
【０５９２】
ラミブジン耐性突然変異株に対して認められた活性に関しては、ＰＭＥＡは、これまでの報告と一致して、すべての突然変異株に対して有意の活性を保持していた（Ｇｉｌｅａｄ  ＦＤＡブリーフィング書類、２００２参照）。２つの二重突然変異株又はＭ５５２Ｉ単一突然変異株に対しては、ＬｄＴ、ＬｄＣ及びラミブジンは概ね不活性であったが（ＥＣ５０＞１ｍＭ）、ＬｄＣはＬ５１５Ｍ／Ｍ５５２Ｖに対して約７８０μＭのＥＣ５０で限界活性を示した。本試験からの主要な所見は、ＬｄＴ及びＬｄＣがＭ５５２Ｖ単一突然変異株に対してほぼ完全な活性を保持していたのに対し、この突然変異株に対するラミブジンの活性は有意に低かった。
【０５９３】
前記薬剤の認められた効果へのラミブジン耐性突然変異株の影響は、表２４ｂに示されている倍数耐性（ｆｏｌｄ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）分析から最もよく理解できる。この試験で得られた結果はこれまでの試験と広く一致する（Ｇｉｌｅａｄ  ＦＤＡ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｂｒｉｅｆｉｎｇ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ，２００２に要約されているように）。ＬｄＴ、ＬｄＣ及びラミブジンが、二重突然変異株又はＭ５５２Ｉ単一突然変異株のいずれかに対して試験したとき、実質的な倍数耐性を示すことは表２４ｂから明らかである。しかし、単一Ｍ５５２Ｖ突然変異株の状況は大きく異なる。ＬｄＴ及びＬｄＣはこの突然変異株に対して基本的に不変の抗ウイルス活性を示し、それぞれの倍数耐性の変化は１．２倍及び２．１倍であったのに対し、ラミブジンは、本発明者らの試験では２４．８倍の耐性、Ｇｌａｘｏ  ｇｒｏｕｐ（Ａｌｌｅｎら、１９９８）によれば１５３倍の耐性を示す。
【０５９４】
ＬｄＴ及びＬｄＣのいずれも、確立されたラミブジン耐性を有するＢ型肝炎患者において一般的に認められる二重突然変異型ＨＢＶ株に対して比較的不活性であった。これらのインビトロでの結果が臨床活性を予測するとすれば、これらの結果は、現在臨床で検討されているＬｄＴ及びＬｄＣプロドラッグは、二重突然変異型ＨＢＶ株を担う、確立されたラミブジン耐性を有する患者において極微の抗ＨＢＶ作用を有するであろうことを示唆する。しかし、文献における最近の２つの抄録報告書は、実験室でのトランスフェクタントについての結果が時として臨床での作用に関する良好な予測的価値を持たないという問題を強調している。Ｇｉｌｅａｄウイルス学者（Ｄｅｌａｎｅｙら、２００１）からの報告は、ＹＭＤＤ突然変異型ＨＢＶ株に対するエンテカビルの極微のインビトロ活性を示唆したが、同じ会議（ＡＡＳＬＤ  ２００１）でのもう１つ別の抄録は、エンテカビルのスポンサー（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）によって実施された大規模な前向き試験の結果を述べており、この試験でエンテカビル治療はラミブジン耐性Ｂ型肝炎患者において実質的なＨＢＶ  ＤＮＡの低下を生じさせた（ＲＥＦ  ｘｘｘ）。それゆえ、ＨＢＶに関連する実験室結果についての疑わしい臨床予測価値に鑑みて、ラミブジン耐性ＨＢＶを有する患者においてＬｄＴ（及びＬｄＣ）に関する小規模な臨床試験を、二重突然変異型ＨＢＶ株に対するこれらの２つの薬剤の最小限のインビトロ活性にもかかわらず、実施することが望ましいと考えられる。
【０５９５】
前記試験は、ラミブジンと異なり、Ｍ５５２Ｖ  ＨＢＶ突然変異株に対するＬｄＴ及びＬｄＣの基本的に不変の抗ウイルス作用を明らかにした。Ｍ５５２Ｖ突然変異は、Ｂ型肝炎患者におけるラミブジン耐性の６０−７０％を占める（Ａｈｍｅｄら、２０００）、Ｍ５１５Ｌ／Ｍ５５２Ｖ二重突然変異株を導く経路における最初の段階であると思われるので、ラミブジン耐性の発現にとって決定的に重要である。鍵となるＭ５５２Ｖ突然変異に対する活性は、ＬｄＴ（テルビブジン）で治療されているＢ型肝炎患者においてウイルス耐性の出現を抑制する助けとなりうるので、このインビトロでの所見はＬｄＴ（テルビブジン）の潜在的耐性プロフィールの全体的理解にとって重要である。
【０５９６】
臨床での抗ウイルス耐性パターンは臨床試験からしか確立することができないが、Ｍ５５２Ｖ  ＨＢＶ突然変異株に対するＬｄＴ及びＬｄＣの不変の活性は、現在の第ＩＩＢ相臨床試験においてＬｄＴ治療患者で認められたＨＢＶ複製のより良好な数量的抑制と合わせて、ＬｄＴに対するＹＭＤＤを介したＨＢＶ耐性はおそらくラミブジン治療で認められるものよりも実質的に頻度が低いであろうことを示唆する。
【０５９７】
表２４．細胞内ヌクレオカプシドのＥＰＡによって測定したときの、安定細胞系統から誘導した野生型及びラミブジン耐性突然変異型ＨＢＶウイルスに対するＬｄＴ、ＬｄＣ、ラミブジン及びＰＭＥＡの阻害プロフィール［（ａ）抗ウイルス効果；及び（ｂ）倍数耐性］。
【０５９８】
【表３５】
2008273960.tif 000095
【０５９９】
【表３６】
2008273960.tif 000096
上の２つの表中の数字は、３または４回の独立した実験からの平均値±ＳＤである。
ＥＣ５０は、細胞培養においてウイルス生産を５０％減らす有効濃度である。
倍数耐性は、突然変異ＨＢＶのＥＣ５０を野生型ＨＢＶのＥＣ５０で割った値である。
【０６００】
Ａｈｍｅｄ  ＳＮＳ，Ｔａｖａｎ  Ｄ，Ｐｉｃｈｏｕｄ  Ｃら「Ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  ｄｅｔｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ．」Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０００，３２，１０７８−１０８８。
【０６０１】
Ａｌｌｅｎ  ＭＩ，Ｄｅｓｌａｕｒｉｅｒｓ  Ｍ，Ｗｅｂｓｔｅｒ  Ａら「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ．」  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９８，２７（６）、１６７０−１６７７。
【０６０２】
Ｄｅｌａｎｅｙ  ＷＥ，Ｈｕｉｌｉｎｇ  Ｙ，Ｗｅｓｔｌａｎｄ  ＣＥら「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｒｏｓｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｅｆｏｖｉｒ，ｅｎｔｅｃａｖｉｒ，ａｎｄ  β−Ｌ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ｌ−ＤＴ）ａｇａｉｎｓｔ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ＨＢＶ．」  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００１，３４（Ｎｏ．４、Ｐｔ２），６２８Ａ，抄録番号１８２５。
【０６０３】
Ｆｕ  Ｌ  及び  Ｃｈｅｎｇ，ＹＣ．「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｕｔｓｉｄｅ  ｔｈｅ  ＹＭＤＤ  ｍｏｔｉｆ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｉｎ  Ｌ（−）ＳｄｄＣ（３ＴＣ）ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８，５５，１５６７−１５７２。
【０６０４】
Ｇａｕｔｈｉｅｒ  Ｊ，Ｂｏｕｒｎｅ  ＥＪ，Ｌｕｔｚ，ＭＷら「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｅｍｉａ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ＹＭＤＤ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ．」Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓ  １９９９，１８０，１７５７−６２。
【０６０５】
Ｇｉｌｅａｄ  ＦＤＡ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｂｒｉｅｆｉｎｇ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ．「Ａｄｅｆｏｖｉｒ  ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ．」ＮＤＡ  ２１−４４９。Ｔａｂｌｅ  １  ｐ．１２、２００２年７月５日
Ｏｎｏ  ＳＫ，Ｋａｔｏ  Ｎ，Ｓｈｉｒａｔｏｒｉ  Ｙら「Ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｌ５２８Ｍ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ−ｓｉｔｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．」Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００１，１０７，４４９−４５５。
【０６０６】
Ｓｅｉｆｅｒ  Ｍ，Ｈａｍａｔａｋｅ  Ｒ，Ｂｉｆａｎｏ  Ｍ，Ｓｔａｎｄｒｉｎｇ  ＤＮ．「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｓ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ．」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８，７２，２７６５−２７７６。
【０６０７】
本発明を、その好ましい実施態様を参照しながら説明した。本発明の変法及び修正は、前記の本発明の詳細な説明から当業者には明白である。これらの変法及び修正はすべて、本発明の範囲内に包含されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０６０８】
【図１ａ】図１ａは、Ｌ−リボース又はＬ−キシロースを出発物質として使用してβ−Ｌ−エリスロペントフラノヌクレオシド（β−Ｌ−ｄＮ）を得るための一般的工程を例示する。
【図１ｂ】図１ｂ及び１ｃは、それぞれ２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンからの２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジン（β−Ｌ−ｄＣ）の３’−及び５’−バリニルエステルの合成の、本発明に従った非制限的な例である。
【図２】図２は、２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンからのＮ４−アセチル−２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンの合成の、本発明に従った非制限的な例である。
【図３】図３は、２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンからのＮ４−［（ジメチルアミノ）メチレン］−２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンの合成の、本発明に従った非制限的な例である。
【図４】図４は、２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンからの３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンの合成の、本発明に従った非制限的な例である。
【図５】図５は、２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンからの２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンの３’，５’−ジ−Ｏ−バリニルエステルの合成の、本発明に従った非制限的な例である。
【図６】図６は、２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンからの２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンのＮ４−（Ｂｏｃ−バリニル）エステルの合成の、本発明に従った非制限的な例である。
【図７】図７は、３’，５’，Ｎ４−トリ−（Ｂｏｃ−Ｌ−バリニル）−２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンからの３’，５’，Ｎ４−トリ−（Ｌ−バリニル）−２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジンの合成の、本発明に従った非制限的な例である。
【図８ａ】図８は、様々なヌクレオシドの溶解度の定量のために有用な標準検定手法を示す折れ線グラフである。図８ａは、天然β−Ｄ−デオキシリボシトシンについて測定した検量線である。
【図８ｂ】図８は、様々なヌクレオシドの溶解度の定量のために有用な標準検定手法を示す折れ線グラフである。図８ｂは、β−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’，５’−ジバリニルエステルについて測定した検量線である。
【図９ａ】図９ａは、ｐＨ７．４２でのβ−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’，５’−ジバリニルエステルの安定性を評価するために使用したＨＰＬＣプロフィールの非制限的な例である。このＨＰＬＣプロフィールは、３つの活性代謝産物、β−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’−バリニルエステル、β−Ｌ−デオキシリボシトシンの５’−バリニルエステル及びＬ−ｄＣと共にβ−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’，５’−ジバリニルエステルの存在を示している。
【図９ｂ】図９ｂは、経時的なβ−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’，５’−ジバリニルエステル及びその代謝産物の相対濃度を示す折れ線グラフである。
【図１０ａ】図１０ａは、ｐＨ７．２０及び４．５１でのβ−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’，５’−ジバリニルエステルの安定性を評価するために使用したＨＰＬＣプロフィールの非制限的な例である。これらのｐＨで、ＨＰＬＣプロフィールは、３つの活性代謝産物、β−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’−バリニルエステル、β−Ｌ−デオキシリボシトシンの５’−バリニルエステル及びＬ−ｄＣと共にβ−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’，５’−ジバリニルエステルの存在を示している。
【図１０ｂ】図１０ｂは、経時的なβ−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’，５’−ジバリニルエステル及びその代謝産物の相対濃度を示す折れ線グラフである。
【図１１ａ】図１１ａは、ｐＨ７．２０及び４．５１でのβ−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’，５’−ジバリニルエステルの安定性を評価するために使用したＨＰＬＣプロフィールの非制限的な例である。これらのｐＨで、ＨＰＬＣプロフィールは、３つの活性代謝産物、β−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’−バリニルエステル、β−Ｌ−デオキシリボシトシンの５’−バリニルエステル及びＬ−ｄＣと共にβ−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’，５’−ジバリニルエステルの存在を示している。
【図１１ｂ】図１１ｂは、経時的なβ−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’，５’−ジバリニルエステル及びその代謝産物の相対濃度を示す折れ線グラフである。
【図１２】図１２は、ｐＨ１．２３でのβ−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’，５’−ジバリニルエステルの安定性を評価するために使用したＨＰＬＣプロフィールの非制限的な例である。このｐＨで、ＨＰＬＣプロフィールは、その３つの活性代謝産物のいずれかへの分解を全く伴わないβ−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’，５’−ジバリニルエステルの存在を示している。
【図１３】図１３は、ヒト血漿中でのβ−Ｌ−デオキシリボシトシンの３’，５’−ジバリニルエステルのインビトロ代謝を示す折れ線グラフである。
【図１４】図１４は、ＨｅｐＧ２細胞におけるβ−Ｌ−デオキシリボシトシン（Ｌ−ｄＣ）の細胞内代謝を示す折れ線グラフである。
【図１５】図１５は、一次ヒト肝細胞におけるＬ−ｄＣの細胞内蓄積を示す折れ線グラフである。
【図１６】図１６は、蓄積及び崩壊の観点からヒトＨｅｐＧ２細胞におけるＬ−ｄＡ、Ｌ−ｄＣ及びＬ−ｄＴの代謝を示すグラフである。前記細胞を化合物１０μＭと共にインキュベートした。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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