(57)【要約】【課題】選択結合性物質を固定化した樹脂性の基材において、被検物質を含む溶液とハイブリダイゼーションさせる際に、選択結合性物質が固定化された面に溶液が接触することによる吸水によって、樹脂性基材に反りが発生し、そのためにシグナルの検出精度が低下するという課題を解決する。【解決手段】本発明は、一主面に選択結合性物質が固定化される選択結合性物質固定化樹脂部材と、該樹脂部材の他主面に接合された平板基材とからなることを特徴とする選択結合性物質固定化複合基材を提供するものである。【選択図】図１
2008014901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択結合性物質が固定される基材であって、一主面に選択結合性物質が固定化される選択結合性物質固定化樹脂部材と、該樹脂部材の他主面に接合された平板基材とからなることを特徴とする選択結合性物質固定化複合基材。
【請求項２】
前記平板基材が、ガラス、セラミックス、金属及び繊維強化樹脂からなる群から選ばれる少なくとも一種の材料からなる平板基材であることを特徴とする、請求項１記載の選択結合性物質固定化複合基材。
【請求項３】
前記平板基材が繊維強化樹脂からなる平板基材であって、該繊維強化樹脂を構成する樹脂が、フェノール樹脂、メラミン樹脂、ユリア樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン樹脂、ジアリルフタレート樹脂、珪素樹脂、ポリイミド樹脂、ビニルエステル樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、フッ素樹脂、ポリアミド樹脂、ポリアセタール樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル、ポリアミド、合成ゴム及びエラストマーからなる群から選ばれる少なくとも１種類からなる樹脂であることを特徴とする請求項１記載の選択結合性物質固定化複合基材。
【請求項４】
前記平板基材の両面に２つの前記選択結合性物質固定化樹脂部材がサンドイッチ型で接合されたことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の選択結合性物質固定化複合基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質と相互作用することができる選択結合性物質が固定される複合基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生物に関する遺伝情報解析研究の結果、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の生物について遺伝子の塩基配列、遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列及びこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が明らかにされた。今後、これら情報に基づいた更なる研究によって、生体内における遺伝子、蛋白質及び糖鎖の機能が解明されることが予測される。
【０００３】
このような機能解析の研究においては、様々な手法が開発され利用されている処ではあるが、何千種類にも及ぶ遺伝子や蛋白質を網羅的に解析する手法としてマイクロアレイ法（チップ法）が様々な形態で利用されている。なかでも、平面基材の一主面に多数のDNAを固定化したDNAチップは、各種細胞における遺伝子発現解析や、蛋白質と遺伝子との相互作用解析に利用されている。これは、原理的には核酸同士のハイブリダイゼーション（サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーションと同様）、核酸と蛋白質との相互作用（ウェスタンブロッティングと同様）に基づいている。また、蛋白質間の相互作用の原理に基づけば、蛋白質を固定化したマイクロアレイを構築することができる。すなわち、マイクロアレイ法といった場合、平面基材上に固定化される物質はDNAやRNA等の核酸、蛋白質並びに糖鎖等に代表される、検査対象物質との間に特異的な結合を形成できる物質を広く意味する。この意味における物質を「選択結合性物質」と呼ぶこともある。
【０００４】
選択結合性物質としてDNA断片を固定化したマイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究検体細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを、平面基材片上に固定化されたDNA断片とハイブリダイゼーションさせ、固定化されたDNA断片とハイブリダイズした標識化サンプルを高解像度解析装置で高速に読みとる。或いは、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出することによって、固定化されたDNA断片とサンプルとのハイブリダイズを検出する。
【０００５】
マイクロアレイにおいて、核酸を基材上に固定化するための技術としては、例えば、スライドガラス等の平坦な基材の一主面にポリ−Ｌ−リジンやアミノシラン等をコーティングし、核酸固定化用のピンを有するスポッターと呼ばれる点着装置を用い、各核酸を固定化する方法などが開発されている（例えば、特許文献１参照）。このような核酸を固定化する基材としては、一般的にガラスが用いられている。しかし、ガラスは破損しやすく、任意の形状に加工し難いといった問題点がある。この問題点を解決するために、樹脂製の基材が提案されている（例えば、特許文献２参照）。樹脂製の基材は、例えば、射出成型法、射出圧縮成型法、プレス成型法等で所望の形状に成型される。
【０００６】
ところで、マイクロアレイ法においては、被検DNAを含む溶液を、DNA断片を固定化した基材表面に接触させることによって上述したハイブリダイゼーションを行っている。また、蛋白質間の相互作用を検出するマイクロアレイ方法においても、被検蛋白質を含む溶液を、蛋白質が固定化された基材表面に接触させている。このとき、基板に供給された溶液の蒸発を防止するため、滴下された溶液をカバーガラスで覆うととともに、基板全体をハイブリダイゼーションチャンバー等の専用治具内に固定した状態で周辺を水で満たすといった方法が提案されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００７】
また、マイクロアレイ法では、基材に固定化した選択結合性物質と被検物質との特異的なハイブリダイズ（相互作用）を、例えば被検物質に結合させた標識物質を検出することで同定する。標識物質の検出には、例えば、標識物質として蛍光物質を使用した場合には蛍光スキャナーを使用する。ところが、樹脂製の基材を用いたマイクロアレイでは、基材自体の反りの影響により標識物質の検出精度が低下してしまうといった問題がある。より具体的には、基材上に固定化される位置によって、標識物質に由来するシグナルの強度にばらつきが生じ、基材表面の全体に亘ってシグナルを正確に検出できないといった問題がある。例えば、基材の反りがレーザービームの焦点深度以上となると、正確な測定ができなくなるという問題点がある。一般に、レンズでレーザービームを縛った場合、その焦点深度は数十μｍであり、これ以上の基材の反りが生じると正確な測定ができなくなる。
【０００８】
一般に、樹脂、特に炭化水素系以外の樹脂は、水分を吸収する性質があることが知られている。通常マイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション工程においては、選択結合性物質が固定化された基材の片面だけが被検体物質の溶液と接触することになり、樹脂製基材にとって不均一な吸水環境となる。樹脂製基材と水分の接触が不均一な場合、基材は不均一に吸水し、その結果、基材に反りが生じる恐れがある。すなわち、従来の樹脂製基材においては、ハイブリダイゼーション時の不均一な吸水環境により基材に反りが生じ、これは被検体物質の検出感度の低下につながるという課題があった。
【特許文献１】特表平１０−５０３８４１号公報（特許請求の範囲）
【特許文献２】特開２００５−４９３２９号公報（特許請求の範囲）
【特許文献３】特開２００２−２３８５６０号公報（特許請求の範囲）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上述したような、選択結合性物質を固定化した従来の樹脂性の基材における課題、すなわち、特に被検物質を含む溶液とハイブリダイゼーションさせる際に、選択結合性物質が固定化された面に該溶液が接触することによる吸水によって、樹脂性基材に反りが発生し、そのためにシグナルの検出精度が低下するという課題を解決した、優れた感度でシグナルを検出することができる選択結合性物質固定化複合基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、樹脂性の選択結合性物質を固定化した基材と溶液、特に被検物質を含む溶液と接触が、当該基材の一方主面に偏っていることに起因して当該基材の反りが生じていることを突き止めた。そして、当該基材に生じる反りを防止することで、シグナルの検出精度を向上させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、一主面に選択結合性物質が固定化される選択結合性物質固定化樹脂部材と、該樹脂部材の他主面に接合された平板基材とからなることを特徴とする選択結合性物質固定化複合基材を提供するものである。
【００１２】
本発明の好ましい態様の１つは、上記平板基材が、ガラス、セラミックス、金属及び繊維強化樹脂からなる群から選ばれる少なくとも一種の材料からなる平板基材であることを特徴とする選択結合性物質固定化複合基材である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る選択結合性物質固定化複合基材は、ハイブリダイゼーション時における不均一な樹脂部材の吸水による反りの発生を防止することができる。これにより、本発明に係る選択結合性物質固定化複合基材は、選択結合性物質を固定化した領域内において高い平面性を維持することができ、シグナルの検出精度に優れたものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１５】
本発明に係る選択結合性物質固定化複合基材は、一主面に選択結合性物質が固定化される選択結合性物質固定化樹脂部材と、該樹脂部材の他主面に接合された平板基材とからなり、選択結合性物質を固定化する樹脂基材の他主面に平板基材を接着することで多層構造にした複合基材である。
【００１６】
接着する平板基材としては、選択結合性物質固定化樹脂部材との接着面及びその反対面の平坦性の高い基材が好ましく、ガラス板、セラミックス板、金属板、繊維強化樹脂板がより好ましい。
【００１７】
本発明の選択結合性物質固定化複合基材の一例を図１に示す。１は選択結合性物質固定化樹脂部材、２は選択結合性物質が固定化される選択結合性物質固定化樹脂部材１の一主面である。選択結合性物質固定化樹脂部材１の他主面５に、平板基材３が接合される。
【００１８】
上記平板基材が金属板である場合は、金、銀、銅、白金、パラジウム、鉄、チタン、鉛、ニッケル、マグネシウム又はアルミニウムからなる金属板であることが好ましい。
【００１９】
上記平板基材が繊維強化樹脂板である場合、該繊維強化樹脂板に用いられる高強度繊維は特に限定されないが、ガラス繊維、セラミックス繊維又は炭素繊維が好ましい。炭素繊維が積層されたものは、ガラス繊維に比べて軽量かつ機械的強度が高いことからより好ましく、この場合炭素繊維糸条が長さ方向と幅方向に平行に配列して、織組織として層構成をなし、平坦な炭素繊維布帛板となる。さらに、炭素繊維の層構成の方向は特に限定されないが、長さ方向に対して０°方向、９０°方向や±４５°方向であってもよい。長さ方向に対して１方向のみ積層させた場合、長さ方向の強度が低下することから、３次元構造に積層する方がより好ましい。
【００２０】
上記繊維強化樹脂を構成する樹脂（マトリックス樹脂）としては、熱硬化性樹脂や熱可塑性樹脂を用いることができ、特に限定されるものではないが、熱硬化性樹脂としては、例えば、フェノール樹脂、メラミン樹脂、ユリア樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン樹脂、ジアリルフタレート樹脂、珪素樹脂、ポリイミド樹脂、ビニルエステル樹脂などやその変性樹脂など、熱可塑性樹脂としては塩化ビニル樹脂、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、フッ素樹脂、ポリアミド樹脂、ポリアセタール樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル、ポリアミドなど、さらには熱可塑性ポリウレタン、ブタジエンゴム、ニトリルゴム、ネオプレン、ポリエステル等の合成ゴム又はエラストマーなどが好ましく使用できる。
【００２１】
本発明において、選択結合性物質を固定化する樹脂基材と接着する平板基材の組み合わせは、樹脂基材−ガラス板、樹脂基材−セラミックス板、樹脂基材−金属板、樹脂基材−繊維強化樹脂板など、平板基材が１種類である場合に限定されるわけではなく、樹脂基材−ガラス板−セラミックス板、樹脂基材−ガラス板−金属板、樹脂基材−ガラス板−繊維強化樹脂板など、複数種類の平板基材を組み合わせて接着してもよい。また、樹脂基材−ガラス板−樹脂基材、樹脂基材−セラミックス板−樹脂基材、樹脂基材−繊維強化樹脂板−樹脂基材など、平板基材の両面を選択結合性物質固定化樹脂基材で挟んだサンドイッチ型に接着してもよい。これら組み合わせる基材の数、種類はこれに限定されたものではない。
【００２２】
さらに本発明において、接着する平板基材の大きさは選択結合性物質を固定化する樹脂基材と同じ大きさであることが好ましいが、特に限定されるわけではなく、樹脂基材の他面に梁となるような大きさで接着してもよい。
【００２３】
さらに本発明において、接着する平板基材の厚さは特に限定されないが、０．１ｍｍ以上であれば強度が高いことから好ましい。
【００２４】
本発明による、少なくとも一方の主面に選択結合性物質を固定化する樹脂基材の他面に他の基材を接着する方法としては、特に限定はされないが、接着剤による接着、加熱加圧による熱融着などが挙げられる。さらに、接着剤による接着を行う場合は、ディスペンサに代表される、接着剤塗布装置により、接着剤の吐出量および吐出位置を正確に制御できるため、均一に塗布できることから好ましい。
【００２５】
ここで、接着剤としては、エポキシ樹脂に代表される２液硬化型接着剤、シアノアクリレートに代表される、水分により硬化する接着剤、紫外線硬化型接着剤、熱硬化型接着剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
ホットプレスに代表される、熱融着による接着を行う場合、樹脂基材の主成分となる樹脂材料のガラス転移温度（Tg）以下となるように加熱する。樹脂材料のガラス転移温度は、公知の手法（ディラトメータによる方法、差動熱量計による方法、動的粘弾性測定装置による方法等）によって測定することができる。例えば、樹脂基材としてポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ、Tg；１２０℃）を使用する場合、樹脂基材の温度が８０℃〜１００℃となるように加熱することが好ましい。このとき、１Ｎ〜１０Ｎの加重で樹脂基材と他の基材を加圧することが好ましい。加重が１Ｎ未満である場合には、接着するのに長時間を要するため好ましくない。一方、加重が１０Ｎより大である場合には、樹脂基材内に応力がかかり、処理後の複合基材に反りが生じる虞があり好ましくない。したがって、樹脂基材に対する加重は１Ｎ〜１０Ｎであとすることが好ましい。さらに、加圧時間は、１０分以上であることが好ましい。加熱時間が５分未満である場合には、十分に接着できない恐れがある。また、加熱時間の上限としては特に規定されず、１０分程度で十分に接着することができる。
【００２７】
本明細書において使用する選択結合性物質とは、物質群の中に含まれる特定の物質に対して特異的に相互作用する物質を意味する。特異的な相互作用とは、特定の物質に対する直接的又は間接的な結合であって、選択性を有する結合と言い換えることができる。具体的に選択結合性物質としては、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。ここで核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡを含む意味である。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう選択結合性物質に該当する。また、タンパク質としては、抗体、Fabフラグメント及びF(ab')2フラグメントのような抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、選択結合性物質に該当する。また、糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、選択結合性物質には、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質も含まれる。選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。
【００２８】
選択結合性物質として、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能であり、また、核酸末端のアミノ基修飾が容易であるため、基材表面への固定化が容易となることから好ましい。さらに、長さが２０塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から、選択結合性物質としては、長さが２０〜１００塩基のオリゴ核酸を使用することがより好ましい。ハイブリダイゼーションの安定性を保持するため、選択結合性物質としては、特に好ましくは４０〜１００塩基の範囲のオリゴ核酸を使用する。
【００２９】
本明細書において使用する選択結合性物質固定化複合基材とは、先に定義した選択結合性物質を一主面に固定化できる平板状の基材を意味する。特に、本発明においては、選択結合性物質固定化基材としては、該平板状部材の主成分が樹脂であるものを対象としている。
【００３０】
選択結合性物質固定化基材を構成する樹脂としては、特に限定されないが、好ましくは、ポリスチレン系樹脂、ジエン系樹脂、ポリアクリル酸エステル系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、シリコン樹脂が挙げられる。選択結合性物質固定化基材としては、特に、カルボニル基を有する樹脂、例えばポリアクリル酸エステル系樹脂を使用することが好ましい。この場合、選択結合性物質固定化基材に対して選択結合性物質を効率よく固定化させることができる。
【００３１】
ポリスチレン系樹脂を構成するスチレン系単位としては、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、α−メチルスチレン、α−メチル−ｐ−メチルスチレンのようなアルキル置換スチレン、ｏ−クロロスチレン、ｐ−クロロスチレンのようなハロゲン系スチレン類が挙げられる。ポリスチレン系樹脂としては、これらスチレン系単位を２種類以上含むものであっても良い。
【００３２】
ジエン系樹脂を構成するジエン系単位としては、ブタジエン、２−メチルブタジエン、２，３−ジメチルブタジエン等が挙げられる。ジエン系樹脂としては、これらジエン系単位を２種類以上含むものであっても良い。
【００３３】
ポリアクリル酸エステル系樹脂を構成するアクリル酸エステル系単位としては、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、アクリル酸シクロヘキシル、アクリル酸フェニル、アクリル酸ベンジル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸フェニル、メタクリル酸ベンジル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチルが挙げられる。ポリアクリル酸エステル系樹脂としては、これらポリアクリル酸エステル系単位を２種類以上含むものであっても良い。
【００３４】
ポリカーボネート系樹脂を構成するカーボネート系単位としては、４,４’−ジヒドロキシビフェニル、ビス（４−ヒドロキシフェニル）メタン、１,１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）エタン、１,１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−１−フェニルエタン、２,２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル）プロパン、１,１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−３,３,５−トリメチルシクロヘキサン、２,２−ビス（３−フェニル−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（４−ヒドロキシ−３−イソプロピルフェニル）プロパン、２,２−ビス（３−t−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）ブタン、２,２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）オクタン、２,２−ビス（３−ブロモ−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（３,５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（３,５−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（３,５−ジメチル−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（３−シクロヘキシル−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、１,１−ビス（３−シクロヘキシル−４−ヒドロキシフェニル）シクロヘキサン、ビス（４−ヒドロキシフェニル）ジフェニルメタン、９,９−ビス（４−ヒドロキシフェニル）フルオレン、９,９−ビス（４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル）フルオレン、１,１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）シクロヘキサン、１,１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）シクロペンタン、４,４’−ジヒドロキシジフェニルエ−テル、４,４’−ジヒドロキシ−３,３’−ジメチルジフェニルエ−テル、４,４’−ジヒドロキシジフェニルスルホン、４,４’−ジヒドロキシジフェニルスルホキシド、４,４’−ジヒドロキシジフェニルスルフィド、４,４’−ジヒドロキシ−３,３’−ジメチルジフェニルスルホン、４,４’−ジヒドロキシ−３,３’−ジメチルジフェニルスルフィド、４,４’−ジヒドロキシ−３,３’−ジメチルジフェニルスルホキシド、４,４’−ジヒドロキシ−３,３’−ジフェニルジフェニルスルホン、４,４’−ジヒドロキシ−３,３’−ジフェニルジフェニルスルフィド、４,４’−ジヒドロキシ−３,３’−ジフェニルジフェニルスルホキシド、１,３−ビス｛２−（４−ヒドロキシフェニル）プロピル｝ベンゼン、１,４−ビス｛２−（４−ヒドロキシフェニル）プロピル｝ベンゼン等が挙げられる。中でも、２,２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル）プロパン、１,１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）シクロヘキサン、１,１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−３,３,５−トリメチルシクロヘキサン、９,９−ビス（４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル）フルオレン等を挙げることができる。特に、カーボネート系単位として２,２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン（以下、“ビスフェノ−ルＡ”と略記する場合がある）を含むポリカーボネート系樹脂が好ましい。ポリカーボネート系樹脂としては、これらカーボネート系単位を２種類以上含むものであっても良い。
【００３５】
以上のような樹脂を使用して選択結合性物質固定化基材を製造する際には、先ず、一対の金型により構成されるキャビティ内に溶融した樹脂を供給する。その後、キャビティ内で樹脂を硬化させ、一対の金型を離間させた後に樹脂基材をキャビティから取り出す。したがって、樹脂基材の形状は、キャビティの形状に依存することとなる。本発明の選択結合性物質固定化基材の製造方法では、平板状の選択結合性物質固定化基材を対象としているが、両主面が平坦であることに限定される意味ではない。すなわち、選択結合性物質固定化基材としては、両主面或いは一主面が平坦である基材、両主面或いは一主面に加工が施された基材、及び両主面或いは一主面に凹凸構造を有する基材（特開２００４−２６４２８９号公報を参照）を例示することができる。
【００３６】
例えば、一対の金型のうち少なくとも一方の金型におけるキャビティ構成面に凹凸加工が形成されていると、この凹凸加工が基材の主面に転写される。この方法によって、両主面或いは一主面に凹凸構造を有する選択結合性物質固定化基材を成型することができる。そして、一主面に凹凸構造を有する選択結合性物質固定化基材であっても、上述した平坦な基材を接着することで、反りを十分に低減することができる。
【００３７】
また、選択結合性物質固定化基材の厚さは、特に限定されないが、通常０．１ｍｍ〜２０ｍｍ程度であり、好ましくは０．１ｍｍ〜２０ｍｍ程度である。選択結合性物質固定化基材の厚さが薄いほど反りの問題が生じやすいが、本発明によれば、０．１ｍｍ程度の厚さの選択結合性物質固定化基材であっても、反りを十分に低減することができる。
【００３８】
さらに、上述した平板基材との接着の前或いは接着の後に、選択結合性物質固定化基材の両主面或いは一主面に表面処理を施してもよい。表面処理としては、特に限定されず、以下を例示することができる。一例として、選択結合性物質固定化基材として、カルボニル基を有する樹脂、例えばポリアクリル酸エステル系樹脂を用いた場合には、少なくとも、選択結合性物質を固定化する一主面におけるエステルを加水分解によりカルボン酸に変換させることが好ましい。これにより、選択結合性物質である核酸をより効率よく固定化させることができる。この表面処理の手段としては、例えば、アルカリ、酸などで対象の表面を処理する方法、温中で超音波処理する方法、酸素プラズマを照射する方法、アルゴンプラズマを照射する方法、放射線を照射する方法が挙げられ、これらの方法を単独或いは適宜組み合わせて使用することができる。これらの方法の中でも、担体の損傷が少なく、また、容易に実施できるという点から、温度を上げたアルカリもしくは酸に樹脂部材を浸漬する方法が好ましい。より具体的には、水酸化ナトリウムや硫酸の水溶液（好ましい濃度は、１Ｎ〜２０Ｎ）に樹脂部材を浸漬し、好ましくは３０〜８０℃の温度に維持して、１〜１００時間の間保持すればよい。
【００３９】
これらいずれの方法でも、カルボキシル基が一表面に生成したかどうかは、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）にて確認できる。具体的には、フッ素を含むラベル化試薬（例えばトリフルオロエタノール）を用いてカルボキシル基をフッ素でラベル化する。そして、ラベル化後の試料でのＣ１ｓ、Ｆ１ｓピーク面積強度に反応率を考慮して官能基量を推定することが可能である。さらに精度を上げるためには、トリフルオロエタノールで標識化された試料の表面のフッ素分布をＴＯＦ−ＳＩＭＳ（飛行時間型二次イオン質量分析法）で観察することにより、カルボキシル基が樹脂部材の一主面に生成しているかどうかを確認すればよい。
【００４０】
このようにカルボキシル基を一主面に生成すれば、これを選択結合性物質を固定化する足がかりに、ビオチン若しくはアビチン修飾し、選択結合性物質をアビチン若しくはビオチン修飾して、アビチン・ビオチン相互作用にて選択結合性物質を基材の一主面に固定化することができる。または、基材の一主面をエチレンジアミン等のリンカーと反応させて、さらにこのリンカーと選択結合性物質とを反応させ固定化することもできる。しかし、これらの方法では、２段階の反応を行うため、反応収率の関係から、基材に固定化できる選択結合性物質が少なくなる場合も生じる。したがって、基材の一主面におけるカルボキシル基と選択結合性物質の官能基とを直接反応させ、選択結合性物質を固定化することが最も好ましい固定化方法である。すなわち、基材の一主面に形成されたカルボキシル基と選択結合性物質のアミノ基や水酸基とを共有結合により固定化することが好ましい。一般的には、これらの結合の反応を助長するため、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホナートなどの様々な縮合剤が用いられる。これらの中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)は、毒性が少ないことや、反応系からの除去が比較的容易なことから、選択結合性物質と基材の一主面に形成されたカルボキシル基との縮合反応には最も有効な縮合剤の１つである。その他、縮合剤としては、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチル−モルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）を好適に使用することができる。これらＥＤＣなどの縮合剤は、選択結合性物質の溶液と混ぜて使用しても良いし、カルボキシル基が表面に形成された基材を予めＥＤＣの溶液に浸漬しておき、表面のカルボキシル基を活性化するように使用しても良い。
【００４１】
このような縮合剤を用い、基材の一表面に形成されたカルボキシル基と選択結合性物質のアミノ基とを反応させた場合は、基材の一表面に対して選択結合性物質がアミド結合により固定化されることになる。また、基材の一表面に形成されたカルボキシル基と選択結合性物質の水酸基とを反応させた場合は、基材の一表面と選択結合性物質とがエステル結合により固定化されることになる。選択結合性物質を含む試料を基材の一主面に作用させる際の温度は、５〜９５℃が好ましく、１５〜６５℃が更に好ましい。処理時間は通常５分〜２４時間であり、１時間以上が好ましい。
【００４２】
一方、選択結合性物質固定化基材は、選択結合性物質を固定した後、適当な処理を施したものであっても良い。例えば、熱処理、アルカリ処理、界面活性剤処理などを行うことにより、固定された選択結合性物質を変性させることもできる。
【００４３】
また、選択結合性物質固定化基材は、上述した樹脂からなる構成に限定されず、上述した樹脂の他に他の成分を混合したような構成であってもよい。例えば、他の成分としては、選択結合性物質固定化基材からの自家発光を抑制する物質を挙げることができる。すなわち、蛍光標識化された被検物質と選択結合性物質との相互作用を、スキャナーと呼ばれる検出装置で蛍光を読みとることで検出する場合、基材自体からの発光（自家発光）が検出感度を低下させるおそれがある。よって、自家発光を抑制する物質を選択結合性物質固定化基材に含ませることによって、検出感度の低下を防止することができる。
【００４４】
より詳細には、スキャナーは励起光であるレーザー光を対物レンズで絞り込み、レーザー光を選択結合性物質固定化基材の一主面に集光し、蛍光標識からの発光をCCDカメラ等の検出手段によって検出している。しかし、基材の一主面から自家蛍光が生じる場合、その発光がノイズとなり検出手段による検出感度の低下に繋がることがある。そこで、自家発光を抑制する物質を樹脂に混合した基材、例えば黒色を呈する基材を使用することによって、基材の自家蛍光を低減させることができ。検出感度の低下を防止することができる。その結果、検出の際のノイズが小さく、すなちＳ／Ｎを向上させることができる。
【００４５】
ここで、黒色とは、可視光（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）範囲において、分光反射率が特定のスペクトルパターン（特定のピークなど）を持たず、一様に低い値であり、且つ、分光透過率も特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値であることをいう。この分光反射率及び分光透過率の値としては、可視光（波長が４００〜８００ｎｍ）の範囲の分光反射率が７％以下であり、同波長範囲での分光透過率が２％以下であることが好ましい。なお、ここでいう分光反射率は、ＪＩＳ Ｚ ８７２２条件Ｃに適合した、照明・受光光学系で、基材からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率をいう。
【００４６】
自家発光を抑制する物質としては、黒色物質を挙げることができる。黒色物質としては、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ及びＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、Ｚｒ及びＣｒの炭化物等を例示することができる。これらの黒色物質は、単独で含有させても良いし、２種類以上を混合して含有させることもできる。黒色物質の中でも、特に、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラックを使用することが好ましい。特に、カーボンブラックは樹脂材料に対する分散性に優れるため好ましく用いることができる。
【００４７】
以上のように、本発明の選択結合性物質固定化複合基材は、選択結合性物質が固定された後に被検物質の検出等に使用される。具体的には、固定された選択結合性物質に対する被検物質の相互作用を検出する際に、当該選択結合性物質が固定化された基材部材の一主面に被検物質を含有する溶液が供給される。当該溶液と基材との接触状態を所定の時間（核酸同士のハイブリダイゼーションの場合には例えば１２〜２４時間）維持した後、選択結合性物質と相互作用しなかった被検物質を基材の一主面から除去する。その後、スキャナー等によって被検物質に結合した標識物質を検出することによって、選択結合性物質と被検物質との相互作用を検出することができる。
【００４８】
本発明において被検物質としては、選択結合性物質に対して選択的に相互作用する物質であれば特に限定されず、選択結合性物質の種類に応じてあらゆる物質を含む意味である。具体的には、DNA、RNA及びPNA等の核酸、抗原や抗体等のタンパク質、糖鎖、その他の高分子化合物、及び低分子化合物を挙げることができる。さらに、被検物質としては、例えば、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができる。また、これらの被検物質を含む溶液としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質として核酸を対象とする場合には、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。
【００４９】
核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオチド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅後の核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、選択結合性物質が固定化された複合基材を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、当該基材に結合した標識を測定することもできる。
【００５０】
選択結合性物質と被検物質とを相互作用させる工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、４０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。また、被検物質を含む溶液を選択結合性物質固定化基材の一主面に供給した後、カバーガラスで一主面を覆うようにすれば、当該溶液の蒸発を防止することができる。
【００５１】
本発明の選択結合性物質固定化複合基材によれば、例えば被検物質を含む溶液を選択結合性物質固定化基材の一主面に接触させる際の樹脂基材の不均一な吸水による反りの発生が防止され高度な平面性を有するため、上述したような被検物質の検出において優れた検出感度を達成することができる。特に、被検物質を定量する場合など高精度な検出が要求されたとしても、本発明の複合基材によれば、その要求を満足するレベルの検出が可能となる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５３】
〔実施例１〕
（ＤＮＡ固定化複合基材の作製及び処理）
本実施例では、選択結合性物質として既知の塩基配列を有するプローブＤＮＡを固定化したＤＮＡ固定化複合基材を準備した。公知の方法であるLIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung)プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の基材（以下、ＰＭＭＡ基材と称する）を得た。なお、この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は１５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製  ＃３０５０Ｂ）を含有させており、基材は黒色である。この黒色基材の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００５４】
ＰＭＭＡ基材の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、ＰＭＭＡ基材の中央部分を除き表面は平坦であった。ＰＭＭＡ基材の中央部分には、１００μｍの凹部が形成されるとともに、当該凹部内に直径５０μｍ、高さ１００μｍの凸部が２５６個形成されている。
【００５５】
以上のように成型して得られた本発明の選択結合性物質固定化樹脂部材であるＰＭＭＡ基材の凹凸部がある主面に対して他面に、平板基材として炭素繊維布帛板を接着した。当該炭素繊維布帛板は大きさ縦７６ｍｍ、横１０ｍｍ、厚さ０．２ｍｍであった。接着方法は、ディスペンサ（武蔵エンジニアリング製ショットミニＳＬ）を用いて、シアノアクリレート系接着剤を炭素繊維布帛板上に、吐出圧力０．４ＭＰａ、吐出速度３ｍｍ／ｓで高精度に塗布した。ついで、ＰＭＭＡ基材を接着剤を塗布した炭素繊維布帛板面に乗せ、ＰＭＭＡ基材の凹凸部がある主面を１Ｎの圧力をかけた状態で、３分間放置し、接着を行った。
【００５６】
〔実施例２，３〕
（ＤＮＡ固定化複合基材の作製及び処理）
上記実施例１と同様の方法で、ＰＭＭＡ基材と、平板基材としてガラス繊維布帛板（大きさ縦７６ｍｍ、横１０ｍｍ、厚さ０．２ｍｍ）、及びガラス板（大きさ縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚さ１ｍｍ）とを接着し、ＰＭＭＡ基材とガラス繊維布帛板及びガラス板との複合基材を作成した。
【００５７】
〔比較例１〕
上記実施例１の方法で作成したＰＭＭＡ基材を、比較例としてそのまま用いた。
【００５８】
〔参考例１〕
（プローブ溶液の調製）
配列番号１（７０塩基、５’末端アミノ化）のプローブＤＮＡを合成した。このプローブＤＮＡを、純水に０．２７ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。基材に点着する際は、ＰＢＳ(ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ６．５)でプローブＤＮＡの終濃度を０．０２７ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、基材表面のカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。さらに、スポットムラを減らすためドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．００５％で加えた。最終的に調製された溶液をプローブ溶液と称する。そして、これらのプローブ溶液を３８４ウェルマイクロタイタープレートの４箇所に３０μｌづつ分注した。
【００５９】
〔実施例４〜６、比較例２〕
（スポッティング）
日本レーザー電子製のスポッター（Ｇｅｎｅ  ＳｔａｍｐII）のピンブロックに、４．５ｍｍの頂点の四隅にセットする形で、４本のステンレス製のピンをセットした。そして、上記実施例１〜３で作製した複合基材及び比較例１で作製した基材について、それぞれ２０枚をスポッターのステージに並べにプローブ溶液をスポットした。なお、ピンには毛管は設けていないが、ピンヘッドに幅５０μｍ、深さ３０μｍの一文字状の溝を刻んでいる。
【００６０】
そして、マイクロカメラで観察しながら、２０枚それぞれの基材について、ある一つの凸部上面をスポッティングする時にピンが下降する位置と、この凸部上面の位置とが合致するように微調整を行った後、先に述べた３８４ウェルマイクロタイタープレートに入れた４つのプローブ溶液に一度に４つのピン先を浸漬し、そして、一度に４つの凸部の上にプローブ溶液をスポットした。「ピン先をプローブ溶液に浸漬」→「凸部上面にスポット」を６４回繰り返し、計２５６個の凸部の上にプローブ溶液のスポッティングを行った。なお、ピンヘッドの大きさの検討のため直径２２０μｍ、２４０μｍ、３００μｍ、４００μｍ、６００μｍのようにピンヘッドの大きさを変えた。
【００６１】
〔参考例２〕
（検体ＤＮＡの調整）
検体ＤＮＡ（被検物質に相当）として、上記ＤＮＡ固定化基材に固定化されたプローブＤＮＡとハイブリダイズ可能な塩基配列を含む配列番号２のＤＮＡ（９６８塩基）を用いた。調整方法を以下に示す。
【００６２】
配列番号３と配列番号４のＤＮＡを合成した。これを純水に溶かして濃度を１００μＭとした。次いで、ｐＫＦ３  プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号５：２２６４塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号３及び配列番号４のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）により増幅を行った。
【００６３】
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ExTaq ２μｌ、10×ExBuffer ４０μｌ、dNTP Mix ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製  製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、 配列番号３の溶液を２μｌ、配列番号４の溶液を２μｌ、テンプレート（配列番号５）を０．２μｌを加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号２（９６８塩基）が増幅されていることを確認した。
【００６４】
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（dATP、dTTP、dGTPの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、dCTPの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡを得た。なお、標識の際、ランダムプライマーを用いたので検体ＤＮＡの長さには、ばらつきがある。最も長い検体ＤＮＡは配列番号２（９６８塩基）となる。なお、検体ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。
【００６５】
この標識化された検体ＤＮＡを、１重量体積％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとはＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物２２．１ｇを純水にとかし、１ｌにメスアップしたもの。またＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物２２．１ｇを純水にとかし、５ｌにメスアップしたものを１×ＳＳＣと表記し、これの１０倍濃縮液を１０×ＳＳＣ、５倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）、０．１重量体積％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量体積％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用の溶液とした。
【００６６】
〔実施例７〜９、比較例３〕
（ハイブリダイゼーション）
上記実施例４〜６及び比較例２で得られたプローブＤＮＡを固定化した基材に上記参考例２で調製した検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、先に用意したプローブ核酸が固定化されている担体にハイブリダイゼーション用の溶液を５０μｌ滴下し、プローブＤＮＡを固定化した面にカバーガラスをかぶせた。これを、プラスチック容器の中に入れ、４２℃、湿度１００％の条件で１０時間インキュベートした。図２は、実施例７〜９についてこの状態を模式的に示す断面図である。図２に示すように、本実施例では、プローブＤＮＡが固定化された選択結合性物質固定化樹脂部材１（）の一主面２にカバーガラス４をかぶせた状態で検体ＤＮＡを含む溶液を滴下し、樹脂部材１の他主面５に平板基材３を接着させている。
【００６７】
なお、インキュベート後、カバーガラスを剥離後に洗浄、乾燥した。
【００６８】
ハイブリダイゼーション後の基材の反り度を、レーザー変位計（キーエンスＬＫ−２０１０）を用いて測定した。基材の中央部を長軸方向に沿って測定を行った。基材全体で高低差の最大値を反り値の定義とした。
【００６９】
平板基材として、ＰＭＭＡ基材に炭素繊維布帛板、ガラス繊維布帛板、ガラス板を接着した実施例７〜９の複合基材の反り値は、いずれも１マイクロメートルであった。これに対して、比較例３の平板基材を接着しなかったＰＭＭＡ基材の反り値は、３００マイクロメートルであった。
【００７０】
以上の結果から分かるように、選択結合性物質固定化樹脂部材（ＰＭＭＡ基材）に炭素繊維布帛板、ガラス繊維布帛板、ガラス板を平板基材として接着させた選択結合性物質固定化複合基材は、平板基材を接着させなかったＰＭＭＡ基材に比べて、いずれもハイブリダイゼーション時の不均一な吸水による反りが低減されていることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、本発明の選択結合性物質固定化複合基材の一例を示す断面図である。
【図２】図２は、選択結合性物質が固定化された一主面にカバーガラスをかぶせた本発明の選択結合性物質固定化複合基材の一例を示す断面図である。
【符号の説明】
【００７２】
１  選択結合性物質固定化樹脂部材
２  選択結合性物質固定化樹脂部材の一主面
３  平板基材
４  カバーガラス
５  選択結合性物質固定化樹脂部材の他主面
【図１】
2008014901.tif 000003
【図２】
2008014901.tif 000004
【配列表】
2008014901000001.app