(57)【要約】      （修正有）【課題】微小流体デバイスを用いた変性剤濃度勾配存在下での二本鎖核酸電気泳動法により二本鎖核酸を塩基配列の違いによって分離する方法、及び当該方法のための装置を提供すること。【解決手段】液体導入用マイクロチャンネルから溶液を移動させて変性剤濃度勾配を形成する工程、試料導入用マイクロチャンネルから二本鎖核酸を分離用マイクロチャンネルに導入する工程、導入された二本鎖核酸を分離する工程、及び分離された二本鎖核酸を検出する工程、を含む方法であって、変性剤濃度勾配を形成する工程の間、液体導入用マイクロチャンネルが位置する部分の温度を制御することを特徴とする方法、及び当該方法に適した装置に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離用マイクロチャンネル、
前記分離用マイクロチャンネルに接続された二本の液体導入用マイクロチャンネル、及び
前記分離用マイクロチャンネルと接続された試料導入用マイクロチャンネル、
とを、少なくとも有する微小流体デバイスを用いて変性剤濃度勾配存在下で電気泳動を行うことによって二本鎖核酸を塩基配列の違いによって分離する方法であって、
該方法は、
少なくとも、
（ａ）前記二本の液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルに変性剤を含む第一の液体を導入し、同時に、他方のマイクロチャンネルに前記第一の液体の変性剤の濃度より低濃度の変性剤を含むか、または変性剤を含まない第二の液体を導入して、前記分離用マイクロチャンネルに変性剤濃度勾配を形成する工程、
（ｂ）前記試料導入用マイクロチャンネルから二本鎖核酸を前記分離用マイクロチャンネルに導入する工程、
（ｃ）前記導入された二本鎖核酸を分離する工程、及び
（ｄ）分離された二本鎖核酸を検出する工程、
を含み、
前記（ａ）の工程の間、前記液体導入用マイクロチャンネルの温度を制御することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
分離用マイクロチャンネル、
前記分離用マイクロチャンネルに接続された二本の液体導入用マイクロチャンネル、及び
前記分離用マイクロチャンネルに接続された試料導入用マイクロチャンネル、
とを、少なくとも有する微小流体デバイスを用いて変性剤濃度勾配存在下で電気泳動を行うことによって二本鎖核酸を塩基配列の違いによって分離する方法であって、
該方法は、
少なくとも、
（ａ）前記二本の液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルに変性剤を含む第一の液体を導入し、同時に、他方のマイクロチャンネルに前記第一の液体の変性剤の濃度より低濃度で変性剤を含むか、または変性剤を含まない第二の液体を導入して、前記分離用マイクロチャンネルに変性剤濃度勾配を形成する工程、
（ｂ）前記試料導入用マイクロチャンネルから二本鎖核酸を前記分離用マイクロチャンネルに導入する工程、
（ｃ）前記導入された二本鎖核酸を分離する工程、及び
（ｄ）分離された二本鎖核酸を検出する工程、
を含み、
前記液体導入用マイクロチャンネルが位置する部分の温度を、前記（ａ）の工程の間、３０乃至８０℃とする、前記方法。
【請求項３】
分離用マイクロチャンネル、
前記分離用マイクロチャンネルに接続された二本の液体導入用マイクロチャンネル、及び
前記分離用マイクロチャンネルと接続された試料導入用マイクロチャンネル、
とを、少なくとも有する微小流体デバイスを用いて変性剤濃度勾配存在下で電気泳動を行うことによって二本鎖核酸を塩基配列の違いによって分離する方法であって、
該方法は、
少なくとも、
（ａ）前記二本の液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルに変性剤を含む第一の液体を導入し、同時に、他方のマイクロチャンネルに前記第一の液体の変性剤の濃度より低濃度で変性剤を含むか、または変性剤を含まない第二の液体を導入して、前記分離用マイクロチャンネルに変性剤濃度勾配を形成する工程、
（ｂ）前記試料導入用マイクロチャンネルから二本鎖核酸を前記分離用マイクロチャンネルに導入する工程、
（ｃ）前記導入された二本鎖核酸を分離する工程、及び
（ｄ）分離された二本鎖核酸を検出する工程、
を含み、
前記（ａ）の工程の間、前記液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を上昇させ、同時に他方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を下降させることを特徴とする、前記方法。
【請求項４】
前記（ａ）の工程の後、前記液体導入用マイクロチャンネルが位置する部分の温度を１０乃至３０℃とすることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記（ｂ）乃至（ｃ）の工程の間、前記液体導入用マイクロチャンネルが位置する部分の温度を１０乃至３０℃とすることを特徴とする、請求項２または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記（ｂ）の工程の間、前記試料導入用マイクロチャンネルが位置する部分の温度を１０乃至３０℃とすることを特徴とする、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記（ｄ）の工程の間、前記分離用マイクロチャンネルが位置する部分の少なくとも一部であって、前記分離された二本鎖核酸が存在する部分の温度を１０乃至５０℃とすることを特徴とする、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記（ａ）の工程の間、前記液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を上昇させ、同時に他方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を下降させ、その時の前記液体導入用マイクロチャンネルの温度の変化量が30℃から80℃であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記（ａ）の工程の間、前記液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を該一方のマイクロチャンネル内に導入された液体の粘度が３分の１乃至２分の１になるように上昇させ、同時に他方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を該他方のマイクロチャンネル内に導入された液体の粘度が２倍乃至３倍になるように下降させることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
分離用マイクロチャンネル、
前記分離用マイクロチャンネルに接続された二本の液体導入用マイクロチャンネル、
前記分離用マイクロチャンネルに接続された試料導入用マイクロチャンネル、
前記分離用マイクロチャンネルが位置する部分の少なくとも一部の温度を制御するための少なくとも一つの温度制御手段、
前記二本の液体導入用マイクロチャンネルが位置する部分の少なくとも一部の温度を制御するための少なくとも一つの温度制御手段、及び
前記試料導入用マイクロチャンネルが位置する部分の少なくとも一部の温度を制御するための少なくとも一つの温度制御手段、
とを、少なくとも有することを特徴とする、変性剤濃度勾配存在下で電気泳動を行うことによって二本鎖核酸を塩基配列の違いによって分離するための微小流体システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小流体デバイスを用いた電気泳動法によって二本鎖核酸を塩基配列の違いによって分離する方法、及び当該方法のための装置に関する。さらには、微小流体デバイスを用いた変性剤濃度勾配存在下での二本鎖核酸電気泳動法により二本鎖核酸を塩基配列の違いによって分離する方法、及び当該方法のための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
キャピラリー又は微小流体デバイスなどを用いた分離技術に関して、下記の先行技術が知られている。特表２００１−５１５２０４号公報（特許文献１）には、流体の温度を決定するためのマイクロ流体システムで、チャンネルに操作可能に連結されたセンサーおよび温度に応答性のエネルギー源を備えるマイクロ流体システムが開示されている。特開２００３−１１７４０９号公報（特許文献２）には、マイクロチップが耐熱性プラスチックを用いて成形されると共に、温度調整手段が設けられていることを特徴とする微小化学分析用デバイスが開示されている。特開２００４−２７９３４０号公報（特許文献３）には、複数の温度センサーを備えたマイクロチップが開示されている。国際公開ＷＯ２００２／０９０９１２号（特許文献４）には、マイクロチップ上の微細流路内の液相温度を蛍光物質からの発光強度の検知によって非接触で測定することを特徴とするマイクロチップ微細流路内液相の温度測定方法が開示されている。しかしながら、これら先行技術は、二本鎖核酸の塩基配列の違いによる分離技術に関するものではない。
【０００３】
キャピラリー内で二本鎖核酸を分離する技術に関与するものとして、特表平１０−５０２７３８号公報（特許文献５）が知られている。これは、電気泳動分離媒体中で非ミセル電気泳動により二本鎖核酸を分離する方法に関し、ＤＮＡ塩基配列の違いにより変性温度が違うことを利用するものである。すなわち、この分離技術は、二本鎖間の水素結合を弱くするための条件として、経時的な温度変化を利用している。
【０００４】
ところで、微小流体デバイスを用いた電気泳動法によって二本鎖核酸の分離を行うことが知られている（特許文献６）。該微小流体デバイスを用いた装置の特徴は次に示すとおりである。
１．二本鎖ＤＮＡを塩基配列の違いにより分離するための装置であって、ＤＮＡ変性剤の濃度勾配を形成する変性剤濃度勾配形成部と、ＤＮＡ試料を装置内に導入する試料導入部と、変性剤濃度勾配形成部で形成された変性剤濃度勾配領域を有し、試料導入部で導入されたＤＮＡ試料を電気泳動的に分離する電気泳動部とを含むマイクロチップ電気泳動装置。
２．前記変性剤濃度勾配形成部には、変性剤含有緩衝液が充填された第１のリザーバーと、緩衝液が充填された第２のリザーバーと、第１のリザーバーに通じる第１のチャンネルと、第２のリザーバーに通じる第２のチャンネルと、第１のチャンネルと第２のチャンネルが連結する第３のチャンネルとを含み、さらに第１のリザーバーには、第１の電極と、第１の電極に接続された第１の電源とを含み、さらに第２のリザーバーには、第２の電極と、第２の電極に接続された第２の電源とを含み、第１の電源と第２の電源の電圧を制御することにより生じる電気浸透流を利用して、変性剤含有緩衝液と緩衝液を任意の割合で混合し、第３のチャンネルに変性剤濃度勾配領域を形成するとともに、変性剤濃度勾配領域を電気泳動部に導入することを特徴とする前記１．のマイクロチップ電気泳動装置。
３．前記変性剤濃度勾配形成部には、変性剤含有緩衝液が充填された第１のリザーバーと、緩衝液が充填された第２のリザーバーと、第１のリザーバーに通じる第１のチャンネルと、第２のリザーバーに通じる第２のチャンネルと、第１のチャンネルと第２のチャンネルが連結する第３のチャンネルとを含み、さらに第１のリザーバーには、第１の電極と、第１の電極に接続された第１の電源とを含み、かつ第１のポンプが接続され、第2のリザーバーには、第２の電極と、第２の電極に接続された第２の電源とを含み、かつ第２のポンプが接続され、第１の電源と第２の電源の電圧及び第１のポンプと第２のポンプの流量を制御することにより、変性剤含有緩衝液と緩衝液を任意の割合で混合し、第３のチャンネルに変性剤濃度勾配領域を形成するとともに、変性剤濃度勾配領域を電気泳動部に導入することを特徴とする前記１．のマイクロチップ電気泳動装置。
４．前記試料導入部には、ＤＮＡ試料が充填された第３のリザーバーと、ＤＮＡ試料廃液用の第４のリザーバーと、第３のリザーバーと前記第3のチャンネルとに通じる第４のチャンネルと、第４のリザーバーと前記第3のチャンネルとに通じる第５のチャンネルとを含み、さらに第３のリザーバーには、第３の電極と、第３の電極に接続された第３の電源とを含み、さらに第４のリザーバーには、第４の電極と、第４の電極に接続された第４の電源とを含み、第３の電源と第４の電源の電圧を制御することにより生じる電気浸透流と電気泳動を利用して、前記第３のチャンネルにＤＮＡ試料を導入することを特徴とする前記１．のマイクロチップ電気泳動装置。
５．前記電気泳動部には、廃液用の第５のリザーバーと、第５のリザーバーに通じる前記第3のチャンネルとを含み、さらに第５のリザーバーには、第５の電極と、第５の電極に接続された第５の電源とを含み、さらに前記２．記載の変性剤濃度勾配形成部と、前記４．記載の試料導入部を含み、前記第３のチャンネルに形成された変性剤濃度勾配領域において、前記第3のチャンネルに導入されたＤＮＡ試料を電気泳動的に分離することを特徴とするマイクロチップ電気泳動装置。
６．前記電気泳動部には、廃液用の第５のリザーバーと、第５のリザーバーに通じる前記第3のチャンネルとを含み、さらに第５のリザーバーには、第５の電極と、第５の電極に接続された第５の電源とを含み、さらに前記３．記載の変性剤濃度勾配形成部と、前記４．記載の試料導入部を含み、前記第３のチャンネルに形成された変性剤濃度勾配領域において、前記第3のチャンネルに導入されたＤＮＡ試料を電気泳動的に分離することを特徴とするマイクロチップ電気泳動装置。
【特許文献１】特表２００１−５１５２０４号公報
【特許文献２】特開２００３−１１７４０９号公報
【特許文献３】特開２００４−２７９３４０号公報
【特許文献４】国際公開第２００２／０９０９１２号パンフレット
【特許文献５】特表平１０−５０２７３８号公報
【特許文献６】国際公開第２００５／０４９１９６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、国際公開第２００５／０４９１９６号に記載の微小流体デバイスを用いた装置及び分析方法は、その分析方法はその効率等の観点から満足できるものではなく、新たな方法及びそのための装置が求められている。例えば、マイクロチャンネル内に導入する変性剤含有溶液の粘度が高いために、マイクロチャンネルへの導入が非常に困難であることが考えられる。そのため、高性能なポンプなどの装置が必要となったり、高圧流体に耐えられる微小流体デバイスが必要になる可能性がある。また、マイクロチャンネルの内壁の材質がアクリル樹脂などの電気浸透流が起こりにくい材質である場合には、電気浸透流を用いた際の溶液の導入に非常に時間がかかったりしてしまうという問題があった。これらの問題は微小流体デバイスを用いた分析の利点である高速、省スペース、低いランニングコストなどが達成できない可能性があった。
【０００６】
そこで本発明は、微小流体デバイスを用いた変性剤濃度勾配存在下での二本鎖核酸電気泳動法により、二本鎖核酸を塩基配列の構造的な違いによって、効率良く、そして分離能良く、分離する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該方法に適した微小流体システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような状況に鑑み本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成したものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、
第１に、
分離用マイクロチャンネル、
前記分離用マイクロチャンネルに接続された二本の液体導入用マイクロチャンネル、及び
前記分離用マイクロチャンネルと接続された試料導入用マイクロチャンネル、
とを、少なくとも有する微小流体デバイスを用いて変性剤濃度勾配存在下で電気泳動を行うことによって二本鎖核酸を塩基配列の違いによって分離する方法であって、
該方法は、
少なくとも、
（ａ）前記二本の液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルに変性剤を含む第一の液体を導入し、同時に、他方のマイクロチャンネルに前記第一の液体の変性剤の濃度より低濃度の変性剤を含むか、または変性剤を含まないか第二の液体を導入して、前記分離用マイクロチャンネルに変性剤濃度勾配を形成する工程、
（ｂ）前記試料導入用マイクロチャンネルから二本鎖核酸を前記分離用マイクロチャンネルに導入する工程、
（ｃ）前記導入された二本鎖核酸を分離する工程、及び
（ｄ）分離された二本鎖核酸を検出する工程、
を含み、
前記（ａ）の工程の間、前記液体導入用マイクロチャンネルの温度を制御することを特徴とする、前記方法、
第２に
分離用マイクロチャンネル、
前記分離用マイクロチャンネルに接続された二本の液体導入用マイクロチャンネル、及び
前記分離用マイクロチャンネルに接続された試料導入用マイクロチャンネル、
とを、少なくとも有する微小流体デバイスを用いて変性剤濃度勾配存在下で電気泳動を行うことによって二本鎖核酸を塩基配列の違いによって分離する方法であって、
該方法は、
少なくとも、
（ａ）前記二本の液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルに変性剤を含む第一の液体を導入し、同時に、他方のマイクロチャンネルに前記第一の液体の変性剤の濃度より低濃度で変性剤を含むか、または変性剤を含まない第二の液体を導入して、前記分離用マイクロチャンネルに変性剤濃度勾配を形成する工程、
（ｂ）前記試料導入用マイクロチャンネルから二本鎖核酸を前記分離用マイクロチャンネルに導入する工程、
（ｃ）前記導入された二本鎖核酸を分離する工程、及び
（ｄ）分離された二本鎖核酸を検出する工程、
を含み、
前記液体導入用マイクロチャンネルが位置する部分の温度を、前記（ａ）の工程の間、３０乃至８０℃とする、前記方法、
第３に、
分離用マイクロチャンネル、
前記分離用マイクロチャンネルに接続された二本の液体導入用マイクロチャンネル、及び
前記分離用マイクロチャンネルと接続された試料導入用マイクロチャンネル、
とを、少なくとも有する微小流体デバイスを用いて変性剤濃度勾配存在下で電気泳動を行うことによって二本鎖核酸を塩基配列の違いによって分離する方法であって、
該方法は、
少なくとも、
（ａ）前記二本の液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルに変性剤を含む第一の液体を導入し、同時に、他方のマイクロチャンネルに前記第一の液体の変性剤の濃度より低濃度で変性剤を含むか、または変性剤を含まない第二の液体を導入して、前記分離用マイクロチャンネルに変性剤濃度勾配を形成する工程、
（ｂ）前記試料導入用マイクロチャンネルから二本鎖核酸を前記分離用マイクロチャンネルに導入する工程、
（ｃ）前記導入された二本鎖核酸を分離する工程、及び
（ｄ）分離された二本鎖核酸を検出する工程、
を含み、
前記（ａ）の工程の間、前記液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を上昇させ、同時に他方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を下降させることを特徴とする、前記方法、
第４に、
前記（ａ）の工程の後、前記液体導入用マイクロチャンネルが位置する部分の温度を１０乃至３０℃とすることを特徴とする、前記第２に記載の方法、
第５に、
前記（ｂ）乃至（ｃ）の工程の間、前記液体導入用マイクロチャンネルが位置する部分の温度を１０乃至３０℃とすることを特徴とする、前記第２または第４に記載の方法。
【０００９】
第６に、
前記（ｂ）の工程の間、前記試料導入用マイクロチャンネルが位置する部分の温度を１０乃至３０℃とすることを特徴とする、前記第２または第３に記載の方法、
第７に、
前記（ｄ）の工程の間、前記分離用マイクロチャンネルが位置する部分の少なくとも一部であって、前記分離された二本鎖核酸が存在する部分の温度を１０乃至５０℃とすることを特徴とする、前記第２または第３に記載の方法、
第８に、
前記（ａ）の工程の間、前記液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を上昇させ、同時に他方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を下降させ、その時の前記液体導入用マイクロチャンネルの温度の変化量が30℃から80℃であることを特徴とする、前記第３に記載の方法、
第９に
前記（ａ）の工程の間、前記液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を該一方のマイクロチャンネル内に導入された液体の粘度が３分の１乃至２分の１になるように上昇させ、同時に他方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を該他方のマイクロチャンネル内に導入された液体の粘度が２倍乃至３倍になるように下降させることを特徴とする、前記第３に記載の方法、
第１０に
分離用マイクロチャンネル、
前記分離用マイクロチャンネルに接続された二本の液体導入用マイクロチャンネル、
前記分離用マイクロチャンネルに接続された試料導入用マイクロチャンネル、
前記分離用マイクロチャンネルが位置する部分の少なくとも一部の温度を制御するための少なくとも一つの温度制御手段、
前記二本の液体導入用マイクロチャンネルが位置する部分の少なくとも一部の温度を制御するための少なくとも一つの温度制御手段、及び
前記試料導入用マイクロチャンネルが位置する部分の少なくとも一部の温度を制御するための少なくとも一つの温度制御手段、
とを、少なくとも有することを特徴とする、変性剤濃度勾配存在下で電気泳動を行うことによって二本鎖核酸を塩基配列の違いによって分離するための微小流体システム、
である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法により、微小流体デバイスを用いた変性剤濃度勾配存在下での二本鎖核酸電気泳動法により二本鎖核酸を塩基配列の違いによって、効率良く、そして分離能良く分離することができる。また、本発明の方法により、変性剤濃度勾配を再現性良く、効率良く形成することができ、このため二本鎖核酸の分離を再現性よく、効率良く行うことができる。
【００１１】
また、本発明の微小流体システムにより、二本鎖核酸の分離を効率良く、そして分離能良く行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の方法及び装置について、図１乃至図６を用いて説明する。
【００１３】
本発明の方法に用いられる微小流体デバイスは、少なくとも、分離用マイクロチャンネル（３）、分離用マイクロチャンネル（３）に接続された二本の液体導入用マイクロチャンネル（１）及び（２）、及び分離用マイクロチャンネル（３）と接続している試料導入用マイクロチャンネル（４）、を有する。このようなマイクロチャンネルは、周知の手法、例えばフォトリソグラフィー技術、金型を用いた精密成形、レーザー加工、精密機械加工などの微細加工技術を用いて、適切な材質（ガラス、石英、プラスチック、シリコン樹脂等）に形成することができる。
【００１４】
各チャンネル（１）乃至（４）の溝幅、溝深さ及び長さは任意に選択することができる。溝幅および溝深さは1μm〜1000μmであり、好ましくは10μm〜500μmであり、さらに好ましくは30μm〜100μmである。そして長さは、チャンネル（１）については、例えば1mm〜100mmであり、好ましくは5mm〜70mmであり、さらに好ましくは10mm〜50mmである。チャンネル（２）については、例えば1mm〜100mmであり、好ましくは5mm〜70mmであり、さらに好ましくは10mm〜50mmである。チャンネル（３）については、例えば1mm〜500mmであり、好ましくは5mm〜200mmであり、さらに好ましくは10mm〜100mmである。そしてチャンネル（４）につては、例えば1mm〜1000mmであり、好ましくは5mm〜500mmであり、さらに好ましくは10mm〜200mmである。
【００１５】
チャンネル（１）及び（２）はチャンネル（３）の端部で接続していることが好ましい。
【００１６】
試料導入用マイクロチャンネル（４）は任意の位置で分離用マイクロチャンネル（３）と接続していてよく、交差していても良い。また、試料導入用マイクロチャンネル（４）は試料の調製や前処理に必要な微小構造物や微小空間等を含んだり、他のマイクロチャンネルと接続されることもできる。例えば、試料の精製に必要な微粒子などを充填するための微小空間や、試料の増幅を行うための反応槽としての微小空間、各種反応溶液と混合、反応させるための混合槽や混合のためのマイクロチャンネル、反応溶液の移動を制限するための構造物などである。
【００１７】
このようなチャンネル（１）乃至（４）のうち、少なくとも分離用マイクロチャンネル（３）に分子篩い分け能力を持つ高分子材料（高分子マトリックス）を含有する緩衝液を充填する。緩衝液は、当該技術分野で既知の方法、例えばポンプによる圧入、真空ポンプによる吸入を用いた機械的な手法により、または界面動電現象、又は重力、遠心力などの物理的現象を利用して導入することができる。ポンプにはシリンジポンプ、真空ポンプ、ダイヤフラムポンプ、などを用いることができる。また、一般的に知られているＭＥＭＳ（微小電気機械システム）技術を用いて、ポンプを微小流体システム内に構築することもできる。緩衝液としては、トリス−酢酸緩衝液及びトリス−ホウ酸緩衝液等、周知の緩衝液を使用することができる。特に本発明での分離手法では30℃以上で分離が行なわれることが予想されるため、３０℃以上の高温においても緩衝能力を持つ緩衝液を選択することが好ましい。分子篩い分け能力を有する高分子マトリックスとしては、ヒドロキシエチルセルロースやヒドロキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリエチレンオキサイド、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、等、周知の高分子マトリックスを使用することができる。また、例えば、国際公開第２００５／０４９１９６号に開示されているような高分子マトリックスを使用することができる。緩衝液中の高分子マトリックスの濃度は高分子マトリックスの種類や平均分子量、また、試料の種類などにも依存するが、例えば0.1%〜10質量%である。例えば、２００ｂｐのＤＮＡ試料を用い、高分子マトリックスとして平均分子量が１０００００前後のヒドロキシエチルセルロースを用いる場合は、０．１〜３質量％の濃度が好適である。
【００１８】
本発明の方法に用いられる微小流体デバイスでは、前記（ｃ）の工程は通常電気泳動を利用するものである。また、前記（ａ）乃至（ｄ）の工程は、ポンプによる圧送や電気浸透流を利用することもできる。以下では、電気浸透流を用いて送液する場合を例に説明する。そのため、電気泳動や電気浸透流の発生等に必要な、電極及び電源が適切に備えられているものである。
【００１９】
また、本発明の方法に用いられる微小流体デバイスでは、各マイクロチャンネルの端部において、必要に応じ、送液のための装置（ポンプ等）、並びに液体及び試料用の充填部等が適切に備えられているものである。
【００２０】
次に、チャンネル（１）及び（２）の一方に変性剤を含む第一の液体を、そして他方に変性剤を含まないかまたは第一の液体の変性剤の濃度より低濃度で変性剤を含む第二の液体を、基本的に、同時に導入して、分離用マイクロチャンネル内に変性剤濃度勾配を形成する（（ａ）の工程）。
【００２１】
変性剤としては、当該技術分野で既知の変性剤、例えば尿素、ホルムアミド及びホルムアルデヒド、グアニジン塩酸塩、酸性物質、塩基性物質等、またはそれらの混合物から適宜選択して使用することができる。そして、このような変性剤は、例えば前記の緩衝液を用いて変性剤を含む液体に用いることができる。
【００２２】
第一の液体と第二の液体の変性剤の濃度は異なるものであれば特に制限は無い。第一の液体と第二の液体の変性剤の濃度は試料の種類などの情報や予備検討などにより適宜選択することができる。また、一方の液体が変性剤を含まないものであってもよい。
【００２３】
変性剤の濃度勾配を形成するには、第一の液体と第二の液体の導入量を経時的に変化させることが必要である。これによって、チャンネル（１）乃至（３）の接続点において、変性剤濃度の経時的な変化が、第一の液体と第二の液体の混合によって形成される。
【００２４】
方法の形態１．
本発明の方法の一つの形態においては、（ａ）の工程における第一の液体及び第二の液体の導入量の経時的な変化は、液体導入用マイクロチャンネル（１）及び（２）の電気浸透流発生のための電圧を経時的に変化させるか、ポンプの流量を経時的に変化させるか、あるいは電圧とポンプの流量の両方を経時的に変化させることによって行なわれる（（ａ）の工程）。これによって、分離用マイクロチャンネル内に変性剤濃度勾配を形成する。
【００２５】
この形態においては、（ａ）の工程の間、液体導入用マイクロチャンネル（１）及び（２）が位置する部分の温度が３０乃至８０℃とされる。好ましくは、（ａ）の工程の間、マイクロチャンネル（１）及び（２）が位置する部分の温度が４０乃至７０℃、または５０乃至６０℃とされる。
このような温度とすることによって、第一の液体及び第二の液体の導入速度を高めることができる。そのため、変性剤の濃度勾配の形成に要する時間が短縮され、二本鎖核酸の分離を効率的に行うことができる。そして、（ａ）の工程の後、液体導入用マイクロチャンネル（１）及び（２）が位置する部分の温度は１０乃至３０℃とされる。好ましくは（ｂ）乃至（ｃ）の工程の間に10乃至30℃とする。これにより、（ｄ）の工程での再現性のよい高感度検出が可能になる。
【００２６】
次に、試料導入用マイクロチャンネルから二本鎖核酸を分離用マイクロチャンネルに導入する（（ｂ）の工程）。
【００２７】
試料の二本鎖核酸としては特に制限が無く、多様な核酸を使用することができる。変性剤濃度勾配存在下での二本鎖核酸電気泳動法は複数の核酸試料の混合物が解析可能であり、同じ鎖長で核酸配列の異なる試料も分析可能である。例えば、人の血液や細胞などのような生体試料や、食品、土壌や河川水、海水などの環境試料、あるいは活性汚泥やメタン発酵汚泥などから抽出した核酸などである。核酸にはＲＮＡやＤＮＡ等があるが、好ましくは核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり、さらに好ましくはＤＮＡの所定の領域をポリメラーゼ連鎖反応などにより、端部にＤＮＡ変性に対する耐性の高い人工的なＤＮＡ配列（ＧＣクランプ）をつけて増幅した二本鎖ＤＮＡを用いる。
【００２８】
試料の二本鎖核酸が溶液の場合はそのまま試料として用いてよい。また、試料の二本鎖核酸が溶液でない場合や、溶媒が分析に悪影響を及ぼす可能性がある場合などは水系の溶媒に溶解させたものを試料として用いることができる。溶媒は水や緩衝液から選択できる。好ましくは、二本鎖核酸はｐＨが６乃至９である緩衝溶液に溶解している。緩衝溶液はトリスヒドロキシエチルアミノメタン−塩酸緩衝液や遺伝子工学分野で従来用いられるグッドバッファーなどより選択することができる。添加剤として、エチレンジアミン四酢酸などを試料に添加することもできる。二本鎖核酸の濃度は、検出手法や検出装置の検出感度に依存するので、仕様や予備検討により決定することができる。
【００２９】
（ｂ）の工程では、二本鎖核酸の変性による高次構造変化が起こらないことが好ましい。導入される試料が温度や変性剤濃度で規定される変性条件に曝されると、試料導入用マイクロチャンネル内で二本鎖核酸の分離が始まってしまうので、均一な試料の適正な導入が妨げられる。また、一本鎖核酸にまで変性してしまう条件では異なる種類の核酸が二本鎖を形成する（ヘテロデュープレックスが形成される）ことにより分離結果に再現性が低下するおそれがある。そのため、（ｂ）の工程の間、試料導入用マイクロチャンネルが位置する部分の温度は分析対象となる二本鎖核酸の変性温度以下とすることが好ましい。たとえば、２００ｂｐのＤＮＡ試料で変性剤濃度が８０％であった場合、温度は８０℃以下、または６０℃以下、または４０℃以下、にすることが好ましい。例えば１０乃至８０℃、または１０乃至６０℃、または２０乃至４０℃、または１０乃至３０℃である。
【００３０】
導入された核酸試料は、分離用マイクロチャンネル内の変性剤濃度勾配の中を電気泳動され、所定の方向へ移動し、分離される（（ｃ）の工程）。
【００３１】
変性剤濃度勾配が存在する分離用マイクロチャンネル内での試料の移動の方向は、分析に用いられる二本鎖核酸の種類と分子量と配列、微小流体デバイスの材質、電場強度の大きさ、圧力勾配等に依存して異なるものである。そのため、二本鎖核酸の分離が行なわれる部分及び分離された二本鎖核酸を検出する部分も変わりえるものである。
【００３２】
図１は、二本鎖核酸が導入される位置から液体導入用マイクロチャンネルの存在する方向と逆の方向に移動、分離される形態を示している。
【００３３】
図２は、二本鎖核酸が導入される位置から液体導入用マイクロチャンネルの存在する方向に移動、分離される形態を示している。
【００３４】
（ｃ）の工程の間、分離用マイクロチャンネルが位置する部分であって、導入された二本鎖核酸の分離が行なわれている部分の温度を３０乃至７０℃とすることが好ましい。このような温度にすることによって、分離能が向上する。７０℃以上にすると尿素は熱分解を起こすことが知られている。
【００３５】
次いで、分離された二本鎖核酸の検出が行なわれる（（ｄ）の工程）。
【００３６】
検出は、一般によく用いられる核酸検出手段である蛍光検出、発光検出、吸光検出、電気化学的検出等の周知の方法から、用途、コスト、感度、精度、装置形状から適宜検討を行い、選択される。蛍光検出を行う場合には、例えば、二本鎖核酸をＰＣＲ反応に用いられるオリゴヌクレオチド等を蛍光標識しておく方法や予め蛍光標識物質で標識しておく方法や核酸染色剤を電気泳動を行う溶液に加えておく方法などがある。検出器にはカメラ、光電子増倍管、ＵＶ検出器、フォトダイオード検出器などを用いることができる。
【００３７】
（ｄ）の工程の間、分離用マイクロチャンネルが位置する部分であって、分離された二本鎖核酸が存在する部分、すなわち検出部分、の温度を（ｃ）の工程の温度よりも低く保つことが好ましい。好ましくは１０乃至５０℃の温度範囲、または１０乃至３０℃の温度範囲で一定とする。このような温度にすることによって、検出感度が向上する。
【００３８】
液体導入用マイクロチャンネル（１）及び（２）が位置する部分の温度を経時的に変化させる本形態は、図２に示した、二本鎖核酸が液体導入用マイクロチャンネルの存在する方向に移動、分離される形態の場合に特に適している。図２に示した形態の場合、二本鎖核酸が液体導入用マイクロチャンネルの存在する方向に移動して分離されるので、検出部分が液体導入用マイクロチャンネルの存在する位置に近接することになる。そのため、検出部分の近傍となる部分、すなわち、液体導入用マイクロチャンネルが位置する部分、の温度を１０乃至３０℃とすることによって、検出感度の低下を防ぎ、若しくは検出感度を向上することができる。
【００３９】
方法の形態２．
国際公開第２００５／０４９１９６号には第一の液体及び第二の液体の導入量の経時的な変化は、チャンネル（１）及び（２）の電気浸透流発生のための電圧を経時的に変化させることによって行うことができることが開示されている。
【００４０】
本発明の方法のもう一つの形態においては、（ａ）の工程における第一の液体及び第二の液体の導入量の経時的な変化は、チャンネル（１）及び（２）が位置する部分の温度を経時的に変化させることによって行うことができる。すなわち、予め液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネル（例えばチャンネル（１））が位置する部分の温度を相対的に高い温度（例えば８０℃）に、そして、他方のマイクロチャンネル（例えばチャンネル（２））が位置する部分の温度を相対的に低い温度（例えば２０℃）に、設定しておく。そして、第一の液体及び第二の液体の導入とともに経時的に、高い温度を低い温度（例えば８０℃から２０℃）に変化させ、同時に低い温度を高い温度（例えば２０℃から８０℃）に変化させることによる。液体の粘度は温度依存性があるので、電気浸透流発生のための電圧が一定の場合、液体の粘度が小さいほどその液体の移動速度が大きくなる、すなわち導入量が大きくなる。そのため、上記のように、マイクロチャンネルが位置する部分の温度を経時的に変化することによって液体の粘度を経時的に変化することができる。この際の温度の変化率は核酸試料の種類、高分子マトリックスの種類、分析時間等を予備的に検討することにより決定することができる。これによって経時的に第一の液体と第二の液体の導入量を変化することができ、そのため、変性剤の濃度勾配を形成することができる。また、一般的には温度が高い方が粘度が低いので、液体導入用マイクロチャンネルが位置する部分の温度を３０℃から８０℃と、室温より高い値に設定することにより、全体的に第一の液体と第二の液体の導入速度を室温での導入条件より上げることができる。そのため、変性剤の濃度勾配の形成に要する時間が短縮され、全体として二本鎖核酸の分離に要する時間が短縮され、分析を短時間で行うことができる。
【００４１】
液体導入用マイクロチャンネルの部分の温度の変化量は実用上効果的である２０℃〜９０℃であることが好ましく、さらに好ましくは３０℃以上８０℃以下である。
【００４２】
本発明の一つの形態においては、（ａ）の工程の間、液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を２０℃から９０℃に上昇させ、同時に他方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を９０℃から２０℃に下降させる。または、（ａ）の工程の間、液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を３０℃から８０℃に上昇させ、同時に他方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を８０℃から３０℃に下降させる。または、（ａ）の工程の間、液体導入用マイクロチャンネルの一方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を３０℃から６０℃に上昇させ、同時に他方のマイクロチャンネルが位置する部分の温度を６０℃から３０℃に下降させる。
【００４３】
また、液体導入用マイクロチャンネル位置するの部分の温度は、一方のマイクロチャンネル内に導入された液体の粘度が３分の１乃至２分の１になるように上昇し、同時に他方のマイクロチャンネル内に導入された液体の粘度が２倍乃至３倍になるように下降するように変化させることが好ましい。
【００４４】
上記の各チャンネルの温度変化は、送液のための各チャンネルの電圧を一定として行うことができる。また、液体の導入量の経時的な変化が同傾向になるような様式で各チャンネルの電圧を変化させながら温度を変化させることもできる。
【００４５】
（ａ）の工程に続く（ｂ）乃至（ｄ）の工程は、形態１．において記載したようにして行うことができる。
【００４６】
本発明の方法において、上述したように、各マイクロチャンネルが位置する部分の温度を制御することが必要である。そのような温度の制御は、例えば、演算機能を有するＣＰＵ等を含む制御装置に接続された加熱冷却装置及び温度検出装置を有する温度制御装置を用いて行うことができる。すなわち、温度制御が必要とされるマイクロチャンネルに沿って、微小流体デバイス本体の上面及び／または下面に適切な加熱冷却装置や冷却装置及び温度検出装置を設け、その部分の温度を制御装置によって制御することによって行うことができる。
【００４７】
本発明の方法において、液体導入用マイクロチャンネルが位置する部分、等の記述における「位置する部分」とは、温度制御が意図されている当該チャンネルの少なくとも一部及びその近傍を含む領域であって、他のチャンネルを含まない領域を意味する。そのような「位置する部分」の大きさは、温度制御に用いる加熱冷却装置の大きさを選択することにより、適宜、変化させることができる。
【００４８】
微小流体システムの形態
従って、本発明は、マイクロチャンネルが位置する部分の温度を制御するための温度制御手段を備えた微小流体システムに関する。
【００４９】
温度制御手段は、例えば、演算機能を有するＣＰＵ等を含む制御装置並びに、その制御装置に接続された加熱冷却装置及び温度検出装置から構成される。
【００５０】
加熱冷却装置としては、例えば、一般的なヒーター及びペルチェ素子等を使用することができる。ペルチェ素子を使用すれば、加熱、冷却ができるので、より応答性がよく精密で広範囲な温度制御が可能となる。またメッキ、蒸着、スパッタ、イオンプレーティング、貼付などにより、高い電気抵抗を持つ金属の薄膜を、直接微小流体デバイス本体にパターニングし、ヒーターとして設けてもよい。また酸化インジウムスズなどの透明導電膜をヒーターとして設けてもよい。また、冷却手段は例えばファンや冷凍機、熱交換器を使用してもよい。外部に冷却手段を有することによって、より高範囲の温度制御が可能となる。  温度検出装置としては、例えば、熱電対、測温抵抗体及びサーミスタ等である。
【００５１】
微小流体デバイスの寸法、材質などの条件により、温度検出装置の固定が困難であれば、放射温度計も使用できる。またメッキ、蒸着、スパッタ、イオンプレーティング及び貼付等により、温度依存性のある金属の薄膜を直接微小流体デバイス本体にパターニングし、温度検出装置を設けてもよい。
【００５２】
本発明の微小流体システムにおいては、加熱冷却装置及び温度検出装置は温度制御を必要とされる部分に適宜、設置することができる。微小流体システムに設置される加熱冷却装置及び温度検出装置は単数でもよく、複数でもよい。また、加熱冷却装置の大きさは、適宜設定できる。例えば、分離用マイクロチャンネルが位置する部分の全体を含むような大きさの加熱冷却装置とすることができ、また、分離用マイクロチャンネルが位置する部分の一部を含むような大きさの加熱冷却装置とすることもできる。
【００５３】
図３及び図４、並びに図５及び図６に温度検出装置と加熱冷却装置としてペルチェ素子を用いた微小流体システムの一例を示す（図には記載していないが、各温度検出装置と加熱冷却装置は制御装置に接続されている）。図３及び図５は上面図であり、図４及び図６は断面図である。温度検出装置とペルチェ素子は、各々、微小流体デバイスの上面及び下面に設置されている。液体導入用マイクロチャンネル、試料導入用マイクロチャンネルを含む部分及び分離用マイクロチャンネルを含む部分に温度検出装置とペルチェ素子を備えている。
【００５４】
図５の構成では、各液体導入用マイクロチャンネル、及び試料導入用マイクロチャンネルを含む部分には一対の温度検出装置とペルチェ素子が設置されている。また分離用マイクロチャンネルには二対の温度検出装置と加ペルチェ素子が設置されている。各対の温度検出装置とペルチェ素子によってその部分の温度が制御される。図３の構成では、二つの液体導入用マイクロチャンネルに対して一対の温度検出装置とペルチェ素子が設置されている。
【００５５】
図５では、各々の部分に一つずつの温度検出装置とペルチェ素子を備えているが、各々の部分に複数個のペルチェ素子および複数個のペルチェ素子を備えてもよい。
【００５６】
図５の微小流体システムは、図１の形態、すなわち二本鎖核酸が導入される位置から液体導入用マイクロチャンネルの存在する方向と逆の方向に移動、分離される形態、に対応したものである。図３の微小流体システムは、図２の形態、すなわち二本鎖核酸が導入される位置から液体導入用マイクロチャンネルの存在する方向に移動、分離される形態、に対応したものである。
【００５７】
図３及び図５の微小流体システムでは分離用マイクロチャンネルの二つの部分に、温度検出装置とペルチェ素子が設置されており、それぞれ、二本鎖核酸の分離が行なわれている部分（分離部分）及び検出部分の温度制御を行うことができる。
【００５８】
図５の微小流体システムでは各々の液体導入用マイクロチャンネルに温度制御手段（一対の温度検出装置とペルチェ素子）が設置されているので、各液体導入用マイクロチャンネルが位置する部分の温度を独立して制御することができる。そのため、図５のシステムによって本発明の上記方法の形態１．及び方法の形態２．を行うことができる。
【００５９】
図３の微小流体システムでは二つの液体導入用マイクロチャンネルに一つの温度制御手段（一対の温度検出装置とペルチェ素子）が設置されているので、各液体導入用マイクロチャンネルが位置する部分の温度が一体として制御される。そのため、図３のシステムによって本発明の上記方法の形態２．を行うことができる。
【００６０】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
使用する微小流体デバイスは図２の形状をしており、アクリル樹脂製である。（１）と（２）のマイクロチャンネルの長さは２１．５ｍｍ、(3)のマイクロチャンネルの長さは４０ｍｍであった。（１）のマイクロチャンネルに蛍光物質であるローダミンＢと高分子マトリックスであるヒドロキシエチルセルロース１．７５％を含むトリス−酢酸緩衝液を充填し、（２）のマイクロチャンネルにヒドロキシエチルセルロース１．７５％を含むトリス−酢酸緩衝液を充填した。微小流体デバイス全体の温度は３０℃で一定に保っていた。（１）乃至（４）のチャンネルの端部には電極が接続してあり、各電極には高圧電源が接続されていた。（１）および（２）のチャンネルに接続された電極に３KVの電位を与え、（３）のマイクロチャンネルに接続された電極をアースに接続した。この条件で（１）のマイクロチャンネルより（３）のマイクロチャンネルへ流入するローダミンＢの蛍光を顕微鏡用ＣＣＤカメラにより撮影した。得られた動画よりローダミンＢの移動速度を計算すると、約２０μｍ／ｓｅｃとなった。
【００６２】
これより、実際の変性剤濃度勾配が５０ｍｍである場合、変性剤濃度勾配の形成に必要な時間は４２分間となる。
【００６３】
（１）と（２）のマイクロチャンネルの温度を６０℃とする場合、ヒドロキシエチルセルロースの粘度は３０℃の場合と比べて約３分の１となり、それにより電気浸透流速度も約３分の１となる。そのため、同じ電圧を印加しても変性剤濃度勾配形成にかかる時間は１４分間となる。核酸試料の導入にかかる時間が１分間、電気泳動による分離時間が１５分間とすると、全体の分析にかかる時間は５８分間から３０分間と約半分になる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は微小流体デバイスを示す概略図。
【図２】図２は微小流体デバイスを示す概略図。
【図３】図３は温度制御手段を備えた微小流体システムの上面図。
【図４】図４は温度制御手段を備えた微小流体システムの断面図。
【図５】図５は温度制御手段を備えた微小流体システムの上面図。
【図６】図６は温度制御手段を備えた微小流体システムの断面図。
【符号の説明】
【００６５】
（１）は液体導入用マイクロチャンネルである。
【００６６】
（２）は液体導入用マイクロチャンネルである。
【００６７】
（３）は分離用マイクロチャンネルである。
【００６８】
（４）は試料導入用マイクロチャンネルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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