(57)【要約】【課題】細胞含有溶液の遠心分離、非開放系下での沈降細胞数の計測、余剰液の除去、沈降細胞の取り出しを効率的に行う遠心分離用容器を提供するものである。【解決手段】少なくとも容量部(A)と(B)からなり、かつ、次の特徴を有する細胞の濃縮に用いる遠心分離用容器。a）容量部(A)の下部に容量部(B)があり、それらの容量が(A)＞(B)、b）容量部(A)と(B)を容易に分離、もしくは分断可能、c）容量部(B)に、細胞量を計測する目盛を具備【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも容量部(A)と(B)からなり、かつ、次の特徴を有する細胞の濃縮に用いる遠心分離用容器。
a)  容量部(A)の下部に容量部(B)があり、それらの容量が(A)＞(B),
b)  容量部(A)と(B)を容易に分離、もしくは分断可能
c)  容量部(B)に、細胞量を計測する目盛を具備
【請求項２】
更に、次の特徴を有する請求項１に記載の遠心分離用容器。
d）容量部(A)と(B)に外部と接続可能な口を具備
【請求項３】
容量部(A)と(B)を分離、もしくは分断する手段が、ネジ式、切断式、折り切り式、コック式、バルブ式から選ばれる請求項１または２に記載の遠心分離用容器。
【請求項４】
容量部(A)と(B)が、バッグ、チューブ、ボトル、管から選ばれる形状である請求項１から３に記載の遠心分離用容器。
【請求項５】
細胞量を計測する目盛が、1 x 105 cells以上、または、0.001 cm3以上を計測可能な請求項１から４に記載の遠心分離用容器。
【請求項６】
請求項１から５に記載の遠心分離用容器を遠心分離装置に設置するための支持器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞医療に適した細胞濃縮用の遠心分離用容器の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体外で調製した細胞を、生体組織の治療、修復、形成に用いる細胞医療が注目されている。
【０００３】
例えば、永谷らは骨髄から採取した間葉系幹細胞を培養増幅させ、心不全のマウスに注入すると、心機能の改善に効果があると報告している（非特許文献１）。
【０００４】
また、吉村らはヒト脂肪組織に含まれる新鮮な幹細胞画分を採取し、脂肪組織と共に再注入すると外科的な組織形成に大変有用であると報告している（非特許文献２）。
【０００５】
一般的に移植目的に細胞を調製する場合、セルプロセッシングセンター（CPC）と呼ばれる特殊な衛生管理を施された場所に設置された遠心分離器を用いて細胞を濃縮し、血球計測器等を用いて含まれる細胞量を求め、そのデータに基づき細胞の懸濁溶液を調製し、CPCから手術室へ運搬する。しかしながら、細胞医療を実施する直前のこのような工程は大きな労力と時間を必要とし、非常に煩雑であった。
【０００６】
今日までに、内容量が５〜１００ｍｌの大容量部と内容量が０．５〜５ｍｌの小容量部を、境界部を薄肉にして破断分離可能にするか、ネジにより接続するか、あるいはフランジを突き合わせて係止具により接続するかして、大容量部と小容量部を分離可能に形成する遠心分離用容器が知られている(特許文献１)。この遠心分離用容器は、従来のような遠心分離用容器からマイクロチューブへの処理液の移し替えが不要となり、移し替えの手間が少なくなり、細胞の損失やダメージがなくなるという利点を有する。しかしながら、細胞医療において、細菌等が混入しないよう非開放系で細胞を調製しなければならない工程、具体的には、細胞の個数の計測、沈降細胞を崩さないように上澄みだけを除去する操作、患者へ投与するために細胞をシリンジ等へ詰め替えする操作には上記のCPCが必要となり、このような遠心分離用容器だけでは出来なかった。
【非特許文献１】永谷ら、Circulation,23;112(8);1128-35（2005年）
【非特許文献２】吉村ら、Oral abstracts, IFATS, V-3（2006年）
【特許文献１】特開平8-108096
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、非開放系で細胞を含む溶液を遠心分離するだけで含まれる細胞量を求めることができ、更に、細胞が沈降した小容器を切り離す、もしくは分断することで吸引装置やデカンテーションを用いることなく不要な上澄みを簡単に除去することができ、かつ、沈降した細胞から細胞懸濁液を簡単に調製すること（シリンジ等へ詰め替えること）ができる細胞医療に適した遠心分離用容器を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らはかかる課題を解決すべく、鋭意検討を進めた。
【０００９】
その結果、少なくともa) 容量部(A)の下部に容量部(B)があり、それらの容量が(A)＞(B)、b) 容量部(A)と(B)を容易に分離、もしくは分断可能、c) 容量部(B)に、細胞量を計測する目盛を具備、という条件を満たす遠心分離用容器を用いると、沈降した細胞量を読み取ることで容易に細胞量を求めることができ、更に、沈降した細胞が入った容量部(B)を分離、もしくは分断することで、不要な上澄みを除去することができ、かつ、沈降した細胞が入った容量部(B)から細胞医療に用いる細胞懸濁液を簡単に調製することが出来るという驚くべき発見を行い、本発明を完成するに至った。
【００１０】
よって、本発明が提供するのは以下の通りである。
〔１〕
少なくとも容量部(A)と(B)からなり、かつ、次の特徴を有する細胞の濃縮に用いる遠心分離用容器。
a)  容量部(A)の下部に容量部(B)があり、それらの容量が(A)＞(B)
b)  容量部(A)と(B)を容易に分離、もしくは分断可能
c)  容量部(B)に、細胞量を計測する目盛を具備
〔２〕
更に、次の特徴を有する〔１〕記載の遠心分離用容器
d)  容量部(A)と(B)に外部と接続可能な口を具備
〔３〕
容量部(A)と(B)を分離、もしくは分断する手段が、ネジ式、切断式、折り切り式、コック式、バルブ式から選ばれる〔１〕または〔２〕記載の遠心分離用容器
〔４〕
容量部(A)と(B)が、バッグ、チューブ、ボトル、管から選ばれる形状である〔１〕から〔３〕記載の遠心分離用容器。
〔５〕
細胞量を計測する目盛が、1 x 105 cells以上、または、0.001 cm3以上を計測可能な〔１〕から〔４〕記載の遠心分離用容器
〔６〕
〔１〕から〔５〕記載の遠心分離用容器を遠心分離装置に設置するための支持器
【発明の効果】
【００１１】
本発明の遠心分離用容器を用いると、細胞を含む溶液を遠心分離したときに、血球計測器等を用いることなく、非開放系下で目盛を読むだけで簡単に細胞量を求めることができ、更に、細胞が沈降した小容器を分離、もしくは分断することで吸引装置を用いることなく上澄みを除去でき、かつ、非開放系を維持したまま、シリンジ等を用いて分離した容器から細胞を調製することができる。効率よく細胞医療に適した細胞懸濁液を調製できるので、大変便利である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明でいう細胞とは、生物学でいう細胞であれば特に限定はない。
【００１４】
例えば、幹細胞、白血球、骨髄由来細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、培養した各種細胞、赤血球、血小板、細菌、真菌、酵母、植物細胞等、またはそれらの混合物等であってよい。
【００１５】
本発明でいう濃縮とは、遠心分離器等により細胞を含む溶液を遠心分離操作し、遠心分離容器の下部に細胞を沈降させることにより、操作前と比較して細胞を集積し、その濃度を高めることを意味する。
【００１６】
濃縮を行う遠心分離装置、およびその遠心条件に特に限定はなく、それぞれの細胞の沈降に適した任意の回転速度、時間、温度、ローターサイズであってよい。例えば、培養した骨髄由来間葉系幹細胞を濃縮する場合、その溶液を遠心分離装置で1200rpm、室温、５分間、という条件で遠心分離操作するという様態である。
【００１７】
本発明でいう容量部とは、遠心分離用容器を構成する容積およびその器であり、溶液を漏らすことなく保持するために必要な遠心分離用容器の一部である。ここでいう容器の材質には特に限定はなく、例えば、一般的に用いられるプラスチック、ガラス、金属等である。
【００１８】
本発明でいう、容量部(A)と(B)からなるとは、少なくとも容量部(A)と(B)が接続されることにより、一体の遠心分離用容器となる態様を指す。
【００１９】
本発明でいう容易に分離、もしくは分断可能とは、接続された容量部(A)と(B)を物理的に簡単に切り離す、もしくは分断することが出来れば特に限定はなく、例えば、容量部(A)と(B)をネジで接続し、ネジを外すことによりそれらを分離できる様態、容量部(A)の接合部をネジの雌、(B)の接合部をネジの雄に設計することにより（またはその逆）、接続と分離ができる様態、容量部(A)と(B)を軟質な材料で作製し、分離時にその接合部をハサミ等で切断して分離できる様態、容量部(A)と(B)の接合部に折部を作製し、分離時に折部を支点に負荷をかけて容量部(A)と(B)を折り切る様態、容量部(A)と(B)の接合部をシールで固定しておき、分離時にシールを取り除いて切り離す様態、容量部(A)と(B)の間にコックやバルブ等を設けて、それらで分断する様態、もしくは、容量部(A)と(B)の間を指で押さえ、簡易に内容物を分断する様態等であってよい。好まし様態の一例を示すと、透明な軟質プラスチックバッグからなる遠心分離用容器で遠心分離操作を行い、容量部(A)に上澄みが、容量部(B)に細胞が沈降した状態において、(A)と(B)の間を指や器具等で挟むことにより閉鎖し、沈降した細胞塊が崩れないよう(A)と(B)の間をハサミで切断するという様態であってよい。または、透明な硬質チューブからなる遠心分離用容器であってその容量部(A)と(B)の間にコックやバルブ等を設けて内容物を分断する様態であってよい。
【００２０】
容量部(A)の容量（mL、またはcm3）に特に限定はないが、細胞医療で必要な処理量という観点より、好ましくは10mlを越える容量である。容量部(B)の容量は、容量部(A)より小さいものであれば特に限定はないが、好ましくは10μl〜10mlであり、更に好ましくは100μl〜5mlである。
【００２１】
本発明でいう細胞量とは、細胞の個数、またはその体積を意味する。細胞量を計測する目盛とは、細胞の個数、またはその体積を測定するために容器(B)に印された目盛を意味する。例えば、骨髄単核球や脂肪組織由来接着細胞の細胞量を計測する場合、1 x 107cellsごとに、または0.05cm3ごとに複数の目盛を容器(B)に印し、それらを目視により計測するという様態である。一般的な細胞集団、例えば、白血球、赤血球、血小板、培養した細胞、接着した細胞等、おおよそ均一な細胞集団では細胞個数と体積がおおよそ正比例するので、それらを変換することができる。
【００２２】
細胞量を計測する目盛の範囲は、好ましくは1 x 105 cells以上、または、0.001 cm3以上である。これらより少ない細胞量の計測は、目視では計測困難であるため好ましくはない。上限は、必要に応じて任意であってよく、特に限定はない。
【００２３】
細胞量を目盛から求めるためには、予め沈降する細胞量と容器(B)の目盛の関係を定めておく必要がある。例えば、予め一定量の細胞を適当な遠心分離条件（一定の回転速度、時間、温度、ローターサイズ）で沈降させ、その量と目盛の位置の関係を求めておくと良い。それ以後は、その関係を基に細胞量を求める。
【００２４】
本発明でいう外部と接続可能な口とは、容量部(A)と(B)の内部と外部を接続し、溶液や細胞を内外へと移送するために必要な口もしくは蓋を意味する。例えば、ネジ式、コネクター式、ルアーロック式、シリンジ針用のゴム製挿入口、コック等であってよい。好ましくは、非開放系を維持したまま容量部の内部と外部を接続することができる、コネクター式、ルアーロック式、シリンジ針用のゴム製挿入口、コック等である。容量部(B)の口の用法を例示すると、容量部(B)に沈降した細胞を別途用意したシリンジへと移送するとき、容量部(B)に設けたシリンジ針用の挿入口から針を挿入し、容量部(B)に沈降した細胞をシリンジでほぐし、吸い取るという様態である。
【００２５】
本発明でいう、遠心分離装置に設置するための支持器とは、細胞分離用容器を細胞分離装置に設置し、保持するために必要なインナーカップ、ローター、調整具、アダプター、ステージ、バインダー等を指す。例えば、遠心分離操作中に容量部(B)の形状を保持するために、凹状に設計した支持器の窪みに容量部(B)を差し込むことができる支持器である。
【００２６】
図１から３に本発明の遠心分離容器の具体例を、図４に遠心分離用容器の支持具を例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
図1は、遠沈管の様態をとる遠心分離用容器（折り切り式）の例である。容量部(A)と(B)に細胞含有液を入れて蓋をする。遠心分離後、容量部(B)に沈降した細胞量を目盛で計測する。そして折部の少し下部を強く圧迫することで液の流れを遮断し、折部を支点に荷重をかけて容量部(A)と(B)を切り離す。次に、分離した容量部(B)の余剰液をシリンジで抜き、次に沈降した細胞をほぐすことにより必要な細胞懸濁液を調製する。
【００２８】
図２は、遠沈管の様態をとる遠心分離用容器（コック式）の例である。容量部(A)と(B)に細胞含有液を入れて蓋をする。遠心分離後、容量部(B)に沈降した細胞量を目盛で計測する。そして容量部(A)と(B)の間のコックを閉じることで内溶液の流れを分断し、容量部(B)のシリンジ針挿入口からシリンジ針を挿入し、必要な細胞懸濁液を調製する。
【００２９】
図３は、バックの様態をとる遠心分離用容器の例である。容量部(A)と(B)に細胞含有液を入れて蓋をする。遠心分離後、容量部(B)に沈降した細胞量を目盛で計測する。そしてハサミ切線の少し下部を強く圧迫することで液の流れを遮断し、ハサミ切線にハサミを入れることにより容量部(A)と(B)を分離する。そして、容量部(B)の非開放系を維持した状態で、シリンジ接続口からシリンジ針を挿入し、シリンジの押し子を上下させることで、沈降した細胞をほぐし、それらをシリンジへと抜き取る。
【００３０】
図４は、バッグの様態をとる遠心分離用容器を、遠心分離装置に設置するために用いる支持器の例である。容量部(B)を支持具の窪みに指し込み、遠心分離操作から容量部(B)の変形を保護する。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
〔実施例１〕
＜骨髄由来間葉系幹細胞の調製＞
ヒト骨髄（Fresh whole bone marrow）をベリタス社から購入し、それを血清含有培地（DMEM+10%FBS）で培養（37℃、5%CO2）した。
【００３３】
培地交換は２〜３日置きに実施し、サブコンフルエントに達した間葉系幹細胞を、トリプシン処理にて継代培養を行った。
【００３４】
このようにして得られた間葉系幹細胞をトリプシン処理にて回収し、これを試験液とした。
【００３５】
＜バッグ型の遠心分離用容器＞
本発明の遠心分離用容器を用意し、上記の間葉系幹細胞を含む試験液を導入した。
【００３６】
それを遠心分離器（1500rpm、5分間）で遠心操作し、容量部(B)に細胞を沈降させた。
【００３７】
沈降した細胞量は、容量部(B)に印された目盛を読み取ることにより、3 x 107 cellsであると分かった。
【００３８】
次に、沈降した細胞の上を指で封じながら（図５）、容量部(A)の液導入口から上澄みを除去した。
【００３９】
そして、容量部(B)をハサミで切り取り（図６）、シリンジで沈降した細胞を吸い上げた。
【００４０】
ヒト骨髄由来の培養間葉系幹細胞を、遠心分離からシリンジに充填するまでに要した時間は合計７分間であった。
【００４１】
図７は、上記条件で遠心沈降させたヒト骨髄由来培養間葉系幹細胞の体積と個数の関係を示す。
【００４２】
〔実施例２〕
＜脂肪組織由来細胞の調製＞
体重3.5kgのウサギ（日本白色種）をケタラール／セラクタールの過剰投与にて安楽死させ、背側の皮下脂肪を採取した。
【００４３】
この白色脂肪を手術用ハサミで細かく刻み、0.075w/v%コラゲナーゼ/リン酸塩緩衝液（pH=7.4）100mLと共に、37℃で振盪した（一時間）。
【００４４】
この操作により皮下脂肪は分解され、流動性を有する粘性液体となった。
【００４５】
この酵素処理液を静置することで溶液を２層に分離し、下層の水溶液層（酵素処理液）を採液した。
【００４６】
この水溶液層を特開2006-121260に示した細胞分離カラムに通液し、含まれる脂肪由来幹細胞を分離回収した。
【００４７】
このようにして得られた（赤血球と血小板の大部分が除去された）有核細胞の細胞回収液を試験液とした。
【００４８】
＜バッグ型の遠心分離用容器＞
本発明の遠心分離用容器を用意し、そこに上記の脂肪由来有核細胞の細胞回収液を導入した。それを遠心分離器（1500rpm、5分間）で遠心操作し、容量部(B)に細胞を沈降させた。
【００４９】
沈降した細胞量は、容量部(B)に印された目盛を読み取ることにより、1 x 107コであると分かった。
【００５０】
次に、沈降した細胞の上を指で封じながら、容量部(A)の液導入口から上澄みを除去した。
【００５１】
そして、容量部(B)をハサミで切り取り、シリンジで沈降した細胞を吸い上げた。
【００５２】
脂肪組織から採取した有核細胞を、シリンジへ充填するまでに要した時間は合計７分間であった。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】遠沈管型遠心分離用容器（折り切り式）の一例を示す図である。
【図２】遠沈管型遠心分離用容器（コック式）の一例を示す図である。
【図３】バッグ型遠心分離用容器の一例を示す図である。
【図４】遠心分離用容器の支持器の一例を示す図である。
【図５】試作したバッグ型の遠心分離用容器を示す図である。
【図６】遠心分離用容器から分離した小容器（容量部(B)）を示す図である。
【図７】遠心沈降させたヒト骨髄由来培養間葉系幹細胞の体積と個数の関係を示す。
【符号の説明】
【００５４】
２  開閉コック
３  ハサミ切線
４  支持器
５  容量部(A)内にある上澄み液
６  沈降した細胞
１１、２１、３１、５１  蓋
１２、２２、３２、４２、５２  容量部(A)
１３、２３、３３、４３、５３、６３  容量部(B)
１４、２４、３４、５４  細胞計測目盛
１５、４５  折部
１６、２６、３６  シリンジ針挿入口
【図１】
2008220319.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008220319.tif 000006
【図６】
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【図７】
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