(57)【要約】【課題】ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供する。【解決手段】電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、内面がオゾン処理された泳動路を用いるヘモグロビン類の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、内面がオゾン処理された泳動路を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
【請求項２】
泳動路は、内面が更に親水性ポリマーでコーティングされていることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法。
【請求項３】
更に、アニオン性ポリマーを含有する緩衝液を用いることを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビン類の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビン（Ｈｂ）類、特に糖化ヘモグロビン類の一種であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）は、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。
従来、ＨｂＡ１ｃの測定方法としては、ＨＰＬＣ法、免疫法、電気泳動法等が用いられている。このうち、臨床検査分野で多く用いられているＨＰＬＣ法では、１試料当たり１〜２分での測定が可能であり、また、同時再現性試験のＣＶ値が１．０％程度の測定精度が実現されている。糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための測定方法としては、このレベルの性能が必要とされている。
【０００３】
一方、電気泳動法は、装置構成が簡便なため、マイクロチップ電気泳動のような安価で小型なシステムを作製することが可能な技術であり、電気泳動法におけるＨｂＡ１ｃの高精度測定技術の臨床検査への適用は、コスト面において非常に有益な効果が期待できる。
電気泳動法によるＨｂ類の測定は、通常とは異なるアミノ酸配列を有する異常Ｈｂ類の分離方法として古くから用いられているが、ＨｂＡ１ｃの分離は非常に困難であり、ゲル電気泳動の手法では３０分以上の時間が必要であった。このように電気泳動法は、臨床検査分野に応用した場合、測定時間及び測定精度の点で問題があるため、現在では糖尿病診断への応用はほとんど行われていなかった。
【０００４】
これに対して、１９９０年頃に登場したキャピラリー電気泳動法は、一般的に高分離・高精度測定が可能とされており、例えば、特許文献１には、キャピラリー電気泳動法によってＨｂＡ１ｃを分離する方法が開示されている。
しかしながら、特許文献１に開示された方法を用いた場合、測定時間が長いという問題点は解消されず、加えて、使用する緩衝液のｐＨが９〜１２と高く、Ｈｂが変性してしまう可能性があることから、この方法を臨床検査に適用することは困難であった。
【０００５】
また、特許文献２には、キャピラリー電気泳動法において、キャピラリーにカチオン性ポリマーを通液することによって、キャピラリー内面にカチオン性ポリマーを動的にコーティングし、硫酸化多糖類を含む緩衝液を用いる方法が開示されている。この方法によれば、１０分間程度で測定することができ、ゲル電気泳動法と比較して短時間で測定することが可能となる。
【０００６】
一般に、糖尿病診断を行う場合は、ＨｂＡ１ｃのなかでも糖尿病の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃを分離して、不安定型ＨｂＡ１ｃ、カルバミル化Ｈｂ、アセチル化Ｈｂ等の修飾Ｈｂ類の影響を排除しなければならない。しかしながら、特許文献１及び２に開示された方法によって得られるエレクトロフェログラムでは、分離性能及び測定精度が不充分であり、これらの方法の技術範囲では安定型ＨｂＡ１ｃを分離することは困難であった。
【０００７】
更に、これまでのキャピラリー電気泳動法、マイクロチップ電気泳動法等の方法では、ガラス製又は樹脂製の比較的疎水性の強い素材からなる泳動路を用いているため、試料中の蛋白質等の成分が泳動路内面に非特異吸着を起こすことによって、測定精度等に悪影響を及ぼすことがあった。また、同一の泳動路を繰り返し使用して電気泳動を行う場合には、泳動路の耐久性能等に悪影響を及ぼすことがあった。
【特許文献１】特表平０９−５１０７９２号
【特許文献２】特開平０９−１０５７３９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、内面がオゾン処理された泳動路を用いるヘモグロビン類の測定方法である。
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討した結果、電気泳動法によるヘモグロビン類の測定方法において、内面がオゾン処理された泳動路を用いることによって、試料となるヒト血液中の蛋白質、脂質等の成分が泳動路内面へ非特異吸着することを抑制することができ、短時間で高精度なヘモグロビン類、特に安定型ＨｂＡ１ｃの測定が可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。
以下に本発明を詳述する。
【００１１】
本発明のヘモグロビン類の測定方法において用いる電気泳動法としては特に限定されず、例えば、キャピラリー電気泳動法、マイクロチップ電気泳動法等が挙げられる。なかでも、マイクロチップ電気泳動法が好ましい。
【００１２】
図１に、本発明のヘモグロビン類の測定方法に用いるキャピラリー電気泳動装置の一例を示す。図１に示すように、キャピラリー電気泳動装置１１は、陽極槽１２、陰極槽１３、キャピラリー１４、高圧電源１５、検出器１６、及び、一対の電極１７、１８からなる。キャピラリー１４の両端は陽極槽１２内、及び、陰極槽１３内の緩衝液に浸され、管状のキャピラリー１４の内部は緩衝液で満たされている。また、電極１７及び１８は高圧電源１５と電気的に接続されている。
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、キャピラリー１４に含まれる泳動路内面にオゾン処理が施されている。そして、ヘモグロビン類を測定する際には、キャピラリー１４の一方より測定試料を注入して、高圧電源１５から所定の電圧を印加することにより、キャピラリー１４内を移動する測定対象を検出器１６によって測定する。
【００１３】
本発明のヘモグロビン類の測定方法は、マイクロチップ電気泳動法を用いるものであることが好ましい。
上記マイクロチップ電気泳動法は、上記キャピラリー電気泳動法におけるキャピラリーの代わりに、マイクロチップを用いて電気泳動を行う方法である。
上記マイクロチップは、無機系又は有機系の従来公知の素材からなり、数ｃｍ〜数十ｃｍ角程度の大きさを有し、電気泳動を行うための泳動路が形成された板状の基板からなるマイクロチップであり、例えば、μ−ＴＡＳ、Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐと呼ばれる技術に用いられる従来公知のチップ等が挙げられる。
【００１４】
本発明のヘモグロビン類の測定方法において、泳動路とは、電気泳動が行われる際に、測定試料が移動及び／又は分離する部位（注入された部位から検出される部位まで）のことをいう。具体的には、例えば、キャピラリー電気泳動法の場合は、キャピラリー内の試料が注入された部位から検出器により検出される部位までのことをいい、マイクロチップ電気泳動法の場合は、マイクロチップ溝内の試料が注入された部位から検出器により検出される部位までのことをいう。
上記泳動路の内面とは、具体的には、例えば、キャピラリー電気泳動法の場合は、キャピラリーの泳動路内面のことをいい、マイクロチップ型電気泳動法の場合は、マイクロチップ溝の泳動路内面のことをいう。
【００１５】
上記泳動路を構成する素材としては特に限定されず、従来公知の素材を用いることができるが、例えば、ホウケイ酸ガラス、石英等のガラス系、フューズドシリカ、ポリジメチルシロキサン等のシリカ系、ポリアクリル系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリ乳酸系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、オレフィン系樹脂等の樹脂系等の素材が好ましい。なかでも、ガラス系、シリカ系、アクリル樹脂系の素材が好ましい。
【００１６】
上記泳動路は、長さの好ましい下限が１０ｍｍ、好ましい上限が３００ｍｍである。１０ｍｍ未満であると、充分に試料が分離されないため、正確な測定をすることができないことがある。３００ｍｍを超えると、測定時間の延長や得られるエレクトロフェログラムにおいてピーク形状の変形が生じることによって、正確な測定をすることができないことがある。
【００１７】
上記泳動路は、幅の好ましい下限が１μｍ、好ましい上限が１００μｍである。１μｍ未満であると、検出器により検出するための光路長が小さく、測定精度が低下することがある。１００μｍを越えると、泳動路内で試料が拡散することにより得られるエレクトロフェログラムにおいてピークがブロードになり、測定精度が低下することがある。
【００１８】
上記泳動路の形状としては特に限定されず、例えば、直線状、一定の曲率を有する曲線状、又は、渦巻状等が挙げられる。なかでも直線状であることが好ましい。
上記泳動路の断面の形状としては特に限定されず、例えば、矩形、円形等が挙げられる。
上記泳動路は、複数の泳動路を一度に用いる構成としてもよい。すなわち、キャピラリー電気泳動法においては、キャピラリーを複数本同時に使用する構成としてもよく、マイクロチップ電気泳動法においては、１枚のチップ上に複数の泳動路が形成された構成としてもよい。
【００１９】
上記泳動路は、内面に従来公知の表面改質処理がされたものであってもよい。
上記表面改質処理とは特に限定されず、例えば、紫外線照射やプラズマ処理等の光学的処理、各種化学物質による反応・結合等の化学的処理、各種化合物・ポリマー等によるコーティング処理等の化学的及び／又は物理的変性処理等が挙げられる。
【００２０】
なかでも、上記コーティング処理を行うことが好ましい。上記コーティング処理を行うことによって、優れた分離性能を発揮することができる。
上記コーティング処理を行うことによって上記泳動路内面に形成されるコーティング層は、単層であってもよく、同一又は異なるコーティング剤からなる多層であってもよい。
【００２１】
上記コーティング処理に用いるコーティング剤としては特に限定されないが、親水性ポリマーが好ましい。
上記親水性ポリマーによるコーティング処理により、泳動路の内面に親水性を付与することができ、更に、後述するオゾン処理によって、上記コーティング剤中のわずかな疎水性部分も親水性化することが可能となる。このような親水性化により、泳動路の内部を通過する試料であるヒト血液中の蛋白質、脂質等の各成分の非特異吸着を抑制し、測定対象であるヘモグロビン類を充分に分離測定することが可能となる。親水性が不充分であると、試料であるヒト血液中の蛋白質、脂質等の各成分が上記泳動路の内面に非特異吸着を起こし、各成分の分離に悪影響を及ぼすことがある。
【００２２】
上記コーティング処理に用いられる親水性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、イオン性ポリマー又は非イオン性ポリマーの親水性ポリマーが挙げられる。
上記イオン性ポリマーの親水性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン等の硫酸基含有多糖類、及び、その塩類；アルギン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸等のカルボキシル基含有多糖類、及び、その塩類；セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類、及び、その誘導体へのイオン性基導入化物、及び、その塩類等のアニオン性多糖類、キチン、キトサン等のキトサン誘導体、及び、その塩類；アミノセルロース、Ｎ−メチルアミノセルロース等のＮ−置換セルロースの誘導体、及び、その塩類；デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類、及び、その誘導体へのアミノ基導入化物、及び、その塩類等のカチオン性多糖類、ポリ（メタ）アクリル酸、リン酸基含有（メタ）アクリル酸エステル重合体、スルホン酸基含有（メタ）アクリル酸重合体、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸重合体、及び、これらの共重合物等のアニオン性基含有有機合成高分子、ポリエチレンイミン、ポリブレン、ポリ（２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート）等のアミノ基含有（メタ）アクリレート、及び、これらの共重合物等のカチオン性基含有有機合成高分子等が挙げられる。
【００２３】
上記コーティング処理に用いられる非イオン性の親水性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の多糖類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等の親水性の有機合成高分子類、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレート等のモノマーを重合又は共重合して得られる有機合成高分子類等が挙げられる。
【００２４】
上記親水性ポリマーを泳動路にコーティングする方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができ、例えば、上記親水性ポリマーを含有する溶液を上記泳動路の内部に通液することによってコーティングする動的コーティング法；上記親水性ポリマーを泳動路の内面に接触させて疎水性的又は静電気的な相互作用等を利用して物理的に吸着・固定化させる固定化コーティング法、泳動路の内面及び親水性ポリマーをそれぞれの物質が有する官能基や他の物質等を介して共有結合により結合・固定化させる固定化コーティング法等が挙げられる。上記固定化コーティング法を用いる場合、更に、加熱工程、乾燥工程等を経ることにより、コーティング層が剥離することがないため、繰り返し測定が可能となる。上記固定化コーティング法としては、具体的には例えば、上記泳動路内部に上記親水性ポリマーを含有する溶液を通液し、該泳動路に空気を注入することによって該溶液を追い出した後、乾燥することを繰り返す方法等が挙げられる。
【００２５】
上記コーティング法のうち、特に固定化コーティング法が好ましい。固定化コーティング法を用いることによって、いったんコーティングすれば剥離することがなく、測定毎に再びコーティングを行う必要がない。そのため、連続測定等の際には、測定時間の短縮を図ることができる。
【００２６】
上記泳動路に上記親水性ポリマーを固定化する際、上記泳動路内面と上記親水性ポリマーからなる層との間に、別種の層を形成してもよい。上記別種の層が形成される場合、上記親水性ポリマーからなる層は、上記泳動路最内面に形成されていればよい。
【００２７】
上記泳動路に上記親水性ポリマーをコーティングする際、上記親水性ポリマーは、その種類やコーティングの方法にもよるが、上記親水性ポリマーを含む溶液としてコーティングに供されることが好ましい。
上記親水性ポリマー溶液の濃度としては、好ましい下限が０．０１％、好ましい上限が２０％である。０．０１％未満であると、コーティングが不充分となることがある。２０％を超えると、上記親水性ポリマーからなる層を均一に形成することができず、ヘモグロビン類の測定途中に剥離し、再現性低下の原因となることがある。
【００２８】
本発明のヘモグロビン類の測定方法に用いる上記泳動路は、内面がオゾン処理されたものである。上記泳動路の内面をオゾン処理することによって、蛋白質等の非特異吸着を防止するとともに、短時間に高精度なヘモグロビン類の測定を行うことが可能となる。
上記オゾン処理としては特に限定されず、例えば、オゾンガス処理、オゾン水処理等が挙げられる。上記オゾンガス処理を行う方法としては特に限定されず、例えば、オゾンガスを泳動路に接触させることによって行うことができる。上記オゾン水処理を行う方法としては特に限定されず、例えば、オゾン水を泳動路に接触させることによって行うことができる。なかでも、上記オゾン水処理が好ましい。
【００２９】
上記オゾン水処理に用いるオゾン水において、溶存するオゾンガスの濃度としては特に限定されないが、好ましい下限は２０ｐｐｍである。２０ｐｐｍ未満であると、オゾン処理に時間がかかったり、測定対象物質等の非特異吸着を充分に抑制することができなかったりすることがある。より好ましい下限は５０ｐｐｍである。
【００３０】
上記オゾン水処理に用いるオゾン水を調製する方法としては特に限定されず、例えば、原料水とオゾンガスとを、気体のみを通し液体の透過を阻止するオゾンガス透過膜を介して接触させる方法等が挙げられる。このような方法を用いることによって、上記オゾンガスを、上記オゾンガス透過膜を通じて上記原料水に溶け込ませて、上記オゾン水を調整することができる。
【００３１】
上記泳動路は、上記オゾン処理をした後に、更に、親水性ポリマーをコーティング処理することにより、分離性能等を改良することもできる。上記オゾン処理後に、上記コーティング処理がなされた場合でも、事前に行われた上記オゾン処理の効果は維持される。
上記コーティング処理は、上記のオゾン処理前に行う上記コーティング処理に用いられる親水性ポリマー類及びコーティング処理方法を適用することができる。
【００３２】
本発明のヘモグロビン類の測定方法において用いる電気泳動法としては特に限定されないが、例えば、上記泳動路に緩衝液を満たした後、測定試料を導入して該泳動路に電圧を負荷する方法等が挙げられる。
【００３３】
上記緩衝液は、電気泳動時に上記泳動路及び流路の内部に満たされる緩衝液、電気泳動時に上記泳動路の両端に設置される陽極槽及び陰極槽に満たされる緩衝液、上記泳動路の内部を洗浄する緩衝液、試料を溶解希釈する溶血希釈液等に用いられる。
【００３４】
上記緩衝液としては、緩衝能を有する従来公知の緩衝能成分を含有する溶液であれば特に限定されず、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸、及び、その塩類；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸、及び、その塩類；又は、緩衝能を有するこれらの誘導体類等の緩衝能成分を含有する溶液が挙げられる。
これらの緩衝能成分は、単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
【００３５】
上記緩衝液は、他に一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、カオトロピック化合物、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。なかでも、添加されるポリマーとしてイオン性ポリマー；特にアニオン性基を有する水溶性ポリマーが添加されることで、性能が向上する場合がある。上記アニオン性基を有する水溶性ポリマー（アニオン性ポリマー）は、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等の公知のアニオン性官能基を有する水溶性のポリマーである。
【００３６】
上記アニオン性ポリマーとしては特に限定されないが、例えば、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン等の硫酸基含有多糖類、及び、その塩類；アルギン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸等のカルボキシル基含有多糖類、及び、その塩類；セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類、及び、その誘導体へのイオン性基導入化物、及び、その塩類等のアニオン性多糖類；ポリ（メタ）アクリル酸、リン酸基含有（メタ）アクリル酸エステル重合体、スルホン酸基含有（メタ）アクリル酸重合体、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸重合体、及び、これらの共重合物等の水溶性アニオン性基含有有機合成高分子類等が挙げられる。
【００３７】
上記緩衝液の上記アニオン性ポリマーの含有量の好ましい下限は０．０１重量％、好ましい上限は１０重量％である。０．０１重量％未満であると、アニオン性ポリマーを添加することによる効果が発現しにくく、ヘモグロビン類の測定において、分離等が不充分となることがある。１０重量％を超えると、測定時間の延長や分離不良を引き起こすことがある。
【００３８】
本発明のヘモグロビン類の測定方法において、測定対象となるヘモグロビン類としては特に限定されず、例えば、従来公知のヘモグロビン類が挙げられる。具体的には例えば、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２；アセチル化Ｈｂ、カルバミル化Ｈｂ等の修飾ヘモグロビン；ＨｂＳ、ＨｂＣ等の異常ヘモグロビン等が挙げられる。なかでも、安定型ＨｂＡ１ｃを好適に測定することが可能である。
【発明の効果】
【００３９】
本発明によれば、試料となるヒト血液中の蛋白質、脂質等の成分の非特異吸着が抑制され、ヘモグロビン類、特に安定型ＨｂＡ１ｃを１試料当たり数分という短時間で、同時再現性を示すＣＶ値が１．０％程度という高精度で測定することが可能となることから、従来技術では困難であった糖尿病患者の電気泳動法によるＨｂＡ１ｃ値の管理を好適に行うことができる。更に、電気泳動法は、ＨＰＬＣ法等よりも装置構成が簡便であることから、安価なヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００４１】
（実施例１）
（１）泳動路の調製
キャピラリー電気泳動装置（ＰＡＣ／Ｅ  ＭＤＱ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）に、フューズドシリカ製キャピラリー（ＧＬサイエンス社製：内径２５μｍ×全長３０ｃｍ）をセットし、該キャピラリーに０．２ＮのＮａＯＨ水溶液、イオン交換水、０．５ＮのＨＣｌ水溶液をこの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、０．５重量％のキトサンを含む０．２Ｎ塩酸溶液を２０分間通液した。その後、空気をキャピラリー内に注入してキトサン溶液を追い出し、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。その後、再びキトサン溶液の注入、空気の注入及び乾燥を５回繰り返した。得られたキャピラリーに、溶存オゾンガス濃度１００ｐｐｍのオゾン水を満たして静置した。１０分後、オゾン水を吸引し、再び同様のオゾン水を注入して１０分間静置して、オゾン水処理済み泳動路を含むキャピラリーを得た。得られたキャピラリーに、２．０重量％のコンドロイチン硫酸を含む１５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）を満たした。
【００４２】
（２）健常人血の測定
健常人よりヘパリン採血した健常人全血１００μＬに、０．０５重量％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（界面活性剤、和光純薬社製）を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１５０μＬを添加して溶血希釈し、健常人血溶血試料を得た。
得られたオゾン水処理済みキャピラリーの一方の端部に得られた溶血試料を添加し、キャピラリーの両端に２５ｋＶの電圧をかけて電気泳動を行い、４１５ｎｍの可視光における吸光度変化を測定することにより、ヒト血液中の安定型ＨｂＡ１ｃの測定を行った。
図２は、実施例１において、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。図２中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０を示す。なお、安定型ＨｂＡ１ｃの分離は、約１．０分の電気泳動時間で行うことができた。
【００４３】
（３）修飾Ｈｂを含む試料の測定
健常人血の測定で用いた健常人全血に、グルコースを２５００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温し、修飾Ｈｂの一種である不安定型ＨｂＡ１ｃを多量に含む試料を人為的に調製した。上述の健常人血の測定と同様の方法を用いて修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。
図３は、実施例１において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
図３中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。図３に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃと修飾Ｈｂである不安定型ＨｂＡ１ｃとが良好に分離された。
【００４４】
（実施例２）
（１）泳動路の調製
ポリジメチルシロキサン製マイクロチップに、長さ７５ｍｍ、幅６０μｍの泳動路を形成しクロス十字型の電気泳動用マイクロチップを作製した。泳動路に０．５重量％のプリブレン水溶液を満たし、２０分間放置した。その後、空気を泳動路内に注入してプリブレン水溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。その後、再びプリブレン水溶液の注入、空気の注入及び乾燥を５回繰り返すことによって、泳動路がコーティングされた電気泳動用マイクロチップを得た。得られた泳動路がコーティングされた電気泳動用マイクロチップに、更に、実施例１と同様の方法を用いてオゾン水処理を施すことよって、オゾン水処理済み電気泳動用マイクロチップを得た。得られたオゾン水処理済み電気泳動用マイクロチップの泳動路に、１．５重量％のデキストラン硫酸を含む５０ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ５．８）を満たした。
【００４５】
（２）健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定
得られたオゾン水処理済み電気泳動用マイクロチップを用いて、泳動路の両端に５００Ｖの電圧をかけて電気泳動を行い、４１５ｎｍの可視光における吸光度変化を測定することにより、実施例１における（２）健常人血の測定及び（３）修飾Ｈｂを含む試料の測定と同様の測定を行った。健常人血の測定では、図２と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂを含む試料の測定では、図３と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
【００４６】
（実施例３）
（１）泳動路の調製
フューズドシリカ製マイクロチップに、長さ９０ｍｍ、幅５０μｍの泳動路を形成し、電気泳動用マイクロチップを作製した。泳動路に０．５重量％のキトサンを含む０．２Ｎ塩酸溶液を満たし、２０分間放置した。その後、空気を泳動路内に注入してキトサン溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。その後、再びキトサン溶液の注入、空気の注入及び乾燥を５回繰り返すことによって、泳動路がコーティングされたマイクロチップを得た。得られた更泳動路がコーティングされた電気泳動用マイクロチップに、更に、実施例１と同様の方法を用いてオゾン水処理を施すことよって、オゾン水処理済み電気泳動用マイクロチップを得た。得られたオゾン水処理済み電気泳動用マイクロチップの泳動路に、２．０重量％のコンドロイチン硫酸を含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を満たした。
【００４７】
（２）健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定
得られたオゾン水処理済み電気泳動用マイクロチップを用いて、泳動路の両端に７００Ｖの電圧をかけて電気泳動を行った以外は、実施例２と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図２と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂを含む試料の測定では、図３と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
【００４８】
（実施例４）
（１）泳動路の調製
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（和光純薬社製）３．０ｇ及びヒドロキシエチルメタクリレート（和光純薬社製）２．０ｇを５０ｍＬのイオン交換水に溶解して、溶液を得た。得られた溶液に過硫酸カリウム（和光純薬社製）０．０５ｇを添加し、窒素雰囲気下で攪拌しながら８０℃に昇温して重合した。１０時間重合後、内容物の全量を透析チューブ（三光純薬社製：ＵＣ  Ｃ６５−５０）に移し、イオン交換水中にて１２時間透析を行い、アニオン性基を有する親水性ポリマーを得た。
メチルメタクリレート製マイクロチップに、長さ７０ｍｍ、幅７０μｍの泳動路を形成し、電気泳動用マイクロチップを作製した。泳動路に０．５重量％の上述の親水性ポリマーの水溶液を満たし、２０分間放置した。その後、空気を泳動路内に注入して上述の親水性ポリマー水溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。その後、再び親水性ポリマー水溶液の注入、空気の注入及び乾燥を５回繰り返すことによって、泳動路がコーティングされたマイクロチップを得た。得られた泳動路がコーティングされたマイクロチップに、更に、実施例１と同様の方法を用いてオゾン水処理を施すことよって、オゾン水処理済み電気泳動用マイクロチップを得た。得られたオゾン水処理済み電気泳動用マイクロチップの泳動路に、２．０重量％の上述の親水性ポリマー水溶液を含む１００ｍＭリンゴ酸緩衝液（ｐＨ５．４）を満たした。
【００４９】
（２）健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定
得られたオゾン水処理済みマイクロチップを用いて、泳動路の両端に４００Ｖの電圧をかけて電気泳動を行った以外は、実施例２と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図２と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂを含む試料の測定では、図３と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
【００５０】
（実施例５）
（１）泳動路の調製
フューズドシリカ製マイクロチップに、長さ８５ｍｍ、幅５５μｍの泳動路を形成し、電気泳動用マイクロチップを作製した。形成された泳動路に、実施例１と同様の方法を用いてオゾン水処理を施すことよって、オゾン水処理済み電気泳動用マイクロチップを得た。得られたオゾン水処理済み電気泳動用マイクロチップの泳動路に、０．５重量％のキトサンを含む０．２Ｎ塩酸溶液を満たし、２０分間放置した。その後、空気を泳動路内に注入してキトサン溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。その後、再びキトサン溶液の注入、空気の注入及び乾燥を５回繰り返すことによって、泳動路がコーティングされたマイクロチップを得た。得られたマイクロチップの泳動路に、２．０重量％のコンドロイチン硫酸を含む１５０ｍＭリンゴ酸緩衝液（ｐＨ５．５）を満たした。
【００５１】
（２）健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定
得られたマイクロチップを用いて、泳動路の両端に７５０Ｖの電圧をかけて電気泳動を行った以外は、実施例２と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図２と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂを含む試料の測定では、図３と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
【００５２】
（比較例１〜４）
オゾン水処理を行わなかったこと以外は実施例１と同様の方法を用いて泳動路を有するキャピラリー電気泳動装置を作製し、修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。
オゾン水処理を行わなかったこと以外は実施例２〜４と同様の方法を用いて泳動路が形成されたマイクロチップを作製し、修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。
比較例１〜４の測定条件における修飾Ｈｂを含む試料の測定では、図３と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
【００５３】
（比較例５）
フューズドシリカ製キャピラリー（ＧＬサイエンス社製、内径２５μｍ×全長３０ｃｍ）を０．２Ｎ−ＮａＯＨ、イオン交換水、０．５Ｎ−ＨＣｌの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、ＢＳＡ（カチオン性ポリマー、牛血清アルブミン、和光純薬社製）の０．５重量％リンゴ酸緩衝液を１分間通液することによって、内面が動的にコーティングされたキャピラリーを得た。
得られた内面がコーティングされたキャピラリーを、キャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｅｒ社製、Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ）にセットし、０．２重量％のコンドロイチン硫酸（和光純薬社製）を含有するリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．７）をキャピラリー内に満たした後、１０ｋＶの電圧を負荷して電気泳動を行った以外は、実施例１と同様の方法によって、修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。
図４は、比較例５において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。図４中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。図４に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃを示すピーク１は、修飾Ｈｂを示すピーク３に重なっている。
【００５４】
（評価）
（１）回収率試験
実施例１〜５及び比較例１〜４の測定条件において、健常人血の測定において得られたエレクトロフェログラムの全ピーク面積値を算出した。実施例１における全ピーク面積値を１００として、実施例１における全ピーク面積値に対する実施例２〜５及び比較例１〜４における全ピーク面積の相対値を算出した。
結果を表１に示した。
【００５５】
【表１】
2008175741.tif 000002
【００５６】
表１に示すように、実施例１〜５の全ピーク面積値と比較して、比較例１〜４の全ピーク面積値は小さかった。これは、泳動路にオゾン処理が施されていない比較例１〜４の測定条件では、ヘモグロビン成分の一部が泳動路内面に非特異的に吸着したためと考えられる。
【００５７】
（２）同時再現性試験
実施例１〜５及び比較例１〜４の測定条件を用いて、健常人血試料の同一試料を２０回連続して得られた安定型ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値を算出した。
なお、ＣＶ値は（標準偏差／平均値）を算出することにより求めた。
結果を表２に示した。
【００５８】
（３）耐久性試験
実施例１〜５及び比較例１〜４の測定条件を用いて、健常人血試料の同一試料を２００回連続して測定して得られた安定型ＨｂＡ１ｃ値の最大値と最小値との差（Ｒ値）を算出した。
結果を表２に示した。
【００５９】
【表２】
2008175741.tif 000003
【００６０】
表２に示すように、実施例１〜５では、同時再現性試験において、バラツキ度合いを示すＣＶ値が１％前後であり良好な結果であった。また、耐久性試験における連続２００試料測定時のバラツキ幅についても、０．２％程度と非常に小さく、大量試料の連続測定においても精度良く安定型ＨｂＡ１ｃを測定できることが判明した。
一方、比較例１〜４では、同時再現性試験におけるＣＶ値が約３〜４％、耐久性試験におけるＲ値が０．６〜１．１％と非常に大きく、糖尿病患者のＨｂＡ１ｃ値を管理する上で全く不充分な値となっていた。
【００６１】
以上の評価結果から、オゾン処理を施さない方法による測定条件を用いた比較例１〜４では、回収率が低く（表１）、ヘモグロビン類の非特異吸着現象が起こっている。そのため、測定初期のエレクトロフェログラムは、オゾン処理を施した実施例１〜４とほぼ同等のものが得られているが（図３）、同時再現性試験及び耐久性試験等の繰り返し測定を行うと、上述の非特異吸着の影響により、測定値が安定せず（表２）、その性能が糖尿病患者のＨｂＡ１ｃ値を管理するレベルに達しないことわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明によれば、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明のヘモグロビン類の測定方法に用いる電気泳動装置の一例を示す模式図である。
【図２】実施例１、２、３及び４において、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
【図３】実施例１、２、３、４及び比較例１、２、３、４において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
【図４】比較例５において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
【符号の説明】
【００６４】
１１  キャピラリー電気泳動装置
１２  陽極槽
１３  陰極槽
１４  キャピラリー
１５  高圧電源
１６  検出器
１７  電極
１８  電極
１  安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
２  ＨｂＡ０のピーク
３  修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）のピーク
【図１】
2008175741.tif 000004
【図２】
2008175741.tif 000005
【図３】
2008175741.tif 000006
【図４】
2008175741.tif 000007