(57)【要約】【課題】医薬品向け高機能性タンパク質の生産方法としてトランスジェニックニワトリによる卵での生産手法が提案されているが、全身発現系のプロモーターでは発現量は多いが目的タンパク質によっては宿主に毒性を呈することから発現致死にいたる問題がある。そこで、普遍的な卵での高機能性タンパク質生産方法として鳥類の卵管特異的に機能するプロモーター配列を用いて卵管特異的な発現と実用レベルでのタンパク生産方法が必要とされる。【解決手段】鳥類卵管細胞で外来性目的タンパク質を高生産させるためにはオボアルブミンプロモーターを利用して卵管特異的な発現を実現することと、その転写活性を増強することにより達成される。オボアルブミンプロモーター配列を切り詰め、卵管特異的発現が可能な出来るだけ短い配列を得、転写活性化因子としてテトラサイクリン応答型のヘルペスウイルス由来ＶＰ１６因子を組込み、オボアルブミンプロモーターの転写活性を増強するレトロウイルスベクターを作製し、トランスジェニックニワトリを作製したところ、卵管で高発現するトランスジェニックニワトリを作製することに成功した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現用プロモーターであって、オボアルブミンプロモーターの、
ａ）ホルモン依存性ＤＮａｓｅＩ超感受性部位ＩＩＩの全部または一部を有し、
ｂ）ホルモン依存性ＤＮａｓｅＩ超感受性部位Ｉ及び／またはホルモン依存性ＤＮａｓｅＩ超感受性部位ＩＩを含まず、
ｃ）鳥類において卵管特異的に機能し、３ｋｂｐ以下でかつ１．０ｋｂｐを超え、
ｄ）ＴＡＴＡボックスを含む、
部分領域からなるプロモーター。
【請求項２】
オボアルブミンプロモーターが鳥類オボアルブミンプロモーターである請求項１に記載のプロモーター。
【請求項３】
鳥類オボアルブミンプロモーターがニワトリオボアルブミンプロモーターである請求項２に記載のプロモーター。
【請求項４】
ニワトリオボアルブミンプロモーターが配列表配列番号１に記載のニワトリオボアルブミンプロモーターである請求項３に記載のプロモーター。
【請求項５】
配列番号２に示す塩基配列からなるか、又は、配列番号２に示す塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ鳥類において卵管特異的に機能する活性を有するプロモーター。
【請求項６】
配列番号３に示す塩基配列からなるか、又は、配列番号３に示す塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ鳥類において卵管特異的に機能する活性を有するプロモーター。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載のプロモーターを有するウイルスベクター。
【請求項８】
レトロウイルスベクターである請求項７記載のウイルスベクター。
【請求項９】
更に外来目的タンパク質遺伝子が組込まれた請求項８記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロモーターがアクチベータータンパク質の卵管特異的発現を誘導し、該アクチベータータンパク質によりシス及び／またはトランスに外来目的タンパク質遺伝子の発現を誘導する請求項９記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
更にエンハンサー、シグナル配列、転写後調節因子を有する請求項１０記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載のウイルスベクターにより作製されたトランスジェニック鳥類。
【請求項１３】
ウイルスベクターを鳥類受精卵の発生段階において胚胎の心臓にマイクロインジェクションし、孵化させることにより得られる請求項１２のトランスジェニック鳥類。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載のトランスジェニック鳥類を他鳥類と交配し得られる後代トランスジェニック鳥類。
【請求項１５】
雌個体の卵管細胞で優位に外来目的タンパク質を発現する請求項１４記載の後代トランスジェニック鳥類。
【請求項１６】
請求項１５の後代トランスジェニック鳥類により産卵される、卵白または卵黄に外来目的タンパク質を含有する卵。
【請求項１７】
請求項１２又は１３に記載のトランスジェニック鳥類、又は、請求項１４又は１５に記載の後代トランスジェニック鳥類による外来目的タンパク質の生産方法。
【請求項１８】
外来目的タンパク質が、抗体、サイトカイン、インスリン、ホルモン、生理活性タンパク質又はこれらからなる融合タンパク質である請求項１７記載の外来目的タンパク質の生産方法。
【請求項１９】
トランスジェニック鳥類がトランスジェニックニワトリである請求項１７又は１８記載の外来目的タンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来目的タンパク質を卵管特異的に発現するトランスジェニック鳥類作製方法、並びに、該トランスジェニック鳥類と子孫により産卵される卵に外来目的タンパク質を蓄積させて回収するタンパク医薬品生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術により、従来生体試料より微量抽出しかできなかった、また化学合成では生産困難なタンパク医薬品を微生物や真核細胞に生産させることにより工業生産されてきた。組換え技術を用いた有用タンパク質の生産方法としては、大腸菌に代表される原核生物、酵母に代表される真核生物による発現系や哺乳動物細胞や昆虫細胞の培養細胞を利用した系が成功している。
だが近年の目ざましい研究成果により細胞内でのタンパク質動態がより詳細に明らかになるにつれ、医薬品として望まれるタンパク質の生産方法として翻訳後修飾やフォールディング、高次構造に注目した特異的、機能的なタンパク質を生産する技術が望まれている。高機能性タンパク質製剤の製造方法としては哺乳動物細胞を利用した系が主流となっているが、この生産方法はコストが高い、生産性が悪い、ウイルスの混入による感染症の恐れといったデメリットが存在する。
【０００３】
そこで着目したのがトランスジェニック動物によるタンパク医薬品の生産方法である。トランスジェニック動物の開発が世界中で報告され、サイトカイン類や血液製剤用の有用タンパク質を乳中に蓄積したトランスジェニックヤギやヒツジはすでに実用段階にある。これらトランスジェニック動物によるタンパク質生産のメリットは、哺乳動物細胞での生産系と同様の翻訳後修飾、フォールディング、高次構造を有した高機能性タンパク質を大量、安価に生産できる点である。トランスジェニック動物によるタンパク医薬品生産に於いては大型哺乳動物が用いられているが、これらウシ、ヒツジ、ヤギといった大型哺乳動物の乳に生産させる手法ではその広い飼育スペースと成熟して生産ラインが確立するまでに長い期間かかる欠点がある。
そこで我々はニワトリに着目した。トランスジェニックニワトリで有用タンパクを生産させる手法が開発され（特許文献１）、この卵から目的タンパク質を回収する手法では、広い飼育スペースを必要とせず、産卵までが６ヶ月と短い点、長年の食経験から安全性が確認されている点が有用である。このトランスジェニックニワトリでの生産方法として、従来は全身発現系のプロモーターを用いていたが、ニワトリに毒性を呈するタンパク質の生産には向いていない。そこでニワトリの卵特異的に目的タンパク質を発現、蓄積させる技術が必要とされている。
【０００４】
卵特異的に目的タンパク質を蓄積させるには、卵白を生成する卵管細胞で特異的に発現するプロモーターを応用すればよい。特許文献２には卵白プロモーターを用いたトランスジェニック鳥類作製方法が開示されるが、レトロウイルスをＸ期受精卵にマイクロインジェクションする該手法では目的配列を宿主に組込むことができても、機構不明の遺伝子サイレンシングにより発現が抑制されることがわかり（特許文献１）卵管細胞特異的に発現させることは不可能であった。
また特許文献３ではニワトリオボアルブミンプロモーターを利用したトランスジェニックニワトリ作製方法が開示されているが、生産性が低く実用向きではなかった。特許文献３では発現量は非常に低いながらも組織特異的な発現は実現できたことから、この発現量を向上するためには、転写活性を増強する遺伝子配列を導入する解決策が考えられる。しかし長い遺伝子配列を導入することができないウイルスベクターの特性上、長鎖のオボアルブミンプロモーターと目的遺伝子以外の配列を導入することは不可能である。
【特許文献１】国際公開第２００４／０１６０８１号パンフレット
【特許文献２】特表２０００−５１２１４９号公報
【特許文献３】特開２００４−２３６６２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
医薬品向け高機能性タンパク質の生産方法としてトランスジェニックニワトリによる卵での生産手法が提案されているが、全身発現系のプロモーターでは発現量は多いが目的タンパク質によっては宿主に毒性を呈することから発現致死にいたる問題がある。そこで普遍的な卵での高機能性タンパク質生産方法として鳥類の卵管特異的に機能するプロモーター配列を用いて卵管特異的な外来目的タンパク質遺伝子の発現を可能とする技術が必要とされている。特開２００４−２３６６２６号公報にはニワトリオボアルブミンプロモーターを組込んだレトロウイルスベクターを用いたトランスジェニックニワトリ作製方法を開示するが、該手法においては実用レベルの発現量が得られなかった。卵管特異的な発現と実用レベルでのタンパク生産方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、オボアルブミンプロモーターを組織特異的な転写活性を示す鎖長まで切り詰め、転写活性化配列を挿入することによって微量転写活性を増強することで、卵管細胞特異的に目的タンパク質を強発現させるベクターシステムを構築、トランスジェニック鳥類に応用することで、トランスジェニックニワトリによる卵特異的な外来目的タンパク質の生産方法を確立した。
本発明は、トランスジェニック鳥類において外来目的タンパク質を鳥類の卵管細胞特異的に高発現させ、該鳥類によって産卵される卵に特異的に外来目的タンパク質を高度に蓄積させ、これを回収することによって得られる外来目的タンパク質の生産方法である。
鳥類卵管細胞で外来目的タンパク質を高生産させるには、オボアルブミンプロモーターを利用して卵管特異的な発現を実現することと、その転写活性を増強することにより達成される。特開２００４−２３６６２６号公報に開示のオボアルブミンプロモーターは配列自体が長く、レトロウイルスベクターに用いられる長さから鑑みて、他の転写活性化配列を挿入することができない。
そこでオボアルブミンプロモーター配列を切り詰め、卵管特異的発現が可能な出来るだけ短い配列を得、転写増強因子を組込むことにより卵管特異的な外来目的タンパク質発現を可能とするレトロウイルスベクターの作製と、該ベクターによるトランスジェニック鳥類作製を試みた。オボアルブミンプロモーターＤＮＡ配列は、ニワトリのオボアルブミン遺伝子の転写開始点を０（基準）とし、上流に、−３８６０〜−１５６８までの約２．３ｋｂｐを用いた（配列表配列番号２）。転写活性化因子としてテトラサイクリン応答型のヘルペスウイルス由来ＶＰ１６因子を組込み、オボアルブミンプロモーターの転写活性を増強するレトロウイルスベクターを作製し、トランスジェニックニワトリを作製したところ卵管で高発現するトランスジェニックニワトリを作製することに成功した。
【０００７】
よって、本発明が提供するのは、以下のとおりである。
（１）
遺伝子発現用プロモーターであって、オボアルブミンプロモーターの、
ａ）ホルモン依存性ＤＮａｓｅＩ超感受性部位ＩＩＩの全部または一部を有し、
ｂ）ホルモン依存性ＤＮａｓｅＩ超感受性部位Ｉ及び／またはホルモン依存性ＤＮａｓｅＩ超感受性部位ＩＩを含まず、
ｃ）鳥類において卵管特異的に機能し、３ｋｂｐ以下でかつ１．０ｋｂｐを超え、
ｄ）ＴＡＴＡボックスを含む、
部分領域からなるプロモーター。
（２）
オボアルブミンプロモーターが鳥類オボアルブミンプロモーターである（１）に記載のプロモーター。
（３）
鳥類オボアルブミンプロモーターがニワトリオボアルブミンプロモーターである（２）に記載のプロモーター。
（４）
ニワトリオボアルブミンプロモーターが配列表配列番号１に記載のニワトリオボアルブミンプロモーターである（３）に記載のプロモーター。
（５）
配列番号２に示す塩基配列からなるか、又は、配列番号２に示す塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ鳥類において卵管特異的に機能する活性を有するプロモーター。
（６）
配列番号３に示す塩基配列からなるか、又は、配列番号３に示す塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ鳥類において卵管特異的に機能する活性を有するプロモーター。
（７）
（１）から（６）のいずれか１項に記載のプロモーターを有するウイルスベクター。
（８）
レトロウイルスベクターである（７）記載のウイルスベクター。
（９）
更に外来目的タンパク質遺伝子が組込まれた（８）記載のウイルスベクター。
（１０）
（１）〜（６）のいずれか１項に記載のプロモーターがアクチベータータンパク質の卵管特異的発現を誘導し、該アクチベータータンパク質によりシス及び／またはトランスに外来目的タンパク質遺伝子の発現を誘導する請求項９記載のウイルスベクター。
（１１）
更にエンハンサー、シグナル配列、転写後調節因子を有する（１０）記載のウイルスベクター。
（１２）
（７）〜（１１）のいずれか１項に記載のウイルスベクターにより作製されたトランスジェニック鳥類。
（１３）
ウイルスベクターを鳥類受精卵の発生段階において胚胎の心臓にマイクロインジェクションし、孵化させることにより得られる（１２）のトランスジェニック鳥類。
（１４）
（１２）又は（１３）記載のトランスジェニック鳥類を他鳥類と交配し得られる後代トランスジェニック鳥類。
（１５）
雌個体の卵管細胞で優位に外来目的タンパク質を発現する（１４）記載の後代トランスジェニック鳥類。
（１６）
（１５）の後代トランスジェニック鳥類により産卵される、卵白または卵黄に外来目的タンパク質を含有する卵。
（１７）
（１２）又は（１３）に記載のトランスジェニック鳥類、又は、（１４）又は（１５）に記載の後代トランスジェニック鳥類による外来目的タンパク質の生産方法。
（１８）
外来目的タンパク質が、抗体、サイトカイン、インスリン、ホルモン、生理活性タンパク質又はこれらからなる融合タンパク質である（１７）記載の外来目的タンパク質の生産方法。
（１９）
トランスジェニック鳥類がトランスジェニックニワトリである（１７）又は（１８）記載の外来目的タンパク質の生産方法。
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の外来目的タンパク質の生産方法は、トランスジェニック鳥類において外来目的タンパク質を卵特異的に高発現させることよりなり、組織特異的な転写活性を示す鎖長まで切り詰めたオボアルブミンプロモーターを用いることを特徴とする。
切り詰めたオボアルブミンプロモーターとしては、ホルモン依存性ＤＮａｓｅＩ超感受性部位ＩＩＩの全部または一部を有し、ホルモン依存性ＤＮａｓｅＩ超感受性部位Ｉまたはホルモン依存性ＤＮａｓｅＩ超感受性部位ＩＩを含まず、鳥類において卵管特異的に機能する３ｋｂｐ以下でかつ１．０ｋｂｐを超え、ＴＡＴＡボックスを含む部分領域（フラグメント）であれば本発明の技術範囲に含まれる。
上記オボアルブミンプロモーターは、鳥類オボアルブミンプロモーターであることが好ましく、ニワトリオボアルブミンプロモーターであることがより好ましい。配列表配列番号１に、ニワトリオボアルブミンプロモーターの配列を示す。
本発明の切り詰めたオボアルブミンプロモーターの部分領域は、３ｋｂｐ以下であり、１．４ｋｂｐ以下であることが好ましい。この切り詰めたプロモーターは、１．１ｋｂｐ以上であることが好ましい。
【０００９】
本発明の切り詰めたオボアルブミンプロモーターとしては、配列表配列番号２又は３に記載のものが挙げられる。
また、配列番号２または配列番号３に示す塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ鳥類において卵管特異的に機能する活性を有するプロモーターも、本発明のプロモーターに含まれる。より好ましくは、９０％以上の同一性、更に好ましくは９５％以上の同一性、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列のプロモーターである。
ここで、「同一性（％）」とは、対比される２つのポリヌクレオチドを最適に整列させ、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８、１９９４年９月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ５３７１１；Ｒｉｃｅ、Ｐ．（１９９６）Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ＥＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｐｅｔｅｒ  Ｒｉｃｅ、Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｈｉｎｘｔｏｎ  Ｈａｌｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ１０  １ＲＱ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、および、ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【００１０】
本発明の外来目的タンパク質の生産方法に用いるトランスジェニック鳥類は、上述の切り詰めたオボアルブミンプロモーターを含むウイルスベクターを鳥類に導入することにより得られる。
上記ウイルスベクターは、複製能欠失型ウイルスベクターであることが好ましい。複製能欠失型ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ボックスウイルス、ヘルペスウイルス等、宿主鳥類に目的遺伝子配列が導入可能なベクターであれば特に限定されない。
本発明において、上記ウイルスベクターは、トランスジェニック鳥類に外来目的タンパク質を生産させるため、更に外来目的タンパク質遺伝子が組込まれたものであることが好ましい。後述の実施例では、外来目的タンパク質遺伝子としてＤｓＲｅｄを用いた。
上記外来目的タンパク質としては、抗体、サイトカイン、インスリン、ホルモン、生理活性タンパク質又はこれらからなる融合タンパク質が好ましい。
【００１１】
上記複製能欠失型ウイルスベクターに組込む配列は、切り詰めたオボアルブミンプロモーターを含み、外来性目的タンパク質をトランスジェニック鳥類の卵に効率的に蓄積できるベクターコンストラクトであれば特に限定されないが、例えば転写活性化因子をコードする遺伝子配列および該転写活性化因子により下流の目的遺伝子を強発現させるシスまたはトランスアクチベーターシステムを組込んだベクターコンストラクトが好ましい。
さらに好ましいシステムとしては、テトラサイクリン応答配列およびヘルペスウイルス由来ＶＰ１６トランスアクチベーターを利用した系が好ましいがこれに限定されることはなく、ガラクトース応答配列等も用いることができる。
【００１２】
またこのウイルスベクターには、転写後調節因子やエンハンサー配列、シグナル配列等、外来導入遺伝子を効率的に発現させることを目的としたＤＮＡ配列を組込んでも良い。
【００１３】
上述のウイルスベクターを宿主鳥類に導入することより、トランスジェニック鳥類（Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類）を作製することができる。
本発明においては、外来目的タンパク質遺伝子を、切り詰めたオボアルブミンプロモーターを導入したウイルスベクターとは別のウイルスベクターに導入し、２種のウイルスベクターを宿主鳥類に導入してＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製することもできる。
本発明で用いられるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製方法の一例としては、本発明者らにより実施された方法が挙げられるが（特開２００２−１７６８８０号公報、特開２００４−２３６６２６号公報および国際公開第２００４／０１６０８１号パンフレット）、これに限定せず、特表２００５−５３５３３１号公報および特開２００６−２６２８７５号公報に開示される非ウイルス法によるトランスジェニック鳥類作製方法にも応用可能であるがこれらに限定されない。複製能欠失型ウイルスベクターを鳥類受精卵の胚胎、心臓または血管にマイクロインジェクションするあらゆる公知の手法は、後代取得効率が良い理由から好ましい。本発明においては、ウイルスベクターを鳥類受精卵の発生段階において胚胎の心臓にマイクロインジェクションし、孵化させることが好ましい。
【００１４】
宿主鳥類としては限定されることはなく、ニワトリ、ウズラ、七面鳥、カモなどが用いられるが、なかでもニワトリやウズラは入手が容易であり産卵種としても多産であり、長年の飼育経験により安全性が認められている点で好ましい。より好ましくはニワトリである。
【００１５】
ここでＧ０トランスジェニックキメラ鳥類とは、本発明のトランスジェニック作製方法により作製された一代目の鳥類のことを示し、その体細胞にモザイクキメラ状に遺伝子が導入された鳥類を示す。
【００１６】
作製されたＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の選抜方法としては特に限定されないが、例えばゲノム抽出後、ＰＣＲ、サザンブロット法等により目的配列が導入されたか確認することが可能である。このＧ０のうち雌個体をあらゆる公知の畜産学的手法を用いて産卵するまで成長させ、その卵に目的タンパク質が蓄積しているかを確認する。確認に用いる手法は特に限定されることはなく、例えば特異抗体を用いて免疫化学的に定量、測定する方法または培養細胞での活性測定や動物試験等によるインビトロ、インビボ活性を測定しても良い。
【００１７】
Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を交配させることにより、後代はすべての体細胞に導入遺伝子を有する完全トランスジェニック個体が得られる。交配手法は自然交配または人工交配等特に限定されない。交配はＧ０トランスジェニックキメラ鳥類に野生型鳥類をかけても良く、またＧ０トランスジェニック同士をかけあわせても良い。この後代完全トランスジェニック鳥類をＧ１、Ｇ２、Ｇ３などとする。
本発明の外来目的タンパク質の生産方法においては、雌個体の卵管細胞で優位に外来目的タンパク質を発現するトランスジェニック鳥類を用いることが好ましい。
このＧ０またはＧ１以降の完全トランスジェニック鳥類の卵を回収し、該卵の卵白または卵黄より目的タンパク質を回収する。回収する方法としては特に限定されず、濾過、アフィニティークロマトグラフや陽イオン、陰イオン交換クロマトグラフ等あらゆる公知の精製または分離手法が用いられる。
このようにして得られた目的タンパク質は、医薬品用途等に用い得る。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、トランスジェニック鳥類で卵管特異的に外来性目的タンパクを高発現させることが可能となる。本技術を用いて宿主に毒性を呈するタンパク質を含めトランスジェニック鳥類で医薬品向け高機能性タンパク質を安価に大量生産可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を実施する好ましい形態を詳述するが、本発明の本質は記載の内容により不当に限定されるべきではない。
（実施例１）切り詰め型オボアルブミンプロモーター配列の取得
１−１  ｐＢｌｕｅＯＶＡ（ｄ）の構築
特開２００４−２３６６２６号公報に記載のベクターｐＬＧＯＧを制限酵素ＥｃｏＲＶ（ＴＡＫＡＲＡ）、ＢａｍＨＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で処理し、１％アガロース電気泳動により目的である２．４ｋｂの断片を分離後、ゲルから切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−（ＴＯＹＯＢＯ）により精製した。この断片をインサートとした。また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ−（Ｎｏｖａｇｅｎ）を制限酵素ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩで処理後、ゲルからの切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−による精製により出来た断片をベクターとした。
精製した各ＤＮＡ断片の濃度及び精製度を１％アガロース電気泳動による確認後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、大腸菌ＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ）へのｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。尚、Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応は、ＬｉｇａＦａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、プロトコールに準じて行った。Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎは、まず、液体窒素内で凍結しているコンピテントセルＤＨ５αを融解し、その溶液に、上記のＬｉｇａｔｉｏｎ反応後の溶液１０μｌを加え氷上で３０分静置した。その後、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋを４２℃で４５秒行い、５分氷冷した。この菌体懸濁液に１ｍｌのＬＢ培地を加え、３７℃で１時間振とうさせ、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリン入りのＬＢプレートに播き、３７℃で１４時間培養した。その後、アルカリ法によりＬＢプレート上に培養したコロニーから目的プラスミドが得られた。
【００２０】
１−２  ｐＥＴＯＶＡ（ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ）の構築
まず、特開２００４／２３６６２６の実施例記載の手法により樹立されたウイルス生産パッケージング細胞ｐＬＧＯＧからＭａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ｇｅｎｏｍｅ−  （ＴＯＹＯＢＯ）によりｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを抽出した。パッケージング細胞ｐＬＧＯＧとは、ｇａｇ、ｐｏｌ遺伝子を染色体上に持つＧＰ２９３をウイルスプロデューサー細胞とし、そのＧＰ２９３細胞に目的遺伝子であるウイルスベクターｐＬＧＯＧ（ＧＦＰ、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｈＧＨ（ｃＤＮＡ））を遺伝子導入することで取得された安定に発現する細胞株のことである。
上記の方法で得られたｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。
５’プライマー（配列表配列番号４）
３’プライマー（配列表配列番号５）
また、ＰＣＲ反応の酵素としてはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、条件は次に示す通りに行った。
（１）９４℃で１５秒、（２）５８℃で３０秒、（３）６８℃で１５秒、（１）から（３）を３５サイクル。
ＰＣＲ反応後の溶液はフェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行い、さらにＢｇｌＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ）、ＸｈｏＩ（ＴＡＫＡＲＡ）により制限酵素反応を行った。その後、１％アガロース電気泳動により目的である約２２０ｂｐの断片を分離後、ゲルから切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−により精製した。
ｐＥＴ  Ｂｌｕｅ２（Ｎｏｖａｇｅｎ）も同様に、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩによる制限酵素反応後、１％アガロース電気泳動により目的断片を分離後、ゲルから切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−により精製した。精製した各ＤＮＡ断片の濃度及び精製度を１％アガロース電気泳動による確認後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、大腸菌ＤＨ５αへのｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。インサートとしては上記ＰＣＲで増幅後調製した約２２０ｂｐの断片、ベクターとしては上記ｐＥＴ  Ｂｌｕｅ２の断片を用いた。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
【００２１】
１−３  ｐＢｌｕｅＯＶＡ（ｄ）ΔＢｇｌＩＩの構築
ｐＥＴＯＶＡ（ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ）及びｐＢｌｕｅ  ＯＶＡ（ｄ）を  ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩにより制限酵素処理し、１％アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−による精製を行った。ｐＥＴＯＶＡ（ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ）から得られた約２２０ｂｐの断片をインサートとし、また、制限酵素処理されたｐＢｌｕｅ  ＯＶＡ（ｄ）をベクターとして、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
【００２２】
１−４  ｐＢｌｕｅＯＶＡの構築
ｐＢｌｕｅＯＶＡ（ｄ）及びｐＢｌｕｅＯＶＡ（ｄ）ΔＢｇｌＩＩをそれぞれＢｇｌＩＩにより制限酵素処理し、１％アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−による精製を行った。ｐＢｌｕｅＯＶＡ（ｄ）から得られた断片１．２ｋｂをインサート、ｐＢｌｕｅＯＶＡ（ｄ）ΔＢｇｌＩＩから得られた断片をベクターとして、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
【００２３】
１−５  ｐＥＴＯＶＡの構築
ｐＢｌｕｅＯＶＡ及びｐＥＴ  Ｂｌｕｅ２をそれぞれＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）、ＸｈｏＩで制限酵素処理し、１％アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−による精製を行った。ｐＢｌｕｅ  ＯＶＡ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）から得られた断片をインサート、ｐＥＴ  Ｂｌｕｅ２から得られた断片をベクターとして、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
【００２４】
１−６  配列の確認
クローニングした約２．３ｋｂのｏｖａｌｂｕｍｉｎ配列を下記のプライマーを用いて塩基配列を確認した。鋳型はｐＢｌｕｅＯＶＡとして用いた。
ＯＶＡ−１（５’プライマー）（配列表配列番号６）
ＯＶＡ−２（５’プライマー）（配列表配列番号７）
ＯＶＡ−３（５’プライマー）（配列表配列番号８）
ＯＶＡ−４（５’プライマー）（配列表配列番号９）
ＯＶＡ−５（５’プライマー）（配列表配列番号１０）
ＯＶＡ−６（５’プライマー）（配列表配列番号１１）
ＯＶＡ−７（３’プライマー）（配列表配列番号１２）
【００２５】
上記のようにして切り詰め型オボアルブミンプロモーター配列（配列番号２）を取得した。
【００２６】
（実施例２）ｐＱｅＧＯＶＡＴＲＥｔＴＡＷ自己活性型ウイルスベクターの構築
２−１  ｐＭＳＣＶｅＧＴＲＥＧＩｔＴＡＷの構築
２−１−１  ｐＭＳＣＶｅＧＴＲＥＧの構築
ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）よりＥＧＦＰ配列をＰＣＲで増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで処理した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ−（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩサイトに組み込んだベクターをｐＢｌｕｅ／ｅＧとした。ｐＢｌｕｅ／ｅＧを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで処理した断片をインサートとし、ｐＭＳＣＶｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトに組込んだベクターをｐＭＳＣＶ／ｅＧとした。ｐＴＲＥ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）よりＴＲＥ配列を制限酵素ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで処理した断片をインサートとし、ｐＭＳＣＶ／ｅＧのＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトに組込んだベクターをｐＭＳＣＶ／ｅＧＴＲＥとした。
ｐＣＥＰ４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の制限酵素ＢａｍＨＩ、ＭｌｕＩサイトに、特開２００４−２３６６２６号公報でクローニングしたｈＧＨ（ｃＤＮＡ）を組込んだｐＣＥＰ４−ｈＧＨ（ｃＤＮＡ）をＢａｍＨＩ、ＭｌｕＩで切り出した断片をインサートとし、ベクターとしてｐＭＳＣＶ／ｅＧＴＲＥをＢａｍＨＩ、ＭｌｕＩで制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動（１％）により目的バンドを分離し、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−で回収した。回収したＤＮＡ濃度をアガロース電気泳動（１％）で確認後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、形質転換、アルカリ法により得られたプラスミドをｐＭＳＣＶｅＧＴＲＥＧとした。
【００２７】
２−１−２  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＩＲＥＳ（５’側制限酵素ＭｌｕＩサイト、３’側制限酵素ＥｃｏＲＩサイト）の取得
細胞性ＩＲＥＳの配列の５’側に制限酵素ＭｌｕＩサイト、３’側に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトをつけた５’ＤＮＡ配列（配列表配列番号１３）、細胞性ＩＲＥＳの配列の３’側に制限酵素ＭｌｕＩサイト、５’側に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトをつけた３’ＤＮＡ配列（配列表配列番号１４）を合成ＤＮＡ配列とした。ただし、この合成ＤＮＡを通常の５’側の制限酵素ＭｌｕＩサイト、３’側の制限酵素ＥｃｏＲＩサイトにＬｉｇａｔｉｏｎしたとき、制限酵素ＥｃｏＲＩでは切れない塩基配列になっている。
【００２８】
２−１−３  ｐＥＴ−ＩＲＥＳ（ｒ）の構築
ベクターとしてｐＥＴ  Ｂｌｕｅ２（Ｎｏｖａｇｅｎ）を制限酵素ＭｌｕＩ、制限酵素ＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動（１％）により目的バンドを分離し、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−で回収した。回収したＤＮＡ濃度をアガロース電気泳動（１％）で確認後、ベクターＤＮＡと２−１−２で合成により作った細胞性ＩＲＥＳをインサートとしてＬｉｇａｔｉｏｎ、形質転換、アルカリ法により得られたプラスミドをｐＥＴ−ＩＲＥＳ（ｒ）とした。
【００２９】
２−１−４  ｐＢｌｕｅ−ｔＴＡの構築
ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）よりＩＲＥＳをＰＣＲにて増幅、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで処理した断片をインサートとし、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ−（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩサイトに組込んだベクターをｐＢｌｕｅ／Ｉとした。
ｐＴＥＴ−ＯＦＦ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＢａｍＨＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ（ＴＡＫＡＲＡ）で平滑化後、ＥｃｏＲＩで処理した断片をインサートとし、ｐＢｌｕｅ／ＩのＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲｖサイトに組込んだベクターをｐＢｌｕｅ／ＩｔＴＡとした。インサートとしてｐＢｌｕｅ／Ｉ  ｔＴＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで、ベクターとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ−（Ｎｏｖａｇｅｎ）を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで、それぞれ制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動（１％）により目的バンドを分離し、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−で回収した。回収したＤＮＡ濃度をアガロース電気泳動（１％）で確認後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、形質転換、アルカリ法により得られたプラスミドをｐＢｌｕｅ−ｔＴＡとした。
【００３０】
２−１−５  ｐＥＴ−ＩｔＴＡの構築
インサートとしてｐＢｌｕｅ−ｔＴＡを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｖｕＩＩで、ベクターとしてｐＥＴ−ＩＲＥＳ（ｒ）を制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶで制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動（１％）により目的バンドを分離し、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−で回収した。回収したＤＮＡ濃度をアガロース電気泳動（１％）で確認後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、形質転換、アルカリ法により得られたプラスミドをｐＥＴ−ＩｔＴＡとした。
【００３１】
２−１−６  ｐＭＳＣＶｅＧＴＲＥＧＩｔＴＡの構築
インサートとしてｐＥＴ−ＩｔＴＡを制限酵素ＭｌｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで、ベクターとしてｐＭＳＣＶｅＧＴＲＥＧを制限酵素ＭｌｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動（１％）により目的バンドを分離し、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−で回収した。回収したＤＮＡ濃度をアガロース電気泳動（１％）で確認後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、形質転換、アルカリ法により得られたプラスミドをｐＭＳＣＶｅＧＴＲＥＧＩｔＴＡとした。
【００３２】
２−１−７  ｐＭＳＣＶｅＧＴＲＥＧＩｔＴＡＷの構築
インサートとして特開２００６／２７１２６６に記載のｐＢｌｕｅ／ＷＰＲＥを制限酵素ＣｌａＩで、ベクターとしてｐＭＳＣＶｅＧＴＲＥＧＩｔＴＡを制限酵素ＣｌａＩで制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動（１％）により目的バンドを分離し、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−で回収した。回収したＤＮＡ濃度をアガロース電気泳動（１％）で確認後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、形質転換、アルカリ法により得られたプラスミドをｐＭＳＣＶｅＧＴＲＥＧＩｔＴＡＷとした。
【００３３】
２−２  ｐＭＳＣＶｅＧＯＶＡＴＲＥＧＩｔＴＡＷの構築
実施例１で構築されたｐＥＴＯＶＡをＳａｌＩ（ＴＡＫＡＲＡ）、ＸｈｏＩで、また、ｐＭＳＣＶｅＧＴＲＥＧＩｔＴＡＷをＸｈｏＩで制限酵素処理し、１％アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−による精製を行った。ｐＥＴＯＶＡから得られた約２．３ｋｂの断片をインサートとし、また、制限酵素処理されたｐＭＳＣＶｅＧＴＲＥＧＩｔＴＡＷをベクターとして、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
【００３４】
２−３  ｐＥＴｔＴＡＷの構築
２−２で構築されたウイルスベクタープラスミドｐＭＳＣＶｅＧＯＶＡＴＲＥＧＩｔＴＡＷ及びｐＥＴ  Ｂｌｕｅ２をそれぞれＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、１％アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−による精製を行った。ｐＭＳＣＶｅＧＯＶＡＴＲＥＧＩｔＴＡＷから得られた約１．７ｋｂの断片をインサートとし、また、制限酵素処理されたｐＥＴ  Ｂｌｕｅ２をベクターとして、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
【００３５】
２−４  ｐＱｔＴＡＷの構築
２−３で構築されたｐＥＴｔＴＡＷ及びｐＱＣＸＩＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をそれぞれＫｐｎＩで制限酵素処理し、１％アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−による精製を行った。ｐＥＴ  ｔＴＡ  Ｗの断片をインサート、また、制限酵素処理されたｐＥＴ  Ｂｌｕｅ２をベクターとして、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
【００３６】
２−５  ｐＱｅＧＴＲＥｔＴＡＷの構築
２−２で構築されたｐＭＳＣＶｅＧＯＶＡＴＲＥＧＩｔＴＡＷ及び２−４で構築されたｐＱｔＴＡＷをそれぞれＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、１％アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−による精製を行った。ｐＭＳＣＶｅＧＯＶＡＴＲＥＧＩｔＴＡＷから得られた約１．５ｋｂの断片をインサートとし、また、ｐＱｔＴＡ  Ｗをベクターとして、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
【００３７】
２−６  ｐＱｅＧＯＶＡＴＲＥｔＴＡＷの構築
２−５で構築されたｐＱｅＧＴＲＥｔＴＡＷ及び実施例１で構築されたｐＥＴＯＶＡをそれぞれＸｈｏＩで制限酵素処理し、１％アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−による精製を行った。ｐＥＴ  ＯＶＡから得られた約２．３ｋｂの断片をインサートとし、また、制限酵素処理されたｐＱｅＧＴＲＥｔＴＡＷをベクターとして、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
【００３８】
２−７  ｐＱｅＧＯＶＡ（ＤＨＳＩＩＩ）ＴＲＥｔＴＡＷの構築
２−６で構築されたｐＱｅＧＯＶＡＴＲＥｔＴＡＷをＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、１％アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−による精製を行った。ｐＱｅＧＯＶＡＴＲＥｔＴＡＷから得られた約８．７ｋｂの断片をベクターとして、ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
【００３９】
図２に、実施例２で調製したレトロウイルスベクターの模式図を示す。図２では、ｔＴＡ融合タンパク質（ｔｅｔＲ＋ＶＰ１６）が発現して、ＴＲＥ配列（ｔｅｔｒａ  ｃｙｃｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合し、下流のＣＭＶ最小プロモーター（ＣＭＶ  ｍｉｎｉ＝ＣＭＶ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）から転写されることを示す。
【００４０】
（実施例３）Ｄｓ−ＲＥＤ発現用ウイルスベクターの構築
３−１  ｐＥＴ  ＤｓＲｅｄの構築
ｐＩＲＥＳ２−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）よりＤｓＲｅｄをＰＣＲ法により増幅した。
５’プライマー（配列表配列番号１５）
３’プライマー（配列表配列番号１６）
ＰＣＲ反応の酵素としてはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、条件は次に示す通りに行った。
（１）９４℃で１５秒、（２）５６℃で３０秒、（３）６８℃で４５秒、（１）から（３）を３０サイクル。
ＰＣＲ反応後の溶液は、フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行った。
その後、ＰＣＲにより増幅したＤｓＲｅｄ及びｐＥＴ  Ｂｌｕｅ２をそれぞれＢａｍＨＩ、ＭｌｕＩで制限酵素処理し、１％アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−による精製を行った。ＤｓＲｅｄの断片をインサート、また、制限酵素処理されたｐＥＴ  Ｂｌｕｅ２をベクターとして、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
【００４１】
３−２  ｐＱｅＧＴＲＥＤｓＲｅｄＷの構築
３−１で構築されたｐＥＴＤｓＲｅｄ及び２−５で構築されたｐＱｅＧＴＲＥｔＴＡＷをそれぞれＢａｍＨＩ、ＭｌｕＩで制限酵素処理し、１％アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−による精製を行った。ＤｓＲｅｄの断片をインサート、また、制限酵素処理されたｐＱｅＧＴＲＥｔＴＡＷをベクターとして、Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
【００４２】
（実施例４）レトロウイルスの産生
まず、ウイルス産出細胞であるＧＰ−２９３細胞を２４ｗｅｌｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）に播種した。播種２４時間後、細胞密度９０〜９５％の状態のときに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社製）を用いて、２−５で構築されたウイルスベクタープラスミドｐＱｅＧＴＲＥｔＴＡＷとｐＶＳＶ−Ｇのコトランスフェクションを行った。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００のプロトコールに準じて行い、トランスフェクション時の培地としては１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ入りのＤＭＥＭを用いた。その後、超遠心によりウイルスを濃縮し、インジェクション実験に用いた。また、２−６で構築したｐＱｅＧＯＶＡｔＴＡＷと３−２で構築したｐＱｅＧＴＲＥＤｓＲｅｄＷの各ベクターに関しても上記と同様にｐＶＳＶ−Ｇとのコトランスフェクションを行い、ウイルス濃縮を行った。
【００４３】
（実施例５）マイクロインジェクションおよび胚体外培養
マイクロインジェクションによるトランスジェニックニワトリの作製は、国際公開第２００４／０１６０８１号パンフレットおよび特開２００４−２３６６２６号公報で実施の手法に従った。
インジェクションに用いたウイルスベクターは組織特異的にｔＴＡ遺伝子の発現を解析するため、実施例４記載の手法により得られたｐＱｅＧＯＶＡＴＲＥｔＴＡレトロウイルスベクターをニワトリ受精卵５５時間孵卵胚の心臓にマイクロインジェクションしてＧ０トランスジェニックニワトリを作製した。またコントロールとしてＯＶＡ配列を持たないｐＱｅＧＴＲＥｔＴＡＷレトロウイルスを同様に用いてＧ０トランスジェニックニワトリを作製した。
またターゲット遺伝子として蛍光タンパク質をコードするＤｓＲｅｄを組みこんだｐＱｅＧＴＲＥＤｓＲｅｄＷとｐＱｅＧＯＶＡＴＲＥｔＴＡＷの２つのウイルスベクターを混合してインジェクションし、卵管特異的に発現するｔＴＡにより増強されたＤｓＲｅｄタンパク質発現の組織特異性を解析した。
インジェクション後の胚体外培養法は同様に国際公開第２００４／０１６０８１号パンフレットおよび特開２００４−２３６６２６号公報で実施の手法に従い、Ｇ０トランスジェニックニワトリを孵化させた。
【００４４】
（実施例６）個体解析
６−１  ステロイドホルモンによる誘導
マイクロインジェクション及び胚体外培養により得られたトランスジェニックニワトリ（Ｇ０個体）２週齢の筋肉、特に胸筋に１００％エタノールに溶かしたｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ（ＤＥＳ：Ｓｉｇｍａ）１０ｍｇ／ｍｌを０．１ｍｌ／ｄａｙで１０日間、連続投与を行うことで、Ｅｓｔｒｏｇｅｎ誘導により輸卵管の膨大部を肥大させた。その後、５日以上何も処理しない状態を経て再び１週間以上ＤＥＳのインジェクションを行い、解剖を行った。
【００４５】
６−２  発現解析
ホルモン処理の済んだ野生型のニワトリ及びトランスジェニックニワトリを解剖し、各組織のサンプリングを行った。サンプリングされた組織からｔｏｔａｌ  ＲＮＡ及びｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを取得し、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにより目的遺伝子の発現解析を行った。
【００４６】
６−２−１  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの取得及びＲＴ−ＰＣＲによるｃＤＮＡ合成
ＰＢＳでよく血を洗い流した各組織から極少量の組織を切り取り、それをハサミで出来るだけ細かく切った。それから、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（登録商標、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡの濃度をＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で測定し、一定濃度に希釈をし、逆転写反応を行った。ＲＮＡ取得の操作はプロトコールに準じた。また、逆転写反応にはＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。一定濃度に合わせたｔｏｔａｌ  ＲＮＡと１０ｐｍｏｌ／μｌ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１μｌを混ぜた計１２μｌを７０℃で１０分間反応させ、氷上で１５分静置した。その溶液に５×Ｂｕｆｆｅｒを４μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓを５μｌ加え、よく懸濁し、４２℃で５分間反応させた。その後、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅを１μｌ加え４２℃で５０分間の逆転写反応を行い、７０℃で１５分酵素の失活処理を行い、氷上で１０分静置した。
【００４７】
６−２−２  ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡの取得
まず、ＰＢＳでよく血を洗い流した各組織から極少量の組織を切り取り、それをハサミで出来るだけ細かく切った。ＭａｇＥｘｔａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−を用いてｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを取得した。操作はプロトコールに従った。尚、ＭａｇＥｘｔａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−の溶解・吸着液を組織に加えた後、２２Ｇテルモ注射針（ＴＥＲＵＭＯ）及び１ｍｌツベルクリン用２６Ｇ注射針付テルモシリンジを用いて組織の塊を非常に細かくすることでｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡの収量を増加させた。ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ濃度はＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒで測定した。
【００４８】
６−２−３  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＨｙｂＰｒｏｂｅ（登録商標、Ｒｏｃｈｅ）を用いて、６−２−１、６−２−２で取得したｃＤＮＡ及びｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡそれぞれのｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。操作はプロトコールに準じた。使用したチップ、エッペンチューブ、希釈用のＭｉｌｌｉＱ水は２回オートクレーブにより滅菌し、一晩以上ＵＶ滅菌しておいた。ピペットマンはプラスミドを扱っていないｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ専用のものを用いた。尚、ｃＤＮＡの定量にはｔＴＡプライマー及びプローブのセット、ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡの定量にはパッケージングシグナルを検出可能なパッケージングシグナルプライマー及びプローブのセットを用いた。
【００４９】
・ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲの条件
Ｍｇ２＋濃度は４ｍＭ、アニーリング温度は５８℃のときＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒによる特異的かつ効果的な増幅が見られたため、この条件でｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。どちらのプローブを用いた時も下記の条件で行った。
９５℃、１０ｍｉｎ、２０℃／ｓ      １ｃｙｃｌｅ
（区分１）９５℃、１０ｓ、２０℃／ｓ（区分２）５８℃、１５ｓ、２０℃／ｓ（区分３）７２℃、５ｓ、２０℃／ｓ    ４５ｃｙｃｌｅ
４０℃、３０ｓ、２０℃／ｓ    １ｃｙｃｌｅ
【００５０】
・ｐｒｉｍｅｒ（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）
５’プライマー（配列表配列番号１７）
３’プライマー（配列表配列番号１８）
【００５１】
・ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）
３’ＦＩＴＣ    （配列表配列番号１９）５’ＬＣＲｅｄ６４０  （配列表配列番号２０）  
【００５２】
・ｐｒｉｍｅｒ（ｔＴＡ）５’プライマー  （配列表配列番号２１）３’プライマー  （配列表配列番号２２）  
【００５３】
・ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ（ｔＴＡ）３’ＦＩＴＣ    （配列表配列番号２３）５’ＬＣＲｅｄ６４０  （配列表配列番号２４）  
【００５４】
＜Ｓａｍｐｌｅｓ＞ＲＮＡ濃度を８００ｎｇに統一して逆転写反応を行って得られたｃＤＮＡはサンプルとして２μｌ用い、各組織から得られたｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡは全て１０ｎｇ／μｌに希釈してサンプルとして２μｌ用いた。＜Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ＆Ｓｔａｎｄａｒｄ＞１コピーのフルトランスジェニックニワトリの血餅から得られたｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡをスタンダード及びｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌとして用いるため６段階希釈してｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。＜Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ＞オートクレーブ及びＵＶ滅菌したＭｉｌｌｉＱ水とｗｉｌｄ  ｔｙｐｅの胚、又はｗｉｌｄ  ｔｙｐｅのニワトリの血餅から得られたｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを用いた。モザイク率計算各組織における導入遺伝子コピー数を統一化するため、組織ゲノムでのリアルタイムＰＣＲを行いモザイク率を計算することで組織毎のｍＲＮＡ発現量を補正した。  
【００５５】
６−２−５  共焦点顕微鏡による組織切片の観察６−１でホルモン誘導を行ったトランスジェニックニワトリの卵管部を３％ホルマリンで固定した後、カミソリで２０μｍの厚さにして、共焦点顕微鏡（オリンパス社製Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ１０００）での観察を行った。サンプルとしては、個体＃２１９、＃２２０を用いた。  
【００５６】
（実施例７）ＯＶＡプロモーターの更なる切り詰め
７−１  ｐＥＴ−ＯＶＡ△ＰｖｕＩＩの構築
実施例１によって得られた約２．３ｋｂｐのオボアルブミンプロモーター配列をさらに切り詰め、組織特異性を示しつつさらに短くするべく以下のベクターを構築した。実施例１−５で得られたｐＥＴ−ＯＶＡを制限酵素ＰｖｕＩＩ（ＴａＫａＲａ）で消化し、切断したベクターをセルフライゲーションした。このベクターを再度、制限酵素ＰｖｕＩＩで消化後、ｐＥＴ−ＯＶＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化して得られる２００ｂｐの断片をインサートとしてライゲーションした。このベクターをｐＥＴ−ＯＶＡ△ＰｖｕＩＩとした。
【００５７】
７−２  ｐＥＴ−ＯＶＡ△ＢｇｌＩＩＸｈｏＩの構築
実施例１−５で得られたｐＥＴ−ＯＶＡを制限酵素ＢｇｌＩＩ（ＴａＫａＲａ）と制限酵素ＸｈｏＩ（ＴａＫａＲａ）で消化した後、Ｋｌｅｎｏｗ（ＴａＫａＲａ）を用いてブラントエンドとした後セルフライゲーションした。このベクターをｐＥＴ−ＯＶＡ△ＢｇｌＩＩＸｈｏＩとした。
【００５８】
７−３  ｐＱｅＧＯＶＡ（ΔＰｖｕＩＩ）ＴＲＥｔＴＡＷおよびｐＱｅＧＯＶＡ（△ＢｇｌＩＩＸｈｏＩ）ＴＲＥｔＴＡＷの構築
実施例２と同様の手法により、上記７−１で得られたｐＥＴ−ＯＶＡ△ＰｖｕＩＩ、および上記７−２で得られたｐＥＴ−ＯＶＡ△ＢｇｌＩＩＸｈｏＩをウイルスベクター化した。このベクターをそれぞれｐＱｅＧＯＶＡ（ΔＰｖｕＩＩ）ＴＲＥｔＴＡＷ、ｐＱｅＧＯＶＡ（ΔＢｇｌＩＩＸｈｏＩ）ＴＲＥｔＴＡＷとした。
【００５９】
７−４  レトロウイルスの産生
実施例４と同様にｐＱｅＧＯＶＡ（ΔＰｖｕＩＩ）ＴＲＥｔＴＡＷおよびｐＱｅＧＯＶＡ（ΔＢｇｌＩＩＸｈｏＩ）ＴＲＥｔＴＡＷレトロウイルスベクターを産生させた。
【００６０】
７−５  トランスジェニックニワトリの作製
上記７−４で得られたレトロウイルスベクターを用いて実施例５と同様にトランスジェニックニワトリを作製した。
【００６１】
７−６  個体解析
実施例６と同様に、ホルモン処理した個体より卵管組織を摘出し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出およびｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲによりｔｅｔＲ／ｍｏｓａｉｃを算出した（図７）。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明で用いたオボアルブミンプロモーター領域の模式図を示す。図１ａは特開２００４／２３６６２６号公報の実施例に用いられたオボアルブミンプロモーター領域（３．８ｋｂｐ）である。図１ｂは本発明に用いた切り詰め型オボアルブミンプロモーター領域（２．３ｋｂｐ）である（実施例１）。
【図２】図１ｂのオボアルブミンプロモーター領域を組込んだ、実施例２で調製したレトロウイルスベクターの模式図を示す。オボアルブミンプロモーターによる卵管特異的な発現と、トランスアクチベーターによる転写増強効果の得られる自己活性型ベクター構造を示す。
【図３】実施例５及び実施例６記載のｐＱｅＧＯＶＡＴＲＥｔＴＡＷのレトロウイルスベクターにより作製された個体（＃２、＃２０５、＃２１、＃５）およびｐＱｅＧＴＲＥｔＴＡＷのレトロウイルスベクターにより作製された個体（＃４９）の各組織でのｔｅｔＲ／ｍｏｓａｉｃを示す。リアルタイムＰＣＲによりｔＴＡのｍＲＮＡの測定（ｔｅｔＲ配列の検出）を行い、同様にモザイク率（パッケージングシグナル領域の検出）を算出して補正した。なお、ＤＥＳ非投与個体（＃２）をコントロールとし、ＤＥＳによる卵管特異的発現ではないことを同様に確認している。
【図４】外来性の目的タンパク質としてＤｓＲｅｄを卵管特異的に発現させるためのベクター構造を示す。記載の２つのウイルスベクターを混合し、インジェクション実験に用いトランスジェニックニワトリを作製した。
【図５】ダブルインジェクションにより孵化した個体の組織切片を共焦点顕微鏡で確認し（実施例６）、目的であるＤｓＲｅｄの蛍光を卵管組織特異的に観察した（個体＃２１９）。対照実験として、ＤｓＲｅｄ単独でインジェクションした個体（個体＃２２０）の解析では、オボアルブミンプロモーターによる卵管特異的なｔＴＡ遺伝子が機能しないため、蛍光を観察することができなかった。以上より、使用したオボアルブミンプロモーターが卵管特異的にｔＴＡ遺伝子を発現し、それにより目的タンパク質であるＤｓＲｅｄを卵管特異的に発現させることを実証した。
【図６】個体＃２１９における発現の組織特異性をリアルタイムＰＣＲ法により測定した。
【図７】実施例７でのトランスジェニックニワトリ作製に用いたレトロウイルスベクターの模式図及びｔｅｔＲ／ｍｏｓａｉｃを示す。ＯＶＡは実施例１によって得られた約２．４ｋｂｐのオボアルブミンプロモーター配列である（配列表配列番号２）。ＯＶＡ（△ＰｖｕＩＩ）は実施例７−１で得られた約１．４ｋｂｐのオボアルブミンプロモーター配列である（配列表配列番号３）。ＯＶＡ（ΔＢｇｌＩＩＸｈｏＩ）は実施例７−２で得られた約１．０ｋｂｐのオボアルブミンプロモーター配列である。各オボアルブミンプロモーター配列を有するウイルスベクターにより作製されたトランスジェニックニワトリをＤＥＳ処理し、卵管組織を摘出し、ｔｅｔＲ／ｍｏｓａｉｃを算出した。ＯＶＡおよびＯＶＡ（△ＰｖｕＩＩ）のプロモーターで卵管細胞での発現が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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