(57)【要約】【課題】試料中のクレアチニンの新規な定量方法、およびそのためのシステムを提供すること。【解決手段】試料中のクレアチニンにクレアチニンと反応する酵素を反応させる工程、反応によって生じたイオンの濃度変化を累積型ＩＳＦＥＴセンサを用いて検出する工程、および検出されたイオン濃度変化に基づいて試料中のクレアチニンを定量する工程を包含することを特徴とする、クレアチニンの測定方法、ならびにそのためのシステム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を包含することを特徴とする、クレアチニンの測定方法：
（１）試料中のクレアチニンにクレアチニンと反応する酵素を反応させる工程；
（２）反応によって生じたイオンの濃度変化を累積型イオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）センサを用いて検出する工程、ここで累積型ＩＳＦＥＴセンサは、センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さとポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ電位リセット後に蓄積する電荷量を電位変化として計測するようにしたＩＳＦＥＴセンサである；および
（３）検出されたイオン濃度変化に基づいて試料中のクレアチニンを定量する工程。
【請求項２】
反応によって生じたイオンがアンモニウムイオンである、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
クレアチニンと反応する酵素が単一の酵素からなる、請求項１記載の測定方法。
【請求項４】
クレアチニンと反応する酵素がクレアチニンデイミナーゼ[ＥＣ３．５．４．２１]である、請求項３記載の測定方法。
【請求項５】
クレアチニンと反応する酵素が反応混合物中で遊離状態で存在する、請求項１記載の測定方法。
【請求項６】
０．１ｍｇ／ｄＬ以上の濃度で試料中に含有されるクレアチニンを測定することができる、請求項１記載の測定方法。
【請求項７】
アルカリ金属塩および／またはアルカリ土類金属塩の存在下で試料中のクレアチニンにクレアチニンと反応する酵素を反応させる、請求項１記載の測定方法。
【請求項８】
バッファー成分の存在下で試料中のクレアチニンにクレアチニンと反応する酵素を反応させ、バッファー成分の反応混合物中の濃度が０．５〜５ｍＭである、請求項１記載の測定方法。
【請求項９】
累積型ＩＳＦＥＴセンサのセンシング部の表面積が１ｍｍ２以下である、請求項１記載の測定方法。
【請求項１０】
試料中のクレアチニンにクレアチニンと反応する酵素を３０μＬ以下の容量の反応混合物中で反応させる、請求項１記載の測定方法。
【請求項１１】
少なくとも下記（ａ）および（ｂ）の要素が含まれる、試料中のクレアチニンを定量するシステム：
（ａ）累積型イオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）センサ、ここで累積型ＩＳＦＥＴセンサは、センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、電位リセット後に蓄積する電荷量を電位変化として計測するようにしたＩＳＦＥＴセンサである；および
（ｂ）クレアチニンと反応する酵素。
【請求項１２】
（ｂ）のクレアチニンと反応する酵素がクレアチニンデイミナーゼ[ＥＣ３．５．４．２１]である、請求項１１記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のクレアチニンの新規な定量方法、およびそのためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
血中および尿中のクレアチニンの定量は、腎臓疾患、特に腎機能障害の診断において利用されている。また、透析移行の指標としても利用されている。
【０００３】
従来、体液中のクレアチニンの定量法としては、アルカリピクリン酸で発色させる方法が広く用いられてきたが、分析機器中での試液の不安定さ、アルカリ性試薬であるがゆえの分析機器への悪影響、多糖類を測り込んでしまい正確性にかける、分析精密性に欠けるなどの欠点があった。これらを解決する方法として、酵素を用いた方法が近年広く用いられるようになった。具体的にはクレアチニンに特異的に作用する酵素（好適な例として、クレアチニナーゼ[ＥＣ３．５．２．１０]）、及びそこから過酸化水素を発生せしめる一連の追随酵素群（好適な例として、クレアチナーゼ[ＥＣ３．５．３．３]、サルコシンオキシダーゼ[ＥＣ１．５．３．１]、ペルオキシダーゼ[ＥＣ１．１１．１．７]）の作用により導き出される過酸化水素を、酸化縮合発色する色素群によって検出し、試料中のクレアチニンを定量しようとするものである。酵素を用いた方法は、アルカリピクリン酸法のように血中に多量に存在する糖類の影響を受けることなく特異性に優れ、その他の干渉物質の影響も受け難い、分析機器中で安定であるなどの利点がある。
【０００４】
そのため現在では、臨床検査の場での主流として、クレアチニナーゼ−クレアチナーゼ−サルコシンオキシダーゼ−ペルオキシダーゼの連続酵素反応系によるクレアチニンの測定方法が、日常的に実施されている（例えば、特許文献１〜５参照）。
【０００５】
しかしながら、この方法は使用する酵素数が多く、各々の酵素の測定目的物質に対する高い特異性が必要となる。いずれかの酵素が、目的物質以外の物質に反応してしまう、すなわち特異性が低い場合には、それらを測り込んでしまい、正誤差として現れることとなる。多数の酵素を使用する場合、いずれかの酵素が試料中の物質によって影響を受けると、反応系全体が左右されて正確な測定が行えない可能性がある。
【０００６】
また、酵素の最適な使用条件は個々の酵素によって異なるため、幾つもの酵素を同じ反応液中で反応させるには、それぞれの酵素の最適条件での使用をあきらめねばならない。
【０００７】
更に、幾つもの酵素を使用した方法では、試薬のコストダウンにも限界がある。
【０００８】
したがって、より少ない酵素種でクレアチニンを測定できることが望まれていた。そのような試みのひとつとして、別の酵素群を用いた方法も開発されている。これは、クレアチニンデイミナーゼ[ＥＣ３．５．４．２１]をクレアチニンに作用させ、生じたアンモニアをグルタミン酸脱水素酵素[ＥＣ１．４．１．２]に作用させることにより、アンモニア量に対応したニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型から酸化型への酵素的変換を、紫外部吸光の減少により測定する方法である。この測定方法では、２種類の酵素しか使用しないため、現在普及している酵素的測定方法よりも少ない酵素種でのクレアチニン測定が可能である（例えば、特許文献６、７参照）。
【０００９】
しかしながら、本方法は吸光の減少で測定しているため、本質的に低感度であるという大きな欠点がある。そのため、本方法は実用の場で全く普及していない。例えば、ヒト血清クレアチニンの正常値が約１ｍｇ／ｄＬであるのに対し、従来のクレアチニンデイミニナーゼを用いたクレアチニンの測定方法の検出感度は５０ｍｇ／ｄＬ程度と低かった（例えば、特許文献８、９参照）。
【００１０】
より少ない酵素種でクレアチニンを測定したいという要望に応えるため、クレアチニンを単一の酵素で測定できる方法、例えば、クレアチニンを酸化還元する酵素の研究開発なども試みられているはずであるが、今現在に至るまで、このような酵素や測定方法は開発されていないのが現状である。
【００１１】
現在では、医療分野や分析化学、食品工学などの分野において、酵素バイオセンサを用いた計測が盛んに実施されている。このようなバイオセンサは、例えば電気化学センサと酵素固定化膜とから構成され、サンプル溶液中に微量に含まれる生化学成分を測定するために用いられる（例えば、特許文献１０〜１５参照）。一例として、主に血糖値測定用である電流検出型の酵素センサは、グルコースセンサとして全世界的に普及し、広く利用されている。グルコースセンサには、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼといった酵素が用いられている。実際には、通常、酵素はセンサ用試験片上に担持されており、サンプルである血液を試験片上にのせ、サンプル中のグルコースが酵素と反応して生じる電流をセンサにて検出する。
【００１２】
電気化学センサとして電流検出型の酵素センサが一般的であるが、電流検出の代わりに電界効果トランジスタを用いて電位検出を行う場合がある。この目的にために、水素イオン濃度（ｐＨ）のセンサとなるイオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）を利用することが考えられる。ＩＳＦＥＴセンサは、ＩＳＦＥＴのゲート上のイオン感応膜（ＳｉＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、Ｔａ２０５など）に溶液が接すると、溶液中のイオン活量に応じて界面電位が発生するしくみを利用している。ＩＳＦＥＴのゲート絶縁膜上にイオンに感応するセンシング部を形成し、このセンシング部の表面の電位の変化に基づくチャネルの電位レベルの変化量を検出して、イオン濃度を検出することができる。用途のひとつとして、ＩＳＦＥＴはセンシング部にて水素イオンに感応し、ｐＨセンサになる。ゲート絶縁膜と試料間の界面電位の変化は、ｐＨ依存性の出力電圧として計測される。更に、ゲート部に種々の感応膜を着膜することにより、種々のポテンショメトリックセンサが作製できる。ＩＳＦＥＴを利用したバイオセンサは、集積回路の製造工程により製造されるので、小型化及び規格化が可能であり、大量生産が可能であるという利点があるため、その開発潜在力が期待されている。
【００１３】
しかしながら、ＩＳＦＥＴはｐＨの測定には利用されているものの、感度が低く、時間的に出力が不安定であり、イオン濃度を高精度に検出できないという問題があり、現在のところ、ＩＳＦＥＴを利用したバイオセンサは電流検出型のバイオセンサに比して全く普及していない。
【００１４】
ＩＳＦＥＴの欠点を克服するため、累積型ＩＳＦＥＴセンサが開発されている（特許文献１６）。累積型ＩＳＦＥＴセンサは、ＩＳＦＥＴのセンシング部の表面電位の変化に基づくセンシング部直下のポテンシャル井戸の深さの変化をドレインに電荷として転送することを繰り返し、ドレインに電荷が累積されるべく構成したことにより、センシング部の表面電位の変化が微量であっても確実に検出し、高感度にイオン濃度の変化を検出することができる。また、本技術の応用として、高感度に試料中の核酸と一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションの発生の有無を検出することができ、ＰＣＲ法によりＤＮＡを増量させることなく、簡便に、短時間に、低コストに塩基配列を決定することができるＦＥＴ型センサ及び塩基配列検出方法についても、既に発明されている（特許文献１７）。しかし、このような累積型ＩＳＦＥＴがクレアチニンなどを高感度に測定するための酵素バイオセンサに利用可能であるかどうかは不明である。
【００１５】
【特許文献１】特開平６−２１７８００号公報
【特許文献２】特開２００２−３０６１９７号公報
【特許文献３】特開平１０−２１５８７４号公報
【特許文献４】特開２０００−１５７２７９号公報
【特許文献５】特開平１１−３４６７７１号公報
【特許文献６】特開平１０−１３６９９７号公報
【特許文献７】特開平７−１４３８８１号公報
【特許文献８】特開平７−３２７６９５号公報
【特許文献９】特開平７−３２２８９８号公報
【特許文献１０】特開平１０−２９３１１２号公報
【特許文献１１】特開２００２−３５０３８３号公報
【特許文献１２】特開平８−３２７５８７号公報
【特許文献１３】特開２００４−２９４０８７号公報
【特許文献１４】特開平８−３１３４７８号公報
【特許文献１５】特開平８−２９３８９号公報
【特許文献１６】特許第３６２３７２８号公報
【特許文献１７】国際公開第０３／０４２６８３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、試料中のクレアチニンの新規な定量方法、およびそのためのシステムを提供することにある。より具体的には、クレアチニンを単一の酵素で測定できる方法、およびそのためのシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記目的を達成するために、鋭意検討した結果、累積型のイオン感応性電界効果トランジスタ（Ion Sensitive Field Effect Transistor：ＩＳＦＥＴ）を利用したセンサ・システムにより、イオン濃度変化として効率よく酵素反応を追跡できることを見出した。また、酵素としてクレアチニンデイミナーゼを使用することにより、試料中のクレアチニンとの反応で生じたイオンの濃度変化を累積型ＩＳＦＥＴセンサにて検出することで、試料中のクレアチニンを定量することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［１］以下の工程を包含することを特徴とする、クレアチニンの測定方法：
（１）試料中のクレアチニンにクレアチニンと反応する酵素を反応させる工程；
（２）反応によって生じたイオンの濃度変化を累積型イオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）センサを用いて検出する工程、ここで累積型ＩＳＦＥＴセンサは、センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さとポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ電位リセット後に蓄積する電荷量を電位変化として計測するようにしたＩＳＦＥＴセンサである；および
（３）検出されたイオン濃度変化に基づいて試料中のクレアチニンを定量する工程。
［２］反応によって生じたイオンがアンモニウムイオンである、［１］の測定方法。
［３］クレアチニンと反応する酵素が単一の酵素からなる、［１］の測定方法。
［４］クレアチニンと反応する酵素がクレアチニンデイミナーゼ[ＥＣ３．５．４．２１]である、［３］の測定方法。
［５］クレアチニンと反応する酵素が反応混合物中で遊離状態で存在する、［１］の測定方法。
［６］０．１ｍｇ／ｄＬの濃度で試料中に含有されるクレアチニンを測定することができる、［１］の測定方法。
［７］アルカリ金属塩および／またはアルカリ土類金属塩の存在下で試料中のクレアチニンにクレアチニンと反応する酵素を反応させる、［１］の測定方法。
［８］バッファー成分の存在下で試料中のクレアチニンにクレアチニンと反応する酵素を反応させ、バッファー成分の反応混合物中の濃度が０．５〜５ｍＭである、［１］の測定方法。
［９］累積型ＩＳＦＥＴセンサのセンシング部の表面積が１ｍｍ２以下である、［１］の測定方法。
［１０］試料中のクレアチニンにクレアチニンと反応する酵素を３０μＬ以下の容量の反応混合物中で反応させる、［１］の測定方法。
［１１］少なくとも下記（ａ）および（ｂ）の要素が含まれる、試料中のクレアチニンを定量するシステム：
（ａ）累積型イオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）センサ、ここで累積型ＩＳＦＥＴセンサは、センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、電位リセット後に蓄積する電荷量を電位変化として計測するようにしたＩＳＦＥＴセンサである；および
（ｂ）クレアチニンと反応する酵素。
［１２］（ｂ）のクレアチニンと反応する酵素がクレアチニンデイミナーゼ[ＥＣ３．５．４．２１]である、［１１］のシステム。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、試料中のクレアチニンを単一の酵素のみで定量することが可能となる。また、極めて簡単な構成で、試料中のクレアチニンを測定するシステムを構築することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明は、以下の工程を包含することを特徴とする、クレアチニンの測定方法を提供する：
（１）試料中のクレアチニンにクレアチニンと反応する酵素を反応させる工程；
（２）反応によって生じたイオンの濃度変化を累積型イオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）センサを用いて検出する工程、ここで累積型ＩＳＦＥＴセンサは、センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さとポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ電位リセット後に蓄積する電荷量を電位変化として計測するようにしたＩＳＦＥＴセンサである；および
（３）検出されたイオン濃度変化に基づいて試料中のクレアチニンを定量する工程。
【００２２】
クレアチニンはメチルグリコシアミジンとも称する物質であり、クレアチンの脱水、環化によって生成する。ヒト血清クレアチニンの正常値は約１ｍｇ／ｄＬであるが、腎臓疾患によってその値は上昇する。
【００２３】
本発明の方法において、クレアチニン測定に供される試料としては特に限定されない。生体試料の例としては、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、尿、便、糞、リンパ液、精液、涙液、および各種臓器などの哺乳類（ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、特にヒト）、鳥類（ニワトリ、アヒル、ウズラ、七面鳥、カモ、キジなど）、無脊椎動物（昆虫；カイコ、ハチ、アリ、クワガタ、カブトムシなど、甲殻類；エビ、カニなど）、植物（桑、小豆、ソラマメ、トマト、ナス、キュウリ、メロン、タバコ、菊、ユリ、バラなど）、微生物（細菌、酵母、カビなど）などの生体由来の試料が挙げられる。また、環境由来の試料としては、食品、河川、土壌なども例示される。
【００２４】
試料は、超音波処理、界面活性剤処理などにより破砕後に測定に供してもよい。このようにすることで、測定感度を向上させることが可能な場合がある。
【００２５】
本発明において、測定するイオンとしては、直接あるいは間接的に水素イオン濃度の変化をもたらすものであれば、特に限定されない。そのようなイオンとしては、水素イオン、アンモニウムイオン、リン酸イオンなどが挙げられる。本発明の好適な測定対象としては、アンモニウムイオンが挙げられる。
【００２６】
本発明にはクレアチニンと反応して上記のようなイオンの濃度変化を生じる任意の酵素を使用することができる。クレアチニンと反応する酵素は、クレアチニンと反応してイオンの濃度変化を生じるのであれば単一の酵素であってもよく、または複数の酵素の組み合わせ（酵素群）であってもよい。そのような酵素（酵素群）としては、クレアチニナーゼ−クレアチナーゼ−サルコシンオキシダーゼ酵素群、クレアチニナーゼ−クレアチンキナーゼ[ＥＣ２．７．３．２]酵素群などが挙げられる。１つの実施態様において、本発明は、試料中のクレアチニンを単一の酵素の使用のみでも正確に定量することができることを特徴とするものである。したがって、本発明の利点を活かすためには、クレアチニンデイミナーゼをクレアチニンに反応させることが好適である。クレアチニンデイミナーゼを使用することにより、本発明の方法にて、生じたイオンの濃度変化を検出し、クレアチニンを定量することが可能となる。
【００２７】
クレアチニンデイミナーゼは、クレアチニンをＮ−メチルヒダントインとアンモニアへ加水分解する反応を触媒する酵素である。クレアチニンデイミナーゼの供給源としては、バチルス属細菌（特開昭６１−２１９３８３号公報）、コリネバクテリウム属細菌（特開昭５２−３４９７６号公報）、フラボバクテリウム属細菌（The Journal of Biological Chemistry Vol.260 No.7 p3915-3922, 1985)などが知られている。本発明に用いるクレアチニンデイミナーゼは、その由来等何ら限定されない。
【００２８】
本発明において、酵素や酵素を含む組成物の形態は、特に限定されない。液状であってもよいし、固形状態であって、試料と混合することにより水分を供給されるものであってもよい。適当な容器に入れられたり、適当なデバイスに搭載されて、例えば、分子生物学用途の分析用試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工した体外診断薬、バイオセンサ、医薬品、食品および飲料など、種々の形態をとることができる。
【００２９】
本発明において酵素は膜などの担体に固定化されていてもよく、遊離状態で存在してもよい。一般に、従来の電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）を利用したバイオセンサは、センシング部の膜に、酵素を直接あるいは間接的に固定化、担持させて使用する。膜に固定化した酵素と固定化していない酵素では、ｐＨ特性が異なる可能性がある。これは、固定化することによって酵素の立体構造が変化し特性が変化することも原因の１つであるが、他に以下の２点が考えられる。第１に、酵素固定化膜によってｐＨの勾配が生じ、溶液中のｐＨと酵素固定化膜中のｐＨに差が生じることと、第２に、酵素反応などによって生成する酸により酵素近傍のｐＨが変化することである。従って、このような場合は、酵素が遊離状態で存在することが好ましい。また、試料をクレアチニン以外の物質の測定に供する多項目同時測定の場合は、酵素が遊離状態で存在することが有利である。
【００３０】
本発明において、試料−酵素反応混合物中で用いる酵素の濃度は特に限定されないが、好ましくは試料と混合後の終濃度が０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬとなる様に含有させると良い。さらに好ましくは、終濃度０．０１〜１ｍｇ／ｍＬとなる様に含有させると良い。
【００３１】
本発明は高感度なクレアチニンの測定方法である。本発明の測定方法によれば、例えば１ｍｇ／ｄＬ以上、好ましくは０．５ｍｇ／ｄＬ以上、より好ましくは０．２５ｍｇ／ｄＬ以上、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｄＬ以上、かつ例えば２ｍｇ／ｄＬ以下、好ましくは５ｍｇ／ｄＬ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｄＬ以下、さらに好ましくは２０ｍｇ／ｄＬ以下の濃度で試料中に含有されるクレアチニンを測定することができる。
【００３２】
アルカリ金属塩および／またはアルカリ土類金属塩の存在下で試料中のクレアチニンにクレアチニンと反応する酵素を反応させてもよい。例えば、アルカリ金属塩として塩化ナトリウムを使用することができる。これらの金属塩は、検出シグナルを安定化することが期待され、また、予想外の効果としてシグナルを増加する効果が見られた（実施例参照）。用いるアルカリ金属塩および／またはアルカリ土類金属塩の添加濃度は、特に限定されない。例えば、１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは１０〜２００ｍＭ、より好ましくは５０〜１００ｍＭの範囲で、効果が期待される。本発明の実施例では、５０〜１００ｍＭの塩化ナトリウムが添加され、劇的なシグナルの増加効果が見られた。
【００３３】
本発明において、試料−酵素反応混合物中には、溶液のｐＨ緩衝作用、タンパク質の安定化などの目的で、さらに他の物質を混合しても良い。１つの実施対応において、バッファー成分の存在下で試料中のクレアチニンにクレアチニンと反応する酵素を反応させてもよい。例えば、バッファー成分としてはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳなどのＧｏｏｄ緩衝液などが挙げられる。バッファー成分の反応混合物中の濃度には特に限定はないが、濃度が高すぎるとイオン濃度が変化しにくく、低すぎると変化が過剰になるので、高い検出感度が達成されるように適切な濃度を選択する。バッファー成分の濃度は例えば０．１〜２０ｍＭ、好ましくは０．２〜１０ｍＭ、より好ましくは０．５〜５ｍＭである。また、エタノールやメタノール、プロパノールなどのアルコール類などを添加しても良い。
【００３４】
本発明において、試料−酵素反応混合物中には、必要に応じてその他の添加剤を含有してもよい。添加剤としては界面活性剤、安定化剤、防腐剤、キレート剤、活性化剤などがあげられる。これらについても何ら限定されるものではないが、具体的には以下のようなものが例示される。界面活性剤としては、ノニオン・アニオン・カチオンいずれでも良い。例えば、ノニオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類（商品名トリトンＸ−１００など）・ポリオキシエチレンアルキルエーテル類など、アニオン界面活性剤としては、アルキルベンゼンスルホン酸塩・直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩など、カチオン界面活性剤としては、テトラアルキルアンモニウム塩などがそれぞれ挙げられる。安定化剤としては、シュークロース・トレハロース・サイクロデキストリンなどの糖類およびその誘導体、アルギニン・リジン・ヒスチジン・グルタミン酸などのアミノ酸類、アルブミンなどの蛋白質、アルカリ金属・アルカリ土類金属などの塩類、アンモニアイオン、グルコン酸などが挙げられる。防腐剤としては、抗生物質、アジ化化合物、その他防菌剤・防かび剤等が挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。活性化剤としては、アルカリ金属・アルカリ土類金属等が挙げられる。
【００３５】
本発明の方法では、クレアチニンの定量手段として、エンドポイント法（一定時間における試料中のクレアチニンに由来するシグナルの増加を計測）、カイネティック法（試料中のクレアチニンに由来する酵素の初速度をシグナルの時間変化で計測）のどちらを採用しても構わない。好適には、エンドポイント法が採用される。
【００３６】
本発明において、試料−酵素反応混合物が累積型ＩＳＦＥＴセンサのセンシング部に直接あるいは間接的に接触することになる。最適な試料−酵素反応混合物の容量は、システムの構成、特にセンシング部の面積に依存することになるが、０．１〜５００μＬが好ましい。更には、０．１〜３０μＬが好適な範囲として挙げられる。
【００３７】
本発明では、累積型ＩＳＦＥＴセンサを使用する。累積型ＩＳＦＥＴセンサは、従来のＩＳＦＥＴの欠点を克服するため、ＩＳＦＥＴのセンシング部の表面電位の変化に基づくセンシング部直下のポテンシャル井戸の深さの変化をドレインに電荷として転送することを繰り返し、ドレインに電荷が累積されるべく構成したことにより、センシング部の表面電位の変化が微量であっても確実に検出し、高感度にイオン濃度の変化を検出することができる。
【００３８】
本発明に使用する累積型ＩＳＦＥＴセンサの形態としては、Ｐ型又はＮ型半導体基板の表面側に所定の間隔を置いて形成された、基板と逆型の拡散領域からなる入力ダイオード部及び浮遊拡散部と、前記入力ダイオード部から浮遊拡散部までの間に形成されるべき導通チャネルの始端及び終端にそれぞれ対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定された入力ゲート及び出力ゲートと、前記チャネルの中間部に対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されたイオン感応膜からなるセンシング部と、前記浮遊拡散部の、前記チャネルから離れた側に連なる前記基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されたリセットゲートと、前記リセットゲートにおける前記浮遊拡散部から離れた側の前記基板表面部に形成された、基板と逆型の拡散領域からなるリセットダイオード部とを備え、前記センシング部に、酵素または酵素を含む組成物および試料を添加混合し、その結果、前記センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、電位リセット後の前記浮遊拡散部が蓄積する電荷量を、電位変化として検出するようにしたＦＥＴ型センサを構成したものである。
【００３９】
以下、本発明に係る実施形態について図面を参照して説明する。
【００４０】
図１（Ａ）は本発明に一実施形態に係るバイオセンサ素子であるＦＥＴ型センサ素子２０Ａの構成を示す縦断面図であり、図１（Ｂ）は図１（Ａ）のＦＥＴ型センサ素子２０Ａのエネルギー準位を示す模式図である。また、図２は図１（Ａ）のＦＥＴ型センサ素子２０Ａのセンサ出力信号を測定するためのバイオセンサ測定装置３０の構成を示すブロック図である。さらに、図３は図２のバイオセンサ測定装置３０により図１（Ａ）のＦＥＴ型センサ素子２０Ａの出力特性を測定するときの動作タイミングチャートである。またさらに、図４は図１（Ａ）のＦＥＴ型センサ素子２０Ａの動作を示す図であって、ポテンシャル状態及び蓄積電荷の推移を示す、図１（Ｂ）と同様のエネルギー準位を示す模式図である。
【００４１】
図１（Ａ）において、典型的にはシリコンにてなるｐ−型の半導体基板１の表側には互いに所定間隔をおいてｎ＋型拡散層からなる電荷供給部としての入力ダイオード２及び浮遊拡散部３が形成され、さらに浮遊拡散部３から小間隔をおいてリセットダイオード４が形成される。半導体基板１上には、この場合、ｎ＋型拡散層上も含めＳｉＯ２又はＳｉ３Ｎ４からなる絶縁膜５が形成される。入力ダイオード２及び浮遊拡散部３間における半導体基板１表面部には、次に述べるゲート構造との関連において導通チャネル（ｎ型反転層）が形成され、その結果、入力ダイオード２をソースとし、浮遊拡散部３をドレインとするＦＥＴ型センサ２０が構成される。絶縁膜５上には、チャネル始端部に対応する入力ダイオード２の隣接位置において入力ゲート６が、またチャネル終端部に対応する浮遊拡散部３の隣接位置において出力ゲート７が、それぞれポリシリコン、又はアルミニウムからなる蒸着層より形成され、さらに浮遊拡散部３とリセットダイオード４との間においてリセットゲート８が同様の蒸着層より形成される。入力ゲート６、出力ゲート７及びリセットゲート８の上面と、これらのゲートを支持したゲート外の絶縁膜５上には、典型的にはＳｉ３Ｎ４蒸着層からなる被着膜１０が形成される。Ｓｉ３Ｎ４膜はＳｉＯ２膜に比べて構造が緻密で、酸素の拡散係数が小さいため、それ自身が入力ゲート６と出力ゲート７間に形成する凹部をセンシング部９として、良好なイオン感応膜を構成する。イオン感応膜としてはＳｉ３Ｎ４の他、ＳｉＯ２やＡｕ、Ｔａ２０５等も用いることができる。当該センシング部９のイオン感応膜には、試料中の検体と反応若しくは結合し、又は検体反応の触媒となる酵素、抗体、微生物及び核酸等の物質が固定化されてもよいが、これらは遊離状態で存在してもよい（図示せず）。
【００４２】
なお、半導体基板１の表面において、入力ダイオード２及びリセットダイオード４の外側には、絶縁膜５と同様なシリコン酸化膜等からなる比較的厚いマスク層１１が形成され、前述したセンシング部９を形成する蒸着膜である被着膜１０は、当該マスグ層１１にも被さり、さらに被着膜１０上にはセンシング部９を除き、例えば、リンガラスからなる保護膜１２と、当該保護膜１２上において外表面を面一にした外装膜１３が被着形成される。図１（Ａ）の左側より、入力ダイオード２、入力ゲート電極６及び出力ゲート電極７、浮遊拡散部３、リセットゲート８及びリセットダイオード４の上面には、各々アルミニウム等からなる電極リードが形成され、それらの電極リードを介して測定シーケンスに従った電圧が印加され、又は浮遊拡散部３の電位が検出される。浮遊拡散部３は電極リード端子の出力電圧Ｖｏｕｔ（本明細書では、当該出力信号電圧をシグナルともいう。）を、ソースフォロワ増幅器を含むバイオセンサ測定装置３０に接続される。
【００４３】
本実施形態において、ＦＥＴ型センサ素子２０Ａは、Ｐ−型半導体基板１の表面側に所定の間隔をおいて形成された、半導体基板１と逆型であるＮ＋型の拡散領域からなる入力ダイオード部２及び浮遊拡散部３と、リセットダイオード４とを有し、浮遊拡散部３とリセットダイオード４との間の絶縁膜５上には同じくリセットゲート８を有することにより、浮遊拡散部３のためのリセットトランジスタを構成したものである。まず、入力ゲート６、及び出力ゲート７は入力ダイオード部２から浮遊拡散部３までの間に形成されるべき導通チャネルの中間部、及び終端部にそれぞれ対応した絶縁膜９上に固定され、両ゲート６及び７を隣接させるため、比較的細幅で高さを持たせた出力ゲート７が、比較的広幅の入力ゲート６の当該隣接側を覆う被着膜１０によって、当該入力ゲート６と絶縁された構造となっている。出力ゲート７は底面が半導体基板１上の絶縁膜に接するとともに、その上方部が被着膜１０及び保護膜１２を貫通し、上端が外装膜１３内に位置する高さを有している。
【００４４】
このように形成された入力ダイオード２と、入力ゲート６との間の基板表面上の位置、すなわち形成されるべき反転チャネルの入力端に対応した位置には、底面をなす絶縁膜５とともにイオン感応膜となる入力ゲート６側の絶縁膜５と、入力ダイオード２側の被着膜１０及び保護膜１２の断層とに挟まれて凹部をなすセンシング部９が形成される。
【００４５】
次いで、図２を参照して、バイオセンサ測定装置３０の構成及び動作について以下説明する。図２において、ＦＥＴ型センサ素子２０Ａには、直流電圧源２１から直流電圧＋Ｖｄｄがリセットダイオード４に印加される。また、コントローラ４０は詳細後述するタイミングチャートで変化し所定のパルス幅や周期などを有する所定の各電圧Ｖｉｎ，Ｖｇｉｎ，Ｖｓｅｎ，Ｖｇｏｕｔ，Ｖｇｒを各Ｄ／Ａ変換器３４乃至３８を介してＦＥＴ型センサ素子２０Ａに印加する。ＦＥＴ型センサ素子２０Ａから出力されるセンサ出力電圧Ｖｏｕｔは、ソースフォロワ増幅器３１を介してＡ／Ｄ変換器３２に入力された後、コントローラ４０によりクロック周波数やタイミングが制御されるクロック発生器３３からのサンプリングクロックを用いてＡ／Ｄ変換される。Ａ／Ｄ変換後のデジタルデータはコントローラ４０に入力された後、ＲＡＭ４２に格納される。
【００４６】
コントローラ４０には、コントローラ４０の動作プログラムやそれを実行するために必要なデータを格納するＲＯＭ４１と、デジタルデータを格納するＲＡＭ４２と、デジタルデータをフレキシブルディスクに保存するためのフレキシブルディスクドライブ４３とが接続されている。また、コントローラ４０には、キーボードインターフェース４４を介して操作者が指示コマンドや測定条件などの指示データを入力するためのキーボード４５が接続されるとともに、ディスプレイインターフェース４６を介して、指示データや測定結果を表示するための液晶ディスプレイ４７が接続される。本実施形態では、コントローラ３０は、測定されたデジタルデータに基づいて測定波形の比較表示、グラフ表示、テーブル表示などを液晶ディスプレイ４７に表示する各種表示機能を有する。
【００４７】
さらに、図１（Ａ）のＦＥＴ型センサ素子２０Ａ及びバイオセンサ測定装置３０を用いて、イオン濃度を検出する方法について、図３及び図４を参照して以下に説明する。
【００４８】
まず、センシング部９内の水溶液に例えば２Ｖの電圧Ｖｇｉｎを印加しセンシング部５の直下の半導体基板１の表面の電位を一定にする。これがポテンシャル井戸入り口の初期設定値となる。次に、図３に示すように、入力ゲート６に適当な直流電圧Ｖｓｅｎ（例えば、２．０Ｖ）を印加し、その直下の半導体基板１の表面電位を固定するとともに、電荷供給部としての入力ダイオード２に逆バイアス電圧Ｖｉｎ＝５Ｖを、また、リセットゲート８に所定のパルス幅のリセット電圧Ｖｇｒを印加し、浮遊拡散部３の電位の初期値を設定する。このとき、出力ゲート７の電圧Ｖｇｏｕｔはゼロボルトである。
【００４９】
入力ダイオード２の電圧Ｖｉｎ＝５Ｖは十分な逆バイアスとして、当該入力ゲート内に残留する電荷を図１（Ｂ）に示すようにごく僅かに抑え、当該電荷プールの上端は、センシング部９のレベルに届かず、センシング部９以降（図１（Ｂ）のセンシング部９の右側）には侵入しない。この場合、水溶液中のマイナスイオン濃度が高くなった場合、センシング部９の表面電位が変化し、当該センシング部９直下の半導体基板１の表面の電位は前記初期設定値ｂ０よりさらに上がり、逆に、マイナスイオン濃度が低くなった場合、又はプラスイオンが高くなった場合には、表面電位はｂ０より下がる。
【００５０】
入力ダイオード２に印加する電圧Ｖｉｎが５Ｖから１．０Ｖに下がると、逆バイアスが緩和された分、電荷プール量が多くなり、そのレベルは、この場合センシング部９直下の基板表面電位ｂ０（ポテンシャル井戸入ロレベル）を越え、当該入力ダイオード２からの電荷が入力ゲート６直下のポテンシャル井戸に供給される（図４（Ａ）参照。）。
【００５１】
再度、入力ダイオード２に印加する電圧Ｖｉｎが５Ｖに上がると、センシング部９直下の表面電位のレベルで電荷がすりきられ、当該レベル下におけるポテンシャル井戸の容量分だけ電荷が残存、それ以外の電荷は入力ダイオード２を経て、当該ダイオード２に残留する分を残し直流電圧源２１に還流する（図４（Ｂ）参照。）。この場合も、ポテンシャル井戸に残留した電荷の量はマイナスイオン濃度によって変化し、センシング部９の表面電位の変化量がこの電荷の量に変換される。
【００５２】
次に、出力ゲート７に電圧Ｖｇｏｕｔが５Ｖ印加されると、当該出力ゲート７が開いて、電荷が予めリセット電位に維持された浮遊拡散部３に転送される（図４（Ｃ）参照。）。この電荷の転送後、出力ゲート７に印加する電圧Ｖｇｏｕｔが０Ｖに下がり、出力ゲート７が閉じられる（図４（Ｄ）参照。）。さらに、浮遊拡散部３は電位が読み取られた後は、リセットゲート８にリセットゲート電圧Ｖｇｒを印加し、当該浮遊拡散部３の電荷を、電源電圧＋Ｖｄｄの直流電圧源２１に接続されたリセットダイオード４に導き、さらに直流電圧源２１に吸収せしめて、初期出力電圧Ｖｏｕｔを再設定する。
【００５３】
以上説明したように、図４（Ｂ）から図４（Ｄ）に示したプロセスを繰り返し行うことにより、センシング部９の表面電位の変化量が浮遊拡散部３の電荷量として累積される。そして、浮遊拡散部３に蓄積された電位変化量は出力電圧Ｖｏｕｔとして、図２のバイオセンサ測定装置３０に入力された後、表示されかつ記録その他の処理に用いられる。
【００５４】
本発明において、累積型ＩＳＦＥＴセンサのセンシング部の表面積は、センサを小型化し至便性を高めるためにはより小さい方が好ましく、試料−酵素反応混合物の容量を高め、シグナルのレベルを上げるためにはより大きい方が好ましい。したがって、その使用目的、対象試料種などに応じて、センシング部の表面積を至適化すればよい。一般的に、センシング部の表面積は、５ｍｍ２以下が好ましく、１ｍｍ２以下がより好ましく、０．０００１ｍｍ２以上が好ましく、０．００５ｍｍ２以上がより好ましい。
【００５５】
本発明は、少なくとも下記（ａ）および（ｂ）の要素が含まれる、試料中のクレアチニンを定量するシステムを提供する：
（ａ）累積型イオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）センサ、ここで累積型ＩＳＦＥＴセンサは、センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、電位リセット後に蓄積する電荷量を電位変化として計測するようにしたＩＳＦＥＴセンサである；および
（ｂ）クレアチニンと反応する酵素。
【００５６】
本発明のシステムは上記の本発明のクレアチニンの測定方法に使用することができる。従って、本発明のクレアチニンの測定方法について上記した各事項を本発明のシステムに適用することができる。例えば、（ｂ）のクレアチニンと反応する酵素としてクレアチニンデイミナーゼ[ＥＣ３．５．４．２１]を使用することができる。
【００５７】
累積型ＩＳＦＥＴをセンサ素子として用いるバイオセンサ測定機によって、クレアチンおよびクレアチンと反応する酵素の反応によって生じるイオン濃度変化を測定することができる。図３に例示的なバイオセンサ測定機のブロック図を示す。図３において、測定機部分を点線で示す。測定機の構成は以下のとおりである。２：センサ（１）からの信号を増幅する；３：アナログ信号をデジタル信号に変換する；４：デジタル信号を記憶する；５：デジタル信号をグラフや表に表示する；６：比較のため過去のデータと重ねて表示する；７：必要に応じて表示データを取り出す；８：素子や回路に電源を供給する；９：３での信号を受けて測定のタイミングをフィードバックする；１０：センサ電圧を付加する；１１：パルス幅や電圧などの測定条件を設定する；１２：累積測定の指令を行う；１３：測定データを保存する；１４：測定データを印刷する。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００５９】
[試薬組成物の調製]
下記試薬組成物を調製した。
１ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１．３９Ｕ／ｍＬ  クレアチニンデイミナーゼ
（東洋紡績製：ＣＮＩ−３１１、０．１ｍｇ／ｍＬ）
０〜１００ｍＭ  塩化ナトリウム
【００６０】
[測定試料の調製]
下記試料溶液を調製した。
１ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
０〜１０ｍｇ／ｄＬ  クレアチニン（東京化成）
【００６１】
[対照用試薬の調製]
下記試薬を調製した。
１ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
【００６２】
[使用装置]
累積型ＩＳＦＥＴセンサ（ＡＭＩＳセンサー、バイオエックス社製）を利用した測定装置（バイオセンサ開発用測定装置、バイオエックス社製）を用いた。装置構成は、先行技術（特許文献１７）に基づいた構成であり、図２にそのブロック図を示した。
ＩＳＦＥＴのゲート上のイオン感応膜は、五酸化タンタルを使用した。センシング部の表面積は、０．０５ｍｍ２とした。
【００６３】
［測定条件］
以下の測定条件にて、試料中のクレアチニン量を測定した。
センサのセンシング部Ａに、試薬組成物を１８μＬ添加し、センシング部Ｂ（対照用）にクレアチンデイミナーゼを含まない対照用試薬を１８μＬ添加した。３７℃で５分間の予備加温を実施し、温度を安定化した後、５０秒間シグナルを計測し、センサの状態を確認した。そして、センシング部ＡおよびＢの試薬に、クレアチニン濃度を０〜１０ｍｇ／ｄＬに調製した測定試料を各２μＬ添加、混合し、シグナルが安定した後（１〜２分後）３７℃にてシグナル（対照用のセンシング部Ｂからのシグナルと比較してのシグナルの増加）を５秒毎に４〜５分間計測した。累積型ＩＳＦＥＴセンサの累積回数は、１０回で設定した。
【００６４】
［実施例１］
塩化ナトリウムを含まない試薬にて、クレアチニン濃度５ｍｇ／ｄＬ、１ｍｇ／ｄＬ、０ｍｇ／ｄＬの各測定試料について計測を実施し、各々のシグナル増加のタイムコースを測定した。結果を図５に示す。試薬中のクレアチニンデイミナーゼが試料中のクレアチニンと反応することにより、イオン濃度が増加し、クレアチニン濃度に応じたシグナル増加が見られ、良好に測定されることがわかる。
【００６５】
［実施例２］
実施例１と同様の方法にて、クレアチニン濃度０、１、２、３、４、５、６、７、８、１０ｍｇ／ｄＬの各測定試料について計測を実施し、各々のシグナル増加を２４５秒間測定した。２４５秒での計測データより、クレアチニン濃度と計測値の直線性をみた。結果を図６に示す。クレアチニン濃度と計測値との間に、非常に良好な相関が見られ、本発明の方法にてクレアチニン量が良好に測定されることがわかる。
【００６６】
［実施例３］
１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む液状試薬にて、クレアチニン濃度０．５ｍｇ／ｄＬ、０．２５ｍｇ／ｄＬ、０ｍｇ／ｄＬの各測定試料について計測を実施し、各々のシグナル増加のタイムコースを測定した。結果を図７に示す。試薬中のクレアチニンデイミナーゼが試料中のクレアチニンと反応することにより、イオン濃度が増加し、クレアチニン濃度に応じたシグナル増加が見られ、良好に測定されることがわかる。
【００６７】
［実施例４］
実施例３と同様の方法にて、クレアチニン濃度０、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２ｍｇ／ｄＬの各測定試料について計測を実施し、各々のシグナル増加を２４５秒間測定した。２４５秒での計測データより、クレアチニン濃度と計測値の直線性をみた。結果を図８に示す。クレアチニン濃度と計測値との間に、良好な相関が見られ、本発明の方法にてクレアチニン量が良好に測定されることがわかる。
【００６８】
［実施例５］
５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む液状試薬にて、クレアチニン濃度０．５ｍｇ／ｄＬ、０．２５ｍｇ／ｄＬ、０．１ｍｇ／ｄＬ、０ｍｇ／ｄＬの各測定試料について計測を実施し、各々のシグナル増加のタイムコースを測定した。結果を図９に示す。試薬中のクレアチニンデイミナーゼが試料中のクレアチニンと反応することにより、イオン濃度が増加し、クレアチニン濃度に応じたシグナル増加が見られ、良好に測定されることがわかる。
【００６９】
［実施例６］
実施例５と同様の方法にて、クレアチニン濃度０、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１ｍｇ／ｄＬの各測定試料について計測を実施し、各々のシグナル増加を２４５秒間測定した。２４５秒での計測データより、クレアチニン濃度と計測値の直線性をみた。結果を図１０に示す。クレアチニン濃度と計測値との間に、非常に良好な相関が見られ、本発明の方法にてクレアチニン量が良好に測定されることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
上述したように、本発明により、従来からの方法、システムと対比して、試料中のクレアチニンの新規な定量方法、およびそのためのシステムを提供することが達成された。特に、クレアチニンを単一の酵素で測定できる方法、およびそのためのシステムを提供することが達成された。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】（Ａ）は本発明に一実施形態に係るＦＥＴ型センサ２０の構成を示す縦断面図であり、（Ｂ）は図１（Ａ）のＦＥＴ型センサ２０のエネルギー準位を示す模式図である。
【図２】図１（ａ）のＦＥＴ型センサ２０のセンサ出力信号を測定するためのバイオセンサ測定装置３０の構成を示すブロック図である。
【図３】図２のバイオセンサ測定装置３０により図１（Ａ）のＦＥＴ型センサ２０の出力特性を測定するときの動作タイミングチャートである。
【図４】図１（Ａ）のＦＥＴ型センサ２０の動作を示す図であって、ポテンシャル状態及び蓄積電荷の推移を示す、図１（Ｂ）と同様のエネルギー準位を示す模式図である。
【図５】本発明の方法（実施例１）における、試料中クレアチニン測定のタイムコースを示す。
【図６】本発明の方法（実施例２）における、クレアチニン希釈直線性を示す。
【図７】本発明の方法（実施例３）における、試料中クレアチニン測定のタイムコースを示す。
【図８】本発明の方法（実施例４）における、クレアチニン希釈直線性を示す。
【図９】本発明の方法（実施例５）における、試料中クレアチニン測定のタイムコースを示す。
【図１０】本発明の方法（実施例６）における、クレアチニン希釈直線性を示す。
【符号の説明】
【００７２】
１…半導体基板、
２…入力ダイオード、
３…浮遊拡散部、
４…リセットダイオード、
５…絶縁膜、
６…入力ゲート、
７…出力ゲート、
８…リセットゲート、
９…センシング部、
１０…被着膜
１１…マスク層、
１２…保護膜、
１３…外装膜、
２０…ＦＥＴ型センサ、
２０Ａ…ＦＥＴ型センサ素子、
２１…直流電圧源、
３０…バイオセンサ測定装置、
３１…ソースフォロワ増幅器、
３２…Ａ／Ｄ変換器、
３３…クロック発生器、
３４乃至３８…Ｄ／Ａ変換器、
４０…コントローラ、
４１…ＲＯＭ、
４２…ＲＡＭ、
４３…フレキシブルディスクドライブ、
４４…キーボードインターフェース、
４５…キーボード、
４６…ディスプレイインターフェース、
４７…液晶ディスプレイ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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