(57)【要約】      （修正有）【課題】化学的に改変された酵素の再活性化を増強する方法を提供する。【解決手段】可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化を増強するための方法であって、この方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を１種以上の窒素含有化合物の存在下で再活性化する工程を包含する。この窒素含有化合物の具体的な例としては、アゾール、ピリジン化合物、Ｎ−ヒドロキシド化合物、ヒドラジン、アンモニウム塩が挙げられる。【選択図】図１
2008005841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化を増強するための方法であって、該方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、アゾールの存在下で再活性化させる工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記アゾールが、式１を有する窒素含有５員環化合物
【化１】
2008005841.tif 000018
を含み、式１において、各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲまたはＮであり；そしてＲは、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であるか、あるいはヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、エステル基、スルホン酸基、エーテル基、またはハロゲン基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アゾールが、式２を有する窒素含有５員環化合物
【化２】
2008005841.tif 000019
を含み、式２において、各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；そして各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であるか、あるいはヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、エステル基、スルホン酸基、エーテル基、またはハロゲン基である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
各Ｘが、互いに独立して、任意の組み合わせでＣＨまたはＮである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アゾールが、式３を有する窒素含有二環式化合物
【化３】
2008005841.tif 000020
を含み、式３において、各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；そして各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であるか、あるいはヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、エステル基、スルホン酸基、エーテル基、またはハロゲン基である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記再活性化させる工程がまた、アンモニウム塩の存在下においてである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アゾールの濃度が、約２ｍＭ〜約１Ｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アゾールの濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．５Ｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化を増強するための方法であって、該方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、式４を有するピリジン化合物
【化４】
2008005841.tif 000021
の存在下で再活性化させる工程を包含し、式４において、各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲまたはＮであり；そしてＲは、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、またはアミノアルキル基である、方法。
【請求項１０】
前記再活性化させる工程がまた、アンモニウム塩の存在下においてである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ピリジン化合物の濃度が、約２ｍＭ〜約１Ｍである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ピリジン化合物の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．５Ｍである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化を増強するための方法であって、該方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、式５を有するＮ−ヒドロキシド含有化合物
【化５】
2008005841.tif 000022
の存在下で再活性化させる工程を包含し、式５において、各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であるか、またはアシル基あるいはこれらの誘導体である、方法。
【請求項１４】
前記再活性化させる工程がまた、アンモニウム塩の存在下においてである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｎ−ヒドロキシド化合物の濃度が、約２ｍＭ〜約１Ｍである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｎ−ヒドロキシド化合物の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．５Ｍである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化の増強のための方法であって、該方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、式６を有するヒドラジン含有化合物
【化６】
2008005841.tif 000023
の存在下で再活性化させる工程を包含し、式６において、各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であるか、またはアシル基あるいはこれらの誘導体である、方法。
【請求項１８】
前記再活性化させる工程がまた、アンモニウム塩の存在下においてである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヒドラジン化合物の濃度が、約２ｍＭ〜約１Ｍである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒドラジン化合物の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．５Ｍである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化の増強のための方法であって、該方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、アンモニウム塩を含有する化合物の存在下で再活性化させる工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記アンモニウム塩が、無機対イオン、有機対イオン、金属酸化物対イオン、または金属錯体対イオンを含有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アンモニウム塩の濃度が、約２ｍＭ〜約１Ｍである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記アンモニウム塩の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．５Ｍである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素と、化合物のうちの少なくとも１種とを備えるキットであって、該化合物は、式１、式２、または式３を有するアゾール、式４を有するピリジン、式５を有するＮ−ヒドロキシド、あるいは式６を有するヒドラジン：
【化７】
2008005841.tif 000024
からなる群より選択され、該式において、
各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；そして各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基、あるいはヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、エステル基、スルホン酸基、エーテル基、またはハロゲン基である、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６０／８１７，０４３号（２００６年６月２８日出願）および第６０／８５２，８０４号（２００６年１０月１９日出願）（これらの両方が、本明細書に参考としてその全体が援用される）に対する優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
いくつかの分子生物学の方法は、その反応にすでに含まれていながらも、制御された様式で活性化され得る酵素を必要とする。この酵素は、同じ反応容器中で予め規定された時点に逐次酵素手順を開始すること、または酵素反応の早まった開始に起因する望ましくない副生成物の生成を回避することを可能にする。化学的に改変された耐熱性酵素の使用に関して、そのような２種の改変が、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼについて記載されている（特許文献１；特許文献２；および特許文献３（これらは、参考としてその全体が本明細書に援用される）を参照のこと）。そのような改変はまた、他の耐熱性酵素に対して利用され得る。なぜなら、すべての酵素に含まれ、かつ酵素の触媒中心にしばしば関与するアミノ酸（例えば、遊離のＮＨ２−基を有するアミノ酸）がこれらの化学によって改変されるからである。さらに、特許文献３は、一般的に任意の耐熱性酵素を改変するのに適しているアルデヒドによる酵素分子の架橋を教示する。そのような化学的に改変された酵素の活性は、加熱インキュベーション工程によって回復される。この加熱インキュベーション工程は、アミノ酸残基に対する共有結合を切断し、それによってその酵素の触媒活性を回復する。しかし、選択される不活化手順または改変因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）濃度に依存して、酵素活性は、低速でしか回復されない。
【０００３】
本発明者らは、窒素含有化合物が、驚くべきことに、化学的に改変された酵素の酵素活性を増強し、一方でその窒素含有化合物が改変されていない酵素への影響を有さないことを発見した。したがって、本発明は、初めて、化学的に改変された酵素の再活性化を増強する機構を記載し、その機構は、多くの適用（例えば、酵素反応の速度を増加させるための適用）に適している。
【特許文献１】米国特許第５，６７７，１５２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７７３，２５８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１８３，９９８号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
化学的に改変された酵素の再活性化を増強すること。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化を増強するための方法であって、この方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、アゾールの存在下で再活性化させる工程を包含する、方法。
（項目２）
上記アゾールが、式１を有する窒素含有５員環化合物
【０００６】
【化８】
2008005841.tif 000003
を含み、式１において、各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲまたはＮであり；そしてＲは、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であるか、あるいはヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、エステル基、スルホン酸基、エーテル基、またはハロゲン基である、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記アゾールが、式２を有する窒素含有５員環化合物
【０００７】
【化９】
2008005841.tif 000004
を含み、式２において、各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；そして各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であるか、あるいはヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、エステル基、スルホン酸基、エーテル基、またはハロゲン基である、項目１に記載の方法。
（項目４）
各Ｘが、互いに独立して、任意の組み合わせでＣＨまたはＮである、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記アゾールが、式３を有する窒素含有二環式化合物
【０００８】
【化１０】
2008005841.tif 000005
を含み、式３において、各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；そして各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であるか、あるいはヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、エステル基、スルホン酸基、エーテル基、またはハロゲン基である、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記再活性化させる工程がまた、アンモニウム塩の存在下においてである、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記アゾールの濃度が、約２ｍＭ〜約１Ｍである、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記アゾールの濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．５Ｍである、項目１に記載の方法。
（項目９）
可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化を増強するための方法であって、この方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、式４を有するピリジン化合物
【０００９】
【化１１】
2008005841.tif 000006
の存在下で再活性化させる工程を包含し、式４において、各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲまたはＮであり；そしてＲは、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、またはアミノアルキル基である、方法。
（項目１０）
上記再活性化させる工程がまた、アンモニウム塩の存在下においてである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記ピリジン化合物の濃度が、約２ｍＭ〜約１Ｍである、項目９に記載の方法。
（項目１２）
上記ピリジン化合物の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．５Ｍである、項目９に記載の方法。
（項目１３）
可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化を増強するための方法であって、この方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、式５を有するＮ−ヒドロキシド含有化合物
【００１０】
【化１２】
2008005841.tif 000007
の存在下で再活性化させる工程を包含し、式５において、各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であるか、またはアシル基あるいはこれらの誘導体である、方法。
（項目１４）
上記再活性化させる工程がまた、アンモニウム塩の存在下においてである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記Ｎ−ヒドロキシド化合物の濃度が、約２ｍＭ〜約１Ｍである、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
上記Ｎ−ヒドロキシド化合物の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．５Ｍである、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化の増強のための方法であって、この方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、式６を有するヒドラジン含有化合物
【００１１】
【化１３】
2008005841.tif 000008
の存在下で再活性化させる工程を包含し、式６において、各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であるか、またはアシル基あるいはこれらの誘導体である、方法。
（項目１８）
上記再活性化させる工程がまた、アンモニウム塩の存在下においてである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記ヒドラジン化合物の濃度が、約２ｍＭ〜約１Ｍである、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
上記ヒドラジン化合物の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．５Ｍである、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化の増強のための方法であって、この方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、アンモニウム塩を含有する化合物の存在下で再活性化させる工程を包含する、方法。
（項目２２）
上記アンモニウム塩が、無機対イオン、有機対イオン、金属酸化物対イオン、または金属錯体対イオンを含有する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記アンモニウム塩の濃度が、約２ｍＭ〜約１Ｍである、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
上記アンモニウム塩の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．５Ｍである、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素と、化合物のうちの少なくとも１種とを備えるキットであって、この化合物は、式１、式２、または式３を有するアゾール、式４を有するピリジン、式５を有するＮ−ヒドロキシド、あるいは式６を有するヒドラジン：
【００１２】
【化１４】
2008005841.tif 000009
からなる群より選択され、この式において、
各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；そして各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基、あるいはヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、エステル基、スルホン酸基、エーテル基、またはハロゲン基である、キット。
【００１３】
（要旨）
開示される材料、化合物、組成物、物品、および方法の目的にしたがって、本明細書で具体化されかつ広く記載されるように、開示される主題は、一局面において、化合物および組成物、ならびにそのような化合物および組成物を調製および使用するための方法に関する。さらなる局面において、開示される主題は、１種以上の窒素含有化合物を使用して、可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化を増強することに関する。
【００１４】
さらなる利点は、部分的に、以下の説明に示され、そして部分的に、その説明から明らかであるか、または以下に記載される局面の実施によって習得され得る。以下に記載される利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘される要素および組み合わせによって理解され、そして達成される。上記の一般的な説明および以下の詳細な説明が例示的かつ説明的のみであり、限定的ではないことが理解されるはずである。
【００１５】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、上記の数種の局面を図示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（詳細な説明）
本明細書中に記載される材料、化合物、組成物、物品、および方法は、開示される主題の具体的な局面の以下の詳細な説明およびそこに含まれる実施例、ならびに図面を参照することによって、より容易に理解され得る。
【００１７】
本発明の材料、化合物、組成物、物品、および方法が開示および記載される前に、以下に記載される局面は、特定の合成方法にも特定の試薬にも限定されないことが理解されるべきである。なぜなら、このような合成方法または試薬は、もちろん、変化し得るからである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の局面を説明する目的のみであり、限定することを意図されないこともまた、理解されるべきである。
【００１８】
また、本明細書全体にわたって、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、その全体が、開示される内容が属する技術水準をより完全に記載する目的で、本願に参考として援用される。開示される参考文献はまた、その参考文献が引用されている文中で議論されている、これらの参考文献中に含まれる材料について、個々にかつ具体的に、本明細書中に参考として援用される。
【００１９】
（一般的な定義）
本明細書および添付の特許請求の範囲において、多数の用語が参照される。これらの用語は、以下の意味を有するように定義されるべきである：
本明細書の説明および特許請求の範囲全体にわたって、単語「含む」およびこの単語の他の形態（例えば、「含有する」および「備える」）は、例えば、他の添加剤、成分、整数または工程を含むがそれらに限定されないことを意味し、そして排他的であることを意図されない。
【００２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、複数の言及を含む。従って、例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」に対する言及は、２種以上のこのような化合物の混合物を含み、「酵素（ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ）」に対する言及は、２種以上のこのような酵素の混合物を含み、「プライマー（ｔｈｅ  ｐｒｉｍｅｒ）」に対する言及は、２種以上のこのようなプライマーの混合物を含む、などである。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「置換（された）」は、有機化合物の全ての許可される置換基を包含することが企図される。広範な局面において、許可される置換基としては、有機化合物の非環式置換基および環式置換基、分枝置換基および非分枝（直鎖）置換基、炭素環式置換基および複素環式置換基、ならびに芳香族置換基および非芳香族置換基が挙げられる。例示的な置換基としては、例えば、以下に記載されるものが挙げられる。許可される置換基は、適切な有機化合物について、１つであってもそれより多くであっても、そして同じであっても異なっていてもよい。本開示の目的で、ヘテロ原子（例えば、窒素）は、そのヘテロ原子の価数を満足させる、水素置換基および／または本明細書中に記載される有機化合物の任意の許可される置換基を有し得る。本開示は、有機化合物の許可される置換基によって、いかなる様式でも限定されることを意図されない。また、用語「置換」または「〜で置換される」は、このような置換が、置換される原子とその置換基との許可される価数に従うこと、およびその置換が、安定な化合物（例えば、転移、環化、脱離などによる変換を自発的には受けない化合物）を生じることという、暗黙の条件を含む。
【００２２】
用語「アルキル」とは、本明細書中で使用される場合、分枝鎖または非分枝鎖の、１個〜２４個の炭素原子の飽和炭化水素基であり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｓ−ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどである。アルキル基はまた、置換されていても置換されていなくてもよい。アルキル基は、１つ以上の基で置換され得、これらの基としては、本明細書中に記載されるような、置換もしくは非置換の、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、ボロン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、アジド、ニトロ、ヒドロキサメート、シリル、スルホ−オキソ、またはチオールが挙げられるが、これらに限定されない。「低級アルキル」基とは、１個〜６個の炭素原子を含むアルキル基である。
【００２３】
用語「アルコキシ」とは、本明細書中で使用される場合、エーテル結合を介して結合するアルキル基またはシクロアルキル基である。すなわち、「アルコキシ」基は、−ＯＡ１として定義され得、ここで、Ａ１は、上で定義されたようなアルキルまたはシクロアルキルである。
【００２４】
用語「アルケニル」とは、本明細書中で使用される場合、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む構造式を有する、２個〜２４個の炭素原子の炭化水素基である。（Ａ１Ａ２）Ｃ＝Ｃ（Ａ３Ａ４）のような非対称構造は、Ｅ異性体とＺ異性体との両方を包含することが意図される。このことは、非対称アルケンが存在する、本明細書中の構造式において想定され得るか、または結合の記号Ｃ＝Ｃによって明示的に示され得る。アルケニル基は、１つ以上の基で置換され得、これらの基としては、本明細書中に記載されるような、置換もしくは非置換の、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、ボロン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、アジド、ニトロ、ヒドロキサメート、シリル、スルホ−オキソ、またはチオールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
用語「アルキニル」とは、本明細書中で使用される場合、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む構造式を有する、２個〜２４個の炭素原子の炭化水素基である。アルケニル基は、非置換であっても、１つ以上の基で置換されていてもよく、これらの基としては、本明細書中に記載されるような、置換もしくは非置換の、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、ボロン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、アジド、ニトロ、ヒドロキサメート、シリル、スルホ−オキソ、またはチオールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
用語「アシル」とは、１０個以下の連続するＣ原子を含む、対応する酸の誘導体を意味する。これらの酸部分は、さらなるアルキル基または官能基（例えば、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、エステル基、もしくはエーテル基）を有し得る。
【００２７】
用語「アリール」とは、本明細書中で使用される場合、任意の炭素ベースの芳香族基を含む基であり、ベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、フェノキシベンゼンなどが挙げられるが、これらに限定されない。用語「アリール」はまた、「ヘテロアリール」を包含し、ヘテロアリールは、芳香族基の環内に組み込まれた少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基を含む基として定義される。ヘテロ原子の例としては、窒素、酸素、硫黄、およびリンが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、用語「非ヘテロアリール」（これもまた、用語「アリール」に包含される）とは、ヘテロ原子を含まない芳香族基を含む基を定義する。アリール基は、置換されていても置換されていなくてもよい。アリール基は、１つ以上の基で置換され得、これらの基としては、本明細書中に記載されるような、置換もしくは非置換の、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、ボロン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、アジド、ニトロ、ヒドロキサメート、シリル、スルホ−オキソ、またはチオールが挙げられるが、これらに限定されない。用語「ビアリール」とは、アリール基の特殊な型であり、「アリール」の定義に含まれる。ビアリールとは、縮合した環構造を介して一緒に結合した２つのアリール基（例えば、ナフタレン）、またはビフェニルのように、１つ以上の炭素−炭素結合を介して結合した２つのアリール基をいう。用語「フェニル」は、アリールの意味に含まれ、そしてベンジル部分を意味し、このベンジル部分は、その環に結合した、さらなるアルキル鎖（４個以下の連続するＣ原子を含む）または官能基（例えば、ヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、カルボニル基、スルホン酸基、エステル基、エーテル基、またはハロゲン基）を有し得る。
【００２８】
用語「アミン」または「アミノ」は、本明細書中で使用される場合、式ＮＡ１Ａ２Ａ３によって表され、この式において、Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、独立して、水素、あるいは本明細書中に記載されるような、置換もしくは非置換の、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、シクロアルキニル基、アリール基、またはヘテロアリール基であり得る。用語「アミノアルキル」とは、アルキル部分を有するアミノ基を意味する。用語「アルキル」は、上で定義される。同様に、アミノアルキルの誘導体は、アルキル基の誘導体に対応する。
【００２９】
用語「アゾール」とは、本明細書中で使用される場合、環内に少なくとも１個の窒素原子を含む、置換五員環もしくは非置換五員環、または縮合五員環である。
【００３０】
用語「カルボン酸」は、本明細書中で使用される場合、式−Ｃ（Ｏ）ＯＨによって表される。
【００３１】
用語「エステル」は、本明細書中で使用される場合、式−ＯＣ（Ｏ）Ａ１または−Ｃ（Ｏ）ＯＡ１によって表され、これらの式において、Ａ１は、本明細書中に記載されるような、置換もしくは非置換の、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、シクロアルキニル基、アリール基、またはヘテロアリール基であり得る。
【００３２】
用語「エーテル」は、本明細書中で使用される場合、式Ａ１ＯＡ２によって表され、この式において、Ａ１およびＡ２は、独立して、本明細書中に記載される、置換もしくは非置換の、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、シクロアルキニル基、アリール基、またはヘテロアリール基であり得る。
【００３３】
用語「ハロゲン化物」または「ハロゲン」とは、本明細書中で使用される場合、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素のハロゲンをいう。
【００３４】
用語「ヒドロキシル」は、本明細書中で使用される場合、式−ＯＨによって表される。
【００３５】
用語「ケトン」は、本明細書中で使用される場合、式Ａ１Ｃ（Ｏ）Ａ２によって表され、この式において、Ａ１およびＡ２は、独立して、本明細書中に記載されるような、置換もしくは非置換の、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、シクロアルキニル基、アリール基、またはヘテロアリール基であり得る。
【００３６】
用語「アジド」は、本明細書中で使用される場合、式−Ｎ３によって表される。
【００３７】
用語「ニトロ」は、本明細書中で使用される場合、式−ＮＯ２によって表される。
【００３８】
用語「ニトリル」は、本明細書中で使用される場合、式−ＣＮによって表される。
【００３９】
用語「シリル」は、本明細書中で使用される場合、式−ＳｉＡ１Ａ２Ａ３によって表され、この式において、Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、独立して、水素、あるいは本明細書中に記載されるような、置換もしくは非置換の、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、シクロアルキニル基、アリール基、またはヘテロアリール基であり得る。
【００４０】
用語「スルホ−オキソ」は、本明細書中で使用される場合、式−Ｓ（Ｏ）Ａ１、−Ｓ（Ｏ）２Ａ１、−ＯＳ（Ｏ）２Ａ１、または−ＯＳ（Ｏ）２ＯＡ１によって表され、これらの式において、Ａ１は、水素、あるいは本明細書中に記載されるような、置換もしくは非置換の、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、シクロアルキニル基、アリール基、またはヘテロアリール基であり得る。本明細書全体にわたって、「Ｓ（Ｏ）」は、Ｓ＝Ｏの簡略表現による表記である。用語「スルホニル」は、本明細書中で、式−Ｓ（Ｏ）２Ａ１によって表されるスルホ−オキソ基をいうために使用され、この式において、Ａ１は、水素、あるいは本明細書中に記載されるような、置換もしくは非置換の、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、シクロアルキニル基、アリール基、またはヘテロアリール基であり得る。用語「スルホン」は、本明細書中で使用される場合、式Ａ１Ｓ（Ｏ）２Ａ１によって表され、この式において、Ａ１およびＡ１は、独立して、本明細書中に記載されるような、置換もしくは非置換の、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、シクロアルキニル基、アリール基、またはヘテロアリール基であり得る。用語「スルホキシド」は、本明細書中で使用される場合、式Ａ１Ｓ（Ｏ）Ａ１によって表され、この式において、Ａ１およびＡ１は、独立して、本明細書中に記載されるような、置換もしくは非置換の、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、シクロアルキニル基、アリール基、またはヘテロアリール基であり得る。
【００４１】
用語「チオール」は、本明細書中で使用される場合、式−ＳＨによって表される。
【００４２】
「Ｒ１」、「Ｒ２」、および「Ｘ」は、本明細書中で使用される場合、上に列挙された基のうちの１つ以上を独立して有し得る。例えば、Ｒ１がアルキル基である場合、このアルキル基の水素原子のうちの１つは、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、ハロゲン化物などで必要に応じて置換され得る。選択される基に依存して、第一の基は、第二の基の内部に組み込まれ得るか、あるいは第一の基は、第二の基からぶら下がり得る（すなわち、結合し得る）。例えば、「アミノ基を含むアルキル基」との語句により、このアミノ基は、このアルキル基の骨格の中に組み込まれ得る。あるいは、このアミノ基は、このアルキル基の骨格に結合し得る。選択される基の性質は、第一の基が第二の基に埋め込まれているか、または結合しているかを決定する。
【００４３】
ここで、開示される材料、化合物、組成物、物品、および方法の具体的な局面が、詳細に参照され、これらの例は、添付の実施例および図に記載される。
【００４４】
（方法および組成物）
本発明は、可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化を増強するための方法を提供する。具体的には、開示される方法は、以下の式１−６によって特徴付けられる、窒素含有化合物の使用を包含する。
【００４５】
【化１５】
2008005841.tif 000010
式１−６において、各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；そして各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基、あるいはヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、エステル基、スルホン酸基、エーテル基、またはハロゲン基である。本明細書中に開示されるように、これらの化合物（その混合物を含む）は、可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化を増強するために使用され得る。
【００４６】
種々の実施例において、本明細書中に、可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化の増強のための方法が開示され、この方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、窒素含有化合物の存在下で再活性化させる工程を包含する。本明細書中で使用するために適切な窒素含有化合物の具体的な例としては、アゾールが挙げられるが、これに限定されない。適切なアゾールは、式１を有する窒素含有５員環化合物を含み得る。
【００４７】
【化１６】
2008005841.tif 000011
式１において、各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲ、またはＮであり得；そしてＲは、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であり得るか、あるいはヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、エステル基、スルホン酸基、エーテル基、またはハロゲン基であり得る。
【００４８】
別の実施例において、適切なアゾールは、式２を有する窒素含有５員環化合物を含み得る。
【００４９】
【化１７】
2008005841.tif 000012
式２において、各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり得；そして各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であり得るか、あるいはヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、エステル基、スルホン酸基、エーテル基、またはハロゲン基であり得る。さらなる実施例において、各Ｘは、互いに独立して、任意の組み合わせで、ＣＨまたはＮであり得る。
【００５０】
なおさらなる実施例において、適切なアゾールは、式３を有する窒素含有二環式化合物を含み得る。
【００５１】
【化１８】
2008005841.tif 000013
式３において、各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり得；そして各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であり得るか、あるいはヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、エステル基、スルホン酸基、エーテル基、またはハロゲン基であり得る。
【００５２】
本明細書中にはまた、可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化の増強のための方法が開示され、この方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、式４を有するピリジンを含む化合物の存在下で再活性化させる工程を包含する。
【００５３】
【化１９】
2008005841.tif 000014
式４において、各Ｘは、互いに独立して、ＣＨ、ＣＲ、またはＮであり得；そしてＲは、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、またはアミノアルキル基、あるいはこれらの誘導体であり得る。
【００５４】
なおさらに、本明細書中には、可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化を増強するための方法が開示され、この方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、式５を有するＮ−ヒドロキシド含有化合物の存在下で再活性化させる工程を包含する。
【００５５】
【化２０】
2008005841.tif 000015
式５において、各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であり得るか、またはアシル基あるいはその誘導体であり得る。
【００５６】
なおさらなる実施例において、本明細書中には、可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化を増強するための方法が開示され、この方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、式６を有するヒドラジン含有化合物の存在下で再活性化させる工程を包含する。
【００５７】
【化２１】
2008005841.tif 000016
式６において、各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基であり得るか、またはアシル基あるいはその誘導体であり得る。
【００５８】
別の実施例において、本明細書中には、可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化を増強するための方法が開示され、この方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を、アンモニウム塩の存在下で再活性化させる工程を包含する。アンモニウム塩は、式＋ＮＲ４の、正に荷電した窒素種と、負に荷電した無機対イオン、有機対イオン、金属酸化物対イオン、または金属錯体対イオンとを含む、任意の化合物であり、この式において、各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアルケニル基、置換もしくは非置換のアルキニル基、置換もしくは非置換のアルコキシル基、または置換もしくは非置換のアリール基、あるいはヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、エステル基、スルホン酸基、エーテル基、またはハロゲン基であり得る。
【００５９】
アンモニウム塩のために適切な、正に荷電した窒素種は、ＮＨ４およびテトラアルキルアンモニウムである。アンモニウム塩において適切な対イオンは、１以上の負電荷を有し得る。適切な対イオンの例としては、ハロゲンイオン（例えば、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、およびＩ−）、擬似ハロゲンイオン（例えば、ＳＣＮ−およびＯＣＮ−）、過塩素酸イオン（ＣｌＯ４−）、塩素酸イオン（ＣｌＯ３−）、亜塩素酸イオン（ＣｌＯ２−）、次亜塩素酸イオン（ＣｌＯ−）、臭素酸イオン（ＢｒＯ３−）、過ヨウ素酸イオン（ＩＯ４−）、硫化物イオン（Ｓ２−）、硫酸イオン（ＳＯ４２−）、亜硫酸イオン（ＳＯ３２−）、重硫酸イオン（ＨＳＯ４−）、リン化物イオン（Ｐ３−）、リン酸イオン（ＰＯ４３−）、リン酸水素イオン（ＨＰＯ４２−）、リン酸二水素イオン（Ｈ２ＰＯ４−）、亜リン酸イオン（ＰＯ３２−）、窒化物イオン（Ｎ３−）、硝酸イオン（ＮＯ３−）、亜硝酸イオン（ＮＯ２−）、水酸化物イオン（ＯＨ−）、過酸化物イオン（Ｏ２２−）、ヘキサフルオロリン酸イオン（ＰＦ６−）、過マンガン酸イオン（ＭｎＯ４−）のような無機対イオンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
適切な対イオンのさらなる例としては、炭酸イオン（ＣＯ３２−）、重炭酸イオン（ＨＣＯ３−）、ギ酸イオン（ＣＨＯ２−）、酢酸イオン（ＣＨ３ＣＯ２−）、ならびに他のアルキルカルボン酸イオン（ＲＣＯ２−であって、ここでＲは、アルキルであり、例えば、プロピオン酸イオン、酪酸イオンなど）、シュウ酸イオン（Ｃ２Ｏ４２−）、酒石酸イオン（Ｃ４Ｈ４Ｏ６２−）およびリンゴ酸イオン（Ｃ４Ｈ４Ｏ５２−）、クエン酸イオン（Ｃ６Ｈ５Ｏ７３−）、および安息香酸イオン（Ｃ６Ｈ５ＣＯ２−）のような有機対イオンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
他の適切な対イオンとしては、金属酸化物および金属錯体が挙げられるが、これらに限定されない。金属酸化物および金属錯体の例としては、オルトバナジン酸塩、モリブデン酸塩（Ｍｏ７Ｏ２４）、ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸塩（ＦｅＣＮ６）４−、および硝酸セリウムが挙げられる。
【００６２】
本明細書中に開示される対イオンの任意のものが、本明細書中に開示されるアンモニウム種の任意のものと結合して、アンモニウム塩を形成し得る。適切なアンモニウム塩のいくつかの具体的な例としては、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、リン酸二水素アンモニウム（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４）、重リン酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４）、（ＮＨ４）３ＰＯ４、（ＮＨ４）４（Ｆｅ（ＣＮ）６）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４ＣＨ３ＣＯ２）、炭酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＣＯ３）、モリブデン酸アンモニウム（ＮＨ４Ｍｏ７Ｏ２４）、過塩素酸アンモニウム（ＮＨ４ＣｌＯ４）、クエン酸アンモニウム（（ＮＨ４）３Ｃ６Ｈ５Ｏ７）、安息香酸アンモニウム（ＮＨ４Ｃ６Ｈ５ＣＯ２）、およびリン酸アンモニウム（（ＮＨ４）３ＰＯ４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
いくらかの調節が、本明細書中に開示される方法に対してなされ得ることが、理解される。例えば、アンモニウム塩の対イオンがその反応系からＭｇ（これは、補因子として酵素によって必要とされる）をキレートする場合、その塩は、依然として、再活性化に対して同じ効果を提供し得る。しかし、この反応系のＭｇ濃度を増加させて、この対イオンのキレート効果を補償しなければならない。また、対イオンが、酵素に対して阻害効果を有する場合、効果的であるが依然として阻害的ではない濃度のために最適化し得る。
【００６４】
１つの特定の局面において、アンモニウム塩は、本明細書中に開示されるアゾール、ピリミジン、Ｎ−ヒドロキシアミン、またはヒドラジンのうちのいずれかとともに使用され得る。以下でより完全に議論されるように、本明細書中に開示されるようなアンモニウム塩の、本明細書中に開示される他の窒素含有化合物のいずれかとの使用は、相乗効果を生じ得る。
【００６５】
本明細書中に開示される方法において、本明細書中に開示されるアゾール、ピリミジン、Ｎ−ヒドロキシド、およびヒドラジンは、約０．５ｍＭ〜約１Ｍ（例えば、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０５ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１１５ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１３５ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１４５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１５５ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１６５ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１８５ｍＭ、約１９０ｍＭ、約１９５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２０５ｍＭ、約２１０ｍＭ、約２１５ｍＭ、約２２０ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２３０ｍＭ、約２３５ｍＭ、約２４０ｍＭ、約２４５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２５５ｍＭ、約２６０ｍＭ、約２６５ｍＭ、約２７０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約２８０ｍＭ、約２８５ｍＭ、約２９０ｍＭ、約２９５ｍＭ、約３００ｍＭ、約３０５ｍＭ、約３１０ｍＭ、約３１５ｍＭ、約３２０ｍＭ、約３２５ｍＭ、約３３０ｍＭ、約３３５ｍＭ、約３４０ｍＭ、約３４５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３５５ｍＭ、約３６０ｍＭ、約３６５ｍＭ、約３７０ｍＭ、約３７５ｍＭ、約３８０ｍＭ、約３８５ｍＭ、約３９０ｍＭ、約３９５ｍＭ、約４００ｍＭ、約４０５ｍＭ、約４１０ｍＭ、約４１５ｍＭ、約４２０ｍＭ、約４２５ｍＭ、約４３０ｍＭ、約４３５ｍＭ、約４４０ｍＭ、約４４５ｍＭ、約４５０ｍＭ、約４５５ｍＭ、約４６０ｍＭ、約４６５ｍＭ、約４７０ｍＭ、約４７５ｍＭ、約４８０ｍＭ、約４８５ｍＭ、約４９０ｍＭ、約４９５ｍＭ、約５００ｍＭ、約５０５ｍＭ、約５１０ｍＭ、約５１５ｍＭ、約５２０ｍＭ、約５２５ｍＭ、約５３０ｍＭ、約５３５ｍＭ、約５４０ｍＭ、約５４５ｍＭ、約５５０ｍＭ、約５５５ｍＭ、約５６０ｍＭ、約５６５ｍＭ、約５７０ｍＭ、約５７５ｍＭ、約５８０ｍＭ、約５８５ｍＭ、約５９０ｍＭ、約５９５ｍＭ、約６００ｍＭ、約６０５ｍＭ、約６１０ｍＭ、約６１５ｍＭ、約６２０ｍＭ、約６２５ｍＭ、約６３０ｍＭ、約６３５ｍＭ、約６４０ｍＭ、約６４５ｍＭ、約６５０ｍＭ、約６５５ｍＭ、約６６０ｍＭ、約６６５ｍＭ、約６７０ｍＭ、約６７５ｍＭ、約６８０ｍＭ、約６８５ｍＭ、約６９０ｍＭ、約６９５ｍＭ、約７００ｍＭ、約７０５ｍＭ、約７１０ｍＭ、約７１５ｍＭ、約７２０ｍＭ、約７２５ｍＭ、約７３０ｍＭ、約７３５ｍＭ、約７４０ｍＭ、約７４５ｍＭ、約７５０ｍＭ、約７５５ｍＭ、約７６０ｍＭ、約７６５ｍＭ、約７７０ｍＭ、約７７５ｍＭ、約７８０ｍＭ、約７８５ｍＭ、約７９０ｍＭ、約７９５ｍＭ、約８００ｍＭ、約８０５ｍＭ、約８１０ｍＭ、約８１５ｍＭ、約８２０ｍＭ、約８２５ｍＭ、約８３０ｍＭ、約８３５ｍＭ、約８４０ｍＭ、約８４５ｍＭ、約８５０ｍＭ、約８５５ｍＭ、約８６０ｍＭ、約８６５ｍＭ、約８７０ｍＭ、約８７５ｍＭ、約８８０ｍＭ、約８８５ｍＭ、約８９０ｍＭ、約８９５ｍＭ、約９００ｍＭ、約９０５ｍＭ、約９１０ｍＭ、約９１５ｍＭ、約９２０ｍＭ、約９２５ｍＭ、約９３０ｍＭ、約９３５ｍＭ、約９４０ｍＭ、約９４５ｍＭ、約９５０ｍＭ、約９５５ｍＭ、約９６０ｍＭ、約９６５ｍＭ、約９７０ｍＭ、約９７５ｍＭ、約９８０ｍＭ、約９８５ｍＭ、約９９０ｍＭ、約９９５ｍＭ、約１０００ｍＭ）の濃度で存在し得、ここで、記載される値の任意のものが、範囲の上限にも下限にもなり得る。アンモニウム塩について、アンモニウム種は、ちょうど列挙された濃度のいずれかにおいて存在し得る。
【００６６】
特定の実施例において、アンモニウム化合物は、クエン酸アンモニウムでも、リン酸水素二アンモニウムでも、安息香酸アンモニウムでも、炭酸アンモニウムでも、硫酸アンモニウムでもない。
【００６７】
開示される方法は、核酸の操作に関係するすべての適用（例えば、増幅反応、連結反応、エキソヌクレアーゼによる分解反応（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）もしくはエンドヌクレアーゼによる分解反応（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、または核酸のトポロジーを変化させる酵素反応）に利用され得、それらの反応において、不活化された酵素は、意図される酵素反応の前もしくはその酵素反応の一部として、本明細書の記載に従う窒素含有化合物の存在下で反応混合物を高温でインキュベートすることによって、再活性化される。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例は、開示される主題に従う方法および結果を例示するために、以下に示される。これらの実施例は、本明細書に開示される主題のすべての局面を含むことを意図するのではなく、代表的な方法および結果を例示することを意図する。これらの実施例は、当業者に明らかである本発明の等価物およびバリエーションを排除することを意図しない。
【００６９】
数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するための努力は行ったが、ある程度の誤差および偏差が、考慮されるべきである。そうではないと示されない限りは、部とは重量部であり、温度は℃で示されているかまたは周囲温度であり、圧力は大気圧であるかまたは大気圧付近である。記載されるプロセスから得られる生成物の純度および収量を最適にするために使用され得る反応条件（例えば、成分濃度、望ましい溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、ならびに他の反応範囲および他の反応条件）について、多数の変化形および組み合わせが存在する。妥当かつ慣用的な実験のみが、このようなプロセス条件を最適化するためには必要とされる。
【００７０】
本発明を例示するためのモデル系として、２種類の市販酵素を用いるホットスタート（ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ）ＰＣＲを選択した。これは、本発明の一般的な適切さを示す。なぜならば、両方のポリメラーゼが、別の化学的改変剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を用いて不活化されたからである。ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ジカルボン酸無水物を使用して化学的に不活化され、一方、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（ＱＩＡＧＥＮ）は、ホルムアミドを使用して化学的に不活化される。ホットスタートＰＣＲは、以下の理由のためにモデル系として選択した：（ｉ）そのポリメラーゼ連鎖反応は、広汎に使用される分子生物学的適用であり、従って、本発明の経済的重要性を示す；（ｉｉ）その反応の固有の高い効率が原因で、ＰＣＲは、本発明において使用される物質が、非改変型（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ）酵素を含む反応に影響を与えず、そして第二に、化学改変型（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ）酵素が含まれる場合にはそのような反応の効率をさらに増強しさえし得ることを示すための、良好なモデル系である。
【００７１】
酵素再活性化効率の増加をさらに容易に示すために、リアルタイムＰＣＲを選択した。リアルタイムＰＣＲにおいて、その反応全体を通して蛍光シグナルを測定することによって、その酵素反応を継続的にモニターする。二本鎖ＤＮＡ分子が、このＰＣＲ反応の間に生成される。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）にのみ選択的に結合するＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ蛍光色素を使用することによって、これらのＰＣＲ生成物を検出する。従って、蛍光の増加は、ＰＣＲ生成物量の増加を示し、従って、この反応中に含まれるＤＮＡポリメラーゼの活性の増加を示す。一旦、全蛍光が蛍光バックグラウンドシグナルよりも顕著に増加した後に、いわゆるＣＴ値に達する。従って、このＣＴ値は、その反応中に含まれる酵素活性についての尺度である。低いＣＴ値は、高い酵素活性を示し、高いＣＴ値は、その反応中に存在する低い酵素活性を示す。
【００７２】
しかし、別の例は、濃度依存性ＰＣＲ生成物量の生成によって、選択した物質のうちの１つ（トリアゾール）の力価決定、およびＰＣＲにおいて酵素活性を増加させることに対するその物質の影響を示す。
【００７３】
（実施例１）
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩベースのＰＣＲ反応を、コントロール反応として役立つ非改変型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ）の存在下で、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ）またはＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。各反応は、０．６２５ユニット（ｕｎｉｔ）のそれぞれのＤＮＡポリメラーゼ、それぞれのＤＮＡポリメラーゼの１×ＰＣＲ反応緩衝液、２００μＭの各種ｄＮＴＰ、０．５μＭのプライマーＡ：５’−ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＴ−３’（配列番号１）、０．５μＭのプライマーＢ：５’−ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＣＴ−３’（配列番号２）、ＰＣＲグレードの水、そして窒素含有化合物を試験する場合には、例としては最終濃度１００ｍＭのトリアゾールを含んだ。各反応は、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを増幅基質として含んだ。ＰＣＲ反応を、９５℃にて５分間の初期酵素活性化反応工程で開始し、その後、「９４℃にて１５秒間および６０℃にて６０秒間」を５０サイクル行った。平均ＣＴ値を、トリアゾールを添加しない反応と１００ｍＭトリアゾールを含む反応とを比較する三連の反応から決定した。
【００７４】
【表１】
2008005841.tif 000017
結果：トリアゾールを添加すると、非改変型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合にその酵素活性に対して何の影響も示さなかった。一方、トリアゾールを含む反応は、両方の化学改変型酵素（ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ）を使用した場合に、それよりも明らかに高い酵素活性を示した。
【００７５】
（実施例２）
サイクル時間を顕著に短くした高速（ｆａｓｔ）ＰＣＲを、トリアゾールの非存在下で、化学改変型ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含んで実施し、漸増トリアゾール濃度の存在下で化学改変型ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含んで実施した。各ＰＣＲ反応は、１．５ユニットのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｎｇのテンプレートヒトゲノムＤＮＡ、２００μＭの各種ｄＮＴＰ、０．５μＭのプライマーＡ：５’−ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  Ｃ−３’（配列番号３）、０．５μＭのプライマーＢ：５’−ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  Ｃ−３’（配列番号４）、ＰＣＲグレードの水、そして窒素含有化合物を試験する場合には、例としては最終濃度１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、および５００ｍＭのトリアゾールを含んだ。ＰＣＲ反応を、９５℃にて５分間の初期酵素活性化反応工程で開始し、その後、「９６℃にて５秒間、６０℃にて５秒間、そして６８℃にて３０秒間」を３５サイクル行った。ＰＣＲ生成物を、１％  ＴＡＥアガロースゲル上で分析した（図１）。
【００７６】
結果：トリアゾール非存在下でのこの高速ＰＣＲは、非特異的副産物の生成のみを示す。一方、いずれかの濃度のトリアゾールを添加すると、高速サイクルＰＣＲ条件下でさえ、望ましいＰＣＲ生成物を生成する酵素活性を顕著に改善する。
【００７７】
（実施例３）
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉに基づくＰＣＲ反応を、コントロール反応として役立つ非改変Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ）、およびＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ）の存在下で行った。各反応物（２０μＬの反応容量）は、ＨｏｔＳｔａｒＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼを含まずに、および（ＮＨ４）２ＳＯ４を含まずに、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ならびに１．０ユニットの各ＤＮＡポリメラーゼおよび０．５μＭのプライマーＡ：５’−ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＴ−３’（配列番号５）、０．５μＭのプライマーＢ：５’−ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＣＴ−３’（配列番号６）、ＰＣＲグレードの水、ならびにアンモニア含有化合物を試験する場合には異なるアンモニア化合物（アンモニア化合物および濃度については、表を参照のこと）を含んだ。各反応物は、増幅基質として１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを含んだ。ＰＣＲ反応を、９５℃で１０分間の初期酵素活性化工程（これは、ＱＩＡＧＥＮ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎプロトコルに記載される時間よりも５分短い）で開始し、その後、９４℃で１５秒間、５５℃で３９秒間および７２℃で４０秒間を４０サイクル行った。平均ＣＴ値を、アンモニア化合物を加えない反応および異なる濃度でアンモニア化合物を含む反応（アンモニア化合物および濃度については、図２を参照のこと）を比較する三連の反応から決定した。
【００７８】
結果：非改変Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合には、アンモニア化合物の添加は酵素活性に対して影響（または高濃度における阻害）を示さなかったが、一方、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのような化学的に改変された酵素を使用した場合には、アンモニア化合物を含む反応は明らかにより高い酵素活性を示した。
【００７９】
（実施例４）
顕著に短縮したサイクル時間での高速ＰＣＲ反応を、増加する塩化アンモニウム濃度の非存在下（コントロール反応；０ｍＭ塩化アンモニウム）および存在下（最終反応混合物中１０ｍＭ、２０ｍＭおよび３０ｍＭ）で、化学的に改変されたＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含めて実施した。各ＰＣＲ反応物は、１．５ユニットのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｎｇのテンプレートヒトゲノムＤＮＡまたはマウスゲノムＤＮＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、異なるＰＣＲアッセイ各々に対する０．５μＭの各プライマー（アッセイＡ、プライマーＡ１：５’−ＧＣＴ  ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＡＣＣ  ＴＧＧ  ＣＴＡ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  ＡＧＧ−３’（配列番号７）、プライマーＡ２：５’−ＧＡＧ  ＴＴＡ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＧ−３’（配列番号８）；アッセイＢ、プライマーＢ１：５’−ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＴＧＡ  Ｇ−３’（配列番号９）、プライマーＢ２：５’−ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＴＴＣ  Ｇ−３’（配列番号１０）；アッセイＣ、プライマーＣ１：５’−ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＧＧＣ  Ａ−３’（配列番号１１）、プライマーＣ２：５’−ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＣＣＣ  ＡＡＣ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＡＣＡ  Ｃ−３’（配列番号１２））、およびＰＣＲグレードの水を含んだ。ＰＣＲ反応は、９５℃で５分間の初期酵素活性化工程で開始し、その後、ＰＣＲ産物のサイズ１ｋｂ当たり、９６℃で５秒間、６０℃で５秒間および６８℃で３０秒間を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物を、１％ＴＡＥアガロースゲル上で分析した。Ｍ：ＤＮＡサイズラダー（図３）。
【００８０】
結果：増加量の塩化アンモニウムの添加は、いかなるアンモニア化合物も含まない反応と比較した場合、化学的に不活化された酵素の全体的な酵素活性の増加をもたらす。
【００８１】
（実施例５）
アンモニア化合物とアゾールとの組み合わせの相乗的な累積効果を実証するために、顕著に短縮したサイクル時間での高速ＰＣＲ反応を、２０ｍＭ塩化アンモニウムの存在下で、増加するトリアゾール濃度の非存在下（コントロール反応０）および存在下（最終反応混合物中の１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭおよび５００ｍＭ）で、化学的に改変したＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含めて実施した。実施例４における系Ｃを、モデル系として選択した。各ＰＣＲ反応物は、１．５ユニットのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｎｇのテンプレートヒトゲノムＤＮＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマーＡ：５’−ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＧＧＣ  Ａ−３’（配列番号１１）、プライマーＢ：５’−ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＣＣＣ  ＡＡＣ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＡＣＡ  Ｃ−３’（配列番号１２）、およびＰＣＲグレードの水を含んだ。ＰＣＲ反応は、９５℃で５分間の初期酵素活性化工程で開始し、続いて、９６℃で５秒間、６０℃で５秒間、および６８℃で４５秒間を３５サイクル行った。二連の反応由来のＰＣＲ産物を、１％ＴＡＥアガロースゲル上で分析した。Ｍ：ＤＮＡサイズラダー。ＰＣＲセットアップの間の操作エラーに起因して、この２００ｍＭのトリアゾールの存在下でのアッセイを示す反応は、何も結果を示していない（図４）。
【００８２】
結果：トリアゾールの非存在下で２０ｍＭ塩化アンモニウムのみを含む反応と比較して、トリアゾールの添加は、化学的に改変された酵素の酵素活性に対して明確な利点を示す。トリアゾールの効果は５００ｍＭの非常に高い濃度においては顕著ではなくなり始めるが、活性は、トリアゾールを含まない反応におけるものよりもなお高い。この実施例は、アンモニア化合物とアゾールとの組み合わせが相乗的に機能し、化学的に改変された酵素の酵素活性を強化することを示す。
【００８３】
改善を示さなかった、さらに試験した化合物は、Ｃ６Ｈ１７Ｎ３Ｏ７（クエン酸アンモニウム）、Ｈ９Ｎ２Ｏ４Ｐ（リン酸水素二アンモニウム）、Ｃ７Ｈ９ＮＯ２（安息香酸アンモニウム）、（ＮＨ４）２ＣＯ３（炭酸アンモニウム）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（硫酸アンモニウム）であった。
【００８４】
種々の改変およびバリエーションが本発明の範囲および精神から逸脱することなく本発明においてなされ得ることは、当業者に明らかである。本発明の他の実施形態は、本明細書および本明細書中に開示される本発明の実施を考慮することにより、当業者に明らかである。本発明の真の範囲および精神は添付の特許請求の範囲によって示され、明細書および実施例は例示のみとしてみなされることが意図される。
【００８５】
（要約）
可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化の増強のための方法が開示され、その方法は、少なくとも１種の可逆的に不活化された耐熱性酵素を１種以上の窒素含有化合物の存在下で再活性化する工程を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、種々の濃度のトリアゾールを用いた高速ＰＣＲ反応に由来するアガロースゲルである。
【図２】図２は、表および付随するグラフのグループであり、各表は、種々の濃度の特定のアンモニア化合物を用いた反応に由来する平均ＣＴ値を示す。
【図３】図３は、種々の濃度の塩化アンモニウムを用いた３種の高速ＰＣＲ反応に由来する３種のアガロースゲルのグループである。
【図４】図４は、塩化アンモニウムおよび種々の濃度のトリアゾールの存在下での高速ＰＣＲ反応に由来するアガロースゲルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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