(57)【要約】【課題】本発明は、微量にしか存在、又は入手できない糖鎖含有試料中の糖鎖成分を、効率よく且つ良好なスループットで解析することが可能な方法を提供することを目的としている。【解決手段】本発明の解析方法においては、糖レセプターを適宜標識したものを糖鎖含有試料と接触してこれらの間に複合体を形成させ、この複合体に固有の光学的性質又は挙動を計測し、この計測値を適宜複合体形成前のものと比較することにより、糖鎖についての種々の性質（存在、成分、大きさ、濃度等）についての知見を得ることが可能になる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）糖鎖を含む解析対象と、当該糖鎖に特異的に結合する糖レセプターを光学的に検出可能な標識で適宜ラベルしたものとを接触させ、当該糖鎖と糖レセプターからなる複合体を形成させる工程；
（２）当該複合体の検出に適する波長の光を当該複合体に照射する工程；及び
（３）当該複合体からの信号を計測する工程；
を含む、糖鎖の解析方法。
【請求項２】
（ａ）糖鎖を含む解析対象中の糖鎖に特異的に結合する糖レセプターを光学的に検出可能な標識で適宜ラベルしたものに、当該糖レセプターの検出に適する波長の光を照射する工程；
（ｂ）当該糖レセプターからの信号を計測する工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）後の糖レセプターに、当該糖鎖を含む解析対象を接触し、当該糖鎖及び当該糖レセプターからなる複合体を形成する工程；
（ｄ）上記工程（ａ）と同一波長の光を当該複合体に照射する工程；及び
（ｅ）当該複合体からの信号を計測する工程；
を含む、糖鎖の解析方法。
【請求項３】
（４）上記糖鎖と同一種類の糖鎖であって濃度既知のものにより予め作成された検量線に基づき、上記工程（３）で計測した値から検出対象中の糖鎖を定量する工程；
を更に含む、請求項１に記載の糖鎖の解析方法。
【請求項４】
前記糖レセプターは、特定の糖鎖に対して特異的に結合する複数種類の糖レセプターの集合であり、且つ分光特性が互いに有意に異なる、光学的に検出可能な標識でそれぞれラベルされたものであり；更に、
前記工程（１）又は（ｃ）において、
前記糖レセプターと前記解析対象との接触を、複数の糖レセプターについて同一の反応系内で行う、請求項１又は２に記載の糖鎖の解析方法。
【請求項５】
前記光学的に検出可能な標識が蛍光標識であり、
前記工程（３）又は（ｅ）の信号の計測が蛍光相互相関解析（ＦｘＣＳ）により行われる、請求項４に記載の糖鎖の解析方法。
【請求項６】
ＦｘＣＳにより相互相関が観測されなかったことが判明した後に、
（Ｘ）各標識からの信号をＦＣＳにより解析する工程；
を行うことを含む、請求項５に記載の糖鎖の解析方法。
【請求項７】
前記糖レセプターが基体に固相化されている、請求項１又は２に記載の糖鎖の解析方法。
【請求項８】
異なる濃度の二種類の蛍光色素の組合せで標識されたビーズの組合せである基体のそれぞれに、結合特異性の異なる糖レセプターがそれぞれ固相化され；
前記工程（１）と（２）の間、又は前記工程（ｃ）と（ｄ）の間において、
（Ｙ）前記糖レセプターが認識する部位とは異なる、解析対象上の糖鎖以外の部位を特異的に認識する抗体を、当該ビーズの標識に用いられている蛍光色素の組合せの分光学的性質とは異なる分光学的性質を有する蛍光色素によりラベルしたものを、前記複合体を含む反応系に添加する工程；
を更に含み；
前記工程（３）又は（ｅ）において、当該ビーズからの蛍光と当該抗体からの蛍光について蛍光相互相関分析（ＦｘＣＳ）を行う、請求項５に記載の糖鎖の解析方法。
【請求項９】
（１’）以下の三種類：
（ｉ）解析対象の糖鎖；
（ｉｉ）当該糖鎖に特異的に結合する複数種類の第１レセプターの集合のそれぞれを、異なる濃度の二種類の蛍光色素の組合せで標識されたビーズの組合せである基体のそれぞれに固相化したもの；及び
（ｉｉｉ）当該第１レセプターの認識部位とは異なる、当該解析対象上の糖鎖以外の部位を特異的に認識する第２レセプターに、前記二種類の蛍光色素の組合せとは分光学的性質のことなる蛍光標識を付加したもの；
を接触することにより、解析対象含有試料を調製する工程；
（２’）当該解析対象含有試料に対し、当該標識の検出に適した波長の光を照射する工程；
（３’）当該混合物からの信号を蛍光相互相関分析（ＦｘＣＳ）により解析する工程；
を含む糖鎖の解析方法。
【請求項１０】
前記糖レセプター又は前記第１レセプターがレクチンである、請求項１、２、又は９に記載の糖鎖の解析方法。
【請求項１１】
前記光学的に検出可能な標識が蛍光標識である、請求項１又は２に記載の糖鎖の解析方法。
【請求項１２】
前記工程（３）又は（ｅ）における信号の計測が、検出対象を含む複合体についての、並進拡散時間、１分子当たりの蛍光強度、蛍光偏光度、散乱、の変化についての計測である、請求項１又は２に記載の糖鎖の解析方法。
【請求項１３】
前記工程（３）又は（ｅ）における信号の計測が、自己相関関数解析（ＦＣＳ）、蛍光強度分布解析（ＦＩＤＡ）、蛍光偏光度解析（ＦＩＤＡ−ＰＯ）、又は散乱解析により行われる、請求項１又は２に記載の糖鎖の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖含有試料の解析方法に関する。より具体的には、糖タンパク質、及びその糖鎖の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質には、翻訳後に修飾を受けることで機能を発揮するものがある。そのためポストゲノム研究においては、修飾部分に起因する機能の解析が重要である。また、真核細胞由来のタンパク質の翻訳後修飾の中で最も多いのが糖鎖による修飾反応であること、そして真核細胞由来のタンパク質の５０％以上のものには糖鎖が付加されていることから、糖鎖解析はプロテオーム研究において重要な領域とされている。
【０００３】
実際の糖鎖解析では、タンパク質を修飾している糖鎖部分がどのような成分から構成されているのか、そしてタンパク質のどの部位に糖鎖がいくつ付加されているのかが調べられる。また、糖鎖は細胞間認識や接着といった現象に関与していることから、糖（糖リガンド）と糖レセプターとの相互作用を解析することも行われている。例えば特許文献１においては、表面プラズモン共鳴法を使って、糖鎖とレクチンとの相互作用が測定・解析されている。
【特許文献１】特許第３７２０５２０号公報
【特許文献２】特開２００５−４３３１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に開示されている表面プラズモン共鳴法においては、糖鎖又は糖レセプターの何れかを、測定前に固相化する必要がある。また、この文献では糖鎖に蛍光標識を行い、標的物（レクチン）との間の相互作用を蛍光偏光度の計測により解析し、更に液体クロマトグラフィーによる２次元マッピング法により糖鎖構造を明らかにしている。従って、測定前の前処理（標識化・固相化）のみならず、測定そのものも煩雑であり、スループットがよくないという問題がある。そのため表面プラズモン共鳴法は一般に、多種・多量の試料の迅速な解析には不向きであるという問題が存在している。
【０００５】
解析のためには解析対象を大量に準備する必要がある。しかしながら大腸菌を使った通常のタンパク質大量合成においては、糖鎖を付加することができないため、糖タンパク質を解析対象とする場合には、これを生体から抽出してくる必要がある。しかしながら天然物由来の糖の分離・精製は、糖鎖の構造の複雑性ゆえに、煩雑且つ長時間を要することが多い。また、測定用に蛍光標識を解析対象に付加する場合には、付加反応により糖タンパク質の生理機能が失活してしまうことがある。その場合、糖鎖の解析が十分に行えないという問題もある。更に、多様な糖鎖を有する糖タンパク質群の中から、特定種類の糖鎖を有するものをスクリーニングすることは、スループットの観点からは従来の方法では困難である。
このような点に鑑み、簡便であり、少量の試料であっても確実に、更に多種類の試料を取り扱う場合であっても迅速に、且つ糖タンパク質がネイティブな状態のまま解析できる手法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、具体的には下記の構成をとる。
（I）  （１）糖鎖を含む解析対象と、当該糖鎖に特異的に結合する糖レセプターを光学的に検出可能な標識で適宜ラベルしたものとを接触させ、当該糖鎖と糖レセプターからなる複合体を形成させる工程；
（２）当該複合体の検出に適する波長の光を当該複合体に照射する工程；及び
（３）当該複合体からの信号を計測する工程；
を含む、糖鎖の解析方法。
【０００７】
（II）  （ａ）糖鎖を含む解析対象中の糖鎖に特異的に結合する糖レセプターを光学的に検出可能な標識で適宜ラベルしたものに、当該糖レセプターの検出に適する波長の光を照射する工程；
（ｂ）当該糖レセプターからの信号を計測する工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）後の糖レセプターに、当該糖鎖を含む解析対象を接触し、当該糖鎖及び当該糖レセプターからなる複合体を形成する工程；
（ｄ）上記工程（ａ）と同一波長の光を当該複合体に照射する工程；及び
（ｅ）当該複合体からの信号を計測する工程；
を含む、糖鎖の解析方法。
【０００８】
（III）  （４）上記糖鎖と同一種類の糖鎖であって濃度既知のものにより予め作成された検量線に基づき、上記工程（３）で計測した値から検出対象中の糖鎖を定量する工程；を更に含む、前記（I）に記載の糖鎖の解析方法。
【０００９】
（IV）  前記糖レセプターは、特定の糖鎖に対して特異的に結合する複数種類の糖レセプターの集合であり、且つ分光特性が互いに有意に異なる、光学的に検出可能な標識でそれぞれラベルされたものであり；更に、
前記工程（１）又は（ｃ）において、
前記糖レセプターと前記解析対象との接触を、複数の糖レセプターについて同一の反応系内で行う、前記（I）又は（II）に記載の糖鎖の解析方法。
【００１０】
（V）  前記光学的に検出可能な標識が蛍光標識であり、
前記工程（３）又は（ｅ）の信号の計測が蛍光相互相関解析（ＦｘＣＳ）により行われる、前記（IV）に記載の糖鎖の解析方法。
【００１１】
（VI）  ＦｘＣＳにより相互相関が観測されなかったことが判明した後に、
（Ｘ）各標識からの信号をＦＣＳにより解析する工程；
を行うことを含む、前記（V）に記載の糖鎖の解析方法。
【００１２】
（VII）  前記糖レセプターが基体に固相化されている、前記（I）又は（II）に記載の糖鎖の解析方法。
【００１３】
（VIII）  異なる濃度の二種類の蛍光色素の組合せで標識されたビーズの組合せである基体のそれぞれに、結合特異性の異なる糖レセプターがそれぞれ固相化され；
前記工程（１）と（２）の間、又は前記工程（ｃ）と（ｄ）の間において、
（Ｙ）前記糖レセプターが認識する部位とは異なる、解析対象上の糖鎖以外の部位を特異的に認識する抗体を、当該ビーズの標識に用いられている蛍光色素の組合せの分光学的性質とは異なる分光学的性質を有する蛍光色素によりラベルしたものを、前記複合体を含む反応系に添加する工程；
を更に含み；
前記工程（３）又は（ｅ）において、当該ビーズからの蛍光と当該抗体からの蛍光について蛍光相互相関分析（ＦｘＣＳ）を行う、前記（V）に記載の糖鎖の解析方法。
【００１４】
（IX）  （１’）以下の三種類：
（ｉ）解析対象の糖鎖；
（ｉｉ）当該糖鎖に特異的に結合する複数種類の第１レセプターの集合のそれぞれを、異なる濃度の二種類の蛍光色素の組合せで標識されたビーズの組合せである基体のそれぞれに固相化したもの；及び
（ｉｉｉ）当該第１レセプターの認識部位とは異なる、当該解析対象上の糖鎖以外の部位を特異的に認識する第２レセプターに、前記二種類の蛍光色素の組合せとは分光学的性質のことなる蛍光標識を付加したもの；
を接触することにより、解析対象含有試料を調製する工程；
（２’）当該解析対象含有試料に対し、当該標識の検出に適した波長の光を照射する工程；
（３’）当該混合物からの信号を蛍光相互相関分析（ＦｘＣＳ）により解析する工程；
を含む糖鎖の解析方法。
【００１５】
（X）  前記糖レセプター又は前記第１レセプターがレクチンである、前記（I）、（II）、又は（XI）に記載の糖鎖の解析方法。
【００１６】
（XI）  前記光学的に検出可能な標識が蛍光標識である、前記（I）又は（II）に記載の糖鎖の解析方法。
【００１７】
（XII）  前記工程（３）又は（ｅ）における信号の計測が、検出対象を含む複合体についての、並進拡散時間、１分子当たりの蛍光強度、蛍光偏光度、散乱、の変化についての計測である、前記（I）又は（II）に記載の糖鎖の解析方法。
【００１８】
（XIII）  前記工程（３）又は（ｅ）における信号の計測が、自己相関関数解析（ＦＣＳ）、蛍光強度分布解析（ＦＩＤＡ）、蛍光偏光度解析（ＦＩＤＡ−ＰＯ）、又は散乱解析により行われる、前記（I）又は（II）に記載の糖鎖の解析方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の解析方法においては糖鎖ではなく糖レセプターを適宜標識化する。また複数種類の糖レセプターを同一反応系にて使用することが可能である。これらに起因して、試料が微量にしか入手できない場合においても、更に多種類の試料を対象とする場合においても、効果的且つ迅速に糖鎖の解析を行うことが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の糖鎖の解析方法は、（１）糖鎖を含む解析対象と、当該糖鎖に特異的に結合する糖レセプターを光学的に検出可能な標識で適宜ラベルしたものとを接触させ、当該糖鎖と糖レセプターからなる複合体を形成させる工程；（２）当該複合体の検出に適する波長の光を当該複合体に照射する工程；及び（３）当該複合体からの信号を計測する工程；を含むものである。
工程（１）においては、糖鎖を含む解析対象ではなく糖レセプターを適宜標識する。そのため、微量にしか存在しないか、又は存在するかどうか不明の糖鎖含有試料を標識するといった不確実な作業を行う必要がなくなる。糖鎖含有試料と糖レセプターとから形成される複合体は、糖レセプター単独時とは異なる光学的性質を帯び、及び/又は異なる光学的挙動をとる。従って、工程（２）においては当該性質又は当該挙動の検出に適した波長の光を照射し、次いで工程（３）で複合体からの信号を適切な手段により計測することにより、当該複合体の存在やその性質についての情報を入手することが可能になる。
【００２１】
本願発明の方法において解析対象とすることができる糖鎖含有試料は、糖鎖を含む試料であれば特に限定されないが、主として真核細胞由来の糖タンパク質を挙げることができる。細胞からの抽出物及び遺伝子工学的手法により真核細胞において産製したものの何れをも対象とすることができる。しかし本発明の解析方法においては、糖鎖を含む試料を標識化することなく測定・解析できるので、微量にしか入手できない天然由来のものを対象とする場合に特にその効果を発揮する。
【００２２】
本願発明の方法において使用することができる糖レセプターとしては、糖鎖を特異的に認識できる蛋白質等を挙げることができる。より具体的には、レクチン、抗体等である。入手及び標識化の容易性の観点からは、レクチンが好ましい。レクチンは、その種類によって認識する糖鎖の構造が異なり、例えばConA（コンカナバリンA）はマンノース結合型、LCA（レンチルレクチン）はフコース結合型、WGA（小麦胚芽アグルチニン）はN-アセチルグルコースアミン結合型である。これらのレクチンには、光学的に検出可能な標識、例えば当該技術分野で知られる蛍光標識を使い、公知の方法により適宜ラベル化を施しておく。使用可能な蛍光標識の種類としては、Rhodamine Green、AlexaFluoro488、TAMRA、TRITC、DY630、AlexaFluoro647等の商品名又は慣用名で販売されるものを挙げることができるが、これら以外のものも利用することができる。あるいは、市販されている蛍光標識化済のレクチンを使用することも可能である。更には分子生物学的な手法において、例えば非天然アミノ酸をアンバーコドン又は４塩基コドンなどの配列に対応させ、そのコドンに対応した蛍光標識ｔRNAを用いることで、レクチンの蛍光標識化を行うことも可能である。この場合、レクチン１分子当たりの蛍光分子数を予め決定し、その設計に沿ったものを調製することが可能である。そのため蛍光強度分布解析においては、糖蛋白質に結合する蛍光標識レクチンの数を正確に定量することが可能になる。また、糖レセプターを遺伝子工学的に産製させたものとする場合には、予めGFP（緑色蛍光蛋白質）やRFP（赤色蛍光蛋白質）等の蛍光性蛋白質との融合蛋白質を作製し、適宜分離・精製したものを標識化済糖レセプターとして利用することも可能である。
尚、上記では複合体検出のために糖レセプターをラベル化したが、当該検出を複合体からの散乱光の検出により行う場合には、ラベル化の必要はない。
【００２３】
本発明の解析方法においては、まず、解析対象中の糖鎖に特異的に結合する糖レセプターに、光学的に検出可能な標識で適宜ラベルしたものと、当該糖鎖を含む解析対象とを接触させる。この接触は、液相又は固相において行うことができる。液相における接触は、解析対象を含む溶液と、適宜標識化した糖レセプターを含む溶液を、複合体形成に適した条件下で混合することにより行うことができる。一方、固相における接触は、解析対象又は糖レセプターの何れかを担体・基体（例えば金コロイドやラテックスビーズ）に固相化しておき、これにもう一方を含む試料を接触させることで行うことができる。解析対象試料である糖鎖が微量にしか存在しないか、存在するか否かが不明の際に固相接触を行う場合は、標識化済糖レセプター側を固相化することが好ましい。
【００２４】
解析対象と糖レセプターとの複合体形成は、結合特異性が阻害されず、より好ましくは以下の検出工程が阻害されない条件下で行う。接触を固相において行う場合には、接触時の環境（溶液組成等）と、検出時の環境とを変えることもより容易であり、適宜洗浄工程を接触工程と検出工程との間に含めることが可能である。従って、複合体形成のための条件が検出工程を阻害する可能性がある場合、固相での接触により複合体を形成し、複合体検出前に洗浄工程を行うことが好ましい。
【００２５】
解析対象と糖レセプターとの複合体形成のための反応条件は、解析する糖鎖及び糖レセプターとの関係によって決まるものであり、当業者らが決定できるものである。複合体が糖鎖とレクチンとの組合せからなる場合、通常の反応条件は室温〜２４℃で、３０〜６０分間である。
【００２６】
本発明の解析方法においては次に、上記複合体の検出に適する波長の光を当該複合体に照射する工程を行う。糖レセプターを標識化している場合には、そのラベルの種類に適した波長の光を照射する。本発明において好ましい標識は蛍光標識であり、当業者は使用する蛍光標識の特性に応じて波長を決定することができる。一方、糖レセプターを標識化せず、散乱光を利用して解析を行うことも可能である。
【００２７】
本発明の解析方法においては次に、特定波長の光が照射された上記複合体からの信号を計測する。この計測には、例えばオリンパス社製の１分子蛍光分析システムMF20を使用することができる。MF20では、１０００兆分の１リットルという超微小領域中での１分子レベルの挙動を、自己相関関数解析（FCS）、蛍光強度分布解析（FIDA）、蛍光偏光度解析（FIDA-PO）により、大量の試料であっても同時且つ短時間で検出・解析することができるよう、反応系及び計測系が構成されている。またMF20の反応系・計測系は、生体内に近い環境とすることができ、精度が高く効率的な解析を行うことができる。
【００２８】
自己相関関数解析法（FCS）では、標識された分子が拡散する時間（並進拡散時間）を求めることができる。そして並進拡散時間は分子の大きさにより変化する。そのため、解析対象の分子がその他の分子と相互作用して複合体を形成する場合や、逆に分子が分解されて、より小さい分子になる場合には、並進拡散時間の変化として、分子の大きさの変化を検出することが可能となる。
【００２９】
蛍光強度分布解析法（FIDA）では、１分子当たりの蛍光強度、及び（試料中の）分子数を求めることができる。例えば１の糖蛋白質が複数種類の糖鎖を有する場合、それぞれの糖鎖には異なる糖レセプターが結合できる。この場合、それぞれの糖鎖に標識化済糖レセプターが結合することで、複合体１分子当たりの（蛍光）標識強度が変化する。従って、この（蛍光）標識強度の変化を解析することで、解析対象である当該糖蛋白質に結合している糖鎖の数を決定することが可能となる。
【００３０】
蛍光偏光度解析（FIDA-PO）では、蛍光標識した解析対象からの蛍光偏光を解析することで、（蛍光）標識分子の回転拡散状態を１分子レベルで検出することができる。そしてこの解析方法で求められる蛍光偏光度は、分子の大きさにより変化する。従ってこの変化を計測することで、上記の自己相関関数解析の場合と同様に分子間の相互作用や分子の崩壊現象を観測することが可能となる。
【００３１】
以上のように本発明においては、糖鎖及び適宜標識化した糖鎖レセプターの複合体に適切な波長の光を照射し、当該複合体からの信号を適切な方法により計測することで、解析対象物中の糖鎖成分や糖鎖の状態についての知見を得ることが可能となる。
【００３２】
本発明の糖鎖の解析方法においては、複合体形成前に、糖鎖レセプターを適宜ラベルしたもの単体についての計測を行うことができる。即ち、（ａ）糖鎖を含む解析対象中の糖鎖に特異的に結合する糖レセプターを光学的に検出可能な標識で適宜ラベルしたものに、当該糖レセプターの検出に適する波長の光を照射する工程；及び（ｂ）当該糖レセプターからの信号を計測する工程；を行い、糖鎖を含む解析対象が結合していない糖レセプターについての光学的性質・挙動をあらかじめ計測しておく。
次いで、上記（１）〜（３）と同様の工程を行う。即ち、（ｃ）上記工程（ｂ）後の糖レセプターに、当該糖鎖を含む解析対象を接触し、当該糖鎖及び当該糖レセプターからなる複合体を形成する工程；（ｄ）上記工程（ａ）と同一波長の光を当該複合体に照射する工程；及び（ｅ）当該複合体からの信号を計測する工程；を行う。
そして工程（ｂ）における計測結果と工程（ｅ）における計測結果とを比較することで、解析対象中の糖鎖についての情報を得ることが可能になる。
【００３３】
本発明の糖鎖の解析方法においては、糖鎖の濃度と光学的計測値との間の関係についての検量線を予め作成しておき、濃度未知の解析対象についての計測結果をこの検量線に当てはめることで、当該解析対象中の糖鎖についての情報を定量的に得ることも可能である。例えば、上記（１）〜（３）の工程を含む方法において、（４）上記糖鎖と同一種類の糖鎖であって濃度既知のものにより予め作成された検量線に基づき、上記工程（３）で計測した値から検出対象中の糖鎖を定量する工程を更に行うことで、濃度未知の解析対象中の糖鎖の濃度を定量することが可能となる。
【００３４】
検量線を作成すると、濃度に関して複数の点で計測値を求めることになり、糖鎖と糖レセプターとの間の反応の強さ（Kd値）を求めることも可能になる。糖鎖の濃度が低い場合、糖蛋白質分子と結合する（蛍光）標識済糖レセプターの割合は低くなるため、FCS解析における並進拡散時間は短く、またFIDA-PO解析における蛍光偏光度は小さいものとなる。糖鎖の濃度が高い場合、糖蛋白質分子と結合する（蛍光）標識済糖レセプターの割合は高くなるため、並進拡散時間は長くなり、蛍光偏光度は大きいものとなる。一方、コントロールとして解析対象物中の糖鎖に特異性のない糖レセプターを使うと、並進拡散時間及び蛍光偏光度と、糖鎖濃度との間には相関関係が見られない。従って濃度が既知であり且つ複数の濃度点において、糖鎖特異的な糖レセプターを使って計測した結果を基に作成した検量線に、濃度未知の糖鎖含有試料の計測結果を当てはめることで、当該糖鎖の濃度を求めたり、糖蛋白質と糖レセプターとの間の相互作用の強さ（Kd値）を求めることが可能となる。
【００３５】
１分子当たりの蛍光強度分布の変化がFIDA解析法において観測される場合、糖蛋白質に結合する糖レセプターの数の変化が示唆される。FIDA解析法では、検出された蛍光分子の数と、１分子当たりの蛍光強度を算出することができるため、これらの算出結果に基づいて糖蛋白質１分子当たりに結合している糖レセプターの数、即ち糖蛋白質上の糖鎖の数についての知見を得ることが可能となる。
【００３６】
本発明の糖鎖の解析方法においては、前記糖レセプターを、それぞれが特定の種類に対して特異的に結合する、複数種類の糖レセプターの集合とすることができる。そしてこの場合に、特異性の異なるそれぞれの糖レセプターに、分光特性が互いに有意に異なる、光学的に検出可能な標識でラベル化を施すことにより、複数種類の糖鎖の検出・解析を同一反応系内で行うことが可能になる。即ち、上記工程（１）又は（ｃ）において、前記糖レセプターと前記解析対象との接触を、複数の糖レセプターについて同一の反応系内で行うことが可能になる。これにより解析に使用する装置の構成を簡略化することが可能になる。
【００３７】
複数種類の糖レセプターを用いる上記の方法を採用する場合、解析対象中の糖鎖が予め具体的に特定できていない状況下でも実施することができる。即ち、糖鎖に対して親和性の異なる複数種類の糖レセプター（レクチン等）に、光学的検出波長が有意に異なる蛍光標識を施し、これら全ての糖レセプターを解析対象と混合して複合体を形成させる。そしてこの複合体に対してFCS解析を行う。特定の糖鎖レセプターが糖鎖に結合している場合、複合体形成に伴い分子の並進拡散時間が長くなる。この変化をそれぞれの蛍光標識に適した波長において観測することで、どの糖レセプターが糖鎖に結合したかを同定することが可能となり、その結果、糖鎖の成分を同定することが可能になる。
複数種類の糖レセプターを同一反応系にて使用することができるため、本発明の方法は、微量にしか入手できないの解析に特に効果を発揮する。さらには、特定の糖鎖を有する対象物をスクリーニングすることにも効果を発揮することができる。
【００３８】
複数種類の糖レセプターを用いる上記の方法において、当該糖レセプターが蛍光標識されている場合には、蛍光相互相関解析（FxCS）により、上記工程（３）又は（ｅ）を行うことができる。蛍光相互相関解析においては、複数種類の糖レセプターが糖鎖に結合している場合、即ち糖鎖が複合糖鎖である場合、それぞれの糖レセプターに付加されている蛍光標識の検出に適した波長の光を照射すると、種類の異なる糖鎖の間での蛍光相互相関が観測される。従って蛍光相互相関が観測された場合には、使用した複数種類の糖レセプターが特異的に認識できる糖鎖を、解析対象の試料が有していることが同定される。使用する糖レセプターが３種類以上の場合には、ダイクロイックミラーや、蛍光フィルターを適宜使用するなど、検出系の構成を工夫したり、これに併せて蛍光標識分子の励起用光源を、ガルバノミラー等を用いる工夫をすることで、３種類以上の蛍光の中より特定の２種類の蛍光のみを選択し、それ以外の蛍光を除去することが可能である。
【００３９】
上記蛍光相互相関解析を行う場合において、測定の結果、特定の蛍光の組合せにおいて相互相関が解析されなかった場合には、その後に、工程（Ｘ）：各標識からの信号をＦＣＳにより解析する工程を行うことができる。相互相関が観測されなかった場合には、解析対象が複合糖鎖ではないことが示されるが、解析に使用した糖レセプターが糖鎖に結合している限りにおいては、引き続いてＦＣＳ解析を行うことで、ＦｘＣＳ解析に用いた同一試料を使って、糖鎖の解析を行うことが可能である。これにより、微量にしか存在しない試料を有効活用することができる。
【００４０】
糖鎖を含む解析対象試料が糖蛋白質である場合、遺伝子工学的手法によりアミノ酸配列に変異を起こしたものについて上記のようにFCS解析を行うと、変異に伴って糖鎖が付加されたか否かについて同定することも可能となる。蛋白質上の糖鎖付加部位が事前にわからない場合においては、糖鎖付加が予想される複数の部位についての変異体を調製する必要があるが、本発明の解析方法は、従来の表面プラズモン共鳴法等に比べてスループットが良好であるため、多数の試料数を取り扱う必要が生じる上記のような場合であっても、迅速に計測・解析を行うことが可能である。
【００４１】
本発明の解析方法は固相において行うことができるが、その場合、糖レセプター側を担体・基体に固相化する。糖レセプターの固相化に適する担体・基体の例としては、種々の金属のコロイド粒子（金コロイド等）；ラテックス等の樹脂ビーズ、半導体、ガラス等の粒子、磁気ビーズ等を挙げることができる。磁気ビーズを用いると、固相化担体の洗浄を自動で行う場合に好適に用いることができる。
【００４２】
上記の方法（I）〜（VII）において、多種類の糖レセプターを利用する場合には、その数だけ種類の異なる蛍光標識を用意する必要がある。しかしながら、費用の観点からは、それぞれが光学的性質の異なる多種類の蛍光標識を準備することは困難である。また、糖レセプター側の問題も存在する。即ち、使用する糖レセプターが糖鎖に比べて分子量が大きいものである場合、糖鎖への結合の前後における分子量変化が相対的に小さくなり、分子の大きさ変化に起因した光学的性質の変化を測定する本発明の場合、計測の精度が低下するという問題がある。
【００４３】
そこで本発明においては、異なる濃度の二種類の蛍光色素の組合せで標識されたビーズの組合せである基体のそれぞれに、結合特異性の異なる糖レセプターがそれぞれ固相化されたものを利用することも可能である。このようなビーズを用いる場合には、異なる濃度の蛍光色素の組合せを識別コードとして利用することが可能になる。即ち、当該組合せで標識されたビーズに、それぞれの蛍光色素に適した波長の光を照射して蛍光色素を励起する。そして励起蛍光をそれぞれの波長に適したバンドパスフィルタに通し、透過光を光センサを利用して電流に変換する。蛍光色素の濃度の組合せが異なるそれぞれのビーズ同士を比較すると、変換された電流値の差として検出されるので、この電流値の差異に基づいて、検出した蛍光がどのビーズ由来であるかを同定することが可能である。蛍光色素の濃度の組合せとしては、検出系において電流値の差異を有意に検出できる限りにおいて特に限定されることはないが、２種類の蛍光色素について数十〜１００種類程度の組合せ数であることが好ましい。このようなビーズとしては、Luminex（登録商標）として市販されているものを利用することができる。Luminexでは、二つの蛍光色素の濃度をそれぞれ１０段階用意し、これらの組み合わせて蛍光色素の組合せが１００種類のマイクロビーズを作製している。
【００４４】
上記のような、異なる濃度の蛍光色素の組合せで標識したビーズを利用する場合、上記（１）〜（３）の工程、又は上記（ａ）〜（ｅ）の工程を有する方法においては、工程（１）と（２）の間、又は前記工程（ｃ）と（ｄ）の間において、
（Ｙ）前記糖レセプターが認識する部位とは異なる、解析対象上の糖鎖以外の部位を特異的に認識する分子（例えば抗体）を、当該ビーズの標識に用いられている蛍光色素の組合せの分光学的性質とは異なる分光学的性質を有する蛍光色素によりラベルしたものを、糖鎖及び糖レセプターからなる複合体を含む反応系に添加する工程；
を更に行う。そして当該工程（３）又は（ｅ）において、当該ビーズからの蛍光と、当該糖鎖以外の部位を認識する分子（抗体等）からの蛍光とについて蛍光相互相関分析（ＦｘＣＳ）を行うことができる。
【００４５】
この場合、解析対象である分子（例えば糖蛋白質）中に解析対象の糖鎖が存在すると、蛍光色素の組合せを有するビーズで標識された糖レセプターが当該糖鎖を認識し、当該糖鎖を有する糖蛋白質の糖鎖以外の部分に抗体が結合する。そしてこの抗体には、ビーズの標識に用いられている蛍光色素の組合せの分光学的性質とは異なる分光学的性質を有する蛍光色素によりラベル化されているので、糖鎖、糖レセプター、及び抗体からなる大きな複合体が形成されている。そしてこの複合体にはビーズの標識と、抗体に付加された標識との二種類の標識が存在しているため、これらの標識について蛍光相互相関分析（ＦｘＣＳ）を行うことができる。
【００４６】
上記のビーズを利用する方法は、例えば糖蛋白質を解析対象としており、蛋白質部分については抗体も入手できているが、糖鎖部分についてはどのようなタイプの糖鎖であるかが不明の場合に、数多くのレクチンを使って、糖鎖解析を行いたい場合に、特に好適に利用することができる。特定の濃度の組合せで標識されたビーズと、抗体に施された標識との間に蛍光相互相関が見られる場合には、当該ビーズに共役させたレクチンが認識する糖鎖が存在することがわかり、当該蛍光相互相関が見られない場合には、当該レクチンが認識する糖鎖が存在しないことがわかる。そして複数のレクチンに関しての情報を、一つの反応系・検出系により入手することが可能である。
【００４７】
上記のビーズを利用する方法においては、標識として用いられる当該ビーズに複数の糖レセプターを結合することができるため、１つのビーズに対して複数の糖鎖含有試料を結合させることができる。従って、糖鎖含有試料に対する分子量比が相対的に大きかった標識を使う場合に、複合体形成前後で大きな分子量変化を得られなかったという問題を解決することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の糖鎖解析方法においては、糖鎖を標識化する必要がないため、微量にしか存在しない糖鎖試料の解析を効果的に行うことが可能であり、プロテオーム研究及びその応用分野に有効活用することができる。
【実施例１】
【００４９】
糖タンパク質の定量
糖レセプターとしてレクチン分子Con Aに、蛍光標識Alexa488によるラベル化が施されたAlexa488-ConA（Molecular Probes P-21462）を用いた。糖タンパク質としては、ConAが認識するマンノースを持つ糖鎖を１個保有しているmouseIgG（Jucson Immunoreserch Code No. 00500003,Lot No.65361）を用いた。
まず、10ng/mlから10mg/mlまでの濃度のmouseIgG抗体溶液を作製した。次に、Alexa488-ConAをバッファ（PBS）で希釈し、約５〜10nMの濃度に調整した。上記で濃度勾配を作製したmouseIgG 溶液にAlexa488-ConAを添加し、室温（24℃）で30分の反応を行った。
反応物（Alexa488-ConAと、mouseIgGとからなる複合体）からの蛍光の計測はオリンパス社製MF２０を使って行った。MF20により、FCS解析、FIDA解析、FIDA-PO解析を行い、各抗体濃度におけるAlexa488-ConAの並進拡散時間、又は蛍光偏光度をもとめ、各抗体濃度でこれらの値をプロットし、検量線を作成した。FCS解析の結果を図１に示した。この検量線を使えば、mouseIgGと同程度の分子量（100〜150ｋDa程度）を有する、濃度が未知の糖蛋白質についても、Alexa４８８-ConAと反応させFCS計測すれば、その並進拡散時間から当該糖蛋白質の濃度を求めることができる。
【実施例２】
【００５０】
糖タンパク質の糖鎖の数に関する解析
糖レセプターとして、レクチン分子ConAに蛍光色素蛍光標識Alexa488によるラベル化が施されたAlexa488-ConA（Molecular Probes P-21462）を用いた。糖タンパク質としては、ConAが認識するN型糖鎖が複数個結合している糖タンパク質を用いた。
まず、Alexa488-ConAの濃度を約10ｎMに固定し、これに対して濃度の異なる試料糖タンパク質を添加し、２４℃で３０分間反応した。そしてMF20にてFCS解析、及びFIDA解析を行った。その結果を図２及び図３に示した。
図２に示されるFCS解析の結果からは、試料糖蛋白質の濃度が濃くなるにつれて、Alexa488-ConAの蛍光色素を有する分子の並進拡散時間が長くなり、Alexa488-ConAが糖タンパク質と相互作用したことが確認された。次に図３に示されるFIDA解析の結果からは、1分子あたりの蛍光強度が糖タンパク質の濃度に伴い大きくなり、これに伴って検出される蛍光分子数が少なくなることが確認された。これは試料糖蛋白質に複数のAlexa488-ConAが結合し、試料糖蛋白質1分子あたりの蛍光強度が大きくなったことを示している。また検出される蛍光分子数が少なくなったのは、試料中に存在しているAlexa488-ConAの数は一定であることから、複数のAlexa488-ConAが1つの分子にいくつか結合したことを示唆するものである。またFCS計測結果からも並進拡散時間が長いものが観測されており分子量のかなり大きいものであることが推測され、この点からも１分子に複数のAlexa488-ConAが結合したことを支持する。
ここでAlexa488-ConAモノマーの1分子あたりの蛍光強度を基準にして、蛍光強度が大きくなったときの（複合体）分子の蛍光強度の相対比を求めた。相対比は、糖タンパク質1分子に結合しているAlexa488-ConAが約４.5個であることを示した。つまり糖タンパク質の糖鎖に存在するConAの認識する糖鎖ユニットは約4.5個であることがわかる。Alexa488-ConAの濃度を1から20ｎM程度に変化させて行なった場合には、糖鎖と結合するAlexa488-ConAの数が多くなるから、長い糖鎖の解析にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】この図は、レクチンConAを蛍光標識Alexa488でラベル化したものを用いてmouse IgGの濃度を、FCS解析により定量した結果を示すものである。
【図２】この図は、レクチンConAを蛍光標識AlexaFluoro488でラベル化したものを用いて、N型糖鎖が複数個結合している糖蛋白質の濃度を、FCS解析により定量した結果を示すものである。
【図３】この図は、図２に結果の示されている同一の糖蛋白質についてFIDA解析により１分子当たりの蛍光強度変化を定量した結果を示すものである。
【図１】
2008157724.tif 000003
【図２】
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【図３】
2008157724.tif 000005