(57)【要約】      （修正有）【課題】癌治療の治療薬の提供。【解決手段】哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する医薬化合物として、非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質及びサブスタンスＰを使用し、ヒトの癌治療、例えば浸潤性悪性黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、ホジキン(Hodgkin)リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、星細胞腫、横紋筋肉腫、ヒト乳癌、バーキット(Burkitt)リンパ腫、肺癌、エドウィング(Edwing)肉腫、ヒト骨肉腫の治療におけるサブスタンスＰ拮抗物質、具体的には非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化合物：
・アプレピタント(aprepitant)またはＭＫ８６９またはＬ−７５４０３０（ＭＳＤ）
・Ｌ−７５８２９８（ＭＳＤ）
・Ｌ−７３３０６０（ＭＳＤ／Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
・ＴＡＫ−６３７（Ｔａｋｅｄａ／Ａｂｂｏｔ）
・ＧＷ５９７５９９（ＧＳＫ）
・ＧＷ６７９７６９（ＧＳＫ）
・Ｒ６７３（Ｒｏｃｈｅ）
の中から選択される拮抗物質を特徴とする哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する医薬化合物の発生(development)のための非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用であって、
該拮抗物質が作用する腫瘍細胞は、下記群：
−浸潤性原発性および浸潤性悪性黒色腫
−転移性黒色腫細胞
−神経節、リンパ節に局在化する細胞
−神経膠腫細胞
−ヒト乳癌細胞
−急性リンパ芽球性白血病Ｂ細胞
−急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞
−原発性神経芽細胞腫細胞
−星細胞腫細胞
−バーキット(Burkitt)リンパ腫細胞
−ホジキン(Hodgkin)リンパ腫細胞
−横紋筋肉腫細胞
−小肺癌細胞
−エドウィング(Edwing)肉腫細胞
−骨肉腫細胞
から選択され、それ故、多数のＮＫ１受容体を非腫瘍細胞に存在するものよりも、４００％から５００％も優れて呈示する、非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
【請求項２】
Ｌ−７３３０６０として市販される拮抗物質（２Ｓ，３Ｓ）３−｛[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ｝−２−フェニルピペリジンの使用を特徴とする、請求項１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する医薬化合物の発生のための非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
【請求項３】
５μＭ〜５０μＭからなる濃度で使用される拮抗物質Ｌ−７３３０６０を特徴とする、請求項２に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する医薬化合物の発生のための非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
【請求項４】
拮抗物質が作用するヒト黒色腫に関連する腫瘍細胞が、セルラインＣＯＬＯ８５８[ＩＣＬＣ、Interlab Cell Line Collection−ＣＢＡ−Genova）、ＭＥＬＨＯ[ＤＳＭＺ、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen]およびＣＯＬＯ６７９[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
【請求項５】
前記拮抗物質が作用するヒト神経膠腫および神経芽細胞腫に関連する腫瘍細胞が、セルラインＧＡＭＧ[ＤＳＭＺ]およびＳＫＮ−ＢＥ（２）[ＩＣＬＣ]に属することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
【請求項６】
前記拮抗物質が作用するリンパ芽球性白血病に関連する腫瘍細胞が、セルラインＢＳＤ１[ＤＳＭＺ]およびＴＢＥ−１３[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
【請求項７】
前記拮抗物質が作用するバーキットリンパ腫に関連する腫瘍細胞が、セルラインＣＡ−４６[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
【請求項８】
前記拮抗物質が作用するホジキンリンパ腫に関連する腫瘍細胞が、セルラインＫＭ−Ｈ２[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
【請求項９】
前記拮抗物質が作用する横紋筋肉腫に関連する腫瘍細胞が、セルラインＡ−２０４[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
【請求項１０】
前記拮抗物質が作用する小細胞肺癌に関連する腫瘍細胞が、セルラインＣＯＬＯ−６７７[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
【請求項１１】
前記拮抗物質が作用する乳癌に関連する腫瘍細胞が、セルラインＭＴ−３[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
【請求項１２】
前記拮抗物質が作用するエドウィング肉腫に関連する腫瘍細胞が、セルラインＭＨＨ−ＥＳ−１[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
【請求項１３】
前記拮抗物質が作用する骨肉腫に関連する腫瘍細胞が、セルラインＭＧ−６３[ＩＣＬＣ]に属することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
【請求項１４】
癌治療用医薬化合物の発生のための、請求項４〜１３のいずれか１に記載される、非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
【請求項１５】
哺乳動物の下記腫瘍細胞：
・浸潤性原発性および浸潤性悪性黒色腫
・転移性黒色腫細胞
・神経節、リンパ節に局在化する細胞
・神経膠腫細胞
・ヒト乳癌細胞
・急性リンパ芽球性白血病Ｂ細胞
・急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞
・原発性神経芽細胞腫細胞
・星細胞腫細胞
・バーキットリンパ腫細胞
・ホジキンリンパ腫細胞
・横紋筋肉腫細胞
・小肺癌細胞
・エドウィング肉腫細胞
・骨肉腫細胞
のための治療方法であって、
多数のＮＫ１受容体を非腫瘍細胞よりも４００％〜５００％も大きく呈示する、哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する医薬を患者に投与し、かつ、
該医薬の組成は、拮抗物質が下記化合物：
・アプレピタントまたはＭＫ８６９またはＬ−７５４０３０（ＭＳＤ）
・Ｌ−７５８２９８（ＭＳＤ）
・Ｌ−７３３０６０（ＭＳＤ／Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
・ＴＡＫ−６３７（Ｔａｋｅｄａ／Ａｂｂｏｔ）
・ＧＷ５９７５９９（ＧＳＫ）
・ＧＷ６７９７６９（ＧＳＫ）
・Ｒ６７３（Ｒｏｃｈｅ）
の中から選択される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰに基づくことを特徴とする治療方法。
【請求項１６】
前記医薬が非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成され、かつ、拮抗物質がＬ−７３３０６０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）として市販される（２Ｓ，３Ｓ）３−｛[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ｝−２−フェニルピペリジンである、請求項１５に記載される、前記細胞のアポトーシスを誘発することによる腫瘍細胞の治療のための医薬。
【請求項１７】
拮抗物質Ｌ−７３３０６０が５μＭ〜５０μＭからなる濃度で使用されることを特徴とする、請求項１６に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される、前記細胞のアポトーシスを誘発することによる哺乳動物の腫瘍細胞の治療のための医薬。
【請求項１８】
拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＣＯＬＯ８５８[ＩＣＬＣ、Interlab Cell Line Collection−ＣＢＡ−Genova）、ＭＥＬＨＯ[ＤＳＭＺ、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen]およびＣＯＬＯ６７９[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒト黒色腫に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
【請求項１９】
拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＧＡＭＧ[ＤＳＭＺ]およびＳＫＮ−ＢＥ（２）[ＩＣＬＣ]に属することを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒト神経膠腫および神経芽細胞腫に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
【請求項２０】
拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＢＳＤ１[ＤＳＭＺ]およびＴＢＥ−１３[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによる哺乳動物リンパ芽白血病に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
【請求項２１】
拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＣＡ−４６[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるバーキットリンパ腫に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
【請求項２２】
拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＫＭ−Ｈ２[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒトホジキンリンパ腫に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
【請求項２３】
拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＡ−２０４ [ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒト横紋筋肉腫に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
【請求項２４】
拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＣＯＬＯ−６７７ [ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒト小細胞肺癌に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
【請求項２５】
拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＭＴ−３ [ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒト乳癌に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
【請求項２６】
拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＭＨＨ−ＥＳ−１ [ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒトエドウィング肉腫に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
【請求項２７】
拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＭＧ−６３ [ＩＣＬＣ]に属することを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒト骨肉腫に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
【発明の詳細な説明】
【発明の技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、ヒトの癌治療、明白には黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、ホジキン(Hodgkin)−ＫＭ−Ｈ２リンパ腫、リンパ芽球性白血病、横紋筋肉腫、乳癌、バーキット(Burkitt)リンパ腫、肺癌、エドウィング(Edwing)肉腫およびヒト骨肉腫の治療におけるサブスタンスＰ拮抗物質、具体的には非ペプチド性ＮＫ１受容体拮拮抗物質の使用にある。
【発明の背景】
【０００２】
サブスタンスＰは、タチキニン(Tachykinins)ファミリー由来の天然ウンデカペプチドであり、平滑筋組織への急速な刺激作用のために使用される。より具体的には、サブスタンスＰは哺乳動物中に産生される活性な薬理学的神経ペプチドである。これは元来、腸で単離されて、D.F. Veber、米国特許第４，６８０，２８３号に記載されているアミノ酸配列を有する。サブスタンスPの特徴は、他のタチキニンと同様に、文献中で十分に証明されている多数の疾病における生理病理学に見られる。
【０００３】
サブスタンスP受容体は、Ｇ−タンパク結合受容体のスーパーファミリーの一員である。サブスタンスＰ（ＮＫ−１）の神経ペプチド受容体は、哺乳動物の神経系（特に、大脳や脊髄）、循環系および末梢組織（特に、十二指腸や空腸）に多く分布されていて、様々な生物学的過程の調節に関与している。
哺乳動物でのタチキニンの中枢作用および末梢作用は、片頭痛、リウマチ関節炎、喘息および腸炎症性疾患などの種々の炎症性状態、ならびに悪心反射およびパーキンソン病などのＣＮＳ神経系障害の制御（Neurosci. Res., 1996, 7,187-214）、不安（Can. J. Phys.;1997, 612-621）およびうつ病（Science, 1998, 281, 1640-1645）の仲介に関連している。
【０００４】
「タチキニン受容体およびタチキニン受容体拮抗物質」と題する文献、J. Auton, Pharmacol.; 1993, 13, 2-93では、サブスタンスＰの拮抗物質の用途が、頭痛、特に片頭痛、アルツハイマー病、多発性硬化症、鎮痛剤非存在下での症候群の減弱、心血管の変化、火傷により引き起こされる浮腫、リウマチ関節炎、喘息、機能亢進性気管支などの急性炎症疾患、およびアレルーギー性鼻炎を含む他の呼吸系疾患などの治療において証明されている。
また、米国特許第５９７２９３８号は、ＮＫ１受容体拮抗物質の投与による、精神免疫学的障害または精神運動の治療方法を記載する。
Nature, 2000, 405(6783), 180-183に発表された論文は、ＮＫ−１受容体を欠くラットの活性を詳しく述べ、モルヒネの有利な効果の減少を示している。その結果、ＮＫ−１拮抗体受容体は、鎮痛剤、ニコチンに関連するものなど、ある種の薬剤中毒習慣の断絶、ならびに薬剤の乱用の減少および禁断に使用することができる。
Life Sci.; 2000, 67(9), 985-1001の論文には、星状膠細胞がサブスタンスＰの受容(reception)において種々の神経伝達物質の機能的な受容体を発現すると記載される。星状膠細胞由来の悪性膠細胞の大脳腫瘍は、ＮＫ−１受容体を仲介するタチキニンの作用のもとに再増殖の速度を増大する可溶性媒介物を分泌して解消される(unchain)。その結果、ＮＫ−１の選択的拮抗物質は悪性神経膠腫の治療および癌の治療の非常に有用な治療薬となる。
【０００５】
さらに、The New Journal of Medicine, 1999, 340,190-105には、選択的ＮＫ１受容体の使用がシスプラチンを使用することによる嘔吐の低下を誘発すると記載される。 
Antal Orosz et al., The International Journal of Cancer, 1995, 60, 82-87に発表された論文には、サブスタンスP（ＳＰ）の多様なペプチド拮抗物質の使用は、肺癌細胞（例、細胞ＮＣＩ−Ｈ６９）の増殖を阻害すると記載される。同様に重要なことには、Cancer Research, 1994, 54, 3602-3610に発表された論文には、ＳＰの他の拮抗物質ならびに癌性肺細胞（例、細胞ＮＣＩ−Ｈ５１０、ＮＣＩ−Ｈ３４５およびＳＨＰ−７７）の種々のインビボラインの成長を阻害することが可能である他のペプチドが記載される。
ヨーロッパ特許第７７３０２６号（Pfizer）には、乳癌の治療、特にアプドーマ（APUdoma）、神経内分泌腫瘍および小外肺癌腫の小肺癌の治療における非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質の使用が記載される。
さらに、特許ＷＯ２００１００１９２２には、腺癌、最も具体的には前立腺癌腫の治療におけるＮＫ１受容体の使用が記載される。Giardina, G.; Gagliardi S.およびMartinelli M.では、「ニューロキニン受容体の拮抗物質−最近の特許文献」(IDrugs 2003; 6(8): 758-772)にＮＫ１、ＮＫ２およびＮＫ３受容体に関する最近の特許を考察している。著者は、最も価値ある可能性ある用途の具体的な徴候をもつ、最も重要な世界的生産者の分子の作用が、うつ病、炎症、不安、嘔吐、潰瘍性大腸炎および他の疾病の治療に使用されることを記載する。
【発明の要約】
【０００６】
本発明の目的は、乳癌腫瘍のアポトーシス生成における非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質とサブスタンスＰの使用である。拮抗物質が作用する腫瘍細胞は、非腫瘍細胞におけるよりも非腫瘍細胞の通常の数の４００％〜５００％をも優れている、多数のＮＫ１受容体を呈示する。
【０００７】
詳しくは、以下の通りである。
「１．下記化合物：
・アプレピタント(aprepitant)またはＭＫ８６９またはＬ−７５４０３０（ＭＳＤ）
・Ｌ−７５８２９８（ＭＳＤ）
・Ｌ−７３３０６０（ＭＳＤ／Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
・ＴＡＫ−６３７（Ｔａｋｅｄａ／Ａｂｂｏｔ）
・ＧＷ５９７５９９（ＧＳＫ）
・ＧＷ６７９７６９（ＧＳＫ）
・Ｒ６７３（Ｒｏｃｈｅ）
の中から選択される拮抗物質を特徴とする哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する医薬化合物の発生(development)のための非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用であって、
該拮抗物質が作用する腫瘍細胞は、下記群：
−浸潤性原発性および浸潤性悪性黒色腫
−転移性黒色腫細胞
−神経節、リンパ節に局在化する細胞
−神経膠腫細胞
−ヒト乳癌細胞
−急性リンパ芽球性白血病Ｂ細胞
−急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞
−原発性神経芽細胞腫細胞
−星細胞腫細胞
−バーキット(Burkitt)リンパ腫細胞
−ホジキン(Hodgkin)リンパ腫細胞
−横紋筋肉腫細胞
−小肺癌細胞
−エドウィング(Edwing)肉腫細胞
−骨肉腫細胞
から選択され、それ故、多数のＮＫ１受容体を非腫瘍細胞に存在するものよりも、４００％から５００％も優れて呈示する、非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
２．Ｌ−７３３０６０として市販される拮抗物質（２Ｓ，３Ｓ）３−｛[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ｝−２−フェニルピペリジンの使用を特徴とする、前項１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する医薬化合物の発生のための非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
３．５μＭ〜５０μＭからなる濃度で使用される拮抗物質Ｌ−７３３０６０を特徴とする、前項２に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する医薬化合物の発生のための非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
４．拮抗物質が作用するヒト黒色腫に関連する腫瘍細胞が、セルラインＣＯＬＯ８５８[ＩＣＬＣ、Interlab Cell Line Collection−ＣＢＡ−Genova）、ＭＥＬＨＯ[ＤＳＭＺ、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen]およびＣＯＬＯ６７９[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
５．前記拮抗物質が作用するヒト神経膠腫および神経芽細胞腫に関連する腫瘍細胞が、セルラインＧＡＭＧ[ＤＳＭＺ]およびＳＫＮ−ＢＥ（２）[ＩＣＬＣ]に属することを特徴とする、前項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
６．前記拮抗物質が作用するリンパ芽球性白血病に関連する腫瘍細胞が、セルラインＢＳＤ１[ＤＳＭＺ]およびＴＢＥ−１３[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
７．前記拮抗物質が作用するバーキットリンパ腫に関連する腫瘍細胞が、セルラインＣＡ−４６[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
８．前記拮抗物質が作用するホジキンリンパ腫に関連する腫瘍細胞が、セルラインＫＭ−Ｈ２[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
９．前記拮抗物質が作用する横紋筋肉腫に関連する腫瘍細胞が、セルラインＡ−２０４[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
１０．前記拮抗物質が作用する小細胞肺癌に関連する腫瘍細胞が、セルラインＣＯＬＯ−６７７[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
１１．前記拮抗物質が作用する乳癌に関連する腫瘍細胞が、セルラインＭＴ−３[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
１２．前記拮抗物質が作用するエドウィング肉腫に関連する腫瘍細胞が、セルラインＭＨＨ−ＥＳ−１[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
１３．前記拮抗物質が作用する骨肉腫に関連する腫瘍細胞が、セルラインＭＧ−６３[ＩＣＬＣ]に属することを特徴とする、前項１〜３のいずれか１に記載される哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
１４．癌治療用医薬化合物の発生のための、前項４〜１３のいずれか１に記載される、非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用。
１５．哺乳動物の下記腫瘍細胞：
・浸潤性原発性および浸潤性悪性黒色腫
・転移性黒色腫細胞
・神経節、リンパ節に局在化する細胞
・神経膠腫細胞
・ヒト乳癌細胞
・急性リンパ芽球性白血病Ｂ細胞
・急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞
・原発性神経芽細胞腫細胞
・星細胞腫細胞
・バーキットリンパ腫細胞
・ホジキンリンパ腫細胞
・横紋筋肉腫細胞
・小肺癌細胞
・エドウィング肉腫細胞
・骨肉腫細胞
のための治療方法であって、
多数のＮＫ１受容体を非腫瘍細胞よりも４００％〜５００％も大きく呈示する、哺乳動物の腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する医薬を患者に投与し、かつ、
該医薬の組成は、拮抗物質が下記化合物：
・アプレピタントまたはＭＫ８６９またはＬ−７５４０３０（ＭＳＤ）
・Ｌ−７５８２９８（ＭＳＤ）
・Ｌ−７３３０６０（ＭＳＤ／Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
・ＴＡＫ−６３７（Ｔａｋｅｄａ／Ａｂｂｏｔ）
・ＧＷ５９７５９９（ＧＳＫ）
・ＧＷ６７９７６９（ＧＳＫ）
・Ｒ６７３（Ｒｏｃｈｅ）
の中から選択される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰに基づくことを特徴とする治療方法。
１６．前記医薬が非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成され、かつ、拮抗物質がＬ−７３３０６０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）として市販される（２Ｓ，３Ｓ）３−｛[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ｝−２−フェニルピペリジンである、前項１５に記載される、前記細胞のアポトーシスを誘発することによる腫瘍細胞の治療のための医薬。
１７．拮抗物質Ｌ−７３３０６０が５μＭ〜５０μＭからなる濃度で使用されることを特徴とする、前項１６に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される、前記細胞のアポトーシスを誘発することによる哺乳動物の腫瘍細胞の治療のための医薬。
１８．拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＣＯＬＯ８５８[ＩＣＬＣ、Interlab Cell Line Collection−ＣＢＡ−Genova）、ＭＥＬＨＯ[ＤＳＭＺ、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen]およびＣＯＬＯ６７９[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒト黒色腫に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
１９．拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＧＡＭＧ[ＤＳＭＺ]およびＳＫＮ−ＢＥ（２）[ＩＣＬＣ]に属することを特徴とする、前項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒト神経膠腫および神経芽細胞腫に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
２０．拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＢＳＤ１[ＤＳＭＺ]およびＴＢＥ−１３[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによる哺乳動物リンパ芽白血病に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
２１．拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＣＡ−４６[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるバーキットリンパ腫に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
２２．拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＫＭ−Ｈ２[ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒトホジキンリンパ腫に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
２３．拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＡ−２０４ [ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒト横紋筋肉腫に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
２４．拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＣＯＬＯ−６７７ [ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒト小細胞肺癌に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
２５．拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＭＴ−３ [ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒト乳癌に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
２６．拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＭＨＨ−ＥＳ−１ [ＤＳＭＺ]に属することを特徴とする、前項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒトエドウィング肉腫に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。
２７．拮抗物質が作用する腫瘍細胞が、セルラインＭＧ−６３ [ＩＣＬＣ]に属することを特徴とする、前項１５〜１７のいずれか１に記載される非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰから構成される前記細胞のアポトーシスを誘発することによるヒト骨肉腫に関連する腫瘍細胞の治療のための医薬。」
【０００８】
また、拮抗物質が作用する腫瘍細胞は、浸潤性原発性および浸潤性悪性黒色腫−転移性黒色腫細胞−神経節リンパ節に局在する細胞−神経膠腫細胞−ヒト乳癌細胞−急性リンパ芽球性白血病Ｂ細胞−急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞−原発性神経芽細胞腫細胞−星細胞腫細胞−バーキットリンパ腫細胞−ホジキンリンパ腫細胞−横紋筋肉腫細胞−小肺癌細胞−エドウィング肉腫細胞−骨肉腫細胞から選択される。これらは、非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰが作用する特定細胞中で継続を示した。
【０００９】
本発明の拮抗物質がセルライン中で作用するヒト黒色腫に関連する腫瘍細胞は、ＣＯＬＯ８５８[ＩＣＬＣ, Interlab, Cell Line Collection-CBA-Genova]、ＭＥＬＨＯ[ＤＳＭＺ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen]およびＣＯＬＯ６７９[ＤＳＭＺ]である。
拮抗物質がセルライン中で作用するヒト神経膠腫およびヒト神経芽細胞腫に関連する腫瘍細胞はＧＡＭＧ[ＤＳＭＺ]およびＳＫＮ−ＢＥ（２）[ＩＣＬＣ]である。
本発明の拮抗物質が作用するリンパ芽球性白血病に関連する腫瘍細胞は、ヒトリンパ芽球性白血病Ｂ細胞ＳＤ１[ＤＳＭＺ]およびヒトリンパ芽球性白血病細胞ＴＢＥ−１３[ＤＳＭＺ]である。拮抗物質がセルライン中で作用するバーキットリンパ腫に関連する腫瘍細胞は、ＣＡ−４６[ＤＳＭＺ]である。拮抗物質が作用するホジキンリンパ腫に関連する腫瘍細胞は、ＫＭ−Ｈ２[ＤＳＭＺ]である。拮抗物質がセルライン中で作用する横紋筋ヒト肉腫に関連する腫瘍細胞は、Ａ−２０４[ＤＳＭＺ]である。拮抗物質がセルライン中で作用する小ヒト肺癌細胞に関連する腫瘍細胞は、ＣＯＬＯ−６７７[ＤＳＭＺ]である。拮抗物質がセルライン中で作用するヒト乳癌に関連する腫瘍細胞は、ＭＴ−３[ＤＳＭＺ]である。
本発明の拮抗物質がセルラインで作用するエドウィング肉腫に関連する腫瘍細胞は、ＭＨＨ−ＥＳ−１[ＤＳＭＺ]である。
本発明の拮抗物質がセルラインで作用するヒト骨肉腫に関連する腫瘍細胞は、ＭＧ−６３[ＩＣＬＣ]である。
【００１０】
使用される拮抗物質の１つは、Ｌ−７３３０６０(Sigma−Aldrich)として市販されている（２Ｓ，３Ｓ）３−｛[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ｝−２−フェニルピペリジンであり、５μM〜５０μMからなる濃度で使用される。
使用され得る非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの他の化合物は、ボフォピタント(vofopitant)６ＧＲ−２０５１７１(Pfizer）、−エチオピタント(eziopitant)６ＣＪ−１１９７４(Pfizer)、−ＣＰ−１２２７２１(Pfizer)、−アプレピタント(Aprepitant)６ＭＫ８６９  ６Ｌ−７５４０３０（ＭＳＤ）、−Ｌ−７５８２９８（ＭＳＤ）、−ＴＡＫ−６３７(Takeda/Abbot)、−ＧＷ５９７５９９（ＧＳＫ）、−ＧＷ６７９７６９（ＧＳＫ）、およびＲ６７３(Roche)を含む。
【００１１】
最後に、本発明の他の目的は癌治療における医薬組成物の製造における前記指示薬(indicator)などの非ペプチド性ＮＫ１受容体拮抗物質およびサブスタンスＰの使用である。
【発明の詳細な説明】
【００１２】
さらに、いかに活性が発揮されるかについては、試験された本発明のそれぞれのセルラインに基づいて詳細に説明される。
【実施例１】
【００１３】
神経芽細胞腫に関連するセルライン
ヒト神経芽細胞腫のセルラインとして、ＳＫＮ−ＢＥ（２）（ＩＣＬＣ, Interlab Cell Line Collection-CBA-Genova）を使用した。
このセルラインをＡＴＣＣの確立された細胞培養条件に従って、１０％胎児性牛血清を補充したＲＰＭＩ１６４０（GIBCO-BRL）の培地中で保持した。
セルラインを７５ｍｌ(Falcon, Germany)のフラスコ中で培養した。半分を２日毎に更新し、細胞をトリプシン（０．０５％および０．０２％ＥＤＴＡ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まず）で６日毎に処理した。細胞を加湿（空気９５％／ＣＯ２５％）下、温度３７℃に加温した。
【００１４】
ＮＫ１受容体拮抗物質による処理
試料を処理する前に、ＮＫ１受容体拮抗物質、（２Ｓ，３Ｓ）３−（[３，５ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ）−２−フェニルピペリジン、（Ｌ−７３３，０６０）（Sigma-Aldrich, U.K.）の溶液を０．２％ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を含む蒸留水中に溶解した。ＩＣ５０を決定する目的で、種々の濃度（２．５μＭ〜２０μＭ）で検討した。
(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)により確立された指示書に従い、ＭＴＳ[３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム]法を使用して、細胞の増殖を試験した。
【００１５】
細胞増殖の方法
実験中、培養された細胞をトリプシン処理により４〜５日毎にばらばらに分離し、細胞生存度を試験するためにトリパンブルー法を使用した。細胞を数量化し、９６穴のプレートでそれぞれ培養した。各実験はＴ０、Ｔ１およびＴ２と称する３つのプレートを含んだ。
Ｔ０は、空白穴と称する細胞を入れていない穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴と称する細胞を入れた穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）を含んでいた。Ｔ１とＴ２は、両方とも空白穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）とＬ−７３３，０６０で処理されたコントロール穴を含んでいた。
Ｔ０では、２０μｌのＭＴＳを穴に直ちに添加し、９０分後に穴を測定した。Ｔ１とＴ２は異なった濃度（２．５μＭ〜２０μＭ）のＬ−７３３，０６０で処理し、３０時間（第１細胞複製）（Ｔ１）および７２時間（第２細胞複製）（Ｔ２）インキュベートした。
細胞の増殖を検討するために、４９２ｎｍにてプレートリーダー(TECAN Spectra Classic)で試料を測定する９０分前に、各穴（Ｔ１，Ｔ２）にＭＴＳ試薬２０μｌを加えた。生きている細胞の数に直接に比例するＭＴＳの反応数量を光学的密度にて測定した。各プレート（空白、コントロールおよび種々の異なった濃度のＬ−７３３，０６０で処理したコントロール）について、３通りに測定した。この実験を３回、異なった状況で繰り返した。Ｌ−７３３，０６０による細胞の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）はパラメーターに適した曲線に基づいて計算した。
【００１６】
統計分析
得られたデータは、有意差Ｐ＜０．０５として、スチューデントのｔ検定を使用して評価した。
【００１７】
結果
図１Ａに示される結果は、Ｌ−７３３，０６０の濃度増加における細胞ＳＫＮ−ＢＥ（２）の濃度の経時変化を示す。
図１Ｂは増加する濃度（２．５，５，１０，２０Ｍ）のＬ−７３３，０６０を添加した後のＳＫＮＢＥ（２）の細胞成長の阻害（３０時間と７２時間）を示す。これは加熱複製における第１時間および第２時間での阻害％である。不連続線は３０時間と７２時間のＩＣ５０を示す。グラフの点は平均値／典型的偏差を示す。
【実施例２】
【００１８】
黒色腫に関連するセルライン
黒色腫に関連するセルラインとして、ＣＯＬＯ８５８（ICLC Interlab Cell Line Collection-CBA-Genova）、ＭＥＬＨＯおよびＣＯＬＯ６７９（DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)を使用した。
これらのセルラインをＡＴＣＣ、ＩＣＬＣおよびＤＳＭＺの確立した細胞培養条件に従って、１０％胎児性牛血清を補充したＲＰＭＩ１６４０(GIBCO BRL)の培地中で保持した。
セルラインを７５ｍｌフラスコ(Falcon, Germany)中で培養した。
半分を２日毎に更新し、細胞をトリプシン（０．０５％および０．０２％ＥＤＴＡ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まず）で６日毎に処理した。細胞を加湿（９５％空気／５％ＣＯ２） 下、３７℃でインキュベートした。
試料を処理する前に、ＮＫ７受容体拮抗物質（２Ｓ，３Ｓ）３−（[３，５ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ）−２−フェニルピペリジン（Ｌ−７３３，０６０）（Sigma-Aldrich, U.K.）を、０．２％ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を含む蒸留水に溶解した。ＩＣ５０を測定する目的で、異なった濃度（２．５μＭ〜５０μＭ）で検討した。
(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)により確立された使用指示書に従い、ＭＴＳ法[３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム]を使用して、細胞の増殖を評価した。
【００１９】
細胞増殖法
実験中、培養された細胞をトリプシン処理によって４〜５日毎にばらばらに分離し、細胞の生存度を試験するためにトリパンブルー法を使用した。細胞を数量化し、９６穴のプレートでそれぞれ培養した。各実験はＴ０、Ｔ１およびＴ２と称する３つのプレートを含んでいた。
Ｔ０は、空白穴と称する細胞を入れていない穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴と称する細胞を入れた穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）を含んでいた。Ｔ１とＴ２は、両方とも空白穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）とＬ−７３３，０６０で処理されたコントロール穴を含んでいた。
２０μｌのＭＴＳを直ちにＴ０へ添加し、９０分後に測定した。Ｔ１およびＴ２を異なった濃度（２．５μＭ〜５０μＭ）のＬ−７３３，０６０で処理し、セルライン中で種々の時間、インキュベートした。ラインＣＯＬＯ８５８：４８時間（第１細胞複製）（Ｔ１）および９６時間（第２細胞複製）（Ｔ２）
ラインＭＥＬＨＯ：２４時間（細胞複製）（Ｔ１）および４８時間（第２細胞複製）（Ｔ２）
ラインＣＯＬＯ６７９：３０時間（細胞複製）（Ｔ１）および７２時間（第２細胞複製）（Ｔ２）
細胞増殖を検討するために、４９２ｎｍにてプレートリーダー(TECAN Spectra Classic)でプレートの試料を測定する９０分前に、活性ＭＴＳ２０μｌを各穴（Ｔ１，Ｔ２）に加えた。生きている細胞の数に直接に比例するＭＴＳの反応数量を光学的密度にて測定した。各プレート（空白、コントロールおよび種々の異なった濃度のＬ−７３３，０６０で処理したコントロール）について、３通りに実施した。この実験を３回、異なった状況で繰り返した。Ｌ−７３３，０６０による細胞の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）はパラメーターに適した曲線に基づいて計算した。
【００２０】
統計分析
得られたデータは、有意差Ｐ＜０．０５として、スチューデントのｔ検定を使用して評価した。
【００２１】
結果
その結果を図２Ａ，２Ｂ（ＣＯＬＯ８５８）、図３Ａ，３Ｂ（ＭＥＬＨＯ）および図４Ａ，４Ｂ（ＣＯＬＯ６７９）に示す。
図２ＡはＬ−７３３，０６０の濃度増加（２．５μＭ〜２０μＭ）に対する細胞ＣＯＬＯ８５８の濃度の経時変化を示す。
図３ＡはＬ−７３３，０６０の濃度増加（１０μＭ〜３０μＭ）に対する細胞ＭＥＬＨＯの濃度の経時変化を示す。
図４ＡはＬ−７３３，０６０の濃度増加（２０μＭ〜５０μＭ）に対する細胞ＣＯＬＯ６７９の濃度の経時変化を示す。
【００２２】
図２Ｂには、増加する濃度（２．５，５，１０，２０μＭ）のＬ−７３３，０６０を添加した後のＣＯＬＯ８５８の細胞成長の阻害（４８および９６時間）を示す。不連続線は４８時間と９６時間のＩＣ５０を示す。グラフの点は平均値／典型的偏差を示す。
図３Ｂには、増加する濃度（１０，２０，２５および３０μＭ）のＬ−７３３，０６０を添加した後のＭＥＬＨＯの細胞成長の阻害（２４および４８時間）を示す。不連続線は２４時間と４８時間のＩＣ５０を示す。グラフの点は平均値／典型的偏差を示す。
図４Ｂには、増加する濃度（２０，３０，４０および５０μＭ）のＬ−７３３，０６０を添加した後のＣＯＬＯ６７９の細胞成長の阻害（３０および７２時間）を示す。不連続線は３０時間と７２時間のＩＣ５０を示す。グラフの点は平均値／典型的偏差を示す。
【実施例３】
【００２３】
リンパ芽球白血病に関連するセルライン
ヒトリンパ芽球性白血病に関連するセルラインとして、ＢＳＤ１（ＤＳＭＺ）および細胞ＴＢＥ−１３（ＤＳＭＺ）を使用した。
これらのセルラインをＡＴＣＣの確立した細胞培養条件に従って、１０％胎児性牛血清を補充した１６４０の培地中に保持した。
セルラインを７５ｍｌのフラスコ(Falcon Germany)中で培養した。半分を２日毎に更新した。細胞を加湿（９５％空気／５％ＣＯ２）下、温度３７℃でインキュベートした。
【００２４】
ＮＫ１受容体拮抗物質による処理
試料を処理する前に、ＮＫ１受容体拮抗物質、（２Ｓ，３Ｓ）３−（[３，５ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ）−２−フェニルピペリジン、（Ｌ−７３３，０６０）（Sigma-Aldrich, U.K.）の溶液を０．２％ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を含む蒸留水中に溶解した。ＩＣ５０を決定するために、異なった濃度（２．５μＭ〜２５μＭ）で検討した。
(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega,USA)の指示書に従い、ＭＴＳ法[３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム]を使用して、細胞の増殖を評価した。
【００２５】
細胞増殖の方法
細胞を数量化し、９６穴のプレートでそれぞれ培養した。各実験はＴ０、Ｔ１およびＴ２と称する３つのプレートを含んでいた。
Ｔ０は、空白穴と称する細胞を入れていない穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴と称する細胞を入れた穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）を含んでいた。Ｔ１とＴ２は、両方とも空白穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）とＬ−７３３，０６０で処理されたコントロール穴を含んでいた。
Ｔ０では、２０μｌのＭＴＳを穴に直ちに添加し、９０分後に穴を測定した。Ｔ１とＴ２は異なった濃度（２．５μＭ〜２０μＭ）のＬ−７３３，０６０で処理し、３０時間（細胞複製）（Ｔ１）および７２時間（第２細胞複製）（Ｔ２）インキュベートした。
細胞の増殖を検討するために、２０μｌの活性ＭＴＳを、４９２ｎｍにてプレートリーダー(TECAN Spectra Classic)で試料を測定する１８０分前に、各穴（Ｔ１，Ｔ２）に加えた。生きている細胞の数に直接、比例する活性ＭＴＳの数量を光学的密度にて測定した。各プレート（空白、コントロールおよび種々の異なった濃度のＬ−７３３，０６０で処理したコントロール）について、３通りに実施した。この実験を３回、異なった状況で繰り返した。Ｌ−７３３，０６０による細胞の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）はパラメーターに適した曲線に基づいて計算した。
【００２６】
統計分析
得られたデータは、有意差Ｐ＜０．０５として、スチューデントのｔ検定を使用して評価した。
【００２７】
結果
図５Ａに示される結果は、Ｌ−７３３，０６０の濃度増加における細胞ＢＳＤ１の濃度の経時変化を示す。
図５Ｂでは、増加する濃度（２．５，５，１０，２５Ｍ）のＬ−７３３，０６０を添加した後のＢＳＤ１の細胞成長の阻害（３０時間と７２時間）を示す。加熱複製における第１および第２時間での阻害％である。不連続線は３０時間と７２時間のＩＣ５０を示す。グラフの点は平均値／典型的偏差を示す。
【実施例４】
【００２８】
バーキットヒトリンパ腫に関連するセルライン
ヒトバーキットリンパ腫に関連するセルラインとして、ＣＡ−４６（ＤＳＭＺ）を使用した。このセルラインをＲＰＭＩ１６４０の培地中に保持し、ＡＴＣＣの確立した細胞培養条件に従って、１０％胎児性牛血清を補充した。
セルラインを７５ｍｌのフラスコ(Falcon Germany)中で培養した。半分を２日毎に更新し、細胞を６日毎にトリプシン（０．０５％および０．０２％ＥＤＴＡ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まず）で処理した。細胞を加湿（９５％空気／５％ＣＯ２）下、温度３７℃でインキュベートした。
【００２９】
ＮＫ１受容体拮抗物質による処理
試料を処理する前に、ＮＫ１受容体拮抗物質、（２Ｓ，３Ｓ）３−（[３，５ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ）−２−フェニルピペリジン、（Ｌ−７３３，０６０）（Sigma-Aldrich, U.K.）の溶液を０．２％ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を含む蒸留水中に溶解した。ＩＣ５０を決定するために、異なった濃度（２．５μＭ〜２５μＭ）で検討した。
(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)の指示書に従い、ＭＴＳ法[３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム]を使用して、細胞の増殖を評価した。
【００３０】
細胞増殖の方法
細胞を数量化し、９６穴のプレートでそれぞれ培養した。各実験はＴ０、Ｔ１およびＴ２と称する３つのプレートを含んでいた。
Ｔ０は、空白穴と称する細胞を入れていない穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴と称する細胞を入れた穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）を含んでいた。Ｔ１とＴ２は、両方とも空白穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）とＬ−７３３，０６０で処理されたコントロール穴を含んでいた。
Ｔ０では、２０μｌのＭＴＳを穴に直ちに添加し、９０分後に穴を測定した。Ｔ１とＴ２は異なった濃度（２．５μＭ〜２０μＭ）のＬ−７３３，０６０で処理し、３５時間（細胞複製）（Ｔ１）および７２時間（第２細胞複製）（Ｔ２）インキュベートした。
細胞の増殖を検討するために、２０μｌの活性ＭＴＳを、４９２ｎｍにてプレートリーダー(TECAN Spectra Classic)で試料を測定する１８０分前に、各穴（Ｔ１，Ｔ２）に加えた。生きている細胞の数に直接、比例する活性ＭＴＳの数量を光学的密度で測定した。各プレート（空白、コントロールおよび種々の異なった濃度のＬ−７３３，０６０で処理したコントロール）について、３通りに実施した。この実験を３回、異なった状況で繰り返した。Ｌ−７３３，０６０による細胞の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）はパラメーターに適した曲線に基づいて計算した。
【００３１】
統計分析
得られたデータは、有意差Ｐ＜０．０５として、スチューデントのｔ検定を使用して評価した。
【００３２】
結果
最高濃度および最大用量で細胞成長の阻害が生じ、アポトーシスを誘発した。
【実施例５】
【００３３】
ヒトホジキンリンパ腫に関連したセルライン
ヒトホジキンリンパ腫に関連したセルラインとして、ＫＭ−Ｈ２（ＤＳＭＺ）を使用した。このセルラインをＲＰＭＩ１６４０の培地で保持し、ＡＴＣＣの確立した細胞培養条件に従って、１０％胎児性牛血清を補充した。
セルラインを７５ｍｌのフラスコ(Falcon Germany)中で培養した。半分を２日毎に更新した。細胞を加湿（９５％空気／５％ＣＯ２）下、温度３７℃でインキュベートした。
【００３４】
ＮＫ１受容体拮抗物質による処理
試料を処理する前に、ＮＫ１受容体拮抗物質、（２Ｓ，３Ｓ）３−（[３，５ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ）−２−フェニルピペリジン、（Ｌ−７３３，０６０）（Sigma-Aldrich, U.K.）の溶液を０．２％ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を含む蒸留水中に溶解した。ＩＣ５０を決定するために、異なった濃度（２．５μＭ〜２５μＭ）で検討した。
(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)の指示書に従い、ＭＴＳ法[３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム]を使用して、細胞の増殖を評価した。
【００３５】
細胞増殖の方法
細胞を数量化し、９６穴のプレートでそれぞれ培養した。各実験はＴ０、Ｔ１およびＴ２と称する３つのプレートを含んでいた。
Ｔ０は、空白穴と称する細胞を入れていない穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴と称する細胞を入れた穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）を含んでいた。Ｔ１とＴ２は、両方とも空白穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）とＬ−７３３，０６０で処理されたコントロール穴を含んでいた。
Ｔ０では、２０μｌのＭＴＳを穴に直ちに添加し、９０分後に穴を測定した。Ｔ１とＴ２は異なった濃度（２．５μＭ〜２０μＭ）のＬ−７３３，０６０で処理し、３５時間（細胞複製）（Ｔ１）および７２時間（第２細胞複製）（Ｔ２）インキュベートした。
細胞の増殖を検討するために、２０μｌの活性ＭＴＳを、４９２ｎｍにてプレートリーダー(TECAN Spectra Classic)で試料を測定する１８０分前に、各穴（Ｔ１，Ｔ２）に加えた。生きている細胞の数に直接、比例する活性ＭＴＳの数量を光学的密度にて測定した。各プレート（空白、コントロールおよび種々の異なった濃度のＬ−７３３，０６０で処理したコントロール）について、３通りに実施した。この実験を３回、異なった状況で繰り返した。Ｌ−７３３，０６０による細胞の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）はパラメーターに適した曲線に基づいて計算した。
【００３６】
統計分析
得られたデータは、有意差Ｐ＜０．０５として、スチューデントのｔ検定を使用して評価した。
【００３７】
結果
その結果を、Ｌ−７３３，０６０の増加する濃度に対する細胞ＫＭ−Ｈ２の濃度の経時間変化を示す図６Ａに示す。
図６Ｂでは、ＫＭ−Ｈ２の細胞成長阻害は増加濃度（２．５、５、１０、２０Ｍ）のＬ−７３３，０６０の添加後に示される（４８時間および９６時間）。加熱複製の第１時間および第２時間における阻害パーセントである。不連続線は４８時間および９６時間のＩＣ５０を示す。グラフ上の点は平均値／典型的偏差を示す。
【実施例６】
【００３８】
ヒト横紋筋肉腫に関連するセルライン
ヒト横紋筋肉腫に関連したセルラインとして、Ａ−２０４（ＤＳＭＺ）を使用した。このセルラインをＡＴＣＣの確立した細胞培養条件に従って、１０％胎児性牛血清を補充したＭｃ−Ｃｏｙの培地中に保持した。
セルラインを７５ｍｌのフラスコ(Falcon Germany)中で培養した。半分を２日毎に更新し、細胞を６日毎にトリプシン（０．０５％および０．０２％ＥＤＴＡ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まず）を添加した。細胞を加湿（９５％空気／５％ＣＯ２）下、温度３７℃でインキュベートした。
【００３９】
ＮＫ１受容体拮抗物質による処理
試料を処理する前に、ＮＫ１受容体拮抗物質、（２Ｓ，３Ｓ）３−（[３，５ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ）−２−フェニルピペリジン、（Ｌ−７３３，０６０）（Sigma-Aldrich, U.K.）の溶液を０．２％ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を含む蒸留水中に溶解した。ＩＣ５０を決定するために、異なった濃度（２．５μＭ〜２５μＭ）で検討した。
(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)の指示書に従い、ＭＴＳ法[３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム]を使用して、細胞の増殖を評価した。
【００４０】
細胞増殖の方法
実験中、培養された細胞をトリプシン処理により４〜５日毎にばらばらに分離し、細胞生存度を試験するためにトリパンブルー法を使用した。細胞を数量化し、９６穴のプレートでそれぞれ培養した。各実験はＴ０、Ｔ１およびＴ２と称する３つのプレートを含んでいた。
Ｔ０は、空白穴と称する細胞を入れていない穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴と称する細胞を入れた穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）を含んでいた。Ｔ１とＴ２は、両方とも空白穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）とＬ−７３３，０６０で処理されたコントロール穴を含んでいた。
Ｔ０では、２０μｌのＭＴＳを穴に直ちに添加し、９０分後に穴を測定した。Ｔ１とＴ２は異なった濃度（２．５μＭ〜２０μＭ）のＬ−７３３，０６０で処理し、３６時間（細胞複製）（Ｔ１）および７２時間（第２細胞複製）（Ｔ２）インキュベートした。
細胞の増殖を検討するために、２０μｌの活性ＭＴＳを、４９２ｎｍにてプレートリーダー(TECAN Spectra Classic)で試料を測定する１８０分前に、各穴（Ｔ１，Ｔ２）に加えた。生きている細胞の数に直接、比例する活性ＭＴＳの数量を光学的密度にて測定した。各プレート（空白、コントロールおよび種々の異なった濃度のＬ−７３３，０６０で処理したコントロール）について、３通りに実施した。この実験を３回、異なった状況で繰り返した。Ｌ−７３３，０６０による細胞の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）はパラメーターに適した曲線に基づいて計算した。
【００４１】
統計分析
得られたデータは、有意差Ｐ＜０．０５として、スチューデントのｔ検定を使用して評価した。
【００４２】
結果
細胞成長は最高濃度と最大用量で阻害され、アポトーシスを誘発した。
【実施例７】
【００４３】
小細胞肺癌に関連するセルライン
小細胞肺癌に関連するセルラインとして、ＣＯＬＯ−６７７（ＤＳＭＺ）を使用した。このセルラインをＡＴＣＣの確立した細胞培養条件に従って、１０％胎児性牛血清を補充したＲＰＭＩ１６４０の培地中に保持した。
セルラインを７５ｍｌのフラスコ(Falcon Germany)中で培養した。半分を２日毎に更新し、細胞を６日毎にトリプシン（０．０５％および０．０２％ＥＤＴＡ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まず）を添加した。細胞を加湿（９５％空気／５％ＣＯ２）下、温度３７℃でインキュベートした。
【００４４】
ＮＫ１受容体拮抗物質による処理
試料を処理する前に、ＮＫ１受容体拮抗物質、（２Ｓ，３Ｓ）３−（[３，５ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ）−２−フェニルピペリジン、（Ｌ−７３３，０６０）（Sigma-Aldrich, U.K.）の溶液を、０．２％ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を含む蒸留水中に溶解した。ＩＣ５０を決定するために、異なった濃度（２．５μＭ〜２５μＭ）で検討した。
(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)の指示書に従い、ＭＴＳ法[３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム]を使用して、細胞の増殖を評価した。
【００４５】
細胞増殖の方法
実験中、培養された細胞をトリプシン処理により４〜５日毎にばらばらに分離し、細胞生存度を試験するためにトリパンブルー法を使用した。細胞を数量化し、９６穴のプレートでそれぞれ培養した。各実験はＴ０、Ｔ１およびＴ２と称する３つのプレートを含んでいた。
Ｔ０は、空白穴と称する細胞を入れていない穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴と称する細胞を入れた穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）を含んでいた。Ｔ１とＴ２は、両方とも空白穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）とＬ−７３３，０６０で処理されたコントロール穴を含んでいた。
Ｔ０では、２０μｌのＭＴＳを穴に直ちに添加し、９０分後に穴を測定した。Ｔ１とＴ２は異なった濃度（５μＭ〜２０μＭ）のＬ−７３３，０６０で処理し、４０時間（細胞複製）（Ｔ１）および９６時間（第２細胞複製）（Ｔ２）インキュベートした。
細胞の増殖を検討するために、２０μｌの活性ＭＴＳを、４９２ｎｍにてプレートリーダー(TECAN Spectra Classic)で試料を測定するために、９０分前に、各穴（Ｔ１，Ｔ２）に加えた。生きている細胞の数に直接、比例する活性ＭＴＳの数量を光学的密度で測定した。各プレート（空白、コントロールおよび種々の異なった濃度のＬ−７３３，０６０で処理したコントロール）について、３通りに実施した。この実験を３回、異なった状況で繰り返した。Ｌ−７３３，０６０による細胞の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）はパラメーターに適した曲線に基づいて計算した。
【００４６】
統計分析
得られたデータは、有意差Ｐ＜０．０５として、スチューデントのｔ検定を使用して評価した。
【００４７】
結果
細胞成長は最高濃度と最大用量で阻害され、アポトーシスを誘発した。
【実施例８】
【００４８】
ヒト乳癌に関連するセルライン
ヒト乳癌に関連するセルラインとして、ＭＴ−３（ＤＳＭＺ）を使用した。このセルラインをＡＴＣＣの確立した細胞培養条件に従って、１０％胎児性牛血清を補充したＲＰＭＩ１６４０の培地中に保持した。
セルラインを７５ｍｌのフラスコ(Falcon Germany)中で培養した。半分を２日毎に更新し、細胞を６日毎にトリプシン（０．０５％および０．０２％ＥＤＴＡ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まず）を添加した。細胞を加湿（９５％空気／５％ＣＯ２）下、温度３７℃でインキュベートした。
【００４９】
ＮＫ１受容体拮抗物質による処理
試料を処理する前に、ＮＫ１受容体拮抗物質、（２Ｓ，３Ｓ）３−（[３，５ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ）−２−フェニルピペリジン、（Ｌ−７３３，０６０）（Sigma-Aldrich, U.K.）の溶液を０．２％ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を含む蒸留水中に溶解した。ＩＣ５０を決定するために、異なった濃度（２．５μＭ〜２５μＭ）で検討した。
(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)の指示書に従い、ＭＴＳ法[３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム]を使用して、細胞の増殖を評価した。
【００５０】
細胞増殖の方法
実験中、培養された細胞をトリプシン処理により４〜５日毎にばらばらに分離し、細胞生存度を試験するためにトリパンブルー法を使用した。細胞を数量化し、９６穴のプレートでそれぞれ培養した。各実験はＴ０、Ｔ１およびＴ２と称する３つのプレートを含んでいた。
Ｔ０は、空白穴と称する細胞を入れていない穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴と称する細胞を入れた穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）を含んでいた。Ｔ１とＴ２は、両方とも空白穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）とＬ−７３３，０６０で処理されたコントロール穴を含んでいた。
Ｔ０では、２０μｌのＭＴＳを穴に直ちに添加し、９０分後に穴を測定した。Ｔ１とＴ２は異なった濃度（２．５μＭ〜２０μＭ）のＬ−７３３，０６０で処理し、３０時間（細胞複製）（Ｔ１）および７２時間（第２細胞複製）（Ｔ２）インキュベートした。
細胞の増殖を検討するために、２０μｌの活性ＭＴＳを、４９２ｎｍにてプレートリーダー(TECAN Spectra Classic)で試料を測定する９０分前に、各穴（Ｔ１，Ｔ２）に加えた。生きている細胞の数に直接、比例する活性ＭＴＳの数量を光学的密度にて測定した。各プレート（空白、コントロールおよび種々の異なった濃度のＬ−７３３，０６０で処理したコントロール）について、３通りに実施した。この実験を３回、異なった状況で繰り返した。Ｌ−７３３，０６０による細胞の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）はパラメーターに適した曲線に基づいて計算した。
【００５１】
統計分析
得られたデータは、有意差Ｐ＜０．０５として、スチューデントのｔ検定を使用して評価した。
【００５２】
結果
その結果は、Ｌ−７３３，０６０の増加濃度に対する細胞ＭＴ−３の濃度の経時変化を示す図７Ａに示される。
図７Ｂでは、ＭＴ−３の細胞成長阻害が増加する濃度のＬ−７３３，０６０（２．５、５、１０、２０μＭ）の添加後に示される（３０時間および７２時間）。加熱複製における第１時間および第２時間の阻害パーセントである。不連続線は３０時間および７２時間のＩＣ５０を示す。グラフ上の点は平均値／典型的偏差を示す。
【実施例９】
【００５３】
エドウィングヒト肉腫に関連するセルライン
エドウィングヒト肉腫に関連するセルラインとして、ＭＨＨ−ＥＳ−１（ＤＳＭＺ）を使用した。このセルラインをＡＴＣＣの確立した細胞培養条件に従って、１０％胎児性牛血清を補充したＲＰＭＩ１６４０の培地中に保持した。
セルラインを７５ｍｌのフラスコ(Falcon Germany)中で培養した。半分を２日毎に更新し、細胞を６日毎にトリプシン（０．０５％および０．０２％ＥＤＴＡ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まず）を添加した。細胞を加湿（９５％空気／５％ＣＯ２）下、温度３７℃でインキュベートした。
【００５４】
ＮＫ１受容体拮抗物質による処理
試料を処理する前に、ＮＫ１受容体拮抗物質、（２Ｓ，３Ｓ）３−（[３，５ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ）−２−フェニルピペリジン、（Ｌ−７３３，０６０）（Sigma-Aldrich, U.K.）の溶液を０．２％ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を含む蒸留水中に溶解した。ＩＣ５０を決定するために、異なった濃度（２．５μＭ〜２５μＭ）で検討した。
(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)の指示書に従い、ＭＴＳ法[３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム]を使用して、細胞の増殖を評価した。
【００５５】
細胞増殖の方法
実験中、培養された細胞をトリプシン処理により４〜５日毎にばらばらに分離し、細胞生存度を試験するためにトリパンブルー法を使用した。細胞を数量化し、９６穴のプレートでそれぞれ培養した。各実験はＴ０、Ｔ１およびＴ２と称する３つのプレートを含んでいた。
Ｔ０は、空白穴と称する細胞を入れていない穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴と称する細胞を入れた穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）を含んでいた。Ｔ１とＴ２は、両方とも空白穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）とＬ−７３３，０６０で処理されたコントロール穴を含んでいた。
Ｔ０では、２０μｌのＭＴＳを穴に直ちに添加し、９０分後に穴を測定した。Ｔ１とＴ２は異なった濃度（５．０μＭ〜２０μＭ）のＬ−７３３，０６０で処理し、３５時間（細胞複製）（Ｔ１）および７２時間（第２細胞複製）（Ｔ２）インキュベートした。
細胞の増殖を検討するために、２０μｌの活性ＭＴＳを、４９２ｎｍにてプレートリーダー(TECAN Spectra Classic)で試料を測定する９０分前に、各穴（Ｔ１，Ｔ２）に加えた。生きている細胞の数に直接、比例する活性ＭＴＳの数量を光学的密度にて測定した。各プレート（空白、コントロールおよび種々の異なった濃度のＬ−７３３，０６０で処理したコントロール）について、３通りに実施した。この実験を３回、異なった状況で繰り返した。Ｌ−７３３，０６０による細胞の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）はパラメーターに適した曲線に基づいて計算した。
【００５６】
統計分析
得られたデータは、有意差Ｐ＜０．０５として、スチューデントのｔ検定を使用して評価した。
【００５７】
結果
その結果は、Ｌ−７３３，０６０の増加濃度に対する細胞ＭＨＨ−ＥＳ−１の濃度の経時変化を示す図８Ａに示される。
図８Ｂでは、ＭＨＨ−ＥＳ−１の細胞成長阻害が増加する濃度のＬ−７３３，０６０（５、１０、１５、２０μＭ）の添加後に示される（３０時間および７２時間）。加熱複製における第１時間および第２時間の阻害パーセントである。不連続線は３０時間および７２時間のＩＣ５０を示す。グラフ上の点は平均値／典型的偏差を示す。
【実施例１０】
【００５８】
ヒト骨肉腫に関連するセルライン
ヒト骨肉腫に関連するセルライン、ＭＧ−６３（ＩＣＬＣ）を使用した。
このセルラインをＡＴＣＣの確立した細胞培養条件に従って、１０％胎児性牛血清を補充したＭＥＮの培地中に保持した。
セルラインを７５ｍｌのフラスコ(Falcon Germany)中で培養した。半分を２日毎に更新し、細胞を６日毎にトリプシン（０．０５％および０．０２％ＥＤＴＡ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まず）を添加した。細胞を加湿（９５％空気／５％ＣＯ２）下、温度３７℃でインキュベートした。
【００５９】
ＮＫ１受容体拮抗物質による処理
試料を処理する前に、ＮＫ１受容体拮抗物質、（２Ｓ，３Ｓ）３−（[３，５ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ）−２−フェニルピペリジン、（Ｌ−７３３，０６０）（Sigma-Aldrich, U.K.）の溶液を０．２％ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を含む蒸留水中に溶解した。ＩＣ５０を決定するために、異なった濃度（２．５μＭ〜２５μＭ）で検討した。
(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)の指示書に従い、ＭＴＳ法[３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム]を使用して、細胞の増殖を評価した。
【００６０】
細胞増殖の方法
実験中、培養された細胞をトリプシン処理により４〜５日毎にばらばらに分離し、細胞生存度を試験するためにトリパンブルー法を使用した。細胞を数量化し、９６穴のプレートでそれぞれ培養した。各実験はＴ０、Ｔ１およびＴ２と称する３つのプレートを含んでいた。
Ｔ０は、空白穴と称する細胞を入れていない穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴と称する細胞を入れた穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）を含んでいた。Ｔ１とＴ２は、両方とも空白穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）とＬ−７３３，０６０で処理されたコントロール穴を含んでいた。
Ｔ０では、２０μｌのＭＴＳを穴に直ちに添加し、９０分後に穴を測定した。Ｔ１とＴ２は異なった濃度（２．５μＭ〜２０μＭ）のＬ−７３３，０６０で処理し、３０時間（細胞複製）（Ｔ１）および７２時間（第２細胞複製）（Ｔ２）インキュベートした。
細胞の増殖を検討するために、２０μｌの活性ＭＴＳを、４９２ｎｍにてプレートリーダー(TECAN Spectra Classic)で試料を測定する９０分前に、各穴（Ｔ１，Ｔ２）に加えた。生きている細胞の数に直接、比例する活性ＭＴＳの数量を光学的密度にて測定した。各プレート（空白、コントロールおよび種々の異なった濃度のＬ−７３３，０６０で処理したコントロール）について、３通りに実施した。この実験を３回、異なった状況で繰り返した。Ｌ−７３３，０６０による細胞の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）はパラメーターに適した曲線に基づいて計算した。
【００６１】
統計分析
得られたデータは、有意差Ｐ＜０．０５として、スチューデントのｔ検定を使用して評価した。
【００６２】
結果
その結果は、Ｌ−７３３，０６０の増加濃度に対する細胞の濃度の経時変化を示す図９Ａに示される。
図９Ｂでは、ＭＧ−６３の細胞成長阻害が増加する濃度のＬ−７３３，０６０（２．５、５、１０、２０および２５μＭ）の添加後に示される（３０時間および７２時間）。加熱複製における第１時間および第２時間の阻害パーセントである。不連続線は３０時間および７２時間のＩＣ５０を示す。グラフ上の点は平均値／典型的偏差を示す。
【実施例１１】
【００６３】
神経膠腫に関連するセルライン
ヒト神経膠腫に関連するセルラインとして、ＧＡＭＧ（ＤＳＭＺ）を使用した。
このセルラインをＡＴＣＣの確立した細胞培養条件に従って、１０％胎児性牛血清を補充したＭＥＮの培地中に保持した。
セルラインを７５ｍｌのフラスコ(Falcon Germany)中で培養した。半分を２日毎に更新し、細胞を６日毎にトリプシン（０．０５％および０．０２％ＥＤＴＡ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まず）を添加した。細胞を加湿（９５％空気／５％ＣＯ２）下、温度３７℃でインキュベートした。
【００６４】
ＮＫ１受容体拮抗物質による処理
試料を処理する前に、ＮＫ１受容体拮抗物質、（２Ｓ，３Ｓ）３−（[３，５ビス（トリフルオロメチル）フェニル]メトキシ）−２−フェニルピペリジン、（Ｌ−７３３，０６０）（Sigma-Aldrich, U.K.）の溶液を０．２％ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を含む蒸留水中に溶解した。ＩＣ５０を決定するために、異なった濃度（２．５μＭ〜２５μＭ）で検討した。
(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)の指示書に従い、ＭＴＳ法[３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム]を使用して、細胞の増殖を評価した。
【００６５】
細胞増殖の方法
実験中、培養された細胞をトリプシン処理により４〜５日毎にばらばらに分離し、細胞生存度を試験するためにトリパンブルー法を使用した。細胞を数量化し、９６穴のプレートでそれぞれ培養した。各実験はＴ０、Ｔ１およびＴ２と称する３つのプレートを含んでいた。
Ｔ０は、空白穴と称する細胞を入れていない穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴と称する細胞を入れた穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）を含んでいた。Ｔ１とＴ２は、両方とも空白穴（０細胞／０．１ｍｌ）とコントロール穴（１０４細胞／０．１ｍｌ）とＬ−７３３，０６０で処理されたコントロール穴を含んでいた。
Ｔ０では、２０μｌのＭＴＳを穴に直ちに添加し、９０分後に穴を測定した。Ｔ１とＴ２は異なった濃度（２．５μＭ〜２０μＭ）のＬ−７３３，０６０で処理し、４８時間（細胞複製）（Ｔ１）および７２時間（第２細胞複製）（Ｔ２）インキュベートした。
細胞の増殖を検討するために、２０μｌの活性ＭＴＳを、４９２ｎｍにてプレートリーダー(TECAN Spectra Classic)で試料を測定する９０分前に、各穴（Ｔ１，Ｔ２）に加えた。生きている細胞の数に直接、比例する活性ＭＴＳの数量を光学的密度にて測定した。各プレート（空白、コントロールおよび種々の異なった濃度のＬ−７３３，０６０で処理したコントロール）について、３通りに実施した。この実験を３回、異なった状況で繰り返した。Ｌ−７３３，０６０による細胞の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）はパラメーターに適した曲線に基づいて計算した。
【００６６】
統計分析
得られたデータは、有意差Ｐ＜０．０５として、スチューデントのｔ検定を使用して評価した。
【００６７】
結果
その結果は、Ｌ−７３３，０６０の増加濃度に対する細胞ＭＴ−３の濃度の経時変化を示す図１０Ａに示される。
図１０Ｂでは、ＧＡＭＧの細胞成長阻害が増加する濃度のＬ−７３３，０６０（１０、１５、２０および２５μＭ）の添加後に示される（４８時間および９６時間）。加熱複製における第１時間および第２時間の阻害パーセントである。不連続線は４８時間および９６時間のＩＣ５０を示す。グラフ上の点は平均値／典型的偏差を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＡおよびＢ：Ｌ−７３３，０６０の増加濃度におけるＳＫＮ−ＢＥ（２）の細胞成長阻害（Ａ）および細胞ＳＫＮ−ＢＥ（２）の濃度の経時変化（Ｂ）である。
【図２】ＡおよびＢ：Ｌ−７３３，０６０の増加濃度におけるＣＯＬＯ８５８の細胞成長阻害（Ａ）および細胞ＣＯＬＯ８５８の濃度の経時変化（Ｂ）である。
【図３】ＡおよびＢ：Ｌ−７３３，０６０の増加濃度におけるＭＥＬＨＯの細胞成長阻害（Ａ）および細胞ＭＥＬＨＯの濃度の経時変化（Ｂ）である。
【図４】ＡおよびＢ：Ｌ−７３３，０６０の増加濃度におけるＣＯＬＯ６７９の細胞成長阻害（Ａ）および細胞ＣＯＬＯ６７９の濃度の経時変化（Ｂ）である。
【図５】ＡおよびＢ：Ｌ−７３３，０６０の増加濃度におけるＳＤ１の細胞成長阻害（Ａ）および細胞ＳＤ１の濃度の経時変化（Ｂ）である。
【図６】ＡおよびＢ：Ｌ−７３３，０６０の増加濃度におけるＫＭ−Ｈ２の細胞成長阻害（Ａ）および細胞ＫＭ−Ｈ２の濃度の経時変化（Ｂ）である。
【図７】ＡおよびＢ：Ｌ−７３３，０６０の増加濃度におけるＭＴ−３の細胞成長阻害（Ａ）および細胞ＭＴ−３の濃度の経時変化（Ｂ）である。
【図８】ＡおよびＢ：Ｌ−７３３，０６０の増加濃度におけるＭＨＨ−ＥＳ−１の細胞成長阻害（Ａ）および細胞ＭＨＨ−ＥＳ−１の濃度の経時変化（Ｂ）である。
【図９】ＡおよびＢ：Ｌ−７３３，０６０の増加濃度におけるＭＧ−６３の細胞成長阻害（Ａ）および細胞ＭＧ−６３の濃度の経時変化（Ｂ）である。
【図１０】ＡおよびＢ：Ｌ−７３３，０６０の増加濃度におけるＧＡＭＧの細胞成長阻害（Ａ）および細胞ＧＡＭＧの濃度の経時変化（Ｂ）である。
【図１】
2008143871.tif 000002
【図２】
2008143871.tif 000003
【図３】
2008143871.tif 000004
【図４】
2008143871.tif 000005
【図５】
2008143871.tif 000006
【図６】
2008143871.tif 000007
【図７】
2008143871.tif 000008
【図８】
2008143871.tif 000009
【図９】
2008143871.tif 000010
【図１０】
2008143871.tif 000011