(57)【要約】【課題】細胞に取り込まれる被験化合物が、任意の化合物でも、細胞に取り込まれた量を簡便、正確、かつ高感度で定量する方法を提供する。【解決手段】下記（１）〜（７）の工程を含む化合物の定量方法。（１）細胞マトリックス／被験化合物の比が異なる混合物を調製する工程（２）（１）の混合物をクロマトグラフで分析し、該化合物の量と該化合物の検出量との相関関係を算出する工程（３）細胞を被験化合物を含む緩衝溶液に浸して細胞に該化合物を取り込ませる工程（４）（３）工程の緩衝溶液を除去する工程（５）（４）工程の細胞から該化合物を含む成分を抽出する工程（６）（２）工程と同様の条件で（５）工程で抽出された成分中に含まれる被験化合物の検出量を算出する工程（７）（６）工程で得られた被験化合物の検出量と、（２）で得られた相関関係から、細胞に取り込まれた被験化合物の量を定量する工程【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（７）の工程を含むことを特徴とする、細胞に取り込まれた被験化合物の定量方法。
（１）前記細胞の細胞マトリックス、被験化合物及び極性有機溶媒を含む混合物であって、細胞マトリックスに対する被験化合物の量比が異なる複数の混合物を調製する工程
（２）（１）で調製された混合物をそれぞれクロマトグラフで分析し、該混合物中に含まれる該化合物の量と該化合物の検出量との相関関係を算出する工程
（３）（１）及び（２）で用いられた細胞とは異なる前記細胞を被験化合物を含む緩衝溶液に浸して細胞に被験化合物を取り込ませる工程
（４）（３）工程で得られた細胞を含む溶液から緩衝溶液を除去する工程
（５）（４）工程で得られた細胞から該被験化合物を含む成分を抽出する工程
（６）（５）工程で抽出された成分を（２）工程と同様の条件のクロマトグラフで分析し、該成分中に含まれる被験化合物の検出量を算出する工程
（７）（６）工程で得られた被験化合物の検出量と、（２）で得られた相関関係から、（５）工程で抽出された成分中に含まれる被験化合物の量を定量する工程
【請求項２】
細胞が哺乳類由来の細胞であることを特徴とする請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
（２）工程及び（６）工程の分析が液体クロマトグラフによる分析であることを特徴とする請求項１又は２に記載の定量方法。
【請求項４】
液体クロマトグラフの検出部がタンデムマススペクトロメーターであることを特徴とする請求項３に記載の定量方法。
【請求項５】
被験化合物が分子量５０００以下の有機化合物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の定量方法。
【請求項６】
（５）工程における抽出方法が、細胞と極性有機溶媒を混合して細胞内容物を抽出する方法であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の定量方法。
【請求項７】
極性有機溶媒が、メタノール、エタノール及びアセトニトリルからなる群から選ばれる少なくとも１種の有機溶媒であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の定量方法。
【請求項８】
（３）工程の被験化合物を含む緩衝溶液中の極性有機溶媒の含有量が０〜５容量％であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の定量方法。
【請求項９】
（６）工程における被験化合物の検出量が、（５）工程で抽出された成分１Ｌあたり１ｆｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌに相当する検出量であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の定量方法。
【請求項１０】
下記（３）〜（７）の工程を含むことを特徴とする、細胞に取り込まれた被験化合物の定量方法。
（３）細胞を被験化合物を含む緩衝溶液に浸して細胞に該化合物を取り込ませる工程
（４）（３）工程で得られた細胞を含む溶液から緩衝溶液を除去する工程
（５）（４）工程で得られた細胞から該被験化合物を含む成分を抽出する工程
（６）前記細胞とは異なる前記細胞の細胞マトリックス、被験化合物及び極性有機溶媒か
らなる混合物であって、細胞マトリックスに対する被験化合物の含有量比が異なる
複数の混合物を調製し、該混合物をそれぞれクロマトグラフで分析し、該混合物中
に含まれる化合物の量と該化合物の検出量との相関関係を算出して得られた相関関
係に、（５）工程から得られた成分を、前記相関関係で求めた際のクロマトグラフ
と同様の条件のクロマトグラフで分析し、該成分中に含まれる被験化合物の検出量
を算出する工程
（７）（６）工程で得られた被験化合物の検出量と、前記相関関係から、細胞に取り込ま
れた被験化合物の量を定量する工程
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の定量方法における各工程をコンピュータに実行させるための被験化合物の定量プログラム。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞に取り込まれた被験化合物の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内での被験化合物の吸収、分布、代謝、排泄を検討する薬物動態は、生体に対する被験化合物の有効性を評価する上で重要である。特に、被験化合物が細胞内に取り込まれるかどうか、あるいはその取込量を正確に定量する方法は、薬物動態上、該被験化合物を評価する指標として重要な方法である。
かかる定量方法としては、例えば、細胞に遺伝子組換え技術を用いて所定の膜タンパク質を発現させ、得られた細胞に対する被験化合物の取り込み量を定量する方法として、放射性同位元素で一部が置換された被験化合物を取り込ませ、細胞からの放射線量を定量する手法が提案されている。具体的には、抗ウイルス剤であるアシクロビルやガンシクロビルの水素原子の一部を放射性同位元素である3Ｈに置換した化合物を、有機陰イオントランスポータ遺伝子を発現させた哺乳類由来の培養細胞であるＳ２細胞に取り込ませ、該細胞の放射線量を定量する方法が非特許文献１に開示されている。
【０００３】
【非特許文献１】M. Takeda et al, J Pharmacol Exp Ther,  300, 918-924（2002）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記文献に記載された方法では、被験化合物が放射性同位元素で置換し得る化合物に限定される上、かかる被験化合物を合成することは容易ではなく、医薬品として用いられる任意の被験化合物に、ただちに適用できなかった。
放射性同位元素で一部が置換された化合物以外の通常の被験化合物を定量するためには、被験化合物を細胞に取り込ませたのち、細胞を破壊し、各種試薬で抽出、変性して得られる細胞内容物を液体クロマトグラフ等で分析して、細胞内容物に含まれる被験化合物を定量することになる。ところが、細胞内容物にはタンパク質や核酸などの多種類の化合物が大量に含まれている上、そもそも細胞への被験化合物の取込量が少なく、さらに、被験化合物が使用する器具や容器、細胞の内容物等に吸着されるため、分析に供される細胞内容物及び被験化合物を含む溶液１Ｌには被験化合物が１ｆｍｏｌ〜１ｐｍｏｌ程度しか含まれておらず、高感度で被験化合物を正確に定量することは困難であった。
本発明の目的は、細胞に取り込まれた被験化合物が、放射性同位元素で一部が置換された化合物のみならず、任意の化合物でも、細胞に取り込まれた量を簡便、正確、かつ高感度で定量する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、下記（１）〜（７）の工程を含むことを特徴とする、細胞に取り込まれた被験化合物の定量方法。
（１）前記細胞の細胞マトリックス、被験化合物及び極性有機溶媒を含む混合物であって、細胞マトリックスに対する被験化合物の量比が異なる複数の混合物を調製する工程
（２）（１）で調製された混合物をそれぞれクロマトグラフで分析し、該混合物中に含まれる該化合物の量と該化合物の検出量との相関関係を算出する工程
（３）（１）及び（２）で用いられた細胞とは異なる前記細胞を被験化合物を含む緩衝溶液に浸して細胞に被験化合物を取り込ませる工程
（４）（３）工程で得られた細胞を含む溶液から緩衝溶液を除去する工程
（５）（４）工程で得られた細胞から該被験化合物を含む成分を抽出する工程
（６）（５）工程で抽出された成分を（２）工程と同様の条件のクロマトグラフで分析し、該成分中に含まれる被験化合物の検出量を算出する工程
（７）（６）工程で得られた被験化合物の検出量と、（２）で得られた相関関係から、（５）工程で抽出された成分中に含まれる被験化合物の量を定量する工程
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、被験化合物が放射性同位元素で一部が置換された化合物でなくとも、細胞に取り込まれた化合物の量を正確、簡便かつ高感度で定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の実施態様について詳細に説明する。
本発明に用いられる細胞（以下、本細胞ということがある）とは、被験化合物の取り込み能力を測定したい細胞であり、具体的には、ヒト、サル、イヌ、ラット、マウス、ハムスターなどの哺乳類由来の培養細胞；酵母、大腸菌等の微生物細胞；昆虫由来の細胞；アフリカツメガエルなどの両生類の卵母細胞などが挙げられる。
哺乳類由来の培養細胞としては、Ｓ２細胞（温度感受性ＳＶ−４０  ＬａｒｇｅＴ遺伝子トランスジェニックマウス腎近位尿細管中間部Ｓ２細胞由来樹立細胞株）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来繊維芽細胞株）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎由来樹立細胞株）、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、ＭＤＣＫＩＩ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＷＩ−３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＫＧ細胞、ＣＶ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、ＨＴ２９細胞等を挙げることができる。
本細胞は、遺伝子組換え技術を用いて得られた細胞であってもよい。
【０００８】
（１）工程で用いられる細胞マトリックスとは、被験化合物を取り込ませる本細胞の細胞内容物であり、（３）工程に用いられる「本細胞」や（５）工程で抽出される成分である「本細胞の細胞内容物」などの（３）工程で用いられる細胞とは別途調製される細胞内容物である。細胞マトリックスとしては、具体的には本細胞の形質膜を破砕して得られた細胞内容物または本細胞と極性有機溶媒を混合して本細胞から抽出して得られる細胞内容物などが挙げられる。
形質膜の破砕方法としては、例えば、磨砕法、磨砕剤との機械的振蘯法、Ｈｕｇｈｅｓプレス法、フレンチプレス法、（超）音波破砕などで本細胞等が破砕される物理的方法等、プロトプラストを調製して本細胞等が破砕される化学的方法などが挙げられる。
細胞マトリックスは、複数の形質膜の破砕方法を組み合わせて得られたものでも、形質膜の破砕方法と極性有機溶媒による抽出方法とを組み合わせて得られたものあってもよく、具体例としては、物理的あるいは化学的方法等によって形質膜を破砕したのち極性有機溶媒で抽出された細胞内容物などが挙げられる。
（１）工程で用いられる細胞マトリックスの調製方法は、後述する（６）工程と略同様の方法によって調製されることが好ましい。中でも、極性有機溶媒による抽出方法が含まれる調製方法は、被験化合物の検出感度が向上する傾向があることから好ましい。
【０００９】
細胞内容物の抽出に用いられる極性有機溶媒とは、水に全ての割合で混合し得る有機溶媒であり、具体的には、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ポリビニルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコールなどのアルコール類、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドンなどの非プロトン性極性溶媒、プロピレングリコールジメチルエーテルなどが挙げられる。中でも、メタノール、エタノール、アセトニトリルなどの炭素数３以下の極性有機溶媒は、被験化合物をタンパク質から抽出し易く、被験化合物の検出感度が向上する傾向があることから好ましく、とりわけ、アセトニトリルが好適である。
細胞マトリックスの調製に用いられる極性有機溶媒の量は、通常、細胞の１０〜５００重量倍程度である。
細胞マトリックスの調製に用いられる極性有機溶媒は、水や緩衝液で希釈されていてもよい。
【００１０】
本発明の（１）工程は、本細胞の細胞マトリックス、被験化合物及び極性有機溶媒からなる混合物であって、細胞マトリックスに対する被験化合物の量比が異なる複数の混合物を調製する工程である。調製された混合物が３つ以上であると後述する（２）工程で得られる相関関係の相関性が向上する傾向があることから好ましく、通常、分析の繁雑さから、３〜７つ程度の混合物が調製される。
【００１１】
被験化合物としては、例えば、医薬化合物や医薬候補化合物などの人造の有機化合物や無機化合物等、生理活性物質などの天然に由来する有機化合物や無機化合物等、などが挙げられる。中でも、超高感度で定量が可能な高速液体クロマトグラフ−タンデムマススペクトロメーター（以下、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳという場合がある）によって定量可能な化合物が好適であり、具体的には、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの移動相に溶解する分子量５０００未満、好ましくは５０〜２０００の有機化合物が好適である。
混合物における被験化合物の含有量及び濃度は、化合物の種類によって適宜設定すればよく、例えば、哺乳類由来の培養細胞に膜タンパク質を発現させて、細胞内への有機化合物の取込量をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより計測する場合、混合物１Ｌ中における被験化合物の含有量は、約１ ｆｍｏｌ 〜 １ μｍｏｌ程度、好ましくは、約１ ｆｍｏｌ 〜 １００ ｐｍｏｌ程度である。本発明は、１ ｆｍｏｌ 〜 １ μｍｏｌの広いレンジで測定可能な上、１ ｆｍｏｌ 〜 １ ｐｍｏｌの低含有量でも測定可能である。
混合物には被験化合物のほかに、被験化合物と略同等の濃度の対照化合物（内部標準化合物、以下、ＩＳという場合がある）を添加して測定を行い、対照化合物の検出量で装置感度の変動を補正する内部標準法が推奨される。この方法を用いると、定量の正確性が向上する傾向があることから好ましい。
【００１２】
（１）工程の混合物に用いられる極性有機溶媒は、細胞内容物の抽出に用いられた極性有機溶媒と同様の有機溶媒が例示される。
細胞マトリックスが本細胞と極性有機溶媒を混合して細胞内容物を抽出されたものである場合、抽出で使用された極性有機溶媒が（１）工程の混合物に用いられる極性有機溶媒とみなし得ることから、別に極性有機溶媒を追加する必要はない。追加する場合には、同一の極性有機溶媒であることが、分析を簡便にする点から好ましい。
【００１３】
（１）工程の混合物に用いられる極性有機溶媒の使用量（細胞マトリックスが本細胞と極性有機溶媒を混合して細胞内容物を抽出されたものである場合は細胞内容物に含まれる量と混合物を調製する際に追加した量との合計量）としては、通常、１測定単位あたり（哺乳類由来の培養細胞の場合は、培養に用いたディッシュ１枚或いはプレート１穴あたり）、１０〜５００μＬ程度であり、極性有機溶媒が混合物の１０〜９０容量％、好ましくは、３０〜７０容量％となるように使用する。１０μＬ以上であると（４）工程で残存した緩衝液の容量や細胞自体の容量のバラツキに由来する定量のバラツキを少なくなる傾向があることから好ましく、５００μＬ以下であると、クロマトグラフィにおける検出感度が向上する傾向があることから好ましい。極性有機溶媒の割合が１０容量％以上であると、被験化合物がタンパク質や使用する器具、容器等へ吸着される量を低減する傾向があることから好ましく、９０容量％以下であると、液体クロマトグラフの測定における分離能の低下など極性有機溶媒の影響を抑制する傾向があることから好ましい。
極性有機溶媒の量の影響を排除するために、通常、複数の混合物には、いずれも略同量の有機溶媒が使用される。
【００１４】
本発明の（２）工程は、（１）で調製された混合物をそれぞれクロマトグラフで分析し、該混合物中に含まれる該化合物の量と該化合物の検出量との相関関係を算出する工程である。
（１）の混合物は、クロマトグラフにそのまま試料として供してもよいが、破砕された形質膜や核酸などの夾雑物が多いことから、通常、目開きが０．１〜２μｍ程度の濾過フィルタを介して得られた液を試料として用いることが推奨される。
クロマトグラフの分析方法が内部標準法である場合には、内部標準試料（以下、ＩＳという場合がある）は、通常、濾過フィルタで濾過する前に混合される。
高速液体クロマトグラフ−マススペクトロメーター（以下、ＬＣ／ＭＳという場合がある）で測定する場合には、通常、ＩＳとしては、被験化合物と同じ方法でイオン化され、被験化合物の検出時間と一致するなどの支障を与えないものが用いられ、好ましくは、被験化合物と分子量が異なる、分子量５０〜２０００程度の有機化合物が用いられる。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳでは、検出の選択性が高いため、ＩＳの検出時間が、被験化合物の検出時間と一致しても差し支えない。
【００１５】
（２）工程で用いられるクロマトグラフィとしては、例えば、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）、イオンクロマトグラフィ（ＩＣ）などが挙げられ、中でも、ＬＣはさまざまな化合物を分析し得ることから好ましい。
以下、ＬＣについて、さらに詳細に説明する。
ＬＣの条件は、通常の化学分析に用いられる高速液体クロマトグラフの条件が用いられる。具体的には、Ｃ１８，Ｃ８，フェニル等を固定化したシリカゲルカラムなどの被験化合物に好適なカラムが適宜、選択される。
移動相としては、通常、水、または１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ緩衝水溶液等とメタノール、アセトニトリル等の極性有機溶媒の混合溶液が用いられ、適宜、極性有機溶媒を順次添加するグラジエント法も用いられる。
【００１６】
検出部としては、液体クロマトグラフに用いられる検出器であれば特に限定されないが、細胞の内容物の分析は、細胞由来の夾雑物が多く含まれ、液体クロマトグラフで分離された１つのピークにも複数の夾雑物が含まれることから、検出の選択性が高い、タンデムマススペクトロメーター（以下、ＭＳ／ＭＳという場合がある）が好ましい。ＭＳ／ＭＳを使用すると、殆どの有機化合物の測定が可能であり、検出感度が非常に高く、極低量の化合物を正確に測定できることから、化合物の種類、測定濃度範囲によらず適用できるために有用である。
ＭＳ／ＭＳの条件は、被験化合物ごとに、装置内各所にかかる電圧や各種ガス圧などの条件を適宜設定するが、装置メーカーより提供される自動最適化アプリケーションを用いて設定することもできる。
イオン化法としては、電子イオン化（ＥＩ）法、化学イオン化（ＣＩ）法、電界イオン化（ＦＩ）法、高速原子衝突（ＦＡＢ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）法などが例示される。中でも、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法は、液体クロマトグラフの検出部としてＭＳ／ＭＳを用いる場合のイオン化方法に好適である。
【００１７】
（１）で調製された混合物中に含まれる被験化合物の量と、クロマトグラフの分析で得られる該被験化合物の検出量との相関関係を求める方法としては、例えば、絶対検量線法の場合、得られたクロマトグラムにおける被験化合物のピーク面積、ピーク高さなどの測定値と、（１）で調製された混合液中における被験化合物の濃度とを点綴し、最小二乗法などの近似法によって検量線を求める方法などが挙げらる。ここで、内部標準法の場合、得られたクロマトグラムにおける被験化合物の測定値とＩＳの測定値の比を求め、該比と（１）で調製された混合液中における被験化合物の濃度とを点綴し、最小二乗法などの近似法によって検量線を求めればよい。
中でも内部標準法による相関関係の算出は、定量の正確性が向上する傾向があることから好ましい。
【００１８】
（２）工程はコンピュータで実施してもよい。具体的に、図１のフローチャートで内部標準法による１次回帰式での相関関係の算出方法を例にして以下に説明する。混合物がｎ種ある場合、Ｓ１においてｉ番目の混合物について得られたクロマトグラムの被験化合物のピーク面積（ａｉ）を入力し、Ｓ２においてｉ番目の混合物について得られたクロマトグラムのＩＳのピーク面積（ｂｉ）を入力し、Ｓ３でｉ番目の混合物中に含まれる被験化合物の濃度（ｘｉ）を入力し、Ｓ４においてｉ番目の混合物における被験化合物のピーク面積とＩＳのピーク面積との比（ｙｉ＝ａｉ／ｂｉ）を求め、Ｓ５でＳ１〜Ｓ４をｎ番目まで繰り返す。すなわち、ｉ＝１〜ｎまでのｘｉ及びｙｉを求める。続いて、Ｓ６において、Ｓ３及びＳ４で求めた値（ｘｉ及びｙｉについてｉ＝１〜ｎのそれぞれの値）から１次回帰式（ｙ＝αｘ＋β）に近似して、該式のα及びβを求めることができる。
尚、コンピュータの実行プログラムにおいて、Ｓ１〜Ｓ３の入力順序は特に限定されるものではない。
【００１９】
本発明の（３）工程は、本細胞を被験化合物を含む緩衝溶液に浸して細胞に該化合物を取り込ませる工程である。
被験化合物を含む緩衝溶液は、通常、有機溶媒、水、ｐＨを調整した水溶液、緩衝液等にて完全に被験化合物を溶解させて、被験化合物溶液を調製したのち、緩衝溶液にて適当な濃度に希釈して用いる。このとき、該溶液は、被験化合物を細胞に取り込ませる所望の条件のｐＨを維持し、且つ、形質膜構造や膜タンパク質等が破壊されない条件とし、具体的には、溶液中の極性有機溶媒の濃度を、通常、０〜２０容量％、好ましくは０〜５容量％に調整すればよい。
緩衝溶液としては、通常、被験化合物を細胞に取り込ませる所望の条件に略同一のｐＨを与える緩衝液を含み、本細胞と等しい浸透圧の溶液、具体的には、中性であれば、リン酸ナトリウム／リン酸緩衝水溶液やＨＥＰＥＳ緩衝水溶液などを含み、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムなどの無機塩類で浸透圧を調整した溶液などが用いられる。（例えば、哺乳類由来の培養細胞に被験化合物を取り込ませる場合には、ｐＨ６〜８の範囲が推奨される。）
取り込ませる温度、取り込ませる時間は、被験化合物を本細胞に取り込ませる所望の条件に略同一であればよく、細胞の培養温度程度で、化合物の取り込みが線形的に増加する範囲内の時間にすればよい。例えば、哺乳類由来の培養細胞に薬物が吸収するか否かを判定する場合には、温度を細胞の培養温度（通常、３７℃前後）、時間を１〜６０分間の範囲で行うことが推奨される。
被験化合物の含有量及び濃度は、被験化合物の種類により、適宜、調整する。
【００２０】
本発明の（４）工程は、（３）工程で得られた細胞を含む溶液から緩衝溶液を除去する工程であり、該細胞の外部にある緩衝溶液を（３）工程で取り込まれなかった被験化合物とともに除去する。
具体的には、先細パスツールピペットなどで水を取り除く方法、細胞が通過しないフィルターなどで濾過する方法などが例示される。
【００２１】
本発明の（５）工程は、（４）工程で回収された細胞から該被験化合物を含む成分を抽出する工程である。ここで、抽出とは（１）工程で用いられる細胞マトリックスの調製方法で例示された方法と同様に、物理的方法、化学的方法等によって形質膜を破砕する方法、又は、極性有機溶媒による抽出する方法、又はこれらを組み合わせた方法などが例示される。
（５）工程の抽出する方法は（１）工程で用いられた細胞マトリックスの調製方法とほぼ同一の方法で実施する方法が好ましい。このことにより、細胞由来の夾雑物や極性有機溶媒が本定量方法で及ぼす量の影響が排除されて、定量の正確性が向上する傾向があることから好ましい。
（１）工程で用いられた細胞マトリックスの調製方法、および（５）工程における抽出方法としては、中でも、極性有機溶媒を用いる方法であると被験化合物の検出感度が向上する傾向があることから好ましい。
【００２２】
本発明の（６）工程は、（５）工程で抽出された成分を（２）工程と同様の条件のクロマトグラフで分析し、該成分中に含まれる被験化合物の検出量を算出する工程である。
好ましくは、分析対象が（５）工程で抽出された成分である以外は、（２）工程で実施された、（１）で調製された混合物の分析と同様にクロマトグラフィを実施し、得られたクロマトグラムからピーク面積値などとして、被験化合物の検出量が算出される。
【００２３】
本発明の（７）工程は、（６）工程で得られた被験化合物の検出量と、（２）で得られた相関関係から、（５）工程で抽出された成分に含まれる被験化合物の量を定量する工程である。
具体的に、図１のフローチャートを例として説明すると、Ｓ７で（６）工程で得られた被験化合物のピーク面積値（ｐ）を入力し、Ｓ８で、Ｓ６で得られた一次回帰式にｐを代入して（５）工程で抽出された成分中に含まれる被験化合物の濃度（ｑ）を算出することができる（ｐ＝α×ｑ＋β）。
【００２４】
また、本発明の（３）工程及び（７）工程は、ハードウェアロジックによって構成してもよいし、次のようにコンピュータ上でソフトウェアによって実現してもよい。
すなわち、コンピュータは、各機能を実現する制御プログラムの命令を実行するＣＰＵ（central processing unit）、上記プログラムを格納したＲＯＭ（read only memory）、上記プログラムを展開するＲＡＭ（random access memory）、上記プログラムおよび各種データを格納するメモリ等の記憶装置（記録媒体）などを備えている。そして、本発明の目的は、図１に示されるＳ１〜Ｓ８で示される処理を実現するソフトウェアである制御プログラムのプログラムコード（実行形式プログラム、中間コードプログラム、ソースプログラム）をコンピュータで読み取り可能に記録した記録媒体を、上記コンピュータに供給し、そのコンピュータ（またはＣＰＵやＭＰＵ）が記録媒体に記録されているプログラムコードを読み出し実行することによっても、達成可能である。
【００２５】
上記記録媒体としては、例えば、磁気テープやカセットテープ等のテープ系、フレキシブルディスク／ハードディスク等の磁気ディスクやＣＤ−ＲＯＭ／ＭＯ／ＭＤ／ＤＶＤ／ＣＤ−Ｒ等の光ディスクを含むディスク系、ＩＣカード（メモリカードを含む）／光カード等のカード系、あるいはマスクＲＯＭ／ＥＰＲＯＭ／ＥＥＰＲＯＭ／フラッシュＲＯＭ等の半導体メモリ系などを用いることができる。
【００２６】
また、上記コンピュータを通信ネットワークと接続可能に構成し、上記プログラムコードを通信ネットワークを介して供給してもよい。この通信ネットワークとしては、特に限定されず、例えば、インターネット、イントラネット、エキストラネット、ＬＡＮ、ＩＳＤＮ、ＶＡＮ、ＣＡＴＶ通信網、仮想専用網（virtual private network）、電話回線網、移動体通信網、衛星通信網等が利用可能である。また、通信ネットワークを構成する伝送媒体としては、特に限定されず、例えば、ＩＥＥＥ１３９４、ＵＳＢ、電力線搬送、ケーブルＴＶ回線、電話線、ＡＤＳＬ回線等の有線でも、ＩｒＤＡやリモコンのような赤外線、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、８０２．１１無線、ＨＤＲ、携帯電話網、衛星回線、地上波デジタル網等の無線でも利用可能である。なお、本発明は、上記プログラムコードが電子的な伝送で具現化された搬送波あるいはデータ信号列の形態でも実現され得る。
【００２７】
（７）工程で求められた、（５）工程で抽出された成分中に含まれる被験化合物の濃度の大小によって、本細胞に取り込まれた被験化合物の量を把握することができる。
比較を容易にするために、（３）工程で用いられた本細胞の数と（７）工程で得られた被験化合物の濃度から、本細胞１個あたりの被験化合物の量（モル数、重量等）を算出してもよいし、（３）工程で用いられた本細胞のタンパク質の量（重量、容量など）と（７）工程で得られた被験化合物の濃度から、本細胞のタンパク質の単位量（重量、容量など）あたりの被験化合物の量（モル数、重量等）を算出してもよいし、（５）工程で抽出された成分中に含まれる本細胞のタンパク質の単位量（重量、容量など）あたりの被験化合物の量（モル数、重量等）を算出してもよい。
【００２８】
本発明の（１）工程及び（２）工程によって得られる相関関係は、細胞と被験化合物とが同じ種類であれば一致することから、（１）工程及び（２）工程によって相関関係が算出されていれば、（３）〜（７）工程を実施する毎に（１）工程及び（２）工程を実施する必要はない。
図１で説明すると、Ｓ０で相関関係である式（ｙ＝α×ｘ＋β）が算出されているか否かを判断し、式が算出されている場合には、Ｓ１〜Ｓ６を省略して被験化合物の検出量である「被験化合物のピーク面積とＩＳのピーク面積との比（ｐ）」のみをコンピュータにを入力し（Ｓ７）、Ｓ８を実施して、被験化合物の量（ｑ）を求めることができる。
定量の正確性を向上させるために、（３）〜（７）工程を実施する毎に（１）工程及び（２）工程を実施することが推奨される。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。部および％は、特に断りがない限り、重量基準を意味する。
【００３０】
＜（１）工程：細胞内容物の調製＞
トランスポーター遺伝子（ｈＯＡＴ−３）を発現させていないＳ２細胞（温度感受性ＳＶ−４０  ＬａｒｇｅＴ遺伝子トランスジェニックマウス腎近位尿細管中間部Ｓ２細胞由来樹立細胞株）を、２４穴培養プレートにて２日間培養し、培養液を除いた後に、Dulbecco'ｓ phosphate buffered saline（８ ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、０．２ ｇ／Ｌ 塩化カリウム、１.１５ ｇ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム、０．２ ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、０．１３３ ｇ／Ｌ 塩化カルシウム・２水和物及び０．１ ｇ／Ｌ 塩化マグネシウム・６水和物。これを、以下、ＤＰＢＳという。）で洗浄した。
２４穴培養プレートの各ｗｅｌｌからＤＰＢＳをできる限り除き、水を５０μＬ／ｗｅｌｌ、次に、アセトニトリルを５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で約５分間振とうした。得られた抽出液を１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに移して遠心分離（１４，０００ ｒｐｍ、５分間、２０℃）し、上清を回収して、極性有機溶媒であるアセトニトリルを含有した細胞内容物を得た。
【００３１】
＜（１）工程：混合物の調製＞
当該チューブに、被験化合物であるプラバスタチンナトリウム（和光純薬製、分子量４４６．５）を０．００２μｍｏｌ／Ｌ含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸アンモニウム溶液／酢酸（容量比４００：１）、前記に調製した極性有機溶媒を含有した細胞内容物５０μＬ、及びレセルピン（ＩＳ、和光純薬製、分子量６０８．７）を０．５μｍｏｌ／Ｌ含有するＩＳ溶液２５μＬを当該チューブに入れ、ボルテックスミキサーにて数秒間攪拌した。続いてろ過フィルター（倉敷紡績製、セントリカット超ミニ、目開き０．４５μｍ）でろ過（１０，０００ｒｐｍ、２分間、室温）して混合物を調製した。
被験化合物プラバスタチンの濃度を、２、１、０．４、０．１、０．０２及び０．００４μｍｏｌ／Ｌとした以外は前記と同様にして合計７本の混合物を調製した。
混合物における添加した被験化合物溶液の添加濃度と細胞マトリックスを含む混合液中における被験化合物の濃度との関係を表１にまとめた。
【００３２】
【表１】
2008014746.tif 000003
【００３３】
＜（２）工程＞
混合物を下記条件のＬＣ／ＭＳ／ＭＳに注入して測定し、得られたピーク面積比（測定対象物質のピーク面積／ＩＳのピーク面積）をＹ、被験化合物濃度をＸとし，解析ソフトAnalyst ver. 1.41（Applied Biosystems / MDS SCIEX社）を用いて最小二乗法により一次回帰式（Ｙ ＝ ２４．８ Ｘ −０．００４０７、１／Ｙ重み付け、相関係数０．９９９６）を算出した。また、添加検量線と同様に調製した、ブランク試料（被験化合物、ＩＳとも不含）及び混合物０試料（被験化合物不含、ＩＳ含有）を注入した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの条件は下記に示した。結果を表３にまとめた。
【００３４】
ＨＰＬＣ条件
装置          ：ＬＣ−２０Ａシリーズ    （株）島津製作所
分析カラム    ：L-column 2.1×150ｍｍ、５μＬ、化学物質評価研究機構
カラム温度    ：２５℃
移動相        ：Ａ  １０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸アンモニウム溶液／酢酸（容量比400：1）
Ｂ  アセトニトリル
グラジエントプログラムは表２に記載
流量          ：０．２ｍＬ／分
注入量        ：１０μＬ
【００３５】
【表２】
2008014746.tif 000004
【００３６】
ＭＳ／ＭＳ条件
タンデム質量分析器  ：API4000  Applied Biosystems/MDS SCIEX社
API interface         ：Turbo V (ESIプローブ)
Ionization mode      ：Negative ion detection mode
Ion spray voltage     ：−４５００Ｖ
Detection MRM      ：precursor ion      product ion
プラバスタチン：m/z 423.4    →    m/z 303.0
ＩＳ：m/z 607.6    →    m/z 210.9
【００３７】
【表３】
2008014746.tif 000005
【００３８】
＜（３）工程＞
ｈＯＡＴ−３を発現させたＳ２細胞を（１）工程と同様に洗浄し、３７℃にて１０分間プレインキュベーションした。その後、予め３７℃に保温しておいた２５μｍｏｌ／Ｌの被験化合物の水溶液を５００μＬ加えて、３７℃にて１分間静置した。
【００３９】
＜（４）工程＞
被験化合物を含む溶液を吸引除去し、氷冷ＤＰＢＳで３回洗浄して取り込みを停止させた。その後、ＤＰＢＳを吸引除去して、被験化合物が取り込まれた細胞を得た。
【００４０】
＜（５）工程＞
ＤＰＢＳが除去されたＳ２細胞に５０μＬの水と５０μＬのアセトニトリルを混合したのち、室温で約５分間振とうし、得られた抽出液を１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに移して遠心分離（１４，０００ ｒｐｍ、５分間、２０℃）して上清を得た。
【００４１】
＜（６）工程＞
得られた上清５０μＬ、１０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸アンモニウム溶液／酢酸（容量比４００：１）２５μＬ及びレセルピン（ＩＳ）を０．５μｍｏｌ／Ｌ含有するＩＳ溶液２５μＬをチューブに入れ、ボルテックスミキサーにて数秒間攪拌した。続いて、ろ過フィルターでろ過（１０，０００ｒｐｍ、２分間、室温）して混合物を調製し、前記と同様のＬＣ／ＭＳ／ＭＳの条件で測定した。
【００４２】
＜（７）工程＞
得られたクロマトグラムのＩＳと被験化合物のピーク面積比及び（３）工程で算出された１次回帰式から、各ｗｅｌｌより得た上清中の被験化合物濃度を算出した。一方、１ ｗｅｌｌあたりのタンパク質量をビシンコニン酸法（ＢＣＡ法）により測定し、０．１５０ ｍｇ/ｗｅｌｌと算出された。そこで、タンパク質１ ｍｇあたり、１分の取り込み時間で取り込まれる被験化合物の量は３４．３ｐｍｏｌ／ｍｇと算出された。
【００４３】
同様に＜（４）工程＞において、２５μｍｏｌ／Ｌの被験化合物の水溶液を加えた後の静置時間（インキュベーション時間、分、図２の横軸）を２、５、１５、３０及び４５分と変えた場合、（７）工程で得られる、タンパク質１ ｍｇあたり取り込まれる被験化合物の量（プラバスタチン取り込み量、pmol/mg protein、図２の縦軸）を求めた。結果を図２の実線（■）で示した。
図２によれば、被験化合物であるプラバスタチンの細胞外から細胞内への輸送が約５分で飽和に達しており、トランスポーターを介した薬物の細胞内取り込みが飽和曲線を描くという一般的知見に一致していることから正しく定量されていることがわかる。
ｈＯＡＴ−３を発現させたＳ２細胞に代えて、遺伝子を発現させなかった未発現のＳ２細胞を用いる以外は前記と同様にして得られた結果を図２の実線（▲）で示した。当該遺伝子を発現させなかった未発現のＳ２細胞は、ｈＯＡＴ−３発現細胞と比較してプラバスタチン取り込み量が少なく、また、その取り込みに飽和性は認められなかった。
【００４４】
また、＜（３）工程＞において、１、３、１０、２５、５０、１００及び１５０μｍｏｌ／Ｌ（取り込み外液中プラバスタチン濃度、μmol/L、図３の横軸）の被験化合物の水溶液を用い、取り込み時間を２分とした場合のタンパク質１ ｍｇあたり取り込まれる被験化合物の量（プラバスタチン取り込み量、pmol/mg protein、図３の縦軸）を求めた。結果を図３にまとめた。
図３によれば、（３）工程で用いる被験化合物であるプラバスタチンの濃度依存性が見られ、Ｋｍ値は１１．９μｍｏｌ／Ｌと算出された。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた測定から算出したこの数値は、同細胞を用い、放射性エストロン硫酸の取り込みを非標識プラバスタチンが阻害することから得られたＩＣ５０値（１３．７μｍｏｌ／Ｌ、M. Takeda et al., Eur J Pharmacol, 483, 133-138 (2004)  参照）とほぼ同等の値を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の定量方法は、例えば、医薬品、農薬品、工業薬品、特定保健薬品、機能性食品などの化合物が細胞に取り込まれる量を定量することができ、薬物動態などのこれら化合物が細胞に及ぼす影響についての知見を与えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】（２）工程及び（７）工程の処理を実現するソフトウェアのフローチャート
【図２】（３）工程において、２５μｍｏｌ／Ｌの被験化合物の水溶液を加えた後の静置時間を１、２、５、１５、３０、４５分と変えた場合、培養Ｓ２細胞に取り込まれるプラバスタチンの量（縦軸、プラバスタチン取り込み量、pmol/mg protein）を経過時間（横軸、インキュベーション時間、分）ごとに点綴したグラフである。■：ｈＯＡＴ−３を発現させたＳ２細胞のタンパク質１ ｍｇあたりのプラバスタチン取込量  ▲：遺伝子を発現させなかった未発現のＳ２細胞のタンパク質１ ｍｇあたりのプラバスタチン取込量
【図３】＜（４）工程＞において、１、３、１０、２５、５０、１００及び１５０μｍｏｌ／Ｌの被験化合物の水溶液を用い、取り込み時間を２分とした場合、培養Ｓ２細胞に取り込まれるプラバスタチンの量（縦軸、プラバスタチン取り込み量、pmol/mg protein）を、前記濃度（横軸、取り込み外液中プラバスタチン濃度、μmol/L）ごとに点綴したグラフである。■：ｈＯＡＴ−３を発現させたＳ２細胞のタンパク質１ ｍｇあたりのプラバスタチン取込量  ▲：遺伝子を発現させなかった未発現のＳ２細胞のタンパク質１ ｍｇあたりのプラバスタチン取込量
【図１】
2008014746.tif 000006
【図２】
2008014746.tif 000007
【図３】
2008014746.tif 000008