(57)【要約】【課題】液体クロマトグラフで分離した各成分の表面増強ラマンスペクトルをオンラインで高感度に取得する方法を提供する。【解決手段】液体クロマトグラフで分離した成分を含む移動相溶媒に導電体超微粒子の表面増強ラマン活性成分を添加し、その添加後に移動相溶媒を所定の長さの吸着用配管中で１０間以上保持して表面増強ラマン活性成分に分離成分を吸着させ、吸着用配管の移動相溶媒の流出口に結合したレーザー光透過部に移動相溶媒を導入し、それにレーザー光を照射し透過させることで、分離成分の表面増強ラマンスペクトルを取得する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフ用試料を移動相溶媒Ａに溶出させ液体クロマトグラフ用カラムに送液し前記カラムから前記移動層溶媒Ａを配管コネクタに流出させる第１の工程と、前記配管コネクタが第２の配管からの導電体超微粒子の表面増強ラマン活性成分を有する溶媒Ｂを前記移動相溶媒Ａに合流させて混合液を形成し吸着用配管に流出させる第２の工程と、前記混合液を前記吸着用配管に１０秒間以上保持して流通させる第３の工程と、前記吸着用配管の流出口の前記混合液をレーザー光透過部に導入しレーザー光を照射することで前記混合液中の前記試料の成分をレーザーラマン分光法により分析する第４の工程を有することを特徴とする高感度分光分析方法。
【請求項２】
液体クロマトグラフ用試料導入部を有し、前記試料導入部に移動相溶媒Ａを送入し前記試料導入部の試料を移動相溶媒Ａに溶出させる液体クロマトグラフ用送液ポンプを有し、前記試料導入部に結合し前記移動相溶媒Ａを流通させる液体クロマトグラフ用カラムを有し、前記カラムの前記移動相溶媒Ａの流出口に結合した配管コネクタを有し、前記配管コネクタに第２の配管と吸着用配管を結合し、前記第２の配管に導電体超微粒子の表面増強ラマン活性成分を有する溶媒Ｂを送入する送液用ポンプを有し、前記配管コネクタが前記移動相溶媒Ａに前記溶媒Ｂを合流させて混合液を形成し前記吸着用配管に流出させ、前記吸着用配管の長さを、前記混合液を１０秒間以上保持し流通させる長さに形成し、前記吸着用配管の前記混合液の流出口に結合し前記混合液を導入するレーザー光透過部を有し、レーザー光を前記レーザー光透過部内の前記混合液へ照射し透過させるレーザー光源を有し、前記レーザー光透過部を透過したレーザー光を受光するラマン散乱検出用分光器を有することを特徴とする高感度分光分析装置。
【請求項３】
前記吸着用配管がコイル状であることを特徴とする請求項２記載の高感度分光分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィーによって分離された溶液中有機化合物の原子団に基づくラマン散乱をオンラインで高感度に検出する方法およびその検出装置に関する。更に詳しくは、工業製品中の有機化合物、例えば、添加剤、高分子材料、天然化合物等の糖や脂質を試料とし、その原子団の同定のための高感度分光分析方法および高感度分光分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、有機化合物の原子団情報取得においては、赤外分光法やラマン分光法が用いられる。いずれもスペクトルとして原子団情報が得られる分光法である。ラマン分光法によって得られるスペクトルをラマンスペクトルと呼ぶ。
【０００３】
ラマンスペクトルとは、物質に一定振動数ν０の単色光を照射することにより発生する散乱光中、同一振動数以外（ν０±νｉ）の散乱光（ラマン散乱光）のスペクトルである。そして、このラマン振動数νｉは、物質を構成する分子や結晶の振動や回転のエネルギー準位間の振動数に等しいことから、物質に含まれる原子団を同定、定量するための情報源となる。しかし、このラマン散乱光は非常に微弱であるため、単色光をレーザー光を用いて照射することで、ラマン散乱光強度を強くする方法が多く用いられるようになってきている。
【０００４】
しかし、試料が微量しかない場合のラマン散乱光はレーザー光を用いても微弱であるため、表面プラズモン共鳴効果を利用して増強した上で測定することが考えられる。この表面プラズモン共鳴効果は、一般に光は電子波（プラズモン）とはカップリングしないが、金属超微粒子表面ではカップリングを起こすという現象を利用したものであって、例えば金の超微粒子を用いた場合には、５２０ｎｍ付近の光に対して強い吸収ピークが現われる。係る技術は、特許文献１と２で開示されている。この技術では、抗体等へ結合するための反応性基を末端に有するポリエチレングリコールで金等の金属超微粒子を被覆することによって溶液中での粒子の分散安定性を高めた上で、表面プラズモン共鳴効果により標的化合物のラマン散乱光の増強を図っている。
【０００５】
以下に先行技術文献を示す。
【特許文献１】特開平１３−２０００５０号公報
【特許文献２】特開平１４−８０９０３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
微弱なラマン散乱は、照射光としてレーザー光を用いることと、表面プラズモン共鳴効果によって増強することにより検出することが可能になると考えられる。しかし、微量試料中に複数成分が含有されている場合には、各成分に含有される原子団起因のラマンスペクトルが重なって得られるために、各成分の原子団を同定することはできないという問題がある。
【０００７】
また、試料中に複数成分が含有されている場合には、液体クロマトグラフで単一成分に分離した後に、オンラインで可視・紫外吸光検出器や質量分析装置で各単一成分を検出する方法を用いることができると考えられるが、可視・紫外吸光検出器や質量分析装置では各成分の原子団に起因する情報を得ることができないという問題がある。
【０００８】
本発明は、上記従来の問題に鑑みてなされたものであり、その課題とするところは、液体クロマトグラフで分離した各成分の表面増強ラマンスペクトルをオンラインで高感度に取得することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、この課題を解決するために、液体クロマトグラフ用試料を移動相溶媒Ａに溶出させ液体クロマトグラフ用カラムに送液し前記カラムから前記移動層溶媒Ａを配管コネクタに流出させる第１の工程と、前記配管コネクタが第２の配管からの導電体超微粒子の表面増強ラマン活性成分を有する溶媒Ｂを前記移動相溶媒Ａに合流させて混合液を形成し吸着用配管に流出させる第２の工程と、前記混合液を前記吸着用配管に１０秒間以上保持して流通させる第３の工程と、前記吸着用配管の流出口の前記混合液をレーザー光透過部に導入しレーザー光を照射することで前記混合液中の前記試料の成分をレーザーラマン分光法により分析する第４の工程を有することを特徴とする高感度分光分析方法である。
【００１０】
また、本発明は、液体クロマトグラフ用試料導入部を有し、前記試料導入部に移動相溶媒Ａを送入し前記試料導入部の試料を移動相溶媒Ａに溶出させる液体クロマトグラフ用送液ポンプを有し、前記試料導入部に結合し前記移動相溶媒Ａを流通させる液体クロマトグラフ用カラムを有し、前記カラムの前記移動相溶媒Ａの流出口に結合した配管コネクタを有し、前記配管コネクタに第２の配管と吸着用配管を結合し、前記第２の配管に導電体超微粒子の表面増強ラマン活性成分を有する溶媒Ｂを送入する送液用ポンプを有し、前記配管コネクタが前記移動相溶媒Ａに前記溶媒Ｂを合流させて混合液を形成し前記吸着用配管に流出させ、前記吸着用配管の長さを、前記混合液を１０秒間以上保持し流通させる長さに形成し、前記吸着用配管の前記混合液の流出口に結合し前記混合液を導入するレーザー光透過部を有し、レーザー光を前記レーザー光透過部内の前記混合液へ照射し透過させるレーザー光源を有し、前記レーザー光透過部を透過したレーザー光を受光するラマン散乱検出用分光器を有することを特徴とする高感度分光分析装置である。
【００１１】
また、本発明は、上記吸着用配管がコイル状であることを特徴とする上記の高感度分光分析装置である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の高感度分光分析方法およびその分光分析装置は、以上の構成により、移動相溶媒Ａと溶媒Ｂの混合溶液を吸着用配管に１０秒間以上保持して流通させるので、液体クロマトグラフで分離された試料の各成分を表面増強ラマン活性成分に安定に吸着した状態で試料の成分を連続的に分析できる効果があり、また、装置を小型化することができる効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の高感度分光分析方法およびその分光分析装置を実施の形態に沿って以下に図面を参照にしながら詳細に説明する。図１は、高感度分光分析方法および高感度分光分析装置の一実施例の概略を説明するための説明概略図である。図１に示すように、本発明の高感度分光分析装置は液体クロマトグラフ用送液ポンプ１２と導入部１３と液体クロマトグラフ用カラム１４と表面増強ラマン活性成分１６の送液用ポンプ１７と配管コネクタ１５とレーザー光透過部２２とコイル状の吸着用配管１８とレーザー光源１９とラマン散乱検出用分光器２０から構成する。
【００１４】
図１で、液体クロマトグラフ用送液ポンプ１２は、試料導入部１３に接続し、その試料導入部１３は液体クロマトグラフ用カラム１４に接続する。また、高感度分光分析装置には、表面増強ラマン活性成分１６を含む溶媒を送入するための送液用ポンプ１７が配置されている。そして、液体クロマトグラフ用送液ポンプ１２から送液され液体クロマトグラ
フ用カラム１４から溶出した移動相溶媒１１に、表面増強ラマン活性成分１６を含む溶媒を導入するための配管コネクタ１５が配されている。実験の結果、移動相溶媒１１と表面増強ラマン活性成分１６を混合した後表面増強ラマン活性成分１６に試料が吸着しラマン活性を示すまでには多くの場合数秒を必要とするという知見を得た。この知見により、移動相溶媒１１と表面増強ラマン活性成分１６を混合しコイル状の吸着用配管１８内に移動相溶媒１１を１０秒間以上保持することで表面増強ラマン活性成分１６に試料が吸着する時間を確保する。これにより、表面増強ラマン活性成分１６に試料が安定に吸着した状態で試料の成分を分析でき、また、装置の小型化を図ることができる。
【００１５】
吸着用配管１８の終端部にレーザー光透過部２２を設ける。そのレーザー光透過部２２にレーザー光源１９からレーザーを照射する構造にする。液体クロマトグラフ用カラム１４による液体クロマトグラフで分離された成分がレーザー光透過部２２を通過したときには、添加した表面増強ラマン活性成分１６に分離成分が吸着を終え、分離成分の持つ原子団に特徴的なラマン散乱が表面増強され、感度よくラマン散乱検出用分光器２０で検出される。その後はその他検出器２１によってラマン散乱以外の情報を得ることができる。
【００１６】
移動相溶媒１１としては、ラマン散乱のない水が好ましいが、試料に特有のラマン散乱を阻害しない有機溶媒であれば使用することが可能である。その例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトニトリル、ヘキサン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、水、クロロホルム、ジクロロメタン、トルエン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。そして、それらは単独であってもよく、あるいは混合物であってもよい。ただし、非水溶性溶媒を液体クロマトグラフ用カラム１４の移動相溶媒１１に用いる場合は、送液用ポンプ１７で用いる移動相溶媒１１には、その非水溶性溶媒と、この非水溶性溶媒との相溶性のある水溶性溶媒と、水との混合溶媒を使用しなくてはならない。前記非水溶性溶媒としては、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ジクロロメタン、トルエン等が挙げられる。
【００１７】
液体クロマトグラフ用カラム１４としては、例えば、順相系クロマトグラフ用カラム、逆相系クロマトグラフ用カラム、サイズ排除クロマトグラフ用カラム、吸着クロマトグラフ用カラム等が挙げられる。
【００１８】
表面増強ラマン活性成分１６の送液用ポンプ１７としては、移動相溶媒１１と表面増強ラマン活性成分１６を有する溶媒を混合して送液するグラジェント式の送液用ポンプ１７を用いることが望ましい。また、液体クロマトグラフ用送液ポンプ１２も複数の移動相溶媒１１の成分を混合して送液するグラジェント式の液体クロマトグラフ用送液ポンプ１２を用いることが、幅広い種類の試料の分析を行う観点から望ましい。配管コネクタ１５はＴ字型、Ｙ字型など３方向の配管を接続するものを用いる。
【００１９】
表面増強ラマン活性成分１６としては、直径が５０ｎｍ程度の金や銀の超微粒子（ナノ粒子）、あるいは銅や銅合金などの表面プラズモン共鳴をおこす金属超微粒子を用いる。また、半導体のシリコンの超微粒子、あるいはゲルマニウムの超微粒子、銅フタロシアニンなど、その他の導電体の超微粒子も表面プラズモン共鳴をおこすと考えられるので同様に表面増強ラマン活性成分１６として用いることができる。レーザー光源１９は表面増強ラマン活性成分１６がラマン活性を示す波長を用いる。すなわち、金属超微粒子として直径が５０ｎｍ程度の金または銀の超微粒子を用いる場合は、レーザー光源１９は、その金属超微粒子がラマン活性を示す５２０ｎｍの波長に近い波長を持つＹＡＧレーザーの第２高調波（５３２ｎｍ）を用いることが望ましい。
【００２０】
レーザー光透過部２２としては、石英ガラス製のセルを用いることができる。あるいは吸着用配管１８がフューズドシリカの場合は、表面に被覆してあるポリイミドコーティン
グを剥がすことで、レーザー光を透過させることができる。
【００２１】
また、レーザーラマン分光分析は非破壊で行われるため、本高感度分光分析装置を通過した吸着用配管１８の下流に接続した配管に液体クロマトグラフで一般的に使用されるその他検出器２１を接続することが可能である。その他検出器２１としては、可視・紫外分光検出器、蒸発型光散乱検出器、屈折率計、質量分析装置などを挙げることができる。
【００２２】
本発明の高感度分析装置を用いて分析する方法によると、微量な試料中に複数成分が含有されている場合であっても、単一成分に分離、および、原子団の同定、定量を同一工程で行うことができる効果がある。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明の実施例を挙げて、さらに詳しく説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
試料として、４−ピリジンカルボン酸、関東化学株式会社製を用いた。これを蒸留水により希釈し、１０-6モル／リットルに調製した。試料注入量は５μＬとした。液体クロマトグラフ用カラム１４には、Ｃ１８  ＭＧII、株式会社資生堂製（３ｍｍ×５０ｍｍ）を用いた。液体クロマトグラフ用移動相溶媒１１は５０ｍモル／リットルのリン酸ナトリウムを用い、移動相溶媒１１の流量は０．２ｍリットル／分とした。表面増強ラマン活性成分１６の金属超微粒子としては、アーカイラス・エンジニアリング合資会社製の直径が５０ｎｍ程度の銀ナノ粒子集合体分散液を用いた。これを１０-7モル／リットルに調製し、流量０．２ｍリットル／分で添加した。吸着用配管１８には内径０．５ｍｍ、全長３０ｃｍのポリエーテル・エーテル・ケトン（ＰＥＥＫ）樹脂のコイル状の配管を用いた。流量０．４ｍリットル／分で約３０秒かけて通過させることで、液体クロマトグラフ用カラム１４による液体クロマトグラフで分離された成分が液体クロマトグラフ用移動相溶媒１１に添加した表面増強ラマン活性成分１６に吸着するために十分な時間を与えた。レーザー光透過部２２には内径０．５ｍｍの石英ガラス製のマイクロフローセルを用い、試料が拡散しないように留意した。レーザー光源１９としてはＹＡＧレーザー、５３２ｎｍを用いた。１秒間に１０回積算してラマンスペクトルを得た。
【００２４】
＜比較例１＞
実施例１において、送液用ポンプ１７と配管コネクタ１５を用いず、表面増強ラマン活性成分１６を添加しないこと、注入する４−ピリジンカルボン酸濃度を１０-2モル／リットルとすること以外は実施例１と同様にして分析を行った。
【００２５】
＜評価結果＞
表１に実施例１と比較例１で測定した４−ピリジンカルボン酸のピリジン環に起因するラマンシフトである１０２０ｃｍ-1のラマン散乱光強度（任意単位）を示す。比較例１は実施例１よりも試料濃度が約１００００倍であるにも関わらず、１０２０ｃｍ-1のラマン散乱光強度は１／２である。実施例は比較例と比べ２００００倍以上高感度に測定できることが分かる。
【００２６】
【表１】
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＜実施例２＞
試料として、４−ピリジンカルボン酸、関東化学株式会社製を用いた。これを蒸留水により希釈し、１０-6モル／リットルに調製した。試料注入量は０．１μＬとした。液体クロマトグラフ用カラム１４には、ＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ  Ｃ１８カラム、アジレント社製（０．３ｍｍ×５０ｍｍ）を用いた。液体クロマトグラフ用移動相溶媒１１は５０ｍモル／リットルのリン酸ナトリウムを用い、移動相溶媒１１の流量は０．０２ｍリットル
／分とした。表面増強ラマン活性成分１６の金属超微粒子としては、アーカイラス・エンジニアリング合資会社製の直径が５０ｎｍ程度の銀ナノ粒子集合体分散液を用いた。これを１０-7モル／リットルに調製し、流量０．０２ｍリットル／分で添加した。吸着用配管１８には内径０．１５ｍｍ、全長３０ｃｍのフューズドシリカキャピラリーのコイル状配管を用いた。流量０．０４ｍリットル／分では約３０秒かけて通過するため、添加した表面増強ラマン活性成分１６に分離された成分が吸着するのに十分な長さである。レーザー光透過部２２には、吸着用配管１８に用いているフューズドシリカキャピラリー表面を被覆しているポリイミドを約２ｃｍ焼くことによってシリカが剥き出しの状態にした部分を用いた。レーザー光源１９としてはＹＡＧレーザー、５３２ｎｍを用いた。１秒間に１０回積算してラマンスペクトルを得た。
【００２７】
＜比較例２＞
実施例２において、送液用ポンプ１７と配管コネクタ１５を用いず、表面増強ラマン活性成分１６を添加しないこと、注入する４−ピリジンカルボン酸濃度を１０-2モル／リットルとすること以外は実施例２と同様にして分析を行った。
【００２８】
＜評価結果＞
表２に実施例２と比較例２で測定した４−ピリジンカルボン酸のピリジン環に起因するラマンシフトである１０２０ｃｍ-1のラマン散乱光強度（任意単位）を示す。比較例２は実施例２よりも試料濃度が約１００００倍であるにも関わらず、１０２０ｃｍ-1のラマン散乱光強度は約１／２である。実施例は比較例と比べ２００００倍以上高感度に測定できることが分かる。
【００２９】
【表２】
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本発明を用いることにより、複数成分混合試料を液体クロマトグラフで分離し、単一成分ごとに高感度に原子団を同定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の高感度分光分析方法およびその分光分析装置の一実施例の概略を説明するための説明概略図である。
【符号の説明】
【００３１】
１１・・・移動相溶媒
１２・・・液体クロマトグラフ用送液ポンプ
１３・・・試料導入部
１４・・・液体クロマトグラフ用カラム
１５・・・配管コネクタ
１６・・・表面増強ラマン活性成分
１７・・・送液用ポンプ
１８・・・吸着用配管
１９・・・レーザー光源
２０・・・ラマン散乱検出用分光器
２１・・・その他検出器
２２・・・レーザー光透過部
【図１】
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