(57)【要約】【課題】  孔径に依存することなく病原性ウイルスや毒素を除くことのできるフィルターを提供する。【解決手段】  シアリルラクトース、ラクトース硫酸、シアリル化オリゴ糖、ヘパリン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、硫酸化キチン、硫酸化コロミン酸、ヘパラン硫酸、ガラクトシルラクトース、およびガラクトシルガラクトースからなる群から選択される糖質の少なくとも１つを結合した高分子を化学結合したことを特徴とする、フィルター。  本発明は、フィルターの孔径に依存することなく病原性ウイルスや毒素を除くことを目的とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアリルラクトース、ラクトース硫酸、シアリル化オリゴ糖、ヘパリン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、硫酸化キチン、硫酸化コロミン酸、ヘパラン硫酸、ガラクトシルラクトース、およびガラクトシルガラクトースからなる群から選択される糖質の少なくとも１つを結合した高分子を化学結合したことを特徴とする、フィルター。
【請求項２】
高分子とフィルターのいずれかが、親水性高分子、または疎水性高分子であることを特徴とする、請求項１記載のフィルター。
【請求項３】
フィルターがセルロースフィルターであることを特徴とする、請求項１または２に記載のフィルター。
【請求項４】
フィルターがろ過膜であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のフィルター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のフィルターを含有することを特徴とする、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスや毒素と結合することのできる糖質を結合させた高分子（以後、糖質高分子とも呼ぶ）を化学結合させたフィルターおよび該フィルターを有する装置に関する。
本発明は、「平成１８年度、新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願」である。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスに起因する種々の疾病が大きな社会問題になっており、エイズはＨＩＶにより、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎はそれぞれＨＢＶ、ＨＣＶによりもたらされ、インフルエンザはＡ型、Ｂ型、Ｃ型などの各種インフルエンザウイルスによりもたらされることが知られている。インフルエンザウイルスは、突然変異を頻繁に起こすため、ワクチンによる予防が極めて困難とされている。また、ＨＩＶ感染患者の完全な治療法は未だ見出されていない。また、大腸菌Ｏ−１５７などが出すベロ毒素は溶血性尿毒症候群を引き起こし死者が多数発生している。これらのウイルスは完全に除去できなくても相当量を吸着などにより除去できれば、発症を遅らせたり、その後の治療効果を向上させることができ、毒素の相当量を除去できれば症状の軽減あるいは快癒をもたらすので、これらのウイルス、毒素などの病原性微粒子の除去に対する期待は高い。
【０００３】
ある種の糖質は、病原性のウイルスやタンパク質、例えばインフルエンザウイルス、ＨＩＶやベロ毒素などと特異的に結合できるので、このような糖質を結合させた高分子（糖質高分子）も病原性のウイルスやタンパク質と結合することができる。例えば、インフルエンザウイルスは、シアリルラクトースやラクトース硫酸を結合したポリマー（糖質高分子）と結合できる。また、ベロ毒素は、ガラクトシルラクトースをポリマーに結合した糖質高分子と結合できる。また、ＨＩＶは硫酸化多糖類に結合することが知られている。
【０００４】
また、シアリルラクトースやラクトース硫酸がポリマーに結合した糖質高分子と結合したインフルエンザウイルスは、感染性が阻害されることも知られている。
【０００５】
特許文献１（特開平１０−４５６０１号公報）には、マンノース結合型レクチンを親水性高分子を介して疎水性高分子鎖よりなる基材に結合した、ビーズ状またはろ過型フィルター状の抗ウイルス素材が開示されている。特許文献１に記載された、マンノース結合型レクチンを結合した親水性高分子を含有するろ過型フィルターは、細胞成分や微生物の入った培養液や血漿から、目的のバイオプロダクツや蛋白質をマンノース結合型レクチンとの結合性を利用して得ることを目的としており、細胞成分やウイルスの除去はフィルターの孔径に依存している。このようなフィルターは、分子の大きさに基づいて分離するので、フィルターの孔径より大きいウイルスや毒素以外の粒子も非選択的に除かれるため、有用な成分も失われる可能性がある。
【０００６】
特許文献２、非特許文献１及び非特許文献２には、ガラクトシルラクトースを再生セルロースに化学結合したベロ毒素除去用病原体除去装置が開示されている。特許文献２、非特許文献１及び非特許文献２に記載された病原性微粒子吸着性中空糸は中空糸の内側表面に糖質高分子を結合させたもので、これに患者血液を通過させウイルスや毒素の除去を行うものである。病原性微粒子を除去するためには、中空糸内側表面に固定化した糖質高分子と病原性微粒子を十分に接触させなければならないが、中空糸内径により接触効率が異なり、十分な接触を得るには中空糸内側に流す血液の流速を維持しながら繰り返し通液させなければならず、時間と費用を要する。特に血液製剤中の病原体微粒子除去には、同様の理由で中空糸法は適していない。
【０００７】
特許文献３には、シアリルラクトース結合高分子をフィルターに固定化したインフルエンザウイルス補捉用空気清浄装置が開示されている。特許文献３に記載されたインフルエンザウイルス捕捉用シアリルラクトース結合高分子固定化空気清浄装置は、合成樹脂（ポリエチレン、ポリスチレン等）基板上に糖鎖高分子をスプレー法等で塗布しているため、物理的吸着などの弱い力で固定化している。よって、容易に糖鎖高分子が剥離してウイルス補捉効果が無くなることが懸念される。
【特許文献１】特開平１０−４５６０１号公報
【特許文献２】特開２００３−１３５５９６号公報
【特許文献３】特開平１１−１８８２１４号公報
【非特許文献１】未来材料、第6巻第7号32〜37頁(2006）
【非特許文献２】Biomaterials、第27巻3304〜3311頁(2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、フィルターの孔径に依存することなく病原性ウイルスや毒素などを簡便に除くことを目的とする。
本発明は、１回通過させるだけで高効率に患者血液、血液製剤中から毒素やウイルスを除去可能な糖鎖ポリマー固定化フィルターの作製を目的とする。
本発明は、化学（共有）結合で糖鎖ポリマーを基材に固定させることにより、糖鎖ポリマーの剥離が生じない、安定な性能を有する糖鎖ポリマー固定化フィルターの作製を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等はこのような状況に鑑み鋭意検討した結果、ウイルスや毒素を除去する方法を見出し、本発明に到達した。即ち、
（１）本発明は、シアリルラクトース、ラクトース硫酸、シアリル化オリゴ糖、ヘパリン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、硫酸化キチン、硫酸化コロミン酸、ヘパラン硫酸、ガラクトシルラクトース、およびガラクトシルガラクトースからなる群から選択される糖質の少なくとも１つを結合した高分子を化学結合したことを特徴とする、フィルターに関する。
（２）本発明は、高分子とフィルターがいずれも親水性高分子であるか、いずれも疎水性高分子であることを特徴とする、上記（１）記載のフィルターに関する。
（３）本発明は、フィルターがセルロースフィルターであることを特徴とする、上記（１）または（２）に記載のフィルターに関する。
（４）本発明は、フィルターがろ過膜である、上記（１）乃至（３）のいずれか１つに記載のフィルターに関する。
（５）本発明は、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のフィルターを含有することを特徴とする、装置に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のフィルターは、ウイルスや毒素を吸着する糖質高分子がフィルターに化学結合しているので、フィルターにウイルスや毒素を含む液体や気体を１回通過させるだけで高効率にウイルスや毒素を除去できる。ウイルスや毒素を吸着するものが糖質であるので、毒性がなく、安全であるという特徴を有する。
本発明は、化学（共有）結合で糖鎖ポリマーを基板に固定化しているため、長期間にわたりウイルスや毒素吸着効果を維持するとともに、フィルターが液体に接触しても糖鎖高分子は容易に剥離しない。
【００１１】
また本発明は、フィルターに結合した糖鎖高分子とウイルスや毒素との特異的結合を利用して除去するものであって、フィルターの孔径の影響を受けない。したがって、平均孔径１μm以上のフィルターに糖鎖高分子を固定すれば良く、重力のみの自然ろ過が可能である。よって、一般的にウイルスや毒素の除去に用いられる限外ろ過で使用するような加圧あるいは送液装置を必要としないため、簡便にウイルスや毒素を除去できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に用いる糖質は、吸着対象となるウイルス、毒素の種類に応じて優れた吸着活性を有する糖質を選択すればよく、除去対象のウイルスがインフルエンザウイルスの場合は、シアリルラクトース、ラクトース硫酸、シアリル化オリゴ糖等を例示できる。また、吸着対象となるウイルスがＨＩＶの場合は、ヘパリン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、硫酸化キチン、硫酸化コロミン酸等を例示できる。吸着対象がヘルペスウイルスの場合は、ヘパラン硫酸等を例示できる。また、吸着対象となる毒素がベロ毒素の場合は、ガラクトシルラクトース、ガラクトシルガラクトース等を例示できる。
これら糖質は、単量体の形態であっても、単一又は２種類以上の糖質からなる多量体の形態であってもよい。
これら糖質は、市販のものを用いても、細胞等から調製しても、人工的に合成してもよい。
【００１３】
糖質と結合する高分子としては、糖質の有する官能基と結合するための官能基を有する高分子であればどのようなものも用いることができる。さらに、糖質および高分子の官能基としては、何らかの反応により高分子側の官能基、糖質側の官能基の一方または両方を改質して結合可能となるものであってもよい。
このような高分子としては、水性溶液中で動けるように親水性であることが好ましい。このような親水性高分子としては、アクリルアミド、メタクリルアミド、及びこれらの誘導体；Ｎ−ビニルアセトアミドやＮ−ビニルアルキルアミド類；ビニルアミン、アリルアミン；アクリル酸、メタクリル酸、及び例えばヒドロキシエチルメタクリレートなどのように親水性基を有するこれらの誘導体；アミノ酸等を構成成分とする重合体や共重合体を例示できる。これらの共重合体には親水性を維持できる範囲で疎水性の単量体を共重合することができる。
【００１４】
これらの親水性高分子の中では、蛋白質の非特異的な吸着を抑制するものが好ましく、アクリルアミド及びその誘導体、Ｎ−ビニルアセトアミド類が好ましく用いられる。
高分子としては疎水性のものも用いることができる。このような高分子の例としては、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリメタクリル酸メチル等を例示できる。
なお、高分子は、単量体の形態であっても、単一又は２種類以上の上記高分子からなる多量体の形態であってもよい。
これら高分子は、市場より入手可能であり、糖質と結合させるために市販品の高分子の官能基を改質してもよい。これら高分子の官能基の改質方法は、当業者には周知である。
【００１５】
糖質と高分子の結合方法としては、高分子と結合するための官能基を有する糖質を合成後、高分子と結合させ、糖質を有する高分子の単量体を合成し、さらにこの単量体を重合する方法、カルボジイミド試薬、ウッドワード試薬等を用いて糖質を親水性高分子に結合する方法等（Biomacromolecules 2006, 7, 2882-2889など）、公知の方法を採用することができる。糖質を高分子に結合させる方法の一例としては、例えば、糖質の１つの水酸基を炭酸水素アンモニウムと反応させてアミノ基を導入し、これとｐ−ビニルベンゾイルクロライドと反応させて、スチレンのパラ位置に糖質側鎖を導入したスチレンモノマーを得、これを重合、またはスチレンと共重合して、スチレンのパラ位置に糖質側鎖を有するポリスチレンを得る方法がある。
【００１６】
糖質高分子を構成する糖質の数と高分子の数は、共に１以上であれば限定されない。
糖質高分子を構成する糖質と高分子の比は、糖質と高分子の合計を１とした時、０＜糖質＜１、０＜高分子＜１であり、好ましくは、０．５＜糖質＜１、０＜高分子＜０．５である。
【００１７】
本発明で用いるフィルターとしては、液体や気体を通過できるフィルターが用いられる。フィルターの素材としては何ら制限がなく、セルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ４−メチルペンテン等を例示できる。糖質と結合する高分子が親水性である場合は、フィルターも親水性であることが好ましく、糖質と結合する高分子が疎水性である場合は、フィルターも疎水性であることが好ましい。
【００１８】
本発明で用いるフィルターとは、孔を有する膜を意味し、フィルターは、孔径より大きい物質を通さないが、孔径より小さい物質を通すことにより、物質の大きさに基づいて物質を分離するのに使用するろ過膜が好ましい。孔径や孔数は、物質に依存して適宜選択することができる。フィルターの大きさ、厚さ、形状は、限定されない。ろ過膜としては、薄膜化が可能で液体や気体のろ過速度が高く、液体への湿潤強度が高く、かつ糖質高分子の固定に使用可能な官能基を有していることから、セルロース膜が好ましい。
【００１９】
本発明においては、糖質高分子はフィルターに化学結合している。化学結合により糖質高分子を固定化する方法は、糖質高分子中のアミノ基（またはカルボキシル基）とフィルター中のカルボキシル基（またはアミノ基）とを１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩やジシクロヘキシルカルボジイミド塩酸塩などの縮合剤を用いて縮合反応させる方法などが用いられる。
【００２０】
本発明においては、ウイルスや毒素の吸着とは、糖質高分子とウイルスや毒素を接触させたとき、接触前に比べて、接触後のウイルスや毒素の量が減少していた場合を意味する。
本発明においては、フィルターにウイルスや毒素を含む液体や気体を通すだけでウイルスや毒素を除去できるとは、フィルター通過前に比べて、通過後のウイルスや毒素の量が減少することを意味する。
本発明において、装置とは、例えば、本発明のフィルターを備えているろ過装置や、口や鼻を覆うマスクなどが挙げられる。
【００２１】
以下に、糖質高分子の製造と糖質高分子のフィルターへの固定につき、糖質としてＤ−ラクトースを用い、高分子としてポリアクリルアミドを合成し、フィルターとしてセルロースフィルターを用いた代表例でさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。
【実施例】
【００２２】
ガラクトシルラクトース結合ポリアクリルアミドを結合したセルロースフィルターの作製
１：糖質合成（ラクトシドの合成）
１−１：４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−１，２，３，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（２）の合成
酢酸ナトリウム（１０９ｇ，１．３３mol）を無水酢酸（１．７５ｌ，１８．７mmol）に懸濁し、１１０℃に加熱した。そこへ、Ｄ−ラクトース一水和物（１）（３００ｇ，８３３mmol、東京化成工業株式会社、Ｄ−（＋）−ラクトース水和物）を少しずつ加え、１時間攪拌する。反応終了後、反応液を氷水にあけ、一晩攪拌し、溶液を濾過し、冷水で洗い、結晶化した。粗結晶をメタノール５３０mlに溶かし再結晶し、結晶した化合物２（４２８ｇ，収率７５．８％）を得た。
【００２３】
１−２：ノルマル−ヘキセル４−Ｏ−（２，３，４，６，−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチルｌ−β−Ｄ−グルコピラノシド（３）の合成
窒素雰囲気下、化合物２（６０．０ｇ，８８．４mmol）をジクロロメタン（２００ml）に溶かし、５−ヘキセン−１−オール（４６．０ml，３８９mmol）を加えた。−５０℃に冷やし、ＢＦ3・Ｅｔ2Ｏ（１００ml，７９６mmol）を加え、１時間攪拌し、０℃で４時間、室温で２時間攪拌した。反応終了後、反応液を氷水にあけ、クロロホルムで抽出し、飽和炭酸水素ナトリム溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶液をグラスフィルターで濾過して濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフ（ヘキサン：酢酸エチル２：１→１．５：１）で精製後、濃縮してシラップ状の化合物３（２３．１ｇ，収率３６．４％）を得た。
【００２４】
１−３：ノルマル−ヘキセル４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド（４）の合成
窒素雰囲気下、化合物３（３５．４ｇ，４９．３mmol）をメタノール（５０５ml）に溶かし、ナトリウムメトキシド（２．１０ｇ，３８．９mmol）を加え、室温で一晩攪拌した。反応終了後、反応液にアンバーライトＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ＋）を加え、中和した。溶液からイオン交換樹脂をろ紙で濾別した後、濃縮しアモルファス状の化合物４（１８．９ｇ，収率９０．１％）を得た。
【００２５】
１−４：ノルマル−ヘキセル４−Ｏ−（４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）の合成
化合物４（９．８８ｇ，２３．３mmol）をＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）（４０．０ml）に溶かし、ベンズアルデヒドジメチルアセタール（５．２４ml，３４．９mmol）とＣＳＡ（カンファスルホン酸）（５４１mg，２．３３mmol）を加え、減圧下、６０℃で時間攪拌した。反応終了後、反応液を空冷後、トリエチルアミン（０．６４９ml）を加え、濃縮し、トルエンで共沸した。残渣をジエチルエーテルで洗浄し、濾過して目的物５を含む混合物を得た。
【００２６】
１−５：ノルマル−ヘキセル４−Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（６）の合成
５０％油性水素化ナトリウム（６．９７ｇ，１７４mmol）を窒素雰囲気下、ヘキサンで洗浄して油分を除去した後、ＤＭＦ（２０ml）を水素化ナトリウムに加え、氷冷下、化合物５の混合物（１１．９ｇ，２３．２mmol）のＤＭＦ（１８０ml）溶液を水素化ナトリウム−ＤＭＦ溶液に滴下した。滴下後、アスピレーターで発生する水素を引き、１時間攪拌した。さらに、氷冷下、ベンジルブロミド（２０．７ml，１７４mmol）を滴下し、室温で９時間攪拌した。反応終了後、氷冷下、メタノール（１５．０ml）を加え、反応液をエバポレーターを用いて濃縮した。残渣をジエチルエーテルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶液を濾過してエバポレーラーを用いて濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（トルエン：酢酸エチル１０：１→へキサン：酢酸エチル３：１）で精製後、エバポレーターを用いて、濃縮してシラップ状の化合物６（１８．０ｇ，収率８０．６％）を得た。
【００２７】
１−６：ノルマル−ヘキセル４−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（７）の合成
窒素雰囲気下、化合物６（１５．５ｇ，１６．１mmol）をＴＨＦ（テトラヒドロフラン）（２５０ml）に溶かし、モレキュラーシーブ４Åパウダー（１５．５ｇ、関東化学株式会社、モレキュラーシーブ０．４nm）を加え、室温で４０分間攪拌した。続いて、ボラントリメチルアミン錯体（８．２０ｇ，１１２mmol）を加え、氷冷下、塩化アルミニウム（１５．０ｇ，１１２mmol）を数回に分けて加え、室温で５時間攪拌した。反応終了後、反応液をセライト濾過し、濾液をクロロホルムで希釈し、氷水、１Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶液を濾過して濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（へキサン：酢酸エチル  ４：１）で精製後、エバポレーターを用いて、濃縮してアモルファス状の化合物７（１１．２ｇ，収率７２．２％）を得た。
【００２８】
２：糖質合成（ガラクトシドの合成）
２−１：メチルＤ−ガラクトピラノシド（９）の合成
アルゴン雰囲気下、Ｄ−ガラクトース（８）（１００ｇ，５５５mmol、東京化成工業株式会社、Ｄ−（＋）−ガラクトース）をメタノール（９００ml）に溶かし、イオン交換樹脂のアンバーライトＩＲ１２０Ｂ（Ｈ＋）（１００ml、オルガノ株式会社）を加え、８０℃で一晩攪拌した。反応終了後、空冷し、イオン交換樹脂を濾別して濃縮した。イソプロパノール１２０ml、メタノール６ml、蒸留水〜１mlで再結晶し、α型、β型の比が、１１：１の混合物として化合物９（４０．１ｇ，収率３７．２％）を得た。
【００２９】
２−２：メチル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−ガラクトピラノシド（１０）の合成
５０％油性水素化ナトリウム（４３．３ｇ，１．０８mol）を窒素雰囲気下、ヘキサンで洗浄して油分を除去した後、ＤＭＦ（１００ml）を水素化ナトリウムに加え、氷冷下、化合物９（３５．０ｇ，１８０mmol）のＤＭＦ（９００ml）溶液を水素化ナトリウム−ＤＭＦ溶液に滴下した。滴下後、アスピレーターで発生する水素を引き、２時間攪拌した。さらに、氷冷下、ベンジルブロミド（１２４ml，１．０８mol）を滴下し、室温で４時間半攪拌した。反応終了後、氷冷下、メタノール（７０ml）を加え、反応液を濃縮した。残渣をクロロホルムで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶液を濾過して濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（へキサン：酢酸エチル６：１）で精製後、エバポレーターを用いて、濃縮し、シラップ状の化合物１０（８６．３ｇ，収率８６．３％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）      
【００３０】
２−３：２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−ガラクトピラノース（１１）の合成
化合物１０（９．９７ｇ，１８．０mmol）を酢酸（１０３ml，１．８０mol）に溶かし、３Ｍ硫酸（１２．３４ml，３７．０mmol）を加え、８０℃で２時間攪拌した。反応終了後、反応液を氷水にあけ、クロロホルムで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶液を濾過して濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフ（ヘキサン：酢酸エチル４：１→３：１）で精製後、エバポレーターを用いて濃縮し、シラップ状の化合物１１（７．３５ｇ，収率７５．６％）を得た。
【００３１】
２−４：２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−ガラクトピラノシル  クロライド（１２）の合成
窒素雰囲気下、化合物１１（１．００ｇ，１．８５mmol）を１，２−ジクロロエタン（８ml）に溶かし、ＤＭＦ（７１．６μl，０．９２５mmol）を加え、氷冷下、塩化チオニル（０．８０６ml，１１．１mmol）を加え、直ちにガラス栓をして氷冷下、一晩攪拌した。反応終了後、反応液をシリカゲル濾過し、エバポレーターを用いて、溶液を濃縮し、さらにトルエンで共沸させて濃縮し、シラップ状の化合物１２（１．０２ｇ，収率９９．３％）を得た。
【００３２】
３：糖質合成（ガラクトシルラクトシドの合成）
３−１：ノルマル−ヘキセル４−Ｏ−［４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１３）の合成
窒素雰囲気下、グルコシル供与体になる上記化合物１２（６．７０ｇ，１２．０mmol）とグルコシル受容体になる上記化合物７（５．３０ｇ，５．４９mmol）を脱水トルエン（２５０ml）に溶かし、γ−コリジン（０．８６８ml，６．５９mmol）とモレキュラーシーブ４Åパウダー（３．３５ｇ）を加え、室温で３０分間攪拌した後、−２０℃でＡｇＯＴｆ（４．２３ｇ，１６．５mmol）を加え、２時間半攪拌した。反応終了後、反応液をクロロホルムで希釈し、セライト濾過した。溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（ヘキサン：酢酸エチル８：１）で精製後、エバポレーターを用いて濃縮し、シラップ状の化合物１３（７．０４ｇ，収率８６．２％）を得た。
【００３３】
３−２：ノルマル−ヘキセル４−Ｏ−［４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１４）の合成
−７８℃の液体アンモニア（３００ml）へ金属ナトリウム（８．９１ｇ，３８７mmol）を加え、そこへ化合物１３（１２．８ｇ，８．６０mmol）を溶解させた１，２−ジメトシキエタン（８０ml）溶液を滴下し、２時間攪拌し、塩化アンモニウム（２０．７ｇ，３８７mmol）を加えて、一晩攪拌した。溶媒を減圧留去した後、残渣をピリジン（１８０ml）に懸濁し、無水酢酸（１７０ml）を加え、室温で一晩攪拌した。反応終了後、反応液に氷水を加え、クロロホルムで抽出し、１Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶液を濾過してエバポレーターを用いて濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（ヘキサン：酢酸エチル１：１．５）で精製し、化合物１４（４．４７ｇ，収率５１．７％）を得、原料であった化合物１３（４．９９ｇ，収率３９．０％）を回収した。
【００３４】
３−３：ノルマル−ヘキセル４−Ｏ−［４−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−β−Ｄ−グルコピラノシド（１５）の合成
窒素雰囲気下、化合物１４（１．１ｇ，１．０９mmol）をメタノール（１１ml）に溶かし、ナトリウムメトキシド（５８．９mg，１．０９mmol）を加え、室温で一晩攪拌した。反応終了後、反応液にアンバーライトＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ＋）を加え、中和した。溶液からイオン交換樹脂を濾別した後、エバポレーターを用いて濃縮し、アモルファス状の化合物１５（６９４mg，収率１０８％）を得た。
【００３５】
３−４：６−（アミノエタンチオニル）ヘキシル−Ｏ−［４−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−β−Ｄ−グルコピラノシド塩酸塩（１６）の合成
窒素雰囲気下、化合物１５（６６０mg，１．１３mmol）をメタノール（１５ml）に溶かし、アミノエタンチオール塩酸塩（６３９mg，５．６３mmol）を加え、０℃で、ＵＶ（λ＝２５４nm）を４時間半照射した。反応終了後、濃縮し、残渣をゲル濾過（セファデックスＬＨ−２０、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）で精製し、化合物１６（８４０mg，１０６％）を得た。収率が１００％を越えているのは、ゲル濾過により、アミノエタンチオール塩酸塩を完全に分けることができなかったためである。
【００３６】
３−５：６−（アクロイルアミノエタンチオニル）ヘキシル−Ｏ−［４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１７）の合成
窒素雰囲気下、化合物１６（９７４mg，１．３９mmol）をメタノール（１５ml）に溶かし、炭酸ナトリウム（４４２mg，４．１７mmol）を加え、０℃に冷やし、アクリル酸クロライド（０．２２６ml，２．７８mmol）を８分間かけて、ゆっくり滴下した。その後、１２分間攪拌し、室温にして、３０分間攪拌した。反応終了後、反応液を濃縮し、大過剰の無水酢酸（２０ml）とピリジン（３０ml）を加え、一晩攪拌した後、氷水を加え、クロロホルムで抽出して、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶液を濾過して濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン：酢酸エチル１：３）で精製後、エバポレーターを用いて濃縮して化合物１７（１．４４ｇ，収率９０．０％）を得た。
【００３７】
３−６：６−（アクロイルアミノエタンチオニル）ヘキシル−Ｏ−［４−Ｏ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−β−Ｄ−グルコピラノシド（１８）の合成
窒素雰囲気下、化合物１７（１．００ｇ，０８６８mmol）をメタノール（１０．０ml）に溶かし、ナトリウムメトキシド（４６．９mg，０．８６８mmol）を加え、室温で一晩攪拌した。反応終了後、反応液にアンバーライトＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ＋）を加え、中和した。溶液からイオン交換樹脂を濾別した後、エバポレーターを用いて濃縮し、アモルファス状の化合物１８（６６１mg，収率１０６）を得た。
【００３８】
４：アミンモノマーの合成
６−アミノヘキシル  アクリルアミド（２０）の合成
窒素雰囲気下、ヘキサメチレンジアミン（１９）（５００mg，４．３０mmol）をメタノール（２０ml）に溶かし、０℃に冷やし、アクリル酸クロライド（０．３８４ml，４．７３mmol）を３分間かけて、ゆっくり滴下し、３０分間攪拌した。その後、室温にして、１時間攪拌した。反応終了後、反応液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール  １：０→２：１）で精製後、エバポレーターを用いて濃縮して化合物２０（４８１mg，収率５５．８％）を得た。
【００３９】
５：糖質高分子である６−（アクロイルアミノエタンチオニル）ヘキシル−Ｏ−［４−Ｏ−Ｄ−ガラクトピラノシル］−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−β−Ｄ−グルコピラノシド−６−アミノヘキシル  アクリルアミド共重合体（２１）の合成
窒素雰囲気下、化合物１８（１００mg，１３９μmol）と化合物２０（１．１７mg，６．９７μmol）をＨ2Ｏ（１．０ml）に溶かし、減圧下、脱気を行った後、ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルメチレンジアミン）（２．０８μl，１３．９μmol）とＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）（１．２７mg，５．５７μmol）を加え、一晩攪拌した。反応終了後、エタノールで再沈殿により精製し、化合物２１（９２．０mg，９０．９％）を得た。化合物２１中の化合物１８と化合物２０の比は、化合物１８：化合物２０＝１．０：０．０４の比であり（1Ｈ  ＮＭＲの積分比により決定）、化合物２１の分子量は、数平均分子量Ｍｎ＝８．１３×１０4、ＧＰＣにより測定された分子量Ｍｗ＝２．２５×１０5であった。
化合物２１を、以後、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーと呼ぶ。
【００４０】
図１−１〜図１−５は、ラクトースからラクトシドの合成、ガラクロースからガラクトシルの合成、ラクトシドおよびガラクトシルからのガラクトシルラクトースの合成、およびガラクトシルラクトースおよびアミンモノマーからのガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーの合成の概略を示す。
【００４１】
６：ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーの固定化されたセルロースフィルターの作製
６−１：セルロースフィルターへのカルボキシル基の導入による活性化
セルロースフィルター１００枚（ワットマン、セミミクロ濾紙、グレード１、φ＝２５mm）を１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液（６０ml）と飽和食塩水（６０ml）の混合溶液中に加え、１時間攪拌した後、ブロモ酢酸（２．７３ｇ）を加え、一晩撹拌した。反応終了後、水で中性になるまで十分に洗い、自然乾燥させた。
【００４２】
６−２：ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーのセルロースフィルターへの固定化
カルボキシル基を導入して活性化したセルロースフィルター（１０枚）を、水（１０ml）と１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１１．５mg）を加え、２時間攪拌した。その後、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマー（１０mg）を水（１０ml）に溶かして、反応溶液中に加え、一晩攪拌した。反応終了後、反応溶液を回収し、濃縮後、透析膜（スペクトラムラボラトリー社、スペクトラポア３透析膜（分画分子量＝３，５００））を用いて、透析を行い、未反応のポリマーを回収した。セルロースフィルターは、自然乾燥を行った。フィルターには、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーが０．７１μg／mm2（０．７０mg／枚）（フィルターに固定化されたガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマー量は、固定化ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマー（mg）＝仕込みのガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマー（mg）−回収したガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマー（mg）より計算される）、ガラクトシルラクトース（グロボトリオース、Ｇｂ３、またはＧａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃとも表すことができる）が１．０nmol／mm2（０．９９μmol／枚）（フィルターに固定化されたガラクトシルラクトース量は、重量（ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマー）／分子量（ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマー）ｘ［ｍ（Ｇｂ３の比）／（ｍ（Ｇｂ３の比）＋ｎ（ＮＨ２の比））］＝モル数（Ｇｂ３）より計算される。なお、ｍ（Ｇｂ３の比）とｎ（ＮＨ２の比）は上記５に記載のように1Ｈ  ＮＭＲにより決定される化合物１８：化合物２０の積分比から決定される）固定化されていた。以後、このガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーの固定化されたセルロースフィルターを、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマー固定化フィルターと呼ぶ。
【００４３】
図２は、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーが固定化されたセルロースフィルターの作製の概略を示す。
【００４４】
７：ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマー固定化フィルターへのベロ毒素吸着実験
濾過用ホルダー（ミリポア社、スウィネクス  フィルターホルダー）にガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーが固定化されたセルロースフィルターを５枚入れ、１mlシリンジを用いてＰＢＳ（リン酸緩衝液）を１０ml流した。その後、Ｓｔｘ１−ＰＢＳ溶液（１mg／ml）を１ml、１０秒かけて流し、続いて、ＰＢＳを４ml流して、計５mlを回収した。回収液は、ＰＢＳにより希釈後、次の毒性評価実験に用いた。Ｓｔｘ２についても、同様に行った。
また、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーが固定化されていないセルロースフィルターについても、Ｓｔｘ１−ＰＢＳ溶液、Ｓｔｘ２−ＰＢＳ溶液を用いて、同様に行い、回収液を調製した。
なお、Ｓｔｘ１、Ｓｔｘ２はナカライテクス株式会社より購入した。
図３は、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマー固定化フィルターへのベロ毒素吸着実験の概略を示す。
【００４５】
８：ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマー固定化フィルターを通したＳｔｘ１、Ｓｔｘ２溶液の毒性試験
８−１：ベロ細胞の培養
ベロ細胞（理化学研究所  セルバンクより購入）は、１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）を補給したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）で、３７℃、ＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2）で培養する。
ベロ細胞の調製は、０．２５％トリプシン−１mM  ＥＤＴＡ溶液でベロ細胞を処理して、シャーレから剥がし、チューブに移し、遠心分離（１０００rpm）により回収後、１０％ＦＢＳ  を補給したＤＭＥＭに、５００００cells／mlになるようにベロ細胞を懸濁して行う。この細胞懸濁液を、試験の前日に、９６well plate（ヌンク社）に５０００cells／well程度にまいて毒性評価実験に用いた。
【００４６】
８−２：毒性評価方法
上記４の希釈された回収液（ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーが固定化されているセルロースフィルターを用いた回収液およびガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーが固定化されていないセルロースフィルターを用いた回収液）をベロ細胞の入っているwellに、１００μl加え、ＷＳＴ法により、生存率を求めた。
スタンダードとして、上記４のベロ毒素吸着実験の最初に用いた毒素溶液をＰＢＳにより２００ng／ml〜０．２pg／mlに希釈したものを、ベロ細胞の入っているwellに、１００μl加え、ＷＳＴ法を用いて、吸光度を測定することにより、細胞の生存率を求めた。そして、毒素濃度と細胞の生存率との検量線を作製した。
【００４７】
【化１】
2008229435.tif 000002
【００４８】
ＷＳＴ法とは、上記スキームに示すように生細胞内で生成される脱水素酵素により、高感度水溶性ホルマザン（ＷＳＴ）は還元され、水溶性のホルマザンを生成する。このホルマザンの吸光度（４５０nm）を測定することにより、生細胞数を計測する方法である。
操作方法
１．細胞を５０００cells／wellになるように、培地で希釈し、９６穴マイクロプレートの各wellに１００μlずつ播種する。
２．２４時間、前培養する。
３．培地を除去し、希釈した毒素溶液を１００μlずつ加え、７２時間インキュベートする。
４．毒素を含む培養液を除去し、バッファーで洗浄し、Cell Counting Kit-8溶液（同仁化学研究所より購入）を適量含む培地を加え、炭酸ガスインキュベーター内で１〜４時間呈色反応を行う。
５．マイクロプレートリーダーを用い、４５０nmの吸光度を測定する。
６．吸光度から、細胞の生存率を計算する（毒素を加えていないｗｅｌｌを１００％とする）。
【００４９】
８−３：毒素溶液の評価結果
図４のノーマルは、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーを固定化していないフィルター、ガラクトシルラクトースは、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーを固定化したフィルターを用いたＳｔｘ１の結果である。Ｓｔｘ１は、フィルターは通さずに毒素溶液を希釈して、細胞に加え、評価したスタンダードの結果である。
ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーを固定化したフィルターでは、スタンダードと比較すると、Ｓｔｘ１を吸着し、Ｓｔｘ１の濃度が１０万分の１に希釈されていることがわかる。
【００５０】
図５のノーマルは、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーを固定化していないフィルター、ガラクトシルラクトースは、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーを固定化したフィルターを用いたＳｔｘ２の結果である。Ｓｔｘ２は、フィルターは通さずに毒素溶液を希釈して、細胞に加え、評価したスタンダードの結果である。ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーを固定化したフィルターではＳｔｘ２を吸着し、Ｓｔｘ２の濃度が１０００分の１に希釈されていることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の毒素やウイルスの除去フィルターは、輸血用の血液などの医薬品の製造や医療用マスクなどの医療器具等に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１−１】ラクトースからラクトシドの合成の概略を示す。
【図１−２】ガラクトースからガラクトシドの合成の概略を示す。
【図１−３】ラクトシドおよびガラクトシドからのガラクトシルラクトースの合成の概略を示す。
【図１−４】アミンモノマーの合成の概略を示す。
【図１−５】ガラクトシルラクトースおよびアミンモノマーからのガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーの合成の概略を示す。
【図２】ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーが固定化されたセルロースフィルターの作製の概略を示す。
【図３】ガラクトシルラクトースアクリルアミドフィルターへのベロ毒素吸着実験の概略を示す。
【図４】Ｓｔｘ１の毒素評価を示す。ノーマルは、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーを固定化していないセルロースフィルター、ガラクトシルラクトースは、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーを固定化したセルロースフィルターを通過後のＳｔｘ１−ＰＢＳ溶液、Ｓｔｘ１は、セルロースフィルターを通過していないＳｔｘ１−ＰＢＳ溶液を示す。
【図５】Ｓｔｘ２の毒素評価を示す。ノーマルは、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーを固定化していないセルロースフィルター、ガラクトシルラクトースは、ガラクトシルラクトースアクリルアミドポリマーを固定化したセルロースフィルターを通過後のＳｔｘ２−ＰＢＳ溶液、Ｓｔｘ２は、セルロースフィルターを通過していないＳｔｘ２−ＰＢＳ溶液を示す。
【図１−１】
2008229435.tif 000003
【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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