(57)【要約】【課題】臓器移植手術の練習・訓練に適した超急性拒絶反応及び急性拒絶反応が抑制されたブタ臓器や、末期臓器不全患者に対する移植が期待できるブタ臓器を提供すること。【解決手段】採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子にＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子を導入したブタ胎児線維芽細胞に核を注入することで得られたＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタと、採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、ｈＤＡＦ遺伝子を導入したブタ胎児線維芽細胞に核を注入することで得られたｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタとを、交配して、ＥｎｄｏＧａｌＣ及びｈＤＡＦを共発現するダブルトランスジェニックブタを作出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子及びｈＤＡＦ遺伝子からなる導入遺伝子を共発現することを特徴とするダブルトランスジェニックブタ又はその子孫。
【請求項２】
採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子にＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子を導入したブタ体細胞核を注入することで得られたＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタと、採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、ｈＤＡＦ遺伝子を導入したブタ体細胞核を注入することで得られたｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタとを、交配することにより得られる、ＥｎｄｏＧａｌＣ及びｈＤＡＦを共発現することを特徴とするダブルトランスジェニックブタ又はその子孫。
【請求項３】
ブタ体細胞核として、ブタ胎児線維芽細胞を用いることを特徴とする請求項２記載のダブルトランスジェニックブタ又はその子孫。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載のダブルトランスジェニックブタ又はその子孫に由来し、ＥｎｄｏＧａｌＣ及びｈＤＡＦを共発現することを特徴とするブタ臓器。
【請求項５】
腎臓であることを特徴とする請求項４記載のブタ臓器。
【請求項６】
請求項４又は５記載のブタ臓器を、非ヒト哺乳動物に移植し、被移植非ヒト哺乳動物における超急性拒絶反応又は急性拒絶反応が抑制されたことを特徴とする移植方法。
【請求項７】
請求項４又は５記載のブタ臓器が移植され、超急性拒絶反応又は急性拒絶反応が抑制されたことを特徴とする被移植非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
請求項４又は５記載のブタ臓器を、非ヒト哺乳動物に移植する前後又は同時に、被検物質を前記非ヒト哺乳動物に投与し、被移植非ヒト哺乳動物における超急性拒絶反応又は急性拒絶反応の程度を、被検物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とする免疫抑制剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥｎｄｏＧａｌＣ及びｈＤＡＦを共発現するダブルトランスジェニックブタや、該ダブルトランスジェニックブタ由来の臓器や、該臓器を用いた移植方法や、前記臓器が移植された哺乳動物や、該哺乳動物を利用した免疫抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の体細胞からのクローン動物の作出は困難と考えられていたが、１９９６年にCampbellらのグループは羊の胚由来の培養細胞（継代６〜１３代）を血清飢餓状態にして細胞周期をＧ0期とし、この細胞の核を移植することにより産仔の獲得に成功し、ほぼ無限に増やせる培養細胞でもクローン個体を作出することができることを示した（非特許文献１参照）。１９９７年、Wilmutらは同様な手法を用いて、培養した乳腺細胞及び胎児線維芽細胞を血清飢餓状態にし、一例ではあるがクローン羊ドーリーの作出を報告した（非特許文献２参照）。クローン羊ドーリーの作出法は、除核した羊の卵母細胞と雌羊由来の細胞を電気的に融合することにより核移植するものであるが、かかる細胞融合による核移植では、ドナー細胞の核だけでなく、その細胞質までも卵子に導入されることが避けられないといわれている。その他、細胞融合による核移植に関しては、乳より分離した乳腺由来の細胞をＧ0期に同調した後、電気的融合効率を高めるため３０〜１２０分間トリプシン処理を行い、かかる細胞を用いて核移植するクローン牛の作出方法が知られている（特許文献１参照）。
【０００３】
また、体細胞核を除核卵母細胞に直接注入するクローン動物の作出については、若山らがクローンマウスの作出方法について報告している（非特許文献３参照）。このクローンマウスの作出方法は、未受精卵の透明帯に穴を開けてピペットを差し込み、分裂中期の染色体を除去した除核卵母細胞に、過排卵を誘発したマウスから採取した卵丘細胞、セルトリ細胞、神経細胞由来の核を細胞膜を破って直接注入（インジェクション）し、ストロンチウムで活性化処理した後、サイトカラシンＢで極体の放出を抑制しながら偽前核を形成させ、この胚を培養した後、偽妊娠雌マウスの子宮に移植する方法である。
【０００４】
ブタの心臓や膵臓等の臓器はその大きさからしてヒトの臓器と交換可能性がきわめて高く、クローンブタの作出は異種移植の問題を解決する手段として、また、良質な食肉生産の点からも期待されていたが、少なくとも４匹の受精卵が子宮に存しないと妊娠に失敗することから、活力ある数個の胚を用いる必要があること、ブタ胚は極めて脆く核移植など取扱中に壊れやすいことなど、クローンブタ作出上の特有の問題があり、多くの研究者がチャレンジしたがうまくいかなかった。しかし最近、スコットランドのPPL Therapeutics社のAlan Colmanらは成体細胞からの細胞融合による核移植でクローンブタを作出していたことを報告（非特許文献４参照）し、また本発明者らによっても体細胞核直接導入法によるクローンブタの作出についての報告（非特許文献５参照）がなされている。
【０００５】
他方、ブタからヒトへの異種移植における超急性拒絶反応を司る主要異種抗原はブタの血管内皮細胞表面に存在するαＧａｌ抗原であり、ヒトにはαＧａｌが存在しないのでαＧａｌ抗原に対し強い自然抗体が生じる。そのため異種移植用ブタの開発ではαＧａｌ抗原の発現抑制が重要な鍵となっている。ＥｎｄｏＧａｌＣ（Endo-β-galactosidase C）はガス壊疽菌の培養上清中に分泌される酵素で、生理的条件下でαＧａｌ抗原のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合を切断してＧａｌα１−３Ｇａｌの二糖を解離する（非特許文献６参照）。ＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子のクローニングによりＥｎｄｏＧａｌＣ酵素の組換え体を得ることができ、インビトロ、エックスビボでブタのαＧａｌを完全に除去することに成功している（非特許文献７参照）。しかしながら、一度消失させたαＧａｌ抗原は４８時間以内に再生され細胞表面に現れることが報告されている（非特許文献８参照）。
【０００６】
超急性拒絶反応を司る主要異種抗原αＧａｌを切断する酵素ＥｎｄｏＧａｌＣではαＧａｌ抗原を完全に除去することはできず、完全に除去するためにはα１，３ＧＴ（α1,3-galactosyltransferase）のノックアウトが必要である。しかし、最近α１，３ＧＴ以外の酵素でαＧａｌを生成する酵素がラットで確認されており（非特許文献９参照）、αＧａｌ抗原以外の異種抗原の存在が示唆されている。
【０００７】
また、本発明者らは、ＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタ（非特許文献１１参照）と、ｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタ（非特許文献１０、１１参照）について報告している。
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−３４１９３５号公報
【非特許文献１】Nature,380,64-66,1996
【非特許文献２】Nature,385,810-813,1997
【非特許文献３】Nature,394,369-374,1998
【非特許文献４】Nature,407,505-509,2000
【非特許文献５】Science,289,1118-1119,2000
【非特許文献６】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. Vol.262. p.10086-92
【非特許文献７】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. Vol.275, p.19368-74. 2000
【非特許文献８】Transplantation. Vol.60, p.841-7
【非特許文献９】Glycobiology(2003) vol.13 no.5 pp.327-337
【非特許文献１０】第２７回日本分子生物学会年会一般演題〔口演〕抄録3PB-502
【非特許文献１１】41th The Japan Society for Transplantation 一般演題〔口演〕抄録079
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、臓器移植手術の練習・訓練に適した超急性拒絶反応及び急性拒絶反応が抑制されたブタ臓器や、末期臓器不全患者に対する移植が期待できるブタ臓器を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、クローンブタ作出技術を既に開発している。そこで、クローンブタ作出技術を利用して、ヒトに移植することが可能なブタ臓器を提供することができるブタの作出について検討した。ブタ臓器をヒトに移植する、ヒトとブタのような異種移植においては、超急性の拒絶反応が問題となる。超急性の拒絶反応は移植直後から発生し、２４時間以内に拒絶される激しい拒絶反応である。この拒絶反応には、抗体と補体が関わっており、異種動物組織に対する抗体を除去するか、補体活性化経路を失活させることが解決の手段として考えられた。例えば、αＧａｌ抗原を分解することができるＥｎｄｏＧａｌＣのトランスジェニッククローンブタや、補体活性化経路のＣ３転換酵素の解離失活を促進することにより補体活性化を抑制する補体制御因子の一つであるＤＡＦ(decay accelerating factor,CD55)のトランスジェニッククローンブタの作出が異種移植用ブタとしてより有用であると考えた。
【００１１】
ブタからヒトへの異種移植における超急性拒絶反応を司る主要異種抗原はブタの血管内皮細胞表面に存在するαＧａｌ抗原であることから、このαＧａｌ抗原を移植後も継続的に分解できるように、ＦＡＣＳ(fluorescence-activated cell sorter)のソーティング技術を用いて、αＧａｌを１００％近く除去したブタ胎児線維芽細胞を選抜し、その細胞よりブタの細胞内においてＥｎｄｏＧａｌＣを高発現させることができるＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタを作出した。ＥｎｄｏＧａｌＣを導入したクローンブタ由来の細胞は、抗体接着を７０〜８０％減少させることは可能であるが、細胞傷害はほとんど抑制しないことを見い出した。
【００１２】
また、同様にＦＡＣＳのソーティング技術を用いｈＤＡＦを高発現するトランスジェニッククローンブタの作出を試みた。その際、ｈＤＡＦ発現ベクターと共にα１，３ＧＴアンチセンスベクターを導入することによりαＧａｌのノックダウン（抑制）も試みた。ｈＤＡＦ高発現細胞では、抗体接着はコントロール細胞に比べ変化は見られなかったが、細胞傷害はネガティブコントロールと同じレベルまで抑制されていたことを見い出した。
【００１３】
次いで、作出したＥｎｄｏＧａｌＣクローンブタとｈＤＡＦクローンブタを交配することにより、ＥｎｄｏＧａｌＣ及びｈＤＡＦを共発現するダブルトランスジェニックブタを作出し、このダブルトランスジェニックブタの腎臓をドグエラヒヒに移植したところ、超急性拒絶反応や急性拒絶反応が抑制され、少なくとも１５日間生存することを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、（１）ＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子及びｈＤＡＦ遺伝子からなる導入遺伝子を共発現することを特徴とするダブルトランスジェニックブタ又はその子孫や、（２）採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子にＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子を導入したブタ体細胞核を注入することで得られたＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタと、採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、ｈＤＡＦ遺伝子を導入したブタ体細胞核を注入することで得られたｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタとを、交配することにより得られる、ＥｎｄｏＧａｌＣ及びｈＤＡＦを共発現することを特徴とするダブルトランスジェニックブタ又はその子孫や、（３）ブタ体細胞核として、ブタ胎児線維芽細胞を用いることを特徴とする前記（２）記載のダブルトランスジェニックブタ又はその子孫に関する。
【００１５】
また本発明は、（４）前記（１）〜（３）のいずれか記載のダブルトランスジェニックブタ又はその子孫に由来し、ＥｎｄｏＧａｌＣ及びｈＤＡＦを共発現することを特徴とするブタ臓器や、（５）腎臓であることを特徴とする前記（４）記載のブタ臓器に関する。
【００１６】
さらに本発明は、（６）前記（４）又は（５）記載のブタ臓器を、非ヒト哺乳動物に移植し、被移植非ヒト哺乳動物における超急性拒絶反応又は急性拒絶反応が抑制されたことを特徴とする移植方法や、（７）前記（４）又は（５）記載のブタ臓器が移植され、超急性拒絶反応又は急性拒絶反応が抑制されたことを特徴とする被移植非ヒト哺乳動物や、（８）前記（４）又は（５）記載のブタ臓器を、非ヒト哺乳動物に移植する前後又は同時に、被検物質を前記非ヒト哺乳動物に投与し、被移植非ヒト哺乳動物における超急性拒絶反応又は急性拒絶反応の程度を、被検物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とする免疫抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、臓器移植手術の練習・訓練に適した超急性拒絶反応及び急性拒絶反応が抑制されたブタ臓器を提供することができる。また、適切な免疫抑制薬の投与により、移植直後から３ヶ月以内に起こる超急性拒絶反応及び急性拒絶反応を抑制しうる、末期臓器不全患者に対する移植が期待できるブタ臓器を提供することができる。さらに、本発明のブタ臓器を移植した非ヒト哺乳動物に被検物質を投与し、被移植非ヒト哺乳動物における超急性拒絶反応又は急性拒絶反応の程度を比較・評価することにより、新たな免疫抑制剤をスクリーニングすることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のダブルトランスジェニックブタとしては、ＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子及びｈＤＡＦ遺伝子からなる導入遺伝子を共発現することを特徴とするダブルトランスジェニックブタや、採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子にＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子を導入したブタ体細胞核を注入することで得られたＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタと、採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、ｈＤＡＦ遺伝子を導入したブタ体細胞核を注入することで得られたｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタとを、交配することにより得られる、ＥｎｄｏＧａｌＣ及びｈＤＡＦを共発現するブタであれば特に制限されず、本発明には、本発明のダブルトランスジェニックブタの子孫も含まれ、本発明のダブルトランスジェニックブタの子孫は、本発明のダブルトランスジェニックブタ同士の交配により作出することができる。
【００１９】
上記ＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタやｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタの作出に用いられる、ブタの卵子（レシピエント卵子）としては、ブタの成熟卵子であれば特に制限されるものではなく、ＰＧＦ２α、ＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール、ｅＣＧ等のホルモン投与による過排卵処理により得られる体内成熟卵子の他、屠場由来の卵巣から採取した卵子を体外成熟させたものも使用できるが、着床率の点からして体内成熟卵子、特に性成熟した雌ブタ、例えば生後１６０〜１９４日齢の春期発動前の雌ブタから採取した体内成熟卵子が好ましい。かかる体内成熟卵子は、過排卵処理により得られる雌ブタの子宮及び卵巣を、ＰＢＳ溶液等を用いて卵管灌流を行うことにより採取することができるが、卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去することが好ましい。
【００２０】
上記ブタのレシピエント卵子からの除核は、細胞骨格形成阻害剤であるサイトカラシンＢ処理を施したブタの卵子から除核することが好ましく、より具体的にはサイトカラシンＢを含有するＰＺＭ３液、ＮＣＳＵ２３等の培地で体外成熟卵子等のレシピエント卵子を処理した後、除核操作用シャーレのサイトカラシン入りドロップに移してホールディングピペットで保定し、透明帯を迅速・的確に貫通することができる除核用ピペット（外径２５〜３０μｍ）を用いて、Ｍ（metaphase）II期の染色体を含む第一極体の付近を極体ごと吸引することにより行われる。なお、吸引した極体を調べることにより除核できていることを確認することが好ましく、また除核卵子からはサイトカラシンＢを除去することが好ましい。
【００２１】
本発明においてトランスジェニッククローンブタ作出に使用する体細胞核としては、ＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子又はｈＤＡＦ遺伝子を導入したブタ体細胞に由来する核であれば特に制限されるものではないが、胎児線維芽細胞核を好適に例示することができる。以下、体細胞核が胎児線維芽細胞核の場合を例にとって説明する。ＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子又はｈＤＡＦ遺伝子を導入したブタ胎児線維芽細胞核としては、ＥｎｄｏＧａｌＣ又はｈＤＡＦを高発現するブタ胎児線維芽細胞から得られる核であれば特に制限されるものではなく、ブタ胎児線維芽細胞にＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子又はｈＤＡＦ遺伝子を導入する方法も電気穿孔法など公知の遺伝子導入方法であれば特に制限されるものではない。上記線維芽細胞はトリプシン処理で細胞を分散させたものが好ましく、また、培養細胞が線維芽細胞であることを、サイトケラチンとＳＳＥＡ−１との陰性反応、ビメンチンでの陽性反応、線維芽細胞の特異的プライマーによるＰＣＲ分析等により確認することが好ましい。また、レシピエントや仮親と毛色の異なる品種のブタを線維芽細胞のドナーとすることが、毛色からクローンブタであるかどうかを簡便に判定する上で好ましい。
【００２２】
ＥｎｄｏＧａｌＣを高発現するブタ胎児線維芽細胞を選抜するには、線維芽細胞をαＧａｌを認識するＦＩＴＣで染色し、ＦＡＣＳによるＥｎｄｏＧａｌＣの発現とαＧａｌの切断を解析し、ＥｎｄｏＧａｌＣを高発現し、αＧａｌが切断されていると思われる細胞集団をＦＡＣＳのソーティングにより分離することがきわめて重要である。また、ｈＤＡＦを高発現するブタ胎児線維芽細胞を選抜するには、線維芽細胞をαＧａｌを認識するＦＩＴＣ、或いはＦＩＴＣ標識された抗ｈＤＡＦ抗体で染色し、ＦＡＣＳによるｈＤＡＦの発現とαＧａｌの切断を解析し、ｈＤＡＦを高発現し、αＧａｌが切断されていると思われる細胞集団をＦＡＣＳのソーティングにより分離することがきわめて重要である。
【００２３】
また、核移植に用いるドナー線維芽細胞の細胞周期は特に制限されるものではないが、細胞周期Ｇ0／Ｇ01期に同調させた細胞が好ましい。細胞周期Ｇ0／Ｇ01期に同調させた細胞は、例えばコンフルエントな状態で培養液の交換なしに、線維芽細胞を１６日間前後培養し続けることによって得ることができる。
【００２４】
採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子にブタ胎児線維芽細胞核を注入する方法としては、ＥｎｄｏＧａｌＣ又はｈＤＡＦを高発現するブタ胎児線維芽細胞の核を除核されたレシピエント卵母細胞に直接注入（インジェクション）する方法を特に好適に例示することができる。かかる核の直接注入には、例えば、プライムテック株式会社製のＰＭＭ三次元マイクロマニピュレーションシステムを用いることができる。特に、インジェクションピペットとしては、透明帯の貫通が迅速・精確かつ簡単にでき、細胞質膜へのダメージを最小にすることができるものが好ましく、かかるインジェクションピペットとしてはピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り付けた体細胞注入用ピペット（外径７〜１２μｍ）を具体的に例示することができる。
【００２５】
上記のようにして得られた体細胞核が注入された卵子には、活性化処理を施すことが好ましい。かかる活性化処理としては、従来公知の核移植胚の活性化処理方法であれば特に制限されるものではないが、電気パルス活性化処理を好適に例示することができる。電気パルス活性化処理としては、電荷の大きい１回の電気パルス、例えば１．５ｋＶ／ｃｍ、１００μｓｅｃ、１回を印加する方がそれより小さい電荷の電気パルスを２回印加するよりも胚活性の点で好ましく、また、電気パルス活性化処理における培地としてはＮＣＳＵ２３（J.Reprod.Fertil.Suppl.,48,61,1993）を用いることが高い胚盤胞形成率の点で好ましい。また、電気パルスによる活性化処理の場合、体内成熟卵子の方が体外成熟卵子に比べて胚盤胞の発生能の点で好ましい。さらに、レシピエント細胞として体内成熟卵子を用いる場合には、過排卵処理のために使用した最初のｈＣＧ投与後、５０〜６０時間後、好ましくは５４〜５５時間後に活性化処理をすることが望ましい。
【００２６】
卵細胞からの除核時及び該除核細胞への体細胞核の直接注入時の２回にわたって損傷を受けた核移植胚の胚盤胞への発生率を高め、クローンブタを効率よく作出するために、活性化処理後の核移植胚は、卵管又は子宮への移植前に、包埋剤により包埋処理を施すこともできる。かかる包埋剤による包埋処理は、複数回の包埋処理を行い、複数被膜で包埋した核移植胚とすることが好ましく、特に３重包埋処理を行い、３重被膜核移植胚とすることが好ましい。また、かかる複数回の包埋処理を行うに際しては、包埋剤の濃度を順次高めていく包埋処理、すなわち外層膜ほど高濃度の包埋剤を用いて包埋し、その物理的強度を内層から外層へと順次高めていくことが好ましい。
【００２７】
包埋処理に用いられる包埋剤としては、核移植胚を包埋することにより、２回にわたって損傷を受けた核移植胚の桑実胚や胚盤胞への発生率を高め、クローンブタを効率よく作出することができるものであれば特に制限されるものではないが、損傷を受けた透明帯の修復・保護機能を有するものや、包埋処理後の核移植胚を卵管及び子宮に移植した後、生体内での分解機能を有するものや、卵管及び子宮の膜運動による損耗からの保護機能を有するものや、白血球の攻撃からの防御機能を有するものや、包埋皮膜を通しての栄養分の透過・排泄物の排出機能を有するものの他、包埋処理時に核移植胚に影響を与えることなく包埋処理することができるものや、顕微鏡下で包埋皮膜が確認しやすいものや、顕微鏡下で包埋胚の操作がし易くなるものなどが好ましい。かかる包埋剤としては、アルギン酸、寒天等の天然多糖類の他、ムコタンパク質、ポリアミノ酸などの蛋白質、生分解性有機高分子等を例示することができるが、上記包埋剤としての好ましい機能を備えたアルギン酸が特に好ましい。その他、包埋剤の使用濃度についても特に制限されるものではないが、上記包埋剤としての好ましい機能を十分発揮しうる濃度が好ましい。なお、複数回の包埋処理を行う場合、例えばアルギン酸と寒天等、包埋剤の種類を変えて包埋処理をすることもできる。
【００２８】
例えば、アルギン酸を包埋剤として３重包埋処理する方法としては、アルギン酸ナトリウムを所定濃度（例えば０．５％、１．５％、２．０％）となるようにリンゲル液等に溶解し、あらかじめ滅菌しておき、この滅菌済みのアルギン酸ナトリウム溶液（例えば０．５％）に核移植胚を浸漬して十分馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させ、アルギン酸ゲル包埋胚とした後、この包埋胚を前記アルギン酸ナトリウム溶液よりも高濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば１．５％）に浸漬して十分馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させ、アルギン酸ゲル２重包埋胚とし、次いでこの２重包埋胚を上記アルギン酸ナトリウム溶液よりも高濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば２．０％）に浸漬して十分馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させ、アルギン酸ゲル３重包埋核移植胚とする方法を具体的に示すことができる。
【００２９】
活性化処理後に、必要に応じて包埋剤による包埋処理をした核移植胚を、卵管又は子宮に移植する雌ブタとしては特に制限されるものではないが、人工授精させた後の妊娠２１〜４０日目にプロスタグランジンＦ２α等を用いて人工流産させ、同期化を行った雌ブタを用いることが好ましい。また、核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植するに際し、複数個の受精卵を核移植胚に混合して雌ブタの卵管又は子宮に移植する追い移植法を用いることが好ましい。
【００３０】
また産仔したブタが、ＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタやｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタであることの確認は、産仔の毛色の他、トランスジェニッククローンブタ、トランスジェニッククローンブタの仮親の耳から採取したＤＮＡ並びにトランスジェニッククローンブタを作出するために用いた線維芽細胞のＤＮＡを採取し、ＰＣＲを行い、トランスジェニッククローンブタが線維芽細胞と同一の遺伝子をもち、ＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子やｈＤＡＦ遺伝子をもち、α−Ｇａｌ抗原の切断能をもつことを確認することにより同定することができる。
【００３１】
次いで、上記ＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタとｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタとの交配は、自然交配よりも人工授精によることが、確実に多くの産仔を得ることができる点で好ましい。誕生した仔ブタの略１／４の割合で、本発明のＥｎｄｏＧａｌＣ及びｈＤＡＦを共発現するダブルトランスジェニックブタが得られるが、ＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子及びｈＤＡＦ遺伝子の存在をＰＣＲを利用して確認することが好ましい。
【００３２】
本発明のブタ臓器としては、本発明のダブルトランスジェニックブタ又はその子孫に由来し、ＥｎｄｏＧａｌＣ及びｈＤＡＦを共発現することができるブタ臓器であれば特に制限されず、かかるブタ臓器としては、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、眼球（角膜）を好適に例示することができるが、中でも、腎臓を特に好適に例示することができる。
【００３３】
本発明の移植方法としては、上記本発明のブタ臓器を、非ヒト哺乳動物に常法により移植する方法であれば特に制限されず、本発明の移植方法によると、被移植非ヒト哺乳動物における超急性拒絶反応又は急性拒絶反応を抑制することができる。上記非ヒト哺乳動物としては、ブタ、サル、ヒヒ等を好適に例示することができる。上記のように、本発明の移植方法によると、被移植非ヒト哺乳動物における超急性拒絶反応又は急性拒絶反応を抑制することができるので、本発明のブタ臓器を、同種のブタや異種のヒヒ等に移植することにより、臓器移植手術の練習・訓練を行うことができる。例えば、移植後に超急性拒絶反応が起きると、移植手術の適否を判断することができない。
【００３４】
本発明はまた、本発明のブタ臓器が移植され、超急性拒絶反応又は急性拒絶反応が抑制された被移植非ヒト哺乳動物に関し、かかる被移植非ヒト哺乳動物は、免疫抑制剤のスクリーニングに有利に用いることができる。
【００３５】
本発明の免疫抑制剤のスクリーニング方法としては、上記本発明のブタ臓器を、非ヒト哺乳動物に移植する前後又は同時に、被検物質を前記非ヒト哺乳動物に投与し、被移植非ヒト哺乳動物における超急性拒絶反応又は急性拒絶反応の程度を、被検物質を投与しない場合と比較・評価する方法であれば特に制限されず、上記超急性拒絶反応の程度とは、移植直後から移植後２４時間以内におこる激しい拒絶反応の程度をいい、血管が縫合されて血流を再開した後、数分から数時間以内に、移植臓器の動脈に血栓が形成されるかどうかを比較・評価の基準とすることができる。また、上記急性拒絶反応の程度とは、移植後１週間から３ヶ月の間に起こる拒絶反応の程度をいい、生検により臓器が障害されるかどうかを比較・評価の基準とすることができる。
【００３６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
［ＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタの作出］
１．胎児線維芽細胞の採取
梅山雌ブタ×梅山雄ブタによる交配後、妊娠４４日目の雌から胎児を採取した。採取した胎児の頭部と内臓をハサミで除去し、残った胴体部分を細切りした。細切りした１ｇの胎児組織を、１０ｍＬの０．２５％トリプシン−０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液に懸濁し、４℃にて一晩冷蔵した。胎児組織を含む縣濁液は、遠心分離処理（１５００ｒｐｍ、５分）により、その上清を除去した後、３７℃に保温したウォーターバスにて２０〜３０分間処理した。保温処理後、胎児組織１ｇ当たり、１０ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを加えてピペッティングし、セルストレーナーに流し込んで濾過した。濾過液は遠心分離処理され、その上清を除去した後、沈殿物を１０ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに再懸濁した。細胞数を計測し、適当量になるようＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにて調整した後、細胞培養用シャーレにまき、３７℃にて、５％ＣＯ２下で培養し、胎児線維芽細胞を分離した。
【００３８】
２．ＥｎｄｏＧａｌＣ発現細胞の作出
分離した胎児線維芽細胞は、植継ぎを行わずに遺伝子導入に用いた。０．２５％トリプシン−０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液にて胎児線維芽細胞を剥離させ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに懸濁した。細胞懸濁液は遠心分離処理（１５００ｒｐｍ、５分）した後、その上清を除去し、冷ＨＢＳに再懸濁した。再懸濁液は、再度遠心分離処理を行って、その上清を除去し、細胞数が２．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＨＢＳにて調整した。キュベットに、細胞溶液０．４ｍＬ（１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）と、１００μＬの調整済みＤＮＡ液（ネオマイシン耐性遺伝子を繋げて新たに作製したＥｎｄｏＧａｌＣ発現ベクター、２５ｎＭ、図１参照）とを入れた後、良く混和した。遺伝子導入は、電気穿孔法により行い、３００Ｖ、９５０μＦ、抵抗∞の条件のパルスにて行った。パルス付加後、室温にて１０分間静置した。静置した細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにて培養した。パルス印加後２〜３日目に増殖してきた細胞に対して、ネオマイシン（Ｇ４１８）を５００μｇ／ｍＬ添加して、５〜１２日間薬剤選択を行った。薬剤選択後に生存していた細胞はコロニーピックアップせず、細胞集団として増殖させた。
【００３９】
３．ＦＡＣＳによる解析及びソーティング
薬剤選択後、細胞数が十分に増殖したところで、細胞を０．２５％トリプシン−０．０４％ＥＤＴＡで剥がし回収した。回収した細胞はＰＢＳで２回洗浄し、細胞数を２×１０５／ｔｕｂｅになるように調整した。細胞は、αＧａｌを認識するＦＩＴＣ-labelled Griffoniasimplicifolia isolectin ＩＢ４(GS-IB4)（ＦＩＴＣ）と４℃で３０分間染色し、ＰＢＳで洗浄した。解析を行う直前に死細胞を判定する為に２００μｇ／ｍＬのＰＩを１０μＬ／ｔｕｂｅ添加した。解析対象である凝集した細胞を取り除くためにセルストレーナーキャップ付きのチューブに移した後、ＦＡＣＳ(fluorescence-activated cell sorter)にて解析した。αＧａｌ発現レベルを計るのに平均蛍光強度（ＭＦＩ）を用いた。またソーティングを行う場合は上記の過程をすべてクリーンベンチ内で行い出来るだけ４℃を保った。αＧａｌ抗原が切断されている細胞のみをＦＡＣＳのソーティング技術を用いて分離し、細胞数に準じたディッシュ若しくはプレートにまき、培養を続けた。
【００４０】
ネオマイシンによる選択後、ＦＡＣＳによりαＧａｌの発現を調べたところ、図２（ａ）に示されるように２つのピークが現れた。ＥｎｄｏＧａｌＣを発現し、αＧａｌが切断されていると思われる細胞集団（図２（ａ）Ｍ１領域）をＦＡＣＳのソーティングにより分離したところ、図２（ｂ）のような細胞集団（EndoGalC sorted）を得ることができた。
【００４１】
４．ホルモン処理による採卵方法
ランドレース（Ｌ）、及びランドレース×大ヨークシャー（Ｗ）×デュロック（Ｄ）の三元交雑種（ＬＷＤ）の生後１６０〜１９４日齢の春期発動前の雌ブタを用いた。供試ブタにｅＣＧ（ピーメックス、三共ライフテック株式会社製）を１５００ＩＵ投与し、その７２時間後にｈＣＧ（プペローゲン、三共ライフテック株式会社製）を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与４８時間後に屠殺し、卵巣、卵管、及び子宮の結合組織を摘出した。また、性成熟に達した雌ブタからの採卵は、予め発情時に雄希釈精液を用いて人工授精を行い、妊娠２１〜５０日後に人工流産処置することにより行った。核移植予定５日前にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール約０．２ｍｇ（プラネート、武田社製：２ｍＬ量）を臀部筋肉内に投与した。その２４時間後に、同様にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にｅＣＧを臀部筋肉内に１５００ＩＵ投与した。ＰＧＦ２αとｅＣＧとを投与してから７２時間後にｈＣＧを５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与４６時間後に屠殺し、卵巣、卵管、及び子宮の結合組織を摘出した。
【００４２】
５．体内成熟卵子の準備
摘出した卵巣、卵管、及び子宮の結合組織を直ちに実験室に持ち帰り、灌流液（ＰＢＳ：Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含（タカラバイオ株式会社製）＋０．１％ウシ血清アルブミン:ＢＳＡ（Sigma社製、Cat.No.A-4503）＋１００ｍＬ当たり１ｍＬ添加抗生物質:Antibiotic,Antimycotic,（Sigma社製A-7292））で卵管を灌流し、卵子を採取した。得られた卵子は０．１％ヒアルロニダーゼを含む、灌流液を用いて卵丘細胞を裸化し、卵細胞質の均一な卵子を選抜した後、ヒアルロニダーゼを含まない灌流液中で洗浄した。その後、ＰＺＭ−３液を用いてインキュベーター（３８．５℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２）内で供試するまで体外培養を行った。
【００４３】
６．屠場卵巣由来卵胞卵子の採卵方法
屠場にて食肉用として屠殺された春期発動前の未経産雌ブタより卵巣を採取し、ＰＢＳ（−）液にて３５℃保温下で研究室に持ち帰った。持ち帰った卵巣は直ちに、３７℃に保温したＰＢＳ（−）にて洗浄し、卵巣結合組織を除去した後、採卵作業を行った。直径２〜６ｍｍの卵胞を選び、メスによりＴＣＭ１９９(Hanks’salts、Gibco社製)に１０％ＦＣＳ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン(Sigma社製)、及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン(Sigma社製)を添加した培養液中で切開した。卵丘細胞が３層以上密に付着した卵丘細胞卵子複合体（ＣＯＣ）とＣＯＣに壁側顆粒層細胞が付着した壁側顆粒層細胞−卵丘細胞卵子複合体（ＧＣＯＣ）を選別し、採卵をした。
【００４４】
７．体外成熟培養
採取したＣＯＣ及びＧＣＯＣは、約３０〜４０個／穴で改変ＮＣＳＵ３７を５００μＬ分注した４穴ディッシュを用いて成熟培養した。改変ＮＣＳＵ−３７は、１０％ブタ卵胞液、０．６ｍＭシステイン、５０μＭβメルカプトエタノール、１ｍＭジブチリルｃＡＭＰ、１０ＩＵ／ｍＬＰＭＳＧ(ピーメックス;1000IU)、及び１０ＩＵ／ｍＬｈＣＧ(プペローゲン;1500IU)を添加して作製した。２０〜２２時間培養後、ホルモン及びジブチリルｃＡＭＰ無添加改変ＮＣＳＵ３７に移して供試時まで培養した。成熟培養は３９℃、気相条件は、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２の条件で実施した。成熟培養時間は４２〜４４時間で行い、成熟卵子（第一極体放出卵子）のみを試験に使用した。
【００４５】
８．卵子核の除去操作（除核操作）
除核操作前に、体内成熟卵子や屠殺採卵した未受精卵子を、サイトカラシンＢ（Sigma社製Cat.No.C-6762）を５μｇ／ｍＬ含むＰＺＭ３液に移し、１５分間以上処理した。除核操作も同濃度のサイトカラシンＢが含まれるＰＺＭ３液で作製したドロップ内（１０ｃｍプラスチックシャーレの中心付近に５０μＬでドロップを作製し、ミネラルオイル２０ｍＬで被った）で行った。卵子は、第一極体が、１２時から３時方向の位置になるようにホールディングピペットで保定した。ピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック社製）に取り付けた除核用ピペット（外径２５−３０μｍ、先端を３０〜４５度の角度で研磨）により、第一極体ごと細胞質を１／４〜１／３量程吸引した。除核用ピペットの操作性が悪くなった場合は、２０％ＰＶＰ液（Sigma社製Cat.No.PVP-360）ドロップにて、吸引と排出とを繰り返し、洗浄を行った。除核操作終了後、直ちにサイトカラシンＢが含まれないＰＺＭ３液に移し、洗浄を行った。洗浄には、ＰＺＭ３液が３ｍＬ入った３５ｍｍディッシュ(Falcon社製1008)で２回以上、丁寧に洗浄し、サイトカラシンＢを除去した。その後、注入操作まで、ＰＺＭ３液ドロップ（３５ｍｍディッシュ（Falcon社製3001）に１００μＬのドロップを作製し、４ｍＬミネラルオイルで被った）に移し、インキュベーター内で培養した。
【００４６】
９．ドナー組換え体細胞の準備
ＦＡＣＳのソーティングによりα−ｇａｌ抗原を１００％近く切断した梅山ブタ雌の胎児の線維芽細胞を核移植ドナー細胞として用いた。培養液にはＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを用い、植継ぎ回数は２〜１２回の細胞を用いた。核移植予定日に合わせて、植継ぎを行った後、コンフルエント状態から培養液の交換を行わず、１０〜１６日間放置し(核移植予定日約１６日前に植え継ぐ)、細胞周期をＧ１／Ｇ０期に同調した。核移植に用いる約１時間前にドナー体細胞の準備を行った。細胞処理は、培養容器の培養液を除去した後に、ＰＢＳ（−）にて３回以上洗浄を行い、０．２５％トリプシン＋０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液にて細胞剥離処理を行った。剥離した細胞に１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭを加え、懸濁した後、遠心分離処理（１５００ｒｐｍ、５分、室温）を行った。遠心分離処理後、上清を除去し、ＰＺＭ３液を適量加えて懸濁し、核移植に用いるまで室温で放置した。体細胞核注入操作時に、適当な細胞数を注入操作用チャンバーのドロップに添加して使用した。
【００４７】
１０．体細胞核の注入操作
注入用チャンバー（１０ｃｍシャーレにＰＺＭ３液５０μＬでドロップを作製し、ミネラルオイル２０ｍＬで被った）のドロップに適量のドナー細胞を添加し、除核済み卵子３０〜５０個を入れて操作した。注入操作には、ピエゾマイクロマニュピレーターに体細胞核注入用ピペット（外径７−１０μｍ、鈍端）を用いた。注入用ピペットをピエゾマイクロマニュピレーターに取り付ける前に、ピペット後端より５ｍｍの位置にフロリナートを３〜５ｍｍ幅になるように、充填して使用した。そのピペットをピエゾに取り付けて使用する時は、先端より培養液、フロリナート、空気、ミネラルオイルの順で満たされている状態にして操作した。注入操作を行う前に、必ず２０％ＰＶＰ液ドロップ内で注入用ピペットを洗浄（ピペッティングやＰＶＰドロップへのピペット先端の出し入れ）した。浮遊している体細胞を吸引し、数回ピペッティングを行い、細胞膜を壊し、ホールディングピペットにて保定した除核済み卵子細胞質内へ注入した。体細胞核を注入した卵子は、活性化処理まで１〜３時間インキュベーターで培養を行った。
【００４８】
１１．卵子の活性化処理
体細胞核を注入した卵子の活性化処理は、直流パルス刺激(SSH-2,島津製作所)を、１．５ｋＶ／ｃｍ１００μｓｅｃ．×１回にて行った。チャンバーには２ｍｍ幅のステンレスワイヤー電極を用い、電気刺激用の電解質溶液には０．０５ｍＭＣａＣｌ２、０．１ｍＭＭｇＳＯ４、及び０．０２％ＢＳＡを含む０．２８Ｍマンニトール溶液を用いた。
【００４９】
１２．活性化卵子の第２極体放出抑制処理
活性化処理卵子や屠殺採卵した未受精卵子は、５μｇ／ｍＬサイトカラシンＢ(Sigma社製Cat.No.C-6762)を含むＰＺＭ３液で２時間培養し、第２極体の放出を抑制させる処理を行った。
【００５０】
１３．活性化卵子の体外培養
活性化後サイトカラシンＢ液で２時間処理した卵子は、サイトカラシンＢを含まないＰＺＭ３液にて複数回洗浄し、ＰＺＭ３液にて体外培養を行い、活性化処理後２日目に分割した胚のみ胚移植に用いた。
【００５１】
１４．ホルモン処理による仮腹の同期化と胚移植方法
仮腹の同期化は妊娠ブタを人工流産処置することで行った。また、仮腹の発情は、採卵ブタのものより、１日遅れるように発情同期化処置を行った。供試予定の雌ブタは、発情時に、雄ブタ希釈精液を用いて人工授精を行い妊娠させた。妊娠後２１〜５０日目の妊娠ブタを用いた。核移植予定６日前にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール約０．２ｍｇを臀部に注射した。その２４時間後に、同様にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にｅＣＧを１０００ＩＵ投与した。ＰＧＦ２αとｅＣＧとを投与してから７２時間後にｈＣＧを５００ＩＵ投与した。ｈＣＧを投与してから約６８時間目に仮腹へケタラールを投与後、ハロセン麻酔下で外科的に胚移植手術を行った。胚移植はＰＰカテーテル（フジヒラ社製）を卵管へ挿入して行った。
【００５２】
ソーティングにより得られたＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子導入細胞による核移植、胚移植の結果を表１に示す。表１に示すように、ＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子導入細胞を用いて、核移植試験６回行い、分割胚１１４４個を７頭の仮腹へ移植した結果、２頭が妊娠し、内１頭は流産したが（２頭の流産胎児）、残り１頭は１頭分娩した（図３参照）。
【００５３】
【表１】
2008220222.tif 000002
【００５４】
１５．誕生したブタのＰＣＲ判定
誕生したブタから採取可能な組織（耳及び臍帯組織）や血液等からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ解析を行った。図１のベクターにおけるＯＲＦ（Open Reading Frame）の５’側と３’側でプライマーを２組設計し、判別に用いた。プライマーはフォワード（5'-ttacatccagattcagcaac-3'；配列番号１）及びリバース（5'-ggaacattagccataacttc-3'；配列番号２）、フォワード（5'-tagagacacaagttggagatggt-3'；配列番号３）及びリバース（5'-gctaattgaatatcagtatttttcac-3'；配列番号４）の２組を用いた。ＰＣＲサイクルの条件は、９４℃にて５分の後、９４℃にて１分、５５℃にて１分、７２℃にて１分を４０サイクルした後、７２℃にて５分処理し、４℃で保存した。ＰＣＲ産物を５μＬ採取し、ＰＡＧＥゲルにて電気泳動（２００Ｖ、３０分間）を行った。２本バンドを検出した場合にＥｎｄｏｇａｌＣ遺伝子の導入の有無を判別した。
【００５５】
流産胎児及び梅山ブタＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタ雌の組織からゲノムを抽出してＰＣＲ解析を行った結果、ＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子が組み込まれていることが確認できた（図４（ａ）及び（ｂ）参照）。
【００５６】
１６．誕生したＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタのＦＡＣＳ解析
誕生したクローンブタの耳組織より細胞を採取し、上記「３・ＦＡＣＳによる解析及びソーティング」記載の方法によりα−Ｇａｌ抗原の切断の有無を解析した。
【００５７】
ＦＡＣＳによりαＧａｌの発現を調べたところ、２頭の流産胎児及び梅山ブタＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタ雌は、約９８％のαＧａｌが切断されていた（図５（ａ）（ｂ）参照）。図５において、ＭＬ／ＥｎｄｏＧａｌＣｃｌｏｎｅｄｐｉｇは、今回誕生したＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタを示し、ＥｎｄｏＧａｌＣ−１及びＥｎｄｏＧａｌＣ−２は、以前に作出したＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタを示す。ＭＬ８は、ＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタを作出するのに用いた元のブタ胎児の非組換え細胞である。Ｍ新生児は、非組換えブタである。（−）はαＧａｌを染色していないコントロールを示す。
【実施例２】
【００５８】
［ｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタの作出］
１．胎児線維芽細胞の採取
ランドレース種雌×大ヨーク種雄による交配後、妊娠７１日目の雌から雄胎児を採取した。採取した胎児の筋肉組織をハサミで採取し、細切りした。その後の処理は、実施例１−１に記載された胎児線維芽細胞の採取の方法に準じて行った。
【００５９】
２．ｈＤＡＦ発現細胞の作出 
分離した胎児線維芽細胞は、植継ぎを行わず、遺伝子導入に用いた。遺伝子導入前日に胎児線維芽細胞を０．２５％トリプシン−０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液にて剥離させ、翌日５０〜９０％コンフルエントになるように１０ｃｍディッシュに継代した（１．０×１０６／ディッシュ）。遺伝子導入には、Lipofectamine PLUS Reagent（invitrogen社製）を用いた。ｈＤＡＦ発現ベクター（図６参照）２．０μｇを７５０μＬのＤ−ＭＥＭに溶解した。次に３０μＬのPLUS Reagentを混合し、１５分間、室温で放置した。その後、別に７５０μＬのＤ−ＭＥＭに溶かしておいたLipofectamine４５μＬをタッピングしながら加え、さらに１５分間、室温で放置した。その間、細胞にＤ−ＭＥＭを加え洗浄後、除去し、再度Ｄ−ＭＥＭを加えてインキュベーター内で培養した。ベクターは室温放置後、分散するように細胞に滴下し、３７℃、５％ＣＯ２下で３時間培養した。３時間後、２０％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭを加え、メディウムが１０％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭになるよう調整した。遺伝子導入から４８時間以降にそれぞれの細胞に適した濃度（１．０〜２．０μｇ／ｍＬ）でピューロマイシンを溶かした１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭに交換した。その後、２〜３日に１回の割合でピューロマイシンを含む培養液の交換を行った。薬剤選択後、生存していた細胞はコロニーピックアップせず、細胞集団として増殖させた。
【００６０】
３．ＦＡＣＳによる解析及びソーティング
トリプシン−ＥＤＴＡで剥がした細胞を２％ＦＣＳ−ＰＢＳで洗浄し、細胞数を５×１０５／ｔｕｂｅになるように調整した。細胞はαＧａｌを認識するＦＩＴＣ、或いはＦＩＴＣ標識された抗ｈＤＡＦ抗体で染色し（４℃、３０分間）、２％ＦＣＳ−ＰＢＳで２回洗浄した。解析を行う直前に死細胞を判定する為に２００μｇ／ｍＬのＰＩを１０μＬ／ｔｕｂｅ添加した。凝集細胞を取り除くためにセルストレーナーキャップ付きのチューブに移した後、ＦＡＣＳで解析した。αＧａｌ発現レベル及びｈＤＡＦ発現レベルを計るのに平均蛍光強度(ＭＦＩ)を用いた。またソーティングを行う場合は上記の過程をすべてクリーンベンチ内で行い出来るだけ４℃を保った。ソーティング技術を用いて分離された細胞は、細胞数に準じたディッシュ若しくはプレートにまき、培養を続けた。
【００６１】
ブタ胎児線維芽細胞にｈＤＡＦ発現ベクター（図６参照）を導入し、薬剤選択直後はｈＤＡＦを高発現している細胞は３．１９％しか存在しなかったが（図７（ａ）参照）、Ｍ１領域（図７（ａ）参照）をソーティングすると、ｈＤＡＦを高発現している細胞が７９．７１％まで増加した（図７（ｂ）参照）。
【００６２】
４．ホルモン処理による採卵方法
実施例１の「４．ホルモン処理による採卵方法」記載の方法に準じて行った。
【００６３】
５．体内成熟卵子の準備
実施例１の「５．体内成熟卵子の準備」記載の方法に準じて行った。
【００６４】
６．屠場卵巣由来卵胞卵子の採卵方法
実施例１の「６．屠場卵巣由来卵胞卵子の採卵方法」記載の方法に準じて行った。
【００６５】
７．体外成熟培養
実施例１の「７．体外成熟培養」記載の方法に準じて行った。
【００６６】
８．卵子核の除去操作（除核操作）
実施例１の「８．卵子核の除去操作（除核操作）」記載の方法に準じて行った。
【００６７】
９．ドナー組換え体細胞の準備
実施例１の「９．ドナー組換え体細胞の準備」記載の方法に準じて行った。その際、ＦＡＣＳのソーティングによりｈＤＡＦを高発現しているＬＷ雄の胎児の線維芽細胞を核移植ドナー細胞として用いた。
【００６８】
１０．体細胞核の注入操作
実施例１の「１０．体細胞核の注入操作」記載の方法に準じて行った。
【００６９】
１１．卵子の活性化処理
実施例１の「１１．卵子の活性化処理」記載の方法に準じて行った。
【００７０】
１２．活性化卵子の第２極体放出抑制処理
実施例１の「１２．活性化卵子の第２極体放出抑制処理」記載の方法に準じて行った。
【００７１】
１３．活性化卵子の体外培養
実施例１の「１３．活性化卵子の体外培養」記載の方法に準じて行った。
【００７２】
１４．ホルモン処理による仮腹の同期化と胚移植方法
実施例１の「１４．ホルモン処理による仮腹の同期化と胚移植方法」記載の方法に準じて行った。
【００７３】
１５．誕生したブタのＰＣＲ判定
誕生したブタから採取可能な組織（耳及び臍帯組織）や血液等からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ解析を行った。プライマーはフォワード（5'-aaggccgtacaagttttccc-3'；配列番号５）、リバース（5'-gaactgttggtgggaccttg-3'；配列番号６）の１組を用いた。ＰＣＲサイクルの条件は、９４℃にて５分の後、９４℃にて１分、６０℃にて１分、７２℃にて１分を４０サイクルした後、７２℃にて５分処理し、４℃で保存した。ＰＣＲ産物を５μＬ採取し、ＰＡＧＥゲルにて電気泳動（２００Ｖ、３０分間）を行った。２本バンドを検出した場合にＥｎｄｏｇａｌＣ遺伝子の導入の有無を判別した。
【００７４】
ソーティングにより得られたｈＤＡＦ遺伝子導入細胞による核移植、胚移植の結果を表２に示す。表２に示すように、試験回数９回から１７１１個の分割胚を得られ、１１頭の仮腹へ移植した結果、２頭のクローンブタを得ることに成功した。
【００７５】
【表２】
2008220222.tif 000003
【００７６】
２００４年８月１日に誕生した２頭（図８参照）の内１頭（ｈＤＡＦクローンブタ−２）は死亡したが、もう１頭（ｈＤＡＦクローンブタ−１）は現在も生存している。ゲノミックＰＣＲの結果、２頭ともｈＤＡＦが組み込まれていた（図９参照）。
【００７７】
１６．誕生したｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタのＦＡＣＳ解析
誕生したクローンブタの耳組織より細胞を採取して、上記「３・ＦＡＣＳによる解析及びソーティング」記載の方法によりｈＤＡＦの発現を解析した。
【００７８】
２頭のｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタの耳より細胞を分離し、ｈＤＡＦの発現をＨＡＥＣ（ヒト大動脈血管内皮細胞）とＭＦＩ値で比較したところ、約２０〜３０倍のｈＤＡＦの発現が認められた（図１０ａ）参照）。また、死亡したｈＤＡＦクローンブタ−２からは血管壁由来細胞を分離し、ＨＡＥＣやＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞）とｈＤＡＦの発現比較を行ったところ、９０倍近い発現が認められた（図１０ｂ）参照）。
【００７９】
死亡したｈＤＡＦクローンブタ−２の組織でのｈＤＡＦの発現を、心臓、腎臓、肝臓について組織染色を行った結果、心臓では非常に強い染色が認められた。腎臓でも強く染色されていたが、肝臓に関しては腎臓に比べ若干染色が弱かった（図１１参照）。
【００８０】
ＨＵＶＥＣ、ＰＡＥＣ（ブタ大動脈血管内皮細胞）、ＬＷＤ耳、ｈＤＡＦクローンブタ−２血管壁由来細胞の各細胞にヒト血清を添加し、ヒトＩｇＧ及びヒトＩｇＭに対する抗体接着をフローサイトメトリーで解析したところ、ｈＤＡＦクローンブタ−２の細胞では抗体接着の低下は認められなかった（図１２（ａ）（ｂ）参照）。しかし、ｈＤＡＦクローンブタ−２の細胞では細胞傷害に関して高い抑制効果が得られた（図１２（ｃ））。
【００８１】
１７．細胞傷害の計測方法
細胞障害試験を行う２〜３日前に９６ｗｅｌｌプレートに細胞（通常の非組換えブタ由来耳細胞＝ＬＷＤ、ＰＡＥＣ＝通常の非組換えブタ由来血管内皮細胞、ｈＤＡＦクローン由来耳細胞、ヒト由来血管内皮細胞＝ＨＵＶＥＣ）をまく。障害試験は、ヒト血清を用いる。ヒト血清は、新鮮な血清と、補体不活化処理（５６℃、３０分）した血清の２種類を用いる。それぞれの細胞に対して、新鮮な血清で感作させた区と補体不活化処理した血清で感作させた区の２つの試験区を設けた。９６ｗｅｌｌプレートの培養液を除去した後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、ヒト血清（新鮮血清または補体不活化処理血清）を含む培養液を添加して、３７℃、３０分間、インキュベーター内で培養する。ヒト血清感作後（３０分間処理後）、培養液を除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＭＴＴ試薬（０．１Ｍコハク酸２Ｎａ、０．４％ＭＴＴを含むＰＢＳ（−）＝生存しているミトコンドリアを染色する方法）を１ｗｅｌｌ当たり２０μｌ加えて３７℃、４時間培養する。ＤＭＳＯを１００μｌ添加して、プレートミキサーで良く混合する。マイクロプレートリーダー（吸光度測定装置）を用いて、測定する。各サンプルの吸光度（Ｏ．Ｄ．値）を用いて以下の計算式で細胞障害度を計算した。
細胞障害度（％）＝（補体不活化処理血清にて感作させたＯ．Ｄ．値−新鮮血清にて感作させたＯ．Ｄ．値）／補体不活化処理血清にて感作させたＯ．Ｄ．値
【実施例３】
【００８２】
［ダブルトランスジェニックブタの作出］
１．ＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタとｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタの交配
ｈＤＡＦクローンブタ雄の精液を採取し、モデナ（ブタ精液希釈液）にて希釈後、誕生したＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタ雌の発情時に人工授精を行った。
【００８３】
２．誕生したブタのＰＣＲ判定
誕生したブタのＰＣＲ判定は、実施例１の「１５．誕生したブタのＰＣＲ判定
」及び実施例２の「１５．誕生したブタのＰＣＲ判定」記載の方法に準じて行った。
【００８４】
ＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタとｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタの交配の結果を表３に示す。合計２５頭の子ブタが誕生した。誕生した子ブタは正常に発育し、離乳後も異常は見られなかった。仔ブタの耳組織より細胞を分離し、ＰＣＲ解析を行ったところ、ダブルトランスジェニックブタ合計６頭が確認できた。
【００８５】
【表３】
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【実施例４】
【００８６】
［ダブルトランスジェニックブタ臓器を用いたヒヒへの移植試験］
１．ダブルトランスジェニックブタの臓器摘出
ＰＣＲ解析及びＦＡＣＳ解析によりＥｎｄｏＧａｌＣ及びｈＤＡＦ遺伝子が組み込まれていることが確認されたブタは体重２３．５ｋｇまで発育させた。発育したダブルトランスジェニックブタ（ドナー）は、ケタラール筋中麻酔後、ハロセン麻酔下で、外科的手術により腎臓を摘出した。摘出した腎臓は、氷冷し、通常のドナー手術に従い、摘出時及びバックテーブルにおいてビアスパン（University of Wisconsin液）で灌流し４℃にて保存した。
【００８７】
２．ヒヒへの腎臓移植
レシピエントには、雌のドグエラヒヒ（体重１２ｋｇ）を用いた。ケタラール筋中麻酔後、ハロセン麻酔下で、外科的手術により、上記ダブルトランスジェニックブタより摘出した腎臓を移植した。
【００８８】
３．免疫抑制処理
ブタ腎臓を移植したヒヒの免疫抑制剤処理は、タクロリムス（ＦＫ）０．１５ｍｇ／ｋｇ／日、シクロホスファミド１〜２ｍｇ／ｋｇ／日、メチルプレドニゾロン２ｍｇ／ｋｇ／日量で投与することにより行った。
【００８９】
ダブルトランスジェニックブタの腎臓を摘出し、ヒヒへ移植した結果、血流再開直後から腎臓の色調は良好で尿の流出も観察され、超急性拒絶反応の所見は認められなかった（図１３（ａ）及び図１３（ｂ）参照）。
【００９０】
移植手術３日後の開腹の腎生検（図１４参照）による病理鑑定の結果、糸球体の血栓、尿細管炎および毛細血管炎は認められず、拒絶反応の所見は認められなかった（図１５参照）。また、移植手術７日後の開腹の腎生検（図１６参照）による病理鑑定の結果、糸球体のわずかな血栓形成は認められたが、間質の血管には血栓形成、尿細管炎及び毛細血管炎は認められず、拒絶反応の所見は認められなかった（図１７参照）。さらに、移植手術８日後の腎生検（図１８参照）による病理鑑定の結果、糸球体に明らかな血栓形成が認められたが、尿細管炎や毛細血管炎は認められず、明らかな進行性拒絶反応の所見は認められなかった（図１９参照）。
【００９１】
これらの結果から、ＥｎｄｏＧａｌＣ及びｈＤＡＦ遺伝子高発現ダブルトランスジェニックブタを用いることにより、異種間移植における超急性拒絶反応を回避することが可能であることが明らかとなった。
【００９２】
なお、実施例２で得られたｈＤＡＦクローンブタ−２の腎臓を、同様にドグエラヒヒに移植したところ、移植後５分以内に超急性拒絶反応が生じ、図２０に示すように、移植した腎臓が黒褐色に変異していた。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ネオマイシン耐性遺伝子を繋げて新たに作製したＥｎｄｏＧａｌＣ発現ベクターを示す図である。
【図２】ＥｎｄｏＧａｌＣ発現ベクター導入後（ａ）、及びソーティング後（ｂ）のαＧａｌの発現を示す図である。
【図３】ＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子導入細胞を用いて、核移植試験６回行い、分割胚１１４４個を７頭の仮腹へ移植した結果、出産した１頭の写真である。
【図４】流産胎児及び梅山ブタＥｎｄｏＧａｌＣトランスジェニッククローンブタ雌の組織からゲノムを抽出してＰＣＲ解析を行った結果を示す図である。
【図５】流産胎児および梅山ブタＥｎｄｏＧａｌＣクローンのαＧａｌの発現における、（ａ）流産胎児及び核移植に供試したソーティング細胞、及び（ｂ）今回誕生した梅山ブタクローンとこれまで作出したＥｎｄｏＧａｌＣクローンの比較を示す図である。
【図６】ｈＤＡＦ発現ベクター及びα１，３ＧＴアンチセンスベクターを示す図である。
【図７】ｈＤＡＦ発現ベクター導入後（ａ）、及びソーティング後（ｂ）のｈＤＡＦの発現を示す図である。
【図８】誕生したｈＤＡＦ遺伝子発現トランスジェニッククローンブタの写真である。
【図９】ｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタの組織からゲノムを抽出してＰＣＲ解析を行った結果を示す図である。
【図１０】フローサイトメトリーによる解析でのｈＤＡＦ発現比較を示す図である。ａ）は、耳由来線維芽細胞でのｈＤＡＦ発現比較を示し、ｂ）ヒト血管内皮細胞とのｈＤＡＦ発現比較を示す。
【図１１】ｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタと対照の組織染色図を示す。
【図１２】各細胞におけるヒト抗体接着とヒト血清に対する細胞障害の結果を示す図である。（ａ）ヒトＩｇＧに対する抗体接着をフローサイトメトリーで解析した結果、（ｂ）ヒトＩｇＭに対する抗体接着をフローサイトメトリーで解析した結果、（ｃ）ヒト血清に対する細胞傷害の結果を示す。
【図１３】本発明のブタ腎臓をヒヒへ移植した直後（ａ）、及び９０分後（ｂ）の腎臓の写真である。
【図１４】ヒヒへ移植した本発明のダブルトランスジェニックブタの腎臓移植手術３日後に開腹したダブルトランスジェニックブタの腎臓の写真である。
【図１５】本発明のブタ腎臓の移植手術３日目の開腹の腎生検による病理鑑定結果を示す図である。
【図１６】ヒヒへ移植した本発明のダブルトランスジェニックブタの腎臓移植手術７日後に開腹したダブルトランスジェニックブタの腎臓の写真である。
【図１７】本発明のブタ腎臓の移植手術７日目の開腹の腎生検による病理鑑定結果を示す図である。
【図１８】ヒヒへ移植した本発明のダブルトランスジェニックブタの腎臓移植手術８日後に開腹したダブルトランスジェニックブタの腎臓の写真である。
【図１９】本発明のブタ腎臓の移植手術８日目の開腹の腎生検による病理鑑定結果を示す図である。
【図２０】ｈＤＡＦトランスジェニッククローンブタ腎臓の移植５分後の超急性拒絶反応を起こして黒褐色に変異した写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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