(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｎｏｘ４阻害剤・抑制剤候補の中から効能の高いＮｏｘ４阻害剤・抑制剤をスクリーニングする方法、また、上記方法によって探索した効力の高いＮｏｘ４阻害剤・抑制剤を有効成分として含有させ、膵臓がん、メラノーマ、グリオーマ（脳腫瘍）等のがん治療用医薬組成物を提供する。【解決手段】ＡＫＴ／ＡＳＫ１へのシグナル伝達阻害を指標に、候補物質から有効なＮｏｘ４阻害剤・抑制剤を効果的に探索する。当該スクリーニング方法で探索されたＮｏｘ４阻害剤・抑制剤は、生存する膵臓がん、メラノーマ、グリオーマを含むがん組織細胞の増殖を抑えることができる。【選択図】図８
2008022841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＫＴ／ＡＳＫ１へのシグナル伝達阻害を指標に探索する、Ｎｏｘ４阻害剤・抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＡＫＴ／ＡＳＫ１へのシグナル伝達阻害を指標に探索された、Ｎｏｘ４阻害剤・抑制剤。
【請求項３】
請求項２のＮｏｘ４阻害剤・抑制剤であって、前記阻害剤・抑制剤はＮＡＤＰＨオキシダーゼ４の発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡ、又はこれを運ぶ遺伝子ベクターであるＮｏｘ４阻害剤・抑制剤。
【請求項４】
請求項２のＮｏｘ４阻害剤・抑制剤であって、前記阻害剤・抑制剤は抗Ｎｏｘ４抗体又はその限定分解産物、これらの修飾物、その他天然物を基原とする物質又はその誘導体であるＮｏｘ４阻害剤・抑制剤。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかのＮｏｘ４阻害剤・抑制剤を有効成分として含有する、がん治療用医薬組成物。
【請求項６】
治療対象のがんは、膵臓がん、メラノーマ又はグリオーマである、請求項５のがん治療用医薬組成物。
【請求項７】
Ｎｏｘ４を検出又は定量できる試薬を用いて、Ｎｏｘ４を検出・定量して判定することを特徴とするがん診断方法。
【請求項８】
前記試薬として、抗Ｎｏｘ４抗体又はその限定分解産物、これらの修飾物を含有する試薬を用いる、請求項７のがん診断方法。
【請求項９】
前記試薬として、アプタマーあるいはその修飾物を含有する試薬を用いる、請求項７のがん診断方法。
【請求項１０】
診断対象のがんは、膵臓がん、メラノーマ又はグリオーマである、請求項７〜９のいずれかのがん診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）ファミリーのうち、活性酸素産生遺伝子Ｎｏｘ４によってコードされる蛋白質の阻害剤・抑制剤のスクリーニング方法、そのスクリーニング方法により得られるＮｏｘ４阻害剤・抑制剤、得られたＮｏｘ４阻害剤・抑制剤を含有するがん治療用医薬組成物、及び膵臓がん、メラノーマ、グリオーマ等を診断するがん診断方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（遺伝子はＮｏｘと略す）ファミリーによって生じた活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）は、最近、いろいろな細胞プロセスにおいて重要なシグナリング（信号伝達）分子として認識されている。Ｎｏｘファミリーは、７つの構成メンバー、すなわち、Ｎｏｘ１，Ｎｏｘ２，Ｎｏｘ３，Ｎｏｘ４，Ｎｏｘ５，Ｄｕｏｘ１及びＤｕｏｘ２から成る。これらは、６回貫通膜ドメインを有し、また、ＦＡＤ及びＮＡＤＰＨ結合部位を含む細胞質ドメインを有する共通の構造的類似性があり、各々のメンバーはスーパーオキサイドの生成を通じて特異的生理機能を果たしていると考えられている。例えば、よく研究されたＮｏｘ２（ｇｐ９１ｐｈｏｘ）は病原菌に対する宿主防御作用であり、Ｎｏｘ１は繊維芽細胞におけるＰＤＧＦ又はＥＧＦで刺激される細胞分裂誘起作用又は血管平滑筋細胞におけるアンジオテンシンに誘導される細胞増殖作用であり、そして、Ｎｏｘ４では脂肪細胞におけるブドウ糖取込みを含むインスリン−シグナルの形質導入と連結しており、Ｔｏｌｌ様レセプター４が仲介する炎症作用とも関係している。【０００３】  ＲＯＳの生成が刺激を引き起こす通常のプロセスとは対照的に、悪性細胞におけるＲＯＳの産生（これは食細胞におけるＲＯＳのそれよりも少ないけれども）は頻繁に増幅され、これは腫瘍促進と関係している。この点で、ＲＯＳ産生Ｎｏｘファミリー酵素のうちのいくつかが悪性新生物の増殖に関わっていることは注意しなければならない。本発明者らは、先に、Ｎｏｘ１に向けられたｓｉＲＮＡが、アンカー非依存性の成長と腫瘍形成を制限しながら発がん性のＲａｓトランスフォーメーションを抑制することを示した（非特許文献１参照）。更には、Ｎｏｘ４（非特許文献２、３参照）及びＮｏｘ５（非特許文献４参照）が、悪性メラノーマ、膵臓カルシノーマ及び前立腺がん細胞の各々の細胞生存を制御しているようだと報告されている。これらの知見は、ＲＯＳの役割についてがん発生の面では遺伝子毒性が強調されているけれども、ＲＯＳによる生存信号の調節もまた、いくつかのタイプのがん発達に重要であることを示唆している。【０００４】  膵臓がんによる死は、がん死の主たるものの一つであり、これはその攻撃的な悪性、すなわち、アポトーシス及び化学療法剤に対する抵抗性に起因するようである。Ｖａｑｕｅｒｏらの最近の報告は、アンチセンスのＮｏｘ４オリゴヌクレオチドが膵臓がん細胞におけるアポトーシスを促進することを示しており、これは、逆に言えば、Ｎｏｘ４により生成されたＲＯＳの、膵臓がん細胞におけるアポトーシス保護作用を示唆している（非特許文献３参照）。しかし、細胞生存シグナリングにおいて、Ｎｏｘ４により生成されたＲＯＳの下流の潜在的ターゲットについては殆ど知られていない。最近の研究は、Ｎｏｘ４とＡＫＴ（セリン−スレオニンキナーゼ）との生化学的関連性が示されている。Ｎｏｘ１は、血管平滑筋細胞の過形成の間、アンジオテンシンＩＩで惹起されたＡＫＴ刺激において仲介的役割がある（Ｕｓｈｉｏ−Ｆｕｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。一方、ｍｅｓａｎｇｉａｌ細胞において、Ｎｏｘ４で生成されたＲＯＳは、タンパ���合成に伴うであろうアンジオテンシンＩＩで惹起されたＡＫＴ活性化を仲介する（Ｇｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。Ｎｏｘ４によるＡＫＴの活性化は、インスリンで誘導されるブドウ糖の取り込みに関与し（Ｍａｈａｄｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、また、ウロテンシンＩＩは肺動脈の平滑筋細胞において、Ｎｏｘ４を通じてＡＫＴを活性化する（Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。これらの観察は、Ｎｏｘタンパク質のｒｅｄｏｘ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇによるＡＫＴの制御を示唆しているが、これまでのところ、細胞生存シグナリングにおいて、Ｎｏｘ４によるＡＫＴ調節の役割に向けた研究は、ＡＫＴが抗アポトーシス／細胞生存経路において重要なキー酵素であるにも拘わらず、行なわれていない。【０００５】
【非特許文献１】Ｍｉｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６４，３５８０−３５８５．
【非特許文献２】Ｂｒａｒ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８２，１２１２−１２２４．
【非特許文献３】Ｖａｑｕｅｒｏ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９，３４６４３−３４６５４．
【非特許文献４】Ｂｒａｒ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８５，３５３−３６９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  上で述べたように、ＡＫＴが抗アポトーシス／細胞生存経路において重要なキー酵素であるにも拘わらず、細胞生存シグナリングにおいてＮｏｘ４によるＡＫＴ調節の役割に向けた研究がこれまで殆ど行なわれてこなかった。そこで、これらを解明するべく、本発明者は、膵臓がん細胞の抗アポトーシスシグナリングにおけるＮｏｘ４の役割に焦点を当てて研究を始めた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】〔発明の概要〕
ヒト膵臓がん細胞（培養細胞）を用いて、これに発現するＮｏｘ４の活性を不活化し、ＲＯＳ産生を抑制すると、ＡＫＴ−ＡＳＫ１のキナーゼカスケードシグナリングを介して、アポトーシスが起こることを、本発明者は見出した。このことは、Ｎｏｘ４によって産生されたＲＯＳは、膵臓がん細胞にその生存活性を賦与することを意味している。これらの知見を基に、本発明を完成することができた。【０００８】  すなわち、本発明は、ＡＫＴ／ＡＳＫ１へのシグナル伝達阻害を指標に探索することを特徴とするＮｏｘ４阻害剤・抑制剤のスクリーニング方法、を提供する。
また、本発明は、上記スクリーニング方法を用いて探索したＮｏｘ４阻害剤・抑制剤、すなわち、ＡＫＴ／ＡＳＫ１へのシグナル伝達阻害を指標に探索されたＮｏｘ４阻害剤・抑制剤も提供する。【０００９】  また、本発明は、上記したＮｏｘ４阻害剤・抑制剤を有効成分として含有するがん治療用医薬組成物も提供する。【００１０】  更には、本発明は、Ｎｏｘ４（その全体もしくは部分構造）を検出又は定量できる試薬を用いて、Ｎｏｘ４を検出・定量して判定することを特徴とするがん診断方法、も提供する。
【発明の更に詳しい説明】
【００１１】  本発明を更に詳しく説明する。
本発明のＮｏｘ４阻害剤・抑制剤としては好ましいものの一つは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ４の発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡ（これを原理とするオリゴヌクレオチドを含む）、又はこれらを運ぶ遺伝子ベクターである。
また、本発明のＮｏｘ４阻害剤・抑制剤は、抗Ｎｏｘ４中和抗体、又はその限定分解産物、これらの修飾物、その他天然物を基原とする物質又はその誘導体であってもよい。
【００１２】  本発明のがん診断方法で使用する試薬として好ましいものの一つは、抗Ｎｏｘ４抗体又はその限定分解産物、これらの修飾物を含有する試薬である。
前記試薬として、アプタマー（ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法によって得られる機能性ＲＮＡの総称）あるいはその修飾物を含有する試薬を用いることもできる。
【００１３】  また、本発明に係る治療用医薬組成物若しくは診断方法の好適な対象は、化学療法に対して抵抗性が強く治療が困難な膵臓がんやメラノーマあるいはグリオーマ等である。
【００１４】  なお、本明細書における「略語の意味」は次のとおり。
・Ｎｏｘ４及びＮＯＸ４：通常、ＮＯＸ４はＮＡＤＰＨオキシダーゼファミリー（タンパク質）のうちの一つを意味し、当該タンパク質をコードする遺伝子（活性酸素産生遺伝子）をＮｏｘ４と表す。ただし、両者を区別するのは煩わしいので、本明細書で「Ｎｏｘ４」と書いた場合は、活性酸素産生遺伝子の意味にも、活性酸素産生遺伝子及びＮＡＤＰＨオキシダーゼファミリー（タンパク質）の両者を含む意味にも用いる。
・ＡＫＴ：Ｐｌｅｓｋｓｔｒｉｎ  ＨｏｍｏｌｏｇｙドメインをＮ末に有するセリン／スレオニンキナーゼ（プロテインキナーゼＢともいう）。
・ＡＳＫ１：アポトーシスシグナル制御キナーゼ１
・ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ（短鎖干渉）ＲＮＡ
・ＤＰＩ：ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅ  ｉｏｄｏｎｉｕｍ（フラボタンパク質インヒビター）
・ＰＤＴＣ：Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ（ＳＨ基含有抗酸化剤）
・ＰＡＲＰ：Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
【００１５】〔作用・機作〕
後述するいくつかの実施例／実験例から、本発明者は、Ｎｏｘ４阻害によるアポトーシス誘導のスキーム（モデル）を図９のように考えている。すなわち、Ｎｏｘ４により生成したＲＯＳがＡＫＴのリン酸化を刺激し、生成したもの（リン酸化ＡＫＴ）が今度はＡＳＫ１のＳｅｒ８３上でリン酸化を刺激することによってＡＳＫ１を不活性化し、その結果、抗アポトーシス効果（細胞生存）をもたらすのであろう。逆に、Ｎｏｘ４の阻害は、ＡＫＴ−ＡＳＫ１キナーゼ・カスケードを減弱させ、アポトーシス（細胞死）をもたらすのであろう。
【発明の効果】
【００１６】  これまで、ＲＯＳが、がんの発生、進展に関与することが指摘されてきたが、その分子機構は十分解明されてはいない。本発明者が、ヒト膵臓がん細胞に発現するＮｏｘ４の活性を不活化し、ＲＯＳ産生を抑制すると、ＡＫＴ−ＡＳＫ１のキナーゼカスケードシグナリングを介して、アポトーシスを誘導することを見出したことから、Ｎｏｘ４によって産生されたＲＯＳは、膵臓がん細胞に、細胞生存活性を賦与するという知見を得た。これは、ＲＯＳをｇｅｎｏｔｏｘｉｃなものと観る立場（従来の立場）とは異なり、レドックス制御分子としてのＲＯＳが過剰蓄積すると、増殖、生死の情報伝達を撹乱し、がん化に発展するというユニークな視点に立っているものである。
本発明のスクリーニング方法によれば、多くの候補物質から有効なＮｏｘ４阻害剤・抑制剤を効果的に探索することができる。
本発明のスクリーニング方法で探索されたＮｏｘ４阻害剤・抑制剤は、ＡＫＴ／ＡＳＫ１へのシグナル伝達阻害作用を有するので、Ｎｏｘ４レドックスシグナリング依存的に、生存する膵臓がん（従来は、化学療法に対して抵抗性が強く治療が困難）、メラノーマ、グリオーマ（脳腫瘍）を含むがん組織細胞の増殖を抑えることができると考えられる。
また、膵臓がん、メラノーマ、グリオーマのがん細胞では、Ｎｏｘ４の発現が亢進している（診断マーカーとなりうる）。そのため、本発明のがん診断方法により、膵臓がん、メラノーマ、グリオーマ等の診断に寄与すると考えられる。
【実施例】
【００１７】  以下、実施例（又は実験例）を示しながら、本発明をさらに具体的に説明する。
なお、用いた「材料及び方法」（“Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）は、次のとおり。
＜細胞培養と材料＞
ヒト膵臓アデノカルシノーマ細胞株ＰＡＮＣ−１（適度に分化した株）はＡＴＣＣから得た。細胞は１０％ＦＣＳ添加Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地を用い、５％炭酸ガス雰囲気中、３７℃で培養した。Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ（ＰＤＴＣ）及びｄｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅ  ｉｏｄｏｎｉｕｍ（ＤＰＩ）は、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社から購入し、６−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，５，７，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（水溶性ビタミンＥ類縁体）はＡｌｄｒｉｃｈ社から、Ｒａｂｂｉｔの抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ１（Ｔｈｒ３０８）抗体及びｍｏｕｓｅの抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＳＫ１（Ｓｅｒ８３）抗体はＵＢＩ社から、ｒａｂｂｉｔの抗ＭｎＳＯＤ抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社から購入した。Ｇｏａｔの抗ＡＫＴ抗体、ｒａｂｂｉｔの抗ＡＳＫ１抗体及びｒａｂｂｉｔの抗ＧＳＴ抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚから得た。Ｒａｂｂｉｔの抗Ｎｏｘ４抗体はＤｒ．Ｂ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎから提供された。【００１８】＜ｓｉＲＮＡｓ及びプラスミドの構築＞
ｓｉＮｏｘ４ＲＮＡｓをコードするＤＮＡでループ配列（ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ）をもつｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓは、ＨＩｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒのｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ｈｙｇｒｏ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）の中に、Ｍｉｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４に記載の方法に従って、サブクローンされた。ヒトのＮｏｘ４ｃＤＮＡ配列に従って、デザインしたｓｉＲＮＡｓは、下記の通り。【００１９】  Ｎｏｘ４ＲＮＡｉ−１に対しては、
５’−ＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＡＣＡＴＴＣＣＡＴＡＴＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＴＡＡＴＡＴＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’，
Ｎｏｘ４ＲＮＡｉ−２に対しては、
５’−ＧＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＡＡＴＧＴＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’【００２０】  ユニバーサルｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｉＲＮＡ配列（Ａｍｂｉｏｎにより供給された）を対照に用いた。
ｐｃＤＮＡ３．０−ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＡ）−ｔａｇｇｅｄ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｈｕｍａｎ  ＡＳＫ１（ｐｃＤＮＡ３．０−ＨＡ−ＡＳＫ１）及びｓｅｒｉｎｅ８３−ｔｏ−ａｌａｎｉｎｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ｐｃＤＮＡ３．０−ＨＡ−ＡＳＫ１（ｐｃＤＮＡ３．０−ＨＡ−ＡＳＫ１Ｓｅｒ８３Ａｌａ）はＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１参照。ｐｃＤＮＡ３．０  ｗｔ  ＡＫＴ１及びＡＫＴ１  Ｌｙｓ１７９Ａｌａ  Ｏｇａｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２参照。ＰＨＢＭｎＳＯＤはＨｉｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３参照。【００２１】＜ＲＴ−ＰＣＲ＞
総ＲＮＡｓは、Ｔｒｉｚｏｌ（ＲＯＣＨＥ）により細胞から調製した。ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎはＰｏｗｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ（ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）を用いて行い、ヒトＮｏｘファミリー遺伝子についてのＰＣＲは次のプライマーを用いて行なった。
Ｎｏｘ１に対しては
ｆｏｒｗａｒｄ，５’−ＧＧＡＧＣＡＧＧＡＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＣ−３’及び
ｒｅｖｅｒｓｅ，５’−ＴＴＧＣＴＧＴＣＣＣＡＴＣＣＧＧＴＧＡＧ−３；
Ｎｏｘ２に対しては
ｆｏｒｗａｒｄ，５’−ＧＧＡＧＴＴＴＣＡＡＧＡＴＧＣＧＴＧＧＡＡＡＣＴＡ−３’及び
ｒｅｖｅｒｓｅ，５’−ＧＣＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＧＣＴ−３’；
Ｎｏｘ３に対しては
ｆｏｒｗａｒｄ，５’−ＧＧＡＴＣＧＧＡＧＴＣＡＣＴＣＣＣＴＴＣＧＣＴＧ−３’及び
ｒｅｖｅｒｓｅ，５’−ＡＴＧＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＴＧＡ−３’；
Ｎｏｘ４に対しては
ｆｏｒｗａｒｄ，５’−ＣＴＣＡＧＣＧＧＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧＣＴＧＴＧ−３’及び
ｒｅｖｅｒｓｅ，５’−ＡＧＡＧＧＡＡＣＡＣＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＴＴＡＧ−３’；
Ｎｏｘ５に対しては
ｆｏｒｗａｒｄ，５’−ＡＴＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣ−３’及び
ｒｅｖｅｒｓｅ，５’−ＣＴＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＴＣＧＡＣＡＧＣ−３’．【００２２】＜トランスフェクション及びイムノブロッティング＞
細胞の感染は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使い、同社のプロトコールに従い、そこに示された発現ベクターを用い行なった。
イムノブロッティングでは、細胞を抽出緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，２０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％ＮＰ−４０，１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）］（図５の場合）又はＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，４ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  ＮａＦ，１ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ，１０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）（図２Ｂ，図６，図７及び図８の場合）中で溶解させ、１０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ、遠心沈殿したのち、抽出されたタンパク質をＳＤＳに溶かしｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ電気泳動させた。分離されたタンパク質は、適当な抗体と反応させ、タンパク質バンドをＥＣＬ又はＥＣＬＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって可視化した（Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。【００２３】＜細胞の生存率＞
生細胞の数は、ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ染色によって求めた。また、別の方法として、３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（０．１μＣｉ：Ａｍｅｒｓｈａｍ）の細胞への取込みも用いた３Ｈ（トリチウム）で標識された細胞は、冷１０％ＴＣＡで１０分間遠心し、ＴＣＡ不溶物をろ過によりニトロセルロース膜に保持させ、シンチレーションカウンターでその放射能を測定した。【００２４】＜Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）開裂分析＞
抽出したタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに掛け、その後、ｒａｂｂｉｔの抗ＰＡＲＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いてイムノブロッティングした。【００２５】＜ＪＮＫ活性の分析＞
ＪＮＫ活性の測定は、ＪＮＫ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて行なった。【００２６】＜アポトーシスの分析＞
カバースリップの上に細胞を置き、上で述べたようにＤＰＩ処理を行い、又はｓｉＮｏｘ４ＲＮＡｓ及びＡＳＫ１Ｓｅｒ８３Ａｌａ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）で感染させた。二重鎖ＤＮＡ破片をＡｐｏｐＴａｑＲ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）を用いて検出した。また、ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎをＣｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて測定した。【００２７】＜細胞内のＲＯＳレベルの測定＞
細胞（５×１０６）を２日間の培養した後に、１０μＭＤＰＩ処理を７２ｈ行なった。あるいはまた、細胞をｓｉＮｏｘ４ＲＮＡｓで感染させ、７２ｈ培養した。その後、細胞を１０μＭの２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦＨ−ＤＡ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）と共に３７℃で３０分間、インキュベートし、トリプシン処理で集めＨＡＮＫ’ｓ緩衝液で洗浄し、１％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定した。蛍光強度はＦＡＣＳ（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４８８ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ：５８０ｎｍ）を用いて測定した。ヒストグラムは、ソフトウェア・プログラムＢＤ  ＦＡＣＳｔａｔｉｏｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。【００２８】例１  ＰＡＮＣ−１細胞の生存に及ぼす抗酸化剤及びＤＰＩの影響
ＰＡＮＣ−１細胞の生存に及ぼす抗酸化剤及びＤＰＩの影響を調べるため、ＰＡＮＣ−１細胞（１０４）を、ビタミンＥ（３ｍＭ）、ＰＤＴＣ（７０μＭ）、及びＤＰＩ（１０μＭ）の存在又は非存在のもとに培養し、所定の時刻に生細胞数を測定した。細胞をトリプシン処理し、生細胞数をトリパンブルー染色で測定した。結果を図１（Ａ）に示した。データは平均値±標準誤差（ｎ＝３）で示す。
また、ＰＡＮＣ−１細胞（２×１０３）を、ビタミンＥ（３ｍＭ）、ＰＤＴＣ（７０μＭ）、及びＤＰＩ（１０μＭ）の存在又は非存在のもとに培養し、所定の時刻にラジオアイソトープ取込みを測定した。トリクロル酢酸（ＴＣＡ）不溶性物質に取り込まれた放射能の量を、“Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”に述べた方法で測定した。結果を図１（Ｂ）に示した。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）を表す。【００２９】例２  Ｎｏｘ４  ｓｉＲＮＡｓによるＮｏｘ４発現の阻害
Ｎｏｘ４  ｓｉＲＮＡｓによるＮｏｘ４発現の阻害をみるため、次の実験を行なった。
ＰＡＮＣ−１細胞（５×１０６）を、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ（ごちゃ混ぜの）ＲＮＡｉ，Ｎｏｘ４ＲＮＡｉ−１及びＮｏｘ４ＲＮＡｉ−２をもつｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクター５μｇによって感染させた。エンドジーナスなＮｏｘ４  ｍＲＮＡｓのレベルを、ＥＦＩ−αｍＲＮＡを対照として、感染後の７２ｈのＲＴ−ＰＣＲで調べた。結果を図２（Ａ）に示した。
また、細胞溶解液は、感染後７２ｈの感染細胞から調製し、エンドジーナスなＮｏｘ４タンパク質は、抗Ｎｏｘ４抗体（上のパネル）又は抗β−アクチン抗体（下のパネル）を用いるイムノブロッティングによって測定した。結果を図２（Ｂ）に示した。
エンドジーナスなＮｏｘ４  ｍＲＮＡｓの発現が各々のｓｉＲＮＡによって阻害されていることが分かる。【００３０】例３  ＤＰＩ又はＮｏｘ４  ｓｉＲＮＡによるＲＯＳ産生の阻害
ＤＰＩ又はＮｏｘ４  ｓｉＲＮＡによるＲＯＳ産生の阻害を調べるため、次の実験を行なった。
ＰＡＮＣ−１細胞（１０７）を７２ｈ培養し、ＤＰＩ（１０μＭ）添加又は無添加で２ｈ処理した（図３下段（Ａ））。また、細胞はｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ＲＮＡｉ又はＮｏｘ４ＲＮＡｉ−１及びＮｏｘ４ＲＮＡｉ−２を運ぶベクターの５μｇで感染させた（図３下段（Ｂ））。細胞は酸化にｓｅｎｓｉｔｉｖｅなＤＣＦＨ−ＤＡ（蛍光物質）で標識され、細胞内のＲＯＳレベルの変化は、ＦＡＣＳ分析で行なった。典型的なＦＡＣＳ分析のプロフィールは、図３上段（Ａ）に示す。なお、ヒストグラムにおけるＤＣＦ蛍光はＤＰＩ非処理細胞又はｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ＲＮＡｉベクター感染細胞の間で正規化されており、データは平均値±標準誤差（ｎ＝３）を表す。
ＲＯＳは自発的に産生され、これはＤＰＩの添加によって阻害されることが分かる。また、細胞へのＮｏｘ４ＲＮＡｉ−１及びＮｏｘ４ＲＮＡｉ−２感染によってもＲＯＳ産生が阻害されているが、その阻害の程度は部分的であることも分かる。【００３１】例４  ＰＡＮＣ−１細胞におけるＮｏｘファミリータンパク質ｍＲＮＡの発現
総ＲＮＡはＰＡＮＣ−１細胞から抽出し、Ｎｏｘ１ファミリータンパク類のｍＲＮＡ発現が、ＲＴ−ＰＣＲによるＥＦ１α発現を（“Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”に述べたように）内部標準として、分析された。結果を図４に示した。ＰＡＮＣ−１細胞では、Ｎｏｘ４及びＮｏｘ５  ｍＲＮＡは発現されているが、Ｎｏｘ１、Ｎｏｘ２及びＮｏｘ３は殆ど発現されていない。【００３２】例５  ＤＰＩ及びｓｉＮｏｘ４ＲＮＡｓによる、ＰＡＮＣ−１細胞のアポトーシス（細胞死）の誘導
ＤＰＩ及びｓｉＮｏｘ４ＲＮＡｓによる、ＰＡＮＣ−１細胞のアポトーシス（細胞死）の誘導を調べるために、次の実験を行なった。ＰＡＮＣ−１細胞（１０４）を４８ｈ培養し、ＤＰＩ（１０μＭ）存在下に２４ｈ処理した。また、細胞を、ｓｃｒａｍｂｌｅｄＲＮＡｉ又はＮｏｘ４ＲＮＡｉ−１及びＮｏｘ４ＲＮＡｉ−２を運ぶベクターの２μｇで感染させ、次いで“Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”に述べたようにＴＵＮＥＬ分析した。矢印の頭はアポトーシスを起こした細胞を示す（図５Ａ）。アポトーシスを起こした細胞数（％）をグラフにしたものが図５Ｂである（データは平均値±標準誤差（ｎ＝３）を表す）。
ＰＡＮＣ−１細胞（１０２）を９６穴プレートに接種し、次いでＤＰＩ（１０μＭ）存在下に２４ｈ処理し、あるいは、上で述べたようにして、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ＲＮＡｉ又はＮｏｘ４ＲＮＡｉ−１及びＮｏｘ４ＲＮＡｉ−２の０．２５μｇで感染させた。ヌクレオソーム間のＤＮＡ断片化を“Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”に述べたように測定した。４５０ｎｍの吸収はＤＰＩ非処理細胞又はｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ＲＮＡｉ感染細胞の間で各々正規化した。対照に対するＤＮＡ断片化の比をグラフにしたものが図５Ｃである（データは平均値±標準誤差（ｎ＝３）を表す）。
ＰＡＮＣ−１細胞をＭｎＳＯＤ（ＰＨＢ−ＭｎＳＯＤ）及び対照ベクター（Ｈｉｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）の０．２５μｇで感染させ、７２ｈ培養した。ＤＮＡ断片化は“Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”に述べたように測定した。感染したＭｎＳＯＤの発現レベルは、抗ＭｎＳＯＤ抗体を用いるイムノブロッティングにより調べた。対照に対するＤＮＡ断片化の比をグラフにしたものが図５Ｄである
図５Ａ及び図５Ｂの結果は、ＤＰＩ（２４ｈ）処理により、アポトーシスを引き起こす細胞の数が増えることを示しており、このことは生じたＲＯＳがＮＯＤ様酵素によって消費されることがアポトーシス誘導に必須的であることを示唆している。また、細胞へのＮｏｘ４ＲＮＡｓの感染は、アポトーシス誘導を有意に高めたことを示している。ヌクレオソーム間のＤＮＡ断片化分析の結果（図５Ｃ）も、Ｎｏｘ４ＲＮＡｓ及びＤＰＩ処理により細胞死が誘導されることを示している。更にマンガンＳＯＤの過発現も細胞死が誘導されることを示している（図５Ｄ）。【００３３】例６  ＤＰＩ処理によるＰＡＲＰ開裂の誘導と、ｓｉＮｏｘ４ＲＮＡによるＪＮＫ活性の増幅
ＤＰＩ処理がＰＡＲＰ開裂（アポトーシスの一つの指標）を引き起こすか調べるために、次の実験を行なった。ＰＡＮＣ−１細胞（１０６）を、１０μＭのＤＰＩ添加又は添加なしで、図表に示した間隔で処理した。細胞溶解液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理して調製した。タンパクの存在は、抗ＰＡＲＰ抗体で調べた。ｔｒｕｎｃａｔｅｄ型とｉｎｔａｃｔ（完全）型との比率はデンシトメータの強度で求めた。その結果を図６Ａの写真（上段）及びグラフ（中段）に示す（データは平均値±標準誤差（ｎ＝３）で表した）。
また、ｓｉＮｏｘ４ＲＮＡがＪＮＫ活性（細胞死シグナリングを調節するもの）を増幅するか調べるために、次の実験を行なった。ＰＡＮＣ−１細胞（１０６）を、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ＲＮＡｉ又はＮｏｘ４ＲＮＡｉ−１及びＮｏｘ４ＲＮＡｉ−２を運ぶｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクターの５μｇで感染させた。その７２ｈ後に、細胞を集め、“Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”に述べたようにして、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃ−Ｊｕｎ抗体を用いＪＮＫ活性を測定した。等量の負荷を確保するために、ＧＳＴ−Ｃ−Ｊｕｎは抗ＧＳＴ抗体を用いイムノブロットした。その結果を図６Ｂの写真に示す。
図６Ａ及び図６Ｂの結果から、Ｎｏｘ４は抗アポトーシス作用を発揮していることを示している。【００３４】例７  ＤＰＩ及びｓｉＮｏｘ４ＲＮＡｓによるＡＫＴ及びＡＳＫ１リン酸化の阻害
ＤＰＩ及びｓｉＮｏｘ４ＲＮＡｓがＡＫＴ及びＡＳＫ１のリン酸化を阻害することを示すため、次の実験を行なった。ＰＡＮＣ−１細胞（５×１０６）を、１０μＭのＤＰＩ添加で２４ｈ培養した。細胞溶解液を調製し、その抽出液は抗フォスフォＡＫＴ抗体を用いて免疫沈降させたものが、図７Ａであり、抗フォスフォＡＳＫ１（Ｓｅｒ−８３）抗体を用いて免疫沈降させたものが図７Ｂで、その免疫沈降物についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、各々、抗体でイムノブロットして分析した。ＰＡＮＣ−１細胞をｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ＲＮＡｉ，Ｎｏｘ４ＲＮＡｉ−１及びＮｏｘ４ＲＮＡｉ−２を運ぶベクター５μｇで感染させた。その４８ｈ後に、細胞溶解液を調製し、免疫沈降させ、引き続いて抗フォスフォＡＫＴ抗体を用いてイムノブロットし（図７Ｃ）、あるいは、抗フォスフォＡＳＫ１（Ｓｅｒ−８３）抗体を用いてイムノブロットした（図７Ｄ）。免疫沈降したＡＫＴ及びＡＳＫ１の量は、ＡＫＴ及びＡＳＫ１の各々の抗体を用いたイムノブロットにより調べた。図７Ｅは対照実験で、ＰＡＮＣ−１細胞（５×１０６）を、ｐｃＤＮＡ３．０ｗｔＡＫＴ１又はＡＫＴ１Ｌｙｓ１７９Ａｌａの５μｇで感染させ、細胞溶解液をＲＩＰＡ緩衝液中で調製し、抗フォスフォＡｓＫ１（ｓｅｒ−８３）抗体を用いてイムノブロットしたものである。ｗｔＡＫＴ１又はＡＫＴ１Ｌｙｓ１７９Ａｌａで感染したものの発現は、抗ＡＫＴ抗体を用いたイムノブロットにより調べた。
ＤＰＩの添加は、ＡＫＴタンパク質の発現には影響を及ぼさないが、ＡＫＴタンパク質のリン酸化を強く阻害した（図７Ａ）。また、ＤＰＩの添加は、Ａｓｋ１タンパク質（ストレス応答のアポトーシスにおける鍵酵素）のリン酸化も強く阻害した（図７Ｂ）。また、ｓｉＮｏｘ４ＲＮＡ−１及びｓｉＮｏｘ４ＲＮＡ−２によるエンドジーニアスなＮｏｘ４活性の減少も各々、Ａｓｋ１タンパク質のリン酸化も強く阻害した（図７Ｃ，Ｄ）ことが分かる。【００３５】例８  ＡＳＫ１  Ｓｅｒ８３ＡｌａミュータントとＰＡＮＣ−１細胞におけるアポトーシスの誘導
ＡＳＫ１Ｓｅｒ８３ＡｌａミュータントのみがＰＡＮＣ−１細胞のアポトーシスを誘導するかどうかを調べるため、次の実験を行なった。
ＰＡＮＣ−１細胞（１０４）を、ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ，ｗｔ  ＡＳＫ１及びＡＳＫ１  Ｓｅｒ８３Ａｌａ  ｍｕｔａｎｔの２μｇで感染させた。これら細胞には、感染４８ｈ後に１０μＭ  ＤＰＩを含む培地を再供給し、更に２４ｈ培養した。次いで、細胞の生存率をＴＵＮＥＬ分析によって求めた。結果をグラフに示したものが図８Ａである。データは平均値±標準誤差（ｎ＝３）。
また、上記細胞を、ｗｔＡＳＫ１，ＡＳＫ１Ｓｅｒ８３Ａｌａ，ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ＲＮＡｉ及びｓｉＮｏｘ４ＲＮＡｉ−２を各々組み合わせて（組合せは図中に示す）感染させたときのものである。細胞の生存率は感染後７２ｈのＤＮＡ断片化（“Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”参照）によって求めた。結果をグラフに示したものが図８Ｂである。データは実験例５（図５）と同様に正規化してあり、平均値±標準誤差（ｎ＝３）で表している。
以上の結果は、ＤＰＩもｓｉＮｏｘ４ＲＮＡもいずれもＡＫＴのリン酸化を阻害したことを示し、また、ＰＡＮＣ−１細胞で、ＡＳＫ１のＳｅｒ−８３上でのＡＫＴリン酸化を阻害したことを示した。更には、ＡＫＴリン酸化能を欠除させたＡＳＫ１ミュータントの導入だけが、誘導アポトーシスにおいて、ＤＰＩ又はｓｉＮｏｘ４ＲＮＡの代替になり得た。これらのデータは、ＡＫＴ−ＡＳＫ１リン酸化シグナリングの阻害が細胞死をもたらすことを示している。このように、ＡＫＴ−ＡＳＫ１リン酸化カスケードは、Ｎｏｘ４依存性の細胞生存シグナリングに重要な役割を果たしているようである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＰＡＮＣ−１細胞の生存に及ぼす抗酸化剤及びＤＰＩの影響をみたグラフ。
【図２】Ｎｏｘ４  ｓｉＲＮＡｓによるＮｏｘ４発現の阻害を示す図（写真）。
【図３】ＤＰＩ又はＮｏｘ４  ｓｉＲＮＡによるＲＯＳ産生の阻害を示す図。
【図４】ＰＡＮＣ−１細胞におけるＮｏｘファミリータンパク質ｍＲＮＡの発現を示す図（写真）。
【図５】ＤＰＩ及びｓｉＮｏｘ４ＲＮＡｓがＰＡＮＣ−１細胞のアポトーシス（細胞死）を引き起こすことを示す図（写真）やグラフ。
【図６】ＤＰＩ処理はＰＡＲＰ開裂を引き起こし、ｓｉＮｏｘ４ＲＮＡはＪＮＫ活性の増幅を起こすことを示す図（写真）やグラフ。
【図７】ＤＰＩ及びｓｉＮｏｘ４ＲＮＡｓはＡＫＴ及びＡＳＫ１リン酸化を阻害することを示す図（写真）。
【図８】ＡＳＫ１Ｓｅｒ８３ＡｌａミュータントのみがＰＡＮＣ−１細胞でのアポトーシスを引き起こすことを示すもの。
【図９】Ｎｏｘ４阻害によるアポトーシス誘導のスキーム（モデル）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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