(57)【要約】      （修正有）【課題】微量検体から迅速且つ正確にＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の変異を検出することによってゲフィチニブ等のＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を迅速且つ正確に予測する技術を提供すること。【解決手段】特定の配列のプライマーセットを使用して、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によるＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の変異の検出を行うことにより、１００％又はそれに近い精度で、該遺伝子の変異の有無を検出し、その遺伝子変異の検出の有無に基づいてゲフィチニブの抗腫瘍効果を予測する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含有する、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性の予測診断方法：
(1)非小細胞肺癌患者から採取した肺癌組織片に含まれる上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の部分配列の内の少なくとも１種の配列を、下記(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも１種のプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅させる工程、
(a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット
(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット
(c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'のプライマーセット
(d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'のプライマーセット
(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'のプライマーセット
(2)増幅産物をＳＳＣＰ法により分析し、上記部分配列中の変異の有無を確認する工程、及び
(3)変異の有無に基づいて、上記患者に対する上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性を予測する工程。
【請求項２】
工程(1)において、(a)又は(b)のプライマーセット、(c)のプライマーセット、及び(d)又は(e)のプライマーセットを用いて、上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の部分配列をＰＣＲ法によりそれぞれ増幅させる、請求項１に記載の予測診断方法。
【請求項３】
工程(1)において、(a)のプライマーセット、(c)のプライマーセット、及び(e)のプライマーセットを用いて、上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の部分配列をＰＣＲ法によりそれぞれ増幅させる、請求項１又は２に記載の予測診断方法。
【請求項４】
肺癌患者から採取した肺癌組織片が、ホルマリン固定されたものである、請求項１乃至３のいずれかに記載の予測診断方法。
【請求項５】
上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤がゲフィチニブである、請求項１乃至４のいずれかに記載の予測診断方法。
【請求項６】
下記(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも１種のプライマーセットを含有する、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を予測するためのキット：
(a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット、
(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット、
(c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'のプライマーセット、
(d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'のプライマーセット、及び
(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'のプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲフィチニブ等の上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による抗腫瘍効果を迅速且つ正確に予測する方法に関する。また、本発明は、該予測診断方法を実施するために使用されるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮増殖因子受容体（以下、ＥＧＦＲと表記する）のチロシンキナーゼを阻害する薬剤は、非小細胞肺癌に対して抗腫瘍作用を効果的に発揮できることが分かっている。ＥＧＦＲを標的とした抗腫瘍剤であるゲフィチニブは、従来の化学療法が無効である非小細胞肺癌に対して、高い抗腫瘍効果が期待される薬剤として、２００２年から日本国内で市販されている。ゲフィチニブの投与は、非小細胞肺癌の１０〜３０％の患者に対しては有効であるものの、他の患者には抗腫瘍効果を示さないだけでなく、７％程度の患者には急性肺障害等の致死的副作用が引き起こされることが分かっている。そのため、ゲフィチニブ等のＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤の投与に先立って、該薬剤の抗腫瘍効果を正確に予測することにより、抗腫瘍効果が期待される患者を正確に選択することが重要とされている。
【０００３】
これまでに、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９又は２１に変異が認められる場合には、ゲフィチニブがその非小細胞肺癌に対して有効な抗腫瘍作用を発揮できることが明らかにされている。しかしながら、ＥＧＦＲの遺伝子変異の確認には、従来、その遺伝子配列の同定が必要とされており、この方法では(1)変異同定に時間がかかる、(2)微量検体からの検出が困難、(3)凍結標本が必要であり、遺伝子が断片化されているホルマリン固定検体を使用できない、(4)高い純度の検体が必要である等の問題点があった。このような従来技術を背景として、微量検体から迅速且つ正確にＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の遺伝子変異を検出する技術の確立が望まれていた。
【０００４】
従来、微量の検体から迅速に遺伝子上の配列異常を検出する方法として、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法が知られている。このＰＣＲ−ＳＳＣＰ法では、一般に遺伝子変異の検出率は８０〜９０％程度であることが知られている（例えば、非特許文献1参照）。しかしながら、ゲフィチニブの抗腫瘍効果が期待される患者を正確に選択するためには、１００％又はそれに近い検出率でＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の遺伝子変異を検出することが求められており、従来のＰＣＲ−ＳＳＣＰ法の精度では、臨床的応用の観点から満足できるものではなかった。
【非特許文献１】須貝幸子、「がんの遺伝子診断」、都臨技会誌、Vol.31、No.1、p.12-16
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上記従来技術の課題を解決することである。詳細には、本発明は、微量検体から迅速且つ正確にＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の変異を検出することによってゲフィチニブ等のＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を迅速且つ正確に予測する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によるＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の変異の検出に特に適したプライマーを見出した。そして、該プライマーを用いてＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を行うことにより、検体としてホルマリン固定検体を使用しても、１００％又はそれに近い検出率でＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の遺伝子変異を検出でき、その遺伝子変異の検出の有無に基づいてゲフィチニブの抗腫瘍効果を迅速且つ正確に予測できることを確認した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることによって完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明は、下記に掲げる発明である：
項１．  下記工程を含有する、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性の予測診断方法：
(1)非小細胞肺癌患者から採取した肺癌組織片に含まれる上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の部分配列の内の少なくとも１種の配列を、下記(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも１種のプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅させる工程、
(a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット
(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット
(c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'のプライマーセット
(d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'のプライマーセット
(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'のプライマーセット
(2)増幅産物をＳＳＣＰ法により分析し、上記部分配列中の変異の有無を確認する工程、及び
(3)変異の有無に基づいて、上記患者に対する上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性を予測する工程。
項２．  工程(1)において、(a)又は(b)のプライマーセット、(c)のプライマーセット、及び(d)又は(e)のプライマーセットを用いて、上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の部分配列をＰＣＲ法によりそれぞれ増幅させる、項１に記載の予測診断方法。
項３．  工程(1)において、(a)のプライマーセット、(c)のプライマーセット、及び(e)のプライマーセットを用いて、上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の部分配列をＰＣＲ法によりそれぞれ増幅させる、項１又は２に記載の予測診断方法。
項４．  肺癌患者から採取した肺癌組織片が、ホルマリン固定されたものである、項１乃至３のいずれかに記載の予測診断方法。
項５．  上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤がゲフィチニブである、項１乃至４のいずれかに記載の予測診断方法。
項６．  下記(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも１種のプライマーセットを含有する、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を予測するためのキット：
(a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット、
(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'のプライマーセット、
(c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'のプライマーセット、
(d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'のプライマーセット、及び
(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'のプライマーセット。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）抗腫瘍効果の有効性の予測診断方法
本発明は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤の非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を予測診断する方法である。ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤とは、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼの活性を阻害する分子標的抗癌剤のことである。該チロシンキナーゼ阻害剤としては、特に制限されないが、例えばゲフィチニブやエロチニブ等が例示される。特に、ゲフィチニブは、他の治療法で効果がなかった進行性非小細胞肺癌の治療に使用されている分子標的抗癌剤であり、本発明の方法は、ゲフィチニブの非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性の予測に好適に使用される。ゲフィチニブは、アストラゼネカ社により商品名「イレッサ」として市販されている。
【０００９】
本発明において、抗腫瘍効果の有効性が判断される癌は非小細胞肺癌であるが、好ましくは進行性の非小細胞肺癌である。
以下、本発明の方法を工程毎に説明する。
工程(1)
本発明の方法では、まず、非小細胞肺癌患者から採取した肺癌組織片に含まれる上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の部分配列の内の少なくとも１種の配列を、特定のプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅させる（工程(1)）。
【００１０】
非小細胞肺癌患者から肺癌組織片を採取する方法としては、特に制限されないが、例えば、気管支鏡下生検や経皮生検等の臨床学的に通常実施されている方法が例示される。なお、該肺癌組織片は、癌細胞と正常細胞が混在するものであってもよい。採取された肺癌組織片は、そのまま本工程(1)において使用してもよいが、ホルマリン固定したものや凍結保存したものを使用してもよい。特に、ホルマリン固定した肺癌組織片は、過去に採取したものを使用できるという点で利点がある。
【００１１】
本工程では、まず、肺癌組織片に対してＤＮＡ抽出処理を行い、肺癌組織片由来のゲノムＤＮＡを調製する。ＤＮＡの抽出処理は、本発明の技術分野において周知の方法で実施できる。簡便には、Fast DNA kit(Qbiogene Inc.製)等の市販のＤＮＡ抽出キットを利用することもできる。
【００１２】
本工程では、極めて微量のＤＮＡであっても、目的の部分配列を増幅できる。例えば、１００万個の正常遺伝子に１個の異常遺伝子が混入していても、該異常遺伝子を増幅し、これを検出することが可能である。
【００１３】
得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、下記(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも１種のプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法によりＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の部分配列の内の少なくとも１種の配列を増幅させる。
(a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'（配列番号１）及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'（配列番号２）のプライマーセット
(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'（配列番号３）及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'（配列番号２）のプライマーセット
(c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'（配列番号４）及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'（配列番号５）のプライマーセット
(d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'（配列番号６）及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'（配列番号７）のプライマーセット
(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'（配列番号６）及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'（配列番号８）のプライマーセット
上記(a)のプライマーセットにより正常ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８の部分配列（２１９ｂｐ）を増幅することができる。また、(b)のプライマーセットにより正常ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８の部分配列（１６９ｂｐ）を増幅することができる。(c)のプライマーセットにより正常ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９の部分配列（２３９ｂｐ）を増幅することができる。(d)のプライマーセットにより正常ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１の部分配列（２２２ｂｐ）を増幅することができる。また、(e)のプライマーセットにより正常ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１の部分配列（１５４ｂｐ）を増幅することができる。
【００１４】
即ち、エクソン１８の変異の検出には(a)又は(b)のプライマーセットが使用され、エクソン１９の変異の検出には(c)のプライマーセットが使用され、エクソン２１の変異の検出には(d)又は(エ)のプライマーセットが使用される。
【００１５】
本発明の方法において、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤の非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を高い精度で判定するためには、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の全てにおいて変異の有無を確認しておくことが望ましい。故に、本工程において、(a)又は(b)のプライマーセット、(c)のプライマーセッ、ト及び(d)又は(e)のプライマーセットをそれぞれ用いて、上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の部分配列をＰＣＲ法によりそれぞれ増幅させることが望ましい。特に、より一層高い精度で変異の有無を確認するためには、(a)のプライマーセット、(c)のプライマーセット及び(e)のプライマーセットをそれぞれ用いて、上皮増殖因子受容体遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の部分配列をＰＣＲ法によりそれぞれ増幅させることが望ましい。
【００１６】
ＰＣＲ条件についても特に限定されず、使用する装置等に応じて適宜設定することができる。ＰＣＲにおいては、ＤＮＡ鎖の熱変性、プライマーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の合成からなる一つのサイクルが、例えば、１０〜５０回、好ましくは２０〜４０回繰り返して行われる。
【００１７】
工程(2)
次いで、上記工程(1)で得られた増幅産物をＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法）により分析し、上記部分配列中の変異の有無の確認を行う（工程(2)）。
【００１８】
変異の有無については、肺癌組織片由来のＥＧＦＲ遺伝子から得られる増幅産物における電気泳動の移動度を、正常ＥＧＦＲ遺伝子を鋳型として得られる増幅産物における電気泳動の移動度と対比することにより確認される。なお、電気泳動された増幅産物のバンドの可視化は、当業界で公知の方法に従って行うことができる。
【００１９】
工程(2)におけるＳＳＣＰの条件としては、上記工程(1)で得られた増幅産物中の変異の有無の識別が可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、ＳＳＣＰ条件として、下記条件が例示される。
温度条件：通常４〜２５℃、好ましくは１０〜２０℃
ゲル濃度：通常１０〜１５重量％
電気泳動条件：通常１０〜２０Ｗ
電気泳動時間：通常６０〜１８０分間、好ましくは６０〜９０分間
このようなＳＳＣＰ条件下で実施することにより、増幅産物中の変異の有無を一層明確に識別することが可能になる。
【００２０】
工程(3)
次いで、上記工程(2)で確認された変異の有無に基づいて、該肺癌患者に対するゲフィチニブの抗腫瘍効果の有効性を予測する（工程(3)）。
【００２１】
ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９又は２１において遺伝子変異が存在している場合、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤は、非小細胞肺癌に対して有効に抗腫瘍作用を発揮することが分かっている。
【００２２】
(a)又は(b)のプライマーセットを使用することにより検出された変異は、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８上の変異に相当している。また、(C)のプライマーセットを使用することにより検出された変異は、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９上の変異に相当している。更に、(d)又は(e)のプライマーセットを使用することにより検出された変異は、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１上の変異に相当している。
【００２３】
故に、(a)〜(e)のプライマーセットのいずれかを使用し、変異が認められた場合、その肺癌患者に対しては、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤の投与が有効であると予測される。一方、(a)又は(b)のプライマーセット、(C)のプライマーセット、及び(d)又は(e)のプライマーセットをそれぞれ使用し、いずれにおいても変異が認められなかった場合、その肺癌患者に対しては、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤を投与しても抗腫瘍効果が得られない可能性が高いと予測される。
【００２４】
２．キット及びプライマーセット
前述するように、(a)〜(e)のプライマーセットは、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤の非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を予測する方法に使用されるものである。従って、本発明は、更に、(a)〜(e)のプライマーセットから選ばれる少なくとも１種のプライマーセットを含有する、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍効果の有効性を予測するためのキットを提供する。該キットには、ＰＣＲに必要な試薬やＳＳＣＰ法に必要な試薬が含まれていてもよい。
【００２５】
また、前述するように、(a)及び(b)のプライマーセットは、ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１８の変異をＰＣＲ−ＳＳＣＰ法により検出するのに特に適している。また、(c)のプライマーセットは、ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９の変異をＰＣＲ−ＳＳＣＰ法により検出するのに特に適している。更に、(ｄ)及び(e)のプライマーセットは、ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン２１の変異をＰＣＲ−ＳＳＣＰ法により検出するのに特に適している。従って、本発明は、更に下記（１）〜（３）の発明を提供する：
（１）  (a)5'-AGGTGACCCTTGTCTCTGTG-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'、又は(b)5'-TACACCCAGTGGAGAAGCTCC-3'及び5'-CCCCACCAGACCATGAGAG-3'からなる、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１８の変異を検出するためのプライマーセット。
（２）  (c)5'-CAATTGCCAGTTAACGTCTTCC-3'及び5'-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAG-3'からなる、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９の変異を検出するためのプライマーセット。
（３）  (d)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-AACAATACAGCTAGTGGGAAGG-3'、又は(e)5'-CTTGGAGGACCGTCGCTT-3'及び5'-CCTCCTTACTTTGCCTCCTTC-3'からなる、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＥＧＦＲ遺伝子のエキソン２１の変異を検出するためのプライマーセット。
【発明の効果】
【００２６】
本発明では、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法において使用するプライマーが、通常のＰＣＲ−ＳＳＣＰ法では不可能とれている１００％又はそれに近い精度で、ＥＧＦＲ遺伝子変異を検出できるように設計されているため、極めて高い精度で、非小細胞肺癌患者に対するＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性を予測することが可能である。
【００２７】
また、本発明によれば、生検検体、気管支洗浄液や喀痰等の微量検体から正確にＥＧＦＲ遺伝子変異を検出できるという利点に加えて、ホルマリン固定標本を検体として使用することもできるので、過去に採取した検体を用いてＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性を予測することが可能となり、患者の肉体的負担が軽減されるという利点も得られる。即ち、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤投与の対象となる患者の多くは末期癌状態であり、EGFRの遺伝子変異を検索するために新たに検体を採取することが困難なことが多く、このような場合に過去に採取した検体を用いてＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤の効果を予測しうる本診断法は多くの癌患者にとって福音となる。
【００２８】
更に、本発明によれば、僅か数時間でＥＧＦＲ遺伝子変異を検出することが可能であり、極めて迅速にＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の有効性を予測することが可能になる。
【００２９】
例えば、本発明によれば、ゲフィチニブの抗腫瘍効果を投与前に予測することが可能になり、ゲフィチニブの有効性が期待される患者には早期からゲフィチニブを投与することにより臨床的メリットが得られる。また、ゲフィチニブの有効性が期待できない患者には、無駄なゲフィチニブ投与による経済的負担を軽減できると共に致死的副作用である急性肺疾患のリスクから回避することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例１
１．ゲノムＤＮＡの調製
本試験は、ＥＧＦＲのエクソン１８、１９及び２１における遺伝子変異の有無が確認されている非小細胞肺癌患者から採取した肺癌組織片の凍結標本１１２例を使用して行った。なお、凍結標本１１２例の内、２例はエクソン１８に変異があり、２５例はエクソン１９に変異があり、１６例はエクソン２１に変異があり、７９例は変異が無いことが確認されている。上記凍結標本から、Fast DNA kit(Qbiogene Inc.製)を用いてゲノムＤＮＡを調製した。
【００３１】
２．ＰＣＲ
得られた大腸癌組織片由来のゲノムＤＮＡ、及び表１に示す５つのプライマーセットを用いて、ＰＣＲによりＥＧＦＲのエクソン１８、１９及び２１の部分配列を増幅した。ＰＣＲ条件は、表１に示す通りである。
【００３２】
【表１】
2008005701.tif 000002
【００３３】
３．ＳＳＣＰ解析
GenePhor System(Amersham Bioscience製)を用いてＳＳＣＰによる分析を行った。上記で得られたＰＣＲ増幅産物のそれぞれを、１２．５％アクリルアミドからなるゲル（高さ１２３ｍｍ×幅１１０ｍｍ×厚さ０．５ｍｍ）にアプライした。電気泳動はゲルと同一の緩衝液系で表１に示す条件で実施した。電気泳動後、DNA Sliver Staining Kit(Amersham Bioscience製)を用いてゲルを染色した。健常肺組織片（Wildタイプ）から得られる泳動パターンと比較することにより、肺癌組織片由来のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９及び２１における変異の有無を確認した。
【００３４】
この結果、１１２例の全てにおいて、ＳＳＣＰ解析により確認されたＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無の判定結果は、従来法の遺伝子配列を同定する方法により得られている結果と同一であった。
【００３５】
本実施例において(a)又は(b)のプライマーセットを使用した場合に得られた結果（電気泳動図）の一例を図１に示す。図１の電気泳動写真において、レーン１、２、４及び５は変異がないＥＧＦＲ遺伝子を有する肺癌組織片；及びレーン３はＥＧＦＲ遺伝子の第2155位のＧがＡに置換されている肺癌組織片について試験した結果である。
【００３６】
本実施例において(c)のプライマーセットを使用した場合に得られた結果（電気泳動図）の一例を図２に示す。図２の電気泳動写真において、レーン１はＥＧＦＲ遺伝子の第2240位から第2257位のヌクレオチドが欠失している変異を有する肺癌組織片；レーン２−４及び６は変異がないＥＧＦＲ遺伝子を有する肺癌組織片；レーン５は第2235位から第2249位のヌクレオチドが欠失している変異を有する肺癌組織片、；レーン７はＥＧＦＲ遺伝子の第2236位から第2250位のヌクレオチドが欠失している変異を有する肺癌組織片について試験した結果である。
【００３７】
本実施例において(d)又は(e)のプライマーセットを使用した場合に得られた結果（電気泳動図）の一例を図３に示す。図３の電気泳動写真において、レーン１、２、４及び５は変異がないＥＧＦＲ遺伝子を有する肺癌組織片；及びレーン３はＥＧＦＲ遺伝子の第2573位のＴがＧに置換されている肺癌組織片について試験した結果である。
【００３８】
比較試験例１
ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９及び２１の増幅に使用されるプライマーセットの候補として、表２に示す(i)〜(xi)のプライマーセットが挙げられる。そこで、これらのプライマーセット(i)〜(xi)を使用すること以外は、上記実施例１と同様にして、大腸癌組織片由来のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９及び２１における変異の有無を確認した。
【００３９】
その結果、(i)〜(xi)のプライマーセットのいずれにおいても、ＰＣＲによる増幅ができない、或いはＳＳＣＰにおける分離ができない等の問題があり、変異の有無を正確に把握することができなかった。また、ＳＳＣＰの条件を種々変更しても変異を正確に検出することはできなかった。
【００４０】
【表２】
2008005701.tif 000003
【００４１】
実施例２
ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９において変異が認められる非小細胞肺癌患者から大腸癌組織片を採取した。これを２つに分けて、一方を凍結標本にし、もう一方をホルマリン固定標本にした。
【００４２】
また、同様に、ＥＧＦＲ遺伝子に変異が無い非小細胞肺癌患者から大腸癌組織片を採取した。これを２つに分けて、一方を凍結標本にし、もう一方をホルマリン固定標本にした。
【００４３】
これらの４つの標本を使用して、上記実施例と同様の方法で、大腸癌組織片由来のＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１８、１９及び２１における変異の有無を確認した。
【００４４】
この結果、ホルマリン固定標本を使用しても、凍結標本と同様に、ＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出できることが確認された。本実施例において、(c)のプライマーセットを使用した場合に得られた（電気泳動図）を図４に示す。図４の電気泳動写真において、レーン１はＥＧＦＲ遺伝子に変異が無い肺癌組織片の凍結標本；レーン２はＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９において変異が認められる肺癌組織片の凍結標本；レーン３はＥＧＦＲ遺伝子に変異が無い肺癌組織片のホルマリン固定標本；及びレーン４はＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９において変異が認められる肺癌組織片のホルマリン固定標本について試験した結果である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例１において、大腸癌組織片の凍結標本を検体として、(a)又は(b)のプライマーセットを使用して得られたＰＣＲ−ＳＳＣＰ法による電気泳動の結果である。
【図２】実施例１において、大腸癌組織片の凍結標本を検体として、(c)のプライマーセットを使用して得られたＰＣＲ−ＳＳＣＰ法による電気泳動の結果である。
【図３】実施例１において、大腸癌組織片の凍結標本を検体として、(d)又は(e)のプライマーセットを使用して得られたＰＣＲ−ＳＳＣＰ法による電気泳動の結果である。
【図４】実施例２において、大腸癌組織片の凍結標本及びホルマリン固定標本を検体として、(c)のプライマーセットを使用して得られたＰＣＲ−ＳＳＣＰ法による電気泳動の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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