(57)【要約】      （修正有）【課題】付着細胞に対する効率的な遺伝子注入作業を可能とするマイクロインジェクション装置及び自動焦点調整方法を提供する。【解決手段】付着細胞の有無を判定する細胞有無判定部１６０と、付着細胞の存在が検出されたシャーレの観測位置において第１の焦点間隔の各焦点位置で撮像された付着細胞の画像に基づく微分総和分布が最大値を取る対物レンズの最大焦点位置を検出する微分総和分布最大焦点位置算出部１５５と、この観測位置における最大焦点位置を含む所定範囲内で第１の焦点間隔よりも狭い第２の焦点間隔の各焦点位置で撮像された付着細胞の画像基づく微分総和分布が最小値を取る対物レンズの最小焦点位置を検出する微分総和分布最小焦点位置算出部１５６とを備え、マイクロインジェクションにおいて自動的に付着細胞を検出して焦点を調整することを可能とした、マイクロインジェクション装置。【選択図】図１２
2008005768.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基底面上の細胞に突き刺した微細な針を通して該細胞に目的物を注入するマイクロインジェクション装置であって、
光源から光が照射される前記細胞の画像を、レンズを通して該レンズの異なる焦点位置毎に撮像する細胞画像撮像手段と、
前記レンズの基準となる焦点位置において前記細胞画像撮像手段により撮像された前記細胞の画像である参照画像と、前記レンズの基準となる焦点位置とは異なる各焦点位置において前記細胞画像撮像手段により撮像された前記細胞の画像との差分画像に基づいて該細胞の状態を計測する細胞状態計測手段と
を備えたことを特徴とするマイクロインジェクション装置。
【請求項２】
前記細胞状態計測手段により前記細胞の状態が計測された前記基底面における観測位置において、前記参照画像と前記レンズの第１の焦点間隔の各焦点位置で前記細胞画像撮像手段により撮像された前記細胞の画像との差分画像に基づいて算出された、該第１の焦点間隔の焦点位置に応じた微分総和分布が最大値を取る前記レンズの第１の焦点位置を検出する第１の焦点位置検出手段と、
前記参照画像と、前記観測位置において前記第１の焦点位置検出手段により検出された前記第１の焦点位置を含む所定範囲内で前記第１の焦点間隔よりも狭い第２の焦点間隔の各焦点位置で前記細胞画像撮像手段により撮像された前記細胞の画像との差分画像に基づいて算出された、該第２の焦点間隔の各焦点位置に応じた微分総和分布が最小値を取る前記レンズの第２の焦点位置を検出する第２の焦点位置検出手段と
をさらに備えたことを特徴とする請求項１に記載のマイクロインジェクション装置。
【請求項３】
前記基底面における少なくとも３箇所の前記観測位置において、前記第１の焦点位置検出手段により検出された前記第１の焦点位置に基づき前記第２の焦点位置検出手段により検出された前記第２の焦点位置に基づいて該基底面の傾斜を算出する基底面傾斜算出手段をさらに備えたことを特徴とする請求項２に記載のマイクロインジェクション装置。
【請求項４】
前記基底面傾斜算出手段により算出された前記基底面の傾斜に応じて、前記観測位置に関わらず該基底面と前記針の先端との距離を一定に保持する距離保持手段をさらに備えたことを特徴とする請求項３に記載のマイクロインジェクション装置。
【請求項５】
レンズを通して視認可能な基底面上の細胞に突き刺した微細な針を通して該細胞に目的物を注入するマイクロインジェクション装置において該細胞に対する該レンズの焦点を自動で調整する自動焦点調整方法であって、
光源から光が照射される前記細胞の画像を、前記レンズの異なる焦点位置毎に撮像する細胞画像撮像工程と、
前記レンズの基準となる焦点位置において前記細胞画像撮像工程により撮像された前記細胞の画像である参照画像と、前記レンズの基準となる焦点位置とは異なる各焦点位置において前記細胞画像撮像工程により撮像された前記細胞の画像との差分画像に基づいて該細胞の状態を計測する細胞状態計測工程と
を含んだことを特徴とする自動焦点調整方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基底面上の細胞に突き刺した微細な針を通して該細胞に目的物を注入するマイクロインジェクション装置及び自動焦点調整方法に関し、特に、基底面に付着する細胞の焦点位置を自動的に効率よく正確に計測し、以って細胞に対する効率的な遺伝子注入作業を可能とするマイクロインジェクション装置及び自動焦点調整方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡を使用して対象とする細胞内に微細な針を通して遺伝子を注入することにより細胞の遺伝情報を改変させる研究は、遺伝子の役目を明らかにするとともに、個人の遺伝的特性に合わせた遺伝子治療を行うテーラメード医療を可能にする。かかる研究により、従来は治療ができなかった遺伝的な原因による病気の治療も可能となってきている。
【０００３】
遺伝子を細胞に注入する方式には、電気的な方式（エレクトロポレーション）、化学的な方式（リポフェクション）、生物的な方式（ベクター法）、機械的な方式（マイクロインジェクション）などがある。
【０００４】
上記の方式のうち、電気的な方式は、大電流を流し細胞膜を破るため、細胞に与えるダメージが大きい。化学的な方式は、導入できる遺伝子に制限があり、導入効率が悪い。生物的な方式は、導入できる材料の種類が限られ、安全性が確認できない等の欠点がある。
【０００５】
そこで、現在では、機械的な方式が、最も安全で効率が高い方法として採用されることが多くなっている。例えば、特許文献１には、細胞を規則正しく配列させ、マイクロインジェクションを自動的に実行するマイクロインジェクション装置に関する技術が開示されている。
【０００６】
【特許文献１】特許第２６２４７１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記特許文献１に代表される従来技術では、次の問題点があった。先ず、第１の問題点としては、対象とする細胞及び該細胞を付着させるシャーレが透明であることから、細胞の存在自体が明確でなく細胞自体を検出して観測位置まで移動させなければならなかったり細胞の高さや細胞とシャーレとの境界が判別しづらかったりするため、遺伝子注入作業に熟練した技術を要するのみならず、顕微鏡は１本の対物レンズを使用するために細胞及びシャーレの立体感をつかみづらいことから、低倍率の対物レンズと高倍率の対物レンズとを交換しながら作業を行わなければならず非効率であることが挙げられる。
【０００８】
また、第２の問題点としては、シャーレの底面自体が傾いているために遺伝子注入作業を行う位置に応じて細胞の垂直方向の絶対的な位置が変化するため、顕微鏡の焦点位置をその都度調整して針の位置を調整しなければならならず非効率であることが挙げられる。さらには、シャーレの底面の厚みや傾きはシャーレの固体毎に異なり均一ではなく、またシャーレを顕微鏡のステージへの配置の仕方によってもシャーレの底面の厚みや傾きが異なってくるために、シャーレ自体を変えたりステージへの配置方法を変えたりする毎に顕微鏡の焦点位置を調整して針の位置を調整しなければならならないという問題点があった。
【０００９】
そこで、従来は、シャーレの底面の高さを計測する方法として、シャーレにマークを書き込む方法やグリッドが描かれた細胞捕捉プレートに細胞を付着させてシャーレ内に配置する方法が行われていたが、これらの方法では、シャーレにマークを書き込む際に細胞を汚染させてしまったり試料作成に手間がかかったりするという問題があった。
【００１０】
また、第２の問題点を解決するために、シャーレの底面を、細胞観測系とは異なる専用の光学系を使用して計測するという方法も考えられてきたが、この方法では、少なくとも２系統の光学系をマイクロインジェクション装置に持たせなければならず、装置の構成を複雑にして装置を高価にしたり装置の可用性及びメンテナンス性を低下させたりという問題点があった。
【００１１】
また、細胞を観測する方法として、従来から、微分干渉法や位相差コントラスト光学系などがあったが、これらの方法は、目視で細胞を見やすくするために開発された方法であって、細胞のエッジが強調されすぎるという問題点を有するために、細胞焦点調節の自動化には適さないものであった。
【００１２】
本発明は、上記問題点（課題）を解消するためになされたものであって、シャーレの底面に付着する細胞の焦点位置を自動的に効率よく正確に計測し、以って細胞に対する効率的な遺伝子注入作業を可能とするマイクロインジェクション装置及び自動焦点調整方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上述した問題を解決し、目的を達成するため、本発明は、基底面上の細胞に突き刺した微細な針を通して該細胞に目的物を注入するマイクロインジェクション装置であって、光源から光が照射される前記細胞の画像を、レンズを通して該レンズの異なる焦点位置毎に撮像する細胞画像撮像手段と、前記レンズの基準となる焦点位置において前記細胞画像撮像手段により撮像された前記細胞の画像である参照画像と、前記レンズの基準となる焦点位置とは異なる各焦点位置において前記細胞画像撮像手段により撮像された前記細胞の画像との差分画像に基づいて該細胞の状態を計測する細胞状態計測手段とを備えたことを特徴とする。
【００１４】
また、本発明は、上記発明において、前記細胞状態計測手段により前記細胞の状態が計測された前記基底面における観測位置において、前記参照画像と前記レンズの第１の焦点間隔の各焦点位置で前記細胞画像撮像手段により撮像された前記細胞の画像との差分画像に基づいて算出された、該第１の焦点間隔の焦点位置に応じた微分総和分布が最大値を取る前記レンズの第１の焦点位置を検出する第１の焦点位置検出手段と、前記参照画像と、前記観測位置において前記第１の焦点位置検出手段により検出された前記第１の焦点位置を含む所定範囲内で前記第１の焦点間隔よりも狭い第２の焦点間隔の各焦点位置で前記細胞画像撮像手段により撮像された前記細胞の画像との差分画像に基づいて算出された、該第２の焦点間隔の各焦点位置に応じた微分総和分布が最小値を取る前記レンズの第２の焦点位置を検出する第２の焦点位置検出手段とをさらに備えたことを特徴とする。
【００１５】
また、本発明は、上記発明において、前記基底面における少なくとも３箇所の前記観測位置において、前記第１の焦点位置検出手段により検出された前記第１の焦点位置に基づき前記第２の焦点位置検出手段により検出された前記第２の焦点位置に基づいて該基底面の傾斜を算出する基底面傾斜算出手段をさらに備えたことを特徴とする。
【００１６】
また、本発明は、上記発明において、前記基底面傾斜算出手段により算出された前記基底面の傾斜に応じて、前記観測位置に関わらず該基底面と前記針の先端との距離を一定に保持する距離保持手段をさらに備えたことを特徴とする。
【００１７】
また、本発明は、レンズを通して視認可能な基底面上の細胞に突き刺した微細な針を通して該細胞に目的物を注入するマイクロインジェクション装置において該細胞に対する該レンズの焦点を自動で調整する自動焦点調整方法であって、光源から光が照射される前記細胞の画像を、前記レンズの異なる焦点位置毎に撮像する細胞画像撮像工程と、前記レンズの基準となる焦点位置において前記細胞画像撮像工程により撮像された前記細胞の画像である参照画像と、前記レンズの基準となる焦点位置とは異なる各焦点位置において前記細胞画像撮像工程により撮像された前記細胞の画像との差分画像に基づいて該細胞の状態を計測する細胞状態計測工程とを含んだことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、人為的な作業を排除して細胞の状態を計測することができ、技能の熟練を必要とせず効率的に簡単にマイクロインジェクションを行う際に細胞の状態を確認することができるという効果を奏する。
【００１９】
また、本発明によれば、第１の焦点間隔で第１の焦点位置を検出した後に、この第１の焦点位置を含む所定範囲内で第１の焦点間隔よりも狭い第２の焦点間隔で第２の焦点位置を検出するので、大まかに第１の焦点位置を検出した後に精密に第２の焦点位置を検出することとなり、より効率的により正確な焦点位置を検出することができるという効果を奏する。
【００２０】
また、本発明によれば、基底面の細胞の焦点位置を少なくとも３箇所において検出することのみで該基底面の傾斜を算出することが可能になり、より簡便により高速に基底面の傾斜を算出することが可能となるという効果を奏する。
【００２１】
また、本発明によれば、基底面の傾斜に応じて、観測位置に関わらず該基底面と針の先端との距離を一定に保持し、観測位置が変化しても針が基底面に衝突するという事故を回避することが可能となるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に添付図面を参照し、本発明のマイクロインジェクション装置及び自動焦点調整方法に係る実施例１及び２を詳細に説明する。実施例１は、照明光源とシャーレの底面に配置した付着細胞を顕微鏡の対物レンズを通して撮影するためのＣＣＤカメラを備えたマイクロインジェクション装置において、付着細胞の焦点を自動的に計測するマイクロインジェクション装置及び自動焦点調整方法に係る実施例である。また、実施例２は、実施例１で示すマイクロインジェクション装置及び自動焦点調整方法を応用して、複数の観測位置で求めた付着細胞の焦点位置に基づいて、シャーレの底面の傾斜を算出する実施例である。
【００２３】
まず、実施例１及び２の説明に先立って、マイクロインジェクションの概要について説明する。図１は、付着細胞へのマイクロインジェクションを説明するための説明図である。なお、付着細胞とは、互いの細胞が付着する性質を有し、同種の細胞が集結することによって生命体の一部を構成する細胞である。付着細胞は、例えば赤血球などの付着する性質を有さず、単独で浮遊して機能する浮遊細胞とは反対の性質を有する細胞である。
【００２４】
同図に示すように、付着細胞に対してマイクロインジェクションを行う場合、培養液等の液体を満たしたシャーレ２００の底面に付着細胞等の細胞が配置される。そして、シャーレ２００の下方に配した対物レンズ１３２によって得られる拡大画像に基づいて針１２２が細胞へ誘導され、インジェクションが実行される。拡大画像を明瞭にするため、シャーレ２００の上方からは照明光源１３１によって光が照射される。
【００２５】
なお、マイクロインジェクションを行う場合、シャーレの底面上に微細な孔を有するプレートを設け、この微細な孔に細胞を補足した上でインジェクションをおこなう場合もあるが、以下の説明では、プレートを用いない場合を示すこととし、シャーレの底面を基底面と称することとする。
【００２６】
付着細胞は、シャーレ２００の底面上では、シャーレ底面に沿って伸展した形状となり、水平方向に２０〜３０μｍの面積を有する一方で、５μｍ程度の厚さしかもたない。このため、付着細胞に針１２２の先端を突き刺して遺伝子等を注入するには、針１２２の先端を基底面から１μｍ程度の距離まで高速に下降させつつ、針１２２が基底面に接触しないように、針１２２のコントロールに熟練が必要となる。
【００２７】
このように、針１２２のコントロールの作業を難しくしているのは、付着細胞が透明であることと、底面に付着細胞を付着させるシャーレ２００が透明な材質からなることによって、細胞とシャーレとの境界が明確でないことと、基本的に１本の対物レンズ１３２のみを使用して観測を行うために、遠近感や立体感が掴みづらいことによる。
【００２８】
また、付着細胞はシャーレ２００の基底面にランダムに存在するために、対物レンズ１３２の対象視野をある一点の観測位置に置いたとしても、この視野内に全く付着細胞が存在しない場合が発生しうる。シャーレ２００の位置を動かしたり付着細胞自体の位置を動かしたりして対物レンズ１３２の視野内に付着細胞が入るように手作業で調整すると、かなりの回数の試行錯誤を行わなければならないという可能性もあり、非常に煩わしいこととなる場合がある。本発明は、これらの問題点（課題）を解消するためになされたものである。
【実施例１】
【００２９】
以下に図２〜１６を参照して、本発明の実施例１のマイクロインジェクション装置及び自動焦点調整方法を説明する。先ず、図２−１〜３を参照して、実施例１に係る自動焦点調整方法の特徴を説明する。図２−１〜３は、実施例１に係る自動焦点調整方法の特徴を説明するための説明図である。
【００３０】
図２−１は、自動焦点調整方法において、基底面上の付着細胞に対する対物レンズの焦点を付着細胞から離れた位置に置いてデフォーカス画像を得る状況を示す。図示するように、基底面に付着する付着細胞の上方に配置された照明光源１３１から付着細胞に照明を照射し、基底面の下方に配置される対物レンズ１３２を通してＣＣＤカメラ１３５により付着細胞のデフォーカス画像を撮影する。
【００３１】
先ず事前に、付着細胞上１ｍｍ上方に焦点を置いたデフォーカス画像を撮影しておく。これを基準となる参照画像とする。この参照画像は、付着細胞の予想される表面位置に近い位置に焦点を置いたデフォーカス画像よりも大変ぼやけた画像となるが、照明光源からの光の強度の分布は近似しており、また、シャーレの基底面の傾斜による高さ変動が高々１００〜２００μｍと、１ｍｍに比べて小さいので画像特性に大差がないため、画像の輝度の参照画面として使用することができる。
【００３２】
次に、付着細胞の上方２００μｍの焦点位置に焦点を置いたデフォーカス画像を撮影し、前述の参照画像との差分画像を取得する。若しくは、付着細胞の予想される表面位置に近い位置において、複数の異なる位置に焦点を置いたデフォーカス画像を撮影し、前述の参照画像との差分画像を取得する。焦点をおく複数の異なる位置を定めるスライスレベルは、参照画像の輝度値より１０〜２０％小さな輝度値とする。
【００３３】
次に、図２−２に示すように、付着細胞の上方２００μｍの焦点位置に焦点を置いて撮影された、若しくは前述のスライスレベルで撮影されたデフォーカス画像のうち付着細胞が存在する画像には、周囲に比べて輝度が低く暗く見える領域が存在する。細胞が存在しない部分は、参照画像の輝度とほとんど変化がない。差分画像のうち付着細胞が存在する差分画像を二値化する。二値化とは、画像をモノクロで表現する処理である。画素毎に当該画素の輝度が所定閾値より大きい場合に当該画素を白色に置換し、当該画素の輝度が所定閾値より小さい場合に当該画素を黒色に置換する処理を行うものである。
【００３４】
付着細胞が二値化された差分画像を参照すると、周囲よりも輝度が低い領域の面積を求めると同時に、この領域において最も小さな輝度値を求める。周囲よりも輝度が低いとは、輝度が所定閾値以下となることをいう。この面積と輝度との相関関係が一定の関係にあれば、マイクロインジェクションの対象となり得る正常な付着細胞が、当該デフォーカス画像が撮影された対物レンズ１３２の視野内に存在すると判定できる。
【００３５】
例えば、図３に示す相関関係を示すグラフにおいて、参照画像の輝度を基準とし、この基準からの輝度の低さの度合いを示すΔＩと、輝度が所定閾値以下となる領域の面積とて特定される点を２次元の相関グラフにプロットする。このプロットされた点が図示するｒ1の領域に存在するならば、付着細胞自体が、当該デフォーカス画像が撮影された対物レンズ１３２の視野内に存在しないと判定できる。
【００３６】
また、プロットされた点が図示するｒ2の領域に存在するならば、マイクロインジェクションの対象となり得る正常な付着細胞が、当該デフォーカス画像が撮影された対物レンズ１３２の視野内に適度に密集して存在すると判定できる。また、プロットされた点が図示するｒ3の領域に存在するならば、マイクロインジェクションの対象となり得る正常な付着細胞が、当該デフォーカス画像が撮影された対物レンズ１３２の視野内に浮遊して存在するため、この付着細胞は利用できないと判定できる。
【００３７】
なお、対物レンズ１３２の視野内にマイクロインジェクションの対象となり得る正常な付着細胞が存在すると判定されない場合には、例えば約１００μｍという比較的粗いピッチで数回程度焦点を上下させ、正常な付着細胞の有無を判定する。この方法によっても正常な付着細胞が存在すると判定されない場合には、対物レンズ１３２の視野である観測位置を水平方向に移動させて、上記の図２−１〜２の説明で示した一連の処理を再度行うことになる。
【００３８】
図２−２の説明で示したように、マイクロインジェクションの対象となり得る正常な付着細胞が、当該デフォーカス画像が撮影された対物レンズ１３２の視野内に存在すると判定されたならば、図２−３に示すように、１０〜２０μｍ程度のピッチで、焦点を上下に移動させながら画像を検知し、前述の参照画面との差分画像を求め、この差分画像の微分処理を行う。微分処理とは、画像内の各位置における画素値の変化率のことである。微分処理は、ソベル処理など代表的なものであってよい。
【００３９】
次に、画像内で微分値の絶対値の総和（微分総和）を算出し、焦点位置に応じた微分総和の分布を算出する。ここで、付着細胞の真の焦点付近では、マクロ的に微分総和が最大値を取る。微分総和がマクロ的に見てピークとなる焦点位置付近に付着細胞の真の焦点（真の焦点では微分値が最小になる）であるので、微分総和分布の曲線の中心を算出する。このようにして、推定される微分総和分布の最大値が算出される（図４参照）。図４に示すように、推定される微分総和分布の最大値付近では、付着細胞のデフォーカス画像が得られる。
【００４０】
微分総和分布がマクロ的に最大となる焦点位置は、微分総和分布のピークを求め、そのピークから所定値下がった値を取る直線と微分総和分布の曲線との２つの交点である焦点位置の中心を算出することによって求まる。前述の直線をスライスという。さらに同一の所定値だけさらに下がった値を取る直線と微分総和分布の曲線との２つの交点である焦点位置の中心を算出する。このスライスから交点を算出し交点の中心を算出する処理を一定回数繰り返えすと焦点位置を示す交点の中心が複数求まるが、これらの平均を微分総和分布がピークとなる焦点位置とする（図５参照）。
【００４１】
次に、前述の方法によって求めた微分総和分布がピークとなる焦点位置を中心として、例えば上下２０μｍの範囲の内部を例えば１μｍの細かいピッチで焦点位置を上下に動かしながら付着細胞の画像を撮影し、前述の参照画像との差分画像の微分値を計算する。次に、焦点位置毎の差分画像の微分値の絶対値の総和（微分総和）を算出し、焦点位置に応じた微分総和の分布を算出する。ここで、付着細胞の真の焦点付近では、ミクロ的に微分総和が最小値を取る。微分総和が最小となる焦点位置が付着細胞の真の焦点であるので、微分総和分布の曲線の中心を算出する。このようにして、推定される微分総和分布の最小値が算出される（図４参照）。図４に示すように、推定される微分総和分布の最小値付近では、付着細胞の合焦画像が得られる。
【００４２】
微分総和分布がミクロ的に最小となる焦点位置は、微分総和分布の最小値から所定値（ここではαとする）だけ上方へオフセットされた直線と微分総和分布の曲線との２つの交点それぞれにおける微分総和分布の曲線の２本の接線の傾きに基づいて求まる。即ち、微分総和分布の最小値からαだけ上方へオフセットされた直線が微分総和分布の曲線によって切り取られた線分が前述の２本の接線の傾きの比によって分割される点が求める焦点位置である（図６参照）。
【００４３】
図６に示すように、微分総和分布の最小値からαだけ上方へオフセットされた直線が微分総和分布の曲線によって切り取られた線分の長さをＬとし、該直線と微分総和分布の曲線との交点のうち対物レンズ位置の値が小さい交点と、微分総和分布の最小値を取る対物レンズ位置の値との距離をＬ´とすると、Ｌ´＝|ｂ|／（|ａ|＋|ｂ|）×Ｌの関係が成り立つ（|＊|は絶対値を表す）。即ち、微分総和分布の最小値からαだけ上方へオフセットされた直線が微分総和分布の曲線によって切り取られた線分が、微分総和分布の最小値を取る対物レンズ位置の値で分割される分割比は、|ｂ|：|ａ|である。
【００４４】
図２−３に示すように、この求められた焦点位置において、付着細胞の撮影画像は、焦点が当該付着細胞の底面に合致した合焦画像となる。合焦画像は、顕微鏡では、微分総和分布が最小となる焦点位置において付着細胞は、その底面に焦点が一致していることから、細胞核などの付着細胞の内容物が最も見えづらくなるという性質を利用して得られるものである。この合焦画像が得られた焦点位置が、付着細胞の輪郭を最も明確に捉えることができる焦点位置である。
【００４５】
図６に示す方法によれば、図７−１に示すような片側の微分総和が相対的に小さいという非対称の微分総和分布や、図７−２に示すような微分総和分布の最小値が所定区間に亘って０となる微分総和分布であっても、微分総和分布が最小値を取る対物レンズ位置の値を推定することが可能となる。なお、対称の微分総和分布である場合であっても、図６に示す方法によって微分総和分布が最小値を取る対物レンズ位置の値を推定することが可能であることはいうまでもない。この場合は、対称の中心が微分総和分布が最小値を取る対物レンズ位置の値となる。
【００４６】
次に、実施例１に係る自動焦点調整方法における細胞の状態計測及び焦点位置計測の処理画像を説明する。図８−１〜４は、実施例１に係る自動焦点調整方法における細胞の状態計測及び焦点位置計測の処理画像を示す図である。
【００４７】
図８−１は、付着細胞の上方約１４０μｍに焦点を置いて得られる該付着細胞のデフォーカス画像の一例である。この図８−１の画像によれば、付着細胞の細胞核の存在は確認できるものの、付着細胞の輪郭が明確ではない。従って、付着細胞が画像内に明確に存在するとはいえない。また、図８−２は、図８−１のデフォーカス画像を二値化した画像の一例である。また、図８−３は、細胞の明視野画像である合焦画像の一例である。また、図８−４は、合焦画像とデフォーカス画像との重ね合わせ画像の一例である。この図８−４の画像によれば、明確な輪郭及び細胞核を伴った付着細胞を識別することができる。
【００４８】
次に、実施例１に係る自動焦点調整方法におけるマイクロインジェクション装置への入力情報を説明する。図９は、実施例１に係る自動焦点調整方法におけるマイクロインジェクション装置への入力情報を説明するための説明図である。同図に示すように、マイクロインジェクション装置へ入力される情報には、シャーレ２００を載せるためのシャーレステージにおける対物レンズ１３２の視野位置情報を示すシャーレステージの位置情報と、インジェクションのための針１２２の動作を制御するための針制御ステージにおける針制御位置を示す針制御ステージにおける位置情報と、シャーレ２００の底面上の付着細胞の焦点を計測するために対物レンズ１３２を移動させる移動位置に関する情報である対物レンズ１３２の高さ位置情報と、シャーレ底面に付着する付着細胞の画像であるシャーレ底面上のＣＣＤカメラ画像とがある。マイクロインジェクション装置に対して入力されたこれらの情報に基づいて、次に示す出力情報が得られる。
【００４９】
次に、実施例１に係る自動焦点調整方法におけるマイクロインジェクション装置からの出力情報を説明する。図１０は、実施例１に係る自動焦点調整方法におけるマイクロインジェクション装置からの出力情報を説明するための説明図である。同図に示すように、マイクロインジェクション装置から出力される情報には、シャーレ２００の底面上の付着細胞の合焦画像を得るために計測された焦点位置を示す対物レンズの高さ位置情報と、付着細胞のデフォーカス画像、二値化されたデフォーカス画像及び合焦画像などの細胞画像とがある。
【００５０】
次に、実施例１に係るマイクロインジェクション装置の構成について説明する。図１１は、実施例１に係るマイクロインジェクション装置の構成を示す機能ブロック図である。同図に示すように、マイクロインジェクション装置１００は、シャーレステージ１１０と、インジェクタ１２１と、針１２２と、照明光源１３１と、対物レンズ１３２と、反射鏡１３３と、結像レンズ１３４と、ＣＣＤカメラ（Charge Coupled Devices）１３５、付着細胞探索パラメータの入力なども行う操作部１３６と、処理結果を出力する表示部１３７と、制御部１５０とを有する。
【００５１】
シャーレステージ１１０は、水平方向に移動可能なＸＹステージであり、シャーレ２００を搭載する台となる。シャーレステージ１１０上には、シャーレ２００を横からのばねの力で押さえつけて固定することができる。このようにして、シャーレ２００とシャーレステージ１１０とは一体化するために、シャーレの内部の底面に存在する付着細胞を探索するためにシャーレの底面の観測位置を移動することが、シャーレステージ１１０を移動させて観測位置を移動することに一致するようになる。インジェクタ１２１は、制御部１５０の制御に基づいて、針１２２の上昇／下降や、針１２２内に充填された遺伝子等の射出を行う装置である。針１２２は、先端を微細化した中空のガラス針である。
【００５２】
照明光源１３１は、インジェクション対象を上方から照らすための光源であり、対物レンズ１３２は、インジェクション対象の拡大画像をシャーレ２００の下方から得るためのレンズである。反射鏡１３３は、対物レンズ１３２により得られた画像を結像レンズ１３４へ向けて反射するための鏡であり、結像レンズ１３４は、画像をＣＣＤカメラ１３５の映像素子上に結像させるためのレンズである。
【００５３】
ＣＣＤカメラ１３５は、映像素子を用いて光学的な画像を電子的な画像データに変換する装置であり、変換後の電子的な画像を制御部１５０に送信する。
【００５４】
制御部１５０は、マイクロインジェクション装置１００を全体制御する制御部であり、針１２２と基底面の接触検出の処理やインジェクションの自動実行処理等を行う。操作部１３６は、制御部１５０が各種処理を行うために必要な処理指示や設定情報の入力を受け付ける入力装置である。表示部１３７は、ユーザから指示等の入力を受け付け、各種情報を表示する装置であり、キーボードやディスプレイ等からなる。また、制御部１５０における各種処理の進行状況を示す情報や、各種処理結果である付着細胞の撮影画像を表示するための表示装置である。
【００５５】
次に、実施例１に係るマイクロインジェクション装置の制御部の構成について説明する。図１２は、実施例１に係るマイクロインジェクション装置の制御部の構成を示す機能ブロック図である。同図に示すように、マイクロインジェクション装置の制御部１５０は、針１２２及び針制御ステージ１２３を駆動制御する針駆動制御部１５１と、対物レンズ駆動部１３８を駆動制御することによって対物レンズ１３２の焦点位置を変化させる対物レンズ駆動制御部１５２と、シャーレステージ１１０を駆動制御するシャーレステージ駆動制御部１５３と、インジェクタ１２１を制御するインジェクション制御部１５４と、微分総和分布最大焦点位置算出部１５５と、微分総和分布最小焦点位置算出部１５６と、微分総和分布算出部１５７と、ＣＣＤカメラ１３５から画像を取得する画像取得部１５８と、差分画像計算部１５９と、細胞有無判定部１６０とを有する。
【００５６】
画像取得部１５８は、操作部１３６から受け付けられた付着細胞の自動焦点調整開始指示若しくは、微分総和分布最大焦点位置算出部１５５からの信号入力を契機として、対物レンズ駆動制御部１５２を制御して操作部１３６から予め入力されて設定されている各焦点位置に対物レンズのＣＣＤ焦点を定め、ＣＣＤカメラ１３５から付着細胞の画像を取得する。そして、一連の処理を経て取得された参照画像及び複数の焦点位置における画像を、差分画像計算部１５９へ受け渡す。また、かかる処理において取得された付着細胞の画像を表示部１３７に表示させるために出力する。
【００５７】
なお、複数の焦点位置における画像のうち、付着細胞の上方の例えば１ｍｍに焦点位置を定めて撮影した画像が参照画像であり、付着細胞の上方２００μｍの焦点位置に焦点を置いて撮影された画像は、細胞の存在を検知するため使用される画像である。また、これら以外の焦点位置に焦点を置いて撮影された画像は、後述の一次探索又は二次探索で使用される画像である。
【００５８】
差分画像計算部１５９は、画像取得部１５８から受け渡された参照画像及び複数の焦点位置における画像を二値化し、両者の差分画像を計算する。付着細胞の上方２００μｍの焦点位置に焦点を置いて撮影された画像が二値化されて計算された参照画像との差分画像は、細胞有無判定部１６０へ受け渡される。一次探索又は二次探索のために所定の焦点位置に焦点を置いて撮影された画像が二値化されて計算された参照画像との差分画像は、共に微分総和分布算出部１５７へ受け渡される。また、表示部１３７において表示可能に出力される。
【００５９】
細胞有無判定部１６０は、付着細胞の上方２００μｍの焦点位置に焦点を置いて撮影された画像が二値化されて計算された参照画像との差分画像に基づいて輝度が所定閾値より低い領域の面積及び該領域における最小輝度を算出し、この面積と最小輝度との相関関係から当該視野における細胞の有無を判定する。当該視野において細胞が存在すると判定された場合には、対物レンズ駆動制御部１５２に対して対物レンズ駆動部１３８を駆動して対物レンズ１３２の焦点位置の一次探索の焦点位置への変化を開始させるように指示し、画像取得部１５８に対して一次探索における付着細胞の画像の取得を開始するように指示する。また、当該視野において細胞が存在すると判定されなかった場合には、シャーレステージ駆動制御部１５３に対して、次の観測サイト（観測位置、観測点）への移動を指示する。
【００６０】
なお、細胞有無判定部１６０の判定結果である付着細胞の状態は、付着細胞自体の有無（存在）のみならず、適度に密集している細胞であるか又は浮遊している付着細胞であるか、若しくは生きている付着細胞であるか否かなど、付着細胞がマイクロインジェクションの対象となり得る状態にあるか否かの状態を含むものである。
【００６１】
微分総和分布算出部１５７は、差分画像計算部１５９から受け渡された差分画像を微分してその微分値の絶対値の総和を微分総和として算出し、焦点位置に応じた微分総和の分布である微分総和分布を算出する処理を行う。微分総和分布が一次探索の結果に基づいて算出されたものである場合には該微分総和分布を微分総和分布最大焦点位置算出部１５５へ受け渡す。また、微分総和分布が二次探索の結果に基づいて算出されたものである場合には該微分総和分布を微分総和分布最小焦点位置算出部１５６へ受け渡す。
【００６２】
微分総和分布最大焦点位置算出部１５５は、微分総和分布の値が最大となる焦点位置である微分総和分布最大焦点位置を、図５に示した方法で算出する。算出された微分総和分布最大焦点位置は、対物レンズ駆動制御部１５２へ受け渡される。対物レンズ駆動制御部１５２は、受け渡された微分総和分布最大焦点位置へ対物レンズ１３２の焦点を移動させるように対物レンズ駆動部１３８を駆動制御する。
【００６３】
微分総和分布最小焦点位置算出部１５６は、微分総和分布の値が最小となる焦点位置である微分総和分布最小焦点位置を、図６に示した方法で算出する。算出された微分総和分布最小焦点位置は、対物レンズ駆動制御部１５２へ受け渡される。対物レンズ駆動制御部１５２は、受け渡された微分総和分布最小焦点位置へ対物レンズ１３２の焦点を移動させるように対物レンズ駆動部１３８を駆動制御する。
【００６４】
また、微分総和分布最小焦点位置算出部１５６は、微分総和分布最小焦点位置が算出された情報を、針駆動制御部１５１及びインジェクション制御部１５４へ受け渡す。針駆動制御部１５１は、受け渡された該情報に応じて針１２２及び針制御ステージ１２３を制御する。インジェクション制御部１５４は、該情報を受け渡されると、操作部１３６からのインジェクション操作指示に基づいてインジェクタ１２１を制御する。
【００６５】
なお、シャーレステージ駆動制御部１５３は、細胞有無判定部１６０からの次の観測サイトへの移動の指示のみならず、操作部１３６からの操作指示に基づいても、シャーレステージ１１０を適切な観測サイトへと移動させる。
【００６６】
次に、実施例１に係るマイクロインジェクション装置において実行される細胞自動焦点処理手順について説明する。図１３は、細胞自動焦点処理手順を示すフローチャートである。同図に示すように、先ず、シャーレ２００上の１ｍｍの位置へ焦点位置を移動させ（ステップＳ１０１）、当該焦点位置において参照画像となる画像を取得する（ステップＳ１０２）。さらに、シャーレ２００上の２００μｍへ焦点位置を移動させ（ステップＳ１０３）、当該焦点位置において画像を取得する（ステップＳ１０４）。
【００６７】
次に、ステップＳ１０２で取得された参照画像とステップＳ１０４で取得された画像との差分画像を計算し（ステップＳ１０５）、差分画像を二値化する（ステップＳ１０６）。続いて、二値化された差分画像に含まれる輝度が閾値以下である低輝度領域の面積を計算し（ステップＳ１０７）、該低輝度領域における最小輝度を検出する（ステップＳ１０８）。そして、最小輝度と低輝度領域の面積との相関からマイクロインジェクションに適した正常細胞の当該視野における有無を判定する（ステップＳ１０９）。
【００６８】
次に、正常細胞が存在するか否かを判定し（ステップＳ１１０）、正常細胞が存在すると判定された場合に（ステップＳ１１０肯定）、一次探索処理を実行し（ステップＳ１１１）、続いて二次探索処理を実行する（ステップＳ１１２）。そして、ステップＳ１１２の二次探索処理によって計測された対物レンズ１３２の焦点位置へ対物レンズ１３２を移動させる（ステップＳ１１３）。続いて、観測終了かを判定し（ステップＳ１１４）、観測終了ならば（ステップＳ１１４肯定）、細胞自動焦点処理を終了し、観測終了でないならば（ステップＳ１１４否定）、ステップＳ１１５へ処理を移す。
【００６９】
また、ステップＳ１１０において、正常細胞が存在すると判定されなかった場合にも（ステップＳ１１０否定）、ステップＳ１１５へ処理を移す。ステップＳ１１５では、次のシャーレステージ１１０を駆動制御して次の観測サイトへと移動させる。ステップＳ１１５が終了すると、ステップＳ１０４へ処理を移す。
【００７０】
これらの一連の処理を実行することによって、対物レンズ１３２の対象視野であって、この視野内に付着細胞が存在する観測点を自動的に探索し検出することが可能となる。即ち、シャーレ２００の位置を手動で動かしたりシャーレ２００の底面において付着細胞自体の位置を動かしたりして対物レンズ１３２の視野内に付着細胞が入るように手作業で調整するという試行錯誤を行う必要がなく、煩わしさから解放され、より正確に細胞の焦点位置を把握して焦点を自動的に調整し、より効率的にマイクロインジェクションの作業を行うことが可能となる。また、上記の一連を処理が自動的に行われることから、マイクロインジェクションの作業時の心理的負担、心理的疲労をより軽減することができる。
【００７１】
次に、実施例１に係るマイクロインジェクション装置において実行される一次探索処理について説明する。図１４は、図１３のステップＳ１１１に示した一次探索処理の処理手順を示すフローチャートである。同図に示すように、先ず、±２００μｍの範囲を２０μｍのピッチ（焦点間隔）で対物レンズ１３２を移動させる（ステップＳ１２１）。ここで±２００μｍの基準となる焦点位置は、細胞自動焦点処理のステップＳ１０３において設定された２００μｍである。
【００７２】
次に、ステップＳ１２１で２０μｍのピッチで移動させられた対物レンズ１３２の各焦点位置で画像を取得する（ステップＳ１２２）。続いて、細胞自動焦点処理のステップＳ１０２で取得された参照画像とステップＳ１２２で取得された各焦点位置における画像との差分画像を計算する（ステップＳ１２３）。続いて、各差分画像の微分値に基づき微分総和分布を算出し（ステップＳ１２４）、微分総和分布が最大値を取る対物レンズ位置を検出する（ステップＳ１２５）。
【００７３】
次に、実施例１に係るマイクロインジェクション装置において実行される二次探索処理について説明する。図１５は、図１３のステップＳ１１２に示した二次探索処理の処理手順を示すフローチャートである。同図に示すように、先ず、±２０μｍの範囲を１μｍのピッチで対物レンズ１３２を移動させる（ステップＳ１３１）。ここで±２０μｍの基準となる焦点位置は、一次探索処理のステップＳ１２５において検出された対物レンズ位置で決まる焦点位置である。
【００７４】
次に、ステップＳ１３１で１μｍのピッチで移動させられた対物レンズ１３２の各焦点位置で画像を取得する（ステップＳ１３２）。続いて、細胞自動焦点処理のステップＳ１０２で取得された参照画像とステップＳ１３２で取得された各焦点位置における画像との差分画像を計算する（ステップＳ１３３）。続いて、各差分画像の微分値に基づき微分総和分布を算出し（ステップＳ１３４）、最良フォーカスの対物レンズ位置算出処理を行う（ステップＳ１３５）。
【００７５】
次に、実施例１に係るマイクロインジェクション装置において実行される最良フォーカスの対物レンズ位置算出処理について説明する。図１６は、図１５のステップＳ１３５に示した最良フォーカスの対物レンズ位置算出処理の処理手順を示すフローチャートである。同図に示すように、先ず、微分総和分布の最小値を求め（ステップＳ１４１）、最小値に所定値αを加算した（最小値＋α）に輝度の閾値を設定する（ステップＳ１４２）。続いて微分総和分布とステップＳ１４２で設定した閾値との交点を求める（ステップＳ１４３）。
【００７６】
続いて、微分総和分布とステップＳ１４２で設定した閾値との交点が２つ存在するか否かを判定し（ステップＳ１４４）、交点が２つ存在する場合には（ステップＳ１４４肯定）、交点における部分総和分布曲線の接線を求め、その傾きを計算する（ステップＳ１４５）。続いて、ステップＳ１４５で計算された接線の傾きの絶対値の比に基づいて、交点を結ぶ線分を分割する（ステップＳ１４７）。そして、ステップＳ１４７で線分を分割する点の対物レンズ位置に関する成分を求め、最良フォーカスの対物レンズ位置とする（ステップＳ１４８）。
【００７７】
一方、ステップＳ１４４における判定で、交点が２つ存在すると判定されなかった場合には（ステップＳ１４４否定）、ステップＳ１４６で設定した閾値を規定するαにα−β（常にα＞β、βは一定値）をセットし（ステップＳ１４６）、ステップＳ１４２へ処理を移す。このようにして、交点が２つ存在するようになるまで、αを段階的に小さくしていき、最終的に交点が２つ存在すると判定されるに至ることとなる。
【実施例２】
【００７８】
以下に図１７〜２０を参照して、本発明の実施例２のマイクロインジェクション装置におけるシャーレ底面の傾斜算出方法を説明する。実施例２は、実施例１を利用してなされる。先ず、図１７を参照して、実施例２の前提となるシャーレ底面の傾斜の概要について説明する。図１７は、シャーレ底面の傾斜の概要を説明するための説明図である。
【００７９】
同図に示すように、シャーレの底面は、完全な水平ではなく、シャーレの中心がより隆起した傾斜を持つ。シャーレの底面の傾斜は、例えば水平方向に１ｍｍの違いに対して垂直方向に１０μｍの高低差がある。従って、対物レンズのある視野位置において焦点深度（焦点位置）がシャーレの底面に一致しているとしても、わずかでも視野位置がずれると、焦点深度がシャーレの底面を離れてしまい、精密な付着細胞観測の正確性を損ねることとなっていた。特に、インジェクションのための針の先端がシャーレの底面に衝突すると該針の先端の破損を招き、問題であり、シャーレの底面の傾斜に関わらず、常に該底面から一定距離を保っていなければならない。
【００８０】
そこで実施例２の発明は、実施例１で示した自動焦点調整方法を利用してシャーレの底面の傾斜を自動的に測定し、測定されたシャーレの底面の傾斜に沿ってシャーレの底面の位置や傾斜に関わらず、針の先端が常に該底面から一定距離を自動的に保つことができることを目的としてなされた。
【００８１】
次に、実施例２に係るシャーレ底面の傾斜算出処理の概要を説明する。図１８は、実施例２に係るシャーレ底面の傾斜算出処理の概要を説明するための説明図である。同図に示すように、選択したＡ〜Ｃの３点の位置に位置する細胞全てに対して一次探索及び二次探索を行うため、一次探索は二次探索と比較して対物レンズの焦点位置のより広い計測範囲を必要とすることから、全ての細胞の焦点位置を探索するために時間がかかっていた。
【００８２】
しかし、実施例２では、特定の１点（実施例２ではＡ点）に位置する細胞に対して一次探索及び二次探索を行い、その他の２点（実施例２ではＢ点及びＣ点）に位置する細胞に対しては二次探索のみを行ってシャーレの傾き分のみを探索することとした。このため、対物レンズの焦点位置の計測範囲を限定することができ、全ての細胞の焦点位置を探索するための時間を短縮することが可能となった。なお、実施例２におけるＡ〜Ｃ点を、「シャーレ底面傾斜計測点」又は、単に「計測点」と呼ぶこととする。
【００８３】
次に、実施例２に係るマイクロインジェクション装置の構成について説明する。図１９は、実施例２に係るマイクロインジェクション装置の構成を示す機能ブロック図である。実施例２のマイクロインジェクション装置１００の機能構成は、実施例１のマイクロインジェクション装置１００の機能構成に次の機能ブロックを追加したものである。即ち、実施例２のマイクロインジェクション装置１００は、シャーレ底面傾斜算出制御部１６１と、シャーレ底面傾斜算出部１６２とをさらに有する。
【００８４】
シャーレ底面傾斜算出制御部１６１は、微分総和分布最小焦点位置算出部１５６により最小焦点位置が算出された情報を受け渡されると、シャーレ底面傾斜算出部１６２へシャーレの底面傾斜の算出を指示する。シャーレ底面傾斜算出部１６２は、シャーレ底面傾斜算出制御部１６１からの底面傾斜算出指示を受け、微分総和分布最小焦点位置算出部１５６により算出された、シャーレ底面傾斜算出点毎のシャーレ傾斜最小焦点位置に基づき、シャーレの底面の傾斜を算出する。この算出されたシャーレの底面の傾斜は、シャーレ底面傾斜算出部１６２から針駆動制御部１５１へ受け渡される。針駆動制御部１５１は、シャーレの底面の傾斜に基づいて、針の先端がシャーレの底面に接触しないように、針制御ステージを制御して、針の先端がシャーレの底面から一定距離（例えば、１μｍ）を保つようにコントロールする。
【００８５】
次に、シャーレ底面傾斜算出処理について説明する。図２０は、シャーレ底面算出処理手順を示すフローチャートである。同図に示すように、先ず、カウンタ変数であるｎ（ｎは自然数）に１をセットし（ステップＳ１５１）、シャーレステージ１１０を制御して第ｎ番目の計測点へ移動する（ステップＳ１５２）。
【００８６】
次に、一次探索処理を行い（ステップＳ１５３）、二次探索処理を行う（ステップＳ１５４）。ここでの一次探索処理及び二次探索処理は、実施例１で示したものである。続いて、ｎ≧３であるか否かを判定し（ステップＳ１５５）、ｎ≧３であると判定される場合に（ステップＳ１５５肯定）、シャーレの底面の傾斜を算出する（ステップＳ１５６）。一方で、ｎ≧３であると判定されなかった場合に（ステップＳ１５５否定）、ｎに１を加算し（ステップＳ１５７）、シャーレステージ１１０を制御して第ｎ番目の計測点移動する（ステップＳ１５８）。
【００８７】
これらの一連の処理を行うことにより、シャーレの底面の傾斜を自動的に測定し、測定されたシャーレの底面の傾斜に沿ってシャーレの底面の位置や傾斜に関わらず、針の先端が常に該底面から一定距離を自動的に保つようにできる。よって、針の先端がシャーレ２００の底面に接触して破損することを気にすることなく、より正確、より効率的かつより安全にマイクロインジェクションの作業を行うことが可能となる。また、針の先端がシャーレ２００の底面に接触して破損することを気にする必要がないので、マイクロインジェクションの作業時の心理的負担、心理的疲労をより軽減することができる。
【００８８】
以上、本発明の実施例１及び２を説明したが、本発明は、これに限られるものではなく、特許請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内で、更に種々の異なる実施例で実施されてもよいものである。また、実施例１及び２に記載した効果は、これに限定されるものではない。
【００８９】
具体的には、上記実施例１及び２で示したマイクロインジェクション装置１００及びその制御部１５０の構成及び各機能ブロックはあくまで一例を示したものに過ぎず、特許請求の範囲に記載したマイクロインジェクション装置及び自動焦点調整方法を実現するために、マイクロインジェクション装置１００及びその制御部１５０の構成及び各機能ブロックは、この特許請求の範囲を逸脱しない範囲において変更可能である。
【００９０】
（付記１）基底面上の細胞に突き刺した微細な針を通して該細胞に目的物を注入するマイクロインジェクション装置であって、
光源から光が照射される前記細胞の画像を、レンズを通して該レンズの異なる焦点位置毎に撮像する細胞画像撮像手段と、
前記レンズの基準となる焦点位置において前記細胞画像撮像手段により撮像された前記細胞の画像である参照画像と、前記レンズの基準となる焦点位置とは異なる各焦点位置において前記細胞画像撮像手段により撮像された前記細胞の画像との差分画像に基づいて該細胞の状態を計測する細胞状態計測手段と
を備えたことを特徴とするマイクロインジェクション装置。
【００９１】
（付記２）前記細胞状態計測手段は、前記差分画像の輝度が所定閾値より低い領域の面積と該輝度との相関関係に基づいて前記細胞の状態を計測することを特徴とする付記１に記載のマイクロインジェクション装置。
【００９２】
（付記３）前記細胞状態計測手段により前記差分画像の輝度が所定閾値より低い領域の面積と該輝度との相関関係に基づいて計測される前記細胞の状態は、細胞の有無、細胞の生死状態又は細胞の付着状態であることを特徴とする付記２に記載のマイクロインジェクション装置。
【００９３】
（付記４）前記細胞状態計測手段により前記細胞の状態が計測された前記基底面における観測位置において、前記参照画像と前記レンズの第１の焦点間隔の各焦点位置で前記細胞画像撮像手段により撮像された前記細胞の画像との差分画像に基づいて算出された、該第１の焦点間隔の焦点位置に応じた微分総和分布が最大値を取る前記レンズの第１の焦点位置を検出する第１の焦点位置検出手段と、
前記参照画像と、前記観測位置において前記第１の焦点位置検出手段により検出された前記第１の焦点位置を含む所定範囲内で前記第１の焦点間隔よりも狭い第２の焦点間隔の各焦点位置で前記細胞画像撮像手段により撮像された前記細胞の画像との差分画像に基づいて算出された、該第２の焦点間隔の各焦点位置に応じた微分総和分布が最小値を取る前記レンズの第２の焦点位置を検出する第２の焦点位置検出手段と
をさらに備えたことを特徴とする付記１、２又は３に記載のマイクロインジェクション装置。
【００９４】
（付記５）前記基底面における少なくとも３箇所の前記観測位置において、前記第１の焦点位置検出手段により検出された前記第１の焦点位置に基づき前記第２の焦点位置検出手段により検出された前記第２の焦点位置に基づいて該基底面の傾斜を算出する基底面傾斜算出手段をさらに備えたことを特徴とする付記４に記載のマイクロインジェクション装置。
【００９５】
（付記６）前記基底面傾斜算出手段により算出された前記基底面の傾斜に応じて、前記観測位置に関わらず該基底面と前記針の先端との距離を一定に保持する距離保持手段をさらに備えたことを特徴とする付記５に記載のマイクロインジェクション装置。
【００９６】
（付記７）レンズを通して視認可能な基底面上の細胞に突き刺した微細な針を通して該細胞に目的物を注入するマイクロインジェクション装置において該細胞に対する該レンズの焦点を自動で調整する自動焦点調整方法であって、
光源から光が照射される前記細胞の画像を、前記レンズの異なる焦点位置毎に撮像する細胞画像撮像工程と、
前記レンズの基準となる焦点位置において前記細胞画像撮像工程により撮像された前記細胞の画像である参照画像と、前記レンズの基準となる焦点位置とは異なる各焦点位置において前記細胞画像撮像工程により撮像された前記細胞の画像との差分画像に基づいて該細胞の状態を計測する細胞状態計測工程と
を含んだことを特徴とする自動焦点調整方法。
【００９７】
（付記８）前記細胞状態計測工程により前記細胞の状態が計測された前記基底面における観測位置において、前記参照画像と前記レンズの第１の焦点間隔の各焦点位置で前記細胞画像撮像工程により撮像された前記細胞の画像との差分画像に基づいて算出された、該第１の焦点間隔の焦点位置に応じた微分総和分布が最大値を取る前記レンズの第１の焦点位置を検出する第１の焦点位置検出工程と、
前記参照画像と、前記観測位置において前記第１の焦点位置検出工程により検出された前記第１の焦点位置を含む所定範囲内で前記第１の焦点間隔よりも狭い第２の焦点間隔の各焦点位置で前記細胞画像撮像工程により撮像された前記細胞の画像との差分画像に基づいて算出された、該第２の焦点間隔の各焦点位置に応じた微分総和分布が最小値を取る前記レンズの第２の焦点位置を検出する第２の焦点位置検出工程と
をさらに含んだことを特徴とする付記７に記載の自動焦点調整方法。
【００９８】
（付記９）前記基底面における少なくとも３箇所の観測位置において、前記第１の焦点位置検出工程により検出された前記第１の焦点位置に基づき前記第２の焦点位置検出工程により検出された前記第２の焦点位置に基づき該基底面の傾斜を算出する基底面傾斜算出工程をさらに含んだことを特徴とする付記８に記載の自動焦点調整方法。
【００９９】
（付記１０）前記基底面傾斜算出工程により算出された前記基底面の傾斜に応じて、前記観測位置に関わらず該基底面と前記針の先端との距離を一定に保持する距離保持工程をさらに含んだことを特徴とする付記９に記載の自動焦点調整方法。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明は、シャーレの底面に付着する細胞の焦点位置を自動的に効率よく正確に計測したい場合に有用であり、以って細胞に対する遺伝子注入作業を効率的に行いたい場合に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】付着細胞へのマイクロインジェクションを説明するための説明図である。
【図２−１】実施例１に係る自動焦点調整方法の特徴を説明するための説明図である。
【図２−２】実施例１に係る自動焦点調整方法の特徴を説明するための説明図である。
【図２−３】実施例１に係る自動焦点調整方法の特徴を説明するための説明図である。
【図３】実施例１に係る自動焦点調整方法における細胞の状態計測の概要を説明するための説明図である。
【図４】実施例１に係る自動焦点調整方法における細胞の焦点位置計測の概要を説明するための説明図である。
【図５】実施例１に係る自動焦点調整方法における微分総和分布が最大となる対物レンズ位置推定の概要を説明するための説明図である。
【図６】実施例１に係る自動焦点調整方法における微分総和分布が最小となる対物レンズ位置推定の概要を説明するための説明図である。
【図７−１】微分総和分布の一例を示す図である。
【図７−２】微分総和分布の一例を示す図である。
【図８−１】実施例１に係る自動焦点調整方法における細胞の状態計測及び焦点位置計測の処理画像を示す図である。
【図８−２】実施例１に係る自動焦点調整方法における細胞の状態計測及び焦点位置計測の処理画像を示す図である。
【図８−３】実施例１に係る自動焦点調整方法における細胞の状態計測及び焦点位置計測の処理画像を示す図である。
【図８−４】実施例１に係る自動焦点調整方法における細胞の状態計測及び焦点位置計測の処理画像を示す図である。
【図９】実施例１に係る自動焦点調整方法におけるマイクロインジェクション装置への入力情報を説明するための説明図である。
【図１０】実施例１に係る自動焦点調整方法におけるマイクロインジェクション装置からの出力情報を説明するための説明図である。
【図１１】実施例１に係るマイクロインジェクション装置の構成を示す機能ブロック図である。
【図１２】実施例１に係るマイクロインジェクション装置の制御部の構成を示す機能ブロック図である。
【図１３】細胞自動焦点処理手順を示すフローチャートである。
【図１４】一次探索処理手順を示すフローチャートである。
【図１５】二次探索処理手順を示すフローチャートである。
【図１６】最良フォーカスの対物レンズ位置算出処理手順を示すフローチャートである。
【図１７】シャーレ底面の傾斜の概要を説明するための説明図である。
【図１８】実施例２に係るシャーレ底面の傾斜算出処理の概要を説明するための説明図である。
【図１９】実施例２に係るマイクロインジェクション装置の制御部の構成を示す機能ブロック図である。
【図２０】シャーレ底面の傾斜算出処理手順を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【０１０２】
１００    マイクロインジェクション装置
１１０    シャーレステージ
１２１    インジェクタ
１２２    針
１２３    針制御ステージ
１３１    照明光源
１３２    対物レンズ
１３３    反射鏡
１３４    結像レンズ
１３５    ＣＣＤカメラ
１３６    操作部
１３７    表示部
１３８    対物レンズ駆動部
１５０    制御部
１５１    針駆動制御部
１５２    対物レンズ駆動制御部
１５３    シャーレステージ駆動制御部
１５４    インジェクション制御部
１５５    微分総和分布最大焦点位置算出部
１５６    微分総和分布最小焦点位置算出部
１５７    微分総和分布算出部
１５８    画像取得部
１５９    差分画像計算部
１６０    細胞有無判定部
１６１    シャーレ底面傾斜算出制御部
１６２    シャーレ底面傾斜算出部
２００    シャーレ
【図１】
2008005768.tif 000003
【図２−１】
2008005768.tif 000004
【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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