(57)【要約】【課題】プラス荷電を有するタンパク質又は化合物の非特異吸着を抑制したバイオセンサー基板を提供すること。【解決手段】ｐＫａ（酸解離定数）が８以下である解離性基を含む親水性高分子化合物で修飾された基板からなるバイオセンサー基板において、該親水性高分子に、タグ分子とＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドを固定した後に、該バイオセンサー基板が実質的に荷電を有しないようにブロッキング処理されていることを特徴とするバイオセンサー基板。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＫａ（酸解離定数）が８以下である解離性基を含む親水性高分子化合物で修飾された基板からなるバイオセンサー基板において、該親水性高分子に、タグ分子とＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドを固定した後に、該バイオセンサー基板が実質的に荷電を有しないようにブロッキング処理されていることを特徴とするバイオセンサー基板。
【請求項２】
タグ分子がビオチンであり、リガンドがビオチン結合蛋白質である、請求項１に記載のバイオセンサー基板。
【請求項３】
ビオチン結合蛋白質がアビジン類である、請求項２に記載のバイオセンサー基板。
【請求項４】
解離性基がカルボキシル基である、請求項１から３の何れかに記載のバイオセンサー基板。
【請求項５】
非電気化学的検出に使用される、請求項１から４の何れかに記載のバイオセンサー基板。
【請求項６】
光学的検出に使用される、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー基板。
【請求項７】
表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサー基板。
【請求項８】
タグ分子で修飾された生理活性物質が該リガンドに結合している、請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサー基板。
【請求項９】
タグ分子で修飾された生理活性物質が該リガンドに結合している請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサー基板と、被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
【請求項１０】
生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から８の何れかに記載のバイオセンサー基板を含む、バイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサー基板及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサー基板及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
特許第３０７１８２３号には、バイオセンサー表面にアビジンを介してビオチン化蛋白を固定することが記載されている。また、特許第２８１５１２０号には、金基板に自己組織化膜（ＳＡＭ）を介してデキストランを結合させ、さらにブロモ酢酸を繰り返し反応させることで、デキストランにカルボキシル基を導入することが記載されている。この蛋白固定化膜は、３次元マトリクスを形成しているので、多量の蛋白を固定化できるメリットを有している。しかしながら、解離性基であるカルボキシル基を多く含有しており、通常のブロッキング処理を行っても、一定量のカルボキシル基が残存する。一般に、アビジンを介してビオチン化蛋白を固定化する場合、さらに、そのビオチン化蛋白質に対するアナライトの結合測定を行う場合は、その固定化膜のカルボキシル基は解離して、基板表面はマイナス荷電を有することになる。そのため、特にプラス荷電を有するビオチン化蛋白、アナライトそのもの、あるいは種々の夾雑物が基板に非特異吸着を起し、正確な結合測定に支障をきたすことがあった。
【０００６】
【特許文献１】特許第３０７１８２３号
【特許文献２】特許第２８１５１２０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、プラス荷電を有するタンパク質又は化合物の非特異吸着を抑制したバイオセンサー基板を提供することを解決すべき課題とした。特に本発明は、マイナスのベースライン変動が小さく、低分子検体の結合検出が可能であるバイオセンサー基板を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ｐＫａ（酸解離定数）が８以下である解離性基を含む親水性高分子化合物で修飾された基板において、該親水性高分子に、タグ分子とＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドを固定した後に、該バイオセンサー基板を実質的に荷電を有しないようにブロッキング処理することによって、生理活性物質を固定化し得るバイオセンサー基板を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明によれば、ｐＫａ（酸解離定数）が８以下である解離性基を含む親水性高分子化合物で修飾された基板からなるバイオセンサー基板において、該親水性高分子に、タグ分子とＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドを固定した後に、該バイオセンサー基板が実質的に荷電を有しないようにブロッキング処理されていることを特徴とするバイオセンサー基板が提供される。
【００１０】
好ましくは、タグ分子はビオチンであり、リガンドはビオチン結合蛋白質である。
好ましくは、ビオチン結合蛋白質はアビジン類である。
好ましくは、解離性基はカルボキシル基である。
【００１１】
好ましくは、本発明のバイオセンサー基板は、非電気化学的検出に使用され、さらに好ましくは光学的検出に使用され、特に好ましくは表面プラズモン共鳴分析に使用される。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、タグ分子で修飾された生理活性物質が該リガンドに結合している、上記した本発明のバイオセンサー基板が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、タグ分子で修飾された生理活性物質が該リガンドに結合している上記した本発明のバイオセンサー基板と、被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
【００１４】
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定し、さらに好ましくは生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のバイオセンサー基板を含む、バイオセンサーが提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のバイオセンサー基板は、荷電を実質的に有しないような処理を施されているので、種々のタンパク質や化合物の非特異吸着が抑制される。特に本発明のバイオセンサー基板によれば、マイナスのベースライン変動が小さく、低分子検体の結合検出が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明のバイオセンサー基板は、ｐＫａ（酸解離定数）が８以下である解離性基を含む親水性高分子化合物で修飾された基板からなり、該親水性高分子に、タグ分子とＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドを固定した後に、該バイオセンサー基板が実質的に荷電を有しないようにブロッキング処理されていることを特徴とする。
【００１８】
本発明におけるｐＫａ（酸解離定数）が８以下である解離性基としては、カルボン酸（カルボキシル基）、スルホン酸、リン酸などを挙げることができ、好ましくはカルボン酸（カルボキシル基）である。
【００１９】
本発明で用いる、ｐＫａ（酸解離定数）が８以下である解離性基を含む親水性高分子の具体例としては、蛋白質（アルブミン、カゼインなど）、セルロース化合物（カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースなど）、多糖類及びその誘導体（アガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、デンプン、デンプン誘導体、キチン、キトサンなど）、合成親水性高分子（ポリビニルアルコール、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸など）などが挙げられる。
【００２０】
好ましくは、ｐＫａ（酸解離定数）が８以下である解離性基を含む親水性高分子として、カルボキシル基含有合成ポリマーおよびカルボキシル基含有多糖類を用いることが可能である。カルボキシル基含有合成ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、およびこれらの共重合体、例えば特開昭５９−４４６１５号、特公昭５４−３４３２７号、特公昭５８−１２５７７号、特公昭５４−２５９５７号、特開昭５９−５３８３６号、特開昭５９−７１０４８号明細書に記載されているようなメタクリル酸共重合体、アクリル酸共重合体、イタコン酸共重合体、クロトン酸共重合体、マレイン酸共重合体、部分エステル化マレイン酸共重合、水酸基を有するポリマーに酸無水物を付加させたものなどが挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等が挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるＣＭＤ、ＣＭＤ−Ｌ、ＣＭＤ−Ｄ４０（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることができる。
【００２１】
カルボキシル基含有ポリマーは、好ましくはカルボキシル基含有多糖類であり、より好ましくはカルボキシメチルデキストランである。
本発明に用いるカルボキシル基含有ポリマーの分子量は特に制限されないが、平均分子量が１０００〜５００００００であることが好ましく、平均分子量が１００００〜３００００００であることがより好ましく平均分子量が１０００００〜２００００００であることがさらに好ましい。この範囲より平均分子量が小さい場合には生理活性物質の固定量が小さくなってしまい、この範囲より平均分子量が大きい場合には高い溶液粘度のため取り扱いが困難となる。
【００２２】
また、本発明に使用する親水性高分子は、水溶液中の膜厚が１ｎｍ以上300ｎｍ以下であることが好ましい。膜厚が薄いと生理活性物質固定量が減少し、またセンサー表面の水和層が薄くなるため生理活性物質自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。膜厚が厚いと被検体物質が膜内に拡散する障害となり、また特にセンサー基板の親水性高分子固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水溶液中の親水性高分子膜厚はＡＦＭ、エリプソメトリーなどで評価することができる。
【００２３】
カルボキシル基含有ポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化、あるいはEDCのみで活性化する方法、特開２００６−５８０７１号公報に記載の方法（即ち、特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いてカルボキシル基を活性化する方法）、特開２００６−９０７８１号公報に記載の方法（即ち、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物を用いてカルボキシル基を活性化する方法）等を好ましく用いることができる。
【００２４】
例えば、以下のカルボジイミド誘導体は化合物１〜３
【化１】
2008209378.tif 000002
下記一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表される含窒素化合物
【化２】
2008209378.tif 000003
[式中、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表し、Ｒ１及びＲ２は結合により５〜６員環を形成しても良く、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す] 
下記一般式（ＩＩＩ）で表される含窒素化合物
【化３】
2008209378.tif 000004
[式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す] 
下記式で表される電子吸引性基を有するフェノール誘導体（好ましくは電子吸引性基のσ値が0.3以上）
【化４】
2008209378.tif 000005
を用いて活性化することができる。
これらの手法で活性化されたカルボキシル基含有ポリマーを、アミノ基を有する基板と反応させることで、本発明のバイオセンサーを製造することが可能となる。
【００２５】
本発明において、バインディングマトリックスである親水性高分子と金属表面との結合法については、公知の手法を用いることが可能である。本明細書中に以下に説明するような疎水性ポリマーを介してバインディングマトリックスを金属表面に結合する方法（特開２００４−２７１５１４号公報を参照））、特許第２８１５１２０号に開示されている、Ｘ−Ｒ−Ｙ（Ｘは金属に結合し、Ｙはバインディングマトリックスと結合する）の密に詰め込まれた単層を介してバインディングマトリックスを金属表面に結合する方法、などを適用することができる。好ましくは、末端に反応性基を有するアルカンチオール（あるいはその酸化体であるジスルフィド）を用いて金属表面に密な層を形成させた後、アルカンチオール末端の反応性基と親水性高分子を反応させる結合法である。
【００２６】
また、本発明のバイオセンサー基板においては、親水性高分子に、タグ分子とＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドが固定されている。タグ分子／リガンドの組み合わせとしては、ビオチン／ビオチン結合蛋白質、ジゴキシゲニン／ジゴキシゲニン抗体、さらにはSCIENCE,280,708-711(1998)に記載のD-Ala-D-Ala誘導体／バンコマイシン3量体誘導体などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。ビオチン結合蛋白質の具体例としては、アビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、又はそれらの改変体など）を挙げることができる。
【００２７】
本発明によれば、親水性高分子は、ｐＫａ（酸解離定数）が８以下である解離性基を含む親水性高分子であり、リガンドは、該解離性基を介して親水性高分子に固定することができる。
【００２８】
本発明のバイオセンサー基板においては、該親水性高分子に、タグ分子とＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドを固定した後に、該バイオセンサー基板が実質的に荷電を有しないようにブロッキング処理されている。ブロッキング処理は、バイオセンサー基板が実質的に荷電を有しないようできる処理であれば特に限定されないが、例えば、荷電を有する解離性基を化学反応により荷電を持たないように化学変化させる方法、解離性基と反対荷電を有する化合物をイオン結合させることにより解離性基の荷電を中和する方法が挙げられる。
【００２９】
前者の例としては、解離性基としてマイナス荷電を有するカルボキシル基を有する親水性高分子基板に対して、アミンカップリング法でアミノ化合物と共有結合を形成する方法がある。好ましくは、ブロッキング剤として、１級アミン化合物が用いられ、さらに好ましくは直鎖の１級アミン化合物が用いられる。具体的には、エタノールアミン、プロパノールアミン、ポリエチレングリコールアミンが挙げられる。具体的なブロッキング操作としては、例えば、カルボキシル基を有する親水性高分子基板に対して、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの混合液を添加し、一定時間反応後、洗浄し、次に、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液を添加し、一定時間反応後、洗浄する操作を挙げることができる。
【００３０】
後者の例としては、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのマイナス荷電を有する解離性基を有する親水性高分子基板に対して、カチオン性基を有する親水性化合物が好ましく用いられ、さらに好ましくはアンモニウム基、ピリジニウム基、ホスホニウム基、スルホニウム塩基を有する親水性化合物が用いられる。具体的には、塩化O-[2-ヒドロキシ-3-（トリメチルアンモニオ）プロピル]デキストラン、テトラブチルアンモニウムが挙げられる。具体的なブロッキング操作としては、カチオン性親水性化合物の水溶液を添加し、一定時間反応後、洗浄する操作を挙げることができる。
【００３１】
実質的に荷電を有しないとは、表面荷電を有した蛋白質が、上記のような親水性高分子基板に対して静電的に濃縮されないことをいう。具体的には、本発明の光学バイオセンサーを用いて、蛋白質が荷電を有するようなｐＨに調整したバッファー系で、蛋白質の親水性高分子基板への濃縮度合いを測定することができる。蛋白質が荷電を有しないｐＨと蛋白質が荷電を有するｐＨの比較において、蛋白質の濃縮量に有意差がない場合に、その親水性高分子基板は実質的に荷電を有しないとみなすことができる。
【００３２】
本発明のバイオセンサー基板の表面に対し、タグ分子で修飾された生理活性物質を接触させることにより、バイオセンサー基板のリガンドと、生理活性物質に結合しているタグ分子が相互作用することにより、バイオセンサー基板に対して生理活性物質を固定化することが可能となる。
【００３３】
タグ分子で修飾された生理活性物質を固定化する時に用いるバッファー、あるいは、タグ分子で修飾された生理活性物質への低分子検体の結合を測定する時に用いるバッファーとしては、中性領域のバッファーを用いることが好ましい。ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が好ましく、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５がさらに好ましい。具体的には、以下のバッファー剤が好ましく用いられる。リン酸、MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid, momohydrate)、Bis-Tris(Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane)、PIPES(Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)、MOPSO(2-Hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid)、BES(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid)、MOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)、HEPES(2-[4-(2-Hydroxyetyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)、POPSO(Piperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonic acid),dihydrate)、HEPPSO(2-Hydroxy-3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonic acid,monohydrate)、EPPS(3-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonic acid)。バッファー剤の濃度は、1mM〜200mMで用いることが好ましく、5mM〜100ｍＭがより好ましい。適宜、NaClを添加することができる。NaCl濃度は、10mM〜500mMで用いることが好ましく、50mM〜200ｍＭがより好ましい。また、EDTA等のキレート試薬を添加することができる。さらに、生理活性物質の活性調整のため、Ca、K、Na、Mn、Fe、Zn等の金属イオンを添加することができる。
【００３４】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００３５】
本発明のバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００３６】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００３７】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００３８】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００３９】
本発明において、親水性高分子は、金属層に、直接又は中間層を介して結合している。中間層としては、疎水性高分子化合物又は自己組織化膜から成る層などを使用することができる。以下、疎水性高分子化合物、及び自己組織化膜について説明する。
【００４０】
疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００４１】
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００４２】
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００４３】
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００４４】
浸漬法は、基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させた後に、前記疎水性高分子化合物溶液を含まない液に接触させる方法でコーティングを行う。好ましくは、疎水性高分子化合物溶液の溶剤と疎水性高分子化合物を含まない液の溶剤とは、同一の溶剤である。
【００４５】
浸漬法では、疎水性高分子化合物のコーティング用溶剤を適切に選択することで、基板の凹凸、曲率、形状などに依らず基板表面に均一なコーティング厚みの疎水性高分子化合物層が得られる。
【００４６】
浸漬法のコーティング用溶剤は特に限定されず、疎水性高分子化合物の一部を溶解すれものであれば任意の溶剤を用いることができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のホルムアミド系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、フェノキシエタノール等のアルコール系溶剤、２−ブタノン等のケトン系溶剤、トルエン等のベンゼン系溶剤などを使用することができるが、これらに限定されない。
【００４７】
基板に接触させる疎水性高分子化合物の溶液は、疎水性高分子化合物が完全に溶解しても、疎水性高分子化合物の不溶解成分を含む懸濁液でもよい。液温は、疎水性高分子化合物の一部が溶解する液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を疎水性高分子化合物の溶液に接触させている間に液温を変動させても良い。溶液の疎水性高分子化合物濃度に特に制限はないが、好ましくは０．０１％以上３０％以下、さらに好ましくは０．１％以上１０％以下である。
【００４８】
固体基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。
【００４９】
疎水性高分子化合物を含まない液としては、溶剤自身のＳＰ値（単位：(Ｊ／ｃｍ3)1/2）と疎水性高分子化合物のＳＰ値との差が、１以上２０以下であることが好ましく、３以上１５以下であることがさらに好ましい。ＳＰ値は、分子間の凝集エネルギー密度の平方根で表され、溶解度パラメーターとも呼ばれる。本発明では、ＳＰ値δは下記式で算出した。各官能基の凝集エネルギーＥｃｏｈとモル容積Ｖは、Ｆｅｄｏｒｓが規定した値を使用した（Ｒ．Ｆ．Ｆｅｄｏｒｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．、１４（２）、Ｐ１４７、Ｐ４７２（１９７４））。
δ＝（ΣＥｃｏｈ／ΣＶ）1/2
例として、疎水性高分子化合物および溶剤のＳＰ値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（１：１）：２１.０に対する溶剤２−フェノキシエタノール：２５.３、ポリメチルメタクリレート：２０.３に対する溶剤アセトニトリル：２２.９、ポリスチレン：２１.６に対する溶剤トルエン：１８.７である。
【００５０】
基板を、疎水性高分子化合物を含まない液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。液温は、溶剤が液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を溶剤に接触させている間に液温を変動させてもよい。揮発させにくい溶剤を使用する場合、溶剤を除去する目的で、該溶媒に接触させた後、互いに溶解する揮発性溶剤で置換してもよい。
【００５１】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。
【００５２】
次に、自己組織化膜について説明する。チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。本発明では、例えば、自己組織化化合物として、6-ヒドロキシ-1-ヘキサンチオール、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。
【００５３】
また、本発明において使用可能な自己組織化化合物として、一般式Ａ−１（一般式Ａ−１において、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）に示すアルカンチオール誘導体を好ましく用いることができる。一般式Ａ−１において例えば、X=NH2である化合物を用いて自己組織化膜を形成させることで、アミノ基を有する有機層で金表面を被覆することが可能となる。
【００５４】
【化５】
2008209378.tif 000006
【００５５】
末端にアミノ基を有するアルカンチオールを使用する場合、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物（一般式１−１）（一般式１−１において、ｎは３から２０の整数を示す）でもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式１−２、１−３）（一般式１−２においてｎは３から２０の整数を示し、一般式４においてｎはそれぞれ独立に１から２０の整数を示す）と大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させた化合物でもよい。末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはジアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させてもよい。
【００５６】
【化６】
2008209378.tif 000007
【００５７】
１−１〜１−３のアルキル基の繰返し数は、3以上20以下が好ましく、さらに3以上16以下が好ましく、4以上8以下が最も好ましい。アルキル鎖が短いと自己組織化膜を形成しにくく、アルキル鎖が長いと水溶性が低下し、ハンドリングが困難になる。
【００５８】
本発明に用いるジアミンとしては、任意の化合物を用いることが可能であるが、バイオセンサー表面に用いる場合、水溶性ジアミンが好ましい。水溶性ジアミンとしては具体的に、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、１．４−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、４，４’−ジアモノビフェニル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルケトン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミンが挙げられる。バイオセンサー表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物（一般式１−４）を用いることも可能である。本発明に用いるジアミンとしては、好ましくはエチレンジアミンまたは一般式１−４（一般式１−４において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）で表される化合物であり、より好ましくは、エチレンジアミンまたは1,2-ビス(アミノエトキシ)エタン（一般式１−４において、n=2,m=1）である。
【００５９】
【化７】
2008209378.tif 000008
【００６０】
これらのアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他の種類のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。バイオセンサー表面に用いる場合、他の種類アルカンチオールとしては、生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のWhitesides教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Langmuir,17,2841-2850, 5605-5620, 6336-6343 (2001)）。例えば、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。非特異吸着抑制能に優れ、入手が容易であることから、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールとしては、水酸基を有するアルカンチオール（一般式１−５）あるいはエチレングルコールユニットを有するアルカンチオール（一般式１−６）（一般式１−５において、ｎは３から２０の整数を示し、一般式１−６において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）を用いることが好ましい。
【００６１】
【化８】
2008209378.tif 000009
【００６２】
アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合、１−１〜１−３のアルキル基の繰返し数は、4以上20以下が好ましく、さらに4以上16以下が好ましく、4以上10以下が最も好ましい。また、１-５,１-６のアルキル基の繰返し数は、3以上16以下が好ましく、さらに5以上12以下が好ましく、5以上10以下が最も好ましい。
【００６３】
混合単分子膜の場合、例えば、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能であるが、アミノ基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には活性化されたカルボキシル基含有ポリマーの結合量が低下し、親水性基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には非特異吸着抑制能が減少する。それゆえ、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールの混合比は、１／１〜１／１，０００，０００の範囲であることが好ましく、１／４〜１／１０，０００の範囲であることがより好ましく、１／１０〜１／１，０００の範囲であることがさらに好ましい。活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーと反応する場合の立体障害低減の観点から、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、親水性基を有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。
【００６４】
本発明で用いるアルカンチオールは、Northwestern大学のGrzybowski教授らによる総説（Curr. Org. Chem., 8, 1763-1797(2004).）およびその引用文献に基づいて合成された化合物を用いても良く、また市販の化合物を用いてもよい。これらの化合物は、同仁化学（株）、Aldrich社、SensoPath Technologies社、Frontier Scientific Inc.社等から購入可能である。本発明においてアルカンチオールの酸化生成物であるジスルフィド化合物は、アルカンチオールと同様に用いることが可能である。
【００６５】
本発明のセンサー用基板に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００６６】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００６７】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００６８】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００６９】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００７０】
これらの生理活性物質は、生理活性物質を含む溶液を親水性高分子が固定された基板上に塗布し、乾燥することによって固定化することが好ましい。
【００７１】
生理活性物質を含む溶液（塗布液）の濃度は、基板表面に固定する生理活性物質の濃度が高い方が好ましい。生理活性物質により異なるが、０.１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬで使用することが好ましく、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬである。
【００７２】
生理活性物質を含む溶液の乾燥過程において、生理活性物質は塗布した溶液の外周部または、塗布液が乾固直前まで液が残った部分に析出する傾向がある。これにより基板表面に固定される生理活性物質の量に分布が発生し好ましくない。基板表面の生理活性物質固定量を均一にするため、塗布液の粘度は生理活性物質の基板表面への結合を阻害しない範囲で高くすることが好ましい。塗布液粘度を高くすることで、乾燥過程における塗布液中の生理活性物質の基板表面に対して水平方向の移動が抑えられ、結果として生理活性物質固定量のばらつきを抑えられる。乾燥過程における塗布液の粘度は０．９ｃＰ以上に保つことが好ましい。
【００７３】
本発明の乾燥する工程とは、生理活性物質を含む溶液の塗布後、その溶液を、静置することによる自然乾燥や、加熱や送風などによって溶液が乾燥する速度を上げ、意図的に乾燥させる工程をいう。ここで、生理活性物質を含む溶液（塗布液）の乾燥速度を上げることは生理活性物質固定量のばらつきを抑えることに効果がある。乾燥速度を上げ、生理活性物質の水平方向の移動速度に対して、十分早く乾燥を終了させることで、生理活性物質が実質的に移動する前に乾燥が終了し、ばらつきを抑えることが可能となる。乾燥速度を上げる方法は特に限定されないが、塗布液温度、乾燥環境温度を上げる、赤外線、レーザーなどの照射で蒸発エネルギーを加える、送風などで乾燥時の溶媒蒸気圧を下げる、溶液を薄層塗布して塗布量に対する蒸発面積を大きくするなどの方法が挙げられる。特に、塗布液が水を含む場合、乾球温度と湿球温度差の大きい環境で乾燥させることで乾燥速度は早くなる。乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境で乾燥させることが好ましく、さらに好ましくは１０℃以上、さらに好ましくは１３．５℃以上である。また、製造工程上、乾燥時間としては１０分以内が好ましく、より好ましくは５分以内、特に好ましくは１分以内である。
【００７４】
生理活性物質を含む溶液を塗布する方法としては、特に塗布液を定量吐出するディスペンサーを使用する方法が挙げられる。ディスペンサーの吐出口を基板上で一定速度、一定間隔で動作させることで基板上の任意の場所に均一塗布することが可能である。ディスペンサーで塗布する場合、基板と吐出口の間隔を極力狭くし、塗布液厚みを薄くすることで生理活性物質の厚みを均一にすることができ、また乾燥速度を上げることができ、好ましい。また生理活性物質を含む溶液を塗布する好ましい方法として、スピンコートも挙げられる。この方法は、特に塗布膜厚を薄くする場合に好ましい。均一厚みの溶液を形成した後に乾燥させるため、スピンコーターは回転中の溶媒の蒸発を防ぐことが好ましい。このため、回転時に基板を密閉容器に入れておくなどの方法で、基板周辺の溶媒濃度が高い環境に保つことで、回転中の薄膜形成と薄膜形成後の乾燥速度を制御できるため、特に好ましい。これらの塗布工程後、温度・湿度を一定に保った条件下で乾燥させることが好ましい。
【００７５】
生理活性物質と被検体物質との相互作用を検出する場合、センサー表面の生理活性物質の固定量の変動は相互作用の定量的、速度論的評価の誤差の原因となる。この誤差を最小限に抑える目的で、生理活性物質の固定量を均一にすることが好ましい。相互作用の検出に使用される基板表面の生理活性物質の固定量のばらつきがＣＶ値（変動係数）（標準偏差／平均値）で１５％以下が好ましく、さらに好ましくは１０％以下である。ＣＶ値は、基板表面の少なくとも２点以上、好ましくは１０点以上、さらに好ましくは１００点以上の固定量から算出することができる。均一性は、生理活性物質を固定する前後のセンサー基板上の物質の量を定量することでも評価可能であるが、生理活性物質と結合することが知られている物質を蛍光標識して、この標識物質をセンサー基板に固定した後に蛍光顕微鏡などを用いて蛍光強度を測定することでも可能である。また、ＳＰＲイメージャー、エリプソメーター、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ、ＡＴＲ−ＩＲ装置などで生理活性物質の定量も可能である。
【００７６】
また、本発明において、基板上に固定化した生理活性物質の保存安定性を向上させる目的で、水素結合を形成しうる残基を有する化合物（以下、化合物Ｓとする）を使用してもよい。
【００７７】
一般に蛋白質などの生理活性物質は水溶液中で水分子が配位することで三次元構造を維持しているが、乾燥されると三次元構造を保持できず失活する。また、基板表面の親水性高分子中に担持されている場合には、乾燥されることで生理活性物質同士が接近し凝集が発生する。本発明の水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水分子に代って生理活性物質の三次元構造を保持することで失活を抑制、または生理活性物質を被覆して立体効果で凝集を抑制する目的で使用することができる。
【００７８】
本発明において水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水溶液で基板上の生理活性物質を固定した層に添加することが好ましい。添加方法としては、生理活性物質との混合溶液として基板表面に塗布しても良く、生理活性物質を基板表面に固定した後オーバーコートなどによりして添加しても良い。化合物Ｓと生理活性物質との混合溶液として塗布した場合、生理活性物質の固定量ばらつきを抑えることもできる。化合物Ｓ水溶液は薄膜状態で基板に添加することが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【００７９】
化合物Ｓの塗布液濃度は塗布性、生理活性物質を含む層への浸透の問題がない範囲で特に限定されないが、０．１重量％以上５重量％以下であることが好ましい。また、塗布液は、塗布性、ｐＨ調整の観点で界面活性剤、緩衝剤、有機溶剤、塩などを添加してもよい。
【００８０】
水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、常温常圧で不揮発性のものが好ましく、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さいものが好ましく、さらに好ましくは１２００以上２００万以下であり、最も好ましくは１２００以上７万以下である。分子内に水酸基を含む化合物Ｓは糖類が好ましく、糖類は、単糖、多糖類でも良い。ｎ糖類の場合ｎが４以上１２００以下であることが好ましく、さらに好ましくはｎが２０以上６００以下である。
【００８１】
化合物Ｓの平均分子量が低いと基板表面で結晶化して、生理活性物質を固定した親水性高分子層の破壊および生理活性物質の三次元構造の破壊の原因となり、反対に平均分子量が高いと生理活性物質の基板への固定の障害となったり、生理活性物質を含む層に含浸できない、層分離を発生するなどの問題が発生する。
【００８２】
基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、デキストラン骨格、又はポリエチレンオキシド骨格を有することが好ましく、本発明の目的を達成する範囲において、どの置換基を使用してもよい。また、基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、解離性基を有しないノニオン性化合物であることが好ましい。また、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは水分子との親和性の高い化合物が好ましく、水とｎ-オクタノールとの分配係数ＬｏｇＰ値が１以上であることが好ましい。ＬｏｇＰ値は、ＪＩＳ規格のＺ７２６０−１０７（２０００）「分配係数（1-オクタノール/水）の測定―振とう法」などに記載の方法で測定することができる。
【００８３】
具体的な水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、ポリビニルアルコールなどの多価アルコール類、コラーゲン、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク質、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、デンプン、セルロース、アルギン酸、デキストランなど多糖類、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド、プルロニックなどポリエチレンキシ-ポリプロピレンオキシド縮合物などのポリエーテル類、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０などの２種以上の残基から成る化合物、またはこれら化合物の誘導体および重合体などが挙げられる。その内、多糖類、ポリエーテル類が好ましく、多糖類がより好ましい。具体的には、デキストラン、セルロース、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０が好ましく用いられる。さらに、特開２００６−１７０８３２に記載の不揮発性モノマー、不揮発性水溶性オリゴマーを用いることもできる。例えば不揮発性モノマーとしては水酸基が保護基で保護されていてもよいテトロース、ペントース、ヘプトース、ヘキトース及びそのグリコキシドでも良く、メチルグルコシドや水酸基が保護基で保護されていてもよいサイクリトール類でもよい。また不揮発性水溶性オリゴマーが、式（１）、（２）または（３） -[CH2-CH(CONH2)-]n- （１） -[CH2-CH2-O-]n- （２） -[CH2-CH(OH)-]n- （３）（式（１）〜（３）中、ｎは１０〜２００のいずれかの整数を示す。）で表されるオリゴマー、水酸基が保護基で保護されていてもよいｎ糖（但し、２≦ｎ≦１０）のオリゴ糖を用いることもできる。さらに、US２００３／０１７５８２７、DE２０３０６４７６A1に記載の糖類、例えば、トレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース、キシリトール、フルクトース、マニトール、グルコース、キシロール、マルトデキストラン、サッカロース、ポリビニルピロリドンなどを使用しても良い。また、これらの化合物Ｓは、本発明において使用している親水性高分子の基本骨格と実質同一であることが好ましい。ここで、基本骨格とは、例えば、糖の環構造のことをいい、官能基や長さが異なっていても、環構造が同一であれば、実質同一であるという。
【００８４】
基板上の、水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓの含有量としては、平均分子量の比で、親水性高分子の平均分子量に対する前記化合物Ｓの平均分子量の割合が０．００５以上０．２以下であることが好ましい。割合がこれよりも低い場合は化合物Ｓが結晶化しやすく、高い場合は親水性高分子層への浸透が困難であり、この範囲内に設定することでこれらの問題を解消し、生理活性物質の失活抑制効果、凝集抑制効果をより高く得ることができる。
【００８５】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００８６】
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００８７】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００８８】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００８９】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００９０】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００９１】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００９２】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００９３】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００９４】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００９５】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００９６】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００９７】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００９８】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００９９】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【０１００】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【０１０１】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【０１０２】
また、本発明のバイオセンサーは、例えば基板表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を導波路を用いて検出するバイオセンサーとして用いることができる。この場合、基板表面の導波構造物は、回折格子と場合によっては付加層とを有している、この導波構造物は、薄い誘電層からなる平面的な導波体から成る。導波体に集光された光線は全反射によりこの薄い層内に導かれる。この導かれる光波（以降モードと呼ぶ）の伝播速度は、Ｃ／Ｎの値をとる。ここでＣは、真空中での光速であり、Ｎは導波体内を導かれるモードの有効屈折率である。有効屈折率Ｎは、一面では導波体の構成により、他面では薄い導波層に隣接する媒体の屈折率により決まる。光波の伝導は、薄い平面層内のみでなく、別の導波構造物、特にストリップ状の導波体によっても行われる。その場合は、導波構造物はストリップ状のフィルムの形状にされる。有効屈折率Ｎの変化は、導波層に隣接する媒体の変化と導波層自身もしくは導波層に隣接する付加層の屈折率および厚さの変化とにより生じることがバイオセンサーにとって重要な要素である。
【０１０３】
この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平６−２７７０３号公報４ページ４８行目から１４ページ１５行目および第１図から第８図、米国特許第 6,829,073号のcolumn6の31行目からcolumn7の47行目および第9図A,Bに記載されている。
【０１０４】
例えば、一つの実施形態として、薄層が平面状の導波路層が基材（たとえばパイレックス（登録商標）・ガラス）上に設けられている構造がある。導波路層と基材とは、一緒にいわゆる導波体を形成する。導波路層は、たとえば酸化物層（ＳｉＯ２，ＳｎＯ２、Ｔａ２Ｏ５，ＴｉＯ２，ＴｉＯ２-ＳｉＯ２，ＨｆＯ２，ＺｒＯ２，Ａｌ２Ｏ３，Ｓｉ３Ｎ４，ＨｆＯＮ，ＳｉＯＮ，酸化スカンジウムまたはこれらの混合物）、プラスチック層（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなど）、など多層の積層体が可能である。光線が全反射により導波路層内を伝播するには、導波路層の屈折率が隣接媒体（たとえば基材や後述の付加層）の屈折率より大でなければならない。基材もしくは測定物質に向いた導波路層表面もしくは導波路層体積内には、回折格子が配置されている。回折格子は、型押し、ホログラフィまたはその他の方法によって基板内に形成することができる。次いでより高い屈折率を有する薄い導波路膜を回折格子の上表面に被覆する。回折格子は導波路層への入射光線を集束したり、既に導波路層内を導かれているモードを放出したり、そのモードの一部を進行方向へ透過させ、一部を反射させたりする機能を持つ。導波路層は、格子域を付加層でカバーしておく。付加層は必要に応じて多層膜とすることができる。この付加層は、測定物質に含まれている物質の選択的検知を可能にする機能を持たせることができる。好ましい態様として付加層の最表面に、検知機能を持つ層を設けることができる。このような検知機能を持つ層として、生理活性物質を固定化し得る層を用いることができる。
【０１０５】
別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表2007-501432）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。
【０１０６】
回折格子導波路は、回折格子導波路の上層（検知領域）上の生理活性物質検出を可能にするために、入射光線、および反射光を検出して屈折特性の変化を検出する。この目的のため、１つまたはそれより多くの光源（例えば、レーザ、ダイオード）及び１つまたはそれより多くの検出器（例えば、分光計、ＣＣＤカメラまたはその他の光検出器）を用いることができる。屈折率変化を測定するための方法として、２つの異なる動作モード−分光法、及び角度法がある。分光法においては、入射光として広帯域ビームが回折格子導波路に送られ、反射光が集められて、例えば分光計で測定される。共鳴波長（ピーク）のスペクトル位置を観測することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。また、角度法においては、公称上単一波長の光がある範囲の照射角を生じるように集束されて、回折格子導波路内に向けられる。反射光がＣＣＤカメラまたはその他の光検出器によって測定される。回折格子導波路によって反射された共鳴角の位置を測定することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。
【０１０７】
以下の実施例により、本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１０８】
以下の実験は、特願２００６−１６７８５５号明細書の段落００２５から００４９と図１から図８に記載の装置を用いて行った。具体的には、以下の装置である。
【０１０９】
本実施形態のスクリーニング装置としてのバイオセンサー１０は、金属膜の表面に発生する表面プラズモンを利用して、生理活性物質Ｄと化合物との相互作用を測定する、いわゆる表面プラズモンセンサーである。本実施形態では、このバイオセンサー１０を、生理活性物質Ｄと特異的に結合する化合物を大量の化合物Ａの中から選別するために使用される。
【０１１０】
図１に示すように、バイオセンサー１０は、トレイ保持部１２、搬送部１４、容器載置台１６、液体吸排部２０、光学測定部５４及び制御部６０を備えている。
【０１１１】
トレイ保持部１２は、載置台１２Ａ及びベルト１２Ｂを含んで構成されている。載置台１２Ａは、矢印Ｙ方向に架け渡されたベルト１２Ｂに取り付けられており、ベルト１２Ｂの回転により矢印Ｙ方向に移動可能とされている。載置台１２Ａ上には、２枚のトレイＴが位置決めして載置される。トレイＴには、センサースティック４０が８本収納されている。センサースティック４０は、生理活性物質Ｄが固定されるチップであり、詳細については後述する。載置台１２Ａの下には、センサースティック４０を後述するスティック保持部材１４Ｃの位置まで押し上げるための押上機構１２Ｄが配置されている。
【０１１２】
センサースティック４０は、図２及び図３に示すように、誘電体ブロック４２、流路部材４４、及び、保持部材４６、で構成されている。
【０１１３】
誘電体ブロック４２は、光ビームに対して透明な透明樹脂等で構成されており、断面が台形の棒状とされたプリズム部４２Ａ、及び、プリズム部４２Ａの両端部にプリズム部４２Ａと一体的に形成された被保持部４２Ｂを備えている。プリズム部４２Ａの互いに平行な２面の内の広い側の上面には、金属膜５７が形成されている。誘電体ブロック４２は、いわゆるプリズムとして機能し、バイオセンサー１０での測定の際には、プリズム部４２Ａの対向する互いに平行でない２つの側面の内の一方から光ビームが入射され、他方から金属膜５７との界面で全反射された光ビームが出射される。
【０１１４】
金属膜５７の表面には、図４に示すように、リンカー層５７Ａが形成されている。リンカー層５７Ａは、生理活性物質Ｄを金属膜５７上に固定化するための層である。
【０１１５】
プリズム部４２Ａの両側面には、上側の端辺に沿って保持部材４６と係合される係合凸部４２Ｃが形成されている。また、プリズム部４２Ａの下側には、側端辺に沿って図示しない搬送用レールと係合されるフランジ部４２Ｄが形成されている。
【０１１６】
図３に示すように、流路部材４４は、６個のベース部４４Ａを備え、ベース部４４Ａの各々に４本の円筒部材４４Ｂが立設されている。ベース部４４Ａは、３個のベース部４４Ａ毎に、立設された円筒部材４４Ｂのうちの１本の上部が連結部材４４Ｄによって連結されている。流路部材４４は、軟質で弾性変形可能な材料、例えば非晶質ポリオフィレンエラストマーで構成されている。
【０１１７】
ベース部４４Ａには、図５及び図６に示すように、底面側に略Ｓ字状の２本の流路溝４４Ｃが形成されている。流路溝４４Ｃは、端部の各々が１の円筒部材４４Ｂの中空部と連通されている。ベース部４４Ａは、底面が誘電体ブロック４２の上面と密着され、流路溝４４Ｃと誘電体ブロック４２の上面との間に構成される空間と前記中空部とで、液体流路４５が構成される。１個のベース部４４Ａには、２本の液体流路４５が構成される。各々の液体流路４５において、円筒部材４４Ｂの上端面に液体流路４５の出入口４３が構成される。
【０１１８】
ここで、２本の液体流路４５のうち、１本は測定流路４５Ａとして用いられ、他の１本は参照流路４５Ｒとして用いられる。測定流路４５Ａの金属膜５７上には生理活性物質Ｄが固定され、参照流路４５Ｒの金属膜５７上には生理活性物質Ｄが固定されない状態で測定が行われる。測定流路４５Ａ及び参照流路４５Ｒには、図５に示すように、各々光ビームＬ１、Ｌ２が入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、ベース部４４Ａの中心寄りに配置されるＳ字の屈曲部分に照射される。以下、流路４５Ａにおける光ビームＬ１の照射領域を測定領域Ｅ１、流路４５Ｒにおける光ビームＬ２の照射領域を参照領域Ｅ２という。参照領域Ｅ２は、生理活性物質Ｄの固定された測定領域Ｅ１から得られるデータを補正するための測定を行う領域である。
【０１１９】
保持部材４６は、長尺とされ、上面部材４７及び２枚の側面板４８が蓋状に構成された形状とされている。側面板４８には、誘電体ブロック４２の係合凸部４２Ｃと係合される係合孔４８Ｃ、及び、光ビームＬ１、Ｌ２の光路に対応する部分に窓４８Ｄが形成されている。保持部材４６は、係合孔４６Ｃと係合凸部４２Ｃとが係合されて、誘電体ブロック４２に取り付けられる。なお、流路部材４４は、後述するように保持部材４６と一体成形されており、保持部材４６と誘電体ブロック４２の間に配置される。
【０１２０】
上面部材４７には、流路部材４４の円筒部材４４Ｂに対応する位置に、受部４９が形成されている。受部４９は、図４に示すように、略円筒状とされ、中空の下部分に円筒部材４４Ｂが配置されている。また、前記中空の円筒部材４４Ｂよりも上側に、出入口４３と連通する凹部４９Ａが構成されている。凹部４９Ａには、ピペットチップ５０が挿入される。
【０１２１】
保持部材４６は、流路部材４４よりも硬質の材料、例えば、晶質ポリオフィレンで構成されている。
【０１２２】
ピペットチップ５０は、図６に示すように、略錐筒状とされ、先端部５１、本体部５２、及び保持部５３で構成されている。先端部５１は円筒状とされ、挿入方向の最先端に液体を吐出または吸入する開口５１Ａが構成されている。本体部５２は、先端部５１より外周が大径の錐筒状とされ、先端部５１との間に外周段差部５２Ａが構成されている。外周段差部５２Ａは、先端部５１側が小径のテーパー状とされている。保持部５３は、本体部５２よりも外周が大径とされ、本体部５２との間に保持段差部５３Ａが構成されている。保持段差部５３Ａは、不図示の保持孔の構成された上面板を有するピペットチップストッカにピペットチップ５０を保持する際に用いられる部分である。
【０１２３】
受部４９の凹部４９Ａは、流路部材４４側の第１内壁部４９Ｂ及び、第２内壁部４９Ｃで囲まれて構成されている。第１内壁部４９Ｂは、ピペットチップ５０の挿入方向Ｚが、ピペットチップ５０の先端部５１よりも僅かに長く、先端部５１の外径よりも僅かに大径とされ、先端部５１に沿った形状とされている。
【０１２４】
第２内壁部４９Ｃは、第１内壁部４９Ｂとの間の内周段差部４９Ｄ、内周段差部４９Ｄと隣接する中央内壁部４９Ｅ、最上部の上部内壁部４９Ｆで構成されている。内周段差部４９Ｄは、第１内壁部４９Ｂから連続され、ピペットチップ５０の外周段差部５２Ａに沿って上方が大径となるテーパー状とされている。中央内壁部４９Ｅは、内周段差部４９Ｄと連続され、ピペットチップ５０の上方が大径となるテーパー状とされている。上部内壁部４９Ｆは、中央内壁部４９Ｅと連続され、ピペットチップ５０の上方がさらに大径となるテーパー状とされている。
【０１２５】
保持部材４６と流路部材４４とは、同一金型内で異材料同士を組み合わせて成形する、いわゆる二色成形法（ダブルモールド）によって一体成形されている。
【０１２６】
図１に示すように、バイオセンサー１０の搬送部１４は、上部ガイドレール１４Ａ、下部ガイドレール１４Ｂ、及び、スティック保持部材１４Ｃ、を含んで構成されている。上部ガイドレール１４Ａ及び下部ガイドレール１４Ｂは、トレイ保持部１２及び光学測定部５４の上部で、矢印Ｙ方向と直交する矢印Ｘ方向に水平に配置されている。上部ガイドレール１４Ａには、スティック保持部材１４Ｃが取り付けられている。スティック保持部材１４Ｃは、センサースティック４０の両端部の被保持部４２Ｂを保持可能とされていると共に、上部ガイドレール１４Ａに沿って移動可能とされている。スティック保持部材１４Ｃに保持されたセンサースティック４０の係合溝４２Ｅと下部ガイドレール１４Ｂとが係合され、スティック保持部材１４Ｃが矢印Ｘ方向に移動することにより、センサースティック４０が光学測定部５４上の測定部５６に搬送される。また、測定部５６には、測定時にセンサースティック４０を押さえる押さえ部材５８が備えられている。押さえ部材５８は、図示しない駆動機構によりＺ方向に移動可能とされ、測定部５６に配置されたセンサースティック４０を上側から押圧する。
【０１２７】
容器載置台１６には、アナライト溶液プレート１７、バッファー液ストック容器１８、廃液容器１９が載置されている。アナライト溶液プレート１７は、マトリクス状に区画されており、各種のアナライト溶液がストックされている。バッファー液ストック容器１８は、複数の容器で構成されており、複数種類の異なる屈折率のバッファー液がストックされている。バッファー液ストック容器１８には、後述するピペットチップ５０を挿入可能な開口Ｋが形成されている。廃液容器１９は、複数の容器で構成されており、バッファー液ストック容器と同様にピペットチップ５０を挿入可能な開口Ｋが形成されている。
【０１２８】
液体吸排部２０は、図１に示すように、ヘッド２４、及び、吸排駆動部２６を含んで構成されている。ヘッド２４は、図示しない搬送レールに沿って矢印Ｙ方向（図１参照）に移動可能とされている。また、ヘッド２４は、ヘッド２４内部の図示しない駆動機構により、鉛直方向（矢印Ｚ方向）にも移動可能とされている。
【０１２９】
ヘッド２４での液体流路４５への液体の供給は、２本のピペットチップ５０を１つの液体流路４５の２つの開口へ各々挿入し、一方のピペットチップ５０から液体を吐出させると共に、他方のピペットチップ５０で液体流路４５中の液体を吸引することにより行われる。
【０１３０】
なお、本実施形態においてはセンサースティック４０への液体供給はピペットチップ５０により行われるが、ピペットチップの代わりに、一端が上記各溶液プレートに接続され、他端がセンサースティック４０に接続可能とされたインジェクションチューブを設け、送液ポンプにより液体の供給を行ってもよい。
【０１３１】
光学測定部５４は、図７に示すように、光源５４Ａ、第１光学系５４Ｂ、第２光学系５４Ｃ、受光部５４Ｄ、信号処理部５４Ｅを含んで構成されている。光源５４Ａからは、発散状態の光ビームＬが出射される。光ビームＬは、第１光学系５４Ｂを介して、２本の光ビームＬ１、Ｌ２となり、測定部５６に配置された誘電体ブロック４２の測定領域Ｅ１と参照領域Ｅ２に入射される。測定領域Ｅ１及び参照領域Ｅ２において、光ビームＬ１、Ｌ２は、金属膜５０と誘電体ブロック４２との界面に対して種々の入射角成分を含み、かつ全反射角以上の角度で入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、誘電体ブロック４２と金属膜５０との界面で全反射される。全反射された光ビームＬ１、Ｌ２も、種々の反射角成分をもって反射される。この全反射された光ビームＬ１、Ｌ２は、第２光学系５４Ｃを経て受光部５４Ｄで受光されて、各々光電変換され、光検出信号が信号処理部５４Ｅへ出力される。信号処理部５４Ｅでは、入力された光検出信号に基づいて所定の処理が行なわれ、測定領域Ｅ１の測定データＧ１及び参照領域Ｅ２の参照データＧ２が求められる。この測定データＧ１、参照データＧ２が制御部６０へ出力される。
【０１３２】
制御部６０は、バイオセンサー１０の全体を制御する機能を有し、図７に示すように、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ及びバイオセンサー１０の図示しない駆動系と接続されている。制御部６０は、図８に示すように、バスＢを介して互いに接続される、ＣＰＵ６０Ａ、ＲＯＭ６０Ｂ、ＲＡＭ６０Ｃ、メモリ６０Ｄ、及びインターフェースＩ／Ｆ６０Ｅを有し、各種の情報を表示する表示部６２及び、各種の指示、情報を入力するための入力部６４と接続されている。
【０１３３】
メモリ６０Ｄには、バイオセンサー１０を制御するための各種プログラムや、各種データが記憶されている。
【０１３４】
〔実施例１〕
（１）金表面基板の作成
6-ヒドロキシ-1-ヘキサンチオール（Aldrich社製）の2mM水溶液を作成した。次に、ゼオネックス（日本ゼオン社製）を射出成型して得られたプラスチックプリズムの上面に以下の方法で金薄膜を製膜した。スパッタ装置の基板ホルダにプリズムを取付け、真空（ベースプレッシャー1×10-3Pa以下）に引いてからArガスを導入し（1Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、基板ホルダにRFパワー（0.5kW）を約9分間印加してプリズム表面をプラズマ処理する。次に、Arガスを止めて真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（10〜40rpm）させながら、8inchのCrターゲットにDCパワー（0.2kW）を約30秒間印加して2nmのCr薄膜を成膜する。次に。Arガスを止めて再び真空に引き、Arガスを再び導入し、（0.5Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー（1kW）を約50秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜した。
【０１３５】
得られたAu薄膜を成膜した試料を、6-ヒドロキシ-1-ヘキサンチオール（Aldrich社製）の2mM水溶液に25℃16時間浸漬し、超純水で10回洗浄した。
【０１３６】
（２）解離性基を含有する親水性高分子修飾基板の作成
0.1重量％のCMD（名糖産業製：分子量100万）溶液4.95mlを溶解した後、全量反応した場合にカルボキシル基の2%が活性化される計算量のEDC（1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride）(0.4M) / NHS（N-hydroxysulfosuccinimide）(0.1M)混合溶液50μlを加え、室温で攪拌した。
【０１３７】
（１）で作成した試料の金表面側に、（２）で作成された活性エステル化されたCMD溶液を500μl滴下し、1000 rpmで45 秒スピンコートすることで、アミノ基を有する基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で1 時間反応させた後、0.1 N NaOHで5回、超純水で5回洗浄することで、解離性基を含有する親水性高分子修飾基板試料を得た。
【０１３８】
（３）ニュートラルアビジンの固定化
ＳＰＲ測定装置に、上記の試料をセットし、以下の手順でニュートラルアビジン（PIERCE社製）を固定化した。
酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を用いて、ニュートラルアビジン１００μｇ／ｍｌ溶液を調製した。次に、ランニングバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を添加し、ベースラインをとった。次に、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を添加し、７分間静置後、ランニングバッファーで洗浄した。次に、作成したニュートラルアビジン溶液を添加し３０分間静置後、ランニングバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した。次に、残存している活性エステル基をブロッキングするために、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液（１Ｍ，ｐＨ８．５）を添加し７分静置後、１０ｍＭ  ＮａＯＨランニングバッファーで３回洗浄、さらにランニングバッファーで３回洗浄した。
【０１３９】
（４）解離性基のブロッキング処理
上記のニュートラルアビジンを固定化した試料に対して、以下に示す解離性基のブロッキング処理を行う。このブロッキング処理の回数を表１に示すように実施し、試料１〜３を得た。
【０１４０】
ＳＰＲ測定装置に試料をセットし、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を添加し、７分間静置後、ランニングバッファーで洗浄した。次に、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液（１Ｍ，ｐＨ８．５）を添加し７分静置後、ランニングバッファーで３回洗浄した。
【０１４１】
（５）表面荷電の評価
酸性雰囲気下で、正荷電を示すKanamycinを用いて、以下の手順で上記試料表面の負荷電の量を相対評価した。
【０１４２】
上記のニュートラルアビジンを固定化した試料をＳＰＲ測定装置にセットし、酢酸バッファー（pH5.0）を添加し、ベースラインをとった。続いて、０.１mg/mlの濃度のKanamycin溶液（酢酸バッファー（pH5.0）に溶解）を添加し、２分間静置した。最初のベースラインからの信号変化分を表面の荷電量（ＲＵ）とした。試料１に対する荷電量を１として、試料２、３の荷電量を相対値として表１に記載した。
【０１４３】
（６）カルボニックアンハイドラーゼのビオチン化
カルボニックアンハイドラーゼ（Bovine由来、SIGMA製）を以下の手順でビオチン化した。2mg/ml カルボニックアンハイドラーゼの1×PBS(pH7.4)溶液が0.5ml入った1.5mlマイクロチューブに0.045mg/ml SNHS-LC-LC-Biotin(PIERCE製) の1×PBS(pH7.4)溶液0.5mlを4℃で加え、4℃で2時間反応させた。反応液をマイクロチューブ上に載せたMicroconフィルター(Millipore製YM-10)に0.5ml入れ、4℃/14000g/60分遠心させた。マイクロチューブに落ちた溶液を捨て、フィルター上に0.2mlの1×PBS(pH7.4)を入れ、4℃/14000g/30分遠心させた。マイクロチューブに落ちた溶液を捨て、フィルター上に0.2mlの1×PBS(pH7.4)を入れ、4℃/14000g/30分遠心させた。フィルターを上下反転させて新しいマイクロチューブにセットし、4℃/1000g/3分遠心させてフィルター上に残った溶液を回収した。更にフィルターに0.1mlの1×PBS(pH7.4)を入れ、4℃/1000g/3分遠心させた。回収した溶液を合わせ、ビオチン化カルボニックアンハイドラーゼ溶液を得た。Microconフィルター操作により、未反応のビオチン化試薬が除かれる。カルボニックアンハイドラーゼ１分子に対して約１分子のビオチン化試薬が修飾された（ビオチン化比率約１）。蛋白の回収率はおよそ70％であった。
【０１４４】
（７）ビオチン化カルボニックアンハイドラーゼの固定化
上記の試料１〜３に対して、以下の手順でビオチン化カルボニックアンハイドラーゼを固定化した。
ランニングバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を添加し、ベースラインをとった。次に、作成したビオチン化カルボニックアンハイドラーゼ溶液を添加し３０分間静置後、ランニングバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した。最初のベースラインからの信号変化分をビオチン化カルボニックアンハイドラーゼの固定量（ＲＵ）とした。試料１に対するビオチン化カルボニックアンハイドラーゼの固定量を１として、試料２、３に対して固定化したビオチン化カルボニックアンハイドラーゼの固定量を相対値として表１に記載した。
【０１４５】
（８）ベースライン変動の測定
ビオチン化カルボニックアンハイドラーゼを固定化した試料１〜３に対して、以下の手順でベースラインの変動を測定した。
ランニングバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を添加しベースライン値（ＲＵ）を記録した。そのまま静置して１０分後に再度ベースライン値（ＲＵ）を記録した。そのベースライン値の差をベースライン変動値とし、表１に記載した。
【０１４６】
ベースライン変動値（ＲＵ）＝１０分後のベースライン値（ＲＵ）−初期のベースライン値（ＲＵ）
１０分間のベースライン変動が５ＲＵを超えると、低分子検体の結合測定に大きな支障をきたす。
【０１４７】
（９）低分子検体の結合測定
ビオチン化カルボニックアンハイドラーゼを固定化した試料１〜３に対して、以下の手順でIndapamide（SIGMA製）の結合測定を行った。Indapamideは、カルボニックアンハイドラーゼに特異的に結合することが知られている低分子阻害剤である。まず、ランニングバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＤＭＳＯ １０容量％）を調整した。ランニングバッファーで、Indapamideが１０μＭになるように溶解した。
【０１４８】
表面プラズモン共鳴測定装置に、ビオチン化カルボニックアンハイドラーゼを固定化した試料１〜３をセットし、ランニングバッファーを添加し、ベースラインをとった。次に、調製したIndapamide溶液を添加して１０分間静置し、さらにランニングバッファーを添加した直後の信号変化（ＲＵ）を記録した。以下の式によりIndapamide結合量（ＲＵ）を算出し、表１に記載した。
Indapamide結合量（ＲＵ）＝洗浄後の信号値（ＲＵ）−初期のベースライン値（ＲＵ）
【０１４９】
【表１】
2008209378.tif 000010
【０１５０】
表１の結果から、試料１はマイナスのベースライン変動が極めて大きく、低分子検体の結合検出が困難なことがわかる。このベースライン変動は、ビオチン化カルボニックアンハイドラーゼが、試料１表面の多量のカルボキシル基が原因で非特異吸着しており、それが徐々に解離するために起こるものと推測される。本発明の試料２、３では、マイナスのベースライン変動は極めて小さく、低分子検体の結合検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】本実施形態にかかるバイオセンサーの全体斜視図である。
【図２】本実施形態にかかるセンサースティックの斜視図である。
【図３】本実施形態のセンサースティックの分解斜視図である。
【図４】本実施形態のセンサースティックの１の液体流路部分の断面図である。
【図５】本実施形態のセンサースティックの測定領域、参照領域へ光ビームが入射している状態を示す図である。
【図６】本実施形態にかかるピペットの斜視図である。
【図７】本実施形態にかかるバイオセンサーの光学測定部付近の概略図である。
【図８】本実施形態にかかる制御部とその周辺の概略ブロック図である。
【符号の説明】
【０１５２】
１０ バイオセンサー
４０ センサースティック
５４ 光学測定部
６０Ｄ  メモリ
６０ 制御部
Ｄ 生理活性物質
Ｇ１ 測定データ
Ｇ２ 参照データ
【図１】
2008209378.tif 000011
【図２】
2008209378.tif 000012
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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