(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉのゲノムに由来する核酸配列の提供、及びその使用に関する。【解決手段】上記の特定配列は、サルモネラ属細菌による培養ＨｅＬａ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染活性に必要な遺伝子情報の全部又は一部を含むことを特徴とする。該遺伝子配列は、サルモネラ属細菌を含む疑いのあるサンプル、食料品におけるサルモネラ属細菌の存在のin vitro診断のためのプローブ、プライマーとして有用であり、本遺伝子配列を含む検出キットも提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルモネラ属の細菌をin vitro検出するためのプローブおよび／またはプライマーとして使用し得る単離された核酸であって、６５℃のＤｅｎｈａｒｄｔ液中６×ＳＳＣ中で、下記ヌクレオチド鎖（Ｉ）
【化１】
2008220376.tif 000005
を含むチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２株由来の７．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとハイブリダイズし得ることを特徴とする前記核酸。
【請求項２】
６５℃のＤｅｎｈａｒｄｔ液中６×ＳＳＣ中で、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２株由来のヌクレオチド鎖（Ｉ）を含む２ｋｂのＳａｃＩフラグメントとハイブリダイズし得ることを特徴とする請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
６５℃のＤｅｎｈａｒｄｔ液中６×ＳＳＣ中で、下記ヌクレオチド鎖（Ｉ）
【化２】
2008220376.tif 000006
とハイブリダイズし得ることを特徴とする請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項４】
約２００乃至５００ヌクレオチドから成るプローブとして使用される請求項１乃至３のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項５】
約１０乃至３０ヌクレオチドから成るプライマーとして使用される請求項１乃至３のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項６】
サルモネラ属の細菌を含む可能性がある生物サンプル中の当該細菌の存在をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出する方法であって、ａ）６５℃のＤｅｎｈａｒｄｔ液中６×ＳＳＣ中で当該サンプルと請求項１乃至４のいずれか１項に記載の核酸を接触させる工程、およびｂ）当該核酸と生物サンプル中の検出すべき核酸配列との間で形成されたハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項７】
工程ａ）の前にサンプルを培養することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）の前に、請求項５に記載の核酸からなるプライマー対を用いて検出すべき核酸配列のコピー数を増幅することを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
検出すべき核酸を増幅する工程が、
１）生物サンプル中に存在する可能性があるサルモネラ属の細菌のゲノムから検出すべき核酸を抽出する工程、および
２）‐  工程１）において抽出された二本鎖核酸を変性させて一本鎖核酸を得る工程、
‐  上記変性工程で得られた核酸鎖を請求項５に記載の核酸から成るプライマー対と接触させて、当該プライマーが当該核酸鎖にハイブリダイズすることを可能とする工程、および
‐  ＤＮＡポリメラーゼおよび適当な量の４種類のヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下でプライマーがハイブリダイズされる鎖に相補的なＤＮＡを形成し、前記変性段階よりも多数の検出すべき二重鎖核酸を形成する工程を含む増幅サイクルを行う工程
を含み、生物サンプル中に当該核酸が存在する場合には当該核酸が検出できる十分な量で検出されるようにこのサイクルを所定回数反復することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抽出された核酸がＲＮＡの形態である場合には、工程１）が逆転写酵素を用いて当該核酸を処理する工程を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
サルモネラ属の細菌を含む可能性がある生物サンプル中の当該細菌の存在を検出するためのキットであって、
‐  少なくとも一対の請求項５に記載の核酸から成るプライマー、および
‐  検出される核酸とハイブリダイズすることが可能な、標識されていてもよい請求項１乃至４のいずれかに記載の１または２以上の核酸を含むことを特徴とする前記キット。
【請求項１２】
当該生物サンプルを培養するのに適した培地を更に含む請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
増幅サイクルを実施するのに適した試薬、特にＤＮＡポリメラーゼおよび適当な量の４種類のヌクレオシド三リン酸を更に含む請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記プローブと検出すべき核酸配列とのハイブリダイゼーション反応を実施するために適当な試薬を更に含む請求項１０乃至１３のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
当該ベクターの複製に必要な部位のうちの１つの中に、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の核酸の少なくとも１つを含む組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の核酸の前に、その制御下に前記単離された核酸の転写が可能となるプロモーターが存在する請求項１５に記載の組換えベクター。
【請求項１７】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の核酸の後に転写終結シグナルをコードする配列が存在することを特徴とする請求項１６に記載の組換え核酸。
【請求項１８】
前記プロモーターが誘導可能なプロモーターである請求項１６または１７に記載の組換えベクター。
【請求項１９】
前記ベクターがプラスミド、コスミドまたはファージである請求項１５乃至１８のいずれかに記載の組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉのゲノムに由来する核酸配列、及び特にサルモネラ属の細菌を含む疑いのある生物学的サンプル、より特定的には食料品における該細菌の存在のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断のためのその使用に係る。
【０００２】
食料品は現在ますます重要になっている。社会的な理由により、すぐに消費できるような加工食品は購入者側からの需要が増加し続けている。その結果、これらの製品の製造源及び外観はここ１５年間に著しく変化している（専門工場における大量生産、一般にプラスチックフィルムで包装した単位販売）。
【０００３】
公衆衛生上の理由から、製造技術及び製品自体は衛生監視が次第に厳しくなっている。細菌検査の範囲では、食品毒物感染に関与する細菌が定期的に検査され、このような細菌としてはまず第１にサルモネラ菌を挙げることができる。また、衛生基準はこの細菌属に関して非常に明確であり、製品２５ｇ中にサルモネラ菌が存在しないことを規定している。
【０００４】
分類学の観点からみると、サルモネラ属は腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科に属する。この属はＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａただ１種からなり、この種は７種の亜種に細分され得る。これらの亜種の各々では、多糖Ｏ抗原及び鞭毛Ｈ抗原に対する血清により多数の血清型を個体化することができる。１９８９年の時点で２２６７種のサルモネラ血清型が知られている。
【０００５】
サルモネラ菌はヒト及び動物の病原体である腸内侵入性細菌である。その病原能は腸管上皮に侵入する能力に結び付けられる。この段階は粘膜に制限されることもある（例えば毒物感染の場合）し、全身散在を伴うこともある（腸チフス熱の場合）。サルモネラ菌の宿主侵入は、非常に多くの場合は口腔経路で行われる。従って、サルモネラ菌は生物学的サンプルの細菌検査の範囲で定期的に検査される。
【０００６】
仏国規格協会（ＡＦＮＯＲ）により推奨されているサルモネラ菌の定期検査参考方法は、２種類の異なる温度でインキュベートし且つ２種類の異なる選択培地上で単離した２種類の異なる濃化培地で被験物質を培養させる段階（この段階はしばしば普通ブイヨン中の「蘇生」段階後に実施される）と、迅速同定培地に６個以上のコロニーを移す段階と、最後に株を血清学的に型別する段階とを含む。公式鑑定時にはＡＮＦＯＲプロトコルに忠実に従わなければならないとしても、試験を実施するために必要な時間（最低１週間）と費用との理由からこのプロトコルを定期検査時に適用するのは困難であると考えられる。
【０００７】
サルモネラ菌の新規検査方法は酵素試験又は核酸プローブを使用することにより行われる。いずれの場合も普通培地中の培養段階及び濃化培地中のサブ培養が推奨され、即ちこれらの段階が不可欠であることに留意すべきである。  モノクローナル抗体を使用する免疫酵素試験は容易に実施することができ、４〜６時間以内に結果が得られ、費用も許容可能である。その大きな欠点は、陽性誤反応が頻発し、陰性誤反応も発生し得ることである。これらの誤反応の結果はどちらの場合も重要であり、陽性誤反応の場合には、製品を押収し、実際には存在しないサルモネラを単離するためのプロセスを分析実験室により開始することになり、陰性誤反応の場合には、製品は公衆衛生に危険を孕んだまま販売される。
【０００８】
２５０個のサルモネラ株とサルモネラ属に属さない７５個の株とで最近行われた研究によると、陽性誤反応は１７株、陰性誤反応は２株に達した（Ｄ’ＡＯＵＳＴ，Ｊ．Ｙ．（１９８７）：“Ｅｆｆｉｃａｃｉｔｅ  ｄｅ  ｌａ  ｔｒｏｕｓｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｑｕｅ  ＢＩＯＥＮＺＡＢＥＡＤ  ｐｏｕｒ  ｌｅ  ｄｅｐｉｓｔａｇｅ  ｄｅ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．ｄａｎｓ  ｌｅｓ  ａｌｉｍｅｎｔｓ”，Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  ｅｔ  Ａｌｉｍｅｎｔｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  Ｒａｐｉｄｅ，Ｃｏｎｔｒｏｌｅ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｌ．Ｃｏｌｌｏｑｕｅ  ｄｅ  ｌａ  Ｓｏｃｉｅｔｅ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｐａｒｉｓ）。この試験は純粋培養物で実施されたので、誤反応の数は多菌性製品ではもっと多いと予想することができる（微生物競合；交差抗原反応の危険）。
【０００９】
核酸プローブはゲノムＤＮＡフラグメントにより構成される（ＦＩＴＴＯ，Ｒ．ら（１９８３），“ＤＮＡ−ＤＮＡ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ”，Ｉｎ  Ｆｏｏｄｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４６，１１４６−１１５１）。核酸プローブは特異的であるとみなされる。数種類のツール（又はキット）が市販されている。実際にこれらのプローブは、使用者により報告された結果によると特異性がないこと（例えばＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒとの交差反応）と、感度が低い（検出限界閾値：サルモネラ１０５個、ある著者によると２．５μｇのＤＮＡは約１０７個の細菌に対応する）という２つの大きな欠点がある。
【００１０】
本発明は特定的には、サルモネラ菌検出用核酸プローブとして使用可能な核酸配列に係り、これらのプローブはサルモネラ属に完全に特異的である（他の細菌、特にＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属との間で交差反応を生じない）。
【００１１】
本発明は更に、サルモネラ菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出又は定量法におけるこれらの核酸プローブの使用に係り、この使用は、高感度であり、応答が迅速であり、４８時間以内、更には２４時間以内に分析結果を得ることができ、特に放射性物質を使用せずに容易に実施でき、費用が妥当であるという利点を有する。
【００１２】
サルモネラ亜種ｅｎｔｒｉｃａ血清型Ｔｙｐｈｉ（以下の文中ではＴｙｐｈｉと呼称する細菌）はヒト腸チフス熱の作用物質である。この細菌は厳密にヒトの病原体である。口腔経路による侵入後、Ｔｙｐｈｉは腸管関門を通って遺伝子系により腸間膜動脈神経節に到達し、腸管粘膜の上皮細胞に付着して浸透する。実験モデルがないので、この第１感染段階はＴｙｐｈｉが付着及び浸透することが可能な培養ＨｅＬａ細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏ検査される。
【００１３】
本発明は特定的には、サルモネラ属の細菌による培養ＨｅＬａ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染活性に必要な遺伝情報の全部又は一部を含むことを特徴とする全核酸配列に係る。
【００１４】
本発明はより特定的には、図１に示す配列の制限地図上にＨ１及びＨ２により示す２つのＨｉｎｄＩＩＩ部位により画成される７．９ｋｂの配列の全部又は一部を含む前記のような全核酸配列に係る。
【００１５】
本発明の核酸配列はより特定的には、前記のような特徴を有しており、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅ  ｌ’Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＰａｓｔｅｕｒにＣＩＰ  ５５−３５で寄託されたＴｙｐｈｉのＴｙ２株のゲノムに由来する核酸配列である。
【００１６】
本発明はより特定的には前記Ｔｙ２株のゲノムに由来する全核酸配列に係り、この配列は前記遺伝情報の全部又は一部を含み、図１に示す制限地図上の２つのＳａｃＩ部位Ｓ１及びＳ２により画成される２ｋｂの配列の全部又は一部を含む。
【００１７】
より一般的には、本発明はサルモネラ属の細菌による培養ＨｅＬａ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染活性に必要な遺伝情報の全部又は一部を含み、ストリンジェント条件下で前記核酸の少なくとも１種の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能な全核酸配列に係る。これらのストリンジェント条件は、Ｄｅｎｈａｒｄｔ培地（０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ；０．０１％ポリビニルピロリドン；０．１％ウシ血清アルブミン）中、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．０１５Ｍ  クエン酸三ナトリウム、ｐＨ７から構成される）中で６５℃で１８時間の条件である。
【００１８】
本発明は更に、前記核酸配列の１種に含まれるか、又は前記ハイブリダイゼーション条件下でこれらの配列の１種とハイブリダイズすることが可能であり、サルモネラ属の細菌、より特定的には生物中で腸管粘膜の上皮細胞に付着及び浸透することが可能なＴｙｐｈｉのような病原サルモネラ菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法の実施のためのプローブとして使用可能な全核酸配列に係る。
【００１９】
有利には、本発明の核酸プローブは約２００〜５００ヌクレオチドの連続から構成される。
【００２０】
この点で本発明はより特定的には以下のヌクレオチド配列（Ｉ）：
【００２１】
【化３】
2008220376.tif 000002
を有する核酸プローブに係る。
【００２２】
本発明は更に、前記核酸配列の１種に含まれるか又は前記ハイブリダイゼーション条件下でこれらの配列の１種とハイブリダイズすることが可能であり、本発明の核酸配列の１種の遺伝子増幅用核酸プライマーとして使用可能な全核酸配列にも係る。
【００２３】
有利には、本発明の核酸プライマーは約１０〜３０ヌクレオチドの連続から構成される。
【００２４】
遺伝子増幅法は、特に高感度のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断法に到達するために非常に有利である。これらの遺伝子増幅法のうちでは、１９８６年３月２７日付けヨーロッパ特許出願第８６／３０２，２９８．４号及び１９８７年１月９日付けヨーロッパ特許出願第８７／３００．２０３．４号に記載されているようなＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法や、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６，ｐａｇｅ  １１９７（１９８８年１０月）に記載されている所謂「Ｑβレプレカーゼ」法及び国際特許出願第ＷＯ８９／０１０５０号れに記載さているＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡ  ポリメラーゼ）を用いる方法を挙げることができる。これらの方法はウイルス又は細菌の核酸の検出感度を改善することができ、特異的合成プライマーの使用を必要とする。
【００２５】
この点で本発明はより特定的には、本発明のヌクレオチド配列（Ｉ）の２６及び４６９位に位置するヌクレオチドにより画成される核酸配列のコピー数の増幅のために使用可能な核酸配列ＳＳ−１及びＳＳ−２：
【００２６】
【化４】
2008220376.tif 000003
に係る。
【００２７】
前記条件下で核酸配列（Ｉ）又は前記核酸プライマーＳＳ−１及びＳＳ−２とハイブリダイズする限り、所定の局在突然変異を含むこれらの核酸配列（Ｉ）又はプライマーの変異核酸も本発明の一部を形成する。
【００２８】
本発明は更に、汎用遺伝子コードに従い、本発明の核酸配列に対応する全ペプチド又はポリペプチドにも係る。
【００２９】
この点で本発明はより特定的には、以下のアミノ酸配列（ＩＩ）：
【００３０】
【化５】
2008220376.tif 000004
の全部又は一部により構成される全ポリペプチドに係り、この配列は汎用遺伝子コードに従い、前記核酸配列（Ｉ）に対応する。
【００３１】
当然のことながら、本発明のポリペプチド、より特定的には前記ペプチド配列（ＩＩ）又は該配列に由来するペプチドサブ配列の１又は複数のアミノ酸の置換及び／又は付加及び／又は抑圧による修飾産物である全ペプチド配列も、この修飾が該ポリペプチドの抗原特性を変えない限り、本発明の範囲に含まれる。
【００３２】
本発明は更に、本発明のポリペプチドを特異的に認識し且つこれらのポリペプチドとの免疫複合体を形成することが可能なポリクローナル又はモノクローナル抗体にも係る。
【００３３】
本発明のポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドで動物を免疫感作後、形成された抗体を回収することにより得られる。
【００３４】
本発明のモノクローナル抗体は、本発明の精製ポリペプチドの１種で免疫感作した動物、特にマウス又はラットの脾細胞と、適切なミエローマ細胞系の細胞とから従来方法により形成され得且つ動物の免疫感作に最初に使用されたポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を産生する能力により選択され得る全ハイブリドーマにより産生される。
【００３５】
本発明は更に、サルモネラ属の細菌を含む疑いのある生物学的サンプル中における該細菌の存在のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法（又は診断方法）にも係り、該方法は、任意段階としてサンプルを培養する段階と、任意段階として前記のような１対の核酸プローブにより検出すべき核酸配列のコピー数を増幅する段階と、前記ハイブリダイゼーション条件下でサンプルを前記のような核酸プローブと接触させる段階と、前記プローブと検出すべき核酸配列との間にハイブリダイゼーション複合体が形成された場合にはこの複合体を検出する段階とを含むことを特徴とする。
【００３６】
生物学的サンプルを培養する段階は、生物学的サンプル２５ｇを１リットル容三角フラスコ中で普通培地２００ｍｌ中で１８時間３７℃で撹拌下に行うと有利である。
【００３７】
前記方法において検出すべき核酸配列を増幅する段階は有利には、一方では生物学的サンプル中に場合により存在するサルモネラ属の細菌のゲノムに属する検出すべき核酸を抽出し、該核酸がＲＮＡ形態である場合には該核酸を逆転写酵素により処理する段階を含み、他方では、検出すべき二重鎖核酸を有利には９４℃で１２０秒間変性させ、一重鎖核酸を形成する段階と、前記変性段階時に得られた核酸鎖を前記のような少なくとも１対のプライマーと有利には６８℃で１８０秒間接触させることにより、前記核酸鎖の各々を少なくとも１個の前記プライマーとハイブリダイズさせることにより再会合させる段階と、ＤＮＡポリメラーゼと適量の異なる４種のヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）との存在下で有利には７２℃で９０秒間、プライマーがハイブリダイズされる鎖に相補的なＤＮＡをプライマーから形成することにより伸長させ、前記変性段階よりも多数の検出すべき二重鎖核酸を形成する段階とを含むサイクルを含み、このサイクルは、前記検出すべき核酸配列が生物学的サンプル中に存在する場合には該核酸配列を検出できるように十分な割合で回収するように所定回数（好ましくは２０〜３０回）反復される。
【００３８】
プローブと場合により前記核酸プライマーとを使用することによりサルモネラの特徴的核酸配列を増幅及び／又は検出する他の方法も、本発明の範囲で使用可能である。例えば、国際特許出願第ＷＯ／０６７００号又はヨーロッパ特許出願第０３５７３３６号に記載の方法を挙げることができる。
【００３９】
本発明は更に、前記のようなサルモネラ属の細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法を実施するためのキットに係り、これらのキットは、任意要素として生物学的サンプルを培養するために適切な培地と、少なくとも１対の前記核酸プライマーと、任意要素として増幅サイクルを実施するのに適切な試薬、特にＤＮＡ（又はＲＮＡ）ポリメラーゼ及び適量の異なる４種の三リン酸ヌクレオシドと、検出すべき核酸配列とハイブリダイズすることが可能な、場合により標識された１（又は複数）の前記核酸プローブと、前記プローブ及び検出すべき核酸の間でハイブリダイゼーション反応を生じるために適切な試薬と、前記プローブとハイブリダイズすることが可能な核酸配列を欠失する参照生物組織又は体液とを含む。
【００４０】
本発明は更に、サルモネラ属の細菌を含む疑いのある生物学的サンプル中における該細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法に係り、該方法は、任意段階として生物学的サンプルを前記のように培養する段階と、任意段階として汎用遺伝子コードに従い、検出すべきポリペプチドに対応する核酸配列のコピー数を増幅する段階（この増幅は前記増幅サイクルに従って実施される）と、検出すべきポリペプチドとの間に免疫複合体を形成することが可能な本発明の抗体に前記サンプルを接触させる段階と、前記抗体と検出すべきペプチド配列との間に免疫複合体が形成された場合には該複合体を検出する段階とを含むことを特徴とする。
【００４１】
本発明は更に、前記検出方法を実施するためのキットにも係り、該キットは、任意要素として生物学的サンプルを培養するために適切な培地と、任意要素として１対の前記プライマー、増幅サイクルを実施するために適切な試薬、特にＤＮＡ（又はＲＮＡ）ポリメラーゼ及び適量の４種の異なるヌクレオシド三リン酸と、場合により特に放射性同位体又は酵素で標識され、検出すべきペプチド配列を有するポリクローナル又はモノクローナル抗体と、前記抗体及びペプチド配列間で免疫反応を生じるために適切な培地を構成するための試薬と、前記免疫反応時に形成された免疫複合体を検出することができ、同様にマーカーを担持するか又は標識試薬により認識され得る試薬と、前記抗体により認識され得るポリペプチドを欠失する参照生物組織又は体液とを含む。
【００４２】
本発明は更に前記核酸配列の製造方法にも係り、該方法は、ｐＨ１２．５のソーダにより処理することによりＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ細菌から単離したゲノムＤＮＡをインキュベートする段階と、こうして抽出したＤＮＡを適切なエンドヌクレアーゼにより処理する段階と、こうして得られた核酸を適切なベクターにクローニングし、前記類から選択された適切なプローブにより所望の核酸を回収する段階とを含む。
【００４３】
本発明の核酸配列の特に有利な製造方法は、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４；２７４−３２５（１９８６）に記載されているβ−シアンエチルホスホラミジトの自動化方法を使用することによりＤＮＡを合成する段階と、こうして得られた核酸を適切なベクターにクローニングし、前記類から選択された適切なプローブとハイブリダイズすることにより核酸を回収する段階とを含む。
【００４４】
本発明のヌクレオチド配列の別の製造方法は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０；７４６１−７４６５，（１９８３）に記載の原理に従って天然ポリペプチドのアミノ酸配列に適合可能な配列を有する異なる制限部位を末端に備える化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアセンブリする段階と、こうして得られた核酸を適切なベクターにクローニングし、前記類から選択された適切なプローブとハイブリダイズすることにより所望の核酸を回収する段階とを含む。
【００４５】
本発明は更に、異種核酸に挿入された少なくとも１個の本発明の核酸配列を含む全組換核酸に係る。
【００４６】
本発明はより特定的には、本発明の核酸配列の転写を制御するプロモーター（特に誘導プロモーター）を本発明の核酸配列の前に有しており、場合により転写終結信号をコードする配列を本発明の核酸配列の後に有する前記のような組換核酸に係る。
【００４７】
本発明は、特に本発明の核酸配列をクローニングし、及び／又はこの配列によりコードされるポリペプチドを発現させるために使用される全組換ベクターに係り、該ベクターは、複製に非必須の部位の１つに前記のような組換核酸を含むことを特徴とする。
【００４８】
前記ベクターの例としては、プラスミド、コスミド又はファージを挙げることができる。
【００４９】
本発明は更に、前記型の組換ベクターにより細胞宿主を形質転換させ、その後、こうして形質転換された細胞宿主を培養し、ポリペプチドを培養培地から回収することにより、本発明のポリペプチドを製造する方法にも係る。
【００５０】
従って、本発明は前記のような組換ベクターにより形質転換され、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を発現させることが可能な調節成分を含む全細胞宿主に係る。
【００５１】
本発明はより特定的には本発明のポリペプチドの製造方法であって、任意段階として、一方のプライマーが該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の最初の１０〜３０個のヌクレオチドと同一であり且つ他方のプライマーが該ヌクレオチド配列の最後の１０〜３０個のヌクレオチドと相補的である（か又はこれらの最後の１０〜３０個のヌクレオチドとハイブリダイズする）ように、又は逆に一方のプライマーが前記配列の最後の１０〜３０個のヌクレオチドと同一であり且つ他方のプライマーが該核酸の最初の１０〜３０個のヌクレオチドと相補的である（か又は最初の１０〜３０個のヌクレオチドをハイブリダイズする）ように選択された２種のＤＮＡプライマーにより該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の量を増幅し、その後、こうして増幅した前記ヌクレオチド配列を適切なベクターに導入する段階と、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸を含む適切なベクターにより予め形質転換された細胞宿主を適切な培養培地で培養する段階と、形質転換された該細胞宿主により産生されたポリペプチドを前記培養培地から回収する段階とを含む方法に係る。
【００５２】
本発明のペプチドは、ペプチド合成分野で従来技術により製造することができる。この合成は均質溶液又は固相で実施され得る。
【００５３】
例えば、Ｅ．Ｗｕｎｓｃｈ編“Ｍｅｔｈｏｄｅ  ｄｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ”，ｖｏｌ．１５−Ｉ及びＩＩ．，ＴＨＩＥＭＥ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ  １９７４にＨＯＵＢＥＮＷＥＹＬにより記載されている均質溶液合成方法を利用する。
【００５４】
この合成方法は、連続アミノアシルを２種ずつ必要な順序で順次縮合するか、又はアミノアシルと予め形成され且つ既に数種のアミノアシルを適切な順序で含むフラグメントもしくはこうして予め調整された複数のフラグメントとを縮合することからなり、当然のことながら、ぺプチド合成で周知の方法に従って特にカルボキシル基の活性化後に通常ペプチド結合の形成に介入しなければならない一方のアミン基と他方のカルボキシル基、又は一方のカルボキシル基と他方のアミン基を除き、これらのアミノアシル又はフラグメントにより担持される全反応基を予め保護するように注意する。変形例によると、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドのようなカルボジイミド型の従来の結合試薬を用いる結合反応を利用してもよい。
【００５５】
使用されるアミノアシルが付加的な酸基を有する場合（特にグルタミン酸の場合）には、これらの基は例えばｔ−ブチルエステル基により保護される。
【００５６】
アミノ酸毎の漸進的合成の場合、合成は好ましくは所望の配列中の隣接アミノアシルに対応するアミノ酸とＣ末端アミノ酸との縮合により開始し、同様にＮ末端アミノ酸まで漸次合成される。本発明の別の好適方法によると、Ｒ．Ｄ．ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤにより論文“Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，４５，２１４９−２１５４）に記載されているような技術を利用する。
【００５７】
ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤの方法に従ってペプチド鎖を製造するためには、非常に多孔質の樹脂を利用し、該樹脂に鎖の最初のＣ末端アミノ酸を固定する。このアミノ酸はカルボキシル基を介して樹脂に固定され、そのアミン基は例えばｔ−ブチルオキシカルボニル基により保護される。
【００５８】
最初のＣ末端アミノ酸がこうして樹脂に固定されたら、樹脂を酸で洗うことによりアミン基の保護基を脱離させる。
【００５９】
アミン基の保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル基である場合には、トリフルオロ酢酸により樹脂を処理することにより保護基を脱離させることができる。
【００６０】
その後、鎖に固定された最初のＣ末端アミノ酸の脱保護アミン基上のＣ末端アミノアシル樹脂から、所望の配列の第２のアミノアシルを供給する第２のアミノ酸を結合する。好ましくは、この第２のアミノ酸のカルボキシル基は例えばジシクロヘキシルカルボジイミドにより活性化され、アミン基は例えばｔ−ブチルオキシカルボニルにより保護される。
【００６１】
こうして２種のアミノ酸を含み、末端アミン基が保護された所望のペプチド鎖の最初の部分が得られる。上述のように、アミン基を脱保護し、その後、第２のＣ末端アミノ酸の付加に類似する条件下で第３のアミノアシルを固定することができる。
【００６２】
こうしてアミノ酸を順次固定し、該アミノ酸は既に形成され且つ樹脂に結合したペプチド鎖の部分から予め脱保護される毎にアミン基上にペプチド鎖を構成する。
【００６３】
所望のペプチド鎖の全体が形成されたら、ペプチド鎖を構成する種々のアミノ酸の保護基を脱離させ、例えばフッ化水素酸により樹脂からペプチドを分離する。
【００６４】
以下、非限定的な実施例により本発明をより詳細に説明する。
１．２ＫｂフラグメントＳａｃＩの単離。
【００６５】
本発明の目的は、Ｔｙｐｈｉの付着−侵入系のクローニングである。
【００６６】
使用した株はＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅ  Ｌ’ＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲにリファレンス番号ＣＩＰ  ５５−３５で寄託されたＴｙｐｈｉのＴｙ２株である。
【００６７】
Ｔｎ５から誘導されるトランスポゾン（ＭＡＮＯＩＬ  Ｃ．及びＢＥＣＫＷＩＴＨ  Ｊ．，１９８５．ＴｎＰｈｏＡ：ａ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｏｒｔ  ｓｉｇｎａｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８２，８１２９−８１３３）をＴｙｐｈｉ  Ｔｙ２株のゲノムに挿入することにより得られた２０００個の独立した突然変異体のバンクから出発し、培養ＨｅＬａ細胞モデルにもはや侵入しない突然変異体を得た。Ｔｙｐｈｉによる培養ＨｅＬａ細胞の感染方法は、次のように行った。１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地でＨｅＬａ細胞を培養した。細胞当たり細菌１００個の割合でこれらの細胞にＴｙｐｈｉを感染させた。３７℃で１時間インキュベーション後、細胞を培養培地で洗浄し、次いで１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンの存在下で再培養した。細胞内細菌をＧｉｅｍｓａ染色により２４時間後に検出した。
【００６８】
この突然変異体のゲノムを制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩにより消化後、ニトロセルロース膜上のハイブリダイゼーション実験の結果、トランスポゾンが２ｋｂのＳａｃＩフラグメントに挿入されていることが判明した。
【００６９】
使用したトランスポゾンはカナマイシン耐性をコードするので、トランスポゾンを含む２ＫｂのＳａｃＩフラグメントをプラスミドｐＵＣ１８のＳａｃＩ部位にクローニングすることができた（ＶＩＥＩＲＡ  Ｊ．及びＭＥＳＳＩＮＧ  Ｊ．，１９８２．Ｔｈｅ  ＰＵＣ  ｐｌａｓｍｉｄｓ，ａｎ  Ｍ１３ｍｐ７−  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒｓ．  Ｇｅｎｅ，１９，２５９−２６８）。この組換プラスミドを使用することにより、本発明の核酸配列を単離した。
【００７０】
Ｔｙ２株のゲノムＤＮＡをエンドヌクレアーゼＳａｃＩにより消化し、この制限産物をクローニングベクターｐＵＣ１８のＳａｃＩ部位に連結した。この連結混合物を使用して大腸菌株ＨＢ１０１（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅ  ｌ’ＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲにリファレンスＣＩＰ１０２４００で寄託）を形質転換させた。形質転換細胞の選択は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する普通ゼロース上で実施した。２４時間３７℃の炉でインキュベーション後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する普通ゼロースに堆積したニトロセルロースディスクに形質転換細胞を移した。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うために、これらのディスクを次に変性用溶液（ＮａＯＨ  ０．５Ｍ）、次いで中和溶液（酢酸アンモニウム  １Ｍ，ＮａＯＨ  ０．０２Ｍ）で処理した。これらの処理により遊離及び変性したＤＮＡを８０℃で３時間加熱することによりニトロセルロースディスクに固定した。
【００７１】
こうして調製したこれらのニトロセルロースディスクを、トランスポゾンを含み且つ３２Ｐで標識した２ｋｂのＳａｃＩフラグメントとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションはＤｅｎｈａｒｄｔ培地（０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ；０．１％ポリビニルピロリドン；０．１％ウシ血清アルブミン）中、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５  ＮａＣｌ及び０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム，ｐＨ７から構成される）中で６５℃で２４時間実施した。
【００７２】
こうして（図１に太線で示すこのフラグメントの制限地図中でＳ１及びＳ２部位により画成される）２ｋｂのＳａｃＩフラグメントが挿入されたクローニングベクターｐＵＣ１８から構成される組換プラスミドを含む大腸菌クローンＨＢ１０１を単離した。
２．２ｋｂのＳａｃＩフラグメントに関連する遺伝子領域。
【００７３】
Ｔｙ２株のゲノムＤＮＡをエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩにより消化した。消化産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、毛管作用によりニトロセルロース膜に移した。次に前記条件下でいずれも２ｋｂのＳａｃＩフラグメントの内側に位置する１．１ｋｂのＳａｃＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（図１のフラグメントＡ）又は１．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（図１のフラグメントＢ）とハイブリダイズさせた。
【００７４】
２ｋｂＳａｃＩフラグメントはＴｙｐｈｉ  Ｔｙ２株のゲノム上の夫々２．３ｋｂ及び５．６ｋｂの寸法の２つのＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（即ち図１に示すこの領域の酵素制限地図上のＨ１及びＨ２部位により画成される７．９ｋｂ部位）によりカバーされることを確認した。
３．サルモネラプローブの単離。
【００７５】
２ｋｂのＳａｃＩフラグメントを含む組換プラスミドのＤＮＡをエンドヌクレアーゼＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより制限消化した。この二重消化により放出された４８７塩基対のＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをクローニングベクターｐＵＣ１８のＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の間に再クローニングした。
【００７６】
４８７塩基対のこのＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを以下の文中ではサルモネラプローブと呼称し、該フラグメントは前記核酸配列（Ｉ）に対応する。２ｋｂのＳａｃＩフラグメントにおけるこのＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの位置を図１に示す。
４．サルモネラプローブの特異性の制御。
【００７７】
この制御を実施するために、使用した株を９６欠微量滴定用プレートで普通ブイヨン２００μｌ中で２４時間３７℃で培養した。多重点接種器により、普通ゼロース箱に配置したニトロセルロースシート上で５時間３７℃で再培養した。次にニトロセルロースシートを処理し、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験に使用した。
【００７８】
サルモネラプローブを作成するために、組換プラスミド（４８７塩基対のＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含むｐＵＣ１８）をエンドヌクレアーゼＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化した。アガロースゲル電気泳動によるこの消化産物の分離後、サルモネラプローブを電気溶離により生成した。次に、プローブをニックトランスレーションにより３２Ｐで標識した。
【００７９】
６５℃Ｄｅｎｈａｒｄｔ培地中、６×ＳＳＣで１８時間の反応時間、ハイブリダイゼーション実験を実施した。これらの実験条件下で、サルモネラ属に属さない３８４株とサルモネラ属に属し且つサルモネラ属の７種の亜種を含む３８４株とに細分される７６８個の細菌株でサルモネラプローブの特異性を制御した。これらの７６８株はＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｕ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｅｕｒ  ｄｅ  ｌ’ＯＭＳ  ｄｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  ｐｏｕｒ  ｌｅｓ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｔ  ｄｅ  ｌａ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｕ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｏｕｒ  ｌｅｓ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａから入手した。
【００８０】
サルモネラ属に属さない３８４株のうちでサルモネラプローブに応答するものは皆無であった。
【００８１】
３８４個のサルモネラ株のうちで３８２株がサルモネラプローブに応答した。サルモネラプローブに応答しなかった２株は、一方がＷｅｄｄｉｎｇ血清型であり、他方がＺｕｅｒｉｃｈ血清型であった。いずれの場合も血清型の参照株であった。これらの２株は培養ＨｅＬａ株モデルに対して非侵入性であり、サルモネラプローブの同種フラグメント及び２ｋｂＳａｃＩフラグメントをもたないことが確認された。
５．遺伝子増幅後の生物学的産物中におけるサルモネラの検出。
【００８２】
生物学的産物中で数千万種の他の細菌から所与の種に属する細菌を検出することは今日ではできない。ヌクレオチドプローブにより多菌性生物学的産物中におけるサルモネラの存在を検出するためには、分析すべきサンプルを培養することにより検出すべき細菌数を増幅し、遺伝子増幅法（又は「ポリメラーゼ鎖反応」即ちＰＣＲ法）を使用することによりヌクレオチドプローブで検出しようとするターゲットのコピー数を増幅することが不可欠である。
【００８３】
サルモネラでは、４８７塩基対のＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（サルモネラプローブ）がサルモネラ属に特異的である。分析すべき生物学的サンプルからこのフラグメントの存在を検出したならば、被験サンプルはサルモネラにより汚染されていると予想することができよう。５．１．ＰＣＲに使用される２種のプライマーの説明。
【００８４】
サルモネラプローブのヌクレオチド配列（Ｉ）から、遺伝子増幅法を実施するために使用される２種のプライマーを選択した。
【００８５】
以下の説明でＳＳ−１及びＳＳ−２と呼称する２種のプライマーに対応する１７塩基配列を使用してサルモネラのコピー数を増幅した。
５．２．ＳＳ−１及びＳＳ−２と共にＰＣＲに使用したプロトコル。
【００８６】
このプロトコルはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ（リファレンス番号８０１−００５５）のキット“Ｇｅｎｅ  ａｍｐ”（登録商標）を使用することにより実施した。プライマーＳＳ−１及びＳＳ−２は２００ｐｍｏｌの最終濃度で使用した。最終容量５０μｌに増幅すべきＤＮＡを含む溶液１０μｌを使用することにより、製造業者の指示に従って反応混合物を調製した。９４℃で１２０秒間の変性段階、６８℃で１８０秒間の再会合段階、及び７２℃で９０秒間の伸長段階を含む条件下でＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ（リファレンス番号８０１−０１７７）の装置“ＤＮＡ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ”（登録商標）を使用することにより、この混合物に増幅サイクルを２０回行った。
【００８７】
こうして増幅したＤＮＡを、低融点アガロース（ＢＲＬ；  ｒｅｆ．５５１７）２％及び標準アガロース（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ａ−６８７７）％を含有するアガロースゲルで電気泳動（１２０Ｖで３０分間）により可視化した。電気泳動後、ＤＮＡをニトロセルロースシートに移し、３２Ｐで標識したサルモネラプローブとハイブリダイズした。５．３．方法の特異性及び感度。
【００８８】
リファレンスＣＩＰ  ６０．６２ＴでＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅ  ｌ’Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒに寄託されたサルモネラＬＴ株血清型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及び大腸菌株ＨＢ１０１（ＣＩＰ  １０２．４００）を使用し、以下の実験条件下でＰＣＲ法の特異性及び感度を調べた。
【００８９】
増幅すべきＤＮＡを含む溶液を次のように調製した。
１）完全細菌を蒸留水１００μｌに懸濁させた。
２）細菌懸濁液を遠心分離用マイクロチューブ内で１００℃で１０分間処理した。
３）次に懸濁液をマイクロ遠心機で最大速度で３分間遠心分離した。遠心分離残渣を避けてこの溶液１０μｌをとり、遺伝子増幅を行った。
【００９０】
サルモネラＬＴ２株血清型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの純粋培養物を使用すると、増幅溶液１０μｌ中に１０個以下の細菌のＤＮＡが検出された。大腸菌ＨＢ１０１株を使用すると、増幅溶液１０μｌ中細菌１０６個に対応するＤＮＡで操作した場合にも増幅を検出することはできなかった。２つの細菌株の混合物を作成した場合には、増幅溶液１０μｌ中で１０６個の大腸菌ＨＢ１０１のＤＮＡと混合した１００個以下のサルモネラのＤＮＡが検出された。
５．４．実験室で再構成したサンプル中におけるサルモネラの検出試験。
【００９１】
使用したサンプルは動物飼料用ミンチ肉である。サンプルは好気性又は嫌気性のグラム陽性又は陰性細菌により非常に強く汚染されている。顕微鏡で概算すると、細菌合計数はミンチ肉ｇ当たり１０９個であった。普通ゼロース箱で計数すると、この培地で培養する好気性細菌数はミンチ肉ｇ当たり１０８であった。このサンプルはサルモネラを含まず、従来の飼料細菌法により実施した３種の分析によると陰性であった。
５．４．１．ＰＣＲによる分析用サンプルの作成。
【００９２】
ミンチ肉２５ｇに可変数（１０，１０２，１０３，１０４，１０５又は１０６）のサルモネラ血清型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを加えることによりサンプルを再構成した。再構成したこのサンプルを１リットル容三角フラスコで１８時間３７℃で撹拌下に大豆トリプトカゼインブイヨン２００ｍｌ中で培養した。サルモネラを含まないミンチ肉２５ｇを同様に処理した。
【００９３】
翌日、三角フラスコを１５分間実験室温度で台上で非撹拌下に放置し、より大きい破片を沈殿させた。次に表面からブイヨン１ｍｌをとり、遠心分離用マイクロチューブに通し、マイクロ遠心機で最大速度で３分間遠心分離した。上清をパスツールピペットで完全に除去した。細菌残渣を蒸留水１００μｌに完全に再懸濁させた後、１０分間で１００℃にした。再び３分間最大速度で遠心分離した。遠心分離残渣を避けてこの溶液１０μｌをとり、前記条件下で遺伝子増幅した。
５．４．２．方法の特異性及び感度。
【００９４】
サルモネラを含まないサンプル２５ｇから出発した場合には、増幅溶液１０μｌに含まれるＤＮＡの増幅を全く検出することができなかった。１０２個以上のサルモネラを含むサンプル２５ｇから出発した場合には、増幅溶液１０μｌに含まれるＤＮＡの増幅が検出された。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】サルモネラ属細菌ゲノムの制限地図である。
【図１】
2008220376.tif 000007