(57)【要約】【課題】水中構造物への海洋生物の付着を防止する機能を有するバイオフィルムを産生する微生物および当該微生物を含有する海洋生物付着防止用塗料、ならびに当該塗料を用いた、水中構造物への海洋生物の付着防止方法を提供する。【解決手段】ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属またはオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属に属する微生物であって、バイオフィルムを産生する微生物および当該微生物を含有する海洋生物付着防止用塗料、ならびに当該塗料を用いた、水中構造物への海洋生物の付着防止方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属またはオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属に属する微生物であって、バイオフィルムを産生する微生物。
【請求項２】
ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）またはオクロバクトラム  インターミディアム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ＮＩＴＥ  Ｐ−３１６株またはＮＩＴＥ  Ｐ−３１７株である、請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の微生物を含有する塗料。
【請求項５】
水中構造物への海洋生物の付着を防止するために用いられる請求項４に記載の塗料。
【請求項６】
水中構造物の表面に、請求項４に記載の塗料を塗布することを特徴とする、水中構造物への海洋生物の付着防止方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオフィルムを産生する微生物および当該微生物を含有する塗料、ならびに当該塗料を用いた、水中構造物への海洋生物の付着防止方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
船舶、魚網等の水中構造物には、フジツボ、ムラサキガイ、イガイ、藻類などの海洋生物が付着しやすく、これによって、船舶の水流抵抗の増加、燃料の浪費、魚網の目詰まり、酸素供給量の低下による養殖魚の酸欠死等の問題が生じる。従来、これらの海洋生物の付着を防止する方法として、防汚剤を含有する防汚塗料を水中構造物に塗布する方法が広く採用されてきた。
【０００３】
しかし、防汚塗料は、塗膜中の防汚剤が徐々に水中に溶出するか、あるいは防汚塗料が徐々に削られて水中に散逸し、常に新しい塗膜面が露出するように設計されているため、海洋環境上悪影響を及ぼす懸念が指摘されている。特に、トリブチルスズ化合物やトリフェニルスズ化合物などの有機スズ系防汚剤は、生物学的に難分解性であり、生物の免疫力低下、リンパ球の減少、生殖障害等を引き起こすことが明らかにされており、日本国内では使用が禁止されている。したがって、これに代わる、海洋環境上より安全な海洋生物付着防止技術の開発が求められていた。
【０００４】
特許文献１および２には、防汚剤を含有する防汚塗料に代替可能な技術として、大型水棲生物の付着を防止することができるスライム状またはゼリー状の物質（スライム層）を産生するＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属に属する微生物を含有する塗料および当該塗料を用いた、水中の構造体に対する大型水棲生物の付着防止方法が開示されている。このような微生物を用いた水棲生物の付着防止技術は、当該微生物が産生するスライム層が天然物質で、海洋に生息する魚介類等に無毒であるため、海洋環境上、より好ましい技術であるといえる。
【特許文献１】特開２００２−１７３４４号公報
【特許文献２】特開２００２−２０６９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、水中構造物への海洋生物の付着を防止する機能を有するフィルム状物質（以下、本明細書においてバイオフィルムともいう）を産生する微生物を提供することである。また、本発明の別の目的は、当該微生物を含有する海洋生物付着防止用塗料および当該塗料を用いた、水中構造物への海洋生物の付着防止方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
イルカの体表面には、海水との摩擦抵抗の低減に寄与するヒドロゲル（膜状物質）が形成されている。本発明者らは、当該ヒドロゲルが微生物により産生されている可能性があるとの着想を得、鋭意研究した結果、当該ヒドロゲルからバイオフィルムを産生する微生物を単離することに成功し、当該バイオフィルムが、海洋生物に対して、従来の菌が産生するフィルム状物質よりも優れた防汚効果を発揮することを見出し、本発明を完成するに至った、すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００７】
本発明は、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属またはオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属に属する微生物であって、バイオフィルムを産生する微生物を提供する。
【０００８】
このような微生物として、より具体的には、ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、オクロバクトラム  インターミディアム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）を挙げることができる。さらに具体的には、ＮＩＴＥ  Ｐ−３１６株、ＮＩＴＥ  Ｐ−３１７株である。
【０００９】
また本発明は、上記いずれかに記載の微生物を含有する塗料を提供する。当該塗料は、水中構造物への海洋生物の付着を防止するために好適に用いられる。
【００１０】
さらに本発明は、水中構造物の表面に、上記塗料を塗布することを特徴とする水中構造物への海洋生物の付着防止方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属およびオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属に属する微生物であって、海洋生物付着防止機能を有するバイオフィルムを産生する微生物を提供することができる。また、本発明に係る微生物を含有する塗料によれば、水中構造物に海洋生物が付着するのを効果的に防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属またはオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属に属する微生物であって、バイオフィルムを産生する微生物を提供する。ここで、本発明において、「バイオフィルム」とは、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属またはオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属に属する微生物が産生するフィルム状物質であって、それが水中構造物上に形成されたときに、海洋生物が該水中構造物に付着するのを抑制または防止できる物質を意味する。
【００１３】
微生物が「バイオフィルム」を産生するか否かは、以下の試験により確認することができる。まず、微生物を、グルコースを炭素源とする特定の人工海水培地に植菌し、３０℃で２週間静置培養することにより、フィルム状物質を作成する。該微生物がフィルム状物質を産生する場合、典型的には、当該フィルム状物質は、人工海水培地の液面上に膜を張るように形成される。次に、フィルム状物質が形成された人工海水培地をガラス繊維ろ紙で吸引ろ過し、フィルム状物質を該ガラス繊維ろ紙上に固定化する。ついで、当該ガラス繊維ろ紙をシャーレに敷いた後、上記人工海水培地と、真性付着珪藻（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｕｌｖａｃｅａ）の懸濁液を加え、光を照射しながら２５℃で２週間培養する。真性付着珪藻（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｕｌｖａｃｅａ）の懸濁液は、特定の観賞魚用人工海水培地にて、光を照射しながら２５℃で１週間培養した後、該培養液に石英砂を入れよく攪拌し、単細胞化したものを用いる。次に、ガラス繊維ろ紙を珪藻が付着したフィルム状物質ごと取り出した後、フィルム状物質上に付着した珪藻中の葉緑色素をメタノールで抽出し、６６５ｎｍおよび７００ｎｍにおける吸光度を測定し、これらの吸光度の差（６６５ｎｍにおける吸光度−７００ｎｍにおける吸光度。以下、単に吸光度差Ａともいう。）を算出する。同様の手順で、フィルム状物質を有しないガラス繊維ろ紙を用いて葉緑色素抽出液を調製して、吸光度差（吸光度差Ｂとする）を算出し（ブランク）、吸光度差Ａがブランクである吸光度差Ｂより低ければ、当該微生物は、バイオフィルムを産生する微生物であると判断される。なお、確認試験のさらなる詳細については後述する。
【００１４】
本発明において水中構造物とは、海水中に存在する構造物を意味し、たとえば船舶、各種魚網、港湾施設、オイルフェンス、配管、橋梁、海底基地等を挙げることができる。また、本発明において海洋生物とは、上記水中構造物に付着し得る海洋に生息する生物、特には大型海洋生物を意味するものである。大型海洋生物とは、個体が目視観察することができる大きさに成長する海洋生物であり、たとえばフジツボ、イガイ、カキ、ヒドロ虫、コケムシ、ホヤ、セルプラ等の動物、アオサ、シオミドロ等の植物を挙げることができる。
【００１５】
本発明の微生物としては、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属またはオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属に属する微生物であって、バイオフィルムを産生する微生物であれば特に制限されるものではないが、たとえばステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）またはオクロバクトラム  インターミディアム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）であって、バイオフィルムを産生する微生物を挙げることができる。さらに具体的には、ＩＲ−５株、ＩＲ−８株等を挙げることができる。
【００１６】
本発明の微生物であるＩＲ−５株およびＩＲ−８株は、本発明者らによって、以下のようにして単離されたものである。まず、イルカの尾びれおよび背びれの表面を拭き取ったガーゼを表１に示される組成の人工海水培地（ｐＨ７．５）に浸し攪拌した。得られた懸濁液を人工海水で希釈した後、表２に示される組成の海洋微生物分離寒天培地に植菌し、３０℃で１週間培養したところ、８種類の微生物を得た。これらの微生物を、それぞれ上記人工海水培地に植菌し、３０℃で２週間培養したところ、いずれの培養液においても培養液液面上にフィルム状物質が観察された。このうち、目視により、フィルム状物質の形成が良好であり、比較的強固で、衝撃によっても容易には崩壊しないフィルム状物質を産生する２種の微生物を、それぞれＩＲ−５株、ＩＲ−８株と命名した。ＩＲ−５株およびＩＲ−８株はともに、産生されたフィルム状物質が、上記確認試験において海洋生物の付着防止能を有していたことから、バイオフィルムを産生する微生物であることがわかった。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
【表２】
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【００１９】
ＩＲ−５株は、海洋性の非発酵性グラム陰性桿菌である。また、塩化ナトリウムを増量した栄養塩培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２４ｇ／Ｌ）で良好に増殖し、多糖、すなわちバイオフィルムを生産する。生育可能温度は１５〜３７℃であり、生育最適温度は、３０℃付近である。生育可能ｐＨは６〜８であり、生育最適ｐＨは、中性付近である。培養は、振とう培養および静置培養が可能であるが、振とう培養のほうが増殖良好である。静置培養では、バイオフィルムの薄膜が観察される。ＩＲ−５株の菌学的性質を表３に示す。
【００２０】
【表３】
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【００２１】
また、ＩＲ−８株は、海洋性の非発酵性グラム陰性短桿菌である。また、塩化ナトリウムを増量した栄養塩培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２４ｇ／Ｌ）で良好に増殖し、多糖、すなわちバイオフィルムを生産する。生育可能温度は１５〜３７℃であり、生育最適温度は、３０℃付近である。生育可能ｐＨは６〜８であり、生育最適ｐＨは、中性付近である。培養は、振とう培養および静置培養が可能であるが、振とう培養のほうが増殖良好である。静置培養では、バイオフィルムの薄膜が観察される。ＩＲ−８株の菌学的性質を表４に示す。なお、上記栄養塩培地の組成は、ＩＲ−５株、ＩＲ−８株の生育を妨げな範囲で調整することが可能であり、上記の組成に限定されるものではない。
【００２２】
【表４】
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【００２３】
上記菌学的性質に基づいて、「Ｂｅｒｇｅｙ'ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、Ｋｒｉｅｇ，Ｎ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｈｏｌｔ，Ｊ．Ｇ．，Ｖｏｌ．1（１９８６）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、および、「Ｂｅｒｇｅｙ'ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、Ｈｏｌｔ，Ｊ．Ｇ．，Ｋｒｉｅｇ，Ｎ．Ｒ．，Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．，Ｓｔａｌｅｙ，Ｊ． Ｔ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｔ．，９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９４）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ等の参考文献から、ＩＲ−５株は、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物であり、ＩＲ−８株は、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属に属する微生物であると同定した。しかし、いずれの微生物についても菌学的性質に基づいて種の同定を行なうことはできなかった。
【００２４】
一方、遺伝的性質に基づいて、ＩＲ−５株およびＩＲ−８株の同定を試みた。その結果、１６ＳｒＲＮＡの合致から、ＩＲ−５株は、ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）に属する微生物であり、ＩＲ−８株は、オクロバクトラム  インターミディアム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）に属する微生物であると認められた。遺伝的性質に基づく同定の具体的手法は以下のとおりである。
【００２５】
まず、２％の寒天を添加したＭＢ２２１６培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）に、ＩＲ−５株およびＩＲ−８株を植菌し、３０℃で２日間培養した。次に、この菌体をＤＮＡ抽出の供試菌体として、ゲノムＤＮＡの抽出を行なった。ゲノムＤＮＡの抽出には、ＩｎｓｔａＧｅｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏ  ＲＡＤ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。ついで、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のうち、５’末端側約５００ｂｐの領域を増幅した。その後、増幅されたＤＮＡ塩基配列の決定を行ない、ＩＲ−５株およびＩＲ−８株の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列を得た。なお、ＰＣＲには、ＭｉｃｒｏＳｅｑ５００  １６ＳｒＤＮＡ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、サイクルシークエンスには、ＭｉｃｒｏＳｅｑ５００  １６ＳｒＤＮＡ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。得られたＩＲ−５株およびＩＲ−８株の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列を、アポロンＤＢ細菌基準株データベース（テクノスルガ，静岡）を用いて検索した。その結果、ＩＲ−５株は、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ  ＬＭＧ９５８の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子と９９．８％という非常に高い相同性を示した。また、ＩＲ−８株は、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ  ＮＢＲＣ１５８２０の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子と９９．８％という非常に高い相同性を示した。
【００２６】
上記遺伝的性質に基づき、ＩＲ−５株およびＩＲ−８株は、それぞれステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、オクロバクトラム  インターミディアム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）に属する微生物であると認められるが、これらに属する微生物であって、海洋生物の付着防止能を有するバイオフィルムを産生する微生物については、これまで報告がないことから、ＩＲ−５株およびＩＲ−８株は、それぞれステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、オクロバクトラム  インターミディアム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）に属する新菌株であると認め、（独）製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ：ＮＩＴＥ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ）に、それぞれ寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−３１６（ＩＲ−５株）、寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−３１７（ＩＲ−８株）として寄託した（寄託日：平成１９年２月２０日）。
【００２７】
本発明の微生物は、水中構造物への海洋生物の付着を防止するための塗料に好適に用いることができる。すなわち、本発明の微生物を塗料中に配合し、該塗料を水中構造物上に塗布して塗膜を形成した場合、海水中においてバイオフィルムを産生するので、水中構造物上に大型海洋生物等の海洋生物が付着するのを防止することができる。塗料中に配合する微生物としては、微生物を液体培地等で培養した培養物の形態であってもよいし、培養物から遠心分離等によって得られる微生物そのものであってもよい。
【００２８】
塗料中に本発明の微生物を配合する場合、塗料１００ｇ中、１０4以上の菌体を配合することが好ましい。１０4未満であると、塗膜を形成した場合に、海水中で微生物が増殖してバイオフィルムを形成するより前に、大型海洋生物の付着が起こる場合がある。好ましくは、１０8以上である。上記塗料は、水中構造体に、ロールコーター、刷毛塗り等によって、膜厚５０〜２０００μｍになるように塗布することが好ましい。より好ましくは、膜厚１００〜５００μｍである。
【００２９】
本発明の微生物を塗膜中に固定化する方法としては、微生物が塗膜中で生存できる方法であれば特に限定されず、たとえば、共有結合等によって不溶性担体に結合させる担体結合法；架橋法；格子型またはマイクロカプセル型の包括法等を挙げることができる。架橋法としては、多糖類（キチン、キトサン、アルギン酸、寒天、グアーガム等）やタンパク質（ミルクカゼイン、セラチン、ポリリジン、ポリグルタミン酸等）等の生体由来高分子を２種以上組み合わせて塗膜としたもの；グルタルアルデヒド等の二以上の官能基を持つアルデヒド類やカルボン酸類の架橋剤によって１種以上の生体由来高分子、またはポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリルアミド等もしくはそれらの誘導体のような合成高分子を架橋もしくは不溶化させて塗膜としたもの等を挙げることができる。
【００３０】
さらに、上記架橋法には、ラジカル重合を利用したヒドロゲルを利用することもでき、たとえば、ジビニルベンゼンジ（メタ）アクリレート、ビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレートによって架橋したポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリルアミド等を挙げることができる。
【００３１】
本発明において、上記微生物を含有する塗料の形態としては、微生物が生存し得るような塗料形態であれば特に限定されないが、微生物を塗膜中に固定化する際に用いる試薬の性質および試薬と微生物との相性等を考慮して選択することが好ましい。たとえば、ビスアクリルアミドによって架橋したポリアクリルアミドを塗膜形成成分として利用する場合には、アクリルアミドモノマー自体が微生物にとって有害であり、微生物とモノマーとを混合した状態では室温等での長期保存に適さないため、微生物と塗膜形成成分とを別々の容器に保存しておき、使用時に混合して塗膜を形成する２液型またはそれ以上の塗料形態とすることが好ましい。多糖類やタンパク質等の生体由来高分子を塗膜形成成分として利用する場合には、生体由来高分子と微生物とを同じ容器に入れた塗料の形態とすることも可能である。
【００３２】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
＜実施例１＞
ＩＲ−５株を用いて、真性付着珪藻（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｕｌｖａｃｅａ）の付着試験を行なった。なお、真性付着珪藻は、器壁等に付着しないとほとんど増殖することができない珪藻である。あらかじめオートクレーブ減菌した、グルコースを炭素源とする上記表１に示される組成の人工海水培地（ｐＨ７．５）に、ＩＲ−５株を植菌し、３０℃で２週間静置培養することにより、バイオフィルムを作成した。バイオフィルムは、人工海水培地の液面上に膜を張るように形成された。次に、バイオフィルムが形成された人工海水培地をガラス繊維ろ紙で吸引ろ過し、バイオフィルムを該ガラス繊維ろ紙上に固定化した。ついで、当該ガラス繊維ろ紙をシャーレに敷いた後、上記人工海水培地と、真性付着珪藻（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｕｌｖａｃｅａ）の懸濁液を加え、光を照射しながら２５℃で２週間培養した。真性付着珪藻（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｕｌｖａｃｅａ）の懸濁液は、表５に示される組成の観賞魚用人工海水培地にて、光を照射しながら２５℃で１週間培養した後、培養液に石英砂を入れよく攪拌し、単細胞化したものを用いた。次に、ガラス繊維ろ紙を、珪藻が付着したバイオフィルムごと取り出した後、バイオフィルム上に付着した珪藻中の葉緑色素をメタノールで抽出し、６６５ｎｍおよび７００ｎｍにおける吸光度を測定した。これらの吸光度の差（６６５ｎｍにおける吸光度（Ａ６６５）−７００ｎｍにおける吸光度（Ａ７００））は０．０２１であった。
【００３４】
【表５】
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【００３５】
＜実施例２＞
バイオフィルムが形成された人工海水培地をガラス繊維ろ紙で吸引ろ過した後、７０℃で２時間、バイオフィルムを乾燥させたこと以外は、実施例１と同様にして、６６５ｎｍおよび７００ｎｍにおける吸光度を測定した。これらの吸光度の差（６６５ｎｍにおける吸光度−７００ｎｍにおける吸光度）は０．０２４であった。
【００３６】
＜実施例３および４＞
ＩＲ−８株を用いたこと以外は実施例１および２と同様にして、真性付着珪藻（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｕｌｖａｃｅａ）の付着試験を行なった。その結果、バイオフィルムを乾燥させない場合（実施例３）、吸光度差は、０．０２１であり、バイオフィルムを乾燥させた場合（実施例４）、吸光度差は、０．０１７であった。
【００３７】
＜比較例１＞
バイオフィルムを有しないガラス繊維ろ紙を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、真性付着珪藻（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｕｌｖａｃｅａ）の付着試験を行なった。吸光度差は、０．０４４であった。
【００３８】
上記実施例および比較例の吸光度差を表６にまとめた。あわせて、比較例１の吸光度差に対する、各実施例の吸光度差の比（％）を記載している。吸光度差は、バイオフィルム上またはガラス繊維ろ紙上に付着した珪藻の量におよそ比例するから、当該吸光度差の比（％）は、バイオフィルムの形成により、珪藻の付着がどの程度低減されたかを示す。すなわち、該吸光度差の比（％）が１００％未満であれば、真性付着珪藻の付着が抑制されたと判断される。表６に示されるように、実施例１〜４の吸光度差の比（％）は、約３８〜約５５％であり、ＩＲ−５株およびＩＲ−８株が産生するバイオフィルムにより、真性付着珪藻の付着を大幅に抑制できることがわかった。
【００３９】
【表６】
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【００４０】
＜実施例５〜６、比較例２〜３＞
以下の手順に従い、本発明のＩＲ−５株（実施例５）およびＩＲ−８株（実施例６）が産生するバイオフィルムの真性付着珪藻の付着抑制能を、上記特開２００２−１７３４４号公報および特開２００２−２０６９３号公報に記載のＳＨＹ１−１株（比較例２）のそれと比較した。
【００４１】
まず、上記表１に示される組成の人工海水培地（ｐＨ７．５）１０ｍｌをシャーレに入れ、ＩＲ−５株、ＩＲ−８株、上記特開２００２−１７３４４号公報および特開２００２−２０６９３号公報に記載のＡｌｔｒｏｍｏｎａｓ  ＳＨＹ１−１株を、それぞれ植菌して３０℃で培養し、バイオフィルムを形成させた。１週間後に培養液を捨て、バイオフィルムを剥さないように、上記表５に示される組成の観賞魚用人工海水培地（ｐＨ８．０〜８．５）１０ｍｌを静かに加えた。一方、上記表５に示される組成の観賞魚用人工海水培地で培養した真性付着珪藻（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｕｌｖａｃｅａ）を石英砂によって単細胞化した後、この珪藻懸濁液２ｍｌを上記シャーレに加えた。これを２５℃で光を照射しながら２週間培養した。
【００４２】
２週間の培養後、シャーレ底面に付着せず浮遊している珪藻量を測定するために、培養液を遠心管へ移し、１０ｍｉｎ、１３０００ｒｐｍで遠心分離し、沈殿物である珪藻を得た。遠心分離により回収した珪藻にメタノールを５ｍｌ加え、よく撹拌した。再び遠心分離を行なって、遠心分離上清の６６５ｎｍの吸光度（Ａ６６５）と７００ｎｍの吸光度（Ａ７００）を測定した。
【００４３】
また、シャーレ底面に付着している珪藻量を測定するために、まず培養液とともに浮遊している珪藻を取り除いた。シャーレに付着した珪藻から光合成色素を抽出するために、シャーレにメタノール５ｍｌを加え、よく撹拌した。この抽出液を１０ｍｉｎ、１３０００ｒｐｍで遠心分離した後、６６５ｎｍの吸光度（Ａ６６５）と７００ｎｍの吸光度（Ａ７００）を測定した。また、バイオフィルムを形成させることなく、上記と同様の試験を行ない比較例３とした（ブランク）。
【００４４】
実施例５〜６および比較例２〜３における、シャーレに付着した珪藻から抽出された光合成色素についての６６５ｎｍでの吸光度（Ａ６６５）、７００ｎｍでの吸光度（Ａ７００）およびそれらの差（Ａ６６５−Ａ７００）を表７に示す。また、シャーレに付着せず浮遊している珪藻から抽出された光合成色素についての６６５ｎｍでの吸光度（Ａ６６５）、７００ｎｍでの吸光度（Ａ７００）およびそれらの差（Ａ６６５−Ａ７００）を表８に示す。
【００４５】
【表７】
2008220272.tif 000008
【００４６】
【表８】
2008220272.tif 000009
【００４７】
表７に示される吸光度差（Ａ６６５−Ａ７００）は、シャーレに付着した珪藻より抽出した光合成色素量に対応するものである。表７に示される結果から、ブランク（比較例３）に比較して、ＩＲ−５株（実施例５）、ＩＲ−８株（実施例６）、ＳＨＹ１−１株（比較例２）全てのバイオフィルムにおいて、シャーレに付着した珪藻より抽出された光合成色素量は大幅に減少しており、珪藻の付着を阻害していることが明らかになった。特に、ＩＲ−５株（実施例５）、ＩＲ−８株（実施例６）では、ＳＨＹ１−１株（比較例２）よりもシャーレに付着した珪藻より抽出した光合成色素量は少なく、ＳＨＹ１−１株が産生するバイオフィルムよりも高い珪藻付着抑制効果を有していることがわかった。
【００４８】
表８に示される吸光度差（Ａ６６５−Ａ７００）は、シャーレに付着せず浮遊している珪藻より抽出した光合成色素量に対応するものである。ブランク（比較例３）では、抽出された光合成色素量は非常に少なく、浮遊している珪藻はほとんどいないことがわかる。一方、ＩＲ−５株（実施例５）、ＩＲ−８株（実施例６）、ＳＨＹ１−１株（比較例２）のバイオフィルムを付着させたシャーレでは、光合成色素量がブランクよりも多く、シャーレ表面に付着できず浮遊している珪藻量がブランクに比較して明らかに多いことがわかる。特に、ＩＲ−５株（実施例５）、ＩＲ−８株（実施例６）では、ＳＨＹ１−１株（比較例２）よりも浮遊する珪藻より抽出した光合成色素量が多く、このことは表７の結果と一致する。すなわち、ＩＲ−５株（実施例５）、ＩＲ−８株（実施例６）では、シャーレに付着している珪藻量が低減されているに伴い、その浮遊量が増加している。
【００４９】
＜実施例７＞
ＩＲ−５株を液体培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ２４ｇ／Ｌ）中にて、３０℃で２日間振盪培養を行った。この培養液中の生菌数は生菌数計測法で３×１０10ｃｅｌｌ／ｍｌであった。これを培養液Ａとする。培養液Ａを１ｍｌ、分子量１３０００のポリアクリルアミド１０％水溶液７０ｇ、エチレングリコールジメタクリレート１０ｇ、過硫酸アンモニウム０．５ｇを１５℃で混合し、次にテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．２ｇを加えアクリル板上に塗布し、窒素雰囲気下室温で２時間放置し、成膜した。
【００５０】
＜実施例８＞
アルギン酸３％水溶液７０ｇに５％アンモニア水溶液２０ｇを加え攪拌後、培養液Ａを０．７ｍｌ、キトサン３％水溶液５０ｇを加え混合し、アクリル板上に塗布し、室温で３時間放置し、成膜した。
【００５１】
＜実施例９＞
２−ヒドロキシエチルメタクリレート４０ｇ、培養液Ａ  １ｍｌ、ＮａＣｌの１０％溶液７０ｇ、エチレングリコールジメタクリレート５ｇ、過硫酸アンモニウム０．５ｇを１５℃で混合し、次にＴＥＭＥＤ０．２ｇを加えアクリル板上に塗布し、窒素雰囲気下、室温で２時間放置し、成膜した。
【００５２】
＜実施例１０＞
キトサン５％水溶液１００ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、培養液Ａ  １．２ｍｌを加え混合した。この溶液中にグルタルアルデヒド０．５ｇを加え混合後アクリル板上に塗布し室温で３時間放置し、成膜した。
【００５３】
＜実施例１１〜１４＞
ＩＲ−８株を用いたこと以外は、実施例７〜１０と同様にして塗膜を形成した。
【００５４】
＜比較例４＞
培養液Ａを加えないこと以外は、実施例７と同様に塗膜を作成した。
【００５５】
上記実施例７〜１４および比較例４の塗膜について防汚性評価を行なった。玉野市日本ペイント社臨海研究所沖の筏（瀬戸内海）で各塗膜を浸漬し、大型海洋生物の付着状態を目視観察した。その結果を表９に示す。表の数字は、生物付着面積（％）を表す。１か月後には、実施例７〜１４の塗膜上に、約２ｍｍの厚さのバイオフィルムが認められた。
【００５６】
【表９】
2008220272.tif 000010
【００５７】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。