(57)【要約】      （修正有）【課題】新規化合物を有効成分とする医薬を提供する。【解決手段】下記一般式（１）で表される医薬。 2008143886.tif 000015【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される環状テトラペプチド誘導体からなるヒストン脱アセチル化酵素阻害活性を有する化合物。
【化１】
2008143886.tif 000011
（式中、Ｒ１とＲ２は、炭素数１〜６の分岐を有していても良いアルキレン基を表し、Ｘは、-ＣＯ-、-Ｏ-、-Ｓ-又は-ＳＯ-から選ばれる基を表し、Ｙは、水素、ハロゲン、置換基を有していても良いフェニル基、置換基を有していても良いピリジル基、炭素数１〜６のアルキル基又はハロゲン置換アルキル基、炭素数１〜６のアルキルオキシ基又はハロゲン置換アルキルオキシ基、炭素数１〜６のアルキルカルボニル基又はハロゲン置換アルキルカルボニル基、炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基又はハロゲン置換アルキルオキシカルボニル基、炭素数１〜６のアルキルチオ基、炭素数１〜６のアルキルチオカルボニル基、炭素数１〜６のモノ又はジアルキルアミノ基を表し、また、Ｙが置換基を有していても良いフェニル基または置換基を有していても良いピリジル基の場合はＲ２と結合した環状構造を有していても良い基を表し、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ３１、Ｒ３２は、それぞれ水素、炭素数１〜６の直鎖アルキル基、炭素数３〜６の分岐のアルキル基、炭素数１〜４のカルボキシアルキル基、炭素数１〜５の直鎖ω−アミノアルキル基、炭素数３〜５の分岐のアミノアルキル基、ベンジル基、置換ベンジル基、ピリジル基が置換したメチル基から選択される一価の基を表し、ｍは１又は２の整数を表す。）
【請求項２】
下記一般式（２）で表される側鎖にカルボニル基を有する環状テトラペプチド誘導体からなる、請求項１記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害活性を有する化合物。
【化２】
2008143886.tif 000012
（式中、ｌは１、２、３、４の整数を表し、Ｙ１はハロゲン，−OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CF3,
-SCH3,-SCOCH3, -N(CH3)2を表す。）
【請求項３】
下記一般式（３）で表される側鎖にスルフィド基、スルホキシド基又はエーテル基を有する環状テトラペプチド誘導体からなる、請求項１記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害活性を有する化合物。
【化３】
2008143886.tif 000013
（式中、ｎは１、２、３、４の整数を表し、Ｘ１は-S-, -SO-, -O-を表し、Ｙ2は水素、-COCF3,
-COCH3, -COCH2OCH3,
フェニル基，2,3,又は4-ピリジル基を表す。）
【請求項４】
下記一般式（８）で表される、請求項１又は２項記載の環状テトラペプチド誘導体の合成中間体。
【化８】
2008143886.tif 000014
（式中、ｌは１、２、３、４の整数を表す。）
【請求項５】
前記請求項１〜３のいずれかに記載の環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な環状テトラペプチド誘導体からなる、ヒストン脱アセチル化酵素阻害活性を有する化合物、及びこの化合物を有効成分として含む医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞内にはＤＮＡと蛋白質の複合体であるクロマチンが存在し、その構造蛋白質であるヒストン（蛋白質）は、遺伝子発現に重要な役割を果たしていることが知られている。ＤＮＡはヒストンにからんでクロマチン構造を形成しているが、このヒストンのヒストンテールがアセチル化されることによって、クロマチン構造の変化（結果としての遺伝子の発現の調節）を引き起こすと言われている。
【０００３】
具体的には、クロマチンは、４種類のヒストンの各２分子が会合してコアヒストン８量体を作り、これに遺伝子DNAが巻き付き、所謂ヌクレオソーム構造と称される基本単位をなし、更にこれが高次構造を形成したものである。そのコアヒストンのＮ末端付近は塩基性アミノ酸に富んだテール状をとり、前記ヌクレオソーム上のDNAをさらに覆う構造をとる。このテール域付近のリジン残基は、可逆的なアセチル化の代謝回転を受けており、ヌクレオソーム自体の構造制御、あるいは、遺伝子DNAに相互作用する他の蛋白質（転写因子群、サイレンサー蛋白質群、RNAポリメラーゼなど）との結合制御を介する転写制御に密接に係わっているとされている。
【０００４】
ヒストンのアセチル化に依存する遺伝子発現制御の査証として、ヒストンの高アセチル化は、その領域に存在する遺伝子からの発現誘導を促進し、一方脱アセチル化は、ヘテロクロマチンと称される転写不活性な領域を形成することが報告されている。即ち、クロマチンの構造蛋白質であるヒストンとそのアセチル化は、染色体遺伝子の全域に及ぶものであるにも係わらず、その機能は特定の遺伝子の発現に大きな影響を及ぼし、いわば核内情報伝達にかかわる厳密な制御に関与することが示唆されている。ヒストンのアセチル化を行う酵素は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼであり、逆に脱アセチル化を行う酵素は、ヒストンデアセチラーゼ（ヒストン脱アセチル化酵素、Histone deacetylase、ＨＤＡＣ）であり、この両酵素はヒストンアセチル化レベルの動的な代謝回転を調節している。
【０００５】
ヒストンデアセチラーゼの作用が亢進すると、細胞の適正な分化や形態正常化が阻害されるが、このヒストンデアセチラーゼの酵素活性を阻害すると、ヒストンからの脱アセチル化が抑制される結果、ヒストン高アセチル化が引き起こされ、分化や形態正常化に必要な遺伝子発現が誘導される。この現象は、ヒストンデアセチラーゼに対する酵素阻害物質（ＨＤＡＣ阻害剤）である、トリコスタチンA（trichostatin
A）やトラポキシン（trapoxin）類縁体を用いた研究により確認され、具体的には、トリコスタチンAは白血病細胞、神経細胞、乳癌細胞などの分化を誘導することが知られている。加えて、これら阻害物質を更に高い濃度で細胞に作用させると、サイクリン依存性蛋白質キナーゼ（ＣＤＫ）を阻害する蛋白質ｐ２１が発現し、細胞周期の阻害が引き起こされ、結果として増殖阻害が起こる。従って、ある種のＨＤＡＣ阻害剤は、細胞分化又は形状正常化を起こす薬剤となると考えられ、制がん剤としての開発も試みられている（例えば、非特許文献１と２参照）。また、多くのがん細胞では、survivinやBcl-xL、Bcl-2などのアポトーシス抑制蛋白質を高発現することにより、過剰増殖に起因する飢餓ストレスや放射線、抗がん剤による細胞障害ストレスによる細胞死を回避することが知られている。一部のＨＤＡＣ阻害剤は、これらアポトーシス抑制蛋白質の発現を低下させ、がん細胞の細胞死を促進することも知られている。
【０００６】
一方、HDAC阻害剤は、制がん剤としてのみならず、がん予防薬としても期待されている。トリコスタチンAやスベロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)等は、動物の化学発がんモデルにおいて乳癌の発生を顕著に抑制したことが報告されている。また、バルプロ酸を用いた研究から、HDAC阻害剤は転移を抑制することも示されている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００７】
また、近年、がん以外にも、加齢に伴って発症頻度が上昇する糖尿病、リウマチなどの発症性疾患、自己免疫疾患、感染症、神経変性疾患などの発症原因にクロマチンの化学修飾を介したエピジェネティクス（後生遺伝）の異常が関与することが示唆されてきた。ヒストンデアセチラーゼはエピジェネティクス制御の中核を担う酵素であり、種々の遺伝子発現を通じて、疾患の発症に関与している。従って、ＨＤＡＣ阻害剤を巧妙に分子設計すれば、がん以外でも、前記糖尿病などエピジェネティクスの異常による種々の疾病の医薬品を開発できる可能性もあり、様々な応用が試みられている。
【０００８】
ヒストンデアセチラーゼには１０種類以上のサブタイプが存在するが、近年、特定のヒストンデアセチラーゼサブタイプとがんとの密接な関係がわかってきた。例えば、発がんの抑制に極めて重要な役割を果たすがん抑制遺伝子ｐ５３の機能発現に、ｐ５３自身のアセチル化が重要であること（非特許文献４）、その機能障害にＨＤＡＣ１やＨＤＡＣ２が関わること（非特許文献５）、前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の発症に関わる蛋白質ＰＭＬ−ＲＡＲやＰＬＺＦ−ＲＡＲ、リンパ腫の発症に関わるＢｃｌ−６等のがん遺伝子が、核内コリプレッサーを介してＨＤＡＣ４などをリクルートし、正常な分化に必要な遺伝子群の発現を抑制することで発がんに至ることなどが明らかにされてきた（例えば、非特許文献６）。その一方で、組織特異的に発現するヒストンデアセチラーゼサブタイプの中には、正常な組織の発生や分化に重要な役割を果たすものの存在が知られている（非特許文献７）。
【０００９】
HDAC6は核外輸送によって核-細胞質間をシャトルし、通常は細胞質に局在する酵素である。HDAC6は精巣などで発現が高く、正常な組織の分化に関わると推定される。また、HDAC6は微小管の脱アセチル化に関与し、微小管の安定性を制御することが知られている。更に、HDAC6は微小管に結合する脱アセチル化酵素で、細胞の運動性に関与する。従って、HDAC6の阻害剤は転移抑制剤となる可能性がある。
【００１０】
ヒストンデアセチラーゼは、活性中心に亜鉛を有する加水分解酵素であり、その阻害剤はヒドロキサム酸基やチオール基を亜鉛配位子としたものが中心であった。そのため、阻害剤の構造多様性に制限があり、ヒストンデアセチラーゼのサブタイプ間を識別するような特異的阻害剤の開発が不十分であった。これまで、環状テトラペプチドに、ヒストンデアセチラーゼの活性中心の亜鉛イオンと配位結合する原子団を導入した阻害剤に関して、幾つかの発見・提案が報告されている。ヒストンデアセチラーゼ酵素阻害活性を有する新規化合物として、例えば、環状テトラペプチド誘導体に関する発明が多数報告されている（特許文献１〜７、非特許文献８参照）。そして、中には強力な酵素阻害活性を有する化合物も合成されているが、毒性や持続投与性（代謝安定性や吸収性）等で必ずしも十分ではなく、医薬品等として未だ実用化されるまでには至っていない。
【００１１】
【特許文献１】特許第３４９４６２４号
【特許文献２】特開２０００−２５６３９７号公報
【特許文献３】特表２００２−５２７４４９号公報
【特許文献４】特表２００３−５０５４１７号公報
【特許文献５】特表２００５−５１７６８３号公報
【特許文献６】ＷＯ２００３−７０７５４号公報
【特許文献７】ＷＯ２００４−１１３３６６号公報
【非特許文献１】〕Nakajima, H., Kim, Y. B., Terano, H., Yoshida, M., and Horinouchi,S. (1998) FR901228, a potent antitumor antibiotic, is a novel histonedeacetylase inhibitor. Exp. Cell Res. 241, 126-133
【非特許文献２】Saito, A., Yamashita, T., Mariko, Y., Nosaka, Y., Tsuchiya, K.,Ando, T., Suzuki, T., Tsuruo, T., and Nakanishi, O. (1999) A syntheticinhibitor of histone deacetylase, MS-27-275, with marked in vivo antitumoractivity against human tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4592-4597
【非特許文献３】Gottlicher, M., Minucci, S., Zhu, P., Kramer, O. H., Schimpf, A.,Giavara, S., Sleeman, J. P., Lo Coco, F., Nervi, C., Pelicci, P. G., andHeinzel, T. (2001) Valproic acid defines a novel class of HDAC inhibitorsinducing differentiation of transformed cells. EMBO J. 20: 6969-6978
【非特許文献４】Ito, A., Lai, C. H., Zhao, X., Saito, S., Hamilton, M. H., Appella,E., and Yao, T. P. (2001) p300/CBP-mediated p53 acetylation is commonly inducedby p53-activating agents and inhibited by MDM2. EMBO J. 20, 1331-1340
【非特許文献５】Juan, L. J., Shia, W. J., Chen, M. H., Yang, W. M., Seto, E., Lin,Y. S., and Wu, C. W. (2000) Histone Deacetylases Specifically Down-regulatep53-dependent Gene Activation. J. Biol. Chem. 275, 20436-20443
【非特許文献６】Dhordain P., Albagli, O., Lin, R. J., Ansieau, S., Quief, S., Leutz,A., Kerckaert, J. P., Evans, R. M., and Leprince, D. (1997) Corepressor SMRTbinds the BTB/POZ repressing domain of the LAZ3/BCL6 oncoprotein. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 94, 10762-10767
【非特許文献７】McKinsey, T. A., Zhang, C. L., Lu, J., and Olson, E. N. (2000)Signal-dependent nuclear export of a histone deacetylase regulates muscledifferentiation. Nature 408, 106-111
【非特許文献８】Furumai, R., Matsuyama, A., Kobashi, N., Lee, K.-H., Nishiyama, M.,Nakajima, H., Tanaka, A., Komatsu, Y., Nishino, N., Yoshida, M., andHorinouchi, S. (2002) FK228 (depsipeptide) as a natural prodrug that inhibitsclass I histone deacetylases. Cancer Res. 62, 4916-4921
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
既存のヒストンデアセチラーゼ（以下、ヒストン脱アセチル化酵素という）阻害剤は、ヒストン脱アセチル化酵素の活性中心の亜鉛原子との結合性が高いヒドロキサム酸基を機能性原子団とすることが多いが、ヒドロキサム酸基は遊離の鉄イオンとの錯体形成能があり、血液毒性が予想されるため、抗がん剤としての用途は可能であるが、その他の疾患、特に糖尿病や神経性炎症等の慢性疾患に対しては適応が躊躇される。また、アルキルチオレートアニオン基も相対的に強く亜鉛原子と結合するため、メルカプタン類も、ヒストン脱アセチル化酵素に対し強い阻害活性を示すことが知られている。しかし、チオール基は、ジスルフィド交換反応によるシスチン含有蛋白質との反応性があるので、副作用の可能性もある。
【００１３】
従って、本発明は、従来想定されていなかった生体内でも安定で副反応を起こす可能性が少ない官能基を組み合わせることによって、効果的な亜鉛配位子を新規に開発し、これらをヒストン脱アセチル化酵素パラログ特異性をもたらすところの種々の環状ペプチド中へ、効率的に導入し、従来のものよりも格段に高活性を示し、且つ、副作用の少ないヒストン脱アセチル化酵素阻害活性を有する新規化合物を提供することを目的とする。また、本発明は、かかるヒストン脱アセチル化酵素阻害物質を有効成分として含有する医薬を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行い、側鎖にカルボニル基、スルフィド基、スルホキシド基又はエーテル基を有する環状テトラペプチド誘導体を種々創製すると共に、これら環状テトラペプチド誘導体がヒストン脱アセチル化酵素活性を可逆的に阻害し、且つ細胞周期を阻害する蛋白質ｐ２１発現促進、並びにアポトーシス抑制蛋白質survivinやBcl-xLの発現抑制活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至ったものである。即ち、本発明は、下記一般式（１）で表される環状テトラペプチド誘導体からなるヒストン脱アセチル化酵素阻害活性を有する化合物である。また、下記の環状テトラペプチド誘導体の薬学的に許容される塩も、本発明に含まれるものである。かかる化合物は、後述する方法によって製造できるが、本発明は、得られた環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩の何れかを有効成分とする、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（以下、ＨＤＡＣ阻害剤ということもある）の医薬としての利用もその範囲に含むものである。
【００１５】
【化１】
2008143886.tif 000002
【００１６】
（式中、Ｒ１とＲ２は、炭素数１〜６の分岐を有していても良いアルキレン基を表し、Ｘは、-ＣＯ-、-Ｏ-、-Ｓ-又は-ＳＯ-から選ばれる基を表し、Ｙは、水素、ハロゲン、置換基を有していても良いフェニル基、置換基を有していても良いピリジル基、炭素数１〜６のアルキル基又はハロゲン置換アルキル基、炭素数１〜６のアルキルオキシ基又はハロゲン置換アルキルオキシ基、炭素数１〜６のアルキルカルボニル基又はハロゲン置換アルキルカルボニル基、炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基又はハロゲン置換アルキルオキシカルボニル基、炭素数１〜６のアルキルチオ基、炭素数１〜６のアルキルチオカルボニル基、炭素数１〜６のモノ又はジアルキルアミノ基を表し、また、Ｙが置換基を有していても良いフェニル基または置換基を有していても良いピリジル基の場合はＲ２と結合した環状構造を有していても良い基を表し、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ３１、Ｒ３２は、それぞれ水素、炭素数１〜６の直鎖アルキル基、炭素数３〜６の分岐のアルキル基、炭素数１〜４のカルボキシアルキル基、炭素数１〜５の直鎖ω−アミノアルキル基、炭素数３〜５の分岐のアミノアルキル基、ベンジル基、置換ベンジル基、ピリジル基が置換したメチル基から選択される一価の基を表し、ｍは１又は２の整数を表す。）
【００１７】
前記一般式（１）で表される環状テトラペプチド誘導体において、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ３１、Ｒ３２は、それぞれ独立に水素、炭素数１〜６の直鎖アルキル基、炭素数３〜６の分岐のアルキル基、炭素数１〜５の直鎖ω−アミノアルキル基、炭素数１〜４のカルボキシアルキル基、ベンジル基、置換ベンジル基を表し、ｍは１又は２の整数を表すものが特に好ましい。
【００１８】
本発明においては、また、下記一般式（２）で表される側鎖にカルボニル基を有する環状テトラペプチド誘導体が好ましい。
【００１９】
【化２】
2008143886.tif 000003
【００２０】
（式中、ｌは１、２、３、４の整数を表し、Ｙ１はハロゲン，-OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CF3,
-SCH3,-SCOCH3, -N(CH3)2を表す。）中でも、Ｙ１がＢｒ又は-OCH3又は-OCH2CH3のものは、強いＨＤＡＣ阻害活性を有しており好ましい。
【００２１】
また、本発明においては、下記一般式（３）で表される側鎖にスルフィド基、スルホキシド基又はエーテル基を有する環状テトラペプチド誘導体も好ましい。
【００２２】
【化３】
2008143886.tif 000004
【００２３】
（式中、ｎは１、２、３、４の整数を表し、Ｘ１は-S-, -SO-, -O-を表し、Ｙ2は水素、-COCF3,
-COCH3, -COCH2OCH3,
フェニル基, 2,3,又は4-ピリジル基を表す。）
【発明の効果】
【００２４】
本発明によると、従来想定されていなかった原子団の組み合わせによって、ヒストン脱アセチル化酵素に対して、これまでの最高級の高活性を示す、新規環状テトラペプチド化合物が提供される。本発明の化合物は、これまでのものと異なる機能構造を有するため、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の構造的多様性を格段に高め、従来品を大きくしのぐ高活性、高特異性ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の創成が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明においては、前記一般式（１）で表される化合物の中でも、前記一般式（２）で表される側鎖にカルボニル基を有する環状テトラペプチド誘導体が好ましい。ケトン類のカルボニル基はヒストン脱アセチル化酵素の活性中心に直接作用しうる官能基である。Apicidin、FR225497、TAN-1746s、または9,10-Desepoxy-9-hydroxy-chlamydocinのように微生物代謝産物として見出されて、ヒストン脱アセチル化酵素阻害活性を示すカルボニル基を有する環状テトラペプチドも知られている。しかし、脱アセチル化酵素の阻害剤として端緒を開いたトリコスタチンA (TSA) やトラポキシン (TPX) と比べて、カルボニル基が酵素の活性中心に存在する亜鉛原子と強固に結合する証拠はなく、また活性中心近傍に存在する求核反応基への強い求電子基ともなり得ず、阻害活性と構造との関係は明確になっていなかった。
【００２６】
これまでに多種類のアビシジン（Apicidin）誘導体が合成され、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤として評価が行われている。また、多種多様のクラミドシン関連環状テトラペプチドの、特殊アミノ酸末端を含む化合物も提案されている（前記特許文献３と５参照）。これらの技術とは別に、本発明者らは、簡便に環状テトラペプチドを基体とするところの種々の有用なカルボニル化合物を合成する新規の方法を見出した。この方法は、過去に例の無い人工アミノ酸の創成を経由するものであり、高純度光学異性体の取得から、保護基の少ない簡便なペプチド合成、容易な環化反応、高効率の官能基変換を含むものであり、従来技術の改良を達成している。そして、かかる方法によって合成された本発明の化合物は、ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC1, HDAC4, HDAC6) に対して、阻害活性を有すると共に、ｐ２１プロモーター誘導活性を有し、加えてヒストン H4 に対するアセチル化亢進作用を有している。
【００２７】
環状テトラペプチドへ導入され側鎖となるカルボニル化合物の特性は、以下のように考えられる。例えば、アピシジンは環状テトラペプチドのアミノ酸側鎖末端にケトン性カルボニル基を有するが、トラポキシン等と同様にヒストン脱アセチル化酵素の活性を阻害する。また、環状テトラペプチドであるFR235222はアピシジンの当該カルボニル基に隣接する炭素原子上に水酸基を有する、即ち、ヒドロキシメチルケトンの構造を有する。これらはいずれもトラポキシン等のエポキシケトン原子団の還元代謝物と考えられる。しかし、単なるケトン基の阻害活性を強め、同時に安定性を確保するには、カルボニル基に隣接する炭素原子に電子吸引性基、例えば、アルコキシメチル、アルキルチオメチル、或いはジアルキルアミノメチルのような基を導入する必要がある。かかる観点から、前記一般式（２）で表されるカルボニル化合物は好ましいものである。
【００２８】
本発明においては、前記一般式（3）で表される側鎖にスルフィド基、スルホキシド基又はエーテル基を有する環状テトラペプチド誘導体も好ましい。抗がん剤FK228（アステラス製薬） のように、分子内にジスルフィド結合を有し、これが細胞内で還元されて、強い亜鉛配位子となるチオール基を生成するものも知られている。一方、チオール基が良い亜鉛配位子であることに対し、スルフィド基には配位が無いことも知られている。また、チオール基は、蛋白質の遊離のチオール基と容易に酸化的に結合する性質を有し、体内動態が安定し難い欠点もある。
【００２９】
しかし、本発明者らの研究において、カルボニル基の分極を高める目的で、通常のスルフィド基とメチレン基1個を隔てて組み合わせた結果、例えば-CH2-S-CH2-CO- の組み合わせが有効であることを発見した。また、芳香環を組み合わせたチオエーテル化合物も強力なヒストン脱アセチル化酵素阻害活性を示した。そして、特に、前記一般式（３）で表されるスルフィド基、スルホキシド基又はエーテル基を有する環状テトラペプチド誘導体を、好ましいヒストン脱アセチル化酵素阻害活性を有する化合物として見出した。
【００３０】
チオール基は、チオレートとして反応性が高いが、スルフィド基やスルホキシド基には金属イオン結合性もジスルフィド交換反応もない。この弱い結合力しかないスルフィド基やスルホキシド基の近傍に、ヒストン脱アセチル化酵素の亜鉛近傍の疎水性空間を占拠する芳香族原子団を組み合わせたり、ケトン性カルボニル基を導入して、相乗効果による強力な阻害活性の実現を行った。この結果、ヒストン脱アセチル化酵素の活性中心に存在する亜鉛原子の配位子として、特に前記一般式（３）の側鎖にスルフィド基、スルホキシド基又はエーテル基を有する環状テトラペプチド誘導体を新規に開発し、同時にヒストン脱アセチル化酵素パラログ特異性をもたらすところの種々の環状ペプチド中への効率的導入による製造も行った。
【００３１】
以下、本発明のヒストン脱アセチル化酵素阻害活性を有する化合物の製造方法について説明する。先ず、本発明の一般式（１）で示される環状テトラペプチド誘導体は、一旦それを構成する４つのアミノ酸を連結して、対応する鎖状テトラペプチド誘導体を調製し、次いで、この鎖状テトラペプチド誘導体を環化して得られるものである。即ち、以下の４つのアミノ酸を用いる。
【００３２】
一般式（４）で示されるα−アミノ酸（式中、Ｒ２１、Ｒ２２は、一般式（１）のＲ２１、Ｒ２２と同じ基を表す）：
【００３３】
【化４】
2008143886.tif 000005
【００３４】
一般式（５）で示されるα−アミノ酸（式中、Ｒ３１、Ｒ３２は、一般式（１）のＲ３１、Ｒ３２と同じ基を表す）：
【００３５】
【化５】
2008143886.tif 000006
【００３６】
一般式（６）で示されるα−アミノ酸（式中、ｍは、一般式（１）のｍと同じ数値を表す）：
【００３７】
【化６】
2008143886.tif 000007
【００３８】
一般式（７）で表される末端に二重結合を有するα−アミノ酸（式中、Ｒ１は、一般式（１）のＲ１と同じ基を表す）：
【００３９】
【化７】
2008143886.tif 000008
【００４０】
これら一般式（４）〜（７）で示される４種のα−アミノ酸をペプチド結合により連結して、対応する鎖状テトラペプチド誘導体を調製し、次いで、この鎖状テトラペプチド誘導体を環化する。そして、環状テトラペプチド骨格を形成したのち、前記一般式（７）の側鎖二重結合を利用して、ケトン類やチオエーテル類にそれぞれ誘導することができる。
【００４１】
本発明の一般式（１）で示される環状ペプチドにおいて、それを構成するα−アミノ酸の立体配置は、L−体、Ｄ−体の何れをも取り得るが、構造的な安定性の観点から、少なくとも一つのアミノ酸残基は、他のアミノ酸残基と異なる立体配置をとることが好ましい。具体的には、これら４種のα−アミノ酸の立体配置を、少なくとも１つ又は２つをD−体にとり、残りをＬ−体とすると良い。α炭素を含む環状構造を有するα-アミノ酸が分岐を有しない場合は光学的に不活性であるが、その場合は一般式（５）または（６）のアミノ酸のいずれかがD-体であることが望ましい。
【００４２】
より好ましくは、前記４種のアミノ酸のうち、一般式（６）で示されるものを、Ｄ−体に選択し、残る３種をＬ−体に選択する、あるいは、一般式（４）及び（６）で示されるものを、D−体に選択し、残る２種をL−体に選択するとよい。
【００４３】
本発明の環状テトラペプチド誘導体は、一旦一般式(４)〜(７)に示す４種のα−アミノ酸がペプチド結合した鎖状のテトラペプチド中間体を調製し、しかる後に環状テトラペプチドとし、最終的に一般式（１）に示す本発明の側鎖にカルボニル基あるいはスルフィド基、スルホキシド基又はエーテル基を有する環状テトラペプチド誘導体に誘導される。環状テトラペプチド自体の製造方法は、例えば、特許文献１〜７等で公知であり、かかる公知の方法に従って製造することができる。
【００４４】
例えば、下記一般式（８）で表される環状テトラペプチド誘導体は、請求の範囲第１項又は第２項記載の環状テトラペプチド誘導体の合成中間体である。
【００４５】
【化８】
2008143886.tif 000009
【００４６】
（式中、ｌは１、２、３、４の整数を表す。）
【００４７】
上記式（８）の環状テトラペプチド誘導体の側鎖末端の二重結合は、エポキシ化、アシル基等の導入等の反応へ経て、請求の範囲第２項記載の側鎖にカルボニル基を有する環状テトラペプチド誘導体へと誘導できる。上記式（８）の環状テトラペプチド誘導体の製法は、実施例１にその具体例を示した。
【００４８】
請求の範囲第３項記載の側鎖にスルフィド基、スルホキシド基又はエーテル基を有する環状テトラペプチド誘導体は、アミノ酸の側鎖末端にハロゲン原子を有するアミノ酸を環状テトラペプチド誘導体に導入し、順次官能基変換を行なって、スルフィド基、スルホキシド基又はエーテル基を有する化合物に誘導できる。
【００４９】
また、請求の範囲第３項記載の側鎖にスルフィド基、スルホキシド基又はエーテル基を有する環状テトラペプチド誘導体は、アミノ酸の側鎖末端にハロゲン原子を有するアミノ酸を環状テトラペプチド誘導体に導入し、次いで順次官能基変換を行なってグリシジル（チオ）エーテル基を導入し、更に順次官能基変換によっても、スルフィド基、スルホキシド基又はエーテル基を有する化合物に誘導できる。
【００５０】
本発明の環状テトラペプチド誘導体の薬学的に許容される塩とは、例えば、塩基性を示す窒素原子を含む誘導体では、例えば、塩酸、臭化水素酸、燐酸、硫酸、硝酸などの無機酸との塩、酢酸、乳酸、酒石酸、フマール酸、マレイン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸などの有機酸との塩を意味する。
【００５１】
本発明の環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩は、それを有効成分とする、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤等の医薬として利用することができる。本発明の化合物が、色々なタイプのヒストン脱アセチル化酵素阻害を有することは、実施例２４−２６において示されている。
【００５２】
また、本発明の環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害自体に起因する遺伝子発現パターンの変化により、がん細胞の細胞増殖阻害をもたらす細胞周期阻害蛋白質ｐ２１の発現誘導のみならず、survivin、Bcl-xL等の細胞死抑制蛋白質の発現低下に起因する、がん細胞のアポトーシス誘導とストレス感受性増強作用の相乗的な効果で、高い治療効果を発揮する利点を持つ。加えて、不可逆的な阻害剤であるトラポキシン類縁体と比較するとき、正常組織細胞に対する副作用等、生体に対する好ましからざる影響の残留が少なく、治療効果においても、相対的な副作用が大幅に低減された薬剤としての応用が期待される。
【００５３】
本発明の医薬において、有効成分となる環状テトラペプチド誘導体の用量は、その治療目的、症状の程度、投与対象者の性別、年齢、体重等に応じて適宜決定されるものである。投与対象者が成人男子である場合、１日当たりの用量を０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内に選ぶのが一般的であり、1日1回または数回に分けて投与することが出来る。本発明の医薬は、有効成分となる環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩に、この種のペプチド様化合物製剤に汎用される添加剤を加えて、投与経路に適する剤形とすることができる。細胞透過性に富むものであるので、多種の投与経路が利用することが可能であるが、ペプチドホルモンなどの投与に多様される投与形態、投与経路を取るのが好ましい。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例により本発明を詳述する。以下において、L-Ae9 はS-2-amino-8-nonenoyl の略号である。このアミノ酸をクラミドシンの環状テトラペプチド骨格に導入し、続いて側鎖末端の二重結合を種々変化させて、エポキシド、ブロモヒドリン等を経て、本発明の側鎖にカルボニル基を有する環状テトラペプチド誘導体に誘導した例を示す。
【００５５】
新たに誘導した官能基の略号を、以下のように括弧内に記入した。ブロモメチルケトン; Ae9(Bmk)、メトキシメチルケトン; Ae9(Mmk)、エトキシメチルケトン; Ae9(Emk)、トリフルオロエトキシメチルケトン; Ae9(Tfemk)、メチルチオメチルケトン; Ae9(Mtmk)、アセチルチオメチルケトン; Ae9(Actmk)、ジメチルアミノメチルケトン; Ae9(Dmamk)。
【００５６】
L-Ab5、L-Ab6、L-Ab7、L-Ab8は、それぞれ
S-2-amino-5-bromopentanoyl、
S-2-amino-6-bromohexanoyl、
S-2-amino-7-bromoheptanoyl、
S-2-amino-8-bromooctanoyl の略号である。
【００５７】
L-Am5、L-Am6、 L-Am7、L-Am8は、それぞれ、
S-2-amino-5-mercaptopentanoyl、
S-2-amino-6-mercaptohexanoyl、  
S-2-amino-7-mercaptoheptanoyl、
S-2-amino-8-mercaptooctanoylの略号であり、これらの硫黄原子と結合する種々の原子団は括弧内に記入したとおり、methy, benzyl, pyridylmethyl 等のアルキル基または修飾アリール基である。これらの硫黄原子のアルキル化によって生じるスルフィド基を、更に酸化した場合 sulfoxide と括弧内に表記した。L-Ah7 は S-2-amino-7-hydroxyheptanoyl の略号であり、これの末端酸素原子を修飾したアルキル基を括弧内に記入した。Aibは２-アミノイソ酪酸の略号である。
【００５８】
［参考例１］t-Butyloxycarbonyl-S-2-amino-8-nonenoic acid (Boc-L-Ae9-OH)の合成
Boc-アミノマロン酸ジエチル(15.2 g, 55.0 mmol) を、等量のナトリウムエトキシドを含む無水エタノールに溶解し、7-ブロモ-1-ヘプテン (8.64 ml, 10.0 g, 55.0 mmol) を加え、5 時間還流した。1 M 水酸化ナトリウム溶液 (60 ml) を加えて半ケン化を行い、十分酸性にした後半エステル半カルボン酸をトルエンで抽出した。トルエン溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、6時間還流して、脱炭酸を行い、生成したBoc-DL-Ae9-OEt を、１％メタノール／クロロホルムを用いたシリカゲルクロマトグラフィーで精製した(12.1 g, 40.4 mmol, 73%)。更にこれをDMF (40  ml)、水 (40  ml) に縣濁し、ズブチリシン (45 mg) を加えて、選択的加水分解を行った。酵素反応進行中は、1
M のアンモニア水を用いて、pH
を８付近に維持した。光学分割した Boc-L-Ae9-OH を pH 3 の酸性条件で酢酸エチルに抽出し、乾燥、溶媒留去後、透明の無色液体として得た。収量、4.88 g (45%)。
【００５９】
HPLC: rt: 7.64 min. (column: Chromolith
Performance RP-18e, 4.6 mm x 100 mm, 10-100％ linear gradient CH3CN/0.1％TFA over 15min, flow rate 2.0 ml/min.以下のＨＰＬＣ条件も同様。) [α]D25 = -3.1 (c = 1, MeOH). HR-FABMS [M+H]+ 272.1893 for C14H26O4N (calcd. 272.1862). 1H NMR (500 MHz,
CDCl3) δH = 1.29-1.39 (6H, m, γ , δ and ε), 1.45 (9H, s, t-Bu), 1.67 and 1.86 (1H, each, each, m, β), 2.06 (2H, m, CH2CH=CH2), 4.29 (1H, m, α), 4.92-5.01 (3H, m, NH
and CH2CH=CH2), 5.79 (1H, ddt, J = 17.2, 10.2, 6.5, CH2CH=CH2), 13C NMR (CDCl3)δ
= 25.15 (γ-C), 
28.32 ((CH3)3C-), 28.62 (δ-C and ε-C), 32.28 (β-C), 33.60 （ω-C）, 53.39 (α-C), 80.22 ( (CH3)3C-), 114.43 (CH2-CH=CH2), 138.83 (CH2-CH=CH2), 163.06 (C=O, -Boc), 176.78 (C=O, -COOH). 
【００６０】
［参考例２］Boc-L-Ae9-Aib-L-Phe-D-Pro-OtBuの合成
参考例１で得られたBoc-L-Ae9-OH (5.43 g, 20 mmol) と H-Aib-L-Phe-D-Pro-OtBu (8.07 g, 20 mmol) をペプチド合成の定法により縮合し、生成物を酢酸エチルに抽出後、１％メタノール／クロロホルムを用いたシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製した (12.3 g, 18.8 mmol, 94%)。HPLC: rt: 11.16 min. HR-FABMS [M+H]+ 657.4270 for C36H57O7N4 (calcd. 657.4227).
【００６１】
［実施例１］Cyclo(-L-Ae9-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（８）においてｌ＝３の化合物（Ｋｙ−１７）。なお、表１及び図１においては、化合物を略号によっても表すが、本化合物はＫｙ−１７である（以下同様）。
【００６２】
参考例２で得られたBoc-L-Ae9-Aib-L-Phe-D-Pro-OtBu (12.3 g, 18.8 mmol) をTFA（テトラフルオロ酢酸）（50 ml）で０℃、３時間処理して、両末端の保護基を除去した。TFA
留去後、エーテルで固化して粉末状の TFA 塩を得た (11.6 g, 100%)。 HPLC, rt 5.96 min. HR-FABMS [M+H]+, 501.3050 (計算値、501.3077, C27H41O5N4)。このTFA 塩(4.92 g, 8.0 mmol)を DMF (20 ml) に溶解し、5分割
30 分間隔で、HATU （ｏ−［７−アザベンゾトリアゾール−１−イル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート）(3.64 g, 9.6 mmol) およびジイソプロピルエチルアミン (4.45 ml, 25.6 mmol) の縮合試薬を用い、室温で、800 ml の DMF 中で、5 mM の希薄条件で環化反応を行った。溶媒を留去後、残渣を酢酸エチルで抽出し、シリカゲルクロマトグラフィー (1% メタノール/クロロホルム) で精製した。無色の固体 3.36g (87%) を得た。
【００６３】
HPLC, rt 9.34 min., HR-FABMS [M+H]+ 483.2971 for C27H39O4N4 (calcd. 483.2971). 1H NMR (500 MHz,
CDCl3): δH 1.28 (m, 2H), 1.32 (m, 2H), 1.34 (s, 3H), 1.38 (m, 2H), 1.63 (m,
1H), 1.73 (m, 1H), 1.76 (m, 1H), 1.77 (s, 3H), 1.80 (m, 1H), 2.03 (m, 2H), 2.18
(m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.95 (dd, J = 13.3, 5.7 Hz, 1H),
3.23 (m, 1H), 3.26 (dd, J =  13.5, 10.0 Hz, 1H), 3.86 (m, 1H), 4.18 (m,
1H), 4.66 (m, 1H), 4.97 (m, 2H), 5.16 (ddd, J = 10.1, 10.1, 5.9 Hz, 1H), 5.79
(ddt, J = 17.2, 10.2, 6.5, 1H), 5.91 (s, 1H), 7.08 (d, J =  10.5 Hz, 1H),
7.21 (m, 3H), 7.27 (m, 2H), 7.52 (d, J =  10.5 Hz, 1H)。
【００６４】
［参考例３］Cyclo(-L-Ae9(O)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成（Ｋｙ−７）
実施例１で得られたCyclo(-L-Ae9-Aib-L-Phe-D-Pro-) (4.73 g, 9.80 mmol) を無水ジクロロメタン (200 ml) に溶解し、氷温でメタクロロ過安息香酸 (3.38 g,
19.6 mmol) の無水ジクロロメタン (100 ml)溶液を加えて、室温で 18 時間反応させた。反応液を 4% NaHCO3 と食塩水で洗い、溶媒留去後、１％メタノール／クロロホルムを用いたシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、無色固形体を得た (4.33 g, 89%)。
【００６５】
HPLC, rt 7.13 min. HR-FAB
MS [M+H]+ 499.2891
for C27H39O5N4
(calcd. 499.2920), 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.28 (m, 2H), 1.32 (m, 2H), 1.34 (s,
3H), 1.38 (m, 1H), 1.46 (m, 1H), 1.52 (m, 2H) 1.64 (m,
1H), 1.74 (m, 1H), 1.76 (m, 1H), 1.77 (s, 3H), 1.80 (m, 1H), 2.18 (m, 1H), 2.32
(m, 1H), 2.46 (m, 1H), 2.74 (m, 1H), 2.89 (m, 1H), 2.95 (dd, J =  13.5,
6.0 Hz, 1H), 3.23 (m, 1H), 3.26 (dd, J =  13.5, 10.0 Hz, 1H),  3.86
(m, 1H), 4.19 (m, 1H), 4.66 (m, 1H), 5.16 (ddd, J = 10.2, 10.2, 5.8 Hz, 1H),
5.94 (s, 1H), 7.10 (d, J =  10.0 Hz, 1H), 7.21 (m, 3H), 7.27 (m, 2H), 7.51
(d, J =  10.5 Hz, 1H).
【００６６】
［参考例４］Cyclo(-L-Ae9(8-OH, 9-Br)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
参考例３で得られたCyclo(-L-Ae9(O)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (2.49 g, 5.00 mmol) を無水 THF ( 50 ml) に溶解し、氷酢酸 (0.83 ml) と無水LiBr (695 mg, 8.00 mmol)
を加え、室温で5時間反応させた。水1 ml を加えて溶媒留去後、生成物を酢酸エチルに抽出し、2% メタノール/クロロホルム溶液を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、無色固形物を得た (2.69 g, 93%)。
【００６７】
HPLC, rt 6.68 min. HR-FAB
MS [M+H]+ 579.2156
for C27H40O5N479Br (calcd. 579.2182) and 581.2098 for C27H40O5N481Br (calcd. 581.2162), 1H NMR (500
MHz, CDCl3): δH 1.30 (m, 2H), 1.31 (m, 2H), 1.34 (s,
3H), 1.35 (m, 1H), 1.46 (m, 1H), 1.54 (m, 2H), 1.63 (m, 1H), 1.74 (m, 1H), 1.77
(s, 3H), 1.79 (m, 1H), 1.80 (m, 1H), 2.09 (s, 1H), 2.17
(m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.95 (dd, J = 13.5, 6.0 Hz, 1H), 3.21 (m, 1H), 3.26 (dd,
J =  13.5, 10.0 Hz, 1H), 3.38 (m, 1H), 3.53 (m, 1H), 3.77 (m, 1H), 3.85
(m, 1H), 4.20 (m, 1H), 4.67 (m, 1H), 5.16 (ddd, J = 10.2, 10.2, 5.5 Hz, 1H),
6.07 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.14 (d, J =  10.5 Hz, 1H), 7.22 (m, 3H), 7.27
(m, 2H), 7.52 (d, J =  10.5 Hz, 1H). 
【００６８】
［参考例５］Cyclo(-L-Ae9(8-OH, 9-OCH3)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
参考例３で得られたCyclo(-L-Ae9(O)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (499 mg, 1.00 mmol) を 0.5 M ナトリウムメトキシド/メタノール溶液  (2 ml) に溶解し、２８℃で１６時間反応させた。酢酸 1 ml を加えて溶媒留去後、生成物を酢酸エチルに抽出し、2% メタノール/クロロホルム溶液を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、無色固形物を得た (361 mg, 68%)。
【００６９】
HPLC, rt 6.27 min. HR-FAB
MS [M+H]+ 531.3204
for C28H43O6N4
(calcd. 531.3183), 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.31 (m, 2H), 1.32 (m, 2H) 1.34 (s,
3H), 1.36 (m, 2H), 1.42 (m, 2H), 1.62 (m, 1H), 1.74 (m, 1H), 1.77 (s, 3H), 1.79
(m, 1H), 1.80 (m, 1H), 1.84 (br, 1H), 2.17 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.95 (dd, J =
13.5, 6.0 Hz, 1H), 3.21 (m, 1H), 3.26 (dd, J = 
13.5, 10.0 Hz, 1H), 3.24 (m, 1H), 3.39 (m, 1H), 3.76 (m, 1H), 3.85 (m, 1H),
3.88 (s, 1H), 4.18 (m, 1H), 4.66 (m, 1H), 5.16 (ddd, J = 10.2, 10.2, 5.5 Hz,
1H), 5.94 (d, J = 5 Hz, 1H), 7.09 (d, J =  10.5 Hz, 1H), 7.22 (m, 3H),
7.27 (m, 2H), 7.51 (d, J =  10.0 Hz, 1H).
【００７０】
［参考例６］Cyclo(-L-Ae9(8-OH, 9-OCH2CH3)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
参考例３で得られたCyclo(-L-Ae9(O)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (499 mg, 1.00 mmol) を 0.5 M ナトリウムエトキシド/エタノール溶液  (2 ml) に溶解し、２８℃で１６時間反応させた。酢酸 1 ml を加えて溶媒留去後、生成物を酢酸エチルに抽出し、2% メタノール/クロロホルム溶液を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、無色固形物を得た (381 mg, 70%)。HPLC, rt 6.85 min.
【００７１】
［参考例７］Cyclo(-L-Ae9(8-OH, 9-OCH2CF3)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
アルゴン雰囲気下で、トリフルオロエタノール (10 ml)に金属ナトリウム(230 mg, 10.0 mmol) を溶解した。このナトリウムトリフルオロエトキシド溶液 (5 ml) に、参考例３で得られたCyclo(-L-Ae9(O)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (499 mg, 1.00 mmol) を溶解し、３８℃で４８時間反応させた。酢酸 1 ml を加えて溶媒留去後、生成物を酢酸エチルに抽出し、1% メタノール/クロロホルム溶液を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、無色固形物を得た  (449 mg, 75%)。
【００７２】
HPLC, rt 7.33 min. HR-FAB
MS [M+H]+ 599.3058
for C29H42O6N4F3 (calcd. 599.3056), 1H NMR (500 MHz,
CDCl3): δH 1.34 (m, 8H), 1.44 (m, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.63 (m, 1H), 1.74 (m,
1H), 1.77 (s, 3H), 1.79 (m, 1H), 1.80 (m, 1H), 2.17 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.95
(dd, J = 13.5, 6.0 Hz, 1H), 3.21 (m, 1H), 3.46 (m, 1H),
3.65 (m, 1H), 3.80 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.26 (dd, J =  13.5, 10.0 Hz, 1H),
3.89 (m, 2H)  4.18 (m, 1H), 4.66 (m, 1H), 5.16 (ddd, J = 10.2, 10.2, 5.5
Hz, 1H), 5.90 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 7.09 (d, J =  10.0 Hz, 1H), 7.21 (m,
3H), 7.28 (m, 2H), 7.50 (d, J =  10.5 Hz, 1H).
【００７３】
［実施例２］Cyclo(-L-Ae9(Bmk)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（２）でｌ＝３、Ｙ１＝Ｂｒの化合物（Ｋｙ−１２）。
【００７４】
参考例４で得られたCyclo(-L-Ae9(8-OH, 9-Br)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (209 mg, 0.360 mmol) を無水ジクロロメタン (4 ml) に溶解し、Dess-Martin 試薬 (458 mg, 1.08 mmol) を加えて２５℃で３時間反応させた。反応液を4 ml のジエチルエーテルで希釈し、チオ硫酸ナトリウム５水和物
(804 mg) を含む飽和
NaHCO3 溶液を加えた。10 分間で懸濁液が透明になり、２層分離した有機層を取り、水洗後無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去して得られた油状物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。無色固形物を得た (185 mg, 89%)。
【００７５】
HPLC, rt 7.33 min. HR-FAB MS [M+H]+ 577.2051 for C27H38O5N479Br
(calcd. 577.2026) and 579.1997 for C27H38O5N481Br (calcd. 579.2005), 1H NMR (500
MHz, CDCl3): δH 1.31 (m, 2H), 1.32 (m, 3H), 1.34 (s, 3H), 1.62 (m, 2H), 1.75 (m,
1H), 1.77 (s, 3H), 1.79 (m, 1H), 1.80 (m, 1H), 2.17 (m,
1H), 2.32 (m, 1H), 2.65 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.95 (dd, J = 13.5, 6.0 Hz, 1H),
3.21 (m, 1H), 3.26 (dd, J =  13.5, 10.0 Hz, 1H), 3.86 (m, 1H), 3.87 (s,
2H), 4.18 (m, 1H), 4.66 (m, 1H), 5.16 (ddd, J = 10.2, 10.2, 5.5 Hz, 1H), 5.93
(s, 1H), 7.10 (d, J =  10.5 Hz, 1H), 7.22 (m, 3H), 7.27 (m, 2H), 7.50 (d,
J =  10.5 Hz, 1H). 
【００７６】
［実施例３］Cyclo(-L-Ae9(Mmk)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（２）でｌ＝３、Ｙ１＝ＯＣＨ３の化合物（Ｋｙ−９）。
【００７７】
参考例５で得られたCyclo(-L-Ae9(8-OH, 9-OCH3)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (318 mg, 0.600 mmol) に対し、Dess-Martin試薬 (765 mg, 1.8 mmol) を実施例２と同様に反応させて、メトキシメチルケトン体 
(270 mg, 85%) を得た。
【００７８】
HPLC, rt 6.16 min. HR-FAB
MS [M+H]+ 529.3026
for C28H41O6N4 (calcd.
529.3026), 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.31 (m, 2H), 1.32 (m, 3H), 1.34 (s,
3H), 1.60 (m, 1H), 1.61 (m, 1H), 1.74 (m, 1H), 1.77 (s,
3H), 1.79 (m, 2H), 2.17 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.95
(dd, J = 13.5, 6.0 Hz, 1H), 3.21 (m, 1H), 3.26 (dd, J =  13.5, 10.0 Hz,
1H), 3.42 (s, 3H), 3.86 (m, 1H), 3.99 (s, 2H), 4.18 (m, 1H), 4.66 (m, 1H), 5.16
(ddd, J = 10.2, 10.2, 5.5 Hz, 1H), 5.97 (s, 1H), 7.11 (d, J =  10.5 Hz,
1H), 7.21 (m, 3H), 7.27 (m, 2H), 7.51 (d, J =  10.5 Hz, 1H).
【００７９】
［実施例４］Cyclo(-L-Ae9(Emk)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（２）でｌ＝３、Ｙ１＝ＯＣＨ２ＣＨ３の化合物（Ｋｙ−１０）。
【００８０】
参考例６で得られたCyclo(-L-Ae9(8-OH, 9-OC2H5)-Aib-L-Phe-D-Pro-)
(326 mg, 0.60 mmol) を実施例２の合成と同様に Dess-Martin 酸化を行って、シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、無色固形物を得た (302mg, 93%)。
【００８１】
HPLC, rt 7.06 min. HR-FAB
MS [M+H]+ 543.3223
for C29H43O6N4
(calcd. 543.3183), 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.25 (t, J = 7.0 Hz, 3H) 1.31 (m, 2H), 1.32 (m, 3H), 1.34 (s, 3H), 1.59 (m, 1H), 1.60 (m, 1H), 1.74
(m, 1H), 1.77 (s, 3H), 1.79 (m, 2H), 2.18 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.45 (t, J =
7.5 Hz, 2H), 2.95 (dd, J = 13.5, 6.0 Hz, 1H), 3.21 (m, 1H), 3.26 (dd, J = 
13.5, 10.0 Hz, 1H), 3.55 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.86 (m, 1H), 4.03 (s, 2H), 4.18
(m, 1H), 4.66 (m, 1H), 5.16 (ddd, J = 10.2, 10.2, 5.5 Hz, 1H), 5.92 (s, 1H), 7.09
(d, J =  10.5 Hz, 1H), 7.21 (m, 3H), 7.26 (m, 2H), 7.50 (d, J =  10.5
Hz, 1H).
【００８２】
［実施例５］Cyclo(-L-Ae9(Tfemk)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（２）でｌ＝３、Ｙ１＝ＯＣＨ２ＣＦ３の化合物（Ｋｙ−６０）。
【００８３】
参考例７で得られたCyclo(-L-Ae9(8-OH, 9-OCH2CF3)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (359 mg, 0.60 mmol) を実施例２の合成と同様に Dess-Martin 酸化を行って、シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、無色固形物を得た (333 mg,  93%)。
【００８４】
HPLC, rt 8.01 min. HR-FAB MS [M+H]+ 597.2881 for C29H40O6N4F3 (calcd. 597.2900). 
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.31 (m, 2H), 1.32 (m, 3H), 1.34 (s, 3H), 1.60 (m, 1H), 1.61 (m, 1H),
1.74 (m, 1H), 1.77 (s, 3H), 1.79 (m, 2H), 2.18 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.44 (t,
J = 7.5 Hz, 2H), 2.95 (dd, J = 13.5, 6.0 Hz, 1H), 3.21 (m,
1H), 3.26 (dd, J =  13.5, 10.0 Hz, 1H), 3.86 (m, 1H), 3.94 (q, JH,F = 8.5
Hz, 2H), 4.18 (m, 1H), 4.22 (s, 2H), 4.66 (m, 1H), 5.16 (ddd, J = 10.2, 10.2,
5.5 Hz, 1H), 5.90 (s, 1H), 7.10 (d, J =  10.0 Hz, 1H), 7.22 (m, 3H), 7.27
(m, 2H), 7.49 (d, J =  10.0 Hz, 1H).
【００８５】
［実施例６］Cyclo(-L-Ae9(Mtmk)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（２）でｌ＝３、Ｙ１＝ＳＣＨ３の化合物（Ｋｙ−１３）。
【００８６】
実施例２で得られたCyclo(-L-Ae9(Bmk)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (62 mg, 0.108 mmol) をDMF (0.5 ml) に溶解し、ナトリウムチオメトキシド (8.0 mg,
0.108 mmol) を加え、室温で1時間反応させた。生成物を酢酸エチルに抽出し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した (51.0 mg, 87%)。
【００８７】
HPLC, rt 7.22 min. HR-FAB
MS [M+H]+ 545.2766
for C28H41O5N4S
(calcd. 545.2798), 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.28 (m, 2H), 1.32 (m, 2H), 1.34 (s,
3H), 1.61 (m, 2H), 1.64 (m, 1H), 1.74 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 1.76 (m, 1H), 1.77
(s, 3H), 1.81 (m, 1H), 2.07 (s, 3H), 2.18 (m, 1H), 2.60 (t, J =  7.5 Hz,
2H), 2.95 (dd, J =  13.7, 5.7 Hz, 1H), 3.16 (s,
2H), 3.23 (m, 1H), 3.26 (dd, J =  14.0, 10.0 Hz, 1H), 3.86 (m, 1H), 4.18
(m, 1H), 4.66 (m, 1H), 5.16 (ddd, J = 10.0, 10.0, 6.0 Hz, 1H), 5.91 (s, 1H),
7.09 (d, J =  10.5 Hz, 1H), 7.21 (m, 3H), 7.28 (m, 2H), 7.50 (d, J = 
10.0 Hz, 1H)
【００８８】
［実施例７］Cyclo(-L-Ae9(Actmk)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（２）でｌ＝３、Ｙ１＝-SCOCH3（Ｋｙ−１８）。
【００８９】
実施例２で得られたCyclo(-L-Ae9(Bmk)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (60.0 mg, 0.104 mmol) をDMF (0.5 m) に溶解し、チオ酢酸カリウム (12.0 mg,
0.104 mmol) を加え、室温で3時間反応させた。生成物を酢酸エチルに抽出し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した (47.0 mg, 79%)。
【００９０】
HPLC, rt 7.40 min. HR-FAB
MS [M+H]+ 573.2723
for C29H41O6N4S
(calcd. 573.2747), 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.28 (m, 2H), 1.32 (m, 2H), 1.34 (s,
3H), 1.61 (m, 2H), 1.64 (m, 1H), 1.74 (m, 1H), 1.76 (m, 1H), 1.77 (s, 3H), 1.81 (m, 1H), 2.18 (m, 1H), 2.32 (m, 1H),2.39 (s, 3H), 2.54 (t, J
=  7.5 Hz, 2H), 2.95 (dd, J =  13.7, 5.7 Hz, 1H), 3.73 (s, 2H), 3.23
(m, 1H), 3.26 (dd, J =  14.0, 10.0 Hz, 1H), 3.86 (m, 1H), 4.18 (m, 1H),
4.66 (m, 1H), 5.16 (ddd, J = 10.0, 10.0, 6.0 Hz, 1H), 5.93 (s, 1H), 7.09 (d, J
=  10.0 Hz, 1H), 7.21 (m, 3H), 7.28 (m, 2H), 7.50 (d, J =  10.0 Hz,
1H).
【００９１】
［実施例８］Cyclo(-L-Ae9(Dmamk)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（２）でｌ＝３、Ｙ１＝−N(CH3)2）の化合物（Ｋｙ−１４）。
【００９２】
実施例２で得られたCyclo(-L-Ae9(Bmk)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (63.0 mg, 0.109 mmol) を無水メタノール (0.5 m) に溶解し、2 M ジメチルアミンのメタノール溶液 (82 μl, 0.160 mmol) を加えて5時間反応させた。生成物を酢酸エチルで抽出し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した (40.0 mg, 68%)。
【００９３】
HPLC, rt 4.54 min. HR-FAB
MS [M+H]+ 542.3320
for C29H44O5N5
(calcd. 542.3342), 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.31 (m, 2H), 1.32 (m, 3H), 1.34 (s,
3H), 1.58 (m, 1H), 1.59 (m, 1H), 1.74 (m, 1H), 1.77 (s, 3H), 1.79 (m, 2H), 2.17
(m, 1H), 2.29 (s, 6H), 2.32 (m, 1H), 2.42 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.95 (dd, J =
13.5, 6.0 Hz, 1H), 3.14 (s, 2H), 3.21 (m, 1H), 3.26 (dd, J =  13.5, 10.0 Hz, 1H), 3.86 (m, 1H), 4.18 (m, 1H), 4.66 (m,
1H), 5.16 (ddd, J = 10.2, 10.2, 5.5 Hz, 1H), 5.94 (s, 1H), 7.09 (d, J = 
10.5 Hz, 1H), 7.21 (m, 3H), 7.27 (m, 2H), 7.50 (d, J =  10.5 Hz, 1H). 
【００９４】
［実施例９］Cyclo(-L-Am7(methyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成。
前記式（３）においてｎ＝３、Ｘ１＝Ｓ、Ｙ２＝Ｈの化合物（Ｋｙ−１５）。
【００９５】
Cyclo(-L-Ab7-Aib-L-Phe-D-Pro-) （535 mg、1.0 mmol） を DMF （2.0 ml） に溶かし、NaSCH3（105 ｍg, 1.5 mmol）を加え、室温で３時間反応させた。溶媒を留去し、残渣を酢酸エチルに抽出して 10％クエン酸水溶液、4％炭酸水素ナトリウム水溶液、および飽和食塩水で順次洗った。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、酢酸エチルを留去し、フォーム状固体を得た (362 mg, 72％)。HPLC,
rt 7.80 min. 
【００９６】
［実施例１０］Cyclo(-L-Am7(2-pyridylmethylthioether)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（３）においてｎ＝３、Ｘ１＝Ｓ、Ｙ２＝2-pyridyl基の化合物（Ｋｙ−１６）。
【００９７】
Cyclo(-L-Am7(SAc)-Aib- L-Phe-D-Pro-) （265 mg、0.50 mmol） を DMF （2.0 ml） に溶かし、アルゴンガスを通気し、9 M メチルアミン/メタノール （0.27 ml, 2.5 mmol） を加え、３時間反応させた。溶媒を留去し、残渣を再びDMF
(2.0 ml) に溶解し、2-ブロモメチルピリジン・臭化水素塩 (190 mg,
0.75 mmol) およびトリエチルアミン (0.18 ml, 1.25 mmol) を加え、アルゴン雰囲気下、室温で３時間反応させた。溶媒を留去し、酢酸エチルで抽出して、上記と同様に処理した。シリカゲルフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー (2% メタノール/クロロホルム) で精製し、油状物を得た (150 mg, 51%)。HPLC, rt 7.54 min. HR-FABMS (2,2’-dithiodiethanol), 580.2972 [M+H]+, C31H42N5O4S (calcd. 580.2958). 
【００９８】
［実施例１１］Cyclo(-L-Am7(2-pyridylmethyl, sulfoxide)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（３）においてｎ＝３、Ｘ１＝ＳＯ、Ｙ２＝2-pyridylmethylの化合物（Ｋｙ−２５）。
【００９９】
実施例１０で得られた
Cyclo(-L-Am7(2-Pyridylmethylthioether)-Aib-L-Phe-D-Pro-)(58.0
mg,0.10 mmol) を DMF (1.0 ml) に溶かし、4% 過酸化水素水 ( 0.13 ml, 0.15 mmol) を加え、15 時間反応させた。反応液を酢酸エチルで抽出し、水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、酢酸エチルを留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (2% メタノール/クロロホルム) で精製し、油状物を得た (24.0 mg, 45%)。HPLC, rt 8.21 min. HR-FAB MS (2,2’-dithiodiethanol), 596.2921
[M+H]+, C31H42N5O5S
(calcd. 596.2907). 
【０１００】
［実施例１２］Cyclo(-L-Am7(3-pyridylmethyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（３）においてｎ＝３、Ｘ１＝Ｓ、Ｙ２＝3-pyridylmethylの化合物（Ｋｙ−６８）。
【０１０１】
実施例１０と同様な方法で、cyclo(-L-Am7(SAc)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (265 mg, 0.50 mmol) と3-ブロモメチルピリジン・臭化水素塩 (190 mg,
0.75 mmol) を用い、油状物を得た  (167 mg, 58%)。HPLC, rt 8.02 min. HR-FABMS (2,2’-dithiodiethanol), 580.2939 [M+H]+, C31H42N5O4S (calcd. 580.2958).
【０１０２】
［実施例１３］Cyclo(-L-Am7(4-pyridylmethyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（３）においてｎ＝３、Ｘ１＝Ｓ、Ｙ２＝4-pyridylmethylの化合物（Ｋｙ−２６）。
【０１０３】
実施例１０と同様な方法で、cyclo(-L-Am7(SAc)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (265 mg, 0.50 mmol) と 4-ブロモメチルピリジン・臭化水素塩 (190 mg,
0.75 mmol) を用い、油状物を得た (127 mg, 44%)。HPLC, rt 8.06 min. HR-FABMS (2,2’-dithiodiethanol), 580.2977 [M+H]+, C31H42N5O4S (calcd. 580.2958). 
【０１０４】
［実施例１４］Cyclo(-L-Am7(benzyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（３）においてｎ＝３、Ｘ１＝Ｓ、Ｙ２＝フェニル基の化合物（Ｋｙ−６９）。
【０１０５】
実施例１０と同様な方法で、cyclo(-L-Am7(SAc)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (265 mg, 0.50 mmol) およびベンジルブロミド (128 mg, 0.75
mmol) を用い、油状物を得た (185 mg, 63%)。HPLC, rt 8.16 min. HR-FAB MS (2,2’-dithiodiethanol), 579.3016 [M+H]+, C32H43N4O4S (calcd. 579.3005). 
【０１０６】
［実施例１５］Cyclo(-L-Am5(1,1,1,-trifluoroacetonyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（３）においてｎ＝１、Ｘ１＝Ｓ、Ｙ２＝ＣＯＣＦ３の化合物（Ｋｙ−２７）。
【０１０７】
実施例１０と同様な方法で、cyclo(-L-Am5(SAc)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (251 mg, 0.50 mmol) および 1,1,1,-トリフルオロ-3-ブロモアセトン (143 mg, 0.75 mmol)
を用い、油状物を得た
(154 mg, 54%)。HPLC,
rt 6.83 min. HR-FABMS (2,2’-dithiodiethanol), 571.2280 [M+H]+, C26H34F3O5N4S
(calcd. 571.2202).  
【０１０８】
［実施例１６］Cyclo(-L-Am6(1,1,1,-trifluoroacetonyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（３）においてｎ＝２、Ｘ１＝Ｓ、Ｙ２＝ＣＯＣＦ３の化合物（Ｋｙ−２８）。
【０１０９】
実施例１０と同様な方法で、cyclo(-L-Am6(SAc)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (258 mg, 0.50 mmol) および 1,1,1,-トリフルオロ-3-ブロモアセトン (143 mg, 0.75 mmol)
を用い、油状物を得た
(134 mg, 47%)。HPLC,
rt 7.60 min. HR-FAB MS (2,2’-dithiodiethanol), 585.2391 [M+H]+, C27H36F3O5N4S
(calcd. 585.2359). 
【０１１０】
［実施例１７］Cyclo(-L-Am7(1,1,1,-trifluoroacetonyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（３）においてｎ＝３、Ｘ１＝Ｓ、Ｙ２＝ＣＯＣＦ３の化合物（Ｋｙ−２９）。
【０１１１】
実施例１０と同様な方法で、cyclo(-L-Am7(SAc)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (265 mg, 0.50 mmol) および 1,1,1,-トリフルオロ-3-ブロモアセトン (143 mg, 0.75 mmol)
を用い、油状物を得た
(161 mg, 54%)。HPLC,
rt 8.11 min. HR-FABMS (2,2’-dithiodiethanol), 599.2534 [M+H]+, C28H38F3O5N4S
(calcd. 599.2515).
【０１１２】
［実施例１８］Cyclo(-L-Am7(1,1,1,-trifluoroacetonyl, sulfoxide)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（３）においてｎ＝３、Ｘ１＝ＳＯ、Ｙ２＝ＣＯＣＦ３の化合物（Ｋｙ−７１）。
【０１１３】
実施例１０と同様な方法で、実施例１７で得られた
cyclo(-L-Am7(1,1,1,-trifluoroacetonyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-)
( 90 mg, 0.15 mmol) を4% 過酸化水素水で酸化した。油状物を得た (43 mg, 44%)。HPLC, rt 8.43 min. HR-FABMS (2,2’-dithiodiethanol), 615.2450 [M+H]+, C28H38F3N4O6S (calcd. 615.2464). 
【０１１４】
［実施例１９］Cyclo(-L-Am8(1,1,1,-trifluoroacetonyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（３）においてｎ＝４、Ｘ１＝Ｓ、Ｙ２＝ＣＯＣＦ３の化合物（Ｋｙ−７３）。
【０１１５】
実施例１０と同様な方法で、cyclo(-L-Am8(SAc)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (272 mg, 0.50 mmol) および 1,1,1,-トリフルオロ-3-ブロモアセトン (143 mg, 0.75 mmol)
を用い、油状物を得た
(147 mg, 48%)。HPLC,
rt 8.51 min. HR-FABMS (2,2’-dithiodiethanol), 613.2691 [M+H]+, C29H40F3N4O5S
(calcd. 613.2672).
【０１１６】
［実施例２０］Cyclo(-L-Am7(acetonyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成。
前記式（３）においてｎ＝３、Ｘ１＝Ｓ、Ｙ２＝ＣＯＣＨ３の化合物（Ｋｙ−７２）。
【０１１７】
実施例１０と同様な方法で、cyclo(-L-Am7(SAc)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (265 mg, 0.50 mmol) とブロモアセトン (102 mg, 0.75
mmol) を用い、油状物を得た (158 mg, 59%)。HPLC, rt 8.01 min. HR-FAB MS (2,2’-dithiodiethanol), 545.2767 [M+H]+, C28H41N4O5S (calcd. 545.2798).
【０１１８】
［実施例２１］Cyclo(-L-Am7(acetonyl, sulfoxide)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（３）においてｎ＝３、Ｘ１＝ＳＯ、Ｙ２＝ＣＯＣＨ３の化合物（Ｋｙ−８６）。
【０１１９】
実施例２０で得られたcyclo(-L-Am7(acetonyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-) 55mg, 0.10 mmol) を4% 過酸化水素水で酸化した。油状物を得た(24 mg,43%)。HPLC, rt 4.84 min.
HR-FABMS (2,2’-dithiodiethanol),
561.2846[M+H]+, C28H41N4O6S
(calcd.561.2995 ). 
【０１２０】
［実施例２２］Cyclo(-L-Am7(methoxyacetonyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（３）においてｎ＝３、Ｘ１＝Ｓ、Ｙ２＝ＣＯＣＨ２ＯＣＨ３の化合物（Ｋｙ−８５）。
【０１２１】
実施例２０で得られたcyclo(-L-Am7(SAc)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (120 mg, 0.23 mmol)と
エピブロモヒドリン(47 mg,0.35 mmol) を用い、
cyclo(-L-Am7(glycidyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-) を油状物として得た (98 mg,78%)。
HPLC, rt 8.05 min. HR-FABMS (2,2’-dithiodiethanol),
545.2782 [M+H]+, C28H41O5N4S
(calcd. 545.2798).  続いてグリシジル基をメタノール中でナトリウムメトキシド（0.2mmol）で開環し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して cyclo(-L-Am7(CH2CH(OH)OCH3)-Aib-L-Phe-D-Pro-) を得た (93 mg, 90%)。
【０１２２】
HPLC, rt 7.81 min. HR-FABMS (2,2’-dithiodiethanol), 577.3053
[M+H]+, C29H45O6N4S (calcd. 577.3060). 
更に、これを無水ジクロロメタン中でDess-Martin
試薬 (271 mg, 0.64
mmol) と反応させ、目的とする化合物(69 mg, 72%) を淡黄色油状物として得た。HPLC, rt 7.52 min. HR-FABMS (2,2’-dithiodiethanol), 575.2920 [M+H]+, C29H43O6N4S (calcd. 575.2903).
【０１２３】
［実施例２３］Cyclo(-L-Ah7(acetonyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-)の合成
前記式（３）においてｎ＝３、Ｘ１＝Ｏ、Ｙ２＝ＣＯＣＨ３の化合物（Ｋｙ−７４）。
【０１２４】
Boc-L-Ah7(allyl)-OH (1.02 g, 1.0 mmol) とH-Aib-L-Phe-D-Pro-OtBu
(1.98 g, 4.87 mmol) を DMF (10 ml) 中で、ペプチド合成の定法で縮合した。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製して、Boc-L-Ah7(allyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-OtBu (1.1 g, 35%) をフォーム状で得た。HPLC, rt 9.19
min. MALDI-TOFMS, m/e 710.13 ([M+Na]+) 。この全量を氷浴上で TFA (3 ml) に溶解し、４時間反応させた。TFA を留去し、エーテルを加えて H-L-Ah7(allyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-OH・TFA (800 mg, 80%) を白色粉末で得た。更にDMF 中、高希釈条件下で HATU (967 mg, 2.55
mmol) と DIEA（ジイソプロピルエチルアミン） (0.84 ml) を用いて環化反応を行い、cyclo(-L-Ah7(allyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (314 mg, 49%) を白色固形物として得た。HPLC, rt 6.91
min. MALDI-TOFMS, [M+H]+ 513.75 for C28H40N4O5 (calcd 512.64) and [M+Na]+ 535.77 for C28H40N4O5.Na (calcd 535.64)。
【０１２５】
参考例３に従い、Allyl 基を無水ジクロロメタン中で、エポキシドに変換し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製してcyclo(-L-Ah7(glycidyl)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (150 mg, 47%) を得た。 HPLC, rt 5.85 min.
MALDI-TOFMS, [M+H]+
529.76 for C28H40N4O6 (calcd
528.64) and [M+Na]+
551.75 for C28H40N4O5.Na
(calcd 551.64)。 続いて、参考例４に従い、エポキシ基を THF 中で無水 LiBrと反応させ、ブロモヒドリンに開環し、cyclo(-L-Ah7(CH2CH(OH)CH2Br)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (174 mg, 91%) を得た。HPLC, rt 5.92 min. MALDI-TOFMS, [M+Li]+ 617.04 for C28H41BrN4O6Li (calcd 616.45) and [M+Na]+ 633.04 for C28H41BrN4O6Na (calcd 633.55)。
【０１２６】
環状ペプチドブロモヒドリン (140 mg, 0.23 mmol) を無水ジクロロメタン中でDess-Martin 試薬 (292 mg, 0.7 mmol) と反応させ、ブロモアセトニル基を含む cyclo(-L-Ah7(CH2COCH2Br)-Aib-L-Phe-D-Pro-) (102 mg, 73%) に誘導した。HPLC, rt 6.75 min.
MALDI-TOFMS, [M+Na]+
630.61 for C28H39BrN4O6Na
(calcd 630.54) and [M+K]+ 646.65 for C28H39BrN4O6K (calcd 646.54). 更に、亜鉛/酢酸によって還元してアセトニル基に変換した cyclo(-L-Ah7(CH2COCH3)-Aib-L-Phe-D-Pro-)
(Ky-74, 37 mg, 48%)を得た。HPLC, rt 6.01 min. MALDI-TOFMS, [M+Na]+ 551.58 for C28H40N4O6Na (calcd 551.64) and [M+K]+ 567.55 for C28H40N4O6K (calcd 567.64)。
【０１２７】
[実施例２４]
［環状テトラペプチドのヒストン脱アセチル化酵素の阻害活性］
本実施例では側鎖にカルボニル基を有する環状テトラペプチド構造の Ky-17, 12, 9, 10, 60, 13, 18, 14（官能基の略号 Ae9, Ae9(Bmk), Ae9(Mmk), Ae9(Emk),
Ae9(Tfemk), Ae9(Mtmk), Ae9(Actmk), Ae9(Dmamk)、および側鎖にスルフィド基を有する環状テトラペプチド構造の Ky-15, Ky-16,
Ky-68, Ky-26, Ky69, Ky-27, Ky-28, Ky-29, Ky-73, Ky-72, Ky-85, Ky-83、スルホキシド基を有する化合物である Ky-25,
Ky-71, Ky-86、エーテル基を有する化合物である Ky-74の酵素阻害活性の測定を行った。
【０１２８】
HDAC阻害活性測定を行うにあたり、次の通りHDAC溶液を調製した。１００ｍｍディッシュに１×１０７個の２９３Ｔ細胞をまき、２４時間後にヒトHDAC１、４またはマウスHDAC６を発現するベクター（５μｇ）をLipofectAmine 2000 reagent（Invitrogen）を用いてトランスフェクションした。なお、上記ヒトHDAC１発現ベクターはｐｃＤＮＡ３−ＨＤ１（Yang, W． M., Yao, Y． L., Sun, J． M., Davie, J． R． & Seto, E． (1997) J． Biol． Chem． 272, 28001-28007.）、ヒトＨＤＡＣ４発現ベクターはｐｃＤＮＡ３−ＨＤ４（Fischle, W., Emiliani, S., Hendzel, M． J., Nagase, T., Nomura, N., Voelter, W． & Verdin, E． (1999) J． Biol． Chem． 274, 11713-11720.）、マウスＨＤＡＣ６発現ベクターはｐｃＤＮＡ３−ｍＨＤＡ２／ＨＤＡＣ６（Verdel, A． & Khochbin, S． (1999) J． Biol． Chem． 274, 2440-2445.）を用いた。
【０１２９】
２４時間インキュベートして細胞を回収し、PBSで洗った後、lysis buffer（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１２０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％
Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）に懸濁し、ソニケーションした。上清を遠心分離により集め、ProteinA/G plus agarose beads（Santa Cruz Biotechnologies,Inc.）を用いて、非特異的蛋白質を除いた。その後、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ
Ｍ２抗体（Sigma-Aldrich
Inc.）を加え４℃で２時間反応させた。
【０１３０】
これにアガロースビーズを加えて４℃で３時間反応させた後、lysis bufferでアガロースビーズを３回洗い、ＨＤ buffer（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０％グリセロール）で１回洗った。ＨＤ
buffer（２００μｌ）中ＦＬＡＧペプチド（４０μｇ）（Sigma-Aldrich Inc.）で４℃、１時間インキュベートしてアガロースビーズから結合した蛋白質を回収し、ＨＤＡＣ反応溶液とし、以下のHDAC阻害活性測定に用いた。
【０１３１】
In vitro の系のＨＤＡＣ阻害活性を以下のように評価した。被験化合物をＤＭＳＯに溶解して、濃度１０ｍＭの原溶液を調製し、これを阻害剤の原溶液とした。アッセイは被験化合物存在下ＨＤＡＣ溶液とクマリンで標識したアセチル化ヒストンペプチド溶液を３７℃で３０分間インキュベートすることで行った（反応容積２０μｌ）。反応液に３０μｌのトリプシンを添加して、酵素反応で切り放されたアミノメチルクマリンを蛍光プレートリーダーで測定した。なお陰性コントロールとして、阻害剤を反応系に添加せず、同じ操作を行った。阻害活性は、陰性コントロールにおけるＨＤＡＣ活性の５０％阻害濃度(「IC50（μM）」)で表した。結果を表１に示した。
【０１３２】
[実施例２５]
［環状テトラペプチドの p２１プロモーターアッセイ］
in vivo の系のHDAC阻害活性として、p２１プロモーター誘導活性を指標に次の通り測定した。実験に用いたMFLL-９細胞はヒト野生型 p２１プロモーターとルシフェラーゼの融合遺伝子 (Dr． B．
Vogelstaein) を安定に保持した細胞であり、１０％ FBSを添加したフェノールレッド不含DMEM培地を用い、３７℃、５％二酸化炭素存在下、水蒸気飽和したインキュベーターを用いて培養を行った。このMFLL-９細胞を２００００個／wellの細胞密度で９６穴マイクロプレートに播種し、各well当たり上記の培地９９μl中で、２４時間培養した後、被験化合物溶液を添加し、引き続き
２０時間培養した。また、ここでもTSAをＨＤＡＣ阻害活性に起因するp２１プロモーター誘導活性の陽性コントロール化合物とした。陰性コントロールとして、阻害剤を反応系に添加せずに同じ操作を行った。
【０１３３】
Luciferase Assay Regent (Promega) を用い、細胞内に発現しているルシフェラーゼの酵素反応の生成物に起因する発光強度を測定した。被験化合物の活性強度は陰性コントロールを１００％とした時の１０００％の値を示す濃度（「EC1000（μM）」）用いて比較した。結果は表1に示した。
【０１３４】
以上の結果より、ヒストン脱アセチル化酵素の活性中心の亜鉛に配位する官能基の構造が異なると、各酵素サブタイプに対する阻害活性が大きく異なることが示された。本発明の化合物は、各酵素サブタイプに対して強い阻害活性を示した。また、官能基の構造が異なると、各酵素サブタイプに対する阻害活性が大きく異なり、本発明の化合物が酵素サブタイプに対して選択性を持つことが示された。本発明の化合物の製造方法により、亜鉛に配位する官能基の構造を容易に変えることで、化合物の標的酵素に対する選択性を変化させることができると期待される。
【０１３５】
[実施例２６]
［環状テトラペプチドによるヒストン蛋白質の過剰アセチル化誘導］
チューブリンおよびヒストンのアセチル化レベルの測定は、HeLa細胞に対して被験化合物を作用させ、抗アセチル化リジン抗体を使用してチューブリンおよびヒストンのアセチル化レベルをウェスタンブロッティングで確認することにより行った。
【０１３６】
詳細には、ヒト子宮がん細胞（HeLa）は１０％FBSを添加したDMEM培地を用い、３７℃、５％二酸化炭素存在下、水蒸気飽和したインキュベーターを用いて培養を行った。この細胞を２５００００個／mlの細胞密度で ２４穴プレートに５００μl播種し、２４時間培養した後、被験化合物溶液を添加し、引き続き６時間培養した。細胞をPBSで洗った後、SDS buffer (４０μl)と混合し、１００℃で５分間処理したサンプルを
５−２０％ SDSグラジェントゲルで電気泳動後、メンブレンフィルムにトランスファーした。ヒストンは1次抗体として Anti-acetyl-Histon H４ (Lys８) および Anti-acetyl-Histon H３ (Lys９) (upstate)、２次抗体：Anti-rabbit (Amersham)、チューブリンは１次抗体として Anti-acetylated-tuburin (SIGMA)、２次抗体：Anti-mouse (Amersham)で処理後ECL(amersham pharmacia
biotech)処理し、アセチル化バンドの検出を行った。結果を図１−図４に示した。
【０１３７】
図１−図４に示す通り、HDAC阻害活性が強い化合物において、ヒストンタンパク質 H３およびH４に対するアセチル化の亢進が確認でき、p２１プロモーター誘導活性の測定結果 (EC1000) と同様の阻害傾向が示された。
【０１３８】
[実施例２７]
［環状テトラペプチドによるｐ２１蛋白質発現の誘導とアポトーシス抑制蛋白質の発現抑制］
細胞内のｐ２１、survivin、Bcl-xLの蛋白質発現レベルの測定は、HeLa細胞に対して被験化合物を作用させ、各の蛋白質に反応する抗体を使用してウェスタンブロッティングで定量した。
【０１３９】
詳細には、ヒト子宮がん細胞（HeLa）は１０％FBSを添加したDMEM培地を用い、３７℃、５％二酸化炭素存在下、水蒸気飽和したインキュベーターを用いて培養を行った。この細胞を１５００００個／wellの細胞密度で ２４穴プレートに５００μl播種し、２４時間培養した後、被験化合物溶液を添加し、引き続き２４時間培養した。ここでもTSAをＨＤＡＣ阻害活性に起因するｐ２１蛋白質発現誘導とアポトーシス抑制蛋白質発現低下の陽性コントロール化合物とした。陰性コントロールとして、阻害剤を反応系に添加せずに同じ操作を行った。
【０１４０】
細胞をPBSで洗った後、SDS buffer (４０μl)と混合し、１００℃で５分間処理したサンプルを
５−２０％ SDSグラジェントゲルで電気泳動後、メンブレンフィルムにトランスファーした。ｐ２１は1次抗体：ｐ２１(Santa Cruz Biotechnology)、２次抗体：Anti-mouse (Amersham)、 Bcl-xLは1次抗体：Anti-Bcl-X antibody(PharMingen)、２次抗体：Anti-rabbit (Amersham)、Survivinは1次抗体：Anti-Survivn antibody(R&D Systems)、２次抗体：Anti-rabbit (Amersham)で処理後、ECL(amersham pharmacia
biotech)処理し、ｐ２１、Bcl-xLおよびSurvivinのバンドの検出を行った。結果を図５と図６に示した。
【０１４１】
図５と図６に示す通り、HDAC阻害活性が強い化合物において、ｐ２１蛋白質の発現誘導が確認できた。また、阻害剤の濃度を高くするにつれて、Bcl-xLおよびSurvivinの発現が減少する傾向が示された。
【０１４２】
【表１】
2008143886.tif 000010
ＸＦいぼうて報告した。うこくした。  
【０１４３】
［実施例２８］
（ヒトがん細胞パネルを用いた化合物の作用機作の評価）
矢守らによって提案されている「ヒトがん細胞パネルを用いた化合物の作用機作の評価方法」（癌と化学療法 29 Suppl II (2002)、Cancer Chemother Pharmacol 52 Suppl 1, S74-79.  (2003)参照）によって、本発明の化合物のヒトがん細胞に対する増殖阻害活性の特徴を調べた。
【０１４４】
この系は、ヒトがん細胞株39系（肺がん7系、胃がん6系、大腸がん5系、卵巣がん5系、脳腫瘍6系、乳がん5系、腎がん2系、前立腺がん2系およびメラノーマ1系）に対するin
vitro 薬剤感受性を測定し、個々のがん細胞株に対する薬剤感受性の違いをフィンガープリントとして表す方法である。これまでの研究で、化学構造あるいは作用機作の類似した薬剤は、統計学的に相関の高いフィンガープリントパターンを示すことを明らかにされている。この性質を利用して、当該化合物の作用機作を推定することができる。また、既存の抗がん剤と異なるユニークで新しい作用機作をもつ抗がん物質を選別することもできるという特徴がある。  
【０１４５】
（方法）
がん細胞を96ウェルプレートにまき込み、翌日サンプル溶液を添加、2日間培養後、細胞増殖をスルホローダミンBによる比色定量で測定する。測定したがん細胞株39系の平均薬剤有効濃度に対する個々のがん細胞株の有効濃度偏差を計算し、フィンガープリントとして表示する。
【０１４６】
（結果）
前記した方法で、本化合物のヒトがん細胞に対する特徴的な増殖阻害活性の効果を評価した結果の一部を、以下に説明する。実施例３の化合物（Ｋｙ−９）は、肺がん細胞のＮＣＩ−Ｈ５２２とメラノーマ細胞ＬＯＸ−ＩＭＶＩに特に強い増殖阻害活性(５０％阻害濃度１０−７ Ｍ以下)を有していた。
【０１４７】
また、実施例１３の化合物（Ｋｙ−２６）は肺がん細胞のＮＣＩ−Ｈ５２２に特に強い増殖阻害活性を有しており(５０％阻害濃度１０−８ Ｍ以下)、乳がん細胞ＢＳＹ−１、脳腫瘍細胞ＳＦ−５３９、ＳＮＢ−７５、大腸がん細胞ＨＣＣ２９９８、ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１１６、肺がん細胞ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ａ５４９、ＤＭＳ１１４、メラノーマ細胞ＬＯＸ−ＩＭＶＩ、卵巣がん細胞ＯＶＣＡＲ−５、ＯＶＣＡＲ−８、腎がん細胞ＲＸＦ−６３１Ｌ、胃がん細胞ＭＫＮ１、前立腺がん細胞ＤＵ−１４５に対して、かなりの増殖阻害効果(５０％阻害濃度１０−７
Ｍ以下)を有していた。
【０１４８】
そして、実施例２０の化合物（Ｋｙ−７２）は、大腸がん細胞ＨＣＴ−１１６と肺がん細胞のＮＣＩ−Ｈ５２２に特に強い増殖阻害活性を有しており(５０％阻害濃度１０−８ Ｍ以下)、乳がん細胞ＢＳＹ−１、脳腫瘍細胞ＳＦ−２６８、ＳＦ−２９５、ＳＦ−５３９、ＳＮＢ−７５、大腸がん細胞ＨＣＣ２９９８、ＫＭ−１２、ＨＴ−２９、肺がん細胞ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ａ５４９、ＤＭＳ１１４、メラノーマ細胞ＬＯＸ−ＩＭＶＩ、卵巣がん細胞ＯＶＣＡＲ−５、ＯＶＣＡＲ−８、ＳＫ−ＯＶ−３、腎がん細胞ＲＸＦ−６３１Ｌ、ＡＣＨＮ、胃がん細胞ＭＫＮ１、前立腺がん細胞ＤＵ−１４５に対して、かなりの増殖阻害効果(５０％阻害濃度１０−７ Ｍ以下)を広範囲に示すメラノーマ細胞ＬＯＸ−ＩＭＶＩに特に強い増殖阻害活性を有していることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】本発明の化合物のHDAC阻害活性を示す図である。
【図２】本発明の化合物のHDAC阻害活性を示す図である。
【図３】本発明の化合物のHDAC阻害活性を示す図である。
【図４】本発明の化合物のHDAC阻害活性を示す図である。
【図５】本発明の化合物のｐ−２１、Bcl-xL、Survivinの発現に及ぼす影響を示す図である。
【図６】本発明の化合物のｐ−２１、Bcl-xL、Survivinの発現に及ぼす影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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