(57)【要約】      （修正有）【課題】広範な植物種で雄性不稔植物体を効率よく作出することができる雄性不稔植物体およびその作出方法を提供する。【解決手段】雄性不稔植物体の作出方法は、フェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡを植物ゲノム中に導入することにより、該植物体を雄性不稔化することを含む。前記ＤＮＡは、担子菌（カワラタケCoriolus versicolor）由来のラッカーゼであることができる。前記ＤＮＡは、前記植物体の雄ずい、及び葯において発現する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡを植物ゲノム中に導入することにより、該植物体を雄性不稔化することを含む、雄性不稔植物体の作出方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記ＤＮＡは、前記植物体の雄ずいにおいて発現する、雄性不稔植物体の作出方法。
【請求項３】
請求項２において、
前記ＤＮＡは、前記植物体の葯において発現する、雄性不稔植物体の作出方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかにおいて、
前記ＤＮＡは、ラッカーゼをコードする、雄性不稔植物体の作出方法。
【請求項５】
請求項４において、
前記ラッカーゼは、分泌型ラッカーゼである、雄性不稔植物体の作出方法。
【請求項６】
請求項４または５において、
前記ラッカーゼは、担子菌由来のラッカーゼである、雄性不稔植物体の作出方法。
【請求項７】
請求項６において、
前記担子菌は、カワラタケである、雄性不稔植物体の作出方法。
【請求項８】
以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列により表され、雄性不稔誘導活性を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号１により表される塩基配列
（ｂ）配列番号１により表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、または付加された塩基配列
【請求項９】
以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列により表され、葯の裂開を抑制する機能を有するタンパク質。
（ａ）配列番号２により表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２により表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列
【請求項１０】
フェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡが導入され、該ＤＮＡが発現している雄性不稔植物体。
【請求項１１】
請求項１０において、
前記ＤＮＡは、ラッカーゼをコードする、雄性不稔植物体。
【請求項１２】
請求項１１において、
ラッカーゼが雄ずいにおいて発現している、雄性不稔植物体。
【請求項１３】
請求項１２において、
ラッカーゼが葯において発現している、雄性不稔植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、雄性不稔植物体およびその作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然界には一代雑種（Ｆ１）の優性が際立って現れる現象（雑種強勢）があり、近年、多くの作物で雑種強勢を利用したＦ１品種の育成が進められている。Ｆ１品種のメリットとしては、雑種強勢の発現により収量性や耐病性などの農業形質が優れたものとなること、単因子優性の農業形質の付与が容易なこと、均一性が高いことが挙げられる。
【０００３】
Ｆ１品種においては、雑種１代目の種子を大量に確保する必要があり、そのための技術として、遺伝的な雄性不稔性を有する母株を使用する方法が行われている。なお、自家不和合性を利用する方法、雄花を人為的に除去する方法、人為的に交配させる方法等によっても、雑種１代目の種子を得ることができるが、これらの方法は、利用できる植物種が限られていたり、効率が低かったりする場合が多い。例えば、イネに代表される自殖性植物では、多数の花が集合していたり、雌しべおよび雄しべが花弁を包み込んでいたりするため、雄花を人為的に刈り取ることが困難であり、自家受粉を避けることが難しい。
【０００４】
したがって、雑種強勢を利用した交配を行なうためには、正常な花粉形成ができない個体（雄性不稔植物体）を利用することが好ましい。すなわち、雄性不稔植物体は、農作物の生産や新品種の育成に必須なものであり、効率よく且つ広範囲の植物に適用できる雄性不稔性体の作成技術が求められている。
【０００５】
また、雄性不稔植物体は正常な花粉形成ができないため、花粉を介した遺伝子漏洩が行われない。このため、雄性不稔植物体の育成技術は、遺伝子組換え植物からの遺伝子の漏洩を防ぐ手段として、非常に重要な要素技術の一つである。
【０００６】
従来、新規な雄性不稔株の作成は、雄性不稔に関与する遺伝子を有する株と、稔性がある個体とを交配させることによりなされてきた。
【０００７】
また、花粉形成に関与する組織において特異的に機能する遺伝子やそのプロモーターを用いた雄性不稔植物体の作出方法が提案されている。
【０００８】
例えば、特開２０００−３００２７３号公報には、葯の裂開および花粉の成熟を制御する遺伝子、その遺伝子の発現が抑制されている雄性不稔植物体、ならびにその雄性不稔植物体の稔性を回復する方法が開示されている。
【０００９】
また、特開２００１−９５４０６号公報には、ＲＮＡ分解酵素遺伝子の上流にプロモーターの断片を結合し、ＲＮＡ分解酵素阻害蛋白遺伝子の上流に前記プロモーターと同一または異なるプロモーターを結合し、植物ゲノム中に導入することにより、当該植物体を雄性不稔化する方法が開示されている。
【００１０】
また、特開２００５−１９２４８３号公報には、花器形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を植物細胞に導入し、生産されるキメラタンパク質が花器形成に関与する遺伝子の発現を抑制させることにより、正常な花粉形成ができない雄性不稔植物体の作出方法が開示されている。
【００１１】
しかしながら、現在までに、広範な植物に用いることができる雄性不稔技術は確立されていない。
【特許文献１】特開２０００−３００２７３号公報
【特許文献２】特開２００１−９５４０６号公報
【特許文献３】特開２００５−１９２４８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、原品種が有する性質を大きく変えることなく、広範な植物種で雄性不稔植物体を効率よく作出することができる雄性不稔植物体の作出方法およびその雄性不稔植物体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第１の態様に係る雄性不稔植物体の作出方法は、
フェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡを植物ゲノム中に導入することにより、該植物体を雄性不稔化することを含む。
【００１４】
上記雄性不稔植物体の作出方法において、前記ＤＮＡは、前記植物体の雄ずいにおいて発現することができる。この場合、前記ＤＮＡは、前記植物体の葯において発現することができる。
【００１５】
上記雄性不稔植物体の作出方法において、前記ＤＮＡは、ラッカーゼをコードするＤＮＡであることができる。この場合、前記ラッカーゼは、分泌型ラッカーゼであることができる。また、この場合、前記ラッカーゼは、担子菌由来のラッカーゼであることができる。さらに、この場合、前記担子菌は、カワラタケであることができる。
【００１６】
本発明の第２の態様に係るＤＮＡは、以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列により表され、雄性不稔誘導活性を有する。
（ａ）配列番号１により表される塩基配列
（ｂ）配列番号１により表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、または付加された塩基配列
【００１７】
本発明の第３の態様に係るタンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列により表され、葯の裂開を抑制する機能を有する。
（ａ）配列番号２により表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２により表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列
【００１８】
本発明の第４の態様に係る雄性不稔植物体は、
フェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡが導入され、該ＤＮＡが発現している。
【００１９】
上記雄性不稔植物体において、前記ＤＮＡは、ラッカーゼをコードするＤＮＡであることができる。この場合、ラッカーゼが雄ずいにおいて発現していることができる。さらに、この場合、ラッカーゼが葯において発現していることができる。
【発明の効果】
【００２０】
前記雄性不稔植物体の作出方法によれば、原品種が有する性質を大きく変えることなく、雄性不稔植物体を効率よく作出することができる。また、遺伝子組換え植物で問題となっている、花粉の飛散を介した組換え遺伝子の野生環境への漏洩を防止することができる。したがって、前記雄性不稔植物体の作出方法によれば、雄性不稔能および環境浄化能を１つの遺伝子の導入によって達成することができる。
【００２１】
また、前記雄性不稔植物体は、フェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡが導入され、該ＤＮＡが発現することにより、雄性不稔性を有し、かつ、フェノールオキシダーゼを根から分泌生産して、有害化学物質を除去することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の一実施形態に係る雄性不稔植物体およびその作出方法について詳細に説明する。
【００２３】
１．雄性不稔植物体の作出方法
本発明の一実施形態に係る雄性不稔植物体の作出方法は、フェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡを植物ゲノム中に導入することにより、該植物体を雄性不稔化することを含む。ここで、前記ＤＮＡは、植物体の雄ずい（例えば、葯）において発現することができる。
【００２４】
本発明において、「植物体を雄性不稔化すること」は、花粉の形成を不能にすることをいい、例えば、花粉の形成に関わる器官の形状が変形すること（例えば、葯の開裂が不能になること）により、花粉の形成が不能になることをいう。
【００２５】
１．１．フェノールオキシダーゼ
フェノールオキシダーゼは、フェノール類を酸化して、ｏ−キノンまたはｐ−キノンに変換する酵素である。フェノールオキシダーゼには、ポリフェノールのみならずモノフェノールにも作用するモノフェノール酸化酵素（例えばチロシナーゼ）と、ｐ−ジフェノールのみに作用するジフェノール酸化酵素（例えばラッカーゼ）とが含まれる。このうち、酵素の用途の多様性、酵素活性、有害化学物質の分解除去能力等から、ラッカーゼが好ましい。
【００２６】
ラッカーゼは動植物、菌類に広く存在する。本実施形態においては、いずれの起源からのラッカーゼも利用することができるが、特に、酵素生産上の操作容易性（例えば、酵素の安定性、有害化学物質の毒性低減能力）等の観点から、種々の菌類（例えば、担子菌類、子嚢菌類、不完全糸状菌類）に由来するラッカーゼが好ましい。そのうち、特に担子菌から得られるラッカーゼが好適である。担子菌としては、例えば、カワラタケ（Coriolus versicolor）、ファネロカエテ  クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）等が挙げられる。
【００２７】
また、本実施形態において、植物に導入し得るラッカーゼは分泌型ラッカーゼであってよい。ここで、分泌型ラッカーゼとは、植物体外へタンパク質を分泌するために必要なシグナル配列によって植物体外へ分泌されるラッカーゼを意味する。
【００２８】
また、ラッカーゼは、多岐にわたる難分解性化学物質を分解することが明らかになっている。例えば、ラッカーゼは、クロロフェノール、農薬、多環芳香族炭化水素、アルキルフェノール、芳香族炭化水素、ニトロ化合物をはじめとする内分泌撹乱物質を酸化的に分解することができる。
【００２９】
したがって、ラッカーゼ等のフェノールオキシダーゼ遺伝子を植物ゲノム中に導入し、該遺伝子を発現させることにより、高生産可能であり、かつ、環境中の有害化学物質を分解および／または除去することができる。
【００３０】
１．２．雄性不稔植物体の作出方法
本実施形態に係る雄性不稔植物体の作出方法は、フェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡを植物ゲノム中に導入することにより、該植物体を雄性不稔化することを含んでいれば、特に限定されるものでないが、例えば、（ｉ）発現ベクター構築工程、（ii）形質転換工程、および必要に応じて（iii）選抜工程を含むことができる。以下、各工程について具体的に説明する。
【００３１】
１．２．１．発現ベクター構築工程
発現ベクター構築工程は、本実施形態に係るＤＮＡを植物体で発現させるために使用される発現ベクターを構築する工程である。
【００３２】
発現ベクター構築工程において使用するベクターとしては、本実施形態に係るＤＮＡを含み、かつ、葯の裂開を抑制する機能を有するタンパク質（フェノールオキシダーゼ，例えばラッカーゼ）を発現することができるものであれば特に限定されない。発現ベクターは、本実施形態に係るＤＮＡを適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるもの、あるいは、宿主細胞の染色体中に組み込み可能であるものが好ましい。
【００３３】
また、本実施形態に係るＤＮＡを発現できる位置に、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの制御配列や、選択マーカーをコードする配列を含有している発現ベクターを好適に使用することができる。
【００３４】
発現ベクターの母体となるベクターとしては、公知の種々のベクターを用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、植物ウイルスベクター等を用いることができる。
【００３５】
プラスミドとしては、例えば、Ｔｉプラスミド（Tumor inducing plasmid）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクター、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ（Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)）、ｐＢＩ１２１（EMBO J. 6, 3901-3907(1987)）などのプラスミドを例示することができる。植物ウイルスベクターとしては、例えば、タバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルスなどの植物ウイルスベクターなどを例示することができる。
【００３６】
特に、植物体への発現ベクターの導入方法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等が挙げられる。
【００３７】
プロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Mol. Gen. Genet (1990) 220, 389-392）、トマトのリブロース１，５−ビスフォスフェートカルボキシラーゼ・オキシダーゼスモールサブユニットプロモーター、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、などを挙げることができる。このうち、プロモーターとしては、局所的な発現を可能にし得るプロモーターが好ましく、例えば、雄ずいおよび根において強力な発現を可能にし得る点で、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(CaMV 35S-P)等がより好ましい。また、この他、葉や茎における局所的発現を促す公知のプロモーターを利用できるが、産生されたタンパク質を分離・精製するための操作が煩雑になるため、雄ずいおよび根における強力な発現を可能にし得るプロモーターの利用が特に好ましい。なお、ここで、局所的な発現とは、植物体の局所においてのみ生じる発現だけではなく、他の部分と比較して、局所の発現が一段と強力に生じ得るものも含まれることを意味する。その一段と強力に生じる程度とは、局所の発現が他の部分の発現よりも約１／３〜１／２以上である場合をいう。具体的には、雄ずいおよび根において局所的に発現し得るとは、葉や茎においても発現を認めるが、雄ずいおよび根における発現がそれらの部分の発現よりも著しく顕著であることを意味する。
【００３８】
さらに、発現を上昇させるプロモーターも導入可能である。そのようなプロモーターとしては、例えば、CMV 35S-Pの上流の非翻訳領域（CaMV 35S-up）等を利用することができる。
【００３９】
ターミネーターとしては、植物細胞で機能するものであればよく、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域、カリフラワーモザイクウイルス35Sの転写終結領域を挙げることができ、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域がより好ましい。
【００４０】
選択マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、カナマイシン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ハイグロマイシン等の抗生物質に対する薬剤耐性遺伝子が挙げられる。これらの抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することにより、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【００４１】
１．２．２．形質転換工程
形質転換工程は、上記発現ベクター構築工程で得られた発現ベクターを植物細胞に導入して、本実施形態に係るＤＮＡを発現させる工程である。
【００４２】
発現ベクターを植物細胞に導入する方法としては、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法が挙げられる。
【００４３】
また、アグロバクテリウムを用いてＤＮＡを植物ゲノムに導入する場合、該ＤＮＡを含む発現ベクターが導入されたアグロバクテリウムを植物細胞に導入させる方法としては、例えば、リーフディスク法、プロトプラスト共存培養法が挙げられる。このうち、容易に多数の形質転換体を得ることができる点、ならびに形質転換植物体を直接得ることができる点で、リーフディスク法が好ましい。
【００４４】
なお、発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、茎、葉、根等の植物器官における組織細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。
【００４５】
１．２．３．選抜工程
選抜工程は、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する工程である。選択工程では、薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、あるいは、形質転換体を育成した後に、成長した植物体において正常な花粉形成ができないことを基準として選抜してもよい。また、選抜工程は、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程を含むことができる。
【００４６】
２．雄性不稔誘導活性を有するＤＮＡ
本発明の一実施形態に係る雄性不稔誘導活性を有するＤＮＡは、以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列により表される。
（ａ）配列番号１により表される塩基配列
（ｂ）配列番号１により表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、または付加された塩基配列
【００４７】
上記「１または数個の塩基が欠失、置換、または付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基配列が置換、欠失、もしくは付加されている塩基配列を意味する。
【００４８】
例えば、１または数個の塩基が欠失、置換、または付加されたＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成法、遺伝子工学的手法、突然変異誘発法などの当業者に既知の任意の方法により作製することができる。具体的には、配列番号１により表される塩基配列を含むＤＮＡに対して、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射させる方法、遺伝子工学的な手法（例えば、部位特異的変異誘発法、制限酵素による切断、エキソヌクレアーゼによる消化）などを用いて、ＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを得ることができる。
【００４９】
遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は、特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、M olecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989.（以下、「モレキュラークローニング第２版」と略す。）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons（1987-1997）などに記載の方法に準じて行なうことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質（後述する）を得ることができる。
【００５０】
また、本実施形態に係る雄性不稔誘導活性を有するＤＮＡは、配列番号１により表される塩基配列と７０％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００５１】
なお、塩基配列の相同性は、当該技術分野において知られている相同性検索アルゴリズムを利用して決定することができる。このようなアルゴリズムとしては、ＢＬＡＳＴが挙げられ、その使用方法は当業者によく知られている。
【００５２】
さらに、本発明の一実施形態に係る雄性不稔誘導活性を有するＤＮＡは、配列番号１により表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。
【００５３】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、例えば、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などの公知の方法を用いて得られるＤＮＡをいい、具体的には、コロニーまたはプラーク由来のＤＮＡが固定化されたフィルターを用いて、０．７−１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行なった後、０．１−２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む。）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版などに記載されている方法に準じて行なうことができる。
【００５４】
例えば、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用可能なＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００５５】
なお、本実施形態に係るＤＮＡは、配列番号１に表される塩基配列またはその一部を有するＤＮＡを使用し、他の生物体などにより、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができるほか、上述の変異ＤＮＡの作製方法によっても調製することができる。
【００５６】
３．葯の裂開を抑制する機能を有するタンパク質
３．１．タンパク質
本発明の一実施形態に係る葯の裂開を抑制する機能を有するタンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列により表される。
（ａ）配列番号２により表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２により表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列
【００５７】
上記「１または数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を意味する。
【００５８】
また、本実施形態に係る葯の裂開を抑制する機能を有するタンパク質は、配列番号２により表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００５９】
配列番号２により表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸位置１〜２１のアミノ酸配列で示されるペプチドを含む領域はシグナル配列として機能し、このシグナル配列によって、本実施形態に係るタンパク質が安定的に確実に植物体外に分泌され得る。このシグナル配列は、本実施形態に係るタンパク質を分泌するための遺伝子であり、ラッカーゼ遺伝子のＮ末端に機能的に結合している。このため、形質転換植物から分泌型のタンパク質（例えば、分泌型ラッカーゼ）を得ることを所望する場合、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちアミノ酸位置１〜２１のアミノ酸配列部分については、置換、欠失、または付加を避けるのが好ましい。
【００６０】
上述のアミノ酸位置１〜２１のアミノ酸配列で示される、ラッカーゼ遺伝子に天然に存在するシグナル配列以外にも、公知のシグナル配列をフェノールオキシダーゼに連結することによって分泌生産することも可能である。しかしながら、安定的に確実にラッカーゼを植物体外に分泌させることができるという点から、上述のシグナル配列を含むアミノ酸配列を有する分泌型ラッカーゼを用いるのが好ましい。
【００６１】
植物に導入し得る、本実施形態に係るタンパク質をコードするＤＮＡを単離するには、幾つかの遺伝子クローニング方法を使用することができる。例えば、酵素を精製し、そのアミノ酸配列を決定し、この配列をもとに合成ヌクレオチドを作製し、ハイブリダイゼーション法により遺伝子ライブラリーから選択できる。また、酵素の精製を経ず、既知の遺伝子塩基配列情報を基にポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）に用いるプライマーを作製し、ＰＣＲを行なうことにより、遺伝子の特定の領域または全領域を増幅し、単離する方法もある。
【００６２】
３．２．タンパク質の取得および調製方法
本実施形態に係るタンパク質はまた、天然由来の単離されたタンパク質、化学合成されたタンパク質、および遺伝子組み換え技術により作製された組み換えタンパク質のいずれでもよい。
【００６３】
天然由来の単離されたタンパク質を取得する場合、かかるタンパク質を発現している細胞または組織からタンパク質の単離および精製を適宜組み合わせることにより、本実施形態に係るタンパク質を取得することができる。
【００６４】
化学合成によりタンパク質を調製する場合、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法にしたがって、本実施形態に係るタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して、本実施形態に係るタンパク質を合成することもできる。
【００６５】
遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合、タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを好適な発現系に導入することにより、本実施形態に係るタンパク質を調製することができる。
【００６６】
これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能である点で、遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００６７】
上記実施形態に係る雄性不稔誘導活性を有するＤＮＡは、組換えタンパク質の調製に利用することができる。組換えタンパク質の調製は、上記実施形態に係る雄性不稔誘導活性を有するＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、次いで、この形質転換体を培養して、発現したタンパク質を該形質転換体またはその培養上清から回収することにより行なうことができる。
【００６８】
遺伝子組み換え技術により本実施形態に係るタンパク質を製造する場合、形質転換細菌、形質転換酵母、形質転換植物細胞などの形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養液の上清から回収する方法を用いることができる。
【００６９】
また、遺伝子組換え技術によって本実施形態に係るタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するためには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーなどの公知の方法（好ましくは高速液体クロマトグラフィー）が用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いられるカラムとしては、例えば、本実施形態に係るタンパク質に対するモノクローナル抗体などの抗体を結合させたカラムや、上記本実施形態に係るタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合、このペプチドタグに親和性のある物質を結合させたカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本実施形態に係るタンパク質が細胞膜に発現している場合、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行なうことにより、精製標品を得ることができる。
【００７０】
４．雄性不稔植物体
本発明の一実施形態に係る雄性不稔植物体は、上記作出方法によって得られる。本実施形態に係る雄性不稔植物体は、正常な花粉形成ができないものである。すなわち、本実施形態に係る雄性不稔植物体としては、例えば、（ｉ）雄ずいの形成が阻害され、花粉が全く形成されないもの、（ii）雄ずいは形成されるが、葯が形成されないため花粉が形成されないもの，（iii）雄ずいおよび葯のいずれもが形成されるが、形成される花粉の量が少なく、葯の開裂に至らないもの、（iv）形成された花粉が肥大化して互いにくっついてしまい、全く飛散しないものが挙げられる。また、本実施形態に係る雄性不稔植物体は、正常な花粉形成ができないことに加えて、他の組織の形成が正常に行われなくなっていてもよい。
【００７１】
本発明の一実施形態に係る雄性不稔植物体は、フェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡが導入され、該ＤＮＡが発現している。ここで、前記ＤＮＡは、ラッカーゼをコードするＤＮＡであることが好ましい。
【００７２】
また、本実施形態に係る雄性不稔植物体において、ラッカーゼが雄ずいにおいて発現していることが好ましく、葯において発現しているのがより好ましい。後述する実施例に示されるように、雄ずい（葯）におけるラッカーゼの活性発現と雄性不稔性の発現とは相関するため、雄ずい（葯）におけるラッカーゼの発現は、雄性不稔性の発現を意味する。
【００７３】
なお、本発明において、「植物体」とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくともいずれかが含まれる。すなわち、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体とみなされる。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖および分化させることにより、植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、公知の方法を用いて行なうことができる。
【００７４】
本実施形態に係る雄性不稔植物体は、細胞、組織、器官からの再分化法が確立され、かつ、遺伝子導入系が構築されているものであれば、いずれの植物種であってもよい。好ましい植物種としては、種子植物を例示することができる。種子植物は、草本植物や木本植物のいずれでもよいが、栽培上の容易性から草本植物が好ましく、例えば、タバコ、イネ、トウモロコシ、ムギ、芝草等が挙げられる。また、本実施形態に係る雄性不稔植物体は、果実や種子を商品とする植物、花や植物体そのものを商品とする観葉植物であってもよく、例えば、ナタネ、ホウレンソウ、ジャガイモ、大豆、キャベツ、レタス、トマト、カリフラワー、さやいんげん、かぶ、めかぶ、大根、ブロッコリー、メロン、オレンジ、スイカ、ネギ、ゴボウなどの食用植物や、バラ、キク、あじさい、カーネーションなどの観葉植物であってもよい。
【００７５】
本実施形態に係る形質転換植物体の雄ずい（葯）から、葯の裂開を抑制する機能を有するタンパク質（フェノールオキシダーゼ）が分泌されるため、この植物体を水耕栽培溶液にて培養し、該栽培溶液から採取することにより、不純物の少ない該タンパク質を得ることができる。水耕栽培溶液は、該形質転換植物が生育し、かつ、上記タンパク質を分泌し得る溶液であれば特に制限されないが、例えば、Murashige & Skoog培地（MS培地）を利用することができる。
【００７６】
例えば、本実施形態に係る形質転換植物体を水耕栽培溶液に植え、該植物体の成長に適した温度下において培養する。本実施形態に係る形質転換植物からフェノールオキシダーゼが十分に分泌されるまでの期間は、利用する植物の種類によって異なり、該酵素の分泌状態を確認しながら培養期間を適宜設定できるが、通常、１週間程度である。水耕栽培溶液中に分泌された上記タンパク質は、通常の酵素分離・精製法によって採取することができる。例えば、上記タンパク質を含む栽培溶液を遠心分離にかけ、さらに限外濾過膜を用いて濃縮することができる。さらに、フェノールオキシダーゼのＮ末端またはＣ末端に６残基のヒスチジンを連結する構築物を作成し、それを発現させることにより、例えば、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー精製レジンで、該酵素を簡便に精製することができる。このようにして得られた酵素は、排水処理、人工漆塗料の製造、飲料の混濁防止、臨床分析等の分野において利用することができる。
【００７７】
また、上述のように、上記タンパク質には有害化学物質の分解除去作用があるため、本実施形態に係る形質転換植物体を有害化学物質により汚染された環境で栽培することにより、持続的かつ自立的に、根圏における有害物質を分解除去することができる。
【００７８】
あるいは、本実施形態に係る形質転換植物から採取されたタンパク質（フェノールオキシダーゼ）を有害化学物質により汚染された環境に散布することによって、有害物質を分解除去することができる。ここで、有害化学物質とは、人体に毒性又は内分泌撹乱性を示す物質であって、フェノールオキシダーゼ（特にラッカーゼ）による分解または毒性の低減が可能な物質をいう。
【００７９】
有害化学物質としては、具体的には、クロロフェノール、農薬、多環芳香族炭化水素、アルキルフェノール、芳香族炭化水素、ニトロ化合物を例示できる。また、環境とは、例えば、土壌、湖沼、河川が挙げられる。
【００８０】
５．実施例
以下に、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００８１】
５．１．実施例１
５．１．１．カワラタケのラッカーゼｃＤＮＡのクローニング
ラッカーゼをコードするｃＤＮＡを単離するために、DDBJ accession No. D13372に登録されているカワラタケ（Coriolus versicolor IFO30340）のラッカーゼIIIゲノムの塩基配列から、ラッカーゼIIIをコードする領域の上流領域および下流領域（すなわち、開始コドンより２０塩基また終始コドンより２２塩基の塩基配列）を選択し、オリゴヌクレオチドを化学合成した。
【００８２】
次に、上記工程にて作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、カワラタケのラッカーゼｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。反応は、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒を２５サイクル行った。反応には、Pyrobest DNAポリメラーゼ（宝酒造）を用いた。反応液の一部を１．５％アガロースゲルの電気泳動で分離したところ、予想したサイズにＤＮＡの増幅物が認められた。次いで、増幅断片をアガロースより切り出し、抽出した後、シークエンスに供した。これにより、配列番号１に表される完全長のラッカーゼｃＤＮＡを得た。また、対応するアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００８３】
５．１．２．ベクターの構築および植物への導入
制限酵素部位が導入されたラッカーゼｃＤＮＡを得るために、プライマーの合成を行った。各プライマーの塩基配列は、以下の通りである。
LfXb: 5'-ttgtttctagatgtcgaggtttcactctct-3'（配列番号３）
LBa: 5'-aattggatccttactggtcgctcgggtcgagcg-3'（配列番号４）
【００８４】
上記プライマーを用いて、配列番号１で表されるラッカーゼｃＤＮＡをテンプレートとして、Pyrobest DNAポリメラーゼによりＰＣＲを行った。反応は、９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で８０秒を３０サイクル行った。プライマーＬｆＸｂおよびプライマーＬｂａを用いることにより、完全長のラッカーゼｃＤＮＡ（配列番号１）にXba I制限部位およびBam HI制限部位が付加されたＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片をpCR2.1に挿入した。塩基配列はシークエンスを行なって確認した。
【００８５】
上記工程により増幅されたｃＤＮＡ断片をpCR2.1から切りだし、特に植物体の雄ずいおよび根における強力な発現を可能にし得るCMV 35S-Pを含むプラスミドpBI221のXba I、Bam HI部位に挿入した。そのプラスミドをpfLac/pBI221と命名した。さらに、プラスミドpfLac/pBI221のCMV 35S-Pの上流にあるHind III、Pst I部位にCMV 35S-upを挿入することにより、ラッカーゼ遺伝子の発現効率の向上を図った。次いで、このプラスミドをHind III、Bam HIで消化し、CMV 35S-up、CMV35S-Pおよびラッカーゼ遺伝子を含む断片を、バイナリーベクターpBI121のHind III、Bam HI部位に挿入した。上記工程により得られたＴｉプラスミド（バイナリーベクター）をpW35SfLac/pBI121（図１参照）と命名した。
【００８６】
図１は、ＴｉプラスミドpW35SfLac/pBI121のT-DNA領域を示す図である。図１において、RBはT-DNAの右側境界を示し、N-proはノパリン合成遺伝子のプロモーター領域を示し、NPT IIはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を示し、N-terはノパリン合成遺伝子の末端領域を示し、35S-upはカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター配列の上流領域を示し、35S-Pはカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター配列を示し、flacはCoriolus versicolor IFO1030のラッカーゼIIIをコードするｃＤＮＡに加えてシグナルシークエンスを示し、LBはT-DNAの左側境界を示す。
【００８７】
次に、ＴｉプラスミドpW35SfLac /pBI121を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404株を用いて、リーフディスク法により、タバコ（Nicotiana tabacum sumsunNN）SR1株に分泌型ラッカーゼ遺伝子を導入し、形質転換植物体（FL4-FL23の２０株）を得た。また、pBI121を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404株を用いてタバコSR1株の形質転換植物体を得、これを対照とした。
【００８８】
すなわち、リーフディスクから再分化した、カナマイシン（１５０μｇ／ｌ）に対して耐性を有する植物体を、３０ｇ／ｌのショ糖および１００μｇ／ｌのカナマイシンを含むＭＳ培地に移し、２５℃で２ヶ月間インキュベートすることにより、各形質転換植物体を得た。これらの形質転換植物体にそれぞれの遺伝子が導入されていることは、各個体由来の全ＤＮＡを用いたサザン解析およびＰＣＲ解析によって確認された。
【００８９】
５．１．３．形質転換植物体の根抽出物におけるラッカーゼの活性測定
上記工程で得られた形質転換植物体の無細胞抽出物を、各植物体の根から調製した。より具体的には、無細胞（cell-free）抽出物中の１００μgのタンパク質について当電点電気泳動（IEF）を行なった後、活性染色を行った。活性染色は、６０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＬ，  ｐＨ４．０）で洗浄し、１０ｍｇの４−クロロ−１−ナフトールを含む緩衝液に浸すことにより行われた。その結果を図２に示す。
【００９０】
図２において、レーン１はカワラタケ（C.versicolor IFO1030）の水耕培地の濃縮物、レーン２および３は対照植物（pBI121のみを導入した植物）の根抽出物、レーン４〜１７は形質転換植物体（図２において、レーン４はFL4,レーン５はFL5,レーン６はFL6,レーン７はFL7,レーン８はFL9,レーン９はFL9,レーン１０はFL10,レーン１１はFL14,レーン１２はFL15,レーン１３はFL19,レーン１４はFL20,レーン１５はFL22,レーン１６はFL23,レーン１７はFL24を示す。）の根抽出物の結果である。
【００９１】
図２から明らかなように、ラッカーゼ遺伝子を導入した形質転換植物体の根抽出物からのみ、該遺伝子がコードするタンパク質（ラッカーゼIII）の等電点であるpI３．５付近に明瞭なバンドが認められた（図２におけるレーン４，５，７−１０，１４−１６）。
【００９２】
これに対して、同条件で調製された、pBI121のみを導入した対照植物体の根抽出物には、全くバンドが認められなかった（図２におけるレーン２および３）。
【００９３】
以上の結果より、ラッカーゼ遺伝子が導入された形質転換植物体は、その根にてラッカーゼを生産していることが明らかとなった。したがって、草本植物や木本植物等の植物にラッカーゼ遺伝子を導入し、該遺伝子を発現させた形質転換植物体を作出することによって、形質転換植物体の根にてラッカーゼを生産させることができることが確認された。
【００９４】
５．１．４．形質転換植物体の根から分泌されたラッカーゼの活性測定
ショ糖含量を所定量の１／５にしたMurashige&Skoog培地を水耕栽培溶液として調製した。体長２０ｃｍ程度に生育させた、上述の工程にて作出された形質転換植物体タバコSR1株を植え、２８℃で培養した。１週間培養後、培養液１０ｍｌを採取し、それを１２，０００ｘｇで１５分間遠心し、分子量１０，０００以下を除外する限外濾過膜を用いて１／１０００に濃縮した。このときの蛋白濃度は１０μｇ／１０μｌであった。この溶液を等電点電気泳動により展開し、４−クロロ−１−ナフトールにより活性染色した。その結果を図３に示す。
【００９５】
図３において、レーン１はカワラタケ（C.versicolor IFO1030）の粗酵素液、レーン２および３は対照植物（pBI121のみを導入した植物）の培養液の濃縮物、レーン４〜１２は形質転換植物体（図３において、レーン４はFL4,レーン５はFL5,レーン６はFL7,レーン７はFL8,レーン８はFL9,レーン９はFL10,レーン１０はFL20,レーン１１はFL22,レーン１２はFL23を示す）の培養液の濃縮物の結果である。
【００９６】
図３から明らかなように、ラッカーゼ遺伝子を導入した形質転換植物体の栽培溶液からのみ、該遺伝子がコードするラッカーゼIIIの等電点であるpI３．５付近に明瞭なバンドが認められた（図３における４〜１２）。
【００９７】
これに対して、同条件で調製された、pBI121のみを導入した対照植物体の培養液には、全くバンドが認められなかった（図３における２および３）。
【００９８】
以上の結果から、ラッカーゼ遺伝子が導入された形質転換植物体は、その根にてラッカーゼを生産していることが明らかとなった。したがって、草本植物や木本植物にラッカーゼ遺伝子を導入し、該遺伝子を発現させた形質転換植物体を作出することによって、該形質転換植物体の根にてラッカーゼを生産させることができることが確認された。
【００９９】
５．２．実施例２
５．２．１．花粉の形成異常の観察
上記工程で得られた形質転換植物体をさらに詳細に解析した結果、これらの形質転換植物体においては、花粉形成の異常が高頻度で起こることを見出した。
【０１００】
得られた複数の形質転換植物体のうち、上述のラッカーゼ活性測定においてラッカーゼ活性が比較的高かった４株（FL4,FL9,FL20,FL22）について、その花粉の形成状態を調べたところ、FL4,FL9,FL22の３株で顕著な花粉形成の異常（雄ずい（葯）の開裂異常）が確認された。
【０１０１】
図４は、FL4株の花器を示す写真である。図４に示すように、形質転換植物体FL4株では、葯が開裂しないため、自家受粉ができない。また、形質転換植物体FL20では、５本の雄ずいにある葯の一部について異常がみられる花器が多く確認された。
【０１０２】
一方、野生型個体では、異常な花粉形成は全くみられず、正常な自家受粉によって種子が得られた。図６は、野生型個体（タバコ）の花器を示す写真である。図６に示されるように、野生型個体の花器では、葯が正常に開裂し、粉状の花粉が外部に放出されている。
【０１０３】
５．２．２．ラッカーゼの活性
次に、葯の開裂異常に対するラッカーゼの効果を評価するため、各々の株から開裂前の葯を採取した後に租タンパク質を抽出し、グアヤコールを基質として、各々の株の開裂前の葯から抽出された租タンパク質に含まれるラッカーゼの活性を測定した。その結果を図５に示す。
【０１０４】
図５によれば、顕著な葯開裂異常がみられた形質転換植物体（FL4,FL9,FL22）では、対照群（野生型個体１，２）の活性と比較して、明らかに高いラッカーゼ活性が認められた。また、葯の一部に異常がみられたFL20でも、対照群（野生型）と比較して相対的に高いラッカーゼ活性が認められた。これにより、各形質転換植物体にみられた葯の異常は、各個体中のラッカーゼ活性によるものであると示唆される。
【０１０５】
以上の結果より、ラッカーゼ遺伝子が導入された形質転換植物体は、その雄ずい（葯）にてラッカーゼを生産していることが明らかとなった。また、草本植物や木本植物等の植物にラッカーゼ遺伝子を導入し、該遺伝子を該植物で発現させることによって、高頻度でかつ高効率にて雄性不稔植物体の作出が可能であることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明の雄性不稔植物体およびその作出方法は、農産物の生産や新品種の育成に有用であるため、例えば、農業、林業、園芸業、環境業、食品産業、医薬品産業、化粧品産業等に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、Ｔｉプラスミド pW35SfLac/pBI121のT-DNA領域を示す図である。
【図２】図２は、実施例１で得られた雄性不稔植物体（タバコ）から調製された根の抽出物を当電点電気泳動し、活性染色した結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例１で得られた雄性不稔植物体（タバコ）の水耕栽培溶液を当電点電気泳動し、活性染色した結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例２で得られた雄性不稔植物体（タバコ）FL4の花器を示す写真である。
【図５】図５は、実施例２で得られた雄性不稔植物体（タバコ）FL4,FL9,FL20,FL22および野生型植物（タバコ）1,2の開裂前の葯から抽出されたタンパク質中のラッカーゼ活性を示す図である。
【図６】図６は、比較例である野生型植物（タバコ）の花器を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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