(57)【要約】【課題】化学発光免疫診断測定等において高いノイズ低減効果を有するプローブ結合粒子およびその製造方法ならびにブロッキング剤を提供する。【解決手段】プローブ結合粒子の製造方法は、粒子の表面にプローブを結合させる工程と、下記式（１）で示される官能基を有する水溶性共重合体からなるブロッキング剤を用いて、前記プローブが結合された前記粒子を処理する工程とを含む。【化１】2008209114.tif 000007  ・・・・・（１）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子の表面にプローブを結合させる工程と、
下記式（１）で示される官能基を有する水溶性共重合体からなるブロッキング剤を用いて、前記プローブが結合された前記粒子を処理する工程と、
を含む、プローブ結合粒子の製造方法。
【化１】
2008209114.tif 000005
・・・・・（１）
【請求項２】
請求項１において、
前記プローブを結合させる工程において、前記粒子は、カルボキシル基、活性エステル基、トシル基、アミノ基、およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を有する、プローブ結合粒子の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記粒子は、磁性粒子である、プローブ結合粒子の製造方法。
【請求項４】
下記式（１）で示される官能基を有する水溶性共重合体からなるブロッキング剤。
【化２】
2008209114.tif 000006
・・・・・（１）
【請求項５】
請求項４において、
前記水溶性共重合体は、（メタ）アクリロイルモルホリンと、その他のモノマーとを共重合して得られる、ブロッキング剤。
【請求項６】
請求項１ないし３のいずれかに記載のプローブ結合粒子の製造方法によって得られるプローブ結合粒子。
【請求項７】
請求項４または５に記載のブロッキング剤を表面に有する、プローブ結合粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブ結合粒子およびその製造方法ならびに粒子などの固相のブロッキング剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、疾病の早期発見等の目的のため、検査の高感度化が求められており、診断薬の感度向上は大きな課題となっている。磁性粒子などの固相を用いた診断薬においても、感度向上のため、検出方式として酵素発色を用いる方式から、より高い感度が得られる蛍光や化学発光を用いる方式へと切り替わりつつある。これらの検出技術の発展により、理論上は一分子の検査対象物質の存在まで検出できるレベルに達しているといわれているが、実際には十分な感度が得られていない。その原因としては、血清などの生体分子混在下で特定の物質を検出する診断では、共存する生体分子や２次抗体、発光基質などが固相へ非特異的に吸着し、その結果、ノイズが増加して高感度化の妨げとなっている。そのため、免疫診断測定においては、特異的に結合する物質以外の物質が免疫反応に使用する固相表面に非特異的に吸着することによる感度の低下を軽減するため、通常、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等の生物由来物質をブロッキング剤として用いることにより、非特異吸着を抑制して、ノイズを低減させている。
【０００３】
しかしながら、従来法によるブロッキング操作を施しても、なお、非特異的な吸着が残り、さらに、生体由来のブロッキング剤を用いる場合、ＢＳＥに代表される生物汚染の問題があることなどから、化学合成による高性能のブロッキング剤の開発が望まれている。
【０００４】
化学合成によるブロッキング剤としては、特開平１１−２８７８０２号公報や特許第３４０７３９７号にポリオキシエチレンを有するポリマーが提案されているが、これらのブロッキング剤によるノイズ低減効果は不十分であった。
【特許文献１】特開平１１−２８７８０２号公報
【特許文献２】特許第３４０７３９７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、非特異吸着が低減され、高いＳ／Ｎ比を得ることができるプローブ結合粒子およびその製造方法、ならびに、化学発光免疫診断測定等において十分なノイズ低減効果を有する化学合成のブロッキング剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、この課題を解決するために、特定の官能基を有する水溶性重合体が顕著なブロッキング効果を示すことを見いだし、本発明を完成した。
【０００７】
本発明の一態様に係るプローブ結合粒子の製造方法は、
粒子の表面にプローブを結合させる工程と、
下記式（１）で示される官能基を有する水溶性共重合体からなるブロッキング剤を用いて、前記プローブが結合された前記粒子を処理する工程と、
を含む。
【０００８】
【化３】
2008209114.tif 000002
・・・・・（１）
上記プローブ結合粒子の製造方法において、
前記プローブを結合させる工程において、前記粒子は、カルボキシル基、活性エステル基、トシル基、アミノ基、およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を有することができる。
【０００９】
上記プローブ結合粒子の製造方法において、
前記粒子は、磁性粒子であることができる。
【００１０】
本発明の一態様に係るブロッキング剤は、下記式（１）で示される官能基を有する水溶性共重合体からなる。
【００１１】
【化４】
2008209114.tif 000003
・・・・・（１）
上記ブロッキング剤において、前記水溶性共重合体を、（メタ）アクリロイルモルホリンと、その他のモノマーとを共重合して得ることができる。
【００１２】
本発明の一態様に係るプローブ結合粒子は、上記プローブ結合粒子の製造方法によって得られる。
【００１３】
本発明の一態様に係るプローブ結合粒子は、上記ブロッキング剤を表面に有する。
【発明の効果】
【００１４】
上記プローブ結合粒子によれば、非特異吸着が低減され、高いＳ／Ｎ比を得ることができる。
【００１５】
上記ブロッキング剤は、化学合成により製造できることから生物汚染の可能性がないうえ、従来用いられてきたブロッキング剤に比べて、ノイズ低減効果が高い。より具体的には、上記ブロッキング剤は、非特異吸着低減のために使用されている牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等のブロッキング剤を代替することができる。
【００１６】
また、上記ブロッキング剤は、免疫診断に使用される粒子（例えば磁性粒子）に用いた場合にシグナル増強効果を発現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の一実施形態に係るブロッキング剤ならびにプローブ結合粒子およびその製造方法について説明する。
【００１８】
１．ブロッキング剤ならびにプローブ結合粒子およびその製造方法
１．１．ブロッキング剤の構造
本発明の一実施形態に係るブロッキング剤は、下記式（１）で示される官能基を有する水溶性共重合体からなる。
【００１９】
【化５】
2008209114.tif 000004
・・・・・（１）
水溶性共重合体は、上記式（１）で示される官能基以外に、水酸基、アルコキシアルキル基、ポリオキシエチレン基、カルボキシル基、カルボニル基、スルホン基、１級〜４級アミノ基、アミド基などの親水基；アルキル基、アリール基、カルボン酸アルキルエステル基などの疎水基を側鎖として含んでいてもよい。
【００２０】
水溶性共重合体は、上記式（１）で示される官能基を側鎖に有することが好ましい。この場合、水溶性共重合体の主鎖としては、例えば、ポリエチレン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネートなどを挙げることができ、製造が容易であることから、好ましい主鎖はポリエチレンである。
【００２１】
水溶性共重合体の分子量は、好ましくは１，０００〜１，０００，０００、より好ましくは２，０００〜２００，０００である。
【００２２】
１．２．ブロッキング剤の製造
本実施形態に係るブロッキング剤において、水溶性共重合体は、（メタ）アクリロイルモルホリンと、その他のモノマーとを共重合して得ることができる。
【００２３】
好ましいモノマーの比率は、（メタ）アクリロイルモルホリン５０〜９９重量部とその他のモノマー５０〜１重量部であり、より好ましいモノマーの比率は、（メタ）アクリロイルモルホリン６０〜９８重量部とその他のモノマー４０〜２重量部である。
【００２４】
（メタ）アクリロイルモルホリンには、アクリロイルモルホリン、メタクリロイルモルホリン、およびこれらの混合物が含まれ、好ましくは、アクリロイルモルホリンを用いる。
【００２５】
その他のモノマーとしては、例えば、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、アリルアルコールなどの水酸基を有するモノマー；メトキシエチル（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールエチルエーテル（メタ）アクリレートなどのアルコキシアルキル基を有するモノマー；ポリエチレングリコール（メタ）アクリルエステル、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリルエステルなどのポリオキシエチレン基を有するモノマー；アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、無類マレイン酸、クロトン酸などのカルボキシル基を有するモノマー；ダイアセトンアクリルアミド、アクロレイン、ホルミルスチロールなどのカルボニル基を有するモノマー；スチレンスルホン酸、イソプレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸などのスルホン基を有するモノマー；アリルアミン、アミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのメチルクロライド４級塩などの１級〜４級アミノ基を有するモノマー；（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミドなどのアミド基を有するモノマー；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ラウリル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸イソボニル、（メタ）アクリル酸ベンジル、スチレンなどの疎水性モノマーを挙げることができる。
【００２６】
これらのモノマーのうち、アミノ基を有するモノマーを共重合することにより、アニオン性の固相表面とクーロン結合することが可能となり、ブロッキング効果を高めることが可能である。また、疎水性モノマーを共重合することにより、疎水性の固相表面と疎水結合することが可能となり、ブロッキング効果を高めることが可能である。
【００２７】
本実施形態に係るブロッキング剤は、これらのモノマーと、必要に応じて副原料である重合開始剤、界面活性剤、電解質、分子量調節剤などを必要に応じて添加し、水、アルコール、ＴＨＦ、ＤＭＦあるいはこれらの混合液などの溶媒中で重合を行うことにより得ることができる。重合時間は好ましくは１〜１０時間、重合温度は好ましく０〜１２０℃である。
【００２８】
なお、開始剤として、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド（和光純薬工業社製「Ｖ−５０」）、２，２’−アゾビス（１−イミノ−１−ピロリジノ−２−エチルプロパン）ジハイドロクロライド（和光純薬工業社製「ＶＡ−０６７」）などのカチオン性開始剤を使用することにより、ブロッキング剤がアニオン性の固相表面とクーロン結合することが可能となり、ブロッキング効果を高めることが可能である。このような開始剤の使用量は、モノマーの総量１００質量部に対して好ましくは０．２〜５質量部である。
【００２９】
また、分子量調節剤として、２−メルカプトエチルアミン（システアミン）、３−メルカプトプロピルアミン、２−メルカプトプロピルアミンなどのカチオン性分子量調節剤を使用することにより、上記のカチオン性開始剤と同様にブロッキング剤がアニオン性の固相表面とクーロン結合することが可能となり、ブロッキング効果を高めることが可能である。このような分子量調節剤の使用量は、モノマーの総量１００質量部に対して好ましくは０．１〜１０質量部である。
【００３０】
１．３．ブロッキング剤の用途ならびにプローブ結合粒子およびその製造
本実施形態に係るブロッキング剤は、従来の免疫診断測定において用いられたアルブミン、カゼイン、ゼラチン等を代替することにより、さらに非特異吸着を抑制して、ノイズを低減することができる。
【００３１】
例えば、プレート法において、プレートへ抗体などのプローブを結合した後、本実施形態に係るブロッキング剤を添加して、プレート表面を処理することができる。
【００３２】
また、本実施形態に係るブロッキング剤は例えば、プローブ結合粒子の製造に好適に使用することができる。本実施形態に係るプローブ結合粒子の製造方法は、粒子の表面にプローブを結合させる工程と、本実施形態に係るブロッキング剤を用いて、プローブが結合された粒子を処理する工程とを含む。
【００３３】
ここで、本実施形態に係るブロッキング剤を用いて、プローブが結合された粒子を処理する工程は、例えば、本実施形態に係るブロッキング剤を粒子の表面に所定時間接触させることにより行うことができる。これにより、粒子表面における非特異吸着を抑制し、ノイズを低減することができる。また、この工程は例えば、本実施形態に係るブロッキング剤の溶液中に粒子を分散させた状態で行うことができる。
【００３４】
この場合、プローブを結合させる粒子は、カルボキシル基、活性エステル基、トシル基、アミノ基、およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を少なくとも表面に有することが好ましい（その理由については後述する）。また、この場合、粒子は磁性粒子であることが好ましい。
【００３５】
より具体的には、例えば、イムノクロマト法において、着色粒子に抗体などのプローブを結合させた後、本実施形態に係るブロッキング剤を添加して、着色粒子の表面を処理することにより、プローブ結合粒子を得ることができる。また、例えば、ＥＩＡ、ＣＬＩＡ、ＣＬＥＩＡなどのアッセイ法において、磁性粒子の表面に抗体などのプローブを結合させた後、本実施形態に係るブロッキング剤を添加して、該磁性粒子の表面を処理することにより、プローブ結合粒子を得ることができる。
【００３６】
以上に説明したように、本実施形態に係るブロッキング剤は、上記式（１）で示される官能基を有する水溶性共重合体からなることにより、非特異吸着を抑制して、ノイズを低減し、免疫診断測定における擬陽性の出現率を低下することができる。
【００３７】
本実施形態に係るブロッキング剤を用いて、特にカルボキシル基、活性エステル基、トシル基、アミノ基、エポキシ基などの活性基を少なくとも表面に有する粒子（例えば磁性粒子）を処理する場合、例えば、ブロッキング剤中のアミド結合と粒子表面の活性基とが共有結合を形成し、免疫診断用抗体の配向性を向上させることから、シグナルを増強する効果が発現する。また、ブロッキング剤の脱離を抑制することができるため、界面活性剤などを含むバッファー類に対して、極めて安定性に富んだ検査試薬となる。
【００３８】
本実施形態に係るブロッキング剤が特に良好な効果を発現する担体は、カルボキシル基を有する粒子（例えば磁性粒子）である。その好ましい処理方法としては、カルボキシル基を有する粒子を水溶性カルボジイミドなどで活性エステルとし、免疫診断プローブを結合した後、本実施形態に係るブロッキング剤（シグナル増強剤）で処理する方法が挙げられる。
【００３９】
本実施形態に係るプローブ結合粒子は、上述のプローブ結合粒子の製造方法によって得ることができる。例えば、本実施形態に係るプローブ結合粒子は、上述のブロッキング剤を表面に有することができる。
【００４０】
なお、本実施形態に係るブロッキング剤は、従来の免疫診断薬において添加剤として用いられたアルブミン、カゼイン、ゼラチン等を代替することにより、保存時における固定化抗体の活性低下を防止したり、非特異検体のシグナルを抑制したり、抗原抗体反応を促進させる効果も有する。
【００４１】
２．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【００４２】
２．１．実施例１
アクリロイルモルホリン９５ｇおよびメチルメタクリレート５ｇを水９００ｇに溶解して攪拌機付きセパラブルフラスコに入れた。これに窒素を吹き込みながら、７０℃まで昇温し、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド１ｇおよび２−メルカプトエチルアミン２ｇを添加した後、６時間重合を続け、さらに８０℃に昇温して３時間エージングした後、室温まで冷却した。得られた共重合体溶液を透析により精製し、さらに凍結乾燥することにより、本実施例のブロッキング剤（Ａ−１）９８ｇを得た。ブロッキング剤（Ａ−１）の液体クロマトグラフィーによる分子量分布は、分子量５，０００をメインピークとするブロードなピークであった。
【００４３】
カルボキシル基を有する磁性粒子（商品名「ＭＡＧ１１０１」、ＪＳＲ社製）１ｍｇを分散させた固形分濃度１％の水分散体に、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（同仁化学社製）水溶液を添加して室温で２時間回転攪拌することにより、カルボキシル基を活性化した。これを磁気分離して上清を捨てた後、腫瘍マーカーであるヒトαフェトプロテイン（以下、「ＡＦＰ」という。）に対する抗体（以下、「抗ＡＦＰ抗体」という。コスモ・バイオ株式会社製）１０μｇを加え１５時間室温で反応した。反応後、ブロッキング剤（Ａ−１）の０．４％水溶液１２５μＬを加え、さらに１時間室温で攪拌した。これを磁気分離し、洗浄液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で繰り返し洗浄した後、粒子濃度０．５％になるように洗浄液で希釈し、一次プローブとして抗ＡＦＰ抗体を結合したタンパク結合粒子（免疫検査用粒子）を得た。得られた免疫検査用粒子の分散液１０μｌ（粒子５０μｇ相当）をテストチューブに取り、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡＦＰ抗原（日本バイオテスト社製）の標準検体５０μｌと混合し、３７℃で１０分間反応させた。磁気分離して粒子を分離し上清を除いた後、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ（以下、「ＡＬＰ」という。）で標識した抗ＡＦＰ抗体（富士レビオ株式会社製、ルミパルスＡＦＰ−Ｎに付属の試薬を使用）４０μｌを添加し、３７℃で１０分間反応させた。次いで、磁気分離して上清を除いた後、ＰＢＳで３回洗浄を繰り返して得られた粒子を５０μｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０に分散させ、新しいチューブに移し替えた。ＡＬＰの基質液（ルミパルス基質液：富士レビオ株式会社製）１００μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、化学発光量を測定することによりシグナル強度を得た。化学発光量の測定には、ベルトールジャパン株式会社製の化学発光測定装置（商品名「Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０７」）を用いた。その結果、シグナル強度は１１７５１３ＲＩＵであった。
【００４４】
また、上記ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡＦＰ抗原の標準検体５０μｌの代わりに、ＡＦＰ抗原を含まないＦＣＳ５０μｌを用いた以外は、上記と同様にして化学発光量を測定することにより得られたノイズ強度は、５８ＲＩＵであった。
【００４５】
２．２．比較例１
実施例１において、アクリロイルモルホリンの代わりにポリエチレングリコールメタクリレートを使用した以外は、実施例1と同様にして、上記式（１）で示される官能基を有さないブロッキング剤を得た。但し、本比較例においては、重合中に溶液の粘度上昇が見られたため、重合中に適宜、水を添加した。本比較例で得られたブロッキング剤の液体クロマトグラフィーによる分子量分布は、分子量８，０００をメインピークとするブロードなピークであった。
【００４６】
また、本比較例で得られたブロッキング剤を用いて、実施例１と同様の方法にて磁性粒子を処理して、シグナル強度およびノイズ強度を求めた。その結果、シグナル強度は、１０９０３３ＲＩＵであり、ノイズ強度は、１０３ＲＩＵであった。
【００４７】
２．３．比較例２
実施例１において、ブロッキング剤（Ａ−１）の代わりに牛血清アルブミンを使用した以外は、実施例１と同様の方法にて磁性粒子を処理して、シグナル強度およびノイズ強度を求めた。その結果、シグナル強度は、９７６２５ＲＩＵであり、ノイズ強度は、８５ＲＩＵであった。
【００４８】
２．４．比較例３
実施例１において、ブロッキング剤（Ａ−１）を使用しなかった以外は、実施例１と同様の方法にて磁性粒子を処理して、シグナル強度およびノイズ強度を求めた。その結果、シグナル強度は、９４７５３ＲＩＵであり、ノイズ強度は、１２１ＲＩＵであった。