(57)【要約】【課題】タイムラプス観察など長期間の観察において、観察者に対して長期間継続的に液体の注液状態を監視させることなく、良好な注液状態を維持して良好な蛍光像を得ることが可能な蛍光撮像方法及び蛍光撮像装置を提供する。【解決手段】液浸対物レンズを備えた倒立型の蛍光撮像装置を用いて蛍光観察体を一定期間撮像する蛍光撮像方法において、蛍光観察体を収納したウェルを複数有する容器の所定ウェルを蛍光撮像装置の撮像位置に配置するステップＳ１と、蛍光撮像装置内の液浸対物レンズの先端部と所定ウェルとの間に所定量の液体を注液するステップＳ２と、液浸対物レンズの先端部との間に液体が充填されている所定ウェル内の蛍光観察体を撮像するステップＳ３と共に、所定の時間的間隔で１回の注液ステップＳ２とその後に行う所定回数の撮像ステップＳ３とからなる一連の操作を繰り返す、制御ステップＳ４を備える。【選択図】図１
2008157984.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液浸対物レンズを備えた倒立型の蛍光撮像装置を用いて、蛍光観察体を一定期間撮像する蛍光撮像方法において、
前記蛍光観察体を収納した容器を前記蛍光撮像装置の撮像位置に配置する撮像位置配置ステップと、
前記蛍光撮像装置内の前記液浸対物レンズの先端部と前記蛍光観察体を収納した容器との間に所定量の液体を注液して充填状態にする注液ステップと、
前記液浸対物レンズの先端部との間に液体が充填されている前記容器内の蛍光観察体を撮像する撮像ステップを備えるとともに、
所定の時間的間隔をもって、１回の前記注液ステップと該１回の注液ステップの後に行う所定回数の前記撮像ステップとからなる一連の操作を繰り返す、繰り返し制御ステップを備えるようにしたことを特徴とする蛍光撮像方法。
【請求項２】
前記所定の時間的間隔として、前記注液ステップにより注液された前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体が蒸発して非充填状態となるまでの所定時間を予め設定しておくことを特徴とする請求項１に記載の蛍光撮像方法。
【請求項３】
前記注液ステップの前に、前記液浸対物レンズと前記容器とが離れるように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる移動ステップを備え、
前記注液ステップと前記撮像ステップの間に、前記液浸対物レンズが前記容器内の前記蛍光観察体に照準するように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる照準ステップを備えるとともに、
前記繰り返し制御ステップにおいて、所定の時間的間隔をもって、１回の前記移動ステップと該１回の移動ステップの後に行う１回の前記注液ステップと該１回の注液ステップの後に行う１回の前記照準ステップと該１回の照準ステップの後に行う所定回数の前記撮像ステップとからなる一連の操作を繰り返すようにしたことを特徴とする請求項１に記載の蛍光撮像方法。
【請求項４】
前記移動ステップにおいて、前記液浸対物レンズと前記容器との相対的位置を、少なくとも該液浸対物レンズの光軸に対して垂直方向に、変位させることを特徴とする請求項３に記載の蛍光撮像方法。
【請求項５】
液浸対物レンズを備えた倒立型の蛍光撮像装置を用いて、蛍光観察体を一定期間撮像する蛍光撮像方法において、
前記蛍光観察体を収納した容器を前記蛍光撮像装置の撮像位置に配置する撮像位置配置ステップと、
前記蛍光撮像装置内の前記液浸対物レンズの先端部と前記蛍光観察体を収納した容器との間に所定量の液体を注液して充填状態にする注液ステップと、
前記液浸対物レンズの先端部との間に液体が充填されている前記容器内の蛍光観察体を撮像する撮像ステップとを備えるとともに、
前記注液ステップにより注液された前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体の充填状態の変化を検知する検知ステップと、
前記検知ステップを介して前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、１回の前記注液ステップと該１回の注液ステップの後に行う所定回数の前記撮像ステップとからなる一連の操作を繰り返す、繰り返し制御ステップを備えるようにしたことを特徴とする蛍光撮像方法。
【請求項６】
前記注液ステップの前に、前記液浸対物レンズと前記容器とが離れるように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる移動ステップを備え、
前記注液ステップと前記撮像ステップの間に、前記液浸対物レンズが前記容器内の前記蛍光観察体に照準するように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる照準ステップを備えるとともに、
前記繰り返し制御ステップにおいて、前記検知ステップを介して前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、１回の前記移動ステップと該１回の移動ステップの後に行う１回の前記注液ステップと該１回の注液ステップの後に行う１回の前記照準ステップと該１回の照準ステップの後に行う所定回数の前記撮像ステップとからなる一連の操作を繰り返すようにしたことを特徴とする請求項５に記載の蛍光撮像方法。
【請求項７】
前記移動ステップにおいて、前記液浸対物レンズと前記容器との相対的位置を、少なくとも該液浸対物レンズの光軸に対して垂直方向に、変位させることを特徴とする請求項６に記載の蛍光撮像方法。
【請求項８】
蛍光観察体を一定期間観察する、液浸対物レンズを備えた倒立型の蛍光撮像装置において、
前記液浸対物レンズの先端部と前記蛍光観察体を収納した容器との間に所定量の液体を注液する注液手段と、
前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間に液体が充填された状態における該容器内の蛍光観察体を撮像する撮像手段と、
所定の時間的間隔をもって、前記注液手段による前記液浸対物レンズの先端部と容器との間の液体の注液を１回行いその後に前記撮像手段による前記蛍光観察体の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、該注液手段及び該撮像手段を制御する、繰り返し制御手段とを有することを特徴とする蛍光撮像装置。
【請求項９】
さらに、前記液浸対物レンズと前記容器とが離れるように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる移動手段と、
前記液浸対物レンズが前記容器内の前記蛍光観察体に照準するように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる照準手段を備えるとともに、
前記繰り返し制御手段が、所定の時間的間隔をもって、前記移動手段による前記液浸対物レンズと前記容器との相対的位置の変位を１回行い次いで前記注液手段による該液浸対物レンズの先端部と該容器との間の液体の注液を１回行い次いで前記照準手段による該液浸対物レンズの該容器内の前記蛍光観察体への照準を１回行いその後に前記撮像手段による該蛍光観察体の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、該移動手段、該注液手段、該照準手段及び該撮像手段を制御するように構成されていることを特徴とする請求項８に記載の蛍光撮像装置。
【請求項１０】
蛍光観察体を一定期間観察する、液浸対物レンズを備えた倒立型の蛍光撮像装置において、
前記液浸対物レンズの先端部と前記蛍光観察体を収納した容器との間に所定量の液体を注液する注液手段と、
前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間に液体が充填された状態における該容器内の蛍光観察体を撮像する撮像手段と、
前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体の充填状態の変化を検知する検知手段と、
前記検知手段を介して前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、前記注液手段による前記液浸対物レンズの先端部と容器との間の液体の注液を１回行いその後に前記撮像手段による前記蛍光観察体の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、該注液手段及び該撮像手段を制御する、繰り返し制御手段とを有することを特徴とする蛍光撮像装置。
【請求項１１】
さらに、前記液浸対物レンズと前記容器とが離れるように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる移動手段と、
前記液浸対物レンズが前記容器内の前記蛍光観察体に照準するように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる照準手段を備えるとともに、
前記繰り返し制御手段が、前記検知手段を介して前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、前記移動手段による該液浸対物レンズと該容器との相対的位置の変位を１回行い次いで前記注液手段による該液浸対物レンズの先端部と該容器との間の液体の注液を１回行い次いで前記照準手段による該液浸対物レンズの該容器内の前記蛍光観察体への照準を１回行いその後に前記撮像手段による該蛍光観察体の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、該移動手段、該注液手段、該照準手段及び該撮像手段を制御するように構成されていることを特徴とする請求項１０に記載の蛍光撮像装置。
【請求項１２】
前記容器が、複数のウェルを有するマルチプレートにおける所定のウェルであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の蛍光撮像方法。
【請求項１３】
前記容器が、複数のウェルを有するマルチプレートにおける所定のウェルであることを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の蛍光撮像装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、生体試料などの被観察物と該被観察物の下側に配置される対物レンズとの間に液体を介在させてタイムラプス観察等、長期間に及ぶ観察により蛍光像を撮像する好適な、蛍光撮像方法及び蛍光撮像装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、液浸対物レンズを備えた倒立型顕微鏡において、観察の際に液浸対物レンズに注液する一般的な手法としては、ピペット等を用いて手動で注液する手法がある。しかし、マイクロプレートサンプルの観察やタイムラプス観察等、複数の試料を観察したり、特定の試料を断続的に長期間観察したりする場合、必要に応じてその都度ピペット等を用いて手動で注液するのは煩雑であり、観察者に負担となる。そこで、従来、この種の液浸対物レンズを備えた倒立型顕微鏡を用いた観察において液浸対物レンズに自動的に注液することが可能な構成が、例えば、次の特許文献１に提案されている。
【特許文献１】特表２００４−５３１７６５号公報
【０００３】
図１４は特許文献１に記載されている液浸対物レンズに自動的に注液する構成を示す説明図である。
図１４の構成では、液浸対物レンズに液体を注入する注液手段としての供給器５１が、液浸対物レンズ５２に固定されるとともに、供給器５１の先端に設けられた供給管５１ａが、液浸対物レンズ５２の側方から液浸対物レンズ５２の先端レンズ５２ａの近傍に延びている。そして、供給管５１ａを経由して液浸対物レンズ５２の先端レンズ５２ａと試料支持具５３に支持されている試料５４との間に自動的に注液することができるようになっている。
また、図１４の構成では、排出手段としてのトラフ状の吸収手段５５が、液浸対物レンズ５２の周囲に設けられるとともに、吸収手段５５には排出用の管５６が接続されている。そして、液浸対物レンズ５２の先端レンズ５２ａから溢れた液体を吸収手段５５に溜め、溜まった液体を排出用の管５６を介して排出することができるようになっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、液浸対物レンズと試料との間に充填された媒質としての液体は、時間の経過と共に蒸発していく。
しかし、特許文献１に記載の構成は、長期間の観察における液体の蒸発に対しては何ら配慮されたものとなっていない。
このため、特許文献１に記載の構成の注液手段を用いても、倒立型顕微鏡を用いてタイムラプス観察等、長期間の観察により蛍光像を撮像するような場合には、ある程度の期間が経過すると液浸対物レンズと試料との間が充填されない状態となり、観察に支障を来たすようになってしまう。
【０００５】
観察に支障を来たすことがないようにするためには、観察者に長期間継続的に液体の注液状態を監視させて、液体が相当量蒸発したときにその都度注液手段を駆動させることが必要となるが、それでは、観察者の肉体的負担が膨大なものとなってしまう。
【０００６】
本発明は、上記従来の課題に鑑みてなされたものであり、タイムラプス観察など長期間の観察において、観察者に対して長期間継続的に液体の注液状態を監視させることなく、良好な注液状態を維持して良好な蛍光像を得ることが可能な蛍光撮像方法及び蛍光撮像装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明による蛍光撮像方法は、液浸対物レンズを備えた倒立型の蛍光撮像装置を用いて、蛍光観察体を一定期間撮像する蛍光撮像方法において、前記蛍光観察体を収納した容器を前記蛍光撮像装置の撮像位置に配置する撮像位置配置ステップと、前記蛍光撮像装置内の前記液浸対物レンズの先端部と前記蛍光観察体を収納した容器との間に所定量の液体を注液して充填状態にする注液ステップと、前記液浸対物レンズの先端部との間に液体が充填されている前記容器内の蛍光観察体を撮像する撮像ステップを備えるとともに、所定の時間的間隔をもって、１回の前記注液ステップと該１回の注液ステップの後に行う所定回数の前記撮像ステップとからなる一連の操作を繰り返す、繰り返し制御ステップを備えるようにしたことを特徴としている。
【０００８】
また、本発明の蛍光撮像方法においては、前記所定の時間的間隔として、前記注液ステップにより注液された前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体が蒸発して非充填状態となるまでの所定時間を予め設定しておくのが好ましい。
【０００９】
また、本発明の蛍光撮像方法においては、前記注液ステップの前に、前記液浸対物レンズと前記容器とが離れるように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる移動ステップを備え、前記注液ステップと前記撮像ステップの間に、前記液浸対物レンズが前記容器内の前記蛍光観察体に照準するように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる照準ステップを備えるとともに、前記繰り返し制御ステップにおいて、所定の時間的間隔をもって、１回の前記移動ステップと該１回の移動ステップの後に行う１回の前記注液ステップと該１回の注液ステップの後に行う１回の前記照準ステップと該１回の照準ステップの後に行う所定回数の前記撮像ステップとからなる一連の操作を繰り返すようにするのが好ましい。
【００１０】
また、本発明の蛍光撮像方法においては、前記移動ステップにおいて、前記液浸対物レンズと前記容器との相対的位置を、少なくとも該液浸対物レンズの光軸に対して垂直方向に、変位させるのが好ましい。
【００１１】
また、本発明による蛍光撮像方法は、液浸対物レンズを備えた倒立型の蛍光撮像装置を用いて、蛍光観察体を一定期間撮像する蛍光撮像方法において、前記蛍光観察体を収納した容器を前記蛍光撮像装置の撮像位置に配置する撮像位置配置ステップと、前記蛍光撮像装置内の前記液浸対物レンズの先端部と前記蛍光観察体を収納した容器との間に所定量の液体を注液して充填状態にする注液ステップと、前記液浸対物レンズの先端部との間に液体が充填されている前記容器内の蛍光観察体を撮像する撮像ステップとを備えるとともに、前記注液ステップにより注液された前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体の充填状態の変化を検知する検知ステップと、前記検知ステップを介して前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、１回の前記注液ステップと該１回の注液ステップの後に行う所定回数の前記撮像ステップとからなる一連の操作を繰り返す、繰り返し制御ステップを備えるようにしたことを特徴としている。
【００１２】
また、本発明の蛍光撮像方法においては、前記注液ステップの前に、前記液浸対物レンズと前記容器とが離れるように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる移動ステップを備え、前記注液ステップと前記撮像ステップの間に、前記液浸対物レンズが前記容器内の前記蛍光観察体に照準するように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる照準ステップを備えるとともに、前記繰り返し制御ステップにおいて、前記検知ステップを介して前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、１回の前記移動ステップと該１回の移動ステップの後に行う１回の前記注液ステップと該１回の注液ステップの後に行う１回の前記照準ステップと該１回の照準ステップの後に行う所定回数の前記撮像ステップとからなる一連の操作を繰り返すようにするのが好ましい。
【００１３】
また、本発明の蛍光撮像方法においては、前記移動ステップにおいて、前記液浸対物レンズと前記容器との相対的位置を、少なくとも該液浸対物レンズの光軸に対して垂直方向に、変位させるのが好ましい。
【００１４】
また、本発明による蛍光撮像装置は、蛍光観察体を一定期間観察する、液浸対物レンズを備えた倒立型の蛍光撮像装置において、前記液浸対物レンズの先端部と前記蛍光観察体を収納した容器との間に所定量の液体を注液する注液手段と、前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間に液体が充填された状態における該容器内の蛍光観察体を撮像する撮像手段と、所定の時間的間隔をもって、前記注液手段による前記液浸対物レンズの先端部と容器との間の液体の注液を１回行いその後に前記撮像手段による前記蛍光観察体の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、該注液手段及び該撮像手段を制御する、繰り返し制御手段とを有することを特徴としている。
【００１５】
また、本発明の蛍光撮像装置においては、さらに、前記液浸対物レンズと前記容器とが離れるように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる移動手段と、前記液浸対物レンズが前記容器内の前記蛍光観察体に照準するように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる照準手段を備えるとともに、前記繰り返し制御手段が、所定の時間的間隔をもって、前記移動手段による前記液浸対物レンズと前記容器との相対的位置の変位を１回行い次いで前記注液手段による該液浸対物レンズの先端部と該容器との間の液体の注液を１回行い次いで前記照準手段による該液浸対物レンズの該容器内の前記蛍光観察体への照準を１回行いその後に前記撮像手段による該蛍光観察体の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、該移動手段、該注液手段、該照準手段及び該撮像手段を制御するように構成されているのが好ましい。
【００１６】
また、本発明による蛍光撮像装置は、蛍光観察体を一定期間観察する、液浸対物レンズを備えた倒立型の蛍光撮像装置において、前記液浸対物レンズの先端部と前記蛍光観察体を収納した容器との間に所定量の液体を注液する注液手段と、前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間に液体が充填された状態における該容器内の蛍光観察体を撮像する撮像手段と、前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体の充填状態の変化を検知する検知手段と、前記検知手段を介して前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、前記注液手段による前記液浸対物レンズの先端部と容器との間の液体の注液を１回行いその後に前記撮像手段による前記蛍光観察体の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、該注液手段及び該撮像手段を制御する、繰り返し制御手段とを有することを特徴としている。
【００１７】
また、本発明の蛍光撮像装置においては、さらに、前記液浸対物レンズと前記容器とが離れるように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる移動手段と、前記液浸対物レンズが前記容器内の前記蛍光観察体に照準するように、該液浸対物レンズと該容器との相対的位置を変位させる照準手段を備えるとともに、前記繰り返し制御手段が、前記検知手段を介して前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、前記移動手段による該液浸対物レンズと該容器との相対的位置の変位を１回行い次いで前記注液手段による該液浸対物レンズの先端部と該容器との間の液体の注液を１回行い次いで前記照準手段による該液浸対物レンズの該容器内の前記蛍光観察体への照準を１回行いその後に前記撮像手段による該蛍光観察体の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、該移動手段、該注液手段、該照準手段及び該撮像手段を制御するように構成されているのが好ましい。
【００１８】
また、本発明の蛍光撮像方法及び蛍光撮像装置においては、前記容器が複数のウェルを有するマルチプレートにおける所定のウェルであるのが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の蛍光撮像方法及び蛍光撮像装置によれば、タイムラプス観察など長期間の観察において、観察者に対して長期間継続的に液体の注液状態を監視させることなく、良好な注液状態を維持して良好な蛍光像を得ることが可能な蛍光撮像方法及び蛍光撮像装置が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
第１実施形態
図１は本発明の第１実施形態にかかる蛍光撮像方法の撮像手順を示すフローチャートである。
第１実施形態の蛍光撮像方法は、液浸対物レンズを備えた倒立型の蛍光撮像装置を用いて、蛍光観察体を一定期間撮像する蛍光撮像方法において、撮像位置配置ステップＳ１と、注液ステップＳ２と、撮像ステップＳ３と、繰り返し制御ステップＳ４を備えている。
撮像位置配置ステップＳ１では、蛍光観察体を収納したウェルを複数有する容器における所定のウェルを蛍光撮像装置の撮像位置に配置する。
注液ステップＳ２では、蛍光撮像装置内の液浸対物レンズの先端部と蛍光観察体を収納した所定のウェルとの間に所定量の液体を注液して充填状態にする。
撮像ステップＳ３では、液浸対物レンズの先端部との間に液体が充填されている所定のウェル内の蛍光観察体を撮像する。
繰り返し制御ステップＳ４では、所定の時間的間隔をもって、１回の注液ステップＳ２と１回の注液ステップＳ２の後に行う所定回数の撮像ステップＳ３とからなる一連の操作を繰り返す、繰り返し制御ステップＳ４を備えるようにしている。
【００２１】
第１実施形態の蛍光撮像方法によれば、繰り返し制御ステップＳ４において所定の時間的間隔をもって、１回の注液ステップＳ２と１回の注液ステップＳ２の後に行う所定回数の撮像ステップＳ３とからなる一連の操作を繰り返すようにしたので、所定の時間的間隔を注液ステップＳ２により注液された液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間の液体が蒸発して非充填状態となるまでの所定時間とすることで、長期間の観察において、観察者が液体の注液状態を監視しなくても、自動的に良好な注液状態を維持して良好な蛍光像を得ることができる。
【００２２】
そこで、第１実施形態の蛍光撮像方法においては、繰り返し制御ステップＳ４における所定の時間的間隔として、注液ステップＳ２により注液された液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間の液体が蒸発して非充填状態となるまでの所定時間を予め設定しておくのが好ましい。
【００２３】
第２実施形態
図２は本発明の第２実施形態にかかる蛍光撮像方法の撮像手順を示すフローチャートである。
第２実施形態の蛍光撮像方法は、撮像位置配置ステップＳ１１と、移動ステップＳ１２と、注液ステップＳ１３と、照準ステップＳ１４と、撮像ステップＳ１５と、繰り返し制御ステップＳ１６を備えている。
撮像位置配置ステップＳ１１では、第１実施形態の蛍光撮像方法における撮像位置配置ステップＳ１と同様に、蛍光観察体を収納したウェルを複数有する容器における所定のウェルを蛍光撮像装置の撮像位置に配置する。
移動ステップＳ１２では、液浸対物レンズと所定のウェルとが離れるように、液浸対物レンズと所定のウェルとの相対的位置を変位させる。
注液ステップＳ１３では、第１実施形態の蛍光撮像方法における注液ステップＳ２と同様に、蛍光撮像装置内の液浸対物レンズの先端部と蛍光観察体を収納した所定のウェルとの間に所定量の液体を注液して充填状態にする。
照準ステップＳ１４では、液浸対物レンズが所定のウェル内の蛍光観察体に照準するように、液浸対物レンズと所定のウェルとの相対的位置を変位させる。
撮像ステップＳ１５では、第１実施形態の蛍光撮像方法における撮像ステップＳ３と同様に、液浸対物レンズの先端部との間に液体が充填されている所定のウェル内の蛍光観察体を撮像する。
繰り返し制御ステップＳ１６では、所定の時間的間隔をもって、１回の移動ステップＳ１２と１回の移動ステップＳ１２の後に行う１回の注液ステップＳ１３と１回の注液ステップＳ１３の後に行う１回の照準ステップＳ１４と１回の照準ステップＳ１４の後に行う所定回数の撮像ステップＳ１５とからなる一連の操作を繰り返す。
【００２４】
第２実施形態の蛍光撮像方法によれば、注液ステップＳ１３の前に、液浸対物レンズと所定のウェルとが離れるように、液浸対物レンズと所定のウェルとの相対的位置を変位させる移動ステップＳ１２を備え、注液ステップＳ１３と撮像ステップＳ１５の間に、液浸対物レンズが所定のウェル内の蛍光観察体に照準するように、液浸対物レンズと所定のウェルとの相対的位置を変位させる照準ステップＳ１４を備えるとともに、繰り返し制御ステップＳ１６において、１回の移動ステップＳ１２と１回の移動ステップＳ１２の後に行う１回の注液ステップＳ１３と１回の注液ステップＳ１３の後に行う１回の照準ステップＳ１４と１回の照準ステップＳ１４の後に行う所定回数の撮像ステップＳ１５とからなる一連の操作を繰り返すようにしたので、長期間の観察において観察者が液体の注液状態を監視しなくても、自動的に良好な注液状態を維持して良好な蛍光像を得ることができることに加えて、蛍光像を得るために必要なほぼ全ての操作を自動で行うことができ、観察者の操作負担を最大限に軽減することができる。
【００２５】
なお、移動ステップＳ１２において、液浸対物レンズと所定のウェルとの相対的位置を、少なくとも液浸対物レンズの光軸に対して垂直方向に、変位させるのが好ましい。
【００２６】
このようにすれば、注液手段を液浸対物レンズとは別個に移動可能にして、撮像位置から離れた位置において液浸対物レンズの上方から液浸対物レンズの先端レンズ面に注液するような構成をとることで、注液手段の先端部が液浸対物レンズや試料を載置するステージと干渉し難くすることができる。そして、観察用途に応じて液浸対物レンズを交換する場合やステージと液浸対物レンズとの相対的な位置を変位させた場合であっても、注液手段の先端部が液浸対物レンズやステージと衝突することがなく、注液手段の先端部を正確な注液位置に維持して液体を注入することができる。その結果、試料と液浸対物レンズとの間に最適な液量が注液でき、観察精度を高精度に維持することができる。
【００２７】
また、注液手段の先端部を液浸対物レンズとは別個に移動可能に構成することで、例えば、レボルバ等の対物レンズ切り替え装置に液浸対物レンズを複数配置して使用する場合であっても、切り換えたそれぞれの液浸対物レンズの先端レンズ面を同じ注液手段の先端部に位置合わせすることができる。その結果、液浸対物レンズに対応した数の注液管が不要となり、注液手段を配置するスペースが不足するようなこともない。
【００２８】
しかも、注液手段の先端部を液浸対物レンズとは別個に移動可能に構成することで、レボルバ等の対物レンズ切り替え装置から液浸対物レンズを取り外してその他の液浸対物レンズや対物レンズに交換することが容易にできる。
【００２９】
第３実施形態
図３は本発明の第３実施形態にかかる蛍光撮像方法の撮像手順を示すフローチャートである。
第３実施形態の蛍光撮像方法は、液浸対物レンズを備えた倒立型の蛍光撮像装置を用いて、蛍光観察体を一定期間撮像する蛍光撮像方法において、撮像位置配置ステップＳ２１と、注液ステップＳ２２と、撮像ステップＳ２３と、検知ステップＳ２４と、繰り返し制御ステップＳ２５を備えている。
撮像位置配置ステップＳ２１では、第１実施形態の蛍光撮像方法における撮像位置配置ステップＳ１と同様に、蛍光観察体を収納したウェルを複数有する容器における所定のウェルを蛍光撮像装置の撮像位置に配置する。
注液ステップＳ２２では、第１実施形態の蛍光撮像方法における注液ステップＳ２と同様に、蛍光撮像装置内の液浸対物レンズの先端部と蛍光観察体を収納した所定のウェルとの間に所定量の液体を注液して充填状態にする。
撮像ステップＳ２３では、第１実施形態の蛍光撮像方法における撮像ステップＳ３と同様に、液浸対物レンズの先端部との間に液体が充填されている所定のウェル内の蛍光観察体を撮像する。
検知ステップＳ２４では、注液ステップＳ２２により注液された液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間の液体の充填状態の変化を検知する。
繰り返し制御ステップＳ２５では、検知ステップＳ２４を介して液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、１回の注液ステップＳ２２と１回の注液ステップＳ２２の後に行う所定回数の撮像ステップＳ２３とからなる一連の操作を繰り返す。
【００３０】
第３実施形態の蛍光撮像方法によれば、検知ステップＳ２４において所定の時間的間隔を注液ステップＳ２２により注液された液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間の液体が蒸発して非充填状態となる状態を検知するとともに、繰り返し制御ステップＳ２５において、検知ステップＳ２４を介して液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、１回の注液ステップＳ２２と１回の注液ステップＳ２２の後に行う所定回数の撮像ステップＳ２３とからなる一連の操作を繰り返すようにしたので、長期間の観察において、観察者が液体の注液状態を監視しなくても、自動的に良好な注液状態を維持して良好な蛍光像を得ることができる。
【００３１】
第４実施形態
図４は本発明の第４実施形態にかかる蛍光撮像方法の撮像手順を示すフローチャートである。
第４実施形態の蛍光撮像方法は、撮像位置配置ステップＳ３１と、移動ステップＳ３２と、注液ステップＳ３３と、照準ステップＳ３４と、撮像ステップＳ３５と、検知ステップＳ３６と、繰り返し制御ステップＳ３７を備えている。
撮像位置配置ステップＳ３１では、第１実施形態の蛍光撮像方法における撮像位置配置ステップＳ１と同様に、蛍光観察体を収納したウェルを複数有する容器における所定のウェルを蛍光撮像装置の撮像位置に配置する。
移動ステップＳ３２では、第２実施形態の蛍光撮像方法における移動ステップＳ１２と同様に、液浸対物レンズと所定のウェルとが離れるように、液浸対物レンズと所定のウェルとの相対的位置を変位させる。
注液ステップＳ３３では、第１実施形態の蛍光撮像方法における注液ステップＳ２と同様に、蛍光撮像装置内の液浸対物レンズの先端部と蛍光観察体を収納した所定のウェルとの間に所定量の液体を注液して充填状態にする。
照準ステップＳ３４では、第２実施形態の蛍光撮像方法における照準ステップＳ１４と同様に、液浸対物レンズが所定のウェル内の蛍光観察体に照準するように、液浸対物レンズと所定のウェルとの相対的位置を変位させる。
撮像ステップＳ３５では、第１実施形態の蛍光撮像方法における撮像ステップＳ３と同様に、液浸対物レンズの先端部との間に液体が充填されている所定のウェル内の蛍光観察体を撮像する。
検知ステップＳ３６では、第３実施形態の蛍光撮像方法における検知ステップＳ２４と同様に、注液ステップＳ３３により注液された液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間の液体の充填状態の変化を検知する。
繰り返し制御ステップＳ３７では、検知ステップＳ３６を介して液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、１回の移動ステップＳ３２と１回の移動ステップＳ３２の後に行う１回の注液ステップＳ３３と１回の注液ステップＳ３３の後に行う１回の照準ステップＳ３４と１回の照準ステップＳ３４の後に行う所定回数の撮像ステップＳ３５とからなる一連の操作を繰り返す。
【００３２】
第４実施形態の蛍光撮像方法によれば、注液ステップＳ３３の前に、液浸対物レンズと所定のウェルとが離れるように、液浸対物レンズと所定のウェルとの相対的位置を変位させる移動ステップＳ３２を備え、注液ステップＳ３３と撮像ステップＳ３５の間に、液浸対物レンズが所定のウェル内の蛍光観察体に照準するように、液浸対物レンズと所定のウェルとの相対的位置を変位させる照準ステップＳ３４を備えるとともに、繰り返し制御ステップＳ３７において、検知ステップＳ３６を介して液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、１回の移動ステップＳ３２と１回の移動ステップＳ３２の後に行う１回の注液ステップＳ３３と１回の注液ステップＳ３３の後に行う１回の照準ステップＳ３４と１回の照準ステップＳ３４の後に行う所定回数の撮像ステップＳ３５とからなる一連の操作を繰り返すようにしたので、長期間の観察において観察者が液体の注液状態を監視しなくても、自動的に良好な注液状態を維持して良好な蛍光像を得ることができることに加えて、蛍光像を得るために必要なほぼ全ての操作を自動で行うことができ、観察者の操作負担を最大限に軽減することができる。
【００３３】
なお、第４実施形態の蛍光撮像方法においても、第３実施形態の蛍光撮像方法と同様に、移動ステップＳ３３において、液浸対物レンズと所定のウェルとの相対的位置を、少なくとも液浸対物レンズの光軸に対して垂直方向に、変位させるのが好ましい。
【００３４】
このようにすれば、第３実施形態の蛍光撮像方法と同様に、注液手段を液浸対物レンズとは別個に移動可能にして、撮像位置から離れた位置において液浸対物レンズの上方から液浸対物レンズの先端レンズ面に注液するような構成をとることで、注液手段の先端部が液浸対物レンズや試料を載置するステージと干渉し難くすることができる。そして、観察用途に応じて液浸対物レンズを交換する場合やステージと液浸対物レンズとの相対的な位置を変位させた場合であっても、注液手段の先端部が液浸対物レンズやステージと衝突することがなく、注液手段の先端部を正確な注液位置に維持して液体を注入することができる。その結果、試料と液浸対物レンズとの間に最適な液量が注液でき、観察精度を高精度に維持することができる。
【００３５】
また、注液手段の先端部を液浸対物レンズとは別個に移動可能に構成することで、例えば、レボルバ等の対物レンズ切り替え装置に液浸対物レンズを複数配置して使用する場合であっても、切り換えたそれぞれの液浸対物レンズの先端レンズ面を同じ注液手段の先端部に位置合わせすることができる。その結果、液浸対物レンズに対応した数の注液管が不要となり、注液手段を配置するスペースが不足するようなこともない。
【００３６】
しかも、注液手段の先端部を液浸対物レンズとは別個に移動可能に構成することで、レボルバ等の対物レンズ切り替え装置から液浸対物レンズを取り外してその他の液浸対物レンズや対物レンズに交換することが容易にできる。
【００３７】
第５実施形態
図５は本発明の第５実施形態にかかる蛍光撮像装置の要部の構成を示すブロック図である。
第５実施形態の蛍光撮像装置は、蛍光観察体を一定期間観察する、液浸対物レンズ（図示省略）を備えた倒立型の蛍光顕微鏡として構成されており、注液手段１と、撮像手段２と、繰り返し制御手段３を有している。
注液手段１は、液浸対物レンズの先端部と蛍光観察体（図示省略）を収納したウェルを複数有する容器における所定のウェルとの間に所定量の液体を注液するように構成されている。
撮像手段２は、液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間に液体を充填した状態で所定のウェル内の蛍光観察体を撮像するように構成されている。
繰り返し制御手段３は、所定の時間的間隔をもって、注液手段１による液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間の液体の注液を１回行いその後に撮像手段２による蛍光観察体の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、注液手段１及び撮像手段２を制御するように構成されている。
【００３８】
第５実施形態の蛍光撮像装置によれば、図１にフローチャートで示した第１実施形態の蛍光撮像方法を実施することができ、第１実施形態の蛍光撮像方法と同様の効果が得られる。
【００３９】
第６実施形態
図６は本発明の第６実施形態にかかる蛍光撮像装置の要部の構成を示すブロック図である。
第６実施形態の蛍光撮像装置は、蛍光観察体を一定期間観察する、液浸対物レンズ（図示省略）を備えた倒立型の蛍光顕微鏡として構成されており、移動手段１’と、注液手段１と、照準手段２’と、撮像手段２と、繰り返し制御手段３を有している。
注液手段１と撮像手段２は、夫々第５実施形態の蛍光撮像装置における注液手段１及び撮像手段２と同様に構成されている。
移動手段１’は、液浸対物レンズと蛍光観察体（図示省略）を収納した所定のウェルとが離れるように、液浸対物レンズと所定のウェルとの相対的位置を変位させるように構成されている。
照準手段２’は、液浸対物レンズが所定のウェル内の蛍光観察体に照準するように、液浸対物レンズと所定のウェルとの相対的位置を変位させるように構成されている。
繰り返し制御手段３は、所定の時間的間隔をもって、移動手段１’による液浸対物レンズと所定のウェルとの相対的位置の変位を１回行い次いで注液手段１による液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間の液体の注液を１回行い次いで照準手段２’による液浸対物レンズの所定のウェル内の蛍光観察体への照準を１回行いその後に撮像手段２による蛍光観察体の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、移動手段１’、注液手段１、照準手段２’及び撮像手段２を制御するように構成されている。
【００４０】
第６実施形態の蛍光撮像装置によれば、図２にフローチャートで示した第２実施形態の蛍光撮像方法を実施することができ、第２実施形態の蛍光撮像方法と同様の効果が得られる。
【００４１】
第７実施形態
図７は本発明の第７実施形態にかかる蛍光撮像装置の要部の構成を示すブロック図である。
第７実施形態の蛍光撮像装置は、蛍光観察体を一定期間観察する、液浸対物レンズ（図示省略）を備えた倒立型の蛍光顕微鏡として構成されており、注液手段１と、撮像手段２と、検知手段４と、繰り返し制御手段３を有している。
注液手段１と撮像手段２は、夫々第５実施形態の蛍光撮像装置における注液手段１及び撮像手段２と同様に構成されている。
検知手段４は、液浸対物レンズの先端部と蛍光観察体（図示省略）を収納した所定のウェルとの間の液体の充填状態の変化を検知するように構成されている。
繰り返し制御手段３は、検知手段４を介して液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、注液手段１による液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間の液体の注液を１回行いその後に撮像手段２による蛍光観察体の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、注液手段１及び撮像手段２を制御するように構成されている。
【００４２】
第７実施形態の蛍光撮像装置によれば、図３にフローチャートで示した第３実施形態の蛍光撮像方法を実施することができ、第３実施形態の蛍光撮像方法と同様の効果が得られる。
【００４３】
第８実施形態
図８は本発明の第８実施形態にかかる蛍光撮像装置の要部の構成を示すブロック図である。
第８実施形態の蛍光撮像装置は、蛍光観察体を一定期間観察する、液浸対物レンズ（図示省略）を備えた倒立型の蛍光顕微鏡として構成されており、移動手段１’と、注液手段１と、照準手段２’と、撮像手段２と、検知手段４と、繰り返し制御手段３を有している。
注液手段１と撮像手段２は、夫々第５実施形態の蛍光撮像装置における注液手段１及び撮像手段２と同様に構成されている。
移動手段１’と照準手段２’は、夫々第６実施形態の蛍光撮像装置における移動手段１’及び照準手段２’と同様に構成されている。
検知手段３は、検知手段４を介して液浸対物レンズの先端部と蛍光観察体（図示省略）を収納した所定のウェルとの間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、移動手段１’による液浸対物レンズと所定のウェルとの相対的位置の変位を１回行い次いで注液手段１による液浸対物レンズの先端部と所定のウェルとの間の液体の注液を１回行い次いで照準手段２’による液浸対物レンズの所定のウェル内の蛍光観察体への照準を１回行いその後に撮像手段２による蛍光観察体の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、移動手段１’、注液手段１、照準手段２’及び撮像手段２を制御するように構成されている。
【００４４】
第８実施形態の蛍光撮像装置によれば、図４にフローチャートで示した第４実施形態の蛍光撮像方法を実施することができ、第４実施形態の蛍光撮像方法と同様の効果が得られる。
なお、上記各実施形態においては、蛍光観察体を収納した容器として、複数のウェルを有する容器（マルチプレート）における所定のウェルを用いて説明したが、蛍光観察体を収納して観察することができる容器であれば、例えば培養容器を用いてもよい。
【００４５】
以下、上述した各実施形態の蛍光撮像方法及び蛍光撮像装置の構成を適用した蛍光撮像装置の実施例について図面を用いて説明する。
実施例１
図９は本発明の実施例１にかかる蛍光撮像装置の全体構成を示す概念図、図１０は図９の部分拡大図、図１１は図９で示した蛍光撮像装置に用いられている試料容器の外観を示す説明図である。
【００４６】
実施例１の蛍光撮像装置は、蛍光観察体を一定期間観察する、液浸対物レンズを備えた倒立型顕微鏡として構成されている。
倒立型顕微鏡は、観察位置に被観察物を載置するステージ２１と、ステージ２１の下方に配置された液浸対物レンズ２２と、被観察物に所定の励起波長の光を照射する照明手段２３と、照明された被観察物からの所望の蛍光を撮像する撮像手段２４と、撮像手段２４で撮像された蛍光を処理する処理手段（データ処理装置）２５と、処理手段２５で処理された情報に基いて画像を形成する画像形成手段（画像形成装置）２６と、画像形成手段２６で形成された画像を表示する画像表示手段（表示装置）２７と、液浸対物レンズ２２に注液する注液手段２８と、液浸対物レンズ２２に注液された液体を排出する排出手段２９と、所定の制御を行う制御手段３０を備えている。
【００４７】
ステージ２１の観察位置には、試料容器として多数のウェル３１ａを備えたプレート３１が載置されている。夫々のウェル３１ａには、被観察物としての試料３２が入れられている。
照明手段２３は、夫々異なる励起波長を出射する照明光源２３ａ，２３ｂ及び励起フィルタ２３ｃ，２３ｄと、光路合成部材２３ｅと、照明レンズ２３ｆと、ダイクロイックミラー２３ｇと、液浸対物レンズ２２を有して構成されている。
撮像手段２４は、液浸対物レンズ２２と、ダイクロイックミラー２３ｇと、バンドパスフィルタ２４ａと、結像レンズ２４ｂと、共焦点アパーチャ２４ｃと、撮像素子２４ｄを有して構成されている。撮像素子２４ｄは、例えば、ＣＣＤなどを用いることができる。
【００４８】
対物レンズ２２の外周には、対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａからこぼれた液体を溜めるための環状溝を形成する液体受け部２２ｂが設けられている。
注液手段２８は、試料３２と液浸対物レンズ２２との間の媒質として注液対象となる液体を入れた容器２８ａと、容器２８ａに入っている液体を注液方向に送り出すポンプ２８ｂと、液体の温度を制御する温度制御装置２８ｃと、注液される液体が通る注液管２８ｄを有している。なお、注液手段２８は、温度制御装置２８ｃを有しない構成でも良い。
排出手段２９は、液浸対物レンズ２２の液体受け部２２ｂに溜められた液体を排出方向に送り出すポンプ２９ａと、排出された液体を溜める容器２９ｂと、排出される液体が通る排出管２９ｃを有している。
制御手段３０は、データ処理装置２５と、ポンプ２８ｂと、温度制御装置２８ｃと、ポンプ２９ａと接続されている。そして、データ処理装置２５に対しては撮像素子２４ｄで撮像した観察情報に対する所定処理を行うための制御信号を、ポンプ２８ｂに対しては容器２８ａに入っている液体を所定量吸い上げるための所定の制御信号を、温度制御装置２８ｃに対しては液体の温度を所定の温度に調整するための制御信号を、ポンプ２９ａに対しては液体を所定量排出するための制御信号をそれぞれ送信するように構成されている。
【００４９】
また、制御手段３０は、所定の時間的間隔をもって、注液手段２８による液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと所定のウェル３１ａとの間の液体の注液を１回行いその後に撮像手段２４による蛍光観察体としての試料３２の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、撮像手段２４及び注液手段２８を制御する機能を備えている。
なお、所定の時間的間隔としては、注液手段２８を介して注液された液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと所定のウェル３１ａとの間の液体が蒸発して非充填状態となるまでの所定時間が予め設定されている。
【００５０】
また、実施例１の蛍光撮像装置では、図１０に拡大して示すように、注液手段２８における注液部としての注液管２８ｄの先端部２８ｄ’が、液浸対物レンズ２２の液体受け部２２ｂに固定されるとともに、液浸対物レンズ２２の側方から液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａの近傍に向けて径が小さく延びたノズル状に形成されていて、ノズルの先端より先端レンズ面２２ａの側方から注液するように構成されている。
また、排出手段２９の排出管２９ｃの先端部２９ｃ’は、液浸対物レンズ２２の液体受け部２２ｂの排出口２２ｂ’に固定されていて、液浸対物レンズ２２の液体受け部２２ｂに溜まった液体が排出口２２ｂ’を経由して排出管２９ｃの先端部２９ｃ’を流れて排出されるように構成されている。
【００５１】
このように、実施例１の蛍光撮像装置は、注液手段２８、撮像手段２４及び制御手段３０が、夫々図５に示した第５実施形態の蛍光撮像装置における注液手段１、撮像手段２及び繰り返し制御手段３に相当する構成となっており、図１にフローチャートで示した第１実施形態の蛍光撮像方法と同様のステップを実施することができるようになっている。
【００５２】
なお、照明手段２３は、被観察物に所定波長の励起光を液浸対物レンズ２２を経由して照射することができれば、どのような構成でも適用可能である。
また、撮像手段１４は、液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと蛍光観察体である試料３２を収納した所定のウェル３１ａとの間に液体を充填した状態で所定のウェル３１ａ内の蛍光観察体を撮像することができれば、どのような構成でも適用可能である。
さらに、実施例１の蛍光撮像装置は、照明手段２３、撮像手段２４、処理手段２５、画像形成手段２６、画像表示手段２７を有して構成されているが、第５実施形態の蛍光撮像装置と同様の構成を備えて、図１にフローチャートで示した第１実施形態の蛍光撮像方法と同様のステップを実施することができ、且つ液浸型対物レンズ２２を備えた倒立型顕微鏡としての機能を備えていれば、どのような構成でも適用可能である。
【００５３】
このように構成された実施例１の蛍光撮像装置によれば、図１にフローチャートで示した第１実施形態の蛍光撮像方法を実施することができ、繰り返し制御ステップＳ４において、注液ステップＳ２により注液された液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと所定のウェル３１ａとの間の液体が蒸発して非充填状態となるまでの所定の時間的間隔をもって、１回の注液ステップＳ２と１回の注液ステップＳ２の後に行う所定回数の撮像ステップＳ３とからなる一連の操作を繰り返すことができるので、長期間の観察において、観察者が液体の注液状態を監視しなくても、自動的に良好な注液状態を維持して良好な蛍光像を得ることができる。
【００５４】
なお、実施例１の蛍光撮像装置の変形例として、液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと所定のウェル３１ａとの間の液体の充填状態の変化を検知する検知手段（図示省略）を設けるとともに、制御手段３０において、検知手段を介して液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと所定のウェル３１ａとの間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、注液手段２８による液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと所定のウェル３１ａとの間の液体の注液を１回行いその後に撮像手段２４による蛍光観察体としての試料３２の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、注液手段２８及び撮像手段２４を制御するように構成し、注液手段２８、撮像手段２４、検知手段（図示省略）及び制御手段３０を、夫々図７に示した第７実施形態の蛍光撮像装置における注液手段１、撮像手段２、検知手段４及び繰り返し制御手段３に相当するように構成して、図３にフローチャートで示した第３実施形態の蛍光撮像方法と同様のステップを実施することができるようにしてもよい。
なお、検知手段は、液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと所定のウェル３１ａとの間の液体の充填状態の変化を検知することができれば、どのような構成でもよい。
実施例１の変形例の蛍光撮像装置によれば、実施例１の蛍光撮像装置と同様に、長期間の観察において、観察者が液体の注液状態を監視しなくても、自動的に良好な注液状態を維持して良好な蛍光像を得ることができる。
【００５５】
実施例２
図１２は本発明の実施例２にかかる蛍光撮像装置の全体構成を示す概念図、図１３は図１２の部分拡大図である。なお、図９に示した実施例１の蛍光撮像装置と同様の構成は同じ符号を付し詳細な説明は省略する。
【００５６】
実施例２の蛍光撮像装置は、図１３に拡大して示すように、注液管２８ｄが、ステージ２１の観察位置から離れた部位の内部を通り、先端部２８ｄ’をステージ２１の下面から垂直に向いた状態で、ステージ２１に固定されており、注液管２８ｄの先端部２８ｄ’が、液浸対物レンズ２２とは別個に移動可能であるとともに、ステージ２１の観察位置から離れた位置において液浸対物レンズ２２の上方から液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａに注液することが出来るように構成されている。
【００５７】
また、実施例２の蛍光撮像装置は、制御装置３０が、位置制御手段としての機能を備えてステージ２１、液浸対物レンズ２２又は液浸対物レンズ２２を支持する支持部材（図示省略）の駆動装置と接続されており、ステージ２１と液浸対物レンズ２２のいずれか又はステージ２１と液浸対物レンズ２２の両方を、水平方向及び垂直方向に所定量移動させる制御信号を送ることによって、注液手段２８の注液位置（即ち、注液管２８ｄの先端部２８ｄ’の先端位置）と液浸対物レンズ２２（より詳しくは、先端レンズ面２２ａ）との相対的位置を自動的に位置合わせするとともに、注液手段２８により注液された液浸対物レンズ２２とステージ２１における所望の観察位置との相対的位置を自動的に位置合わせすることができるようになっている。
【００５８】
また、制御手段３０は、注液手段２８を介して注液された液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと所定のウェル３１ａとの間の液体が蒸発して非充填状態となるまでの所定の時間的間隔をもって、液浸対物レンズ２２と所定のウェル３１ａとの相対的位置の変位を１回行い次いで注液手段２８による液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと所定のウェル３１ａとの間の液体の注液を１回行い次いで液浸対物レンズ２２の所定のウェル３１ａ内の蛍光観察体としての試料３２への照準を１回行いその後に撮像手段２４による蛍光観察体の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、注液手段２８及び撮像手段２４を制御するように構成されている。
【００５９】
また、実施例２の蛍光撮像装置では、排出手段２９の排出管２９ｃが、ステージ２１の観察位置から離れた部位の内部を通り、先端部２９ｃ’をステージ２１の下面から垂直に向いた状態で、ステージ２１に固定され、排出管２９ｃの先端部２９ｃ’が、液浸対物レンズ２２とは別個に移動可能であるとともに、ステージ２１の観察位置から離れた位置において液浸対物レンズ２２の液体受け部２２ａに溜まった液体面に対して垂直に挿入可能であって、液体受け部２２ａに溜まった液体を吸い上げることが出来るように構成されている。即ち、排出手段２９は、排出管２９ｃの先端部２９ｃ’を介して液体受け部２２ａに溜まった液体を上方から吸引するように構成されている。
【００６０】
このように、実施例２の蛍光撮像装置は、制御手段３０が、図６に示した第６実施形態の蛍光撮像装置における移動手段１’と照準手段２’の機能を備えており、注液手段２８、撮像手段２４及び制御手段３０による構成が、夫々図６に示した第６実施形態の蛍光撮像装置における移動手段１’、注液手段１、照準手段２’、撮像手段２及び繰り返し制御手段３に相当する構成となっており、図２にフローチャートで示した第２実施形態の蛍光撮像方法と同様のステップを実施することができるようになっている。
【００６１】
このように構成された実施例２の蛍光撮像装置によれば、図２にフローチャートで示した第２実施形態の蛍光撮像方法を実施することができ、繰り返し制御ステップＳ１６において、注液ステップＳ１３により注液された液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと所定のウェル３１ａとの間の液体が蒸発して非充填状態となるまでの所定の時間的間隔をもって、１回の移動ステップＳ１２と１回の移動ステップＳ１２の後に行う１回の注液ステップＳ１３と１回の注液ステップＳ１３の後に行う１回の照準ステップＳ１４と１回の照準ステップＳ１４の後に行う所定回数の撮像ステップＳ１５とからなる一連の操作を繰り返すことができるので、長期間の観察において観察者が液体の注液状態を監視しなくても、自動的に良好な注液状態を維持して良好な蛍光像を得ることができることに加えて、蛍光像を得るために必要なほぼ全ての操作を自動で行うことができ、観察者の操作負担を最大限に軽減することができる。
【００６２】
また、実施例２の蛍光撮像装置によれば、液浸対物レンズ２２と所定のウェル３１ａとの相対的位置を液浸対物レンズ２２の光軸に対して垂直方向に変位でき、注液管２８ｄの先端部２８ｄ’を液浸対物レンズ２２とは別個に移動可能に構成したので、例えば、レボルバ等の対物レンズ切り替え装置に液浸対物レンズ２２を複数配置して使用する場合であっても、切り換えたそれぞれの液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａを同じ注液管２８ｄの先端部２８ｄ’に位置合わせすることができる。その結果、液浸対物レンズ２２に対応した数の注液管が不要となり、比較例１の倒立型顕微鏡のような注液管を配置するスペース不足の問題を解消することができる。
【００６３】
しかも、注液管２８ｄの先端部２８ｄ’を液浸対物レンズ２２とは別個に移動可能に構成すれば、レボルバ等の対物レンズ切り替え装置から液浸対物レンズ２２を取り外してその他の液浸対物レンズ２２や対物レンズに交換することが容易にできる。
【００６４】
その他、実施例２の蛍光撮像装置によれば、上述した効果に加えて、以下のような効果も得られる。
まず、実施例２の蛍光撮像装置によれば、制御装置３０が位置制御手段として注液手段２８の注液位置（即ち、注液管２８ｄの先端部２８ｄ’の先端位置）と液浸対物レンズ２２（より詳しくは、先端レンズ面２２ａ）との相対的位置を自動的に位置合わせするとともに、注液手段２８により注液された液浸対物レンズ２２とステージ２１における所望の観察位置との相対的位置を自動的に位置合わせすることができるようになっているので、操作者の手を煩わせることなく常に正確な注液位置及び観察位置に位置合わせをすることができ、所望の試料に対して高精度な観察を行うことができる。
【００６５】
また、実施例２の蛍光撮像装置によれば、注液管２８ｄの先端部２８ｄ’を、ステージ２１の観察位置から離れた位置において液浸対物レンズ２２の上方から液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａに注液することが出来るように構成したので、注液管２８ｄの先端部２８ｄ’が液浸対物レンズ２２やステージ２１と干渉することがない。そして、観察用途に応じて液浸対物レンズ２２を交換する場合やステージ２１と液浸対物レンズ２２との相対的な位置を変位させた場合であっても、注液管２８ｄの先端部２８ｄ’が液浸対物レンズ２２やステージ２１と衝突することがなく、注液管２８ｄの先端部２８ｄ’を正確な注液位置に維持して液体を注入することができる。その結果、試料３２と液浸対物レンズ２２との間に最適な液量が注液でき、観察精度を高精度に維持することができる。
【００６６】
また、実施例２の蛍光撮像装置によれば、排出管２９ｃの先端部２９ｃ’を、液浸対物レンズ２２とは別個に移動可能であるとともに、ステージ２１の観察位置から離れた位置において液浸対物レンズ２２の液体受け部２２ａに溜まった液体を吸い上げることができるように構成したので、注液管２８ｄの先端部２８ｄ’を液浸対物レンズ２２とは別個に移動可能にしたのと同様に、他の部材との干渉を防ぐことができ、液浸対物レンズ２２の交換等にも支障を来たさずに済む。
【００６７】
さらに、図１２に示す実施例２の蛍光撮像装置は、図９に示す実施例１の蛍光撮像装置とは異なり、ステージ２１の下側面における観察位置から離れた位置に、液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａを清掃するための清掃部材３３を備えている。また、制御手段３０が、液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａを清掃部材３３にこすりつけることができるように、液浸対物レンズ２２と清掃部材３３との相対的位置を変位可能な位置制御手段としての機能も備えて構成されている。
清掃部材３３は、例えば、不織布など、先端レンズ面２２ａに摺接したときに先端レンズ面２２ａを傷つけずに先端レンズ面２２ａに付着した汚れ等を除去することができる程度の所定の弾性を持った部材を用いて構成されている。
【００６８】
このため、実施例２の蛍光撮像装置によれば、注液手段２８や排出手段２９を備えることに加えて、さらに、液浸対物レンズと所望の観察位置との相対的な位置を自動的に変位させる機能を備えていて、観察者が液浸対物レンズを直接的に清掃することが困難な構成であっても、ステージ２１と液浸対物レンズ２２との相対的位置を変位させるときに清掃部材３３で液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａを清掃することができる。このため、長期間使用しても液浸対物レンズの表面を汚染されない状態に保つことができ、高精度な観察や測定を維持することが出来る。
【００６９】
なお、図１２に示す実施例２の倒立型顕微鏡では、注液手段２８の注液管２８ｄの先端部２８ｄ’がステージ２１に固定されており、移動する場合には、ステージ２１と一体に移動するように構成されているが、液浸対物レンズ２２とは別個に移動可能であって、制御手段３０を介して、注液手段２８の注液位置と液浸対物レンズ２２との相対的位置を自動的に位置合わせするとともに、注液手段２８により注液された液浸対物レンズ２２とステージ２１における所望の観察位置との相対的位置を自動的に位置合わせすることが可能であれば、注液手段２８の注液管２８ｄの先端部２８ｄ’を、ステージ２１とは別体の支持部材（図示省略）に固定し、ステージ２１とは別個に移動するように構成してもよい。
【００７０】
また、実施例２の蛍光撮像装置においては、制御手段３０を介して、注液手段２８の注液位置と液浸対物レンズ２２との相対的位置を自動的に位置合わせするとともに、注液手段２８により注液された液浸対物レンズ２２とステージ２１における所望の観察位置との相対的位置を自動的に位置合わせすることが可能であれば、ステージ２１と液浸対物レンズ２２のいずれを水平方向、又は垂直方向に移動させてもよい。但し、液浸対物レンズ２２と所定のウェル３１ａとの相対的位置を、少なくとも液浸対物レンズ２２の光軸に対して垂直方向に、変位させるのが好ましい。
さらに、注液手段２８の注液管２８ｄの先端部２８ｄ’を、ステージ２１とは別体の支持部材（図示省略）に固定し、ステージ２１とは別個に移動するように構成する場合には、注液管２８ｄの先端部２８ｄ’を水平方向、又は垂直方向に移動させてもよい。
【００７１】
また、図１２に示した実施例２の蛍光撮像装置では、ステージ２１と液浸対物レンズ２２との相対的位置を変位させることによって、排出管２９ｃの先端部２９ｃ’が液浸対物レンズ２２の液体受け部２２ｂに溜まった液体面に対して垂直に挿入されるように構成されているが、排出管２９ｃの先端部２９ｃ’が液浸対物レンズ２２の液体受け部２２ｂに溜まった液体面に対して垂直に挿入される構成であれば、例えば、排出管２９ｃの先端部２９ｃ’を移動させることによって、先端部２９ｃ’の挿入位置の下方に位置する液浸対物レンズ２２の液体受け部２２ｂに対して、先端部２９ｃ’が垂直に挿入されるようにしてもよい。
【００７２】
例えば、排出管２９ｃを、長手方向に水平に延び且つ先端部２９ｃ’を曲げ、排出管２９ｃの長手方向又は排出管２９ｃの長手方向に対して直交する水平方向に回転軸を有し、その回転軸を回転させることにより、先端部２９ｃ’が液体受け部２２ｂに溜まった液体面に対して垂直に挿入される向きと、液体受け部２２ｂに溜まった液体面から外れる向きとに変位するようにしてもよい。
【００７３】
また、実施例２の蛍光撮像装置では、排出管２９ｃの先端部２９ｃ’が注液手段２８の注液管２８ｄと共にステージ２１に支持されており、注液管２８の先端部２８ｄ’の注液位置に液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａが位置するときに、排出管２９ｃの先端部２９ｃ’が液体受け部２２に溜まった液対面に対して垂直に挿入可能な位置に位置するように構成されている。
このようにすれば、液浸対物レンズ２２への注液と液浸対物レンズ２２からこぼれた液体の排出とを同時に行うことができ、作動効率が良い。
なお、注液管２８の先端部２８ｄ’の注液位置の位置合わせと排出管２９ｂの先端部２９ｂ’の挿入位置の位置合わせを別個に行うように構成してもよい。
【００７４】
また、図１２に示した実施例２の蛍光撮像装置では、清掃部材３３を、ステージ２１の下側面に設けたが、清掃部材３３を、ステージ２１とは別個に注液手段２８を支持する支持部材（図示省略）の下側面に設けてもよい。あるいは、清掃部材３３を、ステージ２１とは別個に吸引手段２９を支持する支持部材（図示省略）の下側面に設けてもよい。
【００７５】
また、図１２に示した実施例２の蛍光撮像装置では、単体の液浸対物レンズ２２を取り付けた構成となっているが、複数の液浸対物レンズ２２を切り換え可能なレボルバを有する構成であってもよい。
また、図１２に示した実施例２の蛍光撮像装置において、液浸対物レンズ２２は交換可能でも、支持部材（図示省略）に交換不能に固定された構成のいずれでもよい。交換不能な液浸対物レンズを備えた倒立型顕微鏡に実施例２の構成を適用しても、上述した注水手段２８や排出手段２９との干渉を防いで高精度な観察を行うことができるという効果が得られる。
【００７６】
なお、実施例２の蛍光撮像装置の変形例として、液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと所定のウェル３１ａとの間の液体の充填状態の変化を検知する検知手段（図示省略）を設けるとともに、制御手段３０において、検知手段を介して液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと所定のウェル３１ａとの間の液体が蒸発して非充填状態となったことを検知したときに、液浸対物レンズ２２と所定のウェル３１ａとの相対的位置の変位を１回行い次いで注液手段２８による液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと所定のウェル３１ａとの間の液体の注液を１回行い次いで液浸対物レンズ２２の所定のウェル３１ａ内の蛍光観察体としての試料３２への照準を１回行いその後に撮像手段２４による蛍光観察体の撮像を所定回数行ってなる一連の操作を繰り返すように、注液手段２８及び撮像手段２４を制御するように構成し、制御手段３０が図８に示した第８実施形態の蛍光撮像装置における移動手段１’と照準手段２’の機能を備えるようにし、注液手段２８、撮像手段２４、検知手段（図示省略）及び制御手段３０を、夫々図８に示した第８実施形態の蛍光撮像装置における注液手段１、撮像手段２、検知手段４及び繰り返し制御手段３に相当するように構成して、図４にフローチャートで示した第４実施形態の蛍光撮像方法と同様のステップを実施することができるようにしてもよい。
なお、検知手段は、液浸対物レンズ２２の先端レンズ面２２ａと所定のウェル３１ａとの間の液体の充填状態の変化を検知することができれば、どのような構成でもよい。
実施例２の変形例の蛍光撮像装置によれば、実施例２の蛍光撮像装置と同様に、長期間の観察において、観察者が液体の注液状態を監視しなくても、自動的に良好な注液状態を維持して良好な蛍光像を得ることができる。
【００７７】
以上説明したように、本発明の蛍光撮像方法及び蛍光撮像装置は、特許請求の範囲に記載された特徴のほかに下記に示すような特徴も備えている。
【００７８】
（１）蛍光撮像装置により、蛍光観察体を一定期間撮像する蛍光撮像方法において、前記蛍光観察体を収納した容器を前記蛍光撮像装置にセットするセットステップと、前記蛍光撮像装置内の液浸対物レンズの先端部と前記容器との間に液体を満たした状態で前記容器内の蛍光観察体を撮像手段が撮像する撮像ステップと、所定の時間が経過した後、制御手段の指令を受けて、注液手段が前記液浸対物レンズの先端部と容器との間に液体を満たす注液ステップと、前記制御手段が前記撮像手段及び前記注液手段を制御し、前記撮像ステップと前記注液ステップとを交互に繰り返す繰り返しステップとを有することを特徴とする蛍光撮像方法。
【００７９】
（２）前記所定の時間は、前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体が蒸発する状態に応じて予め設定されていることを特徴とする上記（１）に記載の蛍光撮像方法。
【００８０】
（３）前記注液ステップの前に、前記制御手段が前記液浸対物レンズと前記容器との距離を大きくするように相対的に移動させる移動ステップと、前記注液ステップの後に、前記制御手段が前記液浸対物レンズを前記蛍光観察体に照準するように相対的に移動させる照準ステップとを有することを特徴とする上記（１）に記載の蛍光撮像方法。
【００８１】
（４）前記移動ステップの移動は前記液浸対物レンズの光軸方向に垂直方向に移動することを特徴とする上記（２）に記載の蛍光撮像方法。
【００８２】
（５）蛍光撮像装置により、蛍光観察体を一定期間撮像する蛍光撮像方法において、前記蛍光観察体を収納した容器を前記蛍光撮像装置にセットするセットステップと、前記蛍光撮像装置内の液浸対物レンズの先端部と前記容器との間に液体を満たした状態で前記容器内の蛍光観察体を撮像手段が撮像する撮像ステップと、前記液浸対物レンズと前記容器との間の液体の状態を検知手段が検知する検知ステップと、前記検知手段からの検知信号を受けて制御手段から出される指令により、注液手段が前記液浸対物レンズの先端部と容器との間に液体を注液する注液ステップと、前記制御手段が前記検知手段からの検知信号を受けて前記撮像手段及び前記注液手段を制御し、前記撮像ステップと前記注液ステップとを交互に繰り返す繰り返しステップとを有することを特徴とする蛍光撮像方法。
【００８３】
（６）前記注液ステップの前に、前記制御手段が前記液浸対物レンズと前記容器との距離を大きくするように相対的に移動させる移動ステップと、前記注液ステップの後に、前記制御手段が前記液浸対物レンズを前記蛍光観察体に照準するように相対的に移動させる照準ステップとを有することを特徴とする上記（５）に記載の蛍光撮像方法。
【００８４】
（７）前記移動ステップの移動は前記液浸対物レンズの光軸方向に垂直方向に移動することを特徴とする上記（６）に記載の蛍光撮像方法。
【００８５】
（８）蛍光観察体を一定期間撮像する蛍光撮像装置において、液浸対物レンズの先端部と前記蛍光観察体を収容した容器との間に液体を満たした状態で前記容器内の蛍光観察体を撮像する撮像手段と、前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間に液体を注液する注液手段と、所定の間隔で、前記蛍光観察体の撮像と、前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体の注液とを繰り返すように、前記撮像手段及び前記注液手段を制御する制御手段とを有することを特徴とする蛍光撮像装置。
【００８６】
（９）蛍光観察体を一定期間撮像する蛍光撮像装置において、液浸対物レンズの先端部と前記蛍光観察体を収容した容器との間に液体を満たした状態で前記容器内の蛍光観察体を撮像する撮像手段と、前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間の液体の状態を検知する検知手段と、前記液浸対物レンズの先端部と前記容器との間に液体を注液する注液手段と、前記蛍光観察体の撮像と、前記検知手段からの検知信号を受けて、前記液浸対物レンズの先端部と容器との間の液体の注液とを繰り返すように、前記撮像手段及び前記注液手段とを制御する制御手段とを有することを特徴とする蛍光撮像装置。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の液浸対物レンズを備えた落射型顕微鏡は、生体試料などの被観察物と該被観察物の下側に配置される対物レンズとの間に液体を介在させた、特に、マイクロプレートサンプルの観察や、タイムラプス観察、あるいはこれらを組合せた観察を行うことが必要とされる分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明の第１実施形態にかかる蛍光撮像方法の撮像手順を示すフローチャートである。
【図２】本発明の第２実施形態にかかる蛍光撮像方法の撮像手順を示すフローチャートである。
【図３】本発明の第３実施形態にかかる蛍光撮像方法の撮像手順を示すフローチャートである。
【図４】本発明の第４実施形態にかかる蛍光撮像方法の撮像手順を示すフローチャートである。
【図５】本発明の第５実施形態にかかる蛍光撮像装置の要部の構成を示すブロック図である。
【図６】本発明の第６実施形態にかかる蛍光撮像装置の要部の構成を示すブロック図である。
【図７】本発明の第７実施形態にかかる蛍光撮像装置の要部の構成を示すブロック図である。
【図８】本発明の第８実施形態にかかる蛍光撮像装置の要部の構成を示すブロック図である。
【図９】本発明の実施例１にかかる蛍光撮像装置の全体構成を示す概念図である。
【図１０】図９の部分拡大図である。
【図１１】図９で示した蛍光撮像装置に用いられている試料容器の外観を示す説明図である。
【図１２】本発明の実施例２にかかる蛍光撮像装置の全体構成を示す概念図である。
【図１３】図１２の部分拡大図である。
【図１４】特許文献１に記載されている液浸対物レンズに自動的に注液する構成を示す説明図である。
【符号の説明】
【００８９】
１          注液手段
１’        移動手段
２          撮像手段
２’        照準手段
３          繰り返し制御手段
４          検知手段
２１        ステージ
２１ａ      下端部
２１ａ’    開口
２２        液浸対物レンズ
２２ａ      先端レンズ面
２２ｂ      液体受け部
２２ｂ’    排出口
２３        照明手段
２３ａ，２３ｂ  照明光源
２３ｃ，２３ｃ  励起フィルタ
２３ｅ      光路合成部材
２３ｆ      照明レンズ
２３ｇ      ダイクロイックミラー
２４        観察手段
２４ａ      バンドパスフィルタ
２４ｂ      結像レンズ
２４ｃ      共焦点アパーチャ
２４ｄ      受光素子
２５        処理手段（データ処理装置）
２６        画像形成手段（画像形成装置）
２７        画像表示手段（画像表示装置）
２８        注液手段
２８ａ      容器
２８ｂ      ポンプ
２８ｃ      温度制御装置
２８ｄ      注液管
２８ｄ’    注液管の先端部
２９        排出手段
２９ａ      ポンプ
２９ｂ      容器
２９ｃ      排出管
２９ｃ’    排出管の先端部
３０        制御手段
３１        プレート
３１ａ      ウェル
３２        試料
３３        清掃部材
【図１】
2008157984.tif 000003
【図２】
2008157984.tif 000004
【図３】
2008157984.tif 000005
【図４】
2008157984.tif 000006
【図５】
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【図６】
2008157984.tif 000008
【図７】
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【図８】
2008157984.tif 000010
【図９】
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【図１０】
2008157984.tif 000012
【図１１】
2008157984.tif 000013
【図１２】
2008157984.tif 000014
【図１３】
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【図１４】
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