(57)【要約】【課題】細胞保持チップをプレートの孔に強固に固定することを目的とする。【解決手段】この目的を達成するため本発明は、上面から下面までを貫通する孔１４を有するプレート１２と、孔１４にはめ込まれた細胞保持チップ１５と、この細胞保持チップ１５の上方に設けられた第一電極槽１６と、細胞保持チップ１５の下方に設けられた第二電極槽１７とを備え、細胞保持チップ１５は、第一電極槽１６と第二電極槽１７とを繋ぐ導通孔２１を備え、細胞保持チップ１５の外側面、またはプレート１２に設けられた孔１４の内壁面の少なくともいずれか一方には、凹凸が形成されているものとした。  これにより本発明は、細胞保持チップ１５とプレート１２との接触抵抗を増大させることができ、強固に固定できる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
上面から下面までを貫通する孔を有するプレートと、
前記孔にはめ込まれた細胞保持チップと、
この細胞保持チップの上方に設けられた第一電極槽と、
前記細胞保持チップの下方に設けられた第二電極槽とを備え、
前記細胞保持チップは、
前記第一電極槽と前記第二電極槽とを繋ぐ導通孔を備え、
前記細胞保持チップの側面、または前記プレートに設けられた前記孔の内壁面の少なくとも一方には、
凹凸が形成されている細胞電気生理センサ。
【請求項２】
前記凹凸は、
前記細胞保持チップの底面と平行方向に層状に形成されている請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項３】
前記凹凸は、
前記細胞保持チップの側壁の外周に沿って環状に形成されている請求項１または２に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項４】
前記細胞保持チップは、
シリコン、またはガラスの少なくともいずれか一つからなり、
前記プレートは、
樹脂、またはゴムの少なくともいずれか一つからなる請求項１から３のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ。
【請求項５】
前記プレートの前記孔と前記細胞保持チップの側壁とは、
円柱形である請求項１から４のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ。
【請求項６】
前記プレートの前記孔と前記細胞保持チップの側壁とは、
下方に向かって先細くなる円柱台形である請求項１から４のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ。
【請求項７】
前記プレートの前記孔は、
この孔の内部から前記プレートの表面に向けて外方に広がるテーパ構造の開口部を有する請求項１から６のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ。
【請求項８】
前記細胞保持チップの側面には、
正に帯電した絶縁層が形成されている請求項１から７のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ。
【請求項９】
前記絶縁層は、
シリコン酸化物またはシリコン窒化物のいずれか一方で形成された請求項８に記載の細胞電気整理センサの製造方法。
【請求項１０】
細胞保持チップの側面をドライエッチングして凹凸を形成し、
またプレートの上面から下面に向けて、内壁に凹凸を有する孔を形成し、
次に前記細胞保持チップと前記プレートとを正負逆に帯電させ、
前記孔に細胞保持チップを仮設置した後固定する細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項１１】
プレートの上面から下面に向けて、内壁に凹凸を有する孔を形成し、
またこの孔にはめ込む細胞保持チップの側面に絶縁層を形成し、
次にこの絶縁層と前記プレートとを正負逆に帯電させ、
前記孔に細胞保持チップを仮設置した後固定する細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項１２】
前記細胞保持チップの側面に凹凸を形成する場合、
この凹凸は、
ＣＦ４、またはＳＦ６、またはＮＦ３、またはＸｅＦ２の少なくともいずれか一つからなる促進ガスと、
ＣＨＦ３、またはＣ４Ｆ８の少なくとも一方からなるエッチングを抑制するガスとを交互に用いたドライエッチング加工で形成した請求項９から１１のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の薬理反応など、細胞の物理化学的刺激に対する電気生理現象を測定する細胞電気生理センサとその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
図１４に示す細胞電気生理センサ１は、導通孔２を有する細胞保持チップ３と、この細胞保持チップ３の上方に設けた槽４と、この槽４の内部に配置した第一電極５と、導通孔２の内部に設けた第二電極６とを備えている。
【０００３】
そしてこの細胞電気生理センサ１は、槽４に被験体細胞７を包含する電解液８ａを注入し、導通孔２の上方から加圧、あるいは下方から減圧することで電解液８ａを吸引し、被験体細胞７を細胞保持チップ３に捕捉することができる。そして例えばこの被験体細胞７の上から薬剤を投与し、槽４の電解液８ａと導通孔下方の電解液８ｂとの電位差を第一電極５および第二電極６とで測定し、検出装置（図示せず）を用いて比較・分析することで被験体細胞７の薬理反応を判断することができる。
【０００４】
なお、この出願の発明に関する先行技術文献情報としては、特許文献１および２などが知られている。
【特許文献１】特表２００２−５１８６７８号公報
【特許文献２】特表２００３−５２７５８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述の細胞保持チップ３を、プレート（図示せず）に設けた孔に実装し接着剤などで固定すれば、平面型プローブとして用いることが出来る。しかしこの固定の強度が弱いと、細胞保持チップ３がプレートの孔から落下するという問題があった。
【０００６】
また、特に接着剤が硬化するまでの間は、細胞保持チップ３が孔からすべり落ちやすかった。
【０００７】
そこで本発明は、細胞保持チップをプレートの孔に強固に固定することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的を達成するため本発明は、細胞保持チップの外側面またはプレートの前記孔の内壁面の少なくともいずれか一方に、凹凸を形成するものである。
【発明の効果】
【０００９】
これにより本発明の細胞電気生理センサは、細胞保持チップをプレートの孔に強固に固定することができる。
【００１０】
それは、細胞保持チップの外側面またはプレートの孔の内壁に形成した凹凸によって、細胞保持チップとプレートとの接触抵抗が増大するためである。これにより、細胞保持チップを、プレートの孔に強固に固定できるのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態における細胞電気生理センサ９の構造について説明する。
【００１２】
図１は本実施の形態１における細胞電気生理センサ９の全体の断面図である。この細胞電気生理センサ９は、導入口１０を有するウエル１１と、プレート１２と、流路基板１３との三層構造からなる。
【００１３】
そしてこの細胞電気生理センサ９の要部Ｘを拡大した図２に示すように、プレート１２には上面から下面までを貫通する孔１４が複数個形成されており、この孔１４には細胞保持チップ１５が実装されている。なお、本実施の形態では、孔１４は円柱形状とした。
【００１４】
また、この細胞保持チップ１５の上方には第一電極槽１６が、下方には第二電極槽１７が配置されている。ここで、第一電極槽１６とは、電解液（図５の１８Ａ）を入れる槽であり、この電解液１８Ａを介して第一電極１９と電気的に接続されるものを言う。同様に第二電極槽１７とは、電解液（図５の１８Ｂ）を入れる槽であり、電解液１８Ｂを介して第二電極（図１の２０）と電気的に接続されるものを言う。
【００１５】
そしてこの細胞保持チップ１５は、底面板１５Ａと、この底面板１５Ａ上の外周に枠状に形成された側壁部１５Ｂとからなり、底面板１５Ａには第一電極槽１６と第二電極槽１７とを繋ぐ導通孔２１を備えている。この導通孔２１の直径は、導通孔２１開口部と被験体細胞２２との密着性を高めるために、５μｍ以下が望ましい。なお、図３の細胞電気生理センサ９の上面図に示すように、本実施の形態では、底面板１５Ａは円形であり、側壁部１５Ｂは円筒形状である。
【００１６】
また、図２に示すように、この細胞電気生理センサ９は、ウエル１１に形成された導入口１０と、プレート１２に形成された孔１４と、細胞保持チップ１５に形成された導通孔２１とがそれぞれ連結するように配置されている。
【００１７】
そして細胞保持チップ１５の側壁部１５Ｂの側面には第一凹凸２６が形成され、孔１４の内壁には第二凹凸２７が形成されている。なお、図４の細胞保持チップ１５の斜視図に示すように、この第一凹凸２６は、側壁部１５Ｂの側面の外周形状に沿って、環状の凹部２６Ａと凸部２６Ｂとから形成されている。
【００１８】
本実施の形態では、プレート１２の材料として熱可塑性樹脂である環状オレフィンコポリマーを用い、細胞保持チップ１５の材料としてはプレート１２より帯電列が上位の（正に帯電し易い）シリコンを用いた。この時、プレート１２と細胞保持チップ１５の帯電極性は出来るだけ乖離している方が好ましい。この理由については後述する。また、プレート１２に熱可塑性樹脂を用いるのは、ウエル１１や流路基板１３との接合を、熱溶着で行うことが出来、接着剤を用いる場合と比較し、接着強度が増すためである。また比較的安価で、かつ絶縁性も確保できるためである。そして細胞保持チップ１５としてシリコンを用いたのは、微細加工に適しているためである。
【００１９】
なお、ウエル１１、プレート１２、流路基板１３の材料としては、特に上述の環状オレフィンコポリマーが好ましい。これは透明性、アルカリ・酸などの無機系薬剤に対する耐性が高く、本発明の製造工程もしくは使用環境に適しているためである。その他の材料としては、環状オレフィンポリマー、線状オレフィンポリマー、またはポリエチレン（ＰＥ）などが熱溶着の加工性がよいため好ましい。さらにはポリカーボネート（ＰＣ）、種々のオレフィンポリマー、ポリメタクリル酸メチルアセテート（ＰＭＭＡ）などを用いてもよい。
【００２０】
次に、本実施の形態の細胞電気生理センサ９を用いて、細胞の電気生理活動を測定する方法について説明する。
【００２１】
まず、図５に示すように、第一電極槽１６に細胞外液である電解液１８Ａを充填し、第二電極槽１７内に細胞内液である電解液１８Ｂを充填する。
【００２２】
ここで被験体細胞として哺乳類筋細胞を用いる場合、代表的な電解液１８Ｂとしては、Ｋ+イオンを１５５ｍＭ、Ｎａ+イオンを１２ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンを４．２ｍＭ程度添加したものが挙げられ、電解液１８Ａとしては、Ｋ+イオンを４ｍＭ程度、Ｎａ+イオンを１４５ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンを１２３ｍＭ程度添加したものが挙げられる。
【００２３】
この状態では、第一電極１９と第二電極（図１の２０）との間で、１００ｋΩ〜１０ＭΩ程度の導通抵抗値を観測することができる。これは電解液１８Ａと電解液１８Ｂとが導通孔２１を介してつながっており、第一電極１９と第二電極２０との間で電気回路が形成されるためである。
【００２４】
次に図６に示すように、第一電極槽１６に被験体細胞２２を投入し、第一電極槽１６の上方から加圧するか、あるいは第二電極槽１７側から減圧することによって、被験体細胞２２を導通孔２１の開口部に吸引する。これにより第一電極槽１６と第二電極槽１７との間の電気接続がほぼ断絶された、抵抗の非常に高い状態となる。この状態では、被験体細胞２２の電気生理活動によって細胞内外の電位が変化した場合、わずかな電位差あるいは電流であっても高精度に測定することができる。
【００２５】
以下に、本実施の形態における細胞電気生理センサ９の製造方法を説明する。はじめに、図７を用いて、細胞保持チップ１５の製造方法について詳述する。
【００２６】
まず、図７（ａ）に示すように、シリコンからなる基板２３の下面にレジストマスク２４Ａを配置し、基板２３の上面にはレジストマスク２４Ｂを配置する。ここで、レジストマスク２４Ａには、導通孔２１に相当する部分に、導通孔２１の開口部と略同形状のエッチングホール３０と、また個片化用の溝（図７（ｂ）に示す２５）を設けるためのエッチングホール２９とを形成しておく。そしてレジストマスク２４Ｂには側壁部１５Ｂに相当する部分以外の面に、エッチングホール３１を形成しておく。
【００２７】
次に、図７（ｂ）に示すように、基板２３の下面を後述のドライエッチングによって、導通孔２１を形成する。また、導通孔２１と同時に個片化用の溝２５を形成する。
【００２８】
そして、図７（ｃ）と（ｄ）に示すように、基板２３の上面を、前述の導通孔２１および溝２５と繋がるまでドライエッチングしていく。
【００２９】
その後図７（ｅ）に示すように、レジストマスク２４Ａ、２４Ｂを取り除けば、側壁部１５Ｂと底面板１５Ａとからなる細胞保持チップ１５が完成する。
【００３０】
ここで、前述のドライエッチング工程について、以下に説明する。
【００３１】
このドライエッチング工程では、エッチングを促進するガス（以下促進ガスという）とエッチングを抑制するガス（以下抑制ガスという）とを用いる。本実施の形態では、促進ガスとしてＳＦ6、抑制ガスとしてＣ4Ｆ8を用いた。
【００３２】
まず、基板２３の上方において、外部コイルの誘導結合法によりプラズマを生成させ、ここへエッチングガスとしてＳＦ6を導入すると、Ｆラジカルが生成される。      
【００３３】
そしてこのＦラジカルが基板２３と反応し、基板２３は化学的にエッチングされる。
【００３４】
この時、基板２３に高周波を印加すると、基板２３にはマイナスのバイアス電圧が発生する。すると、エッチングガスに含まれるプラスイオン（ＳＦ５+）が基板２３に向かって垂直に衝突し、このイオン衝撃によって基板２３が物理的にエッチングされる。
【００３５】
その結果、ドライエッチングは基板２３の垂直方向（下方）に進むことになる。
【００３６】
一方、抑制ガスＣ４Ｆ８を用いる際には、基板２３に高周波を加えないでおく。そうすることによって、基板２３にはバイアス電圧は全く発生しない。
【００３７】
したがって、抑制ガスＣ４Ｆ８に含まれるＣＦ＋は、偏向を受けることなく、基板２３のドライエッチング穴の壁面に付着し、均一な膜を形成する。
【００３８】
そしてこのＣＦ＋の膜は、保護膜となってエッチングを抑制する。ここでこの保護膜は、貫通孔１４の壁面部分だけでなく底面にも形成されるが、底面に形成された保護膜は、壁面に形成された保護膜に比較して、上記イオン衝撃により容易に除去されるため、エッチングは下方に進むことになる。
【００３９】
ただし図４の細胞保持チップ１５の斜視図および図８の細胞保持チップ１５の要部拡大図（図７（ｃ）で示す要部Ｙ）のように、底面の保護膜が除去された部分の下方は、エッチングが下方向だけでなく横方向へも等方的に進行するため、細胞保持チップ１５の側面などのエッチング面には環状の凹部２６Ａと凸部２６Ｂとが層状に連なる凹凸（第一凹凸２６など）が形成される。
【００４０】
一方、図９に示すプレート１２は、まずプレスまたは真空蒸着によってプレート１２表面全体に電極を形成する。そして細胞保持チップ１５を実装する位置に、プレート１２の上面から下面までを貫通する孔１４をツイストドリルで形成する。その後前述の電極をフォトリソグラフィーによりパターニングし、さらにＡｇとＡｇＣｌとの混合物をディスペンスまたは印刷等して第一電極１９と第二電極２０とを形成する。なおドリル穴開けとパターニングの工程の順序は逆であってもよい。
【００４１】
そして、図１０に示すように、プレート１２とウエル１１とをレーザ溶着などで接合させる。
【００４２】
次に、図１１に示すように、細胞保持チップ１５を、プレート１２の下方から挿入し、孔１４にはめ込む。
【００４３】
その後、細胞保持チップ１５の底面板１５Ａの下面とプレート１２の下面との境界部分を跨ぐように接着剤２８を塗布し、細胞保持チップ１５を孔１４に固定する。接着剤２８としてはＵＶ硬化型接着剤や熱硬化型接着剤を用いるとよい。
【００４４】
以下に本実施の形態における効果を説明する。
【００４５】
本実施の形態における細胞電気生理センサ９は、細胞保持チップ１５をプレート１２の孔１４に強固に固定することができる。
【００４６】
それは、図６に示すように、細胞保持チップ１５の（側壁部１５Ｂの）外側面に形成した第一凹凸２６と、プレート１２の孔１４の内壁に形成した第二凹凸２７とによって、細胞保持チップ１５とプレート１２との接触抵抗が大きくなるためである。これによって、細胞保持チップ１５が孔１４からずり落ちるのを抑制することができる。また、接着剤２８等で固定するまでの間も、適切な位置に仮設置しておくことができ、細胞保持チップ１５の固定を容易にする効果を有する。
【００４７】
また、プレート１２には、細胞保持チップ１５より弾性率の小さい（柔らかい）樹脂を用いている為、第二凹凸２７が弾性変形して第一凹凸２６に食い込み、接触抵抗を増大させ、細胞保持チップ１５のずり落ちをさらに的確に抑制することができる。そしてこの効果は接着剤２８による固定が完了した後も続くため、固着強度を向上させることが出来る。
【００４８】
なお、この第一凹凸２６および第二凹凸２７は、重力と垂直方向になるように、底面板１５Ａに平行に形成すれば、第一凹凸２６と第二凹凸２７との接触抵抗をより増大させることができ、この結果細胞保持チップ１５のずり落ちを抑制し、固定を容易にすることができる。
【００４９】
また、上述のように、細胞保持チップ１５と孔１４との接触抵抗が増すことによって、これらの界面に発生する静電気が増大する。そしてこの静電気によって、細胞保持チップ１５を、接着剤２８等で接着されるまでの間も、プレート１２の孔１４の適切な位置に仮設置することができ、固定が容易となる。
【００５０】
更に本実施の形態では、プレート１２として負に帯電し易い樹脂を用い、細胞保持チップ１５として正に帯電し易いシリコンを用いた為、静電気の発生をより増大させることが出来る。なお、プレート１２と細胞保持チップ１５の材料は、出来るだけ各帯電列が乖離しているものを選択することで、より大きな静電気を発生させることが出来る。
【００５１】
また、本実施の形態では、図４に示すように、第一凹凸２６を細胞保持チップ１５の側壁部１５Ｂの側面の外周形状に沿った、環状の凹部２６Ａと凸部２６Ｂとで、層を成すように形成したことによって、図６に示すように、細胞保持チップ１５とプレート１２の孔１４との隙間に電解液１８Ａが入り込むのを抑制することができる。
【００５２】
すなわち、第一凹凸２６および第二凹凸２７の形状によっては、細胞保持チップ１５とプレート１２の孔１４との隙間に電解液１８Ａが入り込み、接着剤２８が劣化したり、その隙間を介して第一電極槽１６と第二電極槽１７とが電気的に接続されたりしてしまい、絶縁性が保てなくなるという問題が生じる。
【００５３】
一方、本発明では、この第一凹凸２６は環状に形成されているため、複数の凹部（図４の２６Ａ）によって形成された隙間は、これらの凹部２６Ａと隣接する凸部２６Ｂによって的確に遮断され、その結果隙間に電解液１８Ａが浸透するのを抑制することができるのである。
【００５４】
また、このような環状の第一凹凸２６の方が第二凹凸２７より弾性率が大きい（硬い）為、細胞保持チップ１５とプレート１２とが密着しても、第一凹凸２６の極度な変形は抑制され、上記効果を維持することができる。
【００５５】
また、本実施の形態における細胞保持チップ１５の底面板１５Ａは円形であり、側壁部１５Ｂは円筒形状である。これにより、孔１４に実装する工程やその後固着状態を維持する際においても、プレート１２からの応力が分散され、細胞保持チップ１５の信頼性を向上することができる。そしてこの形状にあわせてプレート１２の孔１４を円柱形に形成するため、孔１４はドリルで容易に形成することができる。
【００５６】
さらにドリルとしてスクリュードリルを用いれば、孔１４の内壁に螺旋状の研削痕が形成され、この研削痕を第二凹凸２７として利用することができ、容易な工法を実現できる。
【００５７】
（実施の形態２）
本実施の形態と実施の形態１との構造の違いは、細胞保持チップ１５の表面にシリコン酸化物からなる絶縁膜を形成した点である。また製造方法の違いは、細胞保持チップ１５をプレート１２の孔１４に実装する前処理として、意図的に電圧を印加し、細胞保持チップ１５とプレート１２とを帯電させた点である。
【００５８】
このように本実施の形態では、電圧を印加して、細胞保持チップ１５側にプラスの静電気を、樹脂側にはマイナスの静電気を帯電させてから細胞保持チップ１５を孔１４にはめ込むため、細胞保持チップ１５と孔１４とが静電気によって引き合い、仮設置された状態となる。
【００５９】
そのため細胞保持チップ１５の孔１４からの落下防止を行なうことができ、この後接着剤２８で固定する際も、容易かつ確実に行うことができる。
【００６０】
絶縁膜の材料としてシリコン酸化物を用いたのは、プラスに帯電しやすいためであり、その他シリコン窒化物などを用いてもよい。これらのシリコン酸化物やシリコン窒化物は、シリコン基板の熱酸化やＣＶＤ法などによって容易に形成することができる。またこれらの材料は、絶縁性を有する為、細胞電気生理センサ９の測定精度を向上させることが出来る。
【００６１】
その他の構造、製造方法、効果については実施の形態１と同様であるため省略する。
【００６２】
（実施の形態３）
本実施の形態と実施の形態１との違いは、図１２に示すように、プレート１２に設けられた孔１４と細胞保持チップ１５の側壁部１５Ｂとを、下方に向かって先細くなる円柱台形とした点である。
【００６３】
これにより、孔１４と細胞保持チップ１５との上方はそれぞれの下方より太いため、細胞保持チップ１５は孔１４の下方から抜け落ちることなく、安定して保持することができる。
【００６４】
なお、この構造を形成するための製造方法は、実施の形態１で述べたドライエッチング加工と略同様であり、テーパ部分はエッチング時間を増減することで形成することができる。
【００６５】
その他の構造、製造方法、効果は実施の形態１と同様である為省略する。
【００６６】
（実施の形態４）
本実施の形態と実施の形態１との違いは、図１３に示すように、孔１４の開口部３２が、孔１４の内部からプレート１２の下面に向けて外方に広がるテーパ構造となるように形成した点である。
【００６７】
すなわち、孔１４の開口部の内径が、細胞保持チップ１５の内径とほぼ同じ大きさの場合、細胞保持チップ１５を孔１４内部へとはめ込むのが困難であるが、このようにテーパ構造を有する開口部３２があれば、この開口部３２から容易に挿入することができる。
【００６８】
その他の構造、製造方法、効果については実施の形態１と同様であるため省略する。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の細胞電気生理センサは、信頼性の高い細胞電気生理センサを容易に作製することにおいて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明の細胞電気生理センサの全体を示す断面図
【図２】本発明の細胞電気生理センサの断面図（図１のＸ）
【図３】本発明の細胞電気生理センサの上面図
【図４】本発明の細胞保持チップの斜視図
【図５】本発明の細胞電気生理センサの断面図
【図６】本発明の細胞電気生理センサの断面図
【図７】本発明の細胞保持チップの製造工程図
【図８】本発明の細胞保持チップの要部拡大断面図（図７のＹ）
【図９】本発明の細胞電気生理センサの製造工程を示す断面図
【図１０】本発明の細胞電気生理センサの製造工程を示す断面図
【図１１】本発明の細胞電気生理センサの製造工程を示す断面図
【図１２】本発明の細胞電気生理センサの断面図
【図１３】本発明の細胞電気生理センサの断面図
【図１４】従来の細胞電気生理センサの断面図
【符号の説明】
【００７１】
９  細胞電気生理センサ
１０  導入口
１１  ウエル
１２  プレート
１３  流路基板
１４  孔
１５  細胞保持チップ
１５Ａ  底面板
１５Ｂ  側壁部
１６  第一電極槽
１７  第二電極槽
１８Ａ  電解液
１８Ｂ  電解液
１９  第一電極
２０  第二電極
２１  導通孔
２２  被験体細胞
２３  基板
２４Ａ  レジストマスク
２４Ｂ  レジストマスク
２５  溝
２６  第一凹凸
２６Ａ  凹部
２６Ｂ  凸部
２７  第二凹凸
２８  接着剤
２９  エッチングホール
３０  エッチングホール
３１  エッチングホール
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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