(57)【要約】【課題】  スフェロイドを簡易な培養手法で大量に製造すること。【解決手段】  抗体、レクチン、細胞接着分子等の、細胞表面に存在する物質又は細胞膜自体を認識する物質を細胞凝集剤として含むスフェロイド及びスフェロイド細胞群、及び培地中で目的の細胞と細胞凝集剤とを接触させ、一定期間細胞を培養することで、スフェロイドを製造する方法、並びにかかるスフェロイドを使用した薬効物質のスクリーニング方法、毒性評価方法、病態モデル動物の調製方法。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相に固着したスフェロイドであって、外因性の細胞凝集剤を含むことを特徴とするスフェロイド。
【請求項２】
少なくとも１０個以上の細胞からなることを特徴とする請求項１記載のスフェロイド。
【請求項３】
直径が１０μｍ以上の大きさであることを特徴とする請求項１又は２記載のスフェロイド。
【請求項４】
スフェロイドを構成する細胞が、初代肝細胞、肝細胞株細胞、初代癌細胞、癌細胞株細胞のいずれかであることを特徴とする請求項１乃至３何れか一項記載のスフェロイド。
【請求項５】
細胞凝集剤が、抗体、レクチン、細胞接着分子のいずれかを含むことを特徴とする請求項１乃至４何れか一項記載のスフェロイド。
【請求項６】
細胞凝集剤がレクチンであることを特徴とする請求項１乃至４何れか一項記載のスフェロイド。
【請求項７】
レクチンがガレクチン又はアネキシンであることを特徴とする請求項６記載のスフェロイド。
【請求項８】
請求項１乃至７何れか一項に記載されたスフェロイドを形成する細胞が全細胞数に対して３０％以上を占める、スフェロイド細胞群。
【請求項９】
細胞の培養を、外因性の細胞凝集剤存在下で行うことを特徴とするスフェロイドの製造方法。
【請求項１０】
下記（ａ）乃至（ｃ）の各工程を含むスフェロイドの製造方法。
（ａ）固相に接する培地に細胞を分散させる工程；
（ｂ）培地に細胞凝集剤を添加する工程；
（ｃ）細胞と細胞凝集剤とを培地中で接触させる工程。
【請求項１１】
細胞が、初代肝細胞、肝細胞株細胞、初代癌細胞、癌細胞株細胞から成る群から選択されるいずれかの細胞を含むことを特徴とする請求項９又は１０記載のスフェロイドの製造方法。
【請求項１２】
細胞凝集剤が、抗体、レクチン、細胞接着分子のいずれかを含むことを特徴とする請求項９乃至１１何れか一項記載のスフェロイドの製造方法。
【請求項１３】
細胞凝集剤が、レクチンであることを特徴とする請求項９乃至１１何れか一項記載のスフェロイドの製造方法。
【請求項１４】
レクチンがガレクチン又はアネキシンであることを特徴とする請求項１３記載のスフェロイドの製造方法。
【請求項１５】
請求項１乃至７何れか一項に記載のスフェロイドの、薬剤スクリーニングのための使用。
【請求項１６】
請求項１乃至７何れか一項に記載のスフェロイドの、薬剤の毒性評価のための使用。
【請求項１７】
請求項１乃至７何れか一項に記載のスフェロイドの、病態モデル動物の作成のための使用。
【請求項１８】
請求項１乃至７何れか一項に記載のスフェロイドと、細胞培養容器とを有する、スフェロイド細胞培養キット。
【請求項１９】
抗体のスフェロイド形成のための使用。
【請求項２０】
レクチンのスフェロイド形成のための使用。
【請求項２１】
細胞接着分子のスフェロイド形成のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規製造方法によって得られるスフェロイド、かかるスフェロイドの製造方法、並びにかかるスフェロイドの薬剤スクリーニング、毒性評価、病態モデル動物の製造への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、新規医薬品の開発において、細胞培養技術によって培養した細胞が、薬剤の薬理活性評価や毒性試験のシミュレーターに利用されている。
【０００３】
しかしながら、従来の細胞培養技術で培養した細胞は、細胞が二次元方向に広がった単層細胞であるため、生体内と同等の三次元組織を構築することができず、また、細胞が体内で有している特異的な機能を長時間維持することができないという問題があった。
【０００４】
そこで近年、生体内と同等の機能を有する三次元組織であるスフェロイドの培養が注目されている。例えば、底面がロート状のウェルに複数の単一細胞を播種し、底面でこの単一細胞を凝集および分裂させてスフェロイドを培養するもの（特許文献１）や、所定のポリマー混合物のキャスト液表面に水を結露させ、該結露により生じた微小水滴を蒸発させることにより得られるハニカム構造体上でスフェロイドを培養するものがある（特許文献２）。
【０００５】
このような方法により製造したスフェロイドは、あるものは培養容器の底面への接着性がないため、スフェロイドを成長させることが困難だったという問題があり、またあるものは、底面への接着性があったとしてもスフェロイドの形成効率が低く、所望の量のスフェロイドが得られないという問題があった。
【０００６】
【特許文献１】特開平６−３２７４６２号公報
【特許文献２】特開２００２−３３５９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
すなわち、従来のスフェロイドの形成方法では、効率よく大量のスフェロイドを形成することが困難だった。そのため、例えば、創薬段階での薬剤スクリーニングや安全性評価のためにスフェロイドを利用することができず、より高度な効率化が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討を行い、培地中で細胞凝集剤と培養細胞とを接触させることで、極めて効率的に大量のスフェロイドが安定して形成されることを見いだして、本発明を完成させた。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
【０００９】
１．固相に固着したスフェロイドであって、外因性の細胞凝集剤を含むことを特徴とするスフェロイド。
２．少なくとも１０個以上の細胞からなることを特徴とする１記載のスフェロイド。
３．  直径が１０μｍ以上の大きさであることを特徴とする１又は２記載のスフェロイド。
４．スフェロイドを構成する細胞が、初代肝細胞、肝細胞株細胞、初代癌細胞、癌細胞株細胞のいずれかであることを特徴とする１乃至３何れか記載のスフェロイド。
５．細胞凝集剤が、抗体、レクチン、細胞接着分子のいずれかを含むことを特徴とする１乃至４何れか記載のスフェロイド。
６．細胞凝集剤がレクチンであることを特徴とする１乃至４何れか記載のスフェロイド。
７．レクチンがガレクチン又はアネキシンであることを特徴とする６記載のスフェロイド。
８．１乃至７何れかに記載されたスフェロイドを形成する細胞が全細胞数に対して３０％以上を占める、スフェロイド細胞群。
９．細胞の培養を、外因性の細胞凝集剤存在下で行うことを特徴とするスフェロイドの製造方法。
１０．下記（ａ）乃至（ｃ）の各工程を含むスフェロイドの製造方法。
（ａ）固相に接する培地に細胞を分散させる工程；
（ｂ）培地に細胞凝集剤を添加する工程；
（ｃ）細胞と細胞凝集剤とを培地中で接触させる工程。
１１．細胞が、初代肝細胞、肝細胞株細胞、初代癌細胞、癌細胞株細胞から成る群から選択されるいずれかの細胞を含むことを特徴とする９又は１０記載のスフェロイドの製造方法。
１２．細胞凝集剤が、抗体、レクチン、細胞接着分子のいずれかを含むことを特徴とする９乃至１１何れか記載のスフェロイドの製造方法。
１３．細胞凝集剤が、レクチンであることを特徴とする９乃至１１何れか記載のスフェロイドの製造方法。
１４．レクチンがガレクチン又はアネキシンであることを特徴とする１３記載のスフェロイドの製造方法。
１５．１乃至７何れかに記載のスフェロイドの、薬剤スクリーニングのための使用。
１６．１乃至７何れかに記載のスフェロイドの、薬剤の毒性評価のための使用。
１７．１乃至７何れかに記載のスフェロイドの、病態モデル動物の作成のための使用。
１８．１乃至７何れかに記載のスフェロイドと、細胞培養容器とを有する、スフェロイド細胞培養キット。
１９．抗体のスフェロイド形成のための使用。
２０．レクチンのスフェロイド形成のための使用。
２１．細胞接着分子のスフェロイド形成のための使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、極めて高い効率で大量のスフェロイドを容易に形成することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、発明を実施するための最良の形態により、本発明を詳説する。
１．本発明スフェロイド
本発明スフェロイドは、外因性の細胞凝集剤を含み、固相に固着したスフェロイドである。
【００１２】
本明細書中において複数の細胞が略球状を形成している細胞群を「スフェロイド」といい、かかるスフェロイドを形成しなかった細胞を「平板細胞」という。
【００１３】
本発明スフェロイドにおける「外因性の細胞凝集剤」とは、スフェロイドを構成する細胞が自ら生産したものではない細胞凝集剤を意味し、具体的にはスフェロイド形成の過程において培養液中に添加した細胞凝集剤を表す。
【００１４】
本発明スフェロイドを形成する細胞は、培養液中で増殖させることができる細胞であれば特に限定はされないが、動物細胞であることが好ましく、その中でもほ乳類由来の細胞であることがより好ましい。前記ほ乳類としては、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウスなどが例示されるが、殊にヒト、イヌ、ネコ、サル、ラット、マウスなどは、スフェロイドの形成容易性の面から特に好ましい。
【００１５】
ほ乳類由来の細胞を用いる場合の、細胞が由来する組織・臓器については、組織を形成する細胞に増殖能を有する細胞が存在しているか、或いは人為的に増殖能を付加することができる組織・臓器である限りに於いて特に限定はされない。かかる組織・臓器としては、例えば、肝臓、角膜、皮膚、軟骨、大腸、小腸、膵臓、胃、筋組織、心臓、肺臓、食道、骨髄、腎臓、脾臓、精巣、卵巣、脂肪組織等の正常な組織・臓器の他、これらの細胞がガン化したもの（腫瘍化したもの）が例示される。その中でも本発明スフェロイドに用いる細胞は、特に肝臓、軟骨、皮膚、膵臓（α細胞、β細胞）、脂肪組織及び前記各組織・臓器由来の腫瘍由来の細胞であることが好ましく、特に肝臓又は腫瘍由来の細胞であることが好ましい。具体的には、初代肝細胞、肝細胞株細胞、初代癌細胞、癌細胞株細胞が好ましい細胞として例示される。
【００１６】
本発明スフェロイドにおける「細胞凝集剤」としては、細胞表面に存在する物質又は細胞膜を特異的に認識して結合し、架橋構造を形成する物質であり、且つ細胞に対する毒性が細胞の培養に於いて無視できる程度の物質である限りに於いて特に限定はされないが、例えば抗体、レクチン、リガンド、細胞接着分子等が例示される。
【００１７】
「抗体」としては複数の抗原認識部位を有するIgA、IgMなどが好ましく、当業者であれば使用する細胞とその由来に応じて適宜最適な抗体を選択して使用することが可能である。例えば、細胞表面に発現するヘパラン硫酸を認識する抗ヘパラン硫酸抗体、細胞表面タンパク質であるアシアロ糖蛋白受容体を認識する抗アシアロ糖蛋白受容体抗体などが例示される。
【００１８】
「レクチン」としては、ガレクチン、C-型レクチン、セレクチン、アネキシンやマメ科レクチン等が例示されるが、様々な細胞に於いて細胞表面に存在するガラクトースを認識するガレクチン、又は同様に様々な細胞に於いて細胞表面に存在するグリコサミノグリカンを認識するアネキシンが好ましい。ガレクチン同様にガラクトースを認識するレクチンである、麦芽凝集素（WGA）等を利用することもできる。
【００１９】
「細胞接着分子」としては、例えば細胞同士の接着を促進する分子（カドヘリンスーパーファミリー（Eカドヘリン、pカドヘリン、Nカドヘリン等）、カテニン（αカテニン、βカテニン、p120カテニン等）、インテグリンスーパーファミリー、免疫グロブリンスーパーファミリー（NCAM、L1、ICAMファミリー、ネクチン）、クローディンファミリー、デスモグレイン、ニューロリギン、ニューレキシン）や、基質と細胞との接着を促進する分子（フィブロネクチン、ラミニン）が例示されるが、前者を用いることが好ましい。
【００２０】
本発明スフェロイドに用いる凝集剤は、上記で例示したもの以外であっても、培養する細胞表面に発現することが知られているレセプターに特異的に複数個結合できる物質である限りに於いて使用することができ、例えば人工的に合成した物質（ポリエチレングリコール等の分子の両端にリガンドや抗体、細胞接着分子、レクチン、脂質等を結合したもの等）も用いることができる。更に癌細胞に対して凝集作用を示すことが知られているキモトリプシンなどの既存の物質を用いることも可能である。
【００２１】
これらの凝集剤は、目的の本発明スフェロイドを形成させる細胞により使い分けることができ、例えば細胞表面にガラクトースを有している初代肝細胞や肝細胞株細胞をスフェロイド形成に使用する場合には、ガレクチンや麦芽凝集素等を使用することができる。一方、初代癌細胞や癌細胞株細胞をスフェロイド形成に使用する場合にはキモトリプシンや抗腫瘍抗体などを用いることも可能である。更に、細胞として神経細胞を使用する場合には、NCAMなどを用いることも可能である。
【００２２】
かかる細胞凝集剤の選択は、各物質が特異的な結合性を示す物質と、細胞表面に存在しているタンパク質、糖鎖などの既存の情報から、当業者であれば容易に適宜選択して使用することが可能である。
【００２３】
本発明スフェロイドは、１０個以上の細胞により形成されていることが好ましく、２０個以上であることがより好ましく、２５個以上であることが最も好ましい。かかる複数の細胞により形成されたスフェロイドは、外部環境と内部環境が異なり、より組織の内部状況を擬似的に再現できるからである。かかる細胞数の測定は、例えば予めスフェロイド数を視覚的に計数しておいた後、スフェロイドをトリプシン処理して細胞同士を分散させ、細胞の全数を測定し、かかる細胞数とスフェロイド数とを基に、スフェロイド１つを形成する細胞数の平均値を算出するなど、様々な既知の手法により行うことができる。
【００２４】
本発明スフェロイドは、その長径が１０μｍ以上、より好ましくは２０μｍ以上である。かかるスフェロイドの長径の測定は、顕微鏡下で目視により行うことができる。
【００２５】
本発明スフェロイドは、固相に固着していることを特徴としている。本発明スフェロイドにおける「固相」とは、培養液に溶解しない材質（ポリスチレン、ポリイミド、環状オレフィン系熱可塑性樹脂、酸化アルミニウム、ガラス、石英ガラス、シリコン等）よりなる培養容器やビーズを示す。かかる固相の表面は平坦であっても良いが、好ましくは線幅が１μｍ以下、深さが１０ｎｍ以上の一次元の線、又は二次元形状（四角形、六角形等の多角形、円、その他の非円形の形状など）を有していることがより好ましい。かかる構造を固相表面に設けることで、固相に一部接着したスフェロイドが効率的に形成されるからである（培養開始時に添加した細胞の３０％以上の細胞がスフェロイドを形成する）。
【００２６】
このような本発明スフェロイドは、(1)創薬等の段階に於いて薬剤となる物質のスクリーニング、(2)物質の毒性試験や、(3)本発明スフェロイドを移植することで様々な病態モデル動物の調製に使用することができる。
【００２７】
例えば、(1)薬剤のスクリーニングに本発明スフェロイドを使用する場合には下記の方法を用いることができる。すなわち、培養容器（マルチプレートや培養皿）に固着した本発明スフェロイドに対して、スクリーニング対象となる物質を各種試験濃度で溶解した培地を添加し、一定時間継続して培養を行った後、本発明スフェロイドの形態的変化、生化学的変化、組織学的変化を既存の手法を応用して確認する。この方法により、本発明スフェロイドに対するスクリーニング対象物質の効果が優れているスクリーニング対象物質を選択することで、単層培養とは異なり、より組織に近い立体的構造を有する細胞群（スフェロイド）に対して効果が期待される物質をスクリーニングすることが可能である。
【００２８】
例えば、(2)物質の毒性試験に本発明スフェロイドを使用する場合には下記の方法を用いることができる。すなわち、培養容器（マルチプレートや培養皿）に固着した本発明スフェロイドに対して、毒性試験の対象物質を各種試験濃度で加えた培地を添加し、一定時間継続して培養を行った後、本発明スフェロイドの形態的変化、生化学的変化、組織学的変化を既存の手法を応用して確認する。この方法により、従来単層培養細胞で行っていた基礎的な毒性試験よりもより動物試験に近く信頼性の高い毒性試験が可能となり、動植物を用いた毒性試験と同様な結果を簡便な細胞培養技術を用いて得ることが可能となる。
【００２９】
例えば、(3)病態モデル動物の調製に本発明スフェロイドを使用する場合には下記の方法を用いることができる。例えば腫瘍モデルマウスを調製する場合には、モデル化に使用する腫瘍細胞から調製した本発明スフェロイドを調製する。かかる本発明スフェロイドを振とう又はごく微量のトリプシン処理などで固相から遊離させたのち、遊離したスフェロイドをマウスの腹腔内、筋肉、大静脈、肺動脈、肝動脈などに投与する。その後、動物の飼育を継続することで病態モデルマウスを従来と比して容易に調製することができる。
【００３０】
本発明スフェロイドは、それを形成する細胞が本来の性質（病理組織より得た細胞や細胞株の細胞の場合には病態の性質、正常組織から得た細胞や細胞株の細胞は正常組織の性質）を維持している細胞を多く含むため、従来の細胞を投与する方法によるモデル動物を調製する方法と比して、より高い頻度で目的の病態モデル動物を調製することができる。
【００３１】
２．本発明細胞群
本発明細胞群は、本発明スフェロイドを形成する細胞が全細胞数に対して３０％以上を占めることを特徴とする。
【００３２】
本発明細胞群は、上述の本発明スフェロイドを形成する細胞が全細胞数の３０％以上を占める。かかる細胞群は、例えば後述する本発明製造方法により、本発明スフェロイドを製造した場合の、培養系に存在する細胞群として形成されるが、更に以下の方法により調製することも可能である。
【００３３】
すなわち本発明スフェロイドを含む培養容器を用意する。かかる培養容器に対して、本発明スフェロイドを形成していない細胞（本発明スフェロイドを形成している細胞と同じ細胞であってもよく、又は異なる細胞であってもよく、更にこれらの混合した細胞であってもよい）を添加して本発明細胞群を得ることができる。このようにして得た本発明細胞群は、共培養と同様の生体内環境の再現がなされるという効果を得ることができる。このような細胞の組み合わせは当業者であれば容易に選択することができるが、例えば血管内皮細胞と線維芽細胞等の組み合わせが例示される。この場合には、血管内皮細胞をスフェロイドとしても良く、また線維芽細胞をスフェロイドとしても良い。
【００３４】
３．本発明製造方法
本発明製造方法は、細胞の培養を、外因性の細胞凝集剤存在下で行うことを特徴とする、スフェロイドの製造方法である。
【００３５】
本発明製造方法における「細胞」とは、スフェロイドを形成させる細胞であり、培養液中で増殖させることができる細胞であれば特に限定はされない。特に、動物細胞であることが好ましく、その中でもほ乳類由来の細胞であることがより好ましい。前記ほ乳類としては、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウスなどが例示されるが、殊にヒト、イヌ、ネコ、サル、ラット、マウスなどは、スフェロイドの形成容易性の面から特に好ましい。なお、当業者であれば使用する細胞に合わせて好ましい培地を適宜選択して使用することができる。
【００３６】
ほ乳類由来の細胞を用いる場合の、細胞が由来する組織・臓器については、組織を形成する細胞に増殖能を有する細胞が存在しているか、或いは人為的に増殖能を付加することができる組織・臓器である限りに於いて特に限定はされない。かかる組織・臓器としては、例えば、肝臓、角膜、皮膚、軟骨、大腸、小腸、膵臓、胃、筋組織、心臓、肺臓、食道、骨髄、腎臓、脾臓、精巣、卵巣、脂肪組織等の正常な組織・臓器の他、これらの細胞がガン化したもの（腫瘍化したもの）が例示される。その中でも本発明製造方法に用いる細胞は、特に肝臓、軟骨、皮膚、膵臓細胞（α細胞、β細胞）、脂肪組織及び前記各組織・臓器由来の腫瘍由来の細胞であることが好ましく、特に肝臓又は腫瘍由来の細胞であることが好ましい。具体的には、初代肝細胞、肝細胞株細胞、初代癌細胞、癌細胞株細胞が好ましい細胞として例示される。
【００３７】
本発明製造方法における「外因性の細胞凝集剤」とは、スフェロイドを構成する細胞が自ら生産したものではない細胞凝集剤を意味し、具体的にはスフェロイド形成の過程において培養液中に添加した細胞凝集剤を表す。
【００３８】
本発明製造方法における「細胞凝集剤」は、細胞表面に存在する物質又は細胞膜を特異的に認識して結合し、架橋構造を形成する物質であり、且つ細胞に対する毒性が細胞の培養に於いて無視できる程度の物質である限りに於いて特に限定はされないが、例えば抗体、レクチン、リガンド、細胞接着分子等が例示される。
【００３９】
「抗体」としては複数の抗原認識部位を有するIgA、IgMなどが好ましく、当業者であれば使用する細胞とその由来に応じて適宜最適な抗体を選択して使用することが可能である。例えば、細胞表面に発現するヘパラン硫酸を認識する抗ヘパラン硫酸抗体、細胞表面タンパク質であるアシアロ糖蛋白質受容体を認識する抗アシアロ糖蛋白質受容体抗体などが例示される。
【００４０】
「レクチン」としては、ガレクチン、C-型レクチン、セレクチン、アネキシンやマメ科レクチン等が例示されるが、様々な細胞に於いて細胞表面に存在するガラクトースを認識するガレクチン、又は同様に様々な細胞に於いて細胞表面に存在するグリコサミノグリカンを認識するアネキシンが好ましい。ガレクチン同様にガラクトースを認識するレクチンである、麦芽凝集素（WGA）等を利用することもできる。
【００４１】
「細胞接着分子」としては、例えば細胞同士の接着を促進する分子（カドヘリンスーパーファミリー（Eカドヘリン、pカドヘリン、Nカドヘリン等）、カテニン（αカテニン、βカテニン、p120カテニン等）、インテグリンスーパーファミリー、免疫グロブリンスーパーファミリー（NCAM、L1、ICAMファミリー、ネクチン）、クローディンファミリー、デスモグレイン、ニューロリギン、ニューレキシン）や、基質と細胞との接着を促進する分子（フィブロネクチン、ラミニン）が例示されるが、前者を用いることが好ましい。
【００４２】
本発明製造方法に用いる凝集剤は、上記で例示したもの以外であっても、培養する細胞表面に発現することが知られているレセプターに特異的に複数個結合できる物質である限りに於いて使用することができ、例えば人工的に合成した物質（ポリエチレングリコール等の分子の両端にリガンドや抗体、細胞接着分子、レクチン、脂質等を結合したもの等）も用いることができる。更に癌細胞に対して凝集作用を示すことが知られているキモトリプシンなどの既存の物質を用いることも可能である。
【００４３】
これらの凝集剤は、目的の本発明スフェロイドを形成させる細胞により使い分けることができ、例えば細胞表面にガラクトースを有している初代肝細胞や肝細胞株細胞をスフェロイド形成に使用する場合には、ガレクチンや麦芽凝集素等を使用することができる。一方、初代癌細胞や癌細胞株細胞をスフェロイド形成に使用する場合にはキモトリプシンや抗腫瘍抗体などを用いることも可能である。更に、細胞として神経細胞を使用する場合には、NCAMなどを用いることも可能である。
【００４４】
かかる細胞凝集剤の選択は、各物質が特異的な結合性を示す物質と、細胞表面に存在しているタンパク質、糖鎖などの既存の情報から、当業者であれば容易に適宜選択して使用することが可能である。
【００４５】
細胞を、細胞凝集剤との共存下で培養することで、スフェロイドの製造を行う。細胞と細胞凝集剤との共存条件は、例えば細胞を培養している途中で、培地に細胞凝集剤を添加してスフェロイドが形成されるまで培養を行う方法により形成できるほか、細胞凝集剤を含む培地に、目的の細胞を添加してスフェロイドが形成されるまで培養を行う方法により形成できる。また、細胞と細胞凝集剤を１時間以上、好ましくは３時間以上、より好ましくは１０時間以上、特に好ましくは２０時間以上接触させた後、細胞凝集剤を含まない培養液に培養液を交換して、細胞の培養を継続することでもスフェロイドを製造できる。
【００４６】
すなわち、本発明製造方法は、以下の工程を含むこととなる。
（ａ）固相に接する培地に細胞を分散させる工程
（ｂ）培地に細胞凝集剤を添加する工程
（ｃ）細胞と細胞凝集剤とを培地中で接触させる工程
以下、上記（ａ）〜（ｃ）に分けて説明する。
【００４７】
（ａ）固相に接する培地に細胞を分散させる工程
本工程における「固相」とは、形成されたスフェロイドが固着する固相であり、具体的には、培養容器、或いはビーズ等を入れた培養容器である。これらの固相は、培養液に溶解しない材質（ポリスチレン、ポリイミド、環状オレフィン系熱可塑性樹脂、酸化アルミニウム、ガラス、石英ガラス、シリコン等）よりなる。かかる固相の表面は平坦であっても良いが、好ましくは線幅が１μｍ以下、深さが１０ｎｍ以上の一次元の線、又は二次元形状（四角形、六角形等の多角形、円、その他の非円形の形状など）を有していることがより好ましい。かかる構造を固相表面に設けることで、固相に一部接着したスフェロイドが効率的に形成されるからである（培養開始時に添加した細胞の３０％以上の細胞がスフェロイドを形成する）。
【００４８】
本工程における「細胞」及び「培地」は、上述したものと同義である。
本工程における細胞を培地に分散させる方法は特に限定はされない。
【００４９】
（ｂ）培地に細胞凝集剤を添加する工程
本工程における「細胞凝集剤」は、上述したものと同義である。
【００５０】
培地への細胞凝集剤の添加の方法は、特に限定はされず、培地に対して細胞凝集剤を添加しても良く、また細胞凝集剤に対して培地を添加しても良く、また容器に対して培地と細胞凝集剤を同時に添加して行っても良い。
【００５１】
（ｃ）細胞と細胞凝集剤とを培地中で接触させる工程
スフェロイドは細胞が細胞凝集剤と接触することで形成されるため、細胞と細胞凝集剤とを培地中で接触させることが必要である。
【００５２】
細胞と細胞凝集剤との接触条件は、例えば細胞を培養している途中で、培地に細胞凝集剤を添加してスフェロイドが形成されるまで培養を行う方法（すなわち上記（ａ）の工程の後（ｂ）を行い混合する方法）により形成できるほか、細胞凝集剤を含む培地に、目的の細胞を添加してスフェロイドが形成されるまで培養を行う方法（すなわち上記（ｂ）の工程ののち、その培地に対して（ａ）の工程を行う方法）により形成でき、細胞と培地と細胞凝集剤とを一度に混合する方法（すなわち上記（ａ）の工程と（ｂ）の工程とを同時に行う方法）により形成することもできる。なお、細胞と細胞凝集剤を１時間以上、好ましくは３時間以上、より好ましくは１０時間以上、特に好ましくは２０時間以上接触させた後、細胞凝集剤を含まない培養液に培養液を交換して、細胞の培養を継続することでもスフェロイドを製造できる。
【００５３】
なお、本発明製造方法における培地中での細胞凝集剤の濃度は、適宜調整することは可能であるが、1μg/ml以上であり、10μg/ml以上であることが好ましく、特に50μg/ml以上であることが好ましく、100μg/ml以上とすることが最も好ましい。10μg/ml以上であれば、70%以上のスフェロイド形成率を達成でき、50μ/ml以上の濃度であれば、90%以上のスフェロイド形成率を達成することができるからである。なお、かかる「スフェロイド形成率」とは、培養系に存在する細胞群数（スフェロイドは１個と数え、平板細胞は１クローンから生じた一群の細胞群（コロニー）を１個として数える）に対するスフェロイド数を百分率で表示したもので、スフェロイド形成の効率性の指標となる指数である。
【００５４】
かかる濃度条件で、細胞を0.3%二酸化炭素/空気、37℃条件下で静置して培養するとスフェロイドが製造できる。なお、培養時の二酸化炭素濃度や温度条件は、通常の培養を行う条件の範囲内であれば適宜変更することが可能である。
【００５５】
４．本発明スフェロイド細胞培養キット
本発明スフェロイド細胞培養キットは、本発明スフェロイドと細胞培養容器とを含む。
【００５６】
本発明スフェロイド細胞培養キットにおける細胞培養容器とは、本発明スフェロイドが培養容器に固着している場合にはかかる培養容器、培養容器ではなくビーズなどの担体に固着している場合には担当とは別個の培養容器を意味する。
【００５７】
かかる培養容器と本発明スフェロイドとがセットになったスフェロイド細胞培養キットにより、従来は調整が困難で大量に利用することができなかったスフェロイドを、簡易な培養操作により利用可能になる。
【００５８】
本発明スフェロイド細胞培養キットは、上記の構成の他に、更にスフェロイドを形成する細胞に適した培地や生理学的分析を行うための試薬を含んでいてもよく、また更にスフェロイドを形成させるために上述した細胞凝集剤を含んでいてもよい。かかる構成とすることで、より操作の簡易なスフェロイド培養が可能となるからである。
【００５９】
なお、本発明スフェロイド細胞培養キットは、本発明スフェロイドにおいて既に説明した創薬等の段階に於いて薬剤となる物質のスクリーニング、物質の毒性試験や、本発明スフェロイドを移植することで様々な病態モデル動物の調製に使用できる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
【００６１】
細胞凝集剤によるスフェロイド形成能の向上を確認するために、麦芽凝集素を用いてHepG2細胞のスフェロイド培養を行った。
【００６２】
すなわち、HepG2細胞（RCB1648、ヒト肝癌由来の培養細胞株）を、凝集剤を下記表１の濃度となるように添加したアルファMEM培地（大日本製薬株式会社製）に100,000個／ｍｌで懸濁し、培養皿（底面に幅２５０ｎｍ、高さ３８０ｎｍで一辺１μｍのハニカムパターンが加工されている９６穴ポリスチレン製マルチウェルプレート：ＳＣＩＶＡＸ株式会社製）に播種し、２%二酸化炭素／空気、37℃条件下で１日間培養した。その後麦芽凝集素を含まない培地に交換の上、３日間培養を行った。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
その結果、対照ではスフェロイド形成率が６８％（256/379）なのに対し（図１）、試料１では７３％（270/372）（図２）、試料２で１００％（279/279）（図３）、試料３でも１００％（110/110）（図４）までスフェロイド形成率が向上していることが明らかとなった。
【００６５】
なお、底面が平坦で何ら加工していないディッシュで同様の試験を行ったところ、対照では0%、試料１では70%、試料２では85%、試料３では93%と、やはりスフェロイド形成能が向上していることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、優れたスフェロイドの形成を可能とするため、バイオテクノロジー分野で広く使用でき、特に医薬品、化粧品、食品のための新規物質の効果の評価、安全性の評価のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】細胞凝集剤を添加せずにHepG2細胞を培養して観察した写真である。
【図２】細胞凝集剤を１μｇ／ｍｌで培地に添加してHepG2細胞を培養して観察した写真である（試料１）。
【図３】細胞凝集剤を１０μｇ／ｍｌで培地に添加してHepG2細胞を培養して観察した写真である（試料２）。
【図４】細胞凝集剤を１００μｇ／ｍｌで培地に添加してHepG2細胞を培養して観察した写真である（試料３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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