(57)【要約】【課題】  これまでに同定されていないケイ素吸収に関与する遺伝子を同定し、その遺伝子の利用方法を提供する。【解決手段】  本発明は、イネおよびトウモロコシから、ケイ素またはケイ素化合物の吸収および輸送に関与する遺伝子（Ｌｓｉ１６，ＺｍＬｓｉ６，ＺｍＬｓｉ１）を同定した。同定した遺伝子が導入された形質転換体は、ケイ素吸収能力が付与されるため、複合ストレス耐性植物として利用できる。一方、同定した遺伝子を抑制した形質転換体は、ケイ素吸収能力が抑制され、やわらかくなるため、家畜飼料やバイオマス燃料の原料として利用できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、発現可能に導入することを特徴とするケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）以下の（１）または（２）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
下記の（ｅ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドを、発現可能に導入することを特徴とするケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法。
（ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）以下の（３）または（４）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（３）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項３】
下記の（ｉ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドを、トウモロコシに発現可能に導入することを特徴とするケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法。
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｌ）以下の（５）または（６）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（５）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項４】
上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、イネに発現可能に導入することを特徴とする請求項１に記載の形質転換体の生産方法。
【請求項５】
上記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドを、トウモロコシに発現可能に導入することを特徴とする請求項２に記載の形質転換体の生産方法。
【請求項６】
下記の（ｍ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制することを特徴とするケイ素吸収が抑制された形質転換体の生産方法。
（ｍ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｐ）以下の（７）または（８）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（７）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（８）配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項７】
下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制することを特徴とする飼料用イネの生産方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）以下の（１）または（２）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（２）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
下記の（ｅ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制することを特徴とするバイオマス燃料製造用トウモロコシの生産方法。
（ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）以下の（３）または（４）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（３）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項９】
トウモロコシに対し、下記の（ｉ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現抑制することを特徴とするケイ素吸収が抑制された形質転換体の生産方法。
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｌ）以下の（５）または（６）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（５）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の生育および硬さを調節するケイ素の吸収に関与する遺伝子の利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多くの植物は、ケイ素（Ｓｉ）を多量に吸収する機能を有していないのに対し、イネやコムギなどの単子葉植物は、ケイ素を多量に吸収する代表的な植物である。ケイ素は、植物の必須元素ではないものの、ケイ素の蓄積量の違いによって、植物の性質は大きく異なる。
【０００３】
例えば、ケイ素は、植物の生育に関与しており、ケイ素の蓄積量が多くなると、
（i）病害および虫害に対する抵抗性（例えば、イネのいもち病、紋枯病、および、ごま葉枯病に対する抵抗性）
（ii）耐塩性および耐乾性の向上
（iii）ミネラルストレスに対する耐性（例えば、アルミニウム、および、マンガンなどの無機物による毒性の軽減、または、植物体内でのリン酸の有効利用度の向上など）
等の性質を、植物に与える。
【０００４】
とりわけ、ケイ素の蓄積量の増加によって、病害や虫害に対する抵抗性が強化されることは、植物の生育が促進される大きな原因となっている。
【０００５】
従って、ケイ素の蓄積量を増加させることは、植物の健全的な生育、および、安定した収量の確保のために、有効であるといえる。また、ケイ素蓄積量の増加は、生物的ストレス、および、非生物的ストレスなどの種々のストレスの軽減にも、有効であるといえる。      
【０００６】
なお、このような複合ストレスに対する耐性は、葉、茎、または果実の表面などの組織（地上部の組織）に、大量に蓄積したケイ素によって、発揮されるとされている。
【０００７】
また、ケイ素は、植物の硬さにも関与しており、ケイ素の蓄積量が少なくなると、植物は、やわらかくなる。例えば、やわらかいイネは、ケイ素の蓄積量が低い。これは、細胞のケイ素蓄積量が増加するとポリマー（シリカ）が形成され、このポリマーが、細胞を硬くするためである。
【０００８】
従って、ケイ素の蓄積量を減少させることは、植物の硬さを変える（やわらかくする）ために、有効であるといえる。
【０００９】
このように、植物のケイ素吸収を促進してケイ素の含有量を高くすれば、複合ストレスに対する耐性を植物に付与し、植物の生育を促進することができる。一方、植物のケイ素吸収を抑制してケイ素の含有量を低くすれば、硬い植物をやわらかくすることができる。
【００１０】
本発明者は、ケイ素（ケイ酸）集積性植物であるイネから、既にいくつかのケイ素吸収に関与する遺伝子を同定することに成功している（特許文献１および２）。具体的には、本発明者は、互いにケイ素吸収メカニズムの異なるＬｓｉ１遺伝子およびＬｓｉ２遺伝子を取得している。Ｌｓｉ１遺伝子は、細胞内にケイ素を取り込むトランスポーターとして機能するＬｓｉ１タンパク質をコードしている。一方、Ｌｓｉ２は、細胞の中から外へケイ素を輸送するトランスポーターとして機能するＬｓｉ２タンパク質をコードしている。
【特許文献１】特開２００６−１８７２０９号公報（２００６年７月２０日公開）
【特許文献２】国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１５９５９                （国際出願日２００６年８月１１日，優先日２００５年８月１８日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、特許文献１および２に記載のＬｓｉ１遺伝子およびＬｓｉ２遺伝子だけでは、複雑な植物のケイ素吸収メカニズムを解明することはできない。また、Ｌｓｉ１遺伝子およびＬｓｉ２遺伝子は、いずれもイネから取得されたものであり、イネ以外の植物からはケイ素吸収に関与する遺伝子は知られていない。
【００１２】
さらに、Ｌｓｉ１遺伝子およびＬｓｉ２遺伝子は、いずれも根のケイ素吸収を促進することによって、前述のような種々のストレスに対して、ある程度の抵抗性（耐性）を付与することができる。この抵抗性（耐性）をさらに高めるには、根以外の部分（特に地上部）にケイ素を蓄積させることが有効であると考えられる。しかし、Ｌｓｉ１遺伝子およびＬｓｉ２遺伝子は、根以外の部分（特に地上部）にケイ素を蓄積させる機能は有していない。従って、種々のストレスに対して高い抵抗性（耐性）を付与した植物を生産するには、まだまだ改善の余地がある。
【００１３】
本発明は、上記従来の問題に鑑みたものであり、その目的は、新規なケイ素吸収に関与するポリヌクレオチドの利用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は、イネＬｓｉ１遺伝子を利用して、イネでの相同遺伝子Ｌｓｉ６遺伝子、トウモロコシでの相同遺伝子ＺｍＬｓｉ１遺伝子およびＺｍＬｓｉ６遺伝子を、それぞれ、クローニングするとともに、各遺伝子の機能を明らかにすることに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明のケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法は、上記の課題を解決するために、下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、発現可能に導入することを特徴としている。
【００１６】
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）以下の（１）または（２）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１７】
また、本発明のケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法は、上記の課題を解決するために、下記の（ｅ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドを、発現可能に導入することを特徴とするものであってもよい。
【００１８】
（ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）以下の（３）または（４）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（３）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１９】
本発明のケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法は、上記の課題を解決するために、下記の（ｉ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドを、トウモロコシに発現可能に導入することを特徴とするものであってもよい。
【００２０】
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｌ）以下の（５）または（６）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（５）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００２１】
本発明の形質転換体の生産方法では、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、イネに発現可能に導入することが好ましい。
【００２２】
本発明の形質転換体の生産方法では、上記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドを、トウモロコシに発現可能に導入することが好ましい。
【００２３】
本発明のケイ素吸収が抑制された形質転換体の生産方法は、上記の課題を解決するために、下記の（ｍ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制することを特徴としている。
【００２４】
（ｍ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｐ）以下の（７）または（８）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（７）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（８）配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００２５】
本発明の飼料用イネの生産方法は、上記の課題を解決するために、下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制することを特徴としている。
【００２６】
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）以下の（１）または（２）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（２）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００２７】
本発明のバイオマス燃料製造用トウモロコシの生産方法は、上記の課題を解決するために、下記の（ｅ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制することを特徴としている。
【００２８】
（ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）以下の（３）または（４）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（３）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００２９】
本発明のケイ素吸収が抑制された形質転換体の生産方法は、上記の課題を解決するために、トウモロコシに対し、下記の（ｉ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現抑制することを特徴としている。
【００３０】
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｌ）以下の（５）または（６）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（５）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００３１】
このように、（ａ）〜（ｌ）の遺伝子は、ケイ素吸収を促進する遺伝子である。これにより、（ａ）〜（ｌ）のいずれかの遺伝子を導入し、その遺伝子を発現させれば、ケイ素吸収が促進される。従って、ケイ素蓄積量の高い形質転換体を生産することができる。
【００３２】
特に、（ａ）〜（ｈ）の遺伝子は、根から吸収したケイ素を地上部に蓄積させる機能を有する。すなわち、（ａ）〜（ｈ）の遺伝子は、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有する。これにより、形質転換体のケイ素蓄積量を高めることができる。ケイ素蓄積量の増加は、植物に病害および虫害などの種々のストレスに対する耐性（抵抗性）を付与し、生育を促進させる。このため、ケイ素吸収を促進した形質転換体を利用すれば、農薬および化学肥料を極力使用せずに、より安全性の高い形質転換体を栽培することができる。また、より安全性の高い食料として提供することができる。
【００３３】
一方、（ａ）〜（ｌ）の遺伝子の発現を抑制すれば、ケイ素吸収を抑制することができる。これにより、形質転換体のケイ素蓄積量を低下させることができる。ケイ素蓄積量の減少は、硬い植物をやわらかくする。このため、ケイ素吸収を抑制した形質転換植物は、家畜飼料に利用することができる。さらに、バイオエタノールをはじめとするバイオマス燃料製造用の資源としても利用することができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、ケイ素吸収に関与するポリペプチドを、発現させるまたは発現を抑制することによって、ケイ素吸収が促進または抑制された形質転換体を生産することができる。
【００３５】
従って、ケイ素蓄積量を増加させることにより、植物に病害および虫害などの種々のストレスに対する耐性（抵抗性）を付与し、生育を促進させた形質転換体を生産することができる。
【００３６】
一方、ケイ素蓄積量を減少させることにより、植物体をやわらかくし、家畜飼料やバイオマス燃料用の原料資源として利用できる形質転換体を生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明は、イネまたはトウモロコシから新たに取得した、ケイ素吸収に関与するポリヌクレオチド（Ｌｓｉ６遺伝子，ＺｍＬｓｉ６遺伝子，ＺｍＬｓｉ１遺伝子）の利用方法に関するものである。以下では、ケイ素吸収に関与する遺伝子の発現を制御することによって、ケイ素吸収機能が促進または抑制された形質転換体を生産する方法と、その利用方法について説明する。
【００３８】
Ａ．本発明の形質転換体の生産方法
本発明の形質転換体の生産方法は、（ｉ）ケイ素吸収に関与するポリヌクレオチドを発現させることによる、ケイ素吸収が促進された形質転換体の生産と、（ｉｉ）ケイ素吸収に関与するポリヌクレオチドの発現を抑制することによる、ケイ素吸収が抑制された形質転換体の生産とを含んでいる。
【００３９】
＜Ａ−１＞ケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法
ケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法は、下記の（ａ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドを、発現可能に導入する工程を含んでいる。
【００４０】
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）以下の（１）または（２）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００４１】
（ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）以下の（３）または（４）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（３）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００４２】
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｌ）以下の（５）または（６）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（５）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００４３】
上記のポリヌクレオチドのうち、配列番号１、３、５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、イネまたはトウモロコシから本発明者等によって新たに同定された、ケイ素吸収に関与する（ケイ素吸収を促進する）遺伝子である。また、配列番号２、４、６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号１、３、５の遺伝子の翻訳産物である。すなわち、配列番号２、４、６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、イネまたはトウモロコシから本発明者等によって新たに同定された、ケイ素吸収に関与する（ケイ素吸収を促進する）タンパク質である。
【００４４】
なお、配列番号と、配列表中の配列表中の塩基配列またはアミノ酸配列との対応関係は、下記の通りである。
・配列番号１は、イネ由来のＬｓｉ６遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列である。
・配列番号２は、配列番号１のＬｓｉ６遺伝子にコードされるポリペプチド（Ｌｓｉ６タンパク質）のアミノ酸配列である。
・配列番号３は、トウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ６遺伝子(ｃＤＮＡ)の塩基配列である。
・配列番号４は、配列番号３のＺｍＬｓｉ６遺伝子にコードされるポリペプチド（ＺｍＬｓｉ６タンパク質）のアミノ酸配列である。
・配列番号５は、トウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ１遺伝子(ｃＤＮＡ)の塩基配列である。
・配列番号６は、配列番号５のＺｍＬｓｉ１遺伝子にコードされるポリペプチド（ＺｍＬｓｉ１タンパク質）のアミノ酸配列である。
・配列番号７は、イネ由来のＬｓｉ１遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列である。
・配列番号８は、配列番号７のＬｓｉ１遺伝子にコードされるポリペプチド（Ｌｓｉ１タンパク質）のアミノ酸配列である。
・配列番号９は、イネ由来のＬｓｉ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列である。
・配列番号１０は、配列番号９のＬｓｉ２遺伝子にコードされるポリペプチド（Ｌｓｉ２タンパク質）のアミノ酸配列である。
【００４５】
なお、本発明において、「ケイ素吸収」とは、ケイ素およびケイ素を含む化合物（ケイ酸など）を吸収することを示すものとする。例えば、植物は、通常、ケイ酸としてケイ素を吸収する。
【００４６】
また、上記「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体が意図されている。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言でき、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列からなるポリヌクレオチドを示している。
【００４７】
上記「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。また、ＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。
【００４８】
上記ポリヌクレオチドを取得する方法は、特に限定されるものではないが、公知の技術により、上記ポリヌクレオチドまたはその一部の配列を含むオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、上記ポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記ポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【００４９】
また、上記ポリヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法によっても取得することができる。例えば、上記（ａ）〜（ｈ）のポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することによって、上記のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。また、例えば、公知の日本晴またはトウモロコシの配列情報に基づいて、Ｌｓｉ６遺伝子、ＺｍＬｓｉ６遺伝子、ＺｍＬｓｉ１遺伝子領域を増幅できるようなプライマーを設計し、そのプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）またはＲＴ−ＰＣＲ産物を鋳型にして、各遺伝子領域を増幅することによっても、取得することができる。
【００５０】
上記ポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、イネ科植物（イネ、トウモロコシなど）であることが好ましい。
【００５１】
また、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも90％の同一性、好ましくは少なくとも95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、60℃で2×SSC 洗浄条件下で結合することを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、「Molecular Cloning (Third Edition)」 (J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。
【００５２】
また、上記「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」とも換言できる。なお、配列番号２、４、６に示されるポリペプチドは、配列番号１、３、５に示されるポリヌクレオチドの翻訳産物であり、少なくともケイ素吸収に関与するものである。
【００５３】
さらに、上記「ポリペプチド」は、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。ここで、「単離された」ポリペプチドは、その天然の環境から取り出されたポリペプチドを示す。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドは、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドと同様に、単離されたものとする。
【００５４】
従って、上記「ポリペプチド」は、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主によっては、上記ポリペプチドは、グリコシル化など、糖鎖修飾される場合もある。つまり、上記ポリペプチドには、このような修飾されたポリペプチドも含まれる。
【００５５】
上記「１または数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、または付加ができる程度の数（例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、または付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００５６】
ここで、ケイ素吸収が促進された形質転換体の生産方法は、（ａ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチド、または、そのポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入されており、かつ、ケイ素吸収に関与するポリペプチドを発現させるものであれば、特に限定されるものではない。
【００５７】
ここで、上記「形質転換体」は、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。また、本発明では、「形質転換体」は主として植物であり、この植物の範疇には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００５８】
上記「組換え発現ベクター」は、（ａ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むものであれば、その種類は特に限定されるものではない。例えば、配列番号１、３、または５に示すｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。
【００５９】
すなわち、上記「組換え発現ベクター」は、ホスト細胞（対象細胞または宿主細胞）の種類に応じて、（ａ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドを確実に発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、選択したプロモーターと（ａ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドとを各種プラスミド等に組み込んだベクターを組換え発現ベクターとして用いればよい。
【００６０】
なお、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば、特に限定されるものではない。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系等のバイナリーベクターを用いることが好ましい。バイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。また、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターを有するベクターであることが好ましい。プロモーターとしては公知のプロモーターを好適に用いることができ、具体的には、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、ユビキチンプロモーターやアクチンプロモーターを挙げることができる。
【００６１】
ここで、「ポリヌクレオチドまたは組換え発現ベクターが導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、ホスト細胞内に発現可能に導入されることを意味する。
【００６２】
上記ポリヌクレオチドまたは組換え発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、アグロバクテリウム感染法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、およびパーティクルガン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００６３】
上記ポリヌクレオチドがホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ハイグロマイシンのような抗生物質に抵抗性を与える薬剤耐性遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明にかかるポリヌクレオチドとを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。
【００６４】
上記ホスト細胞は、ケイ素吸収能を有する細胞、生物であれば、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、イネ，トウモロコシ，きゅうり，アブラナ，またはトマト等の植物細胞を挙げることができるが、特に限定されるものではない。また、植物細胞に限らず、例えば、大腸菌等の細菌細胞、酵母細胞、線虫、アフリカツメガエルの卵母細胞、哺乳類由来の細胞等を適用してもよい。上記のホスト細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知であり、特に限定されるものではない。
【００６５】
なお、Ｌｓｉ６遺伝子はイネ由来であるため、上記（ａ）〜（ｄ）のポリペプチドを導入するホスト細胞もイネであることが好ましいが、当然イネ以外のホスト細胞にも適用してもよい。同様に、ＺｍＬｓｉ１遺伝子およびＺｍＬｓｉ１遺伝子はトウモロコシ由来であるため、上記（ｅ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドを導入するホスト細胞もトウモロコシであることが好ましいが、当然トウモロコシ以外のホスト細胞にも適用してもよい。
【００６６】
このようにして生産された形質転換体は、上記（ａ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドまたは上記の組換え発現ベクターが導入されており、かつ、ケイ素吸収に関与するポリペプチドを発現しているものである。すなわち、生産された形質転換体に、上記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドが導入さていれば、イネ由来のＬｓｉ６関連遺伝子を発現し、上記（ｅ）〜（ｈ）のポリヌクレオチドが導入されていれば、トウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ６関連遺伝子を発現し、、上記（ｉ）〜（ｌ）のポリヌクレオチドが導入されれば、トウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ１関連遺伝子を発現する。これにより、ケイ素吸収を促進するポリペプチドが発現する。その結果、形質転換体のケイ素の蓄積量を増加させることができる。
【００６７】
このように、ケイ素吸収が促進された形質転換体は、ケイ素蓄積量の増加により、病害や虫害に対する抵抗性、耐塩性および耐乾性、およびミネラルストレスに対する耐性が向上する。従って、複合ストレス（例えば、病害や虫害に対する抵抗性、耐塩性および耐乾性、およびミネラルストレス）に対する耐性が向上し、生育を促進させることができる。
【００６８】
特に、上記（ａ）〜（ｈ）に示すイネ由来のＬｓｉ６関連遺伝子およびトウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ６関連遺伝子は、地上部にケイ素を蓄積させる機能を有している。すなわち、根からケイ素を吸収する活性と、根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有している。
【００６９】
このような機能（活性）を有するのは、Ｌｓｉ６タンパク質およびＺｍＬｓｉ６タンパク質の機能と、特許文献１および２に記載のＬｓｉ１タンパク質およびＬｓｉ２タンパク質の機能とが大きく異なるためである。すなわち、Ｌｓｉ６タンパク質およびＺｍＬｓｉ６タンパク質が、根のみではなく、地上部にも発現するためである。一方、特許文献１および２に記載のＬｓｉ１タンパク質およびＬｓｉ２タンパク質は、根にしか発現しない。
【００７０】
従って、より高いケイ素吸収が促進された形質転換体を生産するには、上記（ａ）〜（ｌ）のうち、上記（ａ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。これにより、前述のような複合ストレスに対する耐性を、顕著に高い形質転換体を取得することができる。
【００７１】
一方、上記（ｉ）〜（ｌ）に示すトウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ１関連遺伝子は、表皮に局在化するのに対し、イネＬｓｉ１遺伝子は、外皮および内皮に局在化する。つまり、ＺｍＬｓｉ１遺伝子およびＬｓｉ１遺伝子の発現部位は異なる。これにより、ＺｍＬｓｉ１遺伝子は、外皮細胞に取り込まれたケイ素を、原形質連絡によって、導管まで輸送される。一方、Ｌｓｉ１遺伝子は、ケイ素を外部から導管まで、輸送することができる。このため、ＺｍＬｓｉ１遺伝子を発現させれば、イネＬｓｉ１遺伝子や（ａ）〜（ｈ）のＬｓｉ６遺伝子およびＺｍＬｓｉ６遺伝子とは異なるルートによって、ケイ素吸収を促進することができる。
【００７２】
ここで、近年、食の安全性に関心が寄せられており、より安全性の高い食品が、望まれている。このため、農薬を全くまたは極力使用せずに栽培する有機栽培および無農薬（減農薬）栽培によって生産された農産物が、注目されている。
【００７３】
コメは、日本ばかりではなく、世界各地で主食とされている消費量の多い植物である。また、果物や野菜も、生産量および消費量が多い。このため、これらの農作物は、特に安全性が重要視される。
【００７４】
前述のように、ケイ素吸収が促進された形質転換体は、病害や虫害に対する抵抗性等の複合ストレスに対する耐性（抵抗性）が向上する。このため、この形質転換体は、農薬および化学肥料を極力使用せずに、栽培することができる。従って、有機栽培および無農薬栽培などが可能となり、より安全性の高い形質転換体を、食料として提供することができる。つまり、上記の形質転換体は、食品として利用することができる。このような食品としては、コメ、野菜、および果物のような農産物であることが好ましい。これにより、安全性が高く、有用な米（イネ）、野菜、および果物の栽培を実現できる。
【００７５】
特に、Ｌｓｉ６タンパク質またはＺｍＬｓｉ６タンパク質が発現した形質転換体は、根のケイ素吸収が向上するとともに、地上部にケイ素を蓄積する。このため、複合ストレスに対して、特に高い抵抗性を示す。従って、形質転換体を食品として利用する場合も、Ｌｓｉ６タンパク質またはＺｍＬｓｉ６タンパク質が発現した形質転換体を適用することが好ましい。
【００７６】
なお、上記（ａ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドは、単独で発現させてもよいし、複数を発現させてもよい。つまり、（ａ）〜（ｈ）のうち少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させればよい。さらに、Ｌｓｉ６遺伝子、ＺｍＬｓｉ６遺伝子、およびＺｍＬｓｉ１遺伝子を適宜組合わせて発現させてもよい。この場合、ケイ素吸収メカニズムの異なるケイ素吸収を促進するポリペプチドを複数導入し、ケイ素吸収が促進することが好ましい。これにより、取得した形質転換体は、ケイ素吸収メカニズムが異なるケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されており、かつ、ケイ素吸収を促進するポリペプチドを発現している。このため、ケイ素の蓄積量を、より増加させることができる。従って、ケイ素蓄積量を一層高めることができ、複合ストレスに対して強い耐性を示す形質転換体を取得することができる。
【００７７】
なお、本発明者は、既に、イネにおけるケイ素吸収に関与する別の遺伝子およびタンパク質（Ｌｓｉ１遺伝子・タンパク質（配列番号７・８），Ｌｓｉ２遺伝子・タンパク質（配列番号９・１０））を単離し、その配列を特定している（特許文献１および２）。
【００７８】
図１は、Ｌｓｉ１タンパク質、Ｌｓｉ６タンパク質、ＺｍＬｓｉ１タンパク質、ＺｍＬｓｉ６タンパク質のアミノ配列を比較した図である。図１のように、これらの各タンパク質の相同性は高い。このため、ケイ素吸収を促進する機能は共通であるものの、その機能は全く異なる。
【００７９】
すなわち、Ｌｓｉ６タンパク質およびＺｍＬｓｉ６タンパク質は、根のみではなく、地上部にも発現している。一方、Ｌｓｉ１タンパク質は、細胞内にケイ素を取り込むトランスポーターであるのに対し、Ｌｓｉ２タンパク質は、細胞の中から細胞外へ、ケイ素を輸送するトランスポーターである。このため、Ｌｓｉ６タンパク質およびＺｍＬｓｉ６タンパク質は、根に発現するものの地上部に発現しないＬｓｉ１タンパク質およびＬｓｉ２タンパク質とは、全く異なる機能を有している。
【００８０】
従って、Ｌｓｉ６遺伝子、ＺｍＬｓｉ６遺伝子、およびＺｍＬｓｉ１遺伝子を適宜組み合わせて使用する場合には、少なくともＬｓｉ６遺伝子およびＺｍＬｓｉ６遺伝子の一方とともに、これらＬｓｉ１遺伝子およびＬｓｉ２遺伝子も組み合わせてもよい。
【００８１】
また、Ｌｓｉ６遺伝子（タンパク質）の改変または発現量を制御することにより、ケイ素の有益効果をある程度維持したまま、地上部のケイ素分布のみを、制御することが可能となる。
【００８２】
なお、図１において、ＴＭ１〜ＴＭ６は、膜貫通ドメインを示している。また、図１において、△で示す部位のアミノ酸は、ケイ素吸収を促進する機能を維持する上で重要な部分である。具体的には、△部位は、Ｈ２およびＨ５（へリックス）、および、ＬＥ１およびＬＥ２（ループ）を示している。このため、各タンパク質を変異（改変）するときには、△で示す部位のアミノ酸を保持することが好ましい。
【００８３】
＜Ａ−２＞ケイ素吸収が抑制された形質転換体の生産方法
一方、ケイ素吸収が抑制された形質転換体の生産方法は、ケイ素吸収を促進するポリヌクレオチドの発現を抑制することによって、ケイ素吸収を促進するポリペプチドの発現を抑制する工程を含んでいればよい。
【００８４】
例えば、ケイ素吸収が抑制された形質転換体の生産方法は、（ｍ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制する工程を含んでいればよい。この方法によれば、Ｌｓｉ６遺伝子またはＺｍＬｓｉ６遺伝子の発現を抑制した形質転換体が生産される。
【００８５】
（ｍ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｐ）以下の（７）または（８）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、根からケイ素を吸収する活性と根から地上部へケイ素を輸送する活性とを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（７）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（８）配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００８６】
また、ケイ素吸収が抑制された形質転換トウモロコシ（形質転換体）の生産方法は、トウモロコシに対し、下記の（ｉ）〜（ｌ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現抑制するものであってもよい。この方法によれば、トウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ１遺伝子の発現を抑制した形質転換トウモロコシ（形質転換体）が生産される。
【００８７】
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｌ）以下の（５）または（６）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、表皮に局在化し根のケイ素吸収を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（５）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００８８】
上記ポリヌクレオチドの発現の抑制は、例えば、アンチセンスＲＮＡの導入、ＲＮＡ干渉などの手法による遺伝子発現操作によって行うことができる。例えば、アンチセンスＲＮＡ技術は、標的遺伝子に対して相補的なＲＮＡ転写体を生成するキメラ遺伝子の導入を基本原理とする。その結果として得られる表現型は、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少である。つまり、ケイ素吸収を促進するポリヌクレオチドの部分配列に対するアンチセンスＲＮＡを導入すれば、ケイ素吸収を促進するタンパク質の発現が抑制される。これにより、ケイ素吸収の機能が低下し、植物中のケイ素の含量を低下させることができる。
【００８９】
ケイ素は、植物の硬さに関与しており、植物のケイ素蓄積量が低下すると、植物はやわらかくなる。従って、ケイ素吸収を抑制することによって、形質転換体をやわらかくすることができる。
【００９０】
家畜は、硬い飼料を食べずに残す傾向にあるため、硬い植物を飼料に適用することは好ましくない。ケイ素吸収が抑制された形質転換体は、ケイ素蓄積量の減少により、やわらかくなる。従って、ケイ素吸が抑制された形質転換体は、家畜飼料として好適に利用することができる。つまり、ケイ素吸収を抑制してケイ素の含有量を低くすれば、軟らかく飼料に適した植物（飼料用イネ，飼料用トウモロコシ等）を作製できる。つまり、上記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制すれば、飼料用イネを生産することができる。
【００９１】
さらに、近年、植物資源から製造されるバイオマス燃料が注目を浴びている。バイオマス燃料の代表的な例は、自動車用燃料として利用されるバイオエタノールである。バイオエタノールは、燃やしても二酸化炭素の総量が増えないため、二酸化炭素などの排出量の抑制に有用である。それに加え、バイオエタノールは、ガソリンの半分程度と安価である。このように、環境にやさしい上、経済的にも非常に優れていることが、バイオエタノールをはじめとするバイオマス燃料が注目を浴びる最大の要因である。
【００９２】
バイオマス燃料は、トウモロコシやサトウキビなどの大量の植物原料を発酵させて製造される。しかし、バイオマス燃料の植物原料となるトウモロコシやサトウキビは、ケイ素を多量に吸収する植物である。このため、これらの植物原料は、ケイ素によって硬いものとなっている。その結果、発酵が遅くなり、バイオマス燃料の生産効率も低くなる。
【００９３】
前述のように、ケイ素吸収を抑制した形質転換体はやわらかくなる。従って、ケイ素吸収が抑制された形質転換体は、バイオマス燃料の原料としても好適に利用することができる。つまり、上記の（ｅ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドの発現を抑制すれば、バイオマス燃料製造用トウモロコシを生産することができる。
【００９４】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００９５】
〔実施例１〕ケイ酸輸送活性
アフリカツメガエルの卵母細胞（Xenopus laevis oocyte）を用いて、対象遺伝子（Ｌｓｉ１遺伝子，Ｌｓｉ６遺伝子，ＺｍＬｓｉ１遺伝子，ＺｍＬｓｉ６遺伝子）のｃＲＮＡのＵＴＲをできるだけ除去し、βグロビン遺伝子の３’ＵＴＲを含むプラスミドベクターに組み込んだ（挿入した）。目的遺伝子の挿入と方向を確認したプラスミドの３’末端側を制限酵素で切断し、これを鋳型としてＴ３ポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成した（Ambion社製 mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit）。
【００９６】
次に、アフリカツメガエル卵母細胞を腹部から取り出した後、0.1％Collagenase B(Roche社製)を含むModified Birth's Saline-Ca (MBS-Ca:88mM NaCl, 1mM KCl, 2.4mM NaHCO3, 15mM Tris-HCl(pH7.6), 0.82mM MgSO4, 10μg/ml sodium penicillin,および10μg/ml streptomycin sulfate)で３〜４回洗浄した。顕微鏡下で色、形、大きさなどによって洗浄後の卵母細胞を選抜し、１８℃のインキュベータ内で一晩インキュベートさせた。
【００９７】
翌日、合成されたｃＲＮＡ（1ng/nl）とコントロール用の水とを、電動マイクロインジェクター（Dramond社製 NanojetII）を用いて、各々50nLずる顕微注入した。さらに一晩インキュベートした試料について、ケイ酸輸送活性を評価した。
【００９８】
卵母細胞を入れたチューブに６８Ｇｅ（約2MBq）で標識された１ｍＭケイ酸入りＭＢＳを処理液として１ｍＬずつ加え、１８℃で３０分間処理した。３０分後、処理液を丁寧に取り除き、ケイ酸および６８Ｇｅを含まないＭＢＳで５回洗浄した。洗浄後、卵母細胞に0.1Ｎ硝酸50μLを加えて破砕し、0.1Ｎ水酸化ナトリウムで中和した後、全量が５ｍＬとなるようクリアゾルＩ（ナカライ社製）を加えた。そして、２４時間後に液体シンチレーションカウンタ（Pharmacia社製 WALL 1410E LIQUID SCINTILLATION COUNTER）で６８Ｇｅの放射活性を測定した。その結果、図２のように、Ｌｓｉ６遺伝子，ＺｍＬｓｉ１遺伝子，ＺｍＬｓｉ６遺伝子の発現によって、Ｌｓｉ１遺伝子と同様に、ケイ酸輸送活性を示した。
【００９９】
〔実施例２〕Ｌｓｉ６遺伝子，ＺｍＬｓｉ１遺伝子，ＺｍＬｓｉ６遺伝子の発現部位
水耕栽培したイネおよびトウモロコシの根、葉鞘、葉身から、全ＲＮＡを調製し、１μｇのＲＮＡから、oligo dT(18)プライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。そのｃＤＮＡを鋳型として、Ｌｓｉ６遺伝子，ＺｍＬｓｉ１遺伝子，ＺｍＬｓｉ６遺伝子に特異的なプライマーペアを用いてＰＣＲを行った。その後、ＰＣＲ産物の増幅を、アガロースゲル電気泳動により確認した。
【０１００】
その結果、図３のように、イネ由来のＬｓｉ６およびトウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ６は、Ｌｓｉ１およびＬｓｉ２とは異なり、根に加えて葉鞘および葉身にも発現していた。一方、トウモロコシ由来のＺｍＬｓｉ１は、イネＬｓｉ１と同様に、根に発現したものの、葉鞘および葉身には発現していなかった。
【０１０１】
〔実施例３〕Ｌｓｉ６タンパク質，ＺｍＬｓｉ１タンパク質，ＺｍＬｓｉ６タンパク質の局在部位
イネおよびトウモロコシの幼植物を、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、５％寒天に包埋した。次に、包埋した幼植物を、マイクロスライサーを用いて、厚さ１００μｍの切片とした。その切片を、Ｌｓｉ６タンパク質，ＺｍＬｓｉ１タンパク質およびＺｍＬｓｉ６タンパク質の各タンパク質の部分ペプチドで免疫したウサギ抗ペプチド抗体で処理した後、赤色蛍光標識した二次抗体を用いて検出した。
【０１０２】
その結果、図４のように、Ｌｓｉ６タンパク質およびＺｍＬｓｉ６タンパク質は、木部柔組織（導管の周囲）の細胞に局在化しており、ＺｍＬｓｉ１は、根の表皮に局在化していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
以上のように、Ｌｓｉ６遺伝子、ＺｍＬｓｉ６遺伝子、およびＺｍＬｓｉ６遺伝子は、ケイ素吸収を促進する遺伝子である。このため、これらの遺伝子の発現を抑制すれば、ケイ素蓄積量が減少し、硬い植物をやわらかくすることができる。一方、これらの遺伝子の発現を促進すれば、ケイ素蓄積量が増加し、複合ストレスに対する耐性（抵抗性）を付与し、生育を促進させることができる。それゆえ、本発明は、特に農業、および食品産業に、好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】Ｌｓｉ１タンパク質、Ｌｓｉ６タンパク質、ＺｍＬｓｉ１タンパク質、ＺｍＬｓｉ６タンパク質のアミノ配列を比較した図である。
【図２】Ｌｓｉ１遺伝子、Ｌｓｉ６遺伝子、ＺｍＬｓｉ１遺伝子、ＺｍＬｓｉ６遺伝子のケイ酸輸送活性を示すグラフである。
【図３】Ｌｓｉ１遺伝子、Ｌｓｉ６遺伝子、ＺｍＬｓｉ１遺伝子、ＺｍＬｓｉ６遺伝子の発現部位を示す図である。
【図４】Ｌｓｉ６タンパク質、ＺｍＬｓｉ１タンパク質、ＺｍＬｓｉ６タンパク質の発現部位を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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