(57)【要約】【課題】分離性能に優れ、洗浄効率が良く、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である多孔性膜を使用した核酸の分離精製方法を提供する。【解決手段】（１ａ）核酸を含む試料溶液に遠心力を作用させて核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（２ａ）洗浄液に遠心力を作用させて該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び（３ａ）回収液に遠心力を作用させて該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含むことを特徴とする核酸の分離精製方法。  また、本発明の別の形態として、（１ｂ）核酸を含む試料溶液を減圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（２ｂ）洗浄液を減圧状態で該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び（３ｂ）回収液を、減圧状態もしくは遠心力を作用させて該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含むことを特徴とする核酸の分離精製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１ａ）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
（２ａ）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び
（３ａ）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程、
を含有する核酸の分離精製方法において、（１ａ）、（２ａ）及び（３ａ）の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、遠心力を作用させることにより核酸吸着性多孔性膜に通過させることを特徴とする核酸の分離精製方法。
【請求項２】
（１ａ）、（２ａ）及び（３ａ）の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジに遠心力を作用させて、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させる、請求項１記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３】
（１ｂ）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
（２ｂ）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び
（３ｂ）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程、
を含有する核酸の分離精製方法において、（１ｂ）、及び（２ｂ）の各工程において、核酸を含む試料溶液又は洗浄液を、減圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させ、（３ｂ）の工程において、回収液を、減圧状態又は遠心力を作用させ核酸吸着性多孔性膜に通過させることを特徴とする核酸の分離精製方法。
【請求項４】
（１ｂ）及び（２ｂ）の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液又は洗浄液を注入し、カートリッジの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を減圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させ、上記（３ｂ）の工程において、該一の開口に、回収液を注入し、カートリッジの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を減圧状態にし、又は遠心力を作用させて、該注入した回収液を通過させ、他の開口より排出させる、請求項３記載の核酸の分離精製方法。
【請求項５】
核酸吸着性多孔性膜が、実質的にイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜である、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項６】
核酸吸着性多孔性膜が、多糖構造を有する有機ポリマーから成る多孔性膜である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項７】
多糖構造を有する有機ポリマーから成る多孔性膜が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る多孔性膜である、請求項６に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項８】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物である、請求項７に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項９】
トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の混合比（質量比）が、９９：１〜１：９９である、請求項８に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１０】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物である、請求項７に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１１】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物である、請求項７に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１２】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物である、請求項７に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１３】
多糖構造を有する有機ポリマーから成る多孔性膜が、アセチルセルロースを鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜である、請求項６に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１４】
アセチルセルロースを鹸化処理した後の該アセチルセルロースの鹸化率が、５％以上である、請求項１３に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１５】
アセチルセルロースを鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜である、請求項１３に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１６】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した後の該アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化率が、５％以上である、請求項１５に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１７】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物である、請求項１５または１６に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１８】
トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の混合比（質量比）が、９９：１〜１：９９である、請求項１７に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１９】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料がトリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物である、請求項１５または１６に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２０】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料がトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物である、請求項１５または１６に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２１】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料がジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物である、請求項１５または１６に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２２】
鹸化処理した後の核酸吸着性多孔性膜の平均孔径が、鹸化処理の前に比べて減少している、請求項１３〜２１のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２３】
鹸化処理した後の核酸吸着性多孔性膜が、鹸化処理の前に対して平均孔径の比が０．８以下である、請求項１３〜２２のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２４】
核酸吸着性多孔性膜が、再生セルロースを含有する多孔性膜である、請求項６に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２５】
核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２６】
親水基を持たない有機材料の多孔性膜への親水基の導入の処理が、多孔性膜に、親水基を有するグラフトポリマー鎖を結合することである、請求項２５に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２７】
核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を親水基を持つ材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２８】
親水基を持つ材料が、親水基を有する有機ポリマーである、請求項２７に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２９】
核酸吸着性多孔性膜が、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３０】
核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３１】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜への親水基の導入の処理が、多孔性膜に、親水基を有するグラフトポリマー鎖を結合することである、請求項３０に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３２】
核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を親水基を持つ材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３３】
親水基を持つ材料が、親水基を有する有機ポリマーである、請求項３２に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３４】
親水基が水酸基である、請求項２５〜３３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３５】
核酸吸着性多孔性膜が、表裏非対称性の多孔性膜である、請求項１〜３４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法を行うための、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジ。
【請求項３７】
請求項１〜３５のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うための、核酸分離精製カートリッジと試薬のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸吸着性多孔性膜と、減圧または遠心力により、核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形状で用いることを要求する。
【０００３】
診断分野においても、核酸は種々の方法で用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現におよぶ種々の理由により、興味ある核酸の位置確認、同定および単離において日常的に用いられている。
【０００４】
多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。
血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料の核酸の精製においては、コンタミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険性も加わる。
【０００５】
広く知られた分離精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、引き続く洗浄、脱着等の操作によって分離精製する方法がある（例えば、特許文献１）。この方法は、分離性能としては優れているが、簡便性、迅速性、自動化および小型化適性においては十分でなく、同一性能の吸着媒体の工業的大量生産が困難であり、かつ取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。
【０００６】
また、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、固相に核酸を吸着させる溶液及び固相から核酸を脱着させる溶液をそれぞれ用いて、表面に水酸基を有する有機ポリマーから成る固相に核酸を吸着及び脱着させることによって、核酸を分離精製する方法が記載されている（特許文献２）が、更なる改良が望まれる。
【特許文献１】特公平７−５１０６５号公報
【特許文献２】特開２００３−１２８６９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、検体中の核酸を核酸吸着性の多孔性膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法を提供することである。本発明の別の目的は、分離性能に優れ、洗浄効率が良く、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れた、核酸の分離精製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸を多孔性膜に吸着及び脱着させる過程を含む核酸の分離精製方法において、減圧状態で、または遠心力を作用させて、核酸吸着性多孔性膜を通過させることによって、核酸を含む検体から核酸を収率よく、高純度で分離精製することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明は、下記の構成により、前記目的を達成したものである。
１．  （１ａ）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（２ａ）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び（３ａ）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、（１ａ）、（２ａ）及び（３ａ）の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、遠心力を作用させることにより核酸吸着性多孔性膜に通過させることを特徴とする核酸の分離精製方法。
２．  （１ａ）、（２ａ）及び（３ａ）の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジに遠心力を作用させて、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させる、上記第１項に記載の核酸の分離精製方法。
【００１０】
３．  （１ｂ）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（２ｂ）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び（３ｂ）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、（１ｂ）、及び（２ｂ）の各工程において、核酸を含む試料溶液又は洗浄液を、減圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させ、（３ｂ）の工程において、回収液を、減圧状態又は遠心力を作用させ核酸吸着性多孔性膜に通過させることを特徴とする核酸の分離精製方法。
４．  （１ｂ）及び（２ｂ）の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液又は洗浄液を注入し、カートリッジの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を減圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させ、上記（３ｂ）の工程において、該一の開口に、回収液を注入し、カートリッジの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を減圧状態にし、又は遠心力を作用させて、該注入した回収液を通過させ、他の開口より排出させる、上記第３項に記載の核酸の分離精製方法。
【００１１】
５．  核酸吸着性多孔性膜が、実質的にイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜である、上記第１項〜第４項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
６．  核酸吸着性多孔性膜が、多糖構造を有する有機ポリマーから成る多孔性膜である、上記第１項〜第５項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
７．  多糖構造を有する有機ポリマーから成る多孔性膜が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る多孔性膜である、上記第６項に記載の核酸の分離精製方法。
８．  アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物である、上記第７項に記載の核酸の分離精製方法。
９．  トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の混合比（質量比）が、９９：１〜１：９９である、上記第８項に記載の核酸の分離精製方法。
１０．  アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物である、上記第７項に記載の核酸の分離精製方法。
１１．  アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物である、上記第７項に記載の核酸の分離精製方法。
１２．  アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物である、上記第７項に記載の核酸の分離精製方法。
【００１２】
１３．  多糖構造を有する有機ポリマーから成る多孔性膜が、アセチルセルロースを鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜である、上記第６項に記載の核酸の分離精製方法。
１４．  アセチルセルロースを鹸化処理した後の該アセチルセルロースの鹸化率が、５％以上である、上記第１３項に記載の核酸の分離精製方法。
１５．  アセチルセルロースを鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜である、上記第１３項に記載の核酸の分離精製方法。
１６．  アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した後の該アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化率が、５％以上である、上記第１５項に記載の核酸の分離精製方法。
１７．  アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物である、上記第１５項または第１６項に記載の核酸の分離精製方法。
１８．  トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の混合比（質量比）が、９９：１〜１：９９である、上記第１７項に記載の核酸の分離精製方法。
１９．  アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料がトリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物である、上記第１５項または第１６項に記載の核酸の分離精製方法。
２０．  アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料がトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物である、上記第１５項または第１６項に記載の核酸の分離精製方法。
２１．  アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料がジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物である、上記第１５項または第１６項に記載の核酸の分離精製方法。
【００１３】
２２．  鹸化処理した後の核酸吸着性多孔性膜の平均孔径が、鹸化処理の前に比べて減少している、上記第１３項〜第２１項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
２３．  鹸化処理した後の核酸吸着性多孔性膜が、鹸化処理の前に対して平均孔径の比が０．８以下である、上記第１３項〜第２２項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
２４．  核酸吸着性多孔性膜が、再生セルロースを含有する多孔性膜である、上記第６項に記載の核酸の分離精製方法。
【００１４】
２５．  核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜である、上記第１項〜第５項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
２６．  親水基を持たない有機材料の多孔性膜への親水基の導入の処理が、多孔性膜に、親水基を有するグラフトポリマー鎖を結合することである、上記第２５項に記載の核酸の分離精製方法。
２７．  核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を親水基を持つ材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜である、上記第１項〜第５項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
２８．  親水基を持つ材料が、親水基を有する有機ポリマーである、上記第２７項に記載の核酸の分離精製方法。
【００１５】
２９．  核酸吸着性多孔性膜が、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜である、上記第１項〜第５項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
３０．  核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜である、上記第１項〜第５項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
３１．  親水基を持たない無機材料の多孔性膜への親水基の導入の処理が、多孔性膜に、親水基を有するグラフトポリマー鎖を結合することである、上記第３０項に記載の核酸の分離精製方法。
３２．  核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を親水基を持つ材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜である、上記第１項〜第５項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
３３．  親水基を持つ材料が、親水基を有する有機ポリマーである、上記第３２項に記載の核酸の分離精製方法。
３４．  親水基が水酸基である、上記第２５項〜第３３項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
３５．  核酸吸着性多孔性膜が、表裏非対称性の多孔性膜である、上記第１項〜第３４項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【００１６】
３６．  上記第１項〜第３５項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法を行うための、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジ。
３７．  上記第１項〜第３５項のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うための、核酸分離精製カートリッジと試薬のキット。
【発明の効果】
【００１７】
核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、減圧状態で、または遠心力を作用させて、核酸吸着性多孔性膜に通過させる本発明の核酸の分離精製方法により、分離性能よく、簡便で、迅速に、自動化可能に、核酸を含む検体から核酸を分離精製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の核酸分離精製方法は、（１ａ）核酸を含む試料溶液に遠心力を作用させて核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（２ａ）洗浄液に遠心力を作用させて該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び（３ａ）回収液に遠心力を作用させて該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を少なくとも含むものである。
【００１９】
好ましくは、上記（１ａ）、（２ａ）及び（３ａ）の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、遠心力を作用させて、該注入した各液を通過させ、一の開口とは異なる開口（以下、「他の開口」とも称する。）より排出させるものである。
核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液に遠心力を作用させて、上記多孔性膜に通過させることにより、核酸を含む試料液注入から核酸分離精製カートリッジ外に核酸を得るまでの工程にかかる時間を短縮することが可能となり、好ましい。
【００２０】
上記（１ａ）、（２ａ）及び（３ａ）の各工程において、遠心は、好ましくは、５０００〜１２０００ｒｐｍ、０．２〜５分、より好ましくは７０００〜１００００ｒｐｍ、０．５〜２分、特に好ましくは８０００ｒｐｍ、１分間行うことが好ましい。
遠心力の発生には、通常使用される遠心機のいずれも使用することができる。遠心機として、高速遠心機を用いることが好ましい。核酸分離精製カートリッジの他の開口に、後記する試料液および洗浄液の排出液を収容する廃液容器を取り付け、または後記する回収液を収容する回収容器を取り付け、取り付けた廃液容器または回収容器の方向に遠心力がかかるように遠心機にセットし、遠心力を作用させて、各液を核酸吸着性多孔性膜に通過させる。
【００２１】
本発明の核酸分離精製方法の別の形態は、（１ｂ）核酸を含む試料溶液を減圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（２ｂ）洗浄液を減圧状態で該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び（３ｂ）回収液を、減圧状態もしくは遠心力を作用させて該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を少なくとも含むものである。
【００２２】
好ましくは、上記（１ｂ）、（２ｂ）及び（３ｂ）の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、（１ｂ）及び（２ｂ）の各工程において、カートリッジの一の開口とは異なる開口（他の開口）に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を減圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させ、（３ｂ）の工程において、他の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を減圧状態にして、又は遠心力を作用させて、注入した回収液を通過させ、他の開口より排出させるものである。
核酸を含む試料溶液又は洗浄液を減圧状態で、回収液を減圧状態または遠心力を作用させて、上記多孔性膜に通過させることにより、核酸を含む試料液注入から核酸分離精製カートリッジ外に核酸を得るまでの工程にかかる時間を短縮することが可能となり、好ましい。
【００２３】
上記（１ｂ）、（２ｂ）及び（３ｂ）の各工程において、減圧は、好ましくは−１０〜−８０ｋｐａ、より好ましくは−３０〜−６０ｋｐａの程度で行われる。
圧力差発生装置としては、注射器、エバポレーター、アスピレータ、真空ポンプ、あるいは真空ポンプに接続した真空チャンバーのような減圧が可能な真空ポンプ等が挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作には真空ポンプが適している。
到達真空圧が上記の減圧度を達成可能な装置を用いることが好ましい。
好ましくは、圧力差発生装置は、核酸分離精製カートリッジの他の開口に着脱可能に結合されている。
【００２４】
上記（３ｂ）の回収工程において、遠心は、好ましくは、５０００〜１２０００ｒｐｍ、より好ましくは７０００〜１００００ｒｐｍ、遠心時間は、好ましくは０．５〜１．５分、より好ましくは１分である。
遠心力の発生には、通常使用される遠心機のいずれも使用することができる。遠心機としては、高速遠心機を用いることが好ましい。核酸分離精製カートリッジの他の開口に、後記する回収液を収容する回収容器を取り付け、遠心機にセットし、遠心分離を行う。
【００２５】
上記の核酸分精製の工程では、１ｋｂｐから２００ｋｂｐ、特に２０ｋｂｐから１４０ｋｂｐと広範囲に及ぶ分子量の核酸を回収することができる。すなわち、従来行なわれているガラスフィルターを用いたスピンカラム法に比べて、長鎖の核酸を回収できる。
【００２６】
また、上記の核酸分精製の工程では、紫外可視分光光度計での測定値(２６０ｎｍ／２８０ｎｍ)が、ＤＮＡの場合は１．６〜２．０、ＲＮＡの場合は１．８〜２．２となる純度を持つ核酸を回収することができ、不純物混入量の少ない高純度の核酸を定常的に得ることができる。さらには、紫外可視分光光度計での測定値(２６０ｎｍ／２８０ｎｍ)がＤＮＡの場合は１．８付近、ＲＮＡの場合は２．０付近となる純度を持つ核酸を回収することができる。
【００２７】
本発明において使用できる検体に制限はないが、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルス、培養細胞など、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。
【００２８】
最初にこれらの検体について細胞膜および核膜等を溶解して核酸を可溶化する試薬を含む水溶液（核酸可溶化試薬）で処理する。これにより細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散し、核酸を含む試料溶液を得る。
【００２９】
細胞膜および核膜を溶解して、核酸を可溶化するためには、例えば、対象となる試料が全血の場合、Ａ．赤血球の除去、Ｂ．各種タンパク質の除去、及びＣ．白血球の溶解及び核膜の溶解が必要となる。Ａ．赤血球の除去およびＢ．各種タンパク質の除去は、膜への非特異吸着および多孔性膜の目詰まりを防ぐために、Ｃ．白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ必要となる。
【００３０】
核酸を含む検体は、単一の核酸を含む検体でもよいし、異なる複数種類の核酸を含む検体でもよい。回収する核酸の種類は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、１本鎖または２本鎖、直鎖状または環状等、特に制限されない。検体の数は一つでも複数であってもよい。検体が複数の場合、例えば、複数の容器を用いて複数の検体を並列処理してもよい。回収する核酸の長さも特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸を使用することができる。取扱い上の観点からは、回収する核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度である。本発明の核酸分離精製方法は、従来の簡易的な核酸分離精製方法より比較的長い核酸を迅速に取り出すことができ、好ましくは５０ｋｂｐ以上、より好ましくは７０ｋｂｐ、更に好ましくは１００ｋｂｐ以上の核酸を回収することに用いることができる。
【００３１】
以下に、細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程について説明する。本発明で、細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化するには、核酸可溶化試薬を用いる。核酸可溶化試薬としては、カオトロピック塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む溶液が挙げられる。
【００３２】
細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程としては、（Ｉ）検体を容器に注入する工程、（ＩＩ）該容器に、カオトロピック塩と界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液を添加し、検体と核酸可溶化試薬溶液を混合する工程、（ＩＩＩ）得られた混合液をインキュベートする工程、（ＩＶ）インキュベートされた混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程を含む工程を挙げることができる。
【００３３】
上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、検体をホモジナイズ処理することで、自動化処理適性が向上する。ホモジナイズ処理は、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる、高速攪拌処理を用いる、微細空隙から押し出す処理、ガラスビーズを用いる処理等で行うことができる。
【００３４】
また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、タンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬を使用することにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、必要な核酸を含む検体の微量化及び迅速化が可能となる。
【００３５】
タンパク質分解酵素は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼなどから、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、タンパク質分解酵素は、複数種以上のタンパク質分解酵素の混合物も好ましく用いることができる。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。
システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。
金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素は、添加時の反応系全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵの濃度で用いることができる。
【００３６】
また、タンパク質分解酵素は、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、安定化剤を含んだタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。安定化剤としては、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、マグネシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。
タンパク質分解酵素の安定化剤は、反応系全量に対して好ましくは１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含有することが好ましい。
【００３７】
タンパク質分解酵素は、予めカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とともに混合されて１つの試薬として核酸の回収に供されても良い。
また、タンパク質分解酵素は、カオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とは個別の２つ以上の試薬として供されても良い。後者の場合、タンパク質分解酵素を含む試薬を先に検体と混合した後に、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬と混合される。また、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬を先に混合した後に、タンパク分解酵素を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を検体または、検体とカオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。
【００３８】
核酸可溶化試薬は、乾燥された状態で供給されることも好ましい。また、凍結乾燥のように乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器を用いることができる。上記の、乾燥された状態で供給される核酸可溶化試薬、および乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器の両方を用いて、核酸を含む試料溶液を得ることもできる。
上記の方法で核酸を含む試料溶液を得る場合、核酸可溶化試薬およびタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。
【００３９】
検体とカオトロピック塩および界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液とを混合する方法は、特に限定されない。
混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができる。
【００４０】
検体とカオトロピック塩および界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液との混合液を、タンパク質分解酵素の至適温度および反応時間でインキュベートすることにより、分離精製される核酸の収量を増加させることがきる。インキュベーション温度は、通常２０℃〜７０℃、好ましくはタンパク分解酵素の至適温度である。インキュベーション時間は通常１〜９０分、好ましくはタンパク分解酵素の至適反応時間である。インキュベーション方法は特に限定されず、湯浴や加温器に入れることで行うことができる。
【００４１】
上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、界面活性剤とカオトロピック塩を含む核酸可溶化試薬溶液は、好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ７〜８のものが用いられる。
【００４２】
また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、カオトロピック塩の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ〜４ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは、１ｍｏｌ／Ｌ〜３ｍｏｌ／Ｌである。上記カオトロピック塩としては、塩酸グアニジンが好ましいが、他のカオトロピック塩（イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン）を使用することもできる。また、これらの塩は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
【００４３】
また、上記の核酸可溶化試薬溶液は試薬に含まれる化合物の溶解性向上のために、水溶性有機溶媒を含んでいても良い。この水溶性有機溶媒としてはアルコールが好ましい。アルコールは、1級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体を好ましく用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独または複数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸可溶化試薬溶液における濃度は１〜２０質量％であることが好ましい。
【００４４】
また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、検体にカオトロピック塩およびタンパク質分解酵素とともに混合する界面活性剤は、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤である。
本発明においてはノニオン界面活性剤をこのましく用いることができる。ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができ、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤を用いることができ、さらに好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤はＰＯＥオクチルフェニルエーテルが挙げられ、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤は、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールから選択されるポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。
【００４５】
また、カチオン界面活性剤も好ましく用いることができる。さらに好ましくは、カチオン界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドから選択されるカチオン界面活性剤である。これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。
これら界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。
【００４６】
ＤＮＡなどＲＮＡ以外の核酸を回収する場合、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、核酸可溶化試薬溶液にＲＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＲＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＤＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。
一方、ＲＮＡなどＤＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬溶液にＤＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＤＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、ＲＮＡ分解酵素を特異的に阻害するものが好ましい。
ＲＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、リボヌクレアーゼ  Ｈ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）等のＲＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
ＤＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ等のＤＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
核酸分解酵素および核酸分解酵素阻害剤は、通常用いられる濃度で用いることが出来る。また、通常どおり加温処理することができる。加温処理は、タンパク質分解酵素による処理と同時におこなうことがこのましい。
【００４７】
上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、核酸を含む試料溶液には、消泡剤を含有させることも好ましい。上記消泡剤としては、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分が好ましく挙げられ、また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤が好ましい。
【００４８】
消泡剤の具体例としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルヘキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することができる。また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤を使用することも好ましい。
【００４９】
上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程に含まれる（ＩＶ）インキュベートされた混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程において、添加する水溶性有機溶媒は、アルコールを好ましく用いることができる。アルコールは、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでもよく、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール及びその異性体を好ましく用いることができる。これら水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。
【００５０】
また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、得られた核酸を含む試料溶液は、表面張力は０．０５Ｊ／ｍ2以下であることが好ましく、また、粘度は、１〜１００００ｍＰａ・ｓであることが好ましく、比重は、０．８〜１．２であることが好ましい。
【００５１】
本発明の核酸の分離精製方法では、核酸吸着性多孔性膜を用いる。多孔性膜は、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産することができる。
以下に、本発明で用いる核酸吸着性多孔性膜および吸着工程について説明する。本発明の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が内部を通過可能」とは、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。また、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。
【００５２】
本発明の核酸吸着性多孔性膜は、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることが好ましい。これは、多孔性膜側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。より好ましくは、核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有する多孔性膜であり、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜の親水基同士が引きあるようになると推定される。ここで、親水基を有する多孔性膜とは、多孔性膜を形成する材料自体が、親水基を有する多孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入した多孔性膜であることを意味する。多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜などを、使用することができるが、加工の容易性から、多孔性膜を形成する材料は有機ポリマーなどの有機材料を用いることが好ましい。
【００５３】
親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。
【００５４】
水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などで、形成された多孔性膜を挙げることができるが、特に多糖構造を有する有機ポリマーの多孔性膜を好ましく使用することができる。
【００５５】
多糖構造を有する有機ポリマーとしては、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、アガロース、デキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、マンナン、グルコマンナン、リケナン、イソリケナン、ラミナラン、カラギーナン、キシラン、フルクタン、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キチン、キトサン等を好ましく用いることができる。これらの多糖構造の誘導体を用いてもよい。多糖構造またはその誘導体のいずれかであれば、前記に挙げた材料に限定されることはない。多糖構造の誘導体としては、例えば、多糖構造の水酸基が任意の置換度で、エステル化したもの、エーテル化したもの、ハロゲン化したものが挙げられる。また、前記いずれかの多糖構造のエステル誘導体の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００５６】
前記いずれかの多糖構造のエステル誘導体のエステルとしては、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造の、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００５７】
前記カルボン酸エステルとしては、アルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、アルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００５８】
前記アルキルカルボニルエステルとしては、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基のいずれか一つ以上から選ばれる基を有するエステルであることが好ましい。また、前記アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基のいずれか一つ以上から選ばれる基を有するエステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００５９】
前記アルケニルカルボニルエステルが、アクリル基、メタクリル基のいずれか一つ以上から選ばれる基を有するエステルであることが好ましい。また、前記アクリル基、メタクリル基のいずれか一つ以上から選ばれる基を有するエステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００６０】
前記芳香族カルボニルエステルが、ベンゾイル基、ナフタロイル基の少なくとも一つ以上から選ばれる基を有するエステルであることが好ましい。また、前記ベンゾイル基、ナフタロイル基の少なくとも一つ以上から選ばれる基を有するエステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００６１】
前記硝酸エステルとしては、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどを好ましく用いることができる。
また、前記、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００６２】
前記硫酸エステルとしては、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００６３】
前記多糖構造のスルホン酸エステルとしては、アルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造のアルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００６４】
前記リン酸エステルとしては、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００６５】
前記ホスホン酸エステルとしては、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００６６】
前記ピロリン酸エステルとしては、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００６７】
前記エーテル誘導体としては、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチル−カルバモイルエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、シアノエチルセルロース、カルバモイルエチルセルロース等を用いることができるが、これらに限定されることはない。好ましくは、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースを用いることができる。
【００６８】
多糖構造を有する有機ポリマーから成る多孔性膜の形成材料として好ましくは、アセチルセルロースが挙げられ、更にアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物から成る有機材料の多孔性膜を使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物を好ましく使用する事ができる。
特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましく、９０：１０〜５０：５０である事がより好ましい。
【００６９】
多糖構造を有する有機ポリマーから成る多孔性膜として特に好ましくは、アセチルセルロースを鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜である。例えば、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物からなる多孔性膜が挙げられる。アセチルセルロースの表面鹸化物とは、アセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物を鹸化処理したものであり、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物も好ましく使用することができる。より好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物を使用することである。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましい。更に好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比は、９０：１０〜５０：５０であることである。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で多孔性膜表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率をあげるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。鹸化処理により得られる多孔性膜の鹸化率（表面鹸化率）が５％以上１００％以下であることが好ましく、１０％以上１００％以下であることが更に好ましい。
【００７０】
鹸化処理した後の核酸吸着性多孔性膜は、その平均孔径が、鹸化処理の前に比べて減少していることが好ましい。また、鹸化処理の前に対する鹸化処理の後の平均孔径の比が０．８以下の多孔性膜であることが好ましく、０．５以下の多孔性膜であることが更に好ましい。
【００７１】
ここで、鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したアセチルセルロースの部分は、再生セルロースとなり水酸基が導入される。こうして作成された再生セルロースは、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。本発明において多孔性膜として、再生セルロースを含有する多孔性膜を用いることが好ましい。
鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲ、ＩＲ又はＸＰＳによりにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。
【００７２】
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法として、親水基を有するグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することができる。
有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。
【００７３】
まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる方法においては、ポリマーの主鎖の末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。
【００７４】
ポリマーの主鎖の末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。
【００７５】
多孔性膜を基点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖を形成させる方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、多孔性膜と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合させる方法を指す。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
【００７６】
特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。
【００７７】
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。
【００７８】
また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
【００７９】
親水基を有する無機材料である多孔性膜としては、シリカ化合物を含有する多孔性膜を挙げることができる。シリカ化合物を含有する多孔性膜としては、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調製し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。
【００８０】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる方法においては、ポリマーの主鎖の末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。
多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖を形成するポリマーの主鎖の末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、上記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法において、記載した親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
【００８１】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる。
【００８２】
また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
【００８３】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を加工して作製した多孔性膜を挙げることができる。
【００８４】
前記核酸吸着性多孔性膜としては、厚さが１０μｍ〜５００μｍである多孔性膜を用いる事ができる。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである多孔性膜を用いる事ができる。洗浄がし易い点で、厚さが薄いほど好ましい。
【００８５】
また、前記核酸吸着性多孔性膜としては、平均孔径が０．９〜５．０μｍの多孔性膜を用いる事ができる。更に好ましくは、平均孔径が１．５〜３．５μｍの多孔性膜を用いる事ができる。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。この多孔性膜の平均孔径は、バブルポイント法（ＡＳＴＭＦ３１６−８６、ＪＩＳ  Ｋ３８３２準拠）を用いて決定することができる。
【００８６】
前記核酸吸着性多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜であってもよいが、表裏非対称性の多孔性膜であることが好ましい。ここで、表裏非対称性とは、多孔性膜の一方の面から他方の面へと膜の物理的性質または化学的性質が変化している性質を示す。膜の物理的性質の例としては、平均孔径が挙げられる。また膜の化学的性質としては前記の鹸化度が挙げられる。平均孔径が表裏非対称性の多孔性膜を本発明で使用する場合は、液の通過する方向に平均孔径が、大から小に変化するようにするのが好ましい。ここで、最大孔径と最小孔径の比が２以上である多孔性膜を用いる事が好ましい。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が５以上である。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。
【００８７】
また、前記核酸吸着性多孔性膜としては、空隙率が５０〜９５％である多孔性膜を用いる事ができる。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である多孔性膜を用いる事ができる。また、前記核酸吸着性多孔性膜としては、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2である多孔性膜を用いる事ができる。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ2である多孔性膜を用いる事ができる。
【００８８】
また、前記核酸吸着性多孔性膜としては、圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである多孔性膜を用いる事が好ましい。これにより、過圧時に均一な圧力が得られ、好ましい。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである多孔性膜を用いる事ができる。
ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。
【００８９】
また、前記核酸吸着性多孔性膜としては、また、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で１〜５０００ｍＬである多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で５〜１０００ｍＬである多孔性膜を用いることができる
【００９０】
また、前記核酸吸着性多孔性膜としては、多孔性膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である多孔性膜を好ましく使用する事ができる。さらに好ましくは、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である多孔性膜を用いることができる。
【００９１】
また、前記核酸吸着性多孔性膜としては、一辺が５ｍｍの正方形の多孔性膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに、１時間以内では溶解しないが４８時間以内に溶解するセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用する事ができる。また、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用する事ができる。
【００９２】
核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を一方の面から他方の面へと通過させることが、液を多孔性膜へ均一に接触させることができる点で、好ましい。核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を核酸吸着性多孔性膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で、好ましい。
【００９３】
核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜を通過させる場合の流速は、液の多孔性膜への適切な接触時間を得るために、膜の面積ｃｍ2あたり、２〜１５００μＬ／ｓｅｃである事が好ましい。液の多孔性膜への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、上記流速は、膜の面積ｃｍ2あたり、５〜７００μＬ／ｓｅｃである事が好ましい。
【００９４】
また、使用する核酸吸着性多孔性膜は、１枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。
【００９５】
少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。また、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような核酸吸着性多孔性膜を複数枚収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。この場合、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容される複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。
【００９６】
複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸吸着性多孔性膜との組合せであっても良い。例えば、ガラスフィルターと再生セルロースの多孔性膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸非吸着性多孔性膜との組合せであってもよい、例えば、ガラスフィルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔性膜との組合せを挙げることができる。
【００９７】
核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような核酸吸着性多孔性膜を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。上記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、上記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。
【００９８】
核酸分離精製カートリッジとして、個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段を備えている核酸分離精製カートリッジを使用する事ができる。個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段としては、バーコード、磁気テープなどが挙げられる。
【００９９】
また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔性膜を容易に取り出す事が可能になっている構造を有した核酸分離精製カートリッジを使用することもできる。
【０１００】
前記核酸吸着性多孔性膜を収容する核酸分離精製カートリッジを用いて、以下の工程で核酸を分離精製することができる。
すなわち、（１ａ）核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、（１ｂ）核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（１ｃ）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、（１ｄ）核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、（１ｅ）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、（１ｆ）核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程を挙げることができる。
【０１０１】
また別の形態として、前記核酸吸着性多孔性膜を収容する核酸分離精製カートリッジを用いて、以下の工程で核酸を分離精製することができる。
すなわち、（２ａ）核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、（２ｂ）核酸分離精製カートリッジの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を減圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（２ｃ）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、（２ｄ）核酸分離精製カートリッジの上記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、（２ｅ）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、（２ｆ）核酸分離精製カートリッジの上記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にし、又は核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程を挙げることができる。
【０１０２】
以下、洗浄工程について説明する。洗浄を行うことにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作が簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには1回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返すことが好ましい。
【０１０３】
洗浄工程において、洗浄液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給される。（１）供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、一の開口と異なる開口に、洗浄液の排出液を収容する廃液容器を取り付け、取り付けた廃液容器の方向に遠心力がかかるように遠心機にセットし、遠心力を作用させて、洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。または、（２）供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、一の開口と異なる開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、真空ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にして、洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。
また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が洗浄効率が優れてより好ましい。
洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ/ｍｍ2以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上するが、操作性を保ち、試料の流出を抑止するためには、２００μｌ/ｍｍ2以下が好ましい。
【０１０４】
洗浄工程において、洗浄液を核酸吸着性多孔性膜を通過させる場合の流速は、膜の単位面積（ｃｍ2）あたり、２〜１５００μＬ／ｓｅｃであることが好ましく、５〜７００μＬ／ｓｅｃであることがより好ましい。通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになるが、核酸の分離精製操作の迅速化も重要であるので上記した範囲が選択される。
【０１０５】
洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。
また洗浄工程において、その核酸分離精製カートリッジを器械的な振動や超音波による攪拌を与えながら、または遠心分離により洗浄することもできる。
【０１０６】
洗浄工程において、洗浄液には、一般的には核酸分解酵素のような酵素を含ませないが、タンパク質等の夾雑物質を分解する酵素を含ませることができる。また、場合によってはＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素などを含ませることもできる。ＤＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＲＮＡのみを選択的に回収することができる。逆に、ＲＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＤＮＡのみを選択的に回収することができる。
【０１０７】
洗浄工程において、洗浄液は、水溶性有機溶媒及び/または水溶性塩を含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、核酸吸着性多孔性膜に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸着性多孔性膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である。この目的には、アルコール等の水溶性有機溶媒が核酸が難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不要成分の選択的除去作用が向上する。
【０１０８】
洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトンなどを用いることができ、中でもエタノ―ルを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、２０〜１００質量％であることが好ましく、４０〜８０質量％であることがより好ましい。
【０１０９】
一方、洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましくナトリウム塩が最も好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。
とりわけ、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、さらには、塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが特に好ましい。
【０１１０】
洗浄液は、カオトロッピク物質を含んでいないことが好ましい。それによって、洗浄工程に引き続く回収工程にカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＰＣＲ反応等の酵素反応を阻害するので、後の酵素反応等を考慮すると洗浄液にカオトロッピク物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。
ここで、カオトロピック物質とは、前記したグアニジン塩等のカオトロピック塩、尿素、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。
【０１１１】
従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカートリッジなどの容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程への洗浄液の混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カートリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。
【０１１２】
したがって、洗浄工程における洗浄液が次工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカートリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ2未満にすることが好ましい。表面張力を低くすれば洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。
【０１１３】
逆に、洗浄工程における洗浄液のカートリッジへの残留を減少させる目的で、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ2以上にして、カートリッジとの撥水性を高めて液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量を抑えることもできる。核酸を吸着した多孔性膜、回収液、洗浄液の組合せなどによっていずれかの表面張力が選択される。
【０１１４】
本発明に係る核酸吸着性多孔性膜を利用して洗浄工程を簡素化することができる。（i）洗浄液が核酸吸着性多孔性膜を通過する回数を１回でよい、（ii）洗浄工程を室温で行うことができる。（iii）洗浄後、直ちに回収液をカートリッジに注入することができる。（iv）前記（i）、（ii）、（iii）のいずれか1つもしくは２つ以上行うことも可能である。従来法においては、洗浄液中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くため、しばしば乾燥工程を必要としたが、本発明に係る核酸吸着性多孔性膜は薄膜であるためにこれを省略できるからである。
【０１１５】
従来、核酸分離精製工程において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。
洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫することによって抑止することができる。
【０１１６】
以下に核酸吸着性多孔性膜から核酸を脱着させて回収する工程について示す。
回収工程において、回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を装着した核酸分離精製カートリッジへ供給される。（１）回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、一の開口とは異なる開口に、回収液を収容する回収容器を取り付け、取り付けた回収容器の方向に遠心力がかかるように遠心機にセットし、遠心力を作用させて回収液を核酸吸着性多孔性膜に通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。または（２）回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、上記一の開口とは異なる開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、真空ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。
さらには、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。
さらにまた、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させる方法が回収効率が優れてより好ましい。
【０１１７】
検体から調製した核酸を含む試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整して核酸の脱着を行うことができる。分離精製された核酸を含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変える事ができる。
【０１１８】
回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファ等のバッファ−水溶液が使用できる。また、回収した核酸をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に供する場合、ＰＣＲ反応において用いる緩衝溶液  (例えば、ＫＣｌ  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  １０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ2  １．５ｍｍｏｌ／Ｌを最終濃度とする水溶液)を用いることもできる。
【０１１９】
回収液のｐＨは、ｐＨ２〜１１であることが好ましい。さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましく、さらには、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩濃度であることが好ましい。こうすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収できることができる。
【０１２０】
回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１００〜９９：１００、更に好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１０〜９：１０にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。
【０１２１】
また別の方法としては、回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液よりも多い条件で核酸の脱着を行うことにより、希望の濃度の核酸を含む回収液を得ることができ、次工程（ＰＣＲなど）に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、 (回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、多孔性膜からの核酸回収率の増加を図ることができる。
【０１２２】
また、目的に応じて回収液の温度を変化させることで簡便に核酸を回収することができる。例えば、回収液の温度を０〜１０℃にして多孔性膜からの核酸の脱着を行うことで、酵素による分解を防止する何らかの試薬や特別な操作を加えることなく核酸分解酵素の働きを抑制して、核酸の分解を防ぎ、簡便に、効率よく核酸溶液を得ることができる。
【０１２３】
また、回収液の温度を１０〜３５℃とした場合、一般的な室温で核酸の回収を実施することが出来、複雑な工程を必要とせずに核酸を脱着させて分離精製することができる。
【０１２４】
また別の方法としては、回収液の温度を高温、例えば３５〜７０℃することで、多孔性膜からの核酸の脱着を煩雑な操作を経ず簡便に高い回収率で実施することができる。
【０１２５】
回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入する事がある。
【０１２６】
回収工程においては、核酸の回収液をその後の後工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製された核酸は、しばしばＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応)法により増幅される。この場合、分離精製された核酸溶液はＰＣＲ法に適した前記の緩衝溶液で希釈することができる。回収液にＰＣＲ法に適した緩衝溶液を用いることで、その後のＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができ、好ましい。
【０１２７】
また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解酵素の阻害剤としてはＥＤＴＡなどが上げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。
【０１２８】
また、回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収した核酸溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。２６０ｎｍに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が上げられるがそれに限定されるものではない。
【０１２９】
上記の、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと遠心機、圧力差発生装置、または圧力差発生装置と遠心機とを用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する工程は、工程を自動で行う自動装置を用いて行うことが好ましい。それにより、操作が簡便化および迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、核酸を得ることが可能になる。
【実施例】
【０１３０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）核酸精製カートリッジの作成
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔性膜を収容する部分を持つ核酸分離精製カートリッジ用容器に、核酸吸着性多孔性膜を、上記容器の核酸吸着性多孔性膜を収容する部分に収容し、核酸分離精製カートリッジとした。
核酸吸着性多孔性膜としては、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）が６：４のアセチルセルロース１００質量部に対し有機溶剤としてジクロロメタンとメタノールの混合溶媒（混合比（質量比）８：２）２５０質量部に溶解した液を平面状に流延し、有機溶剤を蒸発させることで、多孔性膜（膜厚＝７０μｍ、平均孔径＝５．０μｍ）とした。この核酸吸着性多孔性膜を２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムの水溶液に２０分間浸漬することで鹸化処理を行い（鹸化度約１００％）、上記カートリッジ内に収容した。
上記の鹸化処理の前後で、多孔性膜の平均孔径は５．０μｍから２．５μｍに減少した。
【０１３１】
（２）核酸可溶化試薬及び洗浄液の調製
下記に示す処方の核酸可溶化試薬溶液、洗浄液および回収液を調製した。
【０１３２】
（核酸可溶化試薬溶液）
塩酸グアニジン（ライフテクノロジー社製）      ３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー社製）          １２．１ｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＩＣＮ製）              １０ｇ
蒸留水                                    １０００ｍｌ
（ｐＨ７．０）
【０１３３】
（洗浄液）
ＮａＣｌ                                    １００ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ                              １０ｍｍｏｌ／Ｌ
６５容量％エタノール                      １０００ｍＬ
【０１３４】
[実施例１]（３−１）核酸分離精製操作
人全血検体２００μｌに、核酸可溶化試薬２００μlと、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＴｙｐｅＸＸＩＶ、ＳＩＧＭＡ社製）濃度２０ｍｇ／ｍＬ（２００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）溶液２０μlを添加して、６０℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、エタノール２００μｌを加え攪拌することで、核酸を含む試料溶液を作製した。該核酸を含む試料溶液を、上記（１）で作製した、アセチル化の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化物の核酸吸着性多孔性膜を備えた、核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて該核酸分離精製カートリッジに廃液容器を取り付け、取り付けた廃液容器の方向に遠心力がかかるように遠心機（ＭＸ−１５０：トミー工業（株）製）にセットし、８０００ｒｐｍ、１分間、遠心力を作用させて、注入した該核酸を含む試料溶液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、上記核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口とは異なる開口（以下、「他の開口」と称する。）より排出した。上記核酸分離精製カートリッジを遠心機から外し、廃液容器を取り替えて、該カートリッジの上記一の開口に、表１で作製した洗浄液５００μＬを注入し、上記核酸分離精製カートリッジの取り付けた廃液容器の方向に遠心力がかかるように遠心機（ＭＸ−１５０：トミー工業（株）製）にセットし、８０００ｒｐｍ、１分間、遠心力を作用させて、注入した洗浄液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。上記核酸分離精製カートリッジを遠心機から外し、廃液容器を外し、回収容器を取り付け、該カートリッジの上記一の開口に回収液（滅菌水、ｐＨ７．０）２００μＬを注入し、上記核酸分離精製カートリッジの取り付けた廃液容器の方向に遠心力がかかるように遠心機（ＭＸ−１５０：トミー工業（株）製）にセットし、８０００ｒｐｍ、１分間、遠心力を作用させて、注入した回収液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
【０１３５】
[比較例１]
比較例１として、実施例１で使用した核酸吸着性多孔性膜の代わりに、ガラスフィルター（シリカゲルフィルター、膜厚＝１０００μｍ）を使用する以外は、実施例１と同様に核酸の分離精製を実施した。
【０１３６】
（４−１）核酸の分離精製の確認
実施例１で得られた回収液と、比較例１で得られた回収液を用いてアガロースゲル電気泳動（０．５％アガロース（エチジウムブロマイド含有）、１００Ｖ、３０分）を行った。分子量マーカーとしてλＨｉｎｄIII  ｄｉｇｅｓｔ（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いた。その結果を図１に示す。
【０１３７】
実施例１で得られた回収液と、比較例１で得られた回収液に対して、２６０ｎｍの吸光度を測定し、分離精製したＤＮＡの収量として換算した。その結果は、実施例１で得られた回収液のＤＮＡ量が、８．３、８．８μｇ、比較例１で得られた回収液のＤＮＡ量が、５．９、６．２μｇであった。
【０１３８】
図１の結果と、２６０ｎｍの吸光度から換算したＤＮＡの収量が高いことから、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化物からなる核酸吸着性多孔性膜を備えた核酸分離精製カートリッジと、核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させることによって、核酸を回収効率よく分離精製できることが判る。
【０１３９】
[実施例２]（３−２）核酸分離精製操作
人全血検体２００μｌに、核酸可溶化試薬２００μlと、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＴｙｐｅＸＸＩＶ、ＳＩＧＭＡ社製）濃度２０ｍｇ／ｍＬ（２００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）溶液２０μlを添加して、６０℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、エタノール２００μｌを加え攪拌することで、核酸を含む試料溶液を作製した。該核酸を含む試料溶液を、上記（１）で作製した、アセチル化の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化物の核酸吸着性多孔性膜を備えた、核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口とは異なる開口（以下、「他の開口」と称する。）に圧力差発生装置（真空ポンプ）を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態（−５０ｋｐａ）にし、注入した該核酸を含む試料溶液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、上記核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、上記（２）で調製した洗浄液５００μＬを注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記他の開口に上記の圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態（−５０ｋｐａ）にし、注入した洗浄液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液（滅菌水、ｐＨ７．０）２００μＬを注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記他の開口に上記の圧力差発生装置を結合して、核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態（−５０ｋｐａ）にし、注入した回収液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
【０１４０】
[比較例２]
比較例２として、実施例２で使用した核酸吸着性多孔性膜の代わりに、ガラスフィルター（シリカゲルフィルター、膜厚＝１０００μｍ）を使用する以外は、実施例２と同様に核酸の分離精製を実施した。
【０１４１】
（４−ｂ）核酸の分離精製の確認
実施例２で得られた回収液と、比較例２で得られた回収液に対して、２６０ｎｍの吸光度を測定し、分離精製したＤＮＡの収量として換算した。その結果は、実施例１で得られた回収液のＤＮＡ量が、８．３、８．８μｇ、比較例２で得られた回収液のＤＮＡ量が、５．９、６．２μｇであった。
２６０ｎｍの吸光度から換算したＤＮＡの収量が高いことから、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化物からなる核酸吸着性多孔膜を備えた核酸分離精製カートリッジと、核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にする装置を用いて、核酸を回収効率よく分離精製できることが判る。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】本発明の方法に従って分離精製した実施例１のＤＮＡ、比較例１のＤＮＡおよび分子量マーカーを電気泳動して得られた写真である。
【図１】
2008220380.tif 000002
【手続補正書】
【提出日】平成20年6月11日(2008.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１ａ）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
（２ａ）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び
（３ａ）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程、
を含有する核酸の分離精製方法において、（１ａ）、（２ａ）及び（３ａ）の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、５０００〜１２０００ｒｐｍにて０．２〜５分間遠心力を作用させることにより核酸吸着性多孔性膜に通過させることを特徴とする核酸の分離精製方法。
【請求項２】
（１ａ）、（２ａ）及び（３ａ）の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジに遠心力を作用させて、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させる、請求項１記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３】
核酸吸着性多孔性膜が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る多孔性膜である、請求項１または２に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項４】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物である、請求項３に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項５】
トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の混合比（質量比）が、９９：１〜１：９９である、請求項４に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項６】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物である、請求項３に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項７】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物である、請求項３に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項８】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物である、請求項３に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項９】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る核酸吸着性多孔性膜が、アセチルセルロースを鹸化処理した多孔性膜である、請求項４に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１０】
アセチルセルロースを鹸化処理した後の該アセチルセルロースの鹸化率が、５％以上である、請求項９に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１１】
鹸化処理した後の核酸吸着性多孔性膜の平均孔径が、鹸化処理の前に比べて減少している、請求項９または１０に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１２】
鹸化処理した後の核酸吸着性多孔性膜が、鹸化処理の前に対して平均孔径の比が０．８以下である、請求項９〜１１のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１３】
核酸吸着性多孔性膜が、再生セルロースを含有する多孔性膜である、請求項１〜１２に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１４】
核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜である、請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１５】
親水基を持たない有機材料の多孔性膜への親水基の導入の処理が、多孔性膜に、親水基を有するグラフトポリマー鎖を結合することである、請求項１４に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１６】
核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を親水基を持つ材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜である、請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１７】
親水基を持つ材料が、親水基を有する有機ポリマーである、請求項１６に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１８】
核酸吸着性多孔性膜が、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜である、請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１９】
核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜である、請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２０】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜への親水基の導入の処理が、多孔性膜に、親水基を有するグラフトポリマー鎖を結合することである、請求項１９に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２１】
核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を親水基を持つ材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜である、請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２２】
親水基を持つ材料が、親水基を有する有機ポリマーである、請求項２１に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２３】
親水基が水酸基である、請求項１４〜２２のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２４】
核酸吸着性多孔性膜が、表裏非対称性の多孔性膜である、請求項１〜２３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法を行うための、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジ。
【請求項２６】
請求項１〜２４のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うための、核酸分離精製カートリッジと試薬のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】削除
【補正の内容】