(57)【要約】【目的】タンパク質又はペプチドを高感度に、正確且つ高精度に測定する。【構成】目的タンパク質の修飾基の割合を正確に確定し、それを目的タンパク質を含む試料に添加する。次に、試料を十分精製し、質量分析法等により、修飾基の割合を測定し、試料中目的タンパク質の量を求める。【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾基を有するタンパク質又はペプチドについてはそのままもしくは反応を行って修飾基を増量し、有しないものについては反応を行って修飾し、その修飾基の割合を確定する。そのタンパク質又はペプチドを試料に添加後、混和して完全に均一とする。次に、その試料について目的タンパク質又はペプチドを選択的に含むように精製した後、飾飾基の割合を測定し、もとの試料中に含まれる目的タンパク質又は目的ペプチドの量を求めることを特徴とする、添加法による生体試料中蛋白・ペプチドの定量方法。
【請求項２】
前記修飾基の割合を測定する方法が、クロマトグラフィーであることを特徴とする請求項１記載の添加法による生体試料中蛋白・ペプチドの定量方法。
【請求項３】
前記修飾基の割合を測定する方法が、質量分析法であることを特徴とする請求項１記載の添加法による生体試料中蛋白・ペプチドの定量方法。
【請求項４】
前記質量分析法が同位体希釈質量分析法であることを特徴とする請求項３基際の添加法による生体試料中蛋白・ペプチドの定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、血清、血しょう、血液、尿などの試料中のアルブミン、ヘモグロビン、グロブリン、Ｃ−反応性タンパク、ホルモン等の特定のタンパク質（修飾されたものも含む）やペプチドを正確に求める方法に関する。
【背景技術】
【０００２】総蛋白を定量する方法としては、ビュレット法が広く使われている。これはたんぱく質を総て求める方法であるが、特定の蛋白質、例えば、アルブミン、グロブリン、マイクロアルブミン等を求める方法としては、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフイニテイークロマトグラフィーなどが広く用いられている。アルブミンに関して言えば、ＢＣＤ法、ＢＣＰ法などの発色させて比色法により求められる方法が簡使法として用いられる。また、質量分析法により微量の蛋白質を測定する方法が広く用いられているが、蛋白質の安定同位体の作製が困難であることと、目的蛋白質を損失なく精製することが困難であるため正確さ及び精密さにおいて十分ではない。さらに、マルチイオン化した蛋白質を質量分析法で測定する場合、感度が低下することと、干渉が飛躍的に増大するという問題がある。このように、特定の蛋白質を正確に且つ高精度に求める方法は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】発明者は、構成アミノ酸による蛋白質・ペプチドの定量方法［特願２００５−３５５３９３］を出願し、特定の蛋白質やペプチドを同位体希釈質量分析法により、高感度で、正確かつ高精度に定量する方法について開示した。しかし、この方法では、複雑なマトリックスを有する生体試料中の特定の蛋白質やペプチドを定量する場合、他成分の干渉が除去できない場合が存在する。さらに、目的の蛋白質やペプチドを操作の過程で損失なく回収することは極めて困難な場合が多く存在する。そのような場合でも適用可能な方法を開発することを目的とした。
【発明が解決しようとする手段】
【０００４】本発明のポイントはあらかじめ生体試料に、求めようとする蛋白質／分子中の特定の修飾アミノ基又はその他の修飾基の比率を特願２００５−３５５３９３の方法で確定しておき、それを一定添加後、試料を十分に精製し、目的の蛋白質のみを得る。精製した試料について、再び特願２００５−３５５３９３の方法により特定の修飾アミノ基又はその他修飾基の比率を測定し、計算によりもとの試料中に含まれる目的蛋白質の量を求める。
【０００５】ここで、生体試料とは、血液、血しょう、血清、組織、尿、髄液などを言う。
【０００６】特定の蛋白質では、生体試料中の総ての蛋白質を対象とするが、生体試料から各種クロマトグラフィー、溶媒抽出、分取電気泳動法、超遠心法、限外ろ過法、抗原抗体法などの方法により、分離して、精製することが可能なものに限られる。
【０００７】ペプチドも同じように精製できなければならない。ペプチドについては、もともと生体試料中に存在していたものの他に、蛋白からある一定の反応式により分解して生じたものも本発明の対象に含まれる。
【０００８】本発明で言う精製においては、試料中のアルブミンを例に取ると精製においてその総てを回収する必要はなく、他の蛋白が混入していない画分のみを分取すればよい。この点は本発明の本質をなす部分といえる。
【０００９】一方特願２００５−３５５３９３や、その他の質量分析法では総てを回収しなければならない。総てを回収するとなれば、極めて困難な精製を行わねばならない場合が多く、種々の蛋白質定量に適応する事は難しい。
【００１０】血清試料を例にとり修飾基をグルコースとすると、血清中のアルブミン濃度をＡｘ、その糖化割合をＧｘ，サンプリング量をＷｘとする。糖化割合を求めたアルブミン標準液の濃度をＡｓ、その糖化割合でＧｓ，サンプリング量をＷｓとすると、両者を混合して均一とした試料の糖化割合Ｇｍは
Ｇｍ  ＝Ａｘ・Ｇｘ・Ｗｘ＋Ａｓ・Ｇｓ・Ｗｓ
Ａｘ・Ｗｘ＋Ａｓ・Ｗｓ
となる。  よって
Ａｘ  ＝  Ａｓ・Ｗｓ（Ｇｍ−Ｇｓ）
Ｗｘ（Ｇｘ−Ｇｍ）
となり、この式により、血清中のアルブミン濃度Ａｘが求まる。
【発明の効果】
【００１１】本発明では、直接定量を行うのは修飾したアミノ酸であり、質量分析においては一価の分子イオンが測定対象となるので、極めて高感度であり、且つ干渉は小さい。他のエレクトロンスプレーイオン化法による質量分析では、蛋白のマルチイオンが測定対象となるので、感度が低く干渉は飛躍的に増大する。また、あらかじめ修飾蛋白を添加するので、これが内標準となり精製による損失が補正されるので、十分な精製が可能である。このように、本法により高感度に、正確且つ高精度に蛋白質を測定できるようになった。
【実施例１】
【００１２】（１）アルブミン標準液の調製とそのアルブミン濃度と糖化割合の測定
溶離液（２２０ｍＭ  塩化マグネシウムを含む５０ｍＭグリシン緩衝液  ｐＨ８．５）で３倍に希釈した血清５００μＬをイオン交換カラム（Ｓｈｏｄｅｘ  ＡｓａｈｉｐａｃｋＥＳ−５０２Ｎ  ２０Ｃ）注入し，流量５ｍＬ／ｍｉｎ、波長２８０ｎｍでモニターしながら保持時間５〜７分のアルブミン分画１０ｍＬを分取した。次に遠心限外ろ過フィルター（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ３０，０００ＣＵＴ）により分子量３万以下の成分を水で洗浄除去して、濃度約１０ｍｇ／ｍＬ（ＢＣＧ比色法で測定）アルブミン溶液５００μＬを得、これをアルブミン標準液とした。Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ電気泳動法ではアルブミンのシングルバンドのみが検出され、また分析専用イオン交換カラムを用いたＨＰＬＣ測定の結果から標準液のアルブミン純度は９８％以上であると確認できた。このアルブミン標準液１００ｍｇ（アルブミン約１５ｎｍｏＬ）と５０ｐｍｏＬ／ｍｇ１３Ｃ６−グルコース糖化リジン１００ｍｇ、１０μｍｏＬ／ｍｇＤ４−リジン１００ｍｇの２種類のスパイク用の安定同位体化合物溶液、それぞれを１本の封菅用のガラス管に精秤して十分に混合した。ついで５０ｍＭ水素化ホウ素ナトリウム３０ｕＬを加え室温で３時間かけて糖化リジン基を水素化して化学的に安定なヘキシトールリジン基としたものに、１０ｍｏＬ／Ｌ塩酸４００ｕＬと水を加え溶液中の塩酸濃度を５ｍｏＬ／Ｌに調整した。ガラス管内を窒素ガスで十分にパージしてから減圧状態でガスバーナーにより封管後、１１０℃に設定した加温器内で２０時間保持してアルブミンのペプチド結合を完全に加水分解した。加水分解が終了して開封したガラス管を真空遠心濃縮機に入れ、５０℃に加温して１５００ＲＰＭで約３時間かけて塩酸と水を揮発除去した得られた乾固物を、０．０６％ＨＦＢＡ（ヘプタフルオロ酪酸）５００ｕＬに溶解したものをＬＣ／ＭＳ測定溶液とした。アルブミンに含まれる自然界の同位体組成の糖化リジンとスパイクした安定同位体化合物の糖化リジンのヘキシトールリジン基にプロトンが付加した各々Ｍ／Ｚ＝３１１．２，Ｍ／Ｚ＝３１７．２のＳＩＭピークの面積比をＬＣ／ＭＳで測定した。また同時に、リジンについてはリジン基にプロトンが付加した各々Ｍ／Ｚ＝１４７．２，Ｍ／Ｚ＝１５１．２のＳＩＭピークの面積比をＬＣ／ＭＳで測定した。高純度の糖化リジン（純度９８％以上）と高純度のリジン（シグマ社、純度９８％以上）を水に溶解して調製した混合標準液（３５ｐｍｏＬ／ｍｇ糖化リジン＋１０μｍｏＬ／ｍｇリジン）に、５０ｐｍｏＬ／ｍｇ１３Ｃ６−グルコース糖化リジンと１０μｍｏＬ／ｍｇＤ４−リジンの２種類のスパイク用の安定同位体化合物溶液それぞれを精秤して加え、各々５種の同位体比組成（糖化リジンの同位体比０．５，１．０，１．５，２．０、２．５、リジンの同位体比０．８，０．９，１．０，１．１，１．２）の検量溶液について、前記と同様にＳＩＭピークの面積比を測定した。得られた検量線から、アルブミン標準液のリジン及び糖化リジンのモル濃度を求めた。またアルブミンのモル濃度は得られたリジンのモル濃度を５９（アルブミン１分子当たりのリジン基の数）で除して求めた。さらに、糖化割合は糖化リジンモル濃度をアルブミンのモル濃度で除して算出した。
（２）血清試料中の糖化割合の測定
前記（１）と同様に、血清試料からアルブミンを精製してその糖化リジン及びアルブミンを測定し糖化割合を求めた。
（３）血清試料とアルブミン標準液の混合液の糖化割合の測定
前記（１）で調製したアルブミン標準液を用いて、本発明で血清試料中のアルブミンを定量するためには、両者の糖化割合（糖化リジン／アルブミン）の値ができるだけ大きく異なる必要がある。つまり、糖化割合が正常域（２０〜４０モル％）の血清試料を定量するには、アルブミン標準液の方を本実施例のように８０モル％程度に大きくしておくと本発明が適用できる。一方、糖化割合が大きい糖尿病患者の血清試料などを定量するには、糖化割合が正常域程度の低いアルブミン標準液を用いる。血清試料１００ｍｇとアルブミン標準液２００ｍｇをそれぞれ精秤して十分に混和したものを、前記（１）と同様に処理して濃度約１０ｍｇ／ｍＬの精製アルブミン試料０．４ｍＬを得た。この精製アルブミン試料１００ｍｇ（アルブミン約１５ｎｍｏＬ）を用いて、前記（１）と同様に糖化リジン及びアルブミンを測定し糖化割合を求めた。
（４）血清試料中のアルブミン定量結果
５種類の血清試料（いずれも糖化割合は正常域）を本法で測定して（式２）を用いて定量した結果と日常検査法であるＢＣＧ法の測定値は５％以内で一致した。