(57)【要約】      （修正有）【課題】高温耐性又は増殖性を回復した酵母の製造方法、及びβ−グルカンを高効率に産生する酵母の製造方法、並びにそのような製造方法により得られた酵母を提供する。【解決手段】酵母の遺伝子破壊株におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程（例えば、変異型ｐｏｌ３遺伝子や変異型ｃｄｃ６−遺伝子を遺伝子破壊株に導入する工程）を含む、高温耐性又は増殖性を回復した酵母の製造方法、及びβ−グルカンを高効率に産生する酵母の製造方法。【選択図】図１
2008220172.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母の遺伝子機能欠損株におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程を含む、高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母の製造方法。
【請求項２】
酵母の遺伝子機能欠損株におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程を含む、β−グルカンを高効率に産生する酵母の製造方法。
【請求項３】
前記酵母の遺伝子機能欠損が、遺伝子破壊によるものであり、前記酵母の遺伝子機能欠損株が酵母の遺伝子破壊株である請求項１又は２に記載の酵母の製造方法。
【請求項４】
前記酵母の遺伝子機能欠損が、遺伝子変異によるものであり、前記酵母の遺伝子機能欠損株が酵母の遺伝子変異株である請求項１又は２に記載の酵母の製造方法。
【請求項５】
前記酵母が、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１又は２に記載の酵母の製造方法。
【請求項６】
前記酵母が、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）である、請求項１又は２に記載の酵母の製造方法。
【請求項７】
前記酵母の遺伝子破壊株が、｛ｏｃｈ１破壊、ｍｎｎ１破壊、ｍｎｎ４破壊、及びａｌｇ３破壊｝からなる群から選ばれるひとつ又は２つ以上の破壊を有する株である、請求項３に記載の酵母の製造方法。
【請求項８】
前記酵母の遺伝子変異株が、｛ｏｃｈ１変異、ｍｎｎ１変異、ｍｎｎ４変異、及びａｌｇ３変異｝からなる群から選ばれるひとつ又は２つ以上の変異を有する株である、請求項４に記載の酵母の製造方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程は、酵母の遺伝子機能欠損株におけるＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度を調節する工程を含む、請求項１又は２に記載の酵母の製造方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程は、酵母の遺伝子機能欠損株におけるＰｏｌ３のアミノ酸配列を改変する工程を含む請求項１又は２に記載の酵母の製造方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程は、酵母の遺伝子機能欠損株におけるＣｄｃ６のアミノ酸配列を改変する工程を含む、請求項１又は２に記載の酵母の製造方法。
【請求項１２】
前記酵母の遺伝子破壊株は、ｏｃｈ１破壊、ｍｎｎ１破壊、及びｍｎｎ４破壊が導入された出芽酵母の遺伝子破壊株であり、前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程は、前記酵母の遺伝子破壊株に、配列番号２で示されるＰＯＬ３遺伝子における９６２番目の塩基がＡからＣに置換され、９６８番目の塩基がＡからＣに置換されたＤＮＡを形質転換する工程を含む、請求項３に記載の酵母の製造方法。
【請求項１３】
前記酵母の遺伝子破壊株が、ｏｃｈ１破壊が導入された分裂酵母の遺伝子破壊株であり、  前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程は、前記酵母の遺伝子破壊株に、配列番号８で示されるｃｄｃ６＋遺伝子における８９８番目から９０６番目の塩基ＧＡＴ  ＡＴＴ  ＧＡＡが、ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＧＣＴに置換されたＤＮＡを形質転換する工程を含む、  請求項３に記載の酵母の製造方法。
【請求項１４】
前記高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母は、  哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質を産生する出芽酵母又は分裂酵母である、  請求項１に記載の酵母の製造方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の酵母の製造方法により得られた酵母を培地で培養し、糖タンパク質を生成させ、前記培養物から前記糖タンパク質を採取する糖タンパク質の製造方法。
【請求項１６】
請求項２に記載の酵母の製造方法により得られた酵母を培地で培養し、β−グルカンを生成させ、前記培養物から前記β−グルカンを採取するβ−グルカンの製造方法。
【請求項１７】
酵母の遺伝子機能欠損株におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程を含む、高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母の製造方法により得られた酵母。
【請求項１８】
酵母の遺伝子機能欠損株におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程を含む、β−グルカンを高効率に産生する酵母の製造方法により得られた酵母。
【請求項１９】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５５」として寄託されている酵母。
【請求項２０】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５６」として寄託されている酵母。
【請求項２１】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１４５」として寄託されている酵母。
【請求項２２】
請求項３〜１４のいずれかに記載の方法で製造された酵母、又は請求項１７及び１９〜２１のいずれかに記載の酵母を用いた糖タンパク質の製造方法。
【請求項２３】
請求項３〜１３のいずれかに記載の方法で製造された酵母、又は請求項１８〜２１のいずれかに記載の酵母を用いたβ−グルカンの製造方法。
【請求項２４】
酵母の遺伝子機能欠損株におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程を含む、外来遺伝子の発現能を有する酵母の製造方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の酵母の製造方法により得られた酵母。
【請求項２６】
請求項２４に記載の酵母の製造方法により得られた酵母を培地で培養し、外来遺伝子を発現させて外来タンパク質を生成させ、前記培養物から前記外来タンパク質を採取する外来タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母の遺伝子破壊株などの遺伝子機能欠損株のＤＮＡポリメラーゼにおける校正機能を制御して、望ましい変異を惹起することにより、高温感受性を回避又は増殖性などを回復した酵母の製造方法、及びそのような製造方法を用いて得られた酵母などに関する。より詳しく説明すると、本発明は、哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質産生能を有する出芽酵母、又は分裂酵母等の酵母の遺伝子機能欠損株を用い、そのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を改変し変異を惹起することにより、高温感受性を回避又は増殖性などを回復した酵母や外来遺伝子の発現能を有する酵母を得るための製造方法などに関する。
【０００２】
また、本発明は、酵母の遺伝子破壊株などの遺伝子機能欠損株のＤＮＡポリメラーゼにおける校正機能を制御して、望ましい変異を惹起することにより、多糖類（特にβ−グルカン）を高効率に産生する酵母の製造方法、及びそのような製造方法を用いて得られた酵母などに関する。より詳しく説明すると、本発明は、哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質産生能を有する酵母の遺伝子機能欠損株を用い、そのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を改変し変異を惹起することにより、機能性食品や医薬品の有効成分として用いられているβ−グルカンを高効率に細胞壁に含有する酵母を得るための製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００３】
糖鎖を有する糖タンパク質は、生体内で重要な機能を有するものが多い。また、糖タンパク質から糖鎖を除くと生物活性を示さなくなることが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）や組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）などで明らかにされている（木幡陽“タンパク質核酸酵素”Ｖｏｌ.３６，p７７５(１９９１)；竹内誠“生化学”ｖｏｌ.６２，p１２７２(１９９０)）。このことから、糖タンパク質における糖鎖は、生物活性に重要な役割を担っているといえる。よって、糖タンパク質を効果的に生産することは、医薬品などを開発する上で望ましい。
【０００４】
糖タンパク質を産生する場合、遺伝学や分子生物学的技術を適用できるという点や、外来異種タンパク質生産能が高い単細胞真核生物であるという点で、酵母を用いることが考えられる。一方、酵母により産生される糖鎖は、多くのマンノースが付加した構造を有しているため、高等動物体内で強い抗原性を示す。このため、酵母により産生された糖タンパク質は、特に経血管的に投与される医薬用には、必ずしも適切ではないという問題がある。このような問題を解決するため、遺伝子破壊により抗原性をなくした糖鎖（ヒト型糖鎖）を生産する酵母株が構築された（例えば、特開平６−２７７０８６号公報、特開平７−２９９５０９号公報、及び特開２００１−１６１３７６号公報を参照のこと）。
【０００５】
特に、国際公開ＷＯ０１／０１４５２２号パンフレット（下記特許文献１を参照）には、ｏｃｈ１破壊（Δｏｃｈ１）、ｍｎｎ１破壊（Δｍｎｎ１）及びｍｎｎ４破壊（Δｍｎｎ４）を有する三重破壊株が開示されている。すなわち、酵母に特異的な外糖鎖の生合成に関与する遺伝子のうち、初発の延長付加反応を行うα−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＯＣＨ１）、糖鎖の非還元末端にマンノースを付加するα−１，３マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＭＮＮ１）、及びマンノース−１−リン酸の付加を制御する遺伝子（ＭＮＮ４）の機能を破壊するか、それらの遺伝子に何らかの変異を導入した酵母変異株が開示されている。これらの酵母株は、哺乳類型の糖鎖を含有する糖タンパク質の産生に優れるので、機能性食品や医薬品の開発などに有用であると考えられる。
【０００６】
しかしながら、遺伝子破壊株は、野生株に比べると温度感受性を示し、たとえば、３７℃において増殖しないなど高温感受性であり増殖性に乏しい。その結果、遺伝子破壊株は、野生株に比べて生育不良を示し、更にタンパク質産生能が低いという問題がある。
【０００７】
ところで、多糖類の一種であるβ−グルカンは、体内の感染細胞やガン細胞を攻撃するマクロファージや、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、キラーＴ細胞を活性化させ、免疫力・抵抗力を増強させる作用を有することが知られている。この免疫増強作用により、身体の中に侵入した細菌や異物の排除能が高まり、仮に感染したとしても発病を抑制する抵抗力が得られる。また、このように免疫力が高まることにより、アレルギー反応を鎮め、ガンなどの腫瘍を抑える効果も期待でき、実際にさまざまな臨床試験によって抗腫瘍性などが明らかにされている。さらには、血糖値の低下、利尿作用、血圧調整、血中コレステロールと中性脂肪値の低下といった効果も得られる。
【０００８】
酵母（特にパン酵母）は、古くから発酵食品などに用いられており、食品として極めて安全である。パン酵母は、細胞壁中に通常約４５％程度のβ−グルカンを含むため、免疫増強効果にターゲットを絞った健康補助食品として商品化されている。パン酵母のβ−グルカンは、主に細胞壁から抽出することによって利用されている。パン酵母由来のβ−グルカンは、既にザイモサンとして米国で医薬品として販売されている。
【０００９】
酵母の細胞壁からより多くのβ−グルカンを取得するためには、酵母を大量に培養することが必要となる。また培養後は、β−グルカンの高効率な抽出作業が必要となるが、この操作は特別な技術を要するため容易ではない。よって、このような行程をできるだけ省略化し、より一層簡便かつ安価に酵母由来β−グルカンを生産し得る方法の開発が望まれている。
【００１０】
一方、１つの大腸菌細胞内に、忠実度の異なる２種類以上のＤＮＡポリメラーゼを共存させることにより、突然変異を誘発する突然変異誘発方法が知られている（特開２００２−２６２８７５号公報）。
【００１１】
また、国際公開ＷＯ００／０２８０１５号パンフレット（下記特許文献２）には、“細胞または生物個体の二重鎖ゲノムＤＮＡの一方の鎖に他方よりも多く点突然変異を導入することを特徴とする遺伝子への突然変異導入方法”（同公報の請求項１）が開示されている。同公報では、“ＤＮＡ鎖の一方に他方より多くのランダムな点突然変異を多く蓄積させることにより、突然変異率を上げつつ変異処理細胞や生体個体の絶滅の危険性を低下させて効率的、効果的に突然変異体を得る”旨が記載されている（同公報の第９頁下から３行目以降）。しかしながら、同公報では大腸菌を用いた実施例があるものの、酵母を用いた実施例はない。したがって、同公報に開示された技術を酵母に応用した場合に、どのような突然変異が惹起されるかについては、必ずしも明らかではない。
【００１２】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０１／０１４５２２号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ００／０２８０１５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
前述のとおり、一般的に酵母の遺伝子破壊株又は遺伝子変異株などのいわゆる遺伝子機能欠損株においては高温感受性や増殖性の低下など生育性における負の形質が認められることが多いので、本発明は、高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母の製造方法、及びそのような製造方法により得られた酵母を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明は、哺乳類型の糖鎖を有する糖タンパク質の産生能を有する遺伝子破壊株又は遺伝子変異株などの遺伝子機能欠損株において、高温感受性を回避するか、又は増殖性を回復し、高温耐性及びタンパク質産生能に優れた酵母を製造する方法などを提供することを目的とする。
【００１５】
本発明は、上記のような高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母の製造方法を用いた哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【００１６】
また前述のとおり、より一層簡便かつ安価に酵母由来β−グルカンを生産し得る方法の開発が望まれているため、本発明は、β−グルカンを高効率に産生する酵母の製造方法、及びそのような製造方法により得られた酵母を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明は、上記のようなβ−グルカンを高効率に産生する酵母の製造方法を用いた、β−グルカンの製造方法を提供することを目的とする。
【００１８】
本発明は、外来遺伝子の発現能を有する酵母の製造方法、及びそのような製造方法を用いた外来タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、基本的には、酵母の遺伝子破壊株又は遺伝子変異株などの遺伝子機能欠損株におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御することにより、有益な変異を惹起し、そのような有益な変異を繰り返す結果、哺乳類型の糖鎖を有しつつ、増殖遅延を回復し、高温耐性及びタンパク質産生能に優れた酵母、及びβ−グルカン産生能に優れた酵母の新規変異株を製造できたという、実験による知見に基づく。すなわち、本発明は、校正機能の制御に関与する変異を導入したｐｏｌ３遺伝子やｃｄｃ６−遺伝子を酵母内で発現させ、培養を繰り返すことによって、タンパク質生産及びβ−グルカン産生能に適した酵母を得ることができるという知見に基づくものである。
【００２０】
すなわち、本発明の第一の側面は、酵母の遺伝子破壊株や遺伝子変異株などの遺伝子機能欠損株におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程を含む、高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母の製造方法、及びβ−グルカンを高効率に産生する酵母の製造方法に関する。本発明の好ましい態様は、前記酵母が、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、上記に記載の酵母の製造方法である。本発明の好ましい態様は、前記酵母が、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）である、上記に記載の酵母の製造方法である。実施例により実証されたとおり、酵母の遺伝子破壊株（特にｏｃｈ１遺伝子破壊株など）におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御することで、高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母、特にβ−グルカンを高効率に産生する酵母を製造できる。
【００２１】
本発明の好ましい態様は、前記酵母の遺伝子破壊株が、｛ｏｃｈ１破壊、ｍｎｎ１破壊、ｍｎｎ４破壊、及びａｌｇ３破壊｝からなる群から選ばれるひとつ又は２つ以上の破壊を有する株であるか、又は｛ｏｃｈ１変異、ｍｎｎ１変異、ｍｎｎ４変異、及びａｌｇ３変異｝からなる群から選ばれるひとつ又は２つ以上の変異を有する株である、上記いずれかに記載の酵母の製造方法である。すなわち、実施例により実証されたとおり、糖鎖の伸長に関するｏｃｈ１などの遺伝子を破壊した遺伝子破壊株を用いると、哺乳類型タンパク質の産生能を発揮しつつ高温感受性を回避し、又は増殖性を回復した酵母、特にβ−グルカンを高効率に産生する酵母を得ることができる。
【００２２】
本発明の好ましい態様は、前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程は、酵母の遺伝子破壊株又は遺伝子変異株などの遺伝子機能欠損株におけるＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度を調節する工程を含む上記いずれかに記載の酵母の製造方法であり、より具体的には、出芽酵母の遺伝子破壊株などの遺伝子機能欠損株におけるＰｏｌ３（たとえば、配列番号１に記載のポリペプチド）のアミノ酸配列を改変する工程を含む上記いずれかに記載の酵母の製造方法である。また、本発明の好ましい態様は、分裂酵母の遺伝子破壊株などの遺伝子機能欠損株におけるＣｄｃ６（たとえば、配列番号７に記載のポリペプチド）のアミノ酸配列を改変する工程を含む上記いずれかに記載の酵母の製造方法である。
【００２３】
本発明の好ましい態様は、実施例により実証されたとおり、前記酵母の遺伝子破壊株は、ｏｃｈ１破壊、ｍｎｎ１破壊、及びｍｎｎ４破壊が導入された出芽酵母の遺伝子破壊株であり、前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程は、前記酵母の遺伝子破壊株に、配列番号２で示されるＰＯＬ３遺伝子における９６２番目の塩基がＡからＣに置換され、９６８番目の塩基がＡからＣに置換されたＤＮＡを形質転換する工程を含む上記いずれかに記載の酵母の製造方法に関する。この態様については、後述する実施例により出芽酵母を用いて実証されたので、酵母一般について用いることができると考えられる。
【００２４】
また、本発明の他の好ましい態様は、実施例により実証されたとおり、前記酵母の遺伝子破壊株は、ｏｃｈ１破壊が導入された分裂酵母の遺伝子破壊株であり、前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程は、前記酵母の遺伝子破壊株に、配列番号８で示されるｃｄｃ６＋遺伝子における８９８番目から９０６番目の塩基ＧＡＴ  ＡＴＴ  ＧＡＡが、ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＧＣＴに置換されたＤＮＡを形質転換する工程を含む上記いずれかに記載の酵母の製造方法に関する。ｏｃｈ１破壊が導入された分裂酵母の遺伝子破壊株は、ｏｃｈ１破壊のみが導入されたものであってもよいし、たとえば、さらに｛ｍｎｎ１破壊、ｍｎｎ４破壊、及びａｌｇ３破壊｝からなる群から選ばれるひとつ又は２つ以上の破壊を有する株であるか、又は｛ｏｃｈ１変異、ｍｎｎ１変異、ｍｎｎ４変異、及びａｌｇ３変異｝からなる群から選ばれるひとつ又は２つ以上の変異を有する株であってもよい。
【００２５】
本発明の好ましい態様は、前記高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母は、哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質を産生する出芽酵母又は分裂酵母である、上記いずれかに記載の酵母の製造方法に関する。
【００２６】
本発明の好ましい利用態様は、上記いずれかに記載の酵母の製造方法により得られた酵母を培地で培養し、糖タンパク質を生成させ、前記培養物から前記糖タンパク質を採取する、糖タンパク質の製造方法に関する。このような製造方法を用いて得られた糖タンパク質は、例えば、哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質であり、医薬等に有効に利用されうる。この利用態様における酵母として出芽酵母又は分裂酵母があげられる。  同様に、本発明の好ましい利用態様は、上記いずれかに記載の酵母の製造方法により得られた酵母を培地で培養し、β−グルカンを生成させ、前記培養物から前記β−グルカンを採取するβ−グルカンの製造方法に関する。このような製造方法を用いて得られたβ−グルカンは、例えば、各種機能性食品や医薬等に有効に利用されうる。この利用態様における酵母として出芽酵母又は分裂酵母があげられる。
【００２７】
本発明の第二の側面は、酵母の遺伝子破壊株又は遺伝子変異株などの遺伝子機能欠損株におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程を含む、高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母の製造方法により得られた酵母、及び、酵母の遺伝子機能欠損株におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程を含む、β−グルカンを高効率に産生する酵母の製造方法により得られた酵母に関する。この酵母は、高温感受性を回避又は増殖性を回復し、β−グルカンを高効率に産生するものであり、遺伝子破壊株などの遺伝子機能欠損株であるにもかかわらず、良好な増殖性などを有する。この利用態様における酵母として出芽酵母又は分裂酵母があげられる。
【００２８】
具体的な酵母として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６
茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター 中央第６）に、受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５５」、「ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５６」又は「ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１４５」として寄託されている酵母があげられる。これらの酵母は、高温感受性を回避又は増殖性を回復したものであり、これらの酵母を用いれば哺乳類に類似したタンパク質を製造することができる。また、これらの酵母はβ−グルカンを高効率に産生するものである。すなわち、本発明は、上記したいずれかの方法で製造された酵母、又は「ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５５」、「ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５６」又は「ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１４５」として寄託されている酵母を用いた、糖タンパク質の製造方法、又はβ-グルカンの製造方法をも提供する。
【００２９】
本発明の第三の側面は、上記いずれかの酵母の製造方法により製造された酵母、又は上記いずれかの酵母を用いた糖タンパク質の製造方法、又はβ−グルカンの製造方法に関する。実施例によって実証されたとおり、これらの酵母は、優れた糖タンパク質産生能と、優れたβ−グルカンの産生能を有するので、これらの酵母を用いることで、効果的に糖タンパク質又はβ−グルカンを製造することができる。
【００３０】
本発明の第四の側面は、酵母の遺伝子破壊株又は遺伝子変異株などの遺伝子機能欠損株におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程を含む、外来遺伝子の発現能を有する酵母の製造方法に関する。すなわち、酵母を用いてヒト由来遺伝子などの外来遺伝子を発現させ、外来タンパク質を得ることができれば、医薬品の開発などに有効であるが、実施例により実証されたとおり、本発明では、外来遺伝子の発現能を有する酵母をも製造することができる。なお、この側面に係る発明は、第一の側面に係る発明と同様の様々な利用態様を採用できる。この利用態様における酵母として出芽酵母又は分裂酵母があげられる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母遺伝子破壊株（又は遺伝子変異株）などの遺伝子機能欠損株の製造方法、及びそのような製造方法により得られた酵母を提供することができる。
【００３２】
本発明によれば哺乳類型の糖鎖を有する糖タンパク質の産生能を維持しつつ、増殖遅延を回復し、高温耐性及びタンパク質産生能に優れた酵母の新規変異株及びそのような変異株を製造する方法を提供できる。
【００３３】
本発明によれば、上記のような高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母の製造方法を用いた哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質の製造方法を提供できる。
【００３４】
本発明によれば、β−グルカンを高効率に産生する酵母遺伝子破壊株（又は遺伝子変異株）の製造方法、及びそのような製造方法により得られた酵母を提供することができる。
【００３５】
本発明によれば、上記のようなβ−グルカンを高効率に産生する酵母の製造方法を用いたβ−グルカンの製造方法を提供できる。
【００３６】
本発明によれば、外来遺伝子の発現能を有する酵母の製造方法、及びそのような製造方法を用いた外来タンパク質の製造方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明の第一の側面は、酵母の遺伝子破壊株又は遺伝子変異株などの遺伝子機能欠損株を用い、ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程を含む、高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母の製造方法、及び、β−グルカンを高効率に産生する酵母の製造方法に関する。そして、本発明の第二の側面はその製造方法に従って製造された酵母に関する。さらに、本発明の好ましい形態は、そのような酵母の製造方法を含む、哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質、又はβ−グルカンの製造方法である。なお、本明細書において、「遺伝子機能欠損株」とは、遺伝子破壊及び遺伝子変異のいずれか又は両方が導入された株を意味する。なお、遺伝子破壊及び遺伝子変異の両方が導入された株であっても、遺伝子破壊株又は遺伝子変異株に含まれる。
【００３８】
本発明に用いる酵母は、一般的に酵母とよばれるものであれば特に限定されず、出芽酵母、分裂酵母などを適宜用いることができる。代表的な酵母として、サッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、又はシゾサッカロミセス科（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）に属するものがあげられる。より具体的な酵母として、真核生物のモデル生物として汎用されており、出芽酵母の一種であるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及び分裂酵母の一種であるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）があげられる。本発明に用い得る他の酵母としては、例えば、黒酵母（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）があげられる。これらの中では、実施例で実証された出芽酵母や分裂酵母が好ましいが、本発明は特に出芽酵母や分裂酵母に限定されず、酵母全般に広く適用できる。特に、分裂酵母については、出芽酵母と同様、所定の遺伝子を破壊することで、糖鎖へのマンノースの付加を効果的に防止し、哺乳類型の糖鎖を有する糖タンパク質を産生できることが知られている（Ｔａｋｅｈｉｋｏ  Ｙｏｋｏ−ｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４８９（２００１）７５−８０；Ｃｌｉｎｔｏｎ  Ｅ．  Ｂａｌｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｖｏｌ．９１．ｐｐ９３２７−９３３１，１９９４；Ｎａｏｔａｋａ  Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３３０（２００５）８１３−８２０；Ｓａｎｄｒａ  Ｆａｎｃｈｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １４３，  Ｎｏ．３，  １９８８，ｐｐ６２５−６３６）。また、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓについては、例えば、Ｗｏｕｔｅｒ  Ｖｅｒｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ７０，  Ｎｏ．５，２００４，ｐｐ２６３９−２６４６に記載され、ｙｅａｓｔ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａについては、例えばＳｔｅｐｈｎｉｅ  Ｂａｒｎａｙ−Ｖｅｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００４），１５０，ｐ２１８５−２１９５に記載されている。そして、本発明において、突然変異を導入するために改変するＤＮＡポリメラーゼの校正機能に関与する遺伝子は、糖鎖に関する遺伝子とはそれほど関連が強くないと考えられるので、これらの文献に開示される遺伝子破壊株、又はそれらの遺伝子破壊株から当業者が容易に得ることができる遺伝子破壊株に対して、ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を調整することで、本発明の実施例と同様に高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母を得ることができると考えられる。
【００３９】
本発明に用いる酵母の遺伝子破壊株は、野生型酵母における何らかの遺伝子を破壊した株であれば特に限定されない。何らかの遺伝子を破壊した株は、一般的に野生型酵母に比べて、高温耐性や増殖性などが低下する。本発明によれば、ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御することで突然変異を導入し、遺伝子破壊により低下した機能を回復した株を提供できる。さらには、ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御して、突然変異を導入することで、野生株には見られない、又は野生株では乏しかった機能を発揮させることができる。後述するとおり、実施例では、出芽酵母の三重破壊株及び分裂酵母の三重破壊株を用いて高温感受性を回避し、増殖性などが回復されることを示したが、上記のとおり本発明は、出芽酵母や分裂酵母の三重破壊株に限定されず様々な酵母の遺伝子破壊株に用いることができる。以下、具体的な遺伝子破壊株を説明する。
【００４０】
特許第３０９１８５１号公報には、ＯＣＨ１遺伝子破壊株（Δｏｃｈ１）にｍｎｎ１破壊を有する二重破壊株（Δｏｃｈ１  ｍｎｎ１）が開示されている（例えば、同公報の実施例１を参照）。すなわち、本発明に用いる酵母の遺伝子破壊株が二重破壊株（Δｏｃｈ１  ｍｎｎ１）である場合、そのような二重破壊株は、同公報に記載の方法に従って得ればよい。そして、同公報によれば、そのような二重破壊株を用いれば、ヒトなど哺乳類細胞の生産する高マンノースと同一のコア型糖鎖、あるいはこの糖鎖構造をもつ高マンノース型糖タンパク質を多量かつ純度よく生産することができるとされている。本発明の酵母の製造方法において、この二重破壊株を用いれば、高温感受性を回避し、増殖性などが回復されるので、効果的に哺乳類細胞の生産する高マンノースと同一のコア型糖鎖などを産生できると考えられる。なお、同公報には、破壊株（Δｏｃｈ１  ｍｎｎ１  ｈｉｓ１及び／又はｈｉｓ３）なども開示されており、本発明の酵母の遺伝子破壊株には、それらを含んでもよい。
【００４１】
特許第３０９１８５１号公報には、ｏｃｈ１破壊、ｍｎｎ１破壊、及びｍｎｎ６破壊を持つ三重破壊株（Δｏｃｈ１  ｍｎｎ１  ｍｎｎ６）が開示されている（例えば、同公報の実施例１を参照）。すなわち、本発明に用いる酵母の遺伝子破壊株が三重破壊株（Δｏｃｈ１  ｍｎｎ１  ｍｎｎ６）などである場合、それらの株は、同公報に記載の方法に従って得ればよい。そして、同公報によれば、そのような三重破壊株などを用いることで、ヒトなど哺乳類細胞の生産する高マンノースと同一のコア型糖鎖、あるいはこの糖鎖構造をもつ高マンノース型糖タンパク質を多量かつ純度よく生産することができるとされている。本発明の酵母の製造方法において、これらの株を用いれば、高温感受性を回避し、増殖性などが回復されるので、効果的に哺乳類細胞の生産する高マンノースと同一のコア型糖鎖などを産生できると考えられる。なお、同公報には、破壊株（Δｏｃｈ１、ｍｎｎ１、ｍｎｎ６、ｈｉｓ１及び／又はｈｉｓ３、ｕｒａ３）なども開示されており、本発明の酵母の遺伝子破壊株には、それらを含んでもよい。さらに、同公報に開示された技術に従って、ＯＣＨ１遺伝子及びＭＮＮ１遺伝子を破壊した二重破壊株を得ることができる。
【００４２】
また、特開平９−２６６７９２号公報には、Δｏｃｈ１  Δｍｎｎ１破壊の他に、ＭＮＮ４遺伝子及びＫＲＥ２遺伝子の機能を破壊した四重破壊株が開示されている。同公報に開示されるように、たとえば、接合型の異なる変異株や遺伝子破壊株を接合させて、生成する２倍体細胞を窒素源を欠乏させた胞子形成培地[例えば、Ｆ．Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１９４，ｐ．１７（１９９１）参照]に移すことにより、減数分裂させ、これによって生成する４つの胞子を顕微鏡下で個別に分離し、その表現型を調べることにより、様々な変異株を作成することができる。
【００４３】
国際公開ＷＯ０１／０１４５２２号パンフレット（特許文献１）には、ｏｃｈ１破壊（Δｏｃｈ１）、ｍｎｎ１破壊（Δｍｎｎ１）及びｍｎｎ４破壊（Δｍｎｎ４）を有する三重破壊株が開示されている。すなわち、酵母に特異的な外糖鎖の生合成に関与する遺伝子のうち、初発の延長付加反応を行うα−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＯＣＨ１）、糖鎖の非還元末端にマンノースを付加するα−１，３マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＭＮＮ１）、及びマンノース−１−リン酸の付加を制御する遺伝子（ＭＮＮ４）の機能を破壊した遺伝子破壊酵母株が開示されている。本発明の実施例で用いたＴＩＹ２０は、同文献に開示されるＴＩＹ１９とｍａｔが異なるものであって、同じクローンから四分子分析によって得られるものである。四分子分析については、例えば、Ｄａｎ  Ｂｕｒｋｅら（大矢禎一ら訳）酵母遺伝子実験マニュアル、丸善株式会社平成１４年１２月１０日発行などに記載される方法に従って行うことができる。
【００４４】
国際公開ＷＯ０１／０１４５２２号パンフレット（特許文献１）には、ｏｃｈ１破壊、ｍｎｎ１破壊、ｍｎｎ４破壊及びａｌｇ３破壊を含む破壊を導入した出芽酵母破壊株が開示される他、ＯＣＨ１遺伝子、ＭＮＮ１遺伝子、ＭＮＮ４遺伝子及びＡＬＧ３遺伝子を破壊した出芽酵母破壊株が開示されている。また、同公報においては、それらの遺伝子破壊による変異形質の他に、ｕｒａ３変異、ｈｉｓ３変異、ｌｅｕ３変異、ｌｅｕ２変異、ａｄｅ２変異、ｔｒｐ１変異、及びｃａｎ１変異からなる群から選ばれる栄養要求性変異形質を有する酵母変異株が開示されている。同公報によれば、これらの変異株は栄養要求性選択マーカーを用いた外来遺伝子の導入が容易に可能であり、これらの変異株を用いることで、哺乳類型の糖鎖あるいは哺乳類蛾他の糖鎖を有する糖タンパク質を多量かつ純度よく製造できることが開示されている。よって、本発明の酵母の製造方法において、同公報に開示される変異株を用いれば、高温感受性を回避し増殖性などが回復されるので、効果的に哺乳類型の糖タンパク質などを製造できると考えられる。さらに、このようにして高温感受性を回避し増殖性などが回復された変異株は、β−グルカンを高効率に産生すると考えられる。
【００４５】
よって、例えば、酵母の遺伝子破壊株又は遺伝子変異株などの遺伝子機能欠損株として、｛ｏｃｈ１破壊、ｍｎｎ１破壊、ｍｎｎ４破壊、及びａｌｇ３破壊｝からなる群から選ばれるひとつ又は２つ以上の破壊を有する株であるか、又は｛ｏｃｈ１変異、ｍｎｎ１変異、ｍｎｎ４変異、及びａｌｇ３変異｝からなる群から選ばれるひとつ又は２つ以上の変異を有する株であるものがあげられる。すなわち、特定の遺伝子機能の欠損が遺伝子の破壊による遺伝子破壊株のみならず、遺伝子の変異による遺伝子変異株においても、上記と同様の問題があるので、ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御することにより、高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母を得ることができ、それによりβ−グルカンを高効率に産生させることができる。遺伝子破壊株又は遺伝子変異株などの遺伝子機能欠損株の中では、ｏｃｈ１破壊のみ又はｏｃｈ１破壊とその他の変異を有する酵母の遺伝子破壊株を好ましく用いることができる。なお、特開２００１−１６１３７６号公報には、分裂酵母の糖転移酵素遺伝子ｏｃｈ１＋の機能を失わせた分裂酵母のｏｃｈ１破壊株（Δｏｃｈ１）が開示されている。本発明は、酵母の遺伝子破壊株として、分裂酵母のｏｃｈ１破壊株（Δｏｃｈ１）を用いてもよい。よって、例えば酵母として分裂酵母を用いた場合であっても、ｏｃｈ１破壊のみ又はｏｃｈ１破壊とその他の変異を有する遺伝子破壊株を好ましく用いることができる。
【００４６】
ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程  酵母の遺伝子破壊株又は遺伝子変異株などの遺伝子機能欠損株におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程として、酵母の遺伝子機能欠損株におけるＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度を調節する工程を含むものがあげられ、より具体的には、出芽酵母の遺伝子破壊株などの遺伝子機能欠損株におけるＰｏｌ３のアミノ酸配列を改変する工程を含むものがあげられる。また、分裂酵母の遺伝子破壊株などの遺伝子機能欠損株におけるＣｄｃ６のアミノ酸配列を改変する工程を含むものがあげられる。
【００４７】
本明細書において「エラープローン頻度」とは、エラープローンの性質のレベルをいう。エラープローン頻度は、たとえば、遺伝子配列における変異の絶対数（変異の数そのもの）または相対数（全長における変異の数の比率）で表現できる。あるいは、ある生物または酵素について言及するとき、エラープローン頻度は、ある生物の生殖または分裂１回あたりの遺伝子配列における変異の絶対数または相対数で表現してもよい。特に言及しない場合、エラープローン頻度は、遺伝子配列における複製過程１回あたりの誤差の数で表される。エラープローン頻度は、逆の尺度として本明細書において「精度」ということがある。エラープローン頻度が均一であるとは、複数の遺伝子の複製を担う因子（ポリメラーゼなど）に言及するとき、互いのエラープローン頻度が実質的に等しいことをいう。他方、エラープローン頻度が不均一であるとは、有意な差異が複数の遺伝子の複製を担う因子（ポリメラーゼなど）に存在する場合をいう。
【００４８】
本明細書において「エラープローン頻度の調節」とは、エラープローン頻度を変化させることをいう。そのようなエラープローン頻度の調節には、エラープローン頻度の上昇および低減が含まれるが、好ましくはエラープローン頻度を上昇するものである。エラープローン頻度を調節するための手法として、たとえば、校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼの改変、複製中に重合反応または伸長反応を阻害または抑制するような因子の挿入、これらの反応を促進するような因子の阻害、抑制、単数または複数の塩基の欠損、ＤＮＡ修復酵素の欠損、異常塩基の除去修復因子機能を有する酵素の改変、ミスマッチ塩基対修復因子の改変、複製自体の精度の低減などがあげられるがそれらに限定されない。エラープローン頻度の調節は、ＤＮＡの二本鎖の両方に対して行われてもよいし、片方のみに対して行われてもよい。ＤＮＡの二本鎖のうち片方のみに対して行われるものは、有害な変異誘発が低減されるため好ましい。
【００４９】
本明細書において「エラープローン」とは、遺伝子（ＤＮＡなど）の複製における誤り易い（すなわち、複製誤りの）性質をいう。エラープローンは、主に、校正機能を有する酵素（たとえば、ＤＮＡポリメラーゼなど）の校正機能の精度によって影響を受ける。本明細書において「複製誤り」とは、遺伝子（ＤＮＡなど）の複製の過程で生じるヌクレオチド取り込みの誤りをいう。複製誤りは、通常、生体では、その頻度は１０８〜１０１２回に１回程度で極めて低い。複製誤りの頻度が低い理由としては、ヌクレオチドの取り込みが鋳型ＤＮＡの取り込まれるヌクレオチドとが相補的な塩基対を形成することによって複製が起こること、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素の校正機能すなわち３’→５’エキソヌクレアーゼが、鋳型に相補性を示さないヌクレオチドが誤って取り込まれたときそれを察知し直ちに切り出す機能が存在することなどがあげられる。したがって、本発明において複製におけるエラープローン頻度の調節は、特異的塩基対形成の障害、校正機能の障害などによって行うことができる。
【００５０】
本明細書において「エラーフリー」とは、遺伝子（ＤＮＡなど）の複製において誤りがほとんどない、好ましくは実質的に全くない性質をいう。エラーフリーは、主に、校正機能を有する酵素の校正機能の精度によって影響を受ける。本明細書においてエラープローンとエラーフリーとは、絶対的に（すなわち、エラープローン頻度のレベルなどで決定する）分類することができ、あるいは相対的（２種以上の遺伝子の複製を担う因子（たとえば、ＤＮＡポリメラーゼなど）におけるエラープローン頻度について多い方をエラープローンとし、少ない方をエラーフリーとする）に分類することができる。
【００５１】
なお、本明細書において“ＤＮＡポリメラーゼ”とは、４種類のデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸からピロリン酸を遊離してＤＮＡを重合する働きを有する酵素をいい、出芽酵母のＰｏｌ３や分裂酵母のＣｄｃ６はこれに含まれる。ＤＮＡポリメラーゼ反応には、鋳型となるＤＮＡ、プライマー分子、Ｍｇ２＋などが必要とされる。プライマーの３’−ＯＨ末端に鋳型に相補的なヌクレオチドを順次付加し分子鎖を伸長する。
【００５２】
本発明において、ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御するためには、何らかの方法で、酵母細胞を不均衡ミューテーター化すればよい。酵母細胞を不均衡ミューテーター化するには、公知の方法に従って、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のうち校正機能に関与する遺伝子領域を破壊するか、そのような遺伝子領域に何らかの変異を導入すればよい。遺伝子破壊及び遺伝子変異の導入方法は、たとえば、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のうち校正機能に関与する遺伝子領域は公知であるから、それらの遺伝子領域の塩基配列を、例えば１個〜１００個、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜３個他の塩基で置換し、形質転換すればよい。例えば、真核生物染色体ＤＮＡ複製時にラギング鎖の複製に関与するとされるポリメラーゼδ（Ｐｏｌδ）の校正機能を消失させた変異タンパク質を目的の酵母細胞内で発現させることで、酵母細胞を不均衡ミューテーター化することができる。すなわち、Ｐｏｌδ変異タンパク質を目的の酵母細胞内で発現させるための方法として、人為的にＰｏｌδ変異遺伝子を得て、対象となる酵母に形質転換することにより、変異遺伝子を発現させ、機能させるものがあげられる。すなわち、出芽酵母におけるＰｏｌδであるＰｏｌ３の校正機能消失変異型の作成方法として、予めクローニングした野生型のＰＯＬ３遺伝子を鋳型にして、その校正機能活性部位のアミノ酸配列を一部人工的に置換し、校正機能を制御すればよい。また、ｐｏｌ３変異株と同様の形質を持ち、既に天然の変異体として同定されている株より、当該遺伝子をクローニングして用いる方法を用いてもよい（後述する実施例においては、後者の方法を用いた。）。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子には、ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子のみならず、ＤＮＡポリメラーゼのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含してもよい。
【００５３】
また、他の例として、分裂酵母におけるＰｏｌδであるＣｄｃ６（Ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ  ６）の校正機能を消失させた変異タンパク質を目的の酵母細胞内で発現させることで、分裂酵母細胞を不均衡ミューテーター化することができる。すなわち、Ｃｄｃ６変異タンパク質を目的の酵母細胞内で発現させるための方法として、人為的にｃｄｃ６−変異遺伝子を得て、対象となる酵母に形質転換することにより、変異遺伝子を発現させ、機能させるものもあげられる。具体的には、前記ｐｏｌ３変異遺伝子と同様の作成方法にて、校正機能消失変異型のｃｄｃ６（ｃｄｃ６−）を得ることができる。
【００５４】
後述する実施例においては、配列番号２で示される塩基配列からなるＰＯＬ３遺伝子におけるｐｏｌ３−０１変異遺伝子（配列番号４で示される塩基配列）は、配列番号２で示されるＰＯＬ３遺伝子における９６２番目の塩基がＡからＣに置換され、９６８番目の塩基がＡからＣに置換されたものである。ただし、出芽酵母におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する方法は、上記の方法に限定されるものではなく、例えば、上記の位置における置換を含んで別の位置の塩基配列を１個〜１０個（好ましくは２個〜５個、更に好ましくは配列番号２で示されるＰＯＬ３遺伝子の８９８番目〜９８０番目の塩基を２個〜５個）置換する方法など、様々な方法が含まれる。  更に、配列番号８で示される塩基配列からなるｃｄｃ６＋遺伝子におけるｃｄｃ６−１変異遺伝子（配列番号１０で示される塩基配列）は、配列番号８で示されるｃｄｃ６＋遺伝子における８９８番目から９０６番目の塩基ＧＡＴ  ＡＴＴ  ＧＡＡが、ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＧＣＴに置換されたものである。ただし、分裂酵母におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する方法は、上記の方法に限定されるものではなく、例えば、上記の位置における置換を含んで別の位置の塩基配列を１個〜１０個（好ましくは２個〜５個、更に好ましくは配列番号８で示されるｃｄｃ６＋遺伝子の８９８番目〜９８０番目の塩基を２個〜５個）置換する方法など、様々な方法が含まれる。
【００５５】
本明細書において校正機能が「野生型のものよりも低い」とは、ある校正機能を有する酵素などについて言及するとき、その酵素の野生型よりも校正機能が低いこと（すなわち、その酵素での校正処理の後に残留する変異の数が野生型による校正処理の後に残留する変異の数よりも多いこと）をいう。そのような野生型との比較は、相対的または絶対的な表示によって行うことができる。そのような比較はまた、エラープローン頻度などによって行うことができる。
【００５６】
本明細書において「変異」とは、遺伝子について言及するとき、その遺伝子の配列の変化を生じることまたはその変化によって生じた遺伝子の（核酸またはアミノ酸）配列の状態をいう。本明細書では、たとえば、変異は、校正機能について生じる遺伝子配列の変化について用いられる。本明細書では、特に言及しない場合は、変異は、改変と同義で用いられる。
【００５７】
有用な変異体を作製するためには、生物において変異誘発を行うことがもっとも一般的である。変異とは、通常、遺伝子をコードする塩基配列の変化をいい、ＤＮＡ配列の変化が包含される。変異は、それが発生した個体に与える影響により、大きく次の３種類に分けられる：Ａ）中立変異（ｎｅｕｔｒａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）：この変異は、ほとんどの変異が該当し、生物の成育および代謝にほとんど影響がない。Ｂ）有害変異（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）：この変異は、中立変異よりは頻度は少ない。生物の成長または代謝を阻害する。有害変異には、生育に必須な遺伝子を破壊するような致死変異（ｌｅｔｈａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）も含まれる。微生物の場合、種によっても異なるが、通常全変異に占める有害変異の割合は、約１／１０〜１／１００とされている。Ｃ）有益変異（ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）：この変異は、生物の育種に有益な変異である。その発生頻度は中立変異と比較して極めて低い。したがって、有益変異が導入された生物個体を得るためには、大きな生物集団と、長い時間が必要となる。また、生物の育種の十分な効果は、単一の変異だけで現れることはまれであり、複数の有益変異の蓄積が必要であることが多い。なお、これらの変異の導入については、例えば、Ｄａｎ  Ｂｕｒｋｅら（大矢禎一ら訳）酵母遺伝子実験マニュアル、丸善株式会社平成１４年１２月１０日発行などに記載される方法に従って行うことができる。
【００５８】
以下では、ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御し、酵母細胞を不均衡ミューテーター化する工程としてＰＯＬ３遺伝子を対象とした場合について説明する。なお、校正機能を制御するＤＮＡポリメラーゼとして、分裂酵母におけるｃｄｃ６遺伝子などを対象とした場合も、ＰＯＬ３遺伝子を対象とした場合と同様にして酵母細胞を不均衡ミューテーター化することができる。なお、Ｐｏｌ３及びＣｄｃ６は、真核生物においてポリメラーゼδ（Ｐｏｌδ）と総称されるＤＮＡ複製酵素であり、それぞれ出芽酵母及び分裂酵母においてＰｏｌδに相当する遺伝子である。ＰＯＬ３遺伝子は、具体的には、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＷ３０３−１Ａ（ｕｒａ３,ｌｅｕ２,ｈｉｓ３,ｔｒｐ１，ａｄｅ２）〔Ｋａｉｎｕｍａら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，１３３−１４１（１９９９）〕株から得たゲノムを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することができる。プライマーには、Ｐｏｌ３タンパク質をコードする部分を容易に切り出せるように制限酵素切断部分を付与したものを用いればよい。具体的に説明すると、出芽酵母ＰＯＬ３遺伝子を適当なベクターにクローニングした後、Ｐｏｌ３の校正機能を調節するように変異を導入するためにプライマーを設計し、変異型ｐｏｌ３を得ることができる。
【００５９】
また、上記変異型ｐｏｌ３を酵母内で発現させるために、上流にプロモーターを、下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、これを発現ベクターに導入すればよい。また、その遺伝子を導入する発現ベクターにプロモーターとターミネーターが既に存在する場合は、発現カセットを構築することなく、そのプロモーターとターミネーターを利用してその間に当該融合遺伝子のみを導入すればよい。
【００６０】
発現カセット中のプロモーターは、酵母発現系で一般に使用され、形質転換酵母菌内で導入した融合遺伝子を発現させることができるプロモーターであれば特に限定はないが、例えば、ＰＧＫ、ＧＡＰ、ＴＰＩ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、及びＣＵＰ１などがあげられ、これらの中ではＧＡＰプロモーターが好ましい。
【００６１】
一方、ターミネーターは、酵母発現系で一般に使用され、導入した融合遺伝子の下流に存在させて転写終結が可能とするものであればよく、例えば、ＡＤＨ１、ＴＤＨ１、ＴＦＦ、及びＴＲＰ５などがあげられる。
【００６２】
発現カセットを導入する発現ベクターとして、酵母発現系で一般に使用されるものであれば特に限定はない。具体的な発現ベクターとして、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、及びｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、及びｐＣ１９４）、酵母由来のプラスミド（例、ｐＳＨ１９、及びｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、並びにバキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができるが、酵母由来のプラスミドが好適に使用されうる。
【００６３】
酵母の形質転換に利用されるプラスミドは、酵母の形質転換に用いることができるプラスミドであれば特に限定されないが、例えば、ＹＥｐと略される酵母エピソーム型プラスミド（ｙｅａｓｔ  ｅｐｉｓｏｍｅ  ｐｌａｓｍｉｄ）、ＹＲpと略される酵母自己複製型プラスミド（ｙｅａｓｔ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ）などがあげられる。酵母エピソーム型プラスミドベクターは、酵母の本来もつ２μプラスミドの配列を含んでおり、その複製起点を利用して宿主酵母細胞内で複製できるようにしたベクターである。本発明で使用する酵母エピソーム型発現ベクターは、酵母の２μプラスミド配列の少なくともＡＲＳ配列を含んでおり、かつ宿主酵母菌体内において染色体外で増殖することができるものが好ましい。具体的なプラスミドとして、ＹＥｐ５１、ｐＹＥＳ２、ＹＥｐ３５１、ＹＥｐ３５２及びｐＲＥＰなどがあげられる。
【００６４】
上記の酵母エピソーム型発現ベクターは、組換え大腸菌でのサブクローニングを行えるように、大腸菌体内部で増殖できるシャトルベクターである方が好ましく、またアンピシリン耐性遺伝子等選択マーカー遺伝子を含むものがさらに好ましい。また、該発現ベクターは、組換え酵母を作成した際に、栄養要求性や薬剤耐性によって酵母クローンを選抜できる、マーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＡＤＥ２、ＣＡＮ１、ＳＵＣ２、ＬＹＳ２、及びＣＵＰ１などがあげられる（大島泰治編著、生物化学実験法３９、酵母分子遺伝学実験法、１１９−１４４  （１９９６））。これらはあくまで例示であり、遺伝子導入の宿主とする酵母菌株の遺伝子型に応じて適宜選択すればよい。上述した融合遺伝子発現プラスミドの構築に関する一連の手法は、後記実施例の記載を参照して、あるいは慣用の技術により当業者が適宜実施することができる。
【００６５】
発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン、タグをコードするＤＮＡなどを付加してもよい。また、発現ベクターは、融合タンパク質発現ベクターであってもよい。市販されている融合タンパク質発現ベクターとして、ｐＧＥＸシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社）、ｐＥＴ  ＣＢＤ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３４ｂ−３８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ｐＥＴ  Ｄｓｂ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ３９ｂ  ａｎｄ  ４０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、及びｐＥＴ  ＧＳＴ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ４１  ａｎｄ  ４２（Ｎｏｖａｇｅｎ社）などがあげられる。
【００６６】
本発明において、上記の変異型ｐｏｌ３遺伝子発現ベクター(ミューテーター)にて形質転換させる宿主酵母としては、サッカロミセス属、カンジダ属に属する酵母を用いるものがあげられるが、特に限定はされない。サッカロミセス属の酵母としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＫ４株、Ｙ３３４株、Ｉｎｖ−Ｓｃ１株、及びＷ３０３株があげられる。また、本発明において、上記の変異型ｃｄｃ６遺伝子発現ベクターにて形質転換させる宿主酵母としては、シゾサッカロミセス属、又はカンジダ属に属する酵母を用いるものがあげられるが、特に限定はされない。シゾサッカロミセス属の酵母としては、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、及びＴＮ８株があげられる。
【００６７】
融合遺伝子発現ベクターにて酵母を形質転換するには、例えば、以下の方法があげられる。リン酸リチウムで処理し、ＤＮＡとＰＥＧを加えてインキュベートする方法や、エレクトロポレーション法などの公知の方法を利用できる（Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９４，  １８２−１８７（１９９１））。また、細胞壁を酵素で消化したスフェロプラスト細胞をＰＥＧとＤＮＡとを、二塩化カルシウムなどに由来するカルシウムイオンの存在下でインキュベートするスフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５:１９２９（１９７８））や、ＤＮＡを表面に付着させた粒子を細胞に照射することにより形質転換を行う方法（Ｆｏｘ  Ｔ．Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，１９８８．Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｃａｎ  ｓｔａｂｌｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｙｅａｓｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｍｔＤＮＡ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：７２８８−７２９２）を用いてもよい。
【００６８】
対数増殖期の酵母細胞を、該酵母細胞に導入する遺伝子およびポリエチレングリコールを含有する溶液中で維持する工程を含む酵母の形質転換方法（特許３６８２５３０号）であってもよい。
【００６９】
形質転換酵母のスクリーニングのために、適当な選択マーカーを用いる。一例として、宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の代謝に関与する遺伝子を用いることが望ましい。すなわち、染色体ＤＮＡ上の上記遺伝子を突然変異等の適当な手段により機能しないような宿主細胞を用い、相当する正常な遺伝子を含む発現ベクターを形質転換することにより、正常な代謝遺伝子を含む形質転換細胞のみを増殖させてスクリーニングできる物が好ましい。具体的には上記したようなＵＲＡ３、ＬＥＵ２等広く用いられている選択マーカー遺伝子を発現ベクターに接続する。染色体組み込み型タイプ（ＹＩｐタイプ）の場合にもこれらの遺伝子はスクリーニングのマーカーとなる。
【００７０】
形質転換された形質転換酵母に多くの変異を導入するために、数世代にわたる分裂を繰り返すことができるように培養する。具体的には、培地５ｍｌで一晩培養し、２ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌとスケールアップを繰り返し、約一週間程度の期間、酵母が分裂できる状態で培養を繰り返す。形質転換酵母の培養方法は、酵母の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。培地として、酵母が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地を用いればよく、具体的には、ＹＰＤ培地、ＹＰＧ培地、ＹＰＤＧ培地、ＹＰＡＤ培地、グルコース合成最小培地（ＳＤ）、ヨウ素添加最小培地（ＳＭＭ）、Ｈａｒｔｗｅｌｌの完全培地（ＨＣ）、ＧＡＬ発酵試験培地、又は胞子形成培地などを適宜用いることができる。また、例えば、Ｄｉｆｃｏ社から供給される各種の培地成分を添加し、かつプラスミドの複製・保持に必要なマーカーによって供給可能となるアミノ酸を除いた合成培地（炭素源、窒素源、無機塩類、アミノ酸、ビタミン等を含む）等を利用できる（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，３−５７（１９９１））。
【００７１】
培地のｐＨは、６〜８に調節することが適当である。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどの添加量を制御することにより行えばよい。培養は、２８〜３２℃、好ましくは３０℃で、約一週間（たとえば、１日から１ヶ月、好ましくは５日〜１０日）、常法に従い、通気や攪拌を適宜加えつつ行えばよい。特に、ＴＩＹ２０株を効率よく培養するためにＫＣｌ及びソルビトールを加え３０℃で培養することが望ましいが、穏やかな選択圧を加えるために、ＫＣｌ及びソルビトールを加えない培地にて培養を行ってもよい。また、穏やかな選択圧を得るために、３１℃〜３５℃（又は３２℃〜３３℃）など３０℃に比べ少し高い温度で培養してもよい。
【００７２】
高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母  高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母は、上記した製造方法により製造された酵母を意味する。そして、具体的には、哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質を産生する出芽酵母、または分裂酵母などがあげられる。より具体的には、公知の遺伝子破壊株、又は公知の遺伝子破壊株から公知の方法に従って製造しうる遺伝子破壊株において、ＤＮＡポリメラーゼの校正機構に関する遺伝子を改変することにより得られる酵母などがあげられる。
【００７３】
哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質  哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質は、上記した公知の遺伝子破壊株によって産生されるものであればよく、遺伝子破壊株から糖タンパク質を単離・精製する方法も、本明細書に記載したいずれかの文献に開示される方法又は公知の方法を適宜用いればよい。例えば、培養が終了した後に、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁する。その後、超音波破砕機、フレンチプレス、ホモジナイザー、ダイノミルなどを適宜用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。そのようにして得られた無細胞抽出液を遠心分離して上清を得て、その上清から溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル−セファロースなどのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法などを適宜組み合せればよい。
【００７４】
本明細書において、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを示す。またアスタリスク（＊）は、リン酸化可能部位を示す。具体的な哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質として、下記式（Ｉ）、又は（ＩＩ）で示されるオリゴ糖鎖をアスパラギン結合型糖鎖として有する糖タンパク質があげられる。
【００７５】
【化１】
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【００７６】
β−グルカンを高効率に産生する酵母  β−グルカンを高効率に産生する酵母は、高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母と同様に、上記した製造方法により製造された酵母があげられる。一方、酵母の遺伝子破壊株におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御することによらずに得られた、高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母を用いることによっても、β−グルカンを高効率に得ることができるとも考えられる。β−グルカンを高効率に産生する酵母の例として、β−グルカンを高効率に産生する出芽酵母又は分裂酵母などがあげられる。より具体的には、公知の遺伝子破壊株、又は公知の遺伝子破壊株から公知の方法に従って製造しうる遺伝子破壊株において、ＤＮＡポリメラーゼの校正機構に関する遺伝子を改変することにより得られる酵母などがあげられる。
【００７７】
β−グルカン
β−グルカンは、上記した公知の遺伝子破壊株によって産生されるものであればよい。例えば、具体的なβ−グルカンの種類として、β−１,３−Ｄ−グルカン及びβ−１，６／１，３−Ｄグルカンがあげられる。遺伝子破壊株から（特に酵母細胞壁から）β−グルカンを単離・精製する方法として、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、培養が終了した後に、得られた培養物（細胞）を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁する。次いで、超音波破砕機、ボルテックスミキサー、フレンチプレス、ホモジナイザー、ダイノミルなどを適宜用いて細胞を破砕し、細胞破砕液を得る。得られた細胞破砕液を遠心分離してペレット（細胞壁含む）を回収する（再懸濁、遠心分離、ペレット回収は適当回数繰り返す。）。その後、溶媒除去や減圧乾燥や再懸濁など、所定の操作を行った後、例えば、ピリジルアミノ（ＰＡ）化法によりＨＰＬＣを用いて糖質分析を行う方法などが好適であり、なかでもＰＡ化法によるＨＰＬＣ分析がより好適である。
【００７８】
本発明の第２の側面は、酵母の遺伝子破壊株におけるＤＮＡポリメラーゼの校正機能を制御する工程を含む、外来遺伝子の発現能を有する酵母の製造方法に関する。本発明の第２の側面は、外来遺伝子を導入した遺伝子破壊株を用いる以外は、第１の側面と同様である。外来遺伝子を導入した遺伝子破壊株の作出方法は、公知の方法に従って、適宜行えばよい。本発明の第２の側面における外来遺伝子は、その種以外の生物に由来する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、ヒト由来のヒトα−ガラクトシターゼＡ遺伝子があげられる。後述する実施例５によって、実証されたとおり、この方法によれば外来遺伝子を効果的に発現させることができる。本発明の第２の側面は、第１の側面と同様、外来遺伝子の発現能を有する酵母の製造方法のみならず、その製造方法によって製造された外来遺伝子の発現能を有する酵母、外来遺伝子、タンパク質などをも提供する。また、この側面に係る発明は、上記した製造方法により得られた酵母を培地で培養し、外来遺伝子を発現させて外来タンパク質を生成させ、得られた培養物から生成させた外来タンパク質を採取することにより、外来タンパク質を効果的に製造する方法をも提供する。
【００７９】
配列番号の説明  本明細書の配列表に記載される配列は、以下の配列を示す。  配列番号１は、Ｐｏｌ３のアミノ酸配列を示す。  配列番号２は、ＰＯＬ３遺伝子をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。  配列番号３は、ｐｏｌ３−０１のアミノ酸配列を示す。  配列番号４は、ｐｏｌ３−０１変異遺伝子をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。  配列番号５は、実施例１におけるＰＣＲ反応で用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。  配列番号６は、実施例１におけるＰＣＲ反応で用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。  配列番号７は、Ｃｄｃ６のアミノ酸配列を示す。  配列番号８は、ｃｄｃ６＋遺伝子をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。  配列番号９は、ｃｄｃ６−１のアミノ酸配列を示す。  配列番号１０は、ｃｄｃ６−１変異遺伝子をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。  配列番号１１は、実施例６におけるＰＣＲ反応で用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。  配列番号１２は、実施例６におけるＰＣＲ反応で用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。  配列番号１３は、実施例６におけるＰＣＲ反応で用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。  配列番号１４は、実施例６におけるＰＣＲ反応で用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。
【００８０】
寄託株の説明  後述する実施例で得られたＹＡＢ１００株は、平成１８年７月１１日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５５として寄託されている。  後述する実施例で得られたＹＡＢ１０１株は、平成１８年７月１１日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５６として寄託されている。
後述する実施例で得られたＣ２−１１株は、平成１８年１２月２７日から独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターに、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１４５として寄託されている。
【００８１】
次に実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００８２】
変異型ｐｏｌ３ＤＮＡ断片を導入したプラスミドｐＡＢ１００の産生  以下のようにして変異型ｐｏｌ３ＤＮＡ断片を出芽酵母強制発現用マルチコピーベクターＹＥＰ３５２ＧＡＰ２のＳａｃＩ−ＳａｌＩサイトにクローニングし、プラスミドｐＡＢ１００（図１（ａ）参照）を構築した。  Ｐｏｌ３のアミノ酸配列は配列番号１に示され、Ｐｏｌ３をコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号２に示されるが、本実施例で得られたｐｏｌ３−０１変異遺伝子は配列番号２における９６２番目の塩基がＡからＣに置換され、９６８番目の塩基がＡからＣに置換されたものである。すなわち、配列番号２で示される塩基配列の９６１番目から９６９番目までの塩基配列によってコードされるアミノ酸残基が、ＤＩＥからＡＩＡに置換されるような変異を導入した。このようにして得られたｐｏｌ３−０１のアミノ酸配列を配列番号３に示し、ｐｏｌ３−０１変異遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号４に示す。具体的に説明すると、天然のミューテーター変異株として知られているＡＭＹ１２８−１株（ＭＡＴαｐｏｌ３−０１、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−１、ｌｙｓ１−１、ａｄｅ２−１、ｈｉｓ１−７、ｈｏｍ３−１０、ｔｒｐ１−２８９）のゲノムをテンプレートに用いて、ＰＣＲ反応（フォワードプライマー：５’−ＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣ（ＳａｃＩ）ＡＴＧＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＴＧ−３’（配列番号５）、リバースプライマー：５’−ＧＣＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣ（ＮｏｔＩ）ＴＴＡＣＣＡＴＴＴＧＣＴＴＡＡＴＴＧＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号６））にてｐｏｌ３−０１変異遺伝子を増幅し、その増幅断片をｐＹＥＳ２ベクターのＳａｃＩ−ＮｏｔＩサイトにクローニングした（得られたプラスミドをｐＹＥＳ２−ｐｏｌ３−０１と命名した。）。さらに、ＧＡＰＤＨプロモーターの支配下でｐｏｌ３−０１変異遺伝子が発現できるように、ｐＹＥＳ２−Ｐｏｌ３−０１からｐｏｌ３−０１変異遺伝子を制限酵素ＳａｃＩとＸｈｏＩにて消化し、ＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩベクターのＳａｃＩ−ＳａｌＩ  ｓｉｔｅにクローニングした（このようにして得られたプラスミドをｐＡＢ１００と命名した。）。
【００８３】
糖鎖改変株の高温耐性株の取得  出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）糖鎖改変株ＴＩＹ２０(ｍａｔα  ｏｃｈ１::ｈｉｓＧ  ｍｎｎ１::ｈｉｓＧ  ｍｎｎ４::ｈｉｓＧ)に、上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢ１００を形質転換した。ＴＩＹ２０は、国際公開ＷＯ０１／０１４５２２号パンフレット（特許文献１）に開示されるＴＩＹ１９と同じクローンから四分子分析によって得た。得られた形質転換体(ＴＩＹ２０／ｐＡＢ１００)を、より多くの変異を入れるために出芽酵母用合成培地ＳＤ−Ｕ（６．７ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  （Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２０ｇ  グルコース、０．７７ｇ  ＣＭＳ−ＵＲＡ（Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（液体）に、できるだけ多く分裂できるように条件を制御して培養した。これらの菌の中から高温耐性株を得るために、ＳＤ−Ｕ固形培地に蒔いてから３７℃で３日培養し、生えてきたコロニーを釣菌した。得られた株からｐＡＢ１００を脱落させるために完全培地ＹＰＡＤ(１０ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ(Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)、２０ｇ  ｐｅｐｔｏｎｅ(Ｄｉｆｃｏ)、０．２ｇ硫酸アデニン(Ｓｉｇｍａ)、２０ｇＧｌｕｃｏｓｅ／１Ｌ)にストリークした後、培養し、シングルコロニーを２０個ずつ回収した。これらのコロニーのうちＳＤ−Ｕ培地で生えることができないコロニーを取得した。
【実施例２】
【００８４】
酵母内タンパク質インベルターゼに付加される糖鎖長の解析  実施例１で得られた９株（Ｃ１５、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ３０、Ｃ３−２０、Ｃ４−１、Ｃ３−３−１、Ｃ３−７−２、及びＣ３−３−９）のＮ結合型糖鎖長を調べるために酵母内で作られるインベルターゼに付加されるＮ−結合型糖鎖長を以下の方法にて調べた。それぞれの株を５ｍｌのＹＰＡＤで培養後、５ｍｌのＹＰＳｕｃ(１０ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ(Ｄｉｆｃｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)、２０ｇのｐｅｐｔｏｎｅ(Ｄｉｆｃｏ)、１０ｇのｓｕｃｒｏｓｅ／１Ｌ)で３時間以上培養し、菌を回収した。回収した菌は５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ６．８)、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、３％ＳＤＳ、０．１％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ、１％２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）とグラスビーズを加えてボルテックスにて破砕した。１５，０００回転で５分間遠心分離した後、上清５μｌずつを５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動(１００Ｖ、３時間)した。ゲルを反応液(３．４ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ、３ｍｌ  ３Ｍ  Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ／１００ｍｌ)に移し、３０分３７℃でインキュベーションした後、脱イオン水にて２回洗浄した。染色液(２ｇ  ＮａＯＨ、５０ｍｇ  ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ／５０ｍｌ)に移し、発色するまで煮込んだ。その結果を図２に示す。図２は、Ｎ結合型糖鎖長を調べるための図面に替わるＳＤＳゲル電気泳動写真である。図２のレーンは、左から、Ｃ１５、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ３０、Ｃ３−２０、Ｃ４−１、Ｃ３−３−１、Ｃ３−７−２、Ｃ３−３−９、ＴＩＹ２０及びＷ３０３−１Ａを示す。図２から、得られた９株のインベルターゼに付加されるＮ−結合型糖鎖は親株であるＴＩＹ２０と同じ糖鎖長をもつことが分かった。
【００８５】
生育の回復効率の解析  次に、実施例１で得られた株の成長回復効率を解析した。５ｍｌのＹＰＡＤで３０℃にて培養を行った後、ＯＤ６００が０．１となるように１０ｍｌのＹＰＡＤに移し、３０℃あるいは３７℃にて培養した。タイムポイントごとに菌を回収しＯＤ６００を調べた。その結果を図３に示す。図３は、３０℃及び３７℃における生育の回復効率を示す図面に替わるグラフである。図３から、解析を行った９株のうち、Ｃ４−１とＣ３−２０は３０℃での成長割合がＴＩＹ２０よりも上回ったことがわかる。また図３から、３７℃ではＴＩＹ２０はほとんど増殖できないにもかかわらず、Ｃ４−１、Ｃ３−２０では増殖能が回復したことがわかる。なお、各株の様子を図１（ｂ）に示し、図１（ｂ）の分画を図１（ｃ）に示す。
【実施例３】
【００８６】
糖鎖構造解析  実施例１で得られた株におけるマンノタンパク質の糖鎖構造を解析した。５０ｍｌで培養した菌を回収し、水で洗浄後、１００ｍＭのクエン酸バッファー(ｐＨ７．０)８ｍｌに懸濁し、１２１℃にて２時間オートクレーブした。遠心にて上清を回収し、２４ｍｌの冷エタノールを添加し、−２０℃にて３０分静置後、遠心して沈殿を回収した。水に懸濁後、３ｍｇ／ｍｌになるようにタンパク溶液を調整し、そのうち５μｌＧｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＦ（タカラバイオ社製４４５０）にて処理した。３７℃１７時間インキュベーション後１００μｌとなるように水を加え、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５・２４・１）を加えて良く攪拌し、遠心にて上清を回収した（フェノールクロロホルム抽出）。回収した液にクロロホルムを加えて攪拌後、遠心して上清を回収し（クロロホルム抽出）、ドライアップした。ドライアップしたサンプルにＰｙｒｉｄｙｌａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍａｎｕａｌ  ｋｉｔ(タカラバイオ社製４４８０)にてピリジルアミノ化した後、７回のフェノールクロロホルム抽出に供し余分な試薬を除去した。クロロホルム抽出を行った後、上清をドライアップし、水に溶解後、ＨＰＬＣ(島津社製Ｃｌａｓｓ−ＶＰ、カラム、ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＡＭＩＤＥ−８０(φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ)、  流速、１ｍｌ／ｍｉｎ、検出、３２０ｎｍ(励起)、４００ｎｍ(蛍光)、バッファーＡ、アセトニトリル、バッファーＢ、２００ｍＭＴＥＡＡ(バッファーの濃度を上げて各糖を溶出)、バッファーＢのグラジエント条件、０−４０分、３０→６０％、４０−５０分、３０％)にて糖鎖構造を解析した。その結果を図４に示す。図４は、糖鎖構造を解析するための図面に替わるカラム解析の結果を示すグラフである。図中、マンノースの数がＭで示されている。縦軸は蛍光強度であり、横軸は保持時間（分）である。図４から、野生株Ｗ３０３−１Ａでは、様々な数のマンノースが付加していることがわかる。一方、図４から、得られた株の全てにおいて、親株であるＴＩＹ２０と同じマンノース８個からなる糖鎖構造を示すピークがメインピークとして観察された。このことは、実施例における変異株が、いわゆる哺乳類型の糖鎖を有していることを示す。すなわち、実施例における変異株を用いれば望ましい糖鎖を有するタンパク質を得ることができる。すなわち、本発明は実施例における変異株を用いたタンパク質の製造方法をも提供する。
【実施例４】
【００８７】
キチナーゼ解析  実施例１で得られた株から分泌されるタンパク質の分泌効率を解析した。４０ｍｌで培養した菌の上清に４０ｍｇのｗｅｔ  ｃｈｉｔｉｎ(Ｓｉｇｍａ)を加え、４℃で一晩攪拌する。遠心してキチン回収後、ＰＢＳで３回洗浄。１００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに懸濁し、１００℃にて１０分処理した後、１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥしＣｏｎＡ−ｂｉｏｔｉｎ(生化学工業)にてレクチンブロットした。検出はＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ(生化学工業)にて検出した。検出用試薬として、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ(Ｍｉｌｉｐｏｒｅ)を用い、検出装置として富士フィルムＬＡＳ１０００を用いた。その結果を図５に示す。図５は、変異株から分泌されるタンパク質の分泌効率を示すための図面に替わるグラフである。図５から、ＴＩＹ２０では分泌効率が野生型株の約５０％にも拘らず、得られた株において分泌効率が回復することがわかる。とりわけ、Ｃ４−１及びＣ３−２０では分泌効率が野生型株と同等までに回復した。そこで、得られた株Ｃ４−１をＹＡＢ１００、Ｃ３−２０をＹＡＢ１０１とし特許微生物寄託した。
【実施例５】
【００８８】
α−ガラクトシダーゼＡ活性測定（外来遺伝子の発現能検証）  ヒトα−ガラクトシダーゼＡ遺伝子をＧＡＰＤＨプロモーターの下流に連結した発現カセットを有するベクター(ｐＲＳ４−ＧＡＰ−αＧａｌＡ)(Ｃｈｉｂａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１２，８２１−８２８，２００２)をＣ４−１、Ｃ３−２０、Ｃ３−７−２、及びＣ２７にそれぞれ形質転換した。得られた形質転換体を図６に表示される時間培養した後、その培養液（菌も含む）を酵素源とした。基質として５ｍＭの４−ＭＵ−α−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを用いて、３７℃において３０分反応後、２００μｌの反応停止液（０．２Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ１０．７））を入れることによって停止させた。蛍光用マイクロプレートリーダー（コロナ社製ＭＴＰ−３２、Ｅｘ：３６５ｎｍ、Ｅｍ：４５０ｎｍ）で測定を行った。酵素活性はタンパク１ｍｇあたり１時間で加水分解された基質をμｍｏｌとして表した（図６の縦軸）。その結果を図６に示す。図６は、α−ガラクトシダーゼＡ活性の測定結果を示す図面に替わるグラフである。図６から、ＴＩＹ２０株は、α−ガラクトシダーゼが失活するのに対し、Ｃ３−２０、Ｃ３−７−２及びＣ４−１は、良好なα−ガラクトシダーゼＡ活性を示し、特にＣ３−２０及びＣ３−７−２は、野生型Ｗ３０３−１Ａよりも高いα−ガラクトシダーゼＡ活性を示すことがわかる。
【実施例６】
【００８９】
変異型ｃｄｃ６&#8212;ＤＮＡ断片を導入したプラスミドｐＲＥＰ１ｃｄｃ６−１の産生
以下のようにして変異型ｃｄｃ６（ｃｄｃ６−１）ＤＮＡ断片を分裂酵母強制発現用マルチコピーベクターｐＲＥＰ１のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩサイトにクローニングし、プラスミドｐＲＥＰ１ｃｄｃ６−１（図７（ａ）参照）を構築した。
分裂酵母のＣｄｃ６のアミノ酸配列は配列番号７に示され、Ｃｄｃ６をコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号８に示される。本実施例で得られたｃｄｃ６−１変異遺伝子は、配列番号８における８９８番目から９０６番目の塩基（ＧＡＴ  ＡＴＴ  ＧＡＡ）を、ＧＣＣＧＧＣＧＣＴに置換したものである。すなわち、８９８番目から９０６番目までの塩基配列によってコードされるアミノ酸残基がＤＩＥからＡＧＡと置換されるような変異を導入した。このようにして得られたｃｄｃ６−１のアミノ酸配列を配列番号９に示し、ｃｄｃ６−１変異遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１０に示す。具体的には、分裂酵母の野生株であるＴＮ８株（ｈ９０ｌｅｕ１−３２）から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＰＣＲ反応によるＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ法によってｃｄｃ６の変異遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ反応には、フォワードプライマー（配列番号１１）：５’−ＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩ）ＧＡＴＧＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＧＧＣＧＴＣ−３’、リバースプライマー（配列番号１２)：５’−ＴＣＧＡＧＧＣＧＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＣＧＣＣＧＧＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＧＡＴ−３’、フォワードプライマー（配列番号１３）：５’−ＡＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＣＣＧＧＣＧＣＴＴＧＣＧＣＡＧＧＴＣＧＣＡ−３’、リバースプライマー（配列番号１４）：５’−ＴＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ（ＮｏｔＩ）ＴＣＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴＴＴＣＡ−３’を用いた。配列番号１２のリバースプライマーおよび配列番号１３のフォワードプライマーにより、前述した８９８番目から９０６番目の塩基の置換が起こる。得られた増幅断片の両端を制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩにて消化し、ｐＲＥＰ１ベクターのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩサイトにクローニングした（このようにして得られたプラスミドをｐＲＥＰ１ｃｄｃ６−１と命名した。）。このプラスミドはｎｍｔ１プロモーターの支配下で変異型ｃｄｃ６遺伝子（ｃｄｃ６−１）を発現させることができた。
【００９０】
糖鎖改変株の高温耐性株の取得
分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）糖鎖改変株ＫＴ９７（ｈ−  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｄ１８  Δｏｃｈ１：：ｕｒａ４＋）に、上記のようにして得られたプラスミドｐＲＥＰ１ｃｄｃ６−１を形質転換した。ＫＴ９７（Ｙｏｋｏ−ｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４８９，７５−８０．（２００１））は、特開２００１−１６１３７６号公報に開示されている。すなわち、ＫＴ９７は、ＯＣＨ１遺伝子を破壊した分裂酵母の遺伝子破壊株である。得られた形質転換体（ＫＴ９７＜ｐＲＥＰ１ｃｄｃ６−１）を、より多くの変異を入れるために分裂酵母用合成培地ＥＭＭ（３ｇ  ｐｈｔｈａｌｉｃ  ａｃｉｄ  Ｋ＋、２．２ｇ  ＮＡ２ＨＰＯ４、５ｇ  ＮＨ４Ｃｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｇ  ＫＣｌ、０．０４ｇ  Ｎａ2ＳＯ4、１ｍｇ  ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ  ａｃｉｄ、１０ｍｇ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ、１０ｍｇ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、１ｍｇ  ｂｉｏｔｉｎ、０．５ｍｇ  ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ、０．４ｍｇ  ＭｎＳＯ４、０．４ｍｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ  ＦｅＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ  ｍｏｌｙｂｄｉｃ  ａｃｉｄ、０．１ｍｇ  Ｋｌ、４０ｍｇ  ＣｕＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１ｍｇ  Ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ／１Ｌ）（液体）に、できるだけ多く分裂できるように条件を制御して培養した。これらの菌の中から高温耐性株を得るために、ＥＭＭ固形培地にて３７℃で６日間培養し、生えてきたコロニーを釣菌した。
【実施例７】
【００９１】
酵母内タンパク質インベルターゼに付加される糖鎖長の解析
実施例６で得られた４株（Ｃ２−１、Ｃ２−２、Ｃ２−３、及びＣ２−１１）のＮ結合型糖鎖長を調べるために酵母内で作られる酸性脱リン酸化酵素に付加されるＮ−結合型糖鎖長を以下の方法にて調べた。それぞれの株を５ｍｌのＹＥＡ培地（３０ｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ、５ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、２０g  ａｇａｒｏｓｅ、０．１６ｇ  ａｄｅｎｉｎｅ−ＳＯ4、０．０５ｇ  Ｕｒａｃｉｌ）で培養後、５ｍｌの低リン酸ＹＰＤ培地(１０ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、２０ｇ  Ｂａｃｔｏ  Ｐｅｐｔｏｎｅ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２０ｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ／１Ｌ)で一晩培養し、菌を回収した。回収した菌は２０ＯＤ／５０μｌとなるように溶解バッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＰＭＳＦ）とガラスビーズを添加し、冷却しながらボルテックスミキサーにて破砕した。菌液を１５，０００回転で１０分間遠心分離した後、上清を回収した。上清の２５μｌに対して７μｌのサンプルバッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．０１％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ、１５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え、そのうち１０μｌずつを４−２０％グラディエントゲルにて電気泳動(１５０Ｖ、２時間)（上層バッファー：５．１６ｇ  Ｔｒｉｓ、３．４８ｇ  ｇｌｙｃｉｎｅ／１Ｌ；下層バッファー：１４．５ｇ  Ｔｒｉｓ、０．０２４Ｎ  ＨＣｌ／１Ｌ）した。ゲルを１００ｍＭ  酢酸ナトリウム(ｐＨ４．０)中にて１５分間振盪させ、ゲルを予め３７℃に温めておいた発色液（1００ｍＭ  Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ(ｐＨ４．０)、２４．６ｍｇ１−ナフチルリン酸一ナトリウム一水和物、１６．７ｍｇ  ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ、Ｔｅｔｒａｚｏｔｉｚｅｄ／５０ｍｌ）に移し、３７℃にて発色するまでインキュベーションを行った。その結果を図８に示す。図８は、Ｎ結合型糖鎖長を調べるための図面に替わるＳＤＳゲル電気泳動写真である。図８のレーンは、左から、ＪＹ７４１(野生株)、ＫＴ９７（親株）、及びＣ２−１１を示す。図８から、実施例６によって得られたＣ２−１１株が産生する酸性脱リン酸化酵素に付加されるＮ−結合型糖鎖は、親株であるＫＴ９７と同様に、野生株（ＪＹ７４１）と比較して短い単一の糖鎖長をもつことが分かった。なお、Ｃ２−１１株を特許微生物寄託した。すなわち、Ｃ２−１１株を用いれば望ましい糖鎖を有するタンパク質を得ることができる。すなわち、本発明はＣ２−１１株を用いたタンパク質の製造方法をも提供する。
【００９２】
生育の回復効率の解析
次に、実施例６で得られた株の成長回復効率を解析した。５ｍｌのＹＥＡで３０℃にて培養を行った後、ＯＤ６００が０．１となるように１０ｍｌのＹＥＡに移し、３０℃にて培養した。タイムポイントごとに菌を回収しＯＤ６００を調べた。その結果を図９に示す。図９は、３０℃における生育の回復効率を示す図面に替わるグラフである。図９から、解析を行った全ての株において、成長割合がＫＴ９７よりも上回っていることがわかる。
【００９３】
上記各実施例によれば、高温耐性、増殖性及び糖タンパク質産生能に優れた新規な出芽酵母及び分裂酵母の変異酵母株を得ることができる。上記の通り、本発明の方法を用いることで出芽酵母及び分裂酵母において有効な変異酵母株を得ることができたので、本発明は、上記実施例で用いられた出芽酵母及び分裂酵母に限定されることはなく、酵母全般に広く適用することができ、いずれの場合でも高温耐性、増殖性及び糖タンパク質産生能に優れた新規な変異酵母株を得ることができる。
【実施例８】
【００９４】
酵母細胞壁の単糖分析
実施例1で得られた酵母Ｃ４−１およびＣ３−７−２を、５mlのＹＰＤ、３０℃で１５時間、浸透培養した後、菌を遠心分離（４０００ 回転５分）することにより回収し、１mlの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー (ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＰＭＳＦ)に懸濁し遠心分離（４０００回転５分）することにより菌体を回収した。この操作を、３回行うことにより菌体を洗浄した。上記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー０．１ｍｌに再懸濁しガラスビーズを液面まで加え−２０℃で1時間保存した。ボルテックスミキサーにより細胞を破砕した後、細胞破砕液のみを回収し、遠心分離（１０００g、１０分）によってペレットを回収した。ペレット（細胞壁）は１ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌに懸濁し、遠心分離した。この操作を３回繰り返すことにより、ペレットを洗浄した。次に、１ｍｌの１ｍＭＰＭＳＦで３回洗浄した。０．２ｍｌの１ｍＭＰＭＳＦに再懸濁した。
５０μｌの細胞壁懸濁液に５０μｌの滅菌超純水を加え、１００μｌの４Ｍ  ＴＦＡを加え１００℃で４時間インキュベーションした。減圧乾燥器にて溶媒を完全に蒸発させた後、１００μlの０．２M酢酸アンモニウムと１０μlの酢酸を加えて、室温にて３０分インキュベーションした。減圧乾燥器にて乾燥した後、１００μlの０．２M酢酸アンモニウムと１０μｌの酢酸を加えて、室温にて３０分インキュベーションした。ＰＡチューブに懸濁液を移し乾燥した。ＰＡラベルはＰＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  (ＰＡＬＳＴＡＴＩＯＮ  Ｐｙｒｉｄｙｌａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  単糖分析用 (ＴａＫａＲａ))を用いて行った。ＨＰＬＣはカラム: ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＳＵＧＡＲ  ＡＸ  タイプ（ＴＯＳＨＯ）、溶媒:０．７Ｍホウ酸カリウム(ｐＨ９．０)；アセトニトリル＝９：１、６５℃、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎで行った。単糖の組成比はピークの面積比から算出した（図１０）。図１０は、酵母細胞壁における単糖含有率の分析結果を示す図面に替わるグラフである。縦軸は％を表し、ＧｌｃＮＡｃはN−アセチルグルコサミン、Ｇｌｃはグルコース、Ｍａｎはマンノースを表す。
図１０に示すように、ＷＴにおけるグルコースの割合（約４５％）に比べ、ＴＩＹ２０株におけるグルコースの割合は約８０％と高いものであったが、本発明の酵母であるC４−１株およびC３−７−２株はさらに高いグルコースの割合（９０％以上）を示した。グルコースの割合が約８０％を超えるようなβ−グルカン含有割合の高い酵母を作製することは、技術的にも非常に困難であると考えられていたが、本発明の酵母は、さらに約１０％以上もグルコースの割合が向上したものであった。以上のことから、本発明の酵母は、酵母を用いたβ−グルカン産生技術において、生産性やコスト面等から極めて有用なものであるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母及びその製造方法は、高温耐性、増殖性及び糖タンパク質産生能に優れた酵母を得ることができ、出芽酵母及び分裂酵母のみならず、酵母全般に広く適用することができる。  本発明のβ−グルカンを高効率に産生する酵母及びその製造方法は、従来公知の酵母に比べてより一層β−グルカン産生能に優れた酵母を得ることができ、出芽酵母及び分裂酵母のみならず、酵母全般に広く適用することができる。  本発明は、酵母を用いた糖タンパク質及びβ−グルカンの生産などに効果的に用いることができるため医薬産業において利用されうる。また、遺伝子破壊株などの特定を適宜制御できるので、試薬産業においても利用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、実施例１で用いたプラスミドｐＡＢ１００及びそのプラスミドを導入した株の高温耐性の回復を検討するための図である。図１（ａ）は、プラスミドｐＡＢ１００の概略を示す図であり、図１（ｂ）は、株の高温耐性の回復性を示す図面に替わる写真であり、図１（ｃ）は、図１（ｂ）の分画を示す図である。
【図２】図２は、Ｎ結合型糖鎖長を調べるための図面に替わるＳＤＳゲル電気泳動写真である。
【図３】図３は、３０℃及び３７℃における生育の回復効率を示す図面に替わるグラフである。
【図４】図４は、糖鎖構造を解析するための図面に替わるカラム解析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、変異株から分泌されるタンパク質の分泌効率を示すための図面に替わるグラフである。
【図６】図６は、α−ガラクトシダーゼＡ活性の測定結果を示す図面に替わるグラフである。
【図７】図７は、実施例６で用いたプラスミドｐＲＥＰ１ｃｄｃ６−１及びそのプラスミドを導入した株の生育性の回復を検討するための図である。図７（ａ）は、プラスミドｐＲＥＰｃｄｃ６−１の概略を示す図であり、図７（ｂ）は、株の高温耐性の回復を示す図面に替わる写真であり、図７（ｃ）は、図７（ｂ）の分画を示す図である。
【図８】図８は、実施例７において、Ｎ結合型糖鎖長を調べるための図面に替わるＳＤＳゲル電気泳動写真である。
【図９】図９は、実施例７において、３０℃における生育の回復効率を示す図面に替わるグラフである。
【図１０】図１０は、酵母細胞壁における単糖含有率の分析結果を示す図面に替わるグラフである。縦軸は％を表し、ＧｌｃＮＡｃはN−アセチルグルコサミン、Ｇｌｃはグルコース、Ｍａｎはマンノースを表す。
【配列表フリーテキスト】
【００９７】
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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