(57)【要約】【課題】広範な核酸ベースの手順またはタンパク質ベースの手順において有用とされ得る新規組成物を提供すること。【解決手段】リガンド対の第１のメンバーの第２のメンバーへの結合を検出するための方法であって、  （ａ）第１のタグ化メンバーのセットを、１以上の第２のメンバーを含み得る生物学的サンプルと、第１のメンバーが第２のメンバーに結合するのに十分な時間および条件下で組み合わせる工程であって、該タグは、特定の第１のメンバーと相関しかつ非蛍光分光分析または電位差滴定により検出可能である、工程；  （ｂ）結合した第１および第２のメンバーを、未結合のメンバーから分離する工程；  （ｃ）該タグを、該第１のタグ化メンバーから切断する工程；および  （ｄ）該タグを、非蛍光分光分析または電位差測定により検出し、そこから該第１のメンバーの該第２のメンバーへの結合を検出する工程；を包含する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載されるような、非蛍光標識を用いるリガンド対の結合の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、概して、核酸分子を分析するための方法および組成物に関し、より詳細には、広範な生物学的ベースのアッセイの分析の感度を高めるのに有用であり得る、特定のタグおよびリンカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
核酸分子の検出および分析は、生物学において最も重要な技術である。これらは分子生物学の中心に位置し、そして残りの生物学において急速に拡張する役割を果たす。
【０００３】
一般的に、実質的に全ての生化学的反応に続いて、分析は、いくつかの形態の検出工程を伴う。特定の関心事は、核酸ハイブリダイゼーションおよび抗体−抗原結合の検出である。理想的には、検出は、感受性であるべきであり、そして複数のサンプルのプロセシングを可能にすべきである。しかし、現在の検出技術は、これら両方の特性において幾分制限される。
【０００４】
一般的に、核酸分子のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションプローブが放射活性標識を含む場合には、オートラジオグラフィーまたはリン光イメージ分析（ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により検出され、ハイブリダイゼーションプローブがビオチンまたはジゴキシンのような標識を含む（すなわち、酵素カップリングされた抗体またはリガンドにより認識される）場合には、デンシトメーターにより検出される。放射性標識化プローブが用いられた場合、オートラジオグラフィーによる検出は、相反則不軌および非線形性のような、フィルムの制限を被る。これらのフィルムの制限は、リン光イメージ分析によって標識を検出することにより克服され得る。しかし、放射性標識は、安全性の要求を有し、資源利用を高め、そして特定の装置および個人のトレーニングを必要とする。このような理由のために、非放射活性標識の使用は、広く増大している。このような系において、ヌクレオチドは、ビオチンまたはジゴキシンのような標識（これは、抗体、または色素生産性基質と反応性の酵素で標識される他の分子により検出され得る）を含む。あるいは、蛍光標識が使用され得る。これらの系は、上記のような安全性の関心事はないが、しばしば不安定（ｌａｂｉｌｅ）で、非特異的反応を生じ得、その結果高いバックグラウンド（すなわち、低いシグナル対ノイズ比）を生じる成分を使用する。
【０００５】
抗体−抗原結合反応は、いくつかの手順のうちの１つで検出され得る。核酸ハイブリダイゼーションに関する限りでは、放射活性または非放射活性の標識は、典型的には、抗体に結合する（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。標識のタイプも同様である：色素生産性基質と反応する酵素、蛍光体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）、リガンドまたは別の抗体により検出されるハプテンなど。核酸ハイブリダイゼーションの検出時と同様の制限が、これらの検出方法において固有である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、広範な核酸ベースの、またはタンパク質（例えば、抗体）ベースの手順において有用とされ得る新規組成物を提供し、さらに、他の関連する利点を提供する。
【０００７】
発明の要旨
簡単にいえば、本発明は、広範なベースのアッセイにおける感度およびサンプル処理数（ｓａｍｐｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）を増大するのに有用であり得る組成物および方法を提供する。特に、本明細書中に記載される発明に基づいて、これまで完結するのに長い期間かかった多くのアッセイが、今や１０倍から１００倍を超える速さで行われ得る。従って、本明細書中に記載される方法は、以前に利用可能であったアッセイより著しくかつ重大な改善を提示する。
【０００８】
例えば、本発明の１つの局面の範囲内にある方法は、リガンド対の第１のメンバーの第２のメンバーへの結合を検出するのに提供され、この方法は、以下の工程を含む：（ａ）第１のタグ化メンバーのセットを、１以上の第２のメンバーを含み得る生物学的サンプルと、第１のメンバーが第２のメンバーに結合するのに十分な時間、条件下で組み合わせる工程であって、該タグは、特定の第１のメンバーに関連し、そして非蛍光分光または電位差測定により検出可能である；（ｂ）結合した第１および第２のメンバーを、未結合のメンバーから分離する工程；（ｃ）該タグを、第１のタグ化メンバーから切断する工程；および（ｄ）該タグを、非蛍光分光または電位差測定により検出し、そこから第１のメンバーの第２のメンバーへの結合を検出する工程。
【０００９】
広範な、第１および第２のメンバーの対は、本発明の文脈内で利用され得、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡのような核酸アナログ、またはこれらの任意の組合せ）、タンパク質、またはポリペプチド（例えば、抗体または抗体フラグメント（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはＣＤＲの様な結合パートナー）、オリゴ糖、ホルモン、有機分子および他の基質（例えば、グルクロニダーゼ−薬物分子のような生体異物）、または任意の他のリガンド対を含む。本発明の種々の実施態様の範囲内で、第１および第２のメンバーは、同じタイプの分子であっても、異なるタイプの分子であってもよい。例えば、代表的な第１のメンバー−第２のメンバーリガンド対は、以下を含む：核酸分子／核酸分子；抗体／核酸分子；抗体／ホルモン：抗体／生体異物；および抗体／タンパク質。
【００１０】
好ましくは、第１のメンバーは、特に（すなわち、他の関連分子を除いて）選択された第２のメンバー、または関連する第２のメンバー分子の１クラス（例えば、関連レセプターの１クラス）のいずれかを認識する。好ましくは、第１のメンバーは、少なくとも約１０−５／Ｍ、好ましくは、１０−６／Ｍ、１０−７／Ｍ、１０−８／Ｍ、１０−９／Ｍ、または１０−１２／Ｍを超える親和性で第２のメンバーに結合する。第１の分子の、第２の分子への親和性は、当業者によって容易に決定され得る（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，  Ａｎｎ，  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１：  ６６０−６７２，  １９４９を参照のこと）。
【００１１】
本発明の他の関連する局面の範囲内にある方法は、選択される生物学的サンプルから、遺伝子発現のパターンを分析するために提供され、この方法は、以下の工程を含む：（ａ）生物学的サンプルから核酸を曝露する工程；（ｂ）該曝露された核酸を、１以上の選択されたタグ化核酸プローブと、該プローブが該核酸にハイブリダイズするのに十分な時間、条件下で組み合わせる工程であって、該タグは、特定の核酸プローブに関連し、そして非蛍光分光または電位差測定により検出可能である；（ｃ）ハイブリダイズしたプローブを、未ハイブリダイズのプローブから分離する工程；（ｄ）該タグを、タグ化フラグメントから切断する工程；および（ｅ）該タグを、非蛍光分光または電位差測定により検出し、そこから生物学的サンプルの遺伝子発現パターンを決定する工程。１つの実施態様の範囲内で、この生物学的サンプルは、核酸を曝露する工程の前に、選択された分子で刺激され得る。代表的な「刺激剤」の例は、核酸分子、組換え遺伝子送達ビヒクル、有機分子、ホルモン、タンパク質、炎症性因子、サイトカイン、薬物、薬物候補、パラ分泌および自己分泌因子などを包含する。
【００１２】
本発明の内容の範囲内において、「生物学的サンプル」は、生存生物（例えば、哺乳動物、魚、バクテリア、寄生動物、ウイルス、カビなど）または環境（例えば、空気、水または固体サンプル）から得られるサンプルだけでなく、人工的または合成的に産生され得る生物学的物質（例えば、ファージライブラリ、有機分子ライブラリ、ゲノムクローンのプールなど）を含むことが理解される。生物学的サンプルの代表的な例としては、生物学的流体（例えば、血液、精液、脳脊髄液、尿）、生物学的細胞（例えば、幹細胞、ＢまたはＴ細胞、肝細胞、繊維芽細胞など）、および生物学的組織が挙げられる。
【００１３】
上記方法の種々の実施態様内において、本発明の核酸プローブおよびまたは分子は、例えば、連結、切断または伸長（例えば、ＰＣＲ）反応により生成され得る。他の関連する局面内において、核酸プローブまたは分子は、５’−末端にタグを付けられ得、そしてそのようにタグを付けられた分子は、オリゴヌクレオチドプライマーまたはジデオキシヌクレオチドターミネーターとして機能する。
【００１４】
本発明の他の実施態様内において、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００より多い、異なりかつ独自のタグ化分子が、所定の反応内で同時に利用され得、ここで各タグは、選択されたフラグメント、プローブ、または第１もしくは第２のメンバーに対して独自であり、そして別々に同定され得る。
【００１５】
本発明のさらなる実施態様内において、タグは、蛍光分析、質量分析、赤外分光分析、紫外線分光分析、または、定電位電流測定（例えば、電量測定または電流測定検出器を利用）により検出され得る。適切な分光分析技術の代表的な例としては、飛行時間型質量分析、四重極型質量分析、磁気セクター質量分析および電気セクター質量分析が挙げられる。このような技術の特定の実施態様としては、イオントラップ質量分析、エレクトロスプレーイオン化質量分析、イオンスプレー質量分析、液体イオン化質量分析、大気圧イオン化質量分析、電子イオン化質量分析、高速原子衝撃イオン化質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、光イオン化飛行時間型質量分析、レーザー液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＡＰＣＩ質量分析、ナノスプレー質量分析、噴霧スプレーイオン化質量分析、化学イオン化質量分析、共鳴イオン化質量分析、２次イオン化質量分析およびサーモスプレー質量分析が挙げられる。
【００１６】
本発明のさらに他の実施態様内において、結合した第１および第２のメンバー、あるいは露出した核酸は、以下のような方法により、未結合のメンバーまたは分子から分離され得る：ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、マイクロチャネル電気泳動、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、逆サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、パルスフィールド電気泳動、フィールド反転電気泳動、透析、および蛍光活性化液体液滴選別が挙げられる。あるいは、第１または第２いずれかのメンバー、あるいは露出した核酸は、固体支持体（例えば、中空ファイバ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  Ｍａｓｓ．）、ビーズ（Ｐｏｙｌｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  Ｐａ．）、磁気ビーズ（Ｒｏｂｂｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆ．）、プレート、皿およびフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ，  Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｎ．Ｙ．）、メッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆ．）、スクリーンおよび固体ファイバ（Ｅｄｅｌｍａｎらの米国特許第３，８４３，３２４号を参照のこと；Ｋｕｒｏｄａらの米国特許第４，４１６，７７７号もまた参照のこと）、膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  Ｍａｓｓ．）、およびディップスティック）に結合され得る。第１または第２のメンバー、あるいは露出した核酸は、固体支持体に結合され、本発明の特定の実施態様内において、本明細書中で開示される方法は、固体支持体の未結合の物質を洗浄する工程をさらに包含する。
【００１７】
他の実施態様内において、タグ化核酸分子またはプローブは、化学的、酸化、還元、酸不安定、塩基不安定、酵素的、電気化学的、熱および光不安定方法などの方法により切断され得る。さらなる実施態様内において、分離、切断および検出工程は、例えば、自動化され得る単一の装置で連続的様式（例えば、連続流として）で実施され得る。
【００１８】
本発明はさらに、以下を提供する：
（項目１）  リガンド対の第１のメンバーの第２のメンバーへの結合を検出するための方法であって、
（ａ）第１のタグ化メンバーのセットを、１以上の第２のメンバーを含み得る生物学的サンプルと、第１のメンバーが第２のメンバーに結合するのに十分な時間および条件下で組み合わせる工程であって、該タグは、特定の第１のメンバーと相関しかつ非蛍光分光分析または電位差滴定により検出可能である、工程；
（ｂ）結合した第１および第２のメンバーを、未結合のメンバーから分離する工程；
（ｃ）該タグを、該第１のタグ化メンバーから切断する工程；および
（ｄ）該タグを、非蛍光分光分析または電位差測定により検出し、そこから該第１のメンバーの該第２のメンバーへの結合を検出する工程；
を包含する、方法。
【００１９】
（項目２）  前記第１のメンバーが固体支持体に結合される、項目１に記載の方法。
【００２０】
（項目３）  結合した第１および第２のメンバーを分離する工程に続いて、前記固体支持体から未結合のメンバーを洗浄する工程をさらに包含する、項目２に記載の方法。
【００２１】
（項目４）  前記タグの検出が、質量分析、赤外分光分析、紫外分光分析、または定電位電流測定による、項目１に記載の方法。
【００２２】
（項目５）  ４個よりも多くの、第１のタグ化メンバーが組み合わされ、そして各タグが、選択された核酸フラグメントごとに別々（ｕｎｉｑｕｅ）である、項目１に記載の方法。
【００２３】
（項目６）  前記結合した第１および第２のメンバーが、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、マイクロチャネル電気泳動、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィーおよび濾過からなる群より選択される方法により、未結合のメンバーから分離される、項目１に記載の方法。
【００２４】
（項目７）  前記第１のタグ化メンバーが、酸化、還元、酸不安定化（ａｃｉｄ  ｌａｂｉｌｅ）法、塩基不安定化（ｂａｓｅ  ｌａｂｉｌｅ）法、酵素的方法、電気化学的方法、熱、および光不安定化（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）方法からなる群より選択される方法により切断される、項目１に記載の方法。
【００２５】
（項目８）  前記タグが、飛行時間型質量分析、四重極型質量分析、磁気セクター質量分析、および電気セクター質量分析により検出される、項目４に記載の方法。
【００２６】
（項目９）  前記タグが、電量測定検出器および電流測定検出器からなる群より選択される検出器を用いる定電位電流測定により検出される、項目４に記載の方法。
【００２７】
（項目１０）  工程ｂ、ｃおよびｄが連続的に行われる、項目１に記載の方法。
【００２８】
（項目１１）  工程ｂ、ｃおよびｄが、単一の装置で連続的に行われる、項目１に記載の方法。
【００２９】
（項目１２）  工程ｂ、ｃおよびｄが自動化される、項目１１に記載の方法。
【００３０】
（項目１３）  前記第１のメンバーが核酸分子である、項目１に記載の方法。
【００３１】
（項目１４）  前記第２のメンバーが核酸分子である、項目１に記載の方法。
【００３２】
（項目１５）  前記核酸分子がプライマー伸長により生じる、項目１３または１４に記載の方法。
【００３３】
（項目１６）  前記核酸分子が、非３’タグ化オリゴヌクレオチドプライマーから生じる、項目１３または１４に記載の方法。
【００３４】
（項目１７）  前記核酸分子が、タグ化ジデオキシヌクレオチドターミネーターから生じる、項目１３または１４に記載の方法。
【００３５】
（項目１８）  前記第１のメンバーが、タンパク質、ホルモンまたは有機分子である、項目１３または１４に記載の方法。
【００３６】
（項目１９）  前記タンパク質が、抗体およびレセプターからなる群より選択される、項目１８に記載の方法。
【００３７】
（項目２０）  選択された生物学的サンプルから遺伝子発現のパターンを分析するための方法であって、
（ａ）生物学的サンプルから核酸を露出させる工程；
（ｂ）該露出された核酸を、１以上の選択されたタグ化核酸プローブと、該プローブが該核酸にハイブリダイズするのに十分な時間および条件下で組み合わせる工程であって、該タグは、特定の核酸プローブと相関しかつ非蛍光分光分析または電位差滴定により検出可能である、工程；
（ｃ）ハイブリダイズしたプローブを、未ハイブリダイズのプローブから分離する工程；
（ｄ）該タグを、該タグ化フラグメントから切断する工程；および
（ｅ）該タグを、非蛍光分光分析または電位差滴定により検出し、そこから該生物学的サンプルの遺伝子発現パターンを決定する工程；
を包含する、方法。
【００３８】
（項目２１）  前記生物学的サンプルが、哺乳動物細胞、細菌、および酵母からなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
【００３９】
（項目２２）  前記哺乳動物細胞がウイルスを含む、項目２１に記載の方法。
【００４０】
（項目２３）  前記露出された核酸が固体支持体に結合される、項目２０に記載の方法。
【００４１】
（項目２４）  前記固体支持体がポリマーである、項目２３に記載の方法。
【００４２】
（項目２５）  分離工程に続いて、前記固体支持体を洗浄する工程をさらに包含する、項目２３に記載の方法。
【００４３】
（項目２６）  前記ハイブリダイズされたプローブが、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、マイクロチャネル電気泳動、ＨＰＬＣ、濾過、およびポリアクリルアミドゲル電気泳動からなる群より選択される方法により、未ハイブリダイズのプローブから分離される、項目２０に記載の方法。
【００４４】
（項目２７）  前記タグ化プローブが、酸化、還元、酸不安定化（ａｃｉｄ  ｌａｂｉｌｅ）法、塩基不安定化（ｂａｓｅ  ｌａｂｉｌｅ）法、酵素的方法、電気化学的方法、熱、および光不安定化（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）方法からなる群より選択される方法により切断される、項目２０に記載の方法。
【００４５】
（項目２８）  前記タグが、飛行時間型質量分析、四重極型質量分析、磁気セクター質量分析、および電気セクター質量分析からなる群より選択される方法により検出される、項目２０に記載の方法。
【００４６】
（項目２９）  前記タグが、電量測定検出器および電流測定検出器からなる群より選択される検出器を用いる定電位電流測定により検出される、項目２０に記載の方法。
【００４７】
（項目３０）  工程ｃ、ｄおよびｅが連続的に行われる、項目２０に記載の方法。
【００４８】
（項目３１）  工程ｃ、ｄおよびｅが、単一の装置で連続的に行われる、項目２０に記載の方法。
【００４９】
（項目３２）  前記装置が自動化される、項目３１に記載の方法。
【００５０】
（項目３３）  以下の式：
Ｔｍｓ−Ｌ−Ｘ
を有する化合物であって、
Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、該基は、炭素；水素およびフッ素のうちの少なくとも１個；ならびに酸素、窒素、硫黄、リンおよびヨウ素から選択される必要に応じた原子；を含有し；
Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を該化合物の残りから切断することを可能にする有機基であり、該Ｔｍｓ含有部分は、該化合物が質量分析に供された際に単一イオン化荷電状態を維持し、そして第３級アミン、第４級アミンおよび有機酸から選択される、官能基を含む：
Ｘは、核酸フラグメント以外のＭＯＩであり、該化合物は少なくとも２５０ダルトンの質量を有する、
化合物。
【００５１】
（項目３４）  Ｔｍｓが、１５〜１０，０００ダルトンの質量、およびＣ１〜５００Ｎ０〜１００Ｏ０〜１００Ｓ０〜１０Ｐ０〜１０ＨαＦβＩδの分子式を有し、ここで、α、βおよびδの合計は、該Ｈ原子、Ｆ原子、Ｉ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子およびＯ原子の原子価を満たすのに十分である、項目３３に記載の化合物。
【００５２】
（項目３５）  ＴｍｓおよびＬが官能基を介して互いに結合されており、該官能基が、アミド、エステル、エーテル、アミン、スルフィド、チオエステル、ジスルフィド、チオエーテル、尿素、チオ尿素、カルバメート、チオカルバメート、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、ホスホンアミド、スルホネート、スルホンアミドまたは炭素−炭素結合から選択される、項目３３に記載の化合物。
【００５３】
（項目３６）  前記官能基が、アミド、エステル、アミン、尿素およびカルバメートから選択される、項目３５に記載の化合物。
【００５４】
（項目３７）  Ｌが、Ｌｈυ、Ｌａｃｉｄ、Ｌｂａｓｅ、Ｌ［Ｏ］、Ｌ［Ｒ］、Ｌｅｎｚ、Ｌｅｌｃ、ＬΔ、およびＬｓｓから選択され、それぞれ、化学線、酸、塩基、酸化、還元、酵素、電気化学的、熱的、およびチオール交換により前記Ｔｍｓ含有部分が前記分子の残りから切断される、項目３５に記載の化合物。
【００５５】
（項目３８）  Ｌｈυが、式Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３を有し、ここで、Ｌ２は、化学線を吸収してＸからのＴｍｓの切断を促進する分子フラグメントであり、そしてＬ１およびＬ３は独立して、直接結合または有機部分であり、ここで、Ｌ１は、ＴｍｓからＬ２を分離し、Ｌ３は、Ｌ２をＸから分離し、そしてＬ２が化学線を吸収するときにＬ１もＬ３も結合が切断されない、項目３７に記載の化合物。
【００５６】
（項目３９）  −Ｌ２−Ｌ３が以下の式：
【００５７】
【化１】
2008220370.tif 000002
を有する、項目３８に記載の化合物であって、
ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄまたはｅの位置の１個の炭素原子は、−Ｌ３−Ｘで置換されており、そして必要に応じて、ｂ、ｃ、ｄまたはｅのうちの１つ以上の位置は、アルキル、アルコキシ、フッ素、塩素、ヒドロキシル、カルボキシレート、またはアミドで置換されており；そしてＲ１は、水素またはヒドロカルビルである、
化合物。
【００５８】
（項目４０）  Ｘが、
【００５９】
【化２】
2008220370.tif 000003
であり、かつＲ２が、−ＯＨであるか、または別の部分とのカップリングにおいてカルボン酸を保護するかもしくは活性化する基である、項目３９に記載の化合物。
【００６０】
（項目４１）  Ｌ３が、直接結合、ヒドロカルビレン、−Ｏ−ヒドロカルビレン、およびヒドロカルビレン−（Ｏ−ヒドロカルビレン）ｎ−Ｈであり、ｎが、１〜１０の整数である、項目３８に記載の化合物。
【００６１】
（項目４２）  −Ｌ−Ｘが以下の式：
【００６２】
【化３】
2008220370.tif 000004
を有する、項目３３に記載の化合物であって、
ここで、ｂ、ｃ、ｄまたはｅのうちの１つ以上の位置は、水素、アルキル、アルコキシ、フッ素、塩素、ヒドロキシル、カルボキシレートまたはアミドで置換されており；Ｒ１は、水素またはヒドロカルビルである、
化合物。
【００６３】
（項目４３）  Ｔｍｓが以下の式：
Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−
を有する、項目３３に記載の化合物であって、
Ｔ２は、炭素と、水素、フッ素、ヨウ素、酸素、窒素、硫黄、およびリンのうちの１つ以上とから形成される有機部分であり、該部分は、１５〜５００ダルトンの質量を有し；
Ｔ３は、炭素と、水素、フッ素、ヨウ素、酸素、窒素、硫黄、およびリンのうちの１つ以上とから形成される有機部分であり、該部分は、５０〜１０００ダルトンの質量を有し；
Ｊは、直接結合または官能基であり、該官能基は、アミド、エステル、アミン、スルフィド、エーテル、チオエステル、ジスルフィド、チオエーテル、尿素、チオ尿素、カルバメート、チオカルバメート、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、ホスホンアミド、スルホネート、スルホンアミド、または炭素−炭素結合から選択され；そして
ｎは、１〜５０の整数であり、ｎが１より大きい場合、Ｔ３およびＪは各々独立して選択される、
化合物。
【００６４】
（項目４４）  Ｔ３が、ヒドロカルビル、ヒドロカルビル−Ｏ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−Ｓ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−ＮＨ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−アミド−ヒドロカルビレン、Ｎ−（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、Ｎ，Ｎ−ジ（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、ヒドロカルビルアシル−ヒドロカルビレン、ヘテロシクリルヒドロカルビル（ここで、ヘテロ原子（単数または複数）は、酸素、窒素、硫黄、およびリンから選択される）、置換ヘテロシクリルヒドロカルビル（ここで、ヘテロ原子（単数または複数）は、酸素、窒素、硫黄、およびリンから選択され、そして該置換基は、ヒドロカルビル、ヒドロカルビル−Ｏ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−ＮＨ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−Ｓ−ヒドロカルビレン、Ｎ−（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、Ｎ，Ｎ−ジ（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、およびヒドロカルビルアシル−ヒドロカルビレンから選択される）、ならびに上記のいずれかの誘導体（１個以上の水素が、等しい数のフッ素で置換されている）から選択される、項目４３に記載の化合物。
【００６５】
（項目４５）  Ｔ３が式−Ｇ（Ｒ２）−を有し、Ｇが１つのＲ２置換基を有するＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、そしてＲ２が、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール縮合シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、アラルキル、アリール置換アルケニルまたはアリール置換アルキニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換シクロアルキル、ビアリール、アルコキシ、アルケノキシ、アルキノキシ、アラルコキシ、アリール置換アルケノキシまたはアリール置換アルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノまたはアルキニルアミノ、アリール置換アルキルアミノ、アリール置換アルケニルアミノまたはアリール置換アルキニルアミノ、アリールオキシ、アリールアミノ、Ｎ−アルキル尿素置換アルキル、Ｎ−アリール尿素置換アルキル、アルキルカルボニルアミノ置換アルキル、アミノカルボニル置換アルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリル置換アルキル、ヘテロシクリル置換アミノ、カルボキシアルキル置換アラルキル、オキソカルボシクリル縮合アリールおよびヘテロシクリルアルキル；シクロアルケニル、アリール置換アルキル、およびアリール置換アラルキル、ヒドロキシ置換アルキル、アルコキシ置換アルキル、アラルコキシ置換アルキル、アルコキシ置換アルキル、アラルコキシ置換アルキル、アミノ置換アルキル、（アリール置換アルキルオキシカルボニルアミノ）置換アルキル、チオール置換アルキル、アルキルスルホニル置換アルキル、（ヒドロキシ置換アルキルチオ）置換アルキル、チオアルコキシ置換アルキル、ヒドロカルビルアシルアミノ置換アルキル、ヘテロシクリルアシルアミノ置換アルキル、ヒドロカルビル置換ヘテロシクリルアシルアミノ置換アルキル、アルキルスルホニルアミノ置換アルキル、アリールスルホニルアミノ置換アルキル、モルホリノアルキル、チオモルホリノアルキル、モルホリノカルボニル置換アルキル、チオモルホリノカルボニル置換アルキル、Ｎ−（アルキル、アルケニルもしくはアルキニル）アミノカルボニル置換アルキルまたはＮ，Ｎ−［ジアルキル、ジアルケニル、ジアルキニルもしくは（アルキル、アルケニル）−アミノ］カルボニル置換アルキル、ヘテロシクリルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルキレンアミノカルボニル、ヘテロシクリルアミノカルボニル置換アルキル、ヘテロシクリルアルキレンアミノカルボニル置換アルキル、Ｎ，Ｎ−［ジアルキル］アルキレンアミノカルボニル、Ｎ，Ｎ−［ジアルキル］アルキレンアミノカルボニル置換アルキル、アルキル置換ヘテロシクリルカルボニル、アルキル置換ヘテロシクリルカルボニルアルキル、カルボキシル置換アルキル、ジアルキルアミノ置換アシルアミノアルキル、およびアミノ酸側鎖（アルギニン、アスパラギン、グルタミン、Ｓ−メチルシステイン、メチオニンおよび対応するそれらのスルホキシド誘導体およびスルホン誘導体、グリシン、ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、アラニン、オルニチン、ヒスチジン、グルタミン、バリン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、β−シアノアラニン、ならびにアロスレオニンか��選択される）；アリーニル（ａｌｙｎｙｌ）およびヘテロシクリルカルボニル、アミノカルボニル、アミド、モノアルキルアミノカルボニルまたはジアルキルアミノカルボニル、モノアリールアミノカルボニルまたはジアリールアミノカルボニル、アルキルアリールアミノカルボニル、ジアリールアミノカルボニル、モノアシルアミノカルボニルまたはジアシルアミノカルボニル、芳香族アシルまたは脂肪族アシル、アルキル（これは、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、メルカプト、モノアルキルアミノまたはジアルキルアミノ、モノアリールアミノまたはジアリールアミノ、アルキルアリールアミノ、ジアリールアミノ、モノアシルアミノまたはジアシルアミノ、アルコキシ、アルケノキシ、アリールオキシ、チオアルコキシ、チオアルケノキシ、チオアルキノキシ、チオアリールオキシ、およびヘテロシクリルから選択される置換基で必要に応じて置換される）から選択される、
項目４３に記載の化合物。
【００６６】
（項目４６）  以下の式：
【００６７】
【化４】
2008220370.tif 000005
を有する、項目３３に記載の化合物であって、
Ｇは、（ＣＨ２）１〜６であり、ここで、該ＣＨ２基のうちのただ１つのＣＨ２基上の水素は−（ＣＨ２）ｎ−アミド−Ｔ４で置換されており；
Ｔ２およびＴ４は、式Ｃ１〜２５Ｎ０〜９Ｏ０〜９ＨαＦβの有機部分であり、ここで、αおよびβの合計は、該H原子およびF原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子およびＯ原子の原子価を満たすのに十分であり；
アミドは、
【００６８】
【化５】
2008220370.tif 000006
であり；
Ｒ１は、水素またはＣ１〜１０アルキルであり；
ｃは、０〜４の整数であり；
Ｘは、項目１で定義され；
ｎは１〜５０の整数であり、ｎが１より大きい場合、Ｇ、ｃ、アミド、Ｒ１およびＴ４は独立して選択される、
化合物。
【００６９】
（項目４７）  以下の式：
【００７０】
【化６】
2008220370.tif 000007
を有する、項目３３に記載の化合物であって、
ここで、Ｔ５は、式Ｃ１〜２５Ｎ０〜９Ｏ０〜９ＨαＦβの有機部分であり、ここで、αおよびβの合計は、該H原子およびF原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子およびＯ原子の原子価を満たすのに十分であり；そしてＴ５は、第３級アミンもしくは第４級アミンまたは有機酸を含み；そしてｍは０〜４９の整数である、
化合物。
【００７１】
（項目４８）  以下の式：
【００７２】
【化７】
2008220370.tif 000008
を有する、項目３３に記載の化合物であって、
ここで、Ｔ５は、式Ｃ１〜２５Ｎ０〜９Ｏ０〜９ＨαＦβの有機部分であり、ここで、αおよびβの合計は、該H原子およびF原子が満たさなければ満たされないC原子、Ｎ原子およびＯ原子の原子価を満たすのに十分であり；そしてＴ５は、第３級アミンもしくは第４級アミンまたは有機酸を含み；そしてｍは０〜４９の整数である、
化合物。
【００７３】
（項目４９）  −アミド−Ｔ５が
【００７４】
【化８】
2008220370.tif 000009
から選択される、項目４７および４８のうちのいずれか１項に記載の化合物。
【００７５】
（項目５０）  −アミド−Ｔ５が、
【００７６】
【化９】
2008220370.tif 000010
から選択される、項目４７および４８のうちのいずれか１項に記載の化合物。
【００７７】
（項目５１）  Ｔ２が、以下の有機酸：
ギ酸、酢酸、プロピオール酸、プロピオン酸、フルオロ酢酸、２−ブチン酸、シクロプロパンカルボン酸、酪酸、メトキシ酢酸、ジフルオロ酢酸、４−ペンチン酸、シクロブタンカルボン酸、３，３−ジメチルアクリル酸、吉草酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｎ−ホルミル−Ｇｌｙ−ＯＨ、エトキシ酢酸、（メチルチオ）酢酸、ピロール−２−カルボン酸、３−フル酸、イソキサゾール−５−カルボン酸、トランス−３−ヘキセン酸、トリフルオロ酢酸、ヘキサン酸、Ａｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−ヒドロキシ−２−メチル酪酸、安息香酸、ニコチン酸、２−ピラジンカルボン酸、１−メチル−２−ピロールカルボン酸、２−シクロペンテン−１−酢酸、シクロペンチル酢酸、（Ｓ）−（−）−２−ピロリドン−５−カルボン酸、Ｎ−メチル−Ｌ−プロリン、ヘプタン酸、Ａｃ−ｂ−Ａｌａ−ＯＨ、２−ブチル−２−ヒドロキシ酪酸、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸、ｐ−トルイル酸、６−メチルニコチン酸、５−メチル−２−ピラジンカルボン酸、２，５−ジメチルピロール−３−カルボン酸、４−フルオロ安息香酸、３，５−ジメチルイソキサゾール−４−カルボン酸、３−シクロペンチルプロピオン酸、オクタン酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルスクシンアミド酸（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、フェニルプロピオール酸、ケイ皮酸、４−エチル安息香酸、ｐ−アニス酸、１，２，５−トリメチルピロール−３−カルボン酸、３−フルオロ−４−メチル安息香酸、Ａｃ−ＤＬ−プロパルギルグリシン、３−（トリフルオロメチル）酪酸、１−ピペリジンプロピオン酸、Ｎ−アセチルプロリン、３，５−ジフルオロ安息香酸、Ａｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨ、インドール−２−カルボン酸、２−ベンゾフランカルボン酸、ベンゾトリアゾール−５−カルボン酸、４−ｎ−プロピル安息香酸、３−ジメチルアミノ安息香酸、４−エトキシ安息香酸、４−（メチルチオ）安息香酸、Ｎ−（２−フロイル）グリシン、２−（メチルチオ）ニコチン酸、３−フルオロ−４−メトキシ安息香酸、Ｔｆａ−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−ナフトエ酸、キナルジン酸、Ａｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、３−メチルインデン−２−カルボン酸、２−キノキサリンカルボン酸、１−メチルインドール−２−カルボン酸、２，３，６−トリフルオロ安息香酸、Ｎ−ホルミル−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ、２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］酢酸、４−ｎ−ブチル安息香酸、Ｎ−ベンゾイルグリシン、５−フルオロインドール−２−カルボン酸、４−ｎ−プロポキシ安息香酸、４−アセチル−３，５−ジメチル−２−ピロールカルボン酸、３，５−ジメトキシ安息香酸、２，６−ジメトキシニコチン酸、シクロヘキサンペンタン酸、２−ナフチル酢酸、４−（１Ｈ−ピロール−１−イル）安息香酸、インドール−３−プロピオン酸、ｍ−トリフルオロメチル安息香酸、５−メトキシインドール−２−カルボン酸、４−ペンチル安息香酸、Ｂｚ−ｂ−Ａｌａ−ＯＨ、４−ジエチルアミノ安息香酸、４−ｎ−ブトキシ安息香酸、３−メチル−５−ＣＦ３−イソオキサゾール−４−カルボン酸、（３，４−ジメトキシフェニル）酢酸、４−ビフェニルカルボン酸、ピバロイル−Ｐｒｏ−ＯＨ、オクタノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、（２−ナフトキシ）酢酸、インドール−３−酪酸、４−（ト���フルオロメチル）フェニル酢酸、５−メトキシインドール−３−酢酸、４−（トリフルオロメトキシ）安息香酸、Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−ペンチルオキシ安息香酸、Ｚ−Ｇｌｙ−ＯＨ、４−カルボキシ−Ｎ−（フル−２−イルメチル）ピロリジン−２−オン、３，４−ジエトキシ安息香酸、２，４−ジメチル−５−ＣＯ２Ｅｔ−ピロール−３−カルボン酸、Ｎ−（２−フルオロフェニル）スクシンアミド酸（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、３，４，５−トリメトキシ安息香酸、Ｎ−フェニルアントラニル酸、３−フェノキシ安息香酸、ノナノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−フェノキシピリジン−３−カルボン酸、２，５−ジメチル−１−フェニルピロール−３−カルボン酸、トランス−４−（トリフルオロメチル）ケイ皮酸、（５−メチル−２−フェニルオキサゾール−４−イル）酢酸、４−（２−シクロヘキセニルオキシ）安息香酸、５−メトキシ−２−メチルインドール−３−酢酸、トランス−４−コチニンカルボン酸、Ｂｚ−５−アミノ吉草酸、４−ヘキシルオキシ安息香酸、Ｎ−（３−メトキシフェニル）スクシンアミド酸（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｚ−Ｓａｒ−ＯＨ、４−（３，４−ジメトキシフェニル）酪酸、Ａｃ−ｏ−フルオロ−ＤＬ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｎ−（４−フルオロフェニル）グルタミン酸、４’−エチル−４−ビフェニルカルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロアクリジンカルボン酸、３−フェノキシフェニル酢酸、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）スクシンアミド酸（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｎ−デカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、（＋）−６−メトキシ−α−メチル−２−ナフタレン酢酸、３−（トリフルオロメトキシ）ケイ皮酸、Ｎ−ホルミル−ＤＬ−Ｔｒｐ−ＯＨ、（Ｒ）−（＋）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸、Ｂｚ−ＤＬ−Ｌｅｕ−ＯＨ、４−（トリフルオロメトキシ）フェノキシ酢酸、４−へプチルオキシ安息香酸、２，３，４−トリメトキシケイ皮酸、２，６−ジメトキシベンゾイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロピオン酸、２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェノキシ酢酸、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）グルタミン酸、Ｎ−ウンデカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−（４−フルオロベンゾイル）安息香酸、５−トリフルオロメトキシインドール−２−カルボン酸、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）ジグリコールアミド酸、Ａｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｔｆａ−Ｌ−フェニルグリシン−ＯＨ、３−ヨード安息香酸、３−（４−ｎ−ペンチルベンゾイル）プロピオン酸、２−フェニル−４−キノリンカルボン酸、４−オクチルオキシ安息香酸、Ｂｚ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ、３，４，５−トリエトキシ安息香酸、Ｎ−ラウロイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３，５−ビス（トリフルオロメチル）安息香酸、Ａｃ−５−メチル−ＤＬ−Ｔｒｐ−ＯＨ、２−ヨードフェニル酢酸、３−ヨード−４−メチル安息香酸、３−（４−ｎ−ヘキシルベンゾイル）プロピオン酸、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−ノニルオキシ安息香酸、４’−（トリフルオロメチル）−２−ビフェニルカルボン酸、Ｂｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｎ−トリデカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３，５−ビス（トリフルオロメチル）フ���ニル酢酸、３−（４−ｎ−へプチルベンゾイル）プロピオン酸、Ｎ−ヘプタノイル−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−デシルオキシ安息香酸、Ｎ−（α，α，α−トリフルオロ−ｍ−トリル）アントラニル酸、ニフルム酸（Ｎｉｆｌｕｍｉｃ  ａｃｉｄ）、４−（２−ヒドロキシヘキサフルオロイソプロピル）安息香酸、Ｎ−ミリストイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３−（４−ｎ−オクチルベンゾイル）プロピオン酸、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−ウンデシルオキシ安息香酸、３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロピオニル−Ｇｌｙ−ＯＨ、８−ヨードナフトエ酸、Ｎ−ペンタデカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、４−ドデシルオキシ安息香酸、Ｎ−パルミトイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、およびＮ−ステアロイル−Ｇｌｙ−ＯＨ
のうちの１つをアミン基と縮合した際にＴ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−を形成する構造を有する、項目４３に記載の化合物。
【００７８】
（項目５２）  ＭＯＩが、タンパク質、ペプチド、オリゴ糖、抗体、抗原、薬物、および合成有機分子から選択される、項目３３に記載の化合物。
【００７９】
（項目５３）  以下の式：
Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩ
の化合物を１対含有する組成物であって、
Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、該基は、炭素；水素およびフッ素のうちの少なくとも１個；ならびに酸素、窒素、硫黄、リンおよびヨウ素から選択される必要に応じた原子；を含有し；
Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を該化合物の残りから切断することを可能にする有機基であり、ここで、該Ｔｍｓ含有部分は、該化合物が質量分析に供された際に単一イオン化荷電状態を維持し、そして第３級アミン、第４級アミンおよび有機酸から選択される、官能基を含み：
ＭＯＩは、核酸フラグメントであり、ここで、Ｌは、ＭＯＩの３’末端以外にてＭＯＩと結合し；そして
該対の化合物は、同一ではないＴｍｓ基を有し、塩基が同一ではない１つの塩基位置以外では同一の配列を有する、
化合物。
【００８０】
（項目５４）  以下の式：
Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩ
を有する化合物を１対含有する組成物であって、
Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、該基は、炭素；水素およびフッ素のうちの少なくとも１個；ならびに酸素、窒素、硫黄、リンおよびヨウ素から選択される必要に応じた原子；を含有し；
Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を該化合物の残りから切断することを可能にする有機基であり、該Ｔｍｓ含有部分は、該化合物が質量分析に供された際に単一イオン化荷電状態を維持し、そして第３級アミン、第４級アミンおよび有機酸から選択される、官能基を含み：
ＭＯＩは、核酸フラグメントであり、Ｌは、ＭＯＩの３’末端以外にてＭＯＩと結合しており；そして
該対の化合物は、同一ではないＴｍｓ基を有し、塩基が同一ではない２つの塩基位置以外では同一の配列を有する、
化合物。
【００８１】
（項目５５）  複数の前記対を含有する、項目５３または５４のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【００８２】
（項目５６）  項目５３または５４のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、
複数の前記対と、
固体支持体上に固定化された、同じ複数の同一ではない核酸と
を含有し、ここで、該複数の核酸の各メンバーは、該対の各々の１つのメンバーに対して正確に相補的である塩基配列を有する、
組成物。
【００８３】
（項目５７）  以下の式：
Ｔｍｓ−Ｌ−Ｘ
を有する化合物を複数含有する組成物であって、
ここで、
Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、該基は、炭素；水素およびフッ素のうちの少なくとも１個；ならびに酸素、窒素、硫黄、リンおよびヨウ素から選択される必要に応じた原子；を含有し；
Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を該化合物の残りから切断することを可能にする有機基であり、ここで、該Ｔｍｓ含有部分は、該化合物が質量分析に供された際に単一イオン化荷電状態を維持し、そして第３級アミン、第４級アミンおよび有機酸から選択される、官能基を含み：
Ｘは、核酸フラグメント以外のＭＯＩであり、
該複数は、少なくとも４つの該化合物を包含し、各化合物は、同一ではないＴｍｓ基を有する、
組成物。
【００８４】
（項目５８）  前記複数が、少なくとも１０である、項目５７に記載の組成物。
【００８５】
（項目５９）  複数の容器を含む変異分析のためのキットであって、
各容器が、以下の式：
Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩ
の化合物を一対含み、
Ｔｍｓは、質量分析により検出可能な有機基であり、該基は、炭素；水素およびフッ素のうちの少なくとも１個；ならびに酸素、窒素、硫黄、リンおよびヨウ素から選択される必要に応じた原子；を含有し；
Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を該化合物の残りから切断することを可能にする有機基であり、ここで、該Ｔｍｓ含有部分は、該化合物が質量分析に供された際に単一イオン化荷電状態を維持し、そして第３級アミン、第４級アミンおよび有機酸から選択される、官能基を含み：
ＭＯＩは、核酸フラグメントであり、ここで、Ｌは、ＭＯＩの３’末端以外にてＭＯＩと結合しており；そして
各対の化合物は、同一ではないＴｍｓ基を有し、塩基が同一ではない１つまたは２つの塩基位置以外では同一の配列を有する、
キット。
【００８６】
（項目６０）  前記複数が、少なくとも３である、項目５９に記載のキット。
【００８７】
（項目６１）  前記複数が、少なくとも５である、項目５９に記載のキット。
【００８８】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明らかとなる。さらに、特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）をより詳細に記載する種々の参考文献を以下に示し、これらは全体が本明細書中で参考として援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８９】
発明の詳細な説明
上記のように、本発明は、核酸分子を分析するための組成物および方法を提供する。ここで、サイズに基づく核酸分子の分離が必要とされる。本発明の方法は、目的の分子（核酸およびフラグメント、タンパク質、ペプチドなどを含む）の同時検出を可能にする。
【００９０】
簡潔に述べると、１つの局面において本発明は、目的の分子、またはその前駆体が不安定結合（単数または複数）を介してタグに連結されている化合物を提供する。従って、本発明の化合物は、一般式：
Ｔ−Ｌ−Ｘ
を有するとして概説され得る。ここで、Ｔはタグ成分であり、Ｌは不安定な結合であるか、または不安定な結合を含むかのいずれかの連結成分であり、そしてＸは目的の分子成分（ＭＯＩ）か、またはこれを介してＭＯＩがＴ−Ｌに結合し得る官能基成分（Ｌｈ）のいずれかである。従って、本発明の化合物は、より詳細な一般式：
Ｔ−Ｌ−ＭＯＩ  および  Ｔ−Ｌ−Ｌｈ
により表され得る。
【００９１】
以下に詳細に記載する理由として、Ｔ−Ｌ−ＭＯＩ化合物の組は、破壊されるべき不安定な結合（単数または複数）を生じる条件に目的をもって供され、従って、化合物の残りからのタグ部分を放出し得る。次いで、タグ部分は、１つ以上の分析技術により特徴付けられ、それによりタグ部分の構造に関する直接的情報、および（最も重要には）対応するＭＯＩのアイデンティティに関する間接的情報を提供する。
【００９２】
本発明の代表的化合物の単純な例示的な実施例（ここでＬは直接結合である）は、以下の構造（ｉ）が参照される：
【００９３】
【化１０】
2008220370.tif 000011
構造（ｉ）において、Ｔはカルボニル基に結合した窒素含有多環式芳香環部分であり、ＸはＭＯＩ（そして詳細にはアミン基において終結する核酸フラグメント）であり、ならびにＬは、アミド基を形成する結合である。アミド結合は、Ｔにおける結合に比較して不安定である。なぜなら、当該分野において理解されるように、アミド結合は、タグ成分中の結合は変化しないままの酸または塩基条件により化学的に切断（破壊）され得るからである。従って、タグ部分（すなわち、Ｔを含む切断産物）は、以下に示すように放出され得る：
【００９４】
【化１１】
2008220370.tif 000012
しかし、リンカーＬは、以下の例示的な実施例に示すように、直接結合ではあり得ず、以下に示す構造を有する本発明の別の代表的化合物が参照される：
【００９５】
【化１２】
2008220370.tif 000013
ο−ニトロベンジルアミン部分（構造（ｉｉ）中の四角で囲んだ原子を参照のこと）を有する化合物は、光分解的に不安定であり、このような化合物の特定波長の化学線照射への曝露は、ベンジルアミン結合（構造（ｉｉ）の太線で示した結合を参照のこと）の選択的切断を生じることは周知である。従って、構造（ｉｉ）は、構造（ｉ）と同じＴ基およびＭＯＩ基を有するが、リンカー基は複数の原子および結合を含み、この中には特定の不安定な結合が存在する。従って、構造（ｉｉ）の光分解は、以下に示すように、化合物の残りからタグ部分（Ｔを含む部分）を放出する。
【００９６】
【化１３】
2008220370.tif 000014
従って、本発明は、適切な切断条件への曝露に際して、切断反応を行いそれにより化合物の残りからタグ部分を放出する化合物を提供する。本発明の化合物は、タグ部分、ＭＯＩ（またはその前駆体、Ｌｈ）、および２つの基を一緒に結合する不安定結合（単数または複数）によって記載され得る。あるいは、本発明の化合物は、形成される成分によって記載され得る。従って、化合物は、以下のように、タグ反応体、リンカー反応体およびＭＯＩ反応体の反応産物として記載され得る。
【００９７】
タグ反応体は、化学ハンドル（Ｔｈ）および可変成分（Ｔｖｃ）をからなり、タグ反応体は一般構造：
Ｔｖｃ−Ｔｈ
を有するように理解される。
【００９８】
この命名法を例示するために、構造（ｉｉ）の化合物を調製するために用いられ得るタグ反応体を示す構造（ｉｉｉ）が参照され得る。構造（ｉｉｉ）を有するタグ反応体は、以下に示すように、タグ可変成分およびタグハンドルを含む：
【００９９】
【化１４】
2008220370.tif 000015
構造（ｉｉｉ）において、タグハンドル（−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ）は、Ｔ−Ｌ部分を形成するためにタグ反応体とリンカー反応体との反応のための接近手段を単純に提供する。構造（ｉｉｉ）における基「Ａ」は、カルボキシル基が化学的に活性な状態にあり、従って他のハンドルに結合し得ることを示す。「Ａ」は、例えば、種々の他の可能性の中でも、水酸基またはペンタフルオロフェノキシであり得る。本発明は、以下により詳細に議論するタグ可変成分に結合され得る多数の可能なタグハンドルを提供する。従って、タグ可変成分は、式Ｔ−Ｌ−Ｘにおける「Ｔ」の部分であり、そしてまたＬを切断する反応から形成されるタグ成分の部分であり得る。
【０１００】
以下にまた詳細に議論するように、タグ可変成分は、本発明による化合物の組の調製において、個々のメンバーが分析技術により別のメンバーから区別され得るように組のメンバーが独特（ｕｎｉｑｕｅ）の可変成分を有することが所望されるので、タグ可変成分と命名される。１つの例として、構造（ｉｉｉ）のタグ可変成分は、以下の組の１つのメンバーであり得る。ここで、組のメンバーは、そのＵＶまたは質量スペクトルにより区別され得る：
【０１０１】
【化１５】
2008220370.tif 000016
同様に、リンカー反応体は、リンカー不安定成分に隣接するその化学ハンドル（これらは少なくとも２つ必要であり、その各々はＬｈとして示され得る）によって記載され得る。ここでリンカー不安定成分は、必要な不安定部分（Ｌ２）および任意の不安定部分（Ｌ１およびＬ３）を含み、ここで任意の不安定部分は、ハンドルＬｈからＬ２を分離するのに効果的に役立ち、そして必要な不安定部分は、リンカー不安定成分中で不安定結合を提供することに効果的に役立つ。従って、リンカー反応体は、一般式：
Ｌｈ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌｈ
を有するものとして理解され得る。
【０１０２】
リンカー反応体を説明するために使用した命名法は、構造（ｉｖ）を考慮して例示され得、これは再度構造（ｉｉ）の化合物から得られる：
【０１０３】
【化１６】
2008220370.tif 000017
構造（ｉｖ）が例示するように、原子は、ひとつより多くの機能的役割を果たし得る。従って、構造（ｉｖ）において、ベンジル窒素は、リンカー反応体をタグ反応体にアミド形成反応を介して結合させる化学ハンドルとして機能する。そして引き続いて、ベンジル炭素−窒素結合における光分解切断に特に感受性な不安定部分Ｌ２の構造の必要な部分としてもまた役立ち得る。構造（ｉｖ）はまた、リンカー反応体は、Ｌ１基を有さず、Ｌ３基（この場合、メチレン基）を有し得ることを例示する。同様に、リンカー反応体は、Ｌ３基ではなくＬ１基を有し得、またはＬ１基およびＬ３基を有し得、あるいはＬ１基およびＬ３基のどちらをも有し得ない。構造（ｉｖ）において、カルボニル基に隣接する基「Ｐ」の存在は、カルボニル基が反応から保護されていることを示す。この構造が与えられたことによって、タグ反応体（ｉｉｉ）の活性化されたカルボキシル基は、リンカー反応体（ｉｖ）のアミン基と完全に反応して、アミド結合を形成し、そして式Ｔ−Ｌ−Ｌｈの化合物を与える。
【０１０４】
ＭＯＩ反応体は、目的の分子の適切に反応性形態である。目的の分子が核酸フラグメントである場合、適切なＭＯＩ反応体は、その５’水酸基を介してホスホジエステル基、次いでアミノ基で終結するアルキレン鎖に結合した核酸フラグメントである。次いで、このアミノ基は、それによりＭＯＩをリンカーに結合し得る。構造（ｉｖ）のカルボニル基と反応（もちろん、カルボニル基の脱保護の後、そして好ましくは引き続くカルボニル基のアミン基との反応の活性化の後）し得、それによりＭＯＩをリンカーに結合し得る。
【０１０５】
時系列で見た場合、本発明は、タグ反応体（化学タグハンドルおよびタグ可変成分を有する）、リンカー反応体（２つの化学的リンカーハンドルおよび必要な不安定部分および０〜２の任意の不安定部分を有する）、およびＭＯＩ反応体（目的成分の分子および目的ハンドルの化学的分子を有する）でＴ−Ｌ−ＭＯＩを形成するように理解される。従って、Ｔ−Ｌ−ＭＯＩを形成するために、タグ反応体およびリンカー反応体が一緒に反応して最初にＴ−Ｌ−Ｌｈを提供し、次いでＭＯＩ反応体はＴ−Ｌ−Ｌｈおよび反応してＴ−Ｌ−ＭＯＩを提供するか、または（より好ましくない）リンカー反応体およびＭＯＩ反応体が一緒に反応して最初にＬｈ−Ｌ−ＭＯＩを提供し、次いでＬｈ−Ｌ−ＭＯＩはタグ反応体と反応してＴ−Ｌ−ＭＯＩを提供するかのいずれかである。便宜の目的のために、式Ｔ−Ｌ−ＭＯＩを有する化合物は、このような化合物を形成するために使用され得るタグ反応体、リンカー反応体およびＭＯＩ反応体によって記載される。もちろん、式Ｔ−Ｌ−ＭＯＩの同じ化合物は、他の（代表的には、より面倒な）方法により調整され得、そしてこれは本発明のＴ−Ｌ−ＭＯＩ化合物の範囲内にある。
【０１０６】
任意の事象において、本発明は、タグ部分が化合物の残りから放出されるような切断条件に供されるべきＴ−Ｌ−ＭＯＩ化合物を提供する。タグ部分は、少なくともタグ可変成分を含み、そして代表的にはさらに、タグ反応体とリンカー反応体とを結合するために使用されたタグハンドルからのいくつかのまたは全ての原子、リンカーハンドルからのいくつかのまたは全ての原子、この基がＴ−Ｌ−ＭＯＩにおいて存在する場合不安定部分を必要に応じて含み、そしてＬ２の精密な構造および切断化学の性質に依存して必要な不安定部分Ｌ２のいくつかの部分をおそらくはさらに含む。便宜のために、タグ部分は、Ｔは代表的にはタグ部分の主要部分（質量において）を構成するので、Ｔ−含有部分として呼ばれ得る。
【０１０７】
本発明の１つの局面へこの導入が与えられるので、種々の成分（Ｔ、Ｌ、およびＸ）が詳細に説明される。この説明は、Ｔ、Ｌ、およびＸの説明において本明細書中に以下で使用される以下の特定の用語の定義から始まる。
【０１０８】
本明細書中に使用される場合、用語「核酸フラグメント」は、選択された標的核酸分子に相補的な（すなわち、その全部または部分に相補的な）分子であり、そして天然または合成由来あるいは組換え的に産生され（天然に存在しない分子を含む）、そして適切な場合２本鎖または１本鎖形態であり；そしてオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、プライマー、プローブ、核酸アナログ（例えば、ＰＮＡ）、ポリメラーゼにより３’から５’末端の方向に伸張されるオリゴヌクレオチド、化学的または酵素的に切断される核酸、ジデオキシターミネーターによって終結させられるか、または３’または５’での重合を阻害する化合物により３’または５’末端でキャップされる核酸、およびこれらの組合せを含むことを意味する。核酸フラグメントの選択された標的核酸分子への相補性は、一般的に、フラグメントの長さ全体にかけて少なくとも約７０％の特異的な塩基対形成を示すことを意味する。好ましくは、核酸フラグメントは、少なくとも約８０％；そして最も好ましくは、約９０％の特異的な塩基対形成を示す。ミスマッチ割合（従って、特異的な塩基対形成の割合）を決定するためのアッセイは、当該分野において周知であり、そして完全に塩基対形成したコントロールに参照される場合のＴｍの関数としてのミスマッチ割合に基づく。
【０１０９】
本明細書中で使用される用語「アルキル」は、単独または組み合わせて、１〜１０、好ましくは１個〜６個そしてより好ましくは１個〜４個の炭素原子を含む飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルをいう。このようなラジカルの例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、デシルなどを含むが、これらに限定されない。用語「アルキレン」は、１個〜１０個、好ましくは１個〜６個そしてより好ましくは１個〜４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素ジラジカルをいう。このようなジラジカルの例は、メチレン、エチレン、（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、プロピレンなどを含むが、これらに限定されない。
【０１１０】
用語「アルケニル」は、単独または組み合わせて、２個〜１０個、好ましくは２個〜６個そしてより好ましくは２個〜４個の炭素原子全体において、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルをいう。このようなラジカルの例は、エテニル、Ｅ−およびＺ−プロペニル、イソプロペニル、Ｅ−およびＺ−ブテニル、Ｅ−およびＺ−イソブテニル、Ｅ−およびＺ−ペンテニル、デセニルなどを含むが、これらに限定されない。用語「アルケニレン」は、２個〜１０個、好ましくは２個〜６個そしてより好ましくは２個〜４個の炭素原子の全体において、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素ジラジカルをいう。このようなジラジカルの例は、メチリデン（＝ＣＨ２）、エチリデン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、プロピリデン（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）などを含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
用語「アルキニル」は、単独または組み合わせて、２個〜１０個、好ましくは２個〜６個そしてより好ましくは２個〜４個の炭素原子の全体において、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルをいう。このようなラジカルの例は、エチニル（アセチレニル）、プロピニル（プロパルジル）、ブチニル、ヘキシニル、デシニルなどを含むが、これらに限定されない。用語「アルキニレン」は、単独または組み合わせて、２個〜１０個、好ましくは２個〜６個そしてより好ましくは２個〜４個の炭素原子の全体において、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素ジラジカルをいう。このようなラジカルの例は、エチニレン（−Ｃ≡Ｃ−）、プロピニレン（−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−）などを含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
用語「シクロアルキル」は、単独または組み合わせて、炭素原子の数が３個〜８個そしてより好ましくは３個〜６個の炭素原子の飽和環状配置をいう。このようなシクロアルキルラジカルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含むが、これらに限定されない。用語「シクロアルキレン」は、シクロアルキルのジラジカル形態をいう。
【０１１３】
用語「シクロアルケニル」は、単独または組み合わせて、４個〜８個、好ましくは５個または６個の炭素原子および１つ以上の二重結合を含む環状炭素環をいう。このようなシクロアルケニルラジカルの例は、シクロペンテニル、シクロヘキシニル、シクロペンタジエニルなどを含むが、これらに限定されない。用語「シクロアルケニレン」は、シクロアルケニルのジラジカル形態をいう。
【０１１４】
用語「アリール」は、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、アズレニル、フルオレニル、およびアントラセニルからなる群から選択される炭素環（炭素および水素の全体からなる）芳香族基；またはフリル、チエニル、ピリジル、ピロリル、オキサゾリル（ｏｘａｚｏｌｙｌｙ）、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、２−ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、１，３，５−トリアジニル、１，３，５−トリチアニル、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、インドリニル、ベンゾ［ｂ］フラニル、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル、１Ｈ−インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノオキサリニル、１，８−ナフチリジニル、プテリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、およびフェノキサジニルからなる群から選択されるヘテロ環芳香族基をいう。
【０１１５】
本明細書中に定義される「アリール」基は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シアノ、カルボキシ、カルボアルコキシ、１，２−ジオキシエチレン、アルコキシ、アルケノキシまたはアルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、脂肪族アシルまたは芳香族アシル、アルコキシ−カルボニルアミノ、アルキルスルホニルアミノ、モルホリノカルボニルアミノ、チオモルホリノカルボニルアミノ、Ｎ−アルキルグアニジノ、アラルキルアミノスルホニル；アラルコキシアルキル；Ｎ−アラルコキシ尿素；Ｎ−ヒドルキシル尿素；Ｎ−アルケニル尿素；Ｎ，Ｎ−（アルキル、ヒドロキシル）尿素；ヘテロシクリル；チオアリールオキシ−置換アリール；Ｎ，Ｎ−（アリール、アルキル）ヒドラジノ；Ａｒ’−置換スルホニルヘテロシクリル；アラルキル−置換ヘトロシクリル；シクロアルキルおよびシクロアケニル置換−ヘトロシクリル；シクロアルキル−縮合アリール；アリールオキシ−置換アルキル；ヘテロシクリルアミノ；脂肪族アシルアミノカルボニルまたは芳香族アシルアミノカルボニル；脂肪族アシル−置換アルケニルまたは芳香族アシル−置換アルケニル；Ａｒ’−置換アミノカルボニルオキシ；Ａｒ’，Ａｒ’−ジ置換アリール；脂肪族アシル−置換アシルまたは芳香族アシル−置換アシル；シクロアルキルカルボニルアルキル；シクロアルキル−置換アミノ；アリールオキシカルボニルアルキル；ホスホロジアミジル酸またはエステル；からなる群から独立して選択される１個〜４個の置換基を、独立して含み得る。
【０１１６】
「Ａｒ’」は、上記に定義されるように水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、１，２−ジオキシメチレン、１，２−ジオキシエチレン、アルコキシ、アルケノキシ、アルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノまたはアルキニルアミノ、アルキルカルボニルオキシ、脂肪族アシルまたは芳香族アシル、アルキルカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、アルキルスルホニルアミノ、Ｎ−アルキル、またはＮ，Ｎ−ジアルキル尿素からなる群から選択される１個〜３個の置換基を有する炭素環またはヘテロ環アリール基である。
【０１１７】
用語「アルコキシ」は、単独または組み合わせて、アルキルエーテルラジカルをいい、ここで、用語「アルキル」は上記のように定義される。適切なアルキルエーテルラジカルの例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどを含むが、これらに限定されない。
【０１１８】
用語「アルケノキシ」は、単独または組み合わせて、アルケニル−Ｏ−式のラジカルをいい、ここで用語「アルケニル」は上記のように定義され、但し、ラジカルはエノールエーテルではない。適切なアルケノキシラジカルの例は、アリルオキシ、Ｅ−３−メチル−２−プロペノキシおよびＺ−３−メチル−２−プロペノキシなどを含むが、これらに限定されない。
【０１１９】
用語「アルキニルオキシ」は、単独または組み合わせて、アルキニル−Ｏ−式のラジカルをいい、ここで用語「アルキニル」は上記のように定義され、但し、ラジカルはイノールエーテルではない。適切なアルキノキシラジカルの例は、プロパルギルオキシ、２−ブチニルオキシなどを含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
用語「チオアルコキシ」は式アルキル−Ｓ−のチオエーテルラジカルをいい、ここでアルキルは上記のように定義される。
【０１２１】
用語「アルキルアミノ」は、単独または組み合わせて、モノ−またはジ−アルキル−置換アミノラジカル（すなわち、式アルキル−ＮＨ−または（アルキル）２−Ｎ−のラジカル）をいい、ここで、用語「アルキル」は上記のように定義される。適切なアルキルアミノラジカルの例は、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｔ−ブチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノなどを含むが、これらに限定されない。
【０１２２】
用語「アルケニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルケニル−ＮＨ−または（アルケニル）２Ｎ−のラジカルをいい、ここで用語「アルケニル」は上記のように定義され、但し、ラジカルはエナミンではない。このようなアルケニルアミノラジカルの例は、アリルアミノラジカルである。
【０１２３】
用語「アルキニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルキニル−ＮＨ−または（アルキニル）２Ｎ−のラジカルをいい、ここで用語「アルキニル」は上記のように定義され、但し、ラジカルはイナミンではない。このようなアルキニルアミノラジカルの例は、プロパルギルアミノラジカルである。
【０１２４】
用語「アミド」は、−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（＝Ｏ）−または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−のいずれかをいい、ここでＲ１は本明細書中で水素ならびに他の基を含むと定義される。用語「置換アミド」は、Ｒ１が水素ではない状況をいい、一方用語「非置換アミド」はＲ１が水素である状況をいう。
【０１２５】
用語「アリールオキシ」は、単独または組み合わせて、式アリール−Ｏ−のラジカルをいい、ここでアリールは上記のように定義される。アリールオキシラジカルの例は、フェノオキシ、ナフトキシ、ピリジルオキシなどを含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
用語「アリールアミノ」は、単独または組み合わせて、式アリール−ＮＨ−のラジカルをいい、ここでアリールは上記のように定義される。アリールアミノラジカルの例は、フェニルアミノ（アニリド）、ナフチルアミノ、２−、３−、および４−ピリジルアミノなどを含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
用語「アリール縮合シクロアルキル」は、単独または組み合わせて、アリールラジカルと隣接する２原子を共有するシクロアルキルラジカルをいい、ここで用語「シクロアルキル」および「アリール」は、上記のように定義される。アリール縮合シクロアルキルラジカルの例は、ベンゾ縮合シクロブチルラジカルである。
【０１２８】
用語「アルキルカルボニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルキル−ＣＯＮＨのラジカルをいい、ここで用語「アルキル」は上記のように定義される。
【０１２９】
用語「アルコキシカルボニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルキル−ＯＣＯＮＨ−のラジカルをいい、ここで用語「アルキル」は上記のように定義される。
【０１３０】
用語「アルキルスルホニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルキル−ＳＯ２ＮＨ−のラジカルをいい、ここで用語「アルキル」は上記のように定義される。
【０１３１】
用語「アリールスルホニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アリール−ＳＯ２ＮＨ−のラジカルをいい、ここで用語「アリール」は上記のように定義される。
【０１３２】
用語「Ｎ−アルキル尿素」は、単独または組み合わせて、式アルキル−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−のラジカルをいい、ここで用語「アルキル」は上記のように定義される。
【０１３３】
用語「Ｎ−アリール尿素」は、単独または組み合わせて、式アリール−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−のラジカルをいい、ここで用語「アリール」は上記のように定義される。
【０１３４】
用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素をいう。
【０１３５】
用語「炭化水素ラジカル」は、１つの水素原子のみが独立した安定な分子であることを必要とする炭素および水素原子の配置をいう。従って、炭化水素ラジカルは炭素原子上に１つの空の電子部位（ｏｐｅｎ  ｖａｌｅｎｃｅ  ｓｉｔｅ）を有し、これを通じて炭化水素ラジカルは他の原子（単数または複数）に結合され得る。アルキル、アルケニル、シクロアルキルなどが、炭化水素ラジカルの例である。
【０１３６】
用語「炭化水素ジラジカル」は、２つの水素原子が独立した安定な分子であることを必要とする炭素および水素原子の配置をいう。従って、炭化水素ラジカルは１つまたは２つの炭素原子上に２つの空の電子部位を有し、これを通じて炭化水素ラジカルは他の原子（単数または複数）に結合され得る。アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレンなどが炭化水素ジラジカルの例である。
【０１３７】
用語「ヒドロカルビル」は、炭素および水素の全体が単一の原子価部位を有し、これを通じて別の部分に結合する任意の安定な配置をいう。従って、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール（アリール環の中へのヘテロ原子の組み込みを含まない）、アリールアルキル、アルキルアリールなどとして知られるラジカルを含む。炭化水素ラジカルは、ヒドロカルビルの別の名前である。
【０１３８】
用語「ヒドロカルビレン」は、炭素および水素の全体が２つの原子価部位を有し、これを通じて他の部分に結合する任意の安定な配置をいう。従って、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、アリーレン（アリーレン環の中へのヘテロ原子の組み込みを含まない）、アリールアルキレン、アルキルアリーレンなどを含む。炭化水素ジラジカルは、ヒドロカルビレンの別の名前である。
【０１３９】
用語「ヒドロカルビル−Ｏ−ヒドロカルビレン」は、酸素原子に結合したヒドロカルビル基をいい、ここで酸素原子は、同様にヒドロカルビレン基が他の部分に結合する２つの原子価部位の１つでヒドロカルビレン基に結合する。用語「ヒドロカルビル−Ｓ−ヒドロカルビレン」、「ヒドロカルビル−ＮＨ−ヒドロカルビレン」および「ヒドロカルビル−アミド−ヒドロカルビレン」は、等価の意味を有し、ここで酸素はイオウ、−ＮＨ−、またはアミド基でそれぞれ置換されている。
【０１４０】
用語Ｎ−（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレンは、ヒドロカルビレン基をいい、ここで２つの原子価部位の１つは窒素原子に結合し、そしてこの窒素原子は同時に水素およびヒドロカルビル基に結合する。用語Ｎ，Ｎ−ジ（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレンは、ヒドロカルビレン基をいい、ここで２つの原子価部位の１つは窒素原子に結合し、そしてこの窒素原子は同時に２つのヒドロカルビル基に結合する。
【０１４１】
用語「ヒドロカルビルアシル−ヒドロカルビレン」は、ヒドロカルビレン基の２つの原子価部位の１つにアシル（−Ｃ（＝Ｏ）−）基を介して結合したヒドロカルビル基をいう。
【０１４２】
用語「ヘテロシクリルヒドロカルビル」および「ヘテロシリル」は、炭素原子および酸素、窒素、リン、およびイオウから選択された４つまでの原子（ヘテロ原子という）を含む、安定な原子の環状配置をいう。環状配置は、３個〜７個の原子のモノ環状環または８個〜１１個の原子の２環状環の形態であり得る。環は、飽和または不飽和（芳香族環を含む）であり得、そして必要に応じてベンゾ縮合され得る。環中の窒素およびイオウ原子は、窒素の４級化形態を含む任意の酸化形態であり得る。ヘテロシクリルヒドロカルビルは、任意の環外炭素またはヘテロ原子で結合し得、安定な構造を作製する。好ましいヘテロシクリルヒドロカルビルは、１個または２個の窒素のヘテロ原子を含む５〜７員のモノ環状ヘテロ環を含む。
【０１４３】
置換ヘテロシクリルヒドロカルビルは、上記のように定義されるヘテロシクリルヒドロカルビルをいい、ここで少なくともその１つの環原子が環外に伸張する示された置換基に結合する。
【０１４４】
ヒドロカルビルおよびヒドロカルビレン基において、用語「１つ以上の水素が等しい数のフッ素に置換されている上記の任意の誘導体」は、炭素、水素およびフッ素原子を含み、それ以外の原子を含まない分子をいう。
【０１４５】
用語「活性エステル」は、容易に求核試薬（例えば、アミンおよびアルコールまたはチオール求核試薬）により置換可能な「脱離基」を含むエステルである。このような脱離基は周知であり、限定はしないがＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ハロゲン（ハライド）、テトラフルオロフェノレートを含むアルコキシ、チオアルコキシなどを含む。用語「保護エステル」は、マスクされたか、またはそうでなければ非反応性のエステル基をいう。例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」を参照のこと。
【０１４６】
上記の定義を考慮して、本明細書全体に使用される他の化学用語は当業者に容易に理解され得る。用語は、単独またはそれらの任意の組合せで使用され得る。好ましいおよびより好ましいラジカルの鎖長は、このような全ての組合わせに適用される。
【０１４７】
Ａ．タグ核酸フラグメントの作製
上記のように、本発明の１つの局面は、各レーンで１６タグより多くの使用を可能にする、ＤＮＡ配列決定のための一般的なスキームを提供する；連続的な検出によってちょうど従来の蛍光ベース配列決定のようにタグが検出され得、そして配列はサイズ分離が生じるごとに読み取られる。このスキームは、タグ分子のサイズ分離に基づく任意のＤＮＡ配列決定技術に適用し得る。本発明における使用のために適切なタグおよびリンカー、ならびに核酸配列決定のための方法は、以下により詳細に議論される。
【０１４８】
１．タグ
本明細書中に使用される「タグ」は、一般に「目的分子」を独特（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）に同定するために使用される化学部分をいい、そしてより詳細にはタグ可変成分ならびに任意のタグ反応物、タグ成分およびタグ部分において、それに最も密接に結合し得るものをいう。
【０１４９】
本発明において有用なタグは、いくつかの性質を有する：
１）他の全てのタグから区別され得る。他の化学部分からのこの区別は、タグ（特に、切断反応後）のクロマトグラフィーの挙動、その分光または電位差特性、またはこれらのいくつかの組合せに基づき得る。タグが有用に区別される分光分析法は、質量スペクトル分析法（ＭＳ）、赤外（ＩＲ）、紫外（ＵＶ）、および蛍光を含み、ここでＭＳ、ＩＲ、およびＵＶが好ましく、そしてＭＳが最も好ましい分光分析法である。電位差電流測定は、好ましい電位差法である。
【０１５０】
２）タグは、１０−２２〜１０−６モルで存在する場合に検出され得る。
【０１５１】
３）タグは、タグが独特（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）に同定されると意図される、ＭＯＩに結合し得る化学的ハンドルを有する。結合は、ＭＯＩに直接的に、または「リンカー」基を介して間接的に形成され得る。
【０１５２】
４）タグは、それが供される全ての操作（ＭＯＩへの結合および切断、およびタグが結合される間のＭＯＩの任意の操作を含む）に対して化学的に安定である。
【０１５３】
５）タグは、タグが結合している間のＭＯＩについて行われる操作を有意に阻害しない。例えば、タグがオリゴヌクレオチドに結合されている場合、タグはオリゴヌクレオチドに行われるいかなるハイブリダイゼーションまたは酵素反応（例えば、ＰＣＲ配列決定反応）を阻害してはならない。同様に、タグが抗体に結合される場合、抗体による抗原認識を有意に阻害してはならない。
【０１５４】
特定の分光分析または電位差法により検出されることを意図されるタグ部分は、その方法による検出の感度および特異性を増強する特性を有する。典型的には、タグ部分は、このような特性を有する。なぜなら、特性は、典型的にタグ部分の主要部分を構成するタグ可変成分の中に設計されているからである。以下の議論において、用語「タグ」の使用は、タグ部分（すなわち、タグ可変成分を含む切断産物）をいうが、タグ可変成分それ自体をいうこともまた考慮され得る。なぜなら、タグ可変性分は、典型的には独特（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）に検出され得る特性を提供することを担うタグ部分の一部であるからである。式Ｔ−Ｌ−Ｘの化合物において、「Ｔ」部分は、タグ可変成分を含む。タグ可変成分が例えば、質量スペクトル分析法により特徴付けされるように設計されている場合、Ｔ−Ｌ−Ｘの「Ｔ」部分はＴｍｓといわれ得る。同様に、Ｔ−Ｌ−ＸからのＴを含む切断産物は、Ｔｍｓ含有部分といわれ得る。以下の分光分析法および電位差法は、Ｔｍｓ含有部分を特徴付けるために使用され得る。
【０１５５】
ａ．ＭＳタグの特徴
タグが質量スペクトル分析計（すなわち、ＭＳ読み取り可能タグ、また本明細書中でＭＳタグ、または「Ｔｍｓ含有部分」といわれる）により分析され得る場合、タグの必須特性は、それがイオン化され得ることである。従って、ＭＳ読み取り可能タグの設計において、そこにＭＳのイオン化条件の下で正電荷または負電荷を有し得る化学官能性を取り込むことは、好ましい要素である。この特性は、特にエレクトロスプレーイオン化において、イオン形成の改善された効率およびより大きい検出の全体的な感度を与える。イオン化電位を維持する化学官能基は、ＴｍｓまたはＬあるいは両方に由来し得る。質量スペクトル分析により検出される分析物の相対的な感度を増加し得る因子は、例えば、Ｓｕｎｎｅｒ，  Ｊ．ら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６０：１３００−１３０７  （１９８８）に議論されている。
【０１５６】
負電荷を有することを容易にするために好ましい官能基は、有機酸（例えば、フェノール性水酸基、カルボン酸、リン酸、リン酸塩、テトラゾール、硫化尿素、パーフルオロアルコールおよびスルホン酸）である。
【０１５７】
イオン化条件下で正電荷を有することを容易にするために好ましい官能基は、脂肪族または芳香族アミンである。ＭＳタグの増強された検出可能性を与えるアミン官能基の例は、第４級アミン（すなわち、各々が炭素原子に対する４つの結合を有するアミン。Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，  米国特許第５，２４０，８５９号を参照のこと）および第３級アミン（すなわち各々が炭素原子に対する３つの結合を有するアミン。これは、ピリジンに存在するようなＣ＝Ｎ−Ｃ基を含む。Ｈｅｓｓら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２４：３７３，  １９９５；  Ｂｕｒｅｓら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２４：３６４，  １９９５を参照のこと）を含む。阻害された第３級アミンが特に好ましい。３級および第４級アミンは、アルキルまたはアリールであり得る。Ｔｍｓ含有部分は、少なくとも１つのイオン化可能種を有さなくてはならないが、１つより多くのイオン化可能種を有し得る。好ましい電荷状態は、１つのタグ当たり１つのイオン化種である。従って、各Ｔｍｓ含有部分（および各タグ可変成分）は、１つの阻害されたアミンまたは有機酸基のみを含むことが好ましい。
【０１５８】
Ｔｍｓ含有部分の一部を形成し得る適切なアミン含有ラジカルは、以下を含む：
【０１５９】
【化１７】
2008220370.tif 000018
質量スペクトル分析によるタグの同定は、好ましくは分子量対電荷比（ｍ／ｚ）に基づく。ＭＳタグの好ましい分子量範囲は約１００〜２，０００ダルトンであり、そして好ましくはＴｍｓ含有部分は少なくとも約２５０ダルトン、より好ましくは少なくとも約３００ダルトン、そしてさらにより好ましくは少なくとも約３５０ダルトンの質量を有する。一般に、２００〜２５０ダルトン未満の親イオンを有する部分を質量スペクトル分析で区別することは特に困難であり（精密な装置に依存する）、従って本発明のＴｍｓ含有部分がこの範囲を超える質量を有することが好ましい。
【０１６０】
上記に説明したように、Ｔｍｓ含有部分は、タグ可変成分に存在するもの以外、そして特にＴｍｓ自体に存在するもの以外の原子を含み得る。従って、Ｔｍｓ自体の質量は、Ｔｍｓ含有部分が少なくとも約２５０ダルトンの質量を有する限り、約２５０ダルトンより少なくあり得る。従って、Ｔｍｓの質量は、１５（すなわち、メチルラジカル）〜約１０，０００ダルトンの範囲、そして好ましくは１００〜約５，０００ダルトンの範囲、そしてより好ましくは約２００〜約１，０００ダルトンの範囲であり得る。
【０１６１】
これらのタグが有意な量で１つより多くの同位体を有する原子を取り込む場合、質量スペクトル分析によりタグを区別することは比較的困難である。従って、質量分析による同定に意図される好ましいＴ基（Ｔｍｓ基）は、炭素；水素およびフッ素のうちの少なくとも１個；ならびに酸素、窒素、イオウ、リンおよびヨウ素から選択される任意の原子；を含む。他の原子はＴｍｓに存在し得るが、その存在は質量スペクトル分析データの分析を幾分より困難にし得る。好ましくは、Ｔｍｓ基は、水素原子および／またはフッ素原子に加えて、炭素、窒素および酸素のみを有する。
【０１６２】
フッ素は、Ｔｍｓ基において有することがなお好ましい任意の原子である。水素と比較して、フッ素はもちろんより重い。従って、フッ素原子の存在は、水素原子よりもより高い質量のＴｍｓ基を導き、それによりＴｍｓ基は上記の説明のように所望される２５０ダルトンの質量に達し得、そしてこれを超え得る。さらに、水素のフッ素での置換は、Ｔｍｓ含有部分により高い揮発性を与え、そして分析物のより高い揮発性は、質量スペクトル分析が検出方法として用いられる場合、感度を増強する。
【０１６３】
Ｔｍｓの分子式は、Ｃ１−５００Ｎ０−１００Ｏ０−１００Ｓ０−１０Ｐ０−１０ＨαＦβＩδの範疇にあり、ここでａ、βおよびδの計は、Ｈ原子、Ｆ原子、Ｉ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、およびＰ原子の原子価を満たすのに十分である。表示Ｃ１−５００Ｎ０−１００Ｏ０−１００Ｓ０−１０Ｐ０−１０ＨαＦβＩδは、Ｔｍｓが少なくとも１つを含み、そして１個〜５００個の任意の数の炭素原子、さらに必要に応じて１００個までの窒素原子（「Ｎ０−」は、Ｔｍｓが窒素原子を１つも含む必要がないことを意味する）、および１００個までの酸素原子、ならびに１０個までのイオウ原子および１０個までのリン原子をＴｍｓに含み得ることを意味する。符合α、β、およびδは、Ｔｍｓ中の水素、フッ素およびヨウ素の数を表し、ここで、これらの数の任意の２つは０であり得、そしてこれらの数の計はＨ原子、Ｆ原子、Ｉ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子およびＰ原子の原子価の総計と等しい。好ましくは、Ｔｍｓは、Ｃ１−５０Ｎ０−１０Ｏ０−１００ＨαＦβの範疇に入る分子式を有し、ここでαおよびβの計は部分に存在する水素およびフッ素原子の数にそれぞれ等しい。
【０１６４】
ｂ．ＩＲタグの特徴
有機化学基のＩＲ検出には、２つの主な形態：ラマン散乱ＩＲおよび吸収ＩＲが存在する。ラマン散乱ＩＲスペクトルと吸収ＩＲスペクトルとは、相補的な分光学的方法である。一般に、ラマン励起は結合極性の変化に依存するが、ＩＲ吸収は結合双極子モーメントの変化に依存する。弱いＩＲ吸収線は強いラマン吸収線となり、そしてその逆も成り立つ。波数は、ＩＲスペクトルの特徴的な単位である。ＩＲタグのための別々の適用を有する３つのスペクトル領域が存在する：１２５００〜４０００ｃｍ−１における近ＩＲ、４０００〜６００ｃｍ−１における中程度のＩＲ、６００〜３０ｃｍ−１における遠ＩＲ。本明細書中に記載される使用（ここで化合物は、ＭＯＩ、プローブ、またはプライマーを同定するためのタグとして機能する）のために、中程度のスペクトル領域が好ましい。例えば、カルボニル伸縮（１８５０〜１７５０ｃｍ−１）は、カルボン酸、カルボン酸エステルおよびカルボン酸アミド、ならびに炭酸アルキルおよび炭酸アリール、カルバメート、ならびにケトンについて測定される。Ｎ−Ｈ変角（１７５０〜１６０ｃｍ−１）は、アミン、アンモニウムイオン、およびアミドを同定するために使用される。１４００〜１２５０ｃｍ−１において、Ｒ−ＯＨ変角ならびにアミド中のＣ−Ｎ伸縮が検出される。芳香族置換パターンは、９００〜６９０ｃｍ−１（ＡｒＮＨ２についてのＣ−Ｈ変角、Ｎ−Ｈ変角）において検出される。飽和Ｃ−Ｈ、オレフィン、芳香環、二重結合および三重結合、エステル、アセタール、ケタール、アンモニウム塩、Ｎ−Ｏ化合物（例えば、オキシム、ニトロ、Ｎ−オキシド、および硝酸塩）、アゾ、ヒドラゾン、キノン、カルボン酸、アミド、ならびにラクタムは全て、振動赤外相関データを有する（Ｐｒｅｔｓｃｈら，  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄａｔａ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９を参照のこと）。好ましい化合物には、２２３０〜２２１０ｃｍ−１において非常に強いニトリル伸縮振動を示す芳香族ニトリルが含まれる。他の有用なタイプの化合物は、２１４０〜２１００ｃｍ−１の間に鋭い吸収バンドを引き起こす強い伸縮振動を有する芳香族アルキンである。第３のタイプの化合物は、２１６０〜２１２０ｃｍ−１領域において強い吸収バンドを示す芳香族アジドである。チオシアネートは、２２７５〜２２６３ｃｍ−１において強い吸収を有する代表的な化合物である。
【０１６５】
ｃ．ＵＶタグの特徴
有機発色団のタイプおよびそれら各々のＵＶ可視特性の編集が、Ｓｃｏｔｔ（Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＶ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｐｅｒｍａｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９６２）において与えられる。発色団は、特定の光吸収を担う原子、または原子もしくは電子の群である。共役系におけるπ→π＊の極大について、経験則が存在する（Ｐｒｅｔｓｃｈら，  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄａｔａ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，  Ｂ６５頁およびＢ７０頁，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９を参照のこと）。好ましい化合物（共役系を有する）は、ｎ→π＊およびπ→π＊遷移を有する。そのような化合物は、以下によって例示される：アシッドバイオレット７、アクリジンオレンジ、アクリジンイエローＧ、ブリリアントブルーＧ、コンゴーレッド、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーンオキサレート、メタニルイエロー、メチレンブルー、メチルオレンジ、メチルバイオレットＢ、ナフトールグリーンＢ、オイルブルーＮ、オイルレッドＯ、４−フェニルアゾフェノール、サフラニンＯ（Ｓａｆｒａｎｉｅ  Ｏ）、ソルベントグリーン３、およびスダンオレンジＧ；これらの全てが市販されている（Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ）。他の適切な化合物は、例えば、Ｊａｎｅ，Ｉ．ら，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍ．  ３２３：１９１−２２５（１９８５）において表記されている。
【０１６６】
ｄ．蛍光タグの特徴
蛍光プローブは、それらの吸収および蛍光放出の波長および強度によって、最も直接的に同定されそして定量される。放出スペクトル（蛍光およびりん光）は、吸収スペクトルよりも非常に感度が高く、そしてより特異的な測定を可能にする。励起状態の寿命および蛍光の異方性のような他の光物理的特性は、より広く使用されていない。最も一般的に有用な強度パラメータは、吸収についてのモル吸光係数（ε）および蛍光についての量子収量（ＱＹ）である。εの値は単一の波長において明示され（通常、プローブの極大吸収）、一方ＱＹは全蛍光スペクトルプロフィールにわたる全光子放出の測定である。狭い最適バンド幅（＜２０ｎｍ）が蛍光励起（吸収を介する）について通常使用され、一方蛍光検出バンド幅はより可変的であり、最大感度についての完全スペクトルから最大解像度についての狭いバンド（約２０ｎｍ）までの範囲にわたる。プローブ分子あたりの蛍光強度は、εとＱＹとの積に比例する。現在実用的に重要な、発蛍光団におけるこれらのパラメータの幅は、εについて約１０，０００〜１００，０００ｃｍ−１Ｍ−１であり、そしてＱＹについて０．１〜１．０である。蛍光タグとして機能し得る化合物は、以下の通りである：フルオロセイン、ローダミン、ラムダブルー４７０、ラムダグリーン、ラムダレッド６６４、ラムダレッド６６５、アクリジンオレンジ、およびヨウ化プロピジウム、これらはＬａｍｂｄａ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏ．（Ｐｌｅａｓａｎｔ  Ｇａｐ，  ＰＡ）から市販されている。蛍光化合物（例えば、ナイルレッド、テキサスレッド、ｌｉｓｓａｍｉｎｅTM、ＢＯＤＩＰＹTM）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）から市販されている。
【０１６７】
ｅ．電位差タグの特徴
電気化学的検出（ＥＣＤ）の原理は化合物の酸化および還元に基づいている。特定の印加された電位において、電子は供与されるかまたは受容されるかのいずれかであり、従って測定され得る電流を産生する。特定の化合物が電位差に供された場合、分子は作用電極の表面において、電子の喪失（酸化）または獲得（還元）による分子転位を受ける。そのような化合物は電子的であると言われ、そして電気化学的反応を受ける。ＥＣ検出器は、その上にＨＰＬＣ溶出液が流れる電極表面に電圧を与える。カラムから溶出する電気的に活性な化合物は、電子を供与（酸化）するかまたは獲得（還元）するかのいずれかであり、即時に電流ピークを生じる。重要なことに、生じる電流の量は、分析物（ａｎａｌｙｔｅ）の濃度および与えられた電圧の両方に依存し、各化合物は、そこにおいて酸化または還元が始まる特定の電圧を有する。現在最もポピュラーな電気化学的検出器は電流測定検出器であり、そこでは電位が一定に保たれており、そして電気化学的反応から生じる電流が次いで測定される。この種類の分光分析は現在「定電位電流測定」と呼ばれている。市販の電流測定器はＥＳＡ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｈｅｌｍｆｏｌｄ，  ＭＡから入手できる。
【０１６８】
検出の効率が１００％である場合、特殊化された検出器は「電量的」であると言われる。電量検出器は高感度であり、選択性および感度に関して多くの実用的な利点を有し、それによりこれらの種類の検出器はアレイにおいて有用となる。電量検出器において、分析物の所定の濃度についてのシグナル電流は、作用電極に対する印加された電位（電圧）の関数としてプロットされる。得られるＳ字型グラフは電流−電圧曲線または流体力学的ボルタマグラム（ＨＤＶ）と呼ばれる。ＨＤＶは、活性電極に印加される電位の最良の選択を可能にし、これは観察されるシグナルを最大化することを可能にする。ＥＣＤの主要な利点は、サブフェムトモルの範囲における検出の電流レベルを有する、その固有の感度である。
【０１６９】
多数の化学物質および化合物が電気化学的に活性であり、それには多くの生化学物質、薬剤、および殺虫剤が含まれる。クロマトグラフィー上で共溶出する化合物は、それらの半波位（最大シグナルの半分における電位）が３０〜６０ｍＶでしか相違しない場合でさえも、効果的に解析され得る。
【０１７０】
最近開発された電量センサーは、液体クロマトグラフィーに基づく分離における検出器として使用される場合、共溶出する化合物の選択性、同定、および解析を提供する。従って、これらのアレイされた検出器は、検出器自身において達成される別の組の分離を加える。現在の計器は１６チャンネルを有し、これらは原則として、データが獲得され得る速度によってのみ制限される。ＥＣアレイ上で解析され得る化合物の数は、クロマトグラフィーによって制限される（すなわち、プレートの総数が制限される）。しかし、クロマトグラフィー上で共溶出する２以上の化合物が半波位において３０〜６０ｍＶの相違を有する場合、アレイは化合物を区別可能である。電気化学的に活性である化合物の能力は、所有のＥＣ活性基（すなわち、−ＯＨ、−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ）に依存する。
【０１７１】
電量検出器を使用して首尾良く検出されている化合物には、以下が含まれる：５−ヒドロキシトリプタミン、３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル−グリコール、ホモゲンチジン酸、ドーパミン、メタネフリン、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ｈｙｄｒｏｘｙｋｙｎｕｒｅｎｉｎｒ）、アセトミノフェン、３−ヒドロキシトリプトホール（３−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈｏｌ）、５−ヒドロキシインドール酢酸、オクタンスルホン酸、フェノール、ｏ−クレゾール、ピロガロール、２−ニトロフェノール、４−ニトロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、４，６−ジニトロクレゾール、３−メチル−２−ニトロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、４−クロロ−３−メチルフェノール、５−メチルフェノール、４−メチル−２−ニトロフェノール、２−ヒドロキシアニリン、４−ヒドロキシアニリン、１，２−フェニレンジアミン、ベンゾカテキン、ブツロン、クロルトルロン、ジウロン、イソプロツロン、リニュロン、メトブロムロン、メトキスロン、モノリニュロン、モニュロン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、４−アミノ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシクマリン酸、７−メトキシクマリン、アピゲニン（ａｐｉｇｅｎｉｎ）バイカレイン、カフェイン酸、カテキン、センタウレイン、クロロゲン酸、ダイドゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ダチスセチン、ジオスメチン、没食子酸エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン、オイゲノール、オイパトリン（ｅｕｐａｔｏｒｉｎ）、フェルル酸、フィセチン、ガランギン（ｇａｌａｎｇｉｎ）、没食子酸、ガルデニン（ｇａｒｄｅｎｉｎ）、ゲニステイン、ゲンチジン酸、ヘスペリジン、イリゲニン、ケンフェロール（ｋａｅｍｆｅｒｏｌ）、ロイコヤニジン（ｌｅｕｃｏｙａｎｉｄｉｎ）、ルテオリン、マンゴスチン、モリン、ミリセチン、ナリンギン、ナリルチン（ｎａｒｉｒｕｔｉｎ）、ペラルゴンジン（ｐｅｌａｒｇｏｎｄｉｎ）、ペオニジン（ｐｅｏｎｉｄｉｎ）、フロレチン（ｐｈｌｏｒｅｔｉｎ）、プラテンセイン、プロトカテキン酸（ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕｉｃ  ａｃｉｄ）、ラムネチン（ｒｈａｍｎｅｔｉｎ）、ケルセチン、サクラネチン、スクテラレイン（ｓｃｕｔｅｌｌａｒｅｉｎ）、スコポレチン（ｓｃｏｐｏｌｅｔｉｎ）、シリングアルデヒド、シリンジン酸（ｓｙｒｉｎｇｉｃ  ａｃｉｄ）、タンゲリチン（ｔａｎｇｅｒｉｔｉｎ）、トロキセルチン（ｔｒｏｘｅｒｕｔｉｎ）、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、バニリン酸、１，３−ジメチルテトラヒドロイソキノリン、６−ヒドロキシドーパミン、γ−サルソリノール、Ｎ−メチル−γ−サルソリノール、テトラヒドロイソキノリン、アミトリプチリン、アポモルヒネ、カプサイシン、クロルジアゼポキシド、クロルプロマジン、ダウノルビシン、デシプラミン、ドキセピン、フルオキセチン、フルアゼパム、イミプラミン、イソプロテレノール、メトキサミン、モルヒネ、モルヒネ−３−グルクロニド、ノルトリプチリン、オキサゼパム、フェニレフリン、トリミプラミン、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルセロトニン、３，４−���ヒドロキシベンジルアミン、３，４−ジヒドロキシマンデル酸（ＤＯＭＡ）、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）、３，４−ジヒドロキシフェニルグリコール（ＤＨＰＧ）、３−ヒドロキシアントラニル酸、２−ヒドロキシフェニル酢酸（２ＨＰＡＣ）、４−ヒドロキシ安息香酸（４ＨＢＡＣ）、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５ＨＩＡＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシマンデル酸、３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニルエチルアミン、４−ヒドロキシフェニル酢酸（４ＨＰＡＣ）、４−ヒドロキシフェニル乳酸（４ＨＰＬＡ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５ＨＴＰ）、５−ヒドロキシトリプトホール（５ＨＴＯＬ）、５−ヒドロキシトリプタミン（５ＨＴ）、５−ヒドロキシトリプタミンスルフェート、３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニルグリコール（ＭＨＰＧ）、５−メトキシトリプタミン、５−メトキシトリプトファン、５−メトキシトリプトホール、３−メトキシチラミン（３ＭＴ）、３−メトキシチロシン（３−ＯＭ−ＤＯＰＡ）、５−メチルシステイン、３−メチルグアニン、ブホテニン、ドーパミン、ドーパミン−３−グルクロニド、ドーパミン−３−スルフェート、ドーパミン−４−スルフェート、エピネフリン、エピニン、葉酸、グルタチオン（還元型）、グアニン、グアノシン、ホモゲンチジン酸（ＨＧＡ）、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）、ホモバニリルアルコール（ＨＶＯＬ）、ホモベラチン酸（ｈｏｍｏｖｅｒａｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ホモバニリン酸スルフェート、ヒポキサンチン、インドール、インドール−３−酢酸、インドール−３−乳酸、キヌレニン、メラトニン、メタネフリン、Ｎ−メチルトリプタミン、Ｎ−メチルチラミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルチラミン、ノルエピネフリン、ノルメタネフリン、オクトパミン、ピリドキサール、ピリドキサールリン酸、ピリドキサミン、シネフリン（ｓｙｎｅｐｈｒｉｎｅ）、トリプトホール、トリプタミン、チラミン、尿酸、バニリルマンデル酸（ｖｍａ）、キサンチン、およびキサントシン。他の適切な化合物は、例えば、Ｊａｎｅ，  Ｉ．ら，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍ．  ３２３：１９１−２２５（１９８５）およびＭｕｓｃｈ，  Ｇ．ら，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍ．  ３４８：９７−１１０（１９８５）に記載される。これらの化合物は、当該分野で公知の方法によって式Ｔ−Ｌ−Ｘの化合物中に取り込まれ得る。例えば、カルボン酸基を有する化合物は、アミン、ヒドロキシルなどと反応し得、ＴとＬとの間にアミド、エステル、および他の結合を形成する。
【０１７２】
上記の特性に加え、そして意図される検出法に関係なく、タグはモジュール式化学構造を有することが好ましい。このことは、コンビナトリアルケミストリーの技術を使用する多数の構造的に関連するタグの構築において助けとなる。例えば、Ｔｍｓ基はいくつかの特性を有することが望ましい。それはＴｍｓ含有部分が質量分析に供された場合に単一のイオン化電荷状態を維持する官能基（より単純には、「質量分析感度増強」基、すなわちＭＳＳＥと呼ばれる）を含むことが望ましい。またそれは、Ｔｍｓ含有部分のファミリーにおける１つのメンバーとして機能し得ることが望ましく、ここでファミリーのメンバーは各々が異なる質量／電荷の比を有するが、質量分析器においてほぼ同一の感度を有する。従って、ファミリーのメンバーは同一のＭＳＳＥを有することが望ましい。化合物のファミリーの作製を可能にするために、モジュール式合成スキームを介してタグ反応部を生成することが好都合であると見出されており、その結果タグ成分自身はモジュールを含んでいると見なされる。
【０１７３】
Ｔｍｓ基の構造への好ましいモジュール式アプローチにおいて、Ｔｍｓは以下の式を有する：
Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−
ここで、Ｔ２は、１５〜５００ダルトンの質量幅を有する、炭素および１個以上の水素、フッ素、ヨウ素、酸素、窒素、硫黄、およびリンから形成される有機部分であり；Ｔ３は、５０〜１０００ダルトンの質量幅を有する、炭素および１個以上の水素、フッ素、ヨウ素、酸素、窒素、硫黄、およびリンから形成される有機部分であり；Ｊは、直接の結合であるか、または以下のような官能基である：アミド、エステル、アミン、スルフィド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオエーテル、尿素、チオ尿素、カルバメート、チオカルバメート、Ｓｃｈｉｆｆ塩基、還元型Ｓｃｈｉｆｆ塩基、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスホンアミド、スルホネート、スルホンアミド、または炭素−炭素結合；そしてｎは１〜５０の範囲の整数であり、これによって、ｎが１より大きい場合、各Ｔ３およびＪは独立して選択される。
【０１７４】
モジュール式構造Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−は、Ｔ−Ｌ−Ｘ化合物のファミリーへの好都合な入口を提供し、ここでファミリーの各メンバーは異なるＴ基を有する。例えば、ＴがＴｍｓであり、そして各ファミリーメンバーが望ましくは同一のＭＳＳＥを有する場合、Ｔ３基の１つはＭＳＳＥ構造を提供する。Ｔｍｓの質量に関してファミリーのメンバー間の変動性を提供するために、Ｔ２基はファミリーメンバーの間で変動し得る。例えば、１つのファミリーメンバーはＴ２＝メチルを有し得るが、別のものはＴ２＝エチルを有し得、そして別のものはＴ２＝プロピルを有し得る、などである。
【０１７５】
質量に「著しい」飛躍または大きな飛躍を提供するために、Ｔ３基はＴ−Ｌ−Ｘに有意の（例えば、百または数百の）質量単位を付加するように設計され得る。そのようなＴ３基は、分子量幅調節基（「ＷＲＡ」）と言われ得る。ＷＲＡは、限界幅を超えて広がる質量を有するＴ２の単一のセットと共に作用する場合、非常に有用である。単一のセットのＴ２基は、単に１以上のＷＲＡ  Ｔ３基をＴｍｓ中に取り込むことにより、幅広い質量を有するＴｍｓ基を作製するために使用され得る。従って、単純な例を使用すると、１セットのＴ２基がＴｍｓについて２５０〜３４０ダルトンの質量幅を与える場合、例示的な数である１００ダルトンをＴ３基として有する単一のＷＲＡの付加は、同一のセットのＴ２基を使用しながら、３５０〜４４０ダルトンの質量幅へのアクセスを提供する。同様に、２つの１００ダルトンＭＷＡ基の付加（各々がＴ３基として）は、４５０〜５４０ダルトンの質量幅へのアクセスを提供し、ここでこのＷＲＡ基の増加的な付加は継続され得、Ｔｍｓ基について非常に大きな質量幅へのアクセスを提供する。式Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−Ｌ−Ｘの好ましい化合物は、式ＲＶＭＣ−（ＲＷＲＡ）ｗ−ＲＭＳＳＥ−Ｌ−Ｘを有し、ここで、ＶＷＣは「Ｔ２」基であり、そしてＷＲＡおよびＭＳＳＥ基の各々は「Ｔ３」基である。この構造は図１２に図示されており、そしてＴｍｓの調製への１つのモジュール式アプローチを表す。
【０１７６】
式Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−において、Ｔ２およびＴ３は、好ましくは以下から選択される：ヒドロカルビル、ヒドロカルビル−Ｏ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−Ｓ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−ＮＨ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−アミド−ヒドロカルビレン、Ｎ−（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、Ｎ，Ｎ−ジ（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、ヒドロカルビルアシル−ヒドロカルビレン、ヘテロシクリルヒドロカルビル（ここで、ヘテロ原子は酸素、窒素、硫黄、およびリンから選択される）、置換ヘテロシクリルヒドロカルビル（ここで、ヘテロ原子は酸素、窒素、硫黄、およびリンから選択され、そして置換基は以下から選択される：ヒドロカルビル、ヒドロカルビル−Ｏ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−ＮＨ−ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル−Ｓ−ヒドロカルビレン、Ｎ−（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、Ｎ，Ｎ−ジ（ヒドロカルビル）ヒドロカルビレン、およびヒドロカルビルアシル−ヒドロカルビレン）。さらに、Ｔ２および／またはＴ３は、１個以上の水素がフッ素で置き換えられているような、以前に表記された任意の潜在的Ｔ２／Ｔ３基の誘導体であり得る。
【０１７７】
また、式Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−に関して、好ましいＴ３は式−Ｇ（Ｒ２）−を有し、ここでＧは単一のＲ２置換基を有するＣ１−６アルキレン鎖である。従って、Ｇがエチレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−）である場合、１個または２個のいずれかのエチレン炭素はＲ２置換基を有し、そしてＲ２は以下から選択される：アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール縮合シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、アラルキル、アリール置換アルケニルもしくはアルキニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換シクロアルキル、ビアリール、アルコキシ、アルケノキシ、アルキノキシ、アラルコキシ、アリール置換アルケノキシもしくはアルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノもしくはアルキニルアミノ、アリール置換アルキルアミノ、アリール置換アルケニルアミノもしくはアルキニルアミノ、アリールオキシ、アリールアミノ、Ｎ−アルキル尿素置換アルキル、Ｎ−アリール尿素置換アルキル、アルキルカルボニルアミノ置換アルキル、アミノカルボニル置換アルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリル置換アルキル、ヘテロシクリル置換アミノ、カルボキシアルキル置換アラルキル、オキソカルボシクリル縮合アリール、およびヘテロシクリルアルキル；シクロアルケニル、アリール置換アルキルおよびアラルキル、ヒドロキシ置換アルキル、アルコキシ置換アルキル、アラルコキシ置換アルキル、アルコキシ置換アルキル、アラルコキシ置換アルキル、アミノ置換アルキル、（アリール置換アルキルオキシカルボニルアミノ）置換アルキル、チオール置換アルキル、アルキルスルホニル置換アルキル、（ヒドロキシ置換アルキルチオ）置換アルキル、チオアルコキシ置換アルキル、ヒドロカルビルアシルアミノ置換アルキル、ヘテロシクリルアシルアミノ置換アルキル、ヒドロカルビル置換ヘテロシクリルアシルアミノ置換アルキル、アルキルスルホニルアミノ置換アルキル、アリールスルホニルアミノ置換アルキル、モルホリノアルキル、チオモルホリノアルキル、モルホリノカルボニル置換アルキル、チオモルホリノカルボニル置換アルキル、［Ｎ−（アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル）−  または  Ｎ，Ｎ−（ジアルキル、ジアルケニル、ジアルキニル、もしくは（アルキル、アルケニル）−アミノ］カルボニル置換アルキル、ヘテロシクリルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルケンアミノカルボニル、ヘテロシクリルアミノカルボニル置換アルキル、ヘテロシクリルアルケンアミノカルボニル置換アルキル、Ｎ，Ｎ−［ジアルキル］アルキレンアミノカルボニル、Ｎ，Ｎ−［ジアルキル］アルキレンアミノカルボニル置換アルキル、アルキル置換ヘテロシクリルカルボニル、アルキル置換ヘテロシクリルカルボニルアルキル、カルボキシル置換アルキル、ジルキルアミノ置換アシルアミノアルキル、および以下から選択されるアミノ酸側鎖：アルギニン、アルバラギン、グルタミン、Ｓ−メチルシステイン、メチオニン、ならびにそれらの対応するスルホキシドおよびスルホン誘導体、グリシン、ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、アラニン��オルニチン、ヒスチジン、グルタミン、バリン、トレオニン、セリン、アスパラギン酸、β−シアノアラニン、およびアロトレオニン；アリニルおよびヘテロシクリルカルボニル、アミノカルボニル、アミド、モノまたはジアルキルアミノカルボニル、モノまたはジアリールアミノカルボニル、アルキルアリールアミノカルボニル、ジアリールアミノカルボニル、モノまたはジアシルアミノカルボニル、芳香族または脂肪族アシル、必要に応じて以下から選択される置換基によって置換されたアルキル：アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、メルカプト、モノまたはジアルキルアミノ、モノまたはジアリールアミノ、アルキルアリールアミノ、ジアリールアミノ、モノまたはジアシルアミノ、アルコキシ、アルケノキシ、アリールオキシ、チオアルコキシ、チオアルケノキシ、チオアルキノキシ、チオアリールオキシ、およびヘテロシクリル。
【０１７８】
式Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−Ｌ−Ｘの好ましい化合物は、以下の構造を有する：
【０１７９】
【化１８】
2008220370.tif 000019
ここでＧは（ＣＨ２）１−６であり、それによって、単一の「Ｇ」で表される１つのかつ唯一のＣＨ２基上の水素が−（ＣＨ２）Ｃ−アミド−Ｔ４に置き換えられ；Ｔ２およびＴ４は、式Ｃ１−２５Ｎ０−９Ｏ０−９ＨαＦβの有機部分であり、それによって、αおよびβの合計は、Ｈ原子、Ｆ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子、およびＯ原子の原子価を満たすのに十分であり；アミドは以下の式であり：
【０１８０】
【化１９】
2008220370.tif 000020
ここでＲ１は水素またはＣ１−１０アルキルであり；ｃは０〜４の範囲の整数であり；そしてｎは１〜５０の範囲の整数であり、これによって、ｎが１より大きい場合、Ｇ、ｃ、アミド、Ｒ１、およびＴ４は独立して選択される。
【０１８１】
さらに好ましい実施態様において、式Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−Ｌ−Ｘの化合物は以下の構造を有する：
【０１８２】
【化２０】
2008220370.tif 000021
ここでＴ５は、式Ｃ１−２５Ｎ０−９Ｏ０−９ＨαＦβの有機部分であり、それによって、αおよびβの合計は、Ｈ原子、Ｆ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子、およびＯ原子の原子価を満たすのに十分であり；そしてＴ５は第３級または第４級アミンまたは有機酸を含み；ｍは０〜４９の範囲の整数であり、そしてＴ２、Ｔ４、Ｒ１、Ｌ、およびＸは以前に定義されている。
【０１８３】
式Ｔ２−（Ｊ−Ｔ３−）ｎ−Ｌ−Ｘを有する別の好ましい化合物は、以下の特定の構造を有する：
【０１８４】
【化２１】
2008220370.tif 000022
ここでＴ５は、式Ｃ１−２５Ｎ０−９Ｏ０−９ＨαＦβの有機部分であり、それによって、αおよびβの合計は、Ｈ原子、Ｆ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子、およびＯ原子の他の満たされていない原子価を満たすのに十分であり；そしてＴ５は第３級または第４級アミンまたは有機酸を含み；ｍは０〜４９の範囲の整数であり、そしてＴ２、Ｔ４、ｃ、Ｒ１、「アミド」、Ｌ、およびＸは以前に定義されている。
【０１８５】
Ｔ５基を有する上記の構造において、−アミド−Ｔ５は、好ましくは以下の１つであり、これらは有機酸を「Ｇ」から伸びる遊離のアミノ基と反応させることにより好都合に調製され得る：
【０１８６】
【化２２】
2008220370.tif 000023
上記の化合物がＴ５基を有し、そして「Ｇ」基が遊離のカルボキシル基（またはそれらの反応性等価体）を有する場合、以下が好ましい−アミド−Ｔ５基であり、これらは適切な有機アミンを「Ｇ」から伸びる遊離のカルボキシル基と反応させることにより好都合に調製され得る：
【０１８７】
【化２３】
2008220370.tif 000024
本発明の３つの好ましい実施態様において、Ｔ−Ｌ−ＭＯＩは以下の構造を有する：
【０１８８】
【化２４】
2008220370.tif 000025
あるいは以下の式を有する：
【０１８９】
【化２５】
2008220370.tif 000026
あるいは以下の式を有する：
【０１９０】
【化２６】
2008220370.tif 000027
ここでＴ２およびＴ４は、式Ｃ１−２５Ｎ０−９Ｏ０−９Ｓ０−３Ｐ０−３ＨαＦβＩδの有機部分であり、それによって、α、β、およびδの合計は、Ｈ原子、Ｆ原子、Ｉ原子が満たさなければ満たされないＣ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、およびＰ原子の原子価を満たすのに十分であり；Ｇは（ＣＨ２）１−６であり、ここで各Ｇで表されるＣＨ２基上の１つのそして唯一の水素は−（ＣＨ２）Ｃ−アミド−Ｔ４に置き換えられており；アミドは以下の式であり：
【０１９１】
【化２７】
2008220370.tif 000028
ここでＲ１は水素またはＣ１−１０アルキルであり；ｃは０〜４の範囲の整数であり；「Ｃ２−Ｃ１０」は２〜１０の炭素原子を有するヒドロカルビレン基を表し、「ＯＤＮ−３’−ＯＨ」は末端３’ヒドロキシル基を有する核酸フラグメント（すなわち、核酸フラグメントの３’末端以外において（Ｃ１−Ｃ１０）に結合した核酸フラグメント）を表し；そしてｎは１〜５０の範囲の整数であり、これによって、ｎが１より大きい場合、Ｇ、ｃ、アミド、Ｒ１、およびＴ４は独立して選択される。好ましくは、単一の炭素原子に結合した３個のヘテロ原子は存在しない。
【０１９２】
上記で示されたＴ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−基を含有する構造において、この基は式ＨＮ（Ｒ１）−のアミンを以下から選択される有機酸（これらは単に例示的であって、潜在的な有機酸の余すところのないリストを構成していない）と反応させることにより形成され得る：ギ酸、酢酸、プロピオール酸、プロピオン酸、フルオロ酢酸、２−ブチン酸、シクロプロパンカルボン酸、酪酸、メトキシ酢酸、ジフルオロ酢酸、４−ペンチン酸、シクロブタンカルボン酸、３，３−ジメチル酢酸、吉草酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｎ−ホルミル−Ｇｌｙ−ＯＨ、エトキシ酢酸、（メトキシチオ）酢酸、ピロール−２−カルボン酸、３−フル酸、イソオキサゾール−５−カルボン酸、ｔｒａｎｓ−３−ヘキセン酸、トリフルオロ酢酸、ヘキサン酸、Ａｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−ヒドロキシ−２−メチル酪酸、安息香酸、ニコチン酸、２−ピラジンカルボン酸、１−メチル−２−ピロールカルボン酸、２−シクロペンテン−１−酢酸、シクロペンチル酢酸、（Ｓ）−（−）−２−ピロリドン−５−カルボン酸、Ｎ−メチル−Ｌ−プロリン、ヘプタン酸、Ａｃ−ｂ−Ａｌａ−ＯＨ、２−エチル−２−ヒドロキシ酪酸、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸、ｐ−トルイン酸、６−メチルニコチン酸、５−メチル−２−ピラジンカルボン酸、２，５−ジメチルピロール−３−カルボン酸、４−フルオロ安息香酸、３，５−ジメチルイソオキサゾール−４−カルボン酸、３−シクロペンチルプロピオン酸、オクタン酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルスクシンアミド酸（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、フェニルプロピオン酸、ケイヒ酸、４−エチル安息香酸、ｐ−アニス酸、１，２，５−トリメトキシピロール−３−カルボン酸、３−フルオロ−４−メチル安息香酸、Ａｃ−ＤＬ−プロパルギルグリシン、３−（トリフルオロメチル）酪酸、１−ピペリジンプロピオン酸、Ｎ−アセチルプロリン、３，５−ジフルオロ安息香酸、Ａｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨ、インドール−２−カルボン酸、２−ベンゾフランカルボン酸、ベンゾトリアゾール−５−カルボン酸、４−ｎ−プロピル安息香酸、３−ジメチルアミノ安息香酸、４−エトキシ安息香酸、４−（メチルチオ）安息香酸、Ｎ−（２−フロイル）グリシン、２−（メチルチオ）ニコチン酸、３−フルオロ−４−メトキシ安息香酸、Ｔｆａ−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−ナフトエ酸、キナルジン酸、Ａｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、３−メチルリンデン−２−カルボン酸、２−キノキサリンカルボン酸、１−メチルインドール−２−カルボン酸、２，３，６−トリフルオロ安息香酸、Ｎ−ホルミル−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ、２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］酢酸、４−ｎ−ブチル安息香酸、Ｎ−ベンゾイルグリシン、５−フルオロインドール−２−カルボン酸、４−ｎ−プロポキシ安息香酸、４−アセチル−３，５−ジメチル−２−ピロール安息香酸、３，５−ジメトキシ安息香酸、２，６−ジメトキシニコチン酸、シクロヘキサンペンタン酸、２−ナフチル酢酸、４−（１Ｈ−ピロール−１−イル）安息香酸、インドール−３−プロピオン酸、ｍ−トリフルオロメチル安息香酸、５−メトキシインドール−２−カルボン酸、４−ペンチル安息香酸、Ｂｚ−ｂ−Ａｌａ−ＯＨ、４−ジエチルアミノ安息香酸、４−���−ブトキシ安息香酸、３−メチル−５−ＣＦ３−イソオキサゾール−４−カルボン酸、（３，４−ジメトキシフェニル）酢酸、４−ビフェニルカルボン酸、ピバロール−Ｐｒｏ−ＯＨ、オクタノール−Ｇｌｙ−ＯＨ、（２−ナフトキシ）酢酸、インドール−３−酪酸、４−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸、５−メトキシインドール−３−酢酸、４−（トリフルオロメトキシ）安息香酸、Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−ペンチルオキシ安息香酸、Ｚ−Ｇｌｙ−ＯＨ、４−カルボキシ−Ｎ−（フル−２−イルメチル）ピロリジン−２−オン、３，４−ジエトキシ安息香酸、２，４−ジメチル−５−ＣＯ２Ｅｔ−ピロール−３−カルボン酸、Ｎ−（２−フルオロフェニル）スクシンアミド酸（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、３，４，５−トリメトキシ安息香酸、Ｎ−フェニルアントラニル酸、３−フェノキシ安息香酸、ノナノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−フェノキシピリジン−３−カルボン酸、２，５−ジメチル−１−フェニルピロール−３−カルボン酸、ｔｒａｎｓ−４−（トリフルオロメチル）ケイヒ酸、（５−メチル−２−フェニルオキサゾール−４−イル）酢酸、４−（２−シクロヘキセニルオキシ）安息香酸、５−メトキシ−２−メチルインドール−３−酢酸、ｔｒａｎｓ−４−コチニンカルボン酸、Ｂｚ−５−アミノ吉草酸、４−ヘキシルオキシ安息香酸、Ｎ−（３−メトキシフェニル）スクシンアミド酸（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｚ−Ｓａｒ−ＯＨ、４−（３，４−ジメトキシフェニル）酪酸、Ａｃ−ｏ−フルオロ−ＤＬ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｎ−（４−フルオロフェニル）グルタミン酸、４’−エチル−４−ビフェニルカルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロアクリジンカルボン酸、３−フェノキシフェニル酢酸、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）スクシンアミド酸（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｎ−デカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、（＋）−６−メトキシ−ａ−メチル−２−ナフタレン酢酸、３−（トリフルオロメトキシ）ケイヒ酸、Ｎ−ホルミル−ＤＬ−Ｌｅｕ−ＯＨ、（Ｒ）−（＋）−ａ−メトキシ−ａ−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸、Ｂｚ−ＤＬ−Ｌｅｕ−ＯＨ、４−（トリフルオロメトキシ）フェノキシ酢酸、４−ヘプチルオキシ安息香酸、２，３，４−トリメトキシケイヒ酸、２，６−ジメトキシベンゾイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロピオン酸、２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェノキシ酢酸、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）グルタミン酸、Ｎ−ウンデカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、２−（４−フルオロベンジル）安息香酸、５−トリフルオロメトキシインドール−２−カルボン酸、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）ジグルコラミン酸、Ａｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｔｆａ−Ｌ−フェニルグリシン−ＯＨ、３−ヨード安息香酸、３−（４−ｎ−ペンチルベンゾイル）プロピオン酸、２−フェニル−４−キノリンカルボン酸、４−オクチルオキシ安息香酸、Ｂｚ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ、３，４，５−トリエトキシ安息香酸、Ｎ−ラウロイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３，５−ビス（トリフルオロメチル）安息香酸、Ａｃ−５−メチル−ＤＬ−Ｔｒｐ−ＯＨ、２−ヨードフェニル酢酸、３−ヨード−４−メチル安息香酸、３−（４−���−ヘキシルベンゾイル）プロピオン酸、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−ノニルオキシ安息香酸、４’−（トリフルオロメチル）−２−ビフェニルカルボン酸、Ｂｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｎ−トリデカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル酢酸、３−（４−ｎ−ヘプチルベンゾイル）プロピオン酸、Ｎ−ヘプタノイル−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−デシルオキシ安息香酸、Ｎ−（α，α，α−トリフルオロ−ｍ−トリル）アントラニル酸、ニフルム酸（ｎｉｆｌｕｍｉｃ  ａｃｉｄ）、４−（２−ヒドロキシヘキサフルオロイソプロピル）安息香酸、Ｎ−ミリストイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３−（４−ｎ−オクチルベンゾイル）プロピオン酸、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４−ウンデシルオキシ安息香酸、３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロピオニル−Ｇｌｙ−ＯＨ、８−ヨードナフトエ酸、Ｎ−ペンタデカノイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、４−ドデシルオキシ安息香酸、Ｎ−パルミトイル−Ｇｌｙ−ＯＨ、およびＮ−ステアロイル−Ｇｌｙ−ＯＨ。これらの有機酸は、以下の１社以上から入手可能である：Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，  Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，  ＫＹ；Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｒｒａｎｃｅ，  ＣＡ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ；Ｆａｒｃｈａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ  ＦＬ；Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｗｉｎｄｈａｍ  ＮＨ；およびＭａｙＢｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （ｃ／ｏ  Ｒｙａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，  ＳＣ。これらの企業からのカタログは、酸を同定するために上記で使用されている省略形を使用する。
【０１９３】
ｆ．タグを調製するための手段としてのコンビナトリアルケミストリー
コンビナトリアルケミストリーは、大きな化学ライブラリの産生を導く一種の合成戦略である（例えば、ＰＣＴ出願公表第ＷＯ  ９４／０８０５１号を参照のこと）。これらのコンビナトリアルライブラリは、目的の分子（ＭＯＩ）の同定のためのタグとして使用され得る。コンビナトリアルケミストリーは、種々の実在分子の巨大なアレイを生じるための、変化する構造の１組の異なる「構築ブロック」の、互いへの体系的かつ反復的な共有結合として定義され得る。構築ブロックは、以下のような多くの天然に存在する形態および合成の形態をとり得る：求核体、求電子体、ジエン、アルキル化剤またはアシル化剤、ジアミン、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、脂質、有機モノマー、シントン、および上記形態の組合せ。構築ブロックを結合するために使用される化学反応は、アルキル化、アシル化、酸化、還元、加水分解、置換、脱離、付加、環化、縮合などである。このプロセスは化合物のライブラリを産生し得、それらはオリゴマーか、非オリゴマーか、またはそれらの組合せである。オリゴマーである場合、化合物は、分枝であるか、分枝でないか、または環状であり得る。組合せ方法によって調製され得るオリゴマー構造の例には、以下が含まれる：オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴサッカライド、ポリリピド、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリエーテル、ポリ（リン誘導体）（例えば、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスファイト、ホスフィンアミドなど）、およびポリ（硫黄誘導体）（例えば、スルホン、スルホネート、スルファイト、スルホンアミド、スルフェンアミドなど）。
【０１９４】
１つの共通のタイプのオリゴマーコンビナトリアルライブラリは、ペプチドコンビナトリアルライブラリである。ペプチド化学および分子生物学における最近の技術革新により、数千万〜数億の異なるペプチド配列からなるライブラリの調製および使用が可能になっている。そのようなライブラリは、３つの広いカテゴリーに分類され得る。ライブラリの１つのカテゴリーは、可溶性の非支持体結合ペプチドライブラリの化学合成に関する（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４，  １９９１）。第２のカテゴリーは、プラスチックピン、樹脂ビーズ、または綿のような支持体上に提示される、支持体結合ペプチドライブラリの化学合成に関する（Ｇｅｙｓｅｎら，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：７０９，  １９８６；Ｌａｍら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２，  １９９１；ＥｉｃｈｌｅｒおよびＨｏｕｇｈｔｅｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１１０３５，  １９９３）。これら最初２つのカテゴリーにおいて、構築ブロックは、典型的にはＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、非天然型アミノ酸、またはそれらのいくつかの混合物もしくは組合せである。第３のカテゴリーは、糸状ファージ粒子またはプラスミドの表面上のペプチドまたはタンパク質を調製するために、分子生物学アプローチを使用する（ＳｃｏｔｔおよびＣｒａｉｇ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ５：４０，  １９９４）。可溶性の非結合ペプチドライブラリは、タグとしての使用を含む、多くの適用に適切なようである。ペプチドライブラリにおける化学的多様性の利用可能なレパートリーは、過メチル化のような工程によって拡張され得る（Ｏｓｔｒｅｓｈら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ９１：１１１３８，  １９９４）。
【０１９５】
ペプチドコンビナトリアルライブラリの多数の改変体が、ペプチド骨格が修飾される場合、および／またはアミド結合が模倣基に置換されている場合に可能である。使用され得るアミド模倣基には、尿素、ウレタン、およびカルボニルメチレン基が含まれる。側鎖がα炭素よりもむしろ各アミノ酸のアミド窒素から生じるような骨格の再構築は、ペプトイドとして公知の化合物のライブラリを与える（Ｓｉｍｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：９３６７，  １９９２）。
【０１９６】
他の共通のタイプのオリゴマーコンビナトリアルケミストリーは、構築ブロックが天然に存在するかまたは非天然型のヌクレオチドまたは多糖誘導体のいくつかの形態である場合、オリゴヌクレオチドコンビナトリアルケミストリーである。これには種々の有機基および無機基がリン酸結合を置換し得る場合、ならびに窒素または硫黄がエーテル結合中の酸素を置換する場合が含まれる（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３４：９５９９，  １９９５；Ｆｒｅｉｅｒら，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３８：３４４，  １９９５；Ｆｒａｎｋ，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４１：２５９，  １９９５；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，  公表ＰＣＴ第ＷＯ  ９４２０５２号；Ｅｃｋｅｒら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１：１８５３，  １９９３）。
【０１９７】
より最近は、非オリゴマーの小分子化合物の集合体の組合せ生成が記載されている（ＤｅＷｉｔｔら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ９０：６９０，  １９９３；Ｂｕｎｉｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ９１：４７０８，  １９９４）。小分子ライブラリへの仕上げに適切な構造は、以下のような広い種類の有機分子を包含する：例えば、ヘテロ環状、芳香族、脂環式、脂肪族、ステロイド、抗生物質、酵素阻害剤、リガンド、ホルモン、薬剤、アルカロイド、オピオイド、テルペン、ポルフィリン、トキシン、触媒、ならびにそれらの組合せ。
【０１９８】
ｇ．タグのコンビナトリアル合成のための特異的方法
多様な組のアミン含有ＭＳタグの調製および使用のための２つの方法を以下に概説する。両方法において、コンビナトリアルケミストリーの技術を使用して多数のタグ化リンカーの同時並行合成を可能にするために、固相合成が使用される。第１の方法において、オリゴヌクレオチドからのタグの最終的な切断は、カルボキシルアミドの遊離を生じる。第２の方法において、タグの切断はカルボン酸を生成する。これらの方法において使用された化学的成分および結合要素を、以下のように略記する：
【０１９９】
【化２８】
2008220370.tif 000029
方法１における工程の順序は以下の通りである：
ＯＨ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓  ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣＯ２Ｈ；カップリング（例えば、ＨＢＴＵ）
ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓  ピペリジン（ＦＭＯＣを除去）
ＮＨ２−Ｒｉｎｋ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓  ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ａ−ＣＯＯＨ；カップリング（例えば、ＨＢＴＵ）
ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ａ−ＣＯＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓  ピペリジン（ＦＭＯＣを除去）
ＮＨ２−Ａ−ＣＯＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓  ｎ個のアリコートに分割
↓↓↓↓↓  ｎ個の異なる酸Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＯＨとカップリング
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓↓↓↓↓  １％ＴＦＡを用いて樹脂からタグ化リンカーを切断
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣＯ２Ｈ
↓↓↓↓↓  ｎ個のオリゴ（ｏｌｉｇｏ１…ｏｌｉｇｏ（ｎ））とカップリング
（例えば、Ｐｆｐエステルを介して）
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣＯＮＨ−ｏｌｉｇｏ１…ｏｌｉｇｏ（ｎ）
↓  タグ化オリゴをプール
↓  配列決定反応を実行
↓  配列決定反応由来の異なる長さのフラグメントを分離
（例えば、ＨＰＬＣまたはＣＥを介して）
↓  ２５％〜１００％ＴＦＡを用いてリンカーからタグを切断
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯＮＨ
↓
質量分析法により分析。
【０２００】
方法２における工程の順序は以下の通りである：
ＯＨ−１ＭｅＯ−ＣＯ２−Ａｌｌ
↓  ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ａ−ＣＯ２Ｈ；カップリング（例えば、ＨＢＴＵ）
ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ａ−ＣＯＯ−１ＭｅＯ−ＣＯ２−Ａｌｌ
↓  パラジウム（アリールを除去）
ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ａ−ＣＯＯ−１ＭｅＯ−ＣＯ２Ｈ
↓  ＯＨ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ；カップリング（例えば、ＨＢＴＵ）
ＦＭＯＣ−ＮＨ−Ａ−ＣＯＯ−１ＭｅＯ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓  ピペリジン（ＦＭＯＣを除去）
ＮＨ２−Ａ−ＣＯＯ−１ＭｅＯ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓  ｎ個のアリコートに分割
↓↓↓↓↓  ｎ個の異なる酸Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＯＨとカップリング
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯＯ−１ＭｅＯ−ＣＯＯ−２ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−Ｒ
↓↓↓↓↓  １％ＴＦＡを用いて樹脂からタグ化リンカーを切断
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯＯ−１ＭｅＯ−ＣＯ２Ｈ
↓↓↓↓↓  ｎ個のオリゴ（ｏｌｉｇｏ１…ｏｌｉｇｏ（ｎ））とカップリング
（例えば、Ｐｆｐエステルを介して）
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯＯ−１ＭｅＯ−ＣＯＮＨ−ｏｌｉｇｏ１…ｏｌｉｇｏ（ｎ）
↓  タグ化オリゴをプール
↓  配列決定反応を実行
↓  配列決定反応由来の異なる長さのフラグメントを分離
（例えば、ＨＰＬＣまたはＣＥを介して）
↓  ２５％〜１００％ＴＦＡを用いてリンカーからタグを切断
Ｘ１…Ｘｎ−ＣＯＮＨ−Ａ−ＣＯ２Ｈ
↓
質量分析法により分析。
【０２０１】
２．リンカー
本明細書において使用される「リンカー」成分（またはＬ）は、「タグ」（またはＴ）を「目的の分子」（またはＭＯＩ）に共有結合性の化学的結合を介して連結するために使用される直接的な共有結合または有機的な化学基のいずれかを意味する。さらに、直接的な結合それ自身、またはリンカー成分内の一つ以上の結合は、Ｔ−Ｌ−Ｘ化合物（これはＭＯＩ成分を含む）の残りからＴが遊離される（言い換えれば、切断される）条件下で切断可能である。Ｔ内に存在するタグ可変成分は、切断条件に対して安定であるべきである。好ましくは、切断は、数分以内に、および好ましくは約１５秒以下の内に迅速に達成され得る。
【０２０２】
一般に、リンカーは、タグの大きなセットの各々をＭＯＩの類似の大きなセットの各々に連結するために使用される。代表的には、単一のタグ−リンカーの組合せは各ＭＯＩに結合される（種々のＴ−Ｌ−ＭＯＩを与えるために）が、いくつかの場合において、一つより多いタグ−リンカーの組合せは、各個々のＭＯＩに結合され得る（種々の（Ｔ−Ｌ）ｎ−ＭＯＩを与えるために）。本発明の別の実施態様において、二つ以上のタグが、リンカー上の複数の独立的な部位を介して単一のリンカーに結合され、次いでこの複数のタグ−リンカーの組合せは、個々のＭＯＩに結合される（種々の（Ｔ）ｎ−Ｌ−ＭＯＩを与えるために）。
【０２０３】
タグ化ＭＯＩのセットの種々の操作の後で、特定の化学的および／または物理的条件が、リンカー中の一つ以上の共有結合を切断するために使用され、これは、ＭＯＩからのタグの遊離を生じる。切断可能な結合は、タグ、リンカー、およびＭＯＩが、共に連結される場合、形成される同一の結合のいくつかがあってもよいし、なくてもよい。リンカーの設計は、大部分において、切断が達成され得る条件を決定する。従って、リンカーは、それらも特に影響を受けやすい切断条件によって同定され得る。リンカーが光不安定性（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）である（すなわち、化学放射線への曝露によって切断される傾向がある）場合、リンカーはＬｈυと命名され得る。同様に、命名Ｌａｃｉｄ、Ｌｂａｓｅ、Ｌ［Ｏ］、Ｌ［Ｒ］、Ｌｅｎｚ、Ｌｅｌｃ、ＬΔ、およびＬＳＳが、酸、塩基、化学的酸化、化学的還元、酵素の触媒活性（より単純には「酵素」）、電気化学的酸化または還元、高温（「熱」）、およびチオール交換のそれぞれに特に影響を受けやすいリンカーに言及するために使用され得る。
【０２０４】
リンカーの特定の型は、単一の型の切断条件に対して不安定であるが、一方リンカーの他の型はいくつかの型の切断条件に対して不安定である。さらに、複数のタグ（（Ｔ）ｎ−Ｌ−ＭＯＩ型構造を与える）を結合し得るリンカーにおいて、タグ結合部位の各々は、異なる切断条件に不安定に成り得る。例えば、リンカーに結合される二つのタグを有するそのリンカーにおいて、タグの一方は塩基に対してのみ不安定に成り得、そして他方は、光分解に対してのみ不安定に成り得る。
【０２０５】
本発明において有用なリンカーは、いくつかの属性を有する：
１）リンカーは化学的ハンドル（Ｌｈ）を有し、それを介してリンカーはＭＯＩに結合され得る。
【０２０６】
２）リンカーは、第二の別の化学的ハンドル（Ｌｈ）を有し、それを介してタグはリンカーに結合する。もし複数のタグが単一のリンカーに結合されるならば（（Ｔ）ｎ−Ｌ−ＭＯＩ型構造）、次いで別のハンドルが各タグについて存在する。
【０２０７】
３）リンカーは、Ｔ含有部分が化合物の残り（これはＭＯＩを含む）から遊離されるように切断を可能にする条件を例外として、供される全ての操作に対して安定である。従って、リンカーは、タグのリンカーへの結合の間、リンカーのＭＯＩへの結合の間、そしてタグおよびリンカー（Ｔ−Ｌ）がＭＯＩに結合される間のＭＯＩの任意の操作の間安定である。
【０２０８】
４）リンカーは、Ｔ−ＬがＭＯＩに結合される間、ＭＯＩ上で行われる操作に有意に干渉しない。例えば、Ｔ−Ｌがオリゴヌクレオチドに結合される場合、Ｔ−Ｌは、オリゴヌクレオチド上で行われる全てのハイブリダイゼーションまたは酵素反応（例えばＰＣＲ）に有意に干渉してはならない。同様に、Ｔ−Ｌが抗体に結合される場合、それは抗体による抗原認識に有意に干渉してはならない。
【０２０９】
５）タグの検出可能性に悪影響を与えない物理的または化学的プロセスを使用して、化合物の残りからのタグの切断は、高度に制御された様式で生じる。
【０２１０】
任意の所定のリンカーについて、リンカーが広範な種々のＭＯＩに結合可能で、そして広範な種々のタグが、リンカーに結合可能であることが望ましい。このような柔軟性は、一旦調製されれば、いくつかの異なるセットのＭＯＩを用いて使用されるＴ−Ｌ結合物のライブラリーを可能にするので、利点に富む。
【０２１１】
上記に説明されたように、好ましいリンカーは以下の式を有する：
Ｌｈ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌｈ
ここで、各Ｌｈは、リンカーをタグ反応物および目的の反応物の分子と連結するために使用され得る反応性ハンドルである。Ｌ２はリンカーに不安定性を与えるので、Ｌ２はリンカーの不可欠な部分である。Ｌ１およびＬ３は、ハンドルＬｈからＬ２を分離するのに効果的に役立つ任意の基である。
【０２１２】
Ｌ１（これは、定義によって、Ｌ３よりＴに近い）は、必要とされる不安定部分Ｌ２からＴを分離するために役立つ。この分離は、切断反応がＴ含有部分の構造においてランダムな変化を生じ得る特定の反応性種（例えば、フリーラジカル）を生じる場合、有用であり得る。切断部位が、Ｔ含有部分からさらに離れている場合、切断部位で形成された反応性種が、Ｔ含有部分の構造を破壊する減少した可能性がある。さらに、Ｌ１における原子は、代表的には、Ｔ含有部分に存在する場合、これらＬ１原子は、Ｔ含有部分に望ましい質で特性を付与し得る。例えば、Ｔ含有部分が、Ｔｍｓ含有部分であり、そして妨害された（ｈｉｎｄｅｒｅｄ）アミンがＴｍｓ含有部分の構造の部分として望ましく存在する（例えば、ＭＳＳＥとして作用する）場合、妨害されたアミンはＬ１不安定部分に存在し得る。
【０２１３】
他の例において、Ｌ１および／またはＬ３は、単にリンカー成分中に存在し得る。なぜならば、リンカーの商業的な供給業者は、そのようなＬ１および／またはＬ３基を有する形態でリンカーを販売するように選択しているからである。そのような例において、Ｌ１および／またはＬ３基は、それらを組み込む化合物に対して性能利点を何ら特に寄与し得ないが、Ｌ１および／またはＬ３基を有するリンカーを使用することに害はない（これらの基が、切断反応を阻害しない限り）。従って、本発明は、Ｌ１および／またはＬ３基がリンカー成分中に存在することを可能にする。
【０２１４】
Ｌ１および／またはＬ３基は、直接的な結合（この場合において、基は実際には存在しない）、ヒドロカルビレン基（例えば、アルキレン、アリーレン、シクロアルキレンなど）、−Ｏ−ヒドロカルビレン（例えば、−Ｏ−ＣＨ２−、Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−など）、またはヒドロカルビレン−（Ｏ−ヒドロカルビレン）Ｗ−（ここでＷは、１〜約１０の範囲にある整数である）（例えば、−ＣＨ２−Ｏ−Ａｒ−、ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）４−など）であり得る。
【０２１５】
固相合成法の出現があったので、特定の反応条件に不安定なリンカーに関する多くの文献が、展開されてきた。代表的な固相合成において、固体支持体は、反応性部位に不安定なリンカーを介して結合され、そして合成されるべき分子は、反応性部位で生成される。分子が完全に合成された場合、固体支持体−リンカー−分子構築物は、固体支持体から分子を遊離する切断条件に供される。この状況における使用のために、開発されてきた不安定なリンカー（またはこの状況において使用され得る）はまた、本発明におけるリンカー反応物として容易に使用され得る。
【０２１６】
Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｐら、「Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．  ３４７，  ４９（４８）：１１０６５−１１１３３（１９９３）は、化学放射線（すなわち、光分解）ならびに酸、塩基、および他の切断条件に不安定なリンカーの広範な議論を提供する。不安定なリンカーについての情報のさらなる供給源は当業者に周知である。
【０２１７】
上記のように、異なるリンカー設計は、異なる特定の物理的または化学的条件下で切断可能性（「不安定性」）を与える。種々の設計のリンカーを切断するのに役立つ条件の例は、酸、塩基、酸化、還元、フッ素、チオール交換、光分解、および酵素的な条件を含む。
【０２１８】
上記のリンカーについての一般的な基準を満足する切断可能なリンカーの例は当業者に周知であり、そしてＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能なカタログにおいて見出されるリンカーを含む。例は、以下を含む：
・エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ヒドロキルシアミンによって切断可能である（３７℃にて３〜６時間で１Ｍ）アミン反応性架橋試薬；
・ジスクシンイミジル酒石酸（ＤＳＴ）およびスルホ−ＤＳＴである（これは０．０１５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムによって切断可能であるアミン反応性架橋試薬である；
・ビス［２−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）およびスルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ（これらは塩基（ｐＨ１１．６）によって切断可能なアミン反応性架橋試薬である）；
・１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ（プロピオンアミド））ブタン（ＤＰＤＰＢ）（チオール交換または還元によって切断可能であるピリジルジチオール架橋剤）；
・Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）−ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）（チオール交換または還元によって切断可能であるピリジルジチオール架橋剤）；
・ビス−［β−４−（アジドサリチルアミド）エチル］−ジスルフィド（チオール交換または還元によって切断可能である光反応性架橋剤）；
・Ｎ−スクシンイミジル−（４−アジドフェニル）−１，３’ジチオプロピオネート（ＳＡＤＰ）（チオール交換または還元によって切断可能である光反応性の架橋剤）；
・スルホスクシンイミジル−２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＥＤ）（チオール交換または還元によって切断可能である光反応性架橋剤）；
・スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−Ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’ジチオプロピオネート（ＳＡＮＤ）（チオール交換または還元によって切断可能である光反応性架橋剤）。
【０２１９】
タグを放出するために使用され得る切断可能なリンカーおよび切断条件の他の例は、以下である。シリル結合基は、フッ素によってかまたは酸条件下で切断され得る。３−、４−、５−、または６−置換−２−ニトロベンジルオキシまたは２−、３−、５−、または６−置換−４−ニトロベンジルオキシ結合基は、光子源によって切断さ得る（光分解）。３−、４−、５、または６−置換−２−アルコキシフェノキシまたは２−、３−、５−、または６−置換−４−アルコキシフェノキシ結合基は、Ｃｅ（ＮＨ４）２（ＮＯ３）６（酸化）によって切断され得る。ＮＣＯ２（ウレタン）リンカーは、水酸化物（塩基）、酸、またはＬｉＡＬＨ４（還元）によって切断され得る。３−ペンテニル、２−ブテニル、または１−ブテニル結合基は、Ｏ３、ＯＳＯ４／ＩＯ４−またはＫＭｎＯ４（酸化）によって切断され得る。２−［３−、４−、または５−置換フリル］オキシ結合基は、Ｏ２、Ｂｒ２、ＭｅＯＨまたは酸によって切断され得る。
【０２２０】
他の不安定な結合基の切断のための条件は、以下を含む：ｔ−アルキルオキシ結合基は酸によって切断され得る；メチル（ジアルキル）メトキシまたは４−置換−２−アルキル−１，３−ジオキサレン（ｄｉｏｘｌａｎｅ）−２−イル結合基は、Ｈ３Ｏ＋によって切断され得る；２−シリルエトキシ結合基は、フッ素または酸によって切断され得る；２−（Ｘ）−エトキシ（ここでＸ＝ケト、エステル、アミド、シアノ、ＮＯ２、スルフィド、スルホキシド、スルホン）結合基は、アルカリ条件下で切断され得る；２−、３−、４−、５−、または６−置換−ベンジルオキシ結合基は、酸または還元条件により切断され得る；２−ブテニルオキシ基は、（Ｐｈ３Ｐ）３ＲｈＣｌ（Ｈ）によって切断され得る、３−、４−、５−、または６−置換−２−ブロモフェノキシ結合基は、Ｌｉ、Ｍｇ、またはＢｕＬｉによって切断され得る；メチルチオメトキシ結合基はＨｇ２＋によって切断され得る；２−（Ｘ）−エチルオキシ（ここでＸ＝ハロゲン）結合基はＺｎまたはＭｇによって切断され得る；２−ヒドロキシエチルオキシ結合基は、酸化（例えば、Ｐｂ（ＯＡｃ）４を用いて）切断され得る。
【０２２１】
好ましいリンカーは、酸または光分解によって切断されるリンカーである。固相ペプチド合成のために開発されてきたいくつかの酸不安定リンカーは、タグをＭＯＩに架橋するに有用である。これらのリンカーのいくつかは、Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：１１０６５−１１１３３，  １９９３）による最新の総説によって記載される。リンカーの一つの有用な型は、ｐ−アルコキシベンジルアルコールに基づき、その内の二つ、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸および４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）酪酸は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，  ＫＹ）から入手可能である。両方のリンカーが、ベンジルアルコールへのエステル結合を介してタグに結合され得、カルボン酸へのアミド結合を介してアミン含有ＭＯＩと結合され得る。これらの分子によって結合されたタグは、多様な濃度のトリフルオロ酢酸を用いてＭＯＩから遊離される。これらの分子の切断は、タグ上のカルボン酸の遊離を生じる。関連するリンカー（例えば、２，４−ジメトキシ−４’−（カルボキシメチルオキシ）−ベンズヒドリルアミン（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈからＦＭＯＣ保護形態で入手可能）を介して結合されたタグの酸切断は、遊離されたタグ上のカルボン酸アミドの遊離を生じる。
【０２２２】
本願にとって有用な光不安定性リンカーはまた、固相ペプチド合成のために最も開発された部分であった（Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ総説を参照のこと）。これらのリンカーは、通常、２−ニトロベンジルエステルまたは２−ニトロベンジルアミドに基づく。文献において最近報告されている光不安定性リンカーの二つの例は、４−（４−（１−Ｆｍｏｃ−アミノ）エチル）−２−メトキシ−５−ニトロフェノキシ）ブタン酸（ＨｏｌｍｅｓおよびＪｏｎｅｓ、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ６０：２３１８−２３１９，  １９９５）および３−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−３−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸（Ｂｒｏｗｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  １：４−１２，  １９９５）である。両リンカーは、ＭＯＩ上でカルボン酸を介してアミンに結合され得る。リンカーへのタグの結合は、タグ上のカルボン酸とリンカー上のアミンとの間でアミドを形成することによって作製される。光不安定性リンカーの切断は、通常、強度で３５０ｎｍ波長のＵＶ光および当業者に公知の時間を用いて行われる。リンカーの切断は、タグ上の一級アミドの遊離を生じる。感光性リンカーの例は、ニトロフェニルグリシンエステル、ｅｘｏ−およびｅｎｄｏ−２−ベンゾノルボルネリルクロライドおよびメタンスルホネート、および３−アミノ−３（２−ニトロフェニル）プロピオン酸を含む。酵素的切断の例には、エステル結合を切断するエステラーゼ、ホスホジエステル結合を切断するヌクレアーゼ、ペプチド結合を切断するプロテアーゼなどが挙げられる。
【０２２３】
好ましいリンカー成分は以下に示すようなオルト−ニトロベンジル構造を有する；
【０２２４】
【化２９】
2008220370.tif 000030
ここでａ、ｂ、ｃ、ｄ、またはｅ位の一つの炭素原子は、−Ｌ３−Ｘで置換され、そしてＬ１（好ましくは直接的な結合である）は、上記構造中のＮ（Ｒ１）の左に存在する。このようなリンカー成分は、「ａ」と標識された炭素とＮ（Ｒ１）間の結合の選択的な光誘導切断に感受性である。Ｒ１の同一性は、切断反応にとって代表的には重要ではないが、しかしＲ１は、好ましくは、水素およびヒドロカルビルより選択される。本発明は、上記の構造において、−Ｎ（Ｒ１）−が、−Ｏ−で置き換えられ得る。さらに上記構造において、ｂ、ｃ、ｄ、またはｅ位の一つ以上が、必要に応じて、アルキル、アルコキシ、フッ素、クロライド、ヒドロキシル、カルボキシレート、またはアミドで置換され得、ここでこれらの置換基は、各存在で独立して選択される。
【０２２５】
化学ハンドルＬｈを有するさらに好ましいリンカー成分は、以下の構造を有する；
【０２２６】
【化３０】
2008220370.tif 000031
ここで、ｂ、ｃ、ｄ、またはｅ位の一つ以上が、水素、アルキル、アルコキシ、フッ素、クロライド、ヒドロキシル、カルボキシレート、アミドで置換され、Ｒ１は水素またはヒドロカルビルであり、そしてＲ２は、−ＯＨまたは別の部分とのカップリングのためにカルボン酸を保護しているかまたは活性化する基である。フルオロカーボンおよびヒドロフルオロカーボンは、別の部分とのカップリングへ向けてカルボン酸を活性化する好適な基である。
【０２２７】
３．目的の分子（ＭＯＩ）
ＭＯＩの例には、核酸、または核酸アナログ（例えば、ＰＮＡ）、核酸のフラグメント（すなわち、核酸フラグメント）、合成核酸またはフラグメント、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド、抗体、または抗体フラグメント、レセプター、レセプターリガンド、リガンド対メンバー、サイトカイン、ホルモン、オリゴ糖、合成有機分子、薬物およびそれらの組合せが挙げられる。
【０２２８】
好ましいＭＯＩの例には、核酸フラグメントが挙げられる。好ましい核酸フラグメントは、ベクターが、塩基配列決定に使用される場合、ベクターに存在する配列に相補的なプライマー配列である。好ましくは、核酸フラグメントは、フラグメントの３’末端以外、そして最も好ましくはフラグメントの５’末端でタグに直接的または間接的に結合される。核酸フラグメントは、購入され得るかまたは遺伝子データベースに基づいて調製され得る（例えば、Ｄｉｂら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：１５２−１５４，  １９９６およびＣＥＰＨ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｐｈｂ．ｆｒ）および商業的なメーカー（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ））
本明細書中で使用されるように、ＭＯＩは、ＭＯＩをＴ−Ｌ−Ｌｈ化合物へ結合するに有用な官能基を含む誘導体を含む。例えば、ホスホジエステルがまたアルキレンアミンに結合される場合、５’末端にホスホジエステルを有する核酸フラグメントは、ＭＯＩである。このようなＭＯＩは、例えば、米国特許第４，７６２，７７９号（本明細書に参考として援用される）に記載される。内部修飾を有する核酸フラグメントもまたＭＯＩである。核酸フラグメントの例示的な内部修飾は、塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル）が、反応性官能基を付加するように修飾された場合である。このような内部修飾核酸フラグメントは、例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｈｅｒｎｄｏｎ，  ＶＡから市販されている。核酸フラグメントの別の例示的な内部修飾は、核酸フラグメントの糖とホスフェート基の間に挿入される修飾ホスホジエステルを合成するために、塩基のホスホルアミデートが使用される場合である。塩基のホスホルアミデートは、このホスホルアミデート由来の部分を含む核酸フラグメントを別の部分（例えば、Ｔ−Ｌ−Ｌｈ化合物）に結合させる反応性基を含む。このような塩基性ホスホルアミデートは例えば、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡから市販されている。
【０２２９】
４．化学ハンドル（Ｌｈ）
化学ハンドルは、安定でしかし第１の分子の部分として存在する反応性原子配列であり、ここでハンドルは、第２の分子の部分として存在する相補的な化学的ハンドルと、２つの分子間で共有結合を形成するために化学反応を受け得る。例えば、これらの２つのハンドル間の反応が２つの分子を結合させる共有結合（特にエステル基）を形成するに際して、化学ハンドルは、水酸基であり得、そして相補的な化学ハンドルはカルボン酸基であり得る（またはその活性化誘導体（例えば、ヒドロフルオロアリールエステル））。
【０２３０】
化学ハンドルは、タグをリンカーに結合し、そしてリンカーをＭＯＩに結合するに適切な多くの共有結合反応に使用され得る。このような反応に、アルキル化（例えば、エーテル、チオエーテルを形成する）、アシル化（例えば、エステル、アミド、カルバメート、尿素、チオ尿素を形成する）、ホスホリル化（例えば、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスホンアミドを形成する）、スルホニル化（例えば、スルホネート、スルホンアミドを形成する）、縮合（イミン、オキシム、ヒドラゾンを形成する）、シリル化、ジスルフィド形成、および光分解による反応性中間体（例えば、ニトレン、またはカルベン）の生成を含む。一般に、タグをリンカーに結合するに適切なハンドルおよび結合形成反応はまた、リンカーをＭＯＩに結合するに適切であり、そしてその逆も同様である。いくつかの場合において、ＭＯＩは、先に修飾または誘導を受けて、リンカーを結合するに必要なハンドルを提供し得る。
【０２３１】
リンカーをＭＯＩに結合するに特に有用な結合の一つの型は、ジスルフィド結合である。その形成は、リンカー上のチオール基（ハンドル）およびＭＯＩ上の別のチオール基の存在を必要とする。従って、緩やかな酸化条件は、２つのチオールをジスルフィドとして結合するに十分である。ジスルフィド形成はまた、過剰な適切なジスルフィド交換試薬（例えば、ピリジルジスルフィド）を使用することによって誘導され得る。ジスルフィド形成は、容易に可逆であるので、ジスルフィドは所望ならばタグを遊離するための切断可能な結合としてもまた使用され得る。代表的には、これは、過剰の適切なチオール交換試薬（例えば、ジチオスレイトール）を使用して、同様の穏やかな条件下で達成される。
【０２３２】
アミド結合の形成は、タグ（またはリンカーを有するタグ）をオリゴヌクレオチドに結合するために特に興味深い。一次脂肪族アミンハンドルは、ホスホルアミダイト（例えば、６−モノメトキシトリチルヘキシルシアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，  ＶＡから入手可能））を有する合成オリゴヌクレオチドに容易に導入され得る。導入された一次アミンと比較した場合、天然のヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびグアノシン）上で見出されるアミンは、実際に非反応性である。反応性におけるこの相違は、アミドおよび導入された一次アミン（ヌクレオチドアミンではなく）を有する関連する結合基（例えば、尿素、チオ尿素、スルホンアミド）を選択的に形成する能力の基礎を形成する。
【０２３３】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｃａｔａｌｏｇ（Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）に収載されるように、アミン反応性官能基には、活性化カルボン酸エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルハライド、およびジクロロトリアゼンが部分的に挙げられる。活性エステルは、形成されるアミド生成物は極めて安定であるので、アミン修飾に優れた試薬である。さらに、これらの試薬は、脂肪族アミンと良好な反応性を有し、そしてオリゴヌクレオチドのヌクレオチドアミンとの低い反応性を有する。活性エステルの例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、およびｐ−ニトロフェニルエステルが挙げられる。活性エステルは、実際にはカルボン酸を含む任意の分子から作製され得るので、活性エステルは有用である。活性エステルを作製する方法は、Ｂｏｄａｎｓｋｙ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （第２版），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９９３）に収載される。
【０２３４】
５．リンカー結合
代表的には、単一の型のリンカーが、特定のセットまたはファミリーのタグを特定のセットのまたはファミリーのＭＯＩに結合するために使用される。本発明の好ましい実施態様において、単一の一様な手順が全ての種々のＴ−Ｌ−ＭＯＩ構造を作製するために付随され得る。Ｔ−Ｌ−ＭＯＩ構造のセットが大きい場合、これは、とくに利点に富む。なぜならば、それによってセットをコンビナトリアルケミストリーの方法または他の平行プロセシング技術を使用して調製することが可能となるからである。類似の方法において、単一の型のリンカーの使用は、単一の一様な手順を全ての種々のＴ−Ｌ−ＭＯＩ構造を切断するために用いることを可能にする。さらに、これは、大きなセットのＴ−Ｌ−ＭＯＩ構造について利点に富む。なぜならば、セットは、平行、反復、および／または自動化方法でプロセスされ得るからである。
【０２３５】
しかし、本発明の他の実施態様では、リンカーの２つ以上が、異なるサブセットのタグを対応するサブセットのＭＯＩを結合するために使用される。この場合において、選択的な切断条件が、各リンカーを独立に、他のサブセットのＭＯＩ上に存在するリンカーを切断することなしに切断するために使用され得る。
【０２３６】
多くの共有結合形成反応は、タグをリンカーに、そしてリンカーをＭＯＩに接着するに適切である。このような反応は、アルキル化（例えば、エーテル、チオエーテルを形成する）、アシル化（エステル、アミド、カルバメート、尿素、チオ尿素を形成する）、リン酸化（例えば、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスホンアミドを形成する）、スルホニル化（例えば、スルホネート、スルホンアミドを形成する）、縮合（例えば、イミン、オキシム、ヒドラゾンを形成する）、シリル化、ジスルフィド形成、および光分解による反応性中間体（例えば、ニトレンまたはカルベン）の生成を含む。一般的に、タグをリンカーに結合するに適切なハンドルおよび結合形成反応はまた、リンカーをＭＯＩに結合するに適切であり、逆も同様である。いくつかの場合において、ＭＯＩは、先の改変または誘導を受け得、リンカーを結合するに必要なハンドルを提供する。
【０２３７】
リンカーをＭＯＩに結合するに特に有用な結合の一つの型は、ジスルフィド結合である。その形成は、リンカー上のチオール基（「ハンドル」）およびＭＯＩ上の別のチオール基の存在を必要とする。次いで、穏やかな酸化条件が、二つのチオール基をジスルフィドとして結合するに十分である。ジスルフィド形成はまた、過剰の適切なジスルフィド交換試薬（例えば、ピリジルジスルフィド）を使用することによって誘導され得る。ジスルフィド形成は、容易に可逆的であるので、ジスルフィドは所望ならばタグを遊離するための切断可能な結合として使用され得る。代表的には、これは、過剰の適切なチオール交換試薬（例えば、ジチオスレイトール）を使用して、同様に穏やかな条件下で達成される。
【０２３８】
アミド結合の形成は、タグをオリゴヌクレオチドに結合するために特に興味深い。一次脂肪族アミンハンドルは、ホスホルアミダイト（例えば、６−モノメトキシトリチルヘキシルシアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，  ＶＡから入手可能）を有する合成オリゴヌクレオチドに容易に導入され得る。導入された一次アミンと比較した場合、天然のヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびグアノシン）上で見出されるアミンは、実際に非反応性である。反応性におけるこの相違は、アミドおよび導入した一級アミン（ヌクレオチドアミンではなく）を有する関連結合基（例えば、尿素、チオ尿素、スルホンアミド）を選択的に形成する能力の基礎を形成する。
【０２３９】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｃａｔａｌｏｇ（Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）に収載されるように、アミン反応性官能基には、活性化カルボン酸エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルハライド、およびジクロロトリアゼンが部分的に挙げられる。活性エステルは、形成されるアミド生成物は極めて安定であるので、アミン修飾に優れた試薬である。さらに、これらの試薬は、脂肪族アミンと良好な反応性を有し、そしてオリゴヌクレオチドのヌクレオチドアミンとの低い反応性を有する。活性エステルの例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、およびｐ−ニトロフェニルエステルが挙げられる。活性エステルは、実際にはカルボン酸を含む任意の分子から作製され得るので、活性エステルは有用である。活性エステルを作製する方法は、Ｂｏｄａｎｓｋｙ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （第２版），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９９３）に収載される。
【０２４０】
リンカーとして機能し得る多くの市販の架橋試薬が存在する（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬを参照のこと）。これらの中に、ホモ二官能性イミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルによって例示されるホモ二官能性アミン反応性架橋試薬がある。連続的な反応を可能にする２つ以上の異なる反応性基を有するヘテロ二官能性架橋試薬が存在する。イミドエステルは、アルカリ性ＰＨでアミンと迅速に反応する。ＮＨＳ−エステルは、一級アミンまたは二級アミンと反応させた場合、安定な生成物を与える。マレイミド、アルキルおよびアリールハライド、α−ハロアシルおよびピリジルジスルフィドは、チオール反応性である。マレイミドは、６．５〜７．５のｐＨの範囲でチオール（スルフヒドリル）基に対して特異的である。そしてアルカリ性ｐＨは、アミン反応性になり得る。チオエーテル結合は、生理学的条件下で安定である。α−ハロアセチル架橋試薬は、ヨードアセチル基と反応し得るが、反応は非常に遅い。イミダゾールは、ヨードアセチル部分を含み、そしてスルフヒドリルに対して反応性である。ピリジルジスルフィドは、チオール基と反応して、ジスルフィド結合を形成し得る。カルボジイミドは、カルボキシルとヒドラジドの一級アミンをカップリングさせ、これはアシル−ヒドラジン結合の形成を生じる。アリールアジドは、ＵＶまたは可視光に曝露されるまで化学的に不活性な光親和性試薬である。このような化合物が、２５０ｎｍ〜４６０ｎｍで光分解される場合、活性アリールニトレンが形成される。反応性アリールニトレンは、比較的非特異的である。グリオキサールは、アルギニンのグアニジル部分に対して反応性である。
【０２４１】
本発明の一つの代表的な実施態様において、タグはまずリンカーに結合され、次いでタグとリンカーとの組合せは、ＭＯＩに結合され、構造Ｔ−Ｌ−ＭＯＩを生じる。あるいは、同一の構造が、リンカーをＭＯＩへまず結合させ、次いでリンカーとＭＯＩとの組合せをタグに結合させることによって形成される。例は、ＭＯＩがＤＮＡプライマーまたはオリゴヌクレオチドである場合である。この場合において、タグは、代表的には、まずリンカーに結合され、次いでＴ−Ｌが、ＤＮＡプライマーまたはオリゴヌクレオチドに結合される。これは、次いで、例えば、配列決定反応において使用される。
【０２４２】
タグが、ＭＯＩに可逆的にＭＯＩに結合し得る一つの有用な形態（例えば、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ配列決定プライマー）は、化学的に不安定なリンカーを介する。リンカーについての一つの好ましい設計によって、リンカーを揮発性の有機酸（例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））に曝露した場合切断することが可能になる。ＴＦＡは、特に、多くのＭＳイオン化の方法（これは電気スプレイを含む）に適合性である。
【０２４３】
変異解析のための本発明の組成物。変異解析のために有用な組成物は、以下の化合物の一対を含む：
Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩ
ここで、Ｔｍｓは、マススペクトル分析によって検出可能な有機基であり、これは、炭素、水素およびフッ素の少なくとも一つ、ならびに酸素、窒素、イオウ、リン、およびヨウ素より選択される任意の原子を含む。式において、Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を化合物の残りから切断させる有機基であり、ここでＴｍｓ含有成分は、化合物がマススペクトル分析に供される場合、単一イオン化荷電状態を維持する官能基を含み、そしてこれは第３級アミン、第４級アミン、および有機酸から選択される。式において、ＭＯＩは核酸フラグメントであり、ここでＬはＭＯＩの３’末端以外の位置でＭＯＩに結合される。組成物は、１対のメンバーが同一ではないＴｍｓ基を有し、そして塩基が同一ではない一塩基の位置を除いて同一の配列を有する化合物の対を含む。本発明の組成物の別の実施態様において、化合物の対のメンバーは、同一ではないＴｍｓ基を有し、そして塩基が同一ではない一塩基の位置を除いて同一の配列を有する。次いで、これらの組成物を、支持体が結合した核酸配列（これは、各対のメンバーの１つの配列と同一である）に添加する。従って、本発明は、上記のような複数の化合物対を含み、そしてさらに固体支持体上に固定化された等量の複数の核酸を含む（ここで複数の核酸の各メンバーは、各対のメンバーの一方に正確に相補的な塩基配列を有する）組成物を提供する。
【０２４４】
本発明はまた、複数の容器を含む変異解析のためのキットを提供する。各容器は、以下の式の化合物の一対を含む：
Ｔｍｓ−Ｌ−ＭＯＩ
ここで、Ｔｍｓは、マススペクトル分析によって検出可能な有機基であり、これは、炭素、水素およびフッ素の少なくとも一つ、ならびに酸素、窒素、イオウ、リン、およびヨウ素より選択される任意の原子を含む。式において、Ｌは、Ｔｍｓ含有部分を化合物の残りから切断させる有機基であり、ここでＴｍｓ含有成分は、化合物がマススペクトル分析に供される場合、単一イオン化荷電状態を維持し、第３級アミン、第４級アミン、および有機酸から選択される官能基を含む。式において、ＭＯＩは核酸フラグメントであり、ここでＬはＭＯＩの３’末端以外の位置でＭＯＩに結合される。キットにおいて、化合物は、各対のメンバーが同一ではないＴｍｓ基を有し、そして塩基が同一ではない１または２の塩基の位置を除いて同一の配列を有する化合物の対を含む。好ましいキットにおいて複数は、少なくとも３であり、そしてより好ましくは少なくとも５である。
【０２４５】
Ｂ．アッセイ
上記のように、本発明は、本明細書で提供されるタグおよび検出方法論が、アッセイの感度および処理量を非常に増加させるために利用され得る、広範な種々のアッセイを提供する。１つの局面では、このような方法は、リガンド対の第１のメンバーの第２のメンバーへの結合を検出するために利用され得、この方法は、（ａ）第１のメンバーの第２のメンバーへの結合を可能にするために十分な条件下および時間で、１セットの第１のタグ化メンバーを１つ以上の第２のメンバーを含み得る生物学的サンプルと組み合わせる工程であって、ここで、該タグが、特定の第１のメンバーと相関しそして非蛍光分光分析または電位差測定によって検出可能である、工程、（ｂ）結合した第１および第２のメンバーを結合していないメンバーから分離する工程、（ｃ）タグ化第１のメンバーからタグを切断する工程、および（ｄ）非蛍光分光分析または電位差測定によってタグを検出し、それから第１のメンバーの第２のメンバーへの結合を検出する工程を包含する。
【０２４６】
広範な種々の第１および第２のメンバー対は、本発明の状況内で利用され得、これは、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡのような核酸アナログ、またはこれらの任意の組み合わせ）、タンパク質またはポリペプチド（例えば、抗体または抗体フラグメント（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはＣＤＲのような結合パートナー）、オリゴ糖、ホルモン、有機分子、および他の基質（例えば、グルクロニダーゼ−薬物分子のような生体異物）、あるいはリガンド対の任意の他のリガンドを含む。本発明の種々の実施態様では、第１および第２のメンバーは、同じタイプまたは異なるタイプの分子であり得る。例えば、代表的な第１のメンバー第２のメンバーリガンド対は、核酸分子／核酸分子；抗体／核酸分子；抗体／ホルモン；抗体／生体異物；および抗体／タンパク質を含む。
【０２４７】
本明細書で提供された開示があれば、完成され得るアッセイのさらなる理解のために、ある特定の好ましいアッセイの簡単な説明が以下に提供される。
【０２４８】
１．核酸アッセイ
ａ．イントロダクション
上記のように、本発明はまた、上記の切断可能なタグおよび／またはリンカーが、同時に分析され得るサンプルの特異性、感度、または数を増強するために、所定の方法の内で、伝統的な標識（例えば、放射性、蛍光性、または酵素的）の代わりに利用され得る、広範な種々の方法を提供する。増強され得るこのような方法の代表的な例には、例えば、標準的核酸ハイブリダイゼーション反応（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）、Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＴ）（米国特許第４，８７６，１８７号および第５，０１１，７６９号を参照のこと）またはＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＯＬＡ）（Ｂｕｒｋｅｔら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，  １９８７）のような診断反応が挙げられる。これらならびに他の技法は、以下でより詳細に記載される。
【０２４９】
ｂ．ハイブリダイゼーション技法
遺伝子の首尾良いクローニングおよび配列決定は、関連のないＤＮＡまたはＲＮＡ分子の大きなプール中の遺伝子またはそのｍＲＮＡを検出することを可能にすることによって、その構造および発現の研究を可能にする。組織中の特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡの量は、遺伝子の活性に重要なパラメータであり、そして機能系の活性に著しく関連され得る。その調節は、遺伝子（シス作用エレメント）および配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質（トランス作用因子）内の配列間の相互作用に依存し、これは、組織特異的に、またはホルモンおよび第２のメッセンジャー系によって活性化される。
【０２５０】
いくつかの技法が、特定の遺伝子、その調節配列、その特異的ｍＲＮＡ、およびその発現の調節の分析に利用可能である；これらは、サザンまたはノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）保護アッセイ、およびインサイチュハイブリダイゼーションが含む。
【０２５１】
ある遺伝子のヌクレオチド組成の変異は、大きな病理生理学的関連性があり得る。非コード領域（５’，３’−フランキング領域およびイントロン）に局在する場合、これらは、遺伝子発現の調節に影響を与え得る。これは、異常な活性化または阻害を引き起こす。遺伝子のコード領域（エキソン）に局在する場合、これらは、タンパク質機能の変化または機能障害タンパク質を生じ得る。
【０２５２】
したがって、遺伝子内のある配列は、特定の病気と相関し得、そして疾患のマーカーとして有用であり得る。したがって、医療分野における研究の１つの最初の目的は、診断ツールとしてそれらの遺伝子変異を検出すること、および病態生理学的現象の理解のために重要な情報を得ることである。
【０２５３】
ある遺伝子内の変異に関する集団の分析の基本的方法は、サザンブロット技法を使用するＤＮＡ分析である。簡単にいえば、調製したゲノムＤＮＡは、制限酵素（ＲＥ）で切断される。これは、ゲノム上のＲＥの特異的認識部位の存在によって決定される、種々の長さの多数のＤＮＡフラグメントを生じる。この制限部位の内側の変異を有するある遺伝子の対立遺伝子は、異なる数および長さのフラグメントに切断される。これは、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）と呼ばれ、そして多くの適用を有する重要な診断マーカーであり得る。
【０２５４】
分析されるフラグメントは、ＤＮＡフラグメントのプールから分離され、そして特異的プローブを使用して他のＤＮＡ種と区別されなければならない。したがって、ＤＮＡは、アガロースゲルを使用して電気泳動分画に供せられ、続いてナイロンまたはニトロセルロースメンブレンへのトランスファー、そして固定に供せられる。固定した一本鎖ＤＮＡは、検出されるＤＮＡに相補的であるタグ化ＤＮＡにハイブリダイズする。非特異的ハイブリダイゼーションを除去した後、目的のＤＮＡフラグメントは、以下でより詳細に記載のようにＭＡＬＤ１−ＭＳによって可視化され得る。
【０２５５】
生理学的パラメータによる特異的遺伝子転写およびその調節の存在および定量は、ノーザンブロット分析およびＲＮａｓｅ保護アッセイによって分析され得る。
【０２５６】
これらの方法の原理の基礎は、特異的プローブへの全細胞性ＲＮＡのプールのハイブリダイゼーションである。ノーザンブロット技法では、組織の全ＲＮＡは、アガロースゲルを使用して電気泳動によって分画され、トランスファーされ、そしてＲＮＡに相補的な標識したアンチセンスＲＮＡ（ｃＲＮＡ）固定され、検出される。次いで、このｃＲＮＡプローブは、本明細書に記載のようにタグを付けられる。ストリンジェントな洗浄条件を適用することによって、非特異的に結合した分子は排除される。特異的に結合した分子は、その後、ＭＡＬＤ１−ＭＳによって検出され得る。さらに、特異性は、検出されたｍＲＮＡのサイズを目的のｍＲＮＡの予測された長さと比較することによって制御され得る。
【０２５７】
より迅速であるが特異的ではないドットブロット法は、ＲＮＡが前述の分画を伴わないメンブレン上に直接ドットされること以外は、ノーザンブロット技法として行われる。ＲＮＡは、ドットブロットに非特異的に固定される。
【０２５８】
ｍＲＮＡ種の検出に最も特異的な方法は、ＲＮａｓｅ保護アッセイである。簡単にいえば、組織または細胞培養物からの全ＲＮＡは、完全な相同性のタグ化特異的ｃＲＮＡにハイブリダイズされる。特異性は、続くＲＮアーゼ消化によって達成される。ハイブリダイズされていない一本鎖ＲＮＡおよび小さなミスマッチさえも有する非特異的にハイブリダイズしたフラグメントは、認識され、そして切断されるが、完全な相同性の二本鎖ＲＮＡは、酵素へ接近可能ではなく、そして保護される。プロテイナーゼＫ消化およびフェノール抽出によってＲＮａｓｅを除去した後、特異的に保護したフラグメントは、通常は変性ポリアクリルアミドゲル上で、分解産物から分離され得、そして予測されたサイズはＨＰＬＣによってチェックされ得る。上記のすべてのアッセイは、非蛍光スペクトロメトリーまたはポテンシオメトリーによって定量され得る。
【０２５９】
組織内の細胞の特定の集団における所定のｍＲＮＡの正確な位置は、インサイチュハイブリダイゼーションによって決定され得る。この方法は、免疫細胞化学的技法に類似し、そして実際に、例えば、あるタンパク質が、本当に、合成されるかまたは他の供給源から実際に取り上げられるかどうかを発見するために、同じ切片での免疫細胞化学で同時に使用され得る。特定のｍＲＮＡを発現する細胞タイプを同定する可能性は別にして、インサイチュハイブリダイゼーションは、上記の技法を使用する全組織ＲＮＡ調製物の分析よりもさらに感受性であり得る。これは、ｍＲＮＡが組織内の非常に異なる領域または細胞タイプ中で高濃度で発現される場合であり、そしてｍＲＮＡが全組織のホモジナイゼーションによって希釈される場合である。したがって、インサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子発現の分析は、脳のような不均質な組織に特に重要である。インサイチュハイブリダイゼーションのために、組織は、凍結または潅流固定され、そして組織化学プロトコルに従って切断されなければならない。組織切片および使用される標識したプローブについてのハイブリダイゼーションプロトコルは、上記の他のハイブリダイゼーション方法と同様である。半定量的分析が可能である。
【０２６０】
ｃ．ｍＲＮＡの代表的集団としてのｃＤＮＡおよびプローブとしての使用
ほとんどのｍＲＮＡは単一のコピー配列から転写される。ｃＤＮＡの別の特性は、ほとんどの遺伝子の染色体型に存在するイントロンのため、ゲノムのより長い領域を代表することである。代表は１つの遺伝子から別の遺伝子へ変化するが、多くの遺伝子が単一のｃＤＮＡで示されるゲノムＤＮＡにおいて１００ｋｂより多くをカバーするので非常に重要であり得る。分子ハイブリダイゼーションの１つの可能性のある使用は、別の種から作成されるクローンを見いだすための１つの種からのプローブの使用である。マウスおよびヒトのｍＲＮＡ間の配列分岐は、長い配列の特異的交差再結合を可能にし、最も高度に保存された領域を除いては、ＰＣＲプライマーの交差ハイブリダイゼーションを抑制する。
【０２６１】
単一細胞から調製したｃＤＮＡプローブを使用する発生中の神経系のような複雑な生物学的サンプルにおけるディファレンシャルスクリーニングは、ＰＣＲベースおよびｃＲＮＡベースの増幅技法の開発によって現在可能である。いくつかのグループは、１０〜５０細胞から調製された少量のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（１ｎｇまたはそれ以下）からのｃＤＮＡライブラリーの生成を既に報告している（Ｂｅｌｙａｖら，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：２９１９，  １９８９）。ライブラリーは、ｍＲＮＡ複雑性を十分に代表するが、これらのライブラリーの平均ｃＤＮＡインサートサイズはかなり小さかった（＜２ｋｂ）。
【０２６２】
より最近には、方法論が、単一細胞からのＰＣＲベース（Ｌａｍｂｏｌｅｚら，  Ｎｅｕｒｏｎ  ９：２４７，  １９９２）およびｃＲＮＡベース（Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：１６６３，  １９９０）プローブの両方を生成するために組み合わされた。電気的記録の後、単一細胞の細胞質含量を、インサイチュｃＤＮＡ合成および増幅のためにパッチクランプ微小電極で吸引した。ＰＣＲを使用して、単一プルキンエ細胞からの選択的グルタミン酸レセプターｍＲＮＡおよび器官型小脳培養物中の単一のグリアからのＧＦＡＰ  ｍＲＮＡのｃＤＮＡを増幅した（Ｌａｍｂｏｌｅｚら，  Ｎｅｕｒｏｎ  ９：２４７，  １９９２）。ｃＲＮＡ増幅の場合、転写プロモーター配列を、ｃＤＮＡ合成のためのプライマー中で設計し、そして複雑なアンチセンスｃＲＮＡを、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼでのインビトロ転写によって生成した。
【０２６３】
したがって、本発明の１つの実施態様では、タグ化ｃＲＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーをランダムにスクリーニングするための、タグ化プローブとして、または目的のｃＤＮＡフラグメント（レセプター、成長因子、イオンチャネルなど）を含むサザンブロットをスクリーニングするための「発現プロファイリング」実験で利用され得る。ＰＣＲベースのアプローチにしばしば遭遇した増幅の直線性の欠如は、ｃＲＮＡベースの方法で最小にされるようである。
【０２６４】
ｄ．オリゴヌクレオチド−ライゲーションアッセイ
オリゴヌクレオチド−ライゲーションアッセイは、標的配列を含むＰＣＲ産物を検出するためにＥＬＩＳＡベースのアッセイ（ＯＬＡ、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：８９２３，１９９０）を使用するＰＣＲベースのスクリーニングの拡張である。したがって、ゲル電気泳動およびコロニーハイブリダイゼーションの両方が排除される。簡単にいえば、ＯＬＡは、以下の２つの隣接するオリゴヌクレオチドを用いる：「リポーター」プローブ（５’末端タグ化）および５’−リン酸化／３’−ビオチン化「アンカー」プローブ。ＰＣＲプライマーの内部の配列に相補的である２つのオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡにアニールされ、そして完璧な相補性がある場合、２つのプローブはＴ４  ＤＮＡリガーゼによって連結される。固定されたストレプトアビジン上へのビオチン化アンカープローブの捕獲および共有結合したリポータープローブについての分析は、ＰＣＲ産物中の標的配列の存在または非存在について試験する。
【０２６５】
ｅ．ハイブリダイゼーション技法の適用
ｉ．法医学
ＤＮＡ配列変異のレベルでの個体の同定は、フィンガープリント、血液型、または身体学的特徴のような従来の基準より多くの実際的な有利点を提供する。ほとんどの表現型マーカーとは対照的に、ＤＮＡ分析は、実父確定試験が必要とされるような個体間の関連性の推定を可能にする。遺伝子分析は、密接に関連するドナーとレシピエント細胞との間を区別することが必要である場合、骨髄移植に非常に有用であることが証明されている。プローブの２つのタイプは、現在、ＤＮＡブロットによるＤＮＡフィンガープリントへの使用である。多型のミニサテライトＤＮＡプローブは、異なる個体中に可変形態でそれぞれ存在する、複数のＤＮＡ配列を同定し、したがって、複雑でありそして個体間の非常に可変性であるパターンを生じる。ＶＮＴＲプローブは、ゲノム中の単一配列を同定するが、これらの配列は、同定したフラグメントのサイズによって区別されるようなヒト集団中の３０までの異なる形態で存在し得る。近親でない個体が複数のＶＮＴＲまたはミニサテライトプローブについて同一のハイブリダイゼーションパターンを有する確率は、非常に低い。ＤＮＡブロットに必要とされるよりも非常に少ない組織は、１本の毛でさえも、遺伝子マーカーのＰＣＲベースの分析に十分なＤＮＡを提供する。また、小さなＤＮＡフラグメントのみが必要とされるので、部分的に分解した組織は、分析に使用され得る。法医学ＤＮＡ分析は、ＯＬＡのような単純な自動化可能なアッセイによって研究され得る多型ＤＮＡ配列で、最終的に行われ得る。例えば、２２の別々の遺伝子配列の分析は、集団中に２つのことなる形態でそれぞれ存在し、１０１０の異なる結果を生じ得、ヒト個体の独特（ｕｎｉｑｕｅ）の同定を可能にする。
【０２６６】
ｉｉ．腫瘍診断
ウイルスまたは細胞性ガン遺伝子の検出は、核酸診断の適用の別の重要な分野である。ウイルスガン遺伝子（ｖ−ガン遺伝子）は、レトロウイルスによって伝染されるが、その細胞性相対物（ｃ−ガン遺伝子）は既に正常細胞に存在する。しかし、細胞性ガン遺伝子は、点変異（膀胱ガンにおけるおよび結腸直腸腫瘍におけるｃ−Ｋ−ｒａｓガン遺伝子でのように）、プロモーター誘導、遺伝子増幅（神経芽腫の場合のＮ−ｍｙｃガン遺伝子でのように）、または染色体の再配置（慢性骨髄性白血病の場合の第９染色体から第２２染色体のｃ−ａｂｌガン遺伝子の転位でのように）のような特異的改変によって活性化され得る。活性化プロセスのそれぞれは、さらなる変性プロセスとともに、増やされ、そして制御されない細胞増殖を導く。（網膜芽腫（Ｒｂ）遺伝子および骨肉芽腫でのように）腫瘍の形成のために不活性化されなければならない、いわゆる「劣性ガン遺伝子」はまた、ＤＮＡプローブの助けで検出され得る。免疫グロブリン遺伝子に対するおよびＴ細胞レセプター遺伝子に対するプローブを使用して、Ｂ細胞リンパ腫およびリンパ芽球白血病の検出が可能である。
【０２６７】
ｉｉｉ．移植分析
移植した組織の拒絶反応は、組織適合性抗原（ＨＬＡ）の特異的クラスによって決定的に制御される。これらは、抗原提示血液細胞（例えば、マクロファージ）の表面で発現される。ＨＬＡと外来抗原との間の複合体は、細胞表面上の対応するＴ細胞レセプターを介するＴヘルパー細胞によって認識される。ＨＬＡ抗原とＴ細胞レセプターとの間の相互作用は、身体におけるカスケード様免疫応答を導く複合防御反応を引き起こす。
【０２６８】
異なる外来抗原の認識は、抗体反応に類似するＴ細胞レセプターの可変性抗原特異的領域によって媒介される。したがって、移植拒絶において、外来抗原に適合する特異的Ｔ細胞レセプターを発現するＴ細胞は、Ｔ細胞プールから除去され得る。このような分析は、ＰＣＲによって増幅される抗原特異的可変性ＤＮＡ配列の同定によって可能であり、そしてそのため選択的に増加される。特異的増幅反応は、特異的Ｔ細胞レセプターの単一細胞特異的同定を可能にする。
【０２６９】
同様の分析は、若年性糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、または脳脊髄炎のような自己免疫疾患の同定について現在行われている。
【０２７０】
ｉｖ．ゲノム診断
すべての新生児の４パーセントは、遺伝子欠損を持って生まれる；記載される、単一の遺伝子のみの改変によって引き起こされる３，５００の遺伝病のうち、一次的分子欠損はそれらの約４００について知られるのみである。
【０２７１】
遺伝病は、ずっと前に、表現型分析（既往症、例えば、血液の欠乏：サラセミア）、染色体分析（核型、例えば、蒙古症：トリソミー２１）、または遺伝子産物分析（改変されたタンパク質、例えば、フェニルケトン尿症：フェニルピルビン酸の増強されたレベルを生じるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素の欠乏）によって診断されている。核酸検出方法のさらなる使用は、ゲノム診断の範囲をかなり増大させる。
【０２７２】
ある遺伝病の場合、２つの対立遺伝子の１つのみの改変は、病気に対して十分である（優勢遺伝した単一遺伝子欠損）；多くの場合、両方の対立遺伝子は、改変されなければならない（劣性遺伝した単一遺伝子欠損）。遺伝子欠損の第３のタイプでは、病気の発生は、遺伝子改変によってだけでなく、食習慣（糖尿病または動脈硬化症の場合）または生活スタイル（ガンの場合）のような因子によって決定される。非常に頻繁には、これらの病気は、高齢で発生する。精神分裂症、躁鬱病、またはてんかんのような病気はまた、この状況で述べられるべきである；これらの場合における病気の発生が、環境因子ならびに異なる染色体の位置におけるいくつかの遺伝子の改変に依存する場合、これは研究中である。
【０２７３】
直接的および間接的ＤＮＡ分析を使用して、一連の遺伝病の診断が可能になる：鎌状赤血球貧血、サラセミア、ａｌ−アンチトリプシン欠乏、レッシュ−ナイハン症候群、嚢胞性線維症／膵臓線維症、デュシェーヌ／ベッカー筋肉ジストロフィー、アルツハイマー病、Ｘ−染色体依存性精神薄弱症、ハンチントン舞踏病。
【０２７４】
ｖ．感染症
感染症の診断についての組換えＤＮＡ法の適用は、現在の方法がわずらわしくそして結果が遅い場合に、ウイルス感染のために最も広く探求されている。組織または培養された細胞のインサイチュハイブリダイゼーションは、急性および慢性ヘルペス感染の診断を可能にした。新鮮なおよびホルマリン固定した組織は、侵入性頚ガンにおけるパピローマウイルスの検出におよびＨＩＶの検出に適切であることが報告されているが、培養された細胞は、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン・バーウイルスの検出に使用されている。組換えＤＮＡ法の細菌疾患の診断への適用は、費用有効性、速度、および正確さの必要性が適合され得る場合、現在の細菌増殖法を置き換える可能性を有する。組換えＤＮＡ手順が適用され始めた臨床的状況には、トランスポゾンの存在、偏好性増殖クラミジア、食物中の微生物；および集団による感染の広がりをフォローすることの単純な手段によるペニシリン耐性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ淋病の同定が含まれる。リーシュマニアおよびプラスモジウムのような寄生虫を含む病気の世界的な疫病学的チャレンジは、既に組換え方法によって適合されている。
【０２７５】
２．タンパク質ベースのアッセイ
ａ．イントロダクション
上記のように、広範な種々のタンパク質ベースのアッセイは、本明細書に記載のタグによって増強されるようであり得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  ＬＡｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬＡｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８を参照のこと）。代表的な例は、向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイのような抗原−抗体アッセイ、同時イムノアッセイ、ならびに免疫濾過アッセイを含む。しかし、広範な種々の他のアッセイは、増強されるようであり得、これは、例えば、リガンド−レセプターアッセイなどを含む。
【０２７６】
ｂ．イムノアッセイ
インスリンおよびチロキシンのＲＩＡの開発以来、放射性同位元素標識した抗原を含む方法は、ホルモンおよび薬物のようなハプテン分子の測定に広く適用されている。この方法は、標識された抗原と限定された量の抗体で標識されていない抗原との間の競合に基づく。これらの方法はまた、アッセイで使用される限定された量の抗体のため、「限定された試薬」方法と記載され得る。
【０２７７】
標識された抗体は、１９４１年以来免疫蛍光法で使用されているが、それらは、ＩＲＭＡで放射性同位元素標識した抗体の導入まで定量的方法でより広く適用されなかった。ＩＲＭＡ、ならびに他の固相ベースの二重抗体または「サンドイッチ」アッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＩＦＭＡ、免疫蛍光染色アッセイ）は、抗原よりも過剰の抗体によって特徴づけられる；したがって、これらは、「過剰試薬」方法と呼ばれ得る。原則として、過剰の試薬を使用することは、インキュベーション時間を短縮し、そして感度を潜在的に増加させる。固相は、分離を容易にし、そしてシグナルは競合アッセイにおける侵入関係に対立するものとして、抗原の量に直接的に比例する。
【０２７８】
アビジン−ビオチン技法の使用は、生化学、分子生物学、および医学の多くの領域でますます重要になり、これには、非放射活性イムノアッセイ、細胞化学染色、細胞分離、および核酸の単離によるタンパク質の検出、ならびにハイブリダイゼーションによる特異的ＤＮＡ／ＲＮＡ配列の検出が含まれる。この技法は、アビジン−ビオチン相互作用（会合定数１０１５Ｍ−１）の非常に高い親和性、および抗体、核酸、および脂質のような広範な標的生体分子をビオチン化する能力からの有用性を誘導する。標的分子の単離における最初の工程は、そのビオチン化、あるいは最終的に標的分子（例えば、抗体あるいは標的複合体を形成するハイブリダイゼーションプローブ）に結合する生体分子のビオチン化である。次いで、ビオチン化した分子または標的複合体は、アビジン−ビオチン相互作用に基づく親和性媒体を使用することによって、不均一な混合物中の他の分子から分離される。
【０２７９】
したがって、本発明の１つの実施態様では、標準的イムノアッセイのいくつかは、代表的な同位元素標識された試薬よりもむしろ、利用されるタグ化試薬を完成し得る。このような方法は、非常に増加した感度、ならびに多くのサンプルを同時に分析する能力を生じる。
【０２８０】
３．遺伝子発現分析
本明細書に開示した発明の１つは、単一の測定で多くの遺伝子（１〜２０００）の発現を測定するための高処理量法である。この方法はまた、１プロセス当たり１００サンプルよりも多くで並行して行う能力を有する。この方法は、薬物スクリーニング、発生生物学、分子医学研究などに適用可能である。したがって、本発明の１つの局面のなかでは、選択された生物学的サンプルから遺伝子発現のパターンを分析するための方法が提供され、この方法は、（ａ）生物学的サンプルから核酸を曝露する工程、（ｂ）上記プローブが上記核酸にハイブリダイズするために十分な条件下および時間で、曝露した核酸を１つ以上の選択したタグ化核酸プローブと組み合わせる工程であって、ここで、上記タグが、特定の核酸プローブと相関しそして非蛍光分光分析または電位差測定によって検出可能である工程、（ｃ）ハイブリダイズしたプローブをハイブリダイズしていないプローブから分離する工程、（ｄ）タグ化フラグメントからタグを切断する工程、および（ｅ）非蛍光分光分析または電位差測定によってタグを検出し、それから生物学的サンプル中の遺伝子発現のパターンを決定する工程を包含する。
【０２８１】
本発明の特に好ましい実施態様では、以下に記載のアッセイまたは方法が提供される：標的供給源からのＲＮＡを、特異的ハイブリダイゼーション工程（すなわち、繋がれたオリゴ（ｄＴ）捕獲プローブによるポリ（Ａ）ｍＲＮＡの捕獲）によって固体支持体に結合する。次いで、固体支持体を洗浄し、そしてｃＤＮＡを標準的方法（すなわち、逆転写酵素）を使用して固体支持体上で合成する。次いで、ＲＮＡ鎖を加水分解によって取り出す。その結果は、ｃＤＮＡが合成されたＲＮＡの多様性、豊富さ、および複雑性を反映する固体支持体に共有結合で固定されるＤＮＡ集団の生成である。次いで、固体支持体を、目的の遺伝子配列に相補的である１〜数千プローブと尋問（ハイブリダイズ）した。各プローブタイプを、切断可能なマススペクトル分析タグまたは他のタイプの切断可能なタグで標識する。尋問工程の後、過剰またはハイブリダイズしていないプローブを洗浄し、固体支持体を（例えば）マイクロタイタープレートのウェル中に入れ、そしてマススペクトル分析タグを、固体支持体から切断する。固体支持体を、サンプル容器のウェルから取り出し、そしてウェルの内容物をマススペクトル分析計で測定する。特定のマススペクトル分析計タグの出現は、サンプル中のＲＮＡの存在を示し、そして特異的遺伝子が所定の生物学的サンプルで発現されることを証明する。この方法はまた、定量可能であり得る。
【０２８２】
切断可能なタグを使用する遺伝子発現の迅速な測定のための組成物および方法は、以下に詳細に記載され得る。簡単にいえば、組織（肝臓、筋肉など）、初代または形質転換した細胞株、単離または精製した細胞型、あるいは遺伝子発現を決定することが有用である生物学的物質の任意の他の供給源は、ＲＮＡの供給源として使用され得る。好ましい方法では、生物学的供給源物質を、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼを抑制しそして固体支持体への標的核酸のストリンジェントなハイブリダイゼーション支持するために、カオトロープの存在で溶解する。組織、細胞、および生物学的供給源を、１〜６モル濃度カオトロピック塩（グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアネート、過塩素酸ナトリウムなど）中で効果的に溶解し得る。供給源生物学的サンプルが溶解された後、溶液を、固体支持体と混合して、溶解物中に存在する標的核酸の捕獲をもたらす。この方法の１つの変換では、ＲＮＡを、繋がれたオリゴ（ｄＴ）捕獲プローブを使用して捕獲する。固体支持体は、ナイロンビーズ、ポリスチレンマイクロビーズ、ガラスビーズ、およびガラス表面、またはオリゴヌクレオチドが共有結合で付着され得る固体支持体の任意の他のタイプを含み得る。固体支持体を、ポリエチレン（イミン）、アクリルアミド、アミン−デンドリマーなどのようなアミン−ポリマーで優先的にコートする。ポリマー上のアミンを、オリゴヌクレオチドを共有結合で固定するために使用する。オリゴヌクレオチドを、５’−アミン（一般的には、６炭素スペーサー−アームおよび遠位アミンを含むヘキシルアミン）で優先的に合成する。オリゴヌクレオチドは、１５〜５０ヌクレオチドの長さであり得る。オリゴヌクレオチドを、塩化シナヌルのようなホモ−二官能性またはヘテロ−二官能性架橋化試薬で活性化する。活性化したオリゴヌクレオチドを、排除クロマトグラフィーによって、過剰の架橋化試薬（すなわち、塩化シアヌル）から精製する。次いで、活性化したオリゴヌクレオチドは、固体支持体と混合して共有付着をもたらす。オリゴヌクレオチドの共有結合性の付着の後、固体支持体の未反応アミンを、固体支持体の正電荷を排除するためにキャップする（すなわち、無水コハク酸で）。
【０２８３】
固体支持体を、並行して使用し得、そして９６−ウェルまたは３８４ウェル形式で優先的に配置する。固体支持体を、９６−ウェルまたは３８４−ウェル配置のペグ、軸、またはロッドに付着し得、固体支持体は、分離可能であるかあるいは特定の配置に必須であるかのいずれかである。固体支持体の特定の配置は、アッセイの機能性に決定的重要性はなかったが、むしろ自動化に適合するためのアッセイの能力に影響を与える。
【０２８４】
固体支持体を、１５分〜数時間溶解物と混合し、固体支持体上への標的核酸の捕獲をもたらす。一般的に、標的核酸の「捕獲」は、標的ＲＮＡおよび固体支持体に固定された捕獲プローブの相補的塩基対合を介す。１つの変換は、固体支持体上の繋がれたオリゴ（ｄＴ）へハイブリダイズするために、ほとんどの真核生物メッセンジャーＲＮＡで見出される３’ポリ（Ａ）ストレッチを利用する。別の変換は、所定の配列を含むＲＮＡを捕獲するために、特異的のオリゴヌクレオチドまたは長いプローブ（５０塩基より大きい）を利用することである。別の可能性は、標的ＲＮＡ集団中の多くの関連する配列の捕獲をもたらす縮重プライマー（オリゴヌクレオチド）を用いることである。ハイブリダイゼーション時間は、ＲＮＡ集団の配列複雑性および用いられる捕獲プローブのタイプによって左右される。ハイブリダイゼーション温度は、用いられるカオトロープのタイプおよびカオトロープの最終濃度によって指示される（一般的指針についてはＶａｎ  ＮｅｓｓおよびＣｈｅｎ，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．を参照のこと）。溶解物は、優先的には、標的ＲＮＡの拡散をもたらすために、固体支持体と継続的に撹拌される。一旦、標的拡散を捕獲する工程が完了すると、溶解物を固体支持体から洗浄し、そしてすべてのカオトロープまたはハイブリダイゼーション溶液を除去する。固体支持体を、イオン性または非イオン性界面活性剤、緩衝剤、および塩を含む溶液で優先的に洗浄する。次の工程は、捕獲したＲＮＡに相補的なＤＮＡの合成である。この工程では、繋がれた捕獲オリゴヌクレオチドを、逆転写酵素のための伸長プライマーとして用いる。反応を、一般的には、２５〜３７℃で行い、そして好ましくは、重合反応の間撹拌する。ｃＤＮＡが合成された後、捕獲オリゴヌクレオチドが伸長プライマーとして用いられるので、ｃＤＮＡは固体支持体に共有結合性に付着される。次いで、ＲＮＡを、ｃＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖から加水分解する。この工程は、二本鎖を変性する熱の使用またはＲＮＡを化学的に加水分解するための塩基（すなわち、０．１Ｎ  ＮａＯＨ）の使用によって行われ得る。この工程での重要な結果は、ｃＤＮＡを所定のプローブとのその後のハイブリダイゼーションに利用可能にすることである。次いで、固体支持体または固体支持体のセットを、さらに洗浄して、ＲＮＡまたはＲＮＡフラグメントを取り出す。この時点で、固体支持体は、配列の豊富さ、複雑性、および多様性によってＲＮＡ集団を示すｃＤＮＡ分子のおおよその代表的集団を含む。
【０２８５】
次の工程は、存在または非存在および比較的豊富な特異的ｃＤＮＡ配列を同定するために、選択されたプローブを固体支持体にハイブリダイズすることである。プローブは、優先的には、１５〜５０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドである。プローブの配列は、アッセイの末端使用者によって記載される。例えば、末端使用者が組織における炎症性応答での遺伝子発現を研究することを意図する場合、プローブは、多くのサイトカインｍＲＮＡ、脂質を調節する酵素をコードするＲＮＡ、炎症性応答に関与する細胞を調節する因子をコードするＲＮＡなどに相補的であるように選択される。一旦、１セットの所定の配列が研究のために規定されると、各配列をオリゴヌクレオチドプローブ中に作成し、そして各プローブを特異的な切断可能なタグに割り当てる。次いで、タグを、それぞれのオリゴヌクレオチドに付着する。次いで、オリゴヌクレオチドを、適切なハイブリダイゼーション条件下で固体支持体上のｃＤＮＡにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション工程の完了後、固体支持体を洗浄してあらゆるハイブリダイズしていないプローブを除去する。次いで、固体支持体または支持体の整列を、マススペクトル分析器タグの切断をもたらす溶液中に配置する。次いで、マススペクトル分析器タグを、マススペクトル分析器による測定にかけ、各タグが存在する質量を同定し、そして発現したｍＲＮＡの存在（および豊富さ）または非存在を決定する。
【０２８６】
４．微生物、特異的遺伝子発現、または核酸中の特異的配列の検出
ＤＮＡプローブの切断可能なタグとの使用は、任意のタイプのサンプルまたは標本中の微生物の存在または非存在を検出するために使用され得る。代表的には、サンプルを、イオン性界面活性剤またはカオトロープを使用する溶解工程にかけ、次いで、核酸を固体支持体上に特異的にまたは非特異的に固定し、そして次にタグ化ＤＮＡプローブで精査する。洗浄工程でハイブリダイズされていないプローブを除去し、タグをそれぞれのプローブから切断し、そして次いで測定する。
【０２８７】
検出可能な核酸は、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。標的核酸の検出をもたらすために、本明細書に記載のアッセイが均一ではないので、標的はいくつかのタイプの固定を必要とする。非特異的または特異的の、２つのタイプの固定が可能である。前者の場合、核酸を、核酸に対していくらかの親和性を有する固体支持体または基質に固定する。核酸を、精製し得るかまたは非特異的固定の前に精製し得る。固体支持体は、ナイロンメンブレン、ニトロセルロースから構成されるメンブレンなどを含み得る。次いで、固体支持体を、予め決定した配列のタグ化オリゴヌクレオチドでプローブして目的の標的核酸を同定する。洗浄工程でハイブリダイズしていないプローブを除去し、タグをそれぞれのプローブから切断し、次いで測定する。
【０２８８】
ある遺伝子またはＤＮＡ配列の存在に関する集団の分析についてより高い特異性を生じる別の方法は、サザンブロット技法を利用する。調整したＤＮＡを、制限酵素（ＲＥ）で切断し、ゲノム上の制限酵素の特異的認識部位の存在によって決定される種々の長さの多数のＤＮＡフラグメントを得る。この制限部位の内側の変異を有するある遺伝子の対立遺伝子を、種々の数および長さのフラグメントに切断する。得られる制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）は、フラグメントが特異的に同定され得る場合、微生物の重要な診断であり得る。
【０２８９】
分析されるべきフラグメントを、ＤＮＡフラグメントのプールから分離し、そして特異的プローブを使用して他のＤＮＡ種と区別すべきである。従って、ＤＮＡを、いくつかのタイプのゲルまたはクロマトグラフィーを使用して電気泳動分画にかけ、続いてナイロンまたはニトロセルロースメンブレンにトランスファーして、そして固定する。固定した一本鎖ＤＮＡを、検出されるべきＤＮＡに相補的な、タグ化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。非特異的ハイブリダイゼーションを除去した後、目的のＤＮＡフラグメントを、ハイブリダイズしたプローブからタグを切断することによって同定する。本明細書に記載の技法で、１００を越えるプローブが同時に使用され得る。
【０２９０】
特異的遺伝子転写物の存在および定量を、ノーザンブロット分析およびＲＮａｓｅ保護アッセイによって分析し得る。これらの方法の原理基礎は、特異的タグ化プローブまたは特異的タグ化プローブのセットへの全細胞性ＲＮＡのプールのハイブリダイゼーションである。ノーザンブロット技法では、組織の全ＲＮＡを、アガロースゲルを使用して電気泳動で分画し、固体支持体（ナイロン、ニトロセルロースなど）にトランスファーし、そして固定する。ＲＮＡを、検出されるべきＲＮＡに相補的な、タグ化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。非特異的ハイブリダイゼーションを除去した後、目的のＲＮＡフラグメントを、ハイブリダイズしたプローブからタグを切断することによって同定する。ストリンジェントな洗浄条件を適用することによって、特異的に結合した分子と比較してより弱いハイブリダイゼーションのため、非特異的に結合した分子を排除する。ドットブロット法は、より迅速であるが特異的ではなく、これは、ＲＮＡが先の分画なしでメンブレン上に直接ドットすること以外は、ノーザンブロット技法のように行われる。
【０２９１】
ｍＲＮＡ種の検出のための特異的方法は、ＲＮａｓｅ保護アッセイである。組織または細胞培養物からの全ＲＮＡを、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドタグ化プローブにハイブリダイズする。特異性を、続くＲＮａｓｅ切断によって達成される。ハイブリダイズしていない一本鎖ＲＮＡおよび小さなミスマッチさえ有する非特異的にハイブリダイズしたフラグメントは、認識され、そして切断されるが、二本鎖ＲＮＡまたは完全な相同性のＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は、酵素に接近可能ではなく、そして保護される。特異的に保護されたフラグメントを分解産物から分離し、タグをそれぞれのプローブから切断し得、そしてその後測定し得る。
【０２９２】
組織内の細胞の特異的集団における所定のｍＲＮＡ（または任意の核酸配列）の正確な位置は、インサイチュハイブリダイゼーションによって決定され得る。インサイチュハイブリダイゼーションは、上記の技法を使用する全組織ＲＮＡ調製物の分析よりもさらに敏感であり得る。これは、ｍＲＮＡが、組織内の非常に分離した領域または細胞タイプにおいて高濃度で発現され、そして全組織のホモジナイズによって希釈される場合である。インサイチュハイブリダイゼーションについては、組織は、組織化学プロトコルに従って、凍結または潅流固定し、そして切片にしなければならない。組織切片および使用される標識したプローブについてのハイブリダイゼーションプロトコルは、上記の他のハイブリダイゼーション方法と同様である。定量分析が可能である。
【０２９３】
５．変異検出技法
疾患の検出は、予防および処置においてますます重要である。多因子病は、遺伝子試験を考案することが困難であるが、２００より多い公知のヒトの病気は、単一の遺伝子中の欠損、しばしば単一のアミノ酸残基の変化によって引き起こされる（Ｏｌｓｅｎ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ａｇｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６）。これらの変異の多くは、病状を引き起こす改変したアミノ酸を生じる。
【０２９４】
敏感な変異検出技法は、変異スクリーニングのために並外れた可能性を提供する。例えば、分析は、受精卵の着床前に行われ得る（ＨｏｌｄｉｎｇおよびＭｏｎｋ，  Ｌａｎｃｅｔ  ３：５３２，  １９８９）。ますます効率的な遺伝子テストはまた、健康診断と関連して気道または膀胱から剥脱した細胞中のガン遺伝子変異についてのスクリーニングを可能にし得る（Ｓｉｄｒａｎｓｋｙら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：７０６，１９９１）。また、未知の遺伝子が遺伝病を引き起こす場合、ＤＮＡ配列改変体をモニターする方法は、遺伝子連鎖分析によって疾患の遺伝を研究するために有用である。しかし、個々の遺伝子中の変異を検出および診断することは、技術的および経済的課題を提出する。いくつかの異なるアプローチが追求されているが、本当に広いスケールの適用に十分な有効かつ安価の両方であるものはない。
【０２９５】
単一ヌクレオチドを含む変異は、物理的、化学的、または酵素的手段によってサンプル中で同定され得る。一般的に、変異検出のための方法は、以前に未知の変異を同定するために適切であるスキャンニング技法、および公知の配列改変体を検出、区別、または定量するために設計された技法に分けられ得る。
【０２９６】
変異検出のためのいくつかのスキャンニング技法が、野生型および変異配列に由来する、特に変性した場合、異常な行動を示す、ミスマッチした相補ＤＮＡ鎖のヘテロ二重鎖で開発されている。この現象は、変性および温度グラジエントゲル電気泳動（それぞれＤＧＧＥおよびＴＧＧＥ）方法で利用される。さらに変性するグラジエントゲルで電気泳動した場合、単一ヌクレオチド位置のみでミスマッチした二重鎖は、部分的に変性し得、遅れた移動を生じる（Ｍｙｅｒｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５，  １９８５；Ａｂｒａｍｓら，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７：４６３，  １９９０；Ｈｅｎｃｏら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：６７３３，１９９０）。変異が検出され得るが、変異の正確な位置に関する情報は得られない。変異体形態は、さらに単離されて、ＤＮＡ配列分析にかけられなければならない。
【０２９７】
あるいは、ＲＮＡプローブおよび標的鎖のヘテロ二重鎖は、２つの鎖が適切に対にならない位置にＲＮａｓｅ  Ａによって切断され得る。次いで、切断部位は、変性したプローブの電気泳動によって決定され得る。しかし、いくつかの変異は、すべてのミスマッチが効果的にＲＮａｓｅ  Ａによって切断されるわけではないので、検出をのがれ得る。
【０２９８】
二重鎖のミスマッチ塩基もまた、化学的改変を受けやすい。このような改変は、鎖がミスマッチの部位で切断を受けやすくなり得るか、またはポリメラーゼをその後の伸長反応で停止させ得る。化学的切断技法は、２ｋｂまでの標的配列での変異の同定を可能にし、そしてミスマッチしたヌクレオチドのおおよその位置についての情報を提供する（Ｃｏｔｔｏｎら，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：４３９７，  １９８８；Ｇａｎｇｕｌｙら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：３９３３，  １９９１）。しかし、この技法は、重労働であり、そして変異の正確な位置を同定し得ない。
【０２９９】
ＤＮＡ鎖における変異を検出するための代替の戦略は、正常なヌクレオチドの１つを改変したヌクレオチドと（合成の間に）置換し、産物の分子量または他の物理的パラメータを変更することによる。野生型配列に対してこの改変したヌクレオチドの増加または減少した数を有する鎖は、変更した電気泳動移動度を示す（Ｎａｙｌｏｒら，  Ｌａｎｃｅｔ  ３３７：６３５，  １９９１）。この技法は、変異の存在を検出するが、位置を提供しない。
【０３００】
２つの他の戦略は、変更したゲル移動によってＤＮＡセグメントにおける変異を可視化する。一本鎖コンフォメーション多型技法（ＳＳＣＰ）では、変異は変性した鎖を異なる二次構造にし、それによって天然のゲル電気泳動の間の移動性に影響を及ぼす。内部ミスマッチを含むヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子はまた、電気泳動によって正しくマッチした分子から分離され得る（Ｏｒｉｔａ，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５：８７４，  １９８９；Ｋｅｅｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：５，  １９９１）。上記の技法でのように、変異の存在は決定され得るが、位置は決定され得ない。同様に、これらの技法の多くは、単一と複数の変異との間を区別しない。
【０３０１】
上記の技法のすべては、ＤＮＡの限定されたセグメントにおける変異の存在を示し、そしてそれらのいくつかは、セグメント内のおおよその局在を可能にする。しかし、配列分析は、セグメントのコード可能性における変異の効果を解明するためになお必要とされる。配列分析は非常に強力であり、例えば、罹患した家族の他の個体における同じ変異についてスクリーニングすること、悪性疾患の場合に病気の進行をモニターすること、または自己移植の前に骨髄における残りの悪性細胞を検出することを可能にする。これらの有利点にもかかわらず、含まれる高い費用のため、手順は、ルーチンの診断方法として採用されないようである。
【０３０２】
多数の他の技法が、公知の配列改変体を分析するために開発されている。自動化および節約は、個体および一般集団をスクリーニングするために適用され得る分析のこれらのタイプについて、非常に重要な考察である。以下に記載の技法はどれも、節約、自動化を必要とされる特異性と組み合わせる。
【０３０３】
変異は、短いオリゴヌクレオチドプローブの標的配列へのハイブリダイゼーションにおける脱安定化効果を介して同定され得る（Ｗｅｔｍｕｒ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２６：２２７，  １９９１を参照のこと）。一般的に、この技法の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、標的配列の増幅および短いオリゴヌクレオチドプローブとのその後のハイブリダイゼーションを含む。したがって、増幅した産物は、固定したオリゴヌクレオチオプローブの整列へのハイブリダイゼーションパターンを決定することによって、多くの可能な配列改変体についてスキャンされ得る。
【０３０４】
しかし、ヌクレオチド配列の差異についての多くの他の戦略を区別する条件を確立することは、すべて、配列の差を同定するための酵素に依存する（Ｓａｉｋｉ，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：６２３０，  １９８９；Ｚｈａｎｇ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：３９２９，  １９９１）。
【０３０５】
例えば、制限酵素は、約４〜８ヌクレオチドの配列を認識する。平均Ｇ＋Ｃ含量に基づいて、ＤＮＡセグメントにおけるヌクレオチド位置の約半分が、１００制限酵素のパネルでモニターされ得る。代わりとして、人工的制限酵素認識配列は、部分的にミスマッチしたＰＣＲプライマーを使用することによって、可変位置のまわりに生成され得る。この技法で、変異体または野生型配列のみのいずれかは、増幅後の制限酵素によって認識されそして切断され得る（Ｃｈｅｎら，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９５：５１，  １９９１；Ｌｅｖｉら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５１：３４９７，  １９９１）。
【０３０６】
別の方法は、３’から２番目の位置で標的配列にミスマッチしたオリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＣＲにおいてプライマーとして用いるための減少した能力を示すという特性を利用する。しかし、いくつかの３’ミスマッチ、明確にはＧ−Ｔは、有用性を制限する他のものよりも阻害しない。この技法を改良するための試みにおいて、さらなるミスマッチが、３’末端から３番目の位置でプライマーに導入される。これは、１つの対立遺伝子改変体とハイブリダイズするプライマーの３つの３’ヌクレオチドにおける２つのミスマッチした位置、および、プライマーが他の対立遺伝子改変体にハイブリダイズする場合に３’末端から３番目の位置での１つのミスマッチを生じる（Ｎｅｗｔｏｎら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：２５０３，１９８９）。１ｂｐミスマッチの増幅を有意に好都合にする増幅条件を定義することが必要である。
【０３０７】
ＤＮＡポリメラーゼはまた、ヌクレオチドが、標的鎖の可変位置のすぐ上流のオリゴヌクレオチドプライマーに添加されることを決定することによって、対立遺伝子配列改変体を区別するために使用されている。
【０３０８】
ライゲーションアッセイが開発されている。この方法では、標的鎖上で直接並列してハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプローブが、ＤＮＡリガーゼによって連結される。２つのオリゴヌクレオチドプローブが隣接するミスマッチがある場合、ライゲーションは阻害される。
【０３０９】
ａ．変異検出のためのアッセイ
変異は、ゲノムＤＮＡ中の単一塩基対の変化である。本発明の状況内では、ほとんどのこのような変化は、問題の配列に相補的であるオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって容易に検出される。本明細書に記載のシステムでは、２つのオリゴヌクレオチドが、変異を検出するために用いられる。一方のオリゴヌクレオチドは野生型配列を有し、そして他方のオリゴヌクレオチドは変異配列を有する。２つのオリゴヌクレオチドが野生型標的ゲノム配列におけるプローブとして使用される場合、野生型オリゴヌクレオチドは、完全に塩基対構造（ｂａｓｅｄ  ｐａｉｒｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成し、そして変異オリゴヌクレオチド配列は単一塩基対ミスマッチを有する二重鎖を形成する。
【０３１０】
上記のように、野生型対ミスマッチした二重鎖のＴｍにおける６〜７℃の差は、２つのタイプの二本鎖の容易な同定または区別を可能にする。この区別をもたらすために、ハイブリダイゼーションを、それぞれのｈｙｂｏｔｒｏｐｅ溶液中でのミスマッチした二本鎖のＴｍで行う。次いで、ハイブリダイゼーションの範囲を、オリゴヌクレオチドプローブのセットについて測定する。野生型プローブのミスマッチしたプローブへのハイブリダイゼーションの範囲の比を測定する場合、１０／１から２０／１より大きい値を得る。これらのタイプの結果は、変異検出についての強力なアッセイの開発を可能にする。
【０３１１】
例示の目的のために、変異検出についての１つのアッセイ形式は、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）および目的の領域にわたるオリゴヌクレオチドプローブを利用する。オリゴヌクレオチドプローブは、２４ｎｔの長さよりも大きいかまたは等しく（最大で約３６ｎｔ）、そしてオリゴヌクレオチドプローブの３’または５’末端で蛍光色素で標識される。標的核酸を、それぞれのハイブリダイゼーション溶液中で組織培養物、細胞、組織、器官などの溶解によって得る。次いで、溶解した溶液を、標的核酸を変性する温度（標的核酸二本鎖のＴｍよりも１５〜２５℃高い）まで加熱する。オリゴヌクレオチドプローブを変性温度で添加し、そしてハイブリダイゼーションを、０．５〜２４時間ミスマッチした二重鎖のＴｍで行う。次いで、ゲノムＤＮＡを、ＧＦ／Ｃ（ＧＦ／Ｂなど）ガラス繊維フィルターを通すことによって集める。次いで、フィルターを、それぞれのハイブリダイゼーション溶液で洗浄し、あらゆるハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドプローブを除去する（ＲＮＡ、短いオリゴ、および核酸は、これらの条件下でガラス繊維フィルターに結合しない）。次いで、ハイブリダイゼーションオリゴプローブは、標的ＤＮＡから温度によって溶出され、そして（例えば、蛍光によって）測定され得る。非常に高レベルの感度を必要とするアッセイについては、プローブを濃縮しそして測定する。
【０３１２】
他の非常に敏感なハイブリダイゼーションプロトコルが使用され得る。本発明の方法は、細胞、サンプルなどに存在することが疑われる変異を含む核酸、すなわち、標的核酸について容易にアッセイする方法を可能にする。「標的核酸」は、その存在が目的でありそしてその存在または非存在がハイブリダイゼーションアッセイで検出されるべきである、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のヌクレオチド配列を含む。本発明のハイブリダイゼーション方法はまた、核酸の複合生物学的混合物（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）に適用され得る。このような複合生物学的混合物は、プロトプラストを含む広範な真核生物および原核生物細胞、および／またはポリヌクレオチド核酸を有する他の生物学的物質を含む。したがって、この方法は、組織培養細胞、動物細胞、動物組織、血液細胞（例えば、網状赤血球、リンパ球）、植物細胞、細菌、酵母、ウイルス、マイコプラズマ、原生動物、菌類などに滴用可能である。公知の供給源の核酸プローブ間の特異的ハイブリダイゼーションを検出することによって、標的核酸の特異的存在が確立され得る。
【０３１３】
核酸の複合集団中の標的核酸を検出するための代表的なハイブリダイゼーションアッセイプロトコルを、以下に記載する：標的核酸を、ゲルマトリクスでサイズによって分離し（電気泳動）、クローニングし、そして単離し、プールに小分けし、または複合集団として放置する。標的核酸を、トランスファーし、スポットし、ナイロンメンブレンまたはニトロセルロースメンブレンのような固体支持体上に固定する。（この「固定」はまた、「整列」といわれる）。次いで、固定した核酸を、加熱工程またはＵＶ照射にかけ、これは核酸を不可逆的に固定する。次いで、メンブレンを「ブロッキング剤」ですすぎ、これには、Ｄｅｎｄｈａｒｔ’ｓ試薬（Ｄｅｎｄｈａｒｔ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ２３：６４１，  １９６６）、ヘパリン（ＳｉｎｇｈおよびＪｏｎｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：５６２７，  １９８４）、および無脂肪ドライミルク（Ｊｏｎｅｓら，  Ｇｅｎｅ  Ａｎａｌ．  Ｔｅｃｈ．  １：３，  １９８４）含まれる。ブロッキング剤は、一般的に、ニトロセルロースが使用される場合、プレハイブリダイゼーション工程およびハイブリダイゼーション工程の両方に含まれる。次いで、標的核酸を、ｈｙｂｏｔｒｏｐｅベースの溶液中にて上記の条件下で、タグ化オリゴヌクレオチドプローブで探査する。次いで、結合していない酵素を洗い流し、そしてメンブレンを基質溶液ですすぐ。次いで、シグナルを、本質的には以下に記載のようにＭＡＬＤ１−ＭＳによって検出する。
【０３１４】
ｂ．ハイブリダイゼーションによる配列決定
ＤＮＡ配列分析を、プライマーを標的ＤＮＡにハイブリダイズし、そしてポリメラーゼを使用して鎖伸長を行うことによって、従来通りに行う。特異的停止を、ジデオキシヌクレオチドの包含によって制御する。このタイプの分析におけるプライミングの特異性は、アニーリング緩衝液中でｈｙｂｏｔｒｏｐｅを包含すること、および／またはプライマーに無塩基性残基を導入することおよび弁別用温度でアニーリングすることによって、増加し得る。
【０３１５】
他の配列分析方法は、ランダムな短いオリゴヌクレオチドの各種と標的のハイブリダイゼーションを含む。配列を、重複ハイブリダイゼーション分析によって構築する。この技法では、正確なハイブリダイゼーションが必須である。ｈｙｂｏｔｒｏｐｅまたは無塩基性残基の使用および弁別用温度でのアニーリングは、ミスマッチしたハイブリダイゼーションを減少または排除するためのこの技法に有用である。この目的は、オリゴヌクレオチドプローブの大きな整列または核酸サンプルの大きな整列をプローブするために、自動化したハイブリダイゼーション方法を開発することである。このような技法の適用は、遺伝子マッピング、クローン特徴付け、医学遺伝子学および遺伝子発見、ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列分析、および最終的に配列決定検証を含む。
【０３１６】
多くのパラメータは、オリゴヌクレオチドプローブを自動化または多重化するために制御されなければならない。それぞれのプローブの安定性は同様でなけれなならず、標的核酸とのミスマッチの程度、温度、イオン強度、プローブ（または標的）のＡ＋Ｔ含量、ならびにプローブが短い場合（すなわち、６〜５０ヌクレオチド）の他のパラメータは同様であるべきである。通常、実験の条件およびプローブの配列は、完全に塩基対になったプローブの形成がミスマッチを含む任意の二本鎖よりも熱動力学的に好ましくなるまで、調節される。ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）、あるいは嚢胞性線維症膜貫通タンパク質遺伝子座のような非常に多型の遺伝子座をテストすることのような、プローブの非常に大規模な適用は、多重化したプローブの制御のよりストリンジェントなレベルを必要とする。
【０３１７】
６．整列
整列したＤＮＡサンプルへの核酸ハイブリダイゼーションは、基礎生物学研究における広範囲の種々の適用に長く用いられており、そして現在、医学診断、法廷、および農業で使用され始めている。以下により詳細に記載のように、核酸分子またはタンパク質は、整列を形成するために固体支持体に付着され、そして本発明のタグ付けした分子でテストされ得る。
【０３１８】
例えば、本発明の１つの実施態様では、整列したＤＮＡサンプルは、個々のクローンの同定に利用され得る。簡単にいえば、公知のＤＮＡ分子をタグ付けして、タグ化プローブを作成し、そして未知クローンの整列に対するハイブリダイゼーションによってテストする。次いで、プローブへの特異的ハイブリダイゼーションを示すクローンは、単離され得る。このようなアッセイは、クローンの順序づけられていない整列を使用して達成され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９）。あるいは、公知の個々の同一性（代表的には未知配列であるが）のクローンの調節したスペースの整列を有するメンブレンもまた、購入され得る（例えば、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ＢＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ａｒｒａｙｓ，  Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，  ＡＬ）。
【０３１９】
別の実施態様では、整列は、多数の遺伝子の転写レベルを同時に測定するために利用され得る（一般的に、Ｇｅｓｓら，  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ３：６０９−６１９，  １９９２を参照のこと）。簡単にいえば、ｃＤＮＡのプールをタグ化し、そして特異的組織において豊富に発現する遺伝子を同定するために、ｃＤＮＡクローンの大きな整列でプローブとして利用され得る。個々のｃＤＮＡクローンからの微小整列はまた、２つの異なるＲＮＡサンプル中の整列における各遺伝子の相対発現を定量的に測定するために利用され得る（Ｓｃｈｅｎａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０，  １９９５）。より詳細には、ロボットが、個々のクローンからのＰＣＲ産物の微小整列を生じるために利用され得る：整列中の各エレメントは単一ｃＤＮＡクローンに対応する。整列についてのプローブを、タグを有する各組織サンプルからの第１の鎖ｃＤＮＡを標識することによって調製する。２つの組織サンプルにおける遺伝子発現を比較するために、それぞれからのｃＤＮＡを、異なるタグで標識する。２つのサンプルをプールし、そして一緒に整列にハイブリダイズする。プローブの整列へのハイブリダイゼーションの後、タグを切断し、そして整列中の各サンプルにハイブリダイズした各タグについて本明細書内に記載のように分析し得る。所定の遺伝子について、各標識した複合ｃＤＮＡサンプルへのハイブリダイゼーションの比は、２つの組織サンプルにおける相対遺伝子発現の測定である。内部コントロールのおよび２つ（および潜在的に４つまで）の異なるタグの使用は、この適用について重要である。
【０３２０】
以下に記載の他の適用の多くは、整列したＤＮＡの種々の供給源およびプローブＤＮＡの種々の供給源を使用するこの基本的実験における変化であるが、各適用は、ハイブリダイゼーション混合物中の４〜６よりも少ない区別可能なプローブへの従来の検出方法の使用によって制限される。
【０３２１】
理論上は証明されておりそして非常に広い適用の可能性を有するＤＮＡ整列へのハイブリダイゼーションの他の適用は、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）である。ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）の概念は、すべてのｎ−ヌクレオチドオリゴマー（ｎ−マー）の整列を使用し、未知ＤＮＡ配列に存在するｎ−マーを同定する。次いで、コンピューター操作アプローチを使用して、完全な配列を組み立て得る（一般的には、Ｄｒｍａｎａｃら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１６４９−１６５２，  １９９３を参照のこと）。ＳＢＨの適用は、重複しているＤＮＡクローンの物理的マッピング（順序づけ）、配列チェック、正常なおよび病気を引き起こす遺伝子を比較するＤＮＡフィンガープリンティング、ならびに相補的ＤＮＡおよびゲノムライブラリー中の特定の配列モチーフを有するＤＮＡフラグメントの同定を含む。
【０３２２】
ＤＮＡ整列はまた、遺伝子改変および多型の検出における広い適用を有する。単一塩基対変化、欠失および挿入、変異および多型が、公知の配列改変体を固定しそして患者または病原体からの標識したＰＣＲ産物でプローブすることによって検出され得る（例えば、Ｇｕｏら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：５４５６−５４６５，  １９９４を参照のこと）。同様に、オリゴヌクレオチドの整列は、ＨＩＶの薬物耐性および薬物感受性改変体の検出を含む、遺伝子改変を測定するために利用され得る（例えば、Ｌｉｐｓｈｕｔｚら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４２−４４７，  １９９５を参照のこと）。
【０３２３】
ＤＮＡ整列は、少なくとも２つの異なる技法を使用して産生され得る：別々に生成したサンプルのインサイチュ合成および沈着（スポッティング）。インサイチュのＤＮＡサンプルの生成についての最も顕著な技法の１つは、Ｐｅａｓｅら，  Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  ９１：５０２２−６，  １９９４に記載のオリゴヌクレオチドの光指向性合成である。簡単にいえば、規定されたＤＮＡ配列の整列を、現代の光リトグラフ方法を使用して、整列中の直接的オリゴヌクレオチド合成を指向する光不安定性ブロッキング基の使用によって生成する。次の合成工程で特定の塩基を必要とする各整列エレメントのようなマスクを調製し、そして光に曝露する。単一ヌクレオチド残基を、マスクによって曝露された各鎖に添加し、合成サイクルを終了し、次のサイクルを、別のマスクおよび別のオリゴヌクレオチド残基の使用によって開始する。このプロトコルの連続的適用は、オリゴヌクレオチドの非常に大きな整列を迅速に構築するために使用され得る。ロボット沈着の１つの改変が、転写分析についての整列の使用に関連してＳｃｈｅｎａら（１９９５）に記載される。
【０３２４】
本発明の１つの実施態様では、第２のメンバーは、シリカ、水晶、またはガラスのような固体支持体上に整列される。次いで、整列は、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックするために処理され、続いて固体支持体上でプローブを標識した第１のメンバーのインキュベーションし得る。特定の好ましい実施態様では、非特異的にハイブリダイズする核酸を除去するために、次いで、整列を溶液で（規定されたストリンジェンシーで）洗浄し、スペクトル分析または電位差分析（例えば、マトリクス補助レーザー解離およびイオン化マススペクトル分析）に適切なマトリクス物質を含む溶液ですすぎ、適切なマトリクスを形成するために乾燥し、そして核酸プローブからタグを切断するために光に曝露する。次いで、切断したタグを、スペクトル分析または電位差分析技法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって分析し得る。
【０３２５】
特定の実施態様では、切断およびレーザー解着は、単一工程で生じる。他の改変では、レーザー解離およびイオン化は、マトリクスなしで行われる。いくつかの実験では、参照−タグ化オリゴヌクレオチドまたは他のタグ化化合物を、光切断の効率、レーザー解離およびＭＳ検出効率における変動を制御するためにマトリクス溶液に添加する。試験タグと一連の参照タグとの間の豊富さの比を測定することによって、定量的情報を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳデータから抽出する。
【０３２６】
他の実施態様では、整列は、５０ｂｐ未満の長さのオリゴヌクレオチドから構成される。これは、遺伝子マッピングについて多型（例えば、単一塩基対変化）を検出するために、あるいは、クローン、実父確定試験、法医学（ｆｏｒｅｓｉｃｓ）、遺伝子マッピングを分析または分類することについてサンプル中の特定のＤＮＡの存在または非存在を検出するために利用され得る。同様に、整列はタンパク質から構成され得る。
【０３２７】
Ｃ．  核酸フラグメントの分離
分析を必要とするサンプルはしばしば、複合体マトリックス中の多数の成分の混合物である。未知の化合物を含むサンプルについては、成分は、それぞれ個々の成分が他の分析方法により同定され得るように互いに分離されなければならない。混合物中の成分の分離特性は一定の条件下で一定であり、従って一旦決定されると、これらは各成分を同定および定量するために使用され得る。このような手順は、クロマトグラフ的および電気泳動的な分析分離において代表的である。
【０３２８】
１．  高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、溶液中に溶解された化合物を分離するためのクロマトグラフ的分離技術である。ＨＰＬＣ機器は、移動相のリザーバー、ポンプ、インジェクター、分離カラム、および検出器からなる。化合物は、サンプル混合物のアリコートをカラムに注入することにより分離される。混合物中の異なる成分は、これらの移動液相と固定相との間の分配挙動の差異に起因して異なる速度でカラムを通過する。
【０３２９】
最近、化学的に結合したアルキル鎖を有する非多孔性ＰＳ／ＤＶＢ粒子でのＩＰ−ＲＯ−ＨＰＬＣは、一本鎖および二本鎖の両方の核酸の分析において類似の程度の分解能を提供するキャピラリー電気泳動に対して迅速な代案となることが示されている（Ｈｕｂｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：３５１，１９９３；Ｈｕｂｅｒら、１９９３，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：１０６１；Ｈｕｂｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６：８９８，１９９３）。二本鎖ＤＮＡを鎖長の関数として保持するとは限らない（ＡＴ塩基対は正に荷電した固定相と、ＧＣ塩基対よりも強力に相互作用するので）イオン交換クロマトグラフィーとは対照的に、ＩＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣは、厳密なサイズ依存性分離を可能にする。
【０３３０】
１００ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテートをイオン対試薬として使用する方法が開発され、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドが、高速液体クロマトグラフィー（Ｏｅｆｎｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３：３９，１９９４）の方法により、アルキル化された非多孔性２．３μＭポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）粒子上で首尾良く分離され得た。記載された技術は、５０〜２００ヌクレオチドのサイズの範囲内においてわずか４〜８塩基対の長さが異なるＰＣＲ産物の分離を可能にした。
【０３３１】
２．  電気泳動
電気泳動は、電場内でのイオン（または本明細書中で記載される場合のようなＤＮＡ）の移動度に基づく分離技術である。負に荷電したＤＮＡは正極に向かって移動し、そして正に荷電したイオンは負極に向かって移動する。安全性の理由のために、一方の電極は通常は接地され、他方の電極は正または負にバイアスをかけられている。荷電した種は、これらの総電荷、サイズ、および形に依存する、異なる移動速度を有し、従って、分離され得る。電極装置は、高電圧電源、電極、緩衝液、および緩衝液のためのポリアクリルアミドゲルまたはキャピラリーチューブのような支持体からなる。オープンキャピラリーチューブが、多くのタイプのサンプルのために使用され、そして他のゲル支持体が、通常は、生物学的サンプル（例えば、タンパク質混合物またはＤＮＡフラグメント）のために使用される。
【０３３２】
３．  キャピラリー電気泳動（ＣＥ）
その種々の出現（フリーソリューション（ｆｒｅｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、等速電気泳動、等電点電気泳動、ポリアクリルアミドゲル、ミセル動電の「クロマトグラフィー」）におけるキャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、非常にわずかなサンプル量である複雑な混合物の、迅速で高い分解能の分離のための方法として開発されている。ＭＳの本来の感度および選択性との併用において、ＣＥ−ＭＳは、生体分析のための潜在的に強力な技術である。本明細書中に開示される新規な適用において、これら２つの技術を調和させることは、配列決定法の現在の速度を数桁の規模で越える優れたＤＮＡ配列決定法に至る。
【０３３３】
ＣＥとエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）との間の流速の対応および両方が溶液中でイオン種により促進される（そして主にイオン種のために使用される）という事実は、非常に魅力的な組み合わせについての基礎を提供する。ＥＳＩに基づく、四重極型（ｑｕａｄｒａｐｏｌｅ）質量分析計を有するキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）およびキャピラリー等速電気泳動の両方の組み合わせが記載されている（Ｏｌｉｖａｒｅｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５９：１２３０，１９８７；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：４３６，１９８８；Ｌｏｏら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：４０４，１９８９；Ｅｄｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ．４７４：２１，１９８９；Ｌｏｏら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎ  Ｓｅｐ．１：２２３，１９８９；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．４５８：３１３，１９８８；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．４８０：２１１，１９８９；Ｇｒｅｓｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２８３５，１９８９）。小さなペプチドは、良好な（フェントモル）感度でＣＺＥ分析で容易に分析できる。
【０３３４】
ＤＮＡフラグメントのための最も強力な分離方法は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）であり、一般にスラブゲルの型である。しかし、現代の技術の主な限界は、配列決定反応により生成されたＤＮＡフラグメントのゲル電気泳動を実施するために必要とされる比較的長い時間である。増大した規模（１０倍）が、超薄ゲルを利用するキャピラリー電気泳動の使用で達成され得る。第一の近似値に対するフリーソリューションにおいて、全てのＤＮＡは、塩基の追加が質量および電荷の代償を生じる移動度と同じ移動度で移動する。ポリアクリルアミドゲルにおいて、ＤＮＡフラグメントはふるいにかけられ、そして長さの関数として移動し、そしてこのアプローチは、現在、ＣＥに適用されている。１メーターあたりの著しいプレート数が、現在、架橋ポリアクリルアミドで達成されている（１メーターあたり１０＋７プレート、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：９６６０，１９８８）。記載されるようにこのようなＣＥカラムは、ＤＮＡ配列決定のために使用され得る。ＣＥの方法は、原則として、標準的なシークエンサーにおけるスラブゲル電気泳動よりも２５倍早い。例えば、１時間あたり約３００塩基が解読され得る。分離速度は、スラブゲル電気泳動において過剰の熱生成を伴わずにゲルに適用され得る電場の規模により制限される。従って、ＣＥのより大きな速度は、より高い電界強度の使用を介して達成され得る（ＣＥにおいて３００Ｖ／ｃｍ対スラブゲル電気泳動において１０Ｖ／ｃｍ）。キャピラリーの型はアンペア数を減らし、従って、電源および生じる熱生成を減少する。
【０３３５】
Ｓｍｉｔｈおよび他の者（Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１８：４４１７，１９９０）は、処理能力を増大するために複数のキャピラリーを平行に使用することを示唆している。同様に、ＭａｔｈｉｅｓおよびＨｕａｎｇ（ＭａｔｈｉｅｓおよびＨｕａｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：１６７，１９９２）は、分離がキャピラリーの平行のアレイ上で実施され、そして高い配列決定処理能力を示すキャピラリー電気泳動を導入した（Ｈｕａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４：９６７，１９９２，Ｈｕａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４：２１４９，１９９２）。キャピラリー電気泳動の主な不利は、キャピラリー上にロードされ得る限定されたサンプル量である。分離前に、キャピラリーの初めに大量のサンプルを濃縮することにより、負荷能力（ｌｏａｄａｂｉｌｉｔｙ）が増大し、そして検出レベルが数桁の規模で低くなり得る。ＣＥにおける予備濃縮の最もポピュラーな方法は、サンプルの積層である。サンプルの積層は、最近、総説されている（ＣｈｉｅｎおよびＢｕｒｇｉ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４：４８９Ａ，１９９２）。サンプルの積層は、サンプル緩衝液とキャピラリー緩衝液との間のマトリックスの差異（ｐＨ、イオン強度）に依存し、その結果、サンプルのゾーンを横切る電場は、キャピラリー領域より大きくなる。サンプルの積層において、低濃度緩衝液中の大量のサンプルは、キャピラリーカラムの上部での予備濃縮のために導入される。キャピラリーは、同一成分であるが高濃度の緩衝液で充填される。サンプルのイオンがキャピラリー緩衝液およびより低い電場に到達した場合、これらは濃縮ゾーンに積層される。サンプルの積層は、１〜３桁の規模で検出性を増大する。
【０３３６】
予備濃縮の別の方法が、分析物のフリーゾーンＣＥ分離の前に等速電気泳動（ＩＴＰ）に適用される。ＩＴＰは、ＣＥに代表的に関連する低いｎＬ注入容量と対照的に、μｌ容量のサンプルをキャピラリーにロードさせる電気泳動的技術である。この技術は、分析物よりもそれぞれ高い移動度および低い移動度の２つの緩衝液（リーディングおよびトレーリングの電解液）の間にサンプルを挿入することに依存する。この技術は、本質的に、分析物が同じ速度で移動する純粋なゾーンに集中する濃縮技術である。リーディングおよびトレーリングの電解液のいくつかの選択の必要性および分離プロセスの間のカチオン種またはアニオン種のみを分離する能力のために、この技術は、現在、上記の積層方法よりもポピュラーではない。
【０３３７】
ＤＮＡ配列決定プロセスの核心は、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドフラグメントの非常に選択的な電気泳動的分離である。これは、各フラグメントが解析され、そしてわずかなヌクレオチドが異なることから、著しい。１０００フラグメント（１０００ｂｐ）までの分離が得られている。切断可能（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）なタグを用いる配列決定のさらなる利点は、以下のようである。切断可能なタグが使用されて、ＤＮＡフラグメントがポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離される場合、スラブゲルの型を使用する必要性はない。多数のサンプル（４〜２０００）が併用されるので、現在の色素プライマーまたは色素ターミネーター方法（すなわち、ＡＢＩ３７３シーケンサー）の場合のように、平行にサンプルを流す必要はない。平行なレーンを流す理由がないので、スラブゲルを使用する理由がない。従って、電気泳動的分離方法のためにチューブゲルの型が使用され得る。Ｇｒｏｓｓｍａｎ（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：９，１９９２）は、スラブゲルの型の代わりにチューブゲルの型が使用される場合、かなりの利点が得られることを示している。これは、スラブゲルと比較してチューブの型においてジュール熱を散逸するより優れた能力に起因し、この能力はより早い運転時間（５０％まで）および高分子量のＤＮＡフラグメント（１０００ｎｔを超える）のかなり高い分解能を生じる。長い解読は、ゲノム配列決定において重要である。従って、配列決定における切断可能なタグの使用は、ユーザーに最も高い分解能を有する最も効率的かつ敏感なＤＮＡ分離方法の使用を可能にするさらなる利点を有する。
【０３３８】
４．  マイクロ作製デバイス（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、ＤＮＡ配列決定、法医学的分析、ＰＣＲ産物分析、および制限フラグメントサイジングのための強力な方法である。ＣＥは、キャピラリーゲルにかなりより高い電場が適用され得るので、従来のスラブＰＡＧＥよりもかなり迅速である。しかし、ＣＥは、ただ１つのサンプルがゲルあたり処理される欠点を有する。この方法は、ＣＥのより迅速な分離時間と、並行して複数のサンプルを分析する能力とを組み合わせる。マイクロ作製デバイスの使用の後ろにある基本的な概念は、レーンの寸法を約１００μｍに縮小化することにより、電気泳動における情報密度を増加させる能力である。エレクトロニクス産業は、１ミクロン未満のサイズの特徴を有する回路を作製するようなマイクロ作製を日常的に使用する。キャピラリーアレイの電流密度は、キャピラリーチューブの外径で制限される。チャネルのマイクロ作製は、より密度の高いアレイを作製する。マイクロ作製はまた、ガラスファイバーを用いて可能でない物理的組立を可能にし、そしてチャネルをチップ上で他のデバイスに直接的に連結する。わずかなデバイスが、分離技術のためにマイクロチップ上で構築されている。ガスクロマトグラフ（Ｔｅｒｒｙら、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ，ＥＤ−２６：１８８０，１９７９）および液体クロマトグラフ（Ｍａｎｚら、Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ１：２４９，１９９０）が、シリコンチップ上で作製されているが、これらのデバイスは広く使用されていない。いくつかのグループが、マイクロ作製デバイスでの蛍光色素およびアミノ酸の分離を報告している（Ｍａｎｚら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ５９３：２５３，１９９２，Ｅｆｆｅｎｈａｕｓｅｒら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．  ６５：２６３７，１９９３）。最近、ＷｏｏｌｌｅｙおよびＭａｔｈｉｅｓ（ＷｏｏｌｌｅｙおよびＭａｔｈｉｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１１３４８，１９９４）は、ガラス基板上で多数の分離チャネルを作製するために使用され得るフォトリソグラフィーおよび化学的エッチングを示している。このチャネルは、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）分離マトリックスで充填される。これは、ＤＮＡ制限フラグメントが、わずか２分で分離され得たことを示した。
【０３３９】
Ｄ．  タグの切断
上記のように、異なるリンカーの設計は、異なる特定の物理的または化学的条件下で切断性（ｃｌｅａｖａｂｉｌｉｔｙ）（「不安定性」）を与える。種々の設計のリンカーを切断するように作用する条件の例は、酸、塩基、酸化、還元、フッ化物、チオール交換、光分解、および酵素的条件を含む。
【０３４０】
上記リンカーの一般基準を満足する切断性リンカーの例は、当該分野で周知であり、そしてＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能なカタログ中に見出される切断性リンカーを含む。例は、以下を含む：
・エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ヒドロキシルアミンにより切断可能であるアミン反応性架橋試薬（１Ｍ、３７℃で３〜６時間）；
・ジスクシンイミジルタルタレート（ＤＳＴ）およびスルホ−ＤＳＴ、これらは、０．０１５Ｍの過ヨウ素酸ナトリウムにより切断可能なアミン反応性架橋試薬である；
・ビス［２−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）およびスルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ、これらは、塩基（ｐＨ  １１．６）により切断可能なアミン反応性架橋試薬である；
・１，４−ジ−｛３’−（２’−ピリジルジチオ（プロピオンアミド））ブタン（ＤＰＤＰＢ）、チオール交換または還元により切断可能であるピリジルジチオール架橋剤；
・Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）−ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、チオール交換または還元により切断可能であるピリジルジチオール架橋剤；
・ビス−［β−４−（アジドサリチルアミド）エチル］−ジスルフィド、チオール交換または還元により切断可能である光反応性架橋剤；
・Ｎ−スクシンイミジル−（４−アジドフェニル）−１，３’ジチオプロピオネート（ＳＡＤＰ）、チオール交換または還元により切断可能である光反応性架橋剤；
・スルホスクシンイミジル−２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＥＤ）、チオール交換または還元により切断可能である光反応性架橋剤；
・スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’ジチオプロピオネート（ＳＡＮＤ）、チオール交換または還元により切断可能である光反応性架橋剤。
【０３４１】
タグを放出するために使用され得る切断性リンカーおよび切断条件の他の例は、以下のようである。シリル結合基は、フッ化物または酸性条件下により切断され得る。３−，４−，５−，または６−置換−２−ニトロベンジルオキシまたは２−，３−，５−，または６−置換−４−ニトロベンジルオキシ結合基は、光子の供給（光分解）により切断され得る。３−，４−，５−，または６−置換−２−アルコキシフェノキシまたは２−，３−，５−，または６−置換−４−アルコキシフェノキシ結合基は、Ｃｅ（ＮＨ４）２（ＮＯ３）６（酸化）により切断され得る。ＮＣＯ２（ウレタン）リンカーは、水酸化物（塩基）、酸、またはＬｉＡｌＨ４（還元）により切断され得る。３−ペンテニル、２−ブテニル、または１−ブテニル結合基は、Ｏ３、ＯｓＯ４／ＩＯ４−、またはＫＭｎＯ４（酸化）により切断され得る。２−［３−，４−，または５−置換−フリル］オキシ結合基は、Ｏ２、Ｂｒ２、ＭｅＯＨ、または酸により切断され得る。
【０３４２】
他の不安定な結合基の切断のための条件は、以下を含む：ｔ−アルキルオキシ結合基は、酸により分解され得る；メチル（ジアルキル）メトキシまたは４−置換−２−アルキル−１，３，−ジオキシラン−２−イル結合基は、Ｈ３Ｏ＋により分解され得る；２−シリルエトキシ結合基は、フッ化物または酸により分解され得る；２−（Ｘ）−エトキシ（ここで、Ｘ＝ケト、エステルアミド、シアノ、ＮＯ２、スルフィド、スルホキシド、スルホン）結合基は、アルカリ条件下で切断され得る；２−，３−，４−，５−，または６−置換−ベンジルオキシ結合基は、酸によるかまたは還元的条件下で切断され得る；２−ブテニルオキシ結合基は、（Ｐｈ３Ｐ）３ＲｈＣｌ（Ｈ）により切断され得、３−，４−，５−，または６−置換−２−ブロモフェノキシ結合基は、Ｌｉ、Ｍｇ、またはＢｕＬｉにより切断され得る；メチルチオメトキシ結合基は、Ｈｇ２＋により切断され得る；２−（Ｘ）−エチルオキシ（ここで、Ｘ＝ハロゲン）結合基は、ＺｎまたはＭｇにより切断され得る；２−ヒドロキシエチルオキシ結合基は、酸化（例えば、Ｐｂ（ＯＡｃ）４）により切断され得る。
【０３４３】
好ましいリンカーは、酸または光分解により切断され得るリンカーである。固相ペプチド合成のために開発されたいくつかの酸不安定なリンカーは、ＭＯＩにタグを結合するために有用である。いくつかのこれらのリンカーは、Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：１１０６５−１１１３３，１９９３）により最近の総説に記載されている。一つの有用なタイプのリンカーは、ｐ−アルコキシベンジルアルコールであり、その２つである４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸および４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）酪酸がＡｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）より市販されている。両方のリンカーは、ベンジルアルコールへのエステル結合を介してタグに結合され得、そしてカルボン酸へのアミド結合を介してアミン含有ＭＯＩに結合され得る。これらの分子により結合されたタグは、種々のトリフルオロ酢酸の濃度を用いてＭＯＩから放出される。これらのリンカーの切断は、タグ上でのカルボン酸の遊離を生じる。関連するリンカー（例えば、２，４−ジメトキシ−４’−（カルボキシメチルオキシ）−ベンズヒドリルアミン（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈよりＦＭＯＣ保護化形態で入手可能））を介して結合したタグの酸切断は、放出されたタグ上でのカルボン酸アミドの遊離を生じる。
【０３４４】
この適用に有用な感光性リンカーはまた、大多数が、固相ペプチド合成のために開発されている（Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓの総説を参照のこと）。これらのリンカーは、通常は、２−ニトロベンジルエステルまたは２−ニトロベンジルアミドに基づく。文献に最近報告されている感光性リンカーの２つの例は、４−（４−（１−Ｆｍｏｃ−アミノ）エチル）−２−メトキシ−５−ニトロフェノキシ）酪酸（ＨｏｌｍｅｓおよびＪｏｎｅｓ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：２３１８−２３１９，１９９５）および３−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−３−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸（Ｂｒｏｗｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  １：４−１２，１９９５）である。両方のリンカーは、カルボン酸を介してＭＯＩ上のアミンに結合され得る。タグのリンカーへの結合は、タグ上のカルボン酸とリンカー上のアミンとの間にアミドを形成することにより作製される。感光性リンカーの切断は、通常は、当該分野で公知の強度および時間で３５０ｎｍ波長のＵＶ光を用いて実施される。光化学的切断のための装置の供給源の例は、Ａｕｒａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｓｔａｔｅｎ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）およびＡｇｒｅｎｅｔｉｃｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）である。リンカーの切断は、タグ上の１級アミドの遊離を生じる。光切断性リンカーの例は、ニトロフェニルグリシンエステル、エキソ−およびエンド−２−ベンゾノルボルネイル（ｂｅｎｚｏｎｏｒｂｏｒｎｅｙｌ）クロライドおよびメタンスルホネート、ならびに３−アミノ−３（２−ニトロフェニル）プロピオン酸を含む。酵素的切断の例は、エステル結合を切断するエステラーゼ、ホスホジエステル結合を切断するヌクレアーゼ、ペプチド結合を切断するプロテアーゼなどを含む。
【０３４５】
Ｅ．  タグの検出
検出方法は、代表的には、いくつかのタイプのスペクトル領域における吸収および発光に依存する。原子または分子が光を吸収する場合、入射エネルギーは、量子化された構造をより高いエネルギーレベルへ励起する。励起のタイプは、光の波長に依存する。電子は、紫外光または可視光により、より高い軌道に活性化され、分子振動は、赤外光により励起され、そして回転は、マイクロ波により励起される。吸収スペクトルは、波長の関数としての光の吸収である。原子または分子のスペクトルは、そのエネルギーレベル構造に依存する。吸収スペクトルは、化合物の同定に有用である。比吸光分光的方法は、原子吸光分光分析（ＡＡ）、赤外分光分析（ＩＲ）、およびＵＶ−ｖｉｓ分光分析（ｕｖ−ｖｉｓ）が含まれる。
【０３４６】
高エネルギーレベルに励起される原子または分子は、光線を放射することにより低いレベルに減衰し得る。光の発光は、遷移が同一スピン間の場合は蛍光と呼ばれ、遷移が異なるスピン間で生じる場合はリン光と呼ばれる。分析物の発光強度は、濃度（低濃度で）に直線的に比例し、そして発光種を定量するために有用である。比発光分光的方法は、原子発光分析（ＡＥＳ）、原子蛍光分析（ＡＦＳ）、分子レーザー誘起蛍光（ＬＩＦ）、およびＸ線蛍光（ＸＲＦ）を含む。
【０３４７】
電磁波が物質を通過する場合、大部分の光線が元の方向で存続するが、少量が他の方向に散乱する。入射光として同一の波長で散乱する光は、Ｒａｙｌｅｉｇｈ散乱と呼ばれる。振動のために透明な固体中で散乱する光（フォノン）は、Ｂｒｉｌｌｏｕｉｎ散乱と呼ばれる。Ｂｒｉｌｌｏｕｉｎ散乱は、代表的には、入射光から０．１〜１波数シフトする。分子中の振動または不透明な固体中の光学的フォノンにより散乱する光は、ラマン散乱と呼ばれる。ラマン散乱光は、入射光から４０００波数と同じ量シフトする。特定の散乱分光学的方法は、ラマン分光分析を含む。
【０３４８】
ＩＲ分光分析は、サンプルによる中間赤外光（ｍｉｄ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｌｉｇｈｔ）の吸収の波長および強度の測定である。中間赤外光（２．５〜５０μｍ、４０００〜２００ｃｍ−１）は、分子振動をより高いエネルギーレベルに励起するのに十分にエネルギー性である。ＩＲ吸収帯の波長は、化学結合の特定のタイプに特徴的であり、そしてＩＲ分光分析は、一般に、有機および有機金属分子の同定に最も有用である。
【０３４９】
近赤外吸収分光分析（ＮＩＲ）は、サンプルによる近赤外光の吸収の波長および強度の測定である。近赤外光は、８００ｎｍ〜２．５μｍ（１２，５００〜４０００ｃｍ−１）の範囲にわたり、そして分子振動の倍音および組み合わせをより高いエネルギーレベルに励起するのに十分にエネルギー性である。ＮＩＲ分光分析は、代表的には、有機の官能基（特にＯ−Ｈ、Ｎ−Ｈ、およびＣ＝Ｏ）の定量的測定のために使用される。ＮＩＲの器械類の構成装置および設計は、ｕｖ−ｖｉｓ吸収分光計と同様である。光源は通常、タングステンランプであり、そして検出器は通常、ＰｂＳ固体検出器（ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）である。サンプルホルダーは、ガラスまたは石英であり得、そして代表的な溶媒は、ＣＣｌ４およびＣＳ２である。ＮＩＲ分光分析の便利な器械類は、オンラインのモニタリングおよびプロセス制御に適している。
【０３５０】
紫外および可視吸収分光分析（ｕｖ−ｖｉｓ）は、サンプルによる近紫外および可視光の吸収の波長および強度の測定である。真空ＵＶの吸収は１００〜２００ｎｍ（１０５〜５０，０００ｃｍ−１）、石英ＵＶの吸収は２００〜３５０ｎｍ（５０，０００〜２８，５７０ｃｍ−１）、および可視の吸収は３５０〜８００ｎｍ（２８，５７０〜１２，５００ｃｍ−１）で起こり、そしてＢｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｂｏｕｇｕｅｔの法則により述べられる。紫外および可視光は、外殻電子をより高いエネルギーレベルに促進するのに十分にエネルギー性である。ＵＶ−ｖｉｓ分光分析は通常、溶液中の分子および無機イオンまたは錯体に適用され得る。ｕｖ−ｖｉｓスペクトルは、スペクトルの広範な特徴により限定される。光源は、通常、ＵＶ測定については水素または重水素ランプであり、そして可視測定についてはタングステンランプである。これらの連続する光源の波長は、波長分離器（例えば、プリズムまたは格子モノクロメーター）を用いて選択される。スペクトルは波長分離器を走査することにより得られ、そして定量測定がスペクトルからまたは単一の波長で行われ得る。
【０３５１】
質量分析計は、イオン化された原子または分子の質量対電荷比（ｍ／ｚ）の差異を使用して、それらをお互いに分離する。それ故、質量分析法は、原子または分子の定量のために、そしてまた、分子についての化学的および構造的情報を決定するために有用である。分子は、化合物を同定するための構造的情報を提供する特有のフラグメント化パターンを有する。質量分析計の一般的な操作は、以下のようである。気相イオンが作製され、イオンがその質量対電荷比に基づいて空間または時間で分離され、そして各質量対電荷比のイオンの量が測定される。質量分析計のイオン分離力は、分解能により述べられ、これはＲ＝ｍ／Δｍとして定義される。ここで、ｍはイオン質量であり、そしてΔｍは質量スペクトルにおける２つの分離可能なピークの間の質量の差異である。例えば、１０００の分解能を有する質量分析計は、ｍ／ｚが１００．１のイオンからｍ／ｚが１００．０のイオンを分離し得る。
【０３５２】
一般に、質量分析計（ＭＳ）は、イオン源、質量選択的な分析器、およびイオン検出からなる。磁気セクター型、四重極型、および飛行時間型の設計もまた、イオンを供給源領域から質量分析器に移すために、イオン光学の抽出および加速を必要とする。いくつかの質量分析器の設計（磁気セクターＭＳ、四重極型ＭＳ、または飛行時間型ＭＳ）の詳細は、以下で議論される。磁気セクターＭＳのための一重集束型（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）分析器は、１８０、９０、または６０°の粒子ビーム経路を利用する。粒子に影響を与える種々の力は、異なる質量電荷比を有するイオンを分離する。二重集束型分析計では、静電気的分析器は、動力学的エネルギーの差異を有する粒子を分離するためにこのタイプの装置に加えられる。
【０３５３】
四重極型ＭＳのための四重極型質量フィルターは、平行に配列された４つの金属ロッドからなる。印加電圧は，４つのロッドの間の中心である飛行経路を進み下りてくるイオンの軌道に影響を与える。所定のＤＣおよびＡＣ電圧のために、特定の質量対電荷比のイオンのみが四重極型フィルターを通過し、そして全ての他のイオンはそれらの元の経路の外へ投げられる。質量スペクトルは、ロッド上の電圧が変化する際の四重極型フィルターを通過するイオンをモニターすることにより得られる。
【０３５４】
飛行時間型質量分析計は、異なる質量のイオンを分離するために、「ドリフト領域」を通過する移動時間の差異を使用する。これは、イオンがパルスで生成されるべきそして／またはパルスで抽出されるべきであるように、パルスモードで稼働する。パルスされた電場は、ｑＶの動力学的エネルギー（ここで、ｑはイオン電荷であり、そしてＶは、印加電圧である）で、全てのイオンを場のない（ｆｉｅｌｄ−ｆｒｅｅ）ドリフト領域へ向けて加速する。イオンの動力学的エネルギーは０．５ｍＶ２であるので、より軽いイオンはより重いイオンよりもより高い速度を有し、そしてより早くドリフト領域の末端の検出器に到達する。イオン検出器の出力は、時間の関数としてオシロスコープ上に示されて質量スペクトルを作成する。
【０３５５】
イオン形成手順は、質量分析の開始点である。化学イオン化は、分析分子（タグ）と反応する試薬イオンを使用して、プロトンまたはヒドリド移動によりイオンを形成する方法である。試薬イオンは、大過剰のメタン（タグに対して）を電子衝撃（ＥＩ）イオン源へ導入することにより生成される。電子衝突は、メタンとさらに反応してＣＨ５＋およびＣ２Ｈ５＋を形成するようなＣＨ４＋およびＣＨ３＋を生成する。タグをイオン化するような別の方法は、プラズマおよびグロー放電である。プラズマは、効率的に原子を励起しそしてイオン化する、熱く部分的にイオン化したガスである。グロー放電は、２つの電極間で維持された低圧のプラズマである。電子衝撃イオン化は、タングステンフィラメントから通常生成される電子ビームを使用して、気相の原子または分子をイオン化する。ビームからの電子は、電子を分析物の原子または分子から打ち落として、イオンを生成する。エレクトロスプレーイオン化は、非常に細い針および一組のスキマー（ｓｋｉｍｍｅｒ）を使用する。サンプル溶液は、原料チャンバにスプレーされ、液滴を形成する。液滴は、キャピラリーを抜け出る場合に電荷を有し、そして溶媒が気化するにつれて液滴は高い電荷を有する分析物分子を残して消失する。ＥＳＩは、気化またはイオン化が困難な大きな生物学的分子のために特に有用である。高速原子衝撃（ＦＡＢ）は、脱離およびイオン化を引き起こす固体サンプルに衝突する中性原子（代表的には、ＸｅまたはＡｒ）の高エネルギービームを使用する。これは、気相になることが困難な大きな生物学的分子のために使用される。ＦＡＢは、ほとんどフラグメント化を生じず、そして通常は、大きな分子イオンピークを示し、分子量決定に有用である。原子ビームは、電荷交換セルを介したイオン源からのイオンを加速することにより生成される。イオンは、中性原子との衝突において電子を捕捉して、高エネルギーの原子のビームを形成する。レーザーイオン化（ＬＩＭＳ）は、レーザーパルスが、サンプルの表面から物質を除去しそしていくつかのサンプル成分をイオン化するマイクロプラズマを生成する方法である。マトリックス補助（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）は、大きな生物学的分子（例えば、タンパク質またはＤＮＡフラグメント）を気化し、そしてイオン化するＬＩＭＳ方法である。生物学的分子は、固体マトリックス（例えば、ニコチン酸）に分散される。ＵＶレーザーパルスは、それらが質量分析計へ抽出され得るように、いくつかの大きな分子をイオン化形態で気相に運ぶマトリックスを除去する。プラズマ脱離イオン化（ＰＤ）は、反対方向に移動する２つの分裂フラグメントを生成する２５２Ｃｆの崩壊を利用する。一方のフラグメントは、サンプルに衝突して１〜１０の分析物イオンをたたき出す。他方のフラグメントは、検出器に衝突し、そしてデータ取得の開始を引き起こす。このイオン化方法は、大きな生物学的分子に特に有用である。共鳴イオン化（ＲＩＭＳ）は、１つ以上のレーザービームが気相原子または分子の遷移に対して共鳴するように調和されて、これのイオン化電位を越えて段階的な様式でこれを促進してイオンを生成する方法である。二次イオン化（ＳＩＭＳ）は、イオンビーム（例えば、３Ｈｅ＋、１６Ｏ＋、または４０Ａｒ＋）を使用し、これはサンプルの表面上に焦点を合わせられ、そして物質を気相に飛ばす。スパーク源は、電流を２つの電極を横切ってパルスすることにより固体サンプルにおける分析物をイオン化する方法である。
【０３５６】
タグは、これが付着する分子からの切断の前、その間、その後に荷電され得る。イオン化方法はイオン「脱離」に基づき、固体または液体表面からのイオンの直接的な形成または発光は、不揮発性および熱に不安定な化合物への適用を増大することを可能にする。これらの方法は、イオン化前の中性分子の気化の必要性を排除し、そして一般に分子種の熱分解を最小化する。これらの方法は、電界脱離（Ｂｅｃｋｙ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｉｅｌｄ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７７）、プラズマ脱離（ＳｕｎｄｑｖｉｓｔおよびＭａｃｆａｒｌａｎｅ、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．４：４２１，１９８５）、レーザー脱離（ＫａｒａｓおよびＨｉｌｌｅｎｋａｍｐ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２２９９，１９８８；Ｋａｒａｓら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１０１：８０５，１９８９）、高速粒子衝撃（例えば、高速原子衝撃、ＦＡＢ、および二次イオン質量分析、ＳＩＭＳ、Ｂａｒｂｅｒら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５４：６４５Ａ，１９８２）、ならびに熱スプレー（ＴＳ）イオン化（Ｖｅｓｔａｌ、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．２：４４７，１９８３）を含む。熱スプレーは、液体クロマトグラフィーとのオンラインの組み合わせについて広範に適用される。連続流通（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｌｏｗ）ＦＡＢ法（Ｃａｐｒｉｏｌｉら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５８：２９４９，１９８６）はまた、顕著な可能性が示されている。イオン化／質量分析法の組み合わせのより完全なリストは、イオントラップ質量分析法、エレクトロスプレーイオン化質量分析法、イオンスプレー質量分析法、液体イオン化質量分析法、大気圧イオン化質量分析法、電子イオン化質量分析法、準安定原子衝撃イオン化質量分析法、高速原子衝撃イオン化質量分析法、ＭＡＬＤＩ質量分析法、光イオン化飛行時間型質量分析法、レーザー液滴質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法、ＡＰＣＩ質量分析法、ナノスプレー質量分析法、噴霧スプレーイオン化質量分析法、化学イオン化質量分析法、共鳴イオン化質量分析法、二次イオン化質量分析法、熱スプレー質量分析法である。
【０３５７】
不揮発性の生物学的化合物を分析できるイオン化方法は、適用性の重複する範囲を有する。イオン化効率は、マトリックス成分および化合物のタイプに非常に依存する。現在利用可能な結果は、ＴＳについて上限の分子量は約８０００ダルトンであることを示す（ＪｏｎｅｓおよびＫｒｏｌｉｋ、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１：６７，１９８７）。ＴＳは、主に四重極型質量分析計と共に実行される（感度は、代表的には、より高い質量対電荷比（ｍ／ｚ）で非部分的に（ｄｉｓｐｏｒｐｏｒｔｉｏｎａｔｅｌｙ）影響される）。飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計は市販され、そしてｍ／ｚ範囲が検出器の能力によってのみ限定されるという利点を有する。最近、２つのさらなるイオン化方法が導入されている。これら２つの方法は、現在、マトリックス補助レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ、ＫａｒａｓおよびＨｉｌｌｅｎｋａｍｐ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２２９９，１９８８；Ｋａｒａｓら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１０１：８０５，１９８９）およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）である。両方の方法論は、非常に高いイオン化効率を有する（すなわち、非常に高い［生成された分子イオン］／［消費された分子］）。技術の最終的な可能性を規定する感度は、サンプルのサイズ、イオンの量、流速、検出効率、および実際のイオン化効率に依存する。
【０３５８】
エレクトロスプレーＭＳは、１９６０年代に最初に提示されたアイデアに基づく（Ｄｏｌｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．４９：２２４０，１９６８）。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）は質量分析法による分析のための荷電した分子を生成する一つの手段である。簡単に述べると、エレクトロスプレーイオン化は、強い静電場に液体を噴霧することにより、高度に荷電した液滴を生成する。大気圧の乾燥バスのガス中で一般に形成される高度に荷電した液滴は、電荷の反発が凝集力を超えるまで、中性の溶媒のエバポレーションにより縮小し、「クーロン爆発（ｃｏｕｌｏｍｂｉｃ  ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ）」に至る。イオン化の正確な機構は議論の余地があり、そしていくつかのグループが仮説を出している（Ｂｌａｄｅｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２１０９−１４，１９９１；Ｋｅｂａｒｌｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５：Ａ９７２−８６，１９９３；Ｆｅｎｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．４：５２４−３５，１９９３）。イオン形成の最終的なプロセスに関わらず、ＥＳＩは、穏やかな条件化で溶液から荷電した分子を生成する。
【０３５９】
少量の有機分子での有用な質量スペクトルデータを得る能力は、イオンの効率的な生成に依存する。ＥＳＩのイオン化の効率は、分子に関する正電荷の程度に関連する。イオン化の実験的な改良は、通常、酸性条件を使用することに関している。イオン化を改良する別の方法は、可能な場合に、第４級アミンを使用する方法である（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １：４９４−５０３，１９９２；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：４３６−４１，１９８８を参照のこと）。
【０３６０】
エレクトロスプレーイオン化は、以下により詳細に記載される。エレクトロスプレーイオン生成は、２つの工程を必要とする：大気圧付近での高度に荷電した液滴の分散、次いで蒸発を導く条件である。分析物分子の溶液は、高い電位に保たれた針に通される。針の末端では、溶液は分散して分析物分子を含む、高度に荷電した液滴の小さなミストになる。小さな液滴は速やかに蒸発し、そして電界脱離または残りの蒸発によりプロトン化されたタンパク質分子が気相へと放出される。エレクトロスプレーは、一般に、キャピラリチューブからの液体のわずかな流れ（一般に１〜１０μＬ／分）への高電場の適用により、生成される。３〜６ｋＶの電位差は、代表的に、０．２〜２ｃｍ離れて配置されたキャピラリーと対電極との間に適用される（ここで、脱溶媒和の程度に依存するイオン、荷電したクラスター、およびさらに荷電した液滴は小口を介してＭＳによりサンプリングされ得る）。電場は、キャピラリーの末端で液体表面での電荷の蓄積を生じる。従って、液体の流速、抵抗率、および表面張力は、液滴の生成において重要なファクターである。高電場は、液体表面の破壊および高度に荷電した液滴の形成を生じる。正にまたは負に荷電した液滴は、キャピラリーのバイアスに依存して生成され得る。負のイオン形態は、電気的な放電を阻止する酸素のような電子捕捉剤の存在を必要とする。
【０３６１】
広範囲の液体は、真空中へ静電的にまたは噴霧剤の助けをかりてスプレーされ得る。噴霧のための電場のみの使用は、液体の電導率および誘電率の範囲に対するいくつかの実際的な制限の原因となる。１０−４Ｍ未満の水性電解質溶液に対応する、１０−５オーム未満の溶液電導率は、有用な液体の流速での安定なエレクトロスプレーのために、室温で必要である。ＥＳＩ−ＭＳに最も有用であると見出された形態において、適切な液体の流速は、液体の微細なミストとしての分散を生じる。キャピラリーからの短い距離は、液滴の直径をしばしば全く均一にし、そしておよそ１μｍにする。全てのエレクトロスプレーのイオン電流がより高い液体の流速のためにほんのわずかに増加することが、特に重要である。加熱はエレクトロスプレーを操作するために有用であるという証拠が存在する。例えば、わずかな加熱は、水溶液が容易にエレクトロスプレー化されることを可能にし、これはおそらく、粘性および表面張力の減少のためである。熱補助（ｔｈｅｒｍａｌｌｙ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）およびガス噴霧補助（ｇａｓ−ｎｅｂｕｌｉｚａｔｉｏｎ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）エレクトロスプレーは両方とも、より高い液体の流速を使用することを可能にするが、液滴の荷電の程度を減少する。分子イオンの形成は、最初の液滴群の蒸発をもたらす条件を必要とする。これは、乾燥ガスの中程度の温度（６０℃未満）での流れにより、インターフェースを介した輸送の間の加熱により、および（特に、イオン捕獲方法の場合に）比較的低圧でのエネルギー性の衝突により、高圧で達成され得る。
【０３６２】
ＥＳＩの基礎にある詳細なプロセスは不明のままであるが、ＥＳＩにより生成される非常に小さな液滴は、溶液中で正味の電荷を有するほとんどの種が残りの溶媒の蒸発の後に気相に移ることを可能にするようである。次いで、質量分析検出は、脱溶媒和の後に扱いやすいｍ／ｚ範囲（四重極型装置については、４０００ダルトン未満）を有し、そして十分な効率で生成され、伝導されるイオンを必要とする。広範囲の溶質は、ＥＳＩ−ＭＳで分析可能であることが既に見出されており、そして分子量に対するイオン化効率の実質的な相関関係の欠如は、高度に識別力がなくそして広範に適用可能なイオン化プロセスを示唆する。
【０３６３】
エレクトロスプレーのイオン「源」は、大気圧付近で機能する。エレクトロスプレー「源」は、代表的に、対電極に対して水溶液に電気的にバイアスをかけるための方法を組み入れている金属またはガラスのキャピラリーである。溶液（代表的には、分析物およびしばしば酢酸のような他の添加物を含む水−エタノール混合物）は、キャピラリーの末端へと流れる。本質的に任意の溶媒系に適合し得るＥＳＩ源は、記載されている（Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６２：８８５，１９９０）。ＥＳＩについての代表的な流速は、１〜１０μＬ／分である。ＥＳＩ−ＭＳインターフェースの主な必要条件は、イオンをサンプリングし、そして可能な限り効率的にイオンを高圧領域からＭＳへ運ぶことである。
【０３６４】
ＥＳＩの効率は、非常に高く、極度に敏感な測定の原理を提供する。これは、本明細書中に記載される本発明に有用である。電流装置の性能は、１価に荷電した種について約２×１０−１２Ａまたは約１０７カウント／秒である検出器において総イオン電流を提供し得る。装置の性能に基づいて、１価に荷電した種の１０−１０Ｍまたは約１０−１８モル／秒ほどの低い濃度は、分析物が完全にイオン化される場合に、検出可能なイオン電流（約１０カウント／秒）を示す。例えば、低いアトモルの検出限界が、キャピラリーゾーン電気泳動を有するＥＳＩインターフェースを使用して４級アンモニウムイオンについて得られている（Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５９：１２３０，１９８８）。１０００の分子量の化合物については、電荷の平均数は１であり、荷電状態のおよその数は１であり、ピーク幅（ｍ／ｚ）は１であり、そして最大強度（イオン／秒）は１×１０１２である。
【０３６５】
非常にわずかなサンプルが、ＥＳＩ質量スペクトルを得ることにおいて、実際に消費される（Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：１９４８，１９８８）。実質的なゲインもまた、セクター装置を有するアレイ検出器の使用により得られ得、これは、スペクトルの一部分の同時検出を可能にする。現在では、ＥＳＩにより形成された全てのイオンのわずか約１０−５しか検出されないので、装置の性能を制限するファクターへの注意は、改良された感度についての原理を提供し得る。本発明が、イオン化および検出の方法論における改良について意図しそして適合することは、当業者には、明らかである。
【０３６６】
インターフェースは、好ましくは、分離器械類（例えば、ゲル）と検出器（例えば、質量分析計）との間に配置される。インターフェースは、好ましくは、以下の特性を有する：（１）わずかな（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）時間間隔でＤＮＡフラグメントを回収する能力、（２）ＤＮＡフラグメントの濃縮、（３）電気泳動の緩衝液および環境からのＤＮＡフラグメントの取り出し、（４）タグのＤＮＡフラグメントからの切断、（５）タグのＤＮＡフラグメントからの分離、（６）ＤＮＡフラグメントの処分、（７）タグの揮発性溶液中への配置、（８）タグの気化およびイオン化、（９）タグを質量分析計へ誘導するエレクトロスプレーデバイスへのタグの配置または移動。
【０３６７】
インターフェースはまた、ＤＮＡフラグメントがゲルの底面から溶出するとＤＮＡフラグメントを「回収する」能力を有する。ゲルは、スラブゲル、管状のゲル、キャピラリー等からなり得る。ＤＮＡフラグメントは、いくつかの方法により回収され得る。第一の方法は、ＤＮＡフラグメントが電極上でまたはその近辺で回収される電場の使用である。第二の方法は、ＤＮＡフラグメントが、液流をゲルの底面を通して流すことにより回収される方法である。両方法の局面は組み合わせられ、ここで、流れに回収されたＤＮＡフラグメントは、後に、電場の使用により濃縮され得る。最終結果は、ＤＮＡフラグメントが分離方法が実施された環境から取り出されることである。つまり、ＤＮＡフラグメントは、電場の使用により一方の溶液タイプからもう一方の溶液タイプへと「ドラッグ（ｄｒａｇ）」され得る。
【０３６８】
一旦、ＤＮＡフラグメントが適切な溶液（エレクトロスプレーおよび質量分析に適合する）中にあれば、タグはＤＮＡフラグメントから切断され得る。次いで、ＤＮＡフラグメント（またはその残存物）が、電場の適用によりタグから分離され得る（好ましくは、タグは、ＤＮＡタグのＤＮＡフラグメントの反対の電荷である）。次いで、タグは、電場または流れる液体の使用により、エレクトロスプレーデバイスに導かれる。
【０３６９】
蛍光タグは、それらの吸収および蛍光発光の波長および強度により最も直接的に同定され、そして定量され得る。
【０３７０】
連続する範囲の励起および発光波長（ｌＥＸ，ｌＳ１，ｌＳ２）を提供する従来の分光蛍光光度計は非常に順応性があるが、より特殊化された装置（例えば、フローサイトメーターおよびレーザー走査顕微鏡）は単一の固定された波長で励起可能なプローブを必要とする。最新の装置においては、これは、通常、アルゴンレーザーの４８８ｎｍ線である。
【０３７１】
１プローブ分子あたりの蛍光強度は、生成物のｅおよびＱＹに比例する。現在実用上重要である発蛍光団間のこれらのパラメーターの範囲は、εについては約１０，０００〜１００，０００ｃｍ−１Ｍ−１およびＱＹについては０．１〜１．０である。吸収が高強度の照明により飽和へとされる場合、励起された発蛍光団の不可逆的な破壊（光退色）が蛍光検出能を制限するファクターとなる。光退色の実際的な影響は、問題となる蛍光検出技術に依存する。
【０３７２】
デバイス（インターフェース）は、分離および検出工程の間に配置されて、サイズ分離およびタグ検出の連続する操作（リアルタイムで）を可能にし得ることは当業者に明らかである。これは、分離の方法論および器械類と検出の方法論および器械類とを一体にし、単一のデバイスを形成する。例えば、インターフェースは、分離技術と質量分析法または定電位電流測定による検出との間に配置される。
【０３７３】
インターフェースの機能は、主に、（例えば、質量分析の）タグの分析物からの放出である。インターフェースについてのいくつかの代表的な実行が存在する。インターフェースの設計は、切断性リンカーの選択に依存する。光（ｌｉｇｈｔ）または光（ｐｈｏｔｏ）切断性リンカーの場合、エネルギーまたは光子源が必要とされる。酸不安定リンカー、塩基不安定リンカー、またはジスルフィドリンカーの場合、試薬の添加がインターフェース内で必要とされる。熱不安定リンカーの場合、エネルギー熱源が必要とされる。酵素の添加が、酵素感受性リンカー（例えば、特異的なプロテアーゼとペプチドリンカー、ヌクレアーゼとＤＮＡもしくはＲＮＡリンカー、グリコシラーゼ、ＨＲＰ、またはホスファターゼ）と切断後に不安定である（例えば、化学発光基質に類似する）リンカーについて必要とされる。インターフェースの他の特性は、最小のバンドの広がり、ＤＮＡの質量分析計への注入前のタグからの分離を含む。分離技術は、電気泳動的方法および技術、アフィニティー技術、サイズ保持（透析）、濾過などに基づく方法を含む。
【０３７４】
タグ（または、核酸−リンカー−タグ構築物）を濃縮し、電気泳動的にこれを捕捉し、次いでこれを選択されたイオン化方法の特定のタイプに適合する、代替（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）試薬の流れに放出することがまた可能である。インターフェースはまた、マイクロビーズ上のタグ（または、核酸−リンカー−タグ構築物）を捕獲し、ビーズ（単数または複数）をチャンバに射出し、次いでレーザー脱離／気化を前もって形成し得る。流れにおいて代替緩衝液中へ抽出することもまた可能である（例えば、キャピラリー電気泳動緩衝液から透過性膜を越えて疎水性緩衝液へ）。いくつかの使用において、タグをインターフェースのさらなる機能を含む質量分析計へ断続的に送達することもまた望ましい。インターフェースの別の機能は、各カラムについての時間帯を交代しながら、タグを複数のカラムから質量分析計へと送達することである。タグを、時間で分離して単一のカラムから複数のＭＳ検出器へと送達すること、数ミリ秒間にタグの各セットを回収すること、次いで質量分析計に送達することもまた可能である。
【０３７５】
以下は、本発明において使用され得る分離および検出技術についての代表的な売手のリストである。Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）は、配列決定アプリケーションについて電気泳動装置（Ｔｗｏ  ＳｔｅｐＴＭ，Ｐｏｋｅｒ  ＦａｃｅＴＭ  ＩＩ）を製造する。Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）は、ＤＮＡ分離および配列決定のための電気泳動装置（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析のためのＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ、ＤＮＡ配列決定のためのＭａｃｒｏＰｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）を製造する。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、蛍光染料に基づく半自動シーケンサー（ＡＢＩ３７３およびＡＢＩ３７７）を製造する。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）は、ＵＶ分光器を製造する。Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）は、原子吸光分光器、蛍光分光器、ＬＣおよびＧＣ質量分析器、ＮＭＲ分光器、およびＵＶ−ＶＩＳ分光器を製造する。ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）は、質量分析器（ＶｏｙａｇｅｒＴＭ  Ｅｌｉｔｅ）を生産する。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．（Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｐａｒｋ，ＭＡ）は、ＦＴＩＲ分光器（Ｖｅｃｔｏｒ２２）、ＦＴ−ラマン分光器、飛行時間型質量分析器（Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＩＴＭ）、イオン捕捉質量分析器（ＥｓｑｕｉｒｅＴＭ）、およびＭａｌｄｉ質量分析器を製造する。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（ＡＴＩ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）は、キャピラリーゲル電気泳動ユニット、ＵＶ検出器、およびダイオードアレイ検出器を作製する。Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）は、イオン捕捉質量分析器（３ＤＱ  ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴＭおよび３ＤＱ  ＡｐｏｇｅｅＴＭ）を製造する。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、エレクトロスプレーに適合するＳｃｉｅｘ質量分析器（三重の四重極型ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＩ  １００／３００）を製造する。Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）は、質量選択的検出器（ＨＰ  ５９７２Ａ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（ＨＰ  Ｇ２０２５Ａ）、ダイオードアレイ検出器、ＣＥユニット、ＨＰＬＣユニット（ＨＰ  １０９０）、ならびにＵＶ分光器を生産する。Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）は、質量分析器（磁気セクター（ＭＡＴ  ９５  ＳＴＭ）、四重極型分光器（ＭＡＴ  ９５  ＳＱＴＭ）、および４つの他の関連する質量分析器）を作製する。Ｒａｉｎｉｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）は、ＨＰＬＣ装置を作製する。
【０３７６】
本明細書中に記載される方法および組成物は、特定のサンプルタイプおよびヌクレオチド同一性に対するマップとして作用する切断されるタグの使用を可能にする。各配列決定法の始めに、特定の（選択された）プライマーは、特定の独特（ｕｎｉｑｕｅ）のタグに割り当てられる。タグは、サンプルタイプ、ジデオキシターミネータータイプ（Ｓａｎｇｅｒ配列決定反応の場合）、または好ましくは両方のいずれかをマップする。特に、タグは、プライマータイプをマップし、次にはベクタータイプをマップし、次にはサンプルの同一性をマップする。タグはまた、タグ化プライマーが配置されるジデオキシヌクレオチド反応を参照してジデオキシターミネータータイプ（ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＡＴＰ）をマップし得る。次いで、配列決定反応が実施され、そして得られるフラグメントはちょうどよい時にサイズにより連続的に分離される。
【０３７７】
タグは、時間枠内にフラグメントから切断され、そして測定され、そして時間枠内で記録される。配列は、タグマップを時間枠と比較することにより構築される。つまり、全てのタグの同一性が、サイジング（ｓｉｚｉｎｇ）工程の後にちょうどよい時に記録され、そして時間枠内で互いに関連する。サイジング工程は、１つのヌクレオチドの増加により核酸フラグメントを分離し、それ故、関連するタグの同一性は、一つのヌクレオチドの増加により分離される。ジデオキシターミネーターまたはヌクレオチドマップおよびサンプルタイプの予知により、配列は、直線的様式で容易に推定される。
【０３７８】
以下の実施例は、制限の目的ではなく例証の目的により提供される。
【０３７９】
他で述べない限り、実施例において使用されるような化学物質は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから入手され得る。以下の略語は、示される意味を有して、本明細書中で使用される：
ＡＮＰ＝３−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−３−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸
ＮＢＡ＝４−（Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−３−ニトロ安息香酸
ＨＡＴＵ＝Ｏ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＤＩＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン
ＭＣＴ＝モノクロロトリアジン
ＮＭＭ＝４−メチルモルホリン
ＮＭＰ＝Ｎ−メチルピロリドン
ＡＣＴ３５７＝Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹからのＡＣＴ３５７ペプチド合成機
ＡＣＴ＝Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ
ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ＝ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ−ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
Ｔｆａ＝トリフルオロアセチル
ｉＮＩＰ＝Ｎ−メチルイソニペコ酸
Ｔｆｐ＝テトラフルオロフェニル
ＤＩＡＥＡ＝２−（ジイソプロピルアミノ）エチルアミン
ＭＣＴ＝モノクロロトリアゼン
５’−ＡＨ−ＯＤＮ＝５’−アミノヘキシル−末端化オリゴデオキシヌクレオチド。
【実施例】
【０３８０】
実施例１
切断可能なタグ配列決定における使用のための酸不安定性リンカーの調製
Ａ．  カルボキシルアミド末端を有する遊離タグのための化学的に切断可能な質量分析タグのペンタフルオロフェニルエステルの合成
図１は反応図を示す。
【０３８１】
工程Ａ。ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ  ＡＣ樹脂（化合物ＩＩ；ＡＣＴより入手可能；１ｅｑ．）を、ＡＣＴ３５７ペプチド合成装置（ＡＣＴ）の回収容器中でＤＭＦに懸濁する。ＤＭＦ中の化合物Ｉ（３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）、およびＤＩＥＡ（７．５  ｅｑ．）を添加し、そして回収容器を１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。樹脂へのＩのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＩＩＩを得る。
【０３８２】
工程Ｂ。樹脂（化合物ＩＩＩ）を、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、そして５分間振盪する。樹脂を濾過し、次いでＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、そして１０分間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄し、そして工程Ｃに直接用いる。
【０３８３】
工程Ｃ。工程Ｂからの脱保護樹脂をＤＭＦに懸濁し、そしてＤＭＦ中の側鎖にアミン官能基を含むＦＭＯＣ保護アミノ酸（化合物ＩＶ（例えば、α−Ｎ−ＦＭＯＣ−３−（３−ピリジル）−アラニン）Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ，  Ａｌｂａｎｙ，  ＯＲより入手可能；３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）、およびＤＩＥＡ（７．５  ｅｑ．）を添加する。容器を１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。樹脂へのＩＶのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物Ｖを得る。
【０３８４】
工程Ｄ。樹脂（化合物Ｖ）を工程Ｂに記載のようにピペリジンで処理し、ＦＭＯＣ基を除去する。次いで、脱保護樹脂を、ＡＣＴ３５７によって、回収容器から１６の反応容器へ均等に分配する。
【０３８５】
工程Ｅ。工程Ｄからの脱保護樹脂の１６のアリコートをＤＭＦ中に懸濁する。各反応容器に、ＤＭＦ中の適切なカルボン酸ＶＩ１−１６（Ｒ１−１６ＣＯ２Ｈ；３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）、およびＤＩＥＡ（７．５  ｅｑ．）を添加する。容器を１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂のアリコートをＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。樹脂のアリコートへのＶＩ１−１６のカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＶＩＩ１−１６を得る。
【０３８６】
工程Ｆ。樹脂（化合物ＶＩＩ１−１６）のアリコートを、ＣＨ２Ｃｌ２（３×）で洗浄する。各反応容器に、ＣＨ２Ｃｌ２中の１％ＴＦＡを添加し、そして容器を３０分間振盪する。溶媒を、反応容器から個々のチューブに濾過する。樹脂のアリコートをＣＨ２Ｃｌ２（２×）およびＭｅＯＨ（２×）で洗浄し、そして濾過物を個々のチューブと合わせる。個々のチューブを真空下で蒸発させ、化合物ＶＩＩＩ１−１６を得る。
【０３８７】
工程Ｇ。各遊離カルボン酸ＶＩＩＩ１−１６を、ＤＭＦに溶解する。各溶液にピリジン（１．０５  ｅｑ．）を加え、続いてペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（１．１  ｅｑ．）を加える。混合物を、室温で４５分間撹拌する。溶液をＥｔＯＡｃで希釈し、１Ｍ  ａｑ．のクエン酸（３×）および５％  ａｑ．のＮａＨＣＯ３（３×）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして真空下で蒸発させ、化合物ＩＸ１−１６を得る。
【０３８８】
Ｂ．  カルボキシル酸末端を有する遊離タグのための化学的に切断可能な質量分析タグのペンタフルオロフェニルエステルの合成
図２は反応図を示す
工程Ａ。４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ酪酸（化合物Ｉ；１ｅｑ．）を、ＣＨＣｌ３中のＤＩＥＡ（２．１  ｅｑ．）およびアリルブロマイド（２．１  ｅｑ．）と合わせ、そして２時間加熱還流する。混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、１Ｎ  ＨＣｌ（２×）、炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）（２×）、および塩水（１×）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして真空で蒸発させ、化合物Ｉのアリルエステルを得る。
【０３８９】
工程Ｂ。工程Ａからの化合物Ｉのアリルエステル（１．７５  ｅｑ．）を、ＣＨ２Ｃｌ２中で、側鎖にアミン官能基を含むＦＭＯＣ保護アミノ酸（化合物ＩＩ（例えば、α−Ｎ−ＦＭＯＣ−３−（３−ピリジル）−アラニン）Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ，  Ａｌｂａｎｙ，  ＯＲより入手可能；１ｅｑ．）、Ｎ−メチルモルフォリン（２．５  ｅｑ．）およびＨＡＴＵ（１．１  ｅｑ．）と合わせ、そして室温で４時間撹拌する。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、１Ｍ  ａｑ．のクエン酸（２×）、水（１×）、および５％  ａｑ．のＮａＨＣＯ３（２×）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして真空下で蒸発させる。化合物ＩＩＩをフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２−−＞ＥｔＯＡｃ）によって単離する。
【０３９０】
工程Ｃ。化合物ＩＩＩを、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（０．０７  ｅｑ．）およびＮ−メチルアニリン（２ｅｑ．）を添加し、そして混合物を室温で４時間撹拌する。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、１Ｍ  ａｑ．のクエン酸（２×）および水（１×）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして真空下で蒸発させる。化合物ＩＶをフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２−−＞ＥｔＯＡｃ＋ＨＯＡｃ）によって単離する。
【０３９１】
工程Ｄ。ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ  ＡＣ樹脂（化合物Ｖ；１ｅｑ．）を、ＡＣＴ３５７ペプチド合成装置（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．（ＡＣＴ），Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，  ＫＹ）の回収容器中でＤＭＦに懸濁する。ＤＭＦ中の化合物ＩＶ（３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）、およびＤＩＥＡ（７．５  ｅｑ．）を添加し、そして回収容器を１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。樹脂へのＩＶのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＶＩを得る。
【０３９２】
工程Ｅ。樹脂（化合物ＶＩ）を、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、そして５分間振盪する。樹脂を濾過し、次いでＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、そして１０分間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。次いで、脱保護樹脂を、ＡＣＴ３５７によって、回収容器から１６の反応容器へ均等に分配する。
【０３９３】
工程Ｆ。工程Ｅからの脱保護樹脂の１６のアリコートを、ＤＭＦに懸濁する。各反応容器に、ＤＭＦ中の適切なカルボン酸ＶＩＩ１−１６（Ｒ１−１６ＣＯ２Ｈ；３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）、およびＤＩＥＡ（７．５  ｅｑ．）を添加する。容器を１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂のアリコートをＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。樹脂のアリコートへのＶＩＩ１−１６のカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＶＩＩＩ１−１６を得る。
【０３９４】
工程Ｇ。樹脂（化合物ＶＩＩＩ１−１６）のアリコートを、ＣＨ２Ｃｌ２（３×）で洗浄する。各反応容器に、ＣＨ２Ｃｌ２中の１％ＴＦＡを添加し、そして容器を３０分間振盪する。溶媒を、反応容器から個々のチューブに濾過する。樹脂のアリコートをＣＨ２Ｃｌ２（２×）およびＭｅＯＨ（２×）で洗浄し、そして濾過物を個々のチューブに合わせた。個々のチューブを真空下で蒸発させ、化合物ＩＸ１−１６を得る。
【０３９５】
工程Ｈ。各遊離カルボン酸ＩＸ１−１６を、ＤＭＦに溶解する。各溶液にピリジン（１．０５  ｅｑ．）を加え、続いてペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（１．１  ｅｑ．）を加える。混合物を、室温で４５分間撹拌する。溶液をＥｔＯＡｃで希釈し、１Ｍ  ａｑ．のクエン酸（３×）および５％  ａｑ．のＮａＨＣＯ３（３×）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして真空下で蒸発させ、化合物Ｘ１−１６を得る。
【０３９６】
実施例２
Ｔ−Ｌ−Ｘの光分解性切断の実証
実施例１１で調製されたＴ−Ｌ−Ｘ化合物を、室温で７分間、近紫外光で照射した。発光ピーク３５０ｎｍを有するＲａｙｏｎｅｔｔ蛍光ＵＶランプ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｃｏ．，  Ｍｉｄｄｌｅｔｏｗｎ，  ＣＴ）を、ＵＶ光供給源として用いる。ランプを、試料を有するペトリ皿から１５ｃｍ離して置く。ＳＤＳゲル電気泳動は、結合の＞８５％がこれらの条件下で切断されることを示す。
【０３９７】
実施例３
蛍光標識化プライマーの調製および発蛍光団の切断の実証
オリゴヌクレオチドの合成および精製
オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）を、製造業者より供給される標準ホスホルアミダイト化学、またはＨ−ホスホネート化学（Ｇｌｅｎｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，  ＶＡ）を用いて自動ＤＮＡ合成装置で調製する。適切にブロックされたｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、およびＴホスホルアミダイトは、これらの形態で市販され、そして合成ヌクレオシドは、適切な形態に容易に変換され得る。オリゴヌクレオチドを、製造業者より供給される標準ホスホルアミダイト、またはＨ−ホスホネート化学を用いて調製する。オリゴヌクレオチドを、標準方法を適応することによって精製する。５’トリチル基を有するオリゴヌクレオチドを、１２μｍ、３００＃Ｒａｉｎｉｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＣＡ）Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ−８  ４．２×２５０ｍｍ逆相カラムを用いて、０．１Ｎ  Ｅｔ３ＮＨ＋ＯＡｃ−（ｐＨ７．０）中の１５％〜５５％ＭｅＣＮの勾配で２０分間、ＨＰＬＣでクロマトグラフする。脱トリチル化を行う場合、オリゴヌクレオチドを、ゲル排除クロマトグラフィーによってさらに精製する。オリゴヌクレオチドの質の分析的チェックを、アルカリｐＨでＰＲＰカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ，  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，  ＩＬ）、およびＰＡＧＥで行う。
【０３９８】
２，４，６−トリクロロトリアジン誘導オリゴヌクレオチドの調製：５’末端アミン連結オリゴヌクレオチドの１０〜１０００μｇを、１９℃〜２５℃で３０〜１２０分間、アルカリ（好ましくはｐＨ８．３〜８．５）緩衝液において１０％ｎ−メチルピロリドン中の過剰の再結晶化塩化シアヌル酸と反応させる。最終反応条件は、０．１５Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）、２ｍｇ／ｍｌの再結晶化塩化シアヌル酸、および５００μｇ／ｍｌのそれぞれのオリゴヌクレオチドからなる。未反応の塩化シアヌル酸を、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）カラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。
【０３９９】
次いで、活性化した精製オリゴヌクレオチドを、０．１５Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）中の１００倍モル過剰のシスタミンと室温で１時間反応させる。未反応のシスタミンを、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。次いで、得られたＯＤＮを、アミン反応性蛍光色素と反応させる。得られたＯＤＮ調製物を、３つの部分に分け、そして各部分を（ａ）２０倍モル過剰のＴｅｘａｓ  Ｒｅｄスルホニルクロライド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）、（ｂ）２０倍モル過剰のＬｉｓｓａｍｉｎｅスルホニルクロライド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）（ｃ）２０倍モル過剰のフルオレセインイソチオシアネートのいずれかと反応させる。最終反応条件は、室温で１時間の０．１５Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）からなる。未反応の蛍光色素を、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。
【０４００】
オリゴヌクレオチドから蛍光色素を切断するために、ＯＤＮを、１×１０−５モル濃度に調整し、次いで希釈物を、ＴＥ（ＴＥは、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡである）中で作製する（１２，３倍希釈）。１００μｌ容量のＯＤＮに対して、２５μｌの０．０１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加する。コントロールの同一のセットに対しては、ＤＴＴを加えない。混合物を、室温で１５分間インキュベートする。蛍光を、黒マイクロタイタープレートにおいて測定する。溶液をインキュベーションチューブ（１５０μｌ）から取り出し、そして黒マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，  ＶＡ）に入れる。次いで、プレートを、フルオレセインについては４９５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍのモニター発光、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄについては５９１ｎｍの励起波長および６１２ｎｍのモニター発光、およびＬｉｓｓａｍｉｎｅについては５７０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍのモニター発光で、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ＩＩ蛍光光度計（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＭｃＬｅａｎ，  ＶＡ）を用いて直接読みとる。
【０４０１】
【化３１】
2008220370.tif 000032
データは、蛍光色素をＯＤＮから切断した場合、相対的な蛍光が約２００倍増加することを示す。
【０４０２】
実施例４
タグ化Ｍ１３配列プライマーの調製およびタグの切断の実証
２，４，６−トリクロロトリアジン誘導オリゴヌクレオチドの調製：１０００μｇの５’末端アミン連結オリゴヌクレオチド（５’ヘキシルアミン−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’）（配列番号１）を、１９℃〜２５℃で３０〜１２０分間、アルカリ（好ましくはｐＨ８．３〜８．５）緩衝液において１０％ｎ−メチルピロリドン中の過剰の再結晶化塩化シアヌル酸と反応させる。最終反応条件は、０．１５Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）、２ｍｇ／ｍｌの再結晶化塩化シアヌル酸、および５００μｇ／ｍｌのそれぞれのオリゴヌクレオチドからなる。未反応の塩化シアヌル酸を、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。
【０４０３】
次いで、活性化した精製オリゴヌクレオチドを、０．１５Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）中の１００倍モル過剰のシスタミンと室温で１時間反応させる。未反応のシスタミンを、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。次いで、得られたＯＤＮを、種々のアミドと反応させる。得られたＯＤＮ調製物を、１２の部分に分割し、そして各部分を、（１）４−メトキシ安息香酸、（２）４−フルオロ安息香酸、（３）トルイル酸、（４）安息香酸、（５）インドール−３−酢酸、（６）２，６−ジフルオロ安息香酸、（７）ニコチン酸Ｎ−オキシド、（８）２−ニトロ安息香酸、（９）５−アセチルサリチル酸、（１０）４−エトキシ安息香酸、（１１）桂皮酸、（１２）３−アミノニコチン酸のいずれかのペンタフルオロフェニルエステル（２５モル過剰）と反応させる。０．２Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）中で、３７℃で２時間反応させる。得られたＯＤＮを、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘで、ゲル排除クロマトグラフィーによって精製する。
【０４０４】
オリゴヌクレオチドからタグを切断するために、ＯＤＮを、１×１０−５モル濃度に調整し、次いで希釈物を、５０％ＥｔＯＨ（Ｖ／Ｖ）を含むＴＥ（ＴＥは、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）５ｍＭ  ＥＤＴＡである）中で希釈する（１２，３倍希釈）。１００μｌ容量のＯＤＮに対して、２５μｌの０．０１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加する。コントロールの同一のセットに対しては、ＤＴＴを加えない。インキュベーションは、室温で３０分間である。次いで、ＮａＣｌを０．１Ｍまで加え、そして２容量のＥｔＯＨを添加し、ＯＤＮを沈殿させる。ＯＤＮを、１４，０００×Ｇ、４℃で１５分間の遠心分離によって溶液から除去する。上清を保存し、完全に乾燥する。次いで、ペレットを、２５μｌのＭｅＯＨに溶解する。次いで、ペレットを、タグの存在について質量分析によって試験する。
【０４０５】
この研究に用いた質量分析計は、外部イオン供給源フーリエ変換質量分析計（ＦＴＭＳ）である。ＭＡＬＤＩ分析のために調製した試料を、直接プローブの先端部に沈積し、そしてイオン供給源に挿入する。試料をレーザーパルスで照射する場合、イオンを供給源から抽出し、そして超伝導磁石の口径内に位置するＦＴＭＳ分析装置のセルに焦点を合わせ、かつ輸送する長四重極型イオンガイドに通過させる。
【０４０６】
スペクトルは、以下の情報をもたらす。以下の分子量での２５〜１００相対強度単位の強度において変化するピーク：（１）４−メトキシ安息香酸誘導体を示す２１２．１ａｍｕ、（２）４−フルオロ安息香酸誘導体を示す２００．１、（３）トルイル酸誘導体を示す１９６．１ａｍｕ、（４）安息香酸誘導体を示す１８２．１ａｍｕ、（５）インドール−３−酢酸誘導体を示す２３５．２ａｍｕ、（６）２，６−ジフルオロ安息香酸を示す２１８．１ａｍｕ、（７）ニコチン酸Ｎ−オキシド誘導体を示す１９９．１ａｍｕ、（８）２−ニトロベンズアミドを示す２２７．１ａｍｕ、（９）５−アセチルサリチル酸誘導体を示す１７９．１８ａｍｕ、（１０）４−エトキシ安息香酸誘導体を示す２２６．１ａｍｕ、（１１）桂皮酸誘導体を示す２０９．１ａｍｕ、（１２）３−アミノニコチン酸誘導体を示す１９８．１ａｍｕ。
【０４０７】
結果は、タグがプライマーから切断され、そして質量分析によって検出され得ることを示す。
【０４０８】
実施例５
式Ｒ１−３６−ＬＹＳ（ε−ｌＮＩＰ）−ＡＮＰ−ＴＦＰを有する化合物のセットの調製
図３は、３６のＴ−Ｌ−Ｘ化合物（Ｘ＝Ｌｈ）のセットの平行合成を例示する。Ｌｈは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、Ｌ２は、ＬｈおよびＬ２を連結するメチレン基であるＬ３を有するο−ニトロベンジルアミン基であり、Ｔはモジュラー構造を有する。ここでリジンのカルボン酸基は、Ｌ２ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分Ｒ１−３６（これらのＲ基は本明細書中に記載のＴ２に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、リジンのα−アミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（Ｎ−メチルイソニペコ酸を介して導入される）は、リジンのε−アミノ基を介して結合される。
【０４０９】
図３について言及する：
工程Ａ。ＮｏｖａＳｙｎ  ＨＭＰ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍより入手可能；１ｅｑ．）を、ＡＣＴ３５７の回収容器中のＤＭＦに懸濁する。ＤＭＦ中の化合物Ｉ（ＡＣＴより入手可能なＡＮＰ；３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）およびＮＭＭ（７．５ｅｑ．）を添加し、そして回収容器を１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。樹脂へのＩのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＩＩを得る。
【０４１０】
工程Ｂ。樹脂（化合物ＩＩ）を、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、５分間振盪する。樹脂を濾過し、次いでＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、そして１０分間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄し、そして工程Ｃに直接用いる。
【０４１１】
工程Ｃ。工程Ｂからの脱保護樹脂を、ＤＭＦ中に懸濁し、ＤＭＦ中の、側鎖に保護アミン官能基を含むＦＭＯＣ保護アミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓｉｎｅ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより入手可能；３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）、およびＮＭＭ（７．５ｅｑ．）を添加する。容器を１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨの樹脂へのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＩＶを得る。
【０４１２】
工程Ｄ。樹脂（化合物ＩＶ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２×）で洗浄し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２中の（ＰＰｈ３）４Ｐｄ（０）（０．３ｅｑ．）およびＰｈＳｉＨ３（１０ｅｑ．）の溶液に懸濁する。混合物を１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２×）で洗浄する。パラジウム工程を反復する。溶媒を除去し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２×）、ＤＭＦ中のＮ，Ｎ−ジイソピロピルエチルアンモニウムジエチルジチオカルバメート（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄し、化合物Ｖを得る。
【０４１３】
工程Ｅ。工程Ｄからの脱保護樹脂を、工程Ｃに記載のＮ−メチルイソニペコ酸とカップリングさせ、化合物ＶＩを得る。
【０４１４】
工程Ｆ。Ｆｍｏｃ保護樹脂ＶＩを、ＡＣＴ３５７によって、回収容器から３６反応容器に等しく分配し、化合物ＶＩ１−３６を得る。
【０４１５】
工程Ｇ。樹脂（化合物ＶＩ１−３６）を工程Ｂに記載のピペリジンで処理し、ＦＭＯＣ基を除去する。
【０４１６】
工程Ｈ。工程Ｇからの脱保護樹脂の３６アリコートを、ＤＭＦ中に懸濁する。各反応容器に、ＤＭＦ中の適切なカルボン酸（Ｒ１−３６ＣＯ２Ｈ；３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）、およびＮＭＭ（７．５ｅｑ．）を添加する。容器を１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂のアリコートをＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。樹脂のアリコートへのＲ１−３６ＣＯ２Ｈのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＶＩＩＩ１−３６を得る。
【０４１７】
工程Ｉ。樹脂（化合物ＶＩＩＩ１−３６）のアリコートをＣＨ２Ｃｌ２（３×）で洗浄する。各反応容器に、９０：５：５  ＴＦＡ：Ｈ２０：ＣＨ２Ｃｌ２を添加し、容器を１２０分間振盪する。溶媒を反応容器から個々のチューブに濾過する。樹脂のアリコートをＣＨ２Ｃｌ２（２×）およびＭｅＯＨ（２×）で洗浄し濾過物を個々のチューブに合わせる。個々のチューブを真空下で蒸発させ、化合物ＩＸ１−３６を得る。
【０４１８】
工程Ｊ。各々の遊離カルボン酸ＩＸ１−３６を、ＤＭＦ中に溶解させる。各溶液に、ピリジン（１．０５ｅｑ．）を添加し、続いて、テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（１．１ｅｑ．）を添加する。混合物を、室温で４５分間撹拌する。溶液をＥｔＯＡｃで希釈し、５％ａｑ．のＮａＨＣＯ３（３×）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして真空下で蒸発させ、化合物Ｘ１−３６を得る。
【０４１９】
実施例６
式Ｒ１−３６−ＬＹＳ（ε−ｌＮＩＰ）−ＮＢＡ−ＴＦＰを有する化合物のセットの調製
図４は、３６のＴ−Ｌ−Ｘ化合物（Ｘ＝Ｌｈ）のセットの平行合成を例示する。Ｌｈは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、Ｌ２は、ＬｈとＬ２との間で直接結合されるＬ３を有するο−ニトロベンジルアミン基であり（ＬｈはＬ２基の芳香環に直接結合する）、Ｔはモジュラー構造を有する。ここでリジンのカルボン酸基は、Ｌ２ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分Ｒ１−３６（これらのＲ基は本明細書中に記載のＴ２に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、リジンのαアミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（Ｎ−メチルイソニペコ酸を介して導入される）は、リジンのε−アミノ基を介して結合される。
【０４２０】
図４について言及する：
工程Ａ。ＮｏｖａＳｙｎ  ＨＭＰ樹脂を、実施例５の工程Ａに記載の手順に従って、化合物Ｉ（Ｂｒｏｗｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，１，４（１９９５）の手順に従って調製されたＮＢＡ）とカップリングさせ、化合物ＩＩを得る。
【０４２１】
工程Ｂ−Ｊ。樹脂（化合物ＩＩ）を、実施例５の工程Ｂ〜Ｊに記載のように処理し、化合物Ｘ１−３６を得る。
【０４２２】
実施例７
式ｌＮＩＰ−ＬＹＳ（ε−Ｒ１−３６）−ＡＮＰ−ＴＦＰを有する化合物のセットの調製
図５は、３６のＴ−Ｌ−Ｘ化合物（Ｘ＝Ｌｈ）のセットの平行合成を例示する。Ｌｈは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、Ｌ２は、ＬｈおよびＬ２を連結するメチレン基であるＬ３を有するο−ニトロベンジルアミン基であり、Ｔはモジュラー構造を有する。ここでリジンのカルボン酸基は、Ｌ２ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分Ｒ１−３６（これらのＲ基は本明細書中に記載のＴ２に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、リジンのεアミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（Ｎ−メチルイソニペコ酸を介して導入される）は、リジンのα−アミノ基を介して結合される。
【０４２３】
図５について言及する：
工程Ａ〜Ｃ。実施例５と同じ。
【０４２４】
工程Ｄ。樹脂（化合物ＩＶ）を、実施例５の工程Ｂに記載のピペリジンで処理し、ＦＭＯＣ基を除去する。
【０４２５】
工程Ｅ。工程Ｄの樹脂上の脱保護αアミンを、実施例５の工程Ｃに記載のＮ−メチルイソニペコ酸とカップリングさせ、化合物Ｖを得る。
【０４２６】
工程Ｆ。実施例５と同じ。
【０４２７】
工程Ｇ。樹脂（化合物ＶＩ１−３６）を、実施例５の工程Ｄに記載のパラジウムで処理し、Ａｌｏｃ基を除去する。
【０４２８】
工程Ｈ〜Ｊ。化合物Ｘ１−３６を、実施例５と同様の様式で調製する。
【０４２９】
実施例８
式Ｒ１−３６−ＧＬＵ（γ−ＤＩＡＥＡ）−ＡＮＰ−ＴＦＰを有する化合物のセットの調製
図６は、３６のＴ−Ｌ−Ｘ化合物（Ｘ＝Ｌｈ）のセットの平行合成を例示する。Ｌｈは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、Ｌ２は、ＬｈおよびＬ２を連結するメチレン基であるＬ３を有するο−ニトロベンジルアミン基であり、Ｔはモジュラー構造を有する。ここでグルタミン酸のαカルボン酸基は、Ｌ２ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分Ｒ１−３６（これらのＲ基は本明細書中に記載のＴ２に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、グルタミン酸のα−アミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（２−（ジイソプロピルアミノ）エチルアミンを介して導入される）は、グルタミン酸のγ−カルボン酸を介して結合される。
【０４３０】
図６について言及する：
工程Ａ〜Ｂ。実施例５と同じ。
【０４３１】
工程Ｃ。脱保護樹脂（化合物ＩＩＩ）を、実施例５の工程Ｃに記載のカップリング方法を用いて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−（ＯＡｌ）−ＯＨにカップリングさせ、化合物ＩＶを得る。
【０４３２】
工程Ｄ。樹脂（化合物ＩＶ）上のアリルエステルを、ＣＨ２Ｃｌ２（２×）で洗浄し、ＣＨ２Ｃｌ２中の（ＰＰｈ３）４Ｐｄ（０）（０．３ｅｑ．）およびＮ−メチルアニリン（３ｅｑ．）の溶液と混合する。混合物を１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２×）で洗浄する。パラジウム工程を反復する。溶媒を除去し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２×）、ＤＭＦ中のＮ，Ｎ−ジイソピロピルエチルアンモニウムジエチルジチオカルバメート（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄し、化合物Ｖを得る。
【０４３３】
工程Ｅ。工程Ｄからの脱保護樹脂を、ＤＭＦ中に懸濁し、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）およびＮＭＭ（７．５ｅｑ．）を混合することによって活性化する。容器を１５分間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＮＭＰ（１×）で洗浄する。樹脂を、２−（ジイソプロピルアミノ）エチルアミン（３ｅｑ．）およびＮＭＭ（７．５ｅｑ．）と混合する。容器を１時間振盪する。樹脂への２−（ジイソプロピルアミノ）エチルアミンのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＶＩを得る。
【０４３４】
工程Ｆ〜Ｊ。実施例５と同じ。
【０４３５】
実施例９
式Ｒ１−３６−ＬＹＳ（ε−ｌＮＩＰ）−ＡＮＰ−ＬＹＳ（ε−ＮＨ２）−ＮＨ２を有する化合物のセットの調製
図７は、３６のＴ−Ｌ−Ｘ化合物（Ｘ＝Ｌｈ）のセットの平行合成を例示する。Ｌｈはアミン（特に、リジン誘導部分のε−アミノ基）であり、Ｌ２は、ＬｈおよびＬ２を連結するカルボキサミド置換アルキレンアミノアシルアルキレン基であるＬ３を有するο−ニトロベンジルアミン基であり、Ｔはモジュラー構造を有する。ここでリジンのカルボン酸基は、Ｌ２ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分Ｒ１−３６（これらのＲ基は本明細書中に記載のＴ２に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、リジンのαアミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（Ｎ−メチルイソニペコ酸を介して誘導される）は、リジンのε−アミノ基を介して結合される。
【０４３６】
図７について言及する：
工程Ａ。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＳＲＡＭ樹脂（ＡＣＴより入手可能：化合物Ｉ）を、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、そして５分間振盪する。樹脂を濾過し、次いでＤＭＦ中の２５％ピペリジンと混合し、そして１０分間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄し、そして工程Ｂに直接用いる。
【０４３７】
工程Ｂ。ＤＭＦ中の樹脂（化合物ＩＩ）、ＡＮＰ（ＡＣＴより入手可能；３ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（３ｅｑ．）およびＮＭＭ（７．５ｅｑ．）を添加し、そして回収容器を１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をＮＭＰ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、およびＤＭＦ（２×）で洗浄する。Ｉの樹脂へのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物ＩＩＩを得る。
【０４３８】
工程Ｃ〜Ｊ。樹脂（化合物ＩＩＩ）を、実施例５の工程Ｂ〜Ｉのように処理し、化合物Ｘ１−３６を得る。
【０４３９】
実施例１０
式Ｒ１−３６−ＬＹＳ（ε−ＴＦＡ）−ＬＹＳ（ε−ｌＮＩＰ）−ＡＮＰ−ＴＦＰを有する化合物のセットの調製
図８は、３６のＴ−Ｌ−Ｘ化合物（Ｘ＝Ｌｈ）のセットの平行合成を例示する。Ｌｈは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、Ｌ２は、ＬｈおよびＬ２を連結するメチレン基であるＬ３を有するο−ニトロベンジルアミン基であり、Ｔはモジュラー構造を有する。ここで第１のリジンのカルボン酸基は、Ｌ２ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、質量分析感度エンハンサー基（Ｎ−メチルイソニペコ酸を介して誘導される）は、第１のリジンのε−アミノ基を介して結合され、第２のリジン分子は第１のリジンのα−アミノ基を介して第１のリジンに結合され、分子量調整基（トリフルオロアセチル構造を有する）は、第２のリジンのε−アミノ基を介して結合され、そして可変重量成分Ｒ１−３６（これらのＲ基は本明細書中に記載のＴ２に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して誘導され得る）は、第２のリジンのαアミノ基を介して結合される。
【０４４０】
図８について言及する：
工程Ａ〜Ｅ。これらの工程は、実施例５の工程Ａ〜Ｅと同一である。
【０４４１】
工程Ｆ。樹脂（化合物ＶＩ）を、実施例５の工程Ｂに記載のピペリジンで処理し、ＦＭＯＣ基を除去する。
【０４４２】
工程Ｇ。脱保護樹脂（化合物ＶＩＩ）を、実施例５の工程Ｃに記載のカップリング方法を用いて、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｔｆａ）−ＯＨにカップリングし、化合物ＶＩＩＩを得る。
【０４４３】
工程Ｈ〜Ｋ。樹脂（化合物ＶＩＩＩ）を、実施例５の工程Ｆ〜Ｊに記載のように処理し、化合物ＸＩ１−３６を得る。
【０４４４】
実施例１１
式Ｒ１−３６−ＬＹＳ（ε−ｌＮＩＰ）−ＡＮＰ−５’−ＡＨ−ＯＤＮを有する化合物のセットの調製
図９は、実施例５のエステル由来の３６のＴ−Ｌ−Ｘ（Ｘ＝ＭＯＩ、ここでＭＯＩは核酸フラグメントである、ＯＤＮ）のセットの平行合成を例示する（同じ手順が、他のＴ−Ｌ−Ｘ化合物で用いられ得る、ここでＸは活性化エステルである）。ＭＯＩを、Ｔ−Ｌに、ＭＯＩの５’末端を介して、ホスホジエステル−アルキレンアミン基により結合する。
【０４４５】
図９について言及する：
工程Ａ。化合物ＸＩＩ１−３６を、Ｖａｎ  Ｎｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９，  ３３４５  （１９９１）の改変したビオチン化手順に従って調製する。２００ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３、
２５０ｍＬ）中に５’−アミノヘキシルオリゴヌクレオチド（化合物ＸＩ１−３６、１ｍｇ）の１つを有する溶液に、テトラフルオロフェニルエステル（実施例Ａからの化合物ＸＩＩ１−３６、２５０ｍＬのＮＭＰ中に１００倍モル過剰）の１つを添加する。反応物を、周囲温度で一晩インキュベートする。未反応および加水分解したテトラフルオロフェニルエステルを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０クロマトグラフィーによって化合物ＸＩＩ１−３６から除去する。
【０４４６】
実施例１２
式Ｒ１−３６−ＬＹＳ（ε−ｌＮＩＰ）−ＡＮＰ−ＬＹＳ（ε−（ＭＣＴ−５’−ＡＨ−ＯＤＮ））−ＮＨ２
を有する化合物のセットの調製
図１０は、実施例１１のアミン由来の３６のＴ−Ｌ−Ｘ（Ｘ＝ＭＯＩ、ここで、ＭＯＩは核酸フラグメントである、ＯＤＮ）のセットの平行合成を例示する（同じ手順が、他のＴ−Ｌ−Ｘ化合物で用いられ得、Ｘはアミンである）。ＭＯＩを、Ｔ−Ｌに、ＭＯＩの５’末端を介して、ホスホジエステル−アルキレンアミン基により結合する。
【０４４７】
図１０について言及する：
工程Ａ。５’−［６−（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ）ヘキシル］オリゴヌクレオチドＸＩＩ１−３６を、Ｖａｎ  Ｎｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９，  ３３４５  （１９９１）に記載のように調製する。
【０４４８】
工程Ｂ。１００ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）中の１ｍｇ／ｍｌの濃度の５’−［６−（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ）ヘキシル］オリゴヌクレオチド（化合物ＸＩＩ１−３６）の１つを有する溶液を、Ｒ１−３６−Ｌｙｓ  （ｅ−ｉＮＩＰ）−ＡＮＰ−Ｌｙｓ（ｅ−ＮＨ２）−ＮＨ２（実施例１１からの化合物Ｘ１−３６）より選択される、１００倍モル過剰の１級アミンに添加した。溶液を室温で１晩混合する。未反応のアミンを、洗浄溶液としてＨ２Ｏ（３×）を用いて、３０００ＭＷカットオフ膜（Ａｍｉｃｏｎ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）を通す限外濾過によって除去する。化合物ＸＩＩＩ１−３６を、１００ｍＬの用量に減少させることによって単離する。
【０４４９】
実施例１３
質量分析による複数のタグの同時検出の実証
本実施例は、質量分析による複数の化合物（タグ）を同時に検出する能力を記載する。この特定の実施例において、３１の化合物をマトリクスと混合し、沈積し、そして固体支持体上で乾燥させ、次いで、レーザーで脱離させる。次いで、得られたイオンを、質量分析装置に導入した。
【０４５０】
以下の化合物（Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩより購入した）を、等モルベースでともに混合し、０．００２Ｍベース（化合物当たり）の最終濃度とする：ベンズアミド（１２１．１４）、ニコチンアミド（１２２．１３）、ピラジンアミド（１２３．１２）、３−アミノ−４−ピラゾールカルボン酸（１２７．１０）、２−チオフェンカルボキサミド（１２７．１７）、４−アミノベンズアミド（１３５．１５）、トルミド（１３５．１７）、６−メチルニコチンアミド（１３６．１５）、３−アミノニコチンアミド（１３７．１４）、ニコチンアミド  Ｎ−オキシド（１３８．１２）、３−ヒドロピコリンアミド（１３８．１３）、４−フルオロベンズアミド（１３９．１３）、桂皮酸アミド（１４７．１８）、４−メトキシベンズアミド（１５１．１７）、２，６−ジフルオロベンズアミド（１５７．１２）、４−アミノ−５−イミダゾール−カルボキシアミド（１６２．５８）、３，４−ピリジン−ジカルボキシアミド（１６５．１６）、４−エトキシベンズアミド（１６５．１９）、２，３−ピラジンジカルボキサミド（１６６．１４）、２−ニトロベンズアミド（１６６．１４）、３−フルオロ−４−メトキシ安息香酸（１７０．４）、インドール−３−アセトアミド（１７４．２）、５−アセチルサリチルアミド（１７９．１８）、３，５−ジメトキシベンズアミド（１８１．１９）、１−ナフタレンアセトアミド（１８５．２３）、８−クロロ−３，５−ジアミノ−２−ピラジンカルボキシアミド（１８７．５９）、４−トリフルオロメチル−ベンズアミド（１８９．００）、５−アミノ−５−フェニル−４−ピラゾール−カルボキサミド（２０２．２２）、１−メチル−２−ベンジル−マロナメート（２０７．３３）、４−アミノ−２，３，５，６−テトラフルオロベンズアミド（２０８．１１）、２，３−ナフタレンジカルボン酸（２１２．２２）。化合物を、上記の濃度でＤＭＳＯ中に入れる。次いで、１μｌの材料をα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸マトリクス（１：１０，０００希釈後）と混合し、そして固体ステンレス支持体に沈積させる。
【０４５１】
次いで、材料を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ，  Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｐａｒｋ，  ＭＡ）を用いて、レーザーによって脱離させ、得られるイオンを、操作の直線および反射モードの両方で測定する。以下のｍ／ｚ値を得る（図１１）：
【０４５２】
【化３２】
2008220370.tif 000033
【０４５３】
【化３３】
2008220370.tif 000034
219.3
221.2
228.2
234.2
237.4
241.4
データは、３１個の化合物の２２個が予想される質量のスペクトルを示し、３１個の化合物の９個が予想される質量を超える＋Ｈ質量（１原子質量単位、ａｍｕ）のスペクトルを示したことを示した。後者の現象はおそらく、化合物内のアミンのプロトン化による。従って、３１個の化合物の３１個が、ＭＡＬＤＩ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙによって検出される。より重要なことに、実施例は、複数のタグが分光学的方法によって同時に検出され得ることを実証する。
【０４５４】
α−シアノマトリクス単体（図１１）は、１４６．２、１６４．１、１７２．１、１７３．１、１８９．１、１９０．１、１９１．１、１９２．１、２１２．１、２２４．１、２２８．０、２３４．３のピークを示す。化合物をさらに精製しなかったので、スペクトルの他の同定された質量は、購入した化合物の夾雑物による。
【０４５５】
実施例１４
複数プローブを用いた遺伝子発現のアッセイ
ホウ酸ナトリウム緩衝液（ＳＢＢ）を、ホウ酸および水酸化ナトリウムから新たに
調製した。ＡＰＢ緩衝液は、０．１８Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．
５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０Ｒである。ＴＭＮＺ緩衝液は、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  
ＺｎＣｌ２である。ＦＷ（フィルター洗浄液）は、０．０９Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．６）、２５
ｍＭ  ＥＤＴＡである。ＳＤＳ／ＦＷは、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を有するＦＷであ
る。溶解およびハイブリダイゼーション溶液は、３Ｍ  グアニジウムチオシアネート、２％  Ｎ−ラウロイルサルコシン（サルコシル）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．６）および２５ｍＭ  ＥＤＴＡである。ＣＡＰ緩衝液は、０．１Ｍクエン酸ナトリウムおよび０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ  ６．５）である。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）基質溶液は、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ  ６．５）、０．２Ｍリン酸ナトリウム、２．８７ｍＭ  ４−メトキシ−１−ナフトール、０．０９３ｍＭ  ３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンヒドロクロリド、および４ｍＭ  過酸化水素である。ＡＰ（アルカリホスファターゼ）基質溶液は、ＴＭＮＺ中の１ｍＭ  ５−ブロモ−４−クロリンドイル−３−ホスフェート、１ｍＭニトロブルーテトラゾリウム、および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０である。アルカリホスファターゼの蛍光基質は、０．５ｍＭ  ４−メチル−ウンベリフェロンホスファターゼ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＺｎＣｌ２である。ポリ（エチレンイミン）を、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）から購入した。研磨されたかまたはよく研磨されていないナイロンビーズを、Ｔｈｅ  Ｈｏｏｖｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｓａｕｌｔ  Ｓｔ．Ｍａｒｉｅ，  ＭＩ）から購入した。トリエチルオキソニウムテトラフルオロボレート、無水コハク酸、および１−メチル−２−ピロリジノン（１−ｍｅｔｙｌ−２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）を、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。Ｔｗｅｅｎ  ２０ＲおよびＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入した。グアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）を、Ｋｏｄａｋ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＮＹ）から購入した。塩化シアヌルは、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）からであり、そしてトルエンから再結晶化した。
【０４５６】
Ａ．ＯＤＮ合成
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐｇ）の１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の保存領域または超可変領域に相補的なＯＤＮ（５’−ＣＣＴＴＡＧＧＡＣＡＧＴＣＴＴＣＴＴＣＡＣＧＣ）を、標準的なシアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−ホスホルアミダイト（ＣＥＤ−ホスホルアミダイト）化学を用いて、ＡＢＩ  ３８０ＢまたはＭｉｌｌｉＧｅｎ  ７５００自動ＤＮＡ合成機のいずれかで合成した。アミン末端を、市販のＮ−モノメトキシトリチルアミノイヘキシ−６−イルオキシ−ＣＥＤ−ホスホルアミダイトを用いて５’末端に組み込んだ。５’−モノメトキシトリチル基を有するＯＤＮを、２０分間にわたって０．１Ｍ  Ｅｔ３ＮＨ＋ＯＡｃ−（ｐＨ７．５）中の５％〜４５％のＣＨ３ＣＮの勾配を使用して、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＰＲＰ−１（７．０×３０５ｍｍ）逆相カラムを用いるＨＰＬＣによりクロマトグラフィーに供した。８０％酢酸を用いた脱トリチル化の後に、ＯＤＮを、３Ｍの酢酸ナトリウムおよび１−ブタノールの添加により沈澱させた。ＯＤＮの質についての分析チェックを、Ｔｏｓｏ−Ｈａａｓ  ＤＥＡＥ−ＮＰＲカラムを用いるイオン交換ＨＰＬＣにより、および変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により行った。
【０４５７】
Ｂ．ポリマーコートナイロンビーズの調製
無水１−メチル−２−ピロリジノン（１８００ｍＬ）中の研磨されていないナイロンビーズ（２５，０００、３／３２インチ直径）を、環境温度で５分間撹拌した。トリエチルオキソニウムテトラフルオロボレート（２００ｍＬ、ジクロロメタン中の１Ｍ）を添加し、次いで環境温度で３０分間撹拌した。液体をデカンテーションし、そしてビーズを１−メチル−２−ピロリジノン（４×５００ｍＬ）で素早く洗浄した。次いで、ビーズを、１−メチル−２−ピロリジノン中の７０，０００ＭＷのポリ（エチレンイミン）の３％（ｗ／ｖ）溶液（１Ｌ）（ポリ（エチレンイミン）の３０％水溶液から調製した）中で１２〜２４時間撹拌した。ポリ（エチレンイミン）溶液をデカンテーションした後、ビーズを１−メチル−２−ピロリジノン（２×１Ｌ）、ＳＤＳ／ＦＷ（２×１Ｌ）、Ｈ２Ｏ（１０×２Ｌ）、そして最後に９５％エタノール（１×５００ｍＬ）で洗浄した。ビーズを、高真空下で４〜５時間乾燥した。ビーズのアミン含有量を、ピクリルスルホン酸との反応により決定した。
【０４５８】
Ｃ．５’−［６−（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ）−ヘキシル］−ＯＤＮの調製
新たに調製された０．１Ｍ  ＳＢＢ（ｐＨ  ８．３，  ３．２ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１．８ｍＬ）中の５’−アミノヘキシル  ＯＤＮ（１ｍＬ，  １０ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、再結晶化された塩化シアヌールのアセトニトリル溶液（１ｍＬ，  ５０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。溶液を、環境温度で３０〜１２０分間混合した。未反応の塩化シアヌールを、洗浄溶液として新たに調製された０．１Ｍ  ＳＢＢ  ｎ（ｐＨ  ９．３，  ４×１０ｍＬ）を用いて、３０００ＭＷカットオフ膜（Ａｍｉｃｏｎ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）を通す限外濾過により取り除いた。最終洗浄の後、容量を１ｍＬまで減少させた。５’−［６−（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ）ヘキシル］−ＯＤＮは、検出可能な分解なく、０．１Ｍ  ＳＢＢ（ｐＨ  ８．３）中で４℃で１週間安定である。
【０４５９】
Ｄ．ナイロンビーズへのＯＤＮの付着
上記のＰＥＩコートナイロンビーズ（５００ビーズ）を、等容量の新たに調製された０．１Ｍ  ＳＢＢ（ｐＨ  ９．３）中に入れ、そして３０分間力強く撹拌して、ビーズを再水和させた。ホウ酸溶液をデカンテーションし、そしてビーズを０．１Ｍ  ＳＢＢ（ｐＨ  ８．３）で１回洗浄し、次いで等容量の新鮮な０．１Ｍ  ＳＢＢでｖｏｃｅｒｅした。次いで、５’−［６−（４−６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ）ヘキシル］−ＯＤＮのホウ酸溶液（１ｍＬ，  ５００ｍｇ／ｍＬ）を、ビーズに添加した。混合物を、環境温度で６０分間力強く撹拌した。溶液をデカンテーションし、次いで、ビーズを０．１Ｍ  ＳＢＢ（ｐＨ  ８．３，  ２×５００ｍＬ）で洗浄した。ビーズを、９：１  １−メチル−２−ピロリジノン：１．０Ｍ  ＳＢＢ（ｐＨ  ８．３）中の無水コハク酸（１０ｍｇ／ｍＬ）で、ビーズの３倍容量で処理した。反応混合物を、環境温度で１時間撹拌した。次いで、ビーズを、１−メチル−２−ピロリジノン（３×２５０ｍＬ）、ｄＨ２Ｏ（２×１Ｌ）、ＳＤＳ／ＦＷ（５×２５０ｍＬ）、次いでｄＨ２Ｏ（４×１Ｌ）を用いて洗浄した。ビーズを、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ中で保存した。
【０４６０】
Ｅ．プローブの設計および標識
実施例５のこの部分において、刺激対非刺激ＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞リンパ腫（ＪＲＴ３．５）においてディファレンシャルなｍＲＮＡ発現を可能にするプローブを設計する。
【０４６１】
１００μｇの上記の各５’末端アミン結合オリゴヌクレオチドを、１０％  ｎ−メチル−ピロリドンアルカリ（好ましくはｐＨ８．３〜ｐＨ８．５）緩衝液中の過剰な再結晶化塩化シアヌールと、１９℃〜２５℃で３０〜１２０分間反応させる。最終反応条件は、０．１５Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）、２ｍｇ／ｍｌ再結晶化塩化シアヌール、および５００μｇ／ｍｌの各オリゴヌクレオチドからなる。未反応の塩化シアヌールを、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより除去する。次いで、活性化精製オリゴヌクレオチドを、０．１５Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ  ８．３）中の１００モル過剰のシスタミンと、室温で１時間反応させる。未反応シスタミンを、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより除去する。次いで、得られたＯＤＮを、アミン反応性蛍光色素と反応させる。得られたＯＤＮ調製物を３部に分け、そして各部を、（ａ）２０倍モル過剰のテキサスレッドスルホニルクロライド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ．Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）、（ｂ）  ２０倍モル過剰のリサミンスルホニルクロライド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）、（ｃ）  ２０倍モル過剰のフルオレセインイソチオシアネートのいずれかと反応させる。最終反応条件は、室温で１時間での０．１５Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）からなる。未反応の蛍光色素を、Ｇ−５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより除去する。ＩＬ−２、ＩＦＮ−ｇ、ＧＭ−ＣＳＦを、テキサスレッドで標識した。ｃ−ｆｏｓ  ＩＬ−４およびＰＫＣ−ｇを、リサミンおよびＣＴＬＡ４／ＣＤ２８で標識し、そしてＧＭＰキナーゼをフルオレセインで標識する。ＩＬ−２、ｃ−ｆｏｓ、およびＣＴＬＡ４プローブをプールした。ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−４、およびＧＭＰキナーゼプローブをプールし、そしてＧＭ−ＣＳＦおよびＰＫＣ−ｇプローブをプールした。
【０４６２】
Ｆ．遺伝子発現アッセイのための固体支持体ｃＤＮＡ合成
オリゴ  ＤＭＯ  ５９６
【０４６３】
【化３４】
2008220370.tif 000035
Ｇ．刺激およびＲＮＡ  ＰＲＥＰ
Ｊｕｒｋａｔ株ＪＲＴ３．５を、１０ｎｇ／ｍｌホルボール−１２−ミリステート−１３アセテート（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）および１００ｎｇ／ｍｌイオノマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下の無血清ＲＰＭＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）中で、１×１０ｅ６細胞／ｍｌの細胞密度で６時間刺激する。細胞をペレット化し、１×ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、再ペレット化し、そして４Ｍグアニジンイソチオシアネート／１％  Ｎ−ラウリルサルコシン／２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．１）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）を含む緩衝液（１０−６細胞あたり０．５ｍｌ）中に溶解する。１／１０容量の２Ｍ酢酸ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ｐＨ  ４．２）、続いて１容量の水飽和フェノール（Ａｍｒｅｓｃｏ．Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を添加する。混合後、１／４容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２９：１）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、そして溶液を力強く混合し、次いで、氷上で１０分間インキュベートする。次いで、溶解物をスピンし、水相を除去し、そしてクロロホルム：イソアミルアルコールの等容量で抽出する。次いで、水相をプールし、そしてＲＮＡを２容量のＥｔＯＨ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｓｃｏｌａ，ＩＬ）で沈殿する。遠心分離後、ＥｔＯＨをデカンテーションし、そしてＲＮＡを短時間風乾し、次いで、ＲＮａｓｅを含まない水に１〜５ｍｇ／ｍｌの濃度まで再懸濁する。
【０４６４】
Ｈ．捕獲および第１鎖合成
共有結合したオリゴヌクレオチド、５’−ＡＣＴＡＣＴＧＡＴＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（Ｇｅｎｓｅｔ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を有する１つのナイロンビーズを、１０μｇの全細胞ＲＮＡに添加し、滅菌１．５ｍｌ微量遠心チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、ビーズをカバーするのに十分な、ＲＮａｓｅを含まない水に希釈する。ＲＮＡおよびビーズを、６５℃で５分間インキュベートする。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．５）、１Ｍ  ＮａＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および２０μｇ／ｍｌアセチル化−ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）からなる等容量の２×ｍＲＮＡハイブリダーゼーション緩衝液を各チューブに添加し、そしてチューブを室温で２時間穏やかに揺する。上清を除去し、次いで、ビーズを１×ｍＲＮＡハイブリダイゼーション緩衝液で３回洗浄する。最後の洗浄が完了した後、１×ＭＭＬＶ逆転写酵素緩衝液、１ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、２ｍＭ  ＤＴＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０単位のＲｎａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ．  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、および１０μｇ／ｍｌアセチル化−ＢＳ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）からなる逆転写混合物を各チューブに添加し、続いて６００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加する。この反応物を、４２℃で２時間穏やかに揺する。次いで、１単位のＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）を添加し、そして各反応をさらに０．５時間続けさせる。上清を再度除去し、そして各ビーズを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ８）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３回洗浄する。残ったＲＮＡテンプレートを、０．０１％ＳＤＳ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＴＥ中でビーズを煮沸することにより除去する。
【０４６５】
次いで、ナイロン固体支持体を、１００ｎｇ／ｍｌの以下のタグ化オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた：
（５’−ＧＡＡＣＴＣＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧ−３’，  ＩＬ−２、
５’−ＣＡＧＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＧＣＧＡＧＣＴＡＴＡ−３’，  ＩＦＮ−γ
５’−ＣＴＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＡ−３’，  ＧＭ−ＣＳＦ
５’−ＣＡＴＴＣＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣ−３’，  ｃ−ｆｏｓ
５’−ＧＣＧＡＣＴＧＴＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣ−３’，  ＩＬ−４
５’−ＧＴＧＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＧＡＴＧＣＣＡＣＧＡＡ−３’，  ＰＫＣ−γ
５’−ＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＧＴＡＣ−３’，  ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８
５’−ＡＴＣＴＴＣＧＴＧＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＣＴＧ−３’，  ＧＭＰキナーゼ）。
【０４６６】
（すべてのオリゴは、ウシ配列に基づくＧＭＰキナーゼを除いて、ヒトホモログである）。ハイブリダイゼーションは、３７℃で８時間、３Ｍ  ＧｕＳＣＮ中であった。反応混合物を、固体支持体へのプローブの拡散を促進するために、ハイブリダイゼーションの間穏やかに混合した。８時間のインキュベーション期間の後、固体支持体を３Ｍ  ＧｕＳＣＮで２回、０．１×ＳＳＣで５回洗浄し、次いで、０．０１Ｍジチオスレイトールを入れて、オリゴヌクレオチドから蛍光色素を切り離した。混合物を室温で１５分間インキュベートする。蛍光をブラックマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，  ＶＡ）中で測定する。次いで、フルオレセインについては４９５ｎｍの励起波長を用い、５２０ｎｍでの発光をモニターして、テキサスレッドについては５９１ｎｍの励起波長を用い、６１２ｎｍでの発光をモニターして、そしてリサミンについては５７０ｎｍの励起波長を用い、５９０ｎｍでの発光をモニターして、プレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ＩＩフルオロメーター（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＭｃＬｅａｎ，  ＶＡ）を用いて直接読む。プロービングからの結果は以下の通りである：
【０４６７】
【化３５】
2008220370.tif 000036
実施例１５
固相上での一塩基対ミスマッチの検出
本実施例は、相補的な蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いた、固定化プローブにおける一塩基対ミスマッチの検出を記載する。プローブオリゴヌクレオチドのセットは、完全な塩基対を形成する１つのプローブ、およびハイブリダイズした場合にミスマッチを含む１つのオリゴヌクレオチドからなる。２つのオリゴヌクレオチドを異なる蛍光色素で標識し、そしてミスマッチのＴｍでのハイブリダイゼーションを生じさせた後に、ハイブリダイズした蛍光色素の割合を決定する。
【０４６８】
「標的」オリゴヌクレオチド（ＤＭＯ５０１：  ５’−ＴＴＧＡＴＴＣＣＣＡＡＴＴＡＴＧＣＧＡＡＧＧＡＧ−３’）を固体支持体のセット上で固定化する。ＯＤＮ−ビーズ（３／３２ｎｄインチ直径）を、以前に記載のように（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：  ３３４５，  １９９１）調製した。ＯＤＮ−ビーズは、０．０１〜１．２ｍｇ／ビーズの共有結合的に固定化したＯＤＮを含んだ。ＤＭＯ５７８は、ＤＭＯ５０１（完全な相補物）に対する相補物である。ＤＭＯ１９６９は、１１位でＧ−−−＞Ｔ変化を有するＤＭＯ５０１に対する相補物である。ＤＭＯ１９７１は、１２位でＡ−−−＞Ｔ変化を有するＤＭＯ５０１に対する相補物である。各プローブオリゴヌクレオチドを、ＢＩＯＤＩＰＹ、ＴＡＭＲＡ、またはテキサスレッドのいずれかで標識した。ハイブリダイゼーション反応を、５０ｎｇ／ｍｌの各プローブで、３Ｍ  ＧｕＳＣＮ、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．６）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ中でアセンブリした。等モル比の各プローブ型を、１チューブあたり３つの固体支持体の存在下で各ハイブリダイゼーションにおいて使用した。ハイブリダイゼーションを、一定に撹拌しながら４２℃で３０分間行う。ビーズを、４２℃で３Ｍ  ＧｕＳＣＮで２回洗浄し、次いでＳＤＳ／ＦＷで５回洗浄した。
【０４６９】
プローブオリゴヌクレオチドを変性させるために、固体支持体を２００μｌ  ＴＥ（ＴＥは０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に入れる。混合物を１００℃で１０分間インキュベートする。蛍光を、ブラックマイクロタイタープレートで測定する。溶液をインキュベーションチューブ（２００μｌ）から取り出し、そしてブラックマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，  ＶＡ）に入れる。次いで、フルオレセインについては４９５ｎｍの励起波長を用い、５２０ｎｍでの発光をモニターして、テキサスレッドについては５９１ｎｍの励起波長を用い、６１２ｎｍでの発光をモニターして、そしてリサミンまたはＴＡＭＲＡについては５７０ｎｍの励起波長を用い、５９０ｎｍでの発光をモニターして、プレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ＩＩフルオロメーター（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＭｃＬｅａｎ，  ＶＡ）を用いて直接読む。
【０４７０】
結果は以下の通りである：
【０４７１】
【化３６】
2008220370.tif 000037
テキサスレッド（ＴＲ）５７８オリゴヌクレオチドおよび５７８−ＢＤ（ＢＩＯＤＩＰＹ）は、標識比がハイブリダーゼーション後に変化しなかったので、固定化標的へのハイブリダイゼーションについて対等に競合したと１行目に示されるように、結果は、ハイブリダイゼーションでの蛍光色素の効果はないことを示す。塩基対ミスマッチの特定の検出を可能にする、ＧｕＳＣＮ中でのミスマッチプローブに完全に基づくプローブは、平均２０倍富化する。
【０４７２】
前述から、本発明の特定の実施態様が、例示の目的のために本明細書中に記載されたが、種々の改変が本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲以外によっては限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０４７３】
【図１】図１は、化学的切断可能質量スペクトル分析タグのペンタフルオロフェニルエステルの合成のための、カルボキシルアミド末端を有するタグを遊離させるフローチャートを示す。
【図２】図２は、化学的切断可能質量スペクトル分析タグのペンタフルオロフェニルエステルの合成のための、カルボキシル酸末端を有するタグを遊離させるフローチャートを示す。
【図３】図３〜６および８は、３６の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグのテトラフルオロフェニルエステルの組の合成のためのフローチャートを示す。
【図４】図３〜６および８は、３６の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグのテトラフルオロフェニルエステルの組の合成のためのフローチャートを示す。
【図５】図３〜６および８は、３６の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグのテトラフルオロフェニルエステルの組の合成のためのフローチャートを示す。
【図６】図３〜６および８は、３６の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグのテトラフルオロフェニルエステルの組の合成のためのフローチャートを示す。
【図７】図７は、３６のアミンで終結する末端光化学的切断可能質量スペクトル分析タグの組の合成のためのフローチャートを示す。
【図８】図３〜６および８は、３６の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグのテトラフルオロフェニルエステルの組の合成のためのフローチャートを示す。
【図９】図９は、光化学的切断可能質量スペクトル分析タグ酸の３６のテトラフルオロフェニルエステルの対応する組から作製された３６の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグ化オリゴヌクレオチドの合成を示す。
【図１０】図１０は、３６のアミン末端光化学的切断可能質量スペクトル分析タグ酸の３６の対応する組から作製された３６の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグ化オリゴヌクレオチドの合成を示す。
【図１１】図１１は、質量スペクトル分析による複数タグの同時検出を示す。
【図１２】図１２は、α−シアノマトリックス単独の質量スペクトル図を示す。
【図１３】図１３は、モジュラーで構築されるタグ化核酸フラグメントを示す。
【図１】
2008220370.tif 000038
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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