(57)【要約】【課題】糖の誘導体ではないシクロヘキサン誘導体に天然糖鎖を転移させることによって非天然型糖鎖誘導体を製造する方法を提供すること。【解決手段】シクロヘキサン環を構成する炭素原子の少なくとも一つの炭素原子上に二級水酸基が結合し、当該二級水酸基が結合している炭素原子と隣接する炭素原子のうちの少なくとも一つの炭素原子上にヒドロキシメチル基が結合しているシクロヘキサン誘導体に、Ｎ−結合型糖鎖を転移させることを含む、非天然型糖鎖誘導体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロヘキサン環を構成する炭素原子の少なくとも一つの炭素原子上に二級水酸基が結合し、当該二級水酸基が結合している炭素原子と隣接する炭素原子のうちの少なくとも一つの炭素原子上にヒドロキシメチル基が結合しているシクロヘキサン誘導体に、Ｎ−結合型糖鎖を転移させることを含む、非天然型糖鎖誘導体の製造方法。
【請求項２】
シクロヘキサン誘導体の少なくとも一つ有している二級水酸基がエカトリアル配座である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いて、シクロヘキサン誘導体にＮ−結合型糖鎖を転移させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが、Mucor hiemalis由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（EC.3.2.1.96）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Mucor hiemalis由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが遺伝子組み換え体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｎ−結合型糖鎖がＮ−結合型天然糖鎖誘導体である、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
Ｎ−結合型天然糖鎖誘導体の糖鎖が、高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖、あるいは混成型糖鎖の何れかである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
シクロヘキサン誘導体が、以下の式（１）又は式（２）で示される化合物である、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【化１】
2008022779.tif 000006
（式中、ｎは１または２を示す。Ｒは、アミノ基の保護基を示す。）
【請求項９】
請求項１から８の何れかに記載に方法により製造される、非天然型糖鎖誘導体。
【請求項１０】
式（１）で示されるシクロヘキサン誘導体。
【化２】
2008022779.tif 000007
【請求項１１】
式（２）で示されるＮω−シクロヘキシルアスパラギンまたはグルタミン誘導体。
【化３】
2008022779.tif 000008
（式中、ｎは１または２を示す。Ｒは、アミノ基の保護基を示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は非天然型糖鎖の製造方法、並びに上記方法の原料として用いられるシクロヘキサン誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖鎖が生体内の第３の鎖として注目を浴びるようになってきている。特に、細胞分化やガン化、免疫反応や受精などとの関わりが研究され、新しい事実が明らかにされている。そうした事実から新たな医薬や医療材料を創製しようとする糖鎖工学の試みが続けられている。しかしながら、現状では、糖鎖を製造することは極めて困難な課題である。その理由の一つは糖鎖の化学が立体化学や糖の種類による反応性の違いなど多くの経験を必要とすることにある。天然糖鎖を組み込む数少ない成功例としては、エンド酵素の糖鎖転移反応を利用する技術が報告されている(特許文献１、２及び３を参照)。しかしながら、この方法でも糖鎖受容体はN-アセチル-D-グルコサミン誘導体であり、糖の化学から脱却することはできない。
【０００３】
【特許文献１】特許第３７３２８７１号
【特許文献２】特許第３７４１４９５号
【特許文献３】特許第３７７６９５２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、糖の誘導体ではないシクロヘキサン誘導体に天然糖鎖を転移させることによって非天然型糖鎖誘導体を製造する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、天然糖鎖の糖鎖転移反応、とりわけ糖鎖受容体の構造と転移反応について鋭意検討した結果、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いて、特定の構造の水酸基を有するシクロヘキサン誘導体に対して天然のＮ−結合型糖鎖の糖鎖転移反応を進行できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明によれば、シクロヘキサン環を構成する炭素原子の少なくとも一つの炭素原子上に二級水酸基が結合し、当該二級水酸基が結合している炭素原子と隣接する炭素原子のうちの少なくとも一つの炭素原子上にヒドロキシメチル基が結合しているシクロヘキサン誘導体に、Ｎ−結合型糖鎖を転移させることを含む、非天然型糖鎖誘導体の製造方法が提供される。
【０００７】
好ましくは、シクロヘキサン誘導体の少なくとも一つ有している二級水酸基はエカトリアル配座である。
好ましくは、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いて、シクロヘキサン誘導体にＮ−結合型糖鎖を転移させる。
【０００８】
好ましくは、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが、Mucor hiemalis由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（EC.3.2.1.96）である。
好ましくは、Mucor hiemalis由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが遺伝子組み換え体である。
【０００９】
好ましくは、Ｎ−結合型糖鎖はＮ−結合型天然糖鎖誘導体である。
好ましくは、Ｎ−結合型天然糖鎖誘導体の糖鎖は、高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖、あるいは混成型糖鎖の何れかである。
【００１０】
好ましくは、シクロヘキサン誘導体が、以下の式（１）又は式（２）で示される化合物である。
【化１】
2008022779.tif 000002
（式中、ｎは１または２を示す。Ｒは、アミノ基の保護基を示す。）
【００１１】
さらに本発明によれば、上記した本発明の方法により製造される、非天然型糖鎖誘導体が提供される。
【００１２】
さらに本発明によれば、式（１）で示されるシクロヘキサン誘導体が提供される。
【化２】
2008022779.tif 000003
【００１３】
さらに本発明によれば、式（２）で示されるＮω−シクロヘキシルアスパラギンまたはグルタミン誘導体が提供される。
【化３】
2008022779.tif 000004
（式中、ｎは１または２を示す。Ｒは、アミノ基の保護基を示す。）
【発明の効果】
【００１４】
本発明による非天然型糖鎖誘導体の製造方法は、シクロヘキサノール誘導体という非糖質誘導体を介し、天然糖鎖を導入できる点で、糖鎖工学における糖鎖誘導体製造技術という観点から工業的価値を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
まず、シクロヘキサン誘導体について述べる。
本発明による非天然型糖鎖誘導体の製造方法で使用できるシクロヘキサン誘導体としては、シクロヘキサン環を構成する炭素原子の少なくとも一つの炭素原子上に二級水酸基が結合し、当該二級水酸基が結合している炭素原子と隣接する炭素原子のうちの少なくとも一つの炭素原子上にヒドロキシメチル基が結合しているシクロヘキサン誘導体である。この二級水酸基の立体配座は固定されていなくてもよいが、エカトリアル配座が好ましい。
【００１６】
また、二級水酸基と、当該二級水酸基が結合している炭素原子と隣接する炭素原子上のヒドロキシメチル基との関係は、トランスであることが現実的である。また、シクロヘキサン環の立体配座は、イス型配座が好ましい。
【００１７】
シクロヘキサン環を構成する他の炭素上の置換基については、特段の制限はなく、周知の置換基が導入されていてもよい。このような置換基としては、アルキル基、アリール基、アラルキル基、あるいは、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、チオール基、アルコキシ基などを挙げることができる。さらに、アミノアルキル基、カルボキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアリール基、アミノアリール基などこれらの置換基が複合化した置換基が含まれることは言うまでもない。また、置換基として、アミノ酸やペプチド、糖誘導体などの天然物やその類縁体、高分子化合物等も加えることができる。
【００１８】
本発明で使用できるシクロヘキサン誘導体の具体例としては、以下の式（１）又は式（２）で示される化合物を挙げることができる。
【化４】
2008022779.tif 000005
（式中、ｎは１または２を示す。Ｒは、アミノ基の保護基を示す。）
【００１９】
Ｒが示すアミノ基の保護基の種類は特に限定されず当業者に周知のものを適宜選択できるが、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、第三ブチルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基を挙げることができる。
【００２０】
糖タンパク質や糖ペプチドの類縁体の製造目的には、アスパラギンまたはグルタミン誘導体が実用的である。そのような目的には、式（２）で示されるシクロヘキサン誘導体が好ましい。
【００２１】
式（１）で示されるシクロヘキサン誘導体は、1-アミノ-4-アセトキシ-3-アセトキシメチルシクロヘキサン（H. J. Schaeffer and R. Vince著, J. Med. Chem.誌, 1968年, 11巻, 15ページに記載の方法に従って合成できる）をメタノールに溶解させ、ナトリウムメトキシドを加えて反応させることによって合成することができる。
【００２２】
式（２）で示されるシクロヘキサン誘導体は、式（１）で示されるシクロヘキサン誘導体から周知の方法で合成できる。即ち、式（１）で示されるシクロヘキサン誘導体のアミノ基と、Nα-保護アスパラギン酸αエステルまたはNα-保護グルタミン酸αエステルのω−カルボキシル基とを周知の方法で縮合し、得られる保護体から周知の方法によって式（２）で示されるシクロヘキサン誘導体へと誘導することができる。
【００２３】
本発明による非天然型糖鎖誘導体の製造方法では、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いて、シクロヘキサン誘導体にＮ−結合型糖鎖を転移させることが好ましい。本発明で用いるエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、周知のエンド酵素を利用できる。
【００２４】
具体的には、Flavobacterium meningosepticum由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-F）、Arthrobacter protophormiae由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-A）、あるいはMucor hiemalis由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-M）などを挙げることができる。これらの中でEndo-Mは、糖鎖構造によらず、様々な構造の糖鎖を転移できる特徴を有しているので、本発明において特に好ましい。本発明で使用するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、天然品でもよいし、遺伝子組み換え体でもよいが、好ましくは遺伝子組み換え体である。
【００２５】
本発明において糖鎖供与体として利用できるＮ−結合型糖鎖誘導体は、天然品でもよいし、人工的に合成した誘導体でもよいが、マンノース3残基、Ｎ−アセチルグルコサミン2残基からなる共通母核構造といわれる５糖構造を有している必要がある。具体的には、高マンノース型天然糖鎖、複合型天然糖鎖、混成型天然糖鎖やこれらの部分構造からなる糖鎖を挙げることができる。実質的には、これら糖鎖がアミノ酸、ペプチド、脂質などと複合化した、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質などの複合糖質を利用できる。具体的には、鶏卵卵黄から調製されるジシアロ二本鎖複合型糖鎖を有する糖ペプチド（SGP）や卵白アルブミンから調製される高マンノース型糖鎖などを挙げることができる。
【００２６】
本発明における糖鎖転移反応は、公知のエンド酵素によるＮ−結合型糖鎖転移反応を利用できる。本発明における糖鎖転移反応は、例えば、特許第３７３２８７１号に記載されているような天然糖鎖をN-アセチル-D-グルコサミン残基へエンド酵素を用いて転移させる方法に準じて行うことができる。
【００２７】
即ち、糖鎖供与体であるＮ−結合型糖鎖誘導体、二級水酸基とヒドロキシメチル基とを有するシクロヘキサン誘導体、および酵素（エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ）を緩衝液中で混合することによって、本発明の糖鎖転移反応を行うことができる。Ｎ−結合型糖鎖誘導体の濃度は反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくは１０ｍＭ以上であり、さらに好ましくは１０〜１００ｍＭである。また、二級水酸基とヒドロキシメチル基とを有するシクロヘキサン誘導体の濃度は反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくは５ｍＭ以上であり、さらに好ましくは５〜１００ｍＭである。また、Ｎ−結合型糖鎖誘導体／二級水酸基とヒドロキシメチル基とを有するシクロヘキサン誘導体のモル比は、反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくは２〜０．５である。
【００２８】
エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの使用量は、反応が進行する限り特に限定されない。例えば、エンド−Ｍの場合、使用量は糖鎖供与体に対して600 ユニット／ミリモル（供与体）程度以下の量である。好ましくは、１０〜５００ユニット／ミリモル（供与体）である。ここで、１ユニットは、ジシアロ複合型二本鎖糖鎖を側鎖に有するFmoc-アスパラギン誘導体（Fmoc-SGN）を基質にし、ｐH=6.0、37℃で1分間に基質１μmolを加水分解する酵素量である。
【００２９】
緩衝液としては、ｐＨ５〜８程度の緩衝液を用いることが好ましい。エンド−Ｍの場合は、ｐＨ５．５〜６．５のリン酸緩衝液又は酢酸緩衝液を用いることができる。
【００３０】
反応温度は、反応が進行する限り特に限定されないが、通常は１０〜５０℃程度、好ましくは１５〜４０℃で行うことができる。反応時間は一般的には１〜２４時間程度である。
【００３１】
本発明の方法で製造した非天然型糖鎖誘導体は、公知の手段で反応液から分離精製することができる。例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー等により反応液から反応生成物である非天然型糖鎖誘導体を分離することができる。
【００３２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
（実施例１）
H. J. Schaeffer and R. Vince著, J. Med. Chem.誌, 1968年, 11巻, 15ページに記載の方法に従って合成した1-アミノ-4-アセトキシ-3-アセトキシメチルシクロヘキサン372mg(1.6mmol)をメタノール3mlに溶解させ、ナトリウムメトキシド12mgを加えて室温で2時間攪拌した。イオン交換樹脂アンバーライトIR120(H+)を加え、pHを約4にした。反応液を濾別し、樹脂を25%アンモニア水で洗浄した。濾液と洗液を集め、減圧濃縮したところ、式（１）で示される1-アミノ-3-ヒドロキシメチル-4-ヒドロキシシクロヘキサンが229mg(97%)得られた。
【００３４】
TLC（シリカゲル）のRf値：０．０８（クロロホルム：メタノール：酢酸=85：25：20）。
【００３５】
（実施例２）
ベンジルオキシカルボニル−アスパラギン酸  α−ベンジルエステル３５３ｍｇ（1.0mmol）とトリエチルアミン０．２８ｍｌ（2.0mmol）をジクロルメタン３mlに溶かし、氷冷下、塩化ジメチルホスフィノチオイル１５０ｍｇ（1.2mmol）を加え、対応する混合酸無水物とした。次いで、実施例1で得られた1-アミノ-3-ヒドロキシメチル-4-ヒドロキシシクロヘキサンをメタノール２ｍｌに溶解して加え、3時間室温で攪拌した。常法により、酢酸エチルで抽出し、シリカゲル薄層クロマト（クロロホルム:メタノール:酢酸=８５：２５：２０）で精製したところ（Rf値＝約０．８）、Nα−ベンジルオキシカルボニル−Nβ−（４−ヒドロキシ−3−ヒドロキシメチルシクロヘキシル）アスパラギン  ベンジルエステルが白色固体として、２９１ｍｇ（７９％）得られた。
【００３６】
1H NMR(400MHz、CDCl3)δ=0.80-1.95(m, 7H, c-Hex-CH), 4.55-4.65(m, 1H, Asn-α-CH), 6.03-6.15(m, 1H, NH), 6.20(bd, 1H, NH), 7.20-7.39(m, 10H, Ph).
【００３７】
（実施例３）
実施例２で合成したNα−ベンジルオキシカルボニル−Nβ−（４−ヒドロキシ−3−ヒドロキシメチルシクロヘキシル）アスパラギン  ベンジルエステル１７６ｍｇ（0.6mmol）をメタノール５ｍｌに溶解し、１０％パラジウム活性炭４２ｍｇと酢酸５６ｍｇを加え、水素雰囲気下、一夜室温で攪拌した。触媒を濾別し、濾液を濃縮すると、Nβ−（４−ヒドロキシ−3−ヒドロキシメチルシクロヘキシル）アスパラギン酢酸塩が白色固体として１０２ｍｇ得られた。次いで、得られたNβ−（４−ヒドロキシ−3−ヒドロキシメチルシクロヘキシル）アスパラギン酢酸塩の９６ｍｇを１０％炭酸ナトリウム水溶液２ｍｌで溶解させ、1，4−ジオキサン２ｍｌに溶解した９−フルオレニルメチルオキシカルボニルコハク酸イミド１３３ｍｇを加え、一夜攪拌した。常法により酢酸エチルで抽出し、シリカゲル薄層クロマト（クロロホルム:メタノール=９：１）で精製し（Rf値＝約０．１−０．３）、さらにSephadex LH-20(2x100cm)のゲルクロマトを行ったところ、式（２）（式中、nは１を示し、Ｒは９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを示す）で示されるNα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Nβ−（４−ヒドロキシ−3−ヒドロキシメチルシクロヘキシル）アスパラギンが白色固体として１５ｍｇ（９％）得られた。
【００３８】
1H NMR(400MHz、CD3OD)δ=0.80-1.95(m, 7H, c-Hex), 4.55-4.63(m, 1H, Asn-α-CH), 7.11-7.79(m, 8H, Ar). 
【００３９】
（実施例４）
鶏卵の卵黄からジシアロ複合型２本鎖糖鎖を有する糖ペプチド（SGP）は、A. Seko, M. Koketsu, M. Nishizono, Y. Enoki, H. R. Ibrahim, L. R. Juneja, M. Kim, T. Yamamoto著、Biochim. Biophys. Acta誌、1997年、1335巻、23ページに記載の方法により調製した。
【００４０】
実施例３で合成したNα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Nβ−（４−ヒドロキシ−3−ヒドロキシメチルシクロヘキシル）アスパラギン０．２μmol、鶏卵の卵黄から単離したジシアロ複合型２本鎖糖鎖を有する糖ペプチド（SGP）０．６μmolをリン酸緩衝液(pH6.25)１０μLとメタノール６μLで溶解し、市販のEndo-M（東京化成工業（株）、製品コードA-1651）の0.1U/mLリン酸緩衝液(pH6.25)溶液４μLを加え、25℃で反応させた。HPLCで反応を追跡した結果、2時間後に３２％の収率で転移生成物がえられることがわかった。HPLCで分取し、構造をMALDI TOF MSで確認した。
【００４１】
MALDI TOF MS. 計算値 C102H155O63N7[M+]:2485.3, 実測値 [M+]:2484.4．