(57)【要約】【課  題】甘味物質として有用なα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの効率的な製造方法を提供する。【解決手段】少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼを失活させて得られるα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含む溶液を準備し、該溶液中に残存するマルトオリゴ糖を糖化酵素で加水分解し、その後または加水分解と同時に、グルコースおよびグリセロールを資化するがα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを資化しない微生物を加えて培養することを特徴とするα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの製造方法。本製造方法により、純度の高いα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼを失活させて得られるα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含む溶液を準備し、該溶液中に残存するマルトオリゴ糖を糖化酵素で加水分解し、その後または加水分解と同時に、グルコースおよびグリセロールを資化するがα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを資化しない微生物を加えて培養することを特徴とするα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの製造方法。
【請求項２】
糖化酵素が、マルトオリゴ糖のα結合を加水分解するがα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを加水分解しない酵素である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
糖化酵素が、グルコアミラーゼである請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
微生物が、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物である請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物が、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
酵素反応後、さらに培養終了液から培地成分を除去する請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの製造方法に関し、さらに詳しくはα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールをより安価に、且つ効率良く製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールは、低褐変性、低メイラード反応性、加熱安定性、非う蝕性、難消化性、高い保湿性を有する甘味物質として有用な物質である。従来、このα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール（以下、ＧＧとも表記する）の製造方法としては、例えば、マルトオリゴ糖などを含有する糖類とグリセロールの混合物にカビ由来のα−グルコシダーゼを作用させることにより、グリセロールにグルコシル基を転移させて製造する方法（特許文献１）、清酒、味噌、みりん等の醸造物から抽出する方法、イソマルトース、マルチトールなどを四酢酸鉛や過ヨウ素酸塩でグリコール開裂したものを還元する方法、あるいはＫｏｅｎｉｇｓ−Ｋｎｏｒｒ反応により合成したβ−グルコシドをアノメリゼーションした後、β−グルコシダーゼでβ−グルコシドを加水分解する方法などが知られている。
【０００３】
上記既知方法の中でも、特許文献１に記載の方法が最も収率がよく工業的に優れた方法である。この方法で得られる酵素反応液中には、ＧＧの他にグルコース、グリセロール、イソマルトオリゴ糖なども残存しているため、前記特許文献１では、前記酵素反応液中のα−グルコシダーゼ活性を失活させた後、該反応液をイオン交換樹脂アンバーライトＭＢ−２処理および活性炭カラムクロマトグラフィーに付し、溶出液を濃縮することによりシロップ状の高純度のＧＧを得ている。
【０００４】
【特許文献１】特許第３５６９４３２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
高純度のＧＧを得るための精製方法としては、アミノカラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、擬似移動床式クロマト分離装置などがあるが、アミノカラムクロマトグラフィーは、溶出液にアセトニトリルを用いるため、食品などに使用する場合に安全性に欠け、また精製効率が悪い。活性炭カラムクロマトグラフィーは精製効率がアミノカラムクロマトグラフィーよりは良いが、擬似移動床式クロマト分離装置に比べると格段に効率が悪い。もっとも効率の良い擬似移動床式クロマト分離装置は、高額な装置であり、充填剤の劣化等によるメンテナンスにもかなりの費用がかかる上に、ＧＧ含有反応液に共存するグルコースとグリセロールにより精製効率が落ちるという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼ活性を失活させて得られるＧＧを含む溶液（以下、ＧＧ反応液とも表記する。）に、糖化酵素（例えば、グルコアミラーゼ）を作用させて、残存しているマルトオリゴ糖類を加水分解することで、ＧＧの減少なしに、ＧＧ、グルコース、グリセロールのほぼ三成分になることを見出した（以下、加水分解後に得られる溶液を加水分解液とも表記する）。
さらに本発明者らは、グルコース及びグリセロールの資化性を持つ酵母の中でもＧＧを資化しない酵母を見出し、加水分解液を添加した培養液中でこの酵母を培養すると、グルコースとグリセロールが除去された高純度のＧＧ溶液が得られることを見出した。
本発明は、上記知見に基づき、さらに検討して完成したものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼを失活させて得られるα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含む溶液を準備し、該溶液中に残存するマルトオリゴ糖を糖化酵素で加水分解し、その後または加水分解と同時に、グルコースおよびグリセロールを資化するがα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを資化しない微生物を加えて培養することを特徴とするα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの製造方法、
［２］糖化酵素が、オリゴ糖のα結合を加水分解するがα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを加水分解しない酵素である前記［１］に記載の製造方法、
［３］糖化酵素が、グルコアミラーゼである前記［１］に記載の製造方法、
［４］微生物が、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物である前記［１］に記載の製造方法、
［５］ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物が、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である［４］に記載の製造方法、および
［６］酵素反応後、さらに培養終了液から培地成分を除去する前記［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法は、煩雑な処理や高額なランニングコストの必要がなく、ＧＧを安価に製造することができる。ＧＧは呈味がよく、安定性に優れており、近年多くの機能性が明らかとなってきていることから、より安価に製造することで、さらに広範な利用が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの製造方法は、少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼを失活させて得られるα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含む溶液を準備し、該溶液中に残存するマルトオリゴ糖を糖化酵素で加水分解し、その後または加水分解と同時に、グルコースおよびグリセロールを資化するがα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを資化しない微生物を加えて培養することを特徴とする。
【００１０】
（原料溶液の準備）
本発明の第一工程は、少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼを失活させて得られるα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含む溶液（ＧＧ反応液）を準備する工程である。
少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類としては、例えばデンプンやアミロースにアミラーゼを作用させることによって得られるマルトオリゴ糖を含む糖類が好適に挙げられる。ここにマルトオリゴ糖としては、例えばマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなど、グルコースが２〜７個α−１，４−グルコシド結合したオリゴ糖が挙げられる。
少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類に対するグリセロールの使用比率は特に限定されない。
【００１１】
一方、α−グルコシダーゼとしては、カビ由来のα−グルコシダーゼが好ましく、特にアスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などの生産するα−グルコシダーゼが好ましい。また、この酵素は、精製酵素であっても、粗精製酵素であってもよい。
マルトオリゴ糖とグリセロールとの酵素反応は常法に従って行なうことができ、例えばｐＨ４〜６で、かつ４０〜６０℃で好適に実施することができる。酵素反応時間は、特に限定されないが、通常１２〜４８時間である。
酵素反応後、反応液を加熱することによりα−グルコシダーゼを失活させることができる。このようにして得た溶液（ＧＧ反応液）中には、ＧＧ以外にもグリセロール、グルコース、オリゴ糖などが存在する。
【００１２】
なお、ＧＧ反応液中に含まれるＧＧは、α−Ｄ−グルコピラノシル基がグリセロールの１位又は２位に置換した化合物であり、式１：
【化１】
2008005735.tif 000002
で示される（２Ｒ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、式２：
【化２】
2008005735.tif 000003
で示される（２Ｓ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、式３：
【化３】
2008005735.tif 000004
で示される２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、またはこれらの混合物のいずれであってもよい。例えば、後記実施例において使用するＧＧ反応液に含まれるＧＧは、式１で示される（２Ｒ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを主成分とする前記三種の混合物である。
【００１３】
（糖化酵素との反応）
本発明の第２工程は、原料溶液である上記ＧＧ反応液中に残存するオリゴ糖を糖化酵素で加水分解する反応である。この反応により、残存するオリゴ糖が分解し、ＧＧ、グリセロール、グルコースのほぼ３成分からなる溶液となる。
【００１４】
糖化酵素（グルコアミラーゼ）は、マルトオリゴ糖などの基質の非還元性末端グルコース残基から順に加水分解する。グルコアミラーゼには酵母やカビ由来のものがあるが、ＧＧを分解しないものであれば使用可能であり、中でもアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）やリゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）などの生産するグルコアミラーゼが好適である。また、α−グルコシダーゼの作用で生成する副産物としてイソマルトオリゴ糖があり、そのα−１，６結合を加水分解するプルラナーゼ等を併用してもよい。
【００１５】
作用条件は特に限定されないが、例えば、反応温度は、２０〜５０℃が好ましいが、反応温度６０℃でも酵素反応には支障がない。反応液の液性は、ｐＨ３〜６、特にｐＨ４〜５が好ましい。また、グルコアミラーゼの添加量は、ＧＧ反応液に含まれる固形分を基質とし、４０℃、２４時間反応させた場合、５０％（ｗ／ｗ）以下の基質に対し、基質グラム（ｇ）あたり３０Ｕ以上、好ましくは６０Ｕ以上（１Ｕは、０．５６％可溶性澱粉溶液９ｍｌに希釈酵素液１ｍｌを加え、４０℃、ｐＨ４．５で３０分反応させた時に、グルコース１０ｍｇ相当の還元力を与える酵素量とする）であれば十分目的を達成することができる。
反応後の加水分解液には、ＧＧの他にグルコース、グリセロール、及びわずかに残存しているオリゴ糖類などが含まれる。
【００１６】
（微生物の培養）
続く第３工程は、微生物を用いて加水分解溶液中で微生物を培養してグルコース及びグリセロールを除去する工程である。
本発明で使用可能な微生物は、ＧＧを分解することなく、グルコース及びグリセロールの資化性を有していれば良く、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、エンテロバクター・エアロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・フロンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）などである。ピキア・パストリスは、一般的にはメタノール資化性酵母として知られているが、グルコース及びグリセロール資化性も有しており、本発明者らは鋭意検討の結果、グルコース及びグリセロール、ＧＧの存在する培養液中でピキア・パストリスを培養すると、先にグルコースを資化し、次いでグリセロールを資化し、ＧＧをまったく資化しないということを初めて確認した。なお、本発明の実施例で使用した微生物（酵母）は、ピキア・パストリスの標準株で、独立行政法人  製品評価技術基盤機構にＮＢＲＣ  Ｎｏ．１０７７７として寄託されており、容易に入手することができる。
【００１７】
培養条件は特に限定されないが、例えば最終固形分濃度３〜１０％になるように調整した加水分解溶液に、微生物の生育に必要な成分（例えば、ペプトン、麦芽エキス、酵母エキスなどの培地成分）を添加し、ピキア・パストリスなどの微生物を植菌して培養を行う。残存する糖類を適宜分析し、グルコースとグリセロールがなくなれば、さらに加水分解液を固形分濃度３〜１０％になるように添加し、培養することを繰り返せば、培養液中のＧＧ濃度を上げることができる。
【００１８】
なお、第２工程の酵素による残存オリゴ糖の加水分解と、第３工程の微生物によるグルコースとグリセロールの除去は同時に行うこともできる。即ち、ＧＧ反応液を最終固形分濃度３〜１０％になるように添加した培地中にグルコアミラーゼなどの酵素を添加し、同時にピキア・パストリスなどの微生物を植菌して、適当な温度で培養を行えば、残存するオリゴ糖の除去が可能である。
【００１９】
上記で得られた培養終了液から、微生物を除去することにより、高濃度のＧＧ溶液が得られる。微生物の除去は、遠心分離、ろ過などの常法により行なうことができる。微生物を除去した後の溶液は、必要に応じて、活性炭カラムクロマトグラフィー及びイオン交換カラムクロマトグラフィーなどを用いて培地成分等を除去することで、ＧＧの純度を高めることができる。
【実施例】
【００２０】
次に本発明の実施例を具体的に示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例で使用したピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、製品評価技術基盤機構にＮＢＲＣ  Ｎｏ．１０７７７として寄託されている。
【００２１】
［ＧＧ反応液の調製］
７０％（ｗ／ｗ）マルトトリオースシロップ３００ｍｌに６０％（ｗ／ｖ）グリセロール４００ｍｌ及びカビ（Ａｓｐ．  ｎｉｇｅｒ）由来のα−グルコシダーゼ製剤（トランスグルコシダーゼＬ−アマノ、天野エンザイム製）２ｍｌを添加後、攪拌しながら４０℃で２４時間反応させた。次いで７０％（ｗ／ｗ）マルトトリオースシロップ３００ｍｌを追添し、攪拌しながら４０℃で２４時間反応させた。この反応液を８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、ＧＧ反応液を得た。
【００２２】
［製造例１］
ＧＧ反応液の固形分が７％（ｗ／ｗ）になるように希釈し、これにカビであるリゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）由来のグルコアミラーゼ製剤（グルクザイムＡＦ６、天野エンザイム製）をＧＧ反応液の固形分１ｇ当たりに６、３０、６０または９０Ｕとなるように添加し、それぞれｐＨ５、４０℃で２４時間反応させた。
これらの反応液中に存在する三糖類、ニ糖類、グルコース、グリセロールおよびＧＧを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。ＨＰＬＣは、カラムにＳｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＣＲ１０１（Ｎ）（島津製作所製）を用い、カラム温度は５０℃とし、溶出液は水を用い、流速は毎分０．６ｍｌ、検出器に示差屈折率計を用いた。
結果は、図１の通りである。図１からグルコアミラーゼ製剤を固形分（基質）１ｇあたり３０Ｕ以上であれば十分効果が得られることがわかる。
【００２３】
［製造例２］
ＧＧ反応液２０ｍｌを固形分が３０％（ｗ／ｗ）になるように希釈して、カビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）由来のグルコアミラーゼ製剤（グルクザイムＡＦ６、天野エンザイム製）０．１４ｇを添加して、３０℃で２４時間反応させ、加水分解液を得た。この加水分解液に栄養培地成分（０．５％ペプトン、０．３％麦芽エキス、０．３％酵母エキス；いずれも最終濃度ｗ／ｖ）を添加して、固形分が最終的に３％（ｗ／ｖ）になるように希釈し、培養液を調製した。酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を植菌後、３０℃で１２０時間振とう培養を行った。その間の三糖類、ニ糖類、グルコース、グリセロールおよびＧＧの経時的変化を実施例１と同様に調べた。
結果は図２の通りである。図中、濃度（％）は全固形分量を１００％としたときの各成分の濃度の相対的な濃度を示す。図２から明らかな通り、２４時間後から培養液中のグルコース、グリセロールが減少し始め、１２０時間後には殆んどなくなっていることがわかる。
【００２４】
１２０時間後培養した後の培養液をイオン交換カラムクロマトグラフィー及び活性炭カラムクロマトグラフィーに付してＧＧ以外の他の残存成分を除去した。溶出液を減圧濃縮し、固形分７０％で純度８５％のＧＧシロップを約３ｇ得た。
【００２５】
［製造例３］
ＧＧ反応液に栄養培地成分（０．５％ペプトン、０．３％麦芽エキス、０．３％酵母エキス；いずれも最終濃度ｗ／ｖ）を添加して、ＧＧ反応液を固形分が５％（ｗ／ｖ）になるように希釈した。この培養液４０ｍｌに、リゾプス  ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）由来のグルコアミラーゼ製剤（グルクザイムＡＦ６、天野エンザイム製）を固形分１ｇに対して６０Ｕとなるように添加し、さらにピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を植菌し、３０℃で振とう培養を行った。７２時間後、培養液をＨＰＬＣで分析した。ＧＧ濃度は約１％でグルコース及びグリセロールは完全に消費されていた。
【００２６】
［製造例４］
製造例３で得られた培養液（培養３日目）にＧＧ反応液を、培養液に対し固形分３％（ｗ／ｖ）相当になるように添加し、３０℃で振とう培養した。４８時間後（培養開始後５日目）にグルコースおよびグリセロールの消費を確認した後、ＧＧ反応液を同様に固形分２％相当を添加し、４８時間培養した。４８時間後（培養開始後７日目）にさらにＧＧ反応液を固形分１．５％（ｗ／ｖ）相当を添加し、７２時間培養した。培養開始後の培養液中の各成分の濃度をＨＰＬＣで分析したときの経時的な変化は図３の通りである。
図３から分かるように、培養開始後１０日目のＧＧ濃度は約２．４７％、ＧＧ純度は全固形分中約６４％であった。
【００２７】
［製造例５］
製造例４で得られた培養液を遠心分離により酵母を沈殿させ、上清を常法に従い活性炭クロマトグラフ、イオン交換クロマトグラフィーで精製した。この溶出液を濃縮し、固形分７０％で純度約８５％のＧＧシロップ約１ｇを得た。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明は、低褐変性、低メイラード反応性、加熱安定性、非う蝕性、難消化性、高い保湿性を有する甘味物質であるＧＧを高い純度にかつ工業的に有利に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】製造例１の酵素反応（酵素量６，３０，６０または９０Ｕ）で得られる反応液中の各成分（三糖類、ニ糖類、グルコース、グリセロール、ＧＧ）をＨＰＬＣで分析した結果を示す図である。
【図２】製造例２の培養で得られる培養液中の各成分（三糖類、ニ糖類、グルコース、グリセロール、ＧＧ）を経時的にＨＰＬＣで分析した結果を示す図である。
【図３】製造例４の培養で得られる培養液中の各成分（三糖類、ニ糖類、グルコース、グリセロール、ＧＧ）を経時的にＨＰＬＣで分析した結果を示す図である。
【図２】
2008005735.tif 000005
【図３】
2008005735.tif 000006
【図１】
2008005735.tif 000007