(57)【要約】【課題】従来の微生物検出方法において、検体中にいた微生物が、生きているか、死んでいるものかがわからないという課題と、従来の方法では、蛍光スペクトルを取得する必要があるため、蛍光スペクトル取得ために鏡を複数枚用いた干渉光学系のような複雑な仕組みが必要であるという課題があり、この課題を解決する検体中の微生物の生死がわかる、検出構成の簡単な微生物検出方法を用いた微生物計測システムを提供を目的とする。【解決手段】第１の励起光源１と、第２の励起光源２と、第１の分光フィルター３と第２の分光フィルター４と、撮影手段５と、撮影された蛍光画像から発光点検出手段１２と、検出した発光点を、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物に分類する発光点分別手段１３と、発光点の個数を計測する発光点計測手段１４と、発光点の個数を表示する機能を備えたパソコンと１５を備えて構成される微生物計測システム。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を蛍光染色試薬用いて蛍光染色し、微生物の蛍光発光した画像を用いて微生物を検出、計測する装置において、全ての微生物を染色する総菌蛍光試薬と、死んだ微生物を染色する死菌蛍光試薬とを用いて染色した検体を蛍光させるための２種類の励起光源と、蛍光発光した発光点の蛍光を分離するための２種類の分光フィルターと、蛍光画像を撮影するための撮影手段と、前記２種類の励起光源と前記２種類の分光フィルターの組み合わせにより励起光波長より長い波長のみを通す分光フィルターを介して撮影される３種類の蛍光画像から蛍光発光点を検出する発光点検出手段と、検出した発光点を、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物に分別する発光点分別手段と、分別した発光点を計測する発光点計測手段とを備えて微生物の個数を計測する微生物計測システム。
【請求項２】
３種類の蛍光画像における発光点の検出手段を撮影画像の輝度値により行うようにした請求項１記載の微生物計測システム。
【請求項３】
３種類の蛍光画像において、発光点の座標のずれを補正する発光点位置補正手段を備えた請求項１または２のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項４】
微生物を捕集する手段にろ過フィルターを用いた請求項１乃至３のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項５】
微生物をろ過したろ過フィルターを保持した構造体を装着可能とした請求項１乃至４のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項６】
２種類の励起光を、ＬＥＤとした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項７】
２種類の励起光を、青色光と、緑色光とした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項８】
２種類の分光フィルターを緑色光を通過させる分光フィルターと、赤色光を通過させるフィルターとした請求項１乃至７のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項９】
撮影手段をＣＣＤカメラとした請求項１乃至８のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項１０】
蛍光画像の撮影前に撮影素子のノイズ画像を撮影する請求項１乃至９のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項１１】
微生物を捕集した捕集面を、複数箇所撮影するようにした請求項１乃至１０のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項１２】
微生物捕集用フィルター表面に金属蒸着を施した請求項１乃至１１のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項１３】
画像撮影面積と、微生物を捕集したフィルター全体の面積の比により１フィルターあたりの微生物数を推測する微生物数推測手段Ａを備えた請求項１乃至１２のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項１４】
捕集したサンプルの量から１ｍｌあたりの微生物の個数を推測する微生物数推測手段Ｂを備えた請求項１乃至１３のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項１５】
捕集する前に希釈したサンプルの希釈割合から、希釈前のサンプル中の微生物の個数を推測する微生物数推測手段Ｃを備えた請求項１乃至１４のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項１６】
捕集した微生物の蛍光染色を捕集したろ過フィルター上で行うようにした請求項１乃至１５のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項１７】
微生物の計測結果に異常があれば、警告音を発生させる警告発生手段を備えた請求項１乃至１６のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項１８】
染色試薬による染色の順番を、総菌蛍光試薬による染色を施した後、死菌蛍光試薬による染色を施すようにした請求項１乃至１７のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項１９】
染色試薬による染色の順番を、死菌蛍光試薬による染色を施した後、総菌蛍光試薬による染色を施すようにした請求項１乃至１８のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項２０】
染色試薬による染色を、総菌蛍光試薬と死菌蛍光試薬を混合した試薬による染色とした請求項１乃至１９のいずれかに記載の微生物計測システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光染色を施した微生物の蛍光画像を取得し、その蛍光画像を使って微生物を検出し、微生物の数を計測する計測システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来この種の微生物の検出方法としては特許文献１に示されたものが知られている。
以下この種の微生物検出方法について説明していく。
【０００３】
この方法は、１種類のＤＮＡ結合性蛍光色素を用いて、染色した試料中の微生物を含む蛍光スペクトル画像より、各ピクセルについて蛍光スペクトルを取得し、取得した試料の蛍光スペクトルの波形成分と、対照微生物蛍光スペクトル、夾雑物蛍光スペクトル、及びバックグラウンド蛍光スペクトルの波形成分とを比較して微生物の存在を検出する微生物検出方法が記載されている。
【特許文献１】特開２００２−２９１４９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記特許文献１のような従来の微生物検出方法では、微生物の存在は把握できても、検体中にいた微生物が、生きているか、死んでいるものかがわからないことと、蛍光スペクトルを取得する必要があるため、蛍光スペクトル取得のために鏡を複数枚用いた干渉光学系のような複雑な仕組みが必要であるという課題があり、検体中に存在している微生物が生きているものか、死んでいるものかを明確させることと、検出のための仕組みを簡単にすることすなわち構造を簡単にすることが要求されている。
【０００５】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、微生物の生死を判別するために２種類の蛍光試薬で染色し、分光フィルターによる蛍光分離を行う機能を備えることで、生物の生死を判定し、構造の簡単な微生物検出方法による微生物計測システムを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の微生物計測システムは、上記目的を達成するため、検体中の微生物を、２種類のＤＮＡ結合性蛍光染色試薬を用いて蛍光染色し、微生物の蛍光発光した画像を用いて微生物を検出、計測する装置において、全ての微生物を染色する総菌蛍光試薬と、死んだ微生物を染色する死菌蛍光試薬とを用いて染色した検体を蛍光させるための２種類の励起光源と、蛍光発光した発光点の蛍光を分離するための２種類の分光フィルターと、蛍光画像を撮影するための撮影手段と、前記２種類の励起光源と前記２種類の分光フィルターの組み合わせにより励起光波長より長い波長のみを通す分光フィルターを介して撮影される蛍光画像から蛍光発光点を検出する発光点検出手段と、検出した発光点を、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物に分別する発光点分別手段と、分別した発光点を計測する発光点計測手段とを備えて微生物の個数を計測する構成としたものである。
【０００７】
この構成により、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物を判別でき、装置構成の簡単な微生物計測システムを提供できる。
【０００８】
また他の手段は、発光点の検出手段を撮影画像の輝度値で行う構成としたものである。
【０００９】
この構成により、発光点が数値化された微生物計測システムが提供できる。
【００１０】
また、他の手段は、３種類の撮影された蛍光画像における発光点の座標のずれを補正する位置補正手段を備えた構成としたものである。
【００１１】
この構成により、発光点を正確に把握することができ、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物を精度よく計測できる微生物計測システムが提供できる。
【００１２】
また他の手段は微生物を捕集する手段にろ過フィルターを用いた構成としたものである。
【００１３】
この構成により、微生物を静止状態で計測できる微生物計測システムを提供できる。
【００１４】
また他の手段は微生物をろ過したろ過フィルターを保持した構造体を装着可能とした構成としたものである。
【００１５】
この構成により、微生物をろ過したフィルタ−を微生物計測のための計測装置への取り付けが容易である微生物計測システムを提供できる。
【００１６】
また他の手段は、２種類の励起光をＬＥＤとした構成としたものである。
【００１７】
この構成により、電源回路構成の簡単な微生物計測システムを提供できる。
【００１８】
また他の手段は、２種類の励起光を青色光と、緑色光とした構成としたものである。
【００１９】
この構成により、緑色蛍光と、赤色蛍光を発生させることができる微生物計測システムを提供できる。
【００２０】
また他の手段は、２種類の分光フィルターを緑色光を通過させる分光フィルターと、赤色光を通過させる分光フィルターとした構成としたものである。
【００２１】
この構成により、緑色の蛍光の分離と、赤色の蛍光の分離ができる微生物計測システムを提供できる。
【００２２】
また他の手段は、撮影手段をＣＣＤカメラとした構成としたものである。
【００２３】
この構成により、蛍光発光点を画像として取り込むことが可能な微生物計測システムが提供できる。
【００２４】
また、他の手段は、蛍光画像の撮影前に撮影素子のノイズ画像を撮影する構成としたものである。
【００２５】
この構成により、ノイズに影響されにくい計測ができる微生物計測システムが提供できる。
【００２６】
また他の手段は、微生物を捕集した捕集面を、複数箇所撮影する構成としたものである。
【００２７】
この構成により、微生物計測結果の推測値の精度を高めた微生物計測システムが提供できる。
【００２８】
また、他の手段は、微生物捕集用フィルター表面に金属蒸着を施した構成としたものである。
【００２９】
この構成により、励起光による反射の影響を受けにくい微生物計測システムが提供できる。
【００３０】
また、他の手段は、画像撮影面積と、微生物を捕集したフィルター全体の面積の比により１フィルターあたりの微生物数を推測する微生物数推測手段Ａを備えた構成としたものである。
【００３１】
この構成により、フィルター全体の面積を計測せずに、１フィルターあたりの微生物の個数を推測できる微生物計測システムが提供できる。
【００３２】
また、捕集したサンプルの量から１ｍｌあたりの微生物の個数を推測する微生物数推測手段Ｂを備えた構成としたものである。
【００３３】
この構成により、サンプル全体から、計測された微生物の個数の比較するレベルを統一できる微生物計測システムが提供できる。
【００３４】
また、他の手段は、捕集する前に希釈したサンプルの希釈割合から、希釈前のサンプル中微生物の個数を推測する微生物数推測手段Ｃを備えた構成としたものである。
【００３５】
この構成により、計測したサンプル全体の微生物の個数を推測できる微生物計測システムが提供できる。
【００３６】
また、他の手段は、捕集した微生物の蛍光染色を捕集したフィルター上で行うようにした構成としたものである。
【００３７】
この構成により、溶液中に染色試薬を投入する必要がないため、試薬を少量で試薬濃度を高い状態で染色できる微生物計測システムが提供できる。
【００３８】
また、他の手段は、微生物の計測結果が規定値以上であれば、警告音を発生する機能を有する構成としたものである。
【００３９】
この構成により、計測結果が規定値以上であることを、音声で知ることができる微生物計測システムが提供できる。
【００４０】
また、他の手段は、染色試薬による染色の順番を、総菌試薬による染色を施した後、死菌試薬による染色を施した構成としたものである。
【００４１】
この構成により、試薬による染色性を高めることのできる微生物計測システムが提供できる。
【００４２】
また、他の手段は、染色試薬による染色の順番を、死菌試薬による染色を施した後、総菌試薬による染色を施した構成としたものである。
【００４３】
この構成により、試薬の種類による染色性を高めることのできる微生物計測システムが提供できる。
【００４４】
また、他の手段は、染色試薬による染色を、総菌試薬と死菌試薬を混合した試薬による染色とした構成としたものである。
【００４５】
この構成により、染色手順の簡単な、微生物計測システムが提供できる。
【発明の効果】
【００４６】
本発明の微生物計数装置によれば、計測を行うサンプル中から検出した微生物が、生きているか死でいるかを判別することできるという効果と、蛍光スペクトルをとるための鏡を用いた光学干渉系といた複雑な仕組みのいらない構造の簡単な微生物検出方法が実現できるという効果を有する微生物計測システムを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明の請求項１記載の発明は、微生物を蛍光染色試薬用いて蛍光染色し、微生物の蛍光発光した画像を用いて微生物を検出、計測する装置において、全ての微生物を染色する総菌蛍光試薬と、死んだ微生物を染色する死菌蛍光試薬とを用いて染色した検体を蛍光させるための２種類の励起光源と、蛍光発光した発光点の蛍光を分離するための２種類の分光フィルターと、蛍光画像を撮影するための撮影手段と、前記２種類の励起光と、前記２種類の分光フィルターの組み合わせにより３種類の蛍光画像を撮影し、撮影した蛍光画像から蛍光発光点を検出する発光点検出手段と、検出した発光点を、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物に分別する発光点分別手段と、分別した発光点を計測する発光点計測手段とを備えたものであり、鏡を利用した干渉光学系といった複雑な仕組みを必要しない構造の簡単な微生物検出方法が実現でき、染色試薬による総ての微生物の蛍光発光画像と、死んだ微生物の蛍光発光画像と検体中の自家蛍光異物の発光画像を区別して撮影できるという作用を有する。
【００４８】
また、請求項２記載の発明は、３種類の蛍光発光画像の同一発光点を検出する手段を撮影画像の輝度値で行う構成としたことで、発光点の数値化が行えるという作用を有する。
【００４９】
また、請求項３記載の発明は、３種類の蛍光画像において、光の屈折による発光点の座標のずれを補正する機能を備えたことで、発光点の位置ずれをなくすことができ、同一発光点を精度よく検出できるという作用を有する。
【００５０】
また、請求項４記載の発明は、微生物を捕集する手段にろ過フィルターを用いたことで、微生物をろ過フィルター上に固定できるという作用を有する。
【００５１】
また、請求項５記載の発明は、微生物をろ過したろ過フィルターを保持した構造体を装着可能としたことで、微生物を含んだ検体を微生物計測装置に容易に装着できるという作用を有する。
【００５２】
また、請求項６記載の発明は、微生物計測装置に備えた２種類の励起光を、ＬＥＤとしたことで、低電流で蛍光発光させることができるという作用を有する。
【００５３】
また、請求項７記載の発明は、微生物計測装置に備えた２種類の励起光を、青色ＬＥＤと、緑色ＬＥＤとしたことで、２種類の蛍光試薬を発光させることができるという作用を有する。
【００５４】
また、請求項８記載の発明は、微生物計測装置に備えた２種類の分光フィルターを緑色光を通過させる分光フィルターと、赤色光を通過させる分光フィルターとしたことにより、蛍光発光成分のみを分離できるという作用を有する。
【００５５】
また、請求項９記載の発明は、撮影手段をＣＣＤカメラとしたことにより、撮影画像を電子データとして、加工ができるという作用を有する。
【００５６】
また、請求項１０記載の発明は、蛍光画像の撮影前に撮影素子のノイズ画像を撮影するようににたことで、撮影した蛍光画像上の撮像素子の影響によるノイズが除去できるという作用を有する。
【００５７】
また、請求項１１記載の発明は、微生物を捕集した捕集面を、複数箇所撮影するようにしたことにより、微生物を捕集した面を複数箇所計測できるという作用を有する。
【００５８】
また、請求項１２記載の発明は、微生物捕集用フィルター表面に金蒸着を施したことにより、フィルター表面の蛍光発光を抑えることができるという効果を有する。
【００５９】
また、請求項１３記載の発明は、画像撮影面積と、微生物を捕集したフィルター全体の面積の比により１フィルターあたりの微生物数を推測する微生物数推測手段Ａを備えたことにより、微生物の捕集面であるフィルター表面全域の撮影計測を行わなくても、ろ過した検体の微生物の数が推測できるという作用を有する。
【００６０】
また、請求項１４記載の発明は、捕集したサンプルの量から１ｍｌあたりの微生物の個数を推測する微生物数推測手段Ｂをそなえたことにより、他のサンプルとの計測結果の比較をしやすくできるという作用を有する。
【００６１】
また、請求項１５記載の発明は、捕集したサンプルの希釈割合から希釈する前の微生物の個数を推測する微生物数推測手段Ｃを備えたことにより、他のサンプル中に含まれる微生物の総数がわかるという作用を有する。
【００６２】
また、請求項１６記載の発明は、捕集した微生物の蛍光染色を捕集したフィルターの上で行うようにしたことにより、蛍光染色試薬の濃度を変えずに染色できるという作用を有する。
【００６３】
また、請求項１７記載の発明は、微生物の計測結果の異常があれば、警告音を発生する機能を有するようにしたことにより、計測結果異常の認知性をよくできるという作用を有する。
【００６４】
また、請求項１８記載の発明は、染色試薬による染色の順番を総菌染色試薬による染色を施した後に、死菌染色試薬による染色を施すようにしたことにより、総菌染色試薬の染色性を向上させることができるという作用を有する。
【００６５】
また、請求項１９記載の発明は、染色染色試薬による染色の順番を死菌染色試薬による染色を施した後に、死菌染色試薬による染色を施すようにしたことにより、死菌染色試薬の染色性を向上させることができるという作用を有する。
【００６６】
また、請求項２０記載の発明は、染色試薬による染色を総菌染色試薬と死菌染色試薬を混合させた染色として染色するようにしたことで、染色の時間を短縮できるという作用を有する。
【００６７】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１の微生物計測システムの構成図の一例である。
【００６８】
図１に示すように、微生物計測システムは、蛍光発光させるための第１の励起光源１と、第２の励起光源２と、励起光と蛍光発光を分離するための第１の分光フィルター３と第２の分光フィルター４と、蛍光画像を撮影する撮影手段５と、検体から発する蛍光を集光する対物レンズ６と、蛍光染色した検体と、検体を設置するためのステージ７と、ステージを移動させるための駆動部８と、励起光と蛍光発光を分離するための第１の分光フィルター３と第２の分光フィルター４とを切り替えるための分光フィルター切り替え手段９と、を制御するための制御基板１０とを備えた微生物計測装置本体１１と、制御基板１０に光源の点等命令や、蛍光画像の撮影命令、フィルターの切り替え命令等の制御信号と、撮影された画像から発光点を検出する発光点検出手段１２と、検出した発光点を、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物に分類する発光点分別手段１３と、発光点の個数を計測する発光点計測手段１４と、発光点の個数を表示する機能を備えたパソコン１５を備えて構成されている。
【００６９】
また、この構成おける微生物計測システムの機能は、総菌蛍光試薬と死菌蛍光試薬で蛍光染色を施した検体に、第１の励起光源１による励起光を照射し、第１の分光フィルター３を介して蛍光画像Ａを撮影し、撮影後、第２の分光フィルター４に切り替えて、蛍光画像Ｂを撮影し、次に励起光を第２の励起光源２に切り替えて、第２の励起光源２による励起光を照射し、第２の分光フィルター４を介して蛍光画像Ｃを撮影し、これらの蛍光画像Ａ、蛍光画像Ｂ、蛍光画像Ｃは、発光点検出手段１２により、発光点が検出され、検出された発光点は、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物に分別する発光点分別手段１３により分別され、分別された発光点を、計測する発光点計測手段１４により、生きた微生物、死んだ微生物、微生物の総数、夾雑物数を算出するようにしたものである。
【００７０】
また、この構成における、撮影手段５は、ＣＣＤイメージセンサーを用いたカメラまたは、ＭＯＳイメージセンサーなどを用いたカメラを用いる。
【００７１】
第１の励起光源１としては、紫外ＬＥＤと紫外光のみを透過させるフィルターを組み合わせた紫外光励起光源、青色ＬＥＤと青色光のみを通過させるフィルターを組み合わせた青色光励起光源、第２の励起光源２としては、青色ＬＥＤと青色光のみを通過させるフィルターを組み合わせた青色光励起光源、緑色ＬＥＤと緑光のみを通過させる緑色光励起光源などを用いて構成される。
【００７２】
本実施例では、第１の励起光源１、第２の励起光源２をともにＬＥＤとしたが、ＬＥＤの代わりに、レーザーを用いることも可能である。
【００７３】
第１の分光フィルター３は、青い光のみを通す青色分光フィルター、緑の光のみを通す緑色分光フィルター、第２の分光フィルター４は、緑の光のみを通す緑色分光フィルター赤の光のみを通す赤色分光フィルターなどが用いられ、第１の励起光源１、第２の励起光源２と第１も分光フィルター３、第２の分光フィルター４の組み合わせ例としては、第１の励起光源１に青色光励起光源、第１の分光フィルター３に、緑色分光フィルター、第２の励起光源２に緑色光励起光源、第２の分光フィルター４に、赤色分光フィルターを用いた方式や、他の例としては、第１の励起光源１に紫外光励起光源、第１の分光フィルター３に青色光分光フィルター、第２の励起光源２に青色光励起光源、第２の分光フィルター４に緑色分光フィルターを用いた方式などがある。
【００７４】
また、励起光は、組み合わせた分光フィルターが通過する波長成分の光を出さないように設計されており、分光フィルターは、組み合わせた励起光源の励起光成分を通過できないように設計されている。例えば、具体的には次のような波長特性を持った、励起光、分光フィルターとなる。青色光励起光源は、４５０ｎｍ〜４９０ｎｍの波長の光を照射する励起光源であり、紫外光励起光源は、３５０ｎｍから４００ｎｍの間の光を照射する励起光源であり、緑色光励起光源は、４９０ｎｍから５４０ｎｍの光を照射する励起光源である。また、分光フィルターは、青色分光フィルターは、４１０ｎｍ〜４９０ｎｍの光を通過させる特性をもち、緑色光分光フィルターは、５００ｎｍ〜５６０ｎｍの波長の成分を通過させる特性をもち、赤色光分光フィルターは、５７０ｎｍ〜７００ｎｍの波長成分を通過させる特徴をもつ分光フィルターとする構成もある。
【００７５】
本例に出てくる第１の分光フィルター３と第２の分光フィルター４の切り替えについては、分光フィルター切り替え手段９で行われ、分光フィルター切り替え手段９は、ソレノイドコイルなどの電磁磁石を用いて、非通電時は、第１の分光フィルター３とし、通電磁は、第２の分光フィルター４と切り替わるように働く。
【００７６】
制御基板１０については、第１の励起光源１、第２の励起光源２、撮影手段５、分光フィルター切り替え手段９などの電源の供給や、それぞれの部位のオン、オフを制御するよう働くものである。
【００７７】
発光点検出手段１２の一例としては、撮影された蛍光画像の輝度値により行う。発光点の輝度値が規定の輝度値以上の画素の集合体として検出するようにすることで、実現できる。例えば輝度値の規定値を１０とし、１０以上の画素の集合体を１発光点として検出することで行われる。
【００７８】
発光点の発光点分別手段１３の一例としては、青色励起光で全ての微生物が緑色発光する蛍光染色試薬と、緑色励起光で死んだ微生物のみが赤色発光する蛍光染色試薬を用いて検体を染色し、第１の励起光源１を青色光励起光源として検体を蛍光させ、第１の分光フィルター３に青色光分光フィルター用いて蛍光画像Ａを撮影し、続けて、第１の励起光源１を用い、分光フィルターを切り替えて、第２の分光フィルター４とし、第２の分光フィルター４に赤色光分光フィルターを用いて、蛍光画像Ｂを撮影し、続けて、励起光を第２の励起光源２に切り替えて、第２の励起光源２を緑色光励起光源として、前記第２の分光フィルター４を介して撮影し、蛍光画像Ｃを取得する。
【００７９】
この時、蛍光染色試薬としては、総菌蛍光試薬としてＳＹＴＯ２４、ＳＹＴＯ９、死菌蛍光試薬としては、ＳＹＴＯＸ・ＯＲＥＮＧＥ、プロピディウムイオダイドなどを用いることができる。
【００８０】
この場合、蛍光画像Ａに写っている発光点を、全ての微生物として計測し、蛍光画像Ｂに写っている発光点を夾雑物として計測し、蛍光画像Ｃに写っている発光点を死んだ微生物として計測する。蛍光画像Ａの発光点数から、蛍光画像Ｃの発光点数を差し引くことで、生きた微生物を分別することができる。
【００８１】
画像から、発光点を計測する発光点計測手段１４としては、発光点検出手段により検出された発光点と、発光点分別手段１３により分別された微生物、夾雑物の個数を各蛍光画像ごとにたしていくことで行われる。
【００８２】
また、この計測結果の表示機能は、パソコン１５に付属される、または機能としてもっている液晶画面で行われる。
【００８３】
また、ステージ７を駆動する駆動部８の役目は、撮影される蛍光画像の視野が、検体全体の一部であるため、検体全体を撮影するために、検体を一定の距離動かすことにある。この構成を備えたことにより、複数枚の蛍光画像を撮影することができる。
【００８４】
このようにして、微生物の検出を鏡を用いた干渉光学系という複雑な仕組みではなく、２種類の光源、カメラ、２種類の分光フィルターという簡単な構成で行え、かつ、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物に分離でき、また、検体中の生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物の個数を計測することができる微生物計測システムが提供できる。
【００８５】
（実施の形態２）
実施の形態１と同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【００８６】
図２は、本発明の実施の形態２の微生物計測システムの構成図の一例である。図２に示すように、図１に対して、発光点位置補正手段１６を追加した構成としたものである。
【００８７】
発光点位置補正手段１６としては、次のような方法で実現される。撮影された蛍光画像Ａと蛍光画像Ｂと、蛍光画像Ｃを第１の励起光源１、第２の励起光源２それぞれで蛍光し、第１の分光フィルター３、第２の分光フィルター４それぞれを介しても、蛍光を撮影することができる蛍光粒子を用いて蛍光画像撮影、蛍光画像Ａ、蛍光画像Ｂ、蛍光画像Ｃを撮影し、各蛍光画像のずれを画像を重ねることにより座標のずれを検出し、ずれの分だけの座標の移動をする位置補正を行い、蛍光画像Ａ、Ｂ、Ｃのうちのどれかに座標をあわせるように補正を行う。このように蛍光画像Ａ、Ｂ、Ｃの位置補正をすることで、蛍光染色した検体の蛍光画像を撮影した時に、それぞれの画像の座標に撮影されていない点があれば、その蛍光点が撮影されている蛍光画像によって、発光点は菌か生菌か死菌か夾雑物かを判断できる。
【００８８】
この時の位置補正手段は、蛍光画像Ａと蛍光画像Ｃだけで行うことも可能である。
【００８９】
また、ここで使用する蛍光粒子は、モリテックス社のＲ０１００などがよい。
【００９０】
また、検体を作成する場合に微生物をろ過して行うが、ろ過する時にフィルターを用いる。このろ過フィルター１７は、一例として、穴径が０．４μｍのものを使用する。この穴径とすることで、より小さな微生物も捕集し、計測することが可能となる。
【００９１】
また、ろ過フィルター１７の穴径を０．４μｍ程度の小さな穴径とすることで、ろ過フィルター１７上に染色用試薬をのせることができ、ろ過フィルター上で微生物の蛍光染色が行うことができるようになる。
【００９２】
また、ろ過フィルター１７に金属薄膜を蒸着することで、ろ過フィルター１７面の自家蛍光を押さえることができ、蛍光画像の発光点と、ろ過フィルター１７面との輝度の差がつき、より蛍光を認識しやすい構成が実現できる。
【００９３】
この時、使用する金属としては、金、チタン、銅など自家蛍光しにくい金属がよい。蒸着薄膜の厚みとしては、ろ過フィルター１７自体の自家蛍光を押さえるために、３０ｎｍ以上とすることが望ましい。ただ、薄膜の厚みを厚くしていくとろ過フィルター１７のコストアップにつながるため、自家蛍光が押さえられる、最も薄い膜厚にすることが最適な膜厚となる。
【００９４】
また、微生物の蛍光染色方法としては、次の３通りで実施することができる。全微生物を染色する総菌蛍光試薬と、死んだ微生物を染色する死菌蛍光試薬により、染色する順序を、第１の方法として、総菌蛍光試薬を微生物をろ過したろ過フィルター１７上に適量のせて染色したのち、一旦総菌蛍光試薬をろ過し、次に同様な手順で適量の死菌蛍光蛍光試薬で染色を行う。計測時に総菌をよりはっきり画像として捕らえたい場合は、先に総菌蛍光試薬で染色することで、全微生物が染色されやすく、より強い蛍光発光をすることができるため、第１の方法がよい。
【００９５】
この場合適量とは、約１００μｌである。
【００９６】
第２の方法としては、死菌蛍光試薬を微生物をろ過したろ過フィルター１７上に適量のせて染色したのち、一旦死菌蛍光試薬をろ過し、次に同様な手順で適量の総菌蛍光試薬で染色を行う。計測時に死菌をよりはっきり画像として捕らえたい場合は、先に死菌蛍光試薬で染色することで、死んだ微生物が染色されやすく、より強い蛍光発光をすることができるため、第２の方法がよい。
【００９７】
この場合の適量とは、約１００μｌである。
【００９８】
第３の方法としては、総菌蛍光染色と死菌蛍光染色を同時に行う方法である。微生物をろ過したろ過フィルター１７上に総菌蛍光染色と死菌蛍光染色を同時に若しくは、それぞれの試薬をろ過せずに適量のせて染色する方法である。この方法では、試薬の染色時間を前記第１の方法、第２の方法に比べて半分にすることが可能であるという特徴がある。次に同様な手順で適量の総菌蛍光試薬で染色を行う。できるだけ早く計測を行いたいときは、第３の方法がよい。
【００９９】
この場合の適量とは、約５０μｌである。このときの各試薬の濃度は、第１、第２の方法に対して、２倍の濃度とするのがよい。
【０１００】
このような構成にすることで、小さな微生物が捕集でき、蛍光発光をきれいに捕らえられることすなわち蛍光を認識しやすくできることで、実施の形態１に記載した微生物計測システムより、計測精度の向上した微生物計測システムが提供できる。
【０１０１】
（実施の形態３）
実施の形態１または２と同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【０１０２】
図３は、本発明の実施の形態３のろ過フィルター１７を保持した構造体とをろ過フィルター保持部１８を装着可能としたステージ７の構成図の一例である。
【０１０３】
ろ過フィルター保持部１８はろ過フィルター１７を挟み込む構造と、ろ過フィルター１７を保持する構造と、ろ過フィルター保持部１８の位置を決める構造を備えて構成され、ステージ７は、ろ過フィルター１７を受け止める構造と、ろ過フィルター保持部１８を受け止める構造と、ろ過フィルターの保持部１８の位置を決めるための突起部をはめ込む溝を備えたステージ７から構成される。ろ過フィルター保持部１８の受け止め部は、ろ過フィルター保持部１８が装着された場合、ろ過フィルター１７がろ過フィルター受け止め部で受け止められた時、ろ過フィルター保持部１８とろ過フィルター受け止め部は、ろ過フィルターの平面度を上げるために、少し隙間があき直接は当たらない構造としている。その隙間は１０μｍから２００μｍである。
【０１０４】
こうすることで、検体と、カメラの間を一定に保つことができ、安定したピント精度の画像を取得することができ、計測精度を安定させることができる。
【０１０５】
実施の形態１と同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【０１０６】
（実施の形態４）
実施の形態１乃至３のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【０１０７】
図４は、本発明の実施の形態４の微生物計測システムの構成図の一例である。図４に示すように、図２に対して、ノイズ画像撮影手段１９及びノイズ画像除去手段２０を追加した構成としたものである。
【０１０８】
ノイズ画像撮影手段１９は、パソコン１５からの信号により、励起光を照射せずに撮影手段５によりノイズ画像を取得することで行われる。
【０１０９】
この時、撮影手段５により撮影された画像の露光時間は、蛍光画像撮影時よりも長い時間とする。例えば６秒の蛍光画像撮影時間であれば、ノイズ画像撮影手段１９は、１０秒の露光時間とする。このようにすることにより、撮影手段５から発生する画像上の一定したノイズを撮影することができ、蛍光画像Ａ、Ｂ、Ｃ、と比較することで、蛍光画像上のノイズを特定することができる。
【０１１０】
また、ノイズ除去手段２０は、撮影した蛍光画像とノイズ画像撮影手段１９で撮影した前記ノイズ画像を比較し、前記ノイズ画像に存在するノイズ発光点を、前記蛍光画像から削除することで、行われる。削除する方法の一例としては、蛍光画像と、ノイズ画像を重ね合わせ、画像同士を減算する方法等で行われる。
【０１１１】
このように、ノイズ画像を撮影し、蛍光画像からノイズの発光点を除去することで、計測制度の高い、微生物計測システムが提供できる。
【０１１２】
（実施の形態５）
実施の形態１乃至４のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。図５は、本発明の実施の形態５の微生物計測システムの構成図の一例である。図４に示すように、図４に対して、ろ過フィルター１７全体の面積と計測した蛍光画像の面積比から微生物数を推測する微生物数推測手段Ａ２１を追加した構成としたものである。
【０１１３】
本構成による微生物推測手段Ａ２１は、次のようにして実現される。
【０１１４】
ろ過フィルター１７全体の面積をあらかじめ、パソコン１５から入力しておき、撮影した蛍光画像の面積との比を計算し、撮影した蛍光画像の全面積中の微生物数を計測し、計測した結果にろ過フィルター１７の全面積と、撮影全面積の比を掛け合わせろ過フィルター１７全面積中の全微生物数を計算することで行われる。
【０１１５】
計算式としては、次のようになる。
【０１１６】
全微生物数（ろ過フィルター１７全面積中）
＝（ろ過フィルター１７全面積／蛍光画像撮影全面積）＊蛍光画像撮影全面積中の微生物計測数
このような方法で、ろ過フィルター１７全面積の微生物数を推測することができるようにすることで、検査対象の検体中の微生物に個数を、ろ過フィルター１７全面積を計測しなくても、わかるため、迅速に検査検体中の微生物数を把握することができる微生物計測システムが提供できる。
【０１１７】
（実施の形態６）
実施の形態１乃至５のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。図６は、本発明の実施の形態６の微生物計測システムの構成図の一例である。図６に示すように、図５に対して、１ｍｌ中の微生物数を推測する微生物数推測手段Ｂ２２を追加した構成としたものである。
【０１１８】
本構成による微生物推測手段Ｂ２２は、次のようにして実現される。
【０１１９】
ろ過する検体の量をあらかじめ、パソコン１５から入力しておき、計測結果を推測したろ過フィルター１７全面積中の微生物数をろ過したろ過量から、１ｍｌあたりの量に換算するよう計算することで行われる。
【０１２０】
計算式としては、次のようになる。
【０１２１】
１ｍｌあたりの微生物数
＝（ろ過フィルター１７全面積中の微生物数の推測値）＊（１ｍｌ／ろ過量ｍｌ）
このような計算にて１ｍｌの微生物数を推測することにより、いろんな検体の混入量を一定の基準で評価することができ、微生物の混入量の比較が容易な微生物計測システムが提供できる。
【０１２２】
（実施の形態７）
実施の形態１乃至６のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。図７は、本発明の実施の形態７の微生物計測システムの構成図の一例である。図７に示すように、図６に対して、採取サンプル中の微生物数を推測する微生物数推測手段Ｃ２３を追加した構成としたものである。
【０１２３】
本構成による微生物推測手段Ｃ２３は、次のようにして実現される。
【０１２４】
採取したサンプルを希釈して使用する場合、希釈した割合（希釈倍率）を、計測前にパソコン１５に入力しておき、計測結果を推測したろ過フィルター１７全面積中の微生物数をろ過したろ過量から、１ｍｌあたりの量に換算し、その結果を希釈割合倍する計算をすることで行われる。
【０１２５】
計算式としては、次のようになる。
【０１２６】
採取サンプルの微生物数
＝（ろ過フィルター１７全面積中の微生物数の推測値）＊（１ｍｌ／ろ過量ｍｌ）＊希釈倍率
このような計算にて採取したサンプル内の微生物数を推測でき、このようにサンプルの中の微生物数がわかることで、そのサンプルの微生物汚染状況を、直接確認することができる微生物計測システムが提供できる。
【０１２７】
（実施の形態８）
実施の形態１乃至７のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。図８は、本発明の実施の形態８の微生物計測システムの構成図の一例である。図８に示すように、図７に対して、警告発生手段２４を追加した構成としたものである。
【０１２８】
本構成による警告発生手段２４は、次のようにして実現される。
【０１２９】
発光点計測手段１４、微生物数推測手段Ａ２１、微生物数推測手段Ｂ２２、微生物数推測手段Ｃ２３により計測された微生物数は、あらかじめ、異常と判定できる数値をパソコン１５より入力し、例えば、微生物数上限値を超えた場合、または、規定発光点面積上限値を超えた場合に、警告発生手段２４により、パソコン１５から警告音を発生させたり、パソコン１５の画面に異常を知らせるメッセージを表示することにより行われる。
【０１３０】
たとえば、この場合の微生物数上限値は、３０万個とすると、微生物数推測Ａ２１．微生物推測手段Ｂ２２、微生物推測手段Ｃ２３のそれぞれの微生物推測手段に応じて３０万個を超えたか超えてないかで、異常を判断し、各手段に応じた警告表示を音声や画面で行うようようにする。
【０１３１】
このように警告発生手段２４を備えることで、計測結果に異常があった場合速やかに異常を確認することができ、サンプルに対する対応が早くすることが可能な、微生物計測システムが提供できる。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明の計測システムは、蛍光染色を施した微生物の蛍光画像を取得し、その蛍光画像を使って微生物を検出することができ、食品工場、医薬品工場、病院などでの、細菌、真菌などの微生物検出などの用途にも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】本発明の実施の形態１の微生物計測システムの構成図
【図２】本発明の実施の形態２の微生物計測システムの構成図
【図３】本発明の実施の形態３のフィルター装着構造の構成図
【図４】本発明の実施の形態４の微生物計測システムの構成図
【図５】本発明の実施の形態５の微生物計測システムの構成図
【図６】本発明の実施の形態６の微生物計測システムの構成図
【図７】本発明の実施の形態７の微生物計測システムの構成図
【図８】本発明の実施の形態８の微生物計測システムの構成図
【符号の説明】
【０１３４】
１    第１の励起光源
２    第２の励起光源
３    第１の分光フィルター
４    第２の分光フィルター
５    撮影手段
６    対物レンズ
７    ステージ
８    駆動部
９    分光フィルター切り替え手段
１０  制御基板
１１  微生物計測装置本体
１２  発光点検出手段
１３  発光点分別手段
１４  発光点計測手段
１５  パソコン
１６  発光点位置補正手段
１７  ろ過フィルター
１９  ノイズ画像撮影手段
２０  ノイズ画像除去手段
２１  微生物数推測手段Ａ
２２  微生物数推測手段Ｂ
２３  微生物数推測手段Ｃ
２４  警告発生手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008005754.tif 000007
【図６】
2008005754.tif 000008
【図７】
2008005754.tif 000009
【図８】
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