(57)【要約】【課題】FFRPと、その会合に異なる効果を持つ複数のリガンドとの複合体の立体構造を、高分解能かつ高い精密度で決定し、両構造を比較・解析することにより、FFRPとリガンドの相互作用の詳細を解明し、FFRPを介した微生物の代謝、増殖あるいは感染を制御する薬剤の設計又はスクリーニング方法を提供する。【解決手段】配列番号１に示されるFFRP DM1アミノ酸配列と３０％以上の相同性を有する標的FFRP配列において、前記FFRP DM1アミノ酸配列の１５、３３、３５、３９、５６、５７、６１、６９、７０、７１、及び７５位から選ばれる1又は２以上に相当する位置のアミノ酸残基を特定し、前記アミノ酸残基の立体構造情報、または当該アミノ酸残基と候補物質との相互作用に基づき、標的FFRPのリガンド候補を決定することを特徴とする、FFRPのリガンド設計あるいはスクリーニング方法、ならびに前記方法を利用した微生物の代謝、増殖及び感染から選ばれる、少なくとも一つ以上を制御する薬剤の設計あるいはスクリーニング方法。【選択図】図１
2008157807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるFFRP DM1アミノ酸配列と３０％以上の相同性を有する標的FFRP配列において、前記FFRP DM1アミノ酸配列の１５、３３、３５、３９、５６、５７、６１、６９、７０、７１、及び７５位から選ばれる1又は２以上に相当する位置のアミノ酸残基を特定し、
前記アミノ酸残基の立体構造情報、または当該アミノ酸残基と候補物質との相互作用に基づき、標的FFRPのリガンド候補を決定することを特徴とする、FFRPのリガンド設計あるいはスクリーニング方法。
【請求項２】
前記アミノ酸残基の立体構造情報、または当該アミノ酸残基と候補物質との相互作用に基づき、標的FFRPの会合状態あるいは立体構造が候補物質の結合により変化する場合に、前記候補物質を標的FFRPのリガンド候補と決定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的FFRP配列のFFRP DM1アミノ酸配列の１５、３３、３５、３９、５６、５７、６１、６９、７０、７１、及び７５位から選ばれる1又は２以上に相当する位置のアミノ酸残基が、標的FFRP配列とFFRP DM1アミノ酸配列とのアラインメントにしたがって特定されるものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的FFRP配列のFFRP DM1アミノ酸配列の１５、３３、３５、３９、５６、５７、６１、６９、７０、７１、及び７５位から選ばれる1又は２以上に相当する位置のアミノ酸残基が、図１に示されるアラインメントにしたがって特定されるものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記標的FFRP配列のFFRP DM1アミノ酸配列の１５、６９、７０、及び７１位に相当する位置のアミノ酸残基の立体構造情報、または前記アミノ酸残基と候補物質との相互作用から、標的FFRPがアミノ酸をリガンドとするかどうかを判定する工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的FFRP配列のFFRP DM1アミノ酸配列の１５、３３、３５、３９、５６、５７、６１、６９、７０、７１、及び７５位から選ばれる1又は２以上に相当する位置のアミノ酸残基の立体構造情報、および当該アミノ酸残基と候補物質との相互作用に基づいて、標的FFRPのリガンド候補を決定することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法を利用した、微生物の代謝、増殖及び感染から選ばれる、少なくとも一つ以上を制御する薬剤の設計あるいはスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤のスクリーニング方法に関する。より詳細には、FFRPとリガンドとの複合体の立体構造に基づき、抗微生物薬をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの細菌の代謝、増殖、感染、及び環境への適応は、互いに類似する一連の蛋白質によって制御されている。FFRP（Feast/Famine  Regulatory  Protein）と総称される、この蛋白質群は、DNA上のプロモーター領域に結合し、下流に位置する遺伝子の転写を制御する。FFRPの名称は、発明者らの発案によるが（非特許文献１）、このグループに含まれる大腸菌のLrp（Leucine−Responsive  Regulatory  Protein）の機能を総括する、「Feast/Famine  Regulation（饗宴−飢餓・制御）」という米国の研究者らの表現に由来する（非特許文献２）。
【０００３】
FFRP蛋白質と相互作用する、自然界の、あるいは人工のリガンドを見つけることができれば、細菌の代謝、増殖、感染、及び環境への適応を制御する、あるいは、阻止することが可能になる。
【０００４】
発明者らは、古細菌Pyrococcus sp. OT3由来のFFRPの一つ、DM1（pot1216151）を結晶化したが、このFFRPは、その生産に用いた大腸菌細胞から未知のリガンドを取り込んで結晶化していた。未知リガンドは電子密度分布からバリン程度の大きさを持つと推定されたが、その分子種を特定するには至らなかった。発明者らは、このFFRPの立体構造、特に、未知リガンドに近接するFFRP部位の立体構造に基づき薬剤をスクリーニングする方法について特許出願した（特許文献１及び２）が、未知リガンドとDM1の化学結合が特定されず、また未知リガンド1種類のみとの複合体に関する立体構造情報しか得られていなかったため、上記の方法で、FFRPのアミノ酸配列のみから自然界のリガンドを推定するためには、ある程度の実験操作が必要であった。
【０００５】
その後、発明者らは、P. OT3が持つ１４種のFFRP中の別のFL11（pot0434017）を結晶化し、その立体構造を決定した(非特許文献３)。また、別のグループにより、Pyrococcus furiosusのLrpA (非特許文献４)とBacillus subtilisのLrpC (非特許文献5)が結晶化され、その立体構造が決定されたが、いずれの結晶にもリガンドは含まれていなかった。
【０００６】
このグループが結晶化した、大腸菌のAsnC（Asparagine Synthesis C Gene Product）の場合、当初、リガンドと考えられていたアスパラギンが、実は大腸菌AsnCの会合状態を変化させないことが結晶化の際に明らかになった(非特許文献５)。それにもかかわらず、同グループがアスパラギン存在下に大腸菌AsnCを結晶化したところ、結晶中にアスパラギン分子は含まれたものの、アスパラギン分子とAsnCの間には、多数の水分子が介在していた。このように一応の結晶化が可能であったとしても、AsnCの会合状態を変化させるデータがない以上、アスパラギンは大腸菌AsnCのリガンドとは呼べず、したがって、この結晶構造も、FFRPとリガンドの複合体ではない。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１８５６５０号
【特許文献２】特開２００５−００８５９５号
【非特許文献１】Koike, H., Sakuma, M., Mikami, A., Amano, N. & Suzuki, M., 2003, A possible disk to cylinder transition of assemblies of feast/famine regulatory proteins. Proc. Jpn Acad. B79, 63-69
【非特許文献２】Calvo, J. M. & Matthews, R. G., 1994, The leucine-responsive regulatory protein, a global regulator of metabolism in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 58, 466-490
【非特許文献３】Koike, H., Ishijima, S. A., Clowney, L.. & Suzuki, M., 2004, The archaeal feast/famine regulatory protein: potential roles of its assembly forms for regulating transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 2840-2845
【非特許文献４】Leonard, P. M., Smits, S. H. J., Sedelnikova, S. E., Brinkman, A. B., de Vos, W. M., van der Oost, J., Rice, D. W. & Rafferty, J. B., 2001, Crystal structure of the Lrp-like transcription regulator from the arcahaeon Pyrococcus furiosus. EMBO J. 20, 990-997
【非特許文献５】Thaw, P., Sedelnikova, S. E., Muranova, T., Wiese, S., Ayora, S., Alonso, J. C., Brinkman, A. B., Akerboom, J., van der Oost, J. & Rafferty, J. B., 2006, Structural insifght into gene transcriptional regulation and effector binding by the Lrp/AsnC family. Nucl. Acids Res. 34, 1439-1449
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
FFRPと、その会合に異なる効果を持つ複数のリガンドとの複合体の立体構造を、高分解能かつ高い精密度で決定し、両構造を比較・解析することにより、FFRPとリガンドの相互作用の詳細を解明し、FFRPを介した微生物の代謝、増殖あるいは感染を制御する薬剤の設計又はスクリーニング方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、鋭意努力の結果、古細菌Pyrococcus sp. OT3（別名：Pyrococcus horikoshii、あるいは、Pyrococcus shinkaii、Japan Collection of Microorganisms  登録番号  JCM9974）由来のFFRPの一つDM1（pot1216151）とセレノメチオニンの複合体を結晶化することに成功した。この複合体は、未知リガンドを抱き込んだ結晶（特開２００３−１８５６５０号、特開２００５−００８５９５号参照：以下、「“元”結晶」という）中にセレノメチオニンを誘導し、“元”結晶に含まれる大腸菌リガンドをセレノメチオニンで置換することにより得られた。
【００１０】
セレノメチオニン中のSe原子の異常X線散乱を使って、セレノメチオニン複合体の立体構造を高分解能かつ精密に決定した。この結果、DM1とセレノメチオニンの相互作用の詳細が明らかになった。
【００１１】
さらに、セレノメチオニン複合体の立体構造に関する情報を基に、“元”結晶の構造を精密化し、大腸菌から取り込まれた未知のリガンドがイソロイシンであることを解明した。これにより、この複合体中のイソロイシンとDM1の相互作用の詳細が明らかになった。溶液中でイソロイシンはDM1の八量体への会合を促進するが、セレノメチオニンあるいはメチオニンの会合促進効果はより低く、条件によってはDM1を二量体へと解離させる。二つの立体構造を比較、解析した結果、セレノメチオニンとイソロイシン、２種のアミノ酸の主鎖の認識に常に関与するDM1のアミノ酸残基、２種のアミノ酸の側鎖を識別するDM1のアミノ酸残基と化学結合様式が明らかになった。これにより、DM1の会合へのメチオニンとイソロイシンの効果が異なる理由も明らかになった。
【００１２】
上記の知見を元に、いくつかのFFRPのアミノ酸配列からそのリガンドを予測し、この予測が正しいことを実証した。さらに、各リガンドとの相互作用の会合状態への効果の違いを説明した。これにより、FFRPと作用するリガンド一般が持つべき特徴が明らかになった。
【００１３】
すなわち、本発明は、FFRPのリガンド設計あるいはスクリーニング方法であって、配列番号１に示されるFFRP DM1アミノ酸配列と３０％以上の相同性を有する標的FFRP配列において、前記FFRP DM1アミノ酸配列の１５、３３、３５、３９、５６、５７、６１、６９、７０、７１、及び７５位から選ばれる1又は２以上に相当する位置のアミノ酸残基を特定し、前記アミノ酸残基の立体構造情報、または当該アミノ酸残基と候補物質との相互作用に基づき、標的FFRPのリガンド候補を決定することを特徴とする方法に関する。
【００１４】
前記方法において、例えば、アミノ酸残基の立体構造情報、または当該アミノ酸残基と候補物質との相互作用に基づき、標的FFRPの会合状態あるいは立体構造が候補物質の結合により変化する場合に、前記候補物質を標的FFRPのリガンド候補と決定することができる。
【００１５】
例えば、標的FFRPの会合あるいは解離が促進される場合、具体的には、標的FFRPの会合による四量体や八量体形成、あるいはそのような会合体の二量体や単量体への解離が促進される場合、前記候補物質は前記薬剤候補として適切であると評価できる。
【００１６】
また、前記標的FFRP配列のFFRP DM1アミノ酸配列の１５、３３、３５、３９、５６、５７、６１、６９、７０、７１、及び７５位から選ばれる1又は２以上に相当する位置のアミノ酸残基は、例えば、標的FFRP配列とFFRP DM1アミノ酸配列とのアラインメントにしたがって特定することができる。そのようなアラインメントの1例を図１に示す。
【００１７】
ある実施形態において、本発明の方法は、前記標的FFRP配列のFFRP DM1アミノ酸配列の１５、６９、７０、及び７１位に相当する位置のアミノ酸残基の立体構造情報、または前記アミノ酸残基と候補物質との相互作用から、標的FFRPがアミノ酸をリガンドとするかどうかを判定する工程を含む。このようにして、アミノ酸をリガンドとするFFRPであるかどうかを判定してから、FFRPの自然界のリガンド（すなわち、アミノ酸）を特定する。
【００１８】
標的FFRPのリガンド候補は、前記標的FFRP配列のFFRP DM1アミノ酸配列の１５、３３、３５、３９、５６、５７、６１、６９、７０、７１、及び７５位から選ばれる1又は２以上に相当する位置のアミノ酸残基の立体構造情報と、当該アミノ酸残基と候補物質との相互作用のいずれかに基づいて決定してもよいし、その両方に基づいて決定してもよい。
【００１９】
上記の方法によって決定されたリガンドは、微生物の代謝、増殖及び感染から選ばれる、少なくとも一つ以上を制御する薬剤として利用可能である。本発明はそのような薬剤の設計あるいはスクリーニング方法も提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、様々なFFRPとリガンドの相互作用の一般的な機構の解明、及びFFRP機能の制御を介した新規な抗微生物薬（微生物の代謝、増殖あるいは感染を制御する薬剤）の設計又はスクリーニングが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．FFRP（Feast/Famine Regulatory Protein）
本発明にかかる「FFRP」は、外界の栄養状態の変化を感知して、細菌の代謝、増殖、感染を制御する蛋白質である。FFRPの名称はこのグループに含まれる大腸菌のLrp（Leucine-Responsive Regulatory Protein）の機能を総括する「Feast/Famine Regulation（饗宴−飢餓制御）」という表現に由来する。大腸菌では、3種のFFRP：Lrp、Asn C、及び機能未解明のFFRPが存在することが確認されている。その他、Pyrococcus属、Sulfolobus属等、多くの細菌でFFRPの存在が確認されている。
【００２２】
FFRPの作用は、その制御下にある遺伝子上流のプロモーター領域にFFRPが結合し、これら遺伝子の転写を活性化もしくは不活性化することにより発揮される。そして、プロモーター領域へのFFRPの結合、解離は、外界の栄養状態を反映する何らかの低分子物質がFFRPの立体構造変化（会合状態の変化）をおこさせ、プロモーターDNAへのFFRPの結合能を変化させるためと予測されている。本発明は、このFFRPに特異的に結合し、その立体構造あるいは会合状態の変化を通じて、細菌の代謝、増殖、感染を制御し、細菌の増殖を阻止あるいは死滅させる薬剤のスクリーニング方法に関する。
【００２３】
なお、本発明において「標的FFRP」とは、薬剤（リガンド）設計あるいはスクリーニングの対象となるFFRPであって、たとえば、図１に示されるようなPutR, DM3, FL9, LysM, FL11, Lrp, FL8, FL4, FL5, DM2, TvDM, TvFL3, YbaO, AldR, MdeR, BkdR, Grp, AsnC2等のアミノ酸配列が既知のFFRPを挙げることができる。
【００２４】
２．FFRPリガンド−微生物の代謝、増殖あるいは感染を制御する薬剤の設計又はスクリーニング方法
FFRPによる転写制御には、外界の栄養状態を反映した低分子物質（リガンド）の結合によるFFRPの立体構造変化と、それによるプロモーター領域への結合能力の変化が関与することが予測されている。具体的にいえば、つまり、FFRPの会合状態を変化させる化合物は、FFRPの転写制御を通じて、細菌の代謝、増殖、あるいは感染を変化させる薬剤（抗微生物薬）として有用である。
【００２５】
すなわち、本発明は、FFRP又はFFRP会合体に特異的に結合し、その立体構造あるいは会合状態を変化させる低分子物質（リガンド）を薬剤候補として選択することを特徴とする、微生物の代謝、増殖、あるいは感染を制御する薬剤の設計あるいはスクリーニング方法を提供する。
【００２６】
発明者らは、古細菌Pyrococcus sp. OT3（別名：Pyrococcus horikoshii、あるいは、Pyrococcus shinkaii、Japan Collection of Microorganisms  登録番号  JCM9974）由来のFFRPの一つDM1（pot1216151）とセレノメチオニンとの複合体を結晶化することに成功した。そして、セレノメチオニン中のSe原子の異常X線散乱を使って、このセレノメチオニン-FFRP複合体の立体構造を高分解能かつ精密に決定した。その結果、リガンドであるセレノメチオニンと相互作用するDM1のアミノ酸位置の詳細が明らかになった。
【００２７】
すなわち、配列番号１に示されるDM1アミノ酸配列の１５位のグルタミン酸、３３位のバリン、３５位のチロシン、３９位のアスパラギン酸、５６位のイソロインシン、５７位のトレオニン、６１位のアルギニン、６９位のトレオニン、７０位のセリン、７１位のトレオニン、及び７５位のイソロイシンの立体構造情報、あるいは前記アミノ酸残基とリガンドとの相互作用が、DM1の会合に重要であることがわかった。
【００２８】
なかでも、１５位のグルタミン酸、６９位のトレオニン、７０位のセリン、７１位のトレオニンの立体構造情報、あるいは前記アミノ酸残基との相互作用が、DM1がアミノ酸をリガンドとするかどうかの決定に重要であることがわかった。
【００２９】
さらに、他のFFRPについては、図１に示すように、上記のDM1のアミノ酸配列と他のFFRPアミノ酸配列をアラインメントし、その対応関係から、DM1以外のアミノ酸をリガンドとしうる全てのFFRPに関して、リガンドとの相互作用に重要なアミノ酸位置を特定することができる。FFRPかどうかの判定は、相同性を認める一般的な限界である、３０％程度（いわゆるトワイライトゾーン）以上の相同性を持つアミノ酸配列に適用することができる。すなわち、配列番号１に示されるFFRP DM1アミノ酸配列と３０％以上の相同性を有する標的FFRP配列において、前記FFRP DM1アミノ酸配列の１５、３３、３５、３９、５６、５７、６１、６９、７０、７１、及び７５位から選ばれる1又は２以上に相当する位置のアミノ酸残基を特定し、前記アミノ酸残基の立体構造情報、または当該アミノ酸残基と候補物質との相互作用に基づき、標的FFRPのリガンド候補を決定することができる。
【００３０】
具体的にいえば、DM1以外のFFRPについては、図１のようなアライメントに基づき、配列番号１に示されるDM1のアミノ酸配列の１５、３３、３５、３９、５６、５７、６１、６９、７０、７１、及び７５位に相当する位置のアミノ酸残基を特定し、前記アミノ酸残基の立体構造情報、あるいは前記アミノ酸残基とリガンドとの相互作用から、前記候補物質がFFRPの会合状態や立体構造に与える影響を知ることができる。リガンド候補は、前記標的FFRP配列のFFRP DM1アミノ酸配列の１５、３３、３５、３９、５６、５７、６１、６９、７０、７１、及び７５位から選ばれる1又は２以上に相当する位置のアミノ酸残基の立体構造情報と、当該アミノ酸残基と候補物質との相互作用のいずれかに基づいて決定してもよいし、その両方に基づいて決定してもよい。
【００３１】
特に、DM1アミノ酸配列の１５、６９、７０、及び７１位に相当する位置のアミノ酸残基の立体構造情報、または前記アミノ酸残基と候補物質との相互作用は、標的FFRPがアミノ酸をリガンドとするかどうかを判定するために重要である。つまり、自然界のリガンドとしてアミノ酸の中に候補を探索する場合は、リガンド候補決定に先立って、まずDM1アミノ酸配列の１５、６９、７０、及び７１位に相当する位置のアミノ酸残基の立体構造情報、または前記アミノ酸残基と候補物質との相互作用から、標的FFRPがアミノ酸をリガンドとするかどうかを判定することになる。
【００３２】
たとえば、特定された前記アミノ酸残基（配列番号１に示されるDM1のアミノ酸配列の１５、３３、３５、３９、５６、５７、６１、６９、７０、７１、及び７５位に相当する位置のアミノ酸残基）の主鎖あるいは側鎖と候補物質が、水素結合、イオン結合、あるいは疎水結合等によって、候補物質を介したFFRPの会合状態を変化させるようなものであれば、当該候補物質はFFRPリガンド、すなわち、FFRPを介して微生物の代謝、増殖あるいは感染を制御する薬剤として有用である。たとえば、FFRPの会合による四量体や八量体形成を促進、あるいは四量体や八量体の二量体や単量体への解離を促進するようなものであれば、当該候補物質はFFRPリガンド、すなわち、FFRPを介して微生物の代謝、増殖あるいは感染を制御する薬剤として有用である。なお、前記した位置以外のアミノ酸残基であっても、候補物質との相互作用の結果FFRPの会合や立体構造に影響を及ぼすものであれば、本発明の方法は、そのようなアミノ酸残基との相互作用を考慮することを排除するものではない。
【００３３】
前述したように、上記方法によって決定されたリガンドは、微生物の代謝、増殖及び感染から選ばれる、少なくとも一つ以上を制御する薬剤として利用可能である。
【００３４】
本発明のリガンド探索、薬剤スクリーニングは、既知のFFRP原子3次元座標（特開２００３−１８５６５０号等参照）をコンピュータに入力し、ここに候補物質の立体構造をあらわす構造座標を入力し、両者をコンピュータ画面上に視覚的に表現し適合させ、その適合状態を、水素結合、イオン結合、疎水結合、あるいは経験的スコアリング関数を指標として評価する。この場合、コンピュータには、原子3次元座標の情報を全部入力してもよいし、必要な情報のみを入力してもよい。用いる立体構造解析プログラムとしては、例えば、CCP4プログラム群、O（プログラム・オー）、X-PLOR、MolScript、Insight II、Grasp、QUANTA等が挙げられる。立体構造画像は、リボンダイアグラム、立体構造モデル、コンピュータグラフィックス等の画像であらわされた情報のいずれであってもよい。
【００３５】
たとえば、既知のFFRP原子3次元座標（特開２００３−１８５６５０号等参照）をバーチャル化合物ライブラリーにインプットし、候補物質と前述の特定部位のアミノ酸との相互作用を予測する。相互作用の結果、候補物質がFFRPの会合状態あるいは立体構造を変化させるものであれば、その候補物質が薬剤候補として選択される。ここで、用いるバーチャル化合物ライブラリーは特に限定されず、例えばDOCK-4 (Kuntz) などの市販のバーチャルスクリーニングソフトウェアや、MDDR（Prous Science）などの三次元構造データベースを用いることができる。
【００３６】
FFRP3次元座標情報（あるいはそこから得られる立体構造画像や数値情報）と本発明で提供される特定アミノ残基の位置情報は、候補物質のスクリーニングにとどまらず、コンピュータを利用した種々のモデリング及びドラッグデザインを可能にする。モデリングは、結晶解析用FRODO、あるいはOを利用し、またドラッグデザインは、QUANTA、InsightII等を利用して行えばよい。例えば、FFRPの原子座標を分子設計ソフトウェアQUANTAに入力し、その立体構造をコンピュータグラフィックで確認しながら、FFRPの会合状態あるいは立体構造を変化させるようなリガンド化合物をデザインすることができる。
【実施例】
【００３７】
１．DM1（pot1216151）蛋白質の精製
PCR反応を用いてゲノムDNAからdm1 (pot1216151) 遺伝子（GenBank Accession No. NC 000961, gi:14589963）をクローン化し、pET3aベクター（ノバジェン社）を用いて大腸菌BL21(DE3)株（ノバジェン社）に導入した。２ｍMイソプロピル・チオガラクト・ピラノシド（IPTG）で誘導後、大腸菌細胞を１ｍM  EDTAを含む１００ｍMトリス塩酸・緩衝液（ｐH7.0）中でフレンチプレス（SLM社）にかけ、得られた抽出液を７５℃で1時間、加温した。４０％飽和硫酸アンモニアに可溶で８０％硫酸アンモニアに不溶な分画を、２００ｍM塩化ナトリウムを含む５０ｍMトリス塩酸・緩衝液（ｐH7.0）に溶解し、５０ｍMトリス塩酸・緩衝液（ｐH7.0）に透析後、Q-セファロースFF（ファルマシア社）と０−２Mの塩化ナトリウム勾配（５０ｍMトリス塩酸・緩衝液、ｐH7.0中）を用いて、アニオン交換クロマトグラフにより精製した。蛋白質画分を２００ｍM塩化ナトリウムを含む５０ｍMトリス塩酸・緩衝液（ｐH7.0）に透析後、同緩衝液と平衡化したセファクリルS-300（GEヘルスケア社）を用いてゲルろ過した。
【００３８】
蛋白質溶液に硫酸アンモニアを加えて濃度1.6Mとした後、ブチル-トヨパール６５０M（トーソー社）と1.5−0Mの硫酸アンモニア勾配（５０ｍMトリス塩酸・緩衝液、ｐH7.0、中）を用いて、疎水性クロマトグラフにより精製した。７５０ｍM硫酸アンモニア付近でA分画が、また３００ｍM硫酸アンモニア付近でD分画が得られた。両分画ともに、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）電気泳動上、期待される位置に単一のバンドを示した。
【００３９】
２．結晶化と回折測定
A分画（１０ｍMトリス塩酸・緩衝液、ｐH7.0、中に２０ｍｇ/ｍｌのDM1を含む）４μｌを、同溶量の、１Mの塩化リチウムと１０％（ｗ/ｖ）のPEG6000を含む１００ｍMクエン酸・緩衝液（ｐH４.０）と混合した。２４穴プレート（ハンプトン・リサーチ社）を使って、同じ緩衝液0.8mlを保存液とし、シッティング・ドロップ方式による蒸気拡散法を用いて、５℃、約一週間で約0.2ミリメートルの大腸菌から取り込んだリガンドを抱きこんだ状態での結晶（特開２００３−１８５６５０号、特開２００５−００８５９５号参照：以下、「“元”結晶」という）を得た。10mM K2[Pt(CN)6]、0.1mM  K[AuCl4]、あるいは1mM  セレノメチオニンを添加した結晶母液に、５℃、２日程、“元”結晶を浸すことにより、未知リガンドを白金、金、あるいはセレノメチオニンで置換した誘導体を得た。
【００４０】
５０ｋV、１００ｍAで回転対陰極（ウルトラX１８、リガク社）を運転し、また、エリア検出器(R-アクシスIV、リガク社)を用いて、“元”結晶及び白金、金・誘導体からの回折を、常温で記録した。“元”結晶からのもう１組の回折を、シンクロトロンX線（0.834A）源（スプリング８、兵庫県ビームラインBL24XU、播磨）を用いて記録した。結晶を、20%(w/v)グリセロール、14％（w/v）PEG6000、１M塩化リチウムを含む１００ｍMクエン酸・緩衝液（pH4.0）に数分間浸し、直径0.4mmのクライオループ（ハンプトン・リサーチ社）に取り付けた後、液体窒素を使って冷却した。装置（Xシステム、リガク社、もしくは、クライオシステムクーラー、オクスフォード社）を使って-173℃に冷却した空気をスプレーしながら、回折データを記録した。セレノメチオニン誘導体からの異常散乱データを、別のシンクロトン光源（フォトンファクトリーBL18、つくば）を使って記録した。波長（0.97935オングストローム）は、結晶からの蛍光を計測して選択した。
【００４１】
３．多同型置換（MIR）に基づく初期モデルの作成
CCP4パッケージ（Collaborative Computational Project Number 4, 1994, CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. D50, 760-763）と、検出器に付属するプログラムを使って、通常X線源からの回折をプロセスし、空間群をP3221かP3121と同定した（a=b=96.9Aでc=98.5 A）。差パターソン・マップを計算し、重原子、すなわち非対称単位あたり二個の金と三個の白金原子の位置を特定し、CCP4のMLPHAREプログラムでこれら重原子の位置と占有率を最適化した。この段階で、分解能は3.0A、全体の良度指数は0.43だった。
【００４２】
得られた位相を使って電子密度図を計算した。CCP4のDMプログラムを使って、溶媒平坦化法やヒストグラム適合化法により、位相を最適化した。非対称単位あたりに４つの単量体を仮定し、非対称単位がP3221空間群で関係づけられると仮定した時にだけ、改良された電子密度図中に右巻きのαへリックスを追うことができた。Oプログラム（Jones T. A., Zou J. Y., Cowan S. W. & Kjeldgaard M., 1991, Improved methods for binding protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Crystallogr. A47, 110-119）を使って、７２個のアラニンからなるポリペプチド４本を電子密度に沿わせた。このモデルを、Xプロア・プログラム（Brunger, A., 1992, X-PLORE v3.1 Manual, Yale University）とOを使って最適化し、回折データや、理想的な化学結合の長さ、角度（Engh, R. A. & Huber, R., 1991, Accurate bond and angle parameters for X-ray protein structure refinement. Acta Crystallogr. A47, 392-400）との一致を高めた。この段階まで、４つの単量体の構造を同じに保った。モデルと回折の一致度を示すR因子は、３９．１％だった。
【００４３】
シンクロトロン線源で得た“元”結晶からの3.0Aまでの回折とCNSプログラム（Brunger, A. T., Adams, P. D., Clore, G. M., DeLano, W. L., Gros, P., Grosse-Kunstleve, R. W., Jiang, J.-S., Kuszewski, J., Nilges, M., Pannu, N. S., Read, R. J., Rice, L. M., Simonson, T. & Warren, G. L., 1998, Crystallography & NMR system: a new software suite for macromolecular structure determination. Acta Ｃrystallogr. D54, 905-921）を使って、アラニンモデルを最適化した。次に、2.0Aから3.0Aまでの回折データを考慮しながら、wARPプログラム（Perrakis, A., Sixma, T. K., Wilson, K. S. & Lamzin, V. S., 1997, wARP: improvement and extension of crystallographic phases by weighted averaging multiple refined dummy atomic models. Acta Crystallogr.D53, 448-455）を使って位相をさらに改良し、電子密度図をもとにアラニン残基に側鎖を付け加えて新モデルを作成した。1.8A分解能の段階で４つのモデルを分化し、差フーリエマップ上の高密度部（３σ以上）のうち、ポリペプチド鎖との親水的相互作用が期待される位置に、順次、水分子、合計１８８個を置いた。この段階でR因子は２１％だった（分解能1.8A）。
【００４４】
４．Seからの異常分散を用いた最適化
上記の多同型置換（MIR）モデルを出発点として、水分子を除き、これをもとに、セレノメチオニン誘導体からの回折を解析した。0.97925Aの回折データにCNSプログラムを適用して、４本のポリペプチド鎖の相対的な位置を最適化した。差フーリエマップの高密度部（３σ以上）のうち、ポリペプチド鎖との親水的な作用が期待される位置に、順次、水分子を置いた。この改良モデルの位相を使って計算した異常分散フーリエマップ中の高密度部（３σ以上）、２箇所を、Se原子の位置と特定した。これらの位置を出発点として、Oプログラムを使ったマニュアル操作により、二分子のセレノメチオニンを配置した。CNSを使って理想的な数値からのずれとR因子をモニターし、またOを使って２FO-FCと差フーリエマップを計算して、モデル（R因子が19.0%で自由R因子が22.9%）を作成した。２つのSe原子をひとまとめにして、また、いかなる理想値にもとらわれずに、f’とf’’の最適化を数回、CNSを使って行い、f’を-5.062、f’’を4.54265と決定し、これによりR因子が0.02%改善された。表１に、DM1立体構造決定に関するパラメーターを示す。最終モデルは、非対称単位あたり２つのDM1二量体を全長すなわちアミノ酸残基１−７５番にわたって有し、また、２分子のセレノメチオニンと２８３個の水分子を含んでいた（表１）。
【００４５】
上記の異常散乱モデル中のセレノメチオニン分子（図３a）と同じ様に、アラニン各一分子を２FO-FCマップの余分な電子密度それぞれに配置した。差フーリエマップを使い、側鎖をバリンのものへ、さらにイソロイシンのものへと伸長した（図３b）。“元”結晶の最終モデルは、分解能1.8AでR因子は19.3%、自由 R因子は21.5%で、非対称単位あたり、２つのDM1二量体の全ての残基、イソロイシン二分子と１４４個の水分子を含んでいた（表１）。CCP4のPROCHECKプログラム（Laskowski, R., MacArther, M. W., Moss, S. D. & Thornton, J. M., 1993, PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Crystallogr. 26, 283-291）を使って作成したラマチャンドランプロット(Ramachandran, G. N., Ramakrishnan, C. & Sassisekharan, V., 1963, Stereochemistry of polypeptide chain conformation. J. Mol. Biol. 7, 95-99）中、98.2%のアミノ酸残基が安定な領域内に同定された（表１）。平均温度（B）因子は３３．３と小さかった。
【００４６】
【表１】
2008157807.tif 000003
【００４７】
５．DM1による八量体の形成
決定されたDM1(pot1216151)蛋白質の立体構造そのものは、“元”結晶でもセレノメチオニン誘導体でも大差なく、２つの非対称単位中の四つの二量体により、直径約60A（図2a）、厚み約40A(図2b)の円盤を形成していた。
【００４８】
各単量体は、２つのαへリックスと４つのβストランドから構成された（図1）。２つの単量体中の合計８つのβストランドから単一のβシートが形成され、二量体が構造単位として安定化されていた（図2a）。DM1のようなデミFFRPは、全長FFRP、つまり、古細菌由来のLrpA (Leonard, P. M., Smits, S. H. J., Sedelnikova, S. E., Brinkman, A. B., de Vos, W. M., van der Oost, J., Rice, D. W. & Rafferty, J. B., 2001, Crystal structure of the Lrp-like transcription regulator from the arcahaeon Pyrococcus furiosus. EMBO J. 20, 990-997)やFL11（pot0434017）(Koike, H., Ishijima, S. A., Clowney, L.. & Suzuki, M., 2004, The archaeal feast/famine regulatory protein: potential roles of its assembly forms for regulating transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 2840-2845)、真正細菌由来のAsnCやLrpC (Thaw, P., Sedelnikova, S. E., Muranova, T., Wiese, S., Ayora, S., Alonso, J. C., Brinkman, A. B., Akerboom, J., van der Oost, J. & Rafferty, J. B., 2006, Structural insifght into gene transcriptional regulation and effector binding by the Lrp/AsnC family. Nucl. Acids Res. 34, 1439-1449)のC末の会合ドメインのみに対応する。全長FFRPが持つDNA結合ドメインを、デミFFRPは持たず（Kudo, N., Allen, M. D., Koike, H. Katsuya, Y. & Suzuki, M., 2001, Crystallization and secondary-structure determination of a protein of the Lrp/AsnC family from a hyperthermophilic archaeon. Acta Crystallogr. D57, 469-471）、全長FFRPと相互作用し、会合体全体のDNA結合特性を調節すると考えられる（Suzuki, M., 2003, Structure and function of the feast/famine regulatory proteins, FFRPs. Proc.Jpn Acad. 79B, 274-289, Yokoyama, K., Ishijima, S. A., Clowney, L., Koike, H., Aramaki, H., Tanaka, C., Makino, K. & Suzuki, M., 2006, Feast/famine regulatory proteins (FFRPs): Escherichia coli Lrp, AsnC and related archaeal transcription factors. FEMS Microbiol. Rev. 30, 89-106）。
【００４９】
中央の直径約１２Aの空洞から隣り合う二量体の間へと間隙が伸展していた（図2aのI-IV）。各間隙の、二つの半分（例えば、図2のIn、ｎすなわち北、とIs、ｓすなわち南）は、ほぼ同じ形状を持ち、偽２回対称性で関係づけられていた。各“半分”中では、二量体の一つ（図2bのB）のβ４とα２が、もう一つの二量体（図2bのＡ）のα１の端、及びβ４とβ２の間のループに接近していた（図2bで四角に囲む）。
【００５０】
６．DM1とイソロイシン及びセレノメチオニンとの相互作用
セレノメチオニン誘導体の場合、間隙I、IIIのそれぞれに、各二つのセレノメチオニン分子が同定された（図3aで赤）。しかし、他の２つの間隙（図2aでII,IV）には同定されなかった。同様に、“元”結晶の方には、間隙I、III中に各二分子のイソロイシン分子が同定された（図3b）。
【００５１】
セレノメチオニン誘導体と“元”結晶、二つの立体構造で、またそれぞれの間隙に存在する独立な二つのリガンド結合部位、ｎとｓ、で、リガンドの主鎖は同じようにDM1と結合していた。すなわち、各リガンドのCOO−末端のOA原子に、二量体B中の同じ単量体のトレオニン69とトレオニン71の側鎖のOH基が水素結合していた（図4a）（HPLUSプログラムによる同定、McDonald, I. K. & Thornton, J. M., 1994, Satisfying hydrogen bonding potential in proteins. J. Mol. Biol. 238, 777-793）。セリン70の側鎖のOH基はOB原子に近いが、距離は4.9-5.0Aで、期待される値3.9Aよりもやや大きい。各リガンドのNH３+末端は、二量体Aのアスパラギン酸39とイオン結合していた(Barlow, D. J. & Thornton, J., 1983, Ion pairs in proteins. J. Mol. Biol. 162, 867-885の基準に基づく)。関係するアミノ酸残基が異なる二量体に分布することから、リガンド主鎖との相互作用によりDM1の会合は安定化すると考えられる。二量体Bのトレオニン71と二量体Aのグリシン36の主鎖のNH基もCOO-基のOB原子へと水素結合を供与していた（図4a）。二量体Aのバリン34、グリシン36、チロシン38の主鎖CO基は、リガンドのNH３+末端からの水素結合を受容していた。グリシン36のコンフォメーションは、他の種類のアミノ酸残基には普通にはとれないもので、ポリペプチド鎖の急な屈曲と上記の二つの水素結合の同時形成にとって重要である（図１でこのグリシンの保存を参照）。また、前述のセリン70の側鎖のOH基も水素結合を供与すると考えられる。
【００５２】
各リガンドの側鎖は、二量体Aのバリン33、チロシン35、イソロイシン75と、二量体Bのイソロイシン56、トレオニン57、トレオニン71からなる疎水性ポケットに囲まれていた（図4b）（各残基の側鎖のCもしくはS原子からリガンドのCもしくはSe原子まで５A以内）。このポケットは、二量体Bのアルギニン61と二量体Aのグルタミン酸15及びアスパラギン酸39の間のイオン結合で閉じられていて（図4b）、この結果、セレノメチオニンの側鎖は折れ曲がり、イソロイシンの側鎖をいくらかまねたようなコンフォメーションをとっていた（図4aと図4bを比較）。
【００５３】
７．イソロイシンによるDM1の会合とセレノメチオニンによる解離
DM1溶液を容量排除HPLC（分析的なゲルろ過）にかけ、その後の溶液を、直接、検出器（miniDAWN Tristar、ワイアットテクノロジー社）に導入し、４５度、９０度、１３５度での光散乱の強度（Chu, B.,1974, Laser Light Scattering, Academic Press）を測定した。同時に、屈折計（Optilab DSP、ワイアットテクノロジー社）で蛋白質濃度を計測し、デバイプロット（Van Holde, K. E., 1971, Physical Biochemistry. Prentice-Hall）を用いて分子量を決定した。この際、dn/dC値を標準値の0.180ml/gとした（ｎは屈折係数、Cは蛋白質の重量濃度）。また、220nmと280nmでの紫外線吸収を計測した。
【００５４】
この結果、四つの会合状態が確認された（図5のピーク１−４）。P. OT3の細胞内環境に似て、カリウムやマグネシウムが存在する時には、結晶化に用いたA分画の主成分は構成要素２になった。様々な条件で両分画からの光散乱を測定した結果、ピーク２、３、４を構成する各構成要素２、３、４の分子量は、それぞれ、約６９K、３０−３６K、１９−２２Kで、構成要素２は八量体、構成要素３は四量体、構成要素４は二量体と結論した。ここで、単量体の分子量は計算上、８．６Kである。一方、ピーク１を構成する構成要素１の分子量は１０４−１２５Kと推定され、十二量体程度に相当した。
【００５５】
イソロイシンは構成要素２を増加させ、バリンは構成要素２もしくは３を増加させた。メチオニンの会合促進効果はより弱く、条件によっては構成要素４への解離を促進した（図５）。メチオニンとセレノメチオニンの効果は基本的に変わらなかった（表２、さらに図６にいくつかのリガンドの化学式を示す）。
【００５６】
【表２】
2008157807.tif 000004
【００５７】
８．FL11 (pot0434017)蛋白質、FL4 (pot1613368)蛋白質、FL5 (pot1664679)蛋白質、DM3 (pot0175330)蛋白質のリガンドの予想
アミノ酸配列を比較した結果、P.OT3由来のFFRP、さらには他生物由来のFFRPの中に、ＤＭ１の３９位に対応する位置にアスパラギン酸を有し、トレオニンあるいは類似のセリンをＤＭ１の６９−７１位に対応する位置の少なくとも一つに持つものが多数みつかった（図１の着色部参照）。これは、これらFFRPのリガンドがアミノ酸であることを示唆する。表３にFFRPのリガンドとその効果を示す。
【００５８】
P.OT3のFL11(pot0434017)は、リガンド側鎖を囲むと予想される、１５，３３，３５，５６，５７，７１，７５相当位置のうちの二つをグルタミン酸とアスパラギン酸が占めていた（表３）。したがって、対応するリガンドは、反対の電荷を持つ、リジンもしくはアルギニンである可能性が示唆される。P.OT3のFL４(pot1613368)では、２つのアルギニンと一つのグルタミン酸が見つかり（表３）、これは、リガンドがグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、あるいはアスパラギンのいずれかである可能性を示唆する。
【００５９】
P.OT3由来のFL5(pot1664679)とDM3(pot0175330)では、上記７位置の全ての残基が疎水性だった。したがって、リガンドもまた、疎水性アミノ酸である可能性が示唆される。
【００６０】
また、図１のアライメントにおいて、アンダーラインされたAsnC2より下では、７０相当位及び、６９−７１相当位のいずれか、の両者が共に着色された例はなく、対応するリガンドがアミノ酸ではない可能性がある。
【００６１】
９．FL11 (pot0434017)蛋白質、FL4 (pot1613368)蛋白質、FL5 (pot1664679)蛋白質、DM3 (pot0175330)蛋白質とリガンドとの相互作用の実証
リガンドとの相互作用を実証するために各FFRPを生産、精製した。
【００６２】
FL11 (pot0434017)蛋白質を、既に発表した方法で (Koike, H., Ishijima, S. A., Clowney, L.. & Suzuki, M., 2004, The archaeal feast/famine regulatory protein: potential roles of its assembly forms for regulating transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 2840-2845)、生産、精製した。
【００６３】
fl4 (pot1613368)遺伝子及びfl5 (pot1664679)遺伝子の上流にHisタグを付けて、また、dm3 (pot0175330)遺伝子にはタグを付けずに、pET28a[fl4、fl5]あるいはpET21d[dm3]ベクターを用いて、大腸菌株（ノバジェン社）、BL21(DE3)[fl4とdm3]あるいはRosetta-gamiTM2(DE3)[fl5]に導入した。
【００６４】
１ｍM IPTGを用いて誘導後、80℃で30−60分間加温し、Ni-NTAアガロース（キアゲン社）と２５０ｍMイミダゾールを用いたアフィニティークロマトグラフにより、FL4とFL5を精製した。FL5は、セントリプラス（ミリポア社）を用いた限外ろ過により、３００ｍM塩化ナトリウムを含む５０ｍMナトリウム-リン酸・緩衝液（ｐH８.0）中、約１０ｍｇ/ｍｌに濃縮した。FL4は、Hisタグをスロンビンで除去後、１０ｍMイミダゾール存在下でNi-NTAアガロース（キアゲン社）を素通りさせ、セファクリルS-１00（GEヘルスケア社）を用いてゲルろ過した。３つのピークが観察され、それぞれ八量体、四量体、二量体に相当する分子量を示した。セントリプレップ１０（ミリポア社）を用いた限外ろ過により、二量体の分画を５００ｍM塩化ナトリウムを含む５０ｍMカリウム-リン酸・緩衝液（ｐH6.8）中、約10ｍｇ/ｍｌに濃縮した。
【００６５】
DM3を、９０℃で３０分間、加温後、Q-セファロースFF（ファルマシア社）と０−１Mの塩化カリウム勾配を用いたアニオン交換クロマトグラフと、これに続くセファクリルS-300（GEヘルスケア社）を用いたゲルろ過により、精製した。セントリプレップYM-３（ミリポア社）を用いた限外ろ過により、２００ｍM塩化カリウムを含む５０ｍM HEPES-塩酸・緩衝液（ｐH7.0）中に、約10 ｍｇ/ｍｌに濃縮した。
【００６６】
精製したFL11、FL4、FL5、DM3を容量排除HPLCにかけ、各蛋白質の会合へのアミノ酸の影響を調べた。その結果、リジンあるいはアルギニンを添加するとFL11の見かけの分子量が増加することを確認した（図７a、会合促進効果）。また、グルタミン酸の添加によりFL4の見かけの分子量が増加することを確認した（図７ｂ、会合促進効果）。
【００６７】
疎水性アミノ酸、フェニルアラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、もしくはロイシンの添加により、DM3の見かけの分子量は増大した（図７ｃ、会合促進効果）。ロイシン存在下に形成される会合体は基本的に四量体で、フェニルアラニン、バリン、メチオニンもしくはイソロイシン存在下に形成される八量体よりも有意に小さかった。
【００６８】
疎水性アミノ酸、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、の添加により、ほぼこの順に大きい会合体をFL5は形成した（図７ｄ、会合促進効果）。メチオニン存在下に形成された会合体の分子量は、非存在下に形成されたものとあまり変わらなかった。フェニルアラニン存在下に形成された会合体は、他のアミノ酸存在下に形成された会合体よりも大きかった。
【００６９】
１０．FFRPとアミノ酸の相互作用の総括
P. OT3由来のFFRPのうち、アミノ酸との相互作用が確認されたもの、すなわちDM1、DM3、FL4、FL5、FL11は、全て、３９相当位にアスパラギン酸を、また６９−７１相当位のいずれかにトレオニンあるいはセリンを持っていた。この記述は、ロイシンと相互作用する大腸菌Lrp（Marasco, R., Varcamonti, M., La Cara, F., Ricca, E., de Felice, M. & Sacco, M., 1994, In vivo footprinting analysis of Lrp binding to the ilvH promoter region of Escherichia coli. J. Bacteriol. 176, 5197-5201）や、アミノ酸との相互作用が実証された、あるいは示唆されている、他のFFRPにも当てはまる：すなわち、プロリンと相互作用するPutR（Jafri, S., Evoy, S., Cho, K., Craighead, H. G. & Winans, S. C., 1999, An Lrp-type transcription regulator from Agrobacterium tumefaciens condenses more than 100 nucleotides of DNA into globular nucleoprotein complexes. J. Mol. Biol.288, 811-824）、リジンと相互作用するLysM（Brinkman, A. B., Bell, S. D., Lebbink, R. J., de Vos, W. M., & van der Oost, J., 2002, The Sulfolobus solfataricus Lrp-like protein LysM regulates lysine biosynthesis in response to lysine availability. J. Biol. Chem. 277, 29537-29549）、バリン、イソロイシン、ロイシンと相互作用するBkdR（Madhusudhan, K. T., Luo, J. & Sokatch, J. R., 1999, In vitro transcription studies of the bkd operon of Pseudomonas putida: L-branched-chain amino acids and D-leucine are the inducers. J. Bacteriol. 181, 2889-2894）、メチオニンと相互作用する可能性のあるMdeR（Inoue, H., Inagaki, K., Eriguchi, S., Tamura, T., Esaki, N., Soda, K., & Tanaka, H., 1997, Molecular characterization of the mdeoperon involved in L-methionine catabolism of Pseudomonas putida. J. Bacteriol. 179, 3956-3962）、グルタミン酸と相互作用する可能性のあるGrp（Peekhaus, N., Tolner, B., Poolman, B. & Kramer, R., 1995, The glutamate uptake regulatory protein (Grp) of Zymmonas mobilis and its relation to the global regulator Lrp of Escherichia coli. J. Bacteriol. 177, 5140-5147）にもあてはまる。
【００７０】
一方、大腸菌AsnCの39相当位はセリンになっていて、アスパラギン酸ではない（図２のAsnC1）。この置換が、AsnCがアミノ酸と相互作用できない一因である可能性がある。
【００７１】
対応するリガンドの種類は、１５、３３，３５，５６、５７，７１、７５相当位を占めるアミノ酸残基により説明可能である。FL11とLysMは３３相当位にグルタミン酸を、１５相当位にアスパラギン酸を持ち、リジンと相互作用する。古細菌Thermoplasma volcanium由来のTvFL3(tvg117949)も３３相当位にグルタミン酸を持ち、やはりリジンと相互作用することを発明者らは確認している。FL4とGrpは２つのアルギニンもしくはリジンを持ち、グルタミン酸と相互作用する。FL5,DM3,DM1,LrpそしてBkdRは、対応する位置に多くの疎水性アミノ酸を持ち、疎水性アミノ酸と相互作用する。
【００７２】
FFRP会合体の安定性は緩衝液等の環境にも依存するので、相互作用がFFRPを会合させるか、解離させるかを予測することはより難しい。しかしながら、一定の原理が存在する。DM1では、６１位のアルギニンと３９位のアスパラギン酸及び１５位のグルタミン酸の間にイオン結合が形成され、この結果、イソロイシンの結合は会合を促進するが、より大きなメチオニン側鎖は十分に伸展できず、その効果はより抑制的であった。疎水性アミノ酸、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、ロイシン、メチオニンは、ほぼ、この順に促進効果が高く、メチオニンが、最も抑制的であった（表２）。
【００７３】
【表３】
2008157807.tif 000005
【００７４】
６１、３９、１５相当位がＤＭ１と同じThermoplasma volcanium由来のTvDM(tvg0307586)に対しては、同様に、５つの疎水性アミノ酸中でフェニルアラニンが３番目に位置した（表２）。FL5及びDM3では、６１相当位が、より小型のアラニン（FL5）もしくはヒスチジン（DM3）に占められていて、DM1同様のイオン結合は形成できそうにない。測定した条件下で、五つの疎水性アミノ酸はいずれもFL5及びDM3の会合を促進した。DM3に対しては、フェニルアラニンが５つの疎水性アミノ酸中でバリン、メチオニンと同等以上の効果を示し、FL5に対しては、フェニルアラニンが５つの疎水性アミノ酸中、最も高い促進効果を示した（表２）。
【００７５】
FL11やFL4でも、６１相当位置が小型のアラニン（FL11）もしくはグリシン（FL4）に占められていて、グルタミン酸や、リジン、アルギニンは、FL11あるいはFL4の会合を促進した。リジンと相互作用する、FL11、TvFL3、LysMのうち、TvFL3とLysMは６１相当位置にアルギニンを持つ。TvFL3はリジン存在下で四量体にまでしか会合せず、また、リジン存在下でLysMのＤＮＡ結合が弱まることから、リジンは会合抑制的効果を持つと考えられた。
【００７６】
以上のとおり、図１に示されるDM1のアミノ酸配列における１５、３３、３５、３９、５６、５７、６１、６９、７０、７１、及び７５位に相当する位置のアミノ酸残基との相互作用から、リガンド候補物質がFFRPの会合状態や立体構造に及ぼす影響を予測することができる。これにより、FFRPのリガンド設計や探索やFFRPを標的とする抗微生物薬の設計や探索が可能になる。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、生命情報科学、生命工学分野等の基礎研究はもとより、医薬・薬学分野における創薬・薬効予測において重要である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、DM1（最上位、ボールド）及び関連するＦＦＲＰのアミノ酸配列である。全長型のFFRP、すなわち、名前がDMから始まっていないものは、そのC末端側半分のアミノ酸配列のみを示す。AsnC1は大腸菌のAsnC、AsnC2はVibrio parahaemolyticus及びVibrio vulnificus由来のAsnC，AsnC3は、Pasteurella multocidasir由来のAsnCを示す。DM1中で二次構造、α1、α2及びβ1-4を形成する部分を四角で囲んである。３９相当位に配置されたアスパラギン酸と６９及び７１相当位に配置されたセリンもしくはトレオニンを赤色で示す。３９相当位に配置されたアスパラギン（アスパラギン酸に類似）と７０相当位に配置されたセリンもしくはトレオニン（DM1中この位置のトレオニンはリガンドのＣ末端からやや離れている）をピンクで示す。
【図２】図２は、イソロイシンと結合したDM1会合体を、上から(a)あるいは横から(b)みたリボンダイアグラムである。二回対称軸で関連づけられた二量体の対を同じ色で示す。二量体の間に形成された間隙I-IV(a)は、それぞれ、二つに等分され、例えば(b)の InとIs、から構成される。各半分の中では、イソロイシン一分子（青色あるいは黄緑色、bで四角に囲んだInでは青色）が、一方の二量体(InではA)のα１、β２、及びβ３ともう一つの二量体(InではB)のα２の間に挟まれている。
【図３】図３は、“元”結晶(b)とセレノメチオニン誘導体(a)の図２bのIsに相当する部位に見つかった余分な電子密度に、セレノメチオニン(a)もしくはイソロイシンを沿わせた図を示す。（a）では、異常散乱を使って同定したSeの密度を赤色で、また、セレノメチオニンの通常の密度を青色で示す。
【図４】図４は、結晶中でのＤＭ１とイソロイシン(a)及びセレノメチオニン(b)との相互作用を示す。図２ｂで四角に囲まれた領域にほぼ相当する部分を示す。DM1のアミノ酸残基の主鎖部分からリガンドに接触している場合には、その残基をv34のように小文字で、また側鎖部分からリガンドに接触している場合には、その残基をD39のように大文字で示す。各アミノ酸残基の番号は図１と同じ番号付けを使用した。(a)では、リガンド主鎖部への接触部位を、(b)では、リガンド側鎖部への接触部位をラベルする。(a)では、水素結合の供与基から受容基への方向を矢印で示す。(b)では、イオン結合を矢印なしの点線で示す。また(b)では、Se原子を黄緑色で示す。
【図５】図５は、イソロイシン、バリン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン添加の際のDM1の容量排除ＨＰＬＣ分析の結果を示す。(a)室温で、20μlの溶液（A分画のDM1、10μg、したがって0.5 mg/mlあるいは0.058 mMと、場合によっては5 mMの各アミノ酸を含む）を、PROTEIN KW802.5 (昭和電工社)に注入し、750 mM KClと10 mM MgCl2を含む50 mM トリス塩酸・緩衝液(pH7.5、アミノ酸を含まない)を1 ml/min の流速で流して実行した。(b)室温で、10μlの溶液（D分画のDM1、10μg、したがって1.0 mg/mlあるいは0.16 mMと、場合によっては1 mMの各アミノ酸を含む）を、Protein Pak125 (ウォータース社)に注入し、200 mM NaClを含む50 mM ナトリウム-リン酸・緩衝液(pH7.0、アミノ酸を含まない)を1 ml/min の流速で流して実行した。
【図６】図６は、DM1と相互作用するいくつかの分子の化学構造を示す。会合促進分子イソロイシンとの構造上の違いを赤色で示す。
【図７】図７は、Asahipak GS-520HQ (昭和電工社)を用い、25℃ で流速0.5ml/minで行った FL11(a)、FL4(b)、DM3(c)及びFL5(d)の容量排除ＨＰＬＣ分析の結果である。２，４，８と表示されたものは、光散乱測定にそれぞれ二量体、四量体、八量体を形成することが確認されたピークを示す。FL11:  Asahipak GS-520HQを200 mM KClと0-100 mMのリジンを含む50 mMトリス-塩酸・緩衝液(pH7.0) で平衡化し、同じ溶液20μlにFL11、10μg、を溶解して注入した。FL4：  Asahipak GS-520HQを500mM NaClと0-100 mMのグルタミン酸を含む50mMカリウム-リン酸・緩衝液(pH6.8) で平衡化し、同じ溶液20μlに二量体のFL4、10μg、を溶解して注入した。FL5：  Asahipak GS-520HQを300mM NaClと0あるいは40 mMのバリン、イソロイシン、メチオニンもしくはフェニルアラニンを含む50 mMナトリウム-リン酸・緩衝液(pH8.0) で平衡化し、同じ溶液20μlにFL5、60μg、を溶解して注入した。DM3：  Asahipak GS-520HQを300mM NaClと0あるいは10 mMのバリン、イソロイシン、メチオニンもしくはフェニルアラニンを含む50 mMナトリウム-リン酸・緩衝液(pH8.0) で平衡化し、同じ溶液20μlにDM3、10μg、を溶解して注入した。
【配列表フリーテキスト】
【００７９】
配列番号１−DM1
配列番号２−PutR
配列番号３−DM3
配列番号４−FL9
配列番号５−LysM
配列番号６−FL11
配列番号７−Lrp
配列番号８−FL8
配列番号９−FL4
配列番号１０−FL5
配列番号１１−DM2
配列番号１２−TvDM
配列番号１３−TvFL3
配列番号１４−YbaO
配列番号１５−AldR
配列番号１６−MdeR
配列番号１７−BkdR
配列番号１８−Grp
配列番号１９−AsnC2
配列番号２０−FL2
配列番号２１−AsnC1
配列番号２２−AsnC3
配列番号２３−LrpC
配列番号２４−FL6
配列番号２５−FL1
配列番号２６−FL7
配列番号２７−FL3
配列番号２８−FL10
配列番号２９−LrpA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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