(57)【要約】【課題】  本発明は、嫌気性・微好気性菌，浮遊性細胞などの生物試料の高効率に培養する方法を新規に提供するものである。【解決手段】  本発明は、振とう培養器内の振とう台上に載せ入れする培養容器内に培養すべき嫌気性・微好気性の生物試料と培地液および二酸化炭素を含む混合ガスを交換流入して該生物試料を振とう培養する方法において、該培養容器内の二酸化炭素，酸素の濃度をセンサーを用いて測定し、該測定濃度をフィードバックして二酸化炭素を１０〜２０％、酸素を０〜１０％の少量にて含む交換流入用の混合ガスを生成し、該混合ガスの培養容器内の流入量を消費排出されるガス量より幾分多くすることで該培養容器内を陽圧の混合ガス環境下に保つようにしたことを特徴とする嫌気性・微好気性菌，浮遊性細胞などの生物試料の高密度培養方法およびそのモニタリング方法にある。【選択図】  図１
2008022705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
振とう培養器内の振とう台上に載せ入れする培養容器内に培養すべき嫌気性・微好気性の生物試料と培地液および二酸化炭素を含む混合ガスを交換流入して該生物試料を振とう培養する方法において、該培養容器内の二酸化炭素，酸素の濃度をセンサーを用いて測定し、該測定濃度をフィードバックして二酸化炭素を１０〜２０％、酸素を０〜１０％の少量にて含む交換流入用の混合ガスを生成し、該混合ガスの培養容器内の流入量を消費排出されるガス量より幾分多くすることで該培養容器内を陽圧の混合ガス環境下に保つようにしたことを特徴とする嫌気性・微好気性菌，浮遊性細胞などの生物試料の高密度培養方法。
【請求項２】
培養容器は三角フラスコであり、該三角フラスコの容量に対して培地液量を３〜１５％の範囲に少なくし、振とう時における混合ガスと培地の接地面積を大きくして培養効率を向上する請求項１に記載の高密度培養方法。
【請求項３】
培養する生物試料は生物の腸管に生息する微生物である請求項１または２に記載の高密度培養方法。
【請求項４】
培養する生物試料は浮遊性の動物細胞である請求項１または２に記載の高密度培養方法。
【請求項５】
生物試料の生長に適した光波長を照射して浮遊性の植物細胞，光合成微生物を振とう培養する請求項１または２に記載の高密度培養方法。
【請求項６】
培地液中に溶存する酸素または二酸化炭素の量を測定するガス濃度センサーを取付けて、該ガス濃度センサーにて培地液中の酸素濃度または二酸化炭素濃度の変化値を測定し演算することにより生物試料の培養進行度または呼吸活性を監視するようにした請求項１乃至５のいずれかに記載の高密度培養方法におけるモニタリング方法。
【請求項７】
培地液の濁度を測定する濁度センサーを取付けて、該濁度センサーにて培地液の濁度を測定し演算することにより生物試料の培養進行度または生成される化学物質の値を監視する請求項１乃至５のいずれかに記載の高密度培養方法におけるモニタリング方法。
【請求項８】
培地液のｐｈ値を測定するｐｈセンサーを取付けて、該ｐＨセンサーにより培地液のｐｈ値の変化値を測定し演算することで生物試料の培養進行度または培養環境の変化を監視する請求項１乃至５のいずれかに記載の高密度培養方法におけるモニタリング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嫌気性・微好気性の菌・浮遊性細胞などの生物試料の高密度培養方法およびそのモニタリング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオプロセス（微生物等による反応プロセス），バイオサイエンスの分野では、細胞そのもの、もしくは細胞内外の有用物質を実験材料として増やす際に培養操作を行っており、研究室等では浮遊細胞を培養する際に温度調節と振とう機構とを連動させた振とう培養器を用いて主に好気性の微生物や植物細胞の培養している。バイオプロセスは化学合成では困難な有用化学物質も生成できる利点があるものの化学プロセスに比較して反応容器の時間当たりの生成速度が遅く、増殖に多大な時間を要している。また、嫌気性微生物や動物細胞の培養では、空気中に含まれる酸素、空気中に僅かにしか存在しない二酸化炭素が増殖の制限要因となっているため、振とう培養器を用いてこれらの細胞を培養することは困難であった。
【０００３】
本願出願人は、特開２００５−２６９９２１号にて、培養すべき細胞や組織等の試料を培地中に浮遊するように注入した１乃至複数個の三角フラスコ等の容器を恒温振とう機の振とう台上に載上し、該各容器に振とう機の外部に設ける供給ユニットより一定割合のガスを混和した大気を分岐管等を用いて直接供給し、且つ該容器より排出すべき大気を該分岐管の併行管路を用いて外部に放出するようにして、該振とう台上の三角フラスコ等の容器内のみをガス環境にして細胞や組織等の試料を恒温振とう培養することを提案した。
【特許文献１】特開２００５−２６９９２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は前記の発明を基礎とし、さらに効率的に嫌気性・微好気性の菌・浮遊性細胞などの生物試料の培養をすることを課題として発明したものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、振とう培養器内の振とう台上に載せ入れする培養容器内に培養すべき嫌気性・微好気性の生物試料と培地液および二酸化炭素を含む混合ガスを交換流入して該生物試料を振とう培養する方法において、該培養容器内の二酸化炭素，酸素の濃度をセンサーを用いて測定し、該測定濃度をフィードバックして二酸化炭素を１０〜２０％、酸素を０〜１０％の少量にて含む交換流入用の混合ガスを生成し、該混合ガスの培養容器内の流入量を消費排出されるガス量より幾分多くすることで該培養容器内を陽圧の混合ガス環境下に保つようにして、前記の課題を解決するようにしたのである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、静置培養でのバイオプロセスが主体だった従来の嫌気性微生物等を混合ガスの陽圧環境下におくことで従来法の数倍の生産効率が得られるという効果を生ずる。
従来に比較して少ない培地容量で多くの菌体が得られることにより大幅なコストダウン実現することができるという効果を生ずる。
動物細胞においては小容量でたんぱく質を高効率で得る手法が限定的であったために遅れていた薬剤候補物質のハイスループットスクリーニング（自動化によりできる限り多くの成分の組合わせの触媒を調整し多様な条件で試験する固体触媒の開発）を可能として、創薬スピードの向上や有用物質のスクリーニングに貢献することができるという効果を生ずる。
培養容器内を生成した混合ガスの陽圧状態を保つことにより雑菌を含む外気の侵入が確実に防止されるので、目的の生物試料を他の影響を受けずして純粋培養することができるという効果を生ずる。
【０００７】
酸素濃度または二酸化炭素濃度の変化値、培地液の濁度または培地液のｐｈ値の変化を測定し演算してモニターすることにより培養する生物試料の培養進行度または生成される化学物質の量を経時的に捉えることができ、また培養環境の再調整等を適格に行うことができるという効果を生じ、よって培養する生物試料に最適な培養条件を判断することができるという効果を生ずる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、振とう培養器内の振とう台上に載せ入れする培養容器内に培養すべき嫌気性・微好気性の生物試料と培地液および二酸化炭素を含む混合ガスを交換流入して該生物試料を振とう培養する方法において、該培養容器としての三角フラスコ内に該フラスコ容量に対して４％ほどの少量の培地液とともに培養する生物試料を入れ、二酸化炭素，酸素の濃度をセンサーを用いて測定し該ガスの各濃度をフィードバックして二酸化炭素を１５％前後、酸素は嫌気性菌のときは０％、微好気性菌のときは５％ほどの少量にて含み、残りを窒素ガスとする交換用の混合ガスを生成して該三角フラスコ内に連続供給するとともに該フラスコ内より消費されて排出されるガス量より前記交換用に生成する混合ガスの供給量を幾分多くすることで該フラスコ内を陽圧の混合ガスの環境を形成するとともに振とう時における混合ガスと培地の接地面積を大きくするようにして培養効率を向上するのである。
【実施例１】
【０００９】
図１は本発明の高密度培養方法に用いるシステムを示すもので、振とう培養器１内の振とう台２上に、培養容器として三角フラスコ３を載上し、振とう機１の外部に混合ガスを生成して三角フラスコ３内に交換流入するマルチガスコントローラー４と、該コントローラー４にＣＯ2ガスとＮ2ガスを供給するボンベ５ａ，５ｂを備える。
【００１０】
マルチガスコントローラー４はＣＯ2とＮ2の取入口６ａ，６ｂに加えて外気よりフィルターを通してＯ2を取入れる取入口６ｃを併設し、これらの取入口と混合ガスを生成するガスチャンバー７間にポンプ８を介する循環管路９を形成し、且つガスチャンバー７内にＯ2センサー７ａとＣＯ2センサー７ｂを備えて各ガスの濃度を測定し、フィードバックしてガス流入口６ｃ，６ａに設けた電磁弁を開閉制御してガス供給量を調整し、所定の成分組成の混合ガスを正確に生成し、さらにガスチャンバー７の出口側に流量計１０を備えて混合ガスの流量を制御して三角フラスコ３内に交換流入するようにするのである。１１は混合ガスを複数の三角フラスコ３に等圧均等に分岐する分岐管、１２は三角フラスコ３の口部を塞ぐ密閉栓で、該密閉栓１２には混合ガスの入口ノズル１３ａと消費ガス排出用の出口ノズル１３ｂを貫通して併設している。
【００１１】
三角フラスコ３内に培養する生物試料サンプルと該サンプルに応じた所定の培地液を入れて密閉栓１２を嵌めて入口ノズル１３ａ，出口ノズル１３ｂにそれぞれ管路を接続してマルチガスコントローラー４にて生成された混合ガスを直接各フラスコ３内に供給し、生物試料の生長過程にて発生した老廃物を含む消費されたガスを排出し、且つ排出される消費ガス量より混合ガスの供給量を幾分多くすることでフラスコ３内を常に陽圧のガス環境下に保つようにして振とう培養するのである。
【００１２】
以下に、ビフィズス菌の培養についての実施例を従来法との比較を交えて説明する。
準備
（１）本発明
ＡＢＣＭ  ｂｒｏｔｈの培地液をオートクレープ（すべてのウイルス・細菌類を死滅することができる１２０℃上まで蒸気を加圧上昇させて殺菌する高圧水蒸気滅菌処理）し、培養が難しいといわれている菌株であるＢｉｆｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｕｍサンプルを植設して２５０ｍｌの三角フラスコ３に入れる。培地液量はフラスコ容量の約４％に相当する１０ｍｌとする。該フラスコ３を振とう培養器１の振とう台２上に載せ入れ、ＣＯ2１５％  Ｎ2８５％の混合ガスを生成して各フラスコ当り２０ｍｌ／ｍｉｎ量にて連続供給し、３７℃、１２５ｒｐｍ回転の振とうにて培養を開始する。出口ノズル１３ｂより自然排出される消費ガス量より混合ガスの供給量を幾分多くすることでフラスコ３内が常に陽圧状態を保つようにするのである。以上の準備は約１０分で行うことができる。
（２）従来法
同様にして培地をオートクレープし、同サンプルを植菌して１Ｌの嫌気ジャー内に入れ、真空ポンプで減圧してから混合ガスを充填し、再度真空ポンプで減圧して混合ガスを追加充填した後恒温器に入れて３７℃の静置状態にて培養を開始する。以上の準備には約１時間を要する。
【００１３】
３０時間培養の経緯と結果は次表の通りである。増殖の量を示すＯＤ値（吸光度ＯＤ６６０ｎｍ）は、従来法が０.８であるに対して本発明のＯＤ値は０.８となり、１０倍以上の培養率を示すものとなり、振とうすることによる混合ガスと培地の接地面積が培養効果に大きく影響することが確認された。
【００１４】
【表１】
2008022705.tif 000003
【００１５】
次表は、本発明の前記同条件において、培地液量を１０ｍｌのほか，２０ｍｌ，３０ｍｌ，５０ｍｌ，７０ｍｌ，１００ｍｌにかえて培養実験をした経緯結果を示すものである。
【００１６】
【表２】
2008022705.tif 000004
【００１７】
培地液を少量にして振とうすることにより混合ガスと培地の接地面積が拡大すること、すなわち振とうによるガス置換効率を上昇することが培養効果に大きく影響して生育が良好となることが確認された。
【００１８】
また、培地液量を１０ｍｌ，２０ｍｌ，３０ｍｌに絞り、ＣＯ2ガス濃度を５％，１０％，１５％，１００％に変化させてそれぞれ実験した結果は次表の通りとなった。これよりＣＯ2ガス濃度は菌の繁殖に大きく影響するもので、１５％濃度のときに最大値を示し、すなわち最適なガス環境であることが判明した。
【００１９】
【表３】
2008022705.tif 000005
【実施例２】
【００２０】
次にピロリ菌の培養についての実施例を従来法との比較を交えて説明する。
（１）本発明
ＢＢＬ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｂｒｏｔｈの培地液をオートクレープし、非動化した馬血清を培地の５％添加した２５０ｍｌ量の培地をＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  Ｐｙｌｏｒｉサンプルとともに５００ｍｌの三角フラスコ３内に入れ、振とう培養器１の振とう台２上に載せ入れ、Ｏ2５％  ＣＯ2１５％  Ｎ2８０％の混合ガスを生成して各フラスコ当り２０ｍｌ／ｍｉｎ量にて連続供給しつつ、３７℃、１８０ｒｐｍ回転の振とうにて培養を開始した。
（２）従来法
同培地をオートクレープし、同サンプルを植菌して嫌気ボックスにＯ2５％  ＣＯ2１５％  Ｎ2８０％の混合ガス条件のアネロバックとともに入れ、振とう培養器内の振とう台２上に載せて、３７℃、１８０ｒｐｍ回転振とうにて培養を開始した。
【００２１】
この実験では本発明と同条件において「振とう」を省いた静置状態による実験も試みた。
【００２２】
【表４】
2008022705.tif 000006
【００２３】
７２時間培養した結果、従来法が０.１４値に対して本発明は０.４３値となり、３倍以上の増殖が確認され、三角フラスコ内の混合ガスを一定の割合とし且つ陽圧に保つことが培養効率に大きく影響することが確認されるとともに、振とうにより混合ガスと培地との設置面積の増大が増殖に好影響を与えることが判明した。
【００２４】
また、前記本発明の同条件において、培地液量を１０ｍｌ，２０ｍｌ，３０ｍｌ，５０ｍｌ，７０ｍｌ，１００ｍｌにかえて培養実験をした結果は次表の通りであった。培地液量を少なくして振とう効率を上げてガス置換効率を良くするほど生育が良いという結果が得られた
【００２５】
【表５】
2008022705.tif 000007
【００２６】
さらに培地液量を１０ｍｌ，２０ｍｌ，３０ｍｌに限定し、Ｏ2ガスの比はそのままで、ＣＯ2ガスの混合比を、５％、１０％、１５％、１００％にかえた実験を試みた結果は次表の通りである。ＣＯ2ガス濃度が１０％で最大のＯＤ値を示すものとなった。
【００２７】
【表６】
2008022705.tif 000008
【実施例３】
【００２８】
図２は一定の混合ガス環境に光照射を加えた培養方法に用いるシステム例を示し、前述の振とう培養器１の天井面，内壁面のいずれかに光波長を可変制御可能な例えばＬＥＤ方式などによる光照射装置１４を設けたものである。
かくして光波長を可変制御することで、特定の光波長で効率的な光合成を行う植物，植物性プランクトン，バクテリアを効率よく増殖させたり、その事前段階として最適な有用物質の生産条件の検討が可能となるのである。さらに未知の種に対してどのような光波長，混合ガス環境が最適な条件となり得るかを効率的に検討することも可能である。なお既に最適な光波長の解明されている試料については単一波長の光源を用いることもある。
【実施例４】
【００２９】
図３は前記した各培養方法において、培養進行度を経時的に捉えるためのモニタリング方法の実施装置（混合ガス入口ノズルと排出ガス出口ノズルの部分は省略）を示すもので、各三角フラスコ３の内底面に特定波長の光を照射すると蛍光を発生するルテニウム金属錯体，多環式芳香族炭化水素などの蛍光体箔１５を貼着し、三角フラスコ３の据置下の振とう台２上に該蛍光体箔１５に特定波長の光を照射し且つその蛍光値を測定する酸素濃度センサー１５を設ける。蛍光体箔１５は酸素との反応によりクエンチング（消光：Quenching）現象を生ずるので、培地液中の溶存酸素が生物試料の培養進行に伴って減少するとクエンチング現象が低下する。この蛍光強度の変化を酸素濃度センサー１６にて測定して演算することにより、生物試料の培養進行度を経時的にモニタリングすることができるのである。なお蛍光体箔１５自体は酸素を消費せず、振とうする培地液の流速による影響を受けることがなく、また培地液および液中の生物試料に影響を与えることはないものである。
【実施例５】
【００３０】
図４は培地液の濁度の変化を測定して演算することにより生物試料の培養進行度を監視するモニタリング方法の実施例を示すもので、レーザー光を照射してその反射光を測定することにより濁度を検出する濁度センサー１７の光照射部および反射光検知部を備えた先端部を培地液中に埋没するようにしてセットする。三角フラスコ３の底面反射の影響を受けないように少し斜めにして設置することが望ましい。培養により生物試料が増殖すると、濁度が増すのでその変化を測定して演算することにより培養進行度をモニタリングすることができることとなる。嫌気性菌など酸素濃度に変化の見られない培養のモニタリングに適すものである。
【実施例６】
【００３１】
図５はｐＨ値の変化を測定して培養進行度をモニタリングする方法の装置を示すもので、三角フラスコ３の内底面に酸化還元電位の変化に反応するｐＨ反応箔１８を貼着し、三角フラスコ３の据置下の振とう台２上に該ｐＨ反応箔１８の変化値を測定するｐｈセンサー１９を設けて、培地液内の酸化還元電位の変化を検知測定して演算することにより生物試料の培養進行度，培養環境の変化等を経時的にモニタリングすることができることとなる。
【００３２】
以上のように、培養する試料に適した各種センサーを選択して取付けることで生物試料の培養進行度を経時的にモニタリングすることにより、培養のための最適環境の確認作業等を能率的に行うことができることとなる。これらのセンサーはパソコン等２０と接続して測定経過をデータベース化することもでき、また培養進行度によって環境の再整備を要するときなどには、指定の進行度を知らせる機能を付加して作業の効率化を図ることができるものとなる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
以上のようにして本発明によれば、新規の装置を使用するほか、既存の振とう培養器にセンサーフィードバック機能を備えたガス制御機構を加えることで、培養する生物試料ごとに最適な培養温度、振とう速度、ガス濃度組成、ガス流量を調整して、これまで培養が困難であった生物試料を簡単且つ高効率にて培養することができるので、バイオプロセス，バイオサイエンスの分野において広く利用することができるものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の高密度培養方法を実施するシステムの１例を示す説明図
【図２】光照射システムを設けた振とう培養器の例を示す正面図
【図３】酸素センサーによるモニタリング方法を実施するシステム例を示す説明図
【図４】濁度センサーによるモニタリング方法を実施するシステム例を示す説明図
【図５】ｐＨセンサーによるモニタリング方法を実施するシステム例を示す説明図
【符号の説明】
【００３５】
１は振とう培養器
２は振とう台
３は三角フラスコ
４はマルチガスコントローラー
５ａ，５ｂはガスボンベ
６ａ，６ｂ，６ｃはガスの取入口
７ａはＯ2センサー
７ｂはＣＯ2センサー
８はポンプ
９は循環管路
１０は流量計
１１は分岐管
１２は密閉栓
１３ａ入口ノズル
１３ｂは出口ノズル
１４は光照射装置
１５は蛍光体箔
１６は酸素濃度センサー
１７は濁度センサー
１８はｐＨ反応箔
１９はｐＨセンサー
２０はパソコン
【図１】
2008022705.tif 000009
【図２】
2008022705.tif 000010
【図３】
2008022705.tif 000011
【図４】
2008022705.tif 000012
【図５】
2008022705.tif 000013