(57)【要約】      （修正有）【課題】顕微鏡装置に色光源や色フィルタを設けなくても、標本スライスの原画像の取得の際に色感度を最適に調整できる標本スライス画像の領域抽出システムを提供する。【解決手段】標本スライス２と、光源及び開口絞りと標本スライスの画像を取得するカラー画像取得手段３とを有する顕微鏡装置１と、標本スライス画像をＲＧＢ分解してカラー画像処理し、標本スライス画像内の特定領域を抽出する画像処理手段４と、を有する、標本スライス画像の領域抽出システムであって、光源の光量と開口絞りの絞り量の少なくとも一方が、カラー画像取得手段における赤成分感度と青成分感度の相対感度が略同一になるように制御されることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本スライスと、
光源及び開口絞りと、前記標本スライスの画像を取得するカラー画像取得手段とを有する顕微鏡装置と、
前記標本スライス画像をＲＧＢ分解してカラー画像処理し、前記標本スライス画像内の特定領域を抽出する領域抽出手段と、
を有する、標本スライス画像の領域抽出システムであって、
前記光源の光量と前記開口絞りの絞り量の少なくとも一方が、前記カラー画像取得手段における赤成分感度と青成分感度の相対感度が略同一になるように制御されることを特徴とする、標本スライス画像の領域抽出システム。
【請求項２】
前記カラー画像取得手段により取得されたＲＧＢ成分からなる画像の全画素のうち、Ｒ成分輝度がＢＧ成分輝度に比べて大きい画素の画素数の合計値と、Ｂ成分輝度がＲＧ成分輝度に比べて大きい画素の画素数の合計値とが略同一になるように、前記光源の光量と前記開口絞りの絞り量の少なくとも一方が制御されることを特徴とする、請求項１記載の標本スライス画像の領域抽出システム。
【請求項３】
前記標本スライスは、対比染色された生物試料を含む染色標本スライスである、請求項１又は２記載の標本スライス画像の領域抽出システム。
【請求項４】
標本スライスの画像を顕微鏡装置及びカラー画像取得手段により取得し、標本スライス画像をカラー画像処理することにより前記標本スライス画像内の特定領域を抽出する標本スライス画像の領域抽出方法であって、
前記カラー画像取得手段により前記標本スライスが無い状態で背景画像を取得する背景画像取得工程と、
ＲＧＢ成分からなる前記背景画像の全画素のうち、Ｒ成分輝度がＢＧ成分輝度に比べて大きい画素の画素数の合計値と、Ｂ成分輝度がＲＧ成分輝度に比べて大きい画素の画素数の合計値とが略同一になるように、前記顕微鏡装置の光源の光量と開口絞りの絞り量の少なくとも一方を制御する光量制御工程と、
前記顕微鏡装置内に前記標本スライスをセットし、前記顕微鏡装置及び前記カラー画像取得手段により標本スライス画像を取得する標本スライス画像取得工程と、
前記標本スライス画像をＲＧＢ分解してカラー画像処理し、前記標本スライス画像内の特定領域を抽出する領域抽出工程と、
を有することを特徴とする、標本スライス画像の領域抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標本スライス（特に対比染色（免疫染色）された生物試料を含む染色標本スライス）の画像を顕微鏡装置により取得し、前記標本スライス画像をＲＧＢ分解してカラー画像処理することで、前記標本スライス画像内の特定領域（特定の細胞領域など）を抽出する標本スライス画像の領域抽出システムに関する。なお、本発明においてＲＧＢとは、赤・緑・青の光の三原色を意味し、Ｒ＝赤、Ｇ＝緑、Ｂ＝青である。
【背景技術】
【０００２】
免疫染色されたスライス標本内に存在する対象部位を定量化する場合、一般的に画像処理が用いられている。そこではNIH-imageなどのソフトウエアが用いられてきた。しかし、しきい値の決定工程における操作者の主観に大きく依存するため定量結果に問題があった。そこで処理の客観性の向上が望まれている。
染色標本スライス画像は、顕微鏡装置に取り付けられたＣＣＤカメラ等により取得される。取得された染色標本スライス画像は、画像処理ソフト等により細胞領域等の抽出が行われる。画像処理ソフトにおいてコントラスト等のパラメータを調節することは可能であるが、より確実な画像処理を行うには、染色標本スライスの原画像が画像処理に適した画像になっていることが望ましい。染色標本スライスの原画像の最適化は、顕微鏡装置における光量の調整などにより行われる。対比染色（免疫染色）された染色標本スライス画像においては色情報が重要なので、領域抽出の画像処理は色情報も含んで行われる。したがって、染色標本スライスの原画像取得にあたっては各色成分の感度も最適化する必要があるが、一般的には顕微鏡装置における光量の調整だけでは各色成分の感度を個別に調整することは不可能であると考えられている。顕微鏡装置において各色成分の感度を調整するためには色成分を有する光源を用いるか、色フィルタを用いるしかないが、これらを用いると装置が複雑になりコストや手間も増すという問題がある。また、従来の顕微鏡装置の設定は視覚的に良好な画像を得るために行われており、画像処理に最適な設定はあまり考慮されていない。
【０００３】
特許文献１には、カラー画像をグレースケールに変換して作成したヒストグラムより、複数の自動しきい値選定法を組み合わせることで得た複数の候補値の中からニューラルネットワークにて最適なしきい値を決定することが記載されている。しかしながら、特許文献１には、原画像の取得にあたって、コントラストや色感度を調整することは記載されていない。
【特許文献１】特開２００４−１９９３９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、従来技術においては染色標本スライスの原画像取得の際に、原画像そのもののコントラストや色感度を調整することは考慮されていなかった。また、原画像のコントラストは顕微鏡装置の光量で調整できるものの、色感度を調整するためには、色成分を有する光源か色フィルタを用いる必要があり、装置が複雑になりコストや手間も増すという問題があった。
本発明は、上記問題を解決し、顕微鏡装置に色光源や色フィルタを設けなくても、標本スライスの原画像の取得の際に色感度を最適に調整できる標本スライス画像の領域抽出システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するため、本発明は以下の構成を有する。
標本スライスと、
光源及び開口絞りと、前記標本スライスの画像を取得するカラー画像取得手段とを有する顕微鏡装置と、
前記標本スライス画像をＲＧＢ分解してカラー画像処理し、前記標本スライス画像内の特定領域を抽出する領域抽出手段と、
を有する、標本スライス画像の領域抽出システムであって、
前記光源の光量と前記開口絞りの絞り量の少なくとも一方が、前記カラー画像取得手段における赤成分感度と青成分感度の相対感度が略同一になるように制御されることを特徴とする、標本スライス画像の領域抽出システム。
標本スライスの画像を顕微鏡装置及びカラー画像取得手段により取得し、標本スライス画像をカラー画像処理することにより前記標本スライス画像内の特定領域を抽出する標本スライス画像の領域抽出方法であって、
前記カラー画像取得手段により前記標本スライスが無い状態で背景画像を取得する背景画像取得工程と、
ＲＧＢ成分からなる前記背景画像の全画素のうち、Ｒ成分輝度がＢＧ成分輝度に比べて大きい画素の画素数の合計値と、Ｂ成分輝度がＲＧ成分輝度に比べて大きい画素の画素数の合計値とが略同一になるように、前記顕微鏡装置の光源の光量と開口絞りの絞り量の少なくとも一方を制御する光量制御工程と、
前記顕微鏡装置内に前記標本スライスをセットし、前記顕微鏡装置及び前記カラー画像取得手段により標本スライス画像を取得する標本スライス画像取得工程と、
前記標本スライス画像をＲＧＢ分解してカラー画像処理し、前記標本スライス画像内の特定領域を抽出する領域抽出工程と、
を有することを特徴とする、標本スライス画像の領域抽出方法。
【０００６】
また、以下の実施態様を有する。
前記カラー画像取得手段により取得されたＲＧＢからなる画像の全画素のうち、Ｒ成分輝度がＢＧ成分輝度に比べて大きい画素の画素数の合計値と、Ｂ成分輝度がＲＧ成分輝度に比べて大きい画素の画素数の合計値とが略同一になるように、前記光源の光量と前記開口絞りの絞り量の少なくとも一方が制御される。前記画像は、前記標本スライス画像でも良いし、前記標本スライスが無い状態で取得された背景画像でも良いが、背景画像を用いる方が好ましい。
前記標本スライスは、対比染色された生物試料を含む染色標本スライスである。標本スライスについては特に限定されないが、赤青対比染色（免疫染色）された生物試料が好適に用いられ得る。
前記カラー画像取得手段は、ＣＣＤカメラである。カラー画像取得手段は特に限定されないが、ＣＣＤカメラが一般的に用いられる。
前記カラー画像処理は、主成分分解処理を含む。主成分分解処理とは、カラー画像データをＲＧＢ空間内で座標変換する処理である。必須の処理ではないが、この処理を行うことで、染色標本スライス画像内の領域抽出がより確実に行えるようになる。
前記光源の光量及び開口絞りの絞り量の両方が独立に制御される。前記光源の光量及び開口絞りの絞り量を個別に制御しても良いが、それぞれを独立に制御して２次元制御することでより確実な制御ができる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の構成により、顕微鏡装置に色光源や色フィルタを設けなくても、標本スライスの原画像取得の際に色感度を最適に調整でき、カラー画像処理においてより確実に領域抽出を行うことができる。本発明者は実験により、顕微鏡装置の光源光量及び絞り量を調整することで、カラー画像取得手段における赤成分感度及び青成分感度が相対的に変化することを見出した。したがって、顕微鏡装置の光源光量及び絞り量を最適値に制御することで、標本スライス画像における赤成分及び青成分のコントラスト比を最適化でき、カラー画像処理の領域抽出をより確実に行うことができる。本発明者の実験では、緑成分感度については光量や絞り量の変化によってほとんど相対変化しないことがわかったが、対比染色（免疫染色）された生物試料は主として赤及び青のコントラストを含んでいることが一般的であるので、赤成分及び青成分のコントラスト比を相対変化させられれば十分である。本発明は、顕微鏡装置に新たな構成を加えることなく、赤成分及び青成分のコントラスト比を相対変化させられるという、従来技術にはない特有の効果を奏する。また、主観的な方法ではなく、ＲＧＢそれぞれが最大輝度になる画素数を計数する方法で最適な光源光量及び開口絞り量を求めることができるので、自動化も容易である。最適な画像を選択する光量及び開口絞りの絞り量を制御するための一例には、取得画像を主成分分析することで得られた解析結果を用いることが考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、図面を用いて本発明の実施形態の一例について説明する。
図１は、本発明の実施形態の一例を表す概略図である。本システムは、光源光量及び開口絞り量が制御可能な顕微鏡装置１、顕微鏡装置１にセットされた標本スライス２、顕微鏡装置１に取り付けられ、標本スライス２のカラー画像を取得するカラー画像取得手段（ＣＣＤカメラ）３、カラー画像取得手段３で取得された標本スライス画像から特定の細胞領域などを抽出する領域抽出手段を含む画像処理手段４、画像処理手段４により抽出された結果画像などを表示する表示手段５からなる。顕微鏡装置１は、光源光量制御又は開口絞り量制御が可能で、ＣＣＤカメラ等の画像取得手段３が取り付け可能であれば、既存の顕微鏡装置を利用できる。標本スライス２としては、例えば、膵臓組織を、ＤＡＢで赤く発色させ、その対比染色としてヘマトキシリンで青く染色させたものを用いる。カラー画像取得手段３としては、一般的に用いられているカラーＣＣＤカメラを用いることができる。画像処理手段４及び表示手段５としては、一般的なパソコンを用いることができる。
【０００９】
画像処理手段４における領域抽出は以下の手順で行われる。まず、ＲＧＢ成分を含む標本スライスの原画像について、ＲＧＢ空間内で座標変換する主成分分解を行う。主成分解は必須ではないが、あった方が領域抽出の精度が高くなる。主成分分解された画像データに基づいて、特定の細胞領域などの領域抽出が行われる。領域抽出のアルゴリズムとしては、ニューラルネットワーク（自己組織化（ＳＯＭ）など）、クラスタリング手法（K-means法など）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）などの公知のものを用いることができる。
【００１０】
顕微鏡装置１の光源光量及び開口絞り量の調整方法について説明する。観察対象である標本スライス２が無い背景画像をカラー画像取得手段３により取得し、画像処理手段４により前記背景画像の各画素のＲＧＢ成分を比較し、Ｒ成分輝度がＢＧ成分輝度に比べて大きい画素の画素数の合計値（Ｒmax画素数）と、Ｂ成分輝度がＲＧ成分輝度に比べて大きい画素の画素数の合計値（Ｂmax画素数）を求める。本発明者の実験により、Ｒmax画素数とＢmax画素数は、光源の色を変えたり色フィルタを用いたりしなくても、光源光量及び開口絞り量を調整するだけで変化することがわかっている。Ｒmax画素数及びＢmax画素数が略同一になるところが赤成分と青成分のコントラストがもっとも良くなるところであるので、Ｒmax画素数及びＢmax画素数が略同一になるように、光源光量及び開口絞り量を制御する。本実施形態では、標本スライス２が無い背景画像に基づいて、Ｂmax画素数及びＲmax画素数を求めて光源光量及び開口絞りを制御しているが、背景画像ではなく標本スライス画像からＲmax画素数及びＢmax画素数を求めて光源光量及び開口絞り量を制御しても良い。ただし、標本スライス画像を用いるより背景画像を用いた方がより確実な制御量に制御できる。
【００１１】
図２に標本スライス画像の一例を示す。図２は、ＤＡＢで赤く発色させ、その対比染色としてヘマトキシリンで青く染色させた膵臓スライス標本画像である。この標本スライス画像をカラー画像処理して、膵外分泌領域と膵β細胞領域を分離する。
図３にカラー画像処理の一例を示す。画像処理は顕微鏡制御装置でＲＧＢに顕著な変化を示した画像に対し実行される。ここでの処理はＲＧＢ輝度データを用いる。また手動設定を必要としない画像処理アルゴリズムを用いることにより自動処理を行うものとする。処理の構成はＲＧＢ空間にデータを移す。ここで主成分分解により主成分を算出することで、より汎用性を保持した処理を行うことができる。次に算出データをニューラルネットワーク（自己組織化マップなど）やクラスタリング（K-means 法）、サポートベクターマシンなどの分割処理を行う。これにより対象領域の自動抽出が可能である。
【００１２】
以下に実験結果を示す。
図４は、標本スライスをセットしない背景のみの画像について、開口絞り量及び光源電圧（光源光量）を変化させた場合、ＲＧＢ成分のうち、Ｒ成分、Ｇ成分、Ｂ成分がそれぞれ最大輝度になった画素数の合計（Ｒmax、Ｇmax、Ｂmax）をグラフにしたものである。なお、Ｒ成分、Ｇ成分、Ｂ成分の輝度がほぼ同じである画素はカウントしていない。このグラフから、開口絞り量が０．３５付近、光源電圧（光源光量）が９〜１０Ｖ付近で、もっともＲ成分とＢ成分の感度バランスが良いことがわかる。Ｇ成分については、開口絞り量及び光源電圧（光源光量）を変化させても、相対感度があまり変化しないことがわかる。対比染色は赤青で行われることが一般的であるので、Ｒ成分とＢ成分の相対感度を制御できることは非常に意味がある。図５は、実際に標本スライスをセットした場合の画像における、ＲＧＢ各成分輝度が最大になる画素の合計である。図５においても、開口絞り量が０．３５付近、光源電圧（光源光量）が９〜１０Ｖ付近で、Ｒ成分とＢ成分の相対感度が最適になっていることがわかる。
【００１３】
以上、本発明の実施形態の一例を説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇において各種の変更が可能であることは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本システムの概略図
【図２】標本スライス画像の例
【図３】領域抽出画像処理の例
【図４】開口絞り量及び光源電圧を変化させたときの背景画像のＲＧＢ強度変化
【図５】開口絞り量及び光源電圧を変化させたときの膵臓標本スライス画像のＲＧＢ強度変化
【符号の説明】
【００１５】
１：顕微鏡装置、  ２：標本スライス、  ３：カラー画像取得手段（ＣＣＤカメラ）、  ４：画像処理手段、  ５：表示手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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