(57)【要約】      （修正有）【課題】血栓関連疾患の早期発見と、治療効果の評価、再発可能性の有無の評価を行うための高感度かつシンプルな評価方法を提供する。【解決手段】食後２時間以上を経過した血液から得られた血漿を検体として、毛細血管の直径（７μｍ）より大きな微小血栓の平均大きさ，および／または最大大きさ、微小血栓の数の変化を顕微鏡とフローサイトメーターとを組み合わせた光学手法および／または電気学的手法によりリアルタイムで測定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小血栓の測定による血栓関連疾患（脳梗塞、隠れ脳梗塞、微小脳梗塞、無症候性脳梗塞、無症候性微小脳梗塞、無症候性脳血管障害、心筋梗塞、肺栓塞、エコノミー症候群、脾貧血性梗塞、腎貧血性梗塞等）の評価方法。
【請求項２】
請求項１に記載した方法を用いての、血栓関連疾患の検査、および／または血栓関連疾患の発症リスクの評価、および／または血栓関連疾患のスクリーニング検査、および／または抗血栓薬の治療効果の評価、および／または最適抗血栓症治療薬のスクリーニング、および／または血漿交換療法における栓子の生じない良質血漿のスクリーニング、および／または輸血における栓子の生じない良質血液のスクリーニング。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、血栓関連疾患の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  血栓関連疾患の検査方法として、血液凝固系の検査が一般的である。近年、血管造影、Ｘ線ＣＴ、ＭＲＩ、超音波検査、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影等の方法も用いられるようになった。また、レーザーの応用も試みられている（例えば、特開２００２−３４５７８７号公報が挙げられる）。【０００３】  しかし、ハイテク検査機器が飛躍的に進歩してきたにもかかわらず、血栓関連疾患を発症の前に事前検出する方法がなく、その発症率は依然高いままである。また、抗血栓薬投与の終了時期も、客観的な判断手法がなく、臨床家の個々の判断に頼っている。その結果、服薬は、数年ないし十数年と長期化され、患者の肉体的、精神的負担に止まらず、国の医療費増にも繋がっている。【０００４】  これらのことは、現在利用可能な検査方法並びに治療効果への評価方法が必ずしも満足できるものではないことを示している。その背景には、血栓関連疾患における有効な評価方法がないことにあると考えられる。【０００５】  血栓関連疾患の早期発見と、治療効果の評価、再発可能性の有無の評価等を行うことは、臨床では極めて重要である。【０００６】  血栓関連疾患を引き起こす直接的な原因物質である血栓は、しばしば、現在利用可能な方法で検出される時点までは、既に血中に存在しているようである。このような血栓は、直径１μｍ以下から、１００μｍ以上に達し、微小血管の梗塞を引き起こしている。このため、４０歳代では４人に１人、５０歳代では３人に１人、６０歳代では八割以上の人が、微小脳梗塞の痕跡が見つかっている（非特許文献１、２）。【０００７】
【特許文献１】特開２００２−３４５７８７号公報
【非特許文献１】西脇祐司、「血管系・神経系の加齢変化に関する６年間のコホート研究  無症候性脳梗塞の予防学的意義を中心にして」、総合健康推進財団研究報告書、Ｖｏｌ．１９９８、１２０−１２８、２００１．
【非特許文献２】中村隆幸ら、「ＭＲＩによる船員の脳循環疾患の検討第２報」、海上医学研究、Ｖｏｌ．３５、６９−７６、１９９８．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】    これまで、血栓の検査方法としては、主に前０００２項に挙げられた線溶系検査と放射線検査がある。線溶系検査は、血栓形成の潜在可能性を間接的に推測する方法であり、直接血栓を測定しているものではない。【０００９】  放射線検査方法は、血栓を直接観察する方法であるが、数ミリメートル位大きさの血栓が形成されるまでには、検地できない。従い、マイクロメートルサイズの微小血栓に対しては、用いる余地がない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  そこで、本研究は、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＥＰＩＣＳ−ＡＬＴＲＡ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を用い、心筋梗塞患者の血漿から、多くの微小血栓が存在していることを発見した。その後、健常者を含め、約二千本の血液検体に対し分析を行い、心筋梗塞患者の血液中、微小血栓の大きさは、一般健常者に比べ著しく大きいことと、微小血栓の数も有意に多いことを見出し、本発明に至った。【００１１】  即ち、本発明は、血中の微小血栓の検出方法を見出し、血栓関連疾患の評価方法を開発した。【００１２】  本発明の方法は、主に血漿を検体とし、フローサイトメトリーと光学顕微鏡を組み合わせて用いた。
【発明の効果】
【００１３】  本発明は、微小血栓を、毛細血管を詰まる前の大きさで検出し、血栓関連疾患の評価に高感度かつシンプルな方法を提供した。【００１４】  本発明の有用性は以下のとおりである。【００１５】  毛細血管の直径（７μｍ）を目安に、これより大きな微小血栓は、毛細血管を塞ぐ栓子となり、血栓関連疾患発症の引き金になりうる。本発明の方法により、微小血栓を、毛細血管を詰まる前の大きさで測定できる。この微小血栓の平均大きさ、および／または最大大きさ、および／または微小血栓の数の変化を測定することにより、
（１）    血栓関連疾患診断
（２）    血栓関連疾患の発生、および／またはその進行状況
（３）    抗血栓治療薬の治療効果
（４）    血栓関連疾患の発症リスク、および／または予防
（５）    集団検診における血栓関連疾患のスクリーニング
（６）    乗り物、および／または運動施設における血栓関連疾患発生の可能性
の評価に有効な手段を提供できる。【００１６】    また、本発明の方法により、７μｍ以上の微小血栓が形成しない血漿のスクリーニングが可能となる。このような血漿は、陸上長距離選手に多く見られる。微小血栓の形成しない血漿のスクリーニングは、血漿交換療法において、肺栓塞症等の血栓関連疾患を避けられる一方、良質な血漿を提供でき、患者の予後改善や入院期間、健康回復期間の短縮に役立つ。【００１７】  また、本発明の方法により、血栓の形成をリアルタイムでモニターでき、血栓分野の研究に役立つ。【００１８】  また、本発明では、０．１ｍｌの血液で測定でき、尚且つ、１検体につき、測定時間がわずか１分で足りる。使用する試薬は、希釈用生理食塩水のみで、コストがほとんど掛からないと同時に、汚染性物質も排出しない。これらの点から考えると、実用性の極めて高い検査方法であると考えられる。【００１９】  また、採血は、指先からでも可能のため、医療機関以外の場所でも本発明の使用が出来る。医療機関以外の場所としては、例えば、エコノミー症候群の発生しやすい乗り物内、心筋梗塞発症しやすいゴルフ場、血栓関連疾患発生しやすい在宅療法者の居る住宅等が挙げられるが、特にこれに限定されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】以下、本発明の方法について具体的に説明する。【００２１】  １．血漿検体の調製
採血には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）−２Ｋ入り真空採血管を用い、静脈から血液を採取した。採取した血液を５００×ｇで１５分間遠心分離し、血小板の含まれている血漿を得た。さらに、３０００×ｇで１５分間遠心分離し、血小板を除去し、血球と血小板の含まれていない血漿を得た。この血漿は、本研究の検体とした。【００２２】  凝固剤としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、ヘパリン、ヘパリン硫酸、低分子量ヘパリンなどの使用もできるが、特に特定しない。【００２３】  採血としては、静脈採血の以外に、動脈採血、指先採血、耳採血等も可能である。【００２４】  遠心分離法としては、臨床で用いられている血漿調製法の何れも用いられるが、特に前００２１項の方法に限定するものではない。【００２５】  採血は食後２時間以上を経過した方が望ましいが、特にこれに限定されるものではない。【００２６】  フローサイトメトリーの測定に際し、検体を生理食塩水で１〜１０００００倍までに希釈して測定できるが、１０〜２０倍の方が望ましい。【００２７】  ただし、光学顕微鏡（全自動顕微鏡写真撮影装置、ＰＭ３０、オリンパス社、東京）で検査する場合は、検体を１００倍以下希釈しても用いられるが、稀釈しない方が望ましい。【００２８】  顕微鏡で検査する場合、微小血栓を染色するのが望ましい。染色方法としては、いずれの染色方法も使用できるが、特に限定しているものではない。本発明では、スカイブルー、又はギムザ染色、又はＩｇＧ−ＦＩＴＣ免疫染色法を用いた。勿論、光の位差を利用し、染色しないでも検査可能である。【００２９】  ２．フローサイトメトリーのセットアップ
微小血栓の大きさと数の測定には、フローサイトメトリーを用いた。前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ）をＹ軸に、側方散乱光（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ）をＸ軸に、微小血栓のスキャタグラフーを作成した（図１参照願い）。微小血栓の大きさは、前方散乱光の散乱光強度として測定し、チャンネル単位で表示した。【００３０】  フローサイトメトリーの精度管理には、「Ｆｌｏｗ−Ｃｈｅｃｋ」（Ｃａｔ＃：６６０５３５９、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）、日差変動管理には「Ｆｌｏｗ−ｓｅｔ」（Ｃａｔ＃：６６０７００７、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ）、微小血栓のサイズ同定には、「Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣＣ  ｓｉｚｅ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ」（Ｃａｔ＃：６６０１３２９、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）、微小血栓の数の測定には「Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ」（Ｃａｔ＃：７５４７０５３、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）を用いた。【００３１】  フローサイトメトリーの測定限界（直径４０μｍ）を超えた検体に対し、顕微鏡の目視法検査を追加実施した。【００３２】  ３．微小血栓の染色
微小血栓の染色には、抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体（Ｃａｔ＃：ＰＦ００４，Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ．ＵＫ）を用いた。０．１ｍｌの血漿に、３μｌのＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体を加えて攪拌し、室温遮光下で１５分間インキュベーションをし、微小血栓を染色した。スカイブルー、ギムザ染色は、何れも通常方法により染色した。染色した後、顕微鏡を用い、微小血栓を観察し、画像撮影を行った。【００３３】  ４．微小血栓のサイズの求め方
サイズの同定には、直径２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、４０μｍの標準粒子（「Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣＣ  ｓｉｚｅ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ」）を用いた。まず、既知サイズの各粒子の前方散乱光強度値を、フローサイトメトリーに付属している専用データ解析ソフト（Ｆｌｏｗ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｅｘｐｏ２，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ）で割り出した。次に、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３を用い、割り出した値と粒子のサイズにより、チャンネル／サイズ換算式「ｙ＝ａｘ−ｂ」を得た。「ｙ」は前方散乱光強度である。この換算式により、粒子の大きさ「ｘ」の値を割り出した。なお、「Ｆｌｏｗ−Ｓｅｔ」でフローサイトメトリーの日差変動を管理している場合、換算式における「ａ」と「ｂ」は、変動がなく、一定である。【００３４】  ５．測定結果
以下、測定結果について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３５】  ５．１．微小血栓のスキャッタ図
図１はフローサイトメトリーで測定した微小血栓のスキャッタ図であった。【００３６】  図１Ａと図１Ｂは、陸上長距離選手の微小血栓スキャッタ図であり、矢印で示した最大微小血栓の直径は４．８μｍであった。このような対象者は、血栓関連疾患発症の可能性はないと考えられる。【００３７】  図１Ｃは、２０歳代健常者の微小血栓スキャッタ図であり、矢印で示した最大微小血栓の直径は１１．２μｍであった。【００３８】  図１Ｄは、４０歳代健常者の微小血栓スキャッタ図であり、矢印で示した最大微小血栓の直径は２３．９μｍであった。このような微小血栓を持つ対象者は、血栓関連疾患発症の可能性はあると考えられる。【００３９】  図１Ｅは、６０歳代健常者の微小血栓スキャッタ図であり、矢印で示した最大微小血栓の直径は３８．１μｍであった。このような微小血栓を持つ対象者は、血栓関連疾患発症の可能性は高いと考えられる。【００４０】  図１Ｆは、心筋梗塞が起き、病院に搬送され、薬を投与する前の検体であった。矢印で示した最大微小血栓は、フローサイトメトリーの測定限界（４０μｍ）を超えていた粒子であった。心筋梗塞が発症した血漿検体では、このようにサイズの大きな微小血栓が大量に出現し、健常者との差が一目瞭然であった。【００４１】  図１Ｇは、通院治療を受けている心筋梗塞患者の検体であった。抗血栓薬は、大きな微小血栓を溶けるだけではなく、微小血栓の数も著しく抑制したことを見事に表現できた。ただし、矢印で示したように、大きな微小血栓がまだ存在し、再発のリスクは高いと判断でき、薬の継続服用が必要であった。【００４２】  図１Ｈは、本発明の発明者本人が、連続３６時間睡眠と休養を取らずに研究を続けていたところ、顔面色が青く、体がだるく、息が重く、胸が少々痛みを感じている時のサンプルであった。この場合、医学的には、毛細血管が収縮し、末梢循環が悪くなっていたと考える。しかしながら、微小血栓の角度から考えると、末梢循環が悪くなる原因は、必ずしも毛細血管収縮のみによるのではなく、微小血栓の増大により、毛細血管の流れが阻害された場合でも、同様に上述症状を引き起こしうる、とのことに気づき、すぐ、左正中静脈から採血し、微小血栓の大きさを測定した。その結果、３０μｍ以上に達した微小血栓が観察され、血栓関連疾患発症のリスクが高い状態にいると判断し、即時に研究を中止し、休養を取った。【００４３】  上述結果から、本発明の方法は、血栓関連疾患の評価に極めて有効であることが確認された。【００４４】  ５．２．微小血栓の顕微鏡写真【００４５】  図２Ａは陸上長距離選手によく見られる微小血栓である。直径は、約５μｍで、血管を塞ぐことがない。このような対象者は血栓関連疾患になる可能性はないと考えられる。【００４６】  図２Ｂは、心筋梗塞患者に見られる不規則な形をしている微小血栓である。写真の粒子の大きさは約１５×３５μｍである。毛細血管を塞ぐには、十分な大きさであった。このような患者は、再発症の可能性があると考えられる。【００４７】  図２Ｃは、健常な６０歳代の人にしばしば観察される微小血栓である。写真の粒子の直径は約３０μｍに達し、微小梗塞を引き起こすには、十分な大きさである。このような粒子を持つ人は、���常者であっても、血栓関連疾患の発症リスクがあると考えられる。【００４８】  図２Ｄは、心筋梗塞歴を有する対象者から検出した大きな微小血栓である。青く見えるのは、抗体ＩｇＧ−ＦＩＴＣに染色されたＩｇＧタンパク質である。強く光っている二つのスポットは、ＩｇＧタンパク質が集中しているところである。その他の黒くなっているところは、空洞ではなく、ＩｇＧタンパク質の少ない部位である。ここでは測定方法とデータを示していないが、薄層クロマトグラフィーによる脂質分析の結果、このような大きな微小血栓には著しい量のトリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）が含まれていることが判明されていた。黒いところは、脂質が集中し、ＩｇＧタンパク質の少ない部位であると考えられる。このような大きさの微小血栓を持つ人は、血栓関連疾患が再発症する可能性が高い。また、服用している薬は十分に効いていないと考えられる。【００４９】  上述結果から、本発明の方法は、微小血栓の正体を明らかにしたと同時に、血栓関連疾患の評価に極めて有用であることも確認された。
【実施例】
【００５０】  以下、実施例について詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５１】  実施例１、
定期的なランニングをしている人は、血栓関連疾患の発症リスクが低いことが周知されている。毎日ランニングをしている人は、一般運動していない人より、微小血栓の大きさが小さく、数も少なくないと考えられる。【００５２】  対象者は、７０名の大学生陸上長距離選手と２５名の同大学非トレーニング学生であった。陸上長距離選手は、毎日早朝８ｋｍのジョギングと、午後１５±５ｋｍの本練習を行っていた。非トレーニング学生はアパートからの通学者であった。これらの対象者に対し、研究の主旨と本研究に参加する場合のリスクとメリットを説明し，書面承諾を得た．実験の結果については各対象者に説明した．【００５３】  測定の結果は図３に示した。学生陸上長距離選手の微小血栓の大きさの平均値は、１．２±１．０μｍで、非トレーニング学生の大きさは、凡そその倍の２．５±１．７μｍであった。非トレーニング学生に比べ、陸上長距離選手の微小血栓は有意に小さかった（ｐ＜０．００１）。また、微小血栓の数も、陸上長距離選手の方は８９．７±７３．６個／μｌ血漿で、非トレーニング学生の３１９．９±１６６．６個／μｌ血漿より、有意に低かった（ｐ＜０．００１）。このように、本発明の方法は、血栓関連疾患のリスクを微小血栓の大きさとその数から評価できることを確認された。【００５４】  実施例２、
心筋梗塞の発症歴を持ち、各々Ａ病院、又はＢ病院、又はＣ病院に通院している４５名の患者である。これらの患者の血液検体の使用は、各病院の院内倫理委員会の承認を得た。実験の結果については病院倫理委員会に説明した．【００５５】  分析の結果では、心筋梗塞患者の微小血栓の平均大きさは、直径６．７±２．７μｍであり、前００５３項の健常者により有意に大きかった（ｐ＜０．００１）。本発明の方法は、血栓関連疾患の検出に極めて有効であることが確認された。【００５６】  実施例３、
加齢に伴い、隠れ脳梗塞の発症率が増加していることは、近年の脳画像診断技術の進歩により明らかになった。その背後には、年齢の増加に伴い、血中にある微小血栓のサイズが大きくなり、数も増加していると考えられる。【００５７】  そこで、Ｅ医療機関の３１名職員を対象者として、本発明の方法を用い、微小血栓の平均大きさ並びにその数と年齢との相関関係を分析した。対象者全員に対し、研究の主旨と本研究に参加する場合のリスクとメリットを説明し，承諾を得た．実験の結果については各対象者に説明した．【００５８】  分析の結果は図４に示した。年齢と微小血栓のサイズとの間には、有意な正の相関関係が認められ（ｒ＝０．５５、ｐ＜０．０１）、加齢と共に微小血栓が大きくなっていくことが判明された。また、年齢と微小血栓の数との間にも、弱い相関関係が認められ（ｒ＝０．３５、ｐ＜０．０５）、加齢と共に微小血栓の数が増えていることも判明された。このように、本発明の方法は、加齢に伴い発症率が高くなっていく血栓関連疾患の評価に有効であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】  本発明は、フローサイトメトリーと顕微鏡の組み合わせで用いてきたが、効率の高い方法とはいえない。フローサイトメトリーの精度管理には非常に複雑で、手間がかかる。顕微鏡での目視法検査は、１検体につき、１５分前後の時間が必要とし、効率が極めて悪く、且つ、人為的見落とすも避けられない。人件費の高い日本では、このような組み合わせ方法は日常的な検査方法として普及できるとは思わない。【００６０】  このように、微小血栓の測定は、臨床的には極めて大きな意味を持っているにもかかわらず、微小血栓測定機器が製造・販売されていない。また、本発明に応用できる機械も市販されていない。【００６１】  本発明に使用できる機械は、光源、検体台（若しくはチューブ、若しくはフローチューブ）、センサ、検出器、信号処理機、データ処理機等の基本要素で構成される。勿論、データの保存や印刷などのいろいろ周辺要素を加えれば、さらに望ましい。これらの要素を揃えた微粒子測定方法としては、光散乱法、光遮断法、電気抵抗法、音響法、ダイナミック光散乱法、光ダイオード法、フォトアコースティック、レーザーブレイクダウン、レーザーフェーズシフト、フラウンフォーファー回折法、顕微鏡走査法、画像走査法等が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】微小血栓を示すスキャッタ図である。
【図２】微小血栓の形態及び大きさを示す写真である。
【図３】陸上長距離選手と非トレーニング学生における微小血栓の大きさ並びにその数の比較
【図４】微小血栓の大きさ並びにその数と年齢との相関関係
【符号の説明】
【００６３】なし。
【図１】
2008134059.tif 000002
【図２】
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【図３】
2008134059.tif 000004
【図４】
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