(57)【要約】【課題】新規ＨＬＡ−Ｂアリルを見出し、その検出に有用なプローブ、試薬、キット等を提供すること。【解決手段】エクソン３が配列番号１の塩基配列からなる新規ＨＬＡ−Ｂ＊４００２アリルが提供される。また、当該アリルの配列を基に設計された検出用プローブ、試薬、及びキット等が提供される。検出プローブ等はＨＬＡ−Ｂ型のタイピングに有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクソン３が配列番号１の塩基配列からなるＨＬＡ−Ｂアリル。
【請求項２】
請求項１に記載のＨＬＡ−Ｂアリルを特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列からなるエクソン３の２６番目塩基を標的とすることを特徴とする、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
前記エクソン３の一部であって前記２６番目塩基を含む領域に相補的な配列を有することを特徴とする、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
ストリンジェントな条件下、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片にハイブリダイズし、配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ断片にハイブリダイズしないことを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
配列番号１の塩基配列からなるエクソン３の１９番目塩基、２０番目塩基及び２６番目塩基を標的とすることを特徴とする、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７】
前記エクソン３の一部であって前記１９番目塩基及び前記２０番目塩基を含む領域に相補的な第１配列部と、前記エクソン３の一部であって前記２６番目塩基を含む領域に相補的な第２配列部とを有することを特徴とする、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項８】
前記第１配列部と前記第２配列部がスペーサーを介して連結されている、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項９】
前記エクソン３の一部であって前記１９番目塩基〜前記２６番目塩基を含む領域に相補的な配列を有することを特徴とする、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１０】
ストリンジェントな条件下、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片に対してハイブリダイズし、配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ断片に対してハイブリダイズしないことを特徴とする、請求項６〜９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１１】
前記エクソン３の前記１９番目塩基〜前記２６番目塩基に相補的な配列を有する塩基配列からなることを特徴とする、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１２】
１０ｂｐ〜４０ｂｐの長さである、請求項２〜１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１３】
配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１の塩基配列を有することを特徴とする、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１４】
標識物質が結合していることを特徴とする、請求項２〜１３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１５】
不溶性支持体に固定化されていることを特徴とする、請求項２〜１４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１６】
配列番号１の塩基配列からなるエクソン３の１９番目塩基及び２０番目塩基を標的とする第１プローブと、前記エクソン３の２６番目塩基を標的とする第２プローブと、からなるオリゴヌクレオチドプローブセットであって、
前記第１プローブの一部と前記第２プローブの一部が相補的であることを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１７】
前記第１プローブは、前記エクソン３の一部であって前記１９番目塩基及び前記２０番目塩基を含む領域に相補的な配列を有し、
前記第２プローブは、前記エクソン３の一部であって前記２６番目塩基を含む領域に相補的な配列を有することを特徴とする、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１８】
前記第１プローブが配列番号２２の塩基配列を有し、前記第２プローブが配列番号２３の塩基配列を有することを特徴とする、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１９】
請求項２〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ、又は請求項１６〜１８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセットを含む、ＨＬＡアリルタイピング用の試薬。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドプローブ又は前記オリゴヌクレオチドプローブセットの標的と異なるＨＬＡアリルを検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを更に含むことを特徴とする、請求項１９に記載の試薬。
【請求項２１】
前記ＨＬＡアリルがＨＬＡ−Ｂアリルである、請求項２０に記載の試薬。
【請求項２２】
前記ＨＬＡアリルが、配列番号１の塩基配列と異なる塩基配列のエクソン３を有するＨＬＡ−Ｂ＊４００２、又はＨＬＡ−Ｂ＊４００６である、請求項２０に記載の試薬。
【請求項２３】
前記ＨＬＡ−Ｂ＊４００２がＨＬＡ−Ｂ＊４００２０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２０２又はＨＬＡ−Ｂ＊４００２０３であり、前記ＨＬＡ−Ｂ＊４００６がＨＬＡ−Ｂ＊４００６０１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４００６０１０２又はＨＬＡ−Ｂ＊４００６０２であることを特徴とする、請求項２２に記載の試薬。
【請求項２４】
請求項１９〜２３のいずれかに記載の試薬と、該試薬と検体とのハイブリダイゼーション反応用の試薬と、及び取扱説明書とを含む、ＨＬＡアリルタイピング用のキット。
【請求項２５】
ＨＬＡ−Ｂアリルのエクソン３を増幅するための試薬を更に含むことを特徴とする、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
ＨＬＡ−Ｂアリルのエクソン２及び３を特異的に増幅するための試薬を更に含むことを特徴とする、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
洗浄用試薬、及び／又は反応用容器を更に含むことを特徴とする、請求項２４〜２６のいずれかに記載のキット。
【請求項２８】
被験者のＨＬＡ−Ｂ遺伝子が、請求項１に記載のＨＬＡ−Ｂアリルを有するか否かを調べるステップを含む、ＨＬＡタイピング法。
【請求項２９】
前記ステップが、被験者のゲノムＤＮＡから調製した核酸試料と、請求項２〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ、又は請求項１６〜１８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセットとを反応させた後、特異的なハイブリッド形成を検出することを含む、請求項２８に記載のＨＬＡタイピング法。
【請求項３０】
請求項２〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ、請求項１６〜１８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセット、請求項１９〜２３のいずれかに記載の試薬、又は請求項２４〜２７のいずれかに記載のキットを用いることを特徴とするＨＬＡタイピング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＨＬＡ−Ｂローカスにおける新規ＨＬＡ−Ｂアリルに関する。詳しくは、新規ＨＬＡ−Ｂアリル、当該アリルに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ、及びそれらの利用・用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
主要組織適合遺伝子複合体（major histocompatibility complex：ＭＨＣ）は、移植片の拒絶反応を決定する抗原として見出された分子であり、免疫応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣはＨＬＡ（humanleukocyte antigen)と呼ばれる。また、ＨＬＡをコードしている遺伝子群はＨＬＡ遺伝子複合体と呼ばれる。ＨＬＡは、その構造や分布及び提示する抗原ペプチドの由来が異なる二つのクラス、即ちクラスＩとクラスＩＩに分けられる。ＨＬＡクラスＩ分子は、すべての有核細胞と血小板に発現している。ウイルスや細菌に感染した細胞や腫瘍細胞などは、非自己タンパク質に由来するペプチドをクラスＩ抗原に結合させて提示し、免疫担当細胞を活性化させる。
一方、クラスＩＩ分子は樹状細胞、マクロファージ、リンパ球Ｂ細胞、モノサイトなどの抗原提示細胞に限定して発現する。これらの抗原提示細胞は細胞外のタンパク質や細胞表面のタンパク質を取り込み分解し、クラスＩＩ抗原と結合させて提示することで免疫応答を活性化させる。
ところで、以上のようなＨＬＡによる抗原提示に始まる一連の免疫応答が移植片に向かって働くと免疫拒絶が生ずる。免疫拒絶を回避するためには移植の際にドナーとレシピエントのＨＬＡ抗原の適合性を厳格に検査することが望まれる。
【０００３】
従来、ＨＬＡ抗原の適合性の検査、即ちＨＬＡ抗原のタイピングは血清学的手法又は細胞学的手法で行われきた。近年になって、ＨＬＡ遺伝子をターゲットとしたＤＮＡタイピングが可能となり、その有用性が確立されている。ＤＮＡタイピングによれば、血清学的手法などでは不可能な、遺伝子の塩基配列の違いに基づく判別が可能となる。ＨＬＡのクラスＩはＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに細分化され、同様にクラスＩＩはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、ＤＰに細分化される。ＤＮＡタイピングによって、これらの各分子について数多くの型（ＨＬＡアリル）が同定・認定されてきた。各ＨＬＡアリルは、それがコードするＨＬＡ分子の種類、アミノ酸配列に影響しない塩基配列の置換の有無、コード領域以外の配列部分での変異の有無などに基づき、所定のルールに従い表記される（「ＨＬＡアリルの命名規則の改訂に関するお知らせ」、日本組織適合性学会ＨＬＡ標準化委員会、http://square.umin.ac.jp/JSHI/standarization/NomenclatureRule2003.pdf）。
ＨＬＡクラスＩ抗原のアリルレベルでの適合性が、非血縁者間での骨髄移植や腎移植の予後（GVHD発症率、1年生存率）に密接に関連することが報告されている。
尚、本願に直接関連するものではないが、ＨＬＡ−Ｂアリルのタイピング法に関していくつかの報告がある（例えば特許文献１、２）。
【特許文献１】特表平０８−５０７６９０号公報
【非特許文献１】特開２００５−１８５１７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の通り、ＤＮＡタイピングの普及によって多数のＨＬＡアリルの存在が明らかにされ、それらの検出・識別が可能な状況にはあるものの、未知のＨＬＡアリルが存在することは否定できず、移植の成功率の更なる向上などのためには新規ＨＬＡアリルを見出すことが望まれる。そこで本発明は新規ＨＬＡ−Ｂアリルを見出し、その検出に有用なオリゴヌクレオチドプローブ、試薬、キット及びこれらを利用したＨＬＡアリルのタイピング法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある患者由来の検体について、現在利用可能なＨＬＡタイピング法を複数併用してＨＬＡ遺伝子型の判定（識別）を試みたところ、統一した判定結果が得られなかった。これらの方法では既知ＨＬＡアリルに特異的な複数のプローブを用いる。そして、検体のＨＬＡ遺伝子に反応するプローブの組合せを基に検体のＨＬＡ遺伝子型を決定する。従って、新規アリルについては判定不能であるか、又は誤った判定結果が出ることになる。そこで本発明者は、このように既存の方法で判定できなかった検体について、そのＨＬＡ遺伝子座の塩基配列を詳細に調べることにした。その結果、新規ＨＬＡ−Ｂアリルを見出すことに成功した。
本発明は以上の成果に基づき、以下に示す新規ＨＬＡ−Ｂアリル及びそれに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ等を提供する。
［１］  エクソン３が配列番号１の塩基配列からなるＨＬＡ−Ｂアリル。
［２］  ［１］に記載のＨＬＡ−Ｂアリルを特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ。
［３］  配列番号１の塩基配列からなるエクソン３の２６番目塩基を標的とすることを特徴とする、［２］に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［４］  前記エクソン３の一部であって前記２６番目塩基を含む領域に相補的な配列を有することを特徴とする、［３］に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［５］  ストリンジェントな条件下、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片にハイブリダイズし、配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ断片にハイブリダイズしないことを特徴とする、［２］〜［４］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［６］  配列番号１の塩基配列からなるエクソン３の１９番目塩基、２０番目塩基及び２６番目塩基を標的とすることを特徴とする、［２］に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［７］  前記エクソン３の一部であって前記１９番目塩基及び前記２０番目塩基を含む領域に相補的な第１配列部と、前記エクソン３の一部であって前記２６番目塩基を含む領域に相補的な第２配列部とを有することを特徴とする、［６］に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［８］  前記第１配列部と前記第２配列部がスペーサーを介して連結されている、［７］に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［９］  前記エクソン３の一部であって前記１９番目塩基〜前記２６番目塩基を含む領域に相補的な配列を有することを特徴とする、［６］に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［１０］  ストリンジェントな条件下、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片に対してハイブリダイズし、配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ断片に対してハイブリダイズしないことを特徴とする、［６］〜［９］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［１１］  前記エクソン３の前記１９番目塩基〜前記２６番目塩基に相補的な配列を有する塩基配列からなることを特徴とする、［２］に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［１２］  １０ｂｐ〜４０ｂｐの長さである、［２］〜［１１］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［１３］  配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１の塩基配列を有することを特徴とする、［２］に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［１４］  標識物質が結合していることを特徴とする、［２］〜［１３］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［１５］  不溶性支持体に固定化されていることを特徴とする、［２］〜［１４］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［１６］  配列番号１の塩基配列からなるエクソン３の１９番目塩基及び２０番目塩基を標的とする第１プローブと、前記エクソン３の２６番目塩基を標的とする第２プローブと、からなるオリゴヌクレオチドプローブセットであって、
前記第１プローブの一部と前記第２プローブの一部が相補的であることを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブセット。
［１７］  前記第１プローブは、前記エクソン３の一部であって前記１９番目塩基及び前記２０番目塩基を含む領域に相補的な配列を有し、
前記第２プローブは、前記エクソン３の一部であって前記２６番目塩基を含む領域に相補的な配列を有することを特徴とする、［１６］に記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
［１８］  前記第１プローブが配列番号２２の塩基配列を有し、前記第２プローブが配列番号２３の塩基配列を有することを特徴とする、［１６］に記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
［１９］  ［２］〜［１５］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ、又は［１６］〜［１８］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセットを含む、ＨＬＡアリルタイピング用の試薬。
［２０］
前記オリゴヌクレオチドプローブ又は前記オリゴヌクレオチドプローブセットの標的と異なるＨＬＡアリルを検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを更に含むことを特徴とする、［１９］に記載の試薬。
［２１］  前記ＨＬＡアリルがＨＬＡ−Ｂアリルである、［２０］に記載の試薬。
［２２］  前記ＨＬＡアリルが、配列番号１の塩基配列と異なる塩基配列のエクソン３を有するＨＬＡ−Ｂ＊４００２、又はＨＬＡ−Ｂ＊４００６である、［２０］に記載の試薬。
［２３］  前記ＨＬＡ−Ｂ＊４００２がＨＬＡ−Ｂ＊４００２０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２０２又はＨＬＡ−Ｂ＊４００２０３であり、前記ＨＬＡ−Ｂ＊４００６がＨＬＡ−Ｂ＊４００６０１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４００６０１０２又はＨＬＡ−Ｂ＊４００６０２であることを特徴とする、［２２］に記載の試薬。
［２４］  ［１９］〜［２３］のいずれかに記載の試薬と、該試薬と検体とのハイブリダイゼーション反応用の試薬と、及び取扱説明書とを含む、ＨＬＡアリルタイピング用のキット。
［２５］  ＨＬＡ−Ｂアリルのエクソン３を増幅するための試薬を更に含むことを特徴とする、［２４］に記載のキット。
［２６］  ＨＬＡ−Ｂアリルのエクソン２及び３を特異的に増幅するための試薬を更に含むことを特徴とする、［２４］に記載のキット。
［２７］  洗浄用試薬、及び／又は反応用容器を更に含むことを特徴とする、［２４］〜［２６］のいずれかに記載のキット。
［２８］  被験者のＨＬＡ−Ｂ遺伝子が、［１］に記載のＨＬＡ−Ｂアリルを有するか否かを調べるステップを含む、ＨＬＡタイピング法。
［２９］  前記ステップが、被験者のゲノムＤＮＡから調製した核酸試料と、［２］〜［１５］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ、又は［１６］〜［１８］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセットとを反応させた後、特異的なハイブリッド形成を検出することを含む、［２８］に記載のＨＬＡタイピング法。
［３０］  ［２］〜［１５］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ、［１６］〜［１８］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセット、［１９］〜［２３］のいずれかに記載の試薬、又は［２４］〜［２７］のいずれかに記載のキットを用いることを特徴とするＨＬＡタイピング法。
尚、本明細書では、日本組織適合性学会ＨＬＡ標準化委員会による「アリル表記法」に従って各アリルを表記する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の第１の局面は、本発明者が見出した新規ＨＬＡ−Ｂアリル（以下、説明の便宜上、省略して「新規アリル」ともいう）に関する。エクソン２及び３について新規アリルと既知の３種類のＨＬＡ−Ｂアリルを比較した図（図１）、及びエクソン３について新規アリルと既知の全ＨＬＡ−Ｂアリルを比較した図（図２〜８）に示すように、新規アリル（図中、「Ｂ＊４００２ｎｅｗ」と表記される）ではエクソン３の２６番目の塩基（新規アリルの全長の塩基配列においては５’側末端から数えて３６９番目の塩基。以下、当該塩基を「特異的塩基」という）がＴ（チミン）であるのに対し、既知ＨＬＡ−Ｂ＊４００２アリルのエクソン３では対応する部分の塩基はＣ（シトシン）である。このように新規アリルは、既知ＨＬＡ−Ｂ＊４００２アリルのエクソン３と１箇所のみで相違するという特徴的な配列のエクソン３（配列番号１）を有する。また、エクソンに関して新規アリルとＨＬＡ−Ｂ＊４００２０１を比較した結果（図９）からわかるように、新規アリルは上記の特異的塩基部分でのみＨＬＡ−Ｂ＊４００２０１と相違している。そして、当該相違をもたらす塩基置換はアミノ酸置換を伴っておらず、即ち同義置換であることから、新規アリルはＨＬＡ−Ｂ＊４００２のサブタイプであると判断された。尚、図１〜８ではＨＬＡ−Ｂ＊０７０２０１の塩基配列を基準として各アリルの塩基配列を示している。「-」は、当該箇所の塩基が、基準の塩基配列における対応位置の塩基と同一であることを表す。一方、図９では上段の配列（新規アリル）と下段の配列（ＨＬＡ−Ｂ＊４００２０１）が一致する箇所を＊で示している。図１〜９では慣例に従い左側が５’側（右側が３’側）となるように各塩基配列が表示される。
【０００７】
新規アリルの存在が明らかにされるとともに、その塩基配列の特徴が明確になったことによって、当該新規アリルのタイピング（識別、検出）を可能にするオリゴヌクレオチドプローブ（即ち、当該新規アリルを特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ）の設計が可能となった。そこで本発明の第２の局面は、新規アリルのタイピングに有用なオリゴヌクレオチドプローブ（以下、説明の便宜上、「オリゴヌクレオチドプローブ」を省略して「プローブ」ともいう）を提供する。本発明における「オリゴヌクレオチド」は好ましくはデオキシリボヌクレオチドで構成される。
【０００８】
本発明のプローブは、新規アリルの塩基配列（特に配列番号１に示すエクソン３の配列）に基づき（他のＨＬＡ−Ｂアリルの塩基配列も考慮される）、新規アリルを特異的に検出することができるように設計される。上記の通り新規アリルの特徴が明確にされたことから、当業者であれば本発明のプローブを常法で設計することができる。本発明のプローブはホスホジエステル法など公知の方法によって合成することができる。尚、プローブの設計、合成等に関しては成書（例えばMolecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）を参考にすることができる。
【０００９】
本発明の第１の態様は、新規アリルの特異的塩基（配列番号１の塩基配列からなるエクソン３の２６番目塩基）を標的とするプローブである。このプローブは、新規アリルと既知ＨＬＡ−Ｂ＊４００２アリルとの相違を特徴づける特異的塩基を標的としたものであり、新規アリルと既知ＨＬＡ−Ｂ＊４００２の識別を可能とする。
ここでの「特異的塩基を標的とする」とは、検体に対するプローブの結合力が、検体における特異的塩基の存在に依存し、検体に特異的塩基が存在する場合に特異的な結合力（ハイブリダイズ能力）をプローブが発揮することをいう。換言すれば、検体のＨＬＡ−Ｂローカスのエクソン３の２６番目塩基がＴ（チミン）である場合とそれ以外の塩基である場合の間でプローブの結合力（ハイブリダイズ能力）が大幅に異なる（前者で大きな結合力が発揮される）ことを意味する。
第１の態様のプローブの具体例として、新規アリルのエクソン３の一部であって２６番目塩基を含む領域（説明の便宜上、当該領域を「標的領域」と呼ぶ）に相補的な配列を有するプローブを挙げることができる。標的領域の具体例として、新規アリルのエクソン３の１９番目塩基〜２６番目塩基からなる領域（配列番号１８）を挙げることができる。このように設定した標的領域に相補的な配列を中心として、新規アリルとの相補性を確保しつつ、前後に伸長させたり又はシフトさせたりすることによってプローブを設計することができる。以下、プローブの具体例を示す。尚、下線部を付した塩基が標的領域に対応する。
CAG AGC ATG TAT GGC TGC（配列番号１９）
AGC ATG TAT GGC TGC（配列番号２０）
TC CAG AGC ATG TAT G（配列番号２１）
【００１０】
本発明の第２の態様は、新規アリルの特異的塩基に加え、新規アリルのエクソン３の１９番目塩基及び２０番目塩基を標的とするプローブである。このプローブによれば、新規アリルと既知ＨＬＡ−Ｂ＊４００２の識別が可能になることに加え、新規アリルと、エクソン３の２６番目塩基が特異的塩基と同一（即ちＴ）であるがエクソン３の１９番目塩基及び２０番目塩基が新規アリルのそれと相違する既知ＨＬＡ−Ｂアリル（特にＨＬＡ−Ｂ＊４００６０１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４００６０１０２、ＨＬＡ−Ｂ＊４００６０２）の識別も可能となる。
第２の態様のプローブの具体例として、新規アリルのエクソン３の一部であって１９番目塩基及び前記２０番目塩基を含む領域（説明の便宜上、当該領域を「第１部分領域」と呼ぶ）に相補的である第１配列部と、新規アリルのエクソン３の一部であって２６番目塩基を含む領域（説明の便宜上、当該領域を「第２部分領域」と呼ぶ）に相補的である第２配列部とを有するプローブを挙げることができる。
ここでの第１配列部と第２配列部はスペーサーか、又は上記第１部分領域と上記第２部分領域の間の塩基配列に相補的な配列を介して連結されている。前者の場合のプローブの一例を模式的に示すと図１４（ａ）の通りとなる。尚、スペーサーは任意の塩基、Ｃ３  Ｓｐａｃｅｒ、Ｃ９  Ｓｐａｃｅｒ、Ｃ１８  Ｓｐａｃｅｒなどによって構成すればよい。
一方、後者の場合のプローブは、結果として、新規アリルのエクソン３の一部であって１９番目塩基〜２６番目塩基を含む領域に相補的な配列を有することになる。
【００１１】
ここで、エクソン３の第１部分領域に相補的な第１配列部と、エクソン３の第２部分領域に相補的な第２配列部が切り離された状態で用意され、使用時に反応液中で共存した際に両者が連結されるようにしてもよい。そこで、本発明は更なる態様として、新規アリルのエクソン３の１９番目塩基及び２０番目塩基を標的とする第１プローブと、新規アリルのエクソン３の２６番目塩基を標的とする第２プローブとからなるオリゴヌクレオチドプローブセット（以下、説明の便宜上、「プローブセット」ともいう）を提供する。本発明のプローブセットは、第１プローブの一部と第２プローブの一部が相補的であるという特徴を備える。このプローブセットでは、各プローブの一部が連結部として機能してハイブリダイズすることによって、新規アリルの第１部分領域と第２部分領域を特異的に認識して結合する複合体を形成する（図１４（ｂ）を参照）。尚、第１プローブの連結部及び第２プローブの連結部の構成ヌクレオチドや長さなどについては、標的配列（新規アリルの一部）と相補的又は立体的構造をとる配列ではなく、且つ両連結部が相補的であることを条件とする以外、任意である。
ここでの第１プローブの例として、新規アリルのエクソン３の一部であって１９番目塩基及び２０番目塩基を含む領域（第１部分領域）に相補的な配列を有するプローブを挙げることができる。同様に、第２プローブの例として、新規アリルのエクソン３の一部であって２６番目塩基を含む領域（第２部分領域）に相補的な配列を有するプローブを挙げることができる。尚、新規アリルのエクソン３の２２番目塩基〜２５番目塩基の一部又は全部と相補的な配列を第１プローブ又は第２プローブが有してもよい。
第１プローブ及び第２プローブの具体例を以下に示す。各プローブにおいて下線を付した部分が連結部である。
第１プローブ：CTC CAG AGC A GCTACTAAGCTCA（配列番号２２）
第２プローブ：TGAGCTTAGTAGC TAT GGC TGC G（配列番号２３）
【００１２】
本発明のプローブの長さは特に限定されないが、プローブの特異性や調製の点から、プローブ長は例えば５ｂｐ〜５０ｂｐ、好ましくは１０ｂｐ〜４０ｂｐ、更に好ましくは１０ｂｐ〜３０ｂｐ、最も好ましくは１５ｂｐ〜２５ｂｐである。
【００１３】
本発明のプローブは、標的である新規アリルに対して特異的な結合力を発揮する。即ち、本発明のプローブは新規アリルに対して高いハイブリダイズ能力を発揮する一方、他のアリルに対してはプローブとして要求される程度のハイブリダイズ能力を発揮しない。「プローブとして要求される程度のハイブリダイズ能力」とは、ストリンジェントな条件下で反応させたときに検体が標的分子であるか否かを識別し得る能力をいう。
好ましくは、本発明のプローブはストリンジェントな条件下、新規アリルに対してのみ実質的なハイブリッド形成をし、他の配列に対しては実質的なハイブリッド形成をしない。特に好ましくは、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２（例えばＨＬＡ−Ｂ＊４００２０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２０２、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２０３）に対して実質的にハイブリダイズしない。この特性によって本発明のプローブは新規アリルとＨＬＡ−Ｂ＊４００２を識別可能となる。この態様のプローブは、ストリンジェントな条件下で反応させた場合、新規アリルのエクソン３に相当するＤＮＡ断片（即ち配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片）にハイブリダイズする一方、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２のエクソン３に相当するＤＮＡ断片（即ち配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ断片）にハイブリダイズしない。
他の態様において本発明のプローブは、ＨＬＡ−Ｂ＊４００６（例えばＨＬＡ−Ｂ＊４００６０１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４００６０１０２、ＨＬＡ−Ｂ＊４００６０２）に対して実質的にハイブリダイズしない。この特性によって本発明のプローブは新規アリルとＨＬＡ−Ｂ＊４００６を識別可能となる。この態様のプローブは、ストリンジェントな条件下で反応させた場合、新規アリルのエクソン３に相当するＤＮＡ断片（即ち配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片）にハイブリダイズする一方、ＨＬＡ−Ｂ＊４００６のエクソン３に相当するＤＮＡ断片（即ち配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ断片）にハイブリダイズしない。
【００１４】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて42℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて68℃で洗浄する条件である。更に好ましいストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を例示することができる。尚、プローブの長さや構成ヌクレオチドの種類（GC含量）がハイブリッド形成に影響するものの、最適なハイブリダイズ条件は実験によって決定することができる。
【００１５】
本発明のプローブを予め標識物質で標識しておくことができる。このような標識化プローブを用いることにより、標識量を指標としてＨＬＡタイピングが可能となる。プローブの標識に用いられる標識物質としては32Pなどの放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、テキサスレッドなどの蛍光物質、ビオチン、ジオキシゲニン等を例示できる。標識方法としてはアルカリフォスファターゼ及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた5'末端標識法、T4 DNAポリメラーゼやKlenow断片を用いた3'末端標識法、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法（Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 9，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）などを例示できる。
本発明のプローブを不溶性支持体に固定化した状態で用いることもできる。不溶性支持体としては、特に限定されるものではないが、例えばナイロンやニトロセルロース製の膜、ガラスやシリコン製の基板などが用いられる。不溶性支持体の形状も特に限定されず、例えばチップ状、ビーズ状などに加工された不溶性支持体が使用される。
プローブの固定化の方法は常法に従えばよく、例えば加熱処理やＵＶ照射などによって行うことができる。必要に応じて、固定化する際にリンカーやスペーサーが利用される。また、結合反応用のアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、ビオチン等の官能基をプローブの末端に予め導入しておき、固定化する場合もある。
【００１６】
本発明の第３の局面は本発明のプローブ又はプローブセットを含むＨＬＡアリルタイピング用の試薬に関する。本発明の試薬は単独で又は後述のキットの一部として提供される。
本発明の試薬は、新規ＨＬＡ−Ｂアリル検出用のプローブ（即ち本発明のプローブ又はプローブセット）のみを含むか、又は当該プローブに加えて他のＨＬＡアリルを検出可能なプローブを含む。このように本発明の試薬は二種類以上のプローブを含むものであってもよい。二種類以上のプローブを含む試薬の場合、二種類以上のＨＬＡアリルを検出（識別）可能なものとなる。例えば、新規アリル検出用のプローブ（本発明のプローブ）に加えて、新規アリルと異なるＨＬＡ−Ｂ＊４００２の検出用のプローブを組み合わせれば、これら二つのアリルを検出（識別）可能な試薬となる。ここでの「新規アリルと異なるＨＬＡ−Ｂ＊４００２」とは、配列番号１の塩基配列と異なる塩基配列のエクソン３を有するＨＬＡ−Ｂ＊４００２であり、具体的にはＨＬＡ−Ｂ＊４００２０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２０２、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２０３等である。これらのアリルのエクソン３の塩基配列は配列番号３で示される。
ＨＬＡ−Ｂ＊４００２０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２０２、又はＨＬＡ−Ｂ＊４００２０３を検出可能なプローブの例を以下に示す。
（１）１種類のプローブで検出する場合の例
CAG AGC ATG TAC GGC TGC（配列番号２４）
（２）相補的な配列からなる連結部を有する一組のプローブで検出する場合の例
第１プローブ：CTC CAG AGC A GCTACTAAGCTCA（配列番号２５）
第２プローブ：TGAGCTTAGTAGC TAC GGC TGC G（配列番号２６）
尚、各プローブにおいて下線を付した部分が連結部である。
【００１７】
また、新規アリル検出用のプローブ（本発明のプローブ）に加えて、ＨＬＡ−Ｂ＊４００６の検出用のプローブを組み合わせれば、これら二つのアリルを検出（識別）可能な試薬となる。ここでの「ＨＬＡ−Ｂ＊４００６」とは、具体的にはＨＬＡ−Ｂ＊４００６０１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４００６０１０２、ＨＬＡ−Ｂ＊４００６０２等である。これらのアリルのエクソン３の塩基配列は配列番号４で示される。
ＨＬＡ−Ｂ＊４００６０１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４００６０１０２、又はＨＬＡ−Ｂ＊４００６０２を検出可能なプローブの例を以下に示す。
（１）１種類のプローブで検出する場合の例
CAG ACG ATG TAT GGC TGC（配列番号２７）
（２）相補的な配列からなる連結部を有する一組のプローブで検出する場合の例
第１プローブ：TGG CAG ACG A GCTACTAAGCTCA（配列番号２８）
第２プローブ：TGAGCTTAGTAGC TAT GGC TGC G（配列番号２９）
尚、各プローブにおいて下線を付した部分が連結部である。
【００１８】
更には、新規アリル検出用のプローブ、新規アリルと異なるＨＬＡ−Ｂ＊４００２の検出用のプローブ、及びＨＬＡ−Ｂ＊４００６の検出用のプローブを組み合わせれば、これら三種類のアリルを検出（識別）可能な試薬となる。
【００１９】
好ましい一形態では、使用目的に応じて、検出（識別）が必要とされるＨＬＡアリルの全てを識別できるように各アリル検出用のプローブを全て含む試薬とする。例えば、日本人が保有すると予想されるＨＬＡ−Ｂアリル（新規ＨＬＡ−Ｂアリルも含まれる）の全てに関して対応するプローブを用意し、それらを全て含む試薬とする。当該試薬は日本人を対象としたＨＬＡ−Ｂタイピング用試薬としての有用性が高い。別の例として、検体のＨＬＡアリルが、限られた種類の型の中でいずれに該当するかを判定することが要求される場合は、当該各型に対応したプローブのみを含む試薬とすればよい。このように必要十分な種類のプローブのみを併用して本発明の試薬を構成することによって、プローブの無駄がなくなることはもとより、検出（識別）精度の向上も図られる。
一方、新規ＨＬＡ−Ｂアリルも含め、これまでに報告されたＨＬＡ−Ｂアリルの全てに関して対応するプローブを用意し、それらを全て含む試薬とすれば、現状で考え得る全ＨＬＡ−Ｂアリルを検出・識別可能な有用性及び汎用性の極めて高いものとなる。
言うまでもないが、新たなＨＬＡアリルの存在が確認された場合、それに対応するプローブを設計し、それを併用することも可能である。
【００２０】
本発明の第４の局面は上記試薬の利用形態に関する。即ち、この局面では（１）上記試薬と、（２）上記試薬と検体とのハイブリダイゼーション反応用の試薬と、及び（３）取扱説明書と、を含んだＨＬＡアリルタイピング用のキットが提供される。キットに含めることができる任意の成分として、洗浄用試薬（生理食塩水、リン酸系緩衝液、クエン酸系緩衝液など）、特異的ハイブリッド形成を確認するための標準試薬（ポジティブコントロール及び／又はネガティブコントロール）、反応用容器（マルチウェルプレート、反応チューブなど）、各操作に必要な器具類を挙げることができる。
また、採用する測定系に応じて、必要な試薬や器具等をキットに含めることもできる。例えば、核酸増幅反応を伴う測定系用とする場合、核酸増幅反応に必要な試薬をキットに含めることができる。ここでの「核酸増幅反応に必要な試薬」の具体例として、ＨＬＡ−Ｂアリルのエクソン３領域を特異的に増幅するための試薬（特異的プライマー及び／又はＤＮＡポリメラーゼ）を挙げることができる。新規アリルの検出に必要な標的領域を含む限り、増幅される領域はエクソン３の一部であってもよい。当該試薬を含むキットによれば、新規ＨＬＡ−Ｂアリルに特異的な塩基が存在するエクソン３領域を増幅することが可能となる。一方、ＨＬＡ−Ｂアリルのエクソン２及び３領域を特異的に増幅するための試薬を含むキットを構築することにしてもよい。このキットによれば、新規ＨＬＡ−Ｂアリルに特異的な塩基が存在するエクソン３に加えてエクソン２も増幅することができる。従って、エクソン２及び３を標的としたタイピングに適したキットとなり、より多くのアリルが識別可能となる。
【００２１】
本発明のさらなる局面はＨＬＡアリルのタイピング法に関する。「ＨＬＡアリルのタイピング」とは、検体のＨＬＡアリルの型（又はその組合せである遺伝子型）を検出・識別することをいう。
本発明のＨＬＡタイピング法では、被験者のＨＬＡ−Ｂ遺伝子が新規アリルを有するか否かを調べるステップが行われる。例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ(restriction fragment length polymorphism：制限酵素断片長多型)法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ(single strand conformation polymorphism：単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、ＰＣＲ−ＳＳＯ(specific sequence oligonucleotide：特異的配列オリゴヌクレオチド)法、ＡＳＯ(allele specific oligonucleotide：アリル特異的オリゴヌクレオチド)ハイブリダイゼーション法(Saiki, Nature, 324, 163-166(1986)等)、リバースＰＣＲ−ＳＳＯ法、Ｌｕｍｉｎｅｘ法（登録商標、米国Luminex社、ＰＣＲ−ＭＰＨ法（Polymerase Chain Reaction-based Microtiter Plate Hybridization）（湧永製薬株式会社）、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法(Livak, KJ, Genet Anal,14,143(1999),Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol.,34,2933(1996))、Ｉｎｖａｄｅｒ法(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol,17,292(1999))、ＲＣＡ(rolling cycle amplification)法(Lizardi PM et al., Nat Genet 19,225(1998))、ＤＮＡチップ又はマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280,1077(1998)等)、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Southern,E., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975)）等、公知の方法を利用して行うことができる。尚、これらの方法を任意に組み合わせてＨＬＡタイピングを行ってもよい。また、ＰＣＲ法又はＰＣＲ法を応用した方法などの核酸増幅法により核酸試料を予め増幅（核酸試料の一部領域の増幅を含む）した後、上記いずれかの検出法を適用することもできる。増幅される部分領域の長さは、検出に適した範囲で適宜設定され、例えば50bp〜200bp、好ましくは80bp〜150bpである。
【００２２】
以上の各方法では、それに応じたプローブやプライマー等の核酸が使用される。ここでのプローブとしては本発明のプローブ、プローブセット、又は試薬を利用できる。一方、新規ＨＬＡ−Ｂアリルの特異的塩基を含む部分領域に相補的なプライマーを片方のプライマーとしたプライマーセットを用いれば、核酸の増幅を指標として新規アリルを検出することができる。
【００２３】
本発明の一態様では、被験者のゲノムＤＮＡから調製した核酸試料と、本発明のプローブ又はプローブセットとを反応させた後、特異的なハイブリッド形成を検出することによって、被験者のＨＬＡ−Ｂ遺伝子が新規アリルを有するか否かを調べる。つまり、特異的プローブによるハイブリダイゼーション反応を利用してＨＬＡタイピングを行う。このようなＨＬＡタイピング法には、上記のＰＣＲ−ＳＳＯ法、リバースＰＣＲ−ＳＳＯ法、Ｌｕｍｉｎｅｘ法などが好適に利用される。ＰＣＲ−ＳＳＯ法では、ＰＣＲで増幅させた核酸試料を膜やマイクロプレートなどの支持体に結合させた後、この支持体を適当なハイブリダイゼーション条件下で標識化プローブと反応させる。非特異的結合成分を洗浄除去した後、標識量を指標として支持体に結合したプローブを検出する。一方、リバースＰＣＲ−ＳＳＯ法では、ＰＣＲで増幅させた核酸試料を標識化した後、適当なハイブリダイゼーション条件下で未標識のプローブを結合させた支持体と反応させる。その後はＰＣＲ−ＳＳＯ法と同様に、非特異的結合成分の洗浄除去、標識の検出を行う。尚、リバースＰＣＲ−ＳＳＯ法の変法も開発されており（米国特許第４，６８３，１９４号）、これを本発明のタイピング法に利用することもできる。Ｌｕｍｉｎｅｘ法はｒＳＳＯ（reverse Sequence Specific Oligonucleotide）法を原理とし、ＰＣＲの増幅産物と、蛍光ビーズに固相化したオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを蛍光により検出する方法である。
【００２４】
ところで、検出可能なＨＬＡアリルの種類は、使用するプローブの種類に依存する。例えば、新規ＨＬＡ−Ｂアリルを検出可能なプローブと、他のＨＬＡアリルを検出可能なプローブを組み合わせて使用すれば、複数のＨＬＡアリルを同時に検出・識別することができる。別の例として、新規ＨＬＡ−Ｂアリルを検出可能なプローブと、ＨＬＡ−Ｂアリルの特定の型（新規ＨＬＡ−Ｂアリルとは異なる）を検出可能なプローブを含む試薬（又はそれを含むキット）を利用すれば、複数のＨＬＡ−Ｂアリルを同時に検出・識別することが可能である。さらには、新規ＨＬＡ−Ｂアリルを検出可能なプローブと、これまでに報告されたＨＬＡ−Ｂアリルのそれぞれに対応したプローブを全て含む試薬（又はそれを含むキット）を利用して本発明のタイピング法を実施すれば、現状で考え得る全てのＨＬＡ−Ｂアリルを検出・識別することが可能となる。一方、使用するプローブ（又は試薬若しくはキット）を選定することで、検体の種類（例えば日本人の検体の場合）やタイピングの目的（例えば二つのＨＬＡ−Ｂアリル間の識別をする場合）に最適なタイピング法を構成することもできる。
【００２５】
本発明のＨＬＡタイピング法に供される核酸試料は通常、被験者の血液、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から抽出したゲノムＤＮＡから調製される。但し、ｍＲＮＡやそれを鋳型として調製したｃＤＮＡを検体として用いることも可能である。ゲノムＤＮＡやｍＲＮＡの調製には公知の抽出方法、精製方法を用いればよい。ＨＬＡ−Ｂをコードする領域（即ちＭＨＣクラスＩ遺伝子）を含むものであれば、任意の長さのゲノムＤＮＡ等を用いることができる。
【実施例】
【００２６】
１．新規アリルの検索
日本人検体について、既存の二種類の方法、即ちジェノサーチＨＬＡ−Ｂキット（株式会社医学生物学研究所）と、ＰＣＲ−ＳＢＴ（Sequencing-Based Typing）法（株式会社SRLウェブページ（http://www.srl-group.co.jp/）などを参照）でＨＬＡ−Ｂの型判定を行ったところ、前者ではＢ＊４００２、後者では判定不能という結果であった。前者の方法で再度試験した結果、母と子は本来一方のアリルの型は一致すべきであるにもかかわらず、当該患者検体の型がＢ＊４００２、患者の母親の型がＢ＊４００６との判定結果であった。これは、患者検体のＨＬＡ−Ｂ型が、既存のプローブでは識別できない新規の型であることを示唆する。そこで、以下の手順に従い、患者検体のＨＬＡ−Ｂ型の塩基配列を決定することにした。
【００２７】
（１）増幅用プライマーの設計
事前の検査によって、当該患者のＨＬＡ−Ｂ型は父親由来がＢ＊５９０１アリルであり、母親由来が新規アリル（Ｂ＊４００６及びＢ＊４００２に近似するアリル）であることが判明していた。そこで、Ｂ＊５９０１アリルを増幅することなく、新規アリルのみを特異的に増幅することが可能な一対のプライマーを以下の通り設計した。
フォワードプライマー
TGA CCG AGA CCT GGG CTG G（配列番号１２）
リバースプライマー
TGG TCA GAG ATG GGG TGG TGG（配列番号１３）
【００２８】
フォワードプライマーがアニーリングする位置は、エクソン１の末端部及びイントロン１の先頭１塩基である（図１０、１２）。このフォワードプライマーの使用によって、新規アリル特異的な増幅が可能となる。尚、エクソンとイントロンを跨ぐようにプライマーを設計することによって、類似のゲノムＤＮＡが増幅されることを防止している。
一方、リバースプライマーはエクソン４の一部に対応する（図１０）。尚、図１０及び１１は、エクソンの配列をＢ＊０７０２０１アリル、Ｂ＊４００２０１アリル、Ｂ＊４００６０１０１アリル及びＢ＊５９０１アリル間で比較したものである。フォワードプライマーのアニーリング位置（図１０）及びリバースプライマーのアニーリング位置（図１１）が網掛けで示される。図１２及び１３はイントロンの配列をＢ＊０７０２０１アリル及びＢ＊４００６０１０１アリル間で比較したものである。フォワードプライマーのアニーリング位置（図１２）が網掛けで示される。
【００２９】
（２）新規アリルのクローニング
患者検体より調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、以下の条件でＰＣＲを行った。
（ａ）反応液
鋳型DNA(10ng/ul)：  1μl
2×GC Buffer1 (タカラバイオ株式会社)：  25μl
25mM dNTPs：  0.4μl
フォワードプライマー  100μM：  0.3μl
リバースプライマー  100μM：  0.3μl
D.D.W（再蒸留水）：  22.8μl
LA taq(タカラバイオ株式会社)：  0.2μl
全量：  50μl
【００３０】
（ｂ）反応条件
94℃で５分
94℃で30秒、62℃で30秒、72℃で1分を３０サイクル
72℃で10分
4℃で放置
【００３１】
1.5%アガロースゲル電気泳動にてPCRの増幅を確認後、QIAquick Gel Extractionk（QIAGEN社）で精製した(約412bp)。PCR産物をPromega pGEMT-easyを用いて発現ベクターに挿入した後、XL1-bleu（又はDH5α）の形質転換を行った。形質転換操作後の細胞をLB Amp(+)プレートで培養し、形成されたコロニーを採取してLB(液体)で培養した。培養後の細胞よりプラスミドをミニプレップ法で抽出した。制限酵素EcoR1を用いて挿入配列（インサート）を確認後、Big Dye v.3.1（Applied Biosystems社）で配列のラベル化を行った。続いて、シークエンサー（Applied Biosystems社）で配列を解読した。尚、シークエンス用のプライマーは以下の通りである。
プライマー（f2）：ACT ACA ACC AGA GCG AGG（配列番号１４）
プライマー（f3）：GCG GAC ACG GCG GCT CAG（配列番号１５）
プライマー（T7）：TAATACGACTCACTATAGGG（配列番号１６）
プライマー（M13)：TCACACAGGAAACAGCTATGAC（配列番号１７）
【００３２】
シークエンスの結果、検体のＨＬＡ−Ｂアリルについてエクソン１〜エクソン４に亘る配列が決定された。決定された配列と既知アリルとの配列を比較した図を図１〜９に示す。図１は、エクソン２及び３について新規ＨＬＡ−Ｂアリル（Ｂ＊４００２ｎｅｗ）と既知ＨＬＡ−Ｂアリル（Ｂ＊０７０２０１、Ｂ＊４００２０１、Ｂ＊４００６０１０１）を比較したものである。同様に図２〜８は、エクソン３について新規ＨＬＡ−Ｂアリル（Ｂ＊４００２ｎｅｗ）と既知の全ＨＬＡ−Ｂアリルとを比較したものである。一方、図９はエクソンに関して新規アリル（上段）とＨＬＡ−Ｂ＊４００２０１（下段）を比較したものである。
【００３３】
新規アリル（図中、「Ｂ＊４００２ｎｅｗ」と表記される）ではエクソン３の２６番目の塩基がＴ（チミン）であるのに対し、既知ＨＬＡ−Ｂ＊４００２アリルのエクソン３では対応する部分の塩基はＣ（シトシン）である。このように新規アリルには、エクソン３の１箇所において既知ＨＬＡ−Ｂ＊４００２アリルと相違するという特徴が認められた。尚、新規アリルのエクソン３の配列（配列番号１）をエクソン２の配列（配列番号２）とともに添付の配列表に示した。
一方、エクソン３以外の部分についても既知ＨＬＡ−Ｂアリルとの比較を行った結果、新規アリルは上記の箇所（エクソン３の２６番目）でのみＨＬＡ−Ｂ＊４００２０１と相違していた（図９）。この相違をもたらす塩基置換はアミノ酸置換を伴っておらず、即ち同義置換であることから、新規アリルはＨＬＡ−Ｂ＊４００２のサブタイプであると判断された。
【００３４】
２．ＨＬＡ−Ｂの遺伝子型判定
＜測定原理＞
ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により遺伝子増幅を行い、その増幅産物と蛍光ビーズに固相したオリゴプローブをハイブリダイゼーションさせることで変異を検出するｒＳＳＯ(reverse Sequence Specific Oligonucleotide)法を原理として、ＨＬＡ−Ｂの遺伝子型を判定する。
＜遺伝子増幅＞
遺伝子増幅は検体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２及びエクソン３領域が特異的に増幅されるプライマーを用い、1チューブで行う。遺伝子増幅の段階でビオチン標識したプライマーを使用することで、増幅産物はビオチン標識される。
＜ハイブリダイゼーション＞
点変異特異的な配列を持つオリゴプローブ（各ＨＬＡ−Ｂアリルに対応した複数のプローブ。新規アリル用プローブ（配列番号１９）、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２０１用プローブ（配列番号２４）、Ｂ＊４００６０１０１用プローブ（配列番号２７）を含む）を固相した、数十種類のLuminex（登録商標、米国Luminex社）用蛍光ビーズを使用する。これらのビーズをミックスしたビーズミックスとハイブリダイゼーション緩衝液及び上記で増幅したＨＬＡ−Ｂの増幅産物を混合し、熱変性後ハイブリダイゼーションさせる。
＜蛍光標識＞
ハイブリダイゼーション反応終了後、洗浄用のリン酸緩衝液を加えた後に遠心分離し、プローブと反応しなかった増幅産物を含む溶液（上清）を除去する。次にストレプトアビジン標識フィコエリスリン（SA-PE）を加え、ビーズ表面のプローブにハイブリダイゼーションした増幅産物のビオチンをフィコエリスリン標識する。
＜検出＞
Luminex（登録商標、米国Luminex社）システムに検体をセットし、検出する。Luminex法はビーズ表面にコーティングされた蛍光を検出することでビーズを識別し、更にビーズ表面のフィコエリスリンの蛍光を同時に測定することで、各ビーズに固相されたオリゴプローブと増幅産物との反応を検出する方法である。
＜判定＞
Luminex（登録商標、米国Luminex社）システムから出力された蛍光値データを基に、専用判定ソフト「ジェノサーチＨＬＡタイピングソフトウェア（株式会社医学生物学研究所）」を使用して判定する
【００３５】
＜操作法の具体例（96検体の同時測定）＞
(1)ＨＬＡ−Ｂのエクソン２及びエクソン３領域が特異的に増幅されるプライマーを含む溶液（マスターミックス）2.0mLにTaq DNA ポリメラーゼ12.5μLを加え混合する。
(2)(1)で調製したマスターミックス溶液を96穴PCRプレートの各ウェルに20μLずつ分注する。
(3)抽出したゲノムＤＮＡ 5μL（50〜100ng）を分注し、サーマルサイクラーにセットする。尚、抽出したゲノムＤＮＡの濃度は10〜20ng／μLに調整する。
(4)遺伝子増幅（93℃で30秒、65℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを40サイクル）。
(5)ハイブリダイゼーション緩衝液4mLを準備し、オリゴプローブを固相した、数十種類の蛍光ビーズ（ビーズミックス）0.5mLを加える。
(6)(5)で調製したビーズミックス溶液を96穴プレートの各ウェルに45μLずつ分注する。
(7)(4)で増幅したＤＮＡ増幅産物を各々5μL加え、プレートシールを貼りサーマルサイクラーにセットする。
(8)ハイブリダイゼーション反応（95℃で2分、52℃で60分、52℃で放置）
(9)リン酸緩衝液を各々75μL加える。
(10)約1,000×gで5分間、もしくは約2,000×gで1分間遠心後、上清を除去する。
(11)リン酸緩衝液 7mLにSA-PE 70μLを加える（100倍希釈）。
(12)上記を70μL加え、プレートシールを貼りサーマルサイクラーにセットする。
(13)SA-PE反応（52℃で5分、52℃で放置）
(14)Luminex（登録商標、米国Luminex社）システムにセットして測定する。
(15)「ジェノサーチＨＬＡタイピングソフトウェア（株式会社医学生物学研究所）」を用いて判定する。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は新規ＨＬＡ−Ｂアリル及びその検出用のプローブなどを提供する。従来、当該アリルの存在が知られていなかったため、ＨＬＡタイピングによって遺伝子型を正しく判別できない場合があった。例えば、移植に際して実施されるＨＬＡタイピングにおいて、実際は当該新規アリルを有するにも拘わらず、他の遺伝子型であると誤断される場合があり、移植の成否に大きな影響を及ぼすおそれがあった。本発明のプローブや試薬等を用いれば、今回明らかにされた新規ＨＬＡ−Ｂアリルを適切に検出することができることから、詳細且つ確実なＨＬＡ遺伝子型の判別が可能となる。このように本発明はＨＬＡ遺伝子型の決定に有用な手段を提供するものであり、移植の成功率の向上に多大な貢献をする。
本発明は移植に伴うＨＬＡ遺伝子型の判別に限らず、輸血の際のＨＬＡ遺伝子型の判別や法医学（親子鑑定や犯罪者の特定など）、更にはＨＬＡ遺伝子型が関与する疾患における診断又は当該疾患の研究等においても利用され得る。
【００３７】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】新規アリル（Ｂ＊４００２ｎｅｗ）と既知ＨＬＡ−Ｂアリルの比較。エクソン２及び３の配列が比較される。新規アリルではエクソン３（配列番号１）の２６番目の塩基がＴ（チミン）であり、他の部分はＢ＊４００２０１と同一の塩基配列である。尚、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２０１の塩基配列を基準として各アリルの塩基配列が示される。また、「-」は、当該箇所の塩基が、基準の塩基配列における対応位置の塩基と同一であることを表す。慣例に従い左側が５’側（右側が３’側）となるように各塩基配列を表示している。
【図２】新規アリル（Ｂ＊４００２ｎｅｗ）と既知の全ＨＬＡ−Ｂアリルとの比較。エクソン３の一部について各配列が比較される。
【図３】図２の続き。
【図４】図３の続き。
【図５】図４の続き。
【図６】図５の続き。
【図７】図６の続き。
【図８】図７の続き。
【図９】新規アリル（上段、エクソン２（配列番号３）とエクソン３（配列番号２）を含む）とＢ＊４００２０１（下段）との比較。
【図１０】Ｂ＊０７０２０１アリル、Ｂ＊４００２０１アリル、Ｂ＊４００６０１０１アリル及びＢ＊５９０１アリルについてエクソンの配列を比較した図。Ｂ＊０７０２０１アリルの配列（エクソン１（配列番号５）、エクソン２（配列番号６）、エクソン３（配列番号７）、エクソン４（配列番号８））を基準として各アリルのエクソンの配列が示される。網掛けはフォワードプライマーのアニーリング位置を示す。
【図１１】図１０の続き。網掛けはリバースプライマーのアニーリング位置。
【図１２】Ｂ＊０７０２０１アリル及びＢ＊４００６０１０１アリルについてイントロンの配列を比較した図。Ｂ＊０７０２０１アリルの配列（イントロン１（配列番号９）、イントロン２（配列番号１０）、イントロン３（配列番号１１））を基準として各アリルのイントロンの配列が示される。網掛けはフォワードプライマーのアニーリング位置。
【図１３】図１２の続き。
【図１４】本発明のプローブの一例。（ａ）は第１配列部（１）と第２配列部（２）がスペーサー（３）を介して連結した構造のプローブを示す。（ｂ）は一部が相補的である第１プローブ（４）と第２プローブ（５）からなるプローブセットを示す。エクソン３の１９番目塩基と２０番目塩基を含む部分領域（第１部分領域）に対して第１プローブ（４）の一部（４ａ）がハイブリダイズし、エクソン３の２６番目塩基を含む部分領域（第２部分領域）に対して第２プローブ（５）の一部（５ａ）がハイブリダイズする。また、第１プローブ（４）の一部（４ｂ）と第２プローブ（５）の一部（５ｂ）がハイブリダイズすることによって、第１プローブ（４）及び第２プローブ（５）の標的への結合が安定する。尚、図中の塩基（Ｇ、Ｃ、Ｔ）の上の数字（１９、２０、２６）は新規アリルのエクソン３における各塩基の位置を表す。
【符号の説明】
【００３９】
１  プローブの第１配列部
２  プローブの第２配列部
３  スペーサー
４  第１プローブ
４ａ  標的に対するハイブリダイズ部
４ｂ  第２プローブとの連結部
５  第２プローブ
５ａ  標的に対するハイブリダイズ部
５ｂ  第１プローブとの連結部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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