(57)【要約】      （修正有）【課題】動脈硬化の検査方法に関し、従来の検査方法に比べて特異性および感度の高い検査方法を提供する。【解決手段】ＨＳＰ６０を構成するアミノ酸配列のうち、特に動脈硬化症のマーカーとなりうる抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の抗原エピトープ部分を用いることによる。具体的には、特定のアミノ酸配列からなる抗ＨＳＰ６０抗体に対する抗原性を有するポリペプチドを用いることによる：１）上記アミノ酸配列から選択される１０〜２０アミノ酸残基のポリペプチド；２）上記アミノ酸配列から選択される１０〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列のうち、１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に示すアミノ酸配列からなる抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体に対する抗原性を有するポリペプチド：
１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号３）から選択される１０〜２０アミノ酸残基のポリペプチド；
２）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号３）から選択される１０〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列のうち、１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列。
【請求項２】
以下に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体に対する抗原性を有するポリペプチド：
１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１４１位〜第１６０位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号７）；
２）配列番号７に示されるアミノ酸配列のうち１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドを少なくとも１種用いることを特徴とする抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の測定方法。
【請求項４】
前記測定方法が、請求項１または２に記載のポリペプチドの少なくとも１種を抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体との反応産物を検出することにより抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の測定を行う、請求項３に記載の抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の測定方法。
【請求項５】
請求項４または５に記載の抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の測定方法を用いた動脈硬化の検査方法。
【請求項６】
請求項１または２に記載のいずれか１種または複数種のポリペプチドに対する抗体を動脈硬化の疾患マーカーとして検出する動脈硬化の検査方法。
【請求項７】
以下に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体との反応産物を検出することによる動脈硬化の検査方法：
１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号３）から選択される１０〜２０アミノ酸残基のポリペプチド；
２）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号３）から選択される１０〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列のうち、１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列。
３）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１４１位〜第１６０位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号７）；
４）配列番号７に示されるアミノ酸配列のうち１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列。
【請求項８】
以下に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを少なくとも一種含む動脈硬化の検査用試薬またはキット：
１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号３）から選択される１０〜２０アミノ酸残基のポリペプチド；
２）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号３）から選択される１０〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列のうち、１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列。
３）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１４１位〜第１６０位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号７）；
４）配列番号７に示されるアミノ酸配列のうち１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化の新規検査方法に関する。具体的には、６０ｋＤａ熱ショックタンパク質を構成するアミノ酸配列の一部分からなるペプチドに対する抗体を検出することによる動脈硬化の新規検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症は、狭心症、心筋梗塞および脳梗塞に帰着する多元的な疾病である。生活の欧米化や高齢化社会の到来と、結核などの感染症対策の充実により、動脈硬化を基盤とする病気は、悪性新生物(癌と肉腫)とともに日本では二大国民病のひとつとなり、その対策はきわめて重要である。 厚生省の「人口動態統計」によると、死亡総数に対する死因別の割合は、１位が悪性新生物、２位心疾患、３位脳血管疾患であり、動脈硬化などの血管の障害を共通の基盤とする心疾患と脳血管疾患の割合の合計から考えると、悪性新生物よりもはるかに高い死亡率が認められる。
【０００３】
動脈硬化を基盤とする病気は、心疾患のうちの多くをしめる虚血性心疾患（心筋梗塞、狭心症）や、脳血管疾患の半数をしめる脳梗塞ばかりでなく、動脈硬化性萎縮腎、下腿の壊疽を引き起こす閉塞性動脈硬化症、またまれには虚血性腸炎の原因となり、いずれも死の原因となる重大な病気である。
【０００４】
動脈硬化の部位には、多量の酸化・変性した低比重リポ蛋白（酸化ＬＤＬ）由来のコレステロールが蓄積していると同時に脂質を多量に取り込んで泡沫化した炎症細胞の一種であるマクロファージも集合しており、動脈硬化の病因として炎症、免疫反応の重要性が指摘されている。
【０００５】
動脈硬化は炎症性疾患であるとの指摘から、近年、動脈硬化の進展に血管の炎症が中心的な役割を担っていることが広く認知されつつある。それに伴い、炎症反応の存在を示す新たな指標として高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）が注目され、動脈硬化巣の形成と進展にかかわる炎症反応の分子機構の研究は活発な展開を見せている（非特許文献１）。
【０００６】
動脈硬化の疾患モデルとして確立され高脂血症ウサギと心筋梗塞を発症した患者の冠動脈を用いた、ＣＲＰと動脈硬化の関係についての報告がある（非特許文献２）。ここでは、動脈硬化の発生頻度と肝臓から分泌されるタンパク質の一種、ＣＲＰの分泌量が、強く関連していることが示唆された。
【０００７】
現在は、動脈硬化の進行度や、心筋梗塞、脳梗塞等の合併症に進行しうる危険度を測定する検査方法として、ｈｓＣＲＰが多用される傾向にある。ｈｓＣＲＰは、炎症の急性期に産生されるタンパク質で、動脈硬化により引き起こされる微妙な炎症を検知することにより動脈硬化を検査しようとするものである。しかしながら、炎症を検知するこの方法は、非特異的な炎症反応を検出するため、特に特異度が劣っていた。
【０００８】
アテローム性動脈硬化症の原因については、種々の研究が進められている。この１０〜２０年の間に、アテローム性動脈硬化症と炎症性・免疫のメカニズムが立証されてきた。疫学的研究において、クラミジア・ニューモニエ(C.pneumoniae)、Porphyromonas gingivalis(P.gingivaris)およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のような伝染性の病原体に対するホスト免疫反応が、アテローム性動脈硬化症の原因になるといわれている。例えば、６０／６５ｋＤａ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６０／６５）が関係することが報告されている（特許文献１）。また、クラミジア・ニューモニエ感染による動脈硬化について、クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６０）が関連することも報告されている（特許文献２）。しかしながら、これらのタンパク質と動脈硬化の検査結果との関係については明確にはされていなかった。
【０００９】
【非特許文献１】Medical Tribune, Vol.37, No.13, p.54(2004)
【非特許文献２】American Journal of pathology, Vol.167, p.1139-1148(2005)
【特許文献１】特開２００５−５０２５８３号公開公報
【特許文献２】特開２００５−１０２６９１号公開公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、動脈硬化の検査方法に関し、従来の検査方法に比べて特異性および感度の高い検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、６０ｋＤａ熱ショックタンパク質（以下、「ＨＳＰ６０」という。）を構成するアミノ酸配列の一部分を構成するペプチドに対する抗体（以下、「抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体」という。）、特に動脈硬化症のマーカーとなりうる抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の抗原エピトープ部分を初めて見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち本発明は以下よりなる。
１．以下に示すアミノ酸配列からなる抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体に対する抗原性を有するポリペプチド：
１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号３）から選択される１０〜２０アミノ酸残基のポリペプチド；
２）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号３）から選択される１０〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列のうち、１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列。
２．以下に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体に対する抗原性を有するポリペプチド：
１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１４１位〜第１６０位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号７）；
２）配列番号７に示されるアミノ酸配列のうち１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列。
３．前項１または２に記載のポリペプチドを少なくとも１種用いることを特徴とする抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の測定方法。
４．前記測定方法が、前項１または２に記載のポリペプチドの少なくとも１種を抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体との反応産物を検出することにより抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の測定を行う、前項３に記載の抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の測定方法。
５．前項４または５に記載の抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の測定方法を用いた動脈硬化の検査方法。
６．前項１または２に記載のいずれか１種または複数種のポリペプチドに対する抗体を動脈硬化の疾患マーカーとして検出する動脈硬化の検査方法。
７．以下に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体との反応産物を検出することによる動脈硬化の検査方法：
１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号３）から選択される１０〜２０アミノ酸残基のポリペプチド；
２）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号３）から選択される１０〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列のうち、１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列。
３）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１４１位〜第１６０位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号７）；
４）配列番号７に示されるアミノ酸配列のうち１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列。
８．以下に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを少なくとも一種含む動脈硬化の検査用試薬またはキット：
１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号３）から選択される１０〜２０アミノ酸残基のポリペプチド；
２）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号３）から選択される１０〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列のうち、１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列。
３）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１４１位〜第１６０位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号７）；
４）配列番号７に示されるアミノ酸配列のうち１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のポリペプチドを用いて抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体測定による検査を行うと、感度および特異性の高い動脈硬化の検査を行うことができる。また、本発明のポリペプチドはＥＬＩＳＡ法に適用することができるため、多くの検体を処理することができ、より早期に動脈硬化の検査を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明においてＨＳＰ６０とは、上述の如く６０ｋＤａ熱ショックタンパク質をいい、抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体とは、ＨＳＰ６０を構成するアミノ酸配列の一部分からなるペプチドに対する抗体をいう。
【００１５】
ＨＳＰ６０は、真核生物・原核生物の両方で発見され、高度に保存されたタンパク質である。微生物やヒトのＨＳＰ６０の高い相同性は、微生物と自己ＨＳＰの間の分子の模倣がある自己免疫性病因に関係するかもしれない。さらにアテローム発生では、伝染性の病原体に由来したＨＳＰ６０に対する細胞性・液性の免疫反応は、血管内皮細胞の表面に発現自己ＨＳＰ６０を認識して、一層アテローム性動脈硬化症を促進する。
【００１６】
本発明において、伝染性の病原体に由来したＨＳＰ６０に対する細胞性・液性の免疫反応について確認し、抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体について検討した結果、特に動脈硬化症のマーカーとなりうる抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の抗原エピトープ部分を初めて確認することができた。
【００１７】
本発明において、配列表の配列番号１および２に示されるアミノ酸配列は、各々GenBank accession No. CAA52062およびNo. NP_955472により特定されるＨＳＰ６０を構成するアミノ酸配列である。配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ヘリコバクターピロリ（以降「Ｈ．ピロリ」または、単に「Ｈｐ」という場合がある。）由来のＨＳＰ６０を構成するアミノ酸配列（Ｈｐ−ＨＳＰ６０）であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ヒト（以下、単に「Ｈｕ」という場合がある。）由来のＨＳＰ６０を構成するアミノ酸配列（Ｈｕ−ＨＳＰ６０）である。本発明の抗原性を有するポリペプチドは、必ずしもＨ．ピロリ由来のペプチド配列に限定されるものではない。上記に該当する配列を有するものであれば、例えばクラミジア・ニューモニエ由来のポリペプチドであっても良いし、他の菌由来のポリペプチドであっても良い。
【００１８】
本発明のポリペプチドは、動脈硬化の疾患マーカーとなりうる抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体に対して抗原性を有するポリペプチドをいう。具体的には、以下に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドである：
１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号３）から選択される１０〜２０アミノ酸残基のポリペプチド；
２）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号３）から選択される１０〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列のうち、１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列。
【００１９】
更に具体的には、以下に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体に対する抗原性を有するポリペプチドである：
１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１４１位〜第１６０位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号７）；
２）配列番号７に示されるアミノ酸配列のうち１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列。
本発明のペプチドとして、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが特に好適である。
【００２０】
本発明の抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の測定方法において使用されるポリペプチドは、上記から選択される少なくとも１種のポリペプチドである。特異性および測定感度を向上させるために、さらに、複数種のポリペプチドを組み合わせて用いても良い。
具体的には、以下に示す配列番号３から選択される１０〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号５〜１４の何れかに示すアミノ酸配列またはこれらに示されるアミノ酸配列のうち１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、を１または複数選択して、組み合わせて用いることができる。
【００２１】
以下において、配列番号３は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第１０１位〜第２００位の領域に示されるアミノ酸配列からなる。配列番号５〜１４についても、各々同様にＮ末端から第１００位〜第１１９位（配列番号５）、第１２０位〜第１３９位（配列番号６）、第１４１位〜第１６０位（配列番号７）、第１４１位〜第１５５位（配列番号８）、第１４５位〜第１５２位（配列番号９）、第１４１位〜第１７０位（配列番号１０）、第１８４位〜第２００位（配列番号１１）、第１７１位〜第２００位（配列番号１２）、第１６１位〜第１７６位（配列番号１３）、第３９４位〜第４１３位（配列番号１４）の領域に示されるアミノ酸配列からなる。
【００２２】
Ｈｐ−ＨＳＰ６０２; Glu101-Ser200 （配列番号３）
Ｈｐ−ＨＳＰ６０４−５; Ile300-Gly435 （配列番号４）
Ａ１(Lys100-Met119)（配列番号５）
Ａ２(Asp120-Gly139)（配列番号６）
Ｂ１(Glu141-Leu160)（配列番号７）
Ｂ２(Glu141-His155)（配列番号８）
Ｂ３(Gln145-Asn152)（配列番号９）
Ｂ４(Glu141-Lys170)（配列番号１０）
Ｄ１(Asp184-Ser200)（配列番号１１）
Ｄ２(Asp171-Ser200)（配列番号１２）
Ｆ１(Ile161-Val176)（配列番号１３）
Ｅ  (Arg394-Gly413)（配列番号１４）
【００２３】
動脈硬化の患者またはその予備軍が産生しうる動脈硬化のマーカーとなりうる抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体はポリクローナル抗体であるため、上記本発明の抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の測定方法に用いられる抗原ペプチドは、複数個所にエピトープとしての機能を有するものであってもよい。また、抗原ペプチドは複数種用いても良い。
【００２４】
本発明の抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の測定方法または動脈硬化の検査方法において、検体として、血清、血漿などの体液を使用することができる。
【００２５】
本発明の抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体の測定方法は、該ＨＳＰ６０抗体と本発明のポリペプチドの抗原抗体反応を検出しうる免疫学的手法による。そのような免疫学的手法としては、ラテックス凝集法、オクタロニー法、免疫クロマトグラフィー法やＥＬＩＳＡ法などの自体公知の手法を適用することができる。多くの検体を処理しうるＥＬＩＳＡ法が、特に好適である。具体的には、本発明のポリペプチドを抗原ペプチドとして固相に固定し、該固相に固定した抗原ペプチドに検体を接触させ、抗原ペプチドと検体中に含有可能性のある抗ＨＳＰ抗体との免疫複合体、または反応産物を検出することで、抗ＨＳＰ抗体を測定することができる。ＥＬＩＳＡ法の実施に伴う非特異反応の抑制方法や、検出の際に使用しうる標識物質、測定機器などは、自体公知のもの、あるいは今後開発されるものを適用することができる。
【００２６】
さらに本発明は、本発明のポリペプチドを少なくとも１種用いる、抗ＨＳＰ抗体の測定方法および該抗ＨＳＰ抗体の測定方法を用いた動脈硬化の検査方法にも及ぶ。さらには、本発明のポリペプチドを少なくとも１種含む動脈硬化検査用試薬にも及ぶ。また、前記検査用試薬を含み、その他ＥＬＩＳＡ法などに使用するマイクロプレート、標識物質など適宜必要な器具および／または試薬を含む動脈硬化検査用キットも本発明に含まれる。
【実施例】
【００２７】
以下に実施例を示して説明するが、本実施例は発明の内容をより理解するためのものであって、本発明は本実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００２８】
（実施例１）ポリペプチド
Ｈ．ピロリＨＳＰ６０（Ｈｐ−ＨＳＰ６０；配列番号１）およびヒトＨＳＰ６０（Ｈｕ−ＨＳＰ６０；配列番号２）のアミノ酸配列および相同分析は、Genetix ソフトウェアを用いて確認した。相同性の詳細は、図１に示した。これらより、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドについて、検討した。
【００２９】
１）Ｈｐ−ＨＳＰ６０の全体配列 (Ｈｐ−ＨＳＰ６０ｗ; Met1-met545 )（配列番号１）
２）Ｈｐ−ＨＳＰ６０２; Glu101-Ser200 （配列番号３）
３）Ｈｐ−ＨＳＰ６０４−５; Ile300-Gly435 （配列番号４）
上記において、２）および３）は、配列番号１に示す配列のうち、Ｈｕ−ＨＳＰ６０ （配列番号２）と９０％相同性を示す部分２箇所の部分配列である（図１）。
【００３０】
上記１）〜３）のポリペプチドは、遺伝子組み換えにより調製した。組換タンパク質をＰＣＲ法を用いた方法によりＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。配列表の配列番号１５〜２０に示す塩基配列からなるＰＣＲ用各プライマーは、GenBankにおいて公表された配列に基づいて設計した。クローニングを促進するために、制限酵素認識部位をプライマー配列に含めた。
１）Ｈｐ−ＨＳＰ６０ｗ用プライマー
5'-GGAGGATCCCCATGGCAAAAGAAATCAAATTT（配列番号１５）
5'-GGGGTCGACCATCATGCCGCCCATGCCTCC（配列番号１６）
２）Ｈｐ−ＨＳＰ６０２用プライマー
5'-TTTGGATCCCCGGCTTGGGAATATCACG（配列番号１７）
5'-TTTGTCGACGGAGAGGTAGCCTCTATCAAA  （配列番号１８）
３）Ｈｐ−ＨＳＰ６０４−５用プライマー
5'-GTCGGATCCCCAGCGAAGAATTGGGCTTG（配列番号１９）
5'-TTCGTCGACCACTTTTTCATCATCGTGTAA（配列番号２０）
【００３１】
上記ＰＣＲ用プライマーは、精製されたＨ．ピロリATCC 43504TのゲノムＤＮＡのＯＲＦ部分を増幅する。
【００３２】
ＰＣＲによる核酸増幅処理を、ExTaqポリメラーゼ（タカラ製）、５ｍＭのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド・プライマーおよび５００ｎｇのＨ．ピロリのＤＮＡを含む溶液（２０μｌ）中で行った。ＰＣＲは、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で３０秒を２５サイクル行った。
【００３３】
増幅産物をBamHIとSalIの制限酵素で切断し、通常の方法によりベクターpGEX-5X-3(アマシャム・ファルマシア)にクローニングした。合成プラスミドを大腸菌DH-5Aに形質転換した。２％グルコースおよびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢブロス（ＯＤ５４０：０．６−０．８）中で、３７℃で３時間培養後、組換タンパク質を２５℃で発現させた。培養は、０．１ｍＭのIPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactoside)誘導剤のもとで行った。
【００３４】
その後、７０００ｇで１０分間遠心分離を行って菌を収集し、氷冷したＰＢＳ（リン酸緩衝液）に再懸濁した。菌懸濁液を−７０℃で凍結したのち融解し、プローブソニケーター(Astrason製)セットを全出力で２分間使用し、菌を破砕した。ＧＳＴ−ＨＳＰ（Ｈｐ−ＨＳＰ６０ｗ、Ｈｐ−ＨＳＰ６０２およびＨｐ−ＨＳＰ６０４−５）により発現した可溶性融合タンパク質は、トロンビンで開裂させ、グルタチオン-Sepharose 4B(アマシャム・ファルマシア製)アフィニティー・クロマトグラフィーによって精製した。さらに同様の方法により、ヒトＨＳＰ６０−ＧＳＴ融合タンパク質を産生した。
【００３５】
（実施例２）ペプチドの合成
実施例１で選別されたポリペプチドを構成するアミノ酸配列（Ｈｐ−ＨＳＰ６０２; Glu101-Ser200（配列番号３）およびＨｐ−ＨＳＰ６０４−５; Ile300-Gly435（配列番号４））のうち、以下の部分ペプチドを合成した。各ペプチドは、アプライドバイオシステムズ社製モデル430Aシンセサイザーを用いて合成した。
【００３６】
Ａ１(Lys100-Met119)（配列番号５）
Ａ２(Asp120-Gly139)（配列番号６）
Ｂ１(Glu141-Leu160)（配列番号７）
Ｂ２(Glu141-His155)（配列番号８）
Ｂ３(Gln145-Asn152)（配列番号９）
Ｂ４(Glu141-Lys170)（配列番号１０）
Ｄ１(Asp184-Ser200)（配列番号１１）
Ｄ２(Asp171-Ser200)（配列番号１２）
Ｆ１(Ile161-Val176)（配列番号１３）
Ｅ(Arg394-Gly413)（配列番号１４）
【００３７】
（実施例３）ＥＬＩＳＡ法−１
各ＨＳＰ６０融合タンパク質およびＨ．ピロリATCC 43504Tに対する抗ＩｇＧ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡ法
【００３８】
９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、各ＨＳＰ６０融合タンパク質１０μｇ／ｍｌまたはＨ．ピロリ破砕物（ATCC 43504Tの超音波破砕物）５０μｇ／ｍｌを含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を１００μｌ、４℃で一夜処理し、抗原を固定した。
【００３９】
各ウェルを０．０５％のTWEEN 20Tを含むＰＢＳ溶液（洗浄緩衝液）で洗浄した。その後、１０％スキムミルク（希釈緩衝液）を含むＰＢＳ２００μｌでブロックした。各ウェルを洗浄緩衝液を用いて洗浄した後、１：１００希釈した検体（血清）を１００μｌ加え、２時間室温にて反応させた。
【００４０】
各抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体を各ウェルに１００μｌ加え、２時間室温にて加温した。抗体は、血清を用いて次のように希釈した。Ｈｐ−ＨＳＰ６０２、Ｈｐ−ＨＳＰ６０４−５およびＨｕ−ＨＳＰ６０は１：１００、Ｈ．ピロリ破砕物および抗Ｈｐ−ＨＳＰ６０ｗ抗体は１：１０００とした。
【００４１】
洗浄緩衝液を用いて各ウェルを洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗体（１：３０００希釈、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体(DAKO JAPAN)）を各ウェルに１００μｌ加え、室温で２時間加温した。さらに各ウェルを洗浄した後、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）中で１ｍｌ当たり１ｍｇのo-フェニレンジアミン（和光純薬）を含む溶液１５０μｌをウェルに加えて反応させた。その後、反応停止液として２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ加えた。ＥＬＩＳＡプレートリーダ（モデル680；Bio-Rad製）を用いてＯＤを４９０ｎｍで測定した。
【００４２】
（実施例４）ＥＬＩＳＡ法−２
個々の合成ペプチドに対する抗ＩｇＧ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡ法
【００４３】
９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、実施例３と同様に、個々の合成ペプチドを４μｇ／ｍｌを含む滅菌ＰＢＳ５０μｌで固定した。その後、プレートを室温で１日間乾燥し、シリカゲルを用いて空気を遮断した状態で−４℃で保存した。
【００４４】
１％アルブミン（シグマ社）を含む滅菌ＰＢＳで、各ウェルを２００μｌでブロックした。各ウェルを洗浄緩衝液を用いて洗浄した後、１：１００希釈した検体（血清）を１００μｌ加え、２時間室温にて反応させた。
【００４５】
ウェルを洗浄緩衝液で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識した１：３０００希釈ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体(DAKO JAPAN)を１００μｌ加え、プレートを室温で２時間培養した。プレートを洗浄した後、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）中で１ｍｌ当たり１ｍｇのo-フェニレンジアミン（和光純薬）を含む溶液１５０μｌでウェルを反応させた。その後、反応停止液として２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ加えた。ＥＬＩＳＡプレート・リーダ（モデル680；Bio-Rad製）を用いてＯＤを４９０ｎｍで測定した。
【００４６】
（実験例１−１２）
インフォームド・コンセントを得た冠動脈疾患患者（ＣＨＤ患者）（ｎ＝２５０）および非ＣＨＤ患者（ｎ＝２９３）から血清を取得し、−８０℃で保存した。ＣＨＤの診断は冠動脈硬化の知見に基づいた。ＣＨＤ患者はある狭窄を持っており、冠動脈血管形成術およびステント挿入のような治療を受けている。ＣＨＤ歴のない患者は非ＣＨＤ患者として選択した。全ての患者について、Ｈ．ピロリの感染を血清学的に調べた。コレステロールおよびｈｓ−ＣＲＰの測定値もすべての患者について測定した。
【００４７】
測定結果を、KaleidaGraphソフトウェアを用いて統計分析により解析した。各疾患患者における抗体のＯＤ差をスチューデントtテスト(統計的有意性：p<0.05)にて評価した。また、抗Ｈｕ−ＨＳＰ６０抗体、各抗Ｈｐ−ＨＳＰ６０抗体並びに各抗各Ｈｐ−ＨＳＰ６０ペプチド抗体の抗体価について相関係数等で評価した。また、カットオフ値が、０．２５以下で判断可能な場合を有意な検査が可能であると判断した。
【００４８】
【表１】
2008143802.tif 000002
【００４９】
[実験例１]
Ｈｐ陽性冠動脈疾患患者（ＣＨＤ患者）および非ＣＨＤ患者についての、Ｈｐ−ＨＳＰ６０ｗに対する抗体価を統計的に調べた（図２）。その結果、ＣＨＤ患者の抗Ｈｐ−ＨＳＰ６０ｗＩｇＧ抗体価は、非ＣＨＤ患者に比べて有意に高かった。
【００５０】
[実験例２]
Ｈｐ陽性ＣＨＤ患者および非ＣＨＤ患者についての、Ｈｕ−ＨＳＰ６０に対する抗体価を統計的に調べた（図３）。その結果、ＣＨＤ患者の抗Ｈｕ−ＨＳＰ６０ＩｇＧ抗体価は、非ＣＨＤ患者に比べて有意に高かった。
【００５１】
[実験例３]
Ｈｐ陽性ＣＨＤ患者におけるＨｐ−ＨＳＰ６０ｗおよびＨｕ−ＨＳＰ６０に対する各抗体価の相関性を調べた（図４）。抗Ｈｕ−ＨＳＰ６０ＩｇＧ抗体および抗Ｈｐ−ＨＳＰ６０ｗＩｇＧ抗体についての相関係数はR=0.057729であり、相関性に乏しかった。
【００５２】
[実験例４]
Ｈｐ陽性ＣＨＤ患者におけるＨｐ−ＨＳＰ６０２およびＨｕ−ＨＳＰ６０に対する各抗体価の相関性を調べた（図５）。抗Ｈｕ−ＨＳＰ６０ＩｇＧ抗体および抗Ｈｐ−ＨＳＰ６０２ＩｇＧ抗体についての相関係数はR=0.55926であった。
【００５３】
[実験例５]
Ｈｐ陽性ＣＨＤ患者におけるＨｐ−ＨＳＰ６０４−５およびＨｕ−ＨＳＰ６０に対する各抗体価の相関性を調べた（図６）。抗Ｈｕ−ＨＳＰ６０ＩｇＧ抗体および抗Ｈｐ−ＨＳＰ６０４−５ＩｇＧ抗体についての相関係数はR=0.14946であった。
【００５４】
[実験例６]
Ｈｐ陽性非ＣＨＤ患者におけるＨｐ−ＨＳＰ６０２およびＨｕ−ＨＳＰ６０に対する各抗体価の相関性を調べた（図７）。抗Ｈｕ−ＨＳＰ６０ＩｇＧ抗体および抗Ｈｐ−ＨＳＰ６０２ＩｇＧ抗体についての相関係数はR=0.36587であった。実験例４の結果と比較したところ、Ｈｐ陽性におけるＨｐ−ＨＳＰ６０２およびＨｕ−ＨＳＰ６０に対する各抗体価の相関性は、ＣＨＤ患者において有意に高い結果が得られた。
【００５５】
[実験例７]
Ｈｐ陰性ＣＨＤ患者におけるＨｐ−ＨＳＰ６０２およびＨｕ−ＨＳＰ６０に対する各抗体価の相関性を調べた（図８）。抗Ｈｕ−ＨＳＰ６０ＩｇＧ抗体および抗Ｈｐ−ＨＳＰ６０２ＩｇＧ抗体についての相関係数はR=0.52301であった。実験例４の結果と比較したところ、Ｈｐ陰性のＣＨＤ患者においてもＨｐ陽性と同等にＨｐ−ＨＳＰ６０２およびＨｕ−ＨＳＰ６０に対する各抗体価の高い相関性を認めた。
【００５６】
[実験例８]
ＣＨＤ患者血清および非ＣＨＤ患者血清からの抗Ｈｐ−ＨＳＰ６０２ＩｇＧ抗体の検定値はp=0.862であり、有意な差は認められなかった（図９）。
【００５７】
[実験例９]
Ｈｐ陽性のＣＨＤ患者の各ペプチドに対する抗体価を統計的に調べた。Ｈｐ−ＨＳＰ６０２由来の各ペプチドに対する抗体価は、Ｈｐ−ＨＳＰ６０４−５由来のペプチドに対する抗体価に比べについて有意に高値であった（図１０）。
【００５８】
[実験例１０]
Ｈｐ陽性患者におけるＣＨＤおよび非ＣＨＤ患者のペプチドＢ１に対する抗体価を調べた（図１１）。両者の検定値は、p<0.0001であり、有意な差が認められた。ここには示さないが、Ｈｐ−ＨＳＰ６０２由来の各ペプチド（D1など）に対する抗体価も同様の結果を認め、これにより、これらペプチドに対する抗体価を調べるのが有意と考えられた。さらにカットオフ値を0.35と定めた。
【００５９】
[実験例１１]
全ＣＨＤおよび非ＣＨＤ患者のペプチドＢ１に対する抗体価を測定した（図１２）。検定値は、p<0.0001であり、有意な差が認められた。
【００６０】
[実験例１２]
全ＣＨＤおよび非ＣＨＤ患者のｈｓ−ＣＲＰの値（カットオフ値：0.2）を調べた（図１３）。検定値は、p<0.0001であり有意な差が認められたが、カットオフ値よりＣＲＰに対する抗体価では、特異性が低いと考えられた。
【００６１】
ペプチドＢ１およびｈｓＣＲＰを用いてのＣＨＤ疾患について検査した結果を表２に示した。
【表２】
2008143802.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上説明したように、本発明の抗原エピトープ部分を用いて抗ＨＳＰ６０ペプチド抗体測定による検査を行うと、感度および特異性の高い動脈硬化の検査を行うことができる。また、本発明のポリペプチドはＥＬＩＳＡ法に適用することができるため、多くの検体を処理することができ、より早期に動脈硬化の検査を行うことができる。これにより、動脈硬化の危険性をより早期に検査することができ、適切な予防および治療を早期に開始することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】Ｈｐ−ＨＳＰ６０およびＨｕ−ＨＳＰ６０の各アミノ酸配列および相同性を示す図である。図１において、上部はＨｕ−ＨＳＰ６０を示し、下部はＨｐ−ＨＳＰ６０を示す。また、図中、各記号で示した部位は、本発明における各ペプチドの部位を示す。
【図２】Ｈｐ陽性冠動脈疾患患者（ＣＨＤ患者）および非ＣＨＤ患者についての、Ｈｐ−ＨＳＰ６０ｗに対する抗体価を統計的に調べた図である。
【図３】Ｈｐ陽性ＣＨＤ患者および非ＣＨＤ患者についての、Ｈｕ−ＨＳＰ６０に対する抗体価を統計的に調べた図である。
【図４】Ｈｐ陽性ＣＨＤ患者におけるＨｐ−ＨＳＰ６０ｗおよびＨｕ−ＨＳＰ６０に対する各抗体価の相関性を調べた図である。
【図５】Ｈｐ陽性ＣＨＤ患者におけるＨｐ−ＨＳＰ６０２およびＨｕ−ＨＳＰ６０に対する各抗体価の相関性を調べた図である。
【図６】Ｈｐ陽性ＣＨＤ患者におけるＨｐ−ＨＳＰ６０４−５およびＨｕ−ＨＳＰ６０に対する各抗体価の相関性を調べた図である。
【図７】Ｈｐ陽性非ＣＨＤ患者におけるＨｐ−ＨＳＰ６０２およびＨｕ−ＨＳＰ６０に対する各抗体価の相関性を調べた図である。
【図８】Ｈｐ陰性ＣＨＤ患者におけるＨｐ−ＨＳＰ６０２およびＨｕ−ＨＳＰ６０に対する各抗体価の相関性を調べた図である。
【図９】Ｈｐ陽性患者におけるＣＨＤおよび非ＣＨＤ患者のＨｐ−ＨＳＰ６０２でのカットオフ値を調べた図である。
【図１０】Ｈｐ陽性患者におけるＣＨＤおよび非ＣＨＤ患者の各ペプチドでのカットオフ値を調べた図である。
【図１１】Ｈｐ陽性患者におけるＣＨＤおよび非ＣＨＤ患者のペプチドＢ１でのカットオフ値を調べた図である。
【図１２】全ＣＨＤおよび非ＣＨＤ患者のペプチドＢ１でのカットオフ値を調べた図である。
【図１３】全ＣＨＤおよび非ＣＨＤ患者のＣＲＰでのカットオフ値を調べた図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2008143802.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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