(57)【要約】 【課題】  採血バッグに入った血小板製剤の細菌感染の有無を非侵襲的に全数検査できる検査方法を提供する。【解決手段】  採血バッグに入った血小板製剤を採血バッグから取り出すことなく、血小板製剤の近赤外スペクトルを、透過法或いはインタラクタンス法により血小板製剤製造直後から経時的に測定し、細菌感染試料と健全試料のスペクトルの経時的変化をケモメトリクスの手法により解析し、未知試料のスペクトルの経時的変化を細菌感染試料と健全試料のそれと比較することにより未知試料の細菌感染の有無を判別する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
採血バッグに入った血小板製剤の近赤外スペクトルを、血小板製剤を採血バッグから取り出すことなく非侵襲で経時的に測定し、細菌感染試料と健全試料のスペクトルの経時的変化を解析し、未知試料のスペクトルの経時的変化を細菌感染試料と健全試料のそれと比較することにより未知試料の細菌感染の有無を識別する血小板製剤非侵襲検査方法において、解析に用いるスペクトルを血小板製剤製造後の最初に測定したスペクトルを基準とした差スペクトルとすることを特徴とする血小板製剤非侵襲検査方法。
【請求項２】
請求項１に記載の血小板製剤非侵襲検査方法において、前記未知試料の細菌感染の有無を判別する方法は、健全試料の感染度を０(零)、細菌感染試料の感染度を１とするＰＬＳ回帰によって作成される回帰モデルを、未知試料に適用することにより得られる感染度の推定値から判別することを特徴とする血小板製剤非侵襲検査方法。
【請求項３】
請求項１に記載の血小板製剤非侵襲検査方法において、前記感染度の推定値が０．４未満の場合、未知試料は健全試料とし、０．４以上の場合、未知試料は細菌感染試料とすることを特徴とする血小板製剤非侵襲検査方法。
【請求項４】
請求項１に記載の血小板製剤非侵襲検査方法において、前記未知試料の細菌感染の有無を判別する方法は、健全試料の差スペクトルから作製されるＳＩＭＣＡモデルを未知試料に適用することにより得られる前記モデルの中心からの距離を用いて判別することを特徴とする血小板製剤非侵襲検査方法。
【請求項５】
請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の血小板製剤非侵襲検査方法により安全性が確認されていることを特徴とする血小板製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、近赤外分光法により血小板製剤の細菌汚染の有無を非侵襲的に検出する血小板製剤非侵襲検査方法、及び当該方法により安全性が確認された血小板製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板製剤の細菌感染の測定方法としては、細菌培養法（非特許文献１、非特許文献２）及び細菌スキャン法（非特許文献３）がある。
前者は細菌の増殖に伴いモニターの酸素圧が低下する又は炭酸ガス圧が上昇する原理を応用したものであり、後者は細菌を染色して顕微鏡でスキャンするものである。
【０００３】
また、血液に関する分析について関連する先行技術として特許文献１〜特許文献６が知られている。
【０００４】
特許文献１には、所定の温度に調整した血液試料入り採血管または採血バッグに、外側から７００ｎｍ〜１１００ｎｍ域の分光した近赤外光を照射して透過光強度を測定し、次いで、波長に対して吸光度をプロットした近赤外吸収スペクトルから検量線を用いて化学成分および理化学的特性に関する情報を抽出する方法が開示されている。
【０００５】
特許文献２には、血液バッグ中の血漿を代表する血漿検体にヘモグロビン(Ｈｂ)、胆汁色素、脂質粒子のような光散乱物質干渉体が含まれているかどうかを判定する方法として、血液バッグの外側から波長４７５〜９１０ｎｍの光を照射し、血液バッグに含まれる血漿試料の異なる波長の光の吸光度を測定し、次いでこの吸光度を、血漿試料中の干渉体に対する標準測定を用いて較正して得られた値と比較し、光散乱物質干渉体が含まれているかどうかを決定する方法が提案されている。
【０００６】
特許文献３には、血液バッグ内に保存された血小板製剤中に保存血小板の生存率を、非破壊的に測定する光学的測定方法が提案されている。具体的には、血液バッグを横向状態として、これを平板で挟むことで、所定厚さの流路である測定用血小板製剤層とし、この層を介して二つの貯溜部に区分し、血液バッグの静止状態で直交方向の光線を照射し、その測定用血小板製剤層の透過光を測知して静的光透過強度を得、当該血液バッグを所定流速による横向揺動下で、上記と同じ測定操作により、動的光透過強度を得、この動的光透過強度と静的光透過強度との相差値と静的光透過強度との比である光透過強度の変化率を演算し、当該変化率と、血液バッグ内の正常な血小板比率を示す％ＤＩＳＫとの相関係数から、その血小板比率を算出するようにしている。また、照射する光の波長としては９５０ｎｍの近赤外光を使用したことが記載されている。
【０００７】
特許文献４には、血液分析物の濃度を非侵襲的に決定する手法として、多重スペクトル分析を用いたケモメトリックス技術を使用し、未知の値を校正された基準値と比較する方法が提案されている。この文献では、ケモメトリックス技術として主成分分析（ＰＣＡ）が挙げられ、特に測定光の波長が約２１２０〜２１８０ｎｍの範囲では反射強度差に著しい変化があり、この反射強度差は血液グルコースレベルの増加と直線関係で増加することについて記載されている。
【０００８】
特許文献５には、液体と血球の混合物を含む血管中の血液の特性を非侵襲的に測定する方法として、異なる二本の光ビーム（波長７７０ｎｍ〜９５０ｎｍと波長４８０ｎｍ〜５９０ｎｍ）を用い、反射光の検出強度の比率を分析することで、ヒトの血管に含まれる液体と血球の混合物を非侵襲的に測定することが記載されている。
【０００９】
特許文献６には、構造のスペクトル応答に基づき、その構造の化学組成のような特性を予測するのに適したケモメトリクス法を適用した血管壁の近赤外線分光分析について記載されている。具体的には、収集したスペクトル中の不要な信号を抑制するためのケモメトリクス法として、具体的に、部分最小自乗判別分析法（ＰＬＳ−ＤＡ）、マハラノビス距離および大きい残差（augmented Residual）を用いる主成分分析法（ＰＣＡ／ＭＤＲ）、Ｋ最近距離（Ｋ−nearest neighbor）を用いる主成分分析法，ユークリッド距離を用いる主成分分析法、シムカ（soft independent modeling by class analogy）（ＳＩＭＣＡ）、ブートストラップ誤差調整単一サンプル法（bootstrap error-adjusted single-sample technique）（ＢＥＳＴ）が挙げられている。
【００１０】
【特許文献１】特開２００２−１２２５３７号公報
【特許文献２】特表２００１−５１４７４４号公報
【特許文献３】特開平９−３１８６２４号公報
【特許文献４】特開２００６−１２６２１９号公報
【特許文献５】特表２００３−５０８７６５号公報
【特許文献６】特表２００５−５３４４１５号公報
【非特許文献１】Ortolano J, et al. Detection of bacteria in WBC-reduced PLT concentrates  using percent oxygen as a marker for bacteria growth. Transfusion43(9):1276-1285, 2003.
【非特許文献２】Brecher M E, et al. Monitoring of apheresis platelet bacterialcontamination with an automated liquid culture system: a university  experience. Transfusion 43:974-978(7), 2003.
【非特許文献３】Schmidt M. et al: A comparison of three rapid bacterial detection methods  under simulated real-life conditions. Transfusion 46(8):1367-1373, 2006.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
採血バッグに入った試料の近赤外スペクトルを非侵襲で測定することについては特許文献１〜５に開示されている。また、試料中の特定物質の濃度を測定するため基準値と比較するのは特許文献４に開示されるように公知である。更に、スペクトル分析の際にケモメトリクス法、即ち、数学的または統計学的手法を用いることも一般的に行われている。
【００１２】
しかしながら、血小板の測定に関しては、上記した一般的な手法では解消できない問題がある。
つまり、製造された血小板製剤は全て同一の組成から成るわけではなく、僅かながら化学的・物理的特性の違い（個体差）がある。この僅かな差によって、血小板製剤のスペクトルは大きく変動する。このため、細菌感染の有無による血小板製剤中の成分の微少変化を捕らえるには、血小板製剤の個体差の影響を低減する必要があるが、上述した先行技術ではこの課題を解消することはできない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、血小板製剤の検査用試料を採血バッグから取り出すことなく、血小板製剤の細菌感染を非侵襲で迅速に検出する血小板製剤非侵襲検査方法において、差スペクトルを用いて健全試料と細菌感染試料を明確に識別する解析手法を提供する。
【００１４】
上記目的を達成するため、本発明は、採血バッグに入った血小板製剤の近赤外スペクトルを、血小板製剤を採血バッグから取り出すことなく、透過法或いはインタラクタンス法により血小板製剤製造直後から経時的に測定し、細菌感染試料と健全試料のスペクトルの経時的変化を分光学的手法により解析し、未知試料のスペクトルの経時的変化を細菌感染試料と健全試料のそれと比較することにより未知試料の細菌感染の有無を識別する血小板製剤非侵襲検査方法において、解析に用いるスペクトルは血小板製剤製造後の最初に測定したスペクトルを基準とした差スペクトルとした。
【００１５】
前記未知試料の細菌感染の有無を判別する方法は、健全試料の感染度を０(零)、
細菌感染試料のそれを１とするＰＬＳ回帰によって作成される回帰モデルを、未知試料に適用することにより得られる感染度の推定値から判別する方法が挙げられる。感染度の推定値がある一定値（例えば０．４）未満の場合、未知試料は健全試料とし、前記一定値以上の場合、未知試料は細菌感染試料と判断する。
【００１６】
採血バッグは光を通しにくいため、通常用いる波長帯域（２５００ｎｍ程度）の近赤外線を用いるとノイズが大きく測定誤差が生じやすい。そこで、通常用いる波長帯域の領域の１０〜１００倍の透過力を有する波長７００ｎｍ〜１１００ｎｍの短波長域の近赤外光を用いることが好ましい。
【００１７】
また、血小板製剤のスペクトルは、血小板製剤の化学的・物理的特性の違い（個体差）によって大きく変動することから、細菌感染の有無による血小板製剤中の成分の微少変化を捕らえるには、血小板製剤の個体差の影響を低減するため、解析に用いるスペクトルは血小板製剤製造後の最初に測定したスペクトルを基準とした差スペクトルとする。スペクトル解析に先立ち、前記差スペクトルには移動平均、微分、及びＭＳＣ処理などの何れか１つ或いは組み合わせによる前処理を施すことが可能である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、採血バッグに入った血小板製剤の細菌感染の有無を非侵襲的に全数検査する際に、採血バッグ毎の個体差を無くし、正確な測定を行うことができる。したがって、例えば血小板製剤の使用期間を３日間から一週間に延長可能になり、期限切れで廃棄されていた血小板製剤の有効利用を安全性を確保しながら達成できる。  
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に本発明の実施の最良の形態を説明する。この検査方法は、（１）スペクトルの測定、（２）差スペクトルの算出、（３）スペクトル解析による識別の過程から構成される。
【００２０】
（１）スペクトルの測定の過程では、恒温振とう装置で揺動させながら一定温度（例えば、２４℃）で保管した採血バッグに入った血小板製剤のスペクトル（試料の厚み：１５ｍｍ）を図１の左側の透過法或いは右側のインタラクタンス法により測定する。
【００２１】
すなわち、透過法においては、試料室２内において、分光した光３が入射光用光ファイバーバンドル５を介してバッグ内に入れられた血小板製剤１に照射され、血小板製剤１を透過した光４が透過光用光ファイバーバンドル６を介して検出器で検出される。
【００２２】
インタラクタンス法においては、分光した光８がインタラクタンス用光ファイバーバンドル１０を介して血小板製剤７に照射され、血小板製剤７の内部で拡散反射しれた光９がインタラクタンス用光ファイバーバンドル１０を介して検出器で検出される。
【００２３】
実際の測定の場合、前記透過法及び前記インタラクタンス法の両方法によりスペクトルを測定する必要はなく、どちらかの方法により測定すればよい。
【００２４】
スペクトル測定後、試料を保管用の恒温振とう装置に戻す。この測定を一定時間間隔、例えば６時間おきに、三日間繰り返す。実際の測定の場合、一週間測定を続けることも可能である。
【００２５】
（２）差スペクトルの算出の過程では、最初（製造時）の血小板製剤の化学的・物理的特性の違い（個体差）から生じる影響をスペクトルから除去するため、経時的に測定したスペクトルから最初のスペクトルを試料ごとに差し引くことにより差スペクトルを算出する。差スペクトルの算出には前処理（移動平均、微分、MSC処理など）を施したスペクトルを用いてもよい。
【００２６】
図２に二次微分スペクトルの例を示す。９７０ｎｍの近傍で観察される強い吸収は水によるもので、強度の違いは個体差等によるものである。この二次微分スペクトルを用いて主成分分析を行った結果を図３に示す。図中、◆は健全区（対象区）の試料、▲はセラチア菌感染区の試料、■は表皮ブドウ菌感染区の試料である。ＰＣ１及びＰＣ２の軸から構成される平面において、それぞれの試料は重複しており、健全試料と感染試料は識別ができない。細菌感染によるスペクトルの変化は微少であることから、試料の個体差の中に埋もれてしまったものと考えられる。
【００２７】
前記未知試料の細菌感染の有無を判別する方法は、健全試料の感染度を０(零)とし、経時的に測定したスペクトルの２次微分値から最初に測定したスペクトルの２次微分値を差し引くことにより得られる差スペクトルの例を図４に示す。差スペクトルにおいては、各血小板製剤の化学的・物理的特性の違い（個体差）によるスペクトルのズレが除去され、細菌感染による微妙な成分変化が強調される。
【００２８】
この差スペクトルを用いて主成分分析した結果を図５に示す。図中、◆は健全区（対象区）の試料、▲はセラチア菌感染区の試料、■は表皮ブドウ菌感染区の試料である。ＰＣ１及びＰＣ２軸から構成される平面において、健全区（対象区）の試料１１は散布図の左側に集中し、セラチア菌感染区の試料１２、表皮ブドウ菌感染区の試料１３は健全区の試料の右側に広く分布した。健全区の試料の分布領域より離れた試料は細菌感染が発生したものとして排除することが可能である。
【００２９】
次に、ＰＬＳ回帰を用いた解析例を示す。健全試料の感染度０（零）、細菌感染試料のそれを１とする検量モデル作成用試料において差スペクトルを基にＰＬＳ回帰を行い、感染度を推定する検量モデルを作成する。作成した検量モデルに評価用試料の差スペクトルを適用しそのモデルの性能を確認する。
【００３０】
図６に検量モデル評価時の散布図を示す。散布図において前記感染度の推定値が０．４未満の場合試料は健全試料とし、前記感染度の推定値が０．４以上の場合試料は細菌感染試料と判断される。
【００３１】
次に、ＳＩＭＣＡを用いた解析例を示す。健全試料の差スペクトルを基にＳＩＭＣＡモデルを作製する。作製した前記ＳＩＭＣＡモデルを未知試料に適用し、未知試料の前記ＳＩＭＣＡモデル中心からの距離を求める。前記距離と健全試料の残渣標準偏差とを比較し、前記距離が前記残渣標準偏差より大きい場合は感染区と、小さい場合健全区と判断される。
【００３２】
図７にＳＩＭＣＡモデルにより健全試料と感染試料(バチラス菌感染試料)を識別したCoomansプロットを示す。横軸は健全試料ＳＩＭＣＡモデル中心からの距離、縦軸は感染試料ＳＩＭＣＡモデル中心からの距離である。健全区１６の試料は同図において左上に分布し、感染区の試料１７は右下に分布する。すなわち、バチラス菌に感染した試料は健全区の試料集団より離れたところに分布していることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明による血小板製剤非侵襲検査システムは、自動化を図ることにより日本赤十字などの血液センターにおいて、血小板製剤の品質管理に活用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】透過法（左）及びインタラクタンス法（右）によるスペクトル測定（断面図）
【図２】二次微分スペクトルを示す図
【図３】二次微分スペクトルを用いた主成分分析結果を示す図
【図４】差スペクトルを示す図
【図５】差スペクトルを用いた主成分分析結果を示す図
【図６】ＰＬＳ回帰による解析結果を示す図
【図７】ＳＩＭＣＡによる解析結果を示す図
【符号の説明】
【００３５】
１・・・採血バッグに入った血小板製剤
２・・・試料室
３・・・試料への入射光
４・・・試料からの透過光
５・・・入射光用光ファイバーバンドル
６・・・透過光用光ファイバーバンドル
７・・・採血バッグに入った血小板製剤
８・・・分光した入射光
９・・・試料からの拡散反射光
１０・・・インタラクタンス用光ファイバーバンドル
１１・・・健全区（対象区）の試料
１２・・・セラチア菌感染区の試料
１３・・・表皮ブドウ菌感染区の試料
１４・・・健全区
１５・・・感染区
１６・・・健全区
１７・・・感染区
【図１】
2008134217.tif 000003
【図２】
2008134217.tif 000004
【図３】
2008134217.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
2008134217.tif 000008
【図７】
2008134217.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月17日(2007.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
採血バッグに入った血小板製剤の近赤外スペクトルを、血小板製剤を採血バッグから取り出すことなく非侵襲で経時的に測定し、細菌感染試料と健全試料のスペクトルの経時的変化を解析し、未知試料のスペクトルの経時的変化を細菌感染試料と健全試料のそれと比較することにより未知試料の細菌感染の有無を判別する血小板製剤非侵襲検査方法において、
未知試料の製造時に最初の近赤外スペクトル測定を行い、この最初の測定で得られたスペクトルの２次微分値を経時的に測定した当該未知試料のスペクトルの２次微分値から差し引いて差スペクトルとし、この差スペクトルを対照値として健全試料の感染度を０(零)、細菌感染試料の感染度を１とするＰＬＳ回帰検量モデルに適用し、感染度の推定値が０．４未満では未知試料は健全試料と判別し、０．４以上では未知試料は細菌感染試料と判別することを特徴とする血小板製剤非侵襲検査方法。
【請求項２】
請求項１に記載の血小板製剤非侵襲検査方法において、前記ＰＬＳ回帰に換えＳＩＭＣＡモデルを適用することを特徴とする血小板製剤非侵襲検査方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の血小板製剤非侵襲検査方法により安全性が確認されていることを特徴とする血小板製剤。
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月27日(2007.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
次に、ＰＬＳ回帰を用いた解析例を示す。健全試料の感染度０（零）、細菌感染試料のそれを１とする検量モデル作成用試料において差スペクトルを基にＰＬＳ回帰を行い、感染度を推定する検量モデルを作成する。作成した検量モデルに感染度が既知の評価用試料の差スペクトルを適用しそのモデルの性能を確認する。
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月6日(2008.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
採血バッグに入った血小板製剤の近赤外スペクトルを、血小板製剤を採血バッグから取り出すことなく非侵襲で経時的に測定し、細菌感染試料と健全試料のスペクトルの経時的変化を解析し、未知試料のスペクトルの経時的変化を細菌感染試料と健全試料のそれと比較することにより未知試料の細菌感染の有無を判別する血小板製剤非侵襲検査方法において、
未知試料の製造時に最初の近赤外スペクトル測定を行い、この最初の測定で得られたスペクトルの２次微分値を経時的に測定した当該未知試料のスペクトルの２次微分値から差し引いて差スペクトルとし、この差スペクトルを対照値として健全試料の感染度を０(零)、細菌感染試料の感染度を１とするＰＬＳ回帰検量モデルに適用し、感染度の推定値が０．４未満では未知試料は健全試料と判別し、０．４以上では未知試料は細菌感染試料と判別することを特徴とする血小板製剤非侵襲検査方法。