(57)【要約】【課題】免疫学的測定法の標識酵素として試薬中に処方するうえで、又、医療用途において、従来の組み換えアルカリホスファターゼの生産で生じる過剰Ｎ型糖鎖付加による高分子量化及び分子の不均一性の問題を克服する。【解決手段】アルカリホスファターゼ遺伝子中の一部、又は全てのＮ型糖鎖付加部位に変異を導入することでＮ型糖鎖付加能を消失させた上で、元のＡＬＰと同等の比活性を有し、宿主を問わず過剰Ｎ型糖鎖付加を生じない新規な組み換えアルカリホスファターゼを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物組織由来の組み換えアルカリホスファターゼの突然変異体であって、Ｎ型糖鎖付加部位又はＮ型糖鎖付加モチーフの一部若しくは全てに変異を有し、該糖鎖付加部位にＮ型糖鎖が結合しなくなるために、アルカリホスファターゼ全体の糖鎖付加量が減少したことを特徴とするアルカリホスファターゼ。
【請求項２】
組み換えアルカリホスファターゼの突然変異体の比活性が5,000U/mg以上である請求項１記載のアルカリホスファターゼ。
【請求項３】
組み換えアルカリホスファターゼの突然変異体の比活性が7,000U/mg以上である請求項１記載のアルカリホスファターゼ。
【請求項４】
真核生物組織が哺乳動物組織であり、Ｎ型糖鎖付加モチーフのうち、１〜３箇所に変異を有し糖鎖付加能を失ったために、アルカリホスファターゼ全体の糖鎖付加量が減少したことを特徴とする請求項１、２又は３記載のアルカリホスファターゼ。
【請求項５】
哺乳動物組織がウシ小腸であり、変異を有することでＮ型糖鎖付加能を失ったＮ型糖鎖付加モチーフが配列番号１のAsn141Thr142Thr143、Asn268Arg269Thr270及びAsn429Gly430Ser431のうちの１〜３箇所である請求項４記載のアルカリホスファターゼ、又は上述のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアルカリホスファターゼ。
【請求項６】
変異を有することでＮ型糖鎖付加能を失ったＮ型糖鎖付加モチーフの変異がAsnからGln又はLysへの置換である請求項４又は５記載のアルカリホスファターゼ、又は上述のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアルカリホスファターゼ。
【請求項７】
配列番号１のAsn268Arg269Thr270の変異がAsn→Asp、Asn→His又はThr→Cysである請求項４又は５記載のアルカリホスファターゼ、又は上述のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアルカリホスファターゼ。
【請求項８】
変異を有することでＮ型糖鎖付加能を失ったＮ型糖鎖付加モチーフが配列番号１のAsn141Thr142Thr143及びAsn429Gly430Ser431の１〜２箇所である請求項４、５又は６記載のアルカリホスファターゼ、又は上述のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアルカリホスファターゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカリホスファターゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰと略称する。）は、大腸菌から哺乳類にいたる全ての生物で見出される２量体、マグネシウム及び亜鉛含有の非特異的モノエステラーゼ（例えば、非特許文献１参照）であり、大腸菌と哺乳動物との間の相同性が２５〜３０％を示す等一次構造上高度に相同性があることが報告されている（例えば、非特許文献２及び３参照）。
【０００３】
ＡＬＰは、分子生物学分野において、遺伝子組み換え実験においてＤＮＡの脱リン酸化に用いたり、ウェスタンブロッティングの抗体の標識等に利用されており、産業分野では、臨床検査の免疫学的方法において標識酵素として用いられている。更に、ＡＬＰは、生体内において、栄養吸収の役割を果たすほかにグラム陰性菌由来の毒素を脱リン酸化により解毒する働きが報告されており（例えば、非特許文献４及び５参照）、細菌感染症あるいは敗血症等の治療、診断用途への応用も期待（例えば、特許文献１及び２参照）されている。
【０００４】
これらの用途、特に標識酵素としてあるいは治療用途に使用する場合に高い触媒活性を有することが、ＡＬＰにおいて魅力的な性質であり、大腸菌由来ＡＬＰに比較して哺乳動物ＡＬＰは、KcatS値が10〜100倍と高く、哺乳動物ＡＬＰは、これらの用途に使用する際に魅力的な酵素である。哺乳動物ＡＬＰは、種あるいは発現する器官等によって多くの比活性の異なるアイソザイムが存在することが知られており、これらＡＬＰの組み換え発現が、CHO細胞（ウシ腸管ＡＬＰの低比活性のもの、例えば、特許文献３及び非特許文献６参照）、COS細胞（ヒト胎盤ＡＬＰ、例えば、非特許文献７参照）又はバキュロウィルス発現系（ヒト胎盤ＡＬＰ、例えば、非特許文献８参照）等で報告されている。なかでも子ウシ腸管由来のＡＬＰには比活性7000U/mg以上の高比活性を有するアイソザイムが知られており、Ｂｉｏｚｙｍｅ社等から市販されており、一次構造が特定されCHO細胞での発現（例えば、非特許文献９参照）が報告されている。
【０００５】
哺乳動物由来の発現系では、細胞内の小胞体・ゴルジ体等の分泌経路において付加された糖鎖をトリミングして適切な形に修正する機能を有するために比較的天然型に近い糖鎖構造が得られる利点があるものの、発現量が少ないため経済性に問題がある。これに対して、高比活性のＡＬＰにおいて酵母での発現（例えば、特許文献４参照）が報告されており、発現量は優れているものの、酵母・糸状菌においては過剰にＮ型糖鎖が付加される傾向が強い（例えば、非特許文献１０参照）ため分子量が大きくなったり、分子の均一性に欠ける等の問題が生じる。これらは、蛋白質溶液の粘性を増す等ＡＬＰハンドリング上の問題点となったり、免疫学的測定において、ＡＬＰの標識後のゲル濾過での精製に支障が生じたり、医療用途ではアレルゲン性等の問題を生じることが危惧される。
【０００６】
酵母における過剰Ｎ型糖鎖付加に対応し、哺乳動物由来の蛋白質を適切な糖鎖構造で生産する方法は、宿主の酵母の育種が進められており、様々な報告がある（例えば、非特許文献１１及び１２参照）。しかし、これら酵母の育種による過剰Ｎ型糖鎖付加防止策は、酵母の外膜の糖鎖構造にも影響を及ぼしうるので、酵母の生育に悪影響を及ぼす可能性があり、又異なる宿主間での付加される糖鎖の違いが存在するため、同一の蛋白質遺伝子を異なる宿主で発現させる場合の発現蛋白質の同一性が担保できないという問題がある。
【０００７】
発現させる蛋白質遺伝子に変異を導入して、Ｎ型糖鎖付加量を減少させる、若しくは糖鎖付加をなくすことは、Ｎ型糖鎖付加モチーフが、Asn-Xaa-Ser/Thrであることが一般に知られており、本モチーフに部位特異的変異を導入して糖鎖付加を生じなくすることは、原理的には可能である。しかし、一般に糖鎖は細胞内の蛋白質輸送及び分泌、高次構造形成あるいは細胞内輸送過程での蛋白質品質管理に重要な役割を果たしていることが知られており、実際にＮ型糖鎖付加モチーフに部位特異的変異を導入して本来の機能を有する組み換え蛋白質を生産可能であるかどうかは保証されない。
【０００８】
【非特許文献１】McComb等,Alkaline Phosphatases Plenum Press,New york(1979)
【非特許文献２】Millan,Anticancer Res.,8,995-1004(1988)
【非特許文献３】Harris,Clin.Chim.Acta,186,133-150(1989)
【非特許文献４】Poelstra等,American J.Pathology,151,No.4,1163-1169(1997)
【非特許文献５】Beumer等,J.Pharmacology and  Experimental Therapeutics,307,No.2,737-744(2003)
【非特許文献６】Weissig等,Bioche.J.,260,503-508(1993)
【非特許文献７】Berger等,Biochemistry,84,4885-4889(1987)
【非特許文献８】Davis等,Biotechnology,10,1149-1150(1992)
【非特許文献９】Manes等,J. Biol.Chem.,273 No. 36,23353-23360(1998)
【非特許文献１０】Dean,Biochim.Biophys.Acta,1426,309-322(1999)
【非特許文献１１】新間等,Bio.Industry,20,No.1,33-49(2003)
【非特許文献１２】Vervecken等,Appl.Environ.Microbiol.,70,No.5,2639-2646(2004)
【特許文献１】特表平９−５０２３４２号公報
【特許文献２】特表２００２−５３３６７９号公報
【特許文献３】国際公開第９３／１８１３９号パンフレット
【特許文献４】特許第３６５７８９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、発現させる蛋白質、即ちＡＬＰのＮ型糖鎖付加能を部分的に、又は完全に消失させたうえで、元のＡＬＰと同等の比活性を有する変異型ＡＬＰが得られる方法を提供し、宿主を問わず、過剰Ｎ型糖鎖付加を生じない組え換えＡＬＰを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで本発明者等は、前記課題の解決のために鋭意研究を重ねた結果、真核生物由来のＡＬＰの持つＮ型糖鎖付加モチーフの一部、又は全てに変異を導入し、該当モチーフのＮ型糖鎖付加能を消失させた上で、元の比活性、安定性を保持するＡＬＰを開発することに成功し、本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）真核生物組織由来の組み換えアルカリホスファターゼの突然変異体であって、Ｎ型糖鎖付加部位又はＮ型糖鎖付加モチーフの一部若しくは全てに変異を有し、該糖鎖付加部位にＮ型糖鎖が結合しなくなるために、アルカリホスファターゼ全体の糖鎖付加量が減少したことを特徴とするアルカリホスファターゼ。
（２）組み換えアルカリホスファターゼの突然変異体の比活性が5,000U/mg以上である項目（１）記載のアルカリホスファターゼ。
（３）組み換えアルカリホスファターゼの突然変異体の比活性が7,000U/mg以上である項目（１）記載のアルカリホスファターゼ。
（４）真核生物組織が哺乳動物組織であり、Ｎ型糖鎖付加モチーフのうち、１〜３箇所に変異を有し糖鎖付加能を失ったために、アルカリホスファターゼ全体の糖鎖付加量が減少したことを特徴とする項目（１）、（２）又は（３）記載のアルカリホスファターゼ。
（５）哺乳動物組織がウシ小腸であり、変異を有することでＮ型糖鎖付加能を失ったＮ型糖鎖付加モチーフが配列番号１のAsn141Thr142Thr143、Asn268Arg269Thr270及びAsn429Gly430Ser431のうちの１〜３箇所である項目（４）記載のアルカリホスファターゼ、又は上述のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアルカリホスファターゼ。
（６）変異を有することでＮ型糖鎖付加能を失ったＮ型糖鎖付加モチーフの変異がAsnからGln又はLysへの置換である項目（４）又は（５）記載のアルカリホスファターゼ、又は上述のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアルカリホスファターゼ。
（７）配列番号１のAsn268Arg269Thr270の変異がAsn→Asp、Asn→His又はThr→Cysである項目（４）又は（５）記載のアルカリホスファターゼ、又は上述のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアルカリホスファターゼ。
（８）変異を有することでＮ型糖鎖付加能を失ったＮ型糖鎖付加モチーフが配列番号１のAsn141Thr142Thr143及びAsn429Gly430Ser431の１〜２箇所である項目（４）、（５）又は（６）記載のアルカリホスファターゼ、又は上述のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアルカリホスファターゼ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、酵母・糸状菌等の宿主においてもＮ型糖鎖付加量が少ないために、免疫学的測定法の標識酵素として試薬中に処方するうえで標識後の分離精製が容易であり、医療用途においても分子の均一性、アレルゲン性のうえで危険性の少ないことが期待できるＡＬＰが安価に提供され、産業上有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＡＬＰ（以下、本発明ＡＬＰと略称する。）とは、真核生物組織由来の組み換えＡＬＰの突然変異体であって、アミノ酸配列中に保持するＮ型糖鎖付加部位又はＮ型糖鎖付加モチーフの一部若しくは全てに変異を有し、該糖鎖付加部位にＮ型糖鎖が結合しなくなるために、ＡＬＰ全体の糖鎖付加量が減少したＡＬＰである。
【００１４】
このように本発明ＡＬＰは、その理化学的性質において、公知の何れの真核生物由来ＡＬＰとも異なっており、新規なＡＬＰである。従って、標識処理後の分離性能が優れた標識用酵素として免疫学的測定法キット試薬中に処方することが可能であり、又医療用途においても分子の均一性、アレルゲン性の危険性が少なく、本用途において実用化の期待が大きい。
【００１５】
次に、本発明ＡＬＰ及び本発明ＡＬＰをコードする遺伝子の取得方法について説明する。
本発明ＡＬＰは、微生物、動物あるいは植物起源の酵素を探索して、自然界より得ることができる。更に、遺伝子工学的技術あるいは変異処理等の方法を用い、本発明酵素と異なる理化学的性質を有するＡＬＰ（以下、性質を異にするＡＬＰと略称する。）を改変することにより、本発明ＡＬＰを得ることもできる。本発明でいう性質を異にするＡＬＰとしては、先に述べた既知のＡＬＰ等が挙げられ、新たに探索して得られたＡＬＰあるいは遺伝子工学的技術により改変して得られたＡＬＰ等でもよい。例えば、既知のＡＬＰとしては、ヒト、ラット、マウス等の哺乳類あるいはエビ等、広く真核生物の肝臓、胎盤等各種臓器由来のＡＬＰが挙げられ、好ましくは、ウシ（Bos taurus）小腸由来の高比活性型ＡＬＰ〔ＢＩＡＰＩＩ；Manes等,J.Biol.Chem., 273,No.36,23353-23360(1998)記載〕等が挙げられる。上記ＡＬＰは、シグナル配列を有する分泌蛋白質であり、本来のシグナル配列を残したまま用いてもよく、宿主ベクター系由来のシグナル配列を利用してもよい。
【００１６】
本発明に用いる、性質を異にするＡＬＰをコードする遺伝子を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、性質を異にするＡＬＰ生産能を有する微生物菌体あるいは種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（WILEY Interscience，1989）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する。更にｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。
このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製する。
次いで、上記性質を異にするＡＬＰのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方法あるいは上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法あるいは３’ＲＡＣＥ法等の適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
【００１７】
このようにして得られた性質を異にするＡＬＰをコードする遺伝子の好ましい一例として、ウシ小腸由来のＡＬＰ遺伝子〔ＢＩＡＰＩ；国際公開第93/18139号パンフレット又はWeissig等,Bioche.J.260,503-508(1993)〕を高比活性型（ＢＩＡＰＩＩ）に部位特異的変異等により改変したもの等が挙げられる。又、ウシ小腸由来ＡＬＰを特に高比活性化する要因として配列番号１及び配列番号３において３４１番目の位置に相当するアミノ酸のアラニン、スレオニン、バリン、セリン特に好ましくはグリシンへの置換が報告されており〔特開平11-332586号公報又はManes等,J.Biol.Chem.,273,No.36, 23353-23360(1998)〕、こうした変異型ＡＬＰ遺伝子の使用も可能である。又、ウシ小腸由来ＡＬＰのアミノ酸配列は公開されていることから、全アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをＤＮＡシンセサイザーにより合成して、相補鎖を会合させたうえでライゲーションして全長遺伝子を得ることもでき、全遺伝子中の一部分を合成したポリヌクレオチドを用い、部分的に相補鎖を会合させ、相補しあう部分をポリメラーゼで増幅し、全長遺伝子を得ることもできる。更に、これらの方法を部分的に組み合わせて用いることも可能である。これらの遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましく、例えば、単離したウシ小腸由来の性質を異にするＡＬＰをコードする遺伝子を含む組み換え体プラスミドｐＮＢＩＡＰＩＩ  ＤＮＡから、例えば、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）を用いることにより、抽出、精製して得られる。なお、本発明において用いることのできるベクターＤＮＡとしては、上記プラスミドベクターＤＮＡに限定されることなくそれ以外の、例えば、プラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等を用いることができる。具体的には、例えば、ｐＫＦ１９ｋ（タカラバイオ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ+ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が好ましい。
【００１８】
次に、上記の方法で得られた性質を異にするＡＬＰをコードする遺伝子を改変することにより、本発明ＡＬＰを得ることができる。すなわち、本発明においては、性質を異にするＡＬＰをコードする遺伝子が改変されることにより、その遺伝子により翻訳される性質を異にするＡＬＰのアミノ酸配列が改変される。その結果、本発明ＡＬＰを含む、改変前の性質を異にするＡＬＰと種々の性質の異なるＡＬＰが得られる。
【００１９】
改変に用いる性質を異にするＡＬＰをコードする遺伝子は特に限定されず、本発明の一実施態様として、ウシ小腸由来の性質を異にするＡＬＰをコードした遺伝子（配列番号４）あるいは合成遺伝子（配列番号２）等を挙げることができる。更に、この遺伝子を宿主生物で発現させるのに適したようにアミノ酸残基を付加、欠失若しくは置換しないように、又は付加、欠失若しくは置換するように塩基配列を改変したものも挙げることができる。又、上記の遺伝子のカルボキシル末端部分に複数のアミノ酸配列が付加したものであってもよく、この場合、本来のＡＬＰ活性を損なわないことが重要である。
【００２０】
上記遺伝子を改変する方法としては、既知の如何なる方法でも用いることができ、例えば、前記の組み換え体プラスミドｐＮＢＩＡＰＩＩ  ＤＮＡに、ハイドロキシルアミン、亜硝酸等の化学変異剤を接触させる方法、又はＰＣＲ法を用いてランダム若しくは部位特異的に変換する等の点変異方法、市販のキットを使用する部位特異的な置換又は欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特異的変異誘導法、この組み換え体プラスミドＤＮＡを選択的に開裂し、次いで、選択されたオリゴヌクレオチドを除去又は付加し、連結する方法、すなわちオリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。これらの変異導入方法は、Asn-Xaa-Thr/SerのＮ型糖鎖付加モチーフに変異を導入することで、該糖鎖付加部位での糖鎖付加が起こらなくなるものであれば、どのような方法であってもよい。次いで、上記処理後の組み換え体ＤＮＡを脱塩カラム、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）等を用いて精製し、種々の組換え体ＤＮＡを得る。この際、ｐＮＢＩＡＰＩＩ  ＤＮＡのアルカリホスファターゼのアミノ末端側のシグナル配列をコードする塩基配列を除去し、代わりに宿主由来あるいは任意のシグナル配列をコードした組み換え体ＤＮＡに交換したり、アミノ末端側をコードした塩基配列を酵母・糸状菌等の宿主生物で発現させるのに適した配列に置換した組み換え体ＤＮＡを用いてもよい。又、ランダムに変異を導入する場合には、アミノ酸配列のＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇ配列等を連結して、精製を容易にすることにより本発明ＡＬＰ生産株の選抜を容易にすることもできる。
【００２１】
このようにして得られた種々の組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、更に好ましくは分裂酵母Schizosaccharomyces pombe等の酵母細胞を形質転換又は形質導入し、種々の改変されたＡＬＰ遺伝子断片を保有する組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体を得ることができる。この際、変異導入方法が、Asn-Xaa-Thr/SerのＮ型糖鎖付加モチーフに部位特異的変異を導入することにより、Ｎ型糖鎖付加を生じなくする変異であるならば、得られた形質転換体のうち、元の宿主と比較してＡＬＰ活性が顕著に上昇しているものが、目的の本発明の宿主を問わず過剰Ｎ型糖鎖付加を生じない形質転換体（本発明ＡＬＰ生産株）である。得られた形質転換体のＡＬＰ活性の上昇を調べるには、例えば、次のように行うことができる。マグネシウム及び亜鉛添加ＹＰＤＧ１０培地〔１％酵母エキス（オリエンタル酵母社製）、２％トリプトン（ＯＸＯＩＤ社製）、２％グルコース（和光純薬社製）、１０μｇＧ４１８ｓｕｌｆａｔｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛〕１０ｍｌに得られた形質転換体を接種し、温度２０〜４２℃、好ましくは約３０℃で１０〜８０時間振とうしながらインキュベートする。次いで、培養液を回収し、リゾチーム、ＥＤＴＡ等の薬剤、超音波、マルチビーズショッカー等により菌体を破壊し、遠心等により菌体破砕上清を得る。得られた菌体破砕上清を使用して、形質転換体破砕上清の活性を測定し、元の宿主のＡＬＰ活性との比較により目的とする本発明の宿主を問わず過剰Ｎ型糖鎖付加を生じない形質転換体（本発明ＡＬＰ生産株）を取得することができる。
【００２２】
このようにして本発明ＡＬＰ生産能を有する形質転換体を得ることができる。例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するウシ小腸由来ＡＬＰ  ＢＩＡＰＩＩについて、上記改変方法を用いて得られた、配列番号１の１４１番目のＡｓｎがＧｌｎに、４２９番目のＡｓｎがＧｌｎに置換されたアミノ酸配列を含む本発明ＡＬＰあるいは配列番号１の１４１番目のＡｓｎがＬｙｓに、４２９番目のＡｓｎがＧｌｎに置換されたアミノ酸配列を含む本発明ＡＬＰ等を挙げることができる。すなわち本発明においては、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むＡＬＰ及び配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むＡＬＰ等も本発明ＡＬＰに含まれる。また、このようにして得られた本発明ＡＬＰを生産する形質転換体の一例としては、配列番号１の１４１番目のＡｓｎがＧｌｎに、４２９番目のＡｓｎがＧｌｎに置換されたアミノ酸配列を含む本発明ＡＬＰをコードする遺伝子を保持するｐＲＩ０ＮＢＩＡＰＩＩΔ１３を保持した酵母を挙げることができる。
【００２３】
又、本発明遺伝子の一例として、上記した本発明ＡＬＰ遺伝子を挙げることができる。配列番号１の１４１番目のＡｓｎがＧｌｎに、４２９番目のＡｓｎがＧｌｎに置換されたアミノ酸配列はプラスミドｐＮＢＩＡＰＩＩΔ１３上の遺伝子配列にコードされており、本プラスミドｐＮＢＩＡＰＩＩΔ１３は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６２６として寄託されている。
【００２４】
次に、本発明ＡＬＰ生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物より該ＡＬＰを採取することにより本発明ＡＬＰを製造する。本発明ＡＬＰ生産能を有する微生物であれば、いかなる微生物も本発明ＡＬＰの製造に用いることができる。例えば、上記のようにして得られた本発明ＡＬＰ生産能を有する形質転換体又は形質導入体等が挙げられる。例えば、本発明ＡＬＰ生産能を有する酵母、好ましくはSaccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Candida属、Pichia属又はHansenulla属に属する形質転換株を用いて本発明ＡＬＰを生産することができる。上記微生物を培養するには、固体培養法で培養してもよく、液体培養法を採用して培養するのがより好ましい。又、上記微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆若しくは小麦麹の浸出液等の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、塩化コバルト若しくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。又、培養は、２０〜３７℃、好ましくは３０℃前後で１０〜８０時間、通気攪拌深部培養、振とう培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物より本発明ＡＬＰを採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができる。培養液から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体から本発明ＡＬＰを採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもでき、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体から本発明ＡＬＰを採取するのが好ましい。
【００２５】
このようにして得られた粗酵素液から本発明ＡＬＰを単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行うことが好ましい。このようにして、本発明ＡＬＰを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一のバンドを示すまでに単離することができる。又、上記精製方法を適宜組み合わせて、用途に応じた精製度合の異なる酵素標品を調整することもできる。
【００２６】
本発明ＡＬＰの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により変換される基質の発色量の増減を測定する方法等が主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、p-ニトロフェニルリン酸の変換により生じるp-ニトロフェノールの吸光度増加を測定する方法について示す。なお、酵素力価は、p-ニトロフェニルリン酸を基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌのp-ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕと定義した。
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：１．０Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液
２．０３ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
（２）試薬２：ジエタノールアミン（ＤＥＡ）バッファー（用事調製）
５２．２ｇ  ＤＥＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を４００ｍｌイオン交換水に溶解し、  ０．２５ｍｌ  ＭｇＣｌ２溶液（試薬１）を加える。その後、３７℃に暖めてから，２Ｎ  ＨＣｌでｐＨ９．８に調整し、イオン交換水で５００ｍｌに定容する。
（３）試薬３：０．６５Ｍ  p-ニトロフェノールリン酸溶液
２４７ｍｇ  p-ニトロフェノールリン酸（Ｓｉｇｍａ社製）を１ｍｌのイオン交換水に溶解する。
（４）酵素希釈液
活性測定値が、０．１０〜０．２０Ｕ／ｍｌになるようにＤＥＡバッファー（試薬２）で希釈する。
Ｂ．測定法
２．９０ｍｌのＤＥＡバッファー（試薬２）と０．０５ｍｌのp-ニトロフェノールリン酸溶液（試薬３）を混和し、３７℃で５分加温する。その後、０．０５ｍｌの酵素希釈液を添加し、混合の後、分光光度計（Ｕ−３０１０、日立社製）により、４０５ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値（ΔODtest）は、４０５ｎｍにおける２分後から４分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液（ΔODblank）は、酵素液の代わりに０．０５ｍｌのＤＥＡバッファーを加える以外は前記と同様にしたものである。下記の計算式に従い、算出した値を酵素活性値（Ｕ／ｍｌ）とした。
ΔOD/min（ΔODtest−ΔODblank）×３(ml)×希釈倍率
Ｕ／ｍｌ＝  ――――――――――――――――――――――――――――――
１８．２×１．０×０．０５(ml)
１８．２：上記の測定条件下でのミリモル分子吸光係数（cm2/micromole）
１．０：光路長(cm)
【００２７】
以下に、実施例により本発明を詳述する。
【実施例１】
【００２８】
（Ａ）ウシ小腸由来ＡＬＰ遺伝子のクローニング
（１）ウシ小腸からのＲＮＡ取得
ウシの小腸〔東京芝浦臓器社より購入〕を５ｍｍ幅程度に切り取り、液体窒素中で凍結させた後、凍結状態のまま乳鉢中で破砕した。約１００ｍｇの破砕したウシ小腸片を１ｍｌのＥＡＳＹＰｒｅｐＲＮＡ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌済み遠心チューブに移し、ホモジェナイザーにホモジェナイズした後、室温で５分間静置した。その後、クロロホルムを添加し、２０秒間強く振った後、室温で１０分間静置した。次いで、１４０００ｒｐｍ、１５分間、４℃にて遠心し、３層に分かれたうちの上層の水層のみを回収し、新しい滅菌済み遠心チューブに移した。そこに１ｍｌのイソプロパノールを加え混合した後、室温で１０分間静置した。それから１４０００ｒｐｍ、１５分間、４℃にて遠心し、沈殿を回収する。この沈殿がＲＮＡであり、これを７５％冷エタノールで洗った後、風乾した。これを０．２ｍｌのＤＥＰＣ処理済みの滅菌イオン交換水に懸濁し、ＲＮＡ試料とした
【００２９】
（２）ウシ小腸由来ＡＬＰ  ｃＤＮＡ取得
ＲＴ−ＰＣＲは、Ｒｅａｄｙ-ｔｏ-Ｇｏ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓキット（アマシャム社製）を使用した。反応は、キットの取扱説明書に従い実施し、ＡＬＰ  ｃＤＮＡ増幅にＡＬＰＮＦプライマー（配列番号５）及びＡＬＰＮＲプライマー（配列番号６）を使用し、ＡＬＰのｃＤＮＡが全長取得できるようにした。その結果、アガロースゲル電気泳動で、１．５ｋｂｐに相当する大きさのＤＮＡ断片の増幅が確認できた。このようにして得たＤＮＡ断片を制限酵素NdeI（第一化学薬品社製）で処理した後、プラスミドpKF19kを同じくNdeIで処理した後、ＢＡＰ処理（タカラバイオ社製）により脱リン酸化を行ったものと混合し、Ligation Kit ver.2（タカラバイオ社製）を利用しライゲーションし、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法〔Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３２６〜３３１，(１９７９)〕に従って大腸菌ＪＭ１０９(東洋紡社製)を形質転換した。形質転換株を夫々カナマイシン含有ＬＢ培地２０ｍｌで３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を７０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組み換え体プラスミドＤＮＡを抽出して精製し、組み換え体プラスミドＤＮＡを１００μｇ得た。回収したプラスミドをＣＥＱ２０００ＸＬ  ＤＮＡ解析システム（ベックマンコールター社製）を用いて塩基配列を決定したところ、プラスミドpKF19k上に組み込まれたｃＤＮＡは配列番号４に示される塩基配列を有していることが分かった。それを元に改変されたアミノ酸残基の同定を行ったところ、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有していた。このようにして作製したプラスミドをｐＡＬＰと命名した。
【実施例２】
【００３０】
（Ｂ）高比活性型ＡＬＰ遺伝子（ＢＩＡＰＩＩ）の作製
（１）アミノ末端側塩基配列を改変した組み換え体プラスミドｐＮＡＬＰの調製
配列番号７〜１０に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをシグマジェノシス社の受託合成サービスにより入手した。尚、配列番号７〜１０では、アミノ末端のコドンユセージを改善すると同時に、配列番号３の２１番目をバリンからイソロイシンへ、２３番目をバリンからアラニンへ、２７番目をアスパラギン酸からアスパラギンへ改変するようにデザインした。配列番号７〜１０の夫々をT4 Polynucleotide kinase（タカラバイオ社製）を用いてリン酸化した。一方、配列番号４を有するｐＡＬＰ  ＤＮＡを鋳型とし、配列番号６及び５１をプライマーとしてEx Taq polymerase（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲ反応を行い、Ｃ末端側をコードする遺伝子断片を調製した。更に、本断片をNdeI及びBiamHI（第一化学薬品社製）で処理した。更に、ｐＫＦ１９ｋＤＮＡをNdeIで処理した後、ＢＡＰ処理（タカラバイオ社製）により脱リン酸化を行った。このようにして得られたリン酸化オリゴヌクレオチドのうち、４本のリン酸化オリゴヌクレオチド、ｐＡＬＰＤＮＡ由来遺伝子断片及びｐＫＦ１９ｋ断片を適量混合し、Ligation Kit ver.2（タカラバイオ社製）を利用しライゲーションし、得られたプラスミドをｐＮＡＬＰと命名した。次いで、実施例１（Ａ）（２）に記載の方法によりｐＮＡＬＰ  ＤＮＡを１００μｇ調製した。
【００３１】
（２）部位特異的変異による高比活性型アミノ酸配列を有したＡＬＰをコードする遺伝子の作製
ｐＮＡＬＰ  ＤＮＡに配列番号１１及び１２（配列番号３の１４１番目をリジンからアスパラギンに置換するようにデザインされている）の配列をプライマーとしてＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲ反応を行った後、アガロースゲル電気泳動にてプラスミドの全長に相当するＤＮＡ断片の増幅を確認し、制限酵素DpnI（メチル化したＤＮＡに作用する；第一化学薬品社製）で処理した後、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、カナマイシンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。生育してきたコロニーをカナマイシン入りの液体培地で培養し、ＡＬＰ遺伝子を有するプラスミド１００μｇを回収し、塩基配列を確認し目的どおりの変異が導入されていることを確認した。
【００３２】
次いで、得られたプラスミドを鋳型として、配列番号１３及び１４（配列番号３の１５２番目をメチオニンからイソロイシンに置換するようにデザインされている）の配列をプライマーとしてＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲ反応を行った後、アガロースゲル電気泳動にてプラスミドの全長に相当するＤＮＡ断片の増幅を確認し、制限酵素DpnI（メチル化したＤＮＡに作用する；第一化学薬品社製）で処理した後、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、カナマイシンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。生育してきたコロニーをカナマイシン入りの液体培地で培養し、ＡＬＰ遺伝子を保持するプラスミド１００μｇを回収し、塩基配列を確認し目的通りの変異が導入されていることを確認した。以降、表１に基づいて順次、部位特異的変異を導入することで、高比活性型ＡＬＰ遺伝子をコードしたプラスミドｐＮＢＩＡＰＩＩを得た。次いで、実施例１（Ａ）（２）に記載の方法によりｐＮＢＩＡＰＩＩ  ＤＮＡを１００μｇ調製した。なお、ｐＮＢＩＡＰＩＩは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６２５として寄託されている。
【００３３】
【表１】
2008005734.tif 000002
【実施例３】
【００３４】
（Ｃ）Ｎ型糖鎖付加部位改変型ＡＬＰ（本発明ＡＬＰ）遺伝子の作製
単一突然変異体Ａｓｎ１４１Ｇｌｎを生成するために、配列番号２の遺伝子配列を有するｐＮＢＩＡＰＩＩをテンプレートとし、配列番号５２及び配列番号５３のオリゴＤＮＡをプライマーとして、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応終了後、アガロースゲル電気泳動によりプラスミドの全長に相当するＤＮＡの増幅を確認し、DpnIで処理して、テンプレートとしたｐＮＢＩＡＰＩＩを切断して、変異型ｐＮＢＩＡＰＩＩを取得した。ここで取得した変異型ｐＮＢＩＡＰＩＩをｐＮＢＩＡＰＩＩΔ１と命名した。ｐＮＢＩＡＰＩＩΔ１を用いて、大腸菌ＪＭ１０９株(東洋紡社製)を形質転換し、カナマイシンを添加した液体培地で培養して、ｐＮＢＩＡＰＩＩΔ１を保有する形質転換体を得た。この形質転換体を培養し、プラスミドを抽出して塩基配列を確認し、目的通りの変異が導入されていることを確認した。以降、表２に基づいて順次、部位特異的変異を導入することで、各種のＮ型糖鎖付加部位改変型ＡＬＰ遺伝子をコードした変異型ｐＢＩＡＰＩＩ及びそれらを保持する形質転換体を得た。このうち、ｐＮＢＩＡＰＩＩΔ１３は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６２６として寄託されている。
【００３５】
【表２】
2008005734.tif 000003
【実施例４】
【００３６】
（Ｄ）組み換えＡＬＰ（本発明ＡＬＰ）生産酵母の作製
（１）ｐＲＩ０ＮＢＩＡＰＩＩの構築
組み換えＡＬＰ（本発明ＡＬＰ）生産酵母を作製するために、Ｎ型糖鎖付加部位改変型ＡＬＰをコードする遺伝子を変異型ｐＮＢＩＡＰＩＩから切り出し、酵母中で自律複製可能なベクターであるｐＲＩ０Ｍ（特開平１１−１９２０９４号公報）へと導入する操作を行った。ｐＮＢＩＡＰＩＩΔ１をテンプレートとし，配列番号６６及び配列番号６７に示すオリゴＤＮＡをプライマーとして、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いてＰＣＲ反応を行い、本発明ＡＬＰをコードする遺伝子及びそのシグナル配列を含むＤＮＡ断片を増幅させた。その結果、アガロースゲル電気泳動で、１．５ｋｂｐに相当する大きさのＤＮＡ断片の増幅が確認できた。このようにして得たＤＮＡ断片を制限酵素SmaI及びKpnI（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ社製）で処理した後、プラスミドｐＲＩ０Ｍを同様にSmaI及びKpnIで処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を利用しライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）を形質転換した。アンピシリンを添加したＬＢ培地２０ｍｌで形質転換株を３７℃、２０時間振とう培養し、培養物を７０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より組み換え体プラスミドＤＮＡを抽出して精製し、組み換え体プラスミドＤＮＡを１００μｇ得た。取得した本発明ＡＬＰ誘導発現プラスミドベクターをｐＲＩ０ＮＢＩＡＰＩＩΔ１と命名した。以降、作製した変異型ｐＮＢＩＡＰＩＩ全てにおいて同様の操作を行い、本発明ＡＬＰ誘導発現ベクターを作製した。
【００３７】
（２）Schizosaccharomyces pombeの形質転換
作製した本発明ＡＬＰ誘導発現ベクターｐＲＩ０ＮＢＩＡＰＩＩΔ１及び導入ベクターｐＡＬ７を用いて、特開平１１−１９２０９４号公報記載の方法でSchizosaccharomyces pombeの形質転換体を作製し、そのグリセロールストックを作製した。以降作製した各種の本発明ＡＬＰ誘導発現ベクターの全てを用いて同様の操作を行い、各種の本発明ＡＬＰ生産酵母を１６種類作製した。
【実施例５】
【００３８】
（Ｅ）組み換えＡＬＰ（本発明ＡＬＰ）生産酵母によるＡＬＰの生産
マグネシウム及び亜鉛添加ＹＰＤＧ１０培地〔１％酵母エキス（オリエンタル酵母社製）、２％トリプトン（ＯＸＯＩＤ社製）、２％グルコース（和光純薬社製）、１０μｇＧ４１８ｓｕｌｆａｔｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛〕１０ｍｌに各種の本発明ＡＬＰ生産酵母のグリセロールストックを接種し、３０℃で７０時間振とうしながらインキュベートした。次いで、培養液を回収し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）により菌体を破砕した。得られた菌体破砕上清を使用して活性試験を行い、各種の本発明ＡＬＰ生産酵母菌体破砕上清の活性を評価した。その結果を表３に示した。
【００３９】
【表３】
2008005734.tif 000004
【実施例６】
【００４０】
（Ｆ）組み換えＡＬＰ（本発明ＡＬＰ）の精製
上記のようにして得られた本発明ＡＬＰを生産する形質転換体、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）を三角フラスコ中の１０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８  Sulfate（Calbiochem社製）入り０．５％酵母エキス、３．０％グルコース培地１００ｍＬに植菌し、攪拌速度１４０ｒｐｍの条件で、３０℃、４８時間攪拌培養し、得られた培養液を１０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８  Sulfate（Calbiochem社製）、１．０％酵母エキス、２．０％ポリペプトン、２．０％グルコース、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛の培地２０Ｌに植菌し、ジャーファーメンターを用いて、通気量０．５Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度４００ｒｐｍの条件で、３０℃、６０時間攪拌培養した。３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して集菌し、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛を含有した１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌに懸濁した。
【００４１】
次いで、高圧ホモジェナイザーにより菌体を破砕し、５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により上清を回収し、粗酵素液とした。その後、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛を含有した１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１０００ｍｌのＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０（アマシャム社製）に懸濁し、ろ液と１０００ｍｌの５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛を含有した１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．０）で洗いこんだものを活性画分として回収する。これを限外膜ＡＩＰ−１０１０（旭化成ファーマ社製）で５００ｍｌに濃縮した後、ｐＨ８．０にトリスを添加することで調整した。５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛含有１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した５００ｍＬのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャム社製）カラムクロマトグラフィーに試料を吸着させた後、１Ｌの５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛含有１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。その後、２．５Ｌの５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛含有１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ８．０）と２．５Ｌの１００ｍＭの塩化カリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛含有１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ８．０）のグラジェントにより、ＡＬＰ活性画分を溶出した。これを限外膜ＡＩＰ−１０１０で５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛含有１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、３００ｍＬに濃縮した。その後、終濃度２０％になるように硫酸アンモニウムを添加し、２０％硫酸アンモニウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛含有１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した３００ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｙｌ６５０Ｃカラムクロマトグラフィー（東ソー社製）に吸着させ、１．５Ｌの２０％硫酸アンモニウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛含有１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．０）１．５Ｌの２０％硫酸アンモニウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛含有１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．０）と１．５Ｌの５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛含有１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．０）のグラジェントによりＡＬＰ活性画分を溶出した。その後、ＡＬＰ活性画分を限外膜ＡＩＰ−１０１０で５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛含有１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、３００ｍＬに濃縮し、ＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐＹＭ−１０（ミリポア社製）により１０ｍｌ程度まで濃縮した。精製した本発明ＡＬＰを常法により、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品社製）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に供し、クマシーブルー染色を行ったところ、図１に示す結果となった。
【実施例７】
【００４２】
（Ｇ）組み換えＡＬＰ（本発明ＡＬＰ）の比活性の測定
本発明ＡＬＰ試料の活性を測定し、蛋白質量をＯＤ２８０の吸光度及びDC protein assay（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により求めた。その活性及び蛋白質量から比活性を算出したところ、表４に示す結果となった。
【００４３】
【表４】
2008005734.tif 000005
【実施例８】
【００４４】
（Ｈ）組み換えＡＬＰ（本発明ＡＬＰ）の分子量測定
本発明ＡＬＰ試料をゲルろ過に供し、分子量を測定した。ＴＳＬ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー社製）をＨＰＬＣ８０２０システム（東ソー社製）に装着し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で測定したところ、表５に示した通りであった。又、本発明ＡＬＰのゲルろ過のパターンは、図２から図７に示すとおりであった。
【００４５】
【表５】
2008005734.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明ＡＬＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図。
【図２】組み換え体ＡＬＰ（ＢＩＡＰＩＩ，分泌）のゲルろ過分析を示す図。
【図３】組換え体ＡＬＰ（ＢＩＡＰＩＩ，菌体内残留）のゲルろ過分析を示す図。
【図４】本発明ＡＬＰ（BIAPIIにN141K変異を生じたもの）のゲルろ過分析を示す図。
【図５】本発明ＡＬＰ（BIAPIIにN141Q、N429Q変異を生じたもの）のゲルろ過分析を示す図。
【図６】本発明ＡＬＰ（BIAPIIにN141K、N429Q変異を生じたもの）のゲルろ過を示す図。
【図７】ウシ由来ＡＬＰのゲルろ過分析を示す図。
【図１】
2008005734.tif 000007
【図２】
2008005734.tif 000008
【図３】
2008005734.tif 000009
【図４】
2008005734.tif 000010
【図５】
2008005734.tif 000011
【図６】
2008005734.tif 000012
【図７】
2008005734.tif 000013
【配列表】
2008005734000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月22日(2006.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
又、本発明遺伝子の一例として、上記した本発明ＡＬＰ遺伝子を挙げることができる。配列番号１の１４１番目のＡｓｎがＧｌｎに、４２９番目のＡｓｎがＧｌｎに置換されたアミノ酸配列はプラスミドｐＮＢＩＡＰＩＩΔ１３上の遺伝子配列にコードされており、本プラスミドｐＮＢＩＡＰＩＩΔ１３は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６２６として寄託されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
次いで、得られたプラスミドを鋳型として、配列番号１３及び１４（配列番号３の１５２番目をメチオニンからイソロイシンに置換するようにデザインされている）の配列をプライマーとしてＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲ反応を行った後、アガロースゲル電気泳動にてプラスミドの全長に相当するＤＮＡ断片の増幅を確認し、制限酵素DpnI（メチル化したＤＮＡに作用する；第一化学薬品社製）で処理した後、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、カナマイシンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。生育してきたコロニーをカナマイシン入りの液体培地で培養し、ＡＬＰ遺伝子を保持するプラスミド１００μｇを回収し、塩基配列を確認し目的通りの変異が導入されていることを確認した。以降、表１に基づいて順次、部位特異的変異を導入することで、高比活性型ＡＬＰ遺伝子をコードしたプラスミドｐＮＢＩＡＰＩＩを得た。次いで、実施例１（Ａ）（２）に記載の方法によりｐＮＢＩＡＰＩＩ  ＤＮＡを１００μｇ調製した。なお、ｐＮＢＩＡＰＩＩは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６２５として寄託されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
（Ｃ）Ｎ型糖鎖付加部位改変型ＡＬＰ（本発明ＡＬＰ）遺伝子の作製
単一突然変異体Ａｓｎ１４１Ｇｌｎを生成するために、配列番号２の遺伝子配列を有するｐＮＢＩＡＰＩＩをテンプレートとし、配列番号５２及び配列番号５３のオリゴＤＮＡをプライマーとして、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応終了後、アガロースゲル電気泳動によりプラスミドの全長に相当するＤＮＡの増幅を確認し、DpnIで処理して、テンプレートとしたｐＮＢＩＡＰＩＩを切断して、変異型ｐＮＢＩＡＰＩＩを取得した。ここで取得した変異型ｐＮＢＩＡＰＩＩをｐＮＢＩＡＰＩＩΔ１と命名した。ｐＮＢＩＡＰＩＩΔ１を用いて、大腸菌ＪＭ１０９株(東洋紡社製)を形質転換し、カナマイシンを添加した液体培地で培養して、ｐＮＢＩＡＰＩＩΔ１を保有する形質転換体を得た。この形質転換体を培養し、プラスミドを抽出して塩基配列を確認し、目的通りの変異が導入されていることを確認した。以降、表２に基づいて順次、部位特異的変異を導入することで、各種のＮ型糖鎖付加部位改変型ＡＬＰ遺伝子をコードした変異型ｐＢＩＡＰＩＩ及びそれらを保持する形質転換体を得た。このうち、ｐＮＢＩＡＰＩＩΔ１３は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６２６として寄託されている。