(57)【要約】【課題】低濃度から高濃度までの広い範囲での計測を可能とする測定手法を提供すること。【解決手段】基質を同じくし、異なる親和性（Ｋｍ値）を示す２種以上の酵素を用いて、基質濃度に対応し最適な感度で定量できる酵素を選択することで広範囲の基質濃度を定量する。基質が低濃度の場合にはＫｍがより小さな酵素によって濃度を測定し、基質が高濃度の場合にはＫｍがより大きな酵素によって濃度を測定することで広濃度範囲にわたり高感度な分析を可能とした。【選択図】図１
2008022728.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種の酵素を用いて、液体試料中の基質濃度を定量する方法であって
前記基質濃度の概略値を測定する工程、
前記基質濃度の概略値に基づいて、前記複数種の酵素から１種を選択する工程、
選択された酵素を用いて、液体試料中の基質濃度を定量する工程、
を有することを特徴とする液体試料分析手法。
【請求項２】
前記複数種の酵素が、同一物質を基質とし、かつ異なる親和性を示すことを特徴とする請求項１記載の液体試料分析手法。
【請求項３】
前記親和性が、酵素のＫｍ値であることを特徴とする請求項１記載の液体試料分析手法。
【請求項４】
前記基質濃度の概略値を測定する工程が、酵素反応測定であることを特徴とする請求項１記載の液体試料分析手法。
【請求項５】
前記基質濃度の概略値を測定する工程が、同一物質を基質とし、かつ異なる親和性を示す複数種の酵素を用いた酵素反応測定であることを特徴とする請求項４記載の液体試料分析手法。
【請求項６】
前記基質濃度の概略値に基づいて、前記複数種の酵素から１種を選択する工程において、前記液体試料中の基質濃度の概略値が低い場合には、Ｋｍ値が小さな酵素を選択し、かつ前記液体試料中の基質濃度の概略値が高い場合には、Ｋｍ値が大きな酵素を選択することを特徴とする請求項１記載の液体試料分析手法。
【請求項７】
前記基質濃度を定量する工程が、レートアッセイ法であることを特徴とする請求項１記載の液体試料分析手法。
【請求項８】
前記基質濃度を定量する工程が、エンドポイント法であることを特徴とする請求項１記載の液体試料分析手法。
【請求項９】
前記基質濃度を定量する工程が、前記基質濃度の概略値が低い場合には、エンドポイント法であり、前記基質濃度の概略値が高い場合には、レートアッセイ法であることを特徴とする請求項１記載の液体試料分析手法。
【請求項１０】
液体試料中の基質濃度を酵素を用いて定量する液体試料分析用センサであって、
同一物質を基質とし、かつ異なる親和性を示す複数種の酵素が、固定もしくは担持されていることを特徴とする液体試料分析用センサ。
【請求項１１】
液体試料中の基質濃度を酵素を用いて定量する液体試料分析用センサであって、
前記基質濃度の概略値を測定する領域、
同一物質を基質とし、かつ異なる親和性を示す複数種の酵素を用いて、前記基質濃度を正確に定量する領域、
からなることを特徴とする液体試料分析用センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として液体試料中の化学物質の分析、特に酵素を用いて液体試料中の基質濃度を測定する分析手法およびセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
環境、食品、医療などの分野において、物質の存在及びその量を分析することは有益な情報をもたらす。分析にはそれぞれの分析対象となる物質を基質とし、かつ基質に対する特異性の高い酵素を用いた酵素分析法が広く用いられている。
【０００３】
酵素分析法においては、分析対象である基質に対する酵素の親和性が測定可能範囲に大きな影響を与える。例えば、生体試料中の物質濃度は、測定対象範囲が非常に広い場合があり、生体中のＢＵＮ濃度は数ｍｇ／ｄＬから４００ｍｇ／ｄＬまでの非常に広い範囲に及ぶことが知られている。このように必要な定量濃度域が広い場合、測定範囲は酵素の親和性により限定される。また、食品中の尿素と生体中の尿素濃度は１オーダー異なるが、両者を同一の酵素、同一の反応系で測定することは困難である。
【０００４】
酵素反応は、一般にＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式に従い、基質濃度に対して酵素反応速度が飽和曲線を描くことが知られている。したがって、正確に基質量を定量するためには酵素の基質に対するＫｍ値が基質濃度よりも十分に大きく、測定値と直線関係をとるように対象試料を調整する必要がある。
【０００５】
例えば、試料中の基質の濃度が酵素のＫｍ値よりも大きい場合には、反応系における基質濃度を低くするために試料を高倍率で希釈を行う。また、基質と酵素の親和性を直接抑制し、Ｋｍ値そのものを適当な値に調節する手段として、拮抗阻害剤としてホウ酸を使用するといった方法が用いられる（例えば、特許文献１、２、３参照）。
【０００６】
しかしこれら方法では、希釈の精度が最終測定値に与える影響や、阻害剤の毒性・環境汚染の問題が無視できないこと、試料中に阻害剤と相互作用を持つ成分が含まれた場合に酵素の阻害作用が弱まり、測定値が上昇するという問題があった。
【０００７】
そのため、同じ基質を認識しＫｍ値の異なる変異酵素を用いるという報告がある。特許文献４では、Ｋｍが大きくなるように改変した微生物由来の変異ウレアーゼについての報告、また、特許文献５では、グルコースに対するＫｍ値が大きい新規な脱水素酵素について報告されている。これら酵素を用いることで高濃度基質を含む試料であっても希釈や拮抗阻害剤添加を行わずに測定することができ、測定可能範囲の上限を上げられることが示されている。
【０００８】
また、特許文献６では、同一の基質を認識するＫｍの異なる２種の酵素を混合することにより、測定範囲を拡大し、必要な濃度域での定量を実現する手法を報告している。
【特許文献１】特開昭５９−１５１９００号公報
【特許文献２】特公平３−６５１６０号公報
【特許文献３】特開２０００−２６２２９９号公報
【特許文献４】特開２０００−４１６９９号公報
【特許文献５】特開２００５−２７８５９７号公報
【特許文献６】特開平１１−２５３１９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、前記従来の試みは測定可能範囲の上限を引き上げる代わりに、基質が低濃度である場合には感度低下を引き起こしてしまうという課題を有していた。
【００１０】
本発明は前記従来の問題を解決するためになされたもので、低濃度から高濃度までの広い範囲において、基質濃度を正確に計測することを可能とする測定手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記従来の課題を解決するために、本発明は、複数種の酵素を用いて、液体試料中の基質濃度を定量する方法であって前記基質濃度の概略値を測定する工程、前記基質濃度の概略値に基づいて、前記複数種の酵素から１種を選択する工程、選択された酵素を用いて、液体試料中の基質濃度を定量する工程、からなることを特徴とする。
【００１２】
また本発明は、前記複数種の酵素が、同一物質を基質とし、かつ異なる親和性を示すことを特徴とし、さらに前記親和性が、酵素のＫｍ値であることを特徴とする。
【００１３】
さらに本発明は前記基質濃度の概略値を測定する工程が、酵素反応測定であることを特徴とする。
【００１４】
さらに本発明は、前記基質濃度の概略値を測定する工程が、同一物質を基質とし、かつ異なる親和性を示す複数種の酵素を用いた酵素反応測定であることを特徴とする。
【００１５】
また本発明は、前記基質濃度の概略値に基づいて、前記複数種の酵素から１種を選択する工程において、前記液体試料中の基質濃度の概略値が低い場合には、Ｋｍ値が小さな酵素を選択し、かつ前記液体試料中の基質濃度の概略値が高い場合には、Ｋｍ値が大きな酵素を選択することを特徴とする。
【００１６】
さらに本発明は、前記基質濃度を定量する工程が、レートアッセイ法であることを特徴とする。
【００１７】
さらに本発明は、前記基質濃度を定量する工程が、エンドポイント法であることを特徴とする。
【００１８】
さらに本発明は、前記基質濃度を定量する工程が、前記基質濃度の概略値が低い場合には、エンドポイント法であり、前記基質濃度の概略値が高い場合には、レートアッセイ法であることを特徴とする。
【００１９】
また本発明は、液体試料中の基質濃度を酵素を用いて定量する液体試料分析用センサであって、同一物質を基質とし、かつ異なる親和性を示す複数種の酵素が、固定もしくは担持されていることを特徴とする。
【００２０】
また本発明は、液体試料中の基質濃度を酵素を用いて定量する液体試料分析用センサであって、前記基質濃度の概略値を測定する領域、同一物質を基質とし、かつ異なる親和性を示す複数種の酵素を用いて、前記基質濃度を正確に定量する領域からなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は基質を同じくし、異なる親和性（Ｋｍ値）を示す複数種の酵素を用いて、基質濃度に対応し最適な感度で定量できる酵素を選択することで広範囲の基質濃度を定量する酵素分析手法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の実施には、Ｋｍが１０倍以上異なり同一基質を認識する２種以上の酵素を用いることができる。自然界には、同じ基質を認識しＫｍの異なる酵素があることが知られており、例えばストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）由来コレステロールオキシダーゼと微生物由来コレステロールオキシダーゼ、アシネトバリラス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来のクレアチンアミドハイドロラーゼと微生物由来のクレアチンアミドハイドロラーゼ、アスベルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来グルコースオキシダーゼと微生物由来グルコース脱水素酵素、アエロコッカス  ビリダンス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）由来乳酸酸化酵素とＰｉｇ  Ｈｅａｒｔ由来乳酸脱水素酵素などがある。
【００２３】
また、部位特異的変異法により改変されたＫｍ値の異なる変異酵素が報告されており、例えば微生物由来の変異ウレアーゼ（ｒＵｒｅａｓｅ、オリエンタル酵母（株））とＪａｃｋ  ｂｅａｎ由来のウレアーゼではＫｍが１０倍以上異なる。
【００２４】
本発明ではこれら酵素に限ることなく、同一基質を認識するＫｍの異なる酵素であれば、天然の酵素であっても、人工的に変異導入を行った酵素をであっても用いることができ、また、組み合わせて用いることもできる。
【００２５】
本発明の実施の形態について図１を用いて詳細を説明する。
【００２６】
（実施の形態１）
まず最初に、Ｋｍの異なる２種以上の酵素をそれぞれ含む分析溶液に液体試料を加え（ＳＴＥＰ１）、液体試料中の基質濃度について、概略値を測定する（ＳＴＥＰ２）。
【００２７】
概略値の測定方法については制限されるものではなく、一般的に知られている酵素反応測定法を用いることができるが、上記Ｋｍの異なる２種以上の酵素による反応初期の酵素反応量を測定することによっても測定できる。この場合、測定開始直後の吸光度から１分後の吸光度を差し引いた値、反応開始直後数秒間の吸光度変化、反応開始から一定時間後の数秒間の吸光度変化、反応開始後のある時間での吸光度、等が利用できる。
【００２８】
Ｋｍの異なる２種以上の酵素を用いて測定したそれぞれの概略値を比較し、液体試料中の基質濃度の概略値が低い場合には、Ｋｍ値が小さな酵素を選択し、液体試料中の基質濃度の概略値が高い場合には、Ｋｍ値が大きな酵素を選択する（ＳＴＥＰ３）。
【００２９】
選択した酵素を用い、試料中の基質濃度を測定する（ＳＴＥＰ４）。この時、測定方法については制限されるものではなく、選択した酵素に適した手法を用いることができる。例えば、Ｋｍの小さな酵素の場合にはエンドポイント法、Ｋｍの大きな酵素の場合にはレートアッセイ法とすることができる。
【００３０】
（実施の形態２）
また、本発明による液体試料の分析手法を備えた液体試料分析用センサの実施の形態を図２を用いて詳細を説明する。
【００３１】
試料分析センサ基板３は試料添加部１と２つ以上の酵素担持部５と概略値測定部７と基質濃度測定部８とを持ち、それぞれの部位が流路２によって連結された構造を持つ。液体試料は流路２を通って、試料添加部１、酵素担持部５、概略値測定部７および基質濃度測定部８を移動していく。移動手段については特に限定されるものではなく、シリンジポンプやプランジャーポンプ等ポンプを利用した方法、毛細管力を利用した方法、遠心力を利用した方法、等を用いることが可能である。
【００３２】
試料分析センサ基板３には、ポリエチレンやポリエチレンテレフタレートなどのプラスチック素材、ガラス素材など一般的素材を用いることができる。酵素担持部５にはそれぞれ、同一物質を基質とし、異なる親和性を示す複数種の酵素の内の１種が含まれる。概略値測定部７及び基質濃度測定部８では光学的な酵素反応測定を行う。ここでの検出は光学的手法に限られるものではなく、電気化学的な手法など酵素反応測定を可能とするすべての手法が利用可能である。
【００３３】
液体試料を試料添加部１に添加し、流路２を通して複数の試薬担持部５に分配する。酵素担持部５において試料とＫｍの異なるそれぞれの酵素を混合し、概略値測定部７において液体試料中の基質濃度についての概略値を測定する。
【００３４】
概略値を比較し、液体試料中の基質濃度の概略値が低い場合には、Ｋｍ値が小さな酵素を担持した酵素担持部５を選択し、液体試料中の基質濃度の概略値が高い場合には、Ｋｍ値が大きな酵素を担持した酵素担持部５を選択する。その後試料を酵素担持部５から基質濃度測定部８へ移送し、基質濃度測定部８において基質濃度測定を行う。また、基質濃度測定部８は概略値測定部７は同一の測定部位を用いることもでき、またそれらの設置箇所は、試薬担持部５と同一反応層の内であっても外であっても構わない。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明の液体試料の分析手法について、さらに具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００３６】
（実施例１）
以下、本発明の一実施の形態に係る液体試料の分析手法を用いて、液体試料中の尿素濃度の測定を行った実施例について説明する。
【００３７】
まず、尿素測定試薬として、下記試薬Ａと試薬Ｂを調整した。ただし、試薬Ａ及び試薬Ｂに標記した濃度は、試料混合後の終濃度である。
【００３８】
〔試薬Ａ〕
ウレアーゼ（Ｊａｃｋ  ｂｅａｎ由来）  ０．５Ｕ／ｍｌ
グルタミン酸脱水素酵素（セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）由来）  ２．５Ｕ／ｍＬ
α―ケトグルタル酸  ２．５ｍＭ
ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）
〔試薬Ｂ〕
ウレアーゼ（微生物由来変異酵素：オリエンタル酵母（株））  ０．５Ｕ／ｍｌ
グルタミン酸脱水素酵素（（セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）由来）  ２．５Ｕ／ｍＬ
α―ケトグルタル酸  ２．５ｍＭ
ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
次に、試薬Ａまたは試薬Ｂ９００μＬを３７℃で加温し、試料として尿素標準液を終濃度がそれぞれ０．１、１、１０、２０、５０、７０ｍＭとなるように１００μＬ添加した。混和後、３７℃で加温しながら一定時間、純水を対照に３４０ｎｍの吸光度を分光光度計を用いて測定した。ここで、測定開始直後の吸光度から１分後の吸光度を差し引いた値を算出し、ΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）とした。
【００３９】
一方、反応開始１分経過後に得られる吸光度変化の傾きを、ΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｓａｍｐｌｅ）とした。また、対照として純水を用いて、同様に得られた吸光度変化の傾きをΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｂｌａｎｋ）とした。最後に、（式１）に従ってΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｔｅｓｔ）を算出した。
（式１）
ΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｔｅｓｔ）＝  ΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｓａｍｐｌｅ）−  ΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｂｌａｎｋ）〕
このようにして算出されたΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｔｅｓｔ）を尿素濃度に対してプロットしたグラフを図４に示す。また、図４の尿素低濃度域を拡大したグラフを図５に示す。
【００４０】
本発明の実施例１における尿素濃度に対するΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）の（表１）に記載する。
【００４１】
（表１）においてΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）がＡＢ両方、もしくは一方でマイナス値となる０．１ｍＭ及び１ｍＭ尿素の時は、図５より試薬Ｂでは反応が非常に小さいため尿素濃度に依存は見られないのに対して、試薬Ａでは濃度依存的な応答が得られた。一方、表１においてΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）がＡＢ共にプラス値となる１０ｍＭ以上の尿素の時は、図４より試薬Ａにおいて飽和反応が見られる一方で、試薬Ｂでは尿素濃度に依存した応答が得られた。
【００４２】
【表１】
2008022728.tif 000003
【００４３】
以上のように、尿素濃度の概略値の指標となるΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）を基準として、０．１ｍＭ及び１ｍＭ尿素の時には試薬Ａでの反応を選択し、１０ｍＭ以上の尿素の時は試薬Ｂでの反応を選択することになり、より感度の高い手法を選択することができ、測定可能濃度範囲を広げることができた。
【００４４】
（実施例２）
以下、本発明の一実施の形態に係る液体試料分析用センサを用いて、液体試料中の尿素濃度の測定を行った実施例について説明する。
【００４５】
まず、ポリエチレンテレフタラート基板を加工して、図２に示す液体試料分析用センサを作製した。
【００４６】
次に、尿素測定試薬として、下記試薬Ａと試薬Ｂを調整し、図２の試薬担持部５のそれぞれに各々を滴下、乾燥を行った。試薬Ａ及び試薬Ｂに標記した濃度は、試料混合後の終濃度である。
【００４７】
〔試薬Ａ〕
ウレアーゼ（Ｊａｃｋ  ｂｅａｎ由来）  ０．５Ｕ／ｍｌ
グルタミン酸脱水素酵素（（セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）由来）  ２．５Ｕ／ｍＬ
α―ケトグルタル酸  ２．５ｍＭ
ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）
〔試薬Ｂ〕
ウレアーゼ（微生物由来変異酵素：オリエンタル酵母（株））  ０．５Ｕ／ｍｌ
グルタミン酸脱水素酵素（（セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）由来）  ２．５Ｕ／ｍＬ
α―ケトグルタル酸  ２．５ｍＭ
ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
試料として０．１、１、１０、２０、５０、７０ｍＭの尿素標準液を用い、試料点着部１に滴下後、シリンジポンプを用いて移動させて、酵素担持部５で前記試薬Ａの乾燥体、前記試薬Ｂの乾燥体とそれぞれと混合した。それぞれの溶解液をさらに移動させて、概略値測定部７と基質濃度測定部８でそれぞれ３４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４８】
試料中の基質濃度の概略値を、測定開始直後の吸光度から１分後の吸光度を差し引いた値から算出し、ΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）とした。一方、反応開始１分経過後に得られた吸光度変化の傾きを、ΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｔｅｓｔ）とした。
【００４９】
このようにして算出されたΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）とΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｔｅｓｔ）の値を比較すると、両者の関係は実施例１と同様であり、尿素濃度の概略値の指標となるΔＡｂｓ／ｍｉｎ（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）を基準として、より感度の高い手法を選択することができ、測定可能濃度範囲を広げることができた。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
以上のように、本発明は、液体試料中の化学物質の分析、特に酵素を用いて液体試料中の基質濃度を測定する分析手法およびセンサに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の液体分析手法の概念ブロック図
【図２】本発明の液体試料分析用センサ図
【図３】本発明の実施例における酵素反応スキームを示す図
【図４】本発明の実施例１における反応曲線を示す図
【図５】本発明の実施例１における反応曲線（低濃度域）を示す図
【符号の説明】
【００５２】
１    試料添加部
２    流路
３    試料分析センサ基板
５    酵素担持部
７    概略値測定部
８    基質濃度測定部
【図１】
2008022728.tif 000004
【図２】
2008022728.tif 000005
【図３】
2008022728.tif 000006
【図４】
2008022728.tif 000007
【図５】
2008022728.tif 000008