(57)【要約】【課題】（ａ）ニンジン又はその抽出物及びそれ以外の生薬を含有する医薬製剤中のニンジン由来のギンセノシドの含有量を、他の生薬の成分によって妨害されることなく確認する方法の提供。【解決手段】（ａ）ニンジン又はその抽出物並びに（ｂ）チョウジ、ウコン、ショウキョウ、カンゾウ、ウイキョウ及びそれらの抽出物から選ばれる１種以上の生薬を含有する医薬製剤と、水及び酢酸エチルを含有する溶液とを混合処理し、次いで該混合処理液の水層を分取し、分取した水層を液体クロマトグラフ法で測定することを特徴とする当該医薬製剤に含まれるギンセノシドの確認方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ニンジン又はその抽出物並びに（ｂ）チョウジ、ウコン、ショウキョウ、カンゾウ、ウイキョウ及びそれらの抽出物から選ばれる１種以上の生薬を含有する医薬製剤と、水及び酢酸エチルを含有する溶液とを混合処理し、次いで該混合処理液の水層を分取し、分取した水層を液体クロマトグラフ法で測定することを特徴とする当該医薬製剤に含まれるギンセノシドの確認方法。
【請求項２】
医薬製剤に、水を加えて混合処理し、次いで酢酸エチルを加えて混合処理する請求項１記載のギンセノシドの確認方法。
【請求項３】
分取した水層に、更に１−ブタノールを加えて混合処理し、次いで該混合処理液の１−ブタノール層を分取後、留去し、水・メタノール混液を加えて測定する請求項１又は２記載のギンセノシドの確認方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニンジン又はその抽出物及びその他の生薬を含有する医薬製剤に含まれるギンセノシドを確認する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニンジン（人参：Ginseng Radix）は、体内の新陳代謝機能の増進や内分泌の促進、精神安定作用、中枢興奮作用などを有する活性成分を含有するウコギ科の植物である。ニンジン及びその抽出物は、前記の薬効を期待する医薬品または漢方処方用薬として広く用いられている。
【０００３】
ニンジン中の活性成分は多種多様であって、その中でギンセノシドRb1、ギンセノシドR0、Ra〜Rh及びギンセノシドRg1等のサポニン類が挙げられる。そのため、ニンジン又はその抽出物中の活性成分含有量を確認する場合には、例えばギンセノシドRb1やギンセノシドRg1等のギンセノシドを指標にして高速液体クロマトグラフ法で定量する確認方法（非特許文献１）が用いられている。
【非特許文献１】第１５改正日本薬局方
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ニンジンを配合する医薬製剤には、他の薬効成分も配合されることが多い。ニンジン又はその抽出物に単一成分を配合した医薬製剤の混合には、従来の確認方法でギンセノシドが確認できる。一方、最近の医薬製剤は複数の生薬を組み合わせて配合されることが多く、ニンジン又はその抽出物に更に他の生薬が配合されることが多い。
【０００５】
本発明者は、ニンジンエキス及びチョウジ、ウコン、ショウキョウ、カンゾウエキス、ウイキョウ等のニンジン以外の生薬を含有する医薬製剤を第１５改正日本薬局方に準じ、高速液体クロマトグラフ法でニンジンの指標となるギンセノシドを定量すると、医薬製剤中に配合されているニンジン以外の生薬によってギンセノシドのピークを妨害するピークが発生し、医薬製剤中のニンジンの配合量の確認を行うことが極めて困難であることが判明した。
【０００６】
従って、本発明の目的は、（ａ）ニンジン又はその抽出物並びに（ｂ）チョウジ、ウコン、ショウキョウ、カンゾウ、ウイキョウ及びそれらの抽出物から選ばれる１種以上の生薬を含有する医薬製剤中に含まれるギンセノシドを、チョウジ、ウコン、ショウキョウ、カンゾウ、ウイキョウ又はその抽出物によって妨害されることなく液体クロマトグラフ法で確認する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者は、ニンジンエキス及びこれら５つの生薬を含有する医薬製剤中のギンセノシドを迅速に、高感度に、正確に検出できる方法を鋭意検討したところ、該医薬製剤を水及び酢酸エチルで処理した後、水層を分取し、該水層を測定検体溶液として液体クロマトグラフ法で測定すると、ニンジン由来のギンセノシドが、他の生薬成分による妨害を受けずに、迅速に、高感度に、正確に確認できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
また、医薬製剤中のニンジンエキスの配合量が少ない場合でも、該水層に、さらに１−ブタノールを加えて１−ブタノール層を分取した後、留去し、水とメタノールの混液を加えて該水・メタノール混液を測定検体溶液とすることで液体クロマトグラフ法でニンジン由来のギンセノシドを良好に確認できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、（ａ）ニンジン又はその抽出物並びに（ｂ）チョウジ、ウコン、ショウキョウ、カンゾウ、ウイキョウ及びそれらの抽出物から選ばれる１種以上の生薬を含有する医薬製剤と、水及び酢酸エチルを含有する溶液とを混合処理し、次いで該混合処理液の水層を分取し、分取した水層を液体クロマトグラフ法で測定することを特徴とする医薬製剤に含まれるギンセノシドの確認方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
ニンジン又はその抽出物並びにチョウジ、ウコン、ショウキョウ、カンゾウ、ウイキョウ及びそれらの抽出物から選ばれる１種以上の生薬を含有する医薬製剤に含まれるニンジン由来のギンセノシドを、共存するチョウジ、ウコン、ショウキョウ、カンゾウ、ウイキョウ又はその抽出物の影響を受けて妨害されることなく、迅速に、高感度に、正確に確認することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に用いられる製剤は、（ａ）ニンジン又はその抽出物（以下、（ａ）成分ともいう。）並びに（ｂ）チョウジ、ウコン、ショウキョウ、カンゾウエキス、ウイキョウ及びそれらの抽出物から選ばれる１種以上の生薬（以下、（ｂ）成分ともいう。）を含有する医薬製剤であり、公知の製造法によって得られるものである。該医薬製剤の剤型としては、散剤、顆粒剤、錠剤、チュアブル剤、フィルムコーティング錠、糖衣錠、液剤等の各剤型が挙げられる。
【００１２】
ここで、本発明の確認方法にて確認するギンセノシドは、ニンジンの根等に含有する活性成分であり、ニンジン又はその抽出物の活性成分含有量を確認する際の指標とされるものである（非特許文献１）。斯かるギンセノシドとしては、例えば、ギンセノシドRa、ギンセノシドRb1、ギンセノシドRb2、ギンセノシドRc、ギンセノシドRd、ギンセノシドRe、ギンセノシドRf、ギンセノシドRg1、ギンセノシドRg2、ギンセノシドRh、ギンセノシドR0等が挙げられ、特にギンセノシドRb1が好ましい。
【００１３】
本発明の確認方法に用いられる医薬製剤に含まれる（ａ）ニンジン又はその抽出物は、定量精度の点で良いため、ニンジン抽出物が好ましい。
該医薬製剤に含まれるニンジンは、ギンセノシドを含む部位であればニンジンの全草又は葉、茎、芽、花、根、根茎等の何れの部位を用いてもよいが、根又は根茎が好ましい。
また、該ニンジンは、生薬として一般的に用いられる状態であればよく、そのままの他、半乾燥若しくは乾燥等したものを用いてもよく、また、適宜、細断、粉砕や粉末にしたものを用いてもよい。
該医薬製剤に含まれるニンジン抽出物は、前記ニンジンを公知の天然有機化合物の抽出に用いられる一般的な方法を用いて得ることができる。例えば、未乾燥若しくは乾燥したニンジンをそのまま又は細断若しくは粉砕し、常温又は加温で、水及び／又は親水性溶媒に浸漬若しくは攪拌等して抽出する方法等を挙げることができる。
該ニンジン抽出物に使用する水及び／又は水性溶媒は、水及び／又は炭素数１〜５のアルコール溶液が好ましく、水・エタノール混液がより好ましい。
該ニンジン抽出物は、医薬製剤の安定性や品質を確保するため、通常、溶媒を除去したニンジン乾燥エキスを使用することが好ましい。ニンジン乾燥エキスを調製する場合、凍結乾燥、減圧蒸留等の通常の溶媒除去方法が使用される。
【００１４】
（ａ）成分及び（ｂ）成分を含有する医薬製剤に含まれるニンジン又はその抽出物の配合量は、ニンジン乾燥エキス換算で０．２〜２質量％が好ましい。
【００１５】
本発明に用いられる医薬製剤に含まれるチョウジ、ウコン、ショウキョウ、カンゾウ、ウイキョウ又はその抽出物は、該医薬製剤中のギンセノシドを確認する従来の液体クロマトグラフ法での測定（非特許文献１）において、ギンセノシドのピークの妨害ピークとなり、正確な定量の妨げとなる成分である。
該医薬製剤に含まれるチョウジ、ウコン、ショウキョウ、カンゾウ又はウイキョウは、それぞれ、全草又は葉、茎、芽、花、根、根茎、種子若しくは果実等の何れの部位を用いてもよいが、それぞれ一般に生薬として使用する部位を用いることが好ましい。これらは、前記（ａ）成分のニンジンと同様に生薬として一般的に用いられる状態で用いればよい。
また、該チョウジ、ウコン、ショウキョウ、カンゾウ又はウイキョウの抽出物は、公知の天然有機化合物の抽出に用いられる一般的な方法、例えば前記（ａ）成分の抽出物の調製方法を用いて得ることができ、またそれぞれを植物乾燥エキスとしてもよい。
【００１６】
ここで、（ａ）成分及び（ｂ）成分を含有する医薬製剤中に、チョウジは０．１〜５質量％、特に０．５〜３質量％含有する場合が好ましい。また、ウコンは１〜１５質量％、特に３〜１０質量％含有する場合が好ましい。また、ショウキョウは０．１〜５質量％、特に０．５〜３質量％含有する場合が好ましい。また、カンゾウエキスは０．５〜５質量％、特に１〜３質量％含有する場合が好ましい。また、ウイキョウは１〜１５質量％、特に０．３〜８質量％含有する場合が好ましい。
【００１７】
本発明の確認方法では、（ａ）成分及び（ｂ）成分を含有する医薬製剤は、先ず水及び酢酸エチルを含有する溶液と混合処理することを要する。そして、適宜、該混合溶液に含まれる不溶物や固形物を遠心分離等で分離処理した後、該混合処理液の水層を分取し、該水層を液体クロマトグラフ法の測定検体溶液とする。
この場合、（１）先ず水と混合処理し、次いで酢酸エチルを加えて混合処理する方法、（２）先ず酢酸エチルと混合処理し、次いで水を加えて混合処理する方法、（３）水及び酢酸エチルを同時に加えて混合処理する方法の何れでもよい。混合処理としては、（ａ）成分に含まれるギンセノシドを水で抽出処理し、次いで酢酸エチル層に（ｂ）成分の妨害成分を移行させる（１）の方法が好ましい。
【００１８】
このとき、（ａ）成分及び（ｂ）成分を含有する医薬製剤中の（ａ）成分及び（ｂ）成分と水の混合比率は、質量比で（ａ）成分及び（ｂ）成分（乾燥エキス換算）：水が１：５〜１：５００、更に１：１０〜１：３００、特に１：２０〜１：１００であるのが好ましい。また、酢酸エチルとの混合比率は、質量比で（ａ）成分及び（ｂ）成分（乾燥エキス換算）：酢酸エチルが１：５〜１：５００、更に１：１０〜１：３００、特に１：２０〜１：１００であるのが好ましい。
より好ましくは、（ａ）成分に含まれるギンセノシドを良好に水に移行させるため、質量比で成分（ａ）（ニンジン乾燥エキス換算）：水が１：１０〜１：１００００、更に１：１００〜１：５０００、特に１：３００〜１：３０００であり、また、（ｂ）成分に含まれる妨害成分を良好に酢酸エチルに移行させるため、質量比で（ｂ）成分（生薬乾燥エキス換算）：酢酸エチルが１：５〜１：５０００、更に１：１０〜１：１０００、特に１：２０〜１：１００である。
【００１９】
使用する水と酢酸エチルの容量比は、水：酢酸エチルが５：１〜１：５、更に２：１〜１：２が好ましく、特に１：１であるのが好ましい。
【００２０】
（ａ）成分及び（ｂ）成分を含有する医薬製剤と水及び酢酸エチルを含有する溶液との混合処理は、その混合物を撹拌、振盪、超音波等で処理する方法で行われる。混合処理時間は、２〜１２０分、更に５〜６０分、特に１０〜３０分が好ましい。混合処理温度は、０〜６０℃、更に１０〜４０℃、特に２０〜３０℃が好ましい。
【００２１】
本発明の確認方法は、前記分取した水層中の（ｂ）成分由来の妨害成分を低減するため、更に該水層を処理してもよい。該水層に１−ブタノールを加えて混合処理し、該１−ブタノール層を分取し、濃縮乾固等により該１−ブタノール層を留去し、水・メタノール混液を加えて該水・メタノール混液を液体クロマトグラフ法の検体に供する。
使用する水と１−ブタノールの容量比は、水層に存在する（ａ）成分を１−ブタノール層に移行されることができれば、特に制限はないが、水：１−ブタノールが５：１〜１：５が好ましく、更に２：１〜１：２  が好ましく、特に１：１であるのが好ましい。
水・メタノール混液は、水：メタノールが１：９〜９：１であり、４：１が好ましい。
【００２２】
このようにして当該医薬製剤を処理した後、常法に従って液体クロマトグラフ法、特に好ましくは高速液体クロマトグラフ法で、（ａ）成分及び（ｂ）成分を含有する製剤中のギンセノシドを確認（定量）する。
【００２３】
本発明の液体クロマトグラムの定量条件は、非特許文献１に準じてギンセノシドを定量できる条件であればよい。
液体クロマトグラム法に用いるカラムの充填材は、オクタデシル化シリカゲル、オクチル化シリカゲル、フェニル化シリカゲル、ジオール化シリカゲル、アミノ化シリカゲル、シアノ化シリカゲルのシリカゲルが好ましく、このうち、オクタデシル化シリカゲルがより好ましい。
また、液体クロマトグラフ法に用いる検出器は、紫外可視分光検出器又は多波長検出器が好ましく、その測定波長は１９５〜２１０ｎｍが好ましい。
また、このときのカラム温度は、２５〜６０℃付近の一定温度が好ましく、更に４０〜６０℃付近の一定温度が好ましく、特に４５〜５５℃が好ましい。
また、このとき用いられる移動相は、アセトニトリル、メタノール、水又はその混液が用いられ，特にアセトニトリルと水の混液が好ましく、このときの流量は０．３〜  ２．０ｍＬ／ｍｉｎ  が好ましい。
【００２４】
本発明の高速液体クロマトグラフの定量条件は、前記液体クロマトグラフの定量条件を適用すればよい。例えば、高速液体クロマトグラフ用カラムは、内径約３〜５ｍｍで、長さ約５〜２５ｃｍのステンレス管に平均粒子径１．７〜７μｍの高速液体クロマトグラフ用シリカゲルを充填したものであり、このときの移動相はアセトニトリル、メタノール、水又はその混液であってその流量は、０．２〜３．０ｍＬ／ｍｉｎ、好ましくは０．３〜２．０ｍＬ／ｍｉｎであることが好ましい。
【００２５】
なお、本発明に用いられる（ａ）成分及び（ｂ）成分を含有する医薬製剤には、前記（ａ）及び（ｂ）成分の他、通常これらの製剤に使用される成分を適宜その使用目的により配合されていてもよい。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、着色剤、矯味剤等を例示することができる。賦形剤としては、乳糖、デンプン類、蔗糖、マンニトール、軽質無水ケイ酸、リン酸水素カルシウム、トウモロコシデンプン、キシリトール等が挙げられる。結合剤としては、硬化油、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン、アルファー化デンプン、ポリビニルピロリドン、プルラン等が挙げられる。崩壊剤としては、カルメロースカルシウム、クロスポビドン、カルボキシメチルスターチナトリウム等が挙げられる。着色剤としては、タール色素、三二酸化鉄等が挙げられる。矯味剤としてはl-メントール、ステビア、アスパルテーム、クエン酸、香料等が挙げられる。
【実施例】
【００２６】
以下に実施例により本発明を具体的に詳述するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００２７】
製造例１
ウイキョウ末（日本粉末薬品株式会社）１３８８．９ｇ、チョウジ末（日本粉末薬品株式会社）３４７．２ｇ、ウコン末（日本粉末薬品株式会社）２０８３．３ｇ、ショウキョウ末（日本粉末薬品株式会社）３４７．２ｇ、カンゾウエキス末（日本粉末薬品株式会社）５２０．８ｇ、ニンジン乾燥エキス（日本粉末薬品株式会社）２０１９．３ｇの生薬の他、乾燥水酸化アルミニウムゲル３１２５ｇ、合成ヒドロタルサイト３１２５ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース７０３．３ｇ、カルメロースカルシウム６１１．１ｇ、結晶セルロース１５０９ｇ、トウモロコシデンプン７７７．９ｇを高速攪拌造粒機（バーチカルグラニュレータ：パウレック社製）にて混合した。この混合物に精製水２０２０ｇとエタノール４７１０ｇとの混液を加えて練合し練合物を得た。この練合物をφ０．８mmのスクリーンを付けた押出造粒機（ペレッター：ダルトン社製）で造粒し、さらに造粒物を流動層乾燥機（フローコーター：フロイント社製）で乾燥した。乾燥物を１４メッシュのスクリーンを付けた整粒機（スピードミル：岡田精工社製）で整粒後、１６号と５０号の篩を用いて分級し、顆粒を得た。
【００２８】
製造例２
製造例１のニンジン乾燥エキスの重量２０１９．３ｇを１３８．９ｇとし、顆粒を得た。
【００２９】
製造例３
製造例１のニンジン乾燥エキスに代えてキシリトール９９０５．６gを混合し、顆粒を得た。
【００３０】
実施例１
前記製造例３の顆粒２６００ｍｇに水２０ｍＬを加えて１０分間振り混ぜた後、酢酸エチル２０ｍＬを加えて１０分間振り混ぜ、次いで遠心分離を行って水層を分取した。なお、混合処理温度は室温であった。
【００３１】
実施例２
前記製造例１の顆粒２６００ｍｇに水２０ｍＬを加えて１０分間振り混ぜた後、酢酸エチル２０ｍＬを加えて１０分間振り混ぜ、次いで遠心分離を行って水層を分取した。なお、混合処理温度は室温であった。
【００３２】
実施例３
前記製造例２の顆粒２６００ｍｇに、実施例２に準じ、水層を分取し、次いで該水層８ｍＬに１−ブタノール１０ｍＬを加えて１０分間振り混ぜた後、遠心分離を行って１−ブタノール層を分取する。１−ブタノールを減圧留去して得た残留物に、水・メタノール混液（４：１）２ｍＬを加えて振り混ぜた後、ろ過し、ろ液を液体クロマトグラフ法での測定検体溶液とした。
【００３３】
比較例１
前記製造例３の顆粒２６００ｍｇを、局方に準じて水・メタノール処理をし、液体クロマトグラフ法での測定検体溶液とした。
【００３４】
比較例２
実施例１の酢酸エチル２０ｍＬに代えて、ヘキサン２０ｍＬを用いて同様にして液体クロマトグラフ法での測定検体溶液を作成した。
【００３５】
比較例３
比較例１の酢酸エチル２０ｍＬに代えて、ジエチルエーテル２０ｍＬを用いて同様にして液体クロマトグラフ法での測定検体溶液を作成した。
【００３６】
標準溶液の作成
ギンセノシドRb1標準品１ｍｇを水／メタノール混液（４：１）に溶解し２５ｍＬとした。この溶液２ｍＬをとり、水／メタノール混液（４：１）を加えて２０ｍＬとし、標準溶液とした。
【００３７】
測定検体溶液及び標準溶液のそれぞれ５０μＬを、次の条件で液体クロマトグラフ法で測定を行った。
測定条件
検出器：多波長検出器（クロマトグラム測定波長；２０５ｎｍ）。
カラム：内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレス管に平均粒子径５μｍの液体クロマトグラフ用オクタデシルシリル化シリカゲルを充填したもの。
カラム温度：５０℃付近の一定温度。
移動相：水／アセトニトリル（１４３：５７）
流量：１．０ｍＬ／分
【００３８】
ギンセノシドRb1標品を図１に示す。
また、比較例１において、局方における水・メタノール処理によるニンジンを除く５つの生薬では、ギンセノシドRb1のピーク（約２２分）周辺に妨害するピークが認められ、ギンセノシドの定量は困難である（図２）。
【００３９】
図３に示すように、ニンジンを除く５生薬を、水・酢酸エチル処理、水・ヘキサン処理、水・エーテル処理した場合、水酢酸エチル処理において、測定検体溶液から得られた液体クロマトグラムのピークの一つは、標準溶液から得られたギンセノシドRb1のピークと同一の保持時間（約２２分）に妨害するピークを認めなかった。
これに対して、比較例２及び比較例３で調製した測定検体溶液の液体クロマトグラフ法での測定では、生薬の妨害ピークがあって、製剤中に配合されている生薬の影響を受けた（図４及び５）。
【００４０】
図６及び７において、製造例１及び２の手順において、ギンセノシドRb1のピークと同一の保持時間（約２２分）に妨害するピークを認めず、ギンセノシドを定量的に測定できた。また、ニンジンの濃度が低い場合には、１−ブタノール処理すれば容易にギンセノシドを測定できた。
【００４１】
従って、本発明のギンセノシド確認方法は、製剤中に配合されているニンジン以外の生薬の影響を受けず、高精度でニンジン乾燥エキス中のギンセノシドRb1を検出することができた。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ギンセノシドRb1標品液体クロマトグラフ法での測定結果を示す図である。
【図２】比較例１の液体クロマトグラフ法での測定結果を示す図である。
【図３】実施例１の液体クロマトグラフ法での測定結果を示す図である。
【図４】比較例２の液体クロマトグラフ法での測定結果を示す図である。
【図５】比較例３の液体クロマトグラフ法での測定結果を示す図である。
【図６】実施例２の液体クロマトグラフ法での測定結果を示す図である。
【図７】実施例３の液体クロマトグラフ法での測定結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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