(57)【要約】【課題】基板の一面に形成する流路を用いる細胞分離用の安価で試料毎に取替えが可能なチップを用いた細胞分析分離装置と、分離された細胞を汚染されること無く培養可能とする培養方法を提供すること。【解決手段】細胞を含む緩衝液を流下させる流路を備え、流路の途中で細胞を検出し、且つ、所定の条件を満足するか否かを判別して下流域で複数の流路に振り分ける。所定の条件を満足する細胞を収集する培養槽の上面には半透膜を張っておき、細胞分離中の汚染を防止する。分離の終わった段階で、所定の条件を満足する細胞を収集する培養槽に連なる流路を閉鎖するとともに、培養槽を分離装置から切り離して、所定の培地を含む培養器に入れて培養する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
該基板の一面に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、
該流路を流下する細胞の情報を流路の所定の領域で検出する細胞情報検出領域と、
前記細胞情報検出領域の下流で検出された細胞の情報に応じて該細胞を前記流路に連絡する複数の分岐流路のいずれかに流下させる細胞分離領域と、
前記複数の分岐流路の下流に設けられ、それぞれの分岐流路を流下する細胞を含む緩衝液を保持する複数の培養槽と、
を備え、
前記細胞情報検出領域で検出された細胞の情報が所定の条件を満足するものであるときに前記細胞分離領域で該所定の条件を満足する細胞が流下させられる分岐流路の下流に設けられた培養槽の上面には該培養槽内に細菌等の流入を防止するための半透膜が設けられたことを特徴とする細胞分離培養チップ。
【請求項２】
前記基板が金型による射出成型で作成されたプラスチック基板であり、前記流路が前記プラスチック基板の一面に作成された溝とこれを覆うラミネートフィルムで形成された請求項１記載の細胞分離培養チップ。
【請求項３】
前記細胞情報検出領域で検出する細胞の情報が細胞の画像情報から得られるものである請求項１記載の細胞分離培養チップ。
【請求項４】
前記流路を緩衝液とともに流下する細胞がアプタマーを介して所定の蛍光材料によって修飾されたものであり、情報検出領域で検出する細胞の情報が細胞を修飾している蛍光材料による蛍光の輝度情報から得られるものである請求項１記載の細胞分離培養チップ。
【請求項５】
前記流路を緩衝液とともに流下する細胞がアプタマーを介して所定の金粒子またはナノ粒子によって修飾されたものであり、情報検出領域で検出する細胞の情報が細胞を修飾している金粒子またはナノ粒子による散乱光情報から得られるものである請求項１記載の細胞分離培養チップ。
【請求項６】
前記細胞分離領域は、前記流路を細胞が緩衝液とともに流下する流路の両側に対向し、かつ、緩衝液の流れに対して位置をずらして配置された電解質を含むゲルからなる複数のゲル電極の開口部が設けられ、前記細胞分離領域において複数のゲル電極間に所定の電流を流した場合と流さない場合に応じて、細胞が前記細胞分離領域で複数の分岐流路のいずれかに分配される請求項１記載の細胞分離培養チップ。
【請求項７】
前記半透膜は前記アプタマーを分解するためのリボザイムが通過できる大きさの穴を有するものである請求項４記載の細胞分離培養チップ。
【請求項８】
前記培養槽の内部の底面が塗布されたコラーゲン、ポリリジン、あるいは、フィブロネクチンの層で覆われ、あるいは、これらの塗布に代えて、疎水性処理されている請求項１記載の細胞分離培養チップ。
【請求項９】
基板と、該基板の一面に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路を流下する細胞の情報を流路の所定の領域で検出する細胞情報検出領域と、前記細胞情報検出領域の下流で検出された細胞の情報に応じて該細胞を前記流路に連絡する複数の分岐流路のいずれかに流下させる細胞分離領域と、前記複数の分岐流路の下流に設けられ、それぞれの流路を流下する細胞を含む緩衝液を保持する複数の培養槽と、を備えた細胞分離培養チップにより、前記細胞情報検出領域で検出された細胞の情報が所定の条件を満足するものであるときに前記細胞分離領域で該所定の条件を満足する細胞が流下させられる一つの分岐流路の下流に設けられた上面に細菌等の流入を防止するための半透膜が設けられた培養槽に前記所定の条件を満足する細胞を収集すること、
前記培養槽に前記所定の条件を満足する細胞を収集した後、前記培養槽と連通する流路を閉鎖するとともに前記培養槽を前記細胞分離培養チップから分離すること、
前記培養槽を所定の培地を有する培養器に入れて前記培養槽に収集された細胞を培養すること、
を特徴とする細胞培養方法。
【請求項１０】
前記培養槽の前記細胞分離培養チップからの分離は、前記培養槽を含む領域を基板ごと熱的に分離するものである請求項９記載の細胞培養方法。
【請求項１１】
前記培養槽の内部の底面が塗布されたコラーゲン、ポリリジン、あるいは、フィブロネクチンの層で覆われ、あるいは、これらの塗布に代えて、疎水性処理されている細胞分離培養チップを使用する請求項９記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離培養装置およびこれを使用した細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物における生体組織は種々細胞が役割を分担して全体として調和の取れた機能を維持している。あるいは、細胞の一部ががん化（ここでは腫瘍も含め、一括してがんと呼ぶことにする）すると、周辺領域と異なる新生物となるが、がん領域とそこから遠く離れた正常組織部分とはある境界を持って必ずしも区切れるものではなく、がん周辺領域も何らかの影響を受けている。したがって、臓器組織における機能を解析するには狭い領域に存在する少数の細胞を分離する必要がある。
【０００３】
再生医療の分野では、組織の中から幹細胞を分離し、これを培養して分化誘導し目的の組織、ひいては臓器を再生しようとする試みがなされている。
【０００４】
細胞を識別したり分離したりしようとすると、何らかの指標に従い区別する必要がある。一般に細胞の区別には、
１）目視による形態学的な細胞分類：たとえば尿中に出現する異型細胞検査による膀胱がんや尿道のがんなどの検査や血中の異型細胞分類、組織中における細胞診によるがん検査などをあげることができる、
２）蛍光抗体法による細胞表面抗原（マーカー）染色による細胞分類：一般にＣＤマーカと呼ばれる細胞表面抗原を、それに特異的な蛍光標識抗体で染色するもので、セルソーターによる細胞分離やフローサイトメーターや組織染色によるがん検査などに用いられている。もちろんこれらは、医療面のみならず、細胞生理研究用や、工業的な細胞利用の上でも多用されている。
３）あるいは、幹細胞の分離に関しては、細胞内に取り込まれる形の蛍光色素をレポーターとして幹細胞を含む細胞を大まかに分離し、更にその後で実際に培養を行うことで目的の幹細胞を分離する例がある。これは、幹細胞の有効なマーカーがまだ確立されていないので、実際に培養し、分化誘導したもののみを利用することで、実質的に目的細胞を分離しているのである。
【０００５】
このように培養液中の特定の細胞を分離し回収することは生物学・医学的な分析においては重要な技術である。細胞の比重の違いで細胞を分離する場合には速度沈降法によって分離することができる。しかし、未感作の細胞と感作した細胞とを見分けるような、細胞の比重の違いがほとんど無い場合には、蛍光抗体で染色した情報あるいは目視の情報を基に細胞を１つ１つ分離する必要がある。
【０００６】
この技術については、例えば、セルソーターがある。セルソーターは、蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収する技術である（非特許文献１：Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)）。
【０００７】
しかし、この技術は高価であること、装置が大型であること、数千ボルトという高電界が必要であること、試料が多量に必要であること、液滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、直接試料を観察できないことなどの問題がある。これらの問題を解決するため、近年、マイクロ加工技術を用いて微細な流路を作成し、流路内の層流中を流れる細胞を直接顕微鏡観察しながら分離するセルソーターが開発されている（非特許文献２：Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998)；Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)）。しかし、このマイクロ加工技術を用いて作成するセルソーターでは観察手段に対する試料分離の応答速度が遅く、実用化するためには、試料に損傷を与えず、かつ、より応答の速い処理方法が必要であった。
【０００８】
本発明者らは、このような問題点を解消するため、マイクロ加工技術を活用して、試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画し、回収する試料に損傷を与えることなく、簡便に細胞試料を分析分離することのできる細胞分析分離装置を出願している（特開２００３−１０７０９９、特開２００４−８５３２３、ＷＯ２００４／１０１７３１）。これは実験室レベルでは十分に実用的なセルソーターであるが、汎用的に使用するには、液搬送法や回収法、試料調製について新たな技術開発が必要である。
【０００９】
【非特許文献１】Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)
【非特許文献２】Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998)；Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)
【特許文献１】特開２００３−１０７０９９号公報
【特許文献２】特開２００４−８５３２３号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／１０１７３１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、基板の一面に形成する流路を用いる細胞分離あるいは検出用に、確実に所定の細胞の検出及び分離を行うことのできる細胞分離培養チップおよび細胞分離培養技術を確立し、安価で試料毎に取替えが可能なチップを用いた細胞分析分離培養装置を提供することを目的とする。さらに、分離された細胞を汚染を受けることなく培養過程に移行できる培養方法を提供する。
【００１１】
基板の一面にマイクロ流路を作成して液を流すと、一般的にはその中を流れる液は層流になる。一見すると、流路の断面積方向には液流速分布が無い様に錯覚するが、実際にこのようなマイクロ流路中に細胞懸濁液を流すと、細胞が流路内の壁に接触する現象が頻発する。壁に接触した細胞は流れに逆らう抵抗を受けることになるため流速が低下し、後方を流れてくる細胞と接触したりする。セルソーターやフローサイトメーターにおいてこのような現象が起きると、細胞の分離検出が困難になる。一般的にこのような現象を防止するにはシースフロー技術が用いられる。これは高速に流れる液流を鞘としてそのコア部分に細胞懸濁液を流し込むことで細胞を一列に整列させる技術で、鞘となるシース流とコア流を合体させた後、空気中にジェット流として流し出すことで達成される。この従来法ではそもそも壁が無いので細胞が壁に接触する現象の無い理想的な状態で細胞を分離することができる。
【００１２】
しかし、シースを用いたジェット流を安定に形成するのは非常に難しく、実用的な装置はきわめて高価であり、シース形成用のセルは試料ごとに取り替えることができない。大型の装置に限らずチップ上に形成したセルソーターに関しても、本願の発明者らが開示している方法以外の従来の技術では、もれなく試料液搬送とシース液搬送のために独立したポンプを用いている。これらのポンプはチップとは別に配置され、チップを交換するごとに繋ぎ換える必要がある。また、チップ交換に伴う試料送液速度とシース送液のバランス変動を調整し直す必要がある。このような厳密な制御を行うため、大掛かりな高安定なポンプが必要である。
【００１３】
セルソーターをチップ上に構築するわけであるから、送液部分および分離した細胞の培養槽もチップ上に形成し、光学系以外の機能はチップのみでクローズドで行うことで使い勝手を改善し、低価格を実現することが重要な課題である。クローズドにすることで、セルソーターチップをサンプルごとの使い切りにする新たな使い方が発生する。たとえば、幹細胞の分離や臨床検査には、他の検体組織由来細胞のコンタミネーション防止が必須であるが、セルソーターチップを一回のみの使い切りにすることでコンタミネーションを考慮する必要が無くなる。このように、セルソーターの主要部分をチップ化することで、装置の小型化、低コスト化、試料ごとのチップ交換によるクロスコンタミネーションの完全な防止などが可能になり、医療分野、特に再生医療分野で必須なクロスコンタミネーションの無い細胞分離培養システムを構築するとともに、これを利用してコンタミネーションの無い細胞培養方法を提案することが本発明の目的である。
【００１４】
チップ状のセルソーターを実現する上で重要な技術的な事項に微細流路内を流れてくる細胞の分離機構がある。分離機構には色々のものが提案されている。たとえば、超音波、磁界、バルブによる流路切り替え、レーザーピンセット、高周波電界、直流電界で細胞を任意の方向に移動させる機構を挙げることができる。このうち、細胞にダメージを与えずに、再現よく、特別な装置を用いずにできるのは低電圧の直流電界を用いる方法である。ところが直流電界を用いて高速な細胞分離を行うとき、通常の金属電極を用いると緩衝液の電気分解が起き、安定して長時間の使用ができない問題がある。最も実用化に近い方法がＷＯ２００４／１０１７３１に記載されている。
【００１５】
ＷＯ２００４／１０１７３１に示されているマイクロ加工技術を用いて作成した量産可能なセルソーターチップでは、電気分解の影響をある程度防ぐために、細胞を分離する機構としてゲル電極を用いて細胞が流れる流路内に直流電界をかけて、電気泳動的に細胞を振り分けている。ゲル電極としては電解質を含むアガロースゲルなどを用いている。細胞の流れる流路近傍は細孔を介したゲルがあるのみなので、気泡発生の影響を所定時間防止することができるが、不十分である。またゲルは、電解質緩衝液を含む状態で供給保存する必要があるために、乾燥に弱く長期保存に適さない問題がある。さらに長期保存を行うために凍結保存しようとすると、ゲルが凍害を受けて破壊されるため、凍結保存はできない。
【００１６】
したがって、電界を掛けている最中の気泡の発生を防止し、保存時に乾燥や凍結に耐性のあるゲル電極を提供し、真の意味での検体ごとの使いきり型セルソーターチップとすることは有用である。
【００１７】
基板の一面に形成する流路を用いて細胞分離を行おうとすると、流路中の特定領域に細胞認識を行う部位を設け、何らかの手段で細胞を認識するアルゴリズムが必要となる。また、細胞分離を行うセルソーターとして使用しようとすると、細胞検出部の下流に分離部を設ける必要がある。一般的に、細胞検出には以下の３つの方法が存在する。
１）レーザーなどを流路上の検出部に照射し、細胞が横切るときの散乱光や細胞を蛍光染色できる場合はその蛍光を検出する、
２）検出部に電極を設け、細胞が電極を横切るときのインピーダンスやコンダクタンスの変化を検出する、
３）ＣＣＤカメラなどを用い、細胞を画像として検出する。
【００１８】
ここで、１）の方法では細胞認識は実質的に一点で行われ、細胞が連続して高速に流れてきたときでも高速な処理が可能であるので、細胞を液滴に封じ込めることで一定速度で検出部と分離部の間を移動させる技術を用いた大型のセルソーターに使用されている。
２）の方法はやはり高速な処理が可能であるが、検出後の細胞の移動速度が測定できないことと、分取機構と組み合わせるのが難しいため、一般的には細胞分類に用いるフローサイトメーターに採用されている。
３）の方法は、一見、簡便のようであるが、流路中を常に移動する複数の細胞を取り扱う必要があるので、セルソーターでは画像処理の負荷が大きくなるため一般的には用いられていない。
【００１９】
しかし、基板の一面の狭い範囲に組み込んだ流路において、同様の細胞認識とそれに続く細胞分離を行おうとすると、種々問題が新たに発生する。まず、流路中を流れる細胞の移動速度はすべての細胞で同じではなく、細胞の形状や大きさ、流路の中心を流れるか壁近傍を流れるかなどの要因でまちまちとなる。このため、特に細胞を認識した後にその下流で細胞を分離するまでの時間にばらつきが発生する。次に、同じく細胞の移動速度がまちまちであるため、ある細胞が他の細胞を流路内で追い抜くといった現象も見られる。このため、細胞を１点で観察する上記１）や２）の方法では各細胞を確実に分離する必要がある場合の解決すべき問題となる。さらに、ＣＣＤカメラなどを用い、細胞を画像として検出することで流路中を連続して高速で流れてくる細胞を識別して、必要な細胞をより分けるためのアルゴリズムが必要である。
【００２０】
このように、本発明では、チップ上に細胞分離培養装置ないしフローサイトメーターを構築する上での具体的アーキテクチャーとして、特に、細胞用流路の形状と細胞懸濁液搬送部分の構造、長期保存に耐えて流通経路にのりうる電極部分の構造、分離アルゴリズム、試料としての組織断片や細胞塊からの細胞計測および分離培養チップを提案する。
【００２１】
さらに、分離培養チップで収集された細胞を汚染を受けることなく、培養過程に移行させることのできる培養方法を提案する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明で想定している細胞は、小さいものではバクテリア、大きいものでは動物細胞でがん細胞のようなものである。したがって、細胞サイズとしては０．５μｍから３０μｍ程度の範囲となる。細胞分離を基板の一面に組み込んだ流路を用いて行おうとすると、まず問題になるのが流路幅（断面形状）である。また、流路は基板表面の一つに基板の厚み方向で１０〜１００μｍ内外のスペースに実質２次元平面状に作成することとなる。細胞の大きさからしてバクテリア用では５〜１０μｍ、動物細胞用では１０から５０μｍが適当なサイズとなる。前記したように、まず細胞が壁に接触するのを防ぐ必要がある。細胞懸濁液が流れる流路の両側面から別の液を側流として流し込み、細胞が壁に接触しないようにする。このような液の合流方法を検討した結果、液の合流前の細胞懸濁液を流す流路の幅（実質的に断面積）と合流後の流路の幅がほぼ等しく、前記両側から合流する流路の流路長が等しいときに最も効果が得られることがわかった。合流後の流路幅が広いと細胞を壁から遠ざける効果が小さくなり、合流後の流路幅が狭いと合流後に細胞の流れる速度が速くなりすぎ、検出しにくくなるし、流れてくる細胞そのものの頻度が極端に少なくなる。また、２本の側流の長さが異なるとそれぞれの流路抵抗が異なるため、細胞を流れる中央の流路が片方によってしまう問題が生じる。
【００２３】
チップ上に、細胞分離培養装置なりフローサイトメーターを構築しようとすると、細胞懸濁液や上記側流の流速制御が非常に難しい問題として浮上する。大規模な無脈流ポンプで、しかも、数十ピコリットル／分の流速を安定して作れるものを使用すれば解決するが、使い切り形のチップを前提とすると、チップとポンプのコネクションを毎回行わなければならず、再現性と使い勝手の面で問題である。そこで、チップ上にポンプを組み込む研究がなされているが、本発明では、一切ポンプを使用せずに、液の自由落下で解決する。すなわち流路の入り口および出口に、それぞれ、リザーバを儲け、流路の入り口側のリザーバ内の液面より流路の出口側のリザーバ内の液面を低くすることで無脈流での微量液送を実現している。
【００２４】
このような液面高さの違いを利用するシステムでは、複数の液を送液するときの液流速制御が困難である。液面の微妙な違いで細胞懸濁液と側流の流速比が変動してしまう問題が発生する。本発明では、細胞懸濁液を入れるリザーバと側流を形成する緩衝液を入れるリザーバを一体化することで両者の液面を厳密に一致させて解決している。すなわち、共通の液面からの高低差をドライビングフォースとして液送を行うことで細胞懸濁液と側流の流速比の変動をなくしている。このような構造のリザーバとして、一つのリザーバに仕切りがあり、一方の底に試料用流路が結合し、他方に側流用の流路が接合している構造を提案する。実質サイホンの原理で両リザーバの液面をそろえていると考えることができる。仕切りより高いところでは液がつながっていることになるが、細胞は緩衝液より比重が高いので、仕切りを乗り越えて側流のほうへ流れ込むことは無い。
【００２５】
さらに、リザーバの液面の上部空間を閉鎖された空間として、ここに、空気圧を加圧して加えることにより、ドライビングフォースを強化するものとしても良い。
【００２６】
本発明の分離培養チップの細胞検出部は、側流の合流した流路部分にある。細胞を画像として捕らえて評価する場合は合流後の流路部分をＣＣＤカメラで観測する部位を設け、必要に応じてその下流に細胞分離領域を設置する構造とする。画像によらず、流路を通過する細胞にレーザーなどを照射し、細胞が横切るときの散乱光や細胞を蛍光で修飾している場合はその蛍光を光検出器で検出することもできる。この場合も、検出部の下流に細胞分離領域を設置する構造とする。
【００２７】
細胞分離領域である分離部の入り口で細胞を移動させるための流路として緩衝液（あるいは培地）のみを流す流路が合流し、下流側で分離部から分岐している。分離部で細胞を分離するわけであるが、細胞分離領域に外部から細胞に外力を加えて細胞を移動させる手段として電極を設置し、細胞を分離して排出することのできる流路を設ける。電極に電圧をかけてイオンを流すことにより細胞の流路内での流路変更を行う時は、イオンの流れる方向と、流路内で液が流れる方向の合成ベクトルの方向に細胞が移動する。細胞はマイナスにチャージしているのでプラスの電極に向かって動く。よって合体後の流路の流れる方向に対してマイナス極を下流側、プラス極を上流側にずらした形で電極を設置することで移動のための合成ベクトルを制御し、少ない電流で細胞の流路変更を可能としている。流路変更する細胞と流路変更しない細胞は各々別の流路に流れ込み分離される。
【００２８】
ここで試料が流れる方の流路は、もともとの試料用の流路に側流が合流した流路となっている。これに対して合流する緩衝液（あるいは培地）のみを流す流路では上流側で側流の合流は無い。試料流路と緩衝液のみの流路および合流後の流路は幅が等しい。合流後の試料流路は側流が乗っている分だけ、流速が早く、このため分離部においては若干緩衝液流路側からの流れの部分にはみ出す構造となっている。このことも、細胞を試料流路側から緩衝液流路側に乗り換えやすくする重要な効果である。電流を流さないときは、細胞は試料流路側の中心を流れているので、そのまま乗換えなしに試料液が流れ出て行く流路側に流れていく。
【００２９】
分離部に設置する電極は、液絡（空間と空間を満たす液を含む細管で、ここではゲルで満たされている）を介してゲルを充填した空間に金属電極が接する構造となっている。これをゲル電極と呼ぶことにする。マイナス電極側は生成するヒドロキシイオンを吸収するために低ｐＨの緩衝液、プラス電極側は生成する水素イオンを吸収するために高いｐＨの緩衝液を含むゲルマトリックスでできている。ゲルマトリックスとしてはアガロースやポリアクリルアミドのような生化学で一般的に使用されている網目構造をとるゲルを利用できる。これにより、ゲル電極部の電気分解によるガス発生を抑え安定に細胞分析分離を可能としている。もちろん、金属電極が細胞に直接触れることが無いので、電極表面で細胞を痛めないで済む。細胞試料の損傷を防ぎ、電極の電気分解による消失を防ぐことを可能にしている。
【００３０】
ゲル電極は上記のように特開２００３−１０７０９９記載の金属電極に比べてメリットが大きいが、ユーザーにチップを供給する上で問題が残る。すなわち、ゲル電極は湿式の電極のため、貯蔵安定性が悪く、実質的にユーザーが使用直前にゲルをチップに充填してゲル電極を作成する必要がある。本発明では、トレハロースなどの非還元性二糖やグリセロール、エチレングリコールなどを加えることで一定期間の室温保存を可能としている。さらに、通常、ゲルは凍結するとゲル構造が壊れるため、凍結による長期保存が困難であるが、前記トレハロースなどを加えて急速冷凍することで、ゲル構造を壊す氷晶の出現を抑えることができ、結果的にゲル電極の冷凍保存による長期保存を可能としている。
【００３１】
更に、本発明の細胞分離培養装置は、細胞分離領域に導入される試料を含む流体が導入される流路の上流部で不純物を捕獲して流路の目詰まりを防ぐ手段を有することができる。
【００３２】
即ち、本発明は、細胞分離用空間、それに細胞を含む流体を注入するための少なくとも一つの流路、それから流体を排出するための少なくとも２つの流路及び該細胞分離領域に外部から細胞に外力を加える手段から成る細胞分離培養装置であって、これらの流路が、細胞分離領域に外部から外力を加えた場合と加えない場合に、細胞が該細胞分離用空間からそれぞれ異なる流路へ排出されるよう配置された細胞分離培養装置である。細胞が所定の条件による評価を受け、細胞分離領域において選択された流路に排出されたとき、この細胞は当該流路の末端に備えられた培養槽に到達する。細胞が所定の条件を満足しない評価を受け、細胞分離領域において非選択の流路に排出されたときも、この細胞は当該流路の末端に備えられた培養槽に到達する。これらの培養槽は共通の出口側のリザーバ内に設けられる。非選択の流路を流れる細胞を培養する必要が無ければ、この流路の末端の培養槽は省略しても良い。これらの培養槽は上面に半透膜が設けてあるので、培養槽内に細菌等の進入が防止でき、分離が進むのに応じて出口側のリザーバ内にたまる緩衝液（培地）で満たされたものとなる。したがって、分離操作が終わった状態のままで時間が経過することにより培養槽内の細胞を培養することができる。さらに、この培養槽を細胞分離培養装置から切り離して、培養槽ごと、適当な培地を持った培養器に入れることにより、半透膜を通して培養槽内に導入される培地により細胞を培養することができる。
【００３３】
この細胞分離培養装置においては、細胞分離領域に外部から細胞に外力を加えるため、電極等が直接細胞を含む緩衝液に接することがなく、さらに、低い電圧で電流を流して(すなわちイオンを流して)細胞を振り分けるため、細胞に対するダメージを少なくしている。
【００３４】
細胞認識と分離のアルゴリズムに関しては次のような特徴がある。
【００３５】
細胞を画像として捕らえて評価する場合は合流後の流路部分をＣＣＤカメラで観測する部位を設け、測定範囲を面に広げ画像認識で細胞の識別を行い、追跡することでより確実な細胞分離を行う。このとき重要なのは、画像の取り込み速度である。一般の３０フレーム／秒のビデオレートのカメラでは、画像での細胞取りこぼしが生じる。最低２００フレーム／秒の取り込みレートがあれば、流路中をかなりの速度で流れる細胞を認識できる。
【００３６】
次に画像処理法であるが、取り込みレートが早いということはあまり複雑な画像処理を行うことはできない。まず、細胞認識であるが、前記したとおり、細胞の移動速度や細胞によりまちまちで、場合によっては細胞の追い越しがある。このため、各細胞が最初に画像フレームに現れたときに細胞にナンバリングを施し、以下、画像フレームから消えるまで同一ナンバーで管理を行うこととする。すなわち、連続する複数枚のフレームで細胞像が移動する状況をナンバーで管理する。各フレーム内での細胞は上流側にあったものから順に下流側に移行し、画像中に認識されるナンバリングされた特定細胞の移動速度はある範囲に収まるとの条件でフレーム間の細胞をリンクさせる。このようにすることで、たとえ、細胞の追い抜きがあったとしても各細胞を確実に追跡できるようにする。
【００３７】
これで、細胞の認識が可能となるが、細胞のナンバリングには、まず細胞像を２値化し、その重心を求める。２値化した細胞の輝度重心、面積、周囲長、長径、短径を求め、これらのパラメーターを用いて各細胞をナンバリングする。各細胞像をこの時点で画像として自動保存することも使用者にとって益があるので行えるようにする。
【００３８】
つぎに、細胞分離に使用する場合であるが、ナンバリングした細胞のうち、特定の細胞のみを分離しなくてはならない。分離の指標は上記した輝度重心、面積、周囲長、長径、短径などの情報でもよいし、画像とは別に蛍光検出を行うことを併用して蛍光を利用した情報を得てもよい。いずれにせよ、検出部で得た細胞をナンバリングに従い分離する。具体的には、所定時間毎に取り込まれる前記画像からナンバリングされた細胞の移動速度（Ｖ）を計算し、細胞移動速度（Ｖ）に対して検出部から分離部までの距離を（Ｌ）、印加時間（Ｔ）によって、印加タイミングを（Ｌ／Ｖ）から（Ｌ／Ｖ＋Ｔ）までとすることでちょうど目的のナンバーの細胞が電極間に来た時に細胞を電気的に振り分けて分離する。
【発明の効果】
【００３９】
本発明により、安定した細胞分離が可能な使いきり型の細胞分離培養チップが実現できるとともに、汚染の無い細胞培養を実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
（細胞分離培養装置のシステム構成）
図１は、本発明の細胞分離培養装置のシステム構成の１例を模式的に示す平面図である。細胞分離培養装置１００はチップ基板１０１により構成されている。チップ基板１０１の下面に流路を、上面にこの流路に連通する開口を設け、試料や必要な緩衝液（培地）の供給口とする。また、十分な緩衝液の供給と各流路での流量の調整のためにリザーバを設ける。流路の作成はＰＭＭＡなどのプラスチックを金型に流し込むいわゆる射出成型で作成することができる。チップ基板１０１全体のサイズは２０×３０×１ｍｍ（ｔ）である。チップ基板１０１の下面に刻まれた溝や貫通穴を流路やウェルの形状とするために、溝が刻まれた下面側に０．１ｍｍ厚のラミネートフィルムを熱圧着してある。開口数１．４、倍率１００倍の対物レンズを用いて、０．１ｍｍのラミネートフィルムを通して流路内を流れる細胞を観察できる。プラスチックを透光性の高いものとすれば、チップ基板１０１の上面側からも観測できる。
【００４１】
チップ基板１０１の上面には、マイクロ流路に細胞を含む試料緩衝液を導入する穴２０１、細胞を含まない緩衝液を導入する穴２０１’，２０２および２０２’が設けられるとともに、これらを包括するリザーバ２０３が設けられる。したがって、リザーバ２０３に十分な緩衝液を供給すると穴２０１，２０１’，２０２および２０２’は緩衝液でつながる。これにより、穴２０１および２０１’に連なる流路２０４と流路２０４’には同じ液面高さの緩衝液が供給される。したがって、両流路の流路幅（流路高さを等しいとすれば）、あるいは、断面積、さらに両流路の流路長を実質等しくすれば、両流路の流量を実質同量にすることができる。同様に、穴２０２，２０２’に連なる流路２０５，２０５’には同じ液面高さの緩衝液が供給され、流路２０５，２０５’を流れる緩衝液の流量を流路２０４に流れる流量と所定の比にそろえることができる。
【００４２】
試料を含む緩衝液を導入する穴２０１の周辺には細胞を含む試料緩衝液の拡散を防ぐための壁２５０が設けられている。壁２５０の高さは、リザーバ２０３の壁よりも低く、緩衝液は壁２５０より高い位置まで満たされている。
【００４３】
穴２０１に導入された細胞を含む緩衝液は、マイクロ流路２０４（幅２０μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、細胞検出領域２２１および細胞分離領域２２２まで導入される。ここで、マイクロ流路２０４上には、必要に応じて、マイクロ流路の目詰まりを防ぐために、チップ中に直接微細構造として組み込まれたフィルター２３０が配置される。他方、穴２０２，２０２’に導入された細胞を含まない緩衝液は流路２０５，２０５’（幅１２μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液と合流する。２４０は合流後のマイクロ流路であり、細胞検出領域２２１となる。さらに、マイクロ流路２４０は細胞分離領域２２２まで導入される。
【００４４】
一方、穴２０１’に導入された細胞を含まない緩衝液は、マイクロ流路２０４’（幅２０μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、細胞分離領域２２２に導入され、マイクロ流路２４０と合流する。合流後の流路幅については、後述する。また、この合流した流路は、細胞分離領域２２２の出口で、マイクロ流路２１８（幅２０μｍ、深さ１５μｍ）および２１９（幅２０μｍ、深さ１５μｍ）に分流する。
【００４５】
２０６，２０６’および２０７，２０７’は電解質を含むゲルを導入する穴であり、それぞれ、穴２０６および２０７に導入されたゲルはチップ基板１０１の下面のマイクロ構造２０８，２０９（幅２００μｍ×高さ１５μｍの折れ曲がった溝）を通して穴２０６’および２０７’に送り込まれる。したがって、マイクロ構造２０８，２０９は電解質を含むゲルで満たされている。マイクロ構造２０８，２０９の屈曲部はマイクロ流路２０４，２０４’との間で２０μｍ程度の長さの液絡構造の連結部２４１，２４２となっていて、細胞分離領域２２２において、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に、ゲルが、直接、接触できる構造とされる。ゲルと緩衝液が接触する面積は、１５μｍ（流路に沿った長さ）×１５μｍ（高さ）である。ゲルを導入する穴２０６および２０７には、黒丸で示す電極が挿入され、これらの電極は、配線１０６，１０７およびスイッチ２１６を通して電源２１５に接続される。スイッチ２１６は、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に電圧をかける時のみＯＮとされる。
【００４６】
細胞分離領域２２２でマイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に、ゲルが接触する連結部２４１と２４２は、図に示すように、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７でのゲルとの接触位置が、連結部２４１のほうが流路の上流に位置する構造となっている。穴２０６の電極にプラス、穴２０７の電極にマイナスの電圧をかけたときに、マイクロ流路２４０を流れてくる細胞を流路２１１’に効率よく移動することができる。なぜなら電流を流したときにマイナスにチャージしている細胞は電気泳動的な力が働き、この力と流路内を流れる緩衝液から受けるベクトルと電気泳動的力のベクトルの合成ベクトルになるからである。これにより、連結部２４１と２４２を流路の流れに対して同位置（流れの線の対称位置）に作成した場合に比べ、効率のよい電界利用が可能となり、より低電圧で安定した細胞のマイクロ流路２１８あるいはマイクロ流路２１９への移動が可能となる。
【００４７】
マイクロ流路２１８，２１９の下流部には、細胞分離領域２２２で振り分けられた細胞の回収穴２１１，２１２が開けられている。それぞれの穴２１１，２１２の周辺には、回収された細胞を収納するための培養槽２１３，２１４が設けられる。培養槽２１３，２１４の周辺には、これを取り巻くように形成されたリザーバ２８５が設けられる。リザーバ２８５は、前述した流路の出口側のリザーバであり、分離操作前の緩衝液の導入によりある程度の高さの位置まで満たされているが、この高さは、流路の入り口側のリザーバ２０３に満たされている緩衝液の位置よりは低いものとされる。
【００４８】
リザーバ２０３の緩衝液の液位はリザーバ２８５のそれよりも高いから、この落差が流路を流れる緩衝液の移動の駆動力となるとともに、脈動のない安定した流れを作り出す。リザーバ２８５の緩衝液の貯蔵量を十分大きなものとしておけば、穴２０１に導入された細胞を含む緩衝液を、全て、流路２０４に流入させることができる。リザーバ２０３に蓋をして、空間部を空気により加圧すれば、緩衝液の移動の駆動力を大きくして、スループットをあげることができる。
【００４９】
培養槽２１３，２１４の内、細胞検出領域２２１で所定の条件を満足すると判定された細胞が、細胞分離領域２２２で分離され流路２１８を流下して培養槽２１３に集められる。所定の条件を満足しないと判定された細胞が、細胞分離領域２２２で分離され流路２１９を流下して培養槽２１４に集められる。培養槽２１３，２１４の上面には、細胞の分離中に汚染物質が入らないように、半透膜２８０が貼られている。この半透膜２８０は、細胞の分離操作の間には、汚染物質が入らないように設けられるものであるが、培養槽２１３，２１４を、培養槽２１３，２１４に連なる流路２１８，２１９を閉鎖するとともに切り取って、後述するように、培養器に入れた細胞培養操作の間には、細胞に培地を供給するための膜として機能するものである。所定の条件を満足しない細胞の培養が必要なければ、培養槽２１４は省略してよい。
【００５０】
図２は、マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液に、マイクロ流路２０５，２０５’の緩衝液が合流し、細胞検出領域２２１となるとともに、さらに、マイクロ流路２４０を流下し、マイクロ流路２０４’を流下する緩衝液と合流してマイクロ流路２４７を流下して細胞分離領域２２２となる状況を説明する図である。
【００５１】
ここで、細胞検出領域２２１の上流部で、流路２０５，２０５’を流下する細胞を含まない緩衝液を、マイクロ流路２０４を流下する細胞を含む緩衝液と合流させる理由を説明する。細胞を含む緩衝液の流れる流路２０４には、細胞を含まない緩衝液の流れる流路２０５，２０５’が細胞検出領域２２１の上流部で合流するが、それぞれの流路の最上流に設けられた穴２０１および２０２，２０２’は、共通の液位の緩衝液のリザーバ２０３に開口している。したがって、それぞれの流路を流下する緩衝液の流量は、流路の高さが同じであるから、流路幅に比例したものとなる。これらの緩衝液が合流するが、合流後の流路２４０の幅を、細胞を含む緩衝液の流れる流路２０４の幅と実質的に等しい幅を持つものとする。実質的に等しいとは、加工精度を考慮して等しいということで、厳密に等しいというわけではない。これにより、流路２０４を流下する緩衝液は流路２０５，２０５’を流下する緩衝液によって、一定の比率で中央部に押しやられるので、流路２０４では側壁に接触しながら流れてくる細胞が、合流後の流路２４０中では側壁に接触しなくなる。
【００５２】
細胞分離領域２２２におけるマイクロ流路２４７は、流路２４０と流路２０４’をそれぞれ流下する緩衝液が、破線で示すようにそれぞれの流れの層を維持しながら、同じ幅の流路を持っているかのように流下し、それぞれ、流路２１９，２１８を流下する。細胞検出領域２２１の流路２０４で流下する細胞を検出して、細胞分離領域２２２で、ゲルが流下する緩衝液と接触する連結部２４１と２４２により電界を作用させて分離するのである。すなわち、電界が作用しないときは、流路２４０を流下する細胞を含む緩衝液が、流路２１９を流下する。これに対して、細胞分離領域２２２で電界が作用させられたときは、この位置にある細胞は流路２１８を流下する緩衝液の流れに押し込まれることになる。図２の例は、黒丸で示す細胞は選択の条件を満足していない細胞であり、星印で示す細胞が選択の条件を満足している細胞である。
【００５３】
ここで、図１、図２では、分離のルートを選択、非選択の二つとしたが、これを３以上の複数ルートにすることができる。この場合、細胞分離領域２２２の下流の流路は、図２に示す２１８，２１９に加えて、ルートの数に応じた流路を設けることになる。細胞検出領域２２１で得られた細胞の情報を選択するルートに対応して準備された基準に応じて評価し、評価結果に応じて細胞分離領域２２２の連結部２４１と２４２により細胞に作用させる電界を制御する。この結果、細胞分離領域２２２を流下する間に、細胞は電界に応じたルートの流路の入り口に到達して、それぞれの流路を流下することになる。この場合、もちろん、追加されたルートの流路の末端に、それぞれ独立した培養槽が設けられる。
【００５４】
あるいは、細胞分離領域２２２の下流の非選択のルート（流路２１９）にカスケードに、二つの分離のルートを持つ複数の段の細胞分離領域をつくり、細胞検出領域２２１で得られた細胞の情報に応じて、どの段で選択側のルートに移動させるかを制御するものとしても良い。この場合、流路２０４’に対応する流路を各段階に設けることが必要となるので、構造が複雑になる面がある。
【００５５】
図３は、細胞検出領域２２１の上流部で、流路２０４を流下する緩衝液が流路２０５，２０５’を流下する緩衝液によって中央部に押しやられた結果の合流後の流路２４０の細胞分布を説明する図である。図において２５５は流路の側壁である。すなわち、幅２０μｍの流路２０４を流下する細胞を含む緩衝液の流れが、幅１２μｍの流路２０５，２０５’を流下する緩衝液の流れによって、幅２０μｍの流路２４０の中央部に押しやられる状況を、横軸に流路２０４の位置、縦軸に細胞の出現頻度で示す図である。曲線３０１は、流路２０５，２０５’のそれぞれを流下する緩衝液が、流路２０４を流下する細胞を含む緩衝液細胞のほぼ半分、すなわち、流路２０５，２０５’の流路幅が流路２０４のほぼ半分である場合に、細胞が中央部のほぼ１０μｍの幅に分布することを示している。曲線３０２は流路２０５，２０５’の流路幅がより小さい場合の細胞分布、曲線３０３は流路２０５，２０５’を設けない場合の細胞分布をそれぞれ示す。曲線３０１から明らかなように、流路２０５，２０５’の流路幅を適切に設定することで、実質的に細胞を、流路壁から離して流すことができ、細胞が壁に接触することを防止できる。
【００５６】
図３では、説明しなかったが、細胞分離領域２２２では流路２４０と流路２０４’とが合流する。したがって、図３に示す特性が、やや流路２０４’の流入する側に広がる傾向を示すが、流路２４０と流路２０４’を流下する緩衝液は、図２に、破線で示したように、それぞれの流れの層を実質的に維持するので、それほど大きな変化はない。すなわち、細胞分離領域２２２の流路２４７の流路２４０に対応する部分の幅がやや広がる傾向を示すが、実質的に変化はないといえる。
【００５７】
ここで、図１では、流路２０４、２０４’、２０５および２０５’は、それぞれの全長で幅は等しいものとしたが、流路の抵抗を下げたいときは、リザーバ２０３に近い部分は幅を広げてよい。また、細胞分布を適切にするために流路幅を所定の幅にする長さは、例えば、１００μｍ程度有ればよいので、流路の抵抗を考慮して幅の広い範囲を長くしてよい。たとえば、細胞を含まない緩衝液の流れる側流を形成する流路２０５の流路幅を、細胞を含む緩衝液の流れる流路２０４の流路幅に比べ、広くし、且つ、所定の流路幅にする長さも短くすると、側流の流路２０５の流路抵抗は流路２０４に比べ小さくなる。その結果、合流後の流路２４０の、流路２０４からの液流幅を絞り込む働きが得られる。すなわち、図３の細胞分布曲線が、より先鋭なものとなる。
【００５８】
図４（Ａ）、（Ｂ）は流路の幅を広くすることに伴う問題と、その解決案の例を示す断面図である。図において、１０１は基板を示し、２６０は基板に形成された溝、４１０は溝２６０を覆うラミネートフィルムである。２０５は流路であり、溝２６０とこれを覆うラミネートフィルム４１０により形成される。図４（Ａ）に示すように、流路の幅を広くすると、流路２０５の幅の広い部分で、チップ基板１０１にラミネートフィルムを圧着するときにラミネートフィルム４１０が溝２６０に落ち込んで、流路２０５をふさいでしまうことが起こる。これに対して、図４（Ｂ）では、溝２６０の幅の広い部分に梁４００を形成したものである。梁４００を設けることにより、ラミネートフィルムが溝２６０に落ち込んで流路２０５をふさぐことを防止できる。
【００５９】
図５（Ａ）は、図４で説明した流路の入り口側のリザーバ２０３と開口２０１，２０１’および流路２０４，２０４’の部分をより詳細に説明するために、図１のＡ−Ａ位置において、矢印方向に見た断面図である。図５（Ｂ）は培養槽２１３，２１４と、開口２１１，２１２、流路２１８，２１９、半透膜２８０および流路の出口側のリザーバ２８５の部分をより詳細に説明するために、図１のＢ−Ｂ位置において、矢印方向に見た断面図である。
【００６０】
チップ基板１０１の下面にはマイクロ流路２０４，２０４’に対応する溝が形成されていて、ラミネートフィルム４１０により覆われ、マイクロ流路２０４，２０４’が形成されている。マイクロ流路に細胞を含む試料緩衝液を導入する穴２０１がマイクロ流路２０４の最上流端に開けられ、細胞を含まない緩衝液を導入する穴２０１’がマイクロ流路２０４’の最上流端に開けられている。穴２０１を取り囲むように、穴２０１に注入された細胞を含む試料緩衝液の拡散を防ぐため壁またはリザーバ２５０が設けられている。
【００６１】
穴２０１’および穴２０１に注入された細胞を含む試料緩衝液の拡散を防ぐため壁またはリザーバ２５０、さらに、図５（Ａ）には表れない穴２０２，２０２’もリザーバ２０３内に設置される。リザーバ２０３内に緩衝液２００が満たされていて、すべての穴に緩衝液２００が供給されるから、マイクロ流路２０４，２０４’を流れる緩衝液の流量を、実質、同量にすることができる。また、マイクロ流路２０５、２０５’を流れる緩衝液の流量を、実質、同量にすることができる。さらに、マイクロ流路２０４とマイクロ流路２０５を流れる緩衝液の流量を所定比に安定に維持することができる。なお、穴２０１をすり鉢上にしたのは、試料細胞が流路２０４に確実に流入するようにするためである。また、壁２５０は図１に示すようにリザーバ２０３の中に配置する背の低い小型のリザーバ様のものでもよいし、単に仕切り板のような構造でもよい。なお、２３１はメンブレンフイルタであり、穴２０１の上面に設けられ、試料に含まれる塵を除く。壁２５０を設けることにより、細胞の分散を防げるので、穴２０１に直接細胞を含む試料緩衝液を注入しなくても良い。
【００６２】
各流路の最上流端に共通のリザーバを設ける構造は本細胞分離培養装置の中核の一つをなすもので、共通の液面を有する構造にすることで複数の流路に同一の圧力で緩衝液を送ることができる構造で、基板上に組み込むことのできる最も簡単な構造の送液系である。さらに、各流路の送液物を区別するために、液面より背の低い仕切り板で仕切ることで種々緩衝液を異なる流路に同じ圧力で流すことができる。各仕切り板で仕切られた緩衝液には共通の液面を形成する緩衝液に比べて比重の高いものを用いれば、基本的にお互いが混ざり合うことは無い。また、細胞の場合はそれ自体が比重が高く、容器底面に沈むので基本的には問題ない。走化性の細胞では仕切り板を乗り越えることができない高さにすればよい。たとえば神経細胞などでは、数十μｍもあれば壁（仕切り板）を乗り越えることができないし、大腸菌のような細胞では、壁２５０の上に、緩衝液は自由に通り抜けることができるが細胞は通過できないようなスポンジ状の膜を設けることで細胞が他の流路に入り込むことを防止するのが良い。
【００６３】
図５（Ｂ）に明らかなように、培養槽２１３，２１４の上面には半透膜２８０が設けら、分離操作中の汚染を防止するものとする。培養槽２１３，２１４を取り囲むようにリザーバ２８５が設けられる。リザーバ２８５の高さは培養槽２１３，２１４と比較して十分に高いものとする。分離の初期段階にリザーバ２０３に十分に入れられた緩衝液は分離が進むにつれてリザーバ２８５に移ることになる。図５（Ｂ）は、ある程度分離が進んで培養槽２１３，２１４が緩衝液（培地）２００の中に沈み込んだ状態になっている様子を模式的に示す。２８７は培養槽２１３，２１４の底面に塗布されたコラーゲン、ポリリジン、あるいは、フィブロネクチンの層である。これらの塗布に代えて、培養槽２１３，２１４の底面を疎水性処理することでもよい。これは、寒天培地上でコロニーを形成する細胞の培養に好都合なように設けられるものである。したがって、分離培養の対照としている細胞が、例えば、バクテリアのように、寒天培地上でコロニーを形成しない細胞である場合には、これらの塗布あるいは処理は不要である。図５（Ｂ）で、培養槽２１３，２１４の塗布されたコラーゲン２８７の上に示す星印あるいは丸印は、図２で説明した分離された細胞を模式的に示すものである。
【００６４】
次に、ゲル電極について具体的に説明する。ゲル電極部は、図１に示す、穴２０６，２０６’および２０７，２０７’、穴２０６と２０６’を結ぶマイクロ構造２０８、穴２０７，２０７’を結ぶマイクロ構造２０９と細胞分離領域２２２における液絡構造の連結部２４１，２４２のことを言う。射出成型でチップ基板１０１を作成し、ラミネートフィルム４１０で溝を覆って細胞分離培養装置１００を形成した段階では、ゲル電極部にはゲルは含まれていない。ここでは電解質を含むアガロースゲルを電解液として使用するケースについて説明する。
【００６５】
ゲルの組成はマイナス極側２０９、２４２に作成するのが０．２５Ｍ  ＮａＣｌ，０．２９６Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）緩衝液、プラス電極側の２０８、２４１に作成するのが０．２５Ｍ  ＮａＣｌ，０．２８２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）の組成を含む１％アガロースである。ｐＨが異なるのは電流を流したときに電気分解により気泡が発生する現象を防ぐためである。プラス極側で発生する水素イオンは水素分子になる前に高いｐＨの緩衝液で中和され、マイナス極側で発生するヒドロキシイオンは低いｐＨの緩衝液で中和され酸素分子の生成を阻害する。
【００６６】
なお、前記ゲル電極は糖類を含むゲル状物質からなるものとするのが良い。この場合、前記糖類は３％ないし５０％の非還元性二糖、１％ないし５０％のトレハロース、５％ないし３０％の濃度のグリセロール、５％ないし４０％の濃度のエチレングリコール、あるいは、５％ないし３０％の濃度のジメチルスルホキシドを含むものとするのが良い。
【００６７】
次に、チップ基板１０１に形成した穴２０６および２０７からゲルを注入して、ゲル電極付細胞分離培養装置１００を完成した後チップを使用しないで放置した状態を考える。ゲルは穴２０６と２０６’，２０７と２０７’の開放部、および、細胞分離領域２２２における流路と液絡構造の連結部２４１，２４２の部分で大気と接しているため、ここから乾燥が始まる。このため作成したゲル電極付細胞分離培養装置を保存するには下記のような工夫が必要である。まず、穴２０６と２０６’，２０７と２０７’の開放部からの乾燥防止は使用直前まで開口部にシールを貼ることで防げる。細胞分離領域２２２における流路と液絡構造の連結部２４１，２４２の部分では、ゲルが乾かないように水を含むシートとともに密閉容器中で保存することで、４℃で３ヶ月程度の保存が容易にできる。密閉容器としては空気部分をなるべく少なくするためにラミネートバックが適している。
【００６８】
さらに、乾燥を防ぎ長期保存を可能とするためにゲルには保湿剤を添加する。保湿剤としてはたとえば１％〜１０％程度のトレハロースやシュークロースなどの２糖類あるいはオリゴ糖、５％〜１０％程度のグリセリンを添加することで乾燥防止に効果がある。
【００６９】
さらに長期の保存にはゲル電極付細胞分離培養装置をラミネートバックに入れたまま凍結保存するのがよい。このときに問題となるのが、凍結時と融解時に氷晶ができてゲル構造を破壊する現象である。細胞分離培養装置のように微小な領域に作成するゲル電極で氷晶ができると、融解後にその部分が空洞となる。空洞ができると、電極に電界を印加したときに、空洞に細胞が入り込んだり、あるいは、入り込んだ細胞が不必要なときに細胞分離培養装置の流路に流れ出たりする問題が生じる。
【００７０】
これを防ぐには、ゲル電極部のゲルに氷の結晶成長を抑える物質を添加し、細胞分離培養装置を凍結状態で長期保存を可能にするのが本発明の最も重要な点である。結晶成長を抑える物質としては上記保湿材料と同様のものが利用できる。ゲル作成時にトレハロースやショ糖などの２糖類やオリゴ糖などを混ぜ込むのが最も有効である。このうちトレハロースは一般的な動物細胞に対してのファンクションは小さくきわめて有効である。濃度は１％でよい。上限濃度は５０％程度である。ショ糖でも効果が高いが、動物細胞に対してはバイオファンクションであることが考えられ、目的によっては不適切なケースがある。糖鎖の水酸基の一部を硫酸基に置き換えることで、凍結防止能を保持して生化学的な影響を低減できるので、これら２糖類の水酸基に硫酸基を導入して利用するとよい。このほかにグリセリンやエチレングリコールといった糖も効力がある。あるいはジメチルスルホキシドでも効果があるが、エチレングリコールやジメチルスルホキシドは細胞毒性が問題となるケースがあることを考慮しなければならないが、一般的にはセルソーティング流路に溶出するジメチルスルホキシドなどは微量なので無視できる。
【００７１】
具体的な実施例を示す。下記組成のカソード電解液とアノード電解液を電子レンジで過熱融解し緩衝液化させる。別途チップ基板１０１を６０℃に加熱してあるホットプレートに乗せて加温する。緩衝液状態になっているカソード電解液とアノード電解液をシリンジで穴２０６、２０７に注入し、穴２０６’と２０７’から吸引し、マイクロ構造２０８、２０９と連結部２４１と２４２を満たす。連結部２４１と２４２には毛管現象で融解したゲルが入り込む。室温で１０分間放置することで、マイクロ構造２０８、２０９と連結部２２２と２４２内の緩衝液がゲル化する。流路２４７は連結部２４１と２４２に比べ断面積が広いので、ゲル緩衝液が入り込むことは無い。
【００７２】
改善されたゲル組成を示す。
マイナス電極液：１％トレハロース、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ，０．２９６Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１％アガロース、
プラス電極液：１％トレハロース、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ，０．２８２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１％アガロース、
上記のように調製したゲル電極付細胞分離培養装置の表面を粘着性テープでシールする。多孔質プラスチックタオルであるプラセームに水を浸し、しぼった２ｃｍ角の断片をゲル電極付細胞分離培養装置とともに３０ｍｍ×４０ｍｍのプラスチックバックにいれシーラーを用いてバックの口をふさぐ。
【００７３】
この状態で４℃あるいは−２０℃で保存する。
【００７４】
作成直後の凍結前のチップ、１ヵ月後、３ヶ月後、６ヵ月後の４℃および−２０℃保存のチップの電極部の状態を、顕微鏡を用いて観察する。また、リザーバ２０３に培養液を添加し、流路２０４と２０５，２０５’に培養液を満たし、穴２０１に赤血球を添加し、ゲル電極に電解をかけたり、切ったりして細胞が流路２１８，２１９に振り分けられることを確認する。まず、作成直後のチップではマイクロ構造２０８、２０９と連結部２４１と２４２にゲルが満たされており、ひび割れたり、乾いたりの外的損傷は無い。ゲル電極に電界をかけると細胞分離領域２２２の流路を流れている赤血球が流路２１９に移り、穴２１２を介してリザーバ２１２’に貯まる。電界をかけなければリザーバ２１１’に貯まる。凍結したものは６ヵ月後においても作成直後と同様にゲル電極に電界をかけることでリザーバ２１２に、電界を切ることでリザーバ２１１に細胞を集めることができる。４℃保存に関しては顕微鏡観察すると３ヶ月目に連結部１０８と１０９にゲルの後退が見られるが、実際に細胞を流してみると、作成直後と同様に分離することができる。
【００７５】
図６は、ゲル電極部分が図１に示す実施例とは異なった構造とされた細胞分離培養装置１００を平面図の形で示す図である。ここでは、図１の配線１０６および１０７と電解質を含むゲルを導入する穴に挿入した電極を、チップ基板１０１の下面に貼り付けるラミネートフィルム４１０に蒸着した導電膜により実現するものである。ラミネートフィルム４１０は、チップ基板１０１の下面に貼り付けられるものであるから、導電膜に形成した電極等は、チップの平面図では見えないが、ここでは、他の構成要素との関係が分かりやすいように、重ねて表示した。
【００７６】
図６の構造では、図１に示したマイクロ構造２０８，２０９に代えて、五角形状のマイクロ構造２０８，２０９とした。五角形状のマイクロ構造２０８，２０９には、チップ基板１０１に設けられた開口２０６，２０７が連通していて、この開口を通してゲルが注入される。２０６’，２０７’はマイクロ構造２０８，２０９に連通している空気抜きの開口である。ゲル注入時に、空気抜きの開口２０６’，２０７’からゲルが溢れる状態になれば、ゲル注入は終わりとすれば良い。五角形状のマイクロ構造２０８，２０９の突出部には、連結部２４１，２４２が形成され、流路２４７を流れる緩衝液とゲルが接触できるようにされる。五角形状のマイクロ構造２０８，２０９に注入されたゲルと配線１０６および１０７に代える蒸着された導電膜１０６および１０７との十分な電気的接続を得るために、五角形状のマイクロ構造２０８，２０９に注入されたゲルが、適当な広さで、導電膜１０６および１０７の端部と接触する位置に、導電膜１０６および１０７は蒸着される。導電膜１０６および１０７の他の端部は、電源２１５に接続されるための端子を形成する。
【００７７】
ここで、ラミネートフィルム４１０は、チップ基板１０１と貼り合わされるから、導電膜１０６および１０７の他の端部の端子は基板に隠されてしまう。図示しなかったが、この端子と接続され、チップ基板１０１の表面で電源２１５と接続可能にするための構造が設けられる。
【００７８】
図６に示す構造においても、培養槽２１３，２１４の内、細胞検出領域２２１で所定の条件を満足すると判定された細胞が、細胞分離領域２２２で分離され流路２１８を流下して培養槽２１３に集められる。所定の条件を満足しないと判定された細胞が培養槽２１４に集められる。培養槽２１３，２１４の上面には、細胞の分離中に汚染物質が入らないように、半透膜２８０が貼られている。この半透膜２８０は、細胞の分離操作の間には、汚染物質が入らないように設けられるものであるが、後述するように、培養槽２１３，２１４を、培養槽２１３，２１４に連なる流路２１８，２１９を閉鎖するとともに、切り取って培養器に入れた細胞培養操作の間には、細胞に培地を供給するための膜として機能するものである。培養槽２１３，２１４の周辺には、リザーバ２８５が設けられる。所定の条件を満足しない細胞の培養が必要なければ、培養槽２１４は省略してよい。また、図１、図２で説明したように、分離のルートを選択、非選択の二つとしたが、これを複数ルートにすることができる。
【００７９】
図１の細胞分離培養装置１００を用いて画像認識による細胞認識と分離のアルゴリズムを説明する。図１を参照しながら説明したように、細胞懸濁液は穴２０１に注入される。穴２０１の周辺には細胞懸濁液の拡散を防ぐための壁２５０が設けられている。壁２５０は、リザーバ２０３の中に作られ、穴２０１の液面は、リザーバ２０３の液面に等しい状態になっている。細胞は穴２０１から流路２０４に流れ、側流を形成する流路２０５と細胞検出領域２２１の前で合流する。これにより、細胞が流路の中心部に寄った状態を作れる（図３）。
【００８０】
流路２０４の細胞検出領域２２１を通過する細胞を、ＣＣＤカメラで撮像する。ＣＣＤカメラは、例えば、毎秒２００フレームで画像を取り込む能力のあるものを使用する。この撮影能力があれば、細胞検出領域２２１の流路を流下する緩衝液の流速が１ｍｍ／ｓｅｃ程度であっても、細胞単位で認識できる。
【００８１】
図７は、ＣＣＤカメラで取り込まれた画像から細胞を認識し、それぞれの細胞をナンバリングして識別するアルゴリズムを説明する図である。図７では、次々に取り込まれる画像をフレーム１，２，---，Ｎとして、それぞれのフレームに表れている細胞を表示している。フレーム１には黒丸で示す細胞のみが表れている。この黒丸で示す細胞を画像認識するとともにＮｏ．４２１とナンバリングする。次のフレーム２では、４２１細胞の他に白丸で示す細胞と星印で示す細胞が表れている。ここで、白丸で示す細胞と星印で示す細胞は、同時に、フレーム２に最初に現れている。これらの細胞を画像認識するとともに、下流側で最初に検出される細胞に若い番号をつける。ここでは白丸で示す細胞のほうが星印で示す細胞に比べて下流に出現しているので、白丸で示す細胞にＮｏ．４２２、星印で示す細胞にＮｏ．４２３とナンバリングする。次のフレーム３では、新しい細胞が認識されていない。フレーム２とフレーム３とを比較すると、４２２細胞は、細胞４２１および４２３細胞より移動速度が速いことが分かる。次のフレーム４でも、新しい細胞が認識されていない。４２２細胞は移動速度が速いのでフレーム４では、かろうじて現れている状態である。一方、細胞４２１および４２３細胞は、ほぼ同じ速度で移動していることが分かる。フレーム８まで認識できる。ここで、細胞の画像の認識は、指標として、各細胞の輝度重心、面積、周囲長、長径、短径に着目する。
【００８２】
このようにして、画像認識され、ナンバリングされた細胞の移動速度から、それぞれの細胞が細胞分離領域２２２（厳密には、連結部２４１，２４２）へ到達する時間を割りだし、連結部２４１のゲル電極にマイナス、連結部２４２の電極にプラスの電界をかけ、あるいは、電界をかけないで、細胞を回収用穴２１１と穴２１２に振り分ける。すなわち、所定時間毎に取り込まれる前記画像からナンバリングされた細胞の移動速度（Ｖ）を計算し、細胞移動速度（Ｖ）に対して予め入力した距離（Ｌ）、印加時間（Ｔ）によって、印加タイミングを（Ｌ／Ｖ）から（Ｌ／Ｖ＋Ｔ）までとして細胞を振り分ける。
【００８３】
図８は、図１に示す構成と比較して試料細胞の導入に工夫を施した細胞分離培養装置のシステム構成の１例を模式的に示す平面図であり、図９（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）は、図８の試料細胞の導入部における工夫を説明するための部分的な断面図である。図１と同じ参照符号を付したものは同じものまたは同じ働きをするものである。
【００８４】
図８と図１とを対比して明らかなように、図８に示す細胞分離培養装置は、流路２０４をより上流部まで延長し、開口２９０を設けて、緩衝液を導入するようにした点において図１に示す細胞分離培養装置と異なるだけで、後は同じである。図９（Ａ）から分かるように、流路２０４は開口２０１を通してリザーバ２５０に連通するのみならず、より上流まで延伸されて開口２９０とも連通している。また、図１、図２で説明したように、分離のルートを選択、非選択の二つとしたが、これを複数ルートにすることができる。
【００８５】
図９（Ｂ）に、開口２０１および開口２９０から流路２０４に流入する緩衝液および細胞を模式的に示したように、実施例６によれば、開口２９０から流路２０４に流入する緩衝液の層によって、開口２０１から流路２０４に流入する緩衝液および細胞がラミネートフィルム４１０に接触することが阻止される。すなわち、開口２０１から流路２０４に流入する緩衝液および細胞は、開口２９０から流路２０４に流入する緩衝液の層の上を流れることになる。したがって、細胞がラミネートフィルム４１０に接触して、それが原因となる滞留を防止することができる。
【００８６】
図９（Ｃ）は、開口２０１から流路２０４に流入する細胞が、ラミネートフィルム４１０に接触して、それが原因となる滞留を生じている様子を模視的に示すものである。細胞の一つがラミネートフィルム４１０に接触して、そこに留まるようなことが起こると、それに他の細胞が引っ掛かり、次々と細胞が溜まってしまって、遂には、細胞の流下が停止してしまうことになる。
【００８７】
図１に示す構成の流路２０４をより上流部まで延長した例で説明したが、これは、図６に示す流路２０４についても同様にできることは明らかである。すなわち、細胞を導入する位置よりも上流側で緩衝液を導入して、緩衝液の流れの層を形成しておいて、細胞を導入することで、細胞が流路の底面に接触するのを防止するのである。
【００８８】
（細胞修飾の例）
ここでは、細胞を蛍光染料により修飾あるいは金微粒子または金微粒子以外のナノ粒子により修飾して、蛍光あるいは散乱光により細胞を検出するために、アプタマーを利用する例を説明する。細胞を識別したり分離したりしようとすると、何らかの指標に従い区別する必要があるが、ここでは、表面抗原の標識物質にマイルドな条件で分解可能な物質を用いるとともに、表面抗原の標識物質を生理的な条件の下で、細胞に影響の無いように分解して除去する例を説明する。具体的には、標識物質に種々立体構造を形成することのできるポリヌクレオチドを利用する。このポリヌクレオチドは一般的にアプタマーと呼ばれる概念のものである。たとえば、全長を８０塩基とし、３’末端側と５’末端側の２０塩基は制御された既知の塩基配列とし、中央部の４０塩基はランダムな配列の多種類の合成ポリヌクレオチドを用意する。これらの合成ポリヌクレオチドを、内面に分離したい細胞の表面抗原を固定したカラムに通す。その結果、カラム内面には分離したい細胞の表面抗原にアフィニティーがある配列のポリヌクレオチドが捕捉される。このカラムをアルカリ処理して、捕捉されたポリヌクレオチドを分離回収し、ＰＣＲ増幅することにより、細胞表面抗原に特異的に結合するポリヌクレオチドを得ることができる。すなわち、マイルドな条件で分解可能な表面抗原の標識物質としてのアプタマーを得ることができる。
【００８９】
より特異性が高く、結合力の強いアプタマー（ポリヌクレオチド）を得るために、ＰＣＲ増幅時にわざとフィデリティーを落として配列が変化するようにしてアフィニティー精製を繰り返す進化工学的な手法を併用しても良い。表面抗原に結合する塩基部分を修飾して電荷を持たせて結合力を高める工夫がなされるケースもある。あるいは塩基の糖鎖部分を修飾したヌクレオチドを用いて結合力を高める工夫がなされるケースもある。
【００９０】
得られる構造認識型ポリヌクレオチドのバックボーン構造はリボヌクレオチド型でもよいし、デオキシリボヌクレオチド型でもよい。一般的に色々な構造に対応するにはリボヌクレオチド型のほうが有利であるが、周辺に存在するＲＮａｓｅによる不用意な分解があるので使いづらいケースもある。使い勝手の面ではデオキシリボヌクレオチド型のほうが有利である。ＤＮａｓｅは細胞の外には多くないし、不活性化も容易であるからである。
【００９１】
このようにして得られた標識物質としての構造認識型ポリヌクレオチド（アプタマー）を識別物質としての蛍光体あるいは金ナノ粒子や磁性ナノ粒子で修飾した識別素子を構成する。この識別素子を試料細胞と混合することで、標識物質と結合する部位を持つ細胞を識別し、識別情報を基に細胞分離培養装置で分離する。
【００９２】
分離後に、細胞をヌクレアーゼで処理することで表面抗原に結合している標識ポリヌクレオチドを分解除去する。標識ポリヌクレオチドがリボヌクレオチド型の場合はＲＮａｓｅで分解する。デオキシリボヌクレオチド型の場合はＤＮａｓｅで分解する。ここで安定性を高めるために修飾ヌクレオチドを利用する場合はこれらヌクレアーゼでの分解が完全に阻害されないように注意することが重要である。ヌクレアーゼの効果を阻害する恐れのあるヌクレオチド構造はアプタマー分子の一部分への導入にとどめるべきである。このようにすることで、たとえ、ヌクレアーゼの働かない部分があるにしてもアプタマー分子全体で見れば十分低分子に分解されるようになる。
【００９３】
この方法によれば、細胞表面抗原の標識物質である構造認識型ポリヌクレオチド（アプタマー）はヌクレアーゼで容易に除去することができる。そして、ＲＮａｓｅやＤＮａｓｅは細胞膜を通過できないので細胞内のＲＮＡやＤＮＡは損傷を受けることがない。また、細胞表面にＲＮＡやＤＮＡが露出していることも考えにくいので、細胞表面抗原に結合した構造認識型ポリヌクレオチド（アプタマー）によって細胞そのものがヌクレアーゼの影響を受けることは無いと考えられる。したがって、細胞の分離のための処理により細胞が変質することを防止できる。
【００９４】
標識物質として有用なアプタマーの例として、細胞表面抗原ＣＤ４に対するアプタマーの調製について説明する。
【００９５】
標識物質としてのアプタマーとしてNucleic Acids Research 26,3915-3924 (1998)記載の論文「Staining of cell surface human CD4 with 3’-F-pyrimidine-containing RNA aptamers for flow cytometry」記載の細胞表面抗原ＣＤ４に対するアプタマーを用いる。このアプタマーはリボヌクレオチド型すなわちＲＮＡアプタマーである。上記論文ではアプタマーを蛍光で識別できるようにするために、識別物質としてＲＮＡアプタマーの５’末端にインビトロトランスクリプションでＧＤＰ−β−Ｓを導入する。すなわちこの時点でアプタマーの５’末端にはチオリン酸基が挿入される。このチオリン酸基にヨードアセチル基を導入したビオチンを反応させ、５’ビオチン化ＲＮＡアプタマーを得る。
【００９６】
蛍光色素としてフィコビリプロテインとストレプトアビジンのコンジュゲートを反応させ、ビオチンアビジン反応でフフィコビリプロテイン修飾ＲＮＡアプタマーを得ている。フィコビリプロテインのうちβ−フィコエリトリンは吸光度計数が２．４１×１０６Ｍ−１ｃｍ−１と大きく、高量子収率も０．９８と高い蛍光タンパク質性蛍光体で、高感度検出に適しているが、分子量が２４０Ｋダルトンと大きい点とタンパク製であるため非特異吸着や不安定さが問題となる場合もある。ここでも、具体例の一つではフィコビリプロテイン修飾ＲＮＡアプタマーを用いる。しかし、分子量が２４０Ｋダルトンもあるのでサイズ的には１０ｎｍ程度の粒子を識別物質に用いるのと同じである。そこで、識別物質としてフィコビリプロテインのほかに、粒子直径が１０ｎｍの蛍光色素含有粒子、粒子直径が１０ｎｍの金ナノ粒子、粒子直径が１０ｎｍの磁性粒子を用いる。
【００９７】
ここでは識別物質をフィコビリプロテインあるいはナノ粒子とする識別素子の例を述べる。
【００９８】
（ｉ）フィコビリプロテイン修飾ＲＮＡアプタマー：上記論文記載の方法を用いてもよいが、ここでは使用しない方法を採用する。ＲＮＡアプタマー合成は化学合成が確実である。合成ＲＮＡアプタマーの５’末端にアミノ基を導入する。アミノ基の導入にはＲＮＡアプタマーの化学合成時に導入する。５’末端に導入したアミノ基にN-(8-Maleimidocapryloxy)sulfosuccinimideのような２価性試薬を反応させてＳＨ基と反応するマレイイミド基をＲＮＡアプタマーの５’末端に導入する。これとは別に、β−フィコエリトリンにＳＨ基を導入したものを調製する。ＳＨ基の導入には２−イミノチオランを用いてβ−フィコエリトリンのアミノ基を修飾しＳＨ基を導入する。マレイイミド基を導入したＲＮＡアプタマーと２−イミノチオラン修飾によりＳＨ基を導入したβ−フィコエリトリンをｐＨ７で混合してβ−フィコエリトリン修飾ＲＮＡアプタマーを得る。
【００９９】
（ｉｉ）金ナノ粒子修飾ＲＮＡアプタマー：Tonya M. Herne と Michael J. TarlovによるJ. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 8916-8920記載の方法、ならびに、James J. StorhoffによるJ. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1959-1964記載の方法を参考にして金ナノ粒子修飾ＲＮＡアプタマーを調製する方法を述べる。金ナノ粒子（２０ｎｍφ）懸濁液に５’末端にＳＨ基を有する合成ＲＮＡアプタマーと６−メルカプト−１−ヘキサノールを添加し、１時間放置する。ここで合成ＲＮＡアプタマーと６−メルカプト−１−ヘキサノールのモル比は１：１００であるが、金ナノ粒子が凝集する場合や、合成ＲＮＡアプタマーと金ナノ粒子が結合しない場合は適宜比率を変えて最適条件を見出す。また、金粒子は凝集しやすいので、炭酸カリウム緩衝液の濃度や合成ＲＮＡアプタマーの濃度勾配ができないように攪拌しながら合成ＲＮＡアプタマーを添加する。金ナノ粒子に対して合成ＲＮＡアプタマーのモル比は、１００倍の条件で反応させる。すなわち金ナノ粒子数と合成ＲＮＡアプタマー分子数が１：１０００で反応させることになる。ＳＨ基を有する合成ＲＮＡアプタマーは化学合成する。反応後８０００Ｇで１時間遠心して、上清を捨てる。０．１ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ炭酸カリウム緩衝液（ｐＨ９）に再懸濁し、再度遠心して上清を除き、０．１ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁してストックとする。
【０１００】
（ｉｉｉ）金粒子以外のナノ粒子修飾ＲＮＡアプタマー：たとえば、クオンタムドットのようなナノ粒子は一般に無機系のナノ粒子でできている。ビオチンを導入したポリエチレングリコールで覆われている製品がたとえばＥｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からＥｖｉＦｌｕｏｒの商品名で、すでに市販されている。このようなビオチンつきのナノ粒子を用いるにはストレプトアビジンを結合したＲＮＡアプタマーを用いればよい。ストレプトアビジンを結合したＲＮＡアプタマーの調製法を述べる。上記（ｉ）の方法でマレイイミド基を５’末端に導入したＲＮＡアプタマーと２−イミノチオラン修飾によりＳＨ基を導入したストレプトアビジンをｐＨ７で混合してストレプトアビジン結合ＲＮＡアプタマーを得る。ストレプトアビジン結合ＲＮＡアプタマーとビオチンつきのナノ粒子を混合することで識別素子としてのナノ粒子標識ＲＮＡアプタマーを得ることができる。
【０１０１】
カルボキシル基を導入したナノ粒子ではカルボキシル基をカルボジイミドで活性エステルの形にして、５’アミノ化ＲＮＡアプタマーを反応させる、よく知られた方法で識別素子としてのナノ粒子修飾ＲＮＡアプタマーを得ることができる。
【０１０２】
以上、ナノ粒子修飾ＲＮＡアプタマーの調製法を述べたが、デオキシリボヌクレオチドでできたＤＮＡアプタマーの場合も、合成機でＤＮＡアプタマーを合成する時に５’末端に上記ＲＮＡアプタマーと同様にＳＨ基やアミノ基を導入することができるので、識別素子としてのフィコビリプロテイン修飾ＤＮＡアプタマー、金ナノ粒子修飾ＤＮＡアプタマー、金粒子以外のナノ粒子修飾ＤＮＡアプタマーを同様に調製することができる。
【０１０３】
ＲＮＡアプタマーは上記合成法以外にも定法に従い５’末端側にＴ７プロモータを持つ１本鎖ＤＮＡとして合成し、その後ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡに転写してもよい。
【０１０４】
細胞表面抗原ＣＤ４を標識するための標識物質としてＲＮＡアプタマーを採用し、ＲＮＡアプタマーが結合した細胞の分離回収のための識別物質としてβ−フィコエリトリンを採用して識別素子を構成した例について説明する。すなわち、細胞表面抗原ＣＤ４提示細胞を上述したβ−フィコエリトリン修飾ＲＮＡアプタマーで特異的に標識し、図１、図６、図８に示すプラスチックチップ基板１０１上に形成した細胞分離培養装置である細胞分離培養チップを用いて分離する。
【０１０５】
図１０は細胞表面抗原ＣＤ４提示細胞をβ−フィコエリトリン修飾ＲＮＡアプタマーで特異的に標識して細胞分離培養装置で分離する処理の流れを説明する図である。図１０の最上段部に試料１０中に２種類の細胞３，４が混在する様子を示す。細胞３には、黒く塗りつぶした三角で示す細胞表面抗原ＣＤ４が表れていて、これを参照符号１で示す。細胞４は、黒く塗りつぶした丸で示すＣＤ４以外の表面抗原２が細胞表面に表れている。この試料に、上述したβ−フィコエリトリン修飾ＲＮＡアプタマー１１を混合する。ＲＮＡアプタマーを参照符号５で、β−フィコエリトリンを参照符号６で示す。標識物質１１の濃度は１００ｎＭである。図１０の最上段部の試料１０から下向きに逆Ｙ字型に表示した矢印のついた線の共通部に矢印で向かう線を示したのはこれを意味するためである。
【０１０６】
この結果、細胞３の細胞表面に存在するＣＤ４抗原１には、識別物質であるβ−フィコエリトリンで修飾された標識物質ＲＮＡアプタマーが結合する。ＣＤ４以外の表面抗原２には標識物質ＲＮＡアプタマーは結合しない。標識物質ＲＮＡアプタマーを修飾する識別物質β−フィコエリトリンは５３２ｎｍのＹＡＧレーザー第２光長波で励起すると、５７５ｎｍ近傍に強い蛍光を発する。したがって、細胞分離培養チップでは、この蛍光を検出することでＣＤ４提示細胞と、そうでない細胞とを分離することができる。逆Ｙ字型に表示した矢印の先端部の参照符号１２で示すのは標識物質ＲＮＡアプタマーが結合した細胞３のグループ、参照符号１３で示すのは標識物質ＲＮＡアプタマーが結合しない細胞４のグループである。
【０１０７】
次に、細胞分離培養装置１００で培養槽２１３に収集したＣＤ４提示細胞を、培養槽２１３ごと細胞分離培養装置１００から切り取って、任意の培養器に入れ、直ちに培養器にヌクレアーゼ１４を投入して、培養槽２１３内に半透膜２８０を介して導入して、作用させる。ＲＮＡアプタマーは立体構造を形成しているので、１本鎖ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼＡのようなタイプのヌクレアーゼだけでは十分な分解ができないケースがある。１本鎖と２本鎖ＲＮＡの両方を分解する酵素を用いるのが効果的である。ここではThe Journal of Biological Chemistry 244, 5219-5225 (1969)記載のSerratia marcescens由来のヌクレアーゼを遺伝子工学的に量産した（European patent No. 0229866、 US patent No. 5,173,418）商品名Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を使用する。この酵素は、３７℃で働き、使用ｐＨレンジが６から９と中性領域であるので細胞に対して利用しやすい。高濃度のリン酸や一価の金属イオンで酵素化成が落ちるので、ここでは緩衝液として比リン酸系の緩衝液、たとえば１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含むものを用いる。リン酸系を使用せざるを得ない場合は、リン酸カリウム／ナトリウム濃度を５ｍＭに押さえ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む条件で用いる。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼの量は１０〜１００ｕ／ｍｌで使用する。あるいは、リボヌクレアーゼＡとリボヌクレアーゼＴ１の混合物を用いることもできるがSerratia marcescens由来のヌクレアーゼのほうが汎用性に富む。
【０１０８】
必要に応じて、緩衝液の代わりに血清を用いることも考えられるがこの場合は、血清中のヌクレアーゼインヒビターの影響があるケースがあるので、血清ロット毎にＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ添加量を加減する必要があるかもしれない。一般的には血清を用いる場合は１００〜４００ｕ／ｍｌで利用することでよい結果を得られる。
【０１０９】
図１０の標識物質ＲＮＡアプタマーが結合した細胞３のグループ１２の下側の矢印にヌクレアーゼの矢印が向いているのはヌクレアーゼを添加する処理を意味するものとして表示された。この処理を参照符号は１４とした。ヌクレアーゼを作用させた結果、細胞３の表面のＣＤ４抗原１に結合している標識物質ＲＮＡアプタマー６は分解される。これを図１０では分解された標識物質ＲＮＡアプタマーを点の集まりとして表示し、参照符号７で示した。ここで、参照符号１５で示すのは、細胞３、分解された標識物質ＲＮＡアプタマー７および識別物質β−フィコエリトリン６の混在したものである。
【０１１０】
次に、培養槽２１３内に半透膜２８０を介して導入され、ヌクレアーゼ１４の作用で培養槽２１３内で分解されたアプタマーは、半透膜２８０を介して排出する。この場合、ヌクレアーゼの半透膜を通しての培養槽２１３内への導入、培養槽２１３内でのアプタマーの分解および培養槽２１３から分解されたアプタマー識別物質β−フィコエリトリンの排出を促進する意味で、培養槽２１３内の投入された培養槽は、振盪タイプとするのが良い。参照符号１８は培養槽２１３内に残されて回収された表面にＣＤ４抗原１を持つ細胞３の集まりである。ここで、細胞３の参照符号を３’とし、表面ＣＤ４抗原１の参照符号を１’としたのは、細胞３にヌクレアーゼを作用させた結果、少ないとはいえ、細胞３、抗原１が何らかの影響を受けている可能性があるから、全く同じではない、と言う意味である。
【０１１１】
図１１はヌクレアーゼの添加により細胞表面に結合した識別物質β−フィコエリトリンの蛍光強度の時間変化を検討した結果を示す図である。ここでは、細胞をプレパラートの上にのせ、蛍光顕微鏡で細胞表面を観察し、細胞全体から得られる蛍光強度の積算値を観察する。ヌクレアーゼでアプタマー部分が分解されると識別物質β−フィコエリトリンが細胞表面から拡散して検出できなくなるので、細胞表面の蛍光強度を追跡することでヌクレアーゼがアプタマー部分を分解していく様子を追跡できる。図１１では横軸に時間、縦軸に一細胞からの蛍光を積算して細胞あたりの蛍光強度として表示した。細胞分離培養装置で分離したβ−フィコエリトリン修飾ＲＮＡアプタマーが結合した細胞表面ＣＤ４提示細胞（図１０に参照符号１２で示す標識物質ＲＮＡアプタマーが結合した細胞３のグループ）を蛍光顕微鏡下で細胞表面の蛍光強度（励起波長５３２ｎｍ、蛍光波長５７５ｎｍ、バンドパスフィルター使用）を経時的に追跡した結果である。蛍光退色を防ぐため、励起光を照射する時間は極力短くし、たとえば１分間インターバルで１秒だけ光照射して蛍光計測を行う。
【０１１２】
２２は蛍光強度の時間変化を示す線である。ここで、矢印２１がＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼを添加したタイミングである。励起波長５３２ｎｍの励起光の照射時間を短くしても、退色を完全に防ぐことは困難であり、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼを添加しない状態（時間領域２３）でも、蛍光強度は時間とともに若干低下する。時刻２１でＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼを添加すると、若干の時間的遅れはあるものの、細胞から検出できる蛍光強度が時間領域２４に示すように、急速に低下する。
【０１１３】
このことは、β−フィコエリトリン修飾ＲＮＡアプタマーが結合した細胞表面ＣＤ４提示細胞を細胞分離培養装置で分離する段階では、β−フィコエリトリンの識別物質としての機能には問題がなく、ヌクレアーゼが添加されると細胞表面に結合しているβ−フィコエリトリン結合ＲＮＡアプタマーのＲＮＡアプタマー部分（図１０の参照符号５）が分解し、蛍光体であるβ−フィコエリトリン６が溶液中に拡散してしまうことを表している。
【０１１４】
図１２は、培養槽２１３内で、β−フィコエリトリン結合ＲＮＡアプタマーを除去して得られた表面ＣＤ４提示細胞が培養可能であることを示す図である。横軸に時間、縦軸に細胞数を表示した。図１１の特性から、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼを添加してβ−フィコエリトリン修飾ＲＮＡアプタマーが十分なレベルで除去できたと言える時間をあらかじめ評価しておく。
【０１１５】
このように細胞標識にＲＮＡアプタマーを結合させて表面抗原を認識し、細胞標識の必要がなくなった後にリボヌクレアーゼでアプタマーを分解除去すれば、細胞標識前の分裂できる程度の自然な状態に戻すことができる。しかも、本発明では、細胞分離培養装置を用いる細胞分離により得られる細胞を、収集した培養槽ごと培養するものとするから、コンタミネーションによる汚染は確実に回避できる。
【０１１６】
次に、標識物質としてのアプタマーがＥｐＣＡＭに結合するＲＮＡタイプであり、識別物質が磁性粒子（粒径１００ｎｍ程度）を用いるケースについて説明する。血中を循環するがん由来細胞でＥｐＣＡＭを表面抗原としてもつ細胞の分離検出を目的とする。
【０１１７】
ＥｐＣＡＭに結合するＲＮＡアプタマーの調製は４０塩基からなるランダムな配列の１本鎖ＤＮＡの５’末端にＴ７プロモーター配列を含む配列番号１の２６塩基長の配列を導入し、３’末端に配列番号２の２４塩基からなるＰＣＲ用のプライミングサイトを導入した全長９０塩基長の配列を合成する。４０塩基からなるランダムな配列の５’側に導入する配列を配列番号１に示す。
TAATACGACT CACTATAGGG AGACAA：（配列番号１）
４０塩基からなるランダムな配列の３’側に導入する配列を配列番号２に示す。NTTCGACAGG AGGCTCACAA CAGG：（配列番号２）である。
【０１１８】
Ｔ７配列を用いてＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡに転写する。ＲＮＡに転写には５００μｌスケールで１００ｐmolのＤＮＡに１００μｌのＴ７ポリメラーゼを作用させる。基質は各々３ｍＭの２’−Ｆ−ＣＴＰ，２’−Ｆ−ＵＴＰ，各々１ｍＭのＡＴＰとＧＴＰで２５℃で１０時間行う。ＲＮＡ転写後ＤＮａｓｅＩでＤＮＡを分解し電気泳動で転写ＲＮＡ産物を回収する。回収した転写ＲＮＡ産物を熱変性後、２ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＥｐＣＡＭ固定セファロースＣＬ４Ｂカラムに通す。結合した転写ＲＮＡ成分を７Ｍ尿素を含む溶液で溶出させる。得られる転写ＲＮＡ成分を逆転写し両端の既知配列部分に相補な配列のプライマーペアーでＰＣＲ増幅する。得られるＰＣＲ産物を再度Ｔ７プロモータで転写し同様にＥｐＣＡＭ固定セファロースＣＬ４Ｂカラムで捕捉し、結合した転写ＲＮＡ成分を回収する。転写−捕捉−回収−ＰＣＲ増幅の工程を１５回繰り返し、ＥｐＣＡＭに特異的に反応するＲＮＡアプタマーを得る。
【０１１９】
得られるアプタマーにNucleic Acids Research 26,3915-3924 (1998)記載の論文「Staining of cell surface human CD4 with 3’-F-pyrimidine-containing RNA aptamers for flow cytometry」記載の方法のインビトロトランスクリプションでアプタマーの５’末端にはチオリン酸基を挿入する。このチオリン酸基にヨードアセチル基を導入したビオチンを反応させ、５’ビオチン化ＲＮＡアプタマーを得る。ストレプトアビジンコンジュゲート磁気ビーズを反応させ、識別物質が磁性粒子のＥｐＣＡＭに特異的に反応するＲＮＡアプタマーを得る。
【０１２０】
ＥｐＣＡＭ陽性のがん細胞へのＲＮＡアプタマー標識磁性粒子の反応を説明する。血液１０ｍｌを５倍容の培養液に懸濁し、ＥｐＣＡＭに対応するＲＮＡアプタマー標識磁性粒子を添加し、３０分間緩やかに攪拌する。懸濁液を内径２ｍｍのチューブに通し、チューブに１ｃｍおきで配したネオジウム系磁石のアレーで穴の磁性粒子を捕捉する。回収した磁性粒子を培養液で洗浄し、実施例１の細胞分離培養装置で細胞を分離する。このとき、細胞に磁性粒子が結合したものを分離する。分離の判断は画像を基礎とした形状認識による。上述したように、細胞分離培養装置１００で分離収集した細胞は、培養槽２１３に収集した細胞を、培養槽２１３ごと細胞分離培養装置１００から切り取って、任意の培養槽に入れ、直ちに培養槽にＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼを添加し、アプタマー部分を分解し、生細胞を得る。培養槽２１３内に半透膜２８０を介して導入され、ヌクレアーゼ１４の作用で培養槽２１３内で分解されたアプタマーは、半透膜２８０を介して排出する。この場合、ヌクレアーゼの半透膜を通しての培養槽２１３内への導入、培養槽２１３内でのアプタマーの分解および培養槽２１３から分解されたアプタマー識別物質β−フィコエリトリンの排出を促進する意味で、培養槽２１３内の投入された培養槽は、振盪タイプとするのが良い。がん細胞であれば長期培養に耐えることができ、培養槽２１３内で程なく分裂を開始する細胞も現れる。
【０１２１】
一般に造血系細胞以外の血液中に循環する生細胞は、がん由来細胞がほとんどである。血内では生きたまま血管内皮表面から剥がれることはないし、剥がれたとしても血中内で防御機構が働き分解されてしまう。これに対して、がん細胞は生きたまま剥がれ落ちるし、血中内でも抵抗を示し、生きたまま血管内を循環する。しかし、量的には少なく、生検には向かない。血液中に循環するがん由来細胞を濃縮して、一定期間培養することができればがんの部位を特定することはできないが体のどこかに病巣があることを知ることができる。
【０１２２】
なお、前記識別素子の識別物質を粒子あるいは磁気粒子とした場合、前記識別素子の標識物質が結合した細胞の識別に粒子像ないし散乱光検出あるいは磁気検出を用いることができる。
【０１２３】
（細胞培養器の例）
図１３は、細胞培養器の例を説明する概略図である。３５０は培養器である。細胞分離培養装置のチップ基板１０１の培養槽２１３，２１４の部分をチップ基板１０１ごと切り取って、培養器３５０の中に入れた状態を示す。培養槽２１３，２１４は、ラック３５１に載せられて培養器３５０内に置かれる。図では５段の架台を備えたラックの例を示す。培養器３５０には、ＣＯ２５％を含む空気の供給パイプ３５４と培地３５２の供給パイプ３５５が設けられる。それぞれのパイプには開閉弁が設けられている。培養槽２１３，２１４を培養器３５０の中に入れて分離された細胞の培養をするためには、ラック３５１が必要と言うわけではなく、培養槽２１３，２１４が、適宜投入された形でも良い。
【０１２４】
図１４（Ａ）−（Ｃ）は、培養槽２１３，２１４を細胞分離培養装置１００のチップ基板１０１ごとチップ基板１０１から切り離すための処理の例を説明する図である。図１４（Ａ）は、図１に示す細胞分離培養装置１００の培養槽２１３，２１４とこれを取り巻くリザーバ２８５の部分のみを示す平面図である。一点鎖線３００は、培養槽２１３，２１４をチップ基板１０１ごと切り離すための切断位置を示す線である。図１４（Ｂ）は、図１４（Ａ）のＣ−Ｃの位置で矢印方向に見た切断操作中の断面図、図１４（Ｃ）は、図１４（Ａ）のＤ−Ｄの位置で矢印方向に見た切断操作中の断面図である。
【０１２５】
培養槽２１３，２１４を切り離すときはリザーバ２８５内の緩衝液（培地）は抜き取っておいた方が良い。この場合でも、培養槽２１３，２１４内の緩衝液（培地）は、分離操作を終えた段階の状態と同じであり、内部には、分離収集された細胞と緩衝液（培地）が存在する。２８９は切断歯であり、切断歯２８９の切っ先が図１４（Ａ）の一点鎖線３００と同じになるように形成される。また切断歯２８９の切っ先の先鋭度は、６０°〜１３０°程度の比較的大きい角度にされる。これは、切断歯２８９の温度を８０℃から１１０℃程度に加熱しながらチップ基板１０１を押しつぶす感じで切断するためである。すなわち、この培養槽２１３，２１４を切り離すときの操作で、培養槽２１３，２１４に連通している流路２１８，２１９を閉塞する必要があるからである。図１４（Ｃ）に示したように、Ｄ−Ｄの位置で矢印方向に見た断面では、流路２１８が長い開口のように見える。この位置で切断歯２８９の先端部分がチップ基板１０１に押し付けられると、ラミネートフィルム４１０は切断歯２８９の先端部分の斜面に添って押し上げられた形となり、流路２１８を閉塞する。流路２１８，２１９のような開口部の無いところでは、図１４（Ｂ），（Ｃ）に示したように、切断歯２８９の先端部分により、切り取られる。
【０１２６】
（光学系の例）
図１５は、細胞検出領域２２１の光学系の概要を示す概念図である。細胞分離培養装置のチップ基板１０１の上面に細胞に光を照射するための光源２５とフイルタ２６を配置する。チップ基板１０１の下面に、細胞に照射された照射光の検出系を示す。ここでは、図２を参照して分るように、細胞検出領域２２１から細胞分離領域２２２を経由して流路２１８への流路に沿った断面として示す。細胞は、図１０で説明したように蛍光染料、あるいは、細胞を金粒子またはナノ粒子で修飾される。
【０１２７】
細胞検出領域２２１の流路２１８を流れる細胞はフイルタ２６を通して光源２５により光を照射される。光を照射された細胞の画像は対物レンズ４４を介して検出され、ダイクロイックミラー４５、フイルタ４６、レンズ４７を通してＣＣＤカメラ４８で画像として捉えられる。ＣＣＤカメラ４８に得られる画像データは画像処理機能を持つコンピュータ６０に送られ、細胞の画像データと、予め準備されている検出すべき細胞に関する画像データと照合される。コンピュータ６０は、ＣＣＤカメラ４８に得られた画像データが予め準備されている検出すべき細胞に関する画像データと所定の関係にあると判定したときは、出力７０を送出し、これにより、細胞分離培養装置１００のスイッチ２１６をオンとして、細胞分離領域２２２において、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に電圧を印加して、細胞に力を作用させる。この際、流路を流下する細胞の移動速度（流路２４７を流れる緩衝液の流速）を別途検出しておき、細胞検出領域２２１において評価した細胞が細胞分離領域２２２を流下するタイミングで電圧を印加するのは当然である。
【０１２８】
一方、細胞が蛍光染料で修飾されていれば、これに応じて、光を照射された細胞の蛍光が対物レンズ４４を介して検出され、ダイクロイックミラー４５は通過して、反射ミラー５１、蛍光フイルタ５２、レンズ５３を通してホトマルチプライア５４で光点として捉えられる。あるいは、細胞が金粒子またはナノ粒子で修飾されていれば、これに応じて、レーザ光を照射された細胞の散乱光が対物レンズ４４を介して検出される。この場合蛍光フイルタ５２は除外されて、ダイクロイックミラー４５は通過して、反射ミラー５１、レンズ５３を通してホトマルチプライア５４で光点として捉えられる。ホトマルチプライア５４に得られる光点は光処理機能を持つコンピュータ６０に送られ、所定の修飾のなされた細胞か否か判定される。コンピュータ６０は、ホトマルチプライアに得られた光点が所定の修飾のなされた細胞によるものと判定したときは、出力７０を送出し、これにより、細胞分離培養装置１００のスイッチ２１６をオンとして、細胞分離領域２２２において、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に電圧を印加して、細胞に力を作用させる。この際、流路を流下する細胞の移動速度（流路２４７を流れる緩衝液の流速）を別途検出しておき、細胞検出領域２２１において評価した細胞が細胞分離領域２２２を流下するタイミングで電圧を印加するのは当然である。
【０１２９】
ここで、ＣＣＤカメラ４８を光子カウンターあるいはホトマルチプライアとした場合には、細胞あるいは細胞に結合した金粒子またはナノ粒子が発する散乱光強度を連続計測して、その強度の変化に基づいて光処理機能を持つコンピュータ６０に送られ、所定の細胞か否か判定させることもできる。また、ホトマルチプライア５４を、蛍光観察が可能な光電子倍増カメラとした場合には、細胞のどの領域が蛍光標識されたかを画像取得して、それに基づいて光処理機能を持つコンピュータ６０に送られ、予め準備されている検出すべき細胞に関する画像データと比較することで、より厳密に所定の修飾のなされた細胞か否か判定させることもできる。
【０１３０】
ここで、画像による処理と、蛍光あるいは散乱光による処理とを併用してもよいことは言うまでもない。また、カメラ４８で得られた画像データはコンピュータのモニターに表示して、使用者の観察に供することもできる。
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110> Onchip Cellomics Consortium
<120> Cell segregating method, cell identifying method, and cell checking method
<130> NT06P0677
<160> 2
<210> 1
<211> 26
<212> DNA 
<213> Artificial Sequence
<220>
<221>
<223> Synthesized DNA
<400> 1
taatacgact cactataggg agacaa           26
<210> 2
<211> 24
<212> DNA 
<213> Artificial Sequence
<220>
<221>
<223> Synthesized DNA
<400> 1
nttcgacagg aggctcacaa cagg           24
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】本発明の細胞分離培養装置のシステム構成の１例を模式的に示す平面図である。
【図２】マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液に、マイクロ流路２０５，２０５’の緩衝液が合流して、マイクロ流路２４０を流下し、細胞検出領域２２１の直前で、マイクロ流路２０４’を流下する緩衝液と合流してマイクロ２４０を流下する状況を説明する図である。
【図３】（Ａ）は、流路２０４を流下する緩衝液が流路２０５，２０５’を流下する緩衝液によって中央部に押しやられた結果の合流後の流路２４０の細胞分布を示す図である。
【図４】（Ａ）、（Ｂ）は流路の幅を広くすることに伴う問題と、その解決案の例を示す断面図である。
【図５】（Ａ）は、図４で説明したリザーバ２０３と開口２０１，２０１’および流路２０４，２０４’の部分をより詳細に説明するために、図１のＡ−Ａ位置において、矢印方向に見た断面図、（Ｂ）は培養槽２１３，２１４と、開口２１１，２１２、流路２１８，２１９、半透膜２８０および流路の出口側のリザーバ２８５の部分をより詳細に説明するために、図１のＢ−Ｂ位置において、矢印方向に見た断面図である。
【図６】ゲル電極部分が異なった構造とされた細胞分離培養装置のシステム構成を平面図の形で示す図である。
【図７】ＣＣＤカメラで取り込まれた画像から細胞を認識し、それぞれの細胞をナンバリングして識別するアルゴリズムを説明する図である。
【図８】図１に示す構成と比較して試料細胞の導入に工夫を施した細胞分離培養装置のシステム構成の１例を模式的に示す平面図である。
【図９】（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）は、図８の試料細胞の導入部における工夫を説明するための部分的な断面図である。
【図１０】細胞表面抗原ＣＤ４提示細胞をβ−フィコエリトリン修飾ＲＮＡアプタマーで特異的に標識して細胞分離培養装置で分離する処理の流れを説明する図である。
【図１１】ヌクレアーゼの添加が識別物質β−フィコエリトリンの蛍光強度に及ぼす影響を検討した結果を示す図である。
【図１２】β−フィコエリトリン結合ＲＮＡアプタマーを除去して得られた表面ＣＤ４提示細胞が培養可能であることを示す図である。
【図１３】培養槽２１３，２１４に収集された細胞の培養のための培養器を説明する概略図である。
【図１４】（Ａ）−（Ｃ）は培養槽２１３，２１４を細胞分離培養装置のチップ基板ごと切り取るための概要を説明する図である。
【図１５】細胞検出領域２２１の光学系の概要を示す概念図である。
【符号の説明】
【０１３２】
１…細胞表面抗原ＣＤ４、２…ＣＤ４以外の表面抗原、３，４…細胞、５…ＲＮＡアプタマー、６…β−フィコエリトリン、１０…試料、１１…β−フィコエリトリン修飾ＲＮＡアプタマー、１２…標識物質ＲＮＡアプタマーが結合した細胞３のグループ、１３…標識物質ＲＮＡアプタマーが結合しない細胞４のグループ、１５…細胞３と分解された標識物質ＲＮＡアプタマー７と識別物質β−フィコエリトリン６が混在したもの、１６…細胞３の回収処理、１７…分解物、１８…回収された表面にＣＤ４抗原１を持つ細胞３の集まり、１００…細胞分離培養装置、１０１…基板、１０６，１０７…配線、２００…緩衝液、２０１，２０１’，２０２，２０２’，２０６，２０７…穴、２０６’，２０７’…空気抜き、２０３，２１３，２１４…リザーバ、２０４，２０４’，２０５，２０５’，２４０，２１８，２１９，２４７…流路、２０８，２０９…マイクロ構造、２１５…電源、２１６…スイッチ、２２１…細胞検出領域、２２２…細胞分離領域、２３０…フイルタ、２４１，２４２…連結部、２５０…壁、２６０…溝、３５０…培養槽、２８７…コラーゲン、ポリリジン、あるいは、フィブロネクチンの層、３５２…細胞の培養のための培地、４１０…ラミネートフィルム、４２１，４２２，４２３…細胞像。
【図１】
2008005749.tif 000003
【図２】
2008005749.tif 000004
【図３】
2008005749.tif 000005
【図４】
2008005749.tif 000006
【図５】
2008005749.tif 000007
【図６】
2008005749.tif 000008
【図７】
2008005749.tif 000009
【図８】
2008005749.tif 000010
【図９】
2008005749.tif 000011
【図１０】
2008005749.tif 000012
【図１１】
2008005749.tif 000013
【図１２】
2008005749.tif 000014
【図１３】
2008005749.tif 000015
【図１４】
2008005749.tif 000016
【図１５】
2008005749.tif 000017