(57)【要約】【課題】境界膜を備える３次元物体において境界膜の内側の観察を可能にする。【解決手段】境界膜を展開するため、境界膜と、この境界膜に囲まれて外界から隔てられる内部物質とからなる３次元物体を支持体の上に静置する。次に、フェムト秒レーザ光を前記境界膜の内部または膜自体を焦点として集光して、集光により生ずる３次元物体内部の空洞膨張により、境界膜を開裂させるとともに支持体に押しつけて、境界膜を支持体上に面状に展開する。こうして得られた境界膜展開体は、支持体と、この支持体の上の１以上の箇所にそれぞれ配置された１以上の面状膜とからなり、各々の面状膜は、３次元物体の前記境界膜が２次元的に展開された膜である。【選択図】図１
2008022819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
境界膜と、前記境界膜に囲まれて外界から隔てられる内部物質とからなる３次元物体を支持体の上に静置し、
次に、フェムト秒レーザ光を前記境界膜の内部または膜自体を焦点として集光して、集光により生ずる前記３次元物体内部の空洞膨張により、境界膜を開裂させるとともに前記支持体に押しつけて、前記境界膜を前記支持体上に面状に展開する、境界膜展開方法。
【請求項２】
前記支持体が平板であることを特徴とする請求項１に記載された境界膜展開方法。
【請求項３】
前記支持体が突起部を備え、前記突起部の頂の上に前記境界膜を静置することを特徴とする請求項１に記載された境界膜展開方法。
【請求項４】
前記支持体が、開口部を有する管であり、管の内面に３次元物体が静置されることを特徴とする請求項１に記載された境界膜展開方法。
【請求項５】
前記３次元物体は細胞であり、前記境界膜は生体膜であることを特徴とする請求項１に記載された境界膜展開方法。
【請求項６】
前記３次元物体は細胞核を含む細胞小器官であり、前記境界膜は生体膜であることを特徴とする請求項１に記載された境界膜展開方法。
【請求項７】
前記３次元物体は、人工的に構築された膜構造物であり、前記境界膜は高分子合成膜から構成されることを特徴とする請求項１に記載された境界膜展開方法。
【請求項８】
前記３次元物体は、人工的に構築された膜構造物と細胞との融合物であり、前記境界膜は高分子合成膜と生体膜との混合膜から構成されることを特徴とする請求項１に記載された境界膜展開方法。
【請求項９】
前記３次元物体は、人工的に構築された膜構造物と、細胞核を含む細胞小器官との融合物であり、前記境界膜は高分子合成膜と生体膜との混合膜から構成されることを特徴とする請求項１に記載された境界膜展開方法。
【請求項１０】
前記３次元物体は、複数の細胞が融合した融合細胞であり、前記境界膜は生体膜であることを特徴とする請求項１に記載された境界膜展開方法。
【請求項１１】
前記支持体は、前記３次元物体を吸引により静置するための開口を備えることを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載された境界膜展開方法。
【請求項１２】
前記支持体は、前記３次元物体を化学結合により固着して静置することを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載された境界膜展開方法。
【請求項１３】
境界膜と、境界膜に囲まれて外界から隔てられる内部物質とからなる３次元物体を静置するための支持体を載せることができ、支持体を３次元方向に移動可能な駆動体と、
前記３次元物体を透過する波長のフェムトレーザ光を発生し、前記駆動体の上の前記支持体に静置された前記３次元物体に導く光源と、
前記駆動体の上の前記支持体上の３次元物体を観察する光学結像装置と、
前記駆動体の上の前記支持体上の３次元物体のみに光を照射可能な光照射器と、前記支持体上の３次元物体を透過した、前記光照射器からの光を検出可能な位置に設置される光検出器とを含む泡検知装置と
を備えた境界膜展開装置。
【請求項１４】
さらに、前記光検出器から検出信号を入力し、所望の照射位置へ駆動体を移動する駆動体制御器を備えることを特徴とする、請求項１３に記載された境界膜展開装置。
【請求項１５】
支持体と、
この支持体の上の１以上の箇所にそれぞれ配置された１以上の面状膜とからなり、
各々の面状膜は、境界膜と前記境界膜により囲まれて外界から隔てられる内部物質とからなる３次元物体の前記境界膜が２次元的に展開された膜である
境界膜展開体。
【請求項１６】
前記支持体は、前記３次元物体を静置するための１以上の開口部を備え、各開口部は、前記３次元物体が当該開口部を通るときに前記３次元物体を捕らえる形状を備えることを特徴とする請求項１５に記載された境界膜展開体。
【請求項１７】
前記３次元物体が磁性体であり、前記支持体は、前記３次元物体を磁力により静置するための１以上の磁石を備え、各磁石は、前記３次元物体が当該磁石を通るときに捕らえる磁場を備えることを特徴とする請求項１５に記載された境界膜展開体。
【請求項１８】
前記支持体は、前記３次元物体を静電吸着により静置するための１以上の静電気発生チャックを備え、各チャックは、前記３次元物体が当該チャックを通るときに捕らえる電場を備えることを特徴とする請求項１５に記載された境界膜展開体。
【請求項１９】
前記支持体は、表面に、前記３次元物体を化学結合により固着するための１以上の区画を備え、各区画は、前記３次元物体と化学結合可能な官能基を備えることを特徴とする請求項１５に記載された境界膜展開体。
【請求項２０】
１以上の開口部を平板と、
この平板の前記開口部を覆って配置された１以上の面状膜と、
前記平板の一方の側に設けた第１の空間と、
前記平板の他方の側に設けた第２の空間とからなり、
各々の面状膜は、境界膜と前記境界膜により囲まれて外界から隔てられる内部物質とからなる３次元物体の前記境界膜が２次元的に展開された膜であり、前記開口部では、前記面状膜が第１空間と第２空間の境界であることを特徴とする境界膜展開体。
【請求項２１】
前記面状膜は生体膜であり、２次元的に展開された状態でも生物学的機能を維持していることを特徴とする請求項１５から２０のいずれかに記載された境界膜展開体。
【請求項２２】
前記面状膜は高分子合成膜であり、２次元的に展開された状態でも、前記３次元物体が人工的に構築された膜構造物であったときと同様の機能を維持していることを特徴とする請求項１５から２０のいずれかに記載された境界膜展開体。
【請求項２３】
前記面状膜は高分子合成膜と生体膜との融合膜との混合膜であり、２次元的に展開された状態でも、前記３次元物体が人工的に構築された膜構造物と細胞との融合物であったときと同様の機能を維持していることを特徴とする請求項１５から２０のいずれかに記載された境界膜展開体。
【請求項２４】
前記面状膜は高分子合成膜と生体膜との融合膜との混合膜であり、２次元的に展開された状態でも、前記３次元物体が人工的に構築された膜構造物と核膜を含む細胞小器官との融合物であったときと同様の機能を維持していることを特徴とする請求項１５から２０のいずれかに記載された境界膜展開体。
【請求項２５】
前記３次元物体は細胞であり、前記境界膜は生体膜であることを特徴とする請求項１５から２０のいずれかに記載された境界膜展開体。
【請求項２６】
前記３次元物体は、核膜を含む細胞小器官であり、前記境界膜は生体膜であることを特徴とする請求項１５から２０のいずれかに記載された境界膜展開体。
【請求項２７】
前記３次元物体は、人工的に構築された膜構造物であり、前記境界膜は高分子合成膜から構成されることを特徴とする請求項１５から２０のいずれかに記載された境界膜展開体。
【請求項２８】
前記３次元物体は、人工的に構築された膜構造物と細胞との融合物であり、前記境界膜は高分子合成膜と生体膜との混合膜から構成されることを特徴とする請求項１５から２０のいずれかに記載された境界膜展開体。
【請求項２９】
前記３次元物体は、人工的に構築された膜構造物と細胞核を含む細胞小器官との融合物であり、前記境界膜は高分子合成膜と生体膜との混合膜から構成されることを特徴とする請求項１５から２０のいずれかに記載された境界膜展開体。
【請求項３０】
前記３次元物体は複数の細胞が融合した融合細胞であり、前記境界膜は生体膜であることを特徴とする請求項１５から２０のいずれかに記載された境界膜展開体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、細胞核を含む細胞小器官などの天然物または人工物の単一体の境界膜を観察する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
単一体の細胞、細胞核を含む細胞小器官などは、３次元構造の境界膜と、境界膜により外界から隔てられる内部物質とからなる３次元的物体である。細胞膜や核膜を含む生体膜などの境界膜は、閉じた曲面を構成する３次元構造物であり、その内側の物質を外界から隔てている。たとえば、細胞は、境界膜、その内側にある細胞質及び細胞小器官からなる。また、核は、核膜及びその内側にある核質からなる。境界膜の外側からは、境界膜の内側の構造（裏打ち）は見えない。境界膜と表面構造の関係の例として、細胞膜や核膜の膜タンパク質の異常と疾病との関係が知られている。癌細胞では膜タンパク質が増加し、筋ジストロフィーでは核膜ラミナが異常化する。しかし、そのような異常を外部から走査（可視化や操作）することができない例がある。それは、癌細胞の膜タンパク質に関しては、走査の対象であるタンパク質膜外部分が、走査の前に切断（シェディング）を受けて失われることである。同様に、核膜ラミナに関しては、走査の対象である裏打ちタンパク質が核膜により隔絶されているために、走査のための探針や観察光が到達しないことである。
【０００３】
細胞膜の内側に存在する癌マーカータンパク質は免疫染色法を用いて検出されている（ハーセプチンを使った乳癌および肺癌指標タンパク質のｅｒｂＢ２の検出など）。細胞膜の外側に露出している領域からでは検出が難しいため、組織切片について免疫染色を用いて検出が行われている(Cheng et al., Virchows Arch. 446, 596(2005))。しかし、この方法では、癌マーカータンパク質は、細胞膜全体ではなく、輪切りにした細胞切片における局所断面でしか検出されない。また、培養した細胞膜画分を可溶化し、タンパク質の定量や検出を行うことが報告されている（Wu, Clinica Chimica Acta 322, 11 (2002))。しかし、この方法では、多量のサンプルや調製の手間が必要であるうえ、細胞膜の面積あたりどの程度局在しているかといった定量的情報が得られない。
【０００４】
たとえば、パッチクランプ法においては、細胞膜の一部を面状として捉えて利用されている（たとえば老木成稔ら著、「新パッチクランプ実験技術法」、吉岡書店、2001年、208-215頁）。この方法では、微細なガラス細管を使って細胞膜の一部を吸い込み、ガラスを絶縁体、吸い込まれた細胞膜を誘電体として、両者の間の電位差を計測している。吸い込まれた細胞膜がガラス細管の口径部円周にそって切り抜かれると、管の口に膜が付着したまま残存し、その結果、膜が平面展開される。しかしながら、口径部に膜を展開するためには職人的技術が要求される。また、パッチクランプは本来、電位測定のための技術であるため、膜の裏打ち構造は可視化されない。
【０００５】
また、Frankelらの論文（Biophys. J. 90, 2404 (2006)）では、細胞の内側を観察する目的で、細胞膜を２枚のカバーガラスで挟み、続いてカバーガラスを剥がす。このとき、カバーガラスの表面に付着した細胞膜が機械的に引きちぎられ、あるいは、カバーガラスの間の液体の表面張力を受けた細胞が剪断を受けて、細胞膜が断片化してカバーガラス上に残る。この剥離式露出により、膜の内側が外部に提示される。しかしながら、細胞のような１０μｍ径の微小な３次元構造物の表面を、カバーガラスのような１０ｍｍ角の巨大な平板面を用いて引きちぎる、あるいは、剪断を付与することは困難である。なぜなら、２枚のガラス面を重ね合わせても、細胞のサイズや気固液界面のサイズよりも大きな隙間が生じるからである。したがって、この剥離式露出方法による平面膜展開は、再現性が低かった。さらに、境界膜は２枚の板によって引き裂かれるため、膜はそれぞれの板表面上で２分配される。つまり、境界膜全体が１枚の板の上に保持されないため、膜の内側の観察には不都合である。
【０００６】
また、タンパク質を固定した平板が特表2005-515402号公報において提案されている。このタンパク質固定板では、はじめに、平板上に特殊な表面修飾を施した作成場を用意し、次に、細胞膜の構成物質を作成場に添加して膜構造物（膜タンパク質など）を再構築する。
【０００７】
なお、本発明では、後で説明するようにフェムト秒レーザを用いるが、フェムト秒レーザ技術は生体材料にも応用されている。たとえば、レーザパルスを照射することにより、２μｍ径サイズの微小な細胞小器官であるミトコンドリア個々をアブレーション（溶発）させるために、または、神経繊維などの生体組織を１μｍ以下の細い線幅で融解しながら切開するために用いられる(Samuel et al., Proc. SPIE, 6108, 610801-1 (2006))。さらには、細胞の膜に瞬時にふさがる可逆的な１μｍ以下の大きさの穴を開けて、その穴が開いているわずかな時間にその穴を通して細胞外から細胞内へ遺伝子を導入することも報告されている（Tirlapur &  Konig, Nature 418, 290 (2003)）。このようにフェムト秒レーザの利用においては、微小な特定の物体がレーザ照射の標的であり、レーザ特性のもつ化学的融除力によって標的物体のみが意図的に融除される。すなわち、従来のフェムト秒レーザ照射に関して、用途は、経時可逆的もしくは不可逆的な溶発に限定されており、加工範囲は、微小な領域に制限されている。
【非特許文献１】Chen-Mei Cheng et al., Virchows Arch. 446, 596 (2005)
【非特許文献２】James T. Wu, Clinica Chimica Acta 322, 11 (2002)
【非特許文献３】Aravinthand D. T. Samuel et al., Proc. SPIE, 6108, 610801-1 (2006)
【非特許文献４】Uday K. Tirlapur & Karsten Konig, Nature 418, 290 (2003)
【非特許文献５】老木成稔ら著、「新パッチクランプ実験技術法」、吉岡書店、2001年、208-215頁
【非特許文献６】D. J. Frankel et al., Biophys. J. 90, 2404 (2006)
【特許文献１】特表２００５−５１５４０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
細胞などの単一体において、細胞膜などの境界膜の外側から境界膜の内側の構造を、走査（可視化や操作）することは困難である。従来は、細胞膜を含む生体膜等の天然の境界膜のみならず、リポソーム小胞膜などの人工膜においても、その内面を観察した例はなかった。しかし、たとえば、細胞膜内にある膜裏打ちタンパク質を観察できれば、たとえば、疾病における膜裏打ちタンパク質の分子メカニズムの研究を促進する。また、さらに、医療診断マーカーとして膜裏打ちタンパク質が検出できる。さらには、高分子合成膜内にある人工構造物を観察できれば、たとえば薬剤の品質検査や性能評価ができる。さらには、高分子合成膜と生体膜との混合膜内ある細胞膜と高分子合成膜との融合物を観察できれば、ドラックデリバリーシステムの開発を推進する。したがって、境界膜の内部の構造を提示可能にすることが望まれる。
【０００９】
本発明の目的は、境界膜を備える３次元物体において境界膜の内側の観察を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る境界膜展開方法では、境界膜と、前記境界膜に囲まれて外界から隔てられる内部物質とからなる３次元物体を支持体の上に静置する。次に、フェムト秒レーザ光を前記境界膜の内部または膜自体を焦点として集光して、集光により生ずる前記3次元物体内部の空洞膨張により、境界膜を開裂させるとともに前記支持体に押しつけて、前記境界膜を前記支持体上に面状に展開する。
【００１１】
前記境界膜展開方法において、たとえば、前記支持体が平板である。または、たとえば、前記支持体が突起部を備え、前記突起部の頂の上に前記境界膜を静置する。または、たとえば、前記支持体が、開口部を有する管であり、管の内面に３次元物体が静置される。
【００１２】
前記境界膜展開方法において、たとえば、前記３次元物体は細胞であり、前記境界膜は生体膜である。または、たとえば、前記３次元物体は細胞核を含む細胞小器官であり、前記境界膜は生体膜である。または、たとえば、前記３次元物体は、人工的に構築された膜構造物であり、前記境界膜は高分子合成膜から構成される。または、たとえば、前記３次元物体は、人工的に構築された膜構造物と細胞との融合物であり、前記境界膜は高分子合成膜と生体膜との混合膜から構成される。または、たとえば、前記３次元物体は、人工的に構築された膜構造物と、細胞核を含む細胞小器官との融合物であり、前記境界膜は高分子合成膜と生体膜との混合膜から構成される。または、たとえば、前記３次元物体は、複数の細胞が融合した融合細胞であり、前記境界膜は生体膜である。
【００１３】
前記境界膜展開方法において、たとえば、前記支持体は、前記３次元物体を吸引により静置するための開口を備える。または、たとえば、前記支持体は、前記３次元物体を化学結合により固着して静置する。
【００１４】
本発明に係る境界膜展開装置は、境界膜と、境界膜に囲まれて外界から隔てられる内部物質とからなる３次元物体を静置するための支持体を載せることができ、支持体を３次元方向に移動可能な駆動体と、前記３次元物体を透過する波長のフェムトレーザ光を発生する光源と、前記光源により発生されたフェムトレーザ光を前記駆動体の上の前記支持体に静置された前記３次元物体に導く第１光学系と、前記駆動体の上の前記支持体上の３次元物体を観察する光学結像装置と、前記駆動体の上の前記支持体上の３次元物体の像を前記光学結像装置に導く第２光学系とからなり、前記第１光学系と前記第２光学系が部分的に共用される。好ましくは、さらに、前記支持体に静置された境界膜に液体を供給する供給装置を備える。
【００１５】
本発明に係る境界膜展開体は、支持体と、この支持体の上の１以上の箇所にそれぞれ配置された１以上の面状膜とからなる。各々の面状膜は、境界膜と前記境界膜により囲まれて外界から隔てられる内部物質とからなる３次元物体の前記境界膜が２次元的に展開された膜である。
【００１６】
前記境界膜展開体において、たとえば、前記支持体は、前記３次元物体を静置するための１以上の開口部を備え、各開口部は、前記３次元物体が当該開口部を通るときに前記３次元物体を捕らえる形状を備える。または、たとえば、前記３次元物体が磁性体であり、前記支持体は、前記３次元物体を磁力により静置するための１以上の磁石を備え、各磁石は、前記３次元物体が当該磁石を通るときに捕らえる磁場を備える。または、たとえば、前記支持体は、前記３次元物体を静電吸着により静置するための１以上の静電気発生チャックを備え、各チャックは、前記３次元物体が当該チャックを通るときに捕らえる電場を備える。または、たとえば、前記支持体は、表面に、前記３次元物体を化学結合により固着するための１以上の区画を備え、各区画は、前記３次元物体と化学結合可能な官能基を備える。
【００１７】
本発明に係る境界膜展開体、１以上の開口部を平板と、この平板の前記開口部を覆って配置された１以上の面状膜と、前記平板の一方の側に設けた第１の空間と、前記平板の他方の側に設けた第２の空間とからなる。ここで、各々の面状膜は、境界膜と前記境界膜により囲まれて外界から隔てられる内部物質とからなる３次元物体の前記境界膜が２次元的に展開された膜であり、前記開口部では、前記面状膜が第１空間と第２空間の境界である。
【００１８】
前記境界膜展開体において、たとえば、前記面状膜は生体膜であり、２次元的に展開された状態でも生物学的機能を維持している。または、たとえば、前記面状膜は高分子合成膜であり、２次元的に展開された状態でも、前記３次元物体が人工的に構築された膜構造物であったときと同様の機能を維持している。または、たとえば、前記面状膜は高分子合成膜と生体膜との融合膜との混合膜であり、２次元的に展開された状態でも、前記３次元物体が人工的に構築された膜構造物と細胞との融合物であったときと同様の機能を維持している。または、たとえば、前記面状膜は高分子合成膜と生体膜との融合膜との混合膜であり、２次元的に展開された状態でも、前記３次元物体が人工的に構築された膜構造物と核膜を含む細胞小器官との融合物であったときと同様の機能を維持している。
【００１９】
前記境界膜展開体において、たとえば、前記３次元物体は細胞であり、前記境界膜は生体膜である。または、たとえば、前記３次元物体は核膜を含む細胞小器官であり、前記境界膜は生体膜である。または、たとえば、前記３次元物体は人工的に構築された膜構造物であり、前記境界膜は高分子合成膜から構成される。または、たとえば、前記３次元物体は、人工的に構築された膜構造物と細胞との融合物であり、前記境界膜は高分子合成膜と生体膜との混合膜から構成される。または、たとえば、前記３次元物体は、人工的に構築された膜構造物と細胞核を含む細胞小器官との融合物であり、前記境界膜は高分子合成膜と生体膜との混合膜から構成される。
【発明の効果】
【００２０】
境界膜を備える３次元物体において境界膜の内面が面状に展開できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、添付の図面を参照して発明の実施の形態を説明する。
生体膜を含む境界膜の内面上の構造（たとえば膜裏打ちタンパク質）は、外部から可視したり操作したりする走査ができない。３次元構造を持つ境界膜の内面を平面状に展開できると、膜内側の構造物の本来の構造と機能が外側に提示され、境界膜の内面上の構造の走査が簡便となる。このため、本発明では、支持体の表面に境界膜を静置し、次に、フェムト秒レーザ光を境界膜の内部または膜自体を焦点として集光して、境界膜を開裂して、平面膜として支持体上に展開する。フェムト秒レーザ光の照射条件（光強度、パルス幅、発射数）は、境界膜を開裂可能な程度に設定する。
【００２２】
この発明について以下でさらに詳しく説明する。以下では主に細胞膜を例として説明する。
図１は、細胞膜の面状展開の状況を図式的に示す。まず、細胞を静置するための平らな面を有する支持材（たとえばガラス板１０）の上に細胞１２を静置する。図において細胞１２は２重丸で表されている。なお、支持体は、必ずしも平板でなくてもよく、図２のような突起部の頂（たとえばカンチレバー１６の先端１８）、あるいは、図３のような管の開口部（たとえばピペット２０の口２２）を含む。なお、突起部の形状は多角柱に限らない。また、管の形状は円錐形に限らない。図２の例では、細胞１２は先端１８に静置され、図３の例では、細胞１２は口２２に静置される。次に、フェムト秒レーザ光を細胞１２の内部に照射して、細胞膜をガラス板１０の上、先端１８の上または口２２の近傍及び内面に平面膜状に展開する。図において、展開された細胞膜１４は、多角形で表されている。同様に、図４は、平板１０の上に複数の細胞１２をアレイ状に静置する場合を示している。複数の細胞が密集していると、平面膜状に展開した場合に、それぞれの細胞膜が重なってしまう。したがって、複数の細胞１２を、展開された細胞膜が重ならないように間隔をあけて静置する。次に、それぞれの細胞の内部にフェムト秒レーザを照射して、細胞膜を平面膜１４に展開する。実際、平板上に複数の細胞１２を配置しフェムト秒レーザを照射したところ、高い再現性で細胞を平面展開することができた。
【００２３】
フェムト秒レーザでは、狭いパルス幅の光のパルスが繰り返して発振される。このとき、光の強度が高いと、焦点付近の非常に狭い範囲で二光子吸収が生じ、より短い波長の２次光が生じる。たとえば、生体を透過する波長（たとえば８００ｎｍの赤外波長）の光のパルスを照射すると、短波長（たとえば４００ｎｍ）の紫外光が２次光として生体内で生じ、生体物質に吸収される。レーザーパワーが高く照射時間が短い場合、主に紫外光のエネルギーにより焦点近傍のみが加熱される。この場合、焦点に対象物が位置するときはその対象物は焼失を受けるが、焦点位置以外の物体はこのような熱的影響を受けない。その結果、焦点を結んだ位置にある標的物体のみが選択的に溶発する。ここではそのような溶発が支配的となる照射条件は用いない。
【００２４】
フェムト秒レーザ光の照射により、３次元形状であった細胞膜が開裂されて面状に展開されるのは、以下の過程によるものであると推定される。フェムト秒レーザ光を細胞膜の中のたとえば１μｍ径のレーザスポットに集光すると強大なエネルギーが生じて、衝撃波を発生する。細胞膜は閉じた曲面からなるので、これに対応して細胞膜に加わる内圧が急激に上昇し、空洞が生まれて膨張を始める。ここで、細胞膜のうち、平板に接している部分は、平板に押し付けられるが、平板に接していない部分では、膨張に伴う高い応力を集中的に受けた箇所から裂けていく。こうして、３次元形状であった細胞膜が開裂されて、裂けた部分が平板の上に２次元形状で押し付けられる。こうして、平板の上には、３次元形状であった細胞膜の内面が、もともと平板に接していた部分を中心として、そのまわりに、他の部分が展開され、面状膜が形成される。
【００２５】
上述のフェムト秒レーザ光の照射についてさらに説明すると、境界膜の内部もしくは境界膜近傍の位置でのフェムト秒レーザ照射によりキャビテーションが局部的に発生する。このとき、衝撃波が発生することで空洞が生じ、その空洞部が瞬時に膨張する。これにより、レーザ光照射位置から空間的に離れた位置にある境界膜が破裂する。その結果、開裂された膜全体が平板部に押しつけられる。こうして、レーザパルス光を受けた場所で引き起こされた物理現象が、そこから離れた位置にある境界膜に間接的に力学的に作用して、空洞膨張にともなう境界膜の開裂と平板への圧着を生じる。これに対して、フェムト秒レーザ照射によるアブレーション（溶発）では、たとえば境界膜内部に照射位置があると、その位置の物質が化学反応により融解して蒸発し、その結果、照射位置の物質のみがすべて切除される。この溶発は、照射位置から離れた位置に力学的作用を及ぼすことはない。
【００２６】
なお、境界膜自体、たとえば細胞膜上に焦点を設定して照射しても、低い再現性ではあるが、細胞膜を含む境界膜を面状に展開できる。この場合、焦点内では、細胞膜の溶発が生じる一方で、同時に空洞膨張も副次的に生じ得る。よって、細胞膜が開裂されて、面状へと展開される。ただし、空洞膨張にともなう圧力は、溶発して消失した細胞膜部分から漏れるため、細胞膜全体が面状に展開されるだけの十分な応力は得られにくい。つまり、溶発と空洞膨張の順序の後先により、換言すれば、焦点内での支配因子が溶発なのか空洞膨張なのかで、面状展開の再現性の高低が決定される。焦点が細胞膜内にある方が、空洞膨張が支配的となるため、実際に高い再現性で細胞膜を面状に展開できる。したがって、好ましくは、フェムト秒レーザ光は、細胞膜内に集光する。
【００２７】
面状に展開された細胞膜の面積を計測したところ、展開前の細胞膜表面積に比べ７割から１０割の範囲の大きさであった。したがって、応力が集中した限られた空間でのみ細胞膜が破壊されたが、それ以外の大半の細胞膜は破壊されないことがわかった。また、展開した細胞膜の多くの部分は無傷であることは、膜脂質の蛍光染色や裏打ちタンパク質の免疫染色により確認された。つまり、面状膜の大半は平板上に無損傷で、すなわち生物学的機能を維持して、提示されており、実用に十分耐え得る。このように、細胞膜の２次元情報は２次元状のまま、最小限の損失の範囲内で保持される。
【００２８】
図５は、免疫染色法によるマウス赤白血病細胞（ＭＥＬ細胞）のα-アクチニンの検出の例を示す。膜構造物の一例としてＭＥＬ細胞を平板上に配置し、フェムト秒レーザにより細胞の平面展開を行った。レーザを照射した細胞（左上側の明視野像）と未照射の検体（左下側の明視野像）について、α-アクチニン（細胞内膜に局在）の免疫染色を行った。染色は、アクチニンに対する抗体を用いて行った。フェムト秒レーザ照射を行った細胞（右上側）にのみアクチニンが検出された。すなわち、本来細胞の内側にある面が、照射により平面展開され露出したことが確認された。また、アクチニンが抗体と結合し染色されたこの結果は、細胞内膜に局在するタンパク質が生物学的機能を保持したまま検出されることを示している。一方、対照実験として、フェムト秒レーザ照射を行っていない細胞（右下側）については、アクチニンは細胞膜によって隔離された状態のままであるために検出されなかった。
【００２９】
以下に、上述の境界膜展開の具体例を説明する。
（１）７６×２６ｍｍ角のガラス板の上に、ＭＥＬ細胞と１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培養液を滴下する。つぎに、３７℃恒温、５％炭酸ガス濃度の培養環境下で２時間放置することにより、ＭＥＬ細胞をガラス表面に静置する。
（２）以下、すべての作業は室温で行われる。まず、チタンサファイアレーザ発振器から発生される波長８００ｎｍ、周波数８０ＭＨｚのフェムト秒レーザ光を、ＵＰｌａｎＳＡｐｏ型６０倍率対物レンズを用いて集光する。このとき、発信器と対物レンズとの間に設置した減衰器を用いることで、レーザ光の出力を４５０ｍＷに調整する。出力調整後、減衰器とレンズとの間に設置したシャッターを閉じて、集光を解除する。
（３）ガラス板を上下左右に微動させることで、標的とするＭＥＬ細胞を対物レンズの焦点位置に誘導する。このとき、レーザの焦点は、好ましくはＭＥＬ細胞の内部に設定する。つぎに、シャッターを３秒間開放し、細胞内部へレーザを照射する。
（４）照射後シャッターを閉じてから、レーザ光の代わりに、可視光源から発生する可視光を、対物レンズを用いて集光する。この可視光を使って明視野顕微鏡観察を行いながら、細胞膜が展開されたことを確認する。
（５）つぎに、ガラス板上の培養液をＰＢＳ（生理的リン酸緩衝液）と置換してから、展開された細胞膜の上に、１％の牛血清アルブミンを滴下する。この状態で１時間放置することにより、非特異的な免疫反応をあらかじめ防止する。
（６）上記のアルブミンをＰＢＳで洗い流してから、展開された細胞膜の上に５μｇ／ｍｌのマウス由来抗アクチニン抗体（１次抗体）を滴下して、２時間放置する。このことにより、アクチニンと１次抗体とを特異的に結合させる。
（７）アクチニンと結合した１次抗体を蛍光染色するため、未結合の１次抗体をＰＢＳで洗い流す。つぎに、７．５μｇ／ｍｌのヤギ由来抗マウス抗体（２次抗体）を滴下して、２時間放置する。この２次抗体はあらかじめＣｙ３蛍光化合物（Ｇ励起）を含んでいる。よって細胞膜中のアクチニンは、１次抗体と、その１次抗体に結合した２次抗体により、Ｇ励起蛍光染色される。
（８）未結合の２次抗体をＰＢＳで洗い流してから、Ｇ励起光蛍光顕微鏡によりアクチニンを撮像する。
（９）Ｇ励起蛍光観察の後、１ｍＭのＤｉＯ（ジアキルオクサカルボアニン）を添加して２０分暗室に放置することで、ＭＥＬ細胞膜を染色する。Ｂ励起光蛍光顕微鏡により、ＭＥＬ細胞膜全体を撮像する。
【００３０】
図６は、免疫染色法によるヒト非小細胞性肺癌細胞（ＫＪ細胞）のｅｒｂＢ２の検出の例を示す。フェムト秒レーザによりＫＪ細胞は面状に展開された（パネル左）。展開されたものが確かに細胞膜であることは、生体膜のみ結合するＤｉＯ染料による可視化実験により確認された（パネル右）。さらに、展開された膜の中にｅｒｂＢ２が存在することを、抗ｅｒｂＢ２抗体を用いた免疫染色により示した（パネル中央、輝点）。ｅｒｂＢ２は腫瘍タンパク質であり、実際、臨床の場において診断や治療や予後観察の対象となっている。このことから、このフェムト秒レーザによる面状膜展開法は医療に応用され得る。
【００３１】
以下に、上述の境界膜展開の方法を説明する。
（１）培養器表面に固着しながら増殖するＫＪ細胞をトリプシン酵素により剥離してから、ＤＭＥＭ培養液中で懸濁する。この懸濁液を、２枚の同一のガラス板（１８×１８ｍｍ角）が２枚の同一のスペーサー（厚さ０．２ｍｍの５×１８ｍｍの長方形）を挟み込む形状で構築された流路に注入し、ＫＪ細胞をガラス表面に静置する。
（２）８００ｎｍ、周波数８０ＭＨｚのフェムト秒レーザ光を、ＬＭＰｌａｎＦｌ型１００倍率対物レンズを用いて集光し、静置されたＫＪ細胞の内部に照射する。このとき、照射出力は４５０ｍＷ、照射時間は６秒に調整する。なお照射条件は、これらの値に限定されない。
（３）明視野顕微鏡観察によってＫＪ細胞の膜が面状に展開されたことを確認してから、流路内の懸濁液をＰＢＳで洗い出す。つぎに、展開された細胞膜に対して、１％の牛血清アルブミンを注入し、１時間放置する。
（４）上記のアルブミンをＰＢＳで洗い出してから、展開された細胞膜に向けて５μｇ／ｍｌのマウス由来抗ヒトｅｒｂＢ２遺伝子産物抗体（１次抗体）を注入し、２時間放置する。このことにより、ｅｒｂＢ２と１次抗体とを特異的に結合させる。
（５）未結合の１次抗体をＰＢＳで洗い出す。つぎに、ｅｒｂＢ２と結合した１次抗体を蛍光染色するため、７．５μｇ／ｍｌのヤギ由来抗マウス抗体（２次抗体）を滴下して、１時間放置する。この２次抗体はあらかじめＣｙ３蛍光化合物（Ｇ励起）を含んでいる。よって細胞膜中のｅｒｂＢ２は、１次抗体と、１次抗体に結合した２次抗体により、Ｇ励起蛍光染色される。
（６）つぎに、未結合の２次抗体をＰＢＳで洗い出してから、Ｇ励起光蛍光顕微鏡によりｅｒｂＢ２を撮像する。
（７）Ｇ励起蛍光観察の後、１ｍＭのＤｉＯを注入して２０分暗室に放置することで、ＫＪ細胞膜を染色する。Ｂ励起光蛍光顕微鏡により、ＫＪ細胞膜全体を撮像する。
【００３２】
以上に説明したように、細胞膜は特殊な形態（すなわち展開した形状）で癌発現マーカーという情報を保存することが可能である。平板上に２次元的に展開された細胞膜は、たとえばカバーガラスで覆うことで、あるいはパラフィンなどの樹脂を重層して包埋することで、プレパラートとして保存できる。
【００３３】
この３次元物体の境界膜全体を面状に展開し、かつ、面状のまま保持する方法は、フェムト秒レーザ照射の（１）空洞発生による境界膜の開裂と（２）空洞膨張による境界膜の支持体への押着という光学的特徴と力学的特徴を新規に組み合わせて実現されたものである。フェムト秒レーザ照射による境界膜の展開では、３次元物体が本来有する膜全体が面状に提示される。実際、３次元時の表面積と展開時（２次元時）の表面積を比較したところ、展開膜は、３次元物体当時の表面積の７０％から１００％を保存していた。この高い表面積保存率により、膜裏打ち構造の全体像を把握することが容易である。対照的に、たとえばパッチクランプ法や剥離式露出方法では、原理上５０％が表面積保存率の最大値であり、実際上はそれよりかなり低い率であって膜のごく一部のみが展開される。換言すれば、パッチクランプ法や剥離式露出方法により展開される膜を用いる場合、走査範囲が制限される。また、フェムト秒レーザを用いた境界膜の展開は、３次元物体１つ１つを標的として選定しながらレーザ照射できるため、高い再現性と高い選択性が両立される。このことから、たとえば、一方で境界膜を展開して面状化された膜を観察しながら、他方で境界膜を３次元形状のまま残して観察するという対照実験を自在に実施できる。それに対して剥離式露出方法では、３次元物体個々を選択することは不可能であり、展開された境界膜の収率も低い。フェムト秒レーザ照射による境界展開方法は、そのような従来技術の膜検体の棄損と内部観察の非効率という欠点をもたない。
【００３４】
上述の細胞膜展開方法を用いて細胞膜展開板、細胞膜展開構造などの細胞膜展開体が提供できる。対象となる細胞は１つに限らず、支持体上に複数の細胞を面状に展開することで細胞膜展開体を作製することができる。細胞膜展開板は、細胞を支持する面を有する支持体を備え、その面上の１以上の箇所に生体膜の面状膜が配置されたものである。それぞれの細胞膜はその内面がフェムト秒レーザにより２次元的に展開されている。典型的な細胞膜展開板の例は、図１や図４の右側に示される。これらの場合、細胞を静置するための１以上の開口部（貫通孔）を備える支持体を用いる。各開口部は、細胞が開口部を通るときに細胞を捕らえる形状を備える。捕らえた細胞をフェムト秒レーザにより照射して、細胞膜が面状に展開される。展開板では、複数の生体膜が固体支持体の表面に安定して結合している。複数の面状生体膜は展開板の表面をわたってまたは覆って、たとえば格子を形成するように行と列に、また円形に、など、任意の便利なパターンに配列させることができ、ここで一般的にこのパターンは、支持体に設けられた吸引穴の位置と個数に依存する。
【００３５】
こうして、細胞から具体的な情報を得るためのチップを構築する。これを用いて、たとえば、細胞内での分子メカニズムをチップ上で再現する。また、オンチップ医療診断などにおいて、細胞膜を並べた細胞膜展開板を使うことによって、少量のサンプルで多検体を診断することへの応用が期待される。また、細胞膜展開板は、たとえば癌タンパク質といった膜タンパク質の同定、定量に特に有用である。さらに、複数の薬物候補に対する複数の膜結合標的の高処理量スクリーニングに極めて大きい可能性をもたらし、それによって薬物発見の過程を非常に加速する。これにより、病理診断の感度の向上、迅速化、正確性、信頼性の向上を図ることが可能である。また、膜展開板を用いた、タンパク質の検出や膜輸送メカニズムを研修するためのキット等も提供できる。なお、特表2005-515402号公報に記載されたタンパク質固定板では外来のタンパク質が人工的に埋め込まれるが、対照的にここでは、生体膜や高分子合成膜、あるいは生体膜と合成膜との混合膜が本来もっている内在性のタンパク質が平板表面に展開される。
【００３６】
細胞を静置する支持体３０の別の例は、図７に示されるような、流路３２、３４と、貫通孔３６である吸引穴の両方を備えた平板である。この支持体３０は第１と第２の互いに直交する２本の流路３２、３４を備え、たとえば第１の流路３２を通じて細胞が貫通孔３６上に運搬される。細胞は貫通孔３６にて発生させた吸引力によって捕らえられて静置される。つづいて、フェムト秒レーザを照射することにより、静置された細胞が面状に展開される。つぎに、たとえば第２の流路３４を通じて、たとえば膜を染色する化合物が、展開された膜に供与され、膜の裏打ち構造が可視化される。流路の数と形状、および流路内に配置される吸引穴の数と配置は、図８や図９のように自在に設定されるが、これらに限定されない。図８の例では、支持体４０に設けた三叉流路４２は互いに１２０°の角度で交わっている。また、図９の例では、支持体５０に設けた流路５２に３個の吸引穴が設けられている。
【００３７】
細胞膜展開構造の１例は、図１０に示されるような、貫通孔である吸引穴を設けた２重層構造の構造体である。この構造体は、レーザ光に対して透明な第１、第２及び第３の３枚の平板６０，６２，６４からなり、第２の板４２に、吸引用の貫通孔６６が所定の位置に設けられる。貫通孔６６は細胞を通さない寸法の径を持つ。第１と第２の板６０，６２の間の第１空間６８には、入口から出口へ細胞（たとえばＭＥＬ細胞）が流される。一方、第２と第３の板６２，６４の間の第２空間７０は吸引系７２に接続されていて、第２空間７０の入口から出口へ（図の左右方向に）ＰＢＳ溶液が流されている。図における矢印は、流れの方向を示す。第２空間７０の圧力は吸引により第１空間６８より低い。第１空間にある細胞７４は、吸引穴７６の付近を流れるとき第２空間７０の方に引っ張られて、その貫通孔６６に位置される。この状態の細胞をフェムト秒レーザで照射して、細胞膜を面状に展開することにより、細胞膜展開構造が得られる。この細胞膜展開構造では、貫通孔での平面膜が第１空間６８と第２空間７０の境界である。
【００３８】
図１１は、吸引穴を用いた細胞膜展開板を用いた観察を図式的に示す。単一体である複数の細胞を用意し、まず、複数の吸引穴を設けた展開板１０に細胞（２重丸で表す）を吸引して固定する。吸引穴の間隔は、展開された細胞膜が重ならないように設定されている。次に、固定された各細胞それぞれを、フェムト秒レーザによりそれぞれ展開していく（平面状に展開された細胞膜は多角形で表される）。そして、展開された細胞膜を、たとえば抗体などで免疫染色をして、観察する。なお、吸引には、たとえば図１２のような平板１０に設けた貫通孔１１の他に、たとえば図１３のような格子８０、たとえば図１４のような凹部を備えたスリット９２を設けた支持体９０、あるいはたとえば図１５のような３次元多孔網目１０２を含む形状を備えた支持体１００の開口部が使用される。
【００３９】
いずれの例でも、支持体は細胞を静置するための１以上の開口部を備え、各開口部は、細胞が当該開口部を通るときに細胞を捕らえる形状を備える。図１３の例では、格子８０を構成する細い枠材８２が透き間８４をつくり、吸引力により透き間８４を通ろうとする細胞は、その透き間８４を取り囲む細い枠材８２に捕らえられる。また、図１４の例では、吸引力によりスリット９２を通ろうとする細胞は、そのスリットの両側の枠材９４に設けられた凹部９６に捕らえられる。また、図１５の例では、多孔網目１０２を通ろうとする細胞は、その多孔網目１０２の入口に捕らえられる。捕らえられた細胞はフェムト秒レーザの照射により面状に展開される。
【００４０】
図１６は、左側に、３６個の吸引穴を３角形上に配置した展開板を示し、右側に、吸引により捕捉された後、生体膜特異的な染料であるＤｉＯの結合によって可視化されたＭＥＬ細胞が配列している様子を示す。また、図１７は、これら配列したＭＥＬ細胞群の中から代表例として、２つのＭＥＬ細胞に関する細胞膜の２次元展開の状況を示す。共に、開裂された細胞膜上に、免疫染色により蛍光可視化されたアクチニンタンパク質の分布が提示されている。２次元の蛍光範囲に関して、上側の展開膜と下側の展開膜を比較すると、下側の方がより広範囲にわたってアクチニンが分布していることがわかる。つまり、複数の境界膜の内部構造の間の差異を同定するのに、この境界膜展開板が有効であることが示された。
【００４１】
以下に、上述の境界膜展開板に関する作業手順を説明する。
（１）ガラス板（０．２ｍｍの厚さ、１８×１８ｍｍの正方形）に、工業用紫外線レーザを照射し、ガラスを溶発させて貫通孔を３６個作製する。貫通孔の個数と配置はこれに限定されない。
（２）つぎに、あらかじめＤｉＯで膜を前染色されたＭＥＬ細胞を含むＤＭＥＭ培養液０．４ｍｌをガラス板に滴下してから、貫通孔に接続されたマイクロシリンジポンプを使って培養液を０．０４ｍｌ／ｍｉｎの速度で吸引する。吸引によって貫通孔の開口部でＭＥＬ細胞を静置する。
（３）静置された個々のＭＥＬ細胞の内部へ、波長８００ｎｍ、周波数８０ＭＨｚのフェムト秒レーザ光を、ＵＰｌａｎＡｐｏ型１００倍率対物レンズを用いて照射する。このとき、照射出力は４００ｍＷ、照射時間は５秒に調整する。
（４）細胞膜を面状に展開した後、ポンプの吸引を停止する。つぎに、展開された膜上の培養液を、１％の牛血清アルブミンで置換して、１時間放置する。
（５）つぎに、アルブミンをＰＢＳで洗い流してから、５μｇ／ｍｌのマウス由来抗アクチニン抗体（１次抗体）を滴下して、２時間放置する。その後、１次抗体をＰＢＳで洗い流してから、７．５μｇ／ｍｌのヤギ由来抗マウス抗体（２次抗体）を滴下して、さらに１時間放置する。
（６）未結合の２次抗体をＰＢＳで洗い出してから、Ｇ励起光蛍光顕微鏡によりアクチニンを撮像する。
【００４２】
細胞膜を静置する支持体の他の１例は、表面に多数のアミノ基を合成したガラス板（アミノ基板１１０）である。アミノ基板を用いると、アミノ基板１１０の表面と細胞膜１１２の表面とが、アミノ基と不特定多数の細胞膜構成物質との間の静電結合、疎水結合、水素結合、リガンド結合、共有結合、あるいはそれら結合の相加によって、安定に固着する。たとえば、図１８に図式的に示すような細胞膜構成物質のひとつであるシアル酸とアミノ基との間の結合により、細胞がガラス板に化学的に固定される。この場合、たとえば図１９において四角形で表されているように、平板上の複数の区画１１４にのみアミノ基が合成されている場合、細胞はそれら区画にのみ結合する。したがって、静置される細胞の配置はアミノ基を有する区画の配置により決定され、制御される。
【００４３】
図２０は、アミノ基を有する区画を備えた細胞膜展開板を用いた観察の１例を図式的に示す。まず、アミノ基板１１０の表面に対して、被覆材１１６を用いて複数のアミノ基区画１１８以外を覆う。複数のアミノ基区画１１８は、展開された細胞膜が重ならない間隔で配置される。次に、細胞１０を各アミノ基区画１１８に結合させ静置する。次に、固定された各細胞１０を、フェムト秒レーザにより平面膜に展開する。展開された細胞膜１４は、たとえば抗体などで免疫染色をして、観察する。区画が複数の流路中に備えられる場合、色の種類が異なる複数の発色性抗体を、それら流路を利用して、展開された細胞膜に向けて逐次添加することが可能である。このことにより、多重染色観察が可能である。
【００４４】
アミノ基板の代わりに、ポリリジン基を合成したガラス板（リジン基板）を用いても、平面状生体膜は化学結合によって安定に静置する。安定に静置するとは、たとえば、展開板に液体を流しても、平面状生体膜が平板から剥離することなく、生体膜の生物学的機能が平板上に維持されることである。なお、アミノ基板とリジン基板とを比較した場合、膜の平板における安定性は、アミノ基板の方がより高かった。したがって、好ましくはアミノ基板を用いる。
【００４５】
境界膜を安定に静置する支持体のさらなる他の例は、平板が、たとえば図２１のような複数の磁石１２２を備えた平板１２０であり、３次元物体が磁石の磁場により捕捉される。あるいは、図２２のような複数の静電気発生チャック１３２を備えた平板１３０であり、３次元物体が静電吸着により捕捉される。図２１において、たとえば３次元物体が細胞である場合、細胞膜表面に磁性体を結合することにより、磁場で捕捉されて磁石上に静置される。磁石または静電気発生チャックは、流路内に設けてもよい。これらの場合も、一般的に面状生体膜の配置のパターンは、平板に設けられた吸引穴、磁石あるいは静電気発生チャックの位置と個数に依存する。
【００４６】
上述の３次元構造の境界膜の面状膜への展開は、一般に使用されている顕微鏡装置とフェムト秒レーザ発振器を用いて行う。フェムト秒レーザは光学系装置なので、境界膜の平板上ヘの静置、細胞の平板への固定、細胞の切開および膜の展開、膜の内構造物の観察といった一連の操作を、顕微鏡ステージ上で、同一視野内で行うことができる。これは、従来の手法に比べて大きな利点である。さらに、実験操作についても従来のものに比べ簡便であるため操作者に特別な技術的な能力や鍛錬を要求しない。
【００４７】
顕微鏡とフェムト秒レーザとを一体化することにより、境界膜の展開をより容易に実施できる。ここでいう一体化とは、観察のための光（たとえば、光学顕微鏡を用いた可視化のための励起光と蛍光）と、膜展開のためのフェムト秒レーザ光とを、自在に切り替える機構を含むことである。図２３は、そのような境界膜展開装置の１例を示す。この装置では、シャフト部を有する駆動体１４０を備え、駆動体１４０は、Ｘ軸平行移動、Ｙ軸平行移動、Ｚ軸平行移動、Ｘ軸中心回転、Ｙ軸中心回転およびＺ軸中心回転により上下左右自在にシャフト部の位置決めができる。シャフト部の上部は、たとえば、流路が設けられた展開板１５０が設置できるテーブルとして機能する。また、図２４に示すように、境界膜展開装置は、さらに、駆動体１４０の側部に垂直に設けた支柱１４２、支柱１４２をはさんで駆動体１４０の反対側に設けられた細胞供給装置１４４（図２３では図示していない）、支柱１４２の上端に、駆動体１４０に対向して設けられた蛍光顕微鏡および光学系検出装置１４６、および、その反対側に設けられたフェムト秒レーザ発振器１４８を備える。細胞供給装置１４４は、駆動体１４０の上の展開板１５０に細胞を供給する。駆動体１４０の位置決めにより、展開板１５０上の細胞などの３次元物体の内部にレーザの焦点を設定できる。これにより、焦点位置は、細胞膜の内部または膜自体を焦点として集光して、集光により生ずる細胞内部の空洞膨張により、細胞膜を開裂させるとともに支持体上に押しつけることが可能な位置に移動される。
【００４８】
駆動体１４０には、図２４の破線が示すように、吸引のための開口部１５２と管１５４が設けられており、この開口部１５２の一端は、シャフト部の上部で、そこに設置された展開板１５０の吸引穴１５６と接続される。したがって、展開板１５０の上に提供された３次元物体（ここでは細胞）を、吸引穴１５６に静置するときは、駆動体１４０の管１５４を通じて開口部１５２の他端を吸引する。この他端には、静置用吸引力を発生するための第１ポンプ（図示しない）が接続されている。なお、第１ポンプは装置に内蔵されてもよい。さらに第１ポンプは、展開板１５０上に設けられた流路と接続することが可能であり、たとえば静置されない余剰の細胞を展開板１５０上から取り除くことができる。展開板１５０上の流路には、さらに、化合物を搬送するための第２ポンプ１５８（図２３参照）が取り付けられる。したがって、この第２ポンプ１５８から、たとえば細胞を染色する試薬が、流路を通ってたとえば細胞もしくは展開された面状細胞膜に提供される。なお、第１ポンプと第２ポンプは一体であってもよい。また、流路にはこれらポンプの他に、廃液が外部へ漏れ出さないような溶液溜が備わっている。
【００４９】
さらに、細胞を流路へ滴出するためのノズル１６０が、位置決め用駆動体１４０の上に向かって、支柱１４２にそって設けられる（図２４）。このノズル１６０は、必要に応じて、駆動体１４０に接続された展開板１５０の上へ、好ましくは、細胞が静置される区画の上へと移動できる機構を備えている。細胞を供給する際には、まずノズル１６０の出射口が移動し、次に、所要量の細胞がノズル１６０を通して展開板１５０上に滴下される。細胞供給装置１４４は、ノズル１６０へ細胞を供給するための細胞供給器および滴出量と滴出時間を設定するための制御機構（図示しない）を含む。この細胞供給器は、細胞培養器を兼ねてもよく、その場合は、細胞供給器には恒温装置が内蔵され、さらには、培地供給装置および培養用気体供給装置が接続される。この細胞培養機能を兼ねた細胞供給器には、図２４に図式的に示されるように、培地の温度を制御する過冷却器と、培地のｐＨを一定に維持するための気体（たとえば炭酸ガスなど）を取り込む接続口と、培地を懸濁攪拌することで細胞の増殖を促進することができる回転翼と、ノズル１６０へ細胞懸濁培地を搬送する管およびポンプが内蔵される。なお、３次元物体の例として細胞に関して説明したが、ノズル１６０から滴出される３次元物体は細胞に限定されない。たとえば人工的に構築された膜構造物の場合、容器内の回転翼は、膜構造物を攪拌することで分散状態のまま維持することができるため、３次元物体は、相互に非特異的に吸着された集合体としてではなく、選択的展開と観察においてもっとも望ましい単一体として、ノズル１６０から展開板１５０へと滴下される。
【００５０】
位置決め用駆動体１４０に対向して設けられる蛍光顕微鏡１４６は、光学系結像レンズ（たとえば対物レンズ）と光検出装置（たとえば撮像用カメラ）からなる。また、フェムト秒レーザ発振器１４８からのレーザ光の光路と、励起光を含む観察蛍光の光路は、一部で共用される（図示しない）。照射、観察、いずれの使用方法に関しても、光の照射量と照射時間を設定できる。作業者の目に対してレーザ光が誤って照射される事故を防ぐため、接眼レンズは設けない。代わりに、光検出装置にモニタ（図示しない）を接続して、境界膜の展開状況と面状展開膜の染色状況を監視する。
【００５１】
さらに、位置決め用駆動体１４０には、泡感知装置が接続される。この泡感知装置は、図２５Ａに示すように、光照射器１６２と光検出器１６４を含む。光照射器１６２から発生した光は、展開板１５０上に静置した３次元物体単一体、たとえば１つの細胞全体を照らす光束（光路断面系３μｍ以上、１００μｍ以下）を発している。光束は細胞を通過して、光照射器１６２と対面した位置に備えられた光検出器１６４の２次元受光平面に入射する。光検出器１６４は、細胞と透過した光を検出可能な位置に設置される。細胞への照射と屈折光の取得は、好ましくは展開板１５０によって遮られない配置で行われ、光束は展開板面に対して平行な位置を通過する。このために好ましくは、図２５Ａに示すように、光照射器１６２と屈折光検出器１６４をそれぞれ展開板１５０の両側で互いに対向させる。フェムト秒レーザが照射されたとき、図２５Ｂに示されるように、細胞で空洞１６６６が生じると、それまで細胞を透過していた光束が空洞で屈折、反射または散乱され、この変化は、光検出器１６４により受光平面における受光位置と受光強度の差異として検出される。検出された差異は、屈折率の経時変化、つまり、空洞の膨張（成長）に応じて、さらに変化し続ける。次に、３次元物体にフェムト秒レーザが照射された際、３次元物体の内部に空洞が生じたか否か、そして、生じた空洞が境界膜開裂に向けて成長しているか否かを検知しながら、図２５Ｃに示すように、面状展開を開始するのに最適なレーザ焦点位置へと３次元物体を移動する。この位置で、細胞膜が面状に展開されると、光束を通していた細胞が光束上からなくなるため、空洞膨張時とは異なる屈折率の変化を示す。それは、細胞質透過時の光束と、たとえば細胞を含む液体を透過するときの光束との大きな違いとなって特徴的に検出される。なお、泡の感知に関して、光屈折の変化を例に説明したが、これは光スペクトルの変化や偏光の変化を含む。
【００５２】
好ましくは、さらに、光検出器１６４で検出された光強度をもとに位置決め用駆動体１４０を制御する制御器１６６を設ける。制御器１６６は、面状展開を開始するのに最適なレーザ焦点位置へと３次元物体（たとえば細胞１２）を移動する。これにより、細胞内の泡の発生と成長を感知して、駆動体１４０の駆動と停止を行う。これにより、泡感知装置は、膜開裂に至適な状態を自動で確保できる。図２５Ａ〜図２５Ｃを参照して、制御器１６６による連動制御の１例を説明する。制御器１６６は、光照射器１６２、光検出器１６４、および駆動体１４０と接続され、それらの間で信号が入出力される。使用者は、制御器１６６を用いて、光照射器１６２に対して、泡感知光を発するように命令信号を出力する。このときにはまだ、泡感知光の光束路上には３次元物体は静置されない。泡感知光が光検出器１６４の２次元受光平面に到達すると、光検出器１６４の受光平面において泡感知光束の位置と強度が検出される。位置に関する情報は制御器１６６に伝達されてから、そこで記憶される。一方、強度に関する情報の信号は制御器１６６に伝達されてから、最適な光強度が算出される。算出結果に基づいて、制御器１６６は最適化命令を光照射器１６２に伝え、泡感知に至適な光強度が設定される。このような校正作業は、必要に応じて使用者が制御器１６６を用いて手動で実施できる。あるいは、制御器１６６を用いず、光照射器１６２を直接操って、電圧を増減することで、あるいは波長を変換することで、あるいは光束断面積を絞ることで、光強度を調節してもよい。つぎに、３次元物体が、たとえばノズル１６０から展開板１５０上へと摘出され静置されると、光照射器１６２から発せられた泡感知光束は３次元物体を通過する。物体通過時の泡感知光束に関しても、光検出器１６４の受光平面における位置と強度が検出され、それらの情報は制御器１６６へと出力され、３次元物体の有無における光束の位置と強度の差が計算され、記憶される。このとき、制御器１６６によって差が得られないと算出された場合は、泡感知光が３次元物体を通過していないと判定され、差が得られるまで（すなわち、３次元物体が泡感知光束中へ移るまで）、駆動体１４０を３次元方向に移動させ続ける。つぎに、フェムト秒レーザを３次元物体に照射し、３次元物体内に空洞（泡）を発生させる。なお、これ以前の初期状態（待機状態）として、駆動体１４０は、フェムト秒レーザの焦点が３次元物体の上空に停滞する状態を維持するように、停止している。使用者が制御器１６６を用いて手動で、もしくは、制御器１６６が自動で、駆動体１４０に対して、たとえば上昇するように（すなわち、３次元物体内部がフェムト秒レーザ焦点へ向かうように）指示する。３次元物体にフェムト秒レーザ光焦点が入り、たとえば図２５Ｂに示されているように、内部で泡１６８が生じ始めた場合（すなわち、光検出器１６４の受光平面において光強度の変化が観察され始めた場合）、制御器１６６からの命令の下、駆動体１４０は一旦上昇を中断する。停止後、たとえば３０μｓから３０ｍｓの間、泡のさらなる生長が光検出器１６４によって認められたときは、駆動体１４０の移動中断をそのまま継続して、境界膜の開裂を待つ。一方���その間、泡の生長が認められなかったときは、たとえば図２５Ｃで示されているように、制御器１６６は、泡の再成長が検出されるまで、もしくは、新たなより大きな泡の発生を探知するまで、駆動体１４０を上昇させる。（なお、図の右側には、破線で光の進む方向を示している。）駆動体１４０の運動は上昇に限らず、駆動体１４０は、たとえば１ｍｓの時間毎に１μｍの距離間隔で３次元方向へランダムに移動し、泡成長もしくは泡探索のための運動を行う。このような運動の指示は、使用者が制御器１６６を用いて自在にプログラミングすることで可能となる。泡が境界膜を開裂して面状に展開し終えると、泡感知光はそれに応じた特徴的変化（すなわち、３次元物体を静置しないときの元の状態の光強度）を示し、これが光検出器１６４で捉えられて制御器１６６に伝えられると、制御器１６６は駆動体１４０を停止させ、使用者があらかじめ指定した場所へと移る。この一連の境界膜展開の工程のすべて、もしくは一部は、使用者が制御器１６６のプログラム設定を変更することによって、自動化され、さらには繰り返される。なお、好ましくは、光照射器１６２と光検出器１６４はそれぞれ３次元方向に自在に移動可能である。このことによって、たとえば、駆動体１４０を移動せずに、代わりに光検出器１６４と光検出器１６４を動かして、３次元物体の泡感知光束中への位置合わせ、さらにはその後の３次元物体内部の泡の定点観察を行うことができる。
【００５３】
また、吸引を用いて３次元物体を静置する代わりに磁場を用いる場合は、位置決め用駆動体１４０に、図２１に示すような磁石を備えた展開板を装着する。また、化学結合を利用して３次元物体を静置するときは、図１９に示すような化学結合区画を備えた展開板を装着する。これらの展開板が流路を併せ持つ場合、第１ポンプあるいは第２ポンプあるいは両者と接続して使用することができる。
【００５４】
また、電場を用いて３次元物体を静置する場合は、位置決め用駆動体１４０に、図２２に示すように静電気発生チャックを備えた展開板を装着する。この場合、位置決め用駆動体１４０にあらかじめ備えられた電極部（図示しない）と展開板のチャック部とが接続され、導通することにより静電気が発生する。チャック部への電圧印加装置は、好ましくは内蔵される。
【００５５】
上述の、位置決め用駆動体、ノズル、ポンプ、光学系など展開装置の種々の構成部分は、必ずしも一体化されなくてもよく、一部が分離されていてもよい。また、目的に応じて一部の構成部分を省いてもよい。なお、各構成部分は、図示されない動作制御システムに接続され、フェムト秒レーザ光の３次元物体への照射から、面状膜が展開されていく様子を監視するモニタへの投影、そして提示された膜構造物の走査までの一連の作業を自動化できる。
【００５６】
以上に境界膜を備える３次元物体として、細胞を例にして境界膜の面状展開を説明したが、細胞は、動物、植物、真核、原核などの生物種や階級（界）に限定されない。また、細胞は、単細胞生物や培養細胞のように元来の単一体、スフェロプラストのように組織から単離された単一体、あるいは、融合細胞やハイブリドーマのように複数の細胞が融合した単一体を含む。これら単一体の境界膜は、すべて生体膜から構成されている。フェムト秒レーザ照射の面状展開効果は物理現象（キャビテーション）であるために、照射を受ける生体膜の生物的起源や機能とは無関係である。キャビテーションが生じやすい物理空間の条件は、照射レーザの焦点径（１μｍから２μｍ）よりも大きいとき、すなわちアブレーションが非支配的（従属的）となるときである。したがって、照射される細胞の大きさの下限は３μｍ以上であり、上限は、細胞の最大径である１００μｍ以下である。
【００５７】
また、境界膜を備える３次元物体は細胞には限られない。たとえば、３次元物体は細胞核などの細胞小器官であってもよく、その場合、前記境界膜は核膜などの生体膜である。たとえば核膜について同様に平板の上に展開できる。すなわち、細胞核を細胞から取り出し、板の上に静置し、次に、フェムト秒レーザ光を核膜内または核膜上に照射して支持体の上にその内面を展開する。これにより、核膜展開板が提供できる。このように、細胞小器官についても、上述の細胞膜について説明したのと同様は種々の形態での面状展開が可能である。
【００５８】
また、境界膜を備える３次元物体は、リポソーム小胞や界面活性剤ミセルを含む人工的に構築された膜構造物であってもよく、この場合、境界膜はリン脂質を含む高分子合成膜から構成される。また、３次元物体は、人工的に構築された膜構造物と細胞との融合物であってもよい。この場合、境界膜は、たとえばフォスファチジルコリンなどの高分子合成膜とたとえばCos 7培養細胞などの生体膜との混合膜から構成される。また、３次元物体は、人工的に構築された膜構造物と、細胞核を含む細胞小器官との融合物であってもよい。この場合、境界膜は高分子合成膜と生体膜との混合膜（たとえばポリエチレングリコールで被覆修飾された核膜）から構成される。これら人工的に構築された３次元物体においても、フェムト秒レーザ光を境界膜内または境界膜上に照射することによって膜を二次元に展開でき、裏打ち構造を提示できる。
【００５９】
上述の高分子合成膜の面状展開の１例として、高機能性食品用マイクロカプセルなどの工業膜製品の表面検査が実施できる。これら工業品のサイズは最小でも５０μｍから１００μｍの範囲であり、フェムト秒レーザ照射による境界膜展開方法に適しているため、境界膜展開体として提供することが可能である。さらに、高分子合成膜と生体膜との混合膜が面状に展開される例としては、薬剤担体としての人工核膜、抗体生産ハイブリドーマ膜、掛け合わせ植物のプロトプラスト膜などである。これらの膜構造について、これまでは、膜外部から走査するという間接的な検査がなされており、無作為抽出された複数の膜の集合体を走査するという総和平均的な検査でもあった。フェムト秒レーザ照射による面状展開板は、創薬や作物改良の場においても、膜構造ひとつひとつの直接的かつ選択的な検査を可能とする。
【００６０】
開口部を有する展開体、たとえば吸引穴を有する展開板において、境界膜が面状膜として展開されたとき、この面状膜は貫通孔の両側の空間の境界に位置されている。したがって、吸引穴の片側から面状膜に対して物質を加えることで、面状膜の他方側への応答伝播を解析することが可能となる。たとえば生体膜に埋め込まれたイオンチャンネルやシグナル結合受容体などの膜透過性や結合親和性などが高い時空間分解能で観察できる。このような生体膜の内外両側から同時に走査する観察方法は、これまでの細胞や細胞小器官を３次元状態のままで観察していたときには不可能であった。さらに、境界膜が開口部において懸架されているため、面状へと展開された膜が板などの構造体に密着していない。つまり、たとえば細胞膜に関して、細胞膜中の膜浮遊性糖鎖や２次元拡散性タンパク質（抗体や酵素、サイトカインなど）などは、構造体と干渉することなく、細胞膜表面上で自由に、本来の生物学的機能を担う分子運動を行うことが可能である。このことにより、膜の構造と機能と動態の相関を網羅的に解明することができる。これまでのような、膜あるいは膜構造物が板上などに圧着した状態では、それらの分子運動の解明は困難であった。本発明における開口部を有する展開体は、これら従来の観察上の欠点を有しない。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】細胞膜の平面展開の状況を図式的に示す図
【図２】支持体が突起部の場合の図
【図３】支持体が管の開口部の場合の図
【図４】複数の細胞膜の平面展開の状況を図式的に示す図
【図５】免疫染色法によるα-アクチニンの検出の例を示す図
【図６】免疫染色法によるｅｒｂＢ２の検出の例を示す図。
【図７】平板上の交差流路内部に設けられた吸引穴の図
【図８】平板上の三叉流路内部に設けられた吸引穴の図
【図９】平板上の流路内部に設けられた吸引穴と、交差流路内部に設けられた吸引穴との図
【図１０】吸引穴を設けた２重層構造の平板の図
【図１１】吸引穴を用いた平板を用いた観察を図式的に示す図
【図１２】開口部が貫通孔の図
【図１３】開口部が格子の図
【図１４】開口部のスリットの図
【図１５】開口部が３次元多孔網目の図
【図１６】細胞膜展開板の図
【図１７】吸引穴を用いた平板を用いた細胞質展開板における平面展開を示す図
【図１８】アミノ基修飾平板を用いた細胞固定を示す図
【図１９】化学結合区画を備えた平板の図
【図２０】磁石を備えた平板の図
【図２１】静電気発生チャックを備えた平板の図
【図２２】アミノ基修飾平板を用いた細胞質展開板における平面展開を示す図
【図２３】平面膜展開装置の図
【図２４】平面膜展開装置の側面図
【図２５Ａ】泡検出装置の構成を示す図
【図２５Ｂ】泡検出装置による泡検出を示す図
【図２５Ｃ】泡検出装置による泡検出を示す別の図
【符号の説明】
【００６２】
１０  ガラス板、    １２  細胞、    １４  展開された細胞膜、    １４０  駆動体、    １４４  細胞供給装置、    １４６  蛍光顕微鏡および光学系検出装置、    １４８  フェムト秒レーザ発振器、    １５０  展開板、    １５６  吸引穴、    １６０  ノズル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図１６】
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【図１７】
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