(57)【要約】【課題】新規なシナプス形成促進剤及びシナプス形成促進方法を提供すること。【解決手段】アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）を有効成分として含む、シナプス形成促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）を有効成分として含む、シナプス形成促進剤。
【請求項２】
アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）を有効成分として含む、神経変性疾患の治療・予防剤。
【請求項３】
神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項２に記載の治療・予防剤。
【請求項４】
アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）をニューロンに作用させることを含む、インビトロ又は非ヒト動物においてシナプス形成を促進する方法。
【請求項５】
アストロサイト上に存在するC末端フラグメントβ（CTFβ）を用いる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
βセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク（APP）の切断を増大させること、及び／又はγセクレターゼによるC末端フラグメントβ（CTFβ）の切断を低減させることを含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
アストロサイトに被験物質を接触させ、アストロサイトにおける、アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）の発現の程度、又はシナプス形成能を指標として、CTFβをアストロサイトに効率的に発現させることができる物質を選択することを特徴とする、CTFβをアストロサイトに効率的に発現させることができる物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シナプス形成促進剤、及びシナプス形成促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アストロサイトは中枢神経系において活発にシナプス形成を促進する［非特許文献1及び２］。アストロサイト条件培地で培養した分離ニューロンにおいて、アストロサイトに接触するとプロテインキナーゼC（PKC）が活性化されることが示されている［非特許文献３］。この活性化は最初は限局的であるがニューロン全体に広がり、ついには興奮性シナプス形成を全体的に促進する。興奮性シナプス形成が促進されると、興奮性シナプス後電流の大きさが増大し、FM色素の取り込みおよび放出の効率が上昇する。多くの細胞型に存在するPKC基質であるMARCKS（ミリストイル化アラニンに富むCキナーゼ基質）のリン酸化型が、アストロサイトと接触したニューロンにおいて免疫染色により検出されることに注目すべきである。これらのニューロンではシナプス前終末ならびにシナプス後膜の成熟が明らかであり、これはシナプス前後でのシナプトタグミンＩとPSD-95の共局在化によって示される。このアストロサイト誘導性のニューロン成熟に関与する受容体がインテグリンであることが、PKC活性化とシナプス形成がともにエキスタチンによって阻害されることによって確認された［非特許文献３］。エキスタチンは、β1またはβ3サブユニットを含むインテグリン複合体によるシグナル伝達を選択的に阻害する。β1インテグリンはニューロン成熟の様々な点において重要である［特許文献４及び５］。しかし、このようにシナプス形成を加速させるニューロン発達のスイッチとなるアストロサイトのリガンドは知られていない。
【０００３】
アルツハイマー病は、老人斑と呼ばれる細胞外に凝集するβ-アミロイド（Aβ）ペプチドを含む沈着物をはじめとして、多くの病理学的変化を特徴とする進行性の神経変性疾患である。Aβペプチドは、アミロイド前駆体タンパク（APP）が、2種類の異なる酵素活性を有するエンド型プロテアーゼにより段階的に切断されることで生じる。まず、βセクレターゼがAPPを切断して膜結合産物であるC末端フラグメントβ（CTFβ）が生じる。脳でみられる主要なβセクレターゼは、BACE1（β部位APP切断酵素1）である。ついで、γセクレターゼがCTFβを切断してAβペプチドが遊離する。
【０００４】
【非特許文献１】Haydon（2001）Nat.Rev.Neurosci. 2, 185-193
【非特許文献２】AllenおよびBarres（2005）Curr.Opin.Neurobiol. 15, 542-538
【非特許文献３】Hamaら、（2004）Neuron 41, 405-415
【非特許文献４】NeugebauerおよびReichardt（1991）Nature 350, 68-71
【非特許文献５】Camposら（2004）Development 131, 3433-3444
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規なシナプス形成促進剤及びシナプス形成促進方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、意外なことに、本発明者らは、CTFβがニューロンインテグリンに対するアストロサイト上のリガンドであることを確認した。野生型およびAPPまたはBACE1欠損型のラットまたはマウスから調製した培養および脳切片におけるアストロサイトおよびニューロンの研究を踏まえ、アストロサイトの細胞膜上にみられるCTFβが、ニューロンのシナプス形成にとってきわめて重要な調節因子であることを本発明者らは始めて見出した。ニューロンが産生するAβの病理学的役割については広範囲に研究されており［WilquelおよびDe Stooper（2004）, Curr.Opin.Neurobiol. 14, 582-588］、Aβ及びAPPの細胞外および細胞内ドメインの生理学的役割領域についても同様である［Turnerら（2003）Prog.Neurobiol. 70, 1-32］。しかしながら、アストロサイトが産生するCTFβに関する機能は明らかにされていなかった。本発明により、アストロサイトとニューロンの細胞間コミュニケーション、中枢神経系の発達におけるAPPの生理学的役割、およびアルツハイマー病の病理学におけるAPPの役割に関する新たな知見が提供されることになった。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明によれば、アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）を有効成分として含む、シナプス形成促進剤が提供される。
【０００８】
本発明の別の側面によれば、アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）を有効成分として含む、神経変性疾患の治療・予防剤が提供される。
好ましくは、神経変性疾患はアルツハイマー病である。
【０００９】
本発明の別の側面によれば、アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）をニューロンに作用させることを含む、インビトロ又は非ヒト動物においてシナプス形成を促進する方法が提供される。
【００１０】
好ましくは、本発明によるシナプス形成を促進する方法においては、アストロサイト上に存在するC末端フラグメントβ（CTFβ）を用いる。
好ましくは、本発明によるシナプス形成を促進する方法においては、βセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク（APP）の切断を増大させること、及び／又はγセクレターゼによるC末端フラグメントβ（CTFβ）の切断を低減させることを含む。
【００１１】
本発明のさらに別の側面によれば、アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）の有効量をヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む、シナプスの形成を促進する方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、シナプス形成促進剤の製造のための、アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）の使用が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、アストロサイトに被験物質を接触させ、アストロサイトにおける、アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）の発現の程度、又はシナプス形成能を指標として、CTFβをアストロサイトに効率的に発現させることができる物質を選択することを特徴とする、CTFβをアストロサイトに効率的に発現させることができる物質をスクリーニングする方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記方法により選択される、CTFβをアストロサイトに効率的に発現させることができる物質が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、新規なシナプス形成促進剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明によるシナプス形成促進剤及び神経変性疾患の治療・予防剤は、アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）を有効成分として含む。
【００１６】
本発明で用いるC末端フラグメントβ（CTFβ）は、アミロイド前駆体タンパク（APP）にβセクレターゼを作用させてAPPを切断することによって調製したものでよいし、あるいは組み換え遺伝子を用いて発現させた組み換えタンパク質でもよい。即ち、C末端フラグメントβ（CTFβ）をコードする組み換え遺伝子を用意し、これを適当な発現系で発現させることによってC末端フラグメントβ（CTFβ）の組み換えタンパク質を調製することができる。アミロイド前駆体タンパク（APP）の塩基配列およびアミノ酸配列は公知であり、例えば、ヒトＡＰＰの配列は、NCBI(National Center of Biotechnology)に登録番号Ａ３３２９２として、ラットＡＰＰの配列はNCBIに登録番号ＮＭ ０１９２８８として、マウスＡＰＰの配列はNCBIに登録番号ＮＭ ００７４７１として登録されている。
【００１７】
ヒトのＡＰＰの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号５及び６に記載する。ラットのＡＰＰの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号７及び８に記載する。マウスのＡＰＰの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号９及び１０に記載する。
【００１８】
ヒトのC末端フラグメントβ（CTFβ）のアミノ酸配列は、配列番号６に記載のアミノ酸配列の597番目のアスパラギン酸(Asp)から695番目のアスパラギン(Asn)までの配列に対応する。
ラットのC末端フラグメントβ（CTFβ）のアミノ酸配列は、配列番号８に記載のアミノ酸配列の672番目のアスパラギン酸(Asp)から770番目のアスパラギン(Asn)までの配列に対応する。
マウスのC末端フラグメントβ（CTFβ）のアミノ酸配列は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の597番目のアスパラギン酸(Asp)から695番目のアスパラギン(Asn)までの配列に対応する。
なお、ヒト、マウス、ラットに共通することとして、APPには695アミノ酸からなるもの、これにインサーションが挿入された770アミノ酸或いは７５１アミノ酸からなるものが知られている。配列番号６及び１０に記載のAPPは695アミノ酸からなるものを、配列番号８に記載のAPPは770アミノ酸からなるものを例示している。つまり、本発明でいうCTFβとは、「何れかのタイプのAPPにおいて、BACE1により切断される部位近傍の配列(Val-Lys-Met)以後で、BACE1によって切断されて新しく生じたN-末端(Asp-Ala-Glu-Phe)の配列（N-末端の１番目から４番目）を含みそれから細胞内のC-末端までの領域からなるタンパク」を指す。
【００１９】
組み換えタンパク質の調製は当業者に公知の常法により行うことができる。先ず、C末端フラグメントβ（CTFβ）をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに組み込むことによって、CTFβ遺伝子を有する発現ベクターを構築する。発現ベクターにおいて、CTFβ）をコードする遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）に機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、大腸菌の lac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられ、哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどが挙げられ、酵母細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータなどが挙げられる。また、発現ベクターには、必要に応じて、ターミネーター、ポリアデニレーションシグナル、エンハンサー配列、選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子など）などを含有してもよい。次いで、CTFβ遺伝子を有する発現ベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製する。宿主は、CTFβ遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。形質転換は、プロトプラスト法、コンピテント細胞を用いる方法、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、スフェロブラスト法などを用いて、酢酸リチウム法等の当業者に公知の常法により行うことができる。上記の形質転換体は、導入されたCTFβ遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、CTFβの組み換えタンパク質を常法により単離、精製することができる。
【００２０】
本発明によるシナプス形成促進剤を適用できる神経疾患の具体例としては、アルツハイマー病又はパーキンソン病等の神経変性疾患などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、本発明によるシナプス形成促進剤は、アルツハイマー病の治療や予防に適用することができる。
【００２１】
本発明のシナプス形成促進剤の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与等）のいずれの投与経路により投与してもよい。経口投与に適する製剤形態としては、固形又は液体の形態が挙げられ、非経口投与に適する製剤形態としては、注射剤、点滴剤、坐剤、外用剤、点眼剤、点鼻剤等の形態が挙げられる。本発明のシナプス形成促進剤は、その製剤形態により必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤が加えられていてもよい。薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、着色剤、矯味剤、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤及び／又は薬学的アジュバント等が挙げられる。
【００２２】
経口用の固形製剤形態の本発明のシナプス形成促進剤は、例えば、有効成分であるアミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）に賦形剤を加え、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、又は矯味剤などの製剤用添加物を加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤として調製することができる。経口用の液体製剤形態の本発明のシナプス形成促進剤は、有効成分であるアミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）に矯味剤、安定化剤、又は保存剤など製剤用添加物の１種又は２種以上を加え、常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等として調製することができる。
【００２３】
本発明のシナプス形成促進剤を液体製剤として処方するために使用される溶媒は、水性又は非水性のいずれでもよい。液体製剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、注射剤は、生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水等の溶剤に溶解した後、フィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプル等）に充填することにより調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。また、非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法を用いてもよい。本発明で用いることができるキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、又は血清アルブミンを含む生理食塩水等が挙げられる。
【００２４】
本発明のシナプス形成促進剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴等を考慮して、当業者が決定することができる。本発明のシナプス形成促進剤の投与量は、例えば、有効成分量として、成人一人当たり、約0.1 ng〜約100 mg/kg、好ましくは約1 ng〜約10 mgである。本発明のシナプス形成促進剤の投与頻度は、例えば、一日一回〜数ヶ月に１回であればよい。
【００２５】
本発明では、アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）をニューロンに作用させることによって、インビトロ又は非ヒト動物（例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類の他、ニワトリ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル等）においてシナプス形成を促進することができる。この場合、C末端フラグメントβ（CTFβ）は、アストロサイト上に存在していることが好ましい。アストロサイト上に存在するC末端フラグメントβ（CTFβ）は、ニューロンのインテグリンと相互作用することによって、PKC活性化が促進され、その結果、ニューロンが成熟してシナプス形成が促進される。
【００２６】
本発明においては、βセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク（APP）の切断を増大させること、及び／又はγセクレターゼによるC末端フラグメントβ（CTFβ）の切断を低減させることによって、アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）の量を増大させることができ、これによってシナプス形成を促進することができる。
【００２７】
βセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク（APP）の切断を増大させるためには、βセクレターゼ活性を増大させればよい。例えば、βセクレターゼ自体を投与したり、あるいはβセクレターゼの発現を増大できる物質を投与することによって、βセクレターゼ活性を増大させることができる。また、γセクレターゼによるC末端フラグメントβ（CTFβ）の切断を低減させるためには、γセクレターゼ活性を低減させればよい。例えば、γセクレターゼの阻害剤を投与したり、γセクレターゼに対する抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡなどを投与したり、あるいはγセクレターゼの発現を低減できる物質を投与することによって、γセクレターゼ活性を低減させることができる。
【００２８】
本発明よれば、アストロサイトに被験物質を接触させ、アストロサイトにおける、アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）の発現の程度、又はシナプス形成能を指標として、CTFβをアストロサイトに効率的に発現させることができる物質を選択することを特徴とする、CTFβをアストロサイトに効率的に発現させることができる物質をスクリーニングする方法、並びに上記方法により選択される、CTFβをアストロサイトに効率的に発現させることができる物質が提供される。
【００２９】
上記スクリーニング方法に供することができる被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。被験物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
【００３０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
（Ｉ）実験方法
（１）細胞培養および変異マウス
ニューロンはWistarラット胚（胚日齢18〜19）から調製し、マイクロアイランド上でプレート培養し、既に報告されている方法［Hamaら、（2004）Neuron 41, 405-415］に従って添加物質を含む基礎培地で維持した。アストロサイトは18日齢ラット胚大脳皮質から調製し、20%胎児ウシ血清を含むDMEMで維持した。アストロサイトは、野生型、APP欠損、またはBACE1欠損マウスからも調製した［Zhengら（1995）, Cell 81, 525-531、Caiら（2001）, Nat.Neurosci. 4, 233-234、Luoら（2001）, Natl.Neurosci. 4, 231-232］（1日齢）。2対のAPP（+/-）マウスをJackson Laboratory社から入手し、ヘテロ接合体の交配によりAPP（+/+）、APP（+/-）、およびAPP（-/-）マウスを作製した。2対のBACE1（-/-）マウスをJackson Laboratory社から入手した。BACE1（+/-）とBACE1（-/-）マウスは、野生型C57BL6Jと交配して作製した。培養したアストロサイト（DIV12〜14）を用いて、カバースリップ周辺の支持細胞層を作製し、またDIV7〜8でニューロンにオーバーレイした。
【００３２】
（２）培養したアストロサイトのセクレターゼインヒビターによる処置
培養したアストロサイトを、50μMのβセクレターゼインヒビターII（Z-VLL-CHO：Calbiochem社製）及び／又は100μMのγセクレターゼインヒビターIII（Z-LL-CHO：Calbiochem社製）とともに、オーバーレイ実験の使用前24時間インキュベートした。
【００３３】
（３）遺伝子構築およびトランスフェクション
ヒトAPPおよびCTFβの発現プラスミド（それぞれpCIneo/APPおよびpCIneo/CTFβ）［Sunら（2002）, Neurosci.Lett. 321, 61-64］をA.Takashima博士から入手した。pCIneo/CTFβによってコードされるタンパク質は、シグナル配列としてラット・プレプロエンケファリンのN末端アミノ酸24残基を保有している。トランスフェクションはTransfectin（Bio-Rad社製）またはEffectene（Qiagen社製） を使用して実施した。
【００３４】
（４）競合ペプチドによるインテグリン受容体の阻害
RGDS、RHDS、GHDS、およびKHIFSDDSSEペプチドを合成して精製した。アストロサイトは、各ペプチド（50μM）とともに、オーバーレイまでの60分間プレインキュベートした。ペプチドも50μMの濃度で共培養の培地に添加した。
【００３５】
（５）顕微鏡観察
画像取得は、倒立顕微鏡（IX80）を装備したOlympus社製FluoView 500共焦点レーザー走査顕微鏡システムを用いて実施した。免疫細胞化学および免疫組織化学試験の画像は全て、開口数1.4のOlympus社製60X型油浸対物レンズで取得した。488nm（アルゴン）および543nm（He/Ne）のレーザー線を使用して画像を取得した。
【００３６】
（６）表面および細胞内の染色
細胞表面のCTFβを検出するため、生細胞をmAb2C8（Medical Biological Laboratory社製）とともに4℃で30分間インキュベートした。ついで、固定化および膜透過化を4％パラホルムアルデヒド（PFA）／0.12 Mスクロースを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で4℃で30分間実施し、ブロッキングを5％ウシ血清アルブミン（BSA）／PBSを用いて4℃で90分間実施した。全APPまたはCTFβを検出するために、試料をpAbCT695（Zymed社製）により室温で60分間染色した。PBSで洗浄後、標識分子をAlexa Fluor 488または546で標識した二次抗体によって可視化した。
【００３７】
（７）ビオチン化試薬による表面標識
細胞表面タンパク質ビオチン標識化および精製キット（PIERCE社製）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した。培養した細胞は、スルホ-NHS-SS-ビオチンを含有する培地中で4℃で30分間インキュベートし、洗浄してビオチン反応を止めてから溶解した。ホモジネートを遠心分離し、上清をImmobilized NeutrAvidinTM Gelと一緒にインキュベートした。洗浄後、結合したタンパク質をSDS試料緩衝液中で再懸濁してから煮沸した。ウエスタンブロットをビオチン標識化（表面）タンパク質について実施するにあたっては、mAb2C8（Medical Biological Laboratory社製）またはpAbCT695（Zymed社製）をプローブとして使用し、HRP（西洋わさびペルオキシダーゼ）で標識した二次抗体（Medical Biological Laboratory社製）を使用した。免疫反応バンドは、ECL Plus（Amersham Biotech社製）を用いて増強化学発光をオートラジオグラフィーで検出した。mAb2C8のAβ検出能は別のブロッティング実験で確認した（図２５）。
【００３８】
（８）PKCの活性化に関する免疫細胞化学
アストロサイトまたはHeLa細胞と1時間インキュベートした後、ニューロンを4％PFA／0.12Mスクロース／PBSで4℃で40分間固定化してから、0.05％Triton X-100含有PBSで90秒間細胞膜を透過性にした。5％BSA／2.5％正常ヤギ血清／PBSにより4で90分間ブロッキングした後、試料を抗P-MARCKSウサギポリクローナル抗体（TransGenic社製）および抗ウサギIgG Alexa Fluor 488 Conjugate（Molecular Probes社製）を用いて室温で染色した。アストロサイトはCy3.5で標識した抗GFAP抗体（Sigma社製）によって可視化した。P-MARCKSに対する免疫反応をImage Pro Plus 4.5.1ソフトウェア（米国メリーランド州シルバースプリング、Media Cybernetics社MD部門）を用いて定量した。HeLa細胞は、mAb2C8によりCTFβについて表面染色した。
【００３９】
（９）シナプスに関する免疫細胞化学法
アストロサイトまたはHeLa細胞と2日間インキュベートした後、ニューロンを4％PFA／0.12Mスクロース／PBSで4℃で40分間固定化してから、0.05％Triton X-100/PBSで90秒間細胞膜を透過性にした。細胞をウサギ抗GluR1ポリクローナル抗体（Upstate Biotechnology社製）およびマウス抗シナプトフィジンモノクローナル抗体（Sigma社製）で染色した。これらの一次抗体を、Alexa Fluor 488および546で標識した二次抗体（Molecular Probes社製）で可視化した。共局在性は、Image Pro Plus 4.5.1ソフトウェアを用いて定量した。緑と赤の画像を重ね合わせ、共局在化シグナルを自動化プログラムによって測定した。共焦点レーザー走査顕微鏡用の2種類のレーザー線および検出チャンネルの位置合わせが適切で画像取得が正確であるかどうかを、二重標識蛍光ビーズ（TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards：直径0.5μm、Molecular Probes社製）によって検証した。緑シグナルと赤シグナルの交差検出を避けるため、画像は488nmと543nmで順次収集した。
【００４０】
（１０）siRNAノックダウン
RNAi配列は次の通りである。
APP：（センス）5'-UUACCACAGAACAUGGCGAUCUGGG-3'  （配列番号１）
（アンチセンス）5'-CCCAGAUCGCCAUGUUCUGUGGUAA-3'  （配列番号２）
対照：（センス）5'-ACUUCUACGACUUUGUCUUCACCGC-3' （配列番号３）
（アンチセンス）5'-GCGGUGAAGACAAAGUCGUAGAAGU-3' （配列番号４）
【００４１】
RNAオリゴヌクレオチドは、ラット遺伝子に由来するものである。各RNAはLipofectamine 2000（Invitrogen社製）を用いて、培養したアストロサイトにトランスフェクトした。APP産生のsiRNAノックダウンレベルを評価するために、細胞サンプルをmAb22C11（Chemicon社製）により室温で60分間染色した。抗体染色は、Pacific Blue（Molecular Probes社製）を用いて視覚化した。
【００４２】
（１１）免疫組織化学
成熟ラットまたはマウス（8週齢）に、ペントバルビタール（ネンブタール注射液）により深く麻酔をかけ、4％PFA／PBSを経心臓的に灌流した。4％PFA／PBSで灌流してから20％スクロース／PBSで凍結保護した後、脳をOCTコンパウンド（Sakura社製）に包理した。クリオスタットによって矢状切片（30μm厚）に切断した。切片は0.1％Triton X-100／10％ウマ血清／PBSで30分間ブロッキングしてから、フリーフローティング免疫組織化学法に使用した。二重染色を行うために、異なる一次抗体を同時にインキュベーションしてから二次抗体と順次インキュベートした。
【００４３】
免疫組織化学法に使用した一次抗体は次の通りである。
マウス抗CTFβ（N末端）モノクローナル抗体（mAb）（2C8：Medical Biological Laboratory社製）
ウサギ抗APP（C末端）ポリクローナル抗体（pAb）（CT695：Chemicon社製）
マウス抗APP（N末端）mAb（22C11、Chemicon社製）
ウサギ抗P-アデューシン（Ser724でリン酸化）pAb（Upstate Biotechnology社製）
マウス抗GFAPmAb（GAS、Sigma社製）
ヤギ抗ダブルコルチンpAb（C-18：Santa Cruz Biotechnology社製）
マウス抗β1インテグリンmAb（clone18：BD Pharmingen Laboratory社製）
マウス抗ポリシアル酸-NCAM（PSA-NCAM）mAb（Chemicon社製）
ウサギ抗シナプシン1pAb（Sigma社製）
ウサギ抗GluR1ポリクローナル抗体（Upstate Biotechnology社製）
マウス抗シナプトフィジンモノクローナル抗体（Sigma社製）
【００４４】
免疫組織化学法に使用した二次抗体は次の通りである。
ヤギ抗マウスIgG抗体Alexa Fluor 546 Conjugate（Molecular Probes社製）
ヤギ抗ウサギIgG抗体Alexa Fluor 488 Conjugate（Molecular Probes社製）
ヤギ抗ウサギIgG抗体Alexa Fluor 546 Conjugate（Molecular Probes社製）
ロバ抗ヤギIgG抗体Alexa Fluor 546 Conjugate（Molecular Probes社製）
ヤギ抗マウスIgG抗体Alexa Fluor 488 Conjugate（Molecular Probes社製）
ヤギ抗マウスIgM抗体Alexa Fluor 546 Conjugate（Molecular Probes社製）
ヤギ抗マウスIgG抗体Pacific Blue Conjugate（Molecular Probes社製）
【００４５】
（１２）フリーズフラクチャーレプリカイムノゴールド電子顕微鏡検査
8週齢Wistarラットをネンブタール注射液による深麻酔下で4％PFA／0.1Mリン酸緩衝液によって経心臓的に灌流し、海馬をマイクロスライサー（京都、堂阪イーエム社製）を用いて100μmに切片化した。30％緩衝化スクロースまたは30％グリセロールで凍結保護後、歯状回を含むスライスの小片を1対のゴールドプレート間に保持し、液体プロパン中で急速冷凍してからフリーズエッチング装置（BAF400T：リヒテンシュタイン、BAL-TEC社製）により-110℃で粉砕した。Fujimoto（1995）, J.Cell.Sci. 108, 3443-3449の方法に従い、粉砕表面上のスライスから得たレプリカをSDS／トリス緩衝液で溶解した。レプリカを免疫電子顕微鏡検査して、細胞膜上のCTFβの位置を特定した。組織を探査するため、以下の一次抗体の組み合わせを使用した：mAb2C8とウサギ抗GLAST4931抗体（GLAST分子のアミン酸4931位周辺における膜外部分に対する抗体）［Shibataら（1997）, J.Neurosci, 17, 9212-9219］、mAb2C8とウサギ抗コネキシン43 C末端膜内部分抗体（米国ミズーリ州セントルイス、Sigma-Aldrich社製：1:400）、ならびにmAb2C8とウサギ抗スターゲイジン抗体（スターゲイジンの細胞外部分に対する抗体）［Inamuraら（2006）, Neurosci. Res. 55, 45-53］を使用した。次いで、これらの抗体は、適切な金標識二次抗体（英国カーディフ、BBI社製）で標識した。免疫標識レプリカを走査電子顕微鏡（LEO 1530）（ドイツ、オーバーコッヘン、LEO社製）とともに透過型電子顕微鏡（LEO 912AB）でも検査した。画像を記録し、デジタル化して、画像処理ソフトであるImageGauge（東京、富士フィルム社製）およびPhotoshop（米国カリフォルニア州サンノゼ、Adobe Systems社製）で解析した。
【００４６】
（ＩＩ）結果
（１）シナプス形成を促進するアストロサイトリガンドの分子同定
本発明者は、アストロサイトが接着依存過程によってニューロンのシナプス形成に影響することを以前に示した。インテグリン受容体経由でアストロサイトと局所的に接触すると、アストロサイト条件培地で培養した分離ニューロンにおいてPKCが活性化する。アストロサイトとニューロンの細胞間コミュニケーションは、リン酸化したMARCKSの免疫反応性がアストロサイトとの接触に依存して増加することから疑いないと思われる（図１Ａおよび図１Ｂ）。MARCKSのリン酸化は、インテグリン相互作用を阻害するRGDSペプチド（50μM）（図１Ｃ）のほか、β1インテグリンに対するモノクローナル抗体（図８）によっても完全に停止した。本発明者は、免疫細胞化学法により、培養したニューロンの細胞膜上に多量のβ1インテグリンを検出している［Hamaら、（2004）Neuron 41, 405-415］。これに対し、神経細胞接着分子（NCAM）の競合（ペプチド）剤であるKHIFSDDSSEペプチド（50μM）は、MARCKSのリン酸化に影響しなかった（図1Ｆ）。
【００４７】
これらの結果より、ニューロン受容体に対するリガンドが、アストロサイトの細胞膜上に存在するということを仮定するに至った。高分子のＩ型膜タンパクであるアミロイド前駆体タンパク（APP）などの膜タンパク質について、β1サブユニットを含有するインテグリン複合体との相互作用能についてスクリーニングした［Ghisoら（1992）,  Biochem. J., 288, 1053-1059、Yamazakiら（1997）, J.Neurosci. 17, 1004-1010］。ヒトおよびラットいずれのAPPにも、該当の細胞外領域にRHDSおよびGHDS配列が含まれる。APP由来のRHDSまたはGHDSペプチドでニューロンの培養物を処置すると、アストロサイト接触に依存するMARCKSリン酸化の誘導が抑制された（図１Ｄおよび図１Ｅ）。本発明者は、MARCKSのリン酸化にアストロサイトのAPPが必要であることは、アストロサイトからAPPを消すことにより直接示した。ラットのアストロサイトにおける内因性APPの産生をsiRNAによって阻害すると、アストロサイトとニューロンが接触してもMARCKSのリン酸化は促進されなかった（図９）。さらに、野生型［APP（+/+）］マウスから調製したアストロサイトでは、MARCKSリン酸化（図２Ｂ）および興奮性シナプスの形成促進（図２Ｆ）がともにラット分離ニューロン培養物において誘導されたのに対し、APP（-/-）マウスから得たアストロサイトでは効果がなかった（図２Ｃおよび図２Ｇ）。APP（+/-）マウスから調製したアストロサイトでは、以上の測定において野生型マウスの場合と同等であった。
【００４８】
（２）βセクレターゼによるAPP切断で生じる膜結合産物であるCTFβは、アストロサイトの細胞膜上に存在する。
本発明者は、βセクレターゼによるAPPの切断後の方が、APP中のRHDS/GHDS配列をニューロンのインテグリンと結合し易いと仮定した。それは、当該配列が、膜結合性のC末端フラグメントであるCTFβのN末端に位置するためである（図３Ａ）。APPのβ部位切断をモニターするため、CTFβまたはAβのN末端と特異的に反応するモノクローナル抗体であるmAb2C8を使用した（なお、mAb2C8は、完全長のAPPを認識しない）。細胞表面上でβ部位切断産物を検出するために、生きた培養アストロサイトをmAb2C8により4℃で30分間インキュベートし、固定し、膜を透過性にした後、二次抗体で検出した。培養アストロサイトがmAb2C8で強く染色されることが観察された（図３Ｂ）。次いで、膜透過性にした細胞をAPPのC末端を認識するポリクローナル抗体（pAbCT695）でインキュベートした（図３Ａ）。この方法では、細胞表面上のCTFβが、mAb2C8とpAbCT695による染色の共局在性として検出される。培養アストロサイトでは、これら2種類の抗体に対するシグナル分子が細胞膜上でほぼ同一の広がりを示した（図３Ｂ）。即ち、細胞表面上の反応性抗原の大半はCTFβであった。また、生物化学的方法によってアストロサイト表面にCTFβは存在するが、Aβは存在しないことを確認した。表面タンパク質を生きたアストロサイト上で選択的にビオチン化した。細胞を溶解した後、ビオチン化タンパク質をアビジンカラムで回収し、mAb2C8でイムノブロット分析した。mAb2C8によるブロット（図３Ｃ）により、CTFβの計算分子量（11.1 kDa）に近い13kDaに単一バンドが認められたが、Aβの分子量に対応するバンド（4.0〜4.2kDa）は検出されなかった。同じブロットをpAbCT695で検出し直すと、CTFβだけでなくAPPも検出された。これらの結果より、APPのβ部位切断がアストロサイトで生じ、CTFβがこれらの細胞膜上に存在することが分かった。また、培養したアストロサイト中に多量の脳型βセクレターゼ（BACE1）［VassarおよびCitron（2000）, Neuron 27, 419-422］が免疫検出された（図１０）。
【００４９】
これに対し、培養ニューロンではmAb2C8抗体とpAbCT695抗体で明確に異なる標識パターンを示した。図１１に示すように、mAb2C8で標識した表面は、ニューロン上では不鮮明であるが、アストロサイト上では鮮明であった。さらに、pAbCT695抗体に対するシグナル分子が、ニューロン内部全体で認められた。mAb2C8とpAbCT695の染色パターンの間に共局在化はみられなかった（図３Ｄ）。したがって、インタクトC末端を含むニューロンAPP種の大部分が細胞内に存在する。これらmAb2C8とpAbCT695による標識パターンには、2％胎児ウシ血清を添加し高密度でニューロン培養しても変化がなかった（図１２）。表面タンパク質をビオチン化し、培養ニューロンから回収し、mAb2C8でイムノブロット分析しても、免疫陽性バンドは検出されなかった（図３Ｅ）。
【００５０】
（３）CTFβは、培養ニューロン中でPKC活性化によるシナプス形成促進の開始のために必要かつ十分である。
培養アストロサイトをβセクレターゼ阻害剤で2日間プレインキュベートすると、mAb2C8による表面標識が著しく減少し（図１３）、処理したアストロサイトでは、培養ニューロン中でMARCKSのリン酸化を誘導できなかった（図１Ｇおよび図１Ｉ）。これに対し、γセクレターゼ阻害剤でプレインキュベートした場合は、これら特性のいずれにも影響しなかった（図１Ｈおよび図１３）。
【００５１】
まず、βセクレターゼ活性（BACE1）を欠損させたマウスアストロサイトで試験した。mAb2C8およびpAbCT695に対する分別染色により、BACE1（-/-）マウスから調製したアストロサイトでは、APPを細胞内で発現するが、細胞膜上にCTFβは発現しないことが示された（図１４）。BACE1を欠損するアストロサイトは、培養ニューロンでMARCKSのリン酸化を誘導せず（図２Ｄ）、興奮性シナプスの形成を促進することもなかった（図２Ｈ）。これらの薬理学的データから、アストロサイトによる接触への応答としてシナプス形成の促進が認められるには、アストロサイト上にCTFβが存在することが必要であることが裏付けられる。
【００５２】
次いで、アストロサイト上にCTFβが存在することが、PKCによるシグナル伝達の活性化による興奮性シナプス形成の開始として十分であるかどうかについて試験した。この細胞間シグナル伝達をin vitroで再構成するシステムを確立するため、まず、培養した哺乳動物細胞株をスクリーニングして、細胞表面にCTFβを発現しない細胞を特定した。mAb2C8により生きたままで染色すると、HeLa細胞はCTFβを発現していないことが示された（図１５）。HeLa細胞と共培養したニューロンは、MARCKSのリン酸化（図４Ｂ）またはシナプス形成の促進（図４Ｇ）を誘導しなかった。APP用の発現プラスミド（APP695）をHeLa細胞にトランスフェクトした後に、生きた細胞を染色すると、これらの細胞がmAb2C8により広範囲にわたって標識されることが示され（図１５）、実質的にβセクレターゼ活性を有するHeLa細胞と一致する観察結果が得られた。これらのmAb2C8陽性細胞をニューロンに重ねると、MARCKSのリン酸化およびシナプス形成がいずれも大きく増大した（図４Ｃおよび４Ｈ）。CTFβ用の発現プラスミドをトランスフェクトしても、同様な結果が得られた（図４Ｄおよび４Ｉ）。以上の結果より、ニューロンと接触する細胞の細胞膜上にCTFβが存在すれば、ニューロンのインテグリンのシグナル伝達を活性化するのに十分であることが示された。
【００５３】
（４）CTFβ／インテグリンの相互作用により、海馬顆粒下層のニューロン成熟においてPKC活性化が促進される。
成熟ニューロン形成は、成熟脳の2領域である脳室下帯（SVZ）および海馬顆粒下層（SGL）で主に生じる。アストロサイトがこれらの領域におけるニューロン形成を補助していることが示されている［Songら（2002）, Nature 417, 39-44、Doetsch（2003）, Nat.Neurosci. 6, 1127-1134、Seriら（2004）, J.Comp.Neurol. 478, 359-378］。インテグリンとCTFβによって仲介されるシグナル伝達がこれらの領域で生じるかどうか確認するために、成熟ラットの脳切片についてリン酸化アデューシン（Pアデューシン）［Matsuokaら（1998）, J.Cell.Biol. 142, 485-497］に対するモノクローナル抗体を用いて免疫組織化学法を実施した。リン酸化MARCKSの免疫反応がニューロンとアストロサイトで同程度に認められたのに対し、Pアデューシンの免疫染色はニューロンの方が顕著であった。したがって、P-アデューシンの免疫染色性は脳内におけるニューロンのPKC活性に対する指標であり、これはリン酸化MARCKSの免疫染色から得られるシグナルよりも明白である。Pアデューシンに対する免疫反応性はSVZおよびSGLに集中しており（図１６）、成熟ニューロン形成に寄与するPKCシグナル伝達と符合した。高倍率の顕微鏡写真から、Pアデューシンが、ダブルコルチンにも免疫陽性であるSGL中の成熟ニューロンのみに局在することがわかる（図５Ａ）。これらの成熟ニューロンは、β1インテグリンにも強い免疫陽性を示した（図５Ｂ）。これに対し、顆粒細胞層（GCL）の成熟ニューロンは、Pアデューシンとβ1インテグリンのいずれに対しても陰性であった。注目すべきは、近接ニューロンと異なり、SGLとGCLの全体で、すべてのアストロサイトがAPPのN末端（図３Ａ）に対して通常使用されている抗体であるmAb22C11［Cailleら（2004）, Development 131, 2173-2181］に対して強い免疫陽性を示した（図５Ｃ）ことである。CTFβを認識する抗体であるmAb2C8の免疫反応性もアストロサイトで顕著に認められた（図５Ｄ）。
【００５４】
アストロサイト表面におけるCTFβの存在を、さらにフリーズフラクチャーイムノゴールド標識（FRIL）によりin vivoでさらに検討した（図６）。ラット海馬領域から調製したレプリカを、mAb2C8（20nmゴールド）とグリア型グルタミン酸トランスポータの細胞外ドメイン（GLAST（ext.））（5nmゴールド）について二重標識した。GLAST（ext.）に特異的な粒子がアストロサイトのE（細胞質外）表面（EA）に局在し、mAb2C8に特異的な粒子がEA表面に効率的に検出された（図６Ａ）。2種類のイムノゴールド粒子の有意な共局在化がEA表面上に認められた（図６Ｃ）。これに対して、コネキシン43の細胞内ドメイン（Cx43（int.））に特異的な粒子（5nmゴールド）はアストロサイトのP（原形質）表面（PA）に局在化し、mAb2C8に特異的な粒子（20nmゴールド）はPA表面に検出されなかった（図６Ｂおよび６Ｃ）。次にCTFβがニューロン表面に存在するかどうかFRILによって試験した。スターゲイジンの第一細胞外ループドメイン（L1）に対する抗体［Inamuraら（2006）, Neurosci. Res. 55, 45-53］を使用してニューロンのE表面（EN）を特定した。mAb2C8イムノゴールド粒子（20nmゴールド）はL1に特異的な粒子で標識したEN上には認められなかったが（図６Ｄ：白色の矢印）、L1に特異的な粒子が達しない近接細胞（おそらくアストロサイト）のE表面上には認められた。mAb2C8イムノゴールド粒子とL1粒子の共局在化は認められなかった（図６Ｅ）ので、CTFβがニューロン表面上には存在しないことが示された。
【００５５】
SGL成熟ニューロンにおけるPKC活性化がAPPの(部位切断にどの程度依存するかを評価するため、CTFβを産生しないBACE1欠損マウスについて検討した［Caiら（2001）, Nat.Neurosci. 4, 233-234、Luoら（2001）, Nat.Neurosci. 4, 231-232］。BACE1（-/-）マウス5匹と野生型BACE1（+/+）マウス5匹から調製した脳切片とを比較すると、Pアデューシン免疫反応性が5匹のBACE1欠損マウスすべてのSGLで著しく低下していた（図１７）。
【００５６】
以上の結果より、SGL中の成熟ニューロンはβ1インテグリンを有し、CTFβを保持するアストロサイトとの接触に反応して、PKCシグナル伝達を活性化していることが示される。
【００５７】
（５）顆粒下層ニューロンにおけるPKC活性化により、CA3ニューロンとのシナプス形成が促進される。
SGLに存在する成熟ニューロンからは、軸索（苔状線維）が海馬のCA3領域に伸びている。ポリシアル酸化神経細胞接着分子（PSA-NCAM）は、これらのニューロンに特異的に発現している［Seki（2002）, J.Neurosci.Res. 70, 327-334］。抗PSA-NCAM抗体による免疫組織化学法をマウスまたはラットの脳切片において行い、CA3領域に接近する苔状線維を追跡した（図５Ｅおよび図１８）。CA3領域におけるPSA-NCAM免疫染色は、前シナプスマーカーであるシナプシン１とともに共局在しており（図５Ｆおよび図１８）、苔状線維末端の前シナプス成熟と一致した。
【００５８】
注目すべきは、苔状線維でみられるシナプシン１の免疫反応性は、5匹のBACE1欠損マウス全て著しく低下したが（図１８）、軸索はBACE1が存在しなくとも同様の突起を示した（図１８）ことである。GluR1とシナプトフィジンの免疫組織化学的共染色によって、苔状線維とCA3ニューロンの間のシナプス（接触）数を定量した（図１９）。5匹のBACE1欠損マウス全てについて検討したところ、苔状線維末端中のシナプトフィジンに対する免疫反応性は大きく低下したが、GluR1免疫反応性は野生型マウスと同等だった。GluR1／シナプトフィジンの共局在性は、統計学的に有意な低下を示した（図１９）。以上の結果より、APPのβ部位切断は、SGLに由来する成熟ニューロンがシナプスを形成するのに必要であることが分かった。
【００５９】
（ＩＩＩ）考察
（１）アストロサイト中のAPP切断反応によって、in vitroとin vivoにおいてシナプス形成が調整される。
脳におけるAPPの生理学的役割については、APP欠損マウスで研究されている。APP欠損マウスは生存力と繁殖力はあるが、前肢握力の低下、運動力の低下、および反応性神経膠症（反応性グリアの増殖）（グリオーシス）を示す［Zhengら（1995）, Cell 81, 525-531］。さらにAPP欠損マウスが加齢すると、学習障害およびシナプス可塑性を示す［Dawsonら（1999）, Neuroscience 90, 1-13、Seabrookら（1999）, Neuropharmacol. 38, 349-359］。しかし、正常な脳機能におけるアストロサイトAPPの役割は未だ検討されていない。アストロサイトにおけるAPP切断反応が、アストロサイトにより惹起されるシナプス形成の促進に必要であることは、本発明により初めて見出された。
【００６０】
（２）アストロサイト細胞膜におけるCTFβの存在はニューロン成熟のために重要である。
CTFβとAβ以外に、sAPP（セクレターゼによる切断を受けたAPP細胞外ドメイン）およびAICD（APP細胞内ドメイン）のいくつかの形態が、APP切断反応の際に生じる。過去の研究から、ニューロンによって産生されるAβの病理学的影響が検討されている。Aβ、sAPP、およびAICDの生理学的役割については広範囲にわたって研究されている［Cailleら（2004）, Development 131, 2173-2181、Turnerら（2003）, Prog.Neurobiol. 70, 1-32、Ohsawaら（1999）,  Eur.J.Neurosci. 11, 1907-1913］のに比べ、CTFβはほとんど注目されていない。本発明では、アストロサイトの細胞膜上にみられるCTFβがニューロン成熟に極めて重要であることが示された。脳に認められる大部分のβ-セクレターゼは、BACE1である［VassarおよびCitron（2000）, Neuron 27, 419-422、WilquetおよびStooper（2004）, Curr.Opin.Neurobiol. 14, 582-588］。BACE1は当初ニューロン中に限定して発現していると報告された［Vassarら（1999）, Science 286, 735-741］が、多量の酵素活性が脳組織から分離されたアストロサイト及び培養液中で検出されている［Roβnerら（2005）, J.Neurochem. 92, 226-234］。本実施例における免疫細胞化学実験および免疫組織化学実験から、アストロサイトがCTFβの主要な産生源であること示された。
【００６１】
（３）アストロサイトが脳における表面CTFβの主要産生源である。
HeLa細胞を用いた再構成実験の結果から、CTFβが表面発現すると、共培養したニューロン中でPKCシグナル伝達を活性化することによってシナプス形成の促進が誘導されることが示された。この観察結果から、シナプス形成の接触依存性メカニズムがアストロサイトに特異的ではない可能性が生じる。しかしCTFβはニューロン表面で検出されなかったため、アストロサイトはin vivoにおけるCTFβの存在する主要な細胞である。mAb2C8による生きた細胞の染色では、様々な条件下で培養したニューロンからの微量のシグナルのみが示された（図３Ｅ、図１１及び１２）。この染色はpAbCT695による染色とは共局在化しなかった（図３Ｅ）ので、ニューロン表面上のβ部位切断産物のほとんどはAβだと思われる。これらの結果と一致するが、培養ニューロンにニューロンをオーバーレイしても、MARCKSリン酸化は誘導されなかった（図２０）。
【００６２】
in vivoでアストロサイトの細胞膜上にCTFβが存在するかどうかを検証するために、免疫電子顕微鏡検査を行った。mAb2C8およびウサギポリクローナル抗体としてGLAST（アストロサイト由来）の細胞外ドメイン、コネキシン43の細胞内領域、またはスターゲイジン（ニューロン由来）の細胞外ドメインに対する抗体を用いたフリーズフラクチャーレプリカイムノゴールド標識実験を行った結果、mAb2C8染色がアストロサイト細胞膜の原形質外（E）表面のみに局在化されていた。
【００６３】
（４）SGLにおけるCTFβとインテグリンの相互作用により、CA3ニューロンによるシナプス形成が仲介される。
歯状回（DG）から皮質に伸びたラット脳切片を用いた免疫組織化学実験を行い、SGLおよび門にBACE1発現アストロサイトが豊富であることが認められた（図２１）。したがって、SGLに存在するニューロンは、アストロサイトと広範囲にわたって接触している可能性がある。実際、SGLはアデューシンのリン酸化に対して強い免疫染色を示した（図１６）。そこで、本発明では、海馬SGLに焦点を当てた。図７にSGLのニューロン成熟におけるシグナル伝達の概略図を示す。図７は、CTFβ／インテグリン間の相互作用を通したニューロンとアストロサイト間の最初の局所的な接触（図７Ａ）からPKCシグナル伝達の全体的活性化（図７Ｂ）までの概要を示す。
【００６４】
図7には、PKCの活性化から生じるシナプス形成促進の概略図も示す（図７Ｃ）。シナプシン1およびシナプトフィジンに対する免疫反応は、BACE1欠損マウスにおける苔状線維末端で著しく低下することが認められた（図１８及び図１９）。他方、GluR1に対する免疫活性はこれらの変異マウスから得られたCA3ニューロンにおいて顕著ではなかった（図１９）。したがって、BACE1欠損が前シナプス特化の成熟に影響すると思われる。Lairdら（2005）, J.Neurosci. 25, 11693-11709による最近の報告によると、BACE1変異マウスは海馬のCA1領域における対パルスの促進を欠損しており、前シナプス放出におけるBACE1と関連する。興味深いことに、苔状線維末端における前シナプスマーカー（シナプシン1およびシナプトフィジン）の欠損が、APP欠損マウスで報告された［Dawsonら（1999）, Neuroscience 90, 1-13］。本発明では、APP欠損マウスで同じ結果が得られた（図２２及び図２３）。BACE1はAPP以外のタンパク質も切断するが、BACE1欠損マウスとAPP欠損マウスとでは免疫組織化学データが類似するので、CTFβの欠損から生じるこれら変異マウスで前シナプス機能が損なわれることとよく一致する。
【００６５】
APP様タンパクであるAPLP1とAPLP2はAPPと強く関連し、BACE1により同様の切断反応を生じる［LiおよびSudhof（2004）, J.Biol.Chem. 279, 10542-10550］。しかし、APLP1とAPLP2はいずれも、BACE1による切断後に露出される(R/G)HDS配列を含まない。したがって、これらの膜結合産物はニューロンインテグリンのリガンドではないと思われる。この可能性を検討するため、HeLa細胞をAPLP1またはAPLP2のcDNAでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をオーバーレイ実験に使用したが、MARCKSリン酸化の促進は共培養したニューロンでは認められなかった（図２４）。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、培養ニューロンにおけるMARCKSリン酸化は、アストロサイト接触によって誘導されることを示す。左：リン酸化MARCKS（P-MARCKS）（緑）およびグリア細胞繊維性酸性タンパク（GFAP）（赤）に対する免疫蛍光染色。中央：微分干渉コントラスト（DIC）法による画像。スケールバーは20μm。N：ニューロン、A：アストロサイト。右：棒グラフはP-MARCKS免疫反応性の定量分析を示す。測定したニューロン数を括弧内に示す。データは平均値±標準偏差である。統計分析は、Kruskal-Wallis法による片側ANOVA検定によって実施した（p<0.01）。（A）単独ニューロン。（B）アストロサイトと接触するニューロン。（C〜F）RGDSペプチド（50μM）（C）、RHDSペプチド（50μM）（D）、GHDSペプチド（50μM）（E）、およびKHIFSDDSSEペプチド（50μM）(F)の存在下でアストロサイトと接触するニューロン。（G〜I）βセクレターゼ（50μM）（G）、γセクレターゼ（100μM）（H）、βおよびγ両セクレターゼ（I）の各阻害剤で前処置したアストロサイトと接触するニューロン。
【図２】図２は、APPまたはBACE1欠損マウス由来のアストロサイトでは、ニューロンにおけるMARCKSのリン酸化または興奮性シナプスの形成促進が誘導されないことを示す。（A〜D）左：P-MARCKS（緑）およびGFAP（赤）の免疫蛍光染色。中央：DIC画像。スケールバーは20μm。N：ニューロン、A：アストロサイト。右：棒グラフはP-MARCKS免疫反応性の定量分析を示す。測定したニューロン数を括弧内に示す。データは平均値±標準偏差である。統計分析はKruskal-Wallis法による片側ANOVA検定によって実施した（p<0.05）。（A）単独ニューロン。（B）野生型マウスのアストロサイトと接触するニューロン。（C）APP（-/-）マウスのアストロサイトと接触するニューロン。（D）BACE1（-/-）マウスのアストロサイトと接触するニューロン。（E〜H）GluR1（緑）とシナプトフィジン（赤）に対する免疫反応性の蛍光画像およびDIC画像。棒グラフはGluR1／シナプトフィジンの共局在化に関する定量分析を示す。N：ニューロン、H：HeLa細胞、A：アストロサイト。左端の画像は、枠囲い部分の高倍率図を示す。括弧内の数字は、検体の10ニューロンで測定した樹状突起数を示す。スケールバーは、DIC画像では20μm、高倍率蛍光画像では2μmを示す。統計分析はKruskal-Wallis法による片側ANOVA検定によって実施した（p<0.01）。データは平均値±標準偏差である。（E）単独ニューロン。（F）野生型マウスから調製したアストロサイトと接触するニューロン。（G）APP（-/-）マウスのアストロサイトと接触するニューロン。（H）BACE1（-/-）マウスのアストロサイトと接触するニューロン。
【図３】図３は、APPのβ部位切断による膜結合産物であるCTFβは、アストロサイトの細胞膜に存在することを示す。(A）βセクレターゼおよびγセクレターゼによる段階的なAPP切断反応の概略を示す図式。ハサミのアイコンは切断部位を示す。mAb22C11、mAb2C8、およびpAbCT695により認識される領域を矢印で示す。（BおよびD）mAb2C8（緑）およびpAbCT695（赤）で染色した培養アストロサイト（B）および培養ニューロン（D）の蛍光染色画像。抗体mAb2C8およびpAbCT695は、それぞれ細胞の膜透過化の前および後に加えた。下部：上部画像に示される緑色線に沿ったx-z断面画像。スケールバーは5μm。（CおよびE）mAb2C8で検出したアストロサイト（C）およびニューロン（E）の表面から収集したビオチン化タンパク質のイムノブロット。黒色矢印および白色矢印はそれぞれCTFβおよびAβの泳動位置を示す。
【図４】図４は、APPまたはCTFβを発現するHeLa細胞との接触後のニューロンにおけるMARCKSのリン酸化と興奮性シナプスの成熟を示す。（A〜E）リン酸化MARCKS（P-MARCKS）（緑）および表面CTFβ（赤）の免疫蛍光染色、DIC画像、およびP-MARCKS免疫反応性の定量分析をまとめた棒グラフ。測定したニューロン数を括弧内に示す。スケールバーは20μm。N：ニューロン、H：HeLa細胞。（A）単独ニューロン。（B）トランスフェクトしないHeLa細胞と接触するニューロン。（C）APP発現プラスミド（APP695）でトランスフェクトしたHeLa細胞と接触するニューロン。（D）CTFβ発現プラスミドでトランスフェクトしたHeLa細胞と接触するニューロン。（E）アストロサイトと接触するニューロン。（F〜J）GluR1（緑）およびシナプトフィジン（赤）の免疫蛍光ならびにDIC画像。棒グラフはGluR1／シナプトフィジンの共局在性に関する定量分析を示す。N：ニューロン、H：HeLa細胞、A：アストロサイト。左端の画像は、枠囲い部分の高倍率図を示す。括弧内は検体の10ニューロンで測定した樹状突起数を示す。スケールバーは、DIC画像では20μm、拡大蛍光染色画像では2μmを示す。（F）単独ニューロン。（G）トランスフェクトしないHeLa細胞と接触するニューロン。（H）APP発現用遺伝子（APP695）でトランスフェクトしたHeLa細胞と接触するニューロン。（I）CTFβ発現用遺伝子でトランスフェクトしたHeLa細胞と接触するニューロン。（J）アストロサイトと接触するニューロン。統計分析はKrulskal-Wallis法による片側ANOVA検定によって実施した（p<0.01）。データは平均値±標準偏差である。
【図５】図５は、成熟ラット脳においてアストロサイトと接触する成熟ニューロンにおけるPKC活性化とシナプス形成を示す。（A〜D）海馬歯状回の高倍率像。（A）Pアデューシン（緑）およびダブルコルチン（赤）に対する免疫染色。（B）β1インテグリン（緑）およびダブルコルチン（赤）に対する免疫染色。（C）APPのN末端（緑）（mAb22C11）およびGFAP（赤）に対する免疫染色。（D）CTFβ（緑）（mAb2C8）およびGFAP（赤）に対する免疫染色。GCL：顆粒細胞層、SGL：顆粒下層。（E）SGLを起始点とする成熟ニューロンを視覚化するポリシアル酸化神経細胞接着分子（PSA-NCAM）（赤）に対する免疫染色。DG：歯状回、mf：苔状線維。（F）シナプシンＩ（緑）およびPSA-NCAM（赤）に対する免疫染色を示すCA3における領域（Eの枠囲い部分）の高倍率像。mf：苔状線維。スケールバーは50μm。
【図６】図６は、成熟ラット歯状回のCTFβに対して標識したアストロサイト細胞膜のフリーズフラクチャーレプリカイムノゴールド画像を示す。（A）CTFβのmAb2C8標識（20 nm、黒色矢印）をアストロサイトのEフラクチャー面上（EA）に検出した。同じ位置にGLASTの細胞外ドメイン（GLAST（ext.））の標識（5nm、白色矢印）も認められた。スケールバーは100nm。（B）Cx43の細胞内ドメイン（Cx43（int.））の標識（5nm、灰色矢印）はアストロサイトのP表面（PA）にのみ検出し、PAにCTFβに特異的な粒子は認められなかった。スケールバーは100 nm。（C）CTFβに特異的なイムノゴールド粒子が、GLASTの細胞外ドメイン（EA）またはCx43の細胞内ドメイン（PA）に特異的な粒子と共在する比率。（D）mAb2C8によるCTFβの標識（20nm、黒色矢印）はニューロンのE表面（EN）で検出されなかった。同じ位置でスターゲイジンの細胞外ループドメインの標識（5nm、白色矢印）が認められた。挿入図：枠囲い部の高倍率図。スケールバーは100nm。mAb2C8粒子が隣接細胞のE表面に認められた。（E）mAb2C8イムノゴールド粒子とGLASTの細胞外ドメイン（EA）を標識する粒子の共在率を、mAb2C8粒子とL1粒子（EN）の共在率と比較する。（CおよびE）統計分析はStudentのt検定によって実施した（p<0.01）。データは平均値±標準偏差である。観察された領域数を括弧内に示す。
【図７】図７は、アストロサイトからニューロンへのシグナル伝達とこれに伴い成熟ニューロンにおいて生じるPKC活性化およびシナプス形成の図式を示す。（A）成熟ニューロン上のβ1サブユニットを含むインテグリン複合体とアストロサイト上のCTFβとの相互作用。α？β1：β1と関連するインテグリンのαサブユニットは特定されていない。（B）成熟ニューロン内のPKCシグナル伝達の発生および伝播。（C）成熟ニューロン（苔状線維）とCA3ニューロンの間のシナプス形成。
【図８】図８は、β1インテグリンに対するブロッキングmAbにより、分離ニューロンにおいてアストロサイト誘導のMARCKSリン酸化が減衰することを示す。左：リン酸化MARCKS（P-MARCKS）（緑）およびグリア細胞繊維性酸性タンパク（GFAP）（赤）に対する免疫蛍光染色。中央：微分干渉コントラスト（DIC）画像。スケールバーは20μm。N：ニューロン、A：アストロサイト。右：棒グラフはP-MARCKS免疫反応性の定量分析を示す。測定したニューロン数を括弧内に示す。データは平均値±標準偏差である。統計分析は、Kruskal-Wallis法による片側ANOVA検定によって実施した（p<0.01）。（A）単独ニューロン。（B）アストロサイトと接触するニューロン。（C）マウスIgG（20 μg/ml）の存在下でアストロサイトと接触するニューロン。（D）β1インテグリンに対するブロッキングmAb（20 μg/ml）（MAB2253、Chemicon社製）の存在下でアストロサイトと接触するニューロン。対照またはブロッキング抗体はアストロサイト重層（オーバーレイ）の際に培地に添加した。
【図９】図９は、APP発現をノックダウンするようsiRNAで処理したアストロサイトは、ニューロンにおけるMARCKSリン酸化を誘導しないことを示す。左：P-MARCKS（緑）およびGFAP（赤）に対する免疫蛍光染色。中央：DIC画像。APPに対するmAb22C11との免疫反応性（図３参照）が重ね合わされている（青）。スケールバーは20μm。N：ニューロン、A：アストロサイト。右：棒グラフはP-MARCKS免疫反応性の定量分析を示す。測定したニューロン数を括弧内に示す。データは平均値±標準偏差である。統計分析はKruskal-Wallis法による片側ANOVA検定によって実施した（p<0.01）。（A）単独ニューロン。（B）アストロサイトと接触するニューロン。（C）対照ヌクレオチドでトランスフェクトしたアストロサイトと接触するニューロン。（D）APP siRNAヌクレオチドでトランスフェクトしたアストロサイトと接触するニューロン。
【図１０】図１０は、培養細胞におけるβセクレターゼ（BACE1）を示す。BACE1に対する免疫蛍光染色および対応するDIC画像。培養細胞は固定化、膜透過化の後、抗BACE1マウスモノクローナル抗体（MAB5308：Chemicon社製）で染色した。（A）14日間in vitro培養した（DIV14）アストロサイト。（B）8日間in vitro培養した（DIV8）ニューロン。スケールバーは20μm。
【図１１】図１１は、生きたアストロサイトおよびニューロンに対するmAb2C8による表面標識を示す。左：培養したアストロサイトおよびニューロンの表面におけるCTFβに対する免疫蛍光染色。代表的な3画像を示す。表面染色実験は抗体mAb2C8を用いて実施した（実験方法を参照）。右：DIC画像。スケールバーは50μm。N：ニューロン、A：アストロサイト。
【図１２】図１２は、異なる培養条件下におけるアストロサイトと接触しないニューロンのmAb2C8（生きた細胞の染色）およびpAbCT695（膜透過後の染色）による免疫染色を示す。mAb2C8（緑）およびpAbCT695（赤）によって染色したニューロンの蛍光画像および対応するDIC画像。スケールバーは20μm。（A）マイクロアイランド上の分離ニューロン。（B）高密度培養したニューロン。mAb2C8およびpAbCT695はそれぞれ細胞の膜透過化の前および後に加えた。
【図１３】図１３は、培養アストロサイトにおけるβおよびγセクレターゼの一方または両方の薬理学的阻害および細胞表面上におけるCTFβの存在を示す。左：未処理のアストロサイト（A）およびセクレターゼ阻害剤（SI）で処置したアストロサイト（B〜D）の表面上におけるCTFβに対する免疫蛍光染色（mAb2C8）。（B）β-セレクターゼ（50 μM）。（C）γ-セクレターゼ（100μM）。（D）βおよびγの両セクレターゼ（それぞれ50μMおよび100μM）。表面染色実験は、抗体mAb2C8を用いて実施した（実験方法を参照）。右：DIC画像。スケールバーは20μm。
【図１４】図１４は、ノックアウトマウスから調製した培養アストロサイトのmAb2C8（生きた細胞の染色）およびpAbCT695（膜透過化後染色）による免疫染色を示す。mAb2C8（緑）およびpAbCT695（赤）で染色したアストロサイトの免疫蛍光染色画像、および対応するDIC画像。スケールバーは10μm。（A）野生型マウス由来のアストロサイト。（B）APP欠損マウス由来のアストロサイト。（C）BACE1欠損マウス由来のアストロサイト。mAb2C8およびpAbCT695はそれぞれ細胞の膜透過化の前および後に加えた。
【図１５】図１５は、全長APPまたはCTFβをコードする発現プラスミドでトランスフェクトしたHeLa細胞表面上におけるCTFβの存在を示す。ベクター（A）およびAPP（B）でトランスフェクトした後、mAb2C8で検出したHeLa細胞に対して細胞表面染色を実施した（実験方法を参照）。赤色の線に沿った断面像を右図に示す。スケールバーは5μm。（C）HeLa細胞表面から収集したビオチン化タンパク質のイムノブロットをpAbCT695によって検出した。黒色矢印および白色矢印はそれぞれ全長APP（APP695）およびCTFβの泳動位置を示す。
【図１６】図１６は、海馬顆粒下層および脳室下帯におけるアデューシンのリン酸化に対する免疫反応位置を示す。成熟ラット脳の矢状断面の低倍率像。リン酸化アデューシン（P-アデューシン）に対する免疫組織化学法（上部）、および該当するDIC画像（下部）。スケールバーは200μm。CC：脳梁、CP：脈絡叢、CX：皮質、DG：歯状回、GCL：顆粒細胞層、LV：側脳室、SGL：顆粒下層、SVZ：脳室下帯
【図１７】図１７は、BACE1欠損マウス由来海馬顆粒下層の成熟ニューロンにおけるアデューシンのリン酸化に対する免疫反応性の低下を示す。野生型マウス（左）およびBACE1ノックアウトマウス（右）から得た海馬歯状回の顕微鏡写真。（A）DIC画像。GCL：顆粒細胞層、SGL：顆粒下層。細胞層を破線で区分してある。（B）Alexa Fluor 488で視覚化したPアデューシンに対する免疫蛍光染色画像。（C）Cysで視覚化したGFAPの免疫蛍光染色画像。（D）PアデューシンおよびGFAPの重ね合わせ画像。スケールバーは100μm。Pアデューシンに対する免疫反応性については、他のBACE1（+/+）／BACE1（-/-）の4ペアでも同様の差が認められた。
【図１８】図１８は、BACE1欠損マウス由来の顆粒下層ニューロンの苔状線維末端における前シナプスマーカー（シナプシンＩ）に対する免疫反応性の低下を示す。野生型マウス（左）およびBACE1ノックアウトマウス（右）から得た海馬歯状回およびCA3の顕微鏡写真。（A）DIC画像。GCL：顆粒細胞層、SGL：顆粒下層、DG：歯状回。細胞層を破線で区分してある。（B）Alexa Fluor 546で視覚化したPSA-NCAMに対する免疫蛍光染色画像。mf：苔状線維。（C）Alexa Fluor 488で視覚化したシナプシンIに対する免疫蛍光画像。（D）（C）の枠内部分の高倍率画像。CA3細胞層は破線で区分してある。（E）PSA-NCAMおよびシナプシンＩの重ね合わせ画像。スケールバーは100μm。シナプシンIに対する免疫反応性については、他のBACE1（+/+）／BACE1（-/-）の4ペアでも同様な差が認められた。
【図１９】図１９は、BACE1欠損マウス由来の顆粒下層ニューロンの苔状線維末端における前シナプスマーカー（シナプトフィジン）に対する免疫反応性の低下を示す。（A）野生型マウス（左）およびBACE1ノックアウトマウス（右）から得たCA3の顕微鏡写真。GluR1（Alexa Fluor 488による）とシナプトフィジン（Alexa Fluor 546による）の重ね合わせ画像。スケールバーは20μm。シナプトフィジンに対する免疫反応性については、他のBACE1（+/+）／BACE1（-/-）の4ペアでも同様な差が認められた。（B）GluR1とシナプトフィジンの共局在性に関する定量分析。括弧内の数字は各系統につき5匹ずつのマウスから得た測定領域数を示す。統計分析はWelch法を用いたStudentのt検定によって実施した（p<0.01）。データは平均±標準偏差である。
【図２０】図２０は、アストロサイトと異なり、ニューロンのオーバーレイではMARCKSのリン酸化が誘導されないことを示す。左：P-MARCKS（緑）に対する免疫蛍光染色。中央：DIC画像。スケールバーは20μm。N：ニューロン、A：アストロサイト。右：棒グラフはP-MARCKS免疫反応性の定量分析を示す。測定したニューロン数を括弧内に示す。データは平均値±標準偏差である。統計分析はKruskal-Wallis法による片側ANOVA検定によって実施した（p<0.01）。（A）単独ニューロン。（B）アストロサイトと接触するニューロン。（C）時間が経過した後で培養に接種した2ニューロンと接触するニューロン。
【図２１】図２１は、成熟ラット脳の矢状切片におけるBACE1およびGFAPの局在化を示す。成熟ラット（8週齢）から得た矢状切片におけるBACE1（緑）およびGFAP（赤）の免疫蛍光染色。スケールバーは0.1 mm。DG：歯状回、CX：皮質、CC：脳梁、HIF：海馬溝、DG：歯状回、ML：分子層、GCL：顆粒細胞層、SGL：顆粒下層
【図２２】図２２は、APP欠損マウス由来の顆粒下層ニューロンの苔状線維末端における前シナプスマーカー（シナプシンＩ）に対する免疫反応性の低下を示す。野生型マウス（左）およびAPPノックアウトマウス（右）から得た海馬歯状回およびCA3の顕微鏡写真。（A）DIC画像。GCL：顆粒細胞層、SGL：顆粒下層、DC：歯状回。細胞層を破線で区分してある。（B）Alexa Fluor 546で視覚化したPSA-NCAMに対する免疫蛍光染色画像。mf：苔状線維。（C）Alexa Fluor 488で視覚化したシナプシンIに対する免疫蛍光染色画像。（D）（C）の枠内部分の高倍率画像。CA3細胞層は破線で示されている。（E）PSA-NCAMおよびシナプシンIの重ね合わせ像。スケールバーは100μm。
【図２３】図２３は、APP欠損マウス由来の顆粒下層ニューロンの苔状線維末端における前シナプスマーカー（シナプトフィジン）に対する免疫反応性の低下を示す。（A）野生型マウス（左）およびAPPノックアウトマウス（右）から得たCA3の顕微鏡写真。GluR1 （Alexa Fluor 488）とシナプトフィジン（Alexa Fluor 546）の重ね合わせ画像。スケールバーは50μm。
【図２４】図２４は、APLP1またはAPLP2を発現するHeLa細胞では、培養ニューロンにおけるMARCKSの接触依存性リン酸化が誘導されないことを示す。（A、B）左：APLP1（A）およびAPLP2（B）に対する免疫蛍光染色。右：DIC画像。（C〜H）左：リン酸化MARCKS（P-MARCKS）に対する免疫染色の蛍光画像（緑）とこれに対応するDIC画像およびAPLP1（赤）（F）、APLP2（赤）（G）、GFAP（赤）（H）に対する免疫染色の蛍光画像。N：ニューロン、H：HeLa細胞、A：アストロサイト。右：棒グラフはP-MARCKS免疫反応性の定量分析を示す。測定したニューロン数を括弧内に示す。データは平均値±標準偏差である。統計分析はKruskal-Wallis法による片側ANOVA検定によって実施した（p<0.01）。（C）単独ニューロン。（D）トランスフェクトしないHeLa細胞と接触するニューロン。（E）発現プラスミドでトランスフェクトしたHeLa細胞と接触するニューロン。（F）APLP1をコードする発現プラスミドでトランスフェクトしたHeLa細胞と接触するニューロン。（G）APLP2をコードする発現プラスミドでトランスフェクトしたHeLa細胞と接触するニューロン。（H）アストロサイトと接触するニューロン。スケールバーは20μm。APLPをコードする発現プラスミドはシカゴ大学のGopal Thinakaran博士から入手した。
【図２５】図２５は、pAbCT695およびmAb2C8によって検索したAβペプチドのイムノブロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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