(57)【要約】【課題】  より高感度に生体のストレスを測定する。【解決手段】  本発明に係るストレス測定方法は、生体の唾液を採取して唾液サンプルとする唾液採取工程（Ｓ１０１）と、唾液サンプルに還元剤を加える還元剤付加工程（Ｓ１０２）と、唾液サンプルに酸化剤を加える酸化剤付加工程（Ｓ１０３）と、還元剤付加工程において還元剤が加えられ、酸化剤付加工程において酸化剤が加えられた唾液サンプルの化学発光をチオシアン酸イオンの濃度の指標として測定する発光測定工程（Ｓ１０４）と、チオシアン酸イオンの濃度から、所定の基準に基づいて生体のストレスを評価するストレス評価工程（Ｓ１０５）と、を含む。【選択図】  図３
2008134210.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の唾液を採取して唾液サンプルとする唾液採取工程と、
前記唾液サンプルに含まれるチオシアン酸イオンの濃度を評価する指標物質評価工程と、
前記指標物質評価工程により評価されたチオシアン酸イオンの濃度から、所定の基準に基づいて前記生体のストレスを評価するストレス評価工程と、
を含むストレス測定方法。
【請求項２】
前記指標物質評価工程は、
前記唾液サンプルに還元剤を加える還元剤付加工程と、
前記唾液サンプルに酸化剤を加える酸化剤付加工程と、
前記還元剤付加工程において還元剤が加えられ、前記酸化剤付加工程において酸化剤が加えられた前記唾液サンプルの化学発光を前記チオシアン酸イオンの濃度の指標として測定する発光測定工程と、
を含むことを特徴とする請求項１に記載のストレス測定方法。
【請求項３】
前記還元剤付加工程において付加する還元剤は、没食子酸を含むことを特徴とする請求項２に記載のストレス測定方法。
【請求項４】
前記酸化剤付加工程において付加する酸化剤は、過酸化水素を含むことを特徴とする請求項２又は３に記載のストレス測定方法。
【請求項５】
前記指標物質評価工程は、
前記唾液サンプルに、当該唾液サンプルに含まれるチオシアン酸イオンと反応して発色する試薬を加える試薬付加工程と、
前記発色剤付加工程において試薬が加えられた前記唾液サンプルの吸光度を前記チオシアン酸イオンの濃度の指標として測定する吸光度測定工程と、
を含むことを特徴とする請求項１に記載のストレス測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体のストレスを測定するストレス測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、健康状態や精神状態の把握、また、その他医療上の目的からストレスの測定や判定が行われている。下記の特許文献１では、簡便かつ容易にストレスの測定を可能とするものとして、唾液中のアミラーゼ活性を指標としてストレスの測定を行なうことが提案されている。
【特許文献１】特開２００２−１６８８６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、唾液中のアミラーゼ活性は、弱いストレッサーに対してはあまり敏感ではないという問題点がある。従って、特許文献１の方法では、弱いストレスを検出することができず、また、ストレスの度合についても正しく測定することができなかった。即ち、特許文献１の方法では、ストレスを十分な感度で検出及び測定することができなかった。
【０００４】
本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、より高感度に生体のストレスを測定することができるストレス測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、生体へのストレスに応じて、当該生体の唾液中のチオシアン酸イオンの濃度が高い感度で変化することを見出した。即ち、生体へのストレスが大きくなると、当該生体の唾液中のチオシアン酸イオンの濃度が、ストレスに対して高感度で高くなる。この知見に基づいて、本願発明者は本発明を完成するに至った。
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明に係るストレス測定方法は、生体の唾液を採取して唾液サンプルとする唾液採取工程と、唾液サンプルに含まれるチオシアン酸イオンの濃度を評価する指標物質評価工程と、指標物質評価工程により評価されたチオシアン酸イオンの濃度から、所定の基準に基づいて生体のストレスを評価するストレス評価工程と、を含むストレス測定方法であることを特徴とする。
【０００７】
本発明に係るストレス測定方法では、ストレスの測定対象の生体から唾液が採取されて、採取された唾液サンプルに含まれるチオシアン酸イオン（チオシアネートイオン：ＳＣＮ−）の濃度が評価されて、チオシアン酸イオンの濃度に基づいて生体のストレスが評価される。本発明に係るストレス測定方法によれば、ストレスに対して高い感度を有するチオシアン酸イオンの濃度を指標としてストレスを評価することによって、より高感度に生体のストレスを測定することができる。
【０００８】
指標物質評価工程は、唾液サンプルに還元剤を加える還元剤付加工程と、唾液サンプルに酸化剤を加える酸化剤付加工程と、還元剤付加工程において還元剤が加えられ、酸化剤付加工程において酸化剤が加えられた唾液サンプルの化学発光をチオシアン酸イオンの濃度の指標として測定する発光測定工程と、を含むことが望ましい。チオシアン酸イオンは、酸化剤及び還元剤を加えることにより化学発光する。また、チオシアン酸イオンの濃度が多くなると化学発光の発光が強くなるなど、チオシアン酸イオンの濃度に応じて化学発光の発光量が変化する。従って、上記の構成のように、化学発光をチオシアン酸イオンの濃度の指標として測定することにより、本発明によるストレスの評価を行うことが可能となる。即ち、この構成によれば、唾液を採取し、採取した唾液サンプルの発光を計測するという、高感度かつ簡易な方法で生体のストレスを測定することができる。
【０００９】
還元剤付加工程において付加する還元剤は、没食子酸を含むことが望ましい。酸化剤付加工程において付加する酸化剤は、過酸化水素を含むことが望ましい。これらの構成によれば、確実に化学発光を生じさせることができるので、本発明を確実に実施することができる。
【００１０】
指標物質評価工程は、唾液サンプルに、当該唾液サンプルに含まれるチオシアン酸イオンと反応して発色する試薬を加える試薬付加工程と、発色剤付加工程において試薬が加えられた唾液サンプルの吸光度をチオシアン酸イオンの濃度の指標として測定する吸光度測定工程と、を含むことが望ましい。この構成によれば、チオシアン酸イオンの濃度を確実に評価することができるので、高感度かつ確実に生体のストレスを測定することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ストレスに対して高い感度を有するチオシアン酸イオンの濃度を指標としてストレスを評価することによって、より高感度に生体のストレスを測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図面と共に本発明によるストレス測定方法の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致しない。
【００１３】
［第１実施形態］
図１は、第１実施形態に係るストレス測定方法に用いられるストレス測定システム１０の機能構成図である。ストレス測定システム１０は、被験者（生体）から採取された唾液に含まれるチオシアン酸イオンの発光現象を利用して被験者のストレスを測定（判定）するものである。具体的には、本システム１０は、唾液サンプル設置部１１と、還元剤付加部１２と、酸化剤付加部１３と、発光測定部１４と、ストレス評価部１５とを含んで構成されている。
【００１４】
唾液サンプル設置部１１は、発光測定の対象となる生体の唾液を含む唾液サンプルを設置する設置手段である。唾液サンプルとしては、液状物質の吸収及び保持が可能な吸収材を利用し、この吸収材に生体の唾液を吸収及び保持したものが用いられる。吸収材としては、好ましくはろ紙が用いられる。あるいは、ろ紙以外のもの、例えばスポンジ等を用いることとしても良い。
【００１５】
唾液サンプル設置部１１に設置された唾液サンプルに対し、測定システム１０には、還元剤付加部１２、及び酸化剤付加部１３が設けられている。還元剤付加部１２は、唾液サンプルに還元剤を加える。また、酸化剤付加部１３は、唾液サンプルに酸化剤を加える。これらの還元剤及び酸化剤は、唾液サンプルで化学発光を生じさせるために用いられる。還元剤としては例えば、没食子酸を含むものを用いるのが好ましい。また、酸化剤としては例えば、過酸化水素を含むものを用いるのが好ましい。これらの構成によれば、確実に化学発光を生じさせることができるので、本発明を確実に実施することができる。
【００１６】
発光測定部１４は、唾液サンプル設置部１１に対して所定位置に設けられており、唾液サンプル設置部１１に設置された唾液サンプルの化学発光を測定する。また、発光測定部１４で測定された化学発光データは、ストレス評価部１５に入力されている。ストレス評価部１５は、測定された化学発光データを参照し、所定の基準に基づいてストレスを評価する。なお、所定の基準とは、化学発光データからストレスの測定を可能とする基準であり、具体的な内容については後述する。
【００１７】
図２は、図１に示した実施形態のストレス測定システム１０における、具体的装置構成の一例を示す。図２に示す構成例においては、ストレス測定システム１０は、シャーレ１０ａと、還元剤付加用シリンジ１０ｂと、酸化剤付加用シリンジ１０ｃと、光電子増倍管１０ｄと、暗箱１０ｅと、フォトンカウンタ１０ｆと、情報処理装置１０ｇとの各装置を含んで構成されている。
【００１８】
シャーレ１０ａは、唾液サンプル２０を設置するためのものであり、唾液サンプル設置部１１に相当する。還元剤付加用シリンジ１０ｂは、液体物質を吐出する装置であり、液体の還元剤をシャーレ１０ａに設置された唾液サンプル２０に付加するためのものである。即ち、還元剤付加用シリンジ１０ｂは、図１における還元剤付加部１２の機能を実現する。また、酸化剤付加用シリンジ１０ｃも構造は還元剤付加用シリンジ１０ｂ同様であり、液体の酸化剤をシャーレ１０ａに設置された唾液サンプル２０に付加するためのものである。即ち、酸化剤付加用シリンジ１０ｃは、図１における酸化剤付加部１３の機能を実現する。なお、還元剤付加用シリンジ１０ｂ及び酸化剤付加用シリンジ１０ｃは、情報処理装置１０ｇにより、還元剤及び酸化剤の唾液サンプル２０に対する吐出の量やタイミングなどが制御される構成とするのが好ましい。
【００１９】
光電子増倍管１０ｄは、シャーレ１０ａに設置された唾液サンプル２０の発光、即ち還元剤、酸化剤と唾液サンプル２０に含まれるチオシアン酸イオンとの酸化還元反応の結果生じるフォトン（光子）を検出する。暗箱１０ｅは、シャーレ１０ａでの微弱な発光を検出するために、外部からの光を遮断し、シャーレ１０ａ及び光電子増倍管１０ｄの周囲を暗くするために設けられている。このような構成において、光電子増倍管１０ｄにより検知されたフォトンに対応して出力された検出信号が、計数回路などから構成されたフォトンカウンタ１０ｆによりカウントされる。これにより、シャーレ１０ａからの化学発光が計測され、化学発光データが取得される。光電子増倍管１０ｄ、及びフォトンカウンタ１０ｆは、図１における発光測定部１４の機能を実現する。
【００２０】
フォトンカウンタ１０ｆにより測定された化学発光データは情報処理装置１０ｇに送信される。情報処理装置１０ｇは、ＣＰＵ及びメモリなどから構成され、ストレスを評価するための所定の基準を記憶しており、ストレスを評価するための演算などを行う。情報処理装置１０ｇは、受信した化学発光データを参照し、所定の基準に基づいて被験者のストレスを評価する。これにより、情報処理装置１０ｇは、図１におけるストレス評価部１５の機能を実現する。また、この情報処理装置１０ｇは、ストレス評価以外の機能、例えば測定システム１０の各部の制御機能などを併せて有していても良い。
【００２１】
なお、各装置には必要に応じて電源が備えられており、動作に必要な電力が供給される。また、情報処理装置１０ｇに対しては、キーボードやマウスなどの入力装置、ＣＲＴディスプレイや液晶ディスプレイなどの表示装置などが、必要に応じて接続される。入力装置は、ストレス測定実行の指示情報や、測定条件の情報などの入力に用いることができる。また、表示装置は、ストレスの測定結果や、測定の実行状況などの表示に用いることができる。
【００２２】
次に、図１及び図２に示したストレス測定システム１０を用いた本発明によるストレス測定方法について、図３に示すフローチャートを参照しつつ説明する。
【００２３】
まず、唾液採取用のチューブ（例えば、サリベット（商品名））を用いて、被験者の口中から唾液を採取する。採取した唾液を、ろ紙やスポンジ等の吸収材に含ませて、唾液サンプル２０とする（ステップＳ１０１、唾液採取工程）。唾液サンプル２０は、シャーレ１０ａ上に設置される。
【００２４】
続いて、以下のように唾液サンプルに含まれるチオシアン酸イオンの濃度を評価する（ステップＳ１０２〜Ｓ１０４、指標物質評価工程）。まず、還元剤付加用シリンジ１０ｂを用いて、唾液サンプル２０に没食子酸等の還元剤を加える（ステップＳ１０２、還元剤付加工程）。また、酸化剤付加用シリンジ１０ｃを用いて、唾液サンプル２０に過酸化水素等の酸化剤を加える（ステップＳ１０３、酸化剤付加工程）。なお、各シリンジ１０ｂ、１０ｃには、それぞれ予め必要量の還元剤、酸化剤を入れておくものとする。また、還元剤を唾液サンプル２０に加える処理までは、測定対象となる唾液サンプル２０からの化学発光はほとんど生じないので、必ずしも暗箱１０ｅ内で行う必要はない。
【００２５】
還元剤及び酸化剤が加えられた唾液サンプル２０では、唾液中に含まれ被験者のストレスに応じた濃度となるチオシアン酸イオンが化学反応をして、化学発光が派生する。このときに起こる化学反応は、酸化剤として過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を用いたときには、以下の化学式で示される反応となる。
Ｓｐｘ
Ｈ２Ｏ２  ＋  ＳＣＮ−    →  ＯＳＣＮ−  ＋  Ｈ２Ｏ  ＋  ＵＣＬ↑
上記の化学式で、Ｓｐｘは、唾液中に含まれるペルオキシターゼを示したものであり、触媒の役割を果たしている。また、ＵＣＬ↑は、微弱化学発光（ultra-weakchemiluminescence）であり、化学反応により化学発光が生じることを示している。また、ＯＳＣＮ−は、化学反応により生じる酸化生成物（抗微生物活性保有物質）を示している。なお、還元剤として用いる没食子酸は、上記の化学式には示されていないが、化学発光の発光量を底上げする役割を果たしていると考えられる。
【００２６】
上述したように、唾液中のチオシアン酸イオンは、被験者である生体のストレスと相関を有しており、ストレスが強い場合はチオシアン酸イオンの濃度が高くなる。従って、ストレスの強さに応じて、化学発光の発光量が大きくなる。光電子増倍管１０ｄは、その化学発光によるフォトンを検知する。さらに、フォトンカウンタ１０ｆが、光電子増倍管１０ｄにより検知されたフォトンをカウントし、化学発光を測定する（ステップＳ１０４、発光測定工程）。フォトンカウンタ１０ｆは測定された化学発光データを情報処理装置１０ｇに送信する。上記のように、化学発光の発光量がチオシアン酸イオンの濃度の指標値として評価される。
【００２７】
次に、情報処理装置１０ｇは、受信した化学発光データを参照し、所定の基準に基づいてストレスを評価する（ステップＳ１０５、ストレス評価工程）。ここで、所定の基準としては、例えば、測定された化学発光における所定の発光パラメータの値が予め定められた標準範囲から外れている場合、ストレスがあると評価する基準を用いることが好ましい。具体的には、化学発光の発光量に対し、閾値によって標準範囲を設定し、発光量が閾値を超えている場合にストレスがあるとする構成がある。また、上記の所定の基準を、化学発光の発光量自体を生体のストレスの度合を示す指標値（数値が大きいほどストレスが大きい）とするものとしてもよい。
【００２８】
また、ストレス評価の基準で用いることができる発光パラメータとしては、発光量以外にも例えば、発光量の時間変化の微分係数（微分係数が大きい、即ち発光が急激に増加していればストレスがある）などを用いてもよい。即ち、これは、唾液中のチオシアン酸イオンの濃度変化を示す評価値を、ストレス評価に用いるものである。
【００２９】
また、ストレスマーカとなる唾液中のチオシアン酸イオン等の成分の量は、通常、個人差があると考えられる。このため、ストレスを測定する生体毎に、予めストレスが無い状態などのデータを取得しておき、そのデータに基づき基準を設定することが好ましい。また、上記の例では、ストレスの有り無しという定性的なストレスの評価について示したが、ストレスを数値化する定量的な基準を設定してもよい。なお、ここで、ストレスが「有る」とはある一定以上のストレスを感じている状態をいう。
【００３０】
本実施形態によるストレス測定方法の効果について説明する。本実施形態に係るストレス測定方法によれば、唾液を採取し、採取されたサンプルの発光を計測することにより評価される唾液中のチオシアン酸イオンの濃度に基づいて、生体のストレスを測定することができる。即ち、ストレスに対して高い感度を有するチオシアン酸イオンの濃度を指標としてストレスを評価することによって、より高感度に生体のストレスを測定することができる。また、上記のような簡易な方法で生体のストレスを測定することができる。また、生化学的な分析装置などの特別な装置を必要としないので、測定システムを簡単な構成で低コスト化することができる。また、ストレス測定を行う測定者において、高度な知識や熟練が不要になる。また、化学発光を測定することによるストレス測定では、発光の計測は通常数十秒〜数分程度行えば充分であるので、迅速な測定が可能である。
【００３１】
また、化学発光を測定対象とする上記構成では、フォトンカウンティングなどの手法を用いることにより、ごく微量物質による発光まで精度よく測定して、確実にストレス測定を行うことが可能である。また、上述したように、唾液サンプルの生成にろ紙という吸収材を用いることとすれば、唾液を液状のまま取り扱うよりもサンプルの局所濃度が高くなり、化学発光の測定を容易かつ高効率で行うことができる。また、このような唾液サンプルは、サンプルの保存等を行う上でも好適である。
【００３２】
このようなストレス測定は、例えば、病院において入院患者に対して１日１回ずつ、例えば起床時に唾液の発光測定を行うなど、被験者の日常的な健康状態や精神状態の把握に利用することができる。また、この他にも様々な目的に対して化学発光測定によるストレス測定を応用することが可能である。例えば、医療上の目的としては、うつ病や極端なストレス状態の測定ならびに神経内科へのサポートへの応用などが挙げられる。また、本測定法で健康状態のモニタリングが可能なことから、健康機器への応用の他、音楽療法、自然療法、アロマセラピーなどの保管代替医療への適用、さらには健康食品の研究開発の支援などに利用することが可能である。
【００３３】
また、上記実施形態では、比較的不安定な酸化剤（例えば過酸化水素）を還元剤の後に加えることとしている。これにより、安定した条件で化学発光を起こさせることができ、より確実にストレスを測定することができる。
【００３４】
また、唾液サンプルの発光測定においては、測定作業の効率などの観点から、例えば複数の被験者についてそれぞれ唾液の採取を行い、その後に、それらの唾液の分析を一度に行う場合がある。この場合、唾液の採取から発光測定までの間で、唾液サンプルの状態が変化しないように保存を行うことが好ましい。このようなサンプルの保存方法としては、唾液サンプル２０を密閉容器に密閉状態で封入して低温で冷却保存しておくことが好ましい。これにより、被験者の唾液の採取から時間を開けて、良好な状態で唾液の化学発光の測定を行うことが可能となる。ただし、唾液の採取後に直ちに発光測定を行っても良い。
【００３５】
また、本実施形態においては、シリンジにより還元剤及び酸化剤を唾液サンプル２０に加えることとしているが、還元剤及び酸化剤の付加手段としては、シリンジ以外の構成を用いても良い。また、例えば、酸化剤及び還元剤のうちの少なくとも一つを、吸収材に予め含ませておき、唾液を採取した時点で加えられた状態となるようにしてもよい。そのような方法としては、ろ紙にお茶のカテキン等を染み込ませておく方法がある。この場合、より簡便なストレス測定が可能となる。
【００３６】
［第２実施形態］
図４に示すフローチャートを参照して、第２実施形態に係るストレス測定方法を説明する。本実施形態に係るストレス測定方法は、被験者（生体）から採取された唾液に含まれるチオシアン酸イオンに基づく吸光度を評価することによって、被験者のストレスを測定するものである。
【００３７】
まず、第１実施形態と同様に、唾液採取用のチューブ（例えば、サリベット）を用いて、被験者の口中から唾液を採取する。採取した唾液は、唾液サンプルとしてチューブ等に液体として保持される（ステップＳ２０１、唾液採取工程）。
【００３８】
続いて、以下のように、唾液サンプルの吸光度を測定することによって唾液サンプルに含まれるチオシアン酸イオンの濃度を評価する（ステップＳ２０２〜Ｓ２０３、指標物質評価工程）。まず、唾液サンプルに、チオシアン酸イオンと反応して発色する試薬を加える（ステップＳ２０２、試薬付加工程）。上記の試薬としては、例えば、塩酸（ＨＣｌ）（溶液）と塩化鉄（II）（溶液）との混合物が相当する。試薬を加える量としては、例えば、１００μｌの唾液サンプルに対して、０．１Ｍの塩酸８００μｌと０．１Ｍの塩化鉄（溶液）１００μｌとの混合溶液が加えられる。
【００３９】
試薬が加えられた唾液サンプルに対して、必要に応じ遠心分離（例えば、１分間１０００ｇで）が行われ、その後、その上澄みの吸光度が測定される（ステップＳ２０３、吸光度測定工程）。測定される吸光度は、試薬が加えられたことにより、唾液サンプルに含まれるチオシアン酸イオンからの生成物によるものである。上記の例では、チオシアン酸鉄（III）［Ｆｅ（ＳＣＮ）］２＋の吸光度である。吸光度の測定は、例えば、４５０ｎｍの波長等の特定の波長を対象として行われる。吸光度の測定には、既存の吸光度測定装置を用いることができる。なお、吸光度の測定によってチオシアン酸イオンの濃度を評価する方法については、Anue,T. M., Thomas, E. L. (1977) Accumulation of hypothiocyanite ion duringperoxidase-catalyzed oxidation of thiocyanate ion, Eur. J. Biochem., 80,209-214.等にも記載されている。
【００４０】
上述したように、唾液中のチオシアン酸イオンは、被験者である生体のストレスと相関を有しており、ストレスが強い場合はチオシアン酸イオンの濃度が高くなる。従って、ストレスの強さに応じて、吸光度が大きくなる。上記のように、吸光度がチオシアン酸イオンの濃度の指標値として評価される。
【００４１】
続いて、測定された吸光度から、所定の基準に基づいてストレスを評価する（ステップＳ２０４、ストレス評価工程）。この評価は、例えば、第１実施形態と同様に情報処理装置によって行われることとしてもよい。また、上記の所定の基準は、第１実施形態のものを化学発光の発光量を吸光度に置き換えて適用することができる。
【００４２】
なお、上記の測定方法では、口内炎や歯周病等による出血が測定の妨害因子となるので、測定された吸光度に異常値が出現した場合には、酵素抗体法によりヘモグロビン及びミエロペルオシダーゼを測定し、両者の混入が確認できる試料を除いた後、ストレス評価を行うことが望ましい。
【００４３】
本実施形態によるストレス測定方法の効果について説明する。本実施形態に係るストレス測定方法によれば、唾液を採取し、採取されたサンプルに試薬を加えて吸光度を計測することにより評価される唾液中のチオシアン酸イオンの濃度に基づいて、生体のストレスを測定することができる。即ち、ストレスに対して高い感度を有するチオシアン酸イオンの濃度を指標としてストレスを評価することによって、より高感度に生体のストレスを測定することができる。また、本実施形態によれば、チオシアン酸イオンの濃度を確実に評価することができるので、確実に生体のストレスを測定することができる。
【００４４】
また、本実施形態によれば、以下のような利点がある。唾液原液で測定可能であり、希釈操作を必要としない。クロマトグラフィーを用いる方法等と比較して試薬調整が簡便である。抽出操作等と比較して、測定操作自体が簡便である。生成物であるチオシアン酸鉄（III）［Ｆｅ（ＳＣＮ）］２＋が安定しており、反応直後でも１時間後でも測定した吸光度に変化がないため、厳密な測定時間を拘束せずに短時間での測定が可能である。プレートリーダー等、広く普及した機器で測定可能である。９６ウェルプレートを使用できるため、多検体測定に適している。
【００４５】
なお、上述したように既存の吸光度測定装置を用いて吸光度を測定することができるが、最も簡易にストレスを評価したい場合には、このような装置を用いずに、目視により試薬が加えられたサンプルの色を評価することにより吸光度を測定してストレスの評価を行ってもよい。その場合には、例えば、ストレスの大きさに応じた色見本を予め用意しておき、それとサンプルの色とを比較することでストレスの評価を行ってもよい。
【００４６】
［その他の実施形態］
上述した第１及び第２実施形態で説明した方法以外でも、生体の唾液に含まれるチオシアン酸イオンの濃度を評価することができる。当該評価されたチオシアン酸イオンの濃度から、所定の基準に基づいて生体のストレスを評価することができる。以下に、第１及び第２実施形態の方法以外で、生体の唾液に含まれるチオシアン酸イオンの濃度を評価する方法を説明する。
【００４７】
（１）銅沈殿による間接測定法
硫酸アンモニウムとエタノールによる抽出において、Ｃｕ（II）がアスコルビン酸によってＣｕ（Ｉ）に還元される。この還元Ｃｕ（Ｉ）とチオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）を反応させると、ＣｕＳＣＮとなり沈殿が生成される。この沈殿生成物は、エタノール層と水層との境界で安定する。反応しなかったＣｕ（Ｉ）から、反応したＣｕ（Ｉ）＝ＳＣＮ−濃度を測定する。なお、この方法は、Indirectdetermination of thiocyanate with ammonium sulfate and ethanol byextraction-flotation of copper.Analyst. 2000 Oct;125(10):1885-8.に、より詳細に記載されている。
【００４８】
（２）キャピラリーゾーン電気泳動法
例えば、０．１Ｍベータアラニン塩酸（ｐＨ３．５）をバックとした間接的紫外部吸収測定法によりシリカキャピラリー（６４．５ｃｍ×７５μｍ）を用いる。検出限界は２００ｎＭである。唾液は、例えば２０倍精製水により希釈調製してから測定を行う。なお、この方法は、Analysis of thiocyanate in biological fluids by capillary zoneelectrophoresis. JChromatogr A. 2001May 4;916(1-2):273-7. に、より詳細に記載されている。
【００４９】
（３）イオンクロマトグラフィー法
例えば、１ｍＭクエン酸溶液を移動層としてセチルメチルアミンでコートされたＯＤＳカラムを用いる。チオシアン酸イオンは、他の有機、無機イオンと明確に分離される。なお、この方法は、Determination of thiocyanate in human saliva and urine by ionchromatographyAnalyst. 1992Dec;117(12):1855-8.により詳細に記載されている。
【実施例１】
【００５０】
次に、実施例により本発明の内容をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００５１】
［実施例１］
実施例１は、上述した第１実施形態のストレス測定方法の実施例である。本実施例においては、男性２３人（平均年齢２１．６±標準偏差１．３）、女性２３人（平均年齢２１．９±標準偏差２．３）の学生をストレスの測定対象の被験者とした。これらの被験者に対して、図５に示すような実験を行った。まず、これらの被験者を、５分間、座った状態（座位：sittingposition）にさせる。その後、３０分間クレペリン検査を行わせる。その後、また、３０分間、座位をとらせる。
【００５２】
クレペリン検査の直前（５分間の座位を取らせた後）、クレペリン検査の直後及び３０分後の３度、唾液を採取し、ストレスの測定を行った。ここで、クレペリン検査は、被験者にとって、ストレスの原因となる検査である。
【００５３】
図６に示すように、唾液の採取には、綿３０ａとチューブ３０ｂとからなるサリベット（Salivette（Salstedt, Germany））３０を用いた。綿３０ａを被験者の口内に含ませて、唾液を綿３０ａに染みこませる。その綿３０ａをチューブ３０ｂに格納して遠心分離を行うと、綿３０ａに染みこんだ唾液３１が分離される。
【００５４】
続いて、図７（ａ）に示すように、シャーレ１０ａに設置されたろ紙４０上に、２００μｌの唾液３１を滴下する。その後、図７（ｂ）に示すように、ろ紙４０上に、３ｍＭの没食子酸（還元剤）１ｍｌを還元剤付加用シリンジ１０ｂから滴下する。その後、図７（ｃ）に示すように、３％（ｗ／ｖ）（０．８８Ｍ）の過酸化水素（酸化剤）１ｍｌを酸化剤付加用シリンジ１０ｃからから滴下する。その後、図７（ｄ）に示すように生じるろ紙４０から生じる化学発光の測定を行った。
【００５５】
測定された時間（タイミング）毎の化学発光の発光量を図８のグラフに示す。図８のグラフは、横軸に測定された時間、縦軸に１００秒あたりにカウントされたフォトンの数、即ち発光量をとったものである。また、図８に示されるグラフで示される値は、被験者４６人の平均値及び標準誤差である。一元配置分散分析（ｐ＜０．０１）によれば、測定された時間の間の測定値の違いは、統計的に有意なものであった。また、Ｔｕｒｋｅｙの多重比較検定（ｐ＜０．０５）によれば、クレペリン検査直後の測定値とクレペリン検査前の測定値との間には有意差があった。このように、クレペリン検査によりストレスがかかっている状態には発光量が大きくなっている。即ち、この本実施例は、本発明による方法がクレペリン検査のような高感度のストレス評価が必要とされるストレスでも、正しくストレスの評価を行えることを示している。
【００５６】
次に、図９のグラフに上記のストレス測定が行われた時間毎の、（ａ）ペルオキシターゼ（Ｓｐｘ）（データ数ｎ＝４０）、（ｂ）チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）（データ数ｎ＝４６）及び（ｃ）尿酸（Uric acid）（データ数ｎ＝４６）の唾液抗酸化成分の濃度を示す。図９のグラフは、横軸に測定された時間、縦軸に濃度をとったものである。また、図９に示されるグラフで示される値は、平均値及び標準誤差である。一元配置分散分析（ｐ＜０．００１）によれば、測定された時間の間の測定値の違いは、統計的に有意なものであった。また、Ｔｕｒｋｅｙの多重比較検定（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）によれば、クレペリン検査直後の測定値とクレペリン検査前の測定値との間には有意差があった。このように、クレペリン検査によりストレスがかかっている状態には各成分の濃度が大きくなっている。
【００５７】
次に、図１０に、クレペリン検査直後の化学発光の発光量（縦軸）と、クレペリン検査直後の（ａ）ペルオキシターゼ（Ｓｐｘ）、（ｂ）チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）及び（ｃ）尿酸（それぞれ横軸）の濃度との散布図及び回帰直線を示す。化学発光の発光量と、その相関係数は、それぞれ（ａ）ペルオキシターゼ（Ｓｐｘ）（ｒ＝０．６１８、ｐ＜０．０００１）、（ｂ）チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）（ｒ＝０．６１５、ｐ＜０．０００１）及び（ｃ）尿酸（ｒ＝０．４９０、ｐ＜０．０００４）となる。これらの結果は、化学発光とこれらの成分とが強い相関を有していることを示している。
【００５８】
次に、図１１に、１０ｍＭのＰＢＳ（リン酸バッファー生理食塩水）（ｐＨ６．９）の中における、（ａ）ペルオキシターゼ（Ｓｐｘ）、（ｂ）チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）及び（ｃ）尿酸の濃度の化学発光に対する影響を示したものである。図１１のグラフは、横軸に各成分の濃度、縦軸に発光量をとったものである。また、図１１に示されるグラフで示される値は、３回の測定値の平均値及び標準誤差である。上記のデータは、１０ｍＭＰＢＳ（６．９）中のペルオキシターゼ（Ｓｐｘ）及びチオシアン酸ナトリウム（０．３〜１．５ｍＭ）のようなヘモグロビン溶液（１〜３０μｇ／ｍＬ）により構成される人工の唾液を用いて測定したものである。
【００５９】
また、図１２に、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ６．９）の中における、（ａ）ペルオキシターゼ（Ｓｐｘ）及びチオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）の混合物、及び（ｂ）ペルオキシターゼ（Ｓｐｘ）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）及び尿酸の混合物の化学発光に対する影響を示したものである。図１２のグラフは、横軸に各成分の（ａ）チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）の濃度、（ｂ）尿酸の濃度、縦軸に発光量をとったものである。また、図１２に示されるグラフで示される値は、３回の測定値の平均値及び標準誤差である。これらのデータは、化学発光には、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）及びペルオキシターゼ（Ｓｐｘ）が大きく影響していることを示している。
【００６０】
［実施例２］
実施例２は、上述した第２実施形態のストレス測定方法の実施例である。この方法では、チオシアン酸イオンの基準の吸光度を測定して検量線を作成して、測定した唾液サンプルの吸光度を作成した検量線と比較することにより、ストレスを評価する。
【００６１】
まず、チオシアン酸ナトリウム（Sodium Thiocyanate；ＮａＳＣＮ  ＭＷ：８１．０７）８．１ｍｇを電子天秤にて秤量し２０ｍｌ容量三角フラスコに移す。精製水１０ｍｌを加えて攪拌し完全に溶解させる（この時点で１０ｍＭチオシアン酸ナトリウム溶液となる）。
【００６２】
続いて、図１３に示すように希釈調整し、０、０．１、０．３、０．５、０．７５、１．２ｍＭチオシアン酸ナトリウム溶液を作成し、検量線作成用サンプルとする。続いて、プラスチック５０ｍｌチューブに精製水９ｍｌをとり、１ｍｏｌ／ｌ塩酸を１ｍｌ加えて攪拌し完全に均一にし０．１ｍｏｌ／ｌ塩酸１０ｍｌを作成する。続いて、塩化鉄（III）六水和物（Iron(III) Chloride Hexahydrate；ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ＭＷ：２７０．３０）０．１ｇを秤量し、１００ｍｌ容量三角フラスコに移す。精製水５０ｍｌを加えて攪拌し完全に溶解させる（この時点で０．１Ｍ塩化鉄（III）六水和物溶液となる）。
【００６３】
続いて、プラスチック９６ウェルプレートの１ウェルに対して、検量線作成用サンプル（０、０．１、０．３、０．５、０．７５、１．２ｍＭチオシアン酸ナトリウム溶液）及びストレスの測定対象の生体の唾液サンプルを５０μｌずつ入れる。さらに調整済み０．１ｍｏｌ／ｌ塩酸を分注器（例：Multipette plus, eppendorf）で１５０μｌずつ同様に加える。最後に０．１Ｍ塩化鉄（III）六水和物溶液を分注器で５０μｌずつ同様に加える。
【００６４】
続いて、サンプル及び試薬が加えられたプラスチック９６ウェルプレートをプレートシェイカーにより２〜３秒程度攪拌し、反応を完全なものとする。反応生生物である塩化鉄（II）チオシアン酸（ＦｅＳＣＮ２＋）の吸光度を４５０ｎｍにおいてプレートリーダーにより測定する。続いて、吸光度とチオシアン酸ナトリウム溶液の濃度より検量線を作成する。作成される検量線は、例えば、図１４に示されるように
ｙ（吸光度）＝０．１８１３ｘ（チオシアン酸ナトリウム）＋０．０１８８
となる。
【００６５】
作成した検量線に基づいて、測定された唾液サンプルの吸光度から実際の唾液に含まれるチオシアン酸濃度を計算する。例えば、被験者Ａの唾液サンプルを用いたときの４５０ｎｍにおける吸光度が０．１５４、被験者Ｂの唾液サンプルを用いたときの４５０ｎｍ吸光度が０．２２０であった場合、上記の検量線の式から、
被験者Ａのチオシアン酸イオン濃度（ｎｍ）＝
（０．１５４−０．０１８８）／０．１８１３＝０．７４６（ｍＭ）
被験者Ｂのチオシアン酸イオン濃度（ｎｍ）＝
（０．２２０−０．０１８８）／０．１８１３＝１．１１０（ｍＭ）
と求められた。このように求められたチオシアン酸イオン濃度から、被験者のストレスを評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明の第１実施形態に係るストレス測定方法に用いられるストレス測定システムの機能構成図である。
【図２】ストレス測定システムにおける、具体的装置構成の一例を示す図である。
【図３】本発明の第１実施形態に係るストレス測定方法の一例を示すフローチャートである。
【図４】本発明の第２実施形態に係るストレス測定方法の一例を示すフローチャートである。
【図５】実施例１における実験方法を示した図である。
【図６】実施例１における唾液の採取方法を示した図である。
【図７】実施例１における化学発光の測定方法を示した図である。
【図８】実施例１における測定された時間と発光量との関係を示したグラフである。
【図９】実施例１における測定された時間と唾液中の各成分との関係を示したグラフである。
【図１０】実施例１における唾液中の成分と発光量との関係を示したグラフである。
【図１１】実施例１における人工の唾液中の成分と発光量との関係を示したグラフである。
【図１２】実施例１における人工の唾液中の各成分と発光量との関係を示したグラフである。
【図１３】実施例２における検量線作成用サンプルの作成方法を示した図である。
【図１４】実施例２におけるチオシアン酸ナトリウム溶液の濃度と４５０ｎｍの波長における吸光度との関係及び検量線を示したグラフである。
【符号の説明】
【００６７】
１０…ストレス測定システム、１０ａ…シャーレ、１０ｂ…還元剤付加用シリンジ、１０ｃ…酸化剤付加用シリンジ、１０ｄ…光電子増倍管、１０ｅ…暗箱、１０ｆ…フォトンカウンタ、１０ｇ…情報処理装置、１１…唾液サンプル設置部、１２…還元剤付加部、１３…酸化剤付加部、１４…発光測定部、１５…ストレス評価部、２０…唾液サンプル、３０…サリベット、３０ａ…綿、３０ｂ…チューブ、３１…唾液、４０…ろ紙。
【図１】
2008134210.tif 000003
【図２】
2008134210.tif 000004
【図３】
2008134210.tif 000005
【図４】
2008134210.tif 000006
【図５】
2008134210.tif 000007
【図６】
2008134210.tif 000008
【図７】
2008134210.tif 000009
【図８】
2008134210.tif 000010
【図９】
2008134210.tif 000011
【図１０】
2008134210.tif 000012
【図１１】
2008134210.tif 000013
【図１２】
2008134210.tif 000014
【図１３】
2008134210.tif 000015
【図１４】
2008134210.tif 000016