(57)【要約】【課題】微粒子を用いた検体中の対象物質を検出する方法において、１種類のプローブのみを使用することによって対象物質を簡便に検出することができ、かつ検出限界を向上させた方法を提供すること。【解決手段】微粒子とプローブとの複合体及び検体を接触させる工程、及び検体中の対象物質とプローブとの相互作用によりプローブが微粒子から脱着することにより生ずる微粒子の物性変化を検出する工程を含む、検体中の対象物質の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子とプローブとの複合体及び検体を接触させる工程、及び検体中の対象物質とプローブとの相互作用によりプローブが微粒子から脱着することにより生ずる微粒子の物性変化を検出する工程を含む、検体中の対象物質の検出方法。
【請求項２】
プローブが生体高分子である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
プローブが核酸である、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
核酸が、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、又はＬＮＡ（Locked核酸）である、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
プローブが微粒子から脱着することにより、微粒子が凝集体の形成により検出可能な物性変化を起こす、請求項１から４の何れかに記載の検出方法。
【請求項６】
検出可能な物性変化が磁気応答性の変化である、請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
微粒子が磁性粒子である、請求項１から６の何れかに記載の検出方法。
【請求項８】
微粒子が平均粒径１から１００nmの磁性ナノ粒子である、請求項１から７の何れかに記載の検出方法。
【請求項９】
（ａ）核酸が固定されている微粒子と、検出ターゲットである核酸を含む検体とを接触させて、検出ターゲットである核酸と、微粒子に固定された核酸とをハイブリダイゼーションさせる工程；及び（ｂ）上記工程（ａ）において形成される微粒子の凝集体を検出する工程を含む、検出ターゲットである核酸を検出する方法。
【請求項１０】
（ａ）抗体が固定されている微粒子と、検出ターゲットである抗原物質を含む試料とを接触させて、検出ターゲットである抗原物質と、微粒子に固定された抗体とを相互作用させる工程；及び（ｂ）上記工程（ａ）において形成される微粒子の凝集体を検出する工程を含む、検出ターゲットである抗原物質を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微粒子とプローブとの複合体を用いて、プローブの微粒子からの脱着を利用した対象物質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマーカー（例えば、核酸、タンパク質、脂質、糖鎖、ホルモン類など）の検出方法は、分析診断用途として非常に重要である。中でも微粒子を用いた検出方法は、反応効率が高く（比表面積が大きいため）、反応速度が大きい（運動性がバルク体に比べて大きいため）ことが期待され、注目されている方法である。
【０００３】
微粒子を用いた検体の検出方法としては、例えば特許文献１に記載の方法がある。この方法は、オリゴヌクレオチドの付着した金ナノ粒子を用いた検体検出方法である。これは、金ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドが検体であるＤＮＡと架橋構造を形成し、これが金ナノ粒子の凝集を起こし、それに伴う色の変化を検出する技術である。しかし、この方法では、検出に架橋構造の形成が必要なため、２種類以上のプローブが必要であった。また、粒子と同等数の検体を必要とするため、検出限界としては不十分であった。
【０００４】
また、プローブとして抗体を用いると、例えばイムノクロマト法などのサンドイッチ構造の形成を利用した検体検出方法が知られている。しかし、ホルモンなどの低分子化合物を検体とする場合は、サンドイッチ構造を形成しないため検出は困難であった。
【特許文献１】特表２００４−５０１３４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、微粒子を用いた検体中の対象物質を検出する方法において、１種類のプローブのみを使用することによって対象物質を簡便に検出することができ、かつ検出限界を向上させた方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、微粒子の分散安定化に寄与するプローブを吸着固定した微粒子に対して検出対象物質を加えることにより、プローブが微粒子から脱着し、結果として不安定化した微粒子が凝集することを見出した。このメカニズムにおいては、微粒子の凝集に架橋構造又はサンドイッチ構造を必要としないため、１種類のプローブのみで対象物質の検出が可能である。さらに、不安定化した微粒子の凝集は近傍に存在する微粒子を巻き込んで起こるため、検出限界の向上にも寄与することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明によれば、微粒子とプローブとの複合体及び検体を接触させる工程、及び検体中の対象物質とプローブとの相互作用によりプローブが微粒子から脱着することにより生ずる微粒子の物性変化を検出する工程を含む、検体中の対象物質の検出方法が提供される。
【０００８】
好ましくは、プローブは生体高分子である。
好ましくは、プローブは核酸である。
好ましくは、核酸は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、又はＬＮＡ（Locked核酸）である。
【０００９】
好ましくは、プローブが微粒子から脱着することにより、微粒子は凝集体の形成により検出可能な物性変化を起こす。
好ましくは、検出可能な物性変化は磁気応答性の変化である。
【００１０】
好ましくは、微粒子は磁性粒子である。
好ましくは、微粒子は平均粒径１から１００nmの磁性ナノ粒子である。
【００１１】
本発明によればさらに、（ａ）核酸が固定されている微粒子と、検出ターゲットである核酸を含む検体とを接触させて、検出ターゲットである核酸と、微粒子に固定された核酸とをハイブリダイゼーションさせる工程；及び（ｂ）上記工程（ａ）において形成される微粒子の凝集体を検出する工程を含む、検出ターゲットである核酸を検出する方法が提供される。
【００１２】
本発明によればさらに、（ａ）抗体が固定されている微粒子と、検出ターゲットである抗原物質を含む試料とを接触させて、検出ターゲットである抗原物質と、微粒子に固定された抗体とを相互作用させる工程；及び（ｂ）上記工程（ａ）において形成される微粒子の凝集体を検出する工程を含む、検出ターゲットである抗原物質を検出する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明による検体中の対象物質の検出方法によれば、１種類のプローブのみを使用することによって対象物質を簡便に検出することができる。また、本発明の方法は、検出限界を向上させた方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による検体中の対象物質の検出方法は、微粒子とプローブとの複合体及び検体を接触させる工程、及び検体中の対象物質とプローブとの相互作用によりプローブが微粒子から脱着することにより生ずる微粒子の物性変化を検出する工程を含む。本発明においては、分散安定化に寄与するプローブを吸着固定した微粒子を用いる。この微粒子に対して検出対象物質を含む検体を接触させると、分散安定化に寄与するプローブが微粒子から脱着し、それによって微粒子が不安定化し、凝集が起こる。微粒子の凝集を、検出可能な変化として検出することにより、検体中の対象物質を検出することができる。なお、プローブが脱着することについては、公知の微量物質検出法を用いて検出可能である。例えば、プローブが核酸である場合は、上澄液を用いてPCR法を行うことによってプローブの脱着を検出することができる。
【００１５】
本発明で用いる微粒子としては、プローブとの複合体においては安定に分散でき、プローブが脱着することによって物性変化が生じるものであれば特に限定されず、任意の微粒子を用いることができる。例えば、プローブが微粒子から脱着することにより、凝集体の形成により検出可能な物性変化を起こすことができる微粒子を用いることができる。ここでいう検出可能な物性変化としては、磁気応答性の変化などを挙げることができる。微粒子として磁性粒子を用いることにより、検出可能な物性変化として磁気応答性の変化を生じさせることができる。
【００１６】
本発明で用いる磁性粒子としては、例えば、鉄、コバルト又はニッケルの塩、酸化物、ホウ化物又は硫化物；高い磁化率を有する稀土類元素（例えば、ヘマタイト又はフェライト）などが挙げられる。磁性ナノ粒子の具体例としては、例えば、マグネタイト（Fe3O4）があり、FePd、FePt、CoPtなどの強磁性規則合金を使用することもできる。本発明では、好ましい磁性粒子は、金属酸化物、特に酸化鉄およびフェライト(Fe, M)3O4からなる群から選択されるものである。ここで酸化鉄には、とりわけマグネタイト、マグヘマイト、またはそれらの混合物が含まれる。前記式中、Mは、該鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成することのできる金属イオンであり、典型的には遷移金属の中から選択され、最も好ましくはFe2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Mg2+などであり、M/Feのモル比は選択されるフェライトの化学量論的な組成に従って決定される。金属塩は固形でまたは溶液状で供給されるが、塩化物塩、臭化物塩、または硫酸塩であることが好ましい。このうち、安全性の観点から酸化鉄、フェライトが好ましい。特に好ましくは、マグネタイト（Fe3O4）である。
【００１７】
本発明で用いる磁性粒子のサイズは特には限定されず、ナノ粒子、マイクロ粒子、又はミリ粒子の何れでもよいが、好ましくはナノ粒子である。ナノ粒子のサイズは１〜１０００ｎｍであるが、特に好ましくは平均粒径１〜７０nmのナノ粒子である。なお、酸化鉄粒子の場合、粒径が１００nmより大きい場合、ブラウン運動による安定化が十分でなく、それ自体が磁気応答性を示してしまう。このため、磁気応答性をシグナルとする場合、上記のように粒径のものを用いることが好ましい。
【００１８】
本発明では、微粒子を分散剤で被覆しておき、分散剤で被覆した微粒子にプローブを吸着固定させることができる。本発明で用いることができる分散剤としては、例えば、微粒子と配位結合又は多点の静電的相互作用などにより結合できる構造を有すると同時に、他の物質と化学結合可能な官能基を有するものでもよい。他の物質と化学結合可能な官能基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、マレイミド基、アルデヒド基、ケトン基、ヒドラジド期、チオール基などを挙げることができるが、好ましくはカルボキシル基又はアミノ基であり、さらに好ましくはカルボキシル基である。
【００１９】
上記したような分散剤で微粒子を被覆する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、粒子の形成中または形成後に、上記分散剤を、当該粒子を含む液体に添加して混合することにより、当該粒子を上記分散剤で被覆することができる。また、粒子は遠心分離や濾過などの常法により洗浄、精製後、上記分散剤を含有する溶媒（好ましくはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、2-エトキシエタノールなどの親水性有機溶媒）に分散させて、粒子を上記分散剤で被覆してもよい。
【００２０】
本発明で用いるプローブは、微粒子の分散安定化に寄与する物質であることが好ましい。プローブとしては生体高分子を用いることができ、例えば、核酸を用いることができる。核酸の具体例としては、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、又はＬＮＡ（Locked核酸）などを用いることができる。また、プローブとして抗体を用いることもできる。
【００２１】
プローブの微粒子への固定は、当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、化学結合可能な官能基としてカルボキシル基を有する分散剤で被覆した微粒子と、アミノ基を有する核酸とをアミノカップリング反応により固定することができる。
【００２２】
本発明では、微粒子とプローブとの複合体及び検体を接触させた後に、検体中の対象物質とプローブとの相互作用によりプローブが微粒子から脱着することにより生ずる微粒子の物性変化を検出する。例えば、プローブが微粒子から脱着することにより、微粒子は凝集体の形成により検出可能な物性変化を起こすことができる。一方、検体中に対象物質が存在しない場合は、プローブとの相互作用は生じないため、微粒子は物性変化を生じない。微粒子の物性変化としては、磁気応答性の変化、濁度の変化、光散乱の変化、沈降の有無などを挙げることができ、これらを検出することによって、検体中の対象物質を検出することができる。特に、微粒子として磁性粒子を用いた場合は、検出可能な物性変化として磁気応答性の変化を利用することができる。
【００２３】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
実施例１：磁性粒子の製造
酢酸鉄（II）15.66gをエタノール600ml、水9mlの混合液に溶解し、75℃に加熱した。得られた溶液に、300mlのエタノールに溶解した水酸化カリウム6.9gを混合し、さらに75℃で2時間加熱した。その後、100℃に加熱し、300mlになるまで溶液を濃縮した（約2時間）。75℃で5時間置いた後、室温へ冷却した。本操作により、エタノール中に分散した酸化鉄粒子が得られた。
【００２５】
実施例２：分散剤の被覆
実施例1で得られたエタノール分散酸化鉄粒子30mlに水70mlを加え、酸化鉄粒子を沈殿させた。その後、上澄みの除去及び洗浄を行った。その後、酸化鉄の重量に対して20％となるように下記式（１）：
【化１】
2008196927.tif 000002
を有する化合物（分散剤）を60mlの水に溶解し、洗浄後の酸化鉄粒子に加えた。超音波処理を一時間行った後、室温で一晩攪拌することで、水分散性磁性粒子が得られた。
【００２６】
実施例３：核酸の吸着固定
実施例２で得た水分散性磁性粒子、配列番号１に示す配列のDNA、MESバッファーを混合した。それぞれ最終濃度を1g/L、50μM、0.1Mに調整した。この混合液を一晩振盪した後、遠心分離、上澄除去、再分散を繰り返して未固定のDNAを除去した。
(5')-GGGCATGGGTCAGAAGGATT-(3')（配列番号１）
【００２７】
実施例４：核酸が吸着固定されることの確認
TOF-SIMSにより、実施例３で製造したDNA固定化酸化鉄の表面分析を行った。ＶとＢｉ3+一次イオンガンを使用し、帯電補正に20eVの電子銃を使用した。硝酸-純水-MeOH-アセトンの順で洗浄したSiウェハ上に分散液を滴下、真空乾燥させたものをサンプルとして用いた。
【００２８】
図１に示すように、酸化鉄由来のフラグメントが存在する領域とDNA由来のフラグメントが存在する領域が一致したことから、DNAが酸化鉄粒子に吸着されていることが確認された。
【００２９】
実施例５：核酸固定化量の評価
核酸が固定されることを確かめるため、蛍光色素（Cy5）が結合した核酸を実施例３で示した手法で固定した。
未固定の核酸を遠心分離で除去した後に、核酸固定化水分散性磁性粒子を再分散し、蛍光（励起：640nm、検出：680nm）を測定した。結果としては、酸化鉄に対して0.01％（モル比）の核酸が固定された。光散乱による測定では今回使用した水分散性磁性粒子は約50nmの凝集体を形成していることがわかっている。50nmの粒子は105〜106個のFe3O4単位から成るため、1粒子当たり10〜102個の核酸が固定されたことになる。
なお、使用した核酸の詳細は以下に示す。
(5' )-GGGCATGGGTCAGAAGGATT-(3' )-Cy5 （配列番号１）
【００３０】
実施例６：ターゲットDNA、偽ターゲットDNAの調整
下記のプライマーを用い、PCR法によりターゲットDNA及び偽ターゲットDNAを得た。なお、表１の液組成、表２の温度プロファイルでPCRを行った。TemplateにはヒトβアクチンのプラスミドDNAを用いた。
(5')-GGGCATGGGTCAGAAGGATT-(3')      (配列番号２)
(5')-CATGTCGTCCCAGTTGGTGA-(3')      (配列番号３)
(5')-CCGAGCGGGAAATCGTGCGT-(3')      (配列番号４)
(5')-TCGTAGCTCTTCTCCAGGGA-(3')      (配列番号５)
【００３１】
【表１】
2008196927.tif 000003
【００３２】
【表２】
2008196927.tif 000004
【００３３】
電気泳動により、ターゲットDNA、偽ターゲットDNAともPCRに成功していることを確認した（図２）。その後、ターゲットDNA、偽ターゲットDNAは一般的なエタノール沈殿法により精製し、保存した。
【００３４】
実施例７：ターゲットDNAの検出実験
実施例３で得られた、核酸を固定した水分散性磁性粒子に最終濃度が0.1MとなるようにNaClを加えた。その後、実施例６で調整したターゲット水溶液、偽ターゲット（配列が異なるDNA）水溶液、水、をそれぞれ10μl加えた。
【００３５】
96℃で１分間加熱し、その後60℃で5分静置した。その後、磁石を30秒間近づけて、沈降状態を観察した。観察結果を図３に示す。ターゲットDNAが存在する系では水分散性磁性粒子が磁気応答性を示し、水または偽ターゲットを加えた系では磁気応答性を示さなかった。以上の結果より、本発明で得られた水分散性磁性粒子を用いてDNAの配列特異的な検出が可能であることが示された。
【００３６】
なお、検出限界を評価したところ、最終濃度が1μMとなるように検体を加えた場合で磁性粒子は磁気応答性を示し、検出が可能であった。これは、“SCIENCE,Vol.277,1078-1081（1997）”に示される結果（60μM）よりも検出限界として優れていた。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、ＤＮＡを固定化した酸化鉄の表面分析の結果を示す。
【図２】図２は、ターゲットDNAと偽ターゲットDNAの電気泳動の結果を示す。
【図３】図３は、ターゲットDNAの検出実験の結果を示す。（１）はターゲット水溶液を加えた結果、（２）は偽ターゲット水溶液を加えた結果、（３）は同量の水を加えた結果を示す。
【図１】
2008196927.tif 000005
【図２】
2008196927.tif 000006
【図３】
2008196927.tif 000007
【配列表】
2008196927000001.app