(57)【要約】【課題】脂肪酸（特に、Ｃ９：０からＣ１８：０の直鎖飽和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸の不飽和脂肪酸）モノグリセリドを効率よく、かつ高純度で製造する方法を提供すること。【解決手段】本発明は、リパーゼを用いるエステル化反応によって脂肪酸とグリセロールとから脂肪酸モノグリセリドを製造する方法を提供し、該方法は、該脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降のエステル化反応を、水分含量０．３〜２．５質量％に制御して行う工程を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リパーゼを用いるエステル化反応によって脂肪酸とグリセロールとから脂肪酸モノグリセリドを製造する方法であって、
該脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降のエステル化反応を、水分含量０．３〜２．５質量％に制御して行う工程を包含する、脂肪酸モノグリセリドの製造方法。
【請求項２】
前記脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降のエステル化反応を、得られる脂肪酸モノグリセリドの融点以下に制御して行う工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂肪酸が、Ｃ９：０からＣ１８：０の直鎖飽和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸からなる群より選択される少なくとも１種の脂肪酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リパーゼが、モノグリセリドリパーゼまたはモノおよびジグリセリドリパーゼである、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸モノグリセリドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸モノグリセリドとは、グリセリン１分子と脂肪酸１分子とがエステル結合した物質であり、モノアシルグリセロールまたはグリセリン脂肪酸エステルともいわれる油脂の一種である。脂肪酸モノグリセリドは、乳化剤（食品添加物）として加工食品（マーガリン、チョコレート、アイスクリーム、パン、ケーキなど）に幅広く使用されている。さらに、中鎖脂肪酸のモノグリセリドは、抗菌活性を有することも知られている。
【０００３】
現在、脂肪酸モノグリセリドは、高温条件下（２２０−２５０℃）でアルカリ触媒を用いて、あるいは無触媒下で脂肪酸とグリセリンとをエステル化する方法；高温・高圧条件下で、油脂をグリセロリシスする方法などの化学法により工業的に製造されている。しかし、これらの化学法による脂肪酸モノグリセリドの製造は、多くのエネルギーを必要とし、アルカリ排水処理が必要となるなどの問題がある。さらに、高温高圧条件下の化学法による製造方法は、熱、酸素などに対して不安定な不飽和脂肪酸を用いる脂肪酸モノグリセリドの製造には、適用できないという問題もある。
【０００４】
そこで、穏和な条件下で反応可能な酵素を用いて、脂肪酸モノグリセリドを製造する方法の研究がなされている。例えば、特許文献１には、リパーゼを用いて、高度不飽和脂肪酸を含有する脂肪酸またはそのエステルとグリセリンとから、高度不飽和脂肪酸含有部分グリセリドを製造する方法が記載されている。しかし、この方法で得られるグリセリド（アシルグリセロールという場合もある）に含まれる脂肪酸モノグリセリドは、最大でも１９％であること、およびグリセリンが高度不飽和脂肪酸に対してモル比で３０倍以上の量が必要であることからも、この方法は、実用的な脂肪酸モノグリセリドの製造方法ではない。
【０００５】
特許文献２には、ペニシリウム属に属する微生物から得られたモノおよびジグリセリドリパーゼを用いて、Ｃ８：０からＣ１８：０の炭素数が偶数個の脂肪酸またはオレイン酸（Ｃ１８：１）とグリセリンとから、部分グリセリド（脂肪酸モノグリセリドの純度、＞９５％）を製造する方法が記載されている（ここで、Ｃｎ：ｍは、炭素数がｎであり、二重結合数がｍ個の直鎖脂肪酸を表す。ｍが０のときは、直鎖飽和脂肪酸である。以下、本明細書において同様である）。しかし、この方法では、グリセリンを大過剰（１０倍モル以上）用いる必要があること、および脂肪酸のエステル化率が最大でも７５％であることから、効率的な方法ではない。
【０００６】
特許文献３には、ペニシリウム属に属する微生物から得られたモノおよびジグリセリドリパーゼを用いて、共役脂肪酸とグリセリンとから、部分グリセリド（脂肪酸モノグリセリドが主成分）を製造する方法が記載されている。さらに、特許文献４には、ペニシリウム属に属する微生物から得られたモノおよびジグリセリドリパーゼを用いて、ω−３系高度不飽和脂肪酸とグリセリンとから、部分グリセリド（脂肪酸モノグリセリドが主成分）を製造する方法が記載されている。
【０００７】
これらの特許文献３および４には、（ｉ）０〜２０℃でエステル化反応を行い、反応途中で減圧してエステル化率を高める方法（特許文献３の段落番号０００８に記載の第１の方法の前半）、（ｉｉ）常温で、反応開始時から減圧下で反応を行う方法（特許文献３の第１の方法の後半、特許文献４、および非特許文献１）、（ｉｉｉ）常温でエステル化反応を行った後（途中から減圧）、０〜２０℃でグリセロリシスを行う方法(特許文献３の第２の方法)、などを用いることにより、脂肪酸のエステル化率が９６％以上で、脂肪酸モノグリセリドを９０％以上含む生成物が得られることが記載されている。
【０００８】
しかし、（ｉ）または（ｉｉｉ）の方法では反応温度を低温にしなくてはならず、多くのエネルギーを必要とし、さらに、反応液が固化するため大容量の反応の場合は、反応液の内部からの減圧脱水の効率が悪いなどの問題があり、実用的ではない。特に、（ｉｉｉ）の方法では、反応に１週間を要するため実用的ではない。一方で、（ｉｉ）の方法（３０℃、５ｍｍＨｇの減圧下で脱水）は、反応系が液状であることから、工業的な大容量の反応に適する。しかし、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のいずれの方法も、原料が共役脂肪酸およびω−３系高度不飽和脂肪酸に限定されており、その他の脂肪酸を用いた場合の脂肪酸モノグリセリドの製造方法については、開示されていない。すなわち、特許文献３および４に記載の方法によっては、限られた脂肪酸のみしか適用できない。後述の比較例に記載するように、この方法によってＣ１４：０などの脂肪酸を用いて脂肪酸モノグリセリドの製造を試みたが、脂肪酸のエステル化率が低く、純度の高い脂肪酸モノグリセリドを得ることができない。
【０００９】
非特許文献２には、ペニシリウム属に属する微生物から得られたリパーゼを用いて、脂肪酸モノグリセリドの融点以下（すなわち、固形の反応系）、常圧下で反応させることにより、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、およびＣ１４：０の脂肪酸、ならびにオレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、およびリノレン酸（Ｃ１８：３）とグリセリンとから、脂肪酸モノグリセリド（グリセリドに対する脂肪酸モノグリセリドの純度、９８％以上）を製造する方法が開示されている。しかし、この方法では、いずれの脂肪酸においても、エステル化率が最大でも８７％であること、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸のモノグリセリドは、室温以下の低温で反応させなければならず、反応に多くのエネルギーを必要とするなどの問題がある。
【００１０】
さらに、酵素法を用いた脂肪酸モノグリセリドの製造方法においては、いずれも原料である脂肪酸の炭素数は偶数であり、炭素数が奇数の脂肪酸（Ｃ９：０、Ｃ１５：０など）を原料とする酵素法を用いた脂肪酸モノグリセリドの製造方法は、未だ報告されていない。
【特許文献１】特開平１０−２６５７９５号公報
【特許文献２】特開昭６１−１８１３９０号公報
【特許文献３】特開２００３−１１３３９６号公報
【特許文献４】特開２００４−１６８９８５号公報
【非特許文献１】J. Am. Oil Chem. Soc., 82, 619-623 (2005)
【非特許文献２】J. Am. Oil Chem. Soc., 81, 543-547 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、脂肪酸（特に、Ｃ９：０からＣ１８：０の直鎖飽和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸の不飽和脂肪酸）を含む部分グリセリド、特に純度の高い脂肪酸モノグリセリドを、効率的に製造し得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、リパーゼを用いた脂肪酸とグリセリンとのエステル化反応において、反応系中の水分量が重要であることを見出したことに基づき、本発明を完成した。
【００１３】
本発明は、リパーゼを用いるエステル化反応によって脂肪酸とグリセロールとから脂肪酸モノグリセリドを製造する方法を提供し、該方法は、該脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降のエステル化反応を、水分含量０．３〜２．５質量％に制御して行う工程を包含する。
【００１４】
１つの実施態様では、上記脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降のエステル化反応を、得られる脂肪酸モノグリセリドの融点以下に制御して行う工程をさらに包含する。
【００１５】
１つの実施態様では、上記脂肪酸は、Ｃ９：０からＣ１８：０の直鎖飽和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸からなる群より選択される少なくとも１種の脂肪酸である。
【００１６】
１つの実施態様では、上記リパーゼは、モノグリセリドリパーゼまたはモノおよびジグリセリドリパーゼである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降のエステル化反応を、水分含量０．３〜２．５質量％に制御することによって、穏和な条件で反応可能なリパーゼを用いて、脂肪酸モノグリセリド、特にＣ９：０からＣ１８：０の直鎖飽和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸の脂肪酸モノグリセリドを効率よく、かつ高純度で製造する方法が提供される。
【００１８】
従来、反応系中の水分量が重要であることは分かっておらず、それを適切に保つための反応条件も明確に解明されていなかったため、限られた脂肪酸モノグリセリドのみしか得ることができなかった。しかし、反応系中の水分量が重要であるという知見に基づいてなされた本発明の製造方法により、従来技術の問題が解消され、幅広い脂肪酸モノグリセリドを実用的に合成し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（リパーゼ）
本発明の製造方法において触媒として使用されるリパーゼは、グリセリド類を基質として認識するものであれば限定されない。例えば、モノグリセリドリパーゼ、モノおよびジグリセリドリパーゼ、トリグリセリドリパーゼ、クチナーゼ、エステラーゼなどが挙げられる。これらの中でもリパーゼが好ましく、特に、脂肪酸トリグリセリドを基質としてほとんど認識せず、脂肪酸モノグリセリドおよび／または脂肪酸ジグリセリドを基質として認識するリパーゼが好ましい。このようなリパーゼとして、モノグリセリドリパーゼ、モノおよびジグリセリドリパーゼなどが挙げられる。以下、リパーゼについて説明する。
【００２０】
リパーゼは、微生物、動物、および植物由来のいずれでもよいが、好ましくはペニシリウム（Penicillium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、バシラス（Bacillus）属、キャンディダ（Candida）属、ゲオトリカム（Geotrichum）属、リゾプス（Rhizopus）属、リゾムコール（Rhizomucor）属、ムコール（Mucor）属、（アスペルギルス）Aspergillus属、（サーモミセス）Thermomyces属（以前の名称はフミコーラ（Humicola）属）、シュードチマ（Pseudozyma）属などの微生物が生産するリパーゼ、豚膵臓由来のリパーゼなどが挙げられる。より好ましくは、ペニシリウム（Penicillium）属およびバシラス（Bacillus）属が生産するリパーゼである。これらのリパーゼは一般に市販されており、容易に入手可能である。
【００２１】
リパーゼは、精製（粗精製および部分精製を含む）されたものを用いてもよい。さらに、遊離型のまま使用してもよく、あるいはイオン交換樹脂、多孔性樹脂、セラミックス、炭酸カルシウムなどの担体に固定して使用してもよい。遊離型のリパーゼを用いる場合は、一旦酵素を水に溶かしてから反応系に添加してもよく、反応系にリパーゼと水とを別々に添加してもよい。固定化されたリパーゼを使用する場合は、反応系への水の添加は任意である。
【００２２】
本発明の製造方法に使用されるリパーゼの量は、反応温度、反応時間、圧力（減圧度）、脂肪酸の種類などにより適宜設定され得、好ましくは反応混合液１ｇ当たり１単位（Ｕ）〜１００００Ｕ、より好ましくは５Ｕ〜１０００Ｕである。酵素活性の１Ｕとは、リパーゼの場合、オリーブ油の加水分解において１分間に１μモルの脂肪酸を遊離する酵素量をいう。モノグリセリドリパーゼ、あるいはモノおよびジグリセリドリパーゼの場合はモノオレイン（グリセリンモノオレエイト）の加水分解において１分間に１μモルの脂肪酸を遊離する酵素量である。
【００２３】
（グリセリン）
本発明の製造方法に使用されるグリセリンの量は、特に限定されない。通常、遊離脂肪酸１モル量に対して、好ましくは１〜１０倍モル量、より好ましくは１．５〜３倍モル量である。
【００２４】
（脂肪酸）
本発明の製造方法で使用される脂肪酸は、遊離型、金属塩型、およびエステル型のいずれの形態でもよい。本発明においては、エステル化反応が進行しやすい点で、遊離型の脂肪酸（遊離脂肪酸）が好ましい。本発明の製造方法で使用される脂肪酸は、特に限定されず、炭素数が偶数の脂肪酸でも奇数の脂肪酸でもよい。好ましくはＣ９：０からＣ１８：０の直鎖飽和脂肪酸、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、リノレン酸（Ｃ１８：３）などが挙げられる。
【００２５】
（脂肪酸モノグリセリドの製造方法）
本発明は、リパーゼを用いるエステル化反応によって脂肪酸とグリセロールとから脂肪酸モノグリセリドを製造する方法であって、該脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降のエステル化反応を、水分含量０．３〜２．５質量％に制御して行う工程を包含する。
【００２６】
リパーゼを用いた脂肪酸とグリセリンとのエステル化反応は、脂肪酸のエステル化率によって、反応前期と反応後期とに区分される。本明細書において、脂肪酸のエステル化率とは、原料とする遊離脂肪酸に対するグリセリンと反応した遊離脂肪酸の割合をいう。エステル化率は、反応系中の遊離脂肪酸量（酸価）をアルカリによる滴定で測定し、以下の式で求められる。
【００２７】
｛（反応前の酸価−反応後の酸価）／（反応前の酸価）｝×１００
【００２８】
本発明においては、脂肪酸のエステル化率が６０％に達する前を反応前期、そして達した以降を反応後期とする。脂肪酸のエステル化率は、サンプリングすることによって経時的に測定することができる。
【００２９】
まず、反応前期では、酵素の活性が失われない量の水分が反応系中に存在すれば、脂肪酸とグリセリンとから脂肪酸モノグリセリドが優先的に合成される。したがって、反応前期では、水分量はあまり重要ではなく、適宜設定し得る。例えば、反応開始時（原料仕込み時）には、反応系中に、好ましくは脂肪酸とグリセリンとの合計質量に対して０．３〜２０質量％、より好ましくは１〜１０質量％の割合で水を添加し、そして反応前期にわたって反応系中の水分量を、好ましくは０．１〜２０質量％、より好ましくは０．３〜５質量％に制御すればよい。
【００３０】
脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降、すなわち反応後期では、反応系中の水分含量を０．３〜２．５質量％に制御する。水分含量は、カールフィッシャー水分計を用いて経時的に測定すればよい。この反応系中の水分含量は、特に重要である。脂肪酸のエステル化率が６０％を超えると、脂肪酸モノグリセリドが基質として認識され脂肪酸ジグリセリドへの変換反応が進行し始めるので、脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降の水分含量を制御する。反応後期においては、反応系中の水分含量が０．３質量％よりも低い場合、エステル化反応はほとんど進行せず、原料である脂肪酸が未反応のまま残り効率が悪くなる。一方、反応系中の水分含量が２．５質量％よりも高い場合、エステル化反応は効率よく進行するものの、同時に脂肪酸モノグリセリドから脂肪酸ジグリセリドへの変換反応も盛んに進むため、脂肪酸ジグリセリドが副産物として反応系内に大量に蓄積し、純度の高い脂肪酸モノグリセリドが得られない。これは、水分量により酵素の基質特異性が変化するためと推定される。すなわち、反応系中の水分含量が０．３質量％よりも少ない場合、リパーゼが脂肪酸およびグリセリンを基質として認識しなくなり、グリセリンと脂肪酸とのエステル化反応が進行し難くなると推定される。一方、反応系中の水分含量が２．５質量％よりも多い場合、リパーゼが脂肪酸および脂肪酸モノグリセリドも基質と認識し、脂肪酸モノグリセリドから脂肪酸ジグリセリドの反応が進行すると推定される。
【００３１】
したがって、反応後期の水分含量は、酵素の活性が失われず、かつ脂肪酸モノグリセリドから脂肪酸ジグリセリドへの変換反応が抑制される水分含量である０．３〜２．５質量％に制御する必要がある。さらにこの反応後期では、酵素の活性が失われない水分含量(０．３質量％以上)の範囲内で、水分量が少なくすれば少なくするほど脂肪酸モノグリセリドの純度が向上するので、水分含量を上記範囲内で極力少なく維持することが好ましい。
【００３２】
至適な水分含量は、用いる脂肪酸によって多少異なる。例えば、Ｃ９：０の脂肪酸は、他の脂肪酸（Ｃ１０：０〜Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、およびＣ１８：３）に比べて、水分含量を上記範囲内でやや高く（１質量％以上）設定することが好ましい。
【００３３】
このように、反応系中の水分含量が０．３〜２．５質量％の範囲内である場合、エステル化反応は効率よく進行し、かつ脂肪酸モノグリセリドから脂肪酸ジグリセリドの変換反応が抑制されて純度の高い脂肪酸モノグリセリドが得られる。
【００３４】
上記水分含量に制御するための反応条件（反応温度および圧力）は、反応系中の水分含量を考慮して適宜設定され得る。反応温度は、好ましくは−２０〜１００℃、より好ましくは０〜８０℃、さらに好ましくは２０〜７０℃である。反応系中の圧力は、好ましくは０．０１〜１００ｍｍＨｇ、より好ましくは１〜３０ｍｍＨｇである。
【００３５】
上記水分含量を保つために、モレキュラーシーブなどの脱水剤を反応系中に添加してもよい。あるいは、水分含量が０．３質量％より少なくなった場合には、反応途中で反応系中に水を添加して、０．３〜２．５質量％の範囲内となるようにしてもよい（例えば、水分含量が０．２質量％まで低下した場合に、水分含量が１質量％となるように水を添加するなど）。さらに、これらの水分含量制御方法を組み合わせてもよい。
【００３６】
エステル化反応は、静置反応でもよいし、各種の撹拌法、振盪法、超音波法、窒素などの吹き込み法、ポンプなどによる循環混合法、弁またはピストンを用いる混合法などにより、あるいはこれらの方法の組合せにより、反応液をよく混合しながら行ってもよい。
【００３７】
反応混合液から脂肪酸モノグリセリドを単離・精製する方法としては、任意の単離・精製方法を採用し得る。単離・精製方法としては、例えば、脱酸、水洗、蒸留、溶媒抽出、イオン交換クロマトグラフィー、膜分離など、およびこれらの方法の組合せが挙げられる。
【００３８】
この反応系は、反応開始から終了まで液状を保っている系であるため、終始、反応液の混合が容易である。さらに、反応終了時に反応槽からの反応液の抜き出しを容易に行い得るので、工業的にも好ましい。しかし、本発明の製造方法においては、上記脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降のエステル化反応を、得られる脂肪酸モノグリセリドの融点以下に制御して行う工程を包含してもよい。脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降のエステル化反応を、得られる脂肪酸モノグリセリドの融点以下に制御して行うことによって、副産物である脂肪酸ジグリセリドの含量を１質量％以下に抑えることができる。すなわち、反応前期には、反応液の撹拌が容易である液状を保つ温度で、適切な水分量を保ちながら減圧下で反応を行い、反応後期に入った時に、反応により得られた脂肪酸モノグリセリドの融点以下の温度（反応系が固化する温度）まで冷却して反応を行う。このように温度制御を行うと、脂肪酸モノグリセリドから脂肪酸ジグリセリドへの変換反応がほとんど起こらないため、副産物である脂肪酸ジグリセリドの含量が１質量％以下になる。
【００３９】
反応後期に反応系を固化させる製造方法においては、反応終了後に反応系の温度を上昇させて溶解させる工程を追加することにより、反応槽からの反応液の抜き出しを容易に行い得るので、工業的にも好ましい。さらに、反応系中の脂肪酸ジグリセリドの含量が１質量％以下であるため、脂肪酸モノグリセリドを容易に単離・精製することができる。一方、反応開始時から脂肪酸モノグリセリドの融点以下の温度（反応系が固化する温度）、減圧下で反応を行った場合、脂肪酸、グリセリン、酵素、および水が十分に混合されず、エステル化反応は、ほとんど進行しない（後述の実施例２を参照）。
【００４０】
これに対し、反応後期に反応系を固化させる製造方法では、反応前期の反応系は液状であるため、脂肪酸、グリセリン、酵素、および水が十分に混合されているので、反応系が固化しても、エステル化反応が効率よく進行する。さらに、この方法における脂肪酸のエステル化率は、反応開始時から脂肪酸モノグリセリドの融点以下の温度かつ常圧下で反応を行った場合（例えば、非特許文献２を参照）よりも高くなる。
【００４１】
本発明の製造方法によれば、脂肪酸のエステル化率が好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上となり効率よく脂肪酸モノグリセリドを得ることができ、この脂肪酸モノグリセリドの純度は、好ましくは純度９０％以上、より好ましくは９５％以上であり得る。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明の脂肪酸モノグリセリド製造方法を実施例に基づいて説明するが、これらはあくまで一例にすぎず、また水分含量を制御するための反応温度、圧力（減圧度）などの条件は、反応容器の形状、大きさ、反応液の容量、混合方法、脂肪酸の種類などによって異なるものであり、本発明は、本実施例に限定されるものではない。
【００４３】
（実施例１：酵素法による脂肪酸モノグリセリドの合成に及ぼす圧力（減圧度）の影響）
約３０ｍＬのバイアル瓶（内径２．８ｃｍおよび高さ５ｃｍ）に、グリセリンと遊離脂肪酸（Ｃ１８：１）との混合液（遊離脂肪酸／グリセリン＝１／２（モル比））１０ｇ、０．１ｇの水、および反応系１ｇに対して２００Ｕのペニシリウム・カマンベルティ（Penicillium camembertii）由来モノおよびジグリセリドリパーゼ（リパーゼＧ；天野エンザイム株式会社製）を添加した。次いで、反応温度を３０℃に保ちながらマグネチックスターラーで撹拌し、表１に記載の圧力条件下（２ｍｍＨｇ、５ｍｍＨｇ、１５ｍｍＨｇ、および７６０ｍｍＨｇ）で、それぞれ４８時間反応を行った。反応開始から７時間後および４８時間後（反応終了後）の脂肪酸のエステル化率および水分量（カールフィッシャー水分計（株式会社ダイアインスツルメンツ製）で測定）、ならびに反応液中の組成を測定した。反応液中の組成の測定は、イアトロスキャンＭＫ−６（株式会社三菱化学ヤトロン製）を用いるＴＬＣ−ＦＩＤ法で行った。ＴＬＣの展開溶媒として、トルエン／クロロホルム／酢酸＝５０／２０／０．７（容量比）の混合溶媒を使用した。結果を表１に示す。
【００４４】
これとは別に、Ｃ１０：０の脂肪酸（反応温度４０℃；圧力１ｍｍＨｇ、５ｍｍＨｇ、１５ｍｍＨｇ、および７６０ｍｍＨｇ）およびＣ１５：０の脂肪酸（反応温度５０℃；圧力４ｍｍＨｇ、１０ｍｍＨｇ、２０ｍｍＨｇ、および５０ｍｍＨｇ）を用いて、上記Ｃ１８：１の脂肪酸を用いた場合と同様の反応を行った。結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
表１に示すように、Ｃ１８：１の脂肪酸は、脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降（反応開始から７時間より以降）の水分含量を、０．３１〜２．２質量％に制御（反応温度が３０℃で圧力が２〜５ｍｍＨｇ）した場合（実験Ａ１およびＡ２）、Ｃ１０：０の脂肪酸は、０．３１〜１．８質量％に制御（反応温度が４０℃で圧力が５ｍｍＨｇ）した場合（実験Ｂ２）、そしてＣ１５：０の脂肪酸は、０．９２〜１．６質量％に制御（反応温度が５０℃で圧力が１０ｍｍＨｇ）した場合（実験Ｃ２）、エステル化率が高く、かつ脂肪酸モノグリセリドの含量も高いことがわかる。いずれの脂肪酸の場合も、脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降の水分含量を、０．３〜２．５質量％に制御することにより、エステル化率が高く、脂肪酸モノグリセリドが高収率で得られることがわかる（表１に評価を○で示す）。
【００４７】
しかし、エステル化率が６０％に達した以降（表１では、反応開始から７時間より以降）も、水分含量が２．５質量％を越える場合（実験Ａ３、Ａ４、Ｂ３、Ｂ４、およびＣ３）、脂肪酸ジグリセリドの生成量が増加して脂肪酸モノグリセリド生成効率が低下する傾向にある。なお、実験Ｃ４については、反応開始から７時間目のエステル化率は５７％であり、水分含量は３．２質量％であった。さらに、反応を進めて、エステル化率が６０％に達した時点の水分含量を測定すると３．０質量％であったため、脂肪酸ジグリセリドの生成量が増加した。したがって、脂肪酸モノグリセリド生成効率と反応液中の水分量との関連性が示唆された。実験Ｂ１およびＣ１においては、反応開始時から水分含量が少なく、酵素が脂肪酸およびグリセリンを基質として認識しなくなり、エステル化反応は、ほとんど進行しなかったと考えられる。
【００４８】
（実施例２：酵素法による脂肪酸モノグリセリドの合成に及ぼす温度の影響）
約３０ｍＬのバイアル瓶に、グリセリンと遊離脂肪酸（Ｃ１０：０）との混合液（遊離脂肪酸／グリセリン＝１／２（モル比））１０ｇ、０．１ｇの水、および反応系１ｇに対して２００ＵのリパーゼＧを添加した。次いで、反応温度を表２に記載の温度（３０℃、４０℃、および５０℃）に保ちながらマグネチックスターラーで撹拌し、１〜３ｍｍＨｇの圧力条件下で、それぞれ４８時間反応を行った。反応開始から７時間後および４８時間後（反応終了後）の脂肪酸のエステル化率および水分量、ならびに反応液中の組成を測定した。結果を表２に示す。
【００４９】
これとは別に、Ｃ１８：１の脂肪酸（圧力１〜３ｍｍＨｇ；反応温度２０℃、３０℃、４０℃、および５０℃）、Ｃ１４：０の脂肪酸（圧力７〜１２ｍｍＨｇ；反応温度３０℃、４０℃、５０℃、および６０℃）、および亜麻仁油脂肪酸（圧力１〜３ｍｍＨｇ；反応温度１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、および５０℃）を用いて、上記Ｃ１０：０の脂肪酸を用いた場合と同様の反応を行った。結果を表２に示す。なお、亜麻仁油脂肪酸（亜麻仁油由来脂肪酸）とは、亜麻仁油をケン化分解して得られる遊離脂肪酸である。亜麻仁油脂肪酸は、Ｃ１６：０を４．９質量％、Ｃ１８：０を３．３質量％、Ｃ１８：１を１７．０質量％、Ｃ１８：２を１６．２質量％、Ｃ１８：３を５７．４質量％、およびその他の脂肪酸を１．２質量％の割合で含む。
【００５０】
【表２】
2008220236.tif 000003
【００５１】
表２に示すように、Ｃ１０：０の脂肪酸は、脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降（反応開始から７時間より以降）の水分含量を、０．３１〜１．０質量％に制御（反応温度が３０℃で圧力が１〜３ｍｍＨｇ）した場合（実験Ｄ２）、Ｃ１８：１の脂肪酸は、０．３２〜２．３質量％に制御（反応温度が２０〜３０℃で圧力が１〜３ｍｍＨｇ）した場合（実験Ｅ１およびＥ２）、Ｃ１４：０の脂肪酸は、１．４〜２．５質量％に制御（反応温度が５０℃で圧力が７〜１２ｍｍＨｇ）した場合（実験Ｆ３）、亜麻仁油脂肪酸は、０．３１〜２．０質量％に制御（反応温度が１０〜３０℃で圧力が１〜３ｍｍＨｇ）した場合（実験Ｇ１〜Ｇ３）、エステル化率が高く、かつ脂肪酸モノグリセリドの含量も高いことがわかる。いずれの脂肪酸の場合も、脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降の水分含量を、０．３〜２．５質量％に制御することにより、エステル化率が高く、脂肪酸モノグリセリドが高収率で得られることがわかる（表２に評価を○で示す）。
【００５２】
しかし、脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降（反応開始から７時間より以降）の水分含量が０．３質量％未満の場合（実験Ｄ３、Ｄ４、Ｅ３、Ｅ４、Ｆ４、Ｇ４、およびＧ５）、エステル化率が低下し、脂肪酸モノグリセリドの収率も低いことがわかる。すなわち、用いる脂肪酸によって多少異なるが、反応温度を高温にすると、水分が減少しやすいためにエステル化率が低下する。一方、飽和脂肪酸（Ｃ１０：０およびＣ１４：０）を用いた実験Ｄ１、Ｆ１、およびＦ２のように、反応温度を低温にすると、反応開始時から反応液が固化して撹拌効率が低下し、反応が進まなかった。
【００５３】
実施例１および２より、約３０ｍＬのバイアル瓶を用いたリパーゼＧによる効率的な脂肪酸モノグリセリドの合成反応は、反応後期（脂肪酸のエステル化率が６０％に達した以降）の水分含量に依存していることが分かった。その関係を図１に示す。図１の白部領域の反応条件（反応温度および圧力）の場合、効率よくかつ高収率で脂肪酸モノグリセリドが得られる。脱水条件が厳しい斜線域（白部領域よりも右下部）では、水分含量が低すぎることにより反応率の低下を招く。一方、脱水条件が緩やかな点領域（白部領域よりも左上部）では、水分含量が高すぎることにより脂肪酸モノグリセリドから脂肪酸ジグリセリドへの変換反応が起こる。なお、反応開始時から固化する場合は、撹拌されにくいために反応率が低下する。
【００５４】
この白部領域の反応条件下の場合、反応容器、撹拌、反応液量、脂肪酸の種類などによって、多少の誤差はあるが、ほぼ反応系中の水分含量が０．３〜２．５質量％に制御され得る。反応後期（エステル化率が約６０％に達した以降（実施例１および２の場合は、反応開始から７時間より以降））における水分量が０．３質量％よりも小さくなると酵素はその活性を失うため、反応後期の水分量を０．３質量％以上に保っておく必要がある。反応後期（エステル化率が約６０％に達した以降（実施例１および２の場合は、反応開始から７時間より以降））の水分量を２．５質量％以下、さらに反応終了時（エステル化率が約９５％に達した時、実施例１および２の場合は、反応開始から４８時間後）の水分量を１．５質量％以下に制御することによって、脂肪酸ジグリセリド含量を１０質量％以下にすることができる。さらに、この反応後期の水分含量が０．３質量％に近ければ近いほど、脂肪酸ジグリセリド含量がより少なくなる。
【００５５】
（実施例３：各種脂肪酸モノグリセリドの合成）
約３０ｍＬのバイアル瓶に、グリセリンと遊離脂肪酸（Ｃ９：０）との混合液（遊離脂肪酸／グリセリン＝１／２（モル比））１０ｇ、０．１ｇの水、および反応系１ｇに対して２００ＵのリパーゼＧを添加した。次いで、反応温度を３０〜６３℃の範囲および圧力を２〜２３ｍｍＨｇの範囲で種々変更し、マグネチックスターラーで撹拌して４８時間反応を行った（実験Ｈ）。
【００５６】
Ｃ１０：０からＣ１７：０の直鎖飽和脂肪酸、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、およびＣ１８：３の脂肪酸についても、上記Ｃ９：０を用いた場合と同様の反応を行った（実験Ｉ〜Ｓ）。各種脂肪酸のモノグリセリドの合成に適した反応温度および圧力、その反応温度および圧力における反応開始から７時間後および４８時間後（反応終了後）の脂肪酸のエステル化率および水分量、および反応液中の組成を表３に示す。
【００５７】
【表３】
2008220236.tif 000004
【００５８】
いずれの脂肪酸の場合も（実験Ｈ〜Ｓ）、反応後期の水分量を０．３〜２．５質量％とすることによって、高収率で脂肪酸モノグリセリドが得られた。また、脂肪酸の種類によって、適した水分含量が多少異なり、例えばＣ９：０の脂肪酸は、他の脂肪酸よりも水分含量がやや多い傾向にあることがわかる。
【００５９】
なお、これらの反応では反応液は固化せずに液状であるため、実用的な製造方法である。
【００６０】
（実施例４：反応途中で固化させる方法によるＣ１０：０脂肪酸モノグリセリドの合成）
約３０ｍＬのバイアル瓶に、グリセリンとＣ１０：０の脂肪酸との混合液（Ｃ１０：０の脂肪酸／グリセリン＝１／２（モル比））１０ｇ、０．１ｇの水、および反応系１ｇに対して２００ＵのリパーゼＧを添加した。次いで、反応温度を３０℃に保ちながらマグネチックスターラーで撹拌し、２ｍｍＨｇの減圧条件下で反応を行った。次いで、脂肪酸のエステル化率が６０％に達した７時間後に反応温度を２０℃に下げ、水分含量を０．３〜２．５質量％に制御した。反応液が固化した時点で撹拌を停止し、さらに減圧下で反応を継続した。反応開始時から４８時間後のエステル化率は９８％であり、脂肪酸モノグリセリド含量は９８質量％、脂肪酸ジグリセリド含量はＴＬＣ−ＦＩＤ法では検出限界以下（１質量％以下）、そして水分量は２．５質量％であった。このように、水分含量を０．３〜２．５質量％に制御し、かつ反応後期の反応温度を下げて反応溶液を固化させることによって、副産物である脂肪酸ジグリセリド含量を１質量％以下に減らすことができる。
【００６１】
Ｃ１０：０の脂肪酸を用いて、反応温度を下げずに反応を行った場合、反応後期の水分含量を０．３７〜１．５質量％に制御すると、脂肪酸モノグリセリドが効率よく得られる（表３の実験Ｉを参照）。このように、副産物である脂肪酸ジグリセリド含量をできるだけ少なくするには、水分含量が０．３質量％未満にならない範囲で、できる限り水分含量を低く保たなければならず、水分含量の抑制を厳密に行う必要がある。しかし、反応後期の反応温度を下げた場合、水分含量の制御を厳密に行わなくても、０．３〜２．５質量％の範囲内であれば、副産物である脂肪酸ジグリセリド含量を１質量％以下に抑えることができ、より効率よく脂肪酸モノエステルが得られることがわかる。したがって、反応後期の反応温度を、得られる脂肪酸モノエステルの融点以下、すなわち、反応溶液が固化する温度まで下げて反応を行うと、水分含量が０．３〜２．５質量％の範囲内であれば、脂肪酸の種類によって厳密に制御しなくてもよいことがわかる。
【００６２】
（比較例１：従来技術の酵素法（特許文献３）による脂肪酸モノグリセリドの合成）
約３０ｍＬのバイアル瓶に、グリセリンと遊離脂肪酸（Ｃ１２：０）との混合液（遊離脂肪酸／グリセリン＝１／２（モル比））１０ｇ、０．２ｇの水、および反応系１ｇに対して２００ＵのリパーゼＧを添加した。次いで、マグネチックスターラーで撹拌し、４ｍｍＨｇの減圧条件下で、水分含量を考慮することなく４８時間反応を行った。この時、反応系をよく撹拌するために、反応温度を遊離脂肪酸が溶解する温度（４５℃）に設定した。反応後の脂肪酸のエステル化率および反応液中の組成を測定した。結果を表４に示す。
【００６３】
これとは別に、Ｃ１４：０の脂肪酸（反応温度３０℃および５０℃；圧力５ｍｍＨｇ）およびＣ１５：０の脂肪酸（反応温度５０℃；圧力４ｍｍＨｇ）を用いて、上記Ｃ１２：０の脂肪酸を用いた場合と同様の反応を行った。結果を表４に示す。
【００６４】
【表４】
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【００６５】
Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、およびＣ１５：０の脂肪酸は融点が高いため、反応系中で脂肪酸が溶解する温度で反応させたが、従来技術の酵素法と同じ方法では、エステル化は、ほとんど進行しなかった（エステル化率、＜２６％）。さらに、Ｃ１４：０の脂肪酸の反応温度を３０℃に下げてもエステル化は、ほとんど進行しなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば、Ｃ９：０からＣ１８：０の直鎖飽和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸の脂肪酸モノグリセリドを効率よく、かつ高純度で製造する方法が提供される。したがって、本発明の製造方法によって得られた脂肪酸モノグリセリドは、乳化剤などの食品添加物として有用であり、さらに、中鎖脂肪酸のモノグリセリドは、抗菌活性を有することから、抗菌剤などとしても期待され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】リパーゼＧによる脂肪酸モノグリセリドの合成における圧力と温度との関係を示すグラフである。
【図１】
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