(57)【要約】【課題】大腸癌の腫瘍マーカー及び大腸癌についての罹患を識別することができる方法を提供する。【解決手段】大腸癌組織から同定されたタンパク質を含む腫瘍マーカー。当該腫瘍マーカーを用いて大腸癌の罹患を識別する方法。当該方法においては、前記タンパク質の、大腸癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する試料中におけるレベルを測定し、得られた測定値レベルと、前記タンパク質の正常レベルとを比較し、得られた測定値レベルが、前記正常レベルよりも増加又は減少していることを、前記対象となる個人が大腸癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとする。【選択図】図１
2008014937.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
6-phosphogluconolactonase、Alpha1 acid glyco protein、Alpha-actinin 1、Apurinic endonuclease、Calumenin、Chaperonin、Clathrin heavy chain 1、Clathrin light polypeptide A、c-myc binding protein、Complement factor H、Cysteine rich intestinal protein 1、F-box protein 40、Fibrinogen gamma、Fk506 Binding Protein Fkbp Mutant R42kH87V COMPLEX WITH Immunosuppressant Fk506、Guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1、Heat shock 70kD protein 9B、Heparan sulfate proteoglycan 2、HLA-C、hypothetical protein FLJ38663、L-plastin polypeptide、MBC2、Migration inhibitory factor-related protein 14 variant E、Mitogen inducible gene、Proteasome subunit p58、RAB18, member RAS oncogene family、RAB22A、Radixin、RAN, member RAS oncogene family、Rhodanese;thiosulfate sulfurtransferase、Ribosomal protein L13、Ribosomal protein L27a、Ribosomal protein L4、Ribosomal protein S18、Ribosomal protein S29、Ribosome binding protein 1、S adenosylhomocysteine hydrolase、Solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; adenine nucleotide translocator), member 5、Solute carrier family 3(activator of dibasic and neutral amino acid transport), member 2、Splicing factor 3B, subunit 3、Splicing factor, arginine/serine-rich 3 (SRp20)、U5 snRNP-specific protein, 116 kD、Ubiquitin isopeptidase T、Vitronectin、XTP3 transactivatied protein A、Galectin 1、Reticulocalbin 1、Vimentin、ESP-2 (zyxin)；  Protein tyrosine phosphatase receptor type C、Protein tyrosine phosphatase, receptor type, alpha、orosomucoid 2、Tumor rejection antigen 1、glycyl-tRNA synthetase、TLS protein、Ribonuclease RNase A family 3、及びheterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2からなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質を含む、大腸癌マーカー。
【請求項２】
ADP-ribosylation factor-like 10C、aldehyde dehydrogenase2、Alpha-actinin 4、Annexin A2 isoform 2、ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit d isoform a、ATP-binding cassette transporter family A member 12、Calnexin、Carbonic Anhydrase Form B、Carbonyl reductase 1、Cathepsin S、cysteine rich protein 1、Dynein light chain 1、Endoplasmic-reticulum-lumenal protein 28、Enoyl coenzyme hydrase,short chain1、Eukaryotic translation elongation factor 2、Filamin B、gelsolin isoform a、Glucosamine-fructose-6-phosphate aminotransferase、GTP-binding protein Rab3B、Haptoglobin、Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2、Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mitochondrial、Isocitrate dehydrogenase 1、Lymphocyte cytosolic protein 1、Major vault protein、MGC15429 protein、MHC class I antigen、Myosin, heavy polypeptide 14、Myozenin 3、NADH Ubiquinone oxidoreductase subunit B13、Normal mucosa of esophagus specific 1、Olfactomedin 4、phosphoenolpyruvate calboxykinase 2、Phosphoglycerate mutase 1、Proline arginine-rich end leucine-rich repeat protein precursor、Protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2、Protein P97、Pyridoxine 5'-phosphate oxidase、Raf kinase inhibitor protein、Ras associated protein Rab5B、Retinoblastoma binding protein 4、succinate dehydrogenase complex,subunit A,,flavoprotein、Thioredoxin domain containing 5、TNRC15 protein；  Collagen, type XIV, alpha 1、及びDesmoglein 2からなる群から選ばれるタンパク質を含む大腸癌マーカー。
【請求項３】
6-phosphogluconolactonase、Alpha1 acid glyco protein、Alpha-actinin 1、Apurinic endonuclease、Calumenin、Chaperonin、Clathrin heavy chain 1、Clathrin light polypeptide A、c-myc binding protein、Complement factor H、Cysteine rich intestinal protein 1、F-box protein 40、Fibrinogen gamma、Fk506 Binding Protein Fkbp Mutant R42kH87V COMPLEX WITH Immunosuppressant Fk506、Guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1、Heat shock 70kD protein 9B、Heparan sulfate proteoglycan 2、HLA-C、hypothetical protein FLJ38663、L-plastin polypeptide、MBC2、Migration inhibitory factor-related protein 14 variant E、Mitogen inducible gene、Proteasome subunit p58、RAB18, member RAS oncogene family、RAB22A、Radixin、RAN, member RAS oncogene family、Rhodanese;thiosulfate sulfurtransferase、Ribosomal protein L13、Ribosomal protein L27a、Ribosomal protein L4、Ribosomal protein S18、Ribosomal protein S29、Ribosome binding protein 1、S adenosylhomocysteine hydrolase、Solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; adenine nucleotide translocator), member 5、Solute carrier family 3(activator of dibasic and neutral amino acid transport), member 2、Splicing factor 3B, subunit 3、Splicing factor, arginine/serine-rich 3 (SRp20)、U5 snRNP-specific protein, 116 kD、Ubiquitin isopeptidase T、Vitronectin、XTP3 transactivatied protein A、Galectin 1、Reticulocalbin 1、Vimentin、ESP-2 (zyxin)；  Protein tyrosine phosphatase receptor type C、Protein tyrosine phosphatase, receptor type, alpha、orosomucoid 2、Tumor rejection antigen 1、glycyl-tRNA synthetase、TLS protein、Ribonuclease RNase A family 3、及びheterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2からなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質を大腸癌マーカーとして使用することによって、大腸癌の罹患を識別する方法。
【請求項４】
前記タンパク質の、大腸癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する試料中におけるレベルを測定し、
得られた測定値レベルと、前記タンパク質の正常レベルとを比較し、
得られた測定値レベルが、前記正常レベルよりも上昇していることを、前記対象となる個人が大腸癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとする、請求項３に記載の大腸癌の罹患を識別する方法。
【請求項５】
ADP-ribosylation factor-like 10C、aldehyde dehydrogenase2、Alpha-actinin 4、Annexin A2 isoform 2、ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit d isoform a、ATP-binding cassette transporter family A member 12、Calnexin、Carbonic Anhydrase Form B、Carbonyl reductase 1、Cathepsin S、cysteine rich protein 1、Dynein light chain 1、Endoplasmic-reticulum-lumenal protein 28、Enoyl coenzyme hydrase,short chain1、Eukaryotic translation elongation factor 2、Filamin B、gelsolin isoform a、Glucosamine-fructose-6-phosphate aminotransferase、GTP-binding protein Rab3B、Haptoglobin、Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2、Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mitochondrial、Isocitrate dehydrogenase 1、Lymphocyte cytosolic protein 1、Major vault protein、MGC15429 protein、MHC class I antigen、Myosin, heavy polypeptide 14、Myozenin 3、NADH Ubiquinone oxidoreductase subunit B13、Normal mucosa of esophagus specific 1、Olfactomedin 4、phosphoenolpyruvate calboxykinase 2、Phosphoglycerate mutase 1、Proline arginine-rich end leucine-rich repeat protein precursor、Protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2、Protein P97、Pyridoxine 5'-phosphate oxidase、Raf kinase inhibitor protein、Ras associated protein Rab5B、Retinoblastoma binding protein 4、succinate dehydrogenase complex,subunit A,,flavoprotein、Thioredoxin domain containing 5、TNRC15 protein；  Collagen, type XIV, alpha 1、及びDesmoglein 2からなる群から選ばれるタンパク質を大腸癌マーカーとして使用することによって、大腸癌の罹患を識別する方法。
【請求項６】
前記タンパク質の、大腸癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する試料中におけるレベルを測定し、
得られた測定値レベルと、前記タンパク質の正常レベルとを比較し、
得られた測定値レベルが、前記正常レベルよりも減少していることを、前記対象となる個人が大腸癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとする、請求項５に記載の大腸癌の罹患を識別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床での診断・検診・経過観察、及び分類の技術に関し、具体的には、腫瘍マーカー及び癌疾病の罹患の識別方法に関する。とりわけ、本発明は、大腸癌の腫瘍マーカー及び大腸癌の罹患の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌の診断・検診・経過観察の手法の一つとして、血液検査が行われている。血液検査においては、患者の血液中のある種のタンパク質（腫瘍マーカー：tumor marker）の濃度を計測することで、進行癌の存在を推定することができる。大腸癌の腫瘍マーカーについては、例えば、Anticancer Research, 2004,24(4), 2519-2530（非特許文献１）などに記載されている。現在、代表的な腫瘍マーカーとしては、癌胎児性抗原（CEA）やCA19-9が挙げられる。肝臓などへの転移があると、これらの腫瘍マーカーの濃度が高度に上昇する。また、US2006/0019256 (COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING AND DIAGNOSING CANCER)（特許文献１）には、肺癌由来の培養細胞(xenograft tumors)の解析結果として、HLA-C, MBC2、RAB22A, MGC15429, MHC class I antigenが癌関連蛋白質として記載されている。さらに、US2003/0211498 (TUMOR MARKERS IN OVARIAN CANCER)（特許文献２）には、子宮癌マーカー遺伝子としてTumor rejection antigen-1が記載されている。
【０００３】
【非特許文献１】「アンチキャンサー・リサーチ（Anticancer Research）」、２００４年、第２４巻、第４号、ｐ．２５１９−２５３０
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００１９２５６号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０２１１４９８号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のように、癌胎児性抗原（CEA）やCA19-9などの腫瘍マーカーが、大腸癌の診断・検診・経過観察における血液検査で用いられている。しかしながら、早期癌の段階においてはこれらの腫瘍マーカーの濃度は正常レベルであることが多く、進行癌の段階においても正常レベルの範囲であることが少なくない。このような観点から、罹患部位についての特異性が高く且つ早期診断に適した新規腫瘍マーカーの発見が求められている。
【０００５】
なお、上記特許文献１には、開示された癌関連タンパク質が、大腸癌に関連していることは記載されていない。また、上記特許文献２には、開示された子宮癌マーカー遺伝子が、大腸癌に関連していることは記載されていない。
【０００６】
本発明は、大腸癌に対してより特異性の高い腫瘍マーカーを提供することを目的とする。また本発明は、大腸癌についての罹患を識別することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、大腸癌患者から採取した大腸粘膜上皮における病理組織と正常組織とを試料とし、プロテオーム解析法としてＮＢＳ法を用い、両組織間で存在量に一定量以上の差が認められるタンパク質群を同定した。ＮＢＳ法は、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドを用いる、タンパク質・ペプチドの相対定量に優れた手法である。ＮＢＳ法を用いるプロテオーム解析法は、二次元電気泳動法を用いる最も汎用的なプロテオーム解析法と、分離様式及び検出原理が根本的に異なる。このため、ＮＢＳ法を用いたプロテオーム解析法によると、現在までに腎癌マーカー候補として報告されているタンパク質群とは異なるマーカー候補タンパク質を見出すことができると考えられる。
【０００８】
本発明は、以下の発明を含む。
下記（１）及び（２）は、大腸癌の腫瘍マーカーに関する。
【０００９】
下記（１）は、癌患者体内で、正常レベルに比べて発現量が多いタンパク質を含む大腸癌の腫瘍マーカーに関する。
（１）
6-phosphogluconolactonase、Alpha1 acid glyco protein、Alpha-actinin 1、Apurinic endonuclease、Calumenin、Chaperonin、Clathrin heavy chain 1、Clathrin light polypeptide A、c-myc binding protein、Complement factor H、Cysteine rich intestinal protein 1、F-box protein 40、Fibrinogen gamma、Fk506 Binding Protein Fkbp Mutant R42kH87V COMPLEX WITH Immunosuppressant Fk506、Guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1、Heat shock 70kD protein 9B、Heparan sulfate proteoglycan 2、HLA-C、hypothetical protein FLJ38663、L-plastin polypeptide、MBC2、Migration inhibitory factor-related protein 14 variant E、Mitogen inducible gene、Proteasome subunit p58、RAB18, member RAS oncogene family、RAB22A、Radixin、RAN, member RAS oncogene family、Rhodanese;thiosulfate sulfurtransferase、Ribosomal protein L13、Ribosomal protein L27a、Ribosomal protein L4、Ribosomal protein S18、Ribosomal protein S29、Ribosome binding protein 1、S adenosylhomocysteine hydrolase、Solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; adenine nucleotide translocator), member 5、Solute carrier family 3(activator of dibasic and neutral amino acid transport), member 2、Splicing factor 3B, subunit 3、Splicing factor, arginine/serine-rich 3 (SRp20)、U5 snRNP-specific protein, 116 kD、Ubiquitin isopeptidase T、Vitronectin、XTP3 transactivatied protein A、Galectin 1、Reticulocalbin 1、Vimentin、ESP-2 (zyxin)；  Protein tyrosine phosphatase receptor type C、Protein tyrosine phosphatase, receptor type, alpha、orosomucoid 2、Tumor rejection antigen 1、glycyl-tRNA synthetase、TLS protein、Ribonuclease RNase A family 3、及びheterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2からなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質を含む、大腸癌の腫瘍マーカー。
【００１０】
下記（２）は、大腸癌患者体内で、正常レベルに比べて発現量が少ないタンパク質を含む大腸癌の腫瘍マーカーに関する。
（２）
ADP-ribosylation factor-like 10C、aldehyde dehydrogenase2、Alpha-actinin 4、Annexin A2 isoform 2、ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit d isoform a、ATP-binding cassette transporter family A member 12、Calnexin、Carbonic Anhydrase Form B、Carbonyl reductase 1、Cathepsin S、cysteine rich protein 1、Dynein light chain 1、Endoplasmic-reticulum-lumenal protein 28、Enoyl coenzyme hydrase,short chain1、Eukaryotic translation elongation factor 2、Filamin B、gelsolin isoform a、Glucosamine-fructose-6-phosphate aminotransferase、GTP-binding protein Rab3B、Haptoglobin、Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2、Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mitochondrial、Isocitrate dehydrogenase 1、Lymphocyte cytosolic protein 1、Major vault protein、MGC15429 protein、MHC class I antigen、Myosin, heavy polypeptide 14、Myozenin 3、NADH Ubiquinone oxidoreductase subunit B13、Normal mucosa of esophagus specific 1、Olfactomedin 4、phosphoenolpyruvate calboxykinase 2、Phosphoglycerate mutase 1、Proline arginine-rich end leucine-rich repeat protein precursor、Protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2、Protein P97、Pyridoxine 5'-phosphate oxidase、Raf kinase inhibitor protein、Ras associated protein Rab5B、Retinoblastoma binding protein 4、succinate dehydrogenase complex,subunit A,,flavoprotein、Thioredoxin domain containing 5、TNRC15 protein；  Collagen, type XIV, alpha 1、及びDesmoglein 2からなる群から選ばれるタンパク質を含む大腸癌の腫瘍マーカー。
【００１１】
下記（３）〜（６）は、大腸癌の罹患を識別する方法に関する。本発明において、罹患とは、広く病的状態をいい、大腸癌の罹患を識別するとは、大腸癌の検出、診断、モニタリング、ステージング及び予後判定を行うことを含む意味で用いる。
【００１２】
下記（３）及び（４）は、上記（１）に記載の大腸癌の腫瘍マーカーを用いて大腸癌の罹患を識別する方法に関する。
【００１３】
（３）
6-phosphogluconolactonase、Alpha1 acid glyco protein、Alpha-actinin 1、Apurinic endonuclease、Calumenin、Chaperonin、Clathrin heavy chain 1、Clathrin light polypeptide A、c-myc binding protein、Complement factor H、Cysteine rich intestinal protein 1、F-box protein 40、Fibrinogen gamma、Fk506 Binding Protein Fkbp Mutant R42kH87V COMPLEX WITH Immunosuppressant Fk506、Guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1、Heat shock 70kD protein 9B、Heparan sulfate proteoglycan 2、HLA-C、hypothetical protein FLJ38663、L-plastin polypeptide、MBC2、Migration inhibitory factor-related protein 14 variant E、Mitogen inducible gene、Proteasome subunit p58、RAB18, member RAS oncogene family、RAB22A、Radixin、RAN, member RAS oncogene family、Rhodanese;thiosulfate sulfurtransferase、Ribosomal protein L13、Ribosomal protein L27a、Ribosomal protein L4、Ribosomal protein S18、Ribosomal protein S29、Ribosome binding protein 1、S adenosylhomocysteine hydrolase、Solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; adenine nucleotide translocator), member 5、Solute carrier family 3(activator of dibasic and neutral amino acid transport), member 2、Splicing factor 3B, subunit 3、Splicing factor, arginine/serine-rich 3 (SRp20)、U5 snRNP-specific protein, 116 kD、Ubiquitin isopeptidase T、Vitronectin、XTP3 transactivatied protein A、Galectin 1、Reticulocalbin 1、Vimentin、ESP-2 (zyxin)；  Protein tyrosine phosphatase receptor type C、Protein tyrosine phosphatase, receptor type, alpha、orosomucoid 2、Tumor rejection antigen 1、glycyl-tRNA synthetase、TLS protein、Ribonuclease RNase A family 3、及びheterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2からなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質を大腸癌の腫瘍マーカーとして使用することによって、大腸癌の罹患を識別する方法。
【００１４】
（４）
前記タンパク質の、大腸癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する試料中におけるレベルを測定し、
得られた測定値レベルと、前記タンパク質の正常レベルとを比較し、
得られた測定値レベルが、前記正常レベルよりも上昇していることを、前記対象となる個人が大腸癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとする、（３）に記載の大腸癌の罹患を識別する方法。
【００１５】
前記タンパク質の正常レベルとは、癌性試料の対照となる非癌性試料における前記タンパク質レベルであればよい。例えば、健康な個人に由来する正常試料におけるレベルや、癌疾病の罹患患者に由来する癌性でない正常試料におけるレベルなどが挙げられる。
【００１６】
前記試料が血清又は尿であり、前記タンパク質のレベルは、生体特異的親和性に基づく検査によって測定される、（４）に記載の大腸癌の罹患を識別する方法。
【００１７】
下記（５）及び（６）は、上記（２）に記載の大腸癌の腫瘍マーカーを用いて大腸癌の罹患を識別する方法に関する。
【００１８】
（５）
ADP-ribosylation factor-like 10C、aldehyde dehydrogenase2、Alpha-actinin 4、Annexin A2 isoform 2、ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit d isoform a、ATP-binding cassette transporter family A member 12、Calnexin、Carbonic Anhydrase Form B、Carbonyl reductase 1、Cathepsin S、cysteine rich protein 1、Dynein light chain 1、Endoplasmic-reticulum-lumenal protein 28、Enoyl coenzyme hydrase,short chain1、Eukaryotic translation elongation factor 2、Filamin B、gelsolin isoform a、Glucosamine-fructose-6-phosphate aminotransferase、GTP-binding protein Rab3B、Haptoglobin、Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2、Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mitochondrial、Isocitrate dehydrogenase 1、Lymphocyte cytosolic protein 1、Major vault protein、MGC15429 protein、MHC class I antigen、Myosin, heavy polypeptide 14、Myozenin 3、NADH Ubiquinone oxidoreductase subunit B13、Normal mucosa of esophagus specific 1、Olfactomedin 4、phosphoenolpyruvate calboxykinase 2、Phosphoglycerate mutase 1、Proline arginine-rich end leucine-rich repeat protein precursor、Protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2、Protein P97、Pyridoxine 5'-phosphate oxidase、Raf kinase inhibitor protein、Ras associated protein Rab5B、Retinoblastoma binding protein 4、succinate dehydrogenase complex,subunit A,,flavoprotein、Thioredoxin domain containing 5、TNRC15 protein；  Collagen, type XIV, alpha 1、及びDesmoglein 2からなる群から選ばれるタンパク質を大腸癌の腫瘍マーカーとして使用することによって、大腸癌の罹患を識別する方法。
【００１９】
（６）
前記タンパク質の、大腸癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する試料中におけるレベルを測定し、
得られた測定値レベルと、前記タンパク質の正常レベルとを比較し、
得られた測定値レベルが、前記正常レベルよりも減少していることを、前記対象となる個人が大腸癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとする、（６）に記載の大腸癌の罹患を識別する方法。
【００２０】
前記タンパク質の正常レベルとは、癌性試料の対照となる非癌性試料における前記タンパク質レベルであればよい。例えば、健康な個人に由来する正常試料におけるレベルや、癌疾病の罹患患者に由来する癌性でない正常試料におけるレベルなどが挙げられる。
【００２１】
前記試料が血清又は尿であり、前記タンパク質のレベルは、生体特異的親和性に基づく検査によって測定される、（６）に記載の大腸癌の罹患を識別する方法。
【００２２】
本発明はまた、下記（７）及び（８）に記載の大腸癌の処理のための薬剤組成物に向けられる。大腸癌の処理とは、大腸癌細胞を死滅させること、及び大腸癌細胞の成長を抑制することを含む。
【００２３】
（７）
大腸癌細胞に対して供給することによって、大腸癌細胞の死滅及び/又は大腸癌細胞成長の抑制を促進する反応を誘発するための薬剤組成物であって、（１）に記載の腫瘍マーカーに免疫特異的に結合する少なくとも１種の抗体を含む、薬剤組成物。
【００２４】
（８）
免疫刺激量で、大腸癌細胞に対して供給することによって、免疫応答を促進するための薬剤組成物であって、（１）に記載の腫瘍マーカーを含む、薬剤組成物。
【００２５】
上記（７）及び（８）の薬剤組成物は、大腸癌の処理に用いられる潜在的な治療剤として特定されうる。或いは、上記（７）及び（８）の薬剤組成物は、大腸癌の処理に用いられる治療剤として用いられうる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によると、大腸癌に対してより特異性の高い腫瘍マーカーを提供することができる。また本発明によると、大腸癌についての罹患を識別することができる方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
＜腫瘍マーカー＞
本発明は、大腸癌の腫瘍マーカーを提供する。
本発明において腫瘍マーカーとして提供するタンパク質は、大腸癌患者から採取された大腸粘膜上皮組織の癌部、非癌部より抽出し、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳＣｌ）を用いた同位体標識法（ＮＢＳ法）とＨＰＬＣを用いた分離法とによるプロテオーム解析技術によって同定された。ＮＢＳ法は、２種類の状態のタンパク質試料のうち一方を重い試薬（２−ニトロ［13Ｃ6］ベンゼンスルフェニルクロリド）で修飾し、他方を軽い試薬（２−ニトロ［12Ｃ6］ベンゼンスルフェニルクロリド）で修飾し、得られたＮＢＳ修飾タンパク質試料双方を互いに混合し、トリプシン消化など当業者による適切な処理を行い、質量分析装置でペプチド量の違いを測定することにより、２種類の状態のタンパク質試料におけるタンパク質含有量の相対的な差を調べることができる方法である。ＮＢＳ法は、Rapid Commun. Mass Spectrom., 2003, 17, 1642-1650及び国際公報第２００４／００２９５０号パンフレットなどに記載されている。
【００２８】
従来から汎用されてきた二次元電気泳動法では、塩基性の等電点を示すタンパク質及び１００ＫＤａ前後の大きな分子量を持つタンパク質の分離と検出とに難があった。本発明で用いたＮＢＳ法では、組織に含まれるタンパク質をトリプシン消化することによって得られるペプチド断片を直接的な解析対象とし、分離にはＨＰＬＣを用いるため、分子量と等電点とに関する制約はない。このことから、従来得られてきた知見と異なるものが得られる可能性がある。
【００２９】
これらのタンパク質は、当業者によって選択されるあらゆるタンパク質精製技術によって単離及び精製することができる。例えば、イオン交換、アフィニティ、及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、遠心分離、溶解度差、及び電気泳動などを含む技術を用いることができる。
【００３０】
本発明が腫瘍マーカーとして提供するタンパク質のうち、癌患者体内で、正常レベルに比べて発現量が多いタンパク質として、6-phosphogluconolactonase、Alpha1 acid glyco protein、Alpha-actinin 1、Apurinic endonuclease、Calumenin、Chaperonin、Clathrin heavy chain 1、Clathrin light polypeptide A、c-myc binding protein、Complement factor H、Cysteine rich intestinal protein 1、F-box protein 40、Fibrinogen gamma、Fk506 Binding Protein Fkbp Mutant R42kH87V COMPLEX WITH Immunosuppressant Fk506、Guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1、Heat shock 70kD protein 9B、Heparan sulfate proteoglycan 2、HLA-C、hypothetical protein FLJ38663、L-plastin polypeptide、MBC2、Migration inhibitory factor-related protein 14 variant E、Mitogen inducible gene、Proteasome subunit p58、RAB18, member RAS oncogene family、RAB22A、Radixin、RAN, member RAS oncogene family、Rhodanese;thiosulfate sulfurtransferase、Ribosomal protein L13、Ribosomal protein L27a、Ribosomal protein L4、Ribosomal protein S18、Ribosomal protein S29、Ribosome binding protein 1、S adenosylhomocysteine hydrolase、Solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; adenine nucleotide translocator), member 5、Solute carrier family 3(activator of dibasic and neutral amino acid transport), member 2、Splicing factor 3B, subunit 3、Splicing factor, arginine/serine-rich 3 (SRp20)、U5 snRNP-specific protein, 116 kD、Ubiquitin isopeptidase T、Vitronectin、XTP3 transactivatied protein A、Galectin 1、Reticulocalbin 1、Vimentin、ESP-2 (zyxin)；  Protein tyrosine phosphatase receptor type C、Protein tyrosine phosphatase, receptor type, alpha、orosomucoid 2、Tumor rejection antigen 1、glycyl-tRNA synthetase、TLS protein、Ribonuclease RNase A family 3、及びheterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2を提供する。
【００３１】
上記タンパク質は、例えば、大腸癌患者数の約５０％以上で、癌部において、非癌部におけるよりも約５０％以上、好ましくは１００％以上大きい発現量を示す傾向にある。
【００３２】
さらに、上記タンパク質のうち、Protein tyrosine phosphatase receptor type C、Protein tyrosine phosphatase, receptor type, alpha、orosomucoid 2、Tumor rejection antigen 1、glycyl-tRNA synthetase、TLS protein、Ribonuclease RNase A family 3、及びheterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2については、癌部において特異的に発現する（或いは、非癌部において検出限界以下である）。
【００３３】
本発明が腫瘍マーカーとして提供するタンパク質のうち、大腸癌患者体内で、正常レベルに比べて発現量が少ないタンパク質として、ADP-ribosylation factor-like 10C、aldehyde dehydrogenase2、Alpha-actinin 4、Annexin A2 isoform 2、ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit d isoform a、ATP-binding cassette transporter family A member 12、Calnexin、Carbonic Anhydrase Form B、Carbonyl reductase 1、Cathepsin S、cysteine rich protein 1、Dynein light chain 1、Endoplasmic-reticulum-lumenal protein 28、Enoyl coenzyme hydrase,short chain1、Eukaryotic translation elongation factor 2、Filamin B、gelsolin isoform a、Glucosamine-fructose-6-phosphate aminotransferase、GTP-binding protein Rab3B、Haptoglobin、Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2、Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mitochondrial、Isocitrate dehydrogenase 1、Lymphocyte cytosolic protein 1、Major vault protein、MGC15429 protein、MHC class I antigen、Myosin, heavy polypeptide 14、Myozenin 3、NADH Ubiquinone oxidoreductase subunit B13、Normal mucosa of esophagus specific 1、Olfactomedin 4、phosphoenolpyruvate calboxykinase 2、Phosphoglycerate mutase 1、Proline arginine-rich end leucine-rich repeat protein precursor、Protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2、Protein P97、Pyridoxine 5'-phosphate oxidase、Raf kinase inhibitor protein、Ras associated protein Rab5B、Retinoblastoma binding protein 4、succinate dehydrogenase complex,subunit A,,flavoprotein、Thioredoxin domain containing 5、TNRC15 protein；  Collagen, type XIV, alpha 1、及びDesmoglein 2を提供する。
【００３４】
上記タンパク質は、例えば、大腸癌患者数の約５０％以上で、非癌部において、癌部におけるよりも約５０％以上、好ましくは１００％以上大きい発現量を示す傾向にある。
さらに、上記タンパク質のうち、Collagen, type XIV, alpha 1、及びDesmoglein 2については、非癌部において特異的に発現する（或いは、癌部において検出限界以下である）。
【００３５】
＜大腸癌の罹患を識別する方法＞
本発明はまた、上記タンパク質群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質を腫瘍マーカーとして使用することにより、大腸癌の罹患を識別する方法を提供する。
【００３６】
本発明の方法においては、大腸癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する試料を用意し、当該試料中において、上記タンパク質群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質のレベルを測定する。得られた測定値レベルは、正常レベルと比較される。正常レベルとは、上記タンパク質群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質の、癌性試料の対照となる試料における前記タンパク質レベルである。ここで、癌性試料の対照となる試料は、癌性でない試料であれば特に限定されない。例えば、健康な個人に由来する試料や、癌疾病の罹患患者に由来する正常試料などが挙げられる。
【００３７】
本発明において、大腸癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する試料としては、特に限定されない。例えば、細胞や組織、体液、及び組織抽出物などが挙げられる。細胞や組織には、組織生検材料及び検死解剖材料などが含まれ、それらの組織切片および組織抽出物も含まれる。特に、試料としては、大腸由来試料の細胞、組織、及び組織抽出物が挙げられる。大腸由来試料としては、粘膜上皮、粘膜固有層、粘膜筋板、粘膜下層、固有筋層、及び漿膜などが挙げられる。体液としては、血液、尿、及び体分泌物などが含まれる。血液としては、全血、血漿、血清などが含まれる。組織抽出物とは、当業者に公知の方法によってホモジネート又は可溶化された組織をいう。これら例示された試料の中でも、血清及び/又は尿を試料とすることが好ましい。
【００３８】
対象となる個人の細胞や組織、体液、及び組織抽出物を含む試料において測定された腫瘍マーカーの測定値は、好ましくは同種の細胞や組織、体液、及び組織抽出物を含む、癌性でない試料におけるレベルと比較される。
【００３９】
大腸癌の罹患の識別において、腫瘍マーカーは、以下の用途で用いられる。組織中の腫瘍マーカーは、例えば、組織切片を用いた癌診断や予後診断（例えば、免疫組織化学染色法、マスイメージングなどにより行う）、及びPET診断（例えば、腫瘍マーカーに対する放射性プローブの使用により行う）におけるターゲットとして、或いは、治療における薬物ターゲット（後述の＜薬剤組成物＞の項目参照）となる。また、血中の腫瘍マーカーは、例えば、癌診断、予後診断において定量的に測定されるべき対象となる。
【００４０】
上記タンパク質群が、6-phosphogluconolactonase、Alpha1 acid glyco protein、Alpha-actinin 1、Apurinic endonuclease、Calumenin、Chaperonin、Clathrin heavy chain 1、Clathrin light polypeptide A、c-myc binding protein、Complement factor H、Cysteine rich intestinal protein 1、F-box protein 40、Fibrinogen gamma、Fk506 Binding Protein Fkbp Mutant R42kH87V COMPLEX WITH Immunosuppressant Fk506、Guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1、Heat shock 70kD protein 9B、Heparan sulfate proteoglycan 2、HLA-C、hypothetical protein FLJ38663、L-plastin polypeptide、MBC2、Migration inhibitory factor-related protein 14 variant E、Mitogen inducible gene、Proteasome subunit p58、RAB18, member RAS oncogene family、RAB22A、Radixin、RAN, member RAS oncogene family、Rhodanese;thiosulfate sulfurtransferase、Ribosomal protein L13、Ribosomal protein L27a、Ribosomal protein L4、Ribosomal protein S18、Ribosomal protein S29、Ribosome binding protein 1、S adenosylhomocysteine hydrolase、Solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; adenine nucleotide translocator), member 5、Solute carrier family 3(activator of dibasic and neutral amino acid transport), member 2、Splicing factor 3B, subunit 3、Splicing factor, arginine/serine-rich 3 (SRp20)、U5 snRNP-specific protein, 116 kD、Ubiquitin isopeptidase T、Vitronectin、XTP3 transactivatied protein A、Galectin 1、Reticulocalbin 1、Vimentin、ESP-2 (zyxin)；  Protein tyrosine phosphatase receptor type C、Protein tyrosine phosphatase, receptor type, alpha、orosomucoid 2、Tumor rejection antigen 1、glycyl-tRNA synthetase、TLS protein、Ribonuclease RNase A family 3、及びheterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2からなる群である場合、得られた測定値レベルが、正常レベルよりも上昇していることを、大腸癌の罹患を識別すべき対象となる個人が、大腸癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとすることができる。測定値レベルにおける上昇の度合いとしては、測定値レベルが正常レベルの５０％以上、好ましくは１００％以上となる程度を目安にすると良い。
【００４１】
さらに、上記タンパク質のうち、Protein tyrosine phosphatase receptor type C、Protein tyrosine phosphatase, receptor type, alpha、orosomucoid 2、Tumor rejection antigen 1、glycyl-tRNA synthetase、TLS protein、Ribonuclease RNase A family 3、及びheterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2については、大腸癌組織において特異的なタンパク質であるため、その存在が確認されれば、大腸癌の罹患を識別すべき対象となる個人が、大腸癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとすることができる。
【００４２】
上記タンパク質群が、ADP-ribosylation factor-like 10C、aldehyde dehydrogenase2、Alpha-actinin 4、Annexin A2 isoform 2、ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit d isoform a、ATP-binding cassette transporter family A member 12、Calnexin、Carbonic Anhydrase Form B、Carbonyl reductase 1、Cathepsin S、cysteine rich protein 1、Dynein light chain 1、Endoplasmic-reticulum-lumenal protein 28、Enoyl coenzyme hydrase,short chain1、Eukaryotic translation elongation factor 2、Filamin B、gelsolin isoform a、Glucosamine-fructose-6-phosphate aminotransferase、GTP-binding protein Rab3B、Haptoglobin、Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2、Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mitochondrial、Isocitrate dehydrogenase 1、Lymphocyte cytosolic protein 1、Major vault protein、MGC15429 protein、MHC class I antigen、Myosin, heavy polypeptide 14、Myozenin 3、NADH Ubiquinone oxidoreductase subunit B13、Normal mucosa of esophagus specific 1、Olfactomedin 4、phosphoenolpyruvate calboxykinase 2、Phosphoglycerate mutase 1、Proline arginine-rich end leucine-rich repeat protein precursor、Protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2、Protein P97、Pyridoxine 5'-phosphate oxidase、Raf kinase inhibitor protein、Ras associated protein Rab5B、Retinoblastoma binding protein 4、succinate dehydrogenase complex,subunit A,,flavoprotein、Thioredoxin domain containing 5、TNRC15 protein；  Collagen, type XIV, alpha 1、及びDesmoglein 2からなる群である場合、得られた測定値レベルが、正常レベルよりも減少している場合、大腸癌の罹患を識別すべき対象となる個人が、大腸癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとすることができる。測定値レベルにおける減少の度合いとしては、正常レベルが測定値レベルの５０％以上、好ましくは１００％以上となる程度を目安にすると良い。
【００４３】
さらに、上記タンパク質のうち、Collagen, type XIV, alpha 1、及びDesmoglein 2については、正常組織（非癌組織）において特異的なタンパク質であるため、その不在が確認されれば、大腸癌の罹患を識別すべき対象となる個人が、大腸癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとすることができる。
【００４４】
上記タンパク質のレベルは、好ましくは、生体特異的親和性に基づく検査によって測定される。生体特異的親和性に基づく検査は当業者に良く知られた方法であり、特に限定されないが、イムノアッセイが好ましい。具体的には、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降法、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集測定、補体結合分析検定、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの、競合及び非競合アッセイ系を含むイムノアッセイが含まれる。イムノアッセイにおいては、個体の試料中の腫瘍マーカーに結合する抗体の存在を検出する。具体的には、アッセイ培地中において、測定すべき腫瘍マーカータンパク質及び当該タンパク質の抗体からなる免疫複合体を形成しうる条件のもと、試料を当該抗体に接触させることによって行われる。より具体的なイムノアッセイプロトコルは、当業者であれば容易に選択することができる。
【００４５】
上記タンパク質のレベルは、上記のように、生体特異的親和性に基づく検査によって測定されることが好ましいが、その他のタンパク質定量法によって測定することもできる。例えば、既に述べたＮＢＳ法は、定量性に優れた方法である。この場合、上記タンパク質を既知レベルで調製した試料や、正常試料などの適当な試料を対照試料として、対象となる個人の試料との間における前記タンパク質の存在量の差を調べることによって、測定を行うことができる。
【００４６】
本発明の方法は、本発明の腫瘍マーカーを単独で測定してもよいし、他のいかなる腫瘍マーカーと組み合わせて測定してもよい。従って、本発明の方法は、本発明の腫瘍マーカーのレベルと同様に他の腫瘍マーカーのレベルを測定することを含んでいてよい。
【００４７】
本発明の腫瘍マーカーは、大腸癌の検出、診断、モニタリング、ステージング及び予後判定を目的として用いられるとよい。好ましくは、腫瘍の動態の把握に用いられるとよい。例えば、腫瘍に対して化学療法や放射線療法が行われている場合、その治療がどれくらいの効果を奏しているかを判断することに用いられるとよい。また、腫瘍マーカー値が高い腫瘍に対して切除手術が行われた場合、術後の経過観察のために用いられるとよい。
【００４８】
＜薬剤組成物＞
本発明はまた、本発明の腫瘍マーカーのうち、大腸癌患者体内で、正常レベルに比べて発現量が多いタンパク質を含む腫瘍マーカーを用いることによって大腸癌を処理するための薬剤組成物に向けられる。
【００４９】
薬剤組成物の一形態は、癌細胞に対して供給することによって、癌細胞の死滅及び/又は癌細胞成長の抑制を促進する反応を誘発するための薬剤組成物であって、本発明の腫瘍マーカーに免疫特異的に結合する少なくとも１種の抗体を含む、薬剤組成物である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び、分子生物学的技術により調製した抗体を含む。ここで抗体とは、広く免疫特異的に結合する物質であればよく、抗体フラグメントや抗体融合タンパク質も用いられてよい。いずれの場合も、抗体の調製は、当業者に良く知られた方法によって行われる。
【００５０】
薬剤組成物の他の一形態は、免疫刺激量で、癌細胞に対して供給することによって、免疫応答を促進するための薬剤組成物であって、本発明の腫瘍マーカーを含む、薬剤組成物である。ここで、免疫刺激量とは、癌の処理のために所望する免疫反応を惹起することが可能な抗原の量をいい、当業者によって良く知られた方法で決定されるものである。この形態によると、いわゆる癌ワクチン療法として知られている、当業者に良く知られた方法を用いて癌の処理が行われる。
【００５１】
上記薬剤組成物は、上記抗体或いは腫瘍マーカーを有効成分として含み、薬剤として許容される希釈剤、担体、賦形剤などをさらに含んでよい。上記薬剤組成物は、大腸癌の処理に用いられる潜在的な治療剤として特定されうる。或いは、上記薬剤組成物は、大腸癌の処理に用いられる治療剤として適用されうる。
【実施例】
【００５２】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００５３】
［実施例１：ＮＢＳ法によるタンパク質発現解析］
大腸癌患者より正常組織（すなわち大腸粘膜上皮組織の非癌部）および癌組織（すなわち大腸粘膜上皮組織の癌部）を採取した。それぞれの組織を可溶化バッファーA(50 mM Tris-HCl(pH8.0),100 mM NaCl, 10 mM EDTA, プロテアーゼインヒビター(アプロチニン, PMSF, ロイペプシン)水溶液)中でホモジナイズし、100000×G (4℃, 1時間)で超遠心した後、その上澄み液を可溶性画分として得た。次に、遠心で得られた沈殿に可溶化バッファーB(9M ウレア、2w/v% CHAPS、10 mM EDTA、プロテアーゼインヒビター(アプロチニン, PMSF, ロイペプシン)水溶液))中で再度ホモジナイズし、100000×G (4℃, 1時間)で超遠心した後、その上澄み液を不溶性画分として得た。
【００５４】
これら可溶性、および不溶性画分の抽出蛋白質をそれぞれNBS試薬により処理を行い、蛋白質の発現解析を行った。NBS試薬処理に関しては、13C NBS Stable Isotope Labeling Kit-N(島津製作所)の推奨プロトコルに従い、安定同位体標識を行った。具体的には、正常組織から抽出された蛋白質を12CNBS(Light NBS)でラベル化し、癌組織から抽出された蛋白質を13CNBS(Heavy NBS)でラベル化した。得られたそれぞれのラベル化蛋白質を混合し、キットの推奨プロトコルに従い、脱塩・還元・アルキル化、およびトリプシン消化を行った。次に、同キットのプロトコルに従い、ラベル化ペプチドを濃縮した。濃縮したラベル化ペプチドに関しては、引き続いてC18カラムを用いたμHPLCによる分離を行い、MSプレートに塗布した。このようにして準備したサンプルに関して質量分析装置Axima-CFR plus(島津製作所製)を用いて測定し、各蛋白質の相対定量解析を行った。
【００５５】
ペアピークを示したペプチド断片についてタンデム質量分析装置Axima-QIT（島津製作所製）によってＭＳ/ＭＳ解析を行い、タンパク質の同定を行った。
【００５６】
このような手法により、最終的に臨床検体２４症例に対して同様の解析を行った。解析の結果、全検体数の５０％以上の検体において、癌組織におけるタンパク質の発現量が増加或いは減少しているタンパク質を同定した。増加或いは減少の度合いとしては、次の量を基準にした。すなわち、癌部において、非癌部におけるより存在量が増加したペプチドについては、癌部における存在量が、非癌部における存在量よりも５０％以上大きいもの（すなわち癌部における存在量が、非癌部における存在量の１５０％以上のもの）を選出した。また、癌部において、非癌部におけるより存在量が減少したペプチドについては、非癌部における存在量が、癌部における存在量よりも５０％以上大きいもの（癌部における存在量が、非癌部における存在量の６６％より少ないもの）を選出した。
【００５７】
その結果、下記表１〜表８に示すタンパク質を同定した。表中、「Mean」、「SEM」、及び「SD」は、それぞれ、各臨床検体において測定した相対比(%)(すなわち非癌部における蛋白質の発現量を100(%)とした時の癌部の発現量(比))の平均値、標準誤差、及び標準偏差値を示す。
【００５８】
表１〜表３は、非癌部におけるよりも、癌部におけるタンパク質の発現量が増加するタンパク質（Up-regulated proteins）のリストである。例えば、２４検体中１６検体において発現量が上昇した6-phosphogluconolactonase（発現量平均値：非癌部に対して約２．１６倍）などのタンパク質を同定した。表４は、癌部において特異的に検出された（All or None）タンパク質のリストである。表１〜表４における「150%≦」は、癌部における存在量が、非癌部における存在量の１５０％以上であった検体数を示す。
【００５９】
【表１】
2008014937.tif 000003
【００６０】
【表２】
2008014937.tif 000004
【００６１】
【表３】
2008014937.tif 000005
【００６２】
【表４】
2008014937.tif 000006
【００６３】
表５〜表７は、非癌部におけるよりも、癌部におけるタンパク質の発現量が減少するタンパク質（Down-regulated proteins）のリストである。例えば、２４検体中１５検体において発現量が減少するCarbonic Anhydrase Form B（発現量平均値：非癌部に対して０．１１倍）などのタンパク質を同定した。表８は、非癌部において特異的に検出された（All or None）タンパク質のリストである。表５〜表８における「<66%」は、癌部における存在量が、非癌部における存在量の６６％より少なかった検体数を示す。
【００６４】
【表５】
2008014937.tif 000007
【００６５】
【表６】
2008014937.tif 000008
【００６６】
【表７】
2008014937.tif 000009
【００６７】
【表８】
2008014937.tif 000010
【００６８】
下記実施例２及び３においては、上記ＮＢＳ法によって、非癌部におけるより癌部において増加を示したタンパク質のうち、ZYX（Zyxin）、RAN（RAN, member RAS oncogene family）、RCN1（Reticulocalbin）、AHCY（S-adenosylhomocysteine hydrolase）、SGALS1（Galectin1）、及びVIM（Vimentin）の６種のタンパク質について、生体組織のウェスタンブロッティング解析と生体組織の免疫組織化学染色によるバリデーション解析とを行った。
【００６９】
［実施例２：ウェスタンブロッティング解析］
大腸癌患者(5症例)より採取した正常組織（すなわち大腸粘膜上皮組織の非癌部）および癌組織（すなわち大腸粘膜上皮組織の癌部）を用意した。それぞれの組織を可溶化バッファーA(50 mM Tris-HCl(pH8.0),100 mM NaCl, 10 mM EDTA, プロテアーゼインヒビター(アプロチニン, PMSF, ロイペプシン)水溶液)中でホモジナイズし、100000×G (4℃, 1時間)で超遠心した後、その上澄み液を可溶性画分として得た。次に、遠心で得られた沈殿に可溶化バッファーB(9M ウレア、2 % CHAPS、10 mM EDTA、プロテアーゼインヒビター(アプロチニン, PMSF, ロイペプシン)水溶液))中で再度ホモジナイズし、100000×G (4℃, 1時間)で超遠心した後、その上澄み液を不溶性画分として得た。
【００７０】
これら蛋白質抽出溶液のうち、可溶性画分をpatient 1〜5の番号を付し、それぞれをZYX、RAN、RCN1、及びAHCYの解析に用い、不溶性画分をpatient 6〜10の番号を付し、それぞれSGALS1及びVIMの解析に用いた。
【００７１】
各抽出液は、12.5 % アクリルアミド (SGALS1の解析に用いるサンプルのみ15 %アクリルアミド) SDS-PAGEゲルにより分離し、その後、ニトロセルロース膜への転写を行った。転写されたサンプルに対して、各蛋白質に対する一次抗体(後述)をロードし、常温2時間インキュベーションした。反応後、ニトロセルロース膜をPBS(Phosphate Buffered Saline)バッファーにより洗浄後、二次抗体(後述)溶液を添加し、1時間反応させた。抗体と反応した後、ECL発色溶液を添加することによって各バンドを検出させた。
【００７２】
なお、本実施例で用いた抗体は以下の通りである。
一次抗体：
マウス抗ヒトZYXポリクローナル抗体 (抗体希釈率 1/500)
マウス抗ヒトRANモノクローナル抗体 (抗体希釈率 1/2000)
マウス抗ヒトAHCYポリクローナル抗体 (抗体希釈率 1/1000)
ウサギ抗ヒトRCN1モノクローナル抗体 (抗体希釈率 1/1000)
ウサギ抗ヒトSGAL1ポリクローナル抗体 (抗体希釈率 1/1000)
ウサギ抗ヒトVIMポリクローナル抗体 (抗体希釈率 1/1000)
【００７３】
二次抗体：
西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート-ヒツジ抗マウスIgG抗体 (抗体希釈率 1/400)
西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート-ロバ抗ウサギIgG抗体 (抗体希釈率 1/400)
【００７４】
図１は、上記のウェスタンブロッティングによって得られた電気泳動図を示す。図１中、Ｎは非癌部由来試料、Ｔは癌部由来試料であることを示す。
図１が示すように、6種類の各蛋白質ともに、5症例全ての癌部において発現が亢進していることが確認された。すなわち、上記実施例１に示すＮＢＳ法による定量結果において、非癌部におけるより癌部において発現亢進を示したタンパク質は、ウェスタンブロッティングによる定量結果においても、実際にそのような発現亢進を示していた。このように、ＮＢＳ法による定量結果と、ウェスタンブロッティングによる定量結果とは、良い相関を示している。従って、これらの分子が大腸癌に関連するタンパク質であることが確かに確認された。
【００７５】
このことから、ＮＢＳ法による定量結果において癌部より非癌部において発現増加を示したタンパク質、すなわち非癌部より癌部において発現抑制を示したタンパク質も同様に、ウェスタンブロッティングによる定量結果において、そのような発現傾向が示されることが容易に推定される。
【００７６】
［実施例３：免疫組織化学染色法による解析］
大腸癌患者(10症例)より採取した、正常組織（すなわち大腸粘膜上皮組織の非癌部）および癌組織（すなわち大腸粘膜上皮組織の癌部）それぞれのパラフィン包埋切片(4 μm)を用意した。抗体としては、上記ウェスタンブロッティング解析に用いたものと同様のものを用いた。
【００７７】
パラフィン切片と一次抗体とを一時間室温にて反応させ、PBSバッファーで洗浄後、さらにストレプトアビジン-ビオチンペルオキシダーゼコンプレックスと反応させた。最終的に、組織切片と発色溶液 (3,3’-ジアミノベンザイダインテトラヒドロクロリド、0.01% 過酸化ペルオキシダーゼ、 0.05 Mトリス水溶液(pH 7.6))とを3分間反応させることにより、組織染色を行った。その結果を、図２に示す。
【００７８】
図２において、(A)は、ZYX、(B)はRAN、(C)はRCN1、(D)はAHCY、(E)はSGALS1、及び(F)はVIMについての免疫組織化学染色結果を示し、Ｔは癌部における染色結果、Ｎは非癌部における染色結果を示す。
図２が示すように、全症例において、6種類の蛋白質の全てが、癌部における癌細胞(もしくは、癌細胞を取り巻く間質細胞)での蛋白質の発現が亢進していることを確認した。すなわち、上記実施例１に示すＮＢＳ法による定量結果において、非癌部におけるより癌部において発現亢進を示したタンパク質は、免疫組織化学染色法による解析結果においても、実際にそのような発現亢進を示していた。このように、ＮＢＳ法による定量結果と、免疫組織化学染色法による解析結果とは、良い相関を示している。従って、これらの分子が大腸癌に関連するタンパク質であることが確かに確認された。
【００７９】
このことから、ＮＢＳ法による定量結果において癌部より非癌部において発現増加を示したタンパク質、すなわち非癌部より癌部において発現抑制を示したタンパク質も同様に、免疫組織化学染色法による解析結果において、そのような発現傾向が示されることが容易に推定される。
【００８０】
以上のことから、請求の範囲第１項に記載のタンパク質は、非癌組織におけるよりも大腸癌組織においてより多く発現し、請求の範囲第３項に記載のタンパク質は、非癌組織におけるよりも大腸癌組織において少なく発現するものである。そして、これらのタンパク質は、大腸癌の腫瘍マーカーとして使用できることが明らかである。これらのタンパク質を大腸癌の腫瘍マーカーとし、大腸癌の罹患が不明な検体について、大腸癌の罹患の識別を行う際は、上記実施例１〜３に記載の手法を用いることができる。
【００８１】
上記実施例においては、本発明の範囲における具体的な形態について示したが、本発明は、これらに限定されることなく他のいろいろな形態で実施することができる。このため、上記実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、請求の範囲の均等範囲に属する変更は、すべて本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】本発明における大腸癌組織で発現が亢進するタンパク質(6種類)について、臨床検体（大腸癌患者の大腸粘膜上皮組織の癌部及び非癌部）でのウェスタンブロッティング解析結果を示す。
【図２】本発明における大腸癌組織で発現が亢進するタンパク質(6種類)について、臨床検体（大腸癌患者の大腸粘膜上皮組織の癌部及び非癌部）での免疫組織化学染色によるバリデーション解析結果を示す。
【図１】
2008014937.tif 000011
【図２】
2008014937.tif 000012