(57)【要約】【課題】ハイブリッドおよび新規のポリケチドシンターゼおよびポリケチドを産生すること。【解決手段】ハイブリッドおよび新規のポリケチドシンターゼおよびポリケチドが、多重ベクター系の使用によって産生される。別々のベクターにおけるPKS系の種々の触媒活性を置換することによって提供される組合せ確率は、PKSおよびポリケチドの改良されたライブラリーの構築を可能にする。さらに、ポリケチドは、所望のPKSのための発現系とともに、ホロACPシンターゼのための発現系を供給することによって、通常はポリケチドを産生しない宿主において産生され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載される、ポリケチドシンターゼ活性を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許法第１１９条の下で、暫定出願６０／０３３，１９３（１９９６年１２月１８日出願）からの優先権を請求する。この暫定出願の内容は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、酵母およびＥ．ｃｏｌｉのような微生物宿主におけるポリケチドの産生、および種々の機能的ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）および得られる種々のポリケチドを含むライブラリーの調製に関する。より詳細には、種々のＰＫＳ産物を作出するようにこれらの部分を混合しそして適合させる簡便性のために、別々のベクターにおけるポリケチドシンターゼ系の部分を供給することに関する。これは、単一産生系に集中した操作よりむしろ組合せアプローチを介する、ポリケチド合成物およびポリケチドのライブラリーの産生を可能にする。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
ポリケチドは、それらの一般的な生合成経路によって関連づけられる天然の産物の特に有用な群を代表する。代表的なメンバーとしては、マクロライド抗生物質（例えば、エリスロマイシン、スピラマイシン、およびタイロシン）、免疫抑制剤（例えば、ラパマイシンおよびＦＫ５０６）、駆虫薬（例えば、アベルメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ））、抗真菌剤（例えば、アンホテリシンＢおよびナイスタチン）、抗ガン剤（例えば、ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、および抗コレステロール剤（ａｎｔｉｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃｓ）（例えば、メビノリン（ｍｅｖｉｎｏｌｉｎ））が挙げられる。ポリケチドは、一般的に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ、およびＮｏｃａｒｄｉａを含む放線菌の二次代謝産物である。１９８６年において、微生物起源の約６，０００の抗生物質が特徴づけられており、そのうちの７０が、臨床的に使用されているいると見積もられた；さらなる１１００の代謝物が、１９８８〜１９９２年に報告され、その約４０％がポリケチドであった。
【０００４】
天然から入手可能なポリケチド構造の多様性にもかかわらず、目的の特定の標的に関連づけられるポリケチドを同定するためのスクリーニングのための好都合な基質が存在するように、利用可能なポリケチドのレパートリーを拡張し、およびライブラリーの形態で多様なポリケチドを合成する必要性が残っている。本発明は、このような必要性に対する解決策を提供する。
【０００５】
ポリケチドは、一般的に、脂肪酸合成に類似の様式において、２炭素単位の縮合によって合成される。一般的には、この合成は、開始単位および伸長単位を包含する；これらの「２炭素」単位は、アシルチオエステル、代表的には、アセチル、プロピニル、マロニル、またはメチルマロニル補酵素−Ａチオエステルに由来する。ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）の２つの主要なクラスが存在し、これらは、触媒部位が使用される「様式」−−いわゆる「芳香族」ＰＫＳおよびモジュール性ＰＫＳにおいて異なる。本発明は、本明細書中でさらに説明されるような両方のこれらのクラスからのコード配列を使用する。
【０００６】
異種機能的ＰＫＳ（すなわち、ポリケチドを産生し得るＰＫＳ）の組換え産生は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおいて達成されており、そして芳香族ＰＫＳのハイブリッド形態は、同様にこれらの宿主において産生されている。例えば、非特許文献１（Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．ら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９９３）１７５：２１９４−２２０４）；非特許文献２（Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１４：６４２−６４４）；非特許文献３（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９９２）１７４：６１８４−６１９０）を参照のこと。さらに、モジュール性ＰＫＳ酵素の組換え産生は、特許文献１（ＰＣＴ出願ＷＯ  ９５／０８５４８）に記載のように、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおいて達成されている。これらの全ての場合において、ＰＫＳ酵素は、単一のベクターから発現されている。ＰＫＳ触媒部位をコードする遺伝子を有する単一のベクターは、非特許文献４（Ｒｏｂｅｒｔｓ．Ｇ．Ａ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９３）２１４：３０５−３１１）によって、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換されたが、ＰＫＳは、機能的ではなかった。おそらく、アシルキャリアタンパク質のパントテン化（ｐａｎｔｏｔｈｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）の欠失に起因する。
【０００７】
本発明は、種々の宿主におけるＰＫＳの産生のための二重ベクターまたは多重ベクター系、および得られるポリケチドを提供する。多重ベクターの使用は、調製され得るＰＫＳおよびポリケチドの組合せ形態の数を増強するためのより効率的な手段を提供する。アシルキャリアタンパク質（すなわち、ホロＡＣＰシンターゼ）のパントテン化のための機構の付加は、広範な宿主におけるポリケチドの産生を可能にする。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ  ９５／０８５４８号パンフレット
【非特許文献１】Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．ら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９９３）１７５：２１９４−２２０４
【非特許文献２】Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１４：６４２−６４４
【非特許文献３】Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９９２）１７４：６１８４−６１９０
【非特許文献４】Ｒｏｂｅｒｔｓ．Ｇ．Ａ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９３）２１４：３０５−３１１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の開示
本発明は、広範な宿主におけるポリケチドの産生およびＰＫＳ酵素のライブラリーの産生のための組換え材料、ならびに多重ベクター系に基づいて得られるポリケチドに関する。多重ベクター系の使用は、組合せライブラリーの構築を容易にし、そしてその種々のメンバーの設計において、より大きな柔軟性を可能にする。本発明はまた、ポリケチド応答性レセプターに関する自己分泌系に起因して本質的に自己スクリーニングされるこのようなライブラリーに関する。
【０００９】
従って、１つの局面において、本発明は、組換え宿主細胞およびそのライブラリーに関し、宿主細胞が少なくとも２つのベクターを含むように改変される場合、第１ベクターは、第１選択マーカーおよび第１発現系を含み、そして第２ベクターは、第２選択マーカーおよび第２発現系を含み、そして必要に応じて、さらなるベクターは、さらなる選択マーカーおよび発現系を含み、ここでこれらの発現系は、少なくとも最低限のＰＫＳ系をコードしそして産生し得るベクターに含まれる。最低限のＰＫＳ系が芳香族系である場合、この最低限の系は、ケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（ＫＳ／ＡＴ）触媒領域、鎖長因子（ＣＬＦ）触媒領域、およびアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）活性を含む。最低限のＰＫＳ系が、モジュール系である場合、この系は、少なくともＫＳ触媒領域、ＡＴ触媒領域、およびＡＣＰ活性を含む。モジュール系について、これらの活性は、合成における中間体が基質として提供された場合、十分である；新規合成経路が要求される場合、ロードするアシルトランスフェラーゼが含まれるべきであり、これは、別のＡＴおよびＡＣＰ領域を含む。
【００１０】
本発明のこの局面の１つの特定の実施態様において、組換え宿主細胞は、以下を含むように改変される：（ａ）第１選択マーカー、およびこの細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結された芳香族ＰＫＳのケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（ＫＳ／ＡＴ）触媒領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含む第１ベクター；（ｂ）第２選択マーカー、およびこの細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結された鎖長因子（ＣＬＦ）触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含む第２ベクター；ならびに（ｃ）第３選択マーカー、およびこの細胞において作動可能なプロモーターおよびこのような細胞のコロニーから構成されるライブラリーに作動可能に連結されたアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）活性をコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含む第３ベクター。あるいは、ベクターの２つが、宿主細胞が２つのベクターのみを含むように組み合わせられ得る；２つの発現系を含むベクターが、これらを別々の発現系として維持し得るか、または２つのオープンリーディングフレームが、単一のプロモーターの制御下に配置され得る。
【００１１】
別の特定の実施態様において、本発明は、第１選択マーカー、およびこの細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたモジュール性ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）の少なくとも１つの最低限のモジュールのための発現系を含む第１ベクター；ならびに第２選択マーカー、およびこの細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたモジュール性ポリケチドシンターゼの少なくとも１つの最低限の第２モジュールをコードするヌクレオチド配列を含む第２ベクター、を含むように改変された細胞、ならびにこのような細胞のコロニーを含むライブラリーに関する。
【００１２】
別の変更において、ＰＫＳ系の規定された部分のための１つ以上の発現系は、宿主染色体に組み込まれ、そして少なくとも１つのさらなる発現系は、複製可能ベクターに存在する。従って、芳香族ＰＫＳの場合において、オープンリーディングフレームの１つのための発現系は、最初に、染色体に取り込まれ得、そしてその他のオープンリーディングフレームのための発現系は、ベクターに存在し得る。モジュール性ＰＫＳの場合において、１つ以上のモジュールのための発現系は、染色体上に存在し、そして１つ以上のモジュールのためのさらなる発現系は、ベクター上に存在する。このような発現系の染色体への組み込みは、公知のファージ媒介性組み込みを介して、または相同組換えによってかのいずれかで生じ得る。
【００１３】
本発明はまた、本発明の方法によって産生される新規のポリケチド、および得られるポリケチドライブラリーをスクリーニングする方法に関する。
【００１４】
なおさらなる局面において、本発明は、アシルキャリアタンパク質の活性化のための機構を欠失する（すなわち、ホロＡＣＰシンターゼを欠失する）宿主において、ポリケチドの合成を得るための方法に関する。別々のベクター（多重ベクター系におけるベクターの１つ（または、ＰＫＳ発現のための単一ベクター））において、またはＰＫＳもしくはその部分との融合タンパク質としてのいずれかに適合するホロＡＣＰシンターゼのための発現系を供給することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、および通例ではポリケチドを合成しない他の微生物のような宿主は、簡便な宿主へとされ得る。このことは、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのポリケチド産生株から供給される「清潔な」宿主の必要性を取り除く。
【００１５】
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
項目１．非改変形態において、ポリケチドを産生しない、改変された組換え宿主細胞であって、該細胞が、最低限のポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）のための発現系、およびホロＡＣＰシンターゼのための発現系を含むように改変され、
該最低限のＰＫＳが、ケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（ＫＳ／ＡＴ）触媒領域、鎖長因子（ＣＬＦ）触媒領域、および芳香族ＰＫＳに対するアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）活性を含むか：あるいは
該最低限のＰＫＳが、ＫＳ触媒領域、ＡＴ触媒領域、およびモジュール性ＰＫＳまたは真菌ＰＫＳに対するＡＣＰ活性を含む、
改変された組換え宿主細胞。
【００１６】
項目２．Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母である、項目１に記載の改変された細胞。
【００１７】
項目３．前記ＰＫＳが、６−メチルサリチル酸についてのシンターゼである、項目１に記載の改変された細胞。
【００１８】
項目４．前記ホロＡＣＰシンターゼをコードするヌクレオチド配列および前記最低限のＰＫＳの部分の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列が、融合タンパク質をコードするように融合される、項目１に記載の改変された細胞。
【００１９】
項目５．前記最低限のＰＫＳのための発現系および前記ホロＡＣＰシンターゼのための発現系が、別々のベクターに存在する、項目１に記載の改変された細胞。
【００２０】
項目６．前記発現系の少なくとも１つが、宿主細胞染色体に組み込まれる、項目１に記載の改変された細胞。
【００２１】
項目７．ポリケチドを産生するための方法であって、前記発現系がコードタンパク質を産生し、そして該ポリケチドが合成される条件下で項目１の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【００２２】
項目８．以下：
ａ）少なくとも２つのベクターであって、該第１ベクターが、第１選択マーカーおよび第１発現系を含み、そして該第２ベクターが、第２選択マーカーおよび第２発現系を含み、そして必要に応じてさらなるベクターが、さらなる選択マーカーおよび発現系を含み、該ベクターにおいて含まれる発現系が、少なくとも１つの最低限のポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）を産生するのに有効である、少なくとも２つのベクター；または
ｂ）少なくとも１つのベクターおよび改変された染色体であって、該１つのベクターが、第１選択マーカーおよび第１発現系を含み、そして該改変された染色体が、第２発現系を含み、そして必要に応じてさらなるベクターが、さらなる選択マーカーおよび発現系を含み、該ベクターにおいて含まれる発現系が、該染色体上の該発現系と組み合わせて、少なくとも最低限のポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）を産生するのに有効である、少なくとも１つのベクターおよび改変された染色体
のいずれかを含むように改変された、組換え宿主細胞であって、
該最低限のＰＫＳは、ケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（ＫＳ／ＡＴ）触媒領域、鎖長因子（ＣＬＦ）触媒領域、および芳香族ＰＫＳについてのアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）活性を含むか：あるいは
該最低限のＰＫＳは、ＫＳ触媒領域、ＡＴ触媒領域、およびモジュール性ＰＫＳまたは真菌ＰＫＳについてのＡＣＰ活性を含む、
組換え宿主細胞。
【００２３】
項目９．酵母細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、放線菌、または植物細胞である、項目８に記載の細胞。
【００２４】
項目１０．機能的ポリケチドについての細胞ベースの検出系のための発現系をさらに含む、項目８に記載の細胞。
【００２５】
項目１１．少なくとも最低限の芳香族ＰＫＳを産生する、項目８に記載の細胞であって：
（ａ）第１選択マーカー、および該細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたＫＳ／ＡＴ触媒領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含む第１ベクター；
（ｂ）第２選択マーカー、および該細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたＣＬＦ触媒領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含む第２ベクター；ならびに
（ｃ）第３選択マーカー、および該細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたＡＣＰ活性をコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含む第３ベクター、
を含む細胞。
【００２６】
項目１２．少なくとも１つの最低限のモジュール性ＰＫＳを産生する、項目８に記載の細胞であって：
（ａ）第１選択マーカー、および該細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）の少なくとも１つのモジュールのための発現系を含む第１ベクター；ならびに
（ｂ）第２選択マーカー、および該細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリケチドシンターゼの第２モジュールを少なくともコードするヌクレオチド配列を含む第２ベクター、
を含む、細胞。
【００２７】
項目１３．前記第１モジュールおよび第２モジュールが、異なるポリケチドシンターゼに由来する、項目１２に記載の細胞。
【００２８】
項目１４．前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、ＫＲ活性をコードするヌクレオチド配列をさらに含むか；または
前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、ＫＲおよびＤＨ活性をコードするか；または
前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、ＫＲ活性、ＤＨ活性、およびＥＲ活性をコードし；ならびに／または
前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、チオエステラーゼ（ＴＥ）活性をコードする、
項目１３に記載の細胞。
【００２９】
項目１５．ポリケチドを産生するための方法であって、該発現系がコードタンパク質を産生しそして該ポリケチドが合成される条件下で、項目８の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【００３０】
項目１６．ホロＡＣＰシンターゼのための組換え発現系を含むようにさらに改変されている、項目８の細胞。
【００３１】
項目１７．ポリケチドを産生するための方法であって、該発現系がコードタンパク質  を産生しそして該ポリケチドが合成される条件下で、項目１６の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【００３２】
項目１８．個々のコロニーのパネルを含むポリケチドシンターゼＰＫＳまたは合成されたポリケチドのライブラリーであって、各コロニーが、以下：
ａ）少なくとも２つのベクターであって、該第１ベクターは、第１選択マーカーおよび第１発現系を含み、そして該第２ベクターは、第２選択マーカーおよび第２発現系を含み、そして必要に応じてさらなるベクターは、さらなる選択マーカーおよび発現系を含み、該ベクターにおいて含まれる発現系は、少なくとも最低限のポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）を産生するのに有効である、少なくとも２つのベクター；あるいは
ｂ）少なくとも１つのベクターおよび改変された染色体であって、該１つのベクターは、第１選択マーカーおよび第１発現系を含み、そして該改変された染色体は、第２発現系を含み、そして必要に応じてさらなるベクターは、さらなる選択マーカーおよび発現系を含み該ベクターにおいて含まれる発現系が、該染色体上の該発現系と組み合わせて、少なくとも最低限のポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）を産生するのに有効である、少なくとも１つのベクターおよび改変された染色体、
のいずれかを含み、
該最低限のＰＫＳが、ケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（ＫＳ／ＡＴ）触媒領域、鎖長因子（ＣＬＦ）触媒領域、および芳香族ＰＫＳについてのアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）活性を含み：ならびに
該最低限のＰＫＳが、ＫＳ触媒領域、ＡＴ触媒領域、およびモジュール性ＰＫＳまたは真菌ＰＫＳについてのＡＣＰ活性を含み、
ここで、ベクターの組合せ、またはベクターと改変された染色体との該組合せが、各コロニーにおいて異なる、ライブラリー。
【００３３】
項目１９．前記コロニーが、酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、放線菌、または植物細胞のコロニーである、項目１８に記載のライブラリー。
【００３４】
項目２０．前記各コロニーが、さらに、機能的ポリケチドについての細胞ベースの検出系のための発現系を含む、項目１８に記載のライブラリー。
【００３５】
項目２１．前記ＰＫＳが芳香族ＰＫＳであり、そして各コロニーが：
（ａ）第１選択マーカー、および前記細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結するＫＳ／ＡＴ触媒領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含む第１ベクター；
（ｂ）第２選択マーカー、および前記細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたＣＬＦ触媒領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含む第２ベクター；
（ｃ）第３選択マーカー、および前記細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたＡＣＰ活性をコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含む第３ベクター；
を含み、
ここで該第１、第２、および第３ベクターの組合せが各コロニーにおいて異なる、項目１８に記載のライブラリー。
【００３６】
項目２２．前記ＰＫＳがモジュール性ＰＫＳであり、ここで各コロニーが、
第１選択マーカー、および前記細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されるＰＫＳの少なくとも１つのモジュールのための発現を含む第１ベクター；ならびに
第２選択マーカー、および前記細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリケチドシンターゼの第２モジュールを少なくともコードするヌクレオチド配列を含む第２ベクター、
を含み、
ここで該第１、および第２ベクターの組合せが各コロニーにおいて異なる、項目１８に記載のライブラリー。
【００３７】
項目２３．前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、ＫＲ活性をコードするヌクレオチド配列をさらに含むか；または
前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、ＫＲおよびＤＨ活性をコードするか；または
前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、ＫＲ、ＤＨ、およびＥＲ活性をコードし；および／または
前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、チオエステラーゼ（ＴＥ）活性をコードする、項目２２に記載のライブラリー。
【００３８】
項目２４．前記各コロニーが、ホロＡＣＰシンターゼのための組換え発現系をさらに含む、項目１８に記載のライブラリー。
【００３９】
項目２５．ポリケチドのライブラリーを産生するための方法であって、前記発現系がコードタンパク質を産生しそして前記ポリケチドが合成される条件下で、項目１８に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【００４０】
項目２６．ポリケチドのライブラリーを産生するための方法であって、前記発現系がコードタンパク質を産生しそして前記ポリケチドが合成される条件下で、項目２４に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【００４１】
項目２７．標的レセプターに結合するポリケチドを同定するための方法であって、該レセプターへの結合が検出され得る条件下で、該レセプターを項目１８に記載のライブラリーの各メンバーと接触させる工程；および
各メンバーに関する該レセプターへの結合の存在または非存在を検出し、それによりレセプターに結合するメンバーが同定される工程、
を包含する、方法。
【００４２】
項目２８．標的レセプターに結合するポリケチドを同定するための方法であって、該レセプターへの結合が検出され得る条件下で、該レセプターを項目２４に記載のライブラリーの各メンバーと接触させる工程；および
各メンバーに関する該レセプターへの結合の存在または非存在を検出し、それによりレセプターに結合するメンバーが同定される工程、
を包含する、方法。
【００４３】
項目２９．細胞ベースの検出系において機能的なポリケチドを同定するための方法であって、該細胞ベースの検出系のシグナルの存在または非存在について、項目１８に記載のライブラリーの各メンバーを評価し、それにより機能的ポリケチドが同定される工程を包含する、方法。
【００４４】
項目３０．酵母における発現に適応させたベクターであって、酵母において作動可能な選択マーカー、および酵母において作動可能なプロモーターに作動可能に連結される少なくとも１つの機能的ポリケチドシンターゼ触媒活性のコード領域を含む発現系、を含むベクター。
【００４５】
項目３１．項目３０に記載のベクターを含むように改変された酵母細胞。
【００４６】
項目３２．ホロＡＣＰシンターゼのための組換え発現系をさらに含む、項目３１に記載の酵母細胞。
【００４７】
項目３３．ポリケチドシンターゼ活性を産生する方法であって、発現が支持される条件下で、項目３１に記載の酵母細胞を培養する工程を包含する、方法。
【００４８】
項目３４．ポリケチドシンターゼ活性を産生する方法であって、発現が支持される条件下で、項目３２に記載の酵母細胞を培養する工程を包含する、方法。
【００４９】
項目３５．Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に適応させたベクターであって、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて作動可能な選択マーカー、およびＥ．ｃｏｌｉにおいて作動可能なプロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つの機能的ポリケチドシンターゼ触媒活性のコード領域を含む発現系、を含むベクター。
【００５０】
項目３６．項目３５のベクターを含むように改変されたＥ．ｃｏｌｉ細胞。
【００５１】
項目３７．ホロＡＣＰシンターゼのための組換え発現系をさらに含む、項目３６に記載のＥ．ｃｏｌｉ細胞。
【００５２】
項目３８．ポリケチドシンターゼ活性を産生する方法であって、発現が支持される条件下で、項目３６に記載のＥ．ｃｏｌｉ細胞を培養する工程を包含する、方法。
【００５３】
項目３９．ポリケチドシンターゼ活性を産生する方法であって、発現が支持される条件下で、項目３７に記載のＥ．ｃｏｌｉ細胞を培養する工程を包含する、方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
発明を実施する態様
本発明は、種々の局面において、芳香族、ＰＫＳ系、モジュール性ＰＫＳ系、真菌ＰＫＳ系、もしくはその改変形態の種々の成分またはこれらの１つより多い部分を使用する。芳香族、モジュール性、および真菌ＰＫＳ系の一般的な特徴を、それぞれ、図１，２、および３に示す。
「芳香族」ＰＫＳ系は、産生されたいくつかの酵素における触媒部位の反復使用によって特徴づけられる。従って、芳香族ＰＫＳにおいて、特定の型の活性を有する１つの酵素のみが産生されて、ポリケチドの合成を通じて、系のための関連活性を触媒する。芳香族ＰＫＳにおいて、最低限のＰＫＳの酵素は、３つのオープンリーディングフレームにおいてコードされる。図１に示すように、アクチノロジン（ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）ＰＫＳは、６つの別々のＯＲＦにおいてコードされる。最低限のＰＫＳについて、１つのＯＲＦは、ケトシンターゼ（ＫＳ）およびアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）を含む；第二のＯＲＦは、鎖長因子（ＣＬＦ）であると考えられるものを含む；そして三番目のリーディングフレームは、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）をコードする。さらなるＯＲＦは、アロマターゼ（ＡＲＯ）、シクラーゼ（ＣＹＣ）、およびケトレダクターゼ（ＫＲ）をコードする。ＫＳ／ＡＴ、ＡＣＰ、およびＣＬＦの組合せは、最低限のＰＫＳを構成する。なぜなら、これらの要素が２炭素単位の単縮合に必要であるからである。
【００５５】
対照的に、ｇｒｉｓ  ＰＫＳは、５つの別々のＯＲＦを含み、ここで、ＫＳ／ＡＴ、ＣＬＦ、およびＡＣＰは、３つのＯＲＦ上にあり、ＫＲは四番目上にあり、そしてＡＲＯは５番目上にある。
【００５６】
「モジュール性」ＰＫＳ系において、各触媒部位は、一回のみ使用され、そしてＰＫＳ全体は、一連の「モジュール」としてコードされる。従って、モジュール性シンターゼタンパク質は、複数の触媒部位を含み、これらは同じ型の触媒活性を有する。最低限のモジュールは、少なくともＫＳ、ＡＴ、およびＡＣＰを含む。必要に応じて、さらなる活性は、ＫＲ、ＤＨ、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）およびチオエステラーゼ（ＴＥ）活性を含む。図２は、抗生物質エリスロマイシンについての中間体前駆体６−ｄＥＢの合成のためのモジュール性ＰＫＳ系の構成を図で示す。示すように、呼び出し（ｌｏａｄｉｎｇ）領域に続いて６つのモジュールが存在する；モジュール６上のチオエステラーゼは、ホスホパントテニル基を介して結合するシンターゼからの、完全な６−デオキシエリスロノリドＢ（６−ｄＥＢ）の遊離をもたらす。図は、６−ｄｅＢの進行性形成を示す。これは、シンターゼのモジュール６上のホロＡＣＰからの除去の後に環化される。エリスロマイシンＡに６−ｄｅＢを変換するために、２つの糖残基は、続く反応において３位および５位でのヒドロキシル基を介して付加される。
【００５７】
６−メチルサリチル酸シンターゼ（６−ＭＳＡＳ）をコードする「真菌」ＰＫＳは、芳香族ＰＫＳおよびモジュール性ＰＫＳの両方にいくらか類似点を有する。それは、ＫＳ、ＡＴ、デヒドラターゼ（ＤＨ）、ＫＲ、およびＡＣＰのための１つのリーディングフレームのみを有する。従って、モジュール性ＰＫＳの単一モジュールに類似するようにみえる。しかし、これらの部位は、反復使用される。芳香族ＰＫＳとは異なり、図３に示すように、それはＣＬＦを含まない。
【００５８】
本発明は、本明細書において、芳香族ＰＫＳ系、モジュール性ＰＫＳ系、および真菌ＰＫＳ系の全てに関与する触媒活性についての発現系を使用する。産生されるタンパク質は、天然のアミノ酸配列を含み得、従って、天然形態またはこれらのタンパク質の改変形態の基質特異性および活性は、所望の触媒活性が維持される限り、使用され得る。しかし、この活性の特異性および効率は、天然形態のそれらとは異なり得る。しかし、天然系に存在する特定の活性は、意図的に欠失され得る。さらに、種々の芳香族系の成分は、混合および一致され得、ならびにモジュール系の種々のモジュールの成分も混合および一致され得る。ＰＣＴ出願ＷＯ  ９５／０８５４８（上記に参照され、そして本明細書中で参考として援用される）は、例えば、アクチノロジンのオープンリーディングフレームが、別の芳香族系からのオープンリーディングフレームを有する発現ベクターに含まれる、ハイブリッド芳香族ＰＫＳ系の構築を記載する。
【００５９】
ＰＫＳタンパク質単独についての発現系は、組換え宿主がまた、アシルキャリアタンパク質のパントテン化をもたらすホロＡＣＰシンターゼ活性をも含む限りは、ポリケチドの実際の産生に十分であり得ない。この活性化工程は、開始単位である「２Ｃ」単位または完成したポリケチドを生じる一連のクライゼン縮合において成長するポリケチドを「拾い出す」ＡＣＰの能力に必要である。ホロＡＣＰシンターゼとして挙動するホスホパントテン化酵素を欠失する宿主について、本発明は、この酵素のための適切な発現系を供給することによって、この活性を付与するための手段を提供する。ホロＡＣＰシンターゼについての発現系は、ＰＫＳ単位を有するものとは別のベクターに供給され得るか、または同じベクターに供給され得るか、または宿主の染色体に組み込まれ得るか、またはポリケチドシンターゼの全てまたは部分との融合タンパク質のための発現系として供給され得る。一般的には、脂肪酸合成に関連するホロＡＣＰシンターゼは、適切ではない；むしろ、ポリケチド合成または非リボソームタンパク質の合成に特異的に関連するシンターゼが、この点に関して有用である。
【００６０】
詳細には、モジュール性および真菌ＰＫＳ系は、Ｅ．ｃｏｌｉに生来のホスホパントテン化酵素によって影響されるホスホパントテン化によって活性化されない；しかし、Ｂａｃｉｌｌｕｓに由来する酵素、特にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓのグラミシジンホロＡＣＰシンターゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓからのサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）関連ホロＡＣＰシンターゼは、基質として、モジュール性および真菌ＰＫＳ  ＡＣＰドメインを利用し得る。以下の実施例に示されるように、適切なホロＡＣＰシンターゼのための発現系の封入は、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母において真菌またはモジュール性ＰＫＳをコードする遺伝子の発現だけを必要としないが、このような発現系の封入は、ポリケチドが産生された酵素によって産生される場合、必要である。
【００６１】
いくつかの組換え宿主において、抗生物質活性を有するポリケチドが所望される場合、合成後の改変を介して産生されるポリケチドを活性化する必要もあり得ることに注意されるべきである。これが、特定の宿主のための場合である場合、宿主は、例えば、形質転換によって改変されて、これらの改変に影響に影響を与えるのに必要な酵素を含むようになる。このような酵素は、例えば、グリコシル化酵素である。
【００６２】
芳香族ＰＫＳ系の合成についての組合せの確率は、反復使用される部位の性質、および最終産物のための合成機構を示すクライゼン縮合に必要な最低限のＰＫＳ系の一部ではない随意の活性の存在または非存在に依存する。従って、芳香族ＰＫシンターゼは、ＫＳ／ＡＴ、ＡＣＰ、およびＣＬＦを含まなければならないが、他の触媒活性（すなわち、ＫＲ、ＡＲＯ、およびＣＹＣ）は随意である。真菌ＰＫシンターゼは、モジュール性ＰＫＳ系と同様に、ＫＳ、ＡＴ、およびＡＣＰ機能性のみを必要とする。種々の供給源からのこれらの活性の種々の組合せ、および変異形態が、使用され得る。
【００６３】
触媒部位は、モジュール性ＰＫＳ系において一回のみ使用されるので、この型のシンターゼにおける組合せ確率はより大きい。モジュール性ＰＫＳの組合せ能力は、以下によって与えられる：ＡＴＬ×（ＡＴＥ×４）Ｍ、ここでＡＴＬは、ローディングアシルトランスフェラーゼの数であり、ＡＴＥは、伸長アシルトランスフェラーゼの数であり、そしてＭは、遺伝子クラスターにおけるモジュールの数である。数４は、これが、ケト基が以下のいずれか：１）反応なし；２）ＫＲ活性単独；３）ＫＲ＋ＤＨ活性；または４）ＫＲ＋ＤＨ＋ＥＲ活性、によって改変され得る方法の数を示すので式中に存在する。エリスロマイシンＰＫＳの最初の２つのモジュールのみの発現が、予測した短縮化トリケト産物の産生を生じることが示されている。Ｋａｏら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ（１９９４）１１６：１１６１２−１１６１３を参照のこと。メチマイシンアグリコンに類似の新規な１２員環マクロライドは、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒにおいて、このＰＫＳのモジュール１〜５の発現によって産生された。Ｋａｏ  Ｃ．ら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ（１９９５）１１７：９１０５−９１０６を参照のこと。この研究、ならびにＣｏｒｔｅｓ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２６８：１４８７−１４８９の研究は、ＰＫＥモジュールは機能的に独立しており、その結果、ラクトン環サイズは、存在するモジュールの数によって制御され得ることを示す。
【００６４】
モジュールの数の制御に加えて、モジュールは、例えば、Ｄｏｎａｄｉｏ，Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５２：６７５−６７９；Ｄｏｎａｄｉｏ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ（１９９２）１１５：９７−１０３に記載されるように、ケトレダクターゼドメインの欠失によって遺伝子的に改変される。さらに、エノイルレダクターゼドメインの変異は、Ｄｏｎａｄｉｏ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：７１１９−７１２３によって報告された。これらの改変もまた、改変ＰＫＳ、従って改変ポリケチドを生じた。
【００６５】
上記のように、天然に見いだされる芳香族、真菌の、またはモジュール性ＰＫＳ系に由来する触媒活性のコード配列は、それらの天然の形態において使用され得るか、または標準的な変異誘発技術によって改変されて、活性を欠失または減少し得るか、本来は存在しないモジュールに活性を導入し得る。例えば、ＫＲ活性は、この機能を通常欠くモジュールに導入される。
【００６６】
上記に示されるように、当該分野では、単一の発現ベクターから、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおいて、ハイブリッドのおよび／または別の芳香族もしくはモジュール性ＰＫＳ系の構築による、いくつかの新規なポリケチドの産生に成功しているが、一般的に広範な種々のシンターゼを産生するための宿主細胞において、多重ベクター系を用いる利点は得られていない。「多重」とは、２つ以上を意味し；「ベクター」は宿主系を形質転換するために使用され得、そして選択マーカー、および発現系を調節するプロモーターおよび任意の他の配列の制御下でコード配列を含む非依存性発現系の両方を含む核酸分子を意味する。代表的なこのようなベクターはプラスミドであるが、ファージミド、コスミド、ウイルスベクターなどのような他のベクターもまた、宿主の性質に従って使用され得る。
【００６７】
もちろん、１つ以上の別のベクターは、関連発現系の宿主の染色体への取り込みを生じ得る。
【００６８】
一般的に、Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母のような微生物宿主は、どちらも、ポリケチドを構築するために首尾良く使用されていない。このことは、本発明の方法に従って、これらの宿主に補充され得るホロＡＣＰシンターゼの欠失に起因すると考えられる。
【００６９】
従って、本発明のポリケチドを産生するために、適切な宿主が改変されて、ベクター（代表的には、プラスミド）を含むようになり、これは、ＰＫＳに関連する１つ以上の活性を有するタンパク質の産生のための発現系を含む。異なる発現ベクターに対して種々の活性を配することによって、高い程度の多様性が達成され得る。種々の宿主が使用され得る：選択マーカーが分割されて多重ベクターの取り込みを確実にし得る任意の適切な宿主細胞は、容易に使用され得る。好ましい宿主としては、なぜ哺乳動物細胞または昆虫細胞または他の適切な組換え宿主が使用され得ないかの理論的な理由はないが、酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、放線菌、および植物細胞が挙げられる。好ましい酵母株は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである。好ましい糸状菌としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの種々の株が挙げられる。
【００７０】
もちろん、宿主の選択は、発現系に関連する制御配列ならびに選択マーカーの選択に影響する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける使用のための適切なプロモーター系としては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、およびλ誘導ＰＬプロモーター、およびＮ−遺伝子リボソーム結合部位が挙げられる。酵母のための適切な制御配列としては、糖化酵素（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ）の合成のためのプロモーターが挙げられる。他のプロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ−１およびＡＤＨ−２）、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、およびマルトースおよびグルコース利用を担う酵素のためのものが挙げられる。終結配列は、コード配列の３’末端で所望され得るとも考えられる。
【００７１】
哺乳動物細胞、放線菌、植物細胞、昆虫細胞などにおける使用に適切なプロモーターもまた、当該分野で周知である。
【００７２】
Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌および放線菌における使用に適切な選択マーカーは、一般的に、抗生物質耐性を与える；酵母における使用のためのものは、しばしば、栄養性要求を補う。酵母における使用のための選択マーカーとしては、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２−ｄ、ＴＲＰ１、ＬＹＳ２、ＨＩＳ１、ＨＩＳ３が挙げられるがこれらに制限されない。放線菌における使用のための選択マーカーとしては、チオストレプトン、アプラマイシン、ハイグロマイシン、およびエリスロマイシン耐性のためのものが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７３】
ベクターの構築、宿主細胞の形質転換、および首尾良い形質転換体のための選択のための方法および材料は、当該分野で十分理解される。
【００７４】
従って、本発明の１つの実施態様に従って、単一の宿主細胞が改変されて、多重ベクターを含むようになり、各ベクターはＰＫＳ系の合成の部分に寄与する。芳香族ＰＫＳ系の産生のための多重ベクターを構築することにおいて、図１に示されるもののような別々のリーディングフレームが、別々のベクターに取り込まれ得るか、適切に構築される場合、リーディングフレームの部分は、１つより多いベクターの間に分布し、各々は、発現の制御に影響するための適切な配列を有し得る。モジュール性のための、単一のモジュールまたは１つより多いモジュールは、単一のベクターにおける発現系の一部として存在し得る；多重ベクターが、細胞を改変して所望のＰＫＳ系全体を含むようにするために使用される。
【００７５】
上記のように、宿主に導入される１つ以上の発現系が、染色体に取り込まれ得る。
【００７６】
従って、本発明のライブラリーを調製するために、適切な宿主細胞が、所望の数のベクターで形質転換される；改変の一部として所望される各ベクターにおける異なる選択マーカーを用いることにより、全ての所望のベクターの封入によって改変される首尾良い形質転換体が選択され得る。ＰＫＳシンターゼの部分のための複数の発現系を含む第１選択マーカーとの第１ベクターの混合物、およびＰＫＳ系の種々の第２部分のための発現系との第２のベクターの混合物などを用いることにより、「ハイブリッド」ＰＫＳ系の組合せ提示を有する首尾良い形質転換体のコロニーが得られる。このような首尾良い形質転換体の個々のコロニーのパネルを調製することによって、ＰＫＳ系のライブラリーが得られ、それによりポリケチドのライブラリーが得られる。ホロＡＣＰシンターゼのための発現系もまた、必要ならば供給される。ポリケチドは、宿主の性質に依存して、グリコシル化され得る。
【００７７】
このアプローチはまた、１つ以上の多重ベクターの適切な部分の、宿主細胞の染色体への取り込みに影響することによって改変され得る。取り込みは、適切なファージベクターを用いて、または相同組換えによって影響され得る。相同組換えが使用される場合、取り込みはまた、上記のＰＣＴ出願ＷＯ  ９５／０８４５８に記載のように、染色体に本来存在する内因性ＰＫＳ活性を欠失し得る。これらの実施態様においてまた、ハイグロマイシンまたはチオストレプトン耐性のような選択マーカーは、取り込みに影響するベクターに含まれ得る。
【００７８】
次いで、ポリケチドライブラリーは、任意のポリケチド応答性標的に関して、活性化するかまたは他の様式で標的に結合する特定のポリケチドメンバーを同定するために、活性についてスクリーニングされ得る。このようなスクリーニング方法は、当該分野で標準的である。
【００７９】
本発明の特定の好ましい実施態様において、ライブラリーは、ポリケチド自体を産生する宿主細胞内または表面で提示されるポリケチド応答性レセプターを導入することによって自己スクリーニングされ得る。この「自己分泌」系は、レセプターを活性化するものについて自己選択するコロニーを可能にする。このような系は、例えば、Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．およびＴｈｏｒｎｅｒ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８４：Ｓｕｐｐ．７：１４−１６による文献に記載される。
【００８０】
自己分泌系は、レセプターに限定されないが、細胞の内部に発現されるタンパク質を含み得、そしてその相互作用は、産生されるポリケチドに関して、米国特許第第５，２８３，１７３号においてＦｉｅｌｄｓによって記載される酵母２ハイブリッド系に類似の様式において評価され得る。
【００８１】
従って、細胞は改変されて、「ポリケチド機能についての細胞ベースの検出系」が作製される。ポリケチドの機能は、細胞の表面で産生されるかまたは細胞内に産生されるいずれかのレセプターに関するアゴニストまたはアンタゴニスト活性を含み得るか、またはポリケチドは、２つのハイブリッド相互作用スクリーニングのためのアゴニストまたはアンタゴニストであり得、その結果、ラパマイシンおよびＦＫ５０６に類似のタンパク質-タンパク質相互作用インヒビターまたは架橋因子について選択可能である。
【００８２】
このような細胞ベースの検出系はまた、ポリケチドのライブラリーをスクリーニングするのに有用であり、これらは、単一のベクター系のみを含む細胞から産生されることに注目するべきである。従って、これらの改良は、本発明の複合ベクター組み合わせライブラリーだけでなく、単一の発現ベクターにおけるこれらの系を含む細胞を用いて産生されるポリケチドシンターゼおよびポリケチドライブラリーに応用可能である。
【００８３】
上記のように、ＰＫＳにおける酵素系に対する翻訳後修飾に影響するさらなる酵素は、適切な組換え発現系を介して宿主に導入される必要があり得る。さらに、例えば、グリコシル化を介してポリケチド自体を活性化する酵素が必要とされ得る。触媒ドメインを改変して、それらの気質特異性を変更するか、またはドメインを適切な特異性と置換する必要もあり得る。一般的に、例えば、酵母におけるマロニルＣｏＡレベルは、メチルマロニルＣｏＡより高いと考えられている；酵母が宿主として選択された場合、エキステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）単位（例えば、スピラマシンまたはタイロシンに由来するもの）としてマロニルＣｏＡを利用し得る触媒ドメインを含むことが所望され得る。
【００８４】
図４は、本発明の概念的な基準の１つの実施態様を図示し、ここで、３つの別々のベクターが使用されて、モジュール性ＰＫＳを産生する。示されるように、各ベクターは、２つのエキステンダーＡＴ（一方はメチルマロニルＣｏＡから、および他方はマロニルＣｏＡから）を用いて、６４の異なるオープンリーディングフレームの構築、および上記のＫＲ、ＤＨ、およびＥＲに関与する４つの組み合わせを可能にする。従って、モジュールＮｏ．１は、エキステンダー単位としてマロニルＣｏＡを使用し得る；モジュールＮｏ．２は、メチルマロニルＣｏＡ；逆配列が使用され得るか、または両方のエキステンダーがマロニルＣｏＡを使用し得るか、または両方がメチルマロニルＣｏＡを使用し得る。このことは、エキステンダーの組み合わせの４つの別の型を生じ、その各々は、４つのＫＲ／ＤＨ／ＥＲ改変体によって多重化される。各々別々のプラスミドが、同じセットの可能性を提供する；プラスミドの１つはまた、ローディング機能を含まねばならず、そして１つは、チオエステラーゼ機能を含まなければならない。従って、１９２のプラスミドの構築によって、新規なポリケチドの合成の上限は、６４×６４×６４または２６２，１４４分子であり、これは、多数の新規なポリケチドを得るための効率的な方法を提供する。
【００８５】
図５は、本明細書中以下の実施例１１により詳細に示される複合ベクター芳香族PKSに対するアプローチを示す。図５において、代表的な芳香族ポリケチドシンターゼの３つの別のリーディングフレームは、別々のベクターに配置される。従って、各リーディングフレームは、所望される場合、異なる芳香族ポリケチドシンターゼに由来し得る。
【００８６】
使用される宿主細胞にかかわらず産生されるポリケチドを変化させるのに有用な別の改変は、ＰＫＳ（特に、モジュール性または真菌ＰＫＳ）を操作して、第１モジュールのケトシンターゼ（ＫＳ）を不活化する。このことは、Ｊａｃｏｂｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７７：３６７−３６９によって記載のように、システムが、３−ヒドロキシ−２−メチルパントン酸（ｐａｎｔｏｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）−Ｎ−アセチルシステアミンチオエステルのような適切なジケチドチオエステル、またはジケチドアナログの類似のチオエステルを取り込むことを可能にする際の増強された効率を可能にする。不活化ケトシンターゼ領域を含むＰＫＳモジュールの構築は、同時係属中の米国特許出願第０８／６７５，８１７号に記載され、そしてＰＣＴ出願ＷＯ  ９７／０２３５８号に公開される。これらは、本明細書中で参考として援用される。これらの改変ＰＫＳモジュールは、多重ベクター法を用いてライブラリーを調製することにおいて、および／または適切なホロＡＣＰシンターゼをコードする遺伝子のさらなる発現を要求し得る、Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母に基づくポリケチド産生生物において、本発明の種々の実施態様において使用され得る。
【００８７】
従って、本発明は、通常はポリケチドを産生しない宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母）においてポリケチドを産生する機会を提供する。本発明はまた、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母宿主においてであろうと、あるいは他のより伝統的に使用される宿主においてであろうと、複数の別々のベクターに導入したＰＫＳのエレメントを供給することによって種々のポリケチド産物を提供する、より効率的な手段を提供する。本発明はまた、本発明の方法を用いて調製されたポリケチドのライブラリーを含む。
【００８８】
ポリケチドの使用
充分に理解されるように、グリコシル化形態におけるポリケチドは、強力な抗生物質である。さらに、多くのポリケチドは、免疫抑制剤および抗ガン剤である。ポリケチドまたはそれらのグリコシル化形態が、特定の環境下で炎症を減少させ得ることもまた見いだされている。このことは、ＩＬ−８のようなサイトカインの放出を阻害する、特定の抗生物質の能力に起因すると考えられる。例えば、Ｈｏｔｔ，Ｍ．は、Ｋｕｒｕｍｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９６）４３：２０７−２１７において、原因不明の組織化肺炎および関連疾患におけるエリスロマイシンの好都合な臨床効果が、ＩＬ−８産生の局所抑制を介する末梢気道における好中球の蓄積の阻害に起因するとの結論を下している。さらなる実験研究において、Ｔａｍａｏｋｉ，Ｊ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（１９９６）４０：１７２６−１７２８は、ロキシスロマイシンまたはエリスロマイシンでのモルモットの前処置が、ＩＬ−８が吸引された場合の杯細胞分泌の増加を阻害することを示した。Ｈａｍａｄａ，Ｋ．ら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）４１：５９−６９は、マウスにおけるエリスロマイシンの抗腫瘍効果は、ＩＬ−４の産生の増強に起因することを示した。別の研究において、Ｋｅｉｃｈｏ，Ｎ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（Ｔｏｋｙｏ）（１９９３）４６：１４０６−１４１３は、エリスロマイシンが、その抗菌作用とは独立して炎症の程度を抑制することが報告されていることを記載し、そしてエリスロマイシンが、分裂促進因子および抗原で刺激されたヒトリンパ球の増殖応答を抑制するが、コンカナバリン−Ａ（ｃｏｎｃａｎａｖｉｌｉｎ−Ａ）誘導性のＩＬ−２産生またはＩＬ−２Ｒ−α発現においては効果がなかったことを示す。Ｂａｉｌｌｙ，Ｓ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（１９９１）３５：２０１６−２０１９は、ロキシスロマイシン、スピラマイシン、およびエリスロマイシンが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−６、ならびに腫瘍壊死因子αの産生において異なる効果を有することを示した。スピラマイシンは、そしてエリスロマイシンはより少ない程度で、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、またはＴＮＦαに影響を与えずに総ＩＬ−６産生を増加させる。ロキシスロマイシンは、影響を有さなかった。
【００８９】
従って、抗生物質もまた、炎症機構を調節するのに重要であることを示す多数の論文が存在する。文献は、エリスロマイシンが、ＩＬ−８の産生を減少させるが、ＩＬ−６、ＩＬ−１、およびＩＬ−２の産生を増強することを示すようである。スピラマイシンは、ＩＬ−６の産生を増強することが示されている。
【００９０】
これらの実施例は、本発明を例示することを意図するが本発明を限定することは意図しない。
【実施例】
【００９１】
（実施例１：102d、6-MSAS酵母発現ベクターの構築）
酵母において有効な制御配列を得、そしてポリリンカーとともにプラスミドｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＤＨ２プロモーターを、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した：
順方向：GGGAGCTCGGATCCATTTAGCGGCCGCAAAACGTAGGGGC
逆方向：CCGAATTCTAGAGGTTTCATATGGTATTACGATATAGTTAATAG。
【００９２】
順方向プライマーは、５’ＡＤＨ２配列に相補的な１５塩基を含み、そしてＳａｃＩ（ヌクレオチド３〜８）、ＢａｍＨＩ（ヌクレオチド９〜１４）、およびＮｏｔＩ（ヌクレオチド２０〜２７）の制限部位を導入する。逆方向プライマーは、３’ＡＤＨ２配列に相補的な１５塩基を含み、そしてＮｄｅＩ（ヌクレオチド１８〜２３）、ＸｂａＩ（ヌクレオチド７〜１２）、およびＥｃｏＲＩ（ヌクレオチド３〜８）の部位を導入する。
【００９３】
ＡＤＨ２ターミネーターを、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した：
順方向：GGGAATTCATAGTCGACCGGACCGATGCCTTCACGATTTATAG
逆方向：TTTTCTATTATAAGATGAAAAACGAGGGGAGCTCCCATGGCC。
【００９４】
順方向プライマーは、ＥｃｏＲＩ（ヌクレオチド３〜８）、ＳａｌＩ（ヌクレオチド１２〜１７）、およびＲｓｒＩＩ（ヌクレオチド１７〜２４）の制限部位を導入する。逆方向プライマーは、ＸｈｏＩ（ヌクレオチド２９〜３４）およびＡｓｐ７１８（ヌクレオチド３５〜４０）の制限部位を導入する。
【００９５】
ＡＤＨ２プロモーターを含むＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント、ＡＤＨ２ターミネーターを含むＥｃｏＲＩ／Ａｓｐ７１８フラグメント、およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔのＳａｃＩ／Ａｓｐ７１８フラグメントを連結して、６ＭＳＡＳについてのクローニング部位（Ｌ２）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからの界面活性物質ホスホパントテイン（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｏｔｈｅｉｎ）トランスフェラーゼについての遺伝子（ｓｆｐ遺伝子）を含む中間体ベクター４３ｄ２を産生した。図６を参照のこと。このプラスミドは、プロモーター／ターミネーターカセットを酵母シャトルベクターに移入するための部位（Ｌ１、Ｌ３）、ならびに中間体ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクターからのプロモーター／遺伝子カセットを酵母シャトルベクターに移動するための部位（Ｌ１、Ｌ２）もまた含む。
【００９６】
次いで、ＡＤＨ２プロモーター／ターミネーターを、Ｅ．ｃｏｌｉ／酵母シャトルベクターｐＹＴ（Ｓ．Ｈａｗｋｅｓ博士，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏから贈与された）に導入した。ｐＹＴからの１３．２ｋｂｐ  ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限フラグメントを、４３ｄ２からの７５７−ｂｐ  ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ制限フラグメントに連結して、プラスミド１０１ｃ（これは、選択のためのＬｅｕマーカーおよびＵｒａマーカーを含む）を得た。
【００９７】
発現ベクターの構築を完了するために、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐａｔｕｌｕｍからの６−メチルサリチル酸シンターゼ（６−ＭＳＡＳ）についての遺伝子を含む５．３−ｋｂｐ  ＮｄｅＩ／ＸｂａＩ制限フラグメントを、脱メチル化プラスミドｐＤＢ１０２（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｄ．ら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９５）１７７：４５４４−４５４８）から得、そしてＮｄｅＩ／ＸｂａＩ制限４３ｄ２に連結して、中間体プラスミド７１ｄを得た。７１ｄからの６．１−ｋｂｐ  ＮｏｔＩ／ＲｓｒＩＩ制限フラグメントを、１０１ｃからの１２．６−ｋｂｐ  ＮｏｔＩ／ＲｓｒＩＩ制限フラグメントに連結して、発現ベクター１０２ｄを産生した。
【００９８】
（実施例２：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける６−ＭＳＡＳの発現）
コンピテントなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１（ＭＡＴａ  ｈｉｓ３ＤＩ  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１−２８９  ｕｒａ３−５２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１０２ｄで形質転換し、次いで最少寒天プレート（アミノ酸または硫酸アンモニウムを含まない１．７ｇ／Ｌ酵母窒素源ベース（ＤＩＦＣＯ）、５ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｇ／Ｌグルコース、ウラシル原栄養性に基づく選択のためのアミノ酸を含む２０ｇ／Ｌ寒天）にプレートした。形質転換体を拾い、そしてウラシル欠損最少培地で２４時間増殖させた。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、そして制限消化分析によって分析して、同一性を確認した。
【００９９】
首尾良い形質転換体を使用して、２ｍＬのウラシル欠損最少培地を接種し、そして旋回式シェーカーで３０℃にて一晩増殖させた。この培養物の１００μＬのアリコートを使用して、１０ｍＬのＹＰＤ培地（Ｗｏｂｂｅ，Ｃ．Ｒ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  補遺３４：１３．０．１−１３．１３．９（Ｗｉｌｅｙ，  １９９６））（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、２０ｇ／Ｌグルコース）に接種し、そして培養物を、シェーカーで３０℃にて増殖させた。
【０１００】
細胞を、増殖の１８および３６時間後に採取した培養物の５００μＬアリコートの遠心分離によって回収し、そして５０μＬの２×ＳＤＳゲルローディング緩衝液において２分間煮沸することによって溶解させた。
【０１０１】
細胞溶解産物を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードすることによって分析した。６−ＭＳＡＳの予測したサイズに対応するバンドは、約１９０ｋＤで観察された。
【０１０２】
（実施例３：ホロACPシンターゼ発現ベクターの構築）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｆｐ遺伝子は、ホロＡＣＰシンターゼ（すなわち、ホスホパントテノイル（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｏｔｈｅｎｏｙｌ）トランスフェラーゼ）をコードし、そしてプラスミドＹｅｐＦＬＡＧ−１（ＩＢＩ／Ｋｏｄａｋ）に挿入される。
【０１０３】
ＹｅｐＦＬＡＧ−１の５．７−ｋｂｐ  ＰａｃＩ／ＮｏｔＩ制限フラグメントを、合成ポリリンカーに連結して、以下の制限部位を導入した：
（ＰａｃＩ）−ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ−ＮｃｏＩ−ＲｓｒＩＩ−ＸｈｏＩ−ＳａｌＩ−（ＮｏｔＩ）。
【０１０４】
元来のＰａｃＩおよびＮｏｔＩ連結部位は、この連結物において破壊された。得られたベクターを、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化した４３ｄ２（実施例１を参照のこと）に連結して、ＡＤＨ２プロモーター／ターミネーターを導入し、従ってプラスミド１２６ｂを得た。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｆｐ遺伝子を、プラスミドｐＵＣ８−ｓｆｐ（Ｎａｋａｎｏ，Ｍ．ら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ（１９９２）２３２：３１３−３２１）から、以下のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した：
順方向：TAGACACATATGAAGATTTACGGAATTTATATG
逆方向：TACATTCTAGAAATTATAAAAGCTCTTCG。
【０１０５】
順方向プライマーは、ＮｄｅＩ制限部位（ヌクレオチド７〜１２）を導入し、そして逆方向プライマーは、ＸｂａＩ部位（ヌクレオチド６〜１１）を導入する。
【０１０６】
得られたＰＣＲフラグメントを、４３ｄ２のＮｄｅＩおよびＸｂａＩ部位に連結して、プラスミド１０９ｃを産生した。
【０１０７】
１０９ｃの１．３−ｋｂｐ  ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限フラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化１２６ｂに連結して、ＡＤＨ配列の制御下のｓｆｐ遺伝子および選択マーカーとしてのトリプトファン原栄養性を含む発現ベクター１２８ａを産生した。
【０１０８】
（実施例４：酵母における６−メチルサリチル酸の産生）
コンピテントなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１細胞を、１０２ｄ（６ＭＳＡＳ）および１２８ａ（ｓｆｐホロＡＣＰシンターゼ）で形質転換した。１２８ａを、トリプトファン原栄養性について選択する最初の形質転換に使用した：次いで、首尾良い形質転換体を、１０２ｄでトランスフェクトし、トリプトファンおよびウラシル原栄養性について選択した。形質転換体は、３０℃にて４８〜７２間後に現れた。
【０１０９】
６ＭＳＡＳ／ｓｆｐ形質転換体のシングルコロニーを、トリプトファンおよびウラシル欠損最少培地において、３０℃にて２４〜４８時間増殖させ、その後、１００μｌを使用して、１０ｍｌのＹＰＤ培地を接種した。培養物を、３０℃にて１８時間、旋回式シェーカーにおいて２２５ｒｐｍにて増殖させた。ＹＰＤ培地（５０ｍｌ）を、０．５ｍｌの一晩培養物で接種し、そして３０℃にて１４２時間インキュベートした。１ｍｌのアリコートを定期的に除去し、そして細胞を遠心分離によって回収した。細胞を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液に懸濁し、２分間煮沸し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、ＰＫＳタンパク質の産生を決定した。上清を、ＨＰＬＣ（Ｃ１８逆相カラム、水／アセトニトリル／酢酸勾配、ダイオードアレイＵＶ検出）への２０μＬの注入によって６−メチルサリチル酸産生について分析した。ＬＣパラメーターは、以下のとおりである：溶媒Ａ＝水中１％酢酸；溶媒Ｂ＝アセトニトリル中１％酢酸；勾配＝３０分間で２０％Ｂから８０％Ｂ、次いで２分間で１００％；流速＝０．５ｍｌ／分。６−メチルサリチル酸の量を、３０７ｎｍでのピーク積分によって定量した。標準曲線を、真正６−メチルサリチル酸を用いて作成した（Ｓｅｉｄｅｌ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｅｃｏｌｏｇｙ（１９９０）１６：１７９１−１８１６）。
【０１１０】
代表的な実験の結果を図７に示す。コントロールプラスミド１０１ｃのみを含むか、またはコントロールプラスミドおよびｓｆｐ発現プラスミド１２８ａを含む酵母は、６−ＭＳＡを産生しなかった（トレースｂ、ｄ）。６−ＭＳＡＳ発現ベクター１０２ｄのみを含む酵母は、かろうじて検出可能な量の６−ＭＳＡを産生した（トレースｃ）。６−ＭＳＡＳ発現ベクター１０２ｄおよびｓｆｐ発現ベクター１２８ａの両方を含む酵母は、１．７ｇ／ｌもの多くの６−ＭＳＡを産生した（トレースａ）。
【０１１１】
形質転換体についての酵母増殖および６−ＭＳＡ産生の速度論を、図８Ａに示す。示されるように、白四角は、ＯＤ６００によって測定した増殖を示す。黒丸は、６−ＭＳＡの産生をｇ／Ｌで示す。６−ＭＳＡの産生は、グルコースが枯渇した場合、ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除と一致して開始される。プラトーには、約６０時間の増殖の後に達し、そして１５０時間まで一定のままであった。
【０１１２】
６−ＭＳＡの大規模調製のために、２つのプラスミドを保有する５００ｍｌの酵母培養物を、１２０時間増殖させ、そして細胞を遠心分離によって除去した。上清ブロス（２８０ｍｌ）を、２８ｍｌの氷酢酸で酸性化し、次いで２８０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を、減圧下で乾燥するまで濃縮した。粗産物、水からの結晶化によって精製し、そして結晶を、ＫＯＨ上で減圧下で乾燥させた。６−ＭＳＡの同定を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認した。上記の特定の実験において、２８０ｍｌの無細胞酵母培養物は、針状結晶として２４０ｍｇの６−ＭＳＡを生じた。振盪フラスコ培養物は、代表的には、１ｇ／Ｌを越える６−メチルサリチル酸を産生した。
【０１１３】
（実施例５：ＤＥＢＳモジュール６ＫＲ−ＡＣＰ−ＴＥ発現ベクター、プラスミド１０４の構築）
プラスミド９０（これは、Ｔ５プロモーター、２ｌａｃオペレーター、およびｌａｃＩｑ（？）を含む）を、ｐＱＥ６０（Ｑｉａｇｅｎ）の１．１ｋｂｐ  ＸｈｏＩ／ＸｂａＩフラグメントを、ｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のより大きなＸｈｏＩ／ＸｂａＩフラグメントに連結することによって構築した。モジュール６ＫＲ−ＡＣＰ−ＴＥをコードするＤＮＡを含むＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ制限フラグメントを、プラスミド９０に連結して、プラスミド１０４（このモジュールのための発現ベクター）を得た。
【０１１４】
（実施例６：モジュール６ＫＲ−ＡＣＰ−ＴＥのホスホパントテン化）
Ａ．インビボ：
βアラニン栄養要求性株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＪ１６（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）を、１０４、および以下のいずれかについての遺伝子を含むホロＡＣＰシンターゼ発現プラスミドで同時形質転換した：
Ｅ，ｃｏｌｉ脂肪酸シンターゼホロＡＣＰＳ（ＡＣＰＳ）；
Ｅ．ｃｏｌｉエンテロバクチンシンテターゼホロＡＣＰＳ（ＥｎｔＤ）、または
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓグラミシジンシンテターゼホロＡＣＰＳ（ＧｓＰ）。
【０１１５】
ホロＡＣＰＳ発現プラスミドは、Ｄｒ．Ｄａｎｉｅｌ  Ｓａｎｔｉ，  ＵＣＳＦから寄贈された（Ｋｕ，Ｊ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）４：２０３−２０７）。
【０１１６】
各同時形質転換体を、０．００１％チアミン、０．０１％メチオニン、および１００μＭβ−アラニンを補充した最小培地Ｅ（Ｖｏｇｅｌ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９５６）２１８：９７−１０６）において、３７℃にて２０時間増殖させた。細胞を遠心分離によって回収し、そしてβ−アラニンを含まない１ｍＬの増殖培地で洗浄した。この洗浄を、４回反復した。最後に、細胞をβ−アラニンを含まない１ｍＬの増殖培地において、３７℃にて６時間インキュベートした。
【０１１７】
飢餓細胞の３０μＬアリコートを、０．５２μＭ  ［３Ｈ］−β−アラニン（１μＣｉ、Ａｍｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を補充した１ｍＬの増殖培地に添加した。３７℃にて６時間後、細胞を、１ｍＭまでのＩＰＴＧの添加によって誘導し、３７℃にてさらに３時間維持し、そして遠心分離した。細胞ペレットを、ＳＤＳゲルローディング緩衝液において煮沸し、次いで１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分析した。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅで染色し、写真撮影し、Ａｍｐｌｉｆｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に浸透させ、乾燥させ、そしてＫｏｄａｋ  Ｂｉｏ−ＭＡＸフィルムを用いて２日間オートラジオグラフした。
【０１１８】
ＤＥＢＳのモジュール６ＫＲ−ＡＣＰ−ＴＥフラグメントは、ＧｓＰおよびＥｎｔＤとの同時発現に基づいて効率的に標識され、一方、ＡＣＰとの同時発現に基づく標識は観察されなかった。ＡＣＰＳがＤＥＢＳフラグメントを活性化し得ないのは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される場合の、ＤＥＢＳタンパク質のホスホパントテン化の公知の不活性および欠失に基づくと考えられる（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９３）２１４：３０５−３１１）。
【０１１９】
Ｂ．インビトロ：ＤＥＢＳのモジュール６ＫＲ−ＡＣＰ−ＴＥフラグメントを、ｐ１０４で形質転換したＥ．ｃｏｌｉから、Ｎｉ＋２アフィニティーカラムを用いて、製造業者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って精製した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓから精製したサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）シンテターゼホロＡＣＰＳ（ｓｆｐ）は、Ｄｒ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｗａｌｓｈ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）から寄贈された。標識化３Ｈ−補酵素Ａは、Ｄｒ．Ｄａｎｉｅｌ  Ｓａｎｔｉ（ＵＣＳＦ）から寄贈された。
【０１２０】
全てのアッセイを、１００μＬの全用量中、１０ｍＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）において行い、そして４０，００ｃｐｍの３Ｈ−補酵素Ａおよび０．３９μＭ  ｓｆｐを含んだ。ポジティブコントロールは、グラミシジンシンテターゼ（Ｄｒ．Ｄａｎｉｅｌ  Ｓａｎｔｉ，  ＵＣＳＦ）からの１．８μＭ  ＯｈｅＡＴドメインを含み、これは、通常、ｓｆｐによってパントテン化される。反応を、３７℃にて１２時間維持し、次いでＳＤＳゲルローディング緩衝液において煮沸し、そして１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分析した。ゲルを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅで染色し、写真撮影し、Ａｍｐｌｉｆｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に浸透させ、乾燥し、そしてＫｏｄａｃｋ  Ｂｉｏ−ＭＡＸフィルムを用いて２時間オートラジオグラフした。
【０１２１】
ＰｈｅＡＴ、およびＤＥＢＳのモジュール６ＫＲ−ＡＣＰ−ＴＥフラグメントの両方を、ｓｆｐによって効率的に標識した。
【０１２２】
（実施例７：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける６−メチルサリチル酸の産生）
プラスミド９０（実施例５を参照のこと）を、プラスミド９０のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの間にリンカーを挿入することによってｐ９５に変換し、Ｔ５プロモーターに隣接する制限部位ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩを導入した。６−ＭＳＡＳ発現ベクター１０９を、６−ＭＳＡＳオープンリーディングフレームを含むＮｄｅＩ／ＸｂａＩフラグメント（Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９５）３４：７４５０−７４５９）を、ベクターのＳｐｅＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位との間の約１ｋｂｐのリンカーを残す９５の大きなＮｄｅＩ／ＳｐｅＩフラグメントと連結することによって構築した。
【０１２３】
ｓｆｐ発現ベクター１０８を、ｐＵＣ−８ｓｆｐの１．１−ｋｂｐ  ＥｃｏＲＩ／ＰｖｕＩＩ制限フラグメント（実施例３を参照のこと）を、ＤＮＡポリメラーゼＩによるＥｃｏＲＩ部位の充填後にＥｃｏＲＶで切断したｐＡＣＹＣ−１８４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に連結することによって作製した。プロモーターに関するｓｆｐ遺伝子の方向を、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって検証した。
【０１２４】
プラスミド１０８および１０９を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ２４５３に同時形質転換し、そして形質転換体を、クロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性によって選択した。両方のプラスミドを含む単一のコロニーを、１０％グリセロールを補充したＡＴＣＣ培地７６５において、３７℃にて、１．０  ＯＤ６００の密度まで増殖させ、次いで３０℃まで冷却し、そして０．５ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって誘導した。細胞増殖を、３０℃にて３６時間続けた。タンパク質発現を、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによってチェックした。６−メチルサリチル酸の形成後に、培養ブロスのＨＰＬＣ分析を行った。
【０１２５】
６−ＭＳＡの濃度を、実施例４に記載のように、基準サンプルを用いて、濃度対、対応するＨＰＬＣピークの積分面積のプロットから評価した。産物の同定を、ＬＣ−質量分析（これは、［Ｍ＋Ｈ］＋＝１５３を示す）によって、Ｈ２Ｏの欠失に対応するｍ／ｚ＝１３５で主要なフラグメントで確認した。これらの条件下で、培養物は、５０ｍｇ／Ｌの６−メチルサリチル酸を産生した。
【０１２６】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける６−ＭＳＡの産生は、ｓｆｐタンパク質をコードするプラスミドの存在に依存した。６−ＭＳＡＳ発現ベクター１０９のみで形質転換したＥ．ｃｏｌｉは、ＩＰＴＧによる誘導に続いて、３７℃にて４時間インキュベーションした場合、全タンパク質の約５％で約１９０ｋＤ  ６−ＭＳＡＳの産生を示した。しかし、タンパク質のほとんどは不溶性であり、そして６−ＭＳＡは、培地において検出されなかった。６−ＭＳＡＳ発現ベクター１０９を含むβ−アラニン栄養要求性株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＪ１６を、誘導の前および後に標識化β−アラニンとともにインキュベートした場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける６−ＭＳＡＳバンドにおいて放射活性は見いだされなかった；従って、６−ＭＳＡＳは、内因性トランスフェラーゼによってホスホパントテニル補因子で改変されなかったようである。プラスミド１０８および１０９の両方で同時形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＳＪ１６に関する同様の実験において、検出可能な量の放射活性を、１９０ｋＤ  ６−ＭＳＡＳバンドにおいて見いだした；しかし、これらの条件下では、６−ＭＳＡは検出されなかった。しかし、インキュベーションの温度を低くして、適切なタンパク質の折り畳みを促進し、そしてグリセロールを培地に添加して、細胞内マロニルＣｏＡ基質のレベルを増加させた場合、６−ＭＳＡの産生が改良された。従って、細胞を、グリセロールの非存在下で３０℃にて増加させるか、または１０％グリセロールの存在下で３７℃にて増殖させた場合、６−ＭＳＡは産生されなかった。しかし、上記のように、１０％グリセロールの存在下で３０℃にて増殖させた場合、インキュベーションの２４時間後に、約７５ｍｇ／Ｌに達するまで６−ＭＳＡを産生した。産生の速度論を、図８Ｂに示す。
【０１２７】
（実施例８：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅにおけるＰＫＳ−ホロＡＣＰシンターゼ融合タンパク質を用いた６−メチルサリチル酸の産生）
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐａｔｕｌｕｍ  ６−メチルサリチル酸シンターゼ（６−ＭＳＡＳ）とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓサーファクチンホロＡＣＰシンターゼ（ｓｆｐ）との間の融合タンパク質を、以下のように作製した：
６−ＭＳＡＳ遺伝子（実施例１を参照のこと）を含む５．３−ｋｂｐ  ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｓｆｐ遺伝子（実施例３を参照のこと）を含む７０８−ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩフラグメント、およびＮｄｅＩ／ＸｂａＩ制限４３ｄ２（実施例１を参照のこと）と連結して、中間体プラスミド６９を産生した。６９からの約６−ｋｂｐ  ＮｏｔＩ／ＲｓｒＩＩ制限フラグメントを、ＮｏｔＩ／ＲｓｒＩＩ制限１０１ｃ（実施例１を参照のこと）と連結して、酵母発現ベクター２６ａ１（実施例１を参照のこと）を得た。このベクターは、ＡＤＨ２プロモーター／ターミネーター対の間に６−ＭＳＡＳ／ｓｆｐ融合遺伝子を含む。
【０１２８】
得られた融合タンパク質は、（アラニン）３リンカーを用いて６−ＭＳＡＳのＣ−末端リジンとｓｆｐのＮ−末端メチオニンとの結合からなり、その結果融合の領域における遺伝子のＤＮＡ配列は、以下であった：
5’-AAGCTTGCCAAA-GCCGCCGCC-ATGAAGATTTAC-3’
ここで、リジンおよびメチオニンコドンに下線を付す。
【０１２９】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１の２６ａ１での形質転換および実施例３に記載の培養は、別々の遺伝子として６−ＭＳＡＳおよびｓｆｐの発現から得られるものと匹敵するレベルで、６−メチルサリチル酸の産生を生じた。従って、融合タンパク質は、６−ＭＳＡＳおよびｓｆｐの酵素活性を組合せ、自己ホスホパントテン化し、そしてポリケチド産物を産生する。
【０１３０】
このことは、発現ベクターに使用可能なプラスミドレプリコンの数が制限される場合、ポリシストロン性メッセージが適切にプロセシングされない場合、または多重ベクターでの形質転換が困難および／もしくは時間のかかる場合、宿主の形質転換に特に有用である。
【０１３１】
（実施例９：染色体組み込みを用いる、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓにおける混合染色体／プラスミド発現系による６−デオキシエリスロノリドの産生）
染色体とプラスミド発現系との間の３つのＤＥＢＳ遺伝子を分割する実現可能性を実証するために、２つの実験を行った。両方の実験において、組み込みベクターｐＳＥＴ１５２（Ｂｉｅｒｍａｎ，Ｍら、Ｇｅｎｅ（１９９２）１１６：４３−４９）を使用して、ＤＥＢＳ遺伝子クラスターの１つの遺伝子を、アクチノロジンプロモーターの制御下で、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ染色体に、ファージ付着部位で配置した。残りの遺伝子を、複製プラスミドｐＲＭ５（ＭｃＤａｎｉｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６２：１５４６−１５５０）に、アクチノロジンプロモーターの制御下で配置した。
【０１３２】
Ａ．ｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子（モジュール５および６ならびにＤＥＢＳのチオエステラーゼをコードする）を、アクチノロジンプロモーターの制御下で、ｐＳＥＴ１５２にクローン化した。得られるベクターを使用して、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  Ｋ４−１１４（アクチノロジン遺伝子が、標準的な方法による同種組換えによって欠失されている株）を形質転換した（米国特許出願０８／２３８，８１１、本明細書中で参考として援用する）。アプラマイシン耐性形質転換体を選択した。
【０１３３】
発現プラスミドを、２つの遺伝子は、アクチノロジンプロモーターの制御下であるように、ｅｒｙＡＩおよびｅｒｙＡＩＩ遺伝子（それぞれ、モジュール１＋２および３＋４を含む）をｐＲＭ５のＰａｃＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローン化することによって構築する。このプラスミドを使用して、組み込みｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子を含むＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓクローンのプロトプラストを形質転換し、そしてチオストレプトンおよびアプラマイシンの両方に耐性であるコロニーを選択した。
【０１３４】
Ｂ．あるいは、アクチノロジンプロモーターおよびｅｒｙＡＩ遺伝子を、ｐＳＥＴ１５２にクローン化して、続いてＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ染色体に組み込んだ。ｅｒｙＡＩＩおよびｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子を、アクチノロジンプロモーターの後ろのｐＲＭ５にクローン化し、そしてこのプラスミドを使用して、組み込みｅｒｙＡＩ遺伝子を含むＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ株を形質転換した。
【０１３５】
混合染色体−プラスミド発現系を含む上記の生物のランダムに選択したコロニーを、ＸＡＤ−１６樹脂上でＲ２ＹＥ培地において培養し、そして７日後に回収した樹脂のエタノール抽出物を、６−デオキシエリスロノリドＢの産生について、ＬＣ／質量分析によって分析した。実験ＡおよびＢの両方からの培養物は、ｐＣＫ７（アクチノロジンプロモーターの制御下で全ての３つのｅｒｙＡ遺伝子を含む複製プラスミド）を含むＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓの培養物の抽出物に見いだされるものに匹敵する１５〜２０ｍｇ／Ｌのレベルで、６−デオキシエリスロノリドＢを産生した。
【０１３６】
（実施例１０：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓにおける混合染色体／プラスミド発現系による６−デオキシエリスロノリドＢの産生）
多重遺伝子ＰＫＳについての混合染色体−プラスミド発現系を構築するための別の方法はまた、ポリケチド産生のための純粋な宿主の同時作製を達成する。適切な発現宿主（これは、通常、ポリケチド産物を産生する）は、同種組換えを介して外来ＰＫＳ遺伝子のサブセットによって置換された染色体ＰＫＳ遺伝子を有する。このことは、外来ＰＫＳ遺伝子の所望の染色体組み込みを達成し、一方、天然のＰＫＳからの妨害および競合を同時に排除する。実施例は、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒおよびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ（その両方が、ブルーポリケチドアクチノロジンを作製する）について容易に説明される。
【０１３７】
全体のアクチノロジン遺伝子クラスターがこれらの生物から除去され、そして同種組換えを介して抗生物質マーカーと置換される方法が記載されている（米国特許出願０８／２３８，８１１）。この方法を、以下のように順応させる：組換えベクターは、以下のエレメントを含む一本鎖ＤＮＡを作製し得る任意のベクター（例えばｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ）からなる：１）作用クラスターの５’  １−ｋｂｐ末端に相同なＤＮＡ配列；２）耐性マーカー（例えば、ハイグロマイシンまたはチオストレプトン）；３）作用ＩＩ−ｏｒｆアクチベーター遺伝子；４）作用プロモーター；５）１つ以上の外来ＰＫＳ遺伝子；および６）作用クラスターの３’  １−ｋｂｐ末端に相同なＤＮＡ配列。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒまたはＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓの組換えベクターでの形質転換、続くハイグロマイシン耐性についての選択、および青色の欠失についてのスクリーニングは、アクチノロジン遺伝子クラスターを欠き、そして必要とされるアクチノロジン制御エレメントとともに外来ＰＫＳ遺伝子の染色体コピーを含む宿主を提供する。この宿主は、続いて、複製ベクター（例えば、ＳＣＰ２＊ベースのプラスミド）によって、そして／または外来ＰＫＳの他の遺伝子を含むファージベクター（例えば、ｐＳＥＴ１５２）と形質転換されて、ＰＫＳ遺伝子のセットを完全にし、そしてポリケチド産物を産生する。
【０１３８】
（実施例１１：芳香族最低限ＰＫＳの発現のための酵母ベクターの構築）
ＫＳ／ＡＴ二機能性タンパク質をコードする遺伝子およびアクチノロジンＰＫＳのＣＬＦ遺伝子（図５に図示する）を、ＰＣＲによって増幅して改変し、そしてそれぞれＧａｌ１およびＧａｌ１０プロモーターの制御下で、酵母発現ベクターｐＹＥＵｒａ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローン化する。ＡＣＰ遺伝子を増幅し、そしてホロＡＣＰシンターゼ遺伝子とともに、必要であれば、Ｕｒａ３遺伝子のＬｅｕ２−ｄ遺伝子との置換によって、ｐＹＥＵｒａ３に由来するプラスミドにクローン化する。発現もまた、それぞれ、Ｇａｌ１およびＧａｌ１０プロモーターによって駆動される。酵母株ＢＪ２１６８を、これらのプラスミドおよびプラスミド１２８ａ（実施例３を参照のこと）で同時形質転換し、そして形質転換体を、標準的な方法によって、ウラシルおよびロイシン欠乏プレートにおいて選択した。発現を、製造業者の説明書に従って、２％ガラクトースにおける増殖によって誘導する。このシンターゼ系によって産生されたポリケチドは、以下のように予測される：
【０１３９】
【化１】
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（実施例１２：モジュール性シンターゼ活性の発現のための酵母ベクターの構築）
２つのベクターを構築する。１つは、ＡＤＨ−２プロモーターの制御下で、エリスロマイシンＰＫＳのチオエステラーゼドメインと同一直線上に、スピラマイシンの推定２モジュール系を含む。コード配列構築物を操作して、コドン開始部位でＮｄｅＩ部位および終止コドンに続いてＮｓｉＩ部位に隣接させる；この構築物を、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、ｐＹＴにクローン化する。
【０１４０】
第２ベクターにおいて、Ｋａｏ，Ｃ．ら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ（１９９５）１１７：９１０５−９１０６によって記載されるような、ＮｄｅＩおよびＮｓｉＩ部位に隣接するエリスロマイシンＰＫＳ系からの類似構造を、ｐＹＴにクローン化して、ＡＤＨ−２プロモーターの制御下に置く。図９は、これらのベクターの関連発現部分および予測されるポリケチド産物を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、いくつかの代表的な芳香族ＰＫＳの組成を示す図である。
【図２】図２は、モジュール性ＰＫＳの代表としてのエリスロマイシンＰＫＳの構成を示す図である。
【図３】図３は、真菌ＰＫＳ系、６−メチルサリチル酸シンターゼ（６−ＭＳＡＳ）の構成を示す図である。
【図４】図４は、多重ベクター化モジュール性ＰＫＳ系の概念化を示す図である。
【図５】図５は、多重ベクター化芳香族ＰＫＳ系の図である。
【図６】図６は、ホロＡＣＰシンターゼの発現のためのベクターおよび６−ＭＳＡＳをコードする遺伝子の発現のためのベクターの構築（両方のベクターは酵母における使用のため）を図で示す。
【図７】図７は、本発明の種々のベクターで形質転換した酵母培養物の上清について、ＨＰＬＣ実行の結果を示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、酵母（図８Ａ）およびＥ．ｃｏｌｉ（図８Ｂ）における、抗生物質６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡ）の産生の速度論を示す。
【図９】図９は、予測した産物とともに、酵母に適合可能なベクターにおける使用のための２つのモジュール性ＰＫＳのための発現系を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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