(57)【要約】      （修正有）【課題】適当な添加剤を移動相に添加することで分析の感度と分離性能の両立を実現できるようなカルボン酸をスクリーニングする。【解決手段】（ａ）幾つかのカルボン酸をそれぞれ移動相に添加したときのカチオン性分析対象物質の保持時間及び電子スプレーイオン（ＥＳＩ）信号強度を測定する工程と、（ｂ）カルボン酸の物性値を説明変数とし、保持時間を目的変数とする第１演算式及びＥＳＩ信号強度を目的変数とする第２演算式をそれぞれ多変量解析により構築する工程と、（ｃ）スクリーニングの対象とするカルボン酸の物性値を求める工程と、（ｄ）工程（ｃ）で求められた物性値を両演算式に適用してスクリーニングの対象とするカルボン酸の保持時間及びＥＳＩ信号強度を予測する工程と、（ｅ）予測した保持時間を添加剤として酢酸を添加したときのものと比較し、かつ予測したＥＳＩ信号強度を添加剤としてトリフルオロ酢酸を添加したときのものと比較する。【選択図】図１
2008134206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフ質量分析に用いる移動相に対する添加剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）幾つかのカルボン酸をそれぞれ前記移動相に添加したときの分析対象物質の保持時間及び電子スプレーイオン（ＥＳＩ）信号強度を測定する工程と、
（ｂ）前記カルボン酸の物性値を説明変数とし、保持時間を目的変数とする第１演算式及びＥＳＩ信号強度を目的変数とする第２演算式をそれぞれ多変量解析により構築する工程と、
（ｃ）スクリーニングの対象とするカルボン酸の物性値を求める工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で求められた物性値を前記両演算式に適用してスクリーニングの対象とするカルボン酸の保持時間及びＥＳＩ信号強度を予測する工程と、
（ｅ）予測した保持時間を添加剤として酢酸を添加したときのものと比較し、かつ予測したＥＳＩ信号強度を添加剤としてトリフルオロ酢酸を添加したときのものと比較することによりスクリーニングの対象とする前記カルボン酸を評価する工程と、を備えたスクリーニングする方法。
【請求項２】
前記物性値は２次元又は３次元構造に基づく分子記述子であり、水素結合酸性度（Ａ）、水素結合塩基性度（Ｂ）、双極子／分極率（Ｓ）、モル屈折率（Ｅ）、固有分子体積（Ｖ）、疎水性度（ＣｌｏｇＰ）、及び酸解離定数（ｐＫａ）のうちの２以上を含む請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記保持時間として、液体クロマトグラフィーにおいて、カラムに保持されない成分の溶出時間に対する添加剤を添加した場合の保持時間の比率を対数値で表わした対数化保持比（ｌｏｇＫ）を用いる請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記第１演算式は疎水性度（ＣｌｏｇＰ）及び酸解離定数（ｐＫａ）を少なくとも含んだ１次元関数でｌｏｇＫを表わしたものであり、
前記第２演算式は水素結合酸性度（Ａ）、水素結合塩基性度（Ｂ）、双極子／分極率（Ｓ）、及び固有分子体積（Ｖ）を少なくとも含んだ１次元関数でＥＳＩ信号強度を表わしたものである請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
スクリーニングの対象とする前記カルボン酸は、部分フッ素化カルボン酸である請求項１から４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
液体クロマトグラフ質量分析に用いられ、添加剤を含んだ移動相において、
前記添加剤はカルボン酸からなり、そのカルボン酸の物性値から以下の第１演算式に基づいて予測される保持時間が添加剤として酢酸を添加したものよりも大きく、以下の第２演算式に基づいて予測されるＥＳＩ信号強度が添加剤としてトリフルオロ酢酸を添加したものよりも大きいことを特徴とする移動相。
ここで、第１演算式と第２演算式は、幾つかのカルボン酸の物性値を説明変数とし、それらのカルボン酸をそれぞれ添加剤を含まない前記移動相に添加したときのカチオン性分析対象物質の保持時間とＥＳＩ信号強度をそれぞれ目的変数として多変量解析により求められたものである。
【請求項７】
前記物性値は２次元又は３次元構造に基づく分子記述子であり、水素結合酸性度（Ａ）、水素結合塩基性度（Ｂ）、双極子／分極率（Ｓ）、モル屈折率（Ｅ）、固有分子体積（Ｖ）、疎水性度（ＣｌｏｇＰ）、及び酸解離定数（ｐＫａ）のうちの２以上を含む請求項６に記載の移動相。
【請求項８】
前記保持時間として液体クロマトグラフィーにおいて、カラムに保持されない成分の溶出時間に対する添加剤を添加した場合の保持時間の比率を対数値で表わした対数化保持比（ｌｏｇＫ）を用いる請求項６又は７に記載の移動相。
【請求項９】
前記第１演算式は疎水性度（ＣｌｏｇＰ）及び酸解離定数（ｐＫａ）を少なくとも含んだ１次元関数でｌｏｇＫを表わしたものであり、
前記第２演算式は水素結合酸性度（Ａ）、水素結合塩基性度（Ｂ）、双極子／分極率（Ｓ）、及び固有分子体積（Ｖ）を少なくとも含んだ１次元関数でＥＳＩ信号強度を表わしたものである請求項８に記載の移動相。
【請求項１０】
前記添加剤のカルボン酸は、部分フッ素化カルボン酸である請求項６から９のいずれか一項に記載の移動相。
【請求項１１】
請求項６から１０のいずれか一項に記載の移動相を用いて分析を行なうことを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ）を用いた分離分析分野に関し、例えばペプチドやタンパク質を分析するプロテオーム解析や細胞内代謝物を分析するメタボローム解析など、ＬＣ−ＭＳを使って分析する方法と、その分析方法で使用される移動相に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＬＣ−ＭＳで陽イオン性薬物やペプチドなどを分析する場合、試料成分の高分離と高感度検出が要求されるため、ＬＣでの高分離効率とＭＳでの高イオン化効率を両立させる移動相に対する添加剤として、主にギ酸（Formic acid, ＦＡ）、酢酸（Acetic acid, ＡＡ）又はトリフルオロ酢酸（Trifluoro acetic acid, 以下ＴＦＡ）が用いられてきた。
【０００３】
しかし、ギ酸や酢酸を用いる場合、ＭＳの感度向上という点では効果があるものの、試料成分の分離が悪い場合が多く、分離性能の点で課題がある。
一方、ＴＦＡは試料成分の分離という点ではギ酸よりも効果があるものの、検出感度がギ酸に比べて低くなってしまうので、高感度化という点で課題がある。
【０００４】
そこで、ＬＣ−ＭＳにおいてペプチドや塩基性薬物などを分析する場合、高感度と高分離性能の両立を実現できる移動相への添加剤が必要とされており、移動相添加剤としてジフルオロ酢酸（Difluoro acetic acid, 以下ＤＦＡ）、トリフルオロプロピオン酸（Trifluoro propionic acid, 以下ＴｒｉＦＰＡ）、又は３，３，３−トリフルオロメチル−２トリフルオロメチルプロピオン酸（3,3,3-trifluoromethyl- 2trifluoromethyl propionic acid, 以下ＴＦＴＦＰＡ）を用いる分析方法が報告されている（特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００４−０７７２７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ある移動相に対して高感度と高分離性能を実現できる添加剤を見つけるには、添加剤を実際にその移動相に添加して測定を行なってみるしかなかった。その方法は、それぞれの移動相について多数の添加剤を逐次試してみることを意味しており、現実には時間とコストがかかって困難である。
【０００６】
移動相に添加する添加剤として、どのような構造の酸を添加すれば分析の高感度化と高分離性能の両立を実現できるかを予測する方法は、未だ報告されていない。
【０００７】
本発明は、ＬＣ−ＭＳにおいてペプチドや陽イオン性薬物などを分離・分析する場合、適当な添加剤を移動相に添加することで、分析の高感度化と高分離性能の両立を実現できる添加剤を見つける方法と、それを用いる液体クロマトグラフ質量分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のスクリーニング方法は、液体クロマトグラフ質量分析に用いる移動相に対する添加剤のスクリーニング方法であって、（ａ）幾つかのカルボン酸をそれぞれ上記移動相に添加したときの分析対象物質の保持時間及び電子スプレーイオン（ＥＳＩ）信号強度を測定する工程と、（ｂ）上記カルボン酸の物性値を説明変数とし、保持時間を目的変数とする第１演算式及びＥＳＩ信号強度を目的変数とする第２演算式をそれぞれ多変量解析により構築する工程と、（ｃ）スクリーニングの対象とするカルボン酸の物性値を求める工程と、（ｄ）工程（ｃ）で求められた物性値を上記両演算式に適用してスクリーニングの対象とするカルボン酸の保持時間及びＥＳＩ信号強度を予測する工程と、（ｅ）予測した保持時間を添加剤として酢酸を添加したときのものと比較し、かつ予測したＥＳＩ信号強度を添加剤としてトリフルオロ酢酸を添加したときのものと比較することによりスクリーニングの対象とする上記カルボン酸を評価する工程と、を備えている。
【０００９】
本発明の移動相は液体クロマトグラフ質量分析に用いられ、添加剤を含んでいる。そして、上記添加剤はカルボン酸からなり、そのカルボン酸の物性値から以下の第１演算式に基づいて予測される保持時間が添加剤として酢酸を添加したものよりも大きく、以下の第２演算式に基づいて予測されるＥＳＩ信号強度が添加剤としてトリフルオロ酢酸を添加したものよりも大きいものである。
ここで、第１演算式と第２演算式は、幾つかのカルボン酸の物性値を説明変数とし、それらのカルボン酸をそれぞれ添加剤を含まない上記移動相に添加したときのカチオン性分析対象物質の保持時間とＥＳＩ信号強度をそれぞれ目的変数として多変量解析により求められたものである。
【００１０】
上記物性値の好ましい一例は２次元又は３次元構造に基づく分子記述子であり、水素結合酸性度（Ａ）、水素結合塩基性度（Ｂ）、双極子／分極率（Ｓ）、モル屈折率（Ｅ）、固有分子体積（Ｖ）、疎水性度（ＣｌｏｇＰ）、及び酸解離定数（ｐＫａ）のうちの２以上を含むことが好ましい。
分子記述子は２次元又は３次元構造に基づいて計算により導き出される数値であるが、水素結合酸性度とは水素結合におけるプロトンの供与性、水素結合塩基性度とは水素結合におけるプロトンの受容性、固有分子体積とは分子の立体構造から求められる体積、疎水性度とは水−オクタノール系における化合物のオクタノール相への分配比の対数を意味する。
【００１１】
上記保持時間として、添加剤を添加しなかった場合の保持時間に対する添加剤を添加した場合の保持時間の比率を対数値で表わした対数化保持比（ｌｏｇＫ）を用いるようにしてもよい。
【００１２】
上記第１演算式の好ましい一例は疎水性度（ＣｌｏｇＰ）及び酸解離定数（ｐＫａ）を少なくとも含んだ１次元関数でｌｏｇＫを表わしたものであり、上記第２演算式の好ましい一例は水素結合酸性度（Ａ）、水素結合塩基性度（Ｂ）、双極子／分極率（Ｓ）、モル屈折率（Ｅ）、及び固有分子体積（Ｖ）を少なくとも含んだ１次元関数でＥＳＩ信号強度を表わしたものである。
【００１３】
スクリーニングの対象とする上記カルボン酸として部分フッ素化カルボン酸を挙げることができる。
本発明の移動相添加剤の好ましい一例は部分フッ素化カルボン酸である。
【００１４】
本発明の液体クロマトグラフ質量分析方法は、本発明の移動相を用いて分析を行なうものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のスクリーニング方法によると、ＬＣ−ＭＳでの分析の高感度化と高分離性能の両立を実現することができる移動相に対する添加剤を、逐次測定により確かめることなく選択することができるようになる。そのようにして選択された添加剤は、塩基性化合物やペプチドに対し、これまでの酢酸やギ酸に比べて良好な保持比と高いＥＳＩ信号強度を与えることができる。
【００１６】
物性値としてカルボン酸の分子記述子を用い、水素結合酸性度（Ａ）、水素結合塩基性度（Ｂ）、双極子／分極率（Ｓ）、モル屈折率（Ｅ）、固有分子体積（Ｖ）、疎水性度（ＣｌｏｇＰ）、及び酸解離定数（ｐＫａ）のうちの２以上を含むようにすれば、これらの物性値を市販のソフトウェアを用いて算出できるようになる。
【００１７】
保持時間の比率を対数値で表わした対数化保持比（ｌｏｇＫ）と物性値を用いるようにすれば、１次相関関係にある演算式を構築することができるようになる。
【００１８】
第１演算式をＣｌｏｇＰとｐＫａ、第２演算式をＡとＣｌｏｇＰ，Ｖ，Ｂ，Ｓで表わされる物性値で構築するようにすれば、より相関関係の良い演算式を構築することができる。
【００１９】
本発明の移動相を使用すれば、ＬＣでの高分離性能を維持した状態で、ＭＳでの高イオン化効率を保持した高感度検出が可能になり、例えば陽イオン性物質・ペプチドやタンパク質などの高感度精密分離が可能となる。
【００２０】
本発明の液体クロマトグラフ質量分析方法によれば、分析の高感度と高分離性能の両立を実現することができる添加剤を含んだ移動相を用いるので、より高精度の分離・分析を行なうことができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の一実施例を図１（Ａ）〜（Ｃ）のフローチャートを参照しながら、本発明のスクリーニング方法を工程（ａ）〜（ｅ）の順に詳細に説明する。（Ａ）はＬＣ−ＵＶによる測定により第１演算式を構築する工程、（Ｂ）はＥＳＩ−ＭＳ検出法により第２演算式を構築する工程、（Ｃ）はスクリーニングの対象となるカルボン酸を評価する工程である。
【００２２】
[分析]
（ａ）幾つかのカルボン酸を移動相に添加したときのカチオン性分析対象物質の保持時間及び電子スプレーイオン（ＥＳＩ）信号強度を測定する工程。
（ａ−１；液体クロマトグラフ質量分析で用いる試料）
ＬＣ−ＭＳとして液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）システムで分離・分析する試料成分として、プロプラノロール：C16H21NO2、ピンドロール：C14H20N2O2、ナドロール：C17H27NO4、アテノロール：C14H22N2O3、イミプラミン：C19H24N2、ピリドキシン：C8H11NO3、スルピリド：C15H23N3O4S、及びテトラハイドロゾリン：C13H16N2を用いる。それらの構造式を図２に示す。
【００２３】
（ａ−２；ＥＳＩ−ＭＳ分析工程）
ＥＳＩ−ＭＳとして、PE-Sciex社製API−３タンデムマススペクトロメーターを用いてポジティブイオンモードでインフュージョン分析を行なった。Harvard社製モデル２２シリンジポンプによって試料溶液を５μＬ／分の流量で注入した。マススペクトロメーターのオリフィス電圧とイオンスプレイ電圧をそれぞれ１００Ｖと５ｋＶに設定した。１回の分析では、２００−６００ａｍｕ（原子質量単位）の範囲を１０ミリ秒／スキャンの速度で２０回スキャンし、２０回の分検出信号を積算した。各試料は繰り返し５回分析した。
【００２４】
試料溶液は、図２に示した試料成分（濃度５００ｎｇ／ｍＬ）を１０ｍｍｏｌ／Ｌのカルボン酸が入った３０％メタノールに溶かし、シリンジを用いて５μＬ／分の流量で送液してインフュージョン分析を行なった。カルボン酸は添加剤として評価しようとするものであり、ＴＦＡは標準カルボン酸として扱う。１試料を分析するごとにＴＦＡが入った試料溶液を標準試料溶液として分析を行ない、ＴＦＡとの相対比較分析を行なった。
【００２５】
（ａ−３；ＬＣ−ＭＳ分析工程）
液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリーには株式会社島津製作所製のＬＣ／ＭＳシステム（送液ポンプ：ＬＣ−１０ＡＤｖｐ×２，カラムオーブン：                ，オートサンプラ：ＳＩＬ−ＨＴ，マススペクトロメーター：２０１０Ａ）を用いた。
【００２６】
ＬＣでは、用いたカラムはシリカＯＤＳ（オクタデシルシラン）カラムＰａｃｋＰｒｏＣ１８（登録商標、ＹＭＣ製）であり、ＬＣ−１０ＡＤｖｐにて２００μＬ／分の流量で送液を行なった。試料溶液は、上記の試料成分を含む薬物混合試料溶液（４０μｇ／ｍＬ）とペプチド溶液（アンジオテンシン３、１０μｇ／ｍＬ）であり、それぞれ５μＬ注入した。薬物混合試料溶液の分析では１０ｍｍｏｌ／Ｌのカルボン酸を含む１５％メタノール溶液を移動相としてアイソクラティックモードで送液した。アンジオテンシンの分析では２．５−５０ｍｍｏｌ／Ｌのカルボン酸を含む２０％メタノール溶液を移動相としてアイソクラティックモードで送液を行なった。
ＥＳＩ−ＭＳは２００−６００ａｍｕの範囲を、１０ミリ秒／スキャンの速度で分析した。
試料成分の保持係数はマスクロマトグラムにより決定した。
【００２７】
［結果］
（ａ−４；ＥＳＩ−ＭＳ分析結果）
一例として、１０ｍｍｏｌ／Ｌのカルボン酸が入った３０％メタノール溶液に、上記の試料成分を溶解させた試料溶液の分析結果について、プロプラノロールの信号強度における酸の効果を観察した。評価するカルボン酸として、ＴＦＡを標準とし、ＡＡ、ＦＡ、ＤＦＡ、ＴｒｉＦＰＡ、テトラフルオロプロピオン酸（Tetrafluoro propionic acid, 以下ＴｅｔｒａＦＰＡ）、ＴＦＴＦＰＡ、ペンタフルオロプロピオン酸（Pentafluoro propionic acid, 以下ＰＦＰＡ）、ヘプタフルオロブチル酸（Heptafluoro butylic acid, 以下ＨＦＢＡ）、ノナフルオロペンタン酸（Nonafluoro pentanoic acid, 以下ＮＦＰＡ）、及びペンタデカフルオロオクタン酸（Pentadeca fluoro octanoic acid, 以下ＰＦＯＡ)を選んだ。
【００２８】
図３は各カルボン酸を添加したときのプロプラノロールのＥＳＩ信号強度を示す。図３に示すように、酢酸とギ酸はＴＦＡよりも高いＥＳＩ信号強度を示す。
そして、ＴＦＡ、ＰＦＰＡ、ＨＦＢＡ、ＮＦＰＡ、ＰＦＯＡなどのパーフルオロカルボン酸の中では、ＴＦＡとＰＦＯＡが他のカルボン酸よりも強い信号強度を示し、酸のカルボン鎖の長さとＥＳＩ信号強度には明らかな関連性は見られなかった。
【００２９】
一方で、ＤＦＡ、ＴｒｉＦＰＡ、ＴｅｔｒａＦＰＡ、ＴＦＴＦＰＡなどの部分フッ素化カルボン酸の場合は、パーフルオロカルボン酸に比べると強いＥＳＩ信号強度を示した。
ここでＤＦＡやＴｒｉＦＰＡ、ＴＦＴＦＰＡの信号強度と、酢酸やギ酸の信号強度とに注目して比較すると、部分フッ素化カルボン酸の「部分フッ素化」は、ＥＳＩ信号強度に大きな影響を与えていない事がわかる。
部分フッ素化カルボン酸の影響をさらに検討するために他の試料成分である３種類のβブロッカー（ピンドール、ナドロール、アテノロール）とイミプラミンで同様の実験を行なったが、ＥＳＩ信号強度に関してこれら薬物に関しても同様の結果が得られた。すなわち、部分フッ素化カルボン酸がＥＳＩ信号強度に及ぼす影響は少ないと言える。
【００３０】
（ａ−５；ＬＣ−ＭＳ分析結果）
液体クロマトグラフィーへのカルボン酸による影響を見るために、１０ｍｍｏｌ／Ｌの様々なカルボン酸をそれぞれ移動相に添加して、試料成分である親水性陽イオン性薬物の保持比を対数化して調査した。
【００３１】
図４に薬物保持比に対する移動相添加剤の影響を対数表示で示す。図４より、すべての部分フッ素化カルボン酸は、陽イオン性薬物に対してＴＦＡと同様に、酢酸及びギ酸と比べて強い保持比を示しており、イオンペア試薬として働いていることがわかる。
また、酢酸やプロピオン酸の系列においては、保持比が酢酸＜ＤＦＡ＜ＴＦＡ、ＴｒｉＦＰＡ＜ＴｅｔｒａＦＰＡ＜ＰＦＰＡ＜ＴＦＴＦＰＡの順に大きくなっており、フッ素に置換される数が多くなるのに伴って、試薬の保持比（保持時間）も長くなっている。
【００３２】
実際、スルピリドとアテノロールを分離しようとした場合、酢酸やギ酸、ＴｒｉＦＰＡを移動相に添加剤として添加したときはクロマトグラム上で充分な分離が得られなかったが、ＴＦＴＦＰＡを添加剤として添加したときはクロマトグラム上で充分な分離が得られた。
移動相添加剤としての能力をＰＦＰＡとＴＦＴＦＰＡで比べた場合、図３及び図４に示すように、ＴＦＴＦＰＡの方が強い保持比を示し、且つ充分なＥＳＩ信号強度も有していることから、ＴＦＴＦＰＡはＰＦＰＡよりも添加剤としての優れた特性を持つことがわかる。すなわち、ＴＦＴＦＰＡは、試料が親水性陽イオン性薬物の場合には理想的な移動相添加剤であると言える。
【００３３】
図５はＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳクロマトグラムとＭＳスペクトルであり、（Ａ）は移動相にギ酸を添加した場合、（Ｂ）はＴＦＴＦＰＡを添加した場合を示している。（Ａ），（Ｂ）のそれぞれにおいて、横軸が時間となっているのがクロマトグラムであり、横軸が質量数（ｍ／ｚ）となっている枠で囲まれたのがＭＳスペクトルである。ギ酸を添加したクロマトグラムではすべての物質から充分なＥＳＩ信号強度が得られているが、ピークが分離していないことがわかる。例えばピリドキシンはピーク１であるが、ピーク１のＭＳスペクトルには質量数が１７０のピリドキシン以外に、質量数２６７のアテノロール（ピーク２）と質量数が３４２のスルピリド（ピーク３）が分離されずに現れていることからも、分離がなされていないことがよくわかる。
【００３４】
一方で、ＴＦＴＦＰＡを移動相に添加した場合のクロマトグラムにおいては、すべての物質が充分に分かれて形の良いピークが得られている。このことは、またピーク１のＭＳスペクトルにはピリドキシンの質量数が１７０のピークしか現れていないことからも確かめられる。加えて、ＥＳＩ信号強度もギ酸の場合と比べて見劣りせず、さらにバックグラウンドレベルもギ酸の場合とほぼ同じで良好である。
【００３５】
すなわち、ＴＦＴＦＰＡはＥＳＩ信号強度を抑制しないという事がわかる。このことは、図５のそれぞれのＥＳＩ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ１７０ ピーク１）において、ギ酸を添加した場合もＴＦＴＦＰＡを添加した場合も充分なＳ／Ｎ比を示していることからもわかる。
すなわち、部分フッ素化カルボン酸はイオンペアＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳにおいて高感度ＥＳＩ−ＭＳ検出を可能にする事がわかる。
【００３６】
（ｂ）カルボン酸の物性値として分子記述子を説明変数とし、保持時間を目的変数とする第１演算式及びＥＳＩ信号強度を目的変数とする第２演算式をそれぞれ多変量解析により構築する工程。
カルボン酸の物性値としての分子記述子はPharma Algorithms社（トロント、カナダ）のADME box 2.0のAbsolvソフトウェア、Daylight Chemical Information Systems社（カリフォルニア、アメリカ合衆国）のDaylight ver. 4.72ソフトウェア、及びCompuDrug International社（カリフォルニア、アメリカ合衆国）のPallas 3.0ソフトウェアを用いて計算した。また、Absolvソフトウェアを用いてAbrahamタイプ方程式（M.H. Abraham. Chem. Soc. Rev. 22 (1993) 73.）より溶媒和特性を計算した。
【００３７】
Absolvで計算した分子記述子は、水素結合酸性度（Ａ）、水素結合塩基性度（Ｂ）、双極子／分極率（Ｓ）、（ｃｍ3／ｍｏｌ）／１０で表わしたモル屈折率（Ｅ）及び（ｃｍ3／ｍｏｌ）／１０で表わしたMcGowanの固有分子体積（Ｖ）である。
DaylightとPallasを使って計算した分子記述子は、疎水性度（ＣｌｏｇＰ）と酸解離定数（ｐＫａ）である。計算を行なったカルボン酸の分子記述子を図６に示す。
【００３８】
（分子記述子を使った多変量解析）
カルボン酸のQuantitative structure- retention factor relationship (ＱＳＲＲ）とquantitative structure- ESI-MS intensity relationship（ＱＳＥＩＲ)は、実験結果にカルボン酸の分子記述子を加え合わせることで検討を行なった。
ＱＳＲＲとＱＳＥＩＲの多変量解析はExcel 2000（登録商標、Microsoft社、アメリカ合衆国)上で動くTAHENRYOKAISEKI ver.4.0 program (Esumi、東京、日本)で行なった。
【００３９】
添加剤の対象となるカルボン酸におけるＱＳＲＲとＱＳＥＩＲを調査して、多変量解析を用いてピリドキシンに対するカルボン酸の分子記述子（Ａ，Ｂ，ｐＫａ，ＣｌｏｇＰ）と対数化保持比（ｌｏｇＫ）の関係を導く事を試みた。また、プロプラノロールに対しては、カルボン酸の分子記述子（Ａ，Ｂ，Ｓ，Ｖ，ＣｌｏｇＰ，ｐＫａ）とＥＳＩ信号強度の関係を導くことを試みた。
【００４０】
まず、ＱＳＲＲを分析するために、図４におけるピリドキシンの対数化保持比（ｌｏｇＫ）を図６に示すカルボン酸の６つの分子記述子（Ａ，Ｂ，Ｓ，Ｖ，ＣｌｏｇＰ，ｐＫａ）を用いて調査した。これら６つの分子記述子を用いた多変量解析によりピリドキシンの保持比を計算した。ＱＳＲＲにおける多変量解析は演算式（１）で示される。
【００４１】
ｌｏｇＫ = 0.2054ＣｌｏｇＰ -0.08566ｐＫａ +0.22218  …演算式(１)
【００４２】
実験値と演算式（１）より計算された対数化保持比の関係は、図７（Ａ）に示すようになり、相関係数０．９０５という良好な結果が得られた。
次にプロプラノロールにおけるＱＳＥＩＲの結果を示す。図３で挙げた種々のカルボン酸のＥＳＩ信号強度より演算式（２）を構築した。
【００４３】
ＥＳＩ信号強度 = -5.347Ａ -0.418ＣｌｏｇＰ +2.625Ｖ -11.319Ｂ +3.925Ｓ +6.380  …演算式(２)
【００４４】
図７（Ｂ）に実験値と計算された信号強度の関係を示す。相関係数は０．９３６であり良好な結果となった。演算式（２）中、水素結合酸性度（Ａ）が最も大きく影響するパラメータである事がわかる。
【００４５】
演算式（１）と（２）のパラメータは独立しており、それぞれの式の中で最も影響するパラメータも異なる。従って、イオン化、イオンペア形状、ＥＳＩ信号強度には関連性は見られない。しかし、演算式（１）と（２）から、イオンペアＬＣにおいて充分な分離が得られ、且つ強いＥＳＩ信号強度が得られるカルボン酸の化学的構造を予見することが出来る。その一例として、長いカルボキシル鎖をもつ部分フッ素化カルボン酸は理想的な移動相添加剤であり、イオンペアＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳにおいて有用である事がわかる。
【００４６】
（ｃ）スクリーニングの対象とするカルボン酸の分子記述子を求める工程。
例えば、構造式（１）  ＣＦ3−（ＣＦ2）n−ＣＨ2−ＣＯＯＨ  （ｎは０以上の整数。）において、変数ｎに種々の整数を代入し、それによって定められた種々の構造から分子記述子を求める。
【００４７】
（ｄ）工程（ｃ）で求められた物性値を両演算式（１），（２）に適用してスクリーニングの対象とするカルボン酸の保持時間及びＥＳＩ信号強度を予測する工程。
例えば、工程（ｃ）により求められた分子記述子を演算式（１）及び（２）に代入する。
【００４８】
（ｅ）スクリーニングの対象とするカルボン酸を評価する工程。
予測した保持時間が添加剤として酢酸を添加したときのものより大きく、かつ予測したＥＳＩ信号強度が添加剤としてトリフルオロ酢酸を添加したときのものより大きければ、そのカルボン酸は移動相への添加剤として使用できるものと評価できる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
ペプチドやタンパク質を分析するプロテオーム解析や細胞内代謝物を分析するメタボローム解析など、ＬＣ−ＭＳを使って分析する方法と、その分析方法で使用される移動相に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明のスクリーニング方法のフローチャートを示しており、（Ａ）はＬＣ−ＵＶによる測定により第１演算式を構築する工程、（Ｂ）はＥＳＩ−ＭＳ検出法により第２演算式を構築する工程、（Ｃ）はスクリーニングの対象となるカルボン酸を評価する工程である。
【図２】液体クロマトグラフ質量分析で用いる種々の試薬の構造式である。
【図３】各カルボン酸を添加したときのプロプラノロールのＥＳＩ信号強度を示す。
【図４】薬物保持比に対する移動相添加剤の影響を対数表示で示したグラフである。
【図５】ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳクロマトグラムとＭＳスペクトルであり、（Ａ）は移動相にギ酸を添加した場合、（Ｂ）はＴＦＴＦＰＡを添加した場合を示している。
【図６】種々のカルボン酸の分子記述子を示した図である。
【図７】構築された演算式の相関関係を示すグラフであり、（Ａ）は対数化保持比、（Ｂ）はＥＳＩ信号強度を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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