(57)【要約】【課題】簡便かつ効率的なＤ−ホモセリン及びＤ−ホモセリンラクトンの製造方法、並びにそのための手段の提供。【解決手段】アルスロバクター属（Arthrobacter）に属し、かつＤ−ホモセリンに対しＬ−ホモセリンを選択的に資化分解することができる微生物、並びに該微生物又はその培養物とＤＬ−ホモセリン又はその塩とを接触させてＬ−ホモセリン又はその塩を分解し、Ｄ−ホモセリン又はその塩を採取することを特徴とするＤ−ホモセリン又はその塩の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルスロバクター属（Arthrobacter）に属し、かつＤ−ホモセリンに対しＬ−ホモセリンを選択的に資化分解することができる微生物。
【請求項２】
アルスロバクター・エスピー２−２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９１４）、アルスロバクター・ニコチノボランス２−３（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９１５）若しくはアルスロバクター・エスピー２−７（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９１６）、又はそれらの誘導株である、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
請求項１又は２記載の少なくとも１種の微生物又はその培養物とＤＬ−ホモセリン又はその塩とを接触させてＬ−ホモセリン又はその塩を分解し、Ｄ−ホモセリン又はその塩を採取することを特徴とする、Ｄ−ホモセリン又はその塩の製造方法。
【請求項４】
得られるＤ−ホモセリン又はその塩が９０％ｅ．ｅ．以上の鏡像体過剰率を有する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載の少なくとも１種の微生物又はその培養物とＤＬ−ホモセリン又はその塩とを接触させてＬ−ホモセリン又はその塩を分解し、Ｄ−ホモセリン又はその塩を採取し、該Ｄ−ホモセリン又はその塩を脱水環化することを特徴とする、Ｄ−ホモセリンラクトンの製造方法。
【請求項６】
請求項１又は２記載の少なくとも１種の微生物又はその培養物を含有することを特徴とするＬ−ホモセリン分解剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農薬・医薬品中間体として有用な光学活性なＤ−ホモセリン又はその等価体であるＤ−ホモセリンラクトンの新規な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−ホモセリンは、抗生物質ノカルデシン（nocardicin）Ａ、サイトメガロウイルスのプロテアーゼ阻害剤、抗癌剤であるＲａｓファルネシル基転移酵素阻害剤などの薬剤の構成要素であり、これらの薬剤を量産する際の原料として使用される。また、Ｄ−ホモセリンはＤ−アミノ酸であるため、農薬及び医薬分野において大量かつ安価な供給が望まれている。
【０００３】
光学活性なＤ−ホモセリンの製造としては、α−アミノ−γ−ブチロラクトンをフサリウム属、シリンドロカルポン属、及びジベレラ属からなる群より選ばれた属に属する微生物を用いて不斉加水分解する方法（特許文献１）が知られている。しかし、この方法は、立体選択性のないα−アミノ−γ−ブチロラクトンの自発的加水分解が不可避である為、得られるＤ−ホモセリンの光学純度が低い。また、Ｄ−ホモセリンラクトンの製造法として、優先晶出法（非特許文献１）等が知られているが、産物の鏡像体過剰率が明らかにされていない上に、操作が煩雑であり、工業的には適当ではない。
【０００４】
このように、現在、光学活性なＤ−ホモセリン及びＤ−ホモセリンラクトンを簡便に、且つ、工業的に製造する方法は知られていない。
【０００５】
【特許文献１】特開平９−３０８４９７号公報
【非特許文献１】Shiraiwa, T. et al., Chem. Pharm. Bull., 第44巻第2322〜2325頁, 1996年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、簡便かつ効率的なＤ−ホモセリン及びＤ−ホモセリンラクトンの製造方法、並びにそのための手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、前記課題を解決するため、Ｄ−ホモセリンに対しＬ−ホモセリンを選択的に資化分解する微生物をスクリーニングした結果、アルスロバクター属に属する微生物の中にそのような選択的資化分解活性を有する微生物を見出し、それを用いることにより、ラセミ体ＤＬ−ホモセリン中のＬ−ホモセリンを消失せしめ、光学活性なＤ−ホモセリンを簡便に取得し得ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいてなされたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、アルスロバクター属（Arthrobacter）に属し、かつＤ−ホモセリンに対しＬ−ホモセリンを選択的に資化分解することができる微生物に関する。該微生物としては、例えばアルスロバクター・エスピー２−２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９１４）、アルスロバクター・ニコチノボランス２−３（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９１５）若しくはアルスロバクター・エスピー２−７（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９１６）、又はそれらの誘導株が挙げられる。
【０００９】
また本発明は、上記の少なくとも１種の微生物又はその培養物とＤＬ−ホモセリン又はその塩とを接触させてＬ−ホモセリン又はその塩を分解し、Ｄ−ホモセリン又はその塩を採取することを特徴とする、Ｄ−ホモセリン又はその塩の製造方法に関する。上記製造方法により得られるＤ−ホモセリン又はその塩は、９０％ｅ．ｅ．以上の鏡像体過剰率を有することが好ましい。
【００１０】
さらに本発明は、上記の少なくとも１種の微生物又はその培養物とＤＬ−ホモセリン又はその塩とを接触させてＬ−ホモセリン又はその塩を分解し、Ｄ−ホモセリン又はその塩を採取し、該Ｄ−ホモセリン又はその塩を脱水環化することを特徴とする、Ｄ−ホモセリンラクトンの製造方法に関する。
【００１１】
またさらに本発明は、上記の少なくとも１種の微生物又はその培養物を含有することを特徴とするＬ−ホモセリン分解剤に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、Ｌ−ホモセリンを選択的に資化分解する微生物が提供される。かかる微生物は、ＤＬ−ホモセリン中のＬ−ホモセリンのみを選択的に分解するため、この微生物を利用して医薬品又は化学薬品の製造原料として有用なＤ−ホモセリン及びＤ−ホモセリンラクトンを簡便かつ効率的に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、アルスロバクター属に属し、かつＤ−ホモセリンに対しＬ−ホモセリンを選択的に資化分解することができる微生物、並びにこれらを利用したＤ−ホモセリン及びＤ−ホモセリンラクトンの製造方法及びＬ−ホモセリン分解剤を提供する。
【００１４】
アルスロバクター属に属し、かつＬ−ホモセリンを選択的に資化分解することができる微生物は、アルスロバクター属に属する微生物の中からスクリーニングによって得ることができる。例えば、代表的な菌株としては、アルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）２−２、アルスロバクター・ニコチノボランス（Arthrobacter nicotinovorans）２−３及びアルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）２−７が挙げられる。本発明者は、土壌からこれらの菌株を単離し、これらの菌株がＬ−ホモセリンを選択的に資化分解することを見出した。これらの微生物の菌学的性質は、実施例１に示す通りである。
【００１５】
本発明に係る微生物は、後述する微生物の菌学的性質を指標として、土壌、河川水、湖沼水、汚泥などから、Ｌ−ホモセリンに対する選択的資化性に基づき、平板分離法や集積培養法などのスクリーニングを行うことにより得ることができる。
【００１６】
なお、アルスロバクター・エスピー２−２、アルスロバクター・ニコチノボランス２−３及びアルスロバクター・エスピー２−７は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００６年５月１８日付で寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９１４、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９１５、及びＦＥＲＭ  Ｐ−２０９１６が与えられている。
【００１７】
本発明においては、上記のアルスロバクター・エスピー２−２、アルスロバクター・ニコチノボランス２−３及びアルスロバクター・エスピー２−７が好ましいが、これらの誘導株も同様に好ましい。「誘導体」とは、上記菌株から天然に又は化学的若しくは物理的処理によって誘導される菌株であって、依然としてＤ−ホモセリンに対しＬ−ホモセリンを選択的に資化分解する能力を保持する菌株を指す。微生物は、その培養条件（例えば培地組成、温度など）や、化学的若しくは物理的処理（例えばγ線照射など）によって変異が誘発されることが知られている。本発明においては、Ｌ−ホモセリンを選択的に資化分解する能力を保持する限り、そのような誘導株も好ましく用いることができる。ある菌株がＬ−ホモセリンを選択的に資化分解する能力を保持する能力は、例えば実施例２に記載のように、ＤＬ−ホモセリンを含む培養液中で菌株を一定時間にわたり培養し、培養後の培養液中のＤ−ホモセリン含量又はＬ−ホモセリン含量を測定することによって簡便に確認することができる。
【００１８】
本発明に係る微生物は、Ｌ−ホモセリンを選択的に資化分解するものであるため、これを用いて、ＤＬ−ホモセリン中のＬ−ホモセリンのみを資化分解し、Ｄ−ホモセリンを簡便かつ効率的に取得することができる。また、このようにして得たＤ−ホモセリンをＤ−ホモセリンラクトンに脱水環化することによって、Ｄ−ホモセリンラクトンを効率的に製造することができる。
【００１９】
従って、本発明に係るＤ−ホモセリン又はＤ−ホモセリンラクトンの製造方法（以下、「本製造方法」ともいう）は、Ｌ−ホモセリンを選択的に資化分解する微生物を利用することにより、ＤＬ−ホモセリン又はその塩中のＬ−ホモセリン又はその塩を選択的に分解し、Ｄ−ホモセリン又はその塩を製造することを特徴とするものである。
【００２０】
本製造方法では、ＤＬ−ホモセリン又はその塩を、上述した微生物の菌体又はその培養物と接触させることで、ＤＬ−ホモセリン又はその塩中のＬ−ホモセリン又はその塩を選択的に分解することができる。出発物質であるラセミ体ＤＬ−ホモセリン又はその塩は、市販品を利用してもよいし（例えば昭和化学カタログ番号0808-8121）、又は化学合成により得てもよい。例えば、ＤＬ−ホモセリンは、（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトンの加水分解によって得ることができる（Armstrong M.D., J. Amer. Chem. Soc.,第70巻第1756〜1759項,1948年）。また、ＤＬ−ホモセリンの塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩などの塩が挙げられる。
【００２１】
本製造方法に使用する微生物又はその培養物は、前述した微生物のうちの１種を単独で、又は複数種を組み合わせて使用することができ、また１種又は複数種の微生物から調製された培養物を使用してもよい。
【００２２】
微生物の培養物を得るには、通常の培養条件を用いて上記微生物を培養すればよく、例えば、培地として、炭素源、窒素源、無機塩類を含有する培地を用いて、各種培養条件を用いて培養を行うことができる。炭素源としては、澱粉又はその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα−澱粉等の炭水化物などを用いることができる。具体例としては、例えば、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘薯澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロース等が挙げられる。窒素源としては、ポリペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー又は大豆若しくは大豆粕等の抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物を用いることができる。そして、無機塩類としては、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄等の鉄イオン含有化合物、リン酸カリウム塩、リン酸ナトリウム塩等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、塩化ナトリウム等のナトリウム塩を用いることができる。また培地は、固体培地及び液体培地のいずれも使用することができる。培養方法も特に限定されるものではなく、振盪培養、通気撹拌培養、静置培養などの公知の培養方法を用いることができる。ここで、培養の最適条件に関しては、用いる微生物の種類により異なるため、上記培地及び培養方法は用いる微生物に適するものに適宜選択及び調製される。また、温度、ｐＨ、培養期間等のその他の培養条件も、微生物が生育し、Ｌ−ホモセリンの分解能力を保持し得る条件であれば適宜選択されて培養が行われることが好ましい。例えば、培養は、振盪培養若しくは通気撹拌培養等の好気的条件下において、培地をｐＨ３〜９の範囲、好ましくはｐＨ６〜８に調整し、温度１０〜５０℃の範囲、好ましくは２０〜３０℃で実施し、通常１〜１５日間培養するのが望ましい。
【００２３】
ここで微生物の培養物は、その培養物のまま使用してもよいし、培養物を濾過、遠心分離若しくは脱水等の精製処理を行って使用してもよいし、又は培養物を水等で希釈して使用してもよい。
【００２４】
微生物又はその培養物の形態は特に限定されず、微生物の菌体又はその培養物のそのままの形態、微生物の菌体又はその培養物を適当な溶媒中に溶解若しくは懸濁した形態、あるいは微生物の菌体又はその培養物を保存可能なように凍結又は乾燥した形態など、任意の形態をとることができる。このような形態は、当技術分野で公知の方法に従って適宜調製することができる。
【００２５】
使用する微生物の菌体又はその培養物の量は、使用する微生物の種類、ＤＬ−ホモセリンの存在量などを考慮して、望ましい結果が得られるように決定しうる。
【００２６】
さらに、Ｌ−ホモセリンの選択的分解をさらに効率的に行うために、上記微生物又はその培養物と共にその他の追加成分を使用してもよく、そのような追加成分としては、限定するものではないが、リン酸二水素カリウムなどのリン酸塩や酵母エキス、ビオチン等が挙げられる。
【００２７】
本製造方法においては、上記微生物又はその培養物を、ＤＬ−ホモセリンと接触させるが、ここで「接触」とは、ＤＬ−ホモセリンと共に上記微生物の菌体を培養すること、ＤＬ−ホモセリンと上記微生物の菌体又は培養物とを混合すること、ＤＬ−ホモセリンに上記微生物の菌体又はその培養物を散布すること、上記微生物の菌体又はその培養物を不織布等に接種したものをＤＬ−ホモセリンに静置することなどを指す。
【００２８】
好ましい方法の１つとしては、ＤＬ−ホモセリンを含む培地で前記微生物を培養する方法である。この場合、ＤＬ−ホモセリン溶液に必要に応じ炭素源、窒素源、無機塩等を加えて培地とする。培地組成は特に限定されるものではなく、上述した微生物の培養に適切なものであればよい。培養は、振盪培養若しくは通気撹拌培養等の好気的条件下において、培地をｐＨ３〜９の範囲、好ましくはｐＨ６〜８に調整し、温度１０〜５０℃の範囲、好ましくは、２０〜３０℃で実施し、通常１〜１５日間培養するのが望ましいが、この条件以外にあっても微生物が生育し、Ｌ−ホモセリンが消失する条件であれば何ら制限されない。
【００２９】
また他の好ましい方法としては、肉汁培地など適当な培地で前記微生物を培養し、得られた菌体をＤＬ−ホモセリン溶液に懸濁し、震盪又は通気攪拌する方法である。Ｌ−ホモセリンの資化を促す為に飢餓培養等の処理を菌体に対して施してもよい。ＤＬ−ホモセリン溶液の組成には何ら限定は無く、必要に応じ、無機塩類やビタミン等を加えてもよい。菌体懸濁液のｐＨや温度等の諸条件は、使用する微生物、ＤＬ−ホモセリン含有量、採用する培養方法などによって異なるが、Ｌ−ホモセリンが活発に資化され、消失する条件であれば何ら限定されるものではなく、当業者であれば適宜設定することができる。
【００３０】
以上の操作によりホモセリンのＤ−体を含む培養液又は懸濁液が得られるので、通常の単離・精製方法、例えば遠心分離、タンパク質又は核酸分解試薬を使用して、微生物菌体又はその他の培養成分を取り除く。続いて、Ｄ−ホモセリンは、溶媒を留去することにより採取できる。更に必要に応じて、再結晶、再沈殿、クロマトグラフィー等の当技術分野で公知の任意の方法を単独で又は組み合わせて用いることによりＤ−ホモセリンを精製することができる。
【００３１】
このようにして製造されるＤ−ホモセリンは、光学純度（鏡像体過剰率）が高い。例えば、Ｄ−ホモセリンの鏡像体過剰率は、約７０％ｅ．ｅ．以上、好ましくは約８０％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは約９０％ｅ．ｅ．以上、最も好ましくは９５％〜１００％ｅ．ｅ．である。
【００３２】
また、ホモセリンとホモセリンラクトンは平衡混合物として存在し、この平衡は、酸性条件下ではホモセリンラクトン方向に、そしてアルカリ性条件ではホモセリンの方向に傾くことが知られている。従って、上述のようにして得られたＤ−ホモセリンを酸性条件下での還流などの公知の方法で脱水環化することによって、Ｄ−ホモセリンラクトンを製造することができる。例えば、２規定濃度の塩酸で、２時間の煮沸処理を行うことにより、ホモセリンはホモセリンラクトンに変換することができる。しかしながら、本製造方法においては、ホモセリンからホモセリンラクトンを製造する公知の方法であれば特に限定されるものではない。
【００３３】
以上のようにして、本発明に係る微生物又はその培養物を用いることにより、簡便かつ効率的にＤ−ホモセリン及びＤ−ホモセリンラクトンを製造できる。
【００３４】
また本発明に係る微生物は、Ｌ−ホモセリンを選択的に資化分解することができるものであるため、本発明はさらに、上記微生物又はその培養物を含むＬ−ホモセリンの分解剤を提供する。
【００３５】
本分解剤は、前述した微生物のうちの１種を単独で、又は複数種を組み合わせて含有することができ、また１種又は複数種の微生物から調製された培養物を含有してもよい。
【００３６】
本分解剤の形態は特に限定されず、微生物の菌体又はその培養物のそのままの形態、微生物の菌体又はその培養物を適当な溶媒中に溶解若しくは懸濁した形態、あるいは微生物の菌体又はその培養物を保存可能なように凍結又は乾燥した形態など、任意の形態をとることができる。このような形態は、当技術分野で公知の方法に従って適宜調製することができる。
【００３７】
また、本分解剤は、他の成分を含んでもよい。他の成分は、微生物の菌体又はその培養物のＬ−ホモセリン選択的分解能を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、例えば、リン酸塩などのｐＨ調整剤、酵母エキスやビオチンなどの賦活剤、カルボキシメチルセルロースや乳糖などの賦形剤等が挙げられる。
【００３８】
本分解剤は、Ｌ−ホモセリンと接触させて使用するが、ここで「接触」とは、Ｌ−ホモセリンと共に本分解剤に含まれる菌体を培養すること、Ｌ−ホモセリンと本分解剤とを混合することなどを指す。
【００３９】
また、使用量は、使用する微生物の種類、Ｌ−ホモセリンの存在量などを考慮して、望ましい結果が得られるように決定しうる。
【００４０】
以下、本説明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトン臭化水素酸塩１ｇを７０ｍｌの蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウムによりｐＨを９．５に調整後、室温に１時間放置した。この溶液にリン酸二水素カリウム０．３ｇを加え、ｐＨを７．０に調整し、オートクレーブにて１２１℃で５分間熱処理した。この処理により化学量論的に（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトンは、ＤＬ−ホモセリンに開環した。
【００４２】
この溶液に硫酸マグネシウム７水和物０．０３ｇ、塩化カルシウム２水和物０．０１ｇ、塩化ナトリウム０．０１ｇを加え、ｐＨを７．０に再調整し、蒸留水を加えて１００ｍｌに調整した後、オートクレーブにて１２１℃で１５分間加熱滅菌し集積培地とした。土壌試料０．５ｇを５ｍｌの滅菌水に懸濁し、上澄み０．５ｍｌを集積培地５ｍｌに接種し、３０℃で震盪培養した。菌が増殖し白濁が認められた場合は、集積培地を１．５％の寒天で固形化した平板培地に培養液を適宜希釈した後に塗布し、生じた微生物のコロニーを分離した。次いで、（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトン臭化水素酸塩の濃度を５％に高め、０．１％の酵母エキスを追加した培地を同様に調製し、これに分離株を接種し、３０℃で震盪培養した。この培地で良好に増殖した３分離株（２−２株、２−３株、２−７株）を選び、実施例２に供した。尚、これらの分離株は、以下の菌学的性質を有する。
【００４３】
（１）アルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）２−２の菌学的性質
１．形態：  長さ１．５〜２．５μｍ、幅０．６〜０．８μｍの桿菌
２．多形性：  有り
３．グラム染色：  陽性
４．抗酸性：  無し
５．酸素に対する態度：  好気性
６．芽胞形成能：  無し
７．オキシターゼ：  陰性
８．カタラーゼ：  陽性
９．ウレアーゼ：  陰性
１０．ＤＮアーゼ：  陽性
１１．ＭＲテスト：  陰性
１２．ＶＰテスト：  陰性
１３．運動性：  無し
１４．硝酸塩還元能：  無し
１５．色素生産性：  黄色の色素を生産
１６．ゼラチンの加水分解能：  陽性
１７．エスクリンの加水分解能：  陽性
１８．澱粉の加水分解能：  陽性
１９．Ｏ−Ｆテスト：  Ｄ−グルコースから酸を生成せず
２０．リボースからの酸の生成：  陰性
２１．マンニトールからの酸の生成：  陰性
２２．シュークロースからの酸の生成：  陰性
２３．キシロースからの酸の生成：  陰性
２４．マルトースからの酸の生成：  陰性
２５．ラクトースからの酸の生成：  陰性
【００４４】
本菌の脂肪酸組成は、アルスロバクター属の特徴と一致した。即ち、１２−メチルテトラデカン酸及び１４−メチルヘキサデカン酸が主要な脂肪酸であった。本菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列はアルスロバクター・ニトログアジァコリクス（Arthrobacter nitroguaiacolicus）と９９％の相同性を示した。しかしながら、アルスロバクター・ニトログアジァコリクスがオキシターゼ反応陽性に対して、本菌は陰性であり、生理学的特徴は一致しなかった。また、他の既知のアルスロバクター属細菌とも生理学的特徴が一致せず、本菌は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）により、アルスロバクター・エスピー（Arthrobactersp.）と同定された。本菌は、アルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）２−２と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２０９１４として寄託されている。
【００４５】
（２）アルスロバクター・ニコチノボランス（Arthrobacter nicotinovorans）２−３の菌学的性質
１．形態：  長さ１．５〜２．５μｍ、幅０．６〜０．８μｍの桿菌
２．多形性：  有り
３．グラム染色：  陽性
４．抗酸性：  無し
５．酸素に対する態度：  好気性
６．芽胞形成能：  無し
７．オキシターゼ：  陰性
８．カタラーゼ：  陽性
９．ウレアーゼ：  陰性
１０．ＤＮアーゼ：  陽性
１１．ＭＲテスト：  陰性
１２．ＶＰテスト：  陰性
１３．運動性：  無し
１４．硝酸塩還元能：  無し
１５．色素生産性：  黄色の色素を生産
１６．ゼラチンの加水分解能：  陽性
１７．エスクリンの加水分解能：  陽性
１８．澱粉の加水分解能：  陽性
１９．Ｏ−Ｆテスト：  Ｄ−グルコースから酸を生成せず
２０．リボースからの酸の生成：  陰性
２１．マンニトールからの酸の生成：  陰性
２２．シュークロースからの酸の生成：  陰性
２３．キシロースからの酸の生成：  陰性
２４．マルトースからの酸の生成：  陰性
２５．ラクトースからの酸の生成：  陰性
２６．１０％  ＮａＣｌ存在下での生育：  陰性
【００４６】
本菌の脂肪酸組成は、アルスロバクター属の特徴と一致した。即ち、１２−メチルテトラデカン酸及び１４−メチルヘキサデカン酸が主要な脂肪酸であった。本菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列は、アルスロバクター・ニコチノボランス（Arthrobacter nicotinovorans）と１００％の相同性を示した。また、生理学的諸性質もアルスロバクター・ニコチノボランスと一致した。本菌は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）により、アルスロバクター・ニコチノボランス（Arthrobacter nicotinovorans）と同定された。本菌は、アルスロバクター・ニコチノボランス（Arthrobacter nicotinovorans）２−３と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２０９１５として寄託されている。
【００４７】
（３）アルスロバクター・エスピー（Arthrobactersp.）２−７の菌学的性質
１．形態：  長さ１．５〜２．５μｍ、幅０．６〜０．８μｍの桿菌
２．多形性：  有り
３．グラム染色：  陽性
４．抗酸性：  無し
５．酸素に対する態度：  好気性
６．芽胞形成能：  無し
７．オキシターゼ：  陰性
８．カタラーゼ：  陽性
９．ウレアーゼ：  陰性
１０．ＤＮアーゼ：  陽性
１１．ＭＲテスト：  陰性
１２．ＶＰテスト：  陰性
１３．運動性：  無し
１４．硝酸塩還元能：  無し
１５．色素生産性：  黄色の色素を生産
１６．ゼラチンの加水分解能：  陽性
１７．エスクリンの加水分解能：  陽性
１８．澱粉の加水分解能：  陽性
１９．Ｏ−Ｆテスト：  Ｄ−グルコースから酸を生成せず
２０．リボースからの酸の生成：  陰性
２１．マンニトールからの酸の生成：  陰性
２２．シュークロースからの酸の生成：  陰性
２３．キシロースからの酸の生成：  陰性
２４．マルトースからの酸の生成：  陰性
２５．ラクトースからの酸の生成：  陰性
【００４８】
本菌の脂肪酸組成は、アルスロバクター属の特徴と一致した。即ち、１２−メチルテトラデカン酸及び１４−メチルヘキサデカン酸が主要な脂肪酸であった。本菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列はアルスロバクター・ニトログアジァコリクス（Arthrobacter nitroguaiacolicus）と９９％の相同性を示した。しかしながら、アルスロバクター・ニトログアジァコリクスがオキシターゼ反応陽性に対して、本菌は陰性であり、生理学的特徴は一致しなかった。また、他の既知のアルスロバクター属細菌とも生理学的特徴が一致せず、本菌は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）により、アルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）と同定された。本菌は、アルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）２−７と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２０９１６として寄託されている。
【実施例２】
【００４９】
本実施例では、実施例１で単離した微生物のＬ−ホモセリン分解活性について試験した。
【００５０】
（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトン臭化水素酸塩５ｇを７０ｍｌの蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウムによりｐＨを９．５に調整後、室温に１時間放置した。この溶液にリン酸二水素カリウム０．３ｇを加え、ｐＨを７．０に調整し、オートクレーブにて１２１℃で５分間熱処理した。この処理により化学量論的に（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトンは、ＤＬ−ホモセリンに開環した。
【００５１】
この溶液に酵母エキス０．１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．０３ｇ、塩化カルシウム２水和物０．０１ｇ、塩化ナトリウム０．０１ｇを加え、ｐＨを７．０に再調整し、蒸留水を加えて１００ｍｌに調整した後、試験管に５ｍｌずつ分注し、オートクレーブにて１２１℃で１５分間加熱滅菌した。各試験管内の培地に表１に記載した菌株をそれぞれ植菌し、３０℃で４０〜７０時間培養した。培養液から遠心分離により菌体を除き、培養液上清を得た。
【００５２】
培養液上清に残存しているホモセリンのＤ−体及びＬ−体は、光学分割カラム［ダイセル化学工業社製ＣｒｏｗｎＰａｋ ＣＲ（＋）］を用いた高速液体クロマトグラフィーで定量し、Ｄ−ホモセリンの残存率及び光学純度（鏡像体過剰率）を算出した。その結果は、表１に示す通りである。
【００５３】
【表１】
2008022844.tif 000002
【００５４】
以上の結果から、実施例１で単離された微生物は、ＤＬ−ホモセリン中のＬ−ホモセリンを選択的に資化分解することが確認された。
【実施例３】
【００５５】
（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトン臭化水素酸塩５ｇ及びリン酸二水素カリウム０．３ｇを７０ｍｌの蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウムによりｐＨを７．０に調整後、オートクレーブにて１２１℃で１０分間熱処理した。この処理により化学量論的に（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトンは、ＤＬ−ホモセリンに開環した。
【００５６】
この溶液に酵母エキス０．１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．０３ｇ、塩化カルシウム２水和物０．０１ｇ、塩化ナトリウム０．０１ｇを加え、ｐＨを７．０に再調整し、蒸留水を加えて１００ｍｌに調整した後、試験管に５ｍｌずつ分注し、オートクレーブにて１２１℃で１５分間加熱滅菌した。この培地にアルスロバクター・ニコチノボランス２−３を接種し、３０℃で１７時間培養し、種培養とした。
【００５７】
二本の５００ｍｌ容坂口フラスコに同じ培地を１００ｍｌずつ分注し、オートクレーブにて１２１℃で１５分間加熱滅菌した。この坂口フラスコに対し前述の種培養を５ｍｌずつ植菌し、３０℃で５３時間震盪培養した。培養液の一部を取り、光学分割カラム［ダイセル化学工業社製ＣｒｏｗｎＰａｋ ＣＲ（＋）］を用いた高速液体クロマトグラフィーでその上清を分析し、Ｌ−ホモセリンの消失を確認した後、培養液から遠心により菌体を除き、培養液上清を得た。
【００５８】
培養液上清のｐＨを塩酸でｐＨ７．０に調整後、沸騰水浴に入れ、９０℃以上の温度に１０分間保ち、溶存しているタンパク質等の高分子を変性させた。冷却後、遠心により沈殿物を除いた。さらに除核酸の為に２００ｍｌの培養液上清に対し１２５０ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（ノバジェン社）を加え、室温に３時間放置した。
【００５９】
本培養液上清を、イオン交換樹脂アンバーライトＩＲ１２０Ｂ（ローム・アンド・ハース・ジャパン社）を充填したカラム（内径２６ｍｍ、長さ２００ｍｍ）に供し、水洗の後、０．２Ｍ濃度のアンモニア水で溶出を行った。ホモセリンを含む画分を集め、ｐＨを７．０に調整し、活性炭で脱色した後、ロータリーエバポレーターを用いて約２０ｍｌに濃縮した。この濃縮液に対し２５０ｍｌの熱エタノールを攪拌しつつ加え、引き続き攪拌しつつ、室温に一晩放置した。析出物を濾過により集め、エタノールで洗浄後、乾燥させ、１．６ｇのＤ−ホモセリンを得た。即ち、Ｄ−ホモセリンに対するモル収率は、４９％であった。
【００６０】
得られたＤ−ホモセリンを光学分割カラム［ダイセル化学工業社製ＣｒｏｗｎＰａｋ ＣＲ（＋）］を用いた高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、９９．９％ｅ．ｅ．以上の光学純度を有していた。またイナートシルＯＤＳ−３カラム（４．６×２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）を用いて、７．５ｍＭの１−ペンタンスルホン酸ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）を移動層とする高速液体クロマトグラフィーで、本標品を分析したところ、９９．６％以上の純度を有することが確認された。
【実施例４】
【００６１】
（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトン臭化水素酸塩１．５ｇ及びリン酸二水素カリウム０．０６８ｇを７ｍｌの蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウムによりｐＨを７．０に調整後、オートクレーブにて１２１℃で１０分間熱処理した。この溶液に酵母エキス０．０２ｇを加え、ｐＨを７．０に再調整し、オートクレーブにて１２１℃で１５分間加熱滅菌した。
【００６２】
肉汁培地にアルスロバクター・ニコチノボランス２−３を接種し、３０℃で２４時間震盪培養した後、菌体を遠心分離により集めた。菌体を滅菌蒸留水で二回洗浄し、その１ｇ（乾燥重量０．１３ｇに相当）を上記の溶液に懸濁した。滅菌蒸留水を加えて体積を１０ｍｌに調整した後、この反応液を３０℃で好気的に震盪した。
【００６３】
反応液を経時的に採取し、その上清に残存しているホモセリンのＤ−体及びＬ−体を光学分割カラム［ダイセル化学工業社製ＣｒｏｗｎＰａｋ ＣＲ（＋）］を用いた高速液体クロマトグラフィーで定量し、残存しているＤ−体の鏡像体過剰率を算出した。その結果を、図１に示す。７１時間の反応により、光学分割が達成された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明により、Ｌ−ホモセリンを選択的に資化分解する微生物が提供される。かかる微生物は、ＤＬ−ホモセリン中のＬ−ホモセリンのみを選択的に分解するため、この微生物を利用して医薬品又は化学薬品の製造原料として有用なＤ−ホモセリン及びＤ−ホモセリンラクトンを簡便かつ効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明のアルスロバクター・ニコチノボランス２−３の菌体を１５％濃度の（ＲＳ）−α−アミノ−γ−ブチロラクトン臭化水素酸塩に作用させた場合における、Ｄ−ホモセリンの鏡像体過剰率の経時変化を測定した結果を示すグラフである。
【図１】
2008022844.tif 000003