(57)【要約】【課題】一般の光学顕微鏡を使用して、アクリジンオレンジ（ＡＯ）染色によるマラリアの迅速診断法を適用して、マラリア原虫を肉眼で迅速、簡単、明りょうに観察することを可能する装置と方法を提供すること。【解決手段】少なくとも５１０〜７２０ｎｍの範囲では光線の透過率が０．１％以下の分光特性を有し、かつ、少なくともアクリジンオレンジの励起波長である４６０ｎｍ近傍と４９０ｎｍ近傍では光線の透過率が８０％以上の分光特性を有し、かつ、４９０ｎｍ近傍から５１０ｎｍの範囲内で透過率が急激に下降する分光特性を有する励起フィルターと、少なくとも５１０ｎｍ以下の波長の範囲では該光線を完全にカットする吸収フィルターを用いること。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィルターを透過する光線の波長が、少なくとも５１０〜７２０ｎｍの範囲では、該光線の透過率が０．１％以下の分光特性を有し、かつ、少なくともアクリジンオレンジの励起波長である４６０ｎｍ近傍と４９０ｎｍ近傍では光線を透過させる分光特性を有することを特徴とするマラリア顕微鏡用の励起フィルター。
【請求項２】
フィルターを透過する光線の波長が、少なくとも５１０〜７２０ｎｍの範囲では、該光線の透過率が０．１％以下の分光特性を有し、かつ、少なくともアクリジンオレンジの励起波長である４６０ｎｍ近傍と４９０ｎｍ近傍では光線の透過率が８０％以上の分光特性を有することを特徴とするマラリア顕微鏡用の励起フィルター。
【請求項３】
フィルターを透過する光線の波長が、少なくとも５１０〜７２０ｎｍの範囲では、該光線の透過率が０．１％以下の分光特性を有し、かつ、少なくともアクリジンオレンジの励起波長である４６０ｎｍ近傍と４９０ｎｍ近傍では光線の透過率が８０％以上の分光特性を有し、かつ、４９０ｎｍ近傍から５１０ｎｍの範囲内で透過率が急激に下降することを特徴とするマラリア顕微鏡用の励起フィルター。
【請求項４】
フィルターを透過する光線の波長が、少なくとも５１０〜７２０ｎｍの範囲では、該光線の透過率が０．１％以下の分光特性を有し、かつ、少なくとも４００〜４９０ｎｍの範囲では、該光線の透過率が８０％以上の分光特性を有し、４９０ｎｍから５１０ｎｍの範囲内で透過率が急激に下降することを特徴とするマラリア顕微鏡用の励起フィルター。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれかの請求項に記載された励起フィルターと、フィルターを透過する光線の波長が少なくとも５１０ｎｍ以下の波長の可視光線の範囲では該光線を完全にカットする吸収フィルターを用いることを特徴とするマラリア顕微鏡。
【請求項６】
光源よりの光を集光させる集光レンズ筒を経た光を所望角度に反射せしめるミラー筒と、かかる反射された光を通すステージと、対物レンズと、接眼レンズとを具備し、前記ステージ下部のコンデンサー部には励起フィルターを、眼鏡筒部には吸収フィルターを各々切り換え自在に配置してなる光学顕微鏡において、
該励起フィルターが請求項１から４までのいずれかの請求項に記載された励起フィルターであり、かつ、該吸収フィルターを透過する光線の波長が少なくとも５１０ｎｍ以下の波長の範囲では該光線を完全にカットする吸収フィルターを用いることを特徴とするマラリア顕微鏡。
【請求項７】
光源から該励起フィルターを通過させてアクリジンオレンジの励起波長の光線を生じさせ、該光線をアクリジンオレンジ溶液により染色された血液の塗抹標本に照射して蛍光波長の励起発光線を生じさせ、該励起発光線を該吸収フィルターに入れて通過させ、該吸収フィルターを通過した光線によりマラリア原虫を観察する方法において、
該励起フィルターとして、請求項１から４までのいずれかの請求項に記載された励起フィルターを用い、かつ、吸収フィルターとして、フィルターを透過する光線の波長が少なくとも５１０ｎｍ以下の波長の範囲では該光線を完全にカットする吸収フィルターを用いることを特徴とするマラリア原虫を観察する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学顕微鏡を使用してマラリア原虫を観察するための顕微鏡及びそれに使用する励起フィルター、並びにこれらを用いたマラリア原虫の観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、マラリア原虫（Plasmodium）の感染に起因する世界で猛威をふるっている感染症の一つで、特有の熱発作とそれに続発する貧血、脾腫のほか多彩な病態を呈する疾患であり、アフリカ・南米・東南アジア等の蔓延地における感染者数は３億人以上、死者もアフリカの子供を中心に年間２００万人以上と報告されている。
【０００３】
ＷＨＯをはじめ多くの研究機関で、マラリアワクチンの開発・新しいマラリア治療薬の開発・媒介蚊の防除対策などのマラリア対策が推進されているが、いまだにマラリアを根絶するための具体的な解決方法は見いだされていない。さらに、マラリアの診断にも大きな問題が残されたままであり、現在でもマラリアの確定診断は、血液塗抹標本にギームザ染色法を適用してマラリア原虫の存在を証明する方法が最も確実とされている。
【０００４】
このギームザ染色法は、１９０２年にハンブルグ熱帯病研究所のグスタフ・ギームザ(Gustav Giemsa)が発表した方法であり、長い間使用されてきているが、判定に時間がかかること、診断精度が検査者の熟練度に大きく依存することなどの欠点を持つ。実際、マラリア蔓延地では、診断結果を知るのに何日も待たされることが多いという実情がある。
【０００５】
これらの欠点を補う検査法として、ＩＦＡ・ＥＬＩＳＡ法など各種の免疫学的診断法やＤＮＡプローブを用いた診断法が開発されつつある。しかし、前者は、過去の感染も陽性となるため結果の判定が難しく、後者は、処理の複雑さと診断の精度の問題があり、いずれも実際のマラリア蔓延地における診断法として応用するには相当な改良が必要であって、フィールドにおける実際の日常検査法となるには至っていない。
【０００６】
本発明の発明者の一人である川本文彦は、上記のギームザ染色法に代わる新しい染色方法として、２つの蛍光色素を用いた原虫感染症の新しい染色診断法を検討した。この研究の結果については、非特許文献１と２を参照されたい。この新しい染色診断方法は、ＤＡＰＩ（4’, 6-diamidino-2-phenylindole）とＰＩ(propidium iodide)の２つの蛍光色素を用いるものであって、ＤＮＡに結合するＤＡＰＩにより核（およびミトコンドリアＤＮＡ）を染め、次いで、ＤＮＡとＲＮＡに結合するＰＩで染色するとＤＮＡ以外の核酸、すなわち細胞質のＲＮＡ（細胞質）が染色されて、容易に核と細胞質の弁別染色が可能となることを利用する。この方法を用いると、各種原虫類が極めて短時間に染色・観察され、特に、住血性原虫のマラリアやトリパノソーマ原虫などは、細胞質が赤く染まることで細胞の輪郭が明りょうとなり、また、従来のギームザ法と同様の形態として観察されることから容易にこれらを同定することができる。実験室内での観察では、この方法によりマラリアの各ステージの同定も可能であり、種類の鑑別もさほど難しくなく、ギームザ染色による観察結果とほぼ同様の結果を得ることができた。
【０００７】
このＤＡＰＩ／ＰＩ法は、マラリアの簡易迅速診断法として応用が可能であるが、励起波長が紫外（ＵＶ）域にあるため、通常の光学顕微鏡を用いて蛍光染色された像をみる観察方法をとることは不可能であり、高価な蛍光顕微鏡の使用が必要となるが、熱帯のマラリア蔓延地域において高価な蛍光顕微鏡を多数備えることは、事実上不可能であるという事情があった。
【０００８】
川本文彦は、更に研究を重ね、アクリジンオレンジ（ＡＯ）染色によるマラリアの迅速診断法を考案した。この研究成果は、非特許文献３と４に示されている。この新しい迅速診断法は、ＡＯのＢ励起域の色素である性質を利用するものであり、高価な水銀ランプを使わなくとも干渉フィルターとハロゲンもしくはＬＥＤ光源との簡単な組み合わせで観察を可能とするものである。その染色液の作製と染色方法を次に記載する。
【０００９】
〈染色液の作製方法〉
ＡＯは、シグマ製のＡ−４９２１を１０ｍｇ／ｍｌとなるように０．１mol／ｌの滅菌済みトリス緩衝液（ｐＨ７．０〜７．５）に溶解しＮａＮ３を０．５〜１．０％（ｗ／ｖ）添加してストック液を作製する。緩衝液はリン酸緩衝液やPBSでもよい。これを滅菌水で１００倍に希釈し染色液を作る。ストック液、染色液ともに冷暗所に保存するか、長時間使用しない場合には凍結保存する。
【００１０】
〈染色方法〉
末梢血の薄層塗抹標本をメタノール固定し、風乾する。染色方法は、染色液をカバーグラスに２、３滴載せ、逆さにして薄層塗抹標本に当てがうのみで、わずか１秒で済む。あるいは、ティッシュペーパーの上にカバーグラスを置き、染色液を載せて薄層塗抹標本を逆さに載せて染色してもよい。いずれもＡＯ染色液を瞬時に拡散させるためで、染色むらが少なくなる。また、４種類の鑑別には塗抹の端の観察が重要なので、必ず１滴のＡＯ液が塗抹の端に拡がるようにする。
【００１１】
ＡＯ染色ではＤＮＡとＲＮＡとが染色され、核は緑〜黄白色、細胞質は赤〜橙色に染まる。ＡＯ染色液を載せすぎると核も赤く染まり、逆に少ないと細胞質が赤く染まらないので注意を要する。
【００１２】
特許文献１は、上記のアクリジンオレンジ（ＡＯ）染色を利用してマラリア原虫や住血性寄生虫等を迅速かつ簡単に観察をすることを可能とした顕微鏡を開示している。しかし、マラリア原虫を明りょうに観察するためには、使用する励起フィルターと吸収フィルターの特性が深く関係し、マラリア原虫の明りょうな観察の成否を決定することが知られている。
【００１３】
本発明の発明者達は、高価な蛍光顕微鏡を使用することなく、特許文献１に例示される普通の光学顕微鏡の使用を前提にアクリジンオレンジ（ＡＯ）染色法を適用してマラリア原虫を明りょうに観察することを可能とする迅速かつ簡単な方法について研究し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
【非特許文献１】Kawamoto F, Kumada N: Fluorescence probes for detection of protozoan parasites.  Parasitol Today 3: pp. 284-286, 1987
【非特許文献２】川本文彦：蛍光色素による各種原虫感染症の迅速診断の試み、臨床検査  32：pp. 803-806,  1988
【非特許文献３】Kawamoto F： Rapid diagnosis of malaria by florescence microscopy with light microscope and interference filter. Lancet 337: pp. 200-202, 1992
【非特許文献４】Kawamoto F, Billingsley PF： Rapid diagnosis of malaria by florescence microscopy.  Parasitol Today 8: pp. 69-71, 1992
【特許文献１】特開平９−１７９０３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、一般の光学顕微鏡を使用して、アクリジンオレンジ（ＡＯ）染色によるマラリアの迅速診断法を適用して、マラリア原虫を肉眼で迅速、簡単、明りょうに観察することを可能する装置と方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に係るマラリア顕微鏡用の励起フィルターは、フィルターを透過する光線の波長が、少なくとも５１０〜７２０ｎｍの範囲では、該光線の透過率が０．１％以下の分光特性を有し、かつ、少なくともアクリジンオレンジの励起波長である４６０ｎｍ近傍と４９０ｎｍ近傍では光線を透過させる分光特性を有する、好ましくは、４６０ｎｍ近傍と４９０ｎｍ近傍では光線の透過率が８０％以上の分光特性を有することを特徴とするものである。
【００１７】
本発明に係るマラリア顕微鏡用の励起フィルターは、フィルターを透過する光線の波長が、少なくとも５１０〜７２０ｎｍの範囲では、該光線の透過率が０．１％以下の分光特性を有し、かつ、少なくともアクリジンオレンジの励起波長である４６０ｎｍ近傍と４９０ｎｍ近傍では光線の透過率が８０％以上の分光特性を有し、かつ、４９０ｎｍ近傍から５１０ｎｍの範囲内で透過率が急激に下降することを特徴とするものである。
【００１８】
本発明に係るマラリア顕微鏡用の励起フィルターは、フィルターを透過する光線の波長が、少なくとも５１０〜７２０ｎｍの範囲では、該光線の透過率が０．１％以下の分光特性を有し、かつ、少なくとも４００〜４９０ｎｍの範囲では、該光線の透過率が８０％以上の分光特性を有し、４９０ｎｍから５１０ｎｍの範囲内で透過率が急激に下降することを特徴とするものである。
【００１９】
本発明に係るマラリア顕微鏡は、上記のいずれかの励起フィルターと、フィルターを透過する光線の波長が少なくとも５１０ｎｍ以下の波長の可視光線の範囲では該光線を完全にカットする吸収フィルターを用いることを特徴とするものである。
【００２０】
本発明に係るマラリア顕微鏡は、光源よりの光を集光させる集光レンズ筒を経た光を所望角度に反射せしめるミラー筒と、かかる反射された光を通すステージと、対物レンズと、接眼レンズとを具備し、前記ステージ下部のコンデンサー部には励起フィルターを、眼鏡筒部には吸収フィルターを各々切り換え自在に配置してなる光学顕微鏡において、該励起フィルターが上記のいずれかの励起フィルターであり、かつ、該吸収フィルターを透過する光線の波長が少なくとも５１０ｎｍ以下の波長の範囲では該光線を完全にカットする吸収フィルターを用いることを特徴とするものである。
【００２１】
本発明に係るマラリア原虫を観察する方法は、光源から該励起フィルターを通過させてアクリジンオレンジの励起波長の光線を生じさせ、該光線をアクリジンオレンジ溶液により染色された血液の塗抹標本に照射して蛍光波長の励起発光線を生じさせ、該励起発光線を該吸収フィルターに入れて通過させ、該吸収フィルターを通過した光線によりマラリア原虫を観察する方法において、該励起フィルターとして、上記のいずれかの励起フィルターを用い、かつ、吸収フィルターとして、フィルターを透過する光線の波長が少なくとも５１０ｎｍ以下の波長の範囲では該光線を完全にカットする吸収フィルターを用いることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、従来の方法と比較して、マラリア原虫を簡易、迅速、明りょうに観察することを実現すると共に、そのための安価な機器を提供するものであり、世界中のマラリア研究と医療、特に開発途上国におけるマラリア対策と医療に大きな貢献をするものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
［実施例１］
図１は、本発明を実施する上で使用される光学顕微鏡１とそれに使用される光源の全体構成を示す図である。顕微鏡の光源としては、ハロゲンランプもしくはＬＥＤランプを内装し顕微鏡とは別体の光源部２を利用した。この光源部２の側面には、集光レンズ３を内装した集光レンズ筒４が取り付けられている。光学顕微鏡１は、その下部に、集光レンズ筒３からの光を反射する鏡５を内装したミラー筒６が設けられており、その上部には、ミラー筒６からの反射光を通過させるコンデンサレンズ７が検体を戴置させるステージ８の下部に設けられ、更に、対物レンズ９と単眼または双眼の眼鏡筒部１０、接眼レンズ１１を内装した接眼筒部を具備している。上記の構成の光学顕微鏡において、コンデンサレンズ７の下部には励起フィルター１２を、眼鏡筒部１０の下部には、吸収フィルター１３をそれぞれ交換可能に配置する。
【００２４】
上記の吸収フィルターとして、フィルターを透過する光線の波長が少なくとも５１０ｎｍ以下の波長の可視光線の範囲では透過率０．００１％程度となるものを用いた。また、上記の励起フィルターとしては、５１０〜７２０ｎｍの範囲では、透過率が０．１％以下の分光特性を有し、かつ、４００〜４９０ｎｍの範囲では、透過率が８０％以上の分光特性を有し、４９０ｎｍから５１０ｎｍの範囲内で透過率が急激に下降するものを用いた。図２−１は、本発明に係る吸収フィルターと比較例の分光特性を示し、図２−２は、これらの分光特性を対数目盛で示したものである。
【００２５】
患者より採取した血液を塗った塗抹標本スライドグラスにアクリジンオレンジ（ＡＯ）染色液を適量塗付したカバーグラスを重ねて密着させ、塗抹標本の血液を蛍光染色して検体を作成する。次に、この検体を上記光学顕微鏡のステージ８上の所定位置に固定する。
【００２６】
次に、光源部２の電源を入れて光源から発光させ、この光を集光レンズ筒４で集光させて、光学顕微鏡１のミラー筒６に導く。ミラー筒６内の反射鏡５により反射された光は、励起フィルター１２を通過することにより、５１０〜７２０ｎｍの範囲の光線は透過率０．１％以下にカットされて検体に照射される。そうすると、検体中のマラリア原虫の核ＤＮＡが励起して５２０ｎｍ近傍に発光し、肉眼では黄色に観察される蛍光を発する。また、上記照射により、検体中のマラリア原虫の細胞質ＲＮＡが励起して６３０ｎｍ近傍に発光し、肉眼では赤色に観察される蛍光を発する。
【００２７】
励起フィルターを通過した光は、コンデンサレンズ７でコンデンスされ対物レンズ９を通過して吸収フィルター１３に達するが、吸収フィルター１３を通過する際に、５１０ｎｍ以下の可視光線は透過率が０．００１％程度となるまでに吸収される。マラリア原虫からの上記の蛍光光線は極めて弱いので、肉眼による観察の際に、背景となる他の波長の光が強いとこれらの蛍光光線を観察することができないし、マラリア原虫の核ＤＮＡと細胞質ＲＮＡに上記のＢ励起を起こす青色も邪魔となるので、これらをすべて吸収フィルターによりカットするのである。
【００２８】
こうして、接眼レンズを通して見る肉眼には、マラリア原虫の核ＤＮＡが励起して発した黄色の蛍光とマラリア原虫の細胞質ＲＮＡが励起して発した赤色の蛍光とが暗視野の中に明確に浮かび上がり、マラリア原虫の存在を明りょうに確認することができるのである。
【００２９】
図３は、本発明により観察されるマラリア原虫の観察写真であり、図４は、比較例の観察写真であって、それぞれ、明るく光る３個のマラリア原虫が写し出されている。
【００３０】
なお、以上の実施例１では、ハロゲンランプもしくはＬＥＤランプを内装した光源を用いたが、これに限定されるものではなく、太陽の直射光、タングステン光源等を利用することもできる。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、医療機器、医療関連の研究機器などの産業上の分野において、利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明に係る励起フィルターと吸収フィルターを装填された光学顕微鏡とそれに使用される光源の全体構成図である。
【図２−１】本発明に係る吸収フィルターと比較例の分光特性を示した図である。
【図２−２】本発明に係る吸収フィルターと比較例の分光特性を、特に対数目盛を用いて示したものである。
【図３】本発明により観察されるマラリア原虫の観察写真である。
【図４】比較例のフィルターを用いた際に観察されるマラリア原虫の観察写真である。
【符号の説明】
【００３３】
１  光学顕微鏡
２  光源部
３  集光レンズ
４  集光レンズ筒
５  反射鏡
６  ミラー筒
７  コンデンサレンズ
８  ステージ
９  対物レンズ
１０  眼鏡筒部
１１  接眼レンズ
１２  励起フィルター
１３  吸収フィルター
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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