(57)【要約】      （修正有）【課題】安全性の高い脂肪蓄積阻害剤及び脂肪蓄積抑制方法の提供。【解決手段】柑橘類に含まれる化合物Ａ：３'，４'，３，５，６，７，８−ヘプタメトキシフラボン、化合物Ｂ：５−ヒドロキシ−３'，４'，６，７，８−ペンタメトキシフラボン、化合物Ｃ：４'，５，６，７，８−ペンタメトキシフラボン、化合物Ｄ：３'，４'，５，６，７，８−ヘキサメトキシフラボン、化合物Ｅ：３'，４'，５，６，７−ペンタメトキシフラボン及び化合物Ｆ：３'，４'，５，７，８−ペンタメトキシフラボンからなる群からから選ばれた少なくとも１種の化合物を有効成分として含む脂肪蓄積阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物を有効成分として含む脂肪蓄積阻害剤。
【化１】
2008273935.tif 000016
【化２】
2008273935.tif 000017
【化３】
2008273935.tif 000018
【化４】
2008273935.tif 000019
【化５】
2008273935.tif 000020
【化６】
2008273935.tif 000021
【請求項２】
化合物Ｂを有効成分として含む請求項１に記載の脂肪蓄積阻害剤。
【請求項３】
化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物を含む有効成分が、柑橘類の抽出成分である請求項１または２に記載の脂肪蓄積阻害剤。
【請求項４】
化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物を含む有効成分が、柑橘類の粉砕物である請求項１または２に記載の脂肪蓄積阻害剤。
【請求項５】
化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物を含む有効成分が、柑橘類の果皮、未完熟摘果物および未完熟摘果果皮の粉砕物からなる群から選ばれた少なくとも１種である請求項４に記載の脂肪蓄積阻害剤。
【請求項６】
有効成分を含有する柑橘類が紀州みかん、橘、柑子、温州みかん、はるか、八朔、および清見からなる群から選ばれた少なくとも１種の柑橘類である請求項３ないし５のいずれかに記載の脂肪蓄積阻害剤。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載された脂肪蓄積阻害剤を含有する食品または健康食品。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれかに記載された脂肪蓄積阻害剤を含有する食品添加剤。
【請求項９】
請求項１ないし６のいずれかに記載された脂肪蓄積害剤を含有する医薬品。
【請求項１０】
化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物を有効成分として含む脂肪蓄積阻害剤を投与することを特徴とする脂肪蓄積抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、柑橘類に多く含まれる特定の５種類の化合物からなる化合物を有効成分として含有する脂肪蓄積阻害剤および脂肪蓄積抑制方法に関する。
柑橘類に多く含まれる成分を主成分とする本発明の脂肪蓄積阻害剤を摂取することにより、肥満を抑制する効果を有しており、食品、健康食品、食品添加剤、医薬品などの各分野に広く利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
近年、先進諸国では摂取食品の高カロリー化が進んでおり、特に脂質の過剰摂取が、現代の文明病とも言われる肥満を引き起こしている。また、肥満は、高脂血症、動脈硬化、糖尿病等、種々の生活習慣病の原因と密接に関連しているため、健康志向の高まりから社会問題となっている。しかし、肥満を解決するために、摂取食品を制限したり、運動によりカロリーを消費する方法などが多く提案されている。しかし、これらの方法によって肥満を解決するのは容易でないことは周知の通りである。
【０００３】
特許文献１にはみかん科柑橘属果実の全果濃縮物、外皮付生果果実の凍結乾燥粉砕物または外皮付生果果実の凍結乾燥粉砕物のアルコール抽出物からなる健康食品が開示されており、この健康食品を摂取することにより、過酸化脂質の生成が大幅に抑制され、肥満、動脈硬化、各種成人病要因を除去できることが開示されている。
【０００４】
特許文献２には果汁を除去した柑橘類果実の粉末と黄緑色野菜粉末を必須成分とする抗肥満食品が開示されており、実施例には柚子果汁を除去した凍結乾燥物とパセリの凍結乾燥物の凍結乾燥物を混合した散剤を与えて、ラットおよびヒトについて体重測定、中性脂肪（ＴＧ）、コレステロール（ＴＣ）、トランスアミラーゼ（ＧＯＴ，ＧＰＴ）を測定した結果が開示されている。
【０００５】
特許文献３の請求項１にはみかん科の植物を有効成分とする脂肪分解促進剤およびこれを含有する皮膚外用剤組成物が開示されており、請求項２には特にみかん科の植物を有効成分とする脂肪分解促進剤に、キサンチン誘導体、βアドレナリン作用興奮剤、α2アド
レナリン作用抑制剤およびビピリジン誘導体から選ばれる一種または二種以上を配合した脂肪分解促進皮膚外用剤組成物が開示されており、脂肪組織に蓄積された中性脂肪の分解を促進し、肥満の抑制、防止および改善効果が開示されている。
【０００６】
特許文献４の請求項１には、脂肪分解促進剤の発明が開示されており、請求項２には、「化粧料形態」が開示されており、請求項２には「食品形態」が開示されている。そして、実施例には、ラット脂肪細胞に対する脂肪分解活性データが開示されており、別の実施例には「ジェル状クリーム」、さらに別の実施例には化粧水、乳液、さらに別の実施例には食品が開示されており、さらに別の実施例にはジェル状クリームを使用したときのヒップ、ウェストの減少量が開示されており、さらに別の実施例には食品を使用したときの体重の減少量が開示されている。しかし、この特許文献は、いずれも一旦蓄積された脂肪の分解作用を開示しているに過ぎず、本件発明の同じカロリーを摂取した場合の脂肪蓄積を阻害して肥満をもともと抑制する作用を示唆するものではない。
【特許文献１】特開昭５７−２０３０１４号公報
【特許文献２】特開昭６２−４４１４５号公報
【特許文献３】特開平８−８１３８２号公報
【特許文献４】特開２０００−２４７８８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
摂取食品の高カロリー化が進んでおり、特に脂質の過剰摂取が、現代の文明病とも言われる肥満を引き起こしており、肥満は、高脂血症、動脈硬化、糖尿病等、種々の生活習慣病の原因と密接に関連しているため、健康志向の高まりから社会問題となっている。肥満を解決するために、摂取食品を制限したり、運動によりカロリーを消費する方法などが多く提案されているが、肥満を解決するのは容易でない。本発明の課題と目的は、安全性の高い脂肪蓄積阻害剤および脂肪蓄積抑制方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題と目的を解決するために、柑橘類成分に含まれる特定の化合物群が脂肪蓄積を阻害する作用を有し、同じカロリーを摂取してももともと効率よく肥満を阻害抑制し予防することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記［１］から［１０］の具体的な内容から構成されるものである。
［１］  化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群からから選ばれた少なくとも１種の化合物を有効成分として含む脂肪蓄積阻害剤。
【００１０】
【化１】
2008273935.tif 000002
【００１１】
【化２】
2008273935.tif 000003
【００１２】
【化３】
2008273935.tif 000004
【００１３】
【化４】
2008273935.tif 000005
【００１４】
【化５】
2008273935.tif 000006
【００１５】
【化６】
2008273935.tif 000007
［２］  化合物Ｂを有効成分として含む上記［１］に記載の脂肪蓄積阻害剤。
［３］  化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物を含む有効成分が、柑橘類の抽出成分である上記［１］または［２］に記載の脂肪蓄積阻害剤。
［４］  化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物を含む有効成分が、柑橘類の粉砕物である上記［１］または［２］に記載の脂肪蓄積阻害剤。
［５］  化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物を含む有効成分が、柑橘類の果皮、未完熟摘果物および未完熟摘果果皮の粉砕物からなる群から選ばれた少なくとも１種である上記［４］に記載の脂肪蓄積阻害剤。
［６］  有効成分を含有する柑橘類が紀州みかん、橘、柑子、温州みかん、はるか、八朔、および清見からなる群から選ばれた少なくとも１種の柑橘類である上記［３］ないし［５］のいずれかに記載の脂肪蓄積阻害剤。
［７］  上記［１］ないし［６］のいずれかに記載された脂肪蓄積阻害剤を含有する食品または健康食品。
［８］  上記［１］ないし［６］のいずれかに記載された脂肪蓄積阻害剤を含有する食品添加剤。
［９］  上記［１］ないし［６］のいずれかに記載された脂肪蓄積阻害剤を含有する医薬品。
［１０］  化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物を有効成分として含む脂肪蓄積阻害剤を投与することを特徴とする脂肪蓄積抑制方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の脂肪蓄積阻害剤によれば、柑橘類成分に含まれる特定の化合物群が脂肪蓄積阻害抑制活性（抗肥満活性作用）を有し、同じカロリーを摂取しても効率よく肥満を抑制することができ、さらには食品、健康食品、食品添加剤、医薬品などの各分野に広く利用することができ、安全性の高い脂肪蓄積阻害剤および脂肪蓄積抑制方法を提供することできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、本発明について詳しく説明する。本発明において用いる化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物は既知物質であり、各種柑橘類に含まれている天然の化合物である。
【００１８】
柑橘類としては、たとえば、表１に記載した柑橘品種リストの一般名と品種名を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
【表１】
2008273935.tif 000008
本発明の脂肪蓄積阻害剤の有効成分の特定の化合物は、たとえば果実、果皮、未完熟摘果果皮等に含有されるので、加工品製造の際の果皮、未完熟摘果およびまたは未完熟摘果果皮を有効利用することができる。果実、果皮、未完熟摘果およびまたは未完熟摘果果皮等をそのまま用いてもよいし、乾燥処理したものを用いてもよい。
【００２０】
本発明の脂肪蓄積阻害剤の有効成分としては、紀州みかん、橘、柑子、温州みかん、はるか、八朔、および清見からなる群から選ばれた少なくとも１種の柑橘類の抽出成分がとくに効果が高いので、本発明の脂肪蓄積阻害剤として好ましい。
【００２１】
各種柑橘類（紀州みかん、橘、柚子、温州みかん、ネーブル、ハッサク、レモン、清見、はるか）中の本発明の化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物からなる有効成分の含有率の測定結果を後述の実施例の図１ないし図２に示した。
【００２２】
本発明の化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物からなる有効成分を抽出するには、水、または低級アルコール(メチルアルコール、エチルアルコールまたはブタノールなど)、酢酸エチルなどの有機溶媒の１種または２種以上を適宜混合して使用することができる。好ましい抽出溶媒は、アルコール、水とアルコールの混合溶媒または酢酸エチルである。
【００２３】
抽出の際の温度は、通常は０〜１００℃、好ましくは１０〜５０℃の範囲である。抽出時間は、抽出温度によって変化するが、通常、室温付近で抽出する場合は１〜３０日間程度であり、さらに高い温度で抽出する場合は時間を短縮できる。
【００２４】
このようにして得た抽出物から、カラムクロマトグラフィーあるいは分取ＨＰＬＣなど
の方法によって、本発明の化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物からなる有効成分を分離および精製することができる。このように分離および精製した有効成分を、本発明の脂肪蓄積阻害剤として使用することもできる。
【００２５】
本発明の脂肪蓄積阻害剤を、食品、健康食品、食品添加剤どの形態にも調製される。本発明の脂肪蓄積阻害剤を食品、健康食品、食品添加剤どの形態に使用する場合には、本発明の化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物からなる有効成分を含有する柑橘類の粉砕物の形態で使用することができる。本発明の脂肪蓄積阻害剤の有効成分の特定の化合物は、たとえば果実、果皮、未完熟摘果、未完熟摘果果皮等に含有されるので、加工品製造の際の果皮または未完熟摘果を有効利用することができる。果実、果皮、未完熟摘果、未完熟摘果果皮等をそのまま粉砕して用いてもよいし、乾燥処理したものを粉砕処理したものを用いてもよいが、果皮、未完熟摘果、未完熟摘果果皮の粉砕物および乾燥処理物からなる群から選ばれた少なくとも１種を用いるのが好ましい。
【００２６】
本発明の脂肪蓄積阻害剤は、とくに食品、健康食品、食品添加剤の形態に調製して用いるのが好ましい。食品、健康食品、食品添加剤の形態としては、顆粒、錠菓、ゼリー、飴、飲料などが挙げられ、その形態に応じて有効成分以外の他の成分が選択される。
【００２７】
本発明の脂肪蓄積阻害剤を食品、健康食品、食品添加剤の形態として使用する場合には、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物からなる有効成分の他に、種々の食品、健康食品、食品添加剤の形態の形態に応じてそれらを調製する際に一般的に使用される各種成分を含有していてもよい。たとえば、食品、健康食品、食品添加剤に調製する際に使用される他の成分は、この分野で普通に使用される原料・材料であってよく、これら食品原料・材料の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、リンゴファイバー、大豆ファイバー、肉エキス、黒酢エキス、ゼラチン、コーンスターチ、蜂蜜、動植物油脂、多糖類などが挙げられる。本発明の脂肪蓄積阻害剤を食品、健康食品、食品添加剤の形態として使用する場合には、１またはそれ以上のこれら食品原料を含むことができる。
【００２８】
本発明の脂肪蓄積阻害剤を食品、健康食品、食品添加剤の形態として使用する場合には、上記の食品原料に加えて、１またはそれ以上の潤沢剤、乳化剤、懸濁化剤、酸化防止剤、防腐剤、甘味剤および香味剤などの成分をさらに含むことができる。また、他の有効成分(水溶性ビタミン類および油溶性ビタミン類などを含む)をさらに含んでいてもよい。脂肪分解促進効果を妨げることのない適切な成分を容易に選択することができる。
【００２９】
本発明の脂肪蓄積阻害剤は、その形態に応じて当該分野で周知の方法によって製造してよい。また、本発明の脂肪分解促進剤は、その形態に応じて適宜に適用あるいは摂取することができる。
【００３０】
本発明の脂肪蓄積阻害剤を医薬品として使用する場合には、有効成分をこのように分離および精製した有効成分を使用することが好ましい。本発明の脂肪蓄積阻害剤を医薬品として使用する場合には、通常内用剤の形態に調製することができる。
【００３１】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。本発明はこれら実施例に限定されない。
【実施例】
【００３２】
実施例１
柑橘成分の抽出・分画［柑橘１６（一般名：小みかん、品種名：紀州みかん）について示す］
柑橘の果皮１ｋｇ（生重量）を粉砕し、これに99.5 ％（ｖ／ｖ）エタノール２Ｌを加
え、２０℃で３０日間抽出した。混合物をろ過し、ろ液2.2 Ｌを得た。このろ液を４０℃以下で減圧濃縮、さらに凍結乾燥し抽出物60.3 ｇを得た。これを蒸留水に溶解し、酢酸
エチルで分液した。酢酸エチル層を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ついで、この酢酸エチル層を４０℃以下で減圧濃縮し、油状物質３．６ｇを得た。この油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶出溶媒  酢酸エチル：メタノール＝１：０（1000 ml）→  １：１（400 ml）  →  ０：１（500 ml）］で粗分画した。薄層クロマトグラフ
ィー（固定相  シリカゲル；  移動層  クロロフォルム：メタノール＝９８：２）によって確認しながら、さらに、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［溶出溶媒  酢酸エチル：メタノール＝９９：１］によって分画・精製し、化合物Ａ 10 mg，化合物Ｂ 49 mg，化合物Ｃ 285 mg，化合物Ｄ 585 mg，化合物Ｅ 96 mg，化合物Ｆ 59 mgを得た。酢酸エチル層におけるこれら化合物の存在率（％）は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）［カラム  Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−８０Ａ（4.6 ｘ 250 ｍｍ）；溶出溶媒アセトニト
リル：水＝７：３）によって確認した。
【００３３】
２．化合物Ａ〜Ｆの構造解析
マススペクトル、核磁気共鳴スペクトル等の測定によって、これらの構造を下記のように決定した。
【００３４】
【化７】
2008273935.tif 000009
化合物Ａ：  ３'，４'，３，５，６，７，８−ヘプタメトキシフラボン
［２−（３，４−ジメトキシフェニル）−３，５，６，７，８−ペンタメトキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン］
同定データ
分子式  C22H24O9
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 
δ 3.86 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.93 (s, 6H), 3.94 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 4.06 (s, 3H), 6.98 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.78 (d, J=2.1 Hz, 1H), 7.81 (dd, J= 2.1 and 8.6 Hz, 1H)
FABMS (positive mode):  m/z 433 (M+1)
【００３５】
【化８】
2008273935.tif 000010
化合物Ｂ：  ５−ヒドロキシ−３'，４'，６，７，８−ペンタメトキシフラボン
［２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６，７，８−トリメトキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン］
同定データ
分子式  C20H20O8
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 
δ 3.94 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 3.960 (s, 3H), 3.963 (s, 3H), 4.09 (s, 3H), 6.60 (s, 1H), 6.98 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.41 (d, J=2.1 Hz, 1H), 7.57 (dd, J=2.1 and 8.5 Hz, 1H)
FABMS (positive mode):  m/z 389 (M+1)
【００３６】
【化９】
2008273935.tif 000011
化合物Ｃ：  ４'，５，６，７，８−ペンタメトキシフラボン
［２−（４−メトキシフェニル）−５，６，７，８−テトラメトキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン]
同定データ
分子式  C20H20O7
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 
δ 3.87 (s, 3H), 3.93 (s, 6H), 4.00 (s, 3H), 4.08 (s, 3H), 6.60 (bs, 1H),
7.00 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.87 (bd, J=8.0 Hz, 1H)
FABMS (positive mode):  m/z 373 (M+1)
【００３７】
【化１０】
2008273935.tif 000012
化合物Ｄ：  ３'，４'，５，６，７，８−ヘキサメトキシフラボン
［２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５，６，７，８−テトラメトキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン］
同定データ
分子式  C21H22O8
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 
δ 3.93 (s, 6H), 3.95 (s, 3H), 3.96 (s, 3H), 4.01 (s, 3H), 4.10 (s, 3H), 6.62 (bs, 1H), 6.98 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.41 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.58 (dd, J= 2.0 and 8.6 Hz, 1H)
FABMS (positive mode):  m/z 403 (M+1)
【００３８】
【化１１】
2008273935.tif 000013
化合物Ｅ：  ３'，４'，５，６，７−ペンタメトキシフラボン
［２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５，６，７−トリメトキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン］
同定データ
分子式  C20H20O7
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 
δ 3.91 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.98 (s, 3H), 3.99 (s, 3H), 6.58 (bs, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.96 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.32 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.52 (dd, J= 2.0 and 8.6 Hz, 1H)
FABMS (positive mode):  m/z 373 (M+1)
【００３９】
【化１２】
2008273935.tif 000014
化合物Ｆ：  ３'，４'，５，７，８−ペンタメトキシフラボン
［２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５，７，８−トリメトキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン］
同定データ
分子式  C20H20O7
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 
δ 3.955 (s, 3H), 3.959 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.99 (s, 3H), 4.03 (s, 3H), 6.47 (s, 1H), 6.61 (s, 1H), 6.99 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.47 (d, J=2.2 Hz, 1H), 7.60 (dd, J=2.2 and 8.6 Hz, 1H)
FABMS (positive mode):  m/z 373 (M+1)
実施例２
実施例１において、柑橘16（一般名：小みかん、品種名：紀州みかん）の代わりに柑橘１（温州みかん）、柑橘５（八朔）、柑橘７（レモン）、柑橘14（清見）、柑橘17（橘）、柑橘18（柑子）、および柑橘22（はるか）を用いて、実施例１と同様に実施し、各柑橘類の酢酸エチル抽出物中の化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる各有効成分の含有量を測定し、結果を図１に示した。
【００４０】
実施例３
実施例１において、柑橘16（一般名：小みかん、品種名：紀州みかん）の代わりに柑橘１（温州みかん）、柑橘４（ネーブル）、柑橘５（八朔）、柑橘７（レモン）、柑橘14（清見）、柑橘17（橘）、柑橘18（柑子）、および柑橘22（はるか）の未完熟摘果果皮を用いて、実施例１と同様に実施し、各柑橘類の酢酸エチル抽出物中の化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる各有効成分の含有量を測定し、結果を図２に示した。
【００４１】
活性評価試験１
マウス脂肪前駆細胞株  ３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いた活性試験
試験方法
マウス脂肪前駆細胞株  ３Ｔ３−Ｌ１細胞の培養は定法に基づいて行った。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇ
ｍａ製）培地に牛胎児血清（第一化学薬品取り扱い）を１０％になるように添加し、ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を１００  Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を１００μｇ／ｍｌになるように加えて培養に用いた。培養は３７℃、５％ＣＯ2において行った。２００００個／ウェルになるように細胞数を調整し、２４穴
プレートに播種した。０．５ｍＭのＩＢＭＸ（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ製）、１μＭ  Ｄｅｘ（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎ、Ｓｉｇｍａ製）、５μｇ／ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎ（ウシ由来、Ｓｉｇｍａ製）となるように上記培地に添加し、分化誘導を行った。サンプルの添加は５００倍希釈になるように添加し
、１日おきに培養液を交換した。これを細胞の播種から、１４日目まで続けた。Ｏｉｌ−ｒｅｄ  Ｏ染色は定法に従って行った。シャーレに入っている培養液を取り除いた後、４％パラホルムアルデヒド溶液を培養細胞に添加し、１５分間固定を行った後、ＰＢＳ（−）で洗浄した。６０％  Ｏｉｌ−ｒｅｄ  Ｏ染色液を調製し、１０分間静置し、染色液をろ過した後、染色に供した。シャーレに入っているＰＢＳ（−）を除き６０％  イソプロパノールを加え、１分間静置した。その後、６０％  イソプロパノールを除き、染色液を加え、室温で２０分間静置した。染色液を除き、６０％  イソプロパノールを加え、１分間静置した。６０％  イソプロパノールを除き、ＰＢＳ（−）で洗った。ＰＢＳ（−）を加え、顕微鏡で観察した。シャーレに入っているＰＢＳ（−）を除き、脱色液を加え、顕微鏡で色素が脱色されたことを確認した。その後、ＥＬＩＳＡリーダーでＯＤ520の値を
測定した。測定結果を図５のコントロール試験結果として示した。
【００４２】
実施例４  脂肪蓄積抑制活性（抗肥満作用を有する品種の探索試験）
上記活性評価試験において、前記実施例１および実施例２における実験と同様の処方で調整した各種柑橘類（柑橘１ないし柑橘２２）の果皮部分の抽出液１００μｇ／ｍｌとなるように添加し、上記「マウス脂肪前駆細胞株  ３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いた活性試験」を行い、脂肪蓄積抑制活性（抗肥満活性作用）を試験した。その結果を図３に示した。
【００４３】
実施例５  脂肪蓄積抑制活性（抗肥満作用を有する品種の探索試験２）
上記実施例４の活性評価試験において強い脂肪蓄積抑制活性（抗肥満活性作用）が認められた各種柑橘類［柑橘7（竹下レモン）、柑橘16（紀州みかん）、柑橘17（橘）、柑橘18（柑子）、柑橘22（はるか）］の果皮部分の抽出液（前記実施例１および実施例２にお
ける実験と同様の処方で調整した）をそれぞれ１００μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌとなるように添加し、上記「マウス脂肪前駆細胞株 3T3-L1細胞を用いた活性試験」を行い
、脂肪蓄積抑制活性（抗肥満活性作用）を試験した。その結果を図４に示した。
【００４４】
上記実施例４および実施例５の探索評価試験の結果から、紀州みかん、橘、柑子、はるかの果皮抽出液の脂肪蓄積抑制活性（抗肥満活性作用）が高いことがわかる。
実施例６  脂肪蓄積抑制活性（抗肥満作用試験）
上記活性評価試験において、前記実施例１において果皮部分から抽出液から分離精製した柑橘類中の化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆからなる各有効成分各５μｇ／ｍｌとなるように添加し、上記「マウス脂肪前駆細胞株 3T3-L1
細胞を用いた活性試験」を行い、脂肪蓄積抑制活性（抗肥満活性作用）を試験した。その結果を図５に示した。
【００４５】
実施例７  高脂肪食マウスを用いた抗肥満試験において柑橘類成分の脂肪蓄積に対する影響
試験方法
精製牛脂、精製コーン油、シスチン、およびスクロースは、ナカライテスク社から購入した。セルロース、コーンスターチ、Vitamin mixture (AIN-93)、Salt mixture (AIN-93G)はオリエンタル酵母社から購入した。カゼインはシグマ アルドリッチ ジャパン社から購入した。雄ICRマウス（5週齢, 初体重18〜22 g）はCharles River Japan社より購入し
た。これらマウスを飼育ケージに入れ(５匹/ケージ)、室温24±1℃、12時間の明暗サイクルにて飼育を行った。水および食餌は自由摂取とした。実験食を与える前の1週間は市販
の食餌（MF, オリエンタル酵母社製）を与えて馴化し、その後、平均体重が等しくなるように飼育群に分けた。20％の牛脂を含む食餌を与えたHigh beef tallow (HB)群を設定し
て、柑橘成分として、凍結破砕した乾燥粉末を５％（餌重量に対して）になるように添加したものを食餌として28日間飼育を行った。体重測定は、毎日行った。摂餌量は、1日当
たりの餌の減少量を飼育期間中の14日間測定し、その平均から算出した。飼育実験終了後、体重測定を行い、ジエチルエーテル麻酔下において、精巣周囲の脂肪組織を摘出し、重
量を測定した。腹部大静脈より採血した後、血清成分において、血清マーカーの測定を行った。測定には、和光純薬工業製測定キットを用いて、使用法に準じて行った。
【００４６】
【表２】
2008273935.tif 000015
凍結破砕した柑橘乾燥粉末としては、柑橘1（温州みかん）、柑橘3（大森ネーブル）、柑橘5（八朔）、柑橘７（竹下レモン）、柑橘14（清見）、柑橘16（紀州みかん）、柑橘17（橘）、柑橘18（柑子）、柑橘22（はるか）の各柑橘の凍結乾燥粉末を使用した。
【００４７】
各柑橘凍結乾燥粉末を含む飼料を用いて28日間飼育した後の脂肪組織重量（ｇ）の数値および脂肪組織重量（ｇ）／体重（ｇ）の数値を図６に対比して示した。
八朔、紀州みかんおよび橘の凍結乾燥粉末を与えたときには顕著な脂肪蓄積抑制活性（抗肥満活性作用）が認められる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
以上のように、本発明の脂肪蓄積阻害剤は、柑橘類成分に含まれる特定の化合物群が脂肪蓄積抑制活性（抗肥満活性作用）を有し、同じカロリーを摂取しても効率よく肥満を予防することをすることができる。それゆえ、本発明の脂肪蓄積阻害剤は、食品、健康食品、食品添加剤、医薬品、医薬外用剤などの各分野に広く利用することができ、安全性の高い脂肪蓄積阻害剤および脂肪蓄積抑制方法を提供することできる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】各種柑橘類果皮の酢酸エチル抽出物中に含まれる各有効成分化合物の含有量を対比して示した図である。
【図２】各種柑橘類の未完熟摘果果皮の酢酸エチル抽出物中に含まれる各有効成分化合物の含有量を対比して示した図である。
【図３】各種柑橘類の果皮抽出液を使用したときの脂肪蓄積抑制活性（抗肥満活性作用）探索試験結果を示した図である。
【図４】各種柑橘類の果皮抽出液の脂肪蓄積抑制活性（抗肥満活性作用）の探索試験結を示した図である。
【図５】抽出液から分離精製した各有効成分化合物各５μｇ／ｍｌとなるように添加したときのマウス脂肪前駆細胞株 3T3-L1細胞を用いた活性試験を示した図である。
【図６】各柑橘凍結乾燥粉末を使用したときの脂肪組織重量（ｇ）の数値および脂肪組織重量（ｇ）／体重（ｇ）の数値を対比して示した図である。
【図３】
2008273935.tif 000022
【図４】
2008273935.tif 000023
【図５】
2008273935.tif 000024
【図６】
2008273935.tif 000025
【図１】
2008273935.tif 000026
【図２】
2008273935.tif 000027