(57)【要約】【課題】ヒト及び哺乳動物の生物学的年齢の判定および加齢の程度を評価する方法を提供することである。【解決手段】被験者の血液試料中のアミノ酸濃度データを、少なくともストレス負荷後に測定する工程と、前記測定工程で測定した前記被験者の前記アミノ酸濃度データに含まれる少なくとも１つの濃度値に基づいて、前記被験者につき生物学的年齢を評価する濃度値基準評価工程とを含むことを特徴とする生物学的年齢の判定方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の血液試料中のアミノ酸濃度データを、少なくともストレス負荷後に測定する工程と、前記測定工程で測定した前記被験者の前記アミノ酸濃度データに含まれる少なくとも１つの濃度値に基づいて、前記被験者につき生物学的年齢を評価する濃度値基準評価工程とを含むことを特徴とする生物学的年齢の判定方法。
【請求項２】
被験者の血液試料中のアミノ酸濃度を、ストレス負荷前に測定する工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸が必須アミノ酸である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
必須アミノ酸が分岐鎖アミノ酸、フェニルアラニンおよびスレオニンよりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
必須アミノ酸が分岐鎖アミノ酸である請求項４記載の方法。
【請求項６】
ストレスが絶食である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ストレスが運動である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ストレスが炎症である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
血中のアミノ酸濃度をマーカーに用いることにより生物学的年齢および加齢・老化の程度を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト及び哺乳動物では血液中の遊離アミノ酸濃度は、通常の状態ではほぼ一定に保たれていることが知られている。一般的に、絶食による低栄養状態や運動の負荷、または、炎症などにより代謝がカタボリックな状態になると、組織中で体蛋白質分解が亢進し、血液中の遊離アミノ酸濃度が高まることが知られている（非特許文献１、２）。
【０００３】
特に分岐鎖アミノ酸などの必須アミノ酸は絶食飢餓後の1日後〜数日後に顕著に血液中の濃度が上昇する。一方で、アラニンやグリシンのような非必須アミノ酸は糖新生の材料として盛んに利用されるため、血液中濃度は低下する。こうした血液中の遊離アミノ酸濃度プロファイル（血中アミノグラム）の変化は、生物のホメオスタシスを維持する基盤であり、ラットなどのげっ歯類小動物からヒトに至るまで保存されていることが知られている（非特許文献３）。
【０００４】
蛋白質代謝に関しては、絶食飢餓により骨格筋蛋白質の分解によって低下した筋肉量や窒素バランスの再摂食による回復度が、加齢ラットにおいては小さいことが知られており、加齢に伴う蛋白質の分解過剰や合成の低下を示唆しているが（非特許文献４）、血中アミノグラムに関しては記述されていない。また絶食飢餓応答時の血中アミノグラムに関して加齢による差異は知られていない。
【０００５】
一方で、加齢による生物学的な老化は、環境ストレスに対する適応力の低下として記述されることが多く、ストレスに対する生体防御物質の量の低下、とりわけ、酸化ストレスに関する適応に必要な抗酸化物質が、加齢・老化に伴って低下すると考えられている。したがって、生体内のストレス応答ホルモンや抗酸化物質をマーカーとして用いて、生物学的な加齢や老化の診断指標にしようという試みがある。こうしたものには、IGF-1やDHEA-Sなどのホルモンや、ビタミンC、ビタミンEやコエンザイムQ10の酸化率などの各種の指標が上げられる。しかし、これらの指標をもってしても、加齢・老化を診断することは難しく、新たな生物学的な加齢の指標が求められている（非特許文献５）。
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Applied Physiology, 25; 52-57 (1968)
【非特許文献２】Clinical Nutrition, 24; 236-243 (2005)
【非特許文献３】American Journal of Physiology, 221; 829-838 (1971)
【非特許文献４】American Journal of Physiology, 277 (Endocrinol. Metab. 40); E608-E616 (1999)
【非特許文献５】アンチエイジング医学の基礎と臨床、編集：日本抗加齢医学会専門医・指導士認定委員会、メジカルレビュー社（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
生物学的年齢は暦年齢と異なる可能性があり、また個体および環境間で大幅に異なりうる。生物学的年齢による加齢・老化の程度を診断・評価する簡便で優れたマーカーに着目し、特定の生物学的年齢と相関する該マーカーを用いて生物学的年齢をより正確にまた客観的に評価することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、鋭意研究を進め、ストレス負荷後、経時的な血中アミノグラムを調べたところ、必須アミノ酸、とりわけ分岐鎖アミノ酸の濃度はストレス負荷後に低下し、低下したアミノ酸濃度は、若齢においては回復するが、加齢にともなって回復しにくくなることから、該アミノ酸の濃度が、簡便な生物学的な加齢の指標となることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。      
（１）被験者の血液試料中のアミノ酸濃度データを、少なくともストレス負荷後に測定する工程と、前記測定工程で測定した前記被験者の前記アミノ酸濃度データに含まれる少なくとも１つの濃度値に基づいて、前記被験者につき生物学的年齢を評価する濃度値基準評価工程とを含むことを特徴とする生物学的年齢の判定方法。
（２）被験者の血液試料中のアミノ酸濃度を、ストレス負荷前に測定する工程を含む（１）記載の方法。
（３）アミノ酸が必須アミノ酸である（１）または（２）記載の方法。
（４）必須アミノ酸が分岐鎖アミノ酸、フェニルアラニンおよびスレオニンよりなる群から選択される少なくとも１種である、（３）記載の方法。
（５）必須アミノ酸が分岐鎖アミノ酸である（４）記載の方法。
（６）ストレスが絶食である（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）ストレスが運動である（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（８）ストレスが炎症である（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（９）（１）または（２）により測定した生物学的年齢と暦年齢を比較する工程を含む加齢度の評価方法。 
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法を用いれば、生物学的年齢をより簡便で、正確にまた客観的に評価することができ、高齢化による医療・介護ニーズの高まりの中で、健康維持、疾患予防のみならず治療方針の決定に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１１】
本発明は、血液試料中のアミノ酸濃度を測定する工程を含む、生物学的年齢の判定方法および加齢度の評価方法に関する。
【００１２】
本発明の生物学的年齢の判定方法は、被験者の血液試料中のアミノ酸濃度データを、少なくともストレス負荷後に測定する工程を含む方法である。さらに前記測定工程で測定した前記被験者の前記アミノ酸濃度データに含まれる少なくとも１つの濃度値に基づいて、前記被験者につき生物学的年齢を評価する濃度値基準評価工程とを含むことを特徴とする判定方法である。
【００１３】
本発明における被験者、すなわち本発明の判定方法を適用することができる対象としては、動物であれば特に限定されないが、例えば、哺乳動物等が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、霊長類、実験用動物、家畜、ペット等が挙げられ、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ブタ、ミニブタ、無毛ブタなどが挙げられる。好ましくは、被験者はヒトであり、ヒトにおいては一般の健康診断の対象者であり得る。
【００１４】
本発明の方法に用いられ得る生体試料は、血液試料、尿、唾液等が挙げられる。好ましくは血液試料である。血液としては、全血、血清、血漿のいずれであってもよく、これらは、対象から採取した血液を常法に従って処理することで、適宜得ることができる。
【００１５】
本発明における「生物学的年齢」とは、たとえば受精、規定の発生学上のまたは胎生段階、または、より好ましくは、出生のような、予め選択された事象から経過した時間の長さとは直線的に固定されていない、表現型のまたは生理学的状態を示す。一方「暦年齢」は、たとえば受精、規定の発生学上のまたは胎生段階、または、より好ましくは、出生のような、予め選択された事象から経過した時間を示す。
【００１６】
ある表現型のまたは生理学的状態が生じる暦年齢は個体によって異なりうる。哺乳類における生物学的加齢の典型的な徴候は、内分泌変化(たとえば、思春期、月経、妊孕性または生殖能力の変化、閉経、および男性型脱毛のような第二次性徴)、代謝変化(たとえば、食欲および活動性の変化)、そして免疫学的変化(たとえば、疾患への抵抗性の変化)を含む。哺乳類の外見も、たとえば、白髪、皮膚の皺などのように生物学的年齢と共に変化する。多くの場合で、ある個体の潜在的な余命はその生物学的年齢の関数であり、生物学的年齢が小さいほど余命は長いと判断される。
【００１７】
本発明においてアミノ酸濃度は、少なくともストレス負荷後に測定する。ストレスを負荷してから一定時間後に採血した血液試料のアミノ酸濃度を測定し、該アミノ酸濃度をもとに生物学的年齢を判定する。すなわち、ストレス負荷後のアミノ酸と測定標準値と比較して生物学的年齢を判定する。測定標準値は、ヒト及び哺乳動物では血液中の遊離アミノ酸濃度はほぼ一定に保たれていることから、臨床検査会社等が提供する測定標準値(http://www.srl.info/srlinfo/kensa_ref_CD/otherdata/57-0833.htmlなど)を用いてもよい。測定標準値は性別、年齢等によって異なっていてもよい。
【００１８】
本発明において、アミノ酸濃度の測定は、ポストカラムでニンヒドリン反応を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を原理としたアミノ酸分析法やプレカラム反応を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を原理としたアミノ酸分析法などによって行うことができる。
【００１９】
アミノ酸濃度の測定は、ストレス負荷後に若齢者において必須アミノ酸レベルが回復すると考えられる時点での測定が好ましい。すなわち、ストレス負荷後通常１２〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間、より好ましくは１６〜２４時間に測定することが望ましい。
【００２０】
また測定回数は、特に限定されず、ストレス負荷後に少なくとも１回、測定回数が多いほど判定の正確性は高くなるので、２回以上の異なる時間で測定することが好ましい。
【００２１】
本発明における濃度基準評価工程とは、ストレス負荷後に測定した少なくとも１つ以上の被験者の血液試料中のアミノ酸濃度を、当該被験者のストレス負荷前の血液試料中の当該アミノ酸濃度や臨床検査会社等が提供する当該アミノ酸の測定標準値と比較し、その増減の程度を評価する工程をいう。または、被験者の血液試料中のアミノ酸濃度データのうち少なくとも１つの濃度値および前記アミノ酸の濃度を変数とする予め設定した多変量判別式に基づいて、当該多変量判別式の値である判別値を算出する工程をいう。
【００２２】
具体的には、絶食飢餓等ストレス負荷後に一過的に低下する血液中の遊離必須アミノ酸、とりわけ分岐鎖アミノ酸濃度の回復を指標として、生物学的年齢を判断する。例えば、測定標準値に比較して、非必須アミノ酸の値が十分に低いにもかかわらず、必須アミノ酸、とりわけ分岐鎖アミノ酸濃度の値が高ければ生物学的に若齢であり、一方で、必須アミノ酸、とりわけ分岐鎖アミノ酸濃度の値が、非必須アミノ酸と同様に低ければ生物学的な加齢の程度が進行していると判定することもできる。また特定のアミノ酸濃度のみを測定、または該濃度の時間的推移を観察して、生物学的年齢を判定してもよい。
【００２３】
また被験者のストレス負荷後、少なくとも十数時間から２４時間程度後のアミノグラムを測定することにより、血液中必須アミノ酸濃度、とりわけ分岐鎖アミノ酸濃度が、測定標準値と比してほぼ同程度か、もしくは高値であるほど生物学的年齢は若齢であり、測定標準値と比して低値であるほど生物学的年齢は老齢と判定される。
【００２４】
測定標準値と同じまたは高レベルであれば、ストレス応答に対するホメオスタシスの維持機能が十分に保たれている程度に若く、また、測定標準値を下回れば下回っているほど、ストレス応答に対するホメオスタシスの維持が困難であり、より生物学的に老齢であり、加齢度が高いとの評価ができる。
【００２５】
さらに本発明の判定方法は、ストレス負荷前と後のアミノ酸を測定することにより生物学的年齢を判定する方法である。同じ被験者において、ストレスを負荷する前、あるいは一定時間前に採血した血液試料のアミノ酸濃度を測定し、さらに上述したようにストレス負荷後に同様にアミノ酸濃度を測定し、両濃度を比較することにより個体差等の影響を少なくし、生物学的年齢を判定することができる。さらにストレス後にアミノ酸濃度を数回測定して、その推移のパターンによってもより正確に生物学的年齢を測定することが可能である。ストレス負荷後の測定時間および測定回数は上述したものと同様である。
【００２６】
ストレス負荷前とは、ストレスの種類によって異なるが、例えば、ストレスが絶食であれば、最後の食事時を意味し、運動等のストレスの場合は、運動する直前等を意味するが、これに限定されない。ストレス負荷前に測定する場合、ストレス負荷前０〜２時間が好ましく、より好ましくは０〜０．５時間である。
【００２７】
被験者のストレス負荷前および、負荷後少なくとも十数時間から２４時間程度後のアミノグラムを測定することにより、該アミノグラムがストレス負荷前と比してほぼ同程度か、もしくは負荷前よりも高値であるほど生物学的年齢は若齢であり、ストレス前と比して低値であるほど老齢と判定され、加齢度が高いとの評価ができる。
【００２８】
本発明において測定するアミノ酸は、ストレスによって一過性に血中濃度が低下するものであれば特に限定されないが、必須アミノ酸が好ましい。
本発明における必須アミノ酸の中でも、分岐鎖アミノ酸、フェニルアラニンおよびスレオニンが好ましく、分岐鎖アミノ酸がより好ましい。測定するアミノ酸は1種類でも、2種以上組み合わせて測定してしてもよい。また遊離アミノ酸濃度プロファイルである血中アミノグラムを測定することにより、より正確な判定が可能になる。
【００２９】
本発明におけるストレスは、一過的に血液中の遊離必須アミノ酸、とりわけ分岐鎖アミノ酸濃度を低下させるものであれば特に限定されないが、絶食、運動、炎症等が挙げられる。中でも絶食、運動が好ましく、絶食がより好ましい。
【００３０】
本発明における絶食とは、一時的な低栄養状態、すなわち、カロリーを制限した状態における飢餓ストレスを意味する。カロリー制限時には、酸化ストレスに対する防御機構が増強することが知られている。カロリー制限の一形態としての絶食後の飢餓ストレスに対する生体防御機構である、血液中の遊離必須アミノ酸、とりわけ分岐鎖アミノ酸濃度の回復が、絶食後に速やかに起こることは、長い余命を持ちうる生物学的年齢が若い個体の特徴であると考えられる。
【００３１】
本発明における運動とは、トレッドミルや、自転車エルゴメーター、階段昇降などの骨格筋に対する運動を負荷し、一過的に最大酸素摂取量を極度に高めるようなストレスを意味する。
【００３２】
本発明における炎症とは、感染やツベルクリン反応などの遅延型過敏反応のようなストレスを意味する。
【００３３】
本発明の加齢度の評価方法は、上記記載の方法による生物学的年齢と暦年齢を比較する工程を含み、その年齢の差（または比）などによって評価される。
【００３４】
また、本発明による加齢度の評価方法は、被験者の血液試料中のアミノ酸濃度データのうち少なくとも１つの濃度値および前記アミノ酸の濃度を変数とする予め設定した多変量判別式に基づいて、当該多変量判別式の値である判別値を算出し、この判別値により被験者の加齢度を評価することもできる。
【００３５】
前記多変量判別式は、変数としてアミノ酸濃度データの少なくともひとつの濃度値を用いうるが、好ましくは必須アミノ酸のうちの少なくともひとつの濃度値を含み、より好ましくは分岐鎖アミノ酸、フェニルアラニン、スレオニンのうちの少なくともひとつの濃度値を含む。
【００３６】
前記多変量判別式は、ロジスティック回帰式、線形判別式、重回帰式、サポートベクターマシンで作成された式、マハラノビス距離法で作成された式、正準判別分析で作成された式、決定木で作成された式などによって表すことができる。
【００３７】
また、前記多変量判別式には、暦年齢を変数として用いることもできる。
【実施例】
【００３８】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に述べる。なお、以下の実施例は、本発明を説明するものであって、本発明をこれに限定するものではない。
【００３９】
成長期にある若齢マウスとして10-11週齢、成熟期にある加齢マウスとして7-8ヶ月齢（２８週齢）のマウスを用い、それぞれアドリブ摂餌を行った。明期（7:00〜19:00）になる直前、すなわち早朝の7時前に摂餌していることを確認した後、7:00を絶食0時間のポイントとし、その後エサを除き、絶食（自由飲水）後12、24、48時間の時点で下記の方法により採血した（n=4）。エーテル麻酔後にそれぞれのマウス右心室から0.5mlをEDTA採血し、15,000rpm、5分、4℃にて遠心して採取し血漿分離、血漿200μlを1.5 mlチューブに取り、10％TCA100μlを加え、よく混ぜた後、氷上で10分冷やし、微量遠心機にて13000rpm、15分、4℃遠心、上清を採取して、Ultrafree-MC限外ろ過カラム（5,000×g、40分、4℃遠心）にて不要成分を除去し、ろ過後の下層サンプルをアミノ酸アナライザー（HITACHI）にて測定した。
【００４０】
図１は、成長期にある若齢マウス（11週齢）の絶食後の血漿アミノ酸濃度の推移をグラフ化したものである。グラフには、代表的な血中アミノ酸の推移を示すものとして、非必須アミノ酸のアラニン（Ala）およびプロリン（Pro）、必須アミノ酸の分岐鎖アミノ酸（イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、バリン（Val））及びスレオニン（Thr）のデータを示す。縦軸の単位はマイクロモルである。各グラフのバーは左から、絶食後0時間、12時間、24時間、48時間の血漿中アミノ酸濃度であり、4個体の平均値±SD（標準偏差）で示した。
【００４１】
非必須アミノ酸のアラニンやプロリンが経時的に濃度が低下するのに対して、必須アミノ酸、とりわけ分岐鎖アミノ酸やスレオニンは12時間後に一過的に濃度が減少した後に、24時間、48時間にもとのレベル以上に濃度が回復していた。
【００４２】
一方、図２は成熟後の加齢マウス（28週齢）での血漿アミノ酸濃度推移の結果である。加齢マウスでは、12時間後までは、若齢マウスとほぼ同様の血漿アミノ酸濃度の変化が見られるが、その後、24〜48時間でも必須アミノ酸、とりわけ分岐鎖アミノ酸やスレオニンの濃度の回復は求められず、血漿アミノ酸濃度は低下したままであった。
【００４３】
若齢マウスでは、絶食飢餓後に速やかに低下した必須アミノ酸、とりわけ分岐鎖アミノ酸が十数時間から２４時間後には絶食前と同じか、もしくはそれ以上のレベルにまで回復するのに対して、加齢マウスでは、絶食飢餓後に速やかに低下した必須アミノ酸、とりわけ分岐鎖アミノ酸の濃度レベルは２４時間以降４８時間までのアミノグラム推移においても回復することがなかった。このことから、絶食飢餓後のある一定時間の血中アミノグラム変化は、生物学的年齢の加齢の程度を示すことは明らかであり、血中のアミノ酸濃度をマーカーに用いることが可能であり、ストレスに対するホメオスタシスを維持するという基本的な生物の能力を測ることにより、対象となる個体の生物学的年齢の評価に用いることができることが明らかとなった。さらに生物学的年齢による加齢・老化の程度の評価に用いることができることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】若齢マウス（11週齢）の絶食後の血漿アミノ酸濃度の推移。
【図２】加齢マウス（28週齢）の絶食後の血漿アミノ酸濃度の推移。
【図１】
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【図２】
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