(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトでのＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答を追跡したり、種々の病態を示す患者のＴ細胞応答を調べるための、検査室レベルで簡便に測定できるＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法やそのための試薬を提供すること。【解決手段】グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−Ｔａｘ融合タンパク質を用いる簡便なＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答の検出系を試作した。Ｔａｘはそれ自身が細胞増殖やアポトーシス抑制活性を持つためＴａｘタンパク質を３分割するようデザインした。ＨＴＬＶ−Ｉ感染者の末梢血単核球にＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質を添加して培養し、培養上清中のＩＦＮγを測定することにより、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的細胞性免疫応答を主要エピトープの部位に応じて感度良く測定する。【選択図】図１
2008022702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＴＬＶ−Ｉ感染者の末梢血単核球に、２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質を添加して培養し、ヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答を検出することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法。
【請求項２】
２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質が、Ｔａｘタンパク質のＮ末端側と中央部とＣ末端側の３分割されたＴａｘタンパク質であることを特徴とする請求項１記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法。
【請求項３】
Ｔａｘタンパク質として、融合タンパク質を用いることを特徴とする請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法。
【請求項４】
融合タンパク質として、タグタンパク質との融合タンパク質を用いることを特徴とする請求項３記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法。
【請求項５】
タグタンパク質として、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いることを特徴とする請求項４記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法。
【請求項６】
ヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答を、培養上清中に産生されたＩＦＮγ量を測定することにより検出することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法。
【請求項７】
２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質を備えたことを特徴とするヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬。
【請求項８】
２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質が、Ｔａｘタンパク質のＮ末端側と中央部とＣ末端側の３分割されたＴａｘタンパク質であることを特徴とする請求項７記載のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬。
【請求項９】
Ｔａｘタンパク質が、融合タンパク質であることを特徴とする請求項７又は８記載のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬。
【請求項１０】
融合タンパク質が、タグタンパク質との融合タンパク質であることを特徴とする請求項９記載のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬。
【請求項１１】
タグタンパク質が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）であることを特徴とする請求項１０記載のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬。
【請求項１２】
さらに、末梢血単核球培養用の培地を含むことを特徴とする請求項７〜１１のいずれか記載のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬。
【請求項１３】
さらに、ＩＦＮγ測定用のＥＬＩＳＡキットを含むことを特徴とする請求項７〜１２のいずれか記載のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的細胞性免疫応答を主要エピトープの部位に応じて感度良く測定できるＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法や、該検定方法に用いられるヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）は終生持続感染し、感染者の大部分は無症候キャリアであるが、一部は成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）を発症する（例えば、非特許文献１，２参照）。感染者の別の一部はＨＴＬＶ−Ｉ随伴脊髄症/熱帯性痙性対麻痺（ＨＡＭ／ＴＳＰ）その他の炎症性疾患を発症する。ＡＴＬは、ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞クローンの悪性増殖による腫瘍性疾患である。ＨＴＬＶ−Ｉのコードする調節タンパク質Ｔａｘは、細胞増殖やアポトーシス抑制に関与する種々の細胞因子を活性化させることが知られており、感染細胞の維持と腫瘍化に貢献すると考えられている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００３】
一方、ＨＡＭ−ＴＳＰ患者や無症候ＨＴＬＶ−Ｉキャリア末梢血リンパ球から、試験管内でＨＴＬＶ−Ｉ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が誘導できることが知られている。このＣＴＬの主要標的抗原はＨＴＬＶ−Ｉ Ｔａｘである（例えば、非特許文献４，５参照）。ＡＴＬ患者からＣＴＬが誘導されることは稀であるが、造血幹細胞移植後のＡＴＬ患者ではＴａｘ特異的ＣＴＬ応答が著しく活性化する例が報告されている（例えば、非特許文献６参照）。また、ラットのＨＴＬＶ−Ｉ感染腫瘍モデルでは、Ｔａｘを抗原とするワクチンは抗腫瘍免疫を誘導できることも知られている（例えば、非特許文献７，８参照）。これらのことから、ＨＴＬＶ−Ｉ感染において、Ｔａｘ特異的ＣＴＬは抗腫瘍免疫監視機構として働いていると考えられる。
【０００４】
【非特許文献１】Poiesz BJ, Ruscetti FW, Gazdar AF, Bunn PA, Minna JD, Gallo RC. Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A 1980;77(12):7415-9.
【非特許文献２】Hinuma Y, Nagata K, Hanaoka M, Nakai M, Matsumoto T, Kinoshita KI, et al. Adult T-cell leukemia: antigen in an ATL cell line and detection of antibodies to the antigen in human sera. Proc Natl Acad Sci U S A 1981;78(10):6476-80.
【非特許文献３】Yoshida M. Multiple viral strategies of HTLV-1 for dysregulation of cell growth control. Annu Rev Immunol2001;19:475-96.
【非特許文献４】Jacobson S, Shida H, McFarlin DE, Fauci AS, Koenig S. Circulating CD8+ cytotoxic T lymphocytes specific for HTLV-I pX in patients with HTLV-I associated neurological disease. Nature1990;348(6298):245-8.
【非特許文献５】Kannagi M, Harada S, Maruyama I, Inoko H, Igarashi H, Kuwashima G, et al. Predominant recognition of human T cell leukemia virus type I (HTLV-I) pX gene products by human CD8+ cytotoxic T cells directed against HTLV-I-infected cells. Int Immunol1991;3(8):761-7.
【非特許文献６】Harashima N, Kurihara K, Utsunomiya A, Tanosaki R, Hanabuchi S, Masuda M, et al. Graft-versus-Tax response in adult T-cell leukemia patients after hematopoietic stem cell transplantation. Cancer Res 2004;64(1):391-9.
【非特許文献７】Ohashi T, Hanabuchi S, Kato H, Tateno H, Takemura F, Tsukahara T, et al. Prevention of adult T-cell leukemia-like lymphoproliferative disease in rats by adoptively transferred T cells from a donor immunized with human T-cell leukemia virus type 1 Tax-coding DNA vaccine. J Virol 2000;74(20):9610-6.
【非特許文献８】Hanabuchi S, Ohashi T, Koya Y, Kato H, Hasegawa A, Takemura F, et al. Regression of human T-cell leukemia virus type I (HTLV-I)-associated lymphomas in a rat model: peptide-induced T-cell immunity. J Natl Cancer Inst 2001;93(23):1775-83.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
何故、ＡＴＬ患者でＣＴＬ誘導率が低いのか、ずっと低いままなのか、発症後に低下したのか、詳細はわかっていない。これを明らかにすることは、ＡＴＬの発症予防や治療に免疫学的なアプローチを行うために不可欠である。本発明の課題は、ヒトでのＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答を追跡したり、種々の病態を示す患者のＴ細胞応答を調べるための、検査室レベルで簡便に測定できるＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法やそのための試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
Ｔ細胞応答はその機能が組織適合性抗原（ＭＨＣ−Ｉ，II）に拘束されるため、抗原抗体反応のような液相の反応系では検出できない。これまで、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答を調べるために用いられてきた方法のうち、最も確実なのは、自己のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞株を樹立して抗原として用いる方法である。しかし、細胞株の樹立は難しく成功率が低いうえ樹立できたとしても時間がかかりすぎる。２番目に挙げられるものは、オリゴペプチドを抗原とする方法である。オリゴペプチドはＭＨＣ−Ｉ、IIに提示されるエピトープ部位が分かっている場合には良い抗原となり得る。しかし、遺伝的に雑多な集団であるヒトでは提示部位の予測が難しいため、結局、標的タンパク質の全領域を網羅するためには何十から何百もの重複する連続オリゴペプチドライブラリーを作製しなければならない。３番目にはＭＨＣ／ペプチド複合体のテトラマーが挙げられる。テトラマーは、血液中のＣＴＬを特異的に定量的に測ることができる。しかし、既知のＣＴＬエピトープの数が限られているため、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答の全体に対して検出できる部分は非常に少ない。
【０００７】
ＨＴＬＶ−Ｉ特異的細胞性免疫の低下は、ＨＴＬＶ−ＩキャリアのＡＴＬ発症リスクの指標の一つである。しかしＴ細胞応答はＭＨＣ拘束を受けるため、検定方法は非常に煩雑である。そこで、本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究し、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−Ｔａｘ融合タンパク質を用いる簡便なＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答の検出系を試作した。Ｔａｘはそれ自身が細胞増殖やアポトーシス抑制活性を持つためＴａｘタンパク質を３分割するようデザインした。このことは融合タンパク質の収量を向上させ、また、Ｔａｘのどの部分にＴ細胞が強く反応するかを区別するのにも役立つ。そして、ＨＴＬＶ−Ｉ感染者の末梢血単核球にＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質を添加して培養することにより、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的細胞性免疫応答を主要エピトープの部位に応じて感度良く測定できることを見い出した。また、このＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質など、２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質を用いたアッセイ系が、免疫ラットやヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答を検出するに有効であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）ＨＴＬＶ−Ｉ感染者の末梢血単核球に、２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質を添加して培養し、ヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答を検出することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法や、（２）２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質が、Ｔａｘタンパク質のＮ末端側と中央部とＣ末端側の３分割されたＴａｘタンパク質であることを特徴とする前記（１）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法や、（３）Ｔａｘタンパク質として、融合タンパク質を用いることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法や、（４）融合タンパク質として、タグタンパク質との融合タンパク質を用いることを特徴とする前記（３）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法や、（５）タグタンパク質として、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いることを特徴とする前記（４）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法や、（６）ヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答を、培養上清中に産生されたＩＦＮγ量を測定することにより検出することを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法に関する。
【０００９】
また本発明は、（７）２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質を備えたことを特徴とするヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬や、（８）２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質が、Ｔａｘタンパク質のＮ末端側と中央部とＣ末端側の３分割されたＴａｘタンパク質であることを特徴とする前記（７）記載のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬や、（９）Ｔａｘタンパク質が、融合タンパク質であることを特徴とする前記（７）又は（８）記載のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬や、（１０）融合タンパク質が、タグタンパク質との融合タンパク質であることを特徴とする前記（９）記載のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬や、（１１）タグタンパク質が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）であることを特徴とする前記（１０）記載のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬や、（１２）さらに、末梢血単核球培養用の培地を含むことを特徴とする前記（７）〜（１１）のいずれか記載のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬や、（１３）さらに、ＩＦＮγ測定用のＥＬＩＳＡキットを含むことを特徴とする前記（７）〜（１２）のいずれか記載のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、ヒトでのＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答を追跡したり、種々の病態を示す患者のＴ細胞応答を調べるに際し、検査室レベルで簡便に、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的細胞性免疫応答を主要エピトープの部位に応じて感度良く測定できる。また、主要エピトープ部位が含まれる領域を決定することにより、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドの検索を容易にすることができ、個々のＨＴＬＶ−Ｉ感染者に特異的な免疫応答誘導用ワクチンの開発が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法としては、２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質を添加して培養し、ヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答を検出する方法であれば特に制限されず、また、本発明のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬としては、２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質を備えた試薬であれば特に制限されるものではなく、上記２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質としては、例えば３個など、２〜５個に分割されたＴａｘタンパク質が好ましい。１０個を越えて分割されたＴａｘタンパク質を用いる場合、主要エピトープ部位が分割される可能性があり好ましくなく、他方、未分割の完全長のＴａｘタンパク質を用いる場合、Ｔ細胞等の免疫細胞が非特異的に活性化され、Ｔａｘ特異的Ｔ細胞応答の精確な検出が妨げられることから好ましくない。また、上記２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質としては、分割された各々のＴａｘタンパク質（断片）をつなぎあわせた場合、Ｔａｘタンパク質のＮ末端からＣ末端までの全領域をカバーするものが好ましく、一部重複部分を有するものであってもよい。また、その大きさ（アミノ酸残基数）がほぼ等しいものから構成することが好ましい。なかでも、Ｔａｘタンパク質のＮ末端からＣ末端までの全領域をカバーする、ＧＳＴ−Ｔａｘ（Ｎ末端側）融合タンパク質とＧＳＴ−Ｔａｘ（中央部）融合タンパク質とＧＳＴ−Ｔａｘ（Ｃ末端側）融合タンパク質とからなるＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質を好適に例示することができる。
【００１２】
上記２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質は、融合タンパク質（融合ペプチドも含む）としても用いることができる。２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質と融合しうるタンパク質としては、Ｔ細胞等の免疫細胞が刺激を受けないタンパク質が好ましく、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグやＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグなどのタグタンパク質（タグペプチドも含む）や、抗体のＦｃ領域や、アルカリフォスファターゼ等のマーカータンパク質を挙げることができる。そして、本発明の検定方法や検出試薬を用いる場合においては、２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質や融合タンパク質を個別にすべて使用することやこれらの混合物を使用することもできるが、これらの混合物をまず使用し、次いで個別に順次使用して主要エピトープ部位が含まれる領域を決定することもできる。
【００１３】
上記２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質は、バキュロウイルスベクターなどを用いて発現精製したＴａｘタンパク質をプロテアーゼで分解することによりうることができるが、例えばＴａｘｃＤＮＡ（アクセッションナンバーＪ０２０２９）に分割数に等しいプライマーセットを用いて所望数の分割Ｔａｘタンパク質をコードするＤＮＡを作製し、発現ベクターにインフレームで組み込み大腸菌等の宿主細胞に導入し、かかる宿主細胞を培養することにより調製することができる。また、２〜１０個に分割されたＴａｘタンパク質を融合タンパク質として用いる場合は、ＴａｘｃＤＮＡ（アクセッションナンバーＪ０２０２９）に分割数に等しいプライマーセットを用いて所望数の分割Ｔａｘタンパク質をコードするＤＮＡを作製し、これらのＤＮＡをＧＳＴ遺伝子等のタグタンパク質などの３’側にそれぞれインフレームで連結することにより発現ベクターを構築し、大腸菌等の宿主細胞に導入し、かかる宿主細胞を培養することにより調製することができる。かかるＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣを含めた公知の方法を適宜組み合わせて用いることができる。
【００１４】
上記ＨＴＬＶ−Ｉ感染者の末梢血単核球は、例えばヘパリン添加静脈血を、Ficoll-PaqueTMPLUS （アマシャムバイオサイエンス社）を用いた密度勾配遠心分離により単離するなど、常法により調製することができる。かかる末梢血単核球、好ましくは未培養の末梢血単核球にＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質を添加して培養する際の培地としては、末梢血単核球の培養に用いることができる培地であれば特に制限されず、例えば１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地を好適に例示することができる。また、培養温度は３７℃が好ましい。
【００１５】
上記のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答を検出する方法としては、ＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質により誘導されるＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞活性を検出する方法であれば特に制限されず、例えば培養上清中のγインターフェロン（ＩＦＮγ）、ＴＮＦα、ＩＬ−２などの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定する方法や、反応した免疫Ｔ細胞の細胞数をＥＬＩＳＰＯＴ法やフローサイトメーターにより測定する方法を具体的に例示することができる。
【００１６】
本発明のヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出試薬は、上記本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答検定方法に好適に用いることができ、ＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質の他、末梢血単核球培養用の培地や、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２測定用のＥＬＩＳＡキットを備えたものを好適に例示することができる。
【００１７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
（ＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質の作製）
ＨＴＬＶ−Ｉ Ｔａｘ−ＧＳＴ融合タンパク質を作製するため、図１に示すように、Ｔａｘ ｃＤＮＡを含むｐβＭＴ−２Ｔａｘ（Matsumoto K, Akashi K, Shibata H, Yutsudo M, Hakura A. Single amino acid substitution (58Pro-->Ser) in HTLV-I tax results in loss of ras cooperative focus formation in rat embryo fibroblasts. Virology 1994;200(2):813-5）から３種類のプライマーセット（矢印）を用いて３種類のＤＮＡ断片（白四角）を得た。それぞれをＴａｘ−Ａ（Ｎ末側）、Ｔａｘ−Ｂ（中央部）、Ｔａｘ−Ｃ（Ｃ末側）と名付け、ＢａｍＨ１とＥｃｏＲ１リンカーを介してＧＳＴ発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（アマシャムバイオサイエンス株式会社）中に挿入した。これを大腸菌ＤＨ５に導入し、封入体中のＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質を抽出しＧＳ４Ｂカラム吸着分画をＨＰＬＣで精製した。プライマーとしては、Bam-TS: 5’-TTGGATCCATGGCCCACTTCCCAGGGTT-3’（配列番号１）、 Eco-TAR: 5’-TTGAATTCCGTGCTGCCCAAGGGTGGGTT-3’ （配列番号２）、  Bam-TBS: 5’-TTGGATCCTCCCCCTTCCGAAATGGATA-3’ （配列番号３）、  Eco-TBR: 5’-TTGAATTCCGAACGGAAGGAGGCCGTTTT-3’ （配列番号４）、  Bam-TCS: 5’-TTGGATCCCCCGTCACGCTAACAGCCTG-3’ （配列番号５）、  Eco-TR: 5’-TTGAATTCCTCAGACTTCTGTTTCTCGGA-3’ （配列番号６）を用いた。  
【実施例２】
【００１９】
（免疫細胞の調整）
ラットの免疫細胞として、ｐβＭＴ−２Ｔａｘプラスミドを遺伝子銃で２回免疫したラットの脾細胞を未培養で用いた。対照としてＴａｘを含まないベクタープラスミドを免疫したラットの脾細胞を用いた。ヒト由来の免疫細胞として、造血幹細胞移植後のＡＴＬ患者末梢血単核球分画を未培養で用いた。対照として非感染者の末梢血単核球分画を未培養で用いた。用いたｐβＭＴ−２Ｔａｘ免疫ラットＴ細胞と移植後ＡＴＬ患者Ｔ細胞は、いずれも、自家ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞と混合培養すればＨＴＬＶ−Ｉ  Ｔａｘ特異的Ｔ細胞が誘導されることが確認されている。
【実施例３】
【００２０】
（ＩＦＮγおよび細胞増殖アッセイ）
１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地にＴ細胞を浮遊させ、９６ウエルプレートに分注し（２×１０５／ｗｅｌｌ）、種々の濃度のＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質あるいは合成ペプチドカクテルを添加したのち３７℃で培養した。４日目および７日目の上清中ＩＦＮγ量はＥＬＩＳＡで測定した。
【実施例４】
【００２１】
（ペプチドカクテルの調製）
Ｔａｘのアミノ酸配列に従い、アミノ酸５個ずつの重複を持たせ、合計３５個の連続オリゴペプチド（各１５ｍｅｒ）を合成した。Ｎ末端から１２個のオリゴペプチドを混合したものをＴａｘｐ１−１２カクテル、１３−２２個目までのオリゴペプチドを混合したものをＴａｘ ｐ１３−２２カクテル、２２個目からＣ末端までのオリゴペプチドを混合したものをＴａｘｐ２３−３５カクテルとした。Ｔａｘ ｐ１−１２、ｐ１３−２２、ｐ２３−３５がカバーする領域は、ＧＳＴ−Ｔａｘ−Ａ、−Ｂ、−Ｃにそれぞれ相当する。  
【実施例５】
【００２２】
（免疫ラット脾T細胞のＧＳＴ−Ｔａｘ反応特異性）
ｐβＭＴ−２Ｔａｘ免疫ラット脾細胞に、ＧＳＴ−Ｔａｘ−Ａ、−Ｂ、−Ｃの各単独を０．０７８、  ０．３１２５、  １．２５μｇ／ｗｅｌｌの３段階の濃度で、３種の混合物を０．２３４、０．９３８、３．７５μｇ／ｗｅｌｌの３段階の濃度で添加し、培養４日目の上清中に産生されたＩＦＮγ量を測定した。結果を図２に示す。その結果、ＧＳＴ−Ｔａｘ−Ａ、−Ｂ、−Ｃの混合物を添加した場合に最も高いＩＦＮγ産生を示した。それぞれを単独で添加した場合は、ＧＳＴ−Ｔａｘ−Ａ、−Ｂ、−ＣのうちＧＳＴ−Ｔａｘ−Ｂに対して最も高い反応を示した。しかし、ＧＳＴタンパク質のみを加えてもほとんど反応しなかった。また、ＧＳＴ−Ｔａｘに対するＴ細胞のＩＦＮγ産生は量依存性であった。
【実施例６】
【００２３】
（ＧＳＴ−Ｔａｘとペプチドカクテルの比較）
ｐβｂＭＴ−２Ｔａｘ免疫ラット脾細胞に、ＧＳＴ−Ｔａｘと同濃度（最終濃度０．０７５〜１．３μｇ／ｗｅｌｌ）のペプチドカクテルを添加し、培養４日目の上清中に産生されたＩＦＮγ量を測定したところ、ほとんど反応が認められなかった。そこで、ペプチドカクテルの濃度を上げ、１．６２５、６．２５、２６μｇ／ｗｅｌｌの３段階の濃度のペプチドカクテルを用いた。結果を図３に示す。その結果、１．６２５〜２６μｇ／ｗｅｌｌの３段階の濃度のペプチドカクテル添加した場合に、有意なレベルのＩＦＮγ産生が認められた。ところが、ＧＳＴ−Ｔａｘの場合には、ＧＳＴ−Ｔａｘ−Ｂが最も反応性が高かったのに対して、これに相当するペプチドカクテルｐ１３−２２にはほとんど反応しなかった。以上のように、ＧＳＴ−Ｔａｘを用いた場合のＴ細胞反応性はペプチドカクテルを用いた場合より感度が良く、反応部位には解離が認められた。
【実施例７】
【００２４】
（ヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者末梢血からのＴａｘ特異的Ｔ細胞応答の検出）
造血幹細胞移植後緩解に至ったＡＴＬ患者の末梢血単核球分画（２×１０５／ｗｅｌｌ）にＧＳＴ−Ｔａｘ−Ａ、−Ｂ、−Ｃの各単独を１．２５μｇ／ｗｅｌｌの濃度で、３種の混合物を３．７５μｇ／ｗｅｌｌの濃度で添加し、培養４日目及び７日目の上清中に産生されたＩＦＮγ量をＥＬＩＳＡ法により定量した。結果を図４に示す。非感染者の末梢血単核球分画はほとんど反応しないのに対し、ＨＴＬＶ−Ｉ感染者（造血幹細胞移植後のＡＴＬ患者）ではＧＳＴ−Ｔａｘに対し高いレベルのＩＦＮγ産生が認められた。ラットの場合と同様にＧＳＴ−Ｔａｘ−Ａ、−Ｂ、−Ｃの混合物を添加した時に高い反応性が認められたが、単独で添加した場合はＧＳＴ−Ｔａｘ−Ａが最も反応性が高かった。ＧＳＴのみでは反応せず、Ｔａｘ特異性が確認された。
【００２５】
（まとめ）
以上のことから、ＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質を用いてＴａｘ特異的Ｔ細胞応答を検出できることが分かった。ＨＴＬＶ−Ｉ感染自家細胞株はＭＨＣ−Ｉ、−IIとも豊富でＴａｘ以外にも多くのＨＴＬＶ−Ｉ抗原を発現している。ＧＳＴ−Ｔａｘを用いたアッセイで検出できるのはその一部であると考えられる。しかし、今回の実験データから、ＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質は末梢血単核球分画中の抗原提示細胞にプロセスおよび提示され、感染個体のＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞に認識され得ることがわかった。
【００２６】
これまで、ＨＴＬＶ−Ｉ感染自家細胞株を樹立することが難しいために、ＡＴＬ発症リスクの一つである感染者のＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞応答を測定することは、容易ではなかった。しかし、本発明方法では、細胞株の樹立は不要であり、ＭＨＣ（ヒトではＨＬＡ型）を調べる必要もなく、末梢血単核球分画に直接ＧＳＴ−Ｔａｘを添加して培養するだけでT細胞応答を調べることができる。
【００２７】
ペプチドカクテルを用いたアッセイも類似のＴ細胞応答を検出できる。しかし、免疫ラットＴ細胞が融合タンパク質ＧＳＴ−Ｔａｘ−Ｂに強く反応したのに対し、相当する領域のペプチドカクテルｐ１３−２２には反応が乏しかった。これは、今回用いた５個のアミノ酸の重複をもつ連続ペプチドでは、実際に細胞内でプロセスされるペプチドを完全に網羅できない可能性を示唆している。また、反応に要求されるタンパク質量はペプチドカクテルの方が高かった。
【００２８】
Ｔａｘの全体を３つの領域に分割した理由は、Ｔａｘ自体の生理活性の影響をさけること、ＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質の収量を向上させることに加え、Ｔ細胞の主要エピトープの存在領域を知るためである。免疫ラットのＴ細胞は、ＧＳＴ−Ｔａｘ−Ｂと特に強く反応したが, このラットの系統ではＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のメジャーエピトープはＴａｘ１８０−１８８であることが分かっている。これは、ＧＳＴ−Ｔａｘ−Ｂの領域に含まれている。また、実験で用いたヒト感染者サンプルはＧＳＴ−Ｔａｘ−Ａに強く反応したが、このサンプルは以前の解析でＴａｘ１１−１９エピトープを認識するＣＤ８陽性ＣＴＬを多く含むことが分かっている。この領域はＧＳＴ−Ｔａｘ−Ａに含まれている。
【００２９】
ＧＳＴ−Ｔａｘのようなタンパク質抗原を用いた方法ではＭＨＣ−ＩよりＭＨＣ−IIに強く抗原提示されると考えられており、いわゆる “cross presentation”により一部の抗原はMHC-Iに提示されると考えられている。また、ヘルパーエピトープとキラーエピトープが近傍に存在することも報告されている。従って、今回の結果は、ＧＳＴ−Ｔａｘ−Ａ、−Ｂ、−Ｃに対する反応性が、Ｔ細胞エピトープの位置予測にも役立つことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質作製に用いたＴａｘ遺伝子断片とプライマーの位置を示す図である。
【図２】ＧＳＴ−Ｔａｘに対する免疫ラットのＴ細胞応答の結果を示す図である。
【図３】ペプチドカクテルに対する免疫ラットのＴ細胞応答の結果を示す図である。
【図４】ヒトＨＴＬＶ−Ｉ感染者のＴ細胞応答の検出結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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