(57)【要約】【課題】電気泳動を行う時の温度、微細流路に充填するコンジュゲートの濃度等さまざまな因子に影響されることなく、コントロール液を使用した目的の生体試料の判別を、確実に行える生体試料判別方法を提供する。【解決手段】電気泳動状態を示すための同一マーカーを含んだコントロール液とサンプル液を別々の微細流路に入れ同時に電気泳動を実施し、電気泳動中にそれぞれのマーカーの電気泳動状態を確認して、電気泳動にずれが生じた場合は泳動速度を調整して電気泳動の状態を同様に保つようにした。【選択図】図１
2008209349.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２本以上の微細流路と、前記微細流路を同一温度に制御する温度制御機構と、前記微細流路に電圧を印加する電圧印加機構と、前記各微細流路から電気泳動結果を取得する泳動結果取得機構と、を備えた電気泳動装置を用い、サンプル溶液中の目的の生体試料を判別する生体試料判別方法において、
前記目的の生体試料を判定するマーカーを有するコントロール液及び前記サンプル溶液それぞれを、前記少なくとも２本以上の微細流路うちの異なる微細流路に注入した後、該微細流路それぞれを前記温度制御機構により同一温度になるよう制御する温度制御工程と、
前記微細流路それぞれに、前記電圧印加機構により電圧を印加して、前記コントロール液中のマーカー及び前記サンプル溶液の電気泳動を同時に開始させ、前記泳動結果取得手段により、前記サンプル溶液及びコントロール液の電気泳動結果を取得する電気泳動工程と、
前記泳動結果取得機構により得た、前記コントロール液中のマーカーと前記サンプル溶液の電気泳動結果を比較して、前記サンプル溶液中に目的の生体試料が存在するかを判定する判定工程と、を含む、
ことを特徴とする生体試料判定方法。
【請求項２】
少なくとも２本以上の微細流路と、前記微細流路を同一温度に制御する温度制御機構と、前記微細流路に電圧を印加する電圧印加機構と、前記各微細流路から電気泳動結果を取得する泳動結果取得機構と、を備えた電気泳動装置を用い、サンプル溶液中の目的の生体試料を判別する生体試料判別方法において、
電気泳動する特性を持ち、電気泳動の先頭位置を示す基準マーカーを含む、前記目的の生体試料を判定するマーカーを有するコントロール液及び前記サンプル溶液それぞれを、前記少なくとも２本以上の微細流路うちの異なる微細流路に注入した後、該微細流路それぞれを前記温度制御機構により同一温度になるよう制御する温度制御工程と、
前記微細流路それぞれに、前記電圧印加機構により電圧を印加して、前記コントロール液中のマーカー及び前記サンプル溶液の電気泳動を同時に開始させ、前記泳動結果取得手段により、前記サンプル溶液及びコントロール液の電気泳動結果を取得する電気泳動工程と、
前記泳動結果取得機構により得た、前記コントロール液中のマーカーと前記サンプル溶液の電気泳動結果を比較して、前記サンプル溶液中に目的の生体試料が存在するかを判定する判定工程と、を含む、
ことを特徴とする生体試料判定方法。
【請求項３】
請求項２に記載の生体試料判定方法において、
前記判定工程は、前記泳動結果取得機構により得た、前記コントロール液中のマーカーと前記サンプル溶液の電気泳動結果を、それぞれの前記基準マーカーの波形ピーク位置を一致させた状態で比較して、前記サンプル溶液中に目的の生体試料が存在するかを判定するものである、
ことを特徴とする生体試料判定方法。
【請求項４】
少なくとも２本以上の微細流路と、前記微細流路を同一温度に制御する温度制御機構と、前記微細流路に電圧を印加する電圧印加機構と、前記各微細流路から、流路全体にわたる電気泳動結果を取得する泳動結果取得機構と、を備えた電気泳動装置を用い、サンプル溶液中の目的の生体試料を判別する生体試料判別方法において、
電気泳動する特性を持ち、電気泳動の先頭位置を示す基準マーカーを含む、前記目的の生体試料を判定するマーカーを有するコントロール液及びサンプル溶液それぞれを、前記少なくとも２本以上の微細流路うちの異なる微細流路に注入した後、該微細流路それぞれを前記温度制御機構により同一温度になるよう制御する温度制御工程と、
前記微細流路それぞれに、前記電圧印加機構により所定電圧を印加して、前記コントロール液中のマーカーと基準マーカー、及び前記サンプル溶液中の基準マーカーの電気泳動を同時に開始させ、電気泳動終了前の同じ経過時点で、前記泳動結果取得手段により、前記サンプル溶液及び前記コントロール液の電気泳動結果を取得してそれぞれの前記基準マーカーの波形ピーク位置を比較し、該基準マーカーの波形ピーク位置が一致するときは、そのまま電気泳動させ、一致しないときは、前記電圧印加機構により、少なくとも前記コントロール液か前記サンプル溶液のどちらか一方に次に印加する電圧を、前記所定電圧とは異なる電圧に変化させて、前記基準マーカーの波形ピーク位置を一致させるように電気泳動させる、電気泳動工程と、
前記泳動結果取得機構により得た、前記コントロール液中のマーカーと前記サンプル溶液の電気泳動結果を、それぞれの前記基準マーカーの波形ピーク位置を一致させた状態で比較して、前記サンプル溶液中に目的の生体試料が存在するかを判定する判定工程と、を含む、
ことを特徴とする生体試料判定方法。
【請求項５】
少なくとも２本以上の微細流路と、前記微細流路を同一温度に制御する温度制御機構と、前記微細流路に電圧を印加する電圧印加機構と、前記各微細流路から、流路全体にわたる電気泳動結果を取得する泳動結果取得機構と、を備えた電気泳動装置を用い、サンプル溶液中の目的の生体試料を判別する生体試料判別方法において、
電気泳動する特性を持ち、電気泳動の先頭位置を示す基準マーカーを含む、前記目的の生体試料を判定するマーカーを有するコントロール液及びサンプル溶液それぞれを、前記少なくとも２本以上の微細流路うちの異なる微細流路に注入した後、該微細流路それぞれを前記温度制御機構により同一温度になるよう制御する温度制御工程と、
前記微細流路それぞれにおいて、前記電圧印加機構により所定電圧を印加して、前記コントロール液中のマーカーと基準マーカー、及び前記サンプル溶液中の基準マーカーの電気泳動を同時に開始させ、電気泳動終了までの間に複数回、前記微細流路それぞれにおいて、前記泳動結果取得手段により前記サンプル溶液及び前記コントロール液の電気泳動結果を取得してそれぞれの前記基準マーカーの波形ピーク位置を比較し、該基準マーカーの波形ピーク位置が一致しないときは、前記電圧印加機構により少なくとも前記コントロール液か前記サンプル溶液のどちらか一方に次に印加する電圧を前記所定電圧とは異なる電圧に変化させて、前記基準マーカーの波形ピーク位置を一致させるように電気泳動させる、電気泳動工程と、
前記泳動結果取得機構により得た、前記コントロール液中のマーカーと前記サンプル溶液の電気泳動結果を、それぞれの前記基準マーカーの波形ピーク位置を一致させた状態で比較して、前記サンプル溶液中に目的の生体試料が存在するかを判定する判定工程と、を含む、
ことを特徴とする生体試料判定方法。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれかに記載の生体試料判定方法を、分離用ＤＮＡコンジュゲートを用いたＳＮＰｓ判定に使用する、
ことを特徴とする生体試料判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、糖類その他のあらゆる生体試料を、導電性媒体中で電気泳動により分離・識別して、目的とする生体試料の判定を行う生体試料判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に生体試料という場合、大まかにはＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質そして糖類等をさすことが多い。近年、分子生物学の急速な進展により様々な遺伝的体質や後天性疾患において、上記生体物質の有無や増減を解析することにより、かなり正確に解明されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。
【０００３】
ＤＮＡに関しては、現在ＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や副作用をあらかじめ予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。
【０００４】
現在ＳＮＰｓを調べる方法としては、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定方法）が最も一般的に用いられている。そして、前記シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、もっとも一般的に行われているのは、ジデオキシシーケンス法（Ｓａｎｇｅｒ法）である。なお、シーケンシングは、このＳａｎｇｅｒ法を含め何れの方法においても、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、キャピラリー電気泳動によって１塩基の長さの違いを分離・識別する技術が基になって成り立っている。そして、このようなシーケンシングによるＳＮＰｓの解析は、ターゲットとする遺伝子を単離した後、増幅・精製し、遺伝子の塩基配列決定法（装置）を用いて、目的遺伝子の塩基配列を読むことによって行なうものであるため、実験に膨大な作業量と時間、さらには多大のランニングコストを要し、またその際に使用する塩基配列決定のための自動化装置は、非常に高価で、大きなスペースを占有し、高価な試薬を大量に必要とするという問題を有している。
【０００５】
こうした問題点は、アフィニティキャピラリー電気泳動によってＤＮＡを分離する方法を用いればほぼ解決できる。アフィニティキャピラリー電気泳動は、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力（ＤＮＡとそれを相補するＤＮＡ、ＤＮＡとそのＤＮＡから転写されたＲＮＡ、酵素と基質、抗原と抗体の親和力等）を利用して分離に特異性を持たせるものであり、具体的には、キャピラリー管中の泳動溶液に、相互作用する二成分のうちの一方を添加しておき、他方の成分を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じることに着目して分析を行うものである（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
ここで、従来のアフィニティキャピラリー電気泳動では、塩基配列を特異的に認識するアフィニティ物質として、被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係にある１本鎖ＤＮＡを使うが、ポリヌクレオチドを成分とするＤＮＡは負電荷を有しているため、電圧を印加すると、このアフィニティ物質である、前記被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係にある一本鎖ＤＮＡが、前記キャピラリー管外に流出してしまう。これを防ぐため、従来では、このアフィニティ物質を、キャピラリー管内に固定化している。そして、前記アフィニティ物質のキャピラリー管への固定化の方法として、ビニル化ＤＮＡをリニアポリマー化したポリアクリルアミドと共重合し、それをキャピラリー管の内壁に共有結合的に固定化するものが提案されている。
【０００７】
これにより、前記被検体ＤＮＡは、アフィニティ物質である固定的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）と強く相互作用して、キャピラリー管内に吸着され、一方前記被検体ＤＮＡ以外のノイズＤＮＡは、該固定的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）に吸着されず、キャピラリー管外に流出され、この結果、前記被検体ＤＮＡを検出することが可能となる（特許文献１参照）。
【０００８】
しかしながら、この方法では、アフィニティ物質である一本鎖ＤＮＡ（以下：アフィニティーＤＮＡ）がキャピラリー管の内壁にしかコーティングできないので、アフィニティＤＮＡと試料ＤＮＡとの相互作用がキャピラリー管の壁面近傍に限られ、測定が難しく、且つ測定精度が悪くなるという問題がある。
【０００９】
そこで、本出願人は、アフィニティＤＮＡと試料ＤＮＡとの相互作用が、キャピラリー管の壁面近傍に限られないように、該アフィニティＤＮＡをキャピラリー管内で擬似的に固定する方法を開発し、例えば、それぞれに電極を配置した第１容器と第２容器間を、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液を充たしたキャピラリー管で連絡し、次いで、このキャピラリー管に充たされた緩衝液中に、試料ＤＮＡに含まれる異常ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を結合したリニアポリマーからなる分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填した後、続いて被検体である試料ＤＮＡを充填し、その後、両電極間に電圧を印加して、キャピラリー管内の被検体である試料ＤＮＡを電気泳動させることで、該試料ＤＮＡを分離する遺伝子診断装置と遺伝子診断方法を提案している（特許文献２参照）。
【００１０】
以下、アフィニティＤＮＡをキャピラリー管内で擬似的に固定化する方法について説明する。
【００１１】
ＤＮＡは二本鎖を形成するものと一本鎖を形成するものとが存在するが、ＤＮＡのもつＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇ４つの塩基は互いにＡとＴ、ＧとＣが結合しペアを形成する性質を有しており、ＤＮＡの二本鎖においてもＡＴ，ＧＣで対をなしている。従って、一方のＤＮＡがＡＴＣＧＣＧＴと配列されている場合、他方のＤＮＡはＴＡＧＣＧＣＡという塩基配列をもっている。
【００１２】
サンプル溶液であるＤＮＡサンプルを分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートは、前述したようなＤＮＡの相補的関係を利用するために、該分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分に、ＤＮＡサンプルの異常ＤＮＡと相補的関係をもつＤＮＡ配列を与えている。例えば、ＤＮＡサンプルの異常ＤＮＡのＤＮＡ配列がＡＴＣＧＣＧＴを含み、正常ＤＮＡがＡＴＣＡＣＧＴを含む場合、下線で示した部分で異常ＤＮＡの塩基と正常ＤＮＡの塩基とが異なっている。このとき、分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分の配列をＴＡＧＣＧＣＡとすると、正常ＤＮＡは下線部において分離用ＤＮＡコンジュゲートと相補的ではなくなる。これにより、全体の結合力は異常ＤＮＡの方が正常ＤＮＡより１塩基分大きくなり、電気泳動時に異常ＤＮＡの方が正常ＤＮＡより遅延して泳動される。
【００１３】
ＤＮＡサンプルは、血液などから細胞を破壊してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲなどによって目的のＤＮＡ配列を含む部分を増幅する。このとき、所定の塩基数にして増幅すると、相補的配列を持つ分離用ＤＮＡコンジュゲートの塩基数も決定できる。
【００１４】
このようにすれば、負に帯電した分離用ＤＮＡコンジュゲートとサンプル溶液とを、電気泳動で第２容器から第１容器へ移動させる際に、キャピラリー管内で、分離用ＤＮＡコンジュゲート中のアフィニティＤＮＡとサンプル溶液中の試料ＤＮＡとの相互作用が壁面近傍に限られないように擬似的に固定し、その試料ＤＮＡの移動速度差から、該試料ＤＮＡ中の正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとを分離することができ、この結果、ＳＮＰｓの遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に判別することが可能になる。
【００１５】
ここで、前述した特許文献２における判定手段では、電気泳動を開始した時間を基点として、その経過時間に対するＤＮＡサンプルの検出を、キャピラリー管の一部で、例えばＤＮＡが良く吸収する２６０ｎｍの波長の吸光度を測定することで検出している。このような方法は一般的にクロマトグラフィーと呼ばれており、代表的な装置として以下に説明するＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙの略）がある。
【００１６】
ＨＰＬＣは、分離したいサンプルをトラップできるカラムを用意しておき、そのカラムにトラップされたサンプルを、親水性の溶離液と疎水性の溶離液の混合物を流すことにより、カラムから剥ぎ取る手法であるが、時間経過に対して親水性の溶離液と疎水性の溶離液の混合比率を定量的に変化させて、目的とするサンプルを抽出するという方法である。
【００１７】
従って、ＨＰＬＣでは、最初に、検出したいと思っている目的の生体試料を予め準備しておき、これをコントロール液として流し、そのコントロール液の時間経過に対する検出位置を測定しておく。その次に、測定したいサンプル溶液を流し、そのサンプル溶液の時間経過に対する検出位置が、予め測定しておいた前記コントロール液の時間経過に対する検出位置と同じかどうかで、サンプル溶液の中に目的の生体試料が含まれているかどうかを判断していた。
【特許文献１】特開平７−３１１１９８号公報
【特許文献２】特開２００２−３４０８５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかしながら、前述したＨＰＬＣのように、最初に基準となるコントロール液を流し、その次にサンプル溶液を実際に流し、コントロール液の検出位置とサンプル溶液の検出位置とを比較する方法を、特許文献２の遺伝子診断装置と診断方法における判定手段に応用した場合、図６（ａ）〜（ｄ）で示すように、サンプル溶液を測定するたびに、得られるサンプル溶液のピーク位置と、予め測定しておいたコントロール液のピーク位置３４がずれてしまう。
【００１９】
これは、電気泳動を行う時の温度、微細流路に注入する分離用コンジュゲートの濃度等さまざまな因子により電気泳動速度がずれ、結果として検出される時間が前後するためである。
【００２０】
ところで、試料ＤＮＡに含まれるＤＮＡの種類は、図７に示されているように、（ａ）ワイルドタイプＤＮＡ（正常ＤＮＡ）のみ（ｂ）ＳＮＰｓタイプＤＮＡ（異常ＤＮＡ）のみ（ｃ）ワイルドタイプＤＮＡとＳＮＰｓタイプＤＮＡの混合の３タイプが考えられる。従って、サンプル溶液の波形にはピークが複数個ある可能性があり、前述したように、コントロール液のピーク位置と、測定したサンプル溶液のピーク位置がずれていると、測定したサンプル溶液のピークのいずれが目的の被検体ＤＮＡであるかを明確に判定することができないという課題を有していた。
【００２１】
また、実際の測定においては、上記３タイプの波形に加えて、プライマーと呼ばれるＰＣＲの残物の波形が加わり、サンプル溶液の波形は、図８に示すように検出される波形が増えて一段と複雑となり、コントロール液のピーク位置と測定したサンプル溶液のピーク位置のずれが存在すると、より一層、測定したサンプル溶液中の被検体ＤＮＡの判定を正確にできないという課題を有していた。
【００２２】
本発明は、前記課題を解決するためになされたものであり、コントロール液あるいはサンプル溶液中に含まれる生体試料の泳動状態および泳動位置を正確に判別して、サンプル溶液中の目的とする生体試料の判定を正確に行える生体試料判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
前記課題を解決するために、本発明にかかる生体試料判定方法は、少なくとも２本以上の微細流路と、前記微細流路を同一温度に制御する温度制御機構と、前記微細流路に電圧を印加する電圧印加機構と、前記各微細流路から電気泳動結果を取得する泳動結果取得機構と、を備えた電気泳動装置を用い、サンプル溶液中の目的の生体試料を判別する生体試料判別方法において、前記目的の生体試料を判定するマーカーを有するコントロール液及び前記サンプル溶液それぞれを、前記少なくとも２本以上の微細流路うちの異なる微細流路に注入した後、該微細流路それぞれを前記温度制御機構により同一温度になるよう制御する温度制御工程と、前記微細流路それぞれに、前記電圧印加機構により電圧を印加して、前記コントロール液中のマーカー及び前記サンプル溶液の電気泳動を同時に開始させ、前記泳動結果取得手段により、前記サンプル溶液及びコントロール液の電気泳動結果を取得する電気泳動工程と、前記泳動結果取得機構により得た、前記コントロール液中のマーカーと前記サンプル溶液の電気泳動結果を比較して、前記サンプル溶液中に目的の生体試料が存在するかを判定する判定工程と、を含むものである。
【００２４】
これにより、生体試料の判定において、温度による影響をなくしたコントロール液の使用ができる。
【００２５】
また、本発明にかかる生体試料判定方法は、少なくとも２本以上の微細流路と、前記微細流路を同一温度に制御する温度制御機構と、前記微細流路に電圧を印加する電圧印加機構と、前記各微細流路から電気泳動結果を取得する泳動結果取得機構と、を備えた電気泳動装置を用い、サンプル溶液中の目的の生体試料を判別する生体試料判別方法において、電気泳動する特性を持ち、電気泳動の先頭位置を示す基準マーカーを含む、前記目的の生体試料を判定するマーカーを有するコントロール液及び前記サンプル溶液それぞれを、前記少なくとも２本以上の微細流路うちの異なる微細流路に注入した後、該微細流路それぞれを前記温度制御機構により同一温度になるよう制御する温度制御工程と、前記微細流路それぞれに、前記電圧印加機構により電圧を印加して、前記コントロール液中のマーカー及び前記サンプル溶液の電気泳動を同時に開始させ、前記泳動結果取得手段により、前記サンプル溶液及びコントロール液の電気泳動結果を取得する電気泳動工程と、前記泳動結果取得機構により得た、前記コントロール液中のマーカーと前記サンプル溶液の電気泳動結果を比較して、前記サンプル溶液中に目的の生体試料が存在するかを判定する判定工程と、を含むものである。
【００２６】
これにより、生体試料の判定において、サンプル溶液とコントロール液に含まれる生体試料の泳動位置がずれていても、基準マーカーを目印にして、生体試料の判定を確実に行うことができる。
【００２７】
さらに、前記判定工程は、前記泳動結果取得機構により得た、前記コントロール液中のマーカーと前記サンプル溶液の電気泳動結果を、それぞれの前記基準マーカーの波形ピーク位置を一致させた状態で比較して、前記サンプル溶液中に目的の生体試料が存在するかを判定するものである。
【００２８】
これにより、より正確に生体試料の判定を行うことができる。
【００２９】
また、本発明にかかる生体試料判定方法は、少なくとも２本以上の微細流路と、前記微細流路を同一温度に制御する温度制御機構と、前記微細流路に電圧を印加する電圧印加機構と、前記各微細流路から、流路全体にわたる電気泳動結果を取得する泳動結果取得機構と、を備えた電気泳動装置を用い、サンプル溶液中の目的の生体試料を判別する生体試料判別方法において、電気泳動する特性を持ち、電気泳動の先頭位置を示す基準マーカーを含む、前記目的の生体試料を判定するマーカーを有するコントロール液及びサンプル溶液それぞれを、前記少なくとも２本以上の微細流路うちの異なる微細流路に注入した後、該微細流路それぞれを前記温度制御機構により同一温度になるよう制御する温度制御工程と、前記微細流路それぞれに、前記電圧印加機構により所定電圧を印加して、前記コントロール液中のマーカーと基準マーカー、及び前記サンプル溶液中の基準マーカーの電気泳動を同時に開始させ、電気泳動終了前の同じ経過時点で、前記泳動結果取得手段により、前記サンプル溶液及び前記コントロール液の電気泳動結果を取得してそれぞれの前記基準マーカーの波形ピーク位置を比較し、該基準マーカーの波形ピーク位置が一致するときは、そのまま電気泳動させ、一致しないときは、前記電圧印加機構により、少なくとも前記コントロール液か前記サンプル溶液のどちらか一方に次に印加する電圧を、前記所定電圧とは異なる電圧に変化させて、前記基準マーカーの波形ピーク位置を一致させるように電気泳動させる、電気泳動工程と、前記泳動結果取得機構により得た、前記コントロール液中のマーカーと前記サンプル溶液の電気泳動結果を、それぞれの前記基準マーカーの波形ピーク位置を一致させた状態で比較して、前記サンプル溶液中に目的の生体試料が存在するかを判定する判定工程と、を含むものである。
【００３０】
これにより、生体試料の判定において、コントロール液とサンプル溶液の泳動速度差を無くすことができ、この結果、生体試料の判定を正確に行うことができる。
【００３１】
また、本発明にかかる生体試料判定方法は、少なくとも２本以上の微細流路と、前記微細流路を同一温度に制御する温度制御機構と、前記微細流路に電圧を印加する電圧印加機構と、前記各微細流路から、流路全体にわたる電気泳動結果を取得する泳動結果取得機構と、を備えた電気泳動装置を用い、サンプル溶液中の目的の生体試料を判別する生体試料判別方法において、電気泳動する特性を持ち、電気泳動の先頭位置を示す基準マーカーを含む、前記目的の生体試料を判定するマーカーを有するコントロール液及びサンプル溶液それぞれを、前記少なくとも２本以上の微細流路うちの異なる微細流路に注入した後、該微細流路それぞれを前記温度制御機構により同一温度になるよう制御する温度制御工程と、前記微細流路それぞれにおいて、前記電圧印加機構により所定電圧を印加して、前記コントロール液中のマーカーと基準マーカー、及び前記サンプル溶液中の基準マーカーの電気泳動を同時に開始させ、電気泳動終了までの間に複数回、前記微細流路それぞれにおいて、前記泳動結果取得手段により前記サンプル溶液及び前記コントロール液の電気泳動結果を取得してそれぞれの前記基準マーカーの波形ピーク位置を比較し、該基準マーカーの波形ピーク位置が一致しないときは、前記電圧印加機構により少なくとも前記コントロール液か前記サンプル溶液のどちらか一方に次に印加する電圧を前記所定電圧とは異なる電圧に変化させて、前記基準マーカーの波形ピーク位置を一致させるように電気泳動させる、電気泳動工程と、前記泳動結果取得機構により得た、前記コントロール液中のマーカーと前記サンプル溶液の電気泳動結果を、それぞれの前記基準マーカーの波形ピーク位置を一致させた状態で比較して、前記サンプル溶液中に目的の生体試料が存在するかを判定する判定工程と、を含むものである。
【００３２】
これにより、生体試料の判定において、コントロール液とサンプル溶液の泳動速度差を細かく調整することができるため、印加電圧の変化量を少なくして、電気泳動物質への影響を少なくでき、この結果、生体試料の判定をより正確に行うことができる。
【００３３】
さらに、本発明にかかる生体試料判定方法は、請求項１から請求項５のいずれかに記載の生体試料判定方法を、分離用ＤＮＡコンジュゲートを用いたＳＮＰｓ判定に使用するものである。
【００３４】
これにより、正確なＳＮＰｓの判定ができる方法を提供することができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の生体試料判定方法によれば、電気泳動する特性をもち、電気泳動の先頭位置を示す基準マーカーを含む、目的の生体試料を判定するマーカーを有するコントロール液及びサンプル溶液それぞれを、２つ以上ある微細流路のうちの異なる微細流路にそれぞれ注入した後、該各微細流路を温度制御機構により同一温度になるよう制御した後、前記電圧印加機構により各微細流路に電圧を印加して電気泳動させ、前記泳動取得機構により取得した前記コントロール液のマーカー及びサンプル溶液の電気泳動結果を比較して、前記サンプル溶液中に目的とする生体試料が含まれるかを判定するようにしたので、コントロール液とサンプル溶液の電気泳動速度が異なっていたとしても、前記基準マーカーを目印に、サンプル溶液中の目的とする生体試料の判定を正確に行うことができる。
【００３６】
また、本発明の生体試料判定方法によれば、前記コントロール液及びサンプル溶液の電気泳動開始から同じ経過時点において、前記コントロール液と前記サンプル溶液中それぞれの電気泳動結果を取得してそれぞれの基準マーカーの波形ピーク位置を比較し、該基準マーカーのピーク位置が一致するときはそのまま電気泳動させ、一致しないときは、前記コントロール液か前記サンプル溶液のいずれか一方の印加電圧を変化させて電気泳動させるようにしたので、前記コントロール液と前記サンプル溶液の電気泳動速度差を少なくすることができ、この結果、サンプル溶液中の目的とする生体試料の判定を正確に行うことができる。
【００３７】
さらに、電気泳動終了までに、前記コントロール液と前記サンプル溶液それぞれの基準マーカーの電気泳動結果を比較して印加電圧を変化させる動作を、複数回行うようにしたので、コントロール液とサンプル溶液の電気泳動速度差が少なくなるように、前記コントロール液及びサンプル溶液の電気泳動速度の調整を細かく行うことができるため、印加電圧の変動量を少なくして、電気泳動物質への影響を小さくでき、この結果、サンプル溶液中の目的とする生体試料の判定をより正確に行うことができる。
【００３８】
加えて、前記サンプル溶液中の目的とする生体試料の判定を、前記コントロール液及びサンプル溶液の基準マーカーの波形ピーク位置を一致させた状態で行うようにしたので、前記生体試料の判定をさらに正確に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
（実施の形態１)
以下に、本発明おける電気泳動装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
図１は、本発明おける電気泳動装置の概略構成を示した図である。電気泳動装置は、本体１、上蓋２及び検査プレート３で構成され、検査プレート３は、２本の嵌合ピン４ａ，４ｂで、本体１のプレート台８ａ上に固定される。固定した検査プレート３は、ステッピングモータ５を動力源とする回転機構６によって回転制御が可能である。なお、回転機構６の動力はＤＣモータを使用してもかまわない。
【００４０】
検査プレート３の下には、泳動結果取得機構である光検出部７が備えられており、検査プレート３に対する光源の照射と検査プレート３からの発光（もしくは反射光や吸光度）を検出する。また、検査プレート３が装着された空間８は、上蓋２を閉めた状態で気密性が高くなる構成となっており、温度制御機構である加熱冷却デバイス９（ペルチェ素子やヒーター）とサーミスタ１０とを用いて温度制御が可能な空間である。これにより、検査プレート３の周辺温度を、一定温度のプラスマイナス１℃以内に制御する。
【００４１】
上蓋２は、圧縮バネ１５と電圧印加機構１１を備えている。圧縮バネ１５は、上蓋２を本体１に押し付けることで、空間８の気密性を高くするものである。また、電圧印加機構１１は、電極基板ユニット１２に装着されたプラスとマイナスの一対の電極プローブ１３ａ，１３ｂと、その一対の電極プローブ１３ａ，１３ｂを昇降させるＤＣモータ１４とからなる。さらに、マイナス電極プローブ１３ｂには、電気泳動中の電流を検出可能な電流検出機構１６が備えられている。電極プローブは、検査流路の数に対応した数、すなわち１検査流路につきプラスとマイナスの電極プローブ１３が１セットずつ装着されており、また各電極プローブ１３ａ，１３ｂは、印加電圧が変更可能な構成とされている。
【００４２】
図２は、上蓋２を開けた状態の電気泳動装置を示した図であり、この状態でプレート台８ａに検査プレート３を脱着する。なお、検査プレート３の脱着は、これに限るものでなく、例えば上蓋２と本体１を一体型の装置とした、光ディスク装置に代表されるような、トレイにプレートを乗せて脱着する方式やスロットインの方式にしても構わない。
【００４３】
次に図３は、上から見た検査プレート３の概略構成を示した図である。検査プレート３は２本の嵌合ピン４ａ，４ｂと嵌合する接続穴２６ａ，ｂが開いており、その接続穴２６ａ，２６ｂと検査プレート３の角を落とした位置あわせ部１７とで、該検査プレート３を本体１に取り付ける際、その取り付け方向を固定にし、本体１に対して検査プレート３の表裏が逆にならないようにする。
【００４４】
検査プレート３には複数の検査部１８が設けられており、本実施の形態では４個の場合を示している。検査部１８は、液体を注入するための注入口１９、電気泳動を検出する微細流路である検査流路２０、余分な液体を溜めるバッファ２１、検査流路２０とバッファ２１との間の微細流路２２、及び検査流路２０へ電圧を印加するための２箇所の電極部２３ａ，２３ｂで構成される。前記検査流路２０は、断面積が直径５０〜３００μｍの円形と同等とし、断面形状は変化してはならない。また、各検査部１８の検査流路２０は、検査プレート３の真ん中に位置する接続穴２６ｂを中心とした同一円周２５上に位置している。同一円周２５は、本体１に検査プレート３を装着して回転機構６で回転させた際に、光検出部７上を通過する。また、バッファ２１には、液体が漏れないほどの空気穴２４が開いている。
【００４５】
以上のように構成された電気泳動装置について、以下にその動作、作用を説明する。なお、ここでは、サンプル溶液中に目的ＤＮＡが存在するか判定するために、コンジュゲートを用いたＳＮＰｓ判定を行う場合を一例に挙げる。
【００４６】
コンジュゲートは、最低でも６０塩基以上の塩基配列で構成されたサンプル溶液であるサンプルＤＮＡの配列の一部と相補的に配列する６〜１０塩基の配列を持つＤＮＡをアミノ化して、ＭＯＳＵ（メタクリロイル・オキシ・スクシンイミド）を使用してビニル化する。ビニル化の詳細な方法は、本発明に直接関係しないので省略する。ビニル化したＤＮＡとモノマーのアクリルアミド、重合開始剤であるＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）とＴＥＭＤ（テトラメチルエチレンジアミン）とを混合して、嫌気性の中で反応させると、リニアーのポリアクリルアミドの一部に、サンプルＤＮＡの配列の一部と相補的に配列する６〜１０塩基の配列を持つＤＮＡが混入される。この特殊なＤＮＡを含むアクリルアミドポリマーと、緩衝液とを混合してコンジュゲートとする。緩衝液は、トリスとホウ酸によってｐＨ調整された水溶液に、塩化マグネシウムなどの結合制御剤を混合したものを使用する。なお、ｐＨが調整できて緩衝作用を有し、サンプルに影響を与えない物質であれば他の緩衝液でも良い。コンジュゲートの詳細な作成方法は特許文献２を参考にすると良い。
【００４７】
前述したコンジュゲートを、検査プレート３上の複数ある検査部１８、ここでは４つの検査部、のうちの使用する検査部１８に注入口１９から注入して、検査流路２０の全体を満たす。
【００４８】
前記検査流路２０の全体をコンジュゲートで満たす際には、本体１の回転機構６による遠心力を使用しても良い。ただ、コンジュゲートを検査流路２０に満たす際に流路中に気泡が混入すると、電圧を印加しても電気が流れないという現象が発生して、電気泳動できなくなるため、気をつける必要がある。
【００４９】
この後、サンプル溶液とコントロール液それぞれを、コンジュゲートで充填された、異なる検査部１８に注入する。例えば、プレート３上の２箇所の検査部１８に、サンプル溶液とコントロール液それぞれを対に注入するか、あるいは複数のサンプル溶液を同一条件下で測定するのであれば、プレート３上の４箇所の検査部１８のうち、１箇所にコントロール液を注入し、残りの３箇所にサンプル溶液を注入するものとしても良い。
【００５０】
サンプル溶液中に含まれるサンプルＤＮＡは、ターゲットの塩基配列を血液や細胞などから抽出してきた全ＤＮＡより、ＰＣＲなどで取り出してくる。ＰＣＲで増幅するためには、前後にプライマーを設ける必要があるため、ＤＮＡの塩基数は４０塩基以上であることが望ましい。更に、同じ配列の型がＤＮＡ内にないことが望ましい。
【００５１】
コントロール液中に含まれるマーカーは、ＳＮＰｓタイプのＤＮＡを使用する。これは、サンプルＤＮＡと同一塩基数で、コンジュゲートに影響を受けないものとするためである。
【００５２】
更に、本実施の形態では、サンプル溶液とコントロール液それぞれに、ＰＣＲに使用したプライマーを意図的に挿入する。これは、前記プライマーを、電気泳動の先頭位置を示す基準マーカーとして使用し、ＰＣＲ時の残物プライマー波形による誤判定の影響を無くすためである。なお、この基準マーカーは、蛍光物質をつけた、プライマーと同じか短い長さの電気泳動物質でも構わない。これは、電気泳動物質の長さが短いほうが、電気泳動速度が速いことが分かっているためである。ただし、より正確に判定するためにも、基準マーカーは、プライマーを利用するか、あるいは蛍光物質をつけた、プライマーと同じ長さの電気泳動物質が好ましい。
【００５３】
前述したようにサンプル溶液とコントロール液が注入された検査プレート３を、本体１のプレート台８ａ上に装着した後、上蓋２を閉め、温度制御機構である加熱冷却デバイス９及びサーミスタ１０により、空間８中を所定温度になるよう温度制御する。このように検査プレート３を同一温度下に置くことで、サンプル溶液及びコントロール液の電気泳動に対する温度による影響をなくすことができる。
【００５４】
検査プレート３が所定の温度になった後、ＤＣモータ１４により各電極プローブ１３ａ，１３ｂを降ろして検査プレート３の電極部２３ａ，２３ｂと接触させる。接触後、サンプル溶液とコントロール液が注入された検査部１８それぞれに、一定の電圧を所定時間印加する。この時の印加電圧と所定時間は、使用する検体によって異なってくるが、本実施の形態では、印加電圧４００Ｖ、所定時間３０秒とする。この所定時間は、電気泳動によって、泳動物質が少し移動する時間である。
【００５５】
３０秒経過後、各検査流路２０の状態（電気泳動結果）を確認するため、電極プローブ１３ａ，１３ｂを上げて、回転機構６を用いて検査プレート３を一定角度回転（図３の状態では、反時計回転方向へ回転）させながら、光検出部７から前記検査流路２０に対して励起光を照射して、蛍光物質が発する光の強度を検出し、電気泳動結果を取得する。なお、このとき、回転機構６によって、検査プレート３を一定角度でなく、一定時間回転させても良い。この時の電気泳動結果を示した図が図４である。
【００５６】
図４（ａ）は、電気泳動開始から３０秒経過後のサンプル溶液の電気泳動結果を示し、図４（ｂ）は、その同じ経過時点におけるコントロール液の電気泳動結果を示すものである。なお、図４中横軸は検査流路２０の位置を示し、縦軸は光度を示している。遺伝子はマイナスに帯電されるので、マイナス側からプラス側に引き寄せられる。そのため、図４中の右側に波形が表示されるほど電気泳動が進んだ状態（電気泳動速度が速い状態）を示している。
【００５７】
検査流路２０に所定時間、所定の電圧を印加すると、コンジュゲート、コントロール液、及びサンプル溶液の濃度のバランスによって、図４に示すように、サンプル溶液中の基準マーカーであるサンプル溶液の先頭のピーク位置２７と、コントロール液中の基準マーカーであるコントロール液の先頭のピーク位置２８との間に、電気泳動速度差２９が発生する。
【００５８】
この電気泳動速度差をなくすために、本実施の形態では、電気泳動が進んでいる方（図４の場合は、コントロール液）に印加する電圧を低下させることで、電気泳動が進んでいる方（コントロール液）の電気泳動速度を遅くして、サンプル溶液の先頭のピーク位置２７とコントロール液の先頭のピーク位置２８とが一致するようにする。この時の印加電圧の低下量は、電流検出機構１６で取得した電流値を参考にして下げると良い（０．５〜３．０μＡ下がるようにする）。なお、このとき印加電圧を下げすぎると電気泳動が進まなくなるため、電流値が所定の値を下回るのであれば、泳動速度の遅い方の電圧を上げて対応する。このようにすることで、コントロール液とサンプル溶液との泳動速度を一致させるようにすることができる。
【００５９】
この後、再び、ＤＣモータ１４により各電極プローブ１３ａ，１３ｂを降ろして検査プレート３の電極部２３ａ，２３ｂと接触させ、サンプル溶液とコントロール液が注入された検査部１８それぞれに、前回印加した電圧と同じ電圧あるいは、該電圧とは異なる変化させた電圧を所定時間印加する。本実施の形態では、コントロール液の印加電圧を３８０Ｖとし、サンプル液の印加電圧を４００Ｖとして、所定時間は３０秒で共通とする。
【００６０】
所定時間経過後、各検査流路２０の状態（電気泳動結果）を確認するため、電極プローブ１３ａ，１３ｂを上げて、回転機構６を用いて検査プレート３を一定角度回転（図３の状態では、反時計回転方向へ回転）させながら、光検出部７から前記検査流路２０に対して励起光を照射して、蛍光物質が発する光の強度を検出し、電気泳動結果を取得する。
【００６１】
そして電気泳動終了後、前記光検出部７により取得したコントロール液とサンプル溶液の電気泳動結果を比較して、サンプル溶液中に目的のＤＮＡが存在するかを判定する。このとき、サンプル溶液とコントロール液の電気泳動結果を、図５に示すように、コントロール液とサンプル溶液の基準マーカーのピーク位置を一致させた状態で比較する。これにより、サンプル溶液中の目的ＤＮＡを正確に判定することができる。
【００６２】
図５は、コントロール液とサンプル溶液の基準マーカーのピーク位置を一致させた、それぞれの電気泳動結果であり、図５（ａ）はサンプル溶液の電気泳動結果、図５（ｂ）はコントロール液の電気泳動結果である。
【００６３】
サンプル溶液中に目的ＤＮＡが存在するか判定するには、図５に示すように、電気泳動終了時の電気泳動結果において、コントロール液とサンプル溶液の基準マーカーのピーク位置３０を一致させた状態にし、基準マーカーのピーク位置３０からコントロール液中のマーカーのピーク位置３１までの電気泳動差３２の位置に、サンプル溶液の電気泳動結果の波形が存在した場合は、ＳＮＰｓタイプＤＮＡが存在すると判定し、更に電気泳動差３２より長い電気泳動差３３の位置に波形のピークが存在した場合は、ワイルドタイプＤＮＡが存在すると判定する。したがって、図５が示す結果においては、両方の条件を満たしているためワイルドタイプＤＮＡとＳＮＰｓタイプＤＮＡが混合して存在すると判定する。
【００６４】
以上の手法を用いた電気泳動装置により、測定したサンプルに目的のＤＮＡ（生体試料）が存在したかの判定を明確にすることが可能となる。
【００６５】
なお、上記の電気泳動装置構成以外でも、２本以上複数のキャピラリー管を備えており、それぞれのキャピラリー管を同一温度下で同時に電気泳動可能であり、各印加電圧が制御可能で、キャピラリー管内の電気泳動位置が確認できるのであれば、前述手法を用いることでコントロール液を使用した生体試料の判定が実施可能である。
【００６６】
以上のように、本実施の形態によれば、目的ＤＮＡを判定するマーカーを有するコントロール液とサンプル溶液それぞれに、電気泳動の先頭位置を示す、プライマーからなる基準マーカーを含め、該コントロール液とサンプル溶液それぞれを、同一検査プレート３上の異なる微細流路に注入し、同一の温度条件下で電気泳動を開始させ、電気泳動終了前の、同じ経過時点におけるサンプル溶液及びコントロール液の電気泳動結果を取得して基準マーカーの波形ピーク位置を比較し、基準マーカーのピーク位置が一致するときは、そのまま電気泳動させ、一致しないときは、サンプル溶液あるいはコントロール液のいずれか一方の印加電圧を変化させて、前記基準マーカーのピーク位置を一致させるように電気泳動させ、電気泳動終了後に、光検出部７により得た、前記コントロール液中のマーカーと前記サンプル溶液の電気泳動結果を比較するようにしたので、電気泳動中に生じるコントロール液とサンプル溶液の電気泳動速度を一致させた状態で、前記コントロール液とサンプル溶液の電気泳動結果を比較することが可能となり、サンプル溶液中の目的ＤＮＡの判定を正確に行うことができる。
【００６７】
なお、コントロール液とサンプル溶液の基準マーカーのピーク位置を比較して、次に印加する電圧を変化させる処理を、電気泳動が終了するまでの間に複数回行うようにしてもよい。このようにすれば、サンプル溶液とコントロール液の電気泳動速度を細かく調整して、変化させる印加電圧を小さくできるため、電気泳動物質への影響を少なくしつつ、コントロール液及びサンプル溶液の電気泳動速度を一定に保つことができ、この結果、前記サンプル溶液中の目的ＤＮＡの判定をさらに正確に行うことができる。
【００６８】
さらに、前述の印加電圧を変化させる処理を行わず、電気泳動終了後に、光検出部７にて取得したコントロール液及びサンプル溶液の電気泳動結果を比較する時に、それぞれの基準マーカーのピーク位置を一致させた状態で行うようにしてもよく、このようにすれば、サンプル溶液中の目的ＤＮＡの判定を迅速、且つ確実に行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明にかかる生体試料判定方法は、電気泳動を使用して、サンプル溶液中に目的の生体試料が存在するかを判定する技術に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本実施の形態１における、電気泳動装置の構成を示す概略図である。
【図２】本実施の形態１における、電気泳動装置の上蓋を開けた状態を示した概略図である。
【図３】本実施の形態１における、検査プレートの概略構成図である。
【図４】本実施の形態１における、３０秒経過後の電気泳動結果を示した図であり、図（ａ）はサンプル溶液の電気泳動結果を示し、図（ｂ）はコントロール液の電気泳動結果を示す図である。
【図５】本実施の形態１における、電気泳動終了時のサンプル溶液及びコントロール液の電気泳動結果の基準マーカーのピーク値を一致させた図であり、図（ａ）はサンプル溶液の電気泳動結果を示し、図（ｂ）はコントロール液の電気泳動結果を示す図である。
【図６】従来における、コントロール液とサンプル溶液の電気泳動結果のずれを示した図であり、図（ａ）はコントロール液の電気泳動結果を示し、図（ｂ）〜（ｄ）はサンプル溶液の電気泳動結果を示す図である。
【図７】従来における、３タイプのサンプルＤＮＡの電気泳動結果を示す図であり、図（ａ）はサンプルＤＮＡが、ワイルドタイプＤＮＡである場合、図（ｂ）はＳＮＰｓタイプＤＮＡである場合、図（ｃ）はワイルドタイプＤＮＡとＳＮＰｓタイプＤＮＡの混合である場合を示す。
【図８】従来における、プライマーを含む、３タイプのサンプルＤＮＡの電気泳動結果を示す図であり、図（ａ）はサンプルＤＮＡが、ワイルドタイプＤＮＡである場合、図（ｂ）はＳＮＰｓタイプＤＮＡである場合、図（ｃ）はワイルドタイプＤＮＡとＳＮＰｓタイプＤＮＡの混合である場合を示す。
【符号の説明】
【００７１】
１  本体
２  上蓋
３  検査プレート
４ａ，４ｂ  嵌合ピン
５  ステッピングモータ
６  回転機構
７  光検出部
８  空間
８ａ  プレート台
９  加熱冷却デバイス
１０  サーミスタ
１１  電圧印加手段
１２  電極基板ユニット
１３ａ，１３ｂ  電極プローブ
１４  ＤＣモータ
１５  圧縮バネ
１６  電流検出機構
１７  位置あわせ部
１８  検査部
１９  注入口
２０  検査流路
２１  バッファ
２２  微細流路
２３ａ，２３ｂ  電極部
２４  空気穴
２５  同一円周
２６ａ，２６ｂ  接続穴
２７、３１  基準マーカーのピーク位置（サンプル溶液）
２８、３０  基準マーカーのピーク位置（コントロール液）
２９  電気泳動速度差
３２、３３  電気泳動差
３４  コントロール液のマーカーのピーク位置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008209349.tif 000009
【図８】
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