(57)【要約】【課題】ＤＮＡ、タンパク質等の所望の物質の微細パターンを所望の基板上に作製するための手段を提供すること。【解決手段】「スポット形成縮小工程」および「物質担持工程」を行うことにより物質が担持された表面を作製する方法。「スポット形成縮小工程」、「スポット転写縮小工程」および「物質担持工程」を行うことにより物質が担持された表面を作製する方法。伸縮性基材の伸長と収縮を利用して縮小スポットを作製する。少なくとも一回の「縮小−転写」または複数回の「縮小−転写」の繰り返しによって所望の表面上に微細なスポットを形成することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質が担持された表面の作製方法であって、
伸長した状態の伸縮性基材Ａの表面に、前記物質を含むスポットを形成し、次いで基材Ａを収縮させることにより前記スポットを縮小する「スポット形成縮小工程」を行い、
前記縮小スポットを有する基材Ａの表面を、物質を担持すべき表面Ｃと接触させ、前記表面Ｃに前記物質の少なくとも一部を転写することにより、前記表面Ｃ上に前記物質を担持させる「物質担持工程」を行う、前記方法。
【請求項２】
物質が担持された表面の作製方法であって、
伸長した状態の伸縮性基材Ａの表面に、前記物質を含むスポットを形成し、次いで基材Ａを収縮させることにより前記スポットを縮小する「スポット形成縮小工程」を行い、
一つ前の工程により縮小されたスポットを有する基材表面を、伸長した状態の別の基材Ｂの表面と接触させ、基材Ｂの表面に前記物質の少なくとも一部を転写することにより、基材Ｂ表面に前記物質を含むスポットを形成し、次いで基材Ｂを収縮させることにより前記スポットを縮小する「スポット転写縮小工程」をＮ回（ここで、Ｎは１以上の整数である。）行い、
Ｎ回目のスポット転写縮小工程によって得られたスポットを有する基材表面を、物質を担持すべき表面Ｃと接触させ、前記表面Ｃに前記物質の少なくとも一部を転写することにより、前記表面Ｃ上に前記物質を担持させる「物質担持工程」を行う、前記方法。
【請求項３】
物質が担持された表面の作製方法であって、
伸長した状態の伸縮性基材Ａの表面に、前記物質を含むスポットを形成し、次いで基材Ａを収縮させることにより前記スポットを縮小する「スポット形成縮小工程」を行い、
一つ前の工程によって作製されたスポットを有する基材表面を、伸長した状態の別の基材Ｂの表面と接触させ、基材Ｂの表面に前記物質の少なくとも一部を転写することにより、基材Ｂ表面に前記物質を含むスポットを形成する「スポット転写縮小工程」をＮ回行い（ここで、Ｎは１以上の整数である。）、但し、前記スポット転写縮小工程は、前記転写後に基材Ｂを収縮させることにより、形成されたスポットを縮小することを少なくとも１回含み、かつ、
Ｎ回目のスポット転写縮小工程によって得られたスポットを有する基材表面を、物質を担持すべき表面Ｃと接触させ、前記表面Ｃに前記物質の少なくとも一部を転写することにより、前記表面Ｃ上に前記物質を担持させる「物質担持工程」を行う、前記方法。
【請求項４】
ｎ回目（ここで、ｎは１以上Ｎ以下の整数である。）のスポット転写縮小工程前に、一つ前の工程によって得られたスポットを有する基材表面を、新たな表面Ｄと接触させることにより、前記表面上に保持された物質の少なくとも一部を表面Ｄ上に転写する「分離工程」を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
伸長した状態の基材表面へのスポットの形成後であって基材の収縮前に、前記基材表面を、新たな表面Ｄと接触させることにより、前記基材表面に保持された物質の少なくとも一部を表面Ｄ上に転写する「分離工程」を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記物質担持工程前に、物質を担持すべき表面Ｃと接触させるスポットを有する基材表面を、新たな表面Ｄと接触させることにより、前記基材表面に保持された物質の少なくとも一部を表面Ｄ上に転写する「分離工程」を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記新たな表面Ｄは、伸長した状態の伸縮性基材の表面である請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記スポット形成縮小工程、スポット転写縮小工程および／または物質担持工程は、湿度５０％以上の環境下で行われる請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記伸縮性基材表面は、親水化処理が施された表面である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記親水化処理は、グリセリン、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール誘導体、糖化合物、塩酸、硫酸および硝酸からなる群から選ばれる少なくとも一種に前記表面を接触させることにより行われる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記物質を担持すべき表面Ｃは、ガラス基板表面、シリコン基板表面、高分子基板表面または金蒸着基板表面である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記物質を担持すべき表面Ｃは、前記物質と共有結合する官能基を有する表面である請求項1〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記物質を担持すべき表面Ｃは、伸長した状態の伸縮性基材表面であり、前記物質担持工程において前記物質を含むスポットが形成され、前記物質担持工程後、前記基材を収縮させることにより前記スポットを縮小することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記伸縮性基材は、シリコーンゴム、フッ化シリコーンゴム、フッ素ゴム、天然ゴム、イソプレンゴム、ブタジエンゴム、クロロプレンゴム、二トリルゴム、ブチルゴム、アクリルゴム、各種熱可塑性エラストマー、およびそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記物質は生体分子である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体分子はＤＮＡおよび／または蛋白である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法により作製された表面を有する基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ、タンパク質等の所望の物質が担持された表面、特に所望の物質の微細パターンを有する表面の作製方法に関する。更に、本発明は、前記方法によって作製された表面を有する基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＤＮＡ、タンパク質等の表面吸着物質パターンの作製方法としては、フォトリソグラフィを用いたin situ合成、スポッティング、インクジェットプリンティングなどが用いられている。これらの方法は、必要とされる表面吸着物質パターンを、必要とされる固体の表面に必要とされる大きさ（微細さ）で直接作製するものであり、微細な表面吸着物質パターンを作製する上での様々な問題が存在する。例えば、フォトリソグラフィを用いたin situ合成の場合、光の回折限界が原因で、光の波長程度（数百ナノメートル）より小さなパターンを作製できない。また、スポッティングの場合、スポットする液量を減らしていくと液滴の表面張力の影響が大きくなり、スポット液量の制御や、スポットされた液滴のにじみやはじきの抑制などが困難になる。インクジェットプリンティングの場合には、微細なパターンを作製しようとすると、液滴の射出量や射出角度の制御をより正確に行わなければならないのみならず、飛行中の液滴のブラウン運動によるプリント位置のずれの影響が無視できなくなるという問題がある。
【０００３】
１９９６年にＨｉｄｂｅｒ等は、熱収縮性フィルムの収縮性を利用して微細パターンを形成することを提案した（非特許文献１参照）。この方法では、（１）マイクロコンタクトプリンティングを用いてパラジウムコロイドからなる、目的とするより大きなパターンを熱収縮フィルム上に作製し、（２）熱収縮性フィルムの収縮を利用して縮小し、（３）最後に無電解メッキを用いてパラジウムコロイドパターン上に銅を析出させて目的とする微細な銅パターンを得る。更に、この方法では、この銅パターンを熱収縮性フィルムから剥離することで、銅のみからなるパターンを得ることも可能である。この方法を用いれば、比較的大きな表面吸着物質パターンを、より微細な表面吸着物質パターンに変換することができるため、微細な表面吸着物質パターンを作製する上での様々な問題が回避できる。
【非特許文献１】Langmuir、1996、Pirmin C. Hidber, Paul F. Nealey, Wolfgang Helbig, and George M. Whitesides 、Vol12、No.21、5209-5215.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、Ｈｉｄｂｅｒ等によって提案された方法には、以下の２つの問題がある。
（１）熱収縮フィルムの収縮率（４〜７倍程度）より大きな収縮率でパターンを縮小することができない。
（２）熱収縮フィルム上でのパターン作製のみが可能であり、収縮性のない基板上でのパターン作製には適用できない。
【０００５】
かかる状況下、本発明は、ＤＮＡ、タンパク質等の所望の物質の微細パターンを所望の基板上に作製するための手段を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成する手段は、以下の通りである。
[１]物質が担持された表面の作製方法であって、
伸長した状態の伸縮性基材Ａの表面に、前記物質を含むスポットを形成し、次いで基材Ａを収縮させることにより前記スポットを縮小する「スポット形成縮小工程」を行い、
前記縮小スポットを有する基材Ａの表面を、物質を担持すべき表面Ｃと接触させ、前記表面Ｃに前記物質の少なくとも一部を転写することにより、前記表面Ｃ上に前記物質を担持させる「物質担持工程」を行う、前記方法。
[２]物質が担持された表面の作製方法であって、
伸長した状態の伸縮性基材Ａの表面に、前記物質を含むスポットを形成し、次いで基材Ａを収縮させることにより前記スポットを縮小する「スポット形成縮小工程」を行い、
一つ前の工程により縮小されたスポットを有する基材表面を、伸長した状態の別の基材Ｂの表面と接触させ、基材Ｂの表面に前記物質の少なくとも一部を転写することにより、基材Ｂ表面に前記物質を含むスポットを形成し、次いで基材Ｂを収縮させることにより前記スポットを縮小する「スポット転写縮小工程」をＮ回（ここで、Ｎは１以上の整数である。）行い、
Ｎ回目のスポット転写縮小工程によって得られたスポットを有する基材表面を、物質を担持すべき表面Ｃと接触させ、前記表面Ｃに前記物質の少なくとも一部を転写することにより、前記表面Ｃ上に前記物質を担持させる「物質担持工程」を行う、前記方法。
[３]物質が担持された表面の作製方法であって、
伸長した状態の伸縮性基材Ａの表面に、前記物質を含むスポットを形成し、次いで基材Ａを収縮させることにより前記スポットを縮小する「スポット形成縮小工程」を行い、
一つ前の工程によって作製されたスポットを有する基材表面を、伸長した状態の別の基材Ｂの表面と接触させ、基材Ｂの表面に前記物質の少なくとも一部を転写することにより、基材Ｂ表面に前記物質を含むスポットを形成する「スポット転写縮小工程」をＮ回行い（ここで、Ｎは１以上の整数である。）、但し、前記スポット転写縮小工程は、前記転写後に基材Ｂを収縮させることにより、形成されたスポットを縮小することを少なくとも１回含み、かつ、
Ｎ回目のスポット転写縮小工程によって得られたスポットを有する基材表面を、物質を担持すべき表面Ｃと接触させ、前記表面Ｃに前記物質の少なくとも一部を転写することにより、前記表面Ｃ上に前記物質を担持させる「物質担持工程」を行う、前記方法。
[４]ｎ回目（ここで、ｎは１以上Ｎ以下の整数である。）のスポット転写縮小工程前に、一つ前の工程によって得られたスポットを有する基材表面を、新たな表面Ｄと接触させることにより、前記表面上に保持された物質の少なくとも一部を表面Ｄ上に転写する「分離工程」を含む、[２]または[３]に記載の方法。
[５]伸長した状態の基材表面へのスポットの形成後であって基材の収縮前に、前記基材表面を、新たな表面Ｄと接触させることにより、前記基材表面に保持された物質の少なくとも一部を表面Ｄ上に転写する「分離工程」を含む、[１]〜[４]のいずれかに記載の方法。
[６]前記物質担持工程前に、物質を担持すべき表面Ｃと接触させるスポットを有する基材表面を、新たな表面Ｄと接触させることにより、前記基材表面に保持された物質の少なくとも一部を表面Ｄ上に転写する「分離工程」を含む、[１]〜[５]のいずれかに記載の方法。
[７]前記新たな表面Ｄは、伸長した状態の伸縮性基材の表面である[４]〜[６]のいずれかに記載の方法。
[８]前記スポット形成縮小工程、スポット転写縮小工程および／または物質担持工程は、湿度５０％以上の環境下で行われる[１〜[７]のいずれかに記載の方法。
[９]前記伸縮性基材表面は、親水化処理が施された表面である[１]〜[８]のいずれかに記載の方法。
[１０]前記親水化処理は、グリセリン、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール誘導体、糖化合物、塩酸、硫酸および硝酸からなる群から選ばれる少なくとも一種に前記表面を接触させることにより行われる[９]に記載の方法。
[１１]前記物質を担持すべき表面Ｃは、ガラス基板表面、シリコン基板表面、高分子基板表面または金蒸着基板表面である[１]〜[１０]のいずれかに記載の方法。
[１２]前記物質を担持すべき表面Ｃは、前記物質と共有結合する官能基を有する表面である[１]〜[１１]のいずれかに記載の方法。
[１３]前記物質を担持すべき表面Ｃは、伸長した状態の伸縮性基材表面であり、前記物質担持工程において前記物質を含むスポットが形成され、前記物質担持工程後、前記基材を収縮させることにより前記スポットを縮小することをさらに含む、[１]〜[１０]のいずれかに記載の方法。
[１４]前記伸縮性基材は、シリコーンゴム、フッ化シリコーンゴム、フッ素ゴム、天然ゴム、イソプレンゴム、ブタジエンゴム、クロロプレンゴム、二トリルゴム、ブチルゴム、アクリルゴム、各種熱可塑性エラストマー、およびそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種である[１]〜[１３]のいずれかに記載の方法。
[１５]前記物質は生体分子である [１]〜[１４]のいずれかに記載の方法。
[１６]前記生体分子はＤＮＡおよび／または蛋白である[１５]に記載の方法。
[１７][１]〜[１６]のいずれかに記載の方法により作製された表面を有する基材。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、複数回のパターン縮小が可能であるため、転写媒体の最大収縮率より大きな縮小率でパターンを縮小することができ、所望のサイズの微細パターンを形成することができる。更に、本発明によれば、伸縮性を持たない任意の基板にも微細パターンを形成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、物質が担持された表面の作製方法に関する。本発明の物質担持表面の作製方法には、以下の３態様が含まれる。
【０００９】
方法Ｉ
伸長した状態の伸縮性基材Ａの表面に、前記物質を含むスポットを形成し、次いで基材Ａを収縮させることにより前記スポットを縮小する「スポット形成縮小工程」を行い、
前記縮小スポットを有する基材Ａの表面を、物質を担持すべき表面Ｃと接触させ、前記表面Ｃに前記物質の少なくとも一部を転写することにより、前記表面Ｃ上に前記物質を担持させる「物質担持工程」を行う。
【００１０】
方法ＩＩ
伸長した状態の伸縮性基材Ａの表面に、前記物質を含むスポットを形成し、次いで基材Ａを収縮させることにより前記スポットを縮小する「スポット形成縮小工程」を行い、
一つ前の工程により縮小されたスポットを有する基材表面を、伸長した状態の別の基材Ｂの表面と接触させ、基材Ｂの表面に前記物質の少なくとも一部を転写することにより、基材Ｂ表面に前記物質を含むスポットを形成し、次いで基材Ｂを収縮させることにより前記スポットを縮小する「スポット転写縮小工程」をＮ回（ここで、Ｎは１以上の整数である。）行い、
Ｎ回目のスポット転写縮小工程によって得られたスポットを有する基材表面を、物質を担持すべき表面Ｃと接触させ、前記表面Ｃに前記物質の少なくとも一部を転写することにより、前記表面Ｃ上に前記物質を担持させる「物質担持工程」を行う。
【００１１】
方法ＩＩＩ
伸長した状態の伸縮性基材Ａの表面に、前記物質を含むスポットを形成し、次いで基材Ａを収縮させることにより前記スポットを縮小する「スポット形成縮小工程」を行い、
一つ前の工程によって作製されたスポットを有する基材表面を、伸長した状態の別の基材Ｂの表面と接触させ、基材Ｂの表面に前記物質の少なくとも一部を転写することにより、基材Ｂ表面に前記物質を含むスポットを形成する「スポット転写縮小工程」をＮ回行い（ここで、Ｎは１以上の整数である。）、但し、前記スポット転写縮小工程は、前記転写後に基材Ｂを収縮させることにより、形成されたスポットを縮小することを少なくとも１回含み、かつ、
Ｎ回目のスポット転写縮小工程によって得られたスポットを有する基材表面を、物質を担持すべき表面Ｃと接触させ、前記表面Ｃに前記物質の少なくとも一部を転写することにより、前記表面Ｃ上に前記物質を担持させる「物質担持工程」を行う。
前記方法はいずれも、伸縮性基材の伸長と収縮を利用して縮小スポットを作製する方法である。方法Ｉでは、少なくとも一回の「縮小−転写」により所望の表面上に微細なスポットを形成することができ、方法ＩＩおよびＩＩＩでは、複数回の「縮小−転写」の繰り返しによって所望の表面上に微細なスポットを形成することができる。
以下に、方法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩにおける各工程の詳細を順次説明する。
【００１２】
[スポット形成縮小工程]
スポット形成縮小工程は、伸縮性基材の伸長と収縮を利用して、所望の物質（最終的に所望の表面に担持すべき物質）を含む縮小スポットを作製する工程である。
前記物質は、無機物質、有機物質、合成物、天然物のいずれであってもよいが、本発明の方法は、常温常圧下でも実施可能であり、かつ、酸、塩基、有機溶媒などの使用が必須ではないため、これらに弱い生体分子からなる微細パターンを形成するための方法として好適である。前記生体分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、蛋白、ペプチド、糖化合物（単糖、オリゴ糖、多糖、糖鎖複合体、糖蛋白質、糖脂質、およびそれら誘導体等）、脂質（脂肪酸、リン脂質、糖脂質、グリセリド等）、天然低分子（ホルモン分子や抗生物質、毒物、ビタミン類、生理活性物質、二次代謝産物等）、合成低分子（天然低分子の合成物、およびそれら誘導体等）等、好ましくはＤＮＡ、蛋白を挙げることができる。
前記物質には、最終的に所望の表面に担持した後の検出のために、蛍光ラベル化等の公知のラベル化を行うことができる。また、物質を担持すべき表面との結合力を高めるための処理（前記表面と反応したり、吸着したりする官能基などの導入）を施すこともできる。
【００１３】
前記伸縮性基材としては、破断することなく所望の倍率に伸長し得るものであれば特に限定されないが、一次元のみならず二次元に伸長可能なものが好ましい。そのような基材としては、シリコーンゴム、フッ化シリコーンゴム、フッ素ゴム、天然ゴム、イソプレンゴム、ブタジエンゴム、クロロプレンゴム、二トリルゴム、ブチルゴム、アクリルゴム、各種熱可塑性エラストマー、およびそれらの誘導体製の基材を使用することができる。また、前記基材の形状は、フィルム、シート等の平板状であることが好ましい。
【００１４】
図１に、本発明の物質担持表面の作製方法の説明図を示す。
以下に、図１に基づきスポット形成縮小工程について説明する。但し、本発明は図１に示す態様に限定されるものではない。
まず、伸縮性基材の外周部に数箇所穴を設ける（図１（ａ））。穴の周辺部分は、基材が引き裂かれることを防ぐために、ゴム、プラスチック、金属などの補強部材によって補強されていることが好ましい。
次いで、基材を、所望の倍率に伸長した後に固定治具に固定する（図１（ｂ））。この際、固定治具の突出部を前記の穴に通すことにより、基材を伸長した状態で固定することができる。
【００１５】
その後、伸長した基材表面に、所望の物質を含むスポットを形成する。なお、本発明において「スポット」とは、所望の物質を所定の面密度以上含む領域をいうものとする。スポットの形状には特に制限はないが、例えば円形状や、スクエア状、ライン状である。スポットの形成方法は、特に制限はないが、例えば、図１（ｃ）に示すように、マイクロコンタクトプリンティング（所望の物質を適当な溶媒に溶解または分散させて、所望の凹凸構造を有するスタンプ表面に塗布または吸着させ、該スタンプと所望の基材とを接触させることで、前記凹凸構造を反映したパターンを前期基材表面に形成させる方法）によって行うことができる。マイクロコンタクトプリンティングの方法に特に制限はないが、一枚の伸長された基材上に、複数回マイクロコンタクトプリンティングを行えば、複数の異なる所望物質からなる複数のスポットを、前記基材上に形成することができる。また、伸長された基材上にスポットを形成する方法としては、スポッティングやインクジェットプリンティング等の、マイクロコンタクトプリンティング以外の公知の方法を用いることもできる。前記スポット形成は、図１（ｃ）に示すように、伸長した基材の背面に支持部材を配置して行うことが好ましい。
【００１６】
伸長した基材表面に形成されるスポット内の所望物質の面密度は、物質の種類、スポット転写縮小工程の繰り返し回数、基材の収縮率などを考慮して、スポット形成時およびその後の基材縮小時に、スポット形状が崩れずに、かつ最終的な物質担持工程までスポット内の所望物質が枯渇することなく良好な転写が行われるように調整することが好ましい。なお、スポット形成縮小工程において、伸長した基材表面に形成されるスポットの大きさ（円形状なら直径、スクエア状なら一辺の長さ、ライン状なら線幅など）は、特に限定されないが、例えば、マイクロコンタクトプリンティングやスポッティング、インクジェットプリンティングなどの公知の方法で作製できる大きさ（例えば０．１μｍ〜１ｍｍ程度）であることが好ましい。
【００１７】
その後、伸長した状態でスポットが形成された伸縮性基材（図１（ｄ））を固定治具から外すことにより、基材を収縮させる（図１（ｅ））。伸長した状態で基材表面に形成されたスポットは、基材の収縮に伴い、ほぼ（１／伸長倍率）のサイズに縮小される。こうして基材表面に縮小スポットを作製することができる。また、このスポットの縮小によってスポット単位面積あたりに含まれる物質量を高めること（濃縮化）ができる。スポット形成縮小工程におけるスポットの縮小率は、特に限定されないが、長さで１．４倍〜５倍程度が好ましい。
但し、本発明における伸縮性基材の伸長方法および収縮方法は、図１に示す態様に限定されるものではなく、任意の方法で行うことができる。また、前記伸長・収縮は、ｘ軸方向、ｙ軸方向に同時に伸長・収縮する態様に限定されるものではない。例えば、ｘ軸またはｙ軸方向のみの伸長・収縮を繰り返し、一方向のみに縮小されたパターンを得ること、ｘ軸方向の伸長・収縮によって縮小されたスポットを、ｙ軸方向に伸長した新たな基材上に転写した後、この基材をｙ軸方向に収縮させ、ｘ軸−ｙ軸方向ともに縮小されたパターンを得ることも、もちろん可能である。
【００１８】
方法Ｉでは、スポット形成縮小工程によって得られた基材表面を、そのまま物質担持工程に付す。一方、方法ＩＩおよびＩＩＩでは、より微細なスポットを作製するために、スポット形成縮小工程後にスポット転写縮小工程を行う。以下に、スポット転写縮小工程について説明する。
【００１９】
[スポット転写縮小工程]
（ｉ）方法ＩＩにおけるスポット転写縮小工程
方法ＩＩにおけるスポット転写縮小工程は、一つ前の工程により縮小されたスポットを有する基材表面を、伸長した状態の別の基材Ｂの表面と接触させ、基材Ｂの表面に前記物質の少なくとも一部を転写することにより、基材Ｂ表面に前記物質を含むスポットを形成し、次いで基材Ｂを収縮させることにより前記スポットを縮小する工程であり、方法ＩＩではこの工程をＮ回（ここで、Ｎは１以上の整数である。）行う。この工程を繰り返すことにより、スポット形成縮小工程において得られたスポットを更に縮小し、より微細なパターンを形成することができる。なお、１回目のスポット転写縮小工程において基材Ｂ表面への物質転写のために使用される表面は、先に行われたスポット形成縮小工程において得られた縮小スポットを有する表面であり、２回目以降のスポット転写縮小工程において基材Ｂ表面への物質転写のために使用される表面は、１つ前のスポット転写縮小工程において得られた縮小スポットを有する表面である。
【００２０】
スポット転写縮小工程では、１つ前の工程によって縮小されたスポットを有する基材表面（以下、表面ｂという）を、伸長した状態の別の基材Ｂの表面と接触させる（図１（ｆ）参照）。これにより、表面ｂに保持された物質の少なくとも一部を表面Ｂに転写し、表面Ｂ上にスポットを形成することができる。そして、その後、先にスポット形成縮小工程について説明したように基材を収縮させれば、基材表面Ｂ上に縮小スポットを作製することができる（図１（ｈ））。
【００２１】
（ｉｉ）方法ＩＩＩにおけるスポット転写縮小工程
方法ＩＩＩにおけるスポット転写工程は、一つ前の工程によって作製されたスポットを有する基材表面を、伸長した状態の別の基材Ｂの表面と接触させ、基材Ｂの表面に前記物質の少なくとも一部を転写することにより、基材Ｂ表面に前記物質を含むスポットを形成する工程「スポット転写縮小工程」をＮ回（ここで、Ｎは１以上の整数である。）行うものである。但し、前記スポット転写縮小工程は、前記転写後に基材Ｂを収縮させることにより、形成されたスポットを縮小することを少なくとも１回含む。なお、１回目のスポット転写縮小工程において基材Ｂ表面への物質転写のために使用される表面は、先に行われたスポット形成縮小工程において得られた縮小スポットを有する表面であり、２回目以降のスポット転写縮小工程において基材Ｂ表面への物質転写のために使用される表面は、１つ前のスポット転写縮小工程において得られたスポットを有する表面である。
【００２２】
方法ＩＩにおけるスポット転写工程では、収縮させた基材表面から伸長した基材表面への転写を行うのに対し、方法ＩＩＩのスポット転写縮小工程における転写には、必ずしも上記態様に限られず、伸長−スポット形成（転写）を行った基材を収縮させずに次の転写に使用する態様（伸長状態の基材表面から別の伸長状態の基材表面への転写）も含まれる。後述するように、基材の収縮により、スポット単位面積あたりに含まれる物質量が高まる（濃縮化）ため、伸長状態で過剰量の物質が保持されていると、その後基材を縮小するとスポットのにじみが生じる場合がある。このような場合、伸長状態の基材から伸長状態の基材への転写を行えば、スポットのにじみを防止することができる。但し、方法ＩＩＩにおけるスポット転写縮小工程にも、収縮させた基材表面から伸長した基材表面への転写が少なくとも１回含まれるため、スポット形成縮小工程において作製された縮小スポットを更に縮小することができる。
【００２３】
本発明では、スポット形成縮小工程により、最大で、使用する伸縮性基材の最大収縮率（伸長状態から収縮状態への収縮率の最大値）でのスポット縮小が可能である。更に、方法ＩＩ、ＩＩＩではスポット転写縮小工程によってスポットを更に縮小することができるため、使用する伸縮性基材の最大収縮率より大きな縮小率でスポットを縮小することができ、より微細なパターンを形成することが可能となる。方法ＩＩおよびＩＩＩにおけるスポット縮小転写工程の繰り返し回数Ｎは、特に限定されないが、転写や縮小の回数が増えれば、それに応じてスポット形状の品質が低下するおそれがあるため、１０回以下程度とすることが好ましい。
【００２４】
スポット転写縮小工程や後述する物質担持工程において、所望の物質を含むスポットを有する表面（以下、表面Ｘという）と他の表面（以下、表面Ｙという）とを接触させると、通常表面Ｘ上に保持された物質の一部が表面Ｙ上に転写され、残りは表面Ｘ上に残留する。よって、通常は表面Ｙ上のスポット中の物質濃度は、転写前の表面Ｘ上のスポット濃度よりも低くなる（希釈される）。他方、伸長した状態の伸縮性基材表面にスポットを形成した後に該基材を収縮させると、スポット単位面積あたりに含まれる物質量は高まる（濃縮化）。本発明では、このように（１）希釈化、（２）濃縮化、の両方が起こるため、（１）と（２）を制御することにより、最終的に所望量の物質を含む所望サイズのスポットを得ることができる。
前記希釈化の程度は、後述するように転写効率の調整や分離工程を行うことによって制御可能である。また、前記濃縮化は基材の伸長・収縮の程度によって制御可能である。以下に、上記の点について説明する。
【００２５】
転写効率の調整
本発明者らの検討の結果、所望の物質を含むスポットを有する表面Ｘから他の表面Ｙへの物質の転写における転写効率には、各表面上の水分が影響することが判明した。この理由について、本発明者らは、基材表面に存在する水分が少ないと、伸長した基材表面に形成されたスポット中の物質が基材の表面に強固に吸着してしまうのに対し、所定量の水分が存在すれば、そのような過度に強い吸着が抑制されるからだと推察している。以上の観点から、本発明における各工程（スポット形成縮小工程、スポット転写縮小工程および／または物質担持工程）は、湿度５０％以上の環境下で行うことが好ましい。前記湿度の上限は特に限定されないが、例えば９０％程度である。
【００２６】
更に、転写効率向上のためには、本発明において使用する伸縮性基材表面に親水化処理を施すことが好ましい。親水化処理は、例えば、グリセリン、エチレングリコール、ポリエチレングリコールおよびそれらの誘導体、糖化合物（単糖、二糖、オリゴ糖、多糖およびそれらの誘導体）、塩酸、硫酸、硝酸などに基材表面を接触させることによって行うことができる。具体的には、親水化処理は、前記物質またはその水溶液に基材表面を浸し、その後、必要に応じて洗浄、乾燥することによって行うことができる。グリセリン、エチレングリコール、ポリエチレングリコールおよびその誘導体、糖化合物で表面処理を行う場合には、８０〜１１０℃程度に加熱することが好ましい。前記親水化処理を行う場合には、処理なしの場合よりも低湿度下（例えば、湿度５０％以下）であっても高い転写効率を得ることが可能である。親水化処理を施される基材表面は、伸長前の状態、伸長状態のいずれであってもよいが、操作性の点から伸長前の状態であることが好ましい。
【００２７】
上記では、主として転写効率を高める手段を説明したが、逆に、転写効率が高く、なおかつ濃縮化効果が強い（基材の収縮率が大きい）場合には、転写量が過剰となりスポットのにじみが起こるおそれがある。この場合の対策の１つとしては、各工程を行う環境の湿度を下げることによって転写効率を意図的に下げることが挙げられる。また、別の対策として、以下に説明する分離工程を行うこともできる。
【００２８】
[分離工程]
本発明における分離工程には、以下の３つの態様がある。
（Ａ）ｎ回目（ここで、ｎは１以上Ｎ以下の整数である。）のスポット転写縮小工程前に、一つ前の工程によって得られたスポットを有する基材表面を、新たな表面Ｄと接触させることにより、前記表面上に保持された物質の少なくとも一部を表面Ｄ上に転写する。
（Ｂ）伸長した状態の基材表面へのスポットの形成後であって基材の収縮前に、前記基材表面を、新たな表面Ｄと接触させることにより、前記基材表面に保持された物質の少なくとも一部を表面Ｄ上に転写する。
（Ｃ）物質担持工程前に、物質を担持すべき表面Ｃと接触させるスポットを有する基材表面を、新たな表面Ｄと接触させることにより、前記基材表面に保持された物質の少なくとも一部を表面Ｄ上に転写する。
【００２９】
前記（Ａ）は、スポット転写縮小工程中に行われ、前記（Ｂ）は、伸縮性基材を伸長してスポットを形成した後、該基材を収縮する前に行われ、前記（Ｃ）は、方法Ｉにおいてはスポット形成縮小工程後であって物質担持工程前に、方法ＩＩおよびＩＩＩにおいては最終回のスポット転写縮小工程と物質担持工程との間に行われる。上記分離工程によって、スポット内の過剰な物質を除去し、転写量が過度に多くなることを防ぐことができる。前記分離工程は、適宜に何度でも行うことができる。なお、先に説明したように、方法ＩＩＩでは、伸長状態の基材表面から別の伸長状態の基材表面への転写を行うことによっても転写量が過度に多くなることを防ぐことができる。
【００３０】
図２（ａ）に、分離工程の説明図を示す。なお、図２（ｂ）は、方法ＩＩＩにおいて伸長状態の基材表面から別の伸長状態の基材表面への転写を行う態様の説明図である。
図２（ａ）に示す態様では、フィルムＡ表面に保持された物質の一部をフィルムＢ表面に転写することによって除去する。その後フィルムＡは次工程に付される。一方、図２（ｂ）に示す態様では、フィルムＡ表面に保持された物質の一部をフィルムＢ表面に転写する。その後フィルムＢが次工程に付される。
【００３１】
分離工程において使用される新たな表面Ｄは、非伸縮性表面（例えばガラス等の固体基板表面）であっても、伸縮性基材表面であってもよい。更に、前記分離工程での副産物（例えば、図２（ａ）中のフィルムＢ）を利用して新たなスポット縮小転写工程および物質担持工程を開始することもできる。また、方法ＩＩＩにおいて伸長状態の基材表面から別の伸長状態の基材表面への転写を行った後、元の伸縮性基材（例えば、図２（ｂ）中のフィルムＡ）を利用して新たなスポット縮小転写工程および物質担持工程を開始することもできる。以下、このプロセスを分岐プロセスと呼ぶ。
【００３２】
図３に、分岐プロセスの概略を示す。図３に示すように、分岐プロセスによれば、一枚のオリジナルパターンから縮小パターンを複数枚得ることができる。この場合、分離工程では、伸長した状態の伸縮性基材表面を、表面Ｄとして使用する。なお、前記の分離工程での副産物や方法ＩＩＩにおける伸長状態の基材表面から別の伸長状態の基材表面への転写を行った後の元の伸縮性基材には所望の物質が担持されている。よって、これらを物質担持表面として各種用途に使用することももちろん可能である。
【００３３】
[物質担持工程]
方法Ｉにおける物質担持工程では、スポット形成縮小工程において得られたスポットを有する基材表面を、物質を担持すべき表面Ｃと接触させ、前記スポットに含まれる物質の少なくとも一部を前記表面Ｃに転写することにより、前記表面Ｃ上に前記物質を担持させる。方法ＩＩおよびＩＩＩでは、最終回のスポット転写縮小工程において得られたスポットを有する基材表面を、物質を担持すべき表面Ｃと接触させ、前記スポットに含まれる物質の少なくとも一部を前記表面Ｃに転写することにより、前記表面Ｃ上に前記物質を担持させる。その後、この表面Ｃに対して、必要に応じて物質を固定化するための処理や洗浄工程を行うことにより、所望の物質が担持された表面を得ることができる。
【００３４】
物質を担持すべき表面Ｃは、非伸縮性基材表面であっても伸縮性基材表面であってもよい。非伸縮性基材としては、ガラス基板、シリコン基板、高分子（例えば、ポリスチレン）基板、金蒸着基板等を挙げることができる。また、伸縮性基材表面については、前述の通りである。物質担持工程において、伸縮性基材表面を表面Ｃとして用いる場合には、伸縮性基材を伸長した状態でスポットを作製すれば、その後、その基材を収縮させることにより、スポットを更に縮小することができる。また、前記表面Ｃには、担持される物質を固定化するための表面処理（例えば、被担持物質と共有結合する官能基を導入する）を行うことができる。
【００３５】
本発明によれば、前記のように縮小と転写を繰り返すことにより、所望のサイズの微細パターンを表面に有する基材を得ることができる。例えば、本発明によれば、縦横約１．８倍程度縮小転写を５回繰り返すことで、微細スポットを縦横２０倍程度縮小することができる。更に、本発明によれば、伸縮性を持たない任意の基板にも微細パターンを形成することができる。
【実施例】
【００３６】
以下に、本発明を実施例により更に説明する。但し、本発明は実施例に示す態様に限定されるものではない。
【００３７】
（1）マイクロコンタクトプリンティングに用いるスタンプの作製
（1-1）スタンプの作製方法
以下に示す全ての実施例では、DNAや蛋白質を含むスポットを、伸長した状態の伸縮性基材表面に形成するための方法として、マイクロコンタクトプリンティングを採用した。マイクロコンタクトプリンティングに用いるスタンプは以下のように作製した。先ず、シリコン基板表面に、公知の方法によりネガティブフォトレジスト（MicroChem社：SU-8  25）、またはポジティブフォトレジスト（Rohm and Haas社：S1805）からなる微細な鋳型を作製した（以下図4参照）。鋳型の表面に離型を容易にするためのプラズマエッチング処理を施した。次に、この鋳型上にシリコーンゴム（Dow Corning 社：Sylgard 184）のプレポリマーを流し込み、65℃で1時間かけて硬化させた。ある程度硬化したシリコーンゴムスタンプを鋳型から引き剥がし、ガラス基板上に置いて、110℃で1晩かけて更に硬化させた。
【００３８】
（1-2）スタンプの表面処理方法
蛍光ラベルされたアビジンをマイクロコンタクトプリンティングする場合には、上記シリコーンゴムスタンプに以下に示す塩酸処理を施した。シリコーンゴムスタンプ表面に塩酸(35-37%)を15分接触させた。その後、シリコーンゴムスタンプを純水で洗浄し、使用する直前まで純水中で保存した。
【００３９】
（2）伸縮性基材として用いるシリコーンゴムフィルムの作製
以下に示す全ての実施例では、伸縮性基材としてシリコーンゴムフィルムを用いた。
（2-1）シリコーンゴムフィルムの作製方法
3cm×3cmに切断したシリコン基板上に、離型を容易にするためのプラズマエッチング処理を施した。このシリコン基板表面に、シリコーンゴム（Dow Corning Toray Silicone 社：SH 9555 clear base）のプレポリマーを、適量スピンコートした（以下図5参照）。スピンコートされたシリコン基板を110℃で1晩加熱し、シリコーンゴムを硬化させた。得られたシリコーンゴムフィルムの外周部8箇所に、厚さ1mmのシリコーンゴムシート（アズワン社：1.0×300×300）を切り抜いて作製した直径3mmの円盤状補強部材を、シリコーンゴム（Dow Corning Toray Silicone 社：SH 9555 clear base）のプレポリマーを用いて接着し、110℃で1時間加熱してプレポリマーを硬化させた。次に、円盤状補強部材の接着されたシリコーンゴムフィルムを、シリコン基板から引き剥がし、プラスチックフィルム上に付着させた。最後に、シリコーンゴムシートからなる円盤の中央に、直径1.2mmの穴を開けた。シリコーンゴムフィルムは使用直前にプラスチックフィルムから引き剥がして用いた。
【００４０】
（2-2）シリコーンゴムフィルムの表面処理方法
以下に示す全ての実施例では、シリコーンゴムフィルムは以下の表面処理を施すか、または、未処理のまま用いられた。
【００４１】
（2-2-1）塩酸処理
シリコーンゴムフィルムの円盤状補強部材の接着されていない側の面を塩酸（３５−３７％）に１５分接触させた後、純水で洗浄した。シリコーンゴムフィルムは使用直前まで、補強部材の接着されていない側の面を下にして純水表面上に浮かべて保存し、1時間以内に使用された。
【００４２】
（2-2-2）グリセリン処理
シリコーンゴムフィルムは、円盤状補強部材の接着されていない面を下にしてグリセリン(99%以上)表面上に浮かべ、110℃で1時間加熱した。シリコーンゴムフィルムはグリセリン表面上に浮かべたまま常温で保存した。使用の30分程度前までに、シリコーンゴムフィルムは純水で数分かけて洗浄され、使用直前まで補強部材の接着されていない側の面を下にして純水表面上に浮かべて保存し、30分以内に使用された。
【００４３】
（2-2-3）ポリエチレングリコール処理
シリコーンゴムフィルムは、円盤状補強部材の接着されていない面を下にしてポリエチレングリコール（和光純薬工業株式会社：ポリエチレングリコール200、167-09045）表面上に浮かべ、110℃で1時間加熱した。シリコーンゴムフィルムはポリエチレングリコール表面上に浮かべたまま常温で保存した。使用の30分程度前までに、シリコーンゴムフィルムは純水で数分かけて洗浄され、使用直前まで補強部材の接着されていない側の面を下にして純水表面上に浮かべて保存し、30分以内に使用された。
【００４４】
（3）蛍光ラベルされたアビジンを含むスポットの縮小転写実験
（3-1）縮小転写条件の最適化
（3-1-1）蛍光ラベルされたアビジンの担持実験1（2回縮小）
図６に示す工程により、蛍光分子（フルオレセインイソチオシアネート:FITC）でラベルされたアビジン（Sigma社：A2901-5MG）（以下蛍光アビジンと呼ぶ）を含むスポットを2回縮小させた。まず、純水中に保存されている塩酸処理されたシリコーンゴムスタンプを、エアガン（窒素）で乾燥させた。スタンプ表面に、蛍光アビジン（1mg/ml）のバッファー溶液（10mM Tirs-HCl（pH8）、100mM NaCl、1mM MgCl2）を1時間以上接触させて、スタンプ表面に蛍光アビジンを充分吸着させた。スタンプをバッファーで軽く洗浄後エアガンで乾燥させた。スタンプを湿度コントロールされたチャンバー内に移した。
次いで、プラスチックフィルム上に付着している未処理のシリコーンゴムフィルム、あるいは、純水上に浮かぶグリセリン処理、またはポリエチレングリコール処理されたシリコーンゴムフィルムを、引き伸ばして治具（８箇所のフックを持ったフレーム）に固定した（図1参照）。フィルム表面が水で濡れている場合はエアガン（窒素）で乾燥させた。フィルムを治具ごと湿度コントロールされたチャンバー内に移した。
その後、チャンバー内で、伸長した状態のフィルム表面上に、アビジンの吸着したスタンプを押し付け、アビジンをフィルム上にプリントした（マイクロコンタクトプリンティング）（図6（a）参照）。ここで形成されたスクエア状のスポットの一辺の長さは約0.21ｍｍであった。フィルムを治具から外し、フィルムを縦横約1.8倍収縮させ、フィルム上のパターンを縮小した（以上、図6（ｂ）参照）。
この収縮したフィルムを、別の治具に固定されたフィルム（2ndFilm）に張り合わせてパターンを転写した。2ndFilmを治具から外して収縮させ、パターンをさらに縦横約1.8倍収縮させた（以上、図6（ｃ）参照）。収縮後のフィルム表面上のスクエア状スポットの一辺の長さは約65μｍであった。つまり、2回の縮小によって、トータルの縮小率は約3倍となり、スポットの集積度（単位面積当たりのスポット数）は約9倍になった。
1stFilmと2ndFilmをN2バブルしたバッファー（上記と同じ組成）に浸漬して蛍光顕微鏡を用いてパターンを観察し、CCDカメラでその画像を取り込んだ。蛍光強度は、フィルム上に担持された蛍光アビジン量に対応している。
【００４５】
（3-1-2）実験結果
図7（ａ）-（ｃ）は、未処理、グリセリン処理、または、ポリエチレングリコール処理されたシリコーンゴムフィルムを用いた場合の1stFilmおよび2ndFilmの蛍光画像である。また、図8はそれらの画像内のスポットの蛍光強度をまとめたグラフである。ここで蛍光強度はそれぞれのフィルムに担持された蛍光アビジンの量を示している。
図7（ａ）、図8（ａ）に示すように、未処理のシリコーンゴムフィルムを用いた場合、2ndFilm表面の蛍光強度は、1stFilm表面の蛍光強度より小さい。当該2ndFilmを用いた場合でも蛍光の検出は充分可能であったが、操作雰囲気を比較的高湿度(約60％以上)にすることによって担持量（蛍光強度）を更に高めることができた。
【００４６】
図7（ｂ）、図8（ｂ）に示すように、グリセリン処理シリコーンゴムフィルムを用いた場合には、2ndFilm表面の蛍光強度は、1stFilm表面の蛍光強度の90％以上の値を湿度に関わらず維持していた。
【００４７】
図7(ｃ)、図8（ｃ）に示すように、ポリエチレングリコール処理シリコーンゴムフィルムを用いた場合には、グリセリン処理シリコーンゴムフィルムを用いた場合と同様に、湿度50％でも良好な転写が行われることが確認された。
【００４８】
（3-2）縮小転写の繰り返し実験
（3-2-1）蛍光ラベルされたアビジンの担持実験1（1-5回縮小転写実験）
異なるスタンプ（作製されるスポットの大きさは同じ（0.21ｍｍ）で集積度のみ異なる）を使用したこと、グリセリン処理シリコーンゴムフィルムのみを用いたこと、かつ湿度45-60％でシリコーンゴムフィルム間での転写を４回（つまり、縮小を5回）繰り返したこと以外は、上記（3-1-1）と同様の操作を行った。1stFilm〜5thFilmをN2バブルしたバッファー（上記と同じ組成）に浸漬して蛍光顕微鏡を用いてパターンを観察しCCDカメラでその画像を取り込んだ。
【００４９】
（3-2-2）実験結果
図9に、1stFilm〜5thFilmの蛍光画像を示す。5回の縮小によってスクエア状スポットの1辺の長さは約16倍縮小され、スポットの集積度（単位面積当たりのスポット数）は約260倍になった。また、グリセリン処理したフィルムを使用した場合、パターン縮小を５回繰り返しても、蛍光強度はほとんど変化しなかった。これはフィルムの収縮によってスポット内での蛍光アビジンの面密度が上昇する効果が、転写によって蛍光アビジンの面密度が減少する効果を充分補っているためであると考えられる。
【００５０】
（4）アミノ化DNAを含むスポットの縮小転写実験
（4-1）材料
（4-1-1）用いたDNA
以下の実験では次に示す2種類のアミノ化DNA、2種類の蛍光ラベルされたDNA、1種類のチオール化DNAの計5種類のDNAを用いた。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、および、Alexa Fluor 594（Alexa）を蛍光ラベルとして用いた。
【００５１】
【表１】
2008014865.tif 000002
【００５２】
（4-1-2）DNA修飾金コロイド（直径１５ｎｍ）の調製
ＤＮＡ修飾金コロイドは、直径約１５ｎｍの金コロイド分散液（BBInternational社）と、上記チオール化DNAとを用いて以下の文献に示す方法で調製した。
Sato, K.; Hoshokawa, K.; Maeda, M. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8102.
【００５３】
（4-2)縮小転写条件の最適化
（4-2-1）アミノ化DNAの担持実験1（1回縮小転写）
図10に示す工程により、アミノ化DNA（A）を含むスポットを1回縮小し、ガラス基板表面に担持させた。未処理のシリコーンゴムスタンプの表面を、アミノ化DNA（A）の溶液（0.25μM アミノ化DNA（A）、1ｍMセチルトリメチルアンモニウムクロライド（CTAC）、10mM NaCl）に3時間以上接触させて、スタンプ表面にアミノ化DNA（A）を充分吸着させた。前記アミノ化DNA（A）の溶液は調製後1分以内に使用した。スタンプをCTAC溶液（0.02mM CTAC、10mMNaCl）で軽く洗浄後、エアガンで乾燥させた。スタンプを湿度コントロールされたチャンバー内に移した。
次いで、プラスチックフィルム上に付着している未処理のシリコーンゴムフィルム、あるいは、純水上に浮かぶ塩酸処理、または、グリセリン処理、ポリエチレングリコール処理したシリコーンゴムフィルムを、引き伸ばして治具（８箇所のフックを持ったフレーム）に固定した。表面が水で濡れている場合は、エアガンで乾燥させた。フィルムを治具ごと湿度コントロールされたチャンバー内に移した。
チャンバー内で、上記の引き伸ばされたシリコーンゴムフィルム（1stFilm）上に、アミノ化DNAの吸着したスタンプを押し付け、アミノ化DNA（A）をフィルム上にプリントした（マイクロコンタクトプリンティング）（以上、図10（ａ）参照）。ここで形成されたスクエア状スポットの一辺の長さは約0.21mmであった。フィルムを治具から外し、フィルムを縦横約1.8倍収縮させ、フィルム上のパターンを縮小した。収縮したフィルムを、ガラス基板（表面を3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)でアミノ化後、グルタルアルデヒドで処理しアルデヒド基を導入したもの）と接触させてパターンを転写した。縮小されたスクエア状スポットの一辺の長さは、0.12mmとなり、スポットの集積度は約3倍となった（以上、図10（ｂ）参照）。
パターンの転写されたガラス基板を、純水の染み込んだ紙と一緒にプラスチックケースに1晩閉じ込め、アミノ化DNA（A）のアミノ基を、基板上に固定されたアルデヒド基と反応させた。基板をSDS水溶液で洗浄した後に、グリシン水溶液に浸漬して未反応のアルデヒド基をグリシンキャップした。最後に、基板に固定されたアミノ化DNA（A）をFITC化DNA（A′）とハイブリダイズさせ、蛍光顕微鏡で観察した（以上、図10（ｃ）参照）。
【００５４】
（4-2-2）アミノ化DNAの担持実験2（スタンプから直接）
図11に示す工程により、アミノ化DNA（A）を含むスポットを直接ガラス基板表面に担持させた。未処理のシリコーンゴムスタンプの表面を、アミノ化DNA（A）の溶液（0.25μM アミノ化DNA（A）、1ｍMセチルトリメチルアンモニウムクロライド（CTAC）、10mM NaCl）に3時間以上接触させて、スタンプ表面にアミノ化DNA（A）を充分吸着させた。前記アミノ化DNA（A）の溶液は調製後1分以内に使用した。スタンプをCTAC溶液（0.02mM CTAC、10mMNaCl）で軽く洗浄後、エアガンで乾燥させた。スタンプを湿度コントロールされたチャンバー内に移した。上記スタンプをチャンバー内でガラス基板表面（APTESでアミノ化後、グルタルアルデヒドで処理しアルデヒド基を導入したもの）と接触させてパターンをプリントした（以上、図11（a）参照）。ここで形成されたスクエア状スポットの一辺の長さは約0.21mmであった。
パターンのプリントされたガラス基板を、純水の染み込んだ紙と一緒にプラスチックケースに1晩閉じ込め、アミノ化DNA（A）のアミノ基を、基板上に固定されたアルデヒド基と反応させた。基板をSDS水溶液で洗浄した後に、グリシン水溶液に浸漬して未反応のアルデヒド基をグリシンキャップした。最後に、基板に固定されたアミノ化DNA（A）をFITC化DNA（A′）とハイブリダイズさせ、蛍光顕微鏡で観察した（以上、図11（ｂ）参照）。
【００５５】
（4-2-3）実験結果
図１２（ａ）〜（ｄ）は、各種表面処理されたシリコーンゴムフィルムを用いて１回縮小実験を行った場合に得られた蛍光画像である。図１２（ｅ）は、シリコーンゴムフィルムを使わず、スタンプから直接ガラス基板にプリントした場合に得られた蛍光画像である。図１３は、図１２の各画像内のスポット蛍光強度をまとめたグラフである。なお、蛍光強度はスポット内に担持されたアミノ化DNA（A）にハイブリダイズした蛍光ＤＮＡ（FITC化DNA(A′）の量に対応しており、間接的に担持されたアミノ化DNA（A）の多寡を示している。
図１２（ａ）、（ｂ）、および図１３（ａ）から、蛍光強度は、未処理のシリコーンゴムフィルムを用いた場合より、グリセリン処理シリコーンゴムフィルムを用いた場合の方が明らかに大きいことが分かる。また、未処理のシリコーンゴムフィルムを用いた場合でも、操作雰囲気を比較的高湿度(約50％以上)とすることにより、蛍光強度を増大させることができる。操作雰囲気湿度50％で比較すると、グリセリン処理、ポリエチレングリコール処理した場合には、シリコーンゴムスタンプから直接ガラス上にアミノ化DNAを転写した場合と同等の蛍光強度が得られた（図１３（ｂ））。また、塩酸処理したシリコーンゴムフィルムを用いた場合でも、未処理のシリコーンゴムフィルムを用いた場合よりは高い蛍光強度が得られた。以上の結果に基づいて、以下の実験ではグリセリン処理したシリコーンゴムフィルムを用いて縮小転写を行う。
【００５６】
（4-3）縮小転写の繰り返し実験
（4-3-1）アミノ化DNAの担持実験3（1-5回縮小転写実験）
操作雰囲気を湿度45-60％の間に調節し、グリセリン処理したシリコーンゴムフィルムのみを用いて、縮小転写を1-5回繰り返した以外は、上記（4-2-1）と同様の操作を行った。例として、図14に縮小転写を2回繰り返す場合の操作を示す。縦横約1.8倍の縮小を5回行った結果、スクエア状スポットの一辺の長さは約20倍縮小され、スポットの集積度は約400倍になった。
【００５７】
（4-3-2）実験結果
図16（ａ）−（ｅ）に、1-5回縮小転写を繰り返した場合に得られる蛍光画像を示す。図16（ｆ）に、それぞれの画像内の蛍光強度の空間分布を示す。縮小転写の繰り返しによって高い縮小率（約２０倍）が得られることが確認できた。また、縮小転写を５回繰り返しても、蛍光強度の顕著な減少は起こらないことが確認された。これはフィルムの収縮によってスポット内でのアミノ化DNAの面密度が上昇する効果が、転写によってアミノ化DNAの面密度が減少する効果を充分補っているためであると考えられる。
【００５８】
（4-4）縮小なしの転写実験
（4-4-1）アミノ化DNAの担持実験4（縮小なしの転写実験）
操作雰囲気を湿度45-60％の間に調節し、グリセリン処理したシリコーンゴムフィルムのみを用いて、縮小なしの転写を1-3回繰り返した以外は、上記（4-2）と同様の操作を行った。例として、図15に縮小なしで転写のみを2回繰り返す場合を示す。
【００５９】
（4-4-2）実験結果
図17（ａ）-（ｃ）に、フィルムの伸縮なしで1-3回の転写を繰り返した場合に得られる蛍光画像を示す。また、図17（ｄ）に、それぞれの画像内の蛍光強度の空間分布を示す。転写回数が増えるに伴って、蛍光強度が急激に減少することが分かる。これは転写によって、スポット内のアミノ化DNAの面密度が下がることが原因であると考えられる。
【００６０】
(4-5）多色刷りパターンの縮小転写
(4-5-1）アミノ化DNAの担持実験5（多色刷りパターンの３回縮小転写実験）
未処理シリコーンゴムスタンプの表面をアミノ化DNA（A）の溶液（0.25μM アミノ化DNA（A）、1ｍMセチルトリメチルアンモニウムクロライド（CTAC）、10mM NaCl）に3時間以上接触させて、スタンプ表面にアミノ化DNA（A）を充分吸着させた。さらに、別の未処理シリコーンゴムスタンプの表面をアミノ化DNA（B）の溶液（0.25μM アミノ化DNA（B）、1ｍMセチルトリメチルアンモニウムクロライド（CTAC）、10mM NaCl）に3時間以上接触させて、スタンプ表面にアミノ化DNA（B）を充分吸着させた。前記アミノ化DNA（A）またはアミノ化DNA(B)の溶液は調製後1分以内に使用した。それぞれのスタンプをCTAC溶液（0.02mM CTAC、10mMNaCl）で軽く洗浄後、エアガンで乾燥させた。これら二つのスタンプを湿度45-60％のチャンバー内に移した。
次いで、グリセリン処理したシリコーンゴムフィルムを、引き伸ばして治具（８箇所のフックを持ったフレーム）に固定した。表面が水で濡れている場合は、エアガンで乾燥させた。フィルムを治具ごと上記の湿度調節チャンバー内に移した。
チャンバー内で、上記の引き伸ばされたシリコーンゴムフィルム上に、アミノ化DNAの吸着した2つのスタンプを少しずらして押し付け、アミノ化DNA（A）を含むスポットとアミノ化DNA（B）含むスポットの両方をフィルム上にプリントした（2回のマイクロコンタクトプリンティング）。ここで形成されたスポットを3回縮小転写して、ガラス基板（表面をAPTESでアミノ化後、グルタルアルデヒドで処理しアルデヒド基を導入したもの）上に縮小パターンを担持した。パターンの担持されたガラス基板を、純水の染み込んだ紙と一緒にプラスチックケースに1晩閉じ込め、アミノ化DNAのアミノ基を、基板上に固定されたアルデヒド基と反応させた。基板をSDS水溶液で洗浄した後に、グリシン水溶液に浸漬して未反応のアルデヒド基をグリシンキャップした。最後に、基板をFITC化DNA（A′）とAlexa化DNA(B′)との両方を含む混合溶液に浸漬しハイブリダイズさせた。基板をバッファーで洗浄し蛍光顕微鏡で観察した。
【００６１】
（4-5-2）実験結果
図18に3回縮小転写された多色刷りスポットの蛍光画像を示す（緑；FITC蛍光、赤；Alexa）。この図から、多色刷りパターンでも単色刷りパターンと同様に縮小できることが分かる。また、縮小転写を3回行った後でもDNAが配列特異的なハイブリダイゼーションを起こす能力を保持していることが確認できた。
【００６２】
（4-6）サブミクロンパターン作製実験
（4-6-1）アミノ化DNAの担持実験6（金コロイドのハイブリダイゼーション）
未処理シリコーンゴムスタンプの表面をアミノ化DNA（A）の溶液（0.25μM アミノ化DNA（A）、1ｍMセチルトリメチルアンモニウムクロライド（CTAC）、10mM NaCl）に3時間以上接触させて、スタンプ表面にアミノ化DNA（A）を充分吸着させた。前記アミノ化DNA（A）の溶液は調製後1分以内に使用した。スタンプをCTAC溶液（0.02mM CTAC、10mM NaCl、20mg/l グリセリン）で軽く洗浄後、エアガンで乾燥させた。このスタンプを湿度45-60％のチャンバー内に移した。
次いで、グリセリン処理したシリコーンゴムフィルムを、引き伸ばして治具（８箇所のフックを持ったフレーム）に固定した。表面が水で濡れている場合は、エアガンで乾燥させた。フィルムを治具ごと上記の湿度調節チャンバー内に移した。
チャンバー内で、上記の引き伸ばされたシリコーンゴムフィルム上に、アミノ化DNAの吸着した2つのスタンプを押し付け、アミノ化DNA（A）を含むスポットをフィルム上にプリントした。ここで形成されたパターンは、ライン状スポットからなるストライプパターンであり、ライン幅は1.4μｍ、ライン間隔は5.2μｍであった。このストライプパターンを縦横1.8倍で2回縮小転写して、シリコン基板（表面に酸化膜を形成後、APTESでアミノ化し、最後にグルタルアルデヒドで処理しアルデヒド基を導入したもの）上にその縮小パターンを担持した。パターンの担持されたシリコン基板を、飽和食塩水の染み込んだ紙と一緒にプラスチックケースに1晩閉じ込め、アミノ化DNAのアミノ基を、基板上に固定されたアルデヒド基と反応させた。基板をSDS水溶液で洗浄した後に、グリシン水溶液に浸漬して未反応のアルデヒド基をグリシンキャップした。基板をDNA修飾金コロイド分散液に浸漬し、DNA修飾金コロイドを基板上に固定されているDNAにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズによって形成されたDNA二本鎖基を、ソラレン（Psoralen）を用いて光クロスリンクさせた。最後に、AFMを用いて固定された金コロイドを観察した。
【００６３】
（4-6-2）実験結果
図19はシリコン基板上に固定された金コロイドのAFM画像である。2回の縮小転写によって、約1.4μｍであった線幅が0.49μmまで縮小できた。このことは今回の技術が、サブミクロンパターンの作製にも利用できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明によれば、所望の物質の微細パターンを所望の表面に作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の物質担持表面の作製方法の説明図を示す。
【図２】図２（ａ）に、分離工程の説明図を示す。図２（ｂ）は、方法ＩＩＩにおいて伸長状態の基材表面から別の伸長状態の基材表面への転写を行う態様の説明図である。
【図３】分岐プロセスの概略を示す。
【図４】マイクロコンタクトプリンティングに用いるスタンプの作製の説明図である。
【図５】シリコーンゴムフィルムの作製方法の説明図である。
【図６】蛍光ラベルされたアビジンの担持実験１（２回縮小）の説明図である。
【図７】未処理、グリセリン処理、ポリエチレングリコール処理されたシリコーンゴムフィルムを用いた蛍光ラベルされたアビジンの担持実験１の結果を示す。
【図８】図７に示す蛍光画像内のスポットの蛍光強度をまとめたグラフである。
【図９】蛍光ラベルされたアビジンの担持実験1（1-5回縮小転写実験）の結果を示す。
【図１０】アミノ化DNAの担持実験1（1回縮小転写）の説明図である。
【図１１】アミノ化DNAの担持実験2（スタンプから直接）の説明図である。
【図１２】アミノ化DNAの担持実験1、アミノ化DNAの担持実験2の結果を示す。
【図１３】図１２の蛍光画像内のスポット蛍光強度をまとめたグラフである。
【図１４】アミノ化DNAの担持実験3（1-5回縮小転写実験）の説明図である。
【図１５】アミノ化DNAの担持実験4（縮小なしの転写実験）の説明図である。
【図１６】アミノ化DNAの担持実験3の結果を示す。
【図１７】アミノ化DNAの担持実験4の結果を示す。
【図１８】アミノ化DNAの担持実験5（多色刷りパターンの３回縮小転写実験）の結果を示す。
【図１９】アミノ化DNAの担持実験6（金コロイドのハイブリダイゼーション）の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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