(57)【要約】【課題】新規なアガラーゼの提供およびその利用。【解決手段】効率の良いアガロオリゴ糖の製造、効率の良いアガロースゲルよりの核酸等の物質の抽出等の使用することの出来るアガラーゼ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドのアミノ酸配列、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドの製造方法、ならびにアガロオリゴ糖の製造方法およびアガロースゲルよりの核酸等の物質の抽出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のβ−１，４結合を加水分解する活性を有するアガラーゼ：
（ａ）配列表の配列番号２２に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号２１〜４３７の４１７残基からなるアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）記載のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加若しくは挿入の少なくとも１つが導入されたアミノ酸配列、及び
（ｃ）（ａ）記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
微生物ＮＡＢ２−１−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５５）より得ることのできる請求項１記載のアガラーゼ。
【請求項３】
下記から選択される塩基配列を含み、かつＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のβ−１，４結合を加水分解する活性を有するアガラーゼをコードする遺伝子：
（ａ）請求項１記載のアガラーゼをコードする塩基配列、
（ｂ）配列表の配列番号２０に示される塩基配列のうちの塩基番号６１〜１３１１の１２５１塩基からなる塩基配列、
（ｃ）（ｂ）記載の塩基配列に１若しくは数個の塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが導入された塩基配列、及び
（ｄ）（ｂ）記載の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【請求項４】
微生物ＮＡＢ２−１−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５５）より得ることのできる請求項３記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項３記載の遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項６】
請求項５記載の組換えＤＮＡ分子を有する形質転換体。
【請求項７】
微生物ＮＡＢ２−１−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５５）または請求項６記載の形質転換体を培養する工程、および該培養物からアガラーゼを採取する工程を包含することを特徴とする請求項１記載のアガラーゼの製造方法。
【請求項８】
アガロースゲルから物質を抽出する方法であって、請求項１記載のアガラーゼによりアガロースゲルを分解する工程を包含する方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法に使用されるキットであって、請求項１記載のアガラーゼを含有することを特徴とするキット。
【請求項１０】
反応至適温度が５５〜６５℃である請求項１記載のアガラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温でアガラーゼ活性を有することを特徴とする新規のアガラーゼおよびその製造方法、並びにその用途に関する。また、本発明は、高温でアガラーゼ活性を有するポリペプチド、および該ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。さらに、該遺伝子を用いた高温でアガラーゼ活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的製造方法に関する。
さらに詳しくは、アガロースから種々の生理活性を有する低重合度のアガロオリゴ糖の製造に有用な高温で活性を有するα−アガラーゼとその製造方法、ならびに該酵素の用途、アガロースゲル電気泳動後のアガロースゲルから核酸等を抽出する際に有用な高温で活性を有するβ−アガラーゼとその製造方法、ならびに該酵素の用途、及び該酵素を用いたアガロースゲルからの核酸等の抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
寒天の主要構成成分であるアガロースは、Ｄ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとが交互にα−１，３結合、β−１，４結合を繰り返してなる多糖である。寒天由来のオリゴ糖を製造するためには、このアガロースを分解し、低分子化しなければならないため、従来よりアガロースを化学的に分解する方法および酵素的に分解する方法が知られている。化学的に分解する方法では、酸を用いてアガロースを加水分解することができ、この場合、主としてα−１，３結合が切断される。また、アガロースを分解する酵素としては、アガロース中のβ−１，４結合を切断するβ−アガラーゼ、ならびにα−１，３結合を切断するα−アガラーゼの２種が知られている。
アガロース中のβ−１，４結合を切断して得られるオリゴ糖はネオアガロオリゴ糖と呼ばれ、その還元末端はＤ−ガラクトースであり、その重合度は偶数である。一方、α−１，３結合を切断して得られるオリゴ糖はアガロオリゴ糖と呼ばれ、その重合度は偶数であり、その還元末端は３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースである。還元末端に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを有するアガロオリゴ糖については、近年、アポトーシス誘発作用、制ガン作用、各種の抗酸化作用、免疫調節作用、抗アレルギー作用、抗炎症作用、α−グルコシダーゼ阻害作用等の生理活性を有することが明らかにされ（特許文献１および２）、その生理作用により、該アガロオリゴ糖を有効成分として含有する医薬品や機能性飲食品の提供が可能となっている。
アガロースを化学的に分解する方法では、生産されるオリゴ糖の大きさを制御することが難しく、特に重合度の低い低分子オリゴ糖を選択的に作ることは極めて難しい（非特許文献１等）。また、β−アガラーゼはβ−１，４結合のみを切断するため、該酵素を用いた場合には、上記の生理活性を有しないネオアガロオリゴ糖しか得ることができない。
α−１，３結合を切断する活性を有するα−アガラーゼを使用することにより、生理活性を有するアガロオリゴ等を製造することが期待される。公知のα−アガラーゼとしては、海洋性のグラム陰性細菌ＧＪ１Ｂ株（非特許文献２、なお、非特許文献３には、該菌株はアルテロモナス・アガリリティクス  ＧＪ１Ｂ株（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ａｇａｒｉｌｙｔｉｃｕｓ  ＧＪ１Ｂ）として記載されている）やビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属細菌（特許文献３、ＪＴ０１０７−Ｌ４株）の生産する酵素がある。しかしながら、アルテロモナス・アガリリティクスＧＪ１Ｂ株由来のα−アガラーゼは６糖以下のオリゴ糖を分解することができないため、生理活性が顕著なアガロビオースを生産することは不可能である。さらに、ビブリオ属細菌由来のα−アガラーゼは６糖以下のオリゴ糖にのみ活性を示す酵素であり、アガロースに対してはまったく作用しないために、アガロースを原料とするアガロオリゴ糖の製造に使用することはできない。
本発明者らは、アガロースのα−１，３結合を切断し、かつ顕著な生理活性を有するアガロオリゴ糖を生成する酵素を得ることを目的として鋭意研究を行ない、この目的に適した性質の酵素を生産する２株の微生物を見出し、これらの微生物の生産する酵素を単離し、理化学的、酵素学的性質を解明した。さらに、これら２種類の酵素の遺伝子を単離し、該遺伝子を用いた遺伝子工学的手法によりα−アガラーゼ活性を有するポリペプチドを簡便に製造する方法を見出した（特許文献４）。しかし、これら２種類のα−アガラーゼの至適反応温度は４０℃付近であり、アガロースを溶解してこれらの酵素で処理し、アガロオリゴ糖を得る場合、反応温度を４０℃付近にまで下げる必要がある。この場合、アガロースの濃度が高いと固形化してしまい酵素反応がすすまなくなるため、これらの酵素を用いる場合は、アガロース濃度を低くした状態で処理する必要があり、高濃度のアガロースを処理することは出来ず、アガロオリゴ糖の生産性は低かった。従って、アガロースが高濃度であっても固形化することのない高い温度で活性を有する耐熱性のα−アガラーゼが望まれていた。
一方、遺伝子工学の分野では、制限酵素処理、あるいは増幅反応処理を行なった核酸等をアガロースゲルにて電気泳動し、その後アガロースゲル中から抽出する操作が広く行われている。この操作において、従来は至適温度が３７℃付近のβ−アガラーゼが用いられてきた。しかしながら、この場合も、反応温度を酵素の至適温度に合わせて低下させる必要があり、アガロースの固形化を防ぐために、処理を行なう核酸等を含んだアガロースゲルを大量の水に溶解してアガロース濃度を低下させさせなければならない。この場合、回収しようとする核酸等の濃度も必然的に低下し、このことは回収率の低下、アガロース分解効率の低下を招き、さらに操作に時間がかかるという問題点を有している。この問題点を克服するためには、従来よりも高温で反応させることが出来るアガラーゼが必要である。そのようなアガラーゼとして、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＮＲ１９由来のβ−アガラーゼ（特許文献５）が知られているが、その至適温度はさほど高くなく、また、耐熱性も十分ではなく、アガロースが高濃度であっても固形化することのない高い温度で活性を有する耐熱性のβ−アガラーゼが望まれていた。
このように、従来の技術では、アガロオリゴ糖の製造、アガロースゲルよりの核酸等の物質の抽出に関して問題を有していた。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第９９／２４４４７号パンフレット
【特許文献２】特願平１１−１１６４６号公報
【特許文献３】特開平７−３２２８７８号公報
【特許文献４】国際公開第００／５０５７８号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５，８６９，３１０号
【非特許文献１】徳永隆久ら、バイオサイエンスとインダストリー、第４９巻、第７３４頁（１９９１）
【非特許文献２】カーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第６６巻、第２０７〜２１２頁（１９７８）
【非特許文献３】ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２１４巻、第５９９〜６０７頁（１９９３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、効率の良いアガロオリゴ糖の製造、効率の良いアガロースゲルよりの核酸等の物質の抽出等の使用することの出来るアガラーゼ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドのアミノ酸配列、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドの製造方法、ならびにアガロオリゴ糖の製造方法およびアガロースゲルよりの核酸等の物質の抽出方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記事情に鑑み、高温でアガロースのα−１，３結合を切断し、かつ顕著な生理活性を有するアガロオリゴ糖の製造等に有用な酵素、および高温でアガロースのβ−１，４結合を切断し、かつアガロースゲルからの効率よい核酸等の抽出等に有用な酵素を得ることを目的として鋭意研究、探索の結果、これらのそれぞれの目的に適した性質を有する２種類の酵素を生産する微生物を見出すことに成功し、該微生物よりそれぞれの酵素を単離し、その理化学的、酵素化学的性質を解明することに成功した。
さらに、本発明者らは、上記のそれぞれの酵素をコードする遺伝子を単離することに成功し、該遺伝子を用いる遺伝子工学的手法により、本発明のα−アガラーゼ活性を有するポリペプチド、β−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをそれぞれ簡便に製造する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、新規のアガラーゼに関し、下記から選択されるアミノ酸配列、もしくは該アミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが導入されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする：
（１）配列表の配列番号２２に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号２１〜４３７の４１７残基からなるアミノ酸配列；または
（２）配列表の配列番号２３に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号３１８〜１０８９の７７２残基からなるアミノ酸配列。
【０００７】
上記アガラーゼとしては、Ｄ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のβ−１，４結合を加水分解する活性を有することを特徴とする酵素、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとＤ−ガラクトースとの間のα−１，３結合を加水分解する活性を有することを特徴とする酵素等が例示される。
【０００８】
本発明の第２の発明は、アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に関し、第１の発明のアガラーゼをコードすることを特徴とする。該遺伝子としては、配列表の配列番号２０に示される塩基配列のうちの塩基番号６１〜１３１１の１２５１塩基からなる塩基配列、または該１２５１塩基からなる塩基配列に１個以上の塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが導入された塩基配列を含む遺伝子、あるいは配列表の配列番号２１に示される塩基配列のうちの塩基番号９５２〜３２６７の２３１６塩基からなる塩基配列、または該２３１６塩基からなる塩基配列に１個以上の塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが導入された塩基配列を含む遺伝子等が例示される。
【０００９】
本発明の第３の発明は、第２の発明の遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつ第１の発明のアガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に関する。
【００１０】
本発明の第４の発明は、第２の発明または第３の発明の遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
【００１１】
本発明の第５の発明は、第４の発明の組換えＤＮＡ分子を有する形質転換体に関する。
【００１２】
本発明の第６の発明は、アガラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法に関し、該アガラーゼの産生能を有する微生物、例えば、微生物ＮＡＢ２−１−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５５）が属する微生物属の微生物（例えば、微生物ＮＡＢ２−１−１）を培養する工程、および該培養物から第１の発明のアガラーゼを採取する工程を包含することを特徴とする。
【００１３】
本発明の第７の発明は、アガラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法に関し、第５の発明の形質転換体を培養する工程、および該培養物から第１の発明のアガラーゼを採取する工程を包含することを特徴とする。
【００１４】
本発明の第８の発明は、アガロオリゴ糖の製造方法に関し、第１の発明のアガラーゼによりアガロースを分解する工程、および該分解物よりアガロオリゴ糖を採取する工程を包含することを特徴とする。
【００１５】
本発明の第９の発明は、アガロースゲルよりの物質の抽出方法に関し、第１の発明のアガラーゼによりアガロースゲルを分解する工程を包含することを特徴とする。
【００１６】
本発明の第１０の発明は、第９の発明のアガロースゲルよりの物質の抽出方法に使用されるキットに関し、第１の発明のアガラーゼを含有することを特徴とする。
本発明の第１１の発明は、第１の発明のアガラーゼの熱安定性の向上方法に関し、アガラーゼのＮ末端側の３０％までのポリペプチドを欠失させる工程を包含することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のアガラーゼは、従来知られていたアガラーゼよりも至適温度が高く、また耐熱性にも優れていることから、高温での反応が可能であり、アガロースが高濃度で存在する場合でも、固形化することなく反応させることができるという優れた効果を有する。
【００１８】
本発明のアガラーゼを用いることにより、重合度が低く、還元末端に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを有するアガロオリゴ糖、たとえばアガロビオース、アガロテトラオース、または、非還元末端に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを有するネオアガロオリゴ糖、たとえばネオアガロビオース、ネオアガロテトラオースをアガロースから直接、かつ効率よく生産することが可能となる。
【００１９】
また、本発明のアガラーゼを用いることにより、アガロースゲルからの核酸等の抽出を効率よく行なうことが出来る。
本発明のアガラーゼを使用して製造されたアガロオリゴ糖は、アポトーシス誘発作用、制ガン作用、各種の抗酸化作用、免疫調節作用、抗アレルギー作用等の生理活性を有しており、医薬品、飲食品の分野で有用である。
【００２０】
また、本発明によりアガラーゼのアミノ酸および塩基配列が初めて明らかとなり、アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を提供することが可能となった。また該遺伝子を用いるアガラーゼ活性を有するポリペプチドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方法が提供される。
【００２１】
さらに、該遺伝子を用いる遺伝子工学的製造方法においてはアガラーゼの誘導生産のために培地にアガロースを添加する必要がないため培養時の手間を省くことが出来、また酵素精製も容易であると考えられる。
【００２２】
さらにまた、本発明により、初めてアガラーゼ遺伝子が提供されたことにより、該遺伝子の情報をもとにして、そこにコードされる組換えポリペプチドおよび該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片、アガラーゼに特異的にハイブリダイズするプローブやプライマーが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本明細書において、オリゴ糖とは、２個以上１０個以下の単糖から構成された糖類をいい、アガロオリゴ糖とはＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にα−１，３結合、β−１，４結合を繰り返し、還元末端に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを有するオリゴ糖をいう。一方、ネオアガロオリゴ糖とはＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にα−１，３結合、β−１，４結合を繰り返し、非還元末端に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを有するオリゴ糖をいう。
また、多糖類とは単糖およびオリゴ糖以外の糖をいう。
【００２４】
本発明のアガラーゼは、配列表の配列番号２２に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号２１〜４３７の４１７残基からなるアミノ酸配列、もしくは配列表の配列番号２３に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号３１８〜１０８９の７７２残基からなるアミノ酸配列を含むアガラーゼである。また、上記アミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが導入されたアミノ酸配列を含むポリペプチドも本発明の一つの様態であり、例えば、上記アミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する領域を有するものが含まれる。相同性は、公知の方法で計算することが出来、この計算を行なうための任意コンピュータプログラム、例えばＤＮＡＳＩＳ（宝酒造社製）を用いて計算することが出来る。
【００２５】
本発明のアガラーゼは、アガロースのような多糖、ならびにアガロオリゴ糖、ネオアガロオリゴ糖等のオリゴ糖のいずれにも作用することが出来、例えば、反応至適温度が４５℃以上であるものである。このような性質を有しているものであれば本発明の酵素に特に限定はないが、例えば、海洋性の微生物である微生物ＮＡＢ２−１−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５５）の生産するアガラーゼが挙げられる。
本発明のアガラーゼの切断様式にも特に限定はなく、例えば、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとＤ−ガラクトースとの間のα−１，３結合を加水分解するα−アガラーゼ、あるいはＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のβ−１，４結合を加水分解するβ−アガラーゼが挙げられる。
【００２６】
本発明のα−アガラーゼは、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとＤ−ガラクトースとの間のα−１，３結合を加水分解する酵素であり、アガロースのような多糖、ならびにアガロヘキサオースのようなオリゴ糖のいずれにも作用することができるものである。このような性質を有しているものであれば本発明の酵素に特に限定はないが、例えば、海洋性の微生物である微生物ＮＡＢ２−１−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５５）の生産するα−アガラーゼであるアガラーゼＩＩを挙げることができる。
微生物ＮＡＢ２−１−１の生産するアガラーゼＩＩは、多糖、オリゴ糖中に存在する３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとＤ−ガラクトースとの間のα−１，３結合を加水分解する酵素である。該酵素はアガロース、アガロオクタオース等のアガロヘキサオース以上のアガロオリゴ糖、およびネオアガロヘキサオース以上のネオアガロオリゴ糖に作用する。
【００２７】
本発明のβ−アガラーゼは、Ｄ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のβ−１，４結合を加水分解する酵素であり、アガロースのような多糖、ならびにアガロヘキサオースのようなオリゴ糖のいずれにも作用することができるものである。このような性質を有しているものであれば本発明の酵素に特に限定はないが、例えば、海洋性の微生物である微生物ＮＡＢ２−１−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５５）の生産するβ−アガラーゼであるアガラーゼＩを挙げることができる。
微生物ＮＡＢ２−１−１の生産するアガラーゼＩは、多糖、オリゴ糖中に存在するＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のβ−１，４結合を加水分解する酵素である。該酵素はアガロース、ネオアガロオクタオース等のネオアガロヘキサオース以上のネオアガロオリゴ糖、およびアガロヘキサオース以上のアガロオリゴ糖に作用する。
【００２８】
上記の酵素の活性測定方法および両酵素の理化学的性質、酵素化学的性質を以下に示す。
（１）酵素化学的測定方法
本発明のアガラーゼの活性測定は、アガロースＬＯ３（宝酒造社製）を基質として酵素反応を行なった後、生じたアガロテトラオースまたはネオアガロテトラオースの量を高速液体クロマトグラフィーを用いて定量することにより行なう。  本明細書において、精製酵素標品および精製中の酵素の活性測定に用いられた酵素活性測定方法は詳しくは以下のとおりである。
０．２％（ｗ／ｖ）または０．５％（ｗ／ｖ）のアガロース溶液〔アガラーゼＩの場合：１０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）、アガラーゼＩＩの場合：１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび１０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）〕を調製し、この溶液  １８０μｌを基質として、酵素溶液  ２０μｌと混合し、５０℃で５〜３０分間、好ましくは１０分間反応させた後、沸騰水中または７５℃で１分間加熱することによって反応を停止させる。この反応溶液  ３０μｌを、内径  ７．８ｍｍ、長さ  ３００ｍｍのＴＳＫｇｅｌ  α−２５００（東ソー社製）なるカラムに供し、７０％アセトニトリル溶液を溶離液とし、０．８ｍｌ／分の流速で溶出させた時の約２５分の保持時間を示すアガロテトラオース、または約２４分の保持時間を示すネオアガロテトラオースを定量し、１０分間当たり１μｍｏｌのアガロテトラオースを生じる酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
【００２９】
（２）至適ｐＨ
アガロースを基質とし、酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）、リンゴ酸緩衝液（ｐＨ５．５）、酢酸緩衝液（ｐＨ６．０、６．５）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０、７．５、８．８）を用いて調製した反応液に酵素を作用させた結果より、アガラーゼＩ、アガラーゼＩＩともに弱酸性から弱アルカリ性でアガロース分解活性を示すことが明らかとなった。
（３）至適温度
本発明のアガラーゼＩＩは４５〜５５℃の範囲で高い酵素活性を示し、さらに５０℃の付近で最大活性を示す。また、本発明のアガラーゼＩは４５〜７０℃の範囲で高い酵素活性を示し、さらに５５〜６５℃の付近で最大活性を示す。
【００３０】
（４）熱安定性
４８℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃で一定時間処理した酵素標品の残存活性を測定した結果、アガラーゼＩＩは５５℃、１０分間処理で４０％、アガラーゼＩは６０℃、１０分処理で１００％、２０分処理で１００％、３０分処理で９８％、６５℃、１０分間処理で１００％、２０分処理で９５％、３０分間処理で９０％、６０分間処理で９０％の活性を示した。
【００３１】
（５）Ｃａイオン要求性
既知のアガラーゼは、その活性発現にカルシウムを必要とする。そこで、本発明のそれぞれのアガラーゼのカルシウムイオンの要求性について検討した結果、アガラーゼＩＩは、カルシウムイオン非存在下で、カルシウム存在下の活性の６０％、アガラーゼＩは、カルシウムイオン非存在下で、カルシウム存在下の活性の１００％の活性を有することが確認された。すなわち、アガラーゼＩＩ 、アガラーゼＩ何れもカルシウムイオン非添加の状態で活性を示す。
また、本発明のアガラーゼＩＩは、ＣａＣｌ２存在下で安定化される。一方、マンガンイオン、マグネシウムイオンによっては影響を受けない。
【００３２】
（６）分子量
１０〜２０％ポリアクリルアミド濃度勾配ゲルを使用したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、アガラーゼＩＩの分子量は約１１７，０００、アガラーゼＩの分子量は、約４８，０００と推定された。
【００３３】
（７）エドマン分解法によるアミノ酸配列
エドマン分解法により決定されたアガラーゼＩＩのＮ末端アミノ酸配列はＧｌｕ-Ｔｈｒ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｌｅｕ-Ｇｌｎ-Ａｌａ-Ｇｌｕ-Ｓｅｒ-Ｐｈｅ、また、アガラーゼＩの配列はＡｌａ-Ａｓｐ-Ｘａａ-Ａｓｐ-Ｇｌｙ-Ｖａｌ-Ｐｒｏ-Ｉｌｅ-Ｐｒｏ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-Ａｌａ-Ｇｌｙであった。配列表の配列番号２および１に、それぞれアガラーゼＩＩおよびアガラーゼＩのＮ末端アミノ酸配列を示す。
なお、下記に示すようにアガラーゼＩＩ、アガラーゼＩをコードする遺伝子は共に単離されており、該遺伝子にコードされるアミノ酸配列も決定されている。アガラーゼＩＩ、アガラーゼＩ遺伝子にコードされるアミノ酸配列を配列表の配列番号２３、２２にそれぞれ示す。配列番号２３に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号３１８〜１０８９の７７２アミノ酸からなるポリペプチドは、本発明のα−アガラーゼ活性を示し、配列番号２２のアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号２１〜４３７の４１７アミノ酸からなるポリペプチドは、それぞれ本発明のβ−アガラーゼ活性を示す。
【００３４】
本発明のアガラーゼは、微生物ＮＡＢ２−１−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５５）を培養し、該培養物から精製することができる。ＮＡＢ２−１−１は、寒天資化性の細菌として海水中から分離されたものであって、下記の菌学的性質を有するものである。
［菌学的性質］
（１）形態
人工海水（商品名ジャマリンＳ、ジャマリンラボラトリー社製）を調製し、これにペプトン（ＤＩＦＣＯ社製）を０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）を０．０２％（ｗ／ｖ）加えた後、３Ｍの炭酸ナトリウムでｐＨ７．８に調整した。これにアガロースＬＯ３（宝酒造社製）を０．１％（ｗ／ｖ）となるよう加え、オートクレーブを用いて滅菌操作を行った後、上記微生物を接種し、３７℃、１２０ｒｐｍで一晩培養した。該培養液で生育した微生物は、グラム陰性の桿菌であり、また運動性を有し、べん毛は極毛である。また、好気性であり、塩類要求性である。
【００３５】
（２）生育状態
人工海水（商品名ジャマリンＳ、ジャマリンラボラトリー社製）を調製し、これにペプトン（ＤＩＦＣＯ社製）を０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）を０．０２％（ｗ／ｖ）となるよう加えた後、３Ｍの炭酸ナトリウムでｐＨ７．８に調整した。これに寒天（ナカライテスク社製）を１．５％（ｗ／ｖ）となるようを加え、オートクレーブした後に平板培地とした。この培地に上記の微生物を接種したところ、
（ｉ）３０〜４０℃で良好に生育する、
（ｉｉ）菌体の生育に従って寒天ゲルは液化される、
（ｉｉｉ）ｐＨ６．０〜８．０において旺盛に生育する、
ことが示された。
ＮＡＢ２−１−１は、平成１３年１月１０日（原寄託日）より、日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５５として寄託されている。
【００３６】
上記微生物について、菌株によって特異的な塩基配列をもつことが知られている１６Ｓ  リボゾームＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＲＮＡ）をコードする遺伝子の塩基配列を解析することにより、その分類学上の位置に関する情報を得ることができる。すなわち、微生物ＮＡＢ２−１−１の菌株から染色体ＤＮＡを抽出し、上記の遺伝子、またはその一部の領域を増幅可能なプライマーを使用したＰＣＲを実施する。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、該配列についてＧｅｎＢａｎｋデータベースを利用したホモロジー検索を行うことにより、上記の領域において類似した塩基配列を有する微生物、すなわち分類学的に近縁に位置する微生物を知ることができる。
ブリッティン・オブ・ジャパニーズ・ソサイエテイ・オブ・ミクロビアル・エコロジー（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ）、第１０巻、第３１〜４２頁（１９９５）に記載の方法により、微生物ＮＡＢ２−１−１の１６Ｓ  リボソームＲＮＡ遺伝子由来のＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰＣＲには上記文献に記載のプライマー２７ｆおよび１４９２ｒを使用した（配列表の配列番号３２および３３に、それぞれプライマー２７ｆおよびプライマー１４９２ｒの塩基配列を示す）。得られた増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を解析した結果、上記の領域に関して、本発明のアガラーゼを生産する微生物と最も高い相同性を持つものとして、９０％程度の相同性をもつ以下のものが見出された。
Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＫＴ０８１２Ａ
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｃｈｕｂｅｒｔｉｉ
【００３７】
また、本発明のアガラーゼは、上記ＮＡＢ２−１−１の他に、ＮＡＢ２−１−１の自然的または人為的変異株、その他ＮＡＢ２−１−１と同じ属に属する微生物であって、本発明のアガラーゼの産生能を有する微生物から得ることが出来る。
人為的変異株は、放射線、紫外線照射や変異誘起剤処理等公知の方法により取得することができる。
一般に、同じ属に属する微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列間の相同性は約９９％以上であることが知られている。従って、微生物ＮＡＢ２−１−１の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９９％以上相同な配列を有する微生物を微生物ＮＡＢ２−１−１と同様に本発明において使用することができる。
【００３８】
上記微生物の培養に用いる培地には、当該微生物が利用し得る窒素源、無機物等を含み、寒天、アガロース等を炭素源として含むものを用いることができる。寒天、アガロースは、市販のものを用いることができる。窒素源としては、例えば、肉エキス、酵母エキス、カゼイン分解物、トリプトン、ペプトン等が挙げられるが、好ましくは酵母エキス、ペプトンを用いる。これらの窒素源は寒天、アガロース以外の炭素源としても使用できる。さらに、塩類としては、塩化ナトリウム、クエン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチウム、ホウ酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム等を組み合わせて用いることができる。
特に好適には、人工海水であるジャマリンＳなる培地に、ペプトン、酵母エキス、寒天またはアガロースを加えた培地を用いることができる。寒天またはアガロースの濃度は０．１〜２．０％が好ましい。寒天またはアガロースの濃度を任意に変えることにより固体培地、液体培地を作り分けることが可能であるが、酵素生産を目的とする場合は濃度０．１〜０．３％の液体培養が好ましく、菌体の保存を目的とするときは濃度１．２〜２．０％の固体培養が好ましい。なお、低融点アガロースを液体培養に用いる場合には、０．１〜１．０％の濃度で使用することができる。
【００３９】
培養条件は、培地の組成によって多少異なるが、例えば、培養温度は３０〜４０℃、培地のｐＨはｐＨ６．０〜８．０、培養時間は１２〜４８時間の条件で培養することが出来る。
以上のようにして培養中に産生された本発明のα−アガラーゼ及び／またはβ−アガラーゼは、菌体外に分泌されるので、培養終了後、菌体を遠心分離、濾過等の方法を用いて除去して培養液上清を得る。
得られた培養液上清を、真空濃縮法または限外濾過法を用いて濃縮した液状酵素として、あるいは凍結乾燥法、噴霧乾燥法等により粉状酵素として粗酵素標品を調製することができる。また、通常用いられる精製方法、例えば硫安塩析、溶媒沈澱法により本発明のα−アガラーゼ及び／またはβ−アガラーゼを部分精製することができる。さらに、陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラム等のカラムクロマトグラフィー等の公知の精製操作を組み合わせて、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素標品を得ることができる。
このようにして得られた培養液または種々の精製度の本発明のα−アガラーゼを、紅藻類に含まれる多糖である寒天またはアガロースを基質として反応させることにより、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース等のアガロオリゴ糖を製造することができる。
【００４０】
アガロースは、Ｄ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にα−１，３結合、β−１，４結合を繰り返してなる多糖である。β−アガラーゼは、このアガロースのβ−１，４結合を加水分解する酵素である。該酵素によって生成する、還元末端にＤ−ガラクトースを有するオリゴ糖はネオアガロオリゴ糖と呼ばれ、アガロオリゴ糖に見られるような生理活性を示さない。アガロースのα−１，３結合を切断するα−アガラーゼを用いた場合には、還元末端が３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースであるアガロオリゴ糖を製造することが可能である。α−アガラーゼは、これまでにアルテロモナス・アガリリティクス  ＧＪ１Ｂ株由来、ビブリオ属細菌（ＪＴ０１０７−Ｌ４株）由来の２種の酵素が知られている。ところが、アルテロモナス・アガリリティクス  ＧＪ１Ｂ株の生産するα−アガラーゼはアガロヘキサオース以下のオリゴ糖に作用することができず、一方、ビブリオ属細菌由来のα−アガラーゼはアガロースを分解することができない。すなわち、これらのα−アガラーゼでは、アガロースを原料としたアガロビオース、アガロテトラオースの効率の良い生産は不可能である。
【００４１】
また、本発明者らによって先に発見された国際公開第００／５０５７８号パンフレットに記載のα−アガラーゼは、アガロース、ならびにアガロヘキサオース以上のアガロオリゴ糖に作用する酵素であるため、アガロースに作用してアガロオリゴ糖を生成し、さらにこうして生じたアガロヘキサオース中の一ヶ所のα−１，３結合を切断することも可能であり、従来の方法では殆ど生成されなかった２糖と４糖であるアガロビオースとアガロテトラオースを生成することが出来る。しかしながら、これらの酵素の反応至適温度は４０℃付近である。アガロースは通常使用される濃度である１％（ｗ／ｖ）の場合、５０℃であれば固形化しないが、４０℃であれば固形化してしまう。即ち、従来の酵素を用いた場合、その反応至適温度ではアガロースが高濃度で存在すると固形化してしまい、酵素反応は進まず、効率の良いアガロビオース、アガロテトラオースの生産は困難であった。
一方、本発明のα−アガラーゼは、反応至適温度が５０℃であり、アガラーゼが固形化しない温度での反応が可能であり、効率の良いアガロオリゴ糖の製造が可能である。
本発明のα−アガラーゼは、上記理化学的性質から明らかなように、アガロース、ならびにアガロヘキサオース以上のアガロオリゴ糖に作用する、すなわち、アガロースに作用してアガロオリゴ糖を生成し、さらにこうして生じたアガロオリゴ糖中のα−１，３結合を切断して、アガロビオース、アガロテトラオースのような低分子アガロオリゴ糖を生成することが可能な酵素であると同時に、至適温度が高く、耐熱性にも優れる酵素であるため、本発明のα−アガラーゼを用いることで、アガロースの固形化による反応阻害を受けることなく、従来の方法では製造が困難であった２糖と４糖であるアガロビオースとアガロテトラオースを大量に得ることが可能となる。
従来公知のα−アガラーゼと本発明のα−アガラーゼの基質特異性を表１に示す。表中、＋はその基質を分解できることを、また、−は分解できないことをそれぞれ示す。
【００４２】
【表１】
2008220378.tif 000002
【００４３】
本発明のα−アガラーゼを使用して生産されたアガロオリゴ糖はアガロビオース、アガロテトラオースを含有するものであり、その使用目的に支障のない限りにおいてアガロヘキサオース以上のアガロオリゴ糖を含んでいてもよい。本発明のα−アガラーゼを使用してアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオースを生産するための原料としては、例えば、寒天、アガロース、または寒天およびアガロース由来のオリゴ糖を使用すればよい。α−アガラーゼを作用させる条件は、該酵素が活性を示すものであれば特に限定はないが、例えば、アガラーゼＩＩの場合はｐＨ６．０〜８．０で、４５〜５５℃で作用させることが好ましい。また、反応液の組成も当該酵素の作用に適したものであれば特に限定はない。
本発明のα−アガラーゼによって生産されるオリゴ糖は、上記のように６糖以下の重合度の低いオリゴ糖を中心とするが、反応条件等により重合度の異なるオリゴ糖を自由に製造することも可能である。このようにして得られたオリゴ糖を分離精製することにより、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオースを単独で得ることも可能である。
【００４４】
上記のようにして得られた培養液または種々の精製度の本発明のβ−アガラーゼを、紅藻類に含まれる多糖である寒天またはアガロースに作用させることにより、寒天またはアガロースをネオアガロビオース、ネオアガロテトラオース、ネオアガロヘキサオース等のアガロオリゴ糖に分解することが出来る。
β−アガラーゼは、これまでに、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．  ＪＴ０１０７−１，４（特開平８−３８１７２号）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｔａｎｔｉｃａ〔Ｍｏｒｒｉｃｅ  Ｌ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．；Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １３５，  ５５３−５５８（１９８３）〕由来の酵素等が知られているが、これらの反応至適温度は約３０℃である。すなわち、これらの酵素をアガロースゲルからの核酸等の抽出に用いようとした場合、これらの酵素が活性を示す温度ではアガロースが固形化しているため、反応は進まず、実用に供することは出来ない。これらの酵素より反応至適温度が高いものとして、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＮＲ１９（米国特許第５，８６９，３１０号）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｎ−７（特公平７−９７９８７号）、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．  ＰＯ−３０３（特開平８−２９４３８９号）由来の酵素等が知られているが、これらの至適温度は５５℃以下であり、低融点アガロースゲルが融解する温度である６５℃より低く、実用上問題を有している。
【００４５】
一方、本発明のβ−アガラーゼは５０℃〜７０℃の広い温度範囲で高い活性を示し、特に５５℃〜６５℃で最大の活性を示すため、アガロースゲルが十分融解した状態での反応が可能である。また、本発明のβ−アガラーゼは、６５℃、３０分間処理した後の残存活性が９８％と耐熱性にも優れ、本発明のβ−アガラーゼを用いることで、アガロースの固形化による阻害を受けることなく、従来の方法では困難であったアガロースゲルからの核酸等の効率の良い抽出が可能となる。
【００４６】
本発明のα−アガラーゼ遺伝子とは、上記α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であり、すなわち、α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸をいう。本発明のα−アガラーゼ遺伝子としては、例えば、上記の微生物ＮＡＢ２−１−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５５）由来のアガラーゼＩＩをコードする塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。アガラーゼＩＩをコードする遺伝子としては、例えば、配列表の配列番号２３のアミノ酸番号３１８〜１０８９の７７２アミノ酸残基からなるポリぺプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
本発明のα−アガラーゼ遺伝子は、上記したアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入が導入されたアミノ酸を有し、かつα−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸をも包合する。
【００４７】
また、本発明の遺伝子には、配列表の配列番号２１の塩基番号９５２〜３２６７の２３１６塩基からなる塩基配列を有する遺伝子が包含され、さらに上記の塩基配列において１個以上の塩基の置換、欠失、付加または挿入が導入された塩基配列を有し、かつα−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸をも包含される。
さらに、本発明の遺伝子は、上記の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸も包合される。ハイブリダイゼーションは、例えば、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．）に記載の方法により実施することができる。上記ストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルト、１００ｍｇ／ｍｌ  ニシン精子ＤＮＡを含む溶液中、プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件があげられる。
【００４８】
本発明のβ−アガラーゼ遺伝子とは、上記β−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であり、すなわち、β−アガラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸をいう。本発明のβ−アガラーゼ遺伝子としては、例えば、上記の微生物ＮＡＢ２−１−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５５）由来のアガラーゼＩをコードする塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。アガラーゼＩをコードする遺伝子としては、例えば、配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１〜４３７の４１７アミノ酸残基からなるポリぺプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
本発明のβ−アガラーゼ遺伝子は、上記したアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入が導入されたアミノ酸を有し、かつβ−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸をも包合する。
【００４９】
また、本発明の遺伝子には、配列表の配列番号２０の塩基番号６１〜１３１１の１２５１塩基からなる塩基配列を有する遺伝子が包含され、さらに上記した塩基配列において１個以上の塩基の置換、欠失、付加または挿入が導入された塩基配列を有し、かつβ−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸をも包含される。
さらに、本発明の遺伝子は、上記の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸も包合される。ストリンジェントな条件としては、前記したものが例示される。
【００５０】
本発明のアガラーゼ遺伝子のクローニングは、例えば、以下のようにして行なうことが出来る。
アガラーゼを生産する微生物よりゲノムＤＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡは適当な公知の方法に従って調製でき、例えば、リゾチーム処理、プロテアーゼ処理、ＲＮａｓｅ処理、フェノール処理、エタノール沈殿等の公知の操作を組合わせて調製することが出来る。このようにして得られたゲノムＤＮＡを適当な公知の方法、例えば、超音波処理、制限酵素消化によって分解する。こうして得られたＤＮＡ断片を通常用いられている方法によってベクター、例えば、プラスミドベクターに組み込み、組み換えＤＮＡ分子を作製する。ついで、該組み換えＤＮＡ分子を適当な宿主、例えば、大腸菌に導入し、形質転換体を得る。組み換えＤＮＡ分子の作製、形質転換等の操作は、通常用いられる方法、例えば、上記したモレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版等に記載の方法から、使用するベクター、宿主に応じたものを選んで用いることが出来る。このようにしてアガラーゼ遺伝子を有する形質転換体を含むゲノムライブラリーが得られる。
【００５１】
つぎに、上記のゲノムライブラリーをスクリーニングし、アガラーゼ遺伝子を有する形質転換体を選択する。当該形質転換体よりアガラーゼ遺伝子を単離することが出来る。スクリーニングの方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
（１）アガラーゼ活性の発現を指標にしたスクリーニング
ゲノムライブラリーを寒天プレート上で増殖させる。アガラーゼ遺伝子を有する形質転換体は、アガラーゼ活性を持つポリペプチドを発現し、そのアガラーゼ活性により寒天ゲルを溶解するので、寒天プレートの寒天ゲルを溶解するコロニーまたはプラークを選択する。
（２）抗体を用いたスクリーニング
アガラーゼの粗酵素標品、部分精製酵素標品、精製酵素標品を前記した方法に従って調製し、これらの何れかを抗原として常法に従って抗アガラーゼ抗体を調製する。
ゲノムライブラリーをプレート上で増殖させ、生育したコロニーまたはプラークをナイロンまたはニトロセルロースのフィルターに移し取る。発現された組み換えタンパク質はコロニー、プラークと共にフィルターに移し取られる。フィルター上の組み換えタンパク質と上記の抗アガラーゼ抗体を反応させ、該抗体と反応するクローンを同定する。
抗体と反応するクローンの同定は、公知の方法に従って、例えば、抗アガラーゼ抗体を反応させたフィルターを、パーオキシダーゼ結合二次抗体と反応させた後、発色基質とインキュベートし、発色を検出することによって行なうことが出来る。
なお、上記（１）、（２）の方法に用いるゲノムライブラリーの作製に、ベクターに組み込まれたＤＮＡ上の遺伝子が高発現されるような発現ベクターを用いた場合には、容易に目的の遺伝子を有する形質転換体を選択することが出来る。
（３）ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションによるスクリーニング
ゲノムライブラリーをプレート上で増殖させ、生育したコロニーまたはプラークをナイロンまたはニトロセルロースのフィルターに移し取り、変性処理によりＤＮＡをフィルターに固定する。このフィルター上のＤＮＡと標識プローブのハイブリダイゼーションを常法に従って行い、該プローブとハイブリダイズするクローンを同定する。
本スクリーニングに用いられるプローブとしては、上記したアガラーゼのアミノ酸配列の情報をもとに作製したオリゴヌクレオチド、その他のアミノ酸配列の情報をもとに作製したオリゴヌクレオチド、またはこれらのアミノ酸配列の情報から作製したプライマーによって増幅したＰＣＲ断片等が挙げられる。これらのプローブの標識は特に限定はないが、例えば、ラジオアイソトープ標識、蛍光色素標識、ジゴキシゲニン標識、ビオチン標識等が挙げられる。
【００５２】
スクリーニングに用いるゲノムライブラリーとしては、以下の方法で作製したアガラーゼ遺伝子を有する形質転換体が富化されたゲノムライブラリーを使用しても良い。
アガラーゼを生産する微生物のゲノムＤＮＡを調製し、これを適当な制限酵素で消化してアガロースゲル電気泳動で分離した後、常法に従いナイロンまたはニトロセルロースのフィルターにブロッティングする。このフィルター上のＤＮＡと上記の標識プローブのハイブリダイゼーションを常法に従って行い、該プローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。このシグナルに対応するＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出、精製する。
こうして得られたＤＮＡ断片を通常用いられている方法によってベクター、例えば、プラスミドベクターに組み込み、組み換えＤＮＡ分子を作製する。ついで該組み換えＤＮＡ分子を適当な宿主、例えば、大腸菌に導入し、形質転換体を得る。形質転換の方法は通常用いられる方法、例えば、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版等に記載の方法から、使用するベクターに応じたものを選んで用いることが出来る。このようにしてアガラーゼ遺伝子を有する形質転換体が富化されたゲノムライブラリーが得られる。
該ゲノムライブラリーを用いることにより、より効率の良いスクリーニングを行なうことが出来る。
【００５３】
上記（１）〜（３）の方法は、何れも形質転換体をスクリーニングして目的に遺伝子をクローニングする方法であるが、ＰＣＲ法を用いることによって、形質転換体を利用することなくｉｎ  ｖｉｔｒｏでクローニングを行なうことが出来る。
アガラーゼを生産する微生物のゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型として、アガラーゼのアミノ酸配列の情報をもとに作製したプライマー対を用いたＰＣＲを行ない、アガラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることが出来る。さらに、該断片をプローブとしたハイブリダイゼーションや、該断片の塩基配列をもとに作製されたプライマーを用いたＰＣＲ等により、アガラーゼ遺伝子の全長を得ることが出来る。このようにして得られた遺伝子の塩基配列は、公知の方法に従って決定することが出来る。該クローンがアガラーゼのポリペプチド全長をコードしていない場合は、解読された塩基配列をもとに新たなプローブを作製し、該プローブを用いてゲノムライブラリーのスクリーニングを行い、新たなクローンを得る操作を繰り返すことにより、アガラーゼのオープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ、以下ＯＲＦと示す）全体が解読される。その情報をもとに、例えば、アガラーゼをコードするＯＲＦ全体を含むクローンを作製することが出来る。
以上のようにして得られたアガラーゼをコードする遺伝子を適当な発現ベクターに連結することにより、アガラーゼ活性を有するポリペプチドを遺伝子工学的に大量に製造することが出来る。
【００５４】
以下に、本発明の遺伝子を取得する方法について、その概略を説明する。
微生物ＮＡＢ２−１−１を培養し得られた菌体をリゾチームで溶菌させた後、タンパク質除去、エタノール沈殿等の操作を施し、染色体ＤＮＡを得る。次に上記のＮＡＢ２−１−１の染色体ＤＮＡを制限酵素で完全消化し、当該制限酵素と対応したアダプターを連結する。得られる染色体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のアガラーゼＩまたはＩＩのＮ末端アミノ酸配列、または内部アミノ酸配列をもとに作製されたプライマーと、当該アダプターの塩基配列に対応するプライマーを用いたＰＣＲを実施する。
このようにして得られたＰＣＲ産物の塩基配列を解析することにより、本発明のアガラーゼをコードする塩基配列を決定することが出来る。その全長が決定できなかった場合には、上記の操作を繰り返すか、染色体ＤＮＡを鋳型としたプライマーウォーキングを行なえば良い。
【００５５】
アガラーゼのアミノ酸配列から設計されたプライマーはミックスプライマーであっても良い。また、Ｎ末端アミノ酸配列、内部アミノ酸配列のそれぞれから作製したプライマーを用い、ＮＡＢ２−１−１の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行ない、得られる増幅産物の塩基配列から新たなプライマーを作製し、使用することも出来る。
このようにして得られたアガラーゼＩＩをコードする遺伝子は、１０８９個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするＯＲＦを有していた。該ＯＲＦの塩基配列を配列表の配列番号２１に、該ＯＲＦの塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２３に示す。なお、得られた遺伝子の塩基配列中にはアガラーゼＩＩのＮ末端アミノ酸配列Ｐ２部分に対応する塩基配列が存在し、その上流にシグナルペプチド様配列を持った２６個のアミノ酸をコードする塩基配列、さらにその上流にＳＤ様配列が見出された。
すなわち、配列表の配列番号２３に示されるアミノ酸配列は本発明のα−アガラーゼの一例である。また、該アミノ酸配列を先に決定されたアガラーゼＩＩのＮ末端アミノ酸配列を比較することにより、アガラーゼＩＩは配列表の配列番号２３に示されるアミノ酸配列のうちの２７〜１０８９のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該アミノ酸配列は配列表の配列番号２１の塩基配列のうちの７９〜３２７０（終止コドンを含む）にコードされることが示される。
なお、該ＯＲＦ内に推定Ｃａ結合領域が３ヵ所（１７１〜１８４、２７１〜２８３、９８７〜９９９）に見出された。
【００５６】
また、アガラーゼＩをコードする遺伝子は、４３８個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするＯＲＦを有していた。該ＯＲＦの塩基配列を配列表の配列番号２０に、該ＯＲＦの塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２２に示す。なお、得られた遺伝子の塩基配列中にはアガラーゼＩのＮ末端アミノ酸配列Ｐ１部分に対応する塩基配列が存在し、その上流に２０個のアミノ酸をコードする塩基配列、さらにその上流にＳＤ様配列が見出された。
すなわち、配列表の配列番号２２に示されるアミノ酸配列は本発明のアガラーゼの一例である。また、該アミノ酸配列を、先に決定されたアガラーゼＩのＮ末端アミノ酸配列を比較することにより、アガラーゼＩは配列表の配列番号２２に示されるアミノ酸配列のうちの２１〜４３８のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該アミノ酸配列は配列表の配列番号２０の塩基配列のうちの６１〜１３１４（終止コドンを含む）にコードされることが示される。
以上のようにして得られたアガラーゼＩのアミノ酸配列と、公知のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＮＲ１９由来のβ−アガラーゼのアミノ酸配列との相同性は３３％しかなく、本発明のアガラーゼＩは、全く新規の配列であると考えられる。
【００５７】
本発明のアガラーゼをコードする遺伝子、例えば、上記のアガラーゼＩ、アガラーゼＩＩをコードする遺伝子を適当なベクターに連結して組換えＤＮＡ分子を作製することが出来る。また、当該組換えＤＮＡ分子を適当な宿主に導入して形質転換体を作製することが出来る。当該形質転換体を培養することにより、培養物中に本発明のアガラーゼが産生される。すなわち、該形質転換体を使用して、本発明のアガラーゼ、例えば、アガラーゼＩ、アガラーゼＩＩを大量に製造することが可能となる。
また、公知の方法でアガラーゼをコードする遺伝子に変異を導入することにより、変異を導入したアガラーゼを製造することも出来る。変異の導入方法としては特に限定はなく、例えばオリゴヌクレオチドダブルアンバー法〔Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．；Ｇｅｎｅ，  １５２，  ２７１−２７５（１９９５）〕、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法〔Ｋｒａｍｅｒ，  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．；Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２，  ９４４１（１９８４）、  Ｋｒａｍｅｒ，  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １５４，  ３５０  （１９８７）〕、Ｋｕｎｋｅｌ法〔Ｋｕｎｋｅｌ，  Ｔ．Ａ．  ；Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２，  ４８８  （１９８５）、  Ｋｕｎｋｅｌ，  Ｔ．Ａ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １５４，  ３６７  （１９８７）〕等を用いることが出来る。
【００５８】
また、発現させようとするアガラーゼのＮ末端側にシグナル配列を付加したものをコードする遺伝子を発現させれば、目的のアガラーゼを形質転換体外に分泌させることが出来る。このようなシグナル配列に特に限定はなく、例えば配列表の配列番号２２のアミノ酸番号１〜２０で表されるアガラーゼＩのシグナル配列が挙げられ、該シグナル配列は配列表の配列番号２２の塩基番号１〜６０にコードされている。あるいは、配列表の配列番号２３のアミノ酸番号１〜２６で表されるアガラーゼＩのシグナル配列が挙げられ、該シグナル配列は配列表の配列番号２１の塩基番号１〜７８にコードされている。
上記の組換えＤＮＡ分子の作製に使用されるベクターは、特に限定するものではなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することが出来、組換えＤＮＡの使用目的に応じて適当なベクターを選択すれば良い。アガラーゼの生産を目的として組換えＤＮＡ分子を作製する場合には、プロモーターやその他の発現調節のための領域を含むベクターが好適である。 そのようなプラスミドベクターとしては、特に限定はないが、例えば、ｐＫＦ１９ｋ、ｐＴ７ＢｌｕｅＴ、ｐＥＴ１６ｂ等が挙げられる。また、形質転換体の作製に使用される宿主も、特に限定するものではなく、細菌、酵母、糸状菌等の微生物の他、哺乳動物、魚類、昆虫等の培養細胞等を使用することが出来る。形質転換体の作製には、宿主に適したベクターで作製された組換えＤＮＡ分子が使用される。
【００５９】
以下に、アガラーゼＩを遺伝子工学的に製造する方法についてその概略を説明する。
例えば、配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１以降のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクター、例えばｐＫＦ１９ｋ（宝酒造社製）、ｐＴ７ＢｌｕｅＴ（宝酒造社製）、又はｐＥＴ１６ｂ（宝酒造社製）等に挿入したプラスミドを構築する。これらのプラスミドで形質転換した大腸菌、例えば大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ等を適当な液体培地中で培養し、必要に応じてＩＰＴＧ等による誘導を行い、各プラスミド上の挿入ＤＮＡ断片にコードされているポリペプチドを発現させる。これらの形質転換体の発現する単位培養液あたりのβ−アガラーゼ活性は、通常、 ＮＡＢ２−１−１の培養液より高い値を示す。
また、アガラーゼＩＩは、例えば配列表の配列番号２３のアミノ酸番号２７、１８１、もしくは３１８以降のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を用い、上記のアガラーゼＩと同様の方法によってアガラーゼＩＩを発現する形質転換体を遺伝子工学的に作製することが出来る。得られた形質転換体は、α−アガラーゼ活性を発現し、かつその単位培養液あたりの活性は、通常、ＮＡＢ２−１−１の培養液より高い。
以上のようにして遺伝子工学的に生産させた本発明のアガラーゼは、通常用いられる精製方法、例えば硫安塩析、溶媒沈澱法により本発明のアガラーゼを部分精製することができる。さらに、陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラム等のカラムクロマトグラフィー等の公知の精製操作を組み合わせて、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素標品を得ることができる。
【００６０】
また、遺伝子工学的に生産させた本発明のアガラーゼが不溶化する場合には、公知の方法で可溶化し回収することが可能である。
このようにして得られた種々の精製度の本発明の遺伝子組換えα−アガラーゼを、紅藻類に含まれる多糖である寒天またはアガロースを基質として反応させることにより、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース等のアガロオリゴ糖を製造することができる。
例えば、１％（ｗ／ｖ）アガロースを基質として、５０℃で１６時間反応させることで、上記アガロオリゴ糖を製造することが出来る。
同様に、上記のようにして得られた種々の精製度の本発明の遺伝子組換えβ−アガラーゼを、核酸等の電気泳動に供したアガロースゲルに作用させることにより、アガロースゲル中の核酸等の物質を効率よく抽出することが出来る。
【００６１】
例えば、１％（ｗ／ｖ）又は３％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動を行った場合、所望の物質を含むアガロースゲルに本発明の遺伝子組換えβ−アガラーゼを６７℃で１０分間作用させることで、ゲル中の物質を効率良く抽出することができる。
本発明のアガラーゼは、そのＯＲＦのＮ末端側の３０％までを欠失させることより、熱安定性を向上させることが出来る。欠失させる領域はＯＲＦの例えば１０％、２０％等、３０％までであれば特に限定はない。例えば、アガラーゼＩＩの場合、Ｎ末端側から２９．１％、すなわち３１７アミノ酸を欠失させることにより、その熱安定性を向上させることが出来る。また、該熱安定性の向上は、カルシウムの存在下において特に顕著である。
熱安定性向上のためのＮ末端側の欠失方法についても特に限定はなく、プロテアーゼ処理によっても良く、また遺伝子工学的手法を用いても良い。
【００６２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６３】
活性測定法
本発明のアガラーゼの精製を行なうにあたって、本酵素の精製品又は部分精製品の活性測定は、アガロースＬＯ３（宝酒造社製）を基質として酵素反応を行った後、生じたアガロテトラオースまたはネオアガロテトラオースの量を高速液体クロマトグラフィーを用いて定量することにより行った。以下にその操作の詳細を示す。
０．2％（ｗ／ｖ）または０．５％（ｗ／ｖ）のアガロース溶液［アガラーゼＩの場合：１０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）、アガラーゼＩＩの場合：１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび１０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］を調製し、この溶液  １８０μlを基質として、酵素溶液  ２０μlと混合し、５０℃で５〜３０分間、好ましくは１０分間反応させた後、沸騰水中または７５℃で１分間加熱することによって反応を停止させる。この反応溶液  ３０μｌを内径  ７．８ｍｍ、長さ  ３００ｍｍのＴＳＫｇｅｌ  α−２５００（東ソー社製）なるカラムに供し、７０％  アセトニトリル溶液を溶離液として０．８ｍｌ／分の流速で溶出させた時の約２５分の保持時間を示す酵素反応によって生じたアガロテトラオース又は約２４分の保持時間を示すネオアガロテトラオースを定量し、１０分間当たり１μｍｏｌのアガロテトラオース又はネオアガロテトラオースを生じる酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
【実施例２】
【００６４】
ＮＡＢ２−１−１由来のアガラーゼの生産
１００ｍｌの人工海水（商品名ジャマリンＳ、ジャマリンラボラトリー社製）を調製し、これにペプトン（ＤＩＦＣＯ社製）を０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）を０．０２％（ｗ／ｖ）となるようそれぞれ加えた後、３Ｍの炭酸ナトリウムでｐＨ７．８に調整した。これを５００ｍｌ容の三角フラスコに移し、ＮｕｓｉｅｖｅＧＴＧアガロース（宝酒造社製）  ０．４ｇを加え、オートクレーブを用いて滅菌操作を行った後、ＮＡＢ２−１−１を接種し、３７℃、１２０ｒｐｍで一晩培養した。得られた培養液を前培養液とした。
本培養は、以下の手順で行った。５，０００ｍｌ容のジャーファーメンター容器に人工海水（商品名ジャマリンＳ、ジャマリンラボラトリー社製）  ３，０００ｍｌを調製し、これにペプトン（ＤＩＦＣＯ社製）を０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）を０．０２％（ｗ／ｖ）となるようそれぞれ加え、ｐＨ７．８に調整した後、ＮｕｓｉｅｖｅＧＴＧアガロース（宝酒造社製）  １２ｇを加え、オートクレーブを用いて滅菌操作を行った。これに上記の前培養液３０ｍｌを接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで１８時間培養し、８，０００×ｇ、２０分間の遠心分離により菌体を除いた約３，０００ｍｌの上清を回収した。
これより以降の操作は４℃以下で行った。
【００６５】
上記上清を透析膜（三光純薬社製）に添加し、約５００ｇのポリエチレングリコール中に二晩浸漬させることにより、約１０倍に濃縮し、得られた３００ｍｌの濃縮液は、緩衝液Ｉ［１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび１０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］で透析を行い脱塩を行った。
この透析液を予め緩衝液で平衡化した陰イオン交換樹脂であるＤＥＡＥ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ（東ソー社製）を充填したカラム（φ２．０ｃｍ×１２ｃｍ）に負荷し、約１２０ｍｌの緩衝液Ｉで洗浄し、その非吸着画分及び洗浄画分の約４００ｍｌをアガラーゼＩ画分として回収した。その後１０ｍＭから１，０００ｍＭの塩化ナトリウムへの直線濃度勾配法（総溶出量４００ｍｌ）で溶出させ、塩化ナトリウム濃度が３００ｍＭから６００ｍＭの間に溶出してくる約１６０ｍｌをアガラーゼＩＩ画分として回収した。
得られたアガラーゼＩ、アガラーゼＩＩ両画分を緩衝液ＩＩ［１０ｍＭ  塩化カルシウム、１０ｍＭ  塩化ナトリウム、５％  グリセロール、および１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］に対して透析して脱塩を行った。
アガラーゼＩＩ画分についてさらに以下の精製を行った。透析後のアガラーゼＩＩ画分を２５ｍｌのＱＡＥ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ５５０Ｃ（東ソー社製）を充填したカラム（φ２．０ｃｍ×８．０ｃｍ）に負荷し、この場合は塩化ナトリウムの１０ｍＭから８００ｍＭの直線濃度勾配法（総溶出量  ２５０ｍｌ）により溶出させ、５００ｍＭ前後で溶出する画分約７０ｍｌを得た。この画分を緩衝液ＩＩで透析し、遠心限外濾過膜ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ−１０（アミコン社製）を用いて約１ｍｌに濃縮した。これを緩衝液ＩＩで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００（ファルマシア社製）を充填したカラム（φ０．８ｃｍ×５０ｃｍ）を用いたゲル濾過に供し、約２０ｍｌのアガラーゼＩＩ画分を得た。これを再度限外濾過膜で約１ｍｌまで濃縮した。
【００６６】
この精製タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動したところ、ほぼ単一に精製されており、全活性は約１５０Ｕであった。
アガラーゼＩ画分についてはさらに以下の精製を行った。
前に述べた透析済みのアガラーゼＩ画分  約４００ｍｌを、予め緩衝液ＩＩで平衡化したＣＭ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０（東ソー社製）を充填したカラム（φ２．０ｃｍ×９．５ｃｍ）に吸着させ、１０ｍＭから１，０００ｍＭの塩化ナトリウムへの直線濃度勾配法（総溶出量  ３００ｍｌ）で溶出させ、塩化ナトリウム濃度が３００ｍＭまでに溶出してくる約９０ｍｌのアガラーゼＩの画分を回収した。この画分を１．０Ｍ  硫酸アンモニウムを含む緩衝液ＩＩで一晩透析後、同緩衝液で平衡化した３０ｍｌのＢｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ（東ソー社製）を充填したカラム（φ２．０ｃｍ×９．５ｃｍ）に負荷した。１．０Ｍから０Ｍまでの硫酸アンモニウム濃度の勾配（総溶出量  ３００ｍｌ）で溶出させ、３００ｍＭ以降のアガラーゼＩ画分（約６０ｍｌ）を回収した。アガラーゼＩＩの場合と同様にこの画分を緩衝液ＩＩに対して透析し、遠心限外濾過膜ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ−１０（アミコン社製）を用いて約１ｍｌに濃縮した。
この精製タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動したところ、ほぼ単一に精製されており、得られた全活性は約３１０Ｕであった。
【実施例３】
【００６７】
酵素の諸性質の検討
［アガラーゼＩ及びアガラーゼＩＩの反応物の同定］
２０μｌの０．５％（ｗ／ｖ）のアガロース溶液［アガラーゼＩ：１０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）、アガラーゼＩＩ：１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび１０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］をアガラーゼＩ、アガラーゼＩＩの精製酵素で切断し、その切断産物を溶離液として７０％  アセトニトリルを用いたゲル濾過カラム（東ソー社製、ＴＳＫｇｅｌ  α−２５００）に供した。その結果、アガラーゼＩについては主に約２４分、約２８分にピークが見られ、これは標準物質の保持時間からそれぞれネオアガロテトラオース、ネオアガロヘキサオースと考えられた。また、アガラーゼＩＩ切断産物は主に約２２分、約２５分、約２９分の保持時間のところにピークが見られ、これは標準物質の保持時間からそれぞれアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオースと考えられた。さらにこの反応生成物をクロロホルム：メタノール：酢酸＝３：３：１の組成から成る展開溶媒で薄層クロマトグラフィーに供し、２回展開することで確認した。なおこの際にはアガロビオース（Ｒｆ値０．７６）、アガロテトラオース（Ｒｆ値０．５０）、アガロヘキサオース（Ｒｆ値０．３３）の３種類のアガロオリゴ糖、及びネオアガロテトラオース（Ｒｆ値０．５９）、ネオアガロヘキサオース（Ｒｆ値０．４１）の２種類のネオアガロオリゴ糖をコントロールとした。その結果、アガラーゼＩ反応物はネオアガロオリゴ糖、アガラーゼＩＩ反応物はアガロオリゴ糖と同じ位置にオルシノール硫酸による発色物が確認された。これらのことからアガラーゼＩはアガロース分子中のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のβ−１，４結合を加水分解し、ネオアガロオリゴ糖を生産するβ−アガラーゼであり、アガラーゼＩＩはアガロース分子中のα−１，３結合を加水分解し、アガロオリゴ糖を生産するα−アガラーゼであることが判明した。
【００６８】
［Ｃａイオン要求性］
アガラーゼＩ溶液、アガラーゼＩＩ溶液をカルシウムを含まない緩衝液［１０ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］で一晩透析した後、０．２％（ｗ／ｖ）アガロース溶液［１０ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］を添加し、５０℃で１０分間反応させた。アガラーゼＩについては沸騰水中で１分間、またアガラーゼＩＩについては７５℃で１分間加熱することにより、反応を停止させた。その後活性測定を行ない、通常のカルシウムを含んだ緩衝液中で反応させた場合の活性を１００％とした場合、アガラーゼＩは約１００％、アガラーゼＩＩは約６０％であった。
［至適温度］
酵素の失活が抑制され、速やかに反応が進む温度はアガラーゼＩが５０〜６５℃であり、アガラーゼＩＩが４５〜５５℃であった。
［熱安定性］
本酵素溶液を４８℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃で一定時間加熱した後、０．２％（ｗ／ｖ）アガロース溶液［アガラーゼＩの場合：１０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）、アガラーゼＩＩの場合：１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび１０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］を添加し、５０℃で１０分間反応させ、アガラーゼＩについては沸騰水中で１分間加熱することにより、またアガラーゼＩＩについては７５℃で１分間加熱することにより、反応を停止させた。その後活性測定を行い、通常の５０℃で１０分間反応させた場合の活性を１００％とした場合、アガラーゼＩは６５℃、６０分間で約８５％、アガラーゼＩＩは５５℃、１０分間で約４０％であった。
【００６９】
［分子量］
分子量はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法で測定した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法では、常法に従って、ＳＤＳを含むポリアクリルアミドの濃度が１０〜２０％のゲルで、分子量マーカー（バイオラッド社製、分子量  ２００，０００のミオシン、１１６，２５０のβ−ガラクトシダーゼ、９７，４００のフォスフォリラーゼ  ｂ、６６，２００のウシ血清アルブミン、４５，０００のオブアルブミン、３１，０００のカルボニックアンヒドラーゼ、２１，５００のトリプシンインヒビター、１４，４００のリゾチーム）とともに電気泳動を行い、移動度から分子量を求めたところ、アガラーゼＩについては約４８，０００、アガラーゼＩＩについては約１１７，０００であった。
［アミノ末端アミノ酸配列］
アガラーゼＩ、アガラーゼＩＩのアミノ末端アミノ酸配列をエドマン分解法により決定した。それぞれ約１０ｐｍｏｌ相当の酵素タンパクを含むアガラーゼＩおよびアガラーゼＩＩの精製酵素標品溶液を１０〜２０％  ポリアクリルアミド濃度勾配ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、ゲル上で分離された酵素をプロブロット（アプライドバイオシステムズ社製）なる膜にブロッテイングし、酵素が吸着した部分の膜をプロテインシークエンサー（Ｇ１０００Ａ、ヒューレット・パッカード社製）を用いて分析した。この結果、決定された両酵素のアミノ末端アミノ酸配列はアガラーゼＩ（Ｐ１、配列番号１）がＡｌａ−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、またアガラーゼＩＩ（Ｐ２、配列番号２）はＧｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅであった。
［部分アミノ酸配列の決定］
精製されたアガラーゼＩ、ＩＩそれぞれ２ｎｍｏｌを用いて、システイン残基のカルボキシルメチル化を行い、リジルエンドペプチダーゼで消化し、得られた消化物からペプチド断片をＨＰＬＣで分離精製した。カラムはμＢｏｎｄａｓｐｈａｒｅＣ８（ウオーターズ社製）を用い、溶出液はＡ液：０．１％  ＴＦＡ、Ｂ液：８０％アセトニトリルを含む０．１％  ＴＦＡを使用した。溶出は流速０．５ｍｌ／分で５０分間でＢ液の割合を０〜１００％まで直線的に増加させることによって行い、２１４ｎｍで検出し、分取した。各ペプチド画分についてアミノ酸配列分析を行い、アガラーゼＩについては部分アミノ酸配列ＰＩ３（配列番号３）、ＰＩ４（配列番号４）、アガラーゼＩＩについてはＰＩＩ５（配列番号５）、ＰＩＩ６（配列番号６）、ＰＩＩ７（配列番号７）を決定した。
【実施例４】
【００７０】
アガロオリゴ糖の製造
２ｍｌの反応用緩衝液［１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび１０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］に１．０％（ｗ／ｖ）になるようにアガロースＬＯ３を加え、さらに約１．０ＵのアガラーゼＩＩ精製標品を加えて５０℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応液を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。この反応液を実施例１記載の本発明の酵素の活性測定において使用したものと同条件の高速液体クロマトグラフィーにより分析し、生成したアガロオリゴ糖を確認した。この結果、反応液中にアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオースが検出され、上記酵素反応により、これらの低分子アガロオリゴ糖が生成していることが確認された。
【実施例５】
【００７１】
ネオアガロオリゴ糖の製造
２ｍｌの反応用緩衝液［１０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］に１．０％（ｗ／ｖ）になるようにアガロースＬＯ３を加え、さらに約１．０ＵのアガラーゼＩ精製標品を加えて６５℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応液を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。この反応液を実施例１記載の本発明の酵素の活性測定において使用したものと同条件の高速液体クロマトグラフィーにより分析し、生成したネオアガロオリゴ糖を確認した。この結果、反応液中にネオアガロテトラオース、ネオアガロヘキサオースが検出され、上記酵素反応により、これらの低分子ネオアガロオリゴ糖が生成していることが確認された。
【実施例６】
【００７２】
アガラーゼＩを用いたアガロースゲルからの核酸の回収
ＤＮＡ分子量マーカーであるλ−ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）を１μｇ分、１．０％（ｗ／ｖ）ＳｅａＰｌａｑｕｅＧＴＧアガロースゲルで電気泳動した。分離した約４．４ｋｂｐと約６．６ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をゲルごと切り出し、１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに入れた。そこに１ｍｌの反応緩衝液［５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］を添加し、室温で１０分間放置した。その後、緩衝液を廃棄して、ゲルのみを残し、６７℃で５分間保温することによりゲルを融解させた。そこに精製したアガラーゼＩ酵素  １．０Ｕを加え、さらにそのまま１０分間保温した。エッペンドルフチューブを氷中に入れ、アガロースゲルが完全に溶解したことを確認した後、常法に従ってエタノール沈殿させ、ＤＮＡ断片を回収した。これと同じ方法でＤＮＡ分子量マーカーである１００ｂｐラダーマーカー（宝酒造社製）についても３．０％（ｗ／ｖ）ＮｕｓｉｅｖｅＧＴＧアガロースゲルからのＤＮＡ回収を行った。なお、この際には４００ｂｐ、５００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。表２にＤＮＡの回収率につき市販のＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ａｔｌａｎｔｉｃａ由来のβ−アガラーゼ（宝酒造社製）との比較を行った結果を示す。
市販のβ−アガラーゼを使用した場合、アガロースゲルを融解させた後、酵素が働くことが出来る温度にまで温度を下げ、その後酵素を添加しなければならず、又反応温度が低いため、長時間反応させる必要があり、操作の所要時間は長くなる。
一方、本発明のアガラーゼＩを使用した場合は、アガロースゲルを融解させた後、直ちに酵素を添加することができ、かつ温度を下げることなく高い温度のままで反応を行うことが出来、所要時間は短くてすむ。
【００７３】
【表２】
2008220378.tif 000003
【実施例７】
【００７４】
ＮＡＢ２−１−１株からの染色体ＤＮＡの調製
人工海水（商品名ジャマリンＳ、ジャマリンラボラトリー社製）を１リットル調製し、ペプトン（ＤＩＦＣＯ社製）を０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）を０．０２％（ｗ／ｖ）となるよう加えた後、３Ｍの炭酸ナトリウムでｐＨ７．８に調整し、これに寒天（ナカライテスク社製）を０．１％（ｗ／ｖ）になるように加え、オートクレーブを用いて滅菌操作を行った。２ｍｌの培地にアガラーゼ生産菌株であるＮＡＢ２−１−１をグリセロールストックより１０μｌを植菌し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液の１ｍｌを１００ｍｌの同培地へ植菌し、同じく３７℃で一晩培養し、８，０００×ｇ、１０分間遠心することにより菌体を回収した。その菌体を１０ｍｌの緩衝液Ａ［１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）］に懸濁し、０．２５ｍｌのリゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加、３７℃、１時間インキュベートした。次に２．５ｍｌの５．０％  ＳＤＳ含有緩衝液Ａを加えた後、６０℃で２０分間振とうしながらインキュベートし、１．５ｍｌのプロテアーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。その後、３７℃で一晩インキュベートし、その溶液に対してほぼ等量のフェノールを加えて室温で約１０分間穏やかに振とうした。２，０００×ｇ、１０分間遠心し、その上清を冷エタノールに移し、染色体ＤＮＡをガラス棒で巻き取った。染色体ＤＮＡを巻き取った後の溶液に、再びほぼ等量のフェノールを加え、同様の操作を行なって再度染色体ＤＮＡを巻き取った。得られた染色体ＤＮＡを１０μｌの緩衝液Ａに懸濁し、ここに５０μｌのＲＮａｓｅＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、３７℃で１０分間インキュベートした。この溶液から染色体ＤＮＡをエタノール沈澱により回収し、５ｍｌの緩衝液Ｂ［１４０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）］に懸濁し、同緩衝液で一晩透析し、約５．０ｍｇの染色体ＤＮＡを得た。その純度をＯＤ２６０ｎｍ／２８０ｎｍで検定したところ、両方共に約１．８であり、以下のアガラーゼＩ、アガラーゼＩＩのクローニングに使用した。
【実施例８】
【００７５】
アガラーゼＩ遺伝子のクローニング
実施例３で明らかにされたアガラーゼＩのＮ末端側のアミノ酸配列Ｐ１（配列番号１）により、配列表の配列番号８、９で表わされる混合プライマー１、２をデザインし、ＤＮＡ合成機で合成し、精製した。すなわち配列番号８、９で表わされる混合プライマー１、２はそれぞれアミノ酸配列Ｐ１のアミノ酸番号４〜１０、４〜１３のアミノ酸配列に対応している。これらのプライマーを用いてＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）によりアガラーゼＩ遺伝子のクローニングを行なった。
一次ＰＣＲ反応は以下のように行なった。実施例７で調製した染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化し、その末端にＢａｍＨＩアダプターをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した。その一部を０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブにとり、５μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ混合液、１μｌの混合プライマー１、１μｌのプライマーＣ１（ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）に添付のプライマー）、０．５μｌのＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて５０μｌとしたものを用いた。この溶液に５０μｌのミネラルオイルを重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）により反応を行なった。反応条件は９４℃で２分間変性を行なった後、９４℃で１分間（変性）→５０℃で２分間（プライマーのアニーリング）→７２℃で２分間（合成反応）のサイクルを３０サイクル行なった。
次にこの反応液をテンプレートとして用い、２次ＰＣＲを行なった。１次ＰＣＲ後の反応液１μｌをテンプレートとし、混合プライマー２とプライマーＣ２（ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）に添付のプライマー）の組み合わせで１次ＰＣＲと同様の条件でＰＣＲを行なった後、上層のミネラルオイルを除去し、次いで５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミドでＤＮＡを染色し、増幅産物の確認を行なった。その結果、約０．８ｋｂのＤＮＡフラグメントが確認され、該ＤＮＡフラグメントをβＮと命名した。
この増幅フラグメントβＮをアガロースゲルより切り出し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターに連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。該形質転換体を用いて、増幅フラグメントβＮの末端領域の塩基配列をジデオキシチェーンターミネーター法にて決定し、Ｎ末端側の領域から配列番号１０、１１に示されるプライマー３、４を、Ｎ末端側と異なる端の領域より、配列番号１２、１３に示すプライマー５、６をデザインし、ＤＮＡ合成機で合成し精製した。これらのプライマーを利用してＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）により同様の操作を行なうことによりβＮ上流と下流のＤＮＡ断片をクローニングした。なおこの際のプライマーのアニーリング条件は５５℃で１分間行なった。
【００７６】
すなわち上流領域はプライマー３、４を利用して、約０．６ｋｂのＤＮＡフラグメントを得、得られたＤＮＡフラグメントをβＵＮとし、またプライマー５、６を用いてβＮの下流側の約１．３ｋｂのＤＮＡフラグメントをβＣとした。βＵＮ、Ｃ共にｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（ノバジェン社製）に連結し、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定した。これらβＮ、βＵＮ、βＣのＤＮＡフラグメントの塩基配列を解析し、重ねあわせた結果、４３８個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦが見出された。
該ＯＲＦの塩基配列を配列表の配列番号２０に、該ＯＲＦの塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２２に示す。なおβＵＮ中にアミノ酸配列Ｐ１部分の塩基配列が存在し、またアミノ酸配列Ｐ１より上流に２０個のアミノ酸をコードする塩基配列が存在し、そのさらに上流にＳＤ様配列が見出された。
なお、実施例３で明らかにされたＮ末端アミノ酸配列Ｐ１は、配列番号２２の２１〜３３番目のアミノ酸に相当する配列であった。また、実施例３で明らかにされた部分アミノ酸配列ＰＩ３（配列番号３）、ＰＩ４（配列番号４）は、それぞれ配列表の配列番号２２の２６５〜２７２番目、３６７〜３７６番目のアミノ酸に一致した。
【実施例９】
【００７７】
アガラーゼＩＩ遺伝子のクローニング
実施例３で明らかにされたアガラーゼＩＩのＮ末端側のアミノ酸配列Ｐ２（配列番号２）、ＰＩＩ６（配列番号６）により、お互いに異なる鎖にハイブリダイズするように配列表の配列番号１４、１５で表わされる混合プライマー７、８をデザインし、ＤＮＡ合成機で合成し、精製した。
すなわち配列番号１４で表わされる混合プライマー７はアミノ酸配列Ｐ２のアミノ酸番号１〜８に、配列番号１５で表される混合プライマー８はアミノ酸配列ＰＩＩ６のアミノ酸番号２〜１０をコードするＤＮＡの相補鎖に対応している。
これらのプライマーを用いてＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）によりアガラーゼＩＩ遺伝子のクローニングを行なった。
一次ＰＣＲ反応は以下のように行なった。実施例７で得られたＮＡＢ２−１−１の染色体ＤＮＡ  １０ｎｇを０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブにとり、５μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ混合液、それぞれ４０ｐｍｏｌ分の混合プライマー７及び８、０．５μｌのＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて５０μｌとした。この溶液に５０μｌのミネラルオイルを重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）により反応を行なった。反応条件は９４℃で２分間変性を行なった後、９４℃で１分間（変性）→５０℃で２分間（プライマーのアニーリング）→７２℃で２分間（合成反応）のサイクルを３０サイクル行なった。上層のミネラルオイルを除去し、次いで５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミドでＤＮＡを染色し、増幅産物の確認を行なった。その結果、約６００ｂｐのＤＮＡフラグメントが確認され、該ＤＮＡフラグメントをαＮと命名した。
【００７８】
この増幅フラグメントαＮをアガロースゲルより切り出し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターに連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。該形質転換体を用いて、増幅フラグメントαＮの末端領域の塩基配列をジデオキシチェーンターミネーター法にて決定し、Ｎ末端側の領域から配列番号１６、１７に示されるプライマー９、１０をＮ末端側と異なる端の領域より、配列番号１８、１９に示すプライマー１１、１２をデザインし、ＤＮＡ合成機で合成し精製した。これらのプライマーを利用してＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）により同様の操作を行なうことにより、αＮ上流と下流のＤＮＡ断片をクローニングした。
その際のＰＣＲ反応は以下のように行なった。実施例７で調製したＮＡＢ２−１−１染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化し、その末端にＢａｍＨＩアダプターをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した。その一部を０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブにとり５μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ混合液、１μｌのプライマー９、１μｌのプライマーＣ１、０．５μｌのＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて５０μｌとしたものを用いた。この溶液に５０μｌのミネラルオイルを重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）により反応を行なった。反応条件は９４℃で２分間変性を行なった後、９４℃で１分間（変性）→５０℃で２分間（プライマーのアニーリング）→７２℃で３分間（合成反応）のサイクルを３０サイクル行なった。
次にこの反応液をテンプレートとして用い、２次ＰＣＲを行なった。１次ＰＣＲ後の反応液  １μｌをテンプレートとし、プライマー１０とプライマーＣ２の組み合わせで１次ＰＣＲと同様の条件でＰＣＲを行なった後、上層のミネラルオイルを除去し、次いで５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミドでＤＮＡを染色し、増幅産物の確認を行なった。その結果、約５００ｂｐのＤＮＡフラグメントが確認され、該ＤＮＡフラグメントをαＵＮと命名した。
【００７９】
同様にしてプライマー１１、１２を用いて得られたαＮの下流側の約２ｋｂのＤＮＡフラグメントをαＣとした。αＵＮ、Ｃ共にｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（ノバジェン社製）に連結し、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定した。これらαＮ、αＵＮ、αＣのＤＮＡフラグメントの塩基配列を解析し、重ねあわせた結果、１０８９個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦが見出された。
該ＯＲＦの塩基配列を配列表の配列番号２１に、該ＯＲＦの塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２３に示す。なおαＵＮ中にアミノ酸配列Ｐ２部分の塩基配列が存在し、またアミノ酸配列Ｐ２より上流にシグナルペプチド様配列をもった２６個のアミノ酸をコードする塩基配列が存在し、そのさらに上流にＳＤ様配列が見出された。
なお、アミノ酸配列Ｐ２は、配列番号２３の２７〜３６番目のアミノ酸に相当する配列であった。また、実施例３で明らかにされた部分アミノ酸配列ＰＩＩ５（配列番号５）、ＰＩＩ６（配列番号６）、ＰＩＩ７（配列番号７）は、それぞれ配列表の配列番号２３の１２９〜１３８番目、６４０〜６４９番目、７３８〜７４７番目のアミノ酸に一致した。
また、推定Ｃａ結合領域が、配列表の配列番号２３の１７１〜１８４番目、２７１〜２８３番目、９８７〜９９９番目の３ヵ所に見出された。
【実施例１０】
【００８０】
アガラーゼＩを発現するプラスミドの構築
プライマー１３（配列番号２４）は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を塩基番号１２〜１７に持ち、さらにアミノ酸配列（配列番号２２）のアミノ酸番号２１〜２７に相当する塩基配列を塩基番号１９〜３８に持つ合成ＤＮＡである。これと制限酵素ＰｓｔＩの認識配列を塩基番号１１〜１６にもち、染色体上のアガラーゼＩの読み枠から約３００ｂｐ下流の相補鎖にハイブリダイズするプライマー１４（配列番号２５）を用いて、以下のようにＰＣＲを行った。０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブにプライマー１３、１４を１０ｐｍｏｌずつ、テンプレートとしてＮＡＢ２−１−１株由来の染色体ＤＮＡ  １０ｎｇ、５μｌの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合液、０．５μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて５０μｌとした。これを自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）にセットし、９４℃で２分間変性を行った後、９４℃で１分間→５５℃で２分間→７２℃で２分間のサイクルを２５サイクル行った。このＰＣＲ産物をエタノール沈澱により濃縮、脱塩し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）及びＰｓｔＩ（宝酒造社製）で二重消化し、１．０％アガロース電気泳動によりそのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ消化物を抽出精製した。この精製したものと同酵素で消化したｐＵＣ１８（宝酒造社製）を混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。白色を呈したコロニーからプラスミドを調製し、ＤＮＡシークエンシングを行ない、正しくＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドを選択し、これをｐＮＢ１０１と命名した。ｐＮＢ１０１は、アガラーゼＩのアミノ酸配列（配列番号２２）のアミノ酸番号２１〜４３７のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。プラスミドｐＮＢ１０１で形質転換された大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＮＢ１０１と命名され、平成１３年１月１０日（原寄託日）より、日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５４として寄託されている。
【００８１】
このｐＮＢ１０１を導入した形質転換体を２．５ｍｌのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。この一部を新たに２．５ｍｌの同培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。ここでＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、培養温度を２０℃にしてさらに２時間培養して目的タンパク質を発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、１５０μｌの細胞破砕溶液［１０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］に再懸濁した。超音波により菌体を破砕し、遠心分離により上澄みの抽出液と沈澱とに分離した。それぞれを試料としてアガロースを基質としたβ−アガラーゼ活性を測定したところ、上清抽出液に活性が確認された。なお、この活性は１００ｍｌの培養液当たりの活性で比較した場合、野性株であるＮＡＢ２−１−１のもつ活性の約２５倍であった。
【実施例１１】
【００８２】
アガラーゼＩのｐＥＴ１６ｂを用いた発現系
実施例１０に準じた条件で、アガラーゼＩのアミノ酸配列（配列番号２２）のアミノ酸番号２１〜２７に相当する塩基配列を塩基番号２０〜３９にもち、さらに制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号１４〜１９にもつプライマー１５（配列番号２６）と制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を塩基番号１２〜１７にもち、染色体ＤＮＡ上のアガラーゼＩの読み枠から約３００ｂｐ下流の相補鎖にハイブリダイズするプライマー１６（配列番号２７）を用いて、ＮＡＢ２−１−１株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲを行った。その増幅断片をエタノール沈澱により濃縮後、ＮｄｅＩ（宝酒造社製）及びＸｈｏＩ（宝酒造社製）切断し、抽出精製した。これを同酵素で切断したｐＥＴ１６ｂ（宝酒造社製）に連結し、これをｐＮＢ２０１と命名した。ｐＮＢ２０１は、アガラーゼＩのアミノ酸配列（配列番号２２）のアミノ酸番号２１〜４３７のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。
このｐＮＢ２０１で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換して得られた形質転換体を用いて、実施例１０と同様にβ−アガラーゼの活性を測定したところ、その抽出液に活性が確認された。これは１００ｍｌの培養液当たりの活性で比較した場合、ＮＡＢ２−１−１のもつ活性の約５０倍であった。
【実施例１２】
【００８３】
アガラーゼＩＩを発現するプラスミドの構築
プライマー１７（配列番号２８）は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に持ち、さらにアガラーゼＩＩのアミノ酸配列（配列番号２３）のアミノ酸番号２７〜３３に相当する塩基配列を塩基番号１７〜３７に持つ合成ＤＮＡである。これと制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を塩基番号１１〜１６にもち、なおかつ染色体上のアガラーゼＩＩの読み枠から約２５０ｂｐ下流とハイブリダイズするプライマー１８（配列番号２９）を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにはプライマー１７、１８を１０ｐｍｏｌずつ、テンプレートとして野生株であるＮＡＢ２−１−１由来の染色体ＤＮＡ  １０ｎｇを用いた。Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いた反応系で、条件は９４℃で２分間変性を行った後、９４℃で１分間→５０℃で２分間→７２℃で３分間のサイクルを３０サイクル行った。このＰＣＲ産物をエタノール沈澱により濃縮し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）及びＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で二重消化し、１．０％アガロース電気泳動により、そのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化物を抽出精製した。実施例１０と同様にしてｐＵＣ１８とのハイブリッドプラスミドを作製し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。このハイブリッドプラスミドをｐＮＡ１０１と命名した。ｐＮＡ１０１は、アガラーゼＩＩののアミノ酸配列（配列番号２３）のアミノ酸番号２７〜１０８９のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。
プラスミドｐＮＡ１０１で形質転換された大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＮＡ１０１と命名され、平成１３年１月１０日（原寄託日）より、日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５３として寄託されている。
このｐＮＡ１０１を導入した形質転換体について、細胞破砕液中に１０ｍＭ  塩化カルシウムを含む以外は実施例１０と同様にしてα−アガラーゼ活性を測定したところ、その抽出液に活性が存在した。これは１００ｍｌの培養液当たりの活性で比較した場合、野性株であるＮＡＢ２−１−１のもつ活性の約１５倍であった。
【実施例１３】
【００８４】
アガラーゼＩＩの欠失タンパク質の活性
遺伝子工学的手法により、以下に示す改変タンパク質を作製し、それぞれについてα−アガラーゼ活性を確認した。
プライマー１９（配列番号３０）は、アガラーゼＩＩのアミノ酸配列（配列番号２３）のアミノ酸番号１８１〜１８８に相当する塩基配列を塩基番号１９〜４０にもち、さらに制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を塩基番号１２〜１７にもつ。
これとプライマー１８（配列番号２９）を用いて、ＮＡＢ２−１−１の染色体ＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲを行い、実施例１２と同様にしてｐＵＣ１８へ連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。ＤＮＡシークエンシングにより連結部分の配列を確認して、得られたハイブリッドプラスミドをｐＮＡ２０１ｄとした。これから発現されるタンパク質は、アガラーゼＩＩのアミノ酸配列（配列番号２３）のアミノ酸番号１８０番目までが欠失したものである。即ち、ｐＮＡ２０１ｄはアガラーゼＩＩのアミノ酸配列（配列番号２３）のアミノ酸番号１８１〜１０８９のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。これを細胞破砕液中に１０ｍＭ  塩化カルシウムを含む以外は実施例１０と同様にしてＩＰＴＧで発現誘導させ、活性を測定したところ、その抽出液にα−アガラーゼの活性が存在した。これは１００ｍｌ培養液当たりの活性で比較した場合、ＮＡＢ２−１−１のもつ活性の２倍程度であった。
プライマー２０（配列番号３１）は、アガラーゼＩＩのアミノ酸配列（配列番号２３）のアミノ酸番号３１８〜３２５に相当する塩基配列を塩基番号１９〜４０にもち、さらに制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を塩基番号１２〜１７にもつ。これとプライマー１８（配列番号２９）を用いてＮＡＢ２−１−１の染色体ＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲを行い、ｐＵＣ１８とのハイブリッドプラスミド（ｐＮＡ３０１ｄ）を作製した。このｐＮＡ３０１ｄを導入した大腸菌ＪＭ１０９からは、アガラーゼＩＩのアミノ酸配列（配列番号２３）のアミノ酸番号３１７までのペプチドが欠失したタンパク質が発現される。即ち、ｐＮＡ３０１ｄはアガラーゼＩＩのアミノ酸配列（配列番号２３）のアミノ酸番号３１８〜１０８９のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。これを細胞破砕液中に１０ｍＭ  塩化カルシウムを含む以外は実施例１０と同様にして活性を確認したところ、その抽出液にα−アガラーゼの活性が存在した。これは１００ｍｌ培養液当たりの活性で比較した場合、ＮＡＢ２−１−１のもつ活性の約１５倍であった。またこのｐＮＡ３０１ｄを導入した形質転換体からの抽出液を、まったくカルシウムを含まない緩衝液［１０ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］で透析した後、０．２％アガロース溶液［１０ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］を反応させたところ、カルシウムを含んだ緩衝液中と同様に切断活性を示した。
【実施例１４】
【００８５】
ＡｇａｒＡＣＥ酵素（プロメガ社製）との比較
［至適温度］
プロメガ社から発売されているｍａｒｉｎｅ  Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来β−アガラーゼであるＡｇａｒＡＣＥ酵素と本発明のアガラーゼＩにつき、その酵素化学的性質を比較検討した。
熱溶解した１．０％（ｗ／ｖ）ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロース［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３）］（ＦＭＣ社製）４０μｌに、１０μｌのアガラーゼＩまたはＡｇａｒＡＣＥ酵素（プロメガ社製）（添付のデータシートより０．２９ユニット分）を添加し、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃で１０分間反応させた。この際、予め両酵素の活性を実施例１に記載の方法で測定しておき、各々の反応において酵素活性量が同じになるようにそれぞれの酵素を添加した。反応後、実施例１に記載の方法で酵素活性を算出した。最大酵素活性を１００％とした場合の相対値で表した結果を表３に示した。この結果から明らかなようにアガラーゼＩの至適温度は５０℃〜６５℃であり、ＡｇａｒＡＣＥ酵素は４５℃〜５０℃であった。
【００８６】
【表３】
2008220378.tif 000004
【００８７】
［耐熱性］
６０℃または６５℃で各時間保温したアガラーゼＩもしくはＡｇａｒＡＣＥ酵素（添付のデータシートより０．２９ユニット分）１０μｌを、あらかじめ熱融解した１．０％（ｗ／ｖ）  ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロース［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３）］（ＦＭＣ社製）  ４０μｌに添加した。なおこの際、上記と同様に、各々の反応における酵素活性量は同一とした。その後、アガラーゼＩについては５５℃で１０分間、ＡｇａｒＡＣＥ酵素については４５℃で１０分間反応させ、これを実施例１に記載の方法で酵素活性を算出し、非加熱時の活性を１００％とした場合の相対値で表した結果を表４に示した。この結果から明らかなようにアガラーゼＩでは、６５℃、３０分間保温でほぼ１００％の活性を維持しているのに対し、ＡｇａｒＡＣＥ酵素は６５℃で１０分間保温するとほぼ完全に失活した。
【００８８】
【表４】
2008220378.tif 000005
【実施例１５】
【００８９】
カルシウムによる酵素の熱安定性の変化
実施例１１記載のｐＮＡ１０１、又は実施例１３に記載のｐＮＡ３０１ｄで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を２．５ｍｌのＬＢ液体培地（アンピシリン  ５０μｇ／ｍｌを含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。次に、この培養液の一部を１００ｍｌの同培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。ここでＩＰＴＧを終濃度  １．０ｍＭとなるように添加し、培養温度を２０℃にして更に２時間培養し、目的のタンパク質の発現を誘導した。その後、菌体を遠心分離により回収し、５ｍｌの細胞破砕溶液［１０ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  塩化カルシウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］に懸濁した。超音波により菌体を破砕し、遠心分離により上澄みを回収し、該上澄みのα−アガラーゼ活性を測定後、両サンプルの容積あたりの酵素活性が同じになるよう細胞破砕溶液で希釈した。このようにして得られた各々の酵素の抽出液を、カルシウムを含む緩衝液Ａ［１０ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ  塩化カルシウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］、またはカルシウムを含まない緩衝液Ｂ［１０ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）］で一晩透析した。それぞれの酵素液  ２０μｌを５５℃、５０℃で１０分間保温後、１８０μｌの０．２％アガロース溶液（１０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２））と反応させ、残存するα−アガラーゼ活性を実施例１に記載の方法で測定した。結果を表５に示す。
なお、対照として、ＮＡＢ２−１−１より得られた天然型アガラーゼＩＩを用いた。
【００９０】
【表５】
2008220378.tif 000006
【実施例１６】
【００９１】
アガラーゼＩＩの欠失タンパク質の活性
遺伝子工学的手法により、以下に示す改変タンパク質を作製し、それぞれについてα−アガラーゼ活性を確認した。
プライマー２１（配列番号３４）は、アガラーゼＩＩのアミノ酸配列（配列番号２３）のアミノ酸番号２９０〜２９７に相当する塩基配列を塩基番号１９〜４０にもち、さらに制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を塩基番号１２〜１７にもつ。
このプライマー２１とプライマー１８（配列番号２９）を用いて、ＮＡＢ２−１−１の染色体ＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲを行い、実施例１２と同様にしてｐＵＣ１８へ連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。ＤＮＡシークエンシングにより連結部分の配列を確認して、得られたハイブリッドプラスミドをｐＮＡ４０１ｄとした。これから発現されるタンパク質は、アガラーゼＩＩのアミノ酸配列（配列番号２３）のアミノ酸番号２８９番目までが欠失したものである。即ち、ｐＮＡ４０１ｄはアガラーゼＩＩのアミノ酸配列（配列番号２３）のアミノ酸番号２９０〜１０８９のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。実施例１３で得られたｐＮＡ３０１ｄ、又は上記したｐＮＡ４０１ｄで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を２．５ｍｌのＬＢ液体培地（アンピシリン  ５０μｇ／ｍｌを含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。次に、この培養液の一部を１００ｍｌの同培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。ここでＩＰＴＧを終濃度  １．０ｍＭとなるように添加し、培養温度を２０℃にして更に２時間培養し、目的のタンパク質の発現を誘導した。その後、菌体を遠心分離により回収し、５ｍｌの細胞破砕溶液［１０ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ  塩化カルシウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］に懸濁した。超音波により菌体を破砕し、遠心分離により上澄みを回収し、該上澄みのα−アガラーゼ活性を測定後、両サンプルの容積あたりの酵素活性が同じになるよう細胞破砕溶液で希釈した。それぞれの酵素液  ２０μｌを５５℃、６０℃で１０分間保温後、１８０μｌの０．２％アガロース溶液（１０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２））と反応させ、残存するα−アガラーゼ活性を実施例１に記載の方法で測定した。結果を表６に示す。この結果より、ｐＮＡ４０１ｄはｐＮＡ３０１ｄと同等もしくはそれ以上の耐熱性を有することが明らかとなった。
なお、対照として、ＮＡＢ２−１−１より得られた天然型アガラーゼＩＩを用いた。
【００９２】
【表６】
2008220378.tif 000007
【００９３】
また、ＩＰＴＧによる誘導条件を３７℃で一晩行い、同様にして超音波により菌体を破砕し、遠心分離により上澄みを回収した。該上澄みのタンパク質量を定量し、同じタンパク質量となるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。また上澄み回収時の沈殿を細胞破砕溶液に懸濁し、同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、ｐＮＡ４０１ｄにおいては該誘導条件で上澄みに回収される目的タンパク質が天然型、ｐＮＡ３０１ｄに比べて多いことが明らかとなった。即ち、ｐＮＡ４０１ｄで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９で発現誘導されるα−アガラーゼ変異体は可溶化しやすいことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明により、新規なアガラーゼが提供される。本発明のアガラーゼを用いることにより、重合度が低く、還元末端に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを有するアガロオリゴ糖、たとえばアガロビオース、アガロテトラオース、または、非還元末端に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを有するネオアガロオリゴ糖、たとえばネオアガロビオース、ネオアガロテトラオースをアガロースから直接、かつ効率よく生産することが可能となる。
また、本発明のアガラーゼを用いることにより、アガロースゲルからの核酸等の抽出を効率よく行なうことが出来る。
本発明のアガラーゼを使用して製造されたアガロオリゴ糖は、アポトーシス誘発作用、制ガン作用、各種の抗酸化作用、免疫調節作用、抗アレルギー作用等の生理活性を有しており、医薬品、飲食品の分野で有用である。
また、本発明によりアガラーゼのアミノ酸および塩基配列が初めて明らかとなり、アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を提供することが可能となった。また該遺伝子を用いるアガラーゼ活性を有するポリペプチドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方法が提供される。
さらに、該遺伝子を用いる遺伝子工学的製造方法においてはアガラーゼの誘導生産のために培地にアガロースを添加する必要がないため培養時の手間を省くことが出来、また酵素精製も容易であると考えられる。
さらにまた、本発明により、初めてアガラーゼ遺伝子が提供されたことにより、該遺伝子の情報をもとにして、そこにコードされる組換えポリペプチドおよび該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片、アガラーゼに特異的にハイブリダイズするプローブやプライマーが提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００９５】
SEQ ID No:1: N-terminal amino acid sequence of agarase I
SEQ ID No:2: N-terminal amino acid sequence of agarase II
SEQ ID No:3: Partial amino acid sequence of agarase I
SEQ ID No:4: Partial amino acid sequence of agarase I
SEQ ID No:5: Partial amino acid sequence of agarase II
SEQ ID No:6: Partial amino acid sequence of agarase II
SEQ ID No:7: Partial amino acid sequence of agarase II
SEQ ID No:8: PCR primer 1
SEQ ID No:9: PCR primer 2
SEQ ID No:10: PCR primer 3
SEQ ID No:11: PCR primer 4
SEQ ID No:12: PCR primer 5
SEQ ID No:13: PCR primer 6
SEQ ID No:14: PCR primer 7
SEQ ID No:15: PCR primer 8
SEQ ID No:16: PCR primer 9
SEQ ID No:17: PCR primer 10
SEQ ID No:18: PCR primer 11
SEQ ID No:19: PCR primer 12
SEQ ID No:20: Nucleotide sequence of ORF in agarase I
SEQ ID No:21: Nucleotide sequence of ORF in agarase II
SEQ ID No:22: Amino acid sequence of agarase I
SEQ ID No:23: Amino acid sequence of agarase II
SEQ ID No:24: PCR primer 13
SEQ ID No:25: PCR primer 14
SEQ ID No:26: PCR primer 15
SEQ ID No:27: PCR primer 16
SEQ ID No:28: PCR primer 17
SEQ ID No:29: PCR primer 18
SEQ ID No:30: PCR primer 19
SEQ ID No:31: PCR primer 20
SEQ ID No:32: Designed oligoucleotide primer for amplifying DNA fragment from 16S ribosomal 
SEQ ID No:33: Designed oligoucleotide primer for amplifying DNA fragment from 16S ribosomal 
SEQ ID No.34: PCR primer 21
【配列表】
2008220378000001.app