(57)【要約】【課題】本発明は、ＰＣＶ２の遺伝子型を正確、迅速、簡便に分類するための方法の提供を目的とする。【解決手段】ブタサーコウイルス２型遺伝子中のＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＡｃｃＩ，ＮｄｅＩ，およびＭｂｏＩＩからなる制限酵素群から選ばれる１または２以上の制限酵素の切断部位の有無を検出することを特徴とする、ブタサーコウイルス２型の遺伝子型分類法；前記ブタサーコウイルス２型遺伝子のＯＲＦ２中の前記切断部位の有無を検出する前記遺伝子型分類法；前記切断部位の有無の検出を、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により行う前記遺伝子型分類法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタサーコウイルス２型遺伝子中のＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＡｃｃＩ，ＮｄｅＩ，およびＭｂｏＩＩからなる制限酵素群から選ばれる１または２以上の制限酵素の切断部位の有無を検出することを特徴とする、ブタサーコウイルス２型の遺伝子型分類法。
【請求項２】
前記ブタサーコウイルス２型遺伝子のＯＲＦ２中の前記切断部位の有無を検出する請求項１に記載の遺伝子型分類法。
【請求項３】
前記切断部位の有無の検出を、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により行う請求項１または２に記載の遺伝子型分類法。
【請求項４】
ブタサーコウイルス２型遺伝子中のＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＡｃｃＩ，ＮｄｅＩ，およびＭｂｏＩＩからなる制限酵素群から選ばれる１または２以上の制限酵素を含む、ブタサーコウイルス２型の遺伝子型分類用キット。
【請求項５】
ブタから採取される試料中のブタサーコウイルス２型遺伝子を、請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子型分類法により分類し、前記ブタが感染しているブタサーコウイルス２型ウイルスを特定することを特徴とする、ブタのブタサーコウイルス２型感染検査法。
【請求項６】
保菌するブタサーコウイルス２型の遺伝子型が請求項１〜３のいずれか一項に記載の分類法により分類され、前記分類法において使用される制限酵素の切断部位の有無により示されてなるブタ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタサーコウイルス２型の遺伝子型分類法に関し、より詳細には、ブタの離乳後多臓器性発育不良症候群発症に関与するウイルスであるブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の遺伝子型をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などで正確かつ簡便に分類するための分類法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）は離乳後多臓器性発育不良症候群（ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＰＭＷＳ）の発生に関与していることが明らかとなっている。ＰＭＷＳ発症豚は末梢血におけるリンパ球の減少や全身リンパ節の腫大を起こし、全身レベルで免疫機能の低下が起きている可能性が示されている。このため、ＰＭＷＳの発生で離乳後の死亡率が上昇し、ブタの生産性が低下する。国内においても離乳後の死廃率がＰＲＲＳと相まって３％から最大２７％に上昇した農場が存在すると動物衛生研究所が調査報告している（非特許文献１：川嶌健司  記、ｈｔｔｐ：／／ｎｉａｈ．ｎａｒｏ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｓｈｉｃｈｉｎｏｈｅ／ＰＭＷＳａｂｓ．ｈｔｍ）。
【０００３】
ＰＣＶ２は直径約２０ｎｍと非常に小型なウイルスで、エンベロープを持たず、約１７００個の塩基で構成された一本鎖状の環状ＤＮＡをもつウイルスである。環状ＤＮＡ上には複数の蛋白質がコードされており、ＯＲＦ１はポリメラーゼ等の非構造蛋白質、ＯＲＦ２は外殻（カプシド）を形成する構造蛋白質をコードすることがわかっている。尚、この構造蛋白質の翻訳には、ＯＲＦ２の遺伝子配列の相補配列が使用される。ＤＮＡウイルスのため、ＰＣＶ２株間の相同性は９６％と非常に高く、遺伝子変異は比較的少ないといえる。このため、遺伝子型はあまり重要視されていなかった。
【０００４】
しかし、近年、海外ではＰＭＷＳによる被害が急激に上昇しており、特に複数の農場で特定の遺伝子型のＰＣＶ２が検出されたという報告がなされている。このことから、他のウイルス同様ＰＣＶ２もその遺伝子型によって豚に対する病原性が異なる可能性が考えられ、遺伝子型を分類する必要性が高まりつつある。
【０００５】
一方の日本においても、ＰＣＶ２はほぼ１００％の豚生産農場で陽性であるといわれているが、遺伝子型までは把握されていない。そこで、各農場のＰＣＶ２遺伝子型が把握できれば、ＰＭＷＳ発生の予測やＰＣＶ２に対する早期対策が可能になり、豚の生産性低下を軽減できる可能性がある。
【０００６】
ＰＣＶ２の遺伝子型分類は２００６年にＯｌｖｅｒａらが報告している（非特許文献２：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００６:ｄｏｉ:１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２００６.０７．０４７）。Ｏｌｖｅｒａらは、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されているＰＣＶ２塩基配列データを用いて分子系統樹を作成した。その結果、ＰＣＶ２の遺伝子型を１型、２型の２クラスターに分類した。分子系統樹は各々２本ずつ分岐し、４グループ（１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ型とする）に分かれたが、更に、彼らは１Ａ型を２つのサブグループ（１Ａａ、１Ａｂとする）および２Ｂ型を４つのサブグループ（２Ｂａ、２Ｂｂ、２Ｂｃ、２Ｂｄ型とする）に分類し、１Ａａ、１Ａｂ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂａ〜２Ｂｄの計８種類のサブグループが存在するとした（Ｏｌｖｅｒａ分類）(図１)。サブグループの中では１Ａに属する１Ａａと１Ａｂ、２Ｂに属する２Ｂａ〜２Ｂｄが比較的近い関係であった。また、ＯｌｖｅｒａらはＯＲＦ２塩基配列を比較することがＰＣＶ２の遺伝子型分類に適していると述べている。
【０００７】
遺伝子型の分類には、上述のＯｌｖｅｒａらの分類のように、遺伝子型の判断対象となる遺伝子部位をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、増幅産物の塩基配列を決定し分子系統樹を描いてグループ化し、遺伝子型とする手法（シーケンス法）が取られていた。この方法によれば最も精度の高い遺伝子型分類が可能であるものの、分類が完了するまでに数日を要するという問題があった。また、実施にあたってはシーケンサーが必要であるが、この装置は高額で、使用に熟練を有し、かつランニングコストが高いという問題もあった。
【０００８】
そこで、近年ではＰＣＲと制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を組み合わせた方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）が遺伝子型分類に用いられる。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法ではまず、遺伝子型の判断対象となる遺伝子部位をＰＣＲにより増幅する。その増幅産物を遺伝子型特異的に切断する制限酵素にて切断し、電気泳動してその切断長を比較し、遺伝子型分類を行う。この方法を用いると操作も簡単で費用も安く、解析当日に判別が可能となる。遺伝子型分類を正確に行うためには遺伝子型特異的に切断することが予めわかっている複数の制限酵素を組み合わせることが必須である。また、電気泳動での判別が容易にできるよう切断断片長は５０ｂｐ以上、複数の断片長の差は１０ｂｐ以上あることが望ましい。
【０００９】
ＰＣＶ２におけるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いた遺伝子型分類は、現在までに、Ｃａｒｍａｎら、ＨａｍｅｌらやＷｅｎらの海外グループがＰＣＶ２のＯＲＦ２塩基配列を用いた方法で報告している。ＣａｒｍａｎらはＸｂａ，Ｅｃｏ，Ｓｍａの３種類の制限酵素を用いて分類を行っているが、この制限酵素の組合せでは、Ｏｌｖｅｒａ分類による１型、２Ａ型および２Ｂｃ型が同じ遺伝子型に分類され、区別がつかない（非特許文献３：Ｃａｎ  Ｖｅｔ  Ｊ．２００６：４７；７６１−７６２）。一方、ＨａｍｅｌらはＡｌｕＩ，ＤｄｅＩ，ＨｉｎｆＩ，ＨｉｎＰ１，ＫｐｎＩ，ＭｓｅＩ，ＲｓａＩ，ＸｂａＩの８種類の制限酵素を用いているが、２型のＲＦＬＰに終始し、１型の分類には言及していない（非特許文献４：Ｃａｎ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ．２０００：６４；４４−５２）。ＷｅｎらはＳａｕ３ＡＩ，ＢａｎＩＩ，ＮｓｐＩ，ＸｂａＩ，ＣｆｒＩの５種類を用いているが２Ａと２Ｂ型の分類に言及していない（非特許文献５：Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５：１１０；１４１−１４６)。
【００１０】
このように、ＰＣＶ２の遺伝子型を、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法など制限酵素切断部位の差を利用して精確に分類する技術は未だ報告されていないのが現状である。
具体的には、Ｏｌｖｅｒａ分類での大きな分類である１型、２型クラスターの区別すらできておらず、当然、グループ分類や、サブグループ分類にも対応できていなかった。
【００１１】
【非特許文献１】川嶌健司、離乳後多臓器性発育不良症候群（Ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｗａｓｔｉｎｇ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＰＭＷＳ）の現状、動物衛生研究所・疫学研究部・七戸研究施設・環境衛生研究室、〔２００７年３月７日検索〕、インターネット（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｎｉａｈ．ｎａｒｏ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｓｈｉｃｈｉｎｏｈｅ／ＰＭＷＳａｂｓ．ｈｔｍ）
【非特許文献２】Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００６:ｄｏｉ:１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２００６.０７．０４７
【非特許文献３】Ｃａｎ  Ｖｅｔ  Ｊ．２００６：４７；７６１−７６２
【非特許文献４】Ｃａｎ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ．２０００：６４；４４−５２
【非特許文献５】Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５：１１０；１４１−１４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ＰＣＶ２の遺伝子型を正確、迅速、簡便に分類するための方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は以下の〔１〕〜〔３〕の発明を提供するものである。
〔１〕  ブタサーコウイルス２型遺伝子中のＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＡｃｃＩ，ＮｄｅＩ，およびＭｂｏＩＩからなる制限酵素群から選ばれる１または２以上の制限酵素の切断部位の有無を検出することを特徴とする、ブタサーコウイルス２型の遺伝子型分類法。
〔２〕  前記ブタサーコウイルス２型遺伝子のＯＲＦ２中の前記切断部位の有無を検出する〔１〕に記載の遺伝子型分類法。
〔３〕  前記切断部位の有無の検出を、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により行う〔１〕または〔２〕に記載の遺伝子型分類法。
〔４〕  ブタサーコウイルス２型遺伝子中のＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＡｃｃＩ，ＮｄｅＩ，およびＭｂｏＩＩからなる制限酵素群から選ばれる１または２以上の制限酵素を含む、ブタサーコウイルス２型の遺伝子型分類用キット。
〔５〕  ブタから採取される試料中のブタサーコウイルス２型遺伝子を、請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子型分類法により分類し、前記ブタが感染しているブタサーコウイルス２型ウイルスを特定することを特徴とする、ブタのブタサーコウイルス２型感染検査法。
〔６〕  保菌するブタサーコウイルス２型の遺伝子型が〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の分類法により分類され、前記分類法において使用される制限酵素の切断部位の有無により示されてなるブタ。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ＰＣＶ２の遺伝子型を正確、迅速、かつ簡便に分類することができるので、この結果、豚生産農場におけるＰＣＶ２が関与しているＰＭＷＳ発生の予測やＰＣＶ２に対する早期対策が可能になり、豚の生産性低下の軽減に繋げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明はブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の遺伝子型分類法に関するものである。ここでＰＣＶ２については、背景技術の項で既に述べたとおりである。
【００１６】
本発明の遺伝子型分類法は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）遺伝子中のＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＡｃｃＩ，ＮｄｅＩ，およびＭｂｏＩＩからなる制限酵素群から選ばれる１または２以上の制限酵素の切断部位の有無を検出することを特徴とする。
【００１７】
ＰＣＶ２の遺伝子には、各遺伝子型に特有の塩基配列部分（配列領域）が存在し、
背景技術の項で述べたようにＯＲＦ１およびＯＲＦ２が存在するが、本発明の検出法においては検出の対象をＯＲＦ２（ＰＣＶ２−ＯＲＦ２）とすることが好ましい。
【００１８】
切断部位の有無の検出は、サンプルの遺伝子を構成する塩基配列を解析し、該配列中の制限酵素の切断部位の有無を配列上で確認して、予めＤＤＢＪ等のデータベースで用意しておいたＰＣＶ２の各遺伝子型に対応する切断部位のパターンと比較して検出することができる。
【００１９】
また、切断部位の有無の検出は、例えば、ＰＣＶ２のサンプルを上記制限酵素群から選ばれる１または２以上の制限酵素で処理し、得られる切断断片の長さ（断片長）を確認して行う。２以上の制限酵素を用いる場合には、制限酵素ごとにサンプルを用意し、それぞれについて各制限酵素による処理を行うことが好ましい。切断断片の長さの確認は、通常、電気泳動によることができる。電気泳動の場合、予め染色後電気泳動を行い、得られる断片長のパターンを、予め用意しておいた各遺伝子型に対応する断片長のパターンと比較して、サンプルの遺伝子型を分類する。或いは、予め遺伝子型が解明されている個体のサンプルの断片長のパターンとの間で照合を行い、サンプルの遺伝子型を分類することもできる。
【００２０】
本発明においては、制限酵素処理前にＰＣＶ２を構成するポリヌクレオチドを増幅しておくと、検出の感度を高めることができるので好ましい。このような方法の代表例としてＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を挙げることができる。ＰＣＲは、ＰＣＶ２の遺伝子、特にＯＲＦ２の全長が増幅可能となるようプライマーペア（例えば、配列番号１３および１４記載の塩基配列からなるもの）を設計し、これを用いて行うことができる。
【００２１】
本発明において遺伝子型とは、生物個体が持つ遺伝子の構成であり、遺伝子中の変異の有無によるタイプを意味する。Ｏｌｖｅｒａ分類によれば、ＰＣＶ２の遺伝子型は、１型、２型の２グループに大きく分けられ、更に４グループ（１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ型とする）に分けられ、さらに１Ａａ、１Ａｂ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂａ〜２Ｂｄの計８種類のサブグループに分けられる。
【００２２】
本発明の分類法においては、ＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＡｃｃＩ，ＮｄｅＩ，およびＭｂｏＩＩからなる制限酵素群から選ばれる１または２以上の制限酵素を用いる。これらの酵素の切断部位は、Ｏｌｖｅｒａ分類による１型、２型のグループあるいはそれらのサブグループに存在する特異的な配列部分に位置する。しかも、制限酵素切断後の断片長が５０ｂｐ以上あり、且つ近接する切断断片長の差がほとんどは８から４００ｂｐであり、特に２０から３００ｂｐのものが多いことから、電気泳動において肉眼的に識別可能なバンドを形成させることができる。
【００２３】
本発明において、各制限酵素により分類される遺伝子型とＯｌｖｅｒａ分類との対応については、以下の通りである。
【００２４】
〔ＡｖａＩＩ〕
ＰＣＶ２の遺伝子型は、ＰＣＶ２のＯＲＦ２中のＡｖａＩＩの切断部位の存在の有無により分類することができる。
すなわち、ＰＣＶ２の遺伝子型は、遺伝子データベースＤＤＢＪに登録されているＰＣＶ２の塩基配列中（アクセッションナンバーＡＦ５３８３２５（配列番号１）、ＡＹ６７８５３２（配列番号２）、ＡＹ１８１９４６（配列番号３）、ＡＦ１０９３９８（配列番号４）、ＡＦ１１７７５３（配列番号５）、ＡＹ１４６９９３（配列番号６）、ＡＹ１８０３９７（配列番号７）、ＡＦ２０１３０８（配列番号８）、ＡＦ２６４０４３（配列番号９）、ＡＦ３８１１７６（配列番号１０）、ＡＹ２５６４５６（配列番号１１）、ＡＦ１１８０９７（配列番号１２））の相補鎖におけるＯＲＦ２翻訳開始部位コドンＡＴＧ〔図４−１〜図４−１２の囲み領域内の下線部分の相補鎖。以下同じ。〕のＡを１とすると、ＡｖａＩＩの切断部位がないもの（パターン１）、切断部位が２５４番目に１箇所のもの（パターン２）、および切断部位が２５４番目と５７９番目の２箇所のもの（パターン３）に分類することができる。尚、翻訳開始部位コドンＡＴＧのＡを１として計数した切断部位の配列上の位置については、個体差などを考慮して１０塩基前後（±１０ｂｐ）の範囲も含むものとし、以下の制限酵素についても同様である。
【００２５】
また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に基づき、ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の全長が増幅可能となるよう設計したプライマーペアを用いたＰＣＲの後の、増幅産物のＡｖａＩＩによる切断断片長は、８０２ｂｐ（切断されないもの）；２８０ｂｐおよび５２２ｂｐ（切断部位が１箇所のもの）；１９７ｂｐ、２８０ｂｐ、および３２５ｂｐ（切断部位が２箇所のもの）の３つに分類され、これらはそれぞれ、上記データベースに基づき分類されるパターン１、パターン２、パターン３に相当する。尚、増幅産物のサイズ（ｂｐ）については、個体差などを考慮して１０塩基前後（±１０ｂｐ）の範囲も含むものとし、以下の制限酵素についても同様である。
【００２６】
ＡｖａＩＩの切断部位により、Ｏｌｖｅｒａ分類のクラスター１はパターン１を、クラスター２はパターン２又は３を示すので、これらの分類が可能である。さらに、１Ａ（１Ａａ、１Ａｂ）型および１Ｂ型はパターン１を、２Ａ型はパターン２を、２Ｂ型（２Ｂａ，２Ｂｂ，２Ｂｃ，２Ｂｄ型）はパターン３を示すので、これらの分類が可能である。
【００２７】
〔ＢａｍＨＩ〕
ＰＣＶ２の遺伝子型は、ＰＣＶ２のＯＲＦ２中のＢａｍＨＩの切断部位の有無により、切断部位が１箇所のもの、および切断部位がないもの、の２通りに分類することができる。すなわち、ＰＣＶ２の遺伝子型は、上記遺伝子データベースＤＤＢＪに登録されているＰＣＶ２の塩基配列中、ＢａｍＨＩの切断部位がないもの（パターン１）、および切断部位が３５５番目に１箇所のもの（パターン２）、に分類することができる。
【００２８】
また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に基づき、ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の全長が増幅可能となるよう設計したプライマーペアを用いたＰＣＲの後の、増幅産物のＢａｍＨＩによる切断断片長は、８０２ｂｐ（切断されないもの）；３８１ｂｐおよび４２１ｂｐ（切断部位が１箇所のもの）の２つに分類される。これらはそれぞれ、上記データベースに基づき分類されるパターン１、パターン２に相当する。
【００２９】
ＢａｍＨＩの切断部位により、Ｏｌｖｅｒａ分類の１Ａ（１Ａａ、１Ａｂ）型、２Ｂａ型、および２Ｂｄ型はパターン１を、２Ａ型および２Ｂｃ型はパターン２を示すので、これらの分類が可能である。尚、２Ｂｂ型はパターン１及びパターン２のどちらをも示すことがあるので、ＢａｍＨＩのみの切断部位検出では遺伝子型の特定が困難である。
【００３０】
〔ＣｌａＩ〕
また、ＰＣＶ２の遺伝子型は、ＰＣＶ２のＯＲＦ２中のＣｌａＩの切断部位の有無により、切断部位が１箇所のもの、および切断部位がないもの、の２通りに分類することができる。すなわち、ＰＣＶ２の遺伝子型は、上記遺伝子データベースＤＤＢＪに登録されているＰＣＶ２の塩基配列中、ＣｌａＩの切断部位がないもの（パターン１）、および切断部位が５１２番目に１箇所のもの（パターン２）に分類することができる。
【００３１】
また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に基づき、ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の全長が増幅可能となるよう設計したプライマーペアを用いたＰＣＲの後の、増幅産物のＣｌａＩによる切断断片長は、８０２ｂｐ（切断されないもの）；２６４ｂｐおよび５３８ｂｐ（切断部位が１箇所のもの）の２つに分類され、これらはそれぞれ、上記データベースに基づき分類されるパターン１、パターン２に相当する。
【００３２】
ＣｌａＩの切断部位により、Ｏｌｖｅｒａ分類の１Ａ（１Ａａ、１Ａｂ）型および２Ｂ型（２Ｂａ，２Ｂｂ，２Ｂｃ，２Ｂｄ型）はパターン１を、２Ａ型はパターン２を示すので、これらの分類が可能である。
【００３３】
〔ＡｃｃＩ〕
そして、ＰＣＶ２の遺伝子型は、ＰＣＶ２のＯＲＦ２中のＡｃｃＩの切断部位の有無により、切断部位が第１の箇所１箇所のもの、切断部位が第１の箇所とは異なる第２の箇所１箇所のもの、切断部位が第１の箇所および第２の箇所の２箇所のもの、および切断部位がないもの、の４通りに分類することができる。すなわち、ＰＣＶ２の遺伝子型は、上記遺伝子データベースＤＤＢＪに登録されているＰＣＶ２の塩基配列中、切断部位がないもの（パターン１）、ＡｃｃＩの切断部位が２０６番目に１箇所のもの（パターン２）、５７８番目に１箇所のもの（パターン３）、および２０６番目及び５７８番目に２箇所のもの（パターン４）に分類することができる。
【００３４】
また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に基づき、ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の全長が増幅可能となるよう設計したプライマーペアを用いたＰＣＲの後の、増幅産物のＡｃｃＩによる切断断片長は、８０２ｂｐ（切断されないもの）；２３２ｂｐおよび５７０ｂｐ（切断部位が１箇所のもの）；１９８ｂｐおよび６０４ｂｐ（切断部位が１箇所のもの）；１９８ｂｐ、２３２ｂｐおよび３７２ｂｐ（切断部位が２箇所のもの）の４つに分類される。これらはそれぞれ、上記データベースに基づき分類されるパターン１、パターン２、パターン３、パターン４に相当する。
【００３５】
ＡｃｃＩの切断部位により、Ｏｌｖｅｒａ分類の２Ｂａ型、２Ｂｃ型および２Ｂｄ型はパターン１を、１Ａ（１Ａａ、１Ａｂ）型および１Ｂ型はパターン３を示すので、これらの分類が可能である。尚、２Ａ型はパターン３及びパターン４のどちらをも示すことがあり、また、２Ｂｂ型はパターン１及びパターン２のどちらをも示すことがあるので、ＡｃｃＩのみの切断部位検出では遺伝子型の特定が困難である。
【００３６】
〔ＮｄｅＩ〕
また、ＰＣＶ２の遺伝子型は、ＰＣＶ２のＯＲＦ２中のＮｄｅＩの切断部位の有無により、切断部位が１箇所のもの、および切断部位がないもの、の２通りに分類することができる。すなわち、ＰＣＶ２の遺伝子型は、上記遺伝子データベースＤＤＢＪに登録されているＰＣＶ２の塩基配列中、ＮｄｅＩの切断部位がないもの（パターン１）、および切断部位が４２０番目に１箇所のもの（パターン２）に分類することができる。
【００３７】
また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に基づき、ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の全長が増幅可能となるよう設計したプライマーペアを用いたＰＣＲの後の、増幅産物のＮｄｅＩによる切断断片長は、２０ｂｐおよび７８２ｂｐ（切断部位が１箇所のもの）；２０ｂｐ、３３６ｂｐおよび４４６ｂｐ（切断部位が２箇所のもの）の２つに分類される。これらはそれぞれ、上記データベースに基づき分類されるパターン１、パターン２に相当する。
【００３８】
ＮｄｅＩの切断部位により、Ｏｌｖｅｒａ分類の１Ａ（１Ａａ、１Ａｂ）型、１Ｂ型、２Ａ型、および２Ｂａ型はパターン１を、２Ｂｄ型はパターン２を示すので、これらの分類が可能である。尚、２Ｂｂ型および２Ｂｃ型はパターン１及びパターン２のどちらをも示すことあるので、ＮｄｅＩのみの切断部位検出では遺伝子型の特定が困難である。
【００３９】
〔ＭｂｏＩＩ〕
ＰＣＶ２の遺伝子型は、ＰＣＶ２のＯＲＦ２中のＭｂｏＩＩの切断部位の有無により、切断部位が１箇所のもの、切断部位が２箇所のもの、および切断部位が３箇所のもの、の３通りに分類することができる。すなわち、ＰＣＶ２の遺伝子型は、上記遺伝子データベースＤＤＢＪに登録されているＰＣＶ２の塩基配列中、ＭｂｏＩＩの切断部位が１２３番目に１箇所のもの（パターン１）、３８〜４７番目（４４番目付近）及び１２３番目の２箇所のもの（パターン２）、および、３８〜４７番目（４４番目付近）１２３番目、２２９番目に３箇所のもの（パターン３）に分類することができる。
【００４０】
また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に基づき、ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の全長が増幅可能となるよう設計したプライマーペアを用いたＰＣＲの後の、増幅産物のＭｂｏＩＩによる切断断片長は、１４９ｂｐおよび６５３ｂｐ（切断部位が１箇所のもの）；６７−７０ｂｐ、７９ｂｐおよび６５３ｂｐ（切断部位が２箇所のもの）；６７−７０ｂｐ、７９ｂｐ、１０６ｂｐおよび５４７ｂｐ（切断部位が３箇所のもの）；の３つに分類される。これらはそれぞれ、上記データベースに基づき分類されるパターン１、パターン２、パターン３に相当する。
【００４１】
ＭｂｏＩＩの切断部位により、Ｏｌｖｅｒａ分類のクラスター１はパターン１を、クラスター２はパターン２又は３を示すので、これらの分類が可能である。さらに、２Ａ型、２Ｂｂ型、２Ｂｃ型および２Ｂｄ型はパターン２を、１Ａ（１Ａａ、１Ａｂ）型および１Ｂ型はパターン３を示すので、これらの分類が可能である。尚、２Ｂａ型はパターン１及びパターン２のどちらをも示すことがあるので、ＭｂｏＩＩのみの切断部位検出では遺伝子型の特定が困難である。
尚、各制限酵素の説明において示したＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に基づく増幅産物のサイズおよび断片のサイズは、あくまでも一例であり本発明を限定するものではない。プライマーがＰＣＶ２−ＯＲＦ２の周囲のどの部分をもとに設計されたかにより左右されるからである。
【００４２】
また、各制限酵素の説明において示すデータベースに基づく切断部位と増幅産物および断片のサイズが合致しないが、これも同じ理由に基づくものである。すなわち、増幅産物にはＰＣＶ２−ＯＲＦ２だけでなく周囲の配列が含まれているからである。
【００４３】
本発明においては検出の際に、上述の制限酵素のうちの１種または２種以上を選抜し、その切断部位の有無を検出するものである。制限酵素は、分類対象となるクラスターやグループの種類により適宜選択することができるが、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上の酵素を組み合わせることができる。２種以上の制限酵素を用いることにより、ＰＣＶ２ウイルスに１〜１０残基程度の置換等の変異が存在した場合にも正確な分類が可能であり、Ｏｌｖｅｒａの分類も可能である。例えば、ＡｖａＩＩおよびＭｂｏＩＩの何れかまたは両方、もしくは、ＢａｍＨＩとＡｃｃＩを組み合わせることにより、Ｏｌｖｅｒａの分類のうち１型と２型のクラスターの区別が可能であるので好ましい。また、ＡｖａＩＩとＣｌａＩの組み合わせや、更に、確実性を上げるために、ＡｖａＩＩとＣｌａＩとＢａｍＨＩを組み合わせた形で使用することにより、Ｏｌｖｅｒａの分類のうちより詳細な４グループ、すなわち、１Ａ型、１Ｂ型、２Ａ型と２Ｂ型の分類が可能となるので好ましい。更に、すべての制限酵素を利用することにより、Ｏｌｖｅｒａの分類のうち、さらにサブグループ、すなわち、１Ａ型（１Ａａ型、１Ａｂ型）、１Ｂ型、２Ａ型、２Ｂａ型＋２Ｂｂ型、２Ｂｃ型、および２Ｂｄ型の分類が可能である。
本発明において各制限酵素およびそれらの好ましい組み合わせと、判定可能なＯｌｖｅｒａの分類の対応を、以下の表１に示す。
【００４４】
【表１】
2008220297.tif 000002
【００４５】
本発明によれば、ブタサーコウイルス２型遺伝子中のＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＡｃｃＩ，ＮｄｅＩ，およびＭｂｏＩＩからなる制限酵素群から選ばれる１または２以上の制限酵素を含む、ブタサーコウイルス２型の遺伝子型分類用キットも提供される。本発明のキットによれば、上記本発明の遺伝子型分類法を簡便かつ迅速に実施することができる。
【００４６】
本発明のキットはＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＡｃｃＩ，ＮｄｅＩ，およびＭｂｏＩＩからなる制限酵素群から選ばれる１または２以上の制限酵素を含んでいればよい。各制限酵素については上記本発明の遺伝子型分類法の説明において述べたとおりである。
【００４７】
本発明のキットは、制限酵素に加えて、ＰＣＶ２の遺伝子、特にＯＲＦ２の全長が増幅可能となるよう設計されたプライマーペアを含めることができる。このようなプライマーを含めることにより、ＰＣＲ−ＲＦＬＰによる遺伝子型分類が可能となるので、より高感度な検出が可能となる。このようなプライマーとしては、例えば配列番号１３および１４に記載の塩基配列を含むものを挙げることができる。
【００４８】
本発明のキットは、上記制限酵素および必要に応じて含めることのできるプライマーのほかに、必要に応じて検出用試薬、説明書や容器などを含めることができる。
【００４９】
また、本発明の前記遺伝子型分類法は、ブタのブタサーコウイルス２型に対する感染の検査にも応用することができる。すなわち、本発明によれば、ブタから採取される試料中のブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）遺伝子を、前記遺伝子型分類法により分類し、前記ブタが感染しているブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ウイルスを特定することを特徴とする、ブタのブタサーコウイルス２型感染検査法が提供される。
【００５０】
本発明の感染検査法において、ブタの品種、年齢、性別などは特に限定されない。ブタから採取される試料としては、血液、血清、尿等の体液、又は、各種臓器組織片、肉片、骨片等が挙げられ、中でも血液が好ましい。試料からのＰＣＶ２遺伝子の抽出は常法に従ってキットなどを利用して行うことができる。前記遺伝子型分類法による遺伝子の分類については、既に述べたとおりである。
【００５１】
家畜としてのブタは、ＰＣＶ２ウイルスのいずれかのタイプに感染しているものが多い。従って、ブタが保菌するＰＣＶ２ウイルスの遺伝子型を、例えば前記分類法により制限酵素の切断部位の有無（ＲＦＬＰパターン）を、予め検出し、ブタの個体ごとに提示しておくことにより、家畜間の伝染防止、養豚業を営む上での衛生管理等のための、等級として応用できるものと期待される。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこの実施例で示す方法に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１  ＧｅｎｂａｎｋデータにおけるＲＦＬＰを用いたＰＣＶ２のサブグループ遺伝子型分類
〔切断部位パターンの作成〕
ＧｅｎｂａｎｋよりＰＣＶ２−ＯＲＦ２を構成する７０２塩基の配列データを複数得た。すなわち、ＤＤＢＪのアクセッションナンバーＡＦ５３８３２５（配列番号１）、ＡＹ６７８５３２（配列番号２）、ＡＹ１８１９４６（配列番号３）、ＡＦ１０９３９８（配列番号４）、ＡＦ１１７７５３（配列番号５）、ＡＹ１４６９９３（配列番号６）、ＡＹ１８０３９７（配列番号７）、ＡＦ２０１３０８（配列番号８）、ＡＦ２６４０４３（配列番号９）、ＡＦ３８１１７６（配列番号１０）、ＡＹ２５６４５６（配列番号１１）、ＡＦ１１８０９７（配列番号１２））として登録されるＰＣＶ２遺伝子の塩基配列データから、ＰＣＶ２−ＯＲＦ２を構成する７０２塩基（但し、変異が含まれる場合は多少前後することがある）を抽出した。尚、図３に示すように、ＰＣＶ２−ＯＲＦ２は上記データベースの塩基配列データに対する相補鎖として翻訳される遺伝子であるので、本実施例においても上記データベースの部分の相補鎖を用いた。具体的には次の通りである。
【００５４】
・ＡＦ５３８３２５（配列番号１）のＰＣＶ２−ＯＲＦ２：配列番号１中の塩基番号１−３１４および１３８０−１７６７の塩基部分（塩基番号３１２−３１４（囲み領域内の下線部分）が開始コドン）〔図４−１の囲み領域〕の相補鎖
・ＡＹ６７８５３２（配列番号２）：配列番号２中の塩基番号１０３３−１７３４（塩基番号１７３２−１７３４（囲み領域内の下線部分）が開始コドン）〔図４−２の囲み領域〕の相補鎖
・ＡＹ１８１９４６（配列番号３）：配列番号３中の塩基番号１０２９−１７３４（塩基番号１７３２−１７３４（囲み領域内の下線部分）が開始コドン）〔図４−３の囲み領域〕の相補鎖
・ＡＦ１０９３９８（配列番号４）：配列番号４中の塩基番号１０３４−１７３５（塩基番号１７３３−１７３５（囲み領域内の下線部分）が開始コドン）〔図４−４の囲み領域〕の相補鎖
・ＡＦ１１７７５３（配列番号５）：配列番号５中の塩基番号１０３４−１７３５（塩基番号１７４３−１７３５（囲み領域内の下線部分）が開始コドン）〔図４−５の囲み領域〕の相補鎖
・ＡＹ１４６９９３（配列番号６）：配列番号６中の塩基番号１０３４−１７３５（塩基番号１７４３−１７３５（囲み領域内の下線部分）が開始コドン）〔図４−６の囲み領域〕の相補鎖
・ＡＹ１８０３９７（配列番号７）：配列番号７中の塩基番号１０３４−１７３５（塩基番号１７４３−１７３５（囲み領域内の下線部分）が開始コドン）〔図４−７の囲み領域〕の相補鎖
・ＡＦ２０１３０８（配列番号８）：配列番号８中の塩基番号３７−７３８（塩基番号７３６−７３８（囲み領域内の下線部分）が開始コドン）〔図４−８の囲み領域〕の相補鎖
・ＡＦ２６４０４３（配列番号９）：配列番号９中の塩基番号３７−７３８（塩基番号７３６−７３８（囲み領域内の下線部分）が開始コドン）〔図４−９の囲み領域〕の相補鎖
・ＡＦ３８１１７６（配列番号１０）：配列番号１０中の塩基番号１０３４−１７３５（塩基番号１７３３−１７３５（囲み領域内の下線部分）が開始コドン）〔図４−１０の囲み領域〕の相補鎖
・ＡＹ２５６４５６（配列番号１１）：配列番号１１中の塩基番号１０３４−１７３５（塩基番号１７３３−１７３５（囲み領域内の下線部分）が開始コドン）〔図４−１１の囲み領域〕の相補鎖
・ＡＦ１１８０９７（配列番号１２）：配列番号１２中の塩基番号１０３４−１７３５（塩基番号１７３３−１７３５（囲み領域内の下線部分）が開始コドン）〔図４−１２の囲み領域〕の相補鎖
【００５５】
尚、ＰＣＶ２遺伝子は本来環状構造を取るのに対し上記のＤＤＢＪには直鎖状として表記しているため、配列番号１中のＰＣＶ２−ＯＲＦ２部分は、見かけ上両端に分断されて位置している。
【００５６】
これらの各塩基配列についてＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＡｃｃＩ，ＮｄｅＩ，およびＭｂｏＩＩによる切断部位を遺伝情報処理ソフトウエア（ＧＥＮＥＴＹＸ  ｖｅｒ．７；ゼネティックス社製）を用いて検索した。切断部位はＯＲＦ２翻訳開始部位コドンＡＴＧのＡを１とし、７０２までで示すこととした。複数の切断パターンが存在する制限酵素については切断部位を簡潔に標記するため、その切断パターンにパターン番号をつけた。
【００５７】
〔切断部位パターンによる遺伝子型分類〕
上述のＧｅｎｂａｎｋ塩基配列データについて、ＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＡｃｃＩ，ＮｄｅＩ，ＭｂｏＩＩによる切断パターン番号を順に並べてその番号の違いにより分類を行った。分類を行った塩基配列データについては分子系統樹作成ソフト（ＣＬＵＳＴＡＬＷ；ｈｔｔｐ：／／ａｌｉｇｎ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／）を用いて分子系統樹を作成し、Ｏｌｖｅｒａらの分類に当てはめた。
【００５８】
〔結果〕
各制限酵素の切断パターン番号を表２に示す。各制限酵素の下に並んでいる数値が切断部位であり、各々の切断パターンについて表中の切断パターン番号をつけた。今回解析を行った塩基配列データでは各制限酵素について２〜４種類の切断パターンが存在した。
【００５９】
表２に基づき、各塩基配列データについて切断パターン番号をＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＡｃｃＩ，ＮｄｅＩ，ＭｂｏＩＩの順に並べ、ＲＦＬＰパターンとした。その結果を表３に示す。ＲＦＬＰパターンによる分類により、各遺伝子配列データの１型、２型のクラスター分類をはじめ、サブグループについても分子系統樹の分類と一致し、ＲＦＬＰパターンによる遺伝子型の分類が可能ということがわかった。但し、遺伝子型的に近縁である１Ａ型のサブグループ１Ａａと１Ａｂ型および２Ｂ型のサブグループ２Ｂａと２Ｂｂ型についてはいずれかに属することまでは分類できたが、サブグループまでは分類できないものもあった。
【００６０】
【表２】
2008220297.tif 000003
【００６１】
【表３】
2008220297.tif 000004
【００６２】
実施例２  ＧｅｎｂａｎｋデータにおけるＲＦＬＰを用いたＰＣＶ２の遺伝子型グループ分類
〔切断部位パターンの作成〕
実施例１で用いたデータについてＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩによる切断部位を実施例１同様に検索し、その切断パターンにパターン番号をつけた。
【００６３】
〔切断部位パターンによる遺伝子型分類〕
実施例１と同様に行った。
【００６４】
〔結果〕
実施例１と同様に表２に基づき、各塩基配列データについて切断パターン番号をＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩの順に並べ、ＲＦＬＰパターンとした。その結果を表４に示す。ＲＦＬＰパターンによる分類により、これらの制限酵素の組合せによって、１Ａ型、１Ｂ型、２Ａ型および２Ｂ型のグループ分類が可能であることがわかった。
【００６５】
【表４】
2008220297.tif 000005
【００６６】
実施例３  ＧｅｎｂａｎｋデータにおけるＲＦＬＰを用いたＰＣＶ２の遺伝子型クラスター分類
〔切断部位パターンの作成〕
実施例１で用いたデータについてＡｖａＩＩ，ＭｂｏＩＩによる切断部位を実施例１同様に検索し、その切断パターンにパターン番号をつけた。
【００６７】
〔切断部位パターンによる遺伝子型分類〕
実施例１と同様に行った。
【００６８】
〔結果〕
実施例１と同様に表２に基づき、各塩基配列データについて切断パターン番号をＡｖａＩＩ，ＭｂｏＩＩの順に並べ、ＲＦＬＰパターンとした。その結果を表５に示す。表５から明らかな通り、ＲＦＬＰパターンによる分類により、これらの制限酵素の組合せによって、１型および２型のサブクラスター分類が可能であることがわかった。
【００６９】
【表５】
2008220297.tif 000006
【００７０】
実施例４  国内豚生産農場におけるＰＣＲ−ＲＦＬＰを用いたＰＣＶ２遺伝子型の分類
〔検体の調製〕
国内の豚生産農場１５農場（イ農場〜ヨ農場）において、各農場それぞれ２〜４ヶ月齢の１０頭の子豚（雄５頭、雌５頭  計１０頭、品種：大ヨークシャあるいはランドレースあるいはデュロックあるいはそれらの交雑種）から血液を採材した。血液を３，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上清より血清を分離した。分離血清２００μｌからＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて製品に記載されているプロトコールに従ってＤＮＡを抽出し検体液とした。
【００７１】
〔ＰＣＶ２−ＯＲＦ２のＰＣＲ〕
検体液２μｌ、５×反応緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ  ＧｏＴａｑ  Ｆｌｅｘｉ  Ｂｕｆｆｅｒ）１０μｌ、ｄＮＴＰ溶液（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰの混合溶液で最終濃度が各２．５ｍＭ）４μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2  ４μｌ、耐熱性ポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。５ｕｎｉｔ／ｍｌ。Ｐｒｏｍｅｇａ社製  ＧｏＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１μｌおよびＰＣＶ２−ＯＲＦ２の全長が増幅可能となるよう設計したプライマーペア（５'−ＣＣＡＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＡ−３'、５’−ＡＣＡＧＣＧＣＡＣＴＴＣＴＴＴＣＧＴＴＴ−３'各２０μＭ）（それぞれ配列番号１３および１４参照）を各１μｌずつ加え、更に滅菌蒸留水を加えて全量５０μｌの反応液を調製した。この反応液を０．２ｍｌ容ＰＣＲ用チューブに入れ、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製ｉＣｙｃｌｅｒ）を用いてＰＣＲを行った（熱変性；９５℃、３０秒間：アニーリング；６０℃、３０秒間：伸長反応；７２℃、１分間：熱変性からアニーリングを経て伸長反応に至る過程を１サイクルとし、このサイクルを４０回繰り返した）。
【００７２】
〔制限酵素反応〕
制限酵素（ＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＡｃｃＩ，ＮｄｅＩ，ＭｂｏＩＩ）（ＮＥＢ社製）いずれか１種類１０ｕｎｉｔ相当量およびその制限酵素に対応する１０×反応緩衝液（ＮＥＢ社製）２μｌを加え、更に滅菌蒸留水を加えて全量２０μｌの反応液とした。各制限酵素について上記反応液を作製し、この反応液をチューブに入れ、３７℃、２時間反応させた。
【００７３】
〔検出〕
制限酵素反応液からＰＣＲ産物の切断パターンを検出するため、アガロースゲル電気泳動を行った。アガロースゲルはゲル濃度２％（Ｗ／Ｖ）とし、臭化エチジウム（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むものを用いた。ＴＡＥ溶液の入った泳動槽にゲルを浸し、１３５Ｖの定電圧で電気泳動を行なった。電気泳動後のゲルはＵＶランプを照射して増幅産物の鎖長を相対的に計測した。
【００７４】
〔遺伝子型分類〕
ＰＣＲ産物をシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて常法により遺伝子配列の解析を行った。更にその配列データについて実施例１と同様の方法で遺伝子型分類を行った。
【００７５】
〔結果〕
ＰＣＲ産物の長さは８０１〜８０２ｂｐであった。何れの農場においても何れかの豚血清よりＰＣＶ２が検出された。表１の切断パターンに従い分類したＰＣＲ産物切断断片長のパターンの例を表６に示す。また、各制限酵素の代表的な切断パターンの電気泳動像を図２−１〜図２−６に示す。図２−１〜図２−６中、左側のレーンは分子量マーカー（Ｍ）を示す。左から２番目以降の列は各切断パターンのＰＣＲ断片長を示し、泳動図上部の数字は各列のパターンが表６に示すパターン１、パターン２、パターン３のいずれかであることを示す（上部に数字のない列は左側に隣接する列のパターンと同じパターンであることを示す）。尚、基本的に、ＰＣＲ産物の長さは表６に示すように、８０２ｂｐであったが、一部に、上記に記載したとおり、８０１ｂｐのものも存在した。これは、個体差による挿入や欠失や置換等の変異を有する個体が一部に存在することによるものである。実際には更に多くの変異、例えば１０残基程度の増減も考えられるものではあるが、この場合は、表６の切断片の長さを１０残基の幅をもって判断することで、適合させることができる。
尚、この点より、ＭｂｏＩＩの切断片長のパターン２とパターン３の小さい方の２つのバンドは、より区別しにくくなる場合も生じることになるが、１０６ｂｐのバンドがあるものがパターン３であると判断出来る等の区別が可能なため問題はない。
【００７６】
【表６】
2008220297.tif 000007
【００７７】
表６に基づき、各切断断片について切断パターン番号をＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＡｃｃＩ，ＮｄｅＩ，ＭｂｏＩＩの順に並べ、ＲＦＬＰパターンとした。その結果を表７に示す。更に、１５農場のうち、イ農場、ロ農場、ニ農場およびチ農場のそれぞれの個体から得られるサンプルのＰＣＲ増幅産物（制限酵素切断前）および切断酵素作用後の切断断片の塩基長および塩基配列を、配列表を引用して以下に示す。
【００７８】
・イ農場（１−１−１−３−１−３〔遺伝子型：１Ａ型〕）
○ＰＣＲ産物全長（８０１ｂｐ：配列番号１５）
○ＡｖａＩ切断片長（切断部位無し・・・８０１ｂｐ／全長と同じ）
○ＢａｍＨＩ切断片長（切断部位無し・・・８０１ｂｐ／全長と同じ）
○ＣｌａＩ切断片長（切断部位無し・・・８０１ｂｐ／全長と同じ）
○ＡｃｃＩ切断片長（６０４ｂｐ：配列番号１６／１９７ｂｐ：配列番号１７）
○ＮｄｅＩ切断片長（７８１ｂｐ：配列番号１８／２０ｂｐ：配列番号１９）
○ＭｂｏＩＩ切断片長（６７ｂｐ：配列番号２０／３ｂｐ（配列：ｃｃｃ）／７９ｂｐ：配列番号２１／１０６ｂｐ：配列番号２２／５４６ｂp：配列番号２３）  尚、３ｂｐの断片は電気泳動時に観察できないので無視できる。
【００７９】
・ロ農場（３−１−１−１−２−２〔遺伝子型  ２Ｂｄ型〕）
○ＰＣＲ産物全長（８０２ｂｐ：配列番号２４）
○ＡｖａＩ切断片長（２８０ｂｐ：配列番号２５／３２５ｂｐ：配列番号２６／１９７ｂｐ：配列番号２７）
○ＢａｍＨＩ切断片長（切断部位無し・・・８０２ｂｐ／全長と同じ）
○ＣｌａＩ切断片長（切断部位無し・・・８０２ｂｐ／全長と同じ）
○ＡｃｃＩ切断片長（切断部位無し・・・８０２ｂｐ／全長と同じ）
○ＮｄｅＩ切断片長（４４６ｂｐ：配列番号２８／３３６ｂｐ：配列番号２９／２０ｂｐ：配列番号３０）
○ＭｂｏＩＩ切断片長（６７ｂｐ：配列番号３１／３ｂｐ（配列：ｃｃｃ）／７９ｂｐ：配列番号３２／６５３ｂｐ：配列番号３３）  尚、３ｂｐの断片は電気泳動時に観察できないので無視できる。
【００８０】
・二農場（３−２−１−２−１−２〔遺伝子型：２Ｂｃ〕)
○ＰＣＲ産物全長（８０２ｂｐ：配列番号３４）
○ＡｖａＩ切断片長（２８０ｂｐ：配列番号３５／３２５ｂｐ：配列番号３６／１９７ｂｐ：配列番号３７）
○ＢａｍＨＩ切断片長（３８１ｂｐ：配列番号３８／４２１ｂｐ：配列番号３９）
○ＣｌａＩ切断片長（切断部位無し・・・８０２ｂｐ／全長と同じ）
○ＡｃｃＩ切断片長（２３２ｂｐ：配列番号４０／５７０ｂｐ：配列番号４１）
○ＮｄｅＩ切断片長（７８２ｂｐ：配列番号４２／２０ｂｐ：配列番号４３）
○ＭｂｏＩＩ切断片長（７０ｂｐ：配列番号４４／７９ｂｐ：配列番号４５／６５３ｂｐ：配列番号４６）
【００８１】
・チ農場（２−２−２−３−１−２〔遺伝子型：２Ａ〕)
○ＰＣＲ産物全長（８０２ｂｐ：配列番号４７）
○ＡｖａＩ切断片長（２８０ｂｐ：配列番号４８／５２２ｂｐ：配列番号４９）
○ＢａｍＨＩ切断片長（３８１ｂｐ：配列番号５０／４２１ｂｐ：配列番号５１）
○ＣｌａＩ切断片長（５３８ｂｐ：配列番号５２／２６４ｂｐ：配列番号５３）
○ＡｃｃＩ切断片長（６０４ｂｐ：配列番号５４／１９８ｂｐ：配列番号５５）
○ＮｄｅＩ切断片長（７８２ｂｐ：配列番号５６／２０ｂｐ：配列番号５７）
○ＭｂｏＩＩ切断片長（７０ｂｐ：配列番号５８／７９ｂｐ：配列番号５９／６５３ｂｐ：配列番号６０）
【００８２】
尚、本ＰＣＲ産物は、ＯＲＦ２のＡＴＧの外側である５'側に２５ｂｐ、ＯＲＦ２の外側である３'側に７５ｂｐの領域がＯＲＦ２の７０２ｂｐの領域を挟んだ形の産物であった。図４−１〜図４−１２に、ＰＣＶ２遺伝子におけるプライマーセット（配列番号１３および１４）に相当する配列部分位置を下線（配列番号１３に相当する部分は単線、配列番号１４に相当する部分は二重線）で示した。前述したように図４−１〜図４−１２に示す塩基配列はＰＣＶ２遺伝子の相補鎖であること（図３参照）から、上記プライマーを用いると図中の下線で囲まれた部分（下線部分も含む）の間が増幅され、増幅される配列中にはＰＣＶ２−ＯＲＦ２（すなわち、図４−１〜図４−１２中の囲み領域）が含まれていることが明らかである。
【００８３】
【表７】
2008220297.tif 000008
【００８４】
今回、国内１５農場においてＰＣＶ２の解析を行ったが、すべての農場の豚血清からＰＣＶ２が分離され、２〜４カ月齢のいずれかで飼育されている豚がＰＣＶ２ウイルス血症を発症していることが確認された。それらのＰＣＶ２はＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により、切断パターンで分離することができ、その結果、その遺伝子型は１Ａ、２Ａ、２Ｂｃ、２Ｂｄ型であった（表７：表中の数字は、(ＡｖａＩＩ)−（ＢａｍＨＩ）−（ＣｌａＩ）−（ＡｃｃＩ）−（ＮｄｅＩ）−（ＭｂｏＩＩ）の順に切断パターン番号を並べたものである。）。国内には少なくとも４種類の遺伝子型をもつＰＣＶ２が分布していることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列番号１：ＡＦ５３８３２５（ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の相補鎖を含む）
配列番号２：ＡＹ６７８５３２（ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の相補鎖を含む）
配列番号３：ＡＹ１８１９４６（ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の相補鎖を含む）
配列番号４：ＡＦ１０９３９８（ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の相補鎖を含む）
配列番号５：ＡＦ１１７７５３（ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の相補鎖を含む）
配列番号６：ＡＹ１４６９９３（ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の相補鎖を含む）
配列番号７：ＡＹ１８０３９７（ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の相補鎖を含む）
配列番号８：ＡＦ２０１３０８（ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の相補鎖を含む）
配列番号９：ＡＦ２６４０４３（ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の相補鎖を含む）
配列番号１０：ＡＦ３８１１７６（ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の相補鎖を含む）
配列番号１１：ＡＹ２５６４５６（ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の相補鎖を含む）
配列番号１２：ＡＦ１１８０９７（ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の相補鎖を含む）
配列番号１３：ＰＣＲ−ＲＦＬＰ用プライマー
配列番号１４：ＰＣＲ−ＲＦＬＰ用プライマー
配列番号１５：イ農場サンプルのＰＣＲ産物全長（８０１ｂｐ）
配列番号１６：イ農場サンプルのＡｃｃＩ切断片長（６０３ｂｐ）
配列番号１７：イ農場サンプルのＡｃｃＩ切断片長（１９８ｂｐ）
配列番号１８：イ農場サンプルのＮｄｅＩ切断片長（７８１ｂｐ）
配列番号１９：イ農場サンプルのＮｄｅＩ切断片長（２０ｂｐ）
配列番号２０：イ農場サンプルのＭｂｏＩＩ切断片長（６７ｂｐ）
配列番号２１：イ農場サンプルのＭｂｏＩＩ切断片長（７９ｂｐ）
配列番号２２：イ農場サンプルのＭｂｏＩＩ切断片長（１０６ｂｐ）
配列番号２３：イ農場サンプルのＭｂｏＩＩ切断片長（５４６ｂｐ）
配列番号２４：ロ農場サンプルのＰＣＲ産物全長（８０２ｂｐ）
配列番号２５：ロ農場サンプルのＡｖａＩ切断片長（２８０ｂｐ）
配列番号２６：ロ農場サンプルのＡｖａＩ切断片長（３２５ｂｐ）
配列番号２７：ロ農場サンプルのＡｖａＩ切断片長（１９７ｂｐ）
配列番号２８：ロ農場サンプルのＮｄｅＩ切断片長（４４６ｂｐ）
配列番号２９：ロ農場サンプルのＮｄｅＩ切断片長（３３６ｂｐ）
配列番号３０：ロ農場サンプルのＮｄｅＩ切断片長（２０ｂｐ）
配列番号３１：ロ農場サンプルのＭｂｏＩＩ切断片長（６７ｂｐ）
配列番号３２：ロ農場サンプルのＭｂｏＩＩ切断片長（７９ｂｐ）
配列番号３３：ロ農場サンプルのＭｂｏＩＩ切断片長（６５３ｂｐ）
配列番号３４：ニ農場サンプルのＰＣＲ産物全長（８０２ｂｐ）
配列番号３５：ニ農場サンプルのＡｖａＩ切断片長（２８０ｂｐ）
配列番号３６：ニ農場サンプルのＡｖａＩ切断片長（３２５ｂｐ）
配列番号３７：ニ農場サンプルのＡｖａＩ切断片長（１９７ｂｐ）
配列番号３８：ニ農場サンプルのＢａｍＨＩ切断片長（３８１ｂｐ）
配列番号３９：ニ農場サンプルのＢａｍＨＩ切断片長（４２１ｂｐ）
配列番号４０：ニ農場サンプルのＡｃｃＩ切断片長（２３２ｂｐ）
配列番号４１：ニ農場サンプルのＡｃｃＩ切断片長（５７０ｂｐ）
配列番号４２：ニ農場サンプルのＮｄｅＩ切断片長（７８２ｂｐ）
配列番号４３：ニ農場サンプルのＮｄｅＩ切断片長（２０ｂｐ）
配列番号４４：ニ農場サンプルのＭｂｏＩＩ切断片長（７０ｂｐ）
配列番号４５：ニ農場サンプルのＭｂｏＩＩ切断片長（７９ｂｐ）
配列番号４６：ニ農場サンプルのＭｂｏＩＩ切断片長（６５３ｂｐ）
配列番号４７：チ農場サンプルのＰＣＲ産物全長（８０２ｂｐ）
配列番号４８：チ農場サンプルのＡｖａＩ切断片長（２８０ｂｐ）
配列番号４９：チ農場サンプルのＡｖａＩ切断片長（５２２ｂｐ）
配列番号５０：チ農場サンプルのＢａｍＨＩ切断片長（３８１ｂｐ）
配列番号５１：チ農場サンプルのＢａｍＨＩ切断片長（４２１ｂｐ）
配列番号５２：チ農場サンプルのＣｌａＩ切断片長（５３８ｂｐ）
配列番号５３：チ農場サンプルのＣｌａＩ切断片長（２６４ｂｐ）
配列番号５４：チ農場サンプルのＡｃｃＩ切断片長（６０４ｂｐ）
配列番号５５：チ農場サンプルのＡｃｃＩ切断片長（１９８ｂｐ）
配列番号５６：チ農場サンプルのＮｄｅＩ切断片長（７８２ｂｐ）
配列番号５７：チ農場サンプルのＮｄｅＩ切断片長（２０ｂｐ）
配列番号５８：チ農場サンプルのＭｂｏＩＩ切断片長（７０ｂｐ）
配列番号５９：チ農場サンプルのＭｂｏＩＩ切断片長（７９ｂｐ）
配列番号６０：チ農場サンプルのＭｂｏＩＩ切断片長（６５３ｂｐ）
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、ＰＣＶ２の分子系統樹による遺伝子型分類を示す図である。
【図２−１】図２−１は、ＡｖａＩＩの代表的な切断パターンの電気泳動像を示す図である。
【図２−２】図２−２は、ＢａｍＨＩの代表的な切断パターンの電気泳動像を示す図である。
【図２−３】図２−３は、ＣｌａＩの代表的な切断パターンの電気泳動像を示す図である。
【図２−４】図２−４は、ＡｃｃＩの代表的な切断パターンの電気泳動像を示す図である。
【図２−５】図２−５は、ＮｄｅＩの代表的な切断パターンの電気泳動像を示す図である。
【図２−６】図２−６は、ＭｂｏＩＩの代表的な切断パターンの電気泳動像を示す図である。
【図３】図３は、ＰＣＶ２のＯＲＦ２の翻訳方向と実施例で用いたＰＣＲプライマーの一の概略を示す説明図である。
【図４−１】図４−１は、ＡＦ５３８３２５（配列番号１）のＰＣＶ２−ＯＲＦ２とプライマーの位置関係を示す図である。
【図４−２】図４−２は、ＡＹ６７８５３２（配列番号２）のＰＣＶ２−ＯＲＦ２とプライマーの位置関係を示す図である。
【図４−３】図４−３は、ＡＹ１８１９４６（配列番号３）のＰＣＶ２−ＯＲＦ２とプライマーの位置関係を示す図である。
【図４−４】図４−４は、ＡＦ１０９３９８（配列番号４）のＰＣＶ２−ＯＲＦ２とプライマーの位置関係を示す図である。
【図４−５】図４−５は、ＡＦ１１７７５３（配列番号５）のＰＣＶ２−ＯＲＦ２とプライマーの位置関係を示す図である。
【図４−６】図４−６は、ＡＹ１４６９９３（配列番号６）のＰＣＶ２−ＯＲＦ２とプライマーの位置関係を示す図である。
【図４−７】図４−７は、ＡＹ１８０３９７（配列番号７）のＰＣＶ２−ＯＲＦ２とプライマーの位置関係を示す図である。
【図４−８】図４−８は、ＡＦ２０１３０８（配列番号８）のＰＣＶ２−ＯＲＦ２とプライマーの位置関係を示す図である。
【図４−９】図４−９は、ＡＦ２６４０４３（配列番号９）のＰＣＶ２−ＯＲＦ２とプライマーの位置関係を示す図である。
【図４−１０】図４−１０は、ＡＦ３８１１７６（配列番号１０）のＰＣＶ２−ＯＲＦ２とプライマーの位置関係を示す図である。
【図４−１１】図４−１１は、ＡＹ２５６４５６（配列番号１１）のＰＣＶ２−ＯＲＦ２とプライマーの位置関係を示す図である。
【図４−１２】図４−１２は、ＡＦ１１８０９７（配列番号１２）のＰＣＶ２−ＯＲＦ２とプライマーの位置関係を示す図である。
【符号の説明】
【００８７】
図２−１〜図２−６中、左側のレーンは分子量マーカー（Ｍ）を示す。左から２番目以降の列は各切断パターンのＰＣＲ断片長を示し、泳動図上部の数字は各列のパターンが表６に示すパターン１、パターン２、パターン３のいずれかであることを示す（上部に数字のない列は左側に隣接する列のパターンと同じパターンであることを示す）。
図４−１〜図４−１２中、囲み領域はＰＣＶ２−ＯＲＦ２の相補鎖を示し、アンダーライン（単線）がプライマー１３に相当する部分を示し、アンダーライン（二重線）がプライマー（配列番号１４）に相当する部分を示し、囲み領域内のアンダーライン（単線）はＰＣＶ２−ＯＲＦ２の開始コドンの相補鎖を示す。
【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【配列表】
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