(57)【要約】【課題】乳がんの発生と進行に関与する、免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質に特異的に結合する抗体を得る。【解決手段】免疫グロブリン様エストロゲン結合タンパク質を動物に免役し、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを調製した後、免疫グロブリンと上記エストロゲン結合タンパク質とに対する結合性を指標に、上記エストロゲン結合性タンパク質に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選別し、選別されたハイブリドーマから、免疫グロブリン様エストロゲン結合タンパク質に対するモノクローナル抗体を得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体であって、免疫グロブリン様エストロゲン結合性蛋白質が、ａ）分子量５２ｋＤａのＨ鎖と３０ｋＤａのＬ鎖からなり、ｂ）ステロイド結合能を有し、かつ、ｃ）エストロゲン存在下で乳ガン細胞増殖抑制作用を有するものである、上記モノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を含有することを特徴とする、請求項１に記載の免疫グロブリン様エストロゲン結合タンパク質の検出試薬。
【請求項３】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を含有することを特徴とする、請求項１に記載の免疫グロブリン様エストロゲン結合タンパク質の定量試薬。
【請求項４】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を含有することを特徴とする、ヒトの体液、組織中に存在する請求項１に記載の免疫グロブリン様エストロゲン結合タンパク質の濃度を定量するために使用する検査薬。
【請求項５】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を含有することを特徴とする診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトなどの哺乳動物血液または組織中に存在する、エストロゲン結合性タンパク質に対するモノクローナル抗体、その製法、該抗体産生細胞、および該抗体を用いた検査薬、診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳がんの発生や進行にはエストロゲンがカギとなっていることが知られている。研究者の間では、エストロゲンは標的細胞核内にある２種類のエストロゲンレセプターに結合することによって細胞に影響するとされている。
しかしながら、いずれのエストロゲンレセプターも乳がん細胞の増殖に直接かかわっていないということが明らかにされており、他にエストロゲンの働きを仲介する因子が見つかっていないので、乳がんの発生と進行に関する研究は進んでいない。本発明者の1人はこれまでに、細胞外にもエストロゲンの働きを仲介する因子が存在している可能性があるという仮説を手掛かりに、ヒト血液からエストロゲンの働きを仲介する未知の乳ガン細胞増殖阻害因子を単離するとともに、この因子が、エストロゲンに結合性を有するタンパク質であることを明らかにし、さらに、エストロゲンの働きを仲介して細胞増殖を抑制する証拠として、血清もしくはこの因子を加えない培養液中ではエストロゲンが乳がん細胞の増殖に全く影響しないことを示した（非特許文献１）。
【０００３】
【非特許文献１】Anticancer Res. 20, 2779-84(2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
その後、この研究をさらに進め、乳がんは病気の進行とともにエストロゲン感受性を失ってゆくことに着目し、これが細胞の形質維持の良いモデルであるため、引き続き乳がん細胞を用いた研究を行った。上記乳がん細胞のエストロゲン感受性の喪失に対し、上記細胞増殖阻害因子に対する感受性が関与していると考えられるが、そのメカニズムを明らかにするためには、上記細胞増殖阻害因子の機能を阻害する手段が必要になる。このため、上記細胞増殖阻害因子に対し特異的に結合する抗体が求められる。しかし、上記細胞増殖阻害因子については、その分子構造等についての知見が未だ充分に得られていないため、該特異抗体を得るのは難しい。したがって、本発明の課題は、このような困難性を克服し、上記細胞増殖阻害因子に対し特異的に結合する抗体を新たに提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、その後の研究の結果、上記細胞増殖阻害因子が、免疫グロブリンと非常に似た構造を有するとの知見を得た。このため、上記細胞増殖因子と生体内に多種多様に存在する免疫グロブリンとを識別しうる抗体を作製することは困難であると予想されたが、このような状況の下、上記細胞増殖阻害因子にのみ特異的に結合するモノクローナル抗体の作成を試み、種々の検討、実験を繰り返した後、上記増殖阻害因子に対し特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることに初めて成功するとともに、該抗体が、乳ガンの発症、防御メカニズム解明あるいは乳がんの発症の可能性を探るための薬剤等として、極めて有用であると確信し、本発明を完成するに至ったものである。すなわち、本発明は以下（１）〜（５）の構成を伴うものである。なお、以下においては、上記細胞増殖阻害因子を免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質という。
【０００６】
（１）ヒト由来の免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体であって、免疫グロブリン様エストロゲン結合性蛋白質が、ａ）分子量５２ｋＤａのＨ鎖と３０ｋＤａのＬ鎖からなり、ｂ）ステロイド結合能を有し、かつ、ｃ）エストロゲン存在下で乳ガン細胞増殖抑制作用を有するものである、上記モノクローナル抗体。
（２）上記（１）に記載のモノクローナル抗体を含有することを特徴とする、上記（１）に記載の免疫グロブリン様エストロゲン結合タンパク質の検出試薬。
（３）上記（１）に記載のモノクローナル抗体を含有することを特徴とする、上記（１）に記載の免疫グロブリン様エストロゲン結合タンパク質の定量試薬。
（４）上記（１）に記載のモノクローナル抗体を含有することを特徴とする、ヒトの体液、組織中に存在する請求項１に記載の免疫グロブリン様エストロゲン結合タンパク質の濃度を定量するために使用する検査薬。
（５）上記（１）に記載のモノクローナル抗体を含有することを特徴とする診断薬。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のモノクローナル抗体の抗原は、エストロゲン依存性乳がん細胞増殖阻害因子として単離された免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質であり、本発明のモノクローナル抗体は、該タンパク質の検出および定量に極めて有用なものである。また、上記モノクローナル抗体を用いて、その生体内の該エストロゲン結合性タンパク質を定量することにより、健全な女性が乳がんになる可能性を検査することも可能となる。
さらに、乳がんは進行が進むと次第にエストロゲンに反応しなくなり、それと同時により悪性化することが知られている。悪性化した乳がん細胞にも細胞内に機能的に問題ないエストロゲン受容体が存在することが多く、細胞の形質変化にエストロゲン受容体が関係していないことが指摘されている。このような乳がん細胞の形質変化に対しては上記エストロゲン結合性タンパク質が関与している可能性が考えられ、本発明のモノクローナル抗体は、乳がんの進行を診断するために使用する診断薬としての使用が考えられる。また、基礎研究としては、エストロゲンの作用機序やホルモンがん発症の防御のメカニズムを調べるうえでも極めて重要な抗体である。
【０００８】
本発明のモノクローナル抗体が認識する免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質の構造を70％決定したところ、リューマチ因子やＲｈ血液型を決定する抗原を認識する抗D免疫グロブリンと共通構造をもっていた。そこで本発明のモノクローナル抗体はエストロゲンが関係する乳がんなどのホルモンがん細胞の形質のモニター、内分泌かく乱物質の働き、骨粗鬆症、白内障の治療法の研究のほか、Ｒｈ血液型の研究、リューマチなどの自己免疫疾患のメカニズムを探る際にも用いられる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、ヒトその他哺乳動物の血液中に存在する免疫グロブリンに類似する構造を有するエストロゲン結合性タンパク質に対するモノクローナル抗体に関するものであり、このエストロゲン結合性タンパク質は、エストロゲンの存在下、乳がん細胞の増殖を抑制する。本発明のモノクローナル抗体は、このような免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質の検出、分布、定量、単離、挙動のモニター、並びに該タンパク質のスクリーニングを可能とするものである。
【００１０】
本発明の上記モノクローナル抗体を得るため、抗原として使用するエストロゲン結合性タンパク質は、例えば、ヒト等の哺乳動物の血液から、以前報告した方法（Anticancer Res. 20, 2785-90(2000)）もしくはその改良法である下記の実施例１の方法にしたがって単離することができる。また、得られるエストロゲン結合性タンパク質は、Ｈ鎖とＬ鎖からなるが、免疫グロブリンと非常に似た構造を有する。そして、血液中には多種多様の免疫グロブリンが存在するが、本発明のモノクローナル抗体はこれら免疫グロブリンと反応してはならず、かつそれと構造上80％以上の類似性をもつエストロゲン結合性タンパク質を確実に検出しなければならない。
【００１１】
以下に、ヒトの細胞増殖阻害因子であるエストロゲン結合性タンパク質を抗原とする場合を例にとり、本発明のモノクローナル抗体を得る方法についてさらに具体的に説明する。
まず、還元条件下のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にて免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質をＨ鎖とＬ鎖に分離し、Ｈ鎖を含むゲルをかみそりで切り出してから電気的に溶出回収して生理食塩水に、一定時間、例えば一昼夜透析し、得られたエストロゲン結合性タンパク質のＨ鎖を抗原としてマウス、ラットその他の動物に注射する。免疫した動物から脾臓を取り出し、得られる脾細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とをポリエチレングリコール等の周知の手段により融合させる。
次に、融合細胞にＨＡＴ培地による選択を行ってモノクローナル抗体を産生する融合細胞を得る。この段階では多種多様な融合細胞が存在し、免疫グロブリンとエストロゲン結合性タンパク質で共通の部分構造を認識するモノクローナル抗体を産生する融合細胞も含まれるため、得られる抗体では免疫グロブリンと抗原である上記エストロゲン結合性タンパク質とを識別できない。
【００１２】
そこで、これらの融合細胞を希釈して多数の培養器に分散させ、各々の培養器中に生じるモノクローナル抗体と、抗原となる上記エストロゲン結合性タンパク質のみを除いたヒト免疫グロブリンの画分、及び上記エストロゲン結合性タンパク質とをそれぞれ反応させ、上記エストロゲン結合性タンパク質のみを除いたヒト免疫グロブリンの画分とは反応せず、エストロゲン結合性タンパク質とのみ反応する融合細胞を選択し、該融合細胞からモノクローナル抗体を得る。得られるモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンとは反応せず、免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質にのみ特異的に結合する抗体である。
【００１３】
上記エストロゲン結合性タンパク質のみを除いたヒト免疫グロブリンの画分は、以下のように調製することができる。
例えば、新鮮な血液を一晩４℃で放置した後に遠心分離により血球を除いて上清を得、活性炭処理によりステロイド成分を除去してから、ステロイド、例えばヒドロコルチゾン（コルチゾール）をリガンドとしたアフィニティカラムを通過させる。
免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質は、ステロイドと結合するので、この操作により、アフィニティカラムに補足され、上記血液中の抗原となるエストロゲン結合性タンパク質を除去することができる。得られた素通り画分をプールし、免疫グロブリン画分をプロテインＡ−アフィニティカラムを用いて精製する。こうして抗原となるエストロゲン結合性タンパク質のみを除いたヒト免疫グロブリンの画分を得る。
【００１４】
次いで、このヒト免疫グロブリン画分と、免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質との反応性（結合性）を指標として、上記の融合細胞を分散させた多数の各培養器のなかから、抗原となる免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質にのみ強く反応する抗体が産生されている培養器を選択し、さらにそれに含まれる融合細胞を希釈した多数の培養器で同じように選択を繰り返すというスクリーニング作業を行い、抗原となるエストロゲン結合性タンパク質とのみ特異的に反応する抗体を産生する融合細胞を単離する。この融合細胞が培養液中に放出する抗体分子が、本発明のモノクローナル抗体である。融合細胞は保存が可能であり、培養により、またはマウスの腹水中に産生させることにより、いつでも本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。本発明においては、上記操作により、免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生する融合細胞として、樹立ハイブリドーマ細胞株「1G6-3E-10D」を得ている。該融合細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００３年１２月８日付けで受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６１０号として寄託されている。
【００１５】
本発明において、動物に免疫する際、抗原として用いる免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質は、哺乳類由来のものであれば特に限定されず、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、ラット、マウス由来の免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質を用いることができる。これら、哺乳動物から免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質は、以前発表した方法（Anticancer Res. 20, 2785-90(2000)）、もしくはその変法、もしくはモノクローナル抗体を用いた免疫沈降法により調整しうる。
この本発明の免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質は、免疫グロブリンと類似した構造を有し、Ｈ鎖とＬ鎖からなる。Ｈ鎖はヒトの場合52ｋＤａ、Ｌ鎖は30ｋＤａである。動物種によって大きさが若干異なる。この免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質は、上記のように、以前、細胞増殖抑制因子として、ステロイド結合能を持ち、エストロゲン存在下で乳がん細胞の増殖を阻害することを報告している（Anticancer Res. 20, 2785-90(2000)）。
【００１６】
抗原として用いるのは、分子を形成するＨ鎖とL鎖のうちＨ鎖である。さらに、遺伝子組み換え体によって作成した細胞増殖抑制因子のＨ鎖を免疫用として用いることもできる。該Ｈ鎖を遺伝子組み換え体によって作成するには、Ｈ鎖の遺伝子を含むDNAの全部もしくは一部を適当な制限酵素によって切り出し、リンカー配列と発現タンパク質判別用タグ配列を接続して適当なプロモーターの下流につないだ後、これを形質転換可能な宿主に導入する。ここで使用されるベクターDNAとしては、プラスミドベクター、シャトルベクター、ファージベクター、ウィルスベクターなどが挙げられ、宿主としては大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞が挙げられる。形質転換体は培養増幅後、プロモーターの性質に応じた発現誘導処理をして菌体もしくは培養上清より、発現したタンパク質をタグ配列を利用してアフィニティカラムクロマトグラフィーで回収、精製する。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
１．抗原（免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質）の調製
1.5リットルの冷凍ヒト血清を４℃で解凍したら、３ｇ T-70デキストラン（ファルマシア社製）で処理した洗浄済み活性炭（シグマ社製）２０ｇを加えて、３４℃、２時間攪拌する。これを遠心分離機にかけて沈殿した活性炭を取り除き、新たにデキストラン処理済活性炭１０ｇを加えて、３４℃、１時間攪拌する。これを遠心分離機にかけて沈殿した活性炭を取り除き上精を得た。
上精に重量パーセントで２５％になるように硫酸アンモニウム結晶（ICN社製、タンパク精製グレード）を加えて、氷上で３０分攪拌する。これを遠心分離機にかけて沈殿を取り除き、上精にさらに硫酸アンモニウム結晶を加えて重量パーセントで４０％になるようにした。これを遠心分離機にかけて沈殿を回収し、２００ｍｌの０.２Ｍ食塩を含む０.０５Ｍピペラジン緩衝溶液（ｐＨ５）を加えて溶かした。
【００１８】
溶液のｐＨを６Ｎ塩酸で５.０に合わせたら、１００ｍｌのコルチゾールゲル（コルチゾールをカルボジイミドカップリング法で付加したファルマシア社製のアミノへキシル基付きアガロースゲルで、あらかじめ０.２Ｍ食塩を含む０.０５Ｍピペラジン緩衝溶液（ｐＨ５）で洗っておく）を加えて、一晩４℃で攪拌する。次の日にゲルをガラス管に詰め（ベッドサイズは直径２.５ｃｍ、高さ１８ｃｍになる）、５００ｍｌの４Ｍ尿素と０.２M食塩を含む０.０５Ｍピペラジン緩衝溶液（ｐＨ５）、続いて１０リットルの０.２M食塩を含む０.０５Ｍピペラジン緩衝溶液（ｐＨ５）で洗った。ゲルについたタンパク質は１リットルの０.５ｍｇ／ｍｌのコルチゾールを加えた０.２M食塩を含む０.０５Ｍピペラジン緩衝溶液（ｐＨ５）で溶出した。プールした溶出液（約９００ｍｌ）は、アミコン社製のＰＭ−１０膜を使って限外ろ過により約２ｍｌ（タンパク量約５ｍｇを含む）に濃縮した。
【００１９】
得られたサンプルは生理食塩水に対して一昼夜透析してベッド体積０.３ｍｌのプロテインＡ・アガロースゲルカラム（米国ＫＰＬ社製）にアプライし、製品の取り扱い説明書に従って免疫グロブリン画分を精製する。溶出用緩衝液を用いてカラムから回収されたサンプルは生理食塩水に対して一昼夜透析し、タンパク質濃度と純度を検定した上で、1ｍｇ／ｍｌになるように調整した。
この精製法で、１.５リットルの血清から約２.５ｍｇの免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質の完全精製標品が得られた。
精製表品をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動後、還元アルキル化後、トリプシンでゲル内消化を行い、得られたペプチド断片をＥＳＩ−ＱＵＡＤ−ＴＯＦでＭＳ／ＭＳ解析し、決定したシークエンスタグをもとにＭＡＳＣＯＴ（www.matrixscience.com）で検索した。その結果免疫グロブリンによく似たタンパク質であることが分かった。
【００２０】
２．免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製
ステロイド結合性タンパク質のみを除いたヒト免疫グロブリンの画分を、以下のように調製した。新鮮な血液を一晩４℃で放置した後に遠心分離により血球を除いて上清を得、活性炭処理によりステロイド成分を除去してから、ヒドロコルチゾンをリガンドとしたアフィニティカラムを通過させた。得られた素通り画分をプールし、免疫グロブリン画分をプロテインＡ−アフィニティカラムを用いて精製した。
【００２１】
実施例1に従って免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質完全精製品10ｍｇを調整した。調整したタンパクの一部（４ｍｇ）は還元条件下のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にてＨ鎖とＬ鎖に分離し、Ｈ鎖を含むゲルをかみそりで切り出してから電気的に溶出回収してプールした後、生理食塩水に一昼夜透析した。こうして免疫用Ｈ鎖1.5ｍｇを得た。
上で調整した免疫用Ｈ鎖を抗原としてマウスに３回に分けて注射した。免疫された動物から脾臓を取り出し、得られる脾細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とをポリエチレングリコールを用いて融合させた。
【００２２】
次に、得られたハイブリドーマ（融合細胞）にＨＡＴ培地による選択を行って、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。得られたハイブリドーマを希釈して多数の培養器に分散させ、各々の培養器中に生じる抗体と、上で調整したステロイド結合性タンパク質のみを除いたヒト免疫グロブリンの画分、及び免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質とをそれぞれ反応させ、ELISA（免疫蛍光測定法）試験の結果、前者と後者の吸光度の差が有意に高いハイブリドーマグループを選択し、多種類の融合細胞から目的のモノクローナル抗体を産生するクローンを得た。詳述すると、１次スクリーニングの結果、拡大培養した336グループのうち吸光度の差が有意に高い５グループを選び、それぞれを88グループに拡大培養した。
【００２３】
２次スクリーニングの結果、それぞれからひとグループずつ吸光度の差が有意に高いクローンが得られた。それぞれを88グループに拡大培養した。３次スクリーニングの結果、３クローンのうち１クローン由来の拡大培養には細胞が見られなかったため、バックアップ用の予備培養細胞を再び拡大培養した（1G6-3E）。もうひとつのクローン由来の拡大培養には抗体産生能がなかった。最後のクローン由来の拡大培養からは吸光度の差が有意に高く、かつ細胞観察から１クローン／ウエルになっているクローンが２つ得られた（2H6-4E-4Aと2H6-4E-9C）。これら３クローンを拡大培養した。４次スクリーニングの結果、1G6-3Eクローンより吸光度の差が有意に高いクローン1G6-3E-10Dが得られた。細胞観察から1G6-3E-10Dはこの時点で単一クローンとなっていた。2H6-4E-4Aと2H6-4E-9Cについては２回撒きなおしを行ったが、吸光度の差が有意に高いクローンは得られなかった。以上より、1G6-3E-10Dを樹立クローンとした。
【００２４】
ELISA法により、1G6-3E-10Dハイブリドーマの培養上清の反応特異性を確認した。ステロイド結合性タンパク質のみを除いたヒト免疫グロブリンの画分と免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質完全精製品を４μg/mlに希釈してELISA用96ウェルプレートに50μlずつ入れ、室温で1時間静置してから、液を捨て、0.5％ゼラチンを加えたPBST（Tween20を添加した生理食塩水）を２００μl加えて室温で１時間静置した。ゼラチン溶液を捨て、1G6-3E-10Dクローンの培養上清の希釈系列（ゼラチン溶液で１〜32768倍希釈）を50μlづつ加えて室温で１時間静置した。ウェルをゼラチン溶液で３回洗い、同溶液で2500倍希釈したHRP結合抗マウスIgG（γ）を50μlずつ入れ、室温で1時間静置した。ウェルをゼラチン溶液で３回洗い、26ｍｌの基質溶液100μlを加えて室温で発色反応し（約１０分）、100μlの停止液を加えてから、プレートリーダーで490nmの吸光度を測定した。結果を図２に示す。1G6-3E-10Dクローンの培養上清に含まれるモノクローナル抗体が免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質完に有意に高い吸光度の差を示すことが確認された。
【００２５】
３．上記モノクローナル抗体の抗原特異性試験
免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質とアルブミンを含まないヒトの処理血清を次のようにようにして調整した。新鮮な血液６ｍｌを一晩４℃で放置した後に18,000ｒｐｍ、１時間遠心分離により上清を血清として得た。得られた血清から３４℃、２時間と１時間の２回にわたる活性炭処理によりステロイドを除去してから、ステロイドをリガンドとしたアフィニティカラム（ベッドボリューム10ｍｌ）を通過させ、免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質を除去した。得られた素通り画分約10ｍｌをプールし、17ｍｌのバイオラッド社製ブルーゲルを加えてアルブミンを除去した。調整を終えた血清は生理食塩水で希釈してタンパク濃度を5mg/mlに調整した。
【００２６】
こうして得られた処理済血清(タンパク量10μg)をネガティブサンプル（抗原を含まない）とした。
ポジティブサンプル（抗原を含む）としては部分精製したエストロゲン結合性タンパク質(純度10％以下、夾雑物は主としてアルブミン）７μgを用いた。ネガティブサンプル、及びポジティブサンプルの両方を還元条件下で変性させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動後のゲルにｐＨ11のトランスファー緩衝液に浸したブロッティング用メンブレンを密着させ、さらにこれを同じｐＨ11のトランスファー緩衝液に浸したろ紙で挟んで、ゲル側にマイナス、メンブレン側にプラスの電荷をかけてタンパク質をメンブレン上に移動、吸着させた。
【００２７】
メンブレンを２枚作成し、一方は本発明のモノクローナル抗体（融合細胞株1G6-3E-10Dの培養上清を200倍希釈で用いた）と、もう一方は別途ウサギを用いて同じ抗原で免役することにより作成したポリクローナル抗体（2500倍希釈）と反応させた。次に前者に対しては、アルカリフォスファターゼ結合抗マウス免疫グロブリン（1000倍希釈）、後者に対しては、アルカリフォスファターゼ結合抗ウサギ免疫グロブリン（5000倍希釈）を反応させ、定法に従って発色反応を行った。
【００２８】
結果を図２に示す。これによれば、ポリクローナル抗体を用いた実験では精製した調整済み血清、上記エストロゲン結合性タンパク質ともに濃いバンドが出ている。調製済み血清に比べて精製したエストロゲン結合性タンパク質のバンドの位置が低いのは、多量に含まれるアルブミンがバンドを下に押し下げているためである。これは細胞増殖抑制因子が免疫グロブリンと構造が良く似ており、ポリクローナル抗体は調整済み血清に含まれる様々な免疫グロブリンとも反応するからである。このようにポリクローナル抗体は精製した細胞増殖抑制因子に含まれる免疫グロブリンと処理済血清に含まれる免疫グロブリンを区別できない。これに対してモノクローナル抗体は細胞増殖抑制因子のみにクロスしている。結論として本発明のモノクローナル抗体は、細胞増殖抑制因子のみを検出するという本発明の要求を満たしているとわかる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
上記のように、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトその他哺乳動物の血液中にあるエストロゲン依存性の細胞増殖抑制因子、すなわち免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質を特異的に認識する。血液中では、このエストロゲン結合性タンパク質は混在する多種多様な免疫グロブリンと構造的に高い類似性を持つため、抗免疫グロブリンポリクローナル抗体で認識される。しかし、抗免疫グロブリンポリクローナル抗体では細胞増殖抑制因子と混在する免疫グロブリンを区別できない。これに対して本発明のモノクローナル抗体は両者を正確に区別する。このため、本発明のモノクローナル抗体を用いると、血液もしくは組織中の免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質を正確に検出、及び／又は定量できる。
【００３０】
したがって本発明のモノクローナル抗体は疫学的調査に用いると、例えば血中の上記エストロゲン結合性タンパク質のレベルと乳がんなどのホルモンがんの発生率の相関を調べるのに用いることが出来る。さらに、細胞の微細構造に注目すれば、多種多様な免疫グロブリン存在下でもこのエストロゲン結合性タンパク質の作用サイトや作用に伴う細胞の表面もしくは内部の局在位置を決定することが可能である。細胞の微視的局在位置を決定すると、細胞増殖抑制因子の作用メカニズムに対する知見が得られる。さらに本発明のモノクローナル抗体は免疫沈降法と組み合わせて用いることにより、エストロゲン結合性タンパク質それ自身、該タンパク質が結合する分子、もしくは該タンパク質にに結合する分子の単離にも利用できる。相互作用する分子を同定すれば、該タンパク質の作用メカニズムに対する知見が得られる。
【００３１】
さらに、注目すべきは、上記エストロゲン結合性タンパク質は、ヒト血中に存在する唯一のエストロゲン依存性乳がん細胞増殖阻害因子として単離されたことである。乳がん細胞は血液が存在しないとエストロゲンに反応しないことが知られており、上記エストロゲン結合性タンパク質は、乳がんなどのホルモンがんの発生や増殖に関係していると考えられる。石油化学の発展とともに我が国あるいは欧米で乳がん患者は急速に増大しており、欧米では７人に１人の女性が乳がんに悩んでいる。しかしながら既知の細胞内エストロゲン受容体には乳がん発症や細胞の増殖促進作用がないとされており、乳がん発症と進展に対するエストロゲンの作用メカニズムは明らかにされていない。これに対して、本発明のモノクローナル抗体が認識する細胞増殖抑制因子にはエストロゲンの働きを仲介する能力があり（Anticancer Res. 20, 2779-84(2000)）、それを認識するモノクローナル抗体は乳がんのリスク管理と治療に応用することができる。
【００３２】
さらに乳がんは進行が進むと次第にエストロゲンに反応しなくなり、それと同時により悪性化することが知られている。悪性化した乳がん細胞にも細胞内に機能的に問題ないエストロゲン受容体が存在することが多く、細胞の形質変化にエストロゲン受容体が関係していないことが指摘されている。このような乳がん細胞の形質変化に対して上記エストロゲン結合性タンパク質が関与している可能性がある。この意味で、本発明の抗体は細胞の形質維持の研究に用いることができる。さらに、進行した乳がん患者の治療法開発にも本発明の抗体を用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ELISA法により、免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質に対する、1G6-3E-10Dクローンの培養上清に含まれるモノクローナル抗体及び免疫グロブリンの反応特異性を比較した結果を示すグラフである。
【図２】ウエスタンブロッテイング法を使用して、免疫グロブリン様エストロゲン結合性タンパク質に対する、ポリクローナル抗体と本発明のモノクローナル抗体の特異性の比較した結果を表す電気泳動写真である。
【図１】
2008273987.tif 000002
【図２】
2008273987.tif 000003