(57)【要約】【課題】生態学的原理により、藻類毒素を防除する方法を提供する。【解決手段】耐光性かつ耐水性のプラスチックフィルムを使用して、藻類が成長する前に池の水面を部分的に被覆することにより、藻類毒素を防除する。そして、同じ水試料を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及び／又はＥＬＩＳＡによる検出に供して防除効果を確認する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
池の藻類が成長する前に、池の表面を、耐光性かつ耐水性のプラスチックフィルムで部分的に被覆して、生態学的に藻類毒素を防除する方法であって、
（１）藻類防除用の試験養魚池を選択する工程、
（２）前記藻類の成長時期を選択する工程、
（３）前記池の水面上に、前記プラスチックフィルムで被覆された固定骨格を作製する工程、および
（４）前記池の所定場所において、試料水を採取し、その試料水をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及び／又はＥＬＩＳＡに供して藻類毒素を検出する工程、
を含んでなることを特徴とする、方法。 
【請求項２】
前記工程（１）の試験養魚池が、池Ａ及び池Ｂであり、それらのうちの一つの池が試験養魚池であり、他の池が比較対照池である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（２）の前記藻類の成長時期が、藻類が成長する前の時期として選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（３）における水面上の前記固定骨格が傘様金属骨格であり、その骨格の下にそれを固定する鉄アンカーが設けられ、その周囲が鋼線ロープにより固定されており、池を被覆するように、前記骨格上にプラスチックフィルムが設けられており、前記被覆面積が、池表面の面積の略１／３である、請求項１に記載の方法。 
【請求項５】
前記工程（４）の検出用試料水を、各池において、池の対角線に沿って３点から採取し、水面及び水面下０．５メートルのそれぞれで試料水を採取する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、予防医療及び環境保護の分野に属し、人の健康に有害な藻類毒素を抑制及び測定する方法、特に被覆により藻類毒素を防除する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラン藻類により産生されるシアノトキシン（cyanotoxin）は、人や動物の健康に有害な天然毒素である。これらは、天然水体、特に、湖や池等に広く分布している。ミクロシスチン（ＭＣ）は、最も毒性があり且つ有害である代表的なシアノトキシンの一種である。ミクロシスチン（以下、ＭＣとも言う。）は、生物活性を有する環状ヘプタペプチド化合物の一種であり、淡水に広く分布している。ミクロシスチンに含まれている神経毒、肝臓毒素等は、生物に障害をもたらすことがある。いままで、ＭＣの６０を超えるアイソマーが発見されている。ＭＣは、耐熱性があり、煮沸によっては駆除できない。また、水の凝集、沈降、及び濾過により、ＭＣを駆除することは困難である。ＭＣは、水性生物中で富化し、保持されるため、飲料水及び食物連鎖を通じて人間に脅威を及ぼす恐れがある。野生動物、家畜、鶏は、ＭＣで汚染された水を飲んで中毒になったり、死亡したりすることがある。したがって、水中のＭＣを、正確且つ迅速に測定し、かつ防除する方法は、世界における関心事のうちの一つである。
【０００３】
人や動物において、ＭＣを含む水を飲むと、下痢や不快感、さらには中毒及びショックを生じたり、又は死に至ることがある。１９９６年に、ブラジル血液透析センターにおいて、１３６人の患者のうち１１７人が、通常の透析後に、肝臓領域における不快感、吐き気及び嘔吐、筋肉疲労及び痛みを訴え、１００人の患者が肝不全を患い、５０人の患者が死亡したことが報告されている。これらの患者の血清のＭＣ含量は１０ｎｇ／ｍＬであり、肝臓のＭＣ含量は０．１〜０．５ｎｇ／ｍｇであった。毒素は、主にＭＣ−ＹＲ，ＭＣ−ＬＲ、及びＭＣ−ＡＲであった。３３人の死亡者の肝臓のＭＣ含量は、死亡動物の肝臓のＭＣ含量と近似していた。調査したところ、透析に使用された湖水は事実上有効に処理されず、藻類細胞を２４５００個／ｍＬ含むことが分かった。さらに、他の研究から、江蘇省啓海地区、広西省扶綏、福建省同安等の、肝臓癌の高発地区においては、飲料水には、藻類毒素が含まれていることが分かっている。このような毒素は、肝細胞に有害であるばかりでなく、Ｂ型肝炎ウイルス及びアフラトキシンとの相乗作用のために、肝臓癌を形成する可能性が高い。中国における水の富栄養化が増すに伴い、糞便の汚染の代わりに、藻類の汚染が重要な健康問題となろう。
【０００４】
ＭＣ検出の公知の方法について、以下の方法が挙げられる。Ｆａｎｓｈｅｎｇ Ｚｈｕ教授らは、まず１９８９年に米国において、抗ＭＣポリクローナル免疫血清を用いて、酵素結合免疫吸着検定法（以下、ＥＬＩＳＡとも言う）によりＭＣを測定した。Ｎａｇａｔａらは、１９９５年に６種のＭＣモノクローナル抗体を調製した。Ｕｅｎｏは、１９９６年に、モノクローナル抗体を用いてセンシティブＥＬＩＳＡ法（５０ｐｇ／ｍｌ）を確立した。１９９６年に、江蘇省海門、並びにＨａｒａｄａ教授及びＵｅｎｏ教授は、ＬＣ／ＭＳにより、分子量が９９４であるＭＣアイソマーが池水に含まれていることを見出し、池、川、浅井戸、及び深井戸から採集した９８９の試料中のＭＣを測定した。続いて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ＨＰＬＣ−ＭＳ、リン酸タンパク質阻害−ＰＰ１／ＰＰ２Ａ等が開発された。
【０００５】
現在では、ＭＣを防除するのに種々の方法が使用できる。藻類等の遮断及び吸着等の物理的な方法は、高価であり、効果が長続きせず、藻類の成長を効果的に抑制できない。硫酸銅等を用いる化学的方法は、藻細胞が死滅した後に多量の毒素が放出されるため、人がこれを飲むと肝機能に障害をきたし、二次汚染が生じることがある。緩速砂ろ過と塩素添加とによる飲料水の殺菌は、効果的であるが高価であり、完全に殺菌するのは困難であり、さらに活性炭を添加して濾過する方法も、効果的ではあるが、常に活性炭を交換しなければならず、コストが増加する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、生態学的原理による藻類毒素を阻害するための循環操作可能な方法、とりわけ、被覆により藻類毒素を防除する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明による方法は、耐光性かつ耐水性のプラスチックフィルムを使用して、藻類が成長する前に池の水面を部分的に被覆することにより、藻類毒素を防除する。そして、同じ水試料を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及び／又はＥＬＩＳＡによる検出に供して防除効果を確認するものである。特に、本発明は、 
（１）藻類防除用の試験養魚池を選択する工程、
（２）前記藻類の成長時期を選択する工程、
（３）前記池の水面上に、前記プラスチックフィルムで被覆された固定骨格を作製する工程、および
（４）前記池の所定場所において、試料水を採取し、その試料水をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及び／又はＥＬＩＳＡに供して藻類毒素を検出する工程、
を含んでなるものである。
【発明の効果】
【０００８】
藻類が成長した時点で池を被覆すると、多少藻類の防除に効果があり、水が僅かに透明となるが、藻類が成長する前に被覆すると、藻類毒素の含量が２桁減少し、水が透明となり、且つ水中のクロロフィルが実質的に減少する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明による方法を、以下、図を参照しながら、詳細に説明する。
【００１０】
ＭＣの検出方法
本願発明において、「ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ」とは、液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析を意味する。先ず、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳについて説明する。
【００１１】
前処理
１０ｍｌ試料水を、０．４５μｍ濾過膜で濾過する。濃度１０μｇ／Ｌのエンケファリン内部標準液１００μｌを添加する。添加後、得られた混合物を、流量１ｍｌ／分でＨＬＢカラム（ローディング前にメタノール３ｍｌと水６ｍｌを用いて活性化したもの）に通した。水３ｍｌと２０％メタノール溶液５ｍｌで順次ＨＬＢカラムを洗浄する。全ての洗液を捨てる。１分間減圧吸引して乾固する。メタノール５ｍｌを用いて収集瓶に溶離する。溶離液を１０ｍｌ試験管に集め、５０℃で窒素により乾燥する。５０％メタノール水溶液を用いて容積を１ｍｌとする。
【００１２】
クロマトグラフィーの条件
クロマトグラフィーカラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ３００，Ｃ１８カラム（４．６×７５ｍｍ、粒径３．５μｍ、細孔径３００Å）；カラム温度：３０℃；試料温度：室温；ローディング容積：１０μｌ；流量：０．２ｍｌ／分。移動相の勾配を、表１に示す。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
質量分析条件
ＥＳＩ＋、キャピラリー電圧３．９０ｋＶ、コーンポア電圧５０Ｖ、イオン源温度１００℃、脱溶媒ガス温度３５０℃、脱溶媒ガスの流量４００Ｌ／時間、低端解像度ＬＭレンズ１：１２．０Ｖ、高端解像度ＬＭレンズ１：１２．０Ｖ、入口レンズの電圧１０Ｖ、出口電圧１２Ｖ、低端解像度ＬＭレンズ２：１２．０Ｖ、高端解像度ＬＭレンズ２：１２．０Ｖとした。
【００１５】
ＥＬＩＳＡ
まず、マイクロタイタープレートに、子ウシ血清アルブミンに結合されたミクロシスチン（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ）（ＭＣーＬＲ）を含有する抗原を５０〜１００μｌ／ウエルで塗布し（５０μｌ／ウエルの結合については、日本のＨａｒａｄａ教授により提供されたものであり、１００μｌ／ウエルの結合については、Ｌｉｒｏｎｇ Ｓｏｎｇ教授により提供されたものである）、４℃で一晩保持した。このプレートを、ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ２０（０．０５％ｖ／ｖＰＢＳで希釈）を用いて２回洗浄した。プレートに、０．１％のＮａＮ３を含有する０．５％ゼラチンを、１ウエル当たり１５０μｌ添加することによりブロッキングし、４℃で４０日まで貯蔵した。ＭＣ−ＬＲ標準を、２ｐｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、２００ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、及び２０００ｐｇ／ｍｌに希釈して標準列を調製した。これらの試料列及び標準列を、１：２００００に希釈したモノクローナル抗体と、等容積で混合し、室温で１時間超保持した（モノクローナル抗体は、日本のＵｅｎｏ教授から提供された）。マイクロタイタープレートを除去し、ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮで４回洗浄した。希釈ホースラデイッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを、５０μｌ／ウエル添加し、室温で２時間保持した。このプレートを、ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮを用いて５回洗浄した。基質緩衝液（１０ｍｇ／ｍｌのＴＭＢＺの１Ｍ酢酸緩衝液を、１：１００に希釈し、そこに０．５％Ｈ２Ｏ２を１０μｌ／ｍｌ添加したもの）を、１００μｌ／ウエル添加し、室温で３０分間保持した。２ＮのＨ２ＳＯ４を、５０μｌ／ウエル添加して反応を停止した。ＯＤ値を、プレートリーダーにより４５０ｎｍで測定した。次に、実際の濃度を、標準曲線の対数回帰直線に基づいてＯＤ値から得た。
【００１６】
試験第一段階
上海の青浦にある２つの養魚池（以下、池Ａ及び池Ｂと称する）を選択して、２００４年７月〜２００４年１１月まで被覆することにより藻類の防除試験を実施した。図１は、第一段階での試験を示した図であり、池の位置と被覆後の藻類毒素の防除の状態を示している。
【００１７】
池Ａ及び池Ｂの面積は、それぞれ３１５４平方メートル及び３０３８平方メートルであった。池Ｂの水面上には、傘状の金属骨格を設け、その下に鉄アンカーを設けて骨格を固定し、その周囲を鋼製ワイヤロープで留めた。この骨格の上に、耐光性且つ耐水性のプラスチックフィルム（２ｍ×１ｍ）を複数つなげて、池を覆った。被覆面積は、池水の表面積の２０％であった。この池水の２つの部分を、各々３００平方メートルのプラスチックフィルムで被覆した。池Ａを、比較対照として使用した。試料水を、毎月、各池から、池の対角線に沿って３点から採取し、水面及び水面下０．５メートルから採取した。試料の総数は、６４であった。結果は、以下の表２に示される通りであった。
【００１８】
被覆した池から採取した表面試料中のＭＣの平均量は、比較対照の池のＭＣ平均量よりも低かった。しかしながら、水面下５０ｃｍから採取した試料間の差は、顕著ではなかった。この理由は、被覆したときが藻類の成長のピーク時期であったことにある。しかしながら、水の透明性、クロロフィルＡ等は、明らかに向上していた（図１は、第一段階での試験を示した図であり、池の位置と被覆後の藻類毒素の防除の状態を示している）。
【００１９】
試験第二段階
２００５年４月２７日〜２００５年７月２０日の期間行った。池Ｂを、比較対照として使用し、池Ａを、２６％被覆した。図２は、第二段階の試験を実施した池を示した図である。
【００２０】
被覆した池と比較対照の池から、それぞれ６点試料を採集した。これらのうちの３点は水面で採集し、３点は水面下５０ｃｍで採集した。各池における、ＭＣ含量水温およびｐＨ、クロロフィルＡ及び藻類細胞の数、導電度および透明度、並びにＣＯＤ及びＤＯ分布を図４に示す。これらの間には、２桁の差があった。２つの池の間には、水温とｐＨの差はなかったが、藻細胞数、ＣＯＤ、総窒素、溶解酸素等には、顕著な差があった（図３及び図４を参照）。
【００２１】
この差が測定誤差かどうかを明らかにするために、６４の試料を検出に供し、２種の方法により比較した。
【００２２】
２種の検出法による結果のＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ試験では、ｌｏｇ（ＭＣ−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）値は、両側対照検定で試験したときに正規分布、Ｐ＜０．１２２であった。一方、ｌｏｇ（ＭＣ−ＥＬＩＳＡ）は、異常分布、Ｐ＜０．００１であった。比較のために、便宜上、両方の値を対数に変換した。２つの方法による結果の平均は顕著な差があったが（Ｐ＜０．０１）、中央値は同程度であった。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
二種の測定方法に関する回帰分析
２種の測定法により得られた結果の対数の相関係数はｒ＝０．９３１（Ｐ＜０．０１）であり、相関度は極めて良好であった（Ｒ２＝０．８７）。回帰式は、ｌｏｇ（ＭＣ−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）ｎｇ／ｍｌ＝０．４１＋０．７１ｌｏｇ（ＭＣ−ＥＬＩＳＡ）ｎｇ／ｍｌであった（図５を参照）。
【００２５】
以上の結果から、２種の方法の結果が概ね一致していた。図５によれば、結果は、４５度の角度で相関しており、より低いＭＣ含量でわずかに変動しているだけである。中／高毒素量でのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定の結果は、ほとんどラインより上である。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
表３から明らかなように、２種の方法の一致率は、低毒素量で６２．５％（１０／１６）であり、高毒素量で９３．８％（１５／１６）であり、中毒素量で５０％（１６／３２）であった。ＥＬＩＳＡでの結果は、中毒素量ではより分散していた。
【００２８】
下記の表４に示される、６４の試料の結果からも明らかなように、青浦の養魚池ではＭＣ−ＲＲが主であり、平均的に検出された藻類毒素の６５．４６％を占める。ＭＣ−ＬＲは、１６．１３％である。ＭＣ−ＬＷ及びＭＣ−ＬＦは、それぞれ約９％を占める。
【００２９】
【表４】
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【００３０】
２つの池における藻類防除の試験で得られる結果の動力学的比較
青浦の養魚池において、プラスチックフィルムで池の表面を１／３被覆した試験池をＥ、もう一方の比較対照の池をＣとした。この２つの池の３点を固定し、そこから毎月試料水を採取し、ＭＣを測定した。
【００３１】
図６に示される通り、池を被覆することによる効果は明かであり、ＭＣ含量において、２桁の差があった。特に低濃度でのＥＬＩＳＡ測定の結果が、この事実をより明確に示していると考えられる。
【００３２】
試験池と比較対照の池との動力学的比較から明らかなように、ＭＣ−ＲＲに大きな変化がみられる。図７に示されるように、全ての毒素、とりわけＭＣ−ＲＲの濃度は、比較対照池では１ｐｇ／ｍｌ以上であり、一方、試験池では１ｐｇ／ｍｌ以下である（図７を参照）。
【００３３】
以上の結果より、２種の測定方法の欠点と利点とを比較すると、以下の表５の通りである。
【００３４】
【表５】
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【００３５】
被覆による藻類毒素防除の利点
養魚池試験から、本発明による方法には、以下の利点があることが明らかとなった。１．水体をプラスチックフィルムを用いて部分的に被覆するので、水体の被覆部と非被覆部とは最大１〜２℃の温度差を生じる。この温度差は、水体の対流を促進する。対流する水では藻類が成長しにくいので、藻類の防除を達成できる。
２．プラスチックフィルムの被覆面積は、水体の表面積の約１／３にしか相当しないので、養魚及び水中での作業には影響しない。被覆により、藻類の生存にとって欠かせない光合成が減少し、局部的な水の対流を促進して、藻類毒素の形成がさらに抑制される。
３．被覆は、藻類が成長する前に実施する必要がある。藻類が成長する前に被覆すると、藻類防除に顕著な効果が得られ、水質が向上する。養魚には影響せず、漁獲量は減少しない。水中酸素処理及び他の操作も影響されない。被覆するプラスチックフィルムは、台風にもそれほど影響されない。
４．水中の藻類毒素の量は、ＥＬＩＳＡにより測定できる。したがって、検出コストが減少する。藻類毒素の含量及び種類は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】第一段階の試験を示す図であり、池の位置及び被覆後の藻類毒素の防除の状態を示している。
【図２】第二段階の試験を示す図である。池の位置及び被覆後の藻類毒素の防除の状態を示している。
【図３】２つの池の藻類毒素の含量を示したグラフである。被覆された池における藻類毒素の含量は、被覆されていない池よりも２桁少ない。
【図４】２つの池の間には、クロロフィルＡ、藻細胞数及び透明度の点で顕著な変化があることを示す図である。
【図５】二種のＭＣ測定結果における、回帰分析を示すグラフである。
【図６】２つの検出法の比較と、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる藻類毒素の成分の測定を示す図である。
【図７】２つの池の各種ＭＣ成分の動力学的比較を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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