(57)【要約】【課題】微量核酸を含有する試料に好適で、高い精度で簡便且つ低コストに高いスループットで行える核酸試料の検査方法及び該検査結果の判定方法並びに該判定結果に基づく核酸試料の検査の管理方法を提供する。【解決手段】解析対象核酸を含有している可能性のある試料と、標準核酸を含有する試料とを混合せずに略同一条件下で略同一時に核酸抽出工程に供し、抽出物を混合せずに略同一条件下で略同一時に増幅工程に供し、増幅産物を混合せずに略同一条件下で略同一時に検出工程に供して、解析対象核酸及び標準核酸の増幅産物検出値を確認する核酸試料の検査方法；該検出結果から工程異常の有無を判定し、異常がない場合は、解析対象核酸を含有している可能性のある試料中における解析対象核酸の有無を判定する核酸試料の検査結果の判定方法；該判定結果から工程異常が認められた核酸試料の検査を再度行い、該検査結果の判定を再度行う核酸試料の検査の管理方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
解析対象核酸を含有している可能性のある試料と、標準核酸を含有する試料とを、混合することなく略同一条件下で略同一時に核酸抽出工程に供し、得られた抽出物を、混合することなく略同一条件下で略同一時に増幅工程に供し、得られた増幅産物を、混合することなく略同一条件下で略同一時に検出工程に供して、解析対象核酸および標準核酸の増幅産物の有無を確認することを特徴とする核酸試料の検査方法。
【請求項２】
標準核酸のサイズが解析対象核酸のサイズと略同一であり、標準核酸の試料中における濃度が解析対象核酸の試料中における濃度と略同一であることを特徴とする請求項１に記載の核酸試料の検査方法。
【請求項３】
標準核酸のサイズが解析対象核酸のサイズの０．５〜２．０倍であり、標準核酸の試料中における濃度が解析対象核酸の試料中における濃度の０．５〜２．０倍であることを特徴とする請求項２に記載の核酸試料の検査方法。
【請求項４】
標準核酸のサイズが１００〜３００塩基対であり、かつ該標準核酸の試料中における濃度が１ｐｇ／μｌ〜１μｇ／μｌであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸試料の検査方法。
【請求項５】
核酸抽出工程に供する解析対象核酸を含有している可能性のある試料が複数であり、核酸抽出工程に供する標準核酸が少なくとも一種であり、核酸抽出工程に供する標準核酸を含有する試料が少なくとも一つであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸試料の検査方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法で核酸試料の検査を行った後、標準核酸の検出結果から、前記抽出工程、増幅工程および検出工程のいずれかにおける異常の有無を判定すると共に、異常なしと判定された場合には、解析対象核酸の検出結果から、解析対象核酸を含有している可能性のある試料中における解析対象核酸の有無を判定することを特徴とする核酸試料の検査結果の判定方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法で核酸試料の検査結果の判定を行った後、該判定結果から、前記抽出工程、増幅工程および検出工程のいずれかにおける異常が認められた場合には、前記検査方法で、異常が認められた核酸試料の検査を再度行い、次いで前記判定方法で該検査結果の判定を再度行うことを特徴とする核酸試料の検査の管理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量の核酸を含有する試料に好適な、核酸試料の検査方法および該検査結果の判定方法並びに該判定結果に基づく核酸試料の検査の管理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界的なヒトゲノム解析が近年終了し、ポストゲノム研究として、単一塩基多型やマイクロサテライトの多型などの遺伝子の変異と、疾病または薬剤反応との関連付けが注目されている。特に、死亡率が最も高い悪性新生物（がん）に関しての研究が広く行われており、近年、がん細胞のＤＮＡが、血液中にわずかに漏れ出ていることが明らかにされた（非特許文献１参照）。血中のがん細胞由来のＤＮＡは、血球成分を除いた血漿・血清中に多く存在し、がんの研究対象として血漿試料が解析されることがある（非特許文献１参照）。血漿中のがん細胞由来ＤＮＡ量は、卵巣がんで血漿１μｌ中に総ＤＮＡ量が２．８ｎｇ（非特許文献２参照）、乳がんで血漿１μｌ中に総ＤＮＡ量が２１１ｐｇ（非特許文献３参照）、小細胞肺がんで血漿１μｌ中に総ＤＮＡ量が３９ｐｇ（非特許文献４参照）と非常に少ないことが報告されている。
【０００３】
このような微量ＤＮＡの検出は、当該ＤＮＡを増幅してから行うことが一般的である。遺伝子増幅法として、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（以下、ＰＣＲ法と略記することがある）が広く利用されている（非特許文献５参照）。ＰＣＲ法などの遺伝子増幅法により、存在量が非常に少ない遺伝子を単離および増幅することができるので、このような遺伝子の検出を容易にすることができる。
【０００４】
代表的な遺伝子の解析工程は、試料から解析対象核酸を抽出する工程、抽出物を増幅する工程および増幅産物を検出する工程から構成されている。核酸抽出方法としては、プロテアーゼＫ／フェノール法（非特許文献６参照）や、核酸が特定の条件下において珪素酸化物（シリカ）に結合する特性を応用した、スピンカラムやマイクロプレートなどを備える核酸抽出キットや核酸抽出自動化装置を用いる方法が広く知られている（特許文献１〜５参照）。
増幅方法としては、ＰＣＲ法（特許文献６および７参照）、核酸配列基準増幅法（以下、ＮＡＳＢＡ法と略記する）（特許文献８参照）などが公知であり、バイオ分野および医療分野で頻繁に利用されている。さらに競合増幅、またはマルチプレックス増幅を利用した増幅法もよく知られている。
検出方法としては、ゲル電気泳動による核酸断片長解析、ＤＮＡマイクロアレイ解析、シークエンシング法、高速液体クロマトグラフィー分析、質量分析などが知られている。中でもキャピラリー電気泳動による核酸断片長解析は、遺伝子多型の一種であるマイクロサテライト解析によく利用されている。
【０００５】
このような複雑な複数の工程を実施していく上で重要なことは、一連の核酸抽出、増幅および検出工程が正常に行われるように管理することであり、これらの工程における異常の有無は、適切な標準物質を用いて確認することができる。
このような工程異常の有無を確認する従来技術としては、核酸抽出、増幅および検出の各工程を、工程ごとに異なる種類の内部標準核酸を解析対象核酸と共存させて行い、内部標準核酸の検出の成否を確認する方法が挙げられる（特許文献９参照）。
【特許文献１】特表平１０−５０４８３４号公報
【特許文献２】特表平９−５０５７２４号公報
【特許文献３】特開平８−３２０２７４号公報
【特許文献４】特開平９−３０４３８５号公報
【特許文献５】特許第２８０７０９０号公報
【特許文献６】米国特許４，６８３，１９５号明細書
【特許文献７】米国特許４，６８３，２０２号明細書
【特許文献８】欧州特許０，３２９，８２２号明細書
【特許文献９】国際公開第２００２／０２４９４９号パンフレット
【非特許文献１】Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，５１：１，１１３−１１８，２００５
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４  Ｊｕｌ  １；１０（１３）：４４２０−６．
【非特許文献３】Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．２００２  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；９（１）：７１−６．
【非特許文献４】Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９６  Ｓｅｐ；２（９）：１０３３−５．
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｖｏｌ．２３９，ｐｐ．４８７−４９１（１９８８）
【非特許文献６】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｅ３−Ｅ４．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献９に記載の方法は、操作が複雑であるという問題点がある。これについて図５および６を用いて詳しく説明する。
図５は、特許文献９に記載の方法をはじめとする、従来法の手順を例示するフローチャートであり、図６は、手順を説明するための説明図である。
従来法においては、解析対象核酸とは異なる種類の内部標準核酸を、核酸抽出、増幅および検出の各工程ごとに用いる必要があるので、少なくとも三種類の内部標準核酸を用意しなければならない。また、内部標準核酸は、解析対象核酸の全検体に添加する必要があるため、相当量を用意しなければならない。さらに、各内部標準核酸を分離および検出してから検出結果の判定を行わなければならない。したがって、内部標準核酸を用意するためのコストや手間がかかり、実施段階においても内部標準核酸を全解析対象核酸に添加するのに時間を要し、検出結果の判定にも時間を要する。すなわち、スループットが低く、安価で簡便に解析を行うことが困難であるという問題点があった。また、特許文献９には、内部標準核酸としてどのようなものが使用できるか具体的な記載がない。
【０００７】
さらに、特許文献９に記載の方法をはじめとする従来の方法は、用いる核酸試料の濃度が比較的高濃度であることを前提としたものである。すなわち、前述のがん細胞由来ＤＮＡを含有する血漿のような、例えば、数ｐｇ／ｌ〜数μｇ／ｌのような濃度が極めて小さい核酸試料を用いることを考慮したものではない。例えば、解析対象核酸としてこのような微量核酸を用いて、内部標準核酸共存下で増幅工程を行うと、内部標準核酸が解析対象核酸をよりも相対的に多量に存在する場合には、内部標準核酸が先に増幅されてしまい、解析対象核酸が増幅されにくくなるということがある。したがって、解析対象核酸が存在するにもかかわらず検出されないという工程異常が発生しているのに、内部標準核酸が正常に検出されているので、抽出、増幅および検出の各工程が正常に行われたと誤判定されてしまうという問題点があった。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、微量の核酸を含有する試料に好適であり、高い精度で、しかも簡便且つ低コストに高いスループットで行うことができる核酸試料の検査方法および該検査結果の判定方法並びに該判定結果に基づく核酸試料の検査の管理方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、解析対象核酸を含有している可能性のある試料と、標準核酸を含有する試料とを、混合することなく略同一条件下で略同一時に核酸抽出工程に供し、得られた抽出物を、混合することなく略同一条件下で略同一時に増幅工程に供し、得られた増幅産物を、混合することなく略同一条件下で略同一時に検出工程に供して、解析対象核酸および標準核酸の増幅産物の有無を確認することを特徴とする核酸試料の検査方法である。
請求項２に記載の発明は、標準核酸のサイズが解析対象核酸のサイズと略同一であり、標準核酸の試料中における濃度が解析対象核酸の試料中における濃度と略同一であることを特徴とする請求項１に記載の核酸試料の検査方法である。
請求項３に記載の発明は、標準核酸のサイズが解析対象核酸のサイズの０．５〜２．０倍であり、標準核酸の試料中における濃度が解析対象核酸の試料中における濃度の０．５〜２．０倍であることを特徴とする請求項２に記載の核酸試料の検査方法である。
請求項４に記載の発明は、標準核酸のサイズが１００〜３００塩基対であり、かつ該標準核酸の試料中における濃度が１ｐｇ／μｌ〜１μｇ／μｌであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸試料の検査方法である。
請求項５に記載の発明は、核酸抽出工程に供する解析対象核酸を含有している可能性のある試料が複数であり、核酸抽出工程に供する標準核酸が少なくとも一種であり、核酸抽出工程に供する標準核酸を含有する試料が少なくとも一つであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸試料の検査方法である。
請求項６に記載の発明は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法で核酸試料の検査を行った後、標準核酸の検出結果から、前記抽出工程、増幅工程および検出工程のいずれかにおける異常の有無を判定すると共に、異常なしと判定された場合には、解析対象核酸の検出結果から、解析対象核酸を含有している可能性のある試料中における解析対象核酸の有無を判定することを特徴とする核酸試料の検査結果の判定方法である。
請求項７に記載の発明は、請求項６に記載の方法で核酸試料の検査結果の判定を行った後、該判定結果から、前記抽出工程、増幅工程および検出工程のいずれかにおける異常が認められた場合には、前記検査方法で、異常が認められた核酸試料の検査を再度行い、次いで前記判定方法で該検査結果の判定を再度行うことを特徴とする核酸試料の検査の管理方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、試料中における含有量が微量でも、解析対象核酸の検査を、高い精度で、しかも簡便且つ低コストに高いスループットで行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について、詳しく説明する。
（核酸試料の検査方法）
本発明において解析対象核酸とは、増幅工程に供した時に増幅可能なＤＮＡであれば、特に限定されない。例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ等を含む全てのＤＮＡまたはその類似体であり、生体に由来するものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。なかでも、生体に由来するものとして、がん細胞由来のＤＮＡが好適である。
そして、解析対象核酸を含有している可能性のある試料としては特に限定されないが、好ましいものとして、例えば、生体組織、血液、血漿、血清、体液、尿、細胞、細菌、ウイルスなどを含む生体試料が挙げられる。また、解析対象核酸を含有している可能性のある試料は、従来公知の方法で採取したものを用いれば良い。
【００１２】
また、標準核酸としては、前述の解析対象核酸と同様のものを用いることができ、特に限定されない。ただし、試料からの抽出、増幅および検出が、解析対象核酸の検査に適用しようとする方法で、正常に行えることが確認されているものが好ましく、さらにサイズが既知のものがより好ましい。抽出、増幅および検出が正常に行えることが確認されていれば、解析対象核酸と同一でも良い。ここで、核酸のサイズとは、核酸の塩基対の数を指し、これは以下においても同様である。そして、標準核酸を含有する試料は、解析対象核酸を含有している可能性のある試料と同様の方法で採取しても良いし、別途単離した標準核酸を、適切な濃度の溶液に調製することで得ても良い。
【００１３】
本発明の核酸抽出工程（以下、抽出工程と略記することがある）においては、標準核酸を含有する試料からは、少なくとも標準核酸が抽出される。そして、解析対象核酸を含有している可能性のある試料に実際に解析対象核酸が含有されていれば、少なくとも解析対象核酸が抽出される。抽出工程に供する解析対象核酸を含有している可能性のある試料は、一つの水準につき複数であることが好ましく、これらについては、引き続き増幅および検出工程まで行うと、後述する検査結果の判定が容易となる。そして、これら複数の試料は、本発明の効果を損なわない範囲で数を多くすることが好ましい。
【００１４】
本発明の検査方法においては、解析対象核酸を含有している可能性のある試料と、標準核酸を含有する試料とを、互いに混合することなく別々に、核酸抽出工程に供する。続いて、得られた抽出物は、別々のまま混合することなく増幅工程に供し、得られた増幅物も、別々のまま混合することなく検出工程に供する。すなわち、抽出、増幅および検出の各工程において、標準核酸は、常に解析対象核酸と混合されることがない。そして、抽出工程で標準物質として用いた標準核酸を、増幅工程および検出工程においても引き続き標準物質として用いるので、抽出〜検出の各工程において、その都度種類の異なる標準核酸を用いる必要がない。
【００１５】
また、解析対象核酸を含有している可能性のある試料と、標準核酸を含有する試料とは、略同一条件下で略同一時に抽出工程に供される。そして、それぞれの抽出物は、略同一条件下で略同一時に増幅工程に供され、それぞれの増幅産物は、略同一条件下で略同一時に検出工程に供される。したがって、解析対象核酸と標準核酸とは、略同一のプロセスを経るので、従来法のように、内部標準核酸を解析対象核酸と共存させなくても、標準核酸の検出が正常か否かを確認することで、核酸試料の検査が正常に行われたか否かを確認することができる。
【００１６】
なお本発明において、検出が正常であるとは、判別に十分な強度で核酸のシグナルが検出されることを指す。また、核酸のサイズが判明している場合には、検出されたサイズがこのサイズと一致することも指す。
【００１７】
また、略同一条件とは、実質的に条件が同一であることを示す。具体的には、解析対象核酸を含有する試料と標準核酸を含有する試料のいずれもが正常である場合に、これらの試料に対して同等の効果を奏するように、解析対象核酸と標準核酸との間で工程ごとに条件の誤差が小さいことを示す。ここで工程条件とは、具体的には、温度、時間、濃度、抽出操作等を指す。
【００１８】
また、略同一時とは、実質的に同一時であることを示す。具体的には、解析対象核酸を含有する試料と標準核酸を含有する試料のいずれもが正常である場合に、これらの試料に対して同等の効果を奏するように、解析対象核酸と標準核酸との間で各工程を行うタイミングの誤差が小さいことを示す。
【００１９】
本発明においては、標準核酸と解析対象核酸とは常に混合されることがない。したがって、内部標準核酸と解析対象核酸とを共存させる従来の方法とは異なり、標準核酸と解析対象核酸は、抽出〜検出の各工程において互いに影響を及ぼすことがないので、試料中の標準核酸および／または解析対象核酸が微量でも、核酸試料の検査を高い精度で行うことができる。例えば、増幅工程においては、共存している内部標準核酸と解析対象核酸のいずれか一方の濃度が比較的大きくなると、濃度の大きい方の核酸が優先的に増幅されてしまい、濃度の小さい方の核酸は増幅され難くなってしまう。本発明では、このような不都合を伴うことが無い。
【００２０】
また、本発明においては、標準物質として抽出工程で用いた標準核酸を、増幅工程および検出工程においても引き続き標準物質として用いるので、抽出〜検出の各工程を大幅に簡略化することができる。これについて、図１および２を用いて詳しく説明する。図１は本発明の検査方法の手順を例示するフローチャートであり、図２は、手順を説明するための説明図である。
【００２１】
図５および６に示す従来法とは異なり、本発明の検査方法では、増幅工程および検出工程において、抽出工程で用いたものとは異なる種類の標準核酸を新たに用いる必要がない。すなわち、用いる標準核酸は、検査一回あたり少なくとも一種だけでよい。そして、標準核酸を含有する試料は、検査一回あたり少なくとも一つで良いので、用意する標準核酸の量も少なくて済む。これにより、分離および検出が必要な標準核酸の数も少なくて済む。したがって、簡便且つ低コストに標準核酸を用意することができ、実施段階においても、抽出〜検出の工程所要時間および検出結果の判定所要時間を大幅に短縮することができる。すなわち、本発明の検査方法は、ハイスループットであり、安価で簡便に検査を行うことができる。この効果は、検査に供する解析対象核酸を含有している可能性のある試料の数が多いほど顕著となる。
【００２２】
本発明においては、解析対象核酸を含有している可能性のある試料と標準核酸を含有する試料についても、これら試料の同一性が高い方が好ましい。ここで試料の同一性とは、例えば、試料中の成分組成の誤差、試料の濃度および量の誤差が、解析対象核酸と標準核酸との間で小さいことを指す。
【００２３】
具体的には、標準核酸のサイズは、解析対象核酸のサイズと略同一であることが好ましく、解析対象核酸のサイズの０．５〜２．０倍であることがより好ましい。
また、標準核酸の試料中における濃度は、解析対象核酸の試料中における濃度と略同一であることが好ましく、解析対象核酸の試料中における濃度の０．５〜２．０倍であることがより好ましい。
そして、標準核酸のサイズが解析対象核酸のサイズと略同一であり、かつ標準核酸の試料中における濃度が解析対象核酸の試料中における濃度と略同一であることがより一層好ましく、標準核酸のサイズが解析対象核酸のサイズの０．５〜２．０倍であり、かつ標準核酸の試料中における濃度が解析対象核酸の試料中における濃度の０．５〜２．０倍であることが特に好ましい。
【００２４】
本発明は、標準核酸および／または解析対象核酸として、その試料中における濃度が、例えば、１ｐｇ／μｌ〜１μｇ／μｌ程度と極めて小さいものに対しても好適である。従来、増幅および検出を行うために抽出に供される核酸の試料中における濃度は、少なくとも概ね数十ｎｇ／μｌ〜数μｇ／μｌ程度であったが、従来公知の方法では用いることが困難であった微量の核酸を含有する試料も、本発明の検査方法には用いることができる。
そして、本発明は、標準核酸および／または解析対象核酸として、例えば、１００〜３００塩基対程度と、サイズの小さいものに対しても好適である。
このようなサイズの小さい微量の解析対象核酸を含有する試料としては、例えば、血液から分離した、がん細胞由来のＤＮＡを含有する血漿等を挙げることができる。
【００２５】
試料中に含有される解析対象核酸が微量である場合には、用いる標準核酸の試料中における含有量も微量であることが好ましい。したがって、解析対象核酸の試料中における濃度が、例えば、１ｐｇ／μｌ〜１μｇ／μｌである場合には、標準核酸の試料中における濃度も、１ｐｇ／μｌ〜１μｇ／μｌであることが好ましい。
そして、解析対象核酸のサイズが小さい場合には、用いる標準核酸のサイズも小さい方が好ましい。したがって、解析対象核酸のサイズが、例えば、１００〜３００塩基対である場合には、標準核酸のサイズも、１００〜３００塩基対であることが好ましい。
すなわち、サイズが１００〜３００塩基対の標準核酸を、１ｐｇ／μｌ〜１μｇ／μｌの濃度で含有する試料を用いれば、従来公知の方法では、用いることが最も困難であった、１００〜３００塩基対の解析対象核酸を１ｐｇ／μｌ〜１μｇ／μｌの濃度で含有する試料も、本発明では好適に用いることができる。
【００２６】
本発明において、抽出工程、増幅工程および検出工程としては、従来公知の方法を適用すれば良く、特に限定されない。
抽出工程においては、例えば、血液を遠心分離し血漿を採取して、これを、解析対象核酸を含有している可能性のある試料または標準核酸を含有する試料とすることができる。続いて市販の各種ＤＮＡ検出キットを用いて、血漿から解析対象核酸または標準核酸を抽出することができる。なお、用いる試料は血漿に限定されず、その他のものを用いることもできるし、抽出工程もここに示すものに限定されるものではない。
【００２７】
抽出工程に供する、解析対象核酸を含有している可能性のある試料の数は特に限定されず、一つでも複数でも良い。複数であれば、例えば、９６ウェルプレートのような、抽出〜検出の各工程を行う容器が複数一体に設けられたもの（以下、ウェルプレート状容器と略記する）を用いても良いし、例えば、チューブ状容器を複数個、別々に用いても良い。抽出工程に供する、解析対象核酸を含有している可能性のある試料が一つの場合でも、このような容器を用いることができるのは言うまでもない。
【００２８】
一方、抽出工程に供する、標準核酸を含有する試料の数は、検査一回につき少なくとも一つで良い。そして、例えば、ウェルプレート状容器を用いる場合には、解析対象核酸を含有している可能性のある試料が添加されていない少なくとも一つのウェルに、標準核酸を含有する試料を添加すれば良い。一回の検査で複数のウェルプレート状容器を用いる場合には、ウェルプレート状容器一つごとに、少なくとも一つのウェルに標準核酸を含有する試料を添加しても良いし、ウェルプレート状容器一つのみに、少なくとも一つの標準核酸を含有する試料を添加しても良い。
【００２９】
チューブ状容器を用いる場合には、解析対象核酸を含有している可能性のある試料だけが添加されている容器以外に、標準核酸を含有する試料だけが添加されている容器を少なくとも一つ準備すれば良い。これについて、図３を用いて説明する。図３は、本発明の一実施形態として、チューブ状容器を用いて、試料入りの各容器を一本ずつ抽出〜検出の各工程に供する方法を説明する説明図である。例えば、図３（ａ）に示すように、標準核酸を含有する試料を一つ用いて、該試料を最初に各工程に供する方法が挙げられる。また好ましい方法としては、例えば、図３（ｂ）に示すように、標準核酸を含有する試料を複数用いて、該試料を、解析対象核酸を含有している可能性のある試料を複数間に挟むように、順次各工程に供する方法が挙げられる。このようにすることで、核酸試料の検査をより高精度に行うことができる。
【００３０】
また、いずれの容器を用いる場合であっても、用いる標準核酸は、少なくとも一種類で良い。
【００３１】
増幅工程においては、例えば、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等の従来公知の増幅方法を適用することができるが、ＰＣＲ法が好ましく、マルチプレックスＰＣＲ法等も用いることができる。
【００３２】
検出工程においては、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により、増幅産物を分離した後、エチジウムブロマイドにより核酸を染色して、ＵＶ照射した時の蛍光を検出する方法が適用できる。あるいは、キャピラリー電気泳動により、解析対象核酸および標準核酸の分離を行った後、インターカレーターを用いて検出する方法を適用しても良い。または、ここに挙げた方法以外の方法を適用しても良い。これらの中でも、特に、解析対象核酸および標準核酸が微量である場合には、キャピラリー電気泳動により分離および検出する方法が好ましい。
【００３３】
このようにして、標準核酸および解析対象核酸の増幅産物の有無を確認することで、核酸試料の検査を行うことができる。検出にあたっては、標準核酸および解析対象核酸のピークの有無により、これら核酸の増幅産物の有無を確認し、有る場合には、そのピークの強度から増幅産物の量を比較しても良い。また、電気泳動ではその泳動距離から分子サイズが求められるので、例えば、塩基対数を確認することもできる。検出工程で、標準核酸および解析対象核酸のいずれもが検出された場合には、用いた核酸試料および抽出〜検出の各工程に異常がなかったと判断できる。
【００３４】
本発明の検査方法は、例えば、解析対象核酸として遺伝子多型を含む塩基配列の核酸を選択すれば、遺伝子多型の解析に好適である。
遺伝子多型とは、ヒト染色体の遺伝的多型であり、遺伝子上の塩基配列の個体差に由来する。平均して数百塩基に一ヶ所程度、このような遺伝子多型が存在すると言われており、遺伝子多型を解析することにより、父方由来の染色体（アリル）と母方由来の染色体（アリル）を区別することができる。したがって、遺伝子多型を利用し、ヘテロ接合体における一方のアリルの消失（Ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ：ＬＯＨ）を測定すれば、遺伝子の欠失を検出することができる。しかし、一塩基の置換による遺伝子多型は、ヘテロ接合体である頻度が最大でも５０％であり、一つの遺伝子の欠失を調べるためには、ヘテロ接合体の出現頻度の高い、複数の遺伝子多型を組み合わせるのが望ましい。また、遺伝子多型には人種差が存在するので、欠失を診断したい遺伝子の中から、その人種で出現頻度の高い遺伝子多型を選択する必要がある。
【００３５】
（核酸試料の検査結果の判定方法）
本発明においては、上記の核酸試料の検査方法で得られた検査結果から、用いた核酸試料および抽出〜検出の各工程における異常の有無を、より詳しく判定することができる。
解析対象核酸と標準核酸とは、抽出〜検出の各工程で略同一のプロセスを経る。したがって、標準核酸を含有する試料の品質に異常がないことが確認されていれば、標準核酸が正常に検出されれば、解析対象核酸を含有している可能性のある試料および標準核酸を含有する試料のいずれについても、抽出〜検出の各工程が正常に行われたと判定される。したがって、この時、解析対象核酸も正常に検出されれば、解析対象核酸を含有している可能性のある試料中に、実際に解析対象核酸が含有されていたと判定される。
【００３６】
また、標準核酸が正常に検出されているのに、解析対象核酸が正常に検出されなければ、解析対象核酸を含有している可能性のある試料中に、解析対象核酸は含有されていなかったと判定される。この場合は、解析対象核酸を含有している可能性のある試料を抽出に供する以前、すなわち、採取された試料にその原因があることが判る。具体的には、例えば、（ｉ）抽出工程に供した試料中に解析対象核酸が全くあるいはほとんど含有されていなかった、（ｉｉ）試料中の解析対象核酸が、抽出工程に供する前に分解していた、（ｉｉｉ）試料中に、抽出〜検出のいずれかの工程を阻害する不純物が混入していた、ことなどが考えられる。前記（ｉ）の場合はさらに、（ｉ−ａ）元来、試料中に解析対象核酸が全くあるいはほとんど含有されていない場合、（ｉ−ｂ）試料の準備の過程に異常があって、含有されているべき解析対象核酸が試料中に含有されていない場合、などが考えられる。
【００３７】
（ｉ−ａ）および（ｉ−ｂ）を区別する方法としては、該当する水準一つにつき複数の試料を用意し、これらを用いて本発明の方法で検査を行うことが挙げられる。（ｉ−ａ）である場合には、これら複数の試料からは、いずれも解析対象核酸は検出されない。一方、（ｉ−ｂ）である場合には、これら複数の試料のうちいくつかからは解析対象核酸が検出され、いくつかからは解析対象核酸が検出されない可能性が高い。したがって、本発明の方法により検査を行う場合には、あらかじめ解析対象核酸を含有している可能性のある試料を、一つの水準につき複数用意しておき、これらを検査に供すれば、上記の確認の手間が省けるので好ましい。
【００３８】
一方、標準核酸および解析対象核酸のいずれもが正常に検出されなければ、抽出〜検出の各工程のいずれかにおいて異常があったと判定される。この場合は、例えば、異常が認められた試料について、抽出物および増幅産物を検出工程に供すれば、異常が生じた工程を特定することができる。
【００３９】
標準核酸を含有する試料は、適切に品質管理を行い、検査の前にその品質に異常がないことを確認しておけば、本発明の検査方法はより信頼性の高いものとなる。例えば、標準核酸を含有する試料の保存は、核酸の種類にもよるが４℃以下で行うことが好ましく、品質異常の有無の確認は、電気泳動等により、検出シグナルの変化の有無を観察することで行えば良い。
【００４０】
（核酸試料の検査の管理方法）
本発明においては、上記の核酸試料の検査結果の判定方法で得られた判定結果から、前記抽出工程、増幅工程および検出工程のいずれかにおける異常が認められた場合には、本発明の方法で、異常が認められた核酸試料の検査を再度行い、次いで本発明の方法で該検査結果の判定を再度行うことで、核酸試料の検査の管理を行うことができる。
【００４１】
工程異常が認められた核酸試料の再検査は、異常が生じた工程が特定されていれば、少なくとも異常が生じた工程以降の工程について行っても良いが、抽出〜検出の各工程を再度行うことが好ましい。
一方、解析対象核酸を含有している可能性のある試料中に解析対象核酸が無いと判定された場合には、先に述べた通り、該当する水準一つにつき、好ましくは複数の試料を再度用意し、本発明の方法で再度検査および判定を行えば良い。これにより、解析対象核酸が検出されなかった原因を特定することができる。
【００４２】
以上の説明のように、本発明によれば、高い精度で、しかも簡便且つ低コストに高いスループットで、核酸試料の検査、該検査結果の判定および核酸試料の検査の管理を行うことができる。そして、本発明は、従来法では用いることが困難であった、微量の核酸を含有する試料に特に好適である。
【実施例】
【００４３】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
[実験例１]
血漿中の核酸含有量を調べるため、健常人血漿試料中に含まれる核酸の量を測定した。具体的には、健常人由来試料９６検体を用いて、直ちに血液から血漿を遠心分離および採取し、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐ７５８９）を用いてＤＮＡ量を測定した。その結果、血漿１ｍｌ中の総ＤＮＡ含有量が平均１．７ｎｇであることが明らかになった。がん患者由来の血漿中のＤＮＡ含有量は、健常人より１０倍〜１００倍程度多いことが知られているが、どちらの血漿中のＤＮＡ含有量も、一般の血液中のＤＮＡ含有量に比べて非常に少ないことが判明した。
【００４４】
［実施例１］
（標準核酸を含有する試料の調製）
健常人５１人、がん患者４５人より５ｍｌの血液を採取し、抗凝固剤入試験管に添加した。その後、（１）３０００ｒｐｍで１０分間、４℃にて遠心分離を行い、上清（血漿）を別の試験管に採取した。さらに、（１）の遠心分離を再度繰り返し、血漿を精製した。精製された血漿から、Ｑｉａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ （５１１８３、ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して、ＤＮＡの抽出を行った。血漿から抽出したＤＮＡをＳｐｅｅｄｖａｃ（ＡＥＳ１０１０、ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ社製）を使用して濃縮し、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ（Ｐ７５８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて、プレートリーダーでＤＮＡ濃度を計測した。そして、計測後の抽出ＤＮＡを−８０℃で保存した。
この濃度既知の抽出ＤＮＡを電気泳動して泳動位置を確かめると、２００塩基対付近にバンドが現れたため、２００塩基対程度のサイズであることがわかった。そして、この抽出ＤＮＡを標準核酸として１００ｐｇ／μｌ程度に調製し、一定濃度でサイズ既知の標準核酸を含有する試料とした。
【００４５】
（解析対象核酸を含有する試料の調製）
解析対象の健常人５１人、がん患者４５人より、５ｍｌ程度の血液を採取し、それ以外は標準核酸調製時と同様の方法で、血漿およびバフィーコートの分離を行い、解析対象核酸を含有する試料を調製した。
【００４６】
（核酸の抽出）
得られた解析対象核酸を含有する試料と、前述の標準核酸を含有する試料とを、それぞれ別の容器に採取して、標準核酸調製時と同様の条件で同時にＤＮＡの抽出操作を行った。標準核酸を含有する試料は、一回の抽出単位ごとに一つ用いた。
【００４７】
（核酸の増幅）
マイクロサテライトマーカーＤ１３Ｓ１５３をデータベース（ＵｎｉＳＴＳ．  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｔｓ／）から選択した。そして、まずＰＣＲ増幅の条件設定を行った。すなわち、ＰＣＲ反応試薬として、配列番号１および２に示す塩基配列からなるプライマーを各０．２５ｐＭ、各ヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）を各４ｎＭ、Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＲＲ００１Ａ、ＴＡＫＡＲＡ社製）を０．５Ｕ混合したものを調製した。これに前述の標準核酸を含有する試料を１μｌ加えて、９６ウェルプレートで総量２０μｌとして、下記（Ａ）のように温度を変化させてＰＣＲ増幅を行った。そして、得られた増幅産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、下記（Ｂ）の温度条件の時、増幅が最も良好に進行し、配列番号３に示す塩基配列からなる１２１塩基対の増幅産物が得られることを確認した。
そこで、標準核酸を含有する試料からの抽出物１μｌと、解析対象核酸を含有する試料からの抽出物１μｌ、そしてネガティブコントロールとして水１μｌを、それぞれ別々に９６ウェルプレートの各ウェルに採取して、前記ＰＣＲ反応試薬と混合し、総量２０μｌとした。そして、下記（Ｂ）の温度条件で同時にＰＣＲ増幅操作を行った。操作終了後、得られた各増幅産物は４℃で保存した。
（Ａ）９５℃／１分→（９５℃／３０秒→５０℃〜７０℃／３０秒→７２℃／３０秒）×３０サイクル
（Ｂ）９５℃／１分→（９５℃／３０秒→６０℃／３０秒→７２℃／３０秒）×３０サイクル
【００４８】
（遺伝子多型の検出）
９６ウェルプレートに前記各増幅産物を１μｌずつとり、Ｈｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＡＢＩ，４３１１３２０）９．５μｌおよびＧｅｎｅＳｃａｎ−５００ＲＯＸ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＡＢＩ，４０１７３４Ｅ）０．５μｌを加えて希釈し、該希釈物をキャピラリー電気泳動装置（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１００Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，アプライドバイオシステムズ社製）に供して、同時に核酸の検出を行った。
【００４９】
（遺伝子多型解析結果の判定）
検出結果の一部を図４に示す。標準核酸の検出結果を解析したところ、図４（ａ）に示すように、標準核酸のピークが観測され、ピーク判別に十分なシグナル強度が得られた。これに対して、図４（ｃ）に示すように、ネガティブコントロールの場合にはピークが観測されなかった。一方、解析対象核酸の検出結果を解析したところ、図４（ｂ）に示すように、配列番号４に示す塩基配列からなる解析対象核酸のピークも標準核酸と同様に、ピーク判別に十分なシグナル強度で得られた。標準核酸、解析対象核酸とも十分なシグナル強度で検出でき、表１の結果１に示す結果となった。すなわち、試料中には微量の解析対象核酸が含まれ、試料の品質には異常が無く、検査プロセスにも異常が無いと判定した。この一連の検査および判定を２５回繰り返して行ったところ、２５回中２３回は結果１となった。
【００５０】
［実施例２］
実施例１に示した検査および判定を２５回行ったうちの１回では、標準核酸および解析対象核酸のいずれも十分なシグナル強度でピークを観測できず、表１の結果３に示す結果となった。標準核酸が正常に検出できていないことから、図１に示すフローチャート中の、核酸抽出工程以降の工程（抽出、増幅、検出）のいずれかに異常があったと判定した。
【００５１】
［実施例３］
実施例１に示した検査および判定を２５回行ったうちの１回では、標準核酸を十分なシグナル強度で検出できたものの、解析対象核酸は十分なシグナル強度でピークを観測できず、表１の結果２に示す結果となった。標準核酸が正常に検出できているので、図１に示すフローチャート中の、抽出工程以降の工程（抽出、増幅、検出）に異常はなく、試料を抽出工程に供する以前の段階、すなわち、解析対象核酸を含有する試料の品質に異常があったと判定した。
【００５２】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、多数の核酸試料、特に微量の核酸を含有する試料の解析を行う医療関連分野において有用であり、臨床検査等の簡便化、低コスト化等に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の検査方法の手順を例示するフローチャートである。
【図２】本発明の検査方法の手順の一例を説明するための説明図である。
【図３】チューブ状容器を用いた場合の、本発明の検査方法の実施形態例を説明する説明図である。
【図４】実施例１における標準核酸および解析対象核酸の検出結果を示すグラフである。
【図５】従来の検査方法の手順を例示するフローチャートである。
【図６】従来の検査方法の手順の一例を説明するための説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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