(57)【要約】【課題】重量平均分子量が１００万Ｄａ以上のグリコーゲンを提供すること【解決手段】重量平均分子量が１００万Ｄａ以上のグリコーゲンが提供される。このグリコーゲンに５０Ｕ／ｇ基質のプルラナーゼを６０℃で３０分間作用させた場合に得られる生成物をＭＡＬＬＳ法によって分析した場合の重量平均分子量は５０万Ｄａ以上であり、かつ、このグリコーゲンに３００Ｕ／ｇ基質のα−アミラーゼを３７℃で３０分間作用させた場合に得られる生成物をＭＡＬＬＳ法によって分析した場合の重量平均分子量は５０万Ｄａ以上である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量平均分子量が１００万Ｄａ以上のグリコーゲンであって、
該グリコーゲンに５０Ｕ／ｇ基質のプルラナーゼを６０℃で３０分間作用させた場合に得られる生成物をＭＡＬＬＳ法によって分析した場合の重量平均分子量が５０万Ｄａ以上であり、かつ該グリコーゲンに３００Ｕ／ｇ基質のα−アミラーゼを３７℃で３０分間作用させた場合に得られる生成物をＭＡＬＬＳ法によって分析した場合の重量平均分子量が５０万Ｄａ以上である、グリコーゲン。
【請求項２】
請求項１に記載のグリコーゲンの製造方法であって、
グリコーゲンを合成する能力を有するブランチングエンザイムを溶液中で基質に作用させて、グリコーゲンを生産する工程を包含し、
該基質が、主にα−１，４−グルコシド結合で連結された重合度４以上のα−グルカンであり、該基質が、澱粉枝切り物、デキストリン枝切り物または酵素合成アミロースであり、反応開始前の該溶液中の糖の数平均分子量が１８０より大きく１５０，０００以下であり、該グリコーゲンの重量平均分子量が１００万Ｄａ以上であり、
該グリコーゲンに５０Ｕ／ｇ基質のプルラナーゼを６０℃で３０分間作用させた場合に得られる生成物をＭＡＬＬＳ法によって分析した場合の重量平均分子量が５０万Ｄａ以上であり、かつ該グリコーゲンに３００Ｕ／ｇ基質のα−アミラーゼを３７℃で３０分間作用させた場合に得られる生成物をＭＡＬＬＳ法によって分析した場合の重量平均分子量が５０万Ｄａ以上であり、
該方法においては、α−グルカンホスホリラーゼまたはグリコーゲン合成酵素のいずれも使用せず、該ブランチングエンザイムのブランチングエンザイム活性／アミロペクチン低分子化活性が、１以上４６６以下であり、ただし、該ブランチングエンザイムが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のいずれのアミノ酸配列も有さない、方法。
【請求項３】
前記ブランチングエンザイムのブランチングエンザイム活性／アミロペクチン低分子化活性が、３５以上４６６以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ブランチングエンザイムが、耐熱性ブランチングエンザイムである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ブランチングエンザイムが、好熱性菌または中温性菌由来である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ブランチングエンザイムが、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからなる群より選択される細菌に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ブランチングエンザイムが、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５株、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ９７８５株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＲＢＥ１４株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ  ＩＦＯ１５３１５株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＩＦＯ１５３１３株およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株からなる群より選択される細菌株に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ブランチングエンザイムの反応至適温度が、４５℃以上９０℃以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記反応開始前の溶液中の糖の数平均分子量が、１８０より大きく４，０００未満である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応開始前の溶液中の糖の数平均分子量が、４，０００以上８，０００未満であり、前記ブランチングエンザイムの使用量と反応時間との積が２５，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上になるように該ブランチングエンザイムの使用量と反応時間とを調整する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応開始前の溶液中の糖の数平均分子量が、８，０００以上１００，０００未満であり、前記ブランチングエンザイムの使用量と反応時間との積が４０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上になるように該ブランチングエンザイムの使用量と反応時間とを調整する、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応開始前の溶液中の糖の数平均分子量が、１００，０００以上１５０，０００以下であり、前記ブランチングエンザイムの使用量と反応時間との積が１５０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上になるように該ブランチングエンザイムの使用量と反応時間とを調整する、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
数平均分子量が１８０より大きく１，５００未満のα−グルカンに４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させることにより、前記基質を生産する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記４−α−グルカノトランスフェラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のアミロマルターゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記数平均分子量が１８０より大きく１，５００未満のα−グルカンが、重合度４〜７のマルトオリゴ糖を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
数平均分子量５００以上の低分岐α−グルカンに枝切り酵素を作用させることにより、前記基質を生産する工程をさらに包含し、該低分岐α−グルカンでは、α−１，６−グルコシド結合の数を１としたときのα−１，４−グルコシド結合の数が、１０〜１００００である、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
４−α−グルカノトランスフェラーゼが前記ブランチングエンザイムと共存する、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記４−α−グルカノトランスフェラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のアミロマルターゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ブランチングエンザイムが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン合成能力を有し、かつブランチングエンザイム活性／アミロペクチン低分子化活性が、１以上４６６以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記ブランチングエンザイムが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のいずれかのアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸の欠失、置換または挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン合成能力を有し、かつブランチングエンザイム活性／アミロペクチン低分子化活性が、１以上４６６以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記ブランチングエンザイムが、配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１３または配列番号１７のいずれかの塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、かつグリコーゲン合成能力を有し、かつブランチングエンザイム活性／アミロペクチン低分子化活性が、１以上４６６以下である、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分岐かつ高分子量のα−グルカン、特にグリコーゲンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−グルカンは、α−Ｄ−グルコースの重合体である。α−グルカンは、自然界に種々の形態で存在する。α−グルカンの中でも、グリコーゲンおよび澱粉が代表的である。しかし、グリコーゲンと澱粉との構造的特性および物理的特性は互いに大きく異なる。
【０００３】
グリコーゲンは、動物、真菌、酵母および細菌の主な貯蔵多糖である。グリコーゲンは、水に可溶性であり、乳白色の溶液となる。動物のグリコーゲンの分子構造はよく研究されている。天然グリコーゲンは、ブドウ糖(グルコース)のα−１，４−グルコシド結合を介して直鎖状に連結した糖鎖からα−１，６−グルコシド結合で枝分れし、さらにそれも枝分かれして網状構造を形成したホモグルカンである。天然グリコーゲンは、α−１，６−グルコシド結合によって連結された、平均重合度約１０〜約１４のα−１，４−グルコシド結合鎖から構成されている。天然グリコーゲンの分子量については、色々な説があるが、約１０５〜約１０８とされている。天然グリコーゲンは、分子量約１０７の粒子（β粒子）またはβ粒子の凝集により形成されたさらに大きな粒子（α粒子）として存在する。細菌のグリコーゲンの構造は、動物のグリコーゲンの構造と類似すると考えられる。ある種の植物（たとえばスイートコーン）にもグリコーゲンと類似した構造のグルカンが存在し、植物グリコーゲン（フィトグリコーゲン）と呼ばれる。
【０００４】
澱粉は、植物の主な貯蔵多糖であり、水不溶性粒子として存在する。この粒子は、２つの異なる多糖を含む。この多糖は、アミロースおよびアミロペクチンである。アミロースは、α−１，４結合によって連結された、本質的に直鎖のＤ−グルコース単位である。アミロペクチンは、分岐した重合体であり、クラスター構造をとると考えられている。各々のクラスター単位は、α−１，６−グルコシド結合によって一緒に連結された、平均重合度約１２〜約２４のα−１，４−グルコシド結合した鎖からなる。クラスター単位は、約３０〜約１００の重合度の、より長いα−１，４−グルコシド結合鎖によってさらに一緒に連結される。アミロペクチン全体の平均鎖長は、重合度約１８〜約２５である。澱粉のアミロペクチンも、グリコーゲンと同様にα−１，４−グリコシド結合およびα−１，６グリコシド結合によって連結されたグルカンであるが、アミロペクチンと比較して、グリコーゲンはより高度に枝分かれしている。
【０００５】
グリコーゲンは、最近、免疫賦活効果を持つことが証明された。そのため、グリコーゲンは、免疫賦活剤、健康食品素材などとしての用途が期待できる。他には化粧品素材、食品素材(調味料)、その他産業用素材としての用途が期待できる。グリコーゲンは、産業上種々の分野で利用されている。グリコーゲンの用途としては、例えば、以下が挙げられる
：微生物感染症治療剤、保湿剤（例えば、皮膚の保湿性向上に有効な化粧料、口唇の荒れを防ぐ口唇用化粧料）、複合調味料（例えば、ホタテ貝柱の味を有する複合調味料）、抗腫瘍剤、発酵乳の生成促進剤、コロイド粒子凝集体、毛髪の櫛通り性および毛髪のツヤに影響する毛髪表面の耐摩耗性を改善する物質、細胞賦活剤（表皮細胞賦活剤、線維芽細胞増殖剤など）、ＡＴＰ産生促進剤、しわなどの皮膚の老化症状改善剤、肌荒れ改善剤、蛍光体粒子表面処理剤、環状四糖（ＣＴＳ；ｃｙｃｌｏ｛→６）−α−Ｄ−ｇｌｃｐ-（１
→３）−α−Ｄ−ｇｌｃｐ−（１→６）−α−Ｄ−ｇｌｃｐ−（１→３）−α−Ｄ−ｇｌｃｐ−（１→｝）の合成の際の基質。グリコーゲンは、皮膚外用剤（例えば、化粧水、乳液、クリーム、美容液、養毛剤、育毛剤、パック、口紅、リップクリーム、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、ファンデーション、アイカラー、チークカラー、シャンプー、リンス、ヘアーリキッド、ヘアートニック、パーマネントウェーブ剤、ヘアカラー、トリートメント、浴用剤、ハンドクリーム、レッグクリーム、ネッククリーム、ボディローションなど）中、眼用溶液中などで用いられ得る。
【０００６】
イガイ(ムール貝)由来のグリコーゲン、およびスイートコーン由来の植物性グリコーゲン(フィトグリコーゲン)は、販売されているが高価であり、主に化粧品に保湿剤として用いられている。試薬としては、各種貝類由来または動物の肝臓由来のグリコーゲンも販売されているが極めて高価であり、産業用に利用することは困難である。
【０００７】
そのため、グリコーゲンを多量にかつ安価に提供することが望まれている。
【０００８】
ブランチングエンザイム（系統名：１，４−α−Ｄ−グルカン：１，４−α−Ｄ−グルカン  ６−α−Ｄ−（１，４−α−Ｄ−グルカノ）−トランスフェラーゼ、ＥＣ  ２．４．１．１８；本明細書中では、ＢＥとも記載する）は、α−１，４−グルコシド結合を切断し、別のグルコース残基の６位ＯＨ基に転移することにより、α−１，６−グルコシド結合を形成する酵素である。ＢＥは、動物、植物、糸状菌類、酵母および細菌に広く分布しており、グリコーゲンまたは澱粉の分岐結合合成を触媒している。
【０００９】
馬鈴薯由来ＢＥの触媒作用は、１９７０年代に詳細に調べられており、ＢＥが分子間枝作り反応（図１Ａ）を触媒することが証明されている。また、ＢＥが環状化反応（図１Ｂ）を触媒することは、１９９０年代後半に証明された。この環状化反応の証明により、分子内枝作り反応（図１Ｃ）が触媒されることも、論理的に推定された。すなわち、α−１，４−グルコシド結合を切断して、別のグルコース残基の６位ＯＨ基に転移してα−１，６−グルコシド結合を形成する、というミクロな観点から見ると、これら３つの反応は同一であるといえるためである。なお、ＢＥは、グリコシドヒドロラーゼファミリー１３（α−アミラーゼファミリー）の一員とされ、α−アミラーゼと基本的に同一のメカニズムにより、単一の活性中心においてα−１，４−グルコシド結合の切断および６位ＯＨ基への転移を触媒すると考えられている。
【００１０】
ＢＥを、別の酵素α-グルカンホスホリラーゼとともにグルコース−１−リン酸とオリ
ゴ糖に作用させることにより、およびグリコーゲン合成酵素（またはデンプン合成酵素）とともにＵＤＰ−グルコース（またはＡＤＰ−グルコース）に作用させることにより、天然グリコーゲンと類似の構造と性質を持つグリコーゲンを合成できることは知られている。しかし、α−グルカンホスホリラーゼは試薬として販売されているが、きわめて高価である。またグリコーゲン合成酵素、デンプン合成酵素の入手は困難である。さらに、グルコース−１−リン酸、ＵＤＰ−グルコース、ＡＤＰ−グルコースは極めて高価である。これらのことから、この方法では、グリコーゲンを多量にかつ安価に提供するという課題は達成できなかった。
【００１１】
グルカンのような高分子は、一般に均一な分子ではなく、種々の大きさの分子の混合物
であるため、その分子量は数平均分子量（Ｍｎ）もしくは重量平均分子量（Ｍｗ）で評価する。Ｍｎは、その系の全質量を、その系に含まれる分子の個数で割ったものである。すなわち数分率による平均である。一方、Ｍｗは重量分率による平均である。完全に均一な物質であれば、Ｍｗ＝Ｍｎとなるが、高分子は一般に分子量分布を有するためＭｗ＞Ｍｎとなる。したがって、Ｍｗ／Ｍｎが１より大きいほど、分子量の不均一度が大きい（分子量分布が広い）ということになる。
【００１２】
酵素を用いて合成したアミロース（例えば、（株）アジノキ製の酵素合成アミロース）は、分子量分布が狭いことが知られている（Ｍｗ／Ｍｎ＜１．２、非特許文献４、およびＦｕｊｉｉ，Ｋ．ら（２００３）Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ２１巻，１６７−１７２頁では、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．００５〜１．００６）。一方天然から抽出したアミロースは、分子量分布が比較的広く、Ｍｗ／Ｍｎは約２〜約５である（Ｅｌｉａｓｓｏｎ，Ａ．−Ｃ．編（１９９６）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｉｎ  ｆｏｏｄ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、中の３４７−４２９頁、Ｈｉｚｕｋｕｒｉ，  Ｓ．、Ｓｔａｒｃｈ：ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ、のＴａｌｂｅ  １５に重合度ＤＰ（数平均ＤＰｎ、重量平均ＤＰｗ）で記載。これらのＤＰに１６２を乗ずれば、それぞれの平均分子量となる）。
【００１３】
Ｍｎは、分子の個数を評価することにより、決定できる。すなわち、アミロースなどにおいては、還元性末端数を測定することにより決定できる。還元性末端数の測定は、例えば非特許文献７に記載されるＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ法により決定できる。また、非特許文献８に記載される示差屈折計と多角度光散乱検出器とを併用したゲルろ過クロマトグラフィー（ＭＡＬＬＳ法）によっても、決定できる。Ｍｗは、非特許文献８に記載されるＭＡＬＬＳ法によって決定できる。
【００１４】
本明細書においては、基質の分子量は主として数平均分子量（Ｍｎ）で評価し、生成物グルカンの分子量は主として重量平均分子量（Ｍｗ）で評価している。生成物においては、図１Ｂに示すような環状化反応が起こった場合、還元末端数評価法では、Ｍｎを正しく評価できないためである。また、非常に巨大な分子の分子量を評価する場合、相対的に還元末端数が少なく、正確なＭｎ評価が行いにくいためでもある。さらに、ＭＡＬＬＳ法によるＭｎ評価法は、ゲルろ過による分画が完全であることを前提としており、分画が不完全であると正確なＭｎ評価ができないためでもある。
【００１５】
ＢＥをアミロペクチンまたはデンプンに作用させて高分子量α−グルカンを得た例は存在する。ＢＥを単独でα−グルカン（例えば、アミロース）に作用させた例は数多くある。しかし、アミロースにＢＥを作用させて分子量約１００万以上の高分子量α-グルカン
を得た例は存在しない。また、アミロペクチンにＢＥを作用させた場合に得られる高分子量α−グルカンは、非特許文献１７にあるように、アミロペクチンの基本構造に枝が増えたようなものであると考えられており、グリコーゲン（球状の構造を有する）は合成されていなかったと言える。例えば、非特許文献１および非特許文献２には、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ由来のＢＥをアミロペクチンまたはアミロースに作用させて、これらを６グルコース単位の単位鎖からなる高分岐グリコーゲン様分子に変換させたことが記載されている。しかし、「グリコーゲン様」とは、ヨウ素による呈色度がグリコーゲンに似たものとなったということを示しているにすぎない。ここで基質として用いられたアミロースは、数平均重合度１５、２２または１３０であり、それぞれ、Ｍｎは約２４３０、約３６００および約２１０００である。特に、非特許文献２は、Ｎ．ｃｒａｓｓａ由来のＢＥが、平均重合度１５あるいは２２の短鎖長のアミロースに作用できること、植物起源のＢＥでは作用しうる最小の重合度が３０〜４０以上であることを記載している。非特許文献２はまた、Ｎ．ｃｒａｓｓａ由来のＢＥが、１２残基以上のグルコース鎖に対して作用し、六糖を最小単位として転移反応を行うことが示唆されたと記載している。非特許文
献１のＦｉｇ．１と２、および非特許文献２のＦｉｇ．３および４からわかるように、Ｎ．ｃｒａｓｓａ由来のＢＥをアミロペクチンおよびアミロースに作用させると、これらの基質の分子量は変化しなかった。さらに、非特許文献１のＦｉｇ．４と５および非特許文献２のＦｉｇ．５と６からは、基質分子よりも若干大きな分子と、若干小さな分子が得られたことが示されており、大幅な高分子化は観察されなかった。
【００１６】
例えば、非特許文献３は、トウモロコシのＢＥＩを平均鎖長３００を超えるアミロースに作用させることにより、生成物のゲルろ過での溶出時間の遅れが生じたこと、これは形状の変化に起因するものであって、分子量の変化によるものではないことを記載している。
【００１７】
例えば、非特許文献４は、ＢＥ（特に、Ｑ酵素）をアミロースに作用させることにより得られたアミロペクチン様分子の分子量が、反応時間が長くなるほど低下することを記載している。
【００１８】
例えば、非特許文献５は、Ｍｗ６７６００のアミロースに馬鈴薯由来のＢＥ（Ｑ酵素）を作用させると、Ｍｗ３３５００の反応産物が得られることを記載している。
【００１９】
例えば、非特許文献６は、Ｍｎ２００，０００のアミロースに馬鈴薯由来のＢＥを作用させることにより、Ｍｗ２２，０００のグルカンが得られることを記載している。
【００２０】
例えば、非特許文献７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢＥを、Ｍｗ３０２，０００の酵素合成アミロースに作用させると、環状化反応により分子量が低下したことを記載している。なお、基質として用いられた、酵素合成アミロースは、その分子量分布が狭いことが知られている。例えば、非特許文献４によれば、Ｍｗ／Ｍｎ＜１．２であり、Ｆｕｊｉｉ,Ｋ．ら（２００３）Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ
ａｎｄ  Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ２１巻，１６７−１７２頁によれば、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．００５〜１．００６である。また、メーカーである（株）アジノキのパンフレットによるとＭｗ／Ｍｎ＜１．１である。したがって、ここで用いられた酵素合成アミロースのＭｎは、約２５２，０００〜３０２，０００である。そのため、酵素合成アミロースのおよそのＭｎは、Ｍｗを１．１で割り算することにより概算できる。
【００２１】
例えば、非特許文献８は、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥを、α−グルカンに作用させると、環状化したグルカンが得られることを記載している。これは、図１Ｂからも明らかなように、グルカンの低分子化が起こることを意味している。
【００２２】
例えば、非特許文献９は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ由来のＢＥを種々の大きさの酵素合成アミロースに作用させたところ、どの酵素合成アミロースからもほとんど同じサイズのグルカンが得られたことを記載している（Ｆｉｇ．５．８）。また、この文献のＦｉｇ．５．９からは、分子量約１００万を超える成分はまったく検出されなかったことが明らかである。さらに、この文献のＦｉｇ．５．１３の反応モデルからは、高分岐の高分子量α−グルカンが生成されることは全く予想されない。図１から明らかなように、ＢＥによる分子間枝作り反応（図１Ａ）では元の分子よりも大きな分子と小さな分子の両方が生じ、環状化反応（図１Ｂ）では元の分子よりも小さな分子が生じ、分子内枝作り反応（図１Ｃ）では反応前後で分子量は変化しない。メカニズムが同一であることから、３つの反応の起こる頻度がそれほど偏るということは予想されない。実際、非特許文献９のＦｉｇ．５．８の結果は、基質分子量により差はあるものの、結果として3つの反応がいず
れも触媒され、結果的にどのような大きさのアミロースからも、同じサイズのグルカンが得られたことを記載しているものである。アミロースから分子量１００万以上の高分子グルカンが得られるためには、圧倒的な高頻度でＡの分子間枝作り反応が触媒される必要が
あり、さらに、生じた分子のうち、大きい方の分子は、さらに高分子化し続ける方向の反応を受ける必要がある。これは従来のＢＥの触媒メカニズムからは全く予想されず、それを示唆する結果も全く得られていなかった。
【００２３】
特許文献２は、ＢＥ（特に、枝作り酵素）をアミロース、澱粉の部分分解物、澱粉枝切り物、ホスホリラーゼによる酵素合成アミロース、マルトオリゴ糖などに作用させることにより、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０から５０００の範囲にあるグルカンを製造する方法を記載する。この方法は、ＢＥによって基質を環状化および低分子化させて、重合度５０〜５０００、最大重合度１０，０００の環状グルカンを製造する方法である。この方法は、基質の低分子化によって生成物を得ているので、基質として用いられるのは、高分子量のアミロースである。これは、００６６段落に、重合度が約４００以上のアミロースが好適に用いられ得ると記載されていることから明らかである。重合度４００のアミロースの分子量は約６５，０００であり、低分子量アミロースを基質として用いて高分子量α−グルカンが得られるか否かは、この特許公報からは明らかでない。
【００２４】
このように、従来、ＢＥをアミロースに作用させると、アミロースの低分子化が生じるか、一部分子の分子量が高くなることはあっても、その高分子化はごくわずかであって、ほとんど変わらないと考えられていた。
【００２５】
さらに、アミロースにＢＥを作用させた場合に得られるα−グルカンは、プルラナーゼにより分解されやすいという点でグリコーゲンとは異なるという報告がある（非特許文献１０、１６）。アミロースにＢＥを作用させて「グリコーゲン」を得た、と記述した文献（例えば、非特許文献１８（Ｗａｌｋｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７１）２０巻、ｐ１４−２１））も存在するが、これらについては、得られたグルカンの分子量も測定しておらず、消化性の分析も行われていない。
【００２６】
さらに、酵素の特性を調べるためにＢＥをアミロースに作用させた例は多数ある（例えば、特許文献３および非特許文献１１〜１２）。しかし、これらの例ではいずれも、反応産物の分子量を測定していない。
【００２７】
ＢＥ（特に植物由来ＢＥ）は、短鎖長のアミロースには作用しにくいことが知られている。例えば、非特許文献１３には、重合度４０以下（分子量約６４８０）のアミロースにはほとんど作用しないとかかれている。その理由は、ＢＥは、基質アミロースが何らかの高次構造をとっていることを必要とするためであり、ある程度の長さがないとアミロースはその高次構造をとれないためであると考察されている（非特許文献１４）。また、その高次構造は温度に関係するものであり、温度が高いとアミロースは、そのような高次構造をとれないのだと考察されている。
【００２８】
細菌由来ＢＥは、短い基質にも作用するようであるが（非特許文献１５）、その作用は弱いことがわかっている（非特許文献９、Ｆｉｇ４．５）。
【００２９】
以上のことから、ＢＥがアミロースを基質として、分子量１００万以上の高分岐かつ高分子量のグルカンを合成しうるとは予想されず、ましてやその高分子量グルカンがプルラナーゼおよびα−アミラーゼによる消化性の低いものであるとは全く予想されなかった。さらに、Ｍｎ４８００および９，３００の酵素合成アミロースへの作用性が低いこと（非特許文献９、Ｆｉｇ４．５。最大活性を示すＭｎ２７０，０００の酵素合成アミロースを基質としたときと比較し、約７％および１２％の活性）から、Ｍｎ８，０００以下（特に、Ｍｎ４，０００以下）のアミロースを基質とすることに関する利点は全く想定されていなかった。
【００３０】
また、従来のグリコーゲンの製造方法においては、高度の精製を行わないと電解質含量および単糖類の含量が高いため、純度の高いグリコーゲンを得るためには非常にコストがかかるという問題点もある。例えば、スクロースホスホリラーゼ、α−グルカンホスホリラーゼにＢＥを加えてグリコーゲンを製造する方法では、反応液に１０ｍＭ程度のリン酸を入れる必要があり、得られた反応産物には、多量のフルクトースと少量のリン酸が入る（スクロース＋リン酸＋オリゴ糖→α−グルカン＋フルクトース＋リン酸）。ＧＰとＢＥとを組み合わせる方法では、さらに多量に電解質が入る（グルコース−１−リン酸＋オリゴ糖→α−グルカン＋リン酸）。グリコーゲンシンターゼ（ＧＳ）とＢＥとを組み合わせる方法も同様である（ＡＤＰ−グルコース＋オリゴ糖→α−グルカン＋ＡＤＰ）。
【００３１】
天然からグリコーゲンを抽出したとしても、電解質の他にさらに、タンパク質、脂質、他の糖質など、非常に色々な物質が混入するので、高純度のグリコーゲンを得るためには非常にコストがかかるという問題点がある。
【特許文献１】特開２０００−３１６５８１号公報
【特許文献２】特許第３１０７３５８号公報、請求項１、００６６段落
【特許文献３】特表２００２−５３９８２２号公報
【非特許文献１】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０７巻、１１８−１２２（１９９０）（Ｆｉｇ．２）
【非特許文献２】松本および松田  澱粉科学  ３０巻  ｐ２１２−２２２（１９８３）（Ｆｉｇ．３および４）
【非特許文献３】Ｂｏｙｅｒら、Ｓｔａｒｃｈ／ｓｔａｅｒｋｅ  ３４  Ｎｒ．３，Ｓ．８１−８５（１９８２）（Ｔａｂｌｅ  １、Ｆｉｇｕｒｅ  ２およびＦｉｇｕｒｅ  ３）
【非特許文献４】Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ，Ｖｏｌ．１０，ｐ７９１５−７９２２（Ｔａｂｌｅ  ２）
【非特許文献５】Ｐｒａｚｎｉｋら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２７（１９９２）ｐ１７１−１８２
【非特許文献６】ＧｒｉｆｆｉｎおよびＶｉｃｔｏｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．９、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９６８
【非特許文献７】Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９６．１７８：ｐ．１６００−１６０６
【非特許文献８】Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０
【非特許文献９】Ｈｉｒｏｋｉ  Ｔａｋａｔａ博士論文（京都大学）１９９７（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｐｅｃｉｅｓ）
【非特許文献１０】Ｃｈａｒｌｅｓ  ＢｏｙｅｒおよびＪａｃｋ  Ｐｒｅｉｓｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９７７，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．１６，ｐ．３６９３−３６９９
【非特許文献１１】Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｍ．Ｌ．ら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１．５７（５−６）：ｐ．６５３−９
【非特許文献１２】Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４．６０：ｐ．３０９６−３１０４
【非特許文献１３】Ｂｏｒｏｖｓｋｙ，Ｄ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｅ．，およびＷｈｅｌａｎ，Ｗ．Ｊ．（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２，３０７−３１２
【非特許文献１４】Ｂｏｒｏｖｓｋｙ，Ｄ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｅ．，およびＷｈｅｌａｎ，Ｗ．Ｊ．（１９７５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５４，２０１−２０５
【非特許文献１５】岡田ら，澱粉科学  ３０巻  ｐ２２３−２３０（１９８３）
【非特許文献１６】Ｋｉｔａｈａｔａ，Ｓ．，およびＯｋａｄａ，Ｓ．（１９８８）ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ａｍｙｌａｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ．  Ｔｈｅｉｒ  ｓｏｕｒｃｅｓ，  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．（Ｔｈｅ  Ａｍｙｌａｓｅ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ  ｅｄ），ｐｐ．１４３−１５４，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ
【非特許文献１７】Ｋａｗａｂａｔａら（２００２）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．Ｖｏｌ．４９，Ｎｏ．３，２７３−２７９頁
【非特許文献１８】Ｗａｌｋｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７１）２０巻、ｐ１４−２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、高分岐かつ高分子量のα−グルカン、特にグリコーゲンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ブランチングエンザイム活性／低分子化活性の比が５００以下であるＢＥが、グリコーゲンを合成する能力を有することを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【００３４】
本発明の製造方法は、グリコーゲンの製造方法であって、グリコーゲンを合成する能力を有するＢＥを基質に作用させて、グリコーゲンを生産する工程を包含し、該基質は、主にα−１，４−グルコシド結合で連結された重合度４以上のα−グルカンであり、反応開始前の該溶液中の糖の数平均分子量（Ｍｎ）が１８０より大きく１５０，０００以下である。
【００３５】
１つの実施形態では、上記ＢＥのブランチングエンザイム活性／低分子化活性は、５００以下であり得る。
【００３６】
１つの実施形態では、上記ＢＥは、耐熱性ＢＥであり得る。
【００３７】
１つの実施形態では、上記ＢＥは、好熱性菌または中温性菌由来であり得る。
【００３８】
１つの実施形態では、上記ＢＥは、Ａｑｕｉｆｅｘ属、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属からなる群より選択される属に属する細菌に由来し得る。
【００３９】
１つの実施形態では、上記ＢＥは、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉからなる群より選択される細菌に由来し得る。
【００４０】
１つの実施形態では、上記ＢＥは、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからなる群より選択される細菌に由来し得る。
【００４１】
１つの実施形態では、上記ＢＥの反応至適温度は、４５℃以上９０℃以下であり得る。
【００４２】
１つの実施形態では、上記基質は、澱粉枝切り物、デキストリン枝切り物または酵素合成アミロースであり得る。
【００４３】
１つの実施形態では、上記反応開始前の溶液中の糖のＭｎは、１８０より大きく４，０００未満であり得る。
【００４４】
１つの実施形態では、上記反応開始前の溶液中の糖のＭｎは、４，０００以上８，０００未満であり得、上記ＢＥの使用量と反応時間との積が２５，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上になるように該ＢＥの使用量と反応時間とを調整され得る。
【００４５】
１つの実施形態では、上記反応開始前の溶液中の糖のＭｎは、８，０００以上１００，０００未満であり得、上記ＢＥの使用量と反応時間との積が４０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上になるように該ＢＥの使用量と反応時間とを調整され得る。
【００４６】
１つの実施形態では、上記反応開始前の溶液中の糖のＭｎは、１００，０００以上１５０，０００以下であり得、上記ＢＥの使用量と反応時間との積が１５０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上になるように該ＢＥの使用量と反応時間とを調整され得る。
【００４７】
１つの実施形態では、本発明の方法は、Ｍｎが１８０より大きく１，５００未満のα−グルカンに４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させることにより、前記基質を生産する工程をさらに包含し得る。
【００４８】
１つの実施形態では、上記Ｍｎが１８０より大きく１，５００未満のα−グルカンは、重合度４〜７のマルトオリゴ糖を含み得る。
【００４９】
１つの実施形態では、本発明の方法は、Ｍｎ５００以上の低分岐α−グルカンに枝切り酵素を作用させることにより、上記基質を生産する工程をさらに包含し得る。
【００５０】
１つの実施形態では、本発明の方法は、α−グルカンホスホリラーゼまたはグリコーゲン合成酵素のいずれも使用しない。
【００５１】
１つの実施形態では、４−α−グルカノトランスフェラーゼが前記ＢＥと共存し得る。
本発明の１つの実施形態では、重量平均分子量が100万Da以上のグリコーゲンであって、該グリコーゲンに５０Ｕ／ｇ基質のプルラナーゼを６０℃で３０分間作用させた場合に得られる生成物をＭＡＬＬＳ法によって分析した場合の重量平均分子量が５０万Ｄａ以上であり、かつ該グリコーゲンに３００Ｕ／ｇ基質のα−アミラーゼを３７℃で３０分間作用させた場合に得られる生成物をＭＡＬＬＳ法によって分析した場合の重量平均分子量が５０万Ｄａ以上である、グリコーゲンが提供される。
また、本発明の好ましい実施形態では、以下の製造方法が提供される。
（１）グリコーゲンの製造方法であって、グリコーゲンを合成する能力を有するブランチングエンザイムを溶液中で基質に作用させて、グリコーゲンを生産する工程を包含し、該基質が、主にα−１，４−グルコシド結合で連結された重合度４以上のα−グルカンであり、該基質が、澱粉枝切り物、デキストリン枝切り物または酵素合成アミロースであり、反応開始前の該溶液中の糖の数平均分子量が１８０より大きく１５０，０００以下であり、該グリコーゲンの重量平均分子量が１００万Ｄａ以上であり、該グリコーゲンに５０Ｕ／ｇ基質のプルラナーゼを６０℃で３０分間作用させた場合に得られる生成物をＭＡＬＬＳ法によって分析した場合の重量平均分子量が５０万Ｄａ以上であり、かつ該グリコーゲンに３００Ｕ／ｇ基質のα−アミラーゼを３７℃で３０分間作用させた場合に得られる生成物をＭＡＬＬＳ法によって分析した場合の重量平均分子量が５０万Ｄａ以上であり、該方法においては、α−グルカンホスホリラーゼまたはグリコーゲン合成酵素のいずれも使用せず、該ブランチングエンザイムのブランチングエンザイム活性／アミロペクチン低分子化活性が、１以上４６６以下であり、ただし、該ブランチングエンザイムが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のいずれのアミノ酸配列も有さない、方法。
（２）前記ブランチングエンザイムのブランチングエンザイム活性／アミロペクチン低分子化活性が、３５以上４６６以下である、上記項１に記載の方法。
（３）前記ブランチングエンザイムが、耐熱性ブランチングエンザイムである、上記項１に記載の方法。
（４）前記ブランチングエンザイムが、好熱性菌または中温性菌由来である、上記項１に記載の方法。
（５）前記ブランチングエンザイムが、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからなる群より選択される細菌に由来する、上記項１に記載の方法。
（６）前記ブランチングエンザイムが、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５株、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ９７８５株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＲＢＥ１４株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ  ＩＦＯ１５３１５株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＩＦＯ１５３１３株およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株からなる群より選択される細菌株に由来する、上記項１に記載の方法。
（７）前記ブランチングエンザイムの反応至適温度が、４５℃以上９０℃以下である、上記項１に記載の方法。
（８）前記反応開始前の溶液中の糖の数平均分子量が、１８０より大きく４，０００未満である、上記項１に記載の方法。
（９）前記反応開始前の溶液中の糖の数平均分子量が、４，０００以上８，０００未満であり、前記ブランチングエンザイムの使用量と反応時間との積が２５，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上になるように該ブランチングエンザイムの使用量と反応時間とを調整する、上記項１に記載の方法。
（１０）前記反応開始前の溶液中の糖の数平均分子量が、８，０００以上１００，０００未満であり、前記ブランチングエンザイムの使用量と反応時間との積が４０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上になるように該ブランチングエンザイムの使用量と反応時間とを調整する、上記項１に記載の方法。
（１１）前記反応開始前の溶液中の糖の数平均分子量が、１００，０００以上１５０，０００以下であり、前記ブランチングエンザイムの使用量と反応時間との積が１５０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上になるように該ブランチングエンザイムの使用量と反応時間とを調整する、上記項１に記載の方法。
（１２）数平均分子量が１８０より大きく１，５００未満のα−グルカンに４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させることにより、前記基質を生産する工程をさらに包含する、上記項１に記載の方法。
（１３）前記４−α−グルカノトランスフェラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のアミロマルターゼである、上記項１２に記載の方法。
（１４）前記数平均分子量が１８０より大きく１，５００未満のα−グルカンが、重合度４〜７のマルトオリゴ糖を含む、上記項１２に記載の方法。
（１５）数平均分子量５００以上の低分岐α−グルカンに枝切り酵素を作用させることにより、前記基質を生産する工程をさらに包含し、該低分岐α−グルカンでは、α−１，６−グルコシド結合の数を１としたときのα−１，４−グルコシド結合の数が、１０〜１００００である、上記項１に記載の方法。
（１６）４−α−グルカノトランスフェラーゼが前記ブランチングエンザイムと共存する、上記項１に記載の方法。
（１７）前記４−α−グルカノトランスフェラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のアミロマルターゼである、上記１６に記載の方法。
（１８）前記ブランチングエンザイムが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン合成能力を有し、かつブランチングエンザイム活性／アミロペクチン低分子化活性が、１以上４６６以下である、上記項１に記載の方法。
（１９）前記ブランチングエンザイムが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のいずれかのアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸の欠失、置換または挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン合成能力を有し、かつブランチングエンザイム活性／アミロペクチン低分子化活性が、１以上４６６以下である、上記項１に記載の方法。
（２０）前記ブランチングエンザイムが、配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１３または配列番号１７のいずれかの塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、かつグリコーゲン合成能力を有し、かつブランチングエンザイム活性／アミロペクチン低分子化活性が、１以上４６６以下である、上記項１に記載の方法。
【発明の効果】
【００５２】
本発明により、グリコーゲンを安価にかつ多量に製造することができる。
【００５３】
本発明の方法は、高度の精製なしで、電解質含量および単糖類含量の非常に低いグリコーゲンを得ることができるという利点を有する。そのため、低コストで純度の高いグリコーゲンを得ることができるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、ＢＥの種々の作用を模式的に示す図である。図１Ａは、ＢＥが分子間枝作り反応を触媒することを示す図である。図１Ｂは、ＢＥが環状化反応を触媒することを示す図である。図１Ｃは、ＢＥが分子内枝作り反応を触媒することを示す図である。
【図２】図２は、α−グルカンからのグリコーゲン生成の模式図である。
【図３】図３は、種々の量のＢＥを用いた場合に得られる生成物のＭｗを示すグラフである。ＢＥ量は基質ｇあたりのＵで示している。
【図４】図４は、種々の分子量の基質を用いた場合に得られる生成物のＭｗを示すグラフである。
【図５】図５は、澱粉を枝切り酵素により分解してアミロースを得て、このアミロースにＢＥを反応させてグリコーゲンを製造する反応の模式図である。
【図６】図６は、イソアミラーゼおよび種々の量のＢＥを用いて澱粉からα−グルカンを生成する場合に得られる生成物のＭｗを示すグラフである。ＢＥ量は基質ｇあたりのＵで示している。
【図７】図７は、４−α−グルカノトランスフェラーゼによってマルトペンタオースからアミロースが生成され、ＢＥによってアミロースからグリコーゲンが生成されることを示す模式図である。
【図８】図８は、種々の基質ＤＰ（重合度）の基質（Ｇ５、Ｇ６、またはＧ７）を用いた場合に得られる生成物のＭｗを示すグラフである。
【図９】図９は、本発明により製造されたグリコーゲン（白三角、「今回製造ＧＬＹ」）、試薬グリコーゲン（黒三角、「試薬ＧＬＹ」）、ワキシーコーンスターチ（黒丸、「ワキシ」）またはコーンスターチ（白丸、「コンス」）に種々の量のプルラナーゼを作用させた後の生成物のＭｗを示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明により製造されたグリコーゲン（白三角、「今回製造ＧＬＹ」）、試薬グリコーゲン（黒三角、「試薬ＧＬＹ」）、ワキシーコーンスターチ（黒丸、「ワキシ」）またはコーンスターチ（白丸、「コンス」）に種々の量のα−アミラーゼを作用させた後の生成物のＭｗを示すグラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、グリコーゲン合成能力を有するＢＥの反応モデルである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、グリコーゲン合成能力を有さないＢＥの反応モデルである。
【図１２】図１２は、ワキシーコーンスターチにＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来ＢＥを作用させた場合の、酵素量と得られる生成物のＭｗとの相関を示すグラフである。縦軸は生成物のＭｗを、横軸はＢＥ添加量を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号１：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５の天然のＢＥをコードする塩基配列；
配列番号２：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５の天然のＢＥのアミノ酸配列；
配列番号３：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ９７８５の天然のＢＥをコードする塩基配列；
配列番号４：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ９７８５の天然のＢＥのアミノ酸配列；
配列番号５：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＲＢＥ１４の天然のＢＥをコードする塩基配列；
配列番号６：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＲＢＥ１４の天然のＢＥのアミノ酸配列；
配列番号７：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １５０３−４Ｒ  ｖａｒ．４の天然のＢＥをコードする塩基配列；
配列番号８：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １５０３−４Ｒ  ｖａｒ．４の天然のＢＥのアミノ酸配列；
配列番号９：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ  ＩＦＯ１５３１５の天然のＢＥをコードする塩基配列；
配列番号１０：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ  ＩＦＯ１５３１５の天然の
ＢＥのアミノ酸配列；
配列番号１１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓの天然のＢＥをコードする塩基配列；
配列番号１２：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓの天然のＢＥのアミノ酸配列；
配列番号１３：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＩＦＯ１５３１３の天然のＢＥをコードする塩基配列；
配列番号１４：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＩＦＯ１５３１３の天然のＢＥのアミノ酸配列；
配列番号１５：Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１の天然のＢＥをコードする塩基配列；
配列番号１６：Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１の天然のＢＥのアミノ酸配列；
配列番号１７：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０の天然のＢＥをコードする塩基配列；
配列番号１８：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０の天然のＢＥのアミノ酸配列；
配列番号１９：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ  ＭａｌＱをコードする塩基配列；
配列番号２０：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ  ＭａｌＱのアミノ酸配列；
配列番号２１：プライマーＥＣＢＥＮ−ＮＣＯの配列；
配列番号２２：プライマーＥＣＢＥＣ−ＨＩＮの配列；
配列番号２３：プライマーＲＯＢＥＮ−ＥＣＯの配列；
配列番号２４：プライマーＲＯＢＥＣ−ＰＳＴの配列。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００５７】
本発明の方法は、高分岐かつ高分子量のα−グルカン（すなわち、グリコーゲン）の製造方法であって、グリコーゲン合成能力を有するＢＥを溶液中で基質に作用させて、グリコーゲンを生産する工程を包含し、該基質は、主にα−１，４−グルコシド結合で連結された重合度４以上のα−グルカンであり、反応開始前の該溶液中の糖のＭｎが約１８０より大きく約１５０，０００以下である。
【００５８】
本明細書では、「グリコーゲン」とは、Ｄ−グルコースを構成単位とする糖であって、α−１，４−グルコシド結合およびα−１，６−グルコシド結合のみによって連結されており、分子量が１００万Ｄａ以上であり、５０Ｕ／ｇ基質のプルラナーゼを評価例１の条件で作用させた場合に得られる生成物をＭＡＬＬＳ法によって分析した場合のＭｗが５０万Ｄａ以上であり、かつ３００Ｕ／ｇ基質のα−アミラーゼを評価例２の条件で作用させた場合に得られる生成物をＭＡＬＬＳ法によって分析した場合のＭｗが５０万Ｄａ以上である糖をいう。ある糖に５０Ｕ／ｇ基質のプルラナーゼを評価例１の条件で作用させた場合に得られる生成物の分子量Ｍｗが５０万Ｄａ以上である場合、その糖は、「プルラナーゼ分解耐性がある」という。ある糖に３００Ｕ／ｇ基質のα−アミラーゼを評価例２の条件で作用させた場合に得られる生成物の分子量Ｍｗが５０万Ｄａ以上である場合、その糖は、「α−アミラーゼ分解耐性がある」という。ここで、α−アミラーゼ活性について、１Ｕのα−アミラーゼ活性とは、ｐＨ６．９、２０℃で反応させた場合に、澱粉から３分間で１ｍｇのマルトースを遊離する酵素量をいう。プルラナーゼ活性について、１Ｕのプルラナーゼ活性とは、終濃度１％のプルランにｐＨ５．０、４０℃で反応させた場合に、反応初期の１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元力を生成するのに必要な酵素
量をいう。
【００５９】
（１．ブランチングエンザイム）
「グリコーゲン合成能力を有するブランチングエンザイム」とは、ＢＥのうちの、グリコーゲンを合成する能力を有するものをいう。あるＢＥが、グリコーゲン合成能力を有するか否かは、当該分野で公知の方法によって決定され得る。すなわち、例えば、アミロースにＢＥを作用させ、その後、その溶液中に分子量が１００万Ｄａ以上である高分子α-
グルカンが生成したか否かを調べることならびに生成した高分子α−グルカンのプルラナーゼ分解耐性およびα−アミラーゼ分解耐性を決定することにより、決定され得る。溶液中に高分子α-グルカンが存在するか否かは、非特許文献８に記載される、多角度光散乱
検出器と、示差屈折計を検出器として併用したＨＰＬＣゲルろ過分析法によって決定され得る。プルラナーゼ分解耐性は、評価例１の方法に準じて決定され得る。α−アミラーゼ分解耐性は、評価例２の方法に準じて決定され得る。
【００６０】
本発明者らの研究によれば、ＢＥのうち、ブランチングエンザイム活性／低分子化活性が５００以下のＢＥは、グリコーゲン合成能力を有し、ブランチングエンザイム活性／低分子化活性が５００より大きいＢＥは、グリコーゲン合成能力を有さなかった。
【００６１】
ブランチングエンザイム活性とは、アミロースとヨウ素との複合体の６６０ｎｍにおける吸光度を減少させる活性であり、ＢＥがα−１，４−グルコシド結合を切断し、別のグルコース残基の６位ＯＨ基に転移することにより、α−１，６−グルコシド結合を形成し、アミロースの直鎖状部分を減少させる作用に基づく。
【００６２】
ＢＥのブランチングエンザイム活性測定法は当該分野で公知であり、例えば、非特許文献８に記載される。ＢＥのブランチングエンザイム活性は、例えば、以下のようにして測定される。まず、５０μＬの基質液（０．１２％（ｗ／ｖ）アミロース（ＴｙｐｅＩＩＩ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製））に５０μＬの酵素液を添加することによって反応を開始する。反応は、そのＢＥの反応至適温度で行う。１０分間ＢＥを作用させた後、１ｍＬの０．４ｍＭ塩酸溶液を添加することによって反応を停止する。その後、１ｍＬのヨウ素液を添加し、よく混合した後、６６０ｎｍの吸光度を測定する。対照液として、酵素液添加前に０．４ｍＭ塩酸溶液を添加したものを同時に調製する。基質液は、１００μＬの１．２％（ｗ／ｖ）アミロースＴｙｐｅＩＩＩ溶液（ジメチルスルホキシドに溶解させる）に、２００μＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、さらに７００μＬの蒸留水を添加してよく混合することにより調製する。ただし、緩衝液のｐＨは、そのＢＥの反応至適ｐＨに合わせる。ヨウ素液は０．１２５ｍＬのストック溶液（２．６重量％Ｉ２、２６重量％ＫＩ水溶液）に０．５ｍＬの１規定塩酸を混合し、蒸留水で６５ｍＬとすることにより調製する。酵素液のＢＥ活性は以下の計算式により求める。
【００６３】
ＢＥ活性（単位（Ｕ）／ｍＬ）
＝｛（対照液６６０ｎｍ吸光度−サンプル液６６０ｎｍ吸光度）／対照液６６０ｎｍ吸光度｝×１００／１０×２０。
【００６４】
本明細書においては、ＢＥの活性としては、原則としてＢＥ活性を用いる。したがって、単に「活性」と呼ぶ場合は「ＢＥ活性」をあらわし、単に「単位」、あるいは「Ｕ」と示す場合は、ＢＥ活性で測定した「単位」、あるいは「Ｕ」をあらわす。
【００６５】
低分子化活性は、本発明者らが定義した活性である。低分子化活性は、アミロペクチン低分子化活性ともいう。本明細書中では、低分子化活性１単位を、ＢＥ活性の測定温度およびｐＨ（好ましくは、その酵素の反応至適温度および至適ｐＨ）と同じ温度およびｐＨで１６時間反応させた場合に、基質（ワキシーコーンスターチ）１ｇのＭｗを４００ｋＤ
ａに低下させるのに必要な酵素量と定義する。
【００６６】
低分子化活性は、例えば、次のようにして測定される。まず、５０ｍｇのワキシーコーンスターチ（ＷＣＳ；三和澱粉製）に１００μｌ  蒸留水を添加し、充分に攪拌する。ついで、９００μｌ  ジメチルスルホキシドを添加して、攪拌し、沸騰湯浴中で、２０分間加熱する。８．９ｍｌの蒸留水を添加してよく撹拌し、沸騰湯浴中で、さらに１０分間加熱する。この溶液に、１００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）または１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加して攪拌し、基質液とする。緩衝液のｐＨは、ＢＥ活性の測定ｐＨに合わせる。
【００６７】
基質液を８００μＬ／チューブで分注する。すなわち、各チューブは、４ｍｇのＷＣＳを含む。次いで、適切に希釈したＢＥ溶液をチューブ１本あたり適当量ＸμＬおよび希釈液をチューブ１本あたり（２００−Ｘ）μＬ添加し、反応を開始する。反応温度は、ＢＥ活性の測定温度に合わせる。希釈液は０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨは、ＢＥ活性測定ｐＨに合わせる）である。反応時間が１６時間になった時点で１Ｎ  ＨＣｌを添加して反応液のｐＨを３〜４に下げ、さらに１００℃で１０分加熱することにより、反応を停止させる。耐熱性の充分に低いＢＥの場合には、単に反応液を１００℃で１０分加熱するだけでも反応を停止できる。
【００６８】
反応停止後、反応液を０．４５μｍのフィルターによりろ過し、含まれる生産物のＭｗを測定する。Ｍｗが２５００ｋＤａから２００ｋＤａの範囲に入るように、ＢＥの量を加減する。Ｍｗの測定は、以下の「製造されたグルカンの重量平均分子量（Ｍｗ）の測定法」に記載の方法により行う。
【００６９】
算出されたＭｗ（ｋＤａ）を縦軸（ｙ軸）に対数でとり、用いた酵素量（μＬ）を横軸（ｘ軸）にとり、マイクロソフト社のソフトＭＳ−Ｅｘｃｅｌを使用して累乗近似曲線を作成する。すなわち、ｙ＝ｃｘｂ（ｃとｂは定数）の方程式で近似曲線を作成する。得られた方程式にｙ＝４００（ｋＤａ）を代入することにより、４ｍｇのＷＣＳを基質としたときに基質Ｍｗを４００ｋＤａに低下させるのに必要な酵素量Ｖ１（μＬ）が算出される。この酵素量Ｖ１を基質１ｇあたりに換算することにより、１単位の低分子化活性に必要な酵素量Ｖ２（＝（Ｖ１μＬ／１０００）×（１０００ｍｇ／４ｍｇ）（ｍＬ））が算出される。酵素液の低分子化活性Ｅ１は、単位低分子化活性の逆数（Ｅ１＝１/Ｖ２）（Ｕ/ｍＬ）である。
【００７０】
ＢＥ活性／低分子化活性の上限は、約５００であり、より好ましくは約４００であり、さらにより好ましくは約３００であり、さらにより好ましくは約２００であり、最も好ましくは約１００である。ＢＥ活性／低分子化活性の下限は特にない。下限は、約1以上、
約５以上または約１０以上であり得る。
【００７１】
ＢＥ活性／低分子化活性の値が約５００以下であるＢＥがグリコーゲン合成能力を有することについてのメカニズムは明確ではない。このメカニズムは、おそらく、以下に説明する原理に基づくと考えられるが、この原理には束縛されない：
ＢＥによる高分子α−グルカン合成が起こるためには、図１に示した、分子間枝作り反応が環状化反応および分子内枝作り反応に比べて高頻度で起こる必要がある。高頻度の分子間枝作り反応は、低分子アミロースを基質とすることで達成される。さらに、この高頻度の分子間枝作り反応に加えて、分岐分子が優先して基質として使用され続ける必要がある。そして、分岐分子は大きな構造単位を保持したままでＢＥの作用を受けなければならない。このことを反応モデルによって説明する（図１１Ａ）。まず、アミロース二分子から、一個のα−１，６−結合を持つ分子が生じる。生じた分子がさらに基質として使用され、二個のα−１，６−結合を持つ分子が生じる。さらにこの生じた分岐分子が優先的に
基質として使用されていくことによって、少数の高分子α−グルカン分子と多数の低分子が生じる。
【００７２】
一方、分岐分子を優先的に基質として使用しないＢＥの場合、あるいは分岐分子が使用されても、大きな構造単位を崩すような使用のされ方をした場合には、多数の分岐分子が生じ、さらなる高分子は生じにくい（図１１Ｂ）。
【００７３】
どちらの場合にも、反応系全体におけるα−１，６−結合の比率が１０〜１２％程度になると、それ以上ＢＥの反応は進まなくなる。
【００７４】
ここで、ＢＥによるアミロペクチンの低分子化作用について説明する。この反応は特許３１０７３５８号に示されているように、ＢＥがアミロペクチンのクラスター構造に作用し、これを環状化することによって起こる。この場合、ＢＥは分岐分子に作用し、その大きな構造単位を保持したままで、クラスター構造の継ぎ目の単位鎖を環状化する。したがって、アミロペクチン低分子化活性が相対的に高いＢＥは、分岐分子を優先して用い、かつ大きな構造単位を保持したまま反応の基質とする、という性質を持つと考えられる。
【００７５】
さらに、本発明者らの研究によれば、現在公知の耐熱性ＢＥは、いずれも、グリコーゲン合成能力を有した。一方、反応至適温度の低い中温性ＢＥの中には、グリコーゲン合成能力を有さないものがあった。
【００７６】
グリコーゲン合成能力を有するＢＥは、好ましくは、耐熱性ＢＥである。耐熱性ＢＥとは、ＢＥ活性測定を、反応温度を変化させて行った場合の反応の至適温度が４５℃以上であるＢＥをいう。
【００７７】
グリコーゲン合成能力を有するＢＥの反応至適温度は、好ましくは、約４５℃以上であり、約９０℃以下である。本明細書中では、「反応至適温度」とは、上述のＢＥ活性測定を温度のみ変化させて行い、最も活性が高い温度をいう。反応至適温度は好ましくは、約４５℃以上であり、約５０℃以上であり、さらに好ましくは約５５℃以上であり、特に好ましくは約６０℃以上であり、最も好ましくは約６５℃以上である。反応至適温度に上限はないが、好ましくは約９０℃以下であり、約８５℃以下であり、さらに好ましくは約８０℃以下であり、特に好ましくは約７５℃以下である。
【００７８】
グリコーゲン合成能力を有するＢＥは、より好ましくは、好熱性菌または中温性菌由来のＢＥである。本明細書中では、「好熱性菌」とは、生育最適温度が約５０℃以上であり、約４０℃以下ではほとんど増殖しない微生物をいう。好熱性菌は、中等度好熱性菌および高度好熱性菌に分けられる。「中等度好熱性菌」とは、生育最適温度が約５０℃〜約７０℃である微生物をいう。「高度好熱性菌」とは、生育最適温度が約７０℃以上である微生物をいう。さらに、高度好熱性菌のうち、生育最適温度が約８０℃以上である微生物を、「超好熱性菌」という。対照的に、「中温性菌」とは、生育温度が通常の温度環境にある微生物をいい、特に、生育最適温度が約２０℃〜約４０℃である微生物をいう。
【００７９】
グリコーゲン合成能力を有するＢＥを産生する好熱性菌は、好ましくは、Ａｑｕｉｆｅｘ属、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、またはＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属に属する。グリコーゲン合成能力を有するＢＥを産生する中温性菌は、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する。
【００８０】
グリコーゲン合成能力を有するＢＥは、より好ましくは、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからなる群より選択される細菌に由来し、さらにより好ましくは、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからなる群より選択される細菌に由来する。なお、最近では、好熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌と記載されることも多い。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓと同一の細菌を指す。
【００８１】
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。
【００８２】
Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５の天然のＢＥをコードする塩基配列を配列番号１に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号２に示す。本明細書中では、「天然の」ＢＥは、もともとＢＥを産生する細菌から単離されたＢＥだけでなく、天然のＢＥと同じアミノ酸配列を有する、遺伝子組換えによって得られるＢＥをも包含する。Ａｑｕｉｆｅｘ
ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来の天然のＢＥをコードする塩基配列のクローニング方法は、非特許文献８およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍａａｒｅｌ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｅ．  Ｃ．ら、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、２００３、２１巻、ｐ１９９−２０７に記載される。Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥは、種々のＭｎの基質からグリコーゲンを極めて良好に製造するという特性を有する。
【００８３】
Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ９７８５の天然のＢＥをコードする塩基配列を配列番号３に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号４に示す。Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ９７８５由来の天然のＢＥをコードする塩基配列のクローニング方法は、非特許文献１１および特許文献３に記載される。
【００８４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＲＢＥ１４の天然のＢＥをコードする塩基配列を配列番号５に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号６に示す。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＲＢＥ１４由来の天然のＢＥをコードする塩基配列のクローニング方法は、非特許文献９および非特許文献１２に記載される。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢＥは、特に低分子量の基質からグリコーゲンを極めて良好に製造するという特性を有する。なお、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌においては、ＡＴＧに加えて、ＴＴＧおよびＧＴＧが開始コドンとして使用され、メチオニンとして翻訳される。そのため、配列番号５の１〜３位のＴＴＧは開始コドンとして作用し、メチオニンに翻訳される。配列番号５の塩基配列を有する核酸分子を用いて他の生物においてＢＥを発現させる場合、一般に、１位のＴはＡに置換される。
【００８５】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １５０３−４Ｒ  ｖａｒ．４の天然のＢＥをコードする塩基配列を配列番号７に示し、そしてアミノ酸配列を配列
番号８に示す。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １５０３−４Ｒ  ｖａｒ．４由来の天然のＢＥをコードする塩基配列のクローニング方法は、Ｋｉｅｌ，Ｊ．Ａ．Ｋ．Ｗ．ら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９１．２３０：ｐ．１３６−１４４およびＥＰ０４１８９４５Ｂ１に記載される。配列番号７の１〜３位のＴＴＧは開始コドンとして作用し、メチオニンに翻訳される。配列番号７の塩基配列を有する核酸分子を用いて他の生物においてＢＥを発現させる場合、一般に、１位のＴはＡに置換される。
【００８６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ  ＩＦＯ１５３１５の天然のＢＥをコードする塩基配列を配列番号９に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号１０に示す。配列番号９の１〜３位のＴＴＧは開始コドンとして作用し、メチオニンに翻訳される。配列番号９の塩基配列を有する核酸分子を用いて他の生物においてＢＥを発現させる場合、一般に、１位のＴはＡに置換される。
【００８７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓの天然のＢＥをコードする塩基配列を配列番号１１に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号１２に示す。配列番号１１の１〜３位のＴＴＧは開始コドンとして作用し、メチオニンに翻訳される。配列番号１１の塩基配列を有する核酸分子を用いて他の生物においてＢＥを発現させる場合、一般に、１位のＴはＡに置換される。
【００８８】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＩＦＯ１５３１３の天然のＢＥをコードする塩基配列を配列番号１３に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号１４に示す。配列番号１３の１〜３位のＴＴＧは開始コドンとして作用し、メチオニンに翻訳される。配列番号１３の塩基配列を有する核酸分子を用いて他の生物においてＢＥを発現させる場合、一般に、１位のＴはＡに置換される。
【００８９】
Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１の天然のＢＥをコードする塩基配列を配列番号１５に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号１６に示す。
【００９０】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０の天然のＢＥをコードする塩基配列を配列番号１７に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号１８に示す。
【００９１】
これらの天然のＢＥの塩基配列およびアミノ酸配列は例示であり、これらの配列とはわずかに異なる配列を有する改変体（いわゆる、対立遺伝子改変体）が天然に存在し得ることは公知である。本発明の方法においては、例示した配列を有するＢＥ以外にも、グリコーゲン合成能力を有する限り、このような、天然に存在する改変体および天然のＢＥに対して人工的に変異を導入した改変体も用い得る。例えば、ＷＯ２０００／０５８４４５号公報および特許文献３には、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来ＢＥの改変体が記載されている。改変体ＢＥは、改変を導入する前のＢＥと同等以上の活性を有することが好ましい。例えば、本発明で用いられるＢＥのアミノ酸配列は、ある実施形態では、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、および配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列（すなわち、対照アミノ酸配列）と同一、すなわち、１００％同一であってもよく、別の実施形態では、このアミノ酸配列は、対照アミノ酸配列と比較してある一定の数までアミノ酸が変化していてもよい。このような変化は、少なくとも１個（好ましくは１または数個）のアミノ酸の欠失、置換（保存的置換および非保存的置換を含む）または挿入からなる群より選択され得る。この変化は対照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。アミノ酸残基の変化は、１残基ずつ点在していてもよく、数残基連続していてもよい。当業者は
、所望の性質を有するＢＥを容易に選択することができる。あるいは、目的とするＢＥをコードする遺伝子を直接化学合成してもよい。そのような化学合成の方法は、当該分野において周知である。
【００９２】
ＢＥの改変は、当該分野で周知の方法を用いて、例えば、部位特異的変異誘発法、変異原を用いた変異誘発法（対象遺伝子を亜硝酸塩などの変異剤で処理すること、紫外線処理を行うこと）、エラープローンＰＣＲを行うことなどによって行われ得る。目的の変異を得やすい点から、部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。部位特異的変異誘発を用いれば、目的とする部位で目的とする改変を導入することができるからである。あるいは、目的とする配列をもつ核酸分子を直接合成してもよい。そのような化学合成の方法は、当該分野において周知である。部位特異的変異誘発の手法は、例えば、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．６４８７−６５００（１９８２）に記載される。
【００９３】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００９４】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として実質的に同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において実質的に等価なタンパク質）を生じさせ得ることは、当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００９５】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換が
挙げられるがこれらに限定されない：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【００９６】
本発明の方法において使用するＢＥは、ＢＥを産生する天然の微生物から単離されてもよい。例えば、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなどから天然のＢＥを単離し得る。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＲＢＥ１４のＢＥについての手順を例示すると、最初に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＲＢＥ１４を適切な培地（例えば、Ｌブロス（１％  Ｂａｃｔｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．，ＵＳＡ）、０．５％  Ｂａｃｔｏ−ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３））中に接種し、振盪させながら約５０℃〜約６０℃で一晩培養する。次いで、この培養液を遠心分離して、菌体を収集する。得られた菌体を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液を得る。この菌体破砕液を、約６０℃の水浴中で約３０分間加熱する。加熱後、この菌体破砕液を、遠心機（ベックマン社製、ＡＶＡＮＴＩ  Ｊ−２５Ｉ）を用いて遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去し、上清を得る。得られた上清を、あらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに流してＢＥを樹脂に吸着させる。樹脂を、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄して不純物を除去する。続いて、４００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液でＢＥを溶出させ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＲＢＥ１４由来ＢＥ酵素液とする。さらなる精製を必要とする場合、必要に応じて、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲ（ファルマシア社製）などを用いたゲルフィルトレーションクロマトグラフィーによる分画、Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー社製）などを用いた疎水クロマトグラフィーによる分画を組み合わせることにより、精製Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＲＢＥ１４由来ＢＥ含有溶液を得ることができる。他の細菌種からのＢＥの精製も同様に行い得る。
【００９７】
あるいは、本発明の方法において使用するＢＥは、ＢＥをコードする塩基配列を含む核酸分子を適切な宿主細胞に導入してＢＥを発現させ、この発現されたＢＥをこの宿主細胞またはその培養液から精製することによって入手され得る。
【００９８】
天然のＢＥをコードする塩基配列を含む核酸分子（遺伝子ともいう）は、上記のようにして得た精製ＢＥをトリプシン処理し、得られるトリプシン処理断片をＨＰＬＣにより分離し、分離されたいずれかのペプチド断片のＮ末端のアミノ酸配列を、ペプチドシークエンサーにより同定し、次いで、同定したアミノ酸配列をもとに作製した合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、適切なゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、入手され得る。オリゴヌクレオチドプローブおよびＤＮＡライブラリーを調製するための、ならびに核酸のハイブリダイゼーションによりそれらをスクリーニングするための基本的な戦略は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第ＩおよびＩＩ  巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編
１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編  １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）を参照のこと。
【００９９】
あるいは、既知のＢＥ遺伝子の塩基配列に対する相同性に基づいて、この塩基配列の少なくとも一部を含む核酸プローブを用いたハイブリダイゼーションによってスクリーニングして、別種のＢＥ遺伝子を含む核酸分子を獲得することもできる。このような方法は当
該分野で公知である。
【０１００】
あるいは、種々のＢＥのアミノ酸配列において保存された領域に対応する縮重プライマーを作製して、ＰＣＲによってＢＥの塩基配列を獲得することも可能である。このような方法は当該分野で公知である。
【０１０１】
ゲノムライブラリーをスクリーニングする場合、得られた核酸分子は、当業者に周知の方法を用いてサブクローニングされ得る。例えば、目的の遺伝子を含むλファージと、適切な大腸菌と、適切なヘルパーファージとを混合することにより、容易に目的の遺伝子を含有するプラスミドを得ることができる。その後、プラスミドを含有する溶液を用いて、適切な大腸菌を形質転換することにより、目的の遺伝子をサブクローニングし得る。得られた形質転換体を培養して、例えばアルカリＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを得、目的の遺伝子の塩基配列を決定し得る。塩基配列を決定する方法は、当業者に周知である。さらに、ＤＮＡフラグメントの塩基配列を基に合成されたプライマーを用い、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓなどのゲノムＤＮＡなどを鋳型に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて直接ＢＥ遺伝子を増幅することもできる。
【０１０２】
あるいは、公知の塩基配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８のアミノ酸配列をコードする塩基配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７の塩基配列））に基づいて化学合成されてもよい。
【０１０３】
本発明の方法で用いられるＢＥのアミノ酸配列をコードする塩基配列は、上記の対照アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（すなわち、対照塩基配列）と比較してある一定の数まで変化していてもよい。このような変化は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入からなる群より選択され得る。この変化は対照塩基配列の５’末端もしくは３’末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。塩基の変化は、１塩基ずつ点在していてもよく、数塩基連続していてもよい。
【０１０４】
塩基の変化は、そのコード配列において、ノンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異を生じ得、このような変化をした後の塩基配列によりコードされるＢＥに変化をもたらし得る。
【０１０５】
２つのアミノ酸配列を直接比較する場合、そのアミノ酸配列間でアミノ酸が、代表的には少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約５０％、特に好ましくは少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％同一であることが好ましい。
【０１０６】
本明細書では配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０（株式会社ゼネティックス）のマキシマムマッチングを用いて算出される。このプログラムは、解析対象となる配列データに対して、比較対照となる配列データを置き換えおよび欠損を考慮しながら、配列間で一致するアミノ酸対が最大になるように並べ替え、その際、一致（Ｍａｔｃｈｅｓ）、不一致（Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、ギャップ（Ｇａｐｓ）についてそれぞれ得点を与え合計を算出して最小となるアライメントを出力しその際の同一性を算出する（参考文献：Ｔａｋａｓｈｉ，Ｋ．，およびＧｏｔｏｈ，Ｏ．１９８４．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  Ｖａｒｉｏｕｓ  ４．５  Ｓ  ＲＮＡ  
Ｓｐａｃｉｅｓ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１１７３−１１７７）。本明細書では配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０のマキシマムマッチングをＭａｔｃｈｅｓ＝−１；Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ＝１；Ｇａｐｓ＝１；＊Ｎ＋＝２の条件で用いて算出される。
【０１０７】
天然の酵素または核酸分子としてはまた、本明細書において具体的に記載されたＢＥのアミノ酸配列またはＢＥをコードする塩基配列（例えば、配列番号１、２など）に対して同一ではないが相同性のある配列を有するものもまた使用され得る。天然の酵素または核酸分子に対して相同性を有するそのような酵素または核酸分子としては、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０のマキシマムマッチングにおいて、上記の条件で用いて比較した場合に、比較対象の配列に対して、核酸の場合、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％の同一性を有する塩基配列を含む核酸分子が挙げられ、そして酵素の場合、少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０８】
配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７からなる群より選択される塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるＢＥは、グリコーゲン合成能力を有する限り、本発明の方法において使用され得る。配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７からなる群より選択される塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子に対して改変を行って得られる改変塩基配列を含む核酸分子によってコードされるＢＥもまた、グリコーゲン合成能力を有する限り、本発明の方法において使用され得る。当業者は、所望のＢＥ遺伝子を容易に選択することができる。
【０１０９】
本明細書中で使用する用語「ストリンジェントな条件」とは、特異的な配列にはハイブリダイズするが、非特異的な配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件の設定は、当業者に周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載される。具体的には、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液（０．２％  ＢＳＡ、０．２％  Ｆｉｃｏｌｌ
４００および０．２％ポリビニルピロリドン）、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄するという条件を用いることにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。
【０１１０】
本発明の方法で用いられるＢＥを製造するために用いられる核酸分子は、天然のＢＥをコードする塩基配列を含む核酸分子に対して保存的に改変された核酸分子であってもよい。「天然のＢＥをコードする塩基配列を含む核酸分子に対して保存的に改変された核酸分子」とは、天然のＢＥのアミノ酸配列と同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸分子をいう。「天然のＢＥのアミノ酸配列と本質的に同一のアミノ酸配列」とは、天然のＢＥと本質的に同じ酵素活性を有するアミノ酸配列をいう。遺伝コードの縮重のため、機能的に同一な多数の塩基配列が任意の所定のアミノ酸配列をコー
ドする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、ＧＣＡコドンによってアラニンが特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたアラニンを変更することなく、ＧＣＣ、ＧＣＧまたはＧＣＵに変更され得る。同様に、複数のコドンによってコードされ得るアミノ酸に関しては、コドンによってそのアミノ酸が特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされた特定のアミノ酸を変更することなく、そのアミノ酸をコードする任意の別のコドンに変更され得る。このような塩基配列の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての塩基配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を包含する。サイレント変異は、コードするアミノ酸が変化しない「サイレント置換」と、そもそも核酸がアミノ酸をコードしない場合（例えば、イントロン部分での変異、他の非翻訳領域での変異など）を包含する。ある核酸がアミノ酸をコードする場合、サイレント変異は、サイレント置換と同義である。本明細書において「サイレント置換」とは、塩基配列において、あるアミノ酸をコードする塩基配列を、同じアミノ酸をコードする別の塩基配列に置換することをいう。遺伝コード上の縮重という現象に基づき、あるアミノ酸をコードする塩基配列が複数ある場合（例えば、グリシンなど）、このようなサイレント置換が可能である。したがって、サイレント置換により生成した塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、もとのポリペプチドと同じアミノ酸配列を有する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンをコードする唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンをコードする唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。
【０１１１】
本発明で用いられるＢＥをコードする塩基配列は、発現のために導入される生物におけるコドンの使用頻度にあわせて変更され得る。コドン使用頻度は、その生物において高度に発現される遺伝子での使用頻度を反映する。例えば、大腸菌において発現させることを意図する場合、公開されたコドン使用頻度表（例えば、Ｓｈａｒｐら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６  第１７号，８２０７頁（１９８８））に従って大腸菌での発現のために最適にすることができる。
【０１１２】
上記のようにして改変された塩基配列を含む核酸分子を用いて、発現ベクターが作製され得る。特定の核酸配列を用いて発現ベクターを作製する方法は、当業者に周知である。
【０１１３】
本明細書において核酸分子について言及する場合、「ベクター」とは、目的の塩基配列を目的の細胞へと移入させることができる核酸分子をいう。そのようなベクターとしては、目的の細胞において自律複製が可能であるか、または目的の細胞の染色体中への組込みが可能で、かつ改変された塩基配列の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであり得る。
【０１１４】
本明細書において、「発現ベクター」とは、改変された塩基配列（すなわち、改変されたＢＥをコードする塩基配列）を目的の細胞中で発現し得るベクターをいう。発現ベクターは、改変された塩基配列に加えて、その発現を調節するプロモーターのような種々の調節エレメント、および必要に応じて、目的の細胞中での複製および組換え体の選択に必要な因子（例えば、複製起点（ｏｒｉ）、および薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー）を含む。発現ベクター中では、改変された塩基配列は、転写および翻訳されるように作動可能に連結されている。調節エレメントとしては、プロモーター、ターミネーターおよびエンハンサーが挙げられる。また、発現された酵素を細胞外へ分泌させることが意図される場合は、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が、改変された塩基配列の上流に正
しいリーディングフレームで結合される。特定の生物（例えば、細菌）に導入するために使用される発現ベクターのタイプ、その発現ベクター中で使用される調節エレメントおよび他の因子の種類が、目的の細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０１１５】
本明細書において使用される「ターミネーター」は、タンパク質コード領域の下流に位置し、塩基配列がｍＲＮＡに転写される際の転写終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
【０１１６】
本明細書において使用される「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、また転写頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウェアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
【０１１７】
本明細書において使用される「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【０１１８】
本明細書において使用される「作動可能に連結された（る）」とは、所望の塩基配列が、発現（すなわち、作動）をもたらす転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０１１９】
改変した核酸配列を、上記調節エレメントに作動可能に連結するために、目的のＢＥ遺伝子を加工すべき場合がある。例えば、プロモーターとコード領域との間が長すぎて転写効率の低下が予想される場合、またはリボゾーム結合部位と翻訳開始コドンとの間隔が適切でない場合などである。加工の手段としては、制限酵素による消化、Ｂａｌ３１、ＥｘｏＩＩＩなどのエキソヌクレアーゼによる消化、あるいはＭ１３などの一本鎖ＤＮＡまたはＰＣＲを使用した部位特異的変異の導入が挙げられる。
【０１２０】
次いで、上記のようにして作製された発現ベクターを細胞に導入してＢＥが発現される。
【０１２１】
本明細書において酵素の「発現」とは、その酵素をコードする塩基配列が、インビボまたはインビトロで転写および翻訳されて、コードされる酵素が生産されることをいう。
【０１２２】
発現ベクターを導入する細胞（宿主ともいう）としては、原核生物および真核生物が挙げられる。発現ベクターを導入する細胞は、ＢＥの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。例えば、ＢＥをグリコーゲンの合成に用いる場合、ＢＥは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない細胞を用いることが好ましい。このような細胞の例としては、細菌、真菌などの微生物が挙げられる。より好ましい細胞の例としては、中温性菌（例えば、大腸菌、枯草菌）が挙げられる。細胞は、微生
物細胞であってもよいが、植物、動物などの細胞であってもよい。用いる細胞によっては、本発明の酵素は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【０１２３】
本発明の方法において、発現ベクターを細胞に導入する技術は、当該分野で公知の任意の技術であり得る。このような技術の例としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、繁用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ
Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
【０１２４】
（２．基質）
本発明では、主にα−１，４−グルコシド結合で連結された重合度４以上のα−グルカンが、基質として用いられる。
【０１２５】
本明細書中では「α−グルカン」とは、Ｄ−グルコースを構成単位とする、糖であって、α−１，４−グルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。α−グルカンは、直鎖状、分岐状または環状の分子であり得る。直鎖状α−グルカンとα−１，４−グルカンとは同義語である。直鎖状α−グルカンでは、α−１，４−グルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。α−１，６−グルコシド結合を１つ以上含むα−グルカンは、分岐状α−グルカンである。α−グルカンは、好ましくは、直鎖状の部分をある程度含む。分岐のない直鎖状α−グルカンがより好ましい。
【０１２６】
本明細書中では「主にα−１，４−グルコシド結合で連結された」とは、糖単位間が主にα−１，４−グルコシド結合によって連結されていることをいう。「主に」とは、糖単位間の結合の５０％以上を占めることをいう。α−１，４−グルコシド結合以外の糖単位間結合は、可能な任意の結合であり得るが、一般的にはα−１，６−グルコシド結合である。
【０１２７】
基質として用いるα−グルカンは、分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）が少ないことが好ましい。このような場合、分岐の数は、１分子あたり、代表的には約０〜約１００個、好ましくは約０〜約５０個、さらに好ましくは約０〜約２５個、約０〜約１０個、約０〜約５個、さらに好ましくは０個である。
【０１２８】
α−１，６−グルコシド結合は、α−グルカン中に無秩序に分布していてもよいし、均質に分布していてもよい。α−グルカン中に糖単位で５個以上の直鎖状部分ができる程度の分布であることが好ましい。
【０１２９】
本発明で基質として用いられるα−グルカンは重合度４（分子量６６６）以上である。基質であるα−グルカンは単一の分子量の純粋な物質であっても、様々な分子量の分子の混合物であってもよい。基質以外に、基質として作用しないグルコースを含む混合物を溶液に添加してもよい。工業的には、種々の分子量の分子の混合物を原料糖として用いることが多い。
【０１３０】
反応開始前の溶液中の糖のＭｎは、約１８０より大きく、好ましくは約１８１以上であり、より好ましくは約１８２以上であり、より好ましくは約１８３以上であり、より好ましくは約１８４以上であり、より好ましくは約１８５以上である。反応開始前の溶液中の
糖の数平均分子量は、例えば、約１９０以上、約１９５以上、約２００以上、約２５０以上、約３００以上、約３５０以上、約４００以上、約４５０以上、約５００以上、約５５０以上、約６００以上、約６５０以上、約７００以上、約７５０以上、約８００以上、約８５０以上、約９００以上、約９５０以上、約１０００以上、約１，０００以上、約１，５００以上、約２，０００以上、約２，５００以上などであってもよい。グルコース（分子量１８０）または重合度３以下のα−グルカンはＢＥの基質とはなり得ないが、重合度４以上のα−グルカンは基質となり得る。少量の基質（例えば、重合度４）に多量のグルコースを添加すると、その混合物のＭｎは１８０に近づく。反応開始前の溶液中の糖のＭｎが１８０付近であっても、重合度４以上のα−グルカンが存在すれば反応は生じる。それゆえ、反応開始前の溶液中の糖のＭｎが１８０付近であっても、重合度４以上のα−グルカンを含めば、反応に使用することができる。
【０１３１】
本発明で基質として用いられるα−グルカンの分子量に上限はない。反応開始前の溶液中の糖のＭｎは、約１５０，０００以下であり、好ましくは約１２０，０００以下であり、より好ましくは約１００，０００以下であり、より好ましくは約８０，０００以下であり、さらにより好ましくは約５０，０００以下であり、さらにより好ましくは約２０，０００以下であり、さらにより好ましくは約８，０００未満であり、最も好ましくは約４，０００未満である。特に、反応開始前の溶液中の糖のＭｎが約１，５００以上約４，０００未満という低分子のα−グルカンを基質として用いると、Ｍｗが１００万以上で、水への溶解性が高く、プルラナーゼおよびα−アミラーゼに対して高い耐性を有する高分岐のα−グルカンを極めて得やすいという利点がある。
【０１３２】
本発明で基質として用いられるα−グルカンは、Ｄ−グルコースのみから構成されていてもよいし、ＢＥによる反応速度が２０％以下に低下しない程度に修飾された誘導体であってもよい。修飾されていないことが好ましい。
【０１３３】
本発明で基質として用いられるα−グルカンは、天然のアミロースであってもよいが、好ましくは、澱粉枝切り物、デキストリン枝切り物または酵素合成アミロースである。天然のアミロースは、若干の分岐構造を有する場合がある。澱粉枝切り物およびデキストリン枝切り物もまた、枝切り反応が不十分な場合、若干の分岐構造を有する場合がある。澱粉枝切り物は、当該分野で公知の澱粉をイソアミラーゼまたはプルラナーゼによって分解したものであり得る。澱粉枝切り物を得るために用いられる澱粉の例としては、例えば、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉などの地下澱粉；コーンスターチ（ワキシーコーンスターチ、ハイアミロースコーンスターチなど）、小麦澱粉、米澱粉（例えば、もち米澱粉、粳米澱粉）、サゴ澱粉、豆澱粉などの地上澱粉が挙げられる。澱粉枝切り物は安価でかつ容易に入手できるため、特に好ましい。ハイアミロースコーンスターチのα−１，６−グルコシド結合分解物を用いることも好ましい。
【０１３４】
（３．他の酵素）
（ｉ．４−α−グルカノトランスフェラーゼ）
本発明の製造方法は、反応開始前の溶液中の糖のＭｎが１８０より大きく１，５００未満の溶液中で、重合度２以上のα−グルカンに４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させることにより、前記基質を生産する工程をさらに包含し得る。
【０１３５】
本発明の製造方法ではまた、４−α−グルカノトランスフェラーゼをＢＥと共存させてもよい。
【０１３６】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、供与体分子の非還元末端からグルコシル基、あるいは、２個以上のグルコースからなるユニットを受容体分子の非還元末端に転移する酵素である。従って、酵素反応は、最初に与えられたマルトオリゴ
糖の重合度の不均一化をもたらす。供与体分子と受容体分子とが同一の場合は、分子内転移が生じ、その結果、環状構造をもつ生成物が得られる。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、その一次構造から６つのタイプに分類されている（ＴｙｐｅＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、およびＯｔｈｅｒｓ）（Ｔａｋａｈａ，Ｔ．およびＳｍｉｔｈ，Ｓ．Ｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｇｅｎｅｔ. Ｅｎｇ. Ｒｅｖ.  １６巻 ｐ２５７−２８０（１９９
９）。ＴｙｐｅＩは、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ(以下、ＣＧＴａ
ｓｅという)と呼ばれている（ＥＣ２．４．１．１９）。ＴｙｐｅＩＩは、ディスプロポ
ーショネーティングエンザイム、Ｄ−酵素、アミロマルターゼ、不均化酵素などとも呼ばれる酵素である（ＥＣ  ２．４．１．２５）（以下、ＭａｌＱと呼ぶ）。ＴｙｐｅＩＩＩは、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅという、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性とアミロ１，６グルコシダーゼ活性を併せ持つ酵素である（ＥＣ  ３．２．１．３３＋ＥＣ  ２．４．１．２５）。ＴｙｐｅＩＶおよびＶには、超好熱性菌由来の４−α−グルカノトランスフェラーゼが分類されている。Ｏｔｈｅｒｓには、一次構造情報は得られていないが、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性は報告されているいくつかの酵素が分類されている。４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性は、Ｔｅｒａｄａら（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６５巻，９１０〜９１５頁（１９９９））に基づいて決定され得る。４−α−グルカノトランスフェラーゼの性質に従って、測定時の反応温度、反応ｐＨなどを調整し得る。
【０１３７】
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、微生物および植物に存在する。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する微生物の例としては、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなどが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する植物の例としては、馬鈴薯、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、トウモロコシ、イネ、コムギ、などの穀類、えんどう豆、大豆、などの豆類などが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、市販のものであっても、当該分野で公知の方法によりこれらの生物から調製されてもよく、またはこれらの生物の枝切り酵素遺伝子を用いて遺伝子組換え法により調製されてもよい。当該分野で公知の任意の４−α−グルカノトランスフェラーゼが使用され得る。
【０１３８】
ＣＧＴａｓｅ（ＥＣ２．４．１．１９）も１種の４−α−グルカノトランスフェラーゼであり、本発明の製造方法に使用しうる。本発明で用いられ得るＣＧＴａｓｅは、マルトオリゴ糖の糖転移反応（不均一化反応）を触媒し得る酵素である。ＣＧＴａｓｅは、供与体分子の非還元末端の６〜８個のグルコース鎖を認識してこの部分を環状化させるように転移反応を行い、重合度６〜８個のシクロデキストリンと非環状リミットデキストリンとを生成する酵素である。
【０１３９】
ＣＧＴａｓｅとしては、周知の微生物由来のＣＧＴａｓｅ、あるいは市販のＣＧＴａｓｅが用いられ得る。好適には、市販のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  由来のＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所、岡山）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍａｃｅｒａｎｓ由来のＣＧＴａｓｅ（商品名：コンチザイム、天野製薬株式会社、名
古屋）、あるいはＡｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  Ａ２−５ａ由来のＣＧＴａｓｅが用いられ得る。より好適には、Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  Ａ２−５ａ由来のＣＧＴａｓｅが用いられ得る。Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  Ａ２−５ａは、特開平７−１０７９７２号に開示されているアルカリ域で高い活性を有するＣＧＴａｓｅを産生する株であり、出願人によって、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３８６４）として寄託されている。ＣＧＴａｓｅを産生する生物はこれらに限定されない。ＣＧＴａｓｅは、市販のものであっても、当該分野で公知の方法によりこれらの生物から調製されてもよく、またはこれらの生物のＣＧＴａｓｅ遺伝子を用いて遺伝子組換え法により調製されてもよい。当該分野で公知の任意のＣＧＴａｓｅが使用され得る。本発明の製造方法では、ＣＧＴａｓｅ以外の４−α−グルカノトランスフェラーゼを用いることが好ましい。ＣＧＴａｓｅ以外の４−α−グルカノトランスフェラーゼをＢＥと共存させると、ＣＧＴａｓｅをＢＥと共存させた場合よりも顕著にグリコーゲンの収率が向上する。
【０１４０】
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、ＢＥと同時に添加することが好ましい。しかし、生成するグリコーゲンの分子量および収率に影響しない限り、ＢＥ添加の前、または後に添加しても良い。４−α−グルカノトランスフェラーゼとＢＥとを共存させると、ＢＥを単独で用いた場合と比較して、グリコーゲンの収率が顕著に向上する。
【０１４１】
（ｉｉ．Ｍｎが１８０より大きく１，５００未満のα−グルカン）
Ｍｎが１８０より大きく１，５００未満のα−グルカンが単独の物質である場合、例としては、重合度２〜９のマルトオリゴ糖が挙げられる。好ましくは、重合度３〜８のマルトオリゴ糖であり、より好ましくは重合度３〜７のマルトオリゴ糖であり、さらにより好ましくは重合度４〜６のマルトオリゴ糖であり、特に好ましくは重合度４〜５のマルトオリゴ糖であり、最も好ましくは重合度４のマルトオリゴ糖である。
【０１４２】
Ｍｎが１８０より大きく１，５００未満のα−グルカンが混合物である場合、例としては、重合度４〜１２のマルトオリゴ糖を含む混合物が挙げられる。Ｍｎが１８０より大きく１，５００未満のα−グルカンは、重合度４〜１２のマルトオリゴ糖に加えて、グルコースなどの低分子の糖を含み得る。Ｍｎが１８０より大きく１，５００未満のα−グルカンは、好ましくは、重合度４〜７のマルトオリゴ糖を含み、より好ましくは重合度４〜７のマルトオリゴ糖である。重合度４〜７のマルトオリゴ糖は、それぞれ、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、およびマルトヘプタオースとも呼ばれる。
【０１４３】
（ｉｉｉ．枝切り酵素）
本発明の製造方法は、Ｍｎ５００以上の低分岐α−グルカンに枝切り酵素を作用させることにより、上記基質を生産する工程をさらに包含し得る。枝切り酵素とは、α−１，６−グルコシド結合を切断し得る酵素である。枝切り酵素は、アミロペクチンおよびグリコーゲンにともによく作用するイソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）と、プルランによく作用するα−デキストリンエンド−１，６−α−グルコシダーゼ（プルラナーゼともいう）（ＥＣ  ３．２．１．４１）との２つに分類される。イソアミラーゼおよびプルラナーゼのいずれも本発明の方法において用いられ得る。枝切り酵素は、澱粉のような安価な材料から、主にα−１，４−グルコシド結合で連結された重合度４以上のα−グルカンを生成するために用いられ得る。枝切り酵素活性は、Ｙｏｋｏｂａｙａｓｈｉら(Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａ,ｖｏｌ.２１２，ｐ４５８−４６９（１９７０）)に
基づいて決定され得る。枝切り酵素の性質に従って、測定時の反応温度、反応ｐＨなどを調整し得る。
【０１４４】
枝切り酵素は、微生物、原核生物、および植物に存在する。枝切り酵素を産生する微生
物の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．が挙げられる。枝切り酵素を産生する原核生物の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｔｈａｌｐｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｏｄｏｒａｔｕｍ、Ｆａｌｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｈａｋｏｎｅｎｓｉｓなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する植物の例としては、馬鈴薯、サツマイモ、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウダイコンなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する生物はこれらに限定されない。枝切り酵素は、市販のものであっても、当該分野で公知の方法によりこれらの生物から調製されてもよく、またはこれらの生物の枝切り酵素遺伝子を用いて遺伝子組換え法により調製されてもよい。当該分野で公知の任意の枝切り酵素が使用され得る。
【０１４５】
枝切り酵素は、ＢＥを反応溶液中に添加する前に添加されることが好ましい。
【０１４６】
（ｉｖ．Ｍｎ５００以上の低分岐α−グルカン）
Ｍｎ５００以上の低分岐α−グルカンは、天然に存在するα−グルカンであり得る。本明細書中では、「低分岐」とは、分岐の頻度が低いことをいう。低分岐α−グルカンは、分岐を含まなくてもよい。低分岐α−グルカンでは、好ましくは、α−１，６−グルコシド結合の数を１としたときのα−１，４−グルコシド結合の数が、好ましくは約１０〜約１００００であり、より好ましくは約１０〜約５０００であり、さらに好ましくは約１５〜約１０００であり、さらに好ましくは約２０〜約６００である。Ｍｎ約５００以上の低分岐α−グルカンの例としては、澱粉、アミロース、アミロペクチンおよびこれらの誘導体あるいは部分分解物が挙げられる。澱粉の例としては、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉などの地下澱粉；コーンスターチ（ワキシーコーンスターチ、ハイアミロースコーンスターチなど）、小麦澱粉、米澱粉（例えば、もち米澱粉、粳米澱粉）、サゴ澱粉、豆澱粉などの地上澱粉が挙げられる。アミロースの例としては、これらの澱粉から単離されたアミロースが挙げられる。アミロペクチンとしては、これらの澱粉から単離されたアミロペクチンが挙げられる。Ｍｎ５００以上の低分岐α−グルカンは、当該分野で公知であり、容易に入手され得る。
【０１４７】
（４．グリコーゲンの製造方法）
本発明の製造方法では、例えば、グリコーゲン合成能力を有するＢＥと、基質（すなわち、主にα−１，４−グルコシド結合で連結された重合度４以上のα−グルカン）と、緩衝剤と、それを溶かしている溶媒とを主な材料として用いる。これらの材料は通常、反応開始時に全て添加されるが、反応の途中でこれらのうちの任意の材料を追加してもよい。上記のように、本発明の製造方法では、必要に応じて、Ｍｎが１８０より大きく１，５００未満のα−グルカンおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼを用いることができる。本発明の製造方法ではまた、Ｍｎ５００以上の低分岐α−グルカンおよび枝切り酵素を用いることができる。
【０１４８】
当業者は、本発明の製造方法で用いられる基質の量、酵素の量、反応時間などを適宜設定することによって所望の分子量のα−グルカンが得られることを容易に理解する。
【０１４９】
反応開始時の溶液中に含まれるＢＥの量は、反応開始時の溶液中のα−グルカンに対して、代表的には約１００Ｕ／ｇ基質以上であり、好ましくは約５００Ｕ／ｇ基質以上であり、より好ましくは約１，０００Ｕ／ｇ基質以上である。反応開始時の溶液中に含まれるＢＥの量は、反応開始時の溶液中のα−グルカンに対して、代表的には約５００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、好ましくは約１００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、さらに好ましくは約８０，０００Ｕ／ｇ基質以下である。ＢＥの使用量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、グリコーゲンの収率が低下する場合がある。
【０１５０】
ＢＥの使用量は、ＢＥを基質（すなわち、α−グルカン）に作用させる時間と関係がある。使用量が少なくとも反応時間を長くすれば反応は進み、使用量が多ければ反応時間が短くとも反応が進むからである。よって酵素量と反応時間との積が、反応物の生成に対して大きな影響を有する。本発明の方法においては、好ましくは、ＢＥの使用量と反応時間との積が約１５０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上になるように、ＢＥの使用量と反応時間とを調整する。本明細書中では、「Ｕ・時間／ｇ基質」とは、基質１ｇあたりの酵素使用量（Ｕ／ｇ基質）と反応時間（時間）との積を示す。ＢＥの使用量と反応時間との積は、より好ましくは約１６０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、より好ましくは約１７０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、より好ましくは約１８０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、より好ましくは約２００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、さらにより好ましくは約２５０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、なおより好ましくは約３００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、なおより好ましくは約３５０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上である。約４００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上、約５００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上、約６００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上、約７００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上、約８００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上のような量・時間で作用させても好適な結果が得られ得る。基質に対してＢＥを多量に、あるいは長時間作用させることにより、グリコーゲンが生成される。作用させるＢＥの量と時間との積に特に上限はないが、あまりにも多量のＢＥをあまりにも長時間作用させると製造コストが高価になりすぎる場合がある。作用させるＢＥの量と時間との積は例えば、約１０，０００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以下、約８，０００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以下、約５０，０００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以下、約１０，０００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以下、約８，０００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以下、約５，０００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以下、約１，０００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以下などであり得る。
【０１５１】
反応開始前の溶液中の糖のＭｎに応じて、酵素量と反応時間との積の好適な範囲は異なる。一般に、反応開始前の溶液中の糖のＭｎが小さければ、酵素量と反応時間との積がどのような範囲であっても高分子量の生成物が得られ、得られる生成物の溶解性も高い。反応開始前の溶液中の糖のＭｎが大きくなるほど、溶解性の高い高分子量の生成物を得るために必要な、酵素量と反応時間との積が大きくなる。
【０１５２】
反応開始前の溶液中の糖のＭｎが約４，０００未満である場合、本発明の方法においては、ＢＥの使用量と反応時間との積は特に限定されない。例えば、この積が約２５，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であれば、高分子量の生成物が得られる。この積は、好ましくは約３５，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、さらに好ましくは約１００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、最も好ましくは約１５０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上である。
【０１５３】
反応開始前の溶液中の糖のＭｎが約４，０００以上約８，０００未満である場合、ＢＥの使用量と反応時間との積は、好ましくは約２５，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、さらに好ましくは約５０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、最も好ましくは約１００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上である。
【０１５４】
反応開始前の溶液中の糖のＭｎが約８，０００以上約１００，０００未満である場合、ＢＥの使用量と反応時間との積は、好ましくは約４０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、さらに好ましくは約１００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、最も好ましくは約１５０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上である。
【０１５５】
反応開始前の溶液中の糖のＭｎが約１００，０００以上約１５０，０００未満である場合、ＢＥの使用量と反応時間との積は、好ましくは約１５０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、さらに好ましくは約２００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、最も好ましくは約３００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上である。
【０１５６】
本発明の製造方法に用いる溶媒は、ＢＥの酵素活性を損なわない溶媒であれば任意の溶媒であり得る。
【０１５７】
なお、グリコーゲンを生成する反応が進行し得る限り、溶媒が本発明の製造方法に用いる材料を完全に溶解する必要はない。例えば、酵素が固体の担体上に担持されている場合には、酵素が溶媒中に溶解する必要はない。さらに、α−グルカンなどの反応材料も全てが溶解している必要はなく、反応が進行し得る程度の材料の一部が溶解していればよい。
【０１５８】
代表的な溶媒は、水である。溶媒は、上記ＢＥを調製する際にＢＥに付随して得られる細胞破砕液のうちの水分であってもよい。
【０１５９】
グリコーゲン合成能力を有するＢＥと、基質（すなわち、主にα−１，４−グルコシド結合で連結されたＭｎが１８０より大きく１５０，０００以下のα−グルカン）とを含む溶液中には、ＢＥとこのα−グルカンとの間の相互作用を妨害しない限り、任意の他の物質を含み得る。このような物質の例としては、緩衝剤、ＢＥを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、塩類、培地成分などが挙げられる。
【０１６０】
これらの材料の使用量は、公知であり、当業者によって適切に設定され得る。
【０１６１】
本発明の製造方法においては、まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、グリコーゲン合成能力を有するＢＥと、基質（すなわち、主にα−１，４−グルコシド結合で連結されたＭｎが１８０より大きく１５０，０００以下のα−グルカン）とを添加することにより調製され得る。あるいは、反応溶液は、グリコーゲン合成能力を有するＢＥを含む溶液と、基質（すなわち、主にα−１，４−グルコシド結合で連結されたＭｎが１８０より大きく１５０，０００以下のα−グルカン）を含む溶液とを混合することによって調製してもよい。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。反応溶液のｐＨは、使用するＢＥが活性を発揮し得るｐＨであれば任意に設定され得る。反応溶液のｐＨは、使用するＢＥの至適ｐＨ付近であることが好ましい。反応溶液のｐＨは、代表的には約２以上であり、好ましくは約３以上であり、さらに好ましくは約４以上であり、特に好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約６以上であり、最も好ましくは約７以上である。反応溶液のｐＨは、代表的には約１３以下であり、好ましくは約１２以下であり、さらに好ましくは約１１以下であり、特に好ましくは約１０以下であり、特に好ましくは約９以下であり、最も好ましくは約８以下である。１つの実施形態では、反応溶液のｐＨは、代表的には、使用するＢＥの至適ｐＨの±３以内であり、好ましくは至適ｐＨの±２以内であり、さらに好ましくは至適ｐＨの±１以内であり、最も好ましくは至適ｐＨの±０．５以内である。
【０１６２】
この反応溶液には、必要に応じて、４−α−グルカノトランスフェラーゼまたは枝切り酵素を添加してもよい。
【０１６３】
反応開始時の溶液中に含まれる４−α−グルカノトランスフェラーゼの量は、反応開始時の溶液中のα−グルカンに対して、代表的には約０．１Ｕ／ｇ基質以上であり、好ましくは約０．５Ｕ／ｇ基質以上であり、より好ましくは約１Ｕ／ｇ基質以上である。反応開始時の溶液中に含まれる４−α−グルカノトランスフェラーゼの量は、特に上限はないが、反応開始時の溶液中のα−グルカンに対して、代表的には約５０，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、好ましくは約１０，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、さらに好ましくは約８，０００Ｕ／ｇ基質以下である。４−α−グルカノトランスフェラーゼの使用量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、グリコーゲンの収率が低下する場合がある。
【０１６４】
反応開始時の溶液中に含まれる枝切り酵素の量は、反応開始時の溶液中のα−グルカンに対して、代表的には約１０Ｕ／ｇ基質以上であり、好ましくは約５０Ｕ／ｇ基質以上であり、より好ましくは約１００Ｕ／ｇ基質以上である。反応開始時の溶液中に含まれる枝切り酵素の量は、特に上限はないが、反応開始時の溶液中のα−グルカンに対して、代表的には約５００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、好ましくは約１００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、さらに好ましくは約８０，０００Ｕ／ｇ基質以下である。枝切り酵素の使用量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、グリコーゲンの収率が低下する場合がある。
【０１６５】
次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応開始時の反応溶液中のＢＥ活性が、反応至適条件で測定した活性の約５〜約１００％である場合には、反応温度は代表的には、約２０℃以上であり得、約１００℃以下であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるＢＥの活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。反応温度は、好ましくは約３０℃以上であり、さらに好ましくは約４０℃以上であり、さらにより好ましくは約５０℃以上であり、さらにより好ましくは約５５℃以上であり、特に好ましくは約６０℃以上であり、最も好ましくは６５℃以上である。反応温度は、約９０℃以下好ましくは約８５℃以下であり、さらにより好ましくは約８０℃以下であり、より好ましくは約７５℃以下であり、特に好ましくは約７０℃以下であり、最も好ましくは６５℃以下である。
【０１６６】
反応時間は、反応温度、反応により生産されるα−グルカンの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間以上であり、より好ましくは約２時間以上であり、さらにより好ましくは約４時間以上であり、最も好ましくは約６時間以上である。反応時間に特に上限はないが、好ましくは約１００時間以下、より好ましくは約７２時間以下、さらにより好ましくは約３６時間以下、最も好ましくは約２４時間以下である。
【０１６７】
本発明の製造方法では、α-グルカンホスホリラーゼまたはグリコーゲン合成酵素のい
ずれも使用しないことが好ましい。
【０１６８】
このようにして、グリコーゲンを含有する溶液が生産される。本発明の方法によって製造されるグリコーゲンのＭｗは、好ましくは、約１００万（Ｄａ）以上であり、より好ましくは約２００万（Ｄａ）以上であり、さらにより好ましくは約５００万（Ｄａ）以上であり、最も好ましくは約１０００万（Ｄａ）以上である。本発明の製造方法によって製造されるグリコーゲンのＭｗに特に上限はないが、例えば、約５０００万（Ｄａ）まで、約１億（Ｄａ）まで、約１０億（Ｄａ）までのグリコーゲンが良好な生産性で合成され得る。得られたグリコーゲンのＭｗは、当該分野で公知の方法によって確認され得る。グリコ
ーゲンのＭｗは、例えば、以下の方法で測定され得る。
【０１６９】
まず、合成したα−グルカンを１Ｎ水酸化ナトリウムで完全に溶解し、適当量の塩酸で中和した後、α−グルカン約１μｇ〜約３００μｇ分を、示差屈折計と多角度光散乱検出器とを併用したゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより平均分子量を求める。
【０１７０】
詳しくは、カラムとしてＳｈｏｄｅｘ  ＯＨ−Ｐａｃｋ  ＳＢ８０６ＭＨＱ（内径８ｍｍ、長さ３００ｍｍ、昭和電工製）を用い、ガードカラムとしてＳｈｏｄｅｘ  ＯＨ−Ｐａｃｋ  ＳＢ−Ｇ（内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍ、昭和電工製）を用い、検出器としては多角度光散乱検出器（ＤＡＷＮ−ＤＳＰ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および示差屈折計（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工製）をこの順序で連結して用いる。カラムを４０℃に保ち、溶離液としては０．１Ｍ硝酸ナトリウム溶液を流速１ｍＬ／分で用いる。分子量が約１万以上のα−グルカンは、Ｓｈｏｄｅｘ製のプルランＰ−５０（ＧＦＣ（水系ＧＰＣ）用標準試料ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２に含まれている）のピーク頂点が、９．３分になるように配管を調整した上記ＨＰＬＣシステムにおいて、１１分より前に溶出される。具体的には、シグナルの出始めの位置から１１分までに溶出される示差屈折計と多角度光散乱検出器の両シグナルを含むように、ピークとしてとり、それらのシグナルを、データ解析ソフトウェア（商品名ＡＳＴＲＡ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて収集し、同ソフトを用いて解析することにより、Ｍｗを求める。本方法を以下、ＭＡＬＬＳ法という。この分析法においては、上記シグナルよりも後のシグナルを収集しないので、分子量が約１万以下のグルカンを除外している。このように、本発明においてＭＡＬＬＳ法に従って決定されるＭｗは、反応液中のグルカン全体のＭｗではなく、分子量約１万以上の高分子量グルカンのＭｗである。さらに、ＨＰＬＣカラムと検出器との間の配管の長さ、太さなどを変更した場合、分子量約１万以上のグルカンの溶出時間は変化し得る。このような場合、当業者は、上記プルランＰ−５０を用いることにより、本発明の方法に従ってＭＡＬＬＳ法によりＭｗを決定するための適切な溶出時間を適切に設定し得る。
【０１７１】
本発明の方法によって製造されたグリコーゲンは、天然のグリコーゲンと同様に、プルラナーゼおよびα−アミラーゼによって分解されにくいという性質を有する。従って、本発明の方法によって製造されたグリコーゲンは、天然のグリコーゲンと同様に利用され得る。
【０１７２】
本発明の方法によって製造されたグリコーゲンは、溶解性が高いという性質を有する。溶解度は、当該分野で公知の方法により決定され得る。例えば、所定量のα−グルカンを水に添加し、所定時間攪拌し、フィルターによって濾過して濾液を得て、この濾液中に溶解しているα−グルカンの量を決定し、添加したα−グルカンの量と溶解しているα−グルカンの量との比を算出することにより決定され得る。すなわち、溶解度（％）＝｛（ろ液中のα−グルカン量）÷（ろ過前の溶液中のα−グルカン量）｝×１００である。製造されたα−グルカンを乾燥し、２ｍｇ／ｍＬとなるように２０℃の蒸留水に添加し、室温で３０秒間攪拌し、０．４５μｍのフィルターによって濾過した場合の溶解度は、好ましくは、約２０％以上であり、より好ましくは約３０％以上であり、より好ましくは約４０％以上であり、さらに好ましくは約５０％以上である。
【０１７３】
（グリコーゲンの用途）
本発明の方法によって製造されたグリコーゲンは、従来のグリコーゲンと同様に、免疫賦活剤、健康食品素材、化粧品素材、食品素材(調味料)、その他産業用素材としての用途に利用され得る。
【実施例】
【０１７４】
以下の実施例においては、製造例１、２、４、５、７および８で製造した各種ＢＥを、ＢＥとして用いた。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ由来のイソアミラーゼ（林原生物化学研究所製）を枝切り酵素として用いた。枝切り酵素活性を、Ｙｏｋｏｂａｙａｓｈｉら(Ｂｉｏｃｈｉｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａ,ｖｏｌ.２１２，ｐ４
５８−４６９（１９７０）)に基づいて決定した。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ
由来のＭａｌＱ（ＴａｑＭａｌＱ）を４−α−グルカノトランスフェラーゼとして用いた。４−α−グルカノトランスフェラーゼの酵素活性を、Ｔｅｒａｄａら（Ａｐｐｌｉｅｄ
ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６５巻，９１０〜９１５頁（１９９９））に基づいて決定した。
【０１７５】
（製造例１：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来のＢＥの組換え生産）
（Ａ）Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５  ＢＥ遺伝子の作製
配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１）の化学的合成を行った。遺伝子の翻訳開始コドン上流にはＳＤ配列を付与し、さらにその上流にＢａｍＨＩサイトを設けた。また、翻訳停止コドン下流にはＥｃｏＲＩサイトを設けた。この合成遺伝子をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断して遺伝子断片を作製し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＵＣ１９（宝酒造株式会社製）に連結することにより、プラスミドｐＡＱＢＥ１を得た。
【０１７６】
（Ｂ）Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＢＥ遺伝子の大腸菌における発現
このプラスミドで、大腸菌ＴＧ−１を形質転換し、形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ寒天培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、Ｄｉｆｃｏ製トリプトン１％、Ｄｉｆｃｏ製酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％、寒天  １．５％、ｐＨ  ７．３）に独立したコロニーが得られるように希釈して塗布し、３７℃で一晩培養した。このアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で増殖した大腸菌は、導入したプラスミドを保有する。このようにして、ＢＥを発現する大腸菌が作製できた。
【０１７７】
組換えプラスミドｐＡＱＢＥ１で形質転換された大腸菌ＴＧ−１株を、終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む０．２リットルのＬ培地（１％  トリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％  イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ）、１％  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で対数増殖期中期まで（約３時間）、３７℃で培養した後、終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を加えた。さらに３７℃で２１時間培養を継続した後、遠心分離を行い集菌した。得られた菌体を５０ｍｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５））で洗浄し、次いで２０ｍｌの緩衝液Ａに分散させた後、超音波により菌体を破砕した。この菌体破砕液を７０℃で３０分加熱することにより、大腸菌由来のタンパク質を変性させ、これをＢＥ酵素液とした。このＢＥ酵素液およびｐＡＱＢＥ１を持たない大腸菌を同様に処理して得た液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけてそれらのパターンを比較した。その結果、形質転換された大腸菌ＴＧ−１株がＢＥ遺伝子を発現しており、本遺伝子にコードされているタンパク質が生産されていることが確認された。
【０１７８】
（製造例２：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＲＢＥ  １４由来のＢＥの組換え生産）
非特許文献１２に示されたプラスミドｐＵＢＥ８２１を保持する大腸菌ＴＧ−１株より、同文献に示された方法によりＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＲＢＥ  １４由来のＢＥを組換え生産した。
【０１７９】
（製造例３：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＭａｌＱ（以下、ＴａｑＭａｌＱという）の組換え生産）
Ｔｅｒａｄａら（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ，６５巻，９１０〜９１５頁（１９９９））に示されたプラスミドｐＦＧＱ８を保持する大腸菌ＭＣ１０６１株より、同文献に示された方法によりＴａｑＭａｌＱを組換え生産した。
【０１８０】
（製造例４：大腸菌由来ＢＥの組換え生産およびグリコーゲン合成能力のテスト）
（手順）
以下のプライマーを用いて、大腸菌Ｗ３１１０株染色体ＤＮＡを鋳型として大腸菌ＢＥ遺伝子を増幅した。このプライマーは、以下の文献を参考にして、大腸菌ＢＥ構造遺伝子全長が増幅されるようにデザインした：Ｈｉｌｄｅｎ，Ｉ．ら（２０００）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６７，２１５０−２１５５。設計したプライマー配列を以下の表１Ａに示す。
【０１８１】
【表１Ａ】
2008095117.tif 000003
タカラバイオ（株）製のＤＮＡポリメラーゼＰｙｒｏＢｅｓｔを用いて、そのプロトコールに従ってＰＣＲを行った。増幅された断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（プロメガ製）のＴＡクローニングサイトに挿入し、得られたプラスミドをｐＥＢＥ１と命名した。ｐＥＢＥ１を制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理して断片を得た。得られた断片を、同じ制限酵素（ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）で処理したｐＴｒｃ９９Ａと連結し、この連結物を含む溶液で大腸菌ＴＧ−１株を形質転換した。形質転換された大腸菌ＴＧ−１株からプラスミドを単離し、得られたプラスミドをｐＥＢＥ２−１と命名した。
【０１８２】
ｐＥＢＥ２−１を含む大腸菌ＴＧ−１株をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む培地で３７℃で振盪培養し、対数期後期に、終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で一晩培養した。
【０１８３】
菌体を遠心分離で集め、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波処理によって破砕した。遠心分離によって上清を集めて粗酵素液とした。
【０１８４】
Ｑ−Ｓｅｐｈａｌｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を充填したカラムを調製し、樹脂を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）で平衡化した。このカラムに粗酵素液を流すことによって、この樹脂に粗酵素液を吸着させ、０．１ＭのＮａＣｌを含む同緩衝液（すなわち、０．１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７））を流して洗浄した。ＢＥ活性は、０．２ＭのＮａＣｌを含む同緩衝液（すなわち、０．２ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７））で溶出された。
【０１８５】
そのＢＥ活性を有する溶出液に、終濃度０．３Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、以下のように疎水性クロマトグラフィーにかけて、ＢＥ酵素を精製した。まず、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ（東ソー）を充填したカラムを調製し、０．３Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）で平衡化した。この樹脂に酵素を吸着させ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）で洗浄した。酵素は、蒸留水をカラムに流すことによって回収した。このようにして、精製ＢＥが得られた。
【０１８６】
（グリコーゲン合成能力のテスト）
アミロースＡ（ナカライテスク（株）製、Ｍｎ２９００）またはアミロースＡＳ１０（
（株）アジノキ製、Ｍｗ１０，０００、数平均としては９１００）を１Ｎ  ＮａＯＨに溶かし、ＨＣｌで中和した。その後、すぐに水、酵素液、緩衝液を以下の反応液組成となるように添加して、３０℃で２４時間反応させた。反応液組成：大腸菌由来ＢＥ４０，０００Ｕ／ｇ基質、基質濃度０．５重量％、リン酸カリウム濃度  ２０ｍＭ、ｐＨ  ７．５。反応液中に合成されたグルカンの平均分子量および収率を、ＭＡＬＬＳ法により調べた。結果を以下の表１Ｂに示す。
【０１８７】
【表１Ｂ】
2008095117.tif 000004
この結果、大腸菌由来のＢＥがＭｗ１０００ｋＤａ以上のグリコーゲンを合成する能力を有することがわかった。
【０１８８】
（製造例５：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来のＢＥの組換え生産）
Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ９７８５は、独立行政法人  理化学研究所  バイオリソースセンターより分譲を受けた。この株をＭａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ  ２２１６（Ｄｉｆｃｏ製）を用いて７０℃で液体培養し、得られた菌体から染色体ＤＮＡを抽出した。
【０１８９】
以下のプライマーを用いて、上述の染色体ＤＮＡを鋳型としてＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ  ＢＥ遺伝子を増幅した。このプライマーは、非特許文献１１で公開されている塩基配列情報を参考にして、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ  ＢＥ構造遺伝子全長が増幅されるようにデザインした。設計したプライマー配列を以下の表１Ｃに示す。
【０１９０】
【表１Ｃ】
2008095117.tif 000005
東洋紡製のＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓを用いて、以下の組成の反応液で、以下の条件でＰＣＲを行った。
【０１９１】
染色体ＤＮＡ（約０．５μｇ／μＬ）         ２μＬ
プライマー１（１０ｐｍｏｌ／μＬ）         ３μＬ
プライマー２（１０ｐｍｏｌ／μＬ）         ３μＬ
×１０  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｂｕｆｆｅｒ     １０μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ                           １０μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４                        ４μＬ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ                           ２μＬ
蒸留水（ＤＷ）                             ７０μＬ
条件：９４℃で２分間の加熱後、９４℃で０．２５分間、５５℃で０．５分間、６８℃で２．５分間のサイクルを３０回。
【０１９２】
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで処理し、同制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびとＰｓｔＩ）で処理したｐＴｒｃ９９Ａと連結し、この連結物を含む溶液で大腸菌ＴＧ−１株を形質転換した。形質転換された大腸菌ＴＧ−１株からプラスミドを単
離し、得られたプラスミドをｐＲＢＥ１と命名した。
【０１９３】
ｐＲＢＥ１を含む大腸菌ＴＧ−１株をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む培地で３７℃で振盪培養し、対数期後期に、終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で一晩培養した。
【０１９４】
菌体を遠心分離で集め、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、超音波処理によって破砕した。遠心分離によって上清を集め、さらに７０℃３０分熱処理し、遠心分離して上清を回収して粗酵素液とした。
【０１９５】
Ｑ−Ｓｅｐｈａｌｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を充填したカラムを調製し、樹脂を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）で平衡化した。このカラムに粗酵素液を流すことによって、この樹脂に粗酵素液を吸着させ、０．１ＭのＮａＣｌを含む同緩衝液を流して洗浄した。ＢＥ活性は、０．５ＭのＮａＣｌを含む同緩衝液で溶出された。本溶出液を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）に対して透析することにより精製ＢＥが得られた。以下の実施例８に示されるように、得られた精製ＢＥは、Ｍｗ１０００ｋＤａ以上のグリコーゲンを合成する能力を有する。
【０１９６】
（製造例６：トラマメ由来のＢＥの組換え生産および高分子量グルカン合成能力のテスト）
トラマメ（Ｋｉｄｎｅｙ  ｂｅａｎ；Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｕｇａｒｉｓ  Ｌ．）由来ＢＥとしては、下記文献に記載されているＫＢＥ２を用いた：Ｎｏｚａｋｉ，Ｋ．ら（２００１）Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６５，１１４１−１１４８。
【０１９７】
（グリコーゲン合成能テスト）
アミロースＡ（ナカライテスク（株）製、Ｍｎ２９００）またはアミロースＡＳ１０（（株）アジノキ製、Ｍｗ１０，０００、数平均としては９１００）を１Ｎ  ＮａＯＨに溶かし、ＨＣｌで中和した。その後、すぐに水、酵素液、緩衝液を以下の反応液組成となるように添加して、３０℃で２４時間反応させた。反応液組成：ＫＢＥ２量４０，０００Ｕ／ｇ基質、基質濃度０．５重量％、リン酸カリウム濃度２０ｍＭ、ｐＨ ７．５。反応液
中に合成されたグルカンの平均分子量および収率を、ＭＡＬＬＳ法により調べた。結果を以下の表１Ｄに示す。
【０１９８】
【表１Ｄ】
2008095117.tif 000006
この結果、ＫＢＥ２を用いた場合には、１０００ｋＤａ以上のグリコーゲンを合成できないことがわかった。
【０１９９】
（製造例７：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ由来ＢＥの組換え生産）
Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥをコードする遺伝子の代わりにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ由来のＢＥをコードする遺伝子（配列番号９）を用いたこと、および加熱処理温度を６０℃としたこと以外は製造例１と同様の方法でＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ由来のＢＥを組換え生産した。
【０２００】
（製造例８：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のＢＥの組換え生産）
Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥをコードする遺伝子の代わりにＢａｃｉ
ｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のＢＥをコードする遺伝子（配列番号１３）を用いたこと、および加熱処理温度を６０℃としたこと以外は製造例１と同様の方法でＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のＢＥを組換え生産した。
【０２０１】
（測定例１：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来ＢＥのアミロペクチン低分子化活性の測定）
まず、５０ｍｇのワキシーコーンスターチ（ＷＣＳ；三和澱粉製）に１００μｌ  蒸留水を添加し、充分に攪拌した。次いで、９００μｌ  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して、攪拌し、沸騰湯浴中で、２０分間加熱した。８．９ｍｌ  蒸留水を添加してよく撹拌し、沸騰湯浴中で、さらに１０分間加熱した。この溶液に、１００μｌの１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加して攪拌し、基質液とした。
【０２０２】
基質液を８００μＬ／チューブで分注した。すなわち、各チューブは、４ｍｇのＷＣＳを含んでいた。次いで、製造例１と同様の方法によって生産した、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来のＢＥ溶液（ＢＥ活性２．４Ｕ／ｍＬ）をチューブ１本あたり６６．７、８３．３、１００、１１６．７、１３３．３、または１５０μＬと、それぞれ、１３３．３、１１６．７、１００、８３．３、６６．７、または５０μＬの希釈液を添加して反応液の体積を１０００μＬにし、７０℃で１６時間反応させた。希釈液は０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）であった。反応時間が１６時間になった時点で１Ｎ  ＨＣｌを添加して反応液のｐＨを３〜４に下げ、さらに１００℃で１０分加熱することにより、反応を停止させた。
【０２０３】
反応停止後、反応液を０．４５μｍのフィルターによりろ過し、含まれる生産物のＭｗをＭＡＬＬＳ法によって測定した。ＭＡＬＬＳ法の詳細は、以下の「製造されたグルカンの重量平均分子量（Ｍｗ）の測定法」に記載した。
【０２０４】
算出されたＭｗ（ｋＤａ）を縦軸（ｙ軸）に対数でとり、用いた酵素量（μＬ）を横軸（ｘ軸）にとり、マイクロソフト社のソフトＭＳ−Ｅｘｃｅｌを使用して累乗近似曲線を作成した。このグラフを図１２に示す。近似曲線の方程式は、ｙ＝２４，０９０ｘ−１．３４０（Ｒ２＝０．９８９６）であらわされた。この方程式から、４ｍｇのＷＣＳを基質としたときに基質Ｍｗを４００ｋＤａに低下させるのに必要な酵素量Ｖ１（μＬ）は、１１９μＬと算出された。この酵素量を基質１ｇあたりに換算することにより、１単位の低分子化活性に必要な酵素量Ｖ２（ｍＬ）（＝（１１９μＬ／１０００）×（１０００ｍｇ／４ｍｇ）＝２９．７５（ｍＬ））が算出される。酵素液の低分子化活性Ｅ１は、単位低分子化活性量の逆数（Ｅ１＝１／Ｖ２＝１／２９．７５＝０．０３３６）（Ｕ／ｍＬ）である。。したがって、ＢＥ活性／低分子化活性＝（２．４（Ｕ／ｍＬ）／０．０３３６（Ｕ／ｍＬ））＝７１であった。
【０２０５】
（測定例２：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ＢＥのアミロペクチン低分子化活性の測定）
Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来ＢＥの代わりに、製造例２で生産したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ＢＥを用い、反応温度を５０℃としたこと以外は測定例１と同様にして、ＢＥ活性／低分子化活性を決定した。この結果、ＢＥ活性／低分子化活性は、２７０であった。
【０２０６】
（測定例３：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来ＢＥのアミロペクチン低分子化活性の測定）
Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来ＢＥの代わりに、製造例５で生産したＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来ＢＥを用い、反応温度を６５℃としたこと以外は測定例１と同様にして、ＢＥ活性／低分子化活性を決定した。この結果、Ｂ
Ｅ活性／低分子化活性は、３５であった。
【０２０７】
（測定例４：大腸菌由来ＢＥのアミロペクチン低分子化活性の測定）
Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来ＢＥの代わりに、製造例４で生産した大腸菌由来ＢＥを用い、反応温度を３０℃としたこと以外は測定例１と同様にして、ＢＥ活性／低分子化活性を決定した。この結果、ＢＥ活性／低分子化活性は、２７３であった。
【０２０８】
（測定例５：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ由来ＢＥのアミロペクチン低分子化活性の測定）
Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来ＢＥの代わりに、非特許文献９に記載の方法に従って製造したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ由来ＢＥを用い、反応温度を３０℃としたこと以外は測定例１と同様にして、ＢＥ活性／低分子化活性を決定した。この結果、ＢＥ活性／低分子化活性は、１０８６であった。
【０２０９】
（測定例６：トラマメ由来ＢＥのアミロペクチン低分子化活性の測定）
Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来ＢＥの代わりに、製造例６にトラマメ由来ＢＥを用い、反応温度を３０℃としたこと以外は測定例１と同様にして、ＢＥ活性／低分子化活性を決定した。この結果、ＢＥ活性／低分子化活性は、１３００６９であった。
【０２１０】
（測定例７：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ由来ＢＥのアミロペクチン低分子化活性の測定）
Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来ＢＥの代わりに、製造例７で生産したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ由来ＢＥを用い、反応温度を５０℃としたこと以外は測定例１と同様にして、ＢＥ活性／低分子化活性を決定した。この結果、ＢＥ活性／低分子化活性は、４６６であった。
【０２１１】
（測定例８：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ由来ＢＥのアミロペクチン低分子化活性の測定）
Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来ＢＥの代わりに、製造例８で生産したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ由来ＢＥを用い、反応温度を５０℃としたこと以外は測定例１と同様にして、ＢＥ活性／低分子化活性を決定した。この結果、ＢＥ活性／低分子化活性は、４０２であった。
【０２１２】
これらの測定例によって測定されたＢＥ活性／低分子化活性、およびグリコーゲン合成能を以下の表１Ｅにまとめる。
【０２１３】
【表１Ｅ】
2008095117.tif 000007
（製造されたグルカンの重量平均分子量（Ｍｗ）および収率の測定法）
製造されたグルカンのＭｗをＭＡＬＬＳ法によって以下の通りに測定した。カラムとし
てＳｈｏｄｅｘ  ＯＨ−Ｐａｃｋ  ＳＢ８０６ＭＨＱ（内径８ｍｍ、長さ３００ｍｍ、昭和電工製）を用い、ガードカラムとしてＳｈｏｄｅｘ  ＯＨ−Ｐａｃｋ  ＳＢ−Ｇ（内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍ、昭和電工製）を用い、検出器としては多角度光散乱検出器（ＤＡＷＮ−ＤＳＰ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および示差屈折計（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工製）をこの順序で連結して用いた。カラムを４０℃に保ち、溶離液としては０．１Ｍ硝酸ナトリウム溶液を流速１ｍＬ／分で用いた。分子量が約１万以上のα−グルカンは、Ｓｈｏｄｅｘ製のプルランＰ−５０（ＧＦＣ（水系ＧＰＣ）用標準試料ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２に含まれている）のピーク頂点が、９．３分になるように配管を調整した上記ＨＰＬＣシステムにおいて、１１分より前に溶出された。具体的には、シグナルの出始めの位置から１１分までに溶出される示差屈折計と多角度光散乱検出器の両シグナルを含むように、ピークとしてとり、それらのシグナルを、データ解析ソフトウェア（商品名ＡＳＴＲＡ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて収集し、同ソフトを用いて解析することにより、Ｍｗを求めた。このような条件下では、分子量約１万以下のグルカンを除外している。グルカンのｄｎ／ｄｃ（固有屈折率増分）として、０．１４５ｍＬ／ｇを用いた。
【０２１４】
示差屈折計のピーク面積を測定し、このピーク面積をｄｎ／ｄｃ値で除算することにより、溶出した高分子グルカンの量（ｇ）を計算する。溶出した高分子グルカンの量を、合成に用いた基質量（計算式においては、基質濃度とＨＰＬＣにロードした容積の積）で割り、１００倍して百分率にすることにより収率を算出する。すなわち、収率は、以下の式で求められる：
収率（％）＝｛（溶出した高分子グルカンの量（ｇ））÷（基質濃度（ｇ／ｍＬ）×ＨＰＬＣにロードした容積）（ｍＬ）｝×１００
分子量１００万以上の高分子グルカンの量を用いることにより、グリコーゲンの収率を求めることができる。
【０２１５】
（実施例１：低分子量アミロースからのグリコーゲンの製造）
（１−１：アミロースＡからの製造）
アミロースＡ（ナカライテスク（株）製、Ｍｎ２９００）を１Ｎ  ＮａＯＨに溶かし、ＨＣｌで中和した。その後、すぐに水、酵素液、緩衝液を以下の反応液組成となるように添加して、７０℃で１７時間反応させた。反応液組成：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ＢＥ量  １００００、２００００または４００００Ｕ／ｇ基質、基質濃度  ２重量％、リン酸カリウム濃度  ２０ｍＭ、ｐＨ７．５。
【０２１６】
低分子量α−グルカンからグリコーゲンの生成の模式図を図２に示す。反応後、製造されたα−グルカンの分子量を測定した。結果を、表１および図３に示す。表１において、グルカン収率は、分子量１万以上のグルカン全体の収率を示し、グリコーゲン収率は、分子量１００万以上のグルカン（すなわち、グリコーゲン）の収率を示す。この結果、１０，０００〜４０，０００Ｕ／ｇ基質のＢＥを用いると、Ｍｎ２９００のアミロースＡから、Ｍｗ１００万以上のグリコーゲンが製造されることおよび生成されるグルカンのほとんどがグリコーゲンであることが確認された。
【０２１７】
（１−２：種々の分子量の基質からのグリコーゲンの製造）
基質として、アミロースＡＳ−５、ＡＳ−１０、ＡＳ−３０、ＡＳ−７０、またはＡＳ−１１０（いずれも、（株）アジノキ製；それぞれ、Ｍｗ５０００、１００００、３００００、７００００、１１００００）を用いた。Ｍｗ／Ｍｎはおよそ１．１であるので、Ｍｎはそれぞれ４，５００、９，１００、２７，０００、６４，０００、１００，０００である。
【０２１８】
それぞれのアミロースを１Ｎ  ＮａＯＨに溶かし、ＨＣｌで中和した。その後、すぐに
水、酵素液、緩衝液を以下の反応液組成となるように添加して、７０℃で１６時間反応させた。反応液組成：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ＢＥ量  １００００Ｕ／ｇ基質、基質濃度  ２重量％、リン酸カリウム濃度  ４０ｍＭ、ｐＨ７．５。
【０２１９】
反応後、製造されたα−グルカンの分子量を測定した。結果を、以下の表１および図４に示す。表１においては、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥをＡｑと示す。
【０２２０】
この結果、Ｍｎが１０万のアミロースからでもグリコーゲンが生成することがわかった。さらに、反応開始前の溶液中の糖のＭｎが９１００よりも大きいと、生成物の分子量が２つのピークに分かれた。ピークが分かれた場合は、高分子量のピークのみを測定した。反応開始前の溶液中の糖のＭｎが大きくなるほど、生成物のＭｗが小さくなり、収率が大きくなる傾向にあった。
【０２２１】
（１−３：種々の濃度の基質からのグリコーゲンの製造）
基質として、アミロースＡ（ナカライテスク（株）製、Ｍｎ２９００）を１Ｎ  ＮａＯＨに溶かし、ＨＣｌで中和した。その後、すぐに水、酵素液、緩衝液を以下の反応液組成となるように添加して、７０℃で１７時間反応させた。反応液組成：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ＢＥ量  １００００または４００００Ｕ／ｇ基質、基質濃度２、４、８または１２重量％、リン酸カリウム濃度  ４０ｍＭ、ｐＨ７．５。
【０２２２】
反応後、製造されたα−グルカンの分子量を測定した。結果を、表１−２に示す。表１−２において、グリコーゲン収率（％）は、分子量１００万以上のグルカン（すなわち、グリコーゲン）の収率を示す。
【０２２３】
この結果、少なくとも、基質濃度１２％程度までは、グリコーゲンが生成することがわかった。基質濃度が上昇すると生成物のＭｗが低下する傾向が見られた。
【０２２４】
【表１】
2008095117.tif 000008
【０２２５】
【表１−２】
2008095117.tif 000009
（実施例２：澱粉からのグリコーゲンの製造）
（２−１：コーンスターチからのグリコーゲンの製造）
コーンスターチ（和光純薬工業（株）製）（２重量％）を水に懸濁し、１００℃で３０分間加熱することにより、コーンスターチを糊化した。それを４０℃まで冷まし、イソアミラーゼ（ＩＡＭと略；５０００または５００００Ｕ／ｇ基質；（株）林原生物化学研究所製）を添加して４０℃で４時間、６時間、８時間、または２０時間反応させ、アミロースを生成させた。その後、この溶液を５ｍＭ  リン酸カリウムバッファーでｐＨ７．５に調整し、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥを添加し、基質濃度２重量％、ＢＥ１００００、２００００、４００００、または６００００Ｕ／ｇ基質とした後、５５℃、６５℃、７０℃または７５℃で２０時間反応させた。
【０２２６】
澱粉を枝切り酵素により分解してアミロースを得て、このアミロースにＢＥを反応させてグリコーゲンを製造する反応の模式図を図５に示す。反応後、製造されたα−グルカンの分子量を測定した。結果を、以下の表２および図６に示す。図６は、ＩＡＭ量が５０００Ｕ／ｇ基質であって、ＢＥ量が１００００、２００００、４００００または６００００Ｕ／ｇ基質である場合の結果をプロットしたグラフである。表２において、グリコーゲン収率（％）は、分子量１００万以上のグルカン（すなわち、グリコーゲン）の収率を示す。
【０２２７】
【表２】
2008095117.tif 000010
この結果、コーンスターチのイソアミラーゼ分解物からグリコーゲンが生成することがわかった。イソアミラーゼ量およびＢＥ量にほとんど関係なく、Ｍｗ５００万前後のグリコーゲンが収率約３０％以上で得られた。イソアミラーゼの反応時間は、４時間以上であれば、グリコーゲンが生成された。また、ＢＥの反応温度は５５℃、６５℃、７０℃または７５℃のいずれでもグリコーゲンが生成された。
【０２２８】
（２−２：各種澱粉からのグリコーゲンの製造）
コーンスターチ（和光純薬工業(株)製）、ワキシーコーンスターチ（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ社製）、小麦澱粉（和光純薬工業(株)製）、馬鈴薯澱粉（和光純薬工業(株)製）、またはタピオカ澱粉（ＶＥＤＡＮ  ＥＮＴＥＲＰＲＩＳＥ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ製）（２重量％）を水に懸濁し、１００℃で３０分間加熱することにより、澱粉を糊化した。それを４０℃まで冷まし、イソアミラーゼ（５０００Ｕ／ｇ基質；（株）林原生物化学研究所製）を添加して４０℃で２０時間反応させ、アミロースを生成させた。その後、この溶液を５ｍＭ  リン酸カリウムバッファーでｐＨ７．５に調整し、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥを添加し、基質濃度２重量％、ＢＥ２００００Ｕ／ｇ基質とした後、５５℃、６５℃または７５℃で２０時間反応させた。
【０２２９】
反応後、製造されたα−グルカンの分子量を測定した。結果を、以下の表３に示す。
【０２３０】
この結果、種々の澱粉をイソアミラーゼの基質として用いて、グリコーゲンを生成できることがわかった。
【０２３１】
（２−３：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢＥを用いた、澱粉からのグリコーゲンの製造）
コーンスターチ（和光純薬工業(株)製）（２重量％）を水に懸濁し、１００℃で３０分間加熱することにより、澱粉を糊化した。それを４０℃まで冷まし、イソアミラーゼ（５０００Ｕ／ｇ基質；（株）林原生物化学研究所製）を添加して４０℃で２０時間反応させ、アミロースを生成させた。その後、この溶液を４０ｍＭ  リン酸カリウムバッファーでｐＨ７．５に調整し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢＥを添加し、基質濃度２重量％、ＢＥ２００００Ｕ／ｇ基質とした後、５５℃で２０時間反応させた。
【０２３２】
反応後、製造されたα−グルカンの分子量を測定した。結果を、以下の表３に示す。表３において、グルカン収率は、分子量１万以上のグルカン全体の収率を示し、グリコーゲン収率は、分子量１００万以上のグルカン（すなわち、グリコーゲン）の収率を示す。
【０２３３】
この結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢＥを用いても、グリコーゲンを生成できることがわかった。
【０２３４】
【表３】
2008095117.tif 000011
（２−３：イソアミラーゼとＢＥとを同時に用いる、グリコーゲンの製造）
コーンスターチ（和光純薬工業(株)製）（１重量％）を水に懸濁し、１００℃で３０分間加熱することにより、糊化した。それを６５℃まで冷まし、イソアミラーゼ（５０００００Ｕ／ｇ基質；（株）林原生物化学研究所製）およびＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥ（６００００Ｕ／ｇ基質）を添加し、この溶液を４０ｍＭ  リン酸カリウムバッファーでｐＨ７．５に調整し、６５℃１６時間反応させた。
【０２３５】
反応後、製造されたα−グルカンの分子量を測定した。この結果、澱粉にイソアミラーゼとＢＥとを同時に作用させても、グリコーゲンを生成させることが可能であることがわかった。
【０２３６】
（実施例３Ａ：糖鎖の短いアミロースに４−α−グルカノトランスフェラーゼとＢＥを作用させることによるグリコーゲンの製造）
（３−１：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥおよびＴａｑＭａｌＱを用いたグリコーゲンの製造）
基質（マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６）、またはマルトヘプタオース（Ｇ７））を水に溶かし、水、酵素液、緩衝液を以下の反応液組成となるように添加して、６５℃で１７時間反応させた。反応液組成：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ＢＥ量  ４００００、８００００、または１６００００Ｕ／ｇ基質、ＴａｑＭａｌＱ量  １０Ｕ／ｇ基質、基質濃度  １％、リン酸カリウム濃度  １０ｍＭ、ｐＨ７．５。
【０２３７】
４−α−グルカノトランスフェラーゼによってマルトペンタオースからアミロースが生成され、ＢＥによってアミロースからグリコーゲンが生成されることを示す模式図を図７に示す。反応後、製造されたα−グルカンの分子量を測定した。結果を、以下の表４および図８に示す。図８においては、ＢＥ量が８００００Ｕ／ｇ基質を用いた場合についてのＭｗを示す。ピークが分かれた場合は、高分子量のピークのみを測定した。
【０２３８】
この結果、４−α−グルカノトランスフェラーゼを併用することによって、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７からグリコーゲンが高い効率で生成されることがわかった。
【０２３９】
（３−２：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢＥおよびＴａｑＭａｌＱを用いたグリコーゲンの製造）
基質（マルトヘプタオース（Ｇ７））を水に溶かし、水、酵素液、緩衝液を以下の反応液組成となるように添加して、５０℃で１７時間反応させた。反応液組成：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ＢＥ量  １６００００Ｕ／ｇ基質、ＴａｑＭａｌＱ量  ２．３Ｕ／ｇ基質、基質濃度  ０．５％、リン酸カリウム濃度  ５ｍＭ、ｐＨ７．５。
【０２４０】
反応後、製造されたα−グルカンの分子量を測定した。結果を、以下の表４に示す。表４において、グルカン収率は、分子量１万以上のグルカン全体の収率を示し、グリコーゲン収率は、分子量１００万以上のグルカン（すなわち、グリコーゲン）の収率を示す。
【０２４１】
この結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢＥを用いた場合も、４−α−グルカノトランスフェラーゼを併用することによって、Ｇ７からグリコーゲンが高い効率で生成されることがわかった。
【０２４２】
【表４】
2008095117.tif 000012
（実施例４：比較的低温条件下でのグリコーゲンの製造）
アミロースＡ（ナカライテスク（株）製、Ｍｎ２９００）を１Ｎ  ＮａＯＨに溶かし、ＨＣｌで中和した。その後、すぐに水、酵素液、緩衝液を以下の反応液組成となるように添加して、３０℃で１６時間反応させた。反応液組成：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ＢＥ量８０，０００Ｕ／ｇ基質、基質濃度２重量％、リン酸カリウム濃度 ２０ｍＭ、ｐＨ ７．５。
【０２４３】
反応後、製造されたα−グルカンの分子量を測定した。結果を、表５に示す。表５において、グルカン収率は、分子量１万以上のグルカン全体の収率を示し、グリコーゲン収率は、分子量１００万以上のグルカン（すなわち、グリコーゲン）の収率を示す。
【０２４４】
この結果、どちらの耐熱性ＢＥを用いた場合も、反応温度が３０℃であっても、アミロースＡから、Ｍｗ１００万以上のグリコーゲンが製造されることが確認された。このことから、グリコーゲンが生成されるのは、反応を高温条件で行うことに起因するのではなく、耐熱性ＢＥの特性に起因すると考えられる。
【０２４５】
（比較例１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来ＢＥを用いたα−グルカンの製造）
アミロースＡまたは、酵素合成アミロース（ＡＳ−１０（Ｍｗ１００００；Ｍｎ９１００）またはＡＳ−３２０（Ｍｗ３２００００；Ｍｎ２９００００））を、１Ｎ  ＮａＯＨに溶かし、ＨＣｌで中和した。その後、すぐに水、酵素液、緩衝液を以下の反応液組成となるように添加して、３０℃で２４時間反応させた。反応液組成：Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ由来ＢＥ量４０，０００Ｕ／ｇ基質、基質濃度０．５重量％、リン酸カリウム濃度 ２０ｍＭ
、ｐＨ ７．５。Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ由来ＢＥは、非特許文献９に記載の方法に従って製造
した。
【０２４６】
反応後、沸騰湯浴中で１０分間加熱して反応を停止させ、生じたα−グルカンをＭＡＬＬＳ法によって分析した。結果を表６に示す。表６において、グルカン収率は、分子量１万以上のグルカン全体の収率を示し、グリコーゲン収率は、分子量１００万以上のグルカン（すなわち、グリコーゲン）の収率を示す。
【０２４７】
アミロースＡを基質とした場合は、高分子α−グルカンを検出できなかった。また、どちらの酵素合成アミロースを用いた場合も、分子量１万〜分子量５０万のグルカンが生成物のほぼ１００％を占めており、分子量１００万以上のグルカンは検出できなかった。生成物のＭｗは、Ｍｎ９１００の基質を用いた場合、８６９００であり、Ｍｎ２９００００の基質を用いた場合、６１９００であった。高分子量の基質を用いた場合、低分子化が生じた。
【０２４８】
さらに、Ｍｎ４５００〜２９００００の各種サイズのアミロースにＢ．ｃｅｒｅｕｓ  ＢＥを同様に作用させた後、生成物のゲル濾過分析を行ったが、主成分の分子量は上記実験とほとんど同じであることが示された。つまり、どの場合にも分子量１００万を超える高分子α−グルカンは得られなかった。
【０２４９】
（実施例３Ｂ：糖鎖の短いアミロースにＢＥのみを作用させることによるα−グルカンの製造）
基質（マルトテトラオース（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６）、またはマルトヘプタオース（Ｇ７））を水に溶かし、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥを添加し、反応液を、以下の表７に示す基質濃度およびＢＥ量とし、１０ｍＭリン酸カリウムバッファーでｐＨ７．５に調整した後、以下の表７に示す温度で、１７時間反応させた。
【０２５０】
反応後、製造されたα−グルカンの分子量を測定した。この結果を、以下の表７に示す
。表７において、グリコーゲン収率（％）は、分子量１００万以上のグルカン（すなわち、グリコーゲン）の収率を示す。
【０２５１】
この結果、Ｇ４〜Ｇ７という低分子量の基質を用いた場合、グリコーゲンを合成できることがわかった。
【０２５２】
（実施例５：澱粉にＢＥおよびプルラナーゼを作用させることによるグリコーゲンの製造）
コーンスターチ（和光純薬工業(株)製）（２重量％）を水に懸濁し、１００℃で３０分間加熱することにより、コーンスターチを糊化した。それを６０℃まで冷まし、プルラナーゼ（５Ｕ／ｇ基質；大和化成（株）製クライスターゼ）を添加して６０℃で２０時間反応させ、アミロースを生成させ、その後、１００℃で１０分間加熱することにより、反応を停止した。その後、この溶液を１０ｍＭ  リン酸カリウムバッファーでｐＨ７．５に調整し、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥを２００００Ｕ／ｇ基質となるように添加し、ＢＥ６５℃で２０時間反応させた。
【０２５３】
反応後、製造されたα−グルカンの分子量を測定した。この結果を、以下の表８に示す。表８において、グリコーゲン収率（％）は、分子量１００万以上のグルカン（すなわち、グリコーゲン）の収率を示す。この結果、プルラナーゼで枝切りしたコーンスターチもイソアミラーゼで枝切りしたコーンスターチ同様グリコーゲンを製造することができた。
【０２５４】
【表５】
2008095117.tif 000013
【０２５５】
【表６】
2008095117.tif 000014
【０２５６】
【表７】
2008095117.tif 000015
【０２５７】
【表８】
2008095117.tif 000016
（評価例１：プルラナーゼに対する分解耐性）
従来の技術でＢＥをアミロースに作用させた場合に得られるα−グルカンは、プルラナーゼにより分解されやすいという点で、天然のグリコーゲンとは異なるということが報告されている（非特許文献１０）。
【０２５８】
本発明の方法によって製造されたグリコーゲンが天然のグリコーゲンと同様にプルラナーゼによる分解に耐性であるか否かを調べた。
【０２５９】
コーンスターチ（和光純薬工業(株)製）（１重量％）を水に懸濁し、ジェットクッカーでコーンスターチを糊化した。それを４０℃まで冷まし、イソアミラーゼ（４００００Ｕ／ｇ基質；（株）林原生物化学研究所製）を添加して４０℃で６時間反応させ、アミロースを生成させた。その後、この溶液を３ｍＭ  リン酸バッファー(ｐＨ７．０))および５
Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整し、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥを２００００Ｕ／ｇ基質となるように添加した後、６５℃で１９時間反応させて重量平均分子量９７１９ｋＤａのグリコーゲンを製造した。このグリコーゲン、牡蠣由来の試薬グリコーゲン（和光純薬工業(株)製）、ワキシーコーンスターチ（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ社製）またはコーンスターチ（和光純薬工業(株)製）を１Ｎ  ＮａＯＨに溶かし、ＨＣｌで中和した。その後、すぐにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ由来のプルラナーゼ(大和化成（株）
製)を添加し、反応液を、基質濃度０．５重量％、プルラナーゼ（０、２、４、１６、６
４、２５６Ｕ／ｇ基質）とし、１０ｍＭ  酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）でｐ
Ｈ５．０に調整した後、６０℃で３０分間反応させた。
【０２６０】
反応後、生成物の分子量を測定した。結果を図９に示す。
【０２６１】
この結果、澱粉は速やかに分解されたが、牡蠣由来の試薬グリコーゲン（和光純薬工業(株)製）および今回の製造方法によるグリコーゲンは、プルラナーゼでほとんど分解されないことがわかった。それゆえ、本発明の方法によって製造されるグリコーゲンは、天然のグリコーゲンと同様の性質を有し、実際にグリコーゲンであるといってよいことが確認された。
【０２６２】
（評価例２：α−アミラーゼに対する分解耐性）
グリコーゲンは、プルラナーゼによってほとんど分解を受けないことが知られているが、本発明者らの実験により、α-アミラーゼによっても非常に分解されにくいことがわか
った。たとえば、ワキシーコーンスターチ、ノーマルコーンスターチは、３００Ｕ／ｇのヒト唾液α−アミラーゼによって３０分処理することにより、分子量１万以下にまで分解されたが、試薬のカキ由来グリコーゲンは同じ条件でほとんど分解を受けなかった。
【０２６３】
本発明の方法によって製造されたグリコーゲンが天然のグリコーゲンと同様にα−アミラーゼによる分解に耐性であるか否かを調べた。
【０２６４】
評価例１で調製したグリコーゲン、牡蠣由来の試薬グリコーゲン（和光純薬工業(株)製）、ワキシーコーンスターチ（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ社製）またはコーンスターチ（和光純薬工業(株)製）を１Ｎ  ＮａＯＨに溶かし、ＨＣｌで中和した。その後、すぐにヒト唾液由来α−アミラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製Ｔｙｐｅ  ＸＩＩＩ−Ａ）を添加し、反応液を、基質濃度０．５重量％、α−アミラーゼ（０、５、３７．５、７５、１５０、３００Ｕ／ｇ基質）とし、２０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）でｐＨ７．０に調整した後、３７℃で３０分間反応させた。
【０２６５】
反応後、生成物の分子量を測定した。結果を図１０に示す。澱粉の分子量については、α−アミラーゼ量が０、５、３７．５Ｕ／ｇ基質のときは、生成物のろ過ができなかったため測定できなかった。
【０２６６】
この結果、澱粉は速やかに分解されたが、牡蠣由来の試薬グリコーゲン（和光純薬工業(株)製）および今回の製造方法で製造したグリコーゲンは、α−アミラーゼでほとんど分解されないことがわかった。それゆえ、本発明の方法によって製造されるグリコーゲンは、天然のグリコーゲンと同様の性質を有し、実際にグリコーゲンであるといってよいことが確認された。
【０２６７】
（実施例６：グリコーゲンの溶解性の確認）
アミロースＡ（ナカライテスク（株）製、Ｍｎ２９００）またはアミロースＡＳ１０（（株）アジノキ製、Ｍｗ１０，０００、Ｍｎとしては９１００）を１Ｎ  ＮａＯＨに溶かし、ＨＣｌで中和した。その後、すぐに水、酵素液、緩衝液を以下の反応液組成となるように添加して、７０℃で２４時間反応させた。反応液組成：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ＢＥ量３４，０００Ｕ／ｇ基質、基質濃度０．５重量％、リン酸カリウム濃度
２０ｍＭ、ｐＨ ７．５。この反応によって得られたグリコーゲンの収率（％）は、基質としてアミロースＡを用いた場合、１０．１％であり、基質としてアミロースＡＳ１０を用いた場合、５９．０％であった。
【０２６８】
以下の方法により、溶解度を決定した。得られたグリコーゲンをエタノールにより沈澱させて回収した後、乾燥し、２ｍｇ／ｍＬとなるように室温（約２０℃）の蒸留水を加え
て、室温で３０秒間ボルテックスミキサーにより撹拌し、０．４５μｍのフィルターによって濾過した。濾液を、溶解したグリコーゲンの量をＭＡＬＬＳ法によって算出した。
【０２６９】
さらに、以下の方法により、プルラナーゼ耐性およびα−アミラーゼ耐性を決定した。まず、エタノール沈澱により回収したグリコーゲンを、水に懸濁し、１００℃で加熱することにより、完全に溶解させた。プルラナーゼ処理は、２５６Ｕ／ｇ基質の大和化成（株）製クライスターゼにより、６０℃で３０分行った。α−アミラーゼ処理は、３００Ｕ／ｇ基質のＳｉｇｍａ社製Ｔｙｐｅ  ＸＩＩＩ−Ａを用いて３７℃で３０分行った。反応停止後、ＭＡＬＬＳ法によって、グルカンのＭｗを算出した。プルラナーゼまたはα−アミラーゼによる耐性は以下の式による比を求めて評価した。すなわち、プルラナーゼ耐性（％）＝｛Ｍｗプルラナーゼ処理後÷Ｍｗ処理前｝×１００であり、
α−アミラーゼ耐性（％）＝｛Ｍｗα−アミラーゼ処理後÷Ｍｗ処理前｝×１００である。
【０２７０】
結果を以下の表９に示す。
【０２７１】
【表９】
2008095117.tif 000017
この結果、本発明の方法により、溶解性が高く、プルラナーゼ耐性が高く、かつα−アミラーゼ耐性が高いグリコーゲンが得られることがわかった。
【０２７２】
（実施例７：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来ＢＥとＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来４−α−グルカノトランスフェラーゼ（ＴａｑＭａｌＱ）との併用による、グリコーゲンの収率向上）
（実施例７−１：アミロースＡにＴａｑＭａｌＱおよびＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥを作用させることによるグリコーゲンの製造）
アミロースＡ（ナカライテスク（株）製、Ｍｎ２９００）を１Ｎ  ＮａＯＨに溶かし、ＨＣｌで中和した。その後、すぐに水、酵素液、緩衝液を以下の反応液組成となるように添加して、６５℃で２０時間反応させた。反応液組成：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ＢＥ量５０００または２００００Ｕ／ｇ基質、ＴａｑＭａｌＱ量５、１０、または２０Ｕ／ｇ基質、基質濃度 ２重量％、リン酸カリウム濃度 ２０ｍＭ、ｐＨ ７．５。反
応条件および生成物の分析結果を以下の表１０に示す。
【０２７３】
【表１０】
2008095117.tif 000018
このように、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥおよびＴａｑＭａｌＱを用いて、Ｍｗ１０００ｋＤａ以上のグリコーゲンを製造できることがわかった。また、ＴａｑＭａｌＱの添加により、グリコーゲンの収率が大幅に向上する事が示された。
【０２７４】
（実施例７−２：コーンスターチにＴａｑＭａｌＱとＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥを作用させることによるグリコーゲンの製造）
コーンスターチ(和光純薬工業(株)製)(２重量％）を水に懸濁し、１００℃で３０分加
熱することにより、コーンスターチを糊化した。それを４０℃まで冷まし、イソアミラーゼ（（株）林原生物化学研究所製）５０００Ｕ／ｇ基質を添加して４０℃で２０時間反応させ、アミロースを生成させた。その後、この溶液を５ｍＭ  リン酸カリウムバッファーでｐＨ７．５に調整し、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥ（２００００Ｕ／ｇ基質）およびＴａｑＭａｌＱ（０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、または２０Ｕ／ｇ基質）を添加し、６５℃で２０時間反応させた。反応条件および生成物の分析結果を以下の表１１に示す。
【０２７５】
【表１１】
2008095117.tif 000019
このように、コーンスターチにイソアミラーゼをさせた後、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥおよびＴａｑＭａｌＱを用いて、Ｍｗ１０００ｋＤａ以上のグリコーゲンを高い効率で製造できることがわかった。
【０２７６】
（実施例７−３：液化コーンスターチ枝切り物を基質とし、ＴａｑＭａｌＱとＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥを作用させることによるグリコーゲンの製造）
コーンスターチ(和光純薬工業(株)製)を６重量％になるように水に懸濁し、α-アミラ
ーゼ（大和化成（株）製）を用いて１００℃でＤＥ１２まで液化させた。反応を停止後、イソアミラーゼ（５０００Ｕ／ｇ基質；（株）林原生物化学研究所製）を添加して４０℃で２０時間反応させ、枝きりした。枝切り物のＭｎは、約６００であった。この溶液のｐＨを５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液で７．５に調整し、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥ（５０００Ｕ／ｇ基質）およびＴａｑＭａｌＱ（１Ｕ／ｇ基質）を添加した後、６５℃で２０時間反応させることにより、Ｍｗ１１３６０ｋＤａのグリコーゲンが得られた。
【０２７７】
（実施例８：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来のＢＥを用いたグリコーゲンの製造）
アミロースＡおよびＡＳ−１０にＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来のＢＥを作用させてグリコーゲンを製造した。詳細には、アミロースＡ（ナカライテスク（株）製、Ｍｎ２９００）、ＡＳ−１０（（株）アジノキ製、Ｍｎ９１００）を１Ｎ  ＮａＯＨに溶かし、ＨＣｌで中和した。その後、すぐに水、酵素液、緩衝液を以下の反応液組成となるように添加して、６５℃で１７時間反応させた。反応液組成：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来ＢＥ量４０，０００Ｕ／ｇ基質、基質濃度 ２重量
％、酢酸ナトリウム濃度 ４０ｍＭ、ｐＨ ６．０。反応条件および生成物の分析結果を以下の表１２に示す。
【０２７８】
【表１２】
2008095117.tif 000020
このように、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来のＢＥを用いて、Ｍｗ１０００ｋＤａ以上のグリコーゲンを高い効率で製造できることがわかった。
【０２７９】
（実施例９：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ由来のＢＥを用いたグリコーゲンの製造）
アミロースＡおよびＡＳ−１０にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ由来のＢＥを作用させてグリコーゲンを製造した。詳細には、アミロースＡ（ナカライテスク（株）製、Ｍｎ２９００）、ＡＳ−１０（（株）アジノキ製、Ｍｎ９１００）を１Ｎ  ＮａＯＨに溶かし、ＨＣｌで中和した。その後、すぐに水、酵素液、緩衝液を以下の反応液組成となるように添加して、５５℃で１６時間反応させた。反応液組成：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ由来ＢＥ量２０，０００Ｕ／ｇ基質、基質濃度 ２重量％、Ｔｒｉｓ
濃度 ２０ｍＭ、ｐＨ ７．０。反応条件および生成物の分析結果を以下の表１３に示す。
【０２８０】
【表１３】
2008095117.tif 000021
このように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ由来のＢＥを用いて、Ｍｗ１０００ｋＤａ以上のグリコーゲンを製造できることがわかった。
【０２８１】
（実施例１０：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のＢＥを用いたグリコーゲンの製造）
アミロースＡおよびＡＳ−１０にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ  由来のＢＥを作用させてグリコーゲンを製造した。詳細には、アミロースＡ（ナカライテスク（株）製、Ｍｎ２９００）、ＡＳ−１０（（株）アジノキ製、Ｍｎ９１００）を１Ｎ  ＮａＯＨに溶かし、ＨＣｌで中和した。その後、すぐに水、酵素液、緩衝液を以下の反応液組成となるように添加して、４５℃で１６時間反応させた。反応液組成：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ由来ＢＥ量２０，０００Ｕ／ｇ基質、基質濃度 ２重量％
、Ｔｒｉｓ濃度 ２０ｍＭ、ｐＨ ７．０。反応条件および生成物の分析結果を以下の表１４に示す。
【０２８２】
【表１４】
2008095117.tif 000022
このように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のＢＥを用いて、Ｍｗ１０００ｋＤａ以上のグリコーゲンを製造できることがわかった。
【０２８３】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２８４】
本発明により、天然のグリコーゲンと同様の性質を有する高分岐かつ高分子量のα−グルカンを安価に製造する方法が提供される。本発明の方法によって製造されるグリコーゲンは、従来の天然由来のグリコーゲンと同様に幅広い分野で利用され得る。天然のグリコーゲンは、産業上種々の分野で利用されている。本発明の方法によって製造されるグリコーゲンは、例えば、免疫賦活剤、健康食品素材などとして用いられ得る。本発明の方法によって製造されるグリコーゲンはまた、化粧品素材、食品素材(調味料)、その他産業用素材としての用途が期待できる。本発明の方法によって製造されるグリコーゲンの用途としては、例えば、以下が挙げられる：微生物感染症治療剤、保湿剤（例えば、皮膚の保湿性
向上に有効な化粧料、口唇の荒れを防ぐ口唇用化粧料）、複合調味料（例えば、ホタテ貝柱の味を有する複合調味料）、抗腫瘍剤、発酵乳の生成促進剤、コロイド粒子凝集体、毛髪の櫛通り性および毛髪のツヤに影響する毛髪表面の耐摩耗性を改善する物質、細胞賦活剤（表皮細胞賦活剤、線維芽細胞増殖剤など）、ＡＴＰ産生促進剤、しわなどの皮膚の老化症状改善剤、肌荒れ改善剤、蛍光体粒子表面処理剤、環状四糖（ＣＴＳ；ｃｙｃｌｏ｛→６）−α−Ｄ−ｇｌｃｐ−（１→３）−α−Ｄ−ｇｌｃｐ−（１→６）−α−Ｄ−ｇｌｃｐ−（１→３）−α−Ｄ−ｇｌｃｐ−（１→｝）の合成の際の基質。本発明の方法によって製造されるグリコーゲンは、皮膚外用剤（例えば、化粧水、乳液、クリーム、美容液、養毛剤、育毛剤、パック、口紅、リップクリーム、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、ファンデーション、アイカラー、チークカラー、シャンプー、リンス、ヘアーリキッド、ヘアートニック、パーマネントウェーブ剤、ヘアカラー、トリートメント、浴用剤、ハンドクリーム、レッグクリーム、ネッククリーム、ボディローションなど）中、眼用溶液中などで用いられ得る。
【０２８５】
本発明の方法によれば、溶解性が高く、プルラナーゼおよびα−アミラーゼによる分解性の低い（天然のグリコーゲンに近い）グリコーゲンが得られる。これは、グリコーゲンを合成する能力を有するＢＥ（特に、耐熱性ＢＥ）が特殊な性質をもっていることに起因すると考えられる。
【０２８６】
得られるグリコーゲンの酵素消化性が低いことは、例えばグリコーゲンの免疫賦活活性発現のために重要であるので、本発明は特に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2008095117.tif 000034
【図１２】
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【配列表】
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