(57)【要約】【課題】比活性の高いミミズ由来セリンプロテアーゼを簡易、迅速かつ高収率に精製可能な方法を提供することミミズ由来セリンプロテアーゼの新たな用途として、ミミズ由来のセリンプロテアーゼを含有する洗浄剤を提供すること。【解決手段】ミミズ由来セリンプロテアーゼの精製方法であって、エタノール、２−プロパノール若しくはアセトン又はこれらの有機溶媒を２０％以上含有する水溶液にミミズを１日以上浸漬する浸漬ステップと、このミミズを緩衝液中でホモジナイズしてホモジネートを調製する破砕ステップと、このホモジネートを遠心分離して沈殿物を取り除き、ミミズ由来セリンプロテアーゼを上清として回収する回収ステップとを備える精製方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミミズ由来セリンプロテアーゼの精製方法であって、
エタノール、２−プロパノール若しくはアセトン又はこれらの有機溶媒を２０％以上含有する水溶液にミミズを１日以上浸漬する浸漬ステップと、
前記ミミズを緩衝液中でホモジナイズしてホモジネートを調製する破砕ステップと、
前記ホモジネートから残渣を取り除き、ミミズ由来セリンプロテアーゼを上清として回収する回収ステップとを備える精製方法。
【請求項２】
前記浸漬ステップは、エタノール、２−プロパノール若しくはアセトン又はこれらの有機溶媒を２０％以上含有する水溶液にミミズを３日以上浸漬するステップである、請求項１記載の精製方法。
【請求項３】
前記浸漬ステップは、エタノール又はエタノールを５０％以上含有する水溶液にミミズを浸漬するステップである、請求項１又は２記載の精製方法。
【請求項４】
前記ミミズは、アカミミズ（Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ  ｒｕｂｅｌｌｕｓ）である、請求項１〜３のいずれか一項記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミミズ由来セリンプロテアーゼの精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミミズは、その体内にセリンプロテーゼを含有していることが知られている。ミミズ由来セリンプロテアーゼとしては、６種類のアイソザイムが存在し、それぞれ基質特異性が異なっている。ミミズ由来セリンプロテアーゼは、生きたミミズを緩衝液中でホモジナイズし、そのホモジネートを硫安沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過法及び電気泳動法等の複数の精製手段を組み合わせて精製できる（非特許文献１）。セリンプロテアーゼを始めとする酵素類は、熱、ｐＨ、有機溶媒に対して感受性であると考えられているため、ミミズ由来のセリンプロテーゼであっても、水系の緩衝液を用いて低温室で精製するのが一般的である。
【０００３】
またミミズは、中国を始めとする東洋諸国を中心に、「地龍」という名の漢方薬として利用されている。「地龍」は、ミミズの体内の土砂を取り除いて乾燥したものであって、煎服又は黒焼き末を服用すれば、鎮静、解熱、利尿、口渇き及び関節痛等に効果があるといわれている。
【０００４】
【非特許文献１】Ｍｉｈａｒａら、Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９１年、４１巻、ｐ．４６１−４７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来法でミミズ由来セリンプロテアーゼを精製しても、比活性の高い酵素を得ることは困難であり、収率が悪いことも現状であった。このため、ミミズ由来セリンプロテアーゼに着目して、漢方薬以外のミミズの用途を探索することも困難であった。
【０００６】
そこで本発明の目的は、比活性の高いミミズ由来セリンプロテアーゼを簡易、迅速かつ高収率に精製可能な方法を提供することにある。本発明の目的はまた、ミミズ由来セリンプロテアーゼの新たな用途として、ミミズ由来のセリンプロテアーゼを含有する洗浄剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明は、ミミズ由来セリンプロテアーゼの精製方法であって、エタノール、２−プロパノール若しくはアセトン又はこれらの有機溶媒を２０％以上含有する水溶液にミミズを１日以上浸漬する浸漬ステップと、このミミズを緩衝液中でホモジナイズしてホモジネートを調製する破砕ステップと、このホモジネートから残渣を取り除き、ミミズ由来セリンプロテアーゼを上清として回収する回収ステップとを備える精製方法を提供する。
【０００８】
本発明者らは、上記課題達成のため鋭意研究を重ねた結果、ミミズ由来セリンプロテーゼは、室温で長期間安定であり、エタノール、２−プロパノール、アセトン、トルエン又はｎ−ヘキサンに対しても極めて強い耐性を有していることを見出した。さらに、エタノール、２−プロパノール、若しくはアセトン又はこれらの有機溶媒を２０％以上含有する水溶液にミミズを浸漬すれば、酵素の精製に不要なタンパク質は上記有機溶媒によって変性し、その後の遠心分離により沈殿物と除くことができることを見出した。これにより、一般的な酵素の精製に使用される硫安沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過法及び電気泳動法等の複数の精製手段が不要となり、ミミズ由来セリンプロテアーゼを簡易、迅速かつ高収率に精製することが可能となった。
【０００９】
上記浸漬ステップは、エタノール、２−プロパノール若しくはアセトン又はこれらの有機溶媒を２０％以上含有する水溶液にミミズを３日以上浸漬するステップであることが好ましく、さらには、エタノール又はエタノールを５０％以上含有する水溶液にミミズを浸漬するステップであることが好ましい。
【００１０】
ミミズ由来セリンプロテアーゼは、上記有機溶媒及び室温条件下で長期間安定であるため、浸漬時間を３日以上としたり、エタノール濃度を５０％以上としたりすることで、酵素の精製に不要なタンパク質をより効率よく変性させることができ、ミミズ由来セリンプロテアーゼの比活性を顕著に高めることができる。
【００１１】
上記ミミズは、アカミミズ（Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ  ｒｕｂｅｌｌｕｓ）であることが好ましい。
【００１２】
上記精製方法は、ミミズの種類を問わずに利用できるが、アカミミズ（Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ  ｒｕｂｅｌｌｕｓ）は入手が容易であり、上記精製方法に供試した場合に比活性の高いミミズ由来セリンプロテアーゼを精製できる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、有機溶媒中で安定であり、かつ、比活性の高いミミズ由来セリンプロテアーゼを簡易、迅速かつ高収率に精製できる。また、本発明によれば、血栓治療剤、バイオマスの分解剤、機能性食品等の原料としてミミズ由来のセリンプロテアーゼを供給でき、ミミズ由来セリンプロテアーゼのさらなる用途として、ミミズ由来のセリンプロテアーゼを含有する洗浄剤を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１５】
本発明のミミズ由来セリンプロテアーゼの精製方法は、エタノール、２−プロパノール若しくはアセトン又はこれらの有機溶媒を２０％以上含有する水溶液にミミズを１日以上浸漬する浸漬ステップと、ミミズを緩衝液中でホモジナイズしてホモジネートを調製する破砕ステップと、このホモジネートから残渣を取り除き、ミミズ由来セリンプロテアーゼを上清として回収する回収ステップとを備えることを特徴としている。
【００１６】
上記精製方法に使用するミミズは、消化管内の糞土を排出させ、水洗してから使用する。ミミズの種類としては、例えば、ツリミミズ科（Ｌｕｍｒｉｃｉｄａｅ）のシマミミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ  ｆｅｔｉｄａ）やアカミミズ（Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ  ｒｕｂｅｌｌｕｓ）、ヒメミミズ科のヒメミミズ（Ｅｎｃｈｙｔｒａｅｕｓ  ｓｐｐ．）を例示できるが、より比活性の高いミミズ由来セリンプロテアーゼを得るには、アカミミズ（Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ  ｒｕｂｅｌｌｕｓ）が好ましい。
【００１７】
浸漬ステップでは、エタノール、２−プロパノール若しくはアセトン又はこれらの有機溶媒を２０％以上含有する水溶液にミミズを１日以上浸漬するが、有機溶媒の種類としては、エタノール、２−プロパノール若しくはアセトンの他にトルエン又はｎ−ヘキサンを使用することができる。浸漬ステップに使用する有機溶媒は、エタノール又は２−プロパノールが好ましく、エタノールがより好ましい。また、有機溶媒の濃度は、濃度が高いほど比活性及び収率を高めることができ、５０％以上がより好ましい。
【００１８】
さらに、浸漬時間は、１日以上であれば１００日間浸漬しても精製されたミミズ由来セリンプロテアーゼの活性に対してマイナスに働くことはなく、３日以上であることが好ましく、７日以上であることがより好ましい。
【００１９】
浸漬方法は、有機溶媒に耐性である容器に、エタノール、２−プロパノール若しくはアセトン又はこれらの有機溶媒を２０％以上含有する水溶液を入れ、その中に上記ミミズを入れれば自然にミミズを浸漬できる。上記有機溶媒又は上記水溶液の量は、ミミズが空気に触れることなく、完全に浸漬できる量であればよいが、ミミズ１０ｇに対して１００ｍＬ以上が好ましく、２００ｍＬ以上がより好ましい。
【００２０】
破砕ステップでは、上記浸漬ステップで上記有機溶媒又は上記水溶液に浸漬されたミミズを緩衝液中でホモジナイズするが、使用する緩衝液は、中性から弱アルカリ性付近のｐＨとなるように緩衝作用を発揮するものが好ましく、ｐＨ８．０付近がより好ましい。用いられる緩衝液としては、例えば、トリス／塩酸緩衝液、トリス／酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。
【００２１】
ホモジナイズは、ミミズを破砕して、ミミズの組織中に存在するセリンプロテアーゼを緩衝液中に抽出できればよく、例えば、シャフトホモジナイザー（ポリトロンホモジナイザー）、テフロンホモジナイザー、乳鉢等を用いて行うことができる。また、ホモジナイズは、一般的な酵素の精製方法に従って、低温室において氷上で行ってもよいが、ホモジナイザーが発熱してタンパク質がその熱によって変性しないのであれば特に冷却する必要はなく、室温で行うことができる。
【００２２】
回収ステップでは、例えば、ミミズをホモジナイズして得たホモジネートを遠心分離して沈殿物を取り除き、その上清を回収するが、遠心分離は、不溶物を沈殿として除くことができる条件であればよい。例えば、高速遠心分離機（エッペンドルフセントリフュージ；エッペンドルフ社）で、１０，０００ｒｐｍ（１２，０００×ｇ）、２０分間、遠心分離して上清を回収することが例示できる。
【００２３】
回収した上清は、タンパク質濃度を測定し、Ｃｌｅａｓｏｎらの方法（Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、１９４１年、７巻、ｐ．１０９−１１３）に従ってセリンプロテアーゼ活性を測定できる。具体的には、０．２５μｍｏｌのクロモザイム基質と０．５μｍｏｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ９．０）と回収した上清（適量の酵素液）を含む反応液（１ｍＬ）を３７℃で一定時間インキュベートし、反応液の４０５ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定することにより、セリンプロテアーゼの活性により生成するｐ−ニトロアニリンの量を算出できる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、特に明記しない限り、「％」は「体積％」を表す。
【００２５】
（実施例１）：ミミズ由来セリンプロテアーゼの精製
以下に、ミミズ由来セリンプロテアーゼの新規精製方法について検討し、ミミズを浸漬するエタノール濃度の影響及び浸漬時間の影響について調べた結果を記載する。
【００２６】
まず、生ミミズを旭化成繊維延岡会社から購入し、生きた状態で水洗し、消化管内の糞土を排出させた。その後、７．５ｇのミミズを量り取り、２００ｍＬの２０％エタノール水溶液、５０％エタノール水溶液又は１００％エタノールのいずれかに、１、３、又は７日間、室温で浸漬した。浸漬後のミミズは再度水洗し、１０ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中でシャフトホモジナイザー（ポリトロンＰＴ１０−３５；ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社）で、室温で１分間ホモジナイズした。こうして得られたホモジネートは、遠心チューブに移し、室温で２０分間、１０，０００ｒｐｍ（１２，０００×ｇ）の条件下で遠心分離し、その上清を酵素液として回収した。尚、生ミミズをエタノール水溶液又はエタノールに浸漬することなく、そのまま５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）中でホモジナイズし、同様に遠心分離して得た上清についてもコントロール酵素液として回収した。
【００２７】
こうして得られた各酵素液のセリンプロテアーゼ活性は、クロモザイム基質としてＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡを用い、Ｃｌｅａｓｏｎらの方法で測定した。Ｃｌｅａｓｏｎらの方法の詳細については、上記の通りである。各酵素液のセリンプロテアーゼ活性は、１分間当たりに１μｍｏｌの基質を分解する酵素量を１unit（以下、Ｕと略す）とし、酵素１ｍｇ当たりの酵素量を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。また、各酵素液のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。
【００２８】
尚、中島らが既に報告し（岡山県立短期大学研究紀要、１９９１年、３６巻、ｐ．７１−７６）、ミミズ由来セリンプロテアーゼの精製方法として知られている一般的な精製方法で精製したミミズ由来セリンプロテアーゼ（以下、標品セリンプロテアーゼ）の活性は、今回精製したコントロール酵素液の活性を基準として比活性で表すと、３７．１  Ｕ／ｍｇであった。この３７．１  Ｕ／ｍｇの比活性と上記精製方法で精製されたミミズ由来セリンプロテアーゼの比活性とを比較することにより精製度を判定できる。
【００２９】
表１は、ミミズを浸漬するエタノール濃度及び浸漬時間が精製したセリンプロテアーゼ活性に及ぼす影響について調べた結果を示したものである。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
その結果、エタノール又はエタノール水溶液への浸漬時間が長いほど精製された酵素液の活性が高くなる傾向が認めら、１、３、又は７日間の浸漬時間では、７日間の浸漬が最も高い値を示した。また、浸漬する溶液は、５０％エタノール水溶液又は１００％エタノールの場合に比活性が顕著に高く、２０％エタノール水溶液の場合でも３又は７日間浸漬することで、コントロール酵素液と比較して２．０〜３．５培高い値を示した。比活性が最も高い値を示したのは、５０％エタノール水溶液に７日間浸漬したミミズから精製した酵素液であり、コントロール酵素液の３１．６倍であり、上記の標品セリンプロテアーゼの比活性に匹敵するものであった。
【００３２】
次に、２０％エタノール水溶液、５０％エタノール水溶液及び１００％エタノールに７日間浸漬したミミズから精製した上記の酵素液並びにコントロール酵素液（ＢＳＡ換算で２０ｍｇに相当する量）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分画し、ゲル中のタンパク質をクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色することにより、セリンプロテアーゼの精製度を分析した。以下、２０％エタノール水溶液に７日間浸漬したミミズから精製した上記の酵素液を精製酵素液１、５０％エタノール水溶液に７日間浸漬したミミズから精製した上記の酵素液を精製酵素液２、１００％エタノールに７日間浸漬したミミズから精製した上記の酵素液を精製酵素液３と呼ぶ。
【００３３】
図１は、各精製酵素液を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色したゲル写真である。第１レーンは分子量マーカー、第２レーンはコントロール酵素液、第３レーンは精製酵素液１、第４レーンは精製酵素液２、第５レーンは精製酵素液３を電気泳動している。
【００３４】
その結果、精製酵素液２及び精製酵素液３を電気泳動した第４及び第５レーンでは、ミミズ由来セリンプロテアーゼアイソザイムの分子量領域（２４，０００〜４０，０００Ｄａ）が強く染色され、ミミズ由来セリンプロテアーゼの純度が高くなっていることが示唆された。
【００３５】
（実施例２）：ミミズを浸漬する有機溶媒及び浸漬時間のフィブリン分解能に及ぼす影響
標品セリンセリンプロテアーゼは、血栓の原因物質であるフィブリンを分解する活性を有しているため、上記の精製酵素液１、２及び３並びにコントロール酵素液（ＢＳＡ換算で２０ｍｇに相当する量）について、フィブリン平板法（Ｈａｒｅｋａｔｅら、１９７４年、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、３２巻、ｐ．３５７−３６５）によりフィブリン分解活性を測定した。
【００３６】
フィブリン平板法で使用するフィブリン平板は、ウシ・フィブリノーゲン（Ｔｙｐｅ  Ｉ、Ｓｉｇｍａ社）を終濃度０．５％（重量％）となるように添加したホウ酸緩衝食塩水（ｐＨ  ７．８）をプラスチックシャーレに２０ｍＬ入れ、このシャーレを軽くゆすりながらウシ・トロンビン（５０  Ｕ／ｍｌ；持田製薬株式会社）を０．３ｍｌ滴下し、十分に混合した後に蓋をして、３０分間室温で放置して作成した。各酵素抽出液（ＢＳＡ換算で１０ｍｇに相当する量）をフィブリンプレートの上にスポットし、２５℃で１２時間静置した。
【００３７】
図２は、各精製酵素液をフィブリン平板にスポットし、フィブリン分解活性を測定した写真である。フィブリン平板上の数字は、各酵素液をスポットした位置を示し、スポット１にはコントロール酵素液を、スポット２〜４にはそれぞれ精製酵素液１〜３をスポットしている。
【００３８】
表２は、図２中の１〜４のスポット位置に認められたフィブリン分解面積を示したものである。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
その結果、いずれのスポットにおいても、フィブリンの分解が認められ、精製酵素液１、２及び３をスポットした位置におけるフィブリン分解面積は、コントロール酵素液をスポットした位置におけるフィブリン分解面積と比べて大きく、特に精製酵素液２及び３をスポットした位置におけるフィブリン分解活性は、コントロール酵素液と比較して顕著に強いものであった。精製酵素液１、２及び３をスポットした位置におけるフィブリン分解面積は、コントロール酵素液をスポットした位置のフィブリン分解面積と比較して、それぞれ約２倍、約７倍及び約７倍であった。
【００４１】
（精製したミミズ由来セリンプロテアーゼの洗浄効果）
ミミズ由来セリンプロテアーゼが極めて強い有機溶媒耐性を有していたことに着目し、衣類の油脂タンパク質汚染に対する洗浄効果について検討した。
【００４２】
まず、９枚の綿布（３ｃｍ×３ｃｍ）にそれぞれ０．５ｇのマヨネーズを塗布し、そのうちの８枚をそれぞれ蓋付きの遠心チューブ（５０ｍＬ容量）に入れた。残りの１枚は、未洗濯コントロールとした。
【００４３】
その後、綿布を各１枚入れた８本の遠心チューブには、２０ｍＬの脱イオン水、１０Ｕの精製酵素２を添加した脱イオン水（精製酵素洗剤液１）、２０％エタノール水溶液、１０Ｕの精製酵素２を添加した２０％エタノール水溶液（精製酵素洗剤液２）、２０％ｎ−ヘキサンを含有する水との混合液（以下、２０％ｎ−ヘキサン混合水；尚、使用時には、直前に十分に振とうし、均一な混合状態としてから使用する。）、１０Ｕの精製酵素２を添加した２０％ｎ−ヘキサン混合水（精製酵素洗剤液３）、市販液体洗剤（エマール（登録商標）；花王株式会社）又は１０Ｕの精製酵素２を添加した上記市販液体洗剤（精製酵素洗剤液４）と、２個のガラス玉（直径１５ｍｍ）とを加え、２５℃、１３０ｒｐｍで１時間振とうした（洗濯作業）。
【００４４】
洗濯作業後は、遠心チューブから綿布を取り出して水道水で十分に濯ぎ、風乾後の綿布にニンヒドリン溶液（東京化成工業株式会社）をスプレーして加熱することにより残存するタンパク質を発色させた。その際、洗濯作業を行っていない綿布についても、未洗濯コントロールとして、同様にニンヒドリン溶液で綿布に付着したタンパク質を発色させた。
【００４５】
ニンヒドリン発色のシグナル強度は、以下の方法で数値化した。まず、エプソンＥＳ−２２００スキャナ（セイコーエプソン社）で９枚の綿布のニンヒドリン発色の画像（解像度を３６０  ｐｉｘｅｌ／ｉｎｃｈ、８  ｂｉｔ）を取得し、引き続き、画像解析ソフトウェアＮＩＨｉｍａｇｅ（ｈｔｔｐ:／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅ／）で各綿布におけるニンヒドリン発色のシグナル強度を測定した。
【００４６】
図３は、各精製酵素洗剤液で洗濯した綿布に残存するタンパク質をニンヒドリンで発色させ写真である。Ｃの綿布は未洗濯コントロール、１の綿布は脱イオン水、２の綿布は精製酵素洗剤液１、３の綿布は２０％エタノール水溶液、４の綿布は精製酵素洗剤液２、５の綿布は２０％ｎ−ヘキサン混合水、６の綿布は精製酵素洗剤液３、７の綿布は市販液体洗剤、８の綿布は精製酵素洗剤液４をそれぞれ示している。
【００４７】
表３は、各洗濯作業後の綿布におけるニンヒドリン発色のシグナル強度を示したものである。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
その結果、精製酵素液２を脱イオン水に添加した精製酵素洗剤液１には、綿布に付着したタンパク質を洗浄する作用が認められ、この作用は市販液体洗剤に匹敵するものであった。また、精製酵素液２を２０％エタノール水溶液又は２０％ｎ−ヘキサン混合水に添加した精製酵素洗剤液２又は３で洗濯作業を行う場合であっても、綿布に付着したタンパク質を洗浄する作用が認められ、精製酵素液２を２０％ｎ−ヘキサン混合水に添加した精製酵素洗剤液３の洗浄効果は、精製酵素液２を脱イオン水に添加した精製酵素洗剤液１の洗浄効果よりも強く、市販液体洗剤とほぼ同等であった。
【００５０】
以上の結果より、ミミズを有機溶媒又は有機溶媒溶液中に一定期間浸漬して精製したミミズ由来セリンプロテアーゼは、有機溶媒を含有する場合であっても強いタンパク質分解効果が認められ、洗剤の洗浄成分として有用であることが強く示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】各精製酵素液を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色したゲル写真である。
【図２】各精製酵素液をフィブリン平板にスポットし、フィブリン分解活性を測定した写真である。
【図３】各精製酵素洗剤液で洗濯した綿布に残存するタンパク質をニンヒドリンで発色させ写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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