(57)【要約】【課題】幅の広いスポット幅ではプレート表面から発せられる自家蛍光や励起光の反射光による蛍光検出感度の低下がなく、安定した検出感度の蛍光検出を行うことができる蛍光検出装置を提供する。【解決手段】流路２０１を持つプレート１０７と、前記プレート１０７に対して励起光を照射し、反射された励起光を受光する光学部１１０とを備え、前記光学部１１０は、励起光を前記流路に照射する光源１０１と、流路内に蛍光物質を注入した際に光源より照射された励起光によって発せられる蛍光を収集するための対物レンズ１０９と、前記対物レンズ１０９を通過した前記蛍光を受光する受光部１０４を有し、流路２０１または流路を含むプレート１０７面を、励起光２０３が照射される照射面としたとき、前記流路２０１または流路を含むプレート面の断面の角度を、前記照射面によって反射された励起光２０３が対物レンズ１０９に入射しない角度とした。【選択図】図５
2008209186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路を持つプレートと、
前記プレートに対して励起光を照射し、反射された励起光を受光する光学部とを備え、
前記光学部は、励起光を前記流路に照射する光源と、前記流路内に蛍光物質を注入した際に励起光によって発せられる蛍光を収集するための対物レンズと、前記対物レンズを通過した前記蛍光を受光する受光部を有し、
前記流路または前記流路を含む前記プレート面を、前記励起光が照射される照射面としたとき、前記流路または前記流路を含む前記プレート面の断面の角度を、前記照射面によって反射された前記励起光が前記対物レンズに入射しない角度とした、
ことを特徴とした蛍光検出装置。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光検出装置において、
前記照射面の材質は、全反射する材料である、
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２のいずれかに記載の蛍光検出装置において、
前記プレートの断面の形状は、前記プレートの表面上に台形形状を載せ、該台形形状の上部にＶ字型の流路を設けた形状とした、
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項４】
請求項１または請求項２のいずれかに記載の蛍光検出装置において、
前記プレートの断面の形状は、前記プレートの表面にＶ字溝の流路を設けた形状とした、
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料が発する蛍光を測定する蛍光検出装置に関し、励起光を照射された試料を支持するプレートの自家蛍光や、反射による蛍光検出感度の低下を抑制する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸、タンパク質、酵素等の生体分子を検出する手法として、蛍光反応を利用する蛍光検出法が採用されてきた。既存の光源や、受光素子等の光学部品を組み合わせて、ラジオアイソトープを使わず、安全、安価に生体分子の測定が可能であることから、蛍光検出法は、酵素免疫測定、電気泳動、共焦点走査型蛍光顕微鏡法などさまざまな生体分子の検出に応用されている。
【０００３】
蛍光検出法は、励起光を照射することで、生体分子から発せられる蛍光信号を検出する方法である。例えばＦＩＴＣは波長４９５ｎｍの励起光に対して、波長５２０ｎｍの蛍光を発する物質である。蛍光を発する物質を検出するためには、励起波長を有する光と、蛍光波長を検出する受光部との組み合わせで測定される。これらを実用化するために、落射式と呼ばれている蛍光測定方法が知られている。これは励起光を試料上方から照射し、励起光によって起こる蛍光反応の変化を、励起光照射側に配置した受光素子で検出するものである。
【０００４】
図１は、従来の一般的な落射式蛍光測定装置の概略図である。
図１において、光学部１１０は、光源１０１、ダイクロックミラー１０２、受光フィルター１０３、受光部１０４、対物レンズ１０９から構成されている。光源１０１から照射されて、ダイクロイックミラー１０２によって反射された励起光１０５は、プレート１０７に配置された生体分子１０８に照射される。前記励起光１０５によって励起された生体分子１０８からの蛍光１０６は、対物レンズ１０９、ダイクロイックミラー１０２、受光フィルター１０３を透過し、蛍光信号として受光部１０４で検出される。このように、蛍光を発する物質と、それに対応した励起光と受光素子を利用することで、様々な蛍光物質や蛍光標識した生体分子を検出できるようになる。
【０００５】
蛍光測定を行う場合、試料を支持するための基板やセル、流路を有するプレートが用いられるが、基板の材料として、石英ガラスは紫外光に対する透過率が良いことから従来から利用されている。しかし、近年は、成型加工が容易でかつ使い捨てが可能なプラスチックなどの高分子材料が頻繁に用いられている。高分子材料は成型が容易であるが、一方で励起光による高分子材料からの自家蛍光を発しやすい特徴を有している。
【０００６】
近年、例えば従来の蛍光検出装置として、特許文献の国際公開第２００５／０６４３３９号パンフレットに開示されているものがあり、樹脂製のプレートに微細な流路を形成したものを用いて、流路内に試料と緩衝液を充填した後、緩衝液に対して所定の電位勾配をかけることでサンプルを電気泳動させながら、同時に生体分子に修飾した蛍光物質に対して励起光を照射しながら蛍光の強度分布を検出することにより、生体分子の泳動状態を観察する方式が見られる（例えば、特許文献１）。
【０００７】
この特許文献１の方式では、生体分子がプレート内の流路に注入され、電気泳動方式で流れる様を、励起光を照射しながらプレートを回動させ走査する必要がある。プレートの回動はプレートの偏心などの影響によって、光学部とプレートとの相対的な位置ずれが問題となってくる。それを補うために、流路に照射する励起光のスポット幅を広くして、位置ずれが発生しても流路には少なくとも励起光の一部が照射されるような対策を行っていた。
【特許文献１】国際公開第２００５／０６４３３９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記対策をとった場合においても、検出する蛍光量が小さくなってくると、幅の広いスポット幅ではプレート表面から発せられる自家蛍光や、励起光の反射光が、バックグラウンドノイズとして蛍光成分に上乗せされてしまい、蛍光検出感度が低下してしまう、という課題を有していた。
【０００９】
本発明は、前記従来の問題点を解決するためになされたものであり、プレート表面からの自家蛍光や、励起光の反射光による検出感度の低下の問題を無くし、常に安定した検出感度の蛍光検出を実現することを可能とした蛍光検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために、本発明の蛍光検出装置は、流路を持つプレートと、前記プレートに対して励起光を照射し、反射された励起光を受光する光学部とを備え、前記光学部は、励起光を前記流路に照射する光源と、前記流路内に蛍光物質を注入した際に励起光によって発せられる蛍光を収集するための対物レンズと、前記対物レンズを通過した前記蛍光を受光する受光部を有し、前記流路または前記流路を含む前記プレート面を、前記励起光が照射される照射面としたとき、前記流路または前記流路を含む前記プレート面の断面の角度を、前記照射面によって反射された前記励起光が前記対物レンズに入射しない角度とした、ことを特徴とする。
【００１１】
これにより、光学部と、プレートとに位置ずれが生じても、光学部がプレート面からの励起光の反射光の受光を低減することができ、蛍光感度の低下を抑えることができる。
【００１２】
また、本発明の蛍光検出装置は、前記照射面の材質は、全反射する材料である、ことを特徴とする。
【００１３】
これにより、励起光が照射面の材質により吸光されるのを防ぎ、プレート表面からの自家蛍光を抑えることができる。
【００１４】
また、本発明の蛍光検出装置は、前記プレートの断面の形状は、前記プレートの表面上に台形形状を載せ、該台形形状の上辺位置にＶ字型の流路を設けた形状とした、ことを特徴とする。
【００１５】
これにより、励起光の照射幅が流路幅より大きい場合、光学部と、プレートとに位置ずれが生じても、対物レンズへの流路を含むプレート面からの励起光の反射光を低減することができ、蛍光感度の低下を抑えることができる。
【００１６】
また、本発明の蛍光検出装置は、前記プレートの断面の形状は、前記プレートの表面にＶ字溝の流路を設けた形状とした、ことを特徴とする。
【００１７】
これにより、励起光の照射幅が流路幅より小さい場合、流路底面からの励起光の反射光の受光を低減することができ、蛍光感度の低下を抑えることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の蛍光検出装置は、流路を持つプレートと、前記プレートに対して励起光を照射し、反射された励起光を受光する光学部とを備え、前記光学部は、励起光を前記流路に照射する光源と、前記流路内に蛍光物質を注入した際に励起光によって発せられる蛍光を収集するための対物レンズと、前記対物レンズを通過した前記蛍光を受光する受光部を有し、前記流路または前記流路を含む前記プレート面を、前記励起光が照射される照射面としたとき、前記流路または前記流路を含む前記プレート面の断面の角度を、前記照射面によって反射された前記励起光が前記対物レンズに入射しない角度とし、かつ前記照射面が全反射する材質によってコーティングされているものとすることにより、光学部とプレートとの位置ずれに対しても、励起光を蛍光物質に一様に照射でき、プレート表面からの励起光の反射光及び自家蛍光などのバックグラウンドノイズによる蛍光検出感度の低下がなく、常に安定した蛍光強度の蛍光検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（実施の形態１）
以下に、本発明の実施の形態による蛍光検出装置を、図面を用いて詳細に説明する。
本発明は、生体分子を緩衝剤中で移動させて、生物学的、酵素的、免疫学的、および化学的アッセイを行う蛍光検出装置において、プレートからの自家蛍光や、励起光の反射による検出能力の低下を排除し、常に安定した検出感度の蛍光検出を実現するものである。
【００２０】
図２は、本発明の実施の形態１による蛍光検出装置におけるプレートの形状の一例を示したものである。なお、本発明の実施の形態１による蛍光検出装置は、プレート以外の構成は図１に示した従来のものと同様であり、その説明を省略する。
【００２１】
図１、図２に示すように、プレート１０７の表面に流路２０１が配置される。流路幅２０２を２００μｍとし、光学部と、プレートとに流路センターより±２００μｍの位置ずれが想定される場合、励起光２０３のスポット幅２０４は６００μｍ必要となる。この場合、励起光２０３の照射面２０５は、流路センターより±５００μｍの範囲となる。流路底面２０６、およびプレート表面の励起光２０３の照射面２０５は、励起光２０３が、図３に示す蛍光３０２を収集するための対物レンズ３０１に入射しないよう、プレート表面に対して傾斜面となるよう、水平方向に対する角度を有する。
【００２２】
具体的には、図３に示すように、対物レンズ３０１の集光角∠３０３を３３度とし、図４に示すように、流路底面以外の照射面全体の傾斜角∠４０１を、θ1、励起光の照射面からの反射角∠４０２を、θ2とすると、流路底面以外の照射面においては、
【００２３】
θ2＝2*θ1
【００２４】
で表せる。上記条件を満たす照射面全体の傾斜角∠４０１は、およそ１７．５度以上９０度未満となる。また、流路底面においては、流路内の試料の屈折率を、１．３３とし、流路の傾斜角∠４０３を、θ3、励起光の流路からの反射角∠４０４を、θ4とすると、
【００２５】
θ4＝asin(1.33*sin(2*θ3))
【００２６】
で表せる。流路の傾斜角∠４０３の条件を、対物レンズ３０１に入射しない角度、かつ流路内の試料の表面によって全反射が起こらない角度とすると、条件を満たす角度∠４０３は、およそ１３度から２４度の範囲である。
【００２７】
図４のような、台形の上辺の位置にＶ字溝を有する形状は、プレートの表面に台形形状を載せて、該台形形状の上辺位置にＶ字型の流路を設けた形状である。流路の傾斜角∠４０３は、上記のおよそ１３度から２４度の範囲以上の角度とした場合、照射された光が流路内で乱反射を起こすため、プレート面に対して照射された励起光は発散し、対物レンズ３０１に入射してしまう可能性がある。
【００２８】
励起光の照射面に、上記のような照射面全体の傾斜角∠４０１、及び流路の傾斜角∠４０３を設けることにより、励起光の反射光は、蛍光を収集するための対物レンズには入射しなくなり、励起光の反射光による蛍光検出感度の低下を防ぐことができる。
【００２９】
本発明の実施の形態１における蛍光検出装置のプレートの励起光の照射面の一例を、図５に示す。
【００３０】
照射面の材質５０１は、例えばアルミニウムのような励起光を全反射する材質であることが望ましく、また、流路内の試料は電気泳動されるため、流路内の材質は、例えば、シリコンや、チタンの酸化物５０２によって絶縁されなければならない。
【００３１】
以上の構成により、光源から発せられた励起光は、プレート表面によって蛍光を収集するための対物レンズに入射しない角度で反射され、さらに全反射されることにより、自家蛍光も発生しないため、光学部と、プレートとの位置ずれを想定した励起光の広幅化によるバックグラウンドノイズの影響からの蛍光感度の低下は、極力抑えることができる。
【００３２】
さらに、図６に示すように、副次的な効果として、流路底面に達した蛍光励起に使われなかった励起光６０１が流路底面で反射された後、再び蛍光物質６０２の励起に使われることにより、光学部から照射された励起光と、一旦流路底面６０３に達して反射された励起光の両方を使用して蛍光物質６０２が励起されるため、蛍光強度が増幅される。
【００３３】
以上のような本実施の形態１の蛍光検出装置によれば、流路を持つプレートと、前記プレートに対して励起光を照射し、反射された励起光を受光する光学部とを備え、前記光学部は、励起光を前記流路に照射する光源と、前記流路内に蛍光物質を注入した際に励起光によって発せられる蛍光を収集するための対物レンズと、前記対物レンズを通過した前記蛍光を受光する受光部を有し、前記流路または前記流路を含む前記プレート面を、前記励起光が照射される照射面としたとき、前記流路または前記流路を含む前記プレート面の断面の角度を、前記照射面によって反射された前記励起光が前記対物レンズに入射しない角度としたので、光学部と、プレートとに位置ずれが生じても、光学部がプレート面からの励起光の反射光の受光を低減することができ、蛍光感度の低下を抑えることができる効果がある。
【００３４】
（実施の形態２）
図７は、本発明の実施の形態２による蛍光検出装置におけるプレートの形状を示したものである。
【００３５】
図７に示すように、プレートの表面に、Ｖ字溝の流路７０１が配置されている。流路幅７０２を６００μｍとし、光学部と、プレートとに、流路センターより±２００μｍの位置ずれが想定される場合、励起光７０３のスポット幅７０４は、２００μｍ必要となる。流路底面の励起光７０３の照射面７０５は、励起光７０３が、図３に示す蛍光３０２を収集するための対物レンズ３０１に入射しないよう、プレート表面に対して角度を設ける。
【００３６】
具体的には、図３に示すように、対物レンズ３０１の集光角∠３０３を、３３度とし、流路内の試料の屈折率を、１．３３とし、図８に示すように、流路の傾斜角∠８０１を、θ5、流路を出射するときの屈折角度∠８０２を、θ6とすると、
【００３７】
θ6＝asin(1.33*sin(2*θ5))
【００３８】
で表せる。流路の傾斜角∠８０１の条件を、対物レンズ３０１に入射しない角度、かつ流路内の試料の表面によって全反射が起こらない角度とすると、条件を満たす角度∠８０１は、およそ１３度から２４度の範囲である。流路の傾斜角∠８０１は、これ以上の角度を設けると、照射された光が流路内で乱反射するため、プレート面に対して照射された励起光は発散し、対物レンズ３０１に入射してしまう可能性がある。
【００３９】
励起光の照射面に上記のような流路の傾斜角∠８０１を設けることにより、励起光の反射光は、蛍光を収集するための対物レンズには入射しなくなり、励起光の反射光による蛍光検出感度の低下を防止することができる。
【００４０】
本発明の実施の形態２による蛍光検出装置における流路面の一例を、図９に示す。
図９において、流路面の材質９０１は、例えば、アルミニウムのような励起光を全反射する材質であることが望ましく、また、流路内の試料は電気泳動されるため、流路内の材質は、例えば、シリコンや、チタンの酸化物９０２によって絶縁されなければならない。
【００４１】
以上の構成により、光源から発せられた励起光は、プレート表面によって蛍光を収集するための対物レンズに入射しない角度で反射され、さらに、全反射されることにより自家蛍光も発生しないため、バックグラウンドノイズの影響による蛍光感度の低下は、極力抑えることができる。
【００４２】
さらに、図６に示すように、副次的な効果として、流路底面に達した蛍光励起に使われなかった励起光６０１が流路底面で反射された後、再び蛍光物質６０２の励起に使われることにより、光学部から照射された励起光と、一旦流路底面６０３に達して反射された励起光の両方を使用して蛍光物質６０２が励起されるため、蛍光強度が増幅される。
【００４３】
以上のような本実施の形態２による蛍光検出装置によれば、プレートの断面の形状を、前記プレートの表面にＶ字溝の流路を設けた形状としたので、励起光の照射幅が流路幅より小さい場合、流路底面からの励起光の反射光の受光を低減することができ、蛍光感度の低下を抑えることができる効果が得られる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明に係る蛍光検出装置は、プレートからの自家蛍光や、励起光の反射光などのバックグラウンドノイズ成分を極力低減可能であるため、非常に高感度に、蛍光物質を検出可能である。このため、高感度測定が必要な一塩基多型や、細菌検査、ウイルス検査に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】従来の一般的な落射式蛍光検出装置の概略図
【図２】本発明の実施の形態１による蛍光検出装置におけるプレートの概略図
【図３】本発明の実施の形態１，２による蛍光検出装置における対物レンズ３０１の集光角の概略図
【図４】本発明の実施の形態１による蛍光検出装置におけるプレートの概略図
【図５】本発明の実施の形態１による蛍光検出装置におけるプレートの概略図
【図６】本発明の実施の形態１，２における蛍光検出装置における副次的な効果を表した図
【図７】本発明の実施の形態２による蛍光検出装置におけるプレートの概略図
【図８】本発明の実施の形態２による蛍光検出装置におけるプレートの概略図
【図９】本発明の実施の形態２による蛍光検出装置におけるプレートの概略図
【符号の説明】
【００４６】
１０１  光源
１０２  ダイクロックミラー
１０３  受光フィルター
１０４  受光部
１０５  励起光
１０６  蛍光
１０７  プレート
１０８  試料
１０９  対物レンズ
１１０  光学部
２０１  流路
２０２  流路幅
２０３  励起光
２０４  スポット幅
２０５  照射幅
３０１  対物レンズ
３０２  蛍光
３０３  集光角
４０１  プレート面の傾斜角
４０２  励起光のプレート面による反射角
４０３  流路底面の傾斜角
４０４  励起光の流路底面による反射角
５０１  材質
５０２  酸化物
６０１  励起光
６０２  蛍光物質
７０１  流路
７０２  流路幅
７０３  励起光
７０４  スポット幅
７０５  照射面
８０１  流路底面の傾斜角
８０２  励起光の流路底面による反射角
９０１  材質
９０２  酸化物
【図１】
2008209186.tif 000003
【図２】
2008209186.tif 000004
【図３】
2008209186.tif 000005
【図４】
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【図５】
2008209186.tif 000007
【図６】
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【図７】
2008209186.tif 000009
【図８】
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【図９】
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