(57)【要約】【課題】安全性が高く、細胞に対してフォーカルアドヒージョン形成を促進することができるフォーカルアドヒージョン形成促進剤、該剤を用いた、生体組織や線維芽細胞の収縮を促進することで、美容医療的薬剤、皮膚弛緩症抑制等の薬剤に利用可能な線維芽細胞の収縮剤あるいは生体組織の収縮促進剤を提供すること。【解決手段】本発明のフォーカルアドヒージョン形成促進剤は、式(１)で表される環状リン酸エステル誘導体を有効成分とする。本発明の線維芽細胞収縮剤及び生体組織収縮促進剤は、本発明のフォーカルアドヒージョン形成促進剤を含む。【化１】2008208058.tif 000004(RO：Ｃ８〜２２のアルコール残基、脂肪酸残基、M：水素原子、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子、置換アンモニウム基、無置換アンモニウム基)【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(１)で表される環状リン酸エステル誘導体を有効成分とするフォーカルアドヒージョン形成促進剤。
【化１】
2008208058.tif 000003
(式中ROは、炭素数８〜２２のアルコール残基または脂肪酸残基を示す。Mは水素原子、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子、置換アンモニウム基または無置換アンモニウム基を表す。)
【請求項２】
請求項１記載のフォーカルアドヒージョン形成促進剤を含む線維芽細胞収縮剤。
【請求項３】
請求項１記載のフォーカルアドヒージョン形成促進剤を含む生体組織収縮促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織モデルである細胞埋入コラーゲンゲルの収縮を促進する作用を有するフォーカルアドヒージョン形成促進剤、さらに医療および美容を目的とする皮内あるいは皮下投与により生体組織の収縮を促進する線維芽細胞収縮剤又は生体組織収縮促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚のハリの衰え、タルミ、シワの発生、毛穴の目立ち等の加齢による肌の衰えは、人の外観における印象を大きく左右することから現在まで多大な関心が払われてきた。これら肌の衰えを改善するために様々なマッサージ法や皮膚外用剤も提案されている。近年はこれらの伝統的なスキンケアの他に肌の衰えを治療対照とした美容医療についての関心が特に高まっている。
しかし、形成外科領域におけるメスを用いた外科的切除術やレーザー治療あるいは脂肪吸引等の形成外科的顔面若返り治療については人々の抵抗感が大きい。一方、レチノイン酸、ボツリヌス毒素、胎盤抽出液、ヒアルロン酸やコラーゲン等の薬剤注入は、医療行為として行われるものであるが、比較的抵抗感が小さく、人々に受け入れられやすい。このような状況において無数の試みが行われているにもかかわらず、皮膚のハリやタルミ、毛穴の改善等による皮膚の若返りに効奏する生体組織の収縮促進剤として働く薬剤等については、よく知られていない。
【０００３】
皮膚のハリの衰え、タルミ、毛穴の目立ちは、皮膚組織のコラーゲン線維に十分な張力が得られなくなることで顕在化される。近年、生体組織に類似した人工組織の構築が現実のものとなりつつあり皮膚も例外ではない。線維芽細胞を埋入したコラーゲンゲルは、人工皮膚として実用化も進んでいる。このようなコラーゲンゲルの張力の発生には細胞の収縮が不可欠であり、そのためには細胞とコラーゲンを結合させるインテグリンの局在化が必要である。このインテグリンの局在化の判断は、通常の細胞培養において、フォーカルアドヒージョン(Focal Adhesion)を、抗ビンキュリン抗体による免疫染色することにより確認できる。該フォーカルアドヒージョンは、日本語の表記では接着斑と呼ばれることもある。またfocal contact(焦点接触)とされることもある。
このように、人工皮膚に対してフォーカルアドヒージョン構築を促進させる薬剤を見出すことにより、肌のハリの衰えやタルミを改善する薬剤を開発する可能性が高くなる。
【０００４】
ところで、環状リン酸エステルは、元来真性粘菌(Physarum polycephalum)培養液より真核生物のＤＮＡポリメラーゼα阻害活性を有する物質として見出された(非特許文献１)。構造解析の結果、グリセリン骨格の２位３位に自己環状エステルを有する構造のグリセロリン脂質であることが明らかにされた。その後、分析技術の向上に伴って、このような環状リン酸エステルは、哺乳類の血清中にも約１０-7M程度存在することが明らかにされた(非特許文献２)。更に、ヒト血清中やウサギ涙腺液中にも環状リン酸エステルが確認される等、高等動物体液に普遍的に存在することが明らかになりその機能への関心が高まっている。
例えば、特許文献１及び２には、環状リン酸エステルによる細胞浸潤の抑制効果に基づく抗がん剤が、特許文献３及び４には、ニューロンやグリア細胞の生存維持、神経突起伸展作用等を有する薬剤が提案されている。
また、特許文献５及び６には、環状リン酸エステルによる抗シワ効果を期待した皮膚外用剤が、特許文献７には、環状リン酸エステルを用いた細胞のヒアルロン酸産生増強剤が、特許文献８には、環状リン酸エステルによる保湿効果を利用した、しっとり感の高い浴用剤が提案されている。
【０００５】
一方、環状リン酸エステルと化学構造が異なるリゾホスファチジン酸(ＬＰＡ)は、グリセリン骨格と１本鎖の脂肪酸を有する単純な構造のリン脂質であり、古くから多くの研究が知られている。
例えば、ＬＰＡに、細胞増殖亢進作用によるアンチリンクル効果があること(特許文献５及び６)、ヒアルロン酸産生増強効果があること(特許文献７)、あるいは毛穴引き締め効果がある(特許文献９)と考えられ、化粧料として用いられることが知られている。
このようなＬＰＡの細胞中における含有率は、全リン脂質の０．５％であり、８０年代より前は、単純にリン脂質の代謝中間体や分解物として理解されていた。８０年代以降、van CorvenやMoolenarらによってＬＰＡが血清中の増殖因子の本体であることが明らかにされた。その後、アクチン細胞骨格の再構築におよぼす作用やフォーカルアドヒージョン(非特許文献４)やコラーゲンゲル収縮の促進作用が次第に明らかにされ、細胞の情報伝達物質として認識されるに至った。現在は組織損傷時において機能する治癒物質としてＬＰＡは広く知られている。
しかしながら、ＬＰＡと化学構造が異なる環状リン酸エステルについては、フォーカルアドヒージョンとの関係について全く知られていない。
一方で、細胞レベルでの診断や治療の分野、また美容医療領域では、フォーカルアドヒージョンの形成促進により線維芽細胞の収縮を促す新しい試薬や薬剤の開発が望まれている。
【特許文献１】特開平７−２５８２７８号公報
【特許文献２】特開平９−２５２３５号公報
【特許文献３】特開２００２−３０８７７８号公報
【特許文献４】特開２００２−３０８７７９号公報
【特許文献５】米国特許第５３４０５６８号明細書
【特許文献６】米国特許第５５２１２２３号明細書
【特許文献７】特開２００２−３６３０８１号公報
【特許文献８】特開平１１−１５８０５７号公報
【特許文献９】特開２００２−１８７８１７号公報
【非特許文献１】J Biol Chem. 267, 30, 21512−21517(1992)
【非特許文献２】Life Science, 65, 2185−2191(1999)
【非特許文献３】Am.J.Physiol., 274, C1065−1074(1998)
【非特許文献４】EMBO J. 13., 11, 2600−2610(1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、安全性が高く、細胞に対してフォーカルアドヒージョン形成を促進することができるフォーカルアドヒージョン形成促進剤を提供することにある。
本発明の別の課題は、安全性が高く、細胞に対してフォーカルアドヒージョン形成を促進し、生体組織や線維芽細胞の収縮を促進することで、美容医療的薬剤、皮膚弛緩症改善等の薬剤に利用可能な線維芽細胞収縮剤あるいは生体組織の収縮促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、式(１)で表される環状リン酸エステル誘導体を有効成分とするフォーカルアドヒージョン形成促進剤が提供される。
【化２】
2008208058.tif 000002
(式中ROは、炭素数８〜２２のアルコール残基または脂肪酸残基を示す。Mは水素原子、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子、置換アンモニウム基または無置換アンモニウム基を表す。)
また本発明によれば、上記フォーカルアドヒージョン形成促進剤を含む線維芽細胞収縮剤又は生体組織収縮促進剤が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のフォーカルアドヒージョン形成促進剤は、上記式(１)で表される環状リン酸エステル誘導体を有効成分とするので、ビンキュリンの局在するフォーカルアドヒージョンの形成を高める効果に優れており、細胞を埋入したコラーゲンゲルの収縮能が著しく高く、生体組織の収縮効果が得られる。
従って、細胞用の試験試薬や、美容医療領域における線維芽細胞収縮剤又は生体組織収縮促進剤としての利用が期待される。また、皮膚弛緩症を改善等が可能な薬剤への利用も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明のフォーカルアドヒージョン形成促進剤は、細胞外基質に対して細胞が接着する分子生物学上の装置であるフォーカルアドヒージョンの形成を促進することで細胞と細胞外基質との相互作用を強化し、細胞の収縮力を高める効果が得られ、その結果として線維芽細胞や生体組織を収縮させることができる。従って、本発明の線維芽細胞収縮剤又は生体組織収縮促進剤は、本発明のフォーカルアドヒージョン形成促進剤を含む。
本発明において、有効成分として用いる環状リン酸エステル誘導体は、上記式(１)で表される化合物である。
式中ROは、炭素数８〜２２の炭化水素基を示す。炭素数８〜２２の炭化水素基としては特に限定されないが、好ましくは、炭素数８〜２２の直鎖状の飽和アシル残基、炭素数８〜２２の分岐鎖状の飽和アシル残基、炭素数８〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アシル残基、炭素数８〜２２の直鎖状の飽和アルキル残基、炭素数８〜２２の分岐鎖状の飽和アルキル残基、炭素数８〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アルキル残基が挙げられる。
【００１０】
前記炭素数８〜２２の直鎖状の飽和アシル残基としては、例えば、カプリル酸(C８：０)、カプリン酸(C１０：０)、ラウリン酸(C１２：０)、ミリスチン酸(C１４：０)、ペンタデカン酸(C１５：０)、パルミチン酸(C１６：０)、マルガリン酸(C１７：０)、ステアリン酸(C１８：０)、ノナデカン酸(C１９：０)、アラキジン酸(C２０：０)、ヘネイコサン酸(C２１：０)、ベヘン酸(C２２：０)等に由来する残基が挙げられる。入手のしやすさ等の点からラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸等が好ましく挙げられる。
また、炭素数８〜２２の直鎖状の飽和アシル残基中に水酸基を有するものとして、例えば、２−ハイドロキシデカン酸(C１０：０)、２−ハイドロキシドデカン酸(C１２：０)、２−ハイドロキシテトラデカン酸(C１４：０)、２−ハイドロキシヘキサデカン酸(C１６：０)、２−ハイドロキシオクタデカン酸(C１８：０)、２−ハイドロキシイコ酸(C２０：０)等が挙げられる。入手のしやすさの点から好ましくは、２−ハイドロキシデカン酸、２−ハイドロキシドデカン酸が例示できる。
直鎖状の飽和アシル残基中にシクロアルカン環を含有する場合、含有されるシクロアルカン環としては、シクロプロパン環、シクロプロペン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロオクタン環が例示でき、入手のしやすさ等の点から具体的には、ラクトバシル酸、マルバリン酸、ステルクリン酸等が好ましく挙げられる。
【００１１】
前記炭素数８〜２２の分岐鎖状の飽和アシル残基としては、例えば、イソバレリアン酸、イソ酸、アンテイソ酸、メチル−２−ハイドロキシデカン酸(C１１：０)、メチル−２−ハイドロキシドデカン酸(C１３：０)、メチル−２−ハイドロキシテトラデカン酸(C１５：０)、メチル−２−ハイドロキシヘキサデカン酸(C１７：０)、メチル−２−ハイドロキシオクタデカン酸(C１９：０)、メチル−２−ハイドロキシイコ酸(C２１：０)等に由来する残基が挙げられる。
前記炭素数８〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アシル残基としては、例えば、ミリストレイン酸(C１４：１)、パルミトレイン酸(C１６：１)、オレイン酸(C１８：１)、エライジン酸(C１８：１)、バクセン酸(C１８：１)、リノール酸(C１８：２)、リノレン酸(C１８：３)、アラキドン酸(C２０：４)、エイコサペンタエン酸(C２０：５)、エルカ酸(C２２：１)、ドコサヘキサエン酸(C２２：６)等の不飽和脂肪酸に由来する残基が挙げられる。
【００１２】
前記炭素数８〜２２の直鎖状の飽和アルキル残基としては、例えば、オクタノール(C８：０)、デカノール(C１０：０)、ドデカノール(C１２：０)、テトラデカノール(C１４：０)、ペンタデカノール(C１５：０)、ヘキサデカノール(C１６：０)、ヘプタデカノール(C１７：０)、オクタデカノール(C１８：０)、ノナデカノール(C１９：０)、イコサノール(C２０：０)、ヘネイコサノール(C２１：０)、ドコサノール(C２２：０)等のアルコール類に由来する残基が挙げられる。
前記炭素数８〜２２の分岐鎖状の飽和アルキル残基としては、例えば、イソバレリアノール、イソノール、アンテイソノール等のアルコール類に由来する残基が挙げられる。
前記炭素数８〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アルキル残基としては、例えば、テトラデセノール(C１４：１)、ヘキサデセノール(C１６：１)、オクタデセノール(C１８：１)、エイコセノール(C２０：１)、ドコセノール(C２０：１)、リノール(C１８：２)、リノレノール(C１８：３)、エイコセノール(C２０：４)、エイコサペンタエノール(C２０：５)、エルカノール(C２２：１)、ドコサヘキサノール(C２２：６)等に由来する残基が挙げられる。
【００１３】
これらのうち、炭素数８〜２２の炭化水素基としては、ホスフェート誘導体としての取扱いのしやすさ、および活性の強さ等の点からラウリン酸(C１２：０)、ミリスチン酸(C１４：０)、ペンタデカン酸(C１５：０)、パルミチン酸(C１６：０)、ミリストレイン酸(C１４：１)、パルミトレイン酸(C１６：１)、オレイン酸(C１８：１)、エライジン酸(C１８：１)、リノール酸(C１８：２)、リノレン酸(C１８：３)、アラキドン酸(C２０：４)、エイコサペンタエン酸(C２０：５)、ドコサヘキサエン酸(C２２：６)に由来する残基が好ましい。さらに、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸が最も好ましく挙げられる。
【００１４】
式中Mは水素原子、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子、置換アンモニウム基もしくは無置換アンモニウム基を表す。
前記アルカリ金属原子としては、ナトリウム、カリウム等が挙げられる。前記アルカリ土類金属原子としては、マグネシウム、カルシウム等が挙げられる。
前記置換アンモニウム基としては、例えば、ブチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、テトラメチルアンモニウム基が挙げられる。
前記無置換アンモニウム基としては、例えば、アンモニウムが挙げられる。このうち、Ｍとしては、リン酸エステル誘導体としての入手のしやすさ等の点からナトリウム、カリウムが最も好ましい。
【００１５】
式(１)で示される環状リン酸エステル誘導体としては、通常、１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体または１−O−アルキル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体が挙げられ、そのアシル基またはアルキル基は、水酸基、シクロアルカン環もしくは芳香環を含んでいても良い。
【００１６】
式(１)で表される環状リン酸エステル誘導体の入手方法は特に限定されず、例えば、１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体の場合、市販品を用いることができる他、市販のホスファチジルコリンやホスファチジン酸等のリン脂質を酵素処理する方法、種々の生物資源を原料とし、抽出等の処理により１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体を精製する方法、特開平６−２２８１６９号公報、特開平７−２５８２７号公報又は特開平９−２５２３５号公報に示された、１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体を、ジシクロヘキシルカルボジイミド存在下に脂肪酸と２，３−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールから化学合成する方法により得ることができる。
また、１−O−アルキル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体の場合、市販品を用いることができる他、合成あるいは生体より抽出した血小板活性化因子、プラスマローゲンあるいはその他の１−O−アルキルリゾリン脂質を、ホスホリパーゼＤやホスホリパーゼＡ２で酵素処理して製造する方法、米国特許第５２３８９６５号明細書に記載された、市販の１−O−アルキル−グリセロールをピリジン溶媒中でオキシ塩化リンと化学反応させて合成する方法等により得ることができる。
また、水酸基を有する環状リン酸エステルは、特開平８−９２０４８号公報に記載される水酸化処理を利用する方法により容易に得ることができる。更に、シクロプロパン環を有する環状リン酸エステルは、例えば、Tetrahedron Letters., 34, 4047頁, 1993年に記載される方法に従って合成することができる。
【００１７】
本発明にかかるフォーカルアドヒージョン形成の促進作用は、例えば、抗ビンキュリン抗体や抗フォーカルアドヒージョンキナーゼ抗体等を用いた免疫染色等の方法によって観察することができる。
本発明にかかる線維芽細胞を収縮促進させる作用は、例えば、細胞埋入コラーゲンゲルの収縮を測定することによって観察することができる。
本発明にかかる生体組織を収縮促進させる作用は、例えば、吸引試験、低周波振動試験、捻れ試験、超音波振動試験や触診等の方法によって観測することができる。
本発明において、フォーカルアドヒージョンの形成促進、線維芽細胞収縮又は生体組織収縮促進の対象となる細胞や、その生体組織としては、例えば、皮膚や粘膜等の外皮、胃や腸等の消化器、血管や心臓等の循環器、気管や肺等の呼吸器が挙げられる。また、口腔、食道、鼻粘膜あるいは皮膚の線維芽細胞に対してフォーカルアドヒージョン形成を促進することができる。
【００１８】
本発明のフォーカルアドヒージョン形成促進剤、線維芽細胞収縮剤及び生体組織収縮促進剤は、経口もしくは非経口的に投与することができる。その剤型としては、例えば、液剤、ドリンク剤、散剤、顆粒剤、注射剤、点滴剤、点眼剤、点鼻薬、吸入剤、座剤等のいずれであっても良いが、局所適用が可能であるとの理由から、注射剤、点眼剤あるいは点鼻薬が好ましい。
前記製剤化は、例えば、有効成分である式(１)で表される環状リン酸エステル誘導体と、公知の薬理的に許容される担体、賦形剤、崩壊剤、増量剤、希釈剤、可溶化剤等とを公知の方法によって製剤化することができる。この際、式(１)で表される環状リン酸エステル誘導体の含有割合は、通常０．０１〜３０重量％の範囲、好ましくは０．１〜１０重量％の範囲、より好ましくは１〜５重量％の範囲である。
本発明のフォーカルアドヒージョン形成促進剤、線維芽細胞収縮剤及び生体組織収縮促進剤の投与量は、いずれの場合も、投与対象、投与経路、症状等によっても著しく異なるが、経口的に投与する場合、式(１)で表される環状リン酸エステル量として、通常約１〜１０００ｍｇ／Kg体重、好ましくは約１０〜１００ｍｇ／Kg体重を１日１〜３回程度である。また、非経口的に投与する場合は、例えば、皮内注では、式(１)で表される環状リン酸エステル誘導体として、約０．０１〜１００ｍｇ／Kg体重を１日１回程度、１週間に１〜７回繰り返し投与することが好ましい。
【００１９】
本発明のフォーカルアドヒージョン形成促進剤は、フォーカルアドヒージョン形成促進剤として、また線維芽細胞収縮や生体組織収縮促進等の目的を達成するための医薬品として用いることができる他、その働きを利用した特殊な使用の方法として、細胞試験のための試験試薬や化粧料原料として用いられる可能性があり、産業発展のために欠かすことの出来ない新規な生体試薬を提供することができる。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
尚、例中の31Ｐ−ＮＭＲの測定は、機種：日本電子社製、JNM AL−４００、溶媒：重クロロホルム−重メタノール−重水(２：５：２ Ｖ／Ｖ／Ｖ)を用い、温度：２５℃の条件で行った。
【００２１】
合成例１
環状リン酸エステル誘導体の合成
１６：０−リゾホスファチジルコリン(ＬＰＣ、シグマ・アルドリッチ社製)１０ｇに水２５０ｇを加え十分に溶解させた。ｐＨ５．５の酢酸ナトリウム緩衝液１Ｍを１００ｇ、２Ｍ塩化ナトリウム１０ｍｌ、ホスホリパーゼＤ(ＰＬ−Ｄ、名糖産業社製)１００ｍｇ添加し、５５℃で加温した。１８時間後にクロロホルム６５０ｇとメタノール７００ｇを添加し、激しく混合した。クロロホルム６５０ｇを加えて混合後、静置し下層を回収し溶媒を５５℃で留去した。
得られた化合物は、31P−ＮＭＲによりリン酸環状構造を有し、開環したＬＰＡや原料のＬＰＣを含有しない、１−Ｏ−ヘキサデカノイルグリセロール−２，３−ホスフェートナトリウム塩(以下、１６：０−環状リン酸エステルという)であることを確認した。結果を図１に示す。
【００２２】
合成例２
大豆由来１−アシル−環状リン酸エステルの調製
ＬＰＣの代わりに、大豆リゾリン脂質(ＳＬＰ−ペーストリゾ、辻製油社製、アシル鎖の組成は、Ｃ１６：０が２１．８％、Ｃ１８：０が３．９％、Ｃ１８：１が１０．４％、Ｃ１８：２が５８．３％、Ｃ１８：３が５．６％である)１０ｇを用いた以外合成例１と同様にして１−アシル−環状リン酸エステルを調製した。
得られた生成物は、31P−ＮＭＲによりリン酸環状構造を有しており、１−アシル−環状リン酸エステルが含有されていることを確認した。結果を図２に示す。
【００２３】
実施例１
環状リン酸エステル誘導体として合成例１で調製した１６：０−環状リン酸エステルを用いた。
＜細胞培養＞
正常人真皮線維芽細胞として、新生児皮膚線維芽細胞NB1RGBを理研細胞バンクより入手した。NB1RGB細胞を、牛胎児血清(FCS)を１０％含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に分散させ、予めカバーガラスを挿入した培養用２４ウェルプレートに２×１０4／ウェルの密度で播種した。培養は５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃で行った。培養開始２４時間後、培地を吸引除去し無血清のDMEMに置換し、さらに３日間培養を継続した。培養最終日に１６：０−環状リン酸エステルを最終濃度が１０μＭとなるように添加した。
＜フォーカルアドヒージョン形成評価＞
環状リン酸エステル誘導体の添加３０分後に培養液を吸引除去し、２％パラフォルムアルデヒドを用いて細胞を１５分間固定した。固定終了前５分間は１％のトライトンＸ−１００を共存させた。固定終了後ブロックエース(雪印社製)によりブロッキングし、抗ビンキュリンモノクローナル抗体(シグマ・アルドリッチ社製)を添加し１時間インキュベートした。PBS(−)で十分洗浄後、FITC標識抗マウスIgG抗体(シグマ・アルドリッチ社製)を添加し１時間インキュベートした。PBS(−)で十分洗浄後、落射蛍光顕微鏡(オリンパス社製、BH2)で露出を一定として蛍光画像を記録し、フォーカルアドヒージョンを可視化した。結果を図３に示す。
【００２４】
実施例２
環状リン酸エステル誘導体として、合成例２で調製した大豆由来１−アシル−環状リン酸エステルを用いた以外は、実施例１と同様にしてフォーカルアドヒージョン形成能の評価を行った。結果を図３に合わせて示す。
【００２５】
比較例１
環状リン酸エステル誘導体の代わりに、１８：１−リゾホスファチジン酸を用いた以外は、実施例１と同様にしてフォーカルアドヒージョン形成能の評価を行った。結果を図３に合わせて示す。
【００２６】
尚、図３中の白抜き三角矢印は、フォーカルアドヒージョンの形成が見られる部分を分かりやすく示す為に付記したものである。白抜き三角矢印が多く見られるものは、フォーカルアドヒージョンの形成が促進されていることを示す。
図３の結果から、実施例１及び２の環状リン酸エステル誘導体を用いた場合は、無添加対照群および比較例１に比べて明らかに染色されるフォーカルアドヒージョン量の増加がみられた。１８：１−リゾホスファチジン酸を用いた比較例１では、無添加対照群と比較すると明らかにフォーカルアドヒージョンの形成が認められたが、実施例１及び２に比べて少なかった。
【００２７】
実施例３
環状リン酸エステル誘導体として合成例１で調製した１６：０−環状リン酸エステルを用いた。
＜コラーゲンゲル収縮促進能の評価＞
(２−１)人真皮モデル
真皮により近似した人工皮膚モデルにおいて評価を行うため、コラーゲンゲルに正常人由来線維芽細胞を内包化させたハイドロゲルを用いた。使用した細胞は、皮膚科学の分野で多用されている正常人皮膚線維芽細胞(NB1RGB)を、理研ジーンバンクから入手した。当該細胞を、FCSを１０％添加したＤＭＥＭにおいて前培養した。細胞はサブコンフルエントになるまで培養後、０．２５％トリプシン−EDTA処理によって接着細胞を浮遊させ、均一な細胞懸濁液を得た。遠心分離によって細胞を集め、DMEM−１０％FCSに再懸濁した。０．５％コーケンコラーゲン液(Cellgen I−PC)１５ｍｌ、３X DMEM ７．５ｍｌ、１X DMEM １５ｍｌに上記細胞懸濁液７．５ｍｌを氷冷下に混合し、予め２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(ＭＰＣ)をコートした６ウェルプレート(Nunc社製)に３．５ｍｌ／ウェルずつ無菌的に分注した。これらを３７℃の炭酸ガスインキュベータ中で静置してゲル化させた。ゲル固化後に１X DMEMを２．５ｍｌ上層し、被験物質を添加した。翌日より３日間に渡り、デジタルカメラを用いてゲルを上面から基準のスケールと同一画像に収まるよう撮影した。
(２−２)ゲル面積の計測
得られたゲルの画像からScan Imageを用いてゲル表面積を求めた。さらに同一視野内のスケールのピクセル数からゲル表面積を絶対値に換算した。結果を図４に示す。
【００２８】
実施例４
環状リン酸エステル誘導体として、合成例２で調製した大豆由来１−アシル−環状リン酸エステルを用いた以外は、実施例３と同様にしてコラーゲン収縮能の評価を行った。得られた結果を図４に合わせて示す。
【００２９】
比較例２
環状リン酸エステル誘導体の代わりに、１８：１−リゾホスファチジン酸を用いた以外は、実施例３と同様にしてコラーゲン収縮能の評価を行った。結果を図４に合わせて示す。
図４から明らかなように、実施例３及び４の環状リン酸エステル誘導体を用いた例では、線維芽細胞を収縮させ、コラーゲンゲルの収縮を促進させる働きが著しいことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】合成例１で調製した生成物の31P−ＮＭＲの結果を示すグラフである。
【図２】合成例２で調製した生成物の31P−ＮＭＲの結果を示すグラフである。
【図３】実施例１、２及び比較例１で行ったフォーカルアドヒージョン形成評価の結果を示す写真の写しである。
【図４】実施例３、４及び比較例２で行ったコラーゲンゲル収縮促進能の評価の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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