(57)【要約】      （修正有）【課題】骨に多く含まれ、細胞接着に関与する糖蛋白質、オステオポンチンに対するヒト化抗体で、従来の抗ヒトオステオポンチン抗体より活性（抗原結合活性、白血球遊走阻害活性等）および／または安定性（熱、低酸性条件、変性剤に対する耐性等）に優れたヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる重鎖および軽鎖可変領域を含み、重鎖定常領域がヒトＩｇγ１、軽鎖定常領域がヒトＩｇκである、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体、およびその製造方法。また、該抗体を含む、リウマチ性関節炎等の治療薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体。
【請求項２】
前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１である、請求項１に記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体。
【請求項３】
前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκである、請求項１に記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体。
【請求項４】
前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１であり、前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκである、請求項１に記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体。
【請求項５】
配列番号２５に示されるアミノ酸配列である重鎖、及び、配列番号２７に示されるアミノ酸配列である軽鎖を含む、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体。
【請求項６】
請求項１に記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１に記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６および／または７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の宿主細胞を培養し、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を発現させる工程を包含する、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を生産する方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を含む、自己免疫疾患、リウマチ、リウマチ性関節炎または変形性関節症の治療薬。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、自己免疫疾患、リウマチ、リウマチ性関節炎または変形性関節症を予防または処置するための方法。
【請求項１３】
自己免疫疾患、リウマチ、リウマチ性関節炎または変形性関節症を予防または処置するための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれかに記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性および安定性に優れたヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体、および該抗体を用いた疾患の治療および診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オステオポンチン（以下、「ＯＰＮ」という）は、骨に多く含まれる酸性のカルシウム結合性の糖蛋白質であり、ヒトの場合、ｍＲＮＡのスプライシングの違いから、オステオポンチン−ａ（以下、「ＯＰＮ−ａ」という）、オステオポンチン−ｂ（以下、「ＯＰＮ−ｂ」という）およびオステオポンチン−ｃ（以下、「ＯＰＮ−ｃ」という）の少なくとも３つのアイソフォームが生じ得ることが知られている（非特許文献１）。このうち、ＯＰＮ−ａの前駆体は、後記配列表の配列番号２３で示されるアミノ酸配列を持ち、分泌により、シグナルペプチドが切断され、Ｉ１７−Ｎ３１４の成熟体ＯＰＮ−ａがつくられると考えられている。また、成熟体ＯＰＮは、生体内のトロンビンにより１６８番目（ＯＰＮ−ａの場合）のアルギニン残基のＣ末端側で切断されて、Ｎ末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントの２つになる。
【０００３】
上記のＯＰＮは、多種の生理学的病理学的に重要な機能を担っており、例えば、細胞接着、細胞遊走、腫瘍形成、免疫応答および補体が媒介する細胞溶解の阻害等の機能を持っている。この多様な機能は、多種の細胞表面受容体により媒介されている。ＯＰＮは、内部にＲＧＤ配列をもち（例えば、ＯＰＮ−ａでは、１５９〜１６１残基目）、このＲＧＤ配列を認識するαＶβ３、αＶβ１およびαＶβ５等のインテグリンは、ＯＰＮの主な受容体であり、このうち、αＶβ３、αＶβ１およびαＶβ５インテグリンは、血管の平滑筋細胞において細胞接着を媒介し、更にαＶβ３は、マクロファージ、リンパ球、内皮細胞および平滑筋細胞等の遊走に関係している。
【０００４】
さらに、これまでの研究から、ＯＰＮは、ＳＶＶＹＧＬＲ配列（配列番号１０）を介してα９β１、α４β１およびα４β７インテグリンと結合することも明らかにされているが、これらのうちα４β１は、トロンビンで切断されていないＯＰＮ（非切断型ＯＰＮ）とトロンビンで切断されたＮ末端フラグメント（切断型ＯＰＮ）の両方に結合し、α９β１はトロンビン切断型ＯＰＮにのみ結合するという様式の差も見出されている（非特許文献２〜４）。これらのα９及びα４、β１及びβ７のインテグリンサブユニットは、相互にアミノ酸配列間の類似性が高い。そして、α４β１及びα４β７インテグリンは、主として、リンパ球と単球で見出されるが、好中球ではごくわずかに発現しているにすぎない。一方、α９β１は、好中球に選択的に高発現しておりVCAM-1やTenascin-Cなどを介して、好中球遊走に必須の機能を担っている。また、筋肉細胞や上皮細胞、肝細胞などで広く発現している。このように、インテグリンサブユニットα４とα９の細胞質ドメインは、それぞれ微妙に異なった細胞内シグナル伝達経路を通して、互いに協同して炎症部位への白血球の遊走と凝集を促し、それらの浸潤活性を増強することによって、様々な炎症反応に関与していると考えられる。
【０００５】
このように、様々な種類のインテグリンが、白血球の遊走を促進し、炎症反応に関与していることから、これらのインテグリン活性を阻害する薬剤は、潜在的には抗炎症剤としての可能性を有していると思われる。たとえば、インテグリンαＶβ３は、破骨細胞、血管内皮細胞および平滑筋細胞等で発現されており、αＶβ３インテグリンとその様々な結合リガンドとの結合を阻害することにより、例えば関節では、関節破壊抑制作用が期待できることから、抗αＶβ３抗体の開発が実際に行われている。
【０００６】
しかしながら、インテグリンファミリーに属する受容体は、広範な組織で普遍的に発現して生命活動維持に必須の機能を担っていることから、リウマチ性関節炎や変形性関節炎の治療にインテグリンに対する抗体を用いると、他の部位でも同様の阻害がおこる可能性があり、副作用の発生も懸念される。
【０００７】
このような観点から、現在までに、リウマチ性関節炎、変形性関節症などの病因を明確にし、より優れた治療方法を提供する試みがなされてきた。
【０００８】
例えば、ＷＯ０２／０８１５２２（特許文献１）では、リウマチ患者および変形性関節症患者で、関節腔液のＯＰＮ濃度が高値を示し、さらにリウマチ患者において、全ＯＰＮに占めるトロンビン開裂型のＮ末端フラグメントの割合が増大することが見出され、ＯＰＮが、これらの疾患の発症に深く関わっていることが確認された。特許文献１では、ＯＰＮをトロンビンで切断したＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントについて、それぞれのフラグメントを区別して認識する抗体を作成し、それらを用いた試験により、リウマチ性関節炎患者では、特にトロンビンにより切断されたＮ末端フラグメントが関節腔内で高濃度を示すことが見出されている。このＮ末端フラグメントには、ヒト型インテグリンが認識するＲＧＤ配列とＳＶＶＹＧＬＲ配列（配列番号１０）が共に存在しており、これら両者の配列を同時にブロックする抗体が、ＯＰＮとインテグリンの結合を幅広く阻害し、リウマチ性関節炎や変形性関節炎等の治療に効果があることが確認されている。
【０００９】
具体的には、特許文献１では、ヒトＯＰＮのＲＧＤ配列とインテグリンの結合およびヒトＯＰＮのＳＶＶＹＧＬＲ配列（配列番号１０）とインテグリンとの結合を阻害する抗体を作成し、細胞接着および細胞遊走等の実験によりその効果が確認されている。さらに、マウスＯＰＮの当該内部配列に対応する合成ペプチドに対する抗体を取得し、マウスの関節炎病態モデルを用いて、そのような抗体の治療薬としての効果が確認されている。
【００１０】
すなわち、マウスＯＰＮは、ヒトＯＰＮとアミノ酸配列上で相同な位置にマウスのインテグリンによって認識されるＲＧＤ配列及びＳＬＡＹＧＬＲ配列（配列番号１２）を有しているので、これらの配列を同時にブロックする抗体として、Ｍ５抗体を取得した。このＭ５抗体とマウスＯＰＮおよびそのトロンビン消化物との結合は、ＲＧＤ配列を含むＧＲＧＤＳＰペプチドで阻害され、またこのＭ５抗体は、ＴＮＦ-αで活性化したマウス脾臓由来の単球の遊走を阻害することが確認された。このＭ５抗体を、マウスのカルバリア（calvaria）器官培養系で調べてみたところ、骨破壊の抑制作用が観察された。さらに、マウスのコラーゲン関節炎モデルに、上記抗体を投与してみたところ、明らかに治療効果を示すことが確認された（特許文献１及び非特許文献５）。
【００１１】
これらの結果は、ＲＧＤ配列、ＳＶＶＹＧＬＲ配列（配列番号１０）とヒト型インテグリンの結合を同時にブロックする抗体が、ＯＰＮとインテグリンの結合を阻害し、リウマチ性関節炎等の治療に有効であることを強く示唆しており、さらに、若年性関節リウマチや慢性リウマチ等のリウマチのみならず、乾癬性関節炎や乾癬の治療への効果が期待されることを示している。また、臓器移植後の慢性拒絶は、血管や気管支の閉塞性病変を特徴としているが、その組織学的検討から、Ｔ細胞やマクロファージの活性化がサイトカイン、増殖因子の産生、血管内皮細胞障害を引き起こし、さらに血管平滑筋の増殖が線維化などを引き起こすために血管閉塞へ進展して行くと考えられている（非特許文献６〜８）。
そして、これらのマクロファージの活性化や血管平滑筋の線維化にはＯＰＮが必須の蛋白として機能することが報告されており（非特許文献９）、ＯＰＮ阻害抗体は、単球や好中球の遊走を抑制することにより、このような線維化に向けての過程を抑制する可能性がある。従って、臓器移植後の慢性拒絶反応を抑制し、臓器生着に寄与し、また、全身性自己免疫疾患、エリテマトーデス、ぶとう膜炎、ベーチェト病、多発性筋炎、糸状体増殖性腎炎、サルコイドーシス等の自己免疫疾患の治療への効果が期待される。また、種々の癌においてもＯＰＮの発現量が増加し、ＯＰＮが癌の進行及び転移を促進し（非特許文献１０〜１２）、抗ＯＰＮ抗体によって癌細胞の増殖や転移が抑制されることも確認されている（特許文献３、非特許文献１３）。従って、抗ＯＰＮ抗体は、種々の癌の治療への効果も期待される。
【００１２】
また、ＷＯ０３／０２７１５１（特許文献２）では、特許文献１記載のマウス抗ヒトオステオポンチン抗体２Ｋ１の可変領域とヒト抗体の定常領域とを有するキメラ抗ヒトオステオポンチン抗体、並びに、２Ｋ１抗体の相補性決定領域とヒト抗体のフレームワーク領域及び定常領域を有するヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体が開示されている。
【００１３】
ところで、今日では、癌治療用抗体（例えば、リツキシマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ）、リウマチ治療用抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ）、移植片拒絶を抑制するための治療用抗体（例えば、ムロモナブ、バシリキシマブ）などの、多くの治療用モノクローナル抗体が上市されている。
【００１４】
今後もモノクローナル抗体製剤はその特異性と安全性の高さという基本的特質から、特に低分子の治療薬開発が困難な多種多様な疾患を標的として研究開発が加速すると考えられる。
【００１５】
一方、このような抗体医薬の開発において最大の問題点となるのが、抗体の生産性である。これまでに市販されているモノクローナル抗体の臨床での投与量は概ね数ｍｇ／ｋｇのレベルであり、相当な製造コストがかかる。
【００１６】
そのため、優れた活性を示す抗体、そして同じ活性を示す抗体の中でも、発現量が高く、タンパク質としての安定性が高い抗体を選択することは、抗体医薬として実用化する上で極めて重要な要件である。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０２／０８１５２２パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０３／０２７１５１パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ０６／０４３９５４パンフレット
【非特許文献１】Y. Saitoh et al., (1995): Laboratory Investigation, 72, 55-63
【非特許文献２】Y. Yokosaki et al., (1999): The Journal of Biological Chemistry 274, 36328-36334
【非特許文献３】P. M. Green et al., (2001): FEBS Letters 503, 75-79
【非特許文献４】S. T. Barry et al., (2000): Experimental Cell Research 258, 342-351
【非特許文献５】Yamamoto et al., (2003): The Journal of Clinical Investigation, 112, 181-188
【非特許文献６】P. Freese et al., (2001): Nephrology, dialysis, transplantation, 16, 2401-2406
【非特許文献７】J. R. Waller et al., (2001): British Journal of Surgery, 88, 1429-1441
【非特許文献８】S. R. Lehtonen et al., (2001): Transplantation, 72, 1138-1144
【非特許文献９】A. O’Regan et al., (2000): International Journal of Experimental Pathology, 81, 373-390
【非特許文献１０】G. F. Weber, (2001): Biochimica et Biophysica Acta, 1552, 61-85
【非特許文献１１】H. Rangaswami et al., (2006): TRENDS in Cell Biology 16, 79-87
【非特許文献１２】S. S. Forootan et al., (2006): Int. J. Cancer: 118, 2255-2261
【非特許文献１３】Z. Hu et al., (2005): Clin. Cancer Res. 11 4646-4652
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は上記の状況を鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、従来の抗ヒトオステオポンチン抗体より活性（抗原結合活性、白血球遊走阻害活性等）および／または安定性（熱、低酸性条件、変性剤に対する耐性等）に優れたヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を提供することにある。本発明者らは、上記課題を解決するために創意研究を重ねた結果、このような特性を有するヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を作製することに成功した。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
すなわち、本発明は、以下の特徴を有する。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体。
（２）前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１である、上記（１）に記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体。
（３）前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκである、上記（１）に記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体。
（４）前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１であり、前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκである、上記（１）に記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体。
（５）配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体。
（６）上記（１）に記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
（７）上記（１）に記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
（８）上記（６）および／または（７）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（９）上記（８）に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
（１０）上記（９）に記載の宿主細胞を培養し、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を発現させる工程を包含する、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を生産する方法。
（１１）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を含む、自己免疫疾患、リウマチ、リウマチ性関節炎または変形性関節症の治療薬。
（１２）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、自己免疫疾患、リウマチ、リウマチ性関節炎または変形性関節症を予防または処置するための方法。
（１３）自己免疫疾患、リウマチ、リウマチ性関節炎または変形性関節症を予防または処置するための医薬の製造における、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の使用。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によって、従来の抗ヒトオステオポンチン抗体より活性（抗原結合活性、白血球遊走阻害活性等）および／または安定性（熱、低酸性条件、変性剤に対する耐性等）に優れたヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体が提供される。このような特質を有する本発明の抗体は、自己免疫疾患、リウマチ、リウマチ性関節炎、変形性関節症を始めとする、種々の炎症性疾患の予防または治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に、本発明について詳述する。
本発明者らは、上記の従来の抗ヒトオステオポンチン抗体に関する課題を克服するために創意検討を重ねた結果、ＷＯ０３／０２７１５１（特許文献２）に記載のキメラ２Ｋ１抗体及びヒト化２Ｋ１抗体に比べ、活性および／または安定性が共に優れたヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を取得することに成功した。
【００２１】
抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在し、それぞれγ１、γ２、γ３、γ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖および２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）および非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
【００２２】
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域（Ｖ領域、ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ、可変部）とよばれている（各ドメインは、それぞれ、ＶＨおよびＶＬと表される）。これよりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域（Ｃ領域、ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ、定常部）とよばれている（各ドメインは、それぞれ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３あるいはＣＬと表される）。
【００２３】
抗体の抗原決定部位はＶＨおよびＶＬによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇのＣ領域の構造の差を反映している。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）と呼んでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）とよばれ、比較的一定である。通常、各可変領域の相補性決定領域の５〜１０個のアミノ酸だけが抗原結合部位を形成している。
【００２４】
本明細書中では、抗原と反応する可変領域についてはマウス抗体（ドナー異種抗体とも称する）由来の可変領域を有し、定常領域についてはヒト抗体由来の定常領域を有する抗体を、キメラ抗体と称し、オステオポンチンおよびその断片を認識するキメラ抗体を、キメラ抗オステオポンチン抗体と称する。また、抗原特異的な非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）抗体分子の相補性決定領域（抗原結合部位）以外をすべてヒト抗体のアミノ酸に置き換えた組換え抗体はヒト化抗体と称する。ヒト化抗体には、本発明の抗体のような、さらにフレームワーク領域にアミノ酸の改変（置換、挿入、欠失、付加）を加えたものも包含される。
【００２５】
一般に、ヒト化抗体の作製においては、相補性決定領域のアミノ酸配列のみを鋳型のヒト抗体フレームワークに移植しただけでは、多くの場合、オリジナルのマウス抗体よりも抗原結合活性が低下することが知られている。上記のヒト化２Ｋ１抗体についても、ＯＰＮペプチドに対する結合性は有するものの、ＯＰＮに対する細胞接着阻害活性が極めて低く、抗体医薬としての使用には適さないことが確認された（後記実施例９）。
【００２６】
本発明者らは、このようなヒト化抗体の活性低下を改善し、かつ、抗体医薬として使用するためにより優れた安定性を有するヒト化抗体を得るために創意検討を重ねた結果、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体が、従来のキメラ及びヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体と比較して有意に改善された活性および／または種々の安定性指標において優れた安定性を有することを同定した。このような本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体は、鋳型のヒト抗体の重鎖および軽鎖のフレームワーク領域において、いくつかのアミノ酸に改変を加えて作製されたものであり、相補性決定領域のみを移植して作製された従来のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体（特許文献２）とは、フレームワーク領域の配列が異なる。
【００２７】
本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体は、本願明細書に開示される、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。具体的には、本発明の抗体の重鎖可変領域アミノ酸（配列番号１）をコードする塩基配列を有する重鎖可変領域遺伝子断片、及び、本発明の抗体の軽鎖可変領域アミノ酸（配列番号３）をコードする塩基配列を有する軽鎖可変領域遺伝子断片を作製する。そして、この可変領域遺伝子をヒト抗体の適当なクラスの定常領域遺伝子と連結させてヒト化抗体遺伝子を作製する。次いで、このヒト化抗体遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、培養細胞中に導入する。最後にこの培養細胞を培養して培養上清からヒト化抗体を得ることができる。
【００２８】
上記の本発明の抗体の重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸（配列番号１及び配列番号３）をコードする各可変領域遺伝子断片は、例えば、ＷＯ０３／０２７１５１に記載される方法に従って、該文献に開示されるヒト化２Ｋ１抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の各々をコードする遺伝子断片を調製し、ヒト化２Ｋ１抗体のフレームワーク領域をコードする該遺伝子断片の所定の部位に変異を導入することによって作製することができる。フレームワーク領域の所定の部位に変異を導入する方法としては、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．１−８．５）等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。あるいは、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子断片は、該重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１及び配列番号３）に基づいてデザインされた塩基配列、または、配列番号５及び配列番号７に示される本発明の抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の塩基配列に基づいて、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することも可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
【００２９】
次いで、上記の可変領域遺伝子断片とヒト抗体の定常領域遺伝子とを連結させてヒト化抗体遺伝子を作製する。使用されるヒト抗体の定常領域は、どのようなサブクラスの定常領域も選択可能であり得るが、好ましくは重鎖定常領域としてはヒトＩｇγ１が、また、軽鎖定常領域としてはヒトＩｇκを用いることができる。
【００３０】
このヒト化抗体遺伝子の作製につづく、ヒト化抗体遺伝子の発現ベクターへの導入、発現ベクターの培養細胞への導入、培養細胞の培養、抗体の精製等については、当該分野で公知の種々の方法を使用してか、あるいは、ＷＯ０２／０８１５２２またはＷＯ０３／０２７１５１に記載される、キメラ抗ヒトオステオポンチン抗体またはヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の作製方法を参照して行うことができる。上記のようにして得られたヒト化抗体遺伝子と連結される発現ベクターとしては、国際公開公報ＷＯ９４／２０６３２に記載のＡＧ−γ１やＡＧ−κ等の発現ベクターが使用できるが、ヒト化抗体遺伝子を発現することができるものであれば特に制限されない。なお、発現ベクターとしてＡＧ−γ１あるいはＡＧ−κ等の予めヒトＩｇ定常領域遺伝子を有するものを利用すれば、これにヒト化抗体可変領域遺伝子を挿入するだけでヒト化抗体遺伝子を有する発現ベクターとなるため好ましい。
【００３１】
上記の発現ベクターは、例えば、リン酸カルシウム法等により、培養細胞中に導入される。
【００３２】
発現ベクターを導入する培養細胞としては、例えば、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞等の培養細胞が使用でき、これを常法により培養すればよい。
【００３３】
上記培養後、培養上清中に蓄積された抗体は、例えば、プロテインＡカラムを用いた各種クロマトグラフィーにより精製することができる。
【００３４】
こうして得られたヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の抗原活性は、例えば、後記実施例に記載されるようなオステオポンチンペプチド等を用いたＥＬＩＳＡや、ＢＩＡＣｏｒｅ（ＢＩＡｃｏｒｅ社）等により測定可能である。また、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の白血球遊走阻害活性は、例えば、後記実施例に記載されるように、被験抗体とＯＰＮまたはトロンビン切断型ＯＰＮの存在下でヒト末梢血単核球を培養することによって測定することができる。本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体は、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）で活性化したヒト末梢血単核球細胞のトロンビン切断型ＯＰＮに対する遊走を阻害する生物活性を有する。
【００３５】
次いで、このようにして作製されたヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を、各種安定性指標について試験する。本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体は、以下の安定性指標（Ａ）〜Ｄ））を示す：
Ａ）ＰＢＳ中で７０℃で２時間加熱処理した後のＳＶＶＹＧＬＲ配列（配列番号１０）を含むペプチドに対する結合活性が、加熱処理しない場合の９０％以上である熱安定性を示す。
Ｂ)ドナー異種抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域を持つキメラ抗体と比べて、変性中点（Ｔｍ）が少なくとも５℃高い。
Ｃ)ドナー異種抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域を持つキメラ抗体と比べて、少なくとも０．５Ｍ高い濃度の塩酸グアニジンにまで耐性を持つ。
Ｄ)ドナー異種抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域を持つキメラ抗体と比べて、少なくとも０．３低いｐＨにまで耐性を持つ。
【００３６】
ここで、上記指標Ａ）およびＢ）は、いずれも熱に対する安定性であり、これらが良好な抗体であるほど、長期の保存安定性および剤型においてメリットを有する。すなわち、抗体製剤は、蛋白質であるため保存安定性が問題になることが多く、凍結乾燥製剤（これは、使用時に溶かさねばならないため、医療現場では利便性の面で問題があり、特に、蛋白製剤は溶解に３０秒以上掛かることが多く医療現場の負担となることが多い）となる場合があるが、良好な温度安定性を有する抗体であれば、溶液状態でも冷蔵で２年以上長期安定性が保障できる。実際に、本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体である後記実施例記載のＲ２Ｋ１ｖ１．７は、室温（２５℃）においても１年程度の安定性が確保されている。また、溶液製剤が可能となれば、プレフィルドシリンジなどのより利便性が高い製剤化が可能である。上記の指標を満たす温度安定性の高い抗体は、製剤化のバリエーションが広がり、より医療ニーズの高い製剤化が可能で選択肢が増える。
上記指標Ｃ）は、塩耐性に関する指標であるが、このような塩耐性を有する抗体は、製剤化においてより有利な処方検討を行うことが可能となる。特にプレフィルドシリンジにおいては、１００〜２００μｇ／ｍＬといった高濃度の蛋白製剤を設計する上において高い塩濃度を使用する場合が多いため有用である。
上記指標Ｄ）は、ｐＨ耐性に関する指標であるが、このようなｐＨ耐性を有する抗体は、抗体の製造精製過程のウイルス失活工程においてより低いｐＨでの処理が可能となり、有用である。そのため、通常の抗体と比較して０．３程度でもより低ｐＨ耐性を有することは大きなメリットとなる。
【００３７】
指標Ａ）の試験方法は、以下のとおりである。まず、被験ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体をＰＢＳ中に希釈し（好ましくは、５０μｇ／ｍＬ）、７０℃で２時間加熱処理する。その後、室温に戻し、該抗体のＳＶＶＹＧＬＲ配列（配列番号１０）を含むペプチドに対する結合活性を、例えば、今らのＥＬＩＳＡ方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８８：４２０−４３２（２００２））によって測定する。この熱処理した抗体の結合活性を、未処理の同じ抗体について測定した結合活性と比較する。本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体は、このような加熱処理した場合、未処理の場合のＳＶＶＹＧＬＲ配列（配列番号１０）を含むペプチドに対する結合活性の９０％以上の結合活性を有する。好ましくは、本指標試験に使用されるＳＶＶＹＧＬＲ配列（配列番号１０）を含むペプチドは、ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ配列（配列番号１３）を有するオステオポンチンペプチドである。
【００３８】
指標Ｂ)の試験方法は、以下のとおりである。まず、被験ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体、及び、ＷＯ０３／０２７１５１に記載のキメラ２Ｋ１抗体（Ｃ２Ｋ１）を、適切な緩衝液（好ましくは、２０ｍＭ  クエン酸バッファー＋１２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ６．０））で調整し、示差走査型カロリメーター（好ましくはマイクロキャル社のＶＰキャピラリーＤＳＣプラットフォーム）により、加熱に対する安定性を評価することができる。本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の変性温度を示す変性中点（Ｔｍ）は、Ｃ２Ｋ１のそれと比較して少なくとも５℃高い。
【００３９】
指標Ｃ）の試験方法は、以下のとおりである。まず、被験ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体、及び、上記のキメラ２Ｋ１抗体（Ｃ２Ｋ１）を、０〜５Ｍの各濃度の塩酸グアニジンを含む緩衝液（好ましくは、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム＋１２０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ  ７．０））に溶解し、適切な濃度（好ましくは、５０μｇ／ｍＬ）に調整する。次いで、各溶液サンプルを１０℃で一晩静置した後、各サンプルの蛍光スペクトルを測定する。具体的には、２８０ｎｍの励起光によりトリプトファンが発する蛍光を波長３２０ｎｍから３７０ｎｍの範囲でスキャンする。ピーク波長は、塩酸グアニジンによる抗体タンパク質の立体構造のゆるみに起因してシフトする。ピーク波長がシフトする塩酸グアニジン濃度を、被験抗体およびキメラ抗体の各々について測定する。本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体についての上記ピーク波長がシフトする塩酸グアニジン濃度は、Ｃ２Ｋ１のそれと比較して、少なくとも約０．５Ｍ高い濃度である。
【００４０】
指標Ｄ）の試験方法は、以下のとおりである。まず、被験ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体、及び、上記のキメラ２Ｋ１抗体（Ｃ２Ｋ１）を、適切な緩衝液（好ましくは、２０ｍＭ  クエン酸バッファー＋１２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ６．０））で調整し（好ましくは、２ｍｇ／ｍＬ）、これらに、酸性溶液（好ましくは、０．１Ｎ  ＨＣｌ）と水を加えながら、所定の濃度（１ｍｇ／ｍＬ）の各低ｐＨのサンプルを調製する。このサンプルを室温にて１時間処理したのち、円二色性（ＣＤ）スペクトルを測定する。波長２０５ｎｍから２６０ｎｍの範囲でＣＤスペクトルを測定し、ＹａｎｇらのＣＤスペクトル解析法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１３０，２０８−２６９（１９８６））に基づいて、各抗体の各ｐＨ処理サンプルについて、ランダム構造の含有率を測定する。本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体についてのランダム構造の含有率が上昇し始めるｐＨは、Ｃ２Ｋ１のそれと比較して、少なくとも約０．３低い。
【００４１】
本発明者らは、ＷＯ０３／０２７１５１に記載のヒト化抗体を基に、部位特異的変異誘発などによるフレームワーク領域遺伝子の改変と、上述のＡ）〜Ｄ）の安定性指標を用いた安定性試験とを組み合わせて創意検討を重ねた結果、ヒト抗体フレームワーク部分（ＦＲ１〜４）を配列番号１に示されるアミノ酸配列（それぞれアミノ酸番号１〜３０、３６〜４９、６７〜９８および１０６〜１１６）並びに配列番号３に示されるアミノ酸配列（それぞれアミノ酸番号１〜２３、４０〜５４、６２〜９３および１０３〜１１３）とすることにより、従来の抗ヒトオステオポンチン抗体より活性（抗原結合活性、白血球遊走阻害活性等）および／または安定性（熱、低酸性条件、変性剤に対する耐性等）に優れたヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を得ることに初めて成功した。本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体は、前述の抗原結合活性、白血球遊走阻害活性および各種安定性指標について試験した結果、該活性を有し、かつ、該指標Ａ）〜Ｄ）の全てを特性として示す。
【００４２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体は、当該分野で公知の方法を用いて、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよび配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し、これらを適当なクラスのヒト抗体定常領域遺伝子、好ましくは重鎖についてはヒトＩｇγ１定常領域遺伝子、軽鎖についてはヒトＩｇκ定常領域遺伝子と連結してヒト化抗体遺伝子を構築し、当該分野で公知の種々の方法あるいはＷＯ０２／０８１５２２またはＷＯ０３／０２７１５１に記載される方法等を用いて、該ヒト化抗体遺伝子を発現ベクターへ導入、該発現ベクターを培養細胞に導入して該培養細胞を培養し、得られる培養物から抗体を精製することによって、容易に取得することができる。配列番号１に示される重鎖可変領域遺伝子とヒトＩｇγ１重鎖定常領域遺伝子とを連結して得られる、本発明の好ましいヒト化抗体重鎖遺伝子としては、配列番号２５に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子、より好ましくは配列番号２４に示される塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。また、配列番号３に示される軽鎖可変領域遺伝子とヒトＩｇκ軽鎖定常領域遺伝子とを連結して得られる、本発明の好ましいヒト化抗体軽鎖遺伝子としては、配列番号２７に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子、より好ましくは配列番号２６に示される塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。配列番号２４に示される塩基配列を含む重鎖遺伝子と、配列番号２６に示される塩基配列を含む軽鎖遺伝子とによってコードされる本発明のヒト化抗オステオポンチン抗体として、後記実施例で示されるＲ２Ｋ１ｖ１．７が挙げられる。
【００４３】
あるいは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、本発明のヒト化抗オステオポンチン抗体は、上記した配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡとヒト抗体重鎖定常領域遺伝子、および配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡとヒト抗体軽鎖定常領域遺伝子を鋳型として、無細胞転写／翻訳系を用いて合成することもできる。無細胞転写／翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液はPratt J.M.ら、“Transcription and Translation”, Hames B.D.およびHiggins S.J.編、IRL Press, Oxford 179-209（1984）に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはE. coli S30 extract system（Promega社製）やRTS 500 Rapid Translation System（Roche社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate System（Promega社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSTM（TOYOBO社製）等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばJohnston F.B.ら、Nature, 179, 160-161（1957）あるいはErickson A.H.ら、Meth. Enzymol., 96, 38-50（1996）等に記載の方法を用いることができる。
【００４４】
本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含み、活性を保持した、一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体フラグメント（抗体断片）をも包含する。
ｓｃＦｖの作製に用いられ得る、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを連結するためのリンカーとしては、本発明の抗体断片が上述したような特性を有し得る限り特に限定されないが、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。また当業者であれば、本発明に基づいて、当該ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体または抗体断片と他のペプチドやタンパク質との融合抗体を作製することや、修飾剤を結合させた修飾抗体を作製することも可能である。融合に用いられる他のペプチドやタンパク質は、抗体の結合活性を低下させないものである限り特に限定されず、例えば、ヒト血清アルブミン、各種ｔａｇペプチド、人工ヘリックスモチーフペプチド、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、各種毒素、その他多量体化を促進しうるペプチドまたはタンパク質等が挙げられる。修飾に用いられる修飾剤は、抗体の結合活性を低下させないものである限り特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、リポソーム、低分子化合物等が挙げられる。
【００４５】
このようにして得られた本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体または当該抗体に起因する活性を保持する抗体断片、当該抗体または抗体断片をペプチドまたは他のタンパク質と融合させた融合抗体、あるいは当該抗体または抗体断片に修飾剤が結合されてなる修飾抗体は、必要によりさらに精製された後、常法に従って製剤化され、リウマチ性関節炎・若年性関節リウマチや慢性リウマチ等のリウマチ・乾癬性関節炎・乾癬等の治療、癌、臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、変形性関節症・全身性自己免疫疾患・エリテマトーデス・ぶどう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の治療に用いることができる。
【００４６】
本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体は、好ましくは、リウマチ治療剤、自己免疫疾患治療剤、変形性関節症治療剤あるいはリウマチ性関節炎治療剤として、より好ましくは、リウマチ性関節炎治療剤として用いることができる。これらリウマチ治療剤等の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤とすることができ、静脈内投与、皮下投与等により投与することが好ましい（自己免疫疾患治療剤とする場合もこれに準じればよい）。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。
【００４７】
上記製剤化に当たってのヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の添加量は、患者の症状の程度、年齢や使用する製剤の剤型あるいは組換えＯＰＮ阻害抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。
【００４８】
このようにして得られた本発明の治療剤は、有効成分であるヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体がＯＰＮのＲＧＤ配列とＳＶＶＹＧＬＲ配列（配列番号１０）に強く結合し、ＯＰＮのこの部分とインテグリンとの結合を阻害することによって、結果的にリウマチ及びリウマチ性関節炎やそれ以外の自己免疫疾患の症状の増悪を押さえることができる。
【００４９】
そして、本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体は、インテグリン側でなくＯＰＮ側に特異的に結合するものであるため、インテグリンの他の重要な機能を阻害するおそれは少なく、副作用の問題は回避されるものと期待される。
【００５０】
更にまた、本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体は、リウマチ性関節炎の診断剤として利用することができる。先述のように、リウマチ性関節炎患者の関節では、特にトロンビンにより切断されたＯＰＮのＮ末端フラグメントが高濃度で見出されることが判明している。そこで、このヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を用いて検体中のＯＰＮまたはそのＮ末端フラグメントの量を測定すれば、リウマチ性関節炎の診断に役立てることができる。その手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（E. Engvall et al., (1980): Methods in Enzymol., 70, 419-439）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）を利用することができる。
【００５１】
上記手法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点からはＥＬＩＳＡ法が好ましい。より好ましい方法の例としては、例えば本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を担体上に固相化し、本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体とは異なるＯＰＮ上の部位を認識する抗体を標識化することにより、ＯＰＮまたはそのＮ末端フラグメントを検出することができ、これをリウマチ性関節炎の診断薬とすることができる。
【００５２】
上記抗体を標識するにあたり使用される標識物質としては、融合タンパク質／ペプチドを形成するためのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ等のタンパク質／ペプチド、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」という）、アルカリフォスファターゼ（以下「ＡＰ」という）等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、３２Ｐ、１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などの修飾剤が挙げられる。
【００５３】
ＯＰＮアイソフォームの検出方法について、例えば、サンドイッチ法等の当該分野で公知の方法を使用するか、より具体的には、ＷＯ０２／０８１５２２（特許文献２）またはＷＯ０３／０２７１５１（特許文献３）に記載の検出方法と同様の方法を使用することによって実施することができる。
【００５４】
本発明はまた、本発明の抗体又はそのフラグメントをコードする遺伝子、及びそれを含む発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明の抗体又はそのフラグメントをコードする遺伝子を発現し、これらポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等を挙げることができる。
【００５５】
本発明の発現ベクターは、本発明の抗体又はそのフラグメントをコードする遺伝子、及び当該遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。細菌中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーターとしては、宿主がエシェリキア属菌の場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母中で本発明の抗体又はそのフラグメントを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
【００５６】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位をさらに含み得る。一方、宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドンを含み得る。また、この場合、エンハンサー配列、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン）を含んでいてもよい。
【００５７】
本発明はまた、本発明の遺伝子が導入された形質転換体を提供する。このような形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより作製できる。形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）など）が例示される。形質転換は、自体公知の方法により行われ得る。
【００５８】
本発明はまた、本発明の遺伝子を宿主細胞に発現させること、即ち、このような形質転換体を用いることを含む、本発明の抗体又はそのフラグメントの生産方法を提供する。
【００５９】
本発明の抗体又はそのフラグメントの生産において、形質転換体は、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン
等）など）を含んでいてもよい。
【００６０】
形質転換体の培養は自体公知の方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は、適宜選択される。例えば、宿主が動物細胞の場合、培地としては、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．５０１，１９５２）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐ．３９６，１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１９９，ｐ．５１９，１９６７）、１９９培地（ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７３，ｐ．１，１９５０）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐ．８４０４，１９８５）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４３１，１９７２）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４５０５，１９８０）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【００６１】
本発明の抗体又はそのフラグメントは、上述のような形質転換体を培養し、該形質転換体から回収、好ましくは単離、精製することができる。単離、精製方法としては、例えば塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００６２】
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００６３】
以下に実施例を示す。キット等を使用した部分については、特にことわりのない限り添付のプロトコールに従った。
【００６４】
（１．ヒト化２Ｋ１抗体の作製）
本発明においては、国際公開公報ＷＯ２００３／０２７１５１に記載のマウス由来抗ヒトオステオポンチン抗体である２Ｋ１抗体をヒト化した、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体（以下、ヒト化２Ｋ１抗体またはＲ２Ｋ１抗体と記載することがある）を２種類作製した。
各ヒト化２Ｋ１抗体の作製は、概ね上記公報に記載の方法に従って作製したので、以下には概略を記す。
まず、合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、図１及び図２に示した塩基配列を持つ２種類のヒト化抗ＯＰＮ抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡと、図３及び図４に示した塩基配列を持つ２種類のヒト化抗ＯＰＮ抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを作製した。以下の記述において、それらを区別するために、図１、図２に記載のヒト化抗ヒトＯＰＮ抗体ＶＨを、それぞれ、Ｒ２Ｋ１−ＶＨ１．７、Ｒ２Ｋ１−ＶＨ１．８と呼称する。同様に、図３、図４に記載のヒト化抗ヒトＯＰＮ抗体ＶＬを、それぞれ、Ｒ２Ｋ１−ＶＬ１．７、Ｒ２Ｋ１−ＶＬ１．８と呼称する。
次に、上記のヒト化抗ヒトＯＰＮ抗体ＶＨをコードするＤＮＡのそれぞれを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位及びＢａｍＨＩ認識部位を利用して、ヒト免疫グロブリン定常領域γ１鎖の遺伝子を含む発現ベクターであるＡＧ−γ１に挿入することにより、Ｒ２Ｋ１−ＶＨ１．７を持つ重鎖の発現プラスミドと、Ｒ２Ｋ１−ＶＨ１．８を持つ重鎖の発現プラスミドを作製した。同様にして、上記のヒト化抗ヒトＯＰＮ抗体ＶＬをコードするＤＮＡのそれぞれを、ヒト免疫グロブリン定常領域κ鎖の遺伝子を含む発現ベクターであるＡＧ−κに挿入することにより、Ｒ２Ｋ１−ＶＬ１．８を持つ軽鎖の発現プラスミドと、Ｒ２Ｋ１−ＶＬ１．７を持つ軽鎖の発現プラスミドを作製した。これらの発現プラスミドは大腸菌に導入して増殖させ、市販のプラスミド精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社）により精製した。
最後に、上記の精製発現プラスミドを組み合わせてリン酸カルシウム法によりＣＨＯ−ＤＧ４４細胞にトランスフェクションし、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と透析済みＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中でセレクションすることにより、２種類のヒト化２Ｋ１抗体の発現細胞を得た。すなわち、Ｒ２Ｋ１−ＶＨ１．８を持つ重鎖とＲ２Ｋ１−ＶＬ１．８を持つ軽鎖から成るヒト化２Ｋ１抗体であるＲ２Ｋ１ｖ１．８抗体、Ｒ２Ｋ１−ＶＨ１．７を持つ重鎖とＲ２Ｋ１−ＶＬ１．７を持つ軽鎖から成るヒト化２Ｋ１抗体であるＲ２Ｋ１ｖ１．７抗体を発現させた。
上記の手順で得た各Ｒ２Ｋ１抗体の産生細胞を、１０％透析済みＦＣＳを添加したＭＥＭ培地中で十分に増殖させ、ローラーボトル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に播種し、３７℃、１ｒｐｍの回転速度の条件で培養した。数日後、細胞が器壁に付着して増殖しているのを確認し、培養液を破棄して、血清を含まないＭＥＭ培地５００ｍＬに交換して上記条件で培養を行った。約２週間後、器壁から剥離して浮遊している細胞が多くなってきた時点で培養を終了し、培養上清を０．２２μｍのフィルターで濾過して回収することにより、各Ｒ２Ｋ１抗体を含む培養上清を得た。
これらの培養上清を材料として、プロテインＡカラム（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）及び陽イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いることにより、２種類の精製ヒト化抗体、すなわちＲ２Ｋ１ｖ１．８抗体及びＲ２Ｋ１ｖ１．７抗体を各数ｍｇずつ得た。
以下に記す各種の実験には上記のようにして得た精製抗体を使用した。また、キメラ２Ｋ１抗体（以下Ｃ２Ｋ１抗体と記載することがある）は前述の国際公開公報ＷＯ２００３／０２７１５１に記載の方法で得たものを使用した。
【００６５】
（２．ＥＬＩＳＡによるヒトオステオポンチンペプチドとの結合性確認）
各Ｒ２Ｋ１抗体とＣ２Ｋ１抗体の、ヒトオステオポンチンペプチド（ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ：配列番号１３）に対する結合活性を、今らのＥＬＩＳＡ法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８８：４２０−４３２（２００２））を参考にして比較した。以下に概略を述べる。
上記の配列を持つペプチド（以下ｈＯＰＮ５ペプチドと記載することがある）を、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ（同仁化学社）でマレイミド基を導入したＢＳＡと反応させて、ｈＯＰＮ５−ＢＳＡコンジュゲートを作製した。ｈＯＰＮ５−ＢＳＡコンジュゲートを２００ｎｇ／１００μＬ／ｗｅｌｌで、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社）に４℃で一夜固定化し、洗浄後、１％ＢＳＡ添加ＰＢＳで4℃一夜ブロッキングした。１％ＢＳＡ添加ＰＢＳで希釈した抗体サンプルを、上記プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して３７℃で１時間反応させた。検出は、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（和光純薬株式会社）を用いて行った。波長４５０ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて測定した。
その結果、Ｒ２Ｋ１ｖ１．７抗体及びＲ２Ｋ１ｖ１．８抗体のｈＯＰＮ５ペプチドに対する結合性は、Ｃ２Ｋ１抗体と同等であることが確認された（図５）。
【００６６】
（３．Ｒ２Ｋ１抗体のヒト末梢血単核球遊走に対する阻害活性）
精製抗体のサイトカイン活性化末梢血単核球遊走に対する阻害活性を次のようにして調べた。
まず、健常人よりヘパリン採血した血液をＲＰＭＩ１６４０培地にて２倍希釈した。希釈した血液をフィコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ；ファルマシア社）に重層し、４００×ｇで室温にて３０分間遠心した。血漿とフィコール−パックの境界に見える白い層を回収し、単核球として用いた。このようにして得られた単核球をヒトＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）で一晩培養し、活性化したものを遊走実験に用いた。
遊走実験は４８−ウェル マイクロ ケモタキシス チャンバー（ｍｉｃｒｏ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ｃｈａｍｂｅｒ；ニューロ プローブ インク社）を用いて行った。ヒトＯＰＮをウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃、２時間反応させて切断した。Ｒ２Ｋ１抗体とＣ２Ｋ１抗体を種々の濃度で添加したものを予め３７℃で１５分間放置してから、下側チャンバーに加えた（ヒトＯＰＮ最終濃度は１０μｇ／ｍＬ）。その上からポリカーボネートフィルター（ポアサイズ  ５μｍ）を載せて、さらに上側チャンバーに５０μＬの細胞懸濁液（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を加えた。
３７℃、５％ＣＯ２存在下で２時間培養してから、ポリカーボネートフィルターを取り外して、上側フィルター表面の細胞を除去してから細胞をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（Ｂａｘｔｅｒ社）にて染色した。上側フィルター表面の細胞数を４０倍の倍率下で計測し、結果は６ウェルの平均細胞数（ｃｅｌｌｓ／ｍｍ３）±ＳＥＭとして示した（表１）。これらの結果より、Ｒ２Ｋ１ｖ１．７抗体及びＲ２Ｋ１ｖ１．８抗体の両方が、Ｃ２Ｋ１抗体と同様にＴＮＦ−αで活性化したヒト末梢血単核球のトロンビン切断型ヒトオステオポンチンに対する遊走を阻害したことが示された。
【００６７】
【表１】
2008005836.tif 000002
【００６８】
（４．ＥＬＩＳＡによる熱安定性の評価）
Ｃ２Ｋ１抗体及び２種類のＲ２Ｋ１抗体をＰＢＳで５０μｇ／ｍＬに希釈し、７０℃の水浴で２時間処理した。その後室温に戻し、前述のＥＬＩＳＡを行って得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した。残存活性は、直線性を有する０．２から２．０までの範囲にある吸光度の値を用いて算出した（以下同様）。その結果、上記処理後の残存活性は、Ｃ２Ｋ１抗体よりもＲ２Ｋ１ｖ１．７抗体及びＲ２Ｋ１ｖ１．８抗体の方が高いことが判った（図６）。特に、Ｒ２Ｋ１ｖ１．７抗体は９０％を超える残存活性を示した。このことから、Ｒ２Ｋ１ｖ１．７抗体及びＲ２Ｋ１ｖ１．８抗体については、Ｃ２Ｋ１抗体と比べて熱安定性が向上していることが判った。
【００６９】
（５．ＥＬＩＳＡによる低ｐＨ耐性の評価）
Ｃ２Ｋ１抗体及び２種類のＲ２Ｋ１抗体の精製品をＰＢＳで５０μｇ／ｍＬに希釈した。１Ｎ  ＨＣｌとｐＨメーター（ＨＯＲＩＢＡ社）を用いてｐＨ５に調整し、２５℃で２時間処理した。その後１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）でｐＨ７に調整し、前述のＥＬＩＳＡを行って得られた吸光度の、未処理サンプルの吸光度に対する割合を残存活性としてグラフに示した。その結果、上記処理後の残存活性は、Ｃ２Ｋ１抗体及びＲ２Ｋ１ｖ１．８抗体よりもＲ２Ｋ１ｖ１．７抗体の方が有意に高いことが判った（図７）。このことから、Ｒ２Ｋ１ｖ１．７抗体については、Ｒ２Ｋ１ｖ１．８抗体及びＣ２Ｋ１抗体と比べて低ｐＨに対する耐性が向上していることが判った。
【００７０】
（６．蛍光スペクトル測定による塩酸グアニジン耐性の評価）
Ｃ２Ｋ１抗体及び２種のＲ２Ｋ１抗体を、各濃度の塩酸グアニジンを含む２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー＋１２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７）で５０μｇ／ｍＬになるように調整し（コントロールは塩酸グアニジン未添加）、１０℃で一夜静置した後、各サンプルの蛍光スペクトルを測定した。蛍光スペクトルの測定はＦＰ−６５００  Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＪＡＳＣＯ社）を用いて行った。光路長３ｍｍのセルを用いて、２８０ｎｍの励起光によりトリプトファンが発する蛍光を波長３２０ｎｍから３７０ｎｍの範囲でスキャンした。塩酸グアニジン濃度とピーク波長の関係を抗体間で比較した。その結果、Ｃ２Ｋ１については塩酸グアニジン濃度が１Ｍを超えた時点から、Ｒ２Ｋ１ｖ１．８については２Ｍを超えた時点から、蛋白の立体構造のゆるみに起因するピーク波長のシフトが観られたのに対して、Ｒ２Ｋ１ｖ１．７については３．８Ｍまではピーク波長はシフトしなかった（図８）。このことから、Ｒ２Ｋ１ｖ１．７抗体については、Ｒ２Ｋ１ｖ１．８抗体及びＣ２Ｋ１抗体と比べて塩酸グアニジンに対する耐性が向上していることが確認された。
【００７１】
（７．ＣＤによる低ｐＨ耐性の評価）
Ｃ２Ｋ１抗体及びＲ２Ｋ１ｖ１．７抗体を２０ｍＭ  クエン酸バッファー＋１２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６）で２ｍｇ／ｍＬに調整した。これらに、０．１Ｎ  ＨＣｌと蒸留水を加えながら抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬの各ｐＨのサンプルを調製し、室温で１時間処理後、ＣＤスペクトルを測定した。
ＣＤ（円二色性）の測定はＪ−８２０  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ（ＪＡＳＣＯ社）を用いて行った。光路長が０．１ｍｍのセルを用いて、波長２０５ｎｍから２６０ｎｍの範囲でＣＤスペクトルを測定した。スペクトルの解析は、ＹａｎｇらのＣＤスペクトルの解析法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１３０，２０８−２６９（１９８６））に基づいたＪＷＳＳＥ−４８０型タンパク質二次構造解析プログラム（ＪＡＳＣＯ社）を用いた。本法で算出されたランダム構造の含有率と処理ｐＨの関係を抗体間で比較した。その結果、Ｃ２Ｋ１抗体についてはｐＨ３からランダム構造の含有率が上昇しているのに対して、Ｒ２Ｋ１ｖ１．７についてはｐＨ２．７まではランダム構造の上昇は観られなかった（図９）。このことにより、Ｒ２Ｋ１ｖ１．７抗体は、Ｃ２Ｋ１抗体と比べて０．３低いｐＨにまで耐性を持っていることが確認された。
【００７２】
（８．示差走査型カロリーメーターによる熱安定性の評価）
Ｃ２Ｋ１抗体及びＲ２Ｋ１ｖ１．７抗体を２０ｍＭ  クエン酸バッファー＋１２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ６．０）バッファーに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、マイクロキャル社の超高感度示差走査型カロリメーター（ＶＰキャピラリーＤＳＣプラットフォーム）により熱安定性を調べた。その結果を図１０に示した。高次構造の変性温度を示す変性中点（Ｔｍ）は、Ｃ２Ｋ１抗体では７６．０℃であるのに対して、Ｒ２Ｋ１ｖ１．７抗体では８２．８℃と約６℃の上昇が確認された。このことからＲ２Ｋ１ｖ１．７抗体の方が熱安定性が顕著に向上していることが確認された。
【００７３】
（９．Ｒ２Ｋ１ｖ１．７によるＯＰＮに対する細胞接着阻害効果）
本願発明のＲ２Ｋ１ｖ１．７と公知のヒト化抗ＯＰＮ抗体（ＷＯ０３／０２７１５１参照、以下、Ｒ２Ｋ１ｖ０と呼ぶ）との薬理効果を比較するために、これら２つの抗体によるヒトＯＰＮに対する細胞接着阻害効果を調べた。
１．細胞の培養、継代
Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１細胞は大日本製薬（株）より購入し、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＣＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン）を用いて継代、培養を行った。
２．試薬調製
接着バッファー（Ｌ−１５  ｍｅｄｉｕｍ、１％  ＢＳＡ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）
ＰＭＡ溶液（接着バッファー中４０ｎｇ／ｍＬ  フォルボール１２−ミリステート  １３−アセテート（ＰＭＡ）［ＳＩＧＭＡ］）
ＣＶ染色液（０．５％クリスタルバイオレット、１％ホルムアミド、２０％メタノール）
ＧＳＴ溶液（ＰＢＳ（−）中５μｇ／ｍＬ  グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）［ＳＩＧＭＡ］）
ヒトＩｇＧ１溶液（ＰＢＳ（−）中４００μｇ／ｍＬ）［ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ］
３．トロンビン切断型ヒトＮ末端オステオポンチン（ＯＰＮ）の調製
ＧＳＴ融合トロンビン切断型ヒトＮ末端ＯＰＮ（ＧＳＴ−ヒトＮ−ＯＰＮ、１．６ｍｇ／ｍＬ）をＷＯ０２／０８１５２２に記載されるように作製し、ＰＢＳ（−）にて５μｇ／ｍＬに希釈して実験に使用した。
４．被験薬物の調製
Ｒ２Ｋ１ｖ１．７（１８．６ｍｇ／ｍＬ）及びＲ２Ｋ１ｖ０（４．３９ｍｇ／ｍＬ）はＰＢＳ（−）にて４、１２、４０、１２０、４００（μｇ／ｍＬ）に希釈し、いずれの溶液ともＴｏｔａｌのタンパク濃度が４００μｇ／ｍＬとなるようヒトＩｇＧ１を添加した。
５．群構成
ブランク群（ＧＳＴ）
コントロール群
被験薬物群  Ｒ２Ｋ１ｖ１．７  （１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍＬ）
Ｒ２Ｋ１ｖ０      （１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍＬ）
６．細胞接着実験
９６ウェルマイクロプレートの、ブランクを除くすべてのウェルにＧＳＴ−ヒトＮ−ＯＰＮ溶液２５μＬを、ブランク群はＧＳＴ溶液２５μＬを添加し、３７℃、１時間インキュベーション後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。ＰＭＡ溶液５０μＬを添加し、３７℃で３０分インキュベーションした後、被験薬物溶液（被験薬物群）またはヒトＩｇＧ１溶液（ブランク群およびコントロール群）２５μＬを添加した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１細胞は、２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう接着バッファーに懸濁し、すべてのウェルに２５μＬを添加した。１５×ｇで１分遠心して細胞をプレートの底に沈殿させた後、３７℃で１時間インキュベーションした。反応終了後、プレートを逆さにして４７×ｇで２分遠心して上清（非接着細胞）を除去した。接着細胞数の定量は、ＣＶ染色液２５μＬを添加し１０分室温で放置して細胞を染色、固定した後、純水で３回洗浄し、すべてのウェルに１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶液２５μＬを添加して細胞が可溶化したのを確認後、マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ２５０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて吸光度（測定波長５９５ｎｍ）を測定した。
７．解析
実験は１群５ウェルを使用した。各群の吸光度の平均値および抑制率を算出し、ＩＣ５０値（抑制率が５０％となる被験薬物濃度）を算出した。抑制率は、ブランク群を１００％、コントロール群を０％とした。ＩＣ５０値は、Ｘ軸に対数で被験薬物濃度を、Ｙ軸に抑制率をプロットし、最小二乗法により直線回帰の式に当てはめて算出した。ＩＣ５０値算出には、用量反応に直線性を示す被験薬物濃度におけるデータを使用した。図１１に示す結果より、公知のヒト化抗ヒトＯＰＮ抗体の細胞接着阻害効果が極めて低いのに対して、Ｒ２Ｋ１ｖ１．７は、優れた細胞接着阻害効果（ＩＣ５０値：６．４）を有するものであることが理解される。
【００７４】
（１０．カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）におけるコラーゲン誘導関節炎に対するＲ２Ｋ１ｖ１．７の効果）
Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバント（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）でエマルジョン化したウシタイプＩＩコラーゲン（コラーゲン技術研修会）を、投薬３６日前に雌性カニクイザルの背部及び尾部に免疫し、投薬１５日前にブーストした。動物を、免疫前と比較した体重及び指骨近位関節楕円面積の変化率に基づき、無作為化して、３つの投薬処置群（ｎ＝１０）に分けた。２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇ用量のＲ２Ｋ１ｖ１．７あるいは溶媒コントロール群を、１週間に１回、計８回、静脈内注入により投与した。最初の投薬日を０日と規定した。投与期間中の０、６、１３、２０、２７、３４、４１、４８及び５５日目に、関節腫張の兆候として、指骨近位関節楕円面積をモニターした。前後肢指骨近位関節をノギスを用いて短軸及び長軸を測定し楕円面積を算出し、１６指の楕円面積の平均値を指骨近位関節楕円面積とした。指骨近位関節楕円面積の変化率を、投薬前の値を１００として算出した。０日目、並びに６、１３、２０、２７、３４、４１、４８及び５５日目（投薬６日後）に、血漿を採取し、Ｒ２Ｋ１ｖ１．７及び抗Ｒ２Ｋ１ｖ１．７抗体を測定した。この測定したＲ２Ｋ１ｖ１．７の血漿中濃度が、トラフレベルに対応する。データ分析は、抗Ｒ２Ｋ１ｖ１．７抗体陽性動物及び試験期間中に死亡した動物のデータを削除して行った。
２５ｍｇ／ｋｇ用量Ｒ２Ｋ１ｖ１．７群の１動物、及び、５０ｍｇ／ｋｇ用量Ｒ２Ｋ１ｖ１．７群の４動物において、抗Ｒ２Ｋ１ｖ１．７抗体が生じた。溶媒コントロール群の２動物、２５ｍｇ／ｋｇ用量Ｒ２Ｋ１ｖ１．７群の２動物、及び、５０ｍｇ／ｋｇ用量Ｒ２Ｋ１ｖ１．７群の１動物が、投薬後に死亡した。死亡例については高度な炎症に起因した衰弱死であると推測された。５０ｍｇ／ｋｇのＲ２Ｋ１ｖ１．７での処置は、コントロール溶媒群と比較して、２７日目〜５５日目の間で、指骨近位関節楕円面積の変化率で測定した足腫張を有意に減少した（図１２）。２５ｍｇ／ｋｇ用量のＲ２Ｋ１ｖ１．７は、指骨近位関節楕円面積の変化に対して有意な効果を示さなかった。２５ｍｇ／ｋｇ用量及び５０ｍｇ／ｋｇ用量での血漿中Ｒ２Ｋ１ｖ１．７トラフ濃度は、それぞれ、３８．４１〜７６．１３μｇ／ｍL及び７３．９１〜１２５．３μｇ／ｍLであった。ヒトＯＰＮのＳＶＶＹＧＬＲ配列は、サルＯＰＮの相当配列（ＳＶＡＹＧＬＲ）（配列番号１１）と異なり、このヒトＯＰＮペプチドに対するＲ２Ｋ１ｖ１．７の結合親和性は、対応するサルＯＰＮペプチドに対する結合親和性よりも１００倍以上高い。これらの点を考慮すると、関節炎治療におけるＲ２Ｋ１ｖ１．７の有効血漿中濃度は、１００μｇ／ｍL以下であると推定される。
【００７５】
（１１．Ｒ２Ｋ１ｖ１．７のｓｃＦｖの作製）
前述のＲ２Ｋ１−ＶＨ１．７を持つ重鎖の発現プラスミドとＲ２Ｋ１−ＶＬ１．７を持つ軽鎖の発現プラスミドを鋳型としたＰＣＲにより、ＶＨ１．７−リンカー−ＶＬ１．７（リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４）で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列である）の構造をした一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）をコードするＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片の末端には、制限酵素ＳｆｉＩとＮｏｔＩの認識配列が付加されている。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩとＮｏｔＩで消化し、同じくＳｆｉＩとＮｏｔＩで消化したｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクター（Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２２２，ｐ５８１−９７，１９９１）のＳｆｉＩ部位とＮｏｔＩ部位に挿入することにより、Ｒ２Ｋ１−ＶＨ１．７のｓｃＦｖの発現プラスミドを作製した。なお、本発現プラスミドにおいてはｓｃＦｖのコード領域の下流にＥ−Ｔａｇをコードする塩基配列が付加されている。このプラスミドを常法にしたがって大腸菌ＨＢ２１５１株に導入し、ＳＯＢＡＧ寒天プレート（２％グルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有ＳＯＢプレート）に播いて形質転換クローンを得た。得られたクローンについてプラスミドＤＮＡを抽出し、それを鋳型としたＤＮＡ塩基配列解析によりｓｃＦｖのコード領域の配列を確認した。ＤＮＡ塩基配列解析にはＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔ及びＣＥＱ２０００ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ともにベックマンコールター社）を使用した。得られた塩基配列を配列番号９に示した。
塩基配列を確認した大腸菌クローンを２％グルコース及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２ｘＹＴ培地で培養後、その一部を１ｍＭのＩＰＴＧ及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えた２ｘＹＴ培地に懸濁し、さらに一夜培養してｓｃＦｖの発現誘導を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により回収し、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳに懸濁して氷中に３０分放置した。次いで１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を回収して０．４５μｍのフィルターで濾過することにより、ｓｃＦｖを含むペリプラズム画分を得た。このペリプラズム画分から、抗Ｅ−Ｔａｇ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりＲ２ｋ１ｖ１．７のｓｃＦｖ（以下Ｒ２Ｋ１ｖ１．７−ｓｃＦｖと記載する）を精製した。
このようにして調製したＲ２Ｋ１ｖ１．７−ｓｃＦｖについて、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った結果、図１３に示した分離パターンから、ほぼ全てがモノマーであることが確認された。
【００７６】
（１２．Ｒ２Ｋ１ｖ１．７−ｓｃＦｖのヒトオステオポンチンペプチドとの結合性確認）
精製したＲ２Ｋ１ｖ１．７−ｓｃＦｖのｈＯＰＮ５ペプチドに対する結合活性をＥＬＩＳＡ法で測定した。方法は概ね前述のとおりであるが、本測定においては標識抗体として、ＨＲＰ標識抗Ｅ−Ｔａｇ抗体を使用した。その結果を図１４に示した。陰性対照のＢＳＡに対しては結合せず、ｈＯＰＮ５ペプチドに対して特異的に結合することが確認された。
【００７７】
（１３．ポリエチレングリコール修飾抗体フラグメントの作製）
Ｒ２Ｋ１ｖ１．７抗体を定法によりペプシン処理した後、ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰカラム（ともにアマシャムバイオサイエンス社）及びＨｉ  ｐｒｅｐ  １６／６０  ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎカラム（アマシャムバイオサイエンス社）を用いることにより精製Ｆ（ａｂ’）２を得た。続いて、精製Ｆ（ａｂ’）２を０．１ＭのＤＴＴで還元処理してチオール基を活性化した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（アマシャムバイオサイエンス社）を用いたゲル濾過を行うことによりＤＴＴを除去した。こうして得られたＦａｂ’をマレイミド化ポリエチレングリコールＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−１２０ＭＡ（日本油脂）とモル比１：１０で混合して４℃で一晩静置することによりカップリング反応させた。ヨードアセトアミド(ナカライ)を添加して、カップリング反応を停止後、Ｈｉ  ｐｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎカラムを用いたゲル濾過により、ポリエチレングリコール修飾Ｆ（ａｂ’）２（以下Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧと記載することがある）を得た。そのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１５に示した。比較対照として泳動した未修飾のＦ（ａｂ’）２との比較により、ポリエチレングリコール修飾による分子量の増加が確認できた。
【００７８】
（１４．Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧのオステオポンチンペプチドとの結合活性確認）
精製Ｒ２Ｋ１ｖ１．７のＦ（ａｂ’）２−ＰＥＧのｈＯＰＮ５ペプチドに対する結合活性を表面プラズモン共鳴測定法を用いて確認した。ビオチン化ｈＯＰＮ５ペプチドをＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡ（ＢＩＡｃｏｒｅ社）に固定化し、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＢＩＡｃｏｒｅ社）で５μｇ／ｍＬに希釈したＦ（ａｂ’）２−ＰＥＧを用いて結合活性を確認した結果を図１６に示した。シグナルの上昇から本Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧのｈＯＰＮ５ペプチドに対するＲ２Ｋ１ｖ１．７と同様の結合活性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体は、活性（抗原結合活性、白血球遊走阻害活性等）および／または安定性（熱、低酸性条件、変性剤に対する耐性等）に優れているので、自己免疫疾患、リウマチ、リウマチ性関節炎、変形性関節症を始めとする、種々の炎症性疾患の予防または治療において、従来の抗ヒトオステオポンチン抗体よりもさらに有効な薬剤として有用である。
【００８０】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、日本国で出願された特願２００６−１５２８９２を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ベクターに組み込んだＲ２Ｋ１−ＶＨ１．７コード領域を含むＤＮＡの塩基配列（上段：配列番号１５）とアミノ酸配列（下段：配列番号１６）を示す図である（下線部は分泌発現のためのリーダー配列）。
【図２】ベクターに組み込んだＲ２Ｋ１−ＶＨ１．８コード領域を含むＤＮＡの塩基配列（上段：配列番号１７）とアミノ酸配列（下段：配列番号１８）を示す図である（下線部は分泌発現のためのリーダー配列）。
【図３】ベクターに組み込んだＲ２Ｋ１−ＶＬ１．７コード領域を含むＤＮＡの塩基配列（上段：配列番号１９）とアミノ酸配列（下段：配列番号２０）を示す図である（下線部は分泌発現のためのリーダー配列）。
【図４】ベクターに組み込んだＲ２Ｋ１−ＶＬ１．８コード領域を含むＤＮＡの塩基配列（上段：配列番号２１）とアミノ酸配列（下段：配列番号２２）を示す図である（下線部は分泌発現のためのリーダー配列）。
【図５】キメラ２Ｋ１抗体及びヒト化２Ｋ１抗体のｈＯＰＮ５ペプチドに対する結合性をＥＬＩＳＡ法で調べた結果を示す図である。
【図６】７０℃で加熱処理したキメラ２Ｋ１抗体及びヒト化２Ｋ１抗体のｈＯＰＮ５ペプチドに対する結合性をＥＬＩＳＡ法で調べた結果を示す図である。加熱処理しない場合の結合性を１００％とした場合の比率を示している。
【図７】ｐＨ５のバッファーで処理したキメラ２Ｋ１抗体及びヒト化２Ｋ１抗体のｈＯＰＮ５ペプチドに対する結合性をＥＬＩＳＡ法で調べた結果を示す図である。ｐＨ５のバッファーで処理しない場合の結合性を１００％とした場合の比率を示している。
【図８】各濃度の塩酸グアニジン含有バッファーで処理したキメラ２Ｋ１抗体及びヒト化２Ｋ１抗体の蛍光スペクトルにおけるピーク波長をプロットした結果を示す図である。
【図９】各ｐＨのバッファーで処理したキメラ２Ｋ１抗体及びヒト化２Ｋ１抗体におけるランダム構造の含量をＣＤで測定した結果を示す図である。
【図１０】キメラ２Ｋ１抗体及びヒト化２Ｋ１抗体の熱安定性を超高感度示差走査型カロリメーターで調べた結果を示す図である。破線矢印と実線矢印はそれぞれ、キメラ２Ｋ１抗体とＲ２Ｋ１ｖ１．７抗体のＴｍを示す。
【図１１】Ｒ２Ｋ１ｖ１．７とＲ２Ｋ１ｖ０によるヒトＯＰＮに対する細胞接着阻害効果を示す図である。
【図１２】サルコラーゲン誘導関節炎における関節腫張に対するＲ２Ｋ１ｖ１．７の効果を示す図である。データは、コントロール群、２５ｍｇ／ｋｇ群及び５０ｍｇ／ｋｇ群当たり、それぞれ、８動物、７動物及び５動物の平均±ＳＥを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１：Ｄｕｎｎｅｔ型多重比較検定によってコントロール群とは有意に異なる。
【図１３】精製Ｒ２Ｋ１ｖ１．７−ｓｃＦｖのＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図１４】精製Ｒ２Ｋ１ｖ１．７−ｓｃＦｖのｈＯＰＮ５ペプチドに対する結合性をＥＬＩＳＡ法で調べた結果を示す図である。
【図１５】完全分子型Ｒ２Ｋ１ｖ１．７抗体、Ｒ２Ｋ１ｖ１．７抗体のＦ（ａｂ’）２及び精製Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である。
【図１６】Ｒ２Ｋ１ｖ１．７のＦ（ａｂ’）２−ＰＥＧのｈＯＰＮ５ペプチドに対する結合性をＢＩＡｃｏｒｅで調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月23日(2007.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号３に示され
るアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体。
【請求項２】
前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１である、請求項１に記載のヒト化抗ヒトオステ
オポンチン抗体。
【請求項３】
前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκである、請求項１に記載のヒト化抗ヒトオステオ
ポンチン抗体。
【請求項４】
前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１であり、前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκ
である、請求項１に記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体。
【請求項５】
配列番号２５に示されるアミノ酸配列である重鎖、及び、配列番号２７に示されるアミ
ノ酸配列である軽鎖を含む、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体。
【請求項６】
請求項１に記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の重鎖可変領域をコードする配列
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１に記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の軽鎖可変領域をコードする配列
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６および／または７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の宿主細胞を培養し、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を発現させる
工程を包含する、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を生産する方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を含む、自己免疫
疾患、リウマチ、リウマチ性関節炎または変形性関節症の治療薬。
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月22日(2007.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載のヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体を含む、リウマチ性関節炎の治療薬。