(57)【要約】      （修正有）【課題】塩耐性形質転換植物体を製造する方法および該製造方法によって得られる形質転換植物体を提供する。【解決手段】（１）遺伝子構築物中の植物用の強力プロモーターに、特定の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを作動的に連結し、遺伝子構築物を得ること、（２）（１）で得られた遺伝子構築物を用いて、植物細胞を形質転換し、塩耐性形質転換植物細胞を得ること、および（３）（２）で得られた塩耐性形質転換植物細胞を培養すること、を含む、塩耐性形質転換植物体の製造方法。植物用の強力プロモーターは、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターまたはノパリン合成酵素遺伝子プロモーターである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）遺伝子構築物中の植物用の強力プロモーターに、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを作動的に連結し、遺伝子構築物を得ること、
（２）（１）で得られた遺伝子構築物を用いて、植物細胞を形質転換し、塩耐性形質転換植物細胞を得ること、および
（３）（２）で得られた塩耐性形質転換植物細胞を培養すること、
を含む、塩耐性形質転換植物体の製造方法。
【請求項２】
植物用の強力プロモーターが、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターまたはノパリン合成酵素遺伝子プロモーターである、請求項１に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項３】
遺伝子構築物が、アグロバクテリウム用バイナリープラスミドである、請求項１に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法によって得られた遺伝子構築物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法によって得られた塩耐性形質転換植物細胞。
【請求項６】
カルスの形態である、請求項５に記載の塩耐性形質転換植物細胞。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法によって得られた塩耐性形質転換植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩耐性形質転換植物体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、塩を高濃度で含む土壌では生育できないため、多くの農作物が塩害の被害を受けており、世界規模で食糧不足を招いている。
【０００３】
これまで、植物に塩耐性を付与させることの出来る遺伝子としていくつかの遺伝子が報告されていた（非特許文献１）。しかし、本発明のシロイヌナズナ由来の配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ（ＴＡＩＲにAt4g39800として登録されている遺伝子、http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/www_bget?ath+At4g39800）について、塩耐性との関連は知られていなかった。
【０００４】
【非特許文献１】Munns R. 2005. Genes and salt tolerance: bringing them together. New Phytologist. 167: 645-663.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、塩耐性形質転換植物体を製造する方法および該製造方法によって得られる形質転換植物体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、シロイヌナズナに、ＣａＭＶ３５Ｓ（カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ）プロモーターのエンハンサーを用いたアクティベーションタギング法（後藤新悟等、蛋白質核酸酵素  Vol.50 No.14、p. 1921-1922 (2005)）を施し、得られた塩耐性植物培養細胞を解析することで、本発明に用いる、配列番号１のＤＮＡ配列が、植物に塩耐性を付与することができる原因遺伝子であることをはじめて見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、下記：
１．（１）遺伝子構築物中の植物用の強力プロモーターに、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを作動的に連結し、遺伝子構築物を得ること、
（２）（１）で得られた遺伝子構築物を用いて、植物細胞を形質転換し、塩耐性形質転換植物細胞を得ること、および
（３）（２）で得られた塩耐性形質転換植物細胞を培養すること、
を含む、塩耐性形質転換植物体の製造方法、
２．植物用の強力プロモーターが、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターまたはノパリン合成酵素遺伝子プロモーターである、上記１に記載の形質転換植物体の製造方法、
３．遺伝子構築物が、アグロバクテリウム用バイナリープラスミドである、上記１に記載の形質転換植物体の製造方法、
４．上記１〜３のいずれか１に記載の製造方法によって得られた遺伝子構築物。
５．上記１〜３のいずれか１に記載の製造方法によって得られた塩耐性形質転換植物細胞、
６．カルスの形態である、上記５に記載の塩耐性形質転換植物細胞、
７．上記１〜３のいずれか１に記載の製造方法によって得られた塩耐性形質転換植物体、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法により、従来、塩に感受性を示す植物に、塩耐性を付与することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で用いる「植物細胞」とは、培地で培養されている脱分化した状態の植物細胞およびその塊を意味する。ここで脱分化とは、植物体中の葉、茎、根、胚などに一旦特定された細胞がその性質を失い、再び葉、茎、根、胚、さらには植物体へと成長する能力をあらたに獲得することを意味する。
【００１０】
本発明で用いる植物細胞は、植物体中の全ての細胞から誘導して得ることができるが、好ましくは、葉、茎、根、胚、より好ましくは、葉、茎、根、さらに好ましくは根から誘導して得たものである。カルス細胞は、植物体、例えば、葉、茎、根、胚を細かく切り刻んだ後、これら細断片を脱分化誘導培地で培養することにより植物細胞を増殖させることが出来る。植物細胞を分化誘導することで、植物体を再生させることができる。
【００１１】
本発明で用いる、植物細胞誘導培地とは、植物組織を植物細胞に誘導するための培地で、植物細胞培養培地、例えばＭＳ培地、Ｇａｍｂｏｒｇ  Ｂ５培地に、植物ホルモン、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、カイネチン、ナフタレン酢酸、インドール酢酸、インドール酪酸、イソペンテニルアデニン、ベンジルアミノプリンなどの少なくとも１つを添加した、上記植物細胞培養培地を意味する。なお、植物細胞誘導培地が、使用される植物により任意に選択されることは当業者にとっては周知である。本発明で用いる、好ましい植物細胞誘導培地は、実施例に記載のカルス細胞誘導培地（ＣＩＭ）である。
【００１２】
ここで、植物は、上記のような方法により培養細胞を形成できる全ての植物を意味し、好ましくは、ダイオウ（Rheum palmatum、R.tangusticum、R.officinale、R.coreanumまたはそれらの種間雑種）、マルバアサガオ（Ipomoea purpurea）、ラズベリー（Rubus idaeus）、ホップ（Humulus lupulus）、ニンジン（Daucus carota）、ムラサキイモ（Ipomoea batatas）、茶（Camellia sinensis）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、より好ましくは、ニンジン、ムラサキイモ、茶、シロイヌナズナ、更に好ましくは、茶、シロイヌナズナである。
【００１３】
本発明で用いる、「遺伝子」とは、特に記載がない限り、デオキシリボヌクレオチドの２本鎖ポリマー、すなわちＤＮＡ鎖を意味する。また、本発明で用いる「ＤＮＡ」も、特に記載がない限り、ＤＮＡ鎖を意味する。「ＲＮＡ」および「ＲＮＡ鎖」は、特に記載がない限り、リボヌクレオチドの１本鎖ポリマーを意味する。本発明で用いる、「ＤＮＡ配列」とは、５’末端側から３’末端側へと読まれるＤＮＡ鎖のデオキシリボヌクレオチド配列を意味し、場合により、用語「遺伝子」と相互互換的に用いることが出来る。また、本発明で用いる、「ゲノム」とは、プラスミドを除く、生物が持っているＤＮＡ全体を意味する。
【００１４】
本発明で用いる、「配列番号１のＤＮＡ配列」とは、The Arabidopsis Information Resource（ＴＡＩＲ）にAt4g39800として登録されている、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana)に由来する、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡを意味する。
【００１５】
本発明で用いる、「配列番号１のＤＮＡ配列を含む遺伝子」とは、配列番号１のＤＮＡ配列が、その５’末端の上流と３’末端の下流に、任意に伸びたＤＮＡ配列（いわゆる、５’および３’フランキング領域）を有し、ＤＮＡ組換え技術に用いることができるようにその５’および３’フランキング領域に制限酵素部位が含まれていることを意味する。
【００１６】
また、「それら等価物の１つを含む遺伝子」という意味も上記の同様で、以下に記載する配列番号１のＤＮＡ配列の等価物が、制限酵素部位を含む５’および３’フランキング領域を有することを意味する。
【００１７】
かかるＤＮＡ配列は、例えば、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡと適当なプライマーを用いてＰＣＲ（Polymerase chain reaction）により得ることが出来る。ＰＣＲとは、鋳型となるＤＮＡと適当なプライマーを用いる遺伝子増幅方法であり、当業者には周知である。ＰＣＲは当業者に周知の標準的な条件で実施できる。ＰＣＲに必要な試薬、器具類はすべて市場より入手できる。
【００１８】
配列番号１のＤＮＡ配列とは同一ではないが、配列番号１のＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列が、シロイヌナズナと異なる植物においても存在することは当業者にとっては周知なことである。よって、配列番号１のＤＮＡ配列と異なっていても、１のＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列は、本発明で用いる、「それら等価物」に含まれる。
【００１９】
ここで、配列番号１のＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列とは、６０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、もっとも好ましくは９８％以上、のＤＮＡ配列の同一性を有するＤＮＡ配列であって、配列番号１のＤＮＡ配列と同様な機能を有するＤＮＡ配列を意味する。ここで、ＤＮＡ配列の同一性とは、２つのＤＮＡ配列間におけるデオキシヌクレオチドの一致率を意味する。ＤＮＡ配列の同一性は、当業者に周知である公開のソフトウェアであるＣＬＡＳＴＬ  Ｗ（http://align.genome.jp/）を用いて行なうことが出来る。また、同様な機能とは、塩感受性植物細胞を、塩耐性植物細胞に形質転換させることができる機能を意味する。
【００２０】
また、配列番号１のＤＮＡ配列に１つ以上のデオキシヌクレオチドの欠失および／または置換および／または付加があっても、その機能が失われないことは当業者にとって周知である。よって、配列番号１のＤＮＡ配列から少なくとも１つのデオキシヌクレオチドの欠失および／または置換および／または挿入によって誘導された誘導体（または変異体）であって、配列番号１のＤＮＡ配列と同様な機能を有するＤＮＡ配列は、本発明で用いる「それら等価物」に含まれる。
【００２１】
また、上記の配列番号１のＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列における同様な誘導体（または変異体）も本発明で用いる「それら等価物」に含まれる。
【００２２】
本発明に用いる「遺伝子構築物」とは、特定の意味を有する遺伝子の２つ以上を人為的に連結することにより構築した遺伝子産物を意味する。ここで、特定の意味を有する遺伝子とは、例えば、特定のアミノ酸配列をコードしている遺伝子、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、複製起点、Ｔ−ＤＮＡなどを意味する。なお、これら特定の意味を有する遺伝子は、それらの５’末端の上流と３’末端の下流に、遺伝子構築物を構築するための、制限酵素部位を含む３’および５’フランキング領域を有していてもよい。
【００２３】
本発明に用いる「遺伝子構築物」は、植物用の強力プロモーターのほかに、転写終結のための植物用のターミネーターを含む。さらにアグロバクテリウム法による植物の染色体への組み込みを希望する場合には、Ｔ−ＤＮＡを含む。また、さらに大腸菌とアグロバクテリウムにおけるＤＮＡ組換え操作のため、大腸菌とアグロバクテリウム用複製起点、プロモーター、リボソーム結合部位、抗生物質耐性遺伝子、ターミネーターを有してもよい。また、形質転換カルス細胞の選別を容易にするために植物用抗生物質耐性遺伝子やそのための植物用の強力プロモーター、植物用のターミネーター、さらに、転写活性の測定を容易にするレポーター遺伝子や転写活性を増強させるエンハンサー（例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのエンハンサー）などを有していても良い。
【００２４】
本発明に用いる「遺伝子構築物」の好ましい形態は、配列番号１のＤＮＡ配列またはそれら等価物を除く先に記載の構築物成分をあらかじめ適切な配置で保有しているベクター（すなわち、ＤＮＡ組換え技術に用いる遺伝子を運ぶための遺伝子）である。ベクターには、プラスミド、プラスミド由来のベクター（例えば、ファージミドやコスミド）、またはウイルスもしくはファージ由来のベクターなどがある。より好ましくは、プラスミドまたはプラスミド由来のベクター、さらに好ましいのは、アグロバクテリウム用バイナリープラスミドである。
【００２５】
ここで、プラスミドとは、ＤＮＡ組換え技術における、ベクターのうち環状ＤＮＡであって、宿主の細胞内において自己増幅できるものを意味する。よって、本発明に用いるプラスミドは、宿主の細胞内における自己増幅機能を備えたものを意味する。ここで、宿主とは、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）を意味する。プラスミドまたプラスミド由来のベクターは、種々のプラスミドを市場より入手可能である。例えば、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８，ｐＢＳ，ｐＧＥＭなどが挙げられる。好ましいのはｐＵＣ１８，ｐＢＳである。また、プラスミド由来のベクターには、ｐＴＨ２，Ｐ１，ＢＡＣなどが挙げられる。好ましいのはｐＴＨ２である。さらに、市場より入手可能なプラスミドまたはプラスミド由来のベクターを、本発明に適したプラスミドまたはプラスミド由来のベクターに自分で改良してもよい。
【００２６】
アグロバクテリウム用バイナリープラスミドとは、大腸菌（Escherichia coli）とアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）の両方を宿主とし、それら両細胞において自己増幅が可能であり、さらにアグロバクテリウムを介する植物の形質転換法に用いられるプラスミドを意味する。
【００２７】
ここで、アグロバクテリウムを介する植物の形質転換法とは、アグロバクテリウムを植物に感染させた時、アグロバクテリウムが自己の遺伝子の一部（Ｔ−ＤＮＡと呼ばれるＤＮＡ配列）を切り離し、Ｔ−ＤＮＡ内、すなわちＴ−ＤＮＡのライトボーダーとレフトボーダーの間に存在する遺伝子をＴ−ＤＮＡとともに植物の染色体中に組み込み、組み込んだ当該遺伝子を染色体から転写および翻訳させることで植物の形質を変化させる方法を意味する。
【００２８】
よって、本発明に用いるアグロバクテリウム用バイナリープラスミドとは、大腸菌（Escherichia coli）とアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）における自己増幅機能と、Ｔ−ＤＮＡを有し植物の形質を変化させる機能を備えたプラスミドを意味する。
【００２９】
アグロバクテリウム用バイナリープラスミドとして、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１などが市販されている。また、市場より入手可能なアグロバクテリウム用バイナリープラスミドを、本発明に適したアグロバクテリウム用バイナリープラスミドに自分で改良してもよい。
【００３０】
本発明で用いる、配列番号１のＤＮＡ配列は、シロイヌナズナの染色体にもともと存在する遺伝子であるが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのエンハンサーによるアクティベーションタギング法により塩耐性形質転換植物細胞の原因遺伝子として見出された。このことから、配列番号１のＤＮＡ配列は、植物培養細胞では、通常は、塩耐性を付与できるほど転写されていない。よって、本発明で用いる、「植物用の強力プロモーター」とは、配列番号１のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子を、植物培養細胞中で転写させることにより、その植物培養細胞を塩耐性へと形質転換させるのに十分な転写活性を有する植物用のプロモーターを意味する。
【００３１】
ここで、「転写」とは、ＤＮＡ鎖がその配列に相補的なＲＮＡ鎖に合成されることを意味する。そして、「プロモーター」とは、特定のアミノ酸配列をコードしている遺伝子の転写開始位置の上流に位置し、その遺伝子の転写を制御する特定のＤＮＡ配列を意味する。なお、ここで、上流または下流とは、遺伝子またはＤＮＡ配列における５’→３’方向において、５’側を上流、３’側を下流と呼ぶ。
【００３２】
したがって、本発明で用いる、「植物用の強力プロモーターに、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを含む遺伝子を作動的に連結する」とは、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを含む遺伝子が、植物用の強力プロモーターによって転写され、そして翻訳されるように、植物用の強力プロモーターおよび植物用のターミネーターと隣接して結合することを意味する。
【００３３】
本発明でも用いる「植物用の強力プロモーター」は、植物培養細胞を本発明の塩耐性形質転換培養細胞へと形質転換させるのに十分な転写活性を有する植物用のプロモーターであれば限定されないが、例えば、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター、またはノパリン合成酵素遺伝子プロモーターが挙げられる。よって、本発明でも用いる「植物用の強力プロモーター」には、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターまたはノパリン合成酵素遺伝子プロモーターの転写活性と同等以上の転写活性を有する植物用プロモーターも含まれる。
【００３４】
さらに、通常においては転写活性の弱いプロモーター（例えば、本発明の配列番号１の遺伝子、またはそれら等価物を本来制御しているプロモーター）が、エンハンサーと組み合わさることによって、植物培養細胞を本発明の塩耐性形質転換培養細胞へと形質転換するのに十分な転写活性、または、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターもしくはノパリン合成酵素遺伝子プロモーターと同等以上の転写活性を有するようになった場合、その転写活性の弱いプロモーターとエンハンサーの組合せは、本発明でも用いる「植物用の強力プロモーター」に含まれる。
【００３５】
本発明でも用いる「ターミネーター」とは、転写される遺伝子の下流に位置し、その遺伝子の転写を終結させる特定のＤＮＡ配列を意味する。
【００３６】
本発明に用いる「植物用のターミネーター」は、植物において遺伝子の転写を終結させる働きをする植物用のターミネーターであれば限定されないが、好ましくは、植物、植物ウイルス、またはアグロバクテリウムのＴｉプラスミドやＲｉプラスミドにコードされている遺伝子に由来するターミネーターである。ここで、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミドとは、アグロバクテリウムがもともと保有している巨大なプラスミド（２０万塩基対前後）で、このなかにはＴ−ＤＮＡ配列が含まれており、ノパリン合成酵素遺伝子などの遺伝子もコードされている。植物用のターミネーターには、例えば、市場より入手可能なノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター、カリフラワーモザイクウィルスの遺伝子に由来するターミネーターなどが挙げられるが、これらには限定されない。好ましいものは、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターである。これらの植物用のターミネーターは、プラスミドなどに含有される形で市場より入手しても、公知の配列に基づいて自分でＰＣＲを用いて入手してもよい。
【００３７】
本発明に用いる「Ｔ−ＤＮＡ」とは、アグロバクテリウムが遺伝子を植物の染色体中に組み込む時に使用する特定のＤＮＡ配列を意味する。このＴ−ＤＮＡを利用すると、植物の染色体中への遺伝子の組み込み効率がよくなる。このＴ−ＤＮＡを利用して、遺伝子を植物の染色体中に組み込ませるためには、その遺伝子が、Ｔ−ＤＮＡ内、すなわちＴ−ＤＮＡのライトボーダーとレフトボーダーの間に存在する必要がある。
【００３８】
したがって、Ｔ−ＤＮＡを利用して、植物の染色体中に植物用の強力プロモーター、配列番号１のＤＮＡ配列またはその等価物の１つを含む遺伝子、植物用のターミネーターなどを組み込む時には、これら遺伝子が、Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーとレフトボーダーの間に存在する必要がある。なお、Ｔ−ＤＮＡは、プラスミドなどに含有される形で市場より入手しても、公知の配列に基づいて自分でＰＣＲを用いて入手してもよい。
【００３９】
また、形質転換植物細胞を、選別しやすくするために、植物用抗生物質耐性遺伝子を遺伝子構築物に含んでもよい。この場合、植物用抗生物質耐性遺伝子を機能させるために、植物用の強力プロモーターや植物用のターミネーターを有する必要がある。植物用抗生物質耐性遺伝子は、植物細胞に抗生物質耐性を付与できるものであれば限定されない。また、植物用抗生物質耐性遺伝子のための植物用の強力プロモーターや植物用のターミネーターは、配列番号１のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つの転写とその終結のために用いられるものと同じであっても異なっていても良い。
【００４０】
本発明でも用いる「植物用抗生物質耐性遺伝子」には、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子が挙げられるが、好ましくは、ハイグロマイシン耐性遺伝子である。これらの植物用抗生物質耐性遺伝子は、プラスミドなどに含有される形で市販されている。
【００４１】
本発明に用いる「遺伝子構築物中の植物用の強力プロモーターに、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子を作動的に連結すること」は、次のように実施することが出来る。
【００４２】
なお、先に記載したように、ＤＮＡ組換え操作を行なうには、制限酵素部位が必要であるので、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを含む遺伝子、植物用の強力プロモーター、植物用のターミネーターや植物用抗生物質耐性遺伝子などの本発明の遺伝子構築物の構築に用いられる遺伝子は、ＤＮＡ組換え操作が実施可能なようにそれらの５’フランキング領域および３’フランキング領域に制限酵素部位を有していてもよい。
【００４３】
例えば、遺伝子構築物中の植物用の強力プロモーターの下流と配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを含む遺伝子の上流とを、そして遺伝子構築物中の植物用のターミネーターの上流と配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを含む遺伝子の下流とをそれぞれの制限酵素部位において連結することにより、遺伝子構築物中の植物用の強力プロモーターに、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを含む遺伝子を作動的に連結することができる。
【００４４】
かかる連結操作後の、［（植物用の強力プロモーター）３’−５’（配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを含む遺伝子）３’−５’（植物用のターミネーター）］を含む遺伝子構築物を、本発明の植物細胞の形質転換に用いてもよいが、該遺伝子構築物が、プラスミドまたはアグロバクテリウム用バイナリープラスミドである場合には、かかる連結操作後に、大腸菌に形質転換を行い、形質転換された大腸菌から得られる組換えプラスミドまたはアグロバクテリウム用バイナリープラスミドを、本発明の植物細胞の形質転換に用いることが好ましい。
【００４５】
また、かかる大腸菌の形質転換体より得られた組換えプラスミドから、［（植物用の強力プロモーター）３’−５’（配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを含む遺伝子）３’−５’（植物用のターミネーター）］を含む部分（または断片）を制限酵素やＰＣＲを用いて取り出して、本発明の植物細胞の形質転換に用いてもよい。
【００４６】
同様に、かかる大腸菌の形質転換体により得られた組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドから、［（Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーまたはレフトボーダー）３’−５’（場合により、存在する抗生物質耐性遺伝子などの他の遺伝子）３’−５’（植物用の強力プロモーター）３’ー５’（配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを含む遺伝子）３’ー５’（植物用のターミネーター）３’−５’（場合により、存在する抗生物質耐性遺伝子など他の遺伝子）３’−５’（Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーまたはレフトボーダー）］を含む部分（または断片）を制限酵素やＰＣＲを用いて取り出して、本発明の植物細胞の形質転換に用いてもよい。
【００４７】
さらに、かかる大腸菌の形質転換体より得られた組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドをアグロバクテリウムに導入し、アグロバクテリウム用バイナリープラスミドを有するようになったアグロバクテリウムの形質転換体を用いて、本発明の植物細胞を形質転換してもよい。
【００４８】
したがって、本発明に用いる、「（１）で得られた遺伝子構築物を用いて」には、
（ｉ）上記のような連結操作により得られた、［（植物用の強力プロモーター）３’−５’（配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを含む遺伝子）３’−５’（植物用のターミネーター）］を含む遺伝子構築物、
（ii）遺伝子構築物が、プラスミドまたはアグロバクテリウム用バイナリープラスミドである場合には、さらに上記の遺伝子構築物を大腸菌に形質転換してその形質転換体より得られた組換えプラスミドまたはアグロバクテリウム用バイナリープラスミド、あるいは、
（iii）上記の形質転換体より得られた、組換えプラスミドから取り出された、［（植物用の強力プロモーター）３’−５’（配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを含む遺伝子）３’−５’（植物用のターミネーター）］を含む部分（または断片）、または、組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドから取り出された、［（Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーまたはレフトボーダー）３’−５’（場合により、存在する抗生物質耐性遺伝子など他の遺伝子）３’−５’（植物用の強力プロモーター）３’ー５’（配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを含む遺伝子）３’ー５’（植物用のターミネーター）３’−５’（場合により、存在する抗生物質耐性遺伝子など他の遺伝子）３’−５’（Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーまたはレフトボーダー）］を含む部分（または断片）を用いることだけでなく、さらに
（iv）上記のようにして得られた組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドにより形質転換されて、組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドを有するようになったアグロバクテリウムの形質転換体を用いること
も含まれる。
【００４９】
本発明の植物細胞の形質転換に用いるのに好ましい「（１）で得られた遺伝子構築物」は、上記（ii）の組換えプラスミドまたは組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミド、または上記（iv）の組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドを有するアグロバクテリウムの形質転換体である。さらに好ましいのは、上記（iv）のアグロバクテリウムの形質転換体である。
【００５０】
本発明で用いる、「植物細胞を形質転換する」とは、外部からＤＮＡを植物細胞の染色体に組込み、植物細胞の形質を変換することを意味する。植物細胞を形質転換する方法には、アグロバクテリウムを介するアグロバクテリウム法、または、金やタングステン粒子にコーティングしたＤＮＡをヘリウムガス圧で植物細胞に打ちこむパーティクルガン法などがあるが、植物細胞を形質転換する方法であればこれらに限定されない。
【００５１】
本発明に用いる「（１）で得られた遺伝子構築物」が、上記（ｉ）〜（iii）のいずれかである場合には、パーティクルガン法により、植物細胞を形質転換することが好ましい。
【００５２】
一方、本発明に用いる「（１）で得られた遺伝子構築物」が、上記の（iv）の組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドを有するアグロバクテリウムの形質転換体である場合には、アグロバクテリウム法により、植物細胞を形質転換することが好ましい。アグロバクテリウムは、市場から入手することができるし、当業者から入手することもできる。
【００５３】
本発明の「植物細胞を形質転換すること」で用いられる好ましい形質転換方法は、形質転換効率がより高いので、上記の（iv）の組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドを有するアグロバクテリウムの形質転換体を用いるアグロバクテリウム法である。
【００５４】
本発明で用いる「塩耐性形質転換植物細胞」は、形質転換後の植物細胞を塩を含む培地で培養することにより、増殖可能な細胞を選別することで得ることができる。
【００５５】
植物細胞の形質転換の際、植物用抗生物質耐性遺伝子が、植物細胞の染色体に組み入れられている場合には、形質転換処理した植物細胞の塩含有培地における培養において、その植物用抗生物質耐性遺伝子を形質転換細胞の選別のために利用することができる。
【００５６】
なお、上記した本発明で用いるＤＮＡ組換え技術や培養技術等は、すべて当業者には周知であり、標準的な試薬、器具、条件および方法を用いることで実施できる（ＤＮＡ組換え技術および培養技術の教科書、例えば、Sambrook, J., et al.(1989) Molecular Cloning 2nd Edition.やAusubel, F. M., et al.(1987) Current Protocol In Molecular Biology., J. Wiley and Sons, New Yorkを参照）。また、本発明において用いるＤＮＡ組換え技術や培養技術に必要な試薬、細菌、細胞、器具、場合により、遺伝子も市場より入手できる。
【００５７】
本発明で用いる「塩耐性形質転換植物細胞」とは、先に記載したように、植物用の強力プロモーターに作動的に連結した配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれら等価物の１つを含む遺伝子構築物により、形質転換されることで、塩耐性を示す形質転換植物細胞を意味する。
【００５８】
以下、本発明について実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。また、下記の実施例で、特に実施条件等を記載していないＤＮＡ組換え技術や培養技術等は、当業者に周知の、標準的な試薬、器具、条件を用いることで実施できる（ＤＮＡ組換え技術および培養技術の教科書、例えば、Sambrook, J., et al.(1989) Molecular Cloning 2nd Edition.やAusubel, F. M., et al.(1987) Current Protocol In Molecular Biology., J. Wiley and Sons, New Yorkを参照）。
【実施例１】
【００５９】
配列番号１の遺伝子（At4g39800）を用いた塩耐性形質転換植物細胞の製造
材料および方法
植物およびアグロバクテリウムと培地組成
ａ．植物
シロイヌナズナは、The Arabidopsis Biological Resource Center（ＡＢＲＣ）より入手したArabidopsis Columbiaの種子を使用した。
種子を次亜塩素酸ナトリウムにより滅菌後、ＭＳ固形培地に播き、４℃で低温処理をして発芽時期を揃えた。２２℃の連続光下で１週間生育させた植物体１５〜２０個体をＭＳ液体培地２００mlに移した。ロータリー式震盪培養機を用いて２２℃の連続光下、１００回転／分の回転速度で２週間震盪培養を行った。
【００６０】
震盪培養後のシロイヌナズナ植物体から、メスを用いて根を切り取り、ピンセットで緑色組織をできるだけ取り除いた。さらに、メスで根を約３mmの長さに細かく切り刻んだ後、ＣＩＭプレート上で２０℃、弱光下（約１００ルクス）で３日間培養を行い、形質転換に用いる根の細断片を得た。
【００６１】
ｂ．  培地
ＭＳ液体培地
１Lあたり、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地用混合塩類（SIGMA）４．６g、ショ糖（和光）２０g、１０００×ビタミンストック（チアミン塩酸塩（和光）３００mg、ニコチン酸（和光）５００mg、ピリドキシン酸（和光）５００mgに滅菌水を加え１００mlに調製したもの）１mlに、滅菌水を加えメスアップし、２NＫＯＨでｐＨを５．８に調製後、１２１℃で、２０分間オートクレーブした。
【００６２】
ＭＳ固形培地
液体培地と同じ組成に、１Lあたりジェライト（三栄原エフ・エフ・アイ）３gを加え１２１℃で、２０分間オートクレーブ後、シャーレ一枚あたり約５０mlずつ分注した。
【００６３】
ＣＩＭ（カルス細胞誘導培地）
ＭＳ固形培地に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）（最終濃度５００ng／ml、和光）、カイネチン（最終濃度５０ng／ml、和光）を加え１２１℃で、２０分間オートクレーブ後シャーレに分注した。
【００６４】
アグロバクテリウム用培地
１Lあたり、イーストエキストラクト（オリエンタル酵母工業）５g、ポリペプトン（和光）１０g、塩化ナトリウム（和光）１０gを加え滅菌水でメスアップし、５NＮａＯＨでｐＨを７．５に調節後、１２１℃で、２０分間オートクレーブを行った。その後５０℃に冷やし、リファンピシリン（最終濃度５０μg／ml、第一製薬）を加えた。
【００６５】
A. tumefaciensの感染および共存培養
A. tumefaciens用培地１０mlにA. tumefaciens（pRi35ADEn4）を植菌し、一晩培養後、３０００rpmで２０分遠心後ＣＩＭ液体培地にＯＤ６０００．１〜０．２になるように再懸濁した。前培養した根を懸濁したA. tumefaciensに２分間浸すことにより感染を行った。A. tumefaciensを感染させた根は、滅菌したキムタオルでよく水分を除いた後、ＣＩＭプレートに置き３日間共存培養を行った。
【００６６】
A. tumefaciensの洗浄
共存培養を行った根をクラフォラン(アベンティスファーマ)（最終濃度１００μg/ml）を含むＭＳ液体培養４０mlに移し、ロータリー式震盪培養機で２０℃、１８０回転/分の条件で激しく洗った。さらに３０分おきにＭＳ液体培地を交換し、計１０回洗浄を行った。
【００６７】
薬剤含有培地での選抜
洗浄後、余分な水分を滅菌したキムタオルで除き、スルホニルウレア（Dr.Ehrenstorferより供与）(最終濃度１００ng/ml)、バンコマイシン（メルク・ホエイ）（最終濃度１００μg/ml）、およびクラフォラン（セフォタキシム）（最終濃度１００μg/ml）を含むＣＩＭプレートに置き、導入されたＴ−ＤＮＡ上のPCAMV35S-SUR-ALSによって獲得される除草剤スルホニルウレア１００ng/mlへの抵抗性で形質転換体がカルス化してくるのを待った。バンコマイシン、およびクランフォランはA. tumefaciensの増殖を抑えるために用いた。約１ヶ月後、カルス化してきた植物体を、同様の薬剤に加えて１５０mMＮａＣｌを含むＣＩＭ選択プレートに置いて２ヶ月以上培養し、盛んに増殖を繰り返すカルスを、同様の薬剤に加えて２００mMＮａＣｌを含むＣＩＭ選択プレートに置き、１ヶ月後、増殖したカルスの中の＃６６系統を耐塩性突然変異系統とした。
【００６８】
ＰＣＲ法による導入されたＴ−ＤＮＡの確認
耐塩性突然変異系統カルスとコントロールカルスの一部（約５mm弱）を１．５mlチューブに入れ、ＤＮＡ抽出液２００μlを加えて磨り潰し撹拌後、１００％エタノール４００μlを加えて撹拌し、１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心した。上清を取り除き、７０％エタノール５００μlを加え、再び遠心して上清を除き、沈殿はＴＥに溶かしてＤＮＡ溶液とした。
ＰＣＲ反応液
１０×ＰＣＲバッファー                ２．５μl
２５０mM  dNTPs mix                   ２μl
１０pmol／μlプライマー Fd-35SminiL   １μl
１０pmol／μlプライマー ALS-Rv22      １μl
５U／μl  Ｔａｑポリメラーゼ          ０．１２５μｌ
鋳型ＤＮＡ溶液                        １μｌ
蒸留水を用いて２５μlとした。
【００６９】
ＰＣＲ条件
９４℃    ３０秒
９４℃    １５秒、５５℃    ３０秒、７２℃    １分を３５サイクル
７２℃    ５分
以上の反応液と条件を用いてＰＣＲを行った。
【００７０】
耐塩性カルスからゲノムＤＮＡを抽出後、ＳＵＲ−ＡＬＳ遺伝子の一部を増幅するＦｄ−３５ＳｍｉｎｉＬとＡＬＳ−Ｒｖ２２をプライマーとして用いてＰＣＲを行ったところ、＃６６突然変異系統から目的の長さのＤＮＡ（約２００ｂｐ）が増幅された。このことにより、アクティべーションタギング法によって得られた＃６６耐塩性突然変異系統において、Ｔ−ＤＮＡが導入されていることが確認できた。
Fd-35SminiL    GCAAGACCCTTCCTCTATATAAGC（配列番号２）
ALS-Rv22       TCTAGGGAGGAGGGTGGAGGATTT（配列番号３）
【００７１】
ＴＡＩＬ−ＰＣＲによるＴ−ＤＮＡ導入部位の確認
ＴＡＩＬ−ＰＣＲはＴ−ＤＮＡと隣接する未知のＤＮＡ配列を増幅する方法である（
Liu Y G, and Whittier R F.: Genomics, 25, 674-684(1995)、Liu Y G et al., Plant J, 8, 457-463(1995)、劉光、植物工学別冊植物細胞工学シリーズ7巻、新版、植物PCR実験プロトコール、第一版、島本功、岡田清孝監修、秀潤社、東京、1997、pp.83-89）。
【００７２】
Ｔ−ＤＮＡ上ライトボーダー側に特異的なプライマーＲＢ１、ＲＢ２、ＲＢ３、レフトボーダー側に特異的なプライマーＬＢ１、ＬＢ２、ＬＢ３、非特異的なランダムプライマー７種類を用いＴＡＩＬ−ＰＣＲ用プログラムにてＰＣＲを行った。
【００７３】
用いたプライマー
RB1          GTCACTTCATCGAAAGGACAGTAG（配列番号４）
RB2          CGTTCAAGATGCCTCTACCGACAG（配列番号５）
RB3          GGATTGATGTGATATCTAGATCCG（配列番号６）
LB1          CCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGC（配列番号７）
LB2          TGGGATTGTGCGTCATCCCTTACG（配列番号８）
LB3          TTGGAGTAGCCCCGATTGCCCTCA（配列番号９）
tail-AD1     NTCGASTWTSGWGTT（配列番号１０）
tail-AD2-1   NGACGASWGANAWGAA（配列番号１１）
tail-AD2-2   NGACGASWGANAWGTT（配列番号１２）
tail-AD2-3   NGACGASWGANAWGAC（配列番号１３）
tail-AD2-4   NGACGASWGANAWCAA（配列番号１４）
tail-AD2-5   NGACGASWGANAWCTT（配列番号１５）
tail-AD3     NGTAWAASGTNTSCAA（配列番号１６）
【００７４】
シークエンシング
ＴＡＩＬ−ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡをシークエンシングした。増幅されたＤＮＡを鋳型にしてDye Terminator Cycle Sepuencing Kit（PE Applied Biosystems）のプレミックス、ＲＢ３およびＬＢ３プライマーで、シークエンス用標準ＰＣＲプログラムにてＰＣＲを行った。反応液を真空乾燥させTemplate Suppression Reagent（PE Applied Biosystems）に溶解させ、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（PE Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【００７５】
＃６６耐塩性カルスにおいて、ＴＡＩＬ−ＰＣＲの結果から、Chromosome 5 BAC T22D6上の21056bp部分と、Chromosome 4 BAC T19P19上の75666bp部分の２ヶ所に、エンハンサーが挿入されていることが明らかになった。
Ｔ−ＤＮＡの導入が予測された部位付近に存在する遺伝子を、ＴＡＩＲデータベースで検索した結果、BAC T22D6上の導入部位から約３．５ｂｐ上流に開口分泌（細胞の分泌機構）に関わるシンタキシンというタンパク質をコードする遺伝子（At5g08080）が存在していることがわかった。また、導入部位から約９ｋｂｐ上流と約１３ｋｂｐ下流にｂＨＬＨ転写因子関連のタンパク質をコードする遺伝子（At5g08070、At5go8150）が存在していた。さらに、BAC T19P19上の導入部位から約７００ｂｐ上流には、細胞膜に存在するイノシトール３リン酸合成酵素（ｍｙｏ−イノシトール１リン酸合成酵素）をコードする遺伝子（At4g39800）が存在していた。
【００７６】
リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ発現量の確認
ＲＮＡ抽出
作製した耐塩性カルスから、リアルタイムＰＣＲに用いるｃＤＮＡを作製する目的でＲＮＡを抽出した。約５０mgのカルスを液体窒素で凍らせ、ISOGEN（日本ジーン）を１ml加え激しくボルテックスした。５０℃、１０分インキュベートしながら混濁させ、室温に５分間放置した。それにクロロホルム２００μｌを加えボルテックスして、室温にて２分間放置した。４℃、１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、上層を回収した。クロロホルムをそれに２００μｌ加え１分間混合した後、４℃、１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した。中間層のタンパク質がなくなるまで同様にクロロホルム処理を繰り返した後、最終的に得た上層に対して、イソプロパノールを５００μｌ加え室温５分で軽く混ぜた。４℃、１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上澄みを捨て７０％エタノールを加えリンスした。さらに４℃、１５，０００ｒｐｍ、１５分間で遠心し、得た沈殿を風乾させた。その沈殿に再蒸留水を１００μｌ加え溶かした。ここで得られたＲＮＡ溶液に対してＤＮａｓｅ処理をおこなった。反応液は、ＲＮＡ溶液を４５μｇ等量、１０×ＤＮａｓｅＩバッファー  ５μｌ、ＤＮａｓｅＩ  １０単位及びＲＮａｓｅインヒビター（Ｗａｋｏ）２０単位をＲＮａｓｅフリー水を用いて５０μｌとし、３７℃、３０分間反応させた。等量のクロロホルムを加え混合し、４℃、１５ｋｒｐｍ、１５分間遠心し上層を回収した。クロロホルム処理を３回繰り返した。１／１０倍容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容の１００％エタノールを加え、−８０℃で１時間放置した。４℃、１５，０００ｒｐｍ、１５分間で遠心し、上清を除いた。３００μｌの８０％をくわえ、４℃、１５，０００ｒｐｍ、１５分間で遠心し上清を除いた。得られたペレットを風乾させ、ＲＮａｓｅフリー水に溶かした。
【００７７】
ｃＤＮＡの合成
ＤＮａｓｅ処理をおこなったＲＮＡ約０．５μｇ当量を用い、逆転写反応試薬（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、標準プロトコールに従いｃＤＮＡの合成を行った。プライマーはキットに含まれるoligo-p(dT)プライマーを用いた。この反応液を１０倍に希釈したものをリアルタイムＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡとした。
【００７８】
リアルタイムＰＣＲ解析
リアルタイムＰＣＲは、Light Cycler-DNA Master SYBR GreenI（Roche）とライトサイクラークイックシステム３３０（Roche）を用いた。
MIPSFd:        TGGAGTCTGTGGATAGGGATGAG（配列番号１７）
MIPSRv:        ATCAATTAGACCTGGAACAAAGGTG（配列番号１８）
【００７９】
内部標準としてＡＣＴ２遺伝子の転写産物量を用いて補正した。ＡＣＴ２遺伝子はＡＣＴ２−ｆｄ、ＡＣＴ２ｒｖ２プライマーで行った（Niwa et al., Plant Cell Physiol. 2006 47: 319-331）。
【００８０】
リアルタイムＰＣＲ解析の結果、ｍｙｏ−イノシトール１リン酸合成酵素遺伝子のみの発現量が増加していることが明らかとなった。
【００８１】
分化誘導および植物個体の作成
＃６６耐塩性カルスは、分化誘導のためインドール酢酸（ＩＡＡ：終濃度０．１５μg／ml）、Ｎ６−（２−イソペンテニル）アデニン（２ｉＰ；終濃度５μg／ml）および選抜用に０．１μg／mlのクロルスルフロンを添加したシュート誘導培地に移し、再生芽が４−１０mmになるまで培養した。その後、５００μg／mlＩＡＡを添加した発根培地へ再生芽を移し３週間培養した。発根を確認後、土に移しその種子（Ｔ２）を得た。
【００８２】
カルスでの耐塩性測定
＃６６カルスとコントロールカルスについて２００もしくは２５０mMＮａＣｌを添加した培地にてその生育状況を比較した。その結果、コントロールと比較して＃６６カルスが耐塩性を示すことが明らかとなった（図１）。
【００８３】
植物体での耐塩性測定
Ｔ２もしくはその次世代のＴ３種子とコントロール種子について１００もしくは１５０ｍＭＮａＣｌを添加した培地に播いてその生育状況を比較した。その結果、コントロールと比較して＃６６植物個体が耐塩性を示すことが明らかとなった（図２）。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】カルスでの耐塩性比較である。Ａ及びＣはコントロールカルスであり、Ｂ及びＤは＃６６カルスである。塩濃度は、Ａ及びＢが２００mMであり、Ｃ及びＤが２５０mMである。その結果、コントロールと比較して＃６６カルスが耐塩性を示すことが明らかとなった。
【図２】植物個体での耐塩性比較である。Ａは１００mMＮａＣｌであり、Ｂは１５０mMＮａＣｌである。Ｃは、１５０mMＮａＣｌでの根の成長を示す。その結果、コントロールと比較して＃６６植物個体が耐塩性を示すことが明らかとなった。また、コントロールと比較して＃６６のほうが根の成長が優れていることも明らかとなった。
【図１】
2008220303.tif 000002
【図２】
2008220303.tif 000003
【配列表】
2008220303000001.app