(57)【要約】【課題】非特異吸着を防止し生理活性物質を固定するバイオサンサー用基板であって、透明性も付与したバイオセンサー基板を提供すること。【解決手段】基板上に無機酸化物から形成される膜と生理活性物質固定化基を有する親水性高分子とを有するバイオセンサー用基板であって、該親水性高分子が、低分子化合物を介して、該無機酸化物から形成される膜と結合されている、バイオセンサー用基板。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に無機酸化物から形成される膜と生理活性物質固定化基を有する親水性高分子とを有するバイオセンサー用基板であって、該親水性高分子が、低分子化合物を介して、該無機酸化物から形成される膜と結合されている、バイオセンサー用基板。
【請求項２】
前記結合が共有結合である、請求項１に記載のバイオセンサー用基板。
【請求項３】
低分子化合物が下記式で表される化合物である、請求項２に記載のバイセンサー用基板。
Ｘ−Ｌ(Ｙ)n
［式中、Ｘは−Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、−Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、−Ｓｉ(ＯＣ3Ｈ7)3、又は−Ｓｉ(ＯＣ4Ｈ9)3から選ばれる、無機酸化物と結合できる官能基を示し、Ｙは−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、グリシドキシ基、メタクリロキシ基、メルカト基、ビニル基、又はエポキシ基から選ばれる親水性高分子と結合する官能基を示し、ｎ個のＹはそれぞれ同一でも異なるものでもよく、Ｌは、単結合、あるいはアルキレン基、フェニレン基、−ＮＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｏ−，−Ｓ−、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、脂肪酸エルテル、又はこれらの組み合わせから選ばれる基であり、分子内に−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯを有してもよい。ｎは１から５の整数を示す。］
【請求項４】
無機酸化物が酸化ケイ素、酸化チタン、酸化ジルコニウム、又はその混合物から選ばれる、請求項１から３の何れかに記載のバイオセンサー用基板。
【請求項５】
無機酸化物から形成される膜の膜厚が、０．１ｎｍ〜５００ｎｍである、請求項１から４の何れかに記載のバイオセンサー用基板。
【請求項６】
無機酸化物の膜が、金、銀又は白金からなる層の上に形成されている、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー用基板。
【請求項７】
生理活性物質固定化基が、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中Ｒ1およびＲ2は互いに独立に水素原子または低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は互いに独立に水素原子または低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、ビニル基、ビオチニル基、ビオチン結合性蛋白質、ジゴキシゲニン、ジゴキシゲニン抗体から選らばれることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載のバイオセンサー用基板。
【請求項８】
請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサー用基板を含むバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非特異的吸着を防止した、生体分子間の相互作用を分析するためのバイオセンサー用基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術、屈折率変化を導波路を用いて検出する測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。屈折率変化を導波路を用いて検出する測定技術は、導波路に隣接する媒体の有効屈折率変化を光学変化で検出する技術である。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
特表２００３-５１６５１９号には、金属または金属酸化物表面に静電引力を利用して多機能性コポリマーを固定したバイオセンサー用基板が記載されている。この基板は生理活性物質と結合するコポリマーを多種の異なる材料の基板に結合することが可能であるが、基板を使用するｐＨに制約がありコポリマーの基板からの脱離の懸念もある。特表２００４-５０７５８０号には、高分子イオン性物質表面に親水性モノマーグラフト重合物を結合した表面が記載されている。親水性ポリマーが共有結合で基板に結合されているため、親水性ポリマーの脱離はないが、基板表面の非特異吸着防止性能が不足している。特許第２８１５１２０号には、金基板に自己組織化膜（ＳＡＭ）を介してデキストランを結合させ、さらにブロモ酢酸を繰り返し反応させることで、デキストランにカルボキシル基を導入することが記載されている。この蛋白固定化膜は、３次元マトリクスを形成しているので、多量の蛋白を固定化できるメリットを有している。しかしながら、チオール分子を介して基板とデキストランとを固定するため、基板表面に使用できる材料が自由電子金属に限定され、光学センサーの用途が限られた。
【０００６】
【特許文献１】特表２００３-５１６５１９号
【特許文献２】特表２００４-５０７５８０号
【特許文献３】特許第２８１５１２０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、非特異吸着を防止した生理活性物質を固定するためのバイオサンサー用基板を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、透明性を付与することも可能なバイオセンサー用基板を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、基板上の無機酸化物の膜の表面に、生理活性物質を固定できる親水性高分子を、低分子化合物を介して結合することによって、所望のバイオセンサー用基板を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明によれば、基板上に無機酸化物から形成される膜と生理活性物質固定化基を有する親水性高分子とを有するバイオセンサー用基板であって、該親水性高分子が、低分子化合物を介して、該無機酸化物から形成される膜と結合されている、バイオセンサー用基板が提供される。低分子化合物は、分子量が１００以上５００以下であることが好ましい。
【００１０】
好ましくは、前記結合は共有結合である。
好ましくは、低分子化合物は下記式で表される化合物である。
Ｘ−Ｌ(Ｙ)n
［式中、Ｘは−Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、−Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、−Ｓｉ(ＯＣ3Ｈ7)3、又は−Ｓｉ(ＯＣ4Ｈ9)3から選ばれる、無機酸化物と結合できる官能基を示し、Ｙは−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、グリシドキシ基、メタクリロキシ基、メルカト基、ビニル基、又はエポキシ基から選ばれる親水性高分子と結合する官能基を示し、ｎ個のＹはそれぞれ同一でも異なるものでもよく、Ｌは、単結合、あるいはアルキレン基、フェニレン基、−ＮＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｏ−，−Ｓ−、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、脂肪酸エルテル、又はこれらの組み合わせから選ばれる基であり、分子内に−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯを有してもよい。ｎは１から５の整数を示す。］
【００１１】
好ましくは、無機酸化物は酸化ケイ素、酸化チタン、酸化ジルコニウム、又はその混合物から選ばれる。
好ましくは、無機酸化物から形成される膜の膜厚は、０．１ｎｍ〜５００ｎｍである。
好ましくは、無機酸化物の膜は、金、銀又は白金からなる層の上に形成されている。
【００１２】
好ましくは、生理活性物質固定化基は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中Ｒ1およびＲ2は互いに独立に水素原子または低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は互いに独立に水素原子または低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、ビニル基、ビオチニル基、ビオチン結合性蛋白質、ジゴキシゲニン、ジゴキシゲニン抗体から選らばれる。
【００１３】
本発明によればさらに、上記のバイオセンサー用基板を含むバイオセンサーが提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のバイオセンサー用基板は、非特異吸着を防止し、生理活性物質を固定する基板であって、さらに透明性も付与できるバイオセンサー用基板である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００１６】
本発明のバイオセンサーでは、無機酸化物の膜を用いる。無機酸化物としては、ＳｉＯ2、ＴｉＯ2、ＺｎＯ2、ＳｎＯ2、Ｔａ2Ｏ2、ＨｆＯ2、Ｓｃ2Ｏ3などが挙げられる。それらの酸化物は単独又は組み合わせて使用することができ、Ｓｉ3Ｎ4などの他の物質との混合物でもよい。この中で、ＳｉＯ2、ＴｉＯ2、ＺｎＯ2およびそれら酸化物の混合物が、生理活性物質および生理活性物質と親和性のある物質の非特異的吸着を低減することからバイオセンサー表面材料として特に好ましい。
【００１７】
無機酸化物の膜厚は任意であるが、例えば、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００１８】
無機酸化物の膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法、フィルムの接着法、フィルムの圧着法等によって行うことができる。
【００１９】
例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、前記の無機酸化物の膜は表面プラズモン共鳴が生じ得るような材料層に直接または中間層を介して隣接していることが好ましい。表面プラズモン共鳴が生じ得る材料としては、好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２０】
上記した金属の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２１】
上記した金属の膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法、フィルムの接着法、フィルムの圧着法等によって行うことができる。
【００２２】
無機酸化物の膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、無機酸化物の膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、無機酸化物膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、前記の無機酸化物膜が表面プラズモン共鳴が生じ得るような材料層を介して光学基板上に配置されていることが好ましい。光学基板としては一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。また、屈折率変化を導波路を用いて検出する測定技術で用いる基板の場合、検出に使用されるレーザー光源が導波層である無機酸化物層内を伝播させるため、導波層に対して屈折率が低い材料を基板に用いることカ゛好ましい。好ましい基板材料としては、光学ガラスあるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。
【００２３】
本発明において、親水性高分子は、低分子化合物を介して、無機酸化物層に結合している。低分子化合物は、分子量が１００以上５００以下であることが好ましい。好ましい低分子化合物としては、一般的にシランカップリング剤と呼ばれる化合物を使用することができる。
【００２４】
本発明で用いることができるシランカップリング剤の具体例としては、下記式で表される化合物を挙げることができる。
Ｘ−Ｌ(Ｙ)n
【００２５】
ここで、Ｘは−Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、−Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、−Ｓｉ(ＯＣ3Ｈ7)3、又は−Ｓｉ(ＯＣ4Ｈ9)3から選ばれる、無機酸化物と結合できる官能基を示し、Ｙは−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、グリシドキシ基、メタクリロキシ基、メルカト基、ビニル基、又はエポキシ基から選ばれる親水性高分子と結合する官能基を示し、ｎ個のＹはそれぞれ同一でも異なるものでもよく、Ｌは、単結合、あるいはアルキレン基、フェニレン基、−ＮＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｏ−，−Ｓ−、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、脂肪酸エルテル、又はこれらの組み合わせから選ばれる基であり、分子内に−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯを有してもよい。ｎは１から５の整数を示す。
【００２６】
シランカップリング剤は水と反応すると加水分解してシラノール基を生成し、無機酸化物表面または金属表面と酸塩基反応で共有結合を形成する。シランカップリング剤の具体的な化合物を以下に示す。
【００２７】
【化１】
2008209379.tif 000002
【００２８】
この内、より好ましいものとして、下記化合物が挙げられる。
【化２】
2008209379.tif 000003
【００２９】
本発明で用いられるセンサー表面は、親水性高分子化合物で表面修飾されている。親水性の高分子化合物としては、アルブミン、カゼインなどの蛋白質、寒天、アルギン酸ナトリウム、デンプン誘導体などの糖誘導体、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースなどのセルロース化合物、デキストラン、デキストラン誘導体、キチン、キトサンなどの多糖類、ポリビニルアルコール、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸などの合成親水性高分子などが挙げられる。
【００３０】
親水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。また基板表面と化学結合する分子を介して化学的に結合しても良い。
【００３１】
センサー表面に固定する親水性高分子化合物は、水溶液中の膜厚が１ｎｍ以上300ｎｍ以下であることが好ましい。膜厚が薄いと生理活性物質固定量が減少し、またセンサー表面の水和層が薄くなるため生理活性物質自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。膜厚が厚いと被検体物質が膜内に拡散する障害となり、また特にセンサー基板の親水性高分子化合物固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水溶液中の親水性高分子化合物膜厚はＡＦＭ、エリプソメトリーなどで評価することができる。
【００３２】
これらの高分子材料は、化学薬品、カップリング剤、界面活性剤、表面蒸着などを使用した化学処理、加熱、紫外線、放射線、プラズマ、イオンなどを使用した物理的処理から、表面修飾することが可能である。
【００３３】
親水性高分子化合物は、生理活性物質と共有結合を生成しうる官能基を有することが好ましい。生理活性物質と共有結合を生成しうる好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。
【００３４】
親水性高分子化合物としてカルボキシル基を含有するポリマーを使用する場合、カルボキシル基を活性化することによって、自己組織化膜で被覆された基板に固定化することができる。カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化する方法、又はEDC単独により活性化する方法を好ましく用いることができる。この手法で活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを、アミノ基を有する基板と反応させることで、本発明のバイオセンサーを製造することが可能となる。
【００３５】
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として含窒素化合物を用いる方法があり、具体的には、下記一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）[式中、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表し、Ｒ１及びＲ２は結合により５〜６員環を形成しても良く、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す]に示される含窒素化合物を用いることもできる。
【００３６】
【化３】
2008209379.tif 000004
【００３７】
ここで、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表すが、好ましくはＲ１及びＲ２は結合により５〜６員環を形成する。特に好ましくは、ヒドロキシコハク酸、ヒドロキシフタル酸、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３、４−ジヒドロキシ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１、２、３−ベンゾトリアジン、及びその誘導体が提供される。
【００３８】
また、好ましくは下記化合物７で示される含窒素化合物を用いることもできる。
【化４】
2008209379.tif 000005
【００３９】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（ＩＩ）[式中、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表す]で表される化合物を用いることもできる。
【００４０】
【化５】
2008209379.tif 000006
【００４１】
具体的には、下記の化合物などを用いることができる。
【００４２】
【化６】
2008209379.tif 000007
【００４３】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記の化合物を用いることもできる。
【００４４】
【化７】
2008209379.tif 000008
【００４５】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（ＩＩＩ）[式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す]を用いることもできる。
【００４６】
【化８】
2008209379.tif 000009
【００４７】
ここで、Ａで表される炭素原子またはリン原子の置換基としては、置換基を有するアミノ基が好ましく、ジメチルアミノ基やピロリジノ基の様なジアルキルアミノ基が好ましい。Mで表される（n-1）価の元素は、リン原子、ホウ素原子、ヒ素原子などが挙げられるが、好ましくはリン原子があげられる。Xで表されるハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、好ましくはフッ素原子が挙げられる。
【００４８】
また一般式（ＩＩＩ）で表される含窒素化合物の具体例としては、下記の化合物などが挙げられる。
【００４９】
【化９】
2008209379.tif 000010
【００５０】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（IV）[式中、Ａは置換基を有す
る炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表
す]を用いることもできる。
【００５１】
【化１０】
2008209379.tif 000011
【００５２】
具体的には、下記の化合物などを用いることができる。
【００５３】
【化１１】
2008209379.tif 000012
【００５４】
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として、電子吸引性基を有するフェノール誘導体を使用することも好ましく、更に電子吸引性基のσ値が0.3以上であることが好ましい。具体的には、下記化合物１６などを用いることができる。
【００５５】
【化１２】
2008209379.tif 000013
【００５６】
更に、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法では、別にカルボジイミド誘導体物を併用することができ、好ましくは、水溶性カルボジイミド誘導体を併用する事ができ、更に好ましくは下記の化合物、（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride）を併用することができる。
【００５７】
【化１３】
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【００５８】
上記のカルボジイミド誘導体及び、含窒素化合物、またはフェノール誘導体は併用して使用するだけではなく、所望により、夫々、単独で用いることもできる。好ましくはカルボジイミド誘導体と含窒素化合物との併用である。
【００５９】
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として、下記化合物を用いることもできる。該化合物は単独で用いることもできるが、カルボジイミド誘導体、含窒素化合物、フェノール誘導体と併用してもよい。
【００６０】
【化１４】
2008209379.tif 000015
【００６１】
さらに、カルボキシル基を含有するポリマーにおけるカルボン酸を活性化する手法としては、特願２００４−２３８３９６号（特開２００６−５８０７１号公報）「００１１」〜「００２２」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いて活性化することによりカルボン酸アミド基を形成する方法）、並びに特願２００４−２７５０１２号（特開２００６−９０７８１号公報）「００１１」〜「００１９」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物でエステルとした後に、アミンと反応させることによりカルボン酸アミド基を形成する方法）を好ましく用いることもできる。
【００６２】
なお、上記した特願２００４−２３８３９６号（特開２００６−５８０７１号公報）における特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体とは、下記一般式１で表されるウロニウム塩、下記一般式２で表されるホスホニウム塩、又は下記一般式３で表されるトリアジン誘導体を示す。
【００６３】
【化１５】
2008209379.tif 000016
【００６４】
（一般式１において、Ｒ1とＲ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は互いに一緒になって炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ3は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ-はアニオンを示す。一般式２において、Ｒ4とＲ5はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は互いに一緒になって炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ6は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ-はアニオンを示す。一般式３において、Ｒ7はオニウム基を示し、Ｒ8及びＲ9はそれぞれ独立に電子供与基を示す。）
【００６５】
また、親水性高分子化合物被膜層に、タグ分子とＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドを生理活性物質の結合基とすることも好ましい。タグ分子／リガンドの組み合わせとしては、ビオチン／ビオチン結合蛋白質、ジゴキシゲニン／ジゴキシゲニン抗体、さらにはSCIENCE,280,708-711(1998)に記載のD-Ala-D-Ala誘導体／バンコマイシン3量体誘導体などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。ビオチン結合蛋白質の具体例としては、アビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、又はそれらの改変体など）を挙げることができる。
【００６６】
また、親水性高分子化合物の薄膜成膜後、基板表面に生理活性物質を固定化することができるよう化学修飾することで、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出することが可能となり有用である。この化学修飾は常法により、水溶液中または、有機溶剤中で基板表面に生理活性物質と共有結合を生成しうる官能基を導入できる。
【００６７】
生理活性物質の固定化基として、ポリマーに導入する反応基は、カルボキシル基やアミノ基の他に、例えば、ビオチン結合性タンパク（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）、プロテインA、プロテインG、抗原、抗体（例えば、抗GST抗体等の公知のtag抗体）などの生理活性物質をあらかじめ固定した態様が可能である。また、ポリマーにアルカンを導入した固定化層を用いれば、脂質などの膜構造を有した生理活性物質を固定することが可能になる。また、用途に応じて、ポリマー鎖の長さ、ポリマーの厚み、ポリマーの密度、あるいは、ポリマーに導入する反応基の量を調整することにより、多様な蛋白に対応することが可能になる。またポリマーに固定基として、NTA（nitrilotriacetic acid）等などを導入すれば、金属キレートを介してHis-tagリガンド等を固定することができる。
【００６８】
上記のようにして得られたバイオセンサー用表面において、上記の官能基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００６９】
本発明のセンサー用基板に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００７０】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００７１】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００７２】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００７３】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。  免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００７４】
これらの生理活性物質は、生理活性物質を含む溶液を親水性高分子化合物が固定された基板上に塗布し、乾燥することによって固定化することが好ましい。
【００７５】
生理活性物質を含む溶液（塗布液）の濃度は、基板表面に固定する生理活性物質の濃度が高い方が好ましい。生理活性物質により異なるが、０.１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬで使用することが好ましく、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬである。
【００７６】
生理活性物質を含む溶液の乾燥過程において、生理活性物質は塗布した溶液の外周部または、塗布液が乾固直前まで液が残った部分に析出する傾向がある。これにより基板表面に固定される生理活性物質の量に分布が発生し好ましくない。基板表面の生理活性物質固定量を均一にするため、塗布液の粘度は生理活性物質の基板表面への結合を阻害しない範囲で高くすることが好ましい。塗布液粘度を高くすることで、乾燥過程における塗布液中の生理活性物質の基板表面に対して水平方向の移動が抑えられ、結果として生理活性物質固定量のばらつきを抑えられる。乾燥過程における塗布液の粘度は０．９ｃＰ以上に保つことが好ましい。
【００７７】
本発明の乾燥する工程とは、生理活性物質を含む溶液の塗布後、その溶液を、静置することによる自然乾燥や、加熱や送風などによって溶液が乾燥する速度を上げ、意図的に乾燥させる工程をいう。ここで、生理活性物質を含む溶液（塗布液）の乾燥速度を上げることは生理活性物質固定量のばらつきを抑えることに効果がある。乾燥速度を上げ、生理活性物質の水平方向の移動速度に対して、十分早く乾燥を終了させることで、生理活性物質が実質的に移動する前に乾燥が終了し、ばらつきを抑えることが可能となる。乾燥速度を上げる方法は特に限定されないが、塗布液温度、乾燥環境温度を上げる、赤外線、レーザーなどの照射で蒸発エネルギーを加える、送風などで乾燥時の溶媒蒸気圧を下げる、溶液を薄層塗布して塗布量に対する蒸発面積を大きくするなどの方法が挙げられる。特に、塗布液が水を含む場合、乾球温度と湿球温度差の大きい環境で乾燥させることで乾燥速度は早くなる。乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境で乾燥させることが好ましく、さらに好ましくは１０℃以上、さらに好ましくは１３．５℃以上である。また、製造工程上、乾燥時間としては１０分以内が好ましく、より好ましくは５分以内、特に好ましくは１分以内である。
【００７８】
生理活性物質を含む溶液を塗布する方法としては、特に塗布液を定量吐出するディスペンサーを使用する方法が挙げられる。ディスペンサーの吐出口を基板上で一定速度、一定間隔で動作させることで基板上の任意の場所に均一塗布することが可能である。ディスペンサーで塗布する場合、基板と吐出口の間隔を極力狭くし、塗布液厚みを薄くすることで生理活性物質の厚みを均一にすることができ、また乾燥速度を上げることができ、好ましい。また生理活性物質を含む溶液を塗布する好ましい方法として、スピンコートも挙げられる。この方法は、特に塗布膜厚を薄くする場合に好ましい。均一厚みの溶液を形成した後に乾燥させるため、スピンコーターは回転中の溶媒の蒸発を防ぐことが好ましい。このため、回転時に基板を密閉容器に入れておくなどの方法で、基板周辺の溶媒濃度が高い環境に保つことで、回転中の薄膜形成と薄膜形成後の乾燥速度を制御できるため、特に好ましい。これらの塗布工程後、温度・湿度を一定に保った条件下で乾燥させることが好ましい。
【００７９】
生理活性物質と被検体物質との相互作用を検出する場合、センサー表面の生理活性物質の固定量の変動は相互作用の定量的、速度論的評価の誤差の原因となる。この誤差を最小限に抑える目的で、生理活性物質の固定量を均一にすることが好ましい。相互作用の検出に使用される基板表面の生理活性物質の固定量のばらつきがＣＶ値（変動係数）（標準偏差／平均値）で１５％以下が好ましく、さらに好ましくは１０％以下である。ＣＶ値は、基板表面の少なくとも２点以上、好ましくは１０点以上、さらに好ましくは１００点以上の固定量から算出することができる。均一性は、生理活性物質を固定する前後のセンサー基板上の物質の量を定量することでも評価可能であるが、生理活性物質と結合することが知られている物質を蛍光標識して、この標識物質をセンサー基板に固定した後に蛍光顕微鏡などを用いて蛍光強度を測定することでも可能である。また、ＳＰＲイメージャー、エリプソメーター、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ、ＡＴＲ−ＩＲ装置などで生理活性物質の定量も可能である。
【００８０】
また、本発明において、基板上に固定化した生理活性物質の保存安定性を向上させる目的で、水素結合を形成しうる残基を有する化合物（以下化合物Sとする）を使用してもよい。
【００８１】
一般に蛋白質などの生理活性物質は水溶液中で水分子が配位することで三次元構造を維持しているが、乾燥されると三次元構造を保持できず失活する。また、基板表面の親水性高分子化合物中に担持されている場合には、乾燥されることで生理活性物質同士が接近し凝集が発生する。本発明の水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水分子に代って生理活性物質の三次元構造を保持することで失活を抑制、または生理活性物質を被覆して立体効果で凝集を抑制する目的で使用することができる。
【００８２】
本発明において水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水溶液で基板上の生理活性物質を固定した層に添加することが好ましい。添加方法としては、生理活性物質との混合溶液として基板表面に塗布しても良く、生理活性物質を基板表面に固定した後オーバーコートなどによりして添加しても良い。化合物Ｓと生理活性物質との混合溶液として塗布した場合、生理活性物質の固定量ばらつきを抑えることもできる。化合物Ｓ水溶液は薄膜状態で基板に添加することが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【００８３】
化合物Ｓの塗布液濃度は塗布性、生理活性物質を含む層への浸透の問題がない範囲で特に限定されないが、０．１重量％以上５重量％以下であることが好ましい。また、塗布液は、塗布性、ｐＨ調整の観点で界面活性剤、緩衝剤、有機溶剤、塩などを添加してもよい。
【００８４】
水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、常温常圧で不揮発性のものが好ましく、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さいものが好ましく、さらに好ましくは１２００以上２００万以下であり、最も好ましくは１２００以上７万以下である。分子内に水酸基を含む化合物Ｓは糖類が好ましく、糖類は、単糖、多糖類でも良い。ｎ糖類の場合ｎが４以上１２００以下であることが好ましく、さらに好ましくはｎが２０以上６００以下である。
【００８５】
化合物Ｓの平均分子量が低いと基板表面で結晶化して、生理活性物質を固定した親水性高分子化合物層の破壊および生理活性物質の三次元構造の破壊の原因となり、反対に平均分子量が高いと生理活性物質の基板への固定の障害となったり、生理活性物質を含む層に含浸できない、層分離を発生するなどの問題が発生する。
【００８６】
基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、デキストラン骨格、又はポリエチレンオキシド骨格を有することが好ましく、本発明の目的を達成する範囲において、どの置換基を使用してもよい。また、基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、解離性基を有しないノニオン性化合物であることが好ましい。また、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは水分子との親和性の高い化合物が好ましく、水とｎ-オクタノールとの分配係数ＬｏｇＰ値が１以上であることが好ましい。ＬｏｇＰ値は、ＪＩＳ規格のＺ７２６０−１０７（２０００）「分配係数（1-オクタノール/水）の測定―振とう法」などに記載の方法で測定することができる。
【００８７】
具体的な水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、ポリビニルアルコールなど多価アルコール類、コラーゲン、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク質、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、デンプン、セルロース、アルギン酸、デキストランなど多糖類、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド、プルロニックなどポリエチレンキシ-ポリプロピレンオキシド縮合物などのポリエーテル類、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０などの２種以上の残基から成る化合物、またはこれら化合物の誘導体および重合体などが挙げられる。多糖類、ポリエーテル類が好ましく、多糖類がより好ましい。具体的には、デキストラン、セルロース、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０が好ましく用いられる。さらに、特開２００６−１７０８３２に記載の不揮発性モノマー、不揮発性水溶性オリゴマーを用いることもできる。例えば不揮発性モノマーとしては水酸基が保護基で保護されていてもよいテトロース、ペントース、ヘプトース、ヘキトース及びそのグリコキシドでも良く、メチルグルコシドや水酸基が保護基で保護されていてもよいサイクリトール類でもよい。また不揮発性水溶性オリゴマーが、式（１）、（２）または（３） -[CH2-CH(CONH2)-]n- （１） -[CH2-CH2-O-]n- （２） -[CH2-CH(OH)-]n- （３）（式（１）〜（３）中、ｎは１０〜２００のいずれかの整数を示す。）で表されるオリゴマー、水酸基が保護基で保護されていてもよいｎ糖（但し、２≦ｎ≦１０）のオリゴ糖を用いることもできる。さらに、US２００３／０１７５８２７、DE２０３０６４７６A1に記載の糖類、例えば、トレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース、キシリトール、フルクトース、マニトール、グルコース、キシロール、マルトデキストラン、サッカロース、ポリビニルピロリドンなどを使用しても良い。また、これらの化合物Ｓは使用している親水性高分子化合物の基本骨格と実質同一であることが好ましい。ここで、基本骨格とは、例えば、糖の環構造のことをいい、官能基や長さが異なっていても、環構造が同一であれば、実質同一であるという。
【００８８】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００８９】
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００９０】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００９１】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００９２】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００９３】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００９４】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００９５】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００９６】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００９７】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００９８】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００９９】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【０１００】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【０１０１】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【０１０２】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【０１０３】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特開２００３−１７２６９４参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【０１０４】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【０１０５】
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【０１０６】
本発明のバイオセンサーは、例えば基板表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を導波路を用いて検出するバイオセンサーとして用いることができる。この場合、基板表面の導波構造物は、回折格子と場合によっては付加層とを有している、この導波構造物は、薄い誘電層からなる平面的な導波体から成る。導波体に集光された光線は全反射によりこの薄い層内に導かれる。この導かれる光波（以降モードと呼ぶ）の伝播速度は、Ｃ／Ｎの値をとる。ここでＣは、真空中での光速であり、Ｎは導波体内を導かれるモードの有効屈折率である。有効屈折率Ｎは、一面では導波体の構成により、他面では薄い導波層に隣接する媒体の屈折率により決まる。光波の伝導は、薄い平面層内のみでなく、別の導波構造物、特にストリップ状の導波体によっても行われる。その場合は、導波構造物はストリップ状のフィルムの形状にされる。有効屈折率Ｎの変化は、導波層に隣接する媒体の変化と導波層自身もしくは導波層に隣接する付加層の屈折率および厚さの変化とにより生じることがバイオセンサーにとって重要な要素である。この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平６−２７７０３号公報４ページ４８行目から１４ページ１５行目および第１図から第８図に記載されている。
【０１０７】
例えば、一つの実施形態として、薄層が平面状の導波路層が基材（たとえばパイレックス（登録商標）・ガラス）上に設けられている構造がある。導波路層と基材とは、一緒にいわゆる導波体を形成する。導波路層は、たとえば酸化物層（ＳｉＯ２，ＳｎＯ２、Ｔａ２Ｏ５，ＴｉＯ２，ＴｉＯ２-ＳｉＯ２，ＨｆＯ２，ＺｒＯ２，Ａｌ２Ｏ３，Ｓｉ３Ｎ４，ＨｆＯＮ，ＳｉＯＮ，酸化スカンジウムまたはこれらの混合物）、プラスチック層（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなど）、など多層の積層体が可能である。光線が全反射により導波路層内を伝播するには、導波路層の屈折率が隣接媒体（たとえば基材や後述の付加層）の屈折率より大でなければならない。基材もしくは測定物質に向いた導波路層表面もしくは導波路層体積内には、回折格子が配置されている。回折格子は、型押し、ホログラフィまたはその他の方法によって基板内に形成することができる。次いでより高い屈折率を有する薄い導波路膜を回折格子の上表面に被覆する。回折格子は導波路層への入射光線を集束したり、既に導波路層内を導かれているモードを放出したり、そのモードの一部を進行方向へ透過させ、一部を反射させたりする機能を持つ。導波路層は、格子域を付加層でカバーしておく。付加層は必要に応じて多層膜とすることができる。この付加層は、測定物質に含まれている物質の選択的検知を可能にする機能を持たせることができる。好ましい態様として付加層の最表面に、検知機能を持つ層を設けることができる。このような検知機能を持つ層として、生理活性物質を固定化し得る層を用いることができる。
【０１０８】
別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表2007-501432）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。
【０１０９】
回折格子導波路は、回折格子導波路の上層（検知領域）上の生理活性物質検出を可能にするために、入射光線、および反射光を検出して屈折特性の変化を検出する。この目的のため、１つまたはそれより多くの光源（例えば、レーザ、ダイオード）及び１つまたはそれより多くの検出器（例えば、分光計、ＣＣＤカメラまたはその他の光検出器）を用いることができる。屈折率変化を測定するための方法として、２つの異なる動作モード−分光法、及び角度法がある。分光法においては、入射光として広帯域ビームが回折格子導波路に送られ、反射光が集められて、例えば分光計で測定される。共鳴波長（ピーク）のスペクトル位置を観測することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。また、角度法においては、公称上単一波長の光がある範囲の照射角を生じるように集束されて、回折格子導波路内に向けられる。反射光がＣＣＤカメラまたはその他の光検出器によって測定される。回折格子導波路によって反射された共鳴角の位置を測定することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。
【０１１０】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１１１】
以下の装置を用いて実験を行った。
【０１１２】
本実施形態のスクリーニング装置としてのバイオセンサー１０は、金属膜の表面に発生する表面プラズモンを利用して、生理活性物質Ｄと化合物との相互作用を測定する、いわゆる表面プラズモンセンサーである。本実施形態では、このバイオセンサー１０を、生理活性物質Ｄと特異的に結合する化合物を大量の化合物Ａの中から選別するために使用される。
【０１１３】
図１に示すように、バイオセンサー１０は、トレイ保持部１２、搬送部１４、容器載置台１６、液体吸排部２０、光学測定部５４及び制御部６０を備えている。
【０１１４】
トレイ保持部１２は、載置台１２Ａ及びベルト１２Ｂを含んで構成されている。載置台１２Ａは、矢印Ｙ方向に架け渡されたベルト１２Ｂに取り付けられており、ベルト１２Ｂの回転により矢印Ｙ方向に移動可能とされている。載置台１２Ａ上には、２枚のトレイＴが位置決めして載置される。トレイＴには、センサースティック４０が８本収納されている。センサースティック４０は、生理活性物質Ｄが固定されるチップであり、詳細については後述する。載置台１２Ａの下には、センサースティック４０を後述するスティック保持部材１４Ｃの位置まで押し上げるための押上機構１２Ｄが配置されている。
【０１１５】
センサースティック４０は、図２及び図３に示すように、誘電体ブロック４２、流路部材４４、及び、保持部材４６、で構成されている。
【０１１６】
誘電体ブロック４２は、光ビームに対して透明な透明樹脂等で構成されており、断面が台形の棒状とされたプリズム部４２Ａ、及び、プリズム部４２Ａの両端部にプリズム部４２Ａと一体的に形成された被保持部４２Ｂを備えている。プリズム部４２Ａの互いに平行な２面の内の広い側の上面には、金属膜５７が形成されている。誘電体ブロック４２は、いわゆるプリズムとして機能し、バイオセンサー１０での測定の際には、プリズム部４２Ａの対向する互いに平行でない２つの側面の内の一方から光ビームが入射され、他方から金属膜５７との界面で全反射された光ビームが出射される。
【０１１７】
金属膜５７の表面には、図４に示すように、リンカー層５７Ａが形成されている。リンカー層５７Ａは、生理活性物質Ｄを金属膜５７上に固定化するための層である。
【０１１８】
プリズム部４２Ａの両側面には、上側の端辺に沿って保持部材４６と係合される係合凸部４２Ｃが形成されている。また、プリズム部４２Ａの下側には、側端辺に沿って図示しない搬送用レールと係合されるフランジ部４２Ｄが形成されている。
【０１１９】
図３に示すように、流路部材４４は、６個のベース部４４Ａを備え、ベース部４４Ａの各々に４本の円筒部材４４Ｂが立設されている。ベース部４４Ａは、３個のベース部４４Ａ毎に、立設された円筒部材４４Ｂのうちの１本の上部が連結部材４４Ｄによって連結されている。流路部材４４は、軟質で弾性変形可能な材料、例えば非晶質ポリオフィレンエラストマーで構成されている。
【０１２０】
ベース部４４Ａには、図５及び図６に示すように、底面側に略Ｓ字状の２本の流路溝４４Ｃが形成されている。流路溝４４Ｃは、端部の各々が１の円筒部材４４Ｂの中空部と連通されている。ベース部４４Ａは、底面が誘電体ブロック４２の上面と密着され、流路溝４４Ｃと誘電体ブロック４２の上面との間に構成される空間と前記中空部とで、液体流路４５が構成される。１個のベース部４４Ａには、２本の液体流路４５が構成される。各々の液体流路４５において、円筒部材４４Ｂの上端面に液体流路４５の出入口４３が構成される。
【０１２１】
ここで、２本の液体流路４５のうち、１本は測定流路４５Ａとして用いられ、他の１本は参照流路４５Ｒとして用いられる。測定流路４５Ａの金属膜５７上には生理活性物質Ｄが固定され、参照流路４５Ｒの金属膜５７上には生理活性物質Ｄが固定されない状態で測定が行われる。測定流路４５Ａ及び参照流路４５Ｒには、図５に示すように、各々光ビームＬ１、Ｌ２が入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、ベース部４４Ａの中心寄りに配置されるＳ字の屈曲部分に照射される。以下、流路４５Ａにおける光ビームＬ１の照射領域を測定領域Ｅ１、流路４５Ｒにおける光ビームＬ２の照射領域を参照領域Ｅ２という。参照領域Ｅ２は、生理活性物質Ｄの固定された測定領域Ｅ１から得られるデータを補正するための測定を行う領域である。
【０１２２】
保持部材４６は、長尺とされ、上面部材４７及び２枚の側面板４８が蓋状に構成された形状とされている。側面板４８には、誘電体ブロック４２の係合凸部４２Ｃと係合される係合孔４８Ｃ、及び、光ビームＬ１、Ｌ２の光路に対応する部分に窓４８Ｄが形成されている。保持部材４６は、係合孔４６Ｃと係合凸部４２Ｃとが係合されて、誘電体ブロック４２に取り付けられる。なお、流路部材４４は、後述するように保持部材４６と一体成形されており、保持部材４６と誘電体ブロック４２の間に配置される。
【０１２３】
上面部材４７には、流路部材４４の円筒部材４４Ｂに対応する位置に、受部４９が形成されている。受部４９は、図４に示すように、略円筒状とされ、中空の下部分に円筒部材４４Ｂが配置されている。また、前記中空の円筒部材４４Ｂよりも上側に、出入口４３と連通する凹部４９Ａが構成されている。凹部４９Ａには、ピペットチップ５０が挿入される。
【０１２４】
保持部材４６は、流路部材４４よりも硬質の材料、例えば、晶質ポリオフィレンで構成されている。
【０１２５】
ピペットチップ５０は、図６に示すように、略錐筒状とされ、先端部５１、本体部５２、及び保持部５３で構成されている。先端部５１は円筒状とされ、挿入方向の最先端に液体を吐出または吸入する開口５１Ａが構成されている。本体部５２は、先端部５１より外周が大径の錐筒状とされ、先端部５１との間に外周段差部５２Ａが構成されている。外周段差部５２Ａは、先端部５１側が小径のテーパー状とされている。保持部５３は、本体部５２よりも外周が大径とされ、本体部５２との間に保持段差部５３Ａが構成されている。保持段差部５３Ａは、不図示の保持孔の構成された上面板を有するピペットチップストッカにピペットチップ５０を保持する際に用いられる部分である。
【０１２６】
受部４９の凹部４９Ａは、流路部材４４側の第１内壁部４９Ｂ及び、第２内壁部４９Ｃで囲まれて構成されている。第１内壁部４９Ｂは、ピペットチップ５０の挿入方向Ｚが、ピペットチップ５０の先端部５１よりも僅かに長く、先端部５１の外径よりも僅かに大径とされ、先端部５１に沿った形状とされている。
【０１２７】
第２内壁部４９Ｃは、第１内壁部４９Ｂとの間の内周段差部４９Ｄ、内周段差部４９Ｄと隣接する中央内壁部４９Ｅ、最上部の上部内壁部４９Ｆで構成されている。内周段差部４９Ｄは、第１内壁部４９Ｂから連続され、ピペットチップ５０の外周段差部５２Ａに沿って上方が大径となるテーパー状とされている。中央内壁部４９Ｅは、内周段差部４９Ｄと連続され、ピペットチップ５０の上方が大径となるテーパー状とされている。上部内壁部４９Ｆは、中央内壁部４９Ｅと連続され、ピペットチップ５０の上方がさらに大径となるテーパー状とされている。
【０１２８】
保持部材４６と流路部材４４とは、同一金型内で異材料同士を組み合わせて成形する、いわゆる二色成形法（ダブルモールド）によって一体成形されている。
【０１２９】
図１に示すように、バイオセンサー１０の搬送部１４は、上部ガイドレール１４Ａ、下部ガイドレール１４Ｂ、及び、スティック保持部材１４Ｃ、を含んで構成されている。上部ガイドレール１４Ａ及び下部ガイドレール１４Ｂは、トレイ保持部１２及び光学測定部５４の上部で、矢印Ｙ方向と直交する矢印Ｘ方向に水平に配置されている。上部ガイドレール１４Ａには、スティック保持部材１４Ｃが取り付けられている。スティック保持部材１４Ｃは、センサースティック４０の両端部の被保持部４２Ｂを保持可能とされていると共に、上部ガイドレール１４Ａに沿って移動可能とされている。スティック保持部材１４Ｃに保持されたセンサースティック４０の係合溝４２Ｅと下部ガイドレール１４Ｂとが係合され、スティック保持部材１４Ｃが矢印Ｘ方向に移動することにより、センサースティック４０が光学測定部５４上の測定部５６に搬送される。また、測定部５６には、測定時にセンサースティック４０を押さえる押さえ部材５８が備えられている。押さえ部材５８は、図示しない駆動機構によりＺ方向に移動可能とされ、測定部５６に配置されたセンサースティック４０を上側から押圧する。
【０１３０】
容器載置台１６には、アナライト溶液プレート１７、バッファー液ストック容器１８、廃液容器１９が載置されている。アナライト溶液プレート１７は、マトリクス状に区画されており、各種のアナライト溶液がストックされている。バッファー液ストック容器１８は、複数の容器で構成されており、複数種類の異なる屈折率のバッファー液がストックされている。バッファー液ストック容器１８には、後述するピペットチップ５０を挿入可能な開口Ｋが形成されている。廃液容器１９は、複数の容器で構成されており、バッファー液ストック容器と同様にピペットチップ５０を挿入可能な開口Ｋが形成されている。
【０１３１】
液体吸排部２０は、図１に示すように、ヘッド２４、及び、吸排駆動部２６を含んで構成されている。ヘッド２４は、図示しない搬送レールに沿って矢印Ｙ方向（図１参照）に移動可能とされている。また、ヘッド２４は、ヘッド２４内部の図示しない駆動機構により、鉛直方向（矢印Ｚ方向）にも移動可能とされている。
【０１３２】
ヘッド２４での液体流路４５への液体の供給は、２本のピペットチップ５０を１つの液体流路４５の２つの開口へ各々挿入し、一方のピペットチップ５０から液体を吐出させると共に、他方のピペットチップ５０で液体流路４５中の液体を吸引することにより行われる。
【０１３３】
なお、本実施形態においてはセンサースティック４０への液体供給はピペットチップ５０により行われるが、ピペットチップの代わりに、一端が上記各溶液プレートに接続され、他端がセンサースティック４０に接続可能とされたインジェクションチューブを設け、送液ポンプにより液体の供給を行ってもよい。
【０１３４】
光学測定部５４は、図７に示すように、光源５４Ａ、第１光学系５４Ｂ、第２光学系５４Ｃ、受光部５４Ｄ、信号処理部５４Ｅを含んで構成されている。光源５４Ａからは、発散状態の光ビームＬが出射される。光ビームＬは、第１光学系５４Ｂを介して、２本の光ビームＬ１、Ｌ２となり、測定部５６に配置された誘電体ブロック４２の測定領域Ｅ１と参照領域Ｅ２に入射される。測定領域Ｅ１及び参照領域Ｅ２において、光ビームＬ１、Ｌ２は、金属膜５０と誘電体ブロック４２との界面に対して種々の入射角成分を含み、かつ全反射角以上の角度で入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、誘電体ブロック４２と金属膜５０との界面で全反射される。全反射された光ビームＬ１、Ｌ２も、種々の反射角成分をもって反射される。この全反射された光ビームＬ１、Ｌ２は、第２光学系５４Ｃを経て受光部５４Ｄで受光されて、各々光電変換され、光検出信号が信号処理部５４Ｅへ出力される。信号処理部５４Ｅでは、入力された光検出信号に基づいて所定の処理が行なわれ、測定領域Ｅ１の測定データＧ１及び参照領域Ｅ２の参照データＧ２が求められる。この測定データＧ１、参照データＧ２が制御部６０へ出力される。
【０１３５】
制御部６０は、バイオセンサー１０の全体を制御する機能を有し、図７に示すように、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ及びバイオセンサー１０の図示しない駆動系と接続されている。制御部６０は、図８に示すように、バスＢを介して互いに接続される、ＣＰＵ６０Ａ、ＲＯＭ６０Ｂ、ＲＡＭ６０Ｃ、メモリ６０Ｄ、及びインターフェースＩ／Ｆ６０Ｅを有し、各種の情報を表示する表示部６２及び、各種の指示、情報を入力するための入力部６４と接続されている。
【０１３６】
メモリ６０Ｄには、バイオセンサー１０を制御するための各種プログラムや、各種データが記憶されている。
【０１３７】
〔実施例〕
（１）酸化珪素表面基板の作成
ゼオネックス（日本ゼオン社製）を射出成形して得られた誘電体ブロック基板に、平行平板型６インチ用スパッタ装置（アルバック（株）社製ＳＨ−５５０）を用いて基板上にクロムの厚さが２ｎｍ、さらにクロム上に金の厚さが５０ｎｍになるようにスパッタ製膜を行った。続いて金上に酸化珪素の厚さが２０ｎｍとなるようにスパッタ製膜を行った。
【０１３８】
（２）シランカップリング剤表面基板の作成
（１）で作成した金表面基板に対して、エタノール／塩酸(１０ｍＮ)（９／１：容量比）で溶解した３−アミノプロピルトリエトキシシラン（和光純薬工業製）の０．１％溶液を接触させ、５０℃で１２分表面処理を行った。その後、１０％エタノール水で３回洗浄を行った。
【０１３９】
（３）ＣＭＤ表面基板の作成
次に、１％のカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ；名糖産業製：分子量100万、置換度0.59）溶液10g(カルボキシル基量：２．８×１０-4mol)に、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド２×１０-5Ｍ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５×１０-5Ｍ）を含む水溶液10mlを加え、室温で1時間攪拌した。（２）で成された基板の上に、前記攪拌溶液を1ml滴下し、密閉式インナーカップを有するスピンコーター（Model408(特)、ナノテック社製）のインナーカップ上に回転中心から半径１３５ｍｍの位置に円弧の接線方向が基板の長軸方向となるように固定した。１０００ rpmで45 秒スピンコートすることで、シランカップリング剤表面基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で15分間反応させた後、1 N NaOH水溶液に30分浸漬し、超純水で5回洗浄することで、ＣＭＤ表面基板を作成した。
【０１４０】
（４）基板表面への非特異吸着防止性評価
バイオセンサー表面に対する非特異的な蛋白質の吸着はノイズの原因となるため、極力少ないほうが好ましい。作製したＣＭＤ表面基板を表面プラズモン共鳴測定装置に設置して、CGP-74514A Hydrochloride（シグマ社製）の非特異吸着性を測定した。１０ｖｏｌ％ ＤＭＳＯのＨＢＳ−Ｎバッファー（ビアコア社製）溶液を基板に添加し２０分間静置後、CGP-74514A Hydrochloride溶液（１０μＭ、１０ｖｏｌ％ＤＭＳＯ ＨＢＳ−Ｎバッファー溶液）を基板に添加し１０分間静置した。なお、HBS-Nバッファーの組成は、ＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid）0.01mol/l（ｐＨ7.4）、ＮａＣｌ0.15mol/lである。１０間静置後の共鳴シグナル（RU値）変化量をCGP-74514A Hydrochlorideの非特異吸着量とした。測定結果を表１に示した。
【０１４１】
表１に示した結果から、本発明の基板を用いたバイオセンサーは、低分子化合物の非特異吸着が非常に少ないことが表面プラズモン共鳴で確認できた。
【０１４２】
（５）基板表面への生理活性物質固定性能評価
（３）で作成したＣＭＤ表面基板を表面プラズモン共鳴測定装置に設置して、１−エチルー２、３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（２００ｍＭ）と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５０ｍＭ）との混合液を３０分接触させ、次に５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４.５、ビアコア社製）で洗浄した。次に、ＰｒｏｔｅｉｎＡ（ナカライテスク社製）溶液（１００μｇ／ｍＬ、５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４.５）を３０分間接触させ、その後５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４.５）で洗浄した。
【０１４３】
さらに、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液（１Ｍ、ｐＨ８.５）を３０分間接触させた後、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４.５）で洗浄することにより、ＰｒｏｔｅｉｎＡと反応せずに残存した活性化ＣＯＯＨ基をブロックした。
【０１４４】
さらに、ＮａＯＨ水溶液（１０ｍＭ）を１分間接触させた後、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＨＥＰＥＳ(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid)０.０１ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７.４）、ＮａＣｌ ０.１５ｍｏｌ／Ｌ、ＥＤＴＡ ０.００３ｍｏｌ／Ｌ、ｓｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０ ０.００５重量％、ビアコア社製）で洗浄することにより、スピンコートチップ表面に非特異的に吸着しているＰｒｏｔｅｉｎＡを除去した。ＰｒｏｔｅｉｎＡ溶液に接触前の共鳴シグナル（RU値）に対するＮａＯＨ水溶液接触後ＨＢＳ−ＥＰバッファー中の共鳴シグナル（RU値）変化量をＰｒｏｔｅｉｎＡ固定量とした。測定結果を表１に示した。
【０１４５】
表１に示した結果から、本発明の基板を用いたバイオセンサーは、生理活性物質を良好に固定したことが表面プラズモン共鳴で確認できた。
【０１４６】
〔比較例１〕
（１）シランカップリング剤表面基板（比較）の作成
実施例（１）で作成の酸化珪素表面基板に、３−アミノプロピルトリエトキシシランの代りに(ＣＨ3Ｏ)3ＳｉＣ3Ｈ6ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨを使用したこと以外は実施例（２）と同じ操作で比較例のシランカップリング剤表面基板を作成した。
【０１４７】
実施例の（４）、（５）の性能評価を行い、結果を表１に示した。
【０１４８】
〔比較例２〕
ゼオネックス（日本ゼオン社製）を射出成形して得られた誘電体ブロック基板に、平行平板型６インチ用スパッタ装置（アルバック（株）社製ＳＨ−５５０）を用いて基板上にクロムの厚さが２ｎｍ、さらにクロム上に金の厚さが５０ｎｍになるようにスパッタ製膜を行った。この誘電体ブロック基板を、6-Amino-1-octanethiol, hydrochloride（同仁化学社製）の1mM水溶液に40℃１時間浸漬し、超純水で5回洗浄した。
【０１４９】
実施例１の（３）と同様の方法で比較例２のＣＭＤ表面基板を作成した。
【０１５０】
実施例の（４）、（５）の性能評価を行い、結果を表１に示した。
【０１５１】
【表１】
2008209379.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】本実施形態にかかるバイオセンサーの全体斜視図である。
【図２】本実施形態にかかるセンサースティックの斜視図である。
【図３】本実施形態のセンサースティックの分解斜視図である。
【図４】本実施形態のセンサースティックの１の液体流路部分の断面図である。
【図５】本実施形態のセンサースティックの測定領域、参照領域へ光ビームが入射している状態を示す図である。
【図６】本実施形態にかかるピペットの斜視図である。
【図７】本実施形態にかかるバイオセンサーの光学測定部付近の概略図である。
【図８】本実施形態にかかる制御部とその周辺の概略ブロック図である。
【符号の説明】
【０１５３】
１０ バイオセンサー
１２  トレイ保持部
１２Ａ  載置台
１２Ｂ  ベルト
１２Ｄ  押上機構
１４  搬送部
１４Ａ  上部ガイドレール
１４Ｂ  下部ガイドレール
１４Ｃ  スティック保持部材
１６  容器載置台
１７  アナライト溶液プレート
１８  バッファー液ストック容器
１９  廃液容器
２０  液体吸排部
２４  ヘッド
２６  吸排駆動部
４０  センサースティック
４２  誘電体ブロック
４２Ａ  プリズム部
４２Ｂ  被保持部
４２Ｃ  係合凸部
４２Ｄ  フランジ部
４２Ｅ  係合溝
４３  出入口
４４  流路部材
４４Ａ  ベース部
４４Ｂ  円筒部材
４４Ｃ  流路溝
４４Ｄ  連結部材
４５  液体流路
４５Ａ  測定流路
４５Ｒ  参照流路
４６  保持部材
４６Ｃ  係合孔
４７  上面部材
４８  側面板
４８Ｃ  係合孔
４８Ｄ  窓
４９  受部
４９Ａ  凹部
４９Ｂ  第１内壁部
４９Ｃ  第２内壁部
４９Ｄ  内周段差部
４９Ｅ  中央内壁部
４９Ｆ  上部内壁部
５０  ピペットチップ
５１  先端部
５１Ａ  開口
５２  本体部
５２Ａ  外周段差部
５３  保持部
５３Ａ  保持段差部
５４  光学測定部
５４Ａ  光源
５４Ｂ  第１光学系
５４Ｃ  第２光学系
５４Ｄ  受光部
５４Ｅ  信号処理部
５６  測定部
５７  金属膜
５７Ａ  リンカー層
５８  押さえ部材
６０Ｄ  メモリ
６０  制御部
６０Ａ  ＣＰＵ
６０Ｂ  ＲＯＭ
６０Ｃ  ＲＡＭ
６０Ｄ  メモリ
６０Ｅ  インターフェースＩ／Ｆ
６２  表示部
６４  入力部
Ｂ  バス
Ｄ  生理活性物質
Ｅ１  測定領域
Ｅ２  参照領域
Ｌ１  光ビーム
Ｌ２  光ビーム
Ｔ  トレイ
Ｇ１  測定データ
Ｇ２  参照データ
【図１】
2008209379.tif 000018
【図２】
2008209379.tif 000019
【図３】
2008209379.tif 000020
【図４】
2008209379.tif 000021
【図５】
2008209379.tif 000022
【図６】
2008209379.tif 000023
【図７】
2008209379.tif 000024
【図８】
2008209379.tif 000025