(57)【要約】【課題】新規な抗植物ウイルス剤の提供。【解決手段】マツタケ80％硫安塩析抽出物を含んでなる抗植物ウイルス剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マツタケ菌を培養して菌糸を形成させ、当該菌糸を破砕して上清を得、この上清を80％飽和の塩析にかけ、それにより生ずる沈澱物から回収される、マツタケの80％硫安塩析抽出物を含んでなる抗植物ウイルス剤。
【請求項２】
請求項１に記載のマツタケの80％硫安塩析抽出物を植物に適用することを特徴とする、ウイルス感染から植物を防護する方法。
【請求項３】
請求項１に記載のマツタケの80％硫安塩析抽出物の製造方法において、
（１）マツタケ菌を培養して菌糸を形成させ、
（２）当該菌糸を破砕して上清を得、
（３）この上清を80％飽和の塩析にかけ、そして
（４）上記の塩析により生ずる沈澱物から回収する、
ことを含んで成る方法。
【請求項４】
前記の回収工程を、前記沈殿物を緩衝液に溶解し、得られる溶液を緩衝液に対して透析して硫安を除去することにより行う、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗植物ウイルス剤及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の病原体の分類と割合をいうと、約80%が菌類であり、約10%は細菌、さらに残りの約10%はウイルス、ウイロイド、ファイトプラズマ、線虫などである。植物ウイルスは病原体の中でわずかな割合しか占めていない。しかし、植物ウイルス病は殻類や野菜類、果樹類などの重要作物に深刻な被害を与えている。植物細胞に侵入したウイルスは、全面的に細胞の代謝に依存して増殖するため、抗ウイルス剤の場合には攻撃目標とする特異的な代謝経路を見つけることが容易ではない。
【０００３】
植物ウイルスは、傷や媒介虫により植物細胞内に侵入すると外被タンパク質の一部が壊れ、粒子内部のゲノム核酸が裸出する脱外被を行う。その後、宿主植物の代謝経路を利用してゲノムRNAの複製や各種タンパク質の発見を行い、細胞間移行と長距離移行を経て植物全体に広がっていく。ウイルス増殖阻害する同時に植物にも薬害を及ぼす（久能ら、1998）。植物ウイルスは各種の代謝過程を完全に宿主植物に依存しているため、植物の代謝経路を正常に保ったままウイルスの増殖のみを特異的に阻害することは困難である。このため、植物ウイルス病は難防除病害とされている( Francki et al，1979 )。
【０００４】
植物病害のうちで、ウイルス病に対する防除薬剤を開発することはきわめて難しい。抗ウイルス剤には増殖阻害剤と感染阻害剤の2種が考えられ、前者はブラストサイジンS（BcS）、リボソーム不活性化タンパク(ribosome inactivating proteins:RIPs)などがあるが、残念ながら薬害もある。後者は予防剤としてスキムミルクやアルギン酸ソーダなどがあるが、感染後のウイルス増殖を阻害する効果はない。そのため実用的な抗ウイルス剤は現在まで開発されていない。
【０００５】
最近、マイタケから抗ウイルス性タンパクが抽出された報告があった。マイタケの干し物を磨り潰し、硫安塩析で抽出した。その抽出物をゲル濾過でさらに精製すると、Grifola frondosa antiviral protein(GFAP)が得られた。GFAPはTMV感染阻害タンパクであり、Cysを含有し、熱に安定であることがわかった(Chenら、2004)。
【０００６】
【非特許文献１】平井篤造  ( 1979).  ウイルスと植物.  南江堂.
【非特許文献２】久能均・白石友紀・高橋壮・露無慎二・眞山滋志 ( 1998 ). 新編  植物病理学概論.  養賢堂.
【非特許文献３】M. Fujiwara, te al.( 2001), J. Gen. Plant Pathology. 67:159-163.
【非特許文献４】R. I. B. Francki, te al. ( 1979 ). CMI/AAB Description of Plant Virus July 1979 No,213.
【非特許文献５】N. Chen, et al., ( 2004 )., Prog. Biochem. Biophys. ( 2004 ): 31(3)283-286.
【非特許文献６】Z. C. Chen, et al. ( 1991 )., Plant Pathology 40:612-620.
【非特許文献７】T. Hirai, et al,. ( 1966 )., Phytopathology 56:1236-1239.
【非特許文献８】K. Tomaru and et al., (1975 ), Ann. Phytopath. Soc. Japan 41:155-161.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、実用的な、抗植物ウイルス剤を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
実用的な抗ウイルス物質を探索するために、本研究ではキノコ菌糸抽出物を候補物質として用い、その選抜と作用機構の解析に試みた。候補物質から抗ウイルス活性を示すものをキュウリモザイクウイルス(Cucumber mosaic virus:CMV)とササゲを用いて選抜した結果、マツタケ80%硫安塩析抽出物が高い感染阻害効果を示した。植物ウイルスの一つであるCMV は、Bromoviridae 科 Cucumovirus 属に属し、直径28~30nmの粒子形態をとっている。CMVは40科191種以上の植物に感染し、植物ウイルスの中でもっとも広い宿主範囲を持つウイルスの一つである( Francki et al，1979 )。
【０００９】
従って、本発明は、マツタケ菌を培養して菌糸を形成させ、当該菌糸を破砕して上清を得、この上清を80％飽和の塩析にかけ、それにより生ずる沈澱物から回収される、マツタケの80％硫安塩析抽出物を含んでなる抗植物ウイルス剤を提供する。
本発明はまた、上記のマツタケの80％硫安塩析抽出物を植物に適用することを特徴とする、ウイルス感染から植物を防護する方法を提供する。
【００１０】
本発明は更に、前記のマツタケの80％硫安塩析抽出物の製造方法において、
（１）マツタケ菌を培養して菌糸を形成させ、
（２）当該菌糸を破砕して上清を得、
（３）この上清を80％飽和の塩析にかけ、そして
（４）上記の塩析により生ずる沈澱物から回収する、
ことを含んで成る方法を提供する。好ましくは、前記の回収工程は、前記沈殿物を緩衝液に溶解し、得られる溶液を緩衝液に対して透析して硫安を除去することにより行う。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
Ｉ．活性成分
１．マツタケの80％硫安塩析抽出物
マツタケの80％硫安塩析抽出物は、下記のようにして調製することが出来る。（１）マツタケ菌を培養して菌糸を形成させ、（２）当該菌糸を破砕して上清を得、（３）この上清を80％飽和の塩析にかけ、そして（４）上記の塩析により生ずる沈澱物から回収する。
【００１２】
マツタケ（Tricholoma matsutake）の菌糸は、当該菌糸が増殖しうる任意の培地で培養することが出来る。具体例として、後に述べる浜田氏培地が挙げられる。培養は、菌糸株の保存と増殖のためには、固体培地（例えば、寒天培地）を用い、表面培養を行う。活性成分の生産のための培地としては液培地が好ましく、例えば下記の浜田氏液体培地が上げられる。培養は好気的条件下で行う必要があり、液体培地上での表面静置培養が好ましい。また、液体培地中で、振とう、通気、撹拌などの常用の手段による好気的条件下で培養を行うことも出来る。
【００１３】
マツタケの菌糸を液体表面培養により培養する場合、本発明の抗ウイルス活性成分は、主とした菌体内に蓄積される。このため、活性成分を含むマツタケの80％硫安塩析抽出物を得るには、先ず、培養液から菌糸を回収する。菌糸の回収方法は、濾過、遠心分離など、液体培地から菌糸（菌体）を回収するために常法を用いることが出来る。
次に、回収した菌糸を破砕する。この方法も、ミキサーや、その他の常用の菌体破砕手段を用いて行うことが出来る。
【００１４】
次に、菌体破砕物から菌体端破片を除去して上清、即ち菌体破砕物から菌体破片等の不溶物を除去した液体を得る。この場合も、濾過、遠心分離など、常用の固液分離手段を用いることが出来る。
【００１５】
次に、この上清に硫安を加えて硫安濃度を80％飽和にすることにより塩析を行い、これにより週ずる沈澱を得る。次に、この沈澱を水又は適当な緩衝液に溶解し、更に水又は適当な緩衝液に対して透析することにより硫安を除去する。この場合の緩衝液のpHは6〜7である。これにより本発明の「マツタケの80％硫安塩析抽出物」が得られる。この抽出物は、そのまま低温保存、例えば凍結保存することが出来、また凍結乾燥などの手段により固体にして保存することも出来る。
【００１６】
本発明のマツタケの80％硫安塩析抽出物は100℃で10分間加熱しても、抗ウイルス活性を殆ど失わない。従って、抗ウイルス活性の本体は低分子物質であると予想される。更に、活性成分が低分子物質であることは、ゲル濾過法によっても確認される。
【実施例】
【００１７】
次に、実施例により、本発明を更に具体的に説明する。
II．材料と方法
１．マツタケの80％硫安塩析抽出物の調製
マツタケ菌糸を浜田氏平板培地（水道水  1000 mL；ブドウ糖  20 ｇ；エビオス粉末  ５ ｇ；pH＝5.1〜5.2；寒天  20 ｇ）上で30日間24℃で培養し菌糸を増殖させた。この菌糸を、200 mL 容の三角フラスコ中の20 mLの浜田氏液体培地（水道水  1000 mL；ブドウ糖  20 ｇ；エビオス粉末  ５ ｇ；pH＝5.1〜5.2）に接種し、24℃にて60日間静置培養し、液体培地表面に菌糸を増殖させた。
【００１８】
上記の培養液を、ブフナー漏斗（No.２濾紙；Advantec製）により濾過してマツタケ菌糸を回収し、20 mM Tris−HCl（pH 7.0）緩衝液に懸濁し、ミキサーを用いて粉砕した。粉砕した菌体を遠心分離（12,000 rpm, 20分間）にかけ、上清を回収した。この上清液に80％飽和になるように硫安を加えて塩析を行った。塩析後、沈殿物を遠心分離（12,000 rpm, 20分間）により回収し、20 mM Tris−HCl（pH＝7.0）緩衝液に溶解し、この溶液を20 mM Tris−HCl（pH＝7.0）緩衝液を用いて透析し、これを「マツタケの80％硫安塩析抽出物」とした。
【００１９】
前記マツタケの80％硫安塩析抽出物の熱に対する性質を調べた。非加熱の「マツタケの80％硫安塩析抽出物」と、100℃にて10分間加熱した「マツタケの80％硫安塩析抽出物」とについて、ササゲを用いるアッセイ系において、ウイルス感染阻害率を調べた。その結果、加熱しても90％以上（92％）のウイルス感染阻害率が維持された。このことから、「マツタケの80％硫安塩析抽出物」中の活性成分は熱に安定な低分子性物質であることが示唆された。
更に、Sephadex G-75を用いたゲル濾過によっても、阻害物質が低分子の物質であることが確認された。
【００２０】
２．供試植物
ササゲ(Vigna sesquipedalis cv. kurodane sanjaku)
バーミキュライトを満たした平鉢に播種し、温室内に置いて発芽した苗をセルトレイに移植して育苗した。実験には初生葉が十分に展開したものを、直径9 cmのプラスチックポットに移植し用いた。
タバコ(Nicotiana tabacum cx. Xanthi nc)
バーミキュライトを満たした平鉢に播種し、温室内に置いて発芽した苗をセルトレイに移植して育苗した。2~3週間後に、鉢に1個体ずつ定植し、7~8葉期のものを実験に使用した。
【００２１】
３．供試ウイルス
CMVのpepo系統
1973年に尾崎らが和歌山県で採種した、モザイク症状を示すペポカボチャより分離した。サテライトRNAを含まない病原力の強い分離株である。ラグナリア系統群、サブグループＩに属する。
【００２２】
４．CMV純化法
CMV接種後7日目のタバコ接種葉を−80℃下で凍結し、ミキサーで磨砕した。凍結感染葉5 gに対し100 mlの抽出バッファー〔0.5Mクエン酸、0.01Mエチレンジアミン-4-酢酸-2-ナトリウム（EDTA）；pH6.5，0.1%チオグリコール酸ナトリウム〕を加え、撹拌した。これを氷冷下で5分間静置した後、10,000 rpmで15分間の遠心分離を行い、上清を得た。この上清に8%（ｗ/v）のポリエチレングリコール6000（PEG）を加え、4℃下で完全に融解させ、10,000 rpmで15分間の遠心分離を行い、ウイルス沈殿を得た。この沈殿をBEバッファー（0.005Mホウ酸；pH9.0，0.01M EDTA）で懸濁し、10,000 rpmで10分間の遠心分離をおこない、夾雑物を除去した。この操作を2、3回おこない、上清を得た。
【００２３】
この上清に1% Triton Xを加え、40,000 rpmで60分間の遠心分離をおこない、ウイルス沈殿を得た。沈殿をBEバッファーで懸濁し、10,000 rpmで10分間の遠心分離をおこない、夾雑物を除去した。この操作を2、3回おこない、上清を得た。この上清を42,000 rpmで90分間遠心分離し、得られたウイルス沈殿を0.005Mホウ酸バッファー（pH9.0）で懸濁した。この懸濁液に対し、10,000 rpmで10分間の遠心分離をおこない、夾雑物を除去した。この操作を2、3回おこない、上清を得た。
以上の操作により得られたウイルス懸濁液は、分光光度計（Ultrospec 3000；Amersham Pharmacia Biotech社）で定量後、-20℃で凍結保存した。CMVの濃度はE260 ＝５を１mg/mlとした。
【００２４】
５．粒子接種
純化ウイルス液を0.1Mリン酸バッファー（pH7.0）で希釈し、3%カーボランダムを加えて懸濁し、綿棒を用いてこすりつけた後、水道水で洗浄した。
【００２５】
６．局部病斑宿主を用いた対葉法
検定にはCMVと、局部病斑宿主であるササゲを用いた。ササゲの初生葉2枚のうち、片方には活性物質を、他方には活性物質の溶媒（20mM Tris-Cl 0.1%Triton X）を塗布した。葉を15分ほど乾燥させた後、CMVを接種し、2〜3日後に出現した壊死病斑数を比較して抗ウイルス性を検討した。ここでは、
感染阻害率（%）＝（1−候補物質処理区局部病斑数／対照区局部病斑数）×100
とした。
【００２６】
７．DAS-ELISA法
カーボネイト緩衝液〔64mM Na2CO3，136mM NaHCO3，0.8% NaN3：pH9.6〕で抗CMV CP IgGを1/1000に希釈し、ELISAプレートに100 μlずつ分注した。その後、37℃で2〜3時間、または4℃で一CP晩静置した後、PBSTでウェルを3回洗浄した。感染葉を10倍量のカーボネイト緩衝液で磨砕し、磨砕液をウェルに100 μlずつ分注した。37℃で2〜3時間、または4℃で一晩静置した。その後、PBSTでウェルを4回洗浄した後、PBSTでコンジュゲート（AP標識抗ウサギ抗体）を1/1000に希釈し、100μlずつ分注した．37℃で2〜3時間静置した後、PBSTでウェルを3回洗浄した。アルカリフォスフォターゼ基質を１0%ジエタノールアミン液で溶かし、100 μlずつ分注し、発色後、microplate reader（autoreader；三光純薬）により吸光度を計測した。
【００２７】
８．純化ウイルスからのRNA抽出
試料に800 μlのグリシンバッファー〔100mMグリシン、100mM NaCl，10mM EDTA：pH9.5〕を加えて1.5mlマイクロチューブに移した。70 μlの１0%SDS，70 μlの4%ベントナイトと500 μlフェノール/クロロフォルム（フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール=25：24：1）を加えて、12,000 rpmで4分間の遠心分離を行った後、上清を別のマイクロチューブに移した。フェノール/クロロフォルムをさらに500 μl加え、12,000 rpmで4分間の遠心分離を行った。上清450 μlに45 μlの3 M酢酸ナトリウム溶液と1 mlのエタノールを加えて-80℃で15分間静置した後、15,000 rpmで15分間の遠心分離を行った。上澄みを除去し内壁に残っているエタノールをマイクロピペットで完全に除去した後、デジケーター中で15分間減圧乾燥した。得られた沈殿はDEPC処理水に融解させ、分光光度計で濃度を計測した。CMV RNAの濃度はE260＝40を1 mg/mlとした。
【００２８】
９．RNA接種
ウイルス粒子から抽出したRNAを0.1Mリン酸バッファー（pH7.0）/ベントナイトで希釈し、粒子接種と同様にして供試植物に接種した。RNA濃度はササゲの場合は0.4 μg/ml、タバコの場合は2 μg/mlに調節した。
【００２９】
10．ティッシュブロット法
あらかじめ、ニトロセルロースメンブレンと濾紙4枚を0.2M CaCl2で15分間振とうしておいた。サンプル葉の主脈を除去し、蒸留水で洗浄した。葉の裏側にセルライトを散布した後、歯ブラシで研磨して表皮組織を除去した。その後、サンプル葉を0.2M CaCl2で軽く洗浄した。ゲル乾燥機の上に濾紙2枚を置き、ニトロセルロースメンブレン、サンプル葉、濾紙2枚の順に重ねた。それらにトランスファーバッファーを十分に含ませた後、真空状態で50℃15分間加熱し転写を行った。
【００３０】
転写後、ニトロセルロースメンブレンをTTBS（1×TBS, pH7.5 (25mM Tris, 137mM NaCl, 25mM KCl), 0.05% Tween 20）に浸し、10分間振とうした。振とう後、TTBSを除去し、ブロッキング溶液に浸し30分間振とうした。ブロッキング溶液を除去し、ニトロセルロースメンブレンをTTBSで軽く洗浄した。その後、TTBSで6000倍に希釈したCMV IgG （1 mg/ml）にニトロセルロースメンブレンを浸し、90分間振とうした。反応終了後、ニトロセルロースメンブレンをTTBSで10分間振とう洗浄した。
【００３１】
この洗浄操作を2階繰り返した後、TTBSで10000倍に希釈したアルカリフォスフォターゼ標識抗ウサギIgG - ヤギIgGにニトロセルロースメンブレンを浸し、90分間振とうした．反応終了後、ニトロセルロースメンブレンをTTBSで10分間振とう洗浄した。この洗浄操作を2回繰り返した後、ニトロセルロースメンブレンを蒸留水で軽くすすいだ。ニトロセルロースメンブレンをAP 9.5(pH7.4, 100mM Tris, 100mM NaCl, 50mM MgCl2)に5分間浸した後、BCIP/NBTに浸し暗所で発色させた。
【００３２】
III．結果
１．候補物質のスクリーニング
抗植物ウイルス活性の評価には、CMVとCMVの局部感染宿主であるジュウロクササゲを用いた。
その結果、マツタケ菌糸磨粋物80%硫安塩析で得られた抽出物で処理したササゲでは局部病斑数が認められなくなることから、高い感染阻害効果を有していると考えられた。
【００３３】
２．マツタケ80%硫安塩析抽出物の抗ウイルス性
次にマツタケ80%硫安塩析抽出物の有効濃度や、CMV接種に対する予防効果または治療効果の有無、CMV局部感染宿主であるササゲとCMV全身感染宿主であるタバコにおける増殖阻害活性について調査した。
【００３４】
（１）マツタケ80%硫安塩析抽出物の抗ウイルス性効果
（ｉ）局部感染宿主におけるマツタケ80%硫安塩析抽出物の抗ウイルス性
（ａ）マツタケ80%硫安塩析抽出物の有効濃度
選抜したマツタケ80%硫安塩析抽出物の有効濃度をササゲにおける対葉法で調査した。マツタケ80%硫安塩析抽出物は、100 μg/ml，10 μg/ml及び1 μg/mの3つの濃度で塗布した。その結果、感染阻害率を80%以上示したのは100 μg/mlであり、濃度10 μg/ml，1 μg/mlは感染阻害率を40%以下示した（図１）。
マツタケ80%硫安塩析抽出物をCMVと混合させ、100 μg/ml，10 μg/ml，1 μg/mlの3つの濃度で接種した。その結果、濃度100μg/mlは96%の感染阻害率を示した．濃度10 μg/ml，1 μg/mlは40%以下の感染阻害率を示した（図２）。
【００３５】
（ｂ）マツタケ80%硫安塩析抽出物処理の有効時間
マツタケ80%硫安塩析抽出物を塗布し乾燥直後にCMVを接種すると、80%以上の感染阻害率を示した。ここでは、マツタケ80%硫安塩析抽出物塗布前と後に時間をおき、その後CMVを接種し、マツタケ80%硫安塩析抽出物の効果の持続性について調査した。
濃度100 μg/mlのマツタケ80%硫安塩析抽出物をササゲの初生葉の一方に綿棒で塗布し、他方に溶媒を塗布した。6，12，24時間後に10 μg/mlのCMVを粒子接種した。その結果、マツタケ80%硫安塩析抽出物処理後6時間では84%の感染阻害率を示した。処理後12及び24時間では40%以下の感染阻害率を示した（図３）。よって、マツタケ80%硫安塩析抽出物は葉面上で6時間にわたり感染阻害効果を持続することがわかった。
【００３６】
続いてCMV接種後に濃度100 μg/mlのマツタケ80%硫安塩析抽出物を処理することにより、マツタケ80%硫安塩析抽出物の病害治療の可能性について調査した。ササゲの初生葉にCMVを接種し、6，12時間後にマツタケ80%硫安塩析抽出物を塗布した。その結果、CMV接種後6，12時間では40%以下の感染阻害率を示した（図４）。よって、CMV接種後のマツタケ80%硫安塩析抽出物塗布処理では病斑形成は抑制できず、病害治療効果はなかった。
【００３７】
（ii）全身感染宿主におけるマツタケ80%硫安塩析抽出物の抗ウイルス性
マツタケ80%硫安塩析抽出物のCMV増殖阻害活性をCMV全身感染宿主であるタバコを用いて調査した。
（ａ）マツタケ80%硫安塩析抽出物のタバコ葉面塗布処理におけるCMV CP蓄積量
タバコに濃度100 μg/mlのマツタケ80%硫安塩析抽出物を塗布し、完全乾燥させた30分後にCMV粒子を20 μg/mlで接種した。対照区には溶媒を塗布し、完全乾燥させた30分後にCMV粒子を接種した。２日おきに、接種葉から2枚上の上位葉をサンプリングし、DAS-ELISA法でCMV CP蓄積量を測定した。
【００３８】
その結果、接種後におけるマツタケ80%硫安塩析抽出物処理区のCMV CPの蓄積量が対照区より明らかに低いことが観察された。また、対照区では接種5日後に葉の奇形と葉脈の透明化が上位葉で観察され、12日後にはモザイク病徴が確認されたが、マツタケ80%硫安塩析抽出物処理区では病徴発見が遅延し、8日後になってはじめて葉に軽い黄化が観察され、15日後にモザイク病徴が確認された。マツタケ80%硫安塩析抽出物処理タバコの病徴はその後も進行し、対照区と差はなくなった（図４、５及び６）。
【００３９】
（ｂ）マツタケ80%硫安塩析抽出物のタバコ葉面混合処理におけるCMV CP蓄積量
タバコに濃度100 μg/mlのマツタケ80%硫安塩析抽出物とCMVの混合液を塗布した。対照区には溶媒とCMVの混合液を塗布した。２日おきに、接種葉から2枚上の上位葉をサンプリングし、DAS-ELISA法でCMV CP蓄積量を測定した。
その結果、接種後におけるマツタケ80%硫安塩析抽出物処理区のCMV CPの蓄積量が対照区より明らかに低いことが観察された。また、対照区では接種6日後に葉の奇形と葉脈の透明化が上位葉で観察され、11日後にはモザイク病徴が確認されたが、マツタケ80%硫安塩析抽出物処理区では病徴発見が遅延し、9日後になってはじめて葉に軽い黄化が観察され、14日後にモザイク病徴が確認された。マツタケ80%硫安塩析抽出物処理タバコの病徴はその後も進行し、対照区と差はなくなった（図７、８及び９）。
【００４０】
（ｃ）ティッシュブロット法でタバコの葉のウイルス分布
タバコに濃度100 μg/mlのマツタケ80%硫安塩析抽出物とCMVの混合液を塗布した。対照区には溶媒とCMVの混合液を塗布した。2日、4日おきに、接種葉をサンプリングし、ティッシュブロット法でタバコの葉のウイルス分布を調査した。
タバコに濃度100 μg/mlのマツタケ80%硫安塩析抽出物を塗布し、完全乾燥させた30分後にCMV粒子を20 μg/mlで接種した。対照区には溶媒を塗布し、完全乾燥させた30分後にCMV粒子を接種した。2日、4日おきに、接種葉をサンプリングし、ティッシュブロット法でタバコの葉のウイルス分布を調査した。
【００４１】
その結果、2日目に、混合した処理区では葉の縁側に少し分布した。対照区では葉の葉脈周囲に多量に分布した。4日目に、処理区と対照区は両方ともウイルスが葉に全面的に拡大した（図10）。
塗布した処理区では2日目に、葉の主葉脈の周囲に少し分布した。対照区では葉の葉脈の周囲に多量に分布した。４日目に、処理区と対照区は両方ともウイルスが葉に全面的に拡大した（図11及び12）。
【００４２】
３．マツタケ80%硫安塩析抽出物の抗ウイルス作用機構
次に、マツタケ80%硫安塩析抽出物の抗ウイルス作用機構の解明を試みた。
（１）ササゲに対する抵抗性の誘導性の有無
葉の裏面に濃度100 μg/mlのマツタケ80%硫安塩析抽出物を塗布し、さらに表面にウイルスを接種した裏面処理でササゲに対する抵抗性の誘導性を調査した。その結果、ウイルスの感染阻害率は40%以下であり、抵抗性の誘導は認められなかった。
【００４３】
（２）ササゲにおける抽出物の移行性の有無
ササゲの片葉に濃度100 μg/mlのマツタケ80%硫安塩析抽出物を塗布し、もう一方の片葉にウイルスを接種し、抽出物の阻害移行性の有無を調査した。その結果、感染阻害率も30%以下であり、浸透移行性は認められなかった。
【００４４】
（３）マツタケ80%硫安塩析抽出物とCMVの混合接種
マツタケ80%硫安塩析抽出物がCMV粒子またはCMV RNAのどちらに作用しているかを調査するために、マツタケ80%硫安塩析抽出物とCMV RNAの混合接種を行った．マツタケ80%硫安塩析抽出物とCMV RNAの混合液を作製し、ササゲに接種した。混合液中のマツタケ80%硫安塩析抽出物の濃度は20%とした。
その結果、対照区の葉面に局部病斑が数十程度出た。処理区の葉面には局部病斑がまったくなく、100%の感染阻害率を示した（図13）。よって、マツタケ80%硫安塩析抽出物がウイルスRNAを阻害することが考えられた。
【００４５】
III．考察
本発明においては、キノコ由来候補物質を材料として、抗ウイルス活性のある物質の選抜を行い、その結果得られたマツタケ80%硫安塩析抽出物の抗植物ウイルス活性と、その作用機構の解析を試みた。
マツタケ80%硫安塩析抽出物を更に精製すると、各々の分子量のタンパクの抗ウイルス活性が低く、CMVに対する抵抗性がほとんどなくなった。マツタケ80%硫安塩析抽出物自体が抗ウイルス活性を有すると考えられる．更に精製できない原因は、マツタケ80%硫安塩析抽出物の抗ウイルス活性が複数の抗ウイルス物質によると考えられる。
【００４６】
マツタケ80%硫安塩析抽出物は塗布処理により、ササゲの病斑形成を抑制した。マツタケ80%硫安塩析抽出物とCMV粒子の混合処理により、ササゲの病斑形成も抑制した。CMV接種6時間前にマツタケ80%硫安塩析抽出物をササゲの塗布した場合においても高い感染阻害率を示したが、接種後のマツタケ80%硫安塩析抽出物処理では病害治療効果がなくなった。濃度100 μg/mlでマツタケ80%硫安塩析抽出物をタバコに塗布すると、病徴遅延とCMV CP蓄積量の低下が観察された。
【００４７】
濃度100μg/mlでマツタケ80%硫安塩析抽出物とCMV粒子の混合液をタバコに塗布すると、病徴遅延とCMV CP蓄積量の低下も観察された。塗布処理と混合処理したタバコの葉をテイッシュブロット法で分析すると、CMVのタバコにおける葉面増殖が2日まで抑制したことが観察された。さらに、マツタケ80%硫安塩析抽出物とCMV RNAの混合液をササゲに接種すると、病斑が完全に観察されなかった。以上のことから、マツタケ80%硫安塩析抽出物は感染阻害活性と増殖阻害活性を持ち、CMV粒子に直接作用して阻害効果を示していることだけではなく、CMV RNAにも作用し、阻害効果を示すと考えられる。
【００４８】
フィガレンは葉内に浸透してウイルスに作用、または抵抗性を誘導すると考えられている(Fujiwara et al，2001)。しかし、ササゲにおいて、CMV接種後のマツタケ80%硫安塩析抽出物処理では病害治療効果がない。ササゲにおいてマツタケ80%硫安塩析抽出物とCMVで裏面処理すると、対照区と変わらない病斑数が計測された。また、ササゲの方初生葉にマツタケ80%硫安塩析抽出物を塗布し、もう一方の葉にCMVを接種する移行性調査を行うと、対照区と変わらない病斑数が計測された。以上のことから、マツタケ80%硫安塩析抽出物は抵抗性を誘導することがなく、植物の葉から他方の葉への移行もしない、施用した葉に分布し、CMV粒子の侵入を阻害し、またCMV粒子とCMV RNAの増殖を阻害すると考えられる。
【００４９】
アルギン酸塩には高いTMVの感染阻止作用がある。また、葉組織内へ浸透し、移行性がない。さらに、アルギン酸塩はin vitroでTMVを凝集させる性質がある（Tomaruら、1965）。マツタケ80%硫安塩析抽出物も同じように植物の葉に浸透し、中に感染したウイルスを阻害する。また、先に葉組織に浸透し、ウイルスの侵入を阻害すると考えられる。
【００５０】
ブラストサイジンS（BcS）はタバコ葉に感染するタバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus : TMV）を抑制する効果があると報告された(Hirai et al.)。接種後と接種後12時間に抑制効果が非常に高い。ブラストサイジンS（BcS）は感染後6~24時間にタバコ葉の細胞質と葉緑体またミトコンドリアでアミノC結合を阻害する。平常のタンパクとTMVタンパクの両方とも抑制される。マツタケ80%硫安塩析抽出物はCMV RNAとの混合接種で高い感染阻害率を示したので、ウイルスRNAに阻害する作用機構を有すると考えられる。
【００５１】
また、Pokeweed antiviral protein : PAPは細胞間移行を通じて、下の葉から上の葉まで浸透し、ウイルス阻害効果があるという報告がある（Chenら）。マツタケ80%硫安塩析抽出物は移行性調査で調べた結果から、移行性を有しないことが考えられる。
抗ウイルス剤として使用する場合、薬害を示さずに抗ウイルス活性を示すことが重要である(平井、1972)。本実験で対象としたマツタケ80%硫安塩析抽出物については、薬害を示さずに抗ウイルス効果を示したので、抗植物ウイルスとして有望と考えられる。
【００５２】
VI．引用文献
平井篤造  ( 1979).  ウイルスと植物.  南江堂.
久能均・白石友紀・高橋壮・露無慎二・眞山滋志 ( 1998 ). 新編  植物病理学概論.  養賢堂.
M. Fujiwara, M. Sakaguchi, B. Ryan, S. T. Ohki and T. Osaki ( 2001). Effect of Figaren, an antiviral Protein from Cucumis figarei, on Cucumber mosaic virus Infection. J. Gen. Plant Pathology. 67:159-163.
R. I. B. Francki, D.W.Mossop, T. Hatta,( 1979 ). CMI/AAB Description of Plant Virus July 1979  No,213.
【００５３】
N. Chen, Z-J Wu, Q-Y. Lin, L-H. Xie, ( 2004 ). Purification and Partial Characterization of a Protein Inhibitor of Tobacco mosaic virus Infection From The Maitake (Grifola frndosa). Prog. Biochem. Biophys. ( 2004 ): 31(3)283-286.
Z. C. Chen, R. F. White, J. F. Antonniw and Q. Lin. ( 1991 ).  Effect of pokeweed antiviral piotein ( PAP ) on the infection of plant viruses. Plant Pathology 40:612-620.
T. Hirai, A. Hiashima, T. Itoh, T.Takahashi, T. Shimomura, and Y. Hayashi. ( 1966 ).  Inhibitory Effect of Blasticidin S on Tobacco Mosaic Virus Multiplication. Phytopathology 56:1236-1239. 
K. Tomaru and Y. Ohkawa. ( 1975 ) The Inhibitory Activity of Alginic Acid Against Tobacco Mosaic Virus Infection. Ann. Phytopath. Soc. Japan  41:155-161.
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、CMVに対するマツタケ80％硫安塩析抽出物の抗ウイルス効果を示すグラフである。
【図２】図２は、CMVに対するマツタケ80％硫安塩析抽出物の抗ウイルス効果を示すグラフである。
【図３】図３は、マツタケ80％硫安塩析抽出物のウイルス阻害有効時間を示すグラフである。
【図４】図４は、マツタケ80％硫安塩析抽出物塗布処理（葉面塗布の後にウイルス接種）における、ウイルス病徴の遅延効果を示す写真である。
【図５】図５は、マツタケ80％硫安塩析抽出物によるタバコ葉面処理（葉面塗布の後にウイルス接種）を行った場合のCMV CPの蓄積抑制効果（接種葉における）を示すグラフである。
【図６】図６は、マツタケ80％硫安塩析抽出物によるタバコ葉面処理（葉面塗布の後にウイルス接種）を行った場合のCMV CPの蓄積抑制効果（上位葉における）を示すグラフである。
【図７】図７は、マツタケ80％硫安塩析抽出物とウイルスとの混合物を葉面塗布処理した場合のウイルス病徴の遅延効果を示す写真である。
【図８】図８は、マツタケ80％硫安塩析抽出物とウイルスとの混合物を葉面塗布処理した場合のCMV CP蓄積抑制効果（接種葉における）を示すグラフである。
【図９】図９は、マツタケ80％硫安塩析抽出物とウイルスとの混合物を葉面塗布処理した場合のCMV CP蓄積抑制効果（上位葉における）を示すグラフである。
【図１０】図10は、マツタケ80％硫安塩析抽出物とウイルスとの混合物をタバコに葉面塗布処理した場合の、ウイルスの葉面分布を示す写真である。
【図１１】図11は、マツタケ80％硫安塩析抽出物とウイルスとの混合物をタバコに葉面塗布処理した場合の、ウイルスの葉面分布を示す写真である（２日後）。
【図１２】図12は、マツタケ80％硫安塩析抽出物とウイルスとの混合物をタバコに葉面塗布処理した場合の、ウイルスの葉面分布を示す写真である（４日後）。
【図１３】図13は、図10は、マツタケ80％硫安塩析抽出物とウイルスRNAとの混合物をタバコに葉面塗布処理した場合の、ウイルスの葉面分布を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図４】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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