(57)【要約】      （修正有）【課題】セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質（ＧＩＰＣ-ＡＰ）合成酵素及びその遺伝子を提供し、当該酵素及びその遺伝子を用いてＧＩＰＣ-ＡＰ及びセラミドの提供。【解決手段】ＧＰＩアンカー型タンパク質に対する脂質リモデリング工程の最終段階でセラミドを付加する酵素及びその遺伝子である、酵母のCwh43タンパク質及びその遺伝子について、CWH43の後半部分と前半部分それぞれに高い相同性を有するヒト及びマウス由来のタンパク質が、それぞれαサブユニット及びβサブユニットとして複合体を形成してＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素として機能すること、及び酵母細胞内でCwh43C及びCwh43Nタンパク質が同様なサブユニット構造をとり得ることの知見に基づく、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体、ＧＩＰＣ-ＡＰ及び、セラミド類、さらにはＧＩＰＣ-ＡＰ前駆物質を効率的に製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
αサブユニットとβサブユニットからなる、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質複合体をコードするＤＮＡであって、
上記αサブユニットをコードするＤＮＡが、下記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかの、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素のαサブユニット活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含むものであり、
（Ａ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号５、配列番号９又は配列番号２６に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｄ）配列番号５、配列番号９又は配列番号２６に示される塩基配列において、１ないし数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号５、配列番号９又は配列番号２６の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号９及び配列番号２６のいずれにも７０％以上の相同性を有するＤＮＡ、
（Ｇ）配列番号５、配列番号９及び配列番号２６のいずれにも３０％以上の相同性を有するＤＮＡ、
かつ、上記βサブユニットをコードするＤＮＡが、下記（Ｈ）〜（Ｎ）のいずれかの、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素のβサブユニット活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含むものであることを特徴とする、上記ＤＮＡ、
（Ｈ）配列番号４、配列番号８又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｉ）配列番号４、配列番号８又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｊ）配列番号３、配列番号７又は配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｋ）配列番号３、配列番号７又は配列番号２４に示される塩基配列において、１ないし数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｌ）配列番号３、配列番号７又は配列番号２４の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（Ｍ）配列番号７及び配列番号２４のいずれにも７０％以上の相同性を有するＤＮＡ、
（Ｎ）配列番号３、配列番号７及び配列番号２４のいずれにも３０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
【請求項２】
前記セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性が、ヒドロキシル化された脂肪酸鎖およびフィトスフィンゴシンより成るセラミド（Ｃ型セラミド）が付加したＧＰＩアンカー型タンパク質を合成する活性であることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質複合体をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質複合体のαサブユニットとして機能するタンパク質をコードするＤＮＡであり、かつ単独でセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、下記の（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかのＤＮＡ、
（Ａ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号５、配列番号９又は配列番号２６に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｄ）配列番号５、配列番号９又は配列番号２６に示される塩基配列において、１ないし数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号５、配列番号９又は配列番号２６の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号９及び配列番号２６のいずれにも７０％以上の相同性を有するＤＮＡ、
（Ｇ）配列番号５、配列番号９及び配列番号２６のいずれにも３０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを用いて形質転換された形質転換体。
【請求項６】
形質転換体が酵母を宿主として形質転換した形質転換酵母である請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の形質転換体を培養して、前記ＤＮＡの発現産物を取得することを特徴とする、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質複合体又はそのαサブユニットの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の製造方法により取得されることを特徴とする、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質複合体又はそのαサブユニット。
【請求項９】
前記セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性が、ヒドロキシル化された脂肪酸鎖およびフィトスフィンゴシンより成るセラミド（Ｃ型セラミド）が付加したＧＰＩアンカー型タンパク質を合成する活性であることを特徴とする、請求項８に記載のセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質複合体又はそのαサブユニット。
【請求項１０】
αサブユニットとβサブユニットとからなるセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質複合体であって、かつαサブユニットが、下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を含むものであり、βサブユニットが下記（Ｅ）〜（Ｈ）のいずれかのアミノ酸配列を含むものであることを特徴とするタンパク質複合体、
（Ａ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、
（Ｃ）配列番号１０及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列のいずれにも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（Ｄ）配列番号６、配列番号１０及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列のいずれにも３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（Ｅ）配列番号４、配列番号８又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列
（Ｆ）配列番号４、配列番号８又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、
（Ｇ）配列番号８及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列のいずれにも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（Ｈ）配列番号４、配列番号８及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列のいずれにも３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
【請求項１１】
前記セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性が、ヒドロキシル化された脂肪酸鎖およびフィトスフィンゴシンより成るセラミド（Ｃ型セラミド）が付加したＧＰＩアンカー型タンパク質を合成する活性であることを特徴とする、請求項１０に記載のタンパク質複合体。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載のタンパク質複合体のαサブユニットとして機能する、下記（Ａ）、〜（Ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつ単独でセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質、
（Ａ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、
（Ｃ）配列番号１０及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列のいずれにも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（Ｄ）配列番号６、配列番号１０及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列のいずれにも３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
【請求項１３】
請求項１０又は１１に記載のタンパク質複合体のβサブユニットとして機能する、下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を増強する活性を有するタンパク質、
（Ａ）配列番号４、配列番号８又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（Ｂ）配列番号４、配列番号８又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号８及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列のいずれにも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（Ｄ）配列番号４、配列番号８及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列のいずれにも３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
【請求項１４】
請求項５又は６に記載の形質転換体を培養して、当該形質転換体が産生するＧＰＩアンカー型タンパク質に対してセラミドを付加させることを特徴とする、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法。
【請求項１５】
ＧＰＩアンカー型タンパク質に対して、請求項１０ないし１２のいずれかに記載のセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質複合体又はそのαサブユニット機能を有するタンパク質を作用させることを特徴とする、セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法。
【請求項１６】
ＧＰＩアンカー型タンパク質に対して、下記の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質を作用させることを特徴とする、セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法、
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１部であって、少なくとも２１８〜９５３位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
（Ｃ）上記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
【請求項１７】
ＧＰＩアンカー型タンパク質に対して、下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのＤＮＡの発現産物として得られる、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質を作用させることを特徴とする、セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法、
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１部であって、少なくとも２１８〜９５３位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列の１部であって、少なくとも６５２〜２８５９位の塩基配列を含むＤＮＡ、
（Ｅ）上記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項１８】
下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いて、ＧＰＩアンカー型タンパク質を生産する宿主細胞を形質転換し、当該形質転換細胞を培養することを特徴とする、セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法、
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１部であって、少なくとも２１８〜９５３位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列の１部であって、少なくとも６５２〜２８５９位の塩基配列を含むＤＮＡ、
（Ｅ）上記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項１９】
前記形質転換体が、酵母宿主を形質転換した形質転換酵母であることを特徴とする、請求項１７に記載のセラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法。
【請求項２０】
請求項１２に記載のセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素のαサブユニット活性を有し、かつ単独でセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質と、請求項１３に記載のセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素のβサブユニット活性を有し、かつセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を増強する活性を有するタンパク質とを、ＧＰＩアンカー型タンパク質もしくはその生産細胞に対して同時に作用させることを特徴とする、セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法。
【請求項２１】
前記セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質が、ヒドロキシル化された脂肪酸鎖およびフィトスフィンゴシンより成るセラミド（Ｃ型セラミド）が付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質である、請求項１４ないし２０のいずれかに記載のセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法。
【請求項２２】
前記セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質を製造する際に、ＧＰＩアンカー型タンパク質産生酵母細胞を用い、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質を酵母細胞表面上にもしくは培養液中に分泌させて産生させることを特徴とする、請求項１４ないし２１のいずれかに記載のセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法。
【請求項２３】
請求項１４ないし２２のいずれかに記載の製造方法で得られることを特徴とするセラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質。
【請求項２４】
セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質が、ヒドロキシル化された脂肪酸鎖およびフィトスフィンゴシンより成るセラミド（Ｃ型セラミド）が付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質である、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２５】
請求項２３又は２４に記載の、セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質からタンパク質および糖鎖部分を酵素で又は化学的処理により切断除去することを特徴とするセラミドの製造方法。
【請求項２６】
セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質からタンパク質および糖鎖部分を切断除去する際に、フォスフォリパーゼＣあるいはフォスフォリパーゼＤを用いることを特徴とする請求項２５に記載のセラミドの製造方法。
【請求項２７】
請求項１４ないし２２に記載の製造方法を用いて、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質組成物を取得し、次いで当該セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質からタンパク質及び糖鎖部分を酵素で又は化学的処理により切断除去することにより、Ｃ型セラミド含有セラミド組成物を製造する方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載のセラミド組成物を製造する方法により得られた、Ｃ型セラミド含有セラミド組成物。
【請求項２９】
出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のゲノムＤＮＡにおいて、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素遺伝子に変異を導入するか、又は当該遺伝子の発現を抑制することで、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質の合成を阻害又は抑制することを特徴とする、出芽酵母を用いて飽和脂肪酸をもつジアシルグリセロールが高純度に付加したＧＰＩアンカー型タンパク質を製造する方法。
【請求項３０】
前記出芽酵母として、出芽酵母cwh43 遺伝子破壊株を用いることを特徴とする、請求項２９に記載の飽和脂肪酸をもつジアシルグリセロールが高純度に付加したＧＰＩアンカー型タンパク質を製造する方法。
【請求項３１】
配列番号５、配列番号９もしくは配列番号２６に示される塩基配列又はその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであって、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素及び／又はそのαサブユニットをコードするＤＮＡ検出用のプローブ又はプライマーとなり得る、ポリヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号１２、１５、１６、１８、１９、又は配列番号２３に示される塩基配列又はその相補配列からなる、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
配列番号３、配列番号７又は配列番号２４に示される塩基配列又はその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであって、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素及び／又はそのβサブユニットをコードするＤＮＡ検出用のプローブ又はプライマーとなり得る、ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
配列番号１１、１３、１４、１７、１８、１９、又は配列番号２１に示される塩基配列又はその相補配列からなる、請求項３３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項３１又は３２に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素及び／又はそのαサブユニットをコードするＤＮＡ検出用のプローブ又はプライマー。
【請求項３６】
請求項３３又は３４に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素及び／又はそのβサブユニットをコードするＤＮＡ検出用のプローブ又はプライマー。
【請求項３７】
請求項３５及び／又は３６に記載のプローブ又はプライマーを用いることを特徴とする、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素及び／又はそのαサブユニットをコードするＤＮＡ及び／又はそのβサブユニットをコードするＤＮＡをスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康食品、化粧品など幅広い用途のあるセラミド及びその製造方法、ならびにＧＰＩアンカー型タンパク質にセラミドを付加することができるセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素及びその遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
セラミドは、スフィンゴ糖脂質やスフィンゴリン脂質の構成成分として、動植物や微生物界に広く分布している脂質であるが、ヒトの皮膚においても、角質層の細胞と皮膚の細胞の間に水分を含んで存在し、乾燥やほこりなどから皮膚を守り、表皮の健康を保つバリアの役目をはたしている。近年、ヒアルロン酸などと共に健康食品や化粧品などへの配合剤として注目されている。
ここで、セラミドとは、狭義ではスフィンゴシンに脂肪酸がアミド結合を介して付加したものを指すが、本発明において「セラミド」というときは広義のセラミド類を意味し、スフィンゴシンに限らず、スフィンゴイド塩基に脂肪酸がアミド結合で付加したものの総称を指す。すなわち、ジヒドロセラミドやフィトセラミドを含むものとする。
これらセラミド類は従来コンニャクイモなどの食品から分離していたが、純度の高いセラミドを効率よく分離するのは困難であったため、セラミド類を高水準で産生する酵母、真菌類などを培養し、セラミド類を抽出することでセラミドを高生産しようとすることが試みられていた（特許文献１、特許文献２）。しかしながら、これらの改良型セラミド生産菌は、野生株よりは高産生ではあるものの、あくまで変異の誘発及び選抜による改良であったので、その生産性には限りがあった。
出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae においては、グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質の脂質部分にセラミドが付加していることが知られている。このセラミド付加は、ＧＰＩの脂質リモデリングと呼ばれる過程において行われることがわかっているものの、具体的な脂質リモデリングのステップに関しては、ようやくその一端が明らかになりつつある状況である（非特許文献１）。このような脂質リモデリングに関与し、最終的にセラミドを付加する酵素遺伝子を取得することができれば、当該遺伝子を用いた形質転換体からの大量生産が可能になるはずであるが、そのような遺伝子はいまだ取得されていない。
【非特許文献１】Bosson et al., 2006; Mol. Biol. Cell 17, 2636-2645.
【非特許文献２】Ram et al., 1994; Yeast 10, 1019-1030.
【非特許文献３】Martin-Yken, et al., 2001; Yeast 18, 827-840.
【非特許文献４】Lorenzi et al., 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8956-8961.
【非特許文献５】Tashima et al., 2006; Mol. Biol. Cell 17, 1410-1420.
【特許文献１】特表平9-504434
【特許文献２】特開2006-67842
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、ＧＰＩアンカー型タンパク質に対して、その脂質部分にセラミドを付加してセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質を合成することのできる、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素及びその遺伝子を提供すること、並びに当該遺伝子検出用プローブ、プライマーを提供することである。
また、当該酵素及びその遺伝子を用いてセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質を製造する方法を提供すること、及び得られたセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質から切断されたセラミドを提供することも本発明の目的である。
さらに、本発明は、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質前駆物質である飽和脂肪酸をもつジアシルグリセロールが高純度に付加したＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、酵母のみならず広くヒトなど哺乳類も含めた生物種において、ＧＰＩアンカー型タンパク質に対してセラミド付加を担う酵素及び酵素遺伝子を取得し、その塩基配列及びアミノ酸配列を決定することができた。
【０００５】
以下、その過程を詳細に述べる。本発明者らは、まず出芽酵母においてＧＰＩアンカー型タンパク質に対する脂質リモデリング工程の最終段階でセラミドを付加する酵素遺伝子を探索することとし、その過程で出芽酵母のCWH43遺伝子に着目した。
CWH43 遺伝子に関しては、Ramらにより、Calcofluor White という薬剤に感受性を示す変異として初めて報告された（非特許文献２）後、2001 年にクローニングがなされて、細胞壁の構成に関与するＰＫＣ１シグナル伝達経路に関与する遺伝子であるという報告がなされている（非特許文献３）ものの、CWH43遺伝子産物であるタンパク質の酵素活性等の機能・性質に関する報告はいままでになされていない。
本発明者らは、鋭意研究の結果、この出芽酵母のCWH43遺伝子こそが、ＧＰＩアンカー型タンパク質の脂質部分をジアシルグリセロール型からセラミド型へと変換する機能を担っている、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素（ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素）をコードする遺伝子であることを突き止めた。
また、本発明者らは、酵母のCWH43遺伝子の後半部分（CWH43C）と前半部分（CWH43N）に高い相同性を有するヒト及びマウス由来のFRAG1遺伝子とC130090K23遺伝子（FLJ21511遺伝子）をヒト及びマウスのＤＮＡデーターベースから探索し、両遺伝子がコードするタンパク質がそれぞれαサブユニット及びβサブユニットとして複合体を形成してＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素として機能することを見出し、酵母細胞内でCwh43C及びCwh43Nタンパク質が同様なサブユニット構造をとり得ることも確認した。その結果は、広い生物種におけるＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素が、上記各α及びβサブユニットと高い相同性を有するサブユニット構造からなる複合体を形成していることを示している。
さらに、上記検討過程において、cwh43遺伝子破壊株を用いることで、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質の前駆物質である、飽和脂肪酸をもつジアシルグリセロールが高純度に付加したＧＰＩアンカー型タンパク質を得ることができることも見出した。
【０００６】
本発明は、これらの知見に基づいて完成に至ったものであり、以下のとおりのものである。
（１）  αサブユニットとβサブユニットからなる、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質複合体をコードするＤＮＡであって、
上記αサブユニットをコードするＤＮＡが、下記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかの、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素のαサブユニット活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含むものであり、
（Ａ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号５、配列番号９又は配列番号２６に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｄ）配列番号５、配列番号９又は配列番号２６に示される塩基配列において、１ないし数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号５、配列番号９又は配列番号２６の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号９及び配列番号２６のいずれにも７０％以上の相同性を有するＤＮＡ、
（Ｇ）配列番号５、配列番号９及び配列番号２６のいずれにも３０％以上の相同性を有するＤＮＡ、
かつ、上記βサブユニットをコードするＤＮＡが、下記（Ｈ）〜（Ｎ）のいずれかの、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素のβサブユニット活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含むものであることを特徴とする、上記ＤＮＡ、
（Ｈ）配列番号４、配列番号８又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｉ）配列番号４、配列番号８又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｊ）配列番号３、配列番号７又は配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｋ）配列番号３、配列番号７又は配列番号２４に示される塩基配列において、１ないし数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｌ）配列番号３、配列番号７又は配列番号２４の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（Ｍ）配列番号７及び配列番号２４のいずれにも７０％以上の相同性を有するＤＮＡ、
（Ｎ）配列番号３、配列番号７及び配列番号２４のいずれにも３０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
（２）  前記セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性が、ヒドロキシル化された脂肪酸鎖およびフィトスフィンゴシンより成るセラミド（Ｃ型セラミド）が付加したＧＰＩアンカー型タンパク質を合成する活性であることを特徴とする、前記（１）に記載のタンパク質複合体をコードするＤＮＡ。
（３）  前記（１）又は（２）に記載のタンパク質複合体のαサブユニットとして機能するタンパク質をコードするＤＮＡであり、かつ単独でセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、下記の（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかのＤＮＡ、
（Ａ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号５、配列番号９又は配列番号２６に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｄ）配列番号５、配列番号９又は配列番号２６に示される塩基配列において、１ないし数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号５、配列番号９又は配列番号２６の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号９及び配列番号２６のいずれにも７０％以上の相同性を有するＤＮＡ、
（Ｇ）配列番号５、配列番号９及び配列番号２６のいずれにも３０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
（４）  前記（１）ないし（３）のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（５）  前記（４）に記載の組換えベクターを用いて形質転換された形質転換体。
（６）  形質転換体が酵母を宿主として形質転換した形質転換酵母である前記（５）に記載の形質転換体。
（７）  前記（５）又は（６）に記載の形質転換体を培養して、前記ＤＮＡの発現産物を取得することを特徴とする、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質複合体又はそのαサブユニットの製造方法。
（８）  前記（７）に記載の製造方法により取得されることを特徴とする、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質複合体又はそのαサブユニット。
（９）  前記セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性が、ヒドロキシル化された脂肪酸鎖およびフィトスフィンゴシンより成るセラミド（Ｃ型セラミド）が付加したＧＰＩアンカー型タンパク質を合成する活性であることを特徴とする、前記（８）に記載のセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質複合体又はそのαサブユニット。
（１０）  αサブユニットとβサブユニットとからなるセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質複合体であって、かつαサブユニットが、下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を含むものであり、βサブユニットが下記（Ｅ）〜（Ｈ）のいずれかのアミノ酸配列を含むものであることを特徴とするタンパク質複合体、
（Ａ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、
（Ｃ）配列番号１０及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列のいずれにも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（Ｄ）配列番号６、配列番号１０及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列のいずれにも３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（Ｅ）配列番号４、配列番号８又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列
（Ｆ）配列番号４、配列番号８又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、
（Ｇ）配列番号８及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列のいずれにも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（Ｈ）配列番号４、配列番号８及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列のいずれにも３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
（１１）  前記セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性が、ヒドロキシル化された脂肪酸鎖およびフィトスフィンゴシンより成るセラミド（Ｃ型セラミド）が付加したＧＰＩアンカー型タンパク質を合成する活性であることを特徴とする、前記（１０）に記載のタンパク質複合体。
（１２）  前記（１０）又は（１１）に記載のタンパク質複合体のαサブユニットとして機能する、下記（Ａ）、〜（Ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつ単独でセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質、
（Ａ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、
（Ｃ）配列番号１０及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列のいずれにも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（Ｄ）配列番号６、配列番号１０及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列のいずれにも３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
（１３）  前記（１０）又は（１１）に記載のタンパク質複合体のβサブユニットとして機能する、下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を増強する活性を有するタンパク質、
（Ａ）配列番号４、配列番号８又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（Ｂ）配列番号４、配列番号８又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号８及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列のいずれにも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（Ｄ）配列番号４、配列番号８及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列のいずれにも３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
（１４）  前記（５）又は（６）に記載の形質転換体を培養して、当該形質転換体が産生するＧＰＩアンカー型タンパク質に対してセラミドを付加させることを特徴とする、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法。
（１５）  ＧＰＩアンカー型タンパク質に対して、前記（１０）ないし（１２）のいずれかに記載のセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質複合体又はそのαサブユニット機能を有するタンパク質を作用させることを特徴とする、セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法。
（１６）  ＧＰＩアンカー型タンパク質に対して、下記の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質を作用させることを特徴とする、セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法、
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１部であって、少なくとも２１８〜９５３位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
（Ｃ）上記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
（１７）  ＧＰＩアンカー型タンパク質に対して、下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのＤＮＡの発現産物として得られる、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質を作用させることを特徴とする、セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法、
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１部であって、少なくとも２１８〜９５３位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列の１部であって、少なくとも６５２〜２８５９位の塩基配列を含むＤＮＡ、
（Ｅ）上記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（１８）  下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いて、ＧＰＩアンカー型タンパク質を生産する宿主細胞を形質転換し、当該形質転換細胞を培養することを特徴とする、セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法、
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１部であって、少なくとも２１８〜９５３位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列の１部であって、少なくとも６５２〜２８５９位の塩基配列を含むＤＮＡ、
（Ｅ）上記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（１９）  前記形質転換体が、酵母宿主を形質転換した形質転換酵母であることを特徴とする、前記（１７）に記載のセラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法。
（２０）  前記（１２）に記載のセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素のαサブユニット活性を有し、かつ単独でセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質と、前記（１３）に記載のセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素のβサブユニット活性を有し、かつセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を増強する活性を有するタンパク質とを、ＧＰＩアンカー型タンパク質もしくはその生産細胞に対して同時に作用させることを特徴とする、セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法。
（２１）  前記セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質が、ヒドロキシル化された脂肪酸鎖およびフィトスフィンゴシンより成るセラミド（Ｃ型セラミド）が付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質である、前記（１４）ないし（２０）のいずれかに記載のセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法。
（２２）  前記セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質を製造する際に、ＧＰＩアンカー型タンパク質産生酵母細胞を用い、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質を酵母細胞表面上にもしくは培養液中に分泌させて産生させることを特徴とする、前記（１４）ないし（２１）のいずれかに記載のセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法。
（２３）  前記（１４）ないし（２２）のいずれかに記載の製造方法で得られることを特徴とするセラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質。
（２４）  セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質が、ヒドロキシル化された脂肪酸鎖およびフィトスフィンゴシンより成るセラミド（Ｃ型セラミド）が付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質である、前記（２３）に記載のタンパク質。
（２５）  前記（２３）又は（２４）に記載の、セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質からタンパク質および糖鎖部分を酵素で又は化学的処理により切断除去することを特徴とするセラミドの製造方法。
（２６）  セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質からタンパク質および糖鎖部分を切断除去する際に、フォスフォリパーゼＣあるいはフォスフォリパーゼＤを用いることを特徴とする前記（２５）に記載のセラミドの製造方法。
（２７）  前記（１４）ないし（２２）に記載の製造方法を用いて、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質組成物を取得し、次いで当該セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質からタンパク質及び糖鎖部分を酵素で又は化学的処理により切断除去することにより、Ｃ型セラミド含有セラミド組成物を製造する方法。
（２８）  前記（２７）に記載のセラミド組成物を製造する方法により得られた、Ｃ型セラミド含有セラミド組成物。
（２９）  出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のゲノムＤＮＡにおいて、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素遺伝子に変異を導入するか、又は当該遺伝子の発現を抑制することで、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質の合成を阻害又は抑制することを特徴とする、出芽酵母を用いて飽和脂肪酸をもつジアシルグリセロールが高純度に付加したＧＰＩアンカー型タンパク質を製造する方法。
（３０）  前記出芽酵母として、出芽酵母cwh43 遺伝子破壊株を用いることを特徴とする、前記（２９）に記載の飽和脂肪酸をもつジアシルグリセロールが高純度に付加したＧＰＩアンカー型タンパク質を製造する方法。
（３１）  配列番号５、配列番号９もしくは配列番号２６に示される塩基配列又はその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであって、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素及び／又はそのαサブユニットをコードするＤＮＡ検出用のプローブ又はプライマーとなり得る、ポリヌクレオチド。
（３２）  配列番号１２、１５、１６、１８、１９、又は配列番号２３に示される塩基配列又はその相補配列からなる、前記（３１）に記載のポリヌクレオチド。
（３３）  配列番号３、配列番号７又は配列番号２４に示される塩基配列又はその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであって、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素及び／又はそのβサブユニットをコードするＤＮＡ検出用のプローブ又はプライマーとなり得る、ポリヌクレオチド。
（３４）  配列番号１１、１３、１４、１７、１８、１９、又は配列番号２１に示される塩基配列又はその相補配列からなる、前記（３３）に記載のポリヌクレオチド。
（３５）  前記（３１）又は（３２）に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素及び／又はそのαサブユニットをコードするＤＮＡ検出用のプローブ又はプライマー。
（３６）  前記（３３）又は（３４）に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素及び／又はそのβサブユニットをコードするＤＮＡ検出用のプローブ又はプライマー。
（３７）  前記（３５）及び／又は（３６）に記載のプローブ又はプライマーを用いることを特徴とする、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素及び／又はそのαサブユニットをコードするＤＮＡ及び／又はそのβサブユニットをコードするＤＮＡをスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の遺伝子を用いた形質転換細胞から、又は本発明のセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素複合体もしくはそのαサブユニットを酵母細胞などに作用させることで、高純度のセラミドが付加したＧＰＩアンカー型タンパク質を得ることができる。
形質転換宿主細胞などのセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質産生細胞として酵母を用いた場合には、得られるセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質のタンパク質部分は、ほとんどマンナンタンパク質であるため、セラミドの保湿作用と共にマンナンタンパク質の整腸作用などの効果も期待できるので、結合したまま精製して機能性食品などとして用いることができる。また、マンナンについてはインターフェロン誘導活性（Acta Virology, 1970; 14: 1-7）、マクロファージ遊走阻止活性（Jpn. J. Microbiol., 1975; 19: 355-362）、TNFα産生の増強（Microbiol. Immunol., 2002; 46: 503-512）など、多くの生理活性機能が報告されていることから、医薬としての用途も期待できる。
そして、亜硝酸処理あるいはフォスフォリパーゼなどによりタンパク質部分を除去すれば、高純度のセラミドを容易に得ることができ、化粧品、機能性食品などに利用可能である。特に、ヒトなど哺乳類由来のセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素複合体を用いた場合には、フィトスフィンゴシンに、ヒドロキシル化された脂肪酸がアミド結合した構造を持つ、極性の高いセラミド（Ｃ型セラミド）が得られることから、より高い保湿性が期待できる。
また、cwh43遺伝子破壊株などのセラミド付加工程が阻害された酵母細胞を用いてＧＰＩアンカー型タンパク質を調製することにより、飽和脂肪酸をもつジアシルグリセロールが高純度に付加したＧＰＩアンカー型タンパク質を得ることができ、この脂質部分は、油脂の改質剤や食品などに応用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
１．酵母由来ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素及びその遺伝子に関連した知見
タンパク質の翻訳後修飾のタイプの一つに、グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）という糖脂質の一種による修飾がある。細胞表層に存在するタンパク質のうちの一部は、ＧＰＩによって細胞膜に繋ぎ留められている。ＧＰＩがあたかも錨のように作用することから、このようなタンパク質はＧＰＩアンカー型タンパク質と呼ばれる。
ＧＰＩの合成は小胞体（ＥＲ）で始まり、リン脂質フォスファチジルイノシトール（ＰＩ）にグルコサミン、マンノース、エタノールアミンリン酸、アシル基などが順番に付加し、完全前駆体が形成される。完全前駆体は、トランスアミダーゼ複合体によってポリペプチドのＣ端に転移される。その後、脱アシル化がおこり、さらに、脂質部分の変換が行われる。ＧＰＩ生合成経路において、ＧＰＩがタンパク質に付加した後の、ＧＰＩアンカー型タンパク質のフォスファチジルイノシトール（ＰＩ）構造をリゾフォスファチジルイノシトール（リゾＰＩ）構造に変換し、さらに、飽和脂肪酸の付加したジアシルグリセロールタイプ（ｐＧ１）を経てセラミドタイプに変換するプロセスを脂質リモデリングプロセスという。
本発明者らは、本発明に先立ち、ＧＰＩの脂質リモデリングプロセス中の、「二本足構造」のＰＩからsn-2 位の不飽和型脂肪酸を除去し、脂肪酸が sn-1 位の 1 カ所のみに付加した、「一本足構造」のリゾＰＩとする酵素である「Per1タンパク質」と共に、リゾＰＩに飽和型の長い脂肪酸をsn-2 位に付加してｐＧ１型構造とする酵素である「Gup1タンパク質」の機能を明らかにし、ＧＰＩアンカー型タンパク質の脂質リモデリングプロセスの前半部分を解明することができた（特願2006-220491）。
しかしながら、当該脂質リモデリングプロセスの最後のセラミド付加工程機構のみが不明なまま残されていた（図１２）。
本発明において、このセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素Cwh43タンパク質（配列番号２）及びそのCWH43遺伝子（配列番号１）が提供されたことで、実質的にセラミドタイプまでのＧＰＩ生合成経路の全容が明らかとなり、「ＧＰＩアンカー型タンパク質の脂質リモデリングプロセス」の全体像を解明したというきわめて画期的な成果が得られた。
【０００９】
２．哺乳動物などにおけるＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素及びその遺伝子に関連した知見
一方、ヒト、マウスなど哺乳類においては、特に皮膚の角質層の細胞と皮膚の細胞の間に豊富に存在するセラミド類がＧＰＩアンカー型タンパク質の脂質部分を構成しているかどうかも、従来不明であった。
本発明者らは、ヒト及びマウスのＤＮＡデーターベースから、CWH43遺伝子と相同性の高いＤＮＡを検索したところ、マウスのC130090K23遺伝子及びヒトFLJ21511遺伝子が、CWH43遺伝子の後半部分（CWH43C）に対して高い相同性を有すること（マウスのC130090K23遺伝子とCWH43C遺伝子との相同性は塩基配列レベルで38％）と共に、マウス及びヒトのFRAG1遺伝子がCWH43遺伝子の前半部分（CWH43N）に対して高い相同性を有すること（マウスのFRAG1遺伝子とCWH43N遺伝子との相同性は塩基配列レベルで33％）ことを見出した。従来のFRAG1遺伝子に関する知見としては、線維芽細胞増殖因子受容体を活性化する機能を持ち、シグナル伝達機構に関与する遺伝子であること（非特許文献４）、及びヒト FRAG1 遺伝子についてのＧＰＩアンカー型タンパク質の脂肪酸鎖のプロセシングに関与しているという報告（非特許文献５）があるのみで、その具体的な機能が解析されておらず、マウスのC130090K23遺伝子及び対応するヒトFLJ21511遺伝子に関しては、機能推定すらなされていない状況であった。そして、そもそもマウス、ヒトいずれの場合もFRAG1遺伝子とC130090K23遺伝子、FLJ21511遺伝子とは、それぞれ別の染色体上に存在しており、両遺伝子を結びつけて考える要因は全く存在していない。
【００１０】
本発明者らは、両遺伝子それぞれの、酵母のCWH43遺伝子の後半部分（CWH43C）と前半部分（CWH43N）への高い相同性をもとに、両者がコードするタンパク質がサブユニット構造を形成してセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を呈する、という仮説をたて、後述する実施例により実験的に証明した。
すなわち、CWH43遺伝子の後半部分（CWH43C）と相同性のあるマウス由来C130090K23遺伝子について、酵母cwh43遺伝子欠損酵母細胞内で発現させた場合に、酵母CWH43遺伝子を相補してセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質を合成させることを確認し、単独でセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性があることを確認した。
また、CWH43Nと相同性を有するマウス由来FRAG1遺伝子を、酵母細胞内でC130090K23遺伝子と同時に発現させた場合に、セラミドが付加されたＧＰＩアンカー型タンパク質の合成量が増加すること、特に、フィトスフィンゴシンに、ヒドロキシル化された脂肪酸がアミド結合したセラミド（Ｃ型セラミド）が付加されたものの増加が際立っていることを見出した。そして、FRAG1遺伝子発現産物（FRAG1）及びC130090K23遺伝子発現産物（C130090K23）に対する共沈試験の結果、両者が速やかに共沈することを確認した。
これらの結果を総合的に判断すれば、哺乳類の系においては、細胞内でC130090K23（FLJ21511）及びFRAG1はそれぞれα及びβサブユニットとして複合体を形成してセラミド型ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素として働き、βサブユニットのFRAG1がαサブユニットのC130090K23によるセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性の増強作用を担っていることは明らかである。
さらに、α及びβサブユニットそれぞれに対応する酵母由来のCwh43C及びCwh43Nタンパク質の共沈試験においても明確な共沈反応が観察されたことは、Cwh43C及びCwh43Nタンパク質も同様にα及びβサブユニットとして機能することが確認できたことに他ならず、哺乳類でのセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素複合体で観察されたα、βサブユニット構造及び機構は広く生物に普遍的なものであることが強く示唆される。
【００１１】
３．本発明におけるＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素 
本発明で得られた以上の知見に基づき、以下、本件発明に含まれるセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素活性を有するタンパク質及び当該タンパク質をコードするＤＮＡについて述べる。
ここで、「セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質（Glycosyl-inositolphophorylceramide-anchored protein）」を、その頭文字をとって「ＧＩＰＣ-ＡＰ」ともいい、「セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素」を「ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素」ともいう。その際、「ＧＩＰＣ-ＡＰ」合成酵素活性を有するタンパク質及び同タンパク質複合体もあわせて「ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素」ということもある。
また、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素複合体における２つのサブユニット構造のうち、酵母由来のCwh43のＣ末側（Cwh43C）と相同性があり、ＩＰＣ合成酵素活性を有するサブユニットをαサブユニットと称し、同Cwh43のＮ末側（Cwh43N）と相同性があり、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素活性の増強効果を有するサブユニットをβサブユニットと称する。
【００１２】
４．出芽酵母由来CWH43関連ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素及びその遺伝子
出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のCWH43遺伝子がコードする酵素タンパク質（Cwh43タンパク質）は、上記脂質リモデリングプロセスにおける、フォスファチジルイノシトール構造のＧＰＩアンカー型タンパク質にセラミドを付加し、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質（ＧＩＰＣ-ＡＰ）を合成する機能を有する。該遺伝子の塩基配列は、配列番号１に示され、当該遺伝子がコードする該酵素タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。
また、この出芽酵母のCwh43タンパク質は、C末側（配列番号２のアミノ酸配列の２１８〜９５３位）の部分タンパク質のみでＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素活性を有していることからみて、配列番号２のうちの少なくとも２１８〜９５３位のアミノ酸配列（配列番号６）を含みさえすればCwh43タンパク質と同等の機能を有する。
そして、上記Cwh43タンパク質及びそのＣ末側の部分タンパク質と高い相同性を有するタンパク質、すなわち、配列番号２又はその少なくとも２１８〜９５３位を含む部分アミノ酸配列のうち、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、同様のＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素活性を有しているタンパク質も、本発明において、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素として用いられる。なお、このような欠失、置換、付加といった改変タンパク質は、化学的または酵素的処理で得ることもでき、また当該タンパク質をコードする遺伝子を用いて部位突然変異法や制限酵素による突然変異導入法などを適用する定法の遺伝子組換え手法により合成できる。
同様に、配列番号１からなるCWH43遺伝子の一部であって、少なくとも６５２〜２８５９位の塩基配列を含む塩基配列はCWH43遺伝子と同等の機能を有する遺伝子であるといえるから、配列番号１又はその少なくとも６５２〜２８５９位の塩基配列を含む部分塩基配列からなるＤＮＡ、及び、それらの塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの場合も本発明のＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとして用いることができる。なお、ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、典型的には Sambrook et al., 1989 (Molecular cloning: a laboratory manual; Cold Spring Harbor Lab, Cold Spring Harbor, NY, 2nd ed.) による、高い緊縮条件下でのサザンハイブリダイゼーションを適用した場合に検出できる程度に高い相同性（同一性）を有していること、通常、８５〜９０％以上の相同性を有していることを表現したものであり、実際にも各種生物の、市販または適宜作成したｃＤＮＡライブラリなどからＰＣＲ法及び／又はサザンハイブリダイゼーション法により取得することができる。
なお、本発明における「相同性」とは、Lipman-Pearsonの計算法（Lipman and Pearson, 1985; Science 227, 1435-1441）での「同一性」を示す換算数値である。また、特定の配列番号で示される塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする、というとき、当該塩基配列と共にその相補配列である場合も含む。
【００１３】
そして、これらの出芽酵母由来CWH43関連ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素は、下記のＤＮＡを用いて形質転換した酵母などの宿主細胞から産生することができる。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
ここで、配列番号２は、Cwh43タンパク質のアミノ酸配列に相当する。
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１部であって、少なくとも２１８〜９５３位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
ここで、配列番号２の２１８〜９５３位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列は、配列番号５に示されるCwh43Cタンパクに相当し、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素活性が確認されている。
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
ここで、配列番号１は、CWH43遺伝子の塩基配列に相当する。
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列の一部であって、少なくとも６５２〜２８５９位の塩基配列を含むＤＮＡ。
配列番号１の６５２〜２８５９位の塩基配列は、配列番号３に示されるCWH43Cの遺伝子に相当する。
（Ｅ）上記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
そして、得られたＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素は、形質転換細胞を破砕し、抽出後、通常のタンパク質精製法を適用して単離精製することもできるが、未精製のままでＧＰＩアンカー型タンパク質に作用させてＧＩＰＣ-ＡＰ合成用に用いることができる。また、当該形質転換細胞に内在するＧＰＩアンカー型タンパク質に対して作用させ形質転換細胞から直接ＧＩＰＣ-ＡＰを合成させることができる。
【００１４】
５．ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のα及びβサブユニットをコードする遺伝子
そして、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のうち、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のαサブユニット機能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、哺乳類由来の典型的なものとしてマウスのC130090K23 (NM_181323)遺伝子（配列番号９）及びヒトFLJ21511(NM_025087)遺伝子（配列番号２６）をあげることができる。両者ともCWH43遺伝子の後半部分（CWH43C）に対して高い相同性を有している（マウスのC130090K23遺伝子とCWH43C遺伝子との相同性は塩基配列レベルで３８％、アミノ酸配列レベルで２８．９％であった。）。哺乳類の中でも進化上遠い種であるマウスとヒト間の相同性は塩基配列レベルで８２．３％（アミノ酸配列レベルでも８１．３％）であったことから、配列番号９及び配列番号２６のいずれに対しても７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは８５％以上の相同性がある塩基配列からなるＤＮＡであって、特に哺乳類由来のＤＮＡであれば、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のαサブユニット機能を有するタンパク質をコードする遺伝子としての機能を有する蓋然性が高い。また、配列番号９及び配列番号２６と共にCWH43C遺伝子の塩基配列（配列番号５）の三者に対しての相同性が高い配列は、ほぼ確実に同様のＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のαサブユニット機能が期待できる。具体的には、配列番号５、９及び２６のいずれの塩基配列に対しても３０％以上、好ましくは４０％以上の相同性があるＤＮＡも包含される。
また、取得したＤＮＡの機能は、小麦胚芽、大腸菌のライセートの系でin vitro翻訳させるか形質転換酵母宿主などで発現させて確認することができるが、取得したＤＮＡを出芽酵母の発現ベクターに接続してcwh43遺伝子破壊株に導入し、形質転換体のCalcofluor White 感受性と温度感受性を調べることによっても確認できる。
なお、cwh43 破壊株は市販されている出芽酵母由来の細胞壁が欠損している酵母細胞株であり、細胞壁欠損を検出する薬剤であるCalcofluor Whiteに対する感受性及び高温感受性を示している。この回復試験は、それぞれ、出芽酵母細胞を Calcofluor White を含んだ栄養培地上で培養する、あるいは、栄養培地上で高温下（たとえば 39℃）で培養することにより行うことができる。
同様に、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のβサブユニット機能を有するタンパク質をコードする遺伝子として典型的なものは、ヒト FRAG1 (GenBank Acc. No. NM_014489)遺伝子（配列番号２４）及びマウス Frag1 (NM_145583)遺伝子（配列番号７）であり、両者ともCWH43遺伝子の前半部分（CWH43N）に対して高い相同性を有している（マウスのFRAG1遺伝子とCWH43N遺伝子との相同性は塩基配列レベルで３３％、アミノ酸配列レベルでは２５．３％であった。）。マウスとヒト間の相同性が塩基配列レベルで６７．９％（アミノ酸配列レベルでは、９４．４％）であったことから、配列番号７及び配列番号２４のいずれに対しても少なくとも７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは８５％以上の相同性がある塩基配列からなるＤＮＡであれば、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のβサブユニット機能を有するタンパク質をコードする遺伝子としての機能を有する蓋然性が高いので、本発明におけるβサブユニットをコードするＤＮＡに包含される。また、配列番号７及び配列番号２４と共にCWH43N遺伝子の塩基配列（配列番号３）の三者に対しての相同性が高い配列は、ほぼ確実に同様のＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のβサブユニット機能が期待できる。具体的には、配列番号３、７及び２４のいずれの塩基配列に対しても３０％以上、好ましくは４０％以上の相同性があるＤＮＡも本発明のＤＮＡとして包含される。
【００１５】
６．ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のα及びβサブユニット
上記ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素のαサブユニットをコードする遺伝子に対応するタンパク質、すなわちＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のαサブユニットとしては、上記同遺伝子について述べたと同様の理由で、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなるアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素活性を有すると共に、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のαサブユニットとしての機能が期待できる。
（Ａ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列。
ここで、配列番号６は、出芽酵母由来Cwh43Cタンパク質に、配列番号１０は、マウスC130090K23タンパク質に、そして配列番号２７はヒトFLJ21511タンパク質に対応するアミノ酸配列である。
（Ｂ）配列番号６、配列番号１０又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号１０及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列のいずれに対しても７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは８５％以上の相同性があるアミノ酸配列。
（Ｄ）配列番号６、配列番号１０及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列のいずれに対しても３０％以上、好ましくは４０％以上の相同性があるアミノ酸配列。
なお、配列番号１０と配列番号２７の相同性は８１．３％であり、配列番号６と配列番号１０とは相同性２８．９％、配列番号６と配列番号２７とは相同性２８．３％であった。
ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のβサブユニットとしては、下記（Ｅ）〜（Ｈ）からなるアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、同様に、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素活性増強作用という、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のβサブユニットとしての機能が期待できる。
（Ｅ）配列番号４、配列番号８又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列。
ここで、配列番号４は、出芽酵母由来Cwh43Nタンパク質に、配列番号８は、マウスFRAG1タンパク質に、そして配列番号２５はヒトFRAG1タンパク質に対応するアミノ酸配列である。
（Ｆ）配列番号４、配列番号８又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
（Ｇ）配列番号８及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列のいずれに対しても７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは８５％以上の相同性があるアミノ酸配列。
（Ｈ）配列番号４、配列番号８及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列のいずれに対しても３０％以上、好ましくは４０％以上の相同性があるアミノ酸配列。
なお、配列番号８と配列番号２５の相同性は９４．４％であり、配列番号４と配列番号８とは相同性２５．３％、配列番号４と配列番号２５とは相同性１７．９％であった。
【００１６】
これらのＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体αサブユニット及びβサブユニットを合成するためには、通常の遺伝子組換え法による形質転換技術が適用でき、典型的には、上記αサブユニット及びβサブユニット遺伝子を、同一のもしくは別々の発現ベクターに繋いで宿主細胞を形質転換して取得することができる。たとえば、酵母の発現ベクターにαサブユニット及びβサブユニット遺伝子をそれぞれ別にもしくは連結して挿入することにより、酵母細胞内で生産させることにより得ることが可能である。具体的には、出芽酵母用発現ベクター YEp352GAP の、TDH3 プロモータと TDH3 ターミネータとの間に、これらの遺伝子を挿入する。このようなプラスミドを酵母細胞に酢酸リチウム法などにより導入し、栄養培地上で増殖させると、酵母細胞は遺伝子産物としてＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体を、または各サブユニットを生産する。
得られたＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のα及びβサブユニットは、それぞれ精製して単離してＧＩＰＣ-ＡＰの合成に用いることもできるが、特に精製されていなくてもよく、未精製の培養溶液、又はミクロソーム膜画分として用いることができる。また、当該αサブユニット及び／又はβサブユニットを産生している酵母などの産生細胞のまま用いることができる。すなわち、ＧＰＩアンカー型タンパク質に対して、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のα及びβサブユニットをコードする遺伝子、又は同αサブユニットをコードする遺伝子を用いて形質転換した細胞を作用させれば、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質を生産することができる。
特に、出芽酵母などの細胞内でＧＰＩアンカー型タンパク質を大量に生産している細胞を宿主として選択すれば、形質転換宿主細胞が、細胞内のＧＰＩアンカー型タンパク質にセラミドを付加したタンパク質を細胞膜中のマイクロドメイン内などに大量に分泌する。その際、細胞内のＧＰＩアンカー型タンパク質は、当該細胞自体が天然に産生する場合であってもよいが、好ましいＧＰＩアンカー型タンパク質をコードする遺伝子、もしくはＧＰＩアンカー型タンパク質合成酵素をコードする遺伝子などにより形質転換された細胞でもよい。
【００１７】
７．ＧＩＰＣ-ＡＰ及びＧＩＰＣ-ＡＰ合成方法
ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体またはそのαサブユニットを用いるセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質の製造方法は上記したとおりであって、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体またはそのαサブユニットをコードする遺伝子の発現産物タンパク質を精製もしくは未精製の状態でＧＰＩアンカー型タンパク質に対して作用させることでセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質を製造することができ、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体またはそのαサブユニットをコードする遺伝子を用いた形質転換細胞により、内在性のもしくは外来ＧＰＩアンカー型タンパク質にセラミドを付加することでセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質（ＧＩＰＣ-ＡＰ）を産生できる。
その際に、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のβサブユニットには、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素活性を増強する作用があるため、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素αサブユニットと共にＧＰＩアンカー型タンパク質に対して作用させると、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質の産生量が増大する。ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素βサブユニットをコードする遺伝子を、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素αサブユニットをコードする遺伝子と共に形質転換した形質転換細胞を用いて、当該形質転換細胞によりセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質を産生することが好ましい。
【００１８】
そして、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素αサブユニットと共にβサブユニットを用いてセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質を合成した場合にはＧＰＩアンカー型タンパク質に付加されるセラミドとして、Ｃ型セラミド（ヒドロキシル化された脂肪酸鎖およびフィトスフィンゴシンより成るセラミド）の割合が高まる。特に、形質転換細胞の宿主として酵母を選択し、酵母細胞内で哺乳類のＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体をコードする遺伝子を発現させ、酵母の内在性ＧＰＩアンカー型タンパク質にセラミドを付加させた場合に得られるセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質には、たとえば実施例６に示すように、顕著にＣ型セラミドが付加されている。
Ｃ型セラミドは、スフィンゴシンおよび脂肪酸鎖がともにヒドロキシル化されており親水性が高いので、より保湿効果が高いなどのセラミドとしての効果が期待できるので、Ｃ型セラミドが付加されているＧＰＩアンカー型タンパク質の有用性は高い。好ましい全セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質中のＣ型セラミド付加型の比率は少なくとも１０％以上であり、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは５０％以上である。
【００１９】
また、上記４．で述べたように、出芽酵母CWH43に関連したＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素をコードする下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのＤＮＡを用いて産生させることができる。具体的には、形質転換した酵母などの宿主細胞から、まずＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素を産生して、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素を単離精製して、もしくは未精製のままでＧＰＩアンカー型タンパク質に作用させるか、又は当該形質転換細胞を培養し、直接セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質を産生させる。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
ここで、配列番号２はCwh43タンパク質のアミノ酸配列である。
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１部であって、少なくとも２１８〜９５３位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
ここで、配列番号２の２１８〜９５３位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列は、配列番号５に示されるCwh43Cタンパクに相当し、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素活性が確認されている。
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
ここで、配列番号１は、CWH43遺伝子の塩基配列に相当する。
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列の１部であって、少なくとも６５２〜２８５９位の塩基配列を含むＤＮＡ。
配列番号１の６５２〜２８５９位の塩基配列は、配列番号３に示されるCWH43Cの遺伝子に相当する。
（Ｅ）上記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００２０】
得られたセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質は、通常のタンパク質精製方法が適用できるが、例えば以下のような方法で精製することができる。典型的な出芽酵母のＧＰＩアンカー型タンパク質、例えば Gas1p や Cwp2p にあらかじめタグを付けておき、タグ付きＧＰＩアンカー型タンパク質遺伝子を発現した酵母の破砕液を、タグを認識する抗体を結合したビーズと混合することにより、特異的にビーズにタグ付きＧＰＩアンカー型タンパク質を吸着させることができる。
【００２１】
８．セラミドの製造方法及びＣ型セラミドリッチのセラミド組成物
上記７．で得られたセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質に対して、フォスフォリパーゼＣあるいはフォスフォリパーゼＤなどの酵素処理を施すか、あるいはタンパク質及び糖質部分を化学的処理、たとえば亜硝酸処理を施すことでセラミドを分離することができる。
その際セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質は、単離精製したセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質でなくても、未精製のままのセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質含有物、たとえば ConA-Sepharose に吸着させた糖タンパク質混合物の状態であっても良い。
また、フォスフォリパーゼの酵素処理条件は、適切な酵素用のバッファ中でたとえば37℃で 24 時間、亜硝酸の処理条件は、まずpronaseなどで処理してタンパク質部分を消化後、煮沸し、乾燥した後に、亜硝酸処理を 37°C で 3 時間行うことが好ましい。
【００２２】
上述のように、哺乳動物のＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素αサブユニットと共にβサブユニットを用いてセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質を合成した場合にはＣ型セラミドタイプのＧＰＩアンカー型タンパク質が産生され、特に、形質転換細胞の宿主として酵母を選択し、酵母細胞内で哺乳動物のＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体をコードする遺伝子を発現させ、酵母の内在性ＧＰＩアンカー型タンパク質にセラミドを付加させた場合には、顕著にＣ型セラミドが付加されているため、これらの製造法で得られたセラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質からセラミドを分離することで、Ｃ型セラミドリッチのセラミド組成物を得ることができる。
好ましい全セラミド組成物中のＣ型セラミドの比率は少なくとも１０％以上であり、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは５０％以上である。
【００２３】
９．セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質前駆物質の製造方法
また、cwh43遺伝子破壊株を用いることで、セラミド付加ＧＰＩアンカー型タンパク質の前駆体に相当する、飽和脂肪酸をもつジアシルグリセロールが高純度に付加したＧＰＩアンカー型タンパク質が酵母細胞内部に著量に蓄積することが、実施例４により確認されている。
したがって、出芽酵母のようなＧＰＩアンカー型タンパク質を本来産生する細胞において、グリセロール型ＧＰＩアンカー型タンパク質からのセラミド型への変換ステップを阻害することで、飽和脂肪酸をもつジアシルグリセロールが高純度に付加したＧＰＩアンカー型タンパク質を製造することができる。
【００２４】
１０．ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素遺伝子のスクリーニング
上記４．及び５．で述べたＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素遺伝子は、市販のｃＤＮＡライブラリなどより、ＰＣＲ法などを用いて取得することが可能であるが、そのためのプライマー、プローブとしては、本発明により取得された出芽酵母由来のCWH43遺伝子に対応する配列番号１に示される塩基配列又はその相補配列の部分配列、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素複合体のαサブユニットに対応する配列番号５、９及び２６に示される塩基配列又はその相補配列の部分配列、同βサブユニットに対応する配列番号３、７及び２４に示される塩基配列又はその相補配列の部分配列を用いることができる。
ここで、配列番号５はCWH43Cの遺伝子配列であり、配列番号３はCWH43Nの遺伝子配列なので、両者をあわせるとほぼ配列番号１となることから、結局、本発明におけるＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素遺伝子検出用に有用なポリヌクレオチドは、
（１）配列番号５、９及び２６に示される塩基配列又はその相補配列の部分配列であり、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素及び／又はそのαサブユニットをコードする遺伝子の検出用のプライマー、プローブとして用いることのできる長さのポリヌクレオチド、ならびに
（２）配列番号３、７及び２４に示される塩基配列又はその相補配列の部分配列であり、ＧＩＰＣ-ＡＰ合成酵素及び／又はそのβサブユニットをコードする遺伝子の検出用のプライマー、プローブとして用いることのできる長さのポリヌクレオチド、
である。
このようなスクリーニング用（検出用）に用いることのできるプライマーの長さは、少なくとも１０塩基以上であり、好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、最も好ましくは２０塩基以上である。同様に、プローブとしての長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、最も好ましくは３０塩基以上である。
たとえば、上記（１）のプライマーとしては、配列番号１２、１５、１６、１８、１９及び２３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが、また上記（２）のプライマーとしては、配列番号１１，１３、１４、１７、１８、１９及び２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが用いられる。
【実施例】
【００２５】
以下に、実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例で用いた測定方法などの実験手法は下記のとおりである。
DRM 画分の単離方法は Bagnat et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97, 3254-3259 によった。波長600 nm における光学密度が30（30 OD600）に相当する量の細胞数になるように、細胞をグラスビーズで破砕し、破砕液に終濃度 1% の Triton X-100 を加えた後、Optiprep によって密度勾配遠心を行なうことで調整する。その後、各画分を SDS-PAGE、ウェスタンブロッティングを行い、Gas1p の抗体を用いて検出することができる。
cwh43 破壊株は市販されている出芽酵母由来の細胞壁が欠損している酵母細胞株であり、細胞壁欠損を検出する薬剤であるCalcofluor Whiteに対する感受性及び高温感受性を示している。この回復試験はそれぞれ、出芽酵母細胞を Calcofluor White を含んだ栄養培地上で培養する、あるいは、栄養培地上で高温下（たとえば 39℃）で培養することにより行うことができる。
【００２６】
＜実施例 1＞
〔出芽酵母 CWH43 遺伝子および Cwh43 タンパク質、マウス FRAG1 遺伝子、FRAG1 タンパク質、マウス C130090K23 遺伝子、C130090K23 タンパク質の調製〕
CWH43 遺伝子は、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）ゲノム DNA を鋳型として、PCR 法によって得た。PCR に用いたプライマーは、以下のとおりである。
CWH43-BamHI-F  5’- aaaaggatccgcaaacaatcttgaaggct -3’（配列番号 11）
CWH43-SalI-stop-NheI-R  5’- aaaagtcgacttagctagctaagtaataacgtggctcatca -3’（配列番号 12）
増幅によって得られた DNA 断片を制限酵素 BamHI および SalI によって切断し、出芽酵母用単コピーベクター pRS316（Sikorski and Hieter, 1989; Genetics 122, 19-27）に挿入し、塩基配列を決定した。オープンリーディングフレーム部分の塩基配列は、配列番号 1 のとおりである。このプラスミドに GPI7 遺伝子のターミネータを挿入し、酵母細胞内に導入、CWH43 遺伝子を発現させ、配列番号 2 に示されるアミノ酸配列を持ったタンパク質を得た。このようにして作られた Cwh43 タンパク質は、cwh43 破壊株の Calcofluor White 感受性や高温感受性を示さなくなり（図 5）、機能を有していることが確認できた。
マウス FRAG1 遺伝子は、NIH 哺乳類遺伝子コレクションクローン No. 3588752 のプラスミド DNA を鋳型として、PCR 法によって得た。PCR に用いたプライマーは、以下のとおりである。
EI-mmFRAG1-F24  5’- ggaattcatgtaccaggtcccactgac -3’（配列番号 13）
mmFRAG1-NotI-R33  5’- ataagaatgcggccgcgaatctcttttcctcaggctg -3’（配列番号 14）
増幅によって得られた DNA 断片を制限酵素 EcoRI および NotI によって切断し、出芽酵母用多コピー発現ベクター YEp352GAP II（Abe et al., 2003; Glycobiology 13, 87-95）のターミネータ直前に HA エピトープタグが挿入されているプラスミドに挿入し、塩基配列を決定した。オープンリーディングフレーム部分の塩基配列は、配列番号 7 のとおりである。このプラスミドYEp352GAPII-FRAG1-HA を酵母細胞内に導入、FRAG1 遺伝子を発現させ、配列番号 8 に示されるアミノ酸配列を持ったタンパク質を得た。
マウス C130090K23 遺伝子は、NIH 哺乳類遺伝子コレクションクローン No. 3584006 のプラスミド DNA を鋳型として、PCR 法によって得た。PCR に用いたプライマーは、以下のとおりである。
Sma-mmFLJ21511-F30  5’- tcccccgggatgccaggcctgtggagag -3’（配列番号 15）
mmFLJ21511-N*Sa-R27  5’- tgcggtcgactcagctagcaacgaagtatttgggtgtattca -3’（配列番号 16）
増幅によって得られた DNA 断片を制限酵素 SmaI および SalI によって切断し、出芽酵母用多コピー発現ベクター YEp352GAP II（Abe et al., 2003; Glycobiology 13, 87-95）に挿入し、塩基配列を決定した。オープンリーディングフレーム部分の塩基配列は、配列番号 9 のとおりである。このプラスミドを酵母細胞内に導入、C130090K23 遺伝子を発現させ、配列番号 10 に示されるアミノ酸配列を持ったタンパク質を得た。さらに、PCR 法で増幅した HA タグを YEp352GAPII-C130090K23 のストップコドン直前の NheI サイトに導入して、YEp352GAPII-C130090K23-HAプラスミドを作成した。このようにして作られた C130090K23 タンパク質は、cwh43 破壊株の Calcofluor White 感受性を回復したことから、cwh43 破壊株における CWH43 の機能を補うことが確認できた（図 9）。
また、HA 抗体を用いたウエスタン解析により、FRAG1-HA タンパク質および C130090K23-HA タンパク質が発現していることが確認できた（図 10A）。
【００２７】
＜実施例 2＞
〔cwh43 破壊株の表現型の解析〕
市販の（EUROSCARF より入手）出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）の CWH43 遺伝子の破壊株（cwh43Δ）を用いて、細胞壁欠損の指標となる薬剤 Calcofluor White (CFW) の感受性と温度感受性とを確認した。野生株はどの条件でも増殖したのに対して、cwh43Δ株は 10μg/mL 以上の CFW に感受性を示し、さらに 39°C で温度感受性を示した（図 5）。このことから cwh43Δは細胞壁合成に異常があることが示唆された。
続いて GPI アンカー型タンパク質の合成に CWH43 遺伝子が関与するかを調べるため、野生株、cwh43Δ株、gup1Δ株および per1Δ株において、酵母の代表的な GPI アンカー型タンパク質である Gas1p のウェスタンブロッティングを行った。ここで、GUP1 および PER1 遺伝子は、GPI アンカー型タンパク質の脂質リモデリングに関与することがすでに示されているため（Bosson et al., 2006; Mol. Biol. Cell 17, 2636-2645 および Fujita et al., 2006; Mol. Biol. Cell 17, 5253-5264）、対照として用いた。報告通り、野生株に比べて gup1Δ株、per1Δ株ではGas1p の発現が非常に減少していたが、cwh43Δ株では野生株とほとんど同じであった（図 1A）。また、蛍光タンパク質である mRFP と融合させた Gas1 タンパク質 mRFP-Gas1 の局在を蛍光顕微鏡で観察したところ、cwh43Δ株においても、野生株と同様に細胞表層に正しく局在していた（図 1B）。これらのことから、cwh43Δ株では Gas1p の局在や発現に欠損はないと考えられる。
【００２８】
＜実施例 3＞
〔GPI アンカー型タンパク質 Gas1 の膜局在の解析〕
GPI アンカー型タンパク質は通常、細胞膜中のマイクロドメインまたは脂質ラフトと呼ばれる、スフィンゴ脂質やステロールが豊富に存在する膜の部分に存在していることが知られている。マイクロドメインに相当する画分は界面活性剤である Triton X-100（1%）で可溶化されない画分（DRM）として生化学的に単離することができる。Bagnat らにより、酵母にもマイクロドメインが存在し、GPI アンカー型タンパク質はマイクロドメインに存在することが明らかとなっている（Bagnat et al., 2000; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3254-3259）。
DRM 画分の単離方法は Bagnat et al., 2000; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3254-3259 に従った。30 OD600（約 3 × 108 個の細胞数に相当）の野生株、cwh43Δ株、gup1Δ株、per1Δ株をグラスビーズで破砕し、破砕液に終濃度 1% の Triton X-100 を加えた後、密度勾配剤として Optiprep を使用した密度勾配遠心を行った。その後、上層から順に分取した各画分に対して SDS-PAGE、ウェスタンブロッティングを行い、調製した抗 Gas1p 抗体および市販の抗 Pma1p、Pho8p 抗体を用いて、Gas1p、Pma1p、および Pho8p をそれぞれ検出した。GPI アンカー型タンパク質である Gas1p を検出した結果、報告通り、野生株では DRM 画分（画分 2）に最も多く存在するのに対して、gup1Δ株および per1Δ株では DRM 画分にはほとんど存在せず、可溶化画分（画分 4-6）に存在した（Bosson et al., 2006; Mol. Biol. Cell 17, 2636-2645 および Fujita et al., 2006; Mol. Biol. Cell 17, 5253-5264）（図 2）。それに対し、cwh43Δ株の Gas1p は野生株と同様に DRM 画分（画分 2）に最も多く存在した。従って、これらの結果から cwh43Δ株の GPI アンカー型タンパク質 Gas1p のマイクロドメインへの局在は異常になっていないと考えられる。
【００２９】
＜実施例 4＞
〔GPI アンカー型タンパク質の脂質部分の解析〕
GPI アンカー型タンパク質よりイノシトールが付加した脂質部分を切り出してその構造を解析した。方法は Guillas et al., 2000; Methods Enzymol. 312, 506-515 に従った。野生株、cwh43Δ株、gup1Δ株、per1Δ株、gup1Δper1Δ二重破壊株、および GPI アンカーの生合成に関与する GPI7 遺伝子の破壊株（gpi7Δ）のそれぞれ 20 OD600（約 2 × 108 個の細胞数に相当）に [2-3H] イノシトール 50μCi を 2 時間取り込ませた後、クロロホルム／メタノールで洗うことにより、細胞中の脂質を完全に除いた。タンパク質を可溶化後、ConA-sepharose（GE Healthcare）により、糖タンパク質を濃縮した。洗浄後、pronase（Roche）で 37°C、16 時間処理してタンパク質部分を消化後、煮沸した。乾燥後、亜硝酸処理を 37°C で 3 時間行うことによって GPI の脂質部分をタンパク質から切り出し、ブタノール抽出を行い、再び乾燥させた。抽出した PI を 15μL のクロロホルム／メタノール（1:1）に懸濁し、シリカ 60 プレート（Merck）にアプライし、クロロホルム／メタノール／0.25% KCl（55:45:10）の溶媒系で薄層クロマトグラフィを行うことにより分離した。検出は発光イメージ解析装置（Bio-Rad 社 Molecular Imager FX）で行った。
その結果、野生株では、sn-2 位に炭素数 26 の飽和脂肪酸を持つジアシルグリセロール型の PI（pG1）およびイノシトールフォスフォセラミド／B 型（IPC/B）、イノシトールフォスフォセラミド／C 型（IPC/C）が報告どおり検出された（Bosson et al., 2006; Mol. Biol. Cell 17, 2636-2645）（図 3）。gup1Δ株ではリゾ体の PI（lyso-PI）が報告どおり検出された（Bosson et al., 2006; Mol. Biol. Cell 17, 2636-2645）。per1Δ株では脂肪酸が短いままのジアシルグリセロール型の PI（PI） のみが報告どおり検出された（Fujita et al., 2006; Mol. Biol. Cell 17, 5253-5264）。さらに、gup1Δper1Δ二重破壊株では per1Δ株同様に PI が検出されるとともに、IPC/C が報告通り検出された（Fujita et al., 2006; Mol. Biol. Cell 17, 5253-5264）。また、gpi7Δ株ではゴルジ体での GPI のリモデリングに欠損があり、IPC/C を持たないことが報告されている（Benachour et al., 1999; J. Biol. Chem. 274, 15251-15261）が、報告どおりの結果となった。これらに対して、cwh43Δ株では、sn-2 位に炭素数 26 の飽和脂肪酸を持つジアシルグリセロール型の PI（pG1）および、リゾ体の PI（lyso-PI）が検出された。このことから、CWH43 は脂質リモデリングの後期ステップである脂質部分のセラミド型への変換に関与していることが示された。
ジヒドロスフィンゴシン（DHS）を細胞内に取り込ませると、セラミド誘導体に代謝されて GPI アンカー型タンパク質に付加されることが知られている。
CWH43 が脂質リモデリングに関与しているかをさらに確かめるために、トリチウムでラベルした DHS（[3H]DHS）のタンパク質への取り込みを検討した。方法は Guillas et al., 2000; Methods Enzymol. 312, 506-515、Umemura et al., 2003; J. Biol. Chem. 287, 23639-23647 および、Benachour et al., 1999; J. Biol. Chem. 274, 15251-15261 に従った。野生株、cwh43Δ株、および gpi7Δ株に、[3H]DHS を 2 時間取り込ませた。生体内での DHS 合成を阻害する薬剤であるミリオシンを一緒にラベル溶液に入れ、[3H]DHS の取り込み効率を上げた。菌体をグラスビーズで破砕し、1% SDS を入れて煮沸しタンパク質を可溶化した。その後、糖タンパク質を ConA-sepharose（GE Healthcare）で濃縮し、SDS-PAGE により分離した。検出は発光イメージ解析装置（Bio-Rad 社 Molecular Imager FX）で行った。
野生株では報告通り 3H でラベルされた糖タンパク質が検出されたことからセラミド付加 GPI アンカー型タンパク質があることが示された。gpi7Δ株では報告通りその量が少なくなっていた（Benachour et al., 1999; J. Biol. Chem. 274, 15251-15261）（図 4）。それに対し、cwh43Δではラベルされた糖タンパク質が全くあるいはほとんど検出されなかった。このことより、cwh43Δにおいては、GPI アンカーのセラミドへの脂質リモデリングが行われていないことが示された。
【００３０】
＜実施例 5＞
〔CWH43 の機能ドメインの解析〕
CWH43 が GPI アンカーのセラミドへの脂質リモデリングに関与することから、この機能に関わる Cwh43 タンパク質のドメインを明らかにし、また、マウス C130090K23 の遺伝子の機能を類推するため、CWH43 遺伝子を、FRAG1 と相同性を持つ N 末端側（CWH43N、1-299、299アミノ酸）と、C130090K23 と相同性を持つ C 末端側（CWH43C、218-953、737アミノ酸）とに分けたプラスミドを構築した（図 5A）。
CWH43N 遺伝子は、pRS316-CWH43-HA プラスミドを鋳型として、PCR 法によって得た。PCR に用いたプライマーは、以下のとおりである。
Xho-CWH43-P-N-F14  5’- gatttctcgaggaataagtaac -3’（配列番号 17）
CWH43-N-NheStpXho-R15  5’- ccgctcgaggtcgacttagctagcactagagtctctaatttggaaaa-3’（配列番号 18）
増幅によって得られた DNA 断片を制限酵素 XhoI によって切断し、CWH43-HA 発現単コピーベクター pRS316-CWH43-HAの XhoI サイトの断片と入れ替え、塩基配列を決定した。オープンリーディングフレーム部分の塩基配列は、配列番号 3 のとおりである。細胞内に導入して CWH43N 遺伝子を発現させ、配列番号 4 に示されるアミノ酸配列を持ったタンパク質を得た。
CWH43C 遺伝子は、CWH43 遺伝子 を鋳型として、PCR 法によって得た。PCR に用いたプライマーは、以下のとおりである。
Xho-CWH43-P-C1-F11  5’- tttctcgaggaataagtaaccaggaatacagaaggtatccaccgccagttatgggtaataccagttttttccaaatt -3’（配列番号 19）
NheStpXho-R12  5’-ccgctcgaggtcgacttagctag-3’（配列番号 20）
増幅によって得られた DNA 断片を制限酵素 XhoI によって切断し、CWH43-HA 発現単コピーベクター pRS316-CWH43-HAの XhoI サイトの断片を入れ替え、塩基配列を決定した。オープンリーディングフレーム部分の塩基配列は、配列番号 5 のとおりである。細胞内に導入して CWH43C 遺伝子を発現させ、配列番号 6 に示されるアミノ酸配列を持ったタンパク質を得た。
このようにして作られた Cwh43N タンパク質および Cwh43C タンパク質の、Calcofluor White 感受性に対する効果を調べた。Cwh43N タンパク質は cwh43 破壊株の Calcofluor White 感受性を回復しなかったが、Cwh43C タンパク質は回復した。このことから、Cwh43C タンパク質は Cwh43 の機能を補いうることがわかった。
次に、CWH43 遺伝子およびその領域の機能をより詳しく調べるために、それぞれの高発現系を構築した。はじめに、CWH43 遺伝子の全長が挿入されているプラスミドを構築した。出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）の CWH43 が入っているプラスミド pRS316-CWH43-HA を鋳型として、PCR 法によって CWH43 全長のオープンリーディングフレームおよびそのカルボキシル末端に HA タグが挿入された断片を得た。PCR に用いたプライマーは、以下のとおりである。
Kpn-CWH43-F18  5’- ggggtaccatgctgatcatcaatgggaag -3’（配列番号 21）
HANheStpXba-R17  5’- gctctagattagctagcgtaatccggtac -3’（配列番号22）
増幅によって得られた DNA 断片を制限酵素 KpnI および XbaI によって切断し、出芽酵母用多コピー発現ベクター YEp352GAP II（Abe et al., 2003; Glycobiology 13, 87-95）に挿入し（YEp352GAPII-CWH43-HA）、塩基配列を決定した。オープンリーディングフレーム部分の塩基配列は、配列番号 1 のとおりである。細胞内に導入、CWH43 遺伝子を高発現させ、配列番号 2 に示されるアミノ酸配列を持ったタンパク質を得た。
CWH43N 遺伝子は、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）の CWH43N が入っているプラスミド pRS316-CWH43-N-HA を鋳型として、PCR 法によって得た。PCR に用いたプライマーは、以下のとおりである。
Kpn-CWH43-F18  5’- ggggtaccatgctgatcatcaatgggaag -3’（配列番号21）
HANheStpXba-R17  5’- gctctagattagctagcgtaatccggtac -3’（配列番号22）
増幅によって得られたオープンリーディングフレームおよびそのカルボキシル末端に挿入された HA タグを含む DNA 断片を、制限酵素 KpnI および XbaI によって切断し、出芽酵母用多コピー発現ベクター YEp352GAP II（Abe et al., 2003; Glycobiology 13, 87-95）に挿入し（YEp352GAP II-CWH43-N-HA）、塩基配列を決定した。オープンリーディングフレーム部分の塩基配列は、配列番号 3 のとおりである。細胞内に導入、CWH43N 遺伝子を高発現させ、配列番号 4 に示されるアミノ酸配列を持ったタンパク質を得た。
CWH43C 遺伝子は、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）の CWH43C が入っているプラスミド pRS316-CWH43-C-HA を鋳型として、PCR 法によって得た。PCR に用いたプライマーは、以下のとおりである。
Kpn-CWH43-C1-F19  5’- ggggtaccatgggtaataccagttttttccaa -3’（配列番号23）
HANheStpXba-R17  5’- gctctagattagctagcgtaatccggtac -3’（配列番号22）
増幅によって得られたオープンリーディングフレームおよびそのカルボキシル末端に挿入された HA タグを含む DNA 断片を、制限酵素 KpnI および XbaI によって切断し、出芽酵母用多コピー発現ベクター YEp352GAP II（Abe et al., 2003; Glycobiology 13, 87-95）に挿入し（YEp352GAPII-CWH43-C-HA）、塩基配列を決定した。オープンリーディングフレーム部分の塩基配列は、配列番号 5 のとおりである。細胞内に導入、CWH43C 遺伝子を高発現させ、配列番号 6 に示されるアミノ酸配列を持ったタンパク質を得た。
Cwh43-HA タンパク質、Cwh43N-HA タンパク質、Cwh43C-HA タンパク質は、HA 抗体を用いたウスタンブロッティング解析により、その発現を確認した（図 6A）。
それぞれのプラスミドを cwh43Δ株に導入し、GPI アンカーの脂質部分の解析を行った。方法は前述の通りである。その結果、野生株では pG1 型、IPC/B 型、IPC/C 型が前述どおり検出された（図 6B）。また、gpi7Δ株ではゴルジ体での GPI のリモデリングに欠損があり、IPC/C を持たないことが報告されているが（Benachour et al., 1999; J. Biol. Chem. 274, 15251-15261）、報告どおりの結果となった。cwh43Δ株にベクターのみを導入した株では pG1 と lyso-PI が前述どおり検出されたが、CWH43 遺伝子を導入した株では、野生株と同様に IPC/B が主に検出された。cwh43Δ株に CWH43N 遺伝子を導入した株はベクターのみを導入した株と同様に pG1 と lyso-PI が検出された。しかし、CWH43C 遺伝子を導入した株では、IPC/B が検出された。従って、CWH43 は C 末端ドメインのみで GPI の脂質部分のセラミドへの変換機能を持つことが示唆された。さらに、CWH43N 遺伝子と CWH43C 遺伝子とを共発現させた株では、CWH43C 遺伝子の単独発現と比較して IPC/B がより多く検出され、CWH43C によるセラミドへの変換を CWH43N が増強していることが明らかになった。
CWH43C 遺伝子を導入した株で GPI アンカー部分のセラミドへの変換が起こっていることをさらに確かめるために、[3H]DHS を細胞内に取り込ませ、ラベルされた糖タンパク質を検出した。方法は前述の通りである。cwh43Δにベクターを導入した株では 3H でラベルされたタンパク質が検出できないことから、GPI アンカーの脂質部分はセラミドに変換されていないことが示された（図 7）。また、CWH43 遺伝子を導入した株では、3H ラベルが検出され、セラミド付加 GPI アンカータンパク質が合成されることが示された。いっぽう、CWH43N 遺伝子を導入した株では、ベクター導入株と同様にタンパク質へのラベルの取り込みは見られないが、CWH43C 遺伝子を導入した株においては、3H ラベルのタンパク質への取り込みが見られた。これらのことから、CWH43C は、GPI アンカーの脂質部分をセラミドに変換する機能を持つと考えられる。さらに、CWH43N 遺伝子と CWH43C 遺伝子とを共発現させた株においては、タンパク質へのラベルの取り込み量が CWH43C 遺伝子単独発現の場合より増加していたことから、CWH43N がセラミドへの変換を増強していることが明らかとなった。
【００３１】
＜実施例 6＞
〔C130090K23の機能解析〕
ヒト FRAG1（PGAP2）遺伝子は GPI の脂質部分のプロセシングに関与していることが報告されている（Tashima et al., 2006; Mol. Biol. Cell 17, 1410-1420）。CWH43 は FRAG1 に類似した遺伝子であるが、FRAG1 よりも 700 アミノ酸ほど長く、N 末端側部分のみが FRAG1 に似ている。いっぽう、CWH43 の C 末端側部分は機能未知な遺伝子である FLJ21511（ヒト）や C130090K23（マウス）に似ており、その遺伝子は種間を通じて広く保存されている。CWH43C は GPI アンカーの脂質部分をセラミドに変換する活性を有することを踏まえて、マウス C130090K23 の機能を解析した。
C130090K23 遺伝子が YEp352GAP II に挿入されたプラスミド YEp352GAPII-C130090K23-HA、および、マウス FRAG1 遺伝子が YEp352GAP II に挿入されたプラスミド YEp352GAPII-FRAG1-HA を cwh43Δ株に導入し、C130090K23 タンパク質および FRAG1 タンパク質が発現していることを確認した（図 10A）。FRAG1 遺伝子導入株および C130090K23 遺伝子導入株の GPI アンカーの脂質部分の解析を行った。方法は前述の通りである。cwh43Δ株に FRAG1 遺伝子を導入した株では、ベクターのみを導入した株と同様に、pG1 とlyso-PI が検出されたが、C130090K23 遺伝子を導入した株では IPC が検出された。さらに、FRAG1 遺伝子と C130090K23 遺伝子とを共発現した株においては、IPC/B に加えて IPC/C が検出され、その量も増加していた（図 10B）。これらのことから、FRAG1 遺伝子と C130090K23 遺伝子はそれぞれ、酵母の CWH43N 遺伝子と CWH43C 遺伝子と同様の機能を有しており、C130090K23 は GPI の脂質部分をセラミドに変換する反応に関与し、FRAG1 は C130090K23 によるセラミドへの変換を増強することが明らかになった。
【００３２】
＜実施例 7＞
〔CWH43 の N 末端ドメインと CWH43 の C 末端ドメインの共沈殿実験〕
CWH43N 遺伝子の C 末端側に FLAG タグを挿入した DNA 断片を構築し、pRS315-CWH43-N-FLAG プラスミドを作成した。CWH43C-HA の発現には CWH43C 遺伝子の C 末端側に HA タグを挿入した pRS316-CWH43-C-HA プラスミドを用いた。この CWH43N-FLAG 発現プラスミドと、CWH43C-HA 発現プラスミドを共に導入した出芽酵母株を用いて、免疫沈降実験を行った。方法は Rayner and Munro, 1998; J. Biol. Chem. 273, 26836-26843を参考にした。
対数増殖期まで培養した酵母細胞を Tris-Sorb バッファー（1 M sorbitol, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4）内で zymolyase とインキュベートし、スフェロプラスト化した。その後、スフェロプラストを TNPI バッファー（50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, protease inhibitors）に懸濁し破砕した。さらに、終濃度 1% のジギトニンを加えて可溶化した。遠心により不溶性画分をのぞいて、免疫沈降のサンプルとした。Anti-FLAG M2 affinity agarose (Sigma) または anti-HA agarose beads (Roche Diagnostics) を加えて、一晩インキュベートし免疫沈降した。ビーズを TNPI バッファーで洗った後、3xFLAG peptide または HA peptide を用いることによりタンパク質を溶出した。検出は SDS-PAGE の後に、ウェスタンブロッティングにて確認した。
Cwh43C-HA タンパク質は Cwh43N-FLAG タンパク質とともに共沈殿し、Cwh43N-FLAG タンパク質は Cwh43C-HA タンパク質とともに共沈殿した（図 8）。このことから、Cwh43N-FLAG タンパク質と Cwh43C-HA タンパク質とは複合体を形成していることが示された。
【００３３】
＜実施例 8＞
〔マウスの FRAG1 タンパク質と C130090K23 タンパク質の共沈殿実験〕
マウスの FRAG1 遺伝子の終止コドン直前に HA タグを挿入した DNA 断片を構築し、YEp351GAPII-FRAG1-HA プラスミドを作成した。さらに、マウスの C130090K23 遺伝子の終止コドン直前に FLAG タグを挿入した DNA 断片を構築し、YEp352GAPII-C130090K23-FLAG プラスミドを作成した。この FRAG1-HA 発現プラスミドと、C130090K23-FLAG 発現プラスミドとをともに導入した酵母株を用いて、免疫沈降実験を行った。方法は前述の通りである。免疫沈降したサンプルは SDS-PAGE した後に、FLAG 抗体と HA 抗体を用いたウェスタンブロッティングにて確認した。
FRAG1-HA タンパク質は C130090K23-FLAG タンパク質とともに共沈殿し、C130090K23-FLAG タンパク質は FRAG1-HA タンパク質とともに共沈殿した（図 11）。このことから、FRAG1-HA タンパク質と C130090K23-FLAG タンパク質とは複合体を形成していることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】cwh43 破壊株における GPI アンカータンパク質 Gas1 の発現をウェスタンブロッティングにより検出した図（A）と Cwh43 タンパク質の局在を顕微鏡観察した図（B）である。
【図２】cwh43 破壊株では Gas1p が界面活性剤不溶画分（DRM）に存在できることを示すウェスタンブロッティングの図である。
【図３】cwh43 破壊株における GPI アンカーの脂質部分の解析結果を示す薄層クロマトグラフィの図である。
【図４】cwh43 破壊株に [3H]DHS を加えたときのタンパク質へのラベルの取り込みを検出した図である。
【図５】CWH43N と CWH43C の構築を示す模式図（A）とその遺伝子導入株の表現型を示した図（B）である。
【図６】CWH43N と CWH43C 遺伝子導入株におけるタンパク質発現をウェスタンブロッティングで確認した図（A）と GPI アンカーの脂質部分を解析した薄層クロマトグラフィの図（B）である。
【図７】CWH43N と CWH43C 導入株に [3H]DHS を加えたときのタンパク質へのラベルの取り込みを検出した図である。
【図８】Cwh43 タンパク質の N 端側と C 端側とが結合していることを示す、免疫沈降およびウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図９】CWH43 のマウスの相同遺伝子である FRAG1 と C130090K23 遺伝子の構築を示す模式図（A）と、これらを cwh43 破壊株に導入した株における表現型を解析した図（B）である。
【図１０】マウス FRAG1 と C130090K23 遺伝子を導入した株において、タンパク質発現をウェスタンブロッティングにより検出した図（A）と GPI アンカーの脂質部分を解析した薄層クロマトグラフィの図（B）である。
【図１１】FRAG1 タンパク質と C130090K23 タンパク質とが結合していることを示す、免疫沈降およびウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図１２】参考図:酵母細胞におけるGPIアンカー型タンパク質の脂質リモデリング
【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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