(57)【要約】  【課題】  可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質、該タンパク質をコードするｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡを保持する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された非ヒト形質転換細胞、可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質の製造方法、可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質を含有してなる薬剤等の提供。  【解決手段】  本発明の可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質を用いることにより、エンドトキシン惹起性の炎症を弱める治療のための薬剤を提供できる。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質。
【請求項２】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列中１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加しているアミノ酸配列を含有する請求項１記載の可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質。
【請求項３】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有する請求項１記載の可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のｃＤＮＡを保持する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターで形質転換された非ヒト形質転換細胞。
【請求項７】
非ヒト形質転換細胞が昆虫細胞由来である、請求項６記載の非ヒト形質転換細胞。
【請求項８】
請求項６または７記載の非ヒト形質転換細胞を培養し、請求項１から３のいずれかに記載の可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質を発現させることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質の製造方法。
【請求項９】
請求項１から３のいずれかに記載の可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質を含有してなる薬剤。
【請求項１０】
エンドトキシン惹起炎症の治療のための抗炎症剤である、請求項９記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質、該タンパク質をコードするｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡを保持する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された非ヒト形質転換細胞、可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質の製造方法、可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質を含有してなる薬剤、等に関する。
【背景技術】
【０００２】
先天性免疫システムは防御の第一線として微生物の侵入を防ぎ、適応免疫のクローン応答を促進する。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）は病原体に関連する分子パターンの認識とシグナル伝達に関与していると考えられてきた。ＴＬＲ２タンパク質およびＴＬＲ４タンパク質はリポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、細菌のリポタンパク質、マイコバクテリアのリポアラビノマンナンおよびザイモサンの認識とシグナル伝達で重要な役割を果たしている。ＴＬＲ４遺伝子欠損マウスの特性から、ＴＬＲ４タンパク質がＬＰＳのシグナル伝達の受容体であるという説得力のある証拠が得られる（非特許文献１）。すなわち、７１２番目のＰｒｏをＨｉｓに代えたアミノ酸配列をコードするＴｌｒ４変異遺伝子をもつＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスはＬＰＳに対して不完全な応答を示す。ＬＰＳに効果的に応答するためには、ＴＬＲ４タンパク質はアクセサリータンパク質のＭＤ−２タンパク質を必要とする。分泌型ＭＤ−２タンパク質はＴＬＲ４タンパク質にＬＰＳ感受性をもたらす。免疫沈降分析の結果、ＭＤ−２タンパク質はＴＬＲ４タンパク質と結合することが明らかとなっている。ＭＤ−２タンパク質の部位特異的突然変異誘発の実験から、ＴＬＲ４タンパク質のシグナル伝達ではジスルフィド結合とＮ−グリコシル化が重要であることが示された。ＭＤ−２タンパク質は細菌のリポ多糖と結合することが示されているが、ＴＬＲ４タンパク質と結合するために必要なＭＤ−２タンパク質の領域はＬＰＳ応答性の領域とは異なると思われる。ＴＬＲタンパク質によるリガンド認識の機構は完全にはわかっていない。ＴＬＲ２タンパク質の細胞外ドメインが直接Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のペプチドグリカンおよびザイモサンに結合し、４０番目のＳｅｒから６４番目のＩｌｅを含有し、３０番目のＣｙｓから３９番目のＳｅｒを含有しないＴＬＲ２タンパク質の細胞外領域はペプチドグリカン認識に重要である。そしてこのことは、リガンド認識におけるＴＬＲ２タンパク質の細胞外ドメインの重要性を示している。ＬＰＳはＣＤ１４タンパク質と共発現したときのみＴＬＲ４タンパク質とＭＤ−２タンパク質とクロスリンクし、このことはＬＰＳが受容体の複合体に密接にあることを示唆している。
【非特許文献１】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １８９：６１５−６２５（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）は病原体に関連した分子パターンの認識に関与していると考えられてきた。ＴＬＲ４タンパク質はリポ多糖（ＬＰＳ）のシグナル伝達受容体であるが、ＬＰＳに効果的に応答するためにはさらにＭＤ−２タンパク質を必要とする。これまではＬＰＳ認識の際に必要なＴＬＲ４タンパク質の構造は明らかではなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明者らは、ＴＬＲ４タンパク質の細胞外ドメインとＭＤ−２タンパク質およびＬＰＳとの相互作用を試験し、ＴＬＲ４タンパク質の細胞外ドメインとＭＤ−２タンパク質の複合体はＬＰＳに結合することができ、ロイシンリッチな繰り返しを含有するＴＬＲ４タンパク質の５５番目のＳｅｒから５６７番目のＰｈｅまでの細胞外領域がＭＤ−２タンパク質への結合およびＴＬＲ４タンパク質のＬＰＳ認識を可能にすることを明らかにした。この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質；
（２）配列番号：１で表されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列中１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加しているアミノ酸配列を含有する上記（１）記載の可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質；
（３）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有する上記（１）記載の可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質；
（４）上記（１）から（３）のいずれかに記載の可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質をコードするｃＤＮＡ；
（５）上記（４）に記載のｃＤＮＡを保持する組換えベクター；
（６）上記（５）に記載の組換えベクターで形質転換された非ヒト形質転換細胞；
（７）非ヒト形質転換細胞が昆虫細胞由来である、上記（６）記載の非ヒト形質転換細胞；
（８）上記（６）または（７）記載の非ヒト形質転換細胞を培養し、上記（１）から（３）のいずれかに記載の可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質を発現させることを特徴とする、上記（１）から（３）のいずれかに記載の可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質の製造方法；
（９）上記（１）から（３）のいずれかに記載の可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質を含有してなる薬剤；
（１０）エンドトキシン惹起炎症の治療のための抗炎症剤である、上記（９）記載の薬剤；
等を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の可溶性Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質を用いることにより、エンドトキシン惹起性の炎症を弱める新規の治療方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
まず本発明は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質を提供する。Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質（以下、ＴＬＲ４タンパク質と称する；配列番号：２）はエンドトキシン惹起性炎症反応のシグナル伝達に必須の分子であって（Immunity 1999,11: 443-51; Science1998, 282: 2085-2088; J Immunol 1999, 162: 3749-52.）、ロイシンリッチな繰り返しを有する点で他のＴＬＲタンパク質およびＣＤ１４タンパク質と相同である。ＴＬＲ４タンパク質は１番目のＭｅｔから５４番目のＰｈｅまでのアミノ末端領域、ロイシンリッチな繰り返しを含む５５番目のＳｅｒから５６７番目のＰｈｅまでの領域、５６８番目のＰｒｏから６３１番目のＬｙｓまでの領域、および膜貫通および細胞質ドメインと推定される６３２番目のＴｈｒから８３９番目のＩｌｅまでの領域からなる（Blood 1998, 91: 4020-4027、および、PredictProteinによる解析）。本発明者らは、ＴＬＲ４タンパク質のＭＤ−２タンパク質とＬＰＳに対する直接的な相互作用を試験し、リガンド認識に際してＴＬＲ４タンパク質の構造の必要な領域を決定し、本発明を完成させた。より詳しくは、発明者らはＴＬＲ４タンパク質の細胞外ドメインからなる可溶型ＴＬＲ４組換えタンパク質（ｓＴＬＲ４）を作製し、ｓＴＬＲ４タンパク質がＴＬＲ４タンパク質と共にエンドトキシン惹起炎症反応に必須なＭＤ−２タンパク質と結合し、ＭＤ−２タンパク質との複合体形成によってエンドトキシンを認識することを示した。ｓＴＬＲ４タンパク質は、野生型ＴＬＲ４タンパク質の惹起するシグナル伝達を抑制することから、エンドトキシン惹起性炎症の治療に有効であることを示した。
【０００８】
本発明で用いられるＴＬＲ４タンパク質は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
【０００９】
ＴＬＲ４タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列はヒト、マウス等で公知であり、ヒトにおける遺伝子領域のイントロンを含む全ＤＮＡ配列は登録番号：ＡＦ１７７７６５（配列番号：３として配列表に記す）として、マウスのｃＤＮＡの塩基配列は登録番号：ＢＣ０２９８５６（アミノ酸配列を配列番号：４として、塩基配列を配列番号：５として配列表に記す）として、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている。本発明で提供される可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質は、ＴＬＲ４タンパク質の細胞内および膜貫通ドメインと推定される領域を欠失する細胞外ドメインからなるタンパク質である（以下、可溶型Ｔｏｌｌ様受容体４タンパク質をｓＴＬＲ４タンパク質という）。
【００１０】
ｓＴＬＲ４タンパク質として用いることができるＴＬＲ４タンパク質は配列番号：１またはそれと実質的に同一の配列を有するものであるが、特に、ｓＴＬＲ４タンパク質として、２４番目のＧｌｕから６３１番目のＬｙｓまでのアミノ酸の配列が好ましく用いられる。
【００１１】
本発明のｓＴＬＲ４タンパク質が含有する配列番号：１で表されるアミノ酸配列は、配列番号：２で表されるＴＬＲ４タンパク質のアミノ酸配列中２４番目のＧｌｕから６３１番目のＬｙｓまでのアミノ酸からなる配列である。しかし、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などを用いることができる。
本発明の配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。ここで「実質的に同質の活性」とは、比較されるタンパク質どうしの活性が性質的に（例えば生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
【００１２】
実質的に同質の活性としては、具体的には例えば、ＭＤ−２結合性とエンドトキシン結合性に基づくエンドトキシン惹起炎症の抑制活性が挙げられる。実質的に同質とは、比較されるタンパク質どうしの活性が性質的に同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
エンドトキシンにより惹起される炎症の抑制活性、ＮＦκ−Ｂ活性化、インターロイキン８分泌などの活性の測定は、後述の実施例で用いた公知の方法に準じて行なうことができる。
【００１３】
また、本発明のｓＴＬＲ４タンパク質は、好ましくは２４番目のＧｌｕから６３１番目のＬｙｓまでのアミノ酸の配列にヒスチジンタグを付加させた組換えタンパク質である。
【００１４】
上記のタンパク質は後述するように、タンパク質をコードするｃＤＮＡを出発材料とし、公知の遺伝子組換え技術を用いて、微生物等に産生させることができる。
【００１５】
本発明のｓＴＬＲ４タンパク質等を発現させるための組換えベクターは、例えば、（イ）本発明のｓＴＬＲ４タンパク質等をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）から目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとして、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋））、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどを用いることができる。
【００１６】
本発明では具体的には、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、および、ｐＶＬ１３９２等、市販のプラスミドベクターを用いることができる。
【００１７】
ヒトＴＬＲ４  ｃＤＮＡ（配列番号：７）は、例えばＳｈｉｍａｚｕ，Ｒ．らの文献（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １８９：１７７７−１７８２（１９９９））に記載された方法により得ることができる。また、Ｃ末端融合ＦＬＡＧタグと６個のＨｉｓタグを含有するＴＬＲ４−ＦＬＡＧ−ＨｉｓをコードするｃＤＮＡ（配列番号：８）をプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングするために、例えば製品添付のマニュアルに記載の方法を用いることができる。
【００１８】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。発現プラスミドの作製において有用なベクターとしては、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターなどのプロモーターなどが挙げられる。構成性プロモーターの具体例としては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来、シミアンウイルス−４０（ＳＶ４０）由来、あるいは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のプロモーターなど、ウイルス由来の強力なプロモーターが挙げられる。組織特異的プロモーターの具体例としては、筋βアクチンプロモーターが挙げられる。誘導性あるいは調節性のプロモーターとしては、例えば、成長ホルモン調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、あるいは抗生物質誘導性プロモーター、あるいは亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。本発明で用いるプロモーターとしては、例えば、宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００１９】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジン不含培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプタータンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。さらに、転写あるいはポリアデニル化シグナルのスプライシングのためのイントロン配列などのＲＮＡプロセシング配列、あるいはＣｐＧモチーフとして知られている免疫刺激ＤＮＡ配列などを含むことができる。
【００２０】
本発明は、上記の組換えベクターで形質転換された非ヒト形質転換細胞、特に非ヒト形質転換細胞が昆虫細胞由来である非ヒト形質転換細胞をも提供する。本発明はまた、上記の非ヒト形質転換細胞を培養し、ｓＴＬＲ４タンパク質を発現させることを特徴とする、ｓＴＬＲ４タンパク質の製造方法を提供する。
【００２１】
上記のように構築した本発明のｓＴＬＲ４タンパク質等をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、ｓＴＬＲ４タンパク質等を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等のエシェリヒア属菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等のバチルス属菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、ＢｍＮ細胞等の昆虫細胞、カイコ等の昆虫、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞などが用いられる。本発明においては、ｓＴＬＲ４タンパク質等を効率的に体調生産できるという理由から、特に昆虫細胞が好ましい。
【００２２】
エシェリヒア属菌、バチルス属菌等の細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されない。例えばカルシウムイオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２３】
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等が用いられる。この場合のプロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＧＡＰプロモーター等が挙げられる。
【００２４】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法［Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｌ．Ｇｕａｒｅｎｔｅ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １９４：１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ７５：１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｉｔｏｈ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １５３，１６３（１９８３）］等が挙げられる。
【００２５】
動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ１．１（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＳＩ  Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＣＩ  Ｖｅｃｔｏｒ（いずれもＰｒｏｍｅｇａ社）等が用いられる。この場合、プロモーターとしてヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。
【００２６】
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００２７】
昆虫細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＭＢａｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＢａｃＰＡＫ８／９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）等が用いられる。
【００２８】
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２９】
本発明のｓＴＬＲ４タンパク質等は、前記形質転換体を培地に培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００３０】
細菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３１】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン、マルトース、デキストリン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ＮＺアミン等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化コバルト等が用いられる。
【００３２】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３０℃で２４〜９６時間行う。培養期間中、ｐＨは５．０〜８．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３３】
プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００３４】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ2存在下、２０〜３０℃で１〜７日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３５】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．  Ｎａｔｕｒｅ，１９５：７８８（１９６２）］に１０％ウシ胎児血清などの添加物を適宜加えたものなどが挙げられる。培地のｐＨは６．０〜７．０に調製し、通常２５℃で１〜７日培養を行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のｓＴＬＲ４タンパク質等を生成できる。
【００３６】
上記培養物から本発明のｓＴＬＲ４タンパク質等を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のｓＴＬＲ４タンパク質等を培養上清から抽出するに際しては、培養終了後、公知の方法で細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清中に含まれるｓＴＬＲ４タンパク質等の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
このようにして得られるｓＴＬＲ４タンパク質等が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するｓＴＬＲ４タンパク質等を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【００３７】
本発明においては、宿主として昆虫細胞を用いると効率よく本発明のタンパク質を大量生産できる。具体的には、本発明のｓＴＬＲ４タンパク質等をＯ'Ｒｒｅｉｌｌｙらの方法（O'Reilly DR, Miller KL, Luckow VA. 1992 Baculovirus Expression Vector. A laboratory mannuak. WH Freeman and Company, New York）を用いて、バキュロウイルス−昆虫細胞発現システムにより発現させることができる。具体的には、1 x 107から5x 108ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは2 x 107から5 x 108ｐｆｕ／ｍｌになるように増幅する。本発明では〜４×１０8ｐｆｕ／ｍｌまで増幅したものが好ましく用いられる。組換えウイルスを無血清培地（Sf900II  SFM（GIBCO，Invitrogen））中で昆虫細胞であるＴｎｉ細胞の単層に感染多重度（ＭＯＩともいう）を少なくとも０．２から０．５、最も好ましくは１から５で感染させることができる。培養3-5日後、好ましくは４日後、ｓＴＬＲ４タンパク質とＭＤ−２タンパク質はニッケル−ニトリロ三酢酸ビーズカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７：２４３１５−２４３２０（２００２）およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７５：２２４４２−２２４５１（２０００））に記載の方法により精製することができる。また、昆虫細胞中に産生される可溶型組換えＴＬＲ２（以下、ｓＴＬＲ２と略記する）またはＣＨＯ細胞中に産生される可溶型ＣＤ１４（以下、ｓＣＤ１４と略記する）は、文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７：２４３１５−２４３２０（２００２）およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７５：２２４４２−２２４５１（２０００））の記載にしたがって調製することができる。
【００３８】
本発明はまた、上記のｓＴＬＲ４タンパク質を含有してなる薬剤、特にエンドトキシンにより惹起される炎症の治療のための抗炎症剤を提供する。
本発明のｓＴＬＲ４タンパク質はＭＤ−２タンパク質の存在下、エンドトキシンにより惹起される炎症を抑制する作用を有するので、該タンパク質をエンドトキシン惹起性の炎症の治療剤などとして使用することができる。
本発明のｓＴＬＲ４タンパク質を上記治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
本発明のｓＴＬＲ４タンパク質は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のｓＴＬＲ４タンパク質を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００３９】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００４０】
また、上記治療剤は例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明のレセプタータンパク質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、エンドトキシン惹起性炎症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、エンドトキシン惹起性炎症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４１】
実施例
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００４２】
使用した実験材料
組換えＭＤ−２タンパク質
Ｃ末端にＶ５タグと６個のＨｉｓタグを含有するＭＤ−２−Ｖ５−Ｈｉｓタンパク質を作製するために、ｐＥＦＢＯＳベクターに挿入してあるヒトＭＤ−２  ｃＤＮＡをＮｏｔＩとＰｍｅＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。このｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター中のＭＤ−２  ｃＤＮＡをＰｍｅＩ消化し、ｐＶＬ１３９２ベクターのＳｍａＩ部位にサブクローニングした。このベクターとバキュロウィルスＤＮＡをＳｆ９細胞にトランスフェクトし、ＭＤ−２  ｃＤＮＡをコードするバキュロウィルスを得た。公知の方法に従い、ＭＤ−２コードバキュロウィルスを増幅させ、Ｔｎｉ細胞に感染させ、培養液中にＭＤ−２タンパク質を分泌させた。常法にしたがい、ＭＤ−２タンパク質を精製した。
【００４３】
ｓＴＬＲ２タンパク質
昆虫細胞を用いて産生されるｓＴＬＲ２タンパク質は、文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７：２４３１５−２４３２０（２００２））の記載にしたがって調製することができる。具体的には以下のように調製した。
ＴＬＲ２の細胞外ドメインのＣ末端にＨｉｓタグを付加したｃＤＮＡをｐＶＬ１３９２ベクターにサブクローニングし、ｓＴＬＲ２  ｃＤＮＡとバキュロウィルスＤＮＡをＳｆ９細胞にトランスフェクトして、ｓＴＬＲ２  ｃＤＮＡをコードするバキュロウィルスを得て、増幅させた。ｓＴＬＲ２コードバキュロウィルスをＴｎｉ細胞に感染させ、培養液中に分泌されるｓＴＬＲ２タンパク質をニッケルカラムにて精製した。
【００４４】
ｓＣＤ１４タンパク質
ＣＨＯ細胞を用いて産生される可溶型ＣＤ１４（以下、ｓＣＤ１４と略記する）は、文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７５：２２４４２−２２４５１（２０００））の記載にしたがって調製することができる。具体的には以下のように調製した。
ｓＣＤ１４のＣ末端にＨｉｓタグを付加したｃＤＮＡをｐＥＥ１４ベクターにサブクローニングし、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。Methionine sulfoxideにて、ｓＣＤ１４発現ＣＨＯ細胞を選択し、安定な細胞株を確立した。ｓＣＤ１４発現ＣＨＯ細胞株を無血清培地で、培養し、分泌されるｓＣＤ１４タンパク質をニッケルカラムにて精製した。
【００４５】
その他の材料
ヒト胎児腎臓２９３細胞（以下、ＨＥＫ２９３細胞と記載する）は、１０％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭで培養維持することが望ましい。Ｒｅ５９５  ＬＰＳはＳｉｇｍａ社等の市販製品を用いた。ｓＴＬＲ４に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である４Ｄ９はＫｏｈｌｅｒ，Ｇ．とＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．の文献（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５））に記載の方法に基づいたハイブリドーマ技術を用いて作製した。抗ＦＬＡＧ抗体、抗ＦＬＡＧ抗体結合アガロースビーズ、抗Ｖ５  ｍＡｂは、Ｓｉｇｍａ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社等の市販製品を用いた。
【実施例１】
【００４６】
組換えｓＴＬＲ４タンパク質の調製
本実施例で調製したｓＴＬＲ４タンパク質は、ＴＬＲ４タンパク質の細胞外に突出していると推定されるドメイン（１番目のＭｅｔから６３１番目のＬｙｓ）とＣ末端の６個のＨｉｓタグからなる（図１）。このｓＴＬＲ４タンパク質をコードするｓＴＬＲ４  ｃＤＮＡをＰＣＲにより構築した。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとしてそれぞれ、５’−ＴＧＣＣＡＧＧＡＴＧＡＴＧＴＣＴＧＣＣ−３’（配列番号：１０）、５’−ＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＴＡＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＡＧＧＴＧ−３’（配列番号：１１）を用い、全量５０μｌの反応系（センスプライマー（１０μＭ）１．５μｌ、アンチセンスプライマー（１０μＭ）１．５μｌ、ｐｆＸポリメラーゼ０．５μｌ、ｐｆＸポリメラーゼ１０Ｘバッファー５μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１．５μｌ、５０ｍＭ  硫酸マグネシウム１μｌ、ＴＬＲ４  ｃＤＮＡ  ５μｌ（５０ｎｇ）、水３４μｌの組成）で、ＰＣＲの反応条件としては、９０℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・２分の条件を用いた。ＰＣＲ後に、ｓＴＬＲ４  ｃＤＮＡをＤＮＡ配列決定法により確認した。上記のようにして得られたｓＴＬＲ４  ｃＤＮＡを、制限酵素ＮｏｔＩとＢａｍＨＩを用いて消化し、同様の制限酵素で消化したｐＶＬ１３９２プラスミドベクターとＤＮＡリガーゼを用いて連結することによりサブクローニングした。
【００４７】
上記のようにして得られたベクターをバキュロウィルスＤＮＡとともに、Ｓｆ９細胞にトランスフェクトし、さらにＯ’Ｒｅｉｌｌｙらの記載の方法（O'Reilly DR, Miller KL, Luckow VA. 1992 Baculovirus Expression Vector. A laboratory mannuak. WH Freeman and Company, New York）にしたがって、バキュロウイルス−昆虫細胞系の発現システムを用いて、この形質転換体を培養し、ｓＴＬＲ４タンパク質を発現させた。
【００４８】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９２シーケンサーで決定したｓＴＬＲ４タンパク質のＮ末端の配列は、ＥＳＷＥＰＣＶＥＶＶＰＮＩＴＹＱＣＭＥＬ（配列番号：１２）であった。この配列は、２４番目のＧｌｕから始まるＴＬＲ４タンパク質の推定アミノ酸配列と一致した。
昆虫細胞で産生されるＭＤ−２タンパク質、ｓＴＬＲ４タンパク質およびｓＴＬＲ２タンパク質、およびチャイニーズハムスターの卵巣細胞で産生されるｓＣＤ１４タンパク質をレーンあたり、１０μｇのＭＤ−２タンパク質、５μｇのｓＴＬＲ２タンパク質、ｓＴＬＲ４タンパク質およびｓＣＤ１４タンパク質をロードし、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミドゲル）にかけた。タンパク質をクーマシーブリリアントブルー染色で染色した。図２に示すように、電気泳動による解析から、ＭＤ−２タンパク質は分子量２３から３０ｋＤａの幅の広いバンドを示すことが明らかとなった。ｓＴＬＲ４タンパク質は還元条件下で分子量約８０ｋＤａの単一バンドとして移動した。文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７：２４３１５−２４３２０（２００２）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７５：２２４４２−２２４５１（２０００）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２３６：４５７−４６４（１９９６））に記載されているように、ｓＴＬＲ２タンパク質およびｓＣＤ１４タンパク質は、分子量〜７０ｋＤａの単一バンドおよび４６から５６ｋＤａの幅の広いバンドをそれぞれ示した。
【実施例２】
【００４９】
精製ＭＤ−２タンパク質のＬＰＳ惹起性のＮＦ−κＢ活性化に対する効果
ＴＬＲ４タンパク質をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における精製ＭＤ−２タンパク質のＬＰＳに惹起されるＮＦ−κＢ活性化に対する効果を試験した。ＮＦ−κＢの活性化は、文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７：２４３１５−２４３２０（２００２）およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７６：４１３５０−４１３５６（２００１））に記載の方法により測定した。トランスフェクション前日にＨＥＫ２９３細胞をウェルあたり１×１０5細胞で、２４ウェルプレートに播いた。この細胞を、ＦｕＧＥＮＥ  ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により、３０ｎｇのＮＦ−κＢコンストラクト（ｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）と１０ｎｇのウミシイタケ  ルシフェラーゼ発現用コントロールコンストラクト（ｐＲＬ−ＴＫ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と、８０ｎｇのＴＬＲ４タンパク質、あるいは、ＭＤ−２タンパク質をコードするｃＤＮＡとともに一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を一定濃度のＬＰＳで６時間あるいは１２時間刺激し、ルシフェラーゼ活性をマニュアル記載の方法にしたがい、例えばデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。３回の実験の平均＋ＳＥでデータを示した。
【００５０】
図３に示したように、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）はＭＤ−２タンパク質なしではＮＦ−κＢ活性化を誘導しなかった。対照的に、ＭＤ−２タンパク質を添加すると、ＬＰＳに応答して、ＴＬＲ４タンパク質をトランスフェクトした細胞にＮＦ−κＢ活性化能が劇的に賦与された。精製ＭＤ−２タンパク質のＬＰＳに惹起されるＮＦ−κＢ活性化に対する促進効果は濃度依存性であった。これらの結果は、培地中に外部から添加されたＭＤ−２タンパク質がＬＰＳレセプター複合体として機能できることを示している。
【実施例３】
【００５１】
ＭＤ−２タンパク質とｓＴＬＲ４タンパク質、ｓＴＬＲ２タンパク質またはｓＣＤ１４タンパク質との結合実験
ｓＴＬＲ４タンパク質、ＭＤ−２タンパク質、ｓＴＬＲ２タンパク質、ｓＣＤ１４タンパク質あるいはウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する；２μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）でマイクロタイターウェル（Ｉｍｍｕｌｏｎ  １Ｂ、Ｄｙｎｅｘ）をコートした。３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ（以下、ブロッキング緩衝液と称する）でウェルをブロックした後、ブロッキング緩衝液に溶解した一定濃度のＭＤ−２タンパク質またはビオチン化ｓＴＬＲ４タンパク質（５０μｌ／ウェル）を添加し、その懸濁液を３７℃で、２時間インキュベートした。ウェルを３％（ｗ／ｖ）スキムミルクと０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで洗浄後、固相タンパク質へのＭＤ−２タンパク質の結合を、抗Ｖ５  ｍＡｂ、続いてセイヨウワサビ・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化抗マウスＩｇＧとのインキュベーションにより検出した。具体的には、固相化ｓＴＬＲ４タンパク質、ｓＴＬＲ２タンパク質、ｓＣＤ１４タンパク質，ＢＳＡに対するＭＤ−２タンパク質の結合をみる場合、２μｇ／ｍｌのｓＴＬＲ４タンパク質、ｓＴＬＲ２タンパク質、ｓＣＤ１４タンパク質、ＢＳＡを５０μｌ／ウェルでマイクロタイターウェルに注入し、２時間室温で放置し固相化させた。固相化溶液を除去後、ブロッキング緩衝液を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃、１時間放置しブロッキングした。ブロッキング緩衝液を除去後、ブロッキング緩衝液に溶解した図に示した濃度のＭＤ−２タンパク質を５０μｌ／ウェルでウェルに添加し３７℃で、２時間インキュベートした。ＭＤ−２タンパク質懸濁液を除去後、ウェルを３％（ｗ／ｖ）スキムミルクと０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで３回洗浄し、同洗浄液で１：２０００に希釈した抗Ｖ５  ｍＡｂ懸濁液を５０μｌ／ウェルで加え、９０分室温でインキュベートした。抗Ｖ５  ｍＡｂ懸濁液を除去後、同洗浄液３回洗浄し、同洗浄液で１：１０００に希釈したＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ懸濁液を５０μｌ／ウェルで加え、６０分室温でインキュベートした。ＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ懸濁液を除去後、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで３回洗浄し、クエン酸バッファーで１回洗浄後、クエン酸バッファーで希釈したｏ−フェニレンジアミン（１０ｍｇ／１０ｍＬ）を５０μｌ／ウェルで加え１５分間インキュベートした後に０．１規定硫酸で反応を止め、４９２ｎｍ吸光度を測定した。
製品添付のマニュアルにしたがって、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いてビオチン化したｓＴＬＲ４タンパク質の固相タンパク質への結合は、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンにより検出した。すなわち、パーオキシダーゼ反応はｏ−フェニレンジアミンを基質に用いて実施し、４９２ｎｍの吸収を測定した。具体的には、ＭＤ−２タンパク質に対するビオチン化ｓＴＬＲ４タンパク質の結合をみる場合、２μｇ／ｍｌのＭＤ−２タンパク質を５０μｌ／ウェルでマイクロタイターウェルに注入し、２時間室温で放置し固相化させた。固相化溶液を除去後、ブロッキング緩衝液を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃、一時間放置しブロッキングした。ブロッキング緩衝液を除去後、ブロッキング緩衝液に溶解した図に示した濃度のビオチン化ｓＴＬＲ４タンパク質を５０μｌ／ウェルでウェルに添加し３７℃で、２時間インキュベートした。ビオチン化ｓＴＬＲ４タンパク質懸濁液を除去後、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで３回洗浄し、クエン酸バッファーで１回洗浄後、クエン酸バッファーで希釈したｏ−フェニレンジアミン（１０ｍｇ／１０ｍＬ）を５０μｌ／ウェルで加え、発色後、０．１規定硫酸で反応を止め、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図４（Ａ）から（Ｃ）に示した。
【００５２】
（Ａ）はＭＤ−２タンパク質のｓＴＬＲ４タンパク質への結合を示す結果である。指示された濃度のＭＤ−２をマイクロタイターウェルにコートしたｓＴＬＲ４タンパク質（黒丸）、ｓＴＬＲ２タンパク質（白三角）、ＣＤ１４タンパク質（白四角）またはＢＳＡ（白丸）（２μｇ／ｍｌ、５０μｌ）と３７℃で２時間インキュベートした。固相タンパク質へ結合したＭＤ−２タンパク質を、抗Ｖ５モノクローナル抗体、続いてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧによるインキュベーションで検出した。データは３回の実験の平均＋ＳＥを示す。（Ｂ）はｓＴＬＲ４タンパク質のＭＤ−２タンパク質への結合を示す結果である。指示された濃度のビオチン化ｓＴＬＲ４タンパク質をマイクロタイターウェルにコートしたＭＤ−２タンパク質（黒丸）またはＢＳＡ（白丸）（２μｇ／ｍｌ、５０μｌ）と３７℃で２時間インキュベートした。固相タンパク質へ結合したｓＴＬＲ４タンパク質を、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンにより検出した。データは３回の実験の平均＋ＳＥを示す。
【００５３】
図示したように、各種濃度のＭＤ−２タンパク質をマイクロタイターウェルにコートしたｓＴＬＲ４タンパク質、ｓＴＬＲ２タンパク質、ｓＣＤ１４タンパク質またはＢＳＡとインキュベートすると、ＭＤ−２タンパク質は濃度依存的に固相ｓＴＬＲ４タンパク質に結合した。しかし、ＭＤ−２タンパク質はｓＴＬＲ２タンパク質、ｓＣＤ１４タンパク質またはＢＳＡとは顕著な結合を示さなかった。ｓＴＬＲ４タンパク質をマイクロタイターウェルにコートしたＭＤ−２タンパク質とインキュベートすると、ｓＴＬＲ４タンパク質は固相ＭＤ−２タンパク質と結合した。
【００５４】
ｓＴＬＲ４タンパク質とＭＤ−２タンパク質の相互作用をまた液相アッセイで試験した。それぞれ２μｇのｓＴＬＲ４タンパク質、ＭＤ−２タンパク質またはｓＴＬＲ４タンパク質＋ＭＤ−２タンパク質を１００μｌのブロッキング緩衝液に添加し、３０分間、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、ブロッキング緩衝液を加えることにより反応液の全容量を５００μｌに調整した。この混合液を４０μｌのプロテインＧセファロース（ＰＢＳへの５０％懸濁液）と１時間、４℃でインキュベートし、夾雑物を除去した。この後、１μｇの抗Ｖ５  ｍＡｂまたは２μｇの抗ｓＴＬＲ４  ｍＡｂ  ４Ｄ９と１時間、４℃でインキュベートした。免疫複合体を４０μｌのプロテインＧセファロースに２時間、４℃で結合させた。セファロースビーズを０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで３回洗浄し、最終的に２０μｌのＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁した後、還元条件下で３分間煮沸した。この試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ポリビニルイデンジフルオリド（以下、ＰＶＤＦと略記する）膜にゲル上のタンパク質をＴｏｗｂｉｎらの方法（Towbin H, Staehelin T, Gordon J. 1979, Proc Natl Acad Sci USA 76:4350-4354.）を用いて移した。この膜を抗ｓＴＬＲ４  ｍＡｂ  ４Ｄ９、続いてＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧとインキュベートした。ＭＤ−２タンパク質はＨＲＰ結合抗Ｖ５  ｍＡｂを用いて検出した。抗体と反応したタンパク質をケミルミネセンス試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、試薬添付のマニュアルに従って可視化した。
【００５５】
図４Ｃに示したように、両タンパク質を共にインキュベートすると、ｓＴＬＲ４タンパク質は、抗Ｖ５抗体で免疫沈降するＭＤ−２タンパク質と結合しており（上側のパネル）、同様にＭＤ−２タンパク質は、抗ｓＴＬＲ４抗体で免疫沈降するｓＴＬＲ４タンパク質と結合していた（下側のパネル）。これらの結果は、２４番目のＧｌｕから６３１番目のＬｙｓを含有するＴＬＲ４タンパク質の細胞外ドメインが直接ＭＤ−２タンパク質に結合できるが、ロイシンリッチな繰り返しを含有するＴＬＲ４タンパク質に相同なタンパク質であるＴＬＲ２タンパク質とＣＤ１４タンパク質はＭＤ−２タンパク質と相互作用できないことを示している。
【実施例４】
【００５６】
ＭＤ−２タンパク質とｓＴＬＲ４タンパク質との相互作用のＢＩＡｃｏｒｅ解析
ｓＴＬＲ４タンパク質のＭＤ−２タンパク質への結合のパラメーターをＢＩＡｃｏｒｅ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ）を用いた表面プラズモン共鳴解析により決定した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）に溶解したＭＤ−２タンパク質（３０μｇ／ｍｌ）をＣＭ５センサーチップ上にアミンカプリング法を用いて固定化した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解した２５０ｎＭから１．５μＭのｓＴＬＲ４タンパク質を流速３０μｌ／分でセンサーチップ表面に通した。相互作用を２５℃における表面プラズモン共鳴応答の変化としてモニターした。モニター２分後、解離のためにｓＴＬＲ４タンパク質溶液に代わって同一緩衝液をセンサーチップ上に通した。センサー表面をそれぞれの実験の終わりに１０ｍＭ  ＨＣｌを用いて再生することが望ましい。結合速度定数（ｋass）と解離速度定数（ｋdiss）をＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン３．１、ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ）により、プログラム１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルを用いて計算した。さらに、この結果から解離定数（ＫＤ）をｋdiss／ｋassで決定した。
図５に示したように、センサーチップに固定化されたＭＤ−２タンパク質上を各種濃度のｓＴＬＲ４タンパク質を通すことにより、結合速度定数ｋass＝７．５６×１０3Ｍ-1・ｓ-1、解離速度定数ｋdiss＝４．７６×１０-4・ｓ-1、および解離定数ＫＤ（ｋdiss／ｋass ）＝６．２９×１０-8Ｍという値を得た。
【実施例５】
【００５７】
ｓＴＬＲ４タンパク質−ＭＤ−２タンパク質複合体とＬＰＳとの結合実験
ｓＴＬＲ４タンパク質−ＭＤ−２タンパク質複合体が直接ＬＰＳに結合するかをＬＰＳセファロースビーズへの結合により試験した。
大腸菌Ｏ２６：Ｂ６（２ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）のＬＰＳを添付のマニュアルに従い、エポキシ活性化セファロース６Ｂ（ゲル容量３ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にクロスリンクさせ、ＬＰＳセファロースビーズを作製した。
それぞれ２μｇのｓＴＬＲ４タンパク質、ＭＤ−２タンパク質またはｓＴＬＲ４タンパク質＋ＭＤ−２タンパク質を１００μｌのブロッキング緩衝液に添加し、３７℃で３０分間、予めインキュベートした。ＬＰＳ結合セファロースビーズ（８０μｌ、ＰＢＳ中５０％懸濁液）または対照のセファロースビーズをｓＴＬＲ４タンパク質および／またはＭＤ−２タンパク質を含有する溶液に添加しブロッキング緩衝液を加えることにより、懸濁液の全容量を５００μｌに調整した。懸濁液を３７℃で２時間緩やかに揺らしながらインキュベートした。インキュベーション後、ビーズを０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで３回洗浄した。ＬＰＳセファロースビーズを含有する最終的な沈殿をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ゲル上のタンパク質をＰＶＤＦ膜に電気的に移した。ＬＰＳセファロースビーズと共沈したｓＴＬＲ４タンパク質とＭＤ−２タンパク質を検出するために、ウェスタンブロット分析を上述のように、抗ｓＴＬＲ４  ｍＡｂ  ４Ｄ９と抗Ｖ５  ｍＡｂを用い、続いてＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧを用いたインキュベーションにより行った。
ｓＴＬＲ４タンパク質、ＭＤ−２タンパク質またはｓＴＬＲ４タンパク質＋ＭＤ−２タンパク質をＬＰＳセファロースと共にインキュベートし、ＬＰＳビーズを沈降させた。その後、ビーズに結合したタンパク質をウェスタンブロットにより解析した。図６に示すように、ＭＤ−２タンパク質だけをＬＰＳビーズとインキュベートすると、かなりの量のＭＤ−２タンパク質がＬＰＳビーズと共沈し、このことはＭＤ−２タンパク質がＬＰＳと結合できることを示している。ｓＴＬＲ４タンパク質だけでインキュベートしたＬＰＳビーズはｓＴＬＲ４タンパク質を共沈せず、このことはＴＬＲ４タンパク質がＬＰＳに結合できないことを示している。しかし、ｓＴＬＲ４タンパク質とＭＤ−２タンパク質の両者を共にインキュベートすると、ＬＰＳビーズはかなりの量のｓＴＬＲ４タンパク質とＭＤ−２タンパク質を共沈した。対照ビーズはｓＴＬＲ４タンパク質もＭＤ−２タンパク質もどちらも共沈しなかった。これらの結果は、ＴＬＲ４タンパク質だけではＬＰＳと相互作用できないが、ＴＬＲ４タンパク質の細胞外ドメインとＭＤ−２タンパク質の複合体はＬＰＳに結合できることを示している。
【実施例６】
【００５８】
ｓＴＬＲ４タンパク質による野生型ＴＬＲ４  ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞のＬＰＳに惹起されるＮＦ−κＢ活性化の減弱
上述のように、ＮＦ−κＢレポータープラスミドおよび対照レポータープラスミドと共に野生型のＴＬＲ４  ｃＤＮＡ（１００ｎｇ）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。空のｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター８０ｎｇを加えることにより、プラスミドの全量をウェルあたり２００ｎｇに調整した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を１２時間、１０ｎｇ／ｍｌ（白いバー）または１００ｎｇ／ｍｌ（黒いバー）のＬＰＳと共に、４μｇ／ｍｌ  ｓＴＬＲ４タンパク質および／または０．１μｇ／ｍｌ  組換えＭＤ−２タンパク質を用いて、または用いず予めインキュベートした培地中でインキュベートした。ＮＦ−κＢ活性を前述の方法により調べた。示したデータは、３回の実験の平均＋ＳＥである。図７にその結果を示す。ＭＤ−２＋ＬＰＳの存在下で、ｓＴＬＲ４なしの条件での結果を比べた際の、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０２を示す。
【００５９】
野生型（ｗｔ）ＴＬＲ４  ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のＬＰＳに惹起されるＮＦ−κＢ活性化に対するｓＴＬＲ４タンパク質の効果を試験した。図７に示すように、１００ｎｇ／ｍｌ  ＭＤ−２タンパク質を培地に外部から添加すると、ＬＰＳはＮＦ−κＢ活性化を惹起した。１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで惹起されたＮＦ−κＢ活性化は、４μｇ／ｍｌのｓＴＬＲ４タンパク質を添加することにより著しく減弱した。これらの結果は、ｓＴＬＲ４タンパク質が野生型ＴＬＲ４  ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＬＰＳに惹起されるＮＦ−κＢ活性化を中和できることを示している。
【実施例７】
【００６０】
野生型ＴＬＲ４発現細胞におけるＬＰＳ惹起性ＩＬ−８分泌に対するｓＴＬＲ４の効果
野生型（ｗｔ）ＴＬＲ４を発現する分化Ｕ９３７細胞のＬＰＳに惹起されるＩＬ−８の分泌に対するｓＴＬＲ４タンパク質の効果を試験した。ｓＴＬＲ４（１０μｇ／ｍｌ）とＭＤ−２（０．２５μｇ／ｍｌ）を７．８−３１．３ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ存在下で３７℃で１時間プレインキュベートし、その後、マクロファージ細胞株のＵ９３７細胞（１×１０5）とさらに６時間インキュベートした。インキュベート後、培養液中に分泌されたＩＬ−８量を酵素免疫測定法で測定した。図８に示すように、ｓＴＬＲ４タンパク質がＬＰＳ惹起ＩＬ−８分泌を抑制することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
ｓＴＬＲ４タンパク質を用いることにより、エンドトキシン惹起性の炎症を弱める新規の治療方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ｓＴＬＲｓの模式図である。
【図２】組換えタンパク質の電気泳動分析の結果を示す図である。
【図３】組換えＭＤ−２タンパク質がＴＬＲ４をトランスフェクトした細胞にＬＰＳ応答性を賦与することを示す図である。
【図４】ＴＬＲ４の細胞外ドメインがＭＤ−２に結合することを示す図である。（Ａ）は、ＭＤ−２のｓＴＬＲ４への結合を示す。（Ｂ）は、ｓＴＬＲ４のＭＤ−２への結合を示す。（Ｃ）は、溶液中のｓＴＬＲ４のＭＤ−２への結合を示す。
【図５】ｓＴＬＲ４の固定化ＭＤ−２との結合と解離を示す図である。
【図６】ｓＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体がＬＰＳに結合することを示す図である。
【図７】ｓＴＬＲ４タンパク質がＬＰＳに惹起されるＮＦ−κＢ活性化を減弱できることを示す図である。
【図８】ｓＴＬＲ４タンパク質がＬＰＳ惹起ＩＬ−８分泌を抑制することを示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
［配列番号：１０］  プライマー
［配列番号：１１］  プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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