(57)【要約】【課題】  ＡＭＰＫ活性化作用を有し、安全性の高い抗メタボリックシンドローム素材を提供すること。【解決手段】  肥満、高脂血症、高血糖症（糖尿病）、高血圧などのメタボリックシンドロームに対する予防および治療を期待することのできる、ＡＭＰＫ活性化剤が開示されている。本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、例えば、ローズマリーおよび／またはセージの抽出物を含有する。本発明のＡＭＰＫ活性化剤を用いれば、ＡＭＰＫの活性化を効率的に促進することができる。本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、副作用を伴うことがなく、生体内において極めて安全にＡＭＰＫ活性を増強させることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ローズマリーおよび／またはセージの抽出物を含有する、ＡＭＰＫ活性化剤。
【請求項２】
ローズマリーおよび／またはセージをエタノール含有溶媒で抽出して成る、ＡＭＰＫ活性化剤。
【請求項３】
以下の式（１）：
【化１】
2008208081.tif 000010
で示されるカルノシン酸を含有する、ＡＭＰＫ活性化剤。
【請求項４】
医薬品、医薬部外品または食品の形態に加工されている、請求項１から３のいずれかに記載のＡＭＰＫ活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノシン一リン酸活性型タンパクキナーゼ［ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ］（以下、ＡＭＰＫと略称する）活性化剤により脂肪の酸化分解を増強させ、肥満、糖尿病および脂質代謝異常を抑制する新規な予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボリックシンドローム（代謝異常症候群）とは肥満、高脂血症、高血糖症（糖尿病）、高血圧が複合した状態をいい、その病気の原因は内臓脂肪型肥満、脂質代謝異常、糖代謝異常、血圧異常などが考えられている (例えば、非特許文献１参照)。我が国における代表的な生活習慣病の１つである糖尿病はメタボリックシンドロームであり、したがって、エネルギー代謝異常を改善することにより、これらの生活習慣病を予防できると期待されている。これまでの研究により、エネルギー代謝異常が生じる機構が、明らかにされてきた。現在では肥満が慢性的なエネルギー過剰状態にあり、それにより脂肪組織において炎症反応が亢進し、ＴＮＦ−αをはじめとした炎症系サイトカインの分泌が高まることが見出されている。その結果、肝臓や筋肉といったインスリンの標的となる組織においてインスリン抵抗性が惹起され、特にエネルギーを最も消費する筋肉組織において糖の取り込み、並びに脂肪の燃焼作用の低下を引き起こし、糖代謝バランスを崩壊させ糖尿病を発症させるとされている（例えば、非特許文献２参照）。こうした中、エネルギー消費を積極的に促進させ、エネルギーバランスを整える生体分子としてＡＭＰＫが注目されている。ＡＭＰＫは、その１７２番目のスレオニン（以下、Ｔｈｒ１７２と略す）がリン酸化されることによって活性化されることが知られている。ＡＭＰＫのＴｈｒ１７２がリン酸化されるとＡＭＰＫ活性化がおこり、エネルギーの生産および消費が促進される（例えば、非特許文献３参照）。特に筋肉組織では、ＡＭＰＫを活性化すると糖輸送担体であるＧＬＵＴ４の膜移行を促し、糖取り込みや脂肪の燃焼を促進することが知られる（例えば、非特許文献４参照）。すなわち、この分子の筋肉組織における活性化は糖代謝異常、脂質代謝異常の改善に繋がり、肥満予防や糖尿病の治療において格好の分子標的とされており、現在その活性化剤が精力的に探索されている。
【０００３】
既知のＡＭＰＫ活性化剤としてはチアゾリジン誘導体やメトホルミンをはじめとした糖尿病治療薬が知られている。更に研究分野で多々扱われるＡＭＰＫ活性化剤としては
５−アミノイミダゾール−４−カルボキシアミド−１−β−Ｄ−リボフラノシド（５−ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌ−４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ−１−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ）（以下、ＡＩＣＡＲと略称する）が知られ、この化合物の投与が動物実験レベルで糖尿病モデルマウスの血中グルコース濃度の低下を促すことが知られている（例えば、非特許文献５参照）。しかしながら、チアゾリジン誘導体やメトホルミンのような医薬品は、副作用を有するという問題があった。
【０００４】
ローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．）およびセージ（Ｓａｌｖｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．）は、古来より、薬用、香料用あるいは料理用に広く使われている安全性の高い植物である。その効能としては、消臭(例えば、特許文献１参照)、抗う触(例えば、特許文献２参照)、抗酸化(例えば、特許文献３参照)、抗ウイルスおよび抗腫瘍(特許文献４)、育毛(特許文献５)などの効果が開示されているにすぎない。
【０００５】
【非特許文献１】チュー，ジー．ティ．（Ｃｈｅｗ，Ｇ．Ｔ．）ら、ザ・メディカル・ジャーナル・オブ・オーストラリア（Ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ），２００６年１０月１６日，第１８５巻，ｐｐ．４４５−４４９
【非特許文献２】ショールソン，エス．イー． (Ｓｈｏｅｌｓｏｎ，Ｓ．Ｅ．)ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）, ２００６年７月，第１１６巻，ｐｐ．１７９３−１８０１
【非特許文献３】カーリング，ディ．（Ｃａｒｌｉｎｇ，Ｄ．）、ビオキミゥ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ），２００５年１月，第８７巻，ｐｐ．８７−９１
【非特許文献４】ロン，ワイ．シー．（Ｌｏｎｇ，Ｙ．Ｃ．）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ），２００６年７月，第１１６巻，ｐｐ．１７７６−１７８３
【非特許文献５】ソング，エクス．エム．（Ｓｏｎｇ，Ｘ．Ｍ．）ら、ダイアベトロジア（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ），２００２年１月，第４５巻，ｐｐ．５６−６５
【特許文献１】特開平４−１７３０７０号公報
【特許文献２】特開平４−１３６３０号公報
【特許文献３】特開平３−１９７５９５号公報
【特許文献４】特開平４−２４７０５４号公報
【特許文献５】特開平４−１８０２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、ＡＭＰＫ活性化作用を有し、安全性の高い抗メタボリックシンドローム素材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ローズマリーおよび／またはセージの抽出物を含有する、ＡＭＰＫ活性化剤である。
【０００８】
本発明はまた、ローズマリーおよび／またはセージをエタノール含有溶媒で抽出して成る、ＡＭＰＫ活性化剤である。
【０００９】
本発明はまた、以下の式（１）：
【００１０】
【化１】
2008208081.tif 000002
【００１１】
で示されるカルノシン酸を含有する、ＡＭＰＫ活性化剤である。
【００１２】
上記ＡＭＰＫ活性化剤はまた、医薬品、医薬部外品または食品の形態に加工される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＡＭＰＫ活性化剤を用いれば、ＡＭＰＫの活性化を効率的に促進することができる。本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、副作用を伴うことがなく、生体内において極めて安全にＡＭＰＫ活性を増強させることができる。このＡＭＰＫの活性化により、肥満、高脂血症、高血糖症（糖尿病）、高血圧などのメタボリックシンドロームに対する予防および治療ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の第一のＡＭＰＫ活性化剤は、ローズマリー抽出物またはセージ抽出物を含有する。
【００１５】
本発明に用いられるローズマリー抽出物およびセージ抽出物は、ローズマリーおよびセージから得られる。本発明においては、ローズマリー抽出物とセージ抽出物とを混合して用いてもよい。
【００１６】
上記ローズマリー抽出物またはセージ抽出物は、ＡＭＰＫ活性化剤中に有効成分として含有される。実質的に有効成分となる上記抽出物の含有量は、ＡＭＰＫ活性化剤を１００重量％とした場合、好ましくは０．０００１重量％〜１００重量％、より好ましくは０．１重量％〜１００重量％である。抽出物の含有量が０．００００１重量％未満では、ＡＭＰＫ活性化を十分に促進させることができない場合がある。
【００１７】
ローズマリー抽出物またはセージ抽出物は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、ローズマリーまたはセージの全草が抽出溶媒中に浸漬する。使用される抽出溶媒の種類は特に限定されない。使用され得る抽出溶媒の例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、エーテル類、クロロホルム、およびジクロロメタンのような有機溶媒ならびに水が挙げられる。これら抽出溶媒は単独または組合せて用いられる。本発明においては、メタノール、エタノール、酢酸エチルまたはこれら溶媒と水との組合わせが好ましく、毒性が低いという生体内における安全性を考慮すれば、エタノール、または水とエタノールとの混合溶媒が、より好ましい。
【００１８】
さらに、上記ローズマリー抽出物およびセージ抽出物はそれぞれ以下のようにして得ることが好ましい。まず、ローズマリーおよび／またはセージは、８０（ｖ／ｖ）％以上１００（ｖ／ｖ）％未満、より好ましくは９０（ｖ／ｖ）％以上１００（ｖ／ｖ）％未満のエタノール濃度を有する水溶液またはエタノールに浸漬して、第一抽出物を得る。
【００１９】
第一抽出物を得るための、抽出温度および抽出時間は特に限定されず、当業者により適切な条件に設定される。一例としては、２０℃〜５０℃および／または１時間〜７２時間の各条件が設定される。
【００２０】
次いで、この第一抽出物に４０（ｖ／ｖ）％以下、好ましくは３０（ｖ／ｖ）％以下のエタノール濃度になるように水が添加される。これによりローズマリー抽出物および／またはセージ抽出物から、ＡＭＰＫ活性化作用を有する成分を析出させることができる。また上記第一抽出物を２倍から２０倍に濃縮した後に水を添加して、当該ＡＭＰＫ活性化剤であるローズマリー抽出物および／またはセージ抽出物を析出させても良い。
【００２１】
第一抽出物からローズマリー抽出物および／またはセージ抽出物を得るための、析出温度および析出時間も特に限定されず、当業者により適切な条件に設定される。一例としては、０℃〜２５℃および／または１時間〜４８時間の各条件が設定される。
【００２２】
このように複数段階にわたり特定濃度になるようにエタノールまたは水を添加し、濾過などの処理を行うことにより、カルノシン酸を多く含有する抽出物を得ることができる。このような抽出方法を用いて得た抽出物を使用することにより、ＡＭＰＫ活性能は飛躍的に向上する。
【００２３】
上記のように抽出を行った後、カルノシン酸を含有するローズマリーおよび／またはセージの抽出物は、当業者に周知の手法により、濾過と濃縮とが行われる。これにより本発明に用いられるローズマリー抽出物およびセージ抽出物を得ることができる。
【００２４】
本発明の第一のＡＭＰＫ活性化剤は、食品、医薬品などの適切な形態に加工される。また、本発明の第一のＡＭＰＫ活性化剤は経口投与または非経口投与のいずれに使用されてもよい。
【００２５】
食品に加工される場合、上記ローズマリー抽出物および／またはセージ抽出物と適切な材料とが混合される。この適切な材料は、一般に食品用材料として使用され得るものである。例としては、米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、昆布、ワカメ、テングサなどの粉類；水飴；乳糖；グルコース；果糖；スクロース；マンニトール；ならびにこれらの組合わせが挙げられる。さらに、香辛料、着色料、甘味料、食用油、ビタミンなどを添加してもよい。これら適切な材料および添加剤は単独または組合せて使用される。またさらに、必要に応じて水を添加して所望の形状に加工してもよい。
【００２６】
医薬品に加工される場合、上記ローズマリー抽出物および／またはセージ抽出物と添加剤とが混合される。添加剤の例としては、界面活性剤、賦形剤、着色料、保存料、コーティング助剤ならびにこれらの組合せが挙げられる。これら添加剤は、通常の医薬品製造における添加剤であれば特に限定されず、より具体的な例としては、ラクトース、デキストリン、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ソルビトール、結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、およびこれらの組合せが挙げられる。さらに、香味料、甘味料などを添加してもよい。またさらに、必要に応じて他の薬剤を添加してもよい。
【００２７】
投与剤形も特に限定されず、日本薬局方に従って適切な剤形に製造される。具体的には、経口投与を目的とする場合は、カプセル剤、錠剤、粉剤、除放剤などの剤形に製造される。非経口投与を目的とする場合は、注射剤、輸液剤などの剤形に製造される。
【００２８】
上記適切な材料および添加剤の含有量は、特に限定されず、上記ローズマリー抽出物および／またはセージ抽出物の含有量に合わせて調製される。
【００２９】
本発明の第二のＡＭＰＫ活性化剤は、以下の式（１）：
【００３０】
【化２】
2008208081.tif 000003
【００３１】
で表されるカルノシン酸を含有する。
【００３２】
上記式（１）のカルノジン酸は、ＡＭＰＫ活性化剤中に有効成分として含有される。実質的に有効成分となるカルノシン酸の含有量は、AMPK活性化剤を１００重量％とした場合、好ましくは０．００００１重量％〜１００重量％、より好ましくは０．００１重量％〜１００重量％である。抽出物の含有量が０．００００１重量％未満では、ＡＭＰＫ活性化を十分に促進させることができない場合がある。
【００３３】
上記式（１）のカルノシン酸は、化学合成することも可能であるが、通常は植物抽出物、好ましくは上記ローズマリー抽出物またはセージ抽出物からの単離により得ることができる。代表的には、式（１）のカルノシン酸は、上記ローズマリー抽出物またはセージ抽出物から、カラムクロマトグラフィーにより夾雑物が取り除かれる。これにより得られた物質は、高速液体クロマトグラフィー、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲなどの周知の手段により式（１）のカルノシン酸であると当業者に容易に同定され得る。
【００３４】
本発明の第二のＡＭＰＫ活性化剤もまた、上記第一のＡＭＰＫ活性化剤と同様に、食品、医薬品などの適切な形態に加工され、経口投与または非経口投与のいずれにも使用することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例によって具体的に記述する。しかし、これらによって本発明は制限されるものではない。
【００３６】
＜実施例１＞
カルノシン酸を以下のようにして得た。ローズマリーの全草（５ｋｇ）をエタノール（２０Ｌ）に浸漬し、４０℃で７２時間抽出を行った。得られた抽出液を濃縮し、これに精製水（２Ｌ）を加え、水不溶物（１０５ｇ）を得た。この水不溶物を酢酸エチルに溶解し、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒；酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）で精製することによって、カルノシン酸（１．５ｇ）を得た。上記で得たカルノシン酸単独をＡＭＰＫ活性化剤とした。
【００３７】
＜実施例２＞
ラット由来筋肉芽細胞株（Ｌ６細胞）を、２％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＤＭＥＭ培地に、細胞数が１×１０５個／穴（平底６ウェルプレート：ＩＷＡＫＩ社製）となるように播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で１週間に２回培地交換をしながら２週間培養し、筋肉細胞に分化させた。培地を除去した後、上記より得たカルノシン酸を10μＭの濃度で含有する培地、もしくは被検物質を含まない前述の培地を添加して、さらに１日培養した。終了後、上澄を捨て、４℃に冷やしたＰＢＳ（−）（日水製薬製）を添加した後、セルスクレーパーで細胞を集め、ＲＩＰＡバッファー（ＵｐＳｔａｔｅ社製）により細胞を溶解した。得られた細胞溶解物の蛋白濃度の定量をＢＣＡプロテインアッセイキット (ＰＩＥＲＣＥ社製)によって行い、濃度を１ ｍｇ／ｍｌに調整した。その後、ＳＤＳサンプルバッファーを添加し１００℃において５分インキュベートしたものをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとした。得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ＰＶＤＦ膜にブロッティングした。抗Ｔｈｒ１７２リン酸化ＡＭＰＫ特異的抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を使用し、リン酸化されたＡＭＰＫの検出を行った。シグナルの強度をＡｌｐｈａＩｎｏｔｅｃｈ社のＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒ４４００デンシトメーターを用いて数値化した。被検物質を添加していない結果を１００％として算出した。結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
2008208081.tif 000004
【００３９】
表１に示されるように、本発明のカルノシン酸を含有する系では、含有しない系と比較して、試料溶液中のＴｈｒ１７２リン酸化AMPKの割合が増加していることがわかる。
【００４０】
＜実施例３＞
ローズマリーの全草の粉砕物（６０ｇ）を８０％エタノール水溶液（３００ｍｌ）に浸漬し、４０℃で２時間抽出を行った。得られた溶液を７５ｍｌにまで濃縮した。濃縮後、抽出物を濾過して不溶物を除去した。ろ液に精製水２２５ｍｌを添加し、４℃にて一晩放置した。次いで、再び濾過を行って、不溶物であるローズマリー抽出物（乾燥重量４ｇ）を得た。このローズマリー抽出物単独をＡＭＰＫ活性化剤として使用したこと以外は、実施例２と同様にしてＡＭＰＫ活性化作用の試験を実施した。この時、被検物質の濃度は５μｇ／ｍｌになるようにした。結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
2008208081.tif 000005
【００４２】
表２に示されるように、被検物質無添加と比較して、実施例３のローズマリー抽出物を添加した細胞は、Ｔｈｒ１７２リン酸化ＡＭＰＫの割合が増加していた。このことから、ローズマリーの抽出物にはＡＭＰＫ活性化作用があることがわかる。
【００４３】
＜実施例４＞
セージの全草（６０ｇ）をエタノール（３００ｍｌ）に浸漬し、室温で一晩放置した。次いで、得られた溶液を１００ｍｌにまで濃縮した。濃縮した抽出物を濾過して不溶物を除去した。ろ液に精製水６００ｍｌを添加し、４℃にて一晩放置した。次いで、再び濾過を行って、不溶物であるセージ抽出物（乾燥重量４ｇ）を得た。このセージ抽出物単独をＡＭＰＫ活性化剤として使用したこと以外は、実施例２と同様にしてＡＭＰＫ活性化作用の試験を実施した。この時、被検物質の濃度は５μｇ／ｍｌになるようにした。結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
2008208081.tif 000006
【００４５】
表３に示されるように、被検物質無添加と比較して、実施例３のセージ抽出物を添加した細胞は、Ｔｈｒ１７２リン酸化ＡＭＰＫの割合が増加していた。このことから、セージの抽出物にはＡＭＰＫ活性化作用があることがわかる。
【００４６】
＜実施例５＞
実施例３で得たローズマリー抽出物を用いて、表４に示す組成を有する食品を調製した。
【００４７】
【表４】
2008208081.tif 000007
【００４８】
各成分を混合した後、水を噴霧して造粒を行い、入風温度８０℃で乾燥した。
【００４９】
＜実施例５：硬ゼラチンカプセル＞
実施例１で得られたカルノシン酸を用い、表５に示す組成の硬ゼラチンカプセルを調製した。
【００５０】
【表５】
2008208081.tif 000008
【００５１】
＜実施例６：錠剤＞
実施例２で得たセージ抽出物を用い、表６に示す組成の錠剤を調製した。
【００５２】
【表６】
2008208081.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のＡＭＰＫ活性化剤を用いれば、ＡＭＰＫの活性化を効率的に促進することができる。本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、副作用を伴うことがなく、生体内において極めて安全にＡＭＰＫ活性を増強させることができる。このＡＭＰＫの活性化により、肥満、高脂血症、高血糖症（糖尿病）、高血圧などのメタボリックシンドロームに対する予防および治療ができる。このため、食品分野、医薬分野などの種々の分野における汎用性を高めることができる。