(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞膜上に存在するエストロゲン受容体（ＧＰＲ３０）を特異的に認識する抗体、及びその作製方法を提供する。【解決手段】ＧＰＲ３０の特定のアミノ酸配列、好ましくは膜外露出領域に対応する１１〜１５アミノ酸からなるエピトープのアミノ酸配列を抗原とし、これを非ヒト哺乳動物に免疫して得られる抗体、及びその作製方法。さらに該抗体を用いたＧＰＲ３０の検出方法。抗体は、ポリクローナル抗体を用いる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１から配列番号１１のうち少なくとも１つに記載のアミノ酸配列からなるエピトープを認識する、抗ＧＰＲ３０抗体。
【請求項２】
配列番号１，３，５，９のうち少なくとも１つに記載のアミノ酸配列からなるエピトープを認識する、抗ＧＰＲ３０抗体。
【請求項３】
配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する、抗ＧＰＲ３０抗体。
【請求項４】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項１から請求項３のうちいずれか１項に記載の抗ＧＰＲ３０抗体。
【請求項５】
配列番号１から配列番号１１に記載のペプチドのうち少なくとも１種類を抗原とする、抗ＧＰＲ３０抗体の作製方法。
【請求項６】
配列番号１，３，５，９に記載のペプチドのうち少なくとも１種類を抗原とする、抗ＧＰＲ３０抗体の作製方法。
【請求項７】
配列番号９に記載のペプチドを抗原とする、抗ＧＰＲ３０抗体の作製方法。
【請求項８】
請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の抗ＧＰＲ３０抗体を用いることを特徴とする、ＧＰＲ３０タンパク質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は女性ホルモン受容体タンパク質の認識・検出方法に関し、より詳しくは、哺乳動物の細胞膜上に存在するエストロゲン受容体タンパク質であるＧ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３０（ＧＰＲ３０）タンパク質を特異的に認識する抗体及び抗体の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
女性ホルモンの一種エストロゲンは月経周期の調節など女性の性活動を制御するほか、血管の拡張作用、コレステロールの調節、骨量バランスの調節など様々な生命維持機構の調節にはたらく物質であり、調節を受ける細胞（エストロゲン標的細胞）にはエストロゲンを認識しそのシグナルを伝達するための受容体タンパク質が存在することが知られている。エストロゲンによる調節は内分泌系、生殖器、骨組織、血管系で重要な役割を担っており、その異常は異常骨吸収、心血管疾患、中枢神経系傷害及びがんなど種々の疾患の発生や進行に関与すると考えられている。エストロゲン受容体の活性を調節するためのリガンドはこれらの疾患を治療・予防するための薬剤となりうることから、エストロゲン受容体とその作用機序を明らかにすることが極めて重要である。
【０００３】
上記の認識から、エストロゲン受容体のうち特に細胞内に存在するＤＮＡ結合型の受容体については多くの研究がなされており、遺伝子が単離されるなど成果も上がっている（特許文献１−４）。細胞質内に存在するエストロゲン受容体は、エストロゲンが結合すると活性化されて核内に移行し、染色体上のエストロゲン応答配列に結合し、さらにエストロゲン−エストロゲン受容体複合体を認識する転写調節因子が結合して、標的となる遺伝子の発現が促されることなどが明らかにされてきている。一方、エストロゲンの刺激により遺伝子の発現を介さない細胞の応答、例えばカルシウムイオンの移動や一酸化窒素の生成、チロシンキナーゼの活性化などが起こることから、エストロゲンに対しては細胞質内に存在する受容体だけではなく、細胞膜上に存在してシグナルを伝達する膜結合型の受容体の存在が予測されていたが、一般に膜タンパク質は可溶性タンパク質に比べて単離精製や機能解析が困難という問題があり、膜結合型エストロゲン受容体の実態については全く明らかではなかった。細胞膜上のタンパク質においては、その発現量や動態を可視化することが機能解析においては有効であることから、エストロゲンの刺激により活性化される細胞膜上のタンパク質を特異的に認識し、更なる解析を可能にする手法の開発が切望されていた。
【特許文献１】特開２００１−３５２９９２  エストロゲンレセプター遺伝子およびその利用
【特許文献２】特表２００４−５０１６０７  新規エストロゲン調節性Ｇタンパク質γサブユニット：組成物および使用法
【特許文献３】特表２００１−５２５３１９  エストロゲン受容体
【特許文献４】特表平１１−５０２４１７  オーファン  レセプター
【非特許文献１】Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｈａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５１８：１７３−１７７．
【非特許文献２】Ｋｉｍｕｒａ  Ｍ．，Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６４５３−２６４６０．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の現状に鑑み、本発明は、細胞膜上に存在するエストロゲン受容体を、細胞膜上に存在する状態で特異的に認識し得る抗体、及びその作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題の解決のため、本発明者らは、細胞膜上に存在する種々の受容体タンパク質の解析を進め、エストロゲン（１７β−エストラジオール；Ｅ２）との関連が指摘されているＧタンパク質結合型の膜受容体タンパク質の一種、ＧＰＲ３０に着目して、ＧＰＲ３０タンパク質を特異的に認識可能な抗体の作製を試みた。本発明者らはラットの一種ノルウェーラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）からＧＰＲ３０ホモログの遺伝子を単離し、その予想されるアミノ酸配列（配列番号１２）から、膜貫通ドメイン（疎水性アミノ酸からなるＨｅｌｉｘ構造など）と膜貫通ドメインとをつなぐ膜外露出部分こそが抗原として利用可能であると予測し、更に可溶化して立体構造の変化した膜タンパク質そのものを抗原とするのではなく、膜外露出部分のアミノ酸配列のみで十分抗原たり得ると予測して、膜外露出部分のアミノ酸配列を基に合成した種々の合成ペプチドを、抗原としてウサギに免疫する手法により抗体の作製を行った。この中から、特定の合成ペプチドを抗原としてウサギに免役し得られる抗体が、細胞膜上のＧＰＲ３０タンパク質を特異的にかつ感度良く検出できることを見いだし、ＧＰＲ３０タンパク質と女性ホルモン刺激との関連性からＧＰＲ３０が確かにエストロゲン応答タンパク質であることを明らかにして、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち本発明の第１の態様は、配列番号１から配列番号１１のうち少なくとも１つに記載のアミノ酸配列からなるエピトープを認識する、抗ＧＰＲ３０抗体を提供する。
【０００７】
本発明の第２の態様は、配列番号１，３，５，９のうち少なくとも１つに記載のアミノ酸配列からなるエピトープを認識する、抗ＧＰＲ３０抗体を提供する。
【０００８】
本発明の第３の態様は、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する、抗ＧＰＲ３０抗体を提供する。
【０００９】
本発明の第４の態様は、抗体がポリクローナル抗体である、第１から第３の態様のうちいずれか１つに記載の抗ＧＰＲ３０抗体を提供する。
【００１０】
本発明の第５の態様は、配列番号１から配列番号１１に記載のペプチドのうち少なくとも１種類を抗原とする、抗ＧＰＲ３０抗体の作製方法を提供する。
【００１１】
本発明の第６の態様は、配列番号１，３，５，９に記載のペプチドのうち少なくとも１種類を抗原とする、抗ＧＰＲ３０抗体の作製方法を提供する。
【００１２】
本発明の第７の態様は、配列番号９に記載のペプチドを抗原とする、抗ＧＰＲ３０抗体の作製方法を提供する。
【００１３】
本発明の第８の態様は、第１から第４の態様のうちいずれか１つに記載の抗ＧＰＲ３０抗体を用いることを特徴とする、ＧＰＲ３０タンパク質の検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の提供する抗ＧＰＲ３０抗体を利用することにより、ＧＰＲ３０すなわちエストロゲン受容体にまつわる種々の物質の動態解析や創薬への応用が可能となる。一般に膜結合型の受容体タンパク質は界面活性剤などで可溶化してしまうと立体構造が失われ、これを用いて作製した抗体が生体では膜タンパク質を認識できないという傾向があるのに対して、本発明の提供する抗体が、生体内に実際に存在する状態の膜タンパク質を特異的に認識しうるため、その利用価値は高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に本発明を実施するための最良の形態を述べる。本発明の第１の態様は、哺乳動物の細胞膜上に存在する女性ホルモン受容体であるＧＰＲ３０タンパク質を特異的に認識する、抗ＧＰＲ３０抗体を提供する。ＧＰＲ３０は世界で初めてその働きが明らかになった膜結合型の女性ホルモン受容体であり、女性ホルモン受容異常に起因する疾患など、その解析は今後創薬や治療につながるものである。本発明は、このＧＰＲ３０タンパク質を特異的に認識可能な抗体を提供するものであり、ＧＰＲ３０タンパク質、好ましくは配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、より好ましくはこのうち膜外露出領域である配列番号１から１１のうちいずれか１つのアミノ酸配列を認識する抗体、あるいはこれらの各のアミノ酸配列を認識する複数の抗体の混合物であっても良く、これらの抗体は疾患の解析や創薬などのツールとして利用可能である。
図１は、本発明者らが明らかにした配列番号１２に記載のノルウェーラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）由来ＧＰＲ３０のアミノ酸配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｐｒｏｔｅｉｎ＆ｖａｌ＝１９４２４２６２）を基に、ＳＯＳＵＩシステム（ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／）を用いてその構造を解析した結果である。図中、中央部が細胞膜を貫通している領域であり、上側が細胞外を、下側が細胞内をそれぞれ表している。また配列番号１，３，５，９に記載の合成ペプチドを作成するために用いたアミノ酸配列に相当する部分を、配列番号と網掛けとで示している。図が示す通り、ＧＰＲ３０は疎水性アミノ酸からなるＨｅｌｉｘドメインが複数回膜を貫通する典型的な膜タンパク質であり、その予想される構造から、特に生きた細胞においては、特定の領域のみが抗原による認識を受ける領域（エピトープ）として利用可能であると予測される。本図はあくまで計算上予想される構造を示すものであり、実際の構造を示すものではない。一般にＧタンパク質結合型の受容体は７回膜貫通型であるため、図の膜貫通部のうち一つは脂質であるエストロゲンを結合するための構造である可能性がある。いずれにせよ、ＧＰＲ３０は複数の膜外に突き出した領域を持っているが、その全てが前記エピトープとして同様に利用可能なわけでは無く、好ましくは図１の例における配列番号１，３，５，９に記された配列のうち少なくとも一つ、または哺乳動物における前記配列の相同部分にあたる配列も含めた配列番号１から１１のうち少なくとも１つ、より好ましくはこれらの配列のうちＣ末端に近く、膜貫通ドメインの影響を受けにくいと考えられる配列番号９（それに対応する他種哺乳類の配列１０，１１含む）に記載のアミノ酸配列からなるエピトープを認識する抗体が本発明の態様としてあげられる。
本発明の提供する抗体は、例えば配列番号１から１１のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体でも良いし、精製やクローニングのコストを抑え感度を上げるためにこれらのエピトープを標的としたポリクローナル抗体でも良い。
【００１６】
本発明の提供する抗体を作出するための方法としては、立体構造を保ったままで精製されたＧＰＲ３０タンパク質を抗原として非ヒト哺乳動物に免疫し、これらの動物に抗体を産生させても良いし、人工的に合成した細胞外突出部分のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド、好ましくは配列番号１から１１のうち少なくとも１つに記載のオリゴペプチド、より好ましくは配列番号１，３，５及び９に記載のオリゴペプチドを抗原として非ヒト哺乳動物に免疫し、抗体を産生させても良い。抗体を産生させる非ヒト哺乳動物、抗体を回収する方法などは通常分子生物学において用いられる手法や動物を適宜利用すれば良く、本発明を限定するものではないが、例えば動物としてラット、マウス、ウサギ、ヤギなどがあげられ、モノクローナル抗体であれば免疫した動物の脾臓細胞、ポリクローナル抗体であれば血清から抗体を回収すれば良い。
また本発明の提供する抗体を用いたＧＰＲ３０タンパク質の検出方法としては、例えば光学顕微鏡下における免疫染色や免疫電顕など細胞や組織に存在するＧＰＲ３０タンパク質を特異的に検出する方法や、この抗体をイムノカラムの様な態様で用い、種々のタンパク質が混在する試料からＧＰＲ３０タンパク質を特異的にふるい分けるといった方法があげられる。下記に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
（ＧＰＲ３０発現ベクターの設計）ノルウェーラットＧＰＲ３０遺伝子の全長は、非特許文献１で本発明者らが明らかにした配列を用いた。この全長ＤＮＡをプラスミドｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ１０またはｐＣＭＶ−ＧＦＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）に規定の方法に従って導入した。ＦＬＡＧは特定の数アミノ酸からなるタグ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）で、この配列に対する抗体を用いることによってトランスフェクションした細胞内における導入遺伝子の発現を検出できる。プラスミドへの遺伝子導入は非特許文献２の方法に従った。
【００１８】
（ＧＰＲ３０ベクターによるトランスフェクション）前記で作製したベクターを、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｈ９ｃ２細胞（８０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｉｎ  ３５ｍｍ  ｄｉａｍｅｔｏｒ  ｄｉｓｈｅｓ）に導入した。これらの細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で３回洗い、作製したプラスミドＤＮＡとリポフェクタミン２０００を適当量含む調製溶液（Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）をそれぞれ１００μｌずつ準備した。両溶液を混合し、２０分間静置した。その後混合溶液を細胞培養液に直接加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件で４８時間培養して、細胞にプラスミドを導入した。
【００１９】
（抗ＧＰＲポリクローナル抗体の作製）ウサギ抗ＧＰＲ３０ポリクローナル抗体は、次の方法で作製した。ＧＰＲ３０のアミノ酸配列の中から、膜外突出部分に相当する配列番号１，３，５及び９の合成アミノ酸配列（１６５−１７５、２９４−３０６、３２８−３４２、３５２−３７０）をそれぞれウサギに注射し、抗血清を回収してイムノブロッティングに用いた。これらの抗体のうち、配列番号９のアミノ酸配列に対する抗体については、アフィニティカラムを通して精製し、スピンカラムを用いて濃縮しその後の解析に用いた。
【００２０】
（免疫染色）ＧＰＲ３０タンパク質に対する免疫染色は以下の方法で行った。対象とする細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、固定後０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５分間処理した。これらの細胞を１０％ＦＢＡ（Ｆａｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ｉｎ  ＰＢＳ）で１時間ブロッキングし、ブロッキング後の細胞に対して３％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を含む抗体溶液（ｉｎ  ＰＢＳ）で２４時間、４℃の温度条件にて処理を行った。処理後、細胞をＰＢＳで洗って結合しなかった抗体を除去し、Ａｌｅｘａ４８８でラベルされた抗マウスＩｇＧ及びＡｌｅｘａ５９４でラベルされた抗ウサギＩｇＧ抗体（ｉｎ  ＰＢＳ，３％  ＢＳＡ含有）で１時間、室温条件下で２次抗体処理を行った。抗体処理した細胞は、蛍光顕微鏡（ＩＸ７０，Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＪＰＮ）にＣＣＤカメラ（Ｃｏｏｌ  ＳＮＡＰ  ＨＱ，Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を取り付けて観察した。撮影した画像はＭｅｔａｍｏｒｐｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）で解析した。
【００２１】
（免疫組織科学的解析及び免疫電顕）ＧＰＲ３０タンパク質の組織科学的解析及び免疫電顕の観察のため、Ｗｉｓｔａｒ  Ｒａｔ（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ  Ｉｎｃ．，ＪＰＮ）を実験動物として用いた。動物実験は全て、山口大学の関係ガイドライン及び日本国の関係法令に従って行った。通常の飼育条件で飼育したラットをペントバルビタールＮａ（６５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）で麻酔し、手術により脳を取り出し、固定液（０．５％  グルタルアルデヒド、４％  パラホルムアルデヒド、０．２％  ピクリン酸、ｉｎ  ０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．４）で固定した。単離した脳の海馬を含む部分を包埋し、ミクロトーム（ＶＴ１０００Ｓ，ＬＥＩＣＡ）で３０μｍの厚さの切片を作製し、１０％ＮＧＳ（Ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ，ｉｎＰＢＳ）で２時間プレインキュベートした。これらの切片を漂白溶液（５０％メタノール、１．５％過酸化水素）で１時間、４℃にて漂白した。更に切片を１％水素化ホウ素ナトリウムで１時間、前処理し、洗浄溶液（０．０５％  ＮＧＳ、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ｉｎ  ＰＢＳ）で洗った後、１：５００に希釈したウサギ抗ＧＰＲ３０ポリクローナル抗体の反応溶液（１％  ＮＧＳ、１％  ブロッキング溶液，ｉｎ  ＰＢＳ）で３日間、２０℃にて交差反応させた。１次抗体処理後の切片を１：５００に希釈（１％  ＮＧＳ  ｉｎ  ＰＢＳ）したビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，ＤＥＮ）で３時間、２０℃の温度下で処理し、その後セイヨウワサビペルオキシダーゼとウサギ抗セイヨウワサビペルオキシダーゼ抗体複合体（ＰＡＰ，Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，１：５００）及びペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，１：５００）の混合溶液（ｉｎ  ＰＢＳ）で３時間、２０℃で２次抗体処理した。処理後の切片を０．０２％のＤＡＢ（３，３‘−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｗａｋｏ，ＪＰＮ）と０．６％のＮｉｃｋｅｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む染色溶液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．００００８％  Ｈ２Ｏ２，ｐＨ７．６）で１０−１５分間、室温にて染色した。染色後、切片を後固定溶液（１％  ＯｓＯ４  ｉｎ  ０．１Ｍ  リン酸緩衝液）で１時間処理し、更に２％酢酸ウランで１時間処理を行い、エタノールのシリーズで脱水を行って観察用とした。超薄切片については、包埋した海馬を含む組織をＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  ＯｍＵ４  ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅを用いて切片とし、Ｈ−７５００電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ，ＪＰＮ）にて８０ｋＶで観察した。
抗ＧＰＲ３０抗体の特異性を確認するための対照としては、（１）抗ＧＰＲ３０抗体を通常のウサギ血清で置き換えて処理、（２）１：５００希釈した抗ＧＰＲ３０抗体溶液に過剰な抗原（合成ペプチド）を加え２４時間おいて抗体を完全に吸着させ、その後使用するという“Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ”の２種類の方法で確認した。対照の切片においては、いかなる抗体反応を示すシグナルも観察されなかった。
【００２２】
（抗ＧＰＲ３０抗体によるＧＰＲ３０の局在の観察）上述の方法で作製したＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０ベクターを導入したＨｅＬａ細胞において、遺伝子導入から２４時間後に今回作製した抗ＧＰＲ３０抗体及び抗ＦＬＡＧ抗体の両方を用いて抗原の局在を観察した。作製した抗ＧＰＲ３０抗体の中では、配列９で示したＧＰＲ３０のＣ末端側のアミノ酸配列を抗原とした抗体が最も反応が良かったため、以後の解析はこの抗体を用いて行った。その結果、抗ＧＰＲ３０抗体、抗ＦＬＡＧ抗体とも細胞表層とのみ反応を示し、両者のシグナルは一致していた。図２に両抗体による染色の結果（色調を反転，×６００）を示す。図２ａは抗ＧＰＲ３０抗体を用いた蛍光染色像で、矢印で示した細胞の表層部分にのみシグナルが観察された。図中ＮｕｃはＤＡＰＩによる核染色像を示す。またＸ−Ｘ’で示した線分は図３におけるシグナル強度解析に用いた部分を示している。図２ｂは抗ＦＬＡＧ抗体を用いた染色像を示しており、ａと同様細胞表層に強いシグナルが観察された。図２ｃはａとｂを重ね合わせたもので、ａで観察されたシグナルとｂで観察されたシグナルの局在が一致していることを示している。
図３Ａは、図２ａにおける線分Ｘ−Ｘ’上のシグナルの強さをＭｅｔａｍｏｒｐｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析したグラフを示し、縦軸は蛍光強度を、横軸は線分上の位置（両端が線分の起点と終点）を表す。またこの結果を細胞膜周辺領域と細胞質内領域に分けて、それぞれの値を積み上げたものが図３Ｂである。両方の結果より、抗ＧＰＲ３０抗体の表すシグナルは、細胞質内には無く専ら細胞膜上に存在することが確認された。
【００２３】
（エストロゲン刺激によるＧＰＲ３０の活性化）ＧＰＲ３０タンパク質がエストロゲン刺激により活性化されるかどうかを確認するため、エストロゲン刺激による標的細胞の代表的な応答の一つである細胞質内へのカルシウムイオンの流入を指標とし、ＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０タンパク質を多量に発現しているＨｅＬａ細胞とインサートとしてＧＰＲ３０を持たない「空の」ベクターを導入したＨｅＬａ細胞とを比較した。それぞれの細胞をカルシウム指示薬であるＦｕｒａ−２ＡＭ（１μＭ）で３０分間プレインキュベートし、そこにＥ２（１００μＭ）を加え、直後から１０分後までの３４０ｎｍ吸光／３８０ｎｍ吸光の比を取ってカルシウムイオンの動態を調べた。図４はその結果を示しており、グラフ横軸はＥ２添加からの時間（矢印Ｅ２がＥ２の添加時点）、縦軸が３４０ｎｍ吸光／３８０ｎｍ吸光の比（平均値±ＳＥ，ｎ＝３，値が大きいほどカルシウムイオンの流入が多い）を表している。グラフ「ｅｍｐｔｙ」が示すとおり、ＧＰＲ３０を発現していないＨｅＬａ細胞ではカルシウムイオンの流入がほとんど起こらず、対照的にＧＰＲ３０を大量発現しているＨｅＬａ細胞ではＥ２添加後すみやかにカルシウムイオンの流入が起こっていることが示された。図４Ｂは、ＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０を発現しているＨｅＬａ細胞における、Ｅ２添加によるシグナルの変化を示したものである。ＡではＥ２を添加せずに１時間インキュベートした細胞を、ＢではＥ２を添加して１時間インキュベートした細胞をそれぞれ４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３分間処理した後、抗ＦＬＡＧ抗体とＡｌｅｘａ  ４８８ラベル抗マウスＩｇＧ抗体で標識しその蛍光を観察した。図中矢印で示したＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０のシグナルは、Ｅ２の添加後１時間で非常に増大しており、ＧＰＲ３０がＥ２の刺激によってカルシウムイオンの流入を引き起こすのと同時に、正のフィードバック効果によって自身の発現量も増大させることが示された。
【００２４】
（ラット脳組織におけるＧＰＲ３０の局在）免疫電顕的手法を用い、ラット脳組織（海馬）におけるＧＰＲ３０の局在を検討した。図６がその結果を示したものであり、図右下のバーは１μｍを表し、Ｎｕｃは核を、Ｃｙｔｏは細胞質を示す。重ね矢頭で示した抗ＧＰＲ３０抗体を示すシグナル（電子密度の大きなスポットとして現れる）は、細胞と細胞の境界部分に限定して点在しており、本抗体が認識するタンパク質が細胞膜に結合したタンパク質であることが電顕レベルでも明らかとなった。
以上の実施例から、本発明の提供する抗ＧＰＲ３０抗体が、膜結合型のエストロゲン（Ｅ２）受容体タンパク質を特異的に認識する能力を持った抗体であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明の提供する抗体を利用することにより、膜結合型のエストロゲン受容体として世界で初めて明らかになったＧＰＲ３０タンパク質の細胞内における動態を追跡することが可能となり、女性ホルモン受容に関連した種々の疾患につき、その治療薬の創薬や病体解析に極めて有効なツールを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明者らが明らかにしたノルウェーラットＧＰＲ３０タンパク質のアミノ酸配列から予想される、ＧＰＲ３０の膜貫通構造を示す。
【図２】ＦＬＡＧ−ＧＰＲを発現したＨｅＬａ細胞における、抗ＧＰＲ抗体及び抗ＦＬＡＧ抗体による免疫染色像を示す。
【図３】図２ａのＸ−Ｘ’線分上における蛍光シグナル強度を、数値化・グラフ化して示す。
【図４】ＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０遺伝子導入ＨｅＬａ細胞と対照ＨｅＬａ細胞における、エストロゲンＥ２添加の影響（Ｃａ２＋の流入）をグラフ化して示す。
【図５】ＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０遺伝子導入ＨｅＬａ細胞での、Ｅ２刺激前後におけるＧＰＲ３０の局在の変化を示す。
【図６】ラット脳組織における、抗ＧＰＲ３０抗体を用いた免疫電顕像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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