(57)【要約】  【課題】  化学療法および／または放射線に起因する消化管内膜の損傷を防止、改善および／または治療する方法を提供する。  【解決手段】  本発明の方法は、有効な量の乳製品抽出物を、それを必要としている患者に投与することを含む。また、本発明は、化学療法および／または放射線に起因する消化管内膜の損傷を防止、改善および／または治療するための薬学上または獣医学上の組成物であって、この組成物は、有効な量の乳製品抽出物、および、その抽出物のための薬学上または獣医学上許容され得る希釈剤、担体または賦形剤を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法および／または放射線に起因する消化管内膜の損傷を、防止、改善および／または治療する方法であって、有効な量の乳製品抽出物を、それを必要としている患者に投与することを含む方法。
【請求項２】
乳製品抽出物が、チーズ乳漿抽出物、初乳乳漿抽出物、脱脂乳抽出物または酸（カゼイン）乳漿抽出物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
乳製品抽出物が、乳製品を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけることによって調製された請求項２に記載の方法。
【請求項４】
乳製品抽出物が、塩基性からほぼ中性の等電点を有する細胞成長因子の混合物を含む乳製品抽出組成物であって、細胞成長因子の混合物は有蹄哺乳動物の乳製品から得られるものであり、その乳製品は、乳製品中に存在するカゼイン、αラクトアルブミンおよびβラクトグロブリンがマトリックスに吸収されない条件下で陽イオン交換マトリックスに接触させ、その後、吸収された成長因子の混合物を塩の実質的に水性の溶液で溶離し、随意、濃縮したものである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
乳製品抽出物が、ラクトペルオキシダーゼおよび／またはラクトフェリンを含む請求項２に記載の方法。
【請求項６】
乳製品抽出物が、前述したＧＦＥまたはＧＦＥ−２を含む請求項２に記載の方法。
【請求項７】
乳製品抽出物が、活性を増強するため、一時的な酸性化によって改質されている請求項１に記載の方法。
【請求項８】
乳製品抽出物が、活性を増強するため、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II、ＴＧＦβ、ＥＧＦ、変換成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）または角化細胞成長因子（ＫＧＦ）を含む一種または多種の成長因子を加えることによって改質されている請求項１に記載の方法。
【請求項９】
損傷が、口および／または食道の内膜の損傷を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
損傷が粘膜炎を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
損傷が、粘膜の陰窩領域および／または粘膜絨毛長の、少なくとも部分的な損失を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
損傷が、消化管の全域における細菌の転移の増加を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
損傷が、メクロールエタミン、メルファラン、ブスルファン、シタラビン、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル、メルカプトプリン、メトトレキセート、チオグアニン、ブレオマイシン、アクチノマイシン−Ｄ、ダウノルビシン、エトポシド、マイトマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ヒドロキシ尿素もしくはプロカルバジンを、単独または組合せて患者に投与することを含む化学療法に起因するものである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
化学療法および／または放射線に起因する消化管内膜の損傷を、防止、改善および／または治療するための薬学上または獣医学上の組成物であって、有効な量の乳製品抽出物、および、その抽出物のための薬学上または獣医学上許容され得る希釈剤、担体または賦形剤を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学療法および／または放射線に起因する消化管内膜の損傷の予防、改善および／または治療に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
化学療法および／または放射線療法は、急速に成長する組織を標的とするため腫瘍の破壊において効果的である。その機構は、ＤＮＡの合成障害、または、急速な細胞分裂に必要とされる代謝作用の妨害を包含する。抗ガン治療によって腫瘍細胞が選択的に攻撃される一方、宿主の急速成長組織、特に体内の免疫細胞および消化管の内膜もまた影響を受ける。消化管における上皮細胞の分裂は粘膜の陰窩領域で起こる。その後、新規に合成された細胞は、内腔表面へ移動しながら（消化酵素のような）機能的特性を得て、最終的には消化管の内腔へ押出される。この全工程にはたったの数日間しか要さないので、消化管の粘膜質の上皮はあらゆる身体組織の中で最も速い細胞分裂速度を有するものの一つである。それゆえ、消化管の粘膜質の上皮は抗ガン療法の毒性を受ける主な部位である。
【０００３】
口および食道の内膜は、化学療法や放射線に対して特に敏感である。粘膜炎の性質を有する口腔内潰瘍（「口内炎」とも言う。）は、相当な痛み、感染に対する感受性の増大および食事不能を引き起こす臨床上の主要な問題となっている。腸内膜の損傷は通常は小腸で起こり、大腸ではそれほど頻繁には起こらず、ひどい下痢と痛みをもたらす。（Verdi CJ 1993年 ガン治療と口腔粘膜炎。薬剤による予防方法の評価。Drug Safety 9:185-195；Sonis ST 1993年 ガンの化学療法による口腔合併症。VT DeVita Jr,S HellmanおよびSA Rosenberg（編）ガン、腫瘍学の原理と実際、pp2385-2394、フィラデルフィア、JB Lippencott Co.）
粘膜炎は、２つの別個の機構によって起こる。抗ガン剤または放射線による消化内膜への直接的な損傷によるものと、免疫組織に損傷を受けた患者の好中球減少に関連した日和見感染に起因して間接的に生じるものである。結果として、重度の好中球減少症を誘発するあらゆる薬剤は間接的に粘膜炎を引き起こす（Verdi CJ 1993年）。また、腸壁への直接的な損傷は、損傷を受けた腸内膜の全域に渡る細菌の転移を許し、日和見感染に対する感受性を増大させる。
【０００４】
一般に粘膜炎は、薬剤または放射線治療を続けて５〜１０日以内に現れ、数週間衰えないこともある。粘膜炎の重症度は、軽度なものから、化学療法の投薬量または放射線量を制限しなくてはならないほど重度なものへ変化することもある。高投薬量（高線量）の化学療法／放射線治療を受ける患者にとって、粘膜炎は、感染およびその結果生じる敗血症の第一の原因であり、罹病および死亡の主要な原因であり、彼等の入院の主たる理由である。粘膜炎を患った患者は、口腔内潰瘍、痙攣、激痛、消化管の皮膚剥離および重度の下痢のため、数週間またはそれ以上の期間、静脈からの栄養供給が必要となる（Verdi 1993年；Sonis 1993年）。
【０００５】
粘膜炎のために、化学療法もしくは放射線療法を受ける患者の退院が延期され、またはその後の投薬削減が余儀なくされ得ることがあり、抗ガン治療の全体的な効力が傷つけられている。いくつかの抗ガン療法にとっては、粘膜炎は制限毒（limiting toxicity）となる。この毒性を克服すれば、生活の質を改善し、二次感染に対する感受性を低下させ、静脈からの栄養供給の必要をなくすことができる。また、重要なことに、高投薬量／高線量の化学療法または放射線に対する耐容性を増大させて腫瘍除去の効果を向上させることができる（Verdi CJ 1993年）。また、入院に要する費用を実質的に削減し、外来患者と同様に更に多くの患者を治療することができる。
【０００６】
化学療法を受けている患者の約４０％に重度の粘膜炎が現れており、いくつかの種類の化学療法または放射線療法においては発生率１００％に達する。臨床上重大な粘膜炎は、結腸、胸部、前立腺、頭部、頸部および造血組織などを含む様々な部位のガンを治療するために単独または組合せて使用される標準的な化学療法薬によって発生する。しばしば粘膜炎の直接的な原因となる薬剤としては、特に限定されるものではないが、メクロールエタミン、メルファランおよびブスルファンなどのアルキル化剤、シタラビン、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル、メルカプトプリン、メトトレキセートおよびチオグアニンなどの抗代謝物、ブレオマイシン、アクチノマイシン−Ｄ、ダウノルビシン、エトポシド、マイトマイシン、ビンブラスチンおよびビンクリスチンなどの細胞毒性薬剤、並びに、ヒドロキシ尿素やプロカルバジンなどその他の化学療法薬が挙げられる（Sonis 1993年）。例えば、全身の光線照射、頭部および頸部腫瘍の治療または腹部腫瘍の放射線治療などの際に起こる、高線量の放射線治療に対する消化管の直接的な露出もまた粘膜炎の発生率の増大を引き起こす。
【０００７】
例えば、骨髄移植または末梢幹細胞移植前の除去療法（ablative therapy）などの、高投薬量の化学療法または一つの治療工程で２種もしくはそれ以上の薬剤を使用する場合に発生する粘膜炎は特に重度である。高投薬量の化学療法と積極的な放射線療法とを組合せて行う場合においても重度の粘膜炎が発生する（Sonis 1993年）。
【０００８】
先行技術においては、化学療法および／または放射線によって生じた消化管内膜の損傷を防止、低減または治療するのに効果的な薬剤が欠落していた。現在、患者の治療は主に、鎮痛剤によって痛みを制御し、感染を防ぎ、静脈から栄養補給するという一時的な緩和手段による。
【０００９】
先行技術においては、粘膜炎の症状を軽減することを目的として、数多くのアプローチがなされている。口腔における低出力レーザー治療が、骨髄移植前に高投薬量の化学療法を受けた患者の口腔粘膜炎の症状を軽減することが報告されている（第９回国際口腔腫瘍学会、1994年６月、NIH,Bethesda,USA）。細胞保護物質（例えば、スクラルファート）およびクロルヘキシジンやベンジダミンなどの抗菌薬剤の効能をある程度備えた多くの薬剤が、粘膜炎の防止において評価されている（Verdi CJ 1993年参照）。また、ソマトスタチン同族体（酢酸オクトレオチド）が、化学療法薬である５−フルオロウラシルによって誘発された粘膜炎を患った患者の分泌性の下痢を防止することが知られている。この作用の機構は、おそらく肝臓および胃腸の機能の抑制に伴う二次的なものである（Petrelli NJ,Rodriguez-Bigas M,Rustum Y,Herrara L,Creaven P 1993年、結腸直腸ガン患者の化学療法によって誘発された下痢を治療するための腸の静養、静脈の水和および継続的な酢酸オクトレオチドの多量注射。Cancer.72:1543-1546）。
【００１０】
組換え型の変換成長因子−ベータ３（transforming growth factor-b3：ＴＧＦ−ｂ３）が、ハムスターに５−フルオロウラシルを注射することにより誘発された口腔粘膜炎の症状を軽減することが知られている（Sonis ST,Lindquist L,Van Vugt A,Stewart AA,Stam K,Qu G-Y,Iwata KK,Haley JD,1994年変換成長因子−ｂ３による化学療法によって誘発された潰瘍性粘膜炎の予防。Cancer Res.54:1135-1138）。他の成長因子の効果はそれほど明確ではない。例えば、組換え型の上皮成長因子（ＥＧＦ）では、口腔粘膜炎の緩和は認められない（Sonis ST,Costa JW,Evitts SM,Lindquist LE,Nicolson M 1992年 ガンの化学療法を受けたハムスターの潰瘍性粘膜炎への上皮成長因子の影響。Oral Surg Oral Med Oral Pathol.74:749-755）が、腹部の放射線治療後の腸の回復を促進することができる（McKenna KJ,Ligato S,Kauffman GL，Abt AB,Stryker JA,Conter RL,1994年 腹部への激しい放射線照射後の、上皮成長因子による腸内の有系分裂活性およびＤＮＡ含有量の増大。Surgery.115:626-632）。
【００１１】
また、先行技術にKabi Pharmaciaの国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ９３／００５０３がある。この出願は、栄養病もしくは胃腸疾患の防止または治療、および人または動物の新生児期成長の促進のための薬剤の製造に、インスリン様成長因子−II（ＩＧＦ−II）または効果的な同族体を使用することが開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、化学療法および／または放射線の結果生じた消化管内膜の損傷の予防、改善および／または治療においての効用は、開示も示唆もされていない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、従来の技術に関連した一つまたはそれ以上の困難もしくは欠陥を、克服または少なくとも軽減することである。
【００１４】
第一の側面において、本発明は、化学療法および／または放射線によって生じた消化管内膜の損傷を防止、改善および／または治療する方法を提供するものであり、この方法は、有効な量の乳製品抽出物を、それを必要としている患者に投与することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
第二の側面において、本発明は、化学療法および／または放射線によって生じた消化管内膜の損傷を防止、改善および／または治療するための薬学上または獣医学上の組成物を提供するものであり、前記組成物は有効な量の乳製品抽出物、および、その抽出物のための薬学上または獣医学上許容され得る希釈剤、担体または賦形剤を含む。
【００１６】
本発明は、消化管内膜に実験的な損傷を受けた動物に乳製品抽出物を投与することを含む研究目的にとっても有用である。例えば、本発明は、５−フルオロウラシルによって誘発された口腔または大腸の粘膜炎を有するハムスター、または、シタラビンやエトポシドなどの化学療法薬もしくは放射線によって誘発された腸内の粘膜炎を有するげっ歯類動物に使用することができる。また本発明は、例えば、細胞培養において、口、食道または胃腸から培養された上皮細胞を、化学療法または放射線によって誘発される損傷から保護し、または治療することにも使用できる。
【００１７】
第三の側面によれば、本発明は、化学療法薬および／または放射線による上皮細胞の治療によって生じた、消化管内膜から培養された前記細胞の損傷を、防止、改善および／または治療する方法を提供するものであり、この方法は、前記細胞を乳製品抽出物の存在下で培養することを含む。
【００１８】
「損傷」とは、正常な構造または機能におけるあらゆる変質を意味する。このような損傷は、粘膜炎、粘膜の陰窩領域および／または粘膜の絨毛長の少なくとも部分的な損失、または消化管の全域における細菌転移の増加を含む。
【００１９】
「消化管」という語は、ここでは、あらゆる動物の、口から肛門までの消化系通路を指すものとして使用し、口、食道および胃腸（胃、小腸および大腸を含む）を含む。本発明は、好ましくは、特に口および／または食道に適用される。
【００２０】
「内膜」とは、表面を被覆または空洞もしくはそれに類似のものを裏打ちし、保護、被覆および／またはその他の機能を果たすあらゆる生体物質を意味する。
【００２１】
消化管の内膜は、口、食道および胃腸の上皮を含む。
【００２２】
「有効な量」とは、患者に対する単一または多重薬量投与（single or multiple dose administration）において、化学療法および／または放射線によって生じた消化管内膜の損傷の、予防、改善および／または治療に有効な乳製品抽出物の量を意味する。
【００２３】
「防止、改善および／または治療」とは、（ａ）損傷の発生前に乳製品抽出物を投与する場合においては、後に生じる損傷を、乳製品抽出物を投与しなかった場合に生じたであろう損傷に比べて軽減または除去することを意味する。また、（ｂ）損傷発生後に乳製品抽出物を投与する場合においては、その損傷を軽減または除去することを意味する。
【００２４】
「薬学上また獣医学上許容され得る希釈剤、担体または賦形剤」とは、組成物中の他の成分と共存でき、患者に有害でない希釈剤、担体または賦形剤を意味する。
【００２５】
「乳製品」という語は、ここでは、人または動物の乳から得られる誘導体であって、含まれる脂肪分および／またはタンパク成分の割合が改変されたものを指す語として使用する。乳製品としては、例えば、乳漿（milk whey）、脱脂乳、初乳乳漿（colostral whey）、チーズ乳漿（cheese whey）および酸（カゼイン）乳漿（acid(casein)whey）が挙げられる。好ましくは、乳製品は有蹄哺乳動物から得られるものである。
【００２６】
「乳製品抽出物」という語は、ここでは、塩分、脂肪分および／または主なタンパク成分の割合が改変された人または動物の乳製品から得られる抽出物を指す語として使用する。乳製品抽出物は、チーズ乳漿抽出物、初乳乳漿抽出物、脱脂乳抽出物または酸（カゼイン）乳漿抽出物であってもよい。乳製品抽出物の例としては、乳製品の限外濾液、またはクロマトグラフィーマトリックスに吸収、溶離された乳製品が挙げられる。好ましくは、乳製品抽出物は、例えば、オーストラリア特許第６４５５８９号に記載の方法のように、乳製品を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけて調製する。
【００２７】
好ましくは、乳製品抽出物は、乳製品から抽出され、濃縮された形態の複数の細胞成長因子を含む乳製品抽出組成物である。前記因子は、塩基性からほぼ中性の等電点を示す。更に好ましい乳製品抽出物は、塩基性からほぼ中性の等電点（例えば、約６．０〜約１０．５の間の等電点）を示す細胞成長因子の混合物を含む乳製品抽出組成物であって、この細胞成長因子の混合物は有蹄哺乳動物の乳製品から得られるものであり、その乳製品は、乳製品中に存在するカゼイン、αラクトアルブミンおよびβラクトグロブリンがマトリックスに吸収されない条件下で陽イオン交換マトリックスに接触させた後、吸収された成長因子を塩の実質的に水性の溶液で溶離し、随意、濃縮したものである。
【００２８】
好ましくは、乳製品抽出組成物はチーズ乳漿抽出組成物である。
【００２９】
チーズ乳漿抽出組成物はチーズ乳漿から得ることができ、主なタンパク成分の割合が改変されている。
【００３０】
乳製品抽出物は、抽出物の全重量を基準にして約１重量％以下の、カゼイン、αラクトアルブミンまたはβラクトグロブリンを含んでいてもよい。
【００３１】
更に好ましい乳製品抽出物は、その開示全体を参考のためにここに取り入れるものとする、オーストラリア特許第６４５５８９号に記載された方法によって調製されたチーズ乳漿抽出物である。これは、オーストラリア特許第６４５５８９号に記載されるように、ＧＦＥおよびＧＦＥ−２を含む。
【００３２】
乳製品は、ラクトペルオキシダーゼおよび／またはラクトフェリンを含んでいてもよい。好ましくは、ラクトペルオキシダーゼおよび／またはラクトフェリンを含む乳製品抽出物は、例えば陽イオン交換マトリックスである、一つまたはそれ以上のクロマトグラフィーマトリックスへの乳製品の吸収、および前記マトリックスからの溶離によって調製される。当業者であれば、オーストラリア特許第６４５５８９号に記載されているように、ラクトペルオキシダーゼおよび／またはラクトフェリンはＧＦＥの主要なタンパク成分であり、ラクトペルオキシターゼはＧＦＥ−２の主要なタンパク成分であることを認めるであろう。
【００３３】
乳製品抽出物は、活性を増強するために改質されてもよく、この改質は、限定されるものではないが、例えば、モレキュラーシーブクロマトグラフィーまたは細孔制御限外濾過（controlled pore ultrafiltration）を使用した、一時的な酸性化および／または酸性条件化での精製を含む。このような方法は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ９５／００２３７に記載されており、その開示全体を参考のためにここに取り入れる。
【００３４】
よって、別の好ましい形態において、乳製品抽出物は、約６．０を超える等電点と約５０００〜３００００の範囲の分子量を有する、複数の改質された乳成長因子を含む乳製品抽出組成物であって、その乳成長因子は一時的な酸性化によって改質されたものである。
【００３５】
択一的または付加的に、乳製品抽出物は、限定されるものではないが、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦβ、ＥＧＦ、変換成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）および角化細胞成長因子（ＫＧＦ）を含む一種または多種の成長因子を加えることにより、活性の増強のため改質されていてもよい。
【００３６】
本発明は、消化管の内膜の損傷を引き起こす、あらゆるタイプの化学療法または放射線治療に関連して適用できる。そのような療法などとしては、限定するものではないが、例えば、メクロールエタミン、メルファランおよびブスルファンなどのアルキル化剤、シタラビン、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル、メルカプトプリン、メトトレキセートおよびチオグアニンなどの抗代謝物、ブレオマイシン、アクチノマイシン−Ｄ、ダウノルビシン、エトポシド、マイトマイシン、ビンブラスチンおよびビンクリスチンなどの細胞毒性薬剤、ヒドロキシ尿素やプロカルバジンなどその他の薬剤、並びに、特定の組織または全身の光線療法が挙げられる。これらの薬剤と放射線療法を組合せたものについても本発明を適用することができる。
【００３７】
乳製品抽出物は、経口、径腸または全身系の経路などのあらゆる適当な経路によって投与することができる。好ましくは、乳製品抽出物は、罹患組織に到達する有効な薬量を最大限とするために、経口送達またはその他の直接的な径腸投与方法によって直接消化管に投与される。
【００３８】
経口投与に適当な本発明の調合物は、カプセル、香粉（sachets）もしくは錠剤のように、各々予め計量された活性成分を含む個々に分離した単位として、粉末もしくは細粒として、水性もしくは非水性の溶液もしくは懸濁液として、含嗽剤として、または水中油型もしくは油中水型の乳液とすることができる。また、この活性成分は、大きな丸薬、舐薬またはペーストとすることもできる。
【００３９】
非経口的な投与に適当な調合物は、酸化防止剤、緩衝剤、制菌剤および溶質を含む水性または非水性の無菌注射溶液、並びに、沈殿防止剤および濃厚化剤を含む水性または非水性の無菌懸濁液である。この調合物は、アンプルおよび小ビンなどのように、１回分単位の薬量または複数回分の薬量を密封する容器に入れられてもよい。また、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されていてもよく、この場合、使用直前に注射の場合の水のような無菌の液体担体が必要となる。即席の注射溶液および懸濁液は、前述のような無菌の粉末、細粒および錠剤によって調製できる。
【００４０】
特に前述したような成分に加えて、本発明の組成物は、その組成物のタイプを考慮して従来から使用されている他の試薬を含むことができると理解すべきである。例えば、経口投与に適用するものであれば甘味料、濃厚剤および香料などの試薬を含むことができる。
【００４１】
乳製品抽出物は、化学療法または放射線治療の前、治療中または治療後を含む、あらゆる適当な時に投与することができる。
【００４２】
乳製品抽出物は、既知の化学療法薬と組合せて使用することができる。投与量を固定して調合する場合、このような組合せ製剤は、乳製品抽出物を適当な薬量範囲で、また、薬学的な活性物質を試験済みの薬量範囲で使用する。本発明の組成物は、組合せ製剤とすることが不適当な場合、既知の化学療法薬の後に使用することができる。
【００４３】
乳製品抽出物が人体に投与される場合、毎日の投与量は、担当の医師が、患者の症状の重症度ばかりでなく、個々の患者の年齢、体重および反応によって通常異なる適量に決定することができる。一般に、本発明の配合物の適当な投与量は、一日当たり、受容者の体重１キログラム当たり１０ｍｇ〜１０ｇの範囲であり、好ましくは、一日当たり、受容者の体重１キログラム当たり１００ｍｇ〜１ｇの範囲である。しかし、投与量は、使用する乳製品抽出物の純度および組成によっても異なる。上記の投薬量は、ＧＦＥまたはＧＦＥ−２として計算したものであり、異なる活性または純度の製品が使用される場合は当業者によって変更することができる。
【００４４】
本発明を、以下の実施例によって更に完全に記述する。しかし、以下の記述は実例にすぎないことを理解するべきであり、上述した本発明の概念を限定するものと取るべきではない。
【００４５】
実施例の概論
驚くべきことに、オーストラリア特許第６４５５８９号のＧＦＥ−２と同様のチーズ乳漿から得た乳製品抽出物は、化学療法薬であるメトトレキセートをラットに注射することにより生じた腸内粘膜炎の症状を軽減することが、出願人によって見出された。
【００４６】
これと同じ乳製品抽出物が、化学療法薬である５−フルオロウラシルをハムスターに注射することにより生じた頬嚢内の口腔粘膜炎の症状を軽減することが、出願人によって見出された。
【００４７】
上記のことから、化学療法または放射線治療の患者に対するＧＦＥ−２を用いた治療は、粘膜の損傷、機能障害および感染に対する感受性を含む、腸の粘膜炎の症状を少なくとも部分的に緩和し、また、口および食道の粘膜炎の症状についても少なくとも部分的に緩和し、それによって回復を促進し、化学療法または放射線の高い投薬量（線量）に対する耐容性を増大させる。
【実施例１】
【００４８】
牛のチーズ乳漿から抽出された乳製品抽出物（ＧＦＥ−２）の経口投与が、メトトレキセートにより誘発された小腸粘膜炎を有するラットの小腸の陰窩および絨毛の損失を部分的に防止する。
【００４９】
この実施例においては、腸内粘膜炎の実験モデルとして、化学療法薬であるメトトレキセートをラットに多量に注射した。ラットにおいては、メトトレキセートは口または結腸粘膜ではなく小腸に損傷を与える（Vanderhoof JA,Park JHY,Mohammadpour H,Blackwood D，1990年 粘膜損傷の回復における食事由来の脂質の影響。Gastroenterology.98:1226-1231）。メトトレキセートを注射したラットに対する、牛のチーズ乳漿から精製した乳製品抽出物（オーストラリア特許第６４５５８９号に記載のＧＦＥ−２）の経口投与によって、乳製品抽出物が化学療法による小腸の損傷を改善できることが証明された。
【００５０】
代謝かご（metabolism cage）内で飼育された平均体重１４０ｇのオスのスプレーグドーリーラット（Sprague Dawley rat）に高炭水化物食を与えた。実験ラットには牛のチーズ乳漿から精製された乳製品抽出物を５日間与えたのに対し、対照ラットには乳製品抽出物を与えなかった。乳漿由来の乳製品抽出物（乳漿成長因子抽出物）は、オーストラリア特許第６４５４８９号にＧＦＥ−２を調製する方法として記載された方法によって調製した。ＧＦＥ−２を投与するラットには、３１．２ｇ／ｋｇのＧＦＥ−２を、これと同量のカゼインの代わりに含む改質食を与えた。更に、ＧＦＥ−２を与えるラットには実験期間中の３、４および５日目にＧＦＥ−２を胃からの摂取によって与え、ＧＦＥ−２の合計投与量が１日当たり平均して５１４ｍｇ／日となるようにした。対照ラットには改質していない餌を与え、同等の窒素摂取量を確保するために先と同一の実験計画書に従って実験期間中の３、４および５日目に同量の牛の血清アルブミンを与えた。
【００５１】
その開示全体を参考のためにここに取り入れるものである、Vanderhoofら（1990年）の実験計画書に従って、対照ラットの１グループとＧＦＥ−２を投与したラット（グループ当たり８匹）に、実験開始の１、２および３日目に２．５ｍｇ／ｋｇのメトトレキセートを皮下注射した。もう１つの対照グループ（「対飼養」（pair-fed））には偽のメトトレキセート注射を行い、メトトレキセートを注射した対照グループに対して対飼養した。
【００５２】
ラットは代謝かご内で５日間飼育し胃腸管を採取するために殺した。組織サンプルは近位の小腸（十二指腸および空腸）および遠位の小腸（回腸）から採取した。組織サンプルは、組織学的分析を行うためメタカーン（methacarn）に固定してパラフィンで包理して切断し、ヘマトキシリン−エオシンで着色した。分析はReadら（1992年）が記述した方法によって行った。その開示全体を参考のためにここに取り入れる（Read LC,Tomas FM,Howarth GS，Martin AA,Edson KJ,Gillespie CM,0wens PC,Ballard FJ，1992年 インスリン様成長因子−ＩおよびＮ末端を修飾したその同族体が、デキサメタゾン投与したラットにおける著しい腸の成長を誘発する。J Endocrinol.133:421-431）。
【００５３】
対飼養対照体に比べメトトレキセートを注射した対照グループは、空腸と小範囲の回腸において粘膜陰窩の損失が認められた。これは、図１（ａ）において、全粘膜の単位面積当たりに存在する損なわれていない陰窩面積によって説明され、メトトレキセートが化学療法に特有の（分裂した上皮細胞を含む）粘膜の陰窩領域の損失を引き起こすことが証明された。また、化学療法による小腸内の損傷に特有の症状である、小腸粘膜の機能を担う腸内絨毛の発育障害および損失がメトトレキセート注射によって生じた。このことは、図１（ｂ）において、メトトレキセートを与えていない対飼養グループに比べ、メトトレキセートを与えた対照体は腸内円周の単位長さ当たりの指状絨毛の表面長が減少していることによって証明された。
【００５４】
最初のメトトレキセート注射時から開始した５日間のＧＦＥ−２の経口投与が、小腸の両領域における粘膜陰窩および絨毛の損失を部分的に防止した（図１）。ＧＦＥ−２の効果は、回腸、およびメトトレキセートが誘発する損傷が更に重症である空腸における絨毛の表面長において、統計的に意義あるものである（ＡＮＯＶＡより、Ｐ＜０．０５）。実施例により、ＧＦＥ−２の経口投与が、化学療法による小腸内の損傷を部分的に防止または回復を促進することが示された。
【実施例２】
【００５５】
実施例１のラットの粘膜におけるスクラーゼ活性
実施例１に記載したのと同様の実験を行い、絨毛の上皮細胞表面に存在する酵素である粘膜スクラーゼの活性を測定するため、４ｃｍの長さの小腸を凍結した。スクラーゼは食事由来のスクロースの消化に必須であるので、腸管の単位長さ当たりのスクラーゼ活性は小腸の機能的能力の尺度となる（Readら、1992年）。
【００５６】
メトトレキセートを注射した対照グループまたは対飼養対照グループと比較して、メトトレキセートを注射したラットに対するＧＦＥ−２の５日間の経口投与は、回腸の単位長さ当たりのスクラーゼ活性を増大させた（Ｐ＜０．０５）（図２）。
【００５７】
この実施例により、ＧＦＥ−２は化学療法によって損傷を受けた小腸の機能的能力を増大させることが示された。
【実施例３】
【００５８】
ラットに対する５〜１２日間のＧＦＥ−２の経口投与は、腸の全域における細菌転移を低減する。
【００５９】
細菌の侵入に対する腸上皮のバリア−供給能は、粘膜炎の影響を受けた腸機能を評価するもう一つの尺度となる。
【００６０】
実施例３では、１４０ｇのオスのスプレーグドーリーラットにメトトレキセートを、実施例１と同様に３日間連続して注射した。メトトレキセートを注射したラットに実施例１と同様の実験計画に従ってＧＦＥ−２を経口投与した。一つのグループのラットは（実施例１と同様に）メトトレキセート注射の開始日から５日後に殺し、他のグループはＧＦＥ−２投与を合計で８または１２日間（１グループ当たり８匹）続けた。実施例１と同様のメトトレキセートを投与した対照ラットと対飼養対照ラットは、５、８および１２日後（１グループ当たり８匹）に殺した。
【００６１】
ラットは５、８または１２日目に刺絡するまで実施例１と同様に代謝かごの中で飼育した。腹部の皮膚を７０％のエタノール中に浸し、無菌条件下で腸を取り外した。目に見える全ての腸間膜リンパ節を予め計量しておいた無菌容器に入れた。サンプルを計量し、最終的な濃度が１００ｍｇ／ｍｌとなるまで脳心臓滲出液（brain heart infusion solution）を加えた。組織は無菌の強化ガラスグラインダーによって溶液中で均一化した。腸間膜リンパ節へのグラム陰性菌の転移を測定するため、４０または６０ｍｇの組織均等質をマックコンキー アガールII（MacConkey agar II）または血液寒天培地に塗布し、３５℃で４８時間有気培養した。腸のグラム陰性菌のコロニーは、ＡＰＩ ２０Ｅストリップを用いて同定し、数えた。発生率（検出可能な細菌転移を示す個体の割合）および組織のグラム当たりの細菌のコロニーの平均数を各々のグループについて算出した。
【００６２】
メトトレキセートを投与されていない対飼養対照動物は、腸全域における細菌転移の発生が認められなかった。メトトレキセート注射は腸壁を損ない、メトトレキセート注射した対照グループ（図３：「ＧＦＥ−２なし」）の全てのラットにおいて、５日目の腸間膜リンパ節から陽性菌が培養された。このグループにおいての発生率は続く７日間に渡って減少したものの、１２日目において６０％残存していた（図３ａ）。腸間膜リンパ節のグラム当たりのコロニー数は５日目に最大となり、その後発生率と並行して減少した（図３ｂ）。
【００６３】
ＧＦＥ−２の経口投与が結果として８および１２日目においての転移発生率を低下させ、１２日目のχ2試験によって、ＧＦＥ−２投与したラットとメトトレキセート注射した対照ラットとの間に統計的に意味のある程度の相違が認められた（Ｐ＜０．０５）。腸間膜リンパ節のグラム当たりのコロニー数もまた、ＧＦＥ−２投与したグループにおいて５および８日目の両日で低下した。
【００６４】
実施例により、乳製品抽出物の経口投与が、化学療法によって誘発された腸におけるバリアー機能の低下を部分的に防止することが示された。これより、化学療法に伴う感染および敗血症の発生率の減少が期待できる。
【実施例４】
【００６５】
乳製品抽出物は、培養中の腸細胞を化学療法薬であるメトトレキセートによる損傷から保護する。
【００６６】
この実施例において評価される乳製品抽出物は、オーストラリア特許第６４５５８９号に記載の方法で調製されたＧＦＥ−２、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ９５／００２３７の実施例２に記載の方法で一時的に酸性化したＧＦＥ−２、および、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ９５／００２３７の実施例５に記載の方法で、酸性条件下でのＧＦＥ−２の細孔制御限外濾過によって得られた透過留分である。
【００６７】
腸の上皮細胞（ＩＥＣ−６）を、プラスチック製９６−ウェルプレート（plastic 96-well plates）上に、１０％のウシ胎児血清を含むダルベッコ改質イーグルス最小限必須培養液（Dulbecco-Modified Eagle’s Minimal Essential Medium:ＤＭＥＭ）中の密度が２．５×１０4個／ｍｌとなるように仕込んだ。このプレートを、１日間、５％のＣＯ2存在下で加湿雰囲気中３７℃で培養した後、培地を取り替え、２日目まで培養を続けた。
【００６８】
３日目、各々のウェル（well）中の培地を、メトトレキセート溶液（ＤＭＥＭと１０％ウシ胎児血清との混合物中１０-6Ｍ）１００μｌと、ＧＦＥ−２、一時的に酸性化したＧＦＥ−２または透過したＧＦＥ−２をＤＭＥＭと１０％ウシ胎児血清との混合物中に様々な濃度で含む乳製品抽出物溶液１００μｌとの混合物で取り替えた。
【００６９】
細胞は１日間これらの溶液に接触させておいた。ウェルはＤＭＥＭで二度洗浄し、ＤＭＥＭと１０％ウシ胎児血清との混合物中で更に１日間培養した。
【００７０】
この新しい培地での１日間の細胞培養の後、細胞を洗浄、固定し、自動メチレンブルー法（MH OliverらJ.Cell Sci.92,513,1989年 その開示全体を参考のためにここに取り入れる。）を用いて細胞数を定量した。成長は、メトトレキセートに接触させていない細胞に対する細胞の生存率のパーセンテージで表す。結果を図４に示す。
【００７１】
実験によって、乳製品抽出物の３つの全ての例において、投与量に依存した腸内細胞の生存率の増加が示された。
【実施例５】
【００７２】
ハムスターの頬嚢への局部的なＧＦＥ−２の継続的投与は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）によって誘発された化学療法誘発粘膜炎を軽減する。
【００７３】
この実験は、オスのゴールデンシリアンハムスター（Golden Syrian hamster）における、化学療法によって誘発された口腔粘膜炎へ局部的に投与されたＧＦＥ−２の効果を調べるものである。この実験は、５−フルオロウラシルを投与された１０匹のハムスターの頬嚢にＧＦＥ−２を継続的に投与することを含む。
ハムスターは、５匹づつ、２つのグループに分けた。実験前の両グループの平均体重はほぼ同じであった。全てのハムスターに、１日目は９０ｍｇ／ｋｇ、３日目は６０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵを腹腔内注射した。１、２および３日目に、頬嚢を金ブラシで一方向に６回、それに直交する方向に６回引っ掻き、均一な傷を形成させた。
【００７４】
各グループに、賦形薬である市販の合嗽剤、または、タンパク濃度４０ｍｇ／ｍｌのＧＦＥ−２を０．３ｍｌ投与した。頬嚢への液体投与は１日に１分間、ハムスターがイソフルラン麻酔によって麻酔をかけられている間に行った。
【００７５】
５、７、８、１１、１３および１５日目に頬嚢を評価した。評価は、全体的な病変の重度や、傷、腫脹および瘢痕の程度を考慮した頬嚢の視覚評価（１から１０の等級をつける。）に基づいて行った。体重は０日目の値に対するパーセンテージで記録した。
【００７６】
賦形薬を投与したグループに比べ、ＧＦＥ−２を局部的に投与した個体は、全体的な視覚評価の値（図５）、潰瘍範囲の合計および体重の減少（図６）で測定される粘膜炎が軽減された。これらの効果は各々、ＧＦＥ−２投与を支持する各々のｔ検定により統計的に意義のあるものであった。
【００７７】
この実施例により、ＧＦＥ−２の局部的な投与が、口腔粘膜炎、およびそれに関連した体重の減少などの症状を軽減することが示された。
【００７８】
最後に、ここに概説した本発明の意図からはずれなければ、その他種々の変性および／または改変を行ってもよいと理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１ａ】メトトレキセートを注射したラットに対する５日間の乳製品抽出物（ＧＦＥ−２）の経口投与が、（ａ）空腸および回腸における粘膜の陰窩領域の損失。
【図１ｂ】メトトレキセートを注射したラットに対する５日間の乳製品抽出物（ＧＦＥ−２）の経口投与が、（ｂ）空腸および回腸における粘膜の絨毛長の損失を低減する。
【図２】メトトレキセートを注射したラットに対する５日間の乳製品抽出物（ＧＦＥ−２）の経口投与が、回腸における粘膜のスクラーゼ活性を増大させる。
【図３ａ】メトトレキセートを注射したラットに対する１２日間に及ぶ乳製品抽出物（ＧＦＥ−２）の経口投与が、（ａ）細菌の転移を示すラットの発生率。
【図３ｂ】メトトレキセートを注射したラットに対する１２日間に及ぶ乳製品抽出物（ＧＦＥ−２）の経口投与が、（ｂ）腸内リンパ節のグラム当たりの細菌のコロニー数を減少させる。
【図４】培地で培養した腸内細胞（ＩＥＣ−６）に、乳製品抽出物（ＧＦＥ−２、一時的に酸性化したＧＦＥ−２および透過したＧＦＥ−２）をメトトレキセートと同時に２４時間投与することが、投与量に依存した細胞の生存率の増大を実現する。
【図５】乳製品抽出物（ＧＦＥ−２）によるハムスターの頬嚢の毎日の治療が、５−フルオロウラシルによって生じた口腔粘膜炎の腫瘍の症状を軽減する。
【図６】乳製品抽出物（ＧＦＥ−２）によるハムスターの頬嚢の毎日の治療が、５−フルオロウラシルによって誘発された体重の減少を軽減する。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月15日(2008.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法薬の投与に起因する消化管内膜の損傷を防止するための組成物であって、
塩基性から中性の等電点を有する複数の細胞成長因子を含む乳製品抽出物を含み、
前記消化管内膜が前記化学療法薬により損傷されていない場合に用いられる組成物。
【請求項２】
乳製品抽出物が、チーズ乳漿抽出物、初乳乳漿抽出物、脱脂乳抽出物または酸カゼイン乳漿抽出物である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
乳製品抽出物が、乳製品を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけることによって調製された請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記複数の細胞成長因子は有蹄哺乳動物の乳製品から得られるものであり、その乳製品は、乳製品中に存在するカゼイン、αラクトアルブミンおよびβラクトグロブリンがマトリックスに吸収されない条件下で陽イオン交換マトリックスに接触させ、その後、吸収された成長因子の混合物を塩の水性の溶液で溶離したものである請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
損傷が、口および／または食道の内膜の損傷を含む請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
損傷が、粘膜の陰窩領域および／または粘膜の絨毛の長さの、少なくとも部分的な損失を含む請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
損傷が、消化管の全域における細菌の転移の増加を含む請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記消化管内膜が前記化学療法薬により損傷されていない場合が、前記化学療法薬の投与前であるか、または投与から５日未満である請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。