(57)【要約】      （修正有）【課題】ペルオキシダーゼ酵素活性をより高感度で測定可能な新規の検出用試薬組成物及び検出方法を提供すること、ペルオキシダーゼを簡便に採取及び測定可能な新規の保持器を提供すること、並びにペルオキシダーゼ酵素活性の測定により生体内の炎症の存在を判定すること、および食品等の抗酸化能の測定を課題とする。【解決手段】従来ペルオキシダーゼの検出に用いられているＤＡＢ及びＧｕａｉａｃｏｌを含む感度に優れたペルオキシダーゼ検出用試薬組成物、ペルオキシダーゼを検出するためのキット、及びペルオキシダーゼ活性を簡便かつ迅速に測定するために直接測定器に用いることができ口腔内で唾液を簡便に採取することも、あるいは固体や粘性物質を含む食品などでも容易に適応できる試料保持器の作製を行い、口腔乾燥症、歯周疾患、心筋梗塞、急性冠状動脈硬化症、慢性腎炎、若しくは糖尿病等の判定、および抗酸化活性の測定を行うために用いる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＡＢ（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）及びＧｕａｉａｃｏｌを有効成分として含むことを特徴とする、ペルオキシダーゼ検出用試薬組成物。
【請求項２】
ＤＡＢ（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）及びＧｕａｉａｃｏｌ｛ｏ（２）−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌ｝、加えてｄａｐｓｏｎｅ（４，４’−ｄｉａｍｉｎｏｄｉｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）を有効成分として含むことを特徴とする、ペルオキシダーゼ検出用試薬組成物。
【請求項３】
前記ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼ又はミエロペルオキシダーゼであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の検出用試薬組成物。
【請求項４】
体液又はそのペルオキシダーゼ濃縮画分に用いることを特徴とする、請求項１、２３いずれか１項に記載の検出用試薬組成物。
【請求項５】
体液が唾液又は血清である、請求項４に記載の検出用試薬組成物。
【請求項６】
ペルオキシダーゼを検出するためのキットであって、ＤＡＢを含む容器及びＧｕａｉａｃｏｌを含む容器、あるいは加えてｄａｐｓｏｎｅを含む容器を含む、ペルオキシダーゼ検出キット。
【請求項７】
前記ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼ又はミエロペルオキシダーゼであることを特徴とする、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
試料担持部である陰イオン交換フィルターと、吸液層を有し、前記試料担持部が試料と請求項１〜５のいずれか１項記載のペルオキシダーゼ検出試薬組成物を接触させるものである、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器。
【請求項９】
分光色差計に直接適用できることを特徴とする、請求項８に記載の試料保持器。
【請求項１０】
唾液を採取するために口腔内に適用することを特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項に記載の試料保持器。
【請求項１１】
試料を、請求項１〜５のいずれか１項記載のペルオキシダーゼ検出試薬組成物と混合させる工程を含む、ペルオキシダーゼ検出方法。
【請求項１２】
前記試料保持器の試料担持部に担持された試料を、請求項１〜５のいずれか１項記載のペルオキシダーゼ検出試薬組成物と接触させる工程を含む、ペルオキシダーゼ検出方法。
【請求項１３】
請求項１１又は１２いずれか1項に記載の検出方法を用いた、ヒト又は動物の生体内における炎症の存在を判定するための方法。
【請求項１４】
請求項１１又は１２いずれか1項に記載の検出方法を用いた、ヒト又は動物の生体内における酸化的ストレスの負荷を判定するための方法。
【請求項１５】
陰イオン交換フィルターと、吸液層を有した請求項８の試料保持器に既知ペルオキシダーゼを共存させ、請求項１のペルオキシダーゼ検出試薬組成物の接触によって発色させる抗酸化活性測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は唾液及び血清中のペルオキシダーゼ活性、特にミエロペルオキシダーゼ活性を特異的かつ高感度に測定する試薬組成物、並びに、これを用いて体内における炎症反応の存在を迅速かつ簡便に予知するための判定法、および食品や化粧品等の抗酸化活性の迅速測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペルオキシダーゼは、酸化的ストレスに対する防御機能と抗菌作用を有する酵素であり、唾液、血清等の体液で検出される（非特許文献１参照)。好中球、モノサイト、マクロファージはミエロペルオキシダーゼを特徴的に有する。
好中球では異物の認識に応答して細胞内のアズール顆粒に存在するミエロペルオキシダーゼ活性が上昇、ミエロペルオキシダーゼは細胞外間隙及びファゴソームに分泌される。ミエロペルオキシダーゼにより産生される次亜ハロゲン酸によって、抗菌作用が生じる（非特許文献２参照）。
好中球の増殖及び／又は活性化の結果、分泌されるミエロペルオキシダーゼばかりでなく、破壊された好中球から体液中に放出されるミエロペルオキシダーゼも増加すると考えられる。従って、体液中のミエロペルオキシダーゼの値は生体内における様々な炎症反応を反映し、例えば多発性硬化症、喘息、アテローム性動脈硬化症、癌、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、歯周疾患、及び冠状動脈疾患等多くの炎症性疾患に関係があるとされる。
実際に、ミエロペルオキシダーゼ活性は急性白血病の判定に使用できるほか、喘息等の疾患における炎症マーカーとしても使用されている（非特許文献２参照）。
【０００３】
このようなミエロペルオキシダーゼの活性上昇を、例えば動脈硬化症の発症、進展の指標として用いることができれば極めて有用である。すなわち、動脈硬化病巣を基盤とする急性冠症候群の発症においては、安定プラークに比べ不安定プラークで好中球の集積が多く見られ、また急性冠症候群患者の末梢血で好中球の活性化が亢進している。
一般に好中球はプロコアグラント活性を有し、血栓形成を誘導すると共にフリーラジカルや各種蛋白分解酵素を産生し、組織障害を惹起する。このことは、血清ミエロペルオキシダーゼ活性の測定により心筋梗塞、急性冠状動脈硬化症候群の予知が可能となることを示す。
従来、心筋梗塞、急性冠状動脈硬化症候群のスクリーニング法は血清中のＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ（ＣＤ４０Ｌ），  ＣＲＰ（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ），  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  （ＰＡＰＰ−Ａ），  ｔｒｏｐｏｎｉｎ等の検査を用いてきたが（非特許文献４参照）、これらの測定法は複雑でかつ時間的及び費用的な負担が大きく、多数の検体処理にも適していなかったため、ミエロペルオキシダーゼ活性の測定によりこれらの疾患／症候群を判定できる意義は大きい。
【０００４】
しかしながら、ミエロペルオキシダーゼ活性の測定には基質の特性や検出感度が要求される。従来、臨床的に使用されているＤＡＢ（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）は酵素反応産物が不溶性の為、溶液中での酵素活性を求めるには難点があった。
また、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体を用いた抗原抗体反応としての、ＥＬＩＳＡ法、あるいはｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅを用いた酵素活性比色法等が用いられてきたが、それぞれ測定感度や操作の煩雑さ、検出結果に至るまでの時間的、測定経費等に問題があり、安価で簡便さが求められる健康診断や疾患のスクリーニングへの応用には適さなかった。
【０００５】
唾液は交感神経と副交感神経により分泌調節されている。唾液には通常ラクトペルオキシダーゼが恒常的に出ているが、唾液中のペルオキシダーゼ活性を測定することにより、老化、疾病並びに酸化ストレスから健康を守る抗酸化能をチェックできる可能性がある（非特許文献５参照）。
一方、唾液中に増加したミエロペルオキシダーゼの活性測定によって、口腔内等の炎症反応を検出できる可能性がある。例えば、歯肉溝浸出液由来のミエロペルオキシダーゼは歯周疾患マーカーの一つとして挙げられている（非特許文献６参照)。しかしながら、綿棒、吐き出し法、スポンジ法等の唾液採取法では液体を取るために遠心分離等の前処理を施す煩雑な操作が必要となる。また、口腔乾燥症並びに歯周疾患のスクリーニング法には唾液分泌量や歯肉滲出溝液の分析があるが、測定法が煩雑で、かつ多数の検体処理には時間を要した。
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｈａｌｉｎ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  Ｐｕｂｉｓｈｅｄ  ｏｎ  ｌｉｎｅ  ｉｎ  Ａｕｇｕｓｔ  ２６，  ２００５
【非特許文献２】Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ  Ｓ．Ｊ．，  Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．，  ７７，  ５９８−６２５，  ２００５
【非特許文献３】Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  Ｓ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｈａｚｅｎ  Ｓ．  Ｌ．、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ２５，  １１０２−１１１１，  ２００５
【非特許文献４】Ｂａｌｌａｎｔｙｎｅ  Ｃ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｎａｍｂｉ  Ｖ．，  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．，  ６，  ２１−２９，  ２００５
【非特許文献５】Ａｂｒａｈａｍ  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ３４，  ３７７−３８４，  ２００３
【非特許文献６】Ｗｅｉ  Ｐ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ．，  ３９，  ２８７−２９３，  ２００４
【０００７】
今般、発明者らは、ペルオキシダーゼに対して感度の良い基質組成物、及び唾液や血清等の体液中のペルオキシダーゼを有効に担持し、その場でペルオキシダーゼ活性の定量を行うことのできる迅速かつ簡便な装置を考案し、安価かつ迅速に体内における炎症状態の存在を判定する方法に係る発明、および予め既知のペルオキシダーゼを存在させた抗酸化活性測定法を完成させるに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ペルオキシダーゼ酵素活性をより高感度で測定可能な新規の検出用試薬組成物及び検出方法を提供すること、ペルオキシダーゼを簡便に採取及び測定可能な新規の保持器を提供すること、並びにペルオキシダーゼ酵素活性の測定により生体内の炎症の存在を判定すること、さらにペルオキシダーゼの阻害活性を測定することによる抗酸化活性測定を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ペルオキシダーゼの検出を的確、簡便かつ迅速に行うための新規なペルオキシダーゼ検出用試薬組成物の作製、新規なキット、及び新規な試料保持器の作成に取り組んだ。すなわち、従来ペルオキシダーゼの検出に用いられているＤＡＢ及びＧｕａｉａｃｏｌを含む感度に優れたペルオキシダーゼ検出用試薬組成物、および加えてｄａｐｓｏｎｅによる唾液ラクトペルオキシダーゼ阻害剤の利用、ペルオキシダーゼを検出するためのキット、及びペルオキシダーゼ活性を簡便かつ迅速に測定するために直接測定器に用いることができ口腔内で唾液を簡便に採取することもできる試料保持器の作製を行い、口腔乾燥症、歯周疾患、心筋梗塞、急性冠状動脈硬化症、慢性腎炎、若しくは糖尿病等の判定を行うために用いた。
【００１０】
本発明は、ペルオキシダーゼの検出用試薬組成物、ペルオキシダーゼを検出するためのキット、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器、ペルオキシダーゼ検出方法、及びヒト又は動物の体内における炎症の存在を判定するための方法に関し、より具体的には、
〔１〕  ＤＡＢ及びＧｕａｉａｃｏｌを有効成分として含むことを特徴とする、ペルオキシダーゼ検出用試薬組成物、
〔２〕ＤＡＢ（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）及びＧｕａｉａｃｏｌ、加えてｄａｐｓｏｎｅ（４，４’−ｄｉａｍｉｎｏｄｉｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）を有効成分として含むことを特徴とする、ペルオキシダーゼ検出用試薬組成物、
〔３〕  前記ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼ又はミエロペルオキシダーゼであることを特徴とする、請求項１および２に記載の検出用試薬組成物、
〔４〕  体液又はそのペルオキシダーゼ濃縮画分に用いることを特徴とする、請求項１又は２，３いずれか１項に記載の検出用試薬組成物、
〔５〕  体液が唾液又は血清である、請求項４に記載の検出用試薬組成物、
〔６〕  ペルオキシダーゼを検出するためのキットであって、ＤＡＢを含む容器及びＧｕａｉａｃｏｌを含む容器を含む、あるいは加えてｄａｐｓｏｎｅを含有するペルオキシダーゼ検出キット、
〔７〕  前記ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼ又はミエロペルオキシダーゼであることを特徴とする、請求項６に記載のキット、
〔８〕  試料担持部である陰イオン交換フィルターと、吸液層を有し、前記試料担持部が試料と請求項１〜５のいずれか１項記載のペルオキシダーゼ検出試薬組成物を接触させるものである、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器、
〔９〕  分光色差計に直接適用できることを特徴とする、請求項８に記載の試料保持器、
〔１０〕  唾液を採取するために口腔内に適用することを特徴とする、請求項８又は９，１０いずれか１項に記載の試料保持器、
〔１１〕試料を、請求項１〜５のいずれか１項記載のペルオキシダーゼ検出試薬組成物と混合させることを含む、ペルオキシダーゼ検出方法、
〔１２〕前記試料保持器の試料担持部に担持された試料を、請求項１〜５のいずれか１項記載のペルオキシダーゼ検出試薬組成物と接触させることを含む、ペルオキシダーゼ検出方法、
〔１３〕請求項１１又は１２いずれか1項に記載の検出方法を用いた、ヒト又は動物の生体内における炎症の存在を判定するための方法、
〔１４〕請求項１１又は１２いずれか1項に記載の検出方法を用いた、ヒト又は動物の生体内における酸化的ストレスの負荷を判定するための方法、
〔１５〕陰イオン交換フィルターと、吸液層を有した請求項８の試料保持器に既知ペルオキシダーゼを共存させ、請求項１のペルオキシダーゼ検出試薬組成物の接触によって発色させる抗酸化活性測定キット、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
〔ペルオキシダーゼの高感度検出〕
本発明係るペルオキシダーゼ検出用試薬組成物及びペルオキシダーゼ検出キットによれば、ペルオキシダーゼ、特にミエロペルオキシダーゼ酵素活性を従来の方法より高感度で測定することが可能となる。
また、試料保持器上の発色度を、ペルオキシダーゼ活性に対応した本発明係るペルオキシダーゼ検出用試薬組成物が呈する発色度を示したカラータグ等と比較して、検体のペルオキシダーゼ活性を目視判定することも可能となる。
〔口腔内での唾液の採取〕
本発明に係るペルオキシダーゼ検出用試料保持器によれば、唾液ペルオキシダーゼ活性の測定がベッドサイドでいつでも、かつ簡単にすることができる。
〔ペルオキシダーゼ活性測定による炎症の判定〕
本発明に係るペルオキシダーゼ検出方法及び炎症の存在を判定するための方法によれば、唾液中のラクトペルオキシダーゼの活性測定により、動脈硬化や高血圧等の生活習慣病、酸化的ストレス、疲労、又は老化等を、唾液中のミエロペルオキシダーゼの活性測定により、歯周疾患を判定するスクリーニング法を提供することができる。また、血清ミエロペルオキシダーゼ活性の測定により、心筋梗塞、急性冠状動脈硬化症候群の予知が可能となり、これら症状への進行を予防するために薬剤等による適切な早期治療が行うことができ、さらには治療経過をモニターすることも可能となる。
〔歯周疾患の特異的判定〕
本発明のペルオキシダーゼ高感度活性測定にｄａｐｓｏｎｅを共存させた系を用いれば、歯周疾患の判定が、バックグラウンドを抑えてより明瞭に判定することが可能となる。
〔食品および化粧品等の抗酸化活性の判定〕
本発明のペルオキシダーゼ高感度活性測定に既知のペルオキシダーゼを共存させることで食品や化粧品などの抗酸化活性を測定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ペルオキシダーゼとは、一般に次式の反応を触媒する酵素である。
Ｈ２Ｏ２＋ＡＨ２→２Ｈ２Ｏ＋Ａ
ペルオキシダーゼは動物・植物・微生物界に広く分布しそれぞれの性質が異なる。例えば、西洋ワサビその他の植物由来でＧｕａｉａｃｏｌ又はアスコルビン酸の酸化に関与しプロトヘムを有する西洋ワサビペルオキシダーゼ、酵母由来でシトクロムｃの酸化に関与しプロトヘムを有するシトクロムｃペルオキシダーゼ、Ｃａｌｄａｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ由来でプロトヘムを有する塩化物ペルオキシダーゼ、ヒト又は動物の甲状腺に若しくは唾液由来でＩ−の酸化又はチロシンの生合成に関与しプロトヘム類似物質を有する唾液ラクトペルオキシダーゼ（ｓａｌｉｖａｒｙ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ヨウ化物ペルオキシダーゼ（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、牛乳に含まれヘムを有するラクトペルオキシダーゼ、白血球由来でヘムａ類似物質を有するミエロペルオキシダーゼ、赤血球由来でセレンを有するグルタチオンペルオキシダーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来でＦＡＤ、ＮＡＤＨの酸化に関与するＮＡＤ＋ペルオキシダーゼ等がある。
【００１３】
また、ミエロペルオキシダーゼには好中球，モノサイト又はマクロファージのミエロペルオキシダーゼ、好酸球に特異的な好酸球ミエロペルオキシダーゼ、及び巨核球・血小板に特徴的な血小板ミエロペルオキシダーゼの３種類がある。ミエロペルオキシダーゼは顆粒球系細胞又はモノサイト系細胞にのみ陽性を示し、リンパ系細胞、赤芽球系細胞、若しくは血小板系細胞に対して陰性を示すことから、顆粒球系のｇｏｌｄｅｎ  ｍａｒｋｅｒとして用いられている。すなわち、ヒト又は動物の体液のペルオキシダーゼ活性を測定することにより、炎症のみならず、酸化的ストレス、又は疲労若しくは老化に対する負荷の度合いを判定し得る。
【００１４】
本発明者らによって、ＤＡＢ及びＧｕａｉａｃｏｌを含む組成物がペルオキシダーゼ、特にミエロペルオキシダーゼに対して高感度を示すことが判明した。従って、本発明の前記組成物、キット、及び／又は検出方法を用いて体液のペルオキシダーゼ活性を測ることによって炎症の存在を判定することができる。また、本発明の試料保持器を用いることによって試料担持部である陰イオン交換フィルターにペルオキシダーゼを含む試料のみを保持することができることから、前記試料保持器を分光色差計に直接適用することにより簡便かつ迅速にペルオキシダーゼ活性の測定が可能となり、これによってヒト又は動物の体内における炎症の存在を簡便かつ迅速に判定することができる。また、前記試料保持器を唾液採取に用いる場合は口腔内で採取することも可能であることから、ベッドサイドでいつでも、迅速かつ簡便に炎症の存在を判定することができる。
【００１５】
本発明において「ＤＡＢ」とは、３，３’−ジアミノベンジジン（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、若しくはその誘導体、又はそれらの塩をいい、「Ｇｕａｉａｃｏｌ」とは、オルト（２−）メトキシフェノール｛ｏ（２）−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌ｝若しくはその誘導体、又はそれらの塩をいう。「ｄａｐｓｏｎｅ」とは、４，４’−ジアミノジフェニールスルフォン（４，４’−ｄｉａｍｉｎｏｄｉｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）。
本発明で用いるＤＡＢ及びＧｕａｉａｃｏｌは、水素供与体として用いるものであればよい。ｄａｐｓｏｎｅは、唾液ラクトペルオキシダーゼ（ｓａｌｉｖａｒｙ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を特異的に阻害するが、好中球ミエロペルオキシダーゼなど炎症に関連するペルオキシダーゼの活性は、阻害しない化合物である。
本発明で用いる「陰イオン交換フィルター」は、陰イオンを吸着することのできる膜素材であり、タンパク質であるペルオキシダーゼ酵素をその表面に電荷によって吸着することができ、一方、水や糖類、その他の水溶性物質は、膜を通過して吸着層へ移行させる物である。その結果、酵素タンパク質は、陰イオン交換フィルター上に濃縮され測定感度を向上させる要因となる。
【００１６】
本発明の検出試薬組成物は、ＤＡＢとＧｕａｉａｃｏｌを有効成分として含むことを特徴とし、それらの組成比は特に限定されない。このうち混合比が特に限定されないＤＡＢとＧｕａｉａｃｏｌの混合物が好ましいが、さらに好ましくはＤＡＢとＧｕａｉａｃｏｌのモル比が０．３ｍｍｏｌ〜５０ｍｍｏｌ：１７６ｍｍｏｌであり、最も好ましくは、３．０ｍｍｏｌ〜４．８ｍｍｏｌ：１７６ｍｍｏｌである。
【００１７】
本発明の検出試薬組成物は、ｐＨ５．０〜９．０となるように緩衝液を調製して使用するのが好ましい。特に、ＤＡＢとＧｕａｉａｃｏｌの混合物からなる前記検出試薬組成物を使用する場合には、ｐＨ７．０から７．５程度に調整するのが最も好ましい。
【００１８】
本発明の検出用試薬組成物を用いるにあたっては、ペルオキシダーゼ活性の検出反応直前にＧｕａｉａｃｏｌをトリス塩酸緩衝液に溶解せしめ、これに過酸化水素水を添加することで得られる溶液とＤＡＢを混合して調製することが好ましい。事前に調製又は混合することも可能であるが、混合の後、室温下では４時間以内に使用することが好ましい。
【００１９】
本発明の検出用試薬組成物は、マイクロプレート上での発色基質としての利用も可能である。マイクロプレートや濾紙にペルオキダーゼを固相化し、若しくは担持し、これに本発明の検出用試薬組成物を滴下すると、ＤＡＢのみをペルオキシダーゼ基質として含んでなる検出試薬や、Ｇｕａｉａｃｏｌのみをペルオキシダーゼ基質として含んでなる検出試薬にといった従来のペルオキシダーゼ検出試薬、若しくは基質に比べて５倍以上の発色度を実現することができる。
また、濾紙に陰イオン交換クロマトグラフィー濾紙を用いた場合、ペルオキシダーゼを担持した陰イオン交換クロマトグラフィー濾紙片に、本発明の検出用試薬組成物を滴下した場合、ペルオキシダーゼ反応の結果による発色度は、約３０分で最高値に達し、その後減退することはない。これらは、本発明の検出用試薬組成物が従来の検出用試薬よりも高感度かつ迅速な反応性を有することを示すものである。
【００２０】
このように本発明の検出用試薬組成物を用いれば、従来技術に比べ高感度なペルオキシダーゼ活性測定を実施することができる。また、分析対象物である試料を担持した試料保持器等（本発明の試料保持器に加え、マイクロプレートや濾紙から構成され、分析対象物である試料が固定化されたものを含む）に本発明の検出用試薬組成物を接触させることで、簡便かつ迅速にペルオキシダーゼの酵素反応を行い、その活性を測定することでペルオキシダーゼを検出する方法が可能となる。
【００２１】
なお、本発明において「接触」とは、触れ合うことをいうが、例えば、本発明においては、試料保持器等に担持された試料と本発明の検出試薬組成物が混合され、ペルオキシダーゼ反応が引き起こされる状態になることが含まれる。
【００２２】
本発明において「ミエロペルオキシダーゼ」とは、好中球ミエロペルオキシダーゼ、モノサイトミエロペルオキシダーゼ、マクロファージミエロペルオキシダーゼ、若しくは好酸球ミエロペルオキシダーゼをいい、すなわちこれらの一部又は全部をいう。
また、本発明において「ペルオキシダーゼ濃縮画分」とは、ペルオキシダーゼが周知の方法により濃縮された状態をいい、液体か固体かを問わない。また、周知の方法とは、ペルオキシダーゼを濃縮することができればその方法は問わないが、少なくともペルオキシダーゼの変性を伴う方法を除き、例えば、遠心による方法、塩析法、液体クロマトグラフィーを用いる方法、透析法、凍結乾燥法、限外濾過法、若しくはエバポレートによる方法等があげられる。
【００２３】
また、本発明において「体液」とは、ヒト又は動物の生体内に存在する液体をいい、体
液を含む水溶液等も含まれる。好ましくは細胞外液、血液又はリンパ液をいうが、最も好ましくは唾液又は血清である。
なお、本発明において「血清」とは、血液中から血球とフィブリノーゲン（I因子）、プロトロンビン（II因子）、V因子、及びVIII因子等の血液凝固因子を取り除いたものをいうが、血球及び前記血液凝固因子の一部を血液から除いたもの、及び血漿を含む。また、「血漿」とは、血液中から血球を取り除いたものをいう。
【００２４】
本発明のキットは、ＤＡＢを含む容器とＧｕａｉａｃｏｌを含む容器とを一揃いにしたペルオキシダーゼ検出用キットとして活用することができる。これにペルオキダーゼ検出用試料保持器を加え、本発明のペルオキシダーゼ検出試薬組成物の検出用途に供すれば、従来技術に比べ高感度かつ簡便なペルオキシダーゼ活性の測定が可能であり、利用者の便益を図ることもできる。
また、必要に応じ、陽性コントロール液としてペルオキシダーゼ溶液又はその粉末を含んでいてもよい。
【００２５】
本発明において「試料担持部」とは、試料を担持し前記検出対象組成物と接触する部分をいい、「試料」とは、分析対象であり、体液又はペルオキシダーゼ濃縮画分の全部又は一部も試料に含まれる。
また、「陰イオン交換フィルター」とは、陰イオン交換能を有し液体を透過することができるものであれば、担体の種類やイオン交換基の種類は、特に限定されない。
また「吸液層」とは、吸湿能があれば特に限定されず、漏液するか否かも問わないが、好ましくは保水能を有し、さらに好ましくは試料に含まれる水分を吸収保持するものであり、最も好ましくは濾紙である。
【００２６】
本発明のペルオキシダーゼ検出用試料保持器は、試料担持部である陰イオン交換フィルター及び吸液層の多重構造を有し、試料が接触する側に陰イオン交換フィルターがあり、他方に吸液層があるものであれば特に限定されないが、好ましくは、試料中の水分を吸収する吸水層を陰イオン交換フィルターである試料担持部に固定してなるものであり、最も好ましくは２つの陰イオン交換フィルターの間に吸液層を挟む構造であるが、陰イオン交換フィルターが１枚でも機能性は変わらない。
なお、「固定」とは、検査対象から試料を担持させるステップ、及び試料を担持した前記多重構造を検出試薬組成物と接触させるステップにおいて前記多重構造が維持されていれば特に限定されず、前記固定のために用いる材料、形状、若しくは構造も特に限定されないが、例えば、前記多重構造に枠体を設ける等が挙げられる。
【００２７】
さらに、本発明のペルオキシダーゼ検出用試料保持器は、口腔内に直接適用することが可能であり、口腔内から試料である唾液を採取することができるものであること、直接、分光色差計等の分析機器に適用可能な仕様であることが好ましい。
すなわち「適用可能な仕様」とは、好ましくは試料担持部の形状が略円形であること、及び口腔内で唾液の採取でき、かつ分光色差計に直接適用できる大きさであることをいい、試料担持部の形状が円形であること、試料担持部の外径が３０ｍｍ以下であること、前記多重層を構成する陰イオン交換フィルターの厚さが０．０１ｍｍ〜２．０ｍｍであること、及び前記多重層を構成する吸液層の厚さが０．１ｍｍ〜２０．０ｍｍであることがより好ましく、試料担持部の形状が円形であること、試料担持部の外径が２５．２ｍｍ以下であること、前記多重層を構成する陰イオン交換フィルターの厚さが０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍであること、及び前記多重層を構成する吸液層の厚さが０．４ｍｍ〜２．０ｍｍであることが最も好ましい。
【００２８】
本発明のペルオキシダーゼ検出用試料保持器は、唾液量が少ない場合でも適用可能であることから、本発明のペルオキシダーゼ検出用試料保持器を用いることにより、唾液の量にかかわらず、唾液中のラクトペルオキシダーゼやミエロペルオキシダーゼの活性の測定が可能である。
【００２９】
また、本発明のペルオキシダーゼ検出用試料保持器には、口腔内における唾液採取のステップにおいて簡便かつ迅速に行うべく、支持棒を設けてもよいが、前記支持棒を設けるために用いる材料、形状、若しくは構造も特に限定されない。例えば、試料担持部に直接取り付けるものや、前記多重構造を固定するための枠体を兼ねるもの等がある。
【００３０】
本発明のペルオキシダーゼ検出用試料保持器に分析対象物である試料を担持させ、本発明にかかる検出試薬組成物を適用することで、ペルオキシダーゼ活性を測定するための酵素反応の反応器としての特徴を有する。
ペルオキシダーゼ検出用試料保持器上で検出用試薬組成物を適用すると、ペルオキシダーゼ活性により試料担持部が発色する。この発色の度合がペルオキシダーゼ活性の高低を指し示すが、この発色度は分光色差計等の分析機器により特定波長の吸光度を測定することで数値化することができる。
【００３１】
本発明におけるペルオキシダーゼの検出工程は、検査対象をペルオキシダーゼ検出用試料保持器の陰イオン交換フィルターに接触させるステップ、試料にＤＡＢを接触させるステップ、及び試料にＧｕａｉａｃｏｌを接触させるステップからなり、前記順により行われることが好ましい。
【００３２】
また、本発明において「炎症」とは、生体内において白血球が活性化した状態をいい、例えば、心筋梗塞、多発性硬化症、動脈硬化症（例えば、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈硬化症候群等）、冠状動脈疾患、癌、高血圧性腎症、慢性腎炎、腎硬化症、腎嚢胞、ＡＮＣＡ腎炎、嚢胞性線維症、糖尿病、膠原病、狭心症、脳出血、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、うっ血性心不全、若しくは喘息、及びこれらに伴うもの等をいう。また、前記症状による臓器機能の低下の他、口腔乾燥症、若しくは歯周疾患も含まれる。
【００３３】
本発明のペルオキシダーゼ検出方法を用いることにより、ヒト又は動物の生体内における炎症の存在を判定することが可能であるが、例えば、唾液中のラクトペルオキシダーゼの活性測定による動脈硬化や高血圧等の生活習慣病、ストレス、若しくは老化等の判定や、唾液中のミエロペルオキシダーゼの活性測定による歯周疾患の判定が可能となる。
【実施例】
【００３４】
次に本発明の実施例について説明する。本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【００３５】
実施例１：検出用試薬組成物
本検出用試薬組成物は、ＤＡＢ（同仁化学研究所製）及びＧｕａｉａｃｏｌ（和光純薬工業社製）より下記のように調製した。すなわち、Ｇｕａｉａｃｏｌ  ３００μｌを０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１４ｍｌに溶解せしめ、これに０．３３％過酸化水素水１３４μｌを添加することで得られる溶液（試薬Ａ）を調製した。ここで使用する過酸化水素水は、３４．５〜３６．５%のＨ２Ｏ２濃度を有する市販の過酸化水素水を希釈したものである。ＤＡＢ５ｍｇに試薬Ａ  ４ｍｌを添加して、混和したものをペルオキシダーゼ検出用試薬（試薬Ｘ＋Ａ）として、ペルオキシダーゼ基質の用途に供した。
【００３６】
実施例２：ペルオキシダーゼ活性比較
マイクロプレートの各ウェルに、緩衝液として０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１５０μｌを加え、これに唾液２０μｌと基質溶液３０μｌを混合し、唾液中に含まれるペルオキシダーゼ活性を測定した。唾液は、５０，１００，２００μｌの健常者唾液（２０〜２５歳の男女の混合唾液  男ｎ＝３６；  女ｎ＝２０）を用いた。基質溶液は、試薬Ｘ＋Ａ、試薬Ａ単独、及び試薬Ｘ｛０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１４ｍｌにＤＡＢ１７．５ｍｇを溶解し、これに０．３３％過酸化水素水１３４μｌを添加して得られる溶液｝単独の３種を用いて、これらのペルオキシダーゼ活性の比較を行った。唾液と基質溶液を混合した時点を反応開始とし、反応時間は６０分間行った。反応開始から１分、３分、５分、以降５分間ごとに４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。反応は室温下で実施した。
その結果を図１に示す。図１より試薬Ｘ＋Ａの場合、反応開始約３０分後に吸光度が最大に達し（約０．５）、以後ほぼ一定の値を示しているのに対し、試薬Ａにおいては値が反応開始１分で約０．２の吸光度を示した。以後、吸光度は低下した。試薬Ｘにおいては、反応開始後、経時的に吸光度は上昇し、反応開始約３０分後には０．１強の吸光度を示し、反応終了時には約０．２にまで上昇したが、試薬Ｘ＋Ａほどの反応は認められなかった。すなわち、反応開始約３０分後では、試薬Ｘ＋Ａは、試薬Ｘの約５倍、試薬Ａの約８倍の吸光度を示した。以上から、試薬Ｘ＋Ａの吸光度は、他の２種の基質溶液に比べ顕著値であることが示された。
【００３７】
実施例３：ペルオキシダーゼ検出用試料保持器
吸水層を形成するクロマトグラフィー用濾紙（厚さ０．７ｍｍ；  Ａｄｖａｎｔｅｃ，  Ｎｏ．５２６;  Ｔｏｙｏ  Ｒｏｓｈｉ  Ｋａｉｓｈａ，  Ｌｔｄ．，  Ｊａｐａｎ)と試料担持部を形成する陰イオン交換クロマトグラフィー用濾紙（厚さ０．２ｍｍ;  Ｗｈａｔｍａｎ  ＤＥ８１;  Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔ．  Ｌｔｄ．，  Ｅｎｇｌａｎｄ）を図２のようにサンドイッチ状に組み合わせ、アルミニウムの外枠でこれらを固定した。また、本実施例は口腔内に適用する際に本保持器の出し入れを容易にする支持棒を付加したものを開示している（図３）。支持棒の材質は製造費を安価にするため爪楊枝を用いた。
本保持器の吸水層における水分保持能力は最大で４００μｌである。本保持器で唾液を採取する際、これを直接口腔内に適用し、歯と頬の間に挟みこみ、軽く口を閉じて２分間放置することで行った（図４）。唾液採取は、飲食及び歯磨き１時間後に行った。採取時は自然体で行った。本検出用試料保持器は予め蒸気滅菌（１２０℃、２０分）で滅菌して用いた。口腔内に適用する代わりに、必要に応じて、本保持器に唾液や血清等の試料を直接滴下し、そのままペルオキシダーゼ活性測定に供した。
【００３８】
実施例４：ペルオキシダーゼ検出用試料保持器によるペルオキシダーゼ検出用試薬の発色度比較
実施例３に記載のペルオキシダーゼ検出用試料保持器にヒト唾液１００μｌを滴下して、これに基質溶液１００μｌを滴下し反応させ、直接、分光色差計に用いることにより唾液中に含まれるペルオキシダーゼ活性を測定した。唾液は実施例２で用いたものと同じである。基質溶液は、試薬Ｘ＋Ａ、試薬Ａ、及び試薬Ｘを用いて、これらのペルオキシダーゼ活性の比較を行った。ペルオキシダーゼ検出用試料保持器に基質溶液を添加した時点を反応開始とし、反応時間は３０分間行った。反応は室温下で実施した。反応後、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器上の発色度をＮＦ３３３簡易型分光色差計（日本電色工業株式会社）を用いて４６０ｎｍで測定した。
その結果を、図５に示す。試薬Ｘ＋Ａにおいて、他の２種の基質溶液と比べ顕著な発色が認められ、その値は試薬Ａの１０倍、試薬Ｘの５．７倍であった。すなわち、試薬Ｘ＋Ａは、実施例３に記載のペルオキシダーゼ検出用試料保持器と組み合わせることで、より高感度かつ迅速なペルオキシダーゼ活性の測定が可能であることを示している。
前記の反応後であって分光色差計で測定を行ったペルオキシダーゼ検出用試料保持器における発色の様子を、図５−Ａに示した。分光色差計で最も高い吸光度を示した試薬Ｘ＋Ａを滴下したペルオキシダーゼ検出用試料保持器において、最も濃く発色している様子が目視でも確認することができた。すなわち、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器上における発色の濃淡から、ペルオキシダーゼ活性を目視で判定することもできた。
【００３９】
実施例５：ペルオキシダーゼ検出用試料保持器における試料担持部の材質によるペルオキシダーゼ活性比較
ペルオキシダーゼ検出用試料保持器における試料担持部の材質を変えて、それらのペルオキシダーゼ活性の発色度の比較を行った。試料担持部には、陰イオン交換クロマトグラフィー用濾紙（ＤＥ８１；  Ｗｈａｔｍａｎ製、厚さ０．２ｍｍ）、陽イオン交換クロマトグラフィー用濾紙（Ｐ８１；  Ｗｈａｔｍａｎ製、厚さ０．２３ｍｍ）、クロマトグラフィー用濾紙（ＴＯＹＯ：  Ａｄｖａｎｔｅｃ  Ｎｏ５２６  Ｔｏｙｏ  Ｒｏｓｈｉ製、厚さ０．７ｍｍ）の３種類を用いた。これらを試料担持部に用いて試料保持器を作製した。それぞれの試料保持器にヒト唾液又はヒト血清を１００μｌ滴下し、滴下２分後に発色基質としてさらに試薬Ｘ＋Ａ  １００μｌを滴下して、３０分間室温下で静置することで反応を行った。唾液は実施例２で用いたものと同じである。反応後は、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器上の発色度をＮＦ３３３簡易型分光色差計（日本電色工業株式会社）を用いて４６０ｎｍで測定した。
その結果を図６に示した。唾液、血清共に、試料担持部に陰イオン交換クロマトグラフィー濾紙（ＤＥ８１）を用いたものが、最も高い発色度を示した。特に陽イオン交換クロマトグラフィー濾紙（Ｐ８１）と比べて約４倍、クロマトグラフィー濾紙（ＴＯＹＯ）と比べて約１．６倍の発色度を示したことから、試料保持器に用いる試料担持部には陰イオン交換クロマトグラフィー濾紙が好ましいことが示された。
前記の反応後であって分光色差計で測定を行ったペルオキシダーゼ検出用試料保持器における発色の様子を、図６−Ａと図６−Ｂにそれぞれ示した。図６−Ａは試料として唾液を滴下したもの、図６−Ｂは試料として血清を滴下したものである。それぞれの図で示したとおり、分光色差計で最も高い吸光度を示した陰イオン交換クロマトグラフィーろ紙（ＤＥ８１）を用いたペルオキシダーゼ検出用試料保持器において、最も濃く発色している様子が目視でも確認することができた。すなわち、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器上における発色の濃淡から、ペルオキシダーゼ活性を目視で判定することもできた。
【００４０】
実施例６：市販の酵素を用いた活性検討
実施例３に記載のペルオキシダーゼ検出用試料保持器にミエロペルオキシダーゼ溶液１００μｌを滴下し、これに基質溶液１００μｌを滴下し、反応させ、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器上でペルオキシダーゼ活性を測定した。ミエロペルオキシダーゼ溶液は、ヒトミエロペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を、ｂｏｖｉｎｅ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を１０ｍｇ／ｍｌ含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．０）に０，１０，２０，５０，１００ｍＵそれぞれ溶解して用いた。基質溶液として、試薬Ｘ＋Ａ、試薬Ａ、及び試薬Ｘを用い、比較を行った。反応条件及び測定方法は実施例４に従った。
その結果を、図７に示す。この結果から、試薬Ｘ＋Ａが試薬Ｘ又は試薬Ａに比してミエロペルオキシダーゼを高感度に検出することが示された。
【００４１】
実施例７：健常者並びに患者より採取した唾液量とペルオキシダーゼ活性の関係
実施例３に記載のペルオキシダーゼ検出用試料保持器及び方法を用いて、健常者と患者より唾液を採取した。健常者の唾液は実施例２で用いたものと同じである。採取した唾液量を電子天秤で測定した後、これに試薬Ｘ＋Ａ  １００μｌを滴下し、唾液中のペルオキシダーゼ活性を測定した。
その結果を図８に示す。唾液分泌量とペルオキシダーゼ活性に正の相関性が認められた。従って、ペルオキシダーゼ活性を測定することで唾液分泌量を把握することができた。同時に、高血圧患者並びに透析患者から採取した唾液量とペルオキシダーゼ活性を健常者と比較した。その結果を図９、及び図１０に示す。図９より高血圧患者と透析患者の唾液量は、健常者と比べて減少していることが示された。ペルオキシダーゼ活性を比較した場合、図１０より、唾液分泌量と同様に、患者から採取した唾液中のペルオキシダーゼ活性は健常者の活性より低いことが示された。従って、ペルオキシダーゼ活性の測定により、各種疾患により併発された口腔乾燥症をスクリーニングすることができる。
【００４２】
実施例８：歯周疾患判定
歯周疾患の疑いがある被験者から採取した唾液１００μｌを試料担持部に滴下し、これに試薬Ｘ＋Ａを発色基質として１００μｌ滴下し。唾液中のペルオキシダーゼ活性を測定した。反応条件及び測定方法は実施例４に従った。被験者においては、ポケット探針で歯肉のポケット（プロービングデプス）の深さを測り、歯周疾患の判定を行った。４ｍｍ以上のポケットを有する歯の数を数え、その割合を計算した。
その結果を表１に示す。歯周疾患の判定で１００％の数値を示した被験者Ｄにおいて、ペルオキシダーゼ活性は他の被験者と比べて顕著に高いことが示された。従って、唾液中のペルオキシダーゼ活性の測定により歯周疾患をスクリーニングすることができた。
【００４３】
表１  ペルオキシダーゼ活性による歯周疾患のスクリーニング
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
被験者      歯周疾患判定＊1（％）    ペルオキシダーゼ活性＊2
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
Ａ              0                          0.231
Ｂ              0                          0.262
Ｃ            41.3                         0.308
Ｄ           100                           0.703
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
歯周疾患判定＊1：２０本以上の歯がある人を対象にして、ポケット探針で４ｍｍ以上のポケット（プルービングデプス）を有する歯の割合（％）
ペルオキシダーゼ活性＊2：Ａ４６０／１００μｌ／３０ｍｉｎ
【００４４】
実施例９：唾液ラクトペルオキシダーゼを特異的に阻害したバックグラウンドの低い歯周疾患判定キット
唾液には通常ラクトペルオキシダーゼが恒常的に出ているが、試薬Ｘ＋Ａは、ｄａｐｓｏｎｅを共存させることによって唾液ラクトペルオキシダーゼを特異的に阻害した発色のバックグラウンドの低い歯周疾患判定を行うことができた。
唾液中には、歯周病疾患から起因するミエロペルオキシダーゼと唾液そのものに起因する唾液ラクトペルオキシダーゼの両方が含まれている。両酵素には相違点があり、唾液ラクトペルオキシダーゼは、ｄａｐｓｏｎｅ（４，４’−ｄｉａｍｉｎｏｄｉｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）の存在で特異的に活性が阻害された。従って、ｄａｐｓｏｎｅを発色液に混合して、歯周疾患の判定反応を行えば、バックグラウンド値が少ない発色を行うことができる。
健康な学生の唾液を採取した。それにｄａｐｓｏｎｅを０から２．２ｍＭを種々の濃度で添加して、発色性を調べた。その結果、ｄａｐｓｏｎｅを共存させると発色は急激に減少し、０．５〜１ｍＭ添加で、ほぼ一定位置にまで低下した（図１１、黒丸で表示）。一方、ミエロペルオキシダーゼ（バイオデザイン・インターナショナル社製）を加えて混合液を作成し、それを試料採取器１００μｌずつ滴下したサンプルでは、ｄａｐｓｏｎｅ濃度を高くしても発色の減少は起こらなかった（図１１、白丸で表示）。
この結果から、ｄａｐｓｏｎｅは、唾液ラクトペルオキシダーゼの活性を特異的に阻害しており、ｄａｐｓｏｎｅをペルオキシダーゼ検出用試薬（試薬Ｘ＋Ａ）に共存させておけば、健康な唾液にも存在する唾液ラクトペルオキシダーゼ活性を特異的に阻害して、バックグラウンドの低い状態で歯周疾患から漏出するミエロペルオキシダーゼ活性を測定することができる。このことは相対感度の向上であり、色で識別するキットとしては、効果的なことである。
【００４５】
３種のペルオキシダーゼ活性に対するｄａｐｓｏｎｅの影響を調べた（表１）。健康な唾液では、ペルオキシダーゼ活性は１０％以下にまで減少したが、ミエロペルオキシダーゼ活性は、ほとんど阻害を受けず、好中球ペルオキシダーゼ活性は、やや阻害を受けたにすぎなかった。
表２  ３種のペルオキシダーゼに対するｄａｐｓｏｎｅの影響
―――――――――――――――――――――――――――――――――
ペルオキシダーゼ                    ペルオキシダーゼ活性（％）  ＊
―――――――――――――――――――――――――――――――――
刺繍疾患のない健康人の唾液                ９．８＋  ２．６
ミエロペルオキシダーゼ                  ９５．５＋  ７．１
好中球ペルオキシダーゼ                  ７８．９＋  １１．２
―――――――――――――――――――――――――――――――――
使用したペルオキシダーゼ試料は、それぞれタンパク量として、唾液中タンパク１７０μｇ，ミエロペルオキシダーゼ４０ｎｇ、および好中球ペルオキシダーゼ２２ｎｇ。
＊：ｄａｐｓｏｎｅ無添加区の活性を１００％として計算した。
【００４６】
歯周疾患のない健常者の唾液に試薬のミエロペルオキシダーゼを種々の濃度で溶解したのち、１００μｌずつ試料保持器にに吸い込ませた。試料保持器を発色するために、反応液には、ｄａｐｓｏｎｅを１ｍＭ共存させたＤＡＢとＧｕａｉａｃｏｌを混合した試薬で発色させた。その結果、ミエロペルオキシダーゼの濃度依存的に発色が濃くなって行くことが観察された（図１２）。発色の程度によってミエオペルオキシダーゼ活性を判定できることがわかった。
【００４７】
ペルオキシダーゼ検出用試薬（試薬Ｘ＋Ａ）にｄａｐｓｏｎｅ１ｍＭを加えた発色試薬で発色させ歯周疾患への有用性を調べた。歯周疾患者２０人から採取した唾液のペルオキシダーゼ活性をｄａｐｓｏｎｅ入り発色薬で発色し発色度を測定して、歯周疾患ポケットの大きさの関係をプロットした（図１３）。バックグラウンドの発色は、ほとんど押さえられており、しかも歯周ポケットの大きさと良い相同性を示した（ｒ＝０．６９８、ｐ＜０．００１）。
【００４８】
実施例１０：グルタチオンペルオキシダーゼ試験
実施例３に記載のペルオキシダーゼ検出用試料保持器にグルタチオンペルオキシダーゼ（ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ；  Ｓｉｇｍａ）又はミエロペルオキシダーゼ（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｓ；  Ｓｉｇｍａ）溶液１００μｌを滴下し、これに試薬Ｘ＋Ａ  １００μｌを滴下し、反応させ、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器上でペルオキシダーゼ活性を測定した。グルタチオンペルオキシダーゼ溶液は、ヒトグルタチオンペルオキシダーゼを、ｂｏｖｉｎｅ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を１０ｍｇ／ｍｌ含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に２０，２００，２０００ｍＵそれぞれ溶解して用いた。ヒトミエロペルオキシダーゼは、ｂｏｖｉｎｅ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を１０ｍｇ／ｍｌ含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に２００ｍＵを溶解して用いた。反応条件及び測定方法は実施例４に従った。
その結果を、表３に示す。この結果から、試薬Ｘ＋Ａはグルタチオンペルオキシダーゼに反応せず、ミエロペルオキシダーゼを高感度に検出することが示された。
【００４９】
表３  試薬X＋Aに対するグルタチオンペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼの基質特異性
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
Ａ４６０
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
ミエロペルオキシダーゼ      グルタチオンペルオキシダーゼ
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
１０ｍＵ            0.051                        ND＊
２０ｍＵ            0.077                      -0.0038
５０ｍＵ            0.209                        ND
１００ｍＵ          0.240                        ND
２００ｍＵ           ND                        -0.000
２０００ｍＵ         ND                        -0.0035
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
ND＊：測定せず
【００５０】
実施例１１：ミエロペルオキシダーゼ阻害剤による試験
患者血清、健常者唾液（実施例２に同じ）にそれぞれミエロペルオキシダーゼ阻害剤としてｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ‐I（Ｃａｌｂｉｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．）を２９、８７、２６１、７８５、及び２，３５４μＭ加えて１５分間室温下で反応し、その後、各１００μｌを実施例３に記載のペルオキシダーゼ検出用試料保持器に滴下し、これに試薬Ｘ＋Ａを滴下し、反応させ、血清中のペルオキシダーゼ活性を測定した。反応条件及び測定方法は実施例４に従った。酵素活性（ＰＯ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ‐I非存在下の活性を１００として比較を行った。
その結果を図１４に示す。血清中のペルオキシダーゼ活性がミエロペルオキシダーゼ阻害剤によって顕著に低下した。よって、試薬Ｘ＋Ａによる血清ペルオキシダーゼ活性は、ミエロペルオキシダーゼ活性を示すものである。
【００５１】
実施例１２：ペルオキシダーゼ活性による炎症性疾患の発症予知のスクリーニング
高血圧性腎症、腎硬化症、慢性腎炎、及び動脈硬化症の被験者及び健常者より採取した血清１００μｌを実施例３に記載のペルオキシダーゼ検出用試料保持器に滴下し、これに試薬Ｘ＋Ａを滴下し、反応させ、血清中のペルオキシダーゼ活性を測定した。反応条件及び測定方法は実施例４に従った。血清中にはミエロペルオキシダーゼが存在し、実施例６で示したとおり試薬Ｘ＋Ａはミエロペルオキシダーゼ活性を高感度で測定ができること、実施例９で示したとおり試薬Ｘ＋Ａはグルタチオンペルオキシダーゼの発色基質になりえないこと、及び実施例１１で示したとおり血清ペルオキシダーゼ活性がミエロペルオキシダーゼ阻害剤によって阻害されたことから、試薬Ｘ＋Ａによる血清中のペルオキシダーゼ活性はミエロペルオキシダーゼ活性を示すものである。
被験者における血清ペルオキシダーゼ活性（ミエロペルオキシダーゼ活性）の測定結果を表４に示す。本発明の方法により、高血圧性腎症、腎硬化症、慢性腎炎、及び動脈硬化症等の炎症性疾患の被験者において高い血清ミエロペルオキシダーゼ活性が観察された。すなわち、健常者（表４、被験者３９〜５７）のミエロペルオキシダーゼ活性が全て０．１未満であったのに対し、高血圧性腎症患者（表３、被験者１〜３）においては３名中２名（６７％）、腎硬化症患者（表４、被験者４〜１０）においては７名中４名（５７％）、慢性腎炎患者（表４、被験者１１〜１８）においては８名中５名（６３％）、動脈硬化症患者においては２０名中７名（３５％）において０．１より大きい値を示した。被験者２０４０及び５７は健常者グループに分類されているが、他の健常者に比して被験者４０については１．８倍〜３．５倍、被験者５７については１．２〜２倍高いミエロペルオキシダーゼ活性を示していた。前記被験者４０及び５７は、何らかの顕在化していない炎症性疾患等を有していた可能性も考えられる。そこで被験者４０及び５７を健常者グループから除いてミエロペルオキシダーゼ活性の正常値を０．０５未満に設定とすると、高血圧性腎症患者においては３名中２名（６７％）、腎硬化症患者においては７名中６名（８６％）、慢性腎炎患者においては８名中７名（８８％）、動脈硬化症患者においては２０名中１６名（８０％）という、それぞれ高い割合で異常値を示した。血清中のミエロペルオキシダーゼ活性の上昇により死亡リスクが高まることが知られているが（非特許文献３）、本実施例の試験期間中に被験者１５の死亡が確認された。ミエロペルオキシダーゼ活性のほか、炎症マーカーとして知られているＣ反応性タンパク質（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ以下ＣＲＰ）の測定も同時におこなっているが、被験者１５のＣＲＰ値は１．２ｍｇ／ｄｌであり、炎症反応においては「弱陽性」と判定される数値であった。
これらの経過から、ミエロペルオキシダーゼ活性の測定がＣＲＰ値等の従来の方法と比べても被験者の病態モニタリングに適している可能性が示唆された。
【００５２】
表４  炎症性疾患の患者におけるミエロペルオキシダーゼ活性
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被験者            病名              MPO
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Ｎｏ．１      高血圧性腎症        0.1973
Ｎｏ．２      高血圧性腎症        0.0426
Ｎｏ．３      高血圧性腎症        0.1038
Ｎｏ．４      腎硬化症            0.0296
Ｎｏ．５      腎硬化症            0.143
Ｎｏ．６      腎硬化症            0.1798
Ｎｏ．７      腎硬化症            0.1962
Ｎｏ．８      腎硬化症            0.0782
Ｎｏ．９      腎硬化症            0.0514
Ｎｏ．１０    腎硬化症            0.1996
Ｎｏ．１１    慢性腎炎            0.0359
Ｎｏ．１２    慢性腎炎            0.0559
Ｎｏ．１３    慢性腎炎            0.0754
Ｎｏ．１４    慢性腎炎            0.1249
Ｎｏ．１５    慢性腎炎            0.1281
Ｎｏ．１６    慢性腎炎            0.1489
Ｎｏ．１７    慢性腎炎            0.1619
Ｎｏ．１８    慢性腎炎            0.1043
Ｎｏ．１９    動脈硬化症          0.0681
Ｎｏ．２０    動脈硬化症          0.1233
Ｎｏ．２１    動脈硬化症          0.2267
Ｎｏ．２２    動脈硬化症          0.0529
Ｎｏ．２３    動脈硬化症          0.075
Ｎｏ．２４    動脈硬化症          0.05
Ｎｏ．２５    動脈硬化症          0.0862
Ｎｏ．２６    動脈硬化症          0.1316
Ｎｏ．２７    動脈硬化症          0.0388
Ｎｏ．２８    動脈硬化症          0.024
Ｎｏ．２９    動脈硬化症          0.1037
Ｎｏ．３０    動脈硬化症          0.588
Ｎｏ．３１    動脈硬化症          0.0408
Ｎｏ．３２    動脈硬化症          0.0469
Ｎｏ．３３    動脈硬化症          0.0686
Ｎｏ．３４    動脈硬化症          0.0964
Ｎｏ．３５    動脈硬化症          0.1271
Ｎｏ．３６    動脈硬化症          0.171
Ｎｏ．３７    動脈硬化症          0.115
Ｎｏ．３８    動脈硬化症          0.0567
Ｎｏ．３９      健常者            0.039
Ｎｏ．４０      健常者            0.09
Ｎｏ．４１      健常者            0.05
Ｎｏ．４２      健常者            0.035
Ｎｏ．４３      健常者            0.047
Ｎｏ．４４      健常者            0.03
Ｎｏ．４５      健常者            0.03
Ｎｏ．４６      健常者            0.027
Ｎｏ．４７      健常者            0.026
Ｎｏ．４８      健常者            0.0441
Ｎｏ．４９      健常者            0.0213
Ｎｏ．５０      健常者            0.0306
Ｎｏ．５１      健常者            0.0093
Ｎｏ．５２      健常者            0.0343
Ｎｏ．５３      健常者            0.0456
Ｎｏ．５４      健常者            0.0374
Ｎｏ．５５      健常者            0.0457
Ｎｏ．５６      健常者            0.0192
Ｎｏ．５７      健常者            0.0559
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ＭＰＯ：ミエロペルオキシダーゼ活性＝Ａ４６０／１００μｌ／３０ｍｉｎ
【００５３】
表４の健常者と各疾患群との有意差検定
高血圧腎症（ｎ＝３）    ０．１１４５±０．０６３６  ｐ＜０．００１
腎硬化症  （ｎ＝７）    ０．１２５４±０．０６６０  ｐ＜０．００１
慢性腎炎  （ｎ＝８）    ０．１０４４±０．０４２０  ｐ＜０．００１
動脈硬化症（ｎ＝２０）  ０．０８７９±０．０４８９  ｐ＜０．００１
健常者    （ｎ＝１９）  ０．０３７８±０．０１６７
【００５４】
実施例１３：抗酸化活性測定キットの実施例
試薬Ｘ＋Ａは、ペルオキシダーゼの高感度検出試薬であるが、試料保持器にあらかじめ既知のペルオキシダーゼを共存させておくことによって、抗酸化活性を測定することができる。この原理を用いて食品や化粧品などの抗酸化力を測定する「抗酸化活性測定キット」を構築した。
抗酸化物質検出用試料保持器の作成
西洋わさびペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７；シグマ−アルドリッチ社製）をアルブミン１．５ｍｇ／ｍｌ入りの０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解し、４０ｍＵ／ｍｌに調製した。そして２００μｌ（８ｍＵ）を試料保持器に滴下し、冷蔵庫で自然乾燥し、抗酸化物質検出用試料保持器として使用した。
抗酸化物質の定量
効能試験のための既知の抗酸化物質としてビタミンＣ（シグマ−アルドリッチ社）を用いた。ビタミンＣは、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解し、種々の濃度に調製した。そしてそれぞれの溶液１００μｌを前出の抗酸化検出濾紙片に滴下し、４分後に試薬Ｘ＋Ａ溶液を１００μｌ滴下した。室温で３０分放置後、呈色反応は分光色差計(日本電色工業株式会社)で４６０ｎｍの吸光度（Ａ４６０）を求め、その酵素活性より抗酸化物質を定量した。
【００５５】
抗酸化物質であるビタミンＣの濃度の増加に伴って、Ａ４６０は減少した（表５）。すなわち抗酸化物質が、存在しない対象区においては、あらかじめ試料保持器に共存させた西洋わさびペルオキシダーゼ活性を測定していることになる。そこへビタミンＣが存在すれば、西洋わさびペルオキシダーゼ活性が阻害を受ける。すなわち抗酸化反応である。ビタミンＣの濃度依存的に抗酸化反応は強まった。
よって、本願の試料保持器に既知ペルオキシダーゼを共存させ、試薬Ｘ＋Ａによって発色させることによって食品や化粧品などの抗酸化活性を測定することができる。本願の有利な点は、試料保持器という固体上で発色反応を行うことから、試料が透明な液体であることを要求しない。固形物や粘性物質の混合があっても問題なく測定できることである。
【００５６】
表５    ペルオキシダーゼ測定による抗酸化物質の定量
――――――――――――――――――――――――――――――
Ａ４６０      酵素活性（％）
――――――――――――――――――――――――――――――
対象区                  ０．５５９        １００
ビタミンＣ  ０．２ｍＭ  ０．４５０          ８１
ビタミンＣ  １．０ｍＭ  ０．４２２          ７６
ビタミンＣ  ５．０ｍＭ  ０．２８３          ５１
ビタミンＣ  １０ｍＭ    ０．２４６          ４４
――――――――――――――――――――――――――――――
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、試薬Ｘ＋Ａ（１．）、試薬Ａ（２．）、及び試薬Ｘ（３．）によるマイクロプレート上での発色度を示すグラフである。図１の横軸は時間（ｍｉｎ）を示し、縦軸は吸光度（４５０ｎｍ）を示す。
【図２】図２は、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器の断面図である。白帯部分が陰イオン交換クロマトグラフィー用濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ  ＤＥ８１）、黒帯部分がクロマトグラフィー用濾紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ，  Ｎｏ．５２６）である。
【図３】図３は、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器の平面図である。内径は１３ｍｍ、外径は２３ｍｍ、全体の長さは７６ｍｍである。外枠にはアルミニウムを、支持棒には爪楊枝を用いている。
【図４】図４は、唾液採取の模式図である。
【図５】図５は、試薬Ｘ＋Ａによるペルオキシダーゼ検出用試料保持器上での発色度を示すグラフである。図５の横軸は試薬Ｘ＋Ａ（発色液１）、試薬Ａ（発色液２）、試薬Ｘ（発色液３）、及びＨ２Ｏ２−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）溶液を示し、縦軸は吸光度（４６０ｎｍ）を示す。
【図５−Ａ】は、前記発色度の比較を、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器を用いて行った様子を示す写真である。
【図６】図６は、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器濾紙片によるペルオキシダーゼ活性の発色度の比較を示すグラフである。図６の横軸は陰イオン交換クロマトグラフィー用濾紙（ＤＥ８１）、陽イオン交換クロマトグラフィー用濾紙（Ｐ８１）、及びクロマトグラフィー用濾紙（ＴＯＹＯ）にＳｅｒｕｍ（患者血清）及びＳａｌｉｖａ（実施例２で用いた唾液）を滴下したものを示し、縦軸は吸光度（４６０ｎｍ）を示す。
【図６−Ａ】、および
【図６−Ｂ】は、前記発色度の比較を、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器を用いて行った様子を示す写真である。
【図７】図７は、ペルオキシダーゼ検出用試料保持器濾紙片におけるヒトミエロペルオキシダーゼ量と試薬Ｘ＋Ａの関係を示すグラフである。図７の横軸は酵素量（ｍＵ）を示し、縦軸は吸光度（４６０ｎｍ）を示す。図７中、１は試薬Ｘ＋Ａ、２は試薬Ａ、３は試薬Ｘを示す。
【図８】図８は、健常者及び患者から採取した唾液量とペルオキシダーゼ活性の関係を示すグラフである。図８の横軸は唾液分泌量（μｌ）を示し、縦軸は吸光度（４６０ｎｍ）を示す。
【図９】図９は、健常者、高血圧、及び透析患者の唾液分泌量を示すグラフである。図９の横軸は唾液が健常者（ｎ＝１３）、高血圧（ｎ＝１０）、及び透析患者（ｎ＝１０）から採取されたことを示し、縦軸は唾液分泌量（μｌ）を示す。図中のブランクはｂｏｖｉｎｅ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を１０ｍｇ／ｍｌ含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）である。
【図１０】図１０は、健常者、高血圧、及び透析患者の唾液ペルオキシダーゼ活性を示すグラフである。図１０の横軸は唾液が健常者（ｎ＝１３）、高血圧（ｎ＝１０）、及び透析患者（ｎ＝１０）から採取されたことを示し、縦軸は吸光度（４６０ｎｍ）を示す。
【図１１】Ｄａｐｓｏｎｅによる唾液ラクトペルオキシダーゼの特異的阻害を示すグラフである。図１１の縦軸は、ペルオキシダーゼ活性を示しており、ｄａｐｓｏｎｅ濃度がゼロの際（無添加区）のＡ４６０を１００％として酵素活性を示した。黒丸は、歯周疾患のない健康者の唾液をサンプル。白丸は、試薬のミエロペルオキシダーゼをサンプルとしている。
【図１２】ミエロペルオキシダーゼの濃度依存性試験。種々の濃度のミエロペルオキシダーゼサンプルを調整して、試薬Ｘ＋Ａ＋ｄａｐｓｏｎｅで発色させＡ４６０を測定した。
【図１３】歯周疾患患者サンプルでの発色試験。ペルオキシダーゼ活性を測定試薬（試薬Ｘ＋Ａ）に加えてｄａｐｓｏｎｅ１ｍＭを共存させた発色液で発色させＡ４６０を測定した。横軸は、歯周疾患患者の歯周ポケットの大きさを示している。
【図１４】図１１は、唾液ペルオキシダーゼならびに血清ミエロペルオキシダーゼ活性に対するｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−Ｉの阻害作用を示すグラフである。図１１の横軸はｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−Ｉの量（μＭ）、縦軸は酵素活性（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−Ｉ非存在下の活性を１００とした対比％）
【図１】
2008005838.tif 000003
【図２】
2008005838.tif 000004
【図３】
2008005838.tif 000005
【図４】
2008005838.tif 000006
【図５】
2008005838.tif 000007
【図５−Ａ】
2008005838.tif 000008
【図６】
2008005838.tif 000009
【図６−Ａ】
2008005838.tif 000010
【図６−Ｂ】
2008005838.tif 000011
【図７】
2008005838.tif 000012
【図８】
2008005838.tif 000013
【図９】
2008005838.tif 000014
【図１０】
2008005838.tif 000015
【図１４】
2008005838.tif 000016
【図１１】
2008005838.tif 000017
【図１２】
2008005838.tif 000018
【図１３】
2008005838.tif 000019