(57)【要約】  本発明は、神経変性疾患を治療および診断するための新規手段および方法を提供する。特に、前記手段および方法は、ＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様タンパク質のリガンドを含む。このようなリガンドをコードする核酸、ならびにそれを含むベクターおよび宿主細胞が本明細書においてさらに提供される。本発明はさらに、医薬組成物ならびにキットおよび診断キットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患の治療または予防方法において使用するための、ＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）のリガンド。
【請求項２】
前記神経変性疾患が、ＡＳＣ凝集体および／またはアミロイド−β凝集体の形成に関連するものである、請求項１に記載のリガンド。
【請求項３】
前記神経変性疾患が認知症を特徴とし、および／または、認知症を伴うものである、請求項１または２に記載のリガンド。
【請求項４】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳性運動失調（Ｓｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ）、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、軽度認知機能障害、パーキンソンプラス症候群、ピック病、進行性孤立性失語症、灰白質変性症［アルパース］、亜急性壊死性脳症およびレビー小体型認知症から選択されるものである、請求項１から３のいずれか一項に記載のリガンド。
【請求項５】
ＡＳＣの生物学的機能および活性をモジュレート、好ましくは妨害、低減、阻害または阻止する、前述の請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＡＳＣリガンド。
【請求項６】
ＡＳＣの前記生物学的機能および活性が、凝集体を形成し、および／またはアミロイド−β凝集体の形成を誘導もしくは促進するその能力を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＡＳＣリガンド。
【請求項７】
好ましくは、アミロイド−β凝集体の形成を阻害または低減することにより、あるいは、アミロイド−β凝集体の形成の誘導または促進を阻害または低減することにより、ＡＳＣと特異的に相互作用、好ましくは結合する、前述の請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＡＳＣリガンド。
【請求項８】
ＡＳＣが、配列番号１のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体もしくは断片を含むか、あるいは配列番号１のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体もしくは断片からなる、前述の請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＡＳＣリガンド。
【請求項９】
ＡＳＣのＰＹＤドメインまたは当該ＰＹＤドメイン内に位置するエピトープ、および／またはＣＡＲＤドメインまたは当該ＣＡＲＤドメイン内に位置するエピトープと特異的に相互作用、好ましくは結合する、前述の請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＡＳＣリガンド。
【請求項１０】
前記ＰＹＤドメイン中に位置する前記エピトープが、配列番号１に対応するアミノ酸配列のアミノ酸Ｋ２１、Ｋ２２および／またはＫ２６を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載のＡＳＣリガンド。
【請求項１１】
抗体、タンパク質もしくはペプチド、核酸または低分子有機化合物から選択される、前述の請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＡＳＣリガンド。
【請求項１２】
モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはその変異体、断片もしくは誘導体、またはモノクローナル抗体またはその変異体、断片もしくは誘導体をコードする核酸である、請求項１１に記載の使用のためのＡＳＣリガンド。
【請求項１３】
前記抗体変異体が、キメラまたはヒト化抗体変異体から選択されるものである、請求項１２に記載の使用のためのＡＳＣリガンド。
【請求項１４】
前記誘導体が、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体、抗体−薬物コンジュゲートまたはキメラ抗原受容体から選択されるものである、請求項１１から１３に記載の使用のためのＡＳＣリガンド。
【請求項１５】
前記抗体が、６５３９０２クローンＴＭＳ−１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）；ＡＬ１７７（ＡｄｉｐｏＧｅｎ，ＡＧ−２５Ｂ−０００６−Ｃ１００，Ｌｉｅｓｔａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＬＳ−Ｃ３３１３１８−５０（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）；ＡＦ３８０５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＮＢＰ１−７８９７７（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；６００−４０１−Ｙ６７（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；ＡＦ３８０５−ＳＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ｏｒｂ１６００３３（Ｂｉｏｒｂｙｔ）；ｏｒｂ２２３２３７（Ｂｉｏｒｂｙｔ）；６７６５０２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；６５３９０２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＭＢＳ１５０９３６（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ）；ＭＢＳ４２０７３２（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ）；ＭＢＳ９４０１３８６（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ）；ＭＢＳ９４０４８７４（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ）；ＭＢＳ８５０４７０３（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ）；ＭＢＳ８４１１１１（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ）；ＡＢ３６０７（Ｍｅｒｃｋ）；０４−１４７クローン２ＥＩ−７（Ｍｅｒｃｋ）；ＮＢ３００−１０５６（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；ＮＢ１００−５６０７５（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；ＮＢＰ１−７８９７８（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；ＮＢＰ１−７８９７７ＳＳ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；ＮＢＰ１−７８９７８ＳＳ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；ＮＢＰ１−７７２９７（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；ＡＰ０７３４３ＰＵ−Ｎ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＡＰ０６７９２ＰＵ−Ｎ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＡＭ２６４５２ＡＦ−Ｎ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＡＰ３２８２５ＰＵ−Ｎ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＡＰ２３６０２ＰＵ−Ｎ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＴＡ３０６０４４（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；３２９１−１００（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）；３２９１−３０Ｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）；ＳＴＪ２５２４５（Ｓｔ  Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＳＴＪ９１７３０（Ｓｔ  Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＬＳ−Ｃ１８０１８０−１００（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）；ＬＳ−Ｃ４８２９２−１００（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）；ＳＴＪ７０１０８（Ｓｔ  Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＳＴＪ１１３１３５（Ｓｔ  Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＬＳ−Ｃ１５５１９６−１００（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）；ＧＴＸ２２２３６（ＧｅｎｅＴｅｘ）；ＧＴＸ１０２４７４（ＧｅｎｅＴｅｘ）；ＧＴＸ２８３９４（ＧｅｎｅＴｅｘ）；Ｄ０８６−３（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；１３８３３Ｓ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ＣＡＥ０４５５２（Ｂｉｏｍａｔｉｋ）；ＡＤＩ−９０５−１７３−１００（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；４０６１８（���ｉｇｎａｌｗａｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＬＬＣ）；Ｅ−ＡＢ−３０５８２（Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）；ａｂ１８０７９９（Ａｂｃａｍ）；１６８−１０２３０（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）；ＥＲ−０３−０００１（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）；Ａ３５９８−０５Ｂ−１００ｕｇ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）；Ａ３５９８−０５Ｎ−５０ｕｇ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）；ＡＰ５６３１（ＥＣＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＡＢＩＮ１００１８２４（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ）；２２８７（ＰｒｏＳｃｉ，Ｉｎｃ）；７０Ｒ−１１７４４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；ＡＨＰ１６０６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；ＰＡ１−４１４０５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；ＰＡ５−１９９５７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；ＰＡ５−２７７１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；ＰＡ１−９０１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；１０５００−１−ＡＰ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ）；ｓｃ−５１４４１４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；およびｓｃ−５１４５５９（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）から選択されるものであるか、あるいはその変異体、断片もしくは誘導体である、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の使用のためのＡＳＣリガンド。
【請求項１６】
前記タンパク質もしくはペプチドが、可溶性受容体、アドネクチン、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディ、ペプチドアプタマーまたはそれらの変異体、断片もしくは誘導体から選択されるものである、請求項１１に記載のＡＳＣリガンド。
【請求項１７】
前記核酸が、アプタマーもしくはアンチセンス核酸、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるものである、請求項１１に記載のＡＳＣリガンド。
【請求項１８】
前述の請求項のいずれか一項に記載のＡＳＣリガンドをコードする核酸分子。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１７に記載の核酸分子および／または請求項１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
少なくとも１つの請求項１から１７のいずれか一項に記載のＡＳＣリガンドおよび／または請求項１８に記載の核酸および／または請求項１９に記載のベクターおよび／または請求項２０に記載の宿主細胞またはそれらの組み合わせを含む医薬組成物。
【請求項２２】
少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
向知性剤、神経保護剤、抗パーキンソン病薬、アミロイドタンパク質沈着阻害剤、ベータアミロイド合成阻害剤、抗鬱剤、抗不安薬、抗精神病薬および抗多発性硬化症薬から選択される少なくとも１つのさらなる活性剤をさらに含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項に記載のＡＳＣリガンド、核酸分子、ベクターまたは宿主細胞または医薬組成物またはそれらの任意の組み合わせを含むキット。
【請求項２５】
神経変性疾患を治療する方法であって、有効量の請求項１から２３のいずれか一項に記載のＡＳＣリガンド、核酸分子、ベクターまたは宿主細胞または医薬組成物またはそれらの任意の組み合わせを、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２６】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳性運動失調（Ｓｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ）、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、軽度認知機能障害、パーキンソンプラス症候群、ピック病、進行性孤立性失語症、灰白質変性症［アルパース］、亜急性壊死性脳症またはレビー小体型認知症である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
被験体における神経変性疾患または神経変性疾患の発症リスクを診断する方法において使用するためのＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）であって、前記方法が、（ｉ）場合により、前記疾患に罹患していると疑われるかまたは前記疾患の発症リスクがある被験体からサンプルを収集する工程と、（ｉｉ）サンプルを、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなるＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片、誘導体もしくは凝集体と接触させる工程と、（ｉｉｉ）前記ＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片、誘導体もしくは凝集体へのアナライトの結合を検出する工程とを含むことを特徴とする、ＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）。
【請求項２８】
前記アナライトが自己抗体である、請求項２７に記載の使用のためのＡＳＣ。
【請求項２９】
前記サンプル中の前記アナライトを定量する工程と、場合により前記定量された値を参照と比較する工程とをさらに含むことを特徴とする、請求項２７または２８に記載の使用のためのＡＳＣ。
【請求項３０】
前記参照と比較した前記サンプル中のアナライトの量の減少が、前記神経変性疾患または当該疾患の発症リスクを示す、請求項２９に記載の使用のためのＡＳＣ。
【請求項３１】
前記神経変性疾患が、ＡＳＣ凝集体および／またはアミロイド−β凝集体の存在を特徴とするか、あるいは前記凝集体の存在を伴うものである、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の使用のためのＡＳＣ。
【請求項３２】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳性運動失調（Ｓｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ）、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、軽度認知機能障害、パーキンソンプラス症候群、ピック病、進行性孤立性失語症、灰白質変性症［アルパース］、亜急性壊死性脳症またはレビー小体型認知症から選択されるものである、請求項２７から３１のいずれか一項に記載の使用のためのＡＳＣ。
【請求項３３】
被験体における神経変性疾患または神経変性疾患の発症リスクを診断する方法であって、（ｉ）場合により、前記疾患に罹患していると疑われるかまたは前記疾患の発症リスクがある被験体からサンプルを収集する工程と、（ｉｉ）前記サンプルを、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなるＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片、誘導体もしくは凝集体と接触させる工程と、（ｉｉｉ）前記ＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片、誘導体もしくは凝集体へのアナライトの結合を検出する工程とを含むことを特徴とする、方法。
【請求項３４】
請求項２８から３１のいずれか一項に記載の方法を行うための診断キットであって、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなるＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片、誘導体もしくは凝集体と、検出手段とを含む、診断キット。
【請求項３５】
候補リガンドが、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなるＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片もしくは誘導体と相互作用、好ましくは結合することができるかを決定するための方法であって、（ｉ）前記候補リガンドを、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなるＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片もしくは誘導体と接触させる工程と；（ｉｉ）前記候補リガンドの結合を検出する工程とを含むことを特徴とする、方法。
【請求項３６】
前記候補リガンドがインビトロにおいてａ）ＡＳＣ凝集および／またはｂ）アミロイド−β凝集を阻害するかを評価する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＡＳＣリガンドのインビトロスクリーニング方法であって、（ａ）配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなるＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片もしくは誘導体を用意する工程と、（ｂ）前記ＡＳＣタンパク質を候補リガンドと接触させる工程と、（ｃ）前記ＡＳＣタンパク質への前記候補リガンドの特異的結合を検出する工程とを含むことを特徴とする、方法。
【請求項３８】
請求項３５に記載の方法により取得可能なＡＳＣリガンドであって、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸または低分子有機化合物から選択されるものである、ＡＳＣリガンド。
【請求項３９】
サンプル中のＡＳＣ凝集体の存在を決定するためのインビトロインビトロ方法であって、ｉ）被験体から得られたサンプルを、請求項１から１７のいずれか一項に記載のＡＳＣリガンドと接触させる工程と、ｉｉ）前記ＡＳＣリガンドの特異的結合を検出する工程とを含み、前記ＡＳＣリガンドの検出可能な結合が、前記被験体におけるＡＳＣ凝集体の存在を示す、インビトロインビトロ方法。
【請求項４０】
前記ＡＳＣ凝集体の存在が、ＡＳＣ凝集体および／またはアミロイド−β凝集体の存在を特徴とするかまたは前記凝集体の存在を伴う神経変性疾患または神経変性疾患の発症リスクを示す、請求項３７に記載のインビトロ方法。
【請求項４１】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項３８に記載のインビトロ方法。
【請求項４２】
前記サンプルが脳生検である、請求項３８または３９に記載のインビトロ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な神経変性疾患、障害および症状、特により大きな凝集体およびプラークへのベータアミロイドペプチド（Ａβ）の集合によりトリガーされ得る自然免疫活性化を特徴とするかまたはそれを伴う前記疾患、障害および症状を治療するための化合物、組成物および方法に関する。特に、本発明者らは、ＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）のインフラマソーム依存性動員および凝集が、Ａβ関連病状において重要な役割を果たすことを見出した。
【背景技術】
【０００２】
遺伝的および実験的証拠は、神経変性障害における免疫活性化の病原性役割を裏付けている１。アルツハイマー病（ＡＤ）において、遺伝的２，３および後成的４研究、ヒトＡＤ脳のトランスクリプトーム分析５ならびに単球における発現量形質実験６はすべて、自然免疫機構の寄与的役割を裏付けている。しかしながら、ＡＤ関連免疫活性化とＡＤの古典的な特徴との関係はあまり明確ではない。病理学的シードへのベータ−アミロイドペプチド（Ａβ）の集合およびそれらのその後の凝集は、ＡＤの重要な病状の１つである。ＡＤ兆候に関するＡβの重要な役割は、家族型ＡＤ（ｆＡＤ）におけるＡβ産生および沈着の増加につながる突然変異により裏付けられている７。散発性ＡＤ（ｓＡＤ）において、Ａβは開始的役割を果たし得、神経変性が蔓延して臨床症候が現れる前に時間と共に収束し得る病理学的プロセスの複雑なネットワークに関連する８。しかしながら、Ａβ凝集および病状の拡大の根底にある正確な機構は十分に理解されていない９。
【０００３】
重要なことに、Ａβ病状の沈着および拡大は、臨床症候の出現に数十年先行する可能性があるので１０、これらのプロセスに関与する機構は、ＡＤの治療可能性を有すると考えられる。凝集すると、Ａβは、ミクログリアパターン認識受容体により感知され、病理学的自然免疫活性化およびそれに続く炎症性メディエーターの産生につながる１１。ＡＤ患者およびＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスの脳において、危険シグナルの中心的なセンサーであるＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）インフラマソームの活性化が最近報告されている１２。ＮＬＲＰ３またはカスパーゼ１の遺伝的欠損は両方とも、ミクログリアＩＬ−１β産生、Ａβ関連病状および認知機能低下の発症から老齢ＡＰＰ／ＰＳ１マウスを保護する１２。同様のマウスＡＤモデルにおけるＩＬ−１β陽性ミクログリアの非常に早期かつ局所的な免疫活性化を実証した以前の知見により、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化は、Ａβ病状の進行および拡大に寄与するかという疑問が生じた。活性化後、ＮＬＲＰ３は、ピリン（ＰＹＤ）ドメインの相互作用を介して、ＡＳＣヘリックス原線維集合をトリガーするアダプタータンパク質であるＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）を動員する１３。次いで、ＡＳＣ原線維は、ＣＡＲＤ相互作用を介してエフェクターカスパーゼ１を動員し、自己タンパク質分解活性化およびそれに続く大きな傍核ＡＳＣ「スペック」へのＡＳＣ原線維の集合につながる１４。事実、プリオン様重合は、自然免疫および炎症における保存されたシグナル伝達機構である１５。実際、炎症促進性ＩＬ−１βサイトカイン活性化および放出を引き起こす他に、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性はまた、集合ＡＳＣスペック（これは、細胞間空間に放出されると、隣接骨髄細胞により取り込まれて、進行中の免疫反応を持続させ得る）の放出をもたらす１６，１７。ＡＳＣ発現は、ＡＰＰ／ＰＳ１動物においては年齢と共に増加するが、野生型マウスにおいては増加しない。
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、加齢による最も一般的な神経変性障害であり、工業化社会における４番目に多い死因であり、心臓病、脳卒中および癌のみがこれを上回っており、ＡＤは、６５歳超の人口の５〜１１％および８５歳超の人口の３０％に影響を及ぼす。しかしながら、他の多くの神経変性疾患のように、アルツハイマー病は依然として不治であり、利用可能な治療選択肢は単に緩和的なものである。これらの疾患の早期検出および治療を可能にするために、新規治療および診断方法が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
上記を考慮して、本発明の目的は、現在の治療および診断選択肢の欠点を克服し、ＡＤなどの神経変性疾患を治療、予防および検出するための新規手段および方法を提供することである。
【０００６】
この目的は、以下および添付の特許請求の範囲において記載されている主題により達成される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１から図１８について、後記する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は以下において詳細に記載されるが、本発明は、本明細書において記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されず、これらは変動し得ることを理解すべきである。本明細書において使用される用語は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解すべきである。特に定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【０００９】
以下、本発明の要素を説明する。これらの要素は特定の実施形態と共に列挙されているが、それらを任意の方法および任意の数により組み合わせて、さらなる実施形態を作り得ることを理解すべきである。様々に記載されている例および好ましい実施形態は、明示的に記載されている実施形態のみに本発明を限定すると解釈されるべきではない。本明細書は、明示的に記載されている実施形態を任意の数の開示されるおよび／または好ましい要素と組み合わせた実施形態をサポートおよび包含することを理解すべきである。さらに、本出願において記載されるすべての要素の任意の順列および組み合わせは、文脈上特に指示がない限り、本出願の明細書により開示されているとみなされるべきである。
【００１０】
本明細書および以下の特許請求の範囲を通して、文脈上特に必要がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語および変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記述されているメンバー、整数または工程の包含を意味し、いかなる他の記述されていないメンバー、整数または工程の除外も意味しないことを理解すべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語の特定の実施形態であり、あらゆる他の記述されていないメンバー、整数または工程は除外される。本発明の文脈において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」という用語を包含する。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみから構成されてもよいし、または追加のもの、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。
【００１１】
本発明を説明する文脈（特に、特許請求の範囲の文脈）において使用される「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに同様の言及は、本明細書において特に指示がない限り、または文脈上明確な矛盾がない限り、単数および複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。本明細書における値域の記載は、その範囲内に含まれる別個の各値を個々に言及する簡単な方法として機能するものであるにすぎない。本明細書において特に指示がない限り、個々の各値は、それが本明細書において個々に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書における文言は、特許請求の範囲において記載されていない任意の要素であって、本発明の実施に必須の要素を示すと解釈されるべきではない。
【００１２】
「実質的に」という語は「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、「実質的に」という語は、本発明の定義から省略され得る。
【００１３】
数値ｘに関する「約」という用語は、ｘ±１０％を意味する。
【００１４】
詳細な説明
脳領域内およびその間の病状の拡大は、神経変性疾患の特徴である。本発明は、ＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）「スペック」のインフラマソーム駆動形成が、アルツハイマー病（ＡＤ）および他の神経変性疾患におけるβ−アミロイド（Ａβ）病状に寄与するという知見に部分的に基づく。本発明者らは、ミクログリアにより放出されたＡＳＣスペックがＡβと迅速に結合し、Ａβオリゴマーおよび凝集体形成を増加させ、Ａβ病状の炎症駆動クロスシードとして作用することを見出した。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、海馬内ＡＳＣスペック注射は、Ａβ病状の拡大をもたらした。対照的に、ＡＳＣ欠損ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、ＡＰＰ／ＰＳ１脳ホモジネートは、Ａβ病状のシーディングおよび拡大を誘発することができなかった。驚くべきことに、本発明者らは、ＡＳＣリガンドの同時適用がＡβ病状の増大を阻止したことを見出した。これらの知見は、インフラマソーム活性化が、アルツハイマー病などの神経変性疾患におけるＡβ病状のシーディングおよび拡大に関連することを示しており、ＡＳＣ凝集を阻止することができるＡＳＣリガンドが、このような疾患を治療および予防するための実行可能な選択肢であることを裏付けている。
【００１５】
アミロイド−β凝集体の沈着および拡大はアルツハイマー病の重要な特徴であり、他の神経変性疾患にも関与すると考えられる。凝集すると、アミロイド−βは、ミクログリアパターン認識受容体により感知され、病理学的免疫活性化およびＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化につながる。危険シグナルの中心的なセンサーとして作用する多タンパク質複合体であるＮＬＲＰ３インフラマソームはＡＣＳを動員し、最終的には、より大きな凝集体（「スペック」）（これは、細胞内空間に放出される）へのその集合をトリガーする。本発明者らは、放出されたＡＳＣ凝集体（「スペック」）がアミロイド−βと迅速に結合し、アミロイド−βオリゴマーおよび凝集体の形成を増加させ、それにより、アミロイド−β病状の炎症駆動クロスシードとして作用し、最終的には神経変性をもたらすことを見出した。
【００１６】
本発明のＡＳＣリガンドは、好ましくは、ＡＳＣの阻害剤として作用し、より大きな凝集体（「スペック」）に集合するその能力を低減または無効化する。このようなＡＳＣ「スペック」の形成を防止または低減するＡＳＣリガンドは、好ましくは、アミロイド−βオリゴマー、凝集体およびプラークの形成を防止または低減することができる。したがって、本発明のＡＳＣリガンドは、好ましくは、ＡＳＣ凝集体（「スペック」）および／またはアミロイド−β病状の形成、特にアミロイド−β凝集体の形成および拡大を特徴とするかまたはそれに関連する神経変性疾患を予防および治療するために有用であると想定される。
【００１７】
第一の態様において、本発明は、神経変性疾患の治療または予防の方法において使用するための、ＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）のリガンドであることを特徴とする。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「リガンド」という用語は、ＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）と相互作用、好ましくは結合することができる（高）分子を指す。好ましくは、リガンドは、ＡＳＣと特異的に相互作用または結合する。「特異的な」相互作用または結合は、リガンドが、他の非標的タンパク質よりも容易にＡＳＣと相互作用または結合することを意味する。別の実施形態において、リガンドは、ＡＳＣに影響を与えるカスケードの上流または下流で作用するタンパク質と相互作用しない。特に、「リガンド」はｐＨ活性化プロテアーゼ、例えばＮＬＲＰ３インフラマソームの下流のｐＨ活性化プロテアーゼと相互作用しなくてもよい。好ましくは、「リガンド」はベータアミロイドではない。より好ましくは、抗ＡＳＣスペック抗体は、ＡβのＡＳＣスペック誘発性凝集を特異的に妨害または低減する。
【００１９】
リガンドは、好ましくは、その標的の生物学的機能または生物学的活性をモジュレートすることができる。「生物学的機能」（または「生物学的活性」）という用語は、本明細書において、生物学的（例えば限定されないが、その天然またはネイティブ）環境における前記標的により媒介される所望のまたは通常の効果を指すために使用される。リガンドは、それが前記生物学的機能を完全または部分的に妨害、低減、阻害、干渉、阻止、増強、活性化、刺激、増加、強化または支援する場合、その標的の生物学的機能を「モジュレート」する。
【００２０】
リガンドは、その標的と直接的または間接的に相互作用し得る。したがって、本発明のＡＳＣリガンドは、ＡＳＣと直接的または間接的に相互作用、好ましくは結合し得る。本発明のＡＳＣリガンドは、好ましくは、ＡＳＣと（特異的に）結合することにより、ＡＳＣと直接的に相互作用する。しかしながら、ＡＳＣリガンドは、例えば、ＡＳＣの生物学的機能または活性に影響を与える他の細胞または細胞間構造、成分または分子に対して作用することにより、ＡＳＣと間接的に相互作用し得ることも想定される。「リガンド」は、ＡＳＣと相互作用し、その結果、ＡＳＣが他のタンパク質、例えばＮＬＲＰと相互作用することを阻止することにより、ＡＳＣを標的にしてもよい。
【００２１】
「ＡＳＣ」という用語は、ＰＹＣＡＲＤ遺伝子または対立遺伝子変異体またはそのオルソログによりコードされるヒトＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＬＺ３、２０１７年１１月２２日のエントリーバージョン＃１７２、配列バージョン＃２）を指す。それは、「ＣＡＲＤ５」または「ＴＭＳ１」とも称され得る。
【００２２】
「ＡＳＣ」は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。「カノニカル」ＡＳＣ配列と称されることが多いこの配列は、以下に示される：
2021509257.tif 000002
【００２３】
（上記配列において下線付きの）ピリンドメイン（ＰＹＤ）は、アミノ酸１〜９１（配列番号２）の範囲のアミノ酸ストレッチに位置する。それは、ＮＬＲＰ３、ＰＹＤＣ１、ＰＹＤＣ２およびＡＩＭ２などのタンパク質のピリンドメインとの同型相互作用を媒介すると考えられる。（上記配列において太字の）ＣＡＲＤドメインは、アミノ酸１０７〜１９５（配列番号３）の範囲のアミノ酸ストレッチに位置する。それは、ＣＡＳＰ１およびＮＬＲＣ４との相互作用を媒介すると考えられる。
【００２４】
「ＡＳＣ」という用語はまた、好ましくは、配列番号１のアミノ酸を特徴とするＡＳＣタンパク質のホモログ、アイソフォーム、変異体および断片を含む。これらのＡＳＣホモログ、アイソフォーム、変異体および断片は、好ましくは、配列番号１の「カノニカル」ＡＳＣアミノ酸配列と比較して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、特により好ましくは少なくとも８５％、特により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％またはさらに９７％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００２５】
このようなＡＳＣホモログ、アイソフォーム、変異体および断片は、好ましくは機能的であり、すなわち、上記に示されている「カノニカル」ＡＳＣアミノ酸配列を特徴とするＡＳＣタンパク質の生物学的機能または活性を保持する。したがって、このようなＡＳＣホモログ、アイソフォーム、変異体および断片は、典型的には、前記生物学的機能または活性に関与するＰＹＤおよび／またはＣＡＲＤドメインの少なくとも最小部分を保持し得る。
【００２６】
ＡＳＣは、いくつかの生物学的機能または活性を示すアダプタータンパク質である。本発明の文脈において、以下の機能および活性は特に興味深い（典型的には、（１）から（５）に経時的に発生する）：（１）ＮＬＲＰ３インフラマソームにより、典型的にはピリン（ＰＹＤ）ドメイン相互作用を介して動員される能力、（２）ＮＬＲＰ３動員によるヘリックス原線維集合、（３）典型的にはＣＡＲＤ相互作用を介したエフェクターカスパーゼ１の動員、（４）自己タンパク質分解活性化およびそれに続く大きな傍核ＡＳＣ凝集体（「スペック」）へのＡＳＣ原線維の集合、ならびに（５）アミロイド−βオリゴマー化および凝集の誘導。
【００２７】
機能的ＡＳＣホモログ、アイソフォーム、変異体および断片は、好ましくは、少なくとも同じ生物学的機能および活性（１）〜（５）を示す。
【００２８】
「アミロイド−β」（または「Ａβ」、「β−アミロイド」、アミロイドベータペプチド）という用語は、ＡＰＰからプロセシングされる３９〜４３個のアミノ酸残基の一群のペプチドのいずれか１つを指す。「ＡＰＰ」という用語は、ＡＰＰ遺伝子によりコードされるアミロイドベータＡ４タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ参照番号Ｐ０５０６７、２０１７年１１月２２日のエントリーバージョン＃２６６）またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体もしくは断片を指す。ＡＰＰは、多くの哺乳動物組織における多種多様な細胞において発現されるグリコシル化された１回膜貫通タンパク質である。ヒトに存在することが現在公知であるＡＰＰ変異体の例は、Ｋａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：７３３−７３６により記載されている６９５アミノ酸のポリペプチド（ＡＰＰ６９５）；Ｐｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５２５−５２７（１９８８）およびＴａｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５２８−５３０により記載されている７５１アミノ酸のポリペプチド（配列番号５６〜５７）（ＡＰＰ７５１）；ならびにＫｉｔａｇｕｃｈｉ  ｅｔ．ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５３０−５３２により記載されている７７０アミノ酸のポリペプチド（配列番号５４〜５５）（ＡＰＰ７７０）である。慣例により、より短いＡＰＰタンパク質のコドン位置に言及する場合であっても、最長のＡＰＰタンパク質であるＡＰＰ７７０のコドンナンバリングが使用され得る。ＡＰＰはセクレターゼ切断によりプロセシングされ、可溶性ＡＰＰまたはアミロイド−βペプチドがもたらされる。
【００２９】
したがって、「アミロイド−β」という用語は、ＡＰＰのベータセクレターゼ切断から生じる任意のペプチドを指す。これは、β−セクレターゼ切断部位からβ−セクレターゼ切断部位のＣ末端の３９、４０、４１、４２および４３アミノ酸に及ぶ３９、４０、４１、４２および４３アミノ酸のペプチドを含む。
【００３０】
本発明のＡＳＣリガンドは、ヒトにおける神経変性疾患の治療について特に想定される。したがって、ＡＳＣリガンドは、好ましくは、ヒトＡＳＣまたはそのアイソフォーム、変異体および断片と（特異的に）相互作用、より好ましくは結合することができる。しかしながら、本発明のＡＳＣリガンドを非ヒト動物の治療に使用することも想定される。したがって、本発明のＡＳＣリガンドはまた、非ヒト動物に見られるＡＳＣホモログと結合し得る。
【００３１】
ＡＳＣ「ホモログ」は、「オルソログ」および「パラログ」の両方を含む。ＡＳＣオルソログは、種分化により共通の祖先遺伝子から進化した異なる種（オルソログ）の遺伝子によりコードされるＡＳＣタンパク質を含む。オルソログは、多くの場合、進化の過程において同じ機能を保持する。したがって、オルソログのペアを比較した場合、機能は喪失または獲得され得る。ＡＳＣパラログは、ゲノム内の遺伝子重複を介して生成された遺伝子によりコードされるＡＳＣタンパク質を含む。典型的には、パラログは新たな機能を進化させ得るか、または最終的に偽遺伝子になり得る。
【００３２】
例示的なＡＳＣ「ホモログ」としては、Ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ（ニシローランドゴリラ）、Ｎｏｍａｓｃｕｓ  ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ（キタホオジロテナガザル）（Ｈｙｌｏｂａｔｅｓ  ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ）、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）、Ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ（アヌビスヒヒ）、Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ａｔｙｓ（スーティーマンガベイ）（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ｔｏｒｑｕａｔｕｓ  ａｔｙｓ）、Ｍａｃａｃａ  ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ（ブタオザル）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）、Ｍａｎｄｒｉｌｌｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｈａｅｕｓ（ドリル）（Ｐａｐｉｏ  ｌｅｕｃｏｐｈａｅｕｓ）、Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ（スマトラオランウータン）（Ｐｏｎｇｏ  ｐｙｇｍａｅｕｓ  ａｂｅｌｉｉ）またはＣｏｌｏｂｕｓ  ａｎｇｏｌｅｎｓｉｓ  ｐａｌｌｉａｔｅｓのＡＳＣタンパク質が挙げられる。
【００３３】
本発明のＡＳＣリガンドは、異なるＡＳＣホモログに対する交差反応性、すなわち、２つ以上の異なる種に見られるＡＳＣホモログと相互作用または結合する能力を示してもよいしまたは示さなくてもよい。
【００３４】
ＡＳＣ「アイソフォーム」は、それらの翻訳後修飾の点において「カノニカル」ＡＳＣタンパク質とは異なるＡＳＣタンパク質を含む。翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、所定のタンパク質の共有結合的または非共有結合的改変をもたらし得る。一般的な翻訳後修飾としては、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、Ｓ−ニトロシル化、メチル化、Ｎ−アセチル化、脂質化、ジスルフィド結合形成、硫酸化、アシル化、脱アミノ化などが挙げられる。翻訳後タンパク質分解プロセシングは、所定のタンパク質のアミノ酸配列を変化させ得る。異なるＰＴＭは、例えば、異なる化学的性質、活性、局在化、相互作用またはコンホメーションをもたらしてもよく、そして場合により、異なるアミノ酸配列をもたらしてもよい。
【００３５】
ＡＳＣ「変異体」は、ＡＳＣタンパク質「配列変異体」、すなわち、参照（または「親」）ＡＳＣタンパク質の参照（または「親」）アミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。前記参照アミノ酸配列は、好ましくは、配列番号１のカノニカルアミノ酸配列であり得る。したがって、ＡＳＣ変異体は、好ましくは、それらのアミノ酸配列において、各参照配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸突然変異、置換、挿入または欠失を含み得る。置換は、同じクラスに由来するアミノ酸が互いに交換される保存的なものであり得るか、または非保存的なものであり得る。ＡＳＣ変異体としては、天然に存在する変異体、例えば、ＡＳＣプレプロタンパク質、プロタンパク質、および翻訳後タンパク質分解プロセシング（これは、Ｎ末端メチオニン、シグナルペプチドの除去、および／または活性もしく機能的なものへの不活性もしくは非機能的タンパク質の変換を伴い得る）を受けたＡＳＣタンパク質、ならびに天然に存在する変異体ＡＳＣタンパク質が挙げられる。ＡＳＣ変異体としてはさらに、「転写産物変異体」（または：「スプライス変異体」）が挙げられる。転写産物変異体は、同じ遺伝子から最初に転写されるメッセンジャーＲＮＡから産生されるが、その後、選択的（またはディファレンシャル）スプライシングに供され、遺伝子の特定のエクソンが最終的なプロセシングメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に含められ得るか、またはそれから除外され得る。ＡＳＣ変異体としてはさらに、操作されたＡＳＣ変異体が挙げられる。ＡＳＣ「変異体」は、参照タンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列により本質的に定義され得ることに留意すべきである。したがって、「変異体」および「ホモログ」、「アイソフォーム」（アミノ酸配列を変化させる翻訳後修飾に言及する場合）および「断片」という用語の間にはいくらかの重複があり得る。本明細書において定義される場合、「変異体」は、各参照タンパク質に由来し得るか、それから単離され得るか、それに関連し得るか、それに基づき得るか、またはそれと相同であり得る。
【００３６】
例示的なＡＳＣ「変異体」としては、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＳＣタンパク質が挙げられる。
【００３７】
ＡＳＣ「断片」は、参照（または「親」）ＡＳＣタンパク質の全長アミノ酸配列の連続部分配列からなるＡＳＣタンパク質または（ポリ）ペプチドを含む。前記参照アミノ酸配列は、好ましくは、配列番号１のカノニカルアミノ酸配列であり得る。したがって、「断片」は、そのアミノ酸配列に関して、前記参照タンパク質のアミノ酸配列と比較してＮ末端、Ｃ末端および／または配列内短縮型であり得る。短縮は、それぞれアミノ酸レベルまたは核酸レベルのいずれかにおいて起こり得る。換言すれば、ＡＳＣタンパク質「断片」は、典型的には、全長ＡＳＣタンパク質アミノ酸配列のより短い部分であり得る。したがって、断片は、典型的には、全長アミノ酸配列内の対応するストレッチと同一の配列からなる。この用語は、天然に存在するＡＳＣタンパク質「断片」（例えば、天然に存在するインビボプロテアーゼ活性から生じる断片）および操作されたＡＳＣタンパク質断片を含む。
【００３８】
好ましくは、ＡＳＣタンパク質「断片」は、参照として機能するＡＳＣタンパク質アミノ酸配列中のアミノ酸の連続ストレッチに対応するアミノ酸の連続ストレッチからなり得、これは、参照アミノ酸配列の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、特により好ましくは少なくとも６０％、特により好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％に相当する。ＡＳＣタンパク質「断片」は、ＡＳＣタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続アミノ酸残基、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、少なくとも１５個の連続アミノ酸残基、少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、少なくとも２５個の連続アミノ酸残基、少なくとも４０個の連続アミノ酸残基、少なくとも５０個の連続アミノ酸残基、少なくとも６０個の連続アミノ残基（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ａｍｉｎｏ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）、少なくとも７０個の連続アミノ酸残基、少なくとも８０個の連続アミノ酸残基、少なくとも９０個の連続アミノ酸残基、少なくとも１００個の連続アミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続アミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続アミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続アミノ酸残基、少なくとも２００個の連続アミノ酸残基または少なくとも２５０個の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。
【００３９】
本発明のＡＳＣホモログ、アイソフォーム、変異体および断片は、好ましくは、各参照アミノ酸配列（これは、好ましくは配列番号１のカノニカルＡＳＣアミノ酸配列である）と少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、特により好ましくは少なくとも８５％、特により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％またはさらに９７％の配列同一性を示し得る。
【００４０】
したがって、ＡＳＣリガンドは、好ましくは、本明細書において記載されるＡＳＣタンパク質と特異的に相互作用または結合することができる。より好ましくは、ＡＳＣリガンドは、配列番号１の「カノニカル」アミノ酸配列を特徴とするＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体もしくは断片と特異的に相互作用または結合することができるものであり得る。
【００４１】
ＡＳＣと相互作用または結合することにより、本発明のＡＳＣリガンドは、好ましくは、上記生物学的機能または活性、すなわち（１）ＮＬＲＰ３インフラマソームにより、典型的にはピリン（ＰＹＤ）ドメイン相互作用を介して動員される能力、（２）ＮＬＲＰ３動員によるヘリックス原線維集合、（３）典型的にはＣＡＲＤ相互作用を介したエフェクターカスパーゼ１の動員、（４）自己タンパク質分解活性化およびそれに続く大きな傍核ＡＳＣ凝集体（「スペック」）へのＡＳＣ原線維の集合、ならびに（５）アミロイド−βオリゴマー化および凝集の誘導をモジュレート、好ましくは完全または部分的に妨害、低減、阻害、干渉または阻止することができる。
【００４２】
換言すれば、本発明のＡＳＣリガンドは、好ましくは、ＡＳＣの阻害剤として作用する。より好ましくは、本発明のＡＳＣリガンドは、凝集体（または「スペック」）を形成するＡＳＣの能力および／またはアミロイド−β凝集を誘導もしくは促進するその能力を妨害、低減、阻害、干渉または阻止する。本明細書において使用される場合、「ＡＳＣ凝集体の形成」という表現は、ＡＳＣのヘリックス原線維集合（上記番号（２））および大きな傍核ＡＳＣ凝集体へのＡＳＣ原線維の集合（上記番号（４））を含む。ＡＳＣリガンドは、最終的にはアミロイド−β凝集体の形成を誘導する上記において定義される機能カスケードの工程（番号（１）〜（５）、好ましくは番号（２）および／または番号（４）ならびに番号（５））のいずれか１つを妨害、低減、阻害、干渉または阻止することにより、その所望の阻害作用を発揮し得る。ＡＳＣリガンドの阻害作用は、添付の実施例、特にＡβ凝集アッセイ（実施例１）において記載されている方法を用いることにより評価され得る。
【００４３】
したがって、本発明のＡＳＣリガンドは、例えば、ＡＳＣのＰＹＤまたはＣＡＲＤドメイン、特にＡＳＣのＰＹＤまたはＣＡＲＤドメイン内に位置するエピトープと相互作用または結合し得る。本発明は、ＣＡＲＤドメインにおける突然変異とは対照的に、ＰＹＤドメインにおける突然変異（これらは両方とも、ＡＳＣヘリックス原線維集合（番号（２））を阻害することができる）が、アミロイド−β凝集に対するＡＳＣ凝集体の促進効果を完全に妨害したことを報告する。特定の理論に縛られるものではないが、したがって、本発明のＡＳＣリガンドは、ＡＳＣ  ＰＹＤドメインまたは前記ドメイン内に位置するエピトープと（特異的に）相互作用または結合し得ることが想定される。前記エピトープは、「カノニカル」ＡＳＣアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸Ｋ２１、Ｋ２２および／またはＫ２６を含み得る。しかしながら、ＡＳＣリガンドは、例えば、ＣＡＲＤドメイン内または他の場所に位置するＡＳＣタンパク質の他の部分と相互作用または結合することも同様に考えられる。このようなＡＳＣリガンドは、例えば、ＰＹＤ相互作用の立体的干渉または他の方法を介して、それらの阻害機能を発揮し得る。
【００４４】
「ＡＳＣリガンド」は任意のタイプの分子であり得、好ましくは、抗体、核酸、タンパク質、ペプチド、アプタマーまたは低分子有機化合物から選択され得る。ＡＳＣリガンドは、ハイスループットスクリーニングまたはインシリコモデリングを使用して容易に同定され得る。
【００４５】
抗体リガンド：
本発明のＡＳＣリガンドは、抗体またはその変異体、断片もしくは誘導体であり得る。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）および「抗体」という用語は、本明細書において互換的に使用される。本明細書において使用される場合、「抗体」（Ａｂ）という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびに所望の生物学的機能（これは、典型的には、対象標的に対するそれらの結合親和性である）を示す限り、抗体変異体、断片および誘導体を含む。
【００４６】
「結合親和性」または「親和性」は、生体分子（本明細書においては：ＡＳＣ）とそのリガンド／結合パートナー（本明細書においては：抗体）との間の結合相互作用の強度である。結合親和性は、典型的には、平衡解離定数（ＫＤ）により測定および報告される。ＫＤは、抗体とその標的との間の比ｋｏｆｆ／ｋｏｎである。ＫＤおよび親和性は反比例する。結合親和性は、２つの分子間の非共有結合的分子間相互作用、例えば水素結合、静電相互作用、疎水性およびファンデルワールス力により影響を受ける。結合親和性および解離定数を測定するための多くの方法、例えばＥＬＩＳＡ、ゲルシフトアッセイ、プルダウンアッセイ、平衡透析、分析超遠心、ＳＰＲおよび分光アッセイがある。等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）。抗体ＡＳＣリガンドは、マイクロモル（ｍＭ）、ナノモル（ｎＭ）、ピコモル（ｐＭ）またはフェムトモルｆＭ）範囲において結合親和性を示し得る。抗体ＡＳＣリガンドは、好ましくは、それらの対象標的に対して高い結合親和性を示し得る。すなわち、抗体ＡＳＣリガンドは、少なくとも約１０７Ｍ−１、少なくとも約１０８Ｍ−１、少なくとも約１０９Ｍ−１、少なくとも約１０−１０Ｍ−１、少なくとも約１０−１１Ｍ−１または少なくとも約１０−１２Ｍ−１の親和性により結合し得る。
【００４７】
抗体ＡＳＣリガンドは、好ましくは、それらの対象標的と特異的に相互作用または結合することができる。本明細書の他の箇所において定義される、「特異的に結合する」という用語は、抗体が、異なる非対象標的よりもその対象標的とより容易に結合することを意味する。抗体は、定量的アッセイ（例えば、放射性リガンド結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、蛍光ベースの技術（例えば、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ））または表面プラズモン共鳴）により測定可能な非標的の存在下であっても、標的と優先的に結合するかまたはそれを優先的に認識する場合、その標的と「特異的に結合する」か、またはそれに対する「結合特異性」もしくは「特異的親和性」を示すと理解されることが好ましい。その標的と「特異的に結合する」抗体は、異なる種由来の（相同）標的に対する交差反応性を示してもよいしまたは示さなくてもよい。
【００４８】
基本的な天然に存在する抗体は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロテトラマー糖タンパク質である。いくつかの抗体は、さらなるポリペプチド鎖、例えばＩｇＭおよびＩｇＡ抗体におけるＪ鎖を含有し得る。各Ｌ鎖は、１つの共有結合的ジスルフィド結合によりＨ鎖に連結されているが、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて、１つ以上のジスルフィド結合により互いに連結されている。各ＨおよびＬ鎖はまた、鎖内ジスルフィド架橋を含む。各Ｈ鎖は、Ｎ末端可変ドメイン（ＶＨ）、続いてαおよびγ鎖のそれぞれの３つの定常ドメイン（ＣＨ）ならびにμおよびεアイソタイプの４つのＣＨドメインを含む。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）、続いてその他方の末端に定常ドメインを有する。ＶＬはＶＨと配列し、ＣＬは重鎖の１番目の定常ドメイン（ＣＨ１）と配列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。
【００４９】
任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと称される２つの明確に区別可能なタイプの一方に割り当てられ得る。重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てられ得る。免疫グロブリンの５つのクラスがある：それぞれα、β、ε、γおよびμと表記される重鎖を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ。γおよびμクラスは、ＣＨ配列および機能の比較的わずかな差異に基づいてサブクラスにさらに分類され、例えば、ヒトは、以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。
【００５０】
一組のＶＨおよびＶＬは一緒になって、単一の抗原結合部位を形成する。「可変」という用語は、可変ドメインの特定のセグメントが、抗体間において配列が大きく異なるという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインのスパン全体にわたって均等に分布しない。それどころか、Ｖ領域は、それぞれ長さが約９〜１２個のアミノ酸残基である「超可変領域」と称される極めて可変性のより短い領域（これは、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも称される）により区切られた約１５〜３０個のアミノ酸残基のフレームワーク領域（ＦＲ）と称される比較的不変のストレッチからなる。ネイティブ重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、４つのＦＲ（これは主に、β−シート構成を採用する）と、それに接続した３つの超可変領域（これはβ−シート構造を接続し、いくつかの場合においてその一部を形成するループを形成する）とを含む。各鎖の超可変領域は、ＦＲにより互いに近接して保持され、他の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の関与を示す。「超可変領域」（「相補性決定領域」またはＣＤＲとも称される）という用語は、本明細書において使用される場合、免疫グロブリンのＶ領域ドメイン内にある（通常は、極めて配列可変性の３つまたは４つの短い領域である）抗体のアミノ酸残基であって、抗原結合部位を形成し、抗原結合特異性の主要な決定因子であるアミノ酸残基を指す。ＣＤＲ残基は、抗原−抗体複合体の種間配列可変性または結晶学的研究に基づいて同定され得る。
【００５１】
したがって、本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、好ましくは、少なくとも１つの相補性決定領域を介して標的エピトープと特異的に結合することができる免疫グロブリン分子またはその変異体、断片もしくは誘導体を指す。この用語は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、単一特異性、二重特異性および多重特異性抗体、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を含む任意のアイソタイプの抗体、ならびに任意の手段により得られた抗体（天然に存在する抗体、宿主生物における免疫化により生成された抗体、天然に存在する抗体から単離および同定された抗体、または宿主生物における免疫化により生成され、当技術分野において公知の生体分子方法により組換え生産された抗体を含む）、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにキメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、イントラボディ、すなわち、細胞において発現され、特定の細胞区画に場合により局在してもよい抗体、ならびにこれらの抗体のいずれかの変異体、断片および誘導体を含む。
【００５２】
本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」（ｍａｂ）という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、すなわち、微量において存在し得る可能性がある天然に存在する突然変異を除いて同一である集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む「ポリクローナル」抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入せずにそれらが合成され得るという点において有利である。「モノクローナル」という形容詞は、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）において最初に記載されているハイブリドーマ方法論により調製され得るか、またはそれらは、細菌もしくは真核生物動物もしくは植物細胞において組換えＤＮＡ法を使用して作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）において記載されている技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００５３】
「抗体変異体」または「抗体突然変異体」は、参照または「親」抗体と比較して１つ以上のアミノ酸残基が改変されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる抗体を指す。したがって、このような抗体変異体は、優先性が増加する順に、参照もしくは「親」抗体とまたはその軽鎖もしくは重鎖と少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、好ましくは少なくとも約７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、より好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示し得る。考えられるアミノ酸突然変異としては、１つ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入または変化が挙げられる。突然変異は、定常領域または抗原結合領域（例えば、超可変または可変領域）に位置し得る。類似の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性およびサイズ）を有する異なるアミノ酸にアミノ酸を変化させる保存的アミノ酸変異が好ましい場合がある。
【００５４】
抗体変異体は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一もしくは相同であるが、鎖の残りの部分が、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一もしくは相同である「キメラ」および「ヒト化」抗体を含む。非ヒト動物、例えばマウスまたは非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に（部分的または完全に）由来する可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「ヒト化」抗体は、好ましくは、Ｆｃエフェクター機能を有効に媒介することができ、および／または人体に導入された場合には減少した免疫原性を示す。「ヒト化」抗体は、最初の工程として「キメラ」抗体（ヒトＦｃにグラフトされた非ヒトＦａｂ）の作製および分子のＦａｂ部分の（非ＣＤＲ）アミノ酸の選択的突然変異により調製され得る。あるいは、「ヒト化」抗体は、非ヒト動物由来の適切な「ドナー」ＣＤＲコードセグメントをヒト抗体「アクセプター」足場にグラフトし、最適化結合のために（非ＣＤＲ）アミノ酸を場合により突然変異させることにより直接得られ得る。
【００５５】
「抗体断片」は、インタクトな抗体（すなわち、抗原結合部位ならびにＣＬおよび少なくとも重鎖ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む抗体）の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合および／または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片が挙げられる。
【００５６】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」（抗原結合断片）断片と称される２つの同一の抗原結合断片と、残りの「Ｆｃ」（結晶化可能断片）断片とを生じさせた。Ｆａｂ断片は、Ｌ鎖全体と、それに加えてＨ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）および一方の重鎖の１番目の定常ドメイン（ＣＨ１）とからなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち、それは単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片（これは、異なる抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片にほぼ対応し、抗原を架橋することができる）およびｐＦｃ’断片をもたらす。Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つのＦａｂ’断片に分割され得る。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域の１つ以上のシステインを含む数個のさらなる残基を有することにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に関する本明細書の表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして生産された。他の抗体断片およびその化学的断片も公知である。Ｆａｂ／ｃまたはＦａｂｃ抗体断片は、一方のＦａｂ領域を欠く。Ｆｄ断片はＦａｂの重鎖部分に対応し、Ｃ末端定常（ＣＨ１）およびＮ末端可変（ＶＨ）ドメインを含有する。
【００５７】
「Ｆｃ」断片は、ジスルフィドにより互いに保持された両Ｈ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、特定のタイプの細胞に見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によっても認識される領域であるＦｃ領域の配列により決定される。
【００５８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。この断片は、緊密な非共有結合的会合にある１つの重鎖可変領域ドメインおよび１つの軽鎖可変領域ドメインのダイマーからなる。これらの２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗原結合特異性を抗体に付与する６つの超可変ループ（ＨおよびＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が発生する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識してそれと結合する能力を有する。
【００５９】
「抗体誘導体」は、新たなまたはさらなる生物学的特性または機能を含む改変抗体変異体である。抗体誘導体は、所望の生物学的機能性（例えば、標的結合親和性もしくは特異性または酵素活性を付与、増強、低減または無効化する部分またはドメインを導入または除去することによる）、製造特性（例えば、増加した溶解性もしくは増強した排泄を付与するか、または精製を可能にする部分を導入することによる）または医療用途の薬物動態／薬理動態特性（例えば、増加した安定性、バイオアベイラビリティ、吸収；分布および／または減少したクリアランスを付与する部分の導入による）を導入するように化学的または生物学的に改変され得る。例えば、抗体誘導体は、変化したグリコシル化パターンを含むように改変され得るか、または血清半減期および安定性を増加させならびに／もしくは免疫原性を減少させることができる部分、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、デキストリン、ヒドロキシエチル−スターチ（ＨＥＳ）、ポリ（２−エチル２−オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ポリペプチド（ＸＴＥＮ技術、ＰＡＳ化）、脂肪酸（脂質化）もしくは（さらなる）抗体Ｆｃ部分にコンジュゲートされ得る。さらなる抗体誘導体は、さらなる治療部分、例えば薬物、毒性剤、酵素またはアダプタードメインを含む。したがって、「誘導体」という用語は、抗体−薬物コンジュゲートをさらに含む。さらなる抗体誘導体は、抗原結合抗体領域（ＣＤＲおよび場合によりＦＲ領域または抗体ＶＬ領域）と他のタンパク質ドメインとの融合産物を含む。例示的な融合産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。さらなる抗体誘導体は、典型的には適切なペプチドリンカーによりカップリングされたいくつかの抗体断片を含む。したがって、抗体「誘導体」は、天然に存在する（野生型）抗体またはその変異体もしくは断片に由来し得る（したがって、場合によりそれらを含んでもよい）。例示的な抗体「誘導体」としては、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体、および抗体断片由来の二重特異性または多重特異性抗体、ＣＡＲならびに抗体−薬物コンジュゲートが挙げられる。記載される改変の組み合わせもまた、本明細書において想定される。
【００６０】
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体誘導体である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間に、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。
【００６１】
「ダイアボディ」（二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）（または二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ））単鎖可変断片、「ｄｉ−ｓｃＦｖ」、「ｂｉ−ｓｃＦｖ」とも称される）という用語は、Ｖドメインの鎖内ペア形成ではなく鎖間ペア形成が達成されるように、典型的にはＶＨおよびＶＬドメインの間に短いリンカー（約５〜１０個の残基）を用いて、２つのｓｃＦｖ断片（前段落を参照のこと）を連結することにより調製される抗体誘導体を指す。別の可能性は、２つのＶＨおよび２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖（「タンデムｓｃＦｖ」）を構築することである。得られた二価誘導体は、２つの抗原結合部位を有する。同様に、三価ｓｃＦｖトリマー（「トリアボディ」または「トリボディ」とも称される）および四価ｓｃＦｖテトラマー（「テトラボディ」）が生産され得る。二価または多価抗体誘導体は単一特異性であり得、すなわち、各抗原結合部位は、同じ標的に対するものであり得る。このような単一特異性二価または多価抗体または抗体断片誘導体は、好ましくは、高い結合親和性を示す。あるいは、二価または多価抗体誘導体の抗原結合部位は、異なる標的に対するものであり、二重特異性または多重特異性抗体誘導体を形成し得る。
【００６２】
「二重特異性または多重特異性」抗体誘導体は、それぞれが異なる標的と特異的に結合することができる１つを超える特異的抗原結合領域を含む。「二重特異性」誘導体は、典型的には、２つの抗体のＶＨおよびＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「クロスオーバー」ｓｃＦｖ断片のヘテロダイマーである。二重特異性または多重特異性誘導体は、エフェクターと各標的との間のアダプター分子として作用し、それにより、エフェクター（例えば、毒素、薬物およびサイトカインまたはエフェクター細胞、例えばＣＴＬ、ＮＫ細胞、マクロファージおよび顆粒球）を、典型的には標的細胞により発現される目的の抗原に動員する。それにより、「二重特異性または多重特異性」誘導体は、好ましくは、エフェクター分子もしくは細胞および所望の標的を近接させ、ならびに／またはエフェクターと標的との間の相互作用を媒介する。二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ抗体構築物）として公知の二重特異性タンデムｄｉ−ｓｃＦｖは、二価および二重特異性抗体誘導体の一例である。
【００６３】
抗体の構造および特性は当技術分野において周知であり、とりわけ、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，９ｔｈｅｄ．（ｒｅｖ．），Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ  ａｎｄ  Ｃａｓｅｙ  Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｌｔｄ．２００８において記載されている。
【００６４】
本発明の文脈における例示的なＡＳＣリガンド抗体は、６５３９０２クローンＴＭＳ−１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）；ＡＬ１７７（ＡｄｉｐｏＧｅｎ，ＡＧ−２５Ｂ−０００６−Ｃ１００，Ｌｉｅｓｔａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＬＳ−Ｃ３３１３１８−５０（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）；ＡＦ３８０５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＮＢＰ１−７８９７７（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；６００−４０１−Ｙ６７（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；ＡＦ３８０５−ＳＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ｏｒｂ１６００３３（Ｂｉｏｒｂｙｔ）；ｏｒｂ２２３２３７（Ｂｉｏｒｂｙｔ）；６７６５０２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；６５３９０２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＭＢＳ１５０９３６（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ）；ＭＢＳ４２０７３２（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ）；ＭＢＳ９４０１３８６（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ）；ＭＢＳ９４０４８７４（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ）；ＭＢＳ８５０４７０３（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ）；ＭＢＳ８４１１１１（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ）；ＡＢ３６０７（Ｍｅｒｃｋ）；０４−１４７クローン２ＥＩ−７（Ｍｅｒｃｋ）；ＮＢ３００−１０５６（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；ＮＢ１００−５６０７５（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；ＮＢＰ１−７８９７８（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；ＮＢＰ１−７８９７７ＳＳ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；ＮＢＰ１−７８９７８ＳＳ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；ＮＢＰ１−７７２９７（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；ＡＰ０７３４３ＰＵ−Ｎ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＡＰ０６７９２ＰＵ−Ｎ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＡＭ２６４５２ＡＦ−Ｎ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＡＰ３２８２５ＰＵ−Ｎ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＡＰ２３６０２ＰＵ−Ｎ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＴＡ３０６０４４（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；３２９１−１００（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）；３２９１−３０Ｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）；ＳＴＪ２５２４５（Ｓｔ  Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＳＴＪ９１７３０（Ｓｔ  Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＬＳ−Ｃ１８０１８０−１００（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）；ＬＳ−Ｃ４８２９２−１００（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）；ＳＴＪ７０１０８（Ｓｔ  Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＳＴＪ１１３１３５（Ｓｔ  Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＬＳ−Ｃ１５５１９６−１００（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）；ＧＴＸ２２２３６（ＧｅｎｅＴｅｘ）；ＧＴＸ１０２４７４（ＧｅｎｅＴｅｘ）；ＧＴＸ２８３９４（ＧｅｎｅＴｅｘ）；Ｄ０８６−３（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；１３８３３Ｓ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ＣＡＥ０４５５２（Ｂｉｏｍａｔｉｋ）；ＡＤＩ−９０５−１７３−１００（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃ���ｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；４０６１８（Ｓｉｇｎａｌｗａｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＬＬＣ）；Ｅ−ＡＢ−３０５８２（Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）；ａｂ１８０７９９（Ａｂｃａｍ）；１６８−１０２３０（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）；ＥＲ−０３−０００１（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）；Ａ３５９８−０５Ｂ−１００ｕｇ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）；Ａ３５９８−０５Ｎ−５０ｕｇ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）；ＡＰ５６３１（ＥＣＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＡＢＩＮ１００１８２４（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ）；２２８７（ＰｒｏＳｃｉ，Ｉｎｃ）；７０Ｒ−１１７４４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；ＡＨＰ１６０６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；ＰＡ１−４１４０５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；ＰＡ５−１９９５７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；ＰＡ５−２７７１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；ＰＡ１−９０１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；１０５００−１−ＡＰ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ）；ｓｃ−５１４４１４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；およびｓｃ−５１４５５９（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）から選択され得る。
【００６５】
本発明のＡＳＣリガンドは、上記抗体またはその変異体（例えば、ヒト化または他の方法により操作された変異体）、断片（例えば、ＦａｂまたはＦｖ断片）または誘導体（例えば、ｓｃＦｖまたはダイアボディ）のいずれか１つから選択され得る。このような変異体、断片または誘導体を提供するための手段および方法は当技術分野において公知であり、とりわけ、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒｏｌａｎｄ；Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓｔｅｆａｎ（Ｅｄｓ．）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｅｒｉｅｓ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌｓ  ２００１，ＩＳＢＮ：９７８−３−５４０−４１３５４−７において記載されている。ヒト化抗体変異体から調製された断片または誘導体が本明細書において特に想定される。
【００６６】
タンパク質またはペプチドＡＳＣリガンド：
本発明のＡＳＣリガンドは、タンパク質またはペプチドから選択され得る。タンパク質またはペプチドＡＳＣリガンドは、好ましくは、抗体またはそれらの変異体、断片または誘導体以外の結合タンパク質またはペプチドであって、ＡＳＣに対する特異的親和性を示す結合タンパク質またはペプチドである。
【００６７】
タンパク質またはペプチドリガンドは、典型的には、ＡＳＣとの（特異的）相互作用または結合を媒介する結合ドメインを含む。このような結合ドメインは、Ｇｒｏｅｎｗａｌｌ  Ｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｅｈｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１４０（２００９）：２５４−２６９において概説されているように、ＦＮ３（フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）、β−シートフレームワーク、クーニッツドメイン、ＰＤＺドメイン（ＰＳＤ−９５／Ｄｉｓｃｓ−ラージ／ＺＯ−１−ドメイン）、ヒトＡドメイン、リピートドメイン（例えば、アンキリンリピートドメイン）またはブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＡ）を含み得るかまたはそれに由来し得る。
【００６８】
タンパク質またはペプチドＡＳＣリガンドは、天然に存在するタンパク質およびペプチド、ならびにそれらの操作された変異体および誘導体を含む。
【００６９】
「特異的親和性」、「変異体」および「誘導体」という用語は、抗体ＡＳＣリガンドの文脈において説明され、必要な変更を加えて、タンパク質またはペプチドＡＳＣリガンドに等しく適用可能である。このようなものとして、誘導体は、例えば、第一のタンパク質の任意のドメインに対して外来のドメインであって、それと実質的に相同ではないドメインを定義する第二のアミノ酸配列に（場合により適切なペプチドリンカーを介して）融合された第一のアミノ酸配列（タンパク質）を含むキメラ融合物を含む。ドメインは、異なる種に由来してもよいしまたは由来しなくてもよい。
【００７０】
例示的なタンパク質またはペプチドＡＳＣリガンドとしては、可溶性受容体、アドネクチン、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）、アビマー、アフィボディ、ペプチドアプタマーまたはそれらの変異体、断片もしくは誘導体が挙げられる。
【００７１】
核酸ＡＳＣリガンド：
本発明のＡＳＣリガンドは、核酸から選択され得る。
【００７２】
核酸ＡＳＣリガンドは、一本鎖または二本鎖またはそれらの混合物であり得、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含み得る。核酸ＡＳＣリガンドは、任意の長さのものであり得る。それらは、改変ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはホスホジエステル結合を含んでもよいしまたは含まなくてもよい。核酸ＡＳＣリガンドは、コードまたは非コードであり得る。
【００７３】
核酸ＡＳＣリガンドは、ＡＳＣに対する特異的親和性を示す結合核酸であり得る。「特異的親和性」という用語は、抗体ＡＳＣリガンドの文脈において説明され、必要な変更を加えて、核酸ＡＳＣリガンドに等しく適用可能である。このような核酸ＡＳＣリガンドは、アプタマーから選択され得る。
【００７４】
「アプタマー」または「オリゴヌクレオチドアプタマー」は、三次元（３Ｄ）構造にフォールディングされるＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドから構成される低分子核酸リガンドである。アプタマーは、抗原抗体反応と同様のプロセスである構造認識を通じて、標的と相互作用および結合する。本明細書において使用される場合、「アプタマー」という用語は、一価、二価および多価アプタマー、単一特異性、二重特異性および多重特異性アプタマー、場合により適切なリンカーを介して薬物に共有結合的にカップリングされたアプタマーを含むアプタマー−薬物コンジュゲート（ＡｐＤＣ）、高分子量ポリマー（例えば、ＰＥＧ）にカップリングされたアプタマー、アプタマー連結ＤＮＡナノトレイン（ａｐｔＮＴｒｓ）、担体（例えば、コポリマー、リポソーム金属ナノ粒子またはウイルス様粒子）に会合したアプタマー、アプタマー−Ｆｃコンジュゲートならびにアプタマー−ｓｉＲＮＡまたはアプタマー−ｍｉＲＮＡキメラを含む（総説については、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１４）３，ｅ１８２を参照のこと）。
【００７５】
あるいは、核酸ＡＳＣリガンドは、例えば、ＡＳＣ発現をモジュレートすることにより、ＡＳＣ機能および活性と間接的に相互作用し得る。このような核酸ＡＳＣリガンドは、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡから選択され得る。
【００７６】
「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、ＡＧＯ−２  ＲＩＳＣ複合体を相補的標的転写産物に動員し、それにより、好ましくはｍｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡｉ経路を誘導することができる低分子（約２０〜２４ヌクレオチドの）非コード二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。マイクロＲＮＡは、典型的には、プリマイクロＲＮＡからプレマイクロＲＮＡと称される短いステムループ構造にプロセシングされ、最終的には成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。プレマイクロＲＮＡのステムの両鎖は、成熟マイクロＲＮＡにプロセシングされ得る。プロセシング後、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中のアルゴノート２（ＡＧＯ２）に会合した成熟一本鎖マイクロＲＮＡは、典型的には、それらの細胞質ｍＲＮＡ標的の３’ＵＴＲと結合し、ｍＲＮＡ転写産物の翻訳または脱アデニル化および分解のいずれかをもたらす。したがって、マイクロＲＮＡの主な機能は、標的ｍＲＮＡの相補的配列と結合することにより、タンパク質翻訳を（負に）調節することである。「マイクロＲＮＡ」という用語は、ｍｉＲＮＡ、成熟一本鎖ｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）、一次ｍｉＲＮＡ転写産物（プリｍｉＲＮＡ）、二重鎖ｍｉＲＮＡおよびそれらの変異体を含む。マイクロＲＮＡは、標的核酸の３’非翻訳領域内の標的部位と結合することができることが特に想定される。
【００７７】
「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡｉを誘導することができる低分子（約１２〜３５ヌクレオチドの）非コードＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、リン酸化５’末端およびヒドロキシル化３’末端との相補的塩基対形成により形成されるＲＮＡ二重鎖（二本鎖領域）であって、１つまたは２つの一本鎖オーバーハングヌクレオチドを場合により有してもよいＲＮＡ二重鎖（二本鎖領域）を含む。二重鎖部分は、典型的には、１７〜２９個のヌクレオチドを含む。ｓｉＲＮＡは、一緒にハイブリダイズする２つのＲＮＡ分子から生成され得るか、またはあるいは自己ハイブリダイズ部分を含む単一のＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）から生成され得る。ｓｉＲＮＡの二重鎖部分は、典型的には含まないが、二重鎖の一方もしくは両方の鎖に１つ以上の不対および／もしくはミスマッチヌクレオチドを含有する１つ以上のバルジを含み得るか、または１つ以上の非相補的ヌクレオチド対を含有し得る。ｓｉＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖と称される）は、標的転写産物（例えば、標的ｍＲＮＡ）とハイブリダイズする部分を含む。アンチセンス鎖は、標的転写産物の相補的領域と正確に相補的であり得るか（すなわち、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖は、単一のミスマッチ、ウォブル塩基対形成またはヌクレオチドバルジを有しない標的配列にハイブリダイズし得る）、またはｓｉＲＮＡアンチセンス鎖と標的転写産物の相補的領域との間の１つ以上のミスマッチ、ウォブル（Ｇ：Ｕ）塩基対形成および／もしくはヌクレオチドバルジが存在し得る。
【００７８】
「ショートヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」は、ハイブリダイズされたまたはハイブリダイズして、ＲＮＡｉを媒介するために十分長い二本鎖（二重鎖）構造を形成することができる少なくとも２つの相補的部分を含む一本鎖ＲＮＡ分子である。これらの相補的部分は、一般に、１７〜２９ヌクレオチドの長さ、典型的には少なくとも１９塩基対の長さである。ｓｈＲＮＡは、典型的には１〜１０ヌクレオチドの長さの少なくとも１つの一本鎖部分であって、二重鎖部分を形成する相補鎖を接続するループを形成する少なくとも１つの一本鎖部分をさらに含む。二重鎖部分は、典型的には含有しないが、１つ以上の不対ヌクレオチドからなる１つ以上のバルジを含有し得る。上記のように、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉ機構によりｓｉＲＮＡ（上記を参照のこと）にプロセシングされると考えられる。したがって、ｓｈＲＮＡはｓｉＲＮＡ前駆体であり、ｓｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡｉ経路を介して遺伝子サイレンシングを誘導すると考えられる。
【００７９】
「アンチセンスＲＮＡ」または「ａｓＲＮＡ」は、天然に存在するｍＲＮＡ配列の一部と好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、特に１００％の（ｄｓＲＮＡのヌクレオチドの）配列同一性を示す一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子である。本発明の文脈において、このような天然に存在するｍＲＮＡ配列は、ＡＳＣをコードし得る。アンチセンスＲＮＡは、典型的には、コードまたは非コード部分のいずれかと相補性を示し、しかしながら、いくつかの場合において、その標的と結合するアンチセンスＲＮＡの能力を無効化しない限り、ウォブル塩基（Ｇ：Ｕ）対形成、ヌクレオチドバルジおよび／またはミスマッチが存在し得る。
【００８０】
低分子ＡＳＣリガンド：
本発明のＡＳＣリガンドは、有機低分子から選択され得る。前記有機低分子は、好ましくは、ＡＳＣに対する特異的親和性を示し得る。「特異的親和性」という用語は、抗体ＡＳＣリガンドの文脈において説明され、必要な変更を加えて、有機低分子ＡＳＣリガンドに等しく適用可能である。
【００８１】
「有機低分子ＡＳＣリガンド」という用語は、ＡＳＣと直接的または間接的に相互作用することができる任意の有機低分子化合物ならびにその薬学的に許容され得る塩、エステル、誘導体、類似体および模倣化合物を含む。
【００８２】
ＡＳＣと相互作用する化合物は、好ましくは、エステル化合物ではなく、より好ましくは、コーヒー酸フェニルエステル（ＣＡＰＥ）、ＣＡＰＥＮ、ＤＨＣまたはＤＭＣではなく、とりわけ、ＣＡＰＥではない。
【００８３】
ＡＳＣリガンドをコードする核酸分子
さらなる態様において、本発明は、本明細書において記載されるＡＳＣリガンド、例えば抗体、タンパク質、ペプチドまたは核酸リガンドをコードする核酸分子を提供する。ＡＳＣリガンドを「コードする」核酸分子は、適切な条件下において発現されて前記リガンドを提供することができる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖またはそれらの混合物であり得、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含む。例示的な核酸分子は、センスおよびアンチセンスＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、前駆体ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、（成熟）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド分子、ミニ遺伝子ならびに遺伝子断片を含む構築物ゲノムＤＮＡから選択され得る。
【００８４】
本発明の核酸分子は、任意の長さのものであり得る。本発明の核酸分子は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニンおよび２−チオシチジン）、ならびに／または化学的もしくは生物学的に改変された塩基（例えば、メチル化塩基）、インターカレート塩基および／もしくは改変糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノースおよびヘキソース）を含むヌクレオシドを含み得る。本発明の核酸分子は、ホスホジエステル結合または任意の他のタイプの結合、例えばホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合を含み得る。天然に存在しないヌクレオシドもしくはヌクレオチド、配列、骨格またはヌクレオチド間結合を含む核酸分子は、本明細書において「改変」核酸分子とも称される。
【００８５】
本発明の核酸分子は、インビボもしくはインビトロにおいて生物学的手段（例えば、酵素的）を使用することにより得られ得るか、または化学的に合成され得る。
【００８６】
本発明の核酸分子は、そのポリヌクレオチド配列を特徴とする。前記配列は、好ましくは、目的のＡＳＣリガンドをコードする「コード領域」または「コード配列」（ｃｄｓ）を含む。本明細書において使用される場合、「コードする」という用語は、適切な環境、例えば適切な宿主細胞において、または適切なインビトロ条件下において、発現されて所望の発現産物（例えば、タンパク質、ペプチドまたは核酸）を提供することができることを意味する。ＡＳＣをコードするオープンリーディングフレームのポリヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ源、ｃＤＮＡ源から容易に単離され得るか、または（例えば、ＰＣＲを介して）合成され得る。
【００８７】
したがって、本発明の核酸分子は、本明細書において記載される（タンパク質性）ＡＳＣリガンドをコードするｃｄｓと、場合によりそれに作動可能に連結された調節エレメントとを含み得るかまたはそれらからなり得る。
【００８８】
「作動可能に連結された」という用語は、配列がそれらの意図する様式において機能することを可能にするような方法により、ポリヌクレオチド配列を別のポリヌクレオチド配列に連結することを指す。タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、前記ポリヌクレオチド配列の発現がコードタンパク質をもたらすことを可能にする機能的様式において調節エレメントに接続される場合、前記エレメントに「作動可能に連結」される。
【００８９】
「調節エレメント」および「調節配列」という用語は互換的に使用され、宿主細胞における作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の生物学的機能または活性をモジュレートすることができるポリヌクレオチド配列を指す。調節エレメントとしては、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列からのタンパク質の発現を指令またはモジュレートする（例えば、増加させる）ことができる配列が挙げられる。したがって、この用語は、プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的相互作用に必要なコアエレメント、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、上流エレメント、エンハンサーおよび応答エレメントを含む、転写を促進または調節するエレメントをカバーする。原核生物における直接的な発現を指令することができる調節エレメントとしては、プロモーター、オペレーター配列およびリボソーム結合部位が挙げられる。調節エレメントは、ゲノム（例えば、ウイルスまたは真核生物）起源ものであり得るか、または合成的に生成され得る。調節エレメントは、ライブラリーまたはデータベースに由来し得、化学的に合成され得る。調節エレメントを本発明の核酸分子に導入して、転写、ｍＲＮＡプロセシングおよび安定化ならびにコードアミノ酸配列への翻訳を最適化し得る。調節エレメントは、適切な制限部位におけるライゲーションにより、または当業者に公知の制限エンドヌクレアーゼを使用して配列に挿入されたアダプターもしくはリンカーを介して、目的のポリヌクレオチド配列に連結され得る。
【００９０】
「プロモーター」または「プロモーター配列」は、転写開始部位（典型的には、転写開始部位の上流または５’）に位置するヌクレオチド配列であり、目的の特定のポリヌクレオチド配列の転写を開始させる。プロモーターは、構成的または誘導性のいずれかであり得る。誘導性プロモーターは、特定の生理学的条件下においてのみ、作動可能に連結されたｃｄｓの転写を開始させ、宿主細胞、所望の発現レベル、宿主細胞の性質などに応じて制御され得る。
【００９１】
プロモーターとしては、真核生物プロモーター、ウイルスプロモーターおよび合成プロモーター、例えばβ−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、レトロウイルスプロモーターなどが挙げられる。プロモーターはエンハンサーを伴うものでもよいしまたは伴わないものでもよく、エンハンサーは特定のプロモーターを天然に伴うものでもよいし、または異なるプロモーターを伴うものでもよい。
【００９２】
「エンハンサー」という用語は、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増強し、方向および位置に非依存的な様式により機能するシス作用性ヌクレオチド配列を指す。エンハンサーは、転写開始部位に対して上流または下流のいずれかの任意の位置において機能し得る。エンハンサーがプロモーターに作動可能に連結されている場合、エンハンサーは、プロモーターからの転写レベルを増加させることができる任意のヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例示的なエンハンサーとしては、ＲＳＶＬＴＲエンハンサー、バキュロウイルスＨＲ１、ＨＲ２もしくはＨＲ３エンハンサーまたはＣＭＶ前初期遺伝子産物エンハンサーが挙げられる。
【００９３】
「マーカー」は、本発明の核酸分子および／またはベクターにより成功裏に形質転換された（すなわち、それを含む）宿主細胞の検出または選択を可能にするために、本発明の核酸分子に導入され得る。マーカーは、典型的には、宿主細胞に導入されると、遺伝子を有する細胞のポジティブ選択または検出を可能にする優勢表現型を発現する遺伝子である。このタイプの遺伝子は当技術分野において公知であり、とりわけ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ（ベータ−Ｇａｌ）、ベータ−グルクロニダーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンダミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が挙げられる。
【００９４】
目的のさらなる調節エレメントとしては、所望の宿主細胞において複製する能力を付与する「複製起点」（「ｏｒｉ」）が挙げられる。場合により、核酸分子は、所望の宿主細胞へのライゲーションまたは挿入をもたらす調節エレメントを含んでもよい。
【００９５】
ベクター
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。換言すれば、本発明は、本明細書において記載されるＡＳＣリガンド、例えば抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【００９６】
「ベクター」（本明細書において「ビヒクル」または「構築物」とも称される）は、目的のポリヌクレオチド配列の輸送、発現、複製、増殖、組み込みおよび／または貯蔵のためのビヒクルとして機能する核酸分子である。
【００９７】
本発明のベクターは、ウイルスまたは非ウイルスベクターから選択され得る。
【００９８】
非ウイルスベクターとしては、プラスミド（組み込みまたは非組み込み）、プラスミドミニサークル、トランスポゾン、コスミドおよび人工染色体、例えば細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。このような非ウイルスベクターは、ポリマーもしくは脂質と複合体形成し得るか、または「ネイキッド」ＲＮＡもしくはＤＮＡの形態において提供され得る。
【００９９】
ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスは宿主細胞ＤＮＡに組み込まれるので、宿主において長期間発現の可能性を有する。レトロウイルスは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶおよび、鳥赤芽球腫ウイルス（ＡＥＶ）から選択され得る。レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）系ベクターから選択され得る。アデノウイルスは、アデノウイルス５型第一および第二世代ならびにガットレスベクターから選択され得る。アデノ随伴ウイルスは、すべてのアデノ随伴血清型から選択され得る。
【０１００】
本発明のベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得るか、または独立した遺伝エレメント（例えば、エピソーム、プラスミド）として存在し得る。ベクターは、単一の核酸分子として、または２つ以上の別個の核酸分子として存在し得る。ベクターは、シングルコピーベクターまたはマルチコピーベクター（典型的には、宿主細胞において維持されるベクターのコピー数を示す）であり得る。ベクターは、典型的には、組換え体、すなわち天然に存在しない人工分子である。ベクターは、線状および／または環状形態において存在し得る。いくつかの環状核酸ベクターは、細胞への送達前に意図的に線状化され得る。
【０１０１】
本発明のＡＳＣリガンドをコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野において公知の方法を使用してベクター「骨格」に挿入され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２（４ｔｈ  ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術ならびに遺伝子組換えを含み得る。得られるベクターは、ドナーゲノム由来の核酸配列とベクター核酸配列との新規組み合わせを含むので、「組換え」ベクターと称される。所望のポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターは、（ａ）配列決定（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション；（ｃ）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在；および（ｄ）挿入されたポリヌクレオチド配列の発現を含む公知の技術により同定され得る。
【０１０２】
ベクターは、その「骨格」に、さらなる調節エレメント、例えば本明細書の他の箇所において記載される複製起点、エンハンサー、制限部位または調節エレメントを含み得る。ベクターは、そのライゲーションおよび宿主細胞ゲノムへの組み込みなどを指令する調節配列を含み得る。
【０１０３】
本発明のベクターは、貯蔵ベクター、クローニングベクター、トランスファーまたはシャトルベクター、発現ベクター、遺伝子治療ベクターおよび他のベクターから選択され得る。容易に理解されるように、上記定義はある程度重複し得、例えば、いくつかのトランスファーベクターは発現ベクターとしても機能し得る。
【０１０４】
好ましくは、本発明のベクターは、遺伝子治療ベクターまたは発現ベクターであり得る。
【０１０５】
「発現ベクター」は、コードされる発現産物の発現をもたらすことができるベクターである。「発現ベクター」は、典型的には、「発現カセット」の形態において目的の発現産物をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子である。「発現カセット」は、前記ポリヌクレオチド配列と、前記ポリヌクレオチド配列の効率的な転写を促進する適切な調節エレメントとを含む。それは、典型的には、ベクター骨格中のマルチクローニングサイトに挿入される。適切な調節エレメントは、転写プロモーター、ならびに場合によりエンハンサー、翻訳シグナル、転写および翻訳終結シグナルを含み得る。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択により影響を受けるであろう。安定的形質転換に使用される発現ベクターは、典型的には、形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択マーカーを有する。いくつかの場合において、複製起点は、ベクターのコピー数を増幅するために使用され得る。
【０１０６】
「遺伝子治療ベクター」は、治療すべき被験体に移入され得るベクターであり、その場所において、それはポリヌクレオチド配列の発現をもたらす。
【０１０７】
宿主細胞
さらなる態様において、本発明は、本発明のＡＳＣリガンド、核酸分子および／またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１０８】
適切な宿主細胞の選択は、それらの所望の用途および機能に依存する。
【０１０９】
本発明は、とりわけ、本発明のＡＳＣリガンドをコードする核酸分子および／またはベクターのポリヌクレオチド配列を発現させるための宿主細胞を想定する。様々な宿主−ベクター系が、ＡＳＣリガンドをコードするポリヌクレオチド配列を発現させるために使用され得る。これらとしては、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルス）を感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡにより形質転換された細菌が挙げられる。
【０１１０】
より具体的には、宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞から選択され得る。
【０１１１】
Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞は、大量の（タンパク質性）ＡＳＣリガンドを生産するために使用され得る。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換は、当業者に周知の簡易かつ迅速な技術である。Ｅ．ｃｏｌｉのための発現ベクターは、例えば、高レベルのタンパク質発現を誘導するための、および宿主細胞に対していくらかの毒性を示すタンパク質を発現させるための誘導性プロモーターを含有し得る。誘導性プロモーターの例としては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６  ＲＮＡプロモーター、ならびに温度調節λＰＬプロモーターが挙げられる。
【０１１２】
（タンパク質性）ＡＳＣリガンドは、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質環境において発現され得る。あるいは、タンパク質を酸化ペリプラズム空間に指向させるために、リーダー配列が所望のタンパク質産物に融合され得る。リーダーは、典型的には、ペリプラズム内のシグナルペプチダーゼにより除去される。ペリプラズムターゲティングリーダー配列の例としては、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のｐｅｌＢリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子由来のリーダーが挙げられる。いくつかの場合において、ペリプラズムの発現は、培養培地への発現タンパク質の漏出を可能にする。タンパク質の分泌は、培養上清からの迅速かつ簡易な精製を可能にする。分泌されないタンパク質は、浸透圧溶解によりペリプラズムから得られ得る。細胞質発現と同様に、いくつかの場合において、タンパク質は不溶性になり得、変性剤および還元剤は、可溶化およびリフォールディングを容易にするために使用され得る。還元剤、例えばジチオトレイトールおよびβ−メルカプトエタノールならびに変性剤、例えばグアニジン−ＨＣｌおよび尿素は、発現タンパク質産物の溶解度を増加させるために使用され得る。誘導および成長の温度もまた、発現レベルおよび溶解度に影響を及ぼし得、典型的には、２５℃〜３７℃の温度が使用される。典型的には、細菌は、アグリコシル化タンパク質を産生する。したがって、タンパク質が機能のためにグリコシル化を必要とする場合、宿主細胞からの精製後に、グリコシル化がインビトロにおいて追加され得る。
【０１１３】
酵母細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、本明細書において記載される（タンパク質性）ＡＳＣリガンドなどのタンパク質の生産に使用され得る周知の酵母発現宿主である。酵母細胞は、エピソーム複製ベクターを用いて、または相同組換えによる安定的染色体組み込みにより形質転換され得る。典型的には、誘導性プロモーターは、遺伝子発現を調節するために使用される。このようなプロモーターの例としては、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５、ならびにメタロチオネインプロモーター、例えばＣＵＰ１、ＡＯＸ１または他のＰｉｃｈｉａもしくは他の酵母プロモーターが挙げられる。発現ベクターは、形質転換ＤＮＡの選択および維持のための選択マーカー、例えばＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３を含み得る。多くの場合、酵母において発現されたタンパク質は可溶性である。Ｂｉｐおよびプロテインジスルフィドイソメラーゼなどのシャペロニンとの共発現は、発現レベルおよび溶解度を改善し得る。加えて、酵母において発現されたタンパク質は、分泌シグナルペプチド融合物、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来の酵母接合型アルファ因子分泌シグナルおよび酵母細胞表面タンパク質、例えばＡｇａ２ｐ接合接着受容体またはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓグルコアミラーゼとの融合物を使用して、分泌を指令され得る。Ｋｅｘ−２プロテアーゼなどのプロテアーゼ切断部位は、発現ポリペプチドが分泌経路を出る際に、それらから融合配列を除去するように操作され得る。酵母はまた、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフにおいてグリコシル化が可能である。
【０１１４】
昆虫細胞発現系は高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物により使用される翻訳後修飾のほとんどが可能である。バキュロウイルスは、安全性を改善して真核生物発現に関する調節懸念を低減する制限的な宿主範囲を有する。典型的な発現ベクターは、高レベル発現のためのプロモーター、例えばバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターを使用する。一般的に使用されるバキュロウイルス系としては、バキュロウイルス、例えばＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）ならびに昆虫細胞株、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９、Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ（Ａ７Ｓ）およびＤａｎａｕｓ  ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ（ＤｐＮ１）が挙げられる。高レベル発現のために、発現させるべき分子のヌクレオチド配列は、ウイルスのポリヘドリン開始コドンの直ぐ下流に融合され得る。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞において正確にプロセシングされ、発現タンパク質を培養培地に分泌するために使用され得る。加えて、細胞株Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ（Ａ７Ｓ）およびＤａｎａｕｓ  ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ（ＤｐＮ１）は、哺乳動物細胞系と同様のグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生する。
【０１１５】
昆虫細胞における代替的な発現系は、安定形質転換細胞の使用である。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ならびにＣ７細胞（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）などの細胞株が発現に使用され得る。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａメタロチオネインプロモーターは、カドミウムまたは銅を用いた重金属誘導の存在下において高レベルの発現を誘導するために使用され得る。発現ベクターは、典型的には、ネオマイシンおよびハイグロマイシンなどの選択マーカーの使用により維持される。
【０１１６】
発現ベクターは、アデノウイルスなどのウイルス感染により、またはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどの直接ＤＮＡ移入により、ならびにエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの物理的手段により、哺乳動物細胞に移入され得る。哺乳動物細胞のための発現ベクターは、典型的には、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）およびポリアデニル化エレメントを含む。選択マーカーなどの別の遺伝子を用いて二シストロン性発現を可能にするために、ＩＲＥＳエレメントも追加され得る。このようなベクターは、多くの場合、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えばＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端リピートを含む。これらのプロモーター−エンハンサーは、多数の細胞タイプにおいて活性である。組織および細胞タイププロモーターおよびエンハンサー領域もまた、発現に使用され得る。例示的なプロモーター／エンハンサー領域としては、限定されないが、エラスターゼ１、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳房腫瘍ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ１アンチトリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２および性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御などの遺伝子に由来するものが挙げられる。選択マーカーは、発現構築物を有する細胞を選択および維持するために使用され得る。選択マーカー遺伝子の例としては、限定されないが、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。例えば、ＤＨＦＲ遺伝子を発現する細胞のみを選択するために、発現は、メトトレキサートの存在下において実施され得る。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γなどの細胞表面シグナル伝達分子との融合物は、細胞表面上における活性状態のタンパク質の発現を指令し得る。
【０１１７】
マウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリおよびハムスター細胞を含む多くの細胞株が哺乳動物発現に利用可能である。例示的な細胞株としては、限定されないが、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌性）および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８ならびにＨＫＢ細胞が挙げられる。細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製を容易にする無血清培地に適合された細胞株も利用可能である。例としては、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．，ｃａｔ  ＃１１６１９−０１２）および無血清ＥＢＮＡ−１細胞株（Ｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：３３２−３４２）が挙げられる。最大発現に最適化された特別な培地において成長するよう適合された細胞株も利用可能である。例えば、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞は、化学的に定義された動物産物を含まない培地における懸濁培養において成長するように適合されている。
【０１１８】
トランスジェニック植物細胞および植物は、本明細書において記載されるものなどのタンパク質を発現させるために使用され得る。発現ベクターは、典型的には、微粒子銃およびプロトプラストへのＰＥＧ媒介性移入などの直接ＤＮＡ移入を使用して、ならびにアグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて植物に移入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメントならびに翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、シロイヌナズナおよびタバコなどの双子葉植物宿主と、トウモロコシおよびイネなどの単子葉植物宿主と間において分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンセターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーターならびにユビキチンおよびＵＢＱ３プロモーターが挙げられる。ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択マーカーは、多くの場合、形質転換細胞の選択および維持を容易にするために使用される。形質転換植物細胞は、細胞、凝集塊（カルス組織）として培養物中において維持され得るか、または植物全体に再生され得る。トランスジェニック植物細胞はまた、ヒアルロニダーゼポリペプチドを産生するよう操作された藻類を含み得る。植物は、哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主において産生されるタンパク質の選択に影響を及ぼし得る。
【０１１９】
（タンパク質性）ＡＳＣリガンドは、当技術分野において公知の任意の適切な技術を使用して、宿主細胞から精製され得る。分泌タンパク質は、典型的には、細胞を除去した後に培養培地から精製される。細胞内発現タンパク質は、典型的には、宿主細胞溶解後に細胞抽出物から精製される。精製技術は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿ならびにイオン交換クロマトグラフィー、例えば陰イオン交換を伴い得る。親和性精製技術もまた、抗体または他のタンパク質もしくはペプチドを精製するために利用され得る。前記抗体またはタンパク質もしくはペプチドはまた、親和性タグ、例えばｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合物またはＨｉｓ６を追加し、それぞれｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂およびＮｉ樹脂による親和性精製を可能にするように操作され得る。純度は、ゲル電気泳動および染色および分光光度技術を含む、当技術分野において公知の任意の方法により評価され得る。
【０１２０】
（医薬）組成物
さらなる態様において、本発明は、本明細書において記載されるＡＳＣリガンド、核酸、ベクターもしくは宿主細胞の少なくとも１つまたはそれらの組み合わせと、場合により少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤とを含む組成物を提供する。組成物は、好ましくは、医薬組成物であり得る。医薬組成物は、典型的には、規制当局または他の当局の承認を考慮して調製され、動物およびヒトにおける使用について一般に認められている薬局方に従って調製される。
【０１２１】
賦形剤は、生産の増強、患者の受容性、安定性の改善、放出の制御などの目的のために追加され得る。典型的には、賦形剤は医薬組成物の主要成分であり、活性剤は比較的少量において存在するにすぎない。時には、賦形剤は、「非活性」または「不活性」成分とも称される。しかしながら、いくつかの賦形剤はまた、薬物動態または薬理動態、特に共投与された活性剤の吸収、分布、代謝および排除（ＡＤＭＥ）プロセスに対する影響を有し得る。
【０１２２】
賦形剤は、典型的には、医薬製剤におけるそれらの役割および薬物送達に影響を与えるそれらの相互作用に基づいて、またそれらの化学的および物理化学的特性に基づいて分類される。賦形剤の主なクラスとしては、抗酸化剤、コーティング材料、乳化剤、風味および香り改善剤、軟膏基剤、保存剤、粘度改善剤、崩壊材料、希釈剤、充填剤、増量材料、担体、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、溶媒および共溶媒、緩衝剤、湿潤剤、消泡剤、増粘剤ならびに保湿剤が挙げられる。いくつかの賦形剤は、複数の目的に役立ち得る；例えば、メチルセルロースはコーティング材料であり、錠剤中の崩壊剤または結合剤として、粘度を増加させるために懸濁液の調製において適用される。
【０１２３】
「薬学的に許容され得る」という用語は、１つ以上の活性剤と適合性であり、その／それらの薬学的効果を妨害および／または実質的に低減しない化合物を指す。薬学的に許容され得る賦形剤は、好ましくは、それらを被験体への活性剤との共投与に適切なものにするために十分に高い純度および十分に低い毒性を有する。
【０１２４】
適切な薬学的に許容され得る賦形剤の選択は、典型的には、医薬組成物の選択された投与経路および製剤により決定される。
【０１２５】
本発明の医薬組成物は、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、腹腔内、血管内（ｉｖ）、鼻腔内、経皮、病変内、腫瘍内、頭蓋内、肺内、心臓内、舌下、直腸、口腔または膣投与経路を介して投与され得る。このような経路に適した製剤は、当業者に公知である。投与は、局所的または全身的であり得る。治療を必要とする領域への局所投与は、例えば限定されないが、手術中の局所注入、例えば、手術後の創傷包帯と併せた局所適用により、注射により、カテーテルを用いて、座薬を用いて、またはインプラントを用いて達成され得る。全身投与は、経口投与により、または無針注射（ジェット注射）および／もしくは針注射であり得る注射により達成され得る。
【０１２６】
医薬組成物は、錠剤、カプセル、丸剤、粉末、顆粒、座薬、滅菌非経口溶液または懸濁液、経口溶液または懸濁液、油水エマルジョンおよび持続放出製剤として製剤化され得る。製剤は、投与様式に適したものであるべきである。本発明の医薬組成物はまた、投与のために溶液、エマルジョンおよび他の混合物として再構成され得る凍結乾燥粉末として提供され得る。それらはまた、固体またはゲルとして再構成および製剤化され得る。
【０１２７】
局所投与のための医薬組成物は、クリーム、ゲル、軟膏、エマルジョン、溶液、エリキシル、ローション、懸濁液、チンキ、ペースト、フォーム、エアロゾル、灌注剤、スプレー、座薬、包帯、皮膚パッチ、エアロゾルまたは局所投与に適切な任意の他の製剤として製剤化され得る。直腸投与のための医薬組成物は、直腸座薬、カプセルおよび錠剤として製剤化され得る。経口投与のための医薬組成物は、錠剤またはカプセルとして製剤化され得る。医薬組成物はまた、制御放出製剤および／または送達デバイスにより投与され得る。本発明の（医薬）組成物は、液体、固体または半固体の形態において製剤化され得る。
【０１２８】
本発明の医薬組成物は、単位剤形または複数剤形において提供され得る。各単位用量は、典型的には、必要な薬学的に許容され得る賦形剤と一緒に有効量の活性剤を含有する。単位剤形の例としては、アンプルおよびシリンジ、ならびに個々にパッケージングされた錠剤またはカプセルが挙げられる。単位用量非経口製剤は、例えば、アンプル、カートリッジ、バイアル、または針を有するシリンジにパッケージングされ得る。単位剤形は、その一部または複数において投与され得る。複数剤形は、分離単位剤形において投与すべき単一容器にパッケージングされた複数の同一の単位剤形である。複数剤形の例としては、バイアル、錠剤もしくはカプセルのボトル、またはパイントまたはガロンのボトルが挙げられる。したがって、複数剤形は、パッケージングにおいて分離されていない複数の単位用量である。
【０１２９】
本発明のＡＳＣリガンドを非経口投与することが好ましい場合がある。
【０１３０】
非経口投与は、注射または注入、例えば皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射または注入により達成され得る。あるいは、非経口投与は、吸入により達成され得る。非経口投与のための医薬組成物は、液体溶液もしくは懸濁液、エマルジョンとして、または投与前に適切な液体媒体により再構成されることができる固体形態において調製され得る。非経口投与のための医薬組成物は、典型的には、バイアル、ＩＶバッグ、アンプル、カートリッジまたはプレフィルドシリンジ中に保存される。
【０１３１】
非経口投与のための医薬組成物としては、好ましくは、投与可能な滅菌溶液、懸濁液もしくはエマルジョン、または使用前に適切な溶媒により希釈されなければならないそれらの濃縮形態が挙げられる。溶液、懸濁液およびエマルジョンは、水性または非水性のいずれかであり得る。
【０１３２】
水性ビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張性デキストロース注射液、滅菌水射液、デキストロースおよび乳酸加リンゲル注射液が挙げられる。非水性ビヒクルとしては、植物起源の固定油、アーモンド油、油性エステル、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油およびピーナッツ油が挙げられる。液体医薬組成物は、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、安定剤、溶解促進剤、抗菌剤、等張剤、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁剤および分散剤、乳化剤、封鎖剤またはキレート剤をさらに含み得る。静菌または静真菌濃度の抗菌剤としては、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、ソルビン酸ならびに塩化ベンゼトニウムが挙げられる。等張剤としては、塩化ナトリウムおよびデキストロースが挙げられる。緩衝液としては、リン酸塩およびクエン酸塩が挙げられる。抗酸化剤としては、重硫酸ナトリウムが挙げられる。局所麻酔剤としては、塩酸プロカインが挙げられる。懸濁剤および分散剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。乳化剤としては、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ８０）が挙げられる。金属イオンの封鎖剤またはキレート剤としては、ＥＤＴＡまたはシクロデキストリンが挙げられる。増粘剤および可溶化剤としては、グルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールが挙げられる。懸濁剤としては、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂が挙げられる。乳化剤としては、レシチンまたはアカシアが挙げられる。目的のさらなる賦形剤としては、水混和性ビヒクルのためのポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール；ｐＨ調整のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸が挙げられる。
【０１３３】
静脈内投与のための液体医薬組成物は、好ましくは、滅菌および等張性である。適切な賦形剤は、好ましくは、滅菌および等張水性ビヒクル、例えば担体としての生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤または可溶化剤、例えばグルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを含む。
【０１３４】
医薬組成物は、送達系、例えばリポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、微粒子またはマイクロカプセルを含み得る。
【０１３５】
医薬組成物は、本明細書において定義される神経変性疾患を治療または予防するために有用なさらなる活性剤をさらに含み得る。このようなさらなる活性剤は、向知性剤、神経保護剤、抗パーキンソン病薬、アミロイドタンパク質沈着阻害剤、ベータアミロイド合成阻害剤、抗鬱剤、抗不安薬、抗精神病薬および抗多発性硬化症薬またはそれらの組み合わせから選択され得る。
【０１３６】
キット
さらなる態様において、本発明は、本発明のＡＳＣリガンド、核酸、ベクター、宿主細胞、医薬組成物またはそれらの任意の組み合わせを含むキットまたはパーツキットに関する。場合により、キットは、セクション「（医薬）組成物」において記載されている薬学的に許容され得る賦形剤またはさらなる活性剤をさらに含んでもよい。
【０１３７】
ＡＳＣリガンド、核酸、ベクター、宿主細胞または医薬組成物は、任意の適切な形態、例えば液体または凍結乾燥形態において提供され得る。
【０１３８】
キットまたはパーツキットは、２つ以上のパーツのキットであり得、典型的には、適切な容器中にその構成要素を含む。例えば、各容器は、バイアル、ボトル、スクイズボトル、ジャー、密封スリーブ、エンベロープもしくはポーチ、チューブもしくはブリスターパッケージの形態、または構成要素の時期尚早の混合を防止するように容器が構成されている限り、任意の他の適切な形態であり得る。異なる各構成要素は別々に提供され得るか、または異なる構成要素のいくつかは一緒に（すなわち、同じ容器において）提供され得る。
【０１３９】
薬剤師または医師による意図的な混合の前に、ある区画の内容物が別の区画の内容物と物理的に会合することができない限り、容器はまた、バイアル、チューブ、ジャーまたはエンベロープまたはスリーブまたはブリスターパッケージまたはボトル内の区画またはチャンバーであり得る。
【０１４０】
キットまたはパーツキットは、その構成要素のいずれかの使用、投与および投与量に関する情報を伴う技術説明書をさらに含有し得る。
【０１４１】
医療用途および治療
さらなる態様において、本発明は神経変性疾患を治療する方法であって、有効量の本発明のＡＳＣリガンド、核酸分子、ベクター、宿主細胞もしくは医薬組成物またはそれらの任意の組み合わせを、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
【０１４２】
このような方法は、その有効量を被験体に投与する前に、本発明のＡＳＣリガンド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または医薬組成物を調製する任意選択の第一の工程を含み得る。
【０１４３】
神経変性疾患：
本発明は、神経変性疾患を治療または予防するためのＡＳＣリガンドを提供する。神経変性疾患は、典型的には、中枢神経系（ＣＮＳ）の個別領域、例えば脳におけるニューロンの段階的喪失を特徴とする慢性進行性障害である。
【０１４４】
本発明のＡＳＣリガンドの使用により治療または予防されることが想定される神経変性疾患は、好ましくは、認知症を特徴とし得および／またはそれを伴い得る。「認知症」は、日常生活を妨げるのに十分に深刻な精神能力の低下の一般用語である。認知症は、記憶、コミュニケーションおよび言語、集中して注意を払う能力、推論および判断、視覚的知覚の低下もしくは喪失またはそれらの組み合わせを含み得る。それは、様々な神経変性疾患において神経変性により引き起こされ得る。
【０１４５】
本発明者らは、自然免疫炎症事象の過程においてその凝集を阻止することができるＡＳＣリガンドが、脳におけるＡβプラークの形成の予防または低減において有用であることを見出した。したがって、本発明のＡＳＣリガンドは、Ａβ関連病状を特徴としおよび／またはそれを伴う神経変性疾患の治療における使用について特に想定される。「Ａβ関連病状」という用語は、脳におけるアミロイド−βの異常産生、沈着および凝集を指す。
【０１４６】
好ましくは、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳性運動失調（Ｓｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ）、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、軽度認知機能障害、パーキンソンプラス症候群、ピック病、進行性孤立性失語症、灰白質変性症［アルパース］、亜急性壊死性脳症またはレビー小体型認知症から選択され、アルツハイマー病が特に好ましい。
【０１４７】
「アルツハイマー病」（「ＡＤ」）は、高齢者における認知症の主な原因である神経変性脳疾患である。ＡＤの症候としては、学習および記憶機能の進行性喪失、人格の変化、神経筋の変化、発作ならびに時折の精神病的行動が挙げられ得る。アルツハイマー病は、記憶および他の認知機能に重要な脳の領域におけるアミロイド−βプラークの沈着を特徴とする。脳のこれらの重要な領域におけるアミロイド−βプラークの沈着は、脳機能を妨害すると考えられる。
【０１４８】
しかしながら、本発明のＡＳＣリガンドの使用は、Ａβプラークの形成を特徴とする神経変性疾患に必ずしも限定される必要はない。ＡＳＣは、様々な生物学的機能を満たすアダプタータンパク質である。したがって、他の神経変性疾患も同様に、本発明のＡＳＣリガンドを用いた治療または予防の対象である。
【０１４９】
本発明の治療または予防に想定されるさらなる神経変性疾患としては、遺伝性運動失調、先天性非進行性運動失調、早期発症小脳性運動失調、遅発性小脳性運動失調、ＤＮＡ修復不全を伴う小脳性運動失調、遺伝性痙性対麻痺、乳児脊髄性筋萎縮症、タイプＩ［ウェルドニッヒ・ホフマン］、遺伝性脊髄性筋萎縮症、中枢神経系に主に影響を与える全身性萎縮、腫瘍随伴性神経筋障害および神経障害、ポリオ後症候群、大脳基底核変性疾患、ハレルフォルデン・スパッツ病、進行性核上性眼筋麻痺［スティール・リチャードソン・オルシェフスキー］、神経性起立性低血圧［シャイ・ドレーガー］、ジストニア、振戦、舞踏病、レストレスレッグス症候群、スティッフマン症候群、錐体外路および運動障害、多発性硬化症、急性播種性脱髄、視神経脊髄炎［デビック］、急性および亜急性出血性白質脳炎［ハースト］、軸周囲脳炎、シルダー病、脳梁中枢性脱髄、橋中央ミエリン溶解、中枢神経系脱髄疾患における急性横断性脊髄炎、亜急性壊死性骨髄炎、同心硬化症、てんかん、局在発症発作を伴う局在関連（限局性）（部分）特発性てんかんおよびてんかん症候群、単純部分発作を伴う局在関連（限局性）（部分）症候性てんかんおよびてんかん症候群、複雑部分発作を伴う局在関連（限局性）（部分）症候性てんかんおよびてんかん症候群、乳児期ミオクローヌスてんかん、新生児痙攣（家族性）、小児欠神てんかん［ピクノレプシー］、欠神てんかん、ミオクローヌスてんかん［衝動性小発作］、ミオクローヌス欠神を伴うてんかん、ミオクロニー失立発作、乳児痙攣、レノックス・ガストー症候群、点頭発作、症候性早期ミオクロニー脳症、ウェスト症候群、持続性部分てんかん［コジェフニコフ］、大発作、小発作、てんかん重積症、大発作てんかん重積症、小発作てんかん重積症、複雑部分てんかん重積症、片頭痛、群発頭痛症候群、血管性頭痛、緊張型頭痛、外傷後慢性頭痛、ナルコレプシーおよびカタプレキシー、クライネ・レヴィン症候群が挙げられる。
【０１５０】
「治療」または「治療すること」は、以下の目標を含む：（１）望ましくない症候もしくは病的状態が、それらを有するとまだ診断されていない被験体において発生することを予防すること；または（２）望ましくない症候もしくは病的状態を抑制すること、すなわち、それらの発症を阻止すること；（３）望ましくない症候もしくは病的状態を改善または軽減すること、すなわち、望ましくない症候もしくは病的状態の退縮を引き起こすこと。
【０１５１】
本発明のＡＳＣリガンド、核酸分子、ベクター、宿主細胞および（医薬）組成物は、ヒトおよびさらには獣医学的医療目的、好ましくはヒト医療目的に使用され得る。したがって、本明細書において使用される場合、「被験体」、「患者」または「個体」という用語は、一般に、キメラおよびトランスジェニック動物および疾患モデルを含むヒトおよび非ヒト動物、好ましくは哺乳動物（例えば、マーモセット、タマリン、クモザル、ヨザル、ベルベットモンキー、リスザルおよびヒヒ、マカク、チンパンジー、オランウータン、ゴリラを含む非ヒト霊長類；ウシ；ウマ；ヒツジ；ブタ；ニワトリ；ネコ；イヌ；マウス、ラット、ウサギ、モルモットなど）を含む。本発明の文脈において、「被験体」という用語は、好ましくは、非ヒト霊長類またはヒト、最も好ましくはヒトを指す。
【０１５２】
「有効量」は、求められている組織、系、動物またはヒトにおいて所望の生物学的または医学的応答を誘発するのために十分な活性剤または組成物の量を意味する。したがって、「有効量」は、好ましくは、治療すべき疾患のポジティブな改変の誘導のために、すなわち、治療されている疾患の症候の緩和、疾患進行の低減、または予防されている疾患の症候の予防のために十分である。しかしながら、同時に、「有効量」は、好ましくは、深刻な副作用を回避するために、すなわち、利点とリスクとの間の合理的な関係を可能にするために十分に安全である（すなわち、少ない）。典型的には、「有効量」は、治療すべき特定の症状、ならびにさらには治療すべき患者の年齢、身体状態、体重、性別および食事、症状の重症度、治療の継続期間、連携療法、使用される特定の薬学的に許容され得る賦形剤の性質、治療レジメンならびに類似要因に関連して変動し得る。「有効量」は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順により決定され得る。「有効量」を決定するために適切な例示的な動物モデルとしては、いかなる限定も意味するものではないが、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌおよび非ヒト霊長類モデルが挙げられる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表され得る。大きな治療指数を示す活性剤または組成物が一般に好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲の策定において使用され得る。このような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。本発明の文脈において、「有効量」は、約０．００１ｍｇ〜１０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜５ｍｇ、約０．１ｍｇ〜２ｍｇ／投与量単位または約０．０１ｎｍｏｌ〜１ｍｍｏｌ／投与量単位、例えば１ｎｍｏｌ〜１ｍｍｏｌ／投与量単位または１μｍｏｌ〜１ｍｍｏｌ／投与量単位の範囲であり得る。「有効量」はまた、（体重１ｋｇ当たり）約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５ｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２．５ｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０１５３】
投与は、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、腹腔内、血管内（ｉｖ）、鼻腔内、経皮、病変内、腫瘍内、頭蓋内、肺内、心臓内、舌下、直腸、口腔または膣投与経路を介して達成され得る。投与は、局所的または全身的であり得る。治療を必要とする領域への局所投与は、例えば限定されないが、手術中の局所注入、例えば、手術後の創傷包帯と併せた局所適用により、注射により、カテーテルを用いて、座薬を用いて、またはインプラントを用いて達成され得る。全身投与は、経口投与により、または無針注射（ジェット注射）および／もしくは針注射であり得る注射により達成され得る。
【０１５４】
ＡＳＣリガンド、核酸、ベクター、宿主細胞または（医薬）組成物は、それを必要とする被験体に１日数回、毎日、隔日、毎週または毎月投与され得る。
【０１５５】
ＡＳＣリガンド、核酸、ベクター、宿主細胞または（医薬）組成物および場合により「医薬組成物」のセクションにおいて記載されている他の活性剤は、（同じまたは異なる投与経路を介して異なる時間に）逐次に、または（同じまたは異なる投与経路を介して同じ時間に）同時に、または同じ医薬組成物においてされる。逐次投与スキームは、「時間差」投与とも称される。時間差投与は、例えば、第一の用量のＡＳＣリガンド、核酸、ベクター、宿主細胞または（医薬）組成物を、第二の用量の同じＡＳＣリガンド、核酸、ベクター、宿主細胞もしくは（医薬）組成物またはある用量の別の活性剤（これは、本発明のＡＳＣリガンド、核酸、ベクター、宿主細胞もしくは（医薬）組成物または別の活性剤であり得る）の前に、それらと同時に、またはそれらの後に投与するレジメンを含む。
【０１５６】
本発明のＡＳＣリガンドをコードする核酸またはベクターはまた、遺伝子治療において使用され得る。「遺伝子治療」は、一般に、治療目的のためのゲノムの操作を指し、疾患を引き起こす突然変異の修正、ゲノムへの治療遺伝子の追加、有害な遺伝子またはゲノム配列の除去および遺伝子発現のモジュレーションのためのゲノム編集技術の使用を含む。遺伝子治療は、被験体の細胞のインビボまたはエクスビボ形質転換を伴い得る。例えば、本発明のＡＳＣリガンドをコードする核酸またはベクターは、神経変性疾患を患っている被験体に投与され得、その場所において、それらは発現されて、コードされるＡＳＣリガンドをもたらす。典型的には、核酸は、コードされるＡＳＣリガンドの移入および発現を可能にする適切なベクターの形態において被験体に送達され得る。このようなベクターは、本明細書の他の箇所において記載されており、例えば、ウイルスベクターを含む。あるいは、核酸は、「ネイキッド」形態において送達され得るか、または脂質、ポリマーもしくは他の適切な錯化剤と複合体形成され得る。
【０１５７】
診断方法およびキット
本発明はさらに、ＡＳＣ凝集体に対する自己抗体の存在を利用する診断方法に関する。本明細書において記載される診断用途および方法は、診断すべき被験体の単離されたサンプルを使用して、インビボまたはインビトロにおいて行われ得る。
【０１５８】
したがって、さらなる態様において、本発明は、被験体における神経変性疾患または神経変性疾患の発症リスクを診断する方法において使用するためのＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）であって、前記方法が、（ｉ）前記サンプルを、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片、誘導体もしくは凝集体と接触させる工程と、（ｉｉｉ）前記ＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片、誘導体もしくは凝集体へのアナライトの結合を検出する工程とを含む、ＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）に関する。
【０１５９】
さらに、本発明はまた、被験体における神経変性疾患または神経変性疾患の発症リスクを診断する方法であって、（ｉ）場合により、前記疾患に罹患していると疑われるかまたはその発症リスクがある被験体からサンプルを収集する工程と、（ｉｉ）前記サンプルを、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片、誘導体もしくは凝集体と接触させる工程と、（ｉｉｉ）前記ＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片、誘導体もしくは凝集体へのアナライトの結合を検出する工程とを含む方法に関する。
【０１６０】
診断用途および方法は、前記ＡＳＣ結合タンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片、誘導体または凝集体を固体支持体上に提供することを伴い得る。アナライトの検出は、免疫拡散、イムノブロッティング技術、免疫蛍光、酵素免疫測定法、およびマルチプレックスビーズ系アッセイのためのフローサイトメトリーを含む周知の技術を使用して達成され得る。
【０１６１】
アナライトは、好ましくは自己抗体であり得る。自己抗体は、前記抗体を産生する宿主の抗原を認識するかまたはそれと結合する抗体である。本発明者らは、ヒト抗ＡＳＣ凝集体抗体が、脳におけるアミロイド−βペプチドのクロスシーディングを防止し得ることを提案する。しかしながら、老化に関連した免疫老化中の抗体生成および免疫監視の機能障害は、ＡＳＣ凝集体に対する自己抗体の産生レベルの低下およびしたがってアミロイド−β凝集のリスク上昇につながり得る。したがって、内因性抗ＡＳＣ凝集体抗体力価は、特にアルツハイマー病などの神経変性疾患の臨床的に無症状の前段階において、可能な疾患進行マーカーとして使用され得る。
【０１６２】
したがって、前記診断用途および方法は、サンプル中のアナライトを定量し、場合により前記量を参照と比較するさらなる工程を含み得る。
【０１６３】
参照は、健常被験体または前記健常被験体に由来するサンプルを同じ診断方法に供することにより得られる抗体力価などの値であり得る。参照は、診断すべき被験体とは異なる被験体に由来し得るか、またはより早い時点における診断すべき同じ被験体に由来したものであり得る。参照はまた、複数の健常被験体に由来する抗体力価などの値、例えば中央値であり得る。
【０１６４】
参照と比較して、診断すべき被験体または診断すべき前記被験体に由来するサンプル中のアナライトの量の減少は、神経変性疾患または前記疾患の発症リスクのリスクを示す。老化中の免疫監視および自己抗体産生の減少は、アミロイド−β凝集のリスクを増加させると考えられる。
【０１６５】
したがって、本明細書において記載される診断用途および方法は、好ましくは、ＡＳＣ凝集および／またはアミロイド−β凝集の存在を特徴とし得るかまたはそれを伴い得る。
【０１６６】
好ましくは、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳性運動失調（Ｓｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ）、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、軽度認知機能障害、パーキンソンプラス症候群、ピック病、進行性孤立性失語症、灰白質変性症［アルパース］、亜急性壊死性脳症またはレビー小体型認知症から選択され得、アルツハイマー病が特に好ましい。
【０１６７】
本発明はさらに、本明細書において記載される診断方法および用途を行うための診断キットであって、ＡＳＣタンパク質またはＡＳＣ凝集体と、前記タンパク質または凝集体への自己抗体の結合を検出するための検出手段とを含むキットを提供する。
【０１６８】
併用療法
本発明のＡＳＣリガンド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または医薬組成物はまた、併用療法において使用される。そのために、神経変性疾患を治療または予防するために有用な任意の治療的または予防的手段が、本発明の治療と組み合わせて使用され得る。
【０１６９】
したがって、神経変性疾患に罹患している被験体は、本発明のＡＳＣリガンド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または医薬組成物を用いて治療され得、加えて、以下の化合物または活性剤の１つ以上を受け得る：コリンエステラーゼ阻害剤、例えばドネペジル、ガランタミン、リバスチグミンまたはタクリン；ＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）受容体アンタゴニスト、例えばメマンチン；ビタミンＥ；ビタミンＡ；アルファ−トコフェロール；セレン；亜鉛；葉酸；ビタミンＢ１２；オメガ−３脂肪酸；ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）；またはそれらの組み合わせ。これらの化合物および活性剤は、本発明のＡＳＣリガンド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または医薬組成物と比較して、時間差投与スキームにより同時投与または逐次投与され得る。
【０１７０】
インビトロ方法
さらなる態様において、本発明はまた、候補リガンドが、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片もしくは誘導体と相互作用、好ましくは結合することができるかを決定するためのインビトロ方法であって、（ｉ）前記候補リガンドを、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片もしくは誘導体と接触させる工程；および（ｉｉ）前記候補リガンドの結合を検出する工程とを含むインビトロ方法を提供する。
【０１７１】
前記方法は、候補リガンドがインビトロにおいてａ）ＡＳＣ凝集および／またはｂ）アミロイド−β凝集を阻害するかを評価する工程をさらに含み得る。このさらなる方法工程は、添付の実施例において記載されている方法を使用して達成され得る。
【０１７２】
さらなる態様において、本発明は、ＡＳＣリガンドのインビトロスクリーニング方法であって、（ａ）配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＳＣタンパク質またはそのホモログ、アイソフォーム、変異体、断片もしくは誘導体を用意する工程、（ｂ）前記ＡＳＣタンパク質を候補リガンドと接触させる工程；および（ｃ）前記ＡＳＣタンパク質への前記候補リガンドの特異的結合を検出する工程を含む方法を提供する。
【０１７３】
本発明はさらに、前記方法により取得可能なＡＳＣリガンドであって、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸または低分子有機化合物から選択されるＡＳＣリガンドに関する。
【０１７４】
さらなる態様において、本発明は、サンプル中のＡＳＣ凝集体の存在を決定するためのインビトロ方法であって、ｉ）被験体から得られたサンプルを、本明細書において記載されるＡＳＣリガンドと接触させる工程、およびｉｉ）前記ＡＳＣリガンドの特異的結合を検出する工程を含み；前記ＡＳＣリガンドの検出可能な結合が、前記被験体におけるＡＳＣ凝集体の存在を示すインビトロ方法に関する。
【０１７５】
サンプルは、例えば、脳生検であり得る。前記ＡＳＣリガンドの検出可能な結合は、ＡＳＣ凝集および／またはアミロイド−β凝集の存在を特徴とするかまたはそれらを伴う神経変性疾患またはその発症リスクを示し得る。前記神経変性疾患は、本明細書において記載される神経変性疾患のいずれかから選択され得、好ましくはアルツハイマー病であり得る。
【０１７６】
図面
以下において、添付の図面の簡単な説明が示されている。図は、本発明をより詳細に説明するものである。しかしながら、それらは、決して本発明の主題を限定するものではない。
【０１７７】
図１  ミクログリア放出ＡＳＣスペックは、β−アミロイドペプチドと結合してクロスシードする。（ａ）ＡＤ脳および年齢適合非認知症対照（対照）の海馬切片におけるミクログリアの内側（対照−内側、ＡＤ−内側）および外側（対照−外側、ＡＤ−外側）において検出されたＡＳＣスペック、（ｎ＝１０の生物学的に独立したヒト症例、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１）（ｂ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬におけるＡＳＣスペック含有ミクログリアおよびＡＳＣスペック不含ミクログリアならびに様々な年齢における定量（（ｎ＝５の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、＊＊＊ｐ＜０．０００２）（ａ、ｂ：バー＝１０μｍ）。（ｃ）ナイジェリシン（１０μＭ）またはＡＴＰ（５ｍＭ）への曝露時にＬＰＳプライミングマウスミクログリアにより放出されたＡｌｅｘａ−４８８標識ＡＳＣスペックのフローサイトメトリー（ｄ）休止または活性化ミクログリアの無細胞上清１μｌ当たりのＡＳＣ−Ａｌｅｘａ  ４８８＋スペックの定量（ｎ＝３の技術的反復、平均±ＳＤ）および細胞外ＡＳＣスペックの拡大を含むＬＰＳプライミングＡＴＰ活性化ミクログリアの共焦点イメージング（バー＝６μｍ）。（ｅ）ＴＨＰ−１細胞への細胞外ＴＡＭＲＡ−Ａβ１−４２結合は、ＧＦＰ連結ＡＳＣスペックを放出させた。（ｆ）免疫刺激初代ミクログリアによるＡＳＣ放出を用いたＡβ結合実験の実験概略図。（ｇ）Ａβ１−４２の存在下および非存在下におけるｗｔまたはＡＳＣ−／−および対照（対照）および免疫刺激（活性化）初代ミクログリア由来の上清のフローサイトメトリー分析、ならびに（ｈ）ｗｔおよびＡＳＣ−／−上清におけるＡＳＣ／Ａβ１−４２事象の数の定量（ｎ＝４の生物学的に独立した実験、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｉ）ＡＳＣスペックおよびＡβ１−４２コインキュベーションのチオフラビン−Ｔ蛍光アッセイ（ｎ＝２の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ）（ｊ）イムノブロット検出によるＡＳＣスペック増強Ａβ１−４２オリゴマー形成の確認、および（ｋ）単一時点における定量（ｎ＝４の生物学的に独立した実験、平均±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定、２時間＊＊ｐ＝０．００８９、４時間＊＊ｐ＝０．００９３、６時間＊＊＊ｐ＝０．００１、２４時間＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ｄ、ｉ、ｊに示されている実験を独立して２回反復した。
【０１７８】
図２  ＡＳＣスペックはＡβと共沈降し、マウスおよびヒトＡβプラークのコアを形成する。（ａ）０および６時間の時点におけるＡＳＣスペック−Ａβ共沈降実験の概略図。（ｂ）（１）Ａβ１−４２もしくはＡβ１−４０のみ、（２）ＡＳＣスペックと一緒のＡβ１−４２もしくはＡβ１−４０または（３）ＡＳＣスペックのみのいずれかのインビトロインキュベーションの上清（ｓｕｐ）およびペレット（ｐｅｌｌｅｔ）。Ａβ１−４０またはＡβ１−４２のいずれかとのコインキュベーション後０および６時間の時点におけるＡＳＣスペックレベルのデンシトメトリーは、パーセンテージとして示されている（ｎ＝４の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ））（ｃ）野生型（ｗｔ）およびＡＰＰ／ＰＳ１（ｔｇ）脳ホモジネートにおける検出のためのＡβ抗体８２Ｅ１を使用してＡβ−ＡＳＣスペック結合を実証する共免疫沈降実験、ならびに（ｄ）３、８および１２カ月齢における定量（ｎ＝４の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｅ）スクロース勾配遠心分離による、８カ月のＡＰＰ／ＰＳ１（ｔｇ）および野生型（ｗｔ）マウス由来のマウスＡβ沈着物の綿状線維およびコア区画のドットブロット分析。（ｆ）ＡＳＣ（ＡＬ１７７）およびＡβ（６Ｅ１０）抗体を使用した、４カ月（４ｍ）のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける初期Ａβ沈着物の共免疫組織化学（バー＝１０μｍ）。（ｇ）年齢適合非認知症対照（対照）およびアルツハイマー病患者（ＡＤ）由来のヒト脳ホモジネートにおけるＡＳＣ結合Ａβを検出する免疫沈降実験、ならびに（ｈ）定量（ｎ＝２７の生物学的に独立したヒト症例、平均±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｉ）スクロース勾配遠心分離による、年齢適合非認知症対照（対照）、ＡＤ（ＭＣＩ）およびＡＤによる軽度認知機能障害を患っている患者由来のＡβ沈着物の綿状線維およびコア区画のドットブロット分析。（ｊ）ＡＳＣ（ＡＬ１７７）およびＡβ（６Ｅ１０）抗体を使用した、ＡＤ患者の海馬における沈着物の共免疫組織化学。矢印は、ＡＬ１７７（赤色）および６Ｅ１０（緑色）免疫陽性を示す（バー＝１０μｍ）。ｃ、ｅ、ｇおよびｈに示されている実験を独立して３回反復した。ｆ、ｈに示されている実験を独立して５回反復した。
【０１７９】
図３  ＡＳＣノックアウトは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡβ病状および空間記憶障害を低減した。Ａβ負荷および空間記憶機能障害について、ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスおよび各対照を分析した。（ａ）抗体６Ｅ１０を使用してＡβを染色した海馬（バー＝５００μｍ）の代表的な顕微鏡写真。（ｂ）総Ａβ免疫染色面積およびＡβ免疫陽性沈着物の数（ｎ＝８の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｃ）モリス水迷路において、空間記憶を評価した（平均±ＳＥＭ）。ｗｔ、ＡＳＣ−／−、ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスにおける、隠されたプラットフォームに到達するために必要な時間（待ち時間）。（ｄ）積分移動時間（ＡＵＣ＝曲線下面積）（ｗｔついてはｎ＝１２、ＡＳＣ−／−ついてはｎ＝１９、ＡＰＰ／ＰＳ１ついてはｎ＝１４、およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−ついてはｎ＝２１の生物学的に独立した動物の平均±ＳＥＭ；一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、ＡＰＰ／ＰＳ１対ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−：＊＊＊ｐ＝０．０００９、他：＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｅ）空間探査試験９日目に、プラットフォームを除去し、象限において費やされた時間を記録した。Ｑ１：１〜８日目のプラットフォーム位置。すべての他の象限において費やされた時間の値を平均化した（ｏ．ａ．）（ｗｔついてはｎ＝１２、ＡＳＣ−／−ついてはｎ＝１９、ＡＰＰ／ＰＳ１ついてはｎ＝１４、およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−ついてはｎ＝２１の生物学的に独立した動物の平均±ＳＥＭ；一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、ＡＰＰ／ＰＳ１＊＊＊ｐ＝０．０００２、ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−＊ｐ＝０．０２３６）。（ｆ）単一のマウスの代表的なラン。（ｇ）ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスは、３カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１またはｗｔマウスのいずれか由来のライセート（ｌｙｓ）の両側海馬注射を受けた。８カ月の時点において、脳を分析した。注射海馬の代表的な顕微鏡写真（バー＝５００μｍ）。（ｈ）総Ａβ免疫染色面積（総面積）またはＡβ沈着物の数について検出されたように、ＡＰＰ／ＰＳ１脳ライセート注射は、ｗｔ脳ライセートと比較して、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてはＡβ病状を増加させたが（ＡＰＰ／ＰＳ１−ライセート対ｗｔ−ライセート）、ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−動物においては増加させなかった（ｎ＝８の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、＊ｐ＝０．０２５２、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｉ）独立した動物群由来の解剖海馬のＥＬＩＳＡ分析により、組織学的評価が確認された（ｎ＝１０の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｊ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）およびｃ末端切断断片（α−ＣＴＦ、β−ＣＴＦ）のレベルは依然として変化しなかった。非注射ＡＰＰ／ＰＳ１またはＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−脳（非注射）およびｗｔ脳は対照として機能した、（ｋ）デンシトメトリー定量（ｎ＝８の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキ��検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。組換えＡβ１−４２ペプチドは陽性対照として機能した（陽性対照）。ａ、ｇに示されている実験を独立して２回反復し、ｊに示されている実験を独立して４回反復した。
【０１８０】
図４  ＡＳＣ欠損ＡＰＰ／ＰＳ１脳ライセートまたは抗ＡＳＣ抗体共注射によるＡβ病状の拡大の低減。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、３カ月のＡＰＰ／ＰＳ１またはＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−動物のいずれか由来の脳ライセートの両側海馬内注射を受けた。８カ月の時点において、抗体６Ｅ１０を使用してＡβ免疫染色により、Ａβ沈着を定量した。（ａ）注射海馬の代表的な顕微鏡写真（バー＝５００μｍ）。（ｂ）総Ａβ免疫染色面積およびＡβプラークの数（ｎ＝５の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ  テューキー検定、総面積：＊ｐ＝０．０１０５、＊＊＊ｐ＝０．０００３、Ａβ沈着物の数：ＡＰＰ／ＰＳ１対ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−＊＊ｐ＝０．００１１、ＡＰＰ／ＰＳ１対非注射＊＊ｐ＝０．００８１）。（ｃ）ＡＰＰ、α−およびβ−Ｃ末端断片（α−ＣＴＦおよびβ−ＣＴＦ）、総Ａβについて脳ライセートをイムノブロットし、（ｄ）脳Ａβモノマーおよびオリゴマー（＞２０ｋＤａ）レベルについて定量した（ｎ＝５の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、モノマー：＊ｐ＝０．０４９７、＊＊ｐ＝０．００９７、オリゴマー：ＡＰＰ／ＰＳ１対ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−＊＊＊ｐ＝０．０００１、ＡＰＰ／ＰＳ１対非注射ｐ＝０．０００８）。（ｅ）ＡＳＣスペックおよび漸増濃度の抗ＡＳＣスペック抗体またはアイソタイプ特異的ＩｇＧ（ｉｓｏ−ＩｇＧ）対照（ＩｇＧ１／２）とのＡβ１−４０コインキュベーションのチオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）アッセイ。（ｆ）抗ＡＳＣスペック抗体またはｉｓｏ−ＩｇＧと共にＡＰＰ／ＰＳ１脳ライセートを両側注射したＡＰＰ／ＰＳ１マウス。ｉｓｏ−ＩｇＧまたは抗ＡＳＣスペック抗体を注射した海馬の代表的な顕微鏡写真（バー＝５００μｍ）。（ｈ）総Ａβ免疫染色面積およびＡβプラークの数（ｎ＝５の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ  テューキー検定、＊＊ｐ＝０．００５８、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｇ）（ｃ）に記載されているように脳ライセートをイムノブロットし、（ｉ）脳Ａβモノマーおよびオリゴマー（＞２０ｋＤａ）レベルについて定量した（ｎ＝５の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、モノマー：ＡＰＰ／ＰＳ１＋Ｉｓｏ−ＩｇＧ対ＡＰＰ／ＰＳ１＋抗ＡＳＣ  ＊＊＊ｐ＝０．０００２、ＡＰＰ／ＰＳ１＋Ｉｓｏ−ＩｇＧ対非注射  ＊＊＊ｐ＜０．０００１、オリゴマー：＊ｐ＝０．０４１８、＊＊ｐ＝０．００５３）。ａ、ｆに示されている実験を２回実施し、ｃ、ｇに示されている実験を独立して４回反復した。ｅに示されている実験を独立して３回反復した。
【０１８１】
図５  マウスおよびヒトにおけるミクログリアＡＳＣスペック形成の特徴。一次または二次抗体のいずれかを省略した、（ａ）アルツハイマー病患者（ＡＤ）または（ｂ）非認知症対照（対照）の脳由来の切片におけるミクログリアマーカーＣＤ１１ｂおよびＡＳＣの免疫組織化学（バー＝１５μｍ）。（ｃ）ＡＤ患者脳（ＡＤ−内側、ＡＤ−外側）および非認知症年齢適合対照（対照−内側、対照−外側）（ｎ＝１０の生物学的に独立したヒト症例、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１）または（ｄ）月単位（ｍ）により示されている表示年齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬（ｎ＝１０の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１）由来の切片におけるミクログリア細胞の内側および外側の免疫組織化学により検出されたＡＳＣスペックのパーセンテージ。（ｅ）観察されたＡβ沈着物と結合したＡＳＣスペックの数／視野（ｎ＝５の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定、＊ｐ＝０．０２１６）（ｆ）４、８、１２および２４カ月齢の野生型（ＷＴ）およびＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウス由来の脳ライセートにおけるＡＳＣ発現（ｇ）８カ月齢の野生型（ｗｔ）、ＡＳＣ−／−、ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスの海馬切片を、一次および二次抗体の存在下において（左パネル）、または各一次抗体の非存在下において（右パネル）、ミクログリアマーカーＣＤ１１ｂおよびＡＳＣについて染色した（バー＝１５μｍ）。（ｈ）８カ月齢のｗｔ、ＡＳＣ−／−、ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスの海馬切片を、一次および二次抗体の存在下において（左パネル）、または各二次抗体の非存在下において（右パネル）、ミクログリアマーカーＣＤ１１ｂおよびＡＳＣについて染色した（バー＝１５μｍ）。ａ、ｂ、ｇ、ｈに示されている実験を独立して３回反復し、ｃ、ｄ、ｅに示されている実験を１回実施した。ｆに示されている実験を独立して２回反復した。
【０１８２】
図６  初代マウスミクログリアおよびヒトＴＨＰ１細胞における実験的ＡＳＣスペック形成。（ａ）ＡＳＣスペックをゲーティングするために２および６μｍ蛍光ビーズを使用した、初代マウスミクログリアからの馴化培地のフローサイトメトリー分析。（ｂ）対照溶媒（対照）、ＬＰＳのみ、またはＬＰＳとそれに続くナイジェリシン（ＬＰＳ＋Ｎｉｇ）またはＡＴＰ（ＬＰＳ＋ＡＴＰ）のいずれかに曝露した初代マウスミクログリアの共焦点イメージング。抗ＡＳＣ抗体、続いてＡ４８８コンジュゲートを用いて、細胞を染色した。矢印は、細胞外ＡＳＣスペックを示す（バー＝２４μｍ；挿入図は、四角により示されている領域の４倍（左下）および８倍（右下）の倍率である）（ｃ）未処理（−）またはＬＰＳプライミングナイジェリシン活性化（１０μＭ）（ＬＰＳ＋Ｎｉｇ）ＡＳＣ−ｍＣｅｒｕｌｅａｎ発現ＴＨＰ−１細胞の無細胞上清におけるＡＳＣスペックの検出のためのゲーティング戦略。（ｄ）細胞外空間における緑色蛍光ＡＳＣスペックを示す、ＬＰＳプライミングナイジェリシン処理ＴＨＰ−１の共焦点イメージング（バー＝３８μｍ、８μｍ）。（ｅ）代表的な２回の独立した実験からの無細胞上清における細胞外スペックの定量（ｎ＝３の技術的反復、平均±ＳＤ）。（ｆ）ＴＡＭＲＡ−Ａβ１−４２の非存在下におけるＴＨＰＲＡ−１細胞の画像は、（ｇ）ＴＡＭＲＡ−Ａβ表面結合および早期取り込み、（ｈ）ＡＳＣのその後のアップレギュレーション（緑色）、（ｉ）ＴＡＭＲＡ−Ａβ１−４２を取り込んだ細胞における早期ＡＳＣスペック、および（ｊ）細胞内に形成されたＡＳＣスペックを示す。ａ、ｂ、ｃおよびｆ〜ｊに示されている実験を独立して３回反復し、ｄ、ｅに示されている実験を２回実施した。
【０１８３】
図７  Ａβ−ＡＳＣ結合の定性的および定量的説明。（ａ）実験デザインおよびタイムライン：３時間ＬＰＳおよび１時間ナイジェリシンは、ＡＳＣスペック放出を引き起こす高炎症性型プログラム細胞死（ピロトーシス）を誘導する。続いて、ＡＳＣスペックを含有する上清をＡβ１−４２と共に６時間インキュベートし、その後、フローサイトメトリーにより分析した。（ｂ）上パネル：未刺激免疫活性化野生型（ｗｔ）およびＡＳＣノックアウト（ＡＳＣ−／−）マクロファージにおけるＡＳＣの免疫沈降およびイムノブロット検出。ＡＳＣモノマー検出は、免疫活性化ＡＳＣコンピテントｗｔ細胞の上清に限定され、未刺激ｗｔ細胞またはＡＳＣ−／−マクロファージにおいて存在しない。下パネル：上パネルについて記載されているのと同じ実験条件下におけるＡＳＣの免疫沈降とそれに続くＡβのイムノブロット検出。ＡＳＣ結合Ａβは、免疫活性化ｗｔマクロファージ由来の上清においてのみ検出され、未刺激ｗｔまたはＡＳＣ−／−細胞由来の上清において検出されない。（ｃ）上パネル：未刺激免疫活性化ｗｔおよびＡＳＣ−／−ミクログリアにおけるＡＳＣの免疫沈降およびＡＳＣのイムノブロット検出。ＡＳＣモノマー検出は、免疫活性化ＡＳＣコンピテントｗｔ細胞の上清に限定され、未刺激ｗｔ細胞またはＡＳＣ−／−マクロファージにおいて存在しない。下パネル：上パネルについて記載されているのと同じ実験条件下におけるＡＳＣの免疫沈降とそれに続くＡβのイムノブロット検出。ＡＳＣ結合Ａβは、免疫活性化ｗｔミクログリア由来の上清においてのみ検出され、未刺激ｗｔまたはＡＳＣ−／−細胞由来の上清において検出されない。（ｄ）ゲーティング戦略および対照群：破片をゲーティングして、残りの細胞およびより大きな粒子を排除する。独立した象限Ｑ１およびＱ３における、ＣＦＰにより標識した組換えＡＳＣおよびＴＡＭＲＡシグナルにより標識したＡβ１−４２。一緒にインキュベートすると、分子は蓄積し、シグナルをＱ２に送る。（ｎ＝３の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｅ）実験群：ＡＳＣ−ｍＣｅｒｕｌｅａｎ発現不死化マクロファージは、同様の結果を示す。ＡＳＣ−／−マクロファージは、ＡＳＣスペック形成およびＡβ１−４２蓄積を示さない（ｎ＝３の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、活性化＋Ａβ１−４２対対照＊＊＊ｐ＝０．０００２、活性化＋Ａβ１−４２対対照＋Ａβ１−４２＊＊＊ｐ＝０．０００９、活性化＋Ａβ１−４２対活性化＊＊＊ｐ＝０．０００２）。（ｆ）ミクログリアの免疫刺激後のＡＳＣ−ＴＡＭＲＡ標識Ａβ１−４０のフローサイトメトリー定量。実験デザインおよびタイムライン：３時間ＬＰＳおよび１時間ＡＴＰは、ＡＳＣスペックを放出させる高炎症性型プログラム細胞死（ピロトーシス）を誘導する。続いて、ＡＳＣスペックを含有する上清をＡβ１−４０と共に３時間インキュベートし、その後、ＦＡＣＳにより分析した。ｂに示されている実験を独立して３回反復した。
【０１８４】
図８  高純度ＡＳＣスペックの生成のための免疫沈降および酵素的切断ベースの方法。（ａ）インフラマソームアセンブリによるＡＳＣスペック形成ならびに免疫沈降および酵素的切断によるＡＳＣスペックの精製の概略図。不死化ＡＳＣ欠損マクロファージに、Ｆｌａｇタグを有するＡＳＣ−ｍＣｅｒｕｌｅａｎと、ＡＳＣおよびｍＣｅｒｕｌｅａｎの間のタバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）のプレシジョンサイトとを含有する構築物を形質導入した。これらの細胞におけるインフラマソーム活性化は、ＡＳＣ凝集およびＡＳＣスペックの形成をもたらす。ｍＣｅｒｕｌｅａｎおよびＦｌａｇタグを含有するＡＳＣスペックを免疫精製し、続いて、ＴＥＶプロテアーゼによりｍＣｅｒｕｌｅａｎ−Ｆｌａｇタグをタンパク質分解切断して、純粋なＡＳＣスペックを生成し得る。（ｂ）抗ＧＦＰ抗体を使用した免疫沈降とそれに続くＴＥＶプロテアーゼの酵素的切断の前（−）または後にＡＳＣ−ｍＣｅｒｕｌｅａｎ−Ｆｌａｇマクロファージから単離されたＡＳＣスペックのイムノブロッティング分析。（ｃ）未処理対ＩＰ＋ＴＥＶ処理ＡＳＣスペックにおけるＡＳＣおよびＧＦＰの免疫染色後の共焦点イメージング（バー＝３．８μｍ（上列）、６．３μｍ（中央列）、９μｍ（下列））。（ｄ）ＡＳＣ−ｍＣｅｒｕｌｅａｎ−Ｆｌａｇマクロファージから単離された抗ＡＳＣ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８および抗ＧＦＰ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７二重染色ＡＳＣスペックのフローサイトメトリー分析。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８または６４７とコンジュゲートした抗マウスＩｇＧを対照として使用した（下パネル）。ｂ〜ｄに示されている実験を独立して４回反復した。
【０１８５】
図９  ＡＳＣスペックは、時間および濃度依存的にＡβペプチドの凝集傾向を増加させる。（ａ）ＡＳＣスペックおよびＡβ１−４０コインキュベーションのチオフラビン−Ｔ蛍光アッセイは、時間依存的なＡＳＣスペックのクロスシーディング効力を示す。（ｂ）Ａβ１−４０の時間依存的なＡＳＣスペック誘発性凝集のウエスタンブロット検出。ＡＳＣスペックとのＡβ１−４０のコインキュベーションは凝集傾向を増加させ、高分子量Ａβオリゴマーおよび前原線維の形成を増加させた。（ｃ）表示時点における定量（ｎ＝４の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定、６時間：＊＊＊ｐ＝０．０００２、４および２４時間＊＊＊ｐ＜０．０００１）、（ｄ）０および２４時間の時点における、漸増濃度のＡＳＣスペック（０．０〜１．７５μＭ）と共にコインキュベートしたＡβ１−４２のウエスタンブロット分析。（ｅ）０および２４時間の時点における、漸増濃度のＡＳＣスペック（０．０〜１．７５μＭ）と共にコインキュベートしたＡβ１−４０のウエスタンブロット分析。両Ａβペプチドについて、ＡＳＣスペックとのコインキュベーションは凝集傾向を増加させ、高分子オリゴマーの形成を増加させた。Ａβ１−４２については、オリゴマー形成の増加は、Ａβモノマーおよびダイマーレベルの減少と平行することに注意する。（ｆ）９６時間のインキュベーション後のＡβ１−４２、ＡＳＣおよびＡＳＣ−Ａβ１−４２凝集の電子顕微鏡検査（バー＝２００ｎｍ）。（ｇ）濁度アッセイによるＡＳＣスペック増強Ａβ１−４０およびＡβ１−４２凝集の確認（ｎ＝３の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ）。（ｈ）ＡＳＣスペックおよびＡβ４２−１コインキュベーションのチオフラビン−Ｔ蛍光アッセイは、逆ペプチドに対するＡＳＣスペックのクロスシーディング能力がないことを示す。（ｉ）ＡＳＣスペックおよび２つの異なる濃度のウシ血清アルブミンとのＡβ１−４０コインキュベーションのチオフラビン−Ｔ蛍光アッセイ。ＡＳＣスペックは、時間依存的にＡβ１−４０をクロスシードするが、０．２２μＭおよび０．６６μＭ  ＢＳＡはいずれも、Ａβ１−４０凝集に影響を及ぼさなかった。ａ、ｂ、ｄおよびｅに示されている実験を独立して４回反復し、ｆ、ｈ、ｉに示されている実験を独立して３回反復した。
【０１８６】
Ｆｒａｎｋｌｉｎらによる刊行物（Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４，１５（８）：７２７−７３７）には、ＡＳＣとその細胞外活性および炎症を伝播するプリオノイド活性が記載されている。その中で、著者らは、ＡＳＣスペックをオプソニン化し、もって炎症を増大させるＡＳＣ抗体について説明する。しかし、その結果生じる炎症はアルツハイマー病の病因として二次的なものである。本発明により見出されたものは、アルツハイマー、例えばＡβ凝集によってトリガーされる炎症性事象の病因として極めて重大である。図９のインビボ実験は、Ａβ凝集がＡＳＣスペックによりトリガーされることを示す。
【０１８７】
図１０  ＡＳＣ  ＰＹＤドメインは、Ａβクロスシーディングに重要である。（ａ）抗体８２Ｅ１を使用して、Ａβについてイムノブロットをプローブし、Ａβ１−４０の時間依存的な凝集を明らかにした。組換えＡＳＣスペック（ｒｅｃＡＳＣ）とのＡβ１−４０のコインキュベーションは凝集を促進し、高分子量Ａβオリゴマーの形成を増加させる。特に、中間体Ａβオリゴマー（２８〜６２ｋＤａのバンド）の形成が観察され、インキュベーション時間と共に増加する。（ｂ）ＡＳＣのイムノブロットは、時間依存的な自己凝集を明らかにしている。（ｃ）抗体８２Ｅ１を使用して、Ａβについてイムノブロットをプローブし、Ａβ１−４２の時間依存的な凝集を明らかにした。組換えＡＳＣスペック（ｒｅｃＡＳＣ）とのＡβ１−４２のコインキュベーションは凝集を促進し、高分子量Ａβオリゴマーの形成を増加させる。特に、中間体Ａβオリゴマー（２８〜６２ｋＤａのバンド）の形成が観察され、インキュベーション時間と共に増加する。（ｄ）ＡＳＣについてイムノブロットをプローブし、時間依存的な自己凝集を明らかにした。（ｅ）ＡＳＣ−ＰＹＤドメイン中の残基Ｋ２１Ａ、Ｋ２２ＡおよびＫ２６Ａにおいて点突然変異を導入することにより、組換え突然変異体ＡＳＣを生成した。精製組換え突然変異体ＡＳＣスペックをＡβ凝集アッセイに使用した。抗体８２Ｅ１を使用して、Ａβについてイムノブロットをプローブし、Ａβの時間依存的な凝集を明らかにした。組換え突然変異体ＡＳＣスペック（ｒｅｃＡＳＣ；Ｋ２１Ａ、Ｋ２２ＡおよびＫ２６Ａ）のコインキュベーションは、高分子量Ａβオリゴマーレベルを増加させることができなかった。組換え突然変異体ＡＳＣスペックを補充したＡβにおいて、中間体Ａβオリゴマー（２８〜６２ｋＤａのバンド）は見られない。（ｆ）ＡＳＣについてイムノブロットを染色し、組換え突然変異体ＡＳＣスペックの自己凝集の欠如を明らかにした。（ｇ）ＡＳＣ−ＣＡＲＤドメイン中の残基Ｄ１３４ＲおよびＹ１８７Ｅにおいて点突然変異を導入することにより生成した精製組換え突然変異体ＡＳＣをＡβ凝集アッセイに使用した。抗体８２Ｅ１を使用して、Ａβについてイムノブロットをプローブし、Ａβ１−４０の時間依存的な凝集を明らかにした。組換え突然変異体ＡＳＣ（ｒｅｃＡＳＣ；Ｄ１３４ＲおよびＹ１８７Ｅ）スペックを添加すると、Ａβサンプルにおける２時間のインキュベーション後に、高分子量Ａβオリゴマーレベルの増加が明白である。Ａβオリゴマーのレベルは、インキュベーション時間と共に増加した。中間体Ａβオリゴマー（２８〜６２ｋＤａのバンド）の形成も明らかであり、インキュベーション時間と共に増加した。（ｈ）ＡＳＣについてイムノブロットを染色し、組換えＡＳＣ−ＣＡＲＤ突然変異体ＡＳＣ（Ｄ１３４ＲおよびＹ１８７Ｅ）スペックの自己凝集を明らかにした。（ｉ）表示時点における定量（ｎ＝３の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定、２時間：＊＊ｐ＝０．００１２、４時間：＊＊ｐ＝０．００５２、６時間：＊＊ｐ＝０．００３２、１２時間：＊＊ｐ＝０．００３３、４８時間：＊＊＊ｐ＝０．０００３、２４および７２時間：＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｊ）表示時点における定量（ｎ＝３の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定、２時間：＊ｐ＝０．０２１２、４時間：＊＊ｐ＝０．００１２、６時間：＊ｐ＝０．０２４０、１２時間：＊＊ｐ＝０．００１８、２４時間：＊＊ｐ＝０．００６９、４８時間＊＊ｐ＝０．００３１、７２時間：＊＊＊ｐ＝０．０００２）。（ｋ）ＡＳＣのＰＹＤおよびＣＡＲＤドメインにおける各突然変異の位置を示すリボン図。ａ〜ｈに示されている実験を独立して３回反復した。
【０１８８】
図１１  ＡβペプチドおよびＡＳＣスペックのチオフラビンｔ蛍光スキャンおよび付随する共沈降アッセイ。４４６ｎｍの励起を用いて４６０〜６０５ｎｍのλｅｍにおいてモニタリングした、インキュベーション後０および６時間におけるＡβ１−４０（Ａβ１−４０のみまたはＡＳＣ（Ａβ１−４０＋ＡＳＣ）との組み合わせ）の（ａ）上清および（ｂ）ペレット画分のチオフラビンｔ（ＴｈＴ）蛍光スペクトル（平均±ＳＥＭ）。励起および放出スリットを１０ｎｍに設定した。（ｃ）最大発光値（４８５ｎｍ）の定量および統計分析（ｎ＝３の生物学的に独立したサンプル±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定、＊＊ｐ＝０．００１１、ｐ＝＊＊＊０．０００３）。上記と同一の条件下において得られた、インキュベーション後０および６時間におけるＡβ１−４２（Ａβ１−４２のみまたはＡＳＣ（Ａβ１−４２＋ＡＳＣ）との組み合わせ）の（ｄ）上清および（ｅ）ペレット画分のＴｈＴ蛍光スペクトル。（ｆ）λｕａ最大値（４８５ｎｍ）の定量および統計分析（ｎ＝３の生物学的に独立したサンプル±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定、＊＊ｐ＝０．００２３、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＡＳＣスペック＋抗Ａβ抗体（８２Ｅ１）の存在下または非存在下における（ｇ）Ａβ１−４０または（ｈ）Ａβ１−４２（１＝Ａβのみ、２＝Ａβ＋ＡＳＣ、３＝ＡＳＣ）。ｇおよびｈに示されている実験を独立して３回反復した。
【０１８９】
図１２  ＡＳＣ免疫陽性は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよびＡＤ患者のＡβ沈着物の中心に見られる。（ａ）図３において分析されているマウス線維またはコア調製物由来の同一サンプルを、ＡＳＣ検出に使用した二次抗体のみを用いてプローブした。（ｂ）図２において分析されているヒト線維またはコア調製物由来の同一サンプルを、ＡＳＣ検出に使用した二次抗体のみを用いてプローブした。（ｃ）組換えＡＳＣおよび合成Ａβ１−４２を系列希釈し、ＡＳＣ（ＡＬ１７７）またはＡβ（６Ｅ１０）抗体を使用して免疫プローブした。さらなる方法論的読み取り値３２ｘｘ３１（ｄ）一次および二次抗体ありおよびなしの場合の、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス由来の切片におけるＡβ（６Ｅ１０）およびＡＳＣ（ＡＬ１７７）の免疫染色（バー＝１５μｍ）。（ｅ）ＡβまたはＡＳＣについて染色したＡＳＣ−／−動物由来の対照切片（バー＝２０μｍ）。非認知症対照（対照）およびＡＤ患者（ＡＤ）由来の脳サンプルにおけるＡＳＣの免疫沈降とそれに続くＡＳＣのイムノブロット検出（ｆ）またはＡβのイムノブロット検出（ｇ）。さらなる対照は、Ａβ１−４２、ＡＳＣおよびＡβ１−４２＋ＡＳＣのインビトロコインキュベーションの同じ検出を示す。（ｈ）ＡＤ脳（ＡＤ）および年齢適合非認知症対照（対照）由来の切片ならびに陰性対照として両一次抗体を省略したものにおけるＡβ（緑色）およびＡＳＣ（赤色）の免疫染色（バー＝１５μｍ）。免疫沈降実験は、（ｉ）血管性認知症（ＶＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）を患っている患者由来の脳サンプルにおけるＡＳＣの免疫沈降とそれに続くＡＳＣのウエスタンブロット検出を示す。（ｊ）同じ脳サンプルにおけるＡＳＣの免疫沈降とそれに続くＡβのウエスタンブロット検出。ＡＳＣ結合Ａβは、ＡＤ患者においてのみ検出された。ａ〜ｃおよびｆ、ｇ、ｉに示されている実験を独立して３回反復した。ｄ、ｅ、ｈに示されている実験を独立して５回反復した。
【０１９０】
図１３  ８および１２カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスにおけるＡβレベルおよび空間ナビゲーション記憶。（ａ）８カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウス由来のＡβ１−３８、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２のＳＤＳおよびＦＡ画分からのＥＬＩＳＡ定量（ｎ＝５の生物学的に独立した動物±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定、ＳＤＳ：Ａβ１−３８＊＊ｐ＝０．００１６、Ａβ１−４０＊＊ｐ＝０．００２５、Ａβ１−４２＊＊＊ｐ＝０．０００８、ＦＡ：Ａβ１−３８＊＊ｐ＝０．００２１、Ａβ１−４０＊＊ｐ＝０．００４０、Ａβ１−４２＊ｐ＝０．０１０６）。（ｂ）モリス水迷路において、空間記憶を評価した。ｗｔ、ＡＳＣ−／−、ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスにおける、プラットフォームまで移動した距離（平均±ＳＥＭ）。移動距離を積分することにより、定量を実施した（曲線下面積）（ｗｔついてはｎ＝１２、ＡＳＣ−／−ついてはｎ＝１９、ＡＰＰ／ＰＳ１ついてはｎ＝１４、およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−ついてはｎ＝２１の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ；一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、ＡＰＰ／ＰＳ１対ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−＊＊＊ｐ＝０．０００５、他：＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｃ）１２カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウス由来のＡβ１−３８、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２のＳＤＳおよびＦＡ画分からのＥＬＩＳＡ定量（ｎ＝５の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ；両側スチューデントｔ検定、ＳＤＳ：Ａβ１−３８＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ａβ１−４０＊＊ｐ＝０．００１５、Ａβ１−４２＊＊＊ｐ＝０．０００２、ＦＡ：Ａβ１−３８＊＊＊ｐ＝０．０００９、Ａβ１−４０＊＊ｐ＝０．００８４、Ａβ１−４２＊＊ｐ＝０．００１０）。（ｄ）１２カ月齢のｗｔ、ＡＳＣ−／−、ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−動物由来の海馬切片（バー＝５００μｍ）ならびにＡβ沈着物の総面積および数の定量（ｎ＝６の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。モリス水迷路試験により、空間記憶を評価した。（ｅ）野生型（ｗｔ）、ＡＳＣ−／−、ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスにおける、プラットフォームに到達するために必要な時間（待ち時間）（平均±ＳＥＭ）ならびに積分移動時間（ＡＵＣ＝曲線下面積）（ｗｔついてはｎ＝１１、ＡＳＣ−／−ついてはｎ＝１１、ＡＰＰ／ＰＳ１ついてはｎ＝１７、およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−ついてはｎ＝１５の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ；一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、ｗｔ対ＡＰＰ／ＰＳ１  ＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＳＣ−／−対ＡＰＰ／ＰＳ１  ＊＊＊ｐ＝０．０００３、ＡＰＰ／ＰＳ１対ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−＊＊ｐ＝０．００２２）。（ｆ）ｗｔ、ＡＳＣ−／−、ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスにおける、プラットフォームまで移動した距離（プラットフォームまでの移動）（平均±ＳＥＭ）ならびに積分移動距離（ｗｔついてはｎ＝１１、ＡＳＣ−／−ついてはｎ＝１１、ＡＰＰ／ＰＳ１ついてはｎ＝１７、お��びＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−ついてはｎ＝１５の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ；一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、ＡＰＰ／ＰＳ１対ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−＊＊＊ｐ＝０．０００４、他：＊＊＊ｐ＜０．０００１）。９日目において、最後のトレーニングセッションの２４時間後に、空間プローブ試験を行い、プラットフォームを除去し、象限において動物が費やした時間を記録した。（ｇ）Ｑ１：１〜８日目のプラットフォーム位置。すべての他の象限において費やされた時間の値を平均化した（ｏ．ａ．）（ｗｔついてはｎ＝１２、ＡＳＣ−／−ついてはｎ＝１９、ＡＰＰ／ＰＳ１ついてはｎ＝１４、およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−ついてはｎ＝２１の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ；一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、ＡＳＣ−／−＊ｐ＝０．０３２９）。（ｈ）単一のマウスの代表的なランが示されている。ｄに示されている実験を独立して２回反復した。
【０１９１】
図１４  ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡＳＣによる皮質Ａβレベルの年齢依存的モジュレーションならびにカスパーゼ１切断、ＮＥＰおよびＩＤＥの分析。（ａ）抗体６Ｅ１０を使用した、３、８および１２カ月齢のｗｔ、ＡＳＣ−／−、ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−動物由来の皮質切片の免疫組織化学（バー＝５００μｍ）。（ｂ）８カ月齢（ｎ＝３の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定、Ａβ沈着物の数＊＊＊ｐ＝０．０００９、総面積＊＊＊ｐ＜０．０００１）および１２カ月齢（ｎ＝６の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定、Ａβ沈着物の数＊＊＊ｐ＝０．０００３、総面積＊＊＊ｐ＝０．０００２）のＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスの各皮質切片における総Ａβ被覆面積（総面積）およびＡβ沈着物の数として示されているＡβ沈着の定量。（ｃ〜ｆ）各実験プロトコールを受けている動物におけるカスパーゼ−１、ネプリライシンおよびインスリン分解酵素レベルの実験Ｉ〜ＩＶの分析（拡張データ図１１ｂ、ｃ：ＥＸＰＩも参照のこと）。β−アクチンレベルの検出は、ローディング対照として機能した。陽性対照は、カスパーゼ１、ＮＥＰおよびＩＤＥによりスパイクしたｗｔマウス脳ライセートである。（Ｒ＝右半球ライセート、Ｌ＝左半球ライセート）。注射動物（ＥＸＰＩ：ＡＰＰ／ＰＳ１マウス；ＥＸＰＩＩ：ＡＰＰ／ＰＳ１、ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウス；ＥＸＰＩＩＩ：ＡＰＰ／ＰＳ１マウス；ＥＸＰＩＶ：ＡＰＰ／ＰＳ１マウス）および各対照の遺伝的背景ならびに注射材料／脳ライセートが示されている。ａに示されている実験を独立して２回反復した。ｃ〜ｆに示されている実験を独立して３回反復した。
【０１９２】
図１５  ８カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスにおけるミクログリアＡβ食作用ならびにＡβインビボシーディング実験の実験概略図。（ａ）８カ月齢におけるメトキシ−ＸＯ４（ＭｘＯ４）の腹腔内（ｉ．ｐ）注射およびミクログリアの単離後にミクログリアアミロイド含有量について分析したマウスの代表的な散布図ならびにアミロイド含有量の定量は、群間に差がないことを明らかにしている（ＡＰＰ／ＰＳ１についてはｎ＝１１、ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−についてはｎ＝１０の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定）。（ｂ）インビボ実験ＥＸＰＩ〜ＩＶのデザインは、ホストマウスの遺伝的背景および注射材料を示す。（ｃ）Ｅｘｐ  Ｉのタイムスケジュール。（ｄ）実験ＩＩ〜ＩＶのタイムスケジュール。（ｅ）Ｆｒｉｔｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２０１４  Ｏｃｔ；１２８（４）：４７７−８４およびさらにはＭｅｙｅｒ−Ｌｕｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６  Ｓｅｐ  ２２；３１３（５７９４）：１７８１−４に記載されているように、脳ライセートを生成した。マウス前脳からの注射材料の調製のスキーム。抗体８２Ｅ１と、タンパク質ローディングを正規化するための抗アクチン抗体とを使用してイムノブロットにより、Ａβ含有量について、ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／／ＡＳＣ−／−マウス由来の脳ホモジネートのアリコートを分析した。（ｆ）互いに１２０μｍの等距離において、両海馬注射の部位および切片を分析した。ａ、ｅに示されている実験を独立して２回反復した。
【０１９３】
図１６  ＡＳＣスペックは、ミクログリア食作用に影響を与えずに、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてＡβ病状の体軸方向拡大を引き起こす。（ａ）注射海馬の代表的な顕微鏡写真（バー＝５００μｍ）ならびに（ｂ）Ａβ免疫染色面積（総面積）およびＡβ免疫陽性沈着物の数（ｎ＝８の生物学的に独立したサンプル（ＡＰＰ／ＰＳ１マウス対照−（対照溶媒）、ＡＳＣスペック注射（ＡＳＣスペック））、ｎ＝４の生物学的に独立したサンプル（非注射（非注射）ＡＰＰ／ＰＳ１マウス）、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、総面積  ＡＳＣスペック対対照溶媒  ＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＳＣスペック対非注射  ＊＊＊ｐ＝０．０００６、Ａβ沈着物の数  ＡＳＣスペック対対照溶媒＊＊＊ｐ＝０．０００３、ＡＳＣスペック対非注射  ＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｃ）注射半球由来のＡＰＰ、αおよびβｃ末端断片（α−ＣＴＦ、β−ＣＴＦ）ならびにＡβのイムノブロット。非注射（非注射）６カ月齢ＡＰＰ／ＰＳ１動物またはｗｔマウス（対照として）由来の脳ライセート。（ｄ）Ａβモノマーの定量（ｎ＝５の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定、ＡＳＣスペック対対照溶媒  ＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＳＣスペック対非注射  ＊＊＊ｐ＝０．０００５）。Ａβ病状のＡＳＣスペック誘発性体軸方向拡大の決定。（ｅ〜ｈ）各セクション（ｅ）Ｅｘｐ−Ｉ（ｃ，ｆ）Ｅｘｐ−ＩＩ（ｇ）Ｅｘｐ−ＩＩＩおよび（ｈ）Ｅｘｐ−ＩＶについて示されたＡβ陽性（＋）沈着物の数（ＥＸＰ−１：ｎ＝７の生物学的に独立したサンプル、ＥＸＰ−ＩＩ  ｎ＝３の生物学的に独立したサンプル、ＥＸＰ−ＩＩＩ：ｎ＝３の生物学的に独立したサンプル、ＥＸＰ−ＩＶ：ｎ＝５の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、片側スチューデントｔ検定（レベル−４〜＋４）ＥＸＰ−Ｉ：−２  ＊＊ｐ＝０．００２８、１  ＊ｐ＝０．０１９４、２  ＊＊ｐ＝０．０６１、４  ＊＊＊ｐ＝０．０００７、ＥＸＰ−ＩＩ：−３  ＊ｐ＝０．０１７５、−２  ＊ｐ＝０．０２１６、１  ＊＊ｐ＝０．００９０、２  ＊ｐ＝０．０３１２、ＥＸＰ−ＩＩＩ：−４  ＊ｐ＝０．０１８１、−２  ＊ｐ＝０．０１９４、２  ＊ｐ＝０．０１９５、３  ＊＊ｐ＝０．００７２、ＥＸＰ−ＩＶ：−４  ＊＊＊ｐ＝０．０００８、−３  ＊ｐ＝０．００３７、−２  ＊ｐ＝０．０４１４、−１  ＊ｐ＝０．０１４４、１  ＊＊＊ｐ＜０．０００１、２  ＊＊ｐ＝０．００８８、３  ＊＊ｐ＝０．００１２）。（ｉ）メトキシ−ＸＯ４（ＭｘＯ４）の腹腔内（ｉ．ｐ）注射および注射１カ月後のミクログリアの単離後にミクログリアアミロイド含有量について分析したマウスの代表的な散布図。Ｃｄ１１ｂ／ＣＤ４５の免疫染色なし（上パネル）およびメトキシ−ＸＯ４の腹腔内投与後（下パネル）のミクログリア細胞集団の野生型マウス（ｗｔ）単離。対照溶媒（上パネル）およびＡＳＣスペック（下パネル）の海馬内注射を受けたＡＰＰ／ＰＳ１マウスを、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ４５／メトキシ−ＸＯ４について免疫染色した。食作用の定量は、群間に差がないことを明らかにしている（ｎ＝３の生物学的に独立した動物、平均±ＳＥＭ、両側スチューデントｔ検定）。ａに示されている実験を独立して２回反復し、ｃに示されている実験を５回独立して反復した。ｉに示されている実験を１回実施した。
【０１９４】
図１７  インビボシーディング実験におけるＩＤＥの欠如および食作用のモジュレーション。メトキシ−ＸＯ４（ＭｘＯ４）の腹腔内（ｉ．ｐ）注射および注射１カ月後のミクログリアの単離後にミクログリアアミロイド含有量について分析した動物の代表的な散布図。（ａ）ＭｘＯ４の腹腔内投与前後の野生型マウス（ｗｔ）由来のミクログリア細胞集団（上パネル）の分析（下パネル）。ＡＰＰ／ＰＳ１またはＷＴマウス脳ホモジネート（注射材料：緑色）のいずれかを注射したＡＰＰ／ＰＳ１またはＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウス（宿主動物：赤色）。（ｂ）アミロイド含有量の定量により、群間に差がないことが明らかになった（ｎ＝３の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定）。（ｃ）ＦＲＥＴ基質（５−ＦＡＭ／ＱＸＬ５２０）を使用してＥＸＰＩ−ＩＶのマウス脳ホモジネートから酵素ＩＤＥ活性を分析し、脳組織１ｍｇ当たりの相対蛍光単位（ＲＦＵ）として示した。（ＥＸＰ−Ｉ：ｎ＝７の生物学的に独立したサンプル（ＡＰＰ／ＰＳ１マウス対照−（対照溶媒）、ＡＳＣスペック注射（ＡＳＣスペック））、ｎ＝４の生物学的に独立したサンプル（非注射（非注射）ＡＰＰ／ＰＳ１マウス）、ＥＸＰ−ＩＩ  ｎ＝４の生物学的に独立したサンプル、ＥＸＰ−ＩＩＩ：５＝３の生物学的に独立したサンプル、ＥＸＰ−ＩＶ：ｎ＝６の生物学的に独立したサンプル、平均±ＳＥＭ、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー検定）。ａに示されている実験を１回実施した。
【０１９５】
図１８  ＡＳＣスペックのボリューム増加の管理に基づく細胞生存率の研究。図１８Ａは実験結果（対照  対  ＡＳＣスペックのボリューム増加）を示す。生存率分析の結果（図１８Ｂ）から、生存ニューロンの濃度依存性減少があったことが示される。したがって、ＡＳＣスペックへの曝露に基づく初期ニューロン経験細胞死（primary neuro-ns experience cell demise）が結論づけられる。抗ＡＳＣスペック抗体治療アプローチを使用することにより、神経保護効果は、Ａｂを凝集させることが可能なＡＳＣスペックの量が減少するにつれて、高まる。したがって、細胞生存率の減少は抗ＡＳＣスペック抗体によって減少する。
【実施例】
【０１９６】
以下において、本発明の様々な実施形態および態様を例証する特定の実施例が提示されている。しかしながら、本発明は、本明細書において記載される特定の実施形態により範囲が限定されるべきではない。以下の調製および実施例は、当業者が本発明をより明確に理解して実施することを可能にするために示されている。しかしながら、本発明は、単に本発明の単一の態様の例示としてのみ意図される例示的な実施形態により範囲が限定されず、機能的に同等の方法は本発明の範囲内である。実際、本明細書において記載されるものに加えて、本発明の様々な改変は、前述の説明、添付の図および以下の実施例から当業者には容易に明らかになるであろう。このような改変はすべて、添付の特許請求の範囲に記載の発明の範囲内である。
【０１９７】
材料および方法
試薬：Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  ＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ０１１１：Ｂ４）はＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）製であった；ナイジェリシンはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）製であり、ＡＴＰはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製であった。ＡＳＣに対する抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｍＡｂ，６５３９０２，クローンＴＭＳ−１，１：５００）およびＡｄｉｐｏＧｅｎ（ＡＳＣ，ＡＬ１７７，ＡＧ−２５Ｂ−０００６−Ｃ１００，Ｌｉｅｓｔａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製であった。精製マウスＩｇＧ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，０２−６１００）および正常ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−２０２７，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、それぞれＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＡＳＣ抗体およびＡｄｉｐｏＧｅｎ  ＡＳＣ抗体のアイソタイプ対照抗体として使用した。
【０１９８】
動物：ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニック動物（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｓｔｒａｉｎ  ＃００５８６４）およびＡＳＣ−／−動物（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）は両方とも、Ｃ５７Ｂｌ／６遺伝的背景であった。２２℃および１２時間明暗サイクルの標準条件下においてマウスを飼育し、食餌および水を自由に摂取させた。動物の管理および取扱いは、ヘルシンキ宣言に従って実施し、地方倫理委員会により承認された（ＬＡＮＵＶ  ＮＲＷ  ＃  ８４−０２．０４．２０１７．Ａ２２６）。雌の動物のみがこの分析に含まれていた。以下の動物群の組織を分析した：ＷＴ、ＡＳＣ−／−、ＡＰＰ／ＰＳ１、ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−。８カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウス由来の組織は、ＥＸＰ−ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの非注射対照として機能した（拡張データ図１１ｂ）。すべての動物実験は、動物の遺伝子型について盲検化された研究者により実施された。インビボ研究の場合、検出力分析を使用して、サンプルサイズを事前決定した。後者において、動物は、実験行為にランダムに割り当てられた。
【０１９９】
ヒト組織サンプル：組織学的に確定されたＡＤ、血管性認知症（ＶＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）および大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）症例ならびに非神経疾患により死亡した年齢適合対照由来の死後脳材料は、病院−ＩＤＩＢＡＰＳのバイオバンクの神経組織バンクに由来するものであった。すべての患者はインフォームドコンセントに署名し、医学研究のための脳材料の使用に同意した。年齢および死後時間は、対照とＡＤ症例との間で同様であった。死後時間は、３．５〜５時間において変動した。外植後、脳標本を直ぐに急速凍結し、さらなる使用まで−８０℃において保存した。患者および対照は７５±６歳であった。
【０２００】
マウスおよびヒトにおける免疫組織化学（ＡＳＣ／ＣＤ１１ｂ／Ａβ）：ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、浮遊性の厚さ４０μｍの連続切片を切断した。得られた切片を０．１％ＮａＮ３、ＰＢＳに保存した。免疫組織化学については、切片を５０％メタノールにより１５分間処理し、次いで、ＰＢＳにより５分間にわたって３回洗浄し、３％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＰＢＳ（ブロッキングバッファー）により３０分間ブロッキングし、続いて、ブロッキングバッファー中、一次抗体と共に一晩インキュベートした。切片を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＰＢＳにより３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  ４８８またはＡｌｅｘａ  ５９４抗体コンジュゲート（１：５００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）と共に９０分間インキュベートし、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＰＢＳにより５分間にわたって３回洗浄した。Ｉｍｍｕ−Ｍｏｕｎｔ（９９９０４０２，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、切片をマウントした。以下の一次抗体を各濃度において使用した：ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（１：２００，ＭＣＡ７１１，Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）、ウサギ抗マウスＡＳＣ（１：２００，ＡＬ１７７，ＡＧ−２５Ｂ−０００６−Ｃ１００，ＡｄｉｐｏＧｅｎ，Ｌｉｅｓｔａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＡβ抗ヒト（１：４００，６Ｅ１０，ＳＩＧ−３９３２０，Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｍｕｅｎｓｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０２０１】
細胞内および細胞外ＡＳＣスペックの定量：ヒト被験体については、１０個の対照および１０個のＡＤ症例を分析した。各患者から、規定の相互距離を有する６つの海馬脳切片を評価した。切片１個当たり１０個のランダムに選択した視野において、４０倍の倍率において、細胞内および細胞外ＡＳＣスペックをカウントした。同様に、２、４および８カ月齢において、ＷＴおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬切片を分析した。細胞内または細胞外ＡＳＣスペックの割合は、ミクログリア１個当たりの細胞内もしくは細胞外ＡＳＣスペックまたは検出されたすべてのＡＳＣスペックのパーセンテージとして示した。
【０２０２】
細胞培養：以前に詳細に記載されているように２６、初代ミクログリア細胞培養物を調製した。簡潔に言えば、混合グリア培養物を新生ｗｔマウスから調製し、１０％ＦＣＳ（１０２７０，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（１５０７０，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＤＭＥＭ（３１９６６，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中において培養した。初代培養の１４日後に、ミクログリア細胞を使用した。シェイクオフによりそれらを回収し、再プレーティングし、基材に３０〜６０分間付着させた。ＡＳＣスペックの放出を評価するために、未刺激またはＬＰＳプライミングミクログリアを未処理状態のままとするか、またはナイジェリシン（１０μＭ）もしくはＡＴＰ（５ｍＭ）により活性化した。細胞を固定し、洗浄し、抗ＡＳＣ（１：１００  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，クローンＨＡＳＣ−７１）または精製ＩｇＧ１（０２−６１００，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により染色し、続いて、ヤギ抗マウス−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ａ−１１０１７，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により染色した。ｍＣｅｒｕｌｅａｎ−ＡＳＣの発現のための構築物を安定的に形質導入した単球細胞株ＴＨＰ−１は記載されている１６。１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中において、細胞を培養した。刺激アッセイについては、細胞を１００ｎＭのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により一晩処理し、１μｇ／ｍｌのＬＰＳにより３時間プライミングし、１０μＭのナイジェリシンによりさらに９０分間活性化した。定期検査により、マイコプラズマ汚染を排除した。
【０２０３】
ＡＳＣスペック放出のＦＡＣＳ分析：ＦＳＣ対ＳＳＣ散乱の分布のための参照として、０．７〜０．９μｍ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ，Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ，ＩＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）または６．０μｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のマイクロサイズビーズを使用して破片サイズ事象をゲーティングした後、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、ミクログリアの無細胞上清中のＡＳＣスペックの定量を行った。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８色素に直接コンジュゲートされた抗ＡＳＣ（クローンＴＭＳ−１，１：５００，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）または等量の精製ＩｇＧ１アイソタイプ（０２−６１００，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、無細胞上清を染色した。ＡＳＣスペックとして破片サイズＡ４８８＋事象をカウントした。ＦｌｏｗＪｏ  Ｘ  １０．０．７（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、データを分析した。
【０２０４】
共焦点レーザー走査顕微鏡検査：Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５  ＳＭＤ共焦点システム（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、ミクログリアまたはＴＨＰ−１細胞をイメージングした。開口数１．２の６３倍対物レンズを使用して画像を取得し、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ  ６．０１ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して分析した。
【０２０５】
ＡＳＣスペックとＡβとの関連性：インビトロにおけるＡＳＣスペックとＡβ１−４２との関連性をイメージングするために、可溶性ＴＡＭＲＡ−Ａβ（ＰＳＬ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下において、ナイジェリシン（１０μＭ）により、ＰＭＡ処理（１００ｎＭ）ＬＰＳプライミング（１μｇ／ｍＬ）ＡＳＣ−ｍＣｅｒｕｌｅａｎ発現ＴＨＰ−１を９０分間活性化した。環境制御チャンバー（Ｌｉｆｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｏｌｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、３７℃、５％ＣＯ２において、細胞をイメージングした。開口数１．２の６３倍対物レンズを使用して画像を取得し、ＬＡＳ  ＡＦバージョン２．２．１（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＶｏｌｏｃｉｔｙ  ６．０１ソフトウェアを使用して分析した。
【０２０６】
ＡＳＣスペックの生成および単離。基本的には以前に記載されているように１６，２７，２８、ＡＳＣスペックの生成および単離を実施した。１５ｃｍディッシュ中において、８０％コンフルエンスに達するまで、インフラマソームレポーターマクロファージを培養した。セルスクレーパーを用いて細胞を５ｍｌのＰＢＳ中に回収し、遠心分離（４００×ｇ／５分）によりペレット化した。残存培地を除去するために、それらを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、４℃、１５００ｒｐｍ／５分において再び遠心分離した。上清を除去し、ペレットを−８０℃に少なくとも１５分間置いて、細胞質膜を不安定化させた。その後、細胞を２倍量のＣＨＡＰＳバッファーに再懸濁し、２０Ｇ針を有する２ｍｌシリンジを使用して溶解させた。細胞破片を除去するために、サンプルを遠心分離（１４，０００ｒｐｍ／８分／４℃）し、上清を滅菌１ｍｌポリカーボネート超遠心チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）に移し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ  ＴＬＸベンチトップ超遠心機により１００，０００ｇにおいて３０分間スピンダウンして、Ｓ１００上清を得た。これらの上清を０．５ｍｌ  ＰＶＤＦ  ０．２２μｍフィルタチューブに移し、遠心分離（１４０００ｒｐｍ／５分／４℃）により濾過した。フロースルーを３７℃において６０〜９０分間インキュベートして、ＡＳＣスペックの集合を誘導した。ＡＳＣスペックをＴＥＶにより４℃において１時間処理し、実験において使用する前にＰＢＳにより２回洗浄した（拡張データ図４）。
【０２０７】
Ｅ．ｃｏｌｉからの組換えＡＳＣの調製：全長ヒトＡＳＣ、続いてＴＥＶプロテアーゼ切断部位およびｍＣｈｅｒｒｙをコードするｃＤＮＡを、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを提供するｐＥＴ−２３ａ発現ベクターにクローニングした（ｐＥＴ２３ａ−ＡＳＣ−Ｔｅｖ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈｉｓ）。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を３７℃において成長させ、０．８のＯＤ６００において、１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドにより発現を４時間誘導した。遠心分離により細胞を回収し、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾールを含有するバッファー（バッファーＡ）中において超音波処理した。細胞ライセートを２０，０００ｒｐｍ、４℃において３０分間遠心分離した。細胞ペレットを、２Ｍグアニジン−ＨＣｌを補充したバッファーＡに再懸濁し、遠心分離し、上清をバッファーＡに対して４℃において透析した（ヴィスキング透析チューブ、セルロース、タイプ３６１３２、ＭＷＣＯ  １４，０００ダルトン；Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。サンプルを再び遠心分離し、Ａｅｋｔａ  Ｐｒｉｍｅ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して上清を事前平衡化ＨｉｓＴｒａｐカラムに注入した。１０カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールによりカラムを洗浄し、２００ｍＭイミダゾールを含有する同じバッファーによりタンパク質を溶出させた。２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーに対して精製タンパク質を透析した。ＡＳＣ−ｍＣｈｅｒｒｙキメラタンパク質の原線維化を誘導するために、溶液を１００，０００ｇ、４℃において１時間遠心分離し、続いて、３７℃において１時間インキュベートした。サンプルを氷上において保存し、さらなる分析に直ぐに供して、凍結／解凍サイクルを回避した。野生型ＡＳＣタンパク質の他に、５つの突然変異体を生成した。これらの突然変異体は、ＰＹＤもしくはＣＡＲＤのいずれかのみにおける、または両ドメインにおけるホモマーオリゴマー化インターフェースを破壊するように設計されていた。ドメイン原線維化の構造分析１，２に基づいて、突然変異体部位を同定した。ＰＹＤ−ＰＹＤアセンブリインターフェースのＫからＥへの突然変異（Ｋ２１Ｅ、Ｋ２２Ｅ、Ｋ２６Ｅ）、インターフェースのＫからＡ（Ｋ２１Ａ、Ｋ２２Ａ、Ｋ２６Ａ）、推定ＣＡＲＤアセンブリインターフェースのＤからＲおよびＹからＥ（Ｄ１３４Ｒ、Ｙ１８７Ｅ）、ならびに２つの組み合わせＫからＥ／ＤからＲ／ＹからＥ（Ｋ２１Ｅ、Ｋ２２Ｅ、Ｋ２６Ｅ、Ｄ１３４Ｒ、Ｙ１８７Ｅ）およびＫからＡ／ＤからＲ／ＹからＥ（Ｋ２１Ｅ、Ｋ２２Ｅ、Ｋ２６Ｅ、Ｄ１３４Ｒ、Ｙ１８７Ｅ）。配列分析により、すべてのタンパク質発現構築物を確認した。タンパク質発現、精製および調製ならびに原線維化に適用したプロトコールは、野生型タンパク質の場合と同じものであった。
【０２０８】
免疫刺激マウスミクログリアおよびマクロファージの上清由来のＡβおよびＡＳＣスペックのＦＡＣＳ分析。ＡＳＣの遺伝的欠損の有無にかかわらず、初代マウスミクログリアおよび不死化ＡＳＣ−ｍＣｅｒｕｌｅａｎおよびマクロファージを、１００μｌの完全培地中において、２００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳにより３時間プライミングした。続いて、５ｍＭのＡＴＰを６０分間添加することにより、ＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化した。上清を除去し、ＴＡＭＲＡ標識Ａβと共に３７℃において６時間インキュベートし、続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７抗ＡＳＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により４℃において一晩染色した。その後、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＦＡＣＳ分析を実施した。
【０２０９】
Ａβオリゴマー形成のイムノブロット：合成Ａβ１−４２は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＰＳＬ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から調達した。凍結乾燥ペプチドを１０ｍＭ  ＮａＯＨに可溶化して１ｍｇ／ｍｌ（２２１μＭ）の最終濃度にし、水浴において５分間超音波処理し、−８０℃において保存した。Ａβ１−４２を５０ｍＭソレンソンリン酸バッファー、ｐＨ７．０により１００μＭに希釈した。ＡＳＣスペック（０．５３μＭ）の有無にかかわらず、Ａβ１−４２を３７℃において２４時間インキュベートした。０、１、２、４、６および２４時間の時点において、サンプルを収集した。４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ上において電気泳動によりサンプルを分離し、ニトロセルロース膜に転写した。ＰＢＳ中５％ミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ブロッキング溶液）により膜をブロッキングし、ブロッキング溶液中、６Ｅ１０抗体（ＳＩＧ−３９３２０，Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｍｕｅｎｓｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に４℃において一晩インキュベートした。膜を抗体コンジュゲートと共にインキュベートし、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｃｌｘイメージングシステム（Ｌｉ−ＣＯＲ，Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して免疫反応性を検出した。
【０２１０】
マウス脳ライセートのイムノブロッティング。ＭＥＳまたはＭＯＰＳバッファーを使用して４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりサンプルを分離し、ニトロセルロース膜に転写した。カスパーゼ−１ブロットについては、２００ｎｇ／ｍｌＬＰＳにより３時間処理し、続いて１０μＭナイジェリシンにより１時間処理した野生型不死化マウスマクロファージ由来の上清を沈殿させることにより、陽性対照を作成した。抗体６Ｅ１０（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｍｕｅｎｓｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびｃ末端ＡＰＰ抗体１４０２９（ＣＴ１５）を使用して、ＡＰＰおよびＡβを検出した。抗体ＰＣ７３０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＩＤＥをブロットし、抗体ｃａｓｐ−１クローン４Ｂ４．２．１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡからの寄贈）およびウサギにおいて生じたカスパーゼ−１抗体（Ｇａｂｒｉｅｌ  Ｎｕｎｉｅｚからの寄贈）を使用してカスパーゼ１をブロットし、抗体５６Ｃ６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してネプリライシンをブロットし、Ａ２２２８（Ｓｉｇｍａ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および９２６−４２２１２（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してβ−アクチンをブロットした。強化化学発光反応（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）または近赤外検出（Ｏｄｙｓｓｅｙ，ＬＩ−ＣＯＲ）により、免疫反応性を検出した。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳドキュメンテーションシステム（Ｂｉｏｒａｄ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、化学発光強度を分析した。ＮＥＰ（組換えマウスＮＥＰタンパク質；１１２６−ＺＮ）およびＩＤＥ（組換えＩＤＥタンパク質；２４９６−ＺＮ）の陽性対照は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）製であった。
【０２１１】
チオフラビンＴ蛍光アッセイ：合成Ａβ１−４０およびＡβ１−４２ペプチドは、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＰＳＬ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から調達した。凍結乾燥ペプチドを１０ｍＭ  ＮａＯＨに可溶化して１ｍｇ／ｍｌの最終濃度にし、水浴（Ｂｒａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｐｕｌｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において５分間超音波処理し、さらなる使用まで−８０℃において保存した。Ａβ原線維化をモニタリングするために、以前に記載されているように３０、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）結合アッセイを実施した。簡潔に言えば、ＴｈＴ蛍光アッセイバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０μＭ  ＴｈＴおよび０．０１％アジ化ナトリウム）により、Ａβストック溶液を５０μＭの最終Ａβ濃度に希釈した。Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、リアルタイムＴｈＴ蛍光測定を行った。サンプルを撹拌しながら３７℃においてインキュベートした。５ｎｍのスリット幅を用いてそれぞれ４４６ｎｍおよび４８２ｎｍの励起および発光波長において、ＴｈＴ蛍光を２５時間にわたって５分ごとに測定した。Ａβ原線維化のクロスシーディングを評価するために、新たに希釈したＡβ１−４０およびＡβ１−４２（５０μＭ）を、ＡＳＣ発現細胞から精製したＡＳＣスペック（０．２２および１．７５μＭ）と共に、撹拌しながら３７℃においてインキュベートした。上記のように、リアルタイムＴｈＴ蛍光測定を行った。ＴＡＭＲＡ標識Ａβ１−４２およびＡβ４２−１ペプチドに対しても、ＡＳＣスペックのクロスシーディング効果を評価した。
【０２１２】
濁度アッセイ：濁度測定については、凝集アッセイの終了時に収集したサンプルアリコートを使用した。４０３ｎｍの波長に設定したＡｇｉｌｅｎｔ  ８４５３  ＵＶ分光光度計を使用して、吸光度を測定した。
【０２１３】
Ａβと組換えＡＳＣタンパク質との相互作用：組換えＡＳＣタンパク質のみ（Ａβなし）、ならびに組換えＡＳＣタンパク質（２μＭ）を補充したまたは補充しなかったモノマーＡβ１−４０およびＡβ１−４２溶液（５０μＭ）を、振盪しながら３７℃において最大９６時間インキュベートした。様々な時間間隔（０、１２、２４、４８、７２および９６時間）において収集したサンプルアリコートを電子顕微鏡検査およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｃｌｘイメージングシステム（Ｌｉ−ＣＯＲ，Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抗ＡＳＣスペックおよび抗Ａβ抗体を使用して、ウエスタンブロット分析を実施した。Ｌｉ−ＣＯＲ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｌｉ−ＣＯＲ，Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、定量を実施した。
【０２１４】
透過型電子顕微鏡検査：１ｍｇの凍結乾燥アミロイド−β（１−４２）ペプチド（ＰＳＬ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を２５０μｌのＮａＯＨおよび７５０μｌのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）バッファーに溶解させて、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。サンプルを３７℃において２時間インキュベートし、その後、２０，０００ｇにおいて５分間遠心分離した。次いで、ＡβをＡＳＣタンパク質と混合し、７２時間までの時間経過実験においてインキュベートした。ＡＳＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ、Ａβ、またはＡβと一緒のＡＳＣ−ｍＣｈｅｒｒｙのいずれかのサンプルを炭素コーティンググリッドと結合させ、１％酢酸ウラニルにより染色した。４０９６×４０９６ピクセルＴｅｍＣａｍを備えるＣＭ１２０顕微鏡（Ｔｉｅｔｚ，Ｇａｕｔｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、スポットスキャンモードにおいて、写真を７２，０００倍の倍率において撮影した。
【０２１５】
免疫沈降実験：阻害剤（ＡＥＢＳＦ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＮａＦおよびＮａＶＯ３）を含むＮＰ−４０バッファー中において、ヒトまたはマウス脳サンプルをホモジナイズした。６０μｌのプロテインＧ磁性ビーズを１ｍｌのＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０により３回洗浄し、抗ＡＳＣまたは６Ｅ１０抗体と共に、回転させながら室温において１０分間インキュベートした。ビーズを１ｍｌの０．１％ＰＢＳ−Ｔにより３回洗浄した。サンプルを添加し、回転させながら室温において１時間インキュベートした。サンプルをＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０により３回洗浄し、４×ＮｕＰＡＧＥサンプルバッファーに再懸濁し、７０℃において１０分間加熱し、１４０００×ｇにおいて５分間遠心分離した。４〜１２％ＮｕＰＡＧＥにより上清を分離し、ウエスタンブロットにより分析した。
【０２１６】
Ａβ−ＡＳＣスペック共沈降分析：精製ＡＳＣスペックおよび合成Ａβペプチドを用いて、Ａβ−ＡＳＣスペック共沈降分析を実施した。ＡＳＣスペック（１．７５μＭ）の有無にかかわらず、モノマーＡβ１−４０およびＡβ１−４２溶液（５０μＭ）を、振盪しながら３７℃においてインキュベートした。各バッファー中にＡβを含まないＡＳＣスペックを対照として使用した。定量的沈降分析のために、異なる時間間隔（０．２５時間および６時間）において収集したサンプルアリコートを上清に分画し、ペレットを超遠心分離（１００，０００×ｇ、１時間、４℃）に供した。得られたペレットを、上清の量に対応する量のバッファーに再懸濁した。変性および還元条件下、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）勾配ゲル上において、上清およびペレット画分を電気泳動した。Ｃｌｘイメージングシステム（Ｌｉ−ＣＯＲ，Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抗ＡＳＣスペックおよび抗Ａβ抗体を使用して、ウエスタンブロット分析を実施した。Ｌｉ−ＣＯＲ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｌｉ−ＣＯＲ，Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、定量を実施した。ＴｈＴ蛍光アッセイにより、□−シートリッチなオリゴマー／原線維の形成を定量した。ＡＳＣスペックの有無にかかわらずＡβ１−４０およびＡβ１−４２上清およびペレット画分の蛍光スペクトルを、４４６ｎｍの励起を用いて４６０〜６０５ｎｍのλ発光においてモニタリングした。励起および放出スリットを１０ｎｍに設定した。０．２５時間および６時間間隔における上清およびペレット画分のλｍａｘ発光値（４８５ｎｍ）を統計分析に使用した。
【０２１７】
行動表現型：モリス水迷路試験。２４℃の混濁水を充填した円形タンク（Φ１ｍ）からなるプールにおいて、空間記憶試験を行った。ウォーターベイスンを薄暗くし（２０〜３０ｌｕｘ）、白色カーテンにより囲んだ。迷路を、１つが、水面下１．５ｃｍに存在する隠されたプラットフォーム（１５×１５ｃｍ）を含有する事実上４つの象限に分割した。空間参照として非対称に配置された３つのさらなる迷路により適応させて、プラットフォームを発見するようにマウスを訓練した。それらを準ランダムに水に入れて、戦略学習を防止した。マウスにプラットフォームを４０秒間探索させた；割り当てられた時間内にマウスがプラットフォームに到達しなかった場合、手動によりそれに入れた。次の試験の開始前に、マウスをプラットフォーム上に１５秒間置いた。４回の試行の完了後、マウスを乾燥させ、それらのホームケージに戻した。マウスは、８日間連続して１日４回の試行を訓練した。積分移動時間または距離を動物ごとに分析し、ベースラインレベルを曲線下面積計算（ＡＵＣ、待ち時間１０秒、距離１００ｃｍ）に設定した。最後の訓練セッション（９日目）の２４時間後に行った空間プローブ試験については、プラットフォームを除去し、マウスを３０秒間泳がせた。降下位置は、第三象限と第四象限との間の境界にあり、開始時にマウスは壁に直面する。データは、プラットフォームを配置した象限に相当する象限Ｑ１に費やされた時間のパーセントとして示され、残りの象限において動物が費やした平均時間と比較した。同じ日の午後に、フラグ付きのプラットフォームならびに各試行中の新たな開始および目標位置を用いて、視覚手掛かり試験を実施した。プラットフォームに到達するために必要な移動距離および待ち時間を計算するコンピューター追跡システム（Ｎｏｌｄｕｓ，Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ  ３．１）により、すべてのマウスの行動を記録した。
【０２１８】
マウスおよびヒトＡβプラーク分析：以前に公開されている方法３２ＸＸ３１に従って、アミロイドプラークコアを単離した。簡潔に言えば、マウス脳半球またはヒト脳サンプルをホモジナイズし、２％ＳＤＳ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＤＴＴ中において沸騰させ、１００，０００×ｇ、１０℃において１時間遠心分離した。ペレットを１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＤＴＴに可溶化し、１００，０００×ｇ、１０℃において１時間遠心分離した。ペレットを１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＤＴＴに懸濁し、不連続スクロース勾配（１％ＳＤＳを含有する５０ｍＭトリスｐＨ７．５中１．０、１．２、１．４および２．０Ｍスクロース）上にロードし、２２０，０００×ｇ、１０℃において２０時間遠心分離し、６つの画分に分画した。アミロイドプラークコアは、１．４／２Ｍ界面において濃縮されることが見出された。ＡＳＣに対する抗体６Ｅ１０またはＡｌｚ−１７７（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して免疫ドットブロットにより、サンプルを分析した。
【０２１９】
脳Ａβ濃度のＥＬＩＳＡ定量。Ａβ１−３８、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２のための電気化学発光ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、Ａβの定量的決定を実施した。ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００リーダー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）により、シグナルを測定した。５％ブロッカーＡ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＡ）、０．１％マウスガンマグロブリン（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）により、プレートをブロッキングした。１％ブロッカーＡ、０．１％マウスガンマグロブリンにより、マウス脳由来のＳＤＳおよびＦＡ画分をそれぞれ１：２５および１：１００希釈した。３０μｌのサンプルを室温において４時間インキュベートし、トリス洗浄バッファー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＡ）により洗浄し、１％ブロッカーＡ、０．１％マウスガンマグロブリンにより希釈した０．２５μｇ／ｍｌ  ＭＳＤタグ付き抗体４Ｇ８（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＡ）と共に室温において１時間インキュベートした。ウェルをトリス洗浄バッファーにより洗浄した。１５０μｌの２×リードバッファー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＡ）において行う検出洗浄を追加した。
【０２２０】
定位手術  ケタミン（０．１０ｍｇ／体重ｇ）およびキシラジン（０．０１ｍｇ／体重ｇ）の腹腔内注射により、３カ月齢のホストマウスを麻酔した。加熱ブランケットを備える定位マウスフレーム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に動物を入れて、手順全体を通して体温を３７℃に維持した。定位フレームに適合したＤｒｅｍｅｌデバイスを使用して、頭蓋骨に２つの小さな穴をドリルにより開けた。その後、ハミルトンシリンジを使用して、ＡＰ−２．５ｍｍ、Ｌ＋／−２ｍｍ、ＤＶ−１．８ｍｍにおいて海馬に、ホスト動物は、２μｌのＡＳＣスペックもしくは対照（拡張データ図１１ｂ、ｆ）。Ｅｘｐ  Ｉ、ホスト：ＡＰＰ／ＰＳ１マウス）、ＡＰＰ／ＰＳ１もしくはＷＴマウスから調製した脳抽出物（拡張データ図１１ｂ、ｆ、Ｅｘｐ．ＩＩ、ホスト：ＡＳＣ−／−、ＡＰＰ／ＰＳ１、ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−）、ＡＰＰ／ＰＳ１もしくはＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスから調製した脳抽出物（拡張データ図１１ｂ、ｆ、ＥｘｐＩＩＩ、ホスト：ＡＰＰ／ＰＳ１）のいずれかの両側定位注射を受けたか、または抗ＡＳＣ−ＩｇＧもしくはアイソタイプＩｇＧのいずれかを含有するＡＰＰ／ＰＳ１マウスから調製した脳抽出物（拡張データ図１１ｂ、ｆ、ＥｘｐＩＶ、ホスト：ＡＰＰ／ＰＳ１）を注射した。注射速度を０．５μｌ／分においてポンプ制御した。針を所定位置にさらに１０分間保持してからそれを徐々に引き抜いて、針管への逆流を回避した。滅菌骨ワックスを頭蓋骨の穴に注意深く充填した。次いで、手術野を再びクリーニングし、切開部を縫合した。麻酔が完全に回復するまで、すべてのマウスをモニタリングした。続いて、ＩＶＣケージにおける屠殺まで、標準的な条件下において動物を飼育した。
【０２２１】
動物灌流：ケタミン／キシラジン（それぞれ１００ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）溶液により、動物を腹腔内麻酔し、次いで、冷ＰＢＳ（３０ｍｌ）により経心灌流した。動物から脳を摘出し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液中に４℃において２４時間保存し、続いて、ＰＢＳにより３回洗浄し、さらなる使用までＰＢＳ−ＮａＮ３中に保存した。
【０２２２】
組織抽出物：２３，３２に記載されている方法に従って、高齢動物（１６カ月齢）のＡＰＰ／ＰＳ１、ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−およびＷＴ前脳（小脳なし）からマウス脳ホモジネートを調製した（拡張データ図１１ｅも参照のこと）。脳組織サンプルを液体窒素により急速凍結し、使用まで−８０℃において保存した。滅菌ＰＢＳ中において組織をホモジナイズした（１０％ｗ／ｖ）。Ａβ１−４２のＥＬＩＳＡ測定からの結果に従って、野生型マウス脳ホモジネートの添加により、ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウス由来の脳ホモジネートのアリコートを等量のＡβに調整した。抗体８２Ｅ１と、タンパク質ローディングを正規化するための抗アクチン抗体とを使用してイムノブロットにより、Ａβ含有量についてアリコートを分析した。ホモジネートを３０００ｇ、４℃において５分間遠心分離し、等分し、使用前に−８０℃において保存した。
【０２２３】
Ａβプラーク沈着物の分析：ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、浮遊性の厚さ４０μｍの連続切片を切断した。切片を０．１％ＮａＮ３、ＰＢＳに保存した。免疫染色については、１匹の動物につき、規定の相互距離を有する８つの切片（拡張データ図１１ｆ）をスライドに固定し、ＰＢＳにより５分間、ＰＢＳ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により１０分間およびＰＢＳ中３％Ｈ２Ｏ２により１５分間にわたって３回洗浄した。それらをＰＢＳにより５分間洗浄し、３％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＰＢＳ（ブロッキングバッファー）により１時間ブロッキングし、続いて、ブロッキングバッファー中、ＩＣ１６（１：４００）抗体３３と共に一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳにより３回洗浄し、ブロッキングバッファー中、二次抗体と共に２時間インキュベートした。サンプルをＰＢＳにより５分間にわたって３回洗浄し、ＰＢＳ中Ａ＋Ｂ溶液（１：５０）（ＡＢＣ  Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  Ｋｉｔ  Ｌｓｇ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳにより５分間にわたって３回洗浄した。ジアミノベンジジン溶液（０．１７ｍＭジアミノベンジジン、ＰＢＳ中０．０１％Ｈ２Ｏ２）中においてサンプルを３０秒間インキュベートし、５分後、水により反応を停止させた。Ｉｍｍｕ−Ｍｏｕｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、切片をマウントした。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６１明視野顕微鏡により明視野顕微鏡検査を行い、ＩｍａｇｅＪを用いて画像を処理した。
【０２２４】
脳タンパク質抽出：以前に記載されているように１２、急速凍結脳半球を抽出した。簡潔に言えば、ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、３μｌ／ｍｌプロテアーゼ阻害剤ミックス（Ｓｉｇｍａ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中において、半球をホモジナイズした。ＲＩＰＡバッファー（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、０．５％ＮａＤＯＣ、０．１％ＳＤＳ）によりホモジネートを抽出し、１００，０００×ｇにおいて３０分間遠心分離し、不溶性Ａβを含有するペレットを２％ＳＤＳ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に可溶化した。加えて、７０％ギ酸水溶液によりＳＤＳ不溶性ペレットを抽出した。ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してギ酸を除去し、得られたペレットを２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に可溶化した。
【０２２５】
ＩＤＥ活性：ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）基質（５−ＦＡＭ／ＱＸＬ５２０）を使用して製造業者の指示に従ってＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）５２０  ＩＤＥ活性アッセイキット（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用して、マウス脳ホモジネート中のＩＤＥ活性を測定した。活性ＩＤＥがＦＲＥＴ基質を切断すると、それは、５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）蛍光の増加をもたらし、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００  ＰＲＯプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により、４９０ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長においてこれを測定した。総ＩＤＥ活性を、式：ＩＤＥ活性＝｛（Ａ１−Ａ０）／Ｃ｝×Ｄ（式中、Ａ１は、３０分における５−ＦＡＭの濃度であり、Ａ０は、０分におけるものであり；Ｃは、総タンパク質濃度であり、Ｄは希釈率である。）を用いて計算した。ＢＣＡ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を使用して決定した総タンパク質１ｍｇ当たりの５−ＦＡＭの相対蛍光単位（ＲＦＵ）を正規化した。
【０２２６】
ＦＡＣＳによるＡβ食作用の評価：食作用活性を決定するために、３カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１またはＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスに、ＡＰＰ／ＰＳ１およびＷＴライセートまたはＡＳＣスペックおよび対照細胞ライセートを注射した。１カ月後、動物に、５０％ＤＭＳＯ／５０％ＮａＣｌ（０．９％）ｐＨ＝１２中の１０ｍｇ／ｋｇメトキシ−ＸＯ４（８６３９１８−７８−９，ＴＯＣＲＩＳ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）を注射し、３時間後、以前に記載されているように１２、それらを分析した。以前に記載されているように１２、マウスからミクログリア集団を単離し、ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ（１０１２１２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｆｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＣＤ４５−ＦＩＴＣ（１１−０４５１−８２，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートし、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）により、メトキシ−ＸＯ４陽性食作用ミクログリアを決定した。ＦｌｏｗＪｏ  Ｘ  １０．０．７（ＦｌｏｗＪｏ，Ａｓｈｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ）を使用して、データを分析した。
【０２２７】
統計：一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて必要に応じて事後分析により、または特に指示がない場合にはＭａｃ  ＯＳもしくはＲ用のＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用して、対応のない両側スチューデントｔ検定により、データを分析した。統計の詳細は、各図の凡例に示されている。
【０２２８】
データの利用可能性：本研究中に作成および／または分析したデータセットは、補足情報（補足図１〜３）およびｘｌｓ．ファイルとして利用可能になった。さらなるデータは、対応する著者への合理的な要求により入手可能である。
【０２２９】
実施例１：ＡＳＣスペックはＡβ凝集を増強する
ＡＳＣスペックは、ＡＤ症例およびＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスの脳切片において視覚化することができ、ミクログリア内および細胞外空間に位置し、Ａβ沈着物とも結合している（図１ａ、ｂ、図５）。インビトロにおいて、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化因子への曝露により、事前刺激マウスミクログリア（図１ｃ、ｄ、図６ａ、ｂ）またはヒトＴＨＰ−１細胞（図６ｃ〜ｊ）において、ＡＳＣスペックの形成および放出を誘導し得る。Ａβ１−４２へのミクログリアの曝露は、ＡＳＣスペックの形成および放出を引き起こした。ダイナミックイメージングにより、放出直後に、ＡＳＣスペックはＴＡＭＲＡ標識Ａβ１−４２と結合していることが明らかになった（図１ｅ）。この観察結果は、さらにインフラマソーム刺激初代野生型およびＡＳＣ−／−ミクログリア（図１ｆ〜ｈ）またはマクロファージ由来の上清をＡβ１−４２と共にインキュベートし、続いて、ＦＡＣＳ分析（図７ａ〜ｅ）または免疫沈降実験（図７ｂ、ｃ）を行うことにより、実証された。ＡＳＣ−／−ミクログリアまたはマクロファージ由来の上清は、ＡＳＣ産生細胞由来の上清中においてのみ検出可能になったＡβ凝集に影響を与えることができなかった（図１ｇ、ｈ、図４ｅ、ｆ）。
【０２３０】
免疫沈降および酵素的放出により生成した精製ＡＳＣスペックを使用したチオフラビンＴ蛍光アッセイおよびウエスタンブロット分析（図８）により、Ａβ１−４２（図１ｉ〜ｋ、図９ｄ）またはＡβ１−４０（図９ａ〜ｃ、ｅ）とのコインキュベーションは、時間および濃度依存的にＡβ凝集を加速させたことがさらに明らかになった。ここで、ＡＳＣの存在下における凝集の遅滞期の減少は、２つの異なるペプチド／タンパク質の相互作用によるシーディング核の形成の増強、およびしたがってＡβ凝集に対するＡＳＣスペックのクロスシーディング活性を示す（図１ｉ、図９ｄ、ｅ）。これらの結果は、濁度アッセイ測定および透過型電子顕微鏡検査によりさらに確認された（図９ｆ、ｇ）。特に、対照実験により、ＡＳＣスペックは、Ａβ１−４２の逆配列および対照ペプチド（ウシ血清アルブミン）の凝集を誘導しなかったことが示された（図９ｈ、ｉ）。
【０２３１】
実施例２：ＡβクロスシーディングはＡＳＣ−ＰＹＤドメインに依存する
イムノブロッティング実験により検出されたように、組換えタンパク質（ｒｅｃＡＳＣ）由来のＡＳＣスペックも同様に、早い時点からＡβ１−４０およびＡβ１−４２凝集を促進したが（図１０ａ〜ｄ、ｉ、ｊ）、これは、以前の観察結果を裏付けている。ＡＳＣスペックとＡβとの特異的相互作用をさらに裏付けるために、ＡＳＣのＰＹＤまたはＣＡＲＤドメインのいずれかに位置する突然変異を有するｒｅｃＡＳＣを試験した。位置２１、２２および２６におけるＡＳＣ−ＰＹＤドメインの突然変異（これは、ＡＳＣヘリックス原線維集合を防止する１８）は、Ａβ凝集に対するＡＳＣスペック促進効果を完全に防止した（図１０ｅ）。対照的に、ＡＳＣ  ＣＡＲＤドメインにおける点突然変異（これは、ＡＳＣスペック形成を助けるＡＳＣ原線維自己集合を防止する）は、Ａβ凝集のＡＳＣスペック媒介性促進を実質的に変化させなかった（図１０ｆ、ｇ）。ＡＳＣの凝集推進作用は、ＡＰＰまたはプレセニリンをコードする遺伝子における突然変異（これは、Ａβペプチドの凝集傾向を増加させる１９〜２１）を引き起こすいくつかのｆＡＤを想起させる。特に、Ａβ１−４０凝集に対するＡＳＣの効果を考慮すると、ミクログリア自然免疫反応は、ＡＳＣスペック放出を通じて同様の効果を達成する可能性がある。したがって、ｓＡＤのリスクを増加させる因子であって、脳におけるインフラマソーム活性化に関与することも公知の因子は、この機構を通じて作用するかを推測し得る２２。
【０２３２】
ＡＳＣスペックおよびＡβの物理的相互作用をさらに決定するために、共沈降アッセイを実施した。ＡＳＣスペックは、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２の存在下においてのみ、インキュベーションの６時間以内にペレット画分に共沈降するが、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２ペプチドの非存在下においては、すべての時点において上清画分に残った（図２ａ、ｂ）。共沈降アッセイサンプルの上清およびペレット画分に対するさらなるチオフラビンＴ実験により、ＡＳＣの存在下におけるベータシートリッチなオリゴマーおよび原線維の増加が実証された（図１１）。共沈降実験において観察されたＡＳＣ−Ａβ相互作用と一致して、ＡＳＣおよびＡβは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳サンプルから共免疫沈降した（図２ｃ、ｄ）。ＡＳＣへのＡβの結合は年齢と共に増加し、野生型の動物においては存在しなかった。勾配遠心分離によりＡＰＰ／ＰＳ１脳から単離したＡβ沈着物のコンパートメント分析により、コア画分だけではなく線維画分においても、ＡＳＣがＡβと一緒に存在することが明らかになった（図２ｅ、図１２ａ〜ｃ）。これと一致して、免疫組織化学により、４カ月齢の初期Ａβ沈着物でさえ、抗体６Ｅ１０免疫陽性Ａβにより囲まれたＡＳＣ免疫陽性コアを示すことが明らかになった（図２ｆ、図１２ｄ、ｅ）。これは、ＡＳＣスペック媒介性自然免疫反応が、インビボにおけるＡβ凝集および沈着の初期段階においてＡβのクロスシーディングをもたらし得ることを示唆している。同様に、ＡＳＣ結合Ａβは、非認知症年齢適合対照由来のヒト脳サンプルにおいてはほぼ存在しなかったが、ＡＤ脳においては大きく増加していた（図２ｇ、ｈ、図１２ｆ、ｇ）。Ａβ沈着物のコアおよび線維画分の分析により、対照とは対照的に、ＡＤに起因する軽度認知機能障害（ＭＣＩ）（明白なＡＤ認知症の臨床前段階）を患っている患者は、コア画分におけるＡＳＣ−Ａβ共局在を有していたが、線維画分は、両標的に対してわずかな免疫反応性のみを示したことが見出された（図２ｉ）。同様に、ＡＤは、コア内におけるＡＳＣおよびＡβの共存を特徴としていたが、線維画分は依然として主にＡβ免疫陽性であり、これは、ＭＣＩの前またはその間にＡＳＣスペック−Ａβクロスシーディングが起こり（図２ｉ）、Ａβにより囲まれたコアのＡＳＣ免疫染色を引き起こすことを示唆している（図２ｊ、図１２ｈ）。特に、前頭側頭型認知症、大脳皮質基底核変性症および血管性認知症を含む他の神経変性疾患を患っている患者の死後組織において、ＡＳＣ結合Ａβは検出不能であった（図１２ｉ、ｊ）。
【０２３３】
実施例３：ＡＳＣスペックはインビボにおけるＡβ沈着を促進する
Ａβ病状および関連行動障害に対するＡＳＣの全体的な影響を特性評価するために、ＡＳＣノックアウト動物（ＡＳＣ−／−）をＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスと交配させ、３、８または１２カ月齢において分析した。３カ月の時点においては、差異は検出不能であったが、８および１２カ月の時点においては、ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−トランスジェニックマウスは、脳Ａβ負荷が有意に減少していた（図３ａ、ｂ、図１３ａ、ｃ、ｄ、図１４ａ、ｂ）。注目すべきことに、１６カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスにおいて以前に記載されているＮＬＲＰ３媒介性免疫機構のモジュレーション、例えば、カスパーゼ−１活性化（ＣＡＳＰ１、図１４ｃ〜ｆ）、Ａβ分解酵素ネプリライシン（ＮＥＰ、図１４ｃ〜ｆ）およびインスリン分解酵素の生成（ＩＤＥ、図１４ｃ〜ｆ）または食作用（図１５ａ）は、観察された脳Ａβの変化を説明しなかった。同様に、ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−動物は、実質的に改善された空間記憶性能を示した（図３ｃ〜ｆ、図１３ｂ）。１２カ月齢において、ＡＳＣ欠損のこの保護効果は依然として検出可能であった（図１３ｅ〜ｈ）。
【０２３４】
ＡＳＣがインビボにおいてＡβクロスシーディング剤として作用するかを調査するために、本発明者らは、細胞上清由来または精製ＡＳＣスペックを３カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬に注射し、６カ月齢においてＡβ沈着についてそれらの脳を分析した（図１４ｂ〜ｆ）。海馬内ＡＳＣスペック注射は、食作用に影響を与えずに（図１６ｉ）、溶媒対照を受けた対側海馬と比較して、Ａβ免疫陽性沈着物の数および総面積を増加させた（図１６ａ、ｂ、ｅ）。この結果は、注射部位までの規定の距離を有する脳切片から生成したプール脳ホモジネートのイムノブロット分析により実証され、ＡＰＰ発現またはＡＰＰ切断産物の変化を伴わずに、ＡＳＣスペック注射によりＡβの実質的な増加が誘導されたことが示された（図１６ｃ、ｄ）。以前、ＡＰＰまたはＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニック動物由来の脳ホモジネートをＡＰＰトランスジェニック動物に注射すると、Ａβ病状が拡大することが記載された９，２３。内因性ＡＳＣがこの現象に寄与するかを試験するために、ＡＰＰ／ＰＳ１またはＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスは、ＡＰＰ／ＰＳ１由来の脳ホモジネートの海馬内注射を受け、その一方で、対側海馬に野生型マウス脳ホモジネートを注射した。３カ月の時点において動物に注射し、８カ月齢において分析した（図１５ｄ）。ＡＰＰ／ＰＳ１動物において、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳由来のホモジネートの注射は、野生型マウス脳の対側注射と比較して、Ａβ陽性沈着物の数および総面積を増加させたが、これは、以前の結果を裏付けている（図３ｇ、ｈ）２３。重要なことに、ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスにおいて、この効果は完全に欠如していた。また、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスと、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳ホモジネートを受けたＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−マウスとの半球の比較により、Ａβ沈着物の数、それらの表面積およびそれらの体軸方向拡大の大きな差異が明らかになった（図１６ｆ）。この免疫組織化学的結果は、ＳＤＳ可溶性Ａβ１−４０およびＡβ１−４２のＥＬＩＳＡまたは脳ホモジネートのイムノブロット分析ならびにＡβモノマーおよびオリゴマー画分の定量により確認され（図３ｉ〜ｋ）、ＡＰＰ発現および切断産物のいかなる変化もなかった（図３ｊ）。本発明者らは、食作用（図１７ａ、ｂ）、ＣＡＳＰ１活性化またはＡβ分解酵素ＮＥＰおよびＩＤＥの生成（図１４ｄ）を評価した。注射および非注射ＡＳＣ−／−動物において増加したＩＤＥを除いて、２つの遺伝子型のすべてのパラメータについて、結果は同等であった（図１４ｄ）。この現象は、同じ脳組織におけるＩＤＥ活性の有意な増加（図１７ｃ）とは同時的ではなかったが、本発明者らは、ＩＤＥの増加が全体的効果に寄与したことを除外することはできない。それにもかかわらず、すべての他のインビボ実験は、ＩＤＥレベルおよび活性の有意差を示さなかったが、Ａβ病状のＡＳＣスペック媒介性モジュレーションは、インビボ所見がＡＳＣ誘導性シーディングに主に基づくことを示唆している。まとめると、これらの実験は、内因性ＡＳＣが、このモデルにおける誘導性Ａβ拡大の潜在的機構であることを示唆している。
【０２３５】
実施例４：ＡＳＣスペック抗体はＡβ沈着を低減する
次に、Ａβ拡大に対する潜在的影響について、注射脳ホモジネート中に存在する内因性ＡＳＣの寄与を試験した。これらの実験において、３カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、等量のＡβに調整した（図１５ｅ）ＡＰＰ／ＰＳ１またはＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−動物のいずれか由来のマウス脳ライセートの海馬内注射を受けた（図１５ｂ、ｄ）。８カ月齢において分析したところ、上記所見と一致して、ＡＰＰ／ＰＳ１／ＡＳＣ−／−由来の脳ライセートは、全体的な脳Ａβ負荷を増加させてＡβ病状の体軸方向拡大を誘導する能力の低減を示した（図４ａ〜ｄ、図１６ｇ）。したがって、複合的な証拠は、ＡＰＰ／ＰＳ１脳ホモジネートに含まれるＡＳＣがＡβ病状の拡大の寄与因子であることを示唆している。インビトロおよびインビボにおけるＡＳＣスペックの病原性役割を検証するために、抗体のコインキュベーションによりＡＳＣスペックをターゲティングする実験を実施した。ＴｈＴ蛍光分光法を用いて、特定の抗ＡＳＣスペック抗体は、Ａβ凝集自体に影響を与えずに（図４ｅ）、濃度依存的にＡＳＣスペック誘導性Ａβ凝集を防止することが見出された（図４ｅ）。ＡＳＣスペックが、インビボにおけるＡβ拡大に対する観察された効果に関与する媒介要素であるかをさらに実証するために、およびＡＳＣ欠損マウスにおける腸内微生物叢の差異の潜在的交絡因子を除外するために２４、ＡＰＰ／ＰＳ１動物は、ＡＳＣスペック特異的ＩｇＧまたはアイソタイプ特異的ＩｇＧのいずれかとＡＰＰ／ＰＳ１脳ホモジネートとの共注射を受けた（図４ｆ〜ｉ）。単回共注射によるＡＳＣスペックのターゲティングは、体軸方向Ａβ沈着を低減した（図１６ｈ）。この効果は、Ａβモノマーおよびオリゴマーの減少を伴った（図４ｇ、ｉ）。上記実験において、ＡＰＰ発現、ＡＰＰ切断産物（図４ｃ、ｉ）ならびにＩＤＥ、ＮＥＰおよびＣＡＳＰ１はいずれも、いかなる変化も示さなかった（図１４ｅ、ｆ）。
【０２３６】
まとめると、これらのデータは、ＡＳＣスペックがＡβ凝集および拡大に寄与することを示唆している。以前の実験により、合成ＡβはＡβプラーク形成を効率的に誘導しないことが報告されたが、これは、Ａβ集合および沈着を駆動する補因子の必要性を示唆している。ミクログリアの自然免疫活性化により放出されるＡＳＣスペックは、このような補因子に相当する可能性があるが、これは、脳におけるインフラマソーム活性化が、ＡＤにおけるＡβプラーク形成の進行に関連することを示唆している。この推定機構に反して、スクレイピーのマウスモデルにおいて、プリオン関連疾患進行は、ＡＳＣまたはＮＬＲＰ３の遺伝的欠損により影響を受けなかったが２５、これは、拡大を駆動する機構が神経変性障害間において異なることを示唆している。インフラマソーム応答とＡβプラーク拡大との病態生理学的関連性は、インフラマソームの薬理学的ターゲティングがＡＤの新規治療モダリティに相当し得ることを示唆している。
【０２３７】
ヒト抗ＡＳＣスペック抗体は、老化中の脳におけるベータ−アミロイドペプチドのクロスシーディングを防止し得る。老化に関連した免疫老化は、抗体生成および免疫監視の機能障害を特徴とする。したがって、免疫老化は、ＡＳＣスペックに対する自己抗体のレベルの減少に関連し得る。本発明者らは、特にアルツハイマー病などの神経変性疾患の臨床的に無症状の前段階において、可能な疾患進行マーカーとして内因性抗ＡＳＣ凝集体抗体力価を使用することを提案する。ベータ−アミロイド沈着はレビー小体型認知症においても起こるので、以下の機構は、特に、すべての形態の認知症の診断および鑑別診断に使用され得る。
【０２３８】
さらに、ＡＳＣスペック形成は、パーキンソン病、多系統萎縮症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症および小脳性運動失調（Ｓｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ）などの他の神経変性疾患において十分に説明されている自然免疫反応の一環として起こり得る。
【０２３９】
実施例５：ＡＳＣスペック（濃度を増加させながら）へ曝露された初期海馬ニューロン
ＡＳＣスペックの精製
ＡＳＣスペックを精製するために、ＮＬＲＰ３およびＡＳＣを過剰発現させながら、不死化マクロファージを使用した。播種した２日後、細胞を集め、ペレット化した。細胞の溶解は、オンアイスで、２０Ｇニードルを備えたシリンジを用いて、２倍ペレット量のＣＨＡＰＳバッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、０．１％のＣＨＡＰＳ、０．１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｘプロテアーゼインヒビターミックス（Ｒｏｃｈｅ製））、２５倍の充填物によって行った。ライセートを遠心分離（１８，５００ｘｇ／８分）し、上清を回収し、再度遠心分離（１００，０００ｘｇ／４℃／３０分）した。得られた上清を取り、０．２２μｍ  ＰＶＤＦフィルターを用いて、遠心分離（１８，５００ｘｇ／４℃／５分）により、ろ過した。その後、ろ液におけるＡＳＣの形成を３７℃、３０分間のインキュベーションにより誘導した。ＡＳＣスペックを遠心分離（６００ｘｇ／４℃／８分）した。ペレットを滅菌ＰＢＳ中で溶解した。溶液を含むＡＳＣスペックを４℃で保管した。
【０２４０】
ＡＳＣスペックによる初期ニューロンの治療
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｅ１５−１６）から海馬ニューロンを調製した。７０，０００個の細胞／ウェルを、２４マルチウェルプレートに播種した。播種した１２日後、ニューロンを様々な量のＡＳＣスペック溶液で２４時間治療した。細胞生存率を測定するため、ＡＳＣスペック治療後、ニューロンを、製造業者のプロトコルに相当するＸＴＴ溶液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ製）によりインキュベートした。３時間後、結果の読み出しを、プレート読み出し装置（ＴＥＣＡＮ製）を用いて４５０ｎｍで吸光度測定を行った。
【０２４１】
本発明者らによって確認されたように、例えばアルツハイマー患者において観察される主な炎症事象はベータアミロイドの凝集に起因する。この作用は例えばアルツハイマー病の主因であることが確認された。Ａβ凝集に続く炎症は抗ＡＳＣスペックリガンド、特にＡ−ベータ凝集および拡大に寄与するＡＳＣスペックの効果を妨げる抗体を使用することにより上手く克服される。したがって、（図９Ｆ−９Ｉのインビボ実験によって示されるように）抗ＡＳＣスペック抗体がＡＳＣスペックに基づく凝集を効果的に低減させることは独創的な知見であった。Ｆｒａｎｋｌｉｎらの知見は、シリカ結晶の注射によりトリガーされるインビボインフラマソーム活性化を伴う異なる状態を説明するものである。このような状態において、抗ＡＳＣスペック抗体は、シリカ結晶がインビボインフラマソーム活性化をトリガーした後に現れるＡＳＣスペックと結合する。
【０２４２】
参考文献
2021509257.tif 000003
2021509257.tif 000004
2021509257.tif 000005
【図１ａｂ】
2021509257.tif 000006
【図１ｃ】
2021509257.tif 000007
【図１ｄｆ】
2021509257.tif 000008
【図１ｇ】
2021509257.tif 000009
【図１ｈｉ】
2021509257.tif 000010
【図１ｊｋ】
2021509257.tif 000011
【図２ａｂ】
2021509257.tif 000012
【図２ｃｄ】
2021509257.tif 000013
【図２ｅｆ】
2021509257.tif 000014
【図２ｇｈ】
2021509257.tif 000015
【図２ｉｊ】
2021509257.tif 000016
【図３ａｂ】
2021509257.tif 000017
【図３ｃｄｅ】
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【図３ｆｇ】
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【図３ｈｉ】
2021509257.tif 000020
【図３ｊ】
2021509257.tif 000021
【図３ｋ】
2021509257.tif 000022
【図４ａｂ】
2021509257.tif 000023
【図４ｃｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆｇ】
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【図４ｈｉ】
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【図５ａｂ】
2021509257.tif 000028
【図５ｃｄｅ】
2021509257.tif 000029
【図５ｆ】
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【図５ｇｈ】
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【図６ａｂ】
2021509257.tif 000032
【図６ｃ】
2021509257.tif 000033
【図６ｄｅ】
2021509257.tif 000034
【図６ｆｇｈｉｊ】
2021509257.tif 000035
【図７ａ】
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【図７ｂｃ】
2021509257.tif 000037
【図７ｄ】
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【図７ｅ】
2021509257.tif 000039
【図７ｆ】
2021509257.tif 000040
【図８ａ】
2021509257.tif 000041
【図８ｂ】
2021509257.tif 000042
【図８ｃ】
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【図８ｄ】
2021509257.tif 000044
【図９ａｂ】
2021509257.tif 000045
【図９ｃｄ】
2021509257.tif 000046
【図９ｅｆ】
2021509257.tif 000047
【図９ｇｈｉ】
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【図１０ａｂ】
2021509257.tif 000049
【図１０ｃｄ】
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【図１０ｅｆ】
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【図１０ｇｈ】
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【図１０ｉｊｋ】
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【図１１ａｂｃｄｅｆ】
2021509257.tif 000054
【図１１ｇｈ】
2021509257.tif 000055
【図１２ａｂｃ】
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【図１２ｄｅ】
2021509257.tif 000057
【図１２ｆｇｈ】
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【図１２ｉｊ】
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【図１３ａｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１３ｅｆ】
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【図１３ｇｈ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃｄ】
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【図１４ｅｆ】
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【図１５ａｂｃｄ】
2021509257.tif 000069
【図１５ｅｆ】
2021509257.tif 000070
【図１６ａｂ】
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【図１６ｃｄ】
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【図１６ｅｆ】
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【図１６ｇｈ】
2021509257.tif 000074
【図１６ｉ−１】
2021509257.tif 000075
【図１６ｉ−２】
2021509257.tif 000076
【図１７ａ】
2021509257.tif 000077
【図１７ｂ】
2021509257.tif 000078
【図１７ｃ】
2021509257.tif 000079
【図１８】
2021509257.tif 000080
【配列表】
2021509257000001.app
【国際調査報告】
2021509257.tif 000081
2021509257.tif 000082
2021509257.tif 000083
2021509257.tif 000084