(57)【要約】  本発明は、細菌において遺伝子発現を阻害する方法に関し、この方法はここでは抗菌性遺伝子サイレンシング（ＡＧＳ）と呼ばれる。特定の実施形態では、この方法を使用して、低分子非コードＲＮＡを介して配列特異的様式で病原性因子および／または必須遺伝子を標的にすることにより植物および動物を病原性細菌から保護する。この方法を使用すれば、相利共生または片利共生細菌の有益な効果および／または成長を増強することができる。本発明は、細菌成長、生存および／または病原性を低減するために、ＲＮＡ抽出物の形態でのまたは植物細胞外小胞（ＥＶ）中に埋め込んでの、低分子ＲＮＡ実体の細菌上への外因性送達を含む。本発明は、抗菌活性を有し抗感染剤としてさらに開発される可能性のある低分子ＲＮＡを、迅速で信頼性があり対費用効果の高い様式で特定する方法も記載している。さらに、後者の方法は、いかなる細菌種由来のいかなる遺伝子でも迅速に特徴付けるのに役立つ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細菌細胞において少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害するためのインビトロ方法であって、前記標的細菌細胞を低分子ＲＮＡに、または低分子ＲＮＡを含有する組成物に接触させるステップを含み、前記低分子ＲＮＡが１５〜３０塩基対の間に含まれる長さを有する、方法。
【請求項２】
前記低分子ＲＮＡが、細菌必須遺伝子または細菌病原性遺伝子または抗生物質耐性遺伝子の発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌が動物病原性細菌である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌が、
アクチノマイセス・イスラエリー（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア菌種（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐ．）（ブルグドルフェリ（ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ガリニ（ｇａｒｉｎｉｉ）、アフゼリ（ａｆｚｅｌｉｉ）、レカレンチス（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）、クロシドゥレ（ｃｒｏｃｉｄｕｒａｅ）、ダットニイ（ｄｕｔｔｏｎｉｉ）、ヘルムシー（ｈｅｒｍｓｉｉ）等）、ブルセラ菌種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐ．）（アボータス（ａｂｏｒｔｕｓ）、カニス（ｃａｎｉｓ）、メリテンシス（ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、スイス（ｓｕｉｓ））、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、クラミジア菌種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）（ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、トラコマチス（ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クロストリジウム菌種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）（ボツリヌス（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、パーフリンジェンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、テタニ（ｔｅｔａｎｉ））、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エーリキア菌種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐ．）（カニス（ｃａｎｉｓ）、シャフェンシス（ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ））、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（フェカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）、フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ））、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ヘリコバクターピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ菌種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、マイコバクテリウム菌種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）（レプラエ（ｌｅｐｒａｅ）、ツベルクローシス（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（ゴノレア（ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、メニンギティディス（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ポルヒロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、サルモネラ菌種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）（���フス菌（ｔｙｐｈｉ）、ティフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、シゲラ菌種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．）（ソンネ（ｓｏｎｎｅｉ）、ディゼンテリエ（ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ））、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）、エピデルミディス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、サプロフィティカス（ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ））、ストレプトコッカス菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（アガラクチアエ（ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）、ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ピオゲネス（ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ビリダンス（ｖｉｒｉｄａｎｓ））、タンネレラ・フォーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、およびエルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が、細胞外遊離低分子ＲＮＡ、または前記低分子ＲＮＡを含有する細胞外小胞または前記低分子ＲＮＡを含有するアポプラスト液または前記低分子ＲＮＡに連結されたナノ粒子を含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
１５〜３０塩基対の間に含まれる長さを有し、少なくとも１つの細菌遺伝子の発現を特異的に阻害する低分子ＲＮＡを活性成分として含有する治療組成物。
【請求項７】
前記細菌遺伝子が、細菌病原性因子遺伝子または細菌生存能遺伝子または抗生物質耐性遺伝子である、請求項６に記載の治療組成物。
【請求項８】
細胞外遊離低分子ＲＮＡ、または前記低分子ＲＮＡを含有する細胞外小胞または前記低分子ＲＮＡを含有するアポプラスト液または前記低分子ＲＮＡに連結されたナノ粒子、および薬学的に許容される賦形剤を含有する、請求項６または７に記載の治療組成物。
【請求項９】
経口、局所または全身投与のために、好ましくは丸薬、クリーム、または口腔スプレーとして製剤化される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の治療組成物。
【請求項１０】
前記病原性因子遺伝子または生存能遺伝子または抗生物質耐性遺伝子が、ＩＩＩ型分泌系を含む分泌系の構造遺伝子、ＩＶ型分泌系の構造遺伝子、ＶＩ型分泌系の構造遺伝子、ｄｏｔ／ｉｃｍ系の遺伝子、クオラムセンシング遺伝子、アミノ酸合成に関与する必須遺伝子、トランスペプチダーゼ、細菌転写装置の構成成分、細菌細胞壁の構造成分、細胞分裂に重要な遺伝子、アクチンの構造相同物、抗生物質標的全般等からなる群において選択される、請求項６〜９のいずれか１項に記載の治療組成物。
【請求項１１】
前記病原性因子遺伝子または細菌生存能遺伝子または抗生物質耐性遺伝子が、ＰｓｃＣ、ＰｓｃＪ、ＰｓｃＮ、ＶｉｒＢ１、ＶｉｒＤ４、ＴｓｓＭ、ＴｓｓＪ、ＴｓｓＢ／ＴｓｓＣ、ＴｓｓＥ、ＶｇｒＧ、Ｈｃｐ、ＤｏｔＣ、ＤｏｔＤ、ＤｏｔＦ、ＤｏｔＧおよびＤｏｔＨ、ＬｕｘＳ、Ｌｕｘｌ／ＬｕｘＲ、ＡｒｏＡ、ＬｙｓＣ、ＣｙｓＨ、ＧａｌＵ、ＰｂｐＡ、ＰｂｐＢ、ＰｂｐＣ、Ｐｉｇｍａ７０、Ｓｉｇｍａ５４、Ａｒｃ、Ｐｔｒ、Ｎｏｒ、Ｍｅｐ、Ｃｍｅ、ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＧＥＳ、ＶＩＭ、ＮＤＭ、ＡｍｐＣ、ＶＩＭ−１、ＶＩＭ−２、ＶＩＭ−３、ＶＩＭ−５、ＣａｓＥ、ＯＸＡ−２８、ＯＸＡ−１４、ＯＸＡ−１９、ＯＸＡ−１４５、ＰＥＲ−１、ＴＥＭ−１１６、ＧＥＳ−９、ＦｔｓＺ、ＦｔｓＡ、ＦｔｓＮ、ＦｔｓＫ、ＦｔｓＩ、ＦｔｓＷ、ＺｉｐＡ、ＺａｐＡ、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、Ｐａｌ、ＭｉｎＣＤ、ＭｒｅＢならびにＭｌｄからなる群において選択される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の治療組成物。
【請求項１２】
それを必要とする対象において細菌感染を処置するおよび／または予防するために使用するための、請求項６〜１１のいずれかにおいて定義される治療組成物。
【請求項１３】
前記対象が、属：ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ハイイロオオカミ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、ヒツジ（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ）、ヤギ（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）、イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、シチメンチョウ（Ｍｅｌｅａｇｒｉｓ  ｇａｌｌｏｐａｖｏ）、ハイイロガン（Ａｎｓｅｒ  ａｎｓｅｒ）、マガモ（Ａｎａｓ  ｐｌａｔｙｒｈｙｎｃｈｏｓ）、またはウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）の動物である、請求項１２に記載の使用のための治療組成物。
【請求項１４】
前記対象に経口的に、局所的にまたは全身的に投与される、請求項１２または１３に記載の使用のための治療組成物。
【請求項１５】
それを必要とする対象において細菌感染を処置するおよび／または予防するために使用するための、低分子ＲＮＡが前記対象に経口的に、局所的にまたは全身的に投与される、１５〜３０塩基対の間に含まれる長さを有し、少なくとも１つの細菌遺伝子の発現を特異的に阻害する前記低分子ＲＮＡ、または請求項６〜１１に記載される治療組成物。
【請求項１６】
前記対象が、属：ヒト、ハイイロオオカミ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イノシシ、ニワトリ、シチメンチョウ、ハイイロガン、マガモ、またはウサギの動物である、請求項１５に記載の使用のための低分子ＲＮＡまたは組成物。
【請求項１７】
前記細菌感染が、
アクチノマイセス・イスラエリー、炭疽菌、セレウス菌、バクテロイデス・フラジリス、百日咳菌、ボレリア菌種（ブルグドルフェリ、ガリニ、アフゼリ、レカレンチス、クロシドゥレ、ダットニイ、ヘルムシー等）、ブルセラ菌種（アボータス、カニス、メリテンシス、スイス）、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア菌種（ニューモニエ、トラコマチス）、オウム病クラミジア、クロストリジウム菌種（ボツリヌス、ディフィシル、パーフリンジェンス、テタニ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ、エーリキア菌種（カニス、シャフェンシス）、エンテロコッカス（フェカリス、フェシウム）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、フランシセラ・ツラレンシス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクターピロリ菌、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ菌種、リステリア・モノサイトゲネス、マイコバクテリウム菌種（レプラエ、ツベルクローシス）、マイコプラズマ・ニューモニエ、ナイセリア（ゴノレア、メニンギティディス）、シュードモナス・エルジノーサ、ポルヒロモナス・ジンジバリス、ノカルジア・アステロイデス、リケッチア・リケッチイ、サルモネラ菌種（チフス菌、ティフィムリウム）、シゲラ菌種（ソンネ、ディゼンテリエ）、スタフィロコッカス（アウレウス、エピデルミディス、サプロフィティカス）、ストレプトコッカス菌種（アガラクチアエ、ミュータンス、ニューモニエ、ピオゲネス、ビリダンス）、タンネレラ・フォーサイシア、トレポネーマ・パリダム、ビブリオ・コレラエ、およびエルシニア・ペスチスから選択されるヒト病原性細菌によるものである、請求項１５または１６に記載の使用のための低分子ＲＮＡまたは組成物。
【請求項１８】
少なくとも１つの細菌病原性因子のまたは細菌必須遺伝子のまたは抗生物質耐性遺伝子の発現を特異的に阻害する、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の使用のための低分子ＲＮＡまたは組成物。
【請求項１９】
細胞外遊離低分子ＲＮＡ、または前記低分子ＲＮＡを含有する細胞外小胞、または前記低分子ＲＮＡを含有するアポプラスト液、または前記低分子ＲＮＡに連結されたナノ粒子を含有する、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の使用のための低分子ＲＮＡまたは組成物。
【請求項２０】
それを必要とする対象において片利共生または相利共生有益細菌の有益な効果を促進するために使用するための、１５〜３０塩基対の間に含まれる長さを有し、少なくとも１つの細菌遺伝子の発現を特異的に阻害する低分子ＲＮＡであって、前記対象に経口的に、局所的にまたは全身的に投与される低分子ＲＮＡ。
【請求項２１】
前記片利共生または相利共生有益細菌が、
アクチノマイセス・ネスルンディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、ベイロネラ・ディスパル（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｄｉｓｐａｒ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、大腸菌Ｋ１２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２）、ビフィドバクテリウム菌種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）（ロンガム（ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィダム（ｂｉｆｉｄｕｍ）、アドレッセンティス（ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、デンティウム（ｄｅｎｔｉｕｍ）、ブレーベ（ｂｒｅｖｅ）、サーモフィラム（ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｍ））、エガセラ・レンタ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ）、バクテロイデス菌種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．）（キシラニソルベンス（ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）、テタイオタオミクロン（ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、フラジリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ブルガタス（ｖｕｌｇａｔｕｓ）、サラニトロニス（ｓａｌａｎｉｔｒｏｎｉｓ））、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、ルミノコッカス菌種（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（ブロミイ（ｂｒｏｍｉｉ）、シャンパネレンシス（ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）、ＳＲ１／５）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（パラサングイニス（ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、サリバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、サーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スイス（ｓｕｉｓ）、ピオゲネス（ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アンギノサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ））、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、ガルビエ（ｇａｒｖｉｅａｅ））、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）、フェカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）、カセリフラブス（ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、デューランス（ｄｕｒａｎｓ）、ヒラエ（ｈｉｒａｅ））、メリソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシルス菌種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（カゼイ（ｃａｓｅｉ）、ルミニス（ｒｕｍｉｎｉｓ）、デリブルエッキイー（ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ブチネリ（ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）、ファーメンタム（ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ペントーサス（ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、アミロボラス（ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、サリバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ））、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）（ペントサセウス（ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、クラウセニ（ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ））、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）（メセンテロイデス（ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、カルノサム（ｃａｒｎｏｓｕｍ）、ゲリダム（ｇｅｌｉｄｕｍ）、シトレウム（ｃｉｔｒｅｕｍ））、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）（タイランデンシス（ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、コリエンシス（ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ））、オエノコッカス・オエニ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ）、パエニバチルス菌種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（テラエ（ｔｅｒｒａｅ）、ポリミキサ（ｐｏｌｙｍｙｘａ）、ムシラギノサス（ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓ）、Ｙ４１２ＭＣ１０）、サーモバチルス・コンポスティ（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｍｐｏｓｔｉ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、サブティリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、リケニフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、アトロファエウス（ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、ウェイヘンステファネンシス（ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）、セレウス（ｃｅｒｅｕｓ）、チューリンゲンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、コアグランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、メガテロウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、セレニティレドセンス（ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ））、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、リジニバチルス・スファエリカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、ハロバチルス・ハロフィラス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、リステリア菌種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐ．）、ストレプトマイセス菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（レクタレ（ｒｅｃｔａｌｅ）、エリゲンス（ｅｌｉｇｅｎｓ）、シラエウム（ｓｉｒａｅｕｍ））、クロストリジウム・サッカロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）および酪酸産生細菌（ｂｕｔｙｒａｔｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＳＳ３／４およびＳＳＣ／２）から選択される、請求項２０に記載の使用のための低分子ＲＮＡ。
【請求項２２】
対象にとって有益である経路の負の制御因子をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害する、請求項２０または２１に記載の使用のための低分子ＲＮＡ。
【請求項２３】
前記片利共生有益細菌の負の複製因子をコードする遺伝子の、または包囲された病原性細菌に向けられた抗生物質もしくは抗菌化合物の産生を抑える遺伝子の発現を特異的に阻害する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の使用のための低分子ＲＮＡ。
【請求項２４】
細胞外遊離低分子ＲＮＡである、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の使用のための低分子ＲＮＡ。
【請求項２５】
それを必要とする対象において抗生物質処理の効率を改善するために使用するための、１５〜３０塩基対の間に含まれる長さを有し、少なくとも１つの細菌抗生物質耐性遺伝子の発現を特異的に阻害する低分子ＲＮＡ。
【請求項２６】
前記対象が、
アクチノマイセス・イスラエリー、炭疽菌、セレウス菌、バクテロイデス・フラジリス、百日咳菌、ボレリア菌種（ブルグドルフェリ、ガリニ、アフゼリ、レカレンチス、クロシドゥレ、ダットニイ、ヘルムシー等）、ブルセラ菌種（アボータス、カニス、メリテンシス、スイス）、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア菌種（ニューモニエ、トラコマチス）、オウム病クラミジア、クロストリジウム菌種（ボツリヌス、ディフィシル、パーフリンジェンス、テタニ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ、エーリキア菌種（カニス、シャフェンシス）、エンテロコッカス（フェカリス、フェシウム）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、フランシセラ・ツラレンシス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクターピロリ菌、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ菌種、リステリア・モノサイトゲネス、マイコバクテリウム菌種（レプラエ、ツベルクローシス）、マイコプラズマ・ニューモニエ、ナイセリア（ゴノレア、メニンギティディス）、シュードモナス・エルジノーサ、ポルヒロモナス・ジンジバリス、ノカルジア・アステロイデス、リケッチア・リケッチイ、サルモネラ菌種（チフス菌、ティフィムリウム）、シゲラ菌種（ソンネ、ディゼンテリエ）、スタフィロコッカス（アウレウス、エピデルミディス、サプロフィティカス）、ストレプトコッカス菌種（アガラクチアエ、ミュータンス、ニューモニエ、ピオゲネス、ビリダンス）、タンネレラ・フォーサイシア、トレポネーマ・パリダム、ビブリオ・コレラエ、およびエルシニア・ペスチスから選択される病原性細菌に感染する、請求項２５に記載の使用のための低分子ＲＮＡ。
【請求項２７】
ａ）１５〜３０塩基対の間に含まれる長さを有し、抗生物質耐性遺伝子の発現を特異的に阻害する低分子ＲＮＡ、または請求項６〜１１に記載の治療組成物、および
ｂ）抗生物質化合物
を含有する医薬キット。
【請求項２８】
前記抗生物質耐性遺伝子が、ＶＩＭ−１、ＶＩＭ−２、ＶＩＭ−３、ＶＩＭ−５、Ｃａｓｅ、ＯＸＡ−２８、ＯＸＡ−１４、ＯＸＡ−１９、ＯＸＡ−１４５、ＰＥＲ−１、ＴＥＭ−１１６、およびＧＥＳ−９から選択される、請求項２７に記載の医薬キット。
【請求項２９】
前記抗生物質化合物が、アミノグリコシド、カルバペネム、セフタジジム（第３世代）、セフェピム（第４世代）、セフトビプロール（第５世代）、セフトロザン／タゾバクタム、フルオロキノロン、ピペラシリン／タゾバクタム、チカルシリン／クラブラン酸、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネルチマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲルダナマイシン（Ｇｅｌｄｅｎａｍｙｃｉｎ）、ハービマイシン、リファキシミン、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セフラジン、セファピリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフォテタン、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、ロラカルベフ、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、モキサラクタム、セフトリアキソン、セファロスポリン、セフェピム、セファロスポリン、セフタロリンフォサミル、セフトビプロール、グリコペプチド、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、ダルババンシン、オリタバンシン、リンコサミド（Ｂｓ）、クリンダマイシン、リンコマイシン、リポペプチド、ダプトマイシン、マクロライド（Ｂｓ）、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、フィダキソマイシン、モノバクタム、アズトレオナム、ニトロフラン、フラゾリドン、ニトロフラントイン（Ｂｓ）、オキサゾリジノン（Ｂｓ）、リネゾリド、ポジゾリド、ラデゾリド、トレゾリド、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリン、ピペラシリン、テモシリン、チカルシリン、ペニシリン組合せ、アミキシシリン／クラブラン酸、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、チカルシリン／クラブラン酸、ポリペプチド、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、キノロン／フルオロキノロン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロシサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、スルホンアミド（Ｂｓ）、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド（古語）、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、スルホンアミドクリソイジン（古語）、テトラサイクリン（Ｂｓ）、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン、サイクロセリン、エタンブトール（Ｂｓ）、エチオナミド、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、ストレプトマイシン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール（Ｂｓ）、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、チアンフェニコール、チゲサイクリン（Ｂｓ）、チニダゾール、およびトリメトプリム（Ｂｓ）から選択される、請求項２７または２８に記載の医薬キット。
【請求項３０】
それを必要とする対象において細菌感染を処置するおよび／または予防するために使用するための、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の医薬キット。
【請求項３１】
細菌感染を予防するおよび／または処置するための同時、別々のまたは時差使用に、それを必要とする対象において使用するための、
ａ）１５〜３０塩基対の間に含まれる長さを有し、抗生物質耐性遺伝子の発現を特異的に阻害する低分子ＲＮＡ、または請求項６〜１１に記載の治療組成物、および
ｂ）抗生物質化合物
を含む組合せ製品。
【請求項３２】
前記低分子ＲＮＡが、抗生物質化合物の前に、好ましくは１日前に投与される、請求項３１に記載の組合せ製品。
【請求項３３】
１５〜３０塩基対の間に含まれる長さを有し、ＰｓｃＣ、ＰｓｃＪ、ＰｓｃＮ、ＶｉｒＢ１、ＶｉｒＤ４、ＴｓｓＭ、ＴｓｓＪ、ＴｓｓＢ／ＴｓｓＣ、ＴｓｓＥ、ＶｇｒＧ、Ｈｃｐ、ＤｏｔＣ、ＤｏｔＤ、ＤｏｔＦ、ＤｏｔＧおよびＤｏｔＨ、ＬｕｘＳ、Ｌｕｘｌ／ＬｕｘＲ、ＡｒｏＡ、ＬｙｓＣ、ＣｙｓＨ、ＧａｌＵ、ＰｂｐＡ、ＰｂｐＢ、ＰｂｐＣ、Ｐｉｇｍａ７０、Ｓｉｇｍａ５４、Ａｒｃ、Ｐｔｒ、Ｎｏｒ、Ｍｅｐ、Ｃｍｅ、ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＧＥＳ、ＶＩＭ、ＮＤＭ、ＡｍｐＣ、ＶＩＭ−１、ＶＩＭ−２、ＶＩＭ−３、ＶＩＭ−５、ＣａｓＥ、ＯＸＡ−２８、ＯＸＡ−１４、ＯＸＡ−１９、ＯＸＡ−１４５、ＰＥＲ−１、ＴＥＭ−１１６、ＧＥＳ−９、ＦｔｓＺ、ＦｔｓＡ、ＦｔｓＮ、ＦｔｓＫ、ＦｔｓＩ、ＦｔｓＷ、ＺｉｐＡ、ＺａｐＡ、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、Ｐａｌ、ＭｉｎＣＤ、ＭｒｅＢならびにＭｌｄからなる群から選択される少なくとも１つの細菌遺伝子の発現を特異的に阻害する低分子ＲＮＡ。
【請求項３４】
細菌細胞において前記遺伝子の発現を阻害するための、請求項３３に定義される低分子ＲＮＡのインビトロ使用。
【請求項３５】
細菌成長、生存能または抗生物質耐性を阻害するための、請求項３３または３４に記載の低分子ＲＮＡのインビトロ使用。
【請求項３６】
それを必要とする対象において細菌感染を処置するおよび／または予防するために使用するための、請求項３３に記載の低分子ＲＮＡ。
【請求項３７】
前記細菌感染が、
アクチノマイセス・イスラエリー、炭疽菌、セレウス菌、バクテロイデス・フラジリス、百日咳菌、ボレリア菌種（ブルグドルフェリ、ガリニ、アフゼリ、レカレンチス、クロシドゥレ、ダットニイ、ヘルムシー等）、ブルセラ菌種（アボータス、カニス、メリテンシス、スイス）、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア菌種（ニューモニエ、トラコマチス）、オウム病クラミジア、クロストリジウム菌種（ボツリヌス、ディフィシル、パーフリンジェンス、テタニ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ、エーリキア菌種（カニス、シャフェンシス）、エンテロコッカス（フェカリス、フェシウム）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、フランシセラ・ツラレンシス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクターピロリ菌、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ菌種、リステリア・モノサイトゲネス、マイコバクテリウム菌種（レプラエ、ツベルクローシス）、マイコプラズマ・ニューモニエ、ナイセリア（ゴノレア、メニンギティディス）、シュードモナス・エルジノーサ、ポルヒロモナス・ジンジバリス、ノカルジア・アステロイデス、リケッチア・リケッチイ、サルモネラ菌種（チフス菌、ティフィムリウム）、シゲラ菌種（ソンネ、ディゼンテリエ）、スタフィロコッカス（アウレウス、エピデルミディス、サプロフィティカス）、ストレプトコッカス菌種（アガラクチアエ、ミュータンス、ニューモニエ、ピオゲネス、ビリダンス）、タンネレラ・フォーサイシア、トレポネーマ・パリダム、ビブリオ・コレラエ、およびエルシニア・ペスチスのうちの少なくとも１つにより引き起こされる、請求項３６に記載の使用のための低分子ＲＮＡ。
【請求項３８】
細菌抗生物質耐性に関与する候補遺伝子を特定するインビトロ方法であって、
ａ）細菌細胞を、１５〜３０塩基対の間に含まれる長さを有し、少なくとも１つの細菌遺伝子を特異的に阻害する低分子ＲＮＡと一緒にインキュベートするステップ、
ｂ）前記低分子ＲＮＡ処理細菌細胞を抗生物質化合物と一緒にインキュベートするステップ、
ｃ）前記抗生物質化合物の存在下での前記低分子ＲＮＡ処理細菌細胞の生存能、成長、代謝活性を評価し、前記抗生物質化合物の非存在下での前記低分子ＲＮＡ処理細菌細胞の生存能、成長、代謝活性と比較するステップ
を含む方法。
【請求項３９】
前記抗生物質化合物の存在下での前記低分子ＲＮＡ処理細菌細胞の生存能、成長、代謝活性が、前記抗生物質化合物の非存在下での前記低分子ＲＮＡ処理細菌細胞の生存能、成長、代謝活性よりも低い場合は、候補遺伝子が細菌抗生物質耐性に関与している、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
抗菌活性を有する候補低分子ＲＮＡを特定するインビトロ方法であって、
ａ）そのコグネートｓｉＲＮＡが少なくとも１つの細菌遺伝子を阻害する少なくとも１つの長いｄｓＲＮＡを植物細胞において発現させるステップ、
ｂ）前記植物細胞を溶解緩衝液に接触させるステップ、
ｃ）前記植物細胞ライセートまたはそのＲＮＡ抽出物を、細菌細胞と一緒にインキュベートするステップ、および
ｄ）前記細菌細胞の生存能、成長、代謝活性を評価するステップ
を含む方法。
【請求項４１】
前記植物細胞がタバコ葉に由来する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ヒト病原性細菌細胞の増殖に影響を及ぼす候補遺伝子を特定するインビトロ方法であって、
ａ）少なくとも１つの細菌遺伝子の発現を阻害する低分子ＲＮＡを生成するステップ、
ｂ）前記低分子ＲＮＡを細菌細胞と一緒にインキュベートするステップ、および
ｃ）前記細菌細胞の生存能、成長、代謝活性を評価するステップ
を含む方法。
【請求項４３】
前記細菌細胞が、
アクチノマイセス・イスラエリー、炭疽菌、セレウス菌、バクテロイデス・フラジリス、百日咳菌、ボレリア菌種（ブルグドルフェリ、ガリニ、アフゼリ、レカレンチス、クロシドゥレ、ダットニイ、ヘルムシー等）、ブルセラ菌種（アボータス、カニス、メリテンシス、スイス）、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア菌種（ニューモニエ、トラコマチス）、オウム病クラミジア、クロストリジウム菌種（ボツリヌス、ディフィシル、パーフリンジェンス、テタニ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ、エーリキア菌種（カニス、シャフェンシス）、エンテロコッカス（フェカリス、フェシウム）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、フランシセラ・ツラレンシス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクターピロリ菌、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ菌種、リステリア・モノサイトゲネス、マイコバクテリウム菌種（レプラエ、ツベルクローシス）、マイコプラズマ・ニューモニエ、ナイセリア（ゴノレア、メニンギティディス）、シュードモナス・エルジノーサ、ポルヒロモナス・ジンジバリス、ノカルジア・アステロイデス、リケッチア・リケッチイ、サルモネラ菌種（チフス菌、ティフィムリウム）、シゲラ菌種（ソンネ、ディゼンテリエ）、スタフィロコッカス（アウレウス、エピデルミディス、サプロフィティカス）、ストレプトコッカス菌種（アガラクチアエ、ミュータンス、ニューモニエ、ピオゲネス、ビリダンス）、タンネレラ・フォーサイシア、トレポネーマ・パリダム、ビブリオ・コレラエ、およびエルシニア・ペスチスから選択される、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
細菌感染に対して標的植物を処置するための方法であって、前記標的植物の少なくとも１つの細胞中に病原性細菌遺伝子もしくは必須細菌遺伝子もしくは抗菌耐性遺伝子を特異的に標的にする長いｄｓＲＮＡ分子を導入する、またはそのような遺伝子を標的にする低分子ＲＮＡ、もしくは前記低分子ＲＮＡを含有する植物抽出物もしくは前記低分子ＲＮＡを含む組成物をヒトまたは動物病原性細菌による細菌感染に先立っておよび／または後に植物組織上に送達するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌において遺伝子発現を阻害する方法に関し、この方法はここでは抗菌性遺伝子サイレンシング（ＡＧＳ）と呼ばれる。特定の実施形態では、この方法を使用して、低分子非コードＲＮＡを介して配列特異的方法で病原性因子および／または必須遺伝子を標的にすることにより植物および動物を病原性細菌から保護する。この方法を使用すれば、相利共生または片利共生細菌の有益な効果および／または成長を増強することができる。本発明は、細菌成長、生存および／または病原性を低減するために、ＲＮＡ抽出物の形態でのまたは植物細胞外小胞（ＥＶ）中に埋め込んでの、低分子ＲＮＡ実体の細菌上への外因性送達を含む。本発明は、抗菌活性を有し抗感染薬としてさらに開発される可能性のある低分子ＲＮＡを、迅速で信頼性があり対費用効果の高い方法で特定する方法も記載している。さらに、後者の方法は、いかなる細菌種由来のいかなる遺伝子でも迅速に特徴付けるのに役立つ。
【背景技術】
【０００２】
植物免疫系の概要
植物免疫系の第１層は、病原体関連分子パターンまたは微生物関連分子パターン（ＰＡＭＰまたはＭＡＭＰ）の認識を含み、これらのパターンは表面局在性パターン認識受容体（ＰＲＲ）により感知される保存された微生物シグネチャーである（１）。リガンドが結合すると、これらの受容体は、ＰＡＭＰ誘導免疫（ＰＴＩ）を引き起こす複雑なリン酸化カスケードをＰＲＲ複合体で開始する（１）。病気を可能にするために、病原体はＰＴＩを抑制するエフェクターを分泌する（２）。例えば、グラム陰性菌シリンゲ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト株ＤＣ３０００（Ｐｔｏ  ＤＣ３０００）は３６のＩＩＩ型分泌エフェクターを植物細胞に注入してＰＴＩを弱める（３）。この細菌は、病原性に不可欠である植物毒素のコロナチン（ＣＯＲ）も産生する（４）。植物は、病原体エフェクターの存在を感知して、宿主カウンターカウンター防御の引き金を引くことができる病気抵抗性（Ｒ）タンパク質を進化させてきた（５）。大半のＲタンパク質は、動物にも存在するロイシンリッチリピート（ＮＬＲ）スーパーファミリーであるヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）に属する（２、５）。Ｒタンパク質は、病原体エフェクターを直接的または間接的に認識し、エフェクター誘導免疫（ＥＴＩ）を開始する。この免疫はＰＴＩと著しく重なるが、より強い幅がある強力な免疫応答である（６、７）。
【０００３】
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は宿主−病原体相互作用を制御する
ＰＴＧＳは保存された転写後遺伝子調節機構であり、この機構はウイルス転写物を標的にして分解することによる植物における天然の抗ウイルス防御応答として広範に特徴付けられてきた（８）。植物でのＲＮＡサイレンシングまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の中心的機構は、リボヌクレアーゼＩＩＩ酵素ＤＩＣＥＲ−ＬＩＫＥ（ＤＣＬ）タンパク質により二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が認識されプロセシングされて、２０〜２５ｎｔ長の短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖が生成することを含む。これらのｓｉＲＮＡ二重鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の中心的成分であるアルゴノート（ＡＧＯ）タンパク質と会合する。ＡＧＯタンパク質上でのそれに続く鎖分離によりＡＧＯとガイド鎖である一本鎖ＲＮＡで構成された成熟ＲＩＳＣが形成され、一方パッセンジャー鎖は分解される。ガイド低分子ＲＮＡは、ＡＧＯ−ＲＩＳＣを配列相補的ｍＲＮＡ標的上に導き、そのエンドヌクレアーゼ活性による切断および／または翻訳阻害をもたらす。この１０年間に、いくつかの内在性短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が非ウイルス病原体に対してＰＴＩおよびＥＴＩ応答を組織化することがさらに見出され（９）、植物免疫系の調節におけるＰＴＧＳの中心的な役割を暗示している。
【０００４】
植物では、モバイル低分子ＲＮＡは、隣接細胞においてならびに遠位組織において非細胞自律的サイレンシングの引き金を引くことができる（１０）。モバイル低分子ＲＮＡは、感染フロントより先に抗ウイルス防御を刺激するのにとりわけ重要である（１０）。非細胞自律的サイレンシングは、植物細胞と、この過程が標的にすることが明らかにされていない細菌を除く、細胞と相互作用する非ウイルス病原菌、寄生生物または共生生物の間のサイレンシングシグナルの移行にも極めて重大な意味を持つ（１１）。この天然の、生物界を跨る調節機構は特に最近、植物−真菌相互作用において特徴付けられた（１２−１７）。例えば、特定の植物ｍｉＲＮＡは、病原真菌バーティシリウム・ダーリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）の菌糸中に運び出されて病原性因子のサイレンシングの引き金を引くことが見出された（１４、１７）。一方、内在性灰色カビ病菌（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ）低分子ＲＮＡは植物細胞中に運び出されて、植物防御遺伝子を発現停止させることができ（１６）、植物と病原真菌の間の双方向性の、生物界を跨るＲＮＡｉに光を当てている。宿主細胞と真菌細胞の間の低分子ＲＮＡ／ｄｓＲＮＡ輸送の機構についてはほとんど分かっていないが、外部吸器（ｅｘｔｒａｈａｕｓｔｏｒｉａｌ）マトリックスにおける多数の小胞の存在から、この小胞が２つの生物間でサイレンシングシグナルを伝達している可能性があることが示唆される（１８）。この仮説と一致して、２件の最近の研究により、植物細胞外小胞（ＥＶ）が、抗真菌低分子ＲＮＡを灰色カビ病菌中に、ならびに抗卵菌低分子ＲＮＡをフィトフソラカプシシ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ）細胞中に送達するのに不可欠であるという証拠が提供されている（１７、１９）。
【０００５】
生物界を跨るＲＮＡｉを利用すれば、カノニカルなＲＮＡサイレンシング装置を有する真核生物病原体に対する防御を与えることができる
交差領域ＲＮＡｉの生物学的関連は、所与の寄生生物または有害生物がカノニカルなＲＮＡｉ装置（例えば、機能的ＤＣＬおよびＡＧＯタンパク質）を有することを条件として、これらの生物由来のウイルス性または病原性因子に対する相同性を有するｄｓＲＮＡを発現することによって最初は実証されてきた。今までに、この宿主誘導遺伝子サイレンシング（ＨＩＧＳ）技術は、昆虫、線虫、卵菌、真菌および寄生植物の侵入および捕食から植物を防御するために使用され成功を収めてきた（国際公開第２０１２／１５５１１２号、国際公開第２０１２／１５５１０９号、ＣＡ  ２７９９４５３、欧州特許第２４０５０１３号、米国特許出願公開第２０１３／１７７５３９号、１５、２０、２１）。例えば、ＨＩＧＳは、フサリウム症菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）および灰色カビ病菌に対する完全防御を与え、この現象は、真菌感染に先立って野生型植物中に関連する外因性ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを噴霧することにより完全に再現される（１５、２０、２１）。後者の現象はスプレー誘導遺伝子サイレンシング（ＳＩＧＳ）と呼ばれ、最初、エレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）でおよび一部の昆虫で記載された環境からのＲＮＡの取込みを含むプロセスである「環境ＲＮＡｉ」を暗示している（２１、２２）。このようにＨＩＧＳ／ＳＩＧＳは、従来の育種またはＲ遺伝子もしくはＰＡＭＰ受容体を農業上関連する作物に導入するよう設計された遺伝子操作の強力な補完物、または時には代替法とさえ見なされる（５、２３、２４）。さらに、この技術は、場合により、人の健康および環境に重大な影響を及ぼす可能性のある農薬使用の減少におそらく寄与する、より永続的で環境にやさしい植物防御解決策を提供する。
【０００６】
ＨＩＧＳ／ＳＩＧＳ技術の現在の限界
ＨＩＧＳ／ＳＩＧＳ技術は、カノニカルなＲＮＡサイレンシング装置を有する植物病原体および寄生生物に対してしか機能することが示されていないという事実により制限される。例えば、麦類赤カビ病（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）に対するＳＩＧＳは、ｄｓＲＮＡの取込みおよび真菌ＤＩＣＥＲ−ＬＩＫＥ  １タンパク質によるさらなるプロセシングに少なくとも一部頼っている（２１）。今までに、S. Ghag, 2017の概説で説明されるように、ＨＩＧＳ／ＳＩＧＳが、発明者らがここで使用し、そのゲノムにカノニカルな真核生物様ＲＮＡサイレンシング因子を含有しない細菌病原体などの、カノニカルなＲＮＡｉ装置を持たない植物病原体に対して向けられた例はない（２２）。そういう理由で、今日現在で、ＲＮＡベースのサイレンシング技術は細菌病原体から植物を防御するのに利用されたことがない。これはかなりの制限となっている。なぜならば、細菌病原体は農産食品品質および生産に対し大きな影響を及ぼし、これが世界的に経済損失をもたらすからである。例として、広範囲の栽培植物の感染を引き起こす、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、キシレラ（Ｘｙｌｅｌｌａ）、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）などの細菌病原体に当てはまる（２５）。植物病原細菌と並んで、動物病原細菌もヒトおよび動物健康に大きな脅威となる。２００９年、欧州医薬品庁と欧州疾病予防管理センターの共同報告書は、この懸念を強調していた。例えば、彼らは、ＥＵでは毎年、多剤耐性（ＭＤＲ）菌に感染した４００，０００患者のうち約２５，０００患者が、抗生物質耐性細菌株のために亡くなっていると推定しており、この数はそのようなＭＤＲ菌の増加のために増えていくと予測されている。このために、保険医療費が余計にかかり、毎年１５億ユーロの経済損失に相当する（６５〜６６）。さらに、生野菜などの未処理の栽培植物がヒト食物媒介感染症の伝播のための媒体であることを示す証拠が現れている（２６〜２９）。実例として、薬剤耐性サルモネラ菌（Ｓａｌｏｍｏｎｅｌｌａ）および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）は、アジスアベバ（エチオピア）の異なるアウトレットから育てられたレタスおよびピーマンで回収されており、したがって、消費者に対する種菌の供給源を表している（２６）。
【０００７】
一部の報告では、細菌細胞を長いｄｓＲＮＡに接触させることにより細菌成長に影響を及ぼすことができる可能性があると推測されている。例えば、国際公開第２００６／０４６１４８号は、長いｄｓＲＮＡ断片（＞８０塩基対）を取り入れることができる有害生物、その中では、おそらく、細菌の増殖を制御することを提唱している。けれども、国際公開第２００６／０４６１４８号の発明者らは、細菌がそのような長いＲＮＡ断片に感受性であるといういかなる実験証拠も提供していなかった（彼らの実例は、線虫に対するｄｓＲＮＡの効果のみを開示している）。それどころか、本発明者らは本明細書において、細菌は長いｄｓＲＮＡに感受性ではないことを実証し、国際公開第２００６／０４６１４８号の発明者らが掲げた仮説は、原核細胞を標的にする場合は妥当ではないことを示している。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の目的
本発明では、筆者らはここに、初めて、植物低分子ＲＮＡが、配列特異的方法で、細菌植物病原体由来の遺伝子の発現を効率的に阻害できることを明らかにしており、これはここでは「抗菌性遺伝子サイレンシング」（ＡＧＳ）と呼ばれる現象である。この調節機構は、とりわけ、２つの異なるグラム陰性植物病原体細菌種内で機能することが明らかにされ、植物低分子ＲＮＡは、複雑な二重膜構造（細菌の内膜および外膜）を含む細胞壁の存在にもかかわらず細菌細胞により取込み可能であることを示している。これは予期せぬ結果である。なぜならば、植物低分子ＲＮＡが、細菌のリン脂質二重層を貫通するまたは病原性細菌細胞内部に受動的にもしくは能動的に輸送されることができることが明らかにされたことはこれまでなかったからである。さらに、この現象は植物病原性細菌に限定されてはいなかった。なぜならば、発明者らは、植物低分子ＲＮＡが、典型的なグラム陰性ヒト病原性細菌においてＡＧＳの引き金を引くことができることをさらに実証したからであり、本発明の広範囲にわたる可能性に光を当てている。
【０００９】
しかし、すべてのこれらの先入観にもかかわらず、発明者らの発見は、細菌細胞を１つまたは複数の細菌標的遺伝子に配列相同性を有する低分子ＲＮＡに接触させることにより、いかなる細菌遺伝子、例えば、病原性因子、必須遺伝子または人工レポーター遺伝子のサイレンシングも指示することが実際に可能であることを実証している。これらの低分子ＲＮＡは、１つまたは複数の細菌病原体から植物細胞を防御するため前記植物細胞により安定して発現させることができる。あるいは、標的病原性細菌と遭遇する植物組織または動物組織の表面または内部に外因的に投与し、それによって細菌の病原性および成長を弱めることができる。このように、今までに考えられたことに反して、低分子ＲＮＡ依存性サイレンシングを使用すれば、真核生物様ＲＮＡサイレンシング装置をもたず二重膜を有してさえいる植物および動物細菌病原体からの遺伝子発現を効率的にノックダウンすることができる。
【００１０】
外因的に送達される低分子ＲＮＡに対する細菌細胞の、この予想外の感受性は抗菌性応用において意図的に使用することができ、植物および動物細菌病原体の生存、病原性および／または成長を低減する莫大な数の処理を想定することができる。
最後に、発明者らは、インビトロベースのアッセイを用いて、抗菌活性のある低分子ＲＮＡを迅速で信頼性があり対費用効果の高い方法で特定した。したがって、（ｉ）細菌病原体から植物および動物を保護する、（ｉｉ）片利共生および相利共生細菌の有益な効果および／または成長を増強する、ならびに（ｉｉｉ）いかなる細菌種におけるいかなる遺伝子の機能でも特徴付けるために本発明が広範に用いられることが予想される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
概説
以下の結果では、発明者らは、ＡＧＳが、細菌病原性に必要な重要な遺伝子を、個別にまたは同時に標的にすることにより、細菌感染に対する保護を増強する効率的な技術であることを明らかにする。発明者らは、注目すべきことに、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において、グラム陰性菌Ｐｔｏ  ＤＣ３０００由来の２つの主要な病原性因子、すなわち、Ｃｆａ６およびＨｒｐＬに対する相同性を有する安定なトランスジェニック植物低分子ＲＮＡを構成的に発現させ、これらの低分子ＲＮＡを発現している植物細胞と接触させると、この細菌病原体の病原性因子および成長が有意に低くなることを見出した。ザントモナス・カンペストリス  ｐｖ.カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（Ｘｃｃ）はアブラナ科作物の最も破壊的な病気の１つである黒腐れ病の病因であるが、これに対する増強された保護は、病原性因子ＨｒｐＧ、ＨｒｐＸおよびＲｓｍＡに対して低分子ＲＮＡを発現しているシロイヌナズナトランスジェニック植物でも観察された。これらのデータは、ＡＧＳを用いれば、無関係な、農業に関連する植物病原体から植物を保護できることを実証している。
【００１２】
発明者らは、抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡを発現しているシロイヌナズナトランスジェニック植物で観察される低減した病原性は、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００における２つの標的病原性因子の発現の特定の減少と関連があることも明らかにしている。このインビボ抗菌性遺伝子サイレンシング現象は、これらの内因性ストレス応答病原性遺伝子に対してだけではなく、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００ゲノムから構成的に発現される異種レポーター遺伝子に対しても効果的であることが見出された。したがって、これらの所見は、カノニカルな真核生物様ＲＮＡサイレンシング装置の欠如にもかかわらず、細菌細胞は、植物コードされた低分子ＲＮＡの作用に実際に感受性であることを強調している。発明者らは、植物中で生成される人工低分子ＲＮＡが細胞外細菌病原体において遺伝子サイレンシングを誘導することができるという証拠も提供し、低分子ＲＮＡは、細胞外植物低分子ＲＮＡの異なる集団が関与する機構を通じて、宿主細胞から細菌細胞へ運び出されなければならないことを示している（下記参照）。
【００１３】
際立ったことに、このサイレンシング効果は、Ｃｆａ６およびＨｒｐＬ遺伝子に対する相同性を有する低分子ＲＮＡを安定的に発現するように遺伝子改変された植物上だけではなく、抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡを含有する全ＲＮＡで前処理されそれに続いてＰｔｏ  ＤＣ３０００を植菌された野生型植物上でも観察された。興味深いことに、発明者らは、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００またはグラム陰性ヒト病原性細菌緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の遺伝子に向けられたインビトロ合成二本鎖低分子ＲＮＡもＡＧＳの能力を持っていたことも発見した。これらの所見は、低分子ＲＮＡが、二重膜の存在にもかかわらず、細菌の細胞質に到達し、カノニカルな真核生物様ＲＮＡｉ装置が存在しないにもかかわらず、種々の原核細胞において遺伝子サイレンシングの引き金を引くことができるという事実をさらに支持している。
【００１４】
さらに、低分子ＲＮＡが標的にする領域中にできる限り多くのサイレント突然変異を含有するＨｒｐＬの低分子ＲＮＡ許容性（ｒｅｓｉｌｉｅｎｔ）バージョンを発現している組換え細菌（ＨｒｐＬ  ｍＲＮＡとの低分子ＲＮＡの結合を変更するが同じタンパク質配列を生じるように設計されていた）を生成することにより、発明者らは、ＨｒｐＬのサイレンシングがもはや効果的ではないことを明らかにした。さらに、発明者らは、この組換え細菌の病原性が、効果的な抗ＨｒｐＬ低分子ＲＮＡを含有する全ＲＮＡを外因性に適用すると変更されないことを観察した。したがって、これらの所見は、ＨｒｐＬ遺伝子に向けられた低分子ＲＮＡがＡＧＳと細菌病原性の減衰の両方の原因であるという説得力のある実験証拠を提供している。
【００１５】
発明者らは、次にどのＲＮＡ実体が、抗菌性ＲＮＡを保有する外因性全ＲＮＡに応答して観察されるＡＧＳ現象の原因であるのかをさらに調べた。興味深いことに、低分子ＲＮＡおよび長いＲＮＡ種を、Ｃｆａ６とＨｒｐＬ遺伝子の両方を標的にするキメラヘアピンを発現するトランスジェニック植物から抽出した全ＲＮＡから分離することにより、発明者らは、植物上への低分子ＲＮＡ画分の外因性送達が抗菌性効果の引き金を引いたが、長いＲＮＡ画分を用いた処理は効果がないことを明らかにした。さらに、発明者らは、ＤＣＬ２、ＤＣＬ３およびＤＣＬ４遺伝子において突然変異を有し、したがって、抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡの生合成が損なわれているＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ参照株由来の全ＲＮＡ抽出物は、ＡＧＳの引き金を引くのにも病因低減にも効果がないことを明らかにした。まとめると、これらの所見は、低分子ＲＮＡがＡＧＳの原因であるＲＮＡ実体であるが、しかしその長いｄｓＲＮＡ前駆体はそうではない（それが植物内で低分子ＲＮＡにプロセシングされなければ）という説得力のある証拠を提供している。これが、具体的には長いｄｓＲＮＡに頼っているエレガンス線虫および植物草食動物において（３０〜３６）、またはｄｓＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡにより引き金を引かれる真核生物糸状病原体灰色カビ病菌およびフサリウム症菌において（１５、２１）以前報告された環境ＲＮＡｉとの主要な違いである。
【００１６】
重要なことに、発明者らは、Ｃｆａ６とＨｒｐＬ遺伝子に対する効果的な低分子ＲＮＡを含有する全ＲＮＡの外因性適用が、この細菌の自然宿主である、農業的に関連のある植物トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）においてＰｔｏ  ＤＣ３０００成長および病原性を効率的に低減できることをさらに実証する。したがって、このＲＮＡベースの生物的防除アプローチを利用すれば、広範な細菌病原体に対する保護を、高い配列ベースの選択性で与えることができると予測される。植物または動物の様々な組織の表面で（または内部で）病原性因子および／または必須遺伝子に対して配列相同性を有する低分子ＲＮＡを適用すれば、細菌感染を著しく低減すると予測することもできる。さらに、この方法は、種々の植物または動物細菌病原体由来の必須遺伝子および／または病原性因子を同時に標的にすることにより複数の細菌病原体を制御するように容易に設計することができる。したがって、ＡＧＳは、植物と動物の両方を細菌病から保護する新規の環境にやさしいＲＮＡｉベースの技術を表す。
【００１７】
下の結果では、発明者らは、細菌細胞へ向かう植物低分子ＲＮＡの輸送におけるＥＶの考えられる役割も調べた。発明者らは、抗菌活性を有するＥＶの少なくとも２つの集団、細菌病原性を弱めるのに十分に活性である大きなサイズの集団、および中程度に活性がより少ない、より小さなＥＶのもう１つの集団を発見した。さらに、発明者らは、これらの抗菌性低分子ＲＮＡは、これらのＥＶ内に埋め込まれているときは、小球菌ヌクレアーゼ（Ｍｎａｓｅ）消化から保護されていることを示し、野外条件においておよびＲＮＡベースの治療学において将来の病気管理戦略についての植物ＥＶの可能性に光を当てている。興味深いことに、発明者らは、タンパク質と会合していないアポプラストＥＶフリー抗菌性低分子ＲＮＡが、病原性を弱めるのにも十分に活性であることをさらに発見した。これらの新規の低分子ＲＮＡ種はここでは細胞外遊離低分子ＲＮＡ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｒｅｅ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）または「ｅｆｓＲＮＡ」と呼ばれ、Ｍｎａｓｅ消化に感受性であった。したがって、発明者らは、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬトランスジェニック植物のアポプラストが機能的抗菌性低分子ＲＮＡの少なくとも３つの集団で構成されており、この低分子ＲＮＡは大きなＥＶに、より小さなＥＶに埋め込まれている、または遊離の形態であると結論づけた。
【００１８】
発明者らは、タバコ葉の十分に確立されたアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介一過性形質転換を使用して低分子ＲＮＡを一過性に発現させ、続いて対応する候補抗菌性ｓｉＲＮＡを細菌細胞と一緒にインビトロでインキュベートした。このアプローチは、Ｃｆａ６とＨｒｐＬ遺伝子を同時に標的にするｓｉＲＮＡと比べた場合、ＨｒｐＬ遺伝子に向けられたｓｉＲＮＡがＰｔｏ  ＤＣ３０００誘導気孔再開を妨げるのに等しく効率的であることを判定するのに特に有用であった。さらに、発明者らは、低分子ＲＮＡのインビトロ合成が、細菌遺伝子サイレンシングおよび細菌誘導気孔再開の抑制などの抗菌効果の引き金を引く候補低分子ＲＮＡを求めてスクリーニングするための、簡便で迅速で信頼性のあるアプローチであることを実証した。発明者らは、インビトロ低分子ＲＮＡ合成アプローチを液滴ベースのマイクロ流体システムと合わせて、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００由来の保存された遺伝子ＧｙｒＢまたはＦｕｓＡに向けられたｓｉＲＮＡが細菌成長をインビトロで劇的に変化させ、それによって新規の殺菌作用物質を特定できることを示した。したがって、候補低分子ＲＮＡのそのような一過性タバコベースまたはインビトロベースの合成、続いて対応する低分子ＲＮＡの細菌細胞とのインキュベーションは、細菌遺伝子発現および／または特定の表現型（例えば、細菌成長、生存、代謝活動）に強い効果のある低分子ＲＮＡを特定するために大学研究室および産業により将来広範に用いられると予想される。本明細書に記載されるＡＧＳ技術は、新規のＲＮＡベースの逆遺伝子アプローチを通じて細菌遺伝子の機能を特徴付けるためにも広く使用されると予想される。この方法は、例えば、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００誘導気孔再開にＨｒｐＬが果たす役割ならびにＰｔｏ  ＤＣ３０００の生存または適合にＧｙｒＢおよびＦｕｓＡが果たす役割を初めて実証するのに役立った。最後に、タバコ植物は既に産業により使用されて高収率の組換えタンパク質または小胞様粒子を対費用効果の高い様式で生産しているので（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  Ｉｎｃ.の欧州特許第２６１０３４５号参照）、タバコ植物は、作物における将来のＲＮＡベースの生物的防除応用のために、特に低分子ＲＮＡがヌクレアーゼ分解から十分に保護されるＥＶ内で候補低分子ＲＮＡを生成するのにおそらく利用される。
【００１９】
植物細胞では当てはまらないが、哺乳動物細胞から発現される長いｄｓＲＮＡが強力な抗ウイルスインターフェロン応答の引き金を引くことが知られているという事実（３７）と共に、上の所見に促されて、発明者らは、動物病原性細菌に対する低分子ＲＮＡ生成のためのバイオリアクターとして植物を利用できるかどうかを評価した。この目的のため、発明者らは、アグロバクテリウム媒介一過性形質転換を使用してタバコ葉で特定の逆方向反復構築物を一過性に発現させ、対応するＲＮＡ抽出物（抗菌性低分子ＲＮＡを含有する）をヒト病原性細菌緑膿菌の細胞と一緒にさらにインキュベートした。そうすることにより、発明者らは、これらの植物低分子ＲＮＡが実際に、緑膿菌において人工レポーター遺伝子ならびにいくつかの内因性ハウスキーピング遺伝子の両方のＡＧＳの引き金を引くことができることを発見した。発明者らは、複数の必須遺伝子に対するｓｉＲＮＡを含有する植物ＲＮＡ抽出物が、インビトロ条件において緑膿菌株の成長の低減の引き金を引いたことを特に明らかにした。さらに、発明者らは、液滴ベースのマイクロ流体システムと合わせた抗菌性低分子ＲＮＡのインビトロ合成が、殺菌活性を有する候補低分子ＲＮＡを迅速に特定するのに適したアプローチでもあることを立証する概念実証実験を実施した。これは特に抗ＳｅｃＥ  ｓｉＲＮＡの場合であり、このｓｉＲＮＡは緑膿菌のインビトロ成長の著しい低減の引き金を引いた。したがって、候補低分子ＲＮＡのそのような一過性タバコベースまたはインビトロベースの合成、続いて対応する低分子ＲＮＡの標的細菌細胞とのインキュベーションは、細菌遺伝子発現を妨害することができる低分子ＲＮＡを特定するために、および／または動物病原性または有益な細菌からの特定の表現型に関して、大学研究室および産業により広範に使用されると予想される。このアプローチは、例えば、抗生物質耐性遺伝子を効率的に発現停止させることができ、所与の抗生物質と同時投与される場合、抗生物質感受性を修復するためにさらに使用される低分子ＲＮＡを特定するのに役立つ。本明細書に記載されるＡＧＳ技術は、動物病原性および有益な細菌由来の細菌遺伝子の機能を特徴付けるのにも利用されると予想される。このアプローチは、例えば、緑膿菌の適合性決定因子としてのＳｅｃＥ、ＤｎａＮおよびＧｙｒＢ遺伝子の役割についての証拠を提供し、それによって以前の報告を確認するのに役立った（３８〜４０）。最後に、タバコ植物は既に産業により使用されて医薬品用途用に高収率の組換えタンパク質または小胞様粒子を生産している（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  Ｉｎｃ.の欧州特許第２６１０３４５号参照）ので、タバコ植物は、将来のＲＮＡベースの治療法のために、特に低分子ＲＮＡをヌクレアーゼ分解から保護するＥＶ内で、抗感染低分子ＲＮＡを生成するのにおそらく利用される。低分子ＲＮＡ送達および治療応用のための植物ＥＶの使用は、これらの天然の小胞が通常、哺乳動物細胞では、合成ナノ粒子の場合にあり得る細胞毒性効果を誘導しないので、特に魅力的である（４１）。
【００２０】
これらすべての発見に基づいて、本発明者らは、細菌において少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害する方法であって、
ｉ）少なくとも１つの植物細胞中に、少なくとも１つの細菌遺伝子を特異的に標的にする少なくとも１つの機能的干渉ＲＮＡ分子（ｉＲＮＡ）を導入するステップであって、前記ｉＲＮＡが前記遺伝子を保有する細菌において前記遺伝子の配列特異的サイレンシングを誘導することができる、ステップ、あるいは
ｉｉ）細菌感染に先立っておよび／もしくはその後で、植物もしくは動物組織上に、低分子ＲＮＡ、例えば、低分子ＲＮＡを包含する細胞外小胞もしくはアポプラスト液、または細胞外遊離ＲＮＡを送達するステップ、あるいは
ｉｉｉ）低分子ＲＮＡ、例えば、低分子ＲＮＡを包含する細胞外小胞もしくはアポプラスト液、または細胞外遊離ＲＮＡを直接細菌細胞上に送達するステップ
を含む方法を提唱する。
【００２１】
一実施形態では、この方法は、植物細胞においてｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの前駆体）を発現する、ｉｉ）前記植物細胞のアポプラスト液（ＡＰＦ）を回収する、ｉｉｉ）前記ＡＰＦに存在する低分子ＲＮＡを動物組織上、動物内（例えば、器官、体液）、または細菌細胞上に送達することにより、１つまたは複数の細菌遺伝子のターゲティングを可能にする。このアプローチは、特に細菌感染の管理において公衆衛生に大きな影響を及ぼす。
より正確には、この技術は、植物および動物において細菌感染を制御し、したがって、このアプローチの高い配列ベースの選択性のために有益な細菌または環境にマイナスの効果を及ぼさずに、抗生物質処理を低減する方法を提供する。
【００２２】
さらに、この戦略はより永続性のある耐病性を提供し、これは一部の従来の処理には当てはまらない。
最後に、本明細書に記載される技術は、宿主動物に対して有益な細菌の増殖および／またはその有益な効果を増強するために有益な細菌由来の遺伝子の発現を制御するのにも有用であると予測することができる。
これらの利点に加えて、提唱される方法は対費用効果が高く工業化するのが比較的容易である。実際、細菌遺伝子に対して効果的な人工ｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を設計し生成する工程は、ニコティアナ・ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉から一過性に発現させる場合は数週間、インビトロで合成する場合はわずか１日しかかからない。さらに、ｓｉＲＮＡ耐性菌が出現したら新規の人工ｉＲＮＡを再設計し生成することは比較的容易である。最後に、特定の細菌種または広範囲にわたる病原性細菌株に向けられたｉＲＮＡを生成し、それによって、望まれるＲＮＡベースの治療法に応じて、標的化されたまたは広域処理を提供することが可能である。
【００２３】
本方法／使用は、インビボでまたはインビトロで実施することができる。「インビトロ」とは、本明細書では、特許請求されている方法のステップまたは使用が、その通常の宿主生物から単離されている生体成分（皮膚、粘膜、便等）またはインビトロ培地において直接成長させる（その宿主生物が存在しないところで）生体成分（例えば、細菌細胞）を使用して行われることを意味する。これは、本発明の低分子ＲＮＡを直接細菌細胞に接触させる場合に当てはまる。
「インビボで」または「植物内で」とは、本明細書では、特許請求されている方法のステップまたは使用が、生物全体、例えば、個体全体を使用して行われることを意味する。
本発明の低分子ＲＮＡを、特に細菌細胞内で病原性因子のサイレンシングの引き金を引くために、その周囲に組織を含有する細菌細胞に直接接触させる場合、本方法／使用は「半インビボ」アッセイとして実施されると言われる。
【００２４】
本発明の低分子ＲＮＡの有用な前駆体
本発明は、細菌細胞中での少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害するための少なくとも１つの機能的干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）の使用を目標に定める。
本明細書で使用される場合、用語「機能的干渉ＲＮＡ」（機能的ｉＲＮＡ）は、特に細菌細胞において少なくとも１つの細菌遺伝子の配列特異的サイレンシングの過程を誘導することができるＲＮＡ分子を指す。特に、前記機能的干渉ＲＮＡ分子は、ｉ）低分子もしくは短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子（一重鎖または二重鎖）として当技術分野で周知である低分子干渉ＲＮＡまたはその前駆体、あるいはｉｉ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子（一重鎖または二重鎖）またはその前駆体であり得る。
本明細書での用語「ｓｉＲＮＡの前駆体」または「ｓｉＲＮＡ前駆体」は、植物（または植物抽出物）中で直接的または間接的にプロセシングしてｓｉＲＮＡ二重鎖にすることができるＲＮＡ分子を指す。直接的にプロセシングすることができるｓｉＲＮＡ前駆体の例は、長い二本鎖ＲＮＡ（長いｄｓＲＮＡ）を含み、間接的にプロセシングすることができるｓｉＲＮＡ前駆体の例は、プロセシング可能な長いｄｓＲＮＡの生成のために鋳型として使用することができる長い一本鎖ＲＮＡ（長いｓｓＲＮＡ）を含む。
【００２５】
本明細書の用語「ｍｉＲＮＡの前駆体」または「ｍｉＲＮＡ前駆体」は、植物（または植物抽出物）中でプロセシングしてｍｉＲＮＡ二重鎖にすることができるＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡ前駆体の例は、ヘアピンループを含む、一次ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）およびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含む。
注目すべきことに、前記前駆体分子をコードするプラスミドまたはベクターおよび他のＤＮＡ構築物またはウイルスベクターも、「機能的干渉ｉＲＮＡ」の定義に包含される。
細菌中で複数の遺伝子を標的にするため、本発明の方法は、ｉ）目的の複数の細菌遺伝子を全部で標的にするいくつかの異なるｉＲＮＡの混合物またはｉｉ）目的のいくつかの異なる細菌遺伝子を標的にするキメラｉＲＮＡまたはｉｉｉ）これらのキメラｉＲＮＡのいずれかの混合物を使用することができる。
特定の一実施形態では、本発明の方法／使用は、さらに製剤化して細菌感染を予防するのに使用することができる低分子ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡｓまたはｍｉＲＮＡ）を植物内で生成するために、１つまたはいくつかの機能的ｉＲＮＡを前駆体として真核細胞（例えば、植物細胞）中に導入することを含む。
【００２６】
さらに具体的な実施形態では、本発明の機能的ｉＲＮＡは長い一本鎖ＲＮＡ分子（以後「長いｓｓＲＮＡ」と名付けられる）である。そのような長いｓｓＲＮＡは植物トランス遺伝子により生成され、植物ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより長いｄｓＲＮＡ分子に変換され、植物ＤＣＬタンパク質によりさらにプロセシングされてｓｉＲＮＡになってもよい。あるいは、長いｓｓＲＮＡは植物ＲＮＡウイルスにより生成され、ウイルス複製中に（複製中間体として）および／または植物ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの作用を通じて長いｄｓＲＮＡ分子にさらに変換されてもよい。こうして得られたウイルスｄｓＲＮＡは続いて植物ＤＣＬタンパク質によりｓｉＲＮＡにプロセシングされ、このｓｉＲＮＡが、続いてウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）と呼ばれる過程を通じて配列特異的サイレンシングの引き金を引く（１１）。
本明細書で使用される場合、用語「長いｓｓＲＮＡ」は、少なくとも５０塩基、さらに好ましくは８０〜７０００塩基の一本鎖を含有する一本鎖構造体を示す。長いｓｓＲＮＡは、植物トランス遺伝子により生成される場合は８０〜７０００塩基を含有するが、植物組換えＲＮＡウイルスにより生成される場合は、好ましくは８０〜２０００塩基を含有することが好ましい。
【００２７】
さらに具体的な実施形態では、本発明の機能的ｉＲＮＡは、長い二本鎖ＲＮＡ分子（以後「長いｄｓＲＮＡ分子」と名付けられる）であり、この長いｄｓＲＮＡ分子はｓｉＲＮＡ前駆体として機能し、ＤＣＬタンパク質および植物ゲノムによりコードされる他の低分子ＲＮＡ新生因子によって、植物内で、プロセシングされてｓｉＲＮＡになることができる。
本明細書で使用される場合、用語「長いｄｓＲＮＡ」は、少なくとも５０塩基対、さらに好ましくは８０〜７０００塩基対の第１（センス鎖）および第２（アンチセンス）鎖を含有する二本鎖構造体を示す。
植物または植物細胞では、長いｄｓＲＮＡは低分子ＲＮＡ二重鎖にプロセシングすることができる。そのような長いｄｓＲＮＡは有利にはキメラｄｓＲＮＡである、すなわち、そのような長いｄｓＲＮＡは複数の細菌遺伝子に配列相同性を有している（下記参照）。
一実施形態では、本発明の機能的ｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを生み出すように植物細胞においてＤＣＬタンパク質により切断可能である長いｄｓＲＮＡである。
【００２８】
本発明の長いｄｓＲＮＡは、センス−アンチセンス転写構築物を通じて、植物ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより基質としてさらに使用される人工センス転写構築物を通じて、またはＶＩＧＳを通じてヘアピン構造体から生み出すことができる。さらに正確には、長いｄｓＲＮＡは、細菌細胞において効率的なＲＮＡ干渉を媒介するようにｄｓＲＮＡ分子の活性をモジュレートするバルジ、ループまたはゆらぎ塩基対を含んでもよい。本発明の長いｄｓＲＮＡ分子の相補的センスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースのまたは非核酸ベースのリンカーによって接続されていてもよい。本発明の長いｄｓＲＮＡ分子は、対称または非対称ヘアピン二次構造を形成するために１つの二重鎖構造および１つのループ構造を含んでもよい。
したがって、一実施形態では、本発明の機能的ｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ前駆体などのヘアピンを含む長い（少なくとも５０塩基対、さらに好ましくは８０〜４００塩基対、１００〜２００塩基対、１２５〜１７５塩基対、特に約１５０塩基対）ｄｓＲＮＡである。
【００２９】
本出願の実施例において実証されるように、ｄｓＲＮＡを植物真核細胞中に導入すると、低分子ＲＮＡの作用を通じて細菌細胞で細菌遺伝子の配列特異的サイレンシングが誘導されるが、長いｄｓＲＮＡではこれは起こらない（実施例６および図７）。これは、細菌細胞が、それに低分子ＲＮＡ実体が直接接触する場合のみ、ＡＧＳに感受性であることを意味する。細菌を低分子ＲＮＡの前駆体（長いｄｓＲＮＡ）に直接接触させても、これらの原核細胞には長いｄｓＲＮＡを機能的な抗菌性ｉＲＮＡに適切にプロセシングするカノニカルな真核生物様ＲＮＡｉ装置がないために、サイレンシング効果はない。
【００３０】
本発明の低分子ＲＮＡ
実際のところ、細菌細胞を５０塩基対よりもサイズが短い低分子ＲＮＡ種に接触させることにより、細菌細胞において細菌遺伝子の発現を直接阻害することが可能である（図８および図１０）。
したがって、別の好ましい実施形態では、本発明の機能的ｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどの低分子ＲＮＡである。これらの低分子ＲＮＡはサイズが短く、５０塩基対未満であり、好ましくは１５〜３０塩基対の間、さらに好ましくは１９〜２７塩基対の間、さらに好ましくは２０〜２５塩基対の間に含まれる。
これらの低分子ＲＮＡは、医薬または化粧品組成物に、例えば、トピック組成物中にまたは噴霧可能な液体組成物として製剤化することができる（下記参照）。この場合、前記低分子ＲＮＡを含有する前記組成物は、組織または細菌に直接投与することができる。
一つの特に好ましい実施形態では、本発明の機能的ｉＲＮＡは、「ｓｉＲＮＡ」であり、これは「ｓｉＲＮＡ二重鎖」または「ｓｉＲＮＡ一重鎖」を示す。
【００３１】
さらに具体的には、用語「ｓｉＲＮＡ二重鎖」は、少なくとも１５塩基対、好ましくは少なくとも１９塩基対の第１（センス鎖）および第２（アンチセンス）鎖を含有する二本鎖構造体または二重鎖分子を示し、好ましくは、前記アンチセンス鎖は、標的遺伝子の転写物に相補的である少なくとも１５連続ヌクレオチドの領域を含む。これらのｓｉＲＮＡ二重鎖は、植物ＤＣＬタンパク質によりプロセシングされる長いｄｓＲＮＡ前駆体から生成することができる。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、下で開示されるように、新規に化学的に合成することもできる。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、サイズが短く、５０塩基対未満であり、好ましくは１５〜３０塩基対の間、さらに好ましくは１９〜２７塩基対の間、さらに好ましくは２０〜２５塩基対の間に含まれる。
下の実験の部に示されているように（実施例９および図１０）、本発明の低分子ＲＮＡは、それが二本鎖構造下にある場合は効率的である。それはインビトロで新規に合成されたｓｉＲＮＡ二重鎖を用いて実証されており、植物抽出物で観察された生物学的効果は、少なくとも一部は、植物により分泌されるこれらのｓｉＲＮＡ二重鎖のためであると考えられる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「ｓｉＲＮＡ一重鎖」または「成熟ｓｉＲＮＡ」は一重鎖分子（「一本鎖」分子としても知られる）を示しており、これはｓｉＲＮＡ二重鎖に由来するが、植物細胞のＲＩＳＣ装置中で成熟しており、ＡＧＯタンパク質にローディングされおよび／または他のＲＮＡ結合タンパク質に会合している。「ｓｉＲＮＡ一重鎖」は、下に開示されるように、新規に化学的に合成することもできる。ｓｉＲＮＡ一重鎖は、サイズが短く、５０塩基未満であり、好ましくは１５〜３０塩基の間、さらに好ましくは１９〜２７塩基の間、さらに好ましくは２０〜２５塩基の間である。
別の実施形態では、本発明の機能的ｉＲＮＡは「ｍｉＲＮＡ」であり、これは「ｍｉＲＮＡ二重鎖」または「ｍｉＲＮＡ一重鎖」を示す。
【００３３】
さらに具体的には、用語「ｍｉＲＮＡ二重鎖」は、少なくとも１５塩基対、好ましくは少なくとも１９塩基対の第１（センス鎖）および第２（アンチセンス）鎖を含有する二本鎖構造体または二重鎖分子を示し、好ましくは、前記アンチセンス鎖は、標的遺伝子の転写物に相補的である少なくとも１５連続ヌクレオチドの領域を含む。これらのｍｉＲＮＡ二重鎖はバルジを含有していてもよい。これらのｍｉＲＮＡ二重鎖は、植物ＤＣＬタンパク質によりプロセシングされるｍｉＲＮＡ前駆体から生成することができる。ｍｉＲＮＡ二重鎖は、下で開示されるように、新規に化学的に合成することもできる。二重鎖ｓｉＲＮＡとして、ｍｉＲＮＡ二重鎖は、サイズが短く、５０塩基対未満であり、好ましくは１５〜３０塩基対の間、さらに好ましくは１９〜２７塩基対の間、さらに好ましくは２０〜２５塩基対の間に含まれる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「ｍｉＲＮＡ一重鎖」または「成熟ｍｉＲＮＡ」は一重鎖分子（「一本鎖」分子としても知られる）を示し、これはｍｉＲＮＡ二重鎖に由来するが、植物細胞のＲＩＳＣ装置中で成熟しており、ＡＧＯタンパク質にローディングされおよび／または他のＲＮＡ結合タンパク質に会合している。「ｍｉＲＮＡ一重鎖」は、下に開示されるように、新規に化学的に合成することもできる。一重鎖ｓｉＲＮＡとして、ｍｉＲＮＡ一重鎖はサイズが短く、５０塩基未満であり、好ましくは１５〜３０塩基の間、さらに好ましくは１９〜２７塩基の間、さらに好ましくは２０〜２５塩基の間に含まれる。
長いｄｓＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡなどのｉＲＮＡを設計する方法は当技術分野で利用可能であり、これを使用すれば、これらの特性を有する長いｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの配列を得ることができる。
発明者らは本明細書において、（ｉ）細胞遺伝子発現を阻害する、（ｉｉ）細菌病原性を弱める、および（ｉｉｉ）インビトロで殺菌効果の引き金を引く（図１０参照）ために人工的にインビトロで合成された二本鎖ｓｉＲＮＡを使用可能であることを明らかにしている（実施例９、図１０）。
【００３５】
本発明は、リボヌクレオチドのみをまたはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含む合成、半合成または組換えｉＲＮＡの使用を包含する。本発明は、１つまたは複数の改変を含む改変ｉＲＮＡ分子の使用も包含し、改変はインビボでのヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を増加しおよび／または細胞安定性（例えば、低分子ＲＮＡ  ３’末端メチル化、ロックド核酸（ＬＮＡ））、細菌細胞による取込み（例えば、ペプチドキャリアー）または細菌細胞内でのサイレンシング効力を改善する。本発明のｉＲＮＡは、糖、リン酸、および／もしくは塩基部分で改変されているヌクレオチド、ならびに／または５’もしくは３’末端の改変、またはヌクレオチド間連鎖を含んでもよい。
本発明で定義される化学的に合成されるｄｓＲＮＡ分子は、別々に合成される２つのはっきり異なるオリゴヌクレオチドから組み立ててもよい。あるいは、ＲＮＡ二重鎖の両方の鎖またはＲＮＡ前駆体分子は、切断可能なリンカー、例えば、サクシニルベースのリンカーを使用して直列に合成してもよい。あるいは、本発明のＲＮＡ前駆体分子は、当業者には公知であり市販されているＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写単位から発現させてもよい（インビトロでまたは植物内で）。後者のアプローチは、長い二本鎖折り畳み構造体を発現するトランス遺伝子の転写、トランス遺伝子のそれぞれの部分から反対方向に置かれているプロモーターを通じたセンス−アンチセンス転写物、ｍｉＲＮＡ前駆体、一次ｍｉＲＮＡ転写物、または一部の例（例えば、内在性または外因性２２ｎｔ長ｍｉＲＮＡにより標的にされる）では、ｄｓＲＮＡを生み出すために植物ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより基質として使用することができるセンス転写物を含むことができることは注目に値する。
【００３６】
本発明のｉＲＮＡ分子、特に、本発明の低分子ＲＮＡは、前記遺伝子を保有する細菌において、好ましくは、標的細菌遺伝子の発現のレベルを少なくとも３０％、好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも８０％減少させる。細菌遺伝子のサイレンシングは、当技術分野で周知である方法により、例えば、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、ノーザンブロット、ＦＡＣＳ、免疫組織学的分析またはウェスタンブロット分析により、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで評価することができる。
本発明の文脈では、人工ｉＲＮＡ分子による細菌遺伝子のサイレンシングは、部分的または全体的でもよいが、例えば、生物において前記細菌の細菌病原性または感染性を低減するなどの、細菌に対する所望の効果を生じるのに十分であるべきである。
【００３７】
好ましい実施形態では、本発明の低分子ＲＮＡは、１５〜３０塩基対の間に含まれるサイズを有し、ＰｓｃＣ、ＰｓｃＪ、ＰｓｃＮ、ＶｉｒＢ１、ＶｉｒＤ４、ＴｓｓＭ、ＴｓｓＪ、ＴｓｓＢ／ＴｓｓＣ、ＴｓｓＥ、ＶｇｒＧ、Ｈｃｐ、ＤｏｔＣ、ＤｏｔＤ、ＤｏｔＦ、ＤｏｔＧおよびＤｏｔＨ、ＬｕｘＳ、Ｌｕｘｌ／ＬｕｘＲ、ＡｒｏＡ、ＬｙｓＣ、ＣｙｓＨ、ＧａｌＵ、ＰｂｐＡ、ＰｂｐＢ、ＰｂｐＣ、Ｐｉｇｍａ７０、Ｓｉｇｍａ５４、Ａｒｃ、Ｐｔｒ、Ｎｏｒ、Ｍｅｐ、Ｃｍｅ、ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＧＥＳ、ＶＩＭ、ＮＤＭ、ＡｍｐＣ、ＶＩＭ−１、ＶＩＭ−２、ＶＩＭ−３、ＶＩＭ−５、ＣａｓＥ、ＯＸＡ−２８、ＯＸＡ−１４、ＯＸＡ−１９、ＯＸＡ−１４５、ＰＥＲ−１、ＴＥＭ−１１６、ＧＥＳ−９、ＦｔｓＺ、ＦｔｓＡ、ＦｔｓＮ、ＦｔｓＫ、ＦｔｓＩ、ＦｔｓＷ、ＺｉｐＡ、ＺａｐＡ、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、Ｐａｌ、ＭｉｎＣＤ、ＭｒｅＢならびにＭｌｄからなる群から選択される少なくとも１つの細菌遺伝子を特異的に阻害する。
【００３８】
標的細菌
本発明の使用／方法は、動物生物に関連していることが知られている有益な細菌を含む、いかなるタイプの細菌（病原性でも非病原性でも；グラム陽性でもグラム陰性でも）でも遺伝子を発現停止にするのに有用である。
好ましい実施形態では、前記標的細菌はヒト病原性細菌である。
【００３９】
本発明の使用／方法を使用して標的にすることができる病原性細菌の非限定的例は：
アクチノマイセス・イスラエリー（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア菌種（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐ．）（ブルグドルフェリ（ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ガリニ（ｇａｒｉｎｉｉ）、アフゼリ（ａｆｚｅｌｉｉ）、レカレンチス（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）、クロシドゥレ（ｃｒｏｃｉｄｕｒａｅ）、ダットニイ（ｄｕｔｔｏｎｉｉ）、ヘルムシー（ｈｅｒｍｓｉｉ）等）、ブルセラ菌種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐ．）（アボータス（ａｂｏｒｔｕｓ）、カニス（ｃａｎｉｓ）、メリテンシス（ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、スイス（ｓｕｉｓ））、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、クラミジア菌種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）（ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、トラコマチス（ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クロストリジウム菌種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）（ボツリヌス（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、パーフリンジェンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、テタニ（ｔｅｔａｎｉ））、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エーリキア菌種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐ．）（カニス（ｃａｎｉｓ）、シャフェンシス（ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ））、エンテロコッカス（フェカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）、フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ））、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ヘリコバクターピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ菌種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、マイコバクテリウム菌種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）（レプラエ（ｌｅｐｒａｅ）、ツベルクローシス（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ナイセリア（ゴノレア（ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、メニンギティディス（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ポルヒロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、サルモネラ菌種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）（チフス菌（ｔｙｐｈｉ）、ティフィムリウム（ｔｙｐｈ���ｍｕｒｉｕｍ））、シゲラ菌種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．）（ソンネ（ｓｏｎｎｅｉ）、ディゼンテリエ（ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ））、スタフィロコッカス（アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）、エピデルミディス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、サプロフィティカス（ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ））、ストレプトコッカス菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（アガラクチアエ（ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）、ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ピオゲネス（ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ビリダンス（ｖｉｒｉｄａｎｓ））、タンネレラ・フォーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、およびエルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）を含む。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明の方法は、有益な細菌（例えば、片利共生または相利共生細菌）のうちの１つまたは複数の遺伝子を標的にする機能的ｉＲＮＡを使用する。この特定の実施形態の目的は、前記細菌の有益な効果を促進することである。この特定の実施形態では、標的細菌遺伝子は、発現停止された場合、標的細菌細胞の複製または宿主にとって有益である経路を促進する因子、および有益な化合物（例えば、アンホルモン（ａｎｈｏｒｍｏｎｅ））、（ｉ）周囲の病原体または競争相手の生存／病原性を変更する、（ｉｉ）宿主防御応答を活性化する（例えば、抗菌ペプチド産生）、（ｉｉｉ）環境からの栄養分の取込みを促進する、（ｉｖ）非生物的ストレス条件に対する宿主生物の耐性を増強する、等の二次代謝産物の生成を正に調節する因子である。そのような細菌標的遺伝子のサイレンシングは、このように、宿主生物の成長速度の増加および／または宿主生物にとっていくつかの他の考え得る有益な効果をもたらすと考えられる。
そのような実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、有益な細菌遺伝子との配列相同性を有するが、病原性細菌ゲノムとの、宿主ゲノムとのまたは宿主生着菌および／もしくは宿主生物を常食とする哺乳動物の他のゲノムとの配列相同性を有するべきではない。
【００４１】
本発明の方法を用いて標的にすることができる有益な（片利共生または相利共生）細菌の非限定的例は：
アクチノマイセス・ネスルンディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、ベイロネラ・ディスパル（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｄｉｓｐａｒ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、大腸菌Ｋ１２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２）、ビフィドバクテリウム菌種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）（ロンガム（ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィダム（ｂｉｆｉｄｕｍ）、アドレッセンティス（ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、デンティウム（ｄｅｎｔｉｕｍ）、ブレーベ（ｂｒｅｖｅ）、サーモフィラム（ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｍ））、エガセラ・レンタ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ）、バクテロイデス菌種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．）（キシラニソルベンス（ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）、テタイオタオミクロン（ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、フラジリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ブルガタス（ｖｕｌｇａｔｕｓ）、サラニトロニス（ｓａｌａｎｉｔｒｏｎｉｓ））、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ルミノコッカス菌種（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（ブロミイ（ｂｒｏｍｉｉ）、シャンパネレンシス（ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）、ＳＲ１／５）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（パラサングイニス（ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、サリバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、サーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スイス（ｓｕｉｓ）、ピオゲネス（ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アンギノサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ））、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、ガルビエ（ｇａｒｖｉｅａｅ））、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）、フェカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）、カセリフラブス（ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、デューランス（ｄｕｒａｎｓ）、ヒラエ（ｈｉｒａｅ））、メリソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシルス菌種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（カゼイ（ｃａｓｅｉ）、ルミニス（ｒｕｍｉｎｉｓ）、デリブルエッキイー（ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ブチネリ（ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）、ファーメンタム（ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ペントーサス（ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、アミロボラス（ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、サリバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ））、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）（ペントサセウス（ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、クラウセニ（ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ））、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）（メセンテロイデス（ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、カルノサム（ｃａｒｎｏｓｕｍ）、ゲリダ��（ｇｅｌｉｄｕｍ）、シトレウム（ｃｉｔｒｅｕｍ））、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）（タイランデンシス（ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、コリエンシス（ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ））、オエノコッカス・オエニ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ）、パエニバチルス菌種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（テラエ（ｔｅｒｒａｅ）、ポリミキサ（ｐｏｌｙｍｙｘａ）、ムシラギノサス（ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓ）、Ｙ４１２ＭＣ１０）、サーモバチルス・コンポスティ（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｍｐｏｓｔｉ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、サブティリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、リケニフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、アトロファエウス（ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、ウェイヘンステファネンシス（ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）、セレウス（ｃｅｒｅｕｓ）、チューリンゲンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、コアグランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、セレニティレドセンス（ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ））、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、リジニバチルス・スファエリカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、ハロバチルス・ハロフィラス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、リステリア菌種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐ．）、ストレプトマイセス菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（レクタレ（ｒｅｃｔａｌｅ）、エリゲンス（ｅｌｉｇｅｎｓ）、シラエウム（ｓｉｒａｅｕｍ））、クロストリジウム・サッカロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）および酪酸産生細菌（ｂｕｔｙｒａｔｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＳＳ３／４およびＳＳＣ／２）を含む。
【００４２】
標的細菌遺伝子
本発明のｉＲＮＡは、少なくとも１つの細菌遺伝子の配列特異的サイレンシングを誘導するために、前記少なくとも１つの細菌遺伝子と十分な配列相同性を有するべきである。さらに、望まないオフターゲット効果を防ぐために、真核生物宿主ゲノムまたは有益な細菌、宿主生着菌および／もしくは宿主生物を常食とする哺乳動物の他のゲノムとの本発明のｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは低分子ＲＮＡ種の配列相同性は、（非存在ではないとすれば）見かけ上の存在であるべきである。
本発明のｉＲＮＡは、少なくとも１つの細菌遺伝子の発現を阻害することができる。
【００４３】
本発明によると、用語「細菌遺伝子」は、細菌中の天然に存在する（天然の）タンパク質コード遺伝子および非コード遺伝子を含む、細菌中の任意の遺伝子ならびに組換えＤＮＡ技術により細菌に導入された人工遺伝子を指す。前記標的細菌遺伝子は、所与の細菌種に特異的であるまたは複数の細菌種にわたって保存されている。好ましくは、細菌遺伝子は、真核生物宿主ゲノム、宿主生着菌および／または宿主生物を常食とする哺乳動物の任意の遺伝子と相同性を共有しない。これにより、植物宿主、宿主に関連する有益な細菌、宿主生着菌および／または宿主生物を常食とする哺乳動物に対する付随的作用は回避される。
好ましい実施形態では、前記少なくとも１つの細菌遺伝子は、細菌病原性因子または細菌についての必須遺伝子または抗生物質耐性遺伝子である。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「細菌についての必須遺伝子」は、細菌細胞生存能に不可欠である任意の細菌遺伝子を指す。これらの遺伝子は、すべての栄養分が利用可能であることを条件として、細菌を生きたまま維持するのに絶対に必要とされる。細菌にとって絶対に必要な、必須遺伝子の数は、約２５０〜５００個であると考えられている。無関係な細菌からのそのような必須遺伝子の同定は、現在ではトランスポゾン塩基配列決定アプローチの使用を通じて比較的容易に行いやすくなりつつある。これらの必須遺伝子は、中心代謝を維持し、ＤＮＡを複製し、適切な細胞分裂を保証し、遺伝子をタンパク質に翻訳し、基本的な細胞構造を維持し、細胞内外への輸送過程を媒介するタンパク質をコードする（４２）。これは、そのサイレンシングがインビトロで緑膿菌の成長を損なうことが分かっているＧｙｒＢ、ＤｎａＮまたはＳｅｃＥ遺伝子に当てはまる（図１２）。
その中で使用される場合、用語「病原性遺伝子」は、以下の活動：病原性、病気の発症、特定の宿主組織への定着または宿主細胞環境等のうちの少なくとも１つに極めて重要な役割を果たすことが明らかにされている任意の細菌遺伝子を指す。これらの活動すべては、細菌が成長するおよび／または宿主において病気の症状を促進する一助となるが、インビトロでの細菌の生存にとって不可欠ではない。
【００４５】
本発明の文脈では、本発明のｉＲＮＡは、ヒトまたは非ヒト動物において細菌病原体により引き起こされる病気を予防するまたは処置するために、例えば、ＩＩＩ型分泌系を含む分泌系の構造遺伝子（例えば、ＰｓｃＣ、ＰｓｃＪ、ＰｓｃＮ）、ＩＶ型分泌系の構造遺伝子（例えば、ＶｉｒＢ１、ＶｉｒＤ４）、ＶＩ型分泌系の構造遺伝子（例えば、ＴｓｓＭ、ＴｓｓＪ、ＴｓｓＢ／ＴｓｓＣ、ＴｓｓＥ、ＶｇｒＧ、Ｈｃｐ）、ｄｏｔ／ｉｃｍ系の遺伝子（ＤｏｔＣ、ＤｏｔＤ、ＤｏｔＦ、ＤｏｔＧおよびＤｏｔＨ）、クオラムセンシング遺伝子（例えば、ＬｕｘＳ、Ｌｕｘｌ／ＬｕｘＲ）、アミノ酸合成に関与する必須遺伝子（ＡｒｏＡ、ＬｙｓＣ、ＣｙｓＨ、ＧａｌＵ）、トランスペプチダーゼ（ＰｂｐＡ、ＰｂｐＢ、ＰｂｐＣ）、細菌転写装置の構成成分（例えば、シグマ７０、シグマ５４）、細菌細胞壁の構造成分（ペプチドグリカン生合成遺伝子）、細胞分裂に極めて重要な遺伝子（例えば、ＦｔｓＺ、ＦｔｓＡ、ＦｔｓＮ、ＦｔｓＫ、ＦｔｓＩ、ＦｔｓＷ）、アクチンの構造相同物（例えば、ＭｒｅＢ、Ｍｂｌ）、ＺｉｐＡ、ＺａｐＡ、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、Ｐａｌ、ＭｉｎＣＤなどの他の極めて重要な遺伝子、アクチン関連遺伝子（ＭｒｅＢおよびＭｌｄ）、抗生物質標的全般（抗菌性耐性遺伝子、タンパク質および表現型に関する参考情報を収集し体系化しており、あらゆる種類の薬物クラスおよび抵抗性機序および構造を取り扱っている生物データベースである、The Comprehensive Antibiotic Resistance Database or “CARD”, 2017参照）（６７）等を標的にする。
【００４６】
本発明のｉＲＮＡは、細菌を前記抗生物質処理に感受性にするために、抗生物質耐性遺伝子の発現を阻害することもできる。
これらの抗生物質耐性遺伝子は、例えば、細菌放出ポンプ遺伝子（Ａｒｃ、Ｐｔｒ、Ｎｏｒ、Ｍｅｐ、Ｃｍｅタイプ）、ベータラクタマーゼの４つの分子クラスの遺伝子：クラスＡ（例えば、ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＧＥＳタイプ）、クラスＢ（例えば、メタロベータラクタマーゼＶＩＭ、ＮＤＭ）、クラスＣ（例えば、ＡｍｐＣタイプ）、クラスＤ（ＯＸＡタイプ）である。抗生物質耐性遺伝子の非限定的例は：ＶＩＭ−１、ＶＩＭ−２、ＶＩＭ−３、ＶＩＭ−５、ＣａｓＥ、ＯＸＡ−２８、ＯＸＡ−１４、ＯＸＡ−１９、ＯＸＡ−１４５、ＰＥＲ−１、ＴＥＭ−１１６、およびＧＥＳ−９、ならびに微生物においてこれらの遺伝子が欠失しているまたは不活化している場合に細菌の致死をもたらす他の生命維持遺伝子およびThe Comprehensive Antibiotic Resistance Database 2017(or “CARD”, 2017)に収載されている遺伝子を含む（６７）。これらの標的遺伝子は、細菌分泌系の組立てに必要な構成成分、細菌エフェクター／毒素の転写活性化因子、クオラムセンシング受容体および標的にされている細菌病原体由来の他のよく特徴付けられた病原性因子などの、細菌病原体の主要な病原性決定基をコードすることもできる。
【００４７】
好ましい実施形態では、したがって、前記病原性因子遺伝子または細菌生存能遺伝子または抗生物質耐性遺伝子は：ＰｓｃＣ、ＰｓｃＪ、ＰｓｃＮ、ＶｉｒＢ１、ＶｉｒＤ４、ＴｓｓＭ、ＴｓｓＪ、ＴｓｓＢ／ＴｓｓＣ、ＴｓｓＥ、ＶｇｒＧ、Ｈｃｐ、ＤｏｔＣ、ＤｏｔＤ、ＤｏｔＦ、ＤｏｔＧおよびＤｏｔＨ、ＬｕｘＳ、Ｌｕｘｌ／ＬｕｘＲ、ＡｒｏＡ、ＬｙｓＣ、ＣｙｓＨ、ＧａｌＵ、ＰｂｐＡ、ＰｂｐＢ、ＰｂｐＣ、Ｐｉｇｍａ７０、Ｓｉｇｍａ５４、Ａｒｃ、Ｐｔｒ、Ｎｏｒ、Ｍｅｐ、Ｃｍｅ、ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＧＥＳ、ＶＩＭ、ＮＤＭ、ＡｍｐＣ、ＶＩＭ−１、ＶＩＭ−２、ＶＩＭ−３、ＶＩＭ−５、Ｃａｓｅ、ＯＸＡ−２８、ＯＸＡ−１４、ＯＸＡ−１９、ＯＸＡ−１４５、ＰＥＲ−１、ＴＥＭ−１１６、ＧＥＳ−９、ＦｔｓＺ、ＦｔｓＡ、ＦｔｓＮ、ＦｔｓＫ、ＦｔｓＩ、ＦｔｓＷ、ＺｉｐＡ、ＺａｐＡ、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、Ｐａｌ、ＭｉｎＣＤ、ＭｒｅＢならびにＭｌｄからなる群において選択される。
【００４８】
この実施形態では、ｉＲＮＡは、有利には、細菌病原体種由来の生存能または病原性遺伝子についての必須遺伝子と配列相同性を有するが、片利共生細菌ゲノムとの配列相同性はない。本方法のそのような有利な実施形態は、宿主に存在する片利共生細菌に対する付随的作用を回避する。
【００４９】
本発明のｉＲＮＡは、例えば、配列番号１０８〜１０９（緑膿菌のＤｎａＡ、ＤｎａＮおよびＧｙｒＢ遺伝子を同時に標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１１０〜１１１（緑膿菌のＲｐｏＣ、ＳｅｃＥおよびＳｏｄＢ遺伝子を同時に標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１１２〜１１３（緑膿菌のＸｃｐＱ、ＰｓｃＦおよびＰｓｃＣ遺伝子を同時に標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１１４〜１１５（緑膿菌のＸｃｐＱ、ＥｘｓＡおよびＨｐｈＡ遺伝子を同時に標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１１６〜１１７（シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）のＦｔｓＡ、ＣａｎおよびＴｓｆ遺伝子を同時に標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１１８〜１１９（シゲラ・フレックスネリのＡｃｃＤ、ＤｅｒおよびＰｓｄ遺伝子を同時に標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１２０〜１２１（シゲラ・フレックスネリのＶｉｒＦ、ＶｉｒＢおよびＩｃｓＡ遺伝子を同時に標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１２２〜１２３（シゲラ・フレックスネリのＦｕｓＡ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１２４〜１２５（シゲラ・フレックスネリのＣａｎ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１２６〜１２７（シゲラ・フレックスネリのＴｓｆ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１２８〜１２９（シゲラ・フレックスネリのＡｃｃＤ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１３０〜１３１（シゲラ・フレックスネリのＤｅｒ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１３２〜１３３（シゲラ・フレックスネリのＰｓｄ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１３４〜１３５（シゲラ・フレックスネリのＶｉｒＢ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１３６〜１３７（シゲラ・フレックスネリのＶｉｒＦ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１３８〜１３９（シゲラ・フレックスネリのＩｃｓＡ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１４０〜１４１（シゲラ・フレックスネリのＳｐａ４７遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１４２〜１４３（シゲラ・フレックスネリのＭｕｋＢ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１４４〜１４５（シゲラ・フレックスネリのＹｂｉＴ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）の配列を有する二重鎖低分子ＲＮＡである。
【００５０】
別の好ましい実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、有益な（片利共生／相利共生）細菌の生存を負に調節する遺伝子、または宿主でのその侵入および会合を妨げる遺伝子、またはその糖代謝および取込みを負に制御する遺伝子を標的にする（そのような遺伝子をノックダウンすると細菌力価が増加する）。
本発明のｉＲＮＡは有利には、標的細菌病原体種由来のこれらの必須遺伝子または病原性遺伝子または抗生物質耐性遺伝子のうちのいずれかと配列相同性を共有する。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「配列相同性」は、配列類似性、すなわち、核酸配列間の十分な程度の同一性または一致を有する配列を指す。本発明の文脈では、２つのヌクレオチド配列は、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、あるいは少なくとも約８１％、あるいは少なくとも約８２％、あるいは少なくとも約８３％、あるいは少なくとも約８４％、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約８６％、あるいは少なくとも約８７％、あるいは少なくとも約８８％、あるいは少なくとも約８９％、あるいは少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９１％、あるいは少なくとも約９２％、あるいは少なくとも約９３％、あるいは少なくとも約９４％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは少なくとも約９６％、あるいは少なくとも約９７％、あるいは少なくとも約９８％、あるいは少なくとも約９９％が類似している場合、「配列相同性」を共有する。
逆に言うと、「配列相同性がない」ヌクレオチド配列は、約１０％未満、あるいは約５％未満、あるいは２％未満の程度の同一性を有するヌクレオチド配列である。
【００５２】
好ましくは、類似するまたは相同なヌクレオチド配列は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用して同定される。別段述べられなければ、本明細書で提供される配列同一性／類似性値は、以下のパラメータ：５０のＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔおよび３のＬｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔを使用するヌクレオチド配列についての％同一性および％類似性、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックス；８のＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔおよび２のＬｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔを使用するアミノ酸配列についての％同一性および％類似性、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス；またはその任意の等価なプログラムを使用するＧＡＰバージョン１０を使用して得られる値を指す。「等価なプログラム」とは、ＧＡＰバージョン１０により生み出される対応するアライメントと比べた場合、問題の任意の２つの配列について、同一のヌクレオチド残基適合および同一のパーセント配列同一性を有するアライメントを生じる任意の配列比較プログラムを意図している。
注目すべきことに、本発明のｉＲＮＡは、真核細胞で、または真菌、昆虫、害虫もしくは他の植物感染病原体で発現される遺伝子を阻害しない。具体的には、本発明のｉＲＮＡは、細菌起源であり他のゲノム中に挿入される癌遺伝子の発現を阻害しない。さらに正確には、本発明のｉＲＮＡは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細菌の癌遺伝子ｉｉａＭおよびｉｐｔの発現を阻害しない。
【００５３】
キメラサイレンシング因子
いくつかの細菌病原体が引き起こす病気から植物を保護するために、本発明の方法は、１つよりも多い細菌遺伝子との配列相同性を保有する機能的ｉＲＮＡ（以後「キメラｉＲＮＡ」と呼ぶ）を有利に使用する。これらのキメラｉＲＮＡは、好ましくは、少なくとも２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多い細菌必須遺伝子および／または上記の因子などの病原性因子との相同性を共有する。
【００５４】
好ましい実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、上で定義される病原性因子をコードする少なくとも１つの遺伝子または細菌細胞の必須遺伝子を、病原性因子をコードする少なくとも１つの他の遺伝子またはＨＩＧＳに感受性であることが知られている他の病原体または寄生生物の必須遺伝子と共に、阻害するキメラｉＲＮＡである。必須遺伝子は、非細菌病原体または植物寄生生物由来の有毒な二次代謝物の生合成に必要とされる遺伝子も可能である。
別の好ましい実施形態では、本発明の方法は、（ｉ）細菌病原体の大きなセットに保存されている必須もしくは病原性遺伝子の広範囲にわたる配列領域を標的にする１つもしくは複数のｉＲＮＡ、または（ｉｉ）無関係な細菌病原体由来の必須もしくは病原性因子である遺伝子を標的にする１つもしくは複数のｉＲＮＡを使用する。本方法のそのような特定の実施形態は、複数の細菌病原体に対する広域性の保護を与える。本発明のｉＲＮＡは、有利には、上で定義される長いｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡである。
【００５５】
特定の実施形態では、本発明の方法は、ウイルス、真菌、卵菌、昆虫または線虫などの、細菌とは異なる寄生生物の１つまたは複数の遺伝子を標的にする１つまたは複数のｄｓＲＮＡを植物中に導入することをさらに含む。この実施形態では、ｉＲＮＡは寄生生物の必須遺伝子または病原性遺伝子に向けられる。寄生生物の遺伝子を標的にする１つまたは複数のｉＲＮＡは、有利には、細菌遺伝子を標的にするｉＲＮＡと同時に送達されるまたは同時発現される。別の特定の実施形態では、本発明の方法は、ウイルス、真菌、卵菌、昆虫または線虫などの、細菌とは異なる寄生生物の１つまたは複数の遺伝子を標的にする低分子ＲＮＡに細菌を接触させることを含む。この実施形態では、低分子ＲＮＡは寄生生物の必須遺伝子または病原性遺伝子に向けられる。寄生生物の遺伝子を標的にする１つまたは複数の低分子ＲＮＡは、有利には、細菌遺伝子を標的にする低分子ＲＮＡと同時に送達されるまたは同時発現される。
【００５６】
そのような方法は、細菌病原体および他の寄生生物により引き起こされる病気の同時予防または処置に有用である。そのような方法は、上で提唱されるように、細菌性遺伝子との配列相同性しかし他の病原性／寄生生物遺伝子との配列相同性も保有するキメラｉＲＮＡ、または一部は細菌遺伝子に相同性を有し、一部は他の病原体／寄生生物由来の遺伝子に相同性を有するｉＲＮＡ分子のカクテルを使用して実行することができる。
本発明の低分子ＲＮＡを生成するためのベクター
好ましい一実施形態では、本発明の長いおよび低分子ＲＮＡは、それぞれ生産植物細胞上でおよび標的細菌細胞上で直接使用される細胞外遊離ＲＮＡ分子として単離される。
層状複水酸化物（ＬＤＨ）粘土ナノシートは、非毒性で分解性であり、抗菌性ｄｓＲＮＡを運ぶのにも使用することができる。この粘土ナノシートは、既に抗ウイルスｄｓＲＮＡを送達するのに用いられて成功しており、少なくとも２０日の期間、ウイルス防除を与えることが分かった（４３）。
【００５７】
別の好ましい実施形態では、本発明の長いＲＮＡは、植物細胞中への導入を促進するおよび／または前記植物細胞での長いＲＮＡの発現を促進する組換えＤＮＡ構築物によりコードされている。前記組換え構築物はプラスミドまたはベクターが可能であり、これらは市販されている場合がある。ベクターは、好ましくは、下に記載される植物発現ベクターである。
別の態様では、したがって、本発明は、少なくとも１つの細菌遺伝子の発現を阻害する少なくとも１つの機能的干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記ポリヌクレオチド配列が真核細胞で発現可能である、植物組換えＤＮＡベクター（または「ＤＮＡ構築物」）または植物ウイルスベクターに関する。
【００５８】
前記機能的ｉＲＮＡは、上で定義されるように、短いまたは長いｄｓＲＮＡ、長いｓｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡであり、好ましくは、前記機能的ｉＲＮＡは長いｄｓＲＮＡ、長いｓｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
前記少なくとも１つの細菌遺伝子は、好ましくは、上で定義される必須もしくは病原性細菌遺伝子または抗生物質耐性遺伝子である。
実施形態では、ベクターはＤＮＡベクターである。前記ＤＮＡベクターは、転写開始領域、転写終結領域、および本発明のｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む転写ユニットを有利には含み、前記ポリヌクレオチド配列は、真核細胞でのｉＲＮＡ分子の発現を可能にするように前記開始および終結領域に作動可能に連結されている。
好ましい実施形態では、前記真核細胞は、アグロバクテロウム媒介一過性形質転換によく適応しているニコティアナ・ベンサミアナ葉などの、高い量のｉＲＮＡを発現することができる植物細胞である。
【００５９】
本発明のＤＮＡベクターは、本発明のｉＲＮＡ分子の１つもしくは両方の鎖、または自己ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二重鎖になる単一の自己相補的鎖をコードしてもよい。転写開始領域は、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターなどの植物細胞において活性であるウイルスプロモーターを含む、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩまたはＩＩＩ）についてのプロモーター由来でもよい。なぜならば、これらのプロモーターからの転写物は植物生物のすべての細胞において高レベルで発現されるからである。植物細胞での異種遺伝子の発現に適している大きな選択範囲のプロモーターは、当技術分野で利用可能である。このようなプロモーターは、例えば、植物ウイルスから利用可能である。このようなプロモーターは、構成的プロモーター、すなわち、大半の組織および細胞でならびに大半の環境条件下で活性であるプロモーター、ならびにある特定の組織またはある特定の細胞型でのみまたは主に活性である組織特異的または細胞特異的プロモーター、および化学的刺激に応答して活性化される誘導性プロモーターを含む。細菌病原体に対する植物保護のために本発明においてさらに使用することができる器官または組織特異的プロモーターは、特に、細菌病原体の進入および増殖に関連する組織／細胞型において、例えば、排水組織、孔辺細胞、木部柔組織細胞および毛状突起の基部を取り囲む細胞において活性であるプロモーターを含む。
【００６０】
前記転写終結領域は好ましくは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼにより、さらに好ましくは、Ｐｏｌ  ＩＩまたはＰｏｌ  ＩＩＩにより認識される。例えば、前記転写終結はＴＴＴＴＴ配列であり得る。
ｄｓＲＮＡ分子発現に適している多数のＤＮＡベクターは、当業者には公知であり、市販されている。適切なベクターの選択およびそこへのＤＮＡ構築物の挿入のための方法は周知である。ｄｓＲＮＡ分子を安定的に発現することができる組換えベクターは、植物内で形質転換され、標的細胞に存続することができる。ベクターの選択は、意図された宿主に、および前記宿主の形質転換の意図された方法に依拠する。
【００６１】
実施形態では、ベクターはウイルスベクター、好ましくは、植物ウイルスベクターである。前記ウイルスベクターは、好ましくは、種々の植物ＲＮＡウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、タバコラットルウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  ｒａｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、ジャガイモウイルスＸ（Ｐｏｔａｔｏ  ｖｉｒｕｓ  Ｘ）、ムギ斑葉モザイクウイルス（Ｂａｒｌｅｙ  ｓｔｒｉｐｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、トマトブッシースタントウイルス（Ｔｏｍａｔｏ  ｂｕｓｈｙ  ｓｈｕｎｔ  ｖｉｒｕｓ）から選択され、これらのウイルスを使用すれば、ＶＩＧＳを通じて植物細胞により高量の低分子ＲＮＡを生成することができる（１１）。ここではその上、ウイルスベクターの選択は、意図された宿主および前記宿主の意図された感染方法に依拠する。
【００６２】
本発明は、１つまたは複数のマーカー遺伝子を含む組換えＤＮＡベクターまたはウイルスベクターも包含し、このマーカー遺伝子により形質転換された宿主細胞を選択することが可能になる。
好ましい実施形態では、本発明のＤＮＡまたはウイルスベクターは、上で定義される２つ、３つ、または４つの機能的干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）をコードし、それゆえに、２つ、３つ、または４つの異なる細菌遺伝子を阻害することができるポリヌクレオチド配列を含む。当業者であれば、従来の手段によりｉＲＮＡの最良の組合せを特定することができる。４つよりも多い標的遺伝子の組合せも、本発明内に包含される。
【００６３】
一実施形態では、本発明のＤＮＡベクターは、配列番号１０８〜１４５および２４８〜２４９の配列のうちの少なくとも１つ、好ましくは配列番号１０８〜１４５の配列のうちの少なくとも１つ、さらに好ましくは、配列番号１０８〜１０９（緑膿菌のＤｎａＡ、ＤｎａＮおよびＧｙｒＢ遺伝子を同時に標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１１０〜１１１（緑膿菌のＲｐｏＣ、ＳｅｃＥおよびＳｏｄＢ遺伝子を同時に標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１１２〜１１３（緑膿菌のＸｃｐＱ、ＰｓｃＦおよびＰｓｃＣ遺伝子を同時に標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１１４〜１１５（緑膿菌のＸｃｐＱ、ＥｘｓＡおよびＨｐｈＡ遺伝子を同時に標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１１６〜１１７（シゲラ・フレックスネリのＦｔｓＡ、ＣａｎおよびＴｓｆ遺伝子を同時に標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１１８〜１１９（シゲラ・フレックスネリのＡｃｃＤ、ＤｅｒおよびＰｓｄ遺伝子を同時に標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１２０〜１２１（シゲラ・フレックスネリのＶｉｒＦ、ＶｉｒＢおよびＩｃｓＡ遺伝子を同時に標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１２２〜１２３（シゲラ・フレックスネリのＦｕｓＡ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１２４〜１２５（シゲラ・フレックスネリのＣａｎ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１２６〜１２７（シゲラ・フレックスネリのＴｓｆ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１２８〜１２９（シゲラ・フレックスネリのＡｃｃＤ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１３０〜１３１（シゲラ・フレックスネリのＤｅｒ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１３２〜１３３（シゲラ・フレックスネリのＰｓｄ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１３４〜１３５（シゲラ・フレックスネリのＶｉｒＢ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１３６〜１３７（シゲラ・フレックスネリのＶｉｒＦ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１３８〜１３９（シゲラ・フレックスネリのＩｃｓＡ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１４０〜１４１（シゲラ・フレックスネリのｓｐａ４７遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１４２〜１４３（シゲラ・フレックスネリのＭｕｋＢ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号１４４〜１４５（シゲラ・フレックスネリのＹｂｉＴ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）、配列番号２４８〜２４９（Ｐｔｏ  ＤＣ３０００および緑膿菌のＬｕｘＡおよびＬｕｘＢ遺伝子を標的にする第１および第２鎖の配列）の配列系を含む。
【００６４】
本発明のＤＮＡベクターは、当技術分野で公知の従来法により調製することができる。例えば、ＤＮＡベクターは、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによる核酸配列の増幅により、相同プローブとのハイブリダイゼーションによりゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、あるいは他に全体的もしくは部分的化学合成により生成することができる。組換えベクターは、当技術分野で公知である従来の技法により宿主細胞中に導入することができる。
本発明のインビトロ抗生物質法および使用
別の態様では、本発明は、標的細菌細胞において少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害するためのインビトロ方法であって、前記標的細菌細胞を、本発明の低分子ＲＮＡのうちの１つもしくは複数に、または本発明の低分子ＲＮＡのうちの１つもしくは複数を含む組成物に接触させるステップを含む方法に関する。宿主細胞の接触で転写的に活性化される病原性因子の場合には、特定の培地（例えば、最少培地）が使用される。
【００６５】
言い換えると、本発明は、標的細菌細胞において少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害するための、低分子ＲＮＡまたは低分子ＲＮＡを含む組成物のインビトロ使用であって、前記標的細菌細胞を前記低分子ＲＮＡまたは前記組成物に直接接触させる使用に関する。
好ましくは、前記低分子ＲＮＡは、一本鎖もしくは二本鎖ｓｉＲＮＡまたは一本鎖もしくは二本鎖ｍｉＲＮＡ二重鎖である。さらに好ましくは、前記低分子または長いＲＮＡは、前記細菌細胞が病原性の場合は、病原性因子をコードする少なくとも１つの遺伝子のもしくは必須遺伝子のもしくは抗生物質耐性遺伝子の発現を阻害する、または前記細菌細胞が有益な場合は、成長の抑制因子をコードする少なくとも１つの遺伝子のもしくは宿主に有用である経路の負の制御因子の発現を阻害する。
【００６６】
好ましくは、前記組成物は、前記細菌細胞の少なくとも１つの遺伝子に特異的である少なくとも１つの長いｄｓＲＮＡに接触させているプロデューサー植物細胞から得られる植物抽出物を含有する。さらに好ましくは、前記組成物は、前記植物抽出物から回収された細胞外小胞、もしくは前記植物抽出物により分泌される細胞外遊離ＲＮＡ、前記植物抽出物由来のアポプラスト液、または前記低分子ＲＮＡと複合体化したナノ粒子を含有する。前記プロデューサー植物細胞は、例えば、タバコ（例えば、ニコティアナ・ベンサミアナ、（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｂａｃｃｕｍ））；タロイモ（コロカシア・エスクレンタ（Ｃｏｌｏｃａｓｉａ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））；ショウガ（Ｇｉｇｅｒ）（ジングバー・オフィシナレ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ））；シロイヌナズナ（例えば、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））；トマト（例えば、リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）またはソラヌム・リコペルシクム）；ジャガイモ（ソラヌム・トゥーベロースム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））；イネ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））；トウモロコシ（ゼア・マイス（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））；オオムギ（ホルデウム・バルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））；コムギ（例えば、トリティクム・エスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トリティクム・デュラム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｄｕｒｕｍ））、綿実、綿、豆、バナナ／オオバコ、モロコシ、エンドウ、サツマイモ、ダイズ、キャベツ、キャッサバ、タマネギ、メロン、オート、ピーナッツ、ヒマワリ、パーム油、ライムギ、柑橘、コムギ、コショウ、ヤマノイモ、オリーブ、ブドウ、ゴマ、サトウキビ、テンサイ、エンドウおよびコーヒー、オレンジの木、リンゴの木、柑橘類の木、オリーブの木等からなる群において選択される。
【００６７】
「少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害する」とは、本明細書では、前記遺伝子の発現が低減される、すなわち、標的配列のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルが、無関係な遺伝子（例えば、真菌遺伝子）を標的にする対照低分子ＲＮＡに曝露された適切な対照細菌中の同じ標的配列のｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルよりも統計的に低いことを意味する。特に、本発明に従って細菌中の標的遺伝子のｍＲＮＡポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリペプチドレベルを低減すると、適切な対照細菌中の同じ標的配列のｍＲＮＡポリヌクレオチドレベルまたはそれにコードされるポリペプチドのレベルの６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満に達する。ＲＮＡ転写物の発現レベル、標的遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現レベル、または前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性をアッセイするための方法は当技術分野では周知である。
【００６８】
この態様では、いかなる種類の細菌でも標的にすることができる。上記の通り、動物（ヒトを含む）宿主、または動物（ヒトを含む）宿主に有益な効果を提供する有益な（例えば、相利共生または片利共生）細菌に感染する病原性細菌を標的にすることができる。
一実施形態では、この方法は、試料中の病原性細菌の病原性および成長を阻害するまたは制限するのに特に興味深い。この方法は、試料中の病原性細菌細胞を殺傷するのにも有用である。
別の実施形態では、この方法は、上述のように、細菌成長を直接的または間接的に負に調節する遺伝子を阻害することにより有益な細菌の複製を促進するのにも使用することができる。
別の実施形態では、抗生物質化合物に対する細菌耐性に関与している遺伝子を標的にすることにより、前記抗生物質化合物に対する細菌細胞の感受性を回復させるためにこの方法を使用することも可能である。
【００６９】
本発明の植物治療法（ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ）および使用
本発明に従って、核酸を発現させるための上述の標準法を使用することにより、本発明の１つまたは複数のｉＲＮＡは植物細胞中に導入される。真核細胞の遺伝子形質転換のための種々の方法は、多くの植物種について当技術分野で利用可能である。非限定的例として、遺伝子銃（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、ウイルス媒介形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換、および同類のものを実施することができる。電気穿孔法は含まれない。
核酸を細胞中に挿入するという文脈での用語「導入される」は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、核酸が細胞のゲノム中に安定的に組み込まれる（例えば、染色体、プラスミド）または一過性に発現（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介する遺伝子構築物の一過性送達）されてもよい真核細胞中への核酸の組込みへの言及を含む。
【００７０】
宿主植物細胞での本発明のｉＲＮＡの発現は、一過性または安定していてもよい。安定な発現は、特に、従来の技法を使用するトランスジェニック植物の調製を指す。
前記ｉＲＮＡは、植物ダイサー様酵素および他の低分子ＲＮＡプロセシング因子を使用することにより、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ二重鎖にプロセシングされる。前記低分子ＲＮＡ二重鎖および／または成熟低分子ＲＮＡガイド（すなわち、ＡＧＯ中にローディングされている）は、その後、細胞外培地に、または植物細胞の表面に移動され、そこでは細菌細胞と遭遇する可能性がある。
下の実施例（実施例４および５ならびに図４〜６）で実証されるように、細菌細胞の成長および病原性は、本発明の成熟ｉＲＮＡが分泌される条件で本発明の植物細胞に接触させて置かれた場合、減少する。
【００７１】
一態様では、本発明は、細菌感染に対して標的植物を処置するための方法であって、病原性細菌遺伝子または必須細菌遺伝子または抗菌耐性遺伝子を特異的に標的にする長いｄｓＲＮＡ分子を前記標的植物の少なくとも１つの細胞中に導入するステップを含む方法に関する。
この方法は、ヒトおよび動物による食用植物の汚染を回避するのに特に有用である。本発明の処理により植物上に存在する細菌の成長または生存を遮断することにより、これは、汚染され、感染した植物の摂取による動物およびヒトの汚染を回避することになる。
この方法は、植物が、赤痢菌、サルモネラ菌、リステリア、ブルセラ菌、大腸菌などの病原性動物細菌に感染するのを予防するのに、その結果、その植物の消費者が続いて感染するのを予防するのに特に有用である。
【００７２】
別の態様では、したがって、本発明は、細菌感染に対して植物を処置するためのＲＮＡベースの生物的防除方法であって、低分子ＲＮＡ、またはそのような低分子ＲＮＡを含有する植物抽出物もしくはこれらの低分子ＲＮＡを含む組成物（例えば、これらの低分子ＲＮＡ実体を安定的にもしくは一過性に発現している植物細胞もしくは組織から抽出される全ＲＮＡ、低分子ＲＮＡ実体を含有する細胞外小胞、または前記ＲＮＡに連結しているナノ粒子）を、アクチノマイセス・イスラエリー、炭疽菌、セレウス菌、バクテロイデス・フラジリス、百日咳菌、ボレリア菌種（ブルグドルフェリ、ガリニ、アフゼリ、レカレンチス、クロシドゥレ、ダットニイ、ヘルムシー等）、ブルセラ菌種（アボータス、カニス、メリテンシス、スイス）、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア菌種（ニューモニエ、トラコマチス）、オウム病クラミジア、クロストリジウム菌種（ボツリヌス、ディフィシル、パーフリンジェンス、テタニ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ、エーリキア菌種（カニス、シャフェンシス）、エンテロコッカス（フェカリス、フェシウム）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、フランシセラ・ツラレンシス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクターピロリ菌、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ菌種、リステリア・モノサイトゲネス、マイコバクテリウム菌種（レプラエ、ツベルクローシス）、マイコプラズマ・ニューモニエ、ナイセリア（ゴノレア、メニンギティディス）、シュードモナス・エルジノーサ、ポルヒロモナス・ジンジバリス、ノカルジア・アステロイデス、リケッチア・リケッチイ、サルモネラ菌種（チフス菌、ティフィムリウム）、シゲラ菌種（ソンネ、ディゼンテリエ）、スタフィロコッカス（アウレウス、エピデルミディス、サプロフィティカス）、ストレプトコッカス菌種（アガラクチアエ、ミュータンス、ニューモニエ、ピオゲネス、ビリダンス）、タンネレラ・フォーサイシア、トレポネーマ・パリダム、ビブリオ・コレラエ、またはエルシニア・ペスチスなどのヒトまたは動物病原性細菌による細菌感染に先立っておよび／またはその後に植物組織上に送達するステップを含む方法に関する。
【００７３】
好ましくは、前記組成物は、前記病原性細菌の前記少なくとも１つの病原性または必須または抗生物質耐性細菌遺伝子に特異的である少なくとも１つの長いｄｓＲＮＡを発現するまたはこれと接触させた植物細胞から得られる植物抽出物を含有する。さらに好ましくは、前記組成物は、前記植物抽出物から回収された細胞外小胞、または前記植物細胞により分泌される細胞外遊離低分子ＲＮＡ、またはナノ粒子連結低分子ＲＮＡを含有する。さらに好ましくは、前記組成物は、液体噴霧可能組成物である。
この態様では、細菌細胞はついには低分子ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）に直接接触し、低分子ＲＮＡはグラム陰性菌の場合は細菌二重膜を通過して細菌細胞の細胞質ゾルに到達することができ、そこで標的遺伝子は配列特異的方法で発現停止され、それにより細菌病原性は減衰する（実施例５〜７ならびに図４〜６および図９〜１０参照）。
【００７４】
本明細書で使用される場合、用語「低分子ＲＮＡ」は、本発明のｉＲＮＡの阻害活性を保有する低分子ＲＮＡを示す。具体的には、低分子ＲＮＡは、少なくとも１つの細菌遺伝子と、好ましくは、少なくとも１つの細菌病原性または必須遺伝子と、さらに好ましくは、上に挙げる遺伝子のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％配列相同性を共有するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ（二重鎖または一重鎖）である。これらの低分子ＲＮＡは一般には、４０以下の塩基対を含む。好ましくは、低分子ＲＮＡは、１８〜３０塩基対、さらに好ましくは、１８〜２５塩基対を含有する。さらに好ましくは、前記低分子ＲＮＡは、上で定義される細菌必須または病原性遺伝子のうちの少なくとも１つを特異的に阻害する。
【００７５】
好ましくは、上で開示されるように、これらの低分子ＲＮＡは二本鎖ｓｉＲＮＡである。
本発明の別の態様は、植物治療剤として、上に定義される、少なくとも１つのｉＲＮＡまたはこのｉＲＮＡを含有するベクターの使用に関する。好ましくは、前記ｉＲＮＡまたはベクターは、植物において病原性細菌により引き起こされる病気を処置するためまたは植物における細菌感染を予防するために使用される。
【００７６】
一実施形態では、この植物治療ｉＲＮＡは、上で定義される、短いまたは長いｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはｍｉＲＮＡ二重鎖、ｓｉＲＮＡ一重鎖またはｍｉＲＮＡ一重鎖である。さらに別の実施形態では、ｉＲＮＡは、植物において細菌病原体および他の病原体／寄生生物により引き起こされる病気の同時予防または処置のために、上で定義される、細菌遺伝子および他の非細菌病原体または寄生生物の遺伝子を標的にする。ｉＲＮＡ、ベクター、および形質転換法について上で提唱されるすべての実施形態はこれにより包含され、繰り返される必要はない。
動物病原性細菌により誘導される植物検疫の技術的問題という文脈では、前記低分子ＲＮＡは種々の手段により（例えば、スプレーにより）植物組織に送達することができる。低分子ＲＮＡは、微粒子、ナノ微粒子、リポソームまたは天然のエキソソーム内に埋め込むことができる。好ましい製剤は下に開示されている。
【００７７】
本発明の低分子ＲＮＡを生成するトランスジェニック植物
本発明のｉＲＮＡで形質転換され本発明の低分子ＲＮＡを生み出すことができる植物細胞は、以後は「本発明の植物細胞」または「本発明の宿主細胞」と呼ぶ。この植物細胞は、細菌遺伝子、例えば、病原性もしくは必須細菌遺伝子を特異的に標的にする少なくとも１つの配列を含有する少なくとも１つのｉＲＮＡ（好ましくは、長いＲＮＡ）、または上で定義されるＤＮＡ構築物もしくはベクターを含有する。
長いＲＮＡをコードするトランス遺伝子で安定的に形質転換された植物は、長いＲＮＡを積極的に発現はしないがそうする能力はある種子、生殖材料、増殖材料、または細胞培養材料として供給してもよい。
【００７８】
植物細胞は、本発明の低分子ＲＮＡの生成のためだけに使用される場合、「プロデューサー植物細胞」と呼ぶことができる。植物細胞は、生成された低分子ＲＮＡにより与えられる抗菌効果から利益を得る場合、「標的植物」と呼ぶこともできる。両タイプの植物（プロデューサーおよび標的植物）は、本発明の低分子ＲＮＡを発現し生成する組換え細胞である。プロデューサー植物は、本発明の低分子ＲＮＡを分泌する植物を観賞／食料目的に使用することができるので、標的植物になることができる。
本明細書の用語「植物」は、植物細胞、植物組織、植物部位、全草、先祖およびその子孫を包含する。植物部位は、植物の任意の部分または器官でもよく、例えば、種子、果実、茎、葉、新芽、花、葯、根、塊茎および葉柄を含む。用語「植物」は、懸濁培養物、胚、分裂領域、カルス組織、配偶体、胞子体、花粉および小胞子も包含する。この用語は、シダおよび樹木を含むすべての植物を指す。
別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つの機能的ｉＲＮＡを安定的にまたは一過性に発現する単離された植物細胞またはトランスジェニック植物に関する。本発明は、本発明のＤＮＡまたはウイルスベクターを含有する単離された植物細胞にも関する。前記植物細胞は、前記ＤＮＡベクターでの形質転換により得られる遺伝子改変細胞でもよい。
形質転換過程の例は、アグロバクテリウム媒介形質転換またはショットガン媒介形質転換である。
植物細胞、ｉＲＮＡ、ベクター、および形質転換法について上で提唱されたすべての実施形態はこれにより包含され、繰り返される必要はない。
【００７９】
そのようなトランスジェニック植物を生み出す方法は、下の実施例の部分で開示される。その方法は、
植物細胞が相当量の低分子ＲＮＡを安定的にまたは一過性に発現するのに十分な時間（典型的には、タバコで３〜４日）、
ｉ）本発明の少なくとも１つの機能的干渉ＲＮＡを発現するＤＮＡベクターで植物細胞を形質転換するステップ、または
ｉｉ）本発明の少なくとも１つの機能的干渉ＲＮＡを発現する植物ウイルス、好ましくは植物ＲＮＡウイルスを植物細胞に感染させるステップ
を含む。
【００８０】
「相当量」とは、本明細書では、上記のような試験において抗菌効果を有することが示されている量を意味する。この相当量は、好ましくは、効果的な低分子ＲＮＡを発現する全ＲＮＡの１０〜３０ｎｇ／μｌの間に含まれる。
特に、前記トランスジェニック植物は、細菌の宿主誘導遺伝子サイレンシングが可能であり、細菌の少なくとも１つの遺伝子の発現を下方調節または抑制することができる発現可能なｉＲＮＡを含有し、そこでは植物は成熟低分子ＲＮＡを発現する。発明者らにより実証されたように、前記低分子ＲＮＡは、標的細菌の二重膜を横切って増殖するまたは通過することができる。
【００８１】
別の態様では、本発明は、本発明の成熟低分子ＲＮＡを安定的にまたは一過性に発現する標的トランスジェニック植物に関する。一実施形態では、前記標的トランスジェニック植物は、本発明のＤＮＡベクターを含有する。好ましい一実施形態では、前記標的植物は、イネ、トウモロコシ、オオムギ、綿実、綿、豆、バナナ／オオバコ、モロコシ、エンドウ、サツマイモ、ダイズ、キャベツ、キャッサバ、ジャガイモ、トマト、タマネギ、メロン、オート、ピーナッツ、ヒマワリ、パーム油、ライムギ、柑橘、コムギ、コショウ、ヤマノイモ、オリーブ、ブドウ、タロイモ、タバコ、ゴマ、サトウキビ、テンサイ、エンドウおよびコーヒー、オレンジの木、リンゴの木、柑橘類の木、ならびにオリーブの木である。ｉＲＮＡ、ベクター、および形質転換技法について上で提唱されたすべての実施形態はこれにより包含され、繰り返される必要はない。
【００８２】
別の態様では、本発明は、本発明のｉＲＮＡを安定的にまたは一過性に発現するトランスジェニック植物に関する。一実施形態では、前記トランスジェニックプロデューサー植物は、本発明のＤＮＡベクターを含有する。好ましい一実施形態では、前記プロデューサー植物は、タバコ（例えば、ニコティアナ・ベンサミアナ、ニコティアナ・タバカム）；タロイモ（コロカシア・エスクレンタ）；ショウガ（Ｇｉｇｅｒ）（ジングバー・オフィシナレ）；シロイヌナズナ（例えば、アラビドプシス・タリアナ）；トマト（例えば、リコペルシコン・エスクレンタムまたはソラヌム・リコペルシクム）；ジャガイモ（ソラヌム・トゥーベロースム）；イネ（オリザ・サティバ）；トウモロコシ（ゼア・マイス）；オオムギ（ホルデウム・バルガレ）；コムギ（例えば、トリティクム・エスチバム、トリティクム・デュラム）、綿実、綿、豆、バナナ／オオバコ、モロコシ、エンドウ、サツマイモ、ダイズ、キャベツ、キャッサバ、タマネギ、メロン、オート、ピーナッツ、ヒマワリ、パーム油、ライムギ、柑橘、コムギ、コショウ、ヤマノイモ、オリーブ、ブドウ、ゴマ、サトウキビ、テンサイ、エンドウおよびコーヒー、オレンジの木、リンゴの木、柑橘類の木、オリーブの木等である。好ましいプロデューサー植物は、タバコ、タロイモおよびショウガ（Ｇｉｇｅｒ）である。
【００８３】
本発明のプロバイオティック法および使用
別の態様では、この方法は、上述のように、細菌成長を直接的または間接的に負の調節をする遺伝子を阻害することにより有益な（片利共生）細菌の複製を促進するためにも使用することができる。
したがって、本発明は、それを必要とする対象において有益な片利共生または相利共生細菌の有益な効果を促進するために使用するための、１５〜３０塩基対の間に含まれる長さを有し、少なくとも１つの細菌遺伝子の発現を特異的に阻害する低分子ＲＮＡであって、前記対象に経口的に、局所的または全身的に投与される低分子ＲＮＡに関する。
【００８４】
好ましくは、前記有益な片利共生または相利共生細菌は、アクチノマイセス・ネスルンディ、ベイロネラ・ディスパル、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、腸内細菌科、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、大腸菌Ｋ１２、ビフィドバクテリウム菌種（ロンガム、ビフィダム、アドレッセンティス、デンティウム、ブレーベ、サーモフィラム）、エガセラ・レンタ、バクテロイデス菌種（キシラニソルベンス、テタイオタオミクロン、フラジリス、ブルガタス、サラニトロニス）、パラバクテロイデス・ディスタソニス、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ルミノコッカス菌種（ブロミイ、シャンパネレンシス、ＳＲ１／５）、ストレプトコッカス（パラサングイニス、サリバリウス、サーモフィルス、スイス、ピオゲネス、アンギノサス）、ラクトコッカス（ラクティス、ガルビエ）、エンテロコッカス（フェシウム、フェカリス、カセリフラブス、デューランス、ヒラエ）、メリソコッカス・プルトニウス、テトラジェノコッカス・ハロフィルス、ラクトバシルス菌種（カゼイ、ルミニス、デリブルエッキイー、ブチネリ、ロイテリ、ファーメンタム、ペントーサス、アミロボラス、サリバリウス）、ペディオコッカス（ペントサセウス、クラウセニ）、ロイコノストック（メセンテロイデス、ラクティス、カルノサム、ゲリダム、シトレウム）、ワイセラ（タイランデンシス、コリエンシス）、オエノコッカス・オエニ、パエニバチルス菌種（テラエ、ポリミキサ、ムシラギノサス、Ｙ４１２ＭＣ１０）、サーモバチルス・コンポスティ、ブレビバチルス・ブレビス、バチルス（アミロリケファシエンス、サブティリス、リケニフォルミス、アトロファエウス、ウェイヘンステファネンシス、セレウス、チューリンゲンシス、コアグランス、メガテリウム、セレニティレドセンス）、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス、リジニバチルス・スファエリカス、ハロバチルス・ハロフィラス、リステリア菌種、ストレプトマイセス菌種、ユーバクテリウム（レクタレ、エリゲンス、シラエウム）、クロストリジウム・サッカロリティカムおよび酪酸産生細菌（ＳＳ３／４およびＳＳＣ／２）からなる群において選択される。
【００８５】
本発明のｉＲＮＡを用いて抗生物質感受性を回復させる
別の態様では、発明者らは、抗生物質化合物に対する細菌耐性に関与している遺伝子を標的にすることにより、前記抗生物質化合物に対する細菌細胞の感受性を回復させるために、この方法を使用することを提案する。
【００８６】
「抗生物質化合物」は、細菌を殺傷するために使用されるまたは提案される化合物を意味する。治療分野で使用される古典的抗生物質化合物は、例えば、銅系殺菌剤またはマクロ生物および微生物由来の二次代謝産物である。これらは、アミノグリコシド、カルバペネム、セフタジジム（第３世代）、セフェピム（第４世代）、セフトビプロール（第５世代）、セフトロザン／タゾバクタム、フルオロキノロン、ピペラシリン／タゾバクタム、チカルシリン／クラブラン酸、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲルダナマイシン（Ｇｅｌｄｅｎａｍｙｃｉｎ）、ハービマイシン、リファキシミン、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セフラジン、セファピリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフォテタン、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、ロラカルベフ、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、モキサラクタム、セフトリアキソン、セファロスポリン、セフェピム、セファロスポリン、セフタロリンフォサミル、セフトビプロール、グリコペプチド、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、ダルババンシン、オリタバンシン、リンコサミド（Ｂｓ）、クリンダマイシン、リンコマイシン、リポペプチド、ダプトマイシン、マクロライド（Ｂｓ）、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、フィダキソマイシン、モノバクタム、アズトレオナム、ニトロフラン、フラゾリドン、ニトロフラントイン（Ｂｓ）、オキサゾリジノン（Ｂｓ）、リネゾリド、ポジゾリド、ラデゾリド、トレゾリド、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリン、ピペラシリン、テモシリン、チカルシリン、ペニシリン組合せ、アモキシシリン／クラブラン酸、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、チカルシリン／クラブラン酸、ポリペプチド、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、キノロン／フルオロキノロン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、スルホンアミド（Ｂｓ）、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド（古語）、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、スルホンアミドクリソイジン（古語）、テトラサイクリン（Ｂｓ）、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン、サイクロセリン、エタンブトール（Ｂｓ）、エチオナミド、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、ストレプトマイシン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール（Ｂｓ）、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、チアンフェニコール、チゲサイクリン（Ｂｓ）、チニダゾール、トリメトプリム（Ｂｓ）等を含むがこれらに限定されない。
【００８７】
好ましくは、次に標的細菌は：
アクチノマイセス・イスラエリー、炭疽菌、セレウス菌、バクテロイデス・フラジリス、百日咳菌、ボレリア菌種（ブルグドルフェリ、ガリニ、アフゼリ、レカレンチス、クロシドゥレ、ダットニイ、ヘルムシー等）、ブルセラ菌種（アボータス、カニス、メリテンシス、スイス）、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア菌種（ニューモニエ、トラコマチス）、オウム病クラミジア、クロストリジウム菌種（ボツリヌス、ディフィシル、パーフリンジェンス、テタニ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ、エーリキア菌種（カニス、シャフェンシス）、エンテロコッカス（フェカリス、フェシウム）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、フランシセラ・ツラレンシス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクターピロリ菌、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ菌種、リステリア・モノサイトゲネス、マイコバクテリウム菌種（レプラエ、ツベルクローシス）、マイコプラズマ・ニューモニエ、ナイセリア（ゴノレア、メニンギティディス）、シュードモナス・エルジノーサ、ポルヒロモナス・ジンジバリス、ノカルジア・アステロイデス、リケッチア・リケッチイ、サルモネラ菌種（チフス菌、ティフィムリウム）、シゲラ菌種（ソンネ、ディゼンテリエ）、スタフィロコッカス（アウレウス、エピデルミディス、サプロフィティカス）、ストレプトコッカス菌種（アガラクチアエ、ミュータンス、ニューモニエ、ピオゲネス、ビリダンス）、タンネレラ・フォーサイシア、トレポネーマ・パリダム、ビブリオ・コレラエ、エルシニア・ペスチス等からなる群において選択される。
【００８８】
使用される植物低分子ＲＮＡの量は典型的には、標的細菌の数および細菌の種類に依拠する。この量は、効果的な低分子ＲＮＡを含有する全ＲＮＡの１０〜３０ｎｇ／μｌの間に含まれることが可能である。
本発明の治療方法
別の態様では、本発明は、細菌感染に対して動物を処置するためのＲＮＡベースの治療方法であって、低分子ＲＮＡ（新規に合成されるまたは植物抽出物から精製される）またはそのような低分子ＲＮＡを含有する植物抽出物もしくはこれらの低分子ＲＮＡを含む組成物（例えば、これらの低分子ＲＮＡ実体を安定的にもしくは一過性に発現する植物細胞もしくは組織から抽出される全ＲＮＡ、前記植物細胞由来の細胞外小胞、前記植物細胞由来のアポプラスト液、前記植物由来の細胞外遊離低分子ＲＮＡ、または前記低分子ＲＮＡに連結されたナノ粒子）を細菌感染に先立っておよび／またはその後で動物組織上に（または内部に）送達するステップを含む方法に関する。
【００８９】
好ましくは、前記動物は、属：ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ハイイロオオカミ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、ヒツジ（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ）、ヤギ（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）、イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、シチメンチョウ（Ｍｅｌｅａｇｒｉｓ  ｇａｌｌｏｐａｖｏ）、ハイイロガン（Ａｎｓｅｒ  ａｎｓｅｒ）、マガモ（Ａｎａｓ  ｐｌａｔｙｒｈｙｎｃｈｏｓ）、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）である。前記動物は、有益な細菌の宿主となる健康な動物、または病原性細菌に既に感染している病気の動物であり得る。
さらに好ましくは、前記動物はヒトである。
ヒトは、有益な細菌の宿主となる健康なヒト、または病原性細菌に既に感染している病気のヒトであり得る。
この態様では、細菌細胞は低分子ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）に直接接触し、低分子ＲＮＡはグラム陰性菌の場合は細菌二重膜を通過して細菌細胞の細胞質ゾルに到達することができ、そこで標的遺伝子は配列特異的方法で発現停止され、それにより細菌病原性は減衰する。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「低分子ＲＮＡ」は、本発明のｉＲＮＡの阻害活性を保有する低分子ＲＮＡを示す。具体的には、低分子ＲＮＡは、少なくとも１つの細菌遺伝子と、好ましくは、少なくとも１つの細菌病原性または必須遺伝子と、さらに好ましくは、上に挙げる遺伝子のうちの少なくとも１つと、少なくとも８０％配列相同性を共有するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ（二重鎖または一重鎖）である。これらの低分子ＲＮＡは一般には、４０以下の塩基対を含む。好ましくは、低分子ＲＮＡは、１８〜２５の塩基対を含有する。さらに好ましくは、前記低分子ＲＮＡは、上で定義される細菌必須または病原性遺伝子のうちの少なくとも１つを特異的に阻害する。
本発明の処置方法は、本発明の低分子ＲＮＡの経口、局所および全身投与を含む。鼻腔内および静脈内投与も想定することができる。
本発明の別の態様は、化粧または治療剤としての、上で定義される少なくとも１つの低分子ＲＮＡの使用に関する。好ましくは、前記低分子ＲＮＡは、病原性細菌により引き起こされる疾患を処置するためまたは細菌感染を予防するために使用される。
一実施形態では、この低分子ＲＮＡは、細菌病原体および他の病原体／寄生生物により引き起こされる疾患の同時予防または処置のために、上に定義される細菌遺伝子および他の非細菌病原体または寄生生物の遺伝子を標的にする。ｉＲＮＡ、ベクター、および形質転換法について上で提唱されるすべての実施形態は、これにより包含されており、繰り返される必要はない。
【００９１】
本発明の別の態様は、病原性細菌により引き起こされる疾患を処置すること、または細菌感染を予防することを意図されている薬物を調製するための、上で定義される少なくとも１つの低分子ＲＮＡ、または前記低分子ＲＮＡを含有する治療組成物（下で開示される）の使用に関する。
一実施形態では、低分子ＲＮＡが上に定義される細菌遺伝子および他の非細菌病原体または寄生生物の遺伝子を標的にする場合、前記薬物は、細菌病原体および他の病原体／寄生生物により引き起こされる疾患を同時に処置するまたは予防することができる。
本発明は、上で定義される有効量の低分子ＲＮＡの使用を含む治療または化粧方法も包含する。
これらの治療／化粧方法では、本発明の低分子ＲＮＡは、液体溶液で、スプレーで、丸薬で、クリームで、または粉末として製剤化することができる。
【００９２】
本発明の低分子ＲＮＡは、低分子ＲＮＡをインビボで効率的に運ぶことが知られているナノ粒子に有利に連結させる／会合させる／融合させることもできる。ｓｉＲＮＡの任意のナノ粒子媒介全身送達は、その毒性が制御されるまたは非存在であればすぐに、動物（ヒトを含む）を処置するのに使用することができる。（４４）に記載されているように、いくつかの系が提唱されており、臨床試験で使用されている。
本発明の低分子ＲＮＡを動物中に全身的に送達するためには、（４４）に開示されているように、本発明の低分子ＲＮＡをナノ粒子系に連結させることも可能である。（４４）の表３に開示されているように、これらは、５０ｎｍ〜５００ｎｍの間に含まれるサイズを有するシリコンベースまたは金属ベースまたは炭素ベースのナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、シクロデキストリン、脂質ベースのナノ粒子、リポソーム、ハイドロゲルまたは半導体ナノ結晶であり得る。この概論で説明されているように、これらの送達系のすべてがｓｉＲＮＡをインビボで効率的に移動させることが証明されている。
脂質ナノ粒子は、最近ＦＤＡによりヒト治療において承認されているので、本明細書では好まれる。
【００９３】
本発明の治療組成物
公衆衛生という文脈では、本発明の低分子ＲＮＡまたは前記低分子ＲＮＡを含む組成物は、種々の手段により（経口的に、局所的に、全身的に等）動物組織に送達することができる。特定の実施形態では、本発明の低分子ＲＮＡは、有害な作用物質から保護するために微粒子、リポソームまたは天然のＥＶ内に埋め込むことができる。本発明の低分子ＲＮＡは、ナノ粒子に連結させることもできる。本発明の低分子ＲＮＡは、ネイキッドｉＲＮＡ分子として直接組成物中に組み込むこともできる。
別の態様では、本発明は、したがって、有効成分として本発明の低分子ＲＮＡを含有する治療組成物に関する。特に、本発明は、少なくとも１つの細菌遺伝子の発現を阻害する、好ましくは、１つの必須もしくは１つの病原性細菌遺伝子のまたは１つの抗生物質耐性細菌遺伝子の発現を阻害する相当量のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含有する治療組成物に関する。
【００９４】
本発明の治療組成物に含有される低分子ＲＮＡは、上で完全に開示されているように、合成でもよく、または前記低分子ＲＮＡを安定的にもしくは一過性に発現する植物、植物組織または植物細胞から得てもよい。
特に、本発明のＤＮＡベクターにより安定的にもしくは一過性に形質転換されたまたは本発明のウイルスベクターに感染された植物、植物組織または植物細胞は低分子ＲＮＡを生成する。
本発明の治療組成物は、このように、目的の低分子ＲＮＡを安定的にもしくは一過性に発現している植物、植物組織もしくは植物細胞の全ＲＮＡ、または全ＲＮＡの精製された低分子ＲＮＡ画分、または新規に合成された低分子ＲＮＡを含んでもよい。
「相当量」とは、本明細書では、下の実施例に記載されているような試験において抗菌効果があることが明らかにされている量を意味する。この量は、好ましくは、効果的な低分子ＲＮＡを発現する全ＲＮＡの１０〜３０ｎｇ／μｌの間に含まれる。
【００９５】
本発明のサイレンシング因子は、スプレーまたはクリームまたは丸薬などの外用組成物に添加することができる。
好ましくは、本発明のサイレンシング因子は、下に開示されるように、有害な作用物質から保護するために微粒子、リポソームもしくは天然のエキソソーム内に埋め込まれる、またはナノ粒子に連結されている。
本発明の治療組成物は、活性抗菌低分子ＲＮＡを含有する細胞（未精製の植物細胞抽出物などの）も含むことができる。一部の細胞抽出物が本発明の少なくとも１つのｉＲＮＡを発現する植物細胞由来である、細胞抽出物の混合物を含む組成物も包含される。他の実施形態では、本発明の治療組成物はいかなる細胞も含有しない。
【００９６】
一実施形態では、本発明の組成物は、個体を細菌感染から保護するため、動物組織に外部から適用される（すなわち、組成物を噴霧することによりまたはローション、ゲル、クリームを前記組織上に塗布することにより）。
本発明の組成物は、細菌と接触し得るいかなる組織上にも塗布することができる。この組織は、好ましくは、皮膚、毛髪、粘膜、爪、腸、創傷、眼等からなる群において選択される。
本発明の治療組成物は、適切なおよび／または環境的に許容できる担体中において製剤化することができる。そのような担体は、処置を受ける個体が許容することができるいかなる材料でも可能である。さらに、担体は、組成物が細菌感染を制御するのに依然として効果的なままであるようなものでなければならない。そのような担体の例は、水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖または他の糖溶液、ハンクス液、ならびに他の水性生理的平衡食塩水、リン酸緩衝液、重炭酸塩緩衝液およびトリス緩衝液を含む。
【００９７】
これらの組成物は、界面活性剤、不活性担体、保存剤、湿潤剤、摂食刺激物質、誘引剤、封入剤、結合剤、乳化剤、色素、ＵＶ保護剤、緩衝剤、流動剤等をさらに含有してもよい。組成物は、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤またはダニ駆除剤などの他の有効成分も含有することができる。これらの薬剤は、製剤の分野で習慣的に用いられる担体、界面活性剤もしくはアジュバンドまたは製品処理および用途を促進する他の成分と組み合わせることができる。適切な担体およびアジュバンドは固体または液体が可能であり、配合技術で通常用いられる物質、例えば、天然のまたは再生ミネラル物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、または結合剤に相当する。
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、液体噴霧可能組成物である。次に、本発明の組成物は、細菌感染を免れるための予防策としてまたは処置として、組織上または衣服上または病原性細菌に接触し得るいかなる材料上にも容易に適用することができる。本発明の組成物は、鼻腔に感染してしまうのを予防するために容易に吸入することもできる。
別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、動物およびヒトが容易に嚥下することができる丸薬として製剤化される。
【００９８】
別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、皮膚または毛髪組織に便利に塗布することができるクリーム、ローション、またはゲルとして製剤化される。
より一般的には、細菌感染が起こるのを予防するために本発明の低分子ＲＮＡ（または低分子ＲＮＡを含むＥＶ）を化粧品に添加することができる。
別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、腸粘膜または他の内部組織に作用するように便利に嚥下することができる丸薬に、例えば、徐放性丸薬として製剤化される。
本発明の低分子ＲＮＡを含む細胞外小胞
好ましい実施形態では、本発明の低分子ＲＮＡまたはその前駆体は、天然の細胞外小胞（ＥＶ）内部にまたはリボヌクレアーゼの作用から保護される人工小胞中に含有される。実際、これらの小胞は処置を受ける動物にとって（特にヒトでは）有毒ではなく、この中に含有される低分子ＲＮＡを効率的に保護することができる。
【００９９】
いくつかの研究が現在公開されており、植物真核生物病原体への低分子ＲＮＡの送達におけるＥＶの重要な保護的役割に光を当てている（１７、１９）。
本発明者らは本明細書において、トランスジェニック植物により分泌されるＥＶを通じて、少なくとも部分的に、植物から細菌への低分子ＲＮＡの送達も起きたことを明らかにしている（図９Ｂ）。
したがって、本発明の組成物は、好ましくは、本発明のトランスジェニック植物により分泌され、本発明の成熟低分子ＲＮＡを含有するＥＶを含有する。
【０１００】
ＥＶが有するサイズ径は不均一である（４５、４６）。ＥＶは、親細胞に由来する細胞質ゾルおよび膜タンパク質を含有する（４５〜４８）。ＥＶは、機能的ｍＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体および成熟ｍｉＲＮＡならびにｓｉＲＮＡも含有する（１７、１９、４９、５０）。
ＥＶの精製は種々の方法で実施することができ、そのうち最も一般的で最も好まれるのは分画超遠心分離である（４５、４６）。
【０１０１】
さらに具体的には、以前記載されている通りに、濾過および分画遠心分離ステップによりＥＶを植物細胞から得ることが可能である（４５、４６）。手短に言えば、葉を、アポプラスト洗浄液を収集するのに使用される古典的な緩衝液（例えば、ｐＨ６  ＭＥＳ緩衝液）を用いて減圧浸潤し、低速でさらに遠心分離する（４６）。最近記載されている通りに、アポプラスト洗浄液を首尾よくさらに収集し、濾過し遠心分離する（４６）。植物ＥＶの集団は、シロイヌナズナではおおよそ５０〜３００ｎｍのサイズ範囲（中央値１５０ｎｍを有する）であるが、アポプラスト液から４０，０００ｇの遠心分離速度で回収することができる（４６）。より小さなＥＶは、シロイヌナズナではおおよそ１０〜２０ｎｍのサイズ範囲であるが、４０，０００ｇの遠心分離速度でアポプラスト液から分画超遠心分離を、続いて前ステップで得られた上澄みに１００，０００ｇでもう１回分画超遠心分離を行使することにより回収することもできる（４６）。植物ＥＶを続いて細菌細胞とのインキュベーションに使用する（インビトロアッセイ）ことができるように、または細菌感染に先立ってまたはその後に、外因的に植物表面に塗布する（植物内アッセイ）ことができるように、植物ＥＶは、専用のカラム（例えば、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ３０Ｋ）を使用して濃縮し、専用の緩衝液に再懸濁することもできる。
【０１０２】
ＥＶを伴わない低分子ＲＮＡを含有するアポプラスト液
本発明の組成物は、本発明のトランスジェニック植物により分泌され、タンパク質と会合していないアポプラストＥＶを伴わない低分子ＲＮＡも含有する場合がある。これらの低分子ＲＮＡ種は、ここでは細胞外遊離低分子ＲＮＡまたは「ｅｆｓＲＮＡ」と呼ばれる。
これらの低分子ＲＮＡ種は、１００，０００ｇ遠心分離速度を伴うアポプラスト液の分画超遠心分離からの上澄み、または４０，０００ｇ、続いて１００，０００ｇ遠心分離速度を伴うアポプラスト液の分画超遠心分離からの上澄みを回収することにより得ることができる。
こうして得られた上澄みは、細菌感染に先立ってまたはその後に、専用の緩衝液で混合するもしくは細菌細胞とのインキュベーションに直接使用する（インビトロアッセイ）、または外因的に植物表面に塗布する（植物内アッセイ）ことができる。
【０１０３】
これらのＥＶ画分は、凍結した形態でまたはフリーズドライもしくは凍結乾燥粉末の形態で有利には保管されるまたは供給され、その元でＥＶ画分はその高い機能性を維持する。
本発明の組合せ製品
本発明の組成物は、他の化合物と同時にまたは連続して適用してもよい。
特に、本発明の組成物は、特に、その組成物が保有するｉＲＮＡが抗生物質耐性遺伝子を標的にする場合には、抗生物質化合物と一緒に適用してもよい。
この場合、本発明の組成物は、別々の容器に、本発明のサイレンシング因子（上で定義される低分子ＲＮＡ）および対応する殺菌性化合物を含む「部品のキット」として供給してもよい。
【０１０４】
さらなる態様では、したがって、本発明は、
ａ）上に開示されるように、１５〜３０塩基対の間に含まれる長さを有し、抗生物質耐性遺伝子を特異的に阻害する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または前記低分子干渉ＲＮＡを含有する治療組成物、ならびに
ｂ）抗生物質化合物
を含有する医薬キットに関する。
本発明は、細菌感染を処置するおよび／または予防するためのそのような医薬キットの、それを必要とする対象における使用ならびにそのような医薬キットを使用する処置方法も目標にする。
【０１０５】
別の態様では、本発明は、
細菌感染を予防するおよび／または処置するための同時、別々のまたは時差使用に、それを必要とする対象において使用するための、
ａ）上に開示されるように、１５〜３０塩基対の間に含まれる長さを有し、抗生物質耐性遺伝子を特異的に阻害する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）、または前記低分子干渉ＲＮＡを含む治療組成物、ならびに
ｂ）抗生物質化合物
を含む組合せ製品に関する。
好ましい実施形態では、前記ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、前記抗生物質化合物の前に、好ましくは１週間前に、さらに好ましくは１日前に投与される。
これらのキットおよび製品では、前記抗生物質耐性遺伝子は、好ましくは、ＶＩＭ−１、ＶＩＭ−２、ＶＩＭ−３、ＶＩＭ−５、ＣａｓＥ、ＯＸＡ−２８、ＯＸＡ−１４、ＯＸＡ−１９、ＯＸＡ−１４５、ＰＥＲ−１、ＴＥＭ−１１６、およびＧＥＳ−９から選択される。
【０１０６】
これらのキットおよび製品では、前記抗生物質化合物は好ましくは、アミノグリコシド、カルバペネム、セフタジジム（第３世代）、セフェピム（第４世代）、セフトビプロール（第５世代）、セフトロザン／タゾバクタム、フルオロキノロン、ピペラシリン／タゾバクタム、チカルシリン／クラブラン酸、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲルダナマイシン（Ｇｅｌｄｅｎａｍｙｃｉｎ）、ハービマイシン、リファキシミン、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セフラジン、セファピリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフォテタン、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、ロラカルベフ、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、モキサラクタム、セフトリアキソン、セファロスポリン、セフェピム、セファロスポリン、セフタロリンフォサミル、セフトビプロール、グリコペプチド、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、ダルババンシン、オリタバンシン、リンコサミド（Ｂｓ）、クリンダマイシン、リンコマイシン、リポペプチド、ダプトマイシン、マクロライド（Ｂｓ）、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、フィダキソマイシン、モノバクタム、アズトレオナム、ニトロフラン、フラゾリドン、ニトロフラントイン（Ｂｓ）、オキサゾリジノン（Ｂｓ）、リネゾリド、ポジゾリド、ラデゾリド、トレゾリド、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリン、ピペラシリン、テモシリン、チカルシリン、ペニシリン組合せ、アモキシシリン／クラブラン酸、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、チカルシリン／クラブラン酸、ポリペプチド、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、キノロン／フルオロキノロン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、スルホンアミド（Ｂｓ）、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド（古語）、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリムスルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、スルホンアミドクリソイジン（古語）、テトラサイクリン（Ｂｓ）、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン、サイクロセリン、エタンブトール（Ｂｓ）、エチオナミド、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、ストレプトマイシン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール（Ｂｓ）、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、チアンフェニコール、チゲサイクリン（Ｂｓ）、チニダゾール、トリメトプリム（Ｂｓ）等から選択される。
【０１０７】
好ましくは、前記対象は、属：ヒト、ハイイロオオカミ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イノシシ、ニワトリ、シチメンチョウ、ハイイロガン、マガモ、ウサギの動物である。前記動物は、有益な細菌の宿主となる健康な動物、または病原性細菌に既に感染している病気の動物であり得る。
さらに好ましくは、前記動物はヒトである。
ヒトは、有益な細菌の宿主となる健康なヒト、または病原性細菌に既に感染している病気のヒトであり得る。
【０１０８】
本発明のスクリーニングシステム
特定の一実施形態では、本発明の方法は、特に機能的ゲノミクスの分野で、実験的研究のためのツールとしても使用することができる。低分子ＲＮＡを用いた細菌遺伝子の下方調節は、実際、線虫のＣ．エレガンスおよびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）についても当技術分野で記載されてきたことに類似するアプローチにおいて遺伝子機能を研究するのに、実際に使用することができる。このアプローチは、インビトロでは培養することができない細菌に対して特に有用である。
特定の細菌遺伝子の標的にされた下方調節または上方調節に基づき、測定可能な表現型をもたらすアッセイは、抗菌剤を特定するための新しいツールを提供する。
【０１０９】
発明者らは、実際に、植物内アッセイに先立って抗菌活性を有する候補低分子ＲＮＡを特定するアッセイをさらに開発した（実験主義者には、後者の方が時間がかかる）。図８Ｃ／Ｄに示されるように、このシステムは、十分に確立されたタバコの葉のアグロバクテリウム媒介一過性形質転換を使用する低分子ＲＮＡの一過性発現に頼ることができる。このシステムに続いて、細菌細胞との対応する候補ｓｉＲＮＡのインキュベーションを行うことができる（細菌細胞に近接して植物組織／抽出物の存在下で、または病原性因子の発現の引き金を引くことが知られている、宿主環境を模倣する最少培地などのインビトロ培地で）。
【０１１０】
別の態様では、本発明は、抗菌活性を有する機能的ｉＲＮＡの迅速で信頼性があり対費用効果の高い特定を可能にするインビトロスクリーニング法であって、
ａ）そのコグネートｓｉＲＮＡが少なくとも１つの細菌遺伝子を阻害する少なくとも１つの長いｄｓＲＮＡを植物細胞において発現させるステップ、
ｂ）前記植物細胞を溶解緩衝液に接触させるステップ、
ｃ）前記植物細胞ライセートまたはそのＲＮＡ抽出物を、細菌細胞と一緒にインキュベートするステップ、および
ｄ）前記細菌細胞の生存能、成長、代謝活性を評価するステップ
を含む方法に関する。
【０１１１】
ステップｄ）は、前記細菌細胞のレポーター（例えば、細菌複製の、一般的ストレス応答、細胞分裂等のレポーター）の発現／活性、代謝活性（例えば、細菌呼吸活性、酸化還元バランス指標および生存能をモニターするのに一般的に使用されている蛍光マーカーレサズリンの外因性送達）、成長（例えば、染色体に組み込まれるまたはプラスミドからコードされる構成的プロモーターにより駆動される蛍光レポーターの発現）、低分子ＲＮＡにより標的遺伝子の発現（例えば、標的遺伝子または遺伝子のうち低分子ＲＮＡにより標的にされる領域に融合されたレポーター遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ分析、ウェスタンブロット分析、発現）を評価することにより、実施することができる。
抗菌性低分子ＲＮＡの安定的なまたは一過性の発現は、上に開示される通りに使用することができる。一過性発現では、前記植物細胞は、好ましくは、アグロバクテリウム媒介一過性形質転換を通じて外因性構築物で容易に、効率的に形質転換することができるタバコの葉細胞である。ｉＲＮＡの生成、ベクター、宿主細胞、標的遺伝子、細菌および形質転換技法について上で提唱されたすべての実施形態はこれにより包含され、繰り返される必要はない。
【０１１２】
分泌された分子およびＥＶ（効果的な低分子ＲＮＡを伴って）を含有する植物細胞のアポプラスト液を使用して、ステップｂ）において細菌細胞に接触させることも可能である。アポプラスト液は、当業者が一般に使用している減圧浸潤および遠心分離などの従来の任意の手段により回収することができる。ＥＶの濃縮は、専用のカラム（例えば、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ３０Ｋ）を製造業者の説明書に従って使用して、さらに実施することも可能である。
本発明の方法は、前記アポプラスト液または前記低分子ＲＮＡと一緒にインキュベートした細菌細胞の生存能、成長、代謝もしくは遺伝子レポーター活性を、同じ細菌細胞の、しかし、アポプラスト洗浄液も前記低分子ＲＮＡも存在しない下での、または、優先的に、対照低分子ＲＮＡを発現する植物由来のアポプラスト洗浄液もしくは本発明で使用した赤カビ病由来の真菌遺伝子ＣＹＰ５１などの無関係な遺伝子を標的にする対照低分子ＲＮＡの存在下での、生存能、成長、代謝もしくは遺伝子レポーター活性と比較する最終ステップｅ）を含有してもよい。
【０１１３】
将来的にはこのスクリーニングシステムを利用して、治療組成物または薬剤中に組み込むことができる効率的な抗菌性低分子ＲＮＡを選択し、最終的に生成することになると予想される。
本発明者らは、細菌遺伝子を標的にする二本鎖低分子ＲＮＡの迅速なインビトロ合成を使用することにより、低分子ＲＮＡの植物生産とは関係のないシステムも開発した（図１０）。概念証明実験として、発明者らは、インビトロで合成された抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡが、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬトランスジェニック植物由来の全ＲＮＡと同じ程度に、細菌遺伝子サイレンシングならびにＰｔｏ  ＤＣ３０００誘導気孔再開の抑制の引き金を引くことを実証した（図１０Ｂ／Ｃ、図６Ａ）。さらに、発明者らは、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００  ＦｕｓＡおよびＧｙｒＢ遺伝子に向けられたインビトロ合成ｓｉＲＮＡが強い殺菌効果を有し、それによってインビトロ条件でＰｔｏ  ＤＣ３０００の成長を妨げることを示した（図１０Ｄ／Ｅ）。さらに、同じ方法論を使用して、発明者らは、緑膿菌ＳｅｃＥ、ＧｙｒＢおよびＤｎａＮ遺伝子に向けられたインビトロ合成ｓｉＲＮＡが、インビトロ条件で緑膿菌の成長の低下の引き金も引くことを示した（図１２）。
【０１１４】
したがって、発明者らは、ヒト病原性細菌細胞の増殖に影響を及ぼす候補遺伝子を特定するインビトロ方法であって、
ａ）少なくとも１つの細菌遺伝子の発現を阻害する低分子ＲＮＡを生成するステップ、
ｂ）前記低分子ＲＮＡを細菌細胞と一緒にインキュベートするステップ、および
ｃ）上で開示されるように、前記細菌細胞の生存能、成長、代謝活性を評価するステップ
を含む方法を提唱する。
【０１１５】
特に、本発明は、細菌抗生物質耐性に関与する候補遺伝子を特定するインビトロ方法であって、
ａ）細菌細胞を、１５〜３０塩基対の間に含まれる長さを有し、少なくとも１つの細菌遺伝子を特異的に阻害する低分子ＲＮＡと一緒にインキュベートするステップ、
ｂ）前記低分子ＲＮＡ処理細菌細胞を抗生物質化合物と一緒にインキュベートするステップ、
ｃ）抗生物質化合物の存在下での前記低分子ＲＮＡ処理細菌細胞の生存能、成長、代謝活性を評価し、抗生物質化合物の非存在下での前記低分子ＲＮＡ処理細菌細胞の生存能、成長、代謝活性と比較するステップ
を含む方法に関する。
好ましい実施形態では、前記候補遺伝子は、抗生物質化合物の存在下での前記低分子ＲＮＡ処理細菌細胞の生存能、成長、代謝活性が、抗生物質化合物の非存在下での前記低分子ＲＮＡ処理細菌細胞の生存能、成長、代謝活性よりも低い場合は、細菌抗生物質耐性に関与している。
【０１１６】
上の構成に加えて、本発明は、以下の説明から生じる別の構成も含み、この説明は、添付の図面および配列表を参照しての本発明の主題の例示的実施形態を指す。
【表１】
2021534817.tif 000002
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【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】未処理と細菌曝露条件の両方で逆方向反復ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬを発現するシロイヌナズナトランスジェニック植物の表現型および分子特徴付け
【図１Ａ】Ｐｔｏ  ＤＣ３０００遺伝子Ｃｆａ６およびＨｒｐＬの概略図である。Ｃｆａ６（１〜２５０ｎｔ）およびＨｒｐＬ（９９〜３４８ｎｔ）遺伝子の２５０ｂｐ領域を使用して、構成的３５Ｓプロモーターの制御下のキメラヘアピン構築物を生成した。
【図１Ｂ】３５Ｓpro：ＩＲ−ＣＹＰ５１（対照ベクター：ＣＶ）または３５Ｓpro：ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ構築物を発現する樹齢５週間Ｃｏｌ−０植物のおよび独立ホモ接合トランスジェニック植物の代表的写真である。
【図１Ｃ】Ｂに描かれているシロイズナズナ植物の低分子量ノーザンブロット分析により検出された抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡの蓄積レベルを示す図である。Ｕ６はローディング対照として使用した。
【図１Ｄ】Ｐｔｏ  ＤＣ３０００  ＨｒｐＬ  ｍＲＮＡ蓄積は、Ｃｏｌ−０およびＣＶ感染植物と比べてＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ感染植物では有意に減少している。Ｂに描かれているシロイズナズナ植物にＰｔｏ  ＤＣ３０００  ＷＴ株を浸漬接種し、感染後（ｄｐｉ）３日目にＰｒｏＣ、Ｃｆａ６およびＨｒｐＬの細菌転写物レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によりモニターした。これらのｍＲＮＡレベルは、細菌ＧｙｒＡ転写物のレベルと比べて定量化する。エラーバーは、３つの独立した実験で得られたｍＲＮＡ値の標準偏差を示している。統計的有意差はＡＮＯＶＡ検定を使用して評価した（ｎｓ：ｐ値＞０．０５；*：ｐ値＜０．０５、**：ｐ値＜０．０１、***：ｐ値＜０．００１）。
【図２】未処理と細菌曝露条件の両方で逆方向反復ＩＲ−ＬｕｘＡ／ＬｕｘＢを発現するシロイヌナズナトランスジェニック植物の表現型および分子特徴付け
【図２Ａ】Ｐｔｏ  ＤＣ３０００ＷＴゲノム中に挿入されたＬｕｘＣＤＡＢＥオペロンの概略図である。ｌｕｘＡ（１〜２５０ｎｔ）およびｌｕｘＢ（１〜２５０ｎｔ）遺伝子の２５０ｂｐ領域を使用して、構成的３５Ｓプロモーターの制御下のキメラヘアピン構築物を生成した。
【図２Ｂ】シロイヌナズナトランスジェニック植物の低分子量ノーザンブロット分析により検出された抗ＩＲ−ＬｕｘＡ／ＬｕｘＢの蓄積レベルを示す図である。Ｕ６はローディング対照として使用した。
【図２Ｃ】感染すると、Ｃｏｌ−０と比べてＩＲ−ＬｕｘＡ／ＬｕｘＢを発現するトランスジェニック系統においてＰｔｏ  ＤＣ３０００ルシフェラーゼ（Ｐｔｏ  Ｌｕｃ）の発光に対する有意な影響が観察された。ＩＲ−ＬｕｘＡ／ＬｕｘＢ＃１８および＃２０の２つの独立したトランスジェニック系統は、Ｃｏｌ−０と共に、１０6ｃｆｕ／ｍｌの濃度でＰｔｏ  Ｌｕｃを注射器浸潤し、発光は浸潤２４時間後に測定した。
【図２Ｄ】Ｐｔｏ  ＤＣ３０００の植物内成長は、Ｃｏｌ−０植物と比べてＩＲ−ＬｕｘＡ／ＬｕｘＢトランスジェニック植物では変更されない。Ｃで使用した植物由来の葉ディスクは粉砕し、連続希釈で蒔いて、感染２４時間後に条件ごとにＰｔｏ  Ｌｕｃを計数した。
【図３】ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ構築物を発現するシロイヌナズナトランスジェニック植物はＰｔｏ  ＤＣ３０００誘導気孔再開を抑制する
【図３Ａ】Ｐｔｏ△ｃｆａ６および△ｈｒｐＬ株は気孔を再開するその能力を損なわれたが、△ｈｒｃＣ株は損なわれず、これらの表現型は外因性ＣＯＲを添加すると救済された。Ｃｏｌ−０植物の皮を剥がされていない葉の部分は偽溶液（水）またはＰｔｏ  ＤＣ３０００  ＷＴ、△ｃｆａ６、△ｈｒｐＬもしくは△ｈｒｃＣ株と一緒に、３時間インキュベートした。気孔開度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して幅および長さを測定することにより評価した。
【図３Ｂ】Ｐｔｏ  ＤＣ３０００  ＷＴは、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬヘアピンを過剰発現するシロイヌナズナトランスジェニック系統においてもはや気孔再開を誘導しなかった。気孔開度測定は、Ａに記載されるＰｔｏ  ＷＴ株を感染させたＣｏｌ−０および３５Ｓpro：ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４、＃５、＃１０トランスジェニック系統で行った。
【図３Ｃ】Ｐｔｏ  ＤＣ３０００誘導気孔再開応答は、Ｃｏｌ−０植物と比べてＣＶでは変更されなかった。気孔開度測定は、Ａに記載されるＰｔｏ  ＷＴ株を感染させたＣｏｌ−０およびＣＶ植物で行った。注記：これらの実験すべてについて、ｎ＝条件あたり分析された気孔の数であり、統計的有意性はＡＮＯＶＡ検定を使用して評価した（ｎｓ：ｐ値＞０．０５；****：ｐ値＜０．０００１）
【図４】ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ構築物を発現するシロイヌナズナトランスジェニック植物は成葉においてＰｔｏ  ＤＣ３０００の維管束伸展および成長の減少を示す
【図４Ａ】ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４、＃５、＃１０感染植物は、Ｃｏｌ−０およびＣＶ感染植物と比べてＰｔｏ  ＷＴの維管束伸展の減少を示す。植物は中央脈にＰｔｏ  ＷＴ−ＧＦＰを傷接種し、Ｃｏｌ−０はＰｔｏ△ｃｆａ６−ＧＦＰを傷接種した。ＧＦＰ蛍光シグナルはＵＶ光下で観測し、写真は感染３日後（ｄｐｉ）に撮った。接種部位からの細菌の伝播に指標を付けるため、ＧＦＰ蛍光はＵＶ光下で観測した。細菌が３つの接種部位のいずれかから遠くまで伝播すると、それに最も高い伝播指標に応じて４の伝播として指標を付けた。３つの生物学的複製物由来の写真を考慮に入れた。
【図４Ｂ】Ａで使用された条件の感染葉の代表的な写真である。白い円は、葉中央脈での傷接種の部位を示している。
【図４Ｃ】ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４、＃５および＃１０トランスジェニック系統は、Ｃｏｌ−０およびＣＶ感染植物と比べた場合、Ｐｔｏ  ＷＴ力価の有意な減少を示している。Ｃｏｌ−０、ＣＶならびにＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４、＃５および＃１０植物はＰｔｏ  ＷＴを浸漬接種し、Ｃｏｌ−０植物はＰｔｏ△ｃｆａ６−ＧＦＰ株を浸漬接種した。細菌力価は感染２日後（ｄｐｉ）にモニターした。条件あたりの３つの植物由来のおよび３つの独立した実験（ｎ）由来の４つの葉は比較分析のために検討した。
【図４Ｄ】ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４、＃５および＃１０トランスジェニック植物は、Ｃｏｌ−０およびＣＶ植物と比べて、水浸漬症状の減少を示す。水浸漬症状の代表的な葉写真は浸漬接種２４時間後に撮った。注記：上の実験すべてについて、統計的有意差は双方向ＡＮＯＶＡ検定を使用して評価した（ｎｓ：ｐ値＞０．０５；*：ｐ値＜０．０５；**：ｐ値＜０．０１；***：ｐ値＜０．００１；****ｐ値＜０．０００１）。
【図５】未処理とザントモナス・カンペストリス  ｐｖ.カンペストリス曝露条件の両方で逆方向反復ＩＲ−ＨＲＰＧ／ＨＲＰＸ／ＲＳＭＡを発現するシロイヌナズナトランスジェニック植物の表現型特徴付け
【図５Ａ】ＩＲ−ＨＲＰＧ／ＨＲＰＸ／ＲＳＭＡ  ＃１および＃６感染植物は、Ｃｏｌ−０感染植物と比べて病原性Ｘｃｃ△ＸｏｐＡＣ（ＧＵＳ／ＧＦＰ）株の維管束伸展の低減を示す。植物は中央脈にＸｃｃ△ＸｏｐＡＣ（ＧＵＳ／ＧＦＰ）をＯＤ＝０．０１で傷接種した。ＧＦＰ蛍光シグナルは、ＵＶ光下で観察され、写真は感染後３日目（ｄｐｉ）に撮った。指標付けは４Ａに記載される通りに行った。
【図５Ｂ】Ｂで使用される条件の感染した葉の代表的な写真である。白い円は、葉中央脈での傷接種の部位を示している。
【図６】ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬトランスジェニック植物由来の外因的に送達される全ＲＮＡは、野生型シロイヌナズナおよびトマト葉の表面に塗布されるとＰｔｏ  ＤＣ３０００病原性を低減する
【図６Ａ】ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４植物由来の全ＲＮＡ抽出物が、Ｃｆａ６とＨｒｐＬ遺伝子両方のサイレンシングの引き金を引くことを示しているインビトロＡＧＳアッセイのグラフである。Ｐｔｏ  ＷＴ細胞をＣＶまたはＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４植物由来の２０ｎｇ／μｌの全ＲＮＡと一緒にインビトロで４および８時間インキュベートした。両時点でＲＴ−ｑＰＣＲにより細菌転写物Ｃｆａ６およびＨｒｐＬの有意な低減が観察され、ＰｒｏＣおよびＲｐｏＢ転写物の蓄積は影響を受けないままであった。細菌転写物の蓄積を定量化するためＧｙｒＡを内部標準として使用した。エラーバーは、３つの独立した実験からの値の標準偏差を示す。
【図６Ｂ】Ｐｔｏ  ＷＴが気孔を再開する能力は、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物由来の全ＲＮＡ抽出物を外因性適用すると、ＣＶ植物と比べて変更された。Ｃｏｌ−０葉は、水またはＣＶもしくはＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４植物から抽出した２０ｎｇ／μｌの全ＲＮＡを用いて１時間処理し、Ｐｔｏ  ＷＴと一緒に３時間インキュベートした。図３Ａに記載される通りに、気孔開度を測定し分析した。
【図６Ｃ】ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ全ＲＮＡを用いた処理では、ＣＶ全ＲＮＡを用いた前処理と比べた場合、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００が葉のアポプラストにおいて増殖する能力は損なわれたが、ＣＶ全ＲＮＡを用いた処理では損なわれなかった。Ｃｏｌ−０葉を、ＣＶまたはＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４植物由来の２０ｎｇ／μｌの全ＲＮＡを用いて１時間処理し、続いてＰｔｏ  ＷＴを用いて浸漬接種した。細菌力価は２ｄｐｉでモニターした。葉の数（ｎ）は３つの独立した実験からの、合わせた値に一致する。
【図６Ｄ】ＣＶ全ＲＮＡを用いて処理した葉は、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４全ＲＮＡを用いて処理した葉と比べた場合、より壊死性の症状を示した。実験はＣの場合と同じように行ったが、樹齢５週間のトマト（ソラヌム・リコペルシクム「ドル箱」）植物を使用した。２つの条件での感染した葉の代表的な写真が描かれている。
【図６Ｅ】ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４対ＣＶ植物由来の全ＲＮＡ抽出物を用いて処理されたトマト葉においてＰｔｏ  ＤＣ３０００−ＧＦＰ増殖巣の数の低減が観察された。感染した葉はＵＶ光下３ｄｐｉで観察して、ＧＦＰ部位の数を見積もった。左側では：葉あたり少なくとも４枚の写真を用いて、条件あたり３〜４の異なる葉からＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析したＧＦＰ部位の数を表すドットプロット。分析に使用した値は、２つの異なる独立した実験由来である。比較分析ではスチューデントｔ検定を実施した。右側では：Ｄに記載されるトマト葉の代表的な写真。
【図６Ｆ】Ｐｔｏ  ＷＴ−ＧＦＰ  ＤＮＡ含有量は、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４対ＣＶ植物由来の全ＲＮＡ抽出物を用いて処理したトマト葉において減少している。細菌ＤＮＡ含有量のレベルは、対照としてトマトユビキチンを使用してｑＰＣＲにより分析した。比較分析ではスチューデントｔ検定を実施した。注記：Ａ、ＢおよびＣでは、統計的有意差はＡＮＯＶＡ検定を使用して評価した（ｎｓ：ｐ値＞０．０５；**：ｐ値＜０．０１；***：ｐ値＜０．００１）。
【図７】ＤＣＬ依存性抗菌性ｓｉＲＮＡは、ＡＧＳのおよび気孔再開の抑制の原因であるＲＮＡ実体であるが、対応する非プロセス型のｄｓＲＮＡ前駆体はそうではない
【図７Ａ】上パネル：Ｃｏｌ−０、ｄｃｌ２−１  ｄｃｌ３−１  ｄｃｌ４−２（ｄｃｌ２３４）、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４（＃４）におけるＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ転写物およびｄｃｌ２３４変異バックグラウンドにおけるＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４（＃４×ｄｃｌ２３４）の蓄積レベルをＲＴ−ｑＰＣＲにより実施した。ユビキチンは対照として使用した。グラフは、３つの独立した実験の平均および標準偏差を表している。下パネル：抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡの蓄積レベルは、同じ遺伝子型において低分子量ノーザンブロット分析により実施した。Ｕ６はローディング対照として使用した。
【図７Ｂ】＃４×ｄｃｌ２３４植物由来の全ＲＮＡ抽出物は、Ｃｆａ６およびＨｒｐＬの転写物蓄積レベルを変更しない。Ｐｔｏ  ＷＴ細胞は、Ａに記載される同じ遺伝子型から抽出された２０ｎｇ／μｌの全ＲＮＡと一緒に８時間インビトロでインキュベートした。Ｃｆａ６およびＨｒｐＬ転写物の蓄積レベルは、対照としてＧｙｒＡを使用してＲＴ−ｑＰＣＲ分析により評価した。エラーバーは、３つの独立した実験からの値の標準偏差を示す。統計的有意差はＡＮＯＶＡ検定を使用して評価した（ｎｓ：ｐ値＞０．０５；*：ｐ値＜０．０５；**：ｐ値＜０．０１）。
【図７Ｃ】＃４×ｄｃｌ２３４植物由来の全ＲＮＡ抽出物は、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００誘導気孔再開応答を抑制しない。Ｃｏｌ−０葉は、水またはＡで使用した遺伝子型と同じ遺伝子型由来の２０ｎｇ／μｌの全ＲＮＡ抽出物を用いて１時間処理し、Ｐｔｏ  ＷＴと一緒に３時間インキュベートした。図２Ａに記載される通りに、気孔開度を測定し分析した。２つの他の生物学的複製物は補足の図４Ｂに提供されている。
【図７Ｄ】上パネル：ＲＮＡ  Ｎａｎｏチップを備えたアジレントＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００を用いて決定されるＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４植物由来の全、長いおよび低分子ＲＮＡのＲＮＡサイズ分布を表す電位図プロファイルを示す図である。低分子量ＲＮＡ画分は試料ごとに取り囲まれている。１８Ｓおよび２５Ｓリボソームピークは強調されている。下パネル：Ａで使用される臭化エチジウムで染色された全、長いおよび低分子ＲＮＡのアガロースゲル写真。
【図７Ｅ】ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物由来の低分子ＲＮＡ種は、全ＲＮＡ抽出物と同じ程度に気孔再開を抑制するが、対応する長いＲＮＡ種は抑制しない。実験はＤの場合と同じように行ったが、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４植物の全ＲＮＡから分離された、全、長い（＞２００ｎｔ）または低分子（＜２００ｎｔ）ＲＮＡ画分を用いた。注記：気孔実験すべてについて、統計的有意差はＡＮＯＶＡ検定を使用して評価した（ｎｓ：ｐ値＞０．０５；****：ｐ値＜０．０００１）。
【図８】細菌で発現されるＨｒｐＬの低分子ＲＮＡ許容性バージョンは抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡにより指示される遺伝子サイレンシングに不応性であり、抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡの外因性適用により正常な気孔再開表現型を示す
【図８Ａ】構成的プロモーターＮｐｔＩＩの制御下でそれぞれＷＴ  ＨｒｐＬまたはｍｕｔ  ＨｒｐＬをコードするプラスミドでの形質転換により生み出される相補性株と一緒にＰｔｏ△ｈｒｐＬ株を示す模式図である。
【図８Ｂ】Ｐｔｏ△ｈｒｐＬ  ＷＴ  ＨｒｐＬ株は抗菌ＲＮＡに感受性であるがＰｔｏ△ｈｒｐＬ  ｍｕｔ  ＨｒｐＬはこれらのＲＮＡ実体に不応性であることを示すインビトロＡＧＳアッセイのグラフである。細菌Ｐｔｏ△ｈｒｐＬ  ＷＴ  ＨｒｐＬおよびＰｔｏ△ｈｒｐＬ  ｍｕｔ  ＨｒｐＬ株を、ＣＶまたはＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４植物から抽出した全ＲＮＡと一緒に８時間インキュベートした。ＷＴ  ＨｒｐＬおよびｍｕｔ  ＨｒｐＬ転写物の蓄積レベルはＲＴ−ｑＰＣＲにより分析した（ｍＲＮＡレベルはＧｙｒＡ転写物のレベルと関連していた）。エラーバーは、３つの独立した実験からの値の標準偏差を示す。統計的有意差はＡＮＯＶＡ検定を使用して評価した（ｎｓ：ｐ値＞０．０５；*：ｐ値＜０．０５；**：ｐ値＜０．０１）。
【図８Ｃ】抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡの蓄積は、３５Ｓpro：ＩＲ−ＨＲＰＬ、３５Ｓpro：ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬを一過性に発現するＮ．ベンサミアナ植物由来のおよび非形質転換Ｎ．ベンサミアナ葉（Ｎｂ）由来の全ＲＮＡ抽出物を使用して低分子量ノーザン分析により評価した。Ｕ６はローディング対照として使用した。
【図８Ｄ】Ｐｔｏ△ｈｒｐＬ  ｍｕｔ  ＨｒｐＬ株は抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡ作用に不応性である。Ｃｏｌ−０葉は、Ｎ．ベンサミアナ単独からまたは逆方向反復ＩＲ−ＨＲＰＬを発現するＮ．ベンサミアナから抽出した全ＲＮＡを用いて処理した。気泡再開応答は以前記載した通りに評価した。注記：気孔実験すべてについて、統計的有意差はＡＮＯＶＡ検定を使用して評価した（ｎｓ：ｐ値＞０．０５；****：ｐ値＜０．０００１）。
【図９】ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物のアポプラスト液は、ＥＶに埋め込まれ、小球菌ヌクレアーゼ作用から保護されている、または遊離した形態であり球菌ヌクレアーゼ消化に感受性である機能的抗菌性ｓｉＲＮＡで構成されている
【図９Ａ】Ｐｔｏ  ＷＴが気孔を再開する能力も、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物由来の全ＲＮＡと比べた場合、アポプラスト液（ＡＰＦ）抽出物の外因性適用により類似するレベルまで変更された。ＣＶ植物から抽出された全ＲＮＡおよびＡＰＦは負の対照として使用した。Ｃｏｌ−０葉は、水（偽）またはＣＶもしくはＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４植物から抽出された２０ｎｇ／μｌの全ＲＮＡもしくは５００μｌのＡＰＦを用いて１時間処理し、Ｐｔｏ  ＷＴと一緒に３時間インキュベートした。気孔開度は、以前の実験に記載される通りに測定し分析した。
【図９Ｂ】２つの異なる小胞画分、Ｐ４０およびＰ１００、ならびに上澄み（ＳＮ）に存在する遊離のＲＮＡ集団は抗菌性ｓｉＲＮＡを保有しており、したがって、ＡＧＳに関与している。ＣＶとＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４植物の両方から抽出されたアポプラスト液は、４０，０００ｇで超遠心分離にかけてＥＶの大きい方の集団（ｐ４０）をペレット化し、残りの上澄みは１００，０００ｇでさらに超遠心分離にかけて、小さい方のＥＶ（Ｐ１００）をペレット化した。ＳＮも回復された。Ｃｏｌ−０葉は、水（偽）またはＣＶもしくはＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４植物から抽出されたＰ４０、Ｐ１００およびＳＮを用いて１時間処理し、Ｐｔｏ  ＷＴと一緒に３時間インキュベートした。＃４のＰ４０、Ｐ１００およびＳＮは２０ユニットのＭｎａｓｅを用いて処理し、＃４のＳＮも２０ユニットのプロテイナーゼＫで処理した。気孔開度は、以前の実験に記載される通りに測定し分析した。注記：気孔実験すべてについて、統計的有意差はＡＮＯＶＡ検定を使用して評価した（ｎｓ：ｐ値＞０．０５；****：ｐ値＜０．０００１）。
【図１０】インビトロ合成抗菌性ｓｉＲＮＡの外因性送達はＰｔｏ  ＤＣ３０００の病原性ならびに生存能を低減する
【図１０Ａ】ＩＲ−ＣＹＰ５１およびＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬに対応する、臭化エチジウム染色した、インビトロ合成された長いｄｓＲＮＡおよびＲＮａｓｅ  ＩＩＩ消化ｓｉＲＮＡの２％アガロースゲルが描かれている。
【図１０Ｂ】Ｐｔｏ  ＷＴが気孔を再開する能力は、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬに対応する、インビトロ合成ｓｉＲＮＡの外因性適用により変更されたが、長いｄｓＲＮＡは変更しなかった。ＩＲ−ＣＹＰ５１由来の長いｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは負の対照として使用した。Ｃｏｌ−０葉は、水（偽）またはＡに提示されるＲＮＡを用いて１時間処理し、次にＰｔｏ  ＷＴと一緒に３時間インキュベートした。気孔開度は、以前の実験に記載される通りに測定し分析した。
【図１０Ｃ】ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ由来のインビトロ合成ｓｉＲＮＡを使用するインビトロＡＧＳアッセイでは、Ｃｆａ６とＨｒｐＬ遺伝子の両方のサイレンシングの引き金が引かれる。Ｐｔｏ  ＷＴ細胞は、ＩＲ−ＣＹＰ５１またはＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４植物由来の２ｎｇ／μｌのインビトロ合成ｓｉＲＮＡと一緒にインビトロで８時間インキュベートした。細菌転写物Ｃｆａ６およびＨｒｐＬの有意な低減がＲＴ−ｑＰＣＲにより観察され、ＰｒｏＣおよびＲｐｏＢ転写物の蓄積は影響を受けないままであった。ＧｙｒＡは内部標準として使用して、細菌転写物の蓄積を定量化した。エラーバーは３つの独立した実験からの値の標準偏差を示す。
【図１０Ｄ】Ｐｔｏ  ＤＣ３０００のｆｕｓＡまたはｇｙｒＢに対するインビトロ合成ｓｉＲＮＡは、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００−ＧＦＰ株の成長に有意な影響を及ぼす。Ｐｔｏ  ＤＣ３０００のｓｅｃＥ、ｇｙｒＢおよびｆｕｓＡ遺伝子に向けられたｓｉＲＮＡは、インビトロ転写、続いてＲＮａｓｅＩＩＩ消化を使用して合成した。Ｐｔｏ  ＤＣ３０００−ＧＦＰ株は指示濃度のインビトロ合成ｓｉＲＮＡと一緒にインキュベートした。液滴ベースのマイクロ流体システム（Ｍｉｌｌｉｄｒｏｐ）により試料が液滴として分画されるように９６ウェルプレートを器械にセットした。ウェルごとに、それぞれ約５００ｎｌの１０液滴を形成し、装置の内部でインキュベートした。液滴ごとに、バイオマスのおよびＧＦＰ蛍光の測定値を約３０分ごとに獲得した。
【図１０Ｅ】Ｐｔｏ  ＤＣ３０００のｆｕｓＡまたはｇｙｒＢに対するインビトロ合成ｓｉＲＮＡは、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００−ＧＦＰ株の成長に有意な影響を及ぼす。Ｐｔｏ  ＤＣ３０００のｓｅｃＥ、ｇｙｒＢおよびｆｕｓＡ遺伝子に向けられたｓｉＲＮＡは、インビトロ転写、続いてＲＮａｓｅＩＩＩ消化を使用して合成した。Ｐｔｏ  ＤＣ３０００−ＧＦＰ株は指示濃度のインビトロ合成ｓｉＲＮＡと一緒にインキュベートした。液滴ベースのマイクロ流体システム（Ｍｉｌｌｉｄｒｏｐ）により試料が液滴として分画されるように９６ウェルプレートを器械にセットした。ウェルごとに、それぞれ約５００ｎｌの１０液滴を形成し、装置の内部でインキュベートした。液滴ごとに、バイオマスのおよびＧＦＰ蛍光の測定値を約３０分ごとに獲得した。
【図１１】ヒト病原性細菌緑膿菌ＰＡＫ株に対する外因性送達植物由来低分子ＲＮＡの影響
【図１１Ａ】植物由来全ＲＮＡ抽出物と一緒にインキュベートした緑膿菌ＰＡＫルシフェラーゼ（ｌｕｘタグ付きＰＡＫ）株の発光の経時的（分）定量化が描かれている。濃度１０8ｃｆｕ  ｍｌ-1のｌｕｘタグ付きＰＡＫ株を水（偽）またはＩＲ−ＧＦ／ＦＧ（負の対照）もしくはＩＲ−ＬｕｘＡ／ＬｕｘＢ（ＩＲ−ＬｕｘＡＢ）を発現するＮ．ベンサミアナ非形質転換葉（ＮＢ）もしくはＮ．ベンサミアナ葉から抽出した特定の全ＲＮＡの２０ｎｇ／μｌと一緒にインキュベートし、発光はＢｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターを使用して測定した。４つの技術的複製物／条件から４時間にわたって３０分ごとに測定した読取り値の平均をプロットしている。
【図１１Ｂ】Ａでの試料についての４時間時点での細菌数（ＯＤ600）を、プレートリーダーを使用して測定し、ドットプロットにプロットした。
【図１１Ｃ】Ａと同じであるが、ｌｕｘタグ付きＰＡＫ株を、水（偽）またはＩＲ−ＧＦ／ＦＧ（負の対照）、ＩＲ−ＤｎａＡ／ＤｎａＮ／ＧｙｒＢ（ＩＴ１３）もしくはＩＲ−ＲｐｏＣ／ＳｅｃＥ／ＳｏｄＢ（ＩＴ１４）を一過性に発現するＮ．ベンサミアナ非形質転換葉（ＮＢ）もしくはＮ．ベンサミアナ葉から抽出した濃度２０ｎｇ／μｌの特定の全ＲＮＡと一緒にインキュベートすることによって行った。
【図１１Ｄ】Ｂと同じであるが、試料についてはＣに描かれている。注記：ＢおよびＣでは、統計的有意差はＡＮＯＶＡ検定を使用して評価した（ｎｓ：ｐ値＞０．０５；**：ｐ値＜０．００１）。
【図１２】ＳｅｃＥに向けられたインビトロ合成ｓｉＲＮＡは、インビトロ条件で緑膿菌ＰＡＯ１株の成長低下の引き金を引く  インビトロ合成抗菌性ｓｉＲＮＡは、緑膿菌ＰＡＯ１株のいくつかの必須遺伝子に対して試験し、細菌の成長に有意な影響を及ぼすことについてスクリーニングした。緑膿菌のＳｅｃＥ、ＧｙｒＢ、ＤｎａＮ、ＤｎａＡ、ＲｐｏＢまたはＳｏｄＢ遺伝子に向けられるｓｉＲＮＡは、インビトロ転写、続いてＲＮａｓｅＩＩＩ消化を使用して合成した。１０8ｃｆｕ  ｍｌ-1のＰＡＯ１株は、５ｎｇ／μｌ濃度の個々の遺伝子ターゲティングｓｉＲＮＡを用いて処理した。Ｍｉｌｌｉｄｒｏｐアナライザーにより試料が液滴として分画されるように９６ウェルプレートを器械にセットした。ウェルごとに、それぞれ約５００ｎＬの１０液滴を形成し、装置の内部でインキュベートした。液滴ごとに、バイオマスの測定値を１４時間の間約３０分ごとに獲得した。それぞれの時点での３０液滴／条件から獲得した分散シグナルの中央値をプロットする。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１）材料および方法
逆方向反復構築物を保有するトランスジェニック系統の生成
Ｃｆａ６の２５０ｂｐ領域（ヌクレオチド１〜２５０）およびヌクレオチド９９〜３４８のＨｒｐＬの２５０ｂｐ領域（配列番号１、２および３）を標的にする人工ｓｉＲＮＡを生成するためにＩＲ−ＨＲＰＬ／ＣＦＡ６キメラヘアピンを設計した。ＩＲ−ＣＦＡ６−ＡおよびＩＲ−ＣＦＡ６−Ｂは、それぞれヌクレオチド１〜２５０（配列番号４、２および５）およびヌクレオチド１〜４７２（配列番号６、２および７）のＣｆａ６遺伝子を特異的に標的にする２つの独立した逆方向反復である。ＩＲ−ＨＲＰＬ−ＡおよびＩＲ−ＨＲＰＬ−Ｂは、それぞれヌクレオチド９９〜３４８（配列番号８、２および９）およびヌクレオチド１〜３４８（配列番号１０、２および１１）のＨｒｐＬを特異的に標的にする２つの独立した逆方向反復である。ＨｒｃＣ遺伝子を特異的に標的にするＩＲ−ＨＲＣＣヘアピン（配列番号１２、２および１３）ならびにＩＩＩ型エフェクターＡｖｒＰｔｏおよびＡｖｒＰｔｏＢ遺伝子を同時に標的にするＩＲ−ＡｖｒＰｔｏ／ＡｖｒＰｔｏＢ（配列番号１４、２および１５）を設計した。真菌麦類赤カビ病の３つのチトクロムＰ４５０ラノステロールＣ−１４αデメチラーゼ遺伝子、すなわち、ＦｇＣＹＰ５１Ａ、ＦｇＣＹＰ５１ＢおよびＦｇＣＹＰ５１Ｃに対するｓｉＲＮＡを以前実施された通りに生成するためにＩＲ−ＣＹＰ５１ヘアピン（配列番号１６、２および１７）を設計した（１９）。このヘアピンは、本発明のすべての植物内アッセイについて負の対照として使用した。シュードモナス、ザントモナスおよびラルストニアの異なる株由来の病原性因子または必須遺伝子を標的にする追加の逆方向反復を本研究の一部として設計しクローニングした。これらのヘアピンは以下の通りに記載されている：ラルストニア種由来のＨｒｐＧ、ＨｒｐＢおよびＨｒｃＣ遺伝子を同時に標的にするように設計されたＩＲ−ＨｒｐＧ／ＨｒｐＢ／ＨｒｃＣヘアピン（配列番号１８、２および１９）、ラルストニア種由来のＨｒｐＢ、ＨｒｃＣ、ＴｓｓＢおよびＸｐｓＲ遺伝子を同時に標的にするように設計されたＩＲ−ＨｒｐＢ／ＨｒｃＣ／ＴｓｓＢ／ＸｐｓＲヘアピン（配列番号２０、２および２１）、ザントモナス・カンペストリス  ｐｖ.カンペストリス由来のＨｒｐＧ、ＨｒｐＸおよびＲｓｍａ遺伝子を同時に標的にするように設計されたＩＲ−ＨｒｐＧ／ＨｒｐＸ／ＲｓｍＡヘアピン（配列番号２２、２および２３）、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００およびシリンゲ菌株ＣＣ４４０由来の必須遺伝子ＲｐｏＢ、ＲｐｏＣおよびＦｕｓＡを同時に標的にするように設計されたＩＲ−ＲｐｏＢ／ＲｐｏＣ／ＦｕｓＡヘアピン（配列番号２４、２および２５）、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００およびシリンゲ菌株ＣＣ４４０由来の必須遺伝子ＳｅｃＥ、ＲｐｏＡおよびＲｐｌＱを同時に標的にするように設計されたＩＲ−ＳｅｃＥ−ＲｐｏＡ−ＲｐｌＱヘアピン（配列番号２６、２および２７）、ザントモナス・カンペストリス  ｐｖ.カンペストリスを含む異なるザントモナス種由来の必須遺伝子ＮａｄＨｂ、ＮａｄＨｄおよびＮａｄＨｅを同時に標的にするように設計されたＩＲ−ＮａｄＨｂ／ＮａｄＨｄ／ＮａｄＨｅヘアピン（配列番号２８、２および２９）、ザントモナス・カンペストリス  ｐｖ.カンペストリスを含む異なるザントモナス種由来の必須遺伝子ＮａｄＨｂ、ＮａｄＨｄおよびＮａｄＨｅを同時に標的にするように設計されたＩＲ−ＤｎａＡ／ＤｎａＥ１／ＤｎａＥ２ヘアピン（配列番号３０、２および３１）。緑膿菌およびシゲラ菌の異なる株由来の病原性因子または必須遺伝子を標的にする逆方向反復を本研究の一部として設計しクローニングした。これらのヘアピンは以下の通りに記載されている：ＤｎａＡ、ＤｎａＮおよびＧｙｒＢ遺伝子を標的にするＩＴ１３ヘアピン（配列番号１０８〜１０９）、ＲｐｏＣ、ＳｅｃＥおよびＳｏｄＢ遺伝子を標的にするＩＴ１４ヘアピン（配列番号１１０〜１１１）、ＸｃｐＱ、ＰｓｃＦおよびＰｓｃＣ遺伝子を標的にするＩＴ１６ヘアピン（配列番号１１２〜１１３）、緑膿菌のＸｃｐＱ、ＥｘｓＡおよびＨｐｈＡ遺伝子を標的にするＩＴ１８ヘアピン（配列番号１１４〜１１５）、ＦｔｓＡ、ＣａｎおよびＴｓｆ遺伝子を標的にするＩＴ２１ヘアピン（配列番号１１６〜１１７）、ＡｃｃＤ、ＤｅｒおよびＰｓｄ遺伝子を標的にするＩＴ２６ヘアピン（配列番号１１８〜１１９）、およびシゲラ・フレックスネリのＶｉｒＦ、ＶｉｒＢおよびＩｃｓＡ遺伝子を標的にするＩＴ２７ヘアピン（配列番号１２０〜１２１）。さらに、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００において構成的カナマイシンプロモーターの下で染色体的に発現されるフォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）ｌｕｘＣＤＡＢＥオペロンを標的にするキメラ逆方向反復：Ｐｔｏ  ＤＣ３０００ルシフェラーゼ株ならびに緑膿菌ルシフェラーゼ株由来のＬｕｘＡ／ＬｕｘＢ遺伝子を同時に標的にするよう設計されたＩＲ−ＬｕｘＡおよびＬｕｘＢヘアピン（配列番号２４８、２および２４９）を本研究の一部として設計しクローニングした。上記のヘアピンすべてがペチュニアカルコン合成酵素遺伝子ＣＨＳＡ由来の特定のイントロン配列（配列番号２）を含有し、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ構成的プロモーターを保有するベクター中にクローニングした。さらに具体的には、以下のヘアピン配列：ＩＲ−ＨＲＰＬ／ＣＦＡ６、ＩＲ−ＣＹＰ５１、ＩＲ−ＣＦＡ６−Ｂ、ＩＲ−ＨＲＰＬ−Ｂ、ＩＲ−ＨｒｐＧ／ＨｒｐＢ／ＨｒｃＣ、ＩＲ−ＨｒｐＢ／ＨｒｃＣ／ＴｓｓＢ／ＸｐｓＲ、ＩＲ−ＡｖｒＰｔｏ／ＡｖｒＰｔｏＢ、ＩＲ−ＨＲＣＣ、ＩＲ−ＨｒｐＧ／ＨｒｐＸ／ＲｓｍＡおよびＩＲ−ＬｕｘＡ／ＬｕｘＢを、これらの長い逆方向反復のベクター中への挿入を促進する追加のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限部位を保有する改変ｐＤＯＮ２２１−Ｐ５−Ｐ２ベクター中にクローニングした。ヘアピン配列を保有するｐＤＯＮ２２１−Ｐ５−Ｐ２と構成的３５Ｓプロモーター配列を保有するｐＤＯＮ２２１−Ｐ１−Ｐ５ｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２５３７−３２）の間の二重組換えをｐＢ７ＷＧ  ＧＡＴＥＷＡＹ適合性デスティネーションベクター（ＢＡＲ選択マーカーおよびｇａｔｅｗａｙ組換え部位を保有するバイナリーベクター）において行った。残りのヘアピン、すなわち、ＩＲ−ＣＦＡ６−Ａ、ＩＲ−ＨＲＰＬ−Ａ、ＩＲ−ＲｐｏＢ／ＲｐｏＣ／ＦｕｓＡ、ＩＲ−ＳｅｃＥ−ＲｐｏＡ−ＲｐｌＱ、ＩＲ−ＮａｄＨｂ／ＮａｄＨｄ��ＮａｄＨｅおよびＩＲ−ＤｎａＡ／ＤｎａＥ１／ＤｎａＥ２配列は、鋳型として細菌ゲノムＤＮＡを使用して標的遺伝子のセンスおよびアンチセンス領域のＰＣＲ増幅により生成し、続いて最終のＧｒｅｅｎＧａｔｅデスティネーションベクターｐＧＧＺ００３中へのクローニングに必要なモジュールを生成した。次に、すべてのプラスミドはアグロバウテリウム・ツメファシエンス株ＧＶ３１０１またはＣ５８Ｃ１中に導入し、ニコティアナ・ベンサミアナでの一過性発現またはシロイヌナズナコロンビア−０（Ｃｏｌ−０）基準系統での安定的発現のためにさらに使用した。
【０１１９】
植物材料および生育条件
アグロバウテリウム媒介フローラルディップ法を使用してシロイヌナズナＷＴ（系統Ｃｏｌ−０）植物を形質転換することによりＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬおよびＣＶの安定したトランスジェニック系統を生成した。等量の抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡを発現する３つの独立したトランスジェニック系統＃４、＃５および＃１０を選択し、Ｔ４世代まで繁殖させた。同様に、ＣＶの選択されたホモ接合系統は麦類赤カビ病に対するｓｉＲＮＡを豊富なレベルで発現する。ＣＹＰ５１Ａ／Ｂ／Ｃ遺伝子は実験のためにＴ４世代まで繁殖させた。同様に、ＩＲ−ＬｕｘＡ／ＬｕｘＢおよびＩＲ−ＨｒｐＧ／ＨｒｐＸ／ＲｓｍＡを発現するトランスジェニック系統は、ｓｉＲＮＡ生成に基づいて選択し、さらに繁殖させた。遺伝子分析では、ｄｃｌ２  ｄｃｌ３  ｄｃｌ４（ｄｃｌ２３４）三重変異体植物は基準ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４系統と交配させ、Ｆ３植物の遺伝子型を同定して、ホモ接合ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬトランス遺伝子を含有するホモ接合ｄｃｌ２３４変異体を選択した。シロイヌナズナＣｏｌ−０の無菌化種子および選択されたホモ接合トランスジェニック系統は先ず、８時間の光周期で１／２×ＭＳ培地（Ｄｕｃｈｅｆａ）、１％スクロースおよび０．８％寒天（抗生物質選択ありまたはなしで）を含有するプレート上で１２〜１４日間２２℃で生育させた。次に、苗を植木鉢の穴に植え付け、１００μＥ／ｍ２／ｓの光強度下８時間の光周期を用いて２２℃／１９℃で環境制御条件において生育させた。すべての実験について樹齢４〜５週間の植物を使用した。トマト（ソラヌム・リコペルシクム「ドル箱」）およびベンサミアナタバコの種子は植木鉢に直接蒔き、１００μＥ／ｍ２／ｓの光強度下１６時間の光周期を用いて２２℃／１９℃（日中／夜）で環境制御条件において生育させた。すべての実験について樹齢４〜５週間の植物を使用した。
【０１２０】
細菌株
ＧＦＰ発現Ｐｔｏ  ＤＣ３０００−ＧＦＰおよびＰｔｏ  ＤＣ３０００△ｃｆａ６−ＧＦＰ（Ｐｔｏ  ＤＣ３１１８）株はＤｒ．Ｓ．Ｙ．Ｈｅより寄贈され、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００△ｈｒｐＬ株はＤｒ．Ｃａｙｏ  Ｒａｍｏｓから寄贈された。Ｐｔｏ  ＤＣ３０００ルシフェラーゼ株はＤｒ．Ｃｈｒｉｓ  Ｌａｍｂから寄贈された。ＧＦＰレポーター遺伝子を発現するＰｔｏ  ＤＣ３０００△ｈｒｐＬおよびＰｔｏ  ＤＣ３０００△ｈｒｃＣ株は、エレクトロポレーションによりＰｔｏ  ＤＣ３０００−ＧＦＰの場合と同じプラスミドでこれらの株を形質転換することにより生成し、次に、選択のためにゲンタマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有するＮＹＧＢ培地（５ｇ／Ｌのバクトペプトン、３ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｍｌ／Ｌグリセロール）上に２８℃で蒔いた。Ｐｔｏ  ＤＣ３０００−ＷＴ−ＨｒｐＬおよび−ｍｕｔ−ＨｒｐＬ株を生成するため、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００△ｈｒｐＬ株を、エレクトロポレーションによりそれぞれプラスミドＮＰＴＩＩpro：ＷＴ−ＨｒｐＬおよびＮＰＴＩＩpro：ｍｕｔ−ＨｒｐＬで形質転換し、次に、ゲンタマイシンを有するＮＹＧＢ培地に蒔いた。緑膿菌のＰＡＫおよびＰＡＯ１株は、協力している他の研究所から入手した。
【０１２１】
ＲＮＡゲルブロット分析
低分子量ＲＮＡのノーザンブロット分析を実施するため、ＴｒｉＺＯＬ試薬を使用して全ＲＮＡを抽出し、５０％ホルムアミドに安定化させた。特定の条件からの約３０μｇの全ＲＮＡを使用して、以前記載された通りにノーザンブロット分析を実施した（５１）。１５０ｂｐ〜３００ｂｐの領域を、遺伝子特異的プライマーを使用してプラスミドから増幅させ、増幅産物をさらに使用して、ランダムプライミングにより合成された特定の３２Ｐ−放射標識プローブを生成した。Ｕ６プローブは、低分子ＲＮＡの同等ローディングについての対照として使用した。
【０１２２】
長いおよび低分子ＲＮＡ画分の分離
全ＲＮＡは、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を製造業者の説明書に従って使用してＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４のシロイヌナズナ葉から抽出した。１００μｇの全ＲＮＡを使用し、長いおよび低分子ＲＮＡ画分をｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の説明書に従って使用して分離した。全ＲＮＡからの長いおよび低分子ＲＮＡの分離は、アガロースゲル電気泳動を使用して可視化し、マイクロ流体ベースのアプローチ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）を使用してさらに分析した。全、長いおよび低分子ＲＮＡをさらに使用して、気孔再開アッセイを実施した。
【０１２３】
植物での細菌感染アッセイ
（ａ）細菌成長アッセイ：この実験用の植物は特に、生育室において夜周期の開始の３時間後に使用した。細菌を、０．０２％のＳｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７（Ｌｅｈｌｅ  ｓｅｅｄｓ）と一緒に５×１０7ｃｆｕ／ｍｌで使用して、条件あたり３つの植物を浸漬接種した。細菌浸漬した植物は直ちに高湿度の室に置かれて適切な感染を促進した。浸漬接種による水浸漬症状が感染２４時間後に観察され、条件あたり３つの植物由来の葉の写真を撮った。接種２日後、言及した条件ごとの細菌力価を、（５１）に記載される通りに個々の感染葉について測定した。感染植物中の細菌転写物を定量化するため、感染葉試料のプールを接種３日後に収集した。
【０１２４】
（ｂ）傷接種アッセイ：中央脈での細菌の増殖をモニターするため、濃度５×１０6ｃｆｕ／ｍｌのＧＦＰタグ付き細菌に浸した爪楊枝を用いて、条件あたり３つの植物由来の約１５の葉を手作業で接種し、次に植物は高湿度の室に３日間置いた。次に、細菌増殖は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＭＶ  １０×マクロズームを使用してＵＶ光下でＧＦＰシグナルをモニターすることにより分析し、写真はＧＦＰフィルター付きのＣＣＤカメラＡｘｉｏＣａｍ  Ｍｒｃ  Ｚｅｉｓｓで撮った。
【０１２５】
（ｃ）植物保護アッセイ：細菌感染に先立って、条件あたり３つのシロイヌナズナ植物の４枚のロゼット葉を、両方ともＳｉｌｗｅｔｔ  Ｌ−７７（０．０２％）を補充した偽溶液または特定の全ＲＮＡの２０ｎｇ／μｌの濃度でのＲＮＡ溶液に繰り返し浸漬することにより個々に処理した。前処理１時間後、ＲＮＡの場合と類似するやり方で濃度５×１０7ｃｆｕ／ｍｌのＰｔｏ  ＤＣ３０００  ＷＴまたはＰｔｏ  ＤＣ３０００△ｃｆａ６を用いて葉に浸漬接種した。細菌力価は、以前指定された通りに、接種２日後にモニターした。トマトでは、条件あたり３つの植物の２枚の葉を、Ｓｉｌｗｅｔｔ  Ｌ−７７（０．０２％）を補充した２０ｎｇ／μｌの特定の全ＲＮＡを有する懸濁液で前処理し、次に５×１０7ｃｆｕ／ｍｌのＧＦＰタグ付きＰｔｏ  ＤＣ３０００を用いて１時間後に浸漬した。次に、植物は、３日間蓋カバーなしで１６時間光周期を用いて２４℃／１９℃（日中／夜）の制御条件に置いた。次に、細菌感染は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＭＶ  １０×マクロズームを使用してＵＶ光下でＧＦＰシグナルをモニターすることにより分析し、写真を撮った。個々の葉試料を収集してＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してそれぞれの条件での細菌の量を定量化した。
【０１２６】
ｄｓＲＮＡおよびｓＲＮＡのインビトロ合成
ＲＮＡのインビトロ合成は、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡｉキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の使用説明書に従ってもたらされた。類似する鋳型は、配列の５’と３’の両末端にＴ７プロモーターを導入するＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ増幅は、プライマーのアニーリングの特異性を上げるために２つの異なるアニーリング温度を有する２つのステップで行った。増幅ステップ後、ＰＣＲ産物は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）によってゲル抽出により精製し、いかなる寄生虫増殖も排除した。次に、その精製されたＰＣＲ産物は、インビトロ転写用の鋳型として使用し、２μｇを、２μＬのＴ７ポリメラーゼ（Ｔ７酵素Ｍｉｘ）、２μＬの１０×Ｔ７反応緩衝液および２μＬのそれぞれの７５ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰと一緒に３７℃で５時間インキュベートした。全容積はヌクレアーゼフリー水で２０μＬに調整する。転写反応後、ｄｓＲＮＡは２μＬのＤＮａｓｅＩ、２μＬのＲＮａｓｅ、５μＬの１０×反応緩衝液で処理してＤＮＡ鋳型および一本鎖ＲＮＡを除去した。次に、ｄｓＲＮＡはキットと一緒に提供される濾過カートリッジで精製した。このステップで得られる長いｄｓＲＮＡは以下の実験に使用する。ｓｉＲＮＡは、ＳｈｏｒｔＣｕｔ（登録商標）ＲＮａｓｅＩＩＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）により得られた。ｄｓＲＮＡはＲＮａｓｅＩＩＩで２０分間消化し、次に、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により精製した。精製後、ｓｉＲＮＡは以下の実験に使用する。その過程のそれぞれのステップに続いて、ゲル電気泳動（ＴＡＥ  １Ｘ、ＤＮＡ増幅には１％アガロースゲルおよびＲＮＡには２％アガロースゲル）を行い、ＲＮＡの品質を調べた。
【０１２７】
細菌発光定量化
条件ごとの３つの植物に、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００ルシフェラーゼ（Ｐｔｏ  Ｌｕｃ）株を１×１０6ｃｆｕ／ｍｌで注射器浸潤した。植物は高湿度の室に置き、適切な感染を促進した。葉ディスクは、９６ウェルプレートの個々のウェルに置いて、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ  ９６０マイクロプレートルミノメーターを使用して発光を定量化した。植物あたり４枚の葉を検討した。個々の葉由来の葉ディスクはプールして、後に上で言及した細菌力価定量化を実施した。ｌｕｘタグ付きＰＡＫ株を用いた発光定量化アッセイは、特定のＲＮＡ抽出物と一緒にインキュベートされた１×１０7ｃｆｕ／ｍｌの種菌を有するＬＢ培地で実施して、条件あたり４つの個々のウェルにおいて最終濃度の２０ｎｇ／μｌの最終濃度を得た。９６ウェルプレートをＢｅｒｔｈｏｌｄ  Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ  ９６０マイクロプレートルミノメーター上に置き、発光は４時間の間３０分ごとに記録した。
【０１２８】
トマト感染定量化
（ａ）ＧＦＰ部位定量化：Ｐｔｏ  ＤＣ３０００−ＧＦＰ株を感染させたトマト葉を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＭＶ  １０×マクロズームを使用してＵＶ光下でＧＦＰ定量化に供し、写真はＧＦＰフィルター付きのＣＣＤカメラＡｘｉｏＣａｍ  Ｍｒｃ  Ｚｅｉｓｓで撮った。ＧＦＰ部位の数は、条件あたり少なくとも１０写真についてＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化した。
（ｂ）細菌ゲノムＤＮＡ定量化
感染トマト植物において細菌感染を定量化するため（Ross et al., 2006）、細菌ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の量を植物ｇＤＮＡと比べて測定した。ゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ植物ミニキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の説明書に従って使用してＰｔｏ  ＤＣ３０００−ＧＦＰを感染させたトマト葉試料から単離した。１ｎｇのｇＤＮＡを使用して、ｑＰＣＲはＴａｋｙｏｎ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（登録商標））およびＧＦＰ遺伝子特異的プライマーを使用して実施した。細菌ｇＤＮＡの量は、ユビキチン特異的プライマーを使用してトマトのｇＤＮＡの量に規準化した。
【０１２９】
Ｎ．ベンサミアナにおける逆方向反復のアグロバクテリウム媒介一過性発現
単一ヘアピンＩＲ−ＣＦＡ６およびＩＲ−ＨＲＰＬ、ならびにキメラヘアピンＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬを生成するため、プラスミドを保有するＡ．ツメファシエンス株をＬＢ培地で一晩、２８℃で成長させた。細胞は遠心分離で収穫し、１０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．６、１０ｍＭの  ＭｇＣｌ2および２００μＭのアセトシリンゴンを含有する溶液に最終密度０．５  ＯＤ600で再懸濁した。培養物は、樹齢４週間のＮ．ベンサミアナでのアグロバクテリウム媒介浸潤前に暗所、室温で５〜６時間インキュベートした。浸潤の３日後、葉組織を収穫し、ノーザンブロット分析を実施して、抗Ｃｆａ６およびＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡの生成を確認した。次に、葉試料は全ＲＮＡ抽出のために使用した。
【０１３０】
インビトロ抗菌性遺伝子サイレンシングアッセイ
細菌転写物Ｃｆａ６およびＨｒｐＬを、ヘアピンＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬにより生成されるｄｓＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡが直接標的にすることができるかどうかを評価するために、１０7ｃｆｕ／ｍｌのＰｔｏ  ＤＣ３０００  ＷＴ、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００−ＷＴ−ＨｒｐＬおよびＰｔｏ  ＤＣ３０００−ｍｕｔ−ＨｒｐＬの２ｍｌの培養物を、それぞれ６ウェルプレートのＣＶまたはＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４トランスジェニック植物から抽出した２０ｎｇ／μｌの特定の全ＲＮＡを用いて４および／または８時間処理した。同様に、インビトロ合成ｓｉＲＮＡを用いた処理による細菌遺伝子のサイレンシングを定量化するため、１０7ｃｆｕ／ｍｌのＰｔｏ  ＤＣ３０００−ＧＦＰの２ｍｌを、それぞれ６ウェルプレートの２ｎｇ／μｌのインビトロ合成ＩＲ−ＣＹＰ５１  ｓｉＲＮＡまたはＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ｓｉＲＮＡを用いて６時間処理した。細菌は条件ごとに収集し、分子分析のためにさらにプロセシングした。
【０１３１】
アポプラスト液（ＡＦ）および細胞外小胞（ＥＶ）抽出
抽出は以前記載された（４６）通りに行った。樹齢５週間のＣＶまたはＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物の葉を６０枚に、針なしの注射器を用いて小胞単離緩衝液（ＶＩＢ；２０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭの３２４  ＣａＣｌ2、０．０１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）を浸潤させた。次に、葉を２０ｍｌの針なし注射器の内部に置いた。次に、注射器を５０ｍｌのＦａｌｃｏｎに置き、９００ｇで１５分間遠心分離した。アポプラスト液（ＡＰＦ）を収集し、続いて２，０００ｇおよび１０，０００ｇで３０分間遠心分離して、いかなる細胞片も取り除き、次に、０．４５μｍのフィルターを通した。ＡＰＦを、４０，０００ｇで超遠心分離ステップにさらに供してＥＶ画分をペレット化した（Ｐ４０）。ペレットは２０μＭのＴｒｉｓ緩衝液  ｐＨ＝７．５の２ｍｌに再懸濁させた。次に、上澄みを１００，０００ｇで超遠心分離ステップに供してＥＶ画分をペレット化した（Ｐ１００）。このステップ由来の上澄みは元に戻した（ＳＮ）。
【０１３２】
気孔開度測定
植物はいかなる処理も受ける前に少なくとも３時間光（１００μＥ／ｍ2／ｓ）の下に維持して、気孔の完全な拡大を確実にした。樹齢４週間の３つの植物由来の無傷の葉部分を切り裂いて水（偽）または１０8ｃｆｕ／ｍｌの濃度の細菌懸濁液に浸した。処理の３時間後、皮を剥がされていない葉の背軸表面をＳＰ５レーザー走査型共焦点顕微鏡下で観察し、異なる領域から写真を撮った。気孔開度（幅／長さ）は、条件あたり３０〜７０気孔についてＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定した。ＲＮＡ前処理の場合、葉部分は、細菌とのインキュベーション前の１時間、特定の遺伝子型から抽出した全ＲＮＡと一緒にインキュベートした。特定の実験で必要とされる場合、１μＭの外因性コロナチン（ＣＯＲ）（Ｓｉｇｍａ）（５２）を細菌懸濁液に補充した。
【０１３３】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
植物コードされた転写物をモニターするため、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ植物ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して植物試料から抽出した。０．５μｇの無ＤＮＡのＲＮＡを、ｑＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して逆転写した。次に、ｃＤＮＡは、Ｔａｋｙｏｎ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（登録商標））および転写物特異的プライマーを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応により増幅した。発現はユビキチンの発現に規準化した。細菌転写物をモニターするため、全ＲＮＡを、以前記載された通りに、細菌感染植物試料またはインビトロ処理細菌から抽出した。ＤＮＡｓｅ処理後、２５０ｎｇの全ＲＮＡを、ランダムヘキサマープライマーおよびｑＳｃｒｉｐｔ  Ｆｌｅｘ  ｃＤＮＡキット（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して逆転写した。次に、ｃＤＮＡを、Ｔａｋｙｏｎ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（登録商標））および転写物特異的プライマーを使用してリアルタイムＰＣＲ反応により増幅した。発現はＧｙｒＡの発現に規準化した。ＰＣＲは、３８４ウェル光学反応プレートにおいて、９５℃で１０分間加熱し、続いて９５℃で１５秒間の変性、６０℃で２０秒間のアニーリングおよび７２℃で４０秒間の伸長を４５サイクル実施した。融解曲線は１℃のステップ（９５℃〜５０℃）による増幅の終了時に実施した。
【０１３４】
インビトロＰｔｏ  ＤＣ３０００−ＧＦＰまたは緑膿菌ＰＡＯ成長のモニタリングのための液滴ベースのマイクロ流体アッセイ
Ｐｔｏ  ＤＣ３０００を用いた液滴ベースのマイクロ流体実験は２８℃の温度でＮＹＧＢ培地において実施し、緑膿菌ＰＡＯを用いた同じ実験は３７℃の温度でＬＢ培地において実施した。ＲＮＡｉアッセイは、異なる溶液を９６ウェルプレートに直接ピペットで移して最終２００μｌ：すなわち、１００μｌの培地、２０μｌの１０7ｃｆｕ／ｍｌの細菌、２０μｌの、望まれる最終濃度を得るためのインビトロ合成候補ｓｉＲＮＡまたは対照試料では無菌水、続いて６０μｌの培地を得ることにより準備した。Ｍｉｌｌｉｄｒｏｐアナライザー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｄｒｏｐ．ｃｏｍ）により試料が液滴として分画されるように９６ウェルプレートを機器にセットした。ウェルごとに、それぞれ約５００ｎｌの１０液滴を形成し、機器内部で２４時間インキュベートした。液滴ごとに、バイオマス（およびＰｔｏ  ＤＣ３０００−ＧＦＰではＧＦＰ蛍光）の測定値を約３０分ごとに獲得した。
【０１３５】
（実施例２）Ｐｔｏ  ＤＣ３０００由来の内在性病原性因子または人工レポーター遺伝子に向けられたシロイヌナズナによりコードされるｓｉＲＮＡは、細菌感染という状況でそのサイレンシングの引き金を引く
宿主によりコードされる低分子ＲＮＡが細菌遺伝子発現を変更することができるかどうかを試験するため、本発明者らは、両方がＰｔｏ  ＤＣ３０００の重要な病原性決定因子をコードする、ＥＣＦ−ファミリーシグマ因子ＨｒｐＬ遺伝子およびコロナチン（ＣＯＲ）生合成、Ｃｆａ６遺伝子に配列相同性を有するキメラ逆方向反復を構成的に発現するシロイヌナズナ安定的トランスジェニック植物を生成した（図１Ａ、（５３、５４））。負の対照として、本発明者らは菌類麦類赤カビ病の３つのチトクロムＰ４５０ラノステロールＣ−１４α−デメチラーゼ（ＣＹＰ５１）遺伝子に配列相同性を有する逆方向反復を過剰発現するトランスジェニック系統も生成しており、この系統はシロイヌナズナとオオムギの両方でこの菌類植物病原体に対する完全な保護を与えることが以前明らかにされていた（２０、２１）。これらの安定したトランスジェニック系統は、それぞれＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬおよびＩＲ−ＣＹＰ５１（またはＶ、対照ベクター植物）と呼ばれ、人工ｓｉＲＮＡの高蓄積にもかかわらず（図１Ｃ）、いかなる発育障害も示さない（図１Ｂ）。Ｃｆａ６およびＨｒｐＬに向けられた人工ｓｉＲＮＡが細菌感染中にこれらの病原性因子の発現を妨げることができるかどうかを調べるため、本発明者らは、上記のトランスジェニック植物をＰｔｏ  ＤＣ３０００で浸漬接種し、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によりＣｆａ６およびＨｒｐＬ  ｍＲＮＡレベルをさらにモニターした。Ｃｆａ６  ｍＲＮＡレベルは、Ｃｏｌ−０植物と比べて３つの独立したＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ系統のうちの２つで中程度に変更されたが、ＨｒｐＬ転写物のレベルは、この時点でＣｏｌ−０植物と比べて３つのＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ系統すべてで再現性よく低下していた（図１Ｄ）。これとは対照的に、Ｃｆａ６またはＨｒｐＬ  ｍＲＮＡの下方調節はＩＲ−ＣＹＰ５１−対Ｃｏｌ−０感染植物では観察されず（図１Ｄ）、この調節過程でのこれらの抗菌ＲＮＡの特異的効果を支持した。同様に、非標的ＰｒｏＣ遺伝子のｍＲＮＡレベルは、Ｃｏｌ−０感染植物と比べてＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ−とＩＲ−ＣＹＰ５１感染系統の両方において変化はなかった（図１Ｄ）。まとめると、これらのデータは、シロイヌナズナによりコードされるＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ逆方向反復が、感染という状況では少なくとも細菌ＨｒｐＬ転写物の配列特異的サイレンシングの引き金を引くことができることを示している。
【０１３６】
ＨｒｐＬおよびＣｆａ６病原性因子の発現は種々の環境要因により調節されることが知られているので（５４、５５）、本発明者らはＡＧＳが、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００において構成的カナマイシンプロモーターの下で染色体的に発現されるフォトラブダス・ルミネセンスｌｕｘＣＤＡＢＥオペロンに対して効果的であり得るかどうかも試験した（５６）。このｌｕｘタグ付きＰｔｏ  ＤＣ３０００株は、ルシフェラーゼ触媒成分ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ遺伝子を、基質産生に必要な遺伝子、すなわち、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥと一緒に同時発現するので、自然に光を発する（５７）。抗ｌｕｘＡおよび抗ｌｕｘＢ  ｓｉＲＮＡを過剰発現する２つの独立したシロイヌナズナトランスジェニック系統である、ＩＲ−ＬｕｘＡ／ＬｕｘＢ系統を選択し、ｌｕｘタグ付きＰｔｏ  ＤＣ３０００株を注射器浸潤した（図２Ａ／Ｂ）。ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ  ｍＲＮＡのレベルならびに発光活性を接種後２４時間（ｈｐｉ）でさらにモニターした。そうすることにより、本発明者らは、Ｃｏｌ−０感染植物と比べてｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ  ｍＲＮＡ量の両方でならびにＩＲ−ＬｕｘＡ／ＬｕｘＢ感染植物の発光活性において有意な低下を見出した（図２Ｃ）。これとは対照的に、細菌レポーター株の成長は、それらの条件ではＣｏｌ−０植物と比べてＩＲ−ＬｕｘＡ／ＬｕｘＢ系統では変化はなく（図２Ｄ）、上記の効果がこれらのトランスジェニック植物での低下した細菌力価のためではないことを示していた。全体として、これらのデータは、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００感染中、内在性ストレス応答細菌遺伝子と外因性構成的細菌レポーター遺伝子の両方に対してＡＧＳが効果的であることを示している。
【０１３７】
（実施例３）Ｃｆａ６およびＨｒｐＬに向けられた、宿主によりコードされるｓｉＲＮＡは、おそらくコロナチン生合成を抑制することによりＰｔｏ  ＤＣ３０００誘導気孔再開を妨げる
Ｃｆａ６とＨｒｐＬは互いに調節し合うことが知られ（５５）またＨｒｐＬとＣｆａ６は両方ともコロナチン（ＣＯＲ）生合成に不可欠なので（５４、５５）、本発明者らは次に、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物をＣＯＲ依存性病原性応答から保護することができるかどうかを調べた。この目的のため、本発明者らは、接種後３時間（３ｈｐｉ）でＰｔｏ  ＤＣ３０００始動気孔再開をモニターしたが、この気孔再開はＣＯＲ生合成に完全に依存しており、したがって、Ｃｆａ６またはＨｒｐＬ遺伝子が欠失しているＰｔｏ  ＤＣ３０００変異体を接種すると消滅する表現型である（図３Ａ、（５２））。この表現型が感染のこの時点でＩＩＩ型エフェクターに依存していないのは注目に値する。なぜならば、ＩＩＩ型分泌系の組立てに障害があるＰｔｏ  ＤＣ３０００  ｈｒｃＣ変異体で処理すると正常な気孔再開応答が観察されたからである（図３Ａ、（５０））。意義深いことに、本発明者らは、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００誘導気孔再開が、Ｃｏｌ−０感染葉と比べた場合、病原性Ｐｔｏ  ＤＣ３０００株を感染させた３つの独立したＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬトランスジェニック系統において完全に消滅しており（図３Ｂ）、それによってＰｔｏ  ＤＣ３０００  ｃｆａ６欠失株またはｈｒｐｌ欠失株を接種したＣｏｌ−０葉上で観察された表現型を模倣していることを見出した（図３Ａ）。これとは対照的に、ＩＲ−ＣＹＰ５１感染植物では正常なＰｔｏ  ＤＣ３０００誘導気孔再開が観察され（図３Ｃ）、観察された効果がＣｆａ６およびＨｒｐＬ遺伝子に向けられたｓｉＲＮＡに特有であることを示している。さらに、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ感染トランスジェニック植物において検出された易感染性気孔再開表現型は、ＣＯＲの外因性適用により完全に救済された（図３Ｂ）。したがって、これらのデータは、感染ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ気孔で現れたＰｔｏ  ＤＣ３０００病態形成の減少は、会合したおよび／または周囲の細菌細胞がＣＯＲを産生する能力の変更によりおそらく引き起こされるという薬理学的証拠を提供する。
【０１３８】
（実施例４）Ｐｔｏ  ＤＣ３０００またはザントモナス・カンペストリス  ｐｖ.カンペストリス由来の重要な病原性因子に対する低分子ＲＮＡを発現するシロイヌナズナ安定的トランスジェニック植物は細菌感染から保護される
抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡがＰｔｏ  ＤＣ３０００病原性に対して及ぼすことができる考え得る効果をさらにモニターするため、本発明者らは次に、この細菌がシロイヌナズナＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬトランスジェニック植物の葉脈管構造に伝播する能力をモニターした。この目的のため、本発明者らは、病原性ＧＦＰタグ付きＰｔｏ  ＤＣ３０００（Ｐｔｏ  Ｄｃ３０００−ＧＦＰ）株を傷接種された個々の葉の中央脈からの３つの部位で生じる細菌伝播の数をスコア化した。この定量化法を使用して、本発明者らは、Ｃｏｌ−０植物と比べた場合、３つの独立したＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬトランスジェニック系統において有意に減少した細菌伝播の指標を観察した（図４Ａ）。これにより、Ｃｆａ６およびＨｒｐＬに向けられたｓｉＲＮＡが木質導管に到達し、シロイヌナズナ葉脈管構造においてＰｔｏ  ＤＣ３０００の病原性活性をさらに弱めることができることが示唆される。これとは対照的に、Ｃｏｌ−０感染葉と比べてＩＲ−ＣＹＰ５１トランスジェニック系統において正常なＰｔｏ  ＤＣ３０００脈管拡散が観察され（図４Ａ）、この過程における抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡの特定の効果を主張した。まとめると、これらの結果は、病原性決定因子Ｃｆａ６およびＨｒｐＬに向けられたｓｉＲＮＡがシロイヌナズナ葉脈管構造においてＰｔｏ  ＤＣ３０００の伝播を特異的に制限できることを示している。グラム陰性菌ザントモナス・カンペストリス  ｐｖ.カンペストリス（Ｘｃｃ）に対する増強された脈管病保護効果は、病原性因子ＨｒｐＸ、ＨｒｐＧおよびＲｓｍＡに対してｓｉＲＮＡを過剰発現するシロイヌナズナトランスジェニック植物でも見出された（図５、データは示さず、（５８〜６２））。これは、ＡＧＳをさらに使用すれば、世界中でアブラナ科作物の最も破壊的な病気の１つである黒斑病の病因である、シロイヌナズナのこのよく特徴付けがなされている脈管細菌病原体から植物を保護することができることを実証している（２５、６３）。
【０１３９】
本発明者らは次に、Ｃｆａ６およびＨｒｐＬに対するｓｉＲＮＡの安定的な発現が、ＣＯＲと機能的ＩＩＩ型分泌系の両方に依存していることが知られている表現型である植物内でのＰｔｏ  ＤＣ３０００の成長にも影響することができるかどうかを調べた（５４）。この目的のため、本発明者らは、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ、ＩＲ−ＣＹＰ５１およびＷＴ植物にＰｔｏ  ＤＣ３０００を浸漬接種し、４８ｈｐｉで細菌力価をさらにモニターした。このアッセイを使用して、本発明者らは、Ｃｏｌ−０感染植物と比べて３つの独立したＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬトランスジェニック系統においてＰｔｏ  ＤＣ３０００力価の有意な低下を見出し、この表現型はｃｆａ６欠失株に感染したＷＴ植物において観察される表現型を暗示していた（図４Ｃ）。興味深いことに、本発明者らは、２４ｈｐｉでＷＴ感染植物と比べて３つの独立したＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物においてＰｔｏ  ＤＣ３０００誘導水浸漬病症状の減少をさらに観察し、これはＣｆａ６変異株を浸漬接種したＷＴ葉において観察された表現型に似ている（図４Ｄ）。これとは対照的に、細菌成長および水浸漬病気症状は、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００を浸漬接種したＩＲ−ＣＹＰ５１トランスジェニック植物では変更がなく（図４Ｃ／Ｄ）、上記の効果がＣｆａ６およびＨｒｐＬ遺伝子に向けられたｓｉＲＮＡに特有であることを示している。全体として、これらのデータは、感染という状況ではＰｔｏ  ＤＣ３０００の病原性活性を弱めるのに抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡが主要な役割を持つことをさらに支持している。これらのデータは、ＡＧＳが、安定的なトランスジェニック植物において細菌病原性を制御するのに使用することができる効果的な戦略であるという説得力のある証拠も提供する。
【０１４０】
（実施例５）ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物由来の全ＲＮＡの外因性送達はＰｔｏ  ＤＣ３０００からＷＴシロイヌナズナおよびトマト植物を保護する
環境ＲＮＡｉは、（微）生物が環境から外部ＲＮＡを取り込んで、ＲＮＡ引き金に配列相同性を含有する遺伝子のサイレンシングを生じることができる現象である（２４）。このＲＮＡベースの過程は最初、線虫で特徴付けられ（３０〜３４）、他の線形動物で、しかし昆虫、植物および真菌でも作動することがさらに見出されていた（３０、３５）。しかし、このアプローチは、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００などのカノニカルな真核生物様ＲＮＡｉ装置を欠く細菌植物病原体に対して使用されたことはなかった。この可能性を試験するため、本発明者らは、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物から発現されるＲＮＡがインビトロ条件でＣｆａ６およびＨｒｐＬ遺伝子のサイレンシングの引き金を引くことができるかどうかを先ず評価した。この目的のため、本発明者らは、ＣＶおよびＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物から全ＲＮＡを抽出し、それをＰｔｏ  ＤＣ３０００細胞と一緒にインキュベートし、ＲＮＡ処理後４および８時間でＣｆａ６およびＨｒｐＬ  ｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによりさらに分析した。これらの分析の結果により、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物由来のＲＮＡ抽出物を用いて処理すると両方の病原性因子ｍＲＮＡの蓄積が減少し、これはＣＶ植物に由来するＲＮＡ抽出物では観察されなかった分子効果であることが明らかにされた（図６Ａ）。これとは対照的に、非標的ＰｒｏＣおよびＲｐｏＢ  ｍＲＮＡのレベルは同じ条件で変更なしのままであった（図６Ａ）。したがって、これらのデータは、植物抗菌性ＲＮＡがおそらくＰｔｏ  ＤＣ３０００細胞により取り入れられ、続いてＣｆａ６およびＨｒｐＬ遺伝子の配列特異的サイレンシングの引き金を引くことを意味している。それは、これらの抗菌性ＲＮＡの外因性適用をＣｏｌ−０植物においてＰｔｏ  ＤＣ３０００病原性を弱める戦略として使用できることも示唆している。この興味をそそる仮説を試験するため、本発明者らは、シロイヌナズナＣｏｌ−０葉組織をＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物由来の全ＲＮＡ抽出物を用いて１時間前処理し、続いてこの組織をＰｔｏ  ＤＣ３０００に３時間曝露し、細菌誘導気孔再開イベントをさらにモニターした。際立ったことに、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物由来のＲＮＡ抽出物が、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００が気孔を再開する能力を完全に抑制し（図６Ｂ）、それによって感染したＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬトランスジェニック植物で観察される表現型（図３）を模倣していることを本発明者らは見出した。本発明者らは、このアプローチを使用すれば植物内でのＰｔｏ  ＤＣ３０００の成長を制御できるかどうかをさらに調べた。この目的のため、本発明者らは先ずＣｏｌ−０シロイヌナズナ植物をＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物由来の全ＲＮＡ抽出物で１時間前処理し、この植物にＰｔｏ  ＤＣ３０００をさらに浸漬接種した。これらのＲＮＡ抽出物が、感染したＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬトランスジェニック植物において（図４Ｃ）、ならびにＰｔｏ△ｃｆａ６株を接種したＣｏｌ−０植物において（図６Ｃ）観察される表現型に匹敵する表現型である、２ｄｐｉでのＰｔｏ  ＤＣ３０００力価の減少の引き金を引くこと（図６Ｃ）を本発明者らは見出した。これとは対照的に、ＣＶ植物由来の全ＲＮＡ抽出��を適用しても同じ条件でＰｔｏ  ＤＣ３０００の成長を変更せず（図６Ｃ）、この過程における抗菌性ＲＮＡの特異的効果を支持している。そのようなＲＮＡベースの生物的防除アプローチが栽培植物でも効果的であり得ることが可能かどうかを評価するため、本発明者らは、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００の天然の宿主であるトマト（ソラヌム・リコペルシクム、栽培品種のドル箱）で同じアッセイを繰り返した。ＷＴトマト葉をＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物由来のＲＮＡ抽出物で１時間前処理すると、易感染性のＰｔｏ  ＤＣ３０００誘導壊死性病気症状およびＣＶ植物由来のＲＮＡ抽出物で前処理した葉と比べて、細菌量の低下ももたらされた（図６Ｄ〜Ｆ）。まとめると、これらのデータは、植物由来抗菌性ＲＮＡを外部適用すると、シロイヌナズナとトマト植物の両方でＡＧＳおよびＰｔｏ  ＤＣ３０００に対する病気保護の引き金を引くことができるという証拠を提供する。
【０１４１】
（実施例６）低分子ＲＮＡ種は、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬヘアピン由来の全ＲＮＡを外因性適用すると観察される易感染性気孔再開表現型の原因であるが、そのｄｓＲＮＡ前駆体は原因ではない
次に、本発明者らは、どのＲＮＡ実体が抗菌性ＲＮＡの外部適用によるＡＧＳおよび病原性低下の原因であるかを調べた。この疑問に取り組むため、先ずＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４基準系統をｄｃｌ２−１  ｄｃｌ３−１  ｄｃｌ４−２（ｄｃｌ２３４）三重変異体と交配させ、続いて３つのｄｃｌ変異についておよびＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬトランス遺伝子についてホモ接合性であるＦ3植物を選択した。これらＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４×ｄｃｌ２３４植物の分子特徴付けにより、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４親系統で検出されたレベルと比べてＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ逆方向反復転写物（すなわち、非処理ｄｓＲＮＡ）の蓄積が増強されていることが明らかになった（図７Ａ）。さらに、この効果は、抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡの検出限界以下のレベルと関連していた（図７Ａ）。したがって、これらのデータは、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ逆方向反復のプロセシングを通じたこれらｓｉＲＮＡの生合成でのＤＣＬ２、ＤＣＬ３およびＤＣＬ４の役割と一致している。それに続いて、これらの植物から全ＲＮＡを抽出し、それをＰｔｏ  ＤＣ３０００細胞と８時間インキュベートし、Ｃｆａ６およびＨｒｐＬ  ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲ分析によりさらにモニターした。このインビトロアッセイを使用して、本発明者らは、人工ｄｓＲＮＡ前駆体の高蓄積にもかかわらず（図７Ａ）、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４×ｄｃｌ２３４植物由来のＲＮＡ抽出物がもはやＣｆａ６およびＨｒｐＬ  ｍＲＮＡの下方調節の引き金を引くことができないことを見出した（図７Ｂ）。これとは対照的に、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４親系統由来のＲＮＡ抽出物は、高レベルの抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡを含有しており（図７Ａ）、両方の標的にされた病原性因子の蓄積の低下の引き金を引いた（図７Ｂ）。さらに、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４植物由来のＲＮＡ抽出物はＰｔｏ  ＤＣ３０００誘導気孔再開イベントを抑制したが、Ｃｏｌ−０またはｄｃｌ２３４植物由来の対照ＲＮＡ抽出物などの、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４×ｄｃｌ２３４植物由来のＲＮＡ抽出物はこの過程では不活性であることを見出した（図７Ｃ、データは示されず）。まとめると、これらのデータは、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ逆方向反復から生成されるｄｓＲＮＡはＡＧＳにも病原性低下にも関与していないという説得力のある証拠を提供する。これらのデータはむしろ、低分子ＲＮＡがおそらくこれらの分子および生理的表現型の原因である抗菌性ＲＮＡ実体であることを示唆していた。この仮定を検証するため、グラスファイバーフィルターベースの方法を使用してＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物全ＲＮＡから低分子ＲＮＡ種をさらに精製し（図７Ｄ）、これを気孔再開アッセイに供した。そうすることにより、本発明者らは、これらの低分子ＲＮＡ種がＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物全ＲＮＡ抽出物と同じ程度にＰｔｏ  ＤＣ３０００始動気孔再開を抑制することを見出した（図７Ｅ）。これとは対照的に、長いＲＮＡ種（２００ｂｐを超える）は、上のカラムで濾過しなかったが、不活性であり（図７Ｅ）、抗菌性植物ｄｓＲＮＡがこの応答には関与していないことをさらに支持している。全体として、これらのデータは、逆方向反復ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬから生成されるＤＣＬ依存性ｓｉＲＮＡがＡＧＳおよび病原性低下に極めて重要であるが、コグネートｄｓＲＮＡ前駆体は両方の過程に無効であるという確かな証拠を提供する。
【０１４２】
（実施例７）ＨｒｐＬの細菌的に発現される低分子ＲＮＡ許容性バージョンはｓｉＲＮＡ依存性サイレンシングに非感受性であり正常な気孔再開表現型を示して、抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡがＡＧＳおよび病原性低下の原因であることを示している
上の所見は、抗菌性ＲＮＡの外部適用がＡＧＳおよび抗菌活性の引き金を引くことができることを示しているが、これらのｓｉＲＮＡ実体がこれらの現象の原因であることを確固としたかたちで実証してはいない。この問題に取り組むため、本発明者らは、インビトロと植物内条件の両方でＡＧＳ調節を受けることが見出されている、ＨｒｐＬ遺伝子のｓｉＲＮＡ許容性バージョンを発現する組換え細菌を生成し特徴付けることに決めた（図１および６）。この目的のため、本発明者らはＰｔｏ△ｈｒｐＬ変異体をＷＴ  ＨｒｐＬトランス遺伝子またはｓｉＲＮＡ標的領域においてできる限り多くのサイレント変異を含有するｍｕｔ  ＨｒｐＬである変異版で補完し、このサイレント変異はＨｒｐＬ  ｍＲＮＡへのｓｉＲＮＡの結合を変更するが、同じタンパク質配列を生成すると予測される。さらに、抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡがこれらの細菌トランス遺伝子に対して発揮し得る転写後調節制御を評価するため、本発明者らは、構成的ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）プロモーターの下でこれらの細菌トランス遺伝子を発現させた。２つの得られた組換え細菌はそれぞれＰｔｏ△ｈｒｐＬ  ＷＴ  ＨｒｐＬおよびＰｔｏ△ｈｒｐＬ  ｍｕｔ  ＨｒｐＬと呼ばれ、Ｃｏｌ−０植物に接種されると気孔を再開する能力を回復することが見出されており（図８Ａ、データは示さず）、両方のトラス遺伝子が機能的であることを示している。ＡＧＳに対するそれぞれの組換え細菌の感受性をさらに評価した。この目的のため、本発明者らはＰｔｏ△ｈｒｐＬ  ＷＴ  ＨｒｐＬおよびＰｔｏ△ｈｒｐＬ  ｍｕｔ  ＨｒｐＬ株をＣＶおよびＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４植物由来の全ＲＮＡ抽出物と一緒に８時間インキュベートし、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によりＨｒｐＬトランス遺伝子ｍＲＮＡレベルをさらにモニターした。本発明者らは、Ｐｔｏ△ｈｒｐＬ  ＷＴ  ＨｒｐＬ株から発現されたＨｒｐＬ  ｍＲＮＡの蓄積の有意な減少を見出し、この減少はＣＶ植物由来の対照ＲＮＡ抽出物での処理では検出されなかった（図８Ｂ）。これらのデータは、Ｐｔｏ△ｈｒｐＬ  ＷＴ  ＨｒｐＬ株から発現されたＷＴ  ＨｒｐＬトランス遺伝子が、ＮＰＴＩＩプロモーターにより駆動されるその構成的発現にもかかわらず、ＡＧＳに十分感受性であることを示している。これとは対照的に、Ｐｔｏ△ｈｒｐＬ  ｍｕｔ  ＨｒｐＬ株から発現されたＨｒｐＬ  ｍＲＮＡの蓄積は、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＃４植物由来のＲＮＡ抽出物に応答して変更はなく（図８Ｂ）、ｓｉＲＮＡがこの組換え細菌に対してそのＡＧＳ効果をもはや発揮していないことを示している。まとめると、これらの所見は、抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡが、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００細胞内でのＨｒｐＬ病原性因子遺伝子の転写後サイレンシングの原因であることを実証している。次に本発明者らは、低分子ＲＮＡ作用に高度に感受性である、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００誘導気孔再開アッセイを利用することによりｓｉＲＮＡ依存性病原性低下へのそれぞれの組換え細菌株の応答性を調べた。ＨｒｐＬ媒介気孔再開機能の抑制に対するｓｉＲＮＡの特異的効果を評価するため、本発明者らは先ずＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬヘアピンにより標的にされる配列領域と同じＨｒｐＬ配列領��を標的にするＩＲ−ＨＲＰＬ逆方向反復をクローニングし、ニコティアナ・ベンサミアナ葉でアグロバクテリウム媒介一過性形質転換するとＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡを生成するその能力をさらに検証した（図８Ｃ）。抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡを含有するＮ．ベンサミアナ全ＲＮＡ抽出物は、気孔を再開するＰｔｏ  ＤＣ３０００の能力を完全に抑制することを見出した（図８Ｄ）。重要なことに、抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡを含有するＮ．ベンサミアナＲＮＡ抽出物を、Ｐｔｏ△ｈｒｐＬ  ＷＴ  ＨｒｐＬ株と一緒にインキュベートすると類似する結果が得られ（図８Ｄ）、ｓｉＲＮＡ作用に対するこの細菌株の感受性を支持している。これとは対照的に、Ｐｔｏ△ｈｒｐＬ  ｍｕｔ  ＨｒｐＬ株は同じ条件で気孔を再開する十分な能力があり（図８Ｄ）、抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡがこの組換え細菌株に対してその抗菌効果をもはや発揮していないことを示している。したがって、これらのデータは、抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡがＨｒｐＬ媒介気孔再開機能の抑制の原因であるという証拠を提供する。これらのデータは、細菌誘導気孔再開でのＨｒｐＬの新規の役割もさらに検証し、細菌遺伝子機能を特徴付けるツールとしてＡＧＳを用いることができることを示している。
【０１４３】
（実施例８）ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物のアポプラスト液は、ＥＶ中に埋め込まれており小球菌ヌクレアーゼ作用から保護されている、または遊離形態であり小球菌ヌクレアーゼ消化に感受性である機能的抗菌性ｓｉＲＮＡで構成されている
実施例３および４に記載される表現型分析の結果は、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬトランスジェニック系統で構成的に発現される低分子ＲＮＡ種は、着生および内部寄生性細菌集団に到達するためには、植物細胞から葉表面、アポプラスト環境および木質導管に向けて外面化されなければならないことを意味する。この現象に関係している可能性のある低分子ＲＮＡ輸送機構についてのいくつかの洞察を得るために、本発明者らは先ず、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物からアポプラスト液（ＡＰＦ）を抽出して、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００誘導気孔再開に対するその影響をモニターすることにより細菌病原性を弱めるその能力を試験した。本発明者らは、この細胞外液は感染中気孔再開の完全な抑制の引き金を引き、それによってＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ由来全ＲＮＡにより引き金を引かれる効果を模倣することを見出した（図９Ａ）。これとは対照的に、ＩＲ−ＣＹＰ５１植物由来のＡＰＦは不活性であり、この過程におけるＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物のＡＰＦ由来の抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡの特異的効果を支持していた（図９Ａ）。本発明者らは、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物由来のＥＶがＡＧＳに貢献できるかどうかをさらに試験した。この目的のため、本発明者らはＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物からＡＰＦを回収し、４０，０００ｇまたは４０，０００ｇとそれに続く１００，０００ｇでの差示的超遠心分離をさらに実施し、これにより、それぞれＰ４０およびＰ１００と名付けた２つの画分を収集することができた。興味深いことに、本発明者らは両画分は気孔再開を抑制することができたが、この過程ではＰ１００の方が効果が中程度により低いことを見出した（図９Ｂ）。重要なことに、両画分は小球菌ヌクレアーゼ（Ｍｎａｓｅ）の存在下で活性なままであり、低分子ＲＮＡがＥＶ中に埋め込まれている場合は外部分解から保護されていることを示していた。興味深いことに、本発明者らは４０，０００ｇおよび１００，０００ｇでの連続遠心分離後に回収された上澄み画分（ＳＮ）が、この画分で検出されるカノニカルなＥＶが欠如しているにもかかわらず、強力な抗菌活性を示すことにも注目した（図９Ｂ、データは示さず）。これは、タンパク質と会合しているおよび／または遊離の形態であるＥＶフリー低分子ＲＮＡがさらにＡＧＳの能力がある可能性があることを示唆している。２つの低分子ＲＮＡ実体のうちどちらがそのような抗菌活性をもつことができるのかを決定するため、本発明者らは、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物由来のＳＮ画分をＭｎａｓｅまたはプロテイナーゼＫで処理して、この画分を気孔再開アッセイにさらに供した。興味深いことに、本発明者らは、Ｍｎａｓｅ処理は、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ由来ＳＮ画分により引き金を引かれる抗菌効果を抑止するが、タンパク質を包括的に分解するプロテイナーゼＫの存在下では変更のない細菌活性が検出されることを見出した（図９Ｂ、データは示さず）。まとめると、これらのデータは、機能的ＥＶフリー抗菌低分子ＲＮＡはおそらくタンパク質と会合していないことを示しており、したがって、ここでは細胞外遊離低分子ＲＮＡまたは「ｅｆｓＲＮＡ」と呼ぶ。本発明者らの結果は、ｅｆｓＲＮＡが、Ｍｎａｓ��作用に感受性であることも示している。なぜならば、このヌクレアーゼで処理するとｅｆｓＲＮＡはその抗菌効果を失ったからである（図９Ｂ）。これらの所見に基づいて、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ植物由来のＡＰＦが機能的抗菌性低分子ＲＮＡの少なくとも３つの集団で構成されており、１）大きなＥＶ（Ｐ４０画分）中に埋め込まれている、２）より小さなサイズのＥＶ（Ｐ１００画分）中に埋め込まれている、または３）遊離の形態であることを、本発明者らは提唱する。
【０１４４】
（実施例９）低分子ＲＮＡのインビトロ合成は、抗菌活性を有する候補低分子ＲＮＡを求めてスクリーニングする容易で迅速で信頼性の高いアプローチである
抗菌活性を有する候補低分子ＲＮＡを特定するためのスクリーニングプラットホームを開発するため、本発明者らは、特定の細菌遺伝子転写物に対するインビトロ合成ｓｉＲＮＡを生成し、細菌病原性または生存に対するその活性をさらに試験することを目指した。この目的のため、本発明者らは先ず、ＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬのＤＣＬ依存性プロセシングから生成される植物ｓｉＲＮＡと同じ配列を標的にするインビトロ合成抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡを生成することにした。そのため、本発明者らは、Ｔ７プロモーター配列を保有するプライマーを使用して、ＩＲ−ＣＹＰ５１またはＩＲ−ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ配列を含有するプラスミドからＣＹＰ５１またはＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、続いてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロＲＮＡ転写のための鋳型として使用し、この転写により予測されるサイズのＣＹＰ５１またはＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ｄｓＲＮＡが生成された（図１０Ａ）。ＳｈｏｒｔＣｕｔ（登録商標）ＲＮａｓｅ  ＩＩＩを使用してこれらのｄｓＲＮＡを１８〜２５ｂｐのｓｉＲＮＡに消化することにより低分子ＲＮＡをさらに得たが、この過程には他の市販されていないＲＮａｓｅ  ＩＩＩも使用することができる（データは示さず）。アガロースゲル電気泳動により明らかにされるように、これらのｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡが取り除かれており（図１０Ａ）、これらの実験で使用されたＲＮａｓｅ  ＩＩＩがｄｓＲＮＡ分子の最初のプールを完全にプロセシングしたことを示している。次に本発明者らは、合成ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡが気孔再開を抑制する能力を分析した。植物ｄｓＲＮＡがＡＧＳの引き金を引くのに不活性であることを示す本発明者らの以前のデータと一致して（図７）、本発明者らはインビトロ合成ＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ｄｓＲＮＡがＰｔｏ  ＤＣ３０００誘導気孔再開を妨げず、インビトロ合成ＣＹＰ５１  ｄｓＲＮＡも妨げないことを見出し、これは負の対照として使用された（図１０Ｂ）。これとは対照的に、Ｃｆａ６およびＨｒｐＬに向けられたインビトロ合成ｓｉＲＮＡはＰｔｏ  ＤＣ３０００誘導気孔再開を完全に妨げたが、インビトロ合成抗ＣＹＰ５１  ｓｉＲＮＡは、この過程において不活性であった（図１０Ｂ）。後者の結果は、インビトロ合成抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡが、Ｃｆａ６およびＨｒｐＬ遺伝子のサイレンシングの引き金を引くことがおそらくできることを示唆していた。この仮説を試験するため、本発明者らは、インビトロ合成ＣＹＰ５１およびＣＦＡ６／ＨＲＰＬ  ｓｉＲＮＡを２ｎｇ／μｌの濃度で１×１０7ｃｆｕ／ｍｌのＰｔｏ  ＤＣ３０００と一緒に６時間さらにインキュベートし、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によりＣｆａ６およびＨｒｐＬ  ｍＲＮＡをさらにモニターした。そうすることにより、抗Ｃｆａ６／ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡが、抗ＣＹＰ５１  ｓｉＲＮＡと比べてＣｆａ６およびＨｒｐＬ  ｍＲＮＡの蓄積の有意な減少の引き金を引くことを本発明者らは見出しており（図１０Ｂ）、この減少は抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡを含有する植物由来全ＲＮＡに応答して観察される効果に匹敵する分子効果であった（図６Ａ、７Ｂ）。これとは対照的に、非標的ＰｒｏＣおよびＲｐｏＢ  ｍＲＮＡのレベルは、抗ＣＹＰ５１  ｓｉＲＮＡと比べて抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡに応答して変化しないままであった（図１０Ｂ）。まとめると、これらのデータは、インビトロ合成ｓｉＲＮＡが、植物由来抗Ｃｆａ６および抗ＨｒｐＬ  ｓｉＲＮＡと同じ程度にＡＧＳおよび抗菌活性の引き金を引くことができることを示している。
【０１４５】
次に本発明者らは、このアプローチが、殺菌活性を有する候補ｓｉＲＮＡの特定のための手段となり得るかどうかを決定することにした。このアイデアを試験するため、本発明者らは、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００由来の３つの保存されたハウスキーピング遺伝子、すなわち、ＳｅｃＥ（ＰＳＰＴＯ＿０６１３、前タンパク質トランスロカーゼＳｅｃＥサブユニット）、ＦｕｓＡ（ＰＳＰＴＯ＿０６２３、翻訳伸長因子Ｇ）およびＧｙｒＢ（ＰＳＰＴＯ＿０００４、ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ）に向けられたｓｉＲＮＡのインビトロ合成を実施し、この細菌のインビトロ成長に対するその影響をさらにモニターした。そのため、本発明者らは、細菌バイオマスおよび細菌的に発現される蛍光レポーター活性の正確な測定に適している確立した液滴ベースのマイクロ流体システムを利用した。このアプローチを使用することにより、本発明者らは、ＦｕｓＡに向けられた０．３３ｎｇ／μｌのインビトロ合成ｓｉＲＮＡが、ｓｉＲＮＡの非存在下または抗ＳｅｃＥ  ｓｉＲＮＡの存在下の条件と比べて、ＧＦＰタグ付きＰｔｏ  ＤＣ３０００（Ｐｔｏ  ＤＣ３０００−ＧＦＰ）のバイオマスとＧＦＰシグナルの両方を低減できることを見出した（図１０Ｅ、Ｆ）。際立ったことに、本発明者らは、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００−ＧＦＰ株を１ｎｇ／μｌのインビトロ合成抗ＦｕｓＡ  ｓｉＲＮＡと一緒にインキュベートした場合も、ＧｙｒＢに向けられたインビトロ合成ｓｉＲＮＡが０．３３ｎｇ／μｌまたは１ｎｇ／μｌの濃度で適用された場合も、いかなるＧＦＰシグナルも細菌バイオマスも検出しなかった（図１０Ｅ、Ｆ）。これらのデータは、ＦｕｓＡおよびＧｙｒＢに向けられたｓｉＲＮＡが、抗生物質が存在する場合に検出されると考えられる効果を模倣する強力な殺菌活性を有することを示している。これらの概念証明実験に基づいて、本発明者らは、ｓｉＲＮＡのインビトロ合成が、抗菌活性を有する新規の候補低分子ＲＮＡを求めてスクリーニングするための容易で迅速で信頼性の高いアプローチであると結論づける。これらの実験は、Ｐｔｏ  ＤＣ３０００の生存におけるＦｕｓＡおよびＧｙｒＢについての役割も明らかにしており、これはこの細菌については以前報告されたことがない。したがって、これらの結果は、ＡＧＳを細菌遺伝子機能を特徴付けるためのツールとして用いることができるという事実をさらに支持している。
【０１４６】
（実施例１０）植物低分子ＲＮＡおよびインビトロ合成低分子ＲＮＡは緑膿菌においてＡＧＳの引き金を引くことができ、この調節過程を利用すれば細菌の必須遺伝子の一部を標的にすることによりこの細菌の成長を低減することができる
植物細胞には当てはまらないが、哺乳動物細胞から発現される長いｄｓＲＮＡは強力な抗ウイルスインターフェロン応答の引き金を引くことで知られている（３７）という事実と共に、上の所見に促されて、本発明者らは、動物病原性細菌に対する低分子ＲＮＡを生成するのに植物を用いることができるかどうかをさらに評価した。この目的のため、先ず、アグロバクテリウム媒介形質転換を使用してＮ．ベンサミアナ葉において実施例２に記載される逆方向反復ＩＲ−ＬｕｘＡ／ＬｕｘＢ構築物を一過性に発現させた。負の対照として、ＧＦＰレポーター遺伝子と配列相同性を保有する逆方向反復もＮ．ベンサミアナ葉において一過性に発現させた。抗ＬｕｘＡ／Ｂ  ｓｉＲＮＡまたは抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを含有する全ＲＮＡを、ｌｕｘレポーター系を発現する、前に記載された緑膿菌（ＰＡＫ）株と一緒にインキュベートし（６４）、マイクロプレートリーダー上インビトロ条件で生物発光活性をさらにモニターした。このアプローチを使用して、抗ＬｕｘＡおよび抗ＬｕｘＢ植物  ｓｉＲＮＡの存在下で生物発光活性の特異的な減少を検出したが、この減少は抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡでは観察されなかった（図１１Ａ）。これとは対照的に、６００ｎｍ（ＯＤ600）での吸光度測定により明らかにされたように、ｌｕｘタグ付きＰＡＫ株の成長はどちらの低分子ＲＮＡ種が存在していても変化はなかった（図１１Ｂ）。この結果は、上で検出された効果が抗ＬｕｘＡおよび抗ＬｕｘＢ  ｓｉＲＮＡの存在下での細菌力価の減少のためではなかったことを示している。むしろ、この結果は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢレポーター遺伝子に向けられた植物由来ｓｉＲＮＡがｌｕｘタグ付きＰＡＫ株においてＡＧＳの引き金を引くことができることを示している。
【０１４７】
ＰＡＫ内在性遺伝子に対するＡＧＳをさらに検出することができるかどうかをさらに決定するため、ＤｎａＡ、ＤｎａＮおよびＧｙｒＢ遺伝子、またはＲｐｏＣ、ＳｅｃＥおよびＳｏｄＢ遺伝子を同時に標的にするように設計されたキメラ逆方向反復をさらに生成した。これらの緑膿菌標的は、その個々の欠失がこの細菌の生存を変更することが知られていたので選択されたことは注目に値する（３８〜４０）。両方の逆方向反復構築物は、Ｎ．ベンサミアナ葉においてアグロバクテリウム媒介形質転換するとこれらの細菌遺伝子に対して低分子ＲＮＡを過剰発現することが見出された（データは示さず）。興味深いことに、２０ｎｇ／μｌのそれぞれの全ＲＮＡ抽出物をｌｕｘタグ付きＰＡＫ株と一緒にインキュベートすると、非形質転換Ｎ．ベンサミアナ葉由来の全ＲＮＡ抽出物と比べて生物発光活性の減少を見出した（図１１Ｃ）。さらに、これらの表現型は、６００ｎｍ（ＯＤ600）での吸光度の低下により明らかにされたように、ｌｕｘタグ付きＰＡＫ株の成長の減少とも関連していた（図１１Ｄ）。これとは対照的に、抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを含有するＲＮＡ抽出物は、同じ条件で生物発光活性も細菌力価も変更しなかった（図１１Ｃ／Ｄ）。これらの結果は、ＰＡＫ株由来の必須遺伝子を同時に標的にする植物人工ｓｉＲＮＡが、インビトロ条件でＡＧＳおよび細菌成長の低下の引き金を引くのに効果的であることを示している。
【０１４８】
最後に、植物病原性細菌Ｐｔｏ  ＤＣ３０００において観察されるように、インビトロ合成ｓｉＲＮＡがこれらの原核細胞においても活性であり得るかどうかを調べた（実施例１０、図１０）。この仮説を試験するため、ＤｎａＡ、ＤｎａＮ、ＧｙｒＢ、ＲｐｏＣ、ＳｅｃＥまたはＳｏｄＢに向けられたｓｉＲＮＡのインビトロ合成を実施した。負の対照として、実施例２に記載されるフサリウムＣＹＰ５１遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡも合成した。これらのｓｉＲＮＡは緑膿菌ＰＡＯ株と一緒に５ｎｇ／μｌの濃度でインキュベートし、この細菌の成長は、液滴ベースのマイクロ流体システムを使用してさらに分析した。これらの分析の結果は、ＤｎａＡ、ＲｐｏＣまたはＳｏｄＢ遺伝子に向けられたインビトロ合成ｓｉＲＮＡが、対照抗ＣＹＰ５１  ｓｉＲＮＡと比べて緑膿菌ＰＡＯ株のインビトロ成長を変更しないことを明らかにした（図１２）。これとは対照的に、ＧｙｒＢ、ＤｎａＮまたはＳｅｃＥ遺伝子に向けられたｓｉＲＮＡは、抗ＣＹＰ５１  ｓｉＲＮＡと比べて、この細菌の成長の減少の引き金を引き、より強い成長低下効果が抗ＳｅｃＥ  ｓｉＲＮＡで検出された（図１２）。これらの結果に基づいて、本発明者らは、特定のインビトロ合成ｓｉＲＮＡの使用は、植物病原性細菌株（実施例９）だけでなく、典型的なグラム陰性菌ヒト細菌病原体（実施例１０）でも効果的であり得ると結論づける。これは、無関係な細菌細胞が外部の低分子ＲＮＡを受動的にまたは能動的に取り込み、続いて標的にされた細菌遺伝子の配列特異的サイレンシングの引き金を引くことができるという考えを支持している。これらの結果は、ｓｉＲＮＡのインビトロ合成が、この実施例で使用された液滴ベースのマイクロ流体装置などのスクリーニングシステムと一体となって、動物細菌病原体に対する抗菌活性を有する低分子ＲＮＡを求めて、容易で迅速で信頼性の高い様式でスクリーニングする強力なアプローチであることも示している。
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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