(57)【要約】  本明細書では、キメラアデノウイルスベクターが提供される。提供されるキメラアデノウイルスベクターは、対象において防御免疫応答を誘導するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は配列番号２から選択されるアミノ酸配列を含むヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含むヘキソンポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクター。
【請求項２】
前記ヘキソンポリペプチド配列が配列番号３又は配列番号４を含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３】
前記アデノウイルスベクターがさらにＥ１欠失を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項４】
前記アデノウイルスベクターがさらにＥ３欠失を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５】
前記アデノウイルスベクターがさらに、ヒトアデノウイルス−５（ＨＡｄＶ−５）Ｅ４  ｏｒｆ６を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６】
前記アデノウイルスベクターが、配列番号５又は配列番号６から選択される核酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７】
前記アデノウイルスベクターがさらに少なくとも１つの導入遺伝子を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項８】
前記導入遺伝子が、前記Ｅ１欠失、前記Ｅ３欠失、及び／又は右逆位末端配列（ｒＩＴＲ）に隣接して位置する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項９】
前記アデノウイルスベクターが、ヒトアデノウイルス−２６（Ａｄ２６）に由来する１種以上の核酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含む組換え細胞。
【請求項１１】
（ａ）請求項１０に記載の組換え細胞を、前記アデノウイルスベクターを産生するための条件下で増殖させること；及び
（ｂ）前記組換え細胞から前記アデノウイルスベクターを単離することを含む、
アデノウイルスベクターを作製する方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物。
【請求項１３】
必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、請求項１２に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む、免疫原性組成物を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーに関する。より詳細には、抗原を送達し、宿主において免疫応答を誘発するための複製欠損アデノウイルスベクターなどのアデノウイルスベクターの分野及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えアデノウイルスベクターは、遺伝子治療適用及びワクチンに広く応用されている。ＡｄＶ−５ベクターに基づくワクチンは、様々な動物モデルにおいて強力で保護的な免疫応答を誘発することが示されている（例えば、国際公開第２００１／０２６０７号パンフレット；国際公開第２００２／２２０８０号パンフレット；Ｓｈｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１（２００２）；Ｌｅｔｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：７３（２００２）；Ｓｈｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｅｍｉｎｉ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５５：３５５（２００４））。しかしながら、組換えＡｄＶ−５ベクターに基づくワクチンの有用性は、ヒト集団におけるＡｄＶ−５特異的中和抗体（ＮＡｂ）の高い血清有病率によって制限される可能性が高い。抗ＡｄＶ−５免疫の存在は、マウス、アカゲザル、及びヒトにおける研究において、ＡｄＶ−５に基づくワクチンの免疫原性を大幅に抑制することが示されている。
【０００３】
最も一般的なヒトアデノウイルス、例えば、ＡｄＶ−５により以前に感染又は治療された個体における既存の免疫の存在を回避するための一つの有望な戦略は、そのような既存の免疫に遭遇しないアデノウイルス血清型からの組換えベクターの開発を含む。１つのそのような戦略は、天然カプシドタンパク質配列（例えば、ヘキソン及び／又はファイバータンパク質配列）の、低い血清有病率を有する（又は有しない）アデノウイルス由来のカプシドタンパク質配列（例えば、ヘキソン及び／又はファイバータンパク質配列）による置換を含むキメラアデノウイルスの使用に基づく。
【０００４】
したがって、大量に生産可能で、宿主の既存の免疫に遭遇しないが依然として免疫原性があり、ベクターに挿入された異種核酸によってコードされる抗原に対して強い免疫応答を誘導することができる代替的なアデノウイルスベクターが、この分野では必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、アデノウイルスベクターが提供される。アデノウイルスベクターは、配列番号１又は配列番号２から選択されるアミノ酸配列を含むヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含むヘキソンポリペプチドをコードする核酸配列を含み得る。特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、配列番号３又は配列番号４を含むヘキソンポリペプチド配列を含み得る。
【０００６】
特定の実施形態では、アデノウイルスベクターはさらに、Ｅ１欠失を含む。特定の実施形態では、アデノウイルスベクターはさらに、Ｅ３欠失を含む。アデノウイルスベクターはさらに、ヒトアデノウイルス−５（ＨＡｄＶ−５）Ｅ４  ｏｒｆ６を含み得る。アデノウイルスベクターは、例えば、配列番号５又は配列番号６から選択される核酸配列を含み得る。
【０００７】
特定の実施形態では、アデノウイルスベクターはさらに、少なくとも１つの導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの導入遺伝子は、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失、及び／又は右逆位末端配列（ｒＩＴＲ）に隣接して位置する。
【０００８】
特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス−２６（Ａｄ２６）に由来する１つ以上の核酸配列を含む。
【０００９】
また、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターを含む組換え細胞も提供される。また、アデノウイルスベクターを作製する方法も提供される。方法は、（ａ）本明細書に記載される組換え細胞を、アデノウイルスベクターを産生するための条件下で増殖させること；及び（ｂ）組換え細胞からアデノウイルスベクターを単離することを含む。
【００１０】
また、本明細書に記載されるアデノウイルスベクター及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物が提供される。また、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法が提供される。方法は、対象に本明細書に記載される免疫原性組成物を投与することを含む。また、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む、免疫原性組成物を作製する方法が提供される。
【００１１】
上述の概要、及び下記の本願の好ましい実施形態の詳細な説明は、添付した図面とともに読む場合により十分に理解されることになる。しかしながら、本願は、図面に示される明確な実施形態に限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本明細書に記載されるヘキソンキメラベクターのヘキソン配列置換の概略図を示す。図１Ａは、ヘキソンキメラＨＡｄＶ−５ベクターＡｄ５ＨＶＲ４８（１−７）を作製するためにＨＡｄＶ−５とＨＡｄＶ−４８ヘキソンの間で以前に交換された５つのヘキソン遺伝子セグメント（灰色のバー）及び７つの短い超可変領域（ＨＶＲ）（黒色のバー）の全長ＨＡｄＶ−２６ヘキソン遺伝子（白色のバー）内の位置を示す概略図を示す（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：２３９−４３（２００６））。図１Ｂは、ＨＡｄＶ−２６、ＰｔｒｏＡｄＶ−１、ＰｔｒｏＡｄＶ−１２、及びＰｔｒｏＡｄＶ−１３のヘキソンポリペプチド配列の部分的なアラインメントを示す。灰色のバーは、ＨＡｄＶ−２６とＰｔｒｏＡｄＶ−１、ＰｔｒｏＡｄＶ−１２、又はＰｔｒｏＡｄＶ−１３の間において本明細書で交換された５つのヘキソン遺伝子セグメントに相当する。黒色のバーは、ＨＡｄＶ−５とＨＡｄＶ−４８の間で交換された前述の以前に割り当てられたＨＶＲに相当する配列を示す。
【図２−１】キメラｐＡｄ２６ベクターの概略図を示す。図２Ａは、ｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１２．ｌｕｃ（配列番号２１）の一般的な特徴の概略図を示す。図２Ｂは、ｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１３．ｌｕｃ（配列番号２２）の一般的な特徴の概略図を示す。
【図２−２】（上記の通り。）
【図３】ｐＡｄ２６．ＡｐｏＡ１．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ（配列番号２９）の一般的な特徴の概略図を示す。
【図４】（Ｅ１補完細胞において）アデノウイルスベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃを作製するために使用された相同組換え戦略の概略図を示す。
【図５−１】Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＦＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＦＬｕｃによって誘導される細胞性及び体液性免疫応答を示す。図５Ａは、実験構成を示す。図５Ｂは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定されるとおりのベクターにコードされた抗原（すなわち、Ｆｌｕｃ、ホタルルシフェラーゼ）に対してＡｄ２６．ＦＬｕｃ、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＦＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＦＬｕｃによって誘導される免疫応答のグラフを示す。ｙ軸は１０６個の脾細胞当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を示し、点線は中程度の刺激の９５％パーセンタイルを示す。
【図５−２】（上記の通り。）
【図６−１】Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃによって誘導される細胞性及び体液性免疫応答を示す。図６Ａは、実験構成を示す。図６Ｂは、Ａｄ２６．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃによる免疫化後８週目に実施されたＲＳＶ  Ａ２ウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）の結果を示す。図６Ｃは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定されるとおりのベクターにコードされた抗原ＲＳＶ  Ｆに対してＡｄ２６．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃによって誘導される細胞性免疫応答を示す。ｙ軸は１０６個の脾細胞当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を示し、点線は中程度の刺激の９５％パーセンタイルを示す。図６Ｄは、免疫化後８週目の免疫化マウスの血清中のＡｄ２６．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃによって誘導されるＲＳＶＦ特異的ＩｇＧ結合抗体のグラフを示す。グラフは、終点力価として計算されたＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ力価を示す（ｌｏｇ１０）。
【図６−２】（上記の通り。）
【図６−３】（上記の通り。）
【図６−４】（上記の通り。）
【図７】アデノウイルスベクターＡｄ３５、Ａｄ２６、Ａｄ５、Ａｄ４、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３で免疫化されたマウスにおいて誘導される同種及び異種アデノウイルス中和力価を示す。
【図８】米国（ＵＳ）及び欧州連合（ＥＵ）に居住する１８歳〜５５歳までの成人に由来する２００名のヒトコホート血清試料におけるＡｄ２６、Ａｄ５、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３の血清有病率を示す。各ベクターに対してこれらの血清において測定された中和力価を、示されるとおりに図表において表される４種のカテゴリー（＜１６（中和なし）、１６〜３００、３００〜１，０００、１０００〜４０００及び＞４０００）に分けた。
【図９】生産細胞株ｓＰＥＲ．Ｃ６における新規のカプシドキメラベクターＡｄＨＶＲＰｔｒ１２．ＦＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＦＬｕｃの生産性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、ヒト骨格及びキメラヘキソン又はファイバーポリペプチド配列のうちの少なくとも１つを含むキメラアデノウイルスベクターの作製に少なくとも部分的に基づく。アデノウイルスベクターは、免疫応答を誘発するが、低い血清有病率を維持することができる。アデノウイルスベクターは、ワクチンのために製剤化され、且つ目的の特異抗原に対する防御免疫を誘導するために使用され得る。
【００１４】
背景技術の項で、また本明細書全体を通して、様々な刊行物、論文及び特許が引用又は記載されており、これらの参考文献はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文献、行為、材料、装置、物品などの議論は、本発明の文脈を提供することを目的とする。そのような議論は、これらの内容のいずれか又は全てが、開示されている、又は特許請求されているあらゆる発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
【００１５】
別途定義されていない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する分野の当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。さもなければ、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書で規定されている意味を有する。
【００１６】
本明細書で使用する場合、及び添付した特許請求の範囲においては、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明白に規定していない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。
【００１７】
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などの任意の数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、数値は、通常、列挙された値の±１０％を含む。例えば、濃度１ｍｇ／ｍＬは、０．９ｍｇ／ｍＬ〜１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は、０．９％（ｗ／ｖ）〜１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、全ての可能な部分的範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含み、文脈に明らかに別段の指示がない限り、そのような範囲内の整数及び値の分数を含む。
【００１８】
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のあらゆる要素を指すと理解すべきである。当業者は、通例の実験だけを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多数の等価物を認識することになるか、又は確認することがきできるであろう。このような等価物は、本発明に包含されるものとする。
【００１９】
本明細書で使用する場合、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｓ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、若しくは「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又はそれらの任意の他の変形は、記載された整数又は整数群を包含することを意味するものと理解されるが、任意の他の整数又は整数群の排除を意味するものではなく、非排他的又はオープンエンドであることが意図されている。例えば、構成要素の一覧を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は必ずしもそれらの構成要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されていない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、若しくは装置が本来具備している他の構成要素を含むことができる。さらに、明確に反対のことを述べない限り、「又は」は包括的「又は」を意味し、排他的「又は」を意味しない。例えば、条件Ａ又はＢは、以下のいずれか１つによって満たされる。Ａが真であり（又は、存在し）且つＢが偽である（又は、存在しない）、Ａが偽であり（又は、存在しない）且つＢが真である（又は、存在する）、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は、存在する）。
【００２０】
本明細書で使用する場合、多数の列挙された要素間の接続語「及び／又は」は、個々の選択肢及び組み合わせた選択肢の両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって結合される場合、第１選択肢は第２要素を伴わない第１要素の適用性を指す。第２選択肢は、第１要素を伴わない第２要素の適用性を指す。第３選択肢は、第１及び第２要素を合わせた適用性を指す。これらの選択肢のいずれか１つは、本明細書で使用する用語「及び／又は」の意味の範囲内に含まれ、このため用語「及び／又は」の要件を満たすと理解される。２つ以上の選択肢の同時の適用性は、さらに用語「及び／又は」の意味の範囲内に含まれ、このため用語「及び／又は」の要件を満たすと理解される。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」という用語、又は「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」若しくは「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」などのその変形は、本明細書及び特許請求の範囲を通して使用されるとき、記載された整数又は整数群を全て包含するが、その特定の方法、構造、又は組成物にさらなる整数又は整数群を加えることはできないことを意味する。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語、又は「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」若しくは「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などのその変形は、本明細書及び特許請求の範囲を通して使用されるとき、記載された整数又は整数群を全て包含し、且つ、その特定の方法、構造、又は組成物の基本の又は新規の特性を実質的に変化させない記載された整数又は整数群を任意選択的に包含することを意味する。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．２１１１．０３節を参照されたい。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「対象」は、本発明の実施形態による方法によってワクチン接種されることになるか又はワクチン接種されたあらゆる動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。用語「哺乳動物」は、本明細書で使用する場合、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ネズミ、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられるが、これに限定されない。
【００２４】
語「右」、「左」、「下」及び「上」は、参照される図面における方向を指定する。
【００２５】
また、本明細書で好ましい発明の構成要素の寸法又は特性に言及するときに使用される「約」、「略」、「一般に」、「実質的に」などの用語は、当業者に理解されるとおり、記載された寸法／特性が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じか又は類似している、そこからのわずかな変形を排除しないことを示すことは理解されたい。少なくとも、そのような数値パラメータを含む言及は、当該技術分野で受容されている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定又はその他の系統誤差、製造上の公差など）を使用して、最下位数を変化させない変動を含むであろう。
【００２６】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列（例えば、ヘキソン及びファイバーポリペプチド並びにそれらをコードするポリヌクレオチド）の文脈における用語「同一」又はパーセント「同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又は目視による調査によって測定されるとおり、最大の一致について比較及び整列される場合に、同じあるか、又は特定のパーセンテージの同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。
【００２７】
配列比較のために、通常１つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００２８】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は目視による調査（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，の合弁事業（１９９５年増補版）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照のこと）によって実行され得る。
【００２９】
パーセント配列同一性及び配列類似性を判定するのに好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２において記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さの文字列とアラインメントさせた場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致又はそれを満たす、クエリ配列中の長さＷの短い文字列を同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは隣接文字列スコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、上記）。これらの最初の隣接文字列ヒットは、より長いＨＳＰを含む文字列を探し出すための探索を開始するためのシードとして作用する。次に、文字列ヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。
【００３０】
累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（一致残基の対に関する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不適正残基に関するペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列に関して、スコアリングマトリックスは、累積スコアを計算するために使用される。各方向における文字列ヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その最大到達値から量Ｘ減少する場合；１つ以上の負のスコアの残基のアラインメントが蓄積することにより、累積スコアが０以下となる場合；又はいずれかの配列の端に到達する場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、ワード長（Ｗ）が１１、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を初期設定として使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長（Ｗ）が３、期待値（Ｅ）が１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを初期設定として使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９））。
【００３１】
パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３））。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりもたらされる類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と参照核酸の比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似していると考えられる。
【００３２】
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、以下に記載されるとおり、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは通常、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合には第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、以下に記載されるとおり、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「防御免疫」又は「防御免疫応答」は、ワクチン接種された対象が、このワクチン接種を行った対象の病原性因子による感染を防除できることを意味する。病原性因子は、例えば、抗原性遺伝子産物若しくは抗原性タンパク質、又はその断片であり得る。通常、「防御免疫応答」が発現された対象は、軽度〜中程度の臨床症状を発現するにすぎないか又は症状を全く発現しない。通常、特定の因子に対する「防御免疫応答」又は「防御免疫」を有する対象は、前記因子による感染の結果として死亡しない。
【００３４】
用語「アジュバント」は、免疫系の刺激を引き起こす１種以上の物質として定義される。この文脈において、アジュバントは、本発明のアデノウイルスベクターに対する免疫応答を増強させるために使用される。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「抗原性遺伝子産物又はその断片」又は「抗原性タンパク質」は、細菌、ウイルス、寄生虫、若しくは真菌タンパク質、又はその断片を含み得る。好ましくは、抗原性タンパク質又は抗原性遺伝子産物は、宿主において防御免疫応答を高め、例えば、疾患又は感染症（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、若しくは真菌疾患又は感染症）に対する免疫応答を誘導し、且つ／又は疾患又は感染症に対して対象を保護する免疫を対象において疾患又は感染症に対してもたらす（すなわち、ワクチン接種する）ことができる。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「キメラ」は、通常互いに関連付けられていない２種以上の遺伝子、核酸、タンパク質、ペプチド又はポリペプチドを含む遺伝子、核酸、タンパク質、ペプチド又はポリペプチドを意味する。「キメラ」遺伝子、核酸、又はタンパク質は、２つ以上の無関係な配列（例えば、２つ以上の異なるタンパク質をコードする２つ以上の異なる核酸）間の融合であり得る。「キメラ」遺伝子、核酸、又はタンパク質は、２つ以上の関連する配列間の融合であり得る（例えば、核酸は同じタンパク質をコードするが、核酸は異なる供給源物質に由来する、すなわち、一方の核酸がヒトであり、他方の核酸がサルである）。
【００３７】
アデノウイルスベクター
特定のアデノウイルスへの曝露は、特定のアデノウイルス血清型に対する免疫応答をもたらし、アデノウイルスベクターの有効性に影響を及ぼす可能性がある。ヒトアデノウイルスによる感染はヒトにおいて一般的であるため、ヒト集団におけるヒトアデノウイルスに対する中和抗体の有病率は高い。個体におけるこのような中和抗体の存在は、ヒトアデノウイルス骨格に基づく遺伝子導入ベクターの有効性を低減すると予想され得る。有効性の低減を回避するための１つの方法は、中和抗体の標的であるアデノウイルスカプシドタンパク質上のエピトープを置き換えることである。カプシドタンパク質上の標的配列は、低い有病率であり、したがって中和抗体がヒト集団において希少である他のアデノウイルス（例えば、サルアデノウイルス）に由来するタンパク質配列で置き換えられ得る。
【００３８】
「カプシドタンパク質」は、特定のアデノウイルスの血清型及び／又は向性の決定に関与する、アデノウイルス又はその機能的断片若しくは誘導体のカプシド上のタンパク質を指す。カプシドタンパク質は通常、ファイバー、ペントン及び／又はヘキソンタンパク質を含む。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、アデノウイルスの全体又は全長カプシドタンパク質である。他の実施形態では、カプシドタンパク質は、アデノウイルスの全長カプシドタンパク質の断片又は誘導体である。特定の実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターによってコードされるヘキソン、ペントン及びファイバーは、同じ又は異なるアデノウイルス骨格のものである。
【００３９】
「ヘキソンポリペプチド」は、アデノウイルスヘキソンコートタンパク質、その機能的断片、及び誘導体を指す。
【００４０】
「ファイバーポリペプチド」は、アデノウイルスファイバータンパク質、その機能的断片、及び誘導体を指す。
【００４１】
アデノウイルスに対する中和抗体の１つの標的は、主要なコートタンパク質であるヘキソンタンパク質である。血清型を定義し、中和抗体に結合するヘキソンタンパク質又はヘキソンタンパク質内の可変配列を、ヒト集団では希少なアデノウイルスに由来するヘキソンタンパク質又はヘキソンタンパク質内の可変配列で置き換えることは、ヒトで一般的に見られる抗体による中和の影響を受けにくいアデノウイルスベクターの構築を可能にし得る。
【００４２】
ヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）は、異なるアデノウイルス血清型間で最も高い可変性を示すヘキソンポリペプチドの領域である。一般に、これらのＨＶＲは、ヘキソンタンパク質三量体の溶媒露出表面に相当すると考えられ（インタクトなウイルス粒子の文脈内）、関連して、それらは、抗体媒介性アデノウイルス中和の重要な決定基であると予想される（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：２３９−４３（２００６））。したがって、所与のアデノウイルスベクターのヘキソンＨＶＲの、ヒトにおいて低い血清有病率を有する（又は有しない）アデノウイルのものによる置換は、ヒト標的集団における既存の抗ベクター体液性免疫を回避するための可能な手段となる。結果的に、主にＨＡｄＶ−５に基づくベクター内でヘキソン配列置換を伴うヘキソンキメラ化のコンセプトを探求する複数の研究が存在している（Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：６８７５−９（１９９８）；Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：１０２６０−４（１９９８）；Ｙｏｕｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：３１１−２０（２００２）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７６：１２７７５−８２（２００２）；Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．３３３：２０７−１４（２００５）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：２３９−４３（２００６）；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８６：１２６７−７２（２０１２）；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．４２１：１７０−６（２０１２）；Ｂｒｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．７（４）：ｅ３３９２０（２０１２））。
【００４３】
アデノウイルスに対する中和抗体の第２の標的は、ファイバータンパク質である。ファイバータンパク質を非ヒト起源である希少なアデノウイルスに由来するファイバー配列で置き換えること、より好ましくは、ファイバータンパク質内で可変配列を置き換えることは、ヒトで一般的に見られる抗体による中和の影響を受けにくいアデノウイルスベクターの構築をも可能にし得る。上記のファイバー置換とヘキソン置換との組合せは、ヒト集団に一般的に存在する抗体による中和に対する追加の抵抗性を付与することができる。
【００４４】
本開示は、導入遺伝子及びキメラヘキソン核酸配列を含むキメラアデノウイルスベクターを提供する。アデノウイルスベクターは、例えば、配列番号１又は配列番号２から選択されるアミノ酸配列を含むヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含むヘキソンポリペプチドをコードする核酸配列を含み得る。特定の実施形態では、ヘキソンポリペプチド配列は、配列番号３又は配列番号４を含む。アデノウイルスベクターは、例えば、ヒトアデノウイルス−４、ヒトアデノウイルス−５、ヒトアデノウイルス−２６、又はヒトアデノウイルス−３５に由来する１種以上の核酸配列を含み得る。特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、配列番号５又は配列番号６から選択される核酸配列を含む。
【００４５】
「アデノウイルスベクター」は、アデノウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するか又は含有する組換えベクターを指す。
【００４６】
典型的には、本発明のアデノウイルスベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、又はバキュロウイルスベクター上に組換えアデノウイルスゲノム全体を含む。本発明の核酸分子は、クローニングにより得られるか、又は合成的に生成されるＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。
【００４７】
当業者であれば、複数の血清型に由来する要素が単一の組換えアデノウイルスベクター、例えば、ヒト又はサルアデノウイルスにおいて組み合わせ得ることを認識するであろう。したがって、異なる血清型から望ましい特性を組み合わせるキメラアデノウイルスベクターが生成され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のキメラアデノウイルスベクターは、キメラヘキソン及び／又はファイバーポリペプチド配列の既存の免疫の不在を、ｒＡｄ４、ｒＡｄ５、ｒＡｄ２６、又はｒＡｄ３５などの現存するアデノウイルスベクターの高いレベルの抗原送達能力及び抗原提示能力と組み合わせることができた。
【００４８】
ワクチンとして使用するためのアデノウイルスベクターの利点としては、報告されている膨大な数のアデノウイルスベクターを用いた研究、開発、製造及び臨床試験における長年の経験に基づく、操作の容易性、良好な大規模での製造可能性、及び優れた安全性の記録が挙げられる。ワクチンとして用いられるアデノウイルスベクターは一般に、導入遺伝子にコードされたタンパク質又は導入遺伝子にコードされた遺伝子産物に対する良好な免疫応答、例えば細胞免疫応答をもたらす。本発明によるアデノウイルスベクターは、アデノウイルスの任意の型に基づいてもよく、特定の実施形態では、ヒトアデノウイルスであり、それは任意の群又は血清型であってもよい。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧに由来するヒトアデノウイルスに基づく。他の好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８、４９、又は５０に基づく。他の実施形態では、それはサルアデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルス又はゴリラアデノウイルスであり、それらは任意の血清型であってもよい。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、チンパンジーアデノウイルス１、３、７、８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７．１、２８．１、２９、３０、３１．１、３２、３３、３４、３５．１、３６、３７．２、３９、４０．１、４１．１、４２．１、４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０、６７、又はＳＡ７Ｐ型に基づく。
【００４９】
より好ましい実施形態では、第２の組成物のチンパンジーアデノウイルスベクターは、ＣｈＡｄＶ３である。組換えチンパンジーアデノウイルス血清型３（ＣｈＡｄ３又はｃＡｄ３）は、ヒトアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のものと類似した特性を有する亜群Ｃのアデノウイルスである。ＣｈＡｄ３は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のための候補ワクチンを評価するヒト試験において安全であり且つ免疫原性であることが示されている（Ｂａｒｎｅｓ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．２０１２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１１５ｒａ１）。ＣｈＡｄ３に基づくワクチンは、ヒトＡｄ５ベクターワクチンに匹敵する免疫応答を誘導できたことが報告された。例えば、Ｐｅｒｕｚｚｉ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：１２９３−３００及びＱｕｉｎｎ  ＫＭ，ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０：２７２０−３５；国際公開第２００５／０７１０９３号パンフレット；国際公開第２０１１／０１３０６２７号パンフレット等を参照されたい。
【００５０】
アデノウイルスベクター、その構築方法及びその増殖方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、同第５，８３７，５１１号明細書、同第５，８４６，７８２号明細書、同第５，８５１，８０６号明細書、同第５，９９４，１０６号明細書、同第５，９９４，１２８号明細書、同第５，９６５，５４１号明細書、同第５，９８１，２２５号明細書、同第６，０４０，１７４号明細書、同第６，０２０，１９１号明細書及び同第６，１１３，９１３号明細書、並びにそれぞれＶｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）の６７及び６８章に収録のＴｈｏｍａｓ  Ｓｈｅｎｋ，「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ」、並びに本明細書で言及している他の参考文献に記載されている。一般的には、アデノウイルスベクターの構築は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ（１９９２）、及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、並びに本明細書で言及している他の参考文献に記載されているものなど、標準的な分子生物学的手法の使用を含む。
【００５１】
特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１欠失及び／又はＥ３欠失を含む。Ｅ１又はＥ３欠失は、例えば、遺伝子の完全な欠失又は部分的な欠失を含むことができ、これによりＥ１又はＥ３遺伝子産物が機能的に欠損する。したがって、特定の実施形態では、アデノウイルスは、複製欠損であり、例えば、これは、ゲノムのＥ１領域に欠失を含むためである。当業者に知られるとおり、アデノウイルスゲノムから必須領域が欠失している場合、これらの領域でコードされる機能は、好ましくは、プロデューサー細胞によってトランスに提供される必要がある。すなわち、Ｅ１、Ｅ２及び／又はＥ４領域の一部又は全部がアデノウイルスから欠失している場合、これらは、プロデューサー細胞内、例えばそのゲノムに組み込まれるか、又はいわゆるヘルパーアデノウイルス若しくはヘルパープラスミドの形態で存在する必要がある。アデノウイルスは、Ｅ３領域内にも欠失を有し得るが、これは複製に不要であるため、そのような欠失は補完される必要はない。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４領域のうちの１つ以上はまた、目的の導入遺伝子（通常、プロモーターに連結されている）を不活性化されることになる領域に挿入するなど、他の手段によっても不活性化され得る。
【００５２】
使用可能なプロデューサー細胞（当該技術分野及び本明細書では、「パッケージング細胞」又は「補完細胞」と称される場合がある）は、所望のアデノウイルスが増殖し得る任意のプロデューサー細胞であり得る。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルス内の欠損を補完するプロデューサー細胞内で行われる。そのようなプロデューサー細胞は、好ましくは、それらのゲノム内に少なくとも１つのアデノウイルスＥ１配列を有し、それによりＥ１領域内に欠失を有する組換えアデノウイルスを補完することができる。任意のＥ１を補完するプロデューサー細胞、例えばＥ１により不死化されたヒト網膜細胞、例えば９１１又はＰＥＲ．Ｃ６細胞（米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照）、Ｅ１形質転換羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４号明細書を参照）、Ｅ１形質転換Ａ５４９細胞（例えば、国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１，６９０号明細書を参照）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１：２１３−１９）、２９３などを用いることができる。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞、又は９１１細胞、又はＩＴ２９３ＳＦ細胞などである。プロデューサー細胞内でのアデノウイルスベクターの産生は（Ｋｏｖｅｓｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｖｉｒｕｓｅｓ  ２：１６８１−７０３）において概説される。
【００５３】
特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、１種以上のヒトアデノウイルス核酸配列を含むキメラアデノウイルスベクターである。ヒトアデノウイルス核酸は、例えば、ヒトアデノウイルス−４（Ａｄ−４）、ヒトアデノウイルス−５（Ａｄ−５）、ヒトアデノウイルス−２６（Ａｄ−２６）、又はヒトアデノウイルス−３５（Ａｄ−３５）から選択され得る。特定の実施形態では、Ｅ１欠損アデノウイルスベクターは、ヒトＡｄ５のアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列を含む。これは、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現するよく知られた補完細胞株、例えば２９３細胞又はＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるそのようなアデノウイルスの増殖を可能にする（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＦａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：１９０９−１７，Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：２１３５−４３；国際公開第０３／１０４４６７号パンフレットを参照のこと）。
【００５４】
特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは導入遺伝子を含む。「導入遺伝子」は、ベクター中において天然に存在しない核酸である異種核酸を指し、本発明によれば、導入遺伝子は、対象において免疫応答を誘発する抗原性遺伝子産物又は抗原性タンパク質をコードし得る。導入遺伝子は、例えば、標準的な分子生物学的手法によってベクターに導入され得る。導入遺伝子は、例えば、アデノウイルスベクターの欠失したＥ１若しくはＥ３領域内、又はＥ４領域とｒＩＴＲとの間の領域内にクローン化され得る。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列に作動可能に連結される。好ましい実施形態では、導入遺伝子は、導入遺伝子挿入部位で挿入される。
【００５５】
必要に応じて、本発明の実施形態によるヘキソン又はファイバー核酸配列、及び／又は導入遺伝子は、治療される宿主（例えば、ヒト）における適切な発現を確実にするためにコドン最適化され得る。コドン最適化は、当該技術分野において広く適用されている技術である。
【００５６】
導入遺伝子は、アデノウイルス由来のプロモーター（例えば、主要後期プロモーター）の制御下に置かれ得る（すなわち、作動可能に連結され得る）か、又は異種プロモーターの制御下に置かれ得る。好適な異種プロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター及びＲＳＶプロモーターが挙げられる。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内部の目的の異種遺伝子の上流に位置する。
【００５７】
好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、配列番号５又は配列番号６から選択される核酸配列を含む。
【００５８】
免疫原性組成物
免疫原性組成物は、本発明における使用のための免疫学的有効量の精製された又は部分的に精製されたヒトアデノウイルスベクターを含む組成物である。前記組成物は、当該技術分野においてよく知られる方法に従ってワクチン（「免疫原性組成物」とも称される）として製剤化され得る。このような組成物は、免疫応答を増強させるためのアジュバントを含み得る。製剤における各々の構成成分の最適な比は、本開示に鑑みて当業者によく知られる技術によって決定され得る。
【００５９】
本発明の実施形態による免疫原性組成物は、本開示に鑑みて当業者に知られる方法を用いて作製され得る。液体医薬組成物としては、一般に、水、石油、動物油若しくは植物油、鉱油、又は合成油などの液体担体が挙げられる。生理食塩水溶液、ブドウ糖若しくは他の糖類溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれてもよい。
【００６０】
本発明に有用な免疫原性組成物は、アジュバントを含み得る。本発明による同時投与に好適なアジュバントは、人において潜在的に安全であり、十分に耐容性を示し且つ有効であるものであるべきであり、ＱＳ−２１、Ｄｅｔｏｘ−ＰＣ、ＭＰＬ−ＳＥ、ＭｏＧＭ−ＣＳＦ、ＴｉｔｅｒＭａｘ−Ｇ、ＣＲＬ−１００５、ＧＥＲＢＵ、ＴＥＲａｍｉｄｅ、ＰＳＣ９７Ｂ、Ａｄｊｕｍｅｒ、ＰＧ−０２６、ＧＳＫ−Ｉ，ＡＳ０１、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ＡＳ１５、ＧｃＭＡＦ、Ｂ−ａｌｅｔｈｉｎｅ、ＭＰＣ−０２６、Ａｄｊｕｖａｘ、ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ、Ａｌｕｍ、及びＭＦ５９を含む。
【００６１】
投与され得る他のアジュバントとしては、レクチン、増殖因子、サイトカイン及びリンホカイン、例えばアルファ−インターフェロン、ガンマインターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ｇＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇＭＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１２又はこれらのコード核酸が挙げられる。
【００６２】
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者によく知られる他の物質を含み得る。このような物質は、無毒性でなければならず、活性成分の効力を阻害してはならない。担体又は他の材料の厳密な性質は、投与経路、例えば筋肉内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内（例えば、腸）、鼻腔内又は腹腔内経路に依存し得る。
【００６３】
防御免疫を誘導するための方法
本発明の別の一般的な態様は、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法に関する。方法は、例えば、本明細書に記載されるアデノウイルスベクター及び薬学的に許容される担体を含むワクチンを対象に投与することを含み得る。また、本明細書ではワクチンを作製する方法も提供される。方法は、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む。
【００６４】
本明細書に記載されるものを含むが、それらに限定されない本発明の実施形態による免疫原性組成物のいずれかは、本発明の方法においてワクチンとして使用され得る。
【００６５】
ベクターを含む免疫原性組成物／ワクチンの投与は通常、筋肉内又は皮下である。しかしながら、静脈内、皮膚、皮内又は経鼻などの他の投与様式も同様に想定され得る。免疫原性組成物の筋肉内投与は、アデノウイルスベクターの懸濁剤を注射するためのニードルを使用することにより行われ得る。代替法は、組成物を投与する無針注射デバイスの使用（例えばＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標）を使用する）、又はワクチンを含有する凍結乾燥粉末である。
【００６６】
静脈内、皮膚若しくは皮下注射、又は罹患部位での注射のために、ベクターは、パイロジェンフリーであり且つ好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態となる。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張媒体を用いて好適な溶液を調製することが十分に可能である。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加剤が含まれ得る。徐放性製剤もまた利用され得る。
【００６７】
通常、投与は、感染又は症状の発症の前に目的の抗原（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、及び／又は真菌病原体）に対する免疫応答を発生させる予防的な目的を有することになる。本発明により治療又は予防され得る疾患及び障害は、免疫応答が防御的又は治療的な役割を果たすことができるものを含む。他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、曝露後の予防のために投与され得る。
【００６８】
キメラヒトアデノウイルスベクターを含有する免疫原性組成物を対象に投与すると、対象において目的の抗原に対する免疫応答が生じる。検出可能な免疫応答を誘導するのに十分な組成物の量は、組成物の「免疫原的有効用量」又は「有効量」と定義される。本発明の免疫原性組成物は、体液性及び細胞性免疫応答を誘導することができる。典型的な実施形態において、免疫応答は、防御免疫応答である。
【００６９】
投与される実際の量、及び投与の速度及び時間経過は、投与されているものの性質及び重症度に依存することになる。治療の処方、例えば、投与量などの決定は、一般開業医や他の医師、又は獣医の場合は獣医師の責任の範囲内であり、通常、治療対象の障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び開業医に知られるその他の要因を考慮する。上述の手法及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．，１９８０において見出され得る。
【００７０】
アデノウイルスベクターの作製及びこのような粒子の組成物への任意選択的な製剤化後、ベクターは、個体、特にヒト又は他の霊長類に投与され得る。投与は、ヒト又は別の哺乳動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、ロバ、サル、イヌ又はネコに対するものであり得る。非ヒト哺乳動物への送達は、治療目的である必要はないが、実験の状況、例えばアデノウイルスベクターに対する免疫応答の機構の究明に使用するためであり得る。
【００７１】
１つの例示的なレジメンにおいて、アデノウイルスベクターは、約１０４〜１０１２ウイルス粒子／ｍｌの濃度を含有する約１００μｌ〜約１０ｍｌの範囲の量で投与される（例えば、筋肉内）。好ましくは、アデノウイルスベクターは、０．１〜２．０ｍｌの範囲の量で投与される。例えば、アデノウイルスベクターは、１００μｌ、５００μｌ、１ｍｌ、２ｍｌで投与され得る。より好ましくは、アデノウイルスベクターは、０．５ｍｌの量で投与される。任意選択により、アデノウイルスベクターは、約１０７ｖｐ／ｍｌ、１０８ｖｐ／ｍｌ、１０９ｖｐ／ｍｌ、１０１０ｖｐ／ｍｌ、５×１０１０ｖｐ／ｍｌ、１０１１ｖｐ／ｍｌ、又は１０１２ｖｐ／ｍｌの濃度で投与され得る。通常、アデノウイルスベクターは、ヒト対象に１回の投与で約１０９〜約１０１２ウイルス粒子（ｖｐ）の量、より典型的には約１０１０〜約１０１２ｖｐの量で投与される。上記のとおり初回ワクチン接種の後にブーストが続く。
【００７２】
初回ワクチン接種の後、目的の抗原をコードする同じアデノウイルスベクターを含むワクチン／組成物又は目的の同じ抗原をコードする異なるアデノウイルスベクターを含むワクチン／組成物からのブースト又はキックが続き得る。
【００７３】
組成物は、必要に応じて、活性成分を含有する１つ以上の単位投薬形態を含むものであり得るキット、パック又はディスペンサーで提示され得る。キットは、例えば、金属又はプラスチックのホイル、例えばブリスターパックを含み得る。キット、パック又はディスペンサーに投与のための使用説明書を付随させてもよい。
【００７４】
本発明の組成物は、単独で又は他の治療と組み合わせて、治療対象の状態に応じて同時に又は順次に投与され得る。
【００７５】
実施形態
実施形態１は、配列番号１又は配列番号２から選択されるアミノ酸配列を含むヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含むヘキソンポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターである。
【００７６】
実施形態２は、ヘキソンポリペプチドが配列番号３又は配列番号４を含む、実施形態１のアデノウイルスベクターである。
【００７７】
実施形態３は、アデノウイルスベクターがさらにＥ１欠失を含む、実施形態１又は２のアデノウイルスベクターである。
【００７８】
実施形態４は、アデノウイルスベクターがさらにＥ３欠失を含む、実施形態１〜３のいずれか１つのアデノウイルスベクターである。
【００７９】
実施形態５は、アデノウイルスベクターがさらに、ヒトアデノウイルス−５（ＨＡｄＶ−５）Ｅ４  ｏｒｆ６を含む、実施形態１〜４のいずれか１つのアデノウイルスベクターである。
【００８０】
実施形態６は、アデノウイルスベクターが、配列番号５又は配列番号６から選択される核酸配列を含む、実施形態１〜５のいずれか１つのアデノウイルスベクターである。
【００８１】
実施形態７は、アデノウイルスベクターがさらに少なくとも１つの導入遺伝子を含む、実施形態１〜６のいずれか１つのアデノウイルスベクターである。
【００８２】
実施形態８は、導入遺伝子が、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失、及び／又は右逆位末端配列（ｒＩＴＲ）に隣接して位置する、実施形態１〜７のいずれか１つのアデノウイルスベクターである。
【００８３】
実施形態９は、アデノウイルスベクターが、ヒトアデノウイルス−２６（Ａｄ２６）に由来する１種以上の核酸配列を含む、実施形態１〜８のいずれか１つのアデノウイルスベクターである。
【００８４】
実施形態１０は、実施形態１〜９のいずれか１つのアデノウイルスベクターを含む組換え細胞である。
【００８５】
実施形態１１は、（ａ）実施形態１０の組換え細胞を、アデノウイルスベクターを産生するための条件下で増殖させること；及び（ｂ）組換え細胞からアデノウイルスベクターを単離することを含む、アデノウイルスベクターを作製する方法である。
【００８６】
実施形態１２は、実施形態１〜９のいずれか１つのアデノウイルスベクター及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物である。
【００８７】
実施形態１３は、実施形態１２の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法である。
【００８８】
実施形態１４は、実施形態１〜９のいずれか１つによるアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む、免疫原性組成物を作製する方法である。
【実施例】
【００８９】
実施例１：ヘキソンキメラアデノウイルスベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３の設計
この実施例では、チンパンジーアデノウイルスから得られた特定のヘキソン配列置換を保有する新規のＨＡｄＶ−２６に基づくベクターである、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３の設計について記載される。これらのヘキソンキメラアデノウイルスベクターは、製造可能であり、ＨＡｄＶ−２６とは血清学的に異なり、且つヒト集団において低い先在する免疫が存在する（又はない）、可能な新規のアデノウイルスに基づく（ワクチン）ベクターを作製する目的で設計された。
【００９０】
それぞれアデノウイルスベクターゲノム配列配列番号４、配列番号５、及び配列番号６を含むＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３が、以前に記載された組換えＨＡｄＶ−２６ベクター（国際公開第２００７１０４７９２Ａ２号パンフレット；Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）のヘキソンキメラバージョンとして設計された。したがって、これらのベクターは、以前に特定されたとおりの（国際公開第２００７１０４７９２Ａ２号パンフレット；Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）同じＥ１欠失、Ｅ３欠失、及びＥ４  ｏｒｆ６置換（ＨＡｄＶ−５のものによる）を保有するように設計された。
【００９１】
以下の実施例において記載されるとおりの本明細書で作製され且つ試験されるヘキソンキメラベクターの特定の変異体は、それぞれウイルスゲノム配列配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１を含むＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１．Ｆｌｕｃ、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．Ｆｌｕｃ、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．Ｆｌｕｃ、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃである。それらのベクター名において示されるとおり、これらのベクターは、それらのＥ１欠失の位置で、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）、又は呼吸器多核体ウイルス株Ａ２融合糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ２Ａ）、口蹄疫ウイルス２Ａペプチド、及びガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）の融合物であるキメラタンパク質「ＲＳＶ−ＦＡ２−２Ａ−ＧＬｕｃ」（ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ）のいずれかをコードするＣＭＶプロモーター駆動発現カセットを保有するように作製された。ＦＬｕｃ及びＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ発現カセットの両方が、ＣＭＶプロモーターによって駆動され、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを保有する。ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃに関するカセットはさらに、５’非翻訳領域内にヒトアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）遺伝子のイントロン２を含む配列を含有する。
【００９２】
アデノウイルスベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３（それぞれ配列番号４、配列番号５、及び配列番号６を含む）は、それらのＨＡｄＶ−２６に基づくゲノム内の特定のヘキソン遺伝子セグメントが、他のアデノウイルスの対応するヘキソン遺伝子セグメントによって置き換えられたという点でヘキソンキメラとして設計された。Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３のためのヘキソン配列ドナーとして作用するウイルスはそれぞれ、ＰｔｒｏＡｄＶ−１、ＰｔｒｏＡｄＶ−１２、及びＰｔｒｏＡｄＶ−１３であった。これらのウイルスは、野生のチンパンジーの糞便試料において同定され、ヒトアデノウイルス種Ｅ（ＨＡｄＶ−Ｅ）に割り当てられてきた（Ｗｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５（２０）：１０７７４−８４（２０１１））。これらのウイルスの部分的なヘキソン遺伝子配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ１６３９７１、ＪＮ１６３９８２、及びＪＮ１６３９８３の下で公的に提供された。ヘキソン配列に関するアクセプターベクターがＨＡｄＶ−２６、すなわちヒトアデノウイルス種Ｄ（ＨＡｄＶ−Ｄ）のメンバーに基づく一方で、３つのヘキソン配列ドナーウイルスがＨＡｄＶ−Ｅに属することを考慮すれば、本明細書で作製されるベクターは、混成アデノウイルス種ヘキソンキメラベクターとなる。
【００９３】
ヘキソンキメラベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３（及び導入遺伝子発現カセットを含有する本明細書で作製されるそれらの誘導体）を作製するために本明細書で置き換えられたＨＡｄＶ−２６ヘキソン遺伝子セグメントは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ１５３４７４（バージョン１）の下で寄託されたＨＡｄＶ−２６の野生型完全ゲノムのヌクレオチド１８１７８〜１８３５７、１８３７９〜１８４３８、１８５５６〜１８６３３、１８６８５〜１８７２３、及び１９０２７〜１９１５８に一致した。これらの５つのＨＡｄＶ−２６ヘキソン遺伝子セグメント、及びＰｔｒｏＡｄＶ−１、ＰｔｒｏＡｄＶ−１２、又はＰｔｒｏＡｄＶ−１３に由来するそれらの対応する置換セグメントは、超可変領域（ＨＶＲ）をコードする配列に大部分であるが全体的ではなく一致した。これは図１Ａにおいて示され、そこでは５つのセグメント及び以前に割り当てられたＨＶＲの位置は、ＨＡｄＶ−２６ヘキソン遺伝子の略図内に示される。さらに、より詳細には、これは、ＨＡｄＶ−２６、ＰｔｒｏＡｄＶ−１、ＰｔｒｏＡｄＶ−１２、及びＰｔｒｏＡｄＶ−１３の（部分的な）ヘキソンポリペプチド配列により実施されたアミノ酸アラインメントによって示され、そこでは、本明細書で交換された特定のセグメントは、以前に割り当てられたＨＶＲと並んで特に強調されている（図１Ｂ）。
【００９４】
注目すべきことに、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３を作製するために本明細書で置き換えられたＨＡｄＶ−２６の５つのヘキソン遺伝子セグメントは、ヘキソンキメラＨＡｄＶ−５に基づくベクターを記載している以前の報告（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：２３９−４３（２００６）；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８６：１２６７−７２（２０１２）；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．４２１：１７０−６（２０１２）；Ｂｒｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．７（４）：ｅ３３９２０（２０１２））において置き換えられたヘキソンＨＶＲを含む配列に全体的には一致しなかった。例えば、図１Ａ及び１Ｂにおいて示されるとおり、５つのヘキソン遺伝子セグメントは、ＨＡｄＶ−５に基づき且つＨＡｄＶ−４８のヘキソンＨＶＲを含むヘキソンキメラベクターであるＡｄ５ＨＶＲ４８（１−７）を作製するために以前に交換された７個のアミノ酸区間に完全には一致できなかった（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：２３９−４３（２００６））。
【００９５】
アデノウイルスベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３の完全なキメラヘキソン遺伝子ヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５において記載される。これらのベクターの完全なキメラヘキソンポリペプチドは、それぞれ配列番号１２、配列番号３、及び配列番号４において記載される。
【００９６】
実施例２：Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１．Ｆｌｕｃ、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．Ｆｌｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．Ｆｌｕｃの完全なアデノウイルスベクターゲノムを保有するプラスミドの分子構築
アデノウイルスＥ１領域におけるＣＭＶプロモーター駆動ＦＬｕｃ発現カセットを保有するＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３ベクターゲノム含有プラスミドは、ヘキソンキメラＦｌｕｃコード化ベクター「Ａｄ２６．ＨＶＲ５Ｃ」の作製について以前に記載されたものと同じ方法及び戦略を用いて構築された（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４１（３）：４１９−２９（２０１５）、付録の図４）。簡潔に述べると、ヘキソン遺伝子に対する所望の変更は、中間体の「ヘキソンシャトル」プラスミドｐＨｅｘ２６−Ｓｈｕｔｔｌｅ．ＢａｍＨＩの文脈において最初に導入された。これは、標準的な遺伝子合成及びサブクローニング手順によってなされ（ＧｅｎｅＡｒｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって実行された）、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５において記載される前述のキメラヘキソン遺伝子配列を保有する改変ヘキソンシャトルプラスミドが得られた。次に、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＢＪ５１８３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ／Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）における相同組換えによって、キメラヘキソン遺伝子は、ヘキソンシャトルプラスミドから、２つのＰａｃＩ制限部位の間においてＣＭＶプロモーター駆動Ｆｌｕｃコード化発現カセットによるそのＥ１欠失の位置に備えられたヘキソン遺伝子欠失組換えＨＡｄＶ−２６ベクターゲノムを保有するｐＡｄ２６．ｌｕｃ．ｄＨプラスミドに運ばれた。上記の分子クローニング手順によって、プラスミドｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１．ｌｕｃ（配列番号２０）、ｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１２．ｌｕｃ（配列番号２１；図２Ａ）、及びｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１３．ｌｕｃ（配列番号２２；図２Ｂ）の作製をもたらした。
【００９７】
３つの一致対照ヘキソンキメラアデノウイルスベクタープラスミドもまた、上記と全く同じ様式において構築された。ｐＡｄ２６．ＨＶＲ５．ｌｕｃ（配列番号１７）、ｐＡｄ２６．ＨＶＲ３５．ｌｕｃ（配列番号１８）、及びｐＡｄ２６．ＨＶＲ５２．ｌｕｃ（配列番号１９）と呼ばれるこれらのプラスミドにおいて、前述の５つのＨＡｄＶ−２６ヘキソン遺伝子セグメントのセットは、それぞれＨＡｄＶ−５、ＨＡｄＶ−３５、及びＨＡｄＶ−５２のセグメントの対応するセットによって置き換えられた。これらのプラスミドは、それぞれ配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５において記載されるキメラヘキソン遺伝子ヌクレオチド配列を含む。これらのヘキソン遺伝子は、それぞれ配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２８において記載されるキメラヘキソンポリペプチド配列をコードする。
【００９８】
実施例３：アデノウイルスベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１．Ｆｌｕｃ、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．Ｆｌｕｃ、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．Ｆｌｕｃの生存率、増殖効率、及び生産性の最初の評価
以前の研究は、混成アデノウイルス種ヘキソン配列交換を含むキメラアデノウイルスベクターが、生存不能であるか又は増殖キネティクスの遅延を示し且つ低い収量をもたらし得ることを示している（Ｙｏｕｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：３１１−２０（２００２）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７６：１２７７５−８２（２００２）；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８６：１２６７−７２（２０１２）；Ｂｒｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．７（４）：ｅ３３９２０（２０１２））。したがって、新規のヘキソンキメラアデノウイルス（ワクチン）ベクターは、基本的な増殖特性、生産収量、及び粒子品質について試験されるべきである。
【００９９】
本明細書で設計され且つ構築されるヘキソンキメラアデノウイルスベクターは、生存率、増殖効率、生産性、及び粒子の感染性について評価され、それらの親ＨＡｄＶ−２６に基づくベクターと比較した。この目的のため、アデノウイルスベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１．Ｆｌｕｃ、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．Ｆｌｕｃ、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．Ｆｌｕｃ、並びに対照ベクターＡｄ２６ＨＶＲ５．Ｆｌｕｃ、Ａｄ２６ＨＶＲ３５．Ｆｌｕｃ、及びＡｄ２６ＨＶＲ５２．Ｆｌｕｃを、リポフェクタミントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いる標準的な手順に従って、実施例２に記載される対応するＡｄベクターゲノムプラスミド（すなわち、それぞれｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１．ｌｕｃ、ｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１２．ｌｕｃ、ｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１３．ｌｕｃ、ｐＡｄ２６．ＨＶＲ５、ｐＡｄ２６．ＨＶＲ３５、及びｐＡｄ２６．ＨＶＲ５２）のＴ２５フラスコで培養されたＥ１補完ＰＥＲ．５５Ｋ細胞（Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７７：８２６３−７１（２００３））へのトランスフェクションによって作製した。トランスフェクションに先立って、Ａｄベクターゲノムプラスミドを、それぞれのアデノウイルスベクターゲノムをプラスミドから放出するためにＰａｃＩで消化した。トランスフェクト細胞培養物を毎日モニターして、最初のウイルスプラーク形成の発生日及び総細胞変性効果（ＣＰＥ）に達した日を登録した（表１）。完全なＣＰＥで、感染細胞及び培地を回収し、３サイクルの凍結融解によってウイルスが放出された。ウイルスレスキュートランスフェクションの回収後、Ｅ１補完細胞培養物に対する複数回の連続的な感染ラウンドによって、ウイルスをさらに増幅した。次に、ウイルスを粗製のウイルス回収物から（２工程の塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配超遠心法によって）精製した後、ウイルス粒子（ＶＰ）及び感染単位力価（ＩＵ／ｍＬ）を、全て以前に記載された標準的な方法によって決定した（Ａｌｂａ  Ｒ，Ｂａｋｅｒ  ＡＨ，Ｎｉｃｋｌｉｎ  ＳＡ．Ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１２；８９１：５５−８４．：５５−８４）。
【０１００】
【表１】
2021500899.tif 000002
【０１０１】
試験された６つのキメラベクターのうちのＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．Ｆｌｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．Ｆｌｕｃのみが、それらのカプシド改変がベクター生産性及び感染性を損なわなかったことを示す結果をもたらした（表１）。（Ｅ１補完細胞へのウイルスＤＮＡトランスフェクション後の）プラーク形成の発生の時間及び完全なＣＰＥに達するのに必要となる時間によって反映されるとおり、これらの２つのベクターのウイルスレスキュー及び増殖効率は、親ベクターＡｄ２６．Ｆｌｕｃについて見られたものの範囲内であった。これは、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１．Ｆｌｕｃ以外の試験された他のキメラベクターについてはそうではなかった。さらに、試験された全てのベクターのうちのＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．Ｆｌｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．Ｆｌｕｃは、大規模生産及び精製時に最も高いウイルス粒子（ＶＰ）収量をもたらした。最後に、他のキメラベクターが全て親Ａｄ２６．Ｆｌｕｃのものより高いＶＰ：ＩＵ比率を示した一方で、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．Ｆｌｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＦｌｕｃはＶＰ：ＩＵ比率の変化を有しないことが見出された。
【０１０２】
４つの他のキメラベクター、すなわち、Ａｄ２６ＨＶＲ５．Ｆｌｕｃ、Ａｄ２６ＨＶＲ３５．Ｆｌｕｃ、Ａｄ２６ＨＶＲ５２．Ｆｌｕｃ、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１．Ｆｌｕｃは、生産性及び／又は感染性が損なわれた様々な程度を示した。Ａｄ２６ＨＶＲ５２．Ｆｌｕｃは全く生存可能ではなかったが（すなわち、ウイルスＤＮＡトランスフェクション後にウイルスプラークが検出できなかった）、他の３つのベクターは順調にレスキューされた。これらの３つのうちのＡｄ２６ＨＶＲ５．Ｆｌｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲ３５．Ｆｌｕｃは、明らかにレスキュー及び増殖キネティクスの遅延し示したが、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１．Ｆｌｕｃは、親ベクターとほぼ同じくらい効率的にレスキューし且つ増殖するように見えた。精製されたベクターバッチの特徴付けにより、物理的なウイルス粒子の収量がＡｄ２６ＨＶＲ５．Ｆｌｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１．Ｆｌｕｃで特に影響を受けていることが明らかになったが、粒子の感染性はそれらのうちの３つ全てで強く損なわれているように見えた（これらのベクターで見られるより高いＶＰ：ＩＵ比率によって示される）。
【０１０３】
結論として、混成アデノウイルス種ヘキソン配列交換を含むヘキソンキメラベクターであるＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３は、良好な増殖及び生産性特性を示し、したがって、（製造性の観点から）新規のワクチンベクターとして作用する有望な候補であると考えられる。同じキメラヘキソン設計を用いるがヘキソン配列ドナーとして他のアデノウイルスを用いることによって作製された４つの他のヘキソンキメラベクターは、より好ましくない特性を示した。
【０１０４】
実施例４：アデノウイルスベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．Ｆｌｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．Ｆｌｕｃの作製
この実施例は、実施例６、８、及び９において記載される免疫原性、血清有病率、交差中和、及び製造性の実験において使用されるヘキソンキメラＦｌｕｃコード化アデノウイルスベクターの作製について記載する。
【０１０５】
それぞれアデノウイルスベクターゲノム配列配列番号８及び配列番号９を含む、アデノウイルスベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．Ｆｌｕｃ（Ａｄ２６Ｃ４ＮＶＴ００５とも命名される）及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．Ｆｌｕｃ（Ａｄ２６Ｃ３ＮＶＴ００５とも命名される）は、対応するＡｄベクターゲノムプラスミド（すなわち、それぞれｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１２．ｌｕｃ及びｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１３．ｌｕｃ）のＥ１補完ＰＥＲ．Ｃ６細胞へのトランスフェクションによって作製された。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の接着細胞培養物として増殖されたＰＥＲ．Ｃ６細胞へのトランスフェクションの前に、Ａｄベクターゲノムプラスミドは、ＰａｃＩで消化されて、プラスミドから対応するアデノウイルスベクターゲノムを放出した。トランスフェクションは、リポフェクタミントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて標準的な手順に従って実施された。ウイルスレスキュートランスフェクションの回収後、ＰＥＲ．Ｃ６細胞培養物に対する複数回の連続的な感染ラウンドによって、ウイルスをさらに増幅した。ウイルスを、以前に記載された２工程の塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配超遠心法を用いて粗製のウイルス回収物から精製した（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｂ−ｇｒｏｕｐ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｈｉｇｈ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｙｉｅｌｄ  ｉｎ  ＰＥＲ．Ｃ６  ｃｅｌｌｓ」，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７（８）：２１３５−４３（２００６））。ウイルス粒子（ＶＰ）力価は、以前に記載された分光光度法に基づく手順によって測定された（Ｍａｉｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｉｏｎ  ａｎｄ  ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅｓ  ２，７Ａ，ａｎｄ  １２」，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３６（１）：１１５−２５（１９６８））。
【０１０６】
実施例５：アデノウイルスベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃの作製
この実施例は、実施例７において記載される免疫原性実験において使用されるヘキソンキメラＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃコード化アデノウイルスベクターの作製について記載する。
【０１０７】
それぞれアデノウイルスベクターゲノム配列配列番号１０及び配列番号１１を含むアデノウイルスベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ（Ａｄ２６Ｃ４ＮＶＴ００１とも命名される）及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−Ｇｌｕｃ（Ａｄ２６Ｃ３ＮＶＴ００１とも命名される）の作製は、それぞれ前述のプラスミドｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１２．ｌｕｃ（配列番号２１；図２Ａ）及びｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１３．ｌｕｃ（配列番号２２；図２ｂ）、並びにプラスミドｐＡｄＡｐｔ２６．ＡｐｏＡＩ．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ（配列番号２９；図３）の使用を伴った。
【０１０８】
ｐＡｄＡｐｔ２６．ＡｐｏＡＩ．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃは、アデノウイルスＥ１欠失の位置で、「ＲＳＶ−ＦＡ２−２Ａ−ＧＬｕｃ」（ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ）をコードする前述の導入遺伝子発現カセットをさらに含有する以前に記載された（国際公開第２００７１０４７９２Ａ２号パンフレット；Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）Ｅ１欠失ＨＡｄＶ−２６に基づくベクターの左末端ゲノム断片を内部に持つプラスミドである。ｐＡｄＡｐｔ２６．ＡｐｏＡＩ．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃは、前記ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃカセットの作製及び前記左末端Ａｄベクターゲノム断片を内部に持つ以前に記載された（国際公開第２００７１０４７９２Ａ２号パンフレット；Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）プラスミドであるｐＡｄＡｐｔ２６への挿入を合わせたいくつかの標準的な遺伝子合成及び分子クローニング工程によって構築された。
【０１０９】
アデノウイルスベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃは、以下のとおりに作製された。プラスミドｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１２．ｌｕｃ及びｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１３．ｌｕｃを、これらのプラスミドからキメラヘキソン配列を含む特定の２８ｋｂの左末端欠失アデノウイルスベクターゲノム断片を放出するために制限酵素ＰａｃＩ及びＰｓｉＩによって消化した。得られたそれぞれの消化産物を、それぞれ別々にＥ１補完ＰＥＲ．Ｃ６にＰａｃＩ消化ｐＡｄＡｐｔ２６．ＡｐｏＡＩ．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃでコトランスフェクトして、図４において示されるとおりの重複しているベクターゲノム制限断片間の相同組換えを介するそれぞれのヘキソンキメラＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃコード化ウイルスのレスキューを可能にした。この戦略において、相同組換えは、ｐＡｄＡｐｔ２６．ＡｐｏＡＩ．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃの６．７ｋｂのＰａｃＩ−ＰａｃＩ制限断片（図４、上段）とｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１２．ｌｕｃ又はｐＡｄ２６．ＨＶＲＰｔｒ１３．ｌｕｃの２８ｋｂのＰｓｉＩ−ＰａｃＩ制限断片（図４、下段）の間の重複領域の２．７ｋｂ領域で発生する。トランスフェクションは、リポフェクタミントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて標準的な手順に従って実施された。２つのレスキューされたウイルスＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−Ｇｌｕｃの単一の単離されたプラークをさらにＰＥＲ．Ｃ６細胞で増殖させた後、精製し、実施例４においてベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＦＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．Ｆｌｕｃについて本明細書で記載されるとおりに力価測定した。
【０１１０】
新規のアデノウイルスベクターによって誘導される細胞性及び体液性免疫応答
実施例６及び７は、本明細書で生成された新規のＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３ベクターの免疫原性を評価するために実施された実験を記載する。これらの実験では、筋肉内免疫後のマウスにおいて、ベクターにコードされる（モデル）抗原に対する体液性及び細胞性免疫応答を誘導する能力について新規のベクターが評価された。ベクターは、２つの異なる抗原：ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）及びＲＳＶ−ＦＡ２−２Ａ−ＧＬｕｃ（ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ）を用いて試験された。ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃは、呼吸器多核体ウイルス株Ａ２融合糖タンパク質、口蹄疫ウイルス２Ａペプチド、及びガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）で構成されるキメラタンパク質である。各ベクターは、同じ抗原をコードする導入遺伝子カセットを保有するヒトアデノウイルス２６型（ＨＡｄＶ−２６、本明細書ではＡｄ２６とも称される）に基づくベンチマークベクターと並べて比較された。それぞれの抗原に対する免疫応答は、酵素免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、及びＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ抗原の場合は呼吸器多核体ウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）などのよく知られる免疫学的アッセイを用いて測定された。
【０１１１】
実施例６：Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＦＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＦＬｕｃによって誘導される細胞性免疫応答
新規のアデノウイルスベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３の細胞性免疫原性を評価するために、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、Ａｄ２６．ＦＬｕｃ（陽性対照）、ＦＬｕｃを発現するＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３ベクター（すなわち、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＦＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＦＬｕｃ）、又はＦＬｕｃをコードしないアデノベクターである空のＡｄ２６で筋肉内において免疫化した。ＦＬｕｃ発現ベクターは、マウス毎に１０９及び１０１０個のウイルス粒子（ｖｐ）で試験され、Ａｄ２６空ベクターは１０１０ｖｐで投与された。免疫化の２週間後、マウスを屠殺し、脾細胞を単離した（図５Ａ）。細胞性免疫応答を、１５量体の重複ＦＬｕｃペプチドプールによる一晩の脾細胞刺激後にＩＦＮ−γ分泌細胞の相対的な数を測定するエクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した（図５Ｂ）。結果は、高用量の免疫化（１０１０）で、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３ベクターにより誘導される細胞性免疫応答が、Ａｄ２６．Ｆｌｕｃに関して見られる応答と同じ範囲又はより高かったことを示す。
【０１１２】
全体的に見て、本発明のＦＬｕｃ発現組換えＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３アデノウイルスベクターにより誘導される細胞性免疫応答は、明らかにマウスにおけるこれらのベクターの強力な免疫原性を示している。
【０１１３】
実施例７：Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃによって誘導される細胞性及び体液性免疫応答
新規のＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３アデノウイルスベクターの免疫原性はさらに、ベクターにコードされた（モデル）ワクチン抗原としてＲＳＶ−ＦＡ２−２Ａ−ＧＬｕｃ（ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ）を用いて評価された。Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、３種の異なる濃度（それぞれマウス毎に１０８ｖｐ、１０９ｖｐ、又は１０１０ｖｐ）のＡｄ２６．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ（陽性対照）、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ、若しくはＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ、又はマウス毎に１０１０ｖｐのＡｄ２６．ＦＬｕｃ、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＦＬｕｃ、若しくはＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＦＬｕｃで筋肉内において免疫化した。免疫化の８週間後、マウスを屠殺し、血液試料及び脾細胞を回収した（図６Ａ）。様々な免疫パラメータを下記のとおりに評価した。
【０１１４】
ウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）を、呼吸器多核体ウイルス中和抗体を誘発するＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃの能力を評価するために実施した。図６Ｂは、免疫化の８週後に回収された血清試料について測定された呼吸器多核体ウイルス株Ａ２（ＲＳＶ  Ａ２）ＶＮＡ力価を示す。各点は１頭のマウスを表し；バーは群平均を表し、点線は定量下限に相当する（ＬＬＯＱ＝６，８８；直線性試料の平均終点力価）。結果は、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃによる１０１０ｖｐ用量の免疫化により、同じ抗原をコードするベンチマークのＡｄ２６について見られたものと同様のＲＳＶ  Ａ２中和力価が生じたことを示す。ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃをコードする３つの全てのベクターＡｄ２６、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３によって誘導される力価は、主に免疫化について使用された最も高い用量１０１０ｖｐで検出された。予想されるとおり、ＲＳＶ  Ａ２特異的応答は、ホタルルシフェラーゼをコードするそれぞれのアデノベクターに対して検出されなかった。
【０１１５】
ベクターにコードされた抗原に対する細胞性免疫の誘導は、ＲＳＶ−ＦＡ２特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価された。この目的のため、免疫化の８週間後、免疫化されたマウスから脾細胞を単離し、ＲＳＶ−ＦＡ２タンパク質を架橋する１５量体の重複ペプチドで一晩刺激し、細胞性免疫応答を、ＩＦＮ−γ分泌細胞の相対的な数を測定するエクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した。データは、ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃをコードする新規のベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３によって誘発される抗原特異的細胞性免疫応答が、用量依存的であり、且つそれぞれベンチマークベクターであるＡｄ２６．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃによって誘導されるものより用量毎に高い及び同様の大きさであったことを示す（図６Ｃ）。予想されるとおり、ＲＳＶＦ−ＦＡ２特異的応答は、ホタルルシフェラーゼをコードするアデノベクターで免疫化されたマウスの脾細胞から測定されなかった。
【０１１６】
ＲＳＶ−ＦＡ２特異的ＩｇＧ抗体を誘発するＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ発現ベクターの能力を、ＥＬＩＳＡによって評価した。ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ導入遺伝子又はホタルルシフェラーゼ（対照）を発現するＡｄ２６（陽性対照）、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３で免疫化されたマウスから免疫化の８週間後に回収された血清が、抗ＲＳＶ  ＦＡ２  ＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡにおいて試験された。特に、このＥＬＩＳＡは、組換え安定型プレ融合ＲＳＶ−ＦＡ２タンパク質（プレ−ＲＳＶ−Ｆ）に対して結合可能なＩｇＧ抗体を検出する。結果は、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃが、Ａｄ２６．ＲＳＶＦ−２Ａ−ＧＬｕｃによって誘導されるものに類似するプレＲＳＶ−Ｆ特異的ＩｇＧ抗体力価を用量依存的に誘発したことを示す（図６Ｄ）。予想されるとおり、ＲＳＶ−ＦＡ２特異的応答は、ホタルルシフェラーゼのみをコードするアデノベクターで免疫化されたマウスの血清から測定されなかった。グラフは、終点力価として計算されたＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ力価を示す（ｌｏｇ１０）。各点は１頭のマウスを表し；バーは群平均を表し、点線は、１，３６  ｌｏｇ１０として計算される定量下限（ＬＬＯＱ）である。
【０１１７】
まとめると、データは、新規のＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３アデノウイルスベクターが、ＨＡｄＶ−２６に基づくベンチマークベクターによって誘導されるものと同様の大きさの又はそれより高いコードされた抗原に対する強力な細胞性及び体液性免疫応答を誘導したことを示す。これらの免疫応答は、明らかにマウスにおけるＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３アデノウイルスベクターの強力な免疫原性を示す。
【０１１８】
実施例８：新規及び既存のアデノウイルスベクター間の血清学的交差中和の評価
新規のアデノウイルスワクチンベクターとしてのそれらの潜在的な有用性に関して、本明細書で作製される新規Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３アデノウイルスベクターは、好ましくは、ヒトアデノウイルス血清型ＨＡｄＶ−５及びＨＡｄＶ−３５に基づくベクターなどの、ワクチンベクターとして現在既に開発中の既存のアデノウイルスベクターとは血清学的に異なるであろう。したがって、交差中和試験を、ＨＡｄＶ−４、ＨＡｄＶ−５、ＨＡｄＶ−２６、及びＨＡｄＶ−３５に基づく新規Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３アデノウイルスベクター及びいくつかの既存のベクター間で実施した。この目的のため、これらのアデノウイルスベクターの１つに対してそれぞれ産生されるマウス抗血清は、アデノウイルス中和アッセイにおいて各種ベクターの各々に対して試験された。このアッセイのために使用されるマウス抗血清は、マウス当たり１０１０ベクター粒子によるそれらの免疫化の２週間又は８週間後にＢａｌｂ／Ｃマウスから回収された。アデノウイルス中和アッセイは、以前に記載されたとおりに行われた（Ｓｐａｎｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：５０４６−５０５２）。簡潔に述べると、１：１６の希釈度から始めて、血清を２倍ずつ段階希釈し、続いてホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）を発現するアデノウイルスベクターと事前に混合した後、Ａ５４９細胞とともに（細胞当たり５００個のウイルス粒子の感染の多重度で）一晩インキュベートした。感染の２４時間後に測定された感染細胞ライセートにおけるルシフェラーゼ活性レベルは、ベクター感染効率を表した。所与のベクターに対する中和力価は、ベクター感染効率の９０％の低減をもたらすことができる最高の血清希釈度として定義された。中和力価は、以下のカテゴリーに任意に分けられた：＜１６（中和なし）、１６〜２００、２００〜２，０００、及び＞２，０００。
【０１１９】
結果は、試験されたベクターの間で交差中和を示さないか又は非常に低いレベルの交差中和を示す（図７）。Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２はＡｄ２６及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３ベクターに対して；Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３はＡｄ２６及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２ベクターに対して、軽微な交差中和が観察された。これらのベクターについて見られる相反的な交差中和力価は、これらの同じベクターについて得られたそれぞれの相同的な中和力価より著しく低かった。重要なこととして、新規のＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３ベクターは、交差中和が非常に低いレベルで観察されたＡｄ２６を除いて、試験されたパネルに含まれるヒトアデノウイルスベクター、すなわち、Ａｄ３５、Ａｄ５及びＡｄ４と交差中和を示さなかった。したがって、新規のアデノウイルスベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３はそれぞれ、場合によっては、例えば、異種プライム−ブーストワクチン接種レジメンの文脈において、或いは又はさらに、異なる疾患若しくは抗原に対する一連の２回以上の継続的なワクチン接種の文脈において、連続的な免疫化におけるこれらの又は他の異なるアデノウイルスベクターの１種以上と組み合わせて使用され得る。
【０１２０】
実施例９：ヒト集団における新規のアデノウイルスベクターの血清有病率
有効なワクチンベクターとしてのそれらの潜在的な使用のために重要なことは、本明細書に記載される新規のアデノウイルスベクターが、ワクチン標的集団における高レベルの既存の抗ベクター体液性免疫によって妨げられないことである。したがって、ベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３はそれぞれ、米国（ＵＳ）及び欧州連合（ＥＵ）に居住する１８歳〜５５歳までの成人に由来する２００名のヒトコホート血清試料内のそれらの血清有病率について評価された。ベクターは、実施例７において実行され且つ以前に記載されたとおりの標準的なアデノウイルス中和アッセイを実施することによって、ヒト血清試料による中和について試験された（Ｓｐａｎｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：５０４６−５０５２）。簡潔に述べると、１：１６の希釈度から始めて、血清を２倍ずつ段階希釈し、続いてホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）を発現するアデノウイルスベクターと事前に混合した後、Ａ５４９細胞とともに（細胞当たり５００個のウイルス粒子の感染の多重度で）一晩インキュベートした。感染の２４時間後に測定された感染細胞ライセートにおけるルシフェラーゼ活性レベルは、ベクター感染効率を表した。所与のベクターに対する中和力価は、ベクター感染効率の９０％の低減をもたらすことができる最高の血清希釈度として定義された。中和力価は、以下のカテゴリーに任意に分けられた：＜１６（中和なし）、１６〜３００、３００〜１，０００、１０００〜４０００及び＞４０００。
【０１２１】
結果は、アデノウイルスベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３が、試験されたヒト対象において対照Ａｄ５ベクターより著しく低い結成有病率を有し、且つこれらの対象においてベンチマークＡｄ２６ベクターと同様の血清有病率を有することを示す（図８）。さらに、新規のＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３ベクターに対して見られた陽性中和力価は一般に、非常に低く、概して３００より高くなかった。対照的に、Ａｄ２６及びＡｄ５の両方に対して見られた陽性中和力価の大部分は、３００より高かった。
【０１２２】
まとめると、上のデータは、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３ベクターに対する既存の体液性抗ベクター免疫が、評価されたワクチン標的集団において低いと考えられ得ることを示し、これらのベクターがこれらの集団において有効なワクチンベクターとしての可能性を有することを示唆している。
【０１２３】
実施例１０：懸濁ＰＥＲ．Ｃ６細胞中のアデノウイルスベクター生産性
臨床試験及びそれ以降に使用されるアデノウイルスベクターは、スケーラブルな無血清アデノウイルス生産プラットフォームで高力価まで容易に生産可能である必要がある。本明細書で懸濁ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はｓＰＥＲ．Ｃ６とも呼ばれる懸濁適応ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は、バイオリアクターでのアデノウイルスベクターの大規模製造を支援し、高力価で臨床グレードのベクター製剤、例えば、ＨＡｄＶ−２６又はＨＡｄＶ−３５に基づくＥ１欠損ベクターを大量にもたらすことが示されているため、このようなプラットフォームとなる（欧州特許第２５３６８２９Ｂ１号明細書、欧州特許第２３５０２６８Ｂ１号明細書）。
【０１２４】
本明細書に記載される新規のベクターが、ｓＰＥＲ．Ｃ６細胞に基づく生産プロセスに合うかどうかに関する最初の評価として、小規模のベクター生産性実験を、振盪フラスコ中で培養されたｓＰＥＲ．Ｃ６細胞に対して実施した。これらの生産性実験は、新規キメラベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３（実施例４において記載される）のＦｌｕｃコード化バージョンを用いて実行された。ベンチマーク対照として、ＨＡｄＶ−２６に基づくベクターＡｄ２６．Ｆｌｕｃを使用した。４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ）を補充した１０ｍｌの総量のＰＥＲＭＥＸＣＩＳ（登録商標）培地（Ｌｏｎｚａから入手可能）中において１×１０６細胞／ｍｌの密度で振盪フラスコに播種された懸濁ＰＥＲ．Ｃ６細胞培養物が、様々なウイルス粒子（ＶＰ）対細胞比率で各種ベクターにより感染され、４日間インキュベートされた。感染のために使用された様々なＶＰ対細胞比率は、７０、１５０及び９００であった。感染細胞培養物の試料を毎日採取し、ＶＰ力価を、これらの試料中においてＣＭＶプロモーター（試験された全てのベクターに存在する）に特異的なプライマー及びプローブを用いる定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に基づくプロトコルによって決定した。このプロトコルでは、遊離のベクターＤＮＡ（すなわち、ウイルス粒子にパッケージされていないベクターゲノム）を除去するために、ｑＰＣＲの前に試験試料をＤＮＡ分解酵素処理する必要がある。
【０１２５】
キメラベクターＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２．ＦＬｕｃ及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３．Ｆｌｕｃについて得られた生産性の結果を図９に示す。２つのキメラベクターにより、親ベンチマークベクターＡｄ２６．Ｆｌｕｃに対して得られたものと同等であったＶＰ力価が得られた。これらの結果は、ｓＰＥＲ．Ｃ６に基づく無血清懸濁細胞培養物モデルに対して新規のキメラベクターの各々の良好な生産性を実証している。
【０１２６】
まとめると、上で示されるとおりの本発明の新規の組換えアデノウイルスベクターに対する体液性及び細胞性免疫応答の試験は、明らかにマウスにおけるこれらのベクターの強力な免疫原性を示す。加えて、これらのベクターは、特定の既存のアデノウイルスワクチンベクター候補（例えば、Ａｄ２６及びＡｄ３５）に対して交差中和抗体応答を誘導しないか、若しくはほとんど誘導せず、又はその逆もまた同じであること、及び互いに交差中和抗体応答を誘導しないか、又は非常に低い交差中和抗体応答のみを誘導することを実証した。さらに、新規のベクターは、ヒトにおいて低い血清有病率を示した。最後に、新規のベクターは、高い収量で容易に生産され得る。低い血清有病率、強力な免疫原性及び生産性の組合せは、本発明の新規のアデノウイルスベクターが、様々な病原体に対する新規のワクチンベクター候補として有用である可能性があり、且つさらに遺伝子治療及び／又は診断において有用性を有し得ることを示唆する。
【０１２７】
上記の実施形態に対して、この広い発明概念から逸脱することなく変更を加えることができることが当業者に理解されるであろう。したがって、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、本明細書によって規定される本発明の趣旨及び範囲に含まれる変形形態を包含することが意図されることを理解されたい。
【図１】
2021500899.tif 000003
【図２−１】
2021500899.tif 000004
【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
2021500899.tif 000010
【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021500899.tif 000017
2021500899.tif 000018
2021500899.tif 000019