(57)【要約】【課題】がん治療用のアリールイミダゾールに関する。【解決手段】本発明は、対象のがんの予防、軽減または治療方法であって、2021501203.tif 000031、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を治療上有効な量、その対象に投与することを含み、その対象が、ＤＮＡ修復遺伝子に変異を有する方法に関するものである。【選択図】図１
2021501203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のがんの予防、軽減または治療方法であって、下記の化合物Ｉ、
【化１】
2021501203.tif 000025
またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレートを治療上有効な量、前記対象に投与することを含み、前記対象が、ＤＮＡ修復遺伝子に変異を有する前記方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ修復遺伝子が、相同組み換え遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ修復遺伝子が、相同組み換え（ＨＲ）依存性のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）二本鎖切断（ＤＳＢ）修復経路の遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ修復遺伝子が、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｒａｄ５１、ＲＰＡ及びＸＲＣＣ３からなる群から選択した１つ以上の遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ修復遺伝子が、ＢＲＣＡ−１及び／またはＢＲＣＡ−２である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記対象では、ＤＮＡ修復遺伝子における変異がヘテロ接合型である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記対象では、前記相同組み換え（ＨＲ）依存性のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）二本鎖切断（ＤＳＢ）修復経路の遺伝子における変異がヘテロ接合型である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象では、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２における変異がヘテロ接合型である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記対象では、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２における変異がホモ接合型である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記がんが、造血癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、子宮頸癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、リンパ節癌、白血病、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、脳腫瘍、頭頸部癌、骨癌、咽頭口腔癌、ユーイング肉腫、皮膚癌、腎臓癌及び心臓癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記がんが、乳癌、肺癌、リンパ節癌、大腸癌、白血病、腎臓癌及び前立腺癌からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記がんが、乳癌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記がんが、ＢＲＣＡ関連癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＢＲＣＡ関連癌が、ＢＲＣＡ−１及び／またはＢＲＣＡ−２遺伝子の１つ以上の変異を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
第２の治療有効剤を治療上有効な量投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象に化合物Ｉを投与前、投与中または投与後に、前記第２の治療有効剤を投与する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の治療有効剤が、免疫療法剤、抗がん剤及び血管新生剤からなる群のうちの１つ以上から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の治療有効剤が、ＰＡＲＰ阻害剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＡＲＰ阻害剤が、オラパリブである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象で、化合物Ｉ
【化２】
2021501203.tif 000026
またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレートを治療上有効な量投与されなかった対象と比べて、骨髄活性の低下が９０％未満となる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象で、骨髄活性の低下が１０％未満となる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象で、骨髄活性の低下が見られない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が、すでにがんである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象で、がんと関連する腫瘍のサイズの低減または縮小が見られる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象で、前記がんと関連する前記腫瘍が完全に消失する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象で、がんと関連する腫瘍における新生血管形成または血管新生が阻害、減少または低減される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
がん細胞の殺傷方法であって、前記細胞と、治療上有効な量の化合物Ｉ
【化３】
2021501203.tif 000027
またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレートを接触させることを含む前記方法。
【請求項２９】
前記がん細胞が、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｒａｄ５１、ＲＰＡ及びＸＲＣＣ３からなる群から選択した１つ以上の遺伝子を欠損している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
がん細胞における細胞周期停止の誘導方法であって、前記細胞と、治療上有効な量の化合物Ｉ
【化４】
2021501203.tif 000028
またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレートを接触させることを含む前記方法。
【請求項３１】
前記がん細胞が、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｒａｄ５１、ＲＰＡ及びＸＲＣＣ３からなる群から選択した１つ以上の遺伝子を欠損している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
対象のがんの予防、軽減または治療方法であって、
【化５】
2021501203.tif 000029
の１つ以上の分子を治療上有効な量、１つ以上の金属原子との錯体で投与すること含み、前記対象が、ＤＮＡ修復遺伝子に変異を有する前記方法。
【請求項３３】
前記１つ以上の金属原子が、鉄、亜鉛、アルミニウム、マグネシウム、白金、銀、金、クロム、ニッケル、チタン、銅、スカンジウム、ジルコニウム、バナジウム、モリブデン、マンガン、タングステン及びコバルトからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ以上の金属原子が、鉄である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記錯体が、下記の構造を有する、請求項３４に記載の方法。
【化６】
2021501203.tif 000030
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１０月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／５７８，９３８号に基づく利益を主張するものであり、この仮出願の内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は概して、対象のがんの予防、軽減または治療方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
乳癌感受性遺伝子によってコードされるタンパク質（ＢＲＣＡタンパク質）は、乳癌、卵巣癌及びその他のがんに対する素因と関連付けられている。これらのタンパク質は、ユビキタスに発現することによって、ＤＮＡの修復及び組み換え、細胞周期のチェックポイント制御及び転写を含め、すべての細胞に不可欠な多くのプロセスに関与している。
【０００４】
具体的には、乳癌に対する遺伝的感受性は、特定の遺伝子（例えば、ＢＲＣＡ−１及びＢＲＣＡ−２）の変異に関連付けられている。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質は、染色体構造を維持するように作用すると考えられるが、それらのタンパク質は多くのプロセスに関与するため、その正確な役割は不明である。変異により、そのタンパク質が欠損し、それが原因で、ＢＲＣＡ欠損細胞において染色体が不安定になることで、それらの細胞が、腫瘍性トランスフォーメーションを起こしやすくなると仮定されている。
【０００５】
ＢＲＣＡ−１遺伝子及びＢＲＣＡ−２遺伝子の変異を原因の一部として、乳癌症例の約１０％は、家族に集積しており、この変異により、がんのリスクが高くなる。腫瘍の抑制と関連付けられている他の遺伝子の変異が、がんの素因となることもある。これらの変異としては、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子、ＳＴＫ１１／ＬＫＢ遺伝子、タンパク質キナーゼ遺伝子またはＰＴＥＮホスファターゼ遺伝子の変異が挙げられる。
【０００６】
腫瘍で相同組み換えを欠損させると、腫瘍細胞を選択的に殺傷する機会が得られるが、この機会を利用する目的で現在用いられている薬物では、用量を制限する重篤な骨髄抑制が起きる。したがって、当該技術分野において、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２の機能喪失によって過敏性が生じる薬物であるが、骨髄抑制を起こさない薬物を特定する最優先の未充足ニーズが依然として存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、対象のがんの予防、軽減または治療方法に関するものである。
【０００８】
一実施形態では、本開示は、対象のがんの予防、軽減または治療方法であって、化合物Ｉ
【化１】
2021501203.tif 000003
、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を治療上有効な量、その対象に投与することを含み、その対象が、ＤＮＡ修復遺伝子に変異を有する方法に関するものである。特定の実施形態では、そのＤＮＡ修復遺伝子は、相同組み換え遺伝子である。例えば、そのＤＮＡ修復遺伝子は、相同組み換え（ＨＲ）依存性のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）二本鎖切断（ＤＳＢ）修復経路の遺伝子である。いくつかの実施形態では、そのＤＮＡ修復遺伝子は、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｒａｄ５１、ＲＰＡ及びＸＲＣＣ３からなる群から選択した１つ以上の遺伝子である。例えば、そのＤＮＡ修復遺伝子は、ＢＲＣＡ−１及び／またはＢＲＣＡ−２である。一実施形態では、その対象は、ヒトである。
【０００９】
一実施形態では、その対象は、ＤＮＡ修復遺伝子における変異がヘテロ接合型である。特定の実施形態では、その対象は、相同組み換え（ＨＲ）依存性のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）二本鎖切断（ＤＳＢ）修復経路の遺伝子における変異がヘテロ接合型である。一実施形態では、その対象は、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２における変異がヘテロ接合型である。別の実施形態では、その対象は、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２における変異がホモ接合型である。
【００１０】
一実施形態では、そのがんは、血液がん、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、子宮頸癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、リンパ節癌、白血病、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、脳腫瘍、頭頸部癌、骨癌、咽頭口腔癌、ユーイング肉腫、皮膚癌、腎臓癌及び心臓癌からなる群から選択する。特定の実施形態では、そのがんは、乳癌、肺癌、卵巣癌、リンパ節癌、大腸癌、白血病、腎臓癌及び前立腺癌からなる群から選択する。一実施形態では、そのがんは、乳癌である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、そのがんは、血液悪性腫瘍である。血液悪性腫瘍の例としては、白血病、リンパ腫、ホジキン病及び骨髄腫が挙げられるが、これらに限らない。また、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好中球性白血病（ＣＮＬ）、急性未分化白血病（ＡＵＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、成人Ｔ細胞ＡＬＬ、３血球系異形成を伴うＡＭＬ（ＡＭＬＩＴＭＤＳ）、混合系統白血病（ＭＬＬ）、好酸球性白血病、マントル細胞リンパ腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）（例えば高リスクＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）及び多発性骨髄腫（ＭＭ）である。いくつかの実施形態では、そのがんは、急性骨髄性白血病である。いくつかの実施形態では、そのがんは、慢性骨髄性白血病である。いくつかの実施形態では、そのがんは、リンパ腫である。いくつかの実施形態では、そのがんは、高リスク骨髄異形成症候群である。
【００１２】
一実施形態では、そのがんは、ＢＲＣＡ関連癌である。特定の実施形態では、そのＢＲＣＡ関連癌は、ＢＲＣＡ−１遺伝子及び／またはＢＲＣＡ−２遺伝子の１つ以上の変異を有する。
【００１３】
一実施形態では、本開示の方法は、第２の治療有効剤を治療上有効な量投与することをさらに含む。その第２の治療有効剤は、対象に
【化２】
2021501203.tif 000004
を投与前、投与中または投与後に投与する。その第２の治療有効剤は、免疫療法剤、抗がん剤及び血管新生剤からなる群のうちの１つ以上から選択する。一実施形態では、その第２の治療有効剤は、ＰＡＲＰ阻害剤である。例えば、そのＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブである。
【００１４】
一実施形態では、その対象は、
【化３】
2021501203.tif 000005
、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を治療上有効な量投与されなかった対象と比べて、骨髄活性の低下が９０％未満となる。例えば、その対象は、骨髄活性の低下が１０％未満となるか、または骨髄活性の低下が見られない場合がある。
【００１５】
一実施形態では、その対象は、すでにがんである。特定の実施形態では、すでにがんであるその対象において、がんと関連する腫瘍のサイズの低減または縮小が見られる。例えば、その対象において、がんと関連する腫瘍が完全に消失する。特定の実施形態では、すでにがんであるその対象において、がんと関連する腫瘍内での新生血管形成または血管新生の阻害、減少または低減が見られる。
【００１６】
別の実施形態では、本開示は、がん細胞の殺傷方法であって、該細胞と、治療上有効な量の
【化４】
2021501203.tif 000006
、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を接触させることを含む方法に関するものである。一実施形態では、そのがん細胞は、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｒａｄ５１、ＲＰＡ及びＸＲＣＣ３からなる群から選択した１つ以上の遺伝子を欠損している。
【００１７】
別の実施形態では、本開示は、がん細胞における細胞周期停止の誘導方法であって、該細胞と、治療上有効な量の細胞を接触させることによって、それらの細胞が腫瘍性トランスフォーメーションを起こしやすくすることを含む方法に関するものである。
【００１８】
別の実施形態では、本開示は、対象のがんの予防、軽減または治療方法であって、
【化５】
2021501203.tif 000007
の１つ以上の分子を治療上有効な量、１つ以上の金属原子との錯体で投与することを含み、その対象が、ＤＮＡ修復遺伝子に変異を有する方法に関するものである。一実施形態では、その１つ以上の金属原子は、鉄、亜鉛、アルミニウム、マグネシウム、白金、銀、金、クロム、ニッケル、チタン、銅、スカンジウム、ジルコニウム、バナジウム、モリブデン、マンガン、タングステン及びコバルトからなる群から選択する。一実施形態では、その１つ以上の金属原子は、鉄である。特定の実施形態では、その錯体は、以下の構造を有する。
【化６】
2021501203.tif 000008
【００１９】
下にさらに詳細に論じられている上記の概念及び追加の概念を組み合わせたもの（ただし、それらの概念が互いに矛盾しないことを条件とする）はいずれも、本明細書に開示されている本発明の主題の一部として企図されていることは言うまでもない。特には、本開示の最後に見られる、特許請求の対象とする主題を組み合わせたものはいずれも、本明細書に開示されている本発明の主題の一部として企図されている。本明細書で明示的に用いられている専門用語のうち、参照により援用されるいずれの開示でも見られ得る専門用語には、本明細書に開示されている特定の概念と最も整合する意味を付与すべきことも言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｆｅ（化合物Ｉ）３が、化合物Ｉの細胞内活性型であることを示している。Ａは、化合物Ｉの構造である。Ｂは、Ｆｅ（化合物Ｉ）３の構造である。Ｃは、Ｒａｊｉ細胞における化合物Ｉ（■）及びＦｅ（化合物Ｉ）３（●）の相対的な細胞毒性である。Ｄは、０．５μＭの化合物Ｉ（■）またはＦｅ（化合物Ｉ）３（■）に６時間暴露させたＲａｊｉ細胞における化合物Ｉ及びＦｅ（化合物Ｉ）３の細胞内蓄積である。縦棒は、±標準誤差であり、標準誤差が示されていないのは、その縦棒のサイズよりも小さい場合である。＊＊＊は、Ｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。
【図２】化合物Ｉが、ＤＮＡを損傷させることを示している。Ａは、Ｒａｊｉ細胞におけるリン酸化ＡＴＭ、γＨ２ＡＸ及び切断ＰＡＲＰの蓄積を０．５μＭの化合物Ｉへの暴露期間の関数として示したものである。示されているイムノブロット画像は、３回の独立した実験のうちの代表的なものである。Ｂは、ＤＭＳＯで処理したＣＡＯＶ３細胞と化合物Ｉで処理したＣＡＯＶ３細胞を比較した、核フォーカス形成の代表的な免疫蛍光画像である。Ｃは、１細胞当たりのγＨ２ＡＸフォーカス数の平均±標準誤差であり、Ｎ＝１００である。Ｄは、ＤＭＳＯまたは０．５μＭの化合物Ｉで６時間処理したＣＡＯＶ３細胞におけるテールＤＮＡの割合（％）を中性コメットアッセイによって定量した結果を示す箱ひげ図であり、Ｎ＝調べた細胞の数である。縦棒は、±標準誤差であり、＊は、ｐ＜０．０５であり、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。
【図３Ａ】ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の機能の喪失により、化合物Ｉに対して過敏性となることを示している。オラパリブ（右）及び化合物Ｉ（左）に対するＢＲＣＡ１非欠損及びＢＲＣＡ１欠損の同種同系ＭＣＦ１０Ａクローンの感受性を示している。
【図３Ｂ】ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の機能の喪失により、化合物Ｉに対して過敏性となることを示している。オラパリブ（右）及び化合物Ｉ（左）に対するＢＲＣＡ１非欠損及びＢＲＣＡ１欠損の同種同系ｈＴＥＲＴ−ＩＭＥＣクローンの感受性を示している。
【図３Ｃ】ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の機能の喪失により、化合物Ｉに対して過敏性となることを示している。オラパリブ（右）及び化合物Ｉ（左）に対するＢＲＣＡ１非欠損及びＢＲＣＡ１欠損の同種同系ＭＣＦ７の感受性を示している。
【図３Ｄ】ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の機能の喪失により、化合物Ｉに対して過敏性となることを示している。オラパリブ及び化合物Ｉに対するＢＲＣＡ２非欠損同種同系ＰＥＯ４及びＢＲＣＡ２欠損同種同系ＰＥＯ１の感受性を示している。
【図３Ｅ】ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の機能の喪失により、化合物Ｉに対して過敏性となることを示している。オラパリブ及び化合物Ｉに対するＨＣＴ１１６  ＢＲＣＡ２欠損クローンの感受性を示している。
【図３Ｆ】ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の機能の喪失により、化合物Ｉに対して過敏性となることを示している。ＤＭＳＯまたは示されている濃度の化合物Ｉで２４時間処理したＭＣＦ７コントロール及びｓｈＢＲＣＡ１クローンＥ７細胞におけるｇ−Ｈ２ＡＦＸの蓄積を示している。縦棒は、±標準誤差である。＊＊＊は、Ｐ＜０．００１である。
【図３Ｇ】ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の機能の喪失により、化合物Ｉに対して過敏性となることを示している。ＤＭＳＯまたは示されている濃度の化合物Ｉで２４時間処理したＢＲＣＡ２非欠損ＨＣＴ１１６及びＢＲＣＡ２欠損クローンＢ１８細胞におけるｇ−Ｈ２ＡＦＸの蓄積を示している。縦棒は、±標準誤差である。＊は、Ｐ＜０．０５であり、＊＊は、Ｐ＜０．０１である。
【図４】化合物Ｉ耐性細胞（化合物ＩＲという）の特徴を示している。Ａは、Ｒａｊｉ細胞（●）、Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞（■）、及び無薬剤培地中で３カ月培養した後のＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞（▲）の濃度−生存率曲線である。Ｂは、ＤＭＳＯまたは０．５μＭの化合物Ｉで２４時間処理したＲａｊｉ細胞及びＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞におけるアポトーシスに関与するタンパク質のウエスタンブロット解析結果である。Ｃは、０．５μＭの化合物Ｉに６時間暴露させた後のＲａｊｉ細胞及びＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞における化合物Ｉ（■）及びＦｅ（化合物Ｉ）３（■）の細胞内蓄積結果である。Ｄは、６時間時点のＲａｊｉ細胞及びＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞におけるＦｅ（化合物Ｉ）３の細胞内蓄積結果を化合物Ｉ濃度の関数として示したものである。縦棒は、±標準誤差であり、＊＊は、ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、ｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。
【図５Ａ】化合物Ｉ耐性におけるＡＢＣＧ２の役割を示している。Ｒａｊｉ細胞及びＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞におけるＡＢＣＧ２  ｍＲＮＡの相対的レベルである。縦棒は、±標準誤差であり、＊＊は、ｐ＜０．０１である。
【図５Ｂ】化合物Ｉ耐性におけるＡＢＣＧ２の役割を示している。ビオチン化タンパク質のウエスタンブロットでは、抗ＡＢＣＧ２抗体でプローブした。Ｎａ／Ｋ  ＡＴＰａｓｅが、ローディングコントロールとしての働きを果たした。
【図５Ｃ】Ｒａｊｉ細胞（●）及びＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞（■）におけるＫｏ１４３の細胞毒性である。縦棒は、±標準誤差である。
【図５Ｄ】化合物Ｉのみで処理したＲａｊｉ細胞（●）、化合物Ｉのみで処理したＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞（■）、化合物Ｉと５ｎＭのＫｏｌ４３を組み合わせて処理したＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞（▲）、または化合物Ｉと５０ｎＭのＫｏｌ４３を組み合わせて処理したＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞（▼）の濃度−生存率曲線である。縦棒は、±標準誤差である。
【図５Ｅ】Ｒａｊｉ細胞におけるトポテカン（●）、Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞におけるトポテカン（■）、ならびにＲａｊｉ／化合物ＩＲにおけるトポテカン及び５０ｎＭのＫｏ１４３の組み合わせ（▲）の細胞毒性である。縦棒は、±標準誤差であり、＊＊は、ｐ＜０．０１である。
【図５Ｆ】Ｒａｊｉ細胞におけるカルボプラチン（●）、Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞におけるにおけるカルボプラチン（■）、ならびにＲａｊｉ／化合物ＩＲにおけるカルボプラチン及び５０ｎＭのＫｏ１４３の組み合わせ（▲）の細胞毒性である。縦棒は、±標準誤差であり、＊＊は、ｐ＜０．０１である。
【図５Ｇ】ｐｃＤＮＡをトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３（●）及びＡＢＣＧ２をトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３クローンＲ５（■）を化合物Ｉで処理したものの濃度−生存率曲線である。縦棒は、±標準誤差である。
【図６】化合物Ｉ及びＦｅ（化合物Ｉ）３の流入及び排出を示している。Ａは、０．５μＭの化合物ＩとともにインキュベートしたＲａｊｉ細胞及びＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞への化合物Ｉ及びＦｅ（化合物Ｉ）３の蓄積の経時的経過である。Ｂは、０．５μＭのＦｅ（化合物Ｉ）３とともにインキュベートしたＲａｊｉ細胞及びＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞へのＦｅ（化合物Ｉ）３の蓄積の経時的経過である。Ｃは、０．５μＭの化合物Ｉに６時間暴露させることによって負荷されたＲａｊｉ細胞及びＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞から、化合物Ｉ及びＦｅ（化合物Ｉ）３が２時間で排出した結果である。
【図７】Ｒａｊｉ細胞におけるリン酸化ＡＴＭ、γＨ２ＡＸ及び切断ＰＡＲＰの蓄積をＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞における蓄積と比較したもの示している。
【図８】白血病細胞株及びリンパ腫細胞株に対する化合物Ｉの抗増殖活性を示している。Ａは、化合物Ｉで５日間処理したＡＭＬ細胞株の濃度−応答曲線である。細胞の成長が、ビヒクルで処理した細胞の成長に対する割合（％）として表されている。Ｂは、他の白血病細胞株及びリンパ腫細胞株の濃度−応答曲線である。エラーバーは、少なくとも３回の反復アッセイの±標準偏差である。
【図９】化合物Ｉが、ＡＭＬ細胞株において、用量依存的かつ時間依存的にＧ０−Ｇ１細胞周期の停止を誘導することを示している。Ａの上図は、示されている濃度の化合物Ｉで２４時間処理したＭＶ４−１１細胞である。細胞周期分布は、材料及び方法の節で説明されているようにしてアッセイした。下図は、化合物Ｉに２４時間暴露させた後のＭＶ４−１１細胞におけるＣＤＫ４及びＣＣＮＤ３のタンパク質レベルである。タンパク質レベルは、３回の独立したウエスタンブロットから定量したものであり、ビヒクルに対する倍率変化としてグラフ化した。Ｂは、化合物ＩがＫＧ−１細胞における細胞周期分布に及ぼした作用である。Ｃは、化合物ＩがＥＯＬ−１細胞における細胞周期分布に及ぼした作用である。Ｄは、化合物Ｉ（５００ｎｍｏｌ／Ｌ）がＭＶ４−１１細胞における細胞周期分布に及ぼした作用を暴露期間の関数として示したものである。Ｅは、化合物Ｉ（６００ｎｍｏｌ／Ｌ）がＫＧ−１細胞における細胞周期分布に及ぼした作用を暴露期間の関数として示したものである。Ｆは、化合物Ｉ（３００ｎｍｏｌ／Ｌ）がＥＯＬ−１細胞における細胞周期分布に及ぼした作用を暴露期間の関数として示したものである。エラーバーは、フローサイトメトリーでは２回の反復アッセイ、ウエスタンブロットでは３回反復分の±標準偏差である。
【図１０】は、化合物Ｉによる処理によって、時間依存的かつ濃度依存的に、アポトーシスが誘導されることを示している。Ａは、化合物Ｉに２４時間暴露させた後のＭＶ４−１１細胞、ＫＧ−１細胞及びＥＯＬ−１細胞におけるアポトーシス（初期及び後期）の割合（％）である。アポトーシスは、材料及び方法の節で説明されているようにして測定した。Ｂは、ＰＡＲＰ１特異的抗体によって、ビヒクル（Ｖ）または化合物Ｉ（Ａ）で２４時間処理したＡＭＬ細胞のウエスタンブロット解析を行った結果である。ＰＡＲＰ１抗体は、完全長ＰＡＲＰ１（上のバンド）及び切断ＰＡＲＰ１（下のバンド）の両方を認識する。Ｃは、５００ｎｍｏｌ／Ｌの化合物Ｉで１〜２４時間処理したＭＶ４−１１細胞、ＫＧ−１細胞及びＥＯＬ−１細胞においてＰＡＲＰ１の切断のウエスタンブロット解析を行った結果である。ＧＡＰＤＨは、ローディングコントロールとして含まれている。Ｄは、ＭＶ４−１１細胞（５００ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＫＧ−１細胞（６００ｎｍｏｌ／Ｌ）及びＥＯＬ−１細胞（３００ｎｍｏｌ／Ｌ）において、化合物Ｉによって誘導されたアポトーシスの経時的経過である。エラーバーは、２回の反復アッセイの±標準偏差である。
【図１１】ＭＹＣのＲＮＡ及びタンパク質の発現が、化合物Ｉによって負に調節されることを示している。Ａは、ＡＭＬ株を２４時間処理し、ＭＹＣ特異的プライマー／プローブ対を用いたｑＲＴ−ＰＣＲによって、ＭＹＣ  ｍＲＮＡレベルを測定したものである。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、ビヒクルに対する割合（％）としてグラフ化した。Ｂは、列挙されている濃度で２４時間処理したＭＶ４−１１細胞、ＫＧ−１細胞及びＥＯＬ−１細胞におけるＭＹＣタンパク質レベルのウエスタンブロット解析を行った結果である。ＧＡＰＤＨは、ローディングコントロールとしての働きを果たした。Ｃは、５００ｎｍｏｌ／Ｌの化合物Ｉで、列挙されている時間にわたって処理したＭＶ４−１１細胞、ＫＧ−１細胞及びＥＯＬ−１細胞において、ビヒクルに対する倍率変化としてグラフ化したＭＹＣ  ｍＲＮＡの発現のヒストグラムプロットである。Ｄは、ＡＭＬ細胞株におけるＭＹＣ  ｍＲＮＡの基底発現レベルを健常ドナー由来のＰＢＭＣと比較したものである。ＧＡＰＤＨに対する発現をｑＲＴ−ＰＣＲによってアッセイした。エラーバーは、少なくとも３回の反復実験の±標準偏差である。
【図１２】化合物ＩがＤＤＲ経路を誘導することを示している。Ａは、ビヒクル（Ｖ）または５００ｎｍｏｌ／Ｌの化合物Ｉ（Ａ）で、漸増期間にわたって処理したＭＶ４−１１細胞における全ＴＰ５３タンパク質レベルである。Ｂは、Ａにおけるように処理したＭＶ４−１１細胞において、ウエスタンブロット解析によって検出された、ＴＰ５３の翻訳後修飾である。Ｃは、５００ｎｍｏｌ／Ｌの化合物Ｉに暴露させたＭＶ４−１１細胞のウエスタンブロット解析の結果である。Ｄは、化合物Ｉで２４時間、示されている濃度で処理したＭＶ４−１１細胞、ＫＧ−１細胞及びＥＯＬ−１細胞におけるγＨ２ＡＸ（Ｈ２ＡＸリン酸化Ｓ１３９）のレベルのウエスタンブロット解析の結果である。
【図１３Ａ】錯体Ｆｅ（化合物Ｉ）３のインビトロ活性及び細胞内活性を示している。親化合物ＩまたはＦｅ（化合物Ｉ）３で５日間処理したＡＭＬ細胞株の濃度−応答曲線である。細胞の成長は、ビヒクルで処理した細胞の成長に対する割合（％）として表されている。エラーバーは、３〜５回の反復アッセイの平均・標準偏差である。
【図１３Ｂ】左図は、錯体Ｆｅ（化合物Ｉ）３のインビトロ活性及び細胞内活性である。左図は、列挙されている濃度のＦｅ（化合物Ｉ）３で処理してから２４時間後のＫＬＦ４、ＣＤＫＮ１Ａ及びＭＹＣのｍＲＮＡの発現量である。エラーバーは、平均±標準偏差である。右図は、ビヒクル（ｖ）または漸増濃度のＦｅ（化合物Ｉ）３に２４時間暴露させた後のＭＶ４−１１細胞におけるｃ−ＰＡＲＰ１、ＭＹＣ及びγＨ２ＡＸのタンパク質レベルのウエスタンブロット解析の結果である。
【図１３Ｃ】錯体Ｆｅ（化合物Ｉ）３のインビトロ活性及び細胞内活性である。図２２及び２３に示されている代表的な例のＦＲＥＴ曲線から計算したΔＴ１／２値であり、曲線ごとに、少なくとも３回反復を行ったものである。各オリゴのΔＴ１／２は、試験した各化合物において、ｌｏｇ［薬物］ｍｏｌ／Ｌに対してプロットされている。
【図１４】Ｆｅ（化合物Ｉ）３耐性におけるＡＢＣＧ２の役割を示している。Ａは、Ｆｅ（化合物Ｉ）３のみで処理したＲａｊｉ細胞（●）及びＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞（■）、または５０ｎＭのＫｏｌ４３と組み合わせて処理したＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞（▼）の濃度−生存率曲線である。Ｂは、空ベクター（●）またはＡＢＣＧ２発現ベクター（■）をトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３クローンＲ５をＦｅ（化合物Ｉ）３で処理したものの濃度−生存率曲線である。
【図１５Ａ】ＡＭＬ細胞株における化合物ＩによるＫＬＦ４の誘導を示している。列挙されている濃度の化合物Ｉで処理してから２４時間後のＫＬＦ４  ｍＲＮＡの誘導である。すべてのｍＲＮＡ測定は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって行い、ローディングコントロールのＧＡＰＤＨに対してグラフ化した。エラーバーは、３回の反復実験の±標準偏差である。
【図１５Ｂ】ＡＭＬ細胞株における化合物ＩによるＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）の誘導を示している。ＡＭＬ株におけるＣＤＫＮ１Ａ  ｍＲＮＡの発現の濃度依存的な増加である。すべてのｍＲＮＡ測定は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって行い、ローディングコントロールのＧＡＰＤＨに対してグラフ化した。
【図１５Ｃ】ＡＭＬ細胞株における化合物ＩによるＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）の誘導を示している。ビヒクル（ｖ）または漸増濃度の化合物Ｉに２４時間暴露した後のＭＶ４−１１細胞におけるＣＤＫＮ１Ａタンパク質レベルのウエスタンブロット解析の結果である。
【図１５Ｄ】ＡＭＬ細胞株における化合物ＩによるＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）の誘導を示している。ｐ２１  ｍＲＮＡの時間依存的な増加である。すべてのｍＲＮＡ測定は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって行い、ローディングコントロールのＧＡＰＤＨに対してグラフ化した。エラーバーは、３回の反復実験の±標準偏差である。
【図１５Ｅ】ＡＭＬ細胞株における化合物ＩによるＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）の誘導を示している。ＭＶ４−１１細胞におけるＣＤＫＮ１Ａタンパク質レベルのウエスタンブロット解析の結果を５００ｎＭの化合物Ｉ（Ａ）の暴露期間の関数として、ビヒクル（Ｖ）の場合と比較したものである。
【図１６】化合物Ｉが、ＡＭＬ細胞株において、用量依存的かつ時間依存的に、Ｇ０／Ｇ１細胞周期の停止を誘導することを示している。Ａは、図１６Ａ〜Ｃの下パネルにおいて定量したＭＶ４−１１細胞、ＫＧ−１細胞及びＥＯＬ−１細胞におけるＣＤＫ４及びＣＣＮＤ３のタンパク質レベルの代表的なウエスタンブロット画像である。Ｂは、ＩＣ５０濃度の化合物Ｉに、示されている時間にわたって暴露させた後のＣＤＫ４及びＣＣＮＤ３のタンパク質レベルである。タンパク質レベルは、３回の独立したウエスタンブロットから定量し、ビヒクルに対する倍率変化としてグラフ化した。エラーバーは、±標準偏差である。Ｃは、ＣＤＫ４及びＣＣＮＤ３のタンパク質レベルを化合物Ｉへの暴露期間に対するものとして示した代表的なウエスタンブロット画像である（ＭＶ４−１１細胞：５００ｎＭ、ＫＧ−１細胞：６００ｎＭ及びＥＯＬ−１細胞：３００ｎＭ）。Ｖは、ビヒクルであり、Ａは、化合物Ｉである。
【図１７】化合物Ｉによる処理によって、時間依存的かつ濃度依存的に、アポトーシスが誘導されることを示している。Ａは、初期アポトーシス細胞と後期アポトーシス細胞を比較した分布を示すヒストグラムである。Ｂは、ＭＶ４−１１細胞、ＫＧ−１細胞及びＥＯＬ−１細胞において、化合物Ｉで処理した場合と、ビヒクルで処理した場合における総アポトーシス細胞を比較したものを時間の関数として示したものである。エラーバーは、２回の反復実験の±標準偏差である。
【図１８】ＭＶ４−１１細胞において、化合物Ｉによって調節された経路を示している。Ａは、ビヒクルまたは５００ｎＭの化合物Ｉで６時間処理したＭＶ４−１１細胞のＲＮＡ−ｓｅｑ解析によって検出された差次的発現遺伝子の遺伝子オントロジー解析（ＧＯ）である。ＧＯターム及びｐ値は、Ｂｒｏａｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓのデータベース（ＭｓｉｇＤＢ）を用いて算出した。Ｂは、ビヒクル及び化合物Ｉ（５００ｎＭ）で処理したＭＶ４−１１細胞における６時間後の正規化タンパク質レベルである。タンパク質レベルは、逆相タンパク質アレイによって検出した。ヒートマップは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで作成し、３つの反復試料の平均である。Ｃは、ＭｓｉｇＤＢを用いて、差次的に発現したタンパク質のＧＯ解析を行ったものである。
【図１９Ａ】ＡＭＬ細胞におけるＭＹＣの発現の化合物Ｉによる調節を示している。５００ｎＭの化合物Ｉで、示されている時間にわたって処理したＭＶ４−１１細胞、ＫＧ−１細胞及びＥＯＬ−１細胞における総ＭＹＣタンパク質レベルである。タンパク質レベルは、３回の独立したウエスタンブロットから定量し、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、ビヒクルに対する倍率変化としてグラフ化した。エラーバーは、±標準偏差である。
【図１９Ｂ】ＡＭＬ細胞におけるＭＹＣの発現の化合物Ｉによる調節を示している。Ａで定量した代表的なウエスタンブロット画像である。
【図１９Ｃ】ＡＭＬ細胞におけるＭＹＣの発現の化合物Ｉによる調節を示している。ＡＭＬ細胞株におけるＭＹＣのタンパク質の基底発現を健常ドナー由来のＰＢＭＣと比較したものである。
【図１９Ｄ】ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ解析で用いたＭＹＣ特異的プライマー対の位置である。
【図１９Ｅ】ＡＭＬ細胞におけるＭＹＣの発現の化合物Ｉによる調節を示している。５００ｎＭの化合物Ｉで２時間、６時間及び２４時間処理したＭＶ４−１１細胞におけるＭＹＣプロモーターのＨ３Ｋ２７ａｃのＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ解析結果をインプットに対して正規化した後、ビヒクルに対する倍率変化としてグラフ化したものである。
【図１９Ｆ】ＡＭＬ細胞におけるＭＹＣの発現の化合物Ｉによる調節を示している。化合物Ｉ（５００ｎＭ）またはビヒクルで３時間、事前に処理したＭＶ４−１１細胞においてＲＴ−ｑＰＣＲによってアッセイしたＭＹＣ  ｍＲＮＡレベルである。試料は、１μＭのアクチノマイシンＤを加えた後に、列挙されている時点に採取した。エラーバーは、３回の生物学的反復実験の±標準偏差である。＊は、Ｐ値＜０．０５であり、＊＊は、＜０．００５である（エクセルを用いて、Ｔ検定によって算出した）。
【図２０】化合物Ｉの細胞内薬理を示している。Ａは、化合物ＩのＫＧ−１細胞への取り込み量の経時的経過である。Ｂは、ＫＧ−１細胞を１μＭの化合物Ｉに暴露させることによって、１時間または６時間負荷した細胞からの化合物Ｉの排出量である。Ｃは、親単量体化合物Ｉの構造である。Ｄは、Ｆｅ（化合物Ｉ）３の構造である。Ｅは、化合物Ｉ及びＦｅ（化合物Ｉ）３のＭＶ４−１１細胞への取り込み量である。
【図２１Ａ】Ｇ−四重鎖構造のＦＲＥＴアッセイ解析を示している。ＦＲＥＴアッセイのクエンチの概略図である。低温度では、Ｇ−四重鎖構造が形成され、蛍光ＦＡＭシグナルは、ＢＨＱ１によってクエンチされ、温度が上昇すると、Ｇ４構造がほどけ、ＦＡＭシグナルが増大する。各薬物濃度において、蛍光シグナルが最大値の５０％である温度（Ｔ１／２）を算出してから、薬物濃度に対してΔＴ１／２（薬物のＴ１／２−ビヒクルのＴ１／２）をプロットした。
【図２１Ｂ】Ｇ−四重鎖構造のＦＲＥＴアッセイ解析を示している。ｄｓ−ＤＮＡコントロールオリゴの融解曲線である。エラーバーは、３回の生物学的反復実験の±標準偏差である。
【図２１Ｃ】Ｇ−四重鎖構造のＦＲＥＴアッセイ解析を示している。化合物Ｉとともにインキュベーションしてから６時間後のＧ４オリゴの融解曲線である。エラーバーは、３回の生物学的反復実験の±標準偏差である。
【図２２Ａ】Ｆｅ（化合物Ｉ）３が、Ｇ−四重鎖オリゴのＴｍを安定化させることを示している。ヒトテロメアにおけるＧ−四重鎖配列を含む５’ＦＡＭ−３’ＢＨＱ１二重標識オリゴの融解曲線である。エラーバーは、３回の生物学的反復実験の±標準偏差である。
【図２２Ｂ】Ｆｅ（化合物Ｉ）３が、Ｇ−四重鎖オリゴのＴｍを安定化させることを示している。ＭＹＣ遺伝子プロモーターにおけるＧ−四重鎖配列を含む５’ＦＡＭ−３’ＢＨＱ１二重標識オリゴの融解曲線である。エラーバーは、３回の生物学的反復実験の±標準偏差である。
【図２２Ｃ】Ｆｅ（化合物Ｉ）３が、Ｇ−四重鎖オリゴのＴｍを安定化させることを示している。ｒＲＮＡ遺伝子座におけるＧ−四重鎖配列を含む５’ＦＡＭ−３’ＢＨＱ１二重標識オリゴの融解曲線である。エラーバーは、３回の生物学的反復実験の±標準偏差である。
【図２２Ｄ】Ｆｅ（化合物Ｉ）３が、Ｇ−四重鎖オリゴのＴｍを安定化させることを示している。ＫＩＴ遺伝子プロモーターにおけるＧ−四重鎖配列を含む５’ＦＡＭ−３’ＢＨＱ１二重標識オリゴの融解曲線である。エラーバーは、３回の生物学的反復実験の±標準偏差である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２の機能喪失により、細胞が過敏性となる薬物であるが、個体において骨髄抑制を起こさない薬物の特定に関連する上記の難題に鑑み、化合物Ｉを特定した。予想外にも、化合物Ｉが、ＤＮＡを損傷させること、及び相同組み換えを欠損した細胞が、ＦＤＡに認可されたＰＡＲＰ阻害剤であるオラパリブに対する過敏性と同程度の過敏性を、化合物Ｉに対して有することを発見した。化合物Ｉは、骨髄抑制を起こさずに、相同組み換え欠損を利用できる限られた薬物群に加わる。
【００２２】
併用薬物研究を誘導し得る合成致死性相互作用を特定するために、化合物Ｉの作用機序及び化合物Ｉに対する耐性に関する機序研究も行った。本明細書に記載されているように、化合物Ｉは細胞内で、その薬物の活性型であるＦｅ錯体（Ｆｅ（化合物Ｉ）３）に変換される。化合物Ｉは、γＨ２ＡＸの蓄積及びフォーカス形成によって立証されたように、早い時点にＤＮＡを損傷させた。ＢＲＣＡ１欠損細胞及びＢＲＣＡ２欠損細胞は、オラパリブに対する過敏性に匹敵する程度の過敏性を、化合物Ｉに対して有することがわかった。Ｒａｊｉ細胞における化合物Ｉに対する耐性は、排出トランスポーターＡＢＣＧ２のアップレギュレーションと関連し、ＡＢＣＧ２の阻害によって、耐性は部分的に解消される。化合物Ｉが相同組み換え欠損を利用する能力は、特に興味深い。この修復機能の喪失により、過敏性をもたらす他のいずれの薬物とも異なり、化合物Ｉは、最大耐用量でも、骨髄抑制を起こさないからである。
【００２３】
化合物Ｉは、広範な固形腫瘍及び血液悪性腫瘍のいずれに対しても強力な細胞毒性を示すが、骨髄抑制を起こさない新規な種類の化合物の１つであるので、興味深い。本明細書に報告されている重要な所見は、単量体の化合物Ｉは細胞内で、二価Ｆｅ原子及び３分子の化合物Ｉを含む活性な錯体に変換でき、その錯体の細胞内濃度が、原薬の細胞内濃度を上回ることができる点である。化合物Ｉ及び／または化合物Ｉと鉄との錯体は、ＤＮＡを損傷させ、その際、ＤＮＡ修復には、化合物Ｉとの合成致死性によって示されたように、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の両方の機能が必要となる。Ｒａｊｉリンパ腫細胞の場合には、耐性の獲得は、薬物取り込み量の減少、ＡＢＣＧ２薬物排出ポンプ（このポンプの阻害により、耐性が部分的に解消される）の顕著な過剰発現と関連付けられている。
【００２４】
化合物Ｉの細胞内蓄積は、リンパ腫の治療に用いる多くの他の化学療法剤と比べて相対的に遅いが、速やかにＦｅ（化合物Ｉ）３に変換されるようである。その薬物の原薬形態が細胞内で検出されるとすぐに、この錯体が存在するからである。６時間までに、Ｆｅ（化合物Ｉ）３の細胞内含有量は、その原薬形態の含有量を約１８倍上回る。錯体Ｆｅ（化合物Ｉ）３の効能は、原薬の２分の１に過ぎないが、このことは、化合物Ｉが電荷を持たないのに対して、Ｆｅ（化合物Ｉ）３が、化合物Ｉよりもかなり大きく、２＋の電荷を持つことから、膜を介した流入が阻害されると予測されることによって説明できる。錯体Ｆｅ（化合物Ｉ）３とともにインキュベートした細胞内では、原薬が検出されなかったことから、Ｆｅ（化合物Ｉ）３が、その薬物の細胞内活性型であることが強く示唆されている。２，１０インドール環構造を含む薬物は、Ｆｅ及びＺｎをキレート化することが知られている。化合物Ｉの場合には、Ｆｅキレートは、細胞内に豊富に存在していたが、Ｚｎキレートは検出できなかった。実際、Ｆｅキレートレベルは、化合物Ｉに暴露した細胞の色がピンクになるほど充分に高かった。Ｆｅ（化合物Ｉ）３レベルの高さから、その錯体の形成により、細胞代謝が損なわれるまで、細胞のＦｅを枯渇させるのかという疑問が生じ、この疑問は依然として、さらなる研究の際の関心事である。いずれかの特定の理論に拘束されるわけではないが、化合物Ｉを完全組織培養培地とともにインキュベートしたところ、細胞外のＦｅ（化合物Ｉ）３は検出されなかったので、キレート化は、細胞内環境によって促進され得る。
【００２５】
ＢＲＣＡ１／２機能の喪失に起因する相同組み換え欠損により、特定の種類のＤＮＡ傷害薬に対する過敏性が生じるという観察結果は、特に卵巣癌の場合に、白金含有薬のシスプラチン及びカルボプラチン、ならびにＰＡＲＰ阻害剤のオラパリブ及びニラパリブの有効性を向上させるのに利用されてきている。Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｌａｐａｒｉｂ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｒｅｌａｐｓｅｄ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ，”Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２０１２；３６６（１５）：１３８２−９２、Ｍｉｒｚａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｉｒａｐａｒｉｂ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ，”Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２０１６；３７５（２２）：２１５４−６４（いずれも、参照により援用される）。様々な程度の相同組み換え欠損が、様々な他の腫瘍で、卵巣癌よりも低い頻度で特定されている。Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“ＨＲＤｅｔｅｃｔ  ｉｓ  ａ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ＢＲＣＡ１  ａｎｄ  ＢＲＣＡ２  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ，”Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１７；２３（４）：５１７−５２５（参照により、本明細書に援用される）。化合物Ｉが相同組み換え欠損を利用する能力は、特に興味深い。化合物Ｉは、この修復機能の喪失によって過敏性をもたらす他のいずれの薬物とも異なり、最大耐用量でも骨髄抑制を起こさないからである。Ｃｅｒｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｓｅ  １  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＣＯＭＰＯＵＮＤ  Ｉ  ＨＣｌ，ａｎ  Ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ＫＬＦ４，ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｒ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ，”Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ，２０１５；３３（５）：１０８６−９２（参照により、本明細書に援用される）。したがって、化合物Ｉは、この重要な治療域を利用できる限られた薬物群に加わる。本明細書に報告されている観察結果によって、薬物の臨床作用の考え得るバイオマーカーとして、γＨ２ＡＸが特定されるとともに、化合物ＩがＤＮＡを損傷させる機序について、より詳細な研究への方向性が示されている。Ｉｖａｓｈｋｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇａｍｍａ−Ｈ２ＡＸ  Ａｓｓａｙ  ｔｏ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，２０１２；３２７（１−２）：１２３−３３（参照により、本明細書に援用される）。
【００２６】
Ｒａｊｉリンパ腫細胞における化合物Ｉ耐性の獲得の発現は、化合物Ｉ及び錯体Ｆｅ（化合物Ｉ）３の蓄積の減少と関連付けられた。感受性Ｒａｊｉ細胞では、耐性細胞よりも、細胞内のＦｅ（化合物Ｉ）３が１６．５±１．９４倍多かったが、この値は、Ｒａｊｉ／化合物ＩＲの感受性細胞に対する相対的な耐性（１６．７±３．９倍）に完全に一致している。Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞のＲＮＡ−ｓｅｑ解析により、最も直接的に、考え得る耐性機序として、ＡＢＣＧ２の過剰発現が示された。ウエスタンブロット解析により、そのタンパク質レベルにおけるアップレギュレーションが確認され、ＡＢＣＧ２阻害剤が、化合物Ｉ及びトポテカンに対する耐性を部分的に解消する能力によって、ＡＢＣＧ２が、化合物Ｉに対する耐性において機能し、この耐性に直接関与することが認められた。Ｆｅ（化合物Ｉ）３の蓄積は、事前に形成したその錯体とともにインキュベートした耐性細胞において減少したことから、Ｆｅ（化合物Ｉ）３及びその原薬が、ＡＢＣＧ２トランスポーターの基質であり得ることが示唆されている。ＡＢＣＧ２の増加によって、耐性が付与される既知の種類の薬物のうち、化合物ＩまたはＦｅ（化合物Ｉ）３と明らかに構造的類似性のある既知の薬物は存在しない。したがって、ＡＢＣＧ２が、化合物Ｉに対する耐性を媒介し得るという発見は、この重要なトランスポーターの既知の基質の範囲を拡大する。化合物Ｉに対する感受性のバイオマーカーとして、ＡＢＣＧ２を利用できるかについては、大規模な細胞株パネルで調べる必要がある。Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍａｐ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｍａｐ／）を検索したところ、化合物Ｉと、大規模な細胞株パネルでこれまで試験された他の薬物のいずれの細胞毒性パターンとの間にも、有意な類似性は何も認められず、この化合物の独自性がさらに浮き彫りとなった。
【００２７】
ＡＢＣＧ２の特異的阻害剤であるＫｏ１４３が、化合物Ｉ耐性の獲得を完全には解消しなかったことを考慮すると、他の機序もその表現型に寄与する可能性が高いようである。この点で、カルボプラチンに対する交差耐性は、特に興味深い。カルボプラチンは、既知のＡＢＣＧ２基質ではないが、カルボプラチンも、ＤＮＡを損傷させ、転写共役修復のアップレギュレーションが、カルボプラチン及びシスプラチンの両方（いずれも、ＤＮＡにおいて同じタイプの付加体を生成する）に対する耐性に寄与することが広く報告されている。Ｅｎｏｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＤＮＡ  Ｉｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｓ  ｂｙ  ａ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌｅｓｉｏｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１２；４０（１８）：８９５３−６４（参照により、本明細書に援用される）。ＤＮＡ修復能のアップレギュレーションが、カルボプラチン耐性及び化合物Ｉ耐性の両方に寄与するのかは、まだ明らかになっていない。
【００２８】
また、本明細書に記載されているように、化合物Ｉは、ＡＭＬ細胞において、ＣＤＫＮ１Ａのアップレギュレーション及びＭＹＣのダウンレギュレーションの後、Ｇ０−Ｇ１細胞周期の停止及びアポトーシスが生じることと関連することが発見された。さらに、ＡＭＬにおける周知の重要ながん遺伝子であるＭＹＣの阻害は、化合物Ｉの細胞毒性と相関付けられた。差次的発現解析によって、化合物Ｉによる処置後、γ−Ｈ２ＡＸの蓄積及び細胞ストレス経路の誘導を含むＤＮＡ損傷の関与が示唆された。事前の細胞内薬物動態試験によって、化合物Ｉが、細胞内で、単量体型から二価鉄錯体［Ｆｅ（化合物Ｉ）３］に変換され、この錯体が、化合物Ｉの主な細胞内形態であることが示された。この試験では、親化合物Ｉ及び錯体Ｆｅ（化合物Ｉ）３が、Ｇ−四重鎖（Ｇ４）モチーフに結合して、そのモチーフを安定化させることを我々は示した。錯体Ｆｅ（化合物Ｉ）３は、重要ながん遺伝子（例えば、ＭＹＣ、ＫＩＴ）のプロモーター、ならびにｒＲＮＡ遺伝子及びテロメアに見られるＧ４モチーフを安定化させた。ＤＮＡ二次構造のこの安定化は、Ｇ４モチーフに特有のものであった。親化合物Ｉ及びＦｅ（化合物Ｉ）３は、ｄｓＤＮＡとは相互作用しなかったからである。また、事前に形成したＦｅ（化合物Ｉ）３でＡＭＬ細胞ＭＶ４−１１を処理すると、ＭＹＣの発現が阻害され、ＣＤＫＮ１Ａの発現が誘導されるとともに、アポトーシス経路及びＤＮＡ損傷経路が誘導される。勘案すると、それらの結果によって、化合物Ｉが、ＭＹＣ及びその下流の標的遺伝子の発現、細胞周期停止、ならびにＤＮＡ損傷及びストレス応答に及ぼす作用は、化合物Ｉ及びＦｅ（化合物Ｉ）３のＧ−四重鎖ＤＮＡモチーフに対する作用と関連し得るという結論が裏付けられる。
【００２９】
定義
別段に定義されていない限り、本明細書で用いられているすべての技術用語及び科学用語は、本願が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本願の実施または試験の際には、本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料を使用できるが、本明細書には、代表的な方法及び材料が記載されている。
【００３０】
本明細書全体を通じて、「一実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「一実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」という場合には、その実施形態との関連で記載されている特定の要素、構造または特徴が、少なくとも一実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通じて、様々な位置に、「一実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）では」または「一実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）では」という語句が見られることは、必ずしも、すべて同じ実施形態について述べているわけではない。さらに、その特定の要素、構造または特徴は、いずれかの好適な形で、１つ以上の実施形態で組み合わせることができる。また、本明細書及び添付の請求項で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、文脈上明らかに別段に解される場合を除き、複数の指示対象が含まれる。「または」という用語は、文脈上明らかに別段に解される場合を除き、概して、「及び／または」を含む意味で用いられていることも留意されたい。
【００３１】
別段に示されていない限り、本明細書及び請求項で用いられている成分、反応条件などの量を表すすべての数字は、いずれのケースでも、「約」という用語で修飾されているものと理解されたい。したがって、反対の記載がない限り、本明細書及び添付の請求項に示されている数値パラメーターは、本願によって得ようとする所望の特性に応じて変動し得る近似値である。
【００３２】
本明細書全体を通じて、特定の量に関しては、数値範囲が示されている。これらの範囲には、その範囲内のすべての小範囲が含まれることを理解されたい。したがって、「５０〜８０」という範囲には、あらゆる考え得る範囲（例えば、５１〜７９、５２〜７８、５３〜７７、５４〜７６、５５〜７５、６０〜７０など）が含まれる。さらに、所定の範囲内のすべての値は、その範囲に含まれる範囲の端点値であり得る（例えば、５０〜８０という範囲には、５５〜８０、５０〜７５などのような端点値を有する範囲が含まれる）。
【００３３】
化合物Ｉとは、下記の構造の２−（５−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｆ］［１，１０］フェナントロリン、その製薬学的に許容可能な塩、エステル、プロドラッグ、水和物、溶媒和物及び異性体を指す。
【化７】
2021501203.tif 000009
化合物Ｉ
【００３４】
Ｆｅ（化合物Ｉ）３とは、以下の構造を指す。
【化８】
2021501203.tif 000010
Ｆｅ（化合物Ｉ）３
【００３５】
「製薬学的に許容可能な塩」には、酸基付加塩及び塩基付加塩の両方が含まれる。
【００３６】
化合物Ｉの製薬学的に許容可能な塩は、無機酸または有機酸に由来する「製薬学的に許容可能な酸付加塩」であってよく、このような塩は、アニオンを含む製薬学的に許容可能な非毒性の酸付加塩であってよい。例えば、その塩としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などのような無機酸、酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸などのような有機カルボン酸、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのようなスルホン酸によって形成される酸付加塩を挙げてよい。
【００３７】
化合物Ｉの製薬学的に許容可能な塩は、当該技術分野において周知の従来の方法によって調製し得る。具体的には、本発明による「製薬学的に許容可能な塩」は、例えば、アセトン、メタノール、エタノールまたはアセトニトリルなどのような水混和性の有機溶媒に化合物Ｉを溶解させ、それに過剰量の有機酸または無機酸の水性溶液を加え、そのようにして得られた混合物を沈殿または結晶化させることによって調製し得る。さらに、その塩から溶媒または過剰な酸をさらに蒸発させてから、その混合物を乾燥するか、または例えば吸引フィルターを用いることによって、その抽出物を濾過することによって調製し得る。
【００３８】
「キレート」という用語は、本明細書で使用する場合、少なくとも１つの二座配位子を伴い、任意に１つ以上の単座配位子または多座配位子を伴う中心金属で構成される分子体を意味する。例えば、「キレート」とは、使用する場合、化合物Ｉの二座配位子を少なくとも１つ伴う中心金属で構成される分子体を意味する。中心金属と、その配位子のうちのいずれかとの相互作用においては、その配位子と中心金属との結合として、共有結合、イオン結合及び／または配位共有結合を挙げることができる。
【００３９】
「錯体」または「金属錯体」という用語は、本明細書で使用する場合、金属と配位子との配位錯体を意味する。例えば、「錯体」または「金属錯体」とは、本明細書で使用する場合、金属と化合物Ｉとの配位錯体を意味する。
【００４０】
「金属」という用語は、本明細書で使用する場合、配位子と配位結合できるいずれかのアルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属、希土類金属、塩基性金属及び半金属を意味する。代表的な金属としては、遷移金属のランタニド及びアクチニドの金属が挙げられる。いくつかの実施形態では、その金属は、配位子と相互作用できるｄ軌道を有する。例えば、その金属は、鉄、亜鉛、アルミニウム、マグネシウム、白金、銀、金、クロム、ニッケル、チタン、銅、スカンジウム、ジルコニウム、バナジウム、モリブデン、マンガン、タングステン及びコバルトであってよい。一実施形態では、その金属は、鉄である。
【００４１】
「エステル」という用語は、本明細書で使用する場合、−（Ｒ）ｎ−ＣＯＯＲ’という化学的構造を有する化学部分を指し、その式中、別段に示されていない限り、Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立して、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（芳香族環によって酸素原子に連結される）及びヘテロ脂環（芳香族環によって連結される）からなる群から選択されており、ｎは、０または１である。
【００４２】
「プロドラッグ」という用語は、本明細書で使用する場合、インビボで代謝活性化して、親薬物を生成させる前駆化合物を指す。プロドラッグは、有用である場合が多い。場合によっては、その親薬物よりも簡単に投与できるからである。例えば、その親薬物の生体内での利用性が劣るのとは異なり、いくつかのプロドラッグは、経口投与によって、生体内で利用可能となる。さらに、プロドラッグは、その親薬物と比べて、医薬組成物で溶解性が向上し得る。例えば、化合物Ｉは、薬物送達効率を上昇させるために、エステルプロドラッグの形態で投与してよい。薬物の溶解性は、細胞膜透過性に悪影響を及ぼし得るからである。そして、エステルプロドラッグの形態の化合物は、標的細胞内に入ると、カルボン酸及び活性体に代謝的に加水分解され得る。
【００４３】
化合物Ｉの水和物または溶媒和物は、本発明の範囲内に含まれる。本明細書で使用する場合、「溶媒和物」は、溶媒和によって形成される複合体（溶媒分子と、本発明の活性剤の分子もしくはイオンの組み合わせ）、または溶質イオンもしくは分子（本発明の活性剤）と１つ以上の溶媒分子からなる凝集体を意味する。その溶媒は、水であることができ、その場合には、溶媒和物は、水和物であることができる。水和物の例としては、半水和物、一水和物、二水和物、三水和物、六水和物などが挙げられるが、これらに限らない。本発明の化合物の製薬学的に許容可能な塩が、溶媒和物形態でも存在し得ることを当業者は理解するはずである。溶媒和物は典型的には、本発明の化合物の調製プロセスの一部である水和反応を介して、または本発明の無水化合物に水分が自然に吸収されることを通じて形成される。水和物を含む溶媒和物は、化学量論比で、例えば、溶媒和物分子または水和物分子１つ当たり２つ、３つ、４つの塩分子で構成され得る。別の可能性は、例えば、２つの塩分子が、３つ、５つ、７つの溶媒分子または水和物分子と化学量論的に関連していることである。アルコール、特にメタノール及びエタノール、アルデヒド、ケトン、特にアセトン、エステル、例えば酢酸エチルのように、結晶化に用いる溶媒は、結晶格子内に取り込まれ得る。特に、製薬学的に許容可能な溶媒である。
【００４４】
本開示の化合物またはその製薬学的に許容可能な塩は、アトロプ異性体化が可能なように、１つ以上のキラリティー軸を含むことができる。アトロプ異性体は、単結合の回転障害が原因で生じる立体異性体であり、その異性体では、立体的歪またはその他の寄与要因によるエネルギー差によって、回転に対する障壁であって、個々の配座異性体を単離可能にするのに充分に高い障壁が生じている。本開示は、本明細書に具体的に示されているか否かを問わず、このような考え得るすべての異性体、ならびにそれらのラセミ体及び光学的に純粋な形態を含むように意図されている。光学活性異性体は、キラルシントンもしくはキラル試薬を用いて調製するか、または従来の技法、例えば、クロマトグラフィー及び分別結晶を用いて分割することができる。個々のアトロプ異性体を調製／単離するための従来の技法としては、好適な光学的に純粋な前駆体からキラル合成すること、あるいは例えばキラル高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、ラセミ体（または塩もしくは誘導体のラセミ体）を分割することが挙げられる。
【００４５】
「立体異性体」とは、同じ結合で結合された同じ原子で構成されているが、異なる３次元構造を持ち、重ね合わせることのできない化合物を指す。本発明では、アトロプ異性に関する場合、様々な立体異性体及びそれらの混合物が企図されている。
【００４６】
特定の疾患または障害に関しては、「治療する」、「治療すること」または「治療」という用語には、その疾患または障害を予防すること、及び／またはその疾患もしくは障害の症状及び／または病態を弱めるか、好転させるか、改善するか、もしくは妨げることが含まれる。概して、それらの用語は、本明細書で使用する場合、疾患の症状または病状を改善すること、緩和すること、弱めること及び除去することを指す。本発明における化合物Ｉは、治療上有効な量で製剤または医薬中に存在してよく、その有効な量は、例えば、ＤＮＡ損傷、特定の細胞（例えば、がん細胞）のアポトーシス、特定の細胞の増殖の低下のような生体作用をもたらすことができるか、または疾患の症状もしくは病状を改善させるか、緩和させるか、弱めるかもしくは除去させることができる量である。それらの用語は、細胞増殖速度を低下もしくは停止させる（例えば、腫瘍の成長を減速もしくは停止させる）か、または増殖しているがん細胞の数を減少させる（例えば、腫瘍の一部もしくは全部を除去する）ことも指す。
【００４７】
上記のような治療が、疾患、障害または病状の予防を指す場合には、前記治療は、予防的治療と称する。増殖性障害に特徴的な症状の発現前に、前記予防剤の投与を行って、疾患または障害を予防するか、またはその代わりに、その進行を遅らせるようにできる。
【００４８】
本明細書で使用する場合、細胞増殖を「阻害すること」または「低下させること」という用語は、当業者に知られている方法を用いて測定した場合に、本願の方法を実施せず、本願の組成物及び組み合わせを与えない増殖細胞と比べて、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％、細胞増殖を減速させるか、細胞増殖の量を減少させるか、または例えば、細胞増殖を停止させることを意味する。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「細胞周期停止」とは、細胞で生じる一連の事象であって、細胞を分裂及び複製させる事象の停止を指し、その停止は、ＤＮＡ損傷、Ｘ線照射、電離性放射線照射及び化学療法剤を含む（ただし、これらに限らない）多くの要因に起因し得る。特定の実施形態では、「ＤＮＡ損傷」及び「細胞周期停止」は、同義的に用いられている。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「アポトーシス」という用語は、内因性の細胞自壊または自殺プログラムを指す。細胞は、誘導刺激に応答して、細胞収縮、細胞膜のブレッビング、ならびにクロマチンの凝縮及び断片化を含む事象のカスケードを起こす。これらの事象により、細胞は、膜に包まれた粒子（アポトーシス小体）の集まりに変換され、その後、アポトーシス小体は、マクロファージに貪食される。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「骨髄抑制」とは、造血の１つ以上の構成要素が抑制されることを指し、造血プロセスの産物である種類の細胞のうちの１つ以上が異常なレベルとなることで顕在化する。造血及び造血細胞の特徴の概説については、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｃｈ．２，ｐｐ．１５−２４（Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｍａｎ，ｅｄｓ．Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，Ｉｎｃ．１９９６）を参照されたいが、それらのページは、参照により、本明細書に援用される。大まかなレベルでは、骨髄抑制とは、白血球数及び／または血小板数の減少を指す。また、より具体的なレベルでは、骨髄抑制とは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞及び血小板という、造血に起因する細胞のうちの１つ以上が、正常レベルと比べて抑制されることを指す。他の用語が、骨髄抑制と同義的に用いられることもあり、そのような用語は、当業者には、容易に明らかになるであろう。このような用語の非限定的な例としては、「骨髄抑制（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、「骨髄毒性」及び「骨髄破壊」が挙げられる。したがって、一方では、「骨髄回復」は、骨髄抑制の対義語である。すなわち、一実施形態では、「骨髄活性」という用語は、当業者には明らかであるＢ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、血小板、赤血球、血小板、骨髄系白血球及びリンパ系白血球などという、造血に起因する細胞のレベルを指す。
【００５２】
「対象」という用語は、本明細書で使用する場合、哺乳動物または非哺乳動物のような動物を指す。例えば、対象は、がんの治療または予防が必要であるヒトのような哺乳動物であってよい。対象という用語は、本発明の関連においては、患者という用語と同義的に用いられることがある。
【００５３】
「哺乳動物」には、ヒト、実験動物及び飼育されているペット（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ）のような飼育動物、ならびに野生動物などのような非飼育動物の両方が含まれる。本明細書で使用する場合、「患者」または「対象」という用語には、ヒト及び動物が含まれる。
【００５４】
「非哺乳動物」には、非哺乳動物の無脊椎動物、及び鳥（例えば、ニワトリもしくはカモ）または魚のような非哺乳動物の脊椎動物が含まれる。
【００５５】
「医薬組成物」とは、本開示の化合物と、その生物活性化合物を哺乳動物、例えばヒトに送達するためのものとして当該技術分野で一般に認められた媒体との調合物を指す。そのような媒体には、上記目的のためのあらゆる製薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤が含まれる。
【００５６】
「有効な量」とは、治療上有効な量または予防上有効な量を指す。「治療上有効な量」とは、がん細胞の死滅、腫瘍サイズの低減、寿命の延長または平均余命の延長などの所望の治療結果を得るために必要な投与量及び期間で有効な量を指す。化合物の治療上有効な量は、対象の病態、年齢、性別及び体重、ならびにその化合物が、対象において所望の応答を惹起する能力のような要因に従って変動し得る。投与レジメンを調整して、最適な治療応答をもたらすことができる。治療上有効な量は、治療上有益な作用が、化合物のいずれの毒性作用または有害作用よりも上回る量でもある。「予防上有効な量」とは、腫瘍の縮小または細胞増殖の減速のような所望の予防的結果をもたらすために必要な投与量及び期間で有効な量を指す。典型的には、予防用量は、疾患の前または疾患早期の対象で使用し、その結果、予防上有効な量は、治療上有効な量未満であることができる。
【００５７】
方法
本発明は、対象のがんの予防、軽減または治療方法を提供する。
【００５８】
本開示の一実施形態では、対象のがんの予防、軽減または治療方法であって、
【化９】
2021501203.tif 000011
（化合物Ｉ）、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を治療上有効な量、その対象に投与することを含み、その対象が、ＤＮＡ修復遺伝子に変異を有する方法を提供する。一実施形態では、その対象は、ヒトである。別の実施形態では、その対象は、すでにがんである。
【００５９】
別の実施形態では、本開示は、対象のがんの予防、軽減または治療方法であって、化合物Ｉの１つ以上の分子を治療上有効な量、１つ以上の金属原子との錯体で投与することを含み、その対象が、ＤＮＡ修復遺伝子に変異を有する方法に関するものである。一実施形態では、その１つ以上の金属原子は、鉄、亜鉛、アルミニウム、マグネシウム、白金、銀、金、クロム、ニッケル、チタン、銅、スカンジウム、ジルコニウム、バナジウム、モリブデン、マンガン、タングステン及びコバルトからなる群から選択する。一実施形態では、その１つ以上の金属原子は、鉄である。特定の実施形態では、その錯体は、以下の構造を有する。
【化１０】
2021501203.tif 000012
【００６０】
一実施形態では、そのＤＮＡ修復遺伝子は、相同組み換え遺伝子である。特定の実施形態では、そのＤＮＡ修復遺伝子は、相同組み換え（ＨＲ）依存性のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）二本鎖切断（ＤＳＢ）修復経路の遺伝子である。そのＨＲ依存性のＤＮＡ  ＤＳＢ修復経路が、相同的な機序を介して、ＤＮＡ内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復して、ＤＮＡの連続的ならせんを再形成することは当業者には明らかであろう。Ｋ．Ｋ．Ｋｈａｎｎａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｐ．Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７（３）：２４７−２５４（２００１）（参照により、その全体が本明細書に援用される）。そのＨＲ依存性のＤＮＡ  ＤＳＢ修復経路の構成要素としては、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＲＰＡ、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｌ１、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｌ３、ＤＭＣ１、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４Ｌ、ＲＡＤ５４Ｂ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１Ａ及びＮＢＳ１が挙げられるが、これらに限らない。そのＨＲ依存性のＤＮＡ  ＤＳＢ修復経路に関与する他のタンパク質として、ＥＭＳＹのような調節因子が挙げられる。Ｈｕｇｈｅｓ−Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ  １１５，ｐｐ５２３−５３５（参照により、その全体が本明細書に援用される）。したがって、特定の実施形態では、そのＤＮＡ修復遺伝子は、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｒａｄ５１、ＲＰＡ及びＸＲＣＣ３からなる群から選択した１つ以上の遺伝子である。特定の実施形態では、そのＤＮＡ修復遺伝子は、ＢＲＣＡ−１及び／またはＢＲＣＡ−２である。
【００６１】
本開示の一実施形態では、その対象は、ＤＮＡ修復遺伝子における変異がヘテロ接合型である。特定の実施形態では、その対象は、相同組み換え（ＨＲ）依存性のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）二本鎖切断（ＤＳＢ）修復経路の遺伝子における変異がヘテロ接合型である。したがって、特定の実施形態では、その相同組み換え（ＨＲ）依存性のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）二本鎖切断（ＤＳＢ）修復経路の遺伝子は、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｒａｄ５１、ＲＰＡ及びＸＲＣＣ３からなる群から選択した１つ以上の遺伝子である。特定の実施形態では、そのＤＮＡ修復遺伝子は、ＢＲＣＡ−１及び／またはＢＲＣＡ−２である。
【００６２】
本開示の一実施形態では、その対象は、ＤＮＡ修復遺伝子における変異がホモ接合型である。特定の実施形態では、その対象は、その相同組み換え（ＨＲ）依存性のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）二本鎖切断（ＤＳＢ）修復経路の遺伝子における変異がホモ接合型である。したがって、特定の実施形態では、その相同組み換え（ＨＲ）依存性のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）二本鎖切断（ＤＳＢ）修復経路の遺伝子は、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｒａｄ５１、ＲＰＡ及びＸＲＣＣ３からなる群から選択した１つ以上の遺伝子である。特定の実施形態では、そのＤＮＡ修復遺伝子は、ＢＲＣＡ−１及び／またはＢＲＣＡ−２である。
【００６３】
一実施形態では、がんの治療または予防のために、その対象に、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を治療上有効な量投与する。本開示の関連においては、様々ながんを治療または予防し得ることは当業者には明らかであろう。すなわち、一実施形態では、そのがんは、造血癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、子宮頸癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、リンパ節癌、白血病、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、脳腫瘍、頭頸部癌、骨癌、咽頭口腔癌、ユーイング肉腫、皮膚癌、腎臓癌及び心臓癌からなる群から選択する。特定の実施形態では、そのがんは、乳癌、肺癌、リンパ節癌、大腸癌、白血病、腎臓癌及び前立腺癌からなる群から選択する。一実施形態では、そのがんは、乳癌である。いくつかの実施形態では、そのがんは、血液悪性腫瘍である。血液悪性腫瘍の例としては、白血病、リンパ腫、ホジキン病及び骨髄腫が挙げられるが、これらに限らない。また、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好中球性白血病（ＣＮＬ）、急性未分化白血病（ＡＵＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、成人Ｔ細胞ＡＬＬ、３血球系異形成を伴うＡＭＬ（ＡＭＬＩＴＭＤＳ）、混合系統白血病（ＭＬＬ）、好酸球性白血病、マントル細胞リンパ腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）（例えば高リスクＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）及び多発性骨髄腫（ＭＭ）である。いくつかの実施形態では、そのがんは、急性骨髄性白血病である。いくつかの実施形態では、そのがんは、慢性骨髄性白血病である。いくつかの実施形態では、そのがんは、リンパ腫である。いくつかの実施形態では、そのがんは、高リスク骨髄異形成症候群である。
【００６４】
一実施形態では、ＢＲＣＡ関連癌の治療または予防のために、その対象に、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を治療上有効な量投与する。様々ながんが、ＢＲＣＡと関連することは当業者には明らかであろう。一実施形態では、そのＢＲＣＡ関連癌は、ＢＲＣＡ−１遺伝子及び／またはＢＲＣＡ−２遺伝子の変異を１つ以上有する。
【００６５】
そのがん細胞は、ＨＲ依存性のＤＮＡ  ＤＳＢ修復経路の構成要素の欠損に特徴的である表現型を有してよく、すなわち、そのがん細胞では、その経路の構成要素の活性が低減または消失している。このような表現型を有するがん細胞は、その経路の構成要素、例えば、上で列挙した構成要素を欠損していてよく、すなわち、そのがん細胞では、例えば、コード核酸または調節因子をコードする遺伝子における変異、多型、または過剰メチル化のようなエピジェネティックな修飾によって、その構成要素の発現及び／または活性が低減または消失していてよい。
【００６６】
いくつかの好ましい実施形態では、そのがん細胞は、ＢＲＣＡ１及び／またはＢＲＣＡ２欠損表現型を有してよく、すなわち、そのがん細胞では、ＢＲＣＡ１及び／またはＢＲＣＡ２の活性が、低減または消失している。この表現型を有するがん細胞は、ＢＲＣＡ１及び／またはＢＲＣＡ２を欠損していてよく、すなわち、そのがん細胞では、例えば、コード核酸または調節因子をコードする遺伝子、例えば、ＢＲＣＡ２調節因子をコードするＥＭＳＹ遺伝子（Ｈｕｇｈｅｓ−Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ  １１５，ｐｐ５２３−５３５、参照により、本明細書に援用される）における変異、多型、または過剰メチル化のようなエピジェネティックな修飾によって、ＢＲＣＡ１及び／またはＢＲＣＡ２の発現及び／または活性が、低減または消失していてよい。
【００６７】
ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２は、ヘテロ接合体キャリアの腫瘍において野生型アレルが消失していることの多い既知の腫瘍抑制因子である（Ｊａｓｉｎ  Ｍ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００２  Ｄｅｃ．１６；２１（５８）：８９８１−９３、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．（２００２）８（１２）：５７１−６）。ＢＲＣＡ１及び／またはＢＲＣＡ２の変異と乳癌との関連性は、当該技術分野において充分に特徴付けがなされている（Ｒａｄｉｃｅ  Ｐ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；２１（３  Ｓｕｐｐｌ）：９−１２、参照により、本明細書に援用される）。ＢＲＣＡ２結合因子をコードするＥＭＳＹ遺伝子の増幅も、乳癌及び卵巣癌と関連することが知られている。
【００６８】
また、ＢＲＣＡ１変異及び／またはＢＲＣＡ２変異のキャリアは、卵巣癌、前立腺癌及び膵臓癌のリスクが高い。
【００６９】
別の好ましい実施形態では、そのがん細胞は、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｒａｄ５１、ＤＳＳ１、ＲＰＡ及び／またはＸＲＣＣ３を欠損した表現型を有してよく、すなわち、そのがん細胞では、これらの構成要素のうちの１つ以上の活性が、低減または消失している。がん細胞は、例えば、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｒａｄ５１、ＤＳＳ１、ＲＰＡ及び／またはＸＲＣＣ３を欠損していてもよく、すなわち、そのがん細胞では、例えば、コード核酸または調節因子をコードする遺伝子における変異、多型、または過剰メチル化のようなエピジェネティックな修飾によって、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｒａｄ５１、ＤＳＳ１、ＲＰＡ及び／またはＸＲＣＣ３の発現及び／または活性が、低減または消失してよい。
【００７０】
一実施形態では、ＤＮＡ修復遺伝子が変異している対象であって、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を治療上有効な量投与される対象は、動物である。特定の実施形態では、その対象は、哺乳動物である。すなわち、本開示の関連における対象は、ヒト、飼育動物（例えば実験動物）、飼育されているペット（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ）、及び野生動物などのような非飼育動物であってよい。一実施形態では、その対象は、ヒトである。
【００７１】
骨髄抑制
一実施形態では、本開示の方法は、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレートを治療上有効な量、対象に投与することであって、化合物Ｉを治療上有効な量投与されなかった対象と比べて、該対象における骨髄抑制の発生を予防または低減することに対するものである。特定の実施形態では、化合物Ｉを治療上有効な量投与されなかった対象は、がんの治療または予防のために、化合物Ｉではない化学療法剤を投与されたことがある。したがって、一実施形態では、本開示の方法は、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を治療上有効な量、対象に投与することであって、化合物Ｉではない化学療法剤を投与されたことがある対象と比べて、該対象における骨髄抑制の発生を予防または低減することに対するものである。本明細書で使用する場合、骨髄抑制とは概して、造血の１つ以上の構成要素（例えば骨髄活性）の抑制を指し、造血プロセスの産物である種類の細胞のうちの１つ以上が異常なレベルとなることで顕在化する。造血の１つ以上の構成要素（例えば骨髄活性）の抑制とは、例えば、白血球数及び／または血小板数の抑制を指してよい。したがって、一実施形態では、対象のがんを予防、軽減または治療するための本開示の方法であって、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を治療上有効な量、その対象に投与することを含み、その対象が、ＤＮＡ修復遺伝子に変異を有し、その対象において、骨髄活性の低下が、化合物Ｉを治療上有効な量投与されなかった対象と比べて９０％未満となる方法を提供する。例えば、その対象は、骨髄活性の低下が、化合物Ｉを治療上有効な量投与されなかった対象と比べて９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２４％未満、２３％未満、２２％未満、２１％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．７５％未満、０．５％未満、０．２５％未満となる。一実施形態では、化合物Ｉを治療上有効な量投与された対象は、骨髄活性の低下が、化合物Ｉを治療上有効な量投与されなかった対象と比べて１０％未満となる。一実施形態では、化合物Ｉを治療上有効な量投与された対象は、骨髄活性が、化合物Ｉを治療上有効な量投与されなかった対象と比べて低下しない。
【００７２】
一実施形態では、対象のがんの治療方法であって、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を治療上有効な量、その対象に投与することを含み、その対象が、ＤＮＡ修復遺伝子に変異を有する方法を提供する。特定の実施形態では、がんである対象において、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を治療上有効な量投与することによって、がんと関連する様々な病理学的状態であって、当業者には容易に明らかとなる状態を治療し得る。したがって、一実施形態では、その対象では、がんと関連する腫瘍のサイズの低減または縮小が見られる。腫瘍サイズの低減または縮小は、腫瘍サイズの約１％の低減または縮小から、腫瘍サイズの約１００％の低減または縮小までのうちのいずれかであってよく、これらの数字の間のあらゆる整数及び範囲が含まれる。例えば、腫瘍サイズの低減または縮小は、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約１００％であってよい。一実施形態では、その対象は、がんと関連する腫瘍が完全に消失する（すなわち、腫瘍サイズが１００％低減または縮小する）。別の実施形態では、その対象では、がんと関連する腫瘍における新生血管形成または血管新生が阻害、減少または低減される。がんと関連する腫瘍における新生血管形成または血管新生の減少または低減は、新生血管形成または血管新生の約１％低減または減少から、新生血管形成または血管新生の約１００％低減または減少までのうちのいずれかであってよく、これらの数字の間のあらゆる整数及び範囲が含まれる。例えば、新生血管形成または血管新生の低減または減少は、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約１００％であってよい。一実施形態では、その対象では、がんと関連する新生血管形成または血管新生が、完全に低減または減少される（すなわち、新生血管形成または血管新生が１００％低減または減少される）。
【００７３】
一実施形態では、本開示は、がん細胞の殺傷方法であって、該細胞と、治療上有効な量の化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）とを接触させることを含む方法に対するものである。特定の実施形態では、そのがん細胞は、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｒａｄ５１、ＲＰＡ及びＸＲＣＣ３からなる群から選択した１つ以上の遺伝子を欠損している。
【００７４】
一実施形態では、本開示は、がん細胞における細胞周期停止の誘導方法であって、該細胞と、治療上有効な量の
【化１１】
2021501203.tif 000013
、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）とを接触させることを含む方法に関するものである。特定の実施形態では、そのがん細胞は、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｒａｄ５１、ＲＰＡ及びＸＲＣＣ３からなる群から選択した１つ以上の遺伝子を欠損している。
【００７５】
一実施形態では、対象におけるＧ−四重鎖（Ｇ４）の安定化方法であって、その対象に、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を治療上有効な量投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、対象におけるＧ−四重鎖（Ｇ４）の安定化方法であって、その対象に、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）、及び本明細書に記載されているような少なくとも１つの追加の治療有効剤を含む併用医薬を治療上有効な量投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象におけるＧ−四重鎖（Ｇ４）の安定化方法であって、その対象に、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を含む併用医薬を治療上有効な量投与すること、及びその対象に上記の化合物を投与する前、投与している間または投与した後に、放射線療法を行うか、または少なくとも１つの追加の治療有効剤を投与することを含む方法を提供する。
【００７６】
一実施形態では、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）は、約１ｍｇ／日〜約３ｇ／日の用量で投与する。特定の実施形態では、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）は、約１ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日の用量で投与する。特定の実施形態では、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）は、約５０ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日の用量で投与する。
【００７７】
併用療法
一実施形態では、本発明は、化合物Ｉを少なくとも１つの追加の治療有効剤とともに含む併用療法剤を提供する。
【００７８】
一実施形態では、本発明は、治療の必要な患者における、細胞増殖と関連する状態を治療する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、がんまたは腫瘍の治療方法を提供する。その方法は、治療の必要な患者に、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、エステル、溶媒和物及び／またはプロドラッグを治療上有効な量と、少なくとも１つの追加の治療有効剤を併用投与することを含む。一実施形態では、少なくとも１つの追加の治療有効剤は、オラパリブである。
【００７９】
「併用投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」または「併用投与（ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」という用語は、（ａ）化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）、及び（ｂ）少なくとも１つの追加の治療有効剤を併せて、協調的に投与することを指す。例えば、併用投与は、同時投与、順次投与、重複投与、間隔を空けた投与、持続投与またはこれらを組み合わせたものであることができる。一実施形態では、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）、及び少なくとも１つの追加の治療有効剤は、単一剤形に調合する。別の実施形態では、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）、及び少なくとも１つの追加の治療有効剤は、別々の剤形で提供する。
【００８０】
医薬製剤
別の実施形態では、本発明は、活性成分として、本明細書に開示されているような化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を治療上有効な量、製薬学的に許容可能な賦形剤または担体と組み合わせて含む医薬組成物及び／または併用剤を提供する。その賦形剤は、様々な目的で、その製剤に添加する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）、及び少なくとも１つの治療有効剤を単一の医薬組成物及び／または併用剤に調合し得る。いくつかの実施形態では、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）、及び少なくとも１つの治療有効剤は、製薬学的に許容可能な賦形剤または担体を含む別々の医薬組成物及び／または併用剤に調合する。
【００８２】
具体的な実施形態では、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）、及び少なくとも１つの治療有効剤は、単一の医薬組成物及び／または併用剤組成物に調合し得る。別の実施形態では、その組成物は、本明細書に開示されているような化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を約１ｍｇ〜約１ｇの量で含み得る。別の実施形態では、その量は、約５ｍｇ〜約５００ｍｇである。別の実施形態では、その量は、約２０ｍｇ〜約４００ｍｇである。別の実施形態では、その量は、約５０ｍｇ〜約３００ｍｇである。別の実施形態では、その量は、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇである。別の実施形態では、その化合物は、化合物Ｉの塩、エステル、溶媒和物またはプロドラッグである。
【００８３】
別の実施形態では、その医薬組成物は、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含み得る。別の実施形態では、その濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである。別の実施形態では、その濃度は、約０．７５ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌである。別の実施形態では、その濃度は、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである。
【００８４】
別の実施形態では、その化合物は、化合物Ｉの塩、エステル、溶媒和物またはプロドラッグである。別の実施形態では、その組成物は、化合物Ｉ、あるいはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、エステル、溶媒和物及び／またはプロドラッグ、ならびにＰＡＲＰ阻害剤を含み得る。別の実施形態では、そのＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブである。
【００８５】
別の実施形態では、その組成物は、化合物Ｉ、あるいはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、エステル、溶媒和物及び／またはプロドラッグ、ならびにオラパリブを含んでよく、その組成物中のオラパリブの量は、約１０ｍｇ〜約８００ｍｇである。別の実施形態では、オラパリブの量は、約２０ｍｇ〜約６００ｍｇである。別の実施形態では、オラパリブの量は、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇである。別の実施形態では、オラパリブの量は、約３００ｍｇ〜約４００ｍｇである。
【００８６】
製薬学的に許容可能な賦形剤をその組成物／製剤に添加し得る。例えば、希釈剤を本発明の製剤に添加し得る。希釈剤は、固体の医薬組成物及び／または併用剤の嵩を増やし、その組成物及び／または併用剤を含む医薬品剤形を、患者及び介護者の扱いやすい剤形にし得る。固体の組成物及び／または併用剤用の希釈剤としては、例えば、微結晶性セルロース（例えばＡＶＩＣＥＬ）、マイクロファインセルロース、ラクトース、デンプン、アルファ化デンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、糖、デキストレート、デキストリン、デキストロース、第二リン酸カルシウム二水和物、第三リン酸カルシウム、カオリン、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マルトデキストリン、マンニトール、ポリメタクリレート（例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標））、塩化カリウム、粉末セルロース、塩化ナトリウム、ソルビトール及びタルクが挙げられる。
【００８７】
固体の医薬組成物及び／または併用剤を圧密して、錠剤のような剤形にしたものは、賦形剤（その機能としては、圧縮後にその活性成分とその他の賦形剤を併せて結合させるのを助けることが挙げられる）を含み得る。固体の医薬組成物及び／または併用剤用の結合剤としては、アカシア、アルギン酸、カルボマー（例えばカルボポール）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、グアーガム、トラガカントガム、硬化植物油、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（例えばＫＬＵＣＥＬ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えばＭＥＴＨＯＣＥＬ）、液状ブドウ糖、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、マルトデキストリン、メチルセルロース、ポリメタクリレート、ポビドン（例えば、ＫＯＬＬＩＤＯＮ、ＰＬＡＳＤＯＮＥ）、アルファ化デンプン、アルギン酸ナトリウム及びデンプンが挙げられる。
【００８８】
患者の胃における、圧密した固体の医薬組成物及び／または併用剤の溶解速度は、その組成物及び／または併用剤に崩壊剤を加えることによって上昇し得る。崩壊剤としては、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム（例えば、ＡＣ−ＤＩ−ＳＯＬ及びＰＲＩＭＥＬＬＯＳＥ）、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン（例えば、ＫＯＬＬＩＤＯＮ及びＰＯＬＹＰＬＡＳＤＯＮＥ）、グアーガム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポラクリリンカリウム、粉末セルロース、アルファ化デンプン、アルギン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム（例えばＥＸＰＬＯＴＡＢ）、バレイショデンプン及びデンプンが挙げられる。
【００８９】
流動化剤を加えて、圧密されていない固体の組成物及び／または併用剤の流動性を上昇させ、投与の正確性を向上させることができる。流動化剤として機能し得る賦形剤としては、コロイド状二酸化ケイ素、三ケイ酸マグネシウム、粉末セルロース、デンプン、タルク及び第三リン酸カルシウムが挙げられる。
【００９０】
粉末の組成物及び／または併用剤を圧密することによって、錠剤のような剤形を作製する場合には、その組成物及び／または併用剤に、パンチ及びダイスから圧力をかける。一部の賦形剤及び活性成分は、パンチ及びダイスの表面に付着する傾向があり、それにより、製品に、点食及び表面のその他の凹凸が生じ得る。潤沢剤をその組成物及び／または併用剤に加えて、付着性を低減し、製品をダイスから外しやすくできる。潤沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセリル、硬化ヒマシ油、硬化植物油、鉱油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、フマル酸ステアリルナトリウム、ステアリン酸、タルク及びステアリン酸亜鉛が挙げられる。
【００９１】
香味剤及び香味増強剤によって、その剤形を、患者にとってさらに飲みやすくする。本発明の組成物及び／または併用剤に含めてよい一般的な医薬品用香味剤及び医薬品用香味増強剤としては、マルトール、バニリン、エチルバニリン、メントール、クエン酸、フマル酸、エチルマルトール及び酒石酸が挙げられる。
【００９２】
固体及び液体の組成物及び／または併用剤は、いずれかの製薬学的に許容可能な着色剤を用いて着色して、その外観を向上させ、及び／またはその製品及び単位用量レベルを患者が識別しやすいようにしてもよい。
【００９３】
液体の医薬組成物及び／または併用剤は、本発明の化合物Ｉ、あるいはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、エステル、溶媒和物及び／またはプロドラッグ、ならびにいずれかの他の固体賦形剤を用いて調製してよく、その際、その構成要素は、水、植物油、アルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンまたはマクロゴール１５ヒドロキシステアレート（Ｓｏｌｕｔｏｌ）のような液体担体に溶解または懸濁されている。
【００９４】
液体の医薬組成物及び／または併用剤は、液体担体に溶解できない活性成分またはその他の賦形剤をその組成物及び／または併用剤の全体にわたって均一に分散させるために、乳化剤を含んでよい。本発明の液体の組成物及び／または併用剤において有用であり得る乳化剤としては、例えば、ゼラチン、卵黄、カゼイン、コレステロール、アカシア、トラガカント、ツノマタ、ペクチン、メチルセルロース、カルボマー、セトステアリルアルコール及びセチルアルコールが挙げられる。
【００９５】
液体の医薬組成物及び／または併用剤は、製品の口当たりを向上させ、及び／または胃腸管の粘膜を覆うために、増粘剤も含み得る。このような添加剤としては、アカシア、アルギン酸、ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セトステアリルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、ゼラチン、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリビニルアルコール、ポビドン、炭酸プロピレン、アルギン酸プロピレングリコール、アルギン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプン、トラガカント及びキサンタンガムが挙げられる。
【００９６】
アスパルテーム、ラクトース、ソルビトール、サッカリン、サッカリンナトリウム、スクロース、アスパルテーム、フルクトース、マンニトール及び転化糖のような甘味剤を加えて、味を改善してもよい。
【００９７】
摂取用として安全なレベルで、アルコール、安息香酸ナトリウム、ブチルヒドロキシルトルエントルエン、ブチルヒドロキシルアニソール及びエチレンジアミンテトラ酢酸のような保存剤及びキレート剤を加えて、保存安定性を向上させてよい。
【００９８】
液体の組成物及び／または併用剤は、グルコン酸、乳酸、クエン酸、酢酸、グルコン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムのような緩衝剤も含んでよい。賦形剤の選択及び使用量は、調合の専門家が、その分野における経験及び標準的な手順及び参考文献の考察に基づき、容易に決定し得る。
【００９９】
本発明の固体の組成物及び／または併用剤としては、散剤、顆粒剤、凝集体、ならびに圧密した組成物及び／または併用剤が挙げられる。その投与量としては、経口投与、口腔内投与、直腸投与、非経口（皮下投与、筋肉内投与及び静脈内投与を含む）、吸入投与、ならびに点眼投与に適する投与量が挙げられる。いずれの所定のケースにおいても、最も好適な投与は、治療する状態の性質及び重症度に左右されることになるが、本発明の最も好ましい経路は、経口である。その投与量は、利便的なことに、単位剤型で供給し得るとともに、製薬分野において周知の方法のうちのいずれによっても調製し得る。
【０１００】
剤形としては、錠剤、散剤、カプセル剤、坐剤、サッシェ剤、トローチ剤及びロゼンジ剤のような固体剤形、ならびに液体シロップ剤、懸濁剤、エアゾール剤及びエリキシル剤が挙げられる。
【０１０１】
本発明の剤形は、本発明の組成物及び／または併用剤、好ましくは粉末状または顆粒状固体の組成物及び／または併用剤を硬カプセルシェルまたは軟カプセルシェルのいずれかに含むカプセル剤であってよい。そのシェルは、ゼラチンから作られていてよく、グリセリン及びソルビトールのような可塑剤、ならびに不透明化剤または着色剤を任意に含んでよい。
【０１０２】
製錠またはカプセル充填用の組成物及び／または併用剤は、湿式造粒によって調製し得る。湿式造粒では、粉末形態の活性成分及び賦形剤の一部または全部をブレンドしてから、その粉末を固めて顆粒にする液体、典型的には水の存在下で、さらに混合する。その顆粒を篩分及び／または粉砕し、乾燥してから、篩分及び／または粉砕して、所望の粒径にする。その顆粒を製錠してよく、あるいは、製錠の前に、流動化剤及び／または潤沢剤のような他の賦形剤を加えてもよい。
【０１０３】
製錠用の組成物及び／または併用剤は従来どおりに、ドライブレンドによって調製し得る。例えば、活性成分と賦形剤とのブレンド組成物及び／または併用剤は、圧密して、スラグまたはシート状にしてから、粉砕して、圧密された顆粒にし得る。その圧密された顆粒は、その後、圧縮して錠剤にし得る。
【０１０４】
乾式造粒の代替策として、直接圧縮法を用いて、ブレンド組成物及び／または併用剤を直接圧縮して、圧密された剤形にしてもよい。直接圧縮により、顆粒を含まない、より均一な錠剤が作られる。直接圧縮製錠に特に適している賦形剤としては、微結晶性セルロース、噴霧乾燥ラクトース、第二リン酸カルシウム二水和物及びコロイダルシリカが挙げられる。直接圧縮製錠でのこれらの賦形剤及びその他の賦形剤の適切な使用は、直接圧縮製錠の具体的な製剤時の課題の経験及び技術を有する当業者に知られている。
【０１０５】
本発明のカプセル充填剤は、製錠に関して説明した上記ブレンド及び顆粒のうちのいずれも含み得るが、これらには、最後の製錠工程は施されていない。
【０１０６】
活性成分及び賦形剤は、当該技術分野において知られている方法に従って、組成物及び／または併用剤、ならびに剤形に調合してよい。
【０１０７】
一実施形態では、剤形は、化合物Ｉ、あるいはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、エステル、溶媒和物及び／またはプロドラッグ、ならびに製薬学的に許容可能な賦形剤及び担体を別々の構成要素として含むキットとして提供し得る。一実施形態では、剤形は、化合物Ｉ、あるいはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、エステル、溶媒和物及び／またはプロドラッグ、少なくとも１つの追加の治療有効剤、ならびに製薬学的に許容可能な賦形剤及び担体を別々の構成要素として含むキットとして提供し得る。いくつかの実施形態では、その剤形キットによって、医師及び患者は、使用前に、化合物Ｉ、あるいはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、エステル、溶媒和物及び／またはプロドラッグを製薬学的に許容可能な賦形剤及び担体とともに溶解、懸濁または混合することによって、経口用溶液または注射用溶液を調合可能になる。一実施形態では、その剤形キットは、化合物Ｉ、あるいはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、エステル、溶媒和物及び／またはプロドラッグを事前に調合した製剤と比べると、安定性が向上している化合物Ｉ、あるいはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、エステル、溶媒和物及び／またはプロドラッグを提供する。
【０１０８】
一実施形態では、本発明の医薬製剤、あるいは組成物及び／または併用剤は、その製剤、あるいは組成物及び／または併用剤に、本明細書に記載されているような化合物Ｉ、あるいはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、エステル、溶媒和物及び／またはプロドラッグを２５〜１００重量％または５０〜１００重量％含む。
【０１０９】
別の実施形態では、本発明の方法は、上記の医薬製剤、あるいは組成物及び／または併用剤で、化合物Ｉ、またはその製薬学的に許容可能な塩、遊離塩基、水和物、錯体もしくはキレート（鉄、亜鉛などのような金属のキレートを含む）を治療上有効な量投与することを含む。具体的な実施形態では、その方法は、対象のがんを予防、軽減または治療するためのものである。別の実施形態では、その方法は、がん細胞を殺傷するためのものである。別の実施形態では、その方法は、がん細胞における細胞周期停止を誘導するためのものである。
【０１１０】
下記の実施例によって、本発明がさらに例示されているが、それらの実施例は、いかなる形でも、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：実施例２〜７の材料及び方法
薬物及び試薬
化合物Ｉ及び重水素化化合物Ｉ（化合物Ｉ−ｄ６）は、ＡＰＴＯＳＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得た。洗浄剤適合タンパク質アッセイキットＤＣ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙは、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ）は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。ＰＡＲＰ、ＭＣＬ−１、ＢＡＤ、ＢＩＫ、Ｎａ＋／Ｋ＋  ＡＴＰａｓｅ抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から得た。ｐＳｅｒ１３９  Ｈ２ＡＸ及びＡＴＭ抗体は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入した。ＡＢＣＧ２抗体は、ＫＡＭＩＹＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（Ｔｕｋｗｉｌａ，ＷＡ）から得た。Ｋｏ１４３及びｐＳｅｒ１９８１−ＡＴＭ抗体は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。オラパリブは、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入した。カルボプラチン及びトポテカンは、ＵＣＳＤ  Ｍｏｏｒｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｙから入手した。
【０１１２】
細胞の種類及び培養
ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、１０％ウシ胎児血清（ＡＴＣＣ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ＡＴＣＣ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。化合物Ｉ耐性Ｒａｊｉ（Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ）細胞株は、６カ月の期間にわたって、漸増濃度の化合物Ｉに暴露させることによって作製した。ＣＡＯＶ３細胞は、ＡＴＣＣから入手し、１０％ウシ胎児血清を添加した完全ＤＭＥＭ中で培養した。ＭＣＦ７ベクターコントロール及びＢＲＣＡ１  ｓｈＲＮＡサブクローンは、Ｄｒ．Ｓｉｍｏｎ  Ｐｏｗｅｌｌ（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）から入手し、１０％ウシ胎児血清を含むＥＭＢＭ中で培養した。ＭＣＦ１０Ａ及びｈＴＥＲＴ−ＩＭＥＣクローンは、Ｄｒ．Ｂｅｎ  Ｈｏ  Ｐａｒｋ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。ＨＣＴ１１６  ＢＲＣＡ２＋／＋細胞及びＢＲＣＡ２−／−細胞は、Ｄｒ．Ｓａｍｕｅｌ  Ａｐａｒｉｃｉｏ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ）から入手した。ＰＥＯ１及びＰＥＯ４細胞は、Ｄｒ．Ｓｈａｒｏｎ  Ｃａｎｔｏｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手し、これらの細胞株は、以前に公開されたのと同じ条件で培養した。Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＲＣＡ２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ＢＲＣＡ２  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＢＲＣＡ２−ｍｕｔａｔｅｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９；６９（１６）：６３８１−６、Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｌｌｅｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅ  ＢＲＣＡ１  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１１；１０８（４３）：１７７７３−８、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＸ−５４６１  ｉｓ  ａ  ＤＮＡ  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｉｎ  ＢＲＣＡ１／２  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０１７；８：１４４３２（いずれも、参照により、本明細書に援用される）。
【０１１３】
細胞毒性試験
細胞を播種し、示されている薬物によって、９６ウェルプレート中で、５日間処理した。細胞の生存能は、Ｐｒｏｍｅｇａから購入したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＭＴＳ）Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙを用いて測定し、ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６というソフトウェアを用いて算出した。
【０１１４】
ビオチン化及びイムノブロッティングの手順
ＡＢＣＧ２の発現を定量するために、細胞の表面をＥＺ−ＬＩＮＫスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）でビオチン化し、以前に報告されたように、ウエスタンブロット解析を行い、ウエスタンブロット解析を行った。Ｔｓａｉ  ＣＹ，Ｌｉｅｂｉｇ  ＪＫ，Ｔｓｉｇｅｌｎｙ  ＩＦ，Ｈｏｗｅｌｌ  ＳＢ，Ｔｈｅ  ｃｏｐｐｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  １（ＣＴＲ１）ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｔｏ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｐｐｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ２（ＣＴＲ２）．Ｍｅｔａｌｌｏｍｉｃｓ  ２０１５；７：１４７７−８７（参照により、本明細書に援用される）。
【０１１５】
ＲＮＡ−ｓｅｑ及びｑＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、実験ごとに、３つの独立した試料から全細胞ＲＮＡを単離した。ライブラリーの作製、及びＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いた検証のために、ＲＮＡ−ｓｅｑ試料をＩＧＭ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ（ｈｔｔｐ：／／ｉｇｍ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｇｅｎｏｍｉｃｓ／）に提出した。シーケンシングをＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＨｉＳｅｑ４０００で行った。バイオインフォマティクス解析をＯＨＳＵによって行った。ＡＢＣＧ２の過剰発現の確認の際に用いたフォワードプライマーは、５’−ＴＴＡ−ＧＧＡ−ＴＴＧ−ＡＡＧ−ＣＣＡ−ＡＡＧ−Ｇ−３’、リバースプライマーは、５’−ＴＡＧ−ＧＣＡ−ＡＴＴ−ＧＴＧ−ＡＧＧ−ＡＡＡ−ＡＴＡ−３’であった。
【０１１６】
化合物Ｉの細胞薬理
標準物質の重水素化化合物Ｉを５ｎｇ含むアセトニトリル中で、化合物ＩまたはＦｅ（化合物Ｉ）３に暴露した細胞をホモジナイズした。ＵＣＳＤ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで、イオン源として、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）を用いた質量分析計Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＣＱｄｅｃａと連結した液体クロマトグラフ（ＬＣ）システムＡｇｉｌｅｎｔ１２６０を用いて、試料を解析した。そのＥＳＩのイオン源電圧は５ｋＶに設定し、シースガス流量は８０単位、補助ガス流量は２０単位、キャピラリー温度は２５０℃とした。ＬＣによる分離では、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｂｉｐｈｅｎｙｌカラム（内径２．１ｍｍ×長さ５０ｍｍ、粒径２．６μｍ）を使用し、０．１％ギ酸を含む水を移動相Ａとして、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルを移動相Ｂとして用いた。ＬＣ流量は、０．３０ｍＬ／分に設定した。ＬＣグラジエントは、１０分で移動相Ｂを５％から移動相Ｂを９５％まで増加させ、Ｂを９５％で２分間保ち、１分でＢを５％まで戻してから、Ｂを５％で６分間保った。正イオンモードのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ解析では、化合物Ｉは、正規化衝突エネルギー４５％で、ｍ／ｚ３６８における分子イオンピークから、主要フラグメントピークがｍ／ｚ３５３で観察され（［Ｍ＋Ｈ］＋）、化合物Ｉ−ｄ６は、正規化衝突エネルギー４５％で、ｍ／ｚ３７４での分子イオンピークから、主要フラグメントピークがｍ／ｚ３５９で観察された（［Ｍ＋Ｈ］＋）。選択反応モニタリング（ＳＲＭ）モードを用いて、ｍ／ｚ３５３及びｍ／ｚ３５９のフラグメントピークを得た。試料における化合物Ｉ及びＦｅ（化合物Ｉ）３の定量には、化合物Ｉ−ｄ６の添加量に対するＳＲＭピーク面積比（化合物Ｉ／化合物Ｉ−ｄ６）を用いた。Ｆｅ（化合物Ｉ）３の検出でも、同じカラム、グラジエント及び流速を使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００  ＨＰＬＣ、及びＴｈｅｒｍｏ  ＩｏｎＭａｘ  ＥＳＩのインターフェースを用いた質量分析計Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて検出した。Ｆｅ（化合物Ｉ）３は、これらの条件によって、１１．５分前後で溶出された。０．３ｍＬ／分の溶出流速に対して、１０：１の流量スプリット比を用いたので、スプリット後、約０．０３０ｍＬ／分をＥＳＩに導入した。イオン源ＭＳパラメーターは、キャピラリー温度２５０℃、シースガス流量２０単位、正の極性、イオン源電圧５．０ｋＶ、キャピラリー電圧２２Ｖ及びチューブレンズ８０Ｖであった。フーリエ変換ＭＳ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）パラメーターは、ＦＴＭＳ  ＡＧＣ  １ｅ６、ＦＴＭＳ平均マイクロスキャン数２及びＦＴＭＳフルスキャン最大イオン時間５００ミリ秒であった。１５，０００という分解能パラメーター（ｍ／ｚ４００におけるピークｍ／ｚを、半値全幅として与えられたピーク幅で除した値）を使用した。ＭＳ−ＭＳ  ＣＩＤのスペクトルでは、４５％の正規化衝突エネルギーを使用した。
【０１１７】
Ｆｅ（化合物Ｉ）３の合成及び特徴付け
濃縮水ストック中のＦｅＳＯ４として二価鉄イオンを５モル当量、エタノール中の化合物Ｉに加えたところ、深赤色の沈殿物が得られ、その後、その沈殿物をＤＭＳＯに溶解させ、ＨＰＬＣ及び質量分析によって特徴付けた。Ｆｅ（化合物Ｉ）３は、純度が９５％超であったとともに、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中で少なくとも５日間安定していた。
【０１１８】
コメットアッセイ
コメットアッセイキットをＴｒｅｖｉｇｅｎ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入し、中性コメットアッセイを製造元の指示に従って行った。Ｋｅｙｅｎｃｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｋｅｙｅｎｃｅ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｔａｓｃａ，ＩＬ）によって画像を取得し、ＯｐｅｎＣｏｍｅｔというソフトウェアを用いて定量した。
【０１１９】
免疫蛍光染色
細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、Ｚ固定液（緩衝亜鉛ホルマリン固定剤、Ａｎａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ，Ｃｒｅｅｋ，ＭＩ）で固定し、５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で浸透化処理及びブロックした。続いて、その細胞をγＨ２ＡＸ抗体（１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００での１：２５０希釈液）とともに一晩インキュベートしてから、３回洗浄した。細胞を１時間、蛍光コンジュゲート二次抗体（１：１０００希釈液）とともにインキュベートしてから、３回洗浄した。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）とともに、非退色試薬ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄを用いてスライドに封入して、細胞核を染色した（分子プローブ）。１００倍の対物倍率を用いて、Ｋｅｙｅｎｃｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで蛍光を観察し、Ｉｍａｇｅ  Ｊというソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）で定量した。
【０１２０】
統計解析
いずれの２群比較においても、不等分散と仮定したスチューデントｔ検定を用いた。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±標準誤差として示されている。
【０１２１】
実施例２：化合物Ｉの細胞薬理
化合物Ｉが強力な細胞毒性を示すタイプの細胞の中でも、リンパ腫は注目されている。この疾患の治療で用いる標準的な化学療法剤の大半が、用量を制限する骨髄抑制を起こすからである。このため、化合物Ｉの細胞薬理試験用には、Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞を選択した。Ｒａｊｉ細胞における化合物Ｉの細胞内蓄積を液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって定量した。化合物Ｉ及びその内部標準である化合物Ｉ−ｄ６は、鋭いピークプロファイルで、ＬＣカラムから約６．９分で溶出された。Ｒａｊｉ細胞には、化合物Ｉは比較的ゆっくり蓄積され、６時間までに、含有量は定常状態に近づいた（図６Ａ）。
【０１２２】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ波形を慎重に検証することによって、化合物Ｉの検出のために選択した同じ反応モニタリングモードで、ＬＣカラムから約８．７分で溶出されたマイナーピークが特定された。ＬＣ−ＨＲ−ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ（液体クロマトグラフィー高分解能エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析）を用いた場合にも、ｍ／ｚ５７８．６５において、約８．７分で溶出されたピークが特定された。Ｏｂｒｉｔｒａｐ−ＭＳによる高分解能ＭＳ／ＭＳ解析では、その物質が、化合物Ｉと二価鉄との３：１の比率の錯体（図１Ｂ）であることが示された。三元錯体であるＦｅ（化合物Ｉ）３の構造をＬＣ−ＭＳ−ＥＳＩによって特徴付けた。プレカーサーイオンマススペクトルの２つの主要な特徴によって、構造の特定が絞られた。第１の特徴は、高分解能ＭＳによって、２価の正電荷を持つそのイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）の質量測定が精密に行われる点であった。第２の特徴は、測定されたピークの同位体分布によって、その構造に少なくとも１つの鉄原子が含まれることが示された点であった。加えて、その錯体のＭＳ−ＭＳスペクトルによって、２つのフラグメントイオンが示され、その１つは、ｍ／ｚ３６８のイオンで、遊離化合物Ｉに一致したものであり、もう１つは、ｍ／ｚ７８９のイオンであり、鉄及び２つの残りの配位子である化合物Ｉと一致していた。その三元錯体の質量計算値５７８．６５２０（ｍ／ｚ）は、数回の異なる日のそれぞれにおいて観察された平均ｍ／ｚの結果（５７８．６５１９（ｍ／ｚ））とほぼ一致していた。測定値と計算値における比率の差は、−０．２ｐｐｍであった。日間標準偏差は０．０００３（ｍ／ｚ、ｎ＝３）、日間質量差率は一貫して、１．０ｐｐｍ未満であった。この一致尺度は、３ｐｐｍという標準値内であり、この標準値は概して、合成有機物の構造実証に適用されるものである。鉄の存在は、その元素に特徴的である同位体パターンによって確認された。鉄には、天然存在比率が５．８５％の５４Ｆｅ、天然存在比率が９１．７５％の５６Ｆｅ、天然存在比率が２．１２％の５７Ｆｅ、及び天然存在比率が０．２８％の５８Ｆｅという４つの安定同位体がある。５４Ｆｅ同位体により現れるＭＳピークは、特徴的である。配位子である化合物Ｉの炭素、水素及び窒素の天然同位体と一致しないからである。その錯体のスペクトルでは、その質量計算値は、５７７．６５４２（ｍ／ｚ）である（最も多く存在する同位体のピークよりも約１（ｍ／ｚ）小さい。そのイオンは、電荷が２大きいからである）。このピークで観察された平均質量は５７７．６５４５（ｍ／ｚ）であり、標準偏差は０．０００３（ｍ／ｚ）であった。質量差率は、０．５ｐｐｍであった（日間、ｎ＝３）。５４Ｆｅのピーク強度の測定結果も一貫して、天然存在比率から予想されるように、主要な５６Ｆｅのピークのイオン存在度強度の約６％であった。上記のピーク位置の測定では、結果を内部標準（周囲バックグラウンドにより偏在するフタル酸ジイソオクチルのイオン）の３９１．２８４３（ｍ／ｚ）に対して再較正した。
【０１２３】
錯体Ｆｅ（化合物Ｉ）３は、ＦｅＳＯ４をエタノール中の化合物Ｉに加えるだけで合成できることが発見された。Ｆｅ（化合物Ｉ）３の純度をＨＰＬＣによって求めたところ、その錯体は、保存時に安定していることがわかった。Ｆｅ（化合物Ｉ）３のＩＣ５０は、１４５．７±０．５ｎＭであり、おそらくは、そのＦｅイオンが２価の正電荷を持つことにより、細胞に進入しにくいため、効能は、化合物Ｉの１．５分の１であった（図１Ｃ）。Ｒａｊｉ細胞を０．５μｍの化合物Ｉ及びＦｅ（化合物Ｉ）３のそれぞれで６時間処理し、各分子のイオン化効率に基づき、細胞内濃度を補正することによって、各化合物の相対的な取り込み量を調べた（図１Ｄ）。化合物Ｉで処理した細胞では、細胞内のＦｅ（化合物Ｉ）３の蓄積が、Ｆｅ（化合物Ｉ）３で処理した細胞よりも多く、これらの２つの分子のＩＣ５０の差と整合していた。化合物Ｉで処理した細胞では、化合物Ｉの大半が、細胞内でＦｅ（化合物Ｉ）３に変換されたが、Ｆｅ（化合物Ｉ）３で処理した細胞では、Ｆｅ（化合物Ｉ）３が細胞内で解離して、検出可能である遊離な化合物Ｉが生成されることはなかった。したがって、Ｆｅ（化合物Ｉ）３は、化合物Ｉの主要な細胞内活性型であると考えられる。
【０１２４】
実施例３：化合物Ｉは、ＤＮＡを損傷させる。
化合物Ｉの構造は、ＤＮＡの四重鎖構造に結合して鎖を切断させる薬物と似ていることから、化合物ＩがＤＮＡを損傷させるか調べた。親Ｒａｊｉ細胞を０．５μＭの化合物Ｉで長期間処理し、ウエスタンブロット解析によって測定される、ＡＴＭのリン酸化形態及びγＨ２ＡＸの蓄積によって、ＤＮＡ損傷の誘導を評価した。図２Ａには、Ｒａｊｉ細胞において、化合物Ｉによって、６時間の時点から、リン酸化ＡＴＭ及びγＨ２ＡＸが明らかに増加したこと、ならびに、その量は、薬物暴露時間（最長で２４時間）とともに増加したことが示されている。８時間の時点から、ＰＡＲＰの切断（アポトーシスの誘導を示す）が検出された。Ｒａｊｉ細胞は、核が非常に小さいため、γＨ２ＡＸのフォーカス形成を定量するのは難しいので、この目的では、ヒト卵巣癌細胞株ＣＡＯＶ３を使用した。図２Ｂには、ＤＭＳＯまたは１μＭの化合物Ｉに２４時間暴露させたＣＡＯＶ３細胞におけるγＨ２ＡＸのフォーカス形成の代表的な画像が示されている。図２Ｃには、１時間の時点に、フォーカス数の増加が検出可能となり、８時間後に、フォーカス数の増加がさらに顕著になったことが示されている。主にＤＮＡ二本鎖切断を検出する中性コメットアッセイの結果によって、ＤＮＡ損傷の証拠がさらに強化された（図２Ｄ）。細胞を０．５μＭの化合物Ｉで６時間処理したところ、ＤＭＳＯで処理した場合と比べて、テールＤＮＡの増加は見られなかったが、細胞を化合物Ｉで６時間処理してから、無薬剤培地で１８時間インキュベートしたところ（パルスチェイス）、コメットテール内のＤＮＡが著しく増加した。これらの結果から、化合物ＩがＤＮＡを損傷させ、アポトーシスを誘導できるＤＮＡ鎖切断を蓄積させる強力な証拠が示されている。
【０１２５】
実施例４：ＢＲＣＡ１／２欠損細胞は、化合物Ｉに対する過敏性を有する。
化合物ＩがＤＮＡを損傷させるという知見から、相同組み換えを欠損した細胞が、化合物Ｉに対する過敏性を有するかを調べることにした。化合物ＩとＢＲＣＡ１の欠損には合成致死性があるのではないかという仮説について、ＢＲＣＡ１非欠損ヒト細胞株及びＢＲＣＡ１欠損ヒト細胞株の同種同系対を用いて試験を行った。２つの独立したＭＣＦ１０Ａサブクローン（それぞれ、ＢＲＣＡ１の２ｂｐが欠失されたヘテロ接合体ノックインを含み、その結果、中途終止コドンが生じる）（ＢＲＣＡ１−ｈｅｔ＃１及びＢＲＣＡ１−＃２）は、ゲノム内でターゲティングベクターのランダムインテグレーションを起こしたクローン（コントロール）よりも、オラパリブに対する感受性が高いことが明らかとなり、その２つのノックインクローンで、ＢＲＣＡ１機能が喪失していることが確認された（図３Ａ、左図）。これらの２つのノックインクローンは、化合物Ｉに対する方が、過敏性がさらに高かった（図３Ａ、右図）。ｈＴＥＲＴ−ＩＭＥＣ細胞株に由来する、同じ２ｂｐのノックインを含むクローンで、ＢＲＣＡ１の機能不全の作用を確認した場合にも、オラパリブ及び化合物Ｉの両方に対する過敏性を有することが明らかになった（図３Ｂ）。ｓｈＲＮＡｉの発現により、ＢＲＣＡ１の発現が安定的にノックダウンされるＭＣＦ７  Ｅ７細胞で得られた結果によって、ＢＲＣＡ１欠損細胞が、化合物Ｉに対する過敏性を有するという結論が、さらに裏付けられた。図３Ｃに示されているように、Ｅ７クローンも、オラパリブ及び化合物Ｉに対する過敏性が同程度である。ＢＲＣＡ１機能正常細胞とＢＲＣＡ１機能不全細胞との３つの独立した同種同系対におけるこれらの結果から、化合物Ｉによって生じるＤＮＡ損傷の修復は部分的に、ＢＲＣＡ１が機能する相同組み換え経路及び／またはその他のＤＮＡ修復経路に依存することが示されている。ＢＲＣＡ２非欠損卵巣癌細胞株ＰＥＯ４及びＢＲＣＡ２欠損卵巣癌細胞株ＰＥＯ１を用いて、ＢＲＣＡ２欠損細胞の方が、化合物Ｉに対して高い感受性を有するかについて、試験を行った。ＰＥＯ１は、ＢＲＣＡ２を欠損しており、シスプラチン及びポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ阻害剤ＡＧ１４３６１に対して感受性を有する。ＰＥＯ４は、再発時の腹水から抽出したものであり、シスプラチン耐性を有し、ＢＲＣＡ２機能を回復させる二次変異を含む。ＢＲＣＡ２機能の回復により、オラパリブ（図３Ｄ、左図）及び化合物Ｉ（図３Ｄ、右図）の両方に対する耐性が向上した。ＢＲＣＡ２を欠損していないＨＣＴ１１６細胞、ならびに２つのＢＲＣＡ２−／−サブクローン（Ｂ１８及びＢ４６）を用いた場合も、同様の結果が得られた（図３Ｅ）。したがって、悪性細胞は、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２の機能のいずれが喪失しても、化合物Ｉに対する過敏性を有するようになる。
【０１２６】
実施例５：薬物耐性の獲得についての選択
化合物Ｉの作用のうち、化合物Ｉに対する感受性と最も密接に関係する作用を明らかにするために、６カ月間にわたって、漸増濃度の化合物Ｉに繰り返し暴露させた結果、耐性を獲得したＲａｊｉバーキットリンパ腫細胞株のサブライン（Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ）を確立した。耐性は、選択プロセスのいずれの時点においても、急激に変化することなく、ゆっくりかつ段階的に獲得された。薬物に１２０時間暴露させた際に、成長速度を定量するアッセイを用いて試験したところ、親Ｒａｊｉ細胞に対する化合物ＩのＩＣ５０は、９１．９±２２．３ｎＭであった。この値は、新鮮単離ＡＭＬ芽球細胞及びＣＬＬ細胞で報告された値と同じ範囲内である。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−Ｍｙｃ  ｂｙ  ＡＴＰＯ−ＣＯＭＰＯＵＮＤ  Ｉ  ａｓ  ａｎ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ［ａｂｓｔｒａｃｔ］，”Ｂｌｏｏｄ  ２０１６；１２８：１７１６、Ｋｕｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｒｏａｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＣＯＭＰＯＵＮＤ  Ｉ  ｉｎ  ＡＭＬ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ＫＦＬ４  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｅｖｅｌ  ［ａｂｓｔｒａｃｔ］，”Ｂｌｏｏｄ  ２０１５；１２６：１３５８（いずれも、参照により、本明細書に援用される）。Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞は、化合物Ｉに対する耐性が１６．７±３．９倍であった（ＩＣ５０：１３８７．７±９８．５ｎＭ）。耐性のレベルは、無薬剤培地での培養中、少なくとも３カ月安定した状態を保った（図４Ａ）。Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞は、親細胞よりもわずかに成長が速かったが、統計的に有意な差は見られなかった。Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞においては、感受性Ｒａｊｉ細胞でアポトーシスが誘導された濃度では、化合物Ｉによってアポトーシスは誘導されなかった。その感受性細胞を０．５μＭの化合物Ｉで２４時間処理したところ、コントロールのＤＭＳＯと比べて、プロアポトーシスタンパク質のＢＩＫが４７．５±１６．８％及びＢＡＤが２．１±０．２５倍増加し（Ｐ＜０．０５、ｎ＝３）、抗アポトーシスタンパク質のＭＣＬ−１は、３８．１±２．３％減少した（ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。同じ暴露を行ったＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞では、これらの変化は検出されなかった（図４Ｂ）。
【０１２７】
実施例６：薬物耐性の機序
Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞における耐性は、薬物の流入もしくは排出の変化、細胞内解毒または一次標的の変化によるものと思われる。ネイティブ化合物Ｉまたは錯体Ｆｅ（化合物Ｉ）３のいずれかとともにインキュベートしたＲａｊｉ細胞及びＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞におけるネイティブ化合物Ｉ及びＦｅ（化合物Ｉ）３の両方の細胞内蓄積をモニタリングした。化合物Ｉに暴露させたＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞では、両方の形態の薬物の蓄積速度が大きく低下した（図６Ａ及び表１）。
【表１】
2021501203.tif 000014
細胞を錯体Ｆｅ（化合物Ｉ）３とともにインキュベートした場合も、程度は低いものの、同様の結果が得られた（図６Ｂ）。対照的に、最初の２時間において、ＡＴＰＯ−化合物ＩまたはＦｅ（化合物Ｉ）３の排出は、細胞にいずれの形態の薬物を負荷した後でも、明らかな差は見られなかった。これらの結果から、Ｒａｊｉ細胞における化合物Ｉに対する耐性が、両方の形態の薬物の蓄積低下と関連することが示されている。６時間時点における薬物蓄積をさらに詳細に測定したところ、Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞を化合物Ｉとともにインキュベートした場合に、両方の形態の薬物の蓄積は著しく低下したが、錯体Ｆｅ（化合物Ｉ）３のレベルは依然として、その原薬のレベルよりも高かったことが確認された（図４Ｃ）。Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞を少なくとも３倍多い化合物Ｉで処理した場合のみ、Ｆｅ（化合物Ｉ）３の細胞内含有量が最終的に、感受性細胞におけるレベルと同程度のレベルに達した（図４Ｄ）。Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞を０．５μＭの化合物Ｉで２４時間処理したところ、リン酸化ＡＴＭまたはリン酸化γＨ２ＡＸは増加せず、ＰＡＲＰの切断は検出不能であったこと（図７）は、その耐性細胞において、細胞内の化合物Ｉ及びＦｅ（化合物Ｉ）３が実質的に少ないことと整合している。
【０１２８】
耐性機序についてさらなる知見を得るために、感受性Ｒａｊｉ細胞及び耐性Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞の両方の３つの独立した試料で、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析を行った。遺伝子レベルの差次的発現解析は、６個すべての試料にわたって、５０リード未満の遺伝子をすべて除去することによって行った。発現が低レベルに過ぎない遺伝子は、差次的発現解析で問題の原因となり得るからである。遺伝子は、補正後のｐ値が、０．０５未満のレベルであり、倍率変化が、いずれの方向でも２超である場合には、差次的に発現するものとみなした。１３，７９１個の評価可能な遺伝子のうち、Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞で有意にアップレギュレートした遺伝子は１，０１２個見られ、有意にダウンレギュレートした遺伝子は７０４個であった。最もアップレギュレートした遺伝子は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーメンバーのＡＢＣＧ２であり、転写産物レベルの上昇は１０００倍超であった（表２）。
【表２】
2021501203.tif 000015
Ｒａｊｉ／化合物ＩＲにおいて、いくつかの他の多剤耐性ＡＢＣトランスポーターもアップレギュレートしたが、ＡＢＣＧ２転写産物の増加が最も顕著であった（表３）。Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞におけるＡＢＣＧ２の顕著なアップレギュレーションは、ｑＲＴ−ＰＣＲ及びウエスタンブロット解析によって確認した（図５Ａ及びＢ）。
【表３】
2021501203.tif 000016
【０１２９】
Ｋｏ１４３は、特異的ＡＢＣＧ２阻害剤であり、その選択性は、Ｐ−ｇｐまたはＭＲＰ−１トランスポーターを阻害する能力と比べて、２００倍高い。Ｋｏ１４３自体は、３００ｎＭまでの濃度では、Ｒａｊｉ細胞またはＲａｊｉ／化合物ＩＲ細胞に対する毒性は有していなかった（図５Ｃ）。化合物ＩがＡＢＣＧ２の基質であるという仮説について試験するために、Ｋｏ１４３が、Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞の耐性を解消する能力を評価した。表４及び図５Ｄのデータから、Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞において、Ｋｏ１４３との併用処理によって、化合物Ｉ耐性が有意に解消されることが示されている。
【表４】
2021501203.tif 000017
【０１３０】
ＡＢＣＧ２機能の増強のさらなる証拠を得るために、その耐性細胞のトポテカン（充分に立証されたＡＢＣＧ２基質）に対する交差耐性について試験した。Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞は、トポテカンに対する交差耐性が３倍であることが明らかになり、Ｋｏ１４３による処理によって、この耐性は完全に解消された（図５Ｅ）。カルボプラチンは、ＡＢＣＧ２の基質ではないと考えられるが、興味深いことに、Ｒａｊｉ／化合物ＩＲは、カルボプラチンにも有意な交差耐性を有し、Ｋｏ１４３による処置によっても、Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞におけるカルボプラチンのＩＣ５０は低下しなかった（図５Ｆ）。驚くべきことに、Ｒａｊｉ／化合物ＩＲ細胞は、エトポシド（ＡＢＣＧ２基質であり、強力な二本鎖切断誘導剤である）に対する過敏性を有することが明らかになった。ＲＮＡ−ｓｅｑデータに由来するＧＯ及び経路解析によって、Ｒａｊｉ／化合物ＩＲにおいて、ＤＮＡ修復経路がダウンレギュレートしたことが明らかになり、これにより、エトポシドに対する過敏性が部分的に説明された。
【０１３１】
実施例７：化合物ＩとＧ−四重鎖ＤＮＡとの相互作用は、ｃ−ＭＹＣの阻害と関連がある。
最新の機序研究によって、化合物Ｉは、そのプロモーターにおけるアセチル化Ｈ３Ｋ２７を減少させること、さらには、ｃ−ＭＹＣ  ｍＲＮＡ不安定化することによって、ｃ−ＭＹＣを転写レベルで調節するをことが示された。加えて、ＲＮＡ−ｓｅｑの示唆的遺伝子発現解析及び逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）データによって、化合物Ｉの機序におけるｃ−ＭＹＣの役割が明らかにされた（ＧＯターム：ｃ−ＭＹＣによってダウンレギュレート（ｐ値６Ｅ−２６）、ｃ−ＭＹＣが結合する遺伝子プロモーター（ｐ値４．２Ｅ−１０）、ｃ−ＭＹＣのＣｈＩＰ標的（ｐ値３．３Ｅ−８））。さらに、ＲＰＰＡデータから、ｐ−ＣＨＫ１、ｐ−ＣＨＫ２、γＨ２ＡＸ、ならびに全ｐ５３及びＥ２Ｆ１の増加が観察され、これらのいずれも、ＤＮＡ損傷応答経路の活性化を示すものである。この増加には、細胞ストレス応答シグナル伝達を示すＸＢＰ１、ＧＲＰ７８及びｐ−ｐ３８のレベルの上昇（ＧＯターム：細胞ストレスの調節、ｐ値１．８９Ｅ−８）が伴っていた。
【０１３２】
化合物Ｉは、複数の機構的事象に関与し得るが、化合物Ｉがｃ−ＭＹＣの発現、細胞周期停止及びＤＮＡ損傷、ならびに損傷ＤＮＡの修復機序との細胞内での合成致死性に及ぼす作用は、Ｇ−四重鎖ＤＮＡモチーフに対する錯体Ｆｅ（化合物Ｉ）３の作用によって説明できる。
【０１３３】
実施例８：実施例９〜１６の材料及び方法
細胞及び化合物
ＥＯＬ−１、ＧＲＡＮＴＡ−５１９、Ｊｅｋｏ−１、Ｊｕｒａｋａｔ、Ｍｏｌｍ−１３、ＮＯＭＯ−１、ＳＫＭ−１及びＳＵ−ＤＨＬ−６は、Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺから入手した。ＨＬ−６０、ＫＧ−１、Ｍｉｎｏ、ＭＶ４−１１、Ｒａｊｉ及びＴＨＰ−１は、ＡＴＣＣから入手した。ＨＥＬ９２．１．７は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓから入手し、Ｒａｍｏｓ細胞は、Ｄｒ．Ｍ．Ａｎｄｒｅｅｆｆ（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から寄付されたものである。すべての細胞は、製造元の指示に従って、完全培地中で培養した。製造元から受領してから１カ月以内に、初期継代細胞を回収し、凍結した。すべての実験は、初期継代細胞で、解凍から６週間以内に行った。６カ月ごとに、ＭｙｃｏＳｃｏｐｅ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓカタログ番号ＭＹ０１０５０）を用いて、コンタミネーションの可能性についてスクリーニングした。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−１４４０−０２）を用いて、新鮮な健常ドナー血液から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。化合物Ｉの遊離塩基の合成では、１０−フェナントロリン−５，６−ジオン（１．２当量）、酢酸（２２倍量）、２−メチル−５−フルオロインドール−３−カルボキシアルデヒド（１．０当量）及び酢酸アンモニウム（１５当量）を培地攪拌下で、９５±５℃で加熱しながら、３〜７時間反応させた。その反応物を２０℃〜２５℃まで冷却し、濾過し、酢酸及びエタノールでリンスし、Ｎ２パージで乾燥してから、６５℃の２：１のエタノール：水で４時間洗浄し、２０℃〜２５℃まで冷却し、濾過し、２：１のエタノール：水及びＥｔＯＡｃでリンスしてから、Ｎ２パージで乾燥した。ＨＰＬＣによる純度は９９．５％であり、構造的な同定をＦＴ−ＩＲ、１ＨＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲ及びＬＣ／ＭＳによって確認した。Ｆｅ（化合物Ｉ）３の合成では、水中の５モル当量の二価鉄イオンＦｅＳＯ４を、エタノールに溶解させた化合物Ｉに加えた。得られた深赤色の沈殿物Ｆｅ（化合物Ｉ）３を回収し、ＤＭＳＯに溶解させ、ＨＰＬＣ及び質量分析によって、純度９５％超として特徴付けられた。ＣＸ−５４６１（７）は、ＭｅｄＣｈｅｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓから購入した（カタログ番号ＨＹ−１３３２３）。
【０１３４】
細胞毒性試験
細胞を播種し、ビヒクルのＤＭＳＯまたは化合物Ｉ（１０個の濃度）によって、９６ウェルプレートにおいて５日間、３７℃及び５％ＣＯ２で処理した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＭＴＳ）Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ３５８１）を用いて、細胞の生存能を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７というソフトウェアを用いて、ＩＣ５０値を算出した。
【０１３５】
取り込み及び排出アッセイ
標準物質の重水素化化合物Ｉを５ｎｇ含むアセトニトリル中で、化合物Ｉに暴露させた細胞をホモジナイズした。ＵＣＳＤ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで、イオン源として、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化法を用いた質量分析計Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＣＱｄｅｃａと連結した液体クロマトグラフ（ＬＣ）システムＡｇｉｌｅｎｔ１２６０を用いて、試料を解析した。
【０１３６】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
細胞をビヒクルまたは化合物Ｉによって、様々な濃度で２４時間、または単一の濃度で１時間、３時間、６時間、１２時間及び２４時間処理してから、回収した。ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒカラム（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号７９６５６）によって細胞を溶解させ、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４１３４）を用いて、全ＲＮＡを単離し、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｃＤＮＡ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０５８９３１５１００１）を用いて、ｃＤＮＡを合成してから、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０６４０２６８２００１）及びＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６を用いたｑＲＴ−ＰＣＲ解析で、そのｃＤＮＡを使用した。プライマープローブ対は、ＩＤＴから購入した（表５）。発現量は、ＧＡＰＤＨに対して正規化した後、ビヒクルで処理した試料に対する倍率変化として計算した（２ΔΔＣｔ）。
【表５】
2021501203.tif 000018
【０１３７】
ウエスタンブロッティング
細胞を上記のようにして処理した。全細胞溶解液を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に転写した。使用した検出抗体は、表６に列挙されている。ＩｍａｇｅＪまたはＩｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｌｉｔｅバージョン５．２というソフトウェアを用いて、デンシトメトリーを行い、ＧＡＰＤＨの密度に対して正規化した。
【表６】
2021501203.tif 000019
【０１３８】
アポトーシス及び細胞周期の解析のためのフローサイトメトリー
細胞を上記のようにして処理した。アポトーシスを測定するために、細胞をＦＩＴＣ−アネキシンＶ及びプロピジウムアイオダイド（ＰＩ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５６５７０）で染色してから、フローサイトメーターＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６で解析した。ＤＮＡ合成及び細胞周期相を測定するために、処理した細胞を５−エチニル−２′−デオキシウリジン（Ｅｄｕ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ１０４２５）及びＰＩ（ＰＩ／ＲＮａｓｅ  Ａ染色溶液、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５０８２５）で染色した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｌ３４９７３）を用いることによって、死細胞を解析から除外した。染色は、製造元の指示に従って行った。
【０１３９】
ＲＮＡシーケンシング解析
処理したＭＶ４−１１細胞において、（ｑＲＴ−ＰＣＲ解析におけるように、）全ＲＮＡ抽出を行い、ＵＣＳＤのＧｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙでシーケンシングした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑを用いて、ＲＮＡを処理し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ４０００で、５０ｂｐのリードに対してシングルエンドシーケンシングを行った。Ｏｒｅｇｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）のＭｃＷｅｅｎｙのラボで、データを解析した。ＦＡＳＴＱＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＦＡＳＴＱｃ／）を用いて、ＦＡＳＴＱファイルをリードの塩基分布及び配列の表現について評価した。ＳｕｂＲｅａｄ  ｖ１．５．０−ｐｌを用いて、リードをＨＧ３７にアラインメントし、ユニークにマッピングされたリードを保持した。（４つのすべの試料にわたって、）５０リード未満の差次的発現遺伝子を除外した。生のデータ及び処理したファイルは、ＧＥＯ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ１１１９４９）アクセッション番号ＧＳＥ１１１９４９で入手可能である。
【０１４０】
逆相タンパク質アレイ解析
ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）解析におけるように、ＭＶ４−１１細胞を処理し、全細胞抽出物をウエスタンブロッティング用に調製した。試料をＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＲｅｖｅｒｓｅ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙ（ＲＰＰＡ）Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで処理した（詳細はｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｄａｎｄｅｒｓｏｎ．ｏｒｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｓｅａｒｃｈ−ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｃｏｒｅ−ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ−ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ−ＲＰＰＡ−ｃｏｒｅ／ＲＰＰＡ−ｐｒｏｃｅｓｓ．ｈｔｍｌ）。タンパク質発現レベルを３回反復分について平均し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７を用いて、ヒートマップを作成した。
【０１４１】
ｑＰＣＲと組み合わせたクロマチン免疫沈降法
ＭＶ４−１１細胞をビヒクルのＤＭＳＯまたは５００ｎｍｏｌ／Ｌの化合物Ｉで２時間、６時間または２４時間処理してから、１％ホルムアルデヒドを用いて架橋した。超音波処理によってクロマチンを抽出してから、Ｈ３Ｋ２７ａｃ抗体（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、＃３９１３３）とともに一晩インキュベートした。プロテインＧビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓカタログ番号１０００４Ｄ）を用いて、その抗体：ＤＮＡ複合体を単離し、ＭＹＣプロモーターに特異的なプライマー（表７）を用いて、ｑＰＣＲによって解析した。Ｈ３Ｋ２７ａｃの濃縮は、インプットＤＮＡコントロールに対する倍率として計算した。
【表７】
2021501203.tif 000020
【０１４２】
ＲＮＡ崩壊アッセイ
細胞を３時間、ビヒクルのＤＭＳＯまたは５００ｎｍｏｌ／Ｌの化合物Ｉで処理してから、１μｍｏｌ／ＬのアクチノマイシンＤで処理した。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析におけるように、ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成を行うために、アクチノマイシンＤの添加前及び添加後１０分おきに、細胞のアリコートを取り出した。特異的プライマー（表８）を用いて、ＭＹＣ及び２８ｓ  ｒＲＮＡのレベルを解析し、ＭＹＣ  ＲＮＡの発現を２８ｓ  ｒＲＮＡに対して正規化した［２＾（２８ｓのＣｔ値−ＭＹＣのＣｔ値）］。
【表８】
2021501203.tif 000021
【０１４３】
ＦＲＥＴアッセイ
以前に説明されたようにして、ＦＲＥＴアッセイ及びデータ解析を行い、二重標識（５′ＦＡＭ−３′ＢＨＱ１）一本鎖オリゴを用いることによって修飾した。Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６［３７℃で３００秒後、温度を３℃ずつ９１℃まで上昇させ（２５段階）、各温度における総インキュベーション時間を３００秒とした］を用いて、ビヒクルのＤＭＳＯ、または漸増濃度の化合物Ｉ、Ｆｅ（化合物Ｉ）３、ＣＸ−５４６１もしくはＴＭＰｙＰ４の存在下で、各オリゴの融解温度を評価した。薬物及びオリゴ反応ミックスを直ちに解析するか、または６時間、室温でインキュベートしてから、解析をするかした。プライマー情報は、表９に示されている。インキュベーション時間が長いほど、Ｆｅ（化合物Ｉ）３、ＴＭＰｙＰ４またはＣＸ−５４６１の活性は影響を受けなかったが、化合物ＩのＧ４結合能は向上した。化合物Ｉのデータは、６時間の時点について示されている。
【表９】
2021501203.tif 000022
【０１４４】
実施例９：化合物Ｉは、ＡＭＬ細胞において、細胞傷害性を誘導し、ｐ２１をアップレギュレートし、Ｇ０−Ｇ１細胞周期の停止を誘導する。
化合物Ｉは、ＡＭＬ細胞株及び様々な型のリンパ腫細胞株において増殖を阻害し、ＩＣ５０値は、５７ｎｍｏｌ／Ｌ〜１．７５μｍｏｌ／Ｌの範囲であった（図８、表１０）。この薬物は、ＭＶ４−１１細胞において、暴露期間の関数としての効能の変動が中程度に過ぎず、ＩＣ５０値は、４８時間の暴露では０．４７μｍｏｌ／Ｌ、７２時間では０．４０μｍｏｌ／Ｌ、１２０時間では０．２４μｍｏｌ／Ｌであった。以前の研究によって、腫瘍におけるＡＰＴ０−化合物Ｉ活性の考え得る機序として、ＫＬＦ４及びＣＤＫＮ１Ａの発現のアップレギュレーションが報告された。化合物Ｉは、試験した６個のＡＭＬ細胞株のうちの４個で、ＫＬＦ４の発現をアップレギュレートするが（図１５Ａ）、すべてのＡＭＬ細胞株で、濃度依存的に、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）の発現が誘導された（図１５Ｂ及び１５Ｃ）。ＣＤＫＮ１Ａ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、試験したすべてのＡＭＬ細胞株において、暴露期間とともに増大した（図１５Ｄ及び１５Ｅ）。その後、ＣＤＫＮ１Ａの発現は減少し始めたが、その理由は、細胞死の増加である可能性が高い。ＣＤＫＮ１Ａの発現の誘導は典型的には、その後にＧ０−Ｇ１細胞周期が停止することと関連し、その停止は、固形腫瘍株の化合物Ｉによる処理後に観察された。これと整合して、試験したすべてのＡＭＬ細胞株において、Ｇ０−Ｇ１期の細胞の用量依存的な増加が観察され、Ｓ期及びＧ２−Ｍ期の細胞画分が同時に減少した（図９Ａ〜Ｃ、上図）。ＭＶ４−１１の場合には、すべての生細胞は、１μｍｏｌ／ＬのＡＰＴ０−化合物Ｉに２４時間暴露後、Ｇ０−Ｇ１が停止した。ＣＣＮＤ３（サイクリンＤ３）及びＣＤＫ４は、Ｇ１細胞周期の進行を促進することが知られているが、ＣＤＫＮＩＡは、このプロセスを負に調節する働きをする。化合物Ｉで処理したＡＭＬ細胞のウエスタンブロット解析によって、３つのＡＭＬ株のそれぞれにおいて、程度は異なるものの、ＣＤＫ４及びＣＣＮＤ３の両方が、用量依存的に阻害されたことが明らかになった（図９Ａ〜Ｃ、下図、図１６Ａ）。
【表１０】
2021501203.tif 000023
【０１４５】
細胞周期停止を経路の様々な摂動と相関させ、機序的事象の順序を明らかにするために、細胞をビヒクルまたは化合物Ｉ（ＩＣ５０濃度）のいずれかで、最長で２４時間までの様々な時間で処理した後、細胞周期解析を行った。ビヒクルのみで処理した細胞では、細胞周期相分布の摂動は見られなかった。２時間ほどで、Ｇ０−Ｇ１期の細胞画分の増加が検出され、この画分は、２４時間の薬物暴露期間にわたり、時間依存的に増加し続けた（図９Ｄ〜Ｆ）。ウエスタンブロット解析によって、ＣＤＫ４及びＣＣＮＤ３のタンパク質レベルの時間依存的な減少（Ｇ０−Ｇ１の停止と整合する）が示された（図１６Ｂ及び１６Ｃ）。これらのデータによって、ＡＭＬ細胞において、化合物Ｉによって、時間依存的及び濃度依存的にＧ０−Ｇ１が停止されることが見出され、この作用が、確立されているｐ２１及びサイクリン依存性キナーゼ経路に媒介されることが示唆されている。
【０１４６】
実施例１０：化合物Ｉは、ＡＭＬ細胞株においてアポトーシスを誘導する。
化合物Ｉが細胞死を引き起こす機序を調べるために、ＭＶ４−１１、ＥＯＬ−１及びＫＧ−１というＡＭＬ細胞を化合物Ｉで処理するか、または処理しないかし、フローサイトメトリー及びウエスタンブロッティングによって、アポトーシスマーカーの検出を行った。細胞をＰＩ及びアネキシンＶで染色して、生細胞（アネキシンＶ陰性かつＰＩ陰性）、初期アポトーシス細胞（アネキシンＶ陽性かつＰＩ陰性）、後期アポトーシス（アネキシンＶ陽性かつＰＩ陽性）、及び死細胞（アネキシンＶ陰性かつＰＩ陽性）を識別した。すべての細胞株において、２４時間の時点に、アポトーシス細胞の濃度依存的な増加が観察された（図１０Ａ、図１７Ａ）。アネキシンＶ染色及びＰＩ染色に基づくＩＣ５０値は、抗増殖性のＩＣ５０値と整合した。ＰＡＲＰの切断（ｃ−ＰＡＲＰ１）は、内因性経路及び外因性経路の両方の下流におけるアポトーシスの古典的シグナルである。化合物Ｉによって、濃度依存的かつ時間依存的にｃ−ＰＡＲＰ１の蓄積が誘導され、この蓄積は、アネキシンＶ／ＰＩ染色によって測定した場合のアポトーシスの誘導と整合した（図１０Ｂ〜Ｃ、図１７Ｂ）。３つのすべてのＡＭＬ細胞株において、化合物Ｉへの暴露から３〜６時間後に、アポトーシス細胞の増加が見られ（図１０Ｄ）、その後、２時間の暴露時に、Ｇ０−Ｇ１細胞周期の停止が観察された。
【０１４７】
実施例１１：化合物Ｉの薬力
化合物Ｉが細胞周期停止及びアポトーシスを引き起こすのに利用する経路について、さらなる知見を得るために、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方で、差次的発現解析を行った。ＭＶ４−１１細胞をビヒクルまたは５００ｎｍｏｌ／Ｌの化合物Ｉのいずれかで、６時間処理してから、ＲＮＡ−ｓｅｑによって遺伝子発現を解析した。合計１，６４３個の遺伝子が、化合物Ｉによる処理によって、差次的に調節されたことが明らかになり（２倍超の変化、Ｐ＜０．０５）、４１６個がアップレギュレートされ、１，２２７個がダウンレギュレートされた（表１１）。ＲＮＡ−ｓｅｑ解析によって、ＫＬＦ４が２倍増加し、ＣＤＫＮ１Ａの発現が４．５倍増加したことが検出され、これは、ＭＶ４−１１細胞を用いたｑＲＴ−ＰＣＲデータによって検証されている。差次的に調節された遺伝子は、Ｂｒｏａｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｍｓｉｇｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）を用いて、経路の濃縮またはＧＯ（遺伝子オントロジー）ターム（図１８Ａ）について解析した。予想どおり、差次的に発現した遺伝子セットにおいて、アポトーシス経路及び細胞周期経路が濃縮されていた。予想外にも、化合物Ｉによる処理後の遺伝子発現プロファイルでは、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路及び小胞体（ＥＲ）ストレス／折り畳み不全タンパク質応答経路も濃縮されていた。加えて、アップレギュレートした遺伝子では、ＭＹＣによってダウンレギュレートされるＴＰ５３経路及びが濃縮されていた。ＭＶ４−１１細胞において検出された遺伝子発現変化により、化合物Ｉが、ＤＮＡ損傷を誘導し、細胞ストレス経路を活性することによって、及び／またはＭＹＣがん遺伝子の発現を阻害することによって、アポトーシスを引き起こし得る可能性が高まった。
【表１１】
2021501203.tif 000024
【０１４８】
化合物Ｉがタンパク質の発現に及ぼす作用を調べるために、ＭＶ４−１１細胞を上記のようにして処理し、ＲＰＰＡマイクロアレイによって解析して、３００個超の全タンパク質及び翻訳後修飾されたタンパク質を定量した。全タンパク質及び翻訳後修飾されたタンパク質の両方のレベルに対する作用が観察され（１．２５倍超、Ｐ＜０．０５）、アップレギュレートされたタンパク質の方が、ダウンレギュレートされたタンパク質よりも多かった（図１８Ｂ、表１１）。留意すべきことに、アポトーシスを示す、カスパーゼ７の切断の増加が見られた。Ｂｒｏａｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓのデータベースを用いて、差次的に発現するタンパク質のＧＯ解析を行った。有意なＧＯタームには、細胞死及びＧ１−Ｓ細胞周期の停止経路（Ｇ０−Ｇ１の停止の形式的記述）が含まれ、フローサイトメトリー及びＲＮＡ−ｓｅｑ解析によって検出された細胞周期作用と整合していた（図１８Ｃ）。Ｅ２Ｆ１、ＴＰ５３、γＨ２ＡＸ、ＣＨＥＫ１リン酸化Ｓ２９６及びＣＨＥＫ２リン酸化Ｔ６８の増加によって、化合物Ｉによる処理によって、ＤＮＡ損傷経路が誘導されるという概念が裏付けられた。加えて、ＸＢＰ１、ＨＳＰＡ５及びＭＡＰＫ１４（ｐ３８）リン酸化Ｔ１８０／１８２の増加が観察されたことから、ＥＲストレスまたは細胞ストレスが示された（Ｐ＝１．８９Ｅ−０８、参照１５）。ＤＤＲ経路は、ＭＡＰＫ１４及びＭＡＰＫ８（ＪＮＫ）を活性化するＭＡＰＫ経路を通じてシグナル伝達でき、ＤＤＲ経路とＥＲストレスとのクロストークは、充分に確立された現象であるが、どの経路が、その開始事象であるかは不明である。差次的に発現するタンパク質及びｍＲＮＡのかなりの部分は、ＭＹＣがんタンパク質の標的遺伝子であり、そのタンパク質は、細胞周期及びアポトーシス経路の調節の両方の不可欠な部分であることが知られている。勘案すると、これらのデータによって、ＭＹＣがん遺伝子の調節が、化合物Ｉの機序において、初期の重要な役割を果たし得ることが示唆された。
【０１４９】
実施例１２：化合物Ｉは、ＡＭＬ細胞において、ＭＹＣ  ｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルを濃度依存的かつ時間依存的にダウンレギュレートする。
ＭＹＣの発現は、白血病及びリンパ腫を含む広範ながんの発症に関与する。最近の研究によって、ＭＹＣの転写を阻害すると、血液由来のがん細胞においてアポトーシスが起こることが示され、ＭＹＣは、魅力的な治療標的となっている。我々のＲＮＡ−ｓｅｑデータセットの考察によって、ＭＶ４−１１細胞において、６時間の時点に、ＭＹＣが化合物Ｉによってダウンレギュレートされたことが明らかになった。化合物Ｉで処理したＭＶ４−１１細胞において、ＭＹＣによって負に調節される遺伝子の転写が増加したことも観察された。試験したすべてのＡＭＬ細胞株において、化合物Ｉによって、ＭＹＣ  ｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルの両方が濃度依存的に低下し、ＭＹＣ阻害のＩＣ５０値は、抗増殖性のＩＣ５０値と整合していた（図１１Ａ及びＢ）。これらの変化は、ＭＶ４−１１、ＥＯＬ−１及びＫＧ−１のＡＭＬ細胞（図１１Ｃ、図１９Ａ及び１９Ｂ）において、最長２４時間までの暴露時間の関数とした場合、増大した。ＭＶ４−１１細胞におけるＭＹＣタンパク質の抑制の経時的経過は、ＲＮＡ−ｓｅｑによって検出された、ＭＹＣ遺伝子の発現レベルの阻害と整合していた。試験したすべてのＡＭＬ細胞株は、健常ドナー由来のＰＢＭＣと比べて、ＭＹＣの基底発現が有意に高かった（図１１Ｄ、図１９Ｃ）。したがって、化合物Ｉは、調べたすべてのＡＭＬ細胞株において、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルで、ＭＹＣをダウンレギュレートする。
【０１５０】
ＭＹＣの発現の調節は、ＭＹＣの転写、ｍＲＮＡ安定性及びタンパク質のターンオーバーを伴う複雑なプロセスである。活性クロマチンの充分に確立されたマーカーであるＨ３Ｋ２７ａｃのＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ解析を行って、化合物Ｉによって処理した後のＭＹＣ遺伝子プロモーターの転写能力を評価した（図１９Ｄ）。２時間ほどで、ＭＶ４−１１細胞におけるＭＹＣプロモーターでのＨ３Ｋ２７ａｃの減少が観察され、時間とともに進行したことから、ＭＹＣプロモーターが修飾され、その後、ＭＹＣ遺伝子の転写が抑制されることは、化合物Ｉの作用機序の初期のメディエーターであることが示された（図１９Ｅ）。化合物Ｉが、ＭＹＣ  ｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼすのかを判断するために、ＲＮＡ崩壊アッセイをＥＯＬ−１細胞で行った。化合物Ｉで事前に処理した細胞において、ＭＹＣ  ｍＲＮＡレベルが、ビヒクルの場合と比べて明らかに低下した（図１９Ｆ）ことから、化合物Ｉが、ＭＹＣ  ｍＲＮＡの安定性を低下できることが示された。これらのデータによって、化合物Ｉが、転写及びｍＲＮＡ安定性の両方に影響を及ぼすことによって、ＭＹＣを調節することが示唆されている。
【０１５１】
実施例１３：化合物Ｉは、ＤＮＡ損傷及び細胞ストレス経路を誘導する。
ＭＹＣに加えて、ＲＮＡ及びタンパク質の差次的発現解析によって、化合物Ｉの作用機序に、ＴＰ５３、ＤＮＡ損傷及びＥＲストレスが関与することが示された。ＭＶ４−１１細胞において、化合物Ｉによる処理後、ＴＰ５３タンパク質レベルの上昇を示したＲＰＰＡデータの検証を試みた。ＭＶ４−１１細胞を５００ｎｍｏｌ／Ｌの化合物Ｉに暴露させたところ、早い時点（１時間、３時間及び６時間）に、ＴＰ５３レベルが有意に上昇し、その後、１２時間の時点に、ベースラインまで戻り、２４時間の時点には、おそらくは、この時点における大規模な細胞死が原因で、さらに低下した（図１２Ａ）。リン酸化Ｓｅｒ１５及びアセチル−Ｋ３８２の増加に付随して、全タンパク質の増加が見られた（図１２Ｂ）。ＴＰ５３は、ＤＮＡ損傷に応答して、Ｓｅｒ１５及びＳｅｒ２０でリン酸化され、それにより、ＭＤＭ２の結合及びｐ５３のプロテアソームによる分解が低減する。さらに、ｐ５３は、細胞ストレスに応答してアセチル化され、この修飾によって、ＴＰ５３タンパク質レベルをさらに安定化して、結合活性を調節し得る。ＴＰ５３の活性化は、ＢＢＣ３（ＰＵＭＡ）、ＰＭＡＩＰ１（ＮＯＸＡ）及びＢＡＸのようなプロアポトーシス因子のアップレギュレーションを通じて、アポトーシスを誘導し得る。ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットによって、化合物Ｉで処理したＭＶ４−１１細胞において、ＢＢＣ３が３．９５倍増加し、ＰＭＡＩＰ１が１．３８倍増加したことが示された。ＤＮＡ損傷及び細胞ストレス経路の関与について、ＭＶ４−１１細胞において、５００ｎｍｏｌ／Ｌの化合物Ｉによる処理後、早い時点においてさらに調べた。化合物Ｉを添加した１時間後に、リン酸化ＣＨＥＫ１の増加が検出され、ピークは約４時間の時点だったことから、ＤＮＡ損傷が早期事象であったことが示唆された（図１２Ｃ）。ＣＨＥＫ１のリン酸化後、６時間の時点までに、ＤＤＲマーカーγＨ２ＡＸの著しい増加が見られた。試験したすべてのＡＭＬ株において、γＨ２ＡＸの濃度依存的な増加が検出されたことによって、化合物ＩがＤＤＲ経路を誘導するという概念がさらに裏付けられた（図１２Ｄ）。加えて、４〜６時間の処理で、ＭＡＰＫ１４リン酸化Ｔ１８０及びＭＡＰＫ８リン酸化Ｔｈｒ１８３／ｐＴｙｒ１８５の両方が増加したことから、ＤＤＲまたはＥＲストレス経路を通じたシグナル伝達が示された（図１２Ｃ）。総合すると、それらのデータによって、化合物Ｉによって誘導されるＤＮＡ損傷が、化合物Ｉの機序における初期事象であることが示唆されている。
【０１５２】
実施例１４：化合物Ｉの細胞内薬物動態
ＫＧ−１  ＡＭＬ細胞における化合物Ｉの取り込み及び排出の動態測定を質量分析によって行ったところ、定常状態に徐々に近づき、初期に急激に排出されるが、終末排出が非常に長く持続するがことが示された（図２０Ａ及び２０Ｂ）。ＫＧ−１細胞を化合物Ｉに１時間または６時間のいずれかで暴露させてから、無薬剤培地に入れたところ、排出パターンは、最初の３０分間で急速な相が見られた後、持続的な終末相が続くものからなり、その結果、２４時間以上、有意な量の化合物ＩがＫＧ−１細胞内に維持された。これらのデータと整合して、細胞内薬物動態試験によって、化合物Ｉが細胞内で、１原子のＦｅ及び３分子の化合物Ｉを含む錯体［Ｆｅ（化合物Ｉ）３］に変換されることが明らかになった（図２０Ｃ及び２０Ｄ）。実際、事前に錯体化したＦｅ（化合物Ｉ）３薬物は、細胞毒性アッセイにおいて、単量体の親化合物Ｉと同様の効能である（図１３Ａ）。さらに、錯体Ｆｅ（化合物Ｉ）３は、ＭＶ−４−１１細胞において、ｃ−ＰＡＲＰによって測定したところ、アポトーシス経路を誘導し、γＨ２ＡＸによって測定したところ、ＤＮＡ損傷経路を誘導した。Ｆｅ（化合物Ｉ）３は、用量依存的に、ＫＬＦ４及びＣＤＫＮ１Ａの発現も誘導し、ＭＹＣを阻害した（図１３Ｂ）。しかしながら、２４時間アッセイ（細胞毒性アッセイにおける５日間の処理と比較）において、親化合物Ｉと同等の応答を惹起するには、親化合物よりも高い濃度のＦｅ（化合物Ｉ）３が必要であった。この理由は、事前に錯体化したＦｅ（化合物Ｉ）３で観察された流入速度の方が遅かったことである可能性が高い（図２０Ｅ）。
【０１５３】
実施例１５：化合物Ｉは、Ｇ−四重鎖配列を安定化させる。
親化合物Ｉ及びその細胞内形態Ｆｅ（化合物Ｉ）３は、その薬剤をＧ−四重鎖（Ｇ４）ＤＮＡリガンドとして機能させることができる金属配位フェナントロリン環及び平面構造のような特定の特徴を含む。Ｇ４は、グアニンリッチ領域に起因する動的なＤＮＡ二次構造であり、それらの領域は、折り畳まれて、平らなグアニン四分子を形成し、それらが上に積み重なっている。Ｇ４特異的な配列は、テロメア及び多くの重要ながん遺伝子のプロモーターに見られる。Ｇ４配列は、遺伝子発現の調節因子として機能し、Ｇ４四重鎖を安定化させる小分子リガンドは、ＫＩＴ及びＭＹＣのような重要ながん遺伝子をダウンレギュレートするのに活用されている。テロメアＤＮＡにおけるＧ４モチーフの安定化は、テロメラーゼの阻害、テロメアの不安定性及び脱保護（これらはいずれも、ＤＤＲ経路を誘導できる）を引き起こすことができる。さらに、ＤＮＡ複製部位の開始点は、ＤＮＡ  Ｇ４配列と重複しており、このような部位でのＧ−四重鎖構造の安定化により、複製フォークの停止及び細胞周期停止が起きる。
【０１５４】
ＦＲＥＴアッセイを修正したものを用いて、化合物Ｉ（親単量体型の薬物）及びＦｅ（化合物Ｉ）３がＧ４配列と結合して、その配列を安定化させる能力を評価した（図２１及び２２）。周知のＧ４リガンドであるＴＭＰｙＰ４、及びＧ４結合特性を有することが最近報告された臨床段階の分子であるＣＸ−５４６１をコントロールとして使用して、Ｇ４安定化活性について、化合物Ｉ及びＦｅ（化合物Ｉ）３の特異性を評価した。予想どおり、ＣＸ−５４６１は、試験したすべてのＧ４配列の強力な安定剤であり、ＴＭＰｙＰ４は、ＫＩＴ遺伝子プロモーターのＧ４以外のすべてのＧ４モチーフを安定化させた（図１３Ｃ）。興味深いことに、漸増濃度のＦｅ（化合物Ｉ）３は、ＭＹＣ及びＫＩＴ遺伝子プロモーター、ｒＲＮＡ及びテロメアに対応するＧ４構造を安定化させ、ＴＭＰｙＰ４と同様の効能を有していた（図１３Ｃ、図２２）。親単量体の化合物Ｉでも、Ｇ４モチーフの時間依存的な安定化が見られたが、ＭＹＣ  Ｇ４配列を安定化させる傾向が最も強いことが示された（図１３Ｃ）。
【０１５５】
ｄｓ−ＤＮＡとの非特異的相互作用を上回る、Ｇ４構造に対する選択性を評価するために、溶液中でｄｓ−ＤＮＡヘアピンを形成する自己相補的オリゴを用いて、ＦＲＥＴアッセイを繰り返した。注目すべきことに、Ｆｅ（化合物Ｉ）３では、ｄｓ−ＤＮＡを上回るＧ４構造に対する選択性の程度が、ＣＸ−５４６１及びＴＭＰｙＰ４におけるよりもかなり高いことが示され、化合物Ｉの方が、より際立ったＧ４リガンドであることが明らかになった（図１３Ｃ、図２１Ｂ）。遺伝子発現解析によって、ＡＭＬ細胞において、化合物Ｉによる処理に応答して、ＭＹＣ及びＫＩＴの発現が減少したが（ＲＮＡ−ｓｅｑデータ、ＭＶ４−１１細胞、６時間の処理）、４５ｓ  ｒＲＮＡのレベルは低下しなかったことが示された。４５ｓ  ｒＲＮＡに対する作用の欠乏は、核のｒＲＮＡリッチな核小体領域での化合物Ｉ及び／またはＦｅ（化合物Ｉ）３の利用性の差の現れであり得る。しかしその一方で、化合物Ｉは明らかに、Ｇ４構造を安定化させることができ、それにより、ＭＹＣ及びその他の遺伝子の発現が阻害される説明が得られる。いずれかの特定の理論に拘束されるわけではないが、化合物ＩによるＧ４モチーフの安定化によって、複製フォーク及びテロメアで一本鎖及び二本鎖が切断されるという仮説が立てられ、化合物ＩのこのＧ４結合能によって、その薬物がＤＤＲ経路、細胞周期停止及びアポトーシスを誘導する機序が特定される。
【０１５６】
実施例１６：考察
化合物Ｉは、非臨床モデルにおけるその有効性、及び動物または固形腫瘍患者における初期の第Ｉ相試験で骨髄抑制を起こさなかったことから、現在、ＡＭＬの治療用として臨床開発段階にある。本明細書に報告されているデータによって、より精密な臨床応用及びバイオマーカーの開発への方向性を示すこの新規薬剤の作用機序に関する新たな知見が得られる。これらの試験によって、化合物Ｉが、ＡＭＬ細胞におけるＧ０−Ｇ１細胞周期の停止及びアポトーシスの強力な誘導剤であることが確認された。さらなる新たな所見には、化合物Ｉが、ＭＹＣのプロモーター及びｍＲＮＡの安定性の両方に対する作用を通じて、ＭＹＣを時間依存的かつ濃度依存的にダウンレギュレーションすること、化合物Ｉが、多くのＡＭＬ細胞株において、マスター転写因子及び腫瘍抑制因子のＫＬＦ４を誘導すること、ならびに、化合物Ｉが、ＤＮＡ損傷を誘導することが含まれる。加えて、事前に錯体化した鉄形態の化合物ＩであるＦｅ（化合物Ｉ）３によって、アポトーシス、ＤＮＡ損傷及びＭＹＣの発現のダウンレギュレーションを含め、同等の細胞傷害性細胞作用が生じる。
【０１５７】
化合物Ｉが、親単量体型またはＦｅ（化合物Ｉ）３の鉄錯体型を問わず、ＤＮＡのＧ４モチーフを安定化させるという発見によって、この薬物の薬力的作用の多くが説明される。Ｇ４の安定化は、テロメアの安定性を破壊し、複製フォークを停止させ、その結果、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡが切断されることが知られている。ＭＹＣプロモーターにおけるＧ４のこのような安定化は、遺伝子サイレンサーとして機能すると考えられる。このことと、ＫＩＴ及びテロメアのＧ４構造が化合物Ｉの標的となることを勘案すると、ＡＭＬ細胞において細胞周期停止を調整して、アポトーシスを促進するＤＤＲ経路を化合物Ｉが活性化する機序が示される。
【０１５８】
加えて、ＢＲＣＡ１／２の変異を有する細胞は、化合物Ｉに対して過敏性を有することから、化合物Ｉの作用機序におけるＤＮＡ損傷に対する役割がさらに裏付けられる。化合物Ｉによって、Ｇ０−Ｇ１期の停止を媒介するＣＤＫＮ１Ａが一貫してアップレギュレーションされる。加えて、ＤＮＡ二本鎖切断の後にＣＤＫＮ１Ａを誘導して、細胞周期の進行をブロックし、ＤＮＡを修復するのに充分な時間を確保できる。化合物Ｉは、ＣＤＫＮ１Ａの誘導と併せて、Ｇ１細胞周期チェックポイントの一部として、ＣＤＫＮ１Ａを調節することが知られているＫＬＦ４遺伝子の発現を多くのＡＭＬ細胞株において増加させた。ＫＬＦ４は、ＤＮＡ損傷に応答してアップレギュレートすることも知られており、Ｇ０−Ｇ１の停止及びアポトーシスの両方において役割を果たす。化合物Ｉの作用機序におけるＫＬＦ４の役割は、今後の研究における関心事である。化合物Ｉの構造によって、活性酸素種を生成でき得ることが示唆されるが、ＭＶ４−１１細胞、ＥＯＬ１細胞またはＫＧ−１細胞において、分子センサーまたはＧＳＨの変化のいずれを用いても、活性酸素種は検出されなかった。
【０１５９】
ＣＨＥＫ１／２の活性化、ＴＰ５３の安定化及びＥ２Ｆ１の誘導によって、化合物Ｉによる処理後の初期事象が、細胞周期停止及びＤＮＡ修復のためのシグナルを伝達する働きをすることも示されている。化合物Ｉによる処理後２時間までに、細胞周期停止が検出された一方で、６時間までに、いくつかのプロアポトーシス因子のアップレギュレーションが、ＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方において観察された。ＤＮＡ修復プロセスの活性化に加えて、ｐＣＨＥＫ１／２及びＴＰ５３は、アポトーシスの誘導においても役割を果たし得る。ＤＮＡが修復されなかった場合には、ｐ５３が、ＢＡＸ、ＢＡＤ、ＢＢＣ３またはＰＭＡＩＰ１のアップレギュレーションを介して、アポトーシスを活性化し得る。化合物Ｉで処理したＭＶ４−１１細胞のＲＮＡ−ｓｅｑ解析によって、これらのプロアポトーシス因子の発現の増加が検出された。ＰＡＲＰ１のカスパーゼ依存性切断には、アポトーシスの進行が必要であることが知られている。化合物Ｉによって、顕著かつ早期にＰＡＲＰ１が切断されたことから、化合物Ｉは、ＤＤＲ経路を誘導することによって機能するという仮説がさらに裏付けられた。これにより、細胞にとって致命的であるＤＮＡ損傷レベル、及び細胞をアポトーシスに導く、転写プログラムの改変が示唆されている。多くの悪性腫瘍において、ＭＹＣの調節障害は、一般的な発がん動因であることから、ＭＹＣは、魅力的な治療標的候補となっている。しかしながら、ＭＹＣの調節及びシグナル伝達の複雑性が原因で、ＭＹＣを標的とするのは困難である。最近、ＢＥＴブロモドメイン阻害剤によるＭＹＣの発現の抑制は、白血病細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効であることが証明された。しかしながら、ブロモドメインタンパク質は、すべての活性遺伝子上に存在し、ブロモドメインタンパク質の阻害により、重度の毒性及び骨髄抑制が発生し得る。化合物Ｉにより、試験したすべてのＡＭＬ細胞株において、ＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方で、ＭＹＣの発現が減少したとともに、ＭＹＣのダウンレギュレーションは、異なるＡＭＬ細胞におけるその細胞傷害性効能に匹敵していた。ＡＭＬ株において、健常ドナー由来のＰＢＭＣよりも高いＭＹＣレベルが検出されたが、これは、化合物Ｉがこれらの種類の細胞に及ぼす差次的作用と関係し得る。最近の研究により、ＴＰ５３のアップレギュレーション及びＭＹＣのダウンレギュレーションの連動によって、ＣＭＬにおいて、白血病性幹細胞集団が効率的に除去されることが示された。ＭＶ４−１１を化合物Ｉによって処理したところ、同様の作用が見られ、化合物Ｉのさらなる開発理由が示されている。上皮性卵巣癌及び神経芽腫において、ＭＹＣの発現が多いほど、臨床転帰が悪いことが報告されており、化合物Ｉが、これらの悪性腫瘍に対して有益な作用を有し得ることが示唆されている。勘案すると、このデータによって、主にＧ−四重鎖構造の関与を通じて、化合物Ｉの多面的な作用機序であって、造血器悪性腫瘍を標的とするのに独自の形で適する作用機序が示されている。さらに、化合物Ｉは、骨髄抑制を起こさないファーストインクラスのＭＹＣ阻害剤であり、骨髄機能の低下したＡＭＬ患者の制御に特に適する薬剤となっている。
【０１６０】
上記の実施例及び特定の実施形態の説明は、請求項によって定義されているような本発明を限定するものではなく、例示するものとして解釈すべきである。容易に認識されるように、請求項に示されているような本発明から逸脱せずに、上に示されている特徴の多くの変形形態及び組み合わせを用いることができる。このような変形形態はいずれも、本発明の範囲内に含まれるように意図されている。引用されている参照文献はいずれも、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０１６１】
本明細書において、いずれかの先行技術文献に言及している場合には、その言及によって、その文献が、いずれの国においても、当該技術分野における技術常識の一部を形成すると認めるものではないことを理解されたい。
【０１６２】
引用部分を特定することによって、本明細書で言及されているいずれの刊行物、特許、特許出願及び特許出願公開の開示内容も、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【図１】
2021501203.tif 000032
【図２】
2021501203.tif 000033
【図３Ａ】
2021501203.tif 000034
【図３Ｂ】
2021501203.tif 000035
【図３Ｃ】
2021501203.tif 000036
【図３Ｄ】
2021501203.tif 000037
【図３Ｅ】
2021501203.tif 000038
【図３Ｆ】
2021501203.tif 000039
【図３Ｇ】
2021501203.tif 000040
【図４】
2021501203.tif 000041
【図５Ａ】
2021501203.tif 000042
【図５Ｂ】
2021501203.tif 000043
【図５Ｃ】
2021501203.tif 000044
【図５Ｄ】
2021501203.tif 000045
【図５Ｅ】
2021501203.tif 000046
【図５Ｆ】
2021501203.tif 000047
【図５Ｇ】
2021501203.tif 000048
【図６】
2021501203.tif 000049
【図７】
2021501203.tif 000050
【図８】
2021501203.tif 000051
【図９】
2021501203.tif 000052
【図１０】
2021501203.tif 000053
【図１１】
2021501203.tif 000054
【図１２】
2021501203.tif 000055
【図１３Ａ】
2021501203.tif 000056
【図１３Ｂ】
2021501203.tif 000057
【図１３Ｃ】
2021501203.tif 000058
【図１４】
2021501203.tif 000059
【図１５Ａ】
2021501203.tif 000060
【図１５Ｂ】
2021501203.tif 000061
【図１５Ｃ】
2021501203.tif 000062
【図１５Ｄ】
2021501203.tif 000063
【図１５Ｅ】
2021501203.tif 000064
【図１６】
2021501203.tif 000065
【図１７】
2021501203.tif 000066
【図１８】
2021501203.tif 000067
【図１９Ａ】
2021501203.tif 000068
【図１９Ｂ】
2021501203.tif 000069
【図１９Ｃ】
2021501203.tif 000070
【図１９Ｄ】
2021501203.tif 000071
【図１９Ｅ】
2021501203.tif 000072
【図１９Ｆ】
2021501203.tif 000073
【図２０】
2021501203.tif 000074
【図２１Ａ】
2021501203.tif 000075
【図２１Ｂ】
2021501203.tif 000076
【図２１Ｃ】
2021501203.tif 000077
【図２２Ａ】
2021501203.tif 000078
【図２２Ｂ】
2021501203.tif 000079
【図２２Ｃ】
2021501203.tif 000080
【図２２Ｄ】
2021501203.tif 000081
【国際調査報告】
2021501203.tif 000082
2021501203.tif 000083