(57)【要約】  本開示は、細胞をアレイへと編成し、短又は長期間に渡る画像に基づく分析に依って其れ等を表現型解析し、及び各細胞の傍に存在するＤＮＡバーコードに依る超並列のバーコード化されたゲノム分析を実施する為のデバイス、システム、及び方法を含む。
2021500012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体デバイスであって、
ａ）少なくとも１つの流体注入口及び少なくとも１つの流体排出口の間に其れ等と流体連通して配設される複数のトラップ堰を含み、各トラップ堰はマイクロ流体デバイスを通過する流体中の懸濁物体を保持する様に構成され、
ｉ）各トラップ堰は、物体の最も小さい寸法の約３分の１よりも小さい少なくとも１つの寸法の狭窄部を含み、
ｉｉ）トラップ堰を通過する流体流路の物に対するトラップ堰をバイパスする流体流路の流体抵抗の比が少なくとも０．４である、
マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
流体抵抗の比が少なくとも０．７５である、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
流体抵抗の比が少なくとも１．０である、請求項１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
流体抵抗の比が少なくとも１．２５である、請求項１〜３の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
マイクロ流体デバイスであって、
ａ）少なくとも１つの流体注入口及び少なくとも１つの流体排出口の間に其れ等と流体連通して配設される複数のトラップ堰を含み、各トラップ堰はマイクロ流体デバイスを通過する流体中の懸濁物体を保持する様に構成され、
ｉ）各トラップ堰は入口領域、内側領域、及び出口領域を含み、此れ等は、集合的に、流体抵抗ＲＴを有するトラップ堰を通る内側流体流路を構成し、
ｉｉ）トラップ堰の大多数の各トラップ堰は、流体抵抗ＲＡを有する１つの長いバイパス流体流れチャネルと、且つ夫々ＲＡよりも小さい流体抵抗を有する１又は２つの短いバイパス流体流れチャネルと流体連通し、各バイパス流体流れチャネルはトラップ堰の出口領域を別のトラップ堰の入口領域に接続し；
ｉｉｉ）比ＲＡ／ＲＴが少なくとも１．０である、
マイクロ流体デバイス。
【請求項６】
マイクロ流体デバイスであって、
ａ）少なくとも１つの流体注入口及び少なくとも１つの流体排出口の間に其れ等と流体連通して配設される複数のトラップ堰を含み、各トラップ堰はマイクロ流体デバイスを通過する流体中の懸濁物体を保持する様に構成され、
ｉ）各トラップ堰は入口領域、内側領域、及び出口領域を含み、此れ等は、集合的に、流体抵抗ＲＴを有するトラップ堰を通る内側流体流路を構成し、
ｉｉ）トラップ堰の大多数の各トラップ堰は、流体抵抗ＲＡを有する１つの長いバイパス流体流れチャネルと、且つ夫々ＲＡよりも小さい流体抵抗を有する１又は２つの短いバイパス流体流れチャネルと流体連通し、各バイパス流体流れチャネルは、トラップ堰の出口領域を別のトラップ堰の入口領域に接続し、
ｉｉｉ）流体は、トラップ堰が未占有である場合には第１の方向に、トラップ堰が物体に依って占有される場合には第２の方向に、隣り合う短いバイパスチャネルを流れる、
マイクロ流体デバイス。
【請求項７】
比ＲＡ／ＲＴが少なくとも１．１である、請求項５又は６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
比ＲＡ／ＲＴが少なくとも１．２である、請求項５〜７の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
比ＲＡ／ＲＴが少なくとも１．３である、請求項５〜８の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
比ＲＡ／ＲＴが少なくとも１．４である、請求項５〜９の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
比ＲＡ／ＲＴが少なくとも１．４５である、請求項５〜１０の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
各トラップ堰が、物体の最も小さい寸法の約２分の１よりも小さい空間寸法を有する少なくとも１つの狭窄部を含む、請求項５〜１１の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
各トラップ堰が、懸濁物体の最も小さい寸法の約３分の１よりも小さい空間寸法を有する少なくとも１つの狭窄部を含む、請求項５〜１２の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
各トラップ堰が、約１．５μｍから約６μｍの範囲である空間寸法を有する少なくとも１つの狭窄部を含む、請求項５〜１３の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
比ＲＡ／ＲＴが少なくとも１．２であり、個々のトラップ堰が第１の接触時に懸濁物体を保持する捕捉確率が少なくとも０．３６である、請求項５〜１４の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１６】
比ＲＡ／ＲＴが少なくとも１．４５であり、個々のトラップ堰が第１の接触時に懸濁物体を保持する捕捉確率が少なくとも０．６０である、請求項５〜１５の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１７】
各トラップ堰が出口領域にフリット構造を含み、フリット構造は、懸濁物体の最も小さい寸法よりも小さい空間寸法を有する１つ以上の狭窄部を含む、請求項５〜１６の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１８】
複数のトラップ堰が少なくとも１００個のトラップ堰を含む、請求項１〜１７の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１９】
複数のトラップ堰が少なくとも１，０００個のトラップ堰を含む、請求項１〜１８の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２０】
複数のトラップ堰が少なくとも１０，０００個のトラップ堰を含む、請求項１〜１９の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２１】
複数のトラップ堰が少なくとも１００，０００個のトラップ堰を含む、請求項１〜２０の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２２】
懸濁物体をトラップする飽和前トラップ効率が少なくとも２０％である、請求項１〜２１の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２３】
懸濁物体をトラップする飽和前トラップ効率が少なくとも５０％である、請求項１〜２１の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２４】
懸濁物体をトラップする飽和前トラップ効率が少なくとも８０％である、請求項１〜２３の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２５】
懸濁物体をトラップする飽和前トラップ効率が少なくとも９０％である、請求項１〜２４の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２６】
懸濁物体をトラップする飽和前トラップ効率が少なくとも９５％である、請求項１〜２５の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２７】
更にｂ）取り外し可能な蓋を含む、請求項１〜２６の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２８】
１つ以上のトラップ堰の内側領域が、トラップ堰の内側領域内の細胞のリシス時に細胞の分子コンポーネントに結合又はハイブリダイゼーションさせられ得る固有の分子識別子を含む、請求項１〜２７の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２９】
方法が、
ａ）請求項１〜２７の何れか１項に記載のマイクロ流体デバイスを提供する事と、
ｂ）物体を含む流体をマイクロ流体デバイスに流して、物体を複数のトラップ堰の１つ以上にトラップする事と、
を含む、流体中の懸濁物体をトラップする為の方法。
【請求項３０】
各トラップ堰が出口領域にフリット構造を含み、フリット構造が、物体の最も小さい寸法よりも小さい空間寸法を有する１つ以上の狭窄部を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
（ｂ）の流す事が第１の流体力学的圧力で行われ、其れに依って、１つ以上のトラップ堰の入口領域の狭窄部に物体をトラップする、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
物体が変形可能な物体を含み、方法が、１つ以上のトラップ堰の入口領域（単数又は複数）の狭窄部にトラップされた物体（単数又は複数）に第１の流体力学的圧力よりも高い第２の流体力学的圧力を掛ける事を更に含み、其れに依って、変形可能な物体（単数又は複数）を１つ以上のトラップ堰の入口領域（単数又は複数）の狭窄部から内側領域に押し込む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第１の流体力学的圧力が約１から約１００ｍｂａｒの範囲である、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
第２の流体力学的圧力が約１００ｍｂａｒから約１，０００ｍｂａｒの範囲である、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
第１の流体力学的圧力に対する第２の流体力学的圧力の比が約１０×から約２０×の範囲である、請求項３２〜３４の何れか１項に記載の方法。
【請求項３６】
物体が細胞又はビーズである、請求項２９〜３５の何れか１項に記載の方法。
【請求項３７】
（ｂ）の流す事が少なくとも１回反復され、其れに依って、少なくとも２つの物体が１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）に閉じ込められる事を許す、請求項３２〜３６の何れか１項に記載の方法。
【請求項３８】
（ｂ）の流す事が、第１の場合に用いられた物と同じ物体を含む流体を用いて少なくとも１回反復される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
（ｂ）の流す事が、第１の場合に用いられた物とは異なる物体を含む流体を用いて少なくとも１回反復される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）に閉じ込められた少なくとも２つの物体が、少なくとも２つの同じ細胞、少なくとも２つの異なる細胞、少なくとも２つの同じビーズ、少なくとも２つの異なるビーズ、又は少なくとも１つの細胞及び１つのビーズを含む、請求項３７〜３９の何れか１項に記載の方法。
【請求項４１】
非混和性の流体をマイクロ流体デバイスに流す事に依って複数のトラップ堰をシールする事を更に含む、請求項２９〜４０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４２】
非混和性の流体が油又は空気である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
物体が細胞であり、細胞が１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）に於いて１日以上の期間に渡って培養される、請求項３２〜４２の何れか１項に記載の方法。
【請求項４４】
細胞が１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）に於いて１週以上の期間に渡って培養される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
細胞が１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）に於いて１ヶ月以上の期間に渡って培養される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
物体が細胞であり、方法が、１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）の細胞を表現型解析する為のイメージング技術の使用を更に含む、請求項３２〜４５の何れか１項に記載の方法。
【請求項４７】
イメージング技術が、明視野イメージング、蛍光イメージング、２光子蛍光イメージング、又は其れ等の何れかの組み合わせから成る群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
複数のトラップ堰の内側領域が夫々固有の分子識別子を含み、此れ等は、トラップ堰の内側領域内の細胞のリシス時に細胞の分子コンポーネントに結合又はハイブリダイゼーションさせられ得る、請求項３２〜４７の何れか１項に記載の方法。
【請求項４９】
分子コンポーネントが蛋白質、ペプチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、又は其れ等の何れかの組み合わせを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
固有の分子識別子が、ＤＮＡシーケンシング、遺伝子発現分析、又はクロマチン分析を行う為に用いられる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
外部から適用される電場が、固有の分子識別子に対する核酸分子コンポーネントのハイブリダイゼーションを容易化する為に用いられる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
マイクロ流体デバイスが更に取り外し可能な蓋を含む、請求項３２〜５１の何れか１項に記載の方法。
【請求項５３】
変形可能な物体が細胞であり、１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）に於ける細胞（単数又は複数）のトラップ後に、生体適合性のハイドロゲルがマイクロ流体デバイス内に灌流され、重合する事を許される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ハイドロゲルの重合後に、マイクロ流体デバイスの蓋が取り外されて、トラップされた細胞へのアクセスを許す、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
生体適合性のハイドロゲルが、細胞のリシス時にトラップされた細胞のゲノム材料を閉じ込める為に用いられる、請求項５３〜５４の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
此の発明は、高スループット単一細胞分析の為のデバイス、システム、及び方法に関する。
【０００２】
相互参照
本願は２０１７年１０月２０日出願の米国仮出願第６２／５７４，８６５号の利益を主張し、此の出願は参照に依って本願に組み込まれる。
【０００３】
連邦政府資金に依る研究の記載
本発明は、国立衛生研究所から授与された連邦助成金第Ｒ２ＧＭ１１１５８４号及び第Ｒ０１ＧＭ１２３５４２号に依る米国政府の支援に依って為された。連邦政府は本発明に或る種の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
単一細胞分析技術は種々の基礎研究及び臨床適用に於ける革新的な進歩を可能化し得る。例えば、従来の細胞培養技術が数週又は数ヶ月の実験作業を要求するケースに於いて、単一細胞分析は稀な薬剤耐性細胞の迅速な同定を可能化するポテンシャルを有する。然し乍ら、何れの既存の単一細胞分析プラットフォームも、大きいデータセットが効率的に分析される事を許す長期的な細胞培養、高スループット顕微鏡法、自動画像処理、生化学的アッセイ、及びゲノム分析技術と適合性である細胞トラップアーキテクチャに依る高い捕捉効率を提供しない。其れ故に、爾後の表現型的、生化学的、生理学的、遺伝学的、ゲノム的、及び／又はプロテオーム的分析の為に単一細胞をトラップ及び区画化する改善された方法の必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願に於いてはマイクロ流体デバイスが開示され、ａ）少なくとも１つの流体注入口及び少なくとも１つの流体排出口の間に其れ等と流体連通して配設される複数のトラップ堰を含み、各トラップ堰はマイクロ流体デバイスを通過する流体中の懸濁物体を保持する様に構成され、ｉ）各トラップ堰は、物体の最も小さい寸法の約３分の１よりも小さい少なくとも１つの寸法の狭窄部を含み、ｉｉ）トラップ堰を通過する流体流路の物に対するトラップ堰をバイパスする流体流路の流体抵抗の比は少なくとも０．４である。
【０００６】
幾つかの実施形態では、流体抵抗の比は少なくとも０．５である。幾つかの実施形態では、流体抵抗の比は少なくとも０．７５である。幾つかの実施形態では、流体抵抗の比は少なくとも１．０である。幾つかの実施形態では、流体抵抗の比は少なくとも１．２５である。
【０００７】
又、本願に於いてはマイクロ流体デバイスが開示され、ａ）少なくとも１つの流体注入口及び少なくとも１つの流体排出口の間に其れ等と流体連通して配設される複数のトラップ堰を含み、各トラップ堰はマイクロ流体デバイスを通過する流体中の懸濁物体を保持する様に構成され、ｉ）各トラップ堰は入口領域、内側領域、及び出口領域を含み、此れ等は、集合的に、流体抵抗ＲＴを有するトラップ堰を通る内側流体流路を構成し、ｉｉ）トラップ堰の大多数の各トラップ堰は、流体抵抗ＲＡを有する１つの長いバイパス流体流れチャネルと、且つ夫々ＲＡよりも小さい流体抵抗を有する１又は２つの短いバイパス流体流れチャネルと流体連通し、各バイパス流体流れチャネルは、トラップ堰の出口領域を別のトラップ堰の入口領域に接続し、ｉｉｉ）比ＲＡ／ＲＴは少なくとも１．０である。
【０００８】
加えて、マイクロ流体デバイスが本願に於いて開示され、ａ）少なくとも１つの流体注入口及び少なくとも１つの流体排出口の間に其れ等と流体連通して配設される複数のトラップ堰を含み、各トラップ堰はマイクロ流体デバイスを通過する流体中の懸濁物体を保持する様に構成され、ｉ）各トラップ堰は、入口領域、内側領域、及び出口領域を含み、此れ等は、集合的に、流体抵抗ＲＴを有するトラップ堰を通る内側流体流路を構成し、ｉｉ）トラップ堰の大多数の各トラップ堰は、流体抵抗ＲＡを有する１つの長いバイパス流体流れチャネルと、且つ夫々ＲＡよりも小さい流体抵抗を有する１又は２つの短いバイパス流体流れチャネルと流体連通し、各バイパス流体流れチャネルは、トラップ堰の出口領域を別のトラップ堰の入口領域に接続し、ｉｉｉ）流体は、トラップ堰が未占有である場合には第１の方向に、トラップ堰が物体に依って占有される場合には第２の方向に、隣り合う短いバイパスチャネルを流れる。
【０００９】
幾つかの実施形態では、比ＲＡ／ＲＴは少なくとも１．１である。幾つかの実施形態では、比ＲＡ／ＲＴは少なくとも１．２である。幾つかの実施形態では、比ＲＡ／ＲＴは少なくとも１．３である。幾つかの実施形態では、比ＲＡ／ＲＴは少なくとも１．４である。幾つかの実施形態では、比ＲＡ／ＲＴは少なくとも１．４５である。幾つかの実施形態では、各トラップ堰は、物体の最も小さい寸法の約２分の１よりも小さい空間寸法を有する少なくとも１つの狭窄部を含む。幾つかの実施形態では、各トラップ堰は、懸濁物体の最も小さい寸法の約３分の１よりも小さい空間寸法を有する少なくとも１つの狭窄部を含む。幾つかの実施形態では、各トラップ堰は、約１．５μｍから約６μｍの範囲である空間寸法を有する少なくとも１つの狭窄部を含む。幾つかの実施形態では、比ＲＡ／ＲＴは少なくとも１．２であり、個々のトラップ堰が第１の接触時に懸濁物体を保持する捕捉確率は少なくとも０．３６である。幾つかの実施形態では、比ＲＡ／ＲＴは少なくとも１．４５であり、個々のトラップ堰が第１の接触時に懸濁物体を保持する捕捉確率は少なくとも０．６０である。幾つかの実施形態では、各トラップ堰は出口領域にフリット構造を含み、フリット構造は、懸濁物体の最も小さい寸法よりも小さい空間寸法を有する１つ以上の狭窄部を含む。幾つかの実施形態では、複数のトラップ堰は少なくとも１００個のトラップ堰を含む。幾つかの実施形態では、複数のトラップ堰は少なくとも１，０００個のトラップ堰を含む。幾つかの実施形態では、複数のトラップ堰は少なくとも１０，０００個のトラップ堰を含む。幾つかの実施形態では、懸濁物体をトラップする飽和前トラップ効率は少なくとも２０％である。幾つかの実施形態では、複数のトラップ堰は少なくとも１００，０００個のトラップ堰を含む。幾つかの実施形態では、懸濁物体をトラップする飽和前トラップ効率は少なくとも５０％である。幾つかの実施形態では、懸濁物体をトラップする飽和前トラップ効率は少なくとも８０％である。幾つかの実施形態では、懸濁物体をトラップする飽和前トラップ効率は少なくとも９０％である。幾つかの実施形態では、懸濁物体をトラップする飽和前トラップ効率は少なくとも９５％である。幾つかの実施形態では、懸濁物体をトラップする飽和前トラップ効率は少なくとも９８％である。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは更にｂ）取り外し可能な蓋を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上のトラップ堰の内側領域は固有の分子識別子（又はバーコード）を含み、此れ等は、トラップ堰の内側領域内の細胞のリシス時に細胞の分子コンポーネントに結合又はハイブリダイゼーションさせられ得る。
【００１０】
流体中の懸濁物体をトラップする為の方法が本願に於いて開示され、方法は、ａ）本願に記載される何れかの実施形態のマイクロ流体デバイスを提供する事と、ｂ）物体を含む流体をマイクロ流体デバイスに流して、物体を複数のトラップ堰の１つ以上にトラップする事と、を含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、各トラップ堰は出口領域にフリット構造を含み、フリット構造は、物体の最も小さい寸法よりも小さい空間寸法を有する１つ以上の狭窄部を含む。幾つかの実施形態では、（ｂ）の流す事は第１の流体力学的圧力で行われ、其れに依って、１つ以上のトラップ堰の入口領域の狭窄部に物体をトラップする。幾つかの実施形態では、物体は変形可能な物体を含み、方法は、１つ以上のトラップ堰の入口領域（単数又は複数）の狭窄部にトラップされた物体（単数又は複数）に第１の流体力学的圧力よりも高い第２の流体力学的圧力を掛ける事を更に含み、其れに依って、変形可能な物体（単数又は複数）を入口領域（単数又は複数）の狭窄部から１つ以上のトラップ堰の内側領域に押し込む。幾つかの実施形態では、第１の流体力学的圧力は約１から約１００ｍｂａｒの範囲である。幾つかの実施形態では、第２の流体力学的圧力は約１００ｍｂａｒから約１，０００ｍｂａｒの範囲である。幾つかの実施形態では、第１の流体力学的圧力に対する第２の流体力学的圧力の比は約１０×から約２０×の範囲である。幾つかの実施形態では、物体は細胞又はビーズである。幾つかの実施形態では、（ｂ）の流す事は少なくとも１回反復され、其れに依って、少なくとも２つの物体が１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）に閉じ込められる事を許す。幾つかの実施形態では、（ｂ）の流す事は、第１の場合に用いられた物と同じ物体を含む流体を用いて少なくとも１回反復される。幾つかの実施形態では、（ｂ）の流す事は、第１の場合に用いられた物とは異なる物体を含む流体を用いて少なくとも１回反復される。幾つかの実施形態では、１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）に閉じ込められた少なくとも２つの物体は、少なくとも２つの同じ細胞、少なくとも２つの異なる細胞、少なくとも２つの同じビーズ、少なくとも２つの異なるビーズ、又は少なくとも１つの細胞及び１つのビーズを含む。幾つかの実施形態では、方法は、非混和性の流体をマイクロ流体デバイスに流す事に依って複数のトラップ堰をシールする事を更に含む。幾つかの実施形態では、非混和性の流体は油又は空気である。幾つかの実施形態では、物体は細胞であり、細胞は、１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）に於いて１日以上の期間に渡って培養される。幾つかの実施形態では、細胞は、１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）に於いて１週以上の期間に渡って培養される。幾つかの実施形態では、細胞は、１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）に於いて１ヶ月以上の期間に渡って培養される。幾つかの実施形態では、物体は細胞であり、方法は、１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）内の細胞を表現型解析する為のイメージング技術の使用を更に含む。幾つかの実施形態では、イメージング技術は、明視野イメージング、蛍光イメージング、２光子蛍光イメージング、又は其れ等の何れかの組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態では、複数のトラップ堰の内側領域は夫々固有の分子識別子を含み、此れ等は、トラップ堰の内側領域内の細胞のリシス時に細胞の分子コンポーネントに結合又はハイブリダイゼーションさせられ得る。幾��かの実施形態では、分子コンポーネントは蛋白質、ペプチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、又は其れ等の何れかの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、固有の分子識別子（又はバーコード）は、ＤＮＡシーケンシング、遺伝子発現分析、又はクロマチン分析を行う為に用いられる。幾つかの実施形態では、外部から適用される電場が、固有の分子識別子に対する核酸分子コンポーネントのハイブリダイゼーションを容易化する為に用いられる。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは更に取り外し可能な蓋を含む。幾つかの実施形態では、変形可能な物体は細胞であり、１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）に於ける細胞（単数又は複数）のトラップ後に、生体適合性のハイドロゲルがマイクロ流体デバイス内に灌流され、重合する事を許される。幾つかの実施形態では、ハイドロゲルの重合後に、マイクロ流体デバイスの蓋が取り外されて、トラップされた細胞へのアクセスを許す。幾つかの実施形態では、生体適合性のハイドロゲルは細胞のリシス時にトラップされた細胞のゲノム材料を閉じ込める為に用いられる。
【００１２】
参照に依る組み込み
本明細書に於いて挙げられる全ての公開物、特許、及び特許出願は、各個々の公開物、特許、又は特許出願の全体が参照に依って組み込まれる事を具体的且つ個々に指示される場合と同じ程度に、其れ等の全体が参照に依って本願に組み込まれる。本願の用語と組み込まれる参照の用語との間に不一致がある場合には、本願の用語が優先される。
【００１３】
本発明の新規の特徴は添付の請求項に於いて特定して記される。本発明の原理が利用されている例示的な実施形態を記す次の詳細な記載と付随する図面とを参照して、本発明の特徴及び利点のより良好な理解が得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、トラップフィーチャ（狭窄部）及び相互接続するバイパス流体チャネルのラダー様ネットワークを含むマイクロ流体デバイスを例示している。
【図２】図２（ａ）及び２（ｂ）は、トラップフィーチャ及び相互接続する流体バイパスチャネルのラダー様ネットワークを含む類似の設計のマイクロ流体デバイスに於ける、２つの異なる流れのレジームを例示している。此の限定しない例では、トラップフィーチャは其れ等の出口領域にフリットを含む。図２（ａ）は、トラップフィーチャを通る内部流路が蛇行するバイパス流体チャネルの物よりも高い流体力学的流れ抵抗を有する時の、デバイスを通る流れを例示している。図２（ｂ）は、トラップフィーチャを通る内部流路が蛇行するバイパス流体チャネルの物よりも低い流体力学的な流れ抵抗を有する時の、デバイスを通る流れを例示している。
【図３】図３は、図１並びに図２（ａ）及び２（ｂ）に示されているトラップフィーチャ及び相互接続する流体チャネルのラダー様ネットワークについて、等価の抵抗回路を例示している。
【図４】図４（ａ）及び４（ｂ）は、トラップフィーチャ及び相互接続する流体チャネルのメッシュ様ネットワークを含む類似の設計のマイクロ流体デバイスに於ける、２つの異なる流れのレジームを例示している。図４（ａ）は、トラップフィーチャを通る内部流路が蛇行するバイパス流体チャネルの物よりも高い流体力学的流れ抵抗を有する時の、デバイスを通る流れを例示している。図４（ｂ）は、トラップフィーチャを通る内部流路が蛇行するバイパス流体チャネルの物よりも低い流体力学的な流れ抵抗を有する時の、デバイスを通る流れを例示している。
【図５】図５は、図４（ａ）及び４（ｂ）に示されているトラップフィーチャ及び相互接続する流体チャネルのメッシュ様ネットワークについて、等価の抵抗回路を例示している。
【図６】図６は、ＲＡ／ＲＴ＝０．４２と近似計算されるトラップ比を有するメッシュネットワークトラップジオメトリを例示している。
【図７】図７は、ＲＡ／ＲＴ＝１．２と近似計算されるトラップ比を有するメッシュネットワークトラップジオメトリを例示している。
【図８】図８は、ＲＡ／ＲＴ＝１．２と近似計算されるトラップ比を有するラダーネットワークトラップジオメトリを例示している。
【図９】図９は、ＲＡ／ＲＴ＝１．４５と近似計算されるトラップ比を有するメッシュネットワークトラップジオメトリを例示している。
【図１０】図１０は、ＲＡ／ＲＴ＝１．４５と近似計算されるトラップ比を有するラダーネットワークトラップジオメトリを例示している。
【図１１】図１１は、トラップ堰が小さい体積の内側流路を含む（即ち、トラップは有意な「内側領域」を有さない）メッシュネットワークトラップジオメトリを例示している。
【図１２】図１２は、後ろ側にフリットを有さない内側流路を有するラダーネットワークトラップジオメトリの１つの限定しない例を例示している。
【図１３】図１３は、後ろ側にフリットを有さない内側流路を有するメッシュネットワークトラップジオメトリの１つの限定しない例を例示している。
【図１４】図１４は人工ニューラルネットワークの模式的な例示を提供している。
【図１５】図１５は、人工ニューラルネットワークの層内のノードの機能性の模式的な例示を提供している。
【図１６】図１６（ａ）〜１６（ｄ）は、４つの異なるマイクロ流体デバイスについて捕捉パーセンテージｖｓ．行番号のプロットを示しており、トラップフィーチャの内部流路及び蛇行するバイパス流体チャネルの流れ抵抗の異なる比を含む。図１６（ａ）：トラップフィーチャを通る流路の物に対する蛇行するバイパスチャネルの流体力学的な流れ抵抗の比（ＲＡ／ＲＴ）＝０．２５のマイクロ流体デバイスのプロット。図１６（ｂ）：ＲＡ／ＲＴ＝０．４２のマイクロ流体デバイスのプロット。図１６（ｃ）：ＲＡ／ＲＴ＝１．２０のマイクロ流体デバイスのプロット。図１６（ｄ）：ＲＡ／ＲＴ＝１．４５のマイクロ流体デバイスのプロット。
【図１７】図１７（ａ）〜１７（ｄ）は、図１６（ａ）〜１６（ｄ）に示されている捕捉パーセンテージ曲線を見せる４つのマイクロ流体デバイスについて、占有されたトラップの分布のヒートマップを示している。図１７（ａ）：ＲＡ／ＲＴ＝０．２５のマイクロ流体デバイスのヒートマップ。図１７（ｂ）：ＲＡ／ＲＴ＝０．４２のマイクロ流体デバイスのヒートマップ。図１７（ｃ）：ＲＡ／ＲＴ＝１．２０のマイクロ流体デバイスのヒートマップ。図１７（ｄ）：ＲＡ／ＲＴ＝１．４５のマイクロ流体デバイスのヒートマップ。
【図１８】図１８はマイクロ流体チャンバー内で成長する単一細胞コロニーの一連のタイムラプス画像を示している。細胞の中心は機械学習に基づく画像処理アルゴリズムを用いて同定され、小さいドットとして図示されている。
【図１９】図１９は、本開示のマイクロ流体デバイス内で成長した細胞の画像の機械学習に基づく分析を用いて得られた、成長曲線の限定しない例を提供している。
【図２０】図２０は、本開示のマイクロ流体デバイス内で成長したＫ５６２細胞の成長速度データのプロットを示しており、コントロール及び０．１ｕＭ、０．３ｕＭ、及び０．５ｕＭイマチニブの存在下で成長した細胞のデータを包含する。
【図２１】図２１は、隣り合うマイクロ流体チャンバー内で成長する４つの細胞コロニーの一連のタイムラプス画像を示している。
【図２２】図２２（ａ）及び２２（ｂ）は、キザルチニブ（図２２（ａ））又はコントロール培地（図２２（ｂ））の存在下で成長したＭＯＬＭ１３細胞の画像を示している。単一のクローンが薬物の存在下で外生する事が観察される。
【図２３】図２３（ａ）及び２３（ｂ）は、マイクロ流体チップ上の個々の細胞並びに識別子及びマーカーを同定する為の、画像セグメント化に基づく機械学習アルゴリズムの使用を例示している。図２３（ａ）：明視野画像。図２３（ｂ）：コンピュータ生成カラー画像が明視野画像上にオーバーレイされており、チップ上のマーカーの同定、機械学習に基づく分析を用いて分類された細胞の異なる場合、個々の細胞の境界、及び検出される物体が細胞であるかどうかの予測の信頼度のクオリティスコアを示している。
【図２４】図２４はマイクロ流体チャンバー内にトラップされた単一細胞のアレイの画像を示している。此れの後に、チャンバーをシールする為に空気が流体チャネルに吹送される。
【図２５】図２５は、マイクロ流体チップ内にパターニングされているオリゴヌクレオチド捕捉プローブに対する蛍光標識された標的プローブのハイブリダイゼーションを示す、蛍光及び明視野画像のオーバーレイを示している。
【図２６】図２６（ａ）〜２６（ｃ）は単一細胞アレイを形成する為のプロセスを例示している。単一細胞アレイは細胞を硬化性のハイドロゲルと併せてアレイに流す事に依って形成される（図２６（ａ））。此れの後に、蓋が剥がされて（図２６（ｂ））、サンプルへのアクセスを提供し得る（図２６（ｃ））。
【図２７】図２７（ａ）及び２７（ｂ）は、流体中の懸濁された単一細胞又は他の物体の捕捉の為の複数のトラップフィーチャを含むマイクロ流体デバイスの限定しない例を提供している。図２７（ａ）：トラップフィーチャ及びマイクロ流体チャンバーの１００×１００アレイを含むマイクロ流体デバイスの写真。図２７（ｂ）：本開示のマイクロ流体デバイス内のトラップフィーチャ及び流体チャンバーの顕微鏡写真。
【図２８】図２８（ａ）〜２８（ｄ）は、原理証明作業に用いられた低効率トラップデバイスのトラップを通る流れプロファイルの例と、単一細胞トラップ効率のデータとを提供している。図２８（ａ）：デバイスの単一のトラップを通る計算上の流体流速。図２８（ｂ）：デバイスの単一のトラップを示す顕微鏡写真。図２８（ｃ）：デバイス内の１０，０００区画について単一細胞トラップ効率を示すヒートマップ。図２８（ｄ）：０、１、２、若しくは３、又はより多くの細胞がトラップされたマイクロ流体チャンバーの分布を示す円グラフ。
【図２９】図２９は細胞アレイの繋ぎ合わせた蛍光画像を示している（細胞はＦＩＴＣ細胞トラッキング色素に依って標識されている）。挿入図：デバイス内にトラップされた個々の細胞を示す蛍光及び明視野画像の拡大オーバーレイ。
【図３０】図３０（ａ）〜３０（ｃ）は、アレイ中の特定の細胞に化学物質を印刷する能力を実証する画像の限定しない例を示しており、此れはマイクロ流体デバイスの開放的なアーキテクチャに依って可能にされる。図３０（ａ）：蛍光標識を用いる単一細胞アレイ中の印刷された２つの並べられたパターン。図３０（ｂ）：蛍光標識を用いる細胞アレイ中の特定の細胞に印刷されたパターン。図３０（ｃ）：蛍光標識を用いる細胞アレイ中の特定の細胞に印刷されたパターン。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、細胞トラップフィーチャ及び相互接続する流体チャネルのメッシュ様ネットワークに基づく新規のマイクロ流体デバイス設計を提供し、此れ等は流体中の懸濁された単一細胞又は他の物体の高度に効率的なトラップを可能化し、且つ此れ等はオンチップ細胞区画化及び培養技術、高スループット顕微鏡法、及び自動画像処理技術、並びに生化学的アッセイ又はゲノム分析技術と適合性がある。
【００１６】
１つの態様では、開示されるマイクロ流体デバイスは、ラダー及びメッシュ流体ネットワークの先には認識されていない形質を活用する設計を使用する事に依って、単一細胞又は他の物体の高度に効率的なトラップを可能化する。複数のトラップフィーチャ及び少なくとも２つの異なる型の相互接続するバイパスチャネルを含む流体力学的流体回路の流路の相対的な流体抵抗をチューニングする事に依って、最も近いバイパスチャネル内の流体の流れの方向は細胞トラップ（から離れるよりも寧ろ）に向かい、其の結果、毎細胞又は物体は其れが遭遇する第１のトラップに押し込まれる。
【００１７】
別の態様では、開示されるマイクロ流体デバイスは、集合的にトラップ堰を通る内側流体流路を構成する入口領域、任意の内側領域、及び出口領域を含むトラップ堰設計を使用する事に依って、単一細胞の区画化及び短期的又は長期的なオンチップ細胞培養を可能化する。幾つかの態様では、内側領域は、トラップされるべき細胞又は物体よりも大きい寸法及び／又は体積を有し、其れ故に単一細胞の区画化及び／又は培養の為に用いられ得る。細胞又は物体を複数のトラップの入口領域にトラップし（例えば、デバイスの比較的低い流体力学的圧力損失を用いて、流体流れを駆動する）、爾後にトラップされた細胞又は物体を複数のトラップの内側領域に押し込む（例えば、比較的高い流体力学的圧力のパルスを用いる）為の方法も又記載される。
【００１８】
本開示の幾つかの態様では、トラップ堰の入口領域又は内側領域にトラップされた単一細胞又は物体は、トラップステップ後に非混和性の流体（例えば、油又は空気）をデバイスに流す事に依って更に単離又は区画化され得る。幾つかの態様では、斯かる単離ステップは、トラップされた細胞の爾後の生化学的、生理学的、遺伝学的、ゲノム的、及び／又はプロテオーム的分析を更に容易化する為に用いられ得る。
【００１９】
本開示の幾つかの態様では、開示されるマイクロ流体単一細胞トラップデバイスは、取り外し可能な蓋を含み得、トラップ堰の入口領域又は内側領域にトラップされた単一細胞又は物体は、半多孔質ハイドロゲルの形成の為に要求される可溶性のコンポーネントをデバイスに流す事と、其れから重合ステップをトリガーする事とに依って、更に単離又は区画化され得る。其れから、蓋の取り外しは、トラップのアレイ内の個々の細胞（又は他の物体）への直接的なアクセスを可能化して、爾後の生化学的、生理学的、遺伝学的、ゲノム的、及び／又はプロテオーム的分析を容易化する。幾つかの態様では、トラップのアレイ内の個々の細胞（又は他の物体）への直接的なアクセスを可能化する為の蓋の取り外しは、アレイからの選択された細胞（又は他の物体）の取り出しを容易化する為に用いられ得る。
【００２０】
本開示の幾つかの態様では、機械学習に基づく画像分析が、表現型的な形質に基づいて、トラップ堰のアレイ内にトラップされた個々の細胞を同定及び分類する為に用いられ得る。
【００２１】
本開示の幾つかの態様では、マイクロ流体単一細胞トラップデバイス内のトラップ堰の内側領域は、トラップ堰内にテザリング、固定化、合成、又は印刷された、予め選択された捕捉若しくは検出試薬（例えば、特異的な細胞表面抗原を対象とする抗体）又はバーコード化試薬（例えば、オリゴヌクレオチドバーコード）のセットを含み得る。例えば、幾つかの態様では、下でより詳細に論じられる通り、開示されるマイクロ流体デバイスは、各細胞の傍にＤＮＡバーコードを印刷する事に依って単一細胞のゲノム分析の為の超並列バーコード化を可能化し得る。
【００２２】
其れ故に、本願に於いて提供されるマイクロ流体デバイス並びに関連する方法及びシステムは、各ステップに於ける並列的な単一細胞分析を許し、（１）高密度の細胞（及び／又は他の物体）のアレイを編成し、デバイスに移入された細胞の大多数を捕捉する為の方法、（２）全透性若しくは半透性容器内に於いて単一細胞を区画化するか、又は其れ等を半多孔質ハイドロゲル内にトラップする為の方法、（３）短い又は長い時間の期間に渡る高解像度画像に基づく分析に依って細胞を表現型解析する為の方法、並びに（４）爾後の生化学的、生理学的、遺伝学的、ゲノム的、及び／又はプロテオーム的分析を行う為の方法を包含するが、此れ等に限定されない。開示される方法、デバイス、及びシステムは、種々の基礎研究及び臨床適用を可能化しようとする。例えば、其れ等は、可能性として、薬物安全性及び有効性を確認する為の新たなアプローチ又はより良好な特許治療を選択する為の新たな方法を実装する為に用いられ得る。開示される方法、デバイス、及びシステムは、細胞挙動の不均一性を同定及び分析する為に必要である高度並列実験を実施する事、特に臨床的意義を有する稀な外れ値の同定に用いられ得る。例えば、薬物に対して耐性である稀な割合の細胞は、薬剤耐性クローンの外生を可能化し腫瘍再発に至る其の薬物処置の傾向の強い指標である。同様に、開示される方法、デバイス、及びシステムは、異なる生化学的シグナル伝達分子及び他の化学的薬剤に対する暴露下での幹細胞分化の不均一性を研究する為に用いられ得る。開示される方法、デバイス、及びシステムは、異なる型の細胞間の相互作用、例えば、チェックポイント阻害剤及び他の抗体治療の存在下で癌細胞と相互作用する免疫細胞を研究する為にも又用いられ得る。開示される方法、デバイス、及びシステムは、所望の蛋白質、酵素、又は他の生物学的産物を産生する事に特に秀でた細胞を素早く同定する為にも又用いられ得る。開示される方法、デバイス、及びシステムは、上に記載されている機能計測両方を包含し且つ其れ等の同じ細胞又は単一細胞由来コロニーからのゲノム計測にリンクされる、マルチパラメータデータセットを確立する為にも又用いられ得る。此れ等の細胞に対して実施され得るゲノム計測の型は、ｍＲＮＡ発現分析、抗体受容体分析、ＤＮＡ変異分析、スプライシングバリアント分析、クロマチン制限、メチル化状態、及び高次染色体構成に基づくエピジェネティックアッセイを包含する。
【００２３】
本願に記載される方法、デバイス、及びシステムの種々の態様は、下に記されている具体的な適用の何れかに、又は何れかの他の型の単一細胞分析適用の為に適用され得る。本開示の異なる態様が個々に、集合的に、又は互いとの組み合わせで理解され得ると言う事は理解されるであろう。
【００２４】
定義：別様に定義されない限り、本願に於いて用いられる全ての技術用語は、本開示が属する分野の業者に依って普通に理解される同じ意味を有する。
【００２５】
文脈が明瞭に別様に述べていない限り、本明細書及び添付の請求項に於いて用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数の参照を包含する。別様に申し立てられていない限り、本願に於ける「又は」の何れかの参照は「及び／又は」を包摂する事が意図される。
【００２６】
本願に於いて用いられる用語「約」或る数は、其の数プラス又はマイナス其の数の１０％を言う。用語「約」は、範囲の文脈で用いられる時には、其の範囲マイナス其の最も低い値の１０％及びプラス其の最も多大な値の１０％を言う。
【００２７】
本願に於いて用いられる用語「トラップ」、「トラップフィーチャ」、「細胞トラップ」、及び「トラップ堰」は交換可能に用いられ、流体中の懸濁された細胞又は他の物体を保持又はトラップする様に設計されている流体チャネル内の１又は２つの寸法の狭窄部を含むフィーチャを言い得る。幾つかの場合には、トラップは入口領域、任意に内側領域、及び出口領域を含み得、此れ等の少なくとも１つは狭窄部を含む。幾つかの場合には、トラップの内側領域は少なくとも１つ又は２つの寸法が入口領域及び／又は出口領域よりも有意に大きくあり得、トラップされた個々の細胞を区画化する様に構成され得る。
【００２８】
一般的に、本願に於いて用いられる用語「物体」は、細胞又は其の断片（例えば細胞のオルガネラ、例えば細胞核、ミトコンドリア、又はエキソソーム）、生物（例えば細菌）、ビーズ、粒子、ドロップレット（例えば、液滴）を言い、又は複数の形態で、其れ等の何れかの組み合わせを言い得る。
【００２９】
一般的に、本願に於いて用いられる用語「細胞」は当業者に公知の種々の細胞の何れかを言う。幾つかの態様では、用語「細胞」は、何れかの接着及び非接着真核細胞、哺乳類細胞、初代若しくは不死化ヒト細胞若しくは細胞株、初代若しくは不死化齧歯類細胞若しくは細胞株、癌細胞、種々の異なる臓器若しくは組織型の何れかに由来する正常若しくは疾患ヒト細胞（例えば、白血球、赤血球、血小板、上皮細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア細胞、アストロサイト、線維芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、配偶子、若しくは心臓、肺、脳、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、胸腺、膀胱、胃、結腸、小腸からの細胞）、個別の細胞サブセット、例えば免疫細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４４ｈｉｇｈ／ＣＤ２４ｌｏｗ癌幹細胞、Ｌｇｒ５／６＋幹細胞、未分化ヒト幹細胞、分化する様に誘導されたヒト幹細胞、稀な細胞（例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環上皮細胞、循環内皮細胞、循環子宮内膜細胞、骨髄細胞、前駆体細胞、泡沫細胞、間葉系幹細胞、若しくはトロホブラスト）、動物細胞（例えば、マウス、ラット、豚、犬、牛、若しくは馬）、植物細胞、酵母細胞、真菌細胞、細菌細胞、藻類細胞、接着若しくは非接着原核細胞、又は複数の形態で、其れ等の何れかの組み合わせを言い得る。幾つかの態様では、用語「細胞」は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、アルファベータＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆体、リンパ系幹細胞、骨髄前駆体細胞、リンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、形質細胞、メモリー細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、単球、樹状細胞、及び／若しくはマクロファージ、又は複数の形態で、其れ等の何れかの組み合わせを言い得る。
【００３０】
本願に於いて用いられる用語「ビーズ」は、一般的には、何れかの型の中実、多孔質、又は中空の球状、非球状、又は不規則形状の物体を言い、ガラス、プラスチック、セラミック、金属、ポリマー材料、又は其れ等の何れかの組み合わせから成る。幾つかの態様では、用語「ビーズ」は、シリカビーズ、シリカゲルビーズ、コントロールドポアガラスビーズ、磁性ビーズ（例えば、ダイナビーズ）、ワング樹脂ビーズ、メリフィールド樹脂ビーズ、アガロースビーズ、セファデックスビーズ、セファロースビーズ、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ等を言い得、又は複数の形態で、其れ等の何れかの組み合わせを言い得る。幾つかの態様では、ビーズは、テザリング又は固定化された捕捉、検出、又はバーコード化試薬、例えば、抗体、サイトカイン特異的抗体、ケモカイン特異的抗体、成長因子特異的抗体、酵素、酵素基質、アビジン若しくはストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、他の蛋白質、小分子、糖蛋白質、薬物分子、多糖、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアプタマー、オリゴヌクレオチドバーコード、又は其れ等の何れかの組み合わせを含み得る。幾つかの場合には、ビーズは、サイトカイン検知ビーズ、例えばサーモフィッシャー（Thermo Fischer）（ウォルサム，ＭＡ）に依って販売されている多重Ｌｕｍｉｎｅｘ−ｘＭＡＰ（登録商標）イムノアッセイビーズであり得、此れは３から３０個の異なるサイトカイン及び成長因子を検出する為に用いられ得る。幾つかの態様では、ビーズの直径又は平均直径は少なくとも０．５μｍ、少なくとも１μｍ、少なくとも５μｍ、少なくとも１０μｍ、少なくとも１５μｍ、少なくとも２０μｍ、少なくとも２５μｍ、少なくとも３０μｍ、少なくとも３５μｍ、少なくとも４０μｍ、少なくとも４５μｍ、又は少なくとも５０μｍであり得る。
【００３１】
単一細胞の効率的なトラップの為のマイクロ流体デバイス設計：上で指摘されている通り、１つの態様では、本開示は、メッシュ流体ネットワークの先には認識されていない形質を活用する設計を使用する事に依って、単一細胞又は他の物体の高度に効率的なトラップを可能化するマイクロ流体デバイスを提供する。複数のトラップフィーチャ及び少なくとも２つの異なる型の相互接続するバイパスチャネルを含む流体力学的流体回路の流路の相対的な流体抵抗をチューニングする事が、全ての流体流れストリームラインがトラップを通って行くと言う事を保証し、其れに依って、毎細胞が其れが遭遇する第１のトラップに押し込まれると言う事を保証する。此の現象は、トラップの流体力学的抵抗ＲＴ（即ち、単一のトラップの入口点から出口点迄の距離に跨るトラップジオメトリ全体の流体抵抗）を、１つ以上の短いバイパスチャネルセクションの流体抵抗ＲＢ及び長いコミュナルバイパスチャネルセクションの流体抵抗ＲＡに対して相対的に、ＲＴ＜ＲＡの要件で調整する事に依って達成される。細胞がトラップされた後には、隣同士のバイパスチャネルの流体流れの方向が逆転し、細胞トラップから離れて流れる様な様式で、流体抵抗のローカルな比が変化し、其れに依って、次にアプローチする細胞が次の利用可能なトラップに向かって移動する事を引き起こす。此の様式で、アレイ内のトラップは、細胞が導入される順に次々に仕込まれる。此れは、原理的には、開示されるデバイスが単一細胞をトラップする完璧に近い効率を達成する事を許す。其れ故に、開示されるデバイスは、高いトラップ効率が肝要である小さい細胞サンプルを取り扱う事に理想的に適する。
【００３２】
開示されるデバイス設計は流体チャネルのメッシュ様ネットワークに基づく。幾つかの態様では、デバイスは、ａ）少なくとも１つの注入口及び少なくとも１つの排出口を有するマイクロ流体ネットワーク、ｂ）複数のマイクロ流体狭窄部（又は「トラップ」）を含み、狭窄部の寸法は、流体に含有される懸濁物体の寸法よりも小さく、狭窄部に流れる懸濁物体を捕捉する様に配設され、ｃ）各マイクロ流体狭窄部は、入口点又は領域及び出口点又は領域と任意に内側領域とを含み、ｄ）前記のマイクロ流体狭窄部の出口点は少なくとも２つの追加のマイクロ流体狭窄部と直接的に流体接続し、ｅ）前記マイクロ流体狭窄部が懸濁物体を未だ捕捉していない時には、前記マイクロ流体狭窄部の出口点の圧力は何れの下流のマイクロ流体狭窄部の入口点の圧力よりも高く、ｆ）前記マイクロ流体狭窄部が懸濁物体を捕捉した時には、前記マイクロ流体狭窄部の出口点の圧力は下流のマイクロ流体狭窄部の少なくとも１つの入口点の圧力よりも低い。幾つかの態様では、狭窄部又はトラップの出口領域は、フリット、例えば、細胞又は他の物体が狭窄部又はトラップの内側領域から出て行く事を防止する為に十分に小さい間隔を有する一連のカラム状フィーチャを含み得る。
【００３３】
図１は、トラップフィーチャ（夫々、狭窄した入口点（又は入口領域）、内側領域、及び出口点を含む）及びバイパス流体チャネルの相互接続するセットの「無限」ラダー様ネットワークを含む、マイクロ流体デバイスを例示している。図２（ａ）及び２（ｂ）は、トラップフィーチャが夫々出口点（又は出口領域）にフリットを含む類似のラダー様流体ネットワークを例示している。トラップを通る流路の流体抵抗ＲＴは、トラップの入口点から内側領域を通ってトラップの出口点迄の距離に跨るトラップジオメトリ全体の流体抵抗を含む。２つの型のバイパス流体チャネル、流体抵抗ＲＡを含む長いコミュナルバイパスチャネル（此処で、任意に、バイパスチャネルは蛇行するレイアウトを有する）及び流体抵抗ＲＢを含むより短い相互接続するバイパスチャネルが、図１及び図２（ａ）〜（ｂ）に指示されている。流体抵抗ＲＡを含む長いバイパスチャネルは、一般的に、デバイスを通る正味の流れの方向と整列させられ、流体抵抗ＲＢを含む短いバイパスチャネルは、一般的に、デバイスを通る正味の流れの方向に対して直角に整列させられる。幾つかの場合には、ＲＢ１、ＲＢ２、．．．の流体抵抗を含む１つよりも多くの型の短いバイパスチャネルがあり得る。ＲＢ１、ＲＢ２、．．．は互いとは異なり得るが、夫々ＲＡよりも小さいであろう。図１及び図２（ａ）〜（ｂ）に例示されている流体デバイスの等価の抵抗回路が図３に示されており、流体抵抗ＲＴ、ＲＡ、及びＲＢに依ってリンクされた一連の圧力ノードＰｉ，ｊを含む。
【００３４】
図３に図示されている無限ラダー流体抵抗ネットワークについて、電流連続方程式は、
【数１】
2021500012.tif 000003
に依って与えられ、式中、ΔＰはラダーの１つの周期（Ｐｉ−１，１からＰｉ＋１，１又はＰｉ−１，０からＰｉ＋１，０）に依る圧力損失である。此の方程式の解は点Ｐｉ−１，０の圧力を用いて与えられる。
【数２】
2021500012.tif 000004
【００３５】
此の方程式系は流体流れの２つのレジームを有する。全てのストリームラインが長いチャネルセクション（流体抵抗ＲＡを含む）を通過し、ストリームラインの或る割合がマイクロ流体狭窄部（流体抵抗ＲＴを含む）を通過し、残りは短いチャネルセクション（流体抵抗ＲＢを含む）を流れ、マイクロ流体狭窄部から離れる方向に流れるレジームがある（図２（ａ））。此の条件は、マイクロ流体狭窄部入口点の圧力（Ｐｉ，０）がＰｉ，１の圧力よりも高い時に達成され、此れはＲＡ＜ＲＴの時に起こる。
【００３６】
ＲＡ＞ＲＴの別のレジームでは、状況は逆転し、全てのストリームラインがマイクロ流体狭窄部（ＲＴ）を通過し、流体は短いチャネルセクション（ＲＢ）を流れ、マイクロ流体狭窄部の方に向けられる（図２（ｂ））。其れ故に、トラップ及びバイパスチャネルの相対的抵抗を調整する事に依って、細胞が狭窄部に移動させられ、先行のアプローチで典型的に達成される通り細胞の何らかの割合がバイパスに於いて失われる事なしにトラップされるであろう事を保証する事が可能である。
【００３７】
２Ｄメッシュネットワーク設計（例えば、図４（ａ）〜（ｂ）に例示されている通り。此れは図５に示されている等価の抵抗回路に依って代表され得る）の分析は、無限ラダーネットワークについて此処で論じられる物に類似であり、下の例１でより詳細に論じられる。同じ条件ＲＡ＞ＲＴは、全てのストリームラインがマイクロ流体狭窄部を通過すると言う事を保証する。此の知見は、アレイを流れる第１の細胞が第１の利用可能なトラップに依って捕捉され、次の細胞は次の利用可能なトラップに仕込むであろうと言う事等を示唆している。細胞は未占有のトラップを逃さず、全てのトラップが順に仕込まれるであろう。
【００３８】
各トラップが単一細胞のみを捕捉すると言う事を保証する為には、一旦其れが細胞に依って占有される様に成ると、如何にトラップ抵抗が変化するか、及び如何なる型の流れバランスが次にアプローチする細胞に依って経験されるかを理解する事も又重要である。理想的には、占有されたトラップは、短いバイパス（ＲＢ）を通る流れが今やトラップを通る流れよりも大きい、流れプロファイルを提供するであろう。流れの比は条件ＲＴ≧２ＲＡ＋２ＲＢを与え、此れは短いチャネルセクションが非常に低い抵抗を有する場合に容易に達成され得、トラップされた懸濁物体の存在はトラップ抵抗（ＲＴ）が倍よりも多く成る事を引き起こす。此の知見は、チャネルの深さが細胞直径よりも有意に大きくあるべきではないと言う事を意味しており、其の結果、トラップされた細胞はマイクロ流体狭窄部の有意な断面積パーセンテージを塞ぎ、トラップ抵抗の最大限の変化を引き起こす。
【００３９】
開示されるラダー様及びメッシュ様流体ネットワーク設計は、先行のマイクロ流体に基づく細胞トラップデバイスからの新規の且つ非自明の改善を構成する。良好な細胞トラップデバイスはトラップを通る高い体積流量とトラップの周りの低い体積流量とを有するであろうと言う事が良く確立されている。然し乍ら、先に発表された設計とは対照的に、我々は、重要な設計考慮事項がトラップに依る総圧力損失ではなく、寧ろ、条件ＲＡ＞ＲＴを維持する為のコミュナルバイパスチャネルの流れ及びトラップを通る流れの相対的な流体抵抗のチューニングであると言う事を認識した。
【００４０】
図２（ａ）、２（ｂ）、４（ａ）、４（ｂ）、及び６〜１３は本開示のラダー様及びメッシュ様流体ネットワーク設計の数個の異なる限定しない例を提供する。上で指摘されている通り、図２（ａ）及び２（ｂ）はトラップ堰（出口領域にフリットを含む）及び相互接続するバイパス流体チャネルのラダー様ネットワークを例示している。トラップ堰を通る内部流路の抵抗がバイパスチャネルの抵抗よりも高い時には（ＲＴ＞ＲＡ；流れのレジーム１）、流れはトラップ堰の入口に於いて分岐する（図２（ａ））。此のジオメトリは、トラップ堰を通る内部流路がバイパスチャネルの流路よりも低い抵抗を有する（ＲＡ＞ＲＴ）流れのレジーム２の物よりも低いトラップ効率を有する。此のケースでは、全ての流体はトラップ堰を流れる（図２（ｂ））。
【００４１】
図４（ａ）及び４（ｂ）は、トラップ堰及び相互接続するバイパス流体チャネルのメッシュ様ネットワークを例示している。再び、トラップ堰を通る内部流路の抵抗がバイパスチャネルの抵抗よりも高い時には（ＲＴ＞ＲＡ；流れのレジーム１）、流れはトラップ堰の入口に於いて分岐する（図４（ａ））。トラップ堰を通る内部流路がバイパスチャネルの流路よりも低い抵抗を有する時には（ＲＡ＞ＲＴ；流れのレジーム２）、流体の全てはトラップ堰を通って流れる（図４（ｂ））。
【００４２】
図６は、ＲＡ／ＲＴ＝０．４２と近似計算されるトラップ比を有するメッシュネットワークトラップジオメトリを例示している。此の例では、各トラップ堰の出口領域は内側領域の境界を形成するフリットを含み、トラップ堰の内側領域は、流体中の懸濁された細胞又は物体をトラップする為に用いられる狭窄部を含む入口領域と比較して可成り大きい。
【００４３】
図７は、ＲＡ／ＲＴ＝１．２と近似計算されるトラップ比を有するメッシュネットワークトラップジオメトリを例示している。再び、此の例のトラップ堰はトラップの出口領域にフリットを含む。
【００４４】
図８は、ＲＡ／ＲＴ＝１．２と近似計算されるトラップ比を有するラダーネットワークトラップジオメトリを例示している。再び、此の例のトラップ堰はトラップの出口領域にフリットを含む。
【００４５】
図９は、ＲＡ／ＲＴ＝１．４５と近似計算されるトラップ比を有するメッシュネットワークトラップジオメトリを例示している。再び、此の例のトラップ堰はトラップの出口領域にフリットを有する。
【００４６】
図１０は、ＲＡ／ＲＴ＝１．４５と近似計算されるトラップ比を有するラダーネットワークトラップジオメトリを例示している。再び、此の例のトラップ堰はトラップの出口領域にフリットを含む。
【００４７】
図１１は、トラップ堰が小さい体積の内側流路を含み（即ち、トラップは有意な「内側領域」を有さない）、且つトラップ堰がトラップの出口領域にフリットを欠くメッシュネットワークトラップジオメトリを例示している。
【００４８】
図１２は、排出口又は出口領域にフリットを有さない内側流路を有するラダーネットワークトラップジオメトリの１つの限定しない例を例示している。
【００４９】
図１３は、排出口又は出口領域にフリットを有さない内側流路を有するメッシュネットワークトラップジオメトリの１つの限定しない例を例示している。
【００５０】
幾つかの場合には、開示されるマイクロ流体デバイスは、ａ）少なくとも１つの流体注入口及び少なくとも１つの流体排出口の間に其れ等と流体連通して配設される複数のトラップ堰を含み得、各トラップ堰は、マイクロ流体デバイスを通過する流体中の懸濁物体を保持する様に構成され、ｉ）各トラップ堰は入口領域、任意の内側領域、及び出口領域を含み、此れ等は、集合的に、トラップ堰を通る内側流体流路を構成し、ｉｉ）トラップ堰の大多数（即ち、少なくとも１つの流体注入口又は少なくとも１つの流体排出口に最も近い物を例外として、トラップ堰の全て）の各トラップ堰が、トラップ堰の出口領域を別のトラップ堰の入口領域に接続する２又は３つの外側流体流路（バイパス流体チャネル）と流体連通し、ｉｉｉ）トラップを通る内側流体流路の物に対する１つの外側流体流路（例えば、より長いコミュナル流体バイパスチャネル）の流体抵抗の比（即ち、ＲＡ／ＲＴ）は少なくとも０．４である。幾つかの実施形態では、トラップ堰の全て又は或る部分の出口領域は、細胞又は他の物体がトラップの内側領域（又はチャンバー）から外に流れる事を防止する為のフリットを含み得る。幾つかの実施形態では、２又は３つの外側流体流路（バイパス流体チャネル）は、ＲＡよりも小さい流体抵抗ＲＢを含む１又は２つのより短い流体バイパスチャネルを含み得る。２つのより短い流体バイパスチャネルがあるケースでは、其れ等の流体抵抗は互いと同じか又は互いと異なり得るが、何れのケースでもＲＡより小さいであろう。
【００５１】
幾つかの実施形態では、比ＲＡ／ＲＴは約０．２から約２．０の範囲であり得る。幾つかの実施形態では、比ＲＡ／ＲＴは、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、又は少なくとも２．０であり得る。幾つかの実施形態では、比ＲＡ／ＲＴは、多くても２．０、多くても１．９、多くても１．８、多くても１．７、多くても１．６、多くても１．５、多くても１．４、多くても１．３、多くても１．２、多くても１．１、多くても１．０、多くても０．９、多くても０．８、多くても０．７、多くても０．６、多くても０．５、多くても０．４、多くても０．３、又は多くても０．２であり得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、比ＲＡ／ＲＴは約０．４から約１．６の範囲であり得る。比ＲＡ／ＲＴが、此の範囲内の何れかの値、例えば約１．２５を有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００５２】
開示されるマイクロ流体デバイスのトラップ堰は、一般的に、少なくとも１つの寸法の狭窄部、例えば、トラップされるべき細胞又は物体の最も小さい寸法よりも小さい狭窄部を含む入口点又は入口領域を含むであろう。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの寸法の狭窄部は、サイズが、トラップされるべき細胞又は物体の最も小さい寸法の約１０％から約９０％の範囲であり得る。幾つかの実施形態では、狭窄部は、トラップされるべき細胞又は物体の最も小さい寸法の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％であり得る。幾つかの実施形態では、狭窄部は、トラップされるべき細胞又は物体の最も小さい寸法の多くても９０％、多くても８０％、多くても７０％、多くても６０％、多くても５０％、多くても４０％、多くても３０％、多くても２０％、又は多くても１０％であり得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、狭窄部は、サイズがトラップされるべき細胞又は物体の最も小さい寸法の約２０％から約７０％の範囲であり得る。狭窄部が、此の範囲内の何れかの値、例えばトラップされるべき細胞又は物体の最も小さい寸法の約３３％を有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００５３】
一般的に、開示されるマイクロ流体デバイスのトラップ堰は、少なくとも１つの寸法の狭窄部、例えば、トラップされるべき細胞又は物体の最も小さい寸法よりも小さい狭窄部を含む入口点又は入口領域を含むであろう。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの寸法の狭窄部はサイズが約１μｍから約１００μｍの範囲であり得る。例えば、幾つかの実施形態では、少なくとも１つの寸法の狭窄部は、少なくとも１μｍ、少なくとも２μｍ、少なくとも３μｍ、少なくとも４μｍ、少なくとも５μｍ、少なくとも６μｍ、少なくとも７μｍ、少なくとも８μｍ、少なくとも９μｍ、少なくとも１０μｍ、少なくとも２０μｍ、少なくとも３０μｍ、少なくとも４０μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも６０μｍ、少なくとも７０μｍ、少なくとも８０μｍ、少なくとも９０μｍ、又は少なくとも１００μｍの寸法を有し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの寸法の狭窄部は、多くても１００μｍ、多くても９０μｍ、多くても８０μｍ、多くても７０μｍ、多くても６０μｍ、多くても５０μｍ、多くても４０μｍ、多くても３０μｍ、多くても２０μｍ、多くても１０μｍ、多くても９μｍ、多くても８μｍ、多くても７μｍ、多くても６μｍ、多くても５μｍ、多くても４μｍ、多くても３μｍ、多くても２μｍ、多くても１μｍの寸法を有し得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、少なくとも１つの寸法の狭窄部はサイズが約３μｍから約６μｍの範囲であり得る。狭窄部が、此の範囲内の何れかの寸法、例えば約４．５μｍを有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００５４】
幾つかの場合には、開示されるマイクロ流体デバイスは、ａ）少なくとも１つの流体注入口及び少なくとも１つの流体排出口の間に其れ等と流体連通して配設される複数のトラップ堰を含み得、各トラップ堰は、マイクロ流体デバイスを通過する流体中の懸濁物体を保持する様に構成され、ｉ）各トラップ堰は、入口領域、内側領域、及び出口領域を含み、此れ等は、集合的に、トラップ堰を通る内側流体流路を構成し、ｉｉ）トラップ堰の内側領域の体積は入口領域又は出口領域の体積よりも多大である。
【００５５】
幾つかの場合には、開示されるマイクロ流体デバイスは、ａ）少なくとも１つの流体注入口及び少なくとも１つの流体排出口の間に其れ等と流体連通して配設される複数のトラップ堰を含み得、各トラップ堰は、マイクロ流体デバイスを通過する流体中の懸濁物体を保持する様に構成され、ｉ）各トラップ堰は、入口領域、内側領域、及び出口領域を含み、此れ等は、集合的に、トラップ堰を通る内側流体流路を構成し、ｉｉ）内側領域は物体の最も大きい寸法よりも多大である少なくとも２つの寸法を有する。
【００５６】
開示されるマイクロ流体デバイスのトラップ堰設計は、入口領域（又は入口点）、任意に内側領域（又はチャンバー）、及び出口領域（又は出口点）を含み得る。存在する場合には、内側領域（又はチャンバー）は、マイクロ流体デバイスの平面内に種々の断面形状の何れかを有し得る。例えば、内側領域は、大きくは円形形状、楕円形形状、正方形形状、長方形形状、三角形形状、六角形形状、不規則な形状、又は其れ等の何れかの組み合わせを有し得る。幾つかの場合には、トラップ堰の全て又は或る部分の出口領域はフリットを含み得る。
【００５７】
幾つかの場合には、内側領域は、トラップの入口及び／又は出口領域の物に対して相対的に僅かに小さい寸法又は体積を有し得る。幾つかの実施形態では、内側領域（又はチャンバー）は、入口領域、出口領域、又はトラップされるべき細胞若しくは物体の物の１×から約１，０００×の範囲である体積を含み得る。例えば、幾つかの実施形態では、内側領域は、入口領域、出口領域、又はトラップされるべき細胞若しくは物体の少なくとも１×、少なくとも１０×、少なくとも２０×、少なくとも３０×、少なくとも４０×、少なくとも５０×、少なくとも６０×、少なくとも７０×、少なくとも８０×、少なくとも９０×、少なくとも１００×、少なくとも２００×、少なくとも３００×、少なくとも４００×、少なくとも５００×、少なくとも６００×、少なくとも７００×、少なくとも８００×、少なくとも９００×、又は少なくとも１，０００×である体積を含み得る。幾つかの実施形態では、内側領域は、入口領域、出口領域、又はトラップされるべき細胞若しくは物体の物の多くても１，０００×、多くても９００×、多くても８００×、多くても７００×、多くても６００×、多くても５００×、多くても４００×、多くても３００×、多くても２００×、多くても１００×、多くても９０×、多くても８０×、多くても７０×、多くても６０×、多くても５０×、多くても４０×、多くても３０×、多くても２０×、多くても１０×、又は多くても１×である体積を含み得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、内側領域は、サイズが入口領域、出口領域、又はトラップされるべき細胞若しくは物体の物の約５０×から約２００×の範囲である体積を含み得る。内側領域が、此の範囲内の何れかの値、例えば入口領域、出口領域、又はトラップされるべき細胞若しくは物体の物の約２５０×を有する体積を含み得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００５８】
幾つかの実施形態では、内側領域（又はチャンバー）は、サイズがトラップされるべき細胞又は物体の最も大きい寸法の物の約１×から約１，０００×の範囲である少なくとも１つ又は少なくとも２つの寸法を含み得る。例えば、幾つかの実施形態では、内側領域は、トラップされるべき細胞又は物体の最も大きい寸法の物の少なくとも１×、少なくとも１０×、少なくとも２０×、少なくとも３０×、少なくとも４０×、少なくとも５０×、少なくとも６０×、少なくとも７０×、少なくとも８０×、少なくとも９０×、少なくとも１００×、少なくとも２００×、少なくとも３００×、少なくとも４００×、少なくとも５００×、少なくとも６００×、少なくとも７００×、少なくとも８００×、少なくとも９００×、又は少なくとも１，０００×である少なくとも１つ又は少なくとも２つの寸法を含み得る。幾つかの実施形態では、内側領域は、トラップされるべき細胞又は物体の最も大きい寸法の物の多くても１，０００×、多くても９００×、多くても８００×、多くても７００×、多くても６００×、多くても５００×、多くても４００×、多くても３００×、多くても２００×、多くても１００×、多くても９０×、多くても８０×、多くても７０×、多くても６０×、多くても５０×、多くても４０×、多くても３０×、多くても２０×、多くても１０×、又は多くても１×である少なくとも１つ又は少なくとも２つの寸法を含み得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、内側領域は、サイズがトラップされるべき細胞又は物体の最も大きい寸法の物の約５０×から約２００×の範囲である少なくとも１つ又は少なくとも２つの寸法を含み得る。内側領域が、此の範囲内の何れかの値を有する少なくとも１つ又は少なくとも２つの寸法、例えば、トラップされるべき細胞又は物体の最も大きい寸法の物の約１２５×を含み得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００５９】
開示されるデバイスの個々のトラップ堰が第１の接触時（即ち、細胞又は物体がデバイス内のトラップ堰に遭遇する第１回）に懸濁細胞又は物体を保持する捕捉確率は、約０．０５から約０．９９までの範囲であり得る。例えば、幾つかの実施形態では、捕捉確率は少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも０．９５、又は少なくとも０．９９であり得る。幾つかの実施形態では、捕捉確率は多くても０．９９、多くても０．９５、多くても０．９、多くても０．８、多くても０．７、多くても０．６、多くても０．５、多くても０．４、多くても０．３、多くても０．２、多くても０．１、又は多くても０．０５であり得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、捕捉確率は約０．２から約０．８の範囲であり得る。捕捉確率が、此の範囲内の何れかの値、例えば約０．６６を有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００６０】
開示されるトラップ堰アレイデバイスを通過する流体中の懸濁された細胞又は他の物体をトラップする飽和前トラップ効率は、約１０％から約１００％の範囲であり得る。例えば、幾つかの実施形態では、開示されるデバイスの飽和前トラップ効率は少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％であり得る。幾つかの実施形態では、飽和前トラップ効率は多くても９９％、多くても９８％、多くても９５％、多くても９０％、多くても８０％、多くても７０％、多くても６０％、多くても５０％、多くても４０％、多くても３０％、多くても２０％、又は多くても１０％であり得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、飽和前トラップ効率は約４０％から約９９％の範囲であり得る。飽和前トラップ効率が、此の範囲内の何れかの値、例えば約９７％を有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００６１】
幾つかの場合には、開示されるマイクロ流体デバイスは、ａ）少なくとも１つの流体注入口及び少なくとも１つの流体排出口の間に其れ等と流体連通して配設される複数のトラップ堰を含み得、各トラップ堰は、マイクロ流体デバイスを通過する流体中の懸濁物体を保持する様に構成され、ｉ）各トラップ堰は、物体の最も小さい寸法よりも小さい少なくとも１つの寸法の狭窄部を含み、ｉｉ）トラップ堰を通過する流体流路の物に対するトラップ堰をバイパスする流体流路の流体抵抗の比は少なくとも０．４である。幾つかの場合には、上で指摘されている通り、少なくとも１つの寸法の狭窄部は、サイズがトラップされるべき細胞又は物体の最も小さい寸法の約１０％から約９０％の範囲であり得る。少なくとも１つの寸法の狭窄部が、サイズがトラップされるべき細胞又は物体の最も小さい寸法の約１０％から約９０％の範囲である此れ等の場合の何れかでは、トラップ堰を通過する流体流路の物に対するトラップ堰をバイパスする流体流路の抵抗（ＲＡ／ＲＴ）は約０．４から約２．０の範囲であり得る。本開示に包含される狭窄部寸法（トラップされるべき細胞又は物体の最も小さい寸法のパーセンテージに換算して定められる）及び抵抗比（ＲＡ／ＲＴ）の組み合わせの限定しない例は、（１０％、０．５）、（１０％、０．６）、（１０％、０．７）、（１０％、０．８）、（１０％、０．９）、（１０％、１．０）、（１０％、１．１）、（１０％、１．２）、（１０％、１．３）、（１０％、１．４）、（１０％、１．５）、（１０％、１．６）、（１０％、１．７）、（１０％、１．８）、（１０％、１．９）、（１０％、２．０）、（２０％、０．５）、（２０％、０．６）、（２０％、０．７）、（２０％、０．８）、（２０％、０．９）、（２０％、１．０）、（２０％、１．１）、（２０％、１．２）、（２０％、１．３）、（２０％、１．４）、（２０％、１．５）、（２０％、１．６）、（２０％、１．７）、（２０％、１．８）、（２０％、１．９）、（２０％、２．０）、（３０％、０．５）、（３０％、０．６）、（３０％、０．７）、（３０％、０．８）、（３０％、０．９）、（３０％、１．０）、（３０％、１．１）、（３０％、１．２）、（３０％、１．３）、（３０％、１．４）、（３０％、１．５）、（３０％、１．６）、（３０％、１．７）、（３０％、１．８）、（３０％、１．９）、（３０％、２．０）、（４０％、０．５）、（４０％、０．６）、（４０％、０．７）、（４０％、０．８）、（４０％、０．９）、（４０％、１．０）、（４０％、１．１）、（４０％、１．２）、（４０％、１．３）、（４０％、１．４）、（４０％、１．５）、（４０％、１．６）、（４０％、１．７）、（４０％、１．８）、（４０％、１．９）、（４０％、２．０）、（５０％、０．５）、（５０％、０．６）、（５０％、０．７）、（５０％、０．８）、（５０％、０．９）、（５０％、１．０）、（５０％、１．１）、（５０％、１．２）、（５０％、１．３）、（５０％、１．４）、（５０％、１．５）、（５０％、１．６）、（５０％、１．７）、（５０％、１．８）、（５０％、１．９）、（５０％、２．０）、（６０％、０．５）、（６０％、０．６）、（６０％、０．７）、（６０％、０．８）、（６０％、０．９）、（６０％、１．０）、（６０％、１．１）、（６０％、１．２）、（６０％、１．３）、（６０％、１．４）、（６０％、１．５）、（６０％、１．６）、（６０％、１．７）、（６０％、１．８）、（６０％、１．９）、（６０％、２．０）、（７０％、０．５）、（７０％、０．６）、（７０％、０．７）、（７０％、０．８）、（７０％、０．９）、（７０％、１．０）、（７０％、１．１）、（７０％、１．２）、（７０％、１．３）、（７０％、１．４）、（７０％、１．５）、（７０％、１．６）、（７０％、１．７）、（７０％、１．８）、（７０％、１．９）、（７０％、２．０）、（８０％、０．５）、（８０％、０．６）、（８０％、０．７）、（８０％、０．８）、（８０％、０．９）、（８０％、１．０）、（８０％、１．１）、（８０％、１．２）、（８０％、１．３）、（８０％、１．４）、（８０％、１．５）、（８０％、１．６）、（８０％、１．７）、（８０％、１．８）、（８０％、１．９）、（８０％、２．０）、（９０％、０．５）、（９０％、０．６）、（９０％、０．７）、（９０％、０．８）、（９０％、０．９）、（９０％、１．０）、（９０％、１．１）、（９０％、１．２）、（９０％、１．３）、（９０％、１．４）、（９０％、１．５）、（９０％、１．６）、（９０％、１．７）、（９０％、１．８）、（９０％、１．９）、及び（９０％、２．０）である。
【００６２】
幾つかの場合には、開示されるマイクロ流体デバイスは、ａ）少なくとも１つの流体注入口及び少なくとも１つの流体排出口の間に其れ等と流体連通して配設される複数のトラップ堰を含み得、各トラップ堰は、マイクロ流体デバイスを通過する流体中の懸濁物体を保持する様に構成され、ｉ）第１の接触時に懸濁された細胞又は物体を保持する個々のトラップ堰の捕捉確率は少なくとも０．０５であり、ｉｉ）トラップ堰を通過する流体流路の物に対するトラップ堰をバイパスする流体流路の流体抵抗の比は少なくとも０．４である。幾つかの場合には、上で指摘されている通り、捕捉確率は約０．０５から約０．９９の範囲であり得る。捕捉確率が約０．０５から約０．９９の範囲である幾つかの場合には、トラップ堰を通過する流体流路の物に対するトラップ堰をバイパスする流体流路の抵抗（ＲＡ／ＲＴ）は、約０．４から約２．０の範囲であり得る。一般的には、捕捉確率は抵抗比の関数であるので、捕捉確率及び抵抗比の幾つかの組み合わせは達成可能ではない。本開示に包含され得る捕捉確率及び抵抗比（ＲＡ／ＲＴ）の組み合わせの限定しない例は、（０．０５、０．４）、（０．０５、０．５）、（０．０５、０．６）、（０．０５、０．７）、（０．０５、０．８）、（０．０５、０．９）、（０．０５、１．０）、（０．０５、１．１）、（０．０５、１．２）、（０．０５、１．３）、（０．０５、１．４）、（０．０５、１．５）、（０．０５、１．６）、（０．０５、１．７）、（０．０５、１．８）、（０．０５、１．９）、（０．０５、２．０）、（０．１、０．４）、（０．１、０．５）、（０．１、０．６）、（０．１、０．７）、（０．１、０．８）、（０．１、０．９）、（０．１、１．０）、（０．１、１．１）、（０．１、１．２）、（０．１、１．３）、（０．１、１．４）、（０．１、１．５）、（０．１、１．６）、（０．１、１．７）、（０．１、１．８）、（０．１、１．９）、（０．１、２．０）、（０．２、０．４）、（０．２、０．５）、（０．２、０．６）、（０．２、０．７）、（０．２、０．８）、（０．２、０．９）、（０．２、１．０）、（０．２、１．１）、（０．２、１．２）、（０．２、１．３）、（０．２、１．４）、（０．２、１．５）、（０．２、１．６）、（０．２、１．７）、（０．２、１．８）、（０．２、１．９）、（０．２、２．０）、（０．３、０．４）、（０．３、０．５）、（０．３、０．６）、（０．３、０．７）、（０．３、０．８）、（０．３、０．９）、（０．３、１．０）、（０．３、１．１）、（０．３、１．２）、（０．３、１．３）、（０．３、１．４）、（０．３、１．５）、（０．３、１．６）、（０．３、１．７）、（０．３、１．８）、（０．３、１．９）、（０．３、２．０）、（０．４、０．４）、（０．４、０．５）、（０．４、０．６）、（０．４、０．７）、（０．４、０．８）、（０．４、０．９）、（０．４、１．０）、（０．４、１．１）、（０．４、１．２）、（０．４、１．３）、（０．４、１．４）、（０．４、１．５）、（０．４、１．６）、（０．４、１．７）、（０．４、１．８）、（０．４、１．９）、（０．４、２．０）、（０．５、０．４）、（０．５、０．５）、（０．５、０．６）、（０．５、０．７）、（０．５、０．８）、（０．５、０．９）、（０．５、１．０）、（０．５、１．１）、（０．５、１．２）、（０．５、１．３）、（０．５、１．４）、（０．５、１．５）、（０．５、１．６）、（０．５、１．７）、（０．５、１．８）、（０．５、１．９）、（０．５、２．０）、（０．６、０．４）、（０．６、０．５）、（０．６、０．６）、（０．６、０．７）、（０．６、０．８）、（０．６、０．９）、（０．６、１．０）、（０．６、１．１）、（０．６、１．２）、（０．６、１．３）、（０．６、１．４）、（０．６、１．５）、（０．６、１．６）、（０．６、１．７）、（０．６、１．８）、（０．６、１．９）、（０．６、２．０）、（０．７、０．４）、（０．７、０．５）、（０．７、０．６）、（０．７、０．７）、（０．７、０．８）、（０．７、０．９）、（０．７、１．０）、（０．７、１．１）、（０．７、１．２）、（０．７、１．３）、（０．７、１．４）、（０．７、１．５）、（０．７、１．６）、（０．７、１．７）、（０．７、１．８）、（０．７、１．９）、（０．７、２．０）、（０．８、０．４）、（０．８、０．５）、（０．８、０．６）、（０．８、０．７）、（０．８、０．８）、（０．８、０．９）、（０．８、１．０）、（０．８、１．１）、（０．８、１．２）、（０．８、１．３）、（０．８、１．４）、（０．８、１．５）、（０．８、１．６）、（０．８、１．７）、（０．８、１．８）、（０．８、１．９）、（０．８、２．０）、（０．９、０．４）、（０．９、０．５）、（０．９、０．６）、（０．９、０．７）、（０．９、０．８）、（０．９、０．９）、（０．９、１．０）、（０．９、１．１）、（０．９、１．２）、（０．９、１．３）、（０．９、１．４）、（０．９、１．５）、（０．９、１．６）、（０．９、１．７）、（０．９、１．８）、（０．９、１．９）、（０．９、２．０）、（０．９５、０．４）、（０．９５、０．５）、（０．９５、０．６）、（０．９５、０．７）、（０．９５、０．８）、（０．９５、０．９）、（０．９５、１．０）、（０．９５、１．１）、（０．９５、１．２）、（０．９５、１．３）、（０．９５、１．４）、（０．９５、１．５）、（０．９５、１．６）、（０．９５、１．７）、（０．９５、１．８）、（０．９５、１．９）、（０．９５、２．０）、（０．９９、０．４）、（０．９９、０．５）、（０．９９、０．６）、（０．９９、０．７）、（０．９９、０．８）、（０．９９、０．９）、（０．９９、１．０）、（０．９９、１．１）、（０．９９、１．２）、（０．９９、１．３）、（０．９９、１．４）、（０．９９、１．５）、（０．９９、１．６）、（０．９９、１．７）、（０．９９、１．８）、（０．９９、１．９）、及び（０．９９、２．０）である。
【００６３】
マイクロ流体デバイス作製：幾つかの実施形態では、本願に於いて開示されるマイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの別々に作製された部品（例えば、（ｉ）エッチング、エンボス加工、又はアブレーション加工された流体チャネルを組み込む基板、及び（ｉｉ）カバー又は蓋）を含み得、此れ等は爾後に一緒に機械的にクランプされるか、一時的に一緒に接着されるか、又は永久的に一緒に結合されるか何れかである。幾つかの実施形態では、本願に於いて開示されるマイクロ流体デバイスは、３つ以上の別々に作製された部品（例えば、（ｉ）基板、（ｉｉ）流体チャネル層、及び（ｉｉｉ）カバー又は蓋）を含み得、此れ等は爾後に一緒に機械的にクランプされるか、一時的に一緒に接着されるか、又は永久的に一緒に結合されるか何れかである。幾つかの実施形態では、本願に於いて開示されるマイクロ流体デバイスは取り外し可能なカバー又は蓋を含み得る。好適な作製技術の例は、従来のマシニング、ＣＮＣマシニング、射出成型、３Ｄ印刷、レーザー若しくはダイカット加工されたポリマーフィルムの１つ以上の層の整列及び積層、又は幾つもの微細加工技術の何れか、例えばフォトリソグラフィー及びウェットケミカルエッチング、ドライエッチング、深堀り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）、又はレーザーマイクロマシニングを包含するが、此れ等に限定されない。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの全て又は或る部分はエラストマー材料から３Ｄ印刷され得る。
【００６４】
本願に於いて開示されるマイクロ流体デバイスは、当業者に公知の種々の材料の何れかを用いて作製され得る。一般的に、用いられる材料の選択肢は作製技術の選択肢に依存し、逆も又同様であろう。好適な材料の例は、シリコン、溶融シリカ、ガラス、種々のポリマーの何れか、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；エラストマー）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリイミド、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、エポキシ樹脂、ノンスティック材料、例えばテフロン（登録商標）（ＰＴＦＥ）、種々のフォトレジストの何れか、例えばＳＵ８若しくは何れかの他の厚膜フォトレジスト、又は此れ等の材料の何れかの組み合わせを包含するが、此れ等に限定されない。
【００６５】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの全て又は或る部分（例えば、カバー又は蓋）は光学的に透明な材料から作製されて、デバイス内にトラップされた細胞又は物体の観察及びモニタリングを容易化し得る。幾つかの実施形態では、複数の層を含むマイクロ流体デバイスの異なる層は異なる材料から作製され得る。例えば、流体チャネル層がエラストマー材料から作製され得、デバイス基板及びカバープレートはガラス又は別の好適な材料から作製され得る。
【００６６】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、基板と複数のトラップ堰を含む流体チャネル層とカバープレートとを包含する３層構造を含み得、此れに依って、マイクロ流体チャンバー（即ち、トラップの内側領域）の体積はチャンバーの断面積及び流体チャネル層の厚さに依って決まる。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは合計で２つの層、３つの層、４つの層、５つの層、又は５つよりも多くの層を含み得る。
【００６７】
上で指示されている通り、幾つかの実施形態では、流体チャネル層の厚さは、デバイス内の流体チャネル及びマイクロ流体チャンバー（例えば、「マイクロチャンバー」、「トラップチャンバー」、又はトラップの内側領域）の深さを決め、其れ故にトラップチャンバーの体積に影響するであろう。幾つかの実施形態では、例えば、流体チャネル及びトラップフィーチャが基板にエッチング、エンボス加工、又はアブレーション加工される所では、デバイス内の流体チャネル及びトラップチャンバーの深さはエッチング深さ、エンボス加工深さ、又はアブレーション加工深さに依って決まり、其れ故にトラップチャンバーの体積に影響するであろう。幾つかの実施形態では、例えば、流体チャネル及びトラップフィーチャが基板にエッチング、エンボス加工、又はアブレーション加工される所では、流体チャネル及びトラップチャンバーは同じ深さ又は異なる深さを有し得る。
【００６８】
一般的に、開示されるデバイス内の流体チャネル及び／又はトラップチャンバーの深さは約１μｍ及び約１ｍｍからの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、流体チャネル及び／又はトラップチャンバーの深さは少なくとも１μｍ、少なくとも５μｍ、少なくとも１０μｍ、少なくとも２０μｍ、少なくとも３０μｍ、少なくとも４０μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍ、少なくとも５００μｍ、少なくとも６００μｍ、少なくとも７００μｍ、少なくとも８００μｍ、少なくとも９００μｍ、又は少なくとも１ｍｍであり得る。幾つかの実施形態では、流体チャネル及び／又はトラップチャンバーの深さは多くても１ｍｍ、多くても９００μｍ、多くても８００μｍ、多くても７００μｍ、多くても６００μｍ、多くても５００μｍ、多くても４００μｍ、多くても３００μｍ、多くても２００μｍ、多くても１００μｍ、多くても５０μｍ、多くても４０μｍ、多くても３０μｍ、多くても２０μｍ、多くても１０μｍ、多くても５μｍ、又は多くても１μｍであり得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、流体チャネル及び／又はトラップチャンバーの深さは約５０μｍから約１００μｍの範囲であり得る。流体チャネル及び／又はトラップチャンバーの深さが、此の範囲内の何れかの値、例えば約９５μｍを有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００６９】
一般的に、開示されるデバイス設計の流体チャネル及びマイクロ流体チャンバーの寸法は、（ｉ）デバイスを通過する流体中の懸濁された細胞又は他の物体の一様且つ効率的な送達及びトラップを提供する様に且つ（ｉｉ）細胞サンプル及び／又はアッセイ試薬消費を最小化する様に最適化されるであろう。一般的に、流体チャネル又はマイクロ流体チャンバーの幅は約１０μｍ及び約２ｍｍの間であり得る。幾つかの実施形態では、流体チャネル又はマイクロ流体チャンバーの幅は少なくとも１０μｍ、少なくとも２５μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍ、少なくとも５００μｍ、少なくとも７５０μｍ、少なくとも１ｍｍ、少なくとも１．５ｍｍ、又は少なくとも２ｍｍであり得る。他の実施形態では、流体チャネル又はマイクロ流体チャンバーの幅は多くても２ｍｍ、多くても１．５ｍｍ、多くても１ｍｍ、多くても７５０μｍ、多くても５００μｍ、多くても４００μｍ、多くても３００μｍ、多くても２００μｍ、多くても１００μｍ、多くても５０μｍ、多くても２５μｍ、又は多くても１０μｍであり得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、流体チャネルの幅は約１００μｍから約１ｍｍの範囲であり得る。流体チャネルの幅が、此の範囲内の何れかの値、例えば約８０μｍを有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００７０】
一般的に、開示されるデバイスに用いられるマイクロ流体チャンバー（例えば、トラップチャンバー）の体積は約１，０００μｍ３から約１ｍｍ３の範囲であり得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体チャンバー体積は少なくとも１，０００μｍ３、少なくとも１０，０００μｍ３、少なくとも１００，０００μｍ３、少なくとも１，０００，０００μｍ３、少なくとも０．２ｍｍ３、少なくとも０．５ｍｍ３、又は少なくとも１ｍｍ３であり得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体チャンバー体積は多くても１ｍｍ３、多くても０．５ｍｍ３、多くても０．２ｍｍ３、多くても１，０００，０００μｍ３、多くても１００，０００μｍ３、多くても１０，０００μｍ３、又は多くても１，０００μｍ３である。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、マイクロ流体チャンバー体積は約１００，０００μｍ３から約０．２ｍｍ３の範囲であり得る。チャンバー体積が、此の範囲内の何れかの値、例えば約８，０００μｍ３を有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００７１】
幾つかの実施形態では、本開示のデバイス内に含有される複数のトラップ及び／又はチャンバーのトラップ堰及び／又はマイクロ流体チャンバーの数は、約１から約１０６、又はより多くの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、デバイス内のトラップ及び／又はチャンバーの数は少なくとも１、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０４、少なくとも１０５、又は少なくとも１０６であり得る。幾つかの実施形態では、デバイス内のトラップ及び／又はチャンバーの数は多くても１０６、多くても１０５、多くても１０４、多くても１，０００、多くても１００、又は多くても１であり得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、デバイス内のトラップ及び／又はチャンバーの数は約１００から約１０，０００の範囲であり得る。デバイス内のトラップ及び／又はチャンバーの数が、此の範囲内の何れかの値、例えば約１，２００を有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００７２】
幾つかの実施形態では、トラップ堰間のピッチ（又は間隔）は約１００μｍから約１，０００μｍ、又はより多くの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、トラップ堰間のピッチは少なくとも１００μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍ、少なくとも５００μｍ、少なくとも６００μｍ、少なくとも７００μｍ、少なくとも８００μｍ、少なくとも９００μｍ、又は少なくとも１，０００μｍであり得る。幾つかの実施形態では、トラップ堰間のピッチは多くても１，０００μｍ、多くても９００μｍ、多くても８００μｍ、多くても７００μｍ、多くても６００μｍ、多くても５００μｍ、多くても４００μｍ、多くても３００μｍ、多くても２００μｍ、又は多くても１００μｍであり得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、トラップ堰間のピッチは約２００μｍから約４００μｍの範囲であり得る。トラップ堰間のピッチが、此の範囲内の何れかの値、例えば約２２０μｍを有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００７３】
別々の部品のセットとして作製される場合には、開示されるマイクロ流体デバイスは、例えば適当な固定具及び留め具を用いて２つ以上の部品を一緒にクランプする事に依って（ガスケットの使用あり若しくはなし）機械的に組み立てられ得るか、或いは、部品は、当業者に公知の種々の技術の何れか（用いられる材料の選択肢に依存する）を用いて、例えば陽極接合、熱接合、又はエポキシ系、アクリル系、シリコーン系、ＵＶ硬化性、ポリウレタン系、若しくはシアノアクリレート系接着剤を包含する種々の接着剤又は接着フィルムの何れかの使用に依って一緒に組み立てられ、結合され得る。
【００７４】
ポンプ又はバルブを含むマイクロ流体デバイス：多くの実施形態では、開示されるマイクロ流体デバイスは、デバイスの流体流れをコントロールする為の外部のポンプと共に用いられ得る。幾つかの実施形態では、開示されるマイクロ流体デバイスは、アクティブな流体コンポーネント、例えばポンプ（例えばマイクロポンプ）又はバルブ（例えばマイクロバルブ）を更に含んで、流体流れの追加のコントロールを提供して、例えば、特定の流体区画への流体送達のアドレス可能なコントロールを可能化し及び／又は特定の流体区画内の細胞、ビーズ、若しくは他の物体の単離を可能化し得る。幾つかの実施形態では、１つ以上のマイクロポンプ又はマイクロバルブがマイクロ流体デバイス其れ自体の内に作製されるか、又は其れと直接的に一体化させられ得る（例えば、マイクロ流体デバイスが、プレパッキングされたアッセイ緩衝液、アッセイ試薬、磁気ビーズにコンジュゲーションされた捕捉抗体又は捕捉プローブ、及び同類、又はデバイスの操作に用いられる他の流体をも又含む実施形態）。幾つかの実施形態では、上で指摘されている通り、１つ以上の従来のポンプ又はバルブが、デバイスの外部に、例えばマイクロ流体デバイスが接続する装置モジュールに包含されるコンポーネントとして在り、適当な配管を介してデバイスに接続され得る。本開示のデバイスへの使用に好適なマイクロポンプ（又は流体アクチュエーションメカニズム）の例は、電気機械的に若しくは空圧的にアクチュエーションされるミニチュアシリンジ若しくはプランジャーメカニズム、空圧的に若しくは外部のピストンに依ってアクチュエーションされる膜ダイアフラムポンプ、空圧的にアクチュエーションされる試薬及び緩衝液パウチ若しくはブラッダー、又は電気浸透流ポンプを包含するが、此れ等に限定されない。本開示のデバイスへの使用に好適なマイクロバルブの例は、変形可能な膜又はチューブ及び空圧的、磁気的、電磁気的、又は電気機械的（ソレノイド）アクチュエーションを用いて構築されたピンチバルブ、変形可能な膜フラップを用いて構築されたワンウェイバルブ、ミニチュアチェックバルブ、及びゲートバルブ、融解若しくは溶解し得るワックス若しくはポリマープラグ又は穿刺され得るポリマー膜を用いて作製されたワンショット「バルブ」、及び同類を包含するが、此れ等に限定されない。開示されるマイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態では、デバイス内の複数のマイクロチャンバーの各マイクロチャンバーは各マイクロチャンバーの注入口（単数又は複数）及び／又は排出口（単数又は複数）に位置した１つ以上のマイクロバルブに依って個々にアドレス可能且つ単離可能であり、其れに依って、個々のマイクロチャンバーがアドレス可能な様式で可逆的にシールされる事を許すであろう。幾つかの実施形態では、複数のマイクロチャンバーの１つ以上のサブセットが、１つ以上のサブセットの為の共通の注入口（単数又は複数）及び／又は排出口（単数又は複数）に位置した１つ以上のマイクロバルブに依って、群としてアドレス可能且つ単離可能であろう。幾つかの実施形態では、デバイスの注入口及び排出口又は其の中の流体チャネルは、流体流れの方向性をコントロールする為の一体化されたチェックバルブを包含し得る。
【００７５】
センサーを含むマイクロ流体デバイス：幾つかの実施形態では、本開示のマイクロ流体デバイス、又は其の中に含有される複数のチャンバーの１つ以上の個々のチャンバーは、デバイス内の細胞又は他の物体の微小環境を制御する事及び細胞生存能を維持する事への使用の為の１つ以上の追加のコンポーネントを更に含み得る。例は、加熱素子、冷却素子、温度センサー、ｐＨセンサー、ガスセンサー（例えば、Ｏ２センサー、ＣＯ２センサー）、電極等、又は其れ等の何れかの組み合わせを包含するが、此れ等に限定されない。幾つかの実施形態では、本開示のマイクロ流体デバイスは、追加のコンポーネント又はフィーチャ、例えば、顕微鏡観察、顕微鏡イメージング、及び／又は分光モニタリング技術を容易化する為の透明な光学窓、灌流システムへの接続を為す為の注入口及び排出口ポート、電極又はセンサーを外部のプロセッサ又は電源に接続する為の電気的接続等を更に含み得る。
【００７６】
マイクロ流体デバイス内の細胞及び／又はビーズの区画化：下でより詳細に論じられる単一細胞分析法の幾つかでは、一旦其れ等が開示されるデバイス内のトラップフィーチャのアレイに依ってトラップされると、細胞を区画化する事が望ましくあり得る。第１に比較的低い流体力学的圧力を用いて細胞、ビーズ、又は他の物体をデバイス内のトラップ堰の全て又は或る部分の入口狭窄部にトラップし、爾後に、より高い流体力学的圧力のパルスを用いて細胞、ビーズ、又は他の物体（但し、其れ等は少なくとも幾らか変形可能である）をトラップの入口狭窄部から内側領域（又はチャンバー）に押し込む為の方法が本願に於いて開示される。細胞、ビーズ、又は他の物体をトラップの入口狭窄部から押し込む為に要求される圧力の大きさは様々であり得、種々の実験パラメータに依存し、細胞の型、細胞の成長ステージ（即ち細胞周期ステージ）、ビーズの型（サイズ及び組成）、狭窄部の寸法、細胞トラップデバイスの流体レイアウト等を包含するが、此れ等に限定されない。此の方法に依る使用に好適なデバイスの例は図２（ａ）及び２（ｂ）、図４（ａ）及び４（ｂ）、並びに図６〜１０に示されている。幾つかの場合には、用いられるトラップ堰設計は、トラップの内側領域に於けるトラップされた細胞又は物体の封じ込めを容易化する為のフリットをトラップの出口領域に含み得、フリット構造は、トラップされた細胞又は物体の最も小さい寸法よりも小さい空間寸法を有する１つ以上の狭窄部を含む。
【００７７】
開示される方法の幾つかの実施形態では、第１の流体力学的圧力（又はトラップ圧力）は約１ｍｂａｒから約２００ｍｂａｒの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、第１の流体力学的圧力（又はトラップ圧力）は、少なくとも１ｍｂａｒ、少なくとも５ｍｂａｒ、少なくとも１０ｍｂａｒ、少なくとも２０ｍｂａｒ、少なくとも３０ｍｂａｒ、少なくとも４０ｍｂａｒ、少なくとも５０ｍｂａｒ、少なくとも６０ｍｂａｒ、少なくとも７０ｍｂａｒ、少なくとも８０ｍｂａｒ、少なくとも９０ｍｂａｒ、少なくとも１００ｍｂａｒ、少なくとも１５０ｍｂａｒ、又は少なくとも２００ｍｂａｒであり得る。幾つかの実施形態では、第１の流体力学的圧力（又はトラップ圧力）は多くても２００ｍｂａｒ、多くても１５０ｍｂａｒ、多くても１００ｍｂａｒ、多くても９０ｍｂａｒ、多くても８０ｍｂａｒ、多くても７０ｍｂａｒ、多くても６０ｍｂａｒ、多くても５０ｍｂａｒ、多くても４０ｍｂａｒ、多くても３０ｍｂａｒ、多くても２０ｍｂａｒ、多くても１０ｍｂａｒ、多くても５ｍｂａｒ、又は多くても１ｍｂａｒであり得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、幾つかの実施形態では、第１の流体力学的圧力は約１０ｍｂａｒから約８０ｍｂａｒの範囲であり得る。第１の流体力学的圧力が、此の範囲内の何れかの値、例えば約９２ｍｂａｒを有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００７８】
開示される方法の幾つかの実施形態では、第２の流体力学的圧力（又は区画化圧力）は約５０ｍｂａｒから約１，０００ｍｂａｒの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、第２の流体力学的圧力（又は区画化圧力）は少なくとも５０ｍｂａｒ、少なくとも１００ｍｂａｒ、少なくとも２００ｍｂａｒ、少なくとも３００ｍｂａｒ、少なくとも４００ｍｂａｒ、少なくとも５００ｍｂａｒ、少なくとも６００ｍｂａｒ、少なくとも７００ｍｂａｒ、少なくとも８００ｍｂａｒ、少なくとも９００ｍｂａｒ、又は少なくとも１，０００ｍｂａｒであり得る。幾つかの実施形態では、第２の流体力学的圧力（又は区画化圧力）は多くても１，０００ｍｂａｒ、多くても９００ｍｂａｒ、多くても８００ｍｂａｒ、多くても７００ｍｂａｒ、多くても６００ｍｂａｒ、多くても５００ｍｂａｒ、多くても４００ｍｂａｒ、多くても３００ｍｂａｒ、多くても２００ｍｂａｒ、多くても１００ｍｂａｒ、又は多くても５０ｍｂａｒであり得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、幾つかの実施形態では、第２の流体力学的圧力は約２００ｍｂａｒから約８００ｍｂａｒの範囲であり得る。第１の流体力学的圧力が、此の範囲内の何れかの値、例えば約８６０ｍｂａｒを有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００７９】
開示される方法の幾つかの実施形態では、第１の流体力学的圧力（又はトラップ圧力）に対する第２の流体力学的圧力（又は区画化圧力）の比は約５×から約２０×の範囲であり得る。幾つかの実施形態では、第１の流体力学的圧力に対する第２の比は少なくとも５×、少なくとも１０×、少なくとも１２×、少なくとも１４×、少なくとも１６×、少なくとも１８×、又は少なくとも２０×であり得る。幾つかの実施形態では、第１の流体力学的圧力に対する第２の比は多くても２０×、多くても１８×、多くても１６×、多くても１４×、多くても１２×、多くても１０×、又は多くても５×であり得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、幾つかの実施形態では、第１の流体力学的圧力に対する第２の比は約１２×から約１６×の範囲であり得る。第１の流体力学的圧力に対する第２の比が、此の範囲内の何れかの値、例えば約１３．５×を有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００８０】
幾つかの実施形態では、細胞、ビーズ、又は他の物体をトラップ及び区画化する為の開示される方法は、少なくとも１回、２回、３回、４回、又はより多く反復され得、其れに依って、２つ以上の細胞、ビーズ、又は物体が１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）に閉じ込められる事を許す。幾つかの場合には、低圧力トラップ及び高圧力区画化ステップは、第１回に用いられた物と同じ細胞、ビーズ、又は他の物体を含む流体を用いて少なくとも１回反復される。幾つかの場合には、低圧力トラップ及び高圧力区画化ステップは、第１回に用いられた物とは異なる細胞、ビーズ、又は他の物体を含む流体を用いて少なくとも１回反復され、其の結果、１つ以上のトラップ堰の内側領域（単数又は複数）に閉じ込められた少なくとも２つの物体は、少なくとも２つの同じ細胞、少なくとも２つの異なる細胞、少なくとも２つの同じビーズ、少なくとも２つの異なるビーズ、若しくは少なくとも１つの細胞及び１つのビーズ、又は細胞、ビーズ、若しくは他の物体の何れかの他の組み合わせを含む。
【００８１】
マイクロ流体デバイス内で細胞を培養する：幾つかの実施形態では、開示される方法、デバイス、及びシステムは、一旦其れ等がデバイス内のトラップ堰の全て又は或る部分に於いてトラップ及び区画化されると、単一細胞（又は細胞の群）を培養する為に用いられ得る。例えば、トラップ及び区画化ステップ後に、マイクロ流体デバイスの注入口は灌流システムに接続され得、此れが連続的に又は周期的に区画化された細胞に成長培地の供給を供給し、定められた温度は、一体化された又は外部の加熱／冷却メカニズムを用いて維持され、温度、ｐＨ、Ｏ２濃度、ＣＯ２濃度等が一体化された又は外部のセンサーを用いてモニタリングされ得る。
【００８２】
幾つかの場合には、トラップ及び区画化された細胞は、開示されるデバイス内に於いて、１日から数ヶ月の範囲である時間の期間に渡って培養され得る。幾つかの場合には、デバイス内の細胞は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週、少なくとも２週、少なくとも３週、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、又は少なくとも６ヶ月に渡って培養され得る。幾つかの場合には、デバイス内の細胞は、多くても６ヶ月、多くても５ヶ月、多くても４ヶ月、多くても３ヶ月、多くても２ヶ月、多くても１ヶ月、多くても３週、多くても２週、多くても１週、多くても６日、多くても５日、多くても４日、多くても３日、多くても２日、又は多くても１日に渡って培養され得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、幾つかの実施形態では、デバイス内の細胞は、１週から１ヶ月の範囲である時間の期間に渡って培養され得る。細胞がデバイスに依って、此の範囲内の何れかの値を有する時間の期間、例えば約２．５週に渡って培養され得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【００８３】
マイクロ流体デバイス内の細胞及び／又はビーズの単離：下でより詳細に論じられる単一細胞分析法の幾つかでは、一旦其れ等が開示されるデバイス内のトラップフィーチャのアレイに依ってトラップされると、細胞を区画化し及び単離する事両方が望ましくあり得る。其れ故に、一旦其れ等がデバイス内のトラップ堰の全て又は或る部分の入口領域又は内側領域に於いてトラップ、区画化、及び／又は培養されると、個々の細胞、ビーズ、若しくは他の物体、又は其れ等の組み合わせを単離する為の方法も又本願に於いて開示される。例えば、幾つかの場合には、トラップ堰（又は其れ等の内側領域）は、単離された細胞のリシス時に放出されたコンポーネントの拡散又は混合を防止する為に、非混和性の流体をデバイスに流す事に依ってシールされ得る。幾つかの場合には、非混和性の流体は油を含み得る。幾つかの場合には、非混和性の流体は空気を含み得る。
【００８４】
非混和性の流体の使用：流体を今にマイクロ流体チャネルから押し込む為に要求される圧力がチャネルの最も小さい寸法に依って支配されると言う事実が原因で、油等の非混和性の流体を用いるトラップ及び／又は区画化された細胞の単離が可能化される。より小さい寸法は流体流れを誘導する為により高い圧力を要求する。更に其の上、開示されるデバイス内のマイクロ流体チャネルは典型的には親水性であるので、もっとより大きい外部圧力が疎水性の油をチャネルに押し込む為に要求される。油は、外部圧力が毛細管圧力を克服する為に要求される臨界値を超える時に流れるであろう。
Ｐｅｘｔ＝γ（ｗ−１＋ｈ−１）
式中、γは油／水界面の表面張力であり、ｗ及びｈは流体チャネルの幅及び高さである。油／水界面についてγ〜５０ｍＪ／ｍ２、且つバイパスチャネルの幅及び高さが夫々２５μｍ及び２０μｍの寸法を有すると仮定すると、バイパスチャネルの流れを誘導する為に要求される臨界圧力は約４．５ｋＰａ（４５ｍｂａｒ）である。逆に、流体トラップの５μｍ狭窄部を通る流れを誘導する為の臨界圧力は約１２．５ｋＰａ（１２５ｍｂａｒ）である。此れは、油に依ってマイクロウェルをシールする為の最適圧力が、図６に示されている物に類似のデバイスでは５〜１０ｋＰａ（５０〜１００ｍｂａｒ）の範囲であると言う事を指示している。空気シールはより高い差圧さえも用い得る。其れ故に、人は、油又は空気等の非混和性の流体がトラップ堰ではなくバイパスチャネルを流れるであろうデバイス設計依存的な圧力の範囲を同定し得る。此のプロセスは、デバイス内のトラップされた区画化された各細胞又は細胞群が油又は空気界面に依って囲まれた水滴中にシールされる事を許す。
【００８５】
マイクロ流体デバイスの流体力学的抵抗をチューニングして、トラップフィーチャを通る親水性の流体の高い流量を達成し、其れに依って、細胞又は他の物体が高い効率でマイクロ流体狭窄部にトラップされる事を許し乍ら、疎水性流体の流れを防止し、其れに依って、混合及びコンタミネーションを防止し且つ例えば単一細胞ｃＤＮＡライブラリーの超並列調製の為の効率的な技術を可能化する媒体に依ってトラップされた細胞が単離される事を許す能力は、本開示の新規の特徴を構成する。本願に於いて開示される高トラップ効率デバイス並びに細胞単離及びバーコード化方法（後者は下で論じられる）の組み合わせは、ランダムなポアソン統計、例えばマイクロウェルへの沈降又は油に依って囲まれた水滴への封入に依拠する単一細胞分析技術について、不良な細胞トラップ効率の問題を克服する。本開示の方法及びデバイスは、フローサイトメーターを用いる細胞ソーティングに基づく既存の低スループットテクノロジー、又は既存のマイクロ流体に基づく単一細胞トラップ及びバーコード化アプローチ、例えば、流体相中に分散されたバーコードを各細胞トラップに送達する為にポンプ及びバルブを用いるフリューダイム（Fluidigm）コーポレーション（サウスサンフランシスコ，ＣＡ）に依って製造されるシステムの問題をも又克服する。
【００８６】
ハイドロゲルの使用：一旦其れ等がデバイス内のトラップ堰の全て又は或る部分の入口領域又は内側領域に於いてトラップ、区画化、及び／又は培養されると、個々の細胞、ビーズ、若しくは他の物体、又は其れ等の組み合わせを単離する為の本願に於いて開示される別の方法は、半透性の生体適合性のハイドロゲルの使用を含む。幾つかの場合には、開示されるマイクロ流体デバイスは取り外し可能な蓋を含み得、此れはデバイスの流体チャネル層に機械的にクランプ又は別様に接着される（即ち、細胞又は他の物体をデバイス内のトラップ堰のアレイに導入する為に要求される程程の流体力学的圧力に耐える様に、十分な力で）。開示されるデバイス内のトラップ又は区画化された細胞、ビーズ、又は他の物体は、半透性のハイドロゲル中にシールされ得、例えば、爾後に重合して流体層をハイドロゲルへと変換する架橋性の溶液をデバイスに流す事に依る。此れの後には、マイクロ流体デバイス蓋が取り外されて、トラップされた細胞、ビーズ、又は他の物体へのアクセスを許し得る。用いられ得るゲルの例は、ポリエチレングリコールゲル、ヒアルロン酸ゲル、ゼラチンメタクリレート、ＵＶ硬化性ゲル、チオール架橋性のゲル、アルギン酸ゲル、アガロースゲル等を包含するが、此れ等に限定されない。
【００８７】
此のアプローチの有意な利点は、ハイドロゲルの半透性の性質を活用する能力である。此れは、小分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ短鎖、リシス化学物質、酵素、及び他の逆転写試薬）の速い拡散を許し乍ら、長いＤＮＡ又はＲＮＡ分子、ウイルス粒子、大きい蛋白質、抗体、又は他の大きい高分子の拡散は妨げる。此の特徴は、例えば細胞ライセートが下でより詳細に論じられる通り爾後のＤＮＡバーコード化ステップの間にハイドロゲル中にトラップされた儘に留まる事を許し、其れに依って細胞コンポーネントが固有の分子識別子と関連する事を許し、此れは爾後の核酸シーケンシング分析の間に特定の個々の細胞迄トレースされ得る。幾つかの場合には、デバイスの蓋を取り外し、ハイドロゲル中の固定化された細胞（又は他の物体）に直接的にアクセスする能力は、細胞がハイドロゲル中に導入及びシールされた後に、人がＤＮＡバーコード、細胞リシス緩衝液、及び／又は他の試薬（例えば、インクジェット印刷又はディップペン・ナノリソグラフィー技術を用いる）を特定の細胞に印刷する事を許す。
【００８８】
単一細胞及び細胞コンポーネントの分子バーコード化：単一細胞に由来する細胞コンポーネントの分子バーコード化の為に開示される高効率細胞トラップデバイスを用いる為の方法も又本願に於いて開示され、例えば、ファン（Fan）等著（２０１５年），「遺伝子発現サイトメトリーの為の単一細胞のコンビナトリアル標識（Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry）」，サイエンス（Science），第３４７巻（第６２２２号）：ｐ．１２５８３６７に依って記載されている方法論を用いる。油中に封入された水滴中のＤＮＡバーコードと併せて単一細胞ライセートを区画化する為の数個の既存のアプローチがある。此れ等は、殆どが、ポアソン統計に基づく細胞及びバーコード分子のランダムな分布に基づいており、細胞及びバーコードは油／水ドロップレット中にランダムに封入されるか（Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ及び其の変形として公知）、又は細胞及びバーコードはマイクロ流体鋳型上にランダムに堆積させられ、油中にシールされる（Ｓｅｑ−Ｗｅｌｌ及び其の変形として公知）。此れ等のアプローチのどちらも、何れの液滴（又はマイクロウェル）が何れのＤＮＡバーコードを含有するのかをアプリオリに決める事は出来ず、其れ故に、此れ等の技術は各細胞について画像に基づく表現型データをゲノムデータにリンクする事は出来ない。
【００８９】
ＤＮＡバーコードを既知の場所に意図的に置く他のプラットフォーム、例えば、アルミニウムプレートにマシニングされたマイクロウェルのアレイの底に固有のＤＮＡバーコードを堆積させるウェーハジェン（WaferGen）（フリーモント，ＣＡ）プラットフォーム、又、９６又は３８４ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルの底に固有のＤＮＡバーコードを堆積させ、其れから単一細胞を各ウェルにソーティングするベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）Ｒｅｓｏｌｖｅ（商標）プラットフォームがある。最後に、上で指摘されている通り、フリューダイム（Fluidigm）プラットフォームは空圧ポンプを用いて流体分散液中のＤＮＡバーコードを各マイクロ流体トラップに送達する。然し乍ら、此れ等のシステムは、ポアソンに基づくアプローチのトラップされた細胞密度、又は本開示の方法及びデバイスの物を達成する事が出来ない。
【００９０】
上に記載されている新規のマイクロ流体デバイス内に単一細胞のアレイを編成する為の方法が本願に於いて開示され、此れは、（１）トラップフィーチャ及び相互接続するバイパスチャネルのアレイを含むマイクロ流体デバイスに水系懸濁液中の細胞を流し、其れに依って単一細胞がアレイ内にトラップされる事を許す事と、（２）流体をリシス緩衝液及び他の生化学試薬に依って置き換える事と、（３）油又は空気等の非混和性の流体をマイクロ流体デバイスに流す事に依ってトラップされた細胞又は細胞ライセートを単離する事と、（４）其れ等が従来若しくは次世代シーケンシング技術又は其れ等の何れかの組み合わせを用いてプール及び分析された後に其れ等がトレースされる事を許す固有の分子バーコードに、細胞ライセートコンポーネントを取り付ける事とを含み得る。下でより詳細に論じられる通り、当業者に公知の種々の細胞リシス技術の何れかが用いられ得る。
【００９１】
幾つかの場合には、固有の分子バーコードはパターニングされたＤＮＡバーコードを含み、此れ等は、トラップされた細胞の画像に基づく表現型解析と、其れから、単一細胞ライセートのｍＲＮＡを各トラップのＤＮＡバーコードに添付されるｃＤＮＡに変換する事に依る各トラップされた細胞の分子的な転写物に基づくジェノタイピングとを両方許すであろう。
【００９２】
幾つかの場合には、デバイスの組み立てに先行し、細胞トラップへの其の使用に先行して、固有の分子バーコードの複数コピーがデバイスの各トラップ堰内に其の場合成され得る（例えば光制御型合成技術、例えば、フォーダー（Fodor）等著（１９９１年），「光制御型の空間的にアドレス可能な並列化学合成（Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis）」，サイエンス（Science），第２５１巻（第４９９５号）：ｐ．７６７−７７３又はマクガル（McGall）等著（１９９６年），「半導体フォトレジストを用いる高密度オリゴヌクレオチドアレイの光制御型合成（Light-directed synthesis of high-density oligonucleotide arrays using semiconductor photoresists）」，米国科学アカデミー紀要，第９３巻（第２４号）：ｐ．１３５５５−１３５６０に依って記載されている物を用いる）。幾つかの場合には、各トラップ堰内で合成される固有の分子バーコード、例えばオリゴヌクレオチドバーコードは、当業者に公知の種々の光切断性の又は化学的に切断可能なリンカーの何れかを用いて、トラップ堰内の表面（例えば、トラップ堰の内側領域の基板表面）に共有結合的にテザリングされ得る。
【００９３】
幾つかの場合には、デバイスの組み立てに先行し、細胞トラップへの其の使用に先行して、固有の分子バーコードの複数コピーがデバイスの各トラップ堰に印刷され得る（例えば、インクジェット印刷又はディップペン・ナノリソグラフィー技術を用いる）。幾つかの場合には、各トラップ堰に印刷される固有の分子バーコード（例えば、オリゴヌクレオチドバーコード）は、トラップ堰内の表面に非特異的に吸着させられ得るか、又は当業者に公知の種々の光切断性の又は化学的に切断可能なリンカーの何れかを用いてトラップ堰の表面に共有結合的にテザリングされ得るか何れかである。
【００９４】
開示される方法は、細胞を導入する事に先行して、ＤＮＡバーコードを直接的にマイクロ流体デバイス内に印刷又は合成する為の方法と、細胞がハイドロゲル中に導入及びシールされた後にＤＮＡバーコード、細胞リシス緩衝液、及び／又は他の試薬を特定の細胞に印刷する為の方法とを包含する。第１の技術（細胞編成に先行してバーコードを印刷する）の利点は、各細胞が既に正しい場所に位置した固有のバーコードを有するであろうと言う事である。第２の技術（細胞編成後にバーコードを印刷する）の利点は、例えばハイコンテント画像に基づくアッセイの使用に依って同定され得る興味深い細胞表現型を見せる細胞にＤＮＡバーコード化を限定する事が可能であると言う事である。
【００９５】
幾つかの場合には、固有の分子バーコードの複数コピーがビーズのライブラリー中の各ビーズにテザリングされ得る。ビーズは、例えば細胞あたり１つのビーズで、開示されるデバイス内に於いて細胞と共にトラップ及び区画化され得る。其の結果、リシス時に、細胞ライセートの各コンポーネントは、下流のシーケンシング分析後に起源の細胞を同定する分子バーコードに依ってタグ付けされ得る。幾つかの場合には、ビーズは磁気ビーズであり得る。
【００９６】
幾つかの場合には、分子バーコードは、例えばｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）尾部に対するハイブリダイゼーションに依って、特異的な分子コンポーネントにハイブリダイゼーション又は結合する標的認識配列又は素子を含み得る。幾つかの場合には、バーコードは、抗原又は他の分子コンポーネントに特異的に結合する抗体又は他の分子認識素子にコンジュゲーションされたオリゴヌクレオチドバーコードを含み得る。
【００９７】
幾つかの場合には、個々の細胞のアイデンティティをコードする固有の分子バーコード（各細胞が固有のバーコードとペアリングされる事を保証する為に、〜１０６又はより多大なオーダーのバーコードライブラリーの総多様性）は、〜１０５又はより多大なオーダーの多様性を含む分子計数機領域をもまた含み得る。其の結果、細胞内の各個々のｍＲＮＡ分子（又は他のオリゴヌクレオチド標的分子、蛋白質標的等。分子バーコードの標的認識部分に依って定義される）は特異的に標識される様に成り、固有の分子計数機に基づいて計数され得る。例えば好適なリシス緩衝液をトラップチャンバーのアレイに導入する事に依って細胞リシスが行われた後に、放出されたｍＲＮＡ分子（又は他の標的分子）は分子バーコード（此れ等は、トラップチャンバー内のビーズ若しくは表面にテザリングされた儘に留まり得るか、又は此れ等は溶液中に放出されてい得る）にハイブリダイゼーションし（又は結合し）、爾後の逆転写、増幅、及び／又はシーケンシング反応が行われ得る。幾つかの場合には、分子バーコードはビーズにテザリングされた儘に留まり、此れ等は爾後にアレイから回収され、逆転写、増幅、及びシーケンシングの為にプールされる。単一細胞遺伝子発現プロファイリング研究では、各単一細胞に由来する全てのポリアデニル化転写物からの相補的なＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）が各単一のビーズの表面上に共有結合的にアーカイブされ、故に、何れかの選択された遺伝子が分析され得る。各細胞の遺伝子発現プロファイルは再構築され、此の時には、バーコード化された転写物が起源の細胞に割り当てられ、計数される。幾つかの実施形態では、例えばビーズの回収に先行して、逆転写反応が細胞トラップアレイのチャンバー内で行われ得る。幾つかの実施形態では、増幅反応（例えば、ＰＣＲ増幅若しくは等温増幅反応）及び／又はシーケンシング反応（例えば、合成反応に依るサイクリックシーケンシング）も又、細胞トラップアレイのチャンバー内で行われ得る。幾つかの実施形態では、複数のチャンバー又はビーズ内の各個々のチャンバー又はビーズは２つ以上の標的分子認識配列又は素子を含み得る。幾つかの実施形態では、２つ以上のビーズがアレイ中の各単一細胞と共に区画化され得、異なるビーズは、異なるオリゴヌクレオチド又は蛋白質標的分子（例えば、ｍＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、ゲノムＤＮＡの断片、特異的な受容体蛋白質又は酵素、及び同類）を対象とする異なる標的認識配列又は標的認識素子を含む。其れから、ビーズの回収が、各単一細胞に関連した異なる型の標的分子を計数する為の分子バーコードの下流処理を許すであろう。幾つかの実施形態では、１つ以上の分子検知ビーズ、例えばサイトカイン検知ビーズ、及び分子バーコード化ビーズが（同時に又は次々に）単一細胞と共に区画化されて、例えば、サイトカイン分泌パターン又は化学的刺激への暴露後のサイトカイン分泌パターンの変化をモニタリングし、次に、遺伝子発現プロファイルの変化を分泌パターンの変化と相関させる為の細胞のリシス及び放出されたｍＲＮＡ分子の分子バーコード化をし得る。
【００９８】
上に記載されている新規のマイクロ流体デバイス内に単一細胞のアレイを編成する為の方法も又本願に於いて開示され、此れは、（１）トラップフィーチャ及び相互接続するバイパスチャネルのアレイを含むマイクロ流体デバイスに水系懸濁液中の細胞を流し、其れに依って単一細胞がアレイ内にトラップされる事を許す事と、（２）流体層をハイドロゲルへと変換する架橋性の溶液をマイクロ流体デバイスに流す事に依って、アレイ内のトラップされた細胞を単離する事と、（３）マイクロ流体デバイスの蓋を取り外して、ハイドロゲルにトラップされた細胞（又は他の物体）のアレイへの直接的なアクセスを可能化する事と、（４）其れ等が従来若しくは次世代シーケンシング技術又は其れ等の何れかの組み合わせを用いてプール及び分析された後に其れ等がトレースされる事を許す固有のバーコードに、細胞ライセートを取り付ける事とを含み得る。此のアプローチは、人がハイドロゲルの生得の多孔性を活用してｍＲＮＡ転写物、長いＤＮＡ鎖、大きい蛋白質、ウイルス粒子等の様な大分子をトラップする事を許し乍ら、リシス試薬、酵素、ＤＮＡ短鎖（例えば、１００〜２００ｂｐよりも短い物）、及び分子生物学プロトコールに典型的に用いられる他の試薬を包含する小分子のゲル内への通過を許す。
【００９９】
上で指摘されている通り、一旦其れ等がトラップされると、種々の技術の何れかが細胞のリシスを行う為に用いられ得る。例は、熱、音響パワー、光学レーザーパルス、電場パルス、凍結融解サイクル、及び化学試薬の使用を包含するが、此れ等に限定されない。幾つかの場合には、細胞リシスは、トラップチャンバーの油若しくは空気シールに先行して水溶液中のリシス緩衝液を注入する事に依って又はリシス緩衝液を油シール媒体中に溶解する事に依って達成され得る。
【０１００】
我々は、デバイス内のトラップチャンバーが実験の終わりにアンシールされ得ると言う事をも又実証した。此れは、例えばビーズ又はバーコード化されたｃＤＮＡが細胞トラップデバイスから回収される事を許す。
【０１０１】
当業者に公知の種々の核酸シーケンシング方法及びプラットフォームの何れかが本願に於いて開示される分子バーコード化方法と共に用いられ得る。例は、ペアエンドシーケンシング、ナノポアシーケンシング、高スループットシーケンシング、ショットガンシーケンシング、ダイターミネーターシーケンシング、マルチプライマーＤＮＡシーケンシング、プライマーウォーキング、サンガージデオキシシーケンシング、マクサム・ギルバートシーケンシング、パイロシーケンシング、ｔＳＭＳシーケンシング、又は其れ等の何れかの組み合わせを包含するが、此れ等に限定されない。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、高スループットシーケンシング法、例えば、ロシュ（Roche）４５４、イルミナＳｏｌｅｘａ、ＡＢＩ−ＳＯＬｉＤ、ＩＯＮ−Ｔｏｒｒｅｎｔ、コンプリート・ゲノミクス（Complete Genomics）、パシフィック・バイオサイエンス（Pacific Bioscience）、ヘリコス（Helicos）等のプラットフォーム、又はＰｏｌｏｎａｔｏｒプラットフォームを用いるサイクリックアレイシーケンシングが利用され得る。幾つかの実施形態では、シーケンシングはイルミナＭｉＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ、又は他のシーケンシングプラットフォームの使用を含み得る。幾つかの実施形態では、シーケンシングは、オックスフォード・ナノポア（Oxford Nanopore）に依って商品化されているＭｉｎＩｏｎ又は関連シーケンシングデバイスの使用、ジェナプシス（Genapsys）からのＧｅｎｉｕｓシステムの使用、又はナノストリング（Nanostring）からのＨｙｂ＆Ｓｅｑ（商標）１分子ダイレクトデジタルシーケンシングテクノロジーを含み得る。幾つかの実施形態では、シーケンシングは、ナノストリング（Nanostring）から利用可能な物等のデジタル空間プロファイリング（ＤＳＰ）テクノロジーの使用を含み得る。
【０１０３】
イメージングに基づく表現型分析＆ゲノムデータとの相関：細胞及び他の物体のトラップの為の開示されるマイクロ流体デバイスは、細胞表現型的な形質の高解像度イメージングに基づく分析を容易化する様に設計されており、幾つかの場合には、此れは其れから上で論じられている通り得られたゲノムデータと相関させられ得る。
【０１０４】
開示されるマイクロ流体デバイス内のトラップされた細胞の表現型分析を行う際には、当業者に公知の種々のイメージング技術の何れかが使用され得る。例は、明視野イメージング、暗視野イメージング、蛍光イメージング、ルミネッセンスイメージング、化学発光イメージング、燐光イメージング、位相差イメージング、定量的位相差イメージング、共焦点顕微鏡法イメージング、超解像度顕微鏡法イメージング、又は時間分解蛍光イメージングを包含するが、此れ等に限定されない。幾つかの実施形態では、二波長励起及び発光（又は多波長励起又は発光）蛍光イメージングが行われ得る。幾つかの実施形態では、二光子蛍光イメージングが行われ得る。幾つかの実施形態では、コヒーレントラマンイメージングが行われ得る。
【０１０５】
幾つかの場合には、高スループット顕微鏡法イメージングシステムを用いて取得された一連の１つ以上の画像が前処理されて、例えば、画像コントラスト及び明るさを補正する、不均一な照明を補正する、光学収差（例えば、球面収差、色収差等）を補正する、ノイズを除去する、画像の夫々から物体（例えば、細胞又はサブセルラー構造）を同定する、画像の夫々をセグメント化して同定された物体を単離する、画像をタイルセグメント化してコンポジット画像を作る、フィーチャ抽出（例えば、観察可能な細胞表現型的な形質等の物体特性の同定及び／又は定量化）、又は其れ等の何れかの組み合わせを行い得る。幾つかの場合には、デバイス内の複数のチャンバーが単一の画像内でイメージングされ得る。幾つかの場合には、デバイス内の複数のチャンバーの全て又は或る部分の高解像度画像を作る為に、一連の画像は「タイル化」され得る。
【０１０６】
幾つかの場合には、自動又は半自動画像処理が利用されて、トラップチャンバー内の細胞又はビーズを同定及び計数し、トラップチャンバー内の細胞又はビーズをモニタリングして、細胞又はビーズの定められたサブセット、例えば、死細胞、生細胞、細胞のペア、活発に分裂している細胞、特定の細胞表面マーカーを見せる細胞、蛍光マーカーに依って標識された細胞内蛋白質、蛍光化学物質検知ビーズ等を同定し得る。開示される方法を実装する際に用いられ得る画像処理アルゴリズムの例は、キャニーエッジ検出法、キャニー・デリチェエッジ検出法、一階勾配エッジ検出法（例えばソーベルオペレータ）、２次微分エッジ検出法、位相一致（位相コヒーレンス）エッジ検出法、他の画像セグメント化アルゴリズム（例えば、強度閾値法、強度クラスタリング法、強度ヒストグラムに基づく方法等）、フィーチャ及びパターン認識アルゴリズム（例えば、任意の形状を検出する為の一般化ハフ変換、円形ハフ変換等）、並びに解析学アルゴリズム（例えば、フーリエ変換、高速フーリエ変換、ウェーブレット分析、自己相関等）、又は其れ等の何れかの組み合わせを包含するが、此れ等に限定されない。
【０１０７】
細胞表現型解析の為の機械学習に基づく画像処理：幾つかの好ましい実施形態では、機械学習に基づくアプローチが用いられて、個々の細胞の検出及び計数、細胞表現型的な形質の分析、及びゲノムデータとの相関の為に、開示される方法の全て又は或る部分を実装し得る。幾つかの場合には、画像処理への機械学習に基づくアプローチが用いられて、例えば、より大きい画像からマイクロ流体デバイスの個々のトラップチャンバーの画像を自動的に整列及びクロッピングする、各チャンバーの特定の行及び列アドレスを決める、各時点に於けるチャンバー内の各細胞を同定する、各細胞の蛍光シグネチャーを分析してレポーター遺伝子、蛋白質、若しくは他の分子的特徴の存在を決める、及び／又は其れから各チャンバー又はコロニー内の細胞数を（任意に、其れ等の分子的特徴のリストを併せて）プロットし得る。幾つかの場合には、機械学習に基づく画像処理が用いられて、分類基準の予め定められたセットに従って其れ等の表現型的な形質に基づいて細胞を分類し得る。幾つかの場合には、機械学習に基づく画像処理が用いられて、機械学習アルゴリズムに依って導出された分類基準のセットに従って其れ等の表現型的な形質に基づいて細胞を分類し得る。
【０１０８】
当業者に公知の種々の機械学習アルゴリズムの何れかは開示される方法への使用に好適であり得る。例は、教師あり学習アルゴリズム、教師なし学習アルゴリズム、半教師あり学習アルゴリズム、強化学習アルゴリズム、深層学習アルゴリズム、又は其れ等の何れかの組み合わせを包含するが、此れ等に限定されない。
【０１０９】
教師あり学習アルゴリズム：本開示の文脈では、教師あり学習アルゴリズムは、ラベル付き訓練データのセット（例えば、細胞表現型的な形質及び対応する既知の細胞分類型）の使用に依拠して、所与の細胞又は細胞サンプルの表現型的な形質のセットと細胞又は細胞サンプルの分類との間の関係性を推論するアルゴリズムである。訓練データはペアリングされた訓練例のセットを含む。例えば、各例は、従来の方法に従う所与の細胞の表現型的な形質データ及び齎される分類のセットを含む。
【０１１０】
教師なし学習アルゴリズム：本開示の文脈では、教師なし学習アルゴリズムは、ラベル付き細胞分類データとペアリングされていない細胞表現型的な形質のデータセットから成る訓練データセットから推論する為に用いられるアルゴリズムである。最も普通に用いられる教師なし学習アルゴリズムはクラスター分析であり、多くの場合に、此れはプロセスデータ中の隠れたパターン又はグループ分けを見出す為の探索的データ分析に用いられる。
【０１１１】
半教師あり学習アルゴリズム：本開示の文脈では、半教師あり学習アルゴリズムは、ラベル付き及びラベルなし細胞分類データ両方を訓練に用いるアルゴリズムである（典型的には、比較的小量のラベル付きデータを大量のラベルなしデータと共に用いる）。
【０１１２】
強化学習アルゴリズム：本開示の文脈では、強化学習アルゴリズムは、例えば、細胞分類報酬関数を最大化する様に取られるべき細胞表現型データ処理ステップのセットを決める為に用いられるアルゴリズムである。強化学習アルゴリズムはマルコフ決定過程（即ち、将来の挙動が過去の挙動単独からは正確に予測され得ず、寧ろランダムな偶然又は確率にも又依存する広い範囲の最適化問題を研究する為に用いられる数理モデル）を最適化する為に普通に用いられる。Ｑ学習は強化学習アルゴリズムの１つのクラスの例である。正しい訓練データインプット／アウトプットペアも提示されず、準最適行動も明示的には補正されないと言う点で、強化学習アルゴリズムは教師あり学習アルゴリズムとは異なる。此れ等のアルゴリズムは、アップデートされたインプットデータに基づく可能なアウトカムの探索と過去の訓練の活用との間のバランスを見出す事に依って、リアルタイム性を焦点にして実装される傾向がある。
【０１１３】
深層学習アルゴリズム：本開示の文脈では、深層学習アルゴリズムは、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）と呼ばれる人間の脳の構造及び機能に触発されたアルゴリズムであり、複数の隠れ層を含む特別に大きいニューラルネットワークであり、此れ等はインプットデータセット（例えば、細胞表現型的な形質のデータセット）をアウトプット（例えば細胞型）分類決定に対してマッピングする為に用いられる。人工ニューラルネットワークは下でより詳細に論じられる。
【０１１４】
人工ニューラルネットワーク＆深層学習アルゴリズム：１つの好ましい実施形態では、開示される方法に使用される機械学習アルゴリズムは人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）又は深層学習アルゴリズムであり得る。従来の画像処理アプローチに用いられる画像処理ステップの１つ以上は、１つ以上の人工ニューラルネットワーク又は深層学習アルゴリズムの使用に依って拡張されるか又は置き換えられ得る。人工ニューラルネットワークは、何れかの型のニューラルネットワークモデル、例えばフィードフォワードニューラルネットワーク、動径基底関数ネットワーク、リカレントニューラルネットワーク、又は畳み込みニューラルネットワーク、及び同類を含み得る。幾つかの実施形態では、開示される方法は訓練済みＡＮＮ又は深層学習アーキテクチャを使用し得る。幾つかの実施形態では、開示される方法はＡＮＮ又は深層学習アーキテクチャを使用し得、訓練データセットは、単一のローカルな細胞分析システム（即ち、開示されるデータ処理方法を含むソフトウェアプログラムを走らせるコンピュータシステム若しくはプロセッサ）からの、複数のローカルな細胞分析システムからの、又はインターネットを介して接続されている複数の地理的に分散した細胞分析システムからのリアルタイム細胞分類データに依って連続的にアップデートされる。
【０１１５】
一般的に、人工ニューラルネットワークは、複数のノード層へと編成された相互接続されたノード群を含む（図１４）。例えば、ＡＮＮアーキテクチャは少なくともインプット層、１つ以上の隠れ層、及びアウトプット層を含み得る。ＡＮＮは何れかの総数の層及び何れかの数の隠れ層を含み得、隠れ層は、１つのアウトプット値又はアウトプット値のセットに対するインプットデータのセットのマッピングを許す訓練可能なフィーチャ抽出器として機能する。本願に於いて用いられる深層学習アルゴリズムは、複数の隠れ層、例えば２つ以上の隠れ層を含むＡＮＮである。ニューラルネットワークの各層は幾つものノード（又は「ニューロン」）を含む。ノードは、インプットデータ（例えば、細胞表現型データ）から直接的に来るインプット又は先の層のノードのアウトプット何れかを受け取り、特定の操作、例えば総和操作を行う。幾つかのケースでは、インプットからノードへの接続は重み（又は重み係数）と関連する。幾つかのケースでは、ノードはインプットｘｉ及び其れ等の関連する重みの全てのペアの積を総和し得る（図１５）。幾つかのケースでは、図１５に例示されている通り、重み付けされた和はバイアスｂに依ってオフセットされ得る。幾つかのケースでは、ノード又はニューロンのアウトプットは、線形又は非線形関数であり得る閾値又は活性化関数ｆを用いてゲーティングされ得る。活性化関数は、例えば、正規化線形ユニット（ＲｅＬＵ）活性化関数、リーキーＲｅＬＵ活性化関数、又は他の関数、例えば飽和双曲線正接、アイデンティティ、バイナリステップ、ロジスティック、ａｒｃＴａｎ、ｓｏｆｔｓｉｇｎ、パラメトリック正規化線形ユニット、指数関数的線形ユニット、ｓｏｆｔＰｌｕｓ、ベントアイデンティティ、ｓｏｆｔＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ、シヌソイド、サイン、ガウス、若しくはシグモイド関数、或いは其れ等の何れかの組み合わせであり得る。
【０１１６】
ニューラルネットワークの重み係数、バイアス値、及び閾値、又は他の計算パラメータは、訓練フェーズに於いて訓練データの１つ以上のセットを用いて「教えられ」又は「学習され」得る。例えば、ＡＮＮが計算するアウトプット値（単数又は複数）（例えば細胞分類結果）が訓練データセットに包含される例と一致する様に、パラメータは訓練データセットからのインプットデータ及び勾配降下法又はバックプロパゲーション法を用いて訓練され得る。パラメータはバックプロパゲーションニューラルネットワーク訓練プロセスから得られ得、此れは本願に於いて開示される細胞分析方法を行う為に用いられる物と同じコンピュータシステムハードウェアを用いて行われ得るか、又は行われずにあり得る。
【０１１７】
他の具体的な型の深層機械学習アルゴリズム、例えば畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）（例えば、多くの場合に、マシンビジョンシステムからの画像データの処理に用いられる）も又、開示される方法及びシステムに依って用いられ得る。普通には、ＣＮＮは、異なる型の層、畳み込み、プーリング、アップスケーリング、及び全結合ノード層から成る。幾つかのケースでは、正規化線形ユニット等の活性化関数が層の幾つかに用いられ得る。ＣＮＮアーキテクチャでは、行われる各型の操作について１つ以上の層があり得る。ＣＮＮアーキテクチャは、合計で何れかの数の層を、且つ行われる異なる型の操作について何れかの数の層を含み得る。最も単純な畳み込みニューラルネットワークアーキテクチャはインプット層から始まり、次に畳み込み層及びプーリング層のシーケンスであり、各畳み込み層は１つ以上のフィルターをも又含み得、此れ等は翻って１つ以上の重み係数又は他の調整可能なパラメータを含み得る。幾つかの場合には、パラメータはバイアス（即ち、活性化関数がシフトする事を可能にするパラメータ）を包含し得る。幾つかのケースでは、畳み込み層の次はＲｅＬＵ活性化関数の層である。他の活性化関数、例えば、飽和双曲線正接、アイデンティティ、バイナリステップ、ロジスティック、ａｒｃＴａｎ、ｓｏｆｔｓｉｇｎ、パラメトリック正規化線形ユニット、指数関数的線形ユニット、ｓｏｆｔＰｌｕｓ、ベントアイデンティティ、ｓｏｆｔＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ、シヌソイド、サイン、ガウス、シグモイド関数、及び種々の他の物も又用いられ得る。畳み込み、プーリング、及びＲｅＬＵ層は学習可能なフィーチャ抽出器として機能し得、全結合層は機械学習に基づく分類器として機能し得る。
【０１１８】
他の人工ニューラルネットワークと同じく、ＣＮＮアーキテクチャの畳み込み層及び全結合層は典型的には種々の計算パラメータ、例えば、重み、バイアス値、及び閾値を包含し、此れ等は上に記載されている通り訓練フェーズに於いて訓練される。
【０１１９】
一般的に、ＡＮＮのインプット層に用いられるノード数（此れはインプットデータセットのサイズを決める）は約１０から約１００，０００ノードの範囲であり得る。幾つかの場合には、インプット層に用いられるノード数は、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも９０，０００、又は少なくとも１００，０００であり得る。幾つかの場合には、インプット層に用いられるノード数は、多くても１００，０００、多くても９０，０００、多くても８０，０００、多くても７０，０００、多くても６０，０００、多くても５０，０００、多くても４０，０００、多くても３０，０００、多くても２０，０００、多くても１０，０００、多くても５０００、多くても４０００、多くても３０００、多くても２０００、多くても１０００、多くても９００、多くても８００、多くても７００、多くても６００、多くても５００、多くても４００、多くても３００、多くても２００、多くても１００、多くても５０、又は多くても１０であり得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、幾つかの実施形態では、インプット層に用いられるノード数は５００から２，０００の範囲であり得る。インプット層に用いられるノード数が、此の範囲内の何れかの値、例えば約５１２ノードを有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【０１２０】
何らかの場合には、ＡＮＮに用いられる層の総数（インプット及びアウトプット層を包含する）は約３から約２０の範囲であり得る。何らかの場合には、層の総数は少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、又は少なくとも２０であり得る。幾つかの場合には、層の総数は多くても２０、多くても１５、多くても１０、多くても５、多くても４、又は多くても３であり得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、幾つかの実施形態では、層の総数は約５から約１５の範囲であり得る。ＡＮＮに用いられる層の総数が、此の範囲内の何れかの値、例えば８層を有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【０１２１】
幾つかの場合には、ＡＮＮに用いられる学習可能な又は訓練可能なパラメータの総数、例えば、重み係数、バイアス、又は閾値は、約１から約１０，０００の範囲であり得る。幾つかの場合には、学習可能なパラメータの総数は少なくとも１、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも３，０００、少なくとも４，０００、少なくとも５，０００、少なくとも６，０００、少なくとも７，０００、少なくとも８，０００、少なくとも９，０００、又は少なくとも１０，０００であり得る。代替的には、学習可能なパラメータの総数は、１００よりも小さい何れかの数、１００及び１０，０００の間の何れかの数、又は１０，０００よりも多大な数であり得る。幾つかの場合には、学習可能なパラメータの総数は多くても１０，０００、多くても９，０００、多くても８，０００、多くても７，０００、多くても６，０００、多くても５，０００、多くても４，０００、多くても３，０００、多くても２，０００、多くても１，０００、多くても５００、多くても１００、多くても１０、又は多くても１であり得る。此のパラグラフに記載される下側及び上側の値の何れかは、本開示に包含される範囲を形成する様に組み合わせられ得る。例えば、幾つかの実施形態では、学習可能な又は訓練可能なパラメータの総数は約１００から約５，０００の範囲であり得る。用いられる学習可能なパラメータの総数が、此の範囲内の何れかの値、例えば約２，２００パラメータを有し得ると言う事を当業者は認識するであろう。
【０１２２】
訓練データセット：上で指摘されている通り、従来の画像処理方法の何れのステップ（単数又は複数）が置き換えられるかに依存して、ＡＮＮ又は深層学習アルゴリズムの訓練の為のインプットデータは種々のインプット値を含み得る。一般的に、ＡＮＮ又は深層学習アルゴリズムの訓練の為のインプットデータは、実際の試験細胞サンプルについて細胞分類結果を決める為に用いられる物と同じインプット値セット又は類似のインプット値セットを含むデータであろう。インプットデータ値は、数値（例えば、整数値、実数値、浮動小数点数、画像からの個々のピクセル若しくはビニング後のピクセルについてのＲＧＢ若しくはグレースケール強度値）、英数字値、ＡＳＣＩＩ値等、又は其れ等の何れかの組み合わせを含み得る。一般的に、ＡＮＮ又は深層学習アルゴリズムは、インプット（例えば表現型的な形質）データ及びペアリングされたアウトプット（例えば細胞分類）データの同じか又は異なるセットを含む１つ以上の訓練データセットを用いて訓練され得る。
【０１２３】
装置システム：装置システムも又本願に於いて開示され、此れは、本願に記載されるマイクロ流体細胞トラップデバイス、光源、画像センサー、流体流れコントローラ、温度コントローラ、ガス及びｐＨコントローラ、並びにプロセッサ、又は其れ等の何れかの組み合わせを含み得る。
【０１２４】
光源：種々の光源の何れかが、励起及び／又はイメージング光を提供する為に用いられ得、タングステンランプ、タングステンハロゲンランプ、アークランプ、レーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）、又はレーザーダイオードを包含するが、此れ等に限定されない。幾つかの場合には、１つ以上の光源、並びに追加の光学コンポーネント、例えば、レンズ、フィルター、アパーチャー、ダイアフラム、ミラー、及び同類の組み合わせが、照明サブシステム又はモジュールを含むであろう。
【０１２５】
画像センサー：種々の画像センサーの何れかがイメージング目的で用いられ得、光ダイオードアレイ、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、又はＣＭＯＳ画像センサー、マイクロレンズアレイ、スキャナー、又は他の光学的検出手段を包含するが、此れ等に限定されない。イメージングセンサーは１次元（線形）又は２次元アレイセンサーであり得る。幾つかの場合には、１つ以上の画像センサー、並びに追加の光学コンポーネント、例えば、レンズ、フィルター、アパーチャー、ダイアフラム、ミラー、及び同類の組み合わせが、イメージングサブシステム又はモジュールを含むであろう。
【０１２６】
多くの場合には、イメージングモジュールは光線をステアリング、シェーピング、フィルタリング、又は集光する為の種々の光学コンポーネントを包含するであろう。好適な光学コンポーネントの例は、レンズ、ミラー、プリズム、回折格子、色ガラスフィルター、狭域干渉フィルター、広域干渉フィルター、ダイクロイックリフレクター、光ファイバー、光ウェーブガイド、及び同類を包含するが、此れ等に限定されない。幾つかの場合には、イメージングモジュールは、照明及び／又はイメージングサブシステムに対して相対的にマイクロ流体デバイスを移動する目的で、１つ以上の並進ステージ又は他のモーションコントロールメカニズムを更に含み得、逆も又同様である。
【０１２７】
流体流れコントローラ：幾つかの場合には、開示される装置システム（又は細胞分析プラットフォーム）は流体流れコントローラ又は灌流システムを含み得、此れは、マイクロ流体デバイスの流体流れを駆動する為に用いられる１つ以上の流体アクチュエーションメカニズムのプログラマブルなコントロールを提供する。開示される方法、デバイス、及びシステムへの使用に好適な流体アクチュエーションメカニズムの例は、１つ以上のデバイス注入口又は排出口に接続された流体リザーバに対する正又は負の圧力、動電力、エレクトロウェッティング力、パッシブな毛細管現象、膜及び／又は吸収パッドの使用に依って容易化された毛細管現象、及び同類の適用を包含する。
【０１２８】
多くの場合には、開示されるマイクロ流体デバイスを通る流体流れのコントロールは、１つ以上のポンプ（又は他の流体アクチュエーションメカニズム）及び１つ以上のバルブの使用に依って行われるであろう。此れ等は、幾つかの実施形態では、デバイスの外部に於いて、ユーザーに依ってコントロールされる装置モジュール内に格納されるであろう。好適なポンプの例は、シリンジポンプ、プログラマブルシリンジポンプ、蠕動運動ポンプ、ダイアフラムポンプ、及び同類を包含するが、此れ等に限定されない。幾つかの場合には、システムの流体流れは、マイクロ流体デバイスに接続された外部の試薬及び緩衝液容器の１つ以上の注入口に於いて、又はマイクロ流体デバイス其れ自体の１つ以上の注入口に於いて正の空圧を適用する事に依ってコントロールされ得る。幾つかの場合には、デバイスの流体流れは、デバイスに接続された廃液リザーバの１つ以上の排出口に於いて、又はデバイスの１つ以上の排出口に於いてバキュームを引く事に依ってコントロールされ得る。好適なバルブの例は、チェックバルブ、二方又は三方電気機械式バルブ、二方及び三方空圧バルブ、並びに同類を包含するが、此れ等に限定されない。
【０１２９】
異なる流体流量が、マイクロ流体デバイス操作シーケンスの異なる点に於いて利用され得る。例えば、開示される方法、デバイス、及びシステムの幾つかの場合には、マイクロ流体デバイスの全て又は或る部分の体積流量は約−１０ｍｌ／ｓｅｃから約＋１０ｍｌ／ｓｅｃまで様々であり得る。幾つかの実施形態では、体積流量の絶対値は少なくとも０．００００１ｍｌ／ｓｅｃ、少なくとも０．０００１ｍｌ／ｓｅｃ、少なくとも０．００１ｍｌ／ｓｅｃ、少なくとも０．０１ｍｌ／ｓｅｃ、少なくとも０．１ｍｌ／ｓｅｃ、少なくとも１ｍｌ／ｓｅｃ、若しくは少なくとも１０ｍｌ／ｓｅｃ、又はより多くであり得る。幾つかの実施形態では、体積流量の絶対値は多くても１０ｍｌ／ｓｅｃ、多くても１ｍｌ／ｓｅｃ、多くても０．１ｍｌ／ｓｅｃ、多くても０．０１ｍｌ／ｓｅｃ、多くても０．００１ｍｌ／ｓｅｃ、多くても０．０００１ｍｌ／ｓｅｃ、又は多くても０．００００１ｍｌ／ｓｅｃであり得る。所与の時点に於ける体積流量は、此の範囲内の何れかの値、例えば１．２ｍｌ／ｓｅｃの順向きの流量、−０．０７ｍｌ／ｓｅｃの逆向きの流量、又は０ｍｌ／ｓｅｃの値（即ち、停止した流れ）であり得る。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、開示される細胞分析プラットフォームは、マイクロ流体デバイス内のユーザーに依って定められた温度を維持して例えば細胞が連続的な顕微鏡観察下にある間に延長された期間に渡ってインキュベーション及び維持される事を可能化する為に、又は２つ以上の定められたタイムインターバルに渡って２つ以上の定められた温度の間で温度をランプする為に、温度コントローラを更に含み得る。マイクロ流体デバイスに又は装置システムに組み込まれ得る温度コントロールコンポーネントの例は、抵抗加熱素子（例えば、酸化インジウム錫抵抗加熱素子）、ペルティエ加熱又は冷却デバイス、ヒートシンク、サーミスタ、熱電対、赤外光源、及び同類を包含するが、此れ等に限定されない。此れ等は電子的フィードバックループを用いて制御される。
【０１３１】
幾つかの場合には、温度コントローラは、特定のデバイス操作ステップを行う事に先行して、１つ以上の定められた調整可能な時間に於けるプログラマブルな温度変更を提供し得る。幾つかの場合には、温度コントローラは、定められたタイムインターバルに渡ってプログラマブルな温度変更を提供し得る。幾つかの実施形態では、温度コントローラは、定められた頻度及びランプ・レートに依る２つ以上の設定温度間の温度サイクリングを更に提供し得、其の結果、増幅反応の為のサーマルサイクリングが行われ得る。
【０１３２】
ガス＆ｐＨコントローラ：幾つかの実施形態では、開示される細胞分析プラットフォームは、ガス、例えばＣＯ２のユーザーに依って定められたパーセンテージ、又はマイクロ流体デバイスに送達されようとする緩衝液、成長培地、若しくは他の流体のユーザーに依って定められたｐＨを維持する為の、ガス及びｐＨコントローラ並びに関連コンポーネント（例えば、センサー）を含み得る。好適なセンサーの例は、非分散赤外（ＮＤＩＲ）ＣＯ２センサー（溶存ＣＯ２検知の為の全反射計測（ＡＴＲ）光学系と併せて用いられる）、溶存ＣＯ２検知の為の金属絶縁体半導体電界効果トランジスタ（ＭＯＳＦＥＴ）型センサー（例えば、ゲート電極上に堆積したアクティブなＣＯ２検知材料としてＰｔ−ＮｉＯ薄膜を有する）、ＣＯ２応答電極（例えば、メトラー・トレド（Mettler Toledo）のＩｎＰｒｏ５０００ｉ溶存ＣＯ２センサーシリーズ）、ｐＨ応答電極、流体中の溶存ＣＯ２量又はｐＨに対応する色変化を生ずる流体中に浸漬されるパッド、例えば商標Ｐｒｅｓｅｎｓ（登録商標）センサースポット［プレセンス・プレシジョン・センシング（PreSens Precision Sensing）ＧｍｂＨ，レーゲンスブルク，ドイツ］で販売されている物、及び同類を包含する。ＣＯ２及びｐＨのコントロールの為には、好適なセンサーがフィードバックループに用いられて、酸塩基滴定及びＣＯ２注入をコントロールする。幾つかの実施形態では、ＣＯ２若しくは他のガス濃度又はｐＨが、デバイス内に含有される流体中に於いて直接的にモニタリングされ得る。幾つかの実施形態では、ＣＯ２又は他のガス濃度が、デバイス内の流体と平衡にあるガス又は雰囲気中に於いてモニタリングされ得る。
【０１３３】
プロセッサ及びコンピュータシステム：多くの場合には、開示される装置システム（細胞分析プラットフォーム）は、コンピュータ（又はプロセッサ）及びコンピュータ読み取り可能な媒体を含むであろう。此れは、ユーザーインターフェースを提供する為の、並びに全てのシステム機能のマニュアル、半自動、又は全自動コントロール、例えば、流体流れコントロールサブシステム、温度・ガスコントロールサブシステム、イメージングサブシステム、及び並進ステージが包含される場合にはモーションコントロールサブシステムのコントロールの為のコードを包含する。多くの場合には、開示される装置システムは、上に記載されている通り従来の及び／又は機械学習に基づく画像処理を行う為のコードを包含するコンピュータ読み取り可能な媒体をも又含むであろう。幾つかの実施形態では、システムコンピュータ又はプロセッサは、装置システムの一体化されたコンポーネントであり得る（例えば、装置に埋め込まれたマイクロプロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、又はマザーボード）。幾つかの実施形態では、システムコンピュータ又はプロセッサは、スタンドアローンモジュール、例えばパーソナルコンピュータ又はラップトップコンピュータであり得る。幾つかの場合には、画像データ、センサーデータ、及び／又は他のシステムデータはローカルに保存され得る。幾つかの場合には、画像データ、センサーデータ、及び／又は他のシステムデータの全て又は或る部分はクラウド系データベースに保存され得る。幾つかの場合には、画像処理の全て又は或る部分はローカルに又はクラウドで行われ得る。
【０１３４】
装置コントロールソフトウェアに依って提供される流体コントロール機能の例は、流体体積流量、流体流速、細胞サンプル（単数又は複数）及び／又はビーズサンプルの導入のタイミング及び期間、アッセイ試薬追加、化学的又は物理的刺激の送達、バルブ切り替え、及びリンスステップを包含するが、此れ等に限定されない。
【０１３５】
装置コントロールソフトウェアに依って提供される温度コントロール機能の例は、温度設定点（単数又は複数）を定める事、並びに温度変更のタイミング、期間、及びランプ・レートのコントロールを包含するが、此れ等に限定されない。
【０１３６】
装置コントロールソフトウェアに依って提供されるガスコントロール機能の例は、ＣＯ２濃度のコントロールを包含するが、此れ等に限定されない。
【０１３７】
装置コントロールソフトウェアに依って提供されるイメージングシステムコントロール機能の例は、オートフォーカス能、照明又は励起光暴露時間及び強度のコントロール、画像取得速度のコントロール、暴露時間、並びにデータ保存オプションを包含するが、此れ等に限定されない。
【０１３８】
装置コントロールソフトウェアに依って提供される並進ステージシステムコントロール機能の例は、ステージ位置、向き、並びに其れ等のタイミング及び時間の期間のコントロールを包含するが、此れ等に限定されない。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、複数の独立コントロール型の流れチャネル及び一体化された流体バルブを含むマイクロ流体コントロールシステムの使用は、トラップアレイ内の単一細胞の微小環境のより良好なコントロールを提供し、人が異なる刺激化合物に対するアレイ化された細胞の暴露レベル及びタイミングをコントロールする事を可能化し得る。幾つかの実施形態では、細胞分析プラットフォームは、マイクロ流体チャンバーを必要に応じて開閉する為に、例えば細胞分泌物に対するビーズに基づく検知試薬の暴露をコントロールする為に、微細加工されたバルブシステムを利用し得る。
【０１４０】
適用：開示される細胞分析プラットフォームは、流れに基づくソーティング及び既存の流体トラップアプローチからの１００倍よりも多大なスループットの増大に依って、単一細胞の画像に基づく表現型解析及び分子バーコード化を可能化する。更に其の上、開示されるシステムのイメージングに基づく表現型解析能は、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ又は他のポアソンに基づくライブラリー調製アプローチを用いては実装され得ない。開示される細胞分析プラットフォームは腫瘍生検等の小さいサンプルと適合性であり、腫瘍応答の精密ドラッグスクリーニングの為の将来の臨床適用に用いられ得る。幾つかの適用では、開示される細胞分析プラットフォームはクロマチン分析に用いられ得る。
【０１４１】
開示される方法、デバイス、及びシステムの幾つかの場合には、例えば、ハイドロゲル中に固定化された単一細胞をリシス化学物質及び逆転写試薬に暴露し乍ら、ハイドロゲルの小さいポアサイズに依拠して単一細胞ライセートからのｍＲＮＡをローカルに閉じ込め、其れからｍＲＮＡ分子をローカルに置かれたＤＮＡバーコードに添付する事に依って、単一細胞に基づくｃＤＮＡライブラリーを調製する為のロバストな超並列ワークフローが達成される。幾つかの場合には、ＤＮＡバーコードは、単一細胞トラップあたり１つの固有の細胞同定バーコードで、マイクロ流体デバイス内に直接的に印刷又は合成され得る。方法は、トラップ内の表面に向かって短い距離を拡散するｍＲＮＡ分子の能力に依拠する。幾つかの場合には、ＤＮＡバーコードは、使用に先行してマイクロ流体デバイス内に直接的に印刷又は合成され、其れから、例えば其れ等を表面に取り付けた光切断性の又は化学的に切断可能なリンカーを切断する事に依って、デバイス内の表面から放出され得る。他の場合には、取り外し可能な蓋を含むマイクロ流体デバイスを用いて、単一細胞がハイドロゲル中にトラップ及び固定化され得、其れから、ＤＮＡバーコードが目当ての細胞上に直接的に印刷され得、此れ等は画像に基づく表現型解析に依って同定される。更に別の適用では、単一細胞がハイドロゲル中にトラップ及び固定化され、其れから蓋を取り外す事に依って薬物に対して暴露されて、単一細胞の表現型的な応答を同定し得る。観察され得る表現型的な応答の例は、サイトカインの放出、ウイルス粒子の排出、成長サイクルの変化、又は細胞の増殖を包含するが、此れ等に限定されない。ハイドロゲルの小さいポアサイズは、細胞及び分泌される何れかの大分子を有効に固定化し乍ら、人が各細胞の表現型変化を経時的に追跡する事を許す。此のアプローチは接着及び懸濁細胞両方に適用可能である。開示される方法及びデバイスと併せての分子バーコード化技術の使用は、人が単一細胞に於いて表現型的な形質又は其れ等の変化をゲノムデータ（例えば、プロファイリングされた遺伝子発現の変化）と相関させる事を許す。
【実施例】
【０１４２】
此れ等の例は、本願に於いて提供される請求項の範囲を限定する為ではなく、例示的な目的でのみ提供する。
【０１４３】
例１  −  メッシュ流体ネットワークに於ける２つの固有の流れのレジームの予測
ラダー及びメッシュネットワークから成る流体力学的システムは電気回路の様にモデル化され得、圧力、流量、及び流体力学的抵抗は電圧、電流、及び電気抵抗に相当する。上で指摘されている通り、本開示のメッシュ様流体ネットワークの例が図４（ａ）及び４（ｂ）に示されている。等価の抵抗回路が図５に示されている。
【０１４４】
メッシュネットワークは２つの型の抵抗器から成り、主流路に対して平行に整列した物、即ちＲＡ及びＲＴと、主流路に対して直角に整列した物、即ちＲＢとを包含する。流れ分布は、アレイの各分岐点に於いて連続方程式を立てる事に依って解かれ得る。其処から、我々は、流れ方向に対してラテラルな周期的境界条件と流れ方向に対して平行な一定の圧力損失ΔＰとを各アレイ周期について適用する。其れ故に、此の方程式系は、最小の単位セルの４つのノードの圧力を解く事に帰着し、此れ等は、
【数３】
2021500012.tif 000005
に依って与えられ、式中、Ｐｉ，ｊ、Ｐｉ，ｊ＋１、Ｐｉ＋１，ｊ、及びＰｉ＋１，ｊ＋１は単位セルの４つの固有のノードである。類似に、「２」の全ての場合を「１」に置き換える事と、ｊを０に、ｊ＋１を１に割り当てる事とに依って、無限ラダーネットワークがモデル化され得る。
【０１４５】
各ノードの圧力は、Ｅｑ．（３）を反転して、此のケースではＰｉ，ｊとして選ばれる任意の点の圧力を用いて一般解を与える事に依って解かれ得る。
【数４】
2021500012.tif 000006
【０１４６】
其れから、我々は、トラップを通る流れＱＴに対して相対的な２つのラテラル路の流れＱＢの比を決め得、此れ等は、
【数５】
2021500012.tif 000007
に依って与えられる。
【０１４７】
解はＲＡ及びＲＴの相対的な大きさの関数として符号を変化させるので、此の結果は流体流れの２つのレジームがあると言う事を指示している。先に研究されたトラップ設計の典型的なシナリオであるＲＴ＞ＲＡの時には、流れ比は正であり、ＲＴが殆どＲＡに等しい時には特異点にアプローチする。此の特異点は、ラテラル分岐を通るゼロ流れＲＢがあり、流れの全てが専らＲＡ及びＲＴ路を通って事実上直線移動する臨界点を定義する。此の現象を考える代替的な道は、ＲＡ及びＲＴが等しい抵抗を有する時には、隣り合うノードＰｉ，ｊ及びＰｉ＋１，ｊの圧力が等しく、ラテラル分岐のゼロ流れに至ると言う事である。
【０１４８】
ＲＴ＜ＲＡの時には、先には報告されていない別の流れのレジームが起こり、此れはＥｑ．（５）の比が負に成る事に至る。此の符号反転は、ラテラル分岐を通る流れＱＢが実際には違った方向に割り当てられると言う事を指示している。其れ故に、此の流れのレジームでは、全ての流体分岐は合流してトラップを通って流れ、此れは理論上は完璧に近いトラップ効率に至る筈である。
【０１４９】
例２  −  細胞が複数のトラップフィーチャを含むメッシュ流体ネットワークに導入される充填プロセスのシミュレーション
マイクロ流体メッシュネットワーク内に捕捉された細胞の分布は、ｍ個のトラップに依るｎ個の細胞の捕捉を記述する条件付き確率ツリーとして、
１）各トラップは１つの細胞のみを受け入れ得る
２）各細胞は永久的に其のトラップに捕捉される
３）細胞は注入口から排出口の方向（即ち、増大する行番号）で移動する
と言う追加の制約に依って、モデル化され得る。
【０１５０】
我々は、各試行投入について、未占有のトラップが細胞を捕捉する確率を記述する成功率ｑ＝［０，１］があり、占有されたトラップが第２の細胞を捕捉するゼロ確率があると仮定する（少なくとも、此の一階モデルの目的の為に）。トラップアレイの各行はＮ個の行に配置されたＭ個のトラップを有すると仮定され、トラップアレイはＮ×Ｍの寸法を有する。最後に、我々は、細胞が第ｉ行に捕捉される確率が、其の行の占有されたトラップのパーセンテージＣｉ＝［０，１］に関係すると言う事を仮定する。式中、Ｃｉ＝１は完全に飽和している行を表し、Ｃｉ＝０は空である行である。また、表記の便宜の為に、我々は表記
【数６】
2021500012.tif 000008
を用いるであろう。
【０１５１】
此処で、Ｐｉは細胞が第ｉ行に依って捕捉される確率であり、一方で、細胞が第（ｉ＋１）行に依って捕捉される確率は、細胞が第１に先のｉ行に依って捕捉されない確率、即ち１−ΣＰｉに依って還元されると言う事を仮定する。其れから、各行に依る捕捉率は、
【数７】
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としてモデル化され得る。
【０１５２】
アレイの充填プロセスは近似速度式に依って解かれ得る。例えば、或る離散的なタイムインターバルの間に、ｎ個の細胞が一定速度γでアレイに投入されると仮定する。其の結果、短いタイムインターバルΔｔの間に、アレイに追加される細胞数はｎ＝γΔｔである。此のプロセスは、第１行について、
【数８】
2021500012.tif 000010
に依って与えられる一次速度式に至り、式中、Ｍは各行のトラップ数である。類似に、ｉ＞１の他の行の濃度Ｃｉの変化は、
【数９】
2021500012.tif 000011
に依って与えられ、此れは上で導出された捕捉確率に基づく。此れ等の速度式は有限差分技術に依って数値的に解かれ、次の通り積分され得る。
【数１０】
2021500012.tif 000012
【０１５３】
此の方程式系は反復的に解かれ、第１にｔ＝１時間ステップの解を見出し、其れからアレイの全ての行の濃度をアップデートする。其れから、時間ステップｔ＝２の各位置の濃度が反復的に決められる。数値的なアーチファクトを回避する為に、時間ステップは十分に小さく保つ。
【０１５４】
例３  −  細胞トラップ効率ｖｓ．抵抗比を定量する
此れ等の予測を、０．２５＞ＲＡ／ＲＴ＞１．５の範囲の異なる抵抗比を有する種々のマイクロ流体トラップアーキテクチャを設計及び作製する事に依って試験した。
【０１５５】
マイクロ流体デバイス作製：チャネル壁を形成する為に深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）を用いて、６”ウェーハ上にマイクロ流体チップを作製した。フォトレジスト（シップレイ（Shipley）１８１３）を５００ｒｐｍで５ｓ、４０００ｒｐｍで６０ｓに渡ってウェーハ上にスピンし、１１５℃で６０ｓに渡ってベーキングし、カールズース（Karl Suss）ＭＡ６マスクアライナーに依って８０〜１００ｍＪ／ｃｍ２に暴露し、其れからＭｉｃｒｏｐｏｓｉｔ−ＭＦ３１９デベロッパーに依って３０ｓに渡って現像した。其れから、ウェーハを徹底的にクリーニングし、ＤＲＩＥ（ＳＰＴＳのＰｅｇａｓｕｓディープシリコンエッチング装置）に依って１５〜２０μｍの深さにエッチングした。其れから、フォトレジストマスクを剥し、ピラニア溶液（２００℃の３：１のＨ２ＳＯ４対Ｈ２Ｏ２）中でクリーニングした。次に、ＡＺ９２６０フォトレジストの１０μｍ厚層をウェーハの裏側に５００ｒｐｍで５ｓ、１８００ｒｐｍで６０ｓに渡ってスピンし、１１０℃で６０ｓに渡ってベーキングし、４０００ｍＪ／ｃｍ２に暴露し、３００ｓに渡ってＡＺ４００Ｋ１：４デベロッパーに依って現像した。此の層を用いて、シリコン貫通電極を作って、注入口及び排出口を確立し、チップをダイシングした。其れから、フォトレジストを剥がし、先に記載されている通り徹底的にクリーニングした。最後に、我々は硼珪酸ガラスをシリコンマイクロチャネルに３００℃で３時間に渡って陽極接合した。合計で、各ウェーハは３６個のデバイス（チップ）を与えた。此れ等は３０ｍｍ×２５ｍｍの寸法を有する。
【０１５６】
マイクロ流体セットアップ：カスタムメイドのチップホルダーがアルミニウム（プロトラブズ（Protolabs），ＭＮ）にマシニングされ、底側ホルダー及び上側覗き窓を含んだ。底側ピースは１／４”−２８ネジ穴を含有し、ねじ込み式ルアーロック（アイデックス（Idex），レークフォレスト，ＩＬ）に依ってチップへの接続が為される事を許した。チップホルダーも又アノダイズした（サートロニクス（Surtronics），ローリー，ＮＣ）。其の結果、其れ等は長期間に渡って細胞培養インキュベータ内に置かれ得る。チップホルダーを、モーター式Ｘ−Ｙステージ（ＡＳＩインストゥルメンツ（ASI Instruments），ユージーン，ＯＲ）にマウントされた３Ｄ印刷されたステージアダプターに固定した。此れは、自動フォーカスドライブ、対物レンズチェンジャー、及びフィルターチェンジャーを含有するライカＤＭＩ６０００−Ｂ倒立蛍光顕微鏡に締着した。排出口にマウントされ且つバキュームコントロールに依って駆動されるエルベシス（Elvesys）ＭＫ３圧力コントローラ（パリ，フランス）に依って、流体をチップに導入した。
【０１５７】
高スループット顕微鏡法：我々は、マイクロ流体デバイス内の各チャンバーの画像を迅速に取る為のカスタムのＭｉｃｒｏ−Ｍａｎａｇｅｒ（オープンソース顕微鏡法ソフトウェア）コードを開発した。アルゴリズムは、第１にアレイの３つのコーナーを同定して平面の方程式を確立する事と、次に各チャンバーのＸＹ位置及び最適な焦点面を含有するステージ位置リストを作る事と、其れから各チャンバーの画像をＲｅｔｉｇａ２０００−Ｒカメラに依って取る事と、最後に画像をカスタムフォーマットでセーブ及び命名して、其れ等を機械学習に基づく画像処理アルゴリズムと適合性にする事とを包含した。
【０１５８】
結果：我々の実験では、アレイが部分的に充填された儘に留まる様に、我々は十分に少数の細胞を導入し、充填割合ｖｓ．行番号の分析を可能化した。各トラップの占有をカスタムのコンピュータビジョンソフトウェアに依って同定した。其れから、２つの当てはめパラメータ、即ちトラップ効率ｑ及び導入された細胞の総数に依って、実験データをＥｑ．（９）に対して当てはめた。各マイクロ流体デバイス設計の１つの試行からの結果が、捕捉効率ｖｓ．行番号として、増大する抵抗比の４つの異なるチップについて、Ｅｑ．（９）への最も良好な当てはめのオーバーレイと併せて図１６（ａ）〜１６（ｄ）に於いてプロットされている。ｑの最も良好な当てはめ値が各図中に指摘されている。図１７（ａ）〜１７（ｄ）は、各設計のトラップ分布について、対応するヒートマップのプロットを提供している。ＲＡ／ＲＴ＝０．２５又は０．４２と言う低い抵抗比では、トラップ効率は夫々６％及び１６％である事が決まった。他方で、抵抗比が１を超えた時には、トラップ効率は劇的に増大し、此れ等の実験では７０％程も高かった。
【０１５９】
例４  −  マイクロ流体トラップアレイに依る長期的な細胞培養
次に、我々は、稀な細胞表現型を同定する為に十分に大きいスケールで個々のコロニーを成長させる能力を実証した。先に報告された方法に類似である穏やかなトラップ及び移入技術に依って、細胞をアレイに導入し、内側チャンバーに移入した（デュラ（Dura）等著（２０１４年），「変形性に基づくマイクロ流体細胞ペアリング及び融合（Deformability-based microfluidic cell pairing and fusion）」，ラボ・オン・ア・チップ（Lab on a Chip），第１４巻：ｐ．２７８３）。具体的には、我々は第１に細胞をトラップの入口に捕捉し、次に、細胞が狭い狭窄部から捩じ込み内側チャンバーに移動する事を引き起こす手短な圧力バーストに依って細胞をチャンバー内に移入した。デバイスが捕捉する様に設計された細胞型に依存して、狭窄部の幅は３〜６ミクロンの範囲で調整した。一般則として、我々は、細胞の直径と比較してトラップ領域の幅の１：３比が理想的であり、細胞が確かにトラップされ、低圧（〜２０ｍｂａｒ）では捩じ込まれないが、より高圧（〜３００ｍｂａｒ）では内側チャンバーに迅速に移入される事を許すと言う事を見出した。流れコントロールは排出口の負圧を調整する事に依って達成した。此れは、デッドボリュームに依る最小限の損失で、細胞が注入口リザーバに於いて直接的にピペッティングされる事を許した。加えて、一旦アレイが全く仕込まれると、此のアプローチは我々が注入口リザーバから細胞を洗浄する事を許した。アレイに仕込む為に要求される時間は細胞濃度及びチップの行数に依存する。然し乍ら、大抵の設計は〜５０行を有し、１０６細胞／ｍＬのオーダーの細胞濃度を用いる事は、我々が５分以内にアレイに全く仕込む事を許した。
【０１６０】
一旦細胞がアレイ化されると、我々はＭｉｃｒｏ−Ｍａｎａｇｅｒで書かれた我々の自動イメージングアルゴリズムを用いて、アレイ中の各チャンバーの高解像度明視野画像を取った。其の後に、チップを顕微鏡及び流れコントロール器具から取り外し、標準的な細胞培養インキュベータに移入し、細胞を７日及び以降に渡って其処に維持した。インキュべータ内にある間に、重力に依って駆動される流れに依って又はインキュベータ内に格納された圧力コントローラに依って何れかで、流れが連続的にチップ内に灌流された。重力流れのケースでは、我々は培地を充填された５ｍＬシリンジに注入口を接続し、排出口は未充填のシリンジに接続した。我々は、チップの日あたり０．２５〜０．５０ｍＬの流量を一貫して達成し、此れは圧力ヘッドに依って生ずる〜５ｍｂａｒを誘導した。他の実験では、我々は圧力コントローラを用いて細胞培地を更新し、此れは我々がチップを周期的に１０分毎にリンスする事を許した。
【０１６１】
細胞を日あたり２回イメージングし、各イメージングサイクル後に直ちにインキュベータに戻した。各チップについて大体５〜１０分を要求した。７日後に、訓練済みのＭａｓｋ−ＲＣＮＮ画像セグメント化モデルを用いて、Ｐｙｔｈｏｎで書かれたカスタムのコンピュータビジョンソフトウェアに依ってイメージングデータセットを分析した。より大きい画像から個々のチャンバーを自動的に整列及びクロッピングし、其れから各チャンバーの特定の行及び列アドレスを決め、各時点に於けるチャンバー内の各細胞を選び出し、其れから各コロニーの細胞数をプロットする為に、我々はテンソルフロー（機械学習）に基づく画像セグメント化アルゴリズムを開発した。
【０１６２】
４日に渡るコントロール基剤に依るＫ５６２単一細胞クローンの増殖のタイムラプス画像が図１８に示されており、赤いドットはコンピュータビジョンアルゴリズムに依って同定された細胞を示している。平均倍加時間は１３．５時間であった。此れはまとめた集団の〜２０時間と言う平均倍加時間よりも速い。より速く成長するクローンの一対の成長速度データが図１９に示されている。
【０１６３】
此のアプローチに依って、我々は、各コロニーの成長速度の分布を自動的にアウトプットする事と此れ等をヒートマップ又は成長ヒストグラムの形態でプロットする事とが出来た。１つの実証として、我々は、様々な濃度のイマチニブ［０．１μＭ、０．３μＭ、０．５μＭ］又はコントロールの存在下でＫ５６２細胞を成長させる実験を実施した。成長速度分布は図２０にプロットされており、増大する薬物濃度に依って減少する成長速度と言う予想される傾向を示している。各分布について、外れ値薬剤耐性細胞は明瞭に此れ等のデータセットから拾われ得た。
【０１６４】
図２１は隣り合うチャンバー内で成長する４つのコロニーの一連のタイムラプス画像を示している。
【０１６５】
図２２（ａ）及び２（ｂ）は、キザルチニブ（急性骨髄性白血病の処置について現在開発中の受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤）（図２２（ａ））又はコントロール培地（図２２（ｂ））の存在下で成長したＭＯＬＭ１３細胞の画像を示している。単一のクローンが薬物の存在下で外生する事が観察される。
【０１６６】
例５  −  他の例
図２３（ａ）及び２３（ｂ）は、マイクロ流体チップ上の個々の細胞並びに識別子及びマーカーを同定する為に機械学習アルゴリズムを用いて実施された画像セグメント化の使用を例示している。図２３（ａ）：明視野画像。図２３（ｂ）：コンピュータ生成カラー画像が明視野画像上にオーバーレイされており、チップ上のマーカーの同定、機械学習に基づく分析を用いて分類された細胞の異なる場合、個々の細胞の境界、及び検出される物体が細胞であるかどうかの予測の信頼度のクオリティスコアを示している。
【０１６７】
図２４はマイクロ流体チャンバー内にトラップされた単一細胞のアレイの画像を示している。此れの後に、チャンバーをシールする為に空気が流体チャネルに吹送される。
【０１６８】
図２５は、マイクロ流体チップ内にパターニングされたオリゴヌクレオチド捕捉プローブに対する蛍光標識された標的プローブのハイブリダイゼーションを示す、蛍光及び明視野画像のオーバーレイを示している。
【０１６９】
図２６（ａ）〜２６（ｃ）は単一細胞アレイを形成する為のプロセスを例示している。単一細胞アレイは細胞を硬化性のハイドロゲルと併せてアレイに流す事に依って形成され（図２６（ａ））。此れの後に、蓋が剥がされて（図２６（ｂ））、サンプルへのアクセスを提供し得る（図２６（ｃ））。
【０１７０】
図２７（ａ）及び２７（ｂ）は、流体中の懸濁された単一細胞又は他の物体の捕捉の為の複数のトラップフィーチャを含むマイクロ流体デバイスの限定しない例を提供している。図２７（ａ）：トラップフィーチャ及びマイクロ流体チャンバーの１００×１００アレイを含むマイクロ流体デバイスの写真。図２７（ｂ）：本開示のマイクロ流体デバイス内のトラップフィーチャ及び流体チャンバーの顕微鏡写真。
【０１７１】
図２８（ａ）〜２８（ｄ）は、原理証明作業に用いられた低効率トラップデバイスのトラップを通る流れプロファイルの例と、単一細胞トラップ効率のデータとを提供している。図２８（ａ）：デバイスの単一のトラップを通る計算上の流体流速。図２８（ｂ）：デバイスの単一のトラップを示す顕微鏡写真。図２８（ｃ）：デバイス内の１０，０００区画について単一細胞トラップ効率を示すヒートマップ。図２８（ｄ）：０、１、２、若しくは３、又はより多くの細胞がトラップされたマイクロ流体チャンバーの分布を示す円グラフ。
【０１７２】
図２９は細胞アレイの繋ぎ合わせた蛍光画像を示している（細胞はＦＩＴＣ細胞トラッキング色素に依って標識されている）。挿入図：デバイス内にトラップされた個々の細胞を示す蛍光及び明視野画像の拡大オーバーレイ。
【０１７３】
図３０（ａ）〜３０（ｃ）は、アレイ中の特定の細胞に化学物質を印刷する能力を実証する画像の限定しない例を示しており、此れはマイクロ流体デバイスの開放的なアーキテクチャに依って可能にされる。図３０（ａ）：蛍光標識を用いる単一細胞アレイ中の印刷された２つの並べられたパターン。図３０（ｂ）：蛍光標識を用いる細胞アレイ中の特定の細胞に印刷されたパターン。図３０（ｃ）：蛍光標識を用いる細胞アレイ中の特定の細胞に印刷されたパターン。
【０１７４】
本発明の好ましい実施形態を本願に示し記載したが、斯かる実施形態は例としてのみ提供されていると言う事は当業者には自明であろう。本発明から逸脱する事なしに、数々の変形、変更、及び置換が今や当業者には思い浮かぶであろう。本発明を実施する際には、本願に記載される本発明の実施形態の種々の代替が何れかの組み合わせで使用され得ると言う事は理解される筈である。次の請求項が本発明の範囲を定義すると言う事と、此れ等の請求項の範囲内の方法及び構造並びに其れ等の均等物が其れ等に依ってカバーされると言う事とが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2021500012.tif 000022
【図１１】
2021500012.tif 000023
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2021500012.tif 000026
【図１５】
2021500012.tif 000027
【図１６】
2021500012.tif 000028
【図１７Ａ】
2021500012.tif 000029
【図１７Ｂ】
2021500012.tif 000030
【図１７Ｃ】
2021500012.tif 000031
【図１７Ｄ】
2021500012.tif 000032
【図１８】
2021500012.tif 000033
【図１９】
2021500012.tif 000034
【図２０】
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【図２１】
2021500012.tif 000036
【図２２Ａ】
2021500012.tif 000037
【図２２Ｂ】
2021500012.tif 000038
【図２３Ａ】
2021500012.tif 000039
【図２３Ｂ】
2021500012.tif 000040
【図２４】
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【図２５】
2021500012.tif 000042
【図２６】
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【図２７】
2021500012.tif 000044
【図２８】
2021500012.tif 000045
【図２８（ｃ）】
2021500012.tif 000046
【図２８（ｄ）】
2021500012.tif 000047
【図２９】
2021500012.tif 000048
【図３０Ａ】
2021500012.tif 000049
【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
2021500012.tif 000051
【国際調査報告】
2021500012.tif 000052
2021500012.tif 000053