(57)【要約】  本開示は、フェノールを含まない抗酸染色組成物に関する。本開示はまた、生物学的試料中の抗酸生物体を検出する方法であって、（ａ）抗酸染色組成物を生物学的試料に適用することであり、抗酸染色溶液が、フクシン、塩基、界面活性剤、およびアルコールを含み、かつ抗酸染色組成物がフェノールを含まない、抗酸染色組成物を生物学的試料に適用することと、（ｂ）生物学的試料を抗酸染色組成物と共に、所定の時間、所定の温度においてインキュベートすることとを含む、方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フクシン、塩基、界面活性剤、およびアルコールを含む抗酸染色組成物であって、組成物中のフクシンの量が、組成物の総容量に対し、約０．７５ｗ／ｖ％〜約２．７５ｗ／ｖ％の範囲であり、抗酸染色組成物がフェノールを含まない、抗酸染色組成物。
【請求項２】
組成物中の塩基の量が、組成物の総容量に対し、約０．０５ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％の範囲である、請求項１に記載の抗酸染色組成物。
【請求項３】
塩基が、水酸化物である、請求項１または２に記載の抗酸染色組成物。
【請求項４】
塩基が、弱塩基である、請求項１または２に記載の抗酸染色組成物。
【請求項５】
弱塩基が、約８〜約２０の範囲のｐＫａを有する、請求項４に記載の抗酸染色組成物。
【請求項６】
塩基が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである、請求項５に記載の抗酸染色組成物。
【請求項７】
界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物。
【請求項８】
非イオン性界面活性剤が、アルコールエトキシレートである、請求項７に記載の抗酸染色組成物。
【請求項９】
非イオン性界面活性剤が、Ｃ８〜Ｃ１８アルコールエトキシレートである、請求項８に記載の抗酸染色組成物。
【請求項１０】
Ｃ８〜Ｃ１８アルコールエトキシレートが、１２モル未満のエチレンオキシドを含む、請求項９に記載の抗酸染色組成物。
【請求項１１】
組成物中の界面活性剤の量が、組成物の総容量に対し、約０．５ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物。
【請求項１２】
フクシンが、ニューフクシンである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物。
【請求項１３】
抗酸染色組成物の１０％水溶液が、約４〜約６の範囲のｐＨを有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物。
【請求項１４】
抗酸染色組成物が、少なくとも４２０日間安定である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物。
【請求項１５】
少なくとも１種の添加剤をさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物。
【請求項１６】
塩基が、フクシンと反応しないものから選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物。
【請求項１７】
抗酸染色組成物が、（ａ）組成物の総容量に対し、約０．７５ｗ／ｖ％〜約２．７５ｗ／ｖ％の範囲の量のフクシン；（ｂ）組成物の総容量に対し、約０．０５ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％の範囲の量の塩基；および（ｃ）組成物の総容量に対し、約０．５ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲の量の界面活性剤から本質的になる、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物。
【請求項１８】
界面活性剤が、Ｃ８〜Ｃ１８アルコールエトキシレートである、請求項１７に記載の抗酸染色組成物。
【請求項１９】
塩基が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである、請求項１７に記載の抗酸染色組成物。
【請求項２０】
塩基の量が、組成物の総容量に対し、約０．１５ｗ／ｖ％〜約０．４ｗ／ｖ％の範囲である、請求項１９に記載の抗酸染色組成物。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物で染色された、生物学的試料。
【請求項２２】
フェノールを含まない、請求項２１に記載の生物学的試料。
【請求項２３】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物を含む、容器。
【請求項２４】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物を、基材上に配置された生物学的試料に適用するように適合されたディスペンサーを備える、システム。
【請求項２５】
（ａ）請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物を含む第１の組成物；ならびに（ｂ）（ｉ）脱パラフィン溶液；（ｉｉ）洗剤を含む洗浄液；（ｉｉｉ）低級アルコールおよび酸を含む、脱色溶液；ならびに（ｉｖ）染料および弱酸を含む二次染料溶液からなる群から選択される第２の組成物を含む、キット。
【請求項２６】
第２の組成物が、脱色溶液である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
第１の組成物、第２の組成物および二次染料が、それぞれが別々の容器内にある、請求項２５または２６に記載のキット。
【請求項２８】
生物学的試料中の抗酸生物体を染色するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ａ）抗酸生物体に感染しているかまたは感染している疑いがある対象からの生物学的試料を準備する工程と、
（ｂ）請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物を生物学的試料に適用する工程と、
（ｃ）抗酸染色組成物または生物学的試料の少なくとも１つを、約３０℃〜約４５℃の範囲の温度まで加熱する工程と
を含む、方法。
【請求項２９】
生物学的試料を、抗酸染色組成物と共に、約１０分〜約４０分の範囲の期間インキュベートする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
生物学的試料を、抗酸染色組成物と共に、約１２分〜約２４分の範囲の期間インキュベートする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
約１００マイクロリットル〜約５００マイクロリットルの間の抗酸染色組成物を、生物学的試料に適用する、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
約２００マイクロリットルの抗酸染色組成物を、生物学的試料に適用する、請求項２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
抗酸染色組成物を適用する前に、生物学的試料を脱パラフィンする工程をさらに含む、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
（ｄ）アルコールおよび酸を含む脱色溶液を生物学的試料に適用する工程と、
（ｅ）染料および弱酸を含む二次染色液を生物学的試料に適用する工程と
をさらに含む、請求項２８から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
生物学的試料を画像化する工程をさらに含む、請求項２８から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
抗酸染色組成物が、自動染色システムで適用される、請求項２８から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
スライド上に配置された生物学的試料中の抗酸生物体を自動染色装置で染色する方法であって、
（ａ）生物学的試料を自動染色装置にロードすることと、
（ｂ）請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物を生物学的試料上に分注することと、
（ｃ）抗酸染色組成物をスライドから除去することと
を含む、方法。
【請求項３８】
生物学的試料が、抗酸生物体に感染しているかまたは感染している疑いがある対象からのものである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
約１００マイクロリットル〜約５００マイクロリットルの間の抗酸染色組成物を、生物学的試料に適用する、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
生物学的試料を、抗酸染色組成物と共に、約１０分〜約３０分の範囲の期間インキュベートする、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
生物学的試料を、約３０℃〜約４５℃の範囲の温度でインキュベートする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
アルコールおよび酸を含む脱色溶液を、生物学的試料上に分注することをさらに含む、請求項３７から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
染料および弱酸を含む二次染色液組成物を、生物学的試料上に分注することをさらに含む、請求項３７から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
抗酸染色組成物の適用前に、試料を脱パラフィンすることをさらに含む、請求項３７から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
スライド上に配置された生物学的試料に、カバーガラスを載せることをさらに含む、請求項３７から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗酸染色組成物を分注するように構成された少なくとも１つのディスペンサーを備える装置。
【請求項４７】
顕微鏡用スライドを加熱するように適合された少なくとも１つのアセンブリをさらに備える、請求項４６に記載の装置。
【請求項４８】
生物学的試料中の抗酸生物体を検出する方法であって、
（ａ）抗酸染色溶液を生物学的試料に適用することとであり、抗酸染色溶液が、フクシン、塩基、界面活性剤、およびアルコールを含み、組成物中のフクシンの量が、組成物の総容量に対し、約０．７５ｗ／ｖ％〜約２．７５ｗ／ｖ％の範囲であり、かつ組成物がフェノールを含まない、抗酸染色溶液を生物学的試料に適用することと、
（ｂ）染色溶液または生物学的試料の少なくとも１つを約３０℃〜約４５℃の範囲の温度まで加熱することと
を含む、方法。
【請求項４９】
生物学的試料を、抗酸染色溶液と共に、約１０分〜約４０分の範囲の期間インキュベートする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
生物学的試料を、抗酸染色溶液と共に、約１２分〜約２４分の範囲の期間インキュベートする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
約１００マイクロリットル〜約５００マイクロリットルの間の抗酸染色溶液を、生物学的試料に適用する、請求項４８から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
約２００マイクロリットルの抗酸染色組成物を、生物学的試料に適用する、請求項４８から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
抗酸染色溶液の１０％水溶液が、約４〜約６の範囲のｐＨを有する、請求項４８から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
フクシンが、組成物の総容量に対し、約０．７５ｗ／ｖ％〜約２．７５ｗ／ｖ％の範囲の量で存在し、塩基が、組成物の総容量に対し、約０．０５ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％の範囲の量で存在し、界面活性剤が、組成物の総容量に対し、約０．５ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲の量で存在する、請求項４８から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
塩基が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
非イオン性界面活性剤が、アルコールエトキシレートである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
非イオン性界面活性剤が、Ｃ８〜Ｃ１８アルコールエトキシレートである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
Ｃ８〜Ｃ１８アルコールエトキシレートが、１２モル未満のエチレンオキシドを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
抗酸染色溶液を適用する前に、生物学的試料を脱パラフィンすることをさらに含む、請求項４８から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
（ｉ）アルコールおよび酸を含む脱色溶液を生物学的試料に適用する工程と、（ｉｉ）染料および弱酸を含む二次染色液を生物学的試料に適用する工程とをさらに含む、請求項４８から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
生物学的試料を画像化する工程をさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
染色溶液が、自動染色システムで適用される、請求項４８から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
スライド上に配置された試料を自動染色装置で染色する方法であって、
（ａ）抗酸染色溶液を試料上に分注することであり、抗酸染色溶液が、（ｉ）組成物の総容量に対し、約０．７５ｗ／ｖ％〜約２．７５ｗ／ｖ％の範囲の量で存在するフクシン；（ｉｉ）組成物の総容量に対し、約０．０５ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％の範囲の量で存在する塩基；および（ｉｉｉ）組成物の総容量に対し、約０．５ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲の量で存在する界面活性剤を含み、かつ抗酸染色溶液がフェノールを含まない、抗酸染色溶液を試料上に分注することと、
（ｂ）抗酸染色溶液をスライドから除去することと
を含む、方法。
【請求項６５】
約１００マイクロリットル〜約５００マイクロリットルの間の抗酸染色溶液を、生物学的試料に適用する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
試料を、抗酸染色溶液と共に、約１０分〜約３０分の範囲の期間インキュベートする、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
試料を、約３０℃〜約４５℃の範囲の温度でインキュベートする、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
アルコールおよび酸を含む脱色溶液を試料上に分注することをさらに含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
染料および弱酸を含む二次染色液組成物を試料上に分注することをさらに含む、請求項６４から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
抗酸染色組成物の適用前に、試料を脱パラフィンすることをさらに含む、請求項６４から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
スライド上に配置された試料に、カバーガラスを載せることをさらに含む、請求項６４から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
フェノールを含まない抗酸染色溶液を、顕微鏡用スライド上に分注するように構成された少なくとも１つのディスペンサーを備える装置であって、抗酸染色溶液が、（ａ）組成物の総容量に対し、約０．７５ｗ／ｖ％〜約２．７５ｗ／ｖ％の範囲の量のフクシン；（ｂ）組成物の総容量に対し、約０．０５ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％の範囲の量の塩基；および（ｃ）組成物の総容量に対し、約０．５ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲の量の界面活性剤を含む、装置。
【請求項７３】
顕微鏡用スライドを加熱するように適合された少なくとも１つのアセンブリをさらに備える、請求項７２に記載の装置。
【請求項７４】
塩基が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである、請求項７２または７３に記載の装置。
【請求項７５】
界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項７２から７４のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／６１０，２１５号の出願日の利益を主張し、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリア、例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの脂質含有細胞壁は、カルボールフクシン染色液との非常に強い結合という独特の特徴を有するため、アルコールおよび強酸などの強力な脱色剤を用いた脱染色に抵抗する。したがって、用語「抗酸」は、酸またはアルコールによる脱染色に抵抗する、マイコバクテリアなどの特定の種類の桿菌に対するカルボールフクシン染色反応を説明するために使用されている。マイコバクテリアの抗酸染色反応は、それらの独特のビーズ状かつわずかに湾曲した形状と共に、感染の早期検出および治療のモニタリングにおける貴重な補助である。唾液または他のマイコバクテリオロジー検体中の抗酸桿菌の発見は、活動性結核症の推定的証拠と考えられ、治療を開始するのに十分である。
【０００３】
結核の疑いがある症例では、マイコバクテリアおよび他の抗酸生物体はグラム染色により染色することができないため、抗酸染色技術が使用される。そこで、生物学的試料（例えばスメア）を含むスライドを、チール−ネールゼン法により処理する。チール−ネールゼン法では、カルボールフクシン染色液を最初に調製する。カルボールフクシン染色液は、０．３グラムの塩基性フクシン、１０．０ミリリットルのエチルアルコール、および９０ミリリットルの５％フェノール水溶液を含有する。カルボールフクシン染色液を、スライドのスメアに５分間適用し、穏やかに蒸気を発生させるために十分な熱を加える。染色液をエバポレートさせてはならず、必要に応じてさらに染色液を加える。次に、スライドを冷却し、水ですすぐ。次に、スライドを、３容量％の濃塩酸を含有する９５％エチルアルコール溶液中で脱色する。カルボールフクシン染色がそれ以上消えなくなるまで、脱色溶液を加える。スライドを水道水で洗浄し、次にメチレンブルー溶液で１〜２分間対比染色する。メチレンブルー溶液は、０．３グラムのメチレンブルー（９０％の染料含有量）および１００ｍｌの蒸留水を含有する。次に、スライドを洗浄し、乾燥して、病理学者により検査される。
【０００４】
チール−ネールゼン（Ｚｉｅｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ）法で使用されるものなどの、抗酸生物体を染色するのに使用される従来の製剤は、フクシンおよびフェノールを含む。フェノールの使用により、いくつかの健康被害がもたらされる。例えば、フェノールは有毒であり、一般に、曝露時にタンパク質変性影響を及ぼす。少量への曝露の症状は、皮膚熱傷および肺浮腫から律動異常、発作、および昏睡の範囲まで及び得る。長期曝露は、肝臓および腎臓の損傷を起こすことが公知である。その毒性に加えて、フェノールは腐蝕性であり、かつ発癌性であるという疑いがある。したがって、フェノール含有染色溶液の調製および使用中に、かなりの安全対策を取らなければならない。加えて、フェノールは不快臭を有し、それは通常、最終製品に依然として存在し、手および衣服に容易に付着する。
【発明の概要】
【０００５】
出願者らは、フェノールを含む従来の製剤（例えばチール−ネールゼン染色）と少なくとも等しい染色性能を達成する、フェノール非含有抗酸染色組成物を開発した。実際、本明細書に記載のフェノール非含有組成物は、フェノール含有製剤と比較して、フェノール曝露という付随するリスクを伴うことなく、少なくとも同一の染色頻度（すなわち、組織の画定された領域内で染色された微生物の総数）および／または染色強度（すなわち、染色の暗さ）を達成する。
【０００６】
その上、出願者らは、染色組成物からフェノールを除去し、塩基および界面活性剤とフェノールとを置き換えることにより、染色溶液中のフクシン染料の溶解度増加を可能にすることを発見した。フクシン溶解度の増加により、任意の染色溶液中で低濃度のフクシンが使用されることが可能となり、これは、高濃度フクシンが器具中に沈殿する可能性があり得る自動染色器具で利用されるこれらの染色溶液にとって特に重要である。最終的に、高い蒸気圧を有するフェノールの除去により、自動染色器具中の相互汚染のリスクが低減されるかまたは取り除かれると考えられている。
【０００７】
以上のことから、本開示の一態様は、フクシン、塩基、界面活性剤、およびアルコールを含む抗酸染色組成物であり、フェノールを含まない、抗酸染色組成物である。一部の実施態様では、組成物中のフクシン（例えばニューフクシン）の量は、組成物の総容量に対し、約０．７５ｗ／ｖ％〜約２．７５ｗ／ｖ％の範囲である。
【０００８】
一部の実施態様では、塩基は、水酸化物（例えばＫＯＨ、ＮａＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）２など）である。一部の実施態様では、塩基は、非求核性塩基である。一部の実施態様では、塩基は、弱塩基である。一部の実施態様では、弱塩基は、約８〜約２０の範囲のｐＫａを有する。一部の実施態様では、塩基は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである。一部の実施態様では、組成物中の塩基の量は、組成物の総容量に対し、約０．０５ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％の範囲である。
【０００９】
一部の実施態様では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。一部の実施態様では、非イオン性界面活性剤は、アルコールエトキシレートである。一部の実施態様では、非イオン性界面活性剤は、Ｃ８〜Ｃ１８アルコールエトキシレートである。一部の実施態様では、Ｃ８〜Ｃ１８アルコールエトキシレートは、１２モル未満のエチレンオキシドを含む。一部の実施態様では、組成物中の界面活性剤の量は、組成物の総容量に対し、約０．５ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲である。
【００１０】
一部の実施態様では、抗酸染色組成物の１０％水溶液は、約２〜約６の範囲のｐＨを有する。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも１２０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも２４０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも３６０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも４２０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも５００日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも５４０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも６００日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも６２０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも１種の添加剤をさらに含む。
【００１１】
一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、（ａ）組成物の総容量に対し、約０．７５ｗ／ｖ％〜約２．７５ｗ／ｖ％の範囲の量のニューフクシン；（ｂ）組成物の総容量に対し、約０．０５ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％の範囲の量の弱塩基；および（ｃ）組成物の総容量に対し、約０．５ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲の量の非イオン性界面活性剤から本質的になる。一部の実施態様では、界面活性剤は、Ｃ８〜Ｃ１８アルコールエトキシレートであり、塩基は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンであり、フクシンは、ニューフクシンである。
【００１２】
本開示の別の態様は、フェノールを含まない抗酸染色組成物で染色された生物学的試料であり、該抗酸染色組成物が、フクシン、塩基、界面活性剤、およびアルコールを含、。一部の実施態様では、生物学的試料は、（ａ）組成物の総容量に対し、約０．７５ｗ／ｖ％〜約２．７５ｗ／ｖ％の範囲の量のニューフクシン；（ｂ）組成物の総容量に対し、約０．０５ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％の範囲の量の弱塩基；および（ｃ）組成物の総容量に対し、約０．５ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲の量の非イオン性界面活性剤から本質的になる抗酸染色組成物で染色された生物学的試料である。
【００１３】
本開示の別の態様は、（ａ）フクシン、塩基、界面活性剤、およびアルコールを含む抗酸染色組成物であって、フェノールを含まない、抗酸染色組成物；ならびに（ｂ）（ｉ）脱パラフィン溶液；（ｉｉ）洗剤を含む洗浄液；（ｉｉｉ）低級アルコールおよび酸を含む脱色溶液；ならびに（ｉｖ）染料および弱酸を含む二次染料溶液からなる群から選択される第２の組成物を含む、キットである。一部の実施態様では、キットは、（ａ）フクシン、塩基、界面活性剤、およびアルコールを含む抗酸染色組成物であって、フェノールを含まない、抗酸染色組成物；ならびに（ｉ）脱パラフィン溶液；（ｉｉ）洗剤を含む洗浄液；（ｉｉｉ）低級アルコールおよび酸を含む脱色溶液；ならびに（ｉｖ）染料および弱酸を含む二次染料溶液からなる群から選択される少なくとも２種の追加の組成物を含む。一部の実施態様では、キットは、フェノールを含まない抗酸染色組成物を有する第１の容器；脱色溶液を有する第２の容器；および二次染料溶液を有する第３の容器を備える。
【００１４】
本開示の別の態様は、生物学的試料（例えば組織学的試料、細胞学的試料など）中の抗酸生物体を染色するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、（ａ）抗酸生物体に感染しているかまたは感染している疑いがある対象からの生物学的試料を準備する工程と、（ｂ）該生物学的試料に抗酸染色組成物を適用する工程と、（ｃ）抗酸染色組成物または生物学的試料の少なくとも１つを約３０℃〜約４５℃の範囲の温度まで加熱する工程とを含む、方法である。一部の実施態様では、試料を、抗酸染色組成物と共に、約１２分〜約２４分の範囲の期間インキュベートする。一部の実施態様では、約１００マイクロリットル〜約５００マイクロリットルの間の抗酸染色組成物を生物学的試料に適用する。一部の実施態様では、約２００マイクロリットルの抗酸染色組成物を生物学的試料に適用する。一部の実施態様では、該方法は、抗酸染色組成物を適用する前に、生物学的試料を脱パラフィンすることをさらに含む。一部の実施態様では、該方法は、（ｄ）アルコールおよび酸を含む脱色溶液を生物学的試料に適用する工程と、（ｅ）染料および弱酸を含む二次染色液を生物学的試料に適用する工程とをさらに含む。一部の実施態様では、該方法は、生物学的試料を画像化する工程をさらに含む。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、自動染色システムで適用される。
【００１５】
本開示の別の態様は、生物学的試料（例えば組織学的試料、細胞学的試料など）中の抗酸生物体を検出する方法であって、（ａ）抗酸染色溶液を生物学的試料に適用することであり、抗酸染色溶液がフクシン、塩基、界面活性剤、およびアルコールを含み、組成物中のフクシンの量が約０．７５ｗ／ｖ％〜約２．７５ｗ／ｖ％の範囲である、抗酸染色溶液を生物学的試料に適用することと、（ｂ）染色溶液または生物学的試料の少なくとも１つを、約３０℃〜約４５℃の範囲の温度まで加熱することとを含む、方法である。一部の実施態様では、染色溶液は、約８〜約２０の範囲のｐＨを有する。一部の実施態様では、試料を、約１０分〜約４０分の範囲の期間、染色溶液と共にインキュベートする。一部の実施態様では、試料を、約１２分〜約２４分の範囲の期間、染色溶液と共にインキュベートする。一部の実施態様では、約１００マイクロリットル〜約５００マイクロリットルの間の染色溶液を生物学的試料に適用する。一部の実施態様では、約２００マイクロリットルの染色溶液を生物学的試料に適用する。
【００１６】
一部の実施態様では、塩基は、組成物の総容量に対し、約０．０５ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％の範囲の量で染色溶液中に存在し；界面活性剤は、組成物の総容量に対し、約０．５ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲の量で染色溶液中に存在する。一部の実施態様では、塩基は、約８〜約２０の範囲のｐＫａを有する弱塩基である。一部の実施態様では、塩基は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである。一部の実施態様では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。一部の実施態様では、非イオン性界面活性剤は、アルコールエトキシレートである。一部の実施態様では、非イオン性界面活性剤は、Ｃ８〜Ｃ１８アルコールエトキシレートである。一部の実施態様では、Ｃ８〜Ｃ１８アルコールエトキシレートは、１２モル未満のエチレンオキシドを含む。
【００１７】
一部の実施態様では、該方法は、染色溶液を適用する前に、生物学的試料を脱パラフィンする工程をさらに含む。一部の実施態様では、該方法は、抗酸染色溶液で染色した後に、以下の工程：（ｉ）アルコールおよび酸を含む脱色溶液を試料に適用する工程と、（ｉｉ）染料および弱酸を含む二次染色液を試料に適用する工程とをさらに含む。一部の実施態様では、該方法は、生物学的試料を画像化する工程をさらに含む。一部の実施態様では、抗酸染色溶液は、生物学的試料に自動検体処理器具で適用される。
【００１８】
本開示の別の態様は、スライド上に配置された生物学的試料中の抗酸生物体を自動染色装置で染色する方法であって、（ａ）生物学的試料を自動染色装置にロードすることと、（ｂ）抗酸染色組成物を生物学的試料上に分注することと、（ｃ）抗酸染色組成物をスライドから除去することとを含む、方法である。一部の実施態様では、生物学的試料は、抗酸生物体に感染しているかまたは感染している疑いがある対象からのものである。一部の実施態様では、約１００マイクロリットル〜約５００マイクロリットルの抗酸染色組成物を生物学的試料に適用する。一部の実施態様では、生物学的試料を、抗酸染色組成物と共に、約１０分〜約３０分の範囲の期間インキュベートする。一部の実施態様では、生物学的試料を、約３０℃〜約４５℃の範囲の温度でインキュベートする。一部の実施態様では、該方法は、アルコールおよび酸を含む脱色溶液を試料上に分注することをさらに含む。一部の実施態様では、該方法は、染料および弱酸を含む二次染色液組成物を試料上に分注することをさらに含む。一部の実施態様では、該方法は、抗酸染色組成物の適用前に、試料を脱パラフィンすることをさらに含む。一部の実施態様では、該方法は、スライド上に配置された試料に、カバーガラスを載せることをさらに含む。
【００１９】
本開示の別の態様は、抗酸染色組成物を分注するように構成された少なくとも１つのディスペンサーを備える装置である。一部の実施態様では、該装置は、顕微鏡用スライドを加熱するように適合された少なくとも１つのアセンブリをさらに備える。
【００２０】
本開示の別の態様は、顕微鏡用スライド上に配置された試料を、自動染色装置で染色する方法であって、（ｉ）フェノール非含有抗酸染色溶液をスライド上に分注することであり、抗酸染色溶液が、（ａ）組成物の総容量に対し、約０．７５ｗ／ｖ％〜約２．７５ｗ／ｖ％の範囲の量で存在するフクシン；（ｂ）組成物の総容量に対し、約０．０５ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％の範囲の量で存在する塩基；および（ｃ）組成物の総容量に対し、約０．５ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲の量で存在する界面活性剤を含む、フェノール非含有抗酸染色溶液をスライド上に分注することと、（ｉｉ）所定の時間後に抗酸染色溶液をスライドから除去することとを含む、方法である。一部の実施態様では、約１００マイクロリットル〜約５００マイクロリットルの間の染色溶液を生物学的試料に適用する。一部の実施態様では、約２００マイクロリットルの染色溶液を生物学的試料に適用する。一部の実施態様では、検体を、約１０分〜約４０分の範囲の期間、染色溶液と共にインキュベートし、検体または染色溶液の少なくとも１つを、約３０℃〜約４５℃の範囲の温度まで加熱する。一部の実施態様では、検体を、約３０℃〜約４５℃の範囲の温度まで加熱する。一部の実施態様では、試料を、約３０℃〜約４５℃の範囲の温度まで加熱する。一部の実施態様では、試料および検体の両方を、約３０℃〜約４５℃の範囲の温度まで加熱する。一部の実施態様では、該方法は、検体を画像化する（例えば顕微鏡でまたは走査機器で）ことをさらに含む。一部の実施態様では、該方法は、第１のリンス液、洗浄液、および／またはバッファーをスライド上に分注することをさらに含む。
【００２１】
一部の実施態様では、該方法は、アルコールおよび酸を含む脱色溶液を、スライド上に分注する工程と、スライドから脱色溶液を除去する工程とをさらに含む。一部の実施態様では、該方法は、第２のリンス液またはバッファーをスライド上に分注することをさらに含む。一部の実施態様では、該方法は、染料および弱酸を含む二次染色液組成物を、スライド上に分注する工程と、二次染色液組成物を除去する工程とをさらに含む。一部の実施態様では、該方法は、第３のリンス液またはバッファーをスライドに分注することをさらに含む。
【００２２】
一部の実施態様では、該方法は、抗酸染色溶液で染色する前に、試料を脱パラフィンすることを含む。一部の実施態様では、該方法は、カバーガラスを試料の上に載せることをさらに含む。一部の実施態様では、該方法は、フェノール非含有抗酸染色溶液で染色された試料を分析して、抗酸菌がそこに存在するかどうかを判定することをさらに含む。
【００２３】
本開示の別の態様は、フクシン、塩基、界面活性剤、およびアルコールを含む抗酸染色溶液を、生物学的検体上に分注するように構成された少なくとも１つのディスペンサーを備える装置であって、該抗酸染色組成物がフェノールを含まず、該装置が、生物学的検体または抗酸染色溶液の少なくとも１つを少なくとも３０℃の温度まで加熱するように適合されたアセンブリをさらに備える、装置である。一部の実施態様では、塩基は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである。一部の実施態様では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。
【００２４】
本開示の特色を全体的に理解するために、図を参照することができる。図中では、同一の要素を明らかにするために、全体を通して同様の参照番号が使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】第１の器具を使用してフェノールを含まない抗酸染色組成物で染色されたスライドに関する、スライド読み取り値のグラフでの要約を提供する図である。
【図２】第１の器具を使用してフェノールを含まない抗酸染色組成物で染色されたスライドに関する、スライド読み取り値のグラフでの要約を提供する図である。
【図３】２つの異なる器具を使用して染色されたスライドに関するスライド読み取り値のグラフでの要約を提供する図である。、スライドは、フェノールを含まない抗酸染色組成物か、または従来のフェノール含有染色組成物のいずれか（ｗｉｔｈｅｒ）で染色された。
【図４】それぞれの試験時間点におけるそれぞれの設計ロット／条件に関するｐＨのグラフを提供する図である。保存条件を有色ドットにより示す。不合格上限および不合格下限を、０日目の測定により確立された赤い勾配バーとして示す。
【図５】それぞれの時間点に関する設計ロット１のＨＰＬＣ測定のグラフを明示する図である。温度条件を有色ドットにより表す。不合格下限を赤線により示す。全ての時間点は、不合格限度より上である。
【図６】それぞれの時間点に関する設計ロット２のＨＰＬＣ測定のグラフを明示する図である。温度条件を有色ドットにより表す。不合格下限を赤線により示す。全ての時間点は、不合格限度より上である。
【図７】それぞれの時間点に関する設計ロット２３のＨＰＬＣ測定のグラフを明示する図である。温度条件を有色ドットにより表す。不合格下限を赤線により示す。全ての時間点は、不合格限度より上である。
【図８】それぞれの時間点における全てのＤＬに関するＵＶ−Ｖｉｓ測定のグラフを提供する図である。温度条件を有色ドットにより表す。不合格上限および不合格下限を赤い勾配バーとして示す。全ての時間点は合格している。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
２つ以上の工程または行為を含む、本明細書で特許請求される任意の方法において、そうでない旨が明らかに示されない限り、方法の工程または行為の順序は、方法の工程または行為が記載されている順序に必ずしも限定されるわけではないこともまた理解されたい。
【００２７】
本明細書で使用される場合、単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により明確に別段の指示がされない限り、複数の指示対象を含む。同様に、語「または」は、文脈により明確に別段の指示がされない限り、「および」を含むことを意図する。用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、「ＡまたはＢを含む」が、Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含むことを意味するように、包括的に定義される。
【００２８】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上で定義されるように「および／または」と同じ意味を有することが理解されよう。例えば、リスト中の項目を区分する場合、「または」または「および／または」は包括的であり、すなわち、少なくとも１つを包含するがまた、２つ以上の数または要素のリスト、かつ、追加のリストされていない項目も含んでもよく、包含すると解釈されるべきである。「１つのみの」もしくは「厳密に１つの」などの、そうでない旨が明らかに示された用語のみ、または特許請求の範囲において使用されている場合、「からなる」は、数または要素のリストの厳密に１つの要素の包含を表す。一般に、用語「または」は、本明細書で使用される場合、「いずれか」、「１つの」、「１つのみの」または「厳密に１つの」などの排他的な用語が先行する場合に、排他的な選択方法（すなわち「一方または他方で、両方ではない」）を示すとのみ解釈されるべきである。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用される、その通常の意味を有するべきである。
【００２９】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは互換的に使用され、同じ意味を有する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」などは互換的に使用され、同じ意味を有する。詳細には、該用語のそれぞれは、一般的な米国特許法の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の定義と一致して定義され、したがって、「少なくとも次に示すもの」を意味する開放された用語であると解釈され、かつさらなる特色、制限、態様などを除外することはないとも解釈される。したがって、例えば、「ａ、ｂ、およびｃの構成部分を有する機器」とは、機器が少なくともａ、ｂおよびｃの構成部分を含むことを意味する。同様に、語句「ａ、ｂ、およびｃの工程を含む方法」とは、方法が、少なくともａ、ｂ、およびｃの工程を含むことを意味する。その上、本明細書において工程およびプロセスが特定の順序で概説され得るけれども、当業者は、工程およびプロセスの順序が変更され得ることを理解するであろう。
【００３０】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、語句「少なくとも１つ」は、１つまたは複数の要素のリストに関して、要素のリスト中の任意の１つまたは複数の要素から選択された少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも要素のリスト内に特に記載されているそれぞれおよび全ての要素の少なくとも１つを含むわけではなく、かつ要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを除外することはないことが理解されよう。この定義によりまた、特に明らかにされたリスト中の要素と関連してもまたは関連しなくても、語句「少なくとも１つ」が言及する要素のリスト内で特に明らかにされた要素以外の要素が任意選択で存在し得ることも可能となる。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」または、同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施態様では、２つ以上、Ａを含んでもよく、Ｂは存在せず（かつＢ以外の要素を含んでもよい）という少なくとも１つを指し；別の実施態様では、２つ以上、Ｂを含んでもよく、Ａは存在せず（かつＡ以外の要素を含んでもよい）という少なくとも１つを指し；さらに別の実施態様では、２つ以上、Ａを含んでもよいという少なくとも１つを指し、かつ２つ以上、Ｂを含んでもよい（かつ他の要素を含んでもよい）という少なくとも１つ；などを指す場合がある。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「抗酸」または「抗酸性」は、特定の細菌細胞および真核細胞と同様にいくつかの細胞内構造の物理的特性、詳細には、検査染色手順中の酸による脱色に対するそれらの抵抗性を指す。試料の一部としていったん染色されると、これらの生物体は、多くの染色プロトコールにおいて一般的な、酸および／またはエタノールに基づく脱色手順に抵抗し得る。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「抗酸菌」または「ＡＦＢ」は、酸洗浄後、染色が保持される細菌を指す。本明細書で使用される用語「ＡＦＢ」は抗酸菌を指し、抗酸である特徴を有する任意の細菌を含み得る。ＡＦＢは、本発明で使用される場合、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の細菌であってもよい。ＡＦＢは、マイコバクテリウム以外の属の細菌であってもよい。したがって、本発明は、マイコバクテリウムではないＡＦＢに適用されてもよい。より詳細には、本発明は、いくつかの例を挙げると、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ツカムレラ属（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）またはアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ノルカルジウム属（Ｎｏｒｃａｒｄｉｕｍ）であるＡＦＢに適用されてもよい。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「生物学的試料」または「組織試料」は、ウイルスを含む任意の生物体から得られる生体分子（タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物、またはこれらの組み合わせなど）を含む任意の試料を指す。生物体の他の例には、哺乳類（ヒト；ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、およびブタのような家畜動物；ならびにマウス、ラットおよび霊長類のような実験動物など）、昆虫、環形動物、クモ類、有袋動物、爬虫類、両生類、細菌、および真菌が含まれる。生物学的試料には、組織試料（組織切片および組織の針生検など）、細胞試料（Ｐａｐスメアもしくは血液スメアなどの細胞学的スメアまたは顕微解剖により得られる細胞の試料など）、または細胞の画分、断片もしくは小器官（細胞を溶解し、かつ遠心分離または他の方法によりそれらの成分を分離することにより得られるなど）が含まれる。生物学的試料の他の例には、血液、血清、尿、精液、糞便、脳脊髄液、間質液、粘液、涙、汗、膿、生検組織（例えば、外科生検もしくは針生検により得られる）、乳頭吸引液、耳垢、乳、膣液、唾液、スワブ（頬側スワブなど）、または最初の生物学的試料に由来する生体分子を含有する任意の物質が含まれる。特定の実施態様では、用語「生物学的試料」は、本明細書で使用される場合、対象から得られる腫瘍またはその一部分から調製される試料（均質化されるかまたは液化された試料など）を指す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「Ｃａ〜Ｃｂ」は、「ａ」および「ｂ」が整数であり、アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基中の炭素原子の数、またはシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニルもしくはアリール基の環中の炭素原子の数、またはヘテロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリシクリル基中の炭素原子およびヘテロ原子の総数を表す。すなわち、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルの環、シクロアルケニルの環、シクロアルキニルの環、アリールの環、ヘテロアリールの環またはヘテロアリシクリルの環は、「ａ」〜「ｂ」個の、包括した炭素原子を含有することができる。したがって、例えば、「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」基は、１〜４個の炭素を有する全てのアルキル基、すなわち、ＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−、（ＣＨ３）２ＣＨ−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−および（ＣＨ３）３Ｃ−を指す。アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロアリシクリル基に関して、「ａ」および「ｂ」が明示されていない場合、これらの定義に記載される最も広い範囲が推測され得る。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「液」は、水、溶媒、溶液（例えばバッファー溶液）などを含む任意の液体を指す。用語「液」はまた、任意の混合物、コロイド、懸濁液なども指す。用語「液」はまた、顕微鏡用スライドおよび／または検体に適用され得る試薬、染色液、および他の検体処理剤（例えば接着剤、固定液など）も包含する。液は水性または非水性であってもよい。さらなる例には、抗体の溶液または懸濁液、核酸プローブの溶液または懸濁液、および染料または染色分子の溶液または懸濁液（例えば、Ｈ＆Ｅ染色溶液、Ｐａｐ染色溶液など）が含まれる。液のまたさらなる例には、パラフィン包埋された生物学的検体を脱パラフィンするための溶媒および／または溶液、水性洗剤溶液、ならびに炭化水素（例えば、アルカン、イソアルカンおよびキシレンなどの芳香族化合物）が含まれる。液のまたさらなる例には、生物学的検体を脱水するかまたは再水和させるために使用される溶媒（およびその混合物）が含まれる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「低級アルコール」は、Ｃ１〜Ｃ６アルコールを指し、これは直鎖または分岐であってもよい。低級アルコールの例には、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールと同様に、これらの異性体も含まれる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「マイコバクテリア」は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ミクロティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム・カネッティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｎｅｔｔｉ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・マルモエンセ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム・ゼノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｎｏｐｉ）、マイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム・シミエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｍｉａｅ）、マイコバクテリウム・テラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｒｒａｅ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・アブセサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム・ケロネー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ）、およびマイコバクテリウム・ゴルドナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ）を含むが、これらに限定されないあらゆる公知のマイコバクテリアを包含することを意図する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「試薬」は、形態学的（例えばヘマトキシリンおよびエオシン）、免疫組織化学的、または特定の染色の文脈に使用される、組織切片または細胞学的試料上に付着される任意の液を指し得る。これには、ワックス除去（すなわち脱パラフィン）用の油脂、有機物、および架橋剤；反応条件を設定し、試薬を適切な濃度まで希釈し、反応をクエンチするか、または過剰な反応物を洗い落とすために使用される洗浄剤、リンス剤、希釈剤、またはバッファー；形態学的染色および特定の染色に使用される小分子染料；ＩＨＣまたはＩＣＣ染色に使用される抗体、抗体コンジュゲート、酵素、多量体、増幅因子、発色性基質、蛍光検出化学物質、化学発光基質、および酵素反応補助因子が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「スライド」は、分析のためにその上に生物学的検体が置かれる、任意の好適な大きさの任意の基材（例えば、全体的または部分的に、ガラス、石英、プラスチック、ケイ素などで作製された基材）を指し、より詳細には標準的な３インチ×１インチの顕微鏡用スライドまたは標準的な７５ｍｍ×２５ｍｍの顕微鏡用スライドなどの「顕微鏡用スライド」を指す。スライド上に置くことができる生物学的検体の例には、限定されることなく、細胞学的スメア、薄い組織切片（生検からなど）、および生物学的検体のアレイ、例えば、組織アレイ、細胞アレイ、ＤＮＡアレイ、ＲＮＡアレイ、タンパク質アレイ、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。したがって、一実施態様では、組織切片、ＤＮＡ試料、ＲＮＡ試料、および／またはタンパク質が、スライド上の特定の位置に置かれる。一部の実施態様では、スライドという用語は、ＳＥＬＤＩおよびＭＡＬＤＩチップ、およびシリコンウエハを指し得る。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「界面活性剤」は、それらの化学的作用様式に応じてアニオン性、カチオン性、または非イオン性に分類される。一般に、界面活性剤は、２つの液体間の界面張力を低減する。界面活性剤分子は、典型的には、極性またはイオン性の「頭部」および非極性の炭化水素「尾部」を有する。水に溶解すると、界面活性剤分子は凝集してミセルを形成し、ミセル中では非極性の尾部が内向きに配置され、かつ極性またはイオン性の頭部が水性環境に向かって外向きに配置される。非極性の尾部は、ミセル内に、非極性の「ポケット」を作り出す。溶液中の非極性化合物は、界面活性剤分子により形成されたポケット中に閉じ込められ、したがって、非極性化合物を水溶液内に混合したままにすることができる。一部の実施態様では、界面活性剤は、組織切片中にわたる試薬の均一な広がりを生み出し、同様にバックグラウンド染色を低減するために使用され得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される用語「染色」、「染色すること」などは、一般に、生物学的検体中の特定の分子（脂質、タンパク質もしくは核酸など）または特定の構造（正常もしくは悪性の細胞、サイトゾル、核、ゴルジ体、もしくは細胞骨格など）の存在、位置、および／または量（濃度など）を検出および／または区別する、生物学的検体の任意の処理を指す。例えば、染色により、生物学的検体の特定の分子または特定の細胞構造と周囲部分との間の対比をもたらすことができ、かつ染色の強度により、検体中の特定の分子の量を測定することができる。染色は、明視野顕微鏡を用いるだけでなく、位相差顕微鏡、電子顕微鏡、および蛍光顕微鏡などの他の視認器具も用いて、分子、細胞構造および生物体の視認を補助するために使用することができる。システム２により実施される一部の染色は、細胞の外郭を可視化するために使用することができる。システム２により実施される他の染色は、他の細胞成分を染色しないかまたは相対的にほとんど染色することなく染色される、特定の細胞成分（分子または構造など）に依存し得る。システム２により実施される染色方法の種類の例には、限定されることなく、組織化学的方法、免疫組織化学的方法、および核酸分子間のハイブリダイゼーション反応などの分子間の反応（非共有結合相互作用を含む）に基づく他の方法が含まれる。特定の染色方法には、一次染色方法（例えば、Ｈ＆Ｅ染色、Ｐａｐ染色など）、酵素結合性の免疫組織化学的方法、および蛍光性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などのｉｎ  ｓｉｔｕのＲＮＡおよびＤＮＡハイブリダイゼーション方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「チール−ネールゼン染色」とは、結核の病原体を含む、マイコバクテリウム属に属する抗酸菌の実証に使用される染色を意味する。
【００４３】
概要
本開示は、フェノールを含まない抗酸染色組成物に関する。本開示はまた、これらの組成物を生物学的試料に適用し、そこに存在する抗酸菌の検出を可能にする方法も提供する。
【００４４】
抗酸染色組成物
本開示の一態様は、フクシン、塩基、界面活性剤、およびアルコールを含む抗酸染色組成物であって、フェノールを含まない、抗酸染色組成物である。
【００４５】
一部の実施態様では、単一のフクシンが任意の抗酸染色組成物内に含まれる。フクシン化合物の例には、ニューフクシン、酸フクシン、塩基フクシン、およびそれらの誘導体またはアナログが含まれる。一部の実施態様では、フクシンはニューフクシンである。
【００４６】
一部の実施態様では、組成物中のフクシンの量は、組成物の総容量に対し、約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の範囲である。他の実施態様では、組成物中のフクシンの量は、組成物の総容量に対し、０．５ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲である。一部の実施態様では、組成物中のフクシンの量は、組成物の総容量に対し、０．５ｗ／ｖ％〜約３．５ｗ／ｖ％の範囲である。さらに他の実施態様では、組成物中のフクシンの量は、組成物の総容量に対し、３ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲である。さらなる実施態様では、組成物中のフクシンの量は、組成物の総容量に対し、０．７５ｗ／ｖ％〜約２．７５ｗ／ｖ％の範囲である。さらなる実施態様では、組成物中のフクシンの量は、組成物の総容量に対し、０．７５ｗ／ｖ％〜約２．５ｗ／ｖ％の範囲である。またさらなる実施態様では、組成物中のフクシンの量は、組成物の総容量に対し、１ｗ／ｖ％〜約２．５ｗ／ｖ％の範囲である。またさらなる実施態様では、組成物中のフクシンの量は、組成物の総容量に対し、１．２５ｗ／ｖ％〜約２．５ｗ／ｖ％の範囲である。さらにまたさらなる実施態様では、組成物中のフクシンの量は、組成物の総容量に対し、１ｗ／ｖ％〜約２．２５ｗ／ｖ％の範囲である。
【００４７】
一部の実施態様では、抗酸染色組成物は塩基を含む。一部の実施態様では、塩基は、例えばＫＯＨ、ＮａＯＨのような水酸化物である。一部の実施態様では、塩基は、非求核性塩基である。一部の実施態様では、塩基は、約９〜約１１の範囲のｐＨを有する。他の実施態様では、塩基は、弱塩基である。一部の実施態様では、弱塩基は、約８〜約２０の範囲であるｐＫａを有する。好適な弱塩基には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「ＴＲＩＳ」）、アンモニア、ピリジン、有機アミン（例えばトリメチルアミン）、カルボキシレート、カルボネートが含まれる。他の実施態様では、塩基は、ＴＲＩＳである。一部の実施態様では、塩基は、フクシンと反応してエトキシル化フクシン誘導体を形成することがない塩基から選択される。
【００４８】
一部の実施態様では、抗酸染色組成物中の塩基の量は、組成物の総容量に対し、約０．０５ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％の範囲である。一部の実施態様では、塩基の量は、組成物の総容量に対し、約０．０７５ｗ／ｖ％〜約０．４５ｗ／ｖ％の範囲である。他の実施態様では、塩基の量は、組成物の総容量に対し、約０．１ｗ／ｖ％〜約０．４ｗ／ｖ％の範囲である。他の実施態様では、塩基の量は、組成物の総容量に対し、約０．１ｗ／ｖ％〜約０．３５ｗ／ｖ％の範囲である。さらに他の実施態様では、塩基の量は、組成物の総容量に対し、約０．１２５ｗ／ｖ％〜約０．３ｗ／ｖ％の範囲である。さらに他の実施態様では、塩基の量は、組成物の総容量に対し、約０．１ｗ／ｖ％〜約０．２ｗ／ｖ％の範囲である。さらに他の実施態様では、塩基の量は、組成物の総容量に対し、約０．２ｗ／ｖ％〜約０．４５ｗ／ｖ％の範囲である。
【００４９】
一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、界面活性剤をさらに含む。界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、またはこれらの混合物の１つであり得る。一部の実施態様では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。好適な非イオン性界面活性剤の中には、Ｃ８〜Ｃ３０アルコールと糖またはデンプンポリマーとの縮合生成物がある。これらの化合物は、式（Ｓ）ｎ−Ｏ−Ｒ［式中、Ｓは、グルコース、フルクトース、マンノース、およびガラクトースなどの糖部分であり、ｎは、約１〜約１０００の整数であり、Ｒは、Ｃ８〜Ｃ３０アルキルである］により表すことができる。Ｒ基が誘導される好適なＣ８〜Ｃ３０アルコールの例には、デシルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコールなどが含まれる。これらの界面活性剤の具体例には、デシルポリグルコシドおよびラウリルポリグルコシドが含まれる。
【００５０】
他の好適な非イオン性界面活性剤には、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（すなわち、脂肪酸のアルキレンオキシドエステル）が含まれる。これらの物質は、一般式ＲＣＯ（Ｘ）ｎＯＨを有し、式中、ＲはＣ１０〜Ｃ３０アルキルであり、Ｘは−ＯＣＨ２ＣＨ２−（エチレンオキシドから誘導）または−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ３−（プロピレンオキシドから誘導）であり、かつｎは約１〜約２００の整数である。
【００５１】
さらに他の好適な非イオン性界面活性剤は、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（すなわち、脂肪酸のアルキレンオキシドジエステル）であり、式ＲＣＯ（Ｘ）ｎＯＯＣＲを有し、式中、ＲはＣ１０〜Ｃ３０アルキルであり、Ｘは−ＯＣＨ２ＣＨ２−（エチレンオキシドから誘導）または−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ３−（プロピレンオキシドから誘導）であり、かつｎは約１〜約２００の整数である。さらに他の非イオン性界面活性剤は、アルキレンオキシドと脂肪アルコールとの縮合生成物（すなわち、脂肪アルコールのアルキレンオキシドエーテル）であり、一般式Ｒ（Ｘ）ｎＯＲ’［式中、ＲはＣ１０〜Ｃ３０アルキルであり、ｎは約１〜約２００の整数であり、Ｒ’はＨまたはＣ１０〜Ｃ３０アルキルである］を有する。
【００５２】
また他の非イオン性界面活性剤は、式ＲＣＯ（Ｘ）ｎＯＲ’を有する化合物であり、式中、ＲおよびＲ’はＣ１０〜Ｃ３０アルキルであり、Ｘは−ＯＣＨ２ＣＨ２−（エチレンオキシドから誘導）または−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ３−（プロピレンオキシドから誘導）であり、かつｎは約１〜約２００の整数である。アルキレンオキシド誘導の非イオン性界面活性剤の例には、セテス−１、セテス−２、セテス−６、セテス−１０、セテス−１２、セテラエス（ｃｅｔｅｒａｅｔｈ）−２、セテアレス６、セテアレス−１０、セテアレス−１２、ステアレス−１、ステアレス−２、ステアルテス（ｓｔｅａｒｔｅｔｈ）−６、ステアレス−１０、ステアレス−１２、ＰＥＧ−２ステアレート、ＰＥＧ４ステアレート、ＰＥＧ６ステアレート、ＰＥＧ−１０ステアレート、ＰＥＧ−１２ステアレート、ＰＥＧ−２０グリセリルステアレート、ＰＥＧ−８０グリセリルタロエート、ＰＰＧ−１０グリセリルステアレート、ＰＥＧ−３０グリセリルココエート、ＰＥＧ−８０グリセリルココエート、ＰＥＧ−２００グリセリルタロエート、ＰＥＧ−８ジラウレート、ＰＥＧ−１０ジステアレート、およびこれらの混合物が含まれる。また他の有用な非イオン性界面活性剤には、例えば、米国特許第２，９６５，５７６号、同第２，７０３，７９８号、および同第１，９８５，４２４号に開示されているポリヒドロキシ脂肪酸アミドが含まれ、これらは本明細書に参照により組み込まれる。
【００５３】
当技術分野および文献で一般に公知の非イオン性界面活性剤の例には、１級または２級のアルコールエトキシレートなどのさまざまな直鎖エトキシレート、他のアルコールアルコキシレート、芳香族エトキシレート、変性エトキシレート、およびこれらのブレンドが含まれる。例には、１２モル未満のエチレンオキシド（ＥＯ）を有するＣ８〜Ｃ１８アルコールエトキシレートを含む、Ｃ８〜Ｃ１８アルコールエトキシレートが含まれるが、これらに限定されない。例示的な界面活性剤には、Ｔｏｍａｄｏｌ  １２００（Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｔｏｍａｄｏｌ  ９００（Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｔｏｍａｄｏｌ  ９１−８（Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｔｏｍａｄｏｌ  １−９（Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  １５−Ｓ−９（Ｓｉｇｍａ）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  １５−Ｓ−１２（Ｓｉｇｍａ）、Ｍａｓｕｒｆ  ＮＲＷ−Ｎ（Ｐｉｌｏｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、Ｂｉｏ−Ｓｏｆｔ  Ｎ９１−６（Ｓｔｅｐａｎ）、およびＢｒｉｊ−３５（ポリエチレングリコールドデシルエーテル）（Ｓｉｇｍａ）が含まれる。本明細書で使用される場合、「Ｔｅｒｇｉｔｏｌ」界面活性剤は以下の式で定義され、式中、ｎ、ｎ１およびｎ２は独立して５〜３０である。例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  １５−Ｓ−５に関しては、ｎ＋ｎ１＝１２、ｎ２＝４；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  １５−Ｓ−７に関しては、ｎ＋ｎ１＝１２およびｎ２＝６；かつＴｅｒｇｉｔｏｌ  １５−Ｓ−９に関しては、ｎ＋ｎ１＝１２およびｎ２＝８である。ポリオキシエチレンのさらなる例には、他に多くのものが公知であるが、Ｎｏｎｏｘｙｎｏｌ−９、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、およびＩｇｅｐａｌシリーズの界面活性剤が含まれる。
【００５４】
他の非イオン性界面活性剤の例には、ポリ（エチレンオキシド）およびポリプロピレンオキシドの共重合体（例えば、ＢＡＳＦ  ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）製品などのポロキサマー）が含まれる。非イオン性界面活性剤のさらなる例には、８−メチル−１−ノナノールプロポキシレート−ｂｌｏｃｋ−エトキシレート、ＡＬＫＡＮＯＬ（登録商標）６１１２、アリルアルコール１，２−ブトキシレート−ｂｌｏｃｋ−エトキシレート、Ｂｒｉｊ（登録商標）３０、Ｂｒｉｊ（登録商標）５２、Ｂｒｉｊ（登録商標）７２、Ｂｒｉｊ（登録商標）７８、Ｂｒｉｊ（登録商標）９２Ｖ、Ｂｒｉｊ（登録商標）９３、Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）９８、Ｂｒｉｊ（登録商標）０１０、Ｂｒｉｊ（登録商標）５１００、Ｂｒｉｊ（登録商標）５１０、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−２１０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−５２０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−７２０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−２１０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−５２０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−６３０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−７２０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−８９０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＤＭ−９７０、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）Ａ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＤＡ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＨＣＳ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＯＪ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＳＥ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＳＨ、ポリエチレン−ｂｌｏｃｋ−ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート、ポリオキシエチレンソルビトールヘキサオレエート、ソルビタンモノパルミテート、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
アニオン性界面活性剤は、一般に硫酸塩、スルホネート、ホスフェート、またはカルボキシレートに基づき、かつ水溶性カチオンを含有する。スルホネートの代表的な式は、Ｒ−ＳＯ３Ｍであり、式中、Ｒは、アルコキシまたはオキシアルコキシを通してスルホネート官能基に結合し得る、約５〜２２個の炭素原子の炭化水素基であり、Ｍは、アルカリ金属などの水溶性カチオンである。アニオン性界面活性剤には、アルキルエーテル硫酸塩、アルキル硫酸塩およびスルホネート、アルキルカルボキシレート、アルキルフェニルエーテル硫酸塩、アルキルポリ（オキシエチレン）スルホネートのナトリウム塩、ドデシルベンジルスルホネートのナトリウム塩などのアルキルベンジルスルホネートのナトリウム塩ならびにラウリルエーテル硫酸ナトリウムが含まれる。アニオン性界面活性剤にはまた、アニオン性ホスフェートエステルも含まれる。
【００５６】
本開示の組成物に有用なカチオン性界面活性剤は、アミノまたは第４級アンモニウム部分を含有する。本明細書で有用なものの中のカチオン性界面活性剤は、以下の文献：Ｍ．Ｃ．Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ、Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ＆  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ、（Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９７９）；Ｓｃｈｗａｒｔｚら；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ、Ｔｈｅｉｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９４９年；米国特許第３，１５５，５９１号、Ｈｉｌｆｅｒ、１９６４年１１月３日発行；米国特許第３，９２９，６７８号、Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９７５年１２月３０日発行；米国特許第３，９５９，４６１号、Ｂａｉｌｅｙら、１９７６年５月２５日発行；および米国特許第４，３８７，０９０号、Ｂｏｌｉｃｈ、Ｊｒ．、１９８３年６月７日発行に開示されている。
【００５７】
一部の実施態様では、組成物中の界面活性剤の量は、組成物の総容量に対し、約０．５ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲である。他の実施態様では、組成物中の界面活性剤の量は、組成物の総容量に対し、約０．７５ｗ／ｖ％〜約３．５ｗ／ｖ％の範囲である。さらに他の実施態様では、組成物中の界面活性剤の量は、組成物の総容量に対し、約１ｗ／ｖ％〜約３ｗ／ｖ％の範囲である。さらなる実施態様では、組成物中の界面活性剤の量は、組成物の総容量に対し、約１．５ｗ／ｖ％〜約２．５ｗ／ｖ％の範囲である。
【００５８】
一部の実施態様では、アルコールは低級アルコールであり、分岐または直鎖であってもよい。一部の実施態様では、アルコールは、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールまたはこれらの混合物である。
【００５９】
一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、ニューフクシン、非イオン性界面活性剤、およびＴＲＩＳを含み、（ａ）ニューフクシンは、組成物の総容量に対し、約０．７５ｗ／ｖ％〜約２．７５ｗ／ｖ％の範囲の量で存在し、（ｂ）ＴＲＩＳは、組成物の総容量に対し、約０．１ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％の範囲の量で存在し、（ｃ）非イオン性界面活性剤は、組成物の総容量に対し、約０．５ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲の量で存在する。
【００６０】
一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも１２０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも１８０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも２４０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも３００日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも３６０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも４２０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも４５０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも５００日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも５２０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも５４０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも５８０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも６００日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも６２０日間安定である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、少なくとも６３０日間安定である。
【００６１】
抗酸染色組成物の非限定的な例を表１に明示する。
2021508055.tif 000003
【００６２】
方法
本開示の別の態様は、生物学的試料（例えば組織学的試料、細胞学的試料など）中の抗酸生物体（例えばマイコバクテリウム）を染色するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、抗酸生物体に感染しているかまたは感染している疑いがある対象からの生物学的試料を準備することと、本開示に基づく抗酸染色組成物を生物学的試料に適用することとを含む、方法である。
【００６３】
本開示の別の態様は、生物学的試料中の抗酸生物体（例えばマイコバクテリウム）を検出する方法であって、抗酸菌に感染しているかまたは感染している疑いがある対象（例えば、患者）からの生物学的試料を受け取ることと、フクシン、塩基、界面活性剤、およびアルコールを含む抗酸染色組成物を生物学的試料に適用することとを含み、該組成物がフェノールを含まない、方法である。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、ニューフクシン、非イオン性界面活性剤、およびＴＲＩＳを含む。
【００６４】
他の実施態様では、抗酸染色組成物は、ニューフクシン、非イオン性界面活性剤、およびＴＲＩＳを含み、（ａ）ニューフクシンは、組成物の総容量に対し、約０．７５ｗ／ｖ％〜約２．７５ｗ／ｖ％の範囲の量で存在し、（ｂ）ＴＲＩＳは、組成物の総容量に対し、約０．１ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％の範囲の量で存在し、（ｃ）非イオン性界面活性剤は、組成物の総容量に対し、約０．５ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の範囲の量で存在する。当然のことながら、本明細書に記述される任意の抗酸染色組成物は、表１で明らかにされたものを含み、生物学的試料に適用され、試料中の抗酸生物体の検出を実現し得る。抗酸染色組成物を生物学的試料に適用する工程は、手動でまたは本明細書に記述される検体処理装置を用いて実施することができる。
【００６５】
一部の実施態様では、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、室温より高い温度まで、例えば約３０℃〜約８０℃の範囲の温度まで加熱する。一部の実施態様では、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、室温より高い温度まで、例えば約３０℃〜約６０℃の範囲の温度まで加熱する。一部の実施態様では、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、室温より高い温度まで、例えば約３０℃〜約５０℃の範囲の温度まで加熱する。他の実施態様では、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、約３５℃〜約４０℃の範囲の温度まで加熱する。一部の実施態様では、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、約３７℃の温度まで加熱する。
【００６６】
一部の実施態様では、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、約１０分〜約４０分の範囲の期間、加熱する。他の実施態様では、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、約１５分〜約４０分の範囲の期間、加熱する。さらに他の実施態様では、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、約１５分〜約３０分の範囲の期間、加熱する。さらなる実施態様では、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、約１２分〜約２４分の範囲の期間、加熱する。またさらなる実施態様では、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、約１６分〜約３６分の範囲の期間、加熱する。一実施態様では、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、約１２分間、加熱する。一実施態様では、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、約１６分間、加熱する。一実施態様では、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、約２０分間、加熱する。
【００６７】
一部の実施態様では、生物学的試料を、抗酸染色組成物と共に、加熱後に追加の期間、例えば生物学的試料を放冷する期間、インキュベートする。一部の実施態様では、この追加の期間は、約１分〜約１５分の範囲である。他の実施態様では、この追加の期間は、約５分〜約１０分の範囲である。一部の実施態様では、組成物が試料と接触を続ける合計時間は、約５分〜約８０分の範囲である。
【００６８】
一部の実施態様では、該方法は、生物学的試料と他の液および／または試薬とを接触させることをさらに含む。例えば、一部の実施態様では、対比染色を含む追加の染色を、生物学的試料に適用してもよい。他の実施態様では、洗浄試薬、検出試薬、脱パラフィン試薬、バッファーなどを、抗酸染色組成物の付着の前またはすぐ後に適用してもよい。
【００６９】
自動検体処理システム
一部の実施態様では、本開示の抗酸染色組成物は、検体処理システムを使用して付着され得る。一部の実施態様では、検体処理装置は、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．により販売されているＢＥＮＣＨＭＡＲＫ  ＸＴ器具、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｔａｉｎｓ器具、ＮｅｘＥＳ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｔａｉｎｅｒ器具、ＳＹＭＰＨＯＮＹ器具、またはＢＥＮＣＨＭＡＲＫ  ＵＬＴＲＡ器具などの自動装置である。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．は、米国特許第５，６５０，３２７号、同第５，６５４，２００号、同第６，２９６，８０９号、同第６，３５２，８６１号、同第６，８２７，９０１号および同第６，９４３，０２９号、ならびに米国特許出願公開第２００３／０２１１６３０号および同第２００４／００５２６８５号を含む、自動分析を実施するためのシステムおよび方法を開示している多数の米国特許の譲受人であり、このそれぞれの特許の全容が参照により本明細書に組み込まれる。あるいは、検体は、手動で処理することができる。
【００７０】
それを通して抗酸染色組成物が適用され得る、他の市販の検体処理システムの例には、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＳＹＭＰＨＯＮＹ（個々のスライド染色器）およびＶＥＮＴＡＮＡ  ＨＥ  ６００（個々のスライド染色器）シリーズ；Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＤａｋｏ  ＣｏｖｅｒＳｔａｉｎｅｒ（バッチ染色器）；Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｎｕｓｓｌｏｃｈ  ＧｍｂＨからのＬｅｉｃａ  ＳＴ４０２０  Ｓｍａｌｌ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｓｔａｉｎｅｒ（バッチ染色器）、Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０２０  Ｍｕｌｔｉｓｔａｉｎｅｒ（バッチ染色器）、およびＬｅｉｃａ  ＳＴ５０１０  ＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＸＬシリーズ（バッチ染色器）Ｈ＆Ｅ染色器が含まれる。
【００７１】
一部の実施態様では、本開示の染色システムは、検体を載置した基材（例えばスライド）の処理、染色およびカバーガラス取付けの工程の全てまたは一部を実施するように適合され得る。一部の実施態様では、生物学的検体を載せたスライドをスライドトレイ上に置き、試料スライドを載せたスライドトレイをシステムにロードし、そこで、スライドをベーキングし、脱ワックスし、染色し、最後にカバーガラスを取付けるという一連の工程を通してスライドは処理される。一部の実施態様では、本明細書に開示される方法は、病理学的分析のために、顕微鏡用スライド（または他の基材）上に組織試料を自動的に調製する方法であって、組織がスライドに接着するのに十分なほど器具で組織を加熱することにより、組織試料をスライド上にベーキングすることと、組織試料と脱パラフィン液とをパラフィンの融点を超える温度で接触させることにより、組織試料を脱パラフィンすることと、続いて、液化したパラフィンをすすぎ落とすことと、組織試料と染色試薬とを接触させることにより、組織試料を染色することと、スライド上の染色された組織試料と、予め接着剤を塗ってあるカバーガラスおよび接着活性化液とを接触させることにより、スライドにカバーガラスを取付けることとを含む、方法に関する。一部の実施態様では、本明細書に開示される方法は、前述の工程の一部のみを利用する。
【００７２】
検体処理装置は、例えば顕微鏡用スライドのような複数の基材を保持するためのカルーセルを備えていてもよく、各基材は染色される生物学的試料を含む。自動染色機はまた、カルーセルを所定の速度で回転させるための機器、ならびにカルーセルの回転中に、抗酸染色組成物を含む試薬を、基材および試料上に適用することを管理しかつ制御する機構を備えることもできる。いったんスライドを器具にロードすると、試験プロトコールが、どの試薬を特定の時間に基材上に分注するかを指示する。適切な時間で、ディスペンサーラックが回転して、正しい試薬を基材を覆うように調節し、器具により所定の量の試薬または液（例えばフェノールを含まない抗酸染色組成物）が基材上に分注される。
【００７３】
一部の実施態様では、システムは、複数のスライドを実質的に水平方向位置に保持するスライドトレイ（例えば、２列で、スライドが水平位置から約０．２°〜約１．２°の間の角度で保持されている）、およびスライドトレイを受け取り、スライドトレイ中のスライドに１つまたは複数のスライド処理操作を実施する、１つまたは複数のワークステーション（例えば、垂直方向に積み重ねて配置された）を備える自動スライド処理システムである。一部の実施態様では、ワークステーションは、例えば、スライドトレイ中の少なくとも２枚もしくは４枚のスライドのような、スライドトレイ中の１つもしくは複数の個々のスライドに、スライド処理操作を実施することができるか、または、スライドトレイ中の全てのスライドに、スライド処理操作を同時に実施することができる。一部の実施態様では、１つまたは複数のワークステーションは、第１のスライドと接触する試薬の相当量が、第２のスライドと接触することなく、スライドトレイ中のスライドに試薬を分注し、それにより、スライド間の相互汚染を最小限にする。そのようなワークステーションは、試薬をスライド上に分注する１つまたは複数の方向指示ノズルを備えることができ、例えば、１つまたは複数の方向指示ノズルは、スライドの表面にわたり、試薬を反対方向に分注する１対の方向指示ノズルを備えることができる。より詳細な実施態様では、１つまたは複数の方向指示ノズルは、試薬をスライドの裏面部に向けて分注する方向指示ノズルをさらに備えることができる。他の詳細な実施態様では、１つもしくは複数のワークステーションは、試薬（例えば、同じ試薬）を、所与のワークステーション内のスライドトレイに保持された少なくとも２枚のスライドに同時に分注することができるか、または１つもしくは複数のワークステーションは、試薬（同じ試薬など）を、所与のワークステーション内のスライドトレイに保持された全てのスライドに同時に分注することができる。さらなるシステム成分およびトレイ構成（同様に制御システム）は、米国特許第８，６６３，９９１号、同第７，４６８，１６１号、および同第９，５２８，９１８号に記載されており、その開示は、それらの全容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
一部の実施態様では、検体処理装置は、所定の量の抗酸染色組成物を生物学的試料に分注するように構成される。一部の実施態様では、検体処理装置は、少なくとも約１００マイクロリットルの抗酸染色組成物を生物学的試料に分注するように構成される。他の実施態様では、少なくとも約１５０マイクロリットルの抗酸染色組成物が、生物学的試料に分注される。さらに他の実施態様では、少なくとも約２００マイクロリットルの抗酸染色組成物が、生物学的試料に分注される。さらなる実施態様では、約２００マイクロリットル〜約５００マイクロリットルの間の抗酸染色組成物が、生物学的試料に分注される。
【００７５】
一部の実施態様では、自動検体処理装置は、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを所定の温度および／または所定の時間加熱するように、加熱または冷却機器（導電ヒーターまたはペルティエ素子など）を備える。スライド加熱機器の好適な例は、米国特許第７，４２５，３０６号および同第６，５８２，９６２号に記載されており、その開示は、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施態様では、試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、約３０℃〜約４５℃の範囲の温度まで加熱する。他の実施態様では、検体処理装置は、生物学的試料または抗酸染色組成物の少なくとも１つを、約３５℃〜約４０℃の範囲の温度まで加熱する。一部の実施態様では、検体処理装置は、試料または染色組成物を、本明細書に記述される期間、例えば１０分〜４０分の間加熱することがある。一実施態様では、検体処理装置は、生物学的試料または抗酸染色組成物を約１２分間インキュベートする。別の実施態様では、検体処理装置は、生物学的試料または抗酸染色組成物を約１６分間インキュベートする。さらに別の実施態様では、検体処理装置は、生物学的試料または抗酸染色組成物を約２０分間インキュベートする。
【００７６】
一部の実施態様では、検体は、例えばスライドから抗酸染色組成物を除去するかまたは洗浄するようなさらなる処理の前に、続いて放冷される。一部の実施態様では、スライド処理装置は、約１分〜約２０分の範囲の「放冷」時間を提供するものもある。一部の実施態様では、放冷時間は、持続して約８分である。
【００７７】
検体処理装置はまた、抗酸染色組成物を生物学的試料に分注する前および後の両方に、他の液および／または試薬を適用するように構成されてもよい。実際、検体処理装置は、限定されることなく、染色液、プローブ、試薬、リンス、および／もしくはコンディショナー、または本明細書に記載される任意の他の液および／もしくは試薬を含む広範囲の物質を、検体に適用することができる。プローブは、検出可能な標識に結合された、単離された核酸または単離された合成オリゴヌクレオチドであり得る。標識は、放射性同位体、酵素基質、補助因子、リガンド、化学発光剤または蛍光剤、ハプテン、および酵素を含み得る。一部の実施態様では、検体処理装置は、例えば、特定の標的細菌に特異的な１種または複数の抗体と共にインキュベートし、かつ標識（抗体上の標識または標識された二次抗体の使用を介するなど）を使用して検出されることによるようなイムノアッセイの実施を容易にする。例示的な検出可能な標識には、フルオロフォア、ハプテン、酵素、放射性標識、および当技術分野で公知の他のものが含まれる。
【００７８】
検体処理装置は、脱色溶液、二次染色液を生物学的試料に適用するようにさらに適合されてもよい。一部の実施態様では、脱色溶液はアルコールおよび酸を含むこともある。好適な脱色組成物およびそれらの適用方法（手動および自動検体処理装置の使用による両方）は、米国特許第９，０２３，６１５号に開示されており、その開示はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施態様では、検体処理装置は、染料および弱酸を含む二次染色液を適用してもよい。一部の実施態様では、約２００マイクロリットル〜約５００マイクロリットルの間の脱色溶液および／または二次染色液のいずれかを生物学的試料に分注する。
【００７９】
一部の実施態様では、検体処理装置は、他の微生物アッセイを容易にする。例えば、試料は、１種または複数の以下の染色液：アルシアンブルー、過ヨウ素酸シッフ反応（ＰＡＳ）用のアルシアンブルー、アルシアンイエロー、コンゴレッド、ジアスターゼ、エラスティック、ギムザ、グロコットのメテナミン銀染色液（ＧＭＳ）ＩＩ、鉄染色、ジョーンズライトグリーン、ジョーンズ、ＰＡＳ用のライトグリーン、ムチカミン（Ｍｕｃｉｃａｍｉｎｅ）ＰＡＳ、細網線維染色、シュタイナーＩＩ、トリクロムブルー、およびトリクロムグリーンなどの１種または複数の他の染料と接触させることができる。
【００８０】
一部の実施態様では、検体が、パラフィンに包埋された試料である場合、試料を、検体処理装置で適切な脱パラフィン液（複数可）を使用して脱パラフィンすることがある。一部の実施態様では、検体処理装置の廃棄物除去機器が任意の脱パラフィン液（複数可）を除去した後、任意の数の物質を、連続して検体に適用することがある。該物質は、前処理（例えば、タンパク質架橋、核酸の露出など）、変性、ハイブリダイゼーション、洗浄（例えば、ストリンジェンシー洗浄）、検出（例えば、可視またはマーカー分子をプローブに結合する）、増幅（例えば、タンパク質、遺伝子などの増幅）、対比染色、カバーガラス取付けなどのためのものであり得る。
【００８１】
本明細書に記載の手順に基づいて染色された生物学的検体の分析は、自動で、コンピュータ解析および／または画像解析システムにより容易となり得る。一部の実施態様では、光学顕微鏡が画像解析に利用される。特定の開示された実施態様は、デジタル画像を取得することを含む。これは、デジタルカメラを顕微鏡（例えば明視野顕微鏡）と接続することにより実行することができる。染色された試料の得られたデジタル画像を、画像解析ソフトウェアを使用して解析する。試料はまた、定性的にかつ半定量的に評価することもできる。定性的判定には、染色強度を判定すること、陽性染色細胞および染色に関わった細胞内区画を特定すること、ならびに全般的な試料またはスライドの質を評価することが含まれる。試験試料に対する別々の評価が実施され、この解析は、公知の平均値との比較を含み、試料が異常な状態を示しているかどうかを決定することができる。
【００８２】
キット
本開示はまた、抗酸染色組成物を含むキットも提供する。一部の実施態様では、キットは、抗酸染色組成物および追加の成分を含む。他の実施態様では、キットは、抗酸染色組成物および少なくとも１種の脱色溶液（例えば、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺから入手可能なＡＦＢ  脱色剤  ＩＩ）  または二次染料溶液（例えば、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺから入手可能なＡＦＢ  ＩＩＩ  Ｂｌｕｅ）を含む。さらに他の実施態様では、キットは、抗酸染色組成物、脱色溶液、および二次染料溶液を含む。一部の実施態様では、キットのそれぞれの成分は、別々の容器で維持される。一実施態様では、キットは、第１の組成物として本明細書に開示される抗酸染色組成物を含み、脱色溶液および二次染料溶液を、それぞれ別々の容器内でさらに含む。
【００８３】
一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、１つの容器で提供される。一部の実施態様では、容器は、検体処理装置で使用されるように構成されている。例えば、容器は、ＮｅｘＥＳ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｔａｉｎｅｒ（「ＮｅｓＥＳ  ＳＳ」）またはＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｔａｉｎｅｒ（「ＢＫＭＫＳＳ」）などの、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．の機器での使用に適合しているものであり得る。一部の実施態様では、抗酸染色組成物は、検体処理装置で使用されるディスペンサーで提供される。
【００８４】
一部の実施態様では、キットはまた、試料を載置し、かついくつかの例では固定するのに好適なスライドなどの１つまたは複数の顕微鏡用スライド、同様にカバーガラス、ピペット、またはこれらの組み合わせも備え得る。一部の実施態様では、キットは、追加的アッセイを実施するための追加的試薬を任意選択でさらに含み得る。例えば、キットは、１種または複数の以下の染色液：アルシアンブルー、過ヨウ素酸シッフ反応（ＰＡＳ）用のアルシアンブルー、アルシアンイエロー、コンゴレッド、ジアスターゼ、エラスティック、ギムザ、グロコットのメテナミン銀染色液（ＧＭＳ）ＩＩ、鉄染色、ジョーンズライトグリーン、ジョーンズ、ＰＡＳ用のライトグリーン、ムチカミンＰＡＳ、細網線維染色、シュタイナーＩＩ、トリクロムブルー、およびトリクロムグリーンを含む容器などの、他の染料、染色液、または対比染色液を含む１つまたは複数の器もしくは容器を備え得る。一例では、キットは、細菌特異的抗体を含む器または容器を備えるものもある。いくつかの例では、キットは、標識された二次抗体（例えば、フルオロフォアで標識された）を含む器または容器を備える。一部の実施態様では、キットは、生物学的試料中の抗酸菌を検出するための指示書を備える。他の実施態様では、キットは、検体処理装置と組み合わせて、抗酸染色組成物を使用するための指示書を備える。
【実施例】
【００８５】
実施例１
染色組成物比較研究
本開示の抗酸染色組成物を、従来のフェノール含有抗酸染色組成物に対して試験するために、研究を展開した。本研究は、０．２２ｗ／ｖ％（「低ＴＲＩＳ」）、０．３２％ｗ／ｖ％（「基準ＴＲＩＳ」）、および０．４３ｗ／ｖ％（「高ＴＲＩＳ」）を含む、ＴＲＩＳ塩基濃度の範囲にわたり調製された抗酸染色組成物が、フェノール含有抗酸染色組成物（例えば、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚｏｎａ、ＵＳＡから入手可能なＶｅｎｔａｎａ  ＡＦＢ  ＩＩＩ）（以後「ＡＦＢ  ＩＩＩ」）を使用する染色に少なくとも匹敵する、機能的染色をもたらすことを実証するために設計された。
【００８６】
種々の程度のＡＦＢ微生物感染を示す３つの組織例を、本研究用に選択した。それぞれの事例に関して、３組のニア−カットのスライド（１事例当たり６枚のスライド＝１実験当たり合計１８枚のスライド）を使用して、盲検ペアにおける１枚のスライドに対する他の１枚に関して、病理学者の選択を判定した。スライドを、ＡＦＢ  ＩＩＩまたは本組成物の１つのいずれかで染色した。染色されたスライドを、９５％試薬アルコール、１００％試薬アルコール、および１００％キシレンのそれぞれでの２回のリンスを通して脱水した。スライドにカバーガラスを取付けた。全てのスライドを、例えば、「低ＴＲＩＳ」および「基準ＴＲＩＳ」で染色されたスライドを有するスライドペア、または「基準ＴＲＩＳ」および「高ＴＲＩＳ」で染色されたスライドを有するスライドペアのように、ペアで可視化した。異なる検体処理システム、すなわち、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｔａｉｎｓ自動染色器（ＢＭＫＳＳ）およびＮｅｘＥＳ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｔａｉｎｅｒ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．  Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺから入手可能）に関するそれぞれの実験内で、合格した／不合格したスライドの総数を数えることにより、「合格」／「不合格」の決定を行い、合格／不合格は、スライドペア中の１枚のスライドが、ペア中のもう１枚のスライドと比べて選択されるかまたは選択されないかを判定することにより決定された。
【００８７】
ＢＭＫＳＳに関して、各病理学者は、高ＴＲＩＳ−基準ＴＲＩＳ（すなわち０．３２ｗ／ｖ％）に関するペア当たり１８／１８のスライドを合格とし、一方、低ＴＲＩＳ−基準ＴＲＩＳのペアに関して、それぞれ１７／１８のスライドを合格とした（図１を参照されたい）。単一の不合格したスライドは、病理学者の見解によると、脱色剤が針生検サイズの組織と接触しなかった結果であると考えられ、フェノール非含有染色組成物それ自体の不合格に起因するものではない。ＮｅｘＥＳ  ＳＳに関しては、全てのスライドが合格した（図２を参照されたい）。病理学者はまた、「基準ＴＲＩＳ」で染色されたスライドおよびＡＦＢ  ＩＩＩで染色されたスライドも評価した。図３に示されるように、病理学者は、「基準ＴＲＩＳ」で染色されたスライドを選択した。
【００８８】
実施例２
加速安定性研究
６０℃における加速条件下で、それぞれの入手可能な販売者ロットの原料を使用して調製された３つのＤＬを使用して、新規の抗酸染色組成物の初期製品寿命推定（ＩＰＤ）を確立するように、研究を開発した。研究では、個々の抗酸染色組成物成分の濃度を変えなかった。
【００８９】
材料
組織の必要条件：本研究で使用されたそれぞれの組織ブロックを、ＡＦＢ陽性に関して、各ブロックから切断される合計５４〜１００枚のスライド（過剰の切断を含む、特定のブロックに依存する数）について認定した。再実験を含み、合計１８３枚のスライドを染色した。
【００９０】
組織切断ブラケッティング：それぞれのブロックの１枚目および２５枚目ごとのスライドを、市販されているＡＦＢ染色キットで染色して、次の時間点における登録のための適格性を決定した。全てのスライドは、ＡＦＢ陽性微生物の存在を示し、合格した。次に、０日目に、スライドを染色して評価した。０日目のスライドの読み取り後、染色の矛盾および組織の質の問題により、本研究からブロック３を除外することを決定した。ブロック３を、そのような矛盾が最初のブロック（１〜４）内に発見された場合の予備と意図されていたブロック５と置き換えた。
【００９１】
対照：特定の週ごとの時間点のそれぞれにおけるペア比較に使用されるベースライン対照を、本研究の０日目に調製した。対照として染色される合計４５枚のスライドが必要とされた。しかしながら、９枚の追加的な０日目スライドは、ラベル付け問題のために、間違った設計ロットを受けていたことが後に確認されたため、０日目以降に染色されなければならなかった。適切な参照例を、正しい設計ロットで染色し、意図したように使用した。周囲条件下で保管された溶液を使用した分析試験および機能的染色は、研究過程にわたり間違いが発見されるまで（１か月）、ＡＦＢ染色の性能または組成に変化を示さなかったため、新しい参照例スライドの使用は適切であった。
【００９２】
バルク試薬：以下のバルク試薬材料を使用した。これらの試薬に関して、ロット制限はなかった。
ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｔａｉｎｓ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ，  Ｐ／Ｎ  ８６０−０３４
ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｔａｉｎｓ  Ｔｗｏ  Ｐａｒｔ  Ｗａｓｈ  Ｋｉｔ，  Ｐ／Ｎ  ８６０−０４０
ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｔａｉｎｓ  Ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （１０Ｘ），  Ｐ／Ｎ  ８６０−０３６
【００９３】
機器
ハードウェア／ソフトウェア：単一の、適切に維持されたＢＭＫＳＳ器具を、本研究における全ての機能的染色に使用した。
【００９４】
環境チャンバ温度：較正の範囲内の適切なセンサーを使用して、試験中の実際の温度を追跡し記録した。全ての温度条件を、５℃の可動域内に維持した。最大温度条件の６０℃で保管されたＡＦＢ染色設計ロットは、本研究の過程にわたり維持され、初期製品寿命推定を確立するのに使用された。広範囲の条件にわたる適切な性能を確認するために、他の温度条件を本研究に含んだが、製品寿命推定を確立するためには使用しなかった。
【００９５】
加速安定性設計
アレニウスモデルを使用する場合、試薬劣化は、考えられる温度範囲にわたって一次反応速度式により大きく支配される単純なプロセスであると仮定する。また、Ｑ則は、加速安定性研究に使用する適切な温度を特定するのに有用である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＆  Ｓｃｏｔｔ、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．１９９１年、３７、３９８を参照されたい）。Ｑ則では、製品劣化速度は、保存温度が１０℃変化する場合、一定の因子により変化する（温度が１０℃上昇するごとに、反応速度はほぼ２倍になる）と述べられている。Ｑの値を、典型的には２、３、または４に設定した。２のＱ値が最も保守的なモデルであり、これを本研究で使用した（表３を参照されたい）。
【００９６】
「試験条件」を、特定のストレス条件下における特定の設計ロット溶液と規定した（例：６０℃において３週目に試験した設計ロット２は、特定の「試験条件」である）。試験条件を、許容基準に基づいて合格または不合格と考えた。安定性プロトコールで不合格とするためには、２つの連続的試験条件が不合格とならなければならない。任意の１つのパラメータに関して、２つの連続した時間点において、特定の試験条件が不合格とならない限り、プロトコールの特定の終点に到達するまで、加速安定性試験を継続した。
【００９７】
３つの設計ロットの試薬を、各試験条件に関して評価した。各設計ロットを、個々の器具試薬ボトルに等分し、各設計ロットに関して１２本のボトルをそれぞれの温度条件において保管した。温度条件は、−２０℃、周囲温度、４０℃、および６０℃であった。これで、試験用に合計９本のボトル（０日目に１本のボトルおよびさらなる８本のボトル、その後の週毎に１本）が可能となり、３本の余分のボトルは、不測の事態のために残した。各ボトルを、試薬情報および保存温度についてラベル付けした。試料を、それぞれの時間点において、分析試験のためにボトルから取りだし、次に、ボトルに、機能的染色における使用のためのストッパーおよび管を取り付けた。各評価パラメータが、６０℃で８週目の時間点において許容範囲内であると判定された場合、アレニウスモデルでは、９１週のリアルタイム安定性が予測される。
【００９８】
加速試験を、各設計ロットに関して、０日目の各評価パラメータの試験から開始した。０日目以降には、試験頻度は、試験を行うパラメータに依存した（表４を参照されたい）。染色のためにそれぞれの時間点では、３枚のスライドを複製した。０日目に染色されたスライドを、有資格のリーダーにより評価して、染色が許容されるかどうかを判定した。全ての時間点において、分析試験を実施した。
【００９９】
不合格が、試験下の試薬以外の何かに起因し得る場合、実験は、無効（不合格ではなく）と考えられた。例には：スライド乾燥、カバーガラスの取り付け不合格、組織の問題（劣化、切断）、器具もしくは試薬のバイアル不調、プロトコールプログラム上のエラー、またはスライドのラベル付け／問題が含まれるが、これらに限定されない。有効性情報は、各スライドに関して記録されなかった。
【０１００】
結果および考察
加速安定性試験を使用して、弱塩基（例えばＴＲＩＳ塩基）および親油性薬剤としての界面活性剤を含有し、かつ外部販売業者から供給されるフェノールを含有する市販のＡＦＢ染色液に取って代わることを意図する、本開示のフェノール非含有ＡＦＢ染色の初期製品寿命推定を確立した。−２０℃〜＋６０℃の範囲の各温度条件下で保管された設計ロットのＡＦＢ染色溶液の性能は、病理研究室およびＡＦＢに関して有資格のリーダーにより独立して評価されて、８週の加速安定性研究（９１週と同等）の全過程を通して同等であった。これらの結果に加えて、本研究中に実施された分析試験（各方法に関して表２を参照されたい）により、いかなる温度条件下においても、予め定義された不合格限度に近づいたパラメータはなかったことが実証された。ｐＨに関して、全ての測定値は、０日目から１ｐＨ単位内であった（図４）。同様に、ＨＰＬＣおよびＵＶ−Ｖｉｓデータにより、ニューフクシン染料濃度に有意な変化はなかったことが実証された（図５〜８）。最終的に、ＴＲＩＳ塩基の代わりにＫＯＨ塩基を含有するＡＦＢ染色製剤にこれまで繰り返し観察されてきた染料劣化（酸化）の徴候は、本研究において評価されたあらゆる条件下で観察されなかった。
【０１０１】
結論
本研究の過程で実施された分析試験または機能的染色のいずれも、試験された任意の４つの条件に関して（ＡＦＢ染色設計ロット溶液の、−２０℃、周囲温度、＋４０℃、および＋６０℃の８週間の保存）、不合格限度に近づいたものはなかった。生成されたデータは、６０℃の条件に対するアレニウスモデルを使用して、９１週までの初期製品寿命推定を支持している。全般に、劣化の徴候は、本開示のＡＦＢ溶液に関して、物理的不合格または化学的不合格のストレスを与えるいずれかのいかなる状況下でも観察されなかった。本研究は、本開示のＦＢ染色製剤の適切な機能を実証することにより、初期製品寿命推定を確立した。
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【０１０２】
追加の実施態様
一部の実施態様では、染色システムは、本明細書に記載の構成要素に加えて構成要素を含む。本システムおよび方法に組み込まれてもよい追加の実施態様、特色、システム、機器、材料、方法、および技術は、米国特許第８，９１１，８１５号；同第９，４９８，７９１号；同第９，６１８，４３０号；同第７，４６８，１６１号；および同第６，３５２，８６１号に記載されており、その開示は、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。染色システムのさらに追加の構成要素は、米国特許第７，３０３，７２５号、同第８，０４８，３７３号、同第９，５２８，９１８号、および同第９，１９２，９３５号に記載されており、その開示は、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
一部の実施態様では、染色システムは、バルク液容器を備える（例えば、試料に分注するかまたは適用する前に、本明細書に記載の任意の溶液を保持するため）。一部の実施態様では、スライド処理装置を備え、一部の実施態様では、複数の追加の染色モジュールおよび各染色モジュールを独立して制御するように構成されたコントローラをさらに備える。
【０１０４】
一部の実施態様では、染色システムは、例えば、塔状に配置されている、１つまたは複数の乾燥またはベーキング用ステーションまたはモジュール、脱ワックスまたは脱パラフィン用ステーションまたはモジュール、１つまたは複数の染色用ステーションまたはモジュールおよびカバーガラス取付け用ステーションまたはモジュールを備える積み重なったワークステーションを支持するフレームを備え得る。一部の実施態様では、輸送およびエレベータ機構が、乾燥／ベーキング、脱ワックス、染色、カバーガラス取付け操作を通して、個々の検体を載せた複数のスライドを運ぶように設計されたスライドトレイを、トレイ保存ステーションから輸送するために、塔に隣接して提供される。
【０１０５】
一部の実施態様では、トレイ保存用ガレージまたはステーションは、スライドトレイを収容するための、垂直方向に間隔をあけて配置された複数の棚またはスキッドを担う１対の支柱を備える。一部の実施態様では、保存ステーションまたはガレージは、第１の棚位置（明確にするために、ガレージに対する外壁またはカバーは省いてある）にアクセスできる、枢着されたドアを備える。駆動モータおよび伝動装置により駆動される、回転可能に載置された１対の駆動輪を備えて一般に示されるトレイ駆動アセンブリは、トレイをポータルに入れかつ出すように動かすために第１の棚位置下に位置する。
【０１０６】
一部の実施態様では、スライドトレイは、底壁、対向する側壁および対向する端壁を備える、一般に長方形のプラン（ｐｌａｎ）を有する、パンまたはスライドトレイを備える。スライドトレイは、典型的には、当技術分野で公知の、そのような使用を意図する合成ポリマーを使用して、従来の射出成形により形成される。
【０１０７】
一部の実施態様では、トレイは、検体スライドを、略水平位置に同一平面中に保持するための、検体スライド支持ラックを備える。全てのスライドを同一平面中に保持することにより、以下に記載するように、ベーキングおよび乾燥が容易となり、また、以下に記載するように、脱パラフィンおよび染色中のスライドの相互汚染が防止される。一部の実施態様では、ラックは、検体スライドがスライドトレイ上にいったん置かれると、その軸方向、横方向および垂直方向の移動を制限する、複数のスライドのバネ支持体を備える。一部の実施態様では、ラックは、トレイ底部の上に、検体スライド底部とトレイ底部との間に、膜または泡の形成を妨害するかまたは防止するのに十分な高さで支持される。一部の実施態様では、スライドバネ支持体は、検体スライドの対向する端部に力を加えることにより、個々の検体スライドを所定の位置に保持する。スライドトレイの床部は中央部に向かって傾斜しており、以下で詳細に記載するように、脱ワックス液および染色液の排出用に、中心位置への排水を容易にする。一部の実施態様では、トレイは、乾燥／ベーキング、脱パラフィン、染色、カバーガラス取付けの工程を通して、複数の検体スライドの自動取扱いを可能にする。一部の実施態様では、トレイはスプラッシュレールを備え、一般に水平グリッドに２枚のスライドの幅でかつ８枚のスライドの高さで配置された１６枚の検体スライドを収容するように配置されている。
【０１０８】
染色モジュールは、第１の側壁、第２の側壁、または両方を伝導的に加熱するように位置する、少なくとも１つの加熱要素を備え得る。スライドホルダーは、液バンドが検体にわたり操作される間に、スライド、検体、および／または液を加熱するために使用され得る。
【０１０９】
コントローラは、一部の実施態様では、１つまたは複数のメモリおよびプログラム可能なプロセッサを備える。メモリは、プログラム命令の第１のシーケンスおよびプログラム命令の第２のシーケンスを記憶する。プログラム可能なプロセッサは、スライド上の検体を第１の液で処理するためにプログラム命令の第１のシーケンスを実行するように構成され、かつ検体を、第１の液とは異なる第２の液で処理するためにプログラム命令の第２のシーケンスを実行するように構成されている。一部の実施態様では、プログラム可能なプロセッサは、スライドを加熱するためにプログラム命令の第１のシーケンスを実行するように構成され、かつコントローラは、スライドを第２の温度まで加熱するために、プログラム命令の第２のシーケンスを実行するように構成されており、第２の温度は、第１の温度とは異なる。
【０１１０】
コントローラは、一部の実施態様では、第１の液をスライドまで第１の速度で送達するように、分注機器に指令するために、プログラム命令の第１のシーケンスを実行するように構成されている。コントローラは、第２の液をスライドまで、第１の速度とは異なる第２の速度で送達するように、分注機器に指令するために、プログラム命令の第２のシーケンスを実行するように、さらに構成されている。
【０１１１】
本明細書に記載されるおよび／または出願データシートに列記される、全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。実施態様の態様は修正され、必要ならば、様々な特許、出願および刊行物の概念を採用して、またさらなる実施態様を提供することができる。
【０１１２】
本開示は、多くの例示的実施態様に関連して記載されているが、多くの他の修正および実施態様が当業者により考案され得て、それらは本開示の原理の趣旨および範囲内に入ることが理解されよう。より詳細には、理にかなった変更および修正が、主題の組み合わせ配置の構成部分および／または配置において、前述の開示、図、および添付の特許請求の範囲の範囲内で、本開示の趣旨から逸脱することなく可能である。構成部分および／または配置における変更および修正に加えて、代替的使用もまた、当業者には明白であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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