(57)【要約】本発明は、抗癌治療のプロバイオティクスアジュバント化の分野に関する。特に、本発明は、癌治療の効率的なアジュバントとして同定された細菌中に存在するプロファージ由来の免疫原性配列に関する。本発明はこのプロファージ由来の免疫原性配列を発現する細菌組成物、このような配列を含む免疫原性組成物、およびこのプロファージ由来の配列を使用する方法を提供し、抗癌武器を増加させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗腫瘍薬と組み合わせて癌を治療する際に使用するための少なくとも１つの天然に存在する細菌株または操作された細菌株を含む細菌組成物であって、前記少なくとも１つの細菌株が、配列番号１のタンパク質、または配列番号１３、１４、５３〜１８８および２０９からなる群より選択される少なくとも１つのエピトープを含む少なくとも９個、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸の、配列番号１のタンパク質のフラグメントを発現するものであって、ただし、前記少なくとも１つの細菌株は、２０１３年１１月７日に番号Ｉー４８１５でＣＮＣＭに寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株１３１４４とは異なる、細菌組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの細菌株が、配列番号１のタンパク質と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質をコードするプロファージゲノムを含む、請求項１に記載の使用のための、請求項１に記載の細菌組成物。
【請求項３】
前記組成物が、配列番号２のプロファージと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するプロファージゲノムを保有する少なくとも１つの株を含み、その結果、このプロファージによってコードされるファージが、それを必要とする対象の腸内細菌叢の組成物の他の株および／または共生細菌にインビボで感染することができる、請求項１に記載の使用のための、請求項１または２に記載の細菌組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌組成物であって、前記組成物が、以下からなる群から選択される細菌を含む、細菌組成物：
（ｉ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５、
（ｉｉ）２０１７年８月３１日に番号Ｉ−５２２４でＣＮＣＭに寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株ＩＧＲ７、
（ｉｉｉ）２０１７年１１月２７日に番号Ｉ−５２６１でＣＮＣＭに寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株ＩＧＲ１１、
（ｉｖ）配列番号１のタンパク質由来の少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０およびより好ましくは少なくとも４０ヌクレオチドのフラグメントと少なくとも６５％、好ましくは少なくとも８０％およびより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を発現する他の任意の細菌株、ならびに
（ｖ）（ｉ）から（ｉｖ）に記載された株の少なくとも２つの混合物、好ましくは（ｉ）および（ｉｉ）に記載された株の混合物。
【請求項５】
前記組成物が、２０１７年１１月２７日に番号Ｉ−５２６０でＣＮＣＭに寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株ＩＧＲ４をさらに含む、請求項１に記載の使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌組成物。
【請求項６】
細菌株の免疫原性を増加させる方法であって、前記株に、配列番号１のタンパク質をコードするヌクレオチド配列または配列番号１３および１４のペプチドを少なくとも含むそのフラグメント、または配列番号５３〜１８７からなる群から選択される少なくとも１つのエピトープを含む少なくとも９アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸のペプチドをコードする配列、または配列番号２０９の少なくとも１つのエピトープを含む少なくとも９アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸のペプチドをコードする配列をインビトロで導入することを含む、方法。
【請求項７】
前記株の細菌を、配列番号１のタンパク質と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質をコードするバクテリオファージでインビトロ感染させることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記バクテリオファージが、配列番号２のヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むゲノムを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
癌の治療に使用するための、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法によって得られた、操作された細菌株を含む細菌組成物。
【請求項１０】
前記細菌株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅからなる群から選択される、請求項９に記載の使用のための、請求項９に記載の細菌組成物。
【請求項１１】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１患者における癌の治療における使用のための、請求項９または１０に記載の細菌組成物。
【請求項１２】
癌の治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ  ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５を含む細菌組成物および請求項１〜５および９〜１１の細菌組成物を含む細菌組成物からなる群から選択される細菌組成物であって、前記細菌組成物は、前記組成物の少なくともいくつかの細菌に存在するプロファージによってコードされるファージの溶解サイクルを誘発することができる抗腫瘍薬と組み合わせて使用される、細菌組成物。
【請求項１３】
前記細菌組成物がＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせて使用される、請求項１２に記載の使用のための、請求項１２に記載の細菌組成物。
【請求項１４】
前記細菌組成物が免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用される、請求項１２または１３に記載の使用のための、請求項１２に記載の細菌組成物。
【請求項１５】
抗癌ワクチンとして使用するための、配列番号１のタンパク質からの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列または配列番号２０９の配列を含むポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物。
【請求項１６】
配列番号１のタンパク質からの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列が、配列番号５３〜１８７からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用のための、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１患者における抗癌ワクチンとして使用するための、配列番号６３、配列番号１８８および配列番号２０９からなる群より選択される配列を含むペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１５または１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
請求項１〜５および９〜１２のいずれか一項に記載の細菌組成物で、または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物でエクスビボでパルスされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞組成物。
【請求項１９】
ＭＨＣ分子が、配列番号５３〜１８８および配列番号２０９からなる群より選択されるエピトープに結合されることを特徴とする、配列番号１のタンパク質に対して高い親和性を有するＴ細胞を単離するためのＭＨＣマルチマー。
【請求項２０】
配列番号６３、配列番号１８８または配列番号２０９の別の配列を含む抗原ペプチドを負荷したＨＬＡ−Ａ＊０２０１マルチマーである、請求項１９に記載のＭＨＣマルチマー。
【請求項２１】
癌の治療に使用するためのバクテリオファージ組成物であって、前記バクテリオファージが、配列番号１のタンパク質と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を発現する、バクテリオファージ組成物。
【請求項２２】
前記バクテリオファージが、配列番号２のヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むゲノムを有する、請求項２０に記載の使用のための、請求項２１に記載のバクテリオファージ組成物。
【請求項２３】
前記組成物が免疫チェックポイントを遮断する薬物と組み合わせて投与される、癌の治療に使用するための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物、または請求項１８に記載の細胞組成物、または請求項１９もしくは２０に記載のＭＨＣマルチマーで単離されたＴ細胞、または請求項２１もしくは２２に記載のバクテリオファージ組成物。
【請求項２４】
対になった正常組織において発現されるレベルよりも優れたＧＰＤ１ＬのｍＲＮＡレベルを発現する腫瘍を治療する際に使用するための、請求項１〜５および９〜１２のいずれか一項に記載の細菌組成物、または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物、または請求項１８に記載の細胞組成物、または請求項１９もしくは２０に記載のＭＨＣマルチマーで単離されたＴ細胞、または請求項２１もしくは２２に記載のバクテリオファージ組成物。
【請求項２５】
抗腫瘍薬を同定するためのスクリーニング方法であって、配列番号１のタンパク質を含むファージの溶解サイクルを誘発する薬物候補の能力を評価するために、ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５株、または配列番号２のプロファージと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％または９５％の同一性を有するプロファージゲノムを保持する任意の他の細菌株からの細菌を使用することを含む、スクリーニング方法。
【請求項２６】
癌を有する患者が化学療法または免疫チェックポイント遮断による治療に対して良好な応答者である可能性があるかどうかを決定する方法であって、前記患者由来の生物学的試料において、配列番号１のタンパク質と少なくとも８０％の同一性を有する配列の存在を評価することを含み、そのような配列が前記試料中に存在する場合、前記患者は、前記治療に応答する可能性がある、方法。
【請求項２７】
（ｉ）腸球菌コロニーの単離を可能にするために、許容培地中で好気性条件下で前記患者からの糞便試料を培養するステップ、
（ｉｉ）配列番号１のフラグメントに特異的なプライマー対を用いていくつかの培養可能な単離コロニーにおいてＰＣＲを実施するステップ、および
（ｉｉｉ）増幅されたフラグメントを検出するステップ
を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２８】
患者が化学療法または免疫チェックポイント遮断による治療に対する良好な応答者である可能性が高いかどうかを決定する方法であって、診断時および／または前記治療中に循環ＣＣＲ９＋  ＣＸＣＲ３＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレベルを測定することを含み、前記レベルが所定の閾値を超える場合、前記患者は治療に応答する可能性が高い、方法。
【請求項２９】
前記患者由来の生物学的試料中の、配列番号１のタンパク質に特異的なＴ細胞の存在を評価するために、請求項１９または２０に記載のＭＨＣマルチマーを使用することを含む、請求項２８に記載の方法であって、ここで、このようなＴ細胞が前記試料中に存在する場合、前記患者は前記治療に応答する可能性が高い、方法。
【請求項３０】
前記患者がＨＬＡ−Ａ＊０２０１であり、ＭＨＣマルチマーが請求項２０に記載のものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
腫瘍中のＧＰＤ１Ｌ  ｍＲＮＡのレベルまたはＧＰＤ１Ｌタンパク質のレベルを評価することをさらに含み、前記レベルが所定の閾値を超える場合、前記患者は前記治療に応答する可能性が高い、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍を有する患者が、免疫チェックポイント遮断による治療に対する良好な応答者である可能性が高いかどうかを決定する方法であって、前記腫瘍におけるＧＰＤ１Ｌ  ｍＲＮＡのレベルまたはＧＰＤ１Ｌタンパク質のレベルを評価することを含み、ここで、前記レベルが所定の閾値を超える場合、前記患者は前記治療に応答する可能性が高い、方法。
【請求項３３】
前記患者が化学療法または免疫チェックポイント遮断による治療に対する良好な応答者である可能性が高いと同定されない場合、化学療法または免疫チェックポイント遮断による治療に対する前記患者の応答を増大させるために、請求項１〜５および９〜１２のいずれか一項に記載の細菌組成物または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物が前記患者に投与される、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、抗癌治療のプロバイオティクスアジュバント化の分野に関する。特に、本発明は、癌治療の効率的なアジュバントとして同定された細菌中に存在するプロファージ由来の免疫原性配列に関する。本発明は、このプロファージ由来の免疫原性配列を発現する細菌組成物、およびこのプロファージの配列を使用して、抗癌武器を増加させる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
癌の発生および進行は、遺伝子調節と環境との複雑な相互作用に起因する（Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、２０１１）。腫瘍に浸潤する免疫細胞の密度、組成物、および機能状態が患者の予後、ならびにアジュバントまたはネオアジュバント化学療法（Ｉｎｇｏｌｄ  Ｈｅｐｐｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６；  Ｐａｌｕｃｋａ  ａｎｄ  Ｃｏｕｓｓｅｎｓ、２０１６）および免疫チェックポイント遮断薬（Ｈｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０；  Ｒｉｂａｓ、２０１５；  Ｒｏｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）に対する治療応答を決定することを明らかにする多くの研究によって示されるように、多くの上皮および造血腫瘍は、強力な免疫監視下にあると考えられている。免疫エフェクターによるがん細胞の認識は，２つのパラメータ、すなわち、抗原性（突然変異を生じたタンパク質を生じる突然変異に由来する腫瘍関連抗原の存在、または通常は胚発生または精巣にのみ存在する遺伝子／タンパク質の異所性発現）とアジュバント性（自然免疫エフェクターを活性化する補助刺激シグナルの存在）に依存している（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。腸ならびに体内の他の場所に生息する共生微生物群集は、未だ特徴付けられていない環境シグナルを提供することによって、腸および腸外発癌において評価されていない役割を果たしているようである（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。無菌、ノトバイオティクス、または抗生物質で処理したげっ歯類で行われた先駆的研究は、炎症の役割に関係なく、腫瘍形成における共生細菌の予想外の役割を明らかにしている。結腸癌または肝癌の発生において、微生物は、毒性代謝産物、発癌性産物を提供することによって、またはゲノム不安定性および／またはＤＮＡ損傷応答および／または免疫逃避に至る炎症性環境を誘導することによって（Ｇａｒｒｅｔｔ，  ２０１５；  Ｇｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５；  Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）、直接形質転換剤であり得る（Ａｂｒｅｕ  ａｎｄ  Ｐｅｅｋ，  ２０１４；  Ｓｅａｒｓ  ａｎｄ  Ｇａｒｒｅｔｔ，  ２０１４）。共生細菌はまた、交差摂食または交差代謝を促進する協調的バイオフィルムを形成し得、癌の景観を再定義する（Ｂｏｎｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；  Ｄｅｊｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。最近、腸外（乳房および卵巣）腫瘍の発生は、腸内微生物によって誘発されるＴＬＲ５媒介性ＩＬ−６またはＩＬ−１７駆動性全身性炎症と関連していた（Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。
【０００３】
対照的に、他の観察は、癌と戦う際の細菌の有益な役割を支持している。メトロニダゾールとシプロフロキサシンの併用による長期抗生物質治療はその後、原癌遺伝子ＨＥＲ２／ｎｅｕ駆動トランスジェニックマウスにおける乳癌（ＢＣ）発生率を３倍にした（Ｒｏｓｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。ヒトでは、疫学研究から、抗生物質の使用とＢＣのリスクとの間に用量依存的な関連性が示唆されている（Ｂｌａｓｅｒ，  ２０１１）。腸内細菌叢の有益な役割はまず全身照射を介して示され、養子Ｔ細胞移入の有効性を促進する抗原提示細胞のＬＰＳ／ＴＬＲ４依存性活性化を促進した（Ｐａｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。白金ベースの抗癌療法および免疫調節レジメンの間、細菌関連ＴＬＲ４アゴニストは腫瘍浸潤骨髄細胞のＲＯＳおよびＴＮＦα媒介抗腫瘍効果を説明した（Ｉｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３）。
【０００４】
アルキル化剤シクロホスファミド（ＣＴＸ）のメトロノミック投薬の抗腫瘍効果はまた、広域スペクトル抗生物質（ＡＴＢ）で処置された無菌動物または特定病原体除去動物において損なわれることが示された（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６；  Ｖｉａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。実際、ＣＴＸは腸関門の完全性を変化させ、別個のグラム陽性細菌の移行を促進した。細菌の移行は、共生腸内微生物が腸粘膜を通して下にある無菌の組織や器官に侵入したときに起こる。この現象により、グラム陽性菌は、腫瘍制御に関連するエフェクター病原性ＣＸＣＲ３＋  ＣＣＲ６＋（ＩＬ−１７＋ＩＦＮγ＋）Ｔｈ１７（略称、病原性ｐＴｈ１７）および記憶Ｔｈ１免疫反応を増強することができた。Ｅ．ｈｉｒａｅおよびＢａｒｎｅｓｉｅｌｌａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓは、ＣＴＸ後の腫瘍微小環境を再形成するために協調して作用する種として同定された。小腸内在性グラム＋細菌Ｅ．ｈｉｒａｅは腫瘍抗原特異的、ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞傷害性ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）、腫瘍内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の減少を誘導し、腫瘍制御に一般的に関連するＣＴＬ／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらした。結腸常駐のＧｒａｍＢ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓは全身性多機能性Ｔｃ１／Ｔｈ１応答を増強し、腫瘍内ＩＦＮγ産生γδＴ細胞を回復させ、腫瘍微小環境におけるγδＴ１７細胞、腫瘍制御に関連する形質を減少させた。これら２つの免疫原性共生細菌は、腸のＮＯＤ２受容体によってチェックされている。この受容体は細菌の蓄積（Ｂ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓについて）または二次リンパ器官への移行（Ｅ．ｈｉｒａｅについて）を制限している。さらに、ＣＴＸ＋癌ワクチン（ＨＰＶ−１６  Ｅ７抗原と融合した志賀毒素のＢサブユニット）は抗生物質治療と併用しても、もはやＥ７発現ＴＣ−１腫瘍に対して宿主を保護しなかったが、Ｅ．ｈｉｒａｅ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉまたはＥ．ｃｏｌｉではなく）の強制経口投与は、腫瘍拒絶に至るＥ７テトラマー結合ＣＤ８＋ＣＴＬの蓄積を回復させた。このモデルでは、Ｅ．ｈｉｒａｅは抗腫瘍効果を仲介した。最後に、マウスにおけるこれら２つの共生細菌の免疫調節的役割は、担癌患者に関連している。Ｅ．ｈｉｒａｅまたはＢ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓ（他の９種の共生細菌ではない）に対する記憶ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔｈ１免疫応答は化学療法歴のある末期肺がんおよび卵巣がん患者における無増悪生存期間の延長と関連していた（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。最近、Ｚｉｔｖｏｇｅｌおよびその他の者はこれらの知見を免疫チェックポイント遮断薬に拡張し、ＢａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓおよびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓまたはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目に属する異なる腸内細菌種が腫瘍微小環境に影響を及ぼし、それぞれ抗ＣＴＬＡ４または抗ＰＤＬ−１Ａｂの効力に寄与することを実証した（Ｓｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５；  Ｖｅｔｉｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。したがって、腸内細菌叢生態系は腸管免疫恒常性だけでなく、二次リンパ器官の炎症／免疫緊張を制御し、それによって体中の腫瘍微小環境を形成していると仮定さ���る。
【０００５】
転移したグラム陽性菌とＣＴＸ誘発殺腫瘍活性との因果関係を証明するために、ＤａｉｌｌｅｒｅらはＭＣＡ２０５肉腫を有するマウスにおいて、１０９のＥ．ｈｉｒａｅ（クローン１３１４４および他の分離株）、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉまたはコントロールの細菌をマウス腸にコロニー形成し、１４日間のＡＴＢレジメンにより腸内菌バランス失調を起こした。ＡＴＢはＣＴＸ媒介性の腫瘍進行の制御を妨げた。しかし、Ｅ．ｈｉｒａｅ株１３１４４（ＥＨ１３１４４）を強制経口投与すると、ＣＴＸを介した抗腫瘍効果が選択的に回復したが、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ分離株は腸内コロニー形成が同等であったにもかかわらず、そのようにはならなかった（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。彼らは次に、ＣＴＸ媒介抗腫瘍効果を増強することができる最良の抗癌プロバイオティクスを選択し、それが起こったメカニズムに取り組み、様々なＥ．ｈｉｒａｅ株を試験して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの特異的免疫原性およびそれらの「オンコミクロバイオティクス」（抗癌プロバイオティクス）特性を分析した。ｒｅｐ−ＰＣＲ法によりこれらのＥ．ｈｉｒａｅ分離株間のクローン関係を調べたところ、ヒト、マウスまたは環境生態系に由来する株間で有意なゲノムの多様性が明らかになった（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。分離株の半分はｐＴｈ１７およびＴｈ１免疫応答を誘導した；ただ１つのヒト分離株（クローン７０８）は、いくつかのオンコミクロバイオティクス特性に関連したナイーブマウスにおいて、ＩＦＮｇ産生ＣＤ８＋Ｔ（Ｔｃ１）細胞を誘導した。アドヒアランスアッセイにおいてｅｘ  ｖｉｖｏバイオフィルムを形成することができるＥ．ｈｉｒａｅ（クローンＥＨ１７）の唯一のヒト株は、免疫原性もオンコミクロバイオティクス特性もなかった（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。
【０００６】
Ｄａｉｌｌｅｒｅら（２０１６）の発表以来、本発明者らは、高い免疫原性を与え、抗腫瘍効果を示したヒト便由来のＥ．ｈｉｒａｅ（ＥＨ）の３つの新規クローン（クローンＩＧＲ７、クローンＩＧＲ４およびクローンＩＧＲ１１）を単離した。
【０００７】
要約すると、ＥＨ１３１４４、ＥＨクローンＩＧＲ７、および程度は低いがクローンＩＧＲ４およびクローンＩＧＲ１１はＣＴＸ処理動物の二次リンパ器官においてｐＴｈ１７細胞を誘導する有意な能力を発揮し、これは癌抗原特異的ＣＴＬ応答およびオンコミクロバイオティクス特性と関連していたが、ＥＨ１７株はそうではなかった。しかしながら、これらの相違の理由は未知であり、本発明者らは癌の治療に有用な新しい分子または微生物を誘導するために、マウス株ＥＨ１３１４４およびヒトクローンＩＧＲ４、ＩＧＲ７およびＩＧＲ１１の免疫原性特性に関与する因子を同定するための研究を追求した。
【０００８】
本発明者らはヒト患者の糞便から培養したいくつかのヒトＥ．ｈｉｒａｅ分離株をスクリーニングし、それらをヒトＥＨ７０８およびマウスＥＨ１３１４４と比較した。彼らは、抗ＰＤ１  Ａｂに反応した非小細胞肺癌患者の糞便からＥ．ｈｉｒａｅの新規隔離する１１株を培養した。ＣＴＸと共にＭＣＡ２０５腫瘍モデルで試験したこれらの１１の新規分離株の中で、クローンＩＧＲ４、クローンＩＧＲ１１はある程度有効であり、クローンＩＧＲ７は、併用した場合、ＣＴＸとの相乗作用、単独または最良に有効であった。
【０００９】
発明者らは、マウスＥＨ１３１４４がヒトクローンＩＧＲ７と非常に高い配列相同性を共有しており（＞２０ＥＨ株の樹状図では同じクレードに入る）、いずれもゲノム配列に挿入されたファージの存在に関連した独特の免疫原性を有する非常に特殊な分離株であることを見出した。彼らは、免疫原性がテンペレートバクテリオファージテールテープメジャータンパク質（ＴＭＰ）に依存することを同定した。さらに、ＥＨ１３１４４＋クローンＩＧＲ４＋クローンＩＧＲ７の組み合わせは、ＣＴＸと組み合わせた相加的抗腫瘍効果を示した。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の要約
第１の態様によれば、本発明は、以下からなる群から選択される細菌を含む細菌組成物に関する：
（ｉ）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に２０１３年１１月７日に番号Ｉ−４８１５で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株１３１４４（別名：ＥＨＦＳ００１）、
（ｉｉ）ＣＮＣＭに２０１７年８月３１日に番号Ｉ−５２２４で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株ＩＧＲ７、
（ｉｉｉ）ＣＮＣＭに２０１７年１１月２７日に番号Ｉ−５２６１で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株ＩＧＲ１１、
（ｉｖ）配列番号１のタンパク質（すなわち、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株１３１４４、ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５の顕著な免疫原性の原因であると同定されたプロファージのＴＭＰ）から少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも４０ヌクレオチドのフラグメントと少なくとも６５、好ましくは少なくとも８０、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を発現する他の細菌株、および
（ｖ）（Ｉ）〜（ｉｖ）に記載の株の少なくとも２つの混合物。
【００１１】
本発明はまた、癌を治療するための上記細菌組成物の使用に関する。
【００１２】
一実施形態によれば、本発明による組成物は癌を治療するために、抗腫瘍薬と組み合わせて使用される。
【００１３】
別の態様によれば、本発明は免疫原性であると同定されたフラグメントの配列番号１のタンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号１３および１４のペプチドを少なくとも含むフラグメント）、またはヒトＨＬＡ分子によって提示される可能性のあるエピトープ（例えば、配列番号５３〜１８７からなる群より選択されるエピトープ）の少なくとも１つを含む少なくとも９個、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸のペプチドをコードする配列を、抗癌細菌株にインビトロで導入することを含む、目的の抗癌細菌株の免疫原性を増加させる方法に関する。
【００１４】
上記の方法によって得られた細菌株もまた、本発明の一部であり、そして癌の処置におけるその使用である。
【００１５】
本発明はまた、抗癌ワクチンとして使用するための、配列番号１のＴＭＰ由来の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列を含むポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物に関する。
【００１６】
別の態様によれば、本発明は、本発明による細菌組成物または免疫原性組成物でex vivoでパルスされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞組成物に関する。
【００１７】
一実施形態によれば、本発明は配列番号１のタンパク質に対して高い親和性を有するＴ細胞を単離するためのＭＨＣマルチマーに関し、ここで、ＭＨＣ分子は、配列番号５３〜１８７からなる群より選択されるエピトープに結合される。
【００１８】
本発明はまた、バクテリオファージ組成物ならびに癌を治療するためのその使用に関し、ここで、該バクテリオファージは、配列番号１のタンパク質と少なくとも８０、好ましくは少なくとも９０およびより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を発現する。
【００１９】
一実施形態によれば、本発明は配列番号１のタンパク質を含むファージの溶解サイクルを誘発する薬物候補の能力を評価するために、ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５株由来の細菌を使用することを含む、抗腫瘍薬を同定するためのスクリーニング方法に関する。
【００２０】
本発明はまた、患者が配列番号１のタンパク質と少なくとも８０％の同一性を有する配列の、前記患者由来の生物学的試料における存在を評価することを含む、化学療法または免疫チェックポイント遮断による治療に対して良好な応答者である可能性があるかどうかを決定する方法に関し、ここで、このような配列が試料中に存在する場合、患者は、治療に応答する可能性がある。
【００２１】
本発明はまた、患者が化学療法または免疫チェックポイント遮断による治療に対して良好な応答者である可能性があるかどうかを決定する方法に関し、該方法は該治療の間に循環ＣＣＲ９＋ＣＸＣＲ３＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレベルを測定することを含み、該レベルが所定の閾値を超える場合、該患者は、該治療に応答する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実験設定。（Ａ）マウスには広域抗生物質（ストレプトマイシン、コリスチン、アンピシリンおよびバンコマイシン）を３日間投与してから、Ｆｅｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（ＦＭＴ）を実施する。ＦＭＴ後１４日目に、ＭＣＡ−２０５肉腫細胞株をマウスの右側腹部に接種する（マウスあたり８．１０５細胞）。化学療法（シクロホスファミド、ＣＴＸ−１００ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水（ＮａＣｌ）を、腫瘍接種の５日後に開始して、週１回ｉｐ注射し、合計３回注射する。Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４株（１．１０９菌）による経口強制経口投与を、ＣＴＸ注射の日およびその翌日に行う。（Ｂ）非ＦＭＴ処置ＳＰＦマウスを対照として使用する。
【図２】ＦＭＴ  ＢＣ患者１による腸内菌共生バランス失調：Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４のＣＴＸを介した抗腫瘍効果回復効果。３サイクルのＣＴＸ対ＮａＣｌを注射したＳＰＦマウス（Ａ）対ＦＭＴ処置マウス（Ｂ）におけるＭＣＡ−２０５肉腫の腫瘍増殖曲線。（Ｃ）対照としてＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４株またはＮａＣｌを強制経口投与した後のＦＭＴ処置マウスにおけるＭＣＡ−２０５肉腫の腫瘍増殖曲線。２つの独立した実験を示す。（Ｄ）Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４株を経口強制経口投与した後の、ＣＴＸまたはＮａＣｌで処置したＦＭＴ処置ＭＣＡ−２０５肉腫担持マウスの全生存率。典型的な生存曲線を、１群あたり６匹のマウスについて示す。（Ｅ）２つの独立した実験からのＣＴＸ後２１日目の腫瘍サイズの連結データを示す。Ａｎｏｖａ  ＆  Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ’検定統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３】ＦＭＴ  ＢＣ患者２による腸内細菌共生バランス失調はない：  Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４はＣＴＸを介した抗腫瘍効果を改善する。３サイクルのＣＴＸ対ＮａＣｌを注射したＳＰＦマウス（Ａ）対ＦＭＴ処置マウス（Ｂ）におけるＭＣＡ−２０５肉腫の腫瘍増殖曲線。（Ｃ）対照としてＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４株またはＮａＣｌを強制経口投与した後のＦＭＴ処置マウスにおけるＭＣＡ−２０５肉腫の腫瘍増殖曲線。２つの独立した実験を示す。（Ｄ）２つの独立した実験からのＣＴＸ後２１日目の腫瘍サイズの連結データを示す。Ａｎｏｖａ  ＆  Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ’検定統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４】Ｅ．ｈｉｒａｅ  ＩＧＲ１、ＩＧＲ１０および１０８１５は、腸内菌共生バランス失調のＦＭＴ設定においてＣＴＸ殺腫瘍活性を効率的に増強することができなかった。Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４株（Ａ）、ＩＧＲ１株（Ｂ）または対照としてのＮａＣｌを経口強制経口投与した後のＦＭＴ処置マウスにおけるＭＣＡ−２０５肉腫の腫瘍増殖曲線。典型的な曲線は、１群あたり６匹のマウスについて描写される。（Ｃ）１〜２回の独立した実験からのＣＴＸ後１７日目の腫瘍サイズの連結データを示す。（Ｄ）種々のＥ．ｈｉｒａｅ株の腫瘍増殖制御能の比較。  ＥＨ  １３１４４に匹敵する有効性を示す２つの新規株ＥＨ  ＩＧＲ  ４および７の同定および発見。ＥＨ１０８１５は機能せず、ＴＭＰ２に存在する突然変異に関連し得る（以下の図１３Ｂを参照のこと）。スチューデントｔ検定統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図５】ＥＨ１３１４４  ＋  ＩＧＲ４  ＋  ＩＧＲ７の組み合わせは、ＥＨ１３１４４誘導化合物よりも優れている。（Ａ）Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４株、ＩＧＲ４株、ＩＧＲ７株、放線菌種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｓｐｐ）（Ａｏ）を強制経口投与した後、３サイクルのＣＴＸ（Ｃ）対  ＮａＣｌ（Ｎ）を注射したＦＭＴ処理マウスにおけるＭＣＡ−２０５肉腫の腫瘍表面。各ドットは、１匹のマウス／腫瘍である。（Ｂ）最良の群のＳＰＦマウスにおけるＭＣＡ−２０５肉腫の腫瘍増殖曲線、各時点における腫瘍サイズおよび屠殺時の腫瘍サイズの平均＋ＳＥＭ（Ｃ：ＣＴＸ）。各ドットは、１匹のマウス／腫瘍である。Ａｎｏｖａ統計は、ＣＴＸと三重組み合わせとの間の有意差を示す。（Ｃ）ＥＨ１３１４４、ＩＧＲ１、ＩＧＲ１１、ＢａｒｎｅｓｉｅｌｌａまたはＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ株を強制経口投与し、３サイクルのＣＴＸを注射したＦＭＴ処置マウスにおけるＭＣＡ−２０５肉腫の腫瘍表面。細菌株は生菌（Ｖ）または低温殺菌（Ｐ）されたものを用いる。低温殺菌のために、細菌を７０℃で３０分間インキュベートし、少なくとも６時間で−８０℃で凍結する。
【図６】マウスＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４は、生存して使用された場合にのみその有効性を媒介する。Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４生菌株（Ａ）、低温殺菌（Ｂ）または対照としてＮａＣｌを経口強制経口投与したＦＭＴ処置マウスにおけるＭＣＡ−２０５肉腫の腫瘍増殖曲線。典型的な曲線は、１群あたり６匹のマウスについて描写される。（Ｃ）３つの独立した実験からのＣＴＸ後１７日目の腫瘍サイズの連結データを示す。スチューデントｔ検定統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図７Ａ−Ｃ】Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４を強制経口投与した後のｍＬＮおよび脾臓におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞の蓄積の増加。（Ａ）実験設定。マウスを、Ｅ．ｈｉｒａｅ（７０８または１３１４４）の強制経口投与およびＣＴＸ  ｉｐ注射を行う前に、３日間、広域スペクトル抗生物質で処置する。ＣＴＸ後１日目、Ｅ．ｈｉｒａｅによる２回目の強制経口投与を行う。ＣＴＸの７２時間後に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）から単離する。Ｅ．ｈｉｒａｅ  ７０８または１３１４４による強制経口投与およびＣＴＸ治療後のｍＬＮにおけるＣＤ８＋（Ｂ）およびＣＤ４＋（Ｃ）Ｔ細胞の割合。
【図７Ｄ−Ｆ】（Ｄ）実験設定。マウスを、Ｅ．ｈｉｒａｅ（７０８または１３１４４）を用いて３日毎に合計４回の強制経口投与を行う前に、広域スペクトル抗生物質で３日間処置する。最初の強制経口投与の５日後、マウスをＣＴＸで処置する。ＣＴＸの１週間後に、脾臓からＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離する。Ｅ．ｈｉｒａｅ  ７０８または１３１４４による強制経口投与およびＣＴＸ処理後の脾臓におけるＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｅ）およびＣＣＲ９＋ＣＸＣＲ３＋  ＣＤ８  Ｔ細胞（Ｆ）の割合。スチューデントｔ検定統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図８】ＥＨ１３１４４の強制経口投与後の腫瘍床におけるＣＤ８＋  ＣＣＤ９＋ＣＸＣＲ３＋  Ｔ細胞の持続的蓄積：ＯｎｃｏＢａｘによる持続的な抗癌反応の腫瘍関連バイオマーカーとしてＣＤ８＋ＣＸＣＲ３＋  ＣＣＲ９＋を考慮。（Ａ）ＳＰＦマウスにＡＴＢを３日間投与した後、ＣＴＸ全身投与前後にＥＨ１３１４４を３週間隔週で強制経口投与した。最初のＣＴＸ処理の７、１４および２１日後にマウスを屠殺して脾臓、腫瘍排出リンパ節（ｄＬＮ）および腫瘍（ＭＣＡ２０５）を採取した。（Ｂ）ＦＭＴ処理マウスに、ＣＴＸ全身投与の前後に、隔週で３週間、ＥＨ１３１４４を経口強制投与した。マウスをＣＴＸ処理日およびＣＴＸ  １、２、３の７２時間後（ｄａｙ  Ｊ０、Ｊ３、Ｊ７、Ｊ１０、Ｊ１４、Ｊ１７）に屠殺し、ｄＬＮおよび腫瘍（ＭＣＡ２０５）を採取した。ＣＣＲ９＋ＣＸＣＲ３＋  二重陽性細胞のパーセンテージを分析するＣＤ８＋ＣＤ３＋上にゲートするＣＤ４５＋細胞のフローサイトメトリー分析を提示する。５匹のマウス／群を含む３群の代表的な実験。Ａｎｏｖａ統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図９】ＥＨペプチドの免疫原性を解明するための実験的免疫化プロトコール。マウスを、Ｅ．ｈｉｒａｅ（７０８または１３１４４）を用いて３日毎に合計４回の強制経口投与を行う前に、広域スペクトル抗生物質で３日間処置する。最初の強制経口投与の５日後、マウスをＣＴＸで処置する。ＣＴＸの１週間後に、脾臓からＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離する。これらのＣＤ８＋  Ｔ細胞を、２０μｇ／ｍｌのペプチドをパルスした樹状細胞（ＤＣ）（１時間の間）または熱不活性化細菌（６時間の間）と共にインキュベートする。細菌の不活性化は、６５℃で２時間のインキュベーションからなる。２４時間培養後、ＩＦＮγのＥＬＩｓｐｏｔを行う。
【図１０】ＣＴＬ脾臓反応性に対する２つのＥ．ｈｉｒａｅ  ７０８種と１３１４４種との間の交差反応性。熱不活化細菌（７０８、１３１４４、ＥＨ１７およびＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の存在下または非存在下でプレ培養したＤＣと共培養した後のＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞を表すＩＦＮγスポットの数。対応する実験設定を図９に示す。スチューデントｔ’検定統計分析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１１】腸の炎症に対するＥＨの影響およびこの炎症におけるおよびＣＤ８＋  Ｔ細胞の役割：ｍＬＮで増幅されたＥＨ特異的ＣＴＬは粘膜固有層に戻る可能性がある。（Ａ）実験設定。マウスは３日間、広域抗生物質で処理する。次いで、発明者らはＥ．ｈｉｒａｅ（７０８または１３１４４）の強制経口投与および抗ＣＤ８注射（２００μｇ／マウス）を３日毎に、合計４回の強制経口投与／注射を行った。最初の強制経口投与の５日後、マウスをＣＴＸで処置する。ＣＴＸの１週間後、ヘマトキシリンエオシン染色（ＨＥＳ）のために結腸を除去する。（Ｂ）Ｅ．ｈｉｒａｅを保菌し、抗ＣＤ８アブレーションＡｂｓおよびＣＴＸで処理したマウスの結腸における炎症性浸潤の程度。スチューデントｔ検定統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１．。
【図１２】ＥＨからＭＨＣクラスＩ結合ペプチドを選択するために使用されるフィルターの概略図。Ｅ．ｈｉｒａｅ（７０８、１３１４４およびＥＨ１７）の全細菌配列から、細胞壁および細胞外局在を有するタンパク質をＰＳＯＲＴソフトウェアで選択した。次に、タンパク質を９アミノ酸のペプチドに分割した。これらのペプチドを、ＮｅｔＭＨＣソフトウェアを用いてＭＨＣクラスＩ  Ｈ−２Ｋｂに結合する能力について試験し、強力なバインダーのみが保持された（ＩＣ５０＜５０ｎＭ）。
【図１３Ａ−Ｂ】ＴＭＰ１およびＴＭＰ２エピトープを含む群７からのペプチドは、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４に対して免疫化されたマウスの脾臓由来のＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化する。１３種類の異なるペプチド群でパルスしたＤＣと培養した後の、ＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞を表すＩＦＮγスポットの数（表６）。群ｎ°１（Ａ）および群ｎ°７（Ｂ）のみを示す。
【図１３Ｃ】（Ｃ、Ｅ）群ｎ°７に属する４つのペプチドでパルスしたＤＣと培養した後のＩＦＮγ分泌性ＣＤ８＋Ｔ細胞を表すＩＦＮγスポットの数（表７）。対応する実験設定を、図９に示す。
【図１３Ｄ】（Ｄ）免疫原性ペプチドのレベルでのＥＨ１３１４４と比較したＥＨ１０８１５のＴＭＰ１およびＴＭＰ２の配列アラインメント。
【図１３Ｅ】（Ｅ）他のＥＨ株によるｉｎ  ｖｉｖｏ免疫後のＴＭＰ１およびＴＭＰ２ならびにＧｒｏｕｐ７に対する想起応答における脾臓ＣＴＬのｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応性。Ａｎｏｖａ統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１４】ＴＭＰエピトープ１プロファージ２特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＥＨ１３１４４およびＩＧＲ７の強制経口投与後にｄＬＮおよび脾臓に蓄積する。マウスを、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４（Ａ，Ｂ）または１０８１５またはＥＨ１７またはＩＧＲ７（Ｃ）による経口強制投与およびＣＴＸ  ｉｐ注射を行う前に、広域スペクトル抗生物質で３日間処置する。対応する実験設定を、ｍＬＮについては図７Ａに、脾臓については図７Ｄに示す。ＴＭＰ１特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を腸間膜リンパ節（Ａ）および脾臓（Ｂ，Ｃ）からテトラマーで単離する。ｍＬＮおよび脾臓におけるＣＣＲ９＋またはＣＣＲ９Ｔ細胞間のＴＭＰ１プロファージ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴＭＰ１特異的ＣＤ８＋Ｔのフローサイトメトリー分析。各ドットは、１つのｍＬＮまたは脾臓を表す。５−６  マウス／群。Ａｎｏｖａ統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１５】ＴＭＰエピトープ１プロファージ２特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞は腫瘍床に蓄積する。（Ａ）ＳＰＦマウスにＡＴＢを３日間処理した後、ＣＴＸ全身投与前後にＥＨ１３１４４を３週間、隔週で強制経口投与した。最初のＣＴＸ治療の７、１４および２１日後にマウスを屠殺し、腫瘍排出リンパ節（ｄＬＮ）および腫瘍（ＭＣＡ２０５）を採取した。（Ｂ）ＦＭＴ投与マウスにＡＴＢで３日間処理した後、ＣＴＸ全身投与前後にＥＨ１３１４４を３週間隔週で強制経口投与した。マウスをＣＴＸ処理日およびＣＴＸ  １、２、３の７２時間後（Ｊ０、Ｊ３、Ｊ７、Ｊ１０、Ｊ１４、Ｊ１７日目）に屠殺し、ｄＬＮおよび腫瘍（ＭＣＡ２０５）を採取した。ＣＣＲ９＋ＣＸＣＲ３＋  二重陽性細胞のうちＴＭＰ１特異的ＣＤ８  Ｔ細胞とＴＭＰ１特異的ＣＤ８  Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析を提示する。５匹のマウス／群を含む３群の代表的な実験。Ａｎｏｖａ統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１６】ＴＭＰペプチドでパルスしたＤＣによる免疫化のプロトコール。ＤＣ分化（６日間のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４による）後、ペプチドの添加（１時間）または熱不活性化細菌の添加（６時間）の前に、それらをポリＩ：Ｃ（１０μｇ／ｍｌ）と一晩インキュベートした。これらのＤＣを、０日目および１０日目に右側腹部に皮下注射する。２回目の注射の１ヶ月後、肉腫（ＭＣＡ２０５）または大腸（ＭＣ３８）腫瘍細胞株を、左側腹部に皮下注射する（それぞれ、マウスあたり８．１０５および１．１０６細胞）。本発明者らは、ＤＣを用いない１群、２０μｇ／ｍｌの無関係なペプチド（ｇｒ１）またはＴＭＰペプチドまたは１３１４４熱不活化細菌をパルスしたＤＣを有する１群の４群を構成する。経時的な平均腫瘍サイズ（Ａ）、各群の各マウス腫瘍動態（Ｂ）、ＭＣＡ２０５の屠殺前の２つの最終時点における群間の詳細な比較を示し（Ｃ）、各ドットは１匹のマウスを表す。ＭＣ３８関連データは示されていない。
【図１７Ａ−Ｂ】１３１４４およびＴＭＰパルスＤＣワクチン接種は、ＭＣＡ２０５の腫瘍増殖を低下させた。ｇｒ１ペプチド、ＴＭＰペプチドおよびＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４でパルスしたＤＣをワクチン接種したマウスにおけるＭＣＡ２０５の腫瘍増殖。（Ａ）異なる動態における腫瘍サイズの平均＋ＳＥＭ。（Ｂ）５〜１０匹のマウスの各個体群に対する腫瘍増殖動態。
【図１７Ｃ】（Ｃ）屠殺時の腫瘍サイズおよび統計学的差異。スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡ統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１８】遠隔部位に肉腫が存在すると、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４の強制経口投与によって誘発される腸の炎症性病変が予防される。（Ａ）実験設定。マウスは、右側腹部にＭＣＡ２０５腫瘍細胞を皮下注射する前に３日間、広域抗生物質で処理される。その後、Ｅ．ｈｉｒａｅ（７０８または１３１４４）を３日毎に経口強制経口投与し、合計４回強制経口投与した。最初の強制経口投与の５日後、マウスをＣＴＸで処置した。ＣＴＸの１週間後、結腸を取り出し、ヘマトキシリン、エオシンおよびサフラン染色（ＨＥＳ）のためにＰＰＦＥに包埋する。（Ｂ）ＭＣＡ２０５腫瘍を有する又は有さない、Ｅ．ｈｉｒａｅをコロニー化し、ＣＴＸで処理した、マウスの結腸における炎症性浸潤の程度。スチューデントｔ検定統計解析：  ＊＊ｐ＜０．０１。
【図１９】Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４と他の４つのＥ．ｈｉｒａｅ株との比較ゲノム解析。（Ａ）５つのＥ．ｈｉｒａｅゲノムのパンゲノム解析。（Ｂ）細菌ゲノムおよびプラスミド内のプロファージ配列の同定およびアノテーションに特化した、ウェブサーバー  ＰＨＡＳＴＥＲ（ＰＨＡｇｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）からの１３１４４ゲノム中のプロファージ領域および他のファージとの相同性のリスト。
【図２０Ａ】Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅプロファージの比較分析。（Ａ）いくつかのＥＨ株の配列のアラインメントとＴＭＰ配列の位置。４０．６−ｋｂプロファージ（Ａ）および３９．２−ｋｂプロファージ（Ｂ）遺伝子配列の存在（黒）および非存在（白）のマトリックスおよびブラストアラインメントパラメータ＝８０％の同一性および＞＝７０％のカバー率に基づく「ヒートマップ」クラスターによる比較分析。
【図２０Ｂ】（図２０Ａの説明を参照。）
【図２１】ＥＨ１３１４４株と他のＥ．ｈｉｒａｅ株のエピトープＴＭＰ間の相同性。（Ａ）プロファージ２  ＥＨ１３１４４由来のＴＭＰは、ＩＧＲ７由来のＴＭＰと相同である（ＥＨ１３１４４およびＥＨ  ＩＧＲ７の両方の配列が同一であるため）。（Ｂ）ＥＨ１３１４４のエピトープＴＭＰ１は、他のＥ．ｈｉｒａｅ株とある程度の相同性を示す：ＩＧＲ１１で１００％、ＩＧＲ１および１０８１５で８８．８９％（（Ｃ）で示される１変異を伴う）。ＥＨ１３１４４のエピトープＴＭＰ２は、ＩＧＲ１１および１０８１５において７７％の相同性を示す（（Ｃ）で示される２つの突然変異を伴う）。
【図２２Ａ】化学療法に先験的に診断された乳がん患者の血液中の共生細菌に対するＴ細胞応答。乳癌患者から採取した自己単球を異なる細菌種で刺激した後、自己ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞とインキュベートしてＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０放出をモニタリングした。（Ａ）Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４に対するＴＨ１／Ｔｃ１／Ｔｒ１免疫応答。診断時の２０％未満の乳癌（ＢＣ）患者は、化学療法前にＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４に対する血中ＴＨ１／Ｔｃ１免疫応答を示す。
【図２２Ｂ】（Ｂ）大腸菌またはＴＣＲ架橋に対するＴＨ１／Ｔｃ１／Ｔｒ１免疫応答。ＢＣ女性は大腸菌に対して記憶Ｔ細胞応答を示し、ＴＣＲ架橋に応答する。
【図２３】ヒトで試験される各ＨＬＡハプロタイプに対するＴＭＰの予測ペプチドの局在。ＮｅｔＭＨＣソフトウェアを用いて評価したＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（閾値５０ｎＭ）に対する有意な結合能力を有するＴｍｐの予測ペプチドの局在化。各ペプチドおよび対立遺伝子について、記号は、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合親和性を有する９アミノ酸長ペプチドに対応する同定された配列の最初のアミノ酸を表す。予測されたペプチドの配列を表９に再開した。
【図２４Ａ−Ｂ】健常ボランティア由来のヒトＰＢＭＣにおけるＴＭＰペプチドの抗原性。２４時間再刺激後のＩＦＮγ放出を明らかにするために、ＥＬＩＳＰＯＴを用いてＰＢＭＣからセントラルメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞を教育するために、ペプチド（群または個々のペプチド）でパルスしたＤＣによる２ラウンドの刺激後に、間接的に、想起反応のＩｎ  ｖｉｔｒｏ刺激アッセイ（Ａ）。各ペプチドはＨＬＡ−Ａ２拘束型（Ｂ）であり、ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子型で６名の健常ボランティア「ＨＶ」（６桁の数字で個別化）を選択した（Ｃ）。（Ｂ）では、以下のグラフで免疫原性を付与したペプチドに下線を引いた。各ＨＶの閾値を決定し（Ｄ）、「陽性」ウェルの数（閾値を上回る）と、表Ｂに示した各ペプチドの応答者の個数を算出した（Ｅ）。これらの結果を棒グラフで表すと、５種類のペプチドが、少なくとも５０％のＨＶにおいてＴｃ１免疫想起反応を誘発することを見出したので、ヒトにおけるＴＭＰの免疫原性と有意に関連している可能性があることを観察した（Ｆ）。矢印は、最も有意なエピトープを示す（Ｇ）。各群のペプチドおよび最も有意なエピトープ（２、３、９、１０、１３）の表をＢに示す。
【図２４Ｃ】（図２４Ａ−Ｂの説明を参照。）
【図２４Ｄ−１】（図２４Ａ−Ｂの説明を参照。）
【図２４Ｄ−２】（図２４Ａ−Ｂの説明を参照。）
【図２４Ｅ−Ｆ】（図２４Ａ−Ｂの説明を参照。）
【図２４Ｇ】（図２４Ａ−Ｂの説明を参照。）
【図２５】マイトマイシンＣによるファージ切除のプロトコール。技術的手順の各工程を示す。
【図２６Ａ】Ｅ．ｈｉｒａｅ１３１４４の上清中のファージ核酸のＰＣＲ検出。種々の温度（３７または４２℃）、種々の濃度のマイトマイシンＣ（０、０．２および１μＭ）、またはＣＴＸの活性代謝産物（マホスファミド−２５μｇ／ｍｌ）で培養したＥＨ１３１４４の上清を処理して、キャプシド破壊を伴う（Ｂ）または伴わない（Ａ）ＤＮＡをコードするファージタンパク質を収集した。ＰＣＲを行い、プロファージ１または２の特異的配列を検出した。
【図２６Ｂ】（図２６Ａの説明を参照。）
【図２７Ａ−Ｂ】Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４におけるユニークな抗原配列としてのファージテールレングステープメジャータンパク質。ＡおよびＣ．  実験設定。マウス（ナイーブ（Ｃ）、肉腫保有（Ａ））に広域抗生物質（ストレプトマイシン、コリスチン、アンピシリン、バンコマイシン）を３日間投与した後、シクロホスファミド（ｉｐ  ＣＴＸ−１００ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水（ＮａＣｌ）を５日目および６日目にそれぞれ１回（Ｃ）または週１回で３回（Ａ）全身投与する前後にＥ．ｈｉｒａｅ株１３１４４（１．１０９菌）を経口強制投与した。１週間後（Ｃ）、精製したＣＤ８＋Ｔ細胞脾細胞を、生理食塩水または別個の熱殺菌細菌株を負荷した骨髄由来ＤＣを用いたリコールアッセイにおいてｅｘ  ｖｉｖｏで再刺激した。Ｂ．  種々の系統のＥ．ｈｉｒａｅを週１回強制経口投与後、３サイクルのＣＴＸ  対  ＮａＣｌを注射したＳＰＦ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＣＡ−２０５肉腫の２５日目（屠殺）の腫瘍サイズ。Ｄ−Ｅ．  ｅｘ  ｖｉｖｏリコールアッセイ。  ｉｎ  ｖｉｖｏ曝露（Ｃ）後、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞を、熱不活性化細菌（６５℃で２時間）（Ｄ）またはペプチド（Ｅ）でパルスした樹状細胞（ＤＣ）で再刺激した。ＩＦＮγ  ＥＬＩｓｐｏｔを２４時間で実施して、共培養後のＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞（スポット）を数えた。各ドットは１匹のマウスを表す。Ｆ、Ｇ、Ｈ  脾臓（Ｆ、Ｈ）または腫瘍排出リンパ節（Ｇ）におけるＨ−２Ｋｂ／ＴＳＬＡＲＦＡＮＩテトラマー結合ＣＴＬのフローサイトメトリー分析（治療後７２時間（ＡおよびＣのレジメン）、ナイーブ（Ｆ、Ｈ）または腫瘍保有（Ｇ））。ＴＭＰ１プロファゲ２特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合は、脾臓ＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ｆ、左パネル、Ｇ、Ｈ、上パネル）中、またはＣＣＲ９＋ＣＸＣＲ３＋  Ｔ細胞（Ｆ、右パネル、Ｇ、下パネル）またはＣＣＲ９＋  ＣＴＬ（Ｈ、下パネル）のゲート中に示される。各実験は、２〜３回の独立した実験からの１０〜１５匹のマウスの１群を含んだ（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）。同様の成績が得られた２件のうち、代表的な試験をＧにおける動態試験において示している。ＡｎｏｖａまたはＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ’検定統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２７Ｃ−Ｄ】（図２７Ａ−Ｂの説明を参照。）
【図２７Ｅ】（図２７Ａ−Ｂの説明を参照。）
【図２７Ｆ−Ｇ】（図２７Ａ−Ｂの説明を参照。）
【図２７Ｈ】（図２７Ａ−Ｂの説明を参照。）
【図２８Ａ−Ｂ】ファージテールレングステープメジャータンパク質を用いた肉腫に対する予防的および治療的免疫。Ａ−Ｂ．予防接種。ＴＬＲ３リガンド曝露ＤＣを、ペプチド（無関係な群、３位で変異している、または変異していない個々のＴＭＰ１）または熱不活化細菌でナイーブマウスの右側腹部における皮下接種の前に、１０日間の間隔をあけてパルスした。２回目の注射の１ヶ月後、肉腫（ＭＣＡ２０５）を左側腹部に皮下移植した。Ｃ−Ｄ．  治療設定。    ＭＣＡ２０５腫瘍保有者をＣＴＸで処置し、ＴＭＰ１（ＴＳＬＡＲＦＡＮＩ）、ＴＭＰ１  ｍｕｔ２（ＴＡＬＡＲＦＡＮＩ）、ＴＭＰ１  ｍｕｔ３（ＴＳＦＡＲＦＡＮＩ）またはＥＧＦＰ配列（対照として）を発現するように遺伝子改変したＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４または大腸菌で強制経口投与したレジメンについては、図２７Ａを参照のこと。ＭＣＡ２０５の長手方向の腫瘍増殖動態（Ａ、Ｃ上部パネル）または断面腫瘍サイズ（Ｂ、Ｃ下部パネル）は、２〜３の独立した実験から集められた１２〜１８匹の動物（Ａ）について、異なる時点（Ａ、Ｃ上部パネル）または犠牲時点（Ｂ、Ｃ下部パネル）での腫瘍サイズの平均＋ＳＥＭとして描写される。Ｄ．  屠殺時の脾臓におけるＨ−２Ｋｂ／ＴＳＬＡＲＦＡＮＩテトラマー結合ＣＴＬのフローサイトメトリー分析。ＴＭＰ１プロファージ２特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合は、脾臓ＣＤ８＋  Ｔ細胞間で描出される。スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡ統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２８Ｃ】（図２８Ａ−Ｂの説明を参照。）
【図２８Ｄ】（図２８Ａ−Ｂの説明を参照。）
【図２９Ａ】エンテロファージのカバー範囲（ＢＯＣ）および癌患者におけるその分子模倣ＧＰＤ１−Ｌの臨床的意義。Ａ．  ＭＧリファレンスカタログのＥ．ｈｉｒａｅおよびプロファージのゲノムのＢＯＣ。１７の異なるデータセット（下段で参照、カラム内の個々のサンプル）からの３０２７のメタゲノムについて、Ｅ．ｈｉｒａｅ株および腸球菌ファージゲノム（列で特徴づけられる）の存在をスクリーニングした。Ｂ−Ｃ．  ＮＳＣＬＣおよびＲＣＣを保有する７６人の患者（Ｒｏｕｔｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１８に記載されたコホート）において、カルチュロオミクスに続いてＰＣＲで評価した、検出可能なＥ．ｈｉｒａｅコロニーおよび／またはＥ．ｆａｅｃａｌｉｓコロニー（Ｂ、上図）を有する糞便の割合、およびＥ．ｈｉｒａｅコロニーおよび／またはＥ．ｆａｅｃａｌｉｓコロニー（Ｂ、下図）のＴＭＰの割合、および進行までの期間（Ｃ、上図）または全生存期間（Ｃ、下図）を示す対応するＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ曲線。  示されるｐ値を有する対数順位（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）解析。Ｄ．  １６個のＨＬＡ−Ａ０２＊０１結合ＴＭＰエピトープでパルスした（またはパルスしなかった）自己単球由来ＤＣでの６人のＨＬＡ−Ａ０２＊０１健常ボランティア由来のナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミング（表９、図２４Ｂおよび図３７）。ＩＦＮγ  ＥＬＩｓｐｏｔアッセイおよび陽性スポットの計数のための１６個のＴＭＰペプチドの各々による７日目の再刺激。ＡＮＯＶＡ統計分析：  ＊ｐ＜０．０５。Ｅ．  公的に入手可能なＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＰスイートおよび７５％を超える相同性を探索するっｆＴＣＧＡデータセットを用いてＤにおいて選択された免疫原性エピトープのブラスト配列アラインメント。エピトープ１０（ＫＬＡＫＦＡＳＶＶ、配列番号６３）のみが有意な一致（ＫＬＱＫＦＡＳＴＶ、配列番号１８８）を得て、ＧＰＤ１−Ｌタンパク質の配列において同定された。Ｆ−Ｈ．  単変量解析における生存の平均およびＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ曲線に従って分離したＴＣＧＡデータセットからの膀胱（Ｆ）、肺腺癌（Ｇ）、５３０腎細胞癌（Ｈ、ＨＬＡ‐Ａ０２＊０１タイピングによる、下図）患者の間のＧＰＤ１‐Ｌ遺伝子産物の発現レベル。Ｉ−Ｊ．ステージＩＩＩＣ／ＩＶのＮＳＣＬＣ患者６２例の第２のコホート（ＣＧＦＬ検定コホート、Ｊ）で検証されたステージＩＩＩＣ／ＩＶのＮＳＣＬＣ患者４４例（ＣＨＵＭ検証コホート、Ｉ）での、二次治療におけるＰＤ−１遮断後の進行までの時間。進行までの時間のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ曲線；患者はＧＰＤ１Ｌ発現の値に従って層別化された。カットオフは、最適なカットオフ戦略で定義した。Ｋ．  ＴＣＧＡアッセイ（ＴＣＧＡ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、ＣＨＵＭおよびＣＧＦＬコホートの全ての肺癌タイプにおけるＧＰＤ１‐Ｌ発現と腫瘍免疫浸潤とのピアソン相関。
【図２９Ｂ−Ｃ】（図２９Ａの説明を参照。）
【図２９Ｄ−Ｅ】（図２９Ａの説明を参照。）
【図２９Ｆ】（図２９Ａの説明を参照。）
【図２９Ｇ】（図２９Ａの説明を参照。）
【図２９Ｈ】（図２９Ａの説明を参照。）
【図２９Ｉ−Ｋ】（図２９Ａの説明を参照。）
【図３０Ａ−Ｂ】マウス癌における腸ファージＴＭＰと発癌性ドライバーＰＳＭＢ４との間の分子模倣。Ａ．  ＞７０％の相同性を示す公的に入手可能なＴＣＧＡデータセットを有する２７Ｅにおいて選択された唯一の免疫原性エピトープＴＳＬＡＲＦＡＮＩのブラスト配列アラインメント。１つのヒット（ＧＳＬＡＲＦＲＮＩ）のみが有意な一致を得、ＰＳＭＢ４タンパク質の配列において同定された。Ｂ．  ＭＣＡ２０５の腫瘍クローンにおける野生型とノックを比較した治療設定。図２７ＡのようにＩｄ．であるが、マウスにＷＴ  ＭＣＡ２０５細胞株を接種するか、またはＴＳＬＡＲＦＡＮＩの３位にノックイン突然変異を有する別個のクローンを接種し、次いで、ＣＴＸ  ＋で処理／Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４（または生理食塩水）で強制経口投与した。同様の結論を得た２つのうちの代表的な試験における６匹の動物／群の、異なる時点（上および下）または屠殺時（右）における、ＭＣＡ２０５の縦方向の腫瘍増殖動態（Ｂ）または断面腫瘍サイズ（Ｂ、右）を腫瘍サイズの平均  ＋ＳＥＭとして描写した。ＡＮＯＶＡ統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．１、＊＊＊ｐ＜０．００１．Ｃ−Ｄ．  Ｅ．ｈｉｒａｅ  サイフォウイルスファージのＩｎ  ｖｉｖｏ切除−感染サイクル。  ＣＴＸ前後のＥ．ｈｉｒａｅによる強制経口投与後、回腸内容物の採取、細菌コロニーの培養・分離、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ同定、ＴＭＰ特異的プローブセットを用いたＰＣＲ（Ｃ）。ＰＣＲにおけるＴＭＰ配列を保有するコロニーを有する、未処置および強制経口投与した動物における各種のコロニーの割合を示すグラフ（Ｄ）。５匹／群及びＰＣＲで同定・精査された７０を超えるコロニーの結果。図３９も参照のこと。Ｅ．この株の配列決定後のＰＣＲにおけるＴＭＰ配列を有するＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍとのファージゲノムのアラインメント。Ｆ−Ｇ．  オルガノイドをＥ．ｈｉｒａｅ（１０８）およびＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（１０８）と共に１時間培養した後、マホスファミド処理（２５μｇ／ｍｌ）を行った。マホスファミド処理の６時間後および２０時間後に、上清を、細菌コロニーの培養および単離（Ｆ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ同定、ならびにＴＭＰ特異的プローブセットを使用するＰＣＲ（Ｇ）のために回収した。（Ｈ）  限局性乳癌ショットガンデータに関するＭｅｔａＰｈｌＡｎ２分析後に細菌およびウイルス種についてＬＥｆＳｅ分析を実施したところ、含まれる８３例から１０例の患者でネオアジュバントパルボシクリブ治療の降順に最も判別度の高いもの（ＬＤＡスコア＞２）が報告され、他の７３例はネオアジュバントＣＤＫ４／６阻害薬の投与を受けなかった。スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡ統計解析：  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３０Ｃ−Ｄ】（図３０Ａ−Ｂの説明を参照。）
【図３０Ｅ】（図３０Ａ−Ｂの説明を参照。）
【図３０Ｆ−Ｈ】（図３０Ａ−Ｂの説明を参照。）
【図３１Ａ】Ｅ．ｈｉｒａｅ株のクラーディングおよびゲノム解析。Ａ．  １６Ｓ配列の類似性に基づく種々の株の樹状図。Ｂ．  ＳＮＰアラインメントに基づくＥ．ｈｉｒａｅ分離株２０株の系統発生樹。Ｃ．  ５つの完全なＥ．ｈｉｒａｅゲノムに対する１３１４４株の比較ゲノム解析。中心から外側へ：  ＧＣスキュー、ＧＣ含有量、１３１４４、ＩＧＲ７、ＩＧＲ１１、ＡＴＣＣ  ９７９０、７０８、１３３４４株。プロファージの位置は黒色で現れる。
【図３１Ｂ−Ｃ】（図３１Ａの説明を参照。）
【図３２】唯一の免疫原性ペプチド群としての群７の事前同定。ナイーブマウスを広域抗生物質（ストレプトマイシン、コリスチン、アンピシリン、バンコマイシン）で３日間処置した後、シクロホスファミド（ｉｐ  ＣＴＸ  １００ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水（ＮａＣｌ）をそれぞれ５日目および６日目に全身投与する前および後に、Ｅ．ｈｉｒａｅ株１３１４４または７０８（１．１０９細菌）を経口強制投与した。１週間後、精製したＣＤ８＋Ｔ細胞脾細胞を、生理食塩水または別個のペプチド群を負荷した骨髄由来ＤＣを用いたリコールアッセイにおいてｅｘ  ｖｉｖｏで再刺激した（表６のリストを参照のこと）。ＩＦＮγ  ＥＬＩｓｐｏｔを２４時間で行い、共培養後のＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋  Ｔ細胞（スポット）を計数した。各ドットは１匹のマウスを表す。統計解析の結果、有意な反応に達したのは７群のみであった：  Ａｎｏｖａ検定：  ＊ｐ＜０．０５，  ＊＊ｐ＜０．１。
【図３３Ａ−Ｂ】ＴＭＰタンパク質の配列およびＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４プロファージ２タンパク質配列の比較分析。Ａ．  １３１４４プロファージ２の全ＴＭＰタンパク質配列。Ｂ．  １３１４４プロファージ２タンパク質配列の存在（黒色）および非存在（白色）のマトリックスに基づく「ヒートマップ」クラスター化による比較分析。
【図３４】Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４のプロファージ２内の免疫原性エピトープ領域の配列アラインメント。Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４由来の免疫原性ペプチドＴＳＬＡＲＦＡＮＩは図２７に描写され、詳述される実験において同定された。ｙ軸は本発明者らのモデルにおいて試験された同じ領域における６つの他のＥ．ｈｉｒａｅ株の配列を示す。
【図３５Ａ−Ｂ】大腸菌におけるＴＭＰ遺伝子の一部のサブクローニング発現。Ａ．  大腸菌ＤＨ５αに発現するＴＭＰ−ＦＬＡＧ、ＴＭＰ−ｍｕｔ２−ＦＬＡＧおよびＴＭＰ−ｍｕｔ３−ＦＬＡＧのアミノ酸配列。示されたエピトープの変異体（下線）を含むＴＭＰタンパク質のＮ末端部分のみが、Ｃ末端ＦＬＡＧタグ（イタリック体）との融合タンパク質として発現されたことに留意されたい。Ｂ．  ｐＤＬ２８−Ｐ２３−ＥＧＦＰまたはｐＤＬ２８−Ｐ２３−ＴＭＰ−ＦＬＡＧでそれぞれ形質転換した大腸菌株におけるＥＧＦＰおよびＴＭＰ−ＦＬＡＧの発現を実証するウェスタンブロット分析。
【図３６】Ｅ．ｈｉｒａｅにおけるファージテールレングステープメジャータンパク質の配列。イタリック体で示したＰＣＲプライマーの結合領域を有するＴＭＰタンパク質全体の遺伝子配列。
【図３７】ＧＰＤ１−Ｌタンパク質におけるＨＬＡ−Ａ０２＊０１結合および免疫原性エピトープの局在化およびそれらの親和性（図３０Ａを参照のこと）。表９に見出され、そして図２９Ｄに示される全てのＨＬＡ−Ａ０２＊０１結合および／または免疫原性エピトープはＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に対するその結合親和性の関数として、色コードおよびアミノ酸配列位置によって示されるように、ＴＭＰタンパク質全体の正確な領域に位置する。
【図３８Ａ−Ｂ】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーの手段によるｐｍｓｂ４変異ＭＣＡ２０５細胞株の生成。Ａ．  Ｐｓｍｂ４  ｃＤＮＡの模式図と設計された突然変異部位。ｓｇＲＮＡの標的部位と点突然変異を示す。Ｂ．  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって導入されたＰｍｓｂ４突然変異２および突然変異３の検証のための代表的な配列電気泳動図。変異したアミノ酸は灰色で強調されている。
【図３９Ａ−Ｂ】１０９  ｃｆｕ  Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４を用いたＣＴＸ＋経口強制投与から構成される、治療を伴うまたは伴わない回腸細菌コロニーの同定。グラム陽性菌を分離するための、好気性条件で回腸内容物を播種した後に増殖する各コロニーにおけるＴＭＰ配列のＰＣＲ増幅（図３６参照）。各アガロース電気泳動ゲルの写真を各動物について示す。Ａは５匹のナイーブマウスにおける結果を示し、Ｂはファージをコードする細菌を用いたＣＴＸ＋経口強制投与後の所見を示す。各垂直レーンは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで同定された１つの細菌に対応する。初期値はパネルＡの下部に詳述されている。陽性対照（Ｃｔｌ＋）はＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４のＤＮＡを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
好適な実施形態の詳細な説明
【００２４】
本文では、以下の一般的な定義が使用される：
【００２５】
腸内細菌叢
【００２６】
「腸内細菌叢」（以前は腸内フローラまたはマイクロフローラと呼ばれていた）とは、動物界に属するあらゆる生物（ヒト、動物、昆虫など）の腸内に生息する微生物の集団を指す。各個体は固有の細菌叢組成を有するが（６０〜８０の細菌種が合計４００〜５００の異なる細菌種／個体において、サンプル集団の５０％を超えて共有される）、それは、常に、類似の主要な生理学的機能を満たし、個体の健康に直接的な影響を有する：
・胃や小腸が消化できない特定の食物（主に非消化性繊維）の消化に寄与する；
・いくつかのビタミン（ＢおよびＫ）の産生に寄与する；
・それは、腸粘膜の完全性を維持し、他の微生物からの攻撃に対して保護する；
・それは適切な免疫系の発達に重要な役割を果たす；
・健康で多様でバランスのとれた腸内細菌叢が、適切な腸機能を確実にする鍵となる。
【００２７】
腸内細菌叢が身体の正常な機能とそれが果たす機能の違いを考慮に入れると、今日では「臓器」と考えられている。しかしながら、赤ちゃんは生まれつき滅菌である。つまり、腸内コロニー形成は出生直後に始まり、その後に進化する「後天性」臓器である。
【００２８】
腸内細菌叢の発達は出生時から始まる。子宮内は無菌であり、新生児の消化管には母体（腟、皮膚、乳房など）、分娩が起こる環境、空気などからの微生物がすぐに定着する。３日目から、腸内細菌叢の組成は乳児がどのように栄養されるかに直接依存している。例えば、母乳栄養の乳児の腸内細菌叢は、乳児用調合乳で栄養される乳児と比較して、主にビフィズス菌によって支配されている。
【００２９】
腸内細菌叢の組成は誕生から老齢まで、生涯を通じて進化し、様々な環境影響の結果である。腸内細菌叢のバランスは老化過程で影響を受けることがあり、その結果、高齢者は若年成人とは実質的に異なる微生物叢を有する。
【００３０】
優勢な腸内細菌叢の一般的な組成はほとんどの健常人（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの４つの主要門）で類似しているが、種レベルでの組成は高度に個別化されており、主に個人の遺伝的、環境および食事によって決定される。腸内細菌叢の組成は一時的または永久的に、食事成分に慣れるようになり得る。
【００３１】
腸内菌共生バランス失調（Ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）
【００３２】
それは変化に適応することができ、高い反発能力を有するが、腸内細菌叢組成物におけるバランスの喪失はいくつかの特定の状況において生じ得る。これは「腸内菌共生バランス失調（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）」と呼ばれ、腸内の潜在的に「有害である」細菌と「有益である」細菌との間の不平衡、または主要な細菌群の構成と多様性の観点から「健康である」細菌叢と考えられるものへの何らかの逸脱である。腸内菌共生バランス失調は、機能性腸疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、肥満、糖尿病および癌などの健康問題と関連している可能性がある。それはまた、細胞毒性治療または抗生物質治療のような治療の結果であり得る。
【００３３】
抗腫瘍治療
【００３４】
本明細書中の「抗腫瘍治療」は、外科手術を除く、癌に対する任意の治療を示す。それらには、化学療法、ホルモン療法および生物学的療法、放射線療法および標的療法（例えば、ｃ−ＫＩＴ、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２／ＨＥＲ３またはＭＥＴまたはＡＬＫ阻害剤など）が含まれる。
【００３５】
化学療法
【００３６】
「化学療法」は、本明細書において、１つ以上の化学療法剤による癌の治療として定義される。化学療法剤は、ほとんどの癌細胞の主要な特性の１つである、急速に分裂する細胞を殺すことによって作用する化学分子であり、。化学物質にはいくつかのカテゴリーが存在する：
−  アルキル化剤；
−  紡錘体毒、例えばメベンダゾール、コルヒチンなど；
−  有糸分裂阻害剤（タキサン系薬剤（パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））およびビンカアルカロイド系薬剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシンなど）を含む）、
−  細胞傷害性／抗腫瘍性抗生物質：例えばアントラサイクリン系（例：ドキソルビシン、ダウノルビシン、アドリアマイシン、イダルビシン、エピルビシンおよびミトキサントロン、バルビシン）、ストレプトマイセス（例：アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン）
−  代謝拮抗剤（例えば、ピリミジン類似体（例えば、フルオロピリミジン類似体、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ  （登録商標））、カペシタビン；プリン類似体（例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、カペシタビン、クロファラビン）；葉酸類似体（例えば、メトトレキサート、葉酸、ペメトレキセド、アミノプテリン、ラルチトレキセド、トリメトプリム、ピリメタミン）；−トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン：イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸、テニポシド）；
−  ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤：２’−デオキシ−５−アザシチジン（ＤＡＣ）、５−アザシチジン、５−アザ−２’デオキシシチジン、１−［β］−Ｄ−アラビノフラノシル−５−アザシトシン、ジヒドロ−５−アザシチジン；
−  血管破壊剤、例えばフラボン酢酸誘導体、５，６−ジメチルキサンテノン−４酢酸（ＤＭＸＡＡ）およびフラボン酢酸（ＦＡＡ）；
−  また、他の化学療法剤、例えばアプレピタント、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標）、ミレニウムファーマシューティカルズ）、イマチニブメシレート（グリベック（登録商標））、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、タモキシフェン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、カルボキシアミドトリアゾール、エファプロキシラール、チラパザミン、ｘｃｙｔｒｉｎ、チマルファシン、ビンフルニン。
【００３７】
免疫チェックポイント阻害剤
【００３８】
本文では「免疫チェックポイントを遮断する薬物」、または「免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＢ）」または「免疫チェックポイント遮断薬」はＴリンパ球の免疫チェックポイントを遮断する薬物、分子または組成物のいずれかを指定する。このような薬物は宿主免疫系を再活性化し、エフェクターＴリンパ球によって間接的に腫瘍細胞を殺す。特に、これらの用語は抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブまたはＤｕｒｖａｌｕｍａｂ）および抗ＰＤ−Ｌ２抗体を包含する。より詳細には、ＩＣＢがニボルマブまたはペンブロリズマブなどの抗ＰＤ１モノクローナル抗体であり得る。他のＩＣＢには、抗Ｔｉｍ３、抗ＢＴＬＡ、抗ＶＩＳＴＡ、抗ＣＤ３８、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＧＩＴＲ、抗ＬＡＧ３、抗ＫＩＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体が含まれ、これらも免疫チェックポイントを阻害する。
【００３９】
現在使用されているＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２などを拮抗する薬剤はモノクローナル抗体であるが、これらに特異的に結合する他の分子は、例えば抗体フラグメントや特別に設計されたアプタマーなど、将来のＩＣＢの開発に使用することができる。もちろん、「免疫チェックポイントを遮断する薬物」、または「免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＢ）」または「免疫チェックポイント遮断薬」という用語は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１またはＰＤＬ１抗体のために組み換えられた腫瘍溶解性ウイルスなどの、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２などのような免疫チェックポイントを拮抗する活性分子を用いるあらゆる治療を包含する。
【００４０】
活性化受容体に対する免疫標的抗体
【００４１】
本文では、「免疫刺激レセプターを活性化する薬物」とは宿主免疫系を再活性化するＴまたはＮＫ細胞レセプターを活性化し、エフェクターＴリンパ球によって間接的に腫瘍細胞を殺傷する、あらゆる薬物、分子または組成物を指す。特に、それは、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ２８抗体を包含する。
【００４２】
ＣＤＫ４／６阻害剤
【００４３】
本文では、「ＣＤＫ４／６阻害剤」は、パルボシクリブ、リボシクリブ、およびアベマシクリブのようなサイクリン依存性キナーゼ４および６（ＣＤＫ４／６）阻害剤を示す。これらの薬物は現在、ホルモン受容体（ＨＲ）陽性、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性（ＨＲ＋／ＨＥＲ２−）進行乳癌患者の治療に使用されているが、卵巣癌や急性骨髄性白血病などの他の癌の治療にも使用されることもできた。
【００４４】
プロバイオティクス
【００４５】
「プロバイオティクス」は消費されたときに健康上の利益を主張してきた微生物である。プロバイオティクスがヨーグルト、大豆ヨーグルト、または栄養補助食品のような、特に活性成分のある生きた培養物を添加した発酵食品の一部として一般に消費される。一般に、プロバイオティクスは腸内細菌叢がそのバランス、完全性、および多様性を保つ（または再発見する）のを助ける。プロバイオティクスの効果は株依存性であり得る。ここでは化学療法、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断、または抗ＣＴＬＡ４＋抗ＰＤ１もしくはＰＤ−Ｌ１ 抗体の組み合わせに対する応答性を回復させる任意の共生組成物を指定するために、用語「抗癌プロバイオティクス」または新造語「オンコバクス」および「オンコミクロバイオティクス」を使用する。したがって、本発明の文脈において、「プロバイオティクス組成物」は食品または栄養補助食品に限定されないが、一般に、患者に有益な微生物を含む任意の細菌組成物を指定する。従って、このようなプロバイオティック組成物は、薬剤または薬物であり得る。
【００４６】
癌、治療等
【００４７】
本明細書で使用される「癌」は、すべてのタイプの癌を意味する。特に、癌は、固形癌または非固形癌であり得る。癌の非限定的な例は、癌腫または腺癌、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、膵癌または結腸癌、肉腫、リンパ腫、黒色腫、白血病、胚細胞癌および芽腫などである。
【００４８】
免疫系は癌に対して２つの役割を果たしている。すなわち、腫瘍細胞の増殖を妨げ、また腫瘍細胞の免疫原性を描写する。したがって、免疫チェックポイントを遮断する薬物は、事実上あらゆる種類の癌の治療に使用できる。したがって、本発明による方法は、以下の中から選択された癌を有する患者に潜在的に有用である：副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌（例えば、門脈周囲がん（ｐｅｒｉｐｈｉｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ）、遠位胆管癌、肝内胆管癌）、膀胱癌、骨癌（例：骨芽細胞腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨粘液性線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨巨細胞腫、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳および中枢神経系癌（例えば、髄膜腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節神経膠腫、神経鞘腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳癌（例えば、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性小葉癌、女性化乳房）、キャッスルマン病（例：巨大リンパ節過形成、血管濾胞性リンパ節過形成）、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌（例：子宮内膜腺癌、腺癌、乳頭状漿液性腺癌、明細胞）、食道癌、胆嚢癌（粘液性腺癌、小細胞癌など）、消化管カルチノイド（絨毛癌、破壊性絨毛腺腫）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌など）、喉頭癌、下咽頭癌、肝臓癌（血管腫、肝線種、限局性結節性過形成、肝細胞癌など）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌など）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔癌、副鼻腔癌（鼻腔神経芽細胞腫、正中線肉芽腫など）、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌および中咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例：胎児性横紋筋肉腫、肺胞横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫）、唾液腺癌、皮膚癌（例：黒色腫、非黒色腫皮膚癌）、胃癌、精巣癌（例：セミノーマ、非セミノーマ胚細胞癌）、胸腺癌、甲状腺癌（例：濾胞癌、未分化癌、低分化癌、甲状腺髄様癌、甲状腺リンパ腫）、膣癌、外陰癌、および子宮癌（例：子宮平滑筋肉腫）。より詳細には本発明による方法が免疫チェックポイントを標的とする薬剤に対する患者の反応を予測および最適化するために使用することができ、ここで患者は転移性黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、中皮腫、膀胱癌、腎細胞癌、頭頸部癌、食道癌および胃癌、直腸癌、肝癌、肉腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンリンパ腫、ＡＬＫ−神経芽細胞腫、（ホルモン不応性）前立腺癌およびＧＩＳＴからなる群から選択される癌を有する。
【００４９】
必要に応じて、他の定義を以下に明記する。
【００５０】
第１の態様によれば、本発明は癌を治療するための組合せ治療における細菌組成物の使用に関し、ここで、細菌組成物は、配列番号１のタンパク質、またはそのフラグメントであり、配列番号１３、１４、５３〜１８８および２０９からなる群より選択される少なくとも１つのエピトープを含む少なくとも９個、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸のフラグメント、を発現する少なくとも１つの細菌株を含む。
【００５１】
本発明の枠組みにおいて、組成物中に存在する少なくとも１つの細菌株は、天然に存在する株、または遺伝子技術もしくは任意の他の技術によって得られる人工の操作された株のいずれかであり得る。２０１３年１１月７日に番号Ｉ−４８１５でＣＮＣＭに寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株１３１４４とは異なる株を、本発明に従って使用することができる。
【００５２】
本文では、「細菌組成物」とは細菌、とりわけ生きた細菌を含有するあらゆる組成を指定する。組成物は、１つの単一株の純粋培養物、いくつかの培養株の混合物、および／または糞便微生物移植（ＦＭＴ）を実施するための糞便材料などの複合材料を含むことができる。組成物は、液体組成物であってもよい。あるいは、組成物は、フリーズドライされた又は凍結乾燥された材料を含み得るものであり、これは食用または砕けやすい製品（例えば、ビスケット様製品）に製剤化または製造され得、これは例えば、飲料に溶解するために粉末に粉砕され得るか、または錠剤もしくはカプセルに挿入され得る。あるいは、細菌組成物が乾燥ロゼンジまたはチューインガムまたは同等物の形成であり得る。本発明による組成物はまた、粉末形態または同等物で調製および／または製剤化することができ；これらの製剤は例えば、錠剤またはカプセル中で、またはアンプル中で、例えば、結腸鏡または経鼻腸管などのチャネルへの挿入、混合または注射のために、液体中に亀裂を開けて溶解する；または、例えば、経鼻胃管（または同等物）、または結腸鏡、または胃鏡などに注入することができる溶液として、すぐに添加できるバッグ中の粉末として、保存するのに有用であり得る。本発明による細菌組成物中に（細菌とは別に）おそらく存在する成分には、塩、緩衝液、栄養素、水、薬学的に許容される賦形剤、凍結保護剤などが含まれる。
【００５３】
癌を治療するための組み合わせ治療において細菌組成物を使用することは、この抗腫瘍薬の効果を増強または増大させるために、細菌組成物を抗腫瘍薬と組み合わせて使用することを意味する。本発明による細菌組成物と組み合わせて有利に投与することができる薬物の非限定的な例には、化学療法、特にアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、単独でまたは組み合わせて使用される、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２などに拮抗する薬物）、受容体を活性化するための免疫標的化抗体（例えば、抗ＩＣＯＳ、抗ＯＸ４０、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ２８抗体）、ＣＤＫ４／６阻害剤などが含まれる。医師は状況に応じて、細菌組成物と組み合わせてどの薬物を患者に投与するか、ならびに治療プロトコル（すなわち、抗腫瘍薬（単数又は複数）および細菌組成物の投与順序）を選択する。
【００５４】
本発明による組成物の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの細菌株は、配列番号１のタンパク質と少なくとも８０、好ましくは少なくとも９０、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質をコードするプロファージゲノムを含む。
【００５５】
本発明の特定の実施形態において、細菌組成物中の少なくとも１つの株は配列番号２のプロファージ（以下の実験部分において「プロファージ２」として同定されるＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４のプロファージ）と少なくとも８０、好ましくは少なくとも９０または９５％の同一性を有するプロファージゲノムを保有し、その結果、このプロファージによってコードされるファージは、組成物が投与される患者の腸内細菌叢の組成物の他の株および／または共生細菌にインビボで感染し得る。
【００５６】
本発明はまた、以下からなる群より選択される細菌を含む細菌組成物に関する：
（ｉ）２０１３年１１月７日に、番号Ｉ−４８１５でＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株１３１４４、
（ｉｉ）２０１７年８月３１日にＣＮＣＭに番号Ｉ−５２２４で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ  ＩＧＲ７株、
（ｉｉｉ）２０１７年１１月２７日にＣＮＣＭに番号Ｉ−５２６１で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株  ＩＧＲ１１、
（ｉｖ）配列番号１のテールテープメジャータンパク質（ＴＭＰ）（以下の実験部分では「プロファージ２のＴＭＰ」と呼ばれる）からの少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも４０ヌクレオチドのフラグメントと少なくとも６５、好ましくは少なくとも８０、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を発現する任意の他の細菌株、および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の株の少なくとも２つの混合物。
【００５７】
一実施形態によれば、この細菌組成物は、癌を治療するために使用される。
【００５８】
本発明による組成物中に存在する細菌株は、任意の細菌ファミリーに属することができる。もちろん、細菌は癌に罹患した患者に投与されるため、非病原性細菌が優先的に使用されることになる。従って、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株以外の細菌もまた、本発明に従って使用され得る。
【００５９】
既に述べたように、細菌組成物は、典型的には抗腫瘍薬と組み合わせて、それを必要とする患者に投与される。
【００６０】
一実施形態によれば、本発明の細菌組成物は、２０１７年１１月２７日に番号Ｉ−５２６０でＣＮＣＭに寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株ＩＧＲ４をさらに含む。
【００６１】
下記の実験部分に例示される一実施形態によれば、組成物は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株１３１４４（ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株ＩＧＲ７（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２２４）およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株ＩＧＲ４（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６０）を含む。
【００６２】
本発明の特定の実施形態によれば、細菌組成物は、プロファージによってコードされるファージの溶解サイクルを誘発することができる抗腫瘍薬と組み合わせて使用される。このような薬物の非限定的な例は、以下の実施例８に例示されるようなマイトマイシンＣ、ならびに実施例１６に例示されるようなＣＤＫ４／６阻害剤である。
【００６３】
一実施形態によれば、細菌組成物は配列番号２のプロファージと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するプロファージゲノムを保有する少なくとも１つの株を含み、その結果、このプロファージによってコードされるファージは、組成物の他の株および／またはおそらく患者の腸内細菌叢に既に存在する他の細菌にインビボで感染することができる。
【００６４】
本発明の別の態様は、配列番号１のＴＭＰまたは配列番号１３および１４のペプチドを少なくとも含む配列番号１のフラグメントをコードするヌクレオチド配列、または配列番号５３〜１８７からなる群から選択される少なくとも１つのエピトープを含む少なくとも９アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸のペプチドをコードする配列、または配列番号２０９の少なくとも１つのエピトープを含む少なくとも９アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸のペプチドをコードする配列を、前記細菌株にインビトロで導入することによって、抗癌プロバイオティック対象の細菌株の免疫原性を増加させる方法である。配列番号１３および１４のペプチドはマウスＨ−２Ｋｂに結合する免疫原性エピトープに対応するが、これらはまた、これらの配列のいくつかまたは種間で共有されるより広い配列に結合し得る適切なＨＬＡクラスＩハプロタイプを保有するヒトにおいて免疫原性であり得る。配列番号５３〜１８７の配列は、ヒトＨＬＡ分子によって結合される配列番号１のＴＭＰ由来のエピトープであるとしてインシリコで同定されている（以下の表９を参照のこと）。配列番号２０９（Ｘ１＝ＡまたはＱおよびＸ２＝ＶまたはＴを有するＫＬＸ１ＫＦＡＳＸ２Ｖ）は配列ＫＬＡＫＦＡＳＶＶ(配列番号６３）のＴＭＰ１ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性免疫原性エピトープ、配列ＫＬＱＫＦＡＳＴＶ（配列番号１８８）のＧＰＤ１Ｌ由来のヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性エピトープ、ならびにこれらの２つのエピトープの２つのハイブリッド：ＫＬＡＫＦＡＳＴＶ（配列番号２１０）およびＫＬＱＫＦＡＳＶＶ(配列番号２１１）に対応する。有利には、対象の抗癌性のプロバイオティックの細菌株は、得られる細菌株が異なるＨＬＡハプロタイプの患者において免疫原性になるように、異なるＨＬＡハプロタイプによって提示され得るいくつかのエピトープを含む配列で形質導入される。
【００６５】
一実施形態によれば、ヌクレオチド配列は少なくともＫＭＶＥＩＬＥＥＩ(配列番号５５）、ＲＬＬＫＹＤＶＧＶ(配列番号５６）、ＬＬＧＩＹＱＳＹＶ(配列番号６２）、ＫＬＡＫＦＡＳＶＶ(配列番号６３）またはＩＬＶＡＩＴＴＴＩ(配列番号６６）をコードし、これらはＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性エピトープであり、その免疫原性はヒトにおいて実験的に確認されている（以下の実施例７および図２４Ｂを参照のこと）。特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は少なくともＫＬＡＫＦＡＳＶＶ（配列番号６３）、ＫＬＱＫＦＡＳＴＶ（配列番号１８８）、またはＸ１＝ＡまたはＱおよびＸ２＝ＶまたはＴを有する配列ＫＬＸ１ＫＦＡＳＸ２Ｖ（配列番号２０９）の任意の他のエピトープをコードする。
【００６６】
一実施形態によれば、細菌株は配列番号１のＴＭＰと８０％、９０％または９５％、好ましくは９７．５％、より好ましくは９８．７％の同一性を有するタンパク質をコードするか、または上記のような少なくとも１つのエピトープを含む前記タンパク質のフラグメントをコードする核酸（例えば、プラスミド）で形質導入される。当業者は得られる細菌株がＴＭＰまたはそのフラグメントを発現するように、適切な配列（プロモーターなど）を選択する。
【００６７】
一実施形態によれば、株の細菌は、配列番号１のＴＭＰと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するＴＭＰをコードするバクテリオファージに感染される。
【００６８】
再び、目的の任意の細菌株は、それが高度に病原性でないという条件で、この方法において使用され得る。特に、それらのプロバイオティクスに関心があることが既に知られている細菌株は、バクテリオファージでのインビトロ感染によって、またはＴＭＰまたはそのフラグメントをコードするプラスミドでの形質導入によって操作することができる。このような細菌の非限定的な例としては、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃａｅ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｍｏｓｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＸＶＩＩＩ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ種（Ａ．ｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ、Ａ．ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、Ａ．ｓｈａｈｉｉ）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ種、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓａｌｙｅｒｓｉａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓ、ＥｒｙｓｉｐｅｌｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉａおよびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｃｏｌｉｎｓｅｌｌａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ｔａｋａｋａｅｉ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ／Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ビフィドバクテリア（ｌｏｎｇｕｍ、ｂｒｅｖｅ、ｔｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ．．．）およびＥ．  ｃｏｌｉが挙げられる。より詳細には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅを出発材料として有利に使用して、上記の方法によって免疫原性が増大した細菌株を得ることができる。
【００６９】
上記方法の特定の実施形態によれば、バクテリオファージは、配列番号２のヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むゲノムを有する。好ましい実施形態によれば、バクテリオファージは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ  １３１４４（ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５）に存在する３９．２ｋｂのプロファージと同一のゲノムを有する。
【００７０】
特定の実施形態によれば、本発明は、上記の方法によって得られた細菌株に関する。特に、本発明は上記で定義されたＴＭＰタンパク質をコードするファージによるプロバイオティック株のインビトロ感染によって得られる、天然に存在しない細菌株に関し、ここで、プロバイオティック株は、天然においてこのバクテリオファージによって感染されることが知られていない。別の実施形態によれば、本発明は、上記で定義されたＴＭＰタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸での形質導入によって、遺伝子編集によって、または任意の他の技術によって得られる、天然に存在しない細菌株に関する。
【００７１】
増加した免疫原性および改善された抗癌特性を有するように操作された本発明の細菌株は、癌の処置において有利に使用される。
【００７２】
これらの操作された細菌株、特に、配列番号３、１８８および２０９の中から選択されるエピトープを含むタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現する細菌株は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１患者における癌を治療するために効率的に使用され得る。
【００７３】
既に言及したように、上記のような操作された細菌株を含む本発明の細菌組成物は、細菌中に存在するプロファージによってコードされるファージの溶解サイクルを誘発し得る抗腫瘍薬および／または免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて有利に使用される。
【００７４】
本発明はまた、配列番号１のＴＭＰ由来の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列または配列番号２０９の配列を含むポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物に関する。このような組成物は有利にはヌクレオチド配列（ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）として、または少なくとも９アミノ酸、例えば、９ａａ（適切なＭＨＣクラスＩ溝に直接結合する短いペプチド）と２０〜３０アミノ酸（それらのＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子においてＤＣによって交差提示される長いペプチド）との間のペプチドストレッチとして、抗癌ワクチンとして使用され得る。このポリペプチドまたはこのｃＤＮＡに対する組換え体を提示する樹状細胞または人工抗原提示細胞は、患者または健常ボランティア由来の腫瘍または血液由来のナイーブまたはエフェクター記憶Ｔリンパ球をプライミングおよび増幅するためのプレートフォームとして役立ち得る。
【００７５】
本発明による免疫原性組成物の特定の実施形態によれば、ＴＭＰ由来の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列は、ＭＨＣ  Ｉヒト分子によって提示される可能性が高いと同定されたペプチド、例えば配列番号５３〜１８７のペプチドである。本発明による特異的免疫原性組成物は、ＨＬＡ−Ａ２個体において免疫原性であることが実証されている配列番号５５、５６、６２、６３または６６のペプチド配列を含む（実施例７）。別の具体的な実施形態によれば、免疫原性組成物は、配列番号６３、配列番号１８８または配列番号２０９の配列を含むペプチド、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む。このような免疫原性組成物は特に、この患者が高いＧＰＤ１Ｌ発現レベル（ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで測定される）を示す腫瘍を有する場合、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１患者における抗癌ワクチンとして特に有用である。
【００７６】
本発明による特定の免疫原性組成物によれば、ポリペプチドは短いポリペプチド（９、１０または１１ｍｅｒ）である。このような短いペプチドを皮下注射すると、注射部位に存在するすべての細胞のＭＨＣ分子に直接結合する。本発明のこの実施形態によれば、いくつかのＴＭＰエピトープを含むペプチドのカクテルを有利に使用することができる。同じＨＬＡ分子に特異的ないくつかのエピトープが一緒に使用される場合、エピトープは、対応するＨＬＡ分子への結合について競合状態にあることに留意されたい。反対に、異なるＨＬＡ制限エピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２または他のもの）の混合物を使用することによって、ＨＬＡ結合についての競合は存在しない。このようなペプチドのカクテルの別の利点はより広範囲の患者において、すなわち、カクテル中に存在するエピトープに対応するＨＬＡ分子のいずれかを発現する個体において有効であることである。
【００７７】
本発明による別の特定の免疫原性組成物によれば、ポリペプチドは、インビボで内在化され、抗原提示細胞によってプロセシングされるのであろう１０〜２０アミノ酸に隣接する、配列番号５３〜１８７の中で選択される少なくとも１つの９〜１０ＴＭＰ免疫原性ストレッチを包含する、２０〜５０アミノ酸、好ましくは２５〜４０アミノ酸の長いポリペプチドである。次いで、これらの細胞はそのフラグメントを提示し、それによって、ＴＭＰエピトープに対する免疫原性応答を誘発する。このような長いポリペプチドは、有利には宿主のＭＨＣクラスＩだけでなくＭＨＣクラスＩＩ分子にも局所ＤＣによって交差提示できる。例えば、キメラポリエピトープポリペプチド、すなわち、おそらくペプチドリンカーによって分離された、ＴＭＰのエピトープの連結を含むポリペプチドを使用することができる。もちろん、上記の段落で言及したのと同じ理由のために、長いポリペプチドは、有利には異なるＨＬＡ制限エピトープを含む。このようなキメラポリエピトープポリペプチドはまた、ＴＭＰとは異なる抗原由来のエピトープ（例えば、腫瘍抗原由来のエピトープ）を含み得る。
【００７８】
本発明による免疫原性組成物はまた、有利には、適切なアジュバントを含む。当業者は、ペプチドの型およびアプリケーションの型に依存して、最も適切なアジュバントを選択する。本発明に従って使用することができる非限定的なアジュバントには、モンタニド、Ｆｌｔ３Ｌ、シクロホスファミド、ＤＣおよびＴＬＲまたはＳＴＩＮＧアゴニストが含まれる。
【００７９】
一実施形態によると、免疫原性組成物は、配列番号１のＴＭＰからの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。このような組成物は、抗癌ワクチンとして有利に使用され得る。本発明によるポリヌクレオチド組成物の例には、裸のＤＮＡ、ＴＭＰをコードするｍＲＮＡ、ＲＮＡ負荷ナノ粒子および組換えウイルス（レンチウイルス、腫瘍溶解性ウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルスなど）が含まれる。もちろん、ポリペプチド組成物中の異なるＨＬＡ分子に特異的なエピトープを混合する利点に関する上記の考察は、本発明による組成物中に含まれるべきポリヌクレオチドを設計する場合に適用される。あるいは、エピトープが患者のＨＬＡハプロタイプに従って選択され、個人化され得る（表９）。
【００８０】
別の態様によれば、本発明は、上記のような細菌組成物または本発明による免疫原性組成物でｅｘ  ｖｉｖｏでパルスされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞組成物に関する。このような細胞組成物は、癌患者の細胞治療に有利に使用することができる。
【００８１】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１のＴＭＰに対して高い親和性を有するＴ細胞を単離するためのＭＨＣマルチマーに関する。このようなＭＨＣマルチマーにおいて、ＭＨＣ分子は好ましくは配列番号５３〜１８７からなる群より選択されるペプチド、例えば、配列番号５５、５６、６２、６３および６６のペプチドの中から選択される少なくとも１つのペプチド、または配列番号１８８もしくは２０９の少なくとも１つのペプチドに結合される。本発明によるＭＨＣマルチマーはダイマーからオクタマー（例えば、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー）までのサイズの範囲であり、またはマルチマー当たりより多量のＭＨＣ（例えば、デキストラマー）を使用する。本発明による特定のＭＨＣ多量体はＨＬＡ−Ａ＊０２０１／ＫＬＡＫＦＡＳＶＶマルチマー、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／ＫＬＱＫＦＡＳＴＶマルチマー、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／ＫＬＱＫＦＡＳＶＶマルチマーおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１／ＫＬＡＫＦＡＳＴＶマルチマー（例えば、タートラマーまたはデキストラマー）である。
【００８２】
本発明による別の細胞組成物は、配列番号１のＴＭＰに特異的なＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。このような組成物に含まれる細胞は細胞選別（例えば、上記のようなＭＨＣマルチマーを使用する）、続いてエクスビボ増殖、またはＴＭＰに対する高い結合活性を有するＴＣＲをコードするｃＤＮＡでのＴリンパ球の形質導入のいずれかによって得られ得る。このような組成物を得るために使用され得るプロトコルの例は、以下の実施例１０および１１に開示される。
【００８３】
既に言及したように、上記の免疫原性組成物および細胞組成物は、癌を処置するために使用され得る。そのような治療において、それらは、単独で、または上記のようなペプチドもしくはヌクレオチドワクチンと組み合わせて、および／または化学療法などの抗腫瘍治療、例えば、シクロホスファミドなどのアルキル化剤、または免疫チェックポイント阻害剤、特に抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体と組み合わせて使用することができる。
【００８４】
本発明はまた、癌を治療するための、配列番号１のＴＭＰと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５〜９８．７％の同一性を有するタンパク質を発現するバクテリオファージの使用に関する。このようなバクテリオファージは好ましくは薬学的に受容可能な組成物で処方され、これは経口または腫瘍内で投与され得る。
【００８５】
本発明のバクテリオファージ組成物の特定の実施形態によれば、バクテリオファージは、配列番号２のヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも９０％または９５％の同一性を有する配列を含むゲノムを有する。
【００８６】
癌患者を治療する場合、本発明によるバクテリオファージ組成物は有利には免疫チェックポイントを遮断する薬物と組み合わせて、例えば、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体と組み合わせて投与することができる。
【００８７】
以下の実験の部分で説明されるように、本発明者らは、ＨＬＡ−０２０１拘束性エピトープＫＬＡＫＦＡＳＶＶ（配列番号６３）がグリセロール−３リン酸デヒドロゲナーゼ１様タンパク質（ＧＰＤ１Ｌ、３ｐ２２．３上にコードされる遺伝子）のエピトープ（ＫＬＱＫＦＡＳＴＶ、配列番号１８８）と７８％の配列相同性を共有することを見出し、ＴＭＰファージ特異的ＴＣＲと、ＧＰＤ１Ｌを過剰発現する自己組織または腫瘍組織との間の交差反応性が本発明の文脈において送達されるファージの抗癌有効性を説明すると考えられる。したがって、本発明の細菌組成物、免疫原性組成物、細胞組成物およびバクテリオファージ組成物はＧＰＤ１Ｌを過剰発現する腫瘍、すなわち、対になった正常組織において発現されるレベルよりも優れたＧＰＤ１ＬのｍＲＮＡレベルを有する腫瘍（例えば、肺癌対周囲の「健康な」肺実質）を治療するのに特に有用である。ＧＰＤ１Ｌを過剰発現する腫瘍は実際に、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４もしくはＥＨ  ＩＧＲ７もしくはＥＨ  ＩＧＲ１１、または３つの株すべての組み合わせ、または配列番号１のＴＭＰのための任意の他の細菌組換え体、または配列番号６３を含むそのフラグメントを用いた経口療法に、ＴＭＰファージ関連ＨＬＡ拘束性ペプチドもしくは核酸もしくは他のワクチン様式による皮内追加免疫の有もしくは無にかかわらず、選択的に適格であると考えられる。これは、肺癌、黒色腫、消化管の腫瘍、膀胱癌、ＲＣＣおよび乳癌、または胎児抗原を発現するあらゆる腫瘍に適用される。
【００８８】
本発明の別の態様は抗腫瘍薬を同定するためのスクリーニング方法であり、これは、ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５株（または配列番号２のプロファージと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％または９５％の同一性を有するプロファージゲノムを保有する任意の他の細菌株）由来の細菌とインキュベートされる場合に、配列番号１のＴＭＰを含むファージの溶解サイクルを誘発する薬物候補の能力を評価することを含む。この方法を実施する場合、当業者は、異なる濃度の薬物候補を使用し得、そして培養のいくつかの時点でファージ切除を測定し得る。
【００８９】
本発明はまた、患者が化学療法または免疫チェックポイント遮断による処置に対して良好な応答者である可能性があるかどうかを決定するための治療学的方法に関し、全て、処置に対する患者の応答におけるＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５株によって発現されるファージＴＭＰタンパク質の重要性を示す以下に開示される結果に基づいている。これらの方法は、ＮＳＣＬＣ、ＲＣＣ、膀胱癌、膵臓癌、大腸癌および乳癌のような癌を有する患者が化学療法または免疫チェックポイント遮断による治療に対する良好な応答者である可能性が高いかどうかを決定するために特に有用である。より詳細には、このような方法がＩＣＢによる免疫療法の前に、ＮＳＣＬＣまたはＲＣＣの診断時の患者に有利に使用され得る。
【００９０】
本発明のこの態様の一実施形態によれば、本発明のセラノスティック方法は、前記患者からの生物学的試料において、配列番号１のＴＭＰと少なくとも８０％、９０％または９５％の同一性を有する配列の存在を評価することを含む。この方法によれば、患者は、そのような配列が試料中に存在する場合、治療に応答する可能性が高いと考えられる。この方法を実施するために使用できる生体試料の非限定的な例は、腫瘍ゲノム、腫瘍内細菌負荷、糞便ファージ、ファージを含む糞便細菌、糞便試料、気管支肺胞試料、頬試料および痰である。
【００９１】
より具体的には、この方法が特定の配列のＰＣＲ増幅によって実施することができ、以下の工程を含む：
（ｉ）患者の便検体を好気性条件下で許容培地で培養し、腸球菌のコロニーを分離できるようにすること、
（ｉｉ）配列番号１のフラグメントに特異的なプライマーの対を用いて、いくつかの培養可能な単離コロニーに対してＰＣＲを実施すること、および
（ｉｉｉ）増幅フラグメントを検出すること。
【００９２】
より正確には、工程（ｉｉ）では各Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅ．ｈｉｒａｅおよびＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ分離便コロニー内、またはそのうちの少なくとも３〜５個でＰＣＲが行われ得る。例えば、ＰＣＲは、配列番号１９１および１９２のプライマーを用いて実施され得、１０２６ｂｐのアンプリコンを生成する。
【００９３】
本発明はまた、例えばフローサイトメトリーまたはＴＭＰテトラマー結合Ｔリンパ球によって、前記処置の間の循環ＣＣＲ９＋ＣＸＣＲ３＋  ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルを測定することを含む、患者が化学療法または免疫チェックポイント遮断による処置に対して良好な応答者である可能性があるかどうかを決定する方法に関するものであり、前記レベルが所定の閾値を超える場合、患者は、処置に応答する可能性がある。
【００９４】
特定の実施形態によれば、上記のＭＨＣマルチマーは、癌患者由来の生物学的サンプル中の、配列番号１のタンパク質に特異的なＴ細胞の存在を評価するために使用される。試料中のこのようなＴ細胞の存在は、患者が治療に応答しそうであることを示す。より詳細には、この方法がＨＬＡ−Ａ＊０２０１患者が化学療法または免疫チェックポイント遮断による処置に対して良好な応答者である可能性があるかどうかを評価するために実施される場合、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／配列番号２０９マルチマーが使用され得る。
【００９５】
別の実施形態によれば、本発明のセラノスティック方法は腫瘍中のＧＰＤ１Ｌ  ｍＲＮＡのレベルまたはＧＰＤ１Ｌタンパク質のレベルを評価することを含み、前記レベルが所定の閾値を超える場合、患者は治療に応答する可能性が高い。
【００９６】
もちろん、医師または熟練した技術者は例えば、腫瘍におけるＧＰＤ１Ｌ発現レベルおよびＫＬＡＫＦＡＳＶＶ（配列番号６３）に特異的なＴ細胞の存在、またはＧＰＤ１Ｌ発現レベルおよび配列番号１のＴＭＰと高いパーセンテージの同一性を有する配列の存在の両方を評価することによって、患者が治療に応答する予後を精緻化するために、上記の方法を組み合わせ得る。
【００９７】
上記のような治療法を実施する場合、患者が化学療法または免疫チェックポイント遮断による治療に応答する可能性が高いと同定されない場合、本発明による細菌組成物によるプロバイオティック治療を患者に有利に投与して、治療に応答する機会を増加させることができる。患者の応答を増加させるための別のプレコンディショニング治療は、上記のような免疫原性組成物でのワクチン接種である。
【００９８】
本発明の他の特徴はまた、本発明の枠組みで実施され、その範囲を限定することなく、必要とされる実験的支援を提供する生物学的アッセイの以下の説明の過程で明らかになるのであろう。
【実施例】
【００９９】
本発明を説明する実験のいくつかは以下の実施例において２回記載され、過去数年間に本発明者らによってなされた継続的な研究努力を示し、これはＥ．ｈｉｒａｅ株１３１４４、ＩＧＲ７およびＩＧＲ１１の効果を説明するメカニズムのより正確な知識、ならびに抗腫瘍特性を有する新たに操作された株の設計を導いた。
【０１００】
材料及び方法
【０１０１】
図１〜２６に示す各実験について、実験を実施するために使用した材料および方法を図の凡例に詳述する。
【０１０２】
以下の表は、以下の実施例１〜１１で言及されるＥ．ｈｉｒａｅ株を要約する。
【表１】
2021508701.tif 000002
表１：本研究で使用した株。「ＩＧＲ」と呼ばれる菌株は、２０１７年にＧｕｓｔａｖｅ  Ｒｏｕｓｓｙ、ＶｉｌｌｅｊｕｉｆでＵ１０１５  ＩＮＳＥＲＭによって、ニボルマブを二次治療として治療されることになると診断された非小細胞肺癌患者から匿名で分離された。７０８はＩＮＲＡからのものであるが、元々は１０年以上前にスペイン人の協力者から送られたものである。他のすべての株は、共生および病原性腸球菌の参考センターであるＣＨＵ  ｄｅ  Ｒｅｎｎｅｓ  −  Ｈｏｐｉｔａｌ  Ｐｏｎｃｈａｉｌｌｏｕ−Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｄｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｅ−Ｈｙｇｉｅｎｅ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒｅ−２  ｒｕｅ  Ｈｅｎｒｉ  Ｌｅ  Ｇｕｉｌｌｏｕｘ  −  ３５０３３  ＲＥＮＮＥＳ  ＣｅｄｅｘのＶｉｎｃｅｎｔ  Ｃａｔｔｏｉｒ博士からのものである。
【０１０３】
以下の材料および方法もまた、以下の実施例１２〜１６に報告される実験を実施するために使用した。
【０１０４】
細胞培養、試薬および腫瘍細胞株
【０１０５】
ＭＣＡ−２０５  ＷＴを、１０％  ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００  ＵＩ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよびＭＥＭ非必須アミノ酸を含むＲＰＭＩ  １６４０（以下、完全ＲＰＭＩ  １６４０と呼ぶ）中、５％  ＣＯ２と共に３７℃で培養した。全ての試薬は、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。
【０１０６】
マウス
【０１０７】
すべての動物実験は、フランスおよびヨーロッパの法律および規則に従って実施した。地域の施設委員会は、すべてのマウス実験を承認した（許可番号：２０１６−１０９−７４５０）。実験は、政府および機関のガイドラインおよび規則に従って行った。雌Ｃ５７ＢＬ／６は、Ｈａｒｌａｎ（フランス）から購入した。マウスは７〜１２週齢で使用した。すべてのマウス実験は、動物が特定の病原体のない状態で飼育されているＧｕｓｔａｖｅ  Ｒｏｕｓｓｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃａｍｐｕｓの動物施設で行われた。
【０１０８】
抗生物質治療
【０１０９】
マウスを、マウスの無菌飲料水に添加したアンピシリン（１ｍｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５ｍｇ／ｍｌ）、コリスチン（１ｍｇ/ｍｌ)(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびバンコマイシン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含有する抗生物質溶液（ＡＴＢ）で３日間処理した。抗生物質活性は、ＣＯＳ（５％ヒツジ血液を含むＢＤ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天）プレート上で、０．１ｇ／ｍｌのＢＨＩ＋１５％グリセロールに再懸濁した糞便ペレットを、好気性および嫌気性条件下で、３７℃で４８時間培養することによって確認した。細菌移植実験の文脈において、マウスには、翌日に細菌移植を受ける前に３日間のＡＴＢを、動物栄養針を用いて強制経口投与した。
【０１１０】
腫瘍負荷および治療
【０１１１】
同系のＣ５７ＢＬ／６マウスに０．８×１０６  ＭＣＡ‐２０５  ＷＴ肉腫細胞を皮下移植し、腫瘍が２０〜３５ｍｍに達した時点でＣＴＸ（１００ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内（ｉ．ｐ．）処理した。実験設定に応じて、マウスに１週間隔で１回または３回注射した。腫瘍の大きさは３日間毎にノギスの手段により日常的にモニターした。
【０１１２】
専用の共生種による腸内コロニー形成
【０１１３】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ  １３１４４は、当研究室でＣＴＸで処理したＳＰＦマウスの脾臓から元々単離された。Ｅ．ｈｉｒａｅ  ７０８はＩＮＲＡ（Ｐ．  Ｌａｎｇｅｌｌａ）によって提供されたが、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３３４４、ＡＴＣＣ９７９０はＣＨＵ  ｄｅ  Ｃａｅｎ、フランスのＣａｔｔｏｉｒ教授によって提供された。Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍは、フランスのパスツール研究所リポジトリのＩｖｏ  Ｇｏｍｐｅｒｔｓ  Ｂｏｎｅｃａ教授から提供されました。Ｅ．ｈｉｒａｅ  ＩＧＲ株はすべて、患者のインフォームドコンセントおよび地域のＩＲＢの承認（Ｏｎｃｏｂｉｏｔｉｃｓ試験）に従い、当研究室のＮＳＣＬＣ患者の便から分離された。すべての細菌を、好気性条件下、３７℃で２４時間〜４８時間、ＣＯＳプレート上で増殖させた。ＡＴＢ前処理マウスのコロニー形成は、１×１０９細菌を含む懸濁液１００μＬを経口強制経口投与することによって行った。細菌強制経口投与のために、１０８  ＣＦＵ／ｍＬの懸濁液を、蛍光分光光度計（エッペンドルフ）を用いて、ＰＢＳ中６００ｎｍの光学濃度で得た。実験設定に応じて、各マウスについて２または６回の細菌強制経口投与を行った：最初はＣＴＸ注射と同日、次いでＣＴＸ注射の２４時間後。コロニー形成の有効性は、強制経口投与の４８時間後に糞を培養することによって確認した。糞ペレットを採取し、０．１ｇ／ｍｌでＢＨＩ＋１５％グリセロールに再懸濁した。糞便の連続希釈物をＣＯＳプレート上にプレーティングし、好気性および嫌気性条件下で３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、特定の細菌の同定を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計（Ａｎｄｒｏｍａｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して達成した。
【０１１４】
骨髄由来樹状細胞の培養・増殖
【０１１５】
８〜１２週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６  ＷＴマウスの大腿骨および脛骨から骨髄前駆体をフラッシングすることにより骨髄由来樹状細胞（ＢＭ‐ＤＣ）を作製した。骨を無菌ＰＢＳ中に収集し、アルコールおよびＩｓｃｏｖｅ培地（ＩＭＤＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）浴中で洗浄し、骨の四肢を切断し、２６Ｇ針を使用して洗い流した。赤血球溶解後、細胞を、１０％のＦＣＳ  ＋  ２ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋１００ＵＩ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン＋５０μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＩＭＤＭ（本明細書では完全ＩＭＤＭ培地と呼ぶ）中で０．５×１０６／ｍｌで培養し、４０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦトランスフェクト細胞Ｊ５５８の上清）および１０ｎｇ／ｍｌのＢＭ−ＤＣ用組換えインターロイキン−４（ＩＬ−４）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ製）で処理した。細胞を３日目に分割し、７日目または８日目の実験に使用した。
【０１１６】
ＥＬＩＳｐｏｔ  ＩＦＮγによる脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞上のメモリーＴＣ１免疫応答およびＨ２−Ｋｂ拘束性ペプチドの試験
【０１１７】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、９６ウェルＰＶＤＦ底部滅菌プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＳＩＰ  Ｓ４５１０）中で、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴキット（Ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ，Ｅｔａｔｓ−Ｕｎｉｓ）を製造者の指示に従って使用することによって行った。エタノール３５％によるＰＶＤＦ膜活性化後、プレートをＩＦＮ−γに対する捕捉抗体で一晩コーティングし、洗浄した後、ブロッキング緩衝液を２時間インキュベートした。ＢＭ−ＤＣ細胞（１×１０５／ウェル）を熱不活性化（６５℃で２時間）細菌株（Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４、Ｅ．ｈｉｒａｅ  ７０８、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３３４４およびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に感染多重度１：１０（ＭＯＩ）で感染、またはペプチド（２０μｇ／ｍｌ）でパルスし、ＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０５／ウェル）と一緒に添加し、３７℃で２０時間インキュベートした。
【０１１８】
次いで、細胞を除去し、プレートを、１時間３０分の間にＩＦＮ−γに対する検出抗体（ビオチン化）で、そして１時間の間にストレプトアビジン−アルカリホスファターゼで展開した。最後に、ストレプトアビジンの基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ緩衝液）を５〜２０分間インキュベートした。ＣＴＬ  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ドイツ）を用いてスポットを計数した。
【０１１９】
マウスワクチン接種
【０１２０】
ＤＣ分化後、これらのＤＣをポリＩ：Ｃ（１０μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）で一晩活性化した後、熱不活性化（６５℃で２時間）細菌株（ＭＯＩ  １０）で感染させるか、またはペプチド（２０μｇ／ｍｌ、ペプチド２．０）でパルスした。細菌との６時間の培養またはペプチドとの１時間の培養の後、ＢＭ−ＤＣをＰＢＳで３回洗浄した後、マウスの右側腹部に皮下注射した（マウスあたり１．５×１０５細胞）。マウスに１０日間隔で２回ワクチン接種し、２回目のワクチン接種から４週間後に左側腹部にＭＣＡ−２０５腫瘍細胞を最小限の腫瘍形成用量で負荷した。
【０１２１】
フローサイトメトリー分析
【０１２２】
腫瘍のない実験では、ＣＴＸの注射の７日後に脾臓を採取した。腫瘍増殖実験では、脾臓、腫瘍および腫瘍排出リンパ節を、ＭＣＡ−２０５腫瘍を有するマウスへのＣＴＸの最初の注射の７、１４および２１日後の異なる時点で採取した。切除した腫瘍を小片に切断し、２５μｇ／ｍＬのリベラーゼ（商標）および１５０  ＵＩ／ｍＬのＤＮａｓｅ１（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＰＭＩ培地（３７℃で３０分間）中で消化し、次いで、１００および４０μｍ細胞ストレーナー（ＢＤ）を使用して２回粉砕し、濾過した。リンパ節および脾臓をＲＰＭＩ培地中で粉砕し、続いて７０μｍ細胞ストレーナーを通して濾過した。２００万個の脾細胞、腫瘍細胞またはリンパ節細胞を、精製した抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン９３；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に４℃で１５分間プレインキュベートした後、膜染色した。死細胞は、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｙｅｌｌｏｗ  ｄｅａｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて除外した。ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８（ｅＢｉｏＨ３５−１７．２）、ＣＸＣＲ３（ＣＸＣＲ３−１７３）、ＣＣＲ９（ＣＷ−１．２）、ＴＭＰ特異的テトラマー（ＢＤ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅ）に対する抗マウス抗体を用いた。染色した試料をＣａｎｔｏ  ＩＩ  ７色サイトメーター（ＢＤ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）を用いて分析を行った。
【０１２３】
ＨＬＡ−Ａ０２＊０１拘束性ＴＭＰエピトープに対するヒトＴ細胞応答
【０１２４】
健康なボランティア（ＥＦＳ、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  ｓａｎｇ）から細胞除去コーンを回収し、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ勾配を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。抗ＨＬＡ‐Ａ２抗体を用いたフローサイトメトリーにより決定したＨＬＡ−Ａ０２＊０１ハプロタイプを有するドナーのみを選択した。ＰＢＭＣを洗浄し、磁気ビーズ分離のために分離培地（ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％ヒトＡＢ＋血清）に再懸濁した。ＣＤ１４＋単球細胞（ヒトＣＤ１４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を７５×１０６  ＰＢＭＣから濃縮し、１０％ヒトＡＢ＋血清、１％２ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン（ＧＩＢＣＯインビトロゲン）、１０００ＩＵ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦおよび１０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を補充したＩＭＤＭ中で０．５×１０６／ｍｌで培養した。細胞を３日目に分割し、６日目または７日目の実験に使用した。単球を９６ウェルプレートに１  ×１０５細胞／ウェル  で単独またはペプチド（２０μｇ／ｍｌ）の存在下のいずれかで播種し、３７℃、５％  ＣＯ２で２時間インキュベートした。残りの自己ＰＢＭＣ画分を、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＤ８＋  Ｔ細胞単離キット、ヒト、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）について濃縮した。濃縮ＣＤ８＋  Ｔ細胞を洗浄し、計数し、１０％ヒトＡＢ＋血清、１％  ２  ｍＭｏｌ／Ｌグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および５０  Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２（プロロイキン）を補充したＲＰＭＩ−１６４０中に１×１０  ５細胞／ウェルで再懸濁した。単球−ペプチド／Ｔ細胞共培養物を、３７℃、５％  ＣＯ２で１週間インキュベートした（培地を２日ごとに交換した）。次に、細胞のプールを９６ウェルＥＬＩｓｐｏｔプレートに２×１０５細胞／ウェルで播種し、ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）有りまたは無しで、または陽性対照として抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ（１μＬ／ｍｌ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、３７℃で２０時間再刺激した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、製造者の指示に従って、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴキット（Ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ，Ｅｔａｔｓ−Ｕｎｉｓ）を使用することによって、９６ウェルＰＶＤＦ底部滅菌プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＳＩＰ  Ｓ４５１０）中で行った。
【０１２５】
ＰＣＲ法によるファージＴＭＰ配列の便検出
【０１２６】
我々は、腸球菌コロニーの分離を可能にするために、好気性条件と許容培地で数回希釈した後、（患者の）便または回腸材料（マウス）を培養した（（Samb−Ba et al., 2014）に記載されている手順に従って）。我々は、各単一の培養可能なＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓコロニーにおけるＴＭＰ配列のＰＣＲを実施した。１つのコロニーを１００μｌのヌクレアーゼを含まない水に入れて細菌ＤＮＡを放出させ、５μｌのＤＮＡ、１２．５μｌのＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５μｌのヌクレアーゼを含まない水、および１．２５μｌの各ＴＭＰプライマー（２０μＭ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、臭化エチジウムを含有する１．５％アガロースゲル上で分離し、ＵＶ暴露によって明らかにした。プライマーの配列は、順方向５’−ＡＣＴＧＣＡＧＣＣＧＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡ−３’（配列番号１９１）および逆方向５’−ＴＣＣＧＴＡＴＣＧＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＴ−３’（配列番号１９２）（アンプリコン１０２６ｂｐ）である。
【０１２７】
ＴＭＰを発現するＥ. ｃｏｌｉの生成
【０１２８】
Ｐ２３プロモーター配列を含有するＤＮＡフラグメントを、２つの相補的プライマー（５’−ＣＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＣＣＴＡＡＧＡＣＴＧＡＴＧＡＣＡＡＡＡＡＧＡＧＣＡＡＡＴＴＴＴＧＡＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＴＴＡＧＡＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＡＴＡＴＡＧ−３’（配列番号１９３）および５’−ＧＡＴＣＡＴＡＴＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＡＣＴＡＴＴＴＡＡＴＴＣＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴＴＣＴＡＡＡＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＡＧＴＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＡＧＴＣＴＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＴＧＣＡＴＧ−３’（配列番号１９４））をアニーリングすることによって生成した。次いで、この配列をＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩ消化ベクターｐＤＬ２７８（Ａｄｄｇｅｎｅ  ４６８８２、Ｇａｒｙ  Ｄｕｎｎｙ（ＬｅＢｌａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２）からのギフト）に挿入して、ベクターｐＤＬ２７８−Ｐ２３を生成した。ＴＭＰ遺伝子の一部（ＴＭＰのＮ末端１１８５ヌクレオチドであって、エピトープＴＳＬＡＲＦＡＮＩ（配列番号１３）を含み、Ｃ末端のＦＬＡＧタグに融合されている）を、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４ゲノムＤＮＡ（５’−ＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＡＧＴＡＡＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＧＣＧ−３’（配列番号１９５）５’−ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＡＣＧＴＡＧＴＡＡＡＣＴＡＴＣＡＣＧＴＡＡＴＣＧＡＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１９６））から増幅させ、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化ベクターｐＤＬ２７８−Ｐ２３に挿入して、ベクターｐＤＬ２７８−Ｐ２３−ＴＭＰ−ＦＬＡＧを生成した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてエピトープにおける突然変異を導入した。プライマー５’−ＡＡＣＧＡＧＣＴＡＡＧＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１９７）および５’−ＧＴＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＧＴＴ−３’（配列番号１９８）を用いて、２位（ＳからＡ、ｐＤＬ２７８−Ｐ２３−ｍｕｔ２−ＦＬＡＧ）を変異させ、プライマー５’−ＡＴＴＡＧＣＡＡＡＡＣＧＡＧＣＧＡＡＧＧＡＡＧＴＡＧＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧ−３’（配列番号１９９）および５’−ＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＡＣＴＴＣＣＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＴＴＧＣＴＡＡＴ−３’（配列番号２００）を用いて、３位（ＬからＦ、ｐＤＬ２７８−Ｐ２３−ＴＭＰ−ｍｕｔ３−ＦＬＡＧ）を変異させた。対照プラスミドｐＤＬ２７８−Ｐ２３−ＥＧＦＰを生成するために、ＥＧＦＰを、ｐＣＩＢ１（ｄｅｌｔａＮＬＳ）−ｐｍＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ２８２４０、Ｃｈａｎｄｒａ  Ｔｕｃｋｅｒ（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）からのギフト）から、プライマー５’−ＣＴＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号２０１）および５’−ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＴＡＡＴＴＡＣＡＣＡＣＴＴＴＧＴＣ−３’（配列番号２０２）を使用して増幅し、そしてＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化ベクターｐＤＬ２７８−Ｐ２３に挿入した。プラスミドを化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α  （ＮＥＢ）に形質転換し、正しい挿入物���有するプラスミドの存在を、配列分析（５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧ−３’（配列番号２０３）および５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号２０４））によって確認した。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＥＧＦＰおよびＴＭＰ−ＦＬＡＧの発現を、それぞれ、ＧＦＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２９５６）またはＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ７４２５）を標的とする抗体を使用するウェスタンブロット分析によって確認した。
【０１２９】
ＭＣＡ２０５細胞におけるマウスＰｓｍｂ４のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介突然変異
【０１３０】
野生型ＭＣＡ２０５細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入し、そして１０％  ＦＢＳ（ｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ、Ｉｎｃ．）、１００  Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ、Ｉｎｃ．）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中に３７℃で維持した。ＣＲＩＳＰＲノックイン変異のために、Ｚｈａｎｇ  ｌａｂによって開発されたＣＲＩＳＰＲデザインツール（http://CRISPR.mit.edu/）を使用することによってｇＲＮＡ（配列ＡＧＡＴＡＴＴＧＣＧＧＡＡＡＣＧＡＧＣＣ（配列番号２０５））を設計した。設計された配列を含むオリゴヌクレオチドを合成し（Ｓｉｇｍａ）、ＣＢｈプロモーター下にあるＣａｓ９遺伝子（ヒトコドン最適化し、選択を可能にする２Ａ−ＧＦＰと融合）と、Ｕ６プロモーター下でクローニングされたｓｇＲＮＡとを含むｐＸ４５８バックボーン（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃４８１３８（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３））にライゲーションした。変異部位を含む相同テンプレート（添付された配列）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ、Ｉｎｃ．）によって合成した。クローニングされたｐＸ４５８プラスミドおよび合成されたホモロジーアームを、メーカーのプロトコールに従ってリポフェクタミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ、Ｉｎｃ．）の手段によってＭＣＡ２０５細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＧＦＰ陽性細胞を９６ウェルプレートに、単一細胞として選別した後、生存クローンを、一方は−８０での凍結保存のため、他方はゲノムＤＮＡ抽出のために、二重条件で増殖させた。クローン由来のゲノムＤＮＡ中の標的化領域を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；ｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびプライマー５’ＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＣＴＴＴＴＣＡＣＧＡ３’（配列番号２０６）および５’ＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＧＴＴＣＴＡＣＡＣＡ  ３’（配列番号２０７）を使用するＰＣＲによってさらに増幅し、そしてＭｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＤＮＡゲル抽出キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で精製した後、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ（ＢＥＲＳＢＥＲＧ  ＧＥＲＭＡＮＹ）に送って、プライマー５’ＧＧＡＣＣＴＴＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＣＡＧＧ３’（配列番号２０８）で配列決定した。配列結果に従い、陽性クローンを増殖させ、配列を確認するためにＤＮＡ抽出に供した。デザインされた突然変異を保有していないトランスフェクションされた単一細胞クローンを「ＷＴ」クローンとして用いた。
【０１３１】
ゲノム配列決定と解析
【０１３２】
５つのＥ．ｈｉｒａｅ（１３１４４、７０８、１３１５２、１３３４４およびＥＨ−１７）株の全ゲノム配列を、ＰａｃＢｉｏ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｋｏｎｓｔａｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。他の１５のＥ．ｈｉｒａｅ単離株から、メーカーの推奨に従い、Ｑｕｉｃｋ−ＤＮＡ  ｆｕｎｇａｌ／ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡを分離した。ＤＮＡ剪断後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＤＮＡライブラリー調製キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いてＤＮＡライブラリーを調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォームおよびＭｉＳｅｑ試薬キットバージョン３を用いてペアエンド読み取り（２×３００ｂｐ）として配列決定した。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（Ｂｏｌｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）を用いてイルミナの読み取りをトリミングし、Ｆａｓｔｘ−ｔｏｏｌｋｉｔ（http://hannonlab.cshl.edu/Fastx_toolkit/）を用いて質フィルタリングし、ＳＰＡｄｅｓ（Ｂａｎｋｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）を用いてアセンブルした。タンパク質配列は、ｐｒｏｋｋａ  ｖ１．１１ソフトウェア（Ｓｅｅｍａｎｎ、２０１４）を用いて予測した。ＰＨＡＳＴソフトウェアを用いてプロファージ領域を検出した。予測されたタンパク質は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）非重複（ＮＲ）データベースに対してＢＬＡＳＴｐを用いて注釈を付けた。
【０１３３】
系統ゲノム学と比較ゲノム学
【０１３４】
２０のＥ．ｈｉｒａｅゲノム間の一塩基多型を、ｐａｒｓｎｐプログラム（Ｔｒｅａｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）および１３１４４ゲノム配列を参考として用いて調査した。系統解析は、２０ゲノムのコアゲノムに保持されている４７，３０３の多型部位を考慮して行った。最尤系統発生を、Ｆａｓｔｒｅｅを用いて構築した（Ｇｕｉｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）。系統樹を、ｆｉｇｔｒｅｅ（http://tree.bio.ed.ac.uk/ software/figtree/）を用いて可視化した。Ｅ．ｈｉｒａｅ２０株の完全プロテオーム配列をＢｌａｓｔＰおよびＣｌｕｓｔａｌＷを用いたペアワイズアラインメントを用いて比較した。発明者らは７０％のアミノ酸配列同一性および５０％の配列カバー率の保存的パラメータ値を有するすべての予測遺伝子の翻訳タンパク質配列について、ｏｒｔｈｏＭＣＬ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）を用いてＥ．ｈｉｒａｅ相同遺伝子をクラスター化した。異なるユニークなコアゲノムの決定は、ｏｒｔｈｏＭＣＬによって見出された相同性クラスターに基づいていた。
【０１３５】
統計解析
【０１３６】
データ分析および表現は、Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）のいずれかを用いて行った。腫瘍の大きさの差を、Ａｎｏｖａまたは専用ソフトウエア（https://kroemerlab.shinyapps.io/TumGrowth/）のいずれかを用いて計算した。簡潔には、腫瘍増殖を、対数前処理腫瘍表面に適用される線形混合効果モデリングに供した。Ｐ値は、腫瘍増殖の傾きと切片（対数スケールで）の両方が対象の治療群間で異なっているかどうかを共同で検定することによって算出した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を用いて生存確率を推定し、中央値または最適カットオフアプローチを用いて連続変数の最良カットオフを選択した。生存曲線を、ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を用いて評価した。報告された検定はすべて両側検定であり、Ｐ値＜０．０５で有意とみなされた。正規化遺伝子発現値（ＦＰＫＭ−ＵＱ）および対応する臨床データをＴＣＧＡデータポータルからダウンロードした。生存分析のために、患者は癌型データセット当たりのＧＰＤ１Ｌの発現中央値および予測ＨＬＡ対立遺伝子によりグループ分けされた（Ｃｈａｒｏｅｎｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７）。全生存期間（ＯＳ）と無増悪生存期間（ＰＦＳ）のハザード比（ＨＲ）と９５％信頼区間（ＣＩ）をＣｏｘ回帰分析で計算した。腫瘍浸潤免疫細胞組成物を、ＣＩＢＥＲＴＳＯＲＴ（絶対モード）（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）を用いて決定し、Ｐｅａｒｓｏｎ相関を用いて遺伝子発現と比較した。
【０１３７】
実施例１：Ｅ．ｈｉｒａｅの異なる株は、異なる免疫原性潜在能および抗腫瘍効果を示す
【０１３８】
発明者らはまず、広域スペクトル抗生物質の１４日間投与によって引き起こされたものよりも、より良い腸内菌共生バランス失調の生理学的条件で、発明者らのＥ．ｈｉｒａｅ分離株を試験した。本発明者らは実際に、腸マイクロバイオームのレパートリーの逸脱を示すか否かにかかわらず、２人の乳癌患者（および明確な予後）からの糞便（ＦＭＴ）をＡＴＢ処置レシピエントに移し、（腸内菌共生バランス良好（ｅｕｂｉｏｔｉｃ）マウスに示されるように）ＣＴＸの完全な効力の回復を試みる異なる系統の補助的Ｅ．ｈｉｒａｅを用いて、それらの腸内菌共生バランス失調を補償した（図１）。腸内菌共生バランス失調ＢＣ患者由来のＦＭＴは腸内菌共生バランス良好（ｅｕｂｉｏｔｉｃ）同腹児と比較してＣＴＸに対する耐性を付与したが（図２Ａ−Ｂ）、ＥＨ１３１４４生菌は有効性の回復に非常に有効であった（図２Ｃ−Ｅ）。別のＢＣ患者（明白な腸内菌共生バランス失調を示さない）からのＦＭＴの第２の例（図３Ａ−Ｂ）では、生きているＥＨ１３１４４によって媒介される効果も有意であった（図３Ｃ−Ｄ）。しかし、同様の状況で、肺癌患者の便から培養したＥ．ｈｉｒａｅの他の株（ＩＧＲ１およびＩＧＲ１１）は免疫原性を示さなかったが（図４Ａ−Ｃ）、ＥＨ１３１４４と同程度にＢＭ−ＤＣによるＩＬ−１βおよびＩＬ−１２産生を誘導するのに有効であった（図には示していない）。
【０１３９】
さらに、肺癌患者の便から培養したＥ．ｈｉｒａｅ（ＩＧＲ４およびＩＧＲ７）も１３１４４で観察されたように免疫原性を示したが、ＥＨ１０８１５は抗腫瘍効果を媒介しなかった（図４Ｄ）。さらに、ＥＨ１３１４４、ＩＧＲ４およびＩＧＲ７の組み合わせは、ＥＨ１３１４４誘導化合物よりも優れている（図５）。
【０１４０】
興味深いことに、低温殺菌されたＥＨ１３１４４は、その生きた対応物よりもはるかに効果が低く、腸内菌共生バランス失調のＦＭＴにおいてＣＴＸ殺腫瘍活性を回復することができなかった（図６）。
【０１４１】
発明者らは、ＥＨ１３１４４がＡＴＢだけでなくＦＭＴ誘発患者の腸内菌共生バランス失調においてＭＣＡ２０５肉腫に対するＣＴＸ免疫および殺腫瘍活性を増強するユニークな特性を有すると結論する。
【０１４２】
実施例２：Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４は、ＥＨ７０８と交差反応性の腸間膜リンパ節および脾臓におけるＣＤ８＋Ｔｃ１細胞を増幅する
【０１４３】
ＥＨ１３１４４はシクロホスファミドとのアジュバント役割を果たし、Ｔ細胞およびＩＦＮγ依存的様式で抗腫瘍免疫応答および抗癌効果をブーストする（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）。腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）および脾臓からの二次リンパ器官におけるＴ細胞免疫応答の動態を解析することにより、ＥＨ１３１４４の免疫原性のメカニズムを解明した（図７Ａおよび７Ｄ）。ＥＨ１３１４４ならびにＥ．ｈｉｒａｅ  ７０８は、両方とも、１週間後のｍＬＮおよび２週間後の脾臓の両方においてＣＤ８＋Ｔ細胞の蓄積を誘導することができた（図７Ｂおよび７Ｅ）。しかし、ＥＨ１３１４４は効率的な抗腫瘍免疫応答を誘導するが、Ｅ．ｈｉｒａｅ  ７０８はそうすることができない（Ｄａｉｌｌｅｒｅら（２０１６）の図１Ｄ）。ＥＨ１３１４４はまた、ｍＬＮのＣＤ４＋Ｔ細胞プールを増幅した（図７Ｃ）。さらに、ＥＨ１３１４４は脾臓（図７Ｆ）および腫瘍床（図８）においてＣＤ８＋  ＣＣＲ９＋  ＣＸＣＲ３＋  の蓄積を誘導する。
【０１４４】
このＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の特殊性を分析するために、種々のＥＨ単離株（１３１４４、ＥＨ７０８およびＥＨ１７またはＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に感染した骨髄由来樹状細胞（ＢＭ−ＤＣ）を脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞に曝露した。共生特異的記憶ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を、Ｔｃ１免疫応答の特徴であるＩＦＮγ陽性スポットの計数（図９）により２４時間後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりモニターした。興味深いことに、ＥＨ７０８およびＥＨ１３１４４のみが、それら自身の間の交差防御を伴う記憶Ｔｃ１免疫応答を誘導し得（図１０）、一方、ＥＨ１７はそうすることに失敗し、Ｄａｉｌｌｅｒｅら（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）によって報告されたＥＨ１７の貧弱な防御抗腫瘍効果を裏付ける。
【０１４５】
免疫組織化学的に中和抗ＣＤ８抗体の有無で腸管炎症性病変をモニタリングし、結腸粘膜のＣＤ８＋  Ｔ細胞浸潤を精査した（図１１Ａ）。ヘマトキシリンエオシン染色結腸粘膜は、ＥＨ１３１４４またはＥＨ７０８を経口強制投与した後、ＣＴＸ後に共生細菌を投与しない場合よりも多く浸潤したが、これらの浸潤は動物を中和抗ＣＤ８抗体のｉｐ投与によって前処置した場合に劇的に減少した（図１１Ｂ）。注目すべきことに、ｍＬＮまたは脾臓でプライムされたこれらのＣＤ８＋  Ｔ細胞は遠隔腫瘍がなくても粘膜固有層に帰宅する傾向があるが、肉腫堆積が皮下に導入された場合はそうではない（図１８）。
【０１４６】
まとめると、これらの所見はシクロホスファミドとの関連でＥＨ１３１４４またはＥＨ７０８を強制経口投与すると、脾臓のＴｈ１だけでなく（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）、腫瘍堆積が存在しない場合に結腸に戻るか、腫瘍床が発生した場合に腫瘍床に戻る可能性があるＥＨ７０８およびＥＨ１３１４４（ただしＥＨ１７ではない）配列の両方を認識する全身性Ｔｃ１免疫応答も引き起こすことを示唆している。
【０１４７】
実施例３：ＥＨ特異的Ｈ−２Ｋｂ拘束性ペプチドのスクリーニング：Ｅ.ｈｉｒａｅ  １３１４４ゲノムは、ＴＭＰファージタンパク質中に免疫原性ペプチド配列を含む
【０１４８】
潜在的な９−ｍｅｒ  ＭＨＣクラスＩ結合エピトープを同定するために、３つのＥ．ｈｉｒａｅ株（１３１４４、７０８およびＥＨ１７）について全ゲノム差別分析を実施した。検索は、細胞内局在化（ＰＳＯＲＴソフトウェアによる細胞壁および細胞外タンパク質の濃縮）、およびＨ２−Ｋｂへの結合親和性（＜５０ｎＭ結合親和性、ＮｅｔＭＨＣソフトウェア）に焦点を当てた（図１２、表２〜５）。
【表２】
2021508701.tif 000003
表２：他の株には存在しないＨ−２ｂ拘束性ＥＨ１３１４４ペプチド
【０１４９】
【表３】
2021508701.tif 000004
表３：他の株には存在しないＨ−２ｂ拘束性ＥＨ７０８ペプチド
【０１５０】
【表４】
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表４：他の株には存在しないＨ−２ｂ拘束性ＥＨ１７ペプチド
【０１５１】
【表５】
2021508701.tif 000006
表５：Ｈ−２ｂ拘束性ＥＨ１３１４４／ＥＨ７０８共通ペプチド
【０１５２】
ＣＴＸ処理マウスから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞脾細胞を、プールした９ｍｅｒペプチドで再刺激して（群１〜１３、表６）、潜在的に免疫原性のエピトープをインビボで同定した。図９に概説したものと同じプロトコールを用いて、本発明者らは、１３１４４の免疫原性が群１（図１３Ａ）のような他の群のペプチド（データは示さず）とは対照的に、群７の関連ペプチド（図１３Ｂ）に依存することを見出した。次に、群７を４つのＨ−２Ｋｂペプチドに分割した（表７）。Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４の免疫原性は、ファージテールレングステープメジャータンパク質（Ｔｍｐ）内に存在し得る（表７）。実際、本発明者らは、ＴＭＰ１およびＴＭＰ２ペプチドのみが記憶ＥＨ１３１４４（７０８およびＥＨ１７ではない）誘導Ｔｃ１細胞によって高度に認識されることを発見した（図１３Ｃ）。注目すべきことに、ＥＨ１０８１５株（ＥＨ１３１４４と同じ２つのプロファージを保有していたが、ＴＭＰ１の３位およびＴＭＰ２の２位と７位に変異を保有している（図１３Ｄ））は、想起応答を誘導せず（図１３Ｅ）、なぜこの細菌が有意な抗腫瘍効果を仲介できなかったのかを説明しうる。対照的に、ＥＨ１３１４４と非常に高い配列相同性を共有するＥＨクローンＩＧＲ７で得られた結果は、想起応答を誘導する（図１３Ｅ）。
【０１５３】
【表６−１】
2021508701.tif 000007
【表６−２】
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表６：ｉｎ  ｖｉｖｏ実験で用いたＨ−２ｂ拘束性Ｅ．ｈｉｒａｅペプチド群
【０１５４】
【表７】
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表７：免疫原性ＥＨペプチド配列に対応するタンパク質
【０１５５】
ＴＭＰ１特異的テトラマーの製造により、腫瘍のないマウスおよびＥＨ１３１４４、ＥＨ１７、１０８１５またはＩＧＲ７およびＣＴＸ処置を伴う経口強制投与後のマウスにおいて、ｍＬＮ（図１４Ａ）および脾臓（図１４Ｂ−Ｃ）中のＴＭＰ１特異的Ｔ細胞をモニターすることが可能になった。発明者らは、腸由来のＴ細胞（ＣＣＲ９＋  Ｔ細胞）のみがＥＨ１３１４４およびＩＧＲ７に対するＴＭＰ１特異的Ｔ細胞であることを観察した（図１４）。さらに、担癌マウスでは、腫瘍流入リンパ節および腫瘍におけるＴＭＰ特異的テトラマー染色が、ＴＭＰエピトープ１プロファージ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍床に蓄積し、ＣＣＲ９＋ＣＸＣＲ３＋  ＣＴＬに含まれることを示している（図１５）。
【０１５６】
テンペレートバクテリオファージは、形質導入を介して毒性、抗菌薬耐性遺伝子、免疫原性配列を新たな細菌宿主に伝達する細菌性ウイルスである（Ｗｅｉｎｂａｕｅｒ、２００４）。ファージテールレングステープメジャータンパク質（Ｔｍｐ）は多数のファージおよびプロファージに高度に保存されており、最も重要なのはサイフォウイルス科のファージであり、高度に保存されたトリプトファンおよびフェニルアラニンアミノ酸を固定された位置に有する様々な数のタンデムリピートを含む。サイフォウイルス科に属するファージはそのＴｍｐにいくつかのモチーフを含んでおり（Ｂｅｌｃａｉｄ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１；Ｐｉｕｒｉ  ａｎｄ  Ｈａｔｆｕｌｌ、２００６）、その中でペプチドグリカン加水分解酵素は周囲の細菌の感染能を促進し、蘇生促進因子（ｒｅｓｃｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）（Ｒｐｆｓ）を含む。Ｒｐｆｓは、休眠菌の再活性化だけでなく、結核菌に対する先天性応答（Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）、ならびに同族の長期免疫応答（Ｃｏｍｍａｎｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）も調節していることに関連している。実際、結核菌  Ｒｐｆｓ  Ｔ細胞エピトープは結核菌に対するヒト免疫応答において重要な免疫原であることが報告された（Ｃｏｍｍａｎｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）。
【０１５７】
実施例４：Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４  Ｔｍｐペプチドまたは生菌による免疫化は、腫瘍負荷に対する防御を付与する
【０１５８】
１．５．１０５を用いた皮下ワクチン接種を行った  ＢＭ−ＤＣは、ポリＩ：Ｃで活性化され、続いて、ＴＭＰペプチドまたは生きたＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４に曝露されて、ＭＣＡ２０５肉腫または同系ＭＣＡ３８結腸癌に対して、１０日間隔で、ナイーブＣ５７ＢＬ／６動物を２回免疫する（図１６）。非パルスＢＭ−ＤＣまたはグループ１のペプチドに暴露されたＢＭ−ＤＣはＭＣＡ２０５による致死的負荷に対する防御を媒介するのに効率的ではなかったが、ＴＭＰ１−ＴＭＰ２に暴露されたＢＭ−ＤＣはＭＣＡ２０５に対する防御効果を生きた細菌と同様に効率的に顕著に伝えた（図１７）。
【０１５９】
発明者らは、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４の強制経口投与が、腸粘膜または腫瘍微小環境に戻ることができるｍＬＮおよび脾臓において免疫応答を引き起こすという仮説を立てた。腸および腫瘍の免疫監視を結びつけるために、発明者らは、未処置マウスと担癌マウスにおいて、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４による連続経口強制投与によって誘発された相対的免疫浸潤を比較した。実際、発明者らはＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞依存性結腸炎症性病変（図１１）が腫瘍保有者において顕著に減少し、細菌の経口投与中の腸と腫瘍微小環境との間の競合を支持することを見出した（図１８）。
【０１６０】
実施例５：  Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４ゲノムは、サイフォウイルス科の２つの４０．６−ｋｂおよび３９．２−ｋｂプロファージ配列をコードする
【０１６１】
ＥＨ１３１４４株および４つの他のＥ．ｈｉｒａｅゲノム（７０８、１０８１５、１３１５２およびＥＨ１７）を、Ｐｒｏｋｋａプログラムを使用して注釈付けした。各々の異なる株の遺伝子間の相同性関係を、＞８０％のアミノ酸同一性カットオフを有するＢＬＡＳＴＰプログラムおよびＲｏａｒｙソフトウェアを用いて評価した。５つのＥ．ｈｉｒａｅゲノムのコアゲノムアラインメントをＰＲＡＮＫプログラムを用いて実施した。ＰＨＡＳＴＥＲオンラインプログラムを用いてプロファージ領域を予測した。
【０１６２】
Ｅ．ｈｉｒａｅ株の比較分析では、１２，７４８遺伝子のパンゲノムが得られた。コアゲノム（すべての株が共有する遺伝子のセット）は２，０３６のオーソロガス遺伝子（５９％）から構成され、アクセサリーゲノム（すべてではないが一部の種に存在する遺伝子のセット）は５７０のオーソロガス遺伝子と９２３のユニーク遺伝子（個々の種に固有の遺伝子）から構成されていた。ＥＨ１３１４４株は１９６のユニークな遺伝子をコードしていたが、１３１４４株と７０８株は２７のオーソロガスなタンパク質を共有していた（図１９Ａ）。
【０１６３】
Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４のゲノムにおける特殊性は、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓファージｐｈｉＥｆ１１およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＣＮＰｘとそれぞれ配列相同性を示す２つのインタクトなプロファージ領域（４０．６−ｋｂおよびａ  ３９．２−ｋｂ）をコードしていることである（図１９Ｂ）。４０．６−ｋｂプロファージは、５つのゲノム間で共有されている１２遺伝子、株１３１４４と７０８との間で共有されている１６遺伝子、およびＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４に特有のおよび８遺伝子を含む、５７の遺伝子をコードしていた（図２０Ａ）。３９．２−ｋｂプロファージは、５つのゲノムの間で共有されている７遺伝子、株１３１４４と７０８との間で共有されている３遺伝子、およびＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４に特有の２２遺伝子を含む、６５の遺伝子をコードしていた（図２０Ｂ）。両プロファージのゲノム構造はサイフォウイルス科に属することを示唆した。実際、２つのプロファージは、サイフォウイルスファージの特徴であるキャプシド、ポータルおよびテール構造をコードする遺伝子を保有している。２つのプロファージは３８％のアミノ酸相同性を有するテールテープメジャータンパク質（ＴＭＰ）をコードした。４０．６−ｋｂプロファージのＴＭＰはＥ．ｈｉｒａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｌｌｏｒｕｍおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍプロファージ  ＴＭＰと配列相同性を示し、それぞれ９８．８％、９６．７％および９７．７％のアミノ酸同一性を示した。３９．２−ｋｂプロファージのＴＭＰは、１００％の相同性を有するＥＨクローンＩＧＲ７（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２２４）のみと配列相同性を示し（図２１、表８）、８９．２％のアミノ酸同一性を有するＥ．ｆａｅｃａｌｉｓプロファージＴＭＰとは程度は低かった。他のファージ遺伝子との配列相同性にもかかわらず、２つのプロファージ全体は株１３１４４で独自にコードされていた。最後に、ＴＭＰ１およびＴＭＰ２ペプチドの両方は、第２のプロファージ（配列番号２）の同じファージテールテープメジャータンパク質（ＴＭＰ）遺伝子の一部である。１３１４４のＴＭＰ１はＩＧＲ７およびＩＧＲ１１と１００％の相同性を示したが、１０８１５およびＩＧＲ１と８８．８９％の相同性を示した（３位における１つの突然変異）。１３１４４のＴＭＰ２はＩＧＲ７とのみ１００％の相同性を示し、１０８１５およびＩＧＲ１１とは７７．７８％の相同性を示した（それぞれ２位および７位または２位および４位における２つの突然変異）（図２１、表８）。
【０１６４】
【表８】
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表８：菌株の特性の要約
【０１６５】
実施例６：Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４細菌およびファージ配列は、ヒトにおいて３，０００を超えるメタゲノムを含むＭＧ参照カタログにおいて時折見出されている
【０１６６】
１７の異なるデータセットからの合計３０２７のメタゲノムをスクリーニングした（図２９Ａ）。大多数は腸マイクロバイオーム（便）であったが、口腔、皮膚、腟、痰も含まれていた。データセットのほとんどは、いくつかの非西洋人集団を含むすべての大陸をカバーする公的に入手可能である。また、発明者らはＮｉｃｏｌａ  Ｓｅｇａｔａの未発表データの一部も含めた（最も顕著なのは、対になった母親／乳児被験体２５例のうち、縦断的に追跡したもの）。Ｅ．ｈｉｒａｅゲノムとそのファージのカバー範囲（ＢＯＣ）を試料の各々で評価した。ＢＯＣは、メタゲノム中の読み取りでカバーされるゲノムの割合を測定する。ＢＯＣ  １．０は、参照株の全ゲノムがメタゲノムにあることを意味する。このスコアに基づいて、発明者らは、Ｅ．ｈｉｒａｅが２つの試料中に確実に存在すると確信して結論づけることができた。１つはモンゴル人の被験体からのものであり、もう１つはスウェーデン人の被験体からのものである（それぞれ０．９および０．７５のＢＯＣ）。おそらくＥ．ｈｉｒａｅの存在を示す０．１〜０．３７のＢＯＣを有する他の５つのサンプルが存在する。ＢＯＣが０．１未満では、Ｅ．ｈｉｒａｅ株の存在を特徴付けることができない。ファージ配列に関しては、Ｅ．ｈｉｒａｅについて陽性のモンゴル人被験体も配列番号２の１３１４４からのプロファージ２を有するが、スウェーデン人は７０８からのプロファージ２を有するようである。ファージは細菌ゲノムよりも多くの試料に存在するようである。１つの興味深い症例は、生後１、３、および７日目の乳児からの３つのサンプル（サンプルＣＡ＿Ｃ１０００６ＩＳ２０８４ＦＥ＿ｔ１Ｍ１５、ＣＡ＿Ｃ１０００６ＩＳ２０８７ＦＥ＿ｔ２Ｍ１５、ＣＡ＿Ｃ１０００６ＩＳ２０９１ＦＥ＿ｔ３Ｍ１５）におけるファージ１３１４４の０．６６  ＢＯＣでの存在である。これら３つのサンプルはＥ．ｈｉｒａｅを有していないが、別のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種由来の別の株を有しているようである。このことは、このファージがＥ．ｈｉｒａｅのみに特異的ではないことを示唆しているかもしれない。
【０１６７】
実施例７：Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４は、マウスだけでなくヒト（正常ボランティアおよび乳癌患者）においても免疫原性である：ヒトにおいて高い免疫原性のＴＭＰ特異的ペプチドを定義する
【０１６８】
Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４はマウス株であるが、ヒト糞便メタゲノミクスとの研究アラインメントでその配列が回収されていることから、ヒト（正常ボランティアまたは乳癌患者）は（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）で報告されているように、この株が提示したエピトープの一部に対して免疫応答を発現する可能性があると仮定した。図２２Ａは、ＣＤ４およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の１２〜１９％がＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４に対する記憶ＩＦＮγギアＴ細胞応答を示すことができることを示しており、実際、このＥＨ株はヒト細胞によって認識され得ることを示唆している。図２２Ａはまた、ＢＣ患者の３２人％がＥＨ１３１４４でパルスした単球に対して反応性を示さないＣＤ４＋  Ｔ細胞を有し、一方５２％がＩＬ−１０産生記憶ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を発達させたことを強調している。これは、記憶ＣＤ４＋  ＴＨ１細胞の大腸菌およびＴＣＲ架橋に対する反応性とは明らかに対照的である（図２２Ｂ）。ヒトＰＢＭＣまたはＴＩＬにおいて試験されるＴｍｐの予測ペプチドを以下の表９に列挙し、それらの局在化を図２３に記載した。ＮｅｔＭＨＣソフトウェアを用いて評価したＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（＜５０ｎＭに設定した閾値、Ｙ軸）に対するそれらの結合能力を示す。各ペプチドおよび対立遺伝子について、記号は、９アミノ酸長（ｍｅｒ）ペプチドに対応する同定された配列の最初のアミノ酸を表す。次に、６人のＨＬＡ−Ａ２＋健康ボランティア（ＨＶ）からの想起反応のインビトロ刺激アッセイ（図２４Ａ）により、ＰＢＭＣ上のすべてのＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔｍｐエピトープを検証した（図２４Ｃ）。その結果、５つのペプチド（図２４Ｂに示されている）は、少なくともＨＶの５０％において有意な反応性を示した（図２４Ｄ−Ｅ）。矢印は、最も有意なエピトープを示す（図２４Ｆ−Ｇ）。
【表９−１】
2021508701.tif 000011
【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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表９：各ＨＬＡハプロタイプについて予測されるＴｍｐのペプチド
【０１６９】
実施例８：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＥＨ１３１４４におけるファージ切除
【０１７０】
ファージを切除し、それをＥ．ｈｉｒａｅの上清中に回収するための古典的な手順を使用して（図２５）（Ｄｕｅｒｋｏｐ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）、本発明者らは細菌の増殖期にかかわらず、異なる温度（３７℃および４２℃）で、マイトマイシンＣ（１μｇ／ｍｌ）とのＥＨ１３１４４のインキュベーション後にプロファージ１および２の切除を観察したが、ＣＴＸは観察しなかった（図２６Ａ）。上清のカプシド溶解（ファージＤＮＡ検出の感度を増大させる）後、自然状態でプロファージＤＮＡが可視化されたことから、ファージも切除ストレスなしに放出できることが示唆された（図２６Ｂ）。
【０１７１】
実施例９:配列番号１のＴＭＰをコードする遺伝子を有する新規株の同定
【０１７２】
２０の異なるＥ．ｈｉｒａｅ株（下表１０）のゲノムの配列を決定し、アラインメントした。注目すべきことに、２つの領域がインタクトである３つのプロファージ領域が免疫原性であることが証明されたＩＧＲ７株のゲノムにおいて同定され（上記の実施例１を参照のこと）、そしてこのゲノムがＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４によってコードされる配列番号１のＴＭＰと同じＴＭＰをコードすることが見出された（表９）。この株は、２０１７年１０月１２日に番号Ｉ−５２２４でＣＮＣＭに寄託された。さらに、ＣＴＸでいくつかの殺腫瘍活性を媒介するのに有効であることが証明されたＩＧＲ１１はまた、１３１４４によってコードされる同じＴＭＰ１エピトープを有する（表９）。この株は２０１７年１１月２７日にＣＮＣＭに、番号Ｉ−５２６１でＣＮＣＭに寄託された。
【０１７３】
【表１０】
2021508701.tif 000015
表１０
【０１７４】
実施例１０：ＴＭＰに特異的なＴＩＬまたは血液Ｔ細胞の細胞選別および増殖
【０１７５】
いくつかのプロトコルを使用して、配列番号１のＴＭＰに特異的なＴＩＬまたはＴ細胞を得ることができる。
【０１７６】
プロトコール１：免疫磁気細胞選別およびＴ細胞選別集団の増殖
【０１７７】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／ＴＭＰモノマー（２０μｇ／ｍｌ）を、６．７・１０６ストレプトアビジン被覆ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン、ＤＹＮＡＬ、Ｃｏｍｐｉｅｇｎｅ、フランス）と共に室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ／０．１％  ＢＳＡ中で洗浄する。５・１０６  ＰＢＭＣを、モノマー被覆ビーズを用いて４℃で４時間回転させる（Ｂｏｄｉｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。１０回洗浄した後、ポリクローナルＴ細胞刺激プロトコール（Ｊｏｔｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１）を用いてビーズ被覆細胞を増殖させる。続いて、細胞を、ヒツジ抗マウスＩｇＧ被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃｏｍｐｉｅｇｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）と共に、４℃で４時間、穏やかに回転させながら１：１の比でインキュベートする。細胞／ビーズ懸濁液を６ウェルプレート中の培養培地中で３７℃で一晩インキュベートし、ビーズを剥離させる。一晩インキュベートした後、ビーズを磁石によって抽出し、選別したリンパ球を、以前に記載されているように（Ｊｏｔｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１）、フィーダー細胞上に移す。簡単に述べると、２０００ビーズ被覆Ｔ細胞／ウェルを、照射フィーダー細胞［ＬＡＺ  ＥＢＶ−Ｂ細胞（２・１０４／ウェル）および同種ＰＢＭＣ（１０５／ウェル）］と混合した９６ウェルプレート中、ＩＬ−２（１５０  Ｕ／ｍｌ）およびＰＨＡ（１５μｇ／ｍｌ）を補充した１５０μｌの培養培地中に分配する。
【０１７８】
プロトコール２
【０１７９】
癌検体から採取した腫瘍検体をサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１）とともに培養し、ＴＩＬを増殖させる。培養１０日後、ＴＩＬを抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）および照射した同種末梢血単核細胞で刺激する（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６に記載されている）。
【０１８０】
実施例１１：Ｔリンパ球の形質導入によるＴＭＰに特異的なＴ細胞の取得
【０１８１】
高結合活性ＴＣＲをコードするｃＤＮＡのβ鎖（ＨＬＡ−Ａ２または他のハプロタイプに対応するＴＭＰプロファージ２エピトープについて）および／または高結合活性ＴＣＲをコードするｃＤＮＡのα鎖（ＨＬＡ−Ａ２または他のハプロタイプに対応するＴＭＰプロファージ２エピトープについて）および当該ＴＣＲをコードするｃＤＮＡのＣＤＲ３領域（ＨＬＡ−Ａ２または他のハプロタイプに対応するＴＭＰプロファージ２エピトープについて）を発現するように操作されたレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターに曝露される前に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８被覆ビーズまたは低用量ＩＬ−２（およびＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１）を用いて、自己または同種Ｔ細胞が増殖期に置かれる。次に、ポリクローナルＴ細胞をクローニングし、９６ウェルプレート中でそれらの特異性（ＴＭＰエピトープに暴露したときのＩＦＮｇまたはＴＮＦａ放出）について試験する。次にサイトカイン産生Ｔ細胞を選択し、ＧＭＰ細胞工場で１０１０から１０１２個の細胞に増殖するまで、Ｔ細胞成長因子（ＩＬ−２；ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１）を用いて週単位で、２〜３週間再増殖させる。
【０１８２】
考察
発明者らの知見は、マウスＥＨ  １３１４４および新たにクローン化されたヒトＥＨ  ＩＧＲ７（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２２４）またはＥＨ  ＩＧＲ１１（両者の配列において１００％相同）の抗原性が主に、５つのゲノム間で共有されている７遺伝子、株１３１４４および７０８の間で共有されている３遺伝子およびＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４に特有の２２遺伝子を含む６５遺伝子をコードする３９．２ｋｂのプロファージにおいて、シホウイルス科ファージのファージテールレングステープメジャータンパク質（Ｔｍｐ）（ラクトコッカスバクテリオファージテールテープメジャータンパク質ＴＰ９０１ファミリー）に依存することを明らかにした。腸球菌種間の遺伝物質の移入が報告されている（Ｍａｚａｈｅｒｉ  Ｎｅｚｈａｄ  Ｆａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、２０１１）。注目すべきことに、グラム陽性細菌に感染するファージは、サイフォウイルス科ファージのテープメジャータンパク質内に局在するペプチダーゼおよびトランスグリコシラーゼ活性に対応するペプチドグリカン加水分解モチーフを含むことが多い（Ｐｉｕｒｉ  ａｎｄ  Ｈａｔｆｕｌｌ、２００６）。今回は、非免疫原性Ｅ．ｈｉｒａｅ株（ＥＨ１７、１０８１５）にサイフォウイルス科に属するバクテリオファージを導入するか、全ファージテールレングステープメジャータンパク質（Ｔｍｐ）またはＴＭＰプロファージ２から選択したエピトープをコードする遺伝子改変プラスミドを導入し、そして陰性対照（ＭＨＣ結合溝で変異したタンパク質またはエピトープ）を導入することで、非免疫原性Ｅ．ｈｉｒａｅ株（ＥＨ１７、１０８１５）の免疫原性の回復を試みる。注目すべきこととして、結核菌  Ｒｐｆｓ  Ｔ細胞抗原は結核菌に対するヒトの免疫応答において重要な標的であることが報告された（Ｃｏｍｍａｎｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）。
【０１８３】
これらのマウスデータは臨床的意義がある。インシリコ予測（Ｅ．ｈｉｒａｅのいくつかの株の配列アラインメント、タンパク質細胞内局在化、およびＭＨＣ結合親和性の予測アルゴリズム）に基づいて、推定免疫原性を有する候補エピトープのリストが、選択の第１の工程において確立された（図２３）。第２の工程において、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋正常ボランティア由来の末梢血単核細胞を使用したインビトロ刺激アッセイで、４群の９ｍｅｒ−ＴＭＰ特異的エピトープに続いて６人の健康なボランティアにおいて実施された単一の９ｍｅｒエピトープを使用する想起応答により、５つのエピトープが免疫原性であると考えられ得ることを明らかにした（図２４）。第３の工程、これらの５つのヒト免疫原性ＴＭＰエピトープとこのようなプロテオームとの間の配列相同性を調査する、３５０を超える腫瘍細胞株における正常ヒトプロテオームおよび遺伝子発現のバイオインフォマティックスクリーニングは、このＨＬＡ−０２０１エピトープＫＬＡＫＦＡＳＶＶ（配列番号６３）の１つが、グリセロール−３リン酸デヒドロゲナーゼ１様タンパク質（ＧＰＤ１Ｌ、３ｐ２２．３上にコードされる遺伝子）と７８％の配列相同性を共有すると結論づけた。ＧＰＤ１Ｌは細胞質タンパク質であり、ナトリウムチャンネル、電位依存性、Ｖ型αサブユニット（ＳＣＮ５Ａ）と細胞膜で会合している。ＧＰＤ１ＬはｍｉＲ−２１０によって負に調節される低酸素関連タンパク質であり、多くの組織（脳、胚および胎児発生中）で過剰発現され、低酸素誘導因子１−α（ＨＩＦ−１α）のプロテオソーム分解に寄与する。実際、ＭｉＲ−２１０はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ１様（ＧＰＤ１Ｌ）酵素のレベルを抑制し、プロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性の抑制に寄与する。正常な生理的条件下では、ＰＨＤは低酸素誘導因子１‐α（ＨＩＦ‐１α）中のプロリンを水酸化し、プロテアソームによるその分解を導く。ｍｉＲ−２１０によるＧＰＤ１ＬのダウンレギュレーションによりＰＨＤ活性が抑制されると、ＨＩＦ−１αはプロテアソームによって分解されず、核に移行し、そこで低酸素誘導因子１−β（ＨＩＦ−１β）とヘテロダイマーを形成する；ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−１βのダイマー化は癌転移に寄与する転写反応を活性化する（Ｃｏｓｔａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７）。したがって、多変量Ｃｏｘ回帰分析では、健常周囲組織と比較して頭頸部扁平上皮癌におけるＧＰＤ１ＬのｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質発現が高いことは独立した予後パラメーターであり、局所再発および遠隔転移までの時間が長いという良好な予測因子であった（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）。
【０１８４】
このファージペプチドのＨＬＡ−Ａ０２０１に対する結合親和性は正常組織ペプチドの結合親和性に類似しているので、ファージペプチドは正常ペプチドの免疫原性分子模倣物と見なすことができる。したがって、ＴＭＰファージ特異的ＴＣＲと自己組織または腫瘍組織（ＧＰＤ１Ｌを過剰発現する）、主に胎児組織または幹細胞との間の交差反応性が、このＥＨ細菌との関連で送達されるファージの抗癌効果を説明できると考えられる。注目すべきことに、腫瘍細胞株はウェブ上で利用可能な遺伝子発現アトラスから明らかなように、様々なレベルのＧＰＤ１Ｌタンパク質を発現することができる。
【０１８５】
ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性エピトープＴＭＰ  ２（ＫＭＶＥＩＬＥＥＩ、配列番号５５）、エピトープ３（ＲＬＬＫＹＤＶＧＶ、配列番号５６）、エピトープ９（ＬＬＧＩＹＱＳＹＶ、配列番号６２）、エピトープ１０（ＫＬＡＫＦＡＳＶＶ、配列番号６３、ＧＰＤ１Ｌからの配列に相同）、およびエピトープＴＭＰ  １３（ＩＬＶＡＩＴＴＴＩ、配列番号６６）がこれまでに見出されており（図２４）、テトラマー製造、腫瘍ベアラー（ヒト患者またはマウス）におけるＴ細胞捕捉、ならびに構造的および機能的特徴付けを可能にしている。腫瘍浸潤リンパ球由来のＥ．ｈｉｒａｅ特異的ＣＴＬクローンの反応性は微生物抗原と腫瘍抗原との間の分子擬態の原理の証明をもたらすために、様々な同系腫瘍細胞株に対して試験することができる。
【０１８６】
このアセットは癌ワクチンおよびＴ細胞移入に利用可能なＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４の準ユニークな抗原性を説明し、このファージを他の細菌株に感染させ、抗癌プロバイオティクスとして使用するか、または専用種のニッチングを可能にし、かつ／またはこのファージの切除にストレスを与えることができるシクロホスファミドと同一または異なるいずれかの薬物と組み合わせてＯｎｃｏＢａｘとして使用することを促す。たとえば、シクロホスファミドは競合するＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍを上回るＥ．ｈｉｒａｅの過剰提示を可能し得た一方で、これら２つの株間の競合は、ファージの除去自体を促進した。
【０１８７】
実施例１２：Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４におけるユニークな抗原配列としてのファージテールレングステープメジャータンパク質。
【０１８８】
化学療法、放射線療法、標的療法、または免疫チェックポイント阻害剤による腫瘍関連抗原に対する免疫応答の開放が、癌治療の成功の主力となっている（Ｇａｌｌｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５；  Ｓｈａｒｍａ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ、２０１５）。腸内細菌叢が癌−免疫セットポイントを決定し、それによって抗癌治療の臨床転帰に影響を及ぼすという最近の発見は微生物またはその産物が腸管免疫だけでなく全身免疫も調節するという概念を改めて提唱した（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０１８）。実際、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、およびＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａに対するＣＤ４＋（ＴＨ１）およびＣＤ８＋（ＴＣ１）Ｔ細胞応答を産生する記憶ＩＦＮγは癌患者における良好な転帰と関連しており（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６；Ｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７；Ｒｏｕｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１８；Ｖｅｔｉｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）、これは、既存の微生物特異的Ｔ細胞が抗癌免疫応答に寄与し得ることを示唆する。しかし、微生物が全身性自己免疫疾患や局所的な腸の慢性炎症の発症にどのような影響を及ぼすかという疑問は解消されていない（Ｒｏｓｅ、２０１７）。分子擬態の理論は、細菌やウイルスによって誘発されたＴ細胞が自己寛容誘導機構（クローン欠失や不活性化など）から「逃れた」ときに、自己抗原を誤って認識してしまう可能性があると仮定している。細菌ゲノム由来のＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ結合エピトープはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで免疫原性を媒介することが同定されているが（Ｃｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７；Ｐｅｒｅｚ−Ｍｕｎｏｚ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５；Ｒｕｂｉｏ−Ｇｏｄｏｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００２；  Ｖｕｊａｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．、２００７；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）、正常組織または腫瘍組織に対する免疫応答について微生物特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔリンパ球の機能的関連性を明らかにした報告はほとんどない（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７；Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）。
【０１８９】
シクロホスファミド（ＣＴＸ）はＥ．ｈｉｒａｅの腸管腔から腸間膜および脾臓の免疫組織への移行を誘導し、それによりＩＬ−１７およびＩＦＮγを産生する特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球を誘発し、治療上有効な抗癌免疫応答と相関する（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６；  Ｖｉａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３）。広域スペクトル抗生物質はＥ．ｈｉｒａｅが経口胃管栄養法によって供給されない限り、ＣＴＸの治療効果を無効にした（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）。ＣＴＸの抗生物質摂動抗癌効果を回復する能力についてＥ．ｈｉｒａｅ株のパネル（表１１、図３１Ａ）を比較すると、発明者らは、いくつかのＥ．ｈｉｒａｅ分離株（１３１４４、ＩＧＲ７、およびＩＧＲ１１など）のみが効果的であることを見出した（図２７Ａ−Ｂ、（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６））。ＣＴＸとＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４の併用の治療効果はＣＤ８＋  Ｔ細胞の枯渇またはＩＦＮγの中和によって打ち消されることを考慮して（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）、宿主のプライムブースト曝露（図２７Ｃ）および樹状細胞（ＤＣ）に負荷した種々のＥ．ｈｉｒａｅ株による脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激後に、記憶ＴＣ１免疫応答を誘発するＥ．ｈｉｒａｅ株の鑑別能力をスクリーニングした。Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４は特異的なＴＣ１免疫応答（関連性のないＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉに対して交差反応性を示さない）を引き起こしたが、Ｅ．ｈｉｒａｅ  ７０８（原型的な非効率的株）はそのような反応を起こさなかった（図２７Ｄ）。２０のＥ．ｈｉｒａｅ株のＰａｎゲノム解析では１，６７７のオーソロガス遺伝子（５９％）のコアゲノムが得られ、アクセサリーゲノムはそれぞれ９４６および４７７のオーソロガス遺伝子とユニーク遺伝子から構成されていた（図３１Ｂ）。この系統発生学的解析により、１３１４４株は８６のオーソロガスなユニークな遺伝子を有するＩＧＲ７株と１００％相同であることが示された（図３１Ｂ）。
【０１９０】
【表１１】
2021508701.tif 000016
表１１：Ｅ．ｈｉｒａｅ株の詳細
【０１９１】
次に、免疫原性（１３１４４）細菌株対非免疫原性（７０８および１３３４４）細菌株について、細胞壁および分泌タンパク質をコードする細菌遺伝子の配列アラインメントを行い（ＰＳＯＲＴソフトウェア）、続いてＭＨＣクラスＩ  Ｈ−２Ｋｂタンパク質（＜５０  ｎＭ結合親和性、ＮｅｔＭＨＣソフトウェア）について強い結合親和性を有するノナペプチドの同定を行った（実施例３の表６）。続いて、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４およびＣＴＸに繰り返し曝露されたマウスから脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞を回収した（図２７Ｃ）。これらのＴ細胞を、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４（表６）由来の潜在的に免疫原性のノナペプチドのプールでインビトロで再刺激して、ＩＦＮγ産生を測定し（図３２）、次いで、最も効率的な群７を個々のペプチドに分割した（図２７Ｅ）。このアプローチは、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４の３９．２ｋｂ（１５０６ａａ）のプロファージ由来のファージテールレングステープメジャータンパク質（ＴＭＰ）のアミノ酸配列の１９７〜１８７位における１つの優性エピトープ（１文字アミノ酸コード：  ＴＳＬＡＲＦＡＮＩ（配列番号２５）、略称ＴＭＰ１）の同定を導いた（図３３Ａ）。実際、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４の特定のゲノム特性は、最も一般的なＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓファージｐｈｉＥｆ１１  ｖＢ＿ＥｆａＳ＿ＩＭＥ１９７（共有遺伝子のそれぞれ１４％および１１％）と弱い配列相同性を示す２つの無傷のプロファージ領域（４０．６−ｋｂおよびａ  ３９．２−ｋｂ）をコードしていることである（図３１Ｃ、表１２）。Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４の３９．２−ｋｂプロファージを１９の他の配列決定されたＥ．ｈｉｒａｅゲノムと比較解析したところ、ＩＧＲ７プロファージタンパク質と１００％のタンパク質同一性が示された。３９．２−ｋｂプロファージは６５の遺伝子をコードしており、その中にはすべてのゲノム間で共有されている１遺伝子と、シホウイルス科ファージの特徴であるカプシド、ポータルおよびテール構造をコードするＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４およびＩＧＲ７に特有の３８遺伝子が含まれる（図３３Ｂ）。重要なことに、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４、Ｅ．ｈｉｒａｅ  ＩＧＲ７およびＥ．ｈｉｒａｅ  ＩＧＲ１１由来の３９．２−ｋｂプロファージのＴＭＰ１エピトープは１００％の配列相同性を示した（図３４）。実際、Ｅ．ｈｉｒａｅ  ＩＧＲ７およびＥ．ｈｉｒａｅ  ＩＧＲ１１はＣＴＸで処置されたＭＣＡ２０５線維肉腫の増殖を減少させる際に、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４と同様に効率的であった（図２７Ｂ）。対照的に、相同性は認められず（Ｅ．ｈｉｒａｅ  ７０８および１３３４４で観察）、ＴＳＬＡＲＦＡＮＩペプチドの３位の突然変異（Ｅ．ｈｉｒａｅ  ＡＴＣＣ９７９０で観察されるＬＦ、図３４）はこれらのＥ．ｈｉｒａｅ株の抗癌効果の低下と相関していた（図２７Ｂおよび（Ｄａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）。ペプチド特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞を検出するようにデザインされたＥｌｉｓｐｏｔアッセイにより、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４（またはＥ．ｈｉｒａｅ  ＩＧＲ７およびＩＧＲ１１株）を強制経口投与したマウスはＴＭＰ１に対してＴＣ１応答をマウントしたが（対照ペプチドであるＴＭＰ２お���びＴＭＰ３ではマウントしなかった）、抗癌活性を欠き、ＴＭＰ１を欠くＥ．ｈｉｒａｅ株（株７０８、１３３４４、ＡＴＣＣ９７９０）はそのようにはできなかったことが明らかになった（図２７Ｅ）。ナイーブおよびＭＣＡ２０５線維肉腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＴＭＰ１特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の頻度および分布を検出するために、蛍光Ｈ‐２Ｋｂ／ＴＳＬＡＲＦＡＮＩテトラマー複合体を用いた。脾臓ＣＤ８＋Ｔの１％までが、ＣＴＸ／Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４レジメン（図２７Ｆ、左パネル）後１２日目にＴＭＰ１ペプチドを認識し、ナイーブからの脾臓（図２７Ｆ、右パネル）および腫瘍保有者、ならびに腫瘍排出リンパ節（図２７Ｇ）において、回腸ケモカイン受容体ＣＣＲ９を保有するＴＣ１サブセットにおけるＴＭＰ１特異的ＣＴＬの３〜５倍の富化を伴った。注目すべきことに、Ｈ−２Ｋｂ／ＴＳＬＡＲＦＡＮＩテトラマーはまた、Ｅ．ｈｉｒａｅ株ＩＧＲ７またはＩＧＲ１１での免疫化後に脾臓ＴＭＰ１特異的ＣＴＬの高比率を明らかにしたが、ＡＴＣＣ９７９０またはＥ．ｈｉｒａｅ  １３３４４では示さなかった（図２７Ｈ）。
【０１９２】
【表１２】
2021508701.tif 000017
表１２：Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４ゲノムにおけるプロファージ配列の探索
【０１９３】
実施例１３：マウスモデルにおけるファージテールレングステープメジャータンパク質を用いた予防的および治療的免疫化
【０１９４】
ＭＣＡ２０５癌の増殖を制御するＴＭＰ１特異的Ｈ−２Ｋｂ拘束性ＴＣ１細胞の能力を調べるために、本発明者らは、熱不活性化Ｅ．ｈｉｒａｅ（陽性対照）、１３１４４、ＩＧＲ７またはＩＧＲ１１由来の天然に存在するＴＳＬＡＲＦＡＮＩペプチド、Ｅ．ｈｉｒａｅ  ＡＴＣＣ９７９０由来のそのＬＦ突然変異体（「ｍｕｔ３」、図３４）、または他の非免疫原性細菌ペプチド（群１、図３２）を負荷した樹状細胞（ＤＣ）を用いて、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスを皮下（ｓ．ｃ．）免疫した。この予防的設定では、ＴＳＬＡＲＦＡＮＩでパルスしたＤＣ（ｍｕｔ３  ＴＳＦＡＲＦＡＮＩではない）が腫瘍増殖の予防または抑制において、Ｅ．ｈｉｒａｅ抽出物全体と同じくらい効率的であった（図２８Ａ−Ｂ）。次に、本発明者らはＴＭＰ１ペプチドが通常非効率的な細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＤＨ５αに免疫原性を付与することができるかどうかを、抗生物質処置の後に、異なる細菌株を用いた強制経口投与およびＣＴＸベースの化学療法が続く治療設定において調査した（図２７Ａ、（Ｄａｉｌｌeｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６））。ＴＳＬＡＲＦＡＮＩ（配列番号１３）ペプチド（図３５）を発現するように操作された大腸菌は、ＭＣＡ２０５腫瘍増殖を抑制し（図２８Ｃ）、脾臓におけるテトラマー結合ＣＴＬの生成を誘発する（図２８Ｄ）際に、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４と同じくらい効率的であった。対照的に、無関係な配列（マウスＥＧＦＰタンパク質をコードする）またはアンカー２位にＳＡ交換を有する突然変異ペプチド（「ｍｕｔ２」、ＴＡＬＡＲＦＡＮＩ）または「ｍｕｔ３」ＴＭＰ１ペプチドを発現する大腸菌は、このような癌防御免疫応答を誘導することができなかった（図２８Ｃ−Ｄ）。
【０１９５】
実施例１４：癌患者における腸ファージの効果の臨床的関連性
【０１９６】
次に、これらの所見の病態生理学的関連性の可能性を検討した。Ｅ．ｈｉｒａｅゲノムおよびそのファージのカバー範囲（ＢＯＣ）の広さを評価するために、公的に利用可能な１７のデータセットから合計３０２７の成人および母親−乳児メタゲノム（大部分はヒトの糞便からであるが、様々な粘膜からも）をスクリーニングした（図２９Ａ）。異なる地理、年齢、およびデータセットからの１３試料において、Ｅ．ｈｉｒａｅは１００％の信頼度で存在した。他の約４０例では、Ｅ．ｈｉｒａｅと近縁の株が検出可能であった。Ｅ．ｈｉｒａｅが見つかった試料の９０％では、３つのファージ（Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４、７０８または１３３４４由来）配列のうち１つが相互排他的にゲノムに挿入されていた（図２９Ａ）。しかし、Ｅ．ｈｉｒａｅコアゲノムの存在を欠く多くのサンプルでＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４ファージが検出可能であったことから、Ｅ．ｈｉｒａｅ以外の細菌も同様にこのファージを宿主とすることができることが示唆された。生後１日、３日、７日の３つの母子ペア便検体と乳児において、０．６６  ＢＯＣでファージ１３１４４の存在を検出できた。豊富でない種を検出することができないメタゲノミクス分析とは対照的に、マトリックスアシストレーザー脱イオン飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）に続くカルチュロミクスは、健康な個人（Ｓａｍｂ−Ｂａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）またはがん患者（Ｒｏｕｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１８）の便中の希少なＥ．  ．ｈｉｒａｅコロニーを検出する技術を提供する。７６人がん患者由来の各単一培養可能な腸球菌コロニー（種および個体当たり最大５個、Ｅ．ｈｉｒａｅ、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅ．ｄｕｒａｎｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓまたはＥ．ａｖｉｕｍ由来のコロニーを表す）のＰＣＲ分析により、患者の３４人％においてＴＭＰ１ペプチドを包含するＴＭＰ配列（図３６）が検出され、ほとんどがＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ内部であった（図２９Ｂ）。診断時に便中ＴＭＰが検出可能であった腎癌および肺癌患者では、免疫チェックポイント阻害薬による治療後に全生存期間の延長が認められた（図２９Ｃ）。したがって、本発明者らは、ヒトＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ０２＊０１に高い親和性で結合すると予測される１６種のＴＭＰ由来ノナペプチド（配列番号５４〜６９）を、インビトロで６人の健康なボランティア由来のナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングする能力についてスクリーニングした。本発明者らは、ＴＭＰタンパク質の２つの異なる領域に位置する、有意なペプチド特異的ＩＦＮγ放出を誘発することができる１６のエピトープのうち６つを見出した（５０４−７０８および１３９７−１４６２、図２９Ｄ、図３７、図２４Ｂ、表９）。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＰスイートを用いて、ヒト癌生検組織における有意な発現レベルに関連するヒトペプチドソームを、これら６種類のＨＬＡ−Ａ０２＊０１拘束性免疫原性ノナペプチドと高度の相同性について検索した（ＴＣＧＡデータベース）。本発明者らはペプチドＫＬＡＫＦＡＳＶＶ（６３１〜６３９、配列番号６３）のみが、タンパク質グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ１様ＧＰＤ１−Ｌ��含まれるペプチドと７８％の相同性（９つの９位のうち７つ、ＭＨＣアンカー２位および９位で同一のアミノ酸を有する）を共有することを見出した（図２９Ｅ）。ＧＰＤ１−Ｌ  報告によれば、頭頸部扁平上皮癌において、発癌性ＨＩＦ１α依存性の低酸素への適応に対抗し、良好な予後と関連している（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４；  Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）。我々の知る限りでは、ＧＰＤ−１Ｌ遺伝子の変異は癌では報告されていない。ＴＣＧＡトランスクリプトミクスデータベースは、ＧＰＤ１−Ｌの高発現が膀胱癌、肺腺癌および５００を超える腎癌の大規模コホートで全生存期間の改善と関連していることを明らかにした（ＨＬＡ−０２＊０１を発現しない低ＧＰＤ−１Ｌの腫瘍では予後不良の傾向がある）（図２９Ｆ−Ｈ）。
【０１９７】
さらに、診断時の腫瘍によるＧＰＤ１−Ｌ  ｍＲＮＡの高発現は抗ＰＤ１／ＰＤＬ−１抗体で治療された非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者の２人つの独立したコホートにおける無増悪生存の改善と関連していた（図２９Ｉ、Ｊ）。興味深いことに、ＧＰＤ−１Ｌの発現レベルは、肺癌のＴＣＧＡデータセット（ＬＵＡＤ、ＬＵＳＣおよびＴＣＧＡ）およびＮＳＣＬＣ患者の２人つのコホート（ＣＨＵＭおよびＣＧＦＬ）における細胞傷害性リンパ球、骨髄樹状細胞、好中球および内皮細胞遺伝子シグネチャーと相関していた（図２９Ｋ）。
【０１９８】
実施例１５：マウス癌におけるエンテロファージＴＭＰと発癌性ドライバーＰＳＭＢ４の間の分子擬態
【０１９９】
マウスモデル（Ｃ５７／Ｂ６マウスにおけるＭＣＡ２０５腫瘍、図２７−２８）においてＴＭＰ１がその抗癌活性を発揮する機構を同定するために、本発明者らは、ＴＭＰ１ペプチド（ＴＳＬＡＲＦＡＮＩ、配列番号１３）に対して高い相同性を有するＨ−２Ｋｂ拘束性マウス腫瘍抗原が存在するかどうかを調べた。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＰスイートを使用して、我々は、アミノ酸７６〜８４位の間のプロテアソームサブユニットβ型−４（ＰＳＭＢ４）に属するペプチド（ＧＳＬＡＲＦＲＮＩ、配列番号１８９）が７８％の相同性を共有することを見出した（９アミノ酸のうち７アミノ酸、ＭＨＣアンカー位２位および９位の同一アミノ酸）（図３０Ａ）。ＭＣＡ２０５の潜在的なネオエピトープを調べたが、本発明者らの結果を説明する有意な相同性は見出されず、したがって、本発明者らは非変異ＰＳＭＢ４ペプチドに焦点を当てた。ＰＳＭＢ４は神経膠芽腫（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１８）、黒色腫（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７）および乳癌（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１８）のような種々の悪性腫瘍における増殖および浸潤に関与する発癌性ドライバーであり（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）、不良な予後に関連する（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１８；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１８）。ＭＣＡ２０５細胞において、ＧＳＦＡＲＦＲＮＩ  （配列番号１９０）によってＧＳＬＡＲＦＲＮＩ（配列番号１８９）を置換したＰＳＭＢ４配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノミックノックイン（ＴＳＬＡＲＦＡＮＩのｍｕｔ  ３と同等の３位でＬＦ交換を有する）（図３８）は自発的な腫瘍成長動態を減少させたが、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４の抗癌効果を劇的に鈍化させたが、ＣＴＸ治療単独では妨害しなかった（図３０Ｂ）。これらの結果は、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４によってコードされるＴＳＬＡＲＦＡＮＩ  ＴＭＰ１ペプチドが実際にＰＳＭＢ４由来ＧＳＬＡＲＦＲＮＩペプチドに対する治療関連反応を誘導するという考えを支持する。
【０２００】
実施例１６：Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４のファージＴＭＰ配列を伝染的に播種する能力
【０２０１】
テンペレートバクテリオファージは、毒性、抗菌薬耐性遺伝子、免疫原性配列を新たな細菌宿主に伝達する細菌性ウイルスである（Ｗｅｉｎｂａｕｅｒ、２００４）。固定位置に高度に保存されたトリプトファンおよびフェニルアラニン残基を有する可変数のタンデム反復を含むＴＭＰタンパク質は、サイフォウイルスファージのゲノムによってコードされる（Ｂｅｌｃａｉｄ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１；  Ｐｉｕｒｉ  ａｎｄ  Ｈａｔｆｕｌｌ、２００６）。ファージＴＭＰ配列を伝染性に播種するＥ．ｈｉｒａｅ  １３１４４の能力を分析するために、Ｅ．ｈｉｒａｅ  １３１４４を経口強制投与し、全身ＣＴＸ治療を行ったＣ５７ＢＬ／６マウスの回腸内容物の培養分析を行った（図３０Ｃ）。本発明者らは７６のコロニーのうち、ファージゲノムの配列決定によって確認されたように、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍがインビボでＥ．ｈｉｒａｅが産むファージによって形質導入された唯一のｂｙ−ｓｔａｎｄｅｒ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉであることを発見するために、各動物から７〜１８の細菌コロニーを検査した（図３０Ｄ、Ｅおよび図３９）。注目すべきは、未処置マウスから分離された９０コロニー（大部分はＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）のいずれもＴＭＰ配列を保有していなかったことである（図３９）。さらに、ＣＴＸはＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍを排除する役割を果たしており、インビトロのエンテロイド系（ｅｎｔｅｒｏｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）または回腸内容物のＰＣＲで示されているように、小腸におけるＥ．ｈｉｒａｅのニッチングおよび／またはコロニー形成を可能にしている（図３０Ｇおよび図には示していない）。重要なことは、小腸エンテロイドを、ファージを保有しているか保有していないＥ．ｈｉｒａｅまたはＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのバランスのとれた１：１の比率でインキュベートすると、Ｅ．ｈｉｒａｅによる感染性／溶菌性ファージのＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍへの伝播が６時間で９％、２０時間で２６％のコロニーで起こることである（図３０Ｇ）。
【０２０２】
シクロホスファミドとは対照的に、乳癌患者ではＣＤＫ４／６阻害薬（パルボシクリブなど）がファージ切除の引き金となるようである。実際、３週間パルボシクリブによる治療を受けた患者１０例と非治療患者７３例を対象に、手術前に採取した患者の便のショットガンメタゲノミクス解析を行ったところ、ＬｅｆＳｅダイアグラム（図３０Ｈ）に示すように、ファージ配列（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｏｄａｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、腸内細菌由来）の劇的な濃縮と過剰表現が明らかになった。
【０２０３】
この観察は、癌抗原とこの分子擬態を示すファージをコードするペプチドがヒトにおけるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓでの検出と一致して、感染性であることを示唆している。
【０２０４】
我々の知る限りでは、これらの結果が腸球菌ファージが記憶ＴＣ１免疫応答を誘導するＭＨＣクラスＩ拘束性抗原、ＴＭＰ１をコードし、その後、３つの主要な証拠に続いて、癌抗原と交差反応することを示す最初の証拠である。まず、ＭＨＣクラスＩ結合ＴＭＰ１エピトープに導入された自然発生（「ｍｕｔ３」）または人工突然変異（「ｍｕｔ２」または「ｍｕｔ３」）は、ファージ保有Ｅ．ｈｉｒａｅ株の腫瘍予防および治療の可能性を抑制した。第二に、ＴＭＰ１をコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉに導入すると、このプロテオバクテリアに免疫原性の能力が付与され、ＴＭＰ１を発現するＥ．ｈｉｒａｅと同じ抗腫瘍特性を獲得した。第三に、癌細胞を遺伝子改変してＰＳＭＢ４タンパク質内のＴＭＰ１交差反応性ペプチドを除去すると、ＴＭＰ１発現Ｅ．ｈｉｒａｅの経口強制投与でもはや制御できない腫瘍を形成した。
【０２０５】
考察２
ファージは、地球上で最も豊富な生物学的実体の中にある。それらの数は、毎秒起こる１０２５ファージ感染の可能性を有する１０３１個もの粒子に達すると推定されている（Ｐｅｄｕｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．、２００３；  Ｗｏｍｍａｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｌｗｅｌｌ、２０００）。ここで研究した「エンテロファージ」の抗原性は、ＴＭＰタンパク質のホットスポットに存在する。ファージテールの長さを決定する上での構造的役割以外に、サイフォウイルス科のファージにコードされるＴＭＰにはいくつかの機能的ドメインがあり、その１つはペプチドグリカン加水分解酵素活性を有し、細菌の効率的な感染を促進し、もう１つはリゾチーム活性を有し、蘇生促進因子であるＲｐｆとして作用する（Ｄｕｅｒｋｏｐ  ｅｔ  ａｌ．、  ２０１４）。Ｒｐｆｓは休眠細菌の再活性化に関与しているだけでなく、結核菌に対する自然応答（Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）や同族の長期免疫応答（Ｃｏｍｍａｎｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）を調節している。実際、結核菌  Ｒｐｆｓに含まれるＴ細胞エピトープはこの病原体に対するヒト免疫応答の鍵である（Ｃｏｍｍａｎｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）。ファージはそれらの特異的抗原特性を超えて、糸状バクテリオファージコートタンパク質ＩＩＩドメインＩを介してＤＮＡワクチンに広範なアジュバント性を伝達する（Ｃｕｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．、２００６；  Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）。このように、バクテリオファージは抗癌免疫応答を刺激するための治療手段を充実させる可能性があるという展望が開けている。
【０２０６】
本文中で使用した略語：
ＡＴＢ：抗生物質
ＢＨＩ：ブレインハートインフュージョン
ＢＭ−ＤＣ：骨髄樹状細胞
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
ＣＧＦＬ：ジョルジュ・フランソワ・ルクールセンター
ＣＨＵＭ：Ｃｅｎｔｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ  ｄｅ  Ｍｏｎｔｒｅａｌ
ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔ細胞
Ｃｔｒｌ： 対照
ＣＴＸ：シクロホスホミド
ＤＣ：樹状細胞
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ＧＰＤ１−Ｌ：グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ１様
ＩＦＮγ：インターフェロンγ
ＩＭＤＭ：Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地
Ｉｐ：腹腔内
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：マトリックスアシストレーザー脱イオン飛行時間
ＭＨＣ：主要組織適合性複合体
ＮａＣｌ：塩化ナトリウム
ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺癌
ＰＢＭＣ：末梢血単核球
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＳＭＢ４：プロテアソームサブユニットβ４型
ＰＶＤＦ：ポリビニリデンジフルオリド
ＲＣＣ：腎細胞癌
Ｒｐｆ：蘇生促進因子
ＲＰＭＩ：Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
Ｓｃ：皮下
ＳＥＭ：平均値の標準誤差
Ｔｃ１：Ｔ細胞傷害性細胞１型
Ｔｈ１：ヘルパーＴ細胞１型
ＴＬＲ３：Ｔｏｌｌ様受容体３
ＴＭＰ：テープメジャータンパク質
【０２０７】
参考文献
【０２０８】
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【図１】
2021508701.tif 000018
【図２】
2021508701.tif 000019
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｃ】
2021508701.tif 000024
【図７Ｄ−Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ−Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４Ａ−Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ−１】
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【図２４Ｄ−２】
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【図２４Ｅ−Ｆ】
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【図２４Ｇ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ−Ｂ】
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【図２７Ｃ−Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ−Ｇ】
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【図２７Ｈ】
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【図２８Ａ−Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２９Ａ】
2021508701.tif 000065
【図２９Ｂ−Ｃ】
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【図２９Ｄ−Ｅ】
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【図２９Ｆ】
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【図２９Ｇ】
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【図２９Ｈ】
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【図２９Ｉ−Ｋ】
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【図３０Ａ−Ｂ】
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【図３０Ｃ−Ｄ】
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【図３０Ｅ】
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【図３０Ｆ−Ｈ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ−Ｃ】
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【図３２】
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【図３３Ａ−Ｂ】
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【図３４】
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【図３５Ａ−Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ−Ｂ】
2021508701.tif 000084
【図３９Ａ−Ｂ】
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【配列表】
2021508701000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月3日(2019.5.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗腫瘍薬と組み合わせて癌を治療する際に使用するための少なくとも１つの天然に存在する細菌株または操作された細菌株を含む細菌組成物であって、前記少なくとも１つの細菌株が、配列番号１のタンパク質、または配列番号１３、１４、５３〜１８８および２０９からなる群より選択される少なくとも１つのエピトープを含む少なくとも９個、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸の、配列番号１のタンパク質のフラグメントを発現するものであって、ただし、前記少なくとも１つの細菌株は、２０１３年１１月７日に番号Ｉー４８１５でＣＮＣＭに寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株１３１４４とは異なる、細菌組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの細菌株が、配列番号１のタンパク質と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質をコードするプロファージゲノムを含む、請求項１に記載の使用のための、請求項１に記載の細菌組成物。
【請求項３】
前記組成物が、配列番号２のプロファージと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するプロファージゲノムを保有する少なくとも１つの株を含み、その結果、このプロファージによってコードされるファージが、それを必要とする対象の腸内細菌叢の組成物の他の株および／または共生細菌にインビボで感染することができる、請求項１に記載の使用のための、請求項１または２に記載の細菌組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌組成物であって、前記組成物が、以下からなる群から選択される細菌を含む、細菌組成物：
（ｉ）２０１７年８月３１日に番号Ｉ−５２２４でＣＮＣＭに寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株ＩＧＲ７、
（ｉｉ）２０１７年１１月２７日に番号Ｉ−５２６１でＣＮＣＭに寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株ＩＧＲ１１、
（ｉｉｉ）配列番号１のタンパク質由来の少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０およびより好ましくは少なくとも４０ヌクレオチドのフラグメントと少なくとも６５％、好ましくは少なくとも８０％およびより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を発現する他の任意の細菌株、ならびに
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載された株およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５からなる群から選択される少なくとも２つの株の混合物、好ましくは株ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５および（ｉ）に記載された株の混合物。
【請求項５】
前記組成物が、２０１７年１１月２７日に番号Ｉ−５２６０でＣＮＣＭに寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ株ＩＧＲ４をさらに含む、請求項１に記載の使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌組成物。
【請求項６】
細菌株の免疫原性を増加させる方法であって、前記株に、配列番号１のタンパク質をコードするヌクレオチド配列または配列番号１３および１４のペプチドを少なくとも含むそのフラグメント、または配列番号５３〜１８７からなる群から選択される少なくとも１つのエピトープを含む少なくとも９アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸のペプチドをコードする配列、または配列番号２０９の少なくとも１つのエピトープを含む少なくとも９アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸のペプチドをコードする配列をインビトロで導入することを含む、方法。
【請求項７】
前記株の細菌を、配列番号１のタンパク質と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質をコードするバクテリオファージでインビトロ感染させることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記バクテリオファージが、配列番号２のヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むゲノムを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
癌の治療に使用するための、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法によって得られた、操作された細菌株を含む細菌組成物。
【請求項１０】
前記細菌株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅからなる群から選択される、請求項９に記載の使用のための、請求項９に記載の細菌組成物。
【請求項１１】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１患者における癌の治療における使用のための、請求項９または１０に記載の細菌組成物。
【請求項１２】
癌の治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ  ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５を含む細菌組成物および請求項１〜５および９〜１１の細菌組成物を含む細菌組成物からなる群から選択される細菌組成物であって、前記細菌組成物は、前記組成物の少なくともいくつかの細菌に存在するプロファージによってコードされるファージの溶解サイクルを誘発することができる抗腫瘍薬と組み合わせて使用される、細菌組成物。
【請求項１３】
前記細菌組成物がＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせて使用される、請求項１２に記載の使用のための、請求項１２に記載の細菌組成物。
【請求項１４】
前記細菌組成物が免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用される、請求項１２または１３に記載の使用のための、請求項１２に記載の細菌組成物。
【請求項１５】
抗癌ワクチンとして使用するための、配列番号１のタンパク質からの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列または配列番号２０９の配列を含むポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物。
【請求項１６】
配列番号１のタンパク質からの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列が、配列番号５３〜１８７からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用のための、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１患者における抗癌ワクチンとして使用するための、配列番号６３、配列番号１８８および配列番号２０９からなる群より選択される配列を含むペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１５または１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
請求項１〜５および９〜１２のいずれか一項に記載の細菌組成物で、または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物でエクスビボでパルスされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞組成物。
【請求項１９】
ＭＨＣ分子が、配列番号５３〜１８８および配列番号２０９からなる群より選択されるエピトープに結合されることを特徴とする、配列番号１のタンパク質に対して高い親和性を有するＴ細胞を単離するためのＭＨＣマルチマー。
【請求項２０】
配列番号６３、配列番号１８８または配列番号２０９の別の配列を含む抗原ペプチドを負荷したＨＬＡ−Ａ＊０２０１マルチマーである、請求項１９に記載のＭＨＣマルチマー。
【請求項２１】
癌の治療に使用するためのバクテリオファージ組成物であって、前記バクテリオファージが、配列番号１のタンパク質と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を発現する、バクテリオファージ組成物。
【請求項２２】
前記バクテリオファージが、配列番号２のヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むゲノムを有する、請求項２０に記載の使用のための、請求項２１に記載のバクテリオファージ組成物。
【請求項２３】
前記組成物が免疫チェックポイントを遮断する薬物と組み合わせて投与される、癌の治療に使用するための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物、または請求項１８に記載の細胞組成物、または請求項１９もしくは２０に記載のＭＨＣマルチマーで単離されたＴ細胞、または請求項２１もしくは２２に記載のバクテリオファージ組成物。
【請求項２４】
対になった正常組織において発現されるレベルよりも優れたＧＰＤ１ＬのｍＲＮＡレベルを発現する腫瘍を治療する際に使用するための、請求項１〜５および９〜１２のいずれか一項に記載の細菌組成物、または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物、または請求項１８に記載の細胞組成物、または請求項１９もしくは２０に記載のＭＨＣマルチマーで単離されたＴ細胞、または請求項２１もしくは２２に記載のバクテリオファージ組成物。
【請求項２５】
抗腫瘍薬を同定するためのスクリーニング方法であって、配列番号１のタンパク質を含むファージの溶解サイクルを誘発する薬物候補の能力を評価するために、ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５株、または配列番号２のプロファージと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％または９５％の同一性を有するプロファージゲノムを保持する任意の他の細菌株からの細菌を使用することを含む、スクリーニング方法。
【請求項２６】
癌を有する患者が化学療法または免疫チェックポイント遮断による治療に対して良好な応答者である可能性があるかどうかを決定する方法であって、前記患者由来の生物学的試料において、配列番号１のタンパク質と少なくとも８０％の同一性を有する配列の存在を評価することを含み、そのような配列が前記試料中に存在する場合、前記患者は、前記治療に応答する可能性がある、方法。
【請求項２７】
（ｉ）腸球菌コロニーの単離を可能にするために、許容培地中で好気性条件下で前記患者からの糞便試料を培養するステップ、
（ｉｉ）配列番号１のフラグメントに特異的なプライマー対を用いていくつかの培養可能な単離コロニーにおいてＰＣＲを実施するステップ、および
（ｉｉｉ）増幅されたフラグメントを検出するステップ
を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２８】
患者が化学療法または免疫チェックポイント遮断による治療に対する良好な応答者である可能性が高いかどうかを決定する方法であって、請求項１９または２０に記載の前記ＭＨＣマルチマーを使用して、診断時および／または前記治療中に配列番号１のタンパク質に特異的な循環ＣＣＲ９＋  ＣＸＣＲ３＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレベルを測定することを含み、前記レベルが所定の閾値を超える場合、前記患者は治療に応答する可能性が高い、方法。
【請求項２９】
前記患者がＨＬＡ−Ａ＊０２０１であり、ＭＨＣマルチマーが請求項２０に記載のものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
腫瘍中のＧＰＤ１Ｌ  ｍＲＮＡのレベルまたはＧＰＤ１Ｌタンパク質のレベルを評価することをさらに含み、前記レベルが所定の閾値を超える場合、前記患者は前記治療に応答する可能性が高い、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
腫瘍を有する患者が、免疫チェックポイント遮断による治療に対する良好な応答者である可能性が高いかどうかを決定する方法であって、前記腫瘍におけるＧＰＤ１Ｌ  ｍＲＮＡのレベルまたはＧＰＤ１Ｌタンパク質のレベルを評価することを含み、ここで、前記レベルが所定の閾値を超える場合、前記患者は前記治療に応答する可能性が高いものであり、
ここで、前記患者が化学療法または免疫チェックポイント遮断による治療に対する良好な応答者である可能性が高いと同定されない場合、化学療法または免疫チェックポイント遮断による治療に対する前記患者の応答を増大させるために、請求項１〜５および９〜１２のいずれか一項に記載の細菌組成物または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物が前記患者に投与される、方法。
【請求項３２】
前記患者が化学療法または免疫チェックポイント遮断による治療に対する良好な応答者である可能性が高いと同定されない場合、化学療法または免疫チェックポイント遮断による治療に対する前記患者の応答を増大させるために、請求項１〜５および９〜１２のいずれか一項に記載の細菌組成物または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物が前記患者に投与される、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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