(57)【要約】  ポリマー支持体をプロセスガスと接触させ、高周波電力をプロセスガス中に導入し、未処理接触表面と比較して、改善された細胞回収を有する処理接触表面を形成する。プロセスガスは、任意選択で、窒素ガス、酸素ガス、又は窒素原子、酸素原子、若しくは窒素及び酸素原子の組合せを含有するガスであってよい。本方法は、任意選択で、処理接触表面からのニワトリ胚細胞培養物の細胞回収を改善する。
2021500031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
・初期接触表面と、前記初期接触表面に隣接する内部部分とを含むポリマー支持体を用意するステップ；
・前記初期接触表面をプロセスガスと接触させるステップ；及び
・前記初期接触表面に隣接する前記プロセスガスに高周波電力を導入して、前記初期接触表面に隣接してプラズマを発生させ、これにより、前記初期接触表面と比較して、処理接触表面からのニワトリ胚細胞培養物の細胞回収を改善するのに有効な条件下で、前記処理接触表面を有する処理ポリマー支持体を形成し、その結果、前記細胞回収試験の開始時に、前記処理接触表面に提供される前記細胞の少なくとも１４０％の前記処理接触表面からの細胞回収を達成するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記処理接触表面のＸ線光電子分光（ＸＰＳ）原子組成が、以下：
・１０％〜２５％酸素、０〜５％窒素、及び７０％〜９０％炭素；
・任意選択で、１５％〜２４％酸素、０．１％〜５％窒素、及び７０％〜８０％炭素；
・任意選択で、２０％〜２４％酸素、０．１％〜１％窒素、及び７０％〜７９％炭素
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記処理ポリマー支持体の前記内部部分の前記ＸＰＳ原子組成が、前記処理接触表面に比べ、少量の酸素と多量の炭素を含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
深さ０．６ｎｍでの前記処理ポリマー支持体の前記内部部分の前記ＸＰＳ原子組成が、１％〜１０％酸素を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
深さ１．２ｎｍでの前記処理ポリマー支持体の前記内部部分の前記ＸＰＳ原子組成が、０．５％〜５％酸素を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
深さ１．７ｎｍでの前記処理ポリマー支持体の前記内部部分の前記ＸＰＳ原子組成が、０．３％〜３％酸素を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
深さ２．３ｎｍでの前記処理ポリマー支持体の前記内部部分の前記ＸＰＳ原子組成が、０．１％〜１％酸素を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
深さ２．９ｎｍでの前記処理ポリマー支持体の前記内部部分の前記ＸＰＳ原子組成が、０．１％〜１％酸素を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記処理接触表面と接触して増殖させ、採取したニワトリ胚細胞培養物の生存率が、前記初期接触表面と比較して、少なくとも８８％、任意選択で８８％〜９９％、任意選択で８８％〜９７％、任意選択で９４％〜９６％である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記処理接触表面と接触して増殖させ、採取したニワトリ胚細胞培養物の回収率が、前記初期接触表面と比較して、少なくとも１３２％、任意選択で１３２％〜３００％、任意選択で１４０％〜２５０％、任意選択で１４０％〜２３０％である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記処理接触表面の表面接触角が、３８°〜６２°、任意選択で５０°〜７０°、任意選択で５５°〜６５°、任意選択で６０°〜６４°、任意選択で３０°〜５０°、任意選択で３０〜４０°、任意選択で３５°〜４５°、任意選択で３７°〜４１°である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記処理ポリマー支持体が、ルーメンを囲む内側表面、外側表面、及び少なくとも前記内側表面と前記外側表面との間に位置し、且つそれらから間隔が置かれた内部部分を備える壁を有する容器を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記内側表面が、概して円筒形である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記処理接触表面が、前記容器の前記内側表面の少なくとも一部を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記容器が、ローラボトルを含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ローラボトルが、前記処理接触表面を画定する内側表面を含み、前記内側表面は、複数のリブを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記容器が、１ｍＬ〜１００Ｌ、任意選択で１００ｍＬ〜５Ｌ、任意選択で約１Ｌ、任意選択で約２Ｌの容積を有する、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記処理ポリマー支持体が、プレート、皿、フラスコ、ボトル、又はチューブを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記処理ポリマー支持体が、熱可塑性材料、例えば、熱可塑性樹脂、例えば、射出成型熱可塑性樹脂を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記熱可塑性材料が、炭化水素ポリマー、例えば、オレフィンポリマー、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、水素化ポリスチレン、ポリシクロヘキシルエチレン（ＰＣＨＥ）、又はこれらのうち２つ以上の組合せ、又はヘテロ原子置換炭化水素ポリマー、例えば、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶｄＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリカーボネート、ポリ乳酸、エポキシ樹脂、ナイロン、ポリウレタンポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、アイオノマー樹脂、又は任意の組合せ、複合材、ブレンド、又はこれら上記の材料のいずれか２種以上の積層体を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記熱可塑性樹脂が、ポリスチレンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記プロセスガスが、酸素原子、窒素原子、又は酸素及び窒素原子の両方を含み、好ましくは、酸素、窒素、亜酸化窒素、又はこれらのうちいずれか２種以上の組合せを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロセスガスが、ほぼ水を含まない、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記初期接触表面と隣接する排出口を備えるガス注入導管を通してプロセスガスを運搬することにより、前記表面を前記プロセスガスと接触させる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記高周波が、１〜５０ＭＨｚ、任意選択で１３．５６ＭＨｚである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記プラズマを励起するために用いられる前記高周波電力が、１〜１０００ワット、任意選択で１００〜９００ワット、任意選択で５０〜６００ワット、任意選択で２００〜７００ワット、任意選択で４００〜６００ワット、任意選択で１００〜５００ワット、任意選択で５００〜７００ワット、任意選択で１〜１００ワット、任意選択で１〜３０ワット、任意選択で１〜１０ワット、任意選択で１〜５ワットである、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記高周波電力は、前記初期接触表面をほぼ取り囲む外部アプリケータによって、少なくとも一部が導入される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記処理ポリマー支持体が、ルーメンを画定する内側表面を含む容器であり、前記高周波電力は、前記ルーメン内に少なくとも部分的に位置する内部アプリケータにより、少なくとも一部が導入される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ルーメン内に少なくとも部分的に位置する前記内部アプリケータが、さらに、前記初期接触表面を前記プロセスガスと接触させるためのガス注入導管を含む、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、概して、親水性、又は表面を親水性にして、表面への細胞接着を増強する、プラスチック支持体（時として、本開示では、接触表面と呼ばれる）の表面、又は表面修飾に関する。より具体的には、本技術は、その増強された細胞接着によって、細胞培養及び細胞増殖のために使用される処理表面を備えた、プラスチック支持体、例えば、実験器具の医療装置若しくは品目に関する。こうした医療装置として、限定はされないが、細胞培養容器及びローラボトルなどがある。
【背景技術】
【０００２】
造血細胞株及び形質転換細胞などの一部の細胞は、懸濁液（例えば、３Ｄスフェア培養懸濁液）中で増殖するが、ほとんどの他の細胞は、高度表面結合（例えば、単層増殖）を選択して増殖する；すなわち、これらの細胞は、増殖するために表面接着を必要とする。歴史的に、優れた光学的性質を有し、親水性で、天然に荷電されているために、細胞増殖を促進する上で好ましいことから、ガラスが増殖表面として用いられた。使い捨てのプラスチック、特にポリスチレンは、細胞培養増殖のために最も一般的に使用されている。ポリスチレン培養容器は、良好な光学的性質を有する。
【０００３】
しかしながら、ほとんどのプラスチック製品は、疎水性であり、細胞増殖には不向きであるため、その表面を処理又はコーティングする必要がある。
【０００４】
細胞増殖容器の場合、生体物質と共に用いられるプラスチック製品に対する細胞吸着及び細胞結合を増強することが望ましい。ポリマープラスチック製の一般的な実験器具構成要素の表面は、疎水性であり、通常、良好な細胞接着を呈さない。従って、プラスチック実験器具及び他の物品について、より高度の親水性、従って、改善された細胞接着で、生体物質と接触する表面を提供することが求められる。
【０００５】
本発明はまた、化学、生化学、医学、及び／又は生物学的使用を実施するために、コーティングされた容器の作製の技術分野にも関する。これらの方法及びシステムは、医学的診断、医学的処置、環境モニタリング、品質管理、新薬発見、及び科学的研究を含む様々な用途で不可欠である。
【０００６】
本発明は、概して、細胞増殖及び細胞培養容器及びプラスチック実験器具の作製に関する。本発明は、プラズマ処理により親水性表面を生成することに関する。本発明は、さらに、細胞接着が増強され、それにより、細胞培養及び細胞増殖が改善された親水性表面の生成にも関する。
【０００７】
伝統的に、ガラス製品は、親水性表面を呈することから、使用され、細胞培養及び細胞増殖のために使用され続けている。しかし、ガラス製品は、割れやすく、非常に高価で、微粒子の問題を被りやすく、重金属抽出物をもたらすと共に、細胞増殖及び／又はタンパク質及び他の生物製剤の凝集に悪影響を生じ得る。
【０００８】
これらの問題のいくつかは、ガラス製品の代わりに射出成型プラスチック製品を使用することによって対処することができる。ガラス製品に伴う多くの課題のために、とりわけ、プラスチック製品は、医療、医学的研究、新薬発見、及び科学的研究の分野など、生物製剤の分野で好ましい。プラスチック製品は、ガラス製品に伴う問題の一部に対処するが、プラスチック製品も同様にいくつかの問題を生み出す。プラスチック製品は、抽出物／浸出物を含有し、様々なタイプの実験室のインビトロ及び分析試験に対して、プラスチック製品の使用が阻まれるか、又はその使用が望ましくなくなる。プラスチック製品は、通常低い細胞接着を賦与する疎水性表面を呈示する。高い細胞接着は、細胞増殖を増強すると考えられる。これらの課題が、細胞培養及びローラボトルでのプラスチック製品の使用を制限している。
【０００９】
ローラボトルは、非常に多様な用途で細胞培養容器として使用される。ローラボトルは、多くの場合、ポリスチレン（ＰＳ）又はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）から製造される。これらの材料は、優れた光学的明澄度、高い安定性、破損しにくさ及び多くの他の利点を呈示する。
【００１０】
ローラボトルの比較的大きな接触表面は、細胞接着を増強するため、細胞増殖を向上させる。接触表面を広げるために、一部のローラボトルは、本体に円周、軸方向、又はその他のリブを備えて設計され、これにより増殖表面を増大することができる。
【００１１】
細胞増殖に有利である親水性表面を生成するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び双性イオンポリマーコーティングをはじめとするいくつかの親水性コーティングが使用されており、これらは、優れた細胞接着をもたらす。これらのポリマーコーティングの多くは、物品表面に共有結合されておらず、流体ペイロード中に移動（溶解、分散）する可能性があり、細胞増殖又は試験を妨害し、それらの有用性を制限する。物品表面に共有結合されたポリマーコーティングは、流体ペイロード中に移動（溶解、分散）する可能性がないため、細胞増殖を妨害する原因を排除する。さらに、共有結合したポリマーコーティングは、ポリマー表面コーティングの移動を防止することから、物品表面の不要な露出を防止する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、プラスチックの表面に対する細胞接着を増強する、プラスチック実験器具、例えば、細胞培養容器及びローラボトルなどの表面の親水性コーティング／処理の必要性がある。同様に、ポリマー表面コーティングの移動を防止し、これによって不要な微粒子妨害及びプラスチック表面の露出を防止する、プラスチック実験器具、例えば、細胞培養容器及びローラボトルなどの表面の共有結合ポリマーコーティング／処理の必要性もある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一態様は、概して、初期接触表面を含むポリマー支持体を用意し、初期接触表面をプロセスガスと接触させ、高周波電力をプロセスガス中に導入し、未処理接触表面と比較して、改善された細胞回収を有する処理接触表面を形成することにより、実施される方法である。
【００１４】
ポリマー支持体は、初期接触表面に加えて、初期接触表面と隣接する内部部分を含む。
【００１５】
プロセスガスは、任意選択で、窒素ガス、酸素ガス、又は窒素原子、酸素原子、若しくは窒素及び酸素原子の組合せを含有する異種ガス、並びに他の種類の原子、例えば、希ガスであってよい。好適なプロセスガスの非制限的例として、酸素ガス、窒素ガス、亜酸化窒素ガス、又はこれらのうち２種以上の組合せが挙げられる。
【００１６】
任意選択で、初期接触表面と隣接するプロセスガス中に、高周波電力を導入して、初期接触表面に隣接してプラズマを発生させる。その結果、処理されたポリマー支持体が、処理接触表面を伴って形成される。
【００１７】
本方法は、任意選択で、初期接触表面と比較して、処理接触表面からのニワトリ胚細胞培養物の細胞回収を改善し、任意選択で、細胞回収試験の開始時に、処理接触表面に提供される細胞の少なくとも１４０％の処理接触表面からの細胞回収を達成する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明のいずれかの実施形態を実施するために有用なプラズマ処理装置の概略図である。
【図２】３つの容器を同時に処理するためのプラズマ処理装置を示す、図１に類似する図である。
【図３】装置の内部詳細と、処理される容器の内部及び外部の圧力を等しくするための追加的特徴とを示す、図１の装置の概略的断面図である。
【図４】ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ（商標）ローラボトルの斜視図を示す。
【図５】壁の内側及び外側に、細胞接着のための表面積を広げる多数の円周リブを有する、市販のローラボトルの図４と類似する写真を示す。
【図６】本明細書の実施例２で述べる図５のＣＥＬＬＴＲＥＡＴ（商標）ローラボトルを示し、ボトルの該当部分を明示する。
【図７Ａ−７Ｂ】本発明の容器を密閉するために使用され得る無菌キャップの２つの例を示す。図７Ａは、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）無菌トランスファーキャップを示し、図７Ｂは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＭＹＣＡＰ（登録商標）クロージャを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
図面には、以下の参照番号を使用する。
【００２０】
【表１】
2021500031.tif 000003
【００２１】
類似の参照番号は、対応する部分を示す。
【００２２】
本開示は、親水性で、且つ未処理表面又は生物学的コーティング処理表面よりも高度の細胞接着を有する接触表面を備えたローラボトル又は他の実験器具若しくは支持体を作製する方法に関する。
【００２３】
任意選択で、細胞増殖のために本発明の支持体を使用する場合、増殖工程が完了した後、細胞を採取又は回収する。回収率は、任意選択で、生物学的コーティングで処理した以外は同一の支持体よりも高い。回収率は、任意選択で、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｂｉｎｄ支持体よりも高い。
【００２４】
任意選択で、支持体を容器として作製する場合、容器は、さらにクロージャを含む。クロージャは、どんな種類のものであってもよい。例えば、クロージャは、任意のストッパー、キャップ、蓋、栓、コルク又はこれらの任意の組合せであってよい。例えば、プラスチック又はエラストマー製ストッパーをキャップ中に挿入して、クロージャを形成することができる。
【００２５】
細胞増殖は、無菌環境が必要である。細胞培養／増殖容器のキャップの頻繁な開閉は、汚染源の１つである。任意選択で、細胞培養／増殖容器（例えば、ローラボトル）は、培地供給、接種、サンプル添加／収集、移動などの間のキャップの開閉による汚染を防ぐために、無菌トランスファーキャップで密閉することができる。任意選択で、クロージャは、無菌プロセス、任意選択で、高温、低温、オートクレーブ処理、照射又はいずれか他の異常条件での無菌処理に適している。例えば、クロージャは、細胞培養／増殖工程中にキャップを開く必要性を排除するための他の付属品を備える無菌トランスファーキャップであってよい。任意選択で、クロージャは、ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）無菌トランスファーキャップであってよい。任意選択で、クロージャは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＭＹＣＡＰ（登録商標）クロージャであってよい。ＭＹＣＡＰ（登録商標）クロージャは、キャップ中に分散されるシリコーンエラストマーを含む。キャップは、キャップ上に予め形成された孔にチューブ類及びガス交換カートリッジを挿入することによって組み立てられる。
【００２６】
任意選択で、本方法は、（ａ）接触表面を有する支持体、例えば、容器を用意するステップ；（ｂ）接触表面に隣接して真空を付与するステップ；（ｃ）接触表面の近傍に、任意選択で窒素を含有する、Ｏ２を含むガスを供給するステップ；及び（ｄ）ガスからプラズマを発生させ、これにより、処理接触表面を形成するステップを含む。形成された接触表面は、高度の細胞結合表面である。
【００２７】
任意選択で、ステップ（ｃ）において、支持体が、ローラボトル又は他の容器である場合、ガスは、任意選択で、容器に挿入されるガス注入口を通して容器内に導入される（図ＸＸに示すように。任意選択で、この実施形態では、ＲＦを用いて、プラズマを発生させる。
【００２８】
驚くことに、ＲＦ電力を、ガス混合物を容器内に導入するガス注入口の使用と組み合わせると、細胞増殖実験の結果を増強する上で大きな利点が得られることが判明した。これらの結果は、コーティングされていない以外は同一の表面よりも優れており、また、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｂｉｎｄ処理表面より優れている。ガス混合物を送達するためのガス注入口を容器に挿入せずに、ＲＦ電力を用いて容器を処理すると、より少ない反応性官能基が表面上に生成されるため、所望の処理が得られない可能性がある。ガス混合物を送達するための、容器に挿入されるガス注入口の使用は、より多くの反応性官能基を表面に生成する上で役立ち、従って、表面活性化及び表面均一性を改善して、優れた細胞接着／細胞増殖結果を達成する。
【００２９】
マイクロ波源に対してＲＦ電力源の使用にはいくつかの利点がある：ＲＦは、低電力で作動することから、支持体／容器の加熱が少ない。本発明の重点は、プラスチック支持体のプラズマ表面処理であるので、支持体の融解／変形を防ぐために、より低い処理温度が望ましい。高周波マイクロ波は、プラスチック支持体内に残留する水、オリゴマー及び他の物質などの揮発性物質のガス放出も引き起こし得る。このガス放出は、処理を妨害する恐れがある。
【００３０】
「接触表面」という用語は、サンプル又は他の材料と接触させようとする位置にあると共に、それが接触するサンプル又は他の材料との相互作用を決定する表面特性を有する表面を意味する。接触表面のいくつかの例は、容器の内側表面（例えば、容器ルーメンと隣接する）又は容器、シート、ブロック、若しくはその他の物体の外側表面の一部若しくは全部である。任意選択で、接触表面は、それがプラズマで処理される前に、内部部分と同じ材料から製造される。
【００３１】
「内部部分」という用語は、接触表面ではないが、バルク製品又はコーティングの内部の部分を形成するバルク製品又はコーティングの一部を示す。その特性を改変するために支持体の接触表面が処理される実施形態では、支持体の内部部分は、処理によって改変されない任意の部分を含む。
【００３２】
任意の実施形態で言及されるように、「プラズマ」は、その構成粒子の大規模な電離、一般にガス形態、及び白熱（すなわち、グロー放電を生じ、それが発光することを意味する）を特徴とする、物質の４つの基本的状態のうち１つの、物理学におけるその一般的意味を有する。
【００３３】
処理接触表面は、全ての実施形態について、本明細書に記載される通り、プラズマ処理され、且つ、こうした処理の結果、増強された細胞増殖を呈示する接触表面として定義される。
【００３４】
本明細書全体を通して使用される「容器」という用語は、液体、ガス、固体、又はこれらのいずれか２つ以上を含有する、又は運搬するように改変された任意のタイプの物品であってよい。容器の一例は、少なくとも１つの開口部（例えば、用途に応じて１つ、２つ以上）と、内側接触表面を含む壁とを有する物品である。
【００３５】
図１〜３を参照しながら、本方法は、概して、初期接触表面１０２を含むポリマー支持体１０１を提供し、初期接触表面１０２をプロセスガス１０４（図１にはガス供給源として、また図１及び３には容器内のガスとして示す）と接触させ、高周波電力をプロセスガス１０４中に導入し、未処理接触表面１０２と比較して、細胞回収が改善された処理接触表面１０２を形成することにより、実施することができる。
【００３６】
任意選択で、いずれかの実施形態では、ポリマー支持体１０１は、初期接触表面１０２に加えて、初期接触表面１０２と隣接する内部部分１０３を含む。
【００３７】
任意選択で、いずれかの実施形態では、プロセスガス１０４は、窒素ガス、酸素ガス、又は窒素原子、酸素原子、若しくは窒素及び酸素原子の組合せ、並びに他の種類の原子を含有する異種ガスであってよい。好適なプロセスガス１０４の非制限的例として、酸素ガス、窒素ガス、亜酸化窒素ガス、又はこれらのうちいずれか２種以上の組合せが挙げられる。任意選択で、プロセスガス１０４は、キャリアガス、例えば、希ガス、例えば、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、若しくはキセノン又はこれらのうちいずれか２種以上の混合物を含み得る。
【００３８】
任意選択で、いずれかの実施形態では、初期接触表面１０２と隣接するプロセスガス１０４中に、高周波電力を導入して、初期接触表面１０２に隣接してプラズマを発生させる。その結果、処理されたポリマー支持体１０１が、処理接触表面１０２を伴って形成される。
【００３９】
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理接触表面１０２のＸ線光電子分光ＸＰＳ原子組成は、次の通りである：
・１０％〜２５％酸素、０〜５％窒素、及び７０％〜９０％炭素；
・任意選択で、１５％〜２４％酸素、０．１％〜５％窒素、及び７０％〜８０％炭素；
・任意選択で、２０％〜２４％酸素、０．１％〜１％窒素、及び７０％〜７９％炭素。
【００４０】
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理ポリマー支持体１０１の内部部分１０３のＸＰＳ原子組成は、処理接触表面１０２に比べ、少量の酸素と多量の炭素を含む。
【００４１】
任意選択で、いずれかの実施形態では、深さ０．６ｎｍでの処理ポリマー支持体１０１の内部部分１０３のＸＰＳ原子組成は、１％〜１０％酸素を含む。
【００４２】
任意選択で、いずれかの実施形態では、深さ１．２ｎｍでの処理ポリマー支持体１０１の内部部分１０３のＸＰＳ原子組成は、０．５％〜５％酸素を含む。
【００４３】
任意選択で、いずれかの実施形態では、深さ１．７ｎｍでの処理ポリマー支持体１０１の内部部分１０３のＸＰＳ原子組成は、０．３％〜３％酸素を含む。
【００４４】
任意選択で、いずれかの実施形態では、深さ２．３ｎｍでの処理ポリマー支持体１０１の内部部分１０３のＸＰＳ原子組成は、０．１％〜１％酸素を含む。
【００４５】
任意選択で、いずれかの実施形態では、深さ２．９ｎｍでの処理ポリマー支持体１０１の内部部分１０３のＸＰＳ原子組成は、０．１％〜１％酸素を含む。
【００４６】
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理接触表面１０２と接触して増殖させ、採取したニワトリ胚細胞培養物の生存率は、初期接触表面１０２と比較して、少なくとも８８％、任意選択で８８％〜９９％、任意選択で８８％〜９７％、任意選択で９４％〜９６％である。
【００４７】
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理接触表面１０２と接触して増殖させ、採取したニワトリ胚細胞培養物の回収率は、初期接触表面１０２と比較して、少なくとも１３２％、任意選択で１３２％〜３００％、任意選択で１４０％〜２５０％、任意選択で１４０％〜２３０％である。
【００４８】
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理接触表面１０２に対する水の表面接触角は、３８°〜６２°、任意選択で５０°〜７０°、任意選択で５５°〜６５°、任意選択で６０°〜６４°、任意選択で３０°〜５０°、任意選択で３０°〜４０°、任意選択で３５°〜４５°、任意選択で３７°〜４１°である。
【００４９】
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理ポリマー支持体１０１は、ルーメン１０８を囲む内側表面１０７、外側表面１０９、及び内側表面１０７と外側表面１０９との間に位置し、且つそれらから間隔が置かれた内部部分１０３を備える壁１０６を有する容器１０５を含む。本明細書に別に指示のない限り、内部部分１０３内の位置は、内側表面１０７からのそれらの距離によって決定される。内側表面１０７は、任意選択で、概して円筒形であり、任意選択で、処理接触表面１０２は、容器１０５の内側表面１０７の少なくとも一部を含む。
【００５０】
任意選択で、いずれかの実施形態では、容器１０５は、図１及び２などに示すように、ローラボトルを含む。任意選択で、ローラボトルは、処理接触表面１０２を画定する内側表面１０７を含み、接触表面１０２は、多数のリブ１１０を備える。接触表面１０２の一部又は全部、例えば、ローラボトル又は他の容器１０５の細胞接触側面若しくは末端壁におけるリブ又は他の構造の複雑さは、接触表面１０２の表面積を増大する上で有用であることがわかっている。任意選択で、いずれかの実施形態では、容器１０５は、１ｍＬ〜１００Ｌ、任意選択で１００ｍＬ〜５Ｌ、任意選択で約１Ｌ、任意選択で約２Ｌの容積を有する。任意選択で、いずれかの実施形態では、処理ポリマー支持体１０１は、図１及び３に示すようにプレート、皿、フラスコ、ボトル、図２に示すようにチューブ、又はいずれか他のタイプの実験器具若しくは生成装置を含み得る。
【００５１】
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理ポリマー支持体１０１は、射出成型可能な熱可塑性又は熱硬化性材料、例えば、熱可塑性材料、例えば、熱可塑性樹脂、例えば、射出成型熱可塑性樹脂を含む。任意選択で、いずれかの実施形態では、熱可塑性材料は、炭化水素ポリマー、例えば、オレフィンポリマー、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、水素化ポリスチレン、ポリシクロヘキシルエチレン（ＰＣＨＥ）、又はこれらのうち２つ以上の組合せ、又はヘテロ原子置換炭化水素ポリマー、例えば、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶｄＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリカーボネート、ポリ乳酸、エポキシ樹脂、ナイロン、ポリウレタンポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、アイオノマー樹脂、又は任意の組合せ、複合材、ブレンド、又はこれら上記の材料のいずれか２種以上の積層体を含む。任意選択で、いずれかの実施形態では、熱可塑性樹脂は、ポリスチレンを含み、これは、一般に、ローラボトル、マイクロプレート、ペトリ皿など、多くの実験器具用途に使用されている。
【００５２】
任意選択で、いずれかの実施形態では、プロセスガス１０４は、酸素原子、窒素原子、又は酸素及び窒素原子の両方を含み、好ましくは、酸素、窒素、亜酸化窒素、又はこれらのうちいずれか２種以上の組合せを含む。任意選択で、いずれかの実施形態では、プロセスガス１０４は、ほぼ水を含まない。
【００５３】
任意選択で、いずれかの実施形態では、本方法は、接触表面１０２をプロセスガス１０４と接触させることによって実施される。これは、例えば、初期接触表面１０２と隣接する排出口１１２を有するガス注入導管１１１を通してプロセスガス１０４を運搬することによって行われ得る。
【００５４】
任意選択で、いずれかの実施形態では、プラズマを発生させるために使用されるＲＦ電力の周波数は、１〜５０ＭＨｚ、任意選択で１３．５６ＭＨｚである。任意選択で、いずれかの実施形態では、プラズマを励起するために用いられる高周波電力は、１〜１０００ワット、任意選択で１００〜９００ワット、任意選択で５０〜６００ワット、任意選択で２００〜７００ワット、任意選択で４００〜６００ワット、任意選択で１００〜５００ワット、任意選択で５００〜７００ワット、任意選択で１〜１００ワット、任意選択で１〜３０ワット、任意選択で１〜１０ワット、任意選択で１〜５ワットである。
【００５５】
任意選択で、いずれかの実施形態では、高周波電力は、初期接触表面１０２をほぼ取り囲む外部アプリケータ１１３によって、少なくとも一部が導入される。任意選択で、いずれかの実施形態では、高周波電力は、ルーメン１０８内に少なくとも部分的に位置する内部アプリケータ１１４により、少なくとも一部が導入される。任意選択で、いずれかの実施形態では、ルーメン１０８内に少なくとも部分的に位置する内部アプリケータ１１４は、さらに、初期接触表面１０２をプロセスガス１０４と接触させるためのガス注入導管１１１を含む。
【００５６】
任意選択で、いずれかの実施形態において、図１に示す装置を用いて、容器１０５の初期接触表面１０２を処理することができる。図１及び３は、ローラボトルとして作製された容器１０５の一例を示す。典型的な１リットル又は２リットル容積のローラボトルのよりわかりやすい図を図４〜６に示す。
【００５７】
ローラボトル又は他の容器の容積について本明細書に示す参照値は、それを完全に満たすのに必要な流体の量を必ずしも示すわけではない。こうした容器の指定容積は、一般に、容器がその容積まで充填されるときの頭隙を残す。ローラボトルの場合、例えば、ボトルは、細胞を容器内で増殖させているとき、横向きに置かれ、機械作用により回転させるため、接触表面１０２に接着した細胞は、頭隙及びボトルの液体内容物（増殖培地など）を交互に通過し、増殖を促進する。
【００５８】
ローラボトル又は他の容器１０５は、ルーメン１０８を囲む内側表面１０７と、外側表面１０９とを備える壁１０６を有する。容器壁１０６は、内側表面１０７と外側表面１０９との間に位置し、且つそれらから間隔が置かれる内部部分１０３を有す。内側表面１０７の少なくとも一部、任意選択で全部が、接触表面１０２を画定し、これは、本処理前の初期接触表面又は本処理後の処理接触表面と呼ばれる。接触表面１０２は、本開示に従って処理された内側表面１０７の任意の部分である。
【００５９】
図１、２、又は３に示す装置は、いずれの実施形態に従って容器１０５を処理するのにも適しているが、他の装置を使用することもできる。この装置は、図１及び２に示す円筒形セラミックチャンバー１１５を含むことができ、これは、アルミニウム底１１６及びアルミニウム蓋１１７（使用中は密閉されているが、ロード及びアンロードの際は開放され得るため、図ｘでは開放状態で示される）を備える。チャンバー１１５は、直径約１２インチ（３０ｃｍ）、深さ８インチ（２０ｃｍ）であってよいが、いずれか他の好適な寸法を使用することもできる。
【００６０】
任意選択で弁１２１により制御される真空ポンプ１２０に真空導管１１９を送るチャンバー１１５のポンピングポート１１８は、アルミニウム底１１６に位置してよく、直径約４インチ（１０ｃｍ）であってよく、ポンピングポート１１８を通って処理エリア１２２に同心円状に突出する直径１／２インチ（１２ｍｍ）のガス注入導管１１１を備える。ポンピングポート１１８上方にプラズマスクリーン（図示していない）を設置してもよく、これは、銅スクリーン及びスチールウールから作製することができる。プロセスガス１０４は、チャンバー１１５下方のガスシステム１２３を介してガス注入導管１１１に供給することができる。圧縮プロセスガス１０４の場合には、１２４などのマスフローコントローラを使用することができる。
【００６１】
セラミックチャンバー１１５は、チャンバー１１５の外側を同心円状に包むことができる銅製外部アプリケータ１１３を備えてもよく、これは、高さ約７インチ（１８ｃｍ）であってよい。外部アプリケータ１１３は、ＣＯＭＤＥＬ（登録商標）マッチングネットワーク１２５に接続してよく、これは、ＣＯＭＤＥＬ（登録商標）１０００ワットＲＦ（１３．５６ＭＨｚ）電源１２６の５０オーム出力を最適電力供給（低反射電力）に適合させることができる。ＣＯＭＤＥＬ（登録商標）装置は、Ｃｏｍｄｅｌ，Ｉｎｃ．，Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡにより販売されている。電源１２６は、同軸ケーブル１２７を介してＣＯＭＤＥＬ（登録商標）マッチングネットワーク１２５に取り付けることができる。プロセス圧力を測定するために、２つのキャパシタンスマノメータ（０〜１Ｔｏｒｒ及び０〜１００Ｔｏｒｒ）（図示していない）を真空導管１１９（ポンプラインとも呼ばれる）に取り付けることができる。
【００６２】
容器１０５を処理するための図２に示す装置は、図１の装置と同じであってもよいが、図示するように、単一処理サイクル内に２つ以上の容器１０５を収容するために、２つ以上のガス注入導管１１１を有する。
【００６３】
図１又は２に示す装置は、任意選択で、図３に示す真空バイパスライン１２８を含む。
【００６４】
任意選択で、いずれかの実施形態では、フラスコ、ボトル、又はチューブとして作製された実験器具を、図１〜３に示すものと類似の装置で処理することができる。
【００６５】
任意選択で、いずれかの実施形態では、プレート、マイクロプレート、皿、又は処理しようとする比較的平坦な外側表面を有する他の物体として作製された実験器具を、図１〜３に示すものと類似するが、より平坦な製品を処理するように改変された装置で処理することができる。任意選択で、いずれかの実施形態では、本明細書に示すセラミックチャンバー１１５の内部を、本明細書に記載の処理中に、複数のマイクロプレート又は他の比較的平坦な物体を支持するために、国際公開第２０１６／１７６５６１号パンフレットの図６に示すように改変することができる。任意選択で、いずれかの実施形態では、マイクロプレート又は他の平坦な物体は、処理しようとする表面が、セラミックチャンバー１１５の中心に向くように配向して、処理のために供される表面に対し直接プラズマ励起ガスを適用するのを促進することができる。
【００６６】
この方法は、任意選択で、初期接触表面１０２と比較して、処理接触表面１０２からのニワトリ胚細胞培養物の細胞回収を改善し、細胞回収試験の開始時に、処理接触表面１０２に提供される細胞の少なくとも１４０％の処理接触表面１０２からの細胞回収を達成する。
【００６７】
細胞はまた、接触表面積をやはり増大する別のタイプの支持体であるマイクロキャリア表面でも増殖することができる。マイクロキャリアは、粘着性細胞増殖を可能にする支持マトリクスである。マイクロキャリアは、通常、１２５〜２５０マイクロメートルの球体（ビーズ）であり、その密度のために、穏やかに攪拌しながら、培地中にそれらを懸濁状態で維持することが可能になる。マイクロキャリア又はビーズは、ＤＥＡＥ−デキストラン、ガラス、ポリスチレンプラスチック、アクリルアミド、コラーゲン、及びアルギン酸塩を含め、多種の材料から製造することができる。これらのマイクロキャリア又はビーズ材料は、様々な表面化学と共に、形態及び増殖をはじめとする細胞挙動に影響を与え得る。マイクロバリア（又はビーズ）技術の使用によって、例えば、必要な培地及び実験器具が少なくて済むなど、多くの利点がある。
【００６８】
細胞接着及び細胞増殖を増大することは重要であるが、増殖工程の完了後に細胞を採取し、細胞の質を保持することも同様に重要である。任意選択で、マイクロキャリアを使用する場合、細胞の採取は、次の２つのステップを含むと考えることができる：第１に、細胞をマイクロキャリアから脱離させて、細胞−マイクロキャリア懸濁液を作製するステップ；及び第２に、細胞を、マイクロキャリアの存在しない懸濁液に残す、さらなる分離ステップ。
【００６９】
典型的に、第１のステップ、すなわち、マイクロキャリアからの細胞脱離は、酵素消化により達成される。マイクロキャリアの種類、細胞の種類などに基づいて、様々な酵素を使用することができる。酵素は、例えば、トリプシン、アキュターゼ、コラゲナーゼ又はトリプシン−アキュターゼ混合物であってよい。第２のステップ中に、フィルター又は遠心分離を使用して、細胞をマイクロキャリアから分離する。
【００７０】
本発明はまた、任意選択で、高親水性表面を提供することにより、細胞接着及び細胞増殖を増強することを目的とする、マイクロキャリア（例えば、ビーズ）表面のプラズマコーティング又は処理にも関する。コーティング又は処理は、細胞接着、細胞増殖及び細胞回収工程中、細胞の完全性にマイナスの影響をもたらさない。
【００７１】
細胞培養、細胞採取及び回収プロトコル
本開示での使用のために以下の材料、装置、及び方法が考慮される。材料：ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ（登録商標）１，０００ｍＬローラボトル（Ｐｒｏｄｕｃｔ  ２２９５８２）、ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ（登録商標）Ｔ−１８２フラスコ（Ｐｒｏｄｕｃｔ  ２２９３５１）、培地ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ；Ｒｅｆ♯１９９５−０６５）、ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ；Ｒｅｆ＠１６１７０−０７８）、１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ；Ｒｅｆ♯１４１９０−１３６）、１×ＰＢＳで希釈した０．１８ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１×トリプシン（Ｇｉｂｃｏ；Ｒｅｆ♯２５２００−０５６）、カウンティングスライド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｃａｔ＃１４５−００１１）、セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｍｏｄｅｌ  ＴＣ１０）、トリパンブルー溶液０．４％（Ａｒｍｅｓｃｏ，Ｃｏｄｅ：Ｋ９４０−１００ＭＬ）、ペニシリン・ストレプトマイシンＳｏｌｎ、１００×（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｒｅｆ＃３０−００２ＣＩ）、競合物２，０００ｍＬローラボトル。
【００７２】
金曜日に受け取った際、選択した細胞を計数し、Ｔ−１８２フラスコ（３／３３）×１５に分割した。月曜日に、１５×Ｔ−１８２フラスコの細胞をプールした。１０ｍＬの細胞を１Ｌのローラボトルに添加して、２０ｍＬの細胞を２Ｌのローラボトルに添加した。空気中５％  ＣＯ２を含む３９℃の加湿チャンバー内でローラボトルを０．２５ｒｐｍで回転させた。４８時間後、細胞を採取した。
【００７３】
１Ｌローラボトルの場合、細胞の採取は下記のように実施した。培地をデカントした。細胞を２５ｍＬの１×ＰＢＳですすいだ。次に、０．１８ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＬの１×トリプシンを添加し、１０分間インキュベートした。最後に、４０ｍＬの完全培地を添加した。１ｍＬのサンプルを収集し、細胞計数を実施した。
【００７４】
２Ｌローラボトルの場合、細胞の採取は下記のように実施した。培地をデカントした。細胞を５０ｍＬの１×ＰＢＳですすいだ。次に、０．１８ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＬの１×トリプシンを添加し、１０分間インキュベートした。８０ｍＬの完全培地を添加した。１ｍＬのサンプルを収集し、細胞計数を実施した。
【００７５】
各サンプルを１０×希釈して、細胞の分離を促した。細胞サンプルをもう一度１０×希釈したが、その際、０．４％トリパンブルーを１：１の比で添加した。１０μＬの細胞／トリパンブルーサンプルをカウンティングスライドに載せ、これをＢｉｏ−Ｒａｄセルカウンターにロードして、記録した。
【００７６】
実施した分析では、生存細胞回収率（Ｖｉａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を比較したが、これは次のように算出される：
％生存細胞回収率＝採取した生存細胞総数／初期生存細胞総数。
【００７７】
【表２】
2021500031.tif 000004
【００７８】
【表３】
2021500031.tif 000005
【実施例】
【００７９】
実施例１
この実験は、ポリスチレン製の１Ｌ  ＣｅｌｌＴｒｅａｔローラボトルに適用される本発明の表面処理による細胞回収（すなわち、細胞増殖）改善及び接触角を調べるために実施した。また、この実験では、本発明の処理を、細胞増殖に関して、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｒｅａｔｅｄ（ＴＣＴ）ローラボトル及びＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｂｉｎｄローラボトルなどの競合処理と比較した。試験対象の細胞株は、ニワトリ胚細胞であった。処理方法を本明細書に記載する。ローラボトル１〜４は、本発明に従って処理し、使用するパラメータを表１ａに示す。続いて、処理済のボトルに、表１ｂに示す通り、細胞をロードした。表２〜４に記載する結果から、ローラボトル２の処理（本明細書では、処理２と呼ぶこともある）が、一貫して最良の細胞増殖結果（細胞回収データに表示する）をもたらしたことが明らかである。以下の実施例に示す表面分析は、別に明示されない限り、処理２の方法で処理されたローラボトルに対して実施した。
【００８０】
表５に記載するように、水接触角も決定した。
【００８１】
【表４】
2021500031.tif 000006
【００８２】
【表５】
2021500031.tif 000007
【００８３】
【表６】
2021500031.tif 000008
【００８４】
【表７】
2021500031.tif 000009
【００８５】
【表８】
2021500031.tif 000010
【００８６】
【表９】
2021500031.tif 000011
【００８７】
実施例２．本発明の処理ローラボトル及び未処理ローラボトルのＸＰＳ表面分析
この実施例は、ポリスチレン製の未処理１Ｌ  ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ（商標）ローラボトルの接触表面、及び処理した以外は同一のローラボトルＢの接触表面の化学組成及び化学結合を決定するために実施した。図６のローラボトルの表面処理方法は、実施例１の処理２と同じである。ＸＰＳは、ボトルＡの接触表面の１つのエリア（中央エリア）と、ボトルＢの接触表面の４つのエリアについて実施した。４つのエリアを図６に示す。元素の濃度は、高解像度スペクトルから決定した。これらのＸＰＳ結果を表６にまとめる。
【００８８】
【表１０】
2021500031.tif 000012
【００８９】
これらの結果から、本発明の処理が、同一の未処理表面よりも、処理表面上に３倍多い酸素をもたらすことがわかる。
【００９０】
化学結合の情報を図７に示す。
【００９１】
【表１１】
2021500031.tif 000013
【００９２】
検出された元素の化学状態は、高解像度スペクトルから決定した。元素Ｃ及びＳｉについて、スペクトルの曲線当てはめを実施して、様々な酸化状態での各元素の相対量を推定した。曲線当てはめの結果は、個々のスペクトルについて示し、表７にまとめる。
【００９３】
実施例３．本発明の処理ローラボトル及び未処理ローラボトルのＸＰＳ詳細分析
この実施例は、本発明の処理ローラボトルＢの接触表面の詳細な化学組成を決定するために使用した。
【００９４】
処理ローラボトルＢの接触表面について、サーベイスペクトルを取得した。深さ方向プロファイルは、１ｋＶ  Ａｒ＋を用いて取得した。結果を表８に示す。このビーム電圧は、酸素原子の優先スパッタリングを最小にするために選択した。これは、優先スパッタリングを最小にするが、この影響を完全に除去するわけではない。その結果、深さ方向プロファイル中の酸素濃度は、測定値より高いことが予想される。この試験での深さ尺度は、サンプルが、ポリスチレンの８２５Åスピンキャスト薄膜と同じ速度で原子を放出させると想定したことに留意されたい。
【００９５】
【表１２】
2021500031.tif 000014
【００９６】
本技術を詳細に、その具体的な例及び実施形態を参照にしながら説明してきたが、当業者には、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正の実施が可能であることは明らかであろう。追加的開示を特許請求の範囲に提供するが、これらは、本発明の記載の一部であると考慮され、各請求項は、任意選択の実施形態を明らかにする。
【図１】
2021500031.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2021500031.tif 000021
【図７Ｂ】
2021500031.tif 000022
【国際調査報告】
2021500031.tif 000023
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