(57)【要約】  本発明は、ウイルス感染を治療及び/又は予防する分野におけるものである。特に、本発明は、インフルエンザ感染を治療及び/又は予防するための、インフルエンザウイルス抗原をコードする自己複製RNA分子を含む免疫原性組成物又は医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、及び(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子を含む免疫原性組成物であって、第1の抗原及び第2の抗原はともにインフルエンザウイルス由来であるが、第1の抗原が第2の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来である、免疫原性組成物。
【請求項２】
第1及び第2の抗原が、ヘマグルチニン(HA)、又はその免疫原性断片若しくは変異体である、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
第1の抗原が、第2の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの亜型由来である、請求項1又は2に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
第1及び第2の抗原が、自己複製RNA分子中のインフルエンザウイルスに由来する唯一の抗原である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
(iii)第3の抗原を含むポリペプチドをコードする第3の自己複製RNA分子をさらに含み、第3の抗原がインフルエンザウイルス由来であるが、第1と第2の抗原の両方とは異なるインフルエンザウイルスの株由来である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
第1、第2及び第3の抗原が、自己複製RNA分子中のインフルエンザウイルスに由来する唯一の抗原である、請求項5に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
(iii)第4の抗原を含むポリペプチドをコードする第4の自己複製RNA分子をさらに含み、第4の抗原がインフルエンザウイルス由来であるが、第1、第2及び第3の抗原のいずれとも異なるインフルエンザウイルスの株由来である、請求項5又は6に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
第1の抗原がインフルエンザA亜型H1由来のHA又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、第2の抗原が第1の抗原とは異なるH1株由来のHA又はその免疫原性断片若しくは変異体である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
第1及び第2の抗原がインフルエンザA亜型H3由来のHA又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、その両方の抗原がH3インフルエンザウイルスの異なる株由来である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
第1及び第2の抗原がインフルエンザA亜型H1由来のHA又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、第3及び第4の抗原がインフルエンザA亜型H3又はその免疫原性断片若しくは変異体由来であり、第1及び第2の抗原がH1ウイルスの異なる株由来であり、第3及び第4の抗原がH3インフルエンザウイルスの異なる株由来である、請求項7に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
アジュバントをさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
自己複製RNA分子がアルファウイルス由来である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
アルファウイルスが、シンドビス(SIN)、ベネズエラウマ脳炎(VEE)、セムリキ森林熱ウイルス(SFV)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか1項に記載の免疫原性組成物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
カチオン性脂質、リポソーム、微粒子、ウイルスレプリコン粒子(VRP)、水中油型エマルジョン又はカチオン性ナノエマルジョンをさらに含む、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
自己複製RNA分子が、カチオン性脂質、リポソーム、微粒子、ウイルスレプリコン粒子(VRP)、水中油型エマルジョン又はカチオン性ナノエマルジョンに封入され、結合され又は吸着される、請求項15に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
自己複製RNA分子が脂質ナノ粒子(LNP)又はカチオン性ナノエマルジョン(CNE)中に製剤化される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の免疫原性組成物又は請求項14〜16のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ワクチンとして使用するための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の免疫原性組成物又は請求項14〜17のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
インフルエンザの予防に使用するための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の免疫原性組成物又は請求項14〜17のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項1〜13のいずれか1項に記載の免疫原性組成物又は請求項14〜17のいずれか1項に記載の医薬組成物を、それを必要とするヒトに投与することを含む、インフルエンザ疾患を予防及び/又は治療する方法。
【請求項２１】
有効量の請求項14〜17のいずれか1項に記載の医薬組成物又は請求項1〜13のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を誘導する方法。
【請求項２２】
(i)第1の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第1の免疫原性組成物の投与、及び(ii)第2の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第2の免疫原性組成物の同時又は連続投与を含むインフルエンザ疾患を予防及び/又は治療する方法であって、第1及び第2の自己複製RNA分子がインフルエンザウイルス由来の抗原をコードするポリペプチドをコードするが、第1の自己複製RNA分子は、第2の自己複製RNA分子によってコードされる抗原とは異なるインフルエンザの株由来の抗原をコードする、方法。
【請求項２３】
インフルエンザ疾患を予防する方法において使用するための、第1の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第1の免疫原性組成物であって、前記方法が、第1の免疫原性組成物を必要とする対象に投与し、続いて、自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第2の免疫原性組成物を投与することを含み、第1及び第2の自己複製RNA分子が、各々、抗原を含むポリペプチドをコードし、抗原がインフルエンザウイルス由来であるが、第1の自己複製RNA分子によってコードされる抗原は、第2の自己複製RNA分子によってコードされる抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来である、第1の免疫原性組成物。
【請求項２４】
第1及び第2の免疫原性組成物が、同時に、実質的に同時に又は連続的に投与される、請求項23に記載の使用のための免疫原性組成物。
【請求項２５】
第1及び第2の免疫原性組成物が、10時間未満、1秒〜10時間、又は1秒〜1時間の間隔で連続的に投与される、請求項23に記載の使用のための免疫原性組成物。
【請求項２６】
(i)水中油型エマルジョンを提供する工程;(ii)自己複製RNA分子を含む水溶液を提供する工程;及び(iii)(ii)の水溶液及び(i)の水中油型エマルジョンを組み合わせて、それによって組成物を調製する工程を含む、請求項1〜13又は17のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を調製する方法。
【請求項２７】
(i)ナノ粒子を形成する少なくとも1つの脂質を提供する工程;(ii)自己複製RNA分子を含む水溶液を提供する工程;及び(iii)(ii)の水溶液及び(i)の少なくとも1つの脂質を組み合わせて、それによって組成物を調製する工程を含む、請求項1〜13又は17のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を調製する方法。
【請求項２８】
複数の自己複製RNA分子を含む免疫原性組成物であって、各自己複製RNA分子が、インフルエンザH3N2亜型の異なる株由来のHA抗原を含むポリペプチドをコードする、免疫原性組成物。
【請求項２９】
6つの自己複製RNA分子を含み、(i)第1の自己複製RNA分子が、A/ビルトホーフェン/16398/1968由来の第1の抗原を含むポリペプチドをコードし、(ii)第2の自己複製RNA分子が、A/バンコク/1/79由来の第2の抗原を含むポリペプチドをコードし、(iii)第3の自己複製RNA分子が、A/北京/32/92由来の第3の抗原を含むポリペプチドをコードし、(iv)第4の自己複製RNA分子が、A/福建省/411/2002由来の第4の抗原を含むポリペプチドをコードし、(v)第5の自己複製RNA分子が、A/ブリスベン/10/2007由来の第5の抗原を含むポリペプチドをコードし、及び(vi)第6の自己複製RNA分子が、A/テキサス/50/2012由来の第6の抗原を含むポリペプチドをコードする、請求項28に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
委託研究に関する声明
本発明は、DARPAより授与された契約番号HR0011-12-3-0001に基づく米国政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。本発明に至る作業はまた、REAグラント契約番号626283に基づき、欧州連合第7次枠組計画(FP7/2007-2013)のPeople Programme(Marie Curie Actions)からも資金提供を受けた。
【０００２】
本発明は、ウイルス感染を治療及び/又は予防する分野におけるものである。特に、本発明は、インフルエンザ感染を治療及び/又は予防するための、インフルエンザウイルス抗原をコードする自己複製RNA分子を含む免疫原性組成物又は医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザ(influenza)(インフルエンザ(flu))ウイルス感染は、世界中で毎年何千人もの死亡者を出す傾向にあり、数十億ドルもの経済的負担の原因となっている。ワクチンは疾患の予防及び制御のための主要なツールであるが、インフルエンザウイルスが頻繁に変化するため、ワクチンは毎年改良されなければならない。利用可能なインフルエンザワクチンは株特異的であり、ワクチン株ウイルスのみに対する防御を提供する。ウイルス表面タンパク質ヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)の頻繁な突然変異に起因する季節性抗原シフトは、前シーズンのワクチンを翌年にはほとんど効果がないものとする。さらに、抗原シフトによって引き起こされるインフルエンザのパンデミックの予測不可能性は、常にサーベイランスを行い、準備レベルを維持しようとする試みに多大な投資を必要とする。これらの限界を考慮すると、将来のパンデミック株を含む複数の株及び亜型に対して持続的な防御を提供する新規インフルエンザワクチンの開発が緊急に必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
弱毒生インフルエンザワクチン(LAIV)及び不活化インフルエンザワクチン(IIV)は、現在、全年齢層でワクチン接種に使用される。いずれのワクチンも、ヒト及び動物において相同免疫及び異種免疫を誘導することが判明している。しかしながら、アジュバント添加サブユニット又は分割ワクチンは、より多様なレパートリーを有する強いHA特異的CD4 T細胞応答及び高力価HA特異的抗体を誘導することが示されている(Dormitzer et al Immunol Rev 2011;239:167-77及びKhurana et al, Sci Transl Med 2011;3:85ra48. Doi:10.1126/scitranslmed.3002336)。これらのワクチンのための煩雑な製造プロセスは、卵における感染性ウイルスの大規模生産を含み、結果として、ワクチンウイルスの抗原ドメインが変化する。したがって、ワクチンウイルス及び得られたワクチンの有効性を変化させる可能性のある複雑な製造工程を回避し、インフルエンザウイルスの複数の株及び/又は亜型に対する防御を示すワクチンを提供するために、新たなアプローチを開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書において、第1の態様では、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、及び(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子を含む免疫原性組成物が提供され、第1及び第2の抗原はともにインフルエンザウイルス由来であるが、第1の抗原は、第2の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来である。
【０００６】
さらなる態様では、以下が提供される:
-  上記の免疫原性組成物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、
-  ワクチンとして使用するための上記の免疫原性組成物又は医薬組成物、
-  インフルエンザの予防に使用するための上記の免疫原性組成物又は医薬組成物、
-  インフルエンザ疾患を予防及び/又は治療する方法であって、上記の免疫原性組成物又は医薬組成物をそれを必要とするヒトに投与することを含む方法、
-  対象においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を誘導する方法であって、上記の医薬組成物又は免疫原性組成物の免疫学的に有効な量を対象に投与することを含む方法、
-  インフルエンザ疾患の予防及び/又は治療の方法であって、(i)第1の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第1の免疫原性組成物の投与、及び(ii)第2の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第2の免疫原性組成物の同時又は連続投与を含み、第1及び第2の自己複製RNA分子がインフルエンザウイルス由来の抗原をコードするポリペプチドをコードするが、第1の自己複製RNA分子は、第2の自己複製RNA分子によってコードされる抗原とは異なるインフルエンザの株由来の抗原をコードする、方法、
-  インフルエンザ疾患を予防する方法において使用するための、第1の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第1の免疫原性組成物であって、前記方法が、第1の免疫原性組成物を必要とする対象に投与し、続いて、自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第2の免疫原性組成物を投与することを含み、第1及び第2の自己複製RNA分子が、各々、抗原を含むポリペプチドをコードし、抗原はインフルエンザウイルス由来であるが、第1の自己複製RNA分子によってコードされる抗原は、第2の自己複製RNA分子によってコードされる抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来である、第1の免疫原性組成物、
-  上記の免疫原性組成物を調製する方法であって、(i)ナノ粒子を形成する少なくとも1種の脂質を提供する工程;(ii)自己複製RNA分子を含む水溶液を提供する工程;及び(iii)(ii)の水溶液及び(i)の少なくとも1種の脂質を組み合わせて、それによって組成物を調製する工程を含む方法、
-  上記の免疫原性組成物を調製する方法であって、(i)水中油型エマルジョンを提供する工程;(ii)自己複製RNA分子を含む水溶液を提供する工程;及び(iii)(ii)の水溶液及び(i)の水中油型エマルジョンを組み合わせて、それによって組成物を調製する工程を含む方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】バイシストロン性SAM(H5-H1)の模式図及び特徴付けを示す図である。(a)HA遺伝子の多重発現を試験するために用いられるバイシストロン性レプリコン構築物。(b)H1-SAM(レーン1)、H5-SAM(レーン3)、H5H1-SAM(レーン4)をトランスフェクトされた又は模擬処理(レーン3)されたBHK細胞におけるHAタンパク質発現。細胞溶解物を非還元性SDS-PAGEによって分析し、続いてHA株特異的血清:i)H1を検出するために使用される抗A/カリフォルニア/07/2009(H1N1)HA血清(NIBSC, London, UK); ii)H5を検出するために使用される抗A/シチメンチョウ/トルコ/1/05(H5N1)HA血清(NIBSC, London, UK)を用いてウエスタンブロット分析した。HAの単量体はアスタリスクで示す(62kDa)。SGP=サブゲノムプロモーター;H1=インフルエンザA/カリフォルニア/07/2009(H1N1)ウイルス株由来のH1 HA遺伝子; H5=A/シチメンチョウ/トルコ/01/2005(H5N1)ウイルス株由来のH5 HA遺伝子;2A=全長2A駆動配列;nsPs=非構造レプリコンタンパク質;HA*モノマー。
【図２−１】SAMモノシストロン性及びバイシストロン性SAM(HA)/LNP候補ワクチンの免疫原性を示す図である。マウス(n=10)は、0日目及び21日目に0.1μgのSAM(H1)、SAM(H5)、SAM(H5-H1)及びSAM(H1)+SAM(H5)を用いてi.m.で免疫化された。2回目の免疫化の2週間後に血清及び脾臓を回収した。血清試料は、A/カリフォルニア/07/2009(H1N1)、A/シチメンチョウ/トルコ/5/2005(H5N1)、A/PR/8/1934(H1N1)及びA/パース/16/2009(H3N2)特異的HI力価(a,b,c,d)について分析された。脾細胞(n=6)をin vitroでH1-Cal、H1-PR8及びH5-turkeyペプチドプール(e〜m)で刺激し、T細胞をフローサイトメトリーによってサイトカイン生成について分析した。バーは、サイトカインを発現するH1-Cal、H5-turkey、H1-PR8特異的CD4+ T細胞(e〜g)及びCD8+ T細胞(h〜j)の累積頻度を表す。CD8(k〜m)によるCD107a発現。統計解析はMann-Whitney U検定を用いて行われた。**P<0.01、****P<0.001。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３−１】多価SAM(HA)/LNP候補ワクチンの比較免疫原性を示す図である。マウス(n=10)は、0日目及び21日目にPBS [群1]並びにSAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj) [群2]; SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex) [群3]; SAM(H1-Cal)+SAM(H1-PR8)+SAM(H5-turkey)+SAM (H7-Shan) [群4]; SAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj)+SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex) [群5]及びSAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj)+SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex)+ SAM(H1-Cal)+SAM(H1-PR8)+SAM(H5-turkey)+SAM (H7-Shan) [群6]の組み合わせを用いてi.m.で免疫化された。血清試料は2回目の免疫化の2週間後に回収された。血清試料は、相同(a〜g)及び異種(h〜l)インフルエンザウイルス抗原を有するHA特異的HI力価について分析された。統計解析はMann-Whitney U検定を用いて行われた。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、ns;有意差なし。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４−１】多価SAM(HA)/LNP候補ワクチンによって誘導される比較CD4+ T細胞応答を示す図である。マウスは、0日目及び21日目にPBS [群1]並びにSAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj) [群2]; SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex) [群3]; SAM(H1-Cal)+SAM(H1-PR8)+SAM(H5-turkey)+SAM (H7-Shan) [群4]; SAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj)+SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex) [群5]及びSAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj)+SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex)+SAM(H1-Cal)+SAM(H1-PR8)+SAM(H5-turkey)+SAM (H7-Shan) [群6]の組み合わせを用いてi.m.で免疫化された。脾細胞(n=6)は、HAペプチドプール(d〜f及びi)及び組換えHAタンパク質(a〜c、g、h及びj〜l)でin vitroで刺激された。CD4+ T細胞媒介相同性(a〜f)及び異種性(g〜l)応答は、フローサイトメトリーによってサイトカイン生成について分析された。バーはサイトカインを生成するCD4+ T細胞の累積頻度を表す。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５】実施例5に使用される免疫化スケジュールを示す概略図である。
【図６】7562〜9256位にH5 HA A/シチメンチョウ/トルコの挿入物を含有するTC83ベクターのグラフマップを示す図である。
【図７】RNAの質及びHA H3遺伝子発現の確認を示す図である。(A)H3抗原をコードするSAMベクターを変性アガロースゲル上で分析した。(B)H3抗原をコードするSAMベクターを一時的にBHK細胞に感染させ、細胞溶解物をSDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)に供し、最後にニトロセルロース膜にブロットした。H3発現は、H3特異的ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットによって可視化された。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本研究では、完全合成の新規な自己増幅mRNA(SAM)ワクチン技術を適用することにより、多価ワクチン候補を開発し、Balb/cマウスモデルで免疫原性を試験した。H3N2、H1N1、H5N1及びH7N9亜型からの全長HAをモノシストロン形態又はバイシストロン形態のいずれかで発現する2つ以上のSAMベクターのカクテルを含むワクチンを作製し、脂質ナノ粒子(LNP)に封入した。マウスにおいて、SAM(H1)、SAM(H5)、SAM(H5-H1)又はSAM(H1)+SAM(H5)は、2回目の免疫化の3週間後にCD4+又はCD8+ T細胞媒介異種応答を誘導することが示された。しかしながら、モノシストロン性及びバイシストロン性SAMベクターのこの比較は、単一のSAMベクター中の2つの異なるインフルエンザ抗原の組み合わせが、モノシストロン性SAMベクターほど機能的な抗体応答を促進するのに効果的ではないことを示唆した。3、4、6又は10個のモノシストロン性SAM(HA)ベクターのカクテルを調製し、マウスにおいて検出可能な交差反応性B及びT細胞応答を誘導することができた。したがって、本発明者らは、相同及び異種インフルエンザウイルスに対してBalb/cマウスにおいて広範な防御免疫応答を誘導することができるSAM(HA)多価ワクチンを初めて示した。
【０００９】
自己複製RNA分子
本発明の免疫原性組成物は自己複製RNA分子を含み、各自己複製RNA分子は抗原を含むポリペプチドをコードする。
【００１０】
自己複製RNA分子は、当該技術分野において周知であり、例えばアルファウイルスに由来する複製エレメントを使用し、構造ウイルスタンパク質を目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列で置換することによって生成することができる。自己複製RNA分子は、典型的には、細胞への送達後に直接翻訳され得るプラス鎖分子であり、この翻訳は、RNA依存性RNAポリメラーゼを提供し、次に、送達されたRNAからアンチセンスとセンス転写物の両方を生成する。このようにして送達されたRNAは複数の娘RNAの生成をもたらす。これらの娘RNA、並びに直列に配置されたサブゲノム転写物は、コードされた抗原(すなわち、インフルエンザウイルス抗原)のin situ発現を提供するためにそれ自体翻訳され得るか、又は抗原のin situ発現を提供するために翻訳される送達されたRNAと同じセンスを有するさらなる転写物を提供するために転写され得る。この転写配列の全体的な結果は、導入されたレプリコンRNAの数の大きな増幅であり、したがって、コードされた抗原は、細胞の主要なポリペプチド産物となる。
【００１１】
このようにして自己複製を達成するのに適した系の1つは、アルファウイルスベースのレプリコンを使用することである。これらのレプリコンはプラス鎖(プラスセンス鎖)RNAであり、細胞への送達後にレプリカーゼ(又はレプリカーゼ-トランスクリプターゼ)の翻訳をもたらす。レプリカーゼはポリタンパク質として翻訳され、それが自己切断してプラス鎖送達RNAのゲノム鎖コピーを生成する複製複合体を提供する。これらのマイナス鎖の転写産物はそれ自体転写され、プラス鎖の親RNAのコピーをさらに生成し、抗原をコードするサブゲノム転写産物も生成する。したがって、サブゲノム転写物の翻訳は、感染細胞による抗原のin situ発現をもたらす。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどからのレプリカーゼを使用することができる。突然変異体又は野生型ウイルス配列を使用することができ、例えば、VEEVの弱毒化TC83突然変異体がレプリコンで使用されている。その内容が参照により組み込まれる以下の参考文献:国際公開第2005/113782号を参照されたい。
【００１２】
一実施形態では、本明細書に記載される各自己複製RNA分子は、(i)自己複製RNA分子からRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼ、及び(ii)インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードする。ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質nsP1、nsP2、nsP3及びnsP4のうちの1つ以上を含むアルファウイルスレプリカーゼであり得る。
【００１３】
天然アルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼポリタンパク質に加えて構造ビリオンタンパク質をコードするが、ある種の実施形態では、自己複製RNA分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしない。したがって、自己複製RNAは細胞内で自身のゲノムRNAコピーの生成をもたらすが、RNA含有ビリオンの生成をもたらさない。これらのビリオンを生成することができないということは、野生型アルファウイルスとは異なり、自己複製RNA分子が感染性の状態では持続することができないことを意味する。野生型ウイルスにおいて持続するのに必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本開示の自己複製RNAには存在せず、それらの代わりに、サブゲノム転写物が構造的アルファウイルスビリオンタンパク質よりもむしろ免疫原をコードするように、目的の免疫原をコードする遺伝子(複数可)によって行われる。
【００１４】
したがって、本発明で有用な自己複製RNA分子は、2つのオープンリーディングフレームを有することができる。第1の(5')オープンリーディングフレームはレプリカーゼをコードし;第2の(3')オープンリーディングフレームはインフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、RNAは、例えば、さらなる抗原をコードするため、又はアクセサリーポリペプチドをコードするために、追加の(例えば下流の)オープンリーディングフレームを有し得る。
【００１５】
ある種の実施形態では、本明細書に開示される自己複製RNA分子は、5'キャップ(例えば7-メチルグアノシン)を有する。このキャップはRNAのin vivo翻訳を増強することができる。一部の実施形態では、自己複製RNA分子の5'配列は、コードされたレプリカーゼとの適合性を確実にするために選択されなければならない。
【００１６】
自己複製RNA分子は3'ポリAテールを有することができる。それはまた、その3'末端近傍にポリAポリメラーゼ認識配列(例えばAAUAAA)を含み得る。
【００１７】
自己複製RNA分子は様々な長さを有し得るが、典型的には長さは5000〜25000ヌクレオチドである。自己複製RNA分子は、典型的には一本鎖である。一本鎖RNAは、一般的に、TLR7、TLR8、RNAヘリカーゼ及び/又はPKRに結合することによってアジュバント効果を開始することができる。二本鎖形態で送達されるRNA(dsRNA)はTLR3に結合することができ、この受容体は一本鎖RNAの複製中又は一本鎖RNAの二次構造内のいずれかで形成されるdsRNAによっても引き起こされる。
【００１８】
自己複製RNAは、in vitro転写(IVT)によって都合よく調製することができる。IVTは、細菌中でプラスミドの形態で作製及び増殖された(cDNA)鋳型を使用することができ、又は合成的に(例えば、遺伝子合成及び/又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)操作方法によって)作製することができる。例えば、DNA依存性RNAポリメラーゼ(例えば、バクテリオファージT7、T3又はSP6 RNAポリメラーゼ)を用いて、DNA鋳型から自己複製RNAを転写することができる。適切なキャッピング反応及びポリA付加反応を必要に応じて用いることができる(ただし、レプリコンのポリAは、通常、DNA鋳型内にコードされている)。これらのRNAポリメラーゼは、転写された5'ヌクレオチドに対してストリンジェントな要件を有することができ、一部の実施形態では、IVT転写されたRNAがその自己コード化レプリカーゼの基質として効率的に機能し得ることを確実にするために、これらの要件は、コードされたレプリカーゼの要件と一致しなければならない。
【００１９】
自己複製RNAは、(任意の5'キャップ構造に加えて)改変された核酸塩基を有する1つ以上のヌクレオチドを含むことができる。本発明で使用されるRNAは、理想的には、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合のみを含むが、一部の実施形態では、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、及び/又はメチルホスホネート結合を含有することができる。
【００２０】
自己複製RNA分子は、単一の異種ポリペプチド抗原(すなわち、インフルエンザウイルス由来の抗原)、又は場合により、配列の各々がアミノ酸配列として発現された場合にその同一性(例えば、直列に連結された)を保持するように互いに連結された2つ以上の異種ポリペプチド抗原をコードし得る。次に、自己複製RNAから生成された異種ポリペプチドは、融合ポリペプチドとして生成され得るか、又は別個のポリペプチド配列若しくはペプチド配列をもたらすように操作され得る。単一の異種ポリペプチド抗原をコードする自己複製RNA分子は、本明細書に記載されているように、「モノシストロン性」と呼ばれ得る。1を超える、例えば2つの別々の異種ポリペプチド抗原をコードする自己複製RNA分子は、それぞれ、「多シストロン性」又は「バイシストロン性」と呼ばれ得る。好ましくは、本発明に係る自己複製RNA分子はモノシストロン性である。
【００２１】
本明細書に記載される自己複製RNA分子は、2つ以上のオープンリーディングフレーム由来の複数のヌクレオチド配列を発現するように操作され得、それによって、免疫応答の生成を増強し得るサイトカイン又は他の免疫調節剤とともに、タンパク質、例えば1つ、2つ又はそれを超えるインフルエンザウイルス抗原の共発現を可能にする。あるいは又は加えて、インフルエンザウイルス抗原、例えばHA抗原は、各自己複製RNA分子中のインフルエンザウイルス由来の唯一の抗原である。
【００２２】
所望であれば、自己複製RNA分子をスクリーニング又は分析して、当業者に公知である種々のin vitro又はin vivo試験方法を用いて、それらの治療的及び予防的特性を確認することができる。例えば、自己複製RNA分子を含むワクチンは、目的とする特定のリンパ球タイプ、例えばB細胞、T細胞、T細胞系、及びT細胞クローンの増殖又はエフェクター機能の誘導におけるそれらの効果について試験することができる。例えば、免疫化されたマウス由来の脾臓細胞を単離することができ、細胞傷害性Tリンパ球が、インフルエンザウイルス由来の抗原をコードする自己複製RNA分子を含有する自己標的細胞を溶解する能力を有する。さらに、Tヘルパー細胞分化は、ELISAによりTH1(IL-2及びIFN-γ)及び/又はTH2(IL-4及びIL-5)サイトカインの増殖又は産生を測定するか又は細胞質サイトカイン染色及びフローサイトメトリーによりCD4+ T細胞において直接的に測定することにより分析することができる。
【００２３】
また、インフルエンザウイルス由来の抗原をコードする自己複製RNA分子は、例えば、目的とするインフルエンザウイルス抗原に特異的な抗体のB細胞産生の誘導によって証明されるように、体液性免疫応答を誘導する能力について試験することができる。これらのアッセイは、例えば、免疫化された個体由来の末梢Bリンパ球を用いて行うことができる。このようなアッセイ方法は当業者に公知である。自己複製RNA分子を特徴付けるために用いることができる他のアッセイは、標的細胞によるコードされたインフルエンザウイルス抗原の発現を検出することを伴うことができる。例えば、FACSを用いて、細胞表面上又は細胞内での抗原発現を検出することができる。FACS選択の別の利点は、異なる発現レベルに対して選別することができることであり、時にはより低い発現が望ましい場合がある。特定の抗原を発現する細胞を同定するための他の適切な方法は、プレート上のモノクローナル抗体を用いたパンニング、又はモノクローナル抗体で被覆された磁性ビーズを用いた捕捉を伴う。
【００２４】
一部の実施形態では、自己複製RNA分子は、(i)自己複製RNA分子からRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼ、及び(ii)インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードする配列を含む。ポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼであり得、例えば、アルファウイルスタンパク質nsP1、nsP2、nsP3及びnsP4のうちの1つ以上を含み得る。
【００２５】
ある種の実施形態では、本発明に係る免疫原性組成物は自己複製分子（複数）を含み、各自己複製RNA分子は、(i)自己複製RNA分子からRNAを転写することができるアルファウイルスレプリカーゼ、及び(ii)ヘマグルチニン(HA)又はその免疫原性断片若しくは変異体を含むポリペプチドをコードする配列を含む。好ましくは、HA又はその免疫原性断片若しくは変異体を含むポリペプチドは、自己複製RNA分子にコードされる唯一の異種ポリペプチドである。典型的には、HA又はその免疫原性断片若しくは変異体は、自己複製RNA分子のインフルエンザウイルス由来の唯一の抗原である。
【００２６】
例えば、自己複製RNA分子は、配列番号2のDNA配列、又は配列番号2と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%同一であるDNA配列によりコードされるRNA配列を含み得る。特定の実施形態では、自己複製RNA分子は、配列番号2と少なくとも90%同一のDNA配列によりコードされるRNA配列を含む。一部の実施形態では、自己複製RNA分子は、配列番号2の全長配列の断片によりコードされるRNA配列を含み、断片は、全長配列よりも最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、又は30核酸短い全長配列の核酸配列の連続したストレッチを含む。具体的な実施形態では、自己複製RNA分子は、配列番号2の断片によってコードされるRNA配列を含み、断片は、全長の核酸配列の連続したストレッチを含むが、全長配列よりも最大15個の核酸短い。
【００２７】
本明細書に開示される免疫原性組成物は、各々が配列番号2と少なくとも90%同一であるDNA配列によりコードされるRNA配列を含む自己複製分子を含み得、各自己複製RNA分子によりコードされるインフルエンザウイルス由来の抗原は、HA又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、HA又はその免疫原性断片若しくは変異体は、各自己複製RNA分子中のインフルエンザウイルス由来の唯一の抗原である。このような実施形態では、HAは、各自己複製RNA分子について、インフルエンザウイルスの同じ亜型(亜型内)由来、又はインフルエンザの異なる亜型(ヘテロ亜型)由来であり得る。
【００２８】
インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチド
本発明の自己複製RNA分子は、インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードする。ある種の実施形態では、コードされる抗原は、野生型インフルエンザウイルスポリペプチド配列であるか又はその断片若しくは変異体である。
【００２９】
ポリペプチド抗原配列の「変異体」は、参照配列と比較した場合、1つ以上のアミノ酸置換、挿入及び/又は欠失を有するアミノ酸配列を含む。変異体は、全長野生型ポリペプチド、例えば、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20又は22のいずれか1つに記載のポリペプチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含み得る。あるいは又はさらに、ポリペプチド抗原の断片は、全長ポリペプチドの連続アミノ酸配列と同一である少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、又はそれ以上のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含み得る、全長ポリペプチドの免疫原性断片(すなわち、エピトープ含有断片)を含み得る。
【００３０】
ポリペプチドの断片は、全長ポリペプチドと比較した場合、N末端及び/又はC末端欠失を含み得、断片は、全長配列のN末端、C末端、又はN末端とC末端の両方からの最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15又は20個のアミノ酸の欠失を含む。欠失が連続したアミノ酸であることを特定し得る。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「抗原」とは、宿主の免疫系を刺激して体液性及び/又は細胞性抗原特異的免疫応答(すなわち、抗原ポリペプチドを特異的に認識する免疫応答)を生じる、1つ以上のエピトープ(例えば、直鎖状、コンホメーション状又はその両方)を含む分子を指す。「エピトープ」とは、その免疫学的特異性を決定する抗原の部分である。
【００３２】
ヒトに感染するインフルエンザウイルスは、A型、B型、C型の3タイプに分類され得る。A型インフルエンザウイルスは、HA(18の亜型、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及びH18)とNAタンパク質(11の亜型、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10及びN11)に基づいて異なる亜型にさらに分類され得る。A型インフルエンザウイルスはさらに別の株に分けられ得る。B型インフルエンザウイルスは現在、異なるHA亜型を示さないが、B型インフルエンザウイルス株は2つの異なる系統に分けられる。これらの系統は1980年代後半に出現し、抗原的及び/又は遺伝的に互いに区別することができるHAを有する。現在循環しているB型インフルエンザウイルス株は、B/ビクトリア又はB/ヤマガタの2つの系統のうちの1つに属している。インフルエンザウイルスに関する国際的に受け入れられた命名規則は、1979年にWHOにより認定され、1980年2月にBulletin of the World Health Organization, 58(4):585-591(1980) (“A revision of the system of nomenclature for influenza viruses: A WHO memorandum”)に発表された。このアプローチでは、抗原型(A、B又はC)、地理的起源、分離年及び株数を含む命名システムのいくつかの構成要素を用いる。現在、A型(H1N1型)、A型(H3N2型)及び1〜2個のB型株が各年のインフルエンザワクチンに含まれる。
【００３３】
本発明の意味において、「インフルエンザ亜型」という用語は、所定のH亜型又は所定のN亜型を有するA型インフルエンザウイルス株として理解されるべきであり、「異なる亜型」という用語は、同一のH亜型又は同一のN亜型を共有しないインフルエンザウイルス株を指す。「亜型内の」とは、同一のインフルエンザ亜型内の株、例えば、H1、H2、H3などのHA亜型の株を指す。「異種亜型の」とは、異なるインフルエンザ亜型由来の株、例えば、H1亜型由来の株対H3亜型由来の株を指す。
【００３４】
A型インフルエンザウイルスは進化し、抗原の変動性を連続的に受ける。ウイルスRNAポリメラーゼによる効果的な校正の欠如は、表面糖タンパク質、例えばHA及びNAタンパク質のアミノ酸置換をもたらす可能性のある高率の転写エラーに導く。これは「抗原ドリフト」と呼ばれる。セグメント化されたウイルスゲノムは、第2のタイプの抗原変動を可能にする。2つのインフルエンザウイルスが同時に宿主細胞に感染した場合、「抗原ドリフト」と呼ばれる遺伝子再集合が、新しい表面あるいは内部タンパク質を有する新しいウイルスを生じさせることがある。これらの抗原変化は、「ドリフト」と「シフト」の両方とも予測不可能であり、免疫学的観点から劇的な影響を与える可能性があり、これは、それらが、最終的には、新しいインフルエンザウイルス株の出現をもたらし、ウイルスが免疫系から逃れることを可能にし、周知のほぼ毎年の流行を引き起こすためである。これらの遺伝子改変はいずれも、ヒトにおけるパンデミックの原因となる新たなウイルス変異体を引き起こしている。
【００３５】
本発明の自己複製RNA分子は、インフルエンザウイルスの任意のタイプ(A型、B型、C型)及び任意の亜型(H1〜H18及びN1〜N11)からのインフルエンザ抗原、又はその免疫原性断片若しくは変異体をコードし得る。例として、本明細書に記載される自己複製RNA分子は、インフルエンザウイルス由来の抗原をコードするポリペプチドをコードすることができ、インフルエンザウイルス由来の抗原は、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20若しくは22のいずれか1つのポリペプチド配列、又はその免疫原性断片若しくは変異体を含む。具体的な実施形態では、インフルエンザウイルス由来の抗原は、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20又は22のいずれか1つの配列を含む。あるいは、インフルエンザウイルス由来の抗原は、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20又は22のいずれか1つの配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する変異体を含み、又はそれらからなる。あるいは又はさらに、インフルエンザウイルス由来の抗原は、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20又は22のいずれか1つの全長配列のN末端、C末端、又はその両方から最大20個のアミノ酸の欠失を含む免疫原性断片を含むか又はそれからなる。
【００３６】
好適には、本発明に係る自己複製RNA分子によってコードされるインフルエンザウイルス抗原は、パンデミック株由来である。パンデミック株とは、ヒト集団の大多数が免疫を持たない新しいインフルエンザウイルスを意味する。本明細書を通じて、「パンデミック株」とは、パンデミック・インフルエンザ疾患のアウトブレイクと関連するか又は関連する可能性のあるインフルエンザウイルス株、例えばパンデミック・インフルエンザA型ウイルス株を指す。パンデミック・アウトブレイクに関連する可能性のあるA株は、ヒトに感染した株(例えば動物のインフルエンザウイルス株)であって、ヒトに循環するインフルエンザの季節性株ではない株(例えばインフルエンザA(H1N1)若しくはA(H3N2)の株ではなく、又はビクトリア若しくはヤマガタの系統のB株ではない)を含み得る。パンデミック・アウトブレイクに関連するパンデミック株又はパンデミックに関連する可能性があるパンデミック株は、当業者には公知であり、国際的に認定された基準(“Pandemic influenza preparedness and response” A WHO Guidance document, 2009, IBSN 9789241547680を参照されたい)に従ってWHOによって同定される。
【００３７】
好適なパンデミック株は、H1、H2、H5、H6、H7又はH9亜型インフルエンザAウイルス株、例えばH5N1、H5N3、H2N2、H6N1、H9N2、H7N7、H2N2、H7N1、H7N9及びH1N1である。H5亜型内では、ウイルスは異なるクレードに分類される。ヒトにおける他の適切なパンデミック株は、H7N3、H10N7及びH5N2である。あるいは、インフルエンザウイルス抗原は、循環する季節性株、すなわち、非パンデミック株からであり得る。
【００３８】
ある種の実施形態では、インフルエンザウイルス由来の抗原は、ヘマグルチニン(HA)若しくはノイラミニダーゼ(NA)、又は任意の他の抗原、例えば、マトリックスタンパク質2(M2)、マトリックスタンパク質1(M1)、核タンパク質(NP)、PB1若しくはPB2又はその免疫原性断片若しくは変異体である。好ましくは、抗原は、HA又はその免疫原性断片若しくは変異体である。
【００３９】
本発明においてポリペプチドは、インフルエンザウイルス由来の抗原に加えて、1つ以上の異種アミノ酸配列(例えば、別の抗原配列、別のシグナル配列、検出可能なタグなど)を含み得る。例えば、本明細書におけるポリペプチドは融合タンパク質であり得る。
【００４０】
核酸及びその調製物
本明細書には、インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子、例えばDNA又はRNAが開示される。本発明に係る免疫原性組成物において、自己複製RNA分子はRNA形態のこのような配列を含む。また、本明細書には、インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードする異種配列の有無にかかわらず、自己複製RNA分子の形態である核酸が開示される。
【００４１】
核酸は、多くの方法、例えば、全部又は一部の化学合成による、ヌクレアーゼ(例えば、制限酵素)を用いたより長い核酸の消化による、より短い核酸又はヌクレオチドの連結(例えば、リガーゼ又はポリメラーゼを用いる)による方法、ゲノム又はcDNAライブラリーなどから調製され得る。例えば、インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードするcDNA鋳型を調製することができる。このようなcDNA鋳型は、細菌においてプラスミド形態で作製及び増幅され得、又は合成的に作製され得る(例えば、遺伝子合成及び/又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)操作方法による)。本発明のポリペプチドをコードするRNA配列は、例えば、cDNA鋳型からRNAを転写するためにDNA依存性RNAポリメラーゼ(例えば、バクテリオファージT7、T3又はSP6 RNAポリメラーゼ)を用いることができるin vitro転写(IVT)によって調製することができる。
【００４２】
用語「核酸」は、一般的に、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び/又はそれらの類似体を含有する、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味する。これにはDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドが含まれる。また、それには、DNA又はRNA類似体、例えば、改変された骨格(例えば、ペプチド核酸(PNA)又はホスホロチオエート)又は改変された塩基を含有するものが含まれる。したがって、本開示の核酸は、mRNA、自己複製RNA、DNA、cDNA、組換え核酸、分岐核酸、プラスミド、ベクターなどを含む。核酸がRNAの形態をとる場合、それは5'キャップを有してもよいし又は有しなくてもよい。
【００４３】
本明細書における核酸は、インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードする配列を含む。典型的には、本発明の核酸は、組換え形態、すなわち、天然に存在しない形態である。例えば、核酸は、インフルエンザウイルス由来の抗原をコードする配列に加えて、1つ以上の異種核酸配列(例えば、別の抗原をコードする配列及び/又は制御配列、例えばプロモーター若しくは内部リボソーム侵入部位)を含み得る。核酸は、ベクターの一部、すなわち、1つ以上の細胞型の形質導入/トランスフェクションのために設計された核酸構築物の一部であり得る。ベクターは、例えば、宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現のために設計された「発現ベクター」、又は組換えウイルス若しくはウイルス様粒子の生成をもたらすように設計された「ウイルスベクター」であり得る。
【００４４】
上記のポリペプチドをコードする核酸は、コドンを最適化することができる。「最適化されたコドン」は、核酸の翻訳効率及び/又は半減期を増加させることができるコドン使用に関して改変が意図される。ポリAテール(例えば、約30個のアデノシン残基又はそれ以上)をRNAの3'末端に結合させて、その半減期を増加させることができる。RNAの5'末端は、m7G(5')ppp(5')Nの構造(キャップ0構造)を有する改変されたリボヌクレオチド又はその誘導体でキャップされ得、これらは、RNA合成中に取り込まれ得るか又はRNA転写後に酵素的に操作され得る(例えば、N7-モノメチル化キャップ0構造の構築を触媒するmRNAトリホスファターゼ、グアニル酸転移酵素及びグアニン-7-メチルトランスフェラーゼからなるワクシニアウイルスキャッピング酵素(VCE)を用いることによる)。キャップ0構造は、RNA分子の安定性及び翻訳効率を維持する上で重要な役割を果たす。RNA分子の5'キャップは、さらに2'-O-メチルトランスフェラーゼにより改変され得、これは、キャップ1構造(m7Gppp[m2'-O]N)の生成をもたらし得、これは翻訳効率をさらに増加させ得る。
【００４５】
核酸は、1つ以上のヌクレオチド類似体又は改変ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド類似体」又は「改変されたヌクレオチド」とは、ヌクレオシド(例えば、シトシン(C)、チミン(T)又はウラシル(U))、アデニン(A)又はグアニン(G))の窒素含有塩基内又はその上に1つ以上の化学改変(例えば置換)を含むヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオシドの糖部分(例えば、リボース、デオキシリボース、改変されたリボース、改変されたデオキシリボース、6員糖類似体、又は開鎖糖類似体)又はリン酸の中又はその上にさらなる化学改変を含有することができる。ヌクレオチド及び改変ヌクレオチド及びヌクレオシドの調製は、当該技術分野において周知であり、以下の参考文献:米国特許第4,373,071号、同第4,458,066号、同第4,500,707号、同第4,668,777号、同第4,973,679号、同第5,047,524号、同第5,132,418号、同第5,153,319号、同第5,262,530号、同第5,700,642号を参照されたい。多くの改変されたヌクレオシド及び改変されたヌクレオチドが市販されている。
【００４６】
改変されたヌクレオシド及びヌクレオチドに組み込むことができ、RNA分子に存在し得る改変された核酸塩基としては、以下が挙げられる:m5C(5-メチルシチジン)、m5U(5-メチルウリジン)、m6A(N6-メチルアデノシン)、s2U(2-チオウリジン)、Um(2'-O-メチルウリジン)、mlA(l-メチルアデノシン); m2A(2-メチルアデノシン); Am(2-1-O-メチルアデノシン); ms2m6A(2-メチルチオ-N6-メチルアデノシン); i6A(N6-イソペンテニルアデノシン); ms2i6A(2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン); io6A(N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン); ms2io6A(2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン); g6A(N6-グリシニルカルバモイルアデノシン); t6A(N6-スレオニルカルバモイルアデノシン); ms2t6A(2-メチルチオ-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン); m6t6A(N6-メチル-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン); hn6A(N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン); ms2hn6A(2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン); Ar(p)(2'-O-リボシルアデノシン(リン酸)); I(イノシン); miI(1-メチルイノシン); m'Im(1, 2'-O-ジメチルイノシン); m3C(3-メチルシチジン); Cm(2T-O-メチルシチジン); s2C(2-チオシチジン); ac4C(N4-アセチルシチジン); 5FC(5-ホルミルシチジン(fonnylcytidine)); m5Cm(5,2-O-ジメチルシチジン); ac4Cm(N4アセチル2TOメチルシチジン); k2C(リシジン); mIG(1-メチルグアノシン); m2G(N2-メチルグアノシン); m7G(7-メチルグアノシン); Gm(2'-O-メチルグアノシン); m22G(N2,N2-ジメチルグアノシン); m2Gm(N2,2'-O-ジメチルグアノシン); m22Gm(N2,N2,2'-O-トリメチルグアノシン); Gr(p)(2'-O-リボシルグアノシン(リン酸)); yW(ワイブトシン); o2yW(ペルオキシワイブトシン); OHyW(ヒドロキシワイブトシン); OHyW*(過少改変ヒドロキシワイブトシン); imG(ワイオシン); mimG(メチルグアノシン); Q(キューオシン); oQ(エポキシキューオシン); galQ(ガルタクトシルキューオシン); manQ(マンノシル-キューオシン); preQo(7-シアノ-7-デアザグアノシン); preQi(7-アミノメチル-7-デアザグアノシン); G*(アルカエオシン); D(ジヒドロウリジン); m5Um(5,2'-O-ジメチルウリジン); s4U(4-チオウリジン); m5s2U(5-メチル-2-チオウリジン); s2Um(2-チオ-2'-O-メチルウリジン); acp3U(3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン); ho5U(5-ヒドロキシウリジン); mo5U(5-メトキシウリジン); cmo5U(ウリジン5-オキシ酢酸); mcmo5U(ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル); chm5U(5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン)); mchm5U(5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル); mcm5U(5-メトキシカルボニルメチルウリジン); mcm5Um(S-メトキシカルボニルメチル-2-O-メチルウリジン); mcm5s2U(5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン); nm5s2U(5-アミノメチル-2-チオウリジン); mnm5U(5-メチルアミノメチルウリジン); mnm5s2U(5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン); mnm5se2U(5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン); ncm5U(5-カルバモイルメチルウリジン); ncm5Um(5-カルバモイルメチル-2'-O-メチルウリジン); cmnm5U(5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン); cnmm5Um(5-カルボキシメチル1アミノメチル-2-L-Oメチルウリジン); cmnm5s2U(5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン); m62A(N6,N6-ジメチルアデノシン); Tm(2'-O-メチルイノシン); m4C(N4-メチルシチジン); m4Cm(N4,2-O-ジメチルシチジン); hm5C(5-ヒドロキシメチルシチジン); m3U(3-メチルウリジン); cm5U(5-カルボキシメチルウリジン); m6Am(N6,T-O-ジメチルアデノシン); rn62Am(N6,N6,O-2-トリメチルアデノシン); m2'7G(N2,7-ジメチルグアノシン); m2'2'7G(N2,N2,7-トリメチルグアノシン); m3Um(3,2T-O-ジメチルウリジン); m5D(5-メチルジヒドロウリジン); F5Cm(5-ホルミル-2'-O-メチルシチジン); mlGm(1,2'-0-ジメチルグアノシン); m'Am(1,2-O-ジメチルアデノシン)イリノメチルウリジン); tm5s2U(S-タウリノメチル-2-チオウリジン)); iniG-14(4-デメチルグアノシン); imG2(イソグアノシン);ac6A(N6-アセチルアデノシン); ヒポキサンチン; イノシン; 8-オキソ-アデニン、その7-置換誘導体; ジヒドロウラシル; シュードウラシル; 2-チオウラシル; 4-チオウラシル; 5-アミノウラシル; 5-(Ci〜Ce)-アルキルウラシル; 5-メチルウラシル; 5-(C2〜C6)-アルケニルウラシル; 5-(C2〜Ce)-アルキニルウラシル; 5-(ヒドロキシメチル)ウラシル; 5-クロロウラシル; 5-フルオロウラシル; 5-ブロモウラシル; 5-ヒドロキシシトシン;5-(Ci〜C6)-アルキルシトシン; 5-メチルシトシン; 5-(C2〜C6)-アルケニルシトシン; 5-(C2〜C6)-アルキニルシトシン; 5-クロロシトシン; 5-フルオロシトシン; 5-ブロモシトシン; N2-ジメチルグアニン; 7-デアザグアニン; 8-アザグアニン; 7-デアザ-7-置換グアニン; 7-デアザ-7(C2〜C6)アルキニルグアニン; 7-デアザ-8-置換グアニン; 8-ヒドロキシグアニン; 6-チオグアニン; 8-オキソグアニン; 2-アミノプリン; 2-アミノ-6-クロロプリン; 2,4-ジアミノプリン; 2,6-ジアミノプリン; 8-アザプリン; 置換7-デアザプリン; 7-デアザ-7-置換プリン; 7-デアザ-8-置換プリン; 水素(脱塩基残基); m5C; m5U; m6A; s2U; W; 又は2'-O-メチル-U。これらの改変された核酸塩基及びそれらの対応するリボヌクレオシドの多くは商業的供給源から入手可能である。
【００４７】
免疫原性及び医薬組成物
本発明に係る免疫原性組成物は、インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードする自己複製RNA分子を含む。このような組成物は、ワクチン、特にRNAベースのワクチンであり得る。
【００４８】
本発明に係る免疫原性組成物は、第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、及び第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子を含む。ある種の実施形態では、本発明に係る免疫原性組成物は、さらなる自己複製分子、例えば3、4、5、6、7、8、9又は10個の自己複製RNA分子を含むか又は含有する。特に、免疫原性組成物は、インフルエンザウイルス由来の第3の抗原を含むポリペプチドをコードする第3の自己複製RNA分子、及び場合によりインフルエンザウイルス由来の第4の抗原を含むポリペプチドをコードする第4の自己複製RNA分子を含み得る。なおさらなる自己複製RNA分子は、例えば、以下の本発明の免疫原性組成物に存在し得る:
−インフルエンザウイルス由来の第5の抗原を含むポリペプチドをコードする第5の自己複製RNA分子、及び場合により
−インフルエンザウイルス由来の第6の抗原を含むポリペプチドをコードする第6の自己複製RNA分子、及び場合により
−インフルエンザウイルス由来の第7の抗原を含むポリペプチドをコードする第7の自己複製RNA分子、及び場合により
−インフルエンザウイルス由来の第8の抗原を含むポリペプチドをコードする第8の自己複製RNA分子、及び場合により
−インフルエンザウイルス由来の第9の抗原を含むポリペプチドをコードする第9の自己複製RNA分子、及び場合により
−インフルエンザウイルス由来の第10の抗原を含むポリペプチドをコードする第10の自己複製RNA分子。
【００４９】
これらの実施形態では、インフルエンザウイルス由来の第1、第2、第3及び/又は場合により後続する抗原は、すべてインフルエンザウイルスの異なる株由来である。一部の実施形態では、各自己複製RNA分子の抗原は、残りの抗原/複数の抗原(例えば、HA; H1、H2、H3、H5、H7、H9など)と比較して、インフルエンザウイルスの異なる亜型に由来し得る。ある種の実施形態では、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の自己複製分子を有する免疫原性組成物は、これらの自己複製RNA分子のみを含有する。
【００５０】
典型的には、免疫原性組成物は、最大10個の自己複製RNA分子、例えば、2〜10個の自己複製RNA分子、2〜8個の自己複製RNA分子、3〜7個の自己複製分子、3〜6個の自己複製RNA分子又は4〜6個の自己複製RNA分子を含むか又は含有し、各自己複製RNA分子は、インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードし、各抗原は、異なるインフルエンザウイルス株由来である。特定の実施形態では、本発明に係る免疫原性組成物は、3〜10個の自己複製RNA分子を含有する。
【００５１】
一実施形態では、本発明の免疫原性組成物の第1の抗原及び/又は第2の抗原及び/又は場合により後続の抗原は、ヘマグルチニン(HA)である。典型的には、HA抗原は、過去若しくは現在の季節性又はパンデミック株のインフルエンザウイルスに由来し得る。例えば、HAは、H1型若しくはH3型の季節性株、又はH1型、H2型、H5型、H6型、H7型、H9型若しくはH10型、例えばH5型若しくはH7型のパンデミック株から選択され得る。一実施形態では、ヘマグルチニンは、免疫原性組成物のインフルエンザウイルス由来の唯一の抗原である。
【００５２】
ある種の実施形態では、免疫原性組成物は、インフルエンザウイルスH1由来のHAである第1及び/又は第2の抗原を含む。他の実施形態では、免疫原性組成物は、インフルエンザウイルスH3由来のHAである第1及び/又は第2の抗原を含む。さらなる実施形態では、第1の抗原はインフルエンザウイルスH1由来であり、第2の抗原はインフルエンザウイルスH3由来である。特に、H1インフルエンザウイルス株はA/H1N1由来であり得、H3インフルエンザウイルス株はA/H3N2株であり得る。
【００５３】
インフルエンザウイルス由来の抗原の他の組み合わせが考えられる。例えば、2つの自己複製分子を含む本発明に係る免疫原性組成物について、第1及び第2の抗原は、それぞれ、以下のヘマグルチニン株タイプ: H1+H1、H3+H3、H1+H3、H5+H7、H5+H5又はH7+H7に由来するHAであり得る。3つの自己複製分子を含む本発明に係る免疫原性組成物について、第1、第2及び第3の抗原は、それぞれ、以下のヘマグルチニン株タイプ: H1+H1+H1、H1+H1+H3、H1+H3+H3、H3+H3+H3、H1+H3+H5、H3+H3+H5、H3+H3+H7又はH1+H5+H7に由来し得る。4つの自己複製分子を含む本発明に係る免疫原性組成物について、第1、第2、第3及びさらなる抗原は、それぞれ、以下の株タイプ: H1+H1+H3+H3、H1+H3+H3+H3、H1+H3+H3+H5、H1+H3+H5+H7又はH3+H3+H3+H3+H3に由来し得る。
【００５４】
2個、3個又は4個の自己複製分子を含むこれらの実施形態のいずれにおいても、HA抗原はA/H1N1株に由来し得る。さらに、HA抗原はA/H3N2株に由来し得る。
【００５５】
したがって、一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、及び(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子を含み、
-  第1と第2の抗原はともにインフルエンザウイルス由来であるが、第1の抗原は第2の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来であり、
-  第1及び第2の抗原は、ヘマグルチニン又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、
-  第1及び第2の抗原は、異なる地理的起源及び/又は分離年を有するインフルエンザウイルスの株に由来する。
【００５６】
さらなる実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、及び(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子を含み、
-  第1と第2の抗原はともにインフルエンザウイルス由来であるが、第1の抗原は第2の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来であり、
-  第1及び第2の抗原は、ヘマグルチニン又はその免疫原性断片又は変異体であり、
-  第1及び第2の抗原は、異なるヘマグルチニン亜型を有するインフルエンザウイルスに由来する。
【００５７】
さらなる実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、及び(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子を含み、
-  第1と第2の抗原はともにインフルエンザウイルス由来であるが、第1の抗原は第2の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来であり、
-  第1及び第2の抗原は、ヘマグルチニン又はその免疫原性断片又は変異体であり、並びに
-  第1の抗原は季節性インフルエンザウイルス(例えば、H1N1、H3N2、B/ビクトリア又はB/ヤマガタ株)由来であり、第2の抗原はパンデミック・インフルエンザウイルス株由来である。
【００５８】
さらなる実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子、及び(iii)第3の抗原を含むポリペプチドをコードする第3の自己複製RNA分子を含み:
-  第1、第2及び第3の抗原はいずれもインフルエンザウイルス由来であるが、第1、第2及び第3の抗原はすべてインフルエンザウイルスの異なる株に由来し、
-  第1、第2及び第3の抗原はヘマグルチニン又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、並びに
-  第1、第2及び第3の抗原はすべて同じヘマグルチニン亜型のインフルエンザウイルス由来であるが、地理的起源及び/又は分離年が異なるウイルス由来である。
【００５９】
さらなる実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子、及び(iii)第3の抗原を含むポリペプチドをコードする第3の自己複製RNA分子を含み、
-  第1、第2及び第3の抗原はいずれもインフルエンザウイルス由来であるが、第1、第2及び第3の抗原はすべてインフルエンザウイルスの異なる株に由来し、
-  第1、第2及び第3の抗原はヘマグルチニン又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、並びに
-  第1及び第2の抗原は過去又は現在の季節性インフルエンザウイルス由来であり、第3の抗原はパンデミック・インフルエンザウイルス由来である。
【００６０】
一実施形態では、免疫原性組成物は、複数の自己複製RNA分子を含み得、各自己複製RNA分子は、インフルエンザウイルスH3由来のHA抗原を含むポリペプチドをコードする。例えば、組成物は、インフルエンザウイルスH3由来のHA抗原を含むポリペプチドをコードする2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の自己複製RNA分子を含み得る。
【００６１】
一部のこのような実施形態では、HA抗原は、インフルエンザH3N2亜型の株から選択される。例えば、一実施形態では、HA抗原は、インフルエンザH3N2亜型の潜在的なパンデミック株及び季節性株から選択される。H3N2亜型のこれらの株は、以下の基準:1)主要なグリコシル化部位、2)重要な季節性及びパンデミックワクチン株、並びに3)細胞適応株のみに基づいて選択することができる。
【００６２】
一実施形態では、免疫原性組成物は、複数の自己複製RNA分子を含み、各自己複製RNA分子は、H3N2インフルエンザウイルスの異なる株由来のHA抗原を含むポリペプチドをコードする。
【００６３】
一実施形態では、免疫原性組成物は3つの自己複製RNA分子を含み、(i)第1の自己複製RNA分子は、A/ビルトホーフェン/16398/1968(EPI362379)由来の第1の抗原を含むポリペプチドをコードし、(ii)第2の自己複製RNA分子は、A/バンコク/1/79(EPI367158)由来の第2の抗原を含むポリペプチドをコードし、(iii)第3の自己複製RNA分子は、A/福建省/411/2002(EPI362915)由来の第3の抗原を含むポリペプチドをコードする。
【００６４】
別の実施形態では、免疫原性組成物は3つの自己複製RNA分子を含み、(i)第1の自己複製RNA分子は、A/北京/32/92(EPI365898)由来の第1の抗原を含むポリペプチドをコードし、(ii)第2の自己複製RNA分子は、A/ブリスベン/10/2007(EPI362338)由来の第2の抗原を含むポリペプチドをコードし、及び(iii)第3の自己複製RNA分子は、A/テキサス/50/2012(EPI398417)由来の第3の抗原を含むポリペプチドをコードする。
【００６５】
1つの好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、6つの自己複製RNA分子を含み、(i)第1の自己複製RNA分子は、A/ビルトホーフェン/16398/1968(EPI362379)由来の第1の抗原を含むポリペプチドをコードし、(ii)第2の自己複製RNA分子は、A/バンコク/1/79 (EPI367158)由来の第2の抗原を含むポリペプチドをコードし、(iii)第3の自己複製RNA分子は、A/北京/32/92 (EPI365898)由来の第3の抗原を含むポリペプチドをコードし、(iv)第4の自己複製RNA分子は、A/福建省/411/2002 (EPI362915)由来の第4の抗原を含むポリペプチドをコードし、(v)第5の自己複製RNA分子は、A/ブリスベン/10/2007(EPI362338)由来の第5の抗原を含むポリペプチドをコードし、並びに(vi)第6の自己複製RNA分子は、A/テキサス/50/2012(EPI398417)由来の第6の抗原を含むポリペプチドをコードする。インフルエンザHAタンパク質をコードする全長遺伝子の配列情報は、Global Initiative on Sharing All Influenza Data Epiflu database (www.gisaid.org)から入手された。
【００６６】
これらの実施形態のすべての免疫原性組成物はまた、1つ以上のさらなる自己複製RNA分子を含み得、1つ以上のさらなる自己複製RNA分子は、インフルエンザウイルスH1、H5及び/又はH7由来のHA抗原を含むポリペプチドをコードする。このような実施形態では、自己複製RNA分子は、2つの異なるインフルエンザH1ウイルス由来のHA抗原を含むポリペプチドをコードし得る。さらに、自己複製RNA分子は、インフルエンザ亜型H5由来のHA抗原を含むポリペプチドをコードし得る。自己複製RNA分子はまた、インフルエンザ亜型H7由来のHA抗原を含むポリペプチドをコードし得る。
【００６７】
一実施形態では、免疫原性組成物は、10個の自己複製RNA分子を含み、(i)第1の自己複製RNA分子は、A/ビルトホーフェン/16398/1968(EPI362379)由来の第1の抗原を含むポリペプチドをコードし、(ii)第2の自己複製RNA分子は、A/バンコク/1/79(EPI367158)由来の第2の抗原を含むポリペプチドをコードし、(iii)第3の自己複製RNA分子は、A/北京/32/92 (EPI365898)由来の第3の抗原を含むポリペプチドをコードし、(iv)第4の自己複製RNA分子は、A/福建省/411/2002 (EPI362915)由来の第4の抗原を含むポリペプチドをコードし、(v)第5の自己複製RNA分子は、A/ブリスベン/10/2007(EPI362338)由来の第5の抗原を含むポリペプチドをコードし、(vi)第6の自己複製RNA分子は、A/テキサス/50/2012(EPI398417)由来の第6の抗原を含むポリペプチドをコードし、(vii)第7の自己複製RNA分子は、A/カリフォルニア/07/2009 (H1N1)由来の第7の抗原を含むポリペプチドをコードし、(viii)第8の自己複製RNA分子は、A/PR/8/1934(H1N1)由来の第8の抗原を含むポリペプチドをコードし、(ix)第9の自己複製RNA分子は、A/シチメンチョウ/トルコ/5/2005(H5N1)由来の第9の抗原を含むポリペプチドをコードし、及び(x)第10の自己複製RNA分子は、A/上海/1/3013(H7N9)由来の第10の抗原を含むポリペプチドをコードする。
【００６８】
免疫原性組成物は、ウイルス又は非ウイルス送達系を含み得る。送達系(本明細書では送達ビヒクルとも呼ばれる)は、インフルエンザウイルス由来のコードされた抗原の免疫原性を増強するアジュバント効果を有し得る。例えば、自己複製RNA分子は、リポソーム、非毒性生分解性ポリマー微粒子若しくはウイルスレプリコン粒子(VRP)に封入されるか又はカチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合化され得る。一部の実施形態では、核酸ベースのワクチンは、カチオン性ナノエマルジョン(CNE)送達系又は脂質ナノ粒子(LNP)送達系を含む。一部の実施形態では、核酸ベースのワクチンは非ウイルス送達系を含む。すなわち、核酸ベースのワクチンはウイルスカプシドを実質的に含まない。あるいは、核酸ベースのワクチンはウイルスレプリコン粒子を含み得る。他の実施形態では、核酸ベースのワクチンは裸の核酸、例えば裸のRNA(例えばmRNA)を含み得るが、CNE又はLNPを介した送達が好ましい。
【００６９】
ある種の実施形態では、核酸ベースのワクチンはカチオン性ナノエマルジョン(CNE)送達系を含む。CNE送達系及びそれらの調製方法は、以下の参考文献: 国際公開第2012/006380号に記載されている。CNE送達系では、抗原をコードする核酸分子(例えばRNA)は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成する。カチオン性水中油型エマルジョンを使用して、負に荷電した分子、例えばRNA分子を細胞に送達することができる。エマルジョン粒子は油性コア及びカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、負に帯電した分子と相互作用することができ、それによって分子をエマルジョン粒子に固定する。有用なCNEのさらなる詳細は、以下の参考文献: 国際公開第2012/006380号; 国際公開第2013/006834号;及び国際公開第2013/006837号(それぞれの内容はそれらの全体が本明細書に組み込まれる)に見出すことができる。
【００７０】
したがって、ある種の実施形態では、本発明に係る免疫原性組成物において、インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードする自己複製RNA分子は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合化される。粒子は、典型的には、25℃で液相にある油性コア(例えば植物油又はスクアレン)、カチオン性脂質(例えばリン脂質)、及び場合により界面活性剤(例えばソルビタントリオレエート、ポリソルベート80)を含み;ポリエチレングリコールも含まれ得る。一部の実施形態では、CNEは、スクアレン及びカチオン性脂質、例えば1,2-ジオレオイルオキシ-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)を含む。一部の好ましい実施形態では、送達系は、非ウイルス送達系、例えばCNEである。これは、体液性及び細胞性免疫応答の誘発に特に有効であり得る。利点としては、限定的な抗ベクター免疫応答の欠如、及びゲノム組込みのリスクの欠如もまた挙げられる。
【００７１】
一部の実施形態では、本発明に係る自己複製RNA分子は、サブミクロンのカチオン性水中油型エマルジョンと複合化することができる。一部の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、直径が約80nm〜180nm(又は代わりに、約80〜約150nm;約80〜130nm;又は約100nm)である平均粒径によって特徴付けられる。一部の実施形態では、RNA複合化前の上記エマルジョン中のDOTAPの濃度は、少なくとも約2.5mM、又は約2.5mM〜約8mMである。特定の実施形態では、上記エマルジョン中のDOTAPの濃度は約4mg/ml(5.73mM)である。油はスクアレン又はスクアランであり得る。
【００７２】
一部の実施形態では、本発明の免疫原性組成物において、自己複製RNA分子は、クエン酸緩衝液中のDOTAP、スクアレン、ソルビタントリオレエート及びポリソルベート80を含むカチオン性水中油型エマルジョンに複合化される。インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードするRNA分子の送達に適したカチオン性水中油型エマルジョンは、約2mg/ml〜7mg/mlのDOTAP;約3mg/ml〜6mg/mlのSpan(登録商標) 85;約3mg/ml〜6mg/mlのTween 80;及び約30mg/ml〜50mg/mlのスクアレンを含有し得る。ある種の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、RNAと複合化する前に、約4.3%w/vスクアレン、0.5% Tween 80、0.5% SPAN(登録商標)85、及び4mg/mL DOTAPを含有する。
【００７３】
したがって、一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、及び(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子を含み、
-  第1と第2の抗原はともにインフルエンザウイルスに由来するが、第1の抗原は第2の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来であり、
-  第1及び第2の抗原はヘマグルチニン又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、
-  自己複製RNA分子は脂質ナノ粒子(LNP)中に製剤化される。
【００７４】
したがって、一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、及び(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子を含み、
-  第1と第2の抗原はともにインフルエンザウイルスに由来するが、第1の抗原は第2の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来であり、
-  第1及び第2の抗原はヘマグルチニン又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、
-  自己複製RNA分子はカチオン性ナノエマルジョン(CNE)中に製剤化される。
【００７５】
したがって、一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、及び(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子を含み、
-  第1と第2の抗原はともにインフルエンザウイルスに由来するが、第1の抗原は第2の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来であり、
-  第1及び第2の抗原はヘマグルチニン又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、
-  自己複製RNA分子は脂質ナノ粒子(LNP)又はカチオン性ナノエマルジョン(CNE)中に製剤化され、並びに
-  インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードするとともに、各自己複製RNA分子は、自己複製RNA分子からRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼをコードする。
【００７６】
さらなる実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子、及び(iii)第3の抗原を含むポリペプチドをコードする第3の自己複製RNA分子を含み、
-  第1、第2及び第3の抗原はいずれもインフルエンザウイルスに由来するが、第1、第2及び第3の抗原はすべてインフルエンザウイルスの異なる株に由来し、
-  第1、第2及び第3の抗原はヘマグルチニン又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、
-  自己複製RNA分子は脂質ナノ粒子(LNP)又はカチオン性ナノエマルジョン(CNE)中に製剤化される。
【００７７】
さらなる実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子、及び(iii)第3の抗原を含むポリペプチドをコードする第3の自己複製RNA分子を含み、
-  第1、第2及び第3の抗原はいずれもインフルエンザウイルスに由来するが、第1、第2及び第3の抗原はすべてインフルエンザウイルスの異なる株に由来し、
-  第1、第2及び第3の抗原はヘマグルチニン又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、
-  自己複製RNA分子は脂質ナノ粒子(LNP)又はカチオン性ナノエマルジョン(CNE)中に製剤化され、並びに
-  インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードするとともに、各自己複製RNA分子は、自己複製RNA分子からRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼをコードする。
【００７８】
また、本発明に係る免疫原性組成物を調製する方法が提供され、自己複製RNA分子が、カチオン性水中油型エマルジョンに複合化され、該方法は、(i)本明細書に記載される水中油型エマルジョンを提供する工程; (ii)自己複製RNA分子を含む水溶液を提供する工程;及び(iii)(ii)の水溶液と(i)の水中油型エマルジョンとを組み合わせ、それによって免疫原性組成物を調製する工程を含む。所望であれば、RNA分子を含む水溶液は緩衝液であり得る。緩衝液は、1つ以上の塩、緩衝液、糖、又はポリマーを含み得る。好ましい実施形態では、緩衝液は、560mMのスクロース、20mMのNaCl、及び10mMのクエン酸塩を含み、これらは、本明細書に記載される水中カチオン油エマルジョンと混合して、280mMのスクロース、10mMのNaCl及び10mMのクエン酸塩を含む最終水相を生成することができる。
【００７９】
また、本発明に係る免疫原性組成物を調製する方法が提供され、自己複製RNA分子を脂質ナノ粒子(LNP)に封入し、本方法は、(i)ナノ粒子を形成する少なくとも1つの脂質を提供する工程; (ii)自己複製RNA分子を含む水溶液を提供する工程;及び(iii)(ii)の水溶液と(i)の少なくとも1つの脂質とを組み合わせ、それによって組成物を調製する工程を含む。
【００８０】
LNP送達系及び無毒性の生分解性ポリマー微粒子、並びにそれらを調製する方法は、以下の参考文献: 国際公開第2012/006376号 (LNP and microparticle delivery systems); Geall et al. (2012) PNAS USA. Sep 4; 109(36): 14604-9 (LNP送達系); 及び国際公開第2012/006359号 (微粒子送達系)に記載されている。LNPは、核酸分子(例えばRNA)が封入され得る非ビリオンリポソーム粒子である。粒子は、いくつかの外部RNA(例えば粒子の表面)を含むことができるが、RNAの少なくとも半分(及び理想的にはそのすべて)が封入される。リポソーム粒子は、例えば、飽和又は不飽和であり得る双性イオン性、カチオン性及びアニオン性脂質、例えば、DSPC(双性イオン性、飽和)、DlinDMA(カチオン性、不飽和)、及び/又はDMG(アニオン性、飽和)の混合物から形成され得る。一部の実施形態では、LNPは、中性脂質、カチオン性脂質、コレステロール及びポリエチレングリコール(PEG)を含み、自己増幅RNAを包含するナノ粒子を形成する。本発明とともに使用するための好ましいLNPは、場合により少なくとも1つのカチオン性脂質(例えば、DOTAP、DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMAなど)と組み合わせて、リポソームを形成し得る両親媒性脂質(ヘルパー脂質(複数可))を含む。有用なヘルパー脂質としては、双性イオン性脂質、例えば、DPPC、DOPC、DSPC、ドデシルホスホコリン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、及び1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPyPE); ステロール、例えば、コレステロール;及びPEG化脂質、例えば、PEG-DMPE(PEG結合1,2-ジミリストイル-Sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)])又はPEG-DMG(PEG結合1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、メトキシポリエチレングリコール)が挙げられる。一部の実施形態では、有用なPEG化脂質は、PEG2K-DMPE(PEG結合1,2-ジミリストイル-Sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000])又はPEG2K-DMG(PEG結合1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール,メトキシポリエチレングリコール-2000)であり得る。DSPC、DlinDMA、PEG-DMG及びコレステロールの混合物は、特に有効である。他の有用なLNPは、以下の参考文献: 国際公開第2012/006376号; 国際公開第2012/030901号; 国際公開第2012/031046号; 国際公開第2012/031043号; 国際公開第2012/006378号; 国際公開第2011/076807号; 国際公開第2013/033563号; 国際公開第2013/006825号; 国際公開第2014/136086号; 国際公開第2015/095340号; 国際公開第2015/095346号; 国際公開第2016/037053号に記載されている。一部の実施形態では、LNPはRV01リポソームであり、以下の参考文献: 国際公開第2012/006376号及びGeall et al. (2012) PNAS USA. Sep 4; 109(36): 14604-9を参照されたい。ある実施形態では、LNPは、カチオン性脂質がDLin-DMAであるRV01リポソームである。
【化１】
2021534182.tif 000002
【００８１】
一部の実施形態では、本明細書におけるカチオン性脂質は、式I:
【００８２】
【化２】
2021534182.tif 000003
【００８３】
の構造を含み、式中、
nは、1から3の整数であり、
(i)R1はCH3であり、R2とR3はともにHであり、及びYはCであり；又は
(ii)R1及びR2は集合的にCH2-CH2であり、窒素と一緒になって、5員、6員、又は7員のヘテロシクロアルキルを形成し、R3はCH3であり、及びYはCであり；又は
(iii)R1はCH3であり、R2とR3はともに存在せず、及びYはOであり；
oは、0又は1であり；
Xは、
(i)
【００８４】
【化３】
2021534182.tif 000004
【００８５】
{式中、
R4及びR5は、独立して、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有するC10〜20炭化水素鎖である}；又は
(ii)-CH(-R6)-R7
{式中、
(1)R6は、-(CH2)p-O-C(O)-R8若しくは-Cp-R8であり；
(2)R7は、-(CH2)p'-O-C(O)-R8'若しくは-Cp'-R8'であり；
(3)p及びp'は、独立して、0、1、2、3若しくは4であり；及び
(4)R8及びR8'は、独立して、
(A)オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有するC8〜20炭化水素鎖；
(B)-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖；
(C)-C6〜16飽和炭化水素鎖；
(D)-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖；
(E)-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖；及び
(F)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖
である}
である。
【００８６】
一実施形態では、R1はCH3であり、R2とR3はともにHであり、YはCである。一部の実施形態では、R1及びR2は集合的にCH2-CH2であり、窒素と一緒になって、5員、6員、又は7員のヘテロシクロアルキルを形成し、R3はCH3であり、及びYはCである。一部の実施形態では、R1はCH3であり、R2とR3はともに存在せず、YはOである。
【００８７】
一実施形態では、Xは、
【００８８】
【化４】
2021534182.tif 000005
【００８９】
であり、式中、R4及びR5は、独立して、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有するC10〜20炭化水素鎖である。
【００９０】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【００９１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【００９２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【００９３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【００９４】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【００９５】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【００９６】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、R8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【００９７】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【００９８】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【００９９】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１００】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１０１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１０２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１０３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１０４】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１０５】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１０６】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１０７】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１０８】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１０９】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１１０】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１１１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１１２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１１３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１１４】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１１５】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１１６】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１１７】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１１８】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１１９】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１２０】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１２１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１２２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１２３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１２４】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１２５】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１２６】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、R8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１２７】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１２８】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１２９】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１３０】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１３１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１３２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１３３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１３４】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１３５】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１３６】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１３７】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１３８】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１３９】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１４０】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１４１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１４２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１４３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１４４】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、R8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１４５】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１４６】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１４７】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１４８】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１４９】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１５０】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１５１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１５２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、及びR8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１５３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１５４】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１５５】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１５６】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１５７】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7はCp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１５８】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１５９】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１６０】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１６１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１６２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１６３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１６４】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１６５】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１６６】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１６７】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１６８】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１６９】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１７０】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１７１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１７２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１７３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１７４】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１７５】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１７６】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１７７】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１７８】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１７９】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１８０】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１８１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１８２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１８３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、R8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１８４】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１８５】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１８６】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１８７】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１８８】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１８９】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１９０】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１９１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１９２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１９３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１９４】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０１９５】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１９６】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１９７】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０１９８】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０１９９】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２００】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０２０１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２０２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２０３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２０４】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０２０５】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２０６】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０２０７】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２０８】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２０９】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２１０】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０２１１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２１２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０２１３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２１４】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２１５】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２１６】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０２１７】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２１８】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０２１９】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２２０】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２２１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２２２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０２２３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２２４】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０２２５】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２２６】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２２７】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２２８】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
【０２２９】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２３０】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
【０２３１】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２３２】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8''であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２３３】
一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
【０２３４】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV28である。
【０２３５】
【化５】
2021534182.tif 000006
【０２３６】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV31である。
【０２３７】
【化６】
2021534182.tif 000007
【０２３８】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV33である。
【０２３９】
【化７】
2021534182.tif 000008
【０２４０】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV37である。
【０２４１】
【化８】
2021534182.tif 000009
【０２４２】
一実施形態では、LNPは、カチオン性脂質RV39、すなわち2,5-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)ベンジル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート)を含む。
【０２４３】
【化９】
2021534182.tif 000010
【０２４４】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV42である。
【０２４５】
【化１０】
2021534182.tif 000011
【０２４６】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV44である。
【０２４７】
【化１１】
2021534182.tif 000012
【０２４８】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV73である。
【０２４９】
【化１２】
2021534182.tif 000013
【０２５０】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV75である。
【０２５１】
【化１３】
2021534182.tif 000014
【０２５２】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV81である。
【０２５３】
【化１４】
2021534182.tif 000015
【０２５４】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV84である。
【０２５５】
【化１５】
2021534182.tif 000016
【０２５６】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV85である。
【０２５７】
【化１６】
2021534182.tif 000017
【０２５８】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV86である。
【０２５９】
【化１７】
2021534182.tif 000018
【０２６０】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV88である。
【０２６１】
【化１８】
2021534182.tif 000019
【０２６２】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV91である。
【０２６３】
【化１９】
2021534182.tif 000020
【０２６４】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV92である。
【０２６５】
【化２０】
2021534182.tif 000021
【０２６６】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV93である。
【０２６７】
【化２１】
2021534182.tif 000022
【０２６８】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有する2-(5-((4-((1,4-ジメチルピペリジン-4-カルボニル)オキシ)ヘキサデシル)オキシ)-5-オキソペンチル)プロパン-1,3-ジイルジオクタノエート（RV94）である。
【０２６９】
【化２２】
2021534182.tif 000023
【０２７０】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV95である。
【０２７１】
【化２３】
2021534182.tif 000024
【０２７２】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV96である。
【０２７３】
【化２４】
2021534182.tif 000025
【０２７４】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV97である。
【０２７５】
【化２５】
2021534182.tif 000026
【０２７６】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV99である。
【０２７７】
【化２６】
2021534182.tif 000027
【０２７８】
一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV101である。
【０２７９】
【化２７】
2021534182.tif 000028
【０２８０】
一実施形態では、カチオン性脂質は、RV28、RV31、RV33、RV37、RV39、RV42、RV44、RV73、RV75、RV81、RV84、RV85、RV86、RV88、RV91、RV92、RV93、RV94、RV95、RV96、RV97、RV99、及びRV101からなる群から選択される。一実施形態では、カチオン性脂質は、RV39、RV88、及びRV94からなる群から選択される。
【０２８１】
式Iを有する化合物、並びにRV28、RV31、RV33、RV37、RV39、RV42、RV44、RV73、RV75、RV81、RV84、RV85、RV86、RV88、RV91、RV92、RV93、RV94、RV95、RV96、RV97、RV99、及びRV101を合成するための組成物及び方法は、2014年12月17日に出願されたPCT/US2014/070882(国際公開番号第2015/095340号)及びPCT/US2014/070891(国際公開番号第2015/095346号)において、並びに2015年9月4日に出願されたPCT/US2015/048535(国際公開番号第2016/037053号)に見出すことができる。
【０２８２】
一部の実施形態では、RNAを封入するリポソームを含む非ウイルス送達系を製造する方法は、以下の工程: (a)(i)溶媒、イオン化可能なカチオン性脂質、双性イオン性脂質、ステロール、及び選択されたPEG化脂質を含む第1の溶液;及び(ii)水及びRNAを含む第2の溶液を混合する工程;並びに(b)溶媒を除去する工程を含む。混合は、国際公開第2012/031046及び/又はPCT/IB2018/053850に記載されているように、Tジャンクションデバイス、マイクロ流体デバイスなどで行うことができる。
【０２８３】
本発明に係る免疫原性組成物は、医薬組成物、例えばワクチン組成物であり得る。したがって、組成物はまた、薬学的に許容される担体を含んでもよい。
【０２８４】
「薬学的に許容される担体」は、それ自体は、組成物を受容する個体に有害な抗体の生成を誘導しない担体を含む。適切な担体は、典型的には、大きな、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸共重合体、スクロース、トレハロース、ラクトース、及び脂質凝集体(油滴又はリポソームなど)である。このような担体は当業者に周知である。組成物はまた、薬学的に許容される希釈剤、例えば、水、生理食塩水、グリセロールなどを含有し得る。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質などが存在し得る。無菌の発熱物質不含のリン酸緩衝生理食塩水が典型的な担体である。
【０２８５】
医薬組成物は、本明細書の他の箇所で記載される、単純水中(例えば、「w.f.i.」)又は緩衝液中、例えば、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、又はクエン酸緩衝液中の免疫原性組成物、核酸配列、及び/又はポリペプチド配列を含み得る。緩衝塩は、典型的には、5〜20mMの範囲に含まれる。医薬組成物は、5.0〜9.5、例えば6.0〜8.0のpHを有することができる。組成物は、等張性を与えるためにナトリウム塩(例えば、塩化ナトリウム)を含み得る。10±2mg/mLのNaClの濃度が典型的であり、例えば約9mg/mLである。組成物は、金属イオンキレート剤を含み得る。これらは、ホスホジエステル加水分解を加速し得るイオンを除去することによってRNA安定性を延長することができる。したがって、組成物は、EDTA、EGTA、BAPTA、ペンテト酸などのうちの1つ以上を含むことができる。このようなキレート剤は、典型的には、10〜500μM、例えば0.1mMで存在する。また、クエン酸塩、例えばクエン酸ナトリウムはキレート剤として作用することができるが、有利には緩衝活性も提供する。医薬組成物は、200mOsm/kg〜400mOsm/kg、例えば、240〜360mOsm/kg、又は290〜310mOsm/kgの浸透圧を有し得る。医薬組成物は、1つ以上の防腐剤、例えばチオメルサール又は2-フェノキシエタノールを含み得る。水銀を含まない組成物が好ましく、防腐剤を含まないワクチンを調製することができる。医薬組成物は、無菌又は滅菌であり得る。医薬組成物は、非発熱性であり、例えば、1用量あたり＜1EU(内毒素単位、標準尺度)、好ましくは1用量あたり＜0.1EUを含み得る。医薬組成物はグルテン不含であり得る。医薬組成物は単位投与形態で調製することができる。一部の実施形態では、単位投与量は、0.1〜1.0mL、例えば約0.5mLの体積を有することができる。
【０２８６】
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、対象に投与された場合、体液性及び/又は細胞性抗原特異的免疫応答(すなわち、天然に存在するインフルエンザウイルス抗原ポリペプチドを特異的に認識する免疫応答)を誘導する免疫原性組成物である。例えば、免疫原性組成物は、インフルエンザウイルス感染後、未治療の対象に対して記憶T及び/又はB細胞集団を誘導し得る。一部の実施形態では、対象は、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒト又は獣医哺乳動物である。
【０２８７】
本発明の免疫原性組成物は、ワクチン組成物として製剤化することができる。ワクチンは、免疫学的に有効な量の抗原を含む。「免疫学的に有効な量」とは、その量の対象への投与が、単回投与又は一連の一部として、対象におけるインフルエンザウイルスに対する測定可能な免疫応答を誘導するのに有効であることが意図される。この量は、治療されるべき個体の健康及び身体状態、年齢、治療されるべき個体の分類学的グループ(例えば、ヒト、非ヒト霊長類など)、個体の免疫系の抗体を合成する能力、所望の防御の程度、組成物又はワクチンの製剤化、処置医による医学的状況の評価、疾患の重症度、投与される化合物の効力、投与の様式、及び他の関連する因子に依存して変化する。日常的な試行で決定され得る比較的幅広い範囲での減少が期待される。本明細書に開示されるワクチンは、予防的(すなわち、感染を予防するため)であるか又は治療的(すなわち、感染を治療するため)であり得るが、典型的には予防的である。一部の実施形態では、本明細書に開示されるワクチン組成物は、インフルエンザウイルス感染に対する有効な免疫応答、すなわち、インフルエンザウイルス感染の治療又は予防に十分な応答を誘導し得る。
【０２８８】
一部の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、追加の抗原をさらに含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、追加の抗原を含むさらなる組成物と組み合わせて対象に投与される。
【０２８９】
具体的な実施形態では、(i)3〜10個の自己複製RNA分子であって、各自己複製RNA分子がインフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードし、各抗原は他の抗原とは異なるインフルエンザの株由来であり、自己複製RNA分子は脂質ナノ粒子(LNP)中に製剤化される自己複製RNA分子、(iii)医薬担体、希釈剤及び/又は緩衝液、並びに場合により(iii)アジュバント、を含むか又はそれらからなる医薬組成物(例えばワクチン組成物)が提供される。
【０２９０】
例えば、(i)脂質ナノ粒子(LNP)中に製剤化された3〜10個の自己複製RNA分子、並びに(ii)医薬担体、希釈剤及び/又は緩衝液を含むか又はそれらからなるワクチン組成物が提供され、
-  各自己複製RNA分子は、インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードし、
-  各抗原は、他の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来であり、
-  LNPは、自己複製RNAを包含するナノ粒子を形成する中性脂質、カチオン性脂質、コレステロール及びポリエチレングリコール(PEG)を含む。ある種の実施形態では、中性脂質はDSPCであり、カチオン性脂質はDLinDMAである。
【０２９１】
本発明の免疫原性組成物はまた、1つ以上のアジュバント(例えば、ワクチンアジュバント)を含み得るか又はそれとともに投与され得る。アジュバントとは、それが、上記抗原単独の投与と比較して、抗原に対する免疫応答を増加させることができることが意図される。一部の態様では、本明細書に開示されるアジュバント組成物は、1つ以上の免疫刺激剤、例えばサポニン、例えばQS21をさらに含む。
【０２９２】
本発明の組成物に使用することができるアジュバントには、限定されないが、下記が含まれる:(A)ミネラル含有組成物、例えばアルミニウム及びカルシウム塩、例えばリン酸アルミニウム。(B)油性エマルジョン、例えば水中スクアレン型エマルジョン、例えばMF59又はAS03。完全フロイントアジュバント(CFA)及び不完全フロイントアジュバント(IF A)もまた使用することができる。(C)サポニン製剤。(D)ビロソーム及びウイルス様粒子(VLP)。(E)細菌又は微生物誘導体、例えば腸内細菌性リポ多糖(LPS)の非毒性誘導体、脂質A誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチド並びにADPリボシル化毒素及びその解毒誘導体。(F)ヒト免疫モジュレーター、例えばサイトカイン、例えばインターロイキン、インターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子、及び腫瘍壊死因子。(G)生体接着剤及び粘膜接着剤、例えばエステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア、ポリ(アクリル酸)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖及びカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体。(H)生分解性であり、無毒性の材料(例えば、ポリ(a-ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど)とポリ(ラクチド-co-グリコリド)とから形成される微粒子、例えば、直径が約100nm〜約150μm、より好ましくは直径が約200nm〜約30μm、最も好ましくは直径が約500nm〜約10μmの微粒子が好ましく、場合により負に帯電した表面(例えばSDSを用いる)又は正に帯電した表面(例えばカチオン性界面活性剤、例えばCTABを用いる)を有するように処理される。(I)リポソーム。(J)ポリオキシエチレンエーテル及びポリオキシエチレンエステル製剤。(K)ポリホスファゼン(PCPP)。(L)ムラミルペプチド。(M)イミダゾキノロン化合物、例えばイミカモド及びその同族体。
【０２９３】
上記で同定された1つ以上のアジュバントの組み合わせはまた、本発明とともに使用することができる。
【０２９４】
具体的な実施形態では、本発明に係るワクチン組成物が提供される。
【０２９５】
投与及び使用
使用方法/使用
一部の実施形態では、インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答をそれを必要とする対象において誘導するための方法が提供され、本明細書に開示される免疫原性又は医薬組成物の免疫学的に有効な量を投与することを含む。
【０２９６】
一部の実施形態では、インフルエンザウイルス抗原に対する免疫応答をそれを必要とする対象において誘導するための本明細書に開示される組成物の使用が提供される。一部の実施形態では、対象におけるインフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を誘導するための本明細書に開示される組成物の使用が提供される。一部の実施形態では、対象においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を誘導する医薬の製造における、本明細書に開示される組成物の使用を提供する。
【０２９７】
「対象」は、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒト又は獣医哺乳動物が意図される。一部の実施形態では、対象はヒトである。「免疫応答」とは、インフルエンザウイルスをin vitroで中和するか又はインフルエンザウイルス感染をin vivoで制御/低減/除去することが示され得る体液性及び/又は細胞性抗原特異的免疫応答(すなわち、抗原ポリペプチドを特異的に認識する免疫応答)が意図される。一部の実施形態では、免疫応答は、インフルエンザウイルスに対する免疫学的記憶及び/又は有効なインフルエンザウイルス応答性記憶T細胞集団によって特徴付けられる。
【０２９８】
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、療法又は医薬に使用するためのものである。好ましい実施形態では、療法はワクチン療法である。好ましくは、療法はインフルエンザウイルス感染を予防するワクチンである。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、インフルエンザの予防若しくは治療に使用するため、又はそれを必要とする対象におけるインフルエンザウイルス感染の予防若しくは治療に使用するためのものである。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、それを必要とする対象におけるインフルエンザウイルス感染に対する免疫応答の誘導に使用するためのものである。
【０２９９】
本明細書に記載される組成物は、インフルエンザウイルスの複数の異なる株によるインフルエンザウイルス感染の予防に使用するため、又はインフルエンザウイルスの複数の異なる株のいずれか1つによる感染に対する免疫応答を誘導するためのものであり得る。例えば、組成物は、インフルエンザウイルスの2つ以上のH1型株及び/又は2つ以上のH3型株に対するインフルエンザウイルス感染の予防又は短縮に使用するためのものであり得る。本組成物は、インフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対するインフルエンザウイルス感染を予防又は短縮するためのものであり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、インフルエンザウイルスの相同株及び/又は異種株に対するインフルエンザウイルス感染の予防に使用するためのものであり得る。一部の実施形態では、組成物は、インフルエンザウイルスの亜型内株及び/又はヘテロ亜型株に対するインフルエンザウイルス感染の予防に使用するためのものであり得る。
【０３００】
したがって、ある種の実施形態では、インフルエンザウイルスの亜型内株に対するインフルエンザウイルス感染の予防に使用するために、本明細書に開示される免疫原性又は医薬組成物が提供される。
【０３０１】
具体的な実施形態では、インフルエンザウイルスの相同株及び/又は異種株に対するインフルエンザウイルス感染の予防に使用するためのワクチン組成物が提供され、ワクチン組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、及び(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子を含み、
-  第1と第2の抗原はともインフルエンザウイルス由来であるが、第1の抗原は第2の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来であり、
-  第1及び第2の抗原は、ヘマグルチニン又はその免疫原性断片又は変異体であり、並びに
-  自己複製RNA分子は、脂質ナノ粒子(LNP)又はカチオン性ナノエマルジョン(CNE)中に製剤化される。
【０３０２】
具体的な実施形態では、インフルエンザウイルスの相同株及び/又は異種株に対するインフルエンザウイルス感染の予防に使用するためのワクチン組成物が提供され、ワクチン組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、及び(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子を含み、
-  第1と第2の抗原はともにインフルエンザウイルス由来であるが、第1の抗原は第2の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来であり、
-  第1及び第2の抗原は、ヘマグルチニン又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、
-  自己複製RNA分子は、脂質ナノ粒子(LNP)又はカチオン性ナノエマルジョン(CNE)中に製剤化され、並びに
-  インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードするとともに、各自己複製RNA分子は、自己複製RNA分子からRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼをコードする。
【０３０３】
さらなる具体的な実施形態では、インフルエンザウイルスの相同及び/又は異種亜型内株に対するインフルエンザウイルス感染の予防に使用するためのワクチン組成物が提供され、ワクチン組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、及び(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子を含み、
-  第1と第2の抗原はともにインフルエンザウイルス由来であるが、第1の抗原は第2の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来であり、
-  第1及び第2の抗原は、ヘマグルチニン又はその免疫原性断片又は変異体であり、並びに
-  インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードするとともに、各自己複製RNA分子は、自己複製RNA分子からRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼをコードする。
【０３０４】
さらなる具体的な実施形態では、インフルエンザウイルスの相同及び/又は異種亜型内株に対するインフルエンザウイルス感染の予防に使用するためのワクチン組成物が提供され、ワクチン組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子、及び(iii)第3の抗原を含むポリペプチドをコードする第3の自己複製RNA分子を含み、
-  第1、第2及び第3の抗原はいずれもインフルエンザウイルス由来であるが、第1、第2及び第3の抗原はすべてインフルエンザウイルスの異なる株に由来し、
-  第1、第2及び第3の抗原は、ヘマグルチニン又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、
-  自己複製RNA分子は、脂質ナノ粒子(LNP)又はカチオン性ナノエマルジョン(CNE)中に製剤化される。
【０３０５】
さらなる具体的な実施形態では、インフルエンザウイルスの相同及び/又は異種亜型内株に対するインフルエンザウイルス感染の予防に使用するためのワクチン組成物が提供され、ワクチン組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子、及び(iii)第3の抗原を含むポリペプチドをコードする第3の自己複製RNA分子を含み、
-  第1、第2及び第3の抗原はいずれもインフルエンザウイルス由来であるが、第1、第2及び第3の抗原はすべてインフルエンザウイルスの異なる株に由来し、
-  第1、第2及び第3の抗原は、ヘマグルチニン又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、並びに
-  インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードするとともに、各自己複製RNA分子は、自己複製RNA分子からRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼをコードする。
【０３０６】
さらなる具体的な実施形態では、インフルエンザウイルスの相同及び/又は異種亜型内株に対するインフルエンザウイルス感染の予防に使用するためのワクチン組成物が提供され、ワクチン組成物は、(i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子、及び(iii)第3の抗原を含むポリペプチドをコードする第3の自己複製RNA分子を含み、
-  第1、第2及び第3の抗原はいずれもインフルエンザウイルス由来であるが、第1、第2及び第3の抗原はすべてインフルエンザウイルスの異なる株に由来し、
-  第1、第2及び第3の抗原は、ヘマグルチニン又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、
-  自己複製RNA分子は、脂質ナノ粒子(LNP)又はカチオン性ナノエマルジョン(CNE)中に製剤化され、並びに
-  インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードするとともに、各自己複製RNA分子は、自己複製RNA分子からRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼをコードする。
【０３０７】
一部の実施形態では、方法は、インフルエンザウイルス感染を予防又は短縮し、及び/又はそれを必要とする対象におけるインフルエンザウイルス感染に伴う臨床症状を低減又は予防するための方法が提供され、本明細書に提供される免疫原性組成物の免疫学的に有効な量を上記対象に投与することを含む。
【０３０８】
一部の実施形態では、インフルエンザウイルスの複数の異なる株に対するインフルエンザウイルス感染を予防又は短縮するための方法が提供される。例えば、本方法は、インフルエンザウイルスの2つ以上のH1及び/又は2つ以上のH3型株、並びに場合により2つ以上のB型インフルエンザウイルス株に対するインフルエンザウイルス感染を予防又は短縮するためであり得る。これらの方法は、インフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対するインフルエンザウイルス感染を予防又は短縮するためであり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、インフルエンザウイルスの相同株及び/又は異種株に対するインフルエンザウイルス感染の予防に使用するためであり得る。
【０３０９】
一部の実施形態では、対象におけるインフルエンザウイルス感染を予防若しくは短縮し、及び/又は対象におけるインフルエンザウイルス感染に伴う臨床症状を低減若しくは予防するための免疫原性組成物の製造における、本明細書に開示される組成物の使用が提供される。
【０３１０】
一部の実施形態では、対象はヒト対象である。具体的な実施形態では、ヒト対象は、インフルエンザウイルス感染に曝露されているか又は曝露されるリスクがある。
【０３１１】
一部の実施形態では、インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードする1つ以上の自己複製RNA分子を含む複数の組成物を使用することができる。したがって、インフルエンザ疾患に対する予防及び/又は治療方法が提供され、(i)第1の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第1の免疫原性組成物の投与、並びに(ii)第2の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第2の免疫原性組成物の同時又は連続的投与を含み、第1及び第2の自己複製RNA分子は、各々、インフルエンザウイルス由来の抗原をコードするポリペプチドをコードするが、第1の自己複製RNA分子は、第2の自己複製RNA分子によりコードされる抗原とは異なるインフルエンザの株由来の抗原をコードする。
【０３１２】
組成物は、連続的に、例えば、実質的に同時に、例えば10時間未満、1秒〜10時間若しくは1秒〜1時間の間隔、又は10時間〜6か月、10時間〜1か月、10時間〜2週間、10時間〜1週間又は10時間〜1日のより長い間隔で投与することができる。好ましくは、連続投与は、1秒〜10時間の間隔である。第1又は第2の免疫原性組成物は、各々、インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードする1つ以上の追加の(例えば、3番目、4番目、5番目、6番目、7番目、8番目、9番目及び/又は10番目の)自己複製RNA分子を含み得るが、各自己複製RNA分子の抗原は、インフルエンザウイルス由来の他の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来である。
【０３１３】
したがって、具体的な実施形態では、インフルエンザ疾患の予防及び/又は治療の方法が提供され、(i)第1の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第1の免疫原性組成物の投与、及び(ii)第2の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第2の免疫原性組成物の同時又は連続投与を含み、
-  第1及び第2の自己複製RNA分子は、各々、インフルエンザウイルス由来の抗原をコードするポリペプチドをコードするが、第1の自己複製RNA分子は、第2の自己複製RNA分子によってコードされる抗原とは異なるインフルエンザの株由来の抗原をコードし、
-  インフルエンザウイルス由来の抗原は、ヘマグルチニン又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、
-  第2の免疫原性組成物は、第1の免疫原性組成物の1日〜6か月後に投与される。
【０３１４】
また、インフルエンザ疾患を予防する方法に使用するための第1の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第1の免疫原性組成物が提供され、上記方法は、第1の免疫原性組成物を必要とする対象に投与し、続いて、自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第2の免疫原性組成物を投与することを含み、第1及び第2の自己複製RNA分子は、各々、抗原を含むポリペプチドをコードし、抗原はインフルエンザウイルス由来であるが、第1の自己複製RNA分子によってコードされる抗原は、第2の自己複製RNA分子によってコードされる抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来である。
【０３１５】
組成物は、10時間未満、1秒〜10時間若しくは1秒〜1時間の間隔で、又は10時間〜6か月、10時間〜1か月、10時間〜2週間、10時間〜1週間若しくは10時間〜1日のより長い間隔で投与することができる。第1/第2の免疫原性組成物は、各々、インフルエンザウイルス由来の抗原を含むポリペプチドをコードする1つ以上の追加の(例えば、3番目、4番目、5番目、6番目、7番目、8番目、9番目、及び/又は10番目の)自己複製RNA分子を含み得るが、各自己複製RNA分子の抗原は、インフルエンザウイルス由来の他の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来である。
【０３１６】
具体的な実施形態では、インフルエンザ疾患を予防する方法で使用するための第1の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第1の免疫原性組成物が提供され、上記方法は、第1の免疫原性組成物を必要とする対象に投与し、続いて、自己複製RNA分子、及び薬学的に許容される担体を含む第2の免疫原性組成物を投与することを含み、
-  第1及び第2の自己複製RNA分子は、各々、抗原を含むポリペプチドをコードし、抗原はインフルエンザウイルス由来であるが、第1の自己複製RNA分子によってコードされる抗原は、第2の自己複製RNA分子によってコードされる抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来であり、
-  インフルエンザウイルス由来の抗原は、ヘマグルチニン又はその免疫原性断片若しくは変異体であり、並びに
-  第2の免疫原性組成物は、第1の免疫原性組成物の1日〜6か月後に投与される。
【０３１７】
投与経路/投与量
本明細書に開示される組成物は、一般的に、対象に直接投与される。直接送達は、非経口注射(例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、又は組織の間質腔)によって達成され得る。代替の送達経路には、直腸、経口(例えば、錠剤、噴霧剤)、口腔、舌下、膣、局所、経皮又は経皮、鼻腔、眼、耳、肺又は他の粘膜投与が含まれる。皮内及び筋肉内投与は2つの好ましい経路である。注射は、針(例えば、皮下注射針)を介し得るが、針を使用しない注射を代わりに使用し得る。投与容量は、0.25ml〜1ml、特に0.5ml又は0.7mlであり得る。投与量のわずかな順応は、元のバルク試料中のRNA濃度に依存して、また送達経路に依存して、経鼻又は経皮経路によって、より少ない用量を投与することによって、日常的に行われる。典型的なヒト筋肉内投与量は0.5mlである。
【０３１８】
自己複製RNAワクチンの用量は、約50μg〜約100μgの核酸を有し得る。一実施形態では、ワクチン投与量は、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100μgの自己複製RNAを含有する。他の実施形態では、本発明に係る組成物の投与量は、<10μgの自己複製RNA; 例えば、1〜10μg、例えば約1μg、2.5μg、5μg、7.5μg又は10μgを有することができるが、例えば<1μg/投与量、<100ng/投与量、<10ng/投与量、<1ng/投与量など、はるかに低いレベルで発現を見ることができる。
【０３１９】
好ましい実施形態では、本明細書に開示される組成物は、所望の免疫応答、例えば、インフルエンザウイルスに対する中和抗体の誘導及び/又はインフルエンザウイルス感染に対する防御を達成するのに十分な投与量を意味する有効投与量で対象に投与される。
【０３２０】
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物(例えば、ワクチン組成物)は、同じ抗原をコードするDNAワクチン又はワクチン組成物の有効投与量の50%、40%、30%、20%若しくは10%未満又はそれに等しい有効投与量を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるワクチンは、同じ抗原をコードするDNAワクチン又はワクチン組成物の有効投与量の3分の1以下の有効投与量を有する。
【０３２１】
製造方法/製剤
自己複製RNAの製造方法を本明細書に提供する。一部の実施形態では、自己増幅RNAの製造方法は、本明細書の他の箇所に記載されるin vitro転写(IVT)の工程を含む。一部の実施形態では、自己複製RNAを製造する方法は、IVTでRNAを生成する工程を含み、本明細書の他の箇所に記載されているように、RNAを非ウイルス送達系と組み合わせる工程をさらに含む。一部の実施形態では、自己複製RNAを製造する方法は、IVTでRNAを生成する工程を含み、本明細書の他の箇所に記載されているように、CNE又はLNP送達系とRNAを組み合わせる工程をさらに含む。
【０３２２】
配列同一性
アミノ酸配列に関する同一性又は相同性は、最大パーセント配列同一性を達成するように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後に、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照アミノ酸配列と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして、本明細書において定義される。核酸配列に関する同一性又は相同性は、最大パーセント配列同一性を達成するように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後に、参照核酸酸配列と同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージとして、本明細書において定義される。
【０３２３】
配列同一性は、2つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するために一般的に使用される標準的な方法によって決定することができる。コンピュータープログラム、例えばBLASTを使用して、2つのポリペプチドをそれらのそれぞれのアミノ酸の一致が最適化するように(一方若しくは両方の配列の全長にわたって、又は一方若しくは両方の配列の所定部分にわたって)整列させる。これらのプログラムは、デフォルトのオープニングペナルティ及びデフォルトのギャップペナルティを提供し、スコアリングマトリックス、例えば、PAM250[標準的なスコアリングマトリックス; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)を参照されたい]をコンピュータープログラムと組み合わせて使用することができる。例えば、同一性の一致の合計数を100倍し、次に一致した領域内のより長い配列の長さと、2つの配列を整列させるためにより短い配列に導入されたギャップの数との合計で除算したものとして、同一性パーセントを計算することができる。ポリペプチドを比較するために使用されるのと同じ方法を使用して、2つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントを計算することもできる。
【０３２４】
本開示がUniProt又はGenbankアクセッションコードへの参照によって配列を参照する場合、参照される配列は本出願の出願日現在のバージョンである。
【０３２５】
一般
他に説明されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」には、文脈からそうでないことが明確に示されていない限り、複数の指示対象が含まれる。同様に、「又は」という言葉は、文脈から明確に他に示されない限り、「及び」を含むことが意図される。「複数」という用語は、2つ以上を指す。さらに、物質の濃度又はレベルに関して与えられる数値限定、例えば、溶液成分濃度又はその比率、及び反応条件、例えば、温度、圧力及びサイクル時間は、近似値であることが意図される。本明細書で使用される「約」という用語は、量±10％を意味することが意図される。
【０３２６】
用語「含む(comprises)」は、「含む(includes)」を意味する。したがって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「含む(comprises)」及び変形、例えば「含む(comprise)」及び「含んでいる(comprising)」は、記載された化合物又は組成物(例えば、核酸、ポリペプチド、抗原)若しくは工程、又は化合物若しくは工程の群を包含することを意味するが、他の化合物、組成物、工程、又はそれらの群の排除を意味しないものと理解される。ある種の成分を含むとして記載される実施形態は、示された成分からなる実施形態を含むことを意図している。
【０３２７】
略語「例えば(e.g.)」は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書では、非限定的な例を示すために使用される。したがって、「例えば(e.g.)」という略語は、「例えば(for example)」という用語と同義である。
【０３２８】
本発明は、以下の非限定的な図及び実施例を参照してさらに記載される。
【０３２９】
[実施例]
[実施例1]
材料及び方法
インフルエンザH3N2ワクチン株の選択
インフルエンザH3N2亜型のパンデミック株及び季節性株の可能性は、3つの主要基準1)主要なグリコシル化部位、2)重要な季節性及びパンデミックワクチン株、3)細胞適応株のみに基づいて選択された。インフルエンザHAタンパク質をコードする全長遺伝子の配列情報は、Global Initiative on Sharing All Influenza Data Epifluデータベース(www.gisaid.org)から入手した。同時にA/ビルトホーフェン/16398/1968(EPI362379)、A/バンコク/1/79(EPI367158)、A/北京/32/92(EPI365898)、A/福建省/411/2002(EPI362915)、A/ブリスベン/10/2007(EPI362338)及びA/テキサス/50/2012(EPI398417)からの全6つのH3N2 HA遺伝子断片を選択した。
【０３３０】
2021534182.tif 000029
【０３３１】
SAMレプリコン及びRNA合成
モノシストロン性SAM(HA)ワクチン構築物、SAM (H1-Cal)、SAM (H1-PR8)、SAM (H5-turkey)、SAM (H3-Biltho)、SAM (H3-Bang)、SAM (H3-Beij)、SAM (H3-Fuj)、SAM (H3-Bris)、SAM (H3-Tex)及びSAM (H7-Shan)は、それぞれアルファウイルスベースのSAMベクターTC83において、A/カリフォルニア/07/2009 (H1N1)、A/PR/8/1934 (H1N1), A/シチメンチョウ/トルコ/5/2005 (H5N1)、A/ビルトホーフェン/16398/1968 (H3N2)、A/バンコク/1/79 (H3N2)、A/北京/32/92 (H3N2)、A/福建省/411/2002 (H3N2)、A/ブリスベン/10/2007 (H3N2)、A/テキサス/50/2012 (H3N2)及びA/上海/1/2013 (H7N9)の全長HA遺伝子セグメントをクローニングした後に生成された。同様に、2つのHA遺伝子のH5及びH1を有するバイシストロン性SAM構築物(図1a)は、一次PCR鋳型として単量体HA形態を有する重複伸長(SOEing)法によるスプライシングを用いて、全長2A駆動配列の下流にある二次HA遺伝子をクローニングすることによって生成された。SOEIng PCRに使用するプライマーを以下に示す:
−catagtctagtcgacgccaccatggagaaaatagtgcttcttcttgc (SB63)
−gtcgaagttcagggtctgcttcacgggggccacgatcttctgcttgtgccgggcctcccgcttggcccgaatgcaaattctgcattgtaacgatc (SB74)
−gtgaagcagaccctgaacttcgacctgctgaagctggccggcgacgtggagagcaaccccggccccatgaaggcaatactagtagttctgc (SB76)
−ggcgtagcggcggccgcttatcaaatacatattctacactgtagagaccca (SB66)
【０３３２】
以前に記載されているように(Hekele et al Emerg Microbes Infect 2013;2 doi:ARTN e52DOI 10.1038/emi.2013.54)自己増幅mRNAを調製した。簡単には、全長HA遺伝子を化学的に合成するか(GeneArt, Thermo Fischer, USA)、又はフォワードプライマー5'- ATT CCC GTC GAC GCC ACC ATG AAG GCA ATA CTA GTA GTT CT -3' 及びリバースプライマー5'- ATT TAC GCC TAG GTT ATC AAA TAC ATA TTC TAC ACT GTA GAG AC -3' を用いて、インフルエンザH1N1 A/カリフォルニア/07/2009の逆転写されたRNAゲノムから増幅された。A/シチメンチョウ/トルコ/01/2005(H5N1)ウイルス株由来の全長H5 HA遺伝子(H5)も増幅した。さらに、A/上海/2/2013由来のH7 HA遺伝子は、誤差補正を伴う以前に記載された酵素的等温アセンブリ法(Dormitzer et al, Sci Transl Med 2013, 15;5(185):185ra68)に基づいて、フォワードプライマー5'- AAT TAA GTC GAC GCC ACC ATG AAC ACT CAA ATC CTG GTA TTC G-3'及びリバースプライマー5'- AAT TAA TCT AGA TTA TCA TAT ACA AAT AGT GCA CCG CAT G-3'を用いてアセンブリされたDNA断片から増幅された。配列番号:[TC83配列のためのINSERT番号]として示されるA836 TC83ベクター中にアンプリコンをクローニングした。
【０３３３】
プラスミドを大腸菌(Escherichia coli)で増幅し、Qiagen maxi Kits(Qiagen, Valencia, CA, USA)を用いて精製した。DNAは、PmeIによる制限消化により自己増幅RNA配列の3'末端の直後に線状化された。線状化DNAプラスミドは、MEGAScript T7キット(Life Technologies)を用いてRNAに転写され、LiCl沈殿により精製された。次に、RNAはScriptCap m7Gキャッピングシステム(Cell Script)を用いてキャップされ、2.8M LiCl沈殿により精製した後、製剤化された。タンパク質発現は、トランスフェクトされたベビーハムスター腎(BHK)細胞溶解物のウエスタンブロット分析によって確認された。
【０３３４】
RNA増幅及びタンパク質発現分析
以前に記載されているように、RNA増幅効率を行った(Magini et al, PLoS One 2016;11(8):e0161193)。簡単には、BHK細胞を200ngのRNAでエレクトロポレーションし、一晩(15〜17時間)、37℃及び5% CO2でインキュベートした。翌日、細胞を回収し、Live/Dead Aqua(Invitrogen)、APC結合抗二本鎖(ds)RNA抗体(J2モノクローナルマウス抗体IgG2aκ鎖、Bioclass)で染色した。dsRNA+細胞の頻度は、FACS CANTO IIフローサイトメーター(BD Biosciences)により分析された。
【０３３５】
レプリコンRNAからのHAの発現を確認するために、リポフェクタミン2000(商標)( LifeTechnologies, CA, USA)を用いて、106 BHK細胞にそれぞれ3μgのRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後に細胞を回収し、完全なプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche, Madison, WI, USA)を用いて100μLの1×放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)緩衝液(Cell Signaling Technology, MA, USA)中に溶解した。溶解物をSDS-PAGEに供し、PVDF膜にブロットした。HA特異的モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体でタンパク質発現を検出した。
【０３３６】
LNP/RNA製剤
等量のRNAを、LNP中に封入する前に混合した。製剤は、以前に記載されているように(Hekele et al, Emerg Microbes Infect 2013)、粒子サイズ、RNA濃度、封入効率及びRNA完全性(ゲル電気泳動を用いて)について特徴付けられた。LNP内のRNAの封入は、以前に記載されているように行われた(Geall et al Proc Natl Acad Sci USA 2012;109:14604-9)。DLinDMAは、以前に記載されているように合成された(Heyes et al, J Control Release 107:276-287)。1,2-ジアステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)をGenzymeから購入した。コレステロールをSigma-Aldrichから入手した。1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩)(PEG DMG 2000)をAvanti Polar Lipidsから入手した。エタノール希釈プロセスを用いて、以下の脂質成分のモル比:DSPC:コレステロール: PEG-DMG 2000: DLinDMA 10:48:2:40モル%でLNP製剤を製造した。8:1のN:Pモル比(RNA上のリン酸に対するDlinDMAにおける窒素)及び100mMクエン酸緩衝液(pH 6)を製剤に使用した。インライン混合の第一工程において、等量の脂質(エタノール中)及び緩衝液中のRNAは、KDS-220シリンジポンプ(kdScientific)を介してT-junctionを通じて混合され、等量の緩衝液を含む第三のシリンジを脂質/RNA混合物に同時に添加した。室温で1時間平衡化した後、混合物をさらに1:1 vol/volクエン酸緩衝液で希釈した。次に、得られたLNP(「RV01」LNP)を濃縮し、100kDaの孔サイズカットオフ及び20cm2表面積を有するポリエーテルスルホン(PES)中空糸膜を有する接線流濾過(TFF)( Spectrum Labs)を用いて1×PBSに対して透析した。in vitro及びin vivo実験のために、製剤を1×PBS(Teknova)を用いて必要なRNA濃度に希釈した。
【０３３７】
in vivoモデル
マウスは、ARRIVEガイドライン並びにGSK動物福祉方針及び基準に従って、GlaxoSmithKline (GSK)ワクチン動物施設に収容された。6〜8週齢の雌BALB/cマウスをCharles River Laboratories, Italyから入手した。幅広い免疫応答を利用可能にするために、10匹のマウスの群は、各0.1μgの各LNP封入モノシストロン性又はバイシストロン性SAM RNA:SAM (H1-Cal); SAM (H5-turkey); SAM (H5-H1)又は群: SAM(H1)+SAM(H5); SAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj) [群2]; SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex) [群3]; SAM(H1-Cal)+SAM(H1-PR8)+SAM(H5-turkey)+SAM (H7-Shan) [群4]; SAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj)+SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex) [群5]及びSAM(H3-Biltho)+SAM(H3-Bang)+SAM(H3-Fuj)+SAM(H3-Beij)+SAM(H3-Bris)+SAM(H3-Tex)+SAM(H1-Cal)+SAM(H1-PR8)+SAM(H5-turkey)+SAM (H7-Shan) [群6]を組み合わせて、別々に、3週間間隔で2回、筋肉内(i.m.)に免疫された(図5を参照されたい)。対照として、PBSを用いた[群1]。HA特異的体液性応答評価のために、2回目の免疫化の2週間後に血液試料を回収した。CD4+及びCD8+T細胞応答を評価するために、各群から6匹の動物の脾臓を回収した。
【０３３８】
赤血球凝集阻害アッセイ
赤血球凝集阻害(HI)アッセイにより測定された血清Ab力価は、成熟シチメンチョウ赤血球の0.5%懸濁液を用いた標準的手順に従って行われた。非特異的阻害剤を不活化するために、すべての血清試料は、製造業者の指示書に従って、受容体破壊酵素(DENKA, Tokyo, 日本)で前処理された。個々の血清の複製は、V底マイクロタイタープレート中で連続的に2倍希釈され、1:10の血清最終希釈を達成した。希釈された血清試料は、同量の株特異的インフルエンザ抗原とともに60分間、室温でインキュベートされ、続いて0.5%シチメンチョウ赤血球懸濁液とともに60分間インキュベートされた。結果は、目視検査により分析され、HI力価は、最後の完全凝集が生じた最後の血清希釈の逆数として計算された。
【０３３９】
細胞内サイトカイン染色
抗原特異的T細胞応答を特徴付けるために、1.5×106個の脾細胞の単細胞懸濁液は、CD107a FITC(BD Biosciences, USA)の存在下、ブレフェルジンAを含有する完全RPMI培地中で、H1-Cal若しくはH5-turkey(JPT, Berlin, Germany)又はH1-PR8((Department of Biochemistry, University of Lausanne, Switzerland)ペプチドプール又はCD4制限ALNNRFQIKGVELKS(A/メンフィス/1/1971、H3N2)(Fitzmaurice et al, Vaccine 1996;14:553-60)ペプチド(2.5μg/ml)、及び5μg/ml濃度の組換えHAタンパク質(Sino Biologicals Inc.)とともに培養された。フローサイトメトリー分析のために、次に、細胞をLive/Dead Near InfraRed (Invitrogen, USA)、抗CD62L(BD Pharmingen)で染色し、固定し、Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)で透過化し、さらに抗CD16/CD32 Fc-ブロック(BD Biosciences)とともにインキュベートした。T細胞は、抗CD3-PerCp-Cy5.5、抗CD4-BV510、抗CD8-PE-テキサスレッド、抗CD44-240 V450、抗IFN-γBv785、抗IL-2-PEcy5、抗TNF-BV605(すべてeBiosciences社製)で染色された。次に、試料はLSRII特注フローサイトメーター(BD Biosciences)で獲得され、データはFlowJoソフトウェアバージョン9.7.4(TreeStar)を用いて分析された。各サイトカインについて対応する陰性対照で測定されたバックグラウンドを差し引いた後、抗原特異的T細胞の頻度を決定した。
【０３４０】
統計解析
統計解析はすべて、GraphPad Prism 5ソフトウェア(GraphPad Software, La Jolla, USA)を用いて行われた。Mann-Whitney U検定を用いて、HI力価及びT細胞頻度を分析した。0.05未満のP値を有意とみなした。
【０３４１】
[実施例2]
1つ以上のインフルエンザHA抗原を発現するSAMワクチンの作製及び特徴付け
第一に、H1N1(A/カリフォルニア/07/2009)及びH5N1(A/シチメンチョウ/トルコ/5/2005)由来の全長HA遺伝子セグメントは、モノシストロン性SAM(H1-Cal)、SAM(H5-turkey)及びバイシストロン性SAM(H5-H1)レプリコンとしてT7 DNAポリメラーゼプロモーター(Perri et al.; Journal of Virology Oct 2003, p10394-10403)を含むVEE/SINV(ベネズエラウマ脳炎-シンドビスウイルス)キメラレプリコンからなるTC83アルファウイルスベクターにクローニングされた。次の工程では、8個の追加のモノシストロン性SAM(HA)レプリコンSAM(H1-PR8)、SAM(H3-Biltho)、SAM(H3-Bang)、SAM(H3-Beij)、SAM(H3-Fuj)、SAM(H3-Bris)、SAM(H3-Tex)及びSAM(H7-Shan)を作製した。すべてのSAMレプリコンからのRNAのin vitro合成は、線状化DNAからの酵素転写反応によって行われた。RNAの自己増幅効率は、BHK細胞における細胞内dsRNAの定量的検出、続いてフローサイトメトリー分析により測定された。
【０３４２】
モノシストロン性及びバイシストロン性SAM(HA)レプリコンによるトランスフェクション後のdsRNA陽性BHK細胞は、公知の効力のRNAと同等であった。SAMレプリコンのタンパク質発現能は、BHK細胞にトランスフェクトすることにより試験され、次にウエスタンブロット分析に供された。モノシストロン性及びバイシストロン性SAM(図1)レプリコン由来のH1、H5(図1)、H3(図7)、及びH7のインフルエンザHAの発現は、HA特異的抗体を用いたタンパク質発現を示した。マウス免疫化の前に、SAMレプリコンは、実施例1に記載されているようにLNP送達系に封入された。平均粒径及び多分散性は、11個すべてのLNP/RNA製剤について動的光散乱によって測定された。LNPのZ平均直径は137〜163nmで、多分散指数は0.01〜0.14であった。さらなるSAM/LNP複合体はまた封入効率について試験され、LNPがmRNAの約95%を封入できることを示した。LNP/RNA粒子サイズ及び封入効率のデータは、LNPが核酸送達のための優れた送達媒体であることを示唆する。アガロースゲル電気泳動は、RNAの完全性が製剤化の間維持されることを示した。
【０３４３】
[実施例3]
モノシストロン性SAM(H1-Cal)、SAM(H5-turkey)又はバイシストロン性SAM(H5-H1)ワクチン後の体液性免疫応答
以前に述べたように、10匹のBalb/cマウス群は、筋肉内に2回、3週間間隔で、LNPとともに製剤化された0.1μgのSAM(H1-Cal)、SAM(H5-turkey)、SAM(H1)+SAM(H5)の両方又はSAM (H5-H1)でワクチン接種された。血清試料は、1回目の免疫化の約3週間後及び2回目の免疫化の2週間後に回収された。しかしながら、SAMワクチンが1回目の免疫化の3週間後にすでに免疫応答を誘導することができることが以前の結果(Hekele et al, Emerg Microbes Infect, 2013; 2, e52)から示唆されたため、抗体応答について最終血清試料のみを分析した。
【０３４４】
ワクチン接種されたBalb/cマウス由来の血清試料は、HIアッセイによりHA特異的機能性抗体の有無について試験された。モノシストロン性SAM(H1-Cal)/LNP又はSAM(H5-turkey)/LNPワクチン候補を受けた動物は、相同性A/カリフォルニア/07/2009(H1N1)及びA/シチメンチョウ/トルコ/5/2005(H5N1)に対してそれぞれ597及び905の幾何平均力価(GMT)を発生した(図2a及びb)。興味深いことに、SAM(H5-H1)/LNPのバイシストロン性のHI GMTは、A/カリフォルニア/07/2009(H1N1)及びA/シチメンチョウ/トルコ/5/2005(H5N1)ウイルスに対するモノシストロン性ワクチンよりも2倍低いように見え、単一SAMベクター中の2つの異なるインフルエンザ抗原の組み合わせは、機能的抗体反応の促進には有効でないことを示唆している(図2a及びb)。さらに、SAM(H1)+SAM(H5)/LNP候補ワクチンの併用は、モノシストロン性SAM(H1-Cal)又はSAM(H5-turkey)に対して同等の反応を誘導し、その差は統計学的に有意ではなかった(図2a及びb)。次に、本発明者らは、2つの異なる抗原の組み合わせが交差反応性機能性抗体を誘導できるか否かを試験した。ワクチン接種マウスの血清は、抗原的に異なるA/PR/8/1934(H1N1)及びA/Perth/16/2009(H3N2)ウイルス株を用いてHI分析のために供された。いずれのワクチン接種群でも交差反応性は認められなかった(図2c及びd)。
【０３４５】
考察
2つの異なるインフルエンザ亜型(H1N1及びH5N1)由来のHAを発現するバイシストロン性SAM(HA)ベクターを開発し、交差反応性免疫応答を誘導する能力を試験した。既存の報告は、両方の亜型がヒト及び動物において交差防御免疫を誘導することを示唆する(Brazzoli et al, J Virol 2015;90:332-44, Wrammert et al, J Exp Med 2011;208:181-93, Sridhar et al, Front Immunol 2016;7, Florek et al, J Virol 2014;88:13418-28)。抗原的に遠く離れた異種株A/PR/8/1934(H1N1)及びA/Perth/16/2009に対する交差反応性抗体は、バイシストロン性SAM(H5-H1)又はモノシストロン性SAM(H1-Cal)、SAM(H5-turkey)又はSAM(H1)+SAM(H5)ワクチンの組み合わせの2回投与後には検出されなかった。抗体媒介交差反応性の欠如は驚くべきことではなく、季節性インフルエンザワクチンの毎年の更新の義務と一致している。しかしながら、バイシストロン性SAM(H5-H1)によって誘導された抗体反応の強度はSAM(H1-Cal)又はSAM(H5-turkey)より低く(<p=0.001)、インフルエンザ抗原を発現する個々のSAM(HA)レプリコンがより効果的であることを示唆した。興味深いことに、交差反応性亜型内及び異種亜型CD4+及びCD8+が検出された。これらの結果は、交差反応性中和抗体の非存在下では、T細胞が抗原的に異なるウイルスに対する防御を提供する可能性があることを示唆する。
【０３４６】
[実施例4]
モノシストロン性SAM(H1-Cal)、SAM(H5-turkey)又はバイシストロン性SAM(H5-H1)ワクチン後の細胞性免疫応答
ワクチン候補によって誘導された機能的T細胞応答を特徴付けるために、Balb/cマウスを0.1μgのSAM/LNPで免疫化し、2回目のワクチン接種の2週間後に脾細胞を回収し、H1-Cal及びH5-turkey由来の全長HA配列をカバーするペプチドプールでin vitroで刺激した。抗原特異的CD4+及びCD8+サイトカイン生成(IFN-γ、TNFα及びIL-2)T細胞の頻度をフローサイトメトリーによって分析した。すべてのワクチン群は、ヘルパーT(Th)細胞プロファイルTh0/Th1表現型(IFN-γ及びIFN-γ/TNFとIFN-γ/TNF/IL-2の組み合わせの分泌が優勢)を伴うHA特異的CD4+T細胞応答を誘発した(図2e、f及びg)。インフルエンザHA特異的CD8+T細胞もまた調べたところ、ほとんどのHA特異的T細胞はIFN-γ及びTNFサイトカイン陽性であった(図2h、I及びj)。さらに、細胞表面マーカーCD107aの発現もまた観察され、細胞毒性活性に関連する脱顆粒に特異的であった。かなりの数のCD8+T細胞がCD107a陽性であることが見出された(図2k、l及びm)。SAM(H1-Cal)及びSAM(H5-turkey)でワクチン接種されたBalb/cマウス由来の脾細胞は、異種性T細胞応答の決定のために、H1/PR/8インフルエンザウイルス由来の全長HAに及ぶペプチドプールで刺激された。刺激されたCD4+及びCD8+T細胞は、マッチしていないH1-PR8ペプチドプール(図2g、j及びm)と反応し、異種ウイルス株由来のHA抗原に共通のT細胞エピトープが存在することを示唆した。バイシストロン性ワクチン候補に対する交差反応性T細胞応答は、脾細胞の量が限られているため試験されなかった。
【０３４７】
[実施例5]
H3、H1、H5及びH7インフルエンザ亜型のHAを発現するSAMベクターのカクテルによるワクチン接種
機能性抗体の誘導
本研究では、4つの異なるインフルエンザ亜型(H1N1、H3N2、H5N1及びH7N9)由来のHAを発現する10のSAMレプリコンのカクテルで構成される多価ワクチンの免疫原性を評価した。3、4、6又は10個の異なるmRNA(各0.1μg)のカクテルは、脂質ナノ粒子(LNP)中に封入された。10匹のBalb/cマウス群は、多価SAM(HA)ワクチン又はPBSを用いてi.m.で免疫化された。2回目の免疫化(35日目)の2週間後に血清試料を回収し、HIアッセイにより機能性抗体を研究した。
【０３４８】
最初に、ワクチン接種されたマウスの血清は、SAM(HA)カクテルワクチンに含まれるものと同一のインフルエンザHAウイルス抗原で分析された(相同性応答) (図3a〜g)。ワクチン接種されたすべてのマウスは、機能的抗体反応を誘導することが示された。3種のSAM(HA)を含有するワクチンカクテル群(群2及び3)に対する機能的抗体反応は、カクテル群6(10種のSAM(HAs)を含有する)よりも強い反応を示した。
【０３４９】
多価ワクチンが、マッチしていないインフルエンザウイルスに対する防御に役割を果たすかどうかを評価するために、血清試料は異種インフルエンザウイルス抗原で分析された。交差反応性の機能性抗体は、H7N9(A/安徽省/2013)(図3)を除くすべての異種ウイルス株に対して認められた。H3N2亜型ではより大きな反応が観察された。異なるワクチンカクテルに対するHI応答の大きさもまた分析された。同一亜型の6種類の異なるRNA(群5)を有するLNPと比較して、3種のSAM RNA(群2及び3)を有するLNPは、抗体応答を1.1〜2.7倍(P<0.3006)に増加させた(図3d〜g)。一方、他の亜型(群2及び群3対群6)由来のSAMレプリコンの存在下では、3つのSAMレプリコンは応答を1.3〜2.6倍に増加させた(P<0.0252)(図3d〜g)。10種のSAM RNA(群6)と比較して、6種のSAM RNA(群5)ではLNPの増加は見出されなかった。群4と群6の間で1.7〜4倍の増加が検出された(P<0.0094)(図3a及びb)。
【０３５０】
CD4+を介した免疫応答の誘導
多価SAM(HA)ワクチン誘導CD4+T細胞応答が、マッチしていないインフルエンザウイルスに対する防御をもたらすかどうかを決定するために、マウス群に多価SAM(HA)ワクチンを3週間の間隔で2回ワクチン接種した。CD4+T細胞応答は、全長組換えHAタンパク質及びペプチドプールを用いて、ワクチン接種されたBalb/cマウス由来の脾細胞をin vitroで刺激することによって分析された。
【０３５１】
第一に、相同インフルエンザウイルス由来のHA組換えタンパク質又はペプチドに対するCD4+T細胞応答を試験した:A/福建省/411/2002、A/ブリスベン/10/2007、A/テキサス/50/2012(H3N2)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5N1)及びA/カリフォルニア/07/2009、A/PR/8/1934(H1N1)。結果は、すべての相同インフルエンザHAに対するCD4+T細胞応答を示した(図4a〜f)。興味深いことに、A/カリフォルニア/07/2009、A/PR/8/1934(H1N1)及びA/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5N1)由来のペプチドプールを用いて刺激されたCD4+T細胞はまた、SAM多価ワクチンにこれらの株由来の抗原が含まれていない他の群において応答を誘導した(図4a〜c)。多価SAMワクチンによって付与される交差防御を決定するために、本発明者らは、亜型内及び異種亜型ウイルス株を用いてマウス脾細胞を分析した。H3(群2、3、5及び6)HAを含有するすべてのSAM(HA)ワクチン群は、遠縁又は近縁のH3N2インフルエンザウイルス株に対して交差反応性CD4+T細胞応答を誘導した。これらの結果は、ウイルスの亜型内株が十分な数のT細胞エピトープを共有していることを示唆する。さらに、HA抗原がSAM(HA)多価ワクチンに含まれていない他の亜型に対して、CD4+T細胞応答が検出された(図4k及びl)。しかしながら、CD4+T細胞を発現するサイトカインの細胞頻度はわずか0.1%未満であった。HA抗原を発現する10個のSAM(HA)を有する群6のCD4 T細胞応答は、SAM(HA)抗原が少ないものと同等の応答を示し、多価インフルエンザワクチンの開発のためのSAMワクチンプラットフォームの有用性を示唆する。
【０３５２】
考察
グリコシル化パターンは直接的に病原性に寄与し、インフルエンザウイルスの異なる抗原性に部分的に関与している。HAの球状頭部ドメイン上に存在するグリコシル化部位は、機能性を損なうことなく置換に耐えることができ、生成される抗体は、一般的に、限定された幅の交差反応性を有する株特異的である(Gomez Lorenzo et al, Chest 2013;143:502-10)。対照的に、HAステムドメインは、いくつかのウイルス株にわたって高度に保存されており、多くの研究では、ステムに対する抗体は交差中和特性で見出される(Sun et al, J Virol, 2013;87:8756-66及びNabel et al, Nat Med 2010;16:1389-91)。したがって、HAは多価インフルエンザワクチンの魅力的な候補である。本実施例では、HA抗原におけるグリコシル化の高い変動性のために、H3N2亜型を含有する多価ワクチンに焦点が当てられる。過去及び現在の季節性ワクチン及びパンデミック株のほとんどが選択された。特に、H3株を1968〜2012年に選択して、頭部のグリコシル化部位に見られる多様性を試み、捕捉した。
【０３５３】
本明細書に記載される実験は、Balb/cマウスモデルにおける交差防御B及びT細胞免疫応答を探索するために、H1、H3、H5及びH7亜型由来の3、4、6又は10 SAM(HA)を組み合わせることによるカクテル戦略を用いる。特定の株の配列を表2に示す。多価SAM(HA)ワクチンは、HIアッセイにより相同及び異種インフルエンザウイルスに対する機能性抗体の誘導について試験された。高いアミノ酸相同性(下記の表1を参照)のため、相同及び亜型内抗体反応が観察された(図3h、i、j及びl)。
【０３５４】
【表１】
2021534182.tif 000030
【０３５５】
ClustalW(EMBL-EBI)ツールは、H1-Cal (A/カリフォルニア/07/2009); H1-PR8 (A/PR/8/1934); H5-turkey (A/シチメンチョウ/トルコ/5/2005); H3-Biltho (A/ビルトホーフェン/16398/1968); H3-Bang (A/バンコク/1/79); H3-Beij (A/北京/32/92); H3-Fuj (A/福建省/411/2002); H3-Bris (A/ブリスベン/10/2007); H3-Tex (A/テキサス/50/2012); H7-Anh (A/安徽省/1/2013); H3-Mem (A/メンフィス/1/1971); H3-Mos (A/モスクワ/10/1999); H2-Jap (A/日本/305/1957); H10-Ho (A/ダック/香港/562/1979)の全長HA遺伝子配列についてのアミノ酸類似性検索のために使用された。
【０３５６】
【表２】
2021534182.tif 000031
【０３５７】
異型ウイルス株に対する交差反応性機能抗体が存在しないにもかかわらず、SAM(HA) H3N2多価ワクチンによるワクチン接種は、A/PR/8/1934(H1N1)、A/カリフォルニア/07/2009(H1N1)及びA/シチメンチョウ/トルコ/2005(H5N1)に対して交差防御CD4+T細胞を示した(図4a〜c)。異型CD4+T細胞応答はまた、H7N9、H10N9及びH2N2に対して検出されたが、その程度は少なかった。
【０３５８】
本研究では、SAM技術に基づく代替ワクチンプラットフォーム技術を用いて、複数のインフルエンザ抗原を同時に送達し、防御免疫応答を誘導する。このワクチンプラットフォーム技術は、広範囲の免疫応答を誘導し、抗原性を損なうことなく同時に複数のインフルエンザ抗原を送達することができる。この技術は、普遍的なインフルエンザワクチンの開発に有益である可能性がある。
【０３５９】
項
項1. (i)第1の抗原を含むポリペプチドをコードする第1の自己複製RNA分子、及び(ii)第2の抗原を含むポリペプチドをコードする第2の自己複製RNA分子を含む免疫原性組成物であって、第1の抗原及び第2の抗原はともにインフルエンザウイルス由来であるが、第1の抗原が第2の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来である、免疫原性組成物。
項2. 第1及び第2の抗原がヘマグルチニン(HA)である、項1に記載の免疫原性組成物。
項3. 第1及び第2の抗原が、ヘマグルチニン(HA)の免疫原性断片又は変異体である、項1に記載の免疫原性組成物。
項4. 第1の抗原が、第2の抗原とは異なるインフルエンザウイルスの亜型由来である、先行するいずれかの項に記載の免疫原性組成物。
項5. 第1及び第2の抗原が、自己複製RNA分子中のインフルエンザウイルス由来の唯一の抗原である、先行するいずれかの項に記載の免疫原性組成物。
項6. (iii)第3の抗原を含むポリペプチドをコードする第3の自己複製RNA分子をさらに含み、第3の抗原がインフルエンザウイルス由来であるが、第1と第2の抗原の両方とは異なるインフルエンザウイルスの株由来である、先行するいずれかの項に記載の免疫原性組成物。
項7. 第1、第2及び第3の抗原が、自己複製RNA分子中のインフルエンザウイルスに由来する唯一の抗原である、項6に記載の免疫原性組成物。
項8. (iii)第4の抗原を含むポリペプチドをコードする第4の自己複製RNA分子をさらに含み、第4の抗原がインフルエンザウイルス由来であるが、第1、第2及び第3の抗原のいずれとも異なるインフルエンザウイルスの株由来である、項6又は7に記載の免疫原性組成物。
項9. 第1の抗原がインフルエンザA亜型H1由来であり、第2の抗原が第1の抗原とは異なるH1株由来である、先行するいずれかの項に記載の免疫原性組成物。
項10. 第1及び第2の抗原がインフルエンザA亜型H3由来であり、その両方の抗原がH3インフルエンザウイルスの異なる株由来である、項1〜8のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
項11. 第1及び第2の抗原がインフルエンザA亜型H1由来であり、第3及び第4の抗原がインフルエンザA亜型H3由来であり、第1及び第2の抗原がH1ウイルスの異なる株由来であり、第3及び第4の抗原がH3インフルエンザウイルスの異なる株由来である、項8に記載の免疫原性組成物。
項12. 抗原がインフルエンザ亜型H1N1由来である、項9又は11に記載の免疫原性組成物。
項13. 抗原がインフルエンザ亜型H3N2由来である、項10又は11に記載の免疫原性組成物。
項14. 1つ以上のさらなる自己複製RNA分子をさらに含み、各々のさらなる自己複製RNA分子がさらなる抗原を含むポリペプチドをコードし、各々のさらなる抗原がインフルエンザウイルス由来であるが、組成物中の他の抗原のいずれとも異なるインフルエンザウイルスの株由来である、項8〜13のいずれかに記載の免疫原性組成物。
項15. 組成物が、5、6、7、8、9又は10個のさらなる自己複製RNA分子を含む、項14に記載の免疫原性組成物。
項16. 組成物が6つの自己複製RNA分子を含み、各々の自己複製RNA分子がインフルエンザ亜型H3N2の異なる株由来の抗原を含むポリペプチドをコードする、先行するいずれかの項に記載の免疫原性組成物。
項17. アジュバントをさらに含む、先行するいずれかの項に記載の免疫原性組成物。
項18. 自己複製RNA分子がアルファウイルス由来である、先行するいずれかの項に記載の免疫原性組成物。
項19. アルファウイルスが、シンドビス(SIN)、ベネズエラウマ脳炎(VEE)、セムリキ森林熱ウイルス(SFV)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、項18に記載の免疫原性組成物。
項20. 自己複製RNA分子がモノシストロン性である、先行するいずれかの項に記載の免疫原性組成物。
項21. 先行する項のいずれか1項に記載の免疫原性組成物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
項22. カチオン性脂質、リポソーム、微粒子、ウイルスレプリコン粒子(VRP)、水中油型エマルジョン又はカチオン性ナノエマルジョンをさらに含む、項21に記載の医薬組成物。
項23. 自己複製RNA分子が、カチオン性脂質、リポソーム、微粒子、ウイルスレプリコン粒子(VRP)、水中油型エマルジョン又はカチオン性ナノエマルジョンに封入され、結合され又は吸着される、項23に記載の医薬組成物。
項24. 自己複製RNA分子が脂質ナノ粒子(LNP)又はカチオン性ナノエマルジョン(CNE)中に製剤化される、項1〜20のいずれか1項に記載の免疫原性組成物又は項21〜23のいずれか1項に記載の医薬組成物。
項25. ワクチンとして使用するための、項1〜20のいずれか1項に記載の免疫原性組成物又は項21〜23のいずれか1項に記載の医薬組成物。
項26. インフルエンザの予防に使用するための、項1〜20のいずれか1項に記載の免疫原性組成物又は項21〜23のいずれか1項に記載の医薬組成物。
項27. 項1〜20のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、又は項21〜23のいずれか1項に記載の医薬組成物を、それを必要とするヒトに投与することを含む、インフルエンザ疾患を予防及び/又は治療する方法。
項28. 有効量の項21〜23のいずれか1項に記載の医薬組成物又は項1〜20のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を誘導するための方法。
項29. (i)第1の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第1の免疫原性組成物の投与、及び(ii)第2の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第2の免疫原性組成物の同時又は連続投与を含むインフルエンザ疾患を予防及び/又は治療する方法であって、第1及び第2の自己複製RNA分子がインフルエンザウイルス由来の抗原をコードするポリペプチドをコードするが、第1の自己複製RNA分子は、第2の自己複製RNA分子によってコードされる抗原とは異なるインフルエンザの株由来の抗原をコードする、方法。
項30. インフルエンザ疾患を予防する方法において使用するための、第1の自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第1の免疫原性組成物であって、前記方法が、第1の免疫原性組成物を必要とする対象に投与し、続いて、自己複製RNA分子及び薬学的に許容される担体を含む第2の免疫原性組成物を投与することを含み、第1及び第2の自己複製RNA分子が、各々、抗原を含むポリペプチドをコードし、抗原がインフルエンザウイルス由来であるが、第1の自己複製RNA分子によってコードされる抗原は、第2の自己複製RNA分子によってコードされる抗原とは異なるインフルエンザウイルスの株由来である、第1の免疫原性組成物。
項31. 第1及び第2の免疫原性組成物が、同時に、実質的に同時に又は連続的に投与される、項30に記載の使用のための免疫原性組成物。
項32. 第1及び第2の免疫原性組成物が、10時間未満、1秒〜10時間、又は1秒〜1時間の間隔で連続的に投与される、項30に記載の使用のための免疫原性組成物。
項33. (i)水中油型エマルジョンを提供する工程;(ii)自己複製RNA分子を含む水溶液を提供する工程;及び(iii)(ii)の水溶液及び(i)の水中油型エマルジョンを組み合わせて、それによって組成物を調製する工程を含む、項1〜20又は24のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を調製する方法。
項34. (i)ナノ粒子を形成する少なくとも1つの脂質を提供する工程;(ii)自己複製RNA分子を含む水溶液を提供する工程;及び(iii)(ii)の水溶液及び(i)の少なくとも1つの脂質を組み合わせて、それによって組成物を調製する工程を含む、項1〜20又は24のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を調製する方法。
【０３６０】
配列表
配列番号1：T7 DNAポリメラーゼプロモーターを含有するA836 TC83 VEE/SINV（ベネズエラウマ脳炎-シンドビスウイルス）キメラレプリコンのヌクレオチドcDNA配列
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【０３６１】
配列番号2：インサートを含まないA836 TC83 VEE/SINVキメラレプリコンのヌクレオチドcDNA配列
ataggcggcgcatgagagaagcccagaccaattacctacccaaaatggagaaagttcacgttgacatcgaggaagacagcccattcctcagagctttgcagcggagcttcccgcagtttgaggtagaagccaagcaggtcactgataatgaccatgctaatgccagagcgttttcgcatctggcttcaaaactgatcgaaacggaggtggacccatccgacacgatccttgacattggaagtgcgcccgcccgcagaatgtattctaagcacaagtatcattgtatctgtccgatgagatgtgcggaagatccggacagattgtataagtatgcaactaagctgaagaaaaactgtaaggaaataactgataaggaattggacaagaaaatgaaggagctcgccgccgtcatgagcgaccctgacctggaaactgagactatgtgcctccacgacgacgagtcgtgtcgctacgaagggcaagtcgctgtttaccaggatgtatacgcggttgacggaccgacaagtctctatcaccaagccaataagggagttagagtcgcctactggataggctttgacaccaccccttttatgtttaagaacttggctggagcatatccatcatactctaccaactgggccgacgaaaccgtgttaacggctcgtaacataggcctatgcagctctgacgttatggagcggtcacgtagagggatgtccattcttagaaagaagtatttgaaaccatccaacaatgttctattctctgttggctcgaccatctaccacgagaagagggacttactgaggagctggcacctgccgtctgtatttcacttacgtggcaagcaaaattacacatgtcggtgtgagactatagttagttgcgacgggtacgtcgttaaaagaatagctatcagtccaggcctgtatgggaagccttcaggctatgctgctacgatgcaccgcgagggattcttgtgctgcaaagtgacagacacattgaacggggagagggtctcttttcccgtgtgcacgtatgtgccagctacattgtgtgaccaaatgactggcatactggcaacagatgtcagtgcggacgacgcgcaaaaactgctggttgggctcaaccagcgtatagtcgtcaacggtcgcacccagagaaacaccaataccatgaaaaattaccttttgcccgtagtggcccaggcatttgctaggtgggcaaaggaatataaggaagatcaagaagatgaaaggccactaggactacgagatagacagttagtcatggggtgttgttgggcttttagaaggcacaagataacatctatttataagcgcccggatacccaaaccatcatcaaagtgaacagcgatttccactcattcgtgctgcccaggataggcagtaacacattggagatcgggctgagaacaagaatcaggaaaatgttagaggagcacaaggagccgtcacctctcattaccgccgaggacgtacaagaagctaagtgcgcagccgatgaggctaaggaggtgcgtgaagccgaggagttgcgcgcagctctaccacctttggcagctgatgttgaggagcccactctggaagccgatgtcgacttgatgttacaagaggctggggccggctcagtggagacacctcgtggcttgataaaggttaccagctacgatggcgaggacaagatcggctcttacgctgtgctttctccgcaggctgtactcaagagtgaaaaattatcttgcatccaccctctcgctgaacaagtcatagtgataacacactctggccgaaaagggcgttatgccgtggaaccataccatggtaaagtagtggtgccagagggacatgcaatacccgtccaggactttcaagctctgagtgaaagtgccaccattgtgtacaacgaacgtgagttcgtaaacaggtacctgcaccatattgccacacatggaggagcgctgaacactgatgaagaatattacaaaactgtcaagcccagcgagcacgacggcgaatacctgtacgacatcgacaggaaacagtgcgtcaagaaagaactagtcactgggctagggctcacaggcgagctggtggatcctcccttccatgaattcgcctacgagagtctgagaacacgaccagccgctccttaccaagtaccaaccataggggtgtatggcgtgccaggatcaggcaagtctggcatcattaaaagcgcagtcaccaaaaaagatctagtggtgagcgccaagaaagaaaactgtgcagaaattataagggacgtcaagaaaatgaaagggctggacgtcaatgccagaactgtggactcagtgctcttgaatggatgcaaacaccccgtagagaccctgtatattgacgaagcttttgcttgtcatgcaggtactctcagagcgctcatagccattataagacctaaaaaggcagtgctctgcggggatcccaaacagtgcggtttttttaacatgatgtgcctgaaagtgcattttaaccacgagatttgcacacaagtcttccacaaaagcatctctcgccgttgcactaaatctgtgacttcggtcgtctcaaccttgttttacgacaaaaaaatgagaacgacgaatccgaaagagactaagattgtgattgacactaccggcagtaccaaacctaagcaggacgatctcattctcacttgtttcagagggtgggtgaagcagttgcaaatagattacaaaggcaacgaaataatgacggcagctgcctctcaagggctgacccgtaaaggtgtgtatgccgttcggtacaaggtgaatgaaaatcctctgtacgcacccacctcagaacatgtgaacgtcctactgacccgcacggaggaccgcatcgtgtggaaaacactagccggcgacccatggataaaaacactgactgccaagtaccctgggaatttcactgccacgatagaggagtggcaagcagagcatgatgccatcatgaggcacatcttggagagaccggaccctaccgacgtcttccagaataaggcaaacgtgtgttgggccaaggctttagtgccggtgctgaagaccgctggcatagacatgaccactgaacaatggaacactgtggattattttgaaacggacaaagctcactcagcagagatagtattgaaccaactatgcgtgaggttctttggactcgatctggactccggtctattttctgcacccactgttccgttatccattaggaataatcactgggataactccccgtcgcctaacatgtacgggctgaataaagaagtggtccgtcagctctctcgcaggtacccacaactgcctcgggcagttgccactggaagagtctatgacatgaacactggtacactgcgcaattatgatccgcgcataaacctagtacctgtaaacagaagactgcctcatgctttagtcctccaccataatgaacacccacagagtgacttttcttcattcgtcagcaaattgaagggcagaactgtcctggtggtcggggaaaagttgtccgtcccaggcaaaatggttgactggttgtcagaccggcctgaggctaccttcagagctcggctggatttaggcatcccaggtgatgtgcccaaatatgacataatatttgttaatgtgaggaccccatataaataccatcactatcagcagtgtgaagaccatgccattaagcttagcatgttgaccaagaaagcttgtctgcatctgaatcccggcggaacctgtgtcagcataggttatggttacgctgacagggccagcgaaagcatcattggtgctatagcgcggcagttcaagttttcccgggtatgcaaaccgaaatcctcacttgaagagacggaagttctgtttgtattcattgggtacgatcgcaaggcccgtacgcacaatccttacaagctttcatcaaccttgaccaacatttatacaggttccagactccacgaagccggatgtgcaccctcatatcatgtggtgcgaggggatattgccacggccaccgaaggagtgattataaatgctgctaacagcaaaggacaacctggcggaggggtgtgcggagcgctgtataagaaattcccggaaagcttcgatttacagccgatcgaagtaggaaaagcgcgactggtcaaaggtgcagctaaacatatcattcatgccgtaggaccaaacttcaacaaagtttcggaggttgaaggtgacaaacagttggcagaggcttatgagtccatcgctaagattgtcaacgataacaattacaagtcagtagcgattccactgttgtccaccggcatcttttccgggaacaaagatcgactaacccaatcattgaaccatttgctgacagctttagacaccactgatgcagatgtagccatatactgcagggacaagaaatgggaaatgactctcaaggaagcagtggctaggagagaagcagtggaggagatatgcatatccgacgactcttcagtgacagaacctgatgcagagctggtgagggtgcatccgaagagttctttggctggaaggaagggctacagcacaagcgatggcaaaactttctcatatttggaagggaccaagtttcaccaggcggccaaggatatagcagaaattaatgccatgtggcccgttgcaacggaggccaatgagcaggtatgcatgtatatcctcggagaaagcatgagcagtattaggtcgaaatgccccgtcgaagagtcggaagcctccacaccacctagcacgctgccttgcttgtgcatccatgccatgactccagaaagagtacagcgcctaaaagcctcacgtccagaacaaattactgtgtgctcatcctttccattgccgaagtatagaatcactggtgtgcagaagatccaatgctcccagcctatattgttctcaccgaaagtgcctgcgtatattcatccaaggaagtatctcgtggaaacaccaccggtagacgagactccggagccatcggcagagaaccaatccacagaggggacacctgaacaaccaccacttataaccgaggatgagaccaggactagaacgcctgagccgatcatcatcgaagaggaagaagaggatagcataagtttgctgtcagatggcccgacccaccaggtgctgcaagtcgaggcagacattcacgggccgccctctgtatctagctcatcctggtccattcctcatgcatccgactttgatgtggacagtttatccatacttgacaccctggagggagctagcgtgaccagcggggcaacgtcagccgagactaactcttacttcgcaaagagtatggagtttctggcgcgaccggtgcctgcgcctcgaacagtattcaggaaccctccacatcccgctccgcgcacaagaacaccgtcacttgcacccagcagggcctgctcgagaaccagcctagtttccaccccgccaggcgtgaatagggtgatcactagagaggagctcgaggcgcttaccccgtcacgcactcctagcaggtcggtctcgagaaccagcctggtctccaacccgccaggcgtaaatagggtgattacaagagaggagtttgaggcgttcgtagcacaacaacaatgacggtttgatgcgggtgcatacatcttttcctccgacaccggtcaagggcatttacaacaaaaatcagtaaggcaaacggtgctatccgaagtggtgttggagaggaccgaattggagatttcgtatgccccgcgcctcgaccaagaaaaagaagaattactacgcaagaaattacagttaaatcccacacctgctaacagaagcagataccagtccaggaaggtggagaacatgaaagccataacagctagacgtattctgcaaggcctagggcattatttgaaggcagaaggaaaagtggagtgctaccgaaccctgcatcctgttcctttgtattcatctagtgtgaaccgtgccttttcaagccccaaggtcgcagtggaagcctgtaacgccatgttgaaagagaactttccgactgtggcttcttactgtattattccagagtacgatgcctatttggacatggttgacggagcttcatgctgcttagacactgccagtttttgccctgcaaagctgcgcagctttccaaagaaacactcctatttggaacccacaatacgatcggcagtgccttcagcgatccagaacacgctccagaacgtcctggcagctgccacaaaaagaaattgcaatgtcacgcaaatgagagaattgcccgtattggattcggcggcctttaatgtggaatgcttcaagaaatatgcgtgtaataatgaatattgggaaacgtttaaagaaaaccccatcaggcttactgaagaaaacgtggtaaattacattaccaaattaaaaggaccaaaagctgctgctctttttgcgaagacacataatttgaatatgttgcaggacataccaatggacaggtttgtaatggacttaaagagagacgtgaaagtgactccaggaacaaaacatactgaagaacggcccaaggtacaggtgatccaggctgccgatccgctagcaacagcgtatctgtgcggaatccaccgagagctggttaggagattaaatgcggtcctgcttccgaacattcatacactgtttgatatgtcggctgaagactttgacgctattatagccgagcacttccagcctggggattgtgttctggaaactgacatcgcgtcgtttgataaaagtgaggacgacgccatggctctgaccgcgttaatgattctggaagacttaggtgtggacgcagagctgttgacgctgattgaggcggctttcggcgaaatttcatcaatacatttgcccactaaaactaaatttaaattcggagccatgatgaaatctggaatgttcctcacactgtttgtgaacacagtcattaacattgtaatcgcaagcagagtgttgagagaacggctaaccggatcaccatgtgcagcattcattggagatgacaatatcgtgaaaggagtcaaatcggacaaattaatggcagacaggtgcgccacctggttgaatatggaagtcaagattatagatgctgtggtgggcgagaaagcgccttatttctgtggagggtttattttgtgtgactccgtgaccggcacagcgtgccgtgtggcagaccccctaaaaaggctgtttaagcttggcaaacctctggcagcagacgatgaacatgatgatgacaggagaagggcattgcatgaagagtcaacacgctggaaccgagtgggtattctttcagagctgtgcaaggcagtagaatcaaggtatgaaaccgtaggaacttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactctctacggctaacctgaatggactacgacatagtctagtccgccaagggcgcgcccacccagcggccgcatacagcagcaattggcaagctgcttacatagaactcgcggcgattggcatgccgccttaaaatttttattttatttttcttttcttttccgaatcggattttgtttttaatatttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagaagagcgtttaaacacgtgatatctggcctcatgggccttcctttcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaacatggtcatagctgtttccttgcgtattgggcgctctccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcgggtaaagcctggggtgcctaatgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaatacacggtgcctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtggccgctacagggcgctcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgtttcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacacgcgtaatacgactcactatag
【０３６２】
配列番号3：インフルエンザウイルスA/California/07/2009（H1N1）由来のヘマグルチニン（HA）のヌクレオチドcDNA配列
atgaaggcaatactagtagttctgctatatacatttgcaaccgcaaatgcagacacattatgtataggttatcatgcgaacaattcaacagacactgtagacacagtactagaaaagaatgtaacagtaacacactctgttaaccttctagaagacaagcataacgggaaactatgcaaactaagaggggtagccccattgcatttgggtaaatgtaacattgctggctggatcctgggaaatccagagtgtgaatcactctccacagcaagctcatggtcctacattgtggaaacacctagttcagacaatggaacgtgttacccaggagatttcatcgattatgaggagctaagagagcaattgagctcagtgtcatcatttgaaaggtttgagatattccccaagacaagttcatggcccaatcatgactcgaacaaaggtgtaacggcagcatgtcctcatgctggagcaaaaagcttctacaaaaatttaatatggctagttaaaaaaggaaattcatacccaaagctcagcaaatcctacattaatgataaagggaaagaagtcctcgtgctatggggcattcaccatccatctactagtgctgaccaacaaagtctctatcagaatgcagatgcatatgtttttgtggggtcatcaagatacagcaagacgttcaagccggaaatagcaataagacccaaagtgagggatcgagaagggagaatgaactattactggacactagtagagccgggagacaaaataacattcgaagcaactggaaatctagtggtaccgagatatgcattcgcaatggaaagaaatgctggatctggtattatcatttcagatacaccagtccacgattgcaatacaacttgtcaaacacccaagggtgctataaacaccagcctcccatttcagaatatacatccgatcacaattggaaaatgtccaaaatatgtaaaaagcacaaaattgagactggccacaggattgaggaatatcccgtctattcaatctagaggcctatttggggccattgccggtttcattgaaggggggtggacagggatggtagatggatggtacggttatcaccatcaaaatgagcaggggtcaggatatgcagccgacctgaagagcacacagaatgccattgacgagattactaacaaagtaaattctgttattgaaaagatgaatacacagttcacagcagtaggtaaagagttcaaccacctggaaaaaagaatagagaatttaaataaaaaagttgatgatggtttcctggacatttggacttacaatgccgaactgttggttctattggaaaatgaaagaactttggactaccacgattcaaatgtgaagaacttatatgaaaaggtaagaagccagctaaaaaacaatgccaaggaaattggaaacggctgctttgaattttaccacaaatgcgataacacgtgcatggaaagtgtcaaaaatgggacttatgactacccaaaatactcagaggaagcaaaattaaacagagaagaaatagatggggtaaagctggaatcaacaaggatttaccagattttggcgatctattcaactgtcgccagttcattggtactggtagtctccctgggggcaatcagtttctggatgtgctctaatgggtctctacagtgtagaatatgtatttgataa
【０３６３】
配列番号4：インフルエンザウイルスA/California/07/2009（H1N1）由来のHAのアミノ酸配列
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKTFKPEIAIRPKVRDREGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
【０３６４】
配列番号5：インフルエンザウイルスA/PR/8/34（H1N1）由来のHAのヌクレオチドDNA配列
ATGAAGGCAAACCTACTGGTCCTGTTATGTGCACTTGCAGCTGCAGATGCAGACACAATATGTATAGGCTACCATACGAACAATTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTCGAGAAGAATGTGACAGTGACACACTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGAAAACTATGTAGATTAAAAGGAATAGCCCCACTACAATTGGGGAAATGTAACATCGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCCAGAATGCGACCCACTGCTTCCAGTGAGATCATGGTCCTACATTGTAGAAACACCAAACTCTGAGAATGGAATATGTTATCCAGGAGATTTCATCGACTATGAGGAGCTGAGGGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTCGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAAGAAAGCTCATGGCCCAACCACAACACAAACGGAGTAACGGCAGCATGCTCCCATGAGGGGAAAAGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGGAGAAGGAGGGCTCATACCCAAAGCTGAAAAATTCTTATGTGAACAAAAAAGGGAAAGAAGTCCTTGTACTGTGGGGTATTCATCACCCGCCTAACAGTAAGGAACAACAGAATCTCTATCAGAATGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGACTTCAAATTATAACAGGAGATTTACCCCGGAAATAGCAGAAAGACCCAAAGTAAGAGATCAAGCTGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCTAAAACCCGGAGACACAATAATATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCACCAATGTATGCTTTCGCACTGAGTAGAGGCTTTGGGTCCGGCATCATCACCTCAAACGCATCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAACACCCCTGGGAGCTATAAACAGCAGTCTCCCTTACCAGAATATACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGCCCAAAATACGTCAGGAGTGCCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACATTCCGTCCATTCAATCCAGAGGTCTATTTGGAGCCATTGCCGGTTTTATTGAAGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGGATGGTATGGTTATCATCATCAGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAAACAAGGTGAACACTGTTATCGAGAAAATGAACATTCAATTCACAGCTGTGGGTAAAGAATTCAACAAATTAGAAAAAAGGATGGAAAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGATTTCTGGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTAGTTCTACTGGAAAATGAAAGGACTCTGGAATTCCATGACTCAAATGTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAAAGAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGATGTTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAATGAATGCATGGAAAGTGTAAGAAATGGGACTTATGATTATCCCAAATATTCAGAAGAGTCAAAGTTGAACAGGGAAAAGGTAGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGGATCTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGTTCTAATGGATCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGATAA
【０３６５】
配列番号6：インフルエンザウイルスA/PR/8/34（H1N1）由来のHAのアミノ酸配列
MKANLLVLLCALAAADADTICIGYHTNNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNTVIEKMNIQFTAVGKEFNKLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLEFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREKVDGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
【０３６６】
配列番号7：インフルエンザウイルスA/Bilthoven/16398/1968（H3N2）由来のHAのヌクレオチドcDNA配列
GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGATGAAGACCATCATTGCCCTGAGCTACATCTTCTGCCTGGCCCTGGGACAGGACCTGCCCGGCAACGACAATAGCACCGCCACCCTGTGTCTGGGCCACCACGCCGTGCCTAACGGCACCCTGGTGAAAACCATCACCGACGACCAGATCGAAGTGACCAACGCCACCGAGCTGGTGCAGAGCAGCAGCACCGGCAAGATCTGCAACAACCCCCACCGGATCCTGGACGGCATCAACTGCACCCTGATCGACGCCCTGCTGGGCGACCCCCACTGCGACGTGTTCCAGGACGAGACATGGGACCTGTTCGTGGAAAGAAGCAAGGCCTTCAGCAACTGCTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCAGCCTGAGAAGCCTGGTGGCCAGCAGCGGCACACTGGAATTCATCACCGAGGGCTTCACCTGGACCGGCGTGACCCAGAACGGCGGCAGCAACGCCTGCAAGAGAGGCCCTGGCAGCGGCTTCTTCAGCAGACTGAACTGGCTGACCAAGAGCGGCAGCACCTACCCCGTGCTGAACGTGACCATGCCCAACAACGACAACTTCGACAAGCTGTACATCTGGGGCGTGCACCACCCCAGCACCAACCAGGAACAGACCAGCCTGTACGTGCAGGCCAGCGGCAGAGTGACCGTGTCCACCAGAAGAAGCCAGCAGACCATCATCCCCAACATCGGCAGCAGACCCTGGGTCCGCGGCCTGAGCAGCCGGATCAGCATCTACTGGACCATCGTGAAGCCCGGCGACGTGCTGGTGATCAACAGCAACGGCAACCTGATCGCCCCCAGAGGCTACTTCAAGATGCGGACCGGCAAGAGCAGCATCATGCGGAGCGACGCCCCCATCGATACCTGCATCAGCGAGTGCATCACCCCCAACGGCAGCATCCCCAACGACAAGCCCTTCCAGAACGTGAACAAGATCACCTACGGCGCCTGCCCCAAATACGTGAAGCAGAACACCCTGAAGCTGGCCACCGGCATGCGGAACGTGCCCGAGAAGCAGACCAGAGGCCTGTTCGGCGCCATTGCCGGCTTCATCGAGAACGGCTGGGAGGGCATGATCGACGGTTGGTACGGCTTCCGGCACCAGAACAGCGAGGGCACAGGACAGGCCGCCGACCTGAAGTCTACCCAGGCCGCCATCGACCAGATCAACGGCAAGCTGAACAGAGTGATCGAAAAGACCAACGAGAAGTTCCACCAGATCGAGAAAGAATTCAGCGAGGTGGAAGGCCGGATCCAGGACCTGGAAAAGTACGTGGAAGATACCAAGATCGACCTGTGGTCCTACAACGCCGAGCTGCTGGTGGCCCTGGAAAACCAGCACACCATCGACCTGACCGACAGCGAGATGAACAAGCTGTTCGAGAAAACCAGACGGCAGCTGCGCGAGAACGCCGAGGACATGGGCAACGGCTGCTTCAAGATCTACCACAAGTGCGACAATGCCTGCATCGAGAGCATCCGGAACGGCACCTACGACCACGACGTGTACAGGGACGAGGCCCTGAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGCGTGGAACTGAAGTCCGGCTACAAGGACTGGATCCTGTGGATCAGCTTCGCCATCAGCTGCTTTCTGCTGTGCGTGGTGCTGCTGGGCTTCATCATGTGGGCCTGCCAGCGGGGCAACATCCGGTGCAACATCTGCATTTAAGGCGCGCCCACCCAGCGGCCGC
【０３６７】
配列番号8：インフルエンザウイルスA/Bilthoven/16398/1968（H3N2）由来のHAのアミノ酸配列
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSSSTGKICNNPHRILDGINCTLIDALLGDPHCDVFQDETWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFITEGFTWTGVTQNGGSNACKRGPGSGFFSRLNWLTKSGSTYPVLNVTMPNNDNFDKLYIWGVHHPSTNQEQTSLYVQASGRVTVSTRRSQQTIIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDVLVINSNGNLIAPRGYFKMRTGKSSIMRSDAPIDTCISECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
【０３６８】
配列番号9：インフルエンザウイルスA/Bangkok/1/79（H3N2）由来のHAのヌクレオチドcDNA配列
GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGATGAAGACCATCATTGCCCTGAGCTACATCTTCTGCCTGGTGTTCGCCCAGAACCTGCCCGGCAACGACAATAGCACCGCCACCCTGTGTCTGGGCCACCACGCCGTGCCTAACGGCACCCTGGTGAAAACCATCACCAACGACCAGATCGAAGTGACCAACGCCACCGAGCTGGTGCAGAGCAGCAGCACCGGCAGAATCTGCGACAGCCCCCACCGGATCCTGGACGGCAAGAACTGCACCCTGATCGACGCCCTGCTGGGCGACCCCCACTGCGACGGCTTCCAGAACGAGAAGTGGGACCTGTTCGTGGAAAGAAGCAAGGCCTTCAGCAACTGCTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCAGCCTGAGAAGCCTGGTGGCCAGCAGCGGCACACTGGAATTCATCAACGAGGGCTTCAACTGGACCGGCGTGACCCAGAGCGGCGGCAGCTATGCCTGCAAGAGAGGCAGCGACAAGAGCTTCTTCAGCAGACTGAACTGGCTGTACGAGAGCGAGAGCAAGTACCCCGTGCTGAACGTGACCATGCCCAACAACGGCAACTTCGACAAGCTGTACATCTGGGGCGTGCACCACCCCAGCACCGACAAAGAACAGACCAACCTGTACGTGCGGGCCAGCGGCAGAGTGACCGTGTCCACCAAGAGAAGCCAGCAGACCATCATCCCCAACATCGGCAGCAGACCCTGGGTCCGCGGCCTGAGCAGCGGCATCAGCATCTACTGGACCATCGTGAAGCCCGGCGACATCCTGCTGATCAACAGCAACGGCAACCTGATCGCCCCCAGAGGCTACTTCAAGATCCGGACCGGCAAGAGCAGCATCATGCGGAGCGACGCCCCCATCGGGACCTGCAGCAGCGAGTGCATCACCCCCAACGGCAGCATCCCCAACGACAAGCCCTTCCAGAACGTGAACAAGATCACCTACGGCGCCTGCCCCAAATACGTGAAGCAGAACACCCTGAAGCTGGCCACCGGCATGCGGAACGTGCCCGAGAAGCAGACCAGAGGCATCTTCGGCGCCATTGCCGGCTTCATCGAGAACGGCTGGGAGGGCATGGTGGACGGTTGGTACGGCTTCCGGCACCAGAACAGCGAGGGCACAGGACAGGCCGCCGACCTGAAGTCTACCCAGGCCGCCATCGACCAGATCAACGGCAAGCTGAACAGAGTGATCGAAAAGACCAACGAGAAGTTCCACCAGATCGAGAAAGAATTCAGCGAGGTGGAAGGCCGGATCCAGGACCTGGAAAAGTACGTGGAAGATACCAAGATCGACCTGTGGTCCTACAACGCCGAGCTGCTGGTGGCCCTGGAAAACCAGCACACCATCGACCTGACCGACAGCGAGATGAACAAGCTGTTCGAGAAAACCAGACGGCAGCTGCGCGAGAACGCCGAGGACATGGGCAACGGCTGCTTCAAGATCTACCACAAGTGCGACAATGCCTGCATCGGCAGCATCCGGAACGGCACCTACGACCACGACGTGTACAGGGACGAGGCCCTGAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGCGTGGAACTGAAGTCCGGCTACAAGGACTGGATCCTGTGGATCAGCTTCGCCATCAGCTGCTTTCTGCTGTGCGTGGTGCTGCTGGGCTTCATCATGTGGGCCTGCCAGAAAGGCAACATCCGGTGCAACATCTGCATTTAAGGCGCGCCCACCCAGCGGCCGC
【０３６９】
配列番号10：インフルエンザウイルスA/Bangkok/1/79（H3N2）由来のHAのアミノ酸配列
MKTIIALSYIFCLVFAQNLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHRILDGKNCTLIDALLGDPHCDGFQNEKWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINEGFNWTGVTQSGGSYACKRGSDKSFFSRLNWLYESESKYPVLNVTMPNNGNFDKLYIWGVHHPSTDKEQTNLYVRASGRVTVSTKRSQQTIIPNIGSRPWVRGLSSGISIYWTIVKPGDILLINSNGNLIAPRGYFKIRTGKSSIMRSDAPIGTCSSECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQKGNIRCNICI
【０３７０】
配列番号11：インフルエンザウイルスA/Beijing/32/92（H3N2）由来のHAのヌクレオチドcDNA配列
GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGATGAAGACCATCATTGCCCTGAGCTACATCCTGTGCCTGGTGTTCGCCCAGAAGCTGCCCGGCAACGACAATAGCACCGCCACCCTGTGTCTGGGCCACCACGCCGTGCCTAACGGCACCCTGGTGAAAACCATCACCAACGACCAGATCGAAGTGACCAACGCCACCGAGCTGGTGCAGAGCAGCAGCACCGGCAGAATCTGCGACAGCCCCCACCGGATCCTGGACGGCAAGAACTGCACCCTGATCGACGCCCTGCTGGGCGACCCCCACTGCGACGGCTTCCAGAACAAAGAGTGGGACCTGTTCGTGGAAAGAAGCAAGGCCTACAGCAACTGCTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCAGCCTGAGAAGCCTGGTGGCCAGCAGCGGCACACTGGAATTCATCAACGAGGACTTCAACTGGACCGGCGTGGCCCAGGATGGCGGCAGCTATGCCTGCAAGAGAGGCAGCGTGAACAGCTTCTTCAGCAGACTGAACTGGCTGCACAAGAGCGAGTACAAGTACCCCGCCCTGAACGTGACCATGCCCAACAACGGCAAGTTCGACAAGCTGTACATCTGGGGCGTGCACCACCCCAGCACCGACAGGGACCAGACCAGCCTGTACGTGCGGGCCAGCGGCAGAGTGACCGTGTCCACCAAGAGAAGCCAGCAGACCGTGACCCCCAACATCGGCAGCAGACCCTGGGTCCGCGGCCAGAGCAGCCGGATCAGCATCTACTGGACCATCGTGAAGCCCGGCGACATCCTGCTGATCAACAGCACAGGCAACCTGATCGCCCCCAGAGGCTACTTCAAGATCCGGAACGGCAAGAGCAGCATCATGCGGAGCGACGCCCCCATCGGGACCTGCAGCAGCGAGTGCATCACCCCCAACGGCAGCATCCCCAACGACAAGCCCTTCCAGAACGTGAACCGGATCACCTACGGCGCCTGCCCCAGATACGTGAAGCAGAACACCCTGAAGCTGGCCACCGGCATGCGGAACGTGCCCGAGAAGCAGACCAGAGGCATCTTCGGCGCCATTGCCGGCTTCATCGAGAACGGCTGGGAGGGCATGGTGGACGGTTGGTACGGCTTCCGGCACCAGAACAGCGAGGGCACAGGACAGGCCGCCGACCTGAAGTCTACCCAGGCCGCCATCGACCAGATCAACGGCAAGCTGAACAGACTGATCGAAAAGACCAACGAGAAGTTCCACCAGATCGAGAAAGAATTCAGCGAGGTGGAAGGCCGGATCCAGGACCTGGAAAAGTACGTGGAAGATACCAAGATCGACCTGTGGTCCTACAACGCCGAGCTGCTGGTGGCCCTGGAAAACCAGCACACCATCGACCTGACCGACAGCGAGATGAACAAGCTGTTCGAGAAAACCAGAAAGCAGCTGCGCGAGAACGCCGAGGACATGGGCAACGGCTGCTTCAAGATCTACCACAAGTGCGACAATGCCTGCATCGGCAGCATCCGGAACGGCACCTACGACCACGACGTGTACAGGGACGAGGCCCTGAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGCGTGGAACTGAAGTCCGGCTACAAGGACTGGATCCTGTGGATCAGCTTCGCCATCAGCTGCTTTCTGCTGTGCGTGGTGCTGCTGGGCTTCATCATGTGGGCCTGCCAGAAAGGCAACATCCGGTGCAACATCTGCATTTAAGGCGCGCCCACCCAGCGGCCGC
【０３７１】
配列番号12：インフルエンザウイルスA/Beijing/32/92（H3N2）由来のHAのアミノ酸配列
MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHRILDGKNCTLIDALLGDPHCDGFQNKEWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINEDFNWTGVAQDGGSYACKRGSVNSFFSRLNWLHKSEYKYPALNVTMPNNGKFDKLYIWGVHHPSTDRDQTSLYVRASGRVTVSTKRSQQTVTPNIGSRPWVRGQSSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRNGKSSIMRSDAPIGTCSSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQKGNIRCNICI
【０３７２】
配列番号13：インフルエンザウイルスA/Fujain/411/2002（H3N2）由来のHAのヌクレオチドcDNA配列
GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGATGAAGACCATCATTGCCCTGAGCTACATCCTGTGCCTGGTGTTCGCCCAGAAGCTGCCCGGCAACGACAATAGCACCGCCACCCTGTGTCTGGGCCACCACGCCGTGCCTAACGGCACCATCGTGAAAACCATCACCAACGACCAGATCGAAGTGACCAACGCCACCGAGCTGGTGCAGAGCAGCAGCACCGGCGGCATCTGCGACAGCCCCCACCAGATCCTGGACGGCGAGAACTGCACCCTGATCGACGCCCTGCTGGGCGACCCCCAGTGCGACGGCTTCCAGAACAAGAAATGGGACCTGTTCGTGGAAAGAAGCAAGGCCTACAGCAACTGCTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCAGCCTGAGAAGCCTGGTGGCCAGCAGCGGCACACTGGAATTCAACAACGAGAGCTTCAACTGGACCGGCGTGACCCAGAACGGCACCAGCAGCGCCTGCAAGAGAAGAAGCAACAAGAGCTTCTTCAGCAGACTGAACTGGCTGACCCACCTGAAGTACAAGTACCCCGCCCTGAACGTGACCATGCCCAACAACGAAAAGTTCGACAAGCTGTACATCTGGGGCGTGCTGCACCCCGGCACCGACAGCGACCAGATCAGCCTGTACGCCCAGGCCAGCGGCAGAATCACCGTGTCCACCAAGAGAAGCCAGCAGACCGTGATCCCCAACATCGGCAGCAGACCCAGAGTCCGCGGCGTGAGCAGCCGGATCAGCATCTACTGGACCATCGTGAAGCCCGGCGACATCCTGCTGATCAACAGCACCGGCAACCTGATCGCCCCCAGAGGCTACTTCAAGATTCGGAGCGGCAAGAGCAGCATCATGCGGAGCGACGCCCCCATCGGCAAGTGCAACAGCGAGTGCATCACCCCCAACGGCAGCATCCCCAACGACAAGCCCTTCCAGAACGTGAACCGGATCACCTACGGCGCCTGCCCCCGGTACATCAAGCAGAACACCCTGAAGCTGGCCACCGGCATGCGGAACGTGCCCGAGAAGCAGACCAGAGGCATCTTCGGCGCCATTGCCGGCTTCATCGAGAACGGCTGGGAGGGCATGGTGGACGGTTGGTACGGCTTCCGGCACCAGAACAGCGAGGGCACAGGACAGGCCGCCGACCTGAAGTCTACCCAGGCCGCCATCAACCAGATCAACGGCAAGCTGAACAGACTGATCGGCAAGACCAACGAGAAGTTCCACCAGATCGAGAAAGAATTCAGCGAGGTGGAAGGCCGGATCCAGGACCTGGAAAAGTACGTGGAAGATACCAAGATCGACCTGTGGTCCTACAACGCCGAGCTGCTGGTGGCCCTGGAAAACCAGCACACCATCGACCTGACCGACAGCGAGATGAACAAGCTGTTCGAGCGGACCAAGAAGCAGCTGCGCGAGAACGCCGAGGACATGGGCAACGGCTGCTTCAAGATCTACCACAAGTGCGACAATGCCTGCATCGGCAGCATCCGGAACGGCACCTACGACCACGACGTGTACAGGGACGAGGCCCTGAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGCGTGGAACTGAAGTCCGGCTACAAGGACTGGATCCTGTGGATCAGCTTCGCCATCAGCTGCTTTCTGCTGTGCGTGGCCCTGCTGGGCTTCATCATGTGGGCCTGCCAGAAAGGCAACATCCGGTGCAACATCTGCATTTAAGGCGCGCCCACCCAGCGGCCGC
【０３７３】
配列番号14：インフルエンザウイルスA/Fujain/411/2002（H3N2）由来のHAのアミノ酸配列
MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACKRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVLHPGTDSDQISLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRVRGVSSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYIKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI
【０３７４】
配列番号15：インフルエンザウイルスA/Brisbane/10/2007（H3N2）由来のHAのヌクレオチドcDNA配列
GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGATGAAGACCATCATTGCCCTGAGCTACATCCTGTGCCTGGTGTTCACCCAGAAGCTGCCCGGCAACGACAATAGCACCGCCACCCTGTGTCTGGGCCACCACGCCGTGCCTAACGGCACCATCGTGAAAACCATCACCAACGACCAGATCGAAGTGACCAACGCCACCGAGCTGGTGCAGAGCAGCAGCACCGGCGAGATCTGCGACAGCCCCCACCAGATCCTGGACGGCGAGAACTGCACCCTGATCGACGCCCTGCTGGGCGACCCCCAGTGCGACGGCTTCCAGAACAAGAAATGGGACCTGTTCGTGGAAAGAAGCAAGGCCTACAGCAACTGCTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCAGCCTGAGAAGCCTGGTGGCCAGCAGCGGCACACTGGAATTCAACAACGAGAGCTTCAACTGGACCGGCGTGACCCAGAACGGCACCAGCAGCGCCTGCATCAGAAGAAGCAACAACAGCTTCTTCAGCAGACTGAACTGGCTGACCCACCTGAAGTTCAAGTACCCCGCCCTGAACGTGACCATGCCCAACAACGAAAAGTTCGACAAGCTGTACATCTGGGGCGTGCACCACCCCGGCACCGACAACGATCAGATCTTCCCATACGCCCAGGCCAGCGGCAGAATCACCGTGTCCACCAAGAGAAGCCAGCAGACCGTGATCCCCAACATCGGCAGCAGACCCAGAGTCCGCAACATCCCCAGCCGGATCAGCATCTACTGGACCATCGTGAAGCCCGGCGACATCCTGCTGATCAACAGCACCGGCAACCTGATCGCCCCCAGAGGCTACTTCAAGATTCGGAGCGGCAAGAGCAGCATCATGCGGAGCGACGCCCCCATCGGCAAGTGCAACAGCGAGTGCATCACCCCCAACGGCAGCATCCCCAACGACAAGCCCTTCCAGAACGTGAACCGGATCACCTACGGCGCCTGCCCCAGATACGTGAAGCAGAACACCCTGAAGCTGGCCACCGGCATGCGGAACGTGCCCGAGAAGCAGACCAGAGGCATCTTCGGCGCCATTGCCGGCTTCATCGAGAACGGCTGGGAGGGCATGGTGGACGGTTGGTACGGCTTCCGGCACCAGAACAGCGAGGGCATTGGACAGGCCGCCGACCTGAAGTCTACCCAGGCCGCCATCGACCAGATCAACGGCAAGCTGAACAGACTGATCGGCAAGACCAACGAGAAGTTCCACCAGATCGAGAAAGAATTCAGCGAGGTGGAAGGCCGGATCCAGGACCTGGAAAAGTACGTGGAAGATACCAAGATCGACCTGTGGTCCTACAACGCCGAGCTGCTGGTGGCCCTGGAAAACCAGCACACCATCGACCTGACCGACAGCGAGATGAACAAGCTGTTCGAGAAAACCAAGAAGCAGCTGCGCGAGAACGCCGAGGACATGGGCAACGGCTGCTTCAAGATCTACCACAAGTGCGACAATGCCTGCATCGGCAGCATCCGGAACGGCACCTACGACCACAACGTGTACAGGGACGAGGCCCTGAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGCGTGGAACTGAAGTCCGGCTACAAGGACTGGATCCTGTGGATCAGCTTCGCCATCAGCTGCTTTCTGCTGTGCGTGGCCCTGCTGGGCTTCATCATGTGGGCCTGCCAGAAAGGCAACATCCGGTGCAACATCTGCATTTAAGGCGCGCCCACCCAGCGGCCGC
【０３７５】
配列番号16：インフルエンザウイルスA/Brisbane/10/2007（H3N2）由来のHAのアミノ酸配列
MKTIIALSYILCLVFTQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSNNSFFSRLNWLTHLKFKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPGTDNDQIFPYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRVRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGIGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHNVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI
【０３７６】
配列番号17：インフルエンザウイルスA/Texas/50/2012（H3N2）由来のHAのヌクレオチドcDNA配列
GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGATGAAGACCATCATTGCCCTGAGCTACATCCTGTGCCTGGTGTTCGCCCAGAAGCTGCCCGGCAACGACAATAGCACCGCCACCCTGTGTCTGGGCCACCACGCCGTGCCTAACGGCACCATCGTGAAAACCATCACCAACGACCGGATCGAAGTGACCAACGCCACCGAGCTGGTGCAGAACAGCAGCATCGGCGAGATCTGCGACAGCCCCCACCAGATCCTGGACGGCGAGAACTGCACCCTGATCGACGCCCTGCTGGGCGACCCCCAGTGCGACGGCTTCCAGAACAAGAAATGGGACCTGTTCGTGGAAAGAAGCAAGGCCTACAGCAACTGCTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCAGCCTGAGAAGCCTGGTGGCCAGCAGCGGCACACTGGAATTCAACAACGAGAGCTTCAACTGGAACGGCGTGACCCAGAACGGCACCAGCAGCGCCTGCATCAGAAGAAGCAACAACAGCTTCTTCAGCAGACTGAACTGGCTGACCCACCTGAACTTCAAGTACCCCGCCCTGAACGTGACCATGCCCAACAACGAGCAGTTCGACAAGCTGTACATCTGGGGCGTGCACCACCCCGGCACCGACAAGGACCAGATCTTCCTGTACGCCCAGCCCAGCGGCAGAATCACCGTGTCCACCAAGAGAAGCCAGCAGGCCGTGATCCCCAACATCGGCAGCAGACCCCGGATCCGCAACATCCCCAGCCGGATCAGCATCTACTGGACCATCGTGAAGCCCGGCGACATCCTGCTGATCAACAGCACCGGCAACCTGATCGCCCCCAGAGGCTACTTCAAGATTCGGAGCGGCAAGAGCAGCATCATGCGGAGCGACGCCCCCATCGGCAAGTGCAAGAGCGAGTGCATCACCCCCAACGGCAGCATCCCCAACGACAAGCCCTTCCAGAACGTGAACCGGATCACCTACGGCGCCTGCCCCAGATACGTGAAGCAGAGCACCCTGAAGCTGGCCACCGGCATGCGGAACGTGCCCGAGAAGCAGACCAGAGGCATCTTCGGCGCCATTGCCGGCTTCATCGAGAACGGCTGGGAGGGCATGGTGGACGGTTGGTACGGCTTCCGGCACCAGAACAGCGAGGGCAGAGGACAGGCCGCCGACCTGAAGTCTACCCAGGCCGCCATCGACCAGATCAACGGCAAGCTGAACAGACTGATCGGCAAGACCAACGAGAAGTTCCACCAGATCGAGAAAGAATTCAGCGAGGTGGAAGGCCGGATCCAGGACCTGGAAAAGTACGTGGAAGATACCAAGATCGACCTGTGGTCCTACAACGCCGAGCTGCTGGTGGCCCTGGAAAACCAGCACACCATCGACCTGACCGACAGCGAGATGAACAAGCTGTTCGAGAAAACCAAGAAGCAGCTGCGCGAGAACGCCGAGGACATGGGCAACGGCTGCTTCAAGATCTACCACAAGTGCGACAATGCCTGCATCGGCAGCATCCGGAACGGCACCTACGACCACGACGTGTACAGGGACGAGGCCCTGAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGCGTGGAACTGAAGTCCGGCTACAAGGACTGGATCCTGTGGATCAGCTTCGCCATCAGCTGCTTTCTGCTGTGCGTGGCCCTGCTGGGCTTCATCATGTGGGCCTGCCAGAAAGGCAACATCCGGTGCAACATCTGCATTTAAGGCGCGCCCACCCAGCGGCCGC
【０３７７】
配列番号18：インフルエンザウイルスA/Texas/50/2012（H3N2）由来のHAのアミノ酸配列
MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWNGVTQNGTSSACIRRSNNSFFSRLNWLTHLNFKYPALNVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAQPSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQSTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI
【０３７８】
配列番号19：インフルエンザウイルスA/turkey/Turkey/1/2005（H5N1）由来のHAのヌクレオチドcDNA配列
atggagaaaatagtgcttcttcttgcaatagtcagccttgttaaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaactcgacagagcaggttgacacaataatggaaaagaacgtcactgttacacacgcccaagacatactggaaaagacacacaacgggaaactctgcgatctagatggagtgaagcctctaattttaagagattgtagtgtagctggatggctcctcgggaacccaatgtgtgacgaattcctcaatgtgccggaatggtcttacatagtggagaagatcaatccagccaatgacctctgttacccagggaatttcaacgactatgaagaactgaaacacctattgagcagaataaaccattttgagaaaattcagatcatccccaaaagttcttggtcagatcatgaagcctcagcaggggtgagctcagcatgtccataccagggaaggtcctccttttttagaaatgtggtatggcttatcaaaaaggacaatgcatacccaacaataaagagaagttacaataataccaaccaagaagatcttttggtattgtgggggattcaccatccaaatgatgcggcagagcagacaaggctctatcaaaacccaactacctatatttccgttgggacatcaacactaaaccagagattggtaccaaaaatagccactagatctaaggtaaacgggcaaagtggaaggatggagttcttttggacaattttaaaaccgaatgatgcaataaactttgagagtaatggaaatttcattgctccagaaaatgcatacaaaattgtcaagaaaggggactcaacaattatgaaaagtgagttggaatatggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaataggggcgataaactctagtatgccattccacaacatccaccctctcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaagcagattagtccttgctactgggctcagaaatagccctcaacgagagacacgaggactatttggagctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtaccaccatagcaacgagcaggggagtgggtacgctgcagacaaagaatccactcaaaaggcaatagatggagtcaccaataaggtcaactcgatcattgacaaaatgaacactcagtttgaggctgttggaagggaatttaataacttagaaaggagaatagaaaatttaaacaagaagatggaagacggattcctagatgtctggacttataatgctgaacttctggttctcatggaaaatgagagaactctagactttcatgactcaaatgtcaagaacctttacgacaaggtccgactacagcttagggataatgcaaaggagcttggtaacggttgtttcgagttctatcacagatgtgataatgaatgtatggaaagtgtaagaaacggaacgtatgactacccgcagtattcagaagaagcaagattaaaaagagaggaaataagtggagtaaaattggaatcaataggaacttaccaaatactgtcaatttattcaacagtggcgagctccctagcactggcaatcatggtggctggtctatctttatggatgtgctccaatggatcgttacaatgcagaatttgcatttaa
【０３７９】
配列番号20：インフルエンザウイルスA/turkey/Turkey/1/2005（H5N1）由来のHAのアミノ酸配列
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKINPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASAGVSSACPYQGRSSFFRNVVWLIKKDNAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSSRLVLATGLRNSPQRETRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI
【０３８０】
配列番号21：インフルエンザウイルスA/Shanghai/2/2013（H7N9）由来のHAのヌクレオチドcDNA配列
ATGAACACTCAAATCCTGGTATTCGCTCTGATTGCGATCATTCCAACAAATGCAGACAAAATCTGCCTCGGACATCATGCCGTGTCAAACGGAACCAAAGTAAACACATTAACTGAAAGAGGAGTGGAAGTCGTCAATGCAACTGAAACAGTGGAACGAACAAACATCCCCAGGATCTGCTCAAAAGGGAAAAGGACAGTTGACCTCGGTCAATGTGGACTCCTGGGGACAATCACTGGACCACCTCAATGTGACCAATTCCTAGAATTTTCAGCCGATTTAATTATTGAGAGGCGAGAAGGAAGTGATGTCTGTTATCCTGGGAAATTCGTGAATGAAGAAGCTCTGAGGCAAATTCTCAGAGAATCAGGCGGAATTGACAAGGAAGCAATGGGATTCACATACAGTGGAATAAGAACTAATGGAGCAACCAGTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAGAAATGAAATGGCTCCTGTCAAACACAGATAATGCTGCATTCCCGCAGATGACTAAGTCATATAAAAATACAAGAAAAAGCCCAGCTCTAATAGTATGGGGGATCCATCATTCCGTATCAACTGCAGAGCAAACCAAGCTATATGGGAGTGGAAACAAACTGGTGACAGTTGGGAGTTCTAATTATCAACAATCTTTTGTACCGAGTCCAGGAGCGAGACCACAAGTTAATGGTCTATCTGGAAGAATTGACTTTCATTGGCTAATGCTAAATCCCAATGATACAGTCACTTTCAGTTTCAATGGGGCTTTCATAGCTCCAGACCGTGCAAGCTTCCTGAGAGGAAAATCTATGGGAATCCAGAGTGGAGTACAGGTTGATGCCAATTGTGAAGGGGACTGCTATCATAGTGGAGGGACAATAATAAGTAACTTGCCATTTCAGAACATAGATAGCAGGGCAGTTGGAAAATGTCCGAGATATGTTAAGCAAAGGAGTCTGCTGCTAGCAACAGGGATGAAGAATGTTCCTGAGATTCCAAAAGGAAGAGGCCTATTTGGTGCTATAGCGGGTTTCATTGAAAATGGATGGGAAGGCCTAATTGATGGTTGGTATGGTTTCAGACACCAGAATGCACAGGGAGAGGGAACTGCTGCAGATTACAAAAGCACTCAATCGGCAATTGATCAAATAACAGGAAAATTAAACCGGCTTATAGAAAAAACCAACCAACAATTTGAGTTGATAGACAATGAATTCAATGAGGTAGAGAAGCAAATCGGTAATGTGATAAATTGGACCAGAGATTCTATAACAGAAGTGTGGTCATACAATGCTGAACTCTTGGTAGCAATGGAGAACCAGCATACAATTGATCTGGCTGATTCAGAAATGGACAAACTGTACGAACGAGTGAAAAGACAGCTGAGAGAGAATGCTGAAGAAGATGGCACTGGTTGCTTTGAAATATTTCACAAGTGTGATGATGACTGTATGGCCAGTATTAGAAATAACACCTATGATCACAGCAAATACAGGGAAGAGGCAA
【０３８１】
配列番号22：インフルエンザウイルスA/Shanghai/2/2013（H7N9）由来のHAのアミノ酸配列
MNTQILVFALIAIIPTNADKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVVNATETVERTNIPRICSKGKRTVDLGQCGLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIERREGSDVCYPGKFVNEEALRQILRESGGIDKEAMGFTYSGIRTNGATSACRRSGSSFYAEMKWLLSNTDNAAFPQMTKSYKNTRKSPALIVWGIHHSVSTAEQTKLYGSGNKLVTVGSSNYQQSFVPSPGARPQVNGLSGRIDFHWLMLNPNDTVTFSFNGAFIAPDRASFLRGKSMGIQSGVQVDANCEGDCYHSGGTIISNLPFQNIDSRAVGKCPRYVKQRSLLLATGMKNVPEIPKGRGLFGAIAGFIENGWEGLIDGWYGFRHQNAQGEGTAADYKSTQSAIDQITGKLNRLIEKTNQQFELIDNEFNEVEKQIGNVINWTRDSITEVWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMDKLYERVKRQLRENAEEDGTGCFEIFHKCDDDCMASIRNNTYDHSKYREEAX
【０３８２】
配列番号23：インフルエンザH1N1 A/California/07/2009インサートのためのフォワードプライマー
ATTCCCGTCGACGCCACCATGAAGGCAATACTAGTAGTTCT
配列番号24：インフルエンザH1N1 A/California/07/2009インサートのためのリバースプライマー
ATTTACGCCTAGGTTATCAAATACATATTCTACACTGTAGAGAC
【０３８３】
配列番号25：A/Shanghai/2/2013由来のH7 HA遺伝子のためのフォワードプライマー
AATTAAGTCGACGCCACCATGAACACTCAAATCCTGGTATTCG
配列番号26：A/Shanghai/2/2013由来のH7 HA遺伝子のためのリバースプライマー
AATTAATCTAGATTATCATATACAAATAGTGCACCGCATG
【０３８４】
配列番号27：ペプチド
ALNNRFQIKGVELKS
配列番号28：SB63プライマー
catagtctagtcgacgccaccatggagaaaatagtgcttcttcttgc 
配列番号29：B74プライマー
gtcgaagttcagggtctgcttcacgggggccacgatcttctgcttgtgccgggcctcccgcttggcccgaatgcaaattctgcattgtaacgatc 
配列番号30：SB76プライマー
gtgaagcagaccctgaacttcgacctgctgaagctggccggcgacgtggagagcaaccccggccccatgaaggcaatactagtagttctgc 
配列番号31：SB66プライマー
ggcgtagcggcggccgcttatcaaatacatattctacactgtagagaccca
【図１】
2021534182.tif 000032
【図２−１】
2021534182.tif 000033
【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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