(57)【要約】  本発明は、水と、ウイルス様粒子と、少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質と、少なくとも１つの緩衝液と、を含む、水性組成物に関する。ある特定の実施形態において、ウイルス様粒子は、水中に粘膜付着性物質を含まないウイルス様粒子の比較サンプルのサイズ平均の約４倍以下のサイズ平均を有する。ある特定の実施形態において、ウイルス様粒子は、約４００ｎｍ以下のサイズ平均を有する。ある特定の実施形態において、ウイルス様粒子は、正のゼータ電位を有する。
2021534074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性組成物であって、
−  水と、
−  ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、
−  少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質と、
−  任意に約６未満のｐＨを有する少なくとも１つの緩衝液と、を含み、
前記ウイルス様粒子が、水中に前記粘膜付着性物質を含まないウイルス様粒子の比較サンプルのサイズ平均の約４倍以下のサイズ平均を有し、及び／または
前記ウイルス様粒子が、約４００ｎｍ以下のサイズ平均を有する、前記水性組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質が、約７未満のｐＫａを有し、
前記水性組成物のｐＨが、前記アミノ基を含有する粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約１ｐＨ単位、さらに酸性である、請求項１に記載の水性組成物。
【請求項３】
前記ウイルス様粒子が、水中に前記粘膜付着性物質を含まないウイルス様粒子の比較サンプルのサイズ平均の約３倍以下、または水中に前記粘膜付着性物質を含まないウイルス様粒子の比較サンプルのサイズ平均の約２．５倍以下のサイズ平均を有する、請求項１または２に記載の水性組成物。
【請求項４】
前記ウイルス様粒子が、約１０ｎｍ〜約３５０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約３００ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約２００ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約１７０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約１２０ｎｍのサイズ平均を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の水性組成物。
【請求項５】
前記ウイルス様粒子が、正のゼータ電位を有する、請求項１〜４に記載の水性組成物。
【請求項６】
前記ウイルス様粒子が、少なくとも約１５ｍＶ、または少なくとも約２０ｍＶ、または少なくとも約３０ｍＶの正のゼータ電位を有する、請求項５に記載の水性組成物。
【請求項７】
前記粘膜付着性物質の濃度が、約８ｍｇ／ｍＬ超、または約１０ｍｇ／ｍＬ超、または約１２．５ｍｇ／ｍＬ超である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の水性組成物。
【請求項８】
前記水性組成物中の前記ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の濃度が、少なくとも約５０μｇ／ｍＬであるか、または少なくとも約１００μｇ／ｍＬであるか、または少なくとも約２５０μｇ／ｍＬであるか、または少なくとも約５００μｇ／ｍＬであるか、または少なくとも約６００μｇ／ｍＬであるか、または少なくとも約７００μｇ／ｍＬであるか、または少なくとも約８００μｇ／ｍＬである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の水性組成物。
【請求項９】
ＶＬＰに対する粘膜付着性物質の重量比率が、約０．５〜約３００、または約０．５〜約１００、または約１０〜約１００、または約２０〜約１００、または約３０〜約１００、または約４０〜約１００、または約１０〜約６０、または約３０〜約６０、または約４０〜約６０、例えば、約５０である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の水性組成物。
【請求項１０】
前記緩衝液の濃度が、約２５ｍＭ〜約２０００ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約５００ｍＭである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の水性組成物。
【請求項１１】
前記緩衝液の濃度が、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、または約２００ｍＭ〜約５００ｍＭである、請求項１０に記載の水性組成物。
【請求項１２】
前記緩衝液が、酢酸緩衝液である、先行請求項のいずれか１項に記載の水性組成物。
【請求項１３】
前記粘膜付着性物質が、多糖類（炭水化物ポリマー）、誘導体化多糖類（誘導体化炭水化物ポリマー）、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、誘導体化ポリビニルアルコール、誘導体化ポリビニルピロリドン、ポリペプチド、誘導体化ポリペプチド、タンパク質、誘導体化タンパク質、誘導体化デオキシリボ核酸、及びポリエチレンイミンの群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の水性組成物。
【請求項１４】
前記粘膜付着性物質が、多糖類、具体的にはキトサンであり、前記キトサンが、任意に、キトサン塩基またはキトサン塩として混合される、請求項１３に記載の水性組成物。
【請求項１５】
前記混合した粘膜付着性物質が、キトサングルタメート、キトサン塩酸塩、キトサン酢酸塩、キトサン乳酸塩、キトサンアルギン酸塩、キトサンアスコルビン酸塩、トリメチル化キトサン、メチルグリコールキトサン、及びカルボキシメチルキトサンの群から選択される、請求項１４に記載の水性組成物。
【請求項１６】
前記混合した粘膜付着性物質が、キトサングルタメートである、請求項１５に記載の水性組成物。
【請求項１７】
ＶＬＰに対する、混合したキトサングルタメート、または等モル量の別の種類のキトサン塩もしくはキトサン塩基の重量比率が、約３０〜約１００、または約４０〜約６０、好ましくは約５０である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の水性組成物。
【請求項１８】
前記ＶＬＰが、ノロウイルスＶＬＰ、ロタウイルスＶＬＰ、ＨＰＶ  ＶＬＰ、インフルエンザウイルスＶＬＰ、デング熱ウイルスＶＬＰ、及びＢ型肝炎ウイルスＶＬＰの種の群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の水性組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、少なくとも１種のウイルスに由来するＶＬＰ、または少なくとも２種の異なるウイルスに由来するＶＬＰ、または少なくとも３種の異なるウイルスに由来するＶＬＰ、または少なくとも４種の異なるウイルスに由来するＶＬＰを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の水性組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、ノロウイルス群１（ＧＩ）のＶＬＰ及びノロウイルス群２（ＧＩＩ）のＶＬＰからなる群から選択される１つ以上の異なる遺伝子型のノロウイルスＶＬＰを含む、請求項１８または１９に記載の水性組成物。
【請求項２１】
前記緩衝液のｐＨが、約２．５〜約５．５、または約３．０〜約５．０、または約３．５〜約４．５である、先行請求項のいずれか１項に記載の水性組成物。
【請求項２２】
前記溶液のｐＨが、前記粘膜付着性物質のｐＫａよりも少なくとも約１ｐＨ単位、さらに酸性であるか、または前記粘膜付着性物質のｐＫａよりも少なくとも約１．５ｐＨ単位、さらに酸性であるか、または前記粘膜付着性物質のｐＫａよりも少なくとも約２．０ｐＨ単位、さらに酸性であるか、または前記粘膜付着性物質のｐＫａよりも少なくとも約２．５ｐＨ単位、さらに酸性であるか、または前記粘膜付着性物質のｐＫａよりも少なくとも約３．０ｐＨ単位、さらに酸性である、先行請求項のいずれか１項に記載の水性組成物。
【請求項２３】
前記溶液のｐＨが、約２．５〜約５．５であり、かつ好ましくは、前記粘膜付着性物質が、キトサンである、先行請求項のいずれか１項に記載の水性組成物。
【請求項２４】
前記溶液のｐＨが、約５．５以下、または約５以下、または約４．５以下、または約４以下であり、かつ好ましくは、前記粘膜付着性物質が、キトサンである、請求項２３に記載の水性組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、約２．５〜約５、または約２．５〜約４．５のｐＨ、例えば、約ｐＨ４または約ｐＨ３を有し、かつ好ましくは、前記粘膜付着性物質が、キトサンである、請求項２４に記載の水性組成物。
【請求項２６】
−  水と、
−  ウイルス様粒子と、
−  キトサンと、
−  約２．５〜約５のｐＨを有する少なくとも１つの緩衝液と、を含み、
前記ウイルス様粒子が、ノロウイルスウイルス様粒子であり、
前記ウイルス様粒子が、約４００ｎｍ以下のサイズ平均を有し、
ＶＬＰに対する、混合したキトサングルタメート、または等モル量の別の種類のキトサン塩もしくはキトサン塩基の重量比率が、約３０〜約１００、または約４０〜約６０、好ましくは約５０である、請求項２５に記載の水性組成物。
【請求項２７】
ミョウバンまたはＭＰＬなどのさらなるアジュバントが、前記組成物中に含まれない、先行請求項のいずれか１項に記載の水性組成物。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の水性組成物を乾燥させることによって得られる、約５ｗ／ｗ％未満、または約４ｗ／ｗ％未満、または約２ｗ／ｗ％未満、または約１ｗ／ｗ％未満、または約０．１ｗ／ｗ％未満の残留水分含有量を有する、乾燥組成物。
【請求項２９】
哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための治療に使用するための、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための粘膜投与治療に使用するための、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための経口治療に使用するための、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発する方法であって、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物を、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項３３】
哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発する方法であって、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物を、そのような治療を必要とする哺乳動物に粘膜投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発する方法であって、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物を、そのような治療を必要とする哺乳動物に経口投与することを含む、前記方法。
【請求項３５】
哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための薬物の製造における、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項３６】
哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための粘膜投与する薬物の製造における、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項３７】
哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための経口薬物の製造における、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項３８】
哺乳動物に投与した場合、血清ＩｇＡ及び／または糞便ＩｇＡのレベルの上昇をもたらす、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項３９】
哺乳動物に投与した場合、血清ＩｇＧのレベルの上昇をもたらす、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項４０】
哺乳動物に投与した場合、前記治療を受けていない対象と比較して、ノロウイルス特異的機能的抗体の血清力価の増加をもたらす、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項４１】
−  水と、
−  ウイルス様粒子と、
−  少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質と、
−  任意に約６未満のｐＨを有する少なくとも１つの緩衝液と、を含む、水性組成物を調製するプロセスであって、
前記ウイルス様粒子が、水中に前記粘膜付着性物質を含まないウイルス様粒子の比較サンプルのサイズ平均の約４倍以下のサイズ平均を有し、及び／または
前記ウイルス様粒子が、約４００ｎｍ以下のサイズ平均を有し、前記プロセスが、少なくとも、
（ａ）ウイルス様粒子を提供するステップと、
（ｂ）粘膜付着性物質を含有する水性組成物を得るために、任意に約６未満のｐＨを有する少なくとも１つの緩衝液を有する緩衝水性組成物中に少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質を提供するステップと、
（ｃ）前記ウイルス様粒子を、前記粘膜付着性物質を含有する水性組成物に添加するステップと、を含む、前記プロセス。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質が、約７未満のｐＫａを有し、
前記水性組成物のｐＨが、前記粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約１ｐＨ単位、さらに酸性であり、
ステップ（ｂ）が、粘膜付着性物質を含有する水性組成物を得るために、前記粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約１ｐＨ単位、さらに酸性のｐＨを有する緩衝水性組成物中に少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質を提供することを含む、請求項４１に記載のプロセス。
【請求項４３】
ステップ（ｂ）で添加される前記粘膜付着性物質が、キトサン塩基またはキトサン塩などのキトサンである、請求項４１または４２に記載のプロセス。
【請求項４４】
請求項４１〜４３に記載のプロセスによって得られた、生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン、特に経口ワクチンに関する。具体的には、本発明は、ノロウイルスに対して有効なワクチン及びそのようなワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
注射による投与は、例えば、筋肉内注射または皮下注射による、ワクチン治療に対して最も一般的に使用される投与方法である。しかしながら、注射による投与には、例えば、針刺し損傷のリスク、針の再利用による感染のリスク、訓練された人材がワクチン接種を実施するために必要とされることなど、いくつかの不利点を有する。注射による投与も痛みを引き起こし、したがって、代替の投与方法が、患者、特に乳児には好ましく、コンプライアンスの向上につながり得る。
【０００３】
ノロウイルスは、世界中のウイルス性胃腸炎の最も一般的な原因のうちの１つである。ノロウイルスは、伝染性が強く、汚染された食品、汚染された水、または人と人との接触によって感染され得る。さらに、ノロウイルスの発生は、高齢者、子供、免疫不全の個人に合併症を引き起こし得る。
【０００４】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、非感染性の粒子であり、ウイルスに似ている。粒子（例えば、ノロウイルスウイルス様粒子、ＮＶ−ＶＬＰ）は、形態学的に天然のキャプシドと同一である。ＶＬＰは、ウイルスの遺伝物質を含まないため、非感染性である。その結果、ＶＬＰは、ウイルスと細胞受容体の機能的相互作用を模倣し、それによって適切な宿主免疫応答を誘発するが、複製または感染を引き起こす能力を欠いている。ワクチン抗原として使用されるＶＬＰは、しばしば、哺乳動物免疫系がナノメートルスケールで粒子を認識する能力があるため、強力な免疫応答を誘発し、これは、ウイルスのサイズ範囲に対応する。
【０００５】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むワクチン製剤は、注射による投与に適した製剤として開発されている。ＵＳ９，３０８，２４９及びＵＳ２０１０／０２６６６３６において、特に、乾燥粒子状の鼻腔内ＶＬＰ製剤は、ノロウイルスに対するワクチン接種のためにすでに開発されている。しかしながら、依然として経口ワクチン接種のための製剤及び方法の必要性がある。
【０００６】
経口ワクチン接種形態は、痛みを伴わずに患者に容易に投与することができ、注射による投与と関連する他のいかなる不利な点もないため、望ましい。経口ワクチン接種は、鼻腔内経路による投与よりもさらに便利な場合がある。しかしながら、経口経路によるワクチン原薬の送達は、特に胃腸バリアのため、ワクチン接種に必要とされる原薬は胃腸管内で不安定であることが多いため、挑戦的であり得る。これらの分子は、例えば、プロテアーゼの作用に対して不安定であり、及び／または胃の強酸性の環境では不安定であり得る。
【０００７】
加えて、ワクチンは、ミョウバンなどの毒性アジュバントが含まれていることが多く、ワクチン製剤に対する免疫応答を高めるために使用される。これらのアジュバントと関連する毒性のために、ワクチン製剤からそれらを除去することに関心がある。
【０００８】
発明の概要
本発明の目的は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含有する水性組成物、具体的には、哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための水性組成物を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、製剤が哺乳動物の消化管の胃腸バリアに抵抗し、腸内の標的免疫細胞にＶＬＰを送達することができ、それによって望ましい免疫応答を誘導することができる経口ワクチン製剤を提供することである。具体的には、経口ワクチンとして使用される場合の組成物は、注射による投与と比較して、同等のまたは増強された免疫応答をもたらす。
【００１０】
上記の目的は、本明細書に記載され、かつ特許請求される本発明の実施形態により達成される。
【００１１】
したがって、本発明は、
−  水と、
−  ウイルス様粒子と、
−  少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質と、
−  任意に約６未満のｐＨを有する少なくとも１つの緩衝液と、を含む、水性組成物に関し、
ウイルス様粒子が、水中に粘膜付着性物質を含まないウイルス様粒子の比較サンプルのサイズ平均の約４倍以下のサイズ平均を有し、及び／または
ウイルス様粒子が、約４００ｎｍ以下のサイズ平均を有する。
【００１２】
上の段落の水性組成物のある特定の態様において、少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質は、約７未満のｐＫａを有し、水性組成物のｐＨは、粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約１ｐＨ単位、さらに酸性である。
【００１３】
ある特定の態様において、本発明は、そのような組成物の乾燥形態に関する。
【００１４】
本発明は、さらに、
−  水と、
−  ウイルス様粒子と、
−  少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質と、
−  任意に約６未満のｐＨを有する少なくとも１つの緩衝液と、を含む、水性組成物を調製するプロセスに関し、
ウイルス様粒子が、水中に当該粘膜付着性物質を含まないウイルス様粒子の比較サンプルのサイズ平均の約４倍以下のサイズ平均を有し、及び／または
ウイルス様粒子が、約４００ｎｍ以下のサイズ平均を有し、当該プロセスは、少なくとも、
（ａ）ウイルス様粒子を提供するステップと、
（ｂ）粘膜付着性物質を含有する水性組成物を得るために、任意に約６未満のｐＨを有する少なくとも１つの緩衝液を有する緩衝水性組成物中に少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質を提供するステップと、
（ｃ）ウイルス様粒子を、粘膜付着性物質を含有する水性組成物に添加するステップと、を含む。
【００１５】
上の段落のプロセスのある特定の態様において、少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質は、約７未満のｐＫａを有し、水性組成物のｐＨは、粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約１ｐＨ単位、さらに酸性である。上の段落のプロセスの当該ある特定の態様において、ステップ（ｂ）は、粘膜付着性物質を含有する水性組成物を得るために、粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約１ｐＨ単位、さらに酸性のｐＨを有する緩衝水性組成物中に少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質を提供することを含む。
【００１６】
本発明はまた、上記の当該プロセスによって得られた生成物に関する。
【００１７】
本発明は、さらに、哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための治療において使用するための、具体的には、経口ワクチン接種において使用するための、治療方法及び対応する薬物の製造のための使用を含む、そのような組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明のキトサンでコーティングしたウイルス様粒子（ＶＬＰ）の概略図。
【図２】実施例１に対応する異なるｐＨの緩衝液中のキトサンでコーティングしたＶＬＰの平均サイズ。
【図３】実施例１に対応する異なるｐＨの緩衝液中のキトサンでコーティングしたＶＬＰのゼータ電位。
【図４】実施例５に対応する異なるｐＨでのマウスモデルにおける血清ＩｇＡ力価。
【図５】実施例５に対応する異なるｐＨでのマウスモデルにおける糞便ＩｇＡ力価。
【図６】実施例６に対応する異なる緩衝液濃度でのマウスモデルにおける血清ＩｇＡ力価。
【図７】実施例６に対応する異なる緩衝液濃度でのマウスモデルにおける糞便ＩｇＡ力価。
【図８】実施例６に対応する異なる緩衝液濃度でのマウスモデルにおける血清ＩｇＧ力価。
【図９】実施例７に対応するＶＬＰに対するキトサンの異なる濃度を有するマウスモデルにおける血清ＩｇＡ力価。
【図１０】実施例７に対応するＶＬＰに対するキトサンの異なる濃度を有するマウスモデルにおける糞便ＩｇＡ力価。
【図１１】実施例７に対応するＶＬＰに対するキトサンの異なる濃度を有するマウスモデルにおける血清ＩｇＧ力価。
【図１２】参考実施例１に対応する裸及びキトサンでコーティングしたＶＬＰを有するマウスモデルにおける血清ＩｇＡ力価。
【図１３】参考実施例１に対応する裸及びキトサンでコーティングしたＶＬＰを含むマウスモデルの糞便ＩｇＡ力価。
【図１４】参考実施例１に対応する裸及びキトサンでコーティングしたＶＬＰを有するマウスモデルにおける血清ＩｇＧ力価。
【図１５】参考実施例２に対応する４匹のｂａｌｂ／ｃマウスへの空腸または経口投与したキトサンでコーティングしたＶＬＰを有するマウスモデルにおける血清ＩｇＡ力価。
【図１６】参考実施例２に対応する４匹のｂａｌｂ／ｃマウスへの空腸または経口投与したキトサンでコーティングしたＶＬＰを有するマウスモデルにおける糞便ＩｇＡ力価。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
別段に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または均等の任意の方法及び材料を、本発明の試験に実際に使用することができるが、好ましい材料及び方法が、本明細書に記載される。本発明を説明及び特許請求することにおいて、以下の用語は、以下に記載の定義に従って使用されるであろう。
【００２０】
別途明確な指示のない限り、「ａ」、「ａｎ」などの用語の使用は、１つ以上を指す。
【００２１】
本発明の目的のために、「生体接着」という用語は、２つの生物学的材料が界面張力によって一緒に保持される機構を指すように定義される。
【００２２】
「粘膜付着性物質」（または「粘膜アジュバント」）という用語は、本発明の目的のために、生体接着性を示し、したがって化合物を粘膜に結合するために使用される材料を指すように定義され、これには、胃腸管、膣、肺、眼などの上皮表面の膜が含まれる。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、粘膜付着性物質は、粘膜を覆う粘膜層と相互作用し、吸収部位での剤形（例えば、ＶＬＰなど）の滞留時間を増加させる任意の分子であり、これは、免疫応答の増加をもたらし得る。粘膜付着性物質は、好ましくは、ポリマーである。本発明によれば、粘膜付着性物質は、１つ以上のアミノ基を含有し、本明細書では、「アミノ基を含有する粘膜付着性物質」と称される。そのような粘膜付着性物質の非排他的な一覧は、以下の段落［００５８］〜［００６５］に提供される。
【００２３】
本発明の意味内で、「アミノ基」という用語は、第１級、第２級、第３級、及び第４級アミン基（ＲＮＨ２、Ｒ２ＮＨ、Ｒ３Ｎ、Ｒ４Ｎ＋）を含む。
【００２４】
「粘膜投与」という用語は、粘膜経路を介した組成物の投与、例えば、哺乳動物への組成物の経口、鼻腔内、直腸、または膣内投与を指す。
【００２５】
本発明の目的のために、「胃腸バリア」という用語は、胃の低ｐＨまたは消化管におけるプロテアーゼ酵素の存在などの経口経路を介した原薬の送達に対するバリアを指すように定義される。
【００２６】
「誘導体化された」という用語は、粘膜付着性物質へのアミノ基の導入を指す。
【００２７】
本発明の目的のために、「ＶＬＰ」という用語は、ウイルス様粒子を指すように定義される。ＮＶ−ＶＬＰなどのウイルス様粒子は、構造的には、ウイルスに類似しているが、感染性の遺伝物質を欠いているため、感染性ではない。ＶＬＰは、通常、キャプシドタンパク質の組換え発現及び自発的自己組織化によって調製される。
【００２８】
本発明の目的のために、「コーティングしたＶＬＰ」または「周囲の粘膜付着性層を有するＶＬＰ」という用語は、本発明による粘膜付着性溶液に懸濁されたＶＬＰを指すように定義される。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、静電気引力のため、これらのＶＬＰは、それらの表面上に吸着される粘膜付着性物質を有すると考えられている。例示目的のために、図１に対して参照を行う。
【００２９】
本発明の目的のために、「裸のＶＬＰ」という用語は、例えば、水中のＶＬＰなどの粘膜付着性及び同等の材料で処理されていないＶＬＰを指すように定義される。
【００３０】
本発明の目的のために、「ウイルス感染」という用語は、ウイルスによって、またはウイルスの複数の種もしくは遺伝子型によって引き起こされる感染を指すように定義される。
【００３１】
国際ウイルス分類委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）による「種」という用語は、複数の基準によってその特性を他の種の特性と区別することができる単系統群のウイルスとして定義される。ノロウイルスは、ウイルス種の一例である。
【００３２】
本発明の目的のために、「遺伝子型」という用語は、ノロウイルス遺伝子型ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、及びＧＩＶなどの生物の遺伝的構成を指すように定義される。
【００３３】
本発明の目的のために、「ワクチン」という用語は、哺乳動物に投与することができ、哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発する形態で、本発明のＶＬＰを含有する製剤を指すように定義される。動物へのワクチンの投与は、「ワクチン接種」と称される。
【００３４】
本発明の目的のために、「アジュバント」という用語は、哺乳動物ワクチンとして使用される場合に、増強された免疫応答をもたらすために、水性組成物に添加される化合物を指すように定義される。アジュバントは、例えば、ミョウバンまたはＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）であり得る。
【００３５】
「防御免疫」または「防御免疫応答」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）によって示される感染因子に対する免疫または免疫応答を誘発することを指し、感染を防御もしくは改善するか、またはその少なくとも１つの症状を軽減させる。防御免疫は、ワクチン接種によって生成されるようなウイルスの症状、例えばノロウイルス感染を経験していない健康な対象における免疫応答、またはウイルスの症状、例えばノロウイルス感染を現在経験している対象において誘発される免疫応答を指すことができる。具体的には、ワクチンの投与から防御免疫応答が誘導されることは、疾患症状の期間または重症度を解消または減少することによって明らかである。疾患症状を減少または解消する防御免疫応答は、集団におけるウイルス発生の拡大を減少または停止させる。例えば、ノロウイルス由来の胃腸炎の臨床的症状には、悪心、下痢、軟便、嘔吐、発熱、及び全身の倦怠感が含まれる。例えば、ノロウイルスに対する防御免疫応答は、哺乳動物が胃腸炎の症状を経験しないか、またはそのような症状の期間または重症度の減少を経験するという結果をもたらす。
【００３６】
「ＩｇＡ」及び「ＩｇＧ」という用語は、本発明の意味の範囲内で、それぞれ、抗体免疫グロブリンＡ及び免疫グロブリンＧを指す。
【００３７】
本発明の目的のために、「ノロウイルス」という用語は、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科のノロウイルス属のメンバーを指すように定義される。いくつかの実施形態において、ノロウイルスは、関連するプラスセンス一本鎖ＲＮＡ、ヒトまたは非ヒト哺乳動物種に対して感染性があり得る非エンベロープウイルスの群を含むことができる。いくつかの実施形態において、ノロウイルスは、ヒトにおいて急性胃腸炎を引き起こし得る。１５の遺伝子クラスターを含む核酸及びアミノ酸配列によって定義される少なくとも４つの遺伝子型（ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ）がノロウイルス群内に含まれる。主要な遺伝子型は、ＧＩ及びＧＩＩである。ノロウイルスの非限定的な例には、ノーウォークウイルス（ＮＶ，ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ８７６６１，ＮＰ０５６８２１）、サウサンプトンウイルス（ＳＨＶ，ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ０７４１８）、デザートシールドウイルス（ＤＳＶ，Ｕ０４４６９）、ヘッセウイルス（ＨＳＶ）、チバウイルス（ＣＨＶ，ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ０４２８０８）、ハワイウイルス（ＨＶ，ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ０７６１１）、スノーマウンテンウイルス（ＳＭＶ，ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ７００５９）、トロントウイルス（ＴＶ，Ｌｅｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４１：８６５−８７５）、ブリストルウイルス（ＢＶ）、ジェナウイルス（ＪＶ，ＡＪ０１０９９）、メリーランドウイルス（ＭＶ，ＡＹ０３２６０５）、セトウイルス（ＳＶ，ＧｅｎＢａｎｋＡＢ０３１０１３）、キャンバーウェル（ＣＶ，ＡＦ１４５８９６）、ローズデールウイルス（ＬＶ，ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ８６５５７）、グリムズビーウイルス（ＧｒＶ，ＡＪ００４８６４）、メキシコウイルス（ＭＸＶ，ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ２２４９８）、ボクサー（ＡＦ５３８６７９）、Ｃ５９（ＡＦ４３５８０７）、ＶＡ１１５（ＡＹ０３８５９８）、ＢＵＤＳ（ＡＹ６６０５６８）、ヒューストンウイルス（ＨｏＶ）、ミネルバ株（ＥＦ  １２６９６３１）、ローレンス株（ＥＦ  １２６９６６１）、ＭＯＨ（ＡＦ３９７１５６）、パリスアイランド（ＰｉＶ，ＡＹ６５２９７９）、ＶＡ３８７（ＡＹ０３８６００）、ＶＡ２０７（ＡＹ０３８５９９）、及びオペレーション・イラク・フリーダム（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｒａｑｉ  Ｆｒｅｅｄｏｍ）（ＯＩＦ，ＡＹ６７５５５４）が含まれる。ＧＩＩ．４株などの２つ以上のノロウイルス株からのコンセンサス配列を表す構築物であるノロウイルスコンセンサスＶＬＰも含まれる。コンセンサス配列が当該２つ以上のノロウイルス株の各配列と比較して、少なくとも１つの異なるアミノ酸を含有するように、２つ以上のノロウイルス株からのコンセンサス配列に由来するノロウイルス複合体ＶＬＰも含まれる。ノロウイルス複合体ＶＬＰの構築は、ＷＯ２０１０／０１７５４２に開示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３８】
本発明の目的のために、「サイズ平均」という用語は、試験方法の項で説明されるように、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して液体中で測定された粒子の平均サイズを指すように定義される。
【００３９】
本発明の目的のために、「比較サンプル」という用語は、同じ遺伝子型の同じ濃度のＶＬＰを含み、試験サンプルと同じ条件下で試験されたサンプルを指すように定義される。試験サンプルとの違いは、明確に言及されている。
【００４０】
本発明の目的のために、「水性組成物」という用語は、最大３０％の組成物内に溶解した有機溶媒、より好ましくは最大２０％、または最大１０％の組成物内に溶解した有機溶媒とともに、水を含む組成物を指すように定義される。水性組成物はまた、それらに溶解した塩または他の物質、ならびに不溶性粒子を含む混合物またはエマルジョンを含み得る。
【００４１】
本発明の目的のために、「乾燥組成物」または「乾燥形態の組成物」という用語は、約１０ｗ／ｗ％未満の残留水分含有量を有する固体材料を指すように定義される。乾燥組成物は、好ましくは、８ｗ／ｗ％以下、５ｗ／ｗ％以下、または好ましくは、約０．１ｗ／ｗ％〜約５ｗ／ｗ％、例えば約２ｗ／ｗ％、または約１ｗ／ｗ％の残留液体（水）含有量に乾燥させる。好ましくは、残留水分含有量は、カールフィッシャー滴定法に従って決定される。
【００４２】
乾燥組成物は、当業者に知られている任意の方法によって調製することができる。薬学的組成物を乾燥させる一般的な方法には、ノズルを通してガス流に液体を噴霧することを含む「噴霧乾燥」、及び組成物を凍結し、減圧を使用して液体を除去することを含む「凍結乾燥」が含まれる。
【００４３】
本発明の目的のために、「血清（ｓｅｒｕｍ）」という用語は、血清（ｂｌｏｏｄ  ｓｅｒｕｍ）を指すように定義される。本発明の目的のために、「血清力価」という用語は、試験方法の項で説明されるように、ＥＬＩＳＡを使用して測定された血清中の抗体の濃度を指すように定義される。
【００４４】
「ＯＤ」及び「ＯＤ４５０ｎｍ」という用語は、本発明内で交換可能に使用され、９６ウェルプレートにおいて４５０ｎｍで測定されたサンプルの光学密度を指す。
【００４５】
別途指示のない限り、「％」は、「重量％」を指す。
【００４６】
「単位剤形」という用語は、ヒトなどの哺乳動物における単一の治療的介入に適した組成物の用量を指す。
【００４７】
ＶＬＰ種及び生成
本発明は、ＶＬＰを含む水性組成物に関する。
【００４８】
ウイルス様粒子（複数可）またはＶＬＰは、ウイルス、特に非エンベロープウイルスのキャプシドタンパク質コード配列から生成され、感染性ウイルスの抗原的特徴と同様の抗原的特徴（複数可）を含む、ウイルス様粒子（複数可）を指す。
【００４９】
ある特定の実施形態において、非エンベロープウイルスは、カリシウイルス（例えば、ノロウイルスまたはサポウイルス）、ピコルナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、及びＥ型肝炎ウイルスからなる群から選択される。
【００５０】
ある特定の実施形態において、水性組成物は、少なくとも１種のウイルスに由来するＶＬＰ、または少なくとも２種の異なるウイルスに由来するＶＬＰ、または少なくとも３種の異なるウイルスに由来するＶＬＰ、または少なくとも４種の異なるウイルスに由来するＶＬＰを含み得る。
【００５１】
ある特定の実施形態において、水性組成物は、ノロウイルスＶＬＰ、ロタウイルスＶＬＰ、ＨＰＶ  ＶＬＰ、インフルエンザウイルスＶＬＰ、デング熱ウイルスＶＬＰ、Ｂ型肝炎ウイルスＶＬＰの種の群から選択されるＶＬＰを含み得る。ある特定の好ましい実施形態において、水性組成物は、ノロウイルスＶＬＰ及びロタウイルスＶＬＰの種の群から選択されるＶＬＰを含み得る。
【００５２】
ある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも１つの遺伝子型のＶＬＰ、または少なくとも２つの異なる遺伝子型のＶＬＰ、または少なくとも３つの異なる遺伝子型のＶＬＰ、または少なくとも４つの異なる遺伝子型のＶＬＰを含み得る。
【００５３】
ある特定のそのような実施形態において、組成物は、ノロウイルス群１のＶＬＰ（ＧＩ）、ノロウイルス群のＶＬＰ（ＧＩＩ）、ノロウイルス群３のＶＬＰ（ＧＩＩＩ）、及びノロウイルス群４のＶＬＰ（ＧＩＶ）からなる群から選択される１つ以上の異なる遺伝子型のノロウイルスＶＬＰを含み得る。ある特定の好ましい実施形態において、ノロウイルスＶＬＰの遺伝子型は、ノロウイルス群１のＶＬＰ（ＧＩ）及びノロウイルス群２のＶＬＰ（ＧＩＩ）の群から選択され得る。ある特定のより好ましい実施形態において、ノロウイルスＶＬＰの遺伝子型は、ノロウイルス群１．１のＶＬＰ（ＧＩ．１）、ノロウイルス群２．２のＶＬＰ（ＧＩＩ．２）、及びノロウイルス群２．４のＶＬＰ（ＧＩＩ．４）の群、例えば、ノーウォークウイルスＶＬＰ、及びいくつかのノロウイルスＧＩＩ．４株からのコンセンサス配列または複合配列を表す構築物から選択され得る。例えば、コンセンサス配列または複合配列は、ヒューストン株、ミネルバ株、及びローレンス株からなる群から選択されるノロウイルス株に由来することができる。特に好ましい実施形態において、ノロウイルスＶＬＰは、ＷＯ２０１０／０１７５４２の配列番号１に対応するＧＩＩ．４複合アミノ酸配列を有する。
【００５４】
粘膜付着性物質
本発明による粘膜付着性物質または粘膜アジュバントは、アミノ基を含み、好ましくはポリマーである。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、アミノ基は、水性組成物中にプロトン化された形態で存在して、有意なカチオン電荷を提供すると考えられている。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、カチオン性粘膜付着物質は、ＶＬＰと粘膜付着性物質との間の静電相互作用の結果として、ＶＬＰに結合すると考えられており、粘膜付着性ポリマーでコーティングされるＶＬＰの生成は、例示目的で図１に参照する。さらに、静電反発力によってＶＬＰに結合した正の粘膜付着性物質の電荷は、ＶＬＰの凝集を防ぐ。
【００５５】
アミノ基の十分なプロトン化及び組成物中のカチオン電荷は、粘膜付着性物質上のアミノ基のｐＫａの値よりも酸性であるｐＨを有する（すなわち、ｐＨの数値がｐＫａの数値よりも小さい）水性環境によって達成され、維持される。したがって、水性環境のｐＨは、粘膜付着性物質上のアミノ基のｐＫａに適合させることが好ましい。したがって、粘膜付着性物質は、塩基の形態で混合することができ、アミノ基のプロトン化は、酸性環境のために組成物中で起こるか、または粘膜付着性物質は、すでにプロトン化されているアミノ基と塩の形態で混合することができる。プロトン化の最終的な程度は、いずれの場合も水性組成物のｐＨに依存するであろう。あるいは、本発明による水性組成物中でアミノ基を含有する粘膜付着性物質は、同じく正に電荷している第４級アンモニウム基または第４級アンモニウム基を含有し得る。
【００５６】
ｐＫａは、粘膜付着性物質のポリマーにおける繰り返し単位の場合には、最も塩基性の高いアミノ基（複数可）のプロトン化形態のｐＫａを指す。本明細書で使用されるｐＫａは、水溶液中で測定されたｐＫａを指す。ｐＫａは、好ましくは、電位差滴定法を使用して決定され、正確な数学的方法、実験設定、及びその値を計算するために使用される正確な滴定曲線に応じて、ｐＫａ値がある程度変化することは、正常である。そのようなパラメーターは、測定される材料ごとに変化し得る。したがって、本発明によれば、ｐＫａは、変動があった場合には、そのような測定及び／または方法から得られたより高い値を指す。粘膜付着性物質のｐＫａは、好ましくは、約７．０〜３．５、または約７．０〜４．０、または約７．０〜５．０である。キトサンは、例えば、約６．５のｐＫａを示すと報告されている。例えば、Ｐａｒｋｅｔ  ａｌ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １９８３，４，６８−７２を参照のこと。本発明のキトサンによれば、具体的には、キトサングルタメートは、５．５及びそれ未満のｐＨと組み合わされる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、粘膜付着性物質は、キトサングルタメートであり、緩衝液は、酢酸緩衝液などの５．５以下、または４．５以下、または４以下のｐＨを有し、水性組成物のｐＨは、５．５以下、または４．５以下、または４以下である。
【００５７】
加えて、緩衝液及び粘膜付着性物質は、胃腸バリアに対してＶＬＰを含有する組成物の化学的及び物理化学的安定性を促進することが企図されている。さらに、粘膜付着性物質は、腸内での組成物の保持時間を延長し、これは、ＶＬＰを含有する組成物の吸収の増加をもたらす。したがって、組成物は、標的免疫細胞へのＶＬＰの送達を増強し、その結果、所望の免疫応答及び／または粘膜付着性物質を含まない組成物よりも高い免疫応答を誘導する。
【００５８】
本発明の意味の範囲内で、粘膜付着性物質は、アミノ基を含有する分子、特にポリマーから選択される。アミノ基は、ポリマーなどの分子内に存在するか、またはその後誘導体化によって導入することができる。
【００５９】
ある特定の実施形態において、組成物は、多糖類（炭水化物ポリマー）、任意に誘導体化多糖類（誘導体化炭水化物ポリマー）、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、任意に誘導体化ポリビニルアルコール、任意に誘導体化ポリビニルピロリドン、ポリペプチド、誘導体化ポリペプチド、タンパク質、誘導体化タンパク質、誘導体化デオキシリボ核酸、ポリエチレンイミン、及びその誘導体からなる群から選択されるアミノ基を含有する粘膜付着性物質を含有する。
【００６０】
ある特定のそのような実施形態において、粘膜付着性物質は、キトサン、キトサン塩、キトサン塩基、誘導体化キトサン、アミノデキストラン、ジメチルアミノエチルデキストラン、グリコサミノグリカン、誘導体化グリコサミノグリカン、セルロース誘導体、誘導体化ペクチン、誘導体化アルギン酸塩、誘導体化グリコーゲン、誘導体化アミロース、誘導体化アミロペクチン、誘導体化キチン、誘導体化スタキオース、誘導体化イヌリン、誘導体化デキストリン、誘導体化デキストラン、ならびにムチン及び他のムコ多糖類などの他の誘導体化多糖類の群から選択される多糖類である。
【００６１】
グリコサミノグリカンの例には、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、及びヒアルロン酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
セルロース誘導体の例には、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
ポリペプチドの例には、ポリリシンが含まれるが、これに限定されない。任意に、ポリペプチドは、アミノ基の導入によって誘導体化される。
【００６４】
タンパク質の例には、レクチン及び線毛タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。これらのタンパク質は、必要に応じて、アミノ基の導入によって誘導体化される。
【００６５】
ある特定の好ましい実施形態において、粘膜付着性物質は、キトサンであり、これは、キトサン塩基またはキトサン塩の形態で混合され得る。ある特定のそのような実施形態において、混合した粘膜付着性物質は、キトサングルタメート、キトサン塩酸塩、キトサン酢酸塩、キトサン乳酸塩、キトサンアルギン酸塩、キトサンアスコルビン酸塩、トリメチル化キトサン、メチルグリコールキトサン、及びカルボキシメチルキトサンの群から選択され、特に、キトサングルタメートである。
【００６６】
ある特定のそのような実施形態において、キトサングルタメートは、２００ｋＤａ〜６００ｋＤａの平均分子量及び／または７５％〜９０％の脱アシル化値及び／または２０〜２００ｍＰａ・ｓの粘度を有し得る。
【００６７】
本発明で使用され得る市販のキトサングルタメートの例を、以下の表に示す。さらなる情報については、２０１８年７月の時点でＮｏｖａＭａｔｒｉｘによって提供された製品情報も参照される。
【表１】
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【００６８】
ある特定の実施形態において、本発明は、水性組成物に関し、混合した粘膜付着性物質の濃度は、約８ｍｇ／ｍＬ超、または約１０ｍｇ／ｍＬ超、または約１２．５ｍｇ／ｍＬ超、または約１５ｍｇ／ｍＬ超、または約３０ｍｇ／ｍＬ超、または約５０ｍｇ／ｍＬ超であり、好ましくは、粘膜付着性物質の最大濃度は、約１００ｍｇ／ｍＬである。上記の数値は、キトサングルタメートの添加に基づいている。また、等モル量の他の種類のキトサン塩またはキトサン塩基を、使用してもよい。
【００６９】
ある特定のそのような実施形態において、本発明は、水性組成物に関し、混合した粘膜付着物の濃度は、約８ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬであるか、または粘膜付着性物質の濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬであるか、または粘膜付着性物質の濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである。
【００７０】
多くの場合、より高い濃度を有する粘膜付着性物質は、より高い粘度を有する。これは、例えば、キトサンの場合である。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、このより高い粘度は、より高い胃腸の保持につながると仮定されている。さらに、キトサンのより高い濃度はまた、キトサン自体の特性に加えて、組成物の吸収を増加させ、望ましい免疫応答を誘導することにも貢献すると考えられている。
【００７１】
組成物
本発明は、
−水と、
−ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、
−少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質と、
−任意に約６未満のｐＨを有する少なくとも１つの緩衝液と、を含む、水性組成物に関し、
ウイルス様粒子が、水中に当該粘膜付着性物質を含まないウイルス様粒子の比較サンプルのサイズ平均の約４倍以下のサイズ平均を有し、及び／または
ウイルス様粒子が、約４００ｎｍ以下のサイズ平均を有する。
【００７２】
上の段落の水性組成物のある特定の態様において、少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質は、約７未満のｐＫａを有し、水性組成物のｐＨは、粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約１ｐＨ単位、さらに酸性である。
【００７３】
ある特定の実施形態において、本発明の水性組成物は、約５．８以下、または約５．５以下、または約５．１以下、または約５以下、または約４．５以下のｐＨを有する。
【００７４】
ある特定の実施形態において、本発明の水性組成物は、粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約０．７ｐＨ単位、さらに酸性であるｐＨを有するか、または粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約１ｐＨ単位、さらに酸性であるｐＨを有するか、粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約１．４ｐＨ単位、さらに酸性であるｐＨを有するか、または粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約１．５ｐＨ単位、さらに酸性であるｐＨを有するか、または粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約２ｐＨ単位、さらに酸性であるｐＨを有するか、または粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約２．５ｐＨ単位、さらに酸性であるｐＨを有するか、または粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約３ｐＨ単位、さらに酸性であるｐＨを有する。すでに述べたように、粘膜付着性物質上のアミノ基のｐＫａの値より少なくとも１ｐＨ単位、さらに酸性である酸性ｐＨ値では、粘膜付着性物質上のアミノ基が著しくプロトン化されると考えられている。次いで、粘膜付着性物質は、静電相互作用を介してＶＬＰに結合する（図１を参照）。ＶＬＰを取り巻く電荷した粘膜付着性物質は、ＶＬＰ間の静電反発力を引き起こし、凝集を減少させる。この効果は、ＶＬＰのゼータ電位の増加に対応する。これらの高電荷のＶＬＰは、互いに反発し、コーティングされていないＶＬＰのサイズの４倍未満または約４００ｎｍ未満の粒子をもたらすと考えられている。
【００７５】
ある特定のそのような実施形態において、本発明は、水性組成物に関し、組成物のｐＨは、約２．５〜約５．５である。そのような組成物は、約６．５のｐＫａを示すキトサンなどの粘膜付着性物質でうまく機能する。
【００７６】
ある特定のそのような実施形態において、水性組成物のｐＨは、約５以下、または約４．５以下、または約４以下である。ある特定のそのような実施形態において、水性組成物のｐＨは、約４．５〜約２．５、または約４．５〜約３．５の範囲に及び、例えば、約ｐＨ４または約ｐＨ３である。
【００７７】
ある特定の実施形態において、水性組成物のｐＨは、約ｐＨ４．０〜ｐＨ４．４である。
【００７８】
水性組成物のｐＨを安定化するために、酢酸緩衝液などの緩衝液が、使用される。緩衝液のｐＨは、約２．５〜約５．５、または約３．０〜約５．０、または約３．５〜約４．５であり得る。
【００７９】
いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、緩衝液は、粘膜付着性物質上のアミノ基をプロトン化するのに適したｐＨを確立し、胃の低ｐＨ（ｐＨ１〜３）に対する組成物の安定性を改善するのに役立つと考えられている。さらに、緩衝液は、腸のｐＨ（約ｐＨ６〜７）で高い腸内のプロテアーゼの活性を防止することによって、腸管内の組成物の安定性を改善するのに役立つと考えられている。
【００８０】
ある特定のそのような実施形態において、本発明は、水性組成物に関し、緩衝液の濃度は、約２５ｍＭ〜約２０００ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、または約２００ｍＭ〜約５００ｍＭである。
【００８１】
ある特定の実施形態において、本発明は、水性組成物に関し、粘膜付着性物質の濃度は、約８ｍｇ／ｍＬ超、または約１０ｍｇ／ｍＬ超、または約１２．５ｍｇ／ｍＬ超である。ある特定のそのような実施形態において、粘膜付着性物質の最大濃度は、約１００ｍｇ／ｍＬ、または約５０ｍｇ／ｍＬ、または約３０ｍｇ／ｍＬである。ある特定のそのような実施形態において、粘膜付着性物質の濃度は、約８ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、または約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、または約１２．５ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍＬの範囲に及ぶ。上記の数値は、粘膜付着性物質がキトサンである場合、キトサングルタメートの添加に基づいている。また、等モル量の他の種類のキトサン塩またはキトサン塩基を、使用してもよい。他の粘膜付着性物質の場合、数字は、遊離塩基を指すものとして解釈されるべきであり、等モル量の塩を同様に使用することができる。
【００８２】
ある特定の実施形態において、本発明は、水性組成物に関し、ウイルス様粒子は、水中に当該粘膜付着性物質を含まないウイルス様粒子の比較サンプルのサイズ平均の約４倍以下、または水中に当該粘膜付着性物質を含まないウイルス様粒子の比較サンプルのサイズ平均の約３倍以下、または水中に当該粘膜付着性物質を含まないウイルス様粒子の比較サンプルのサイズ平均の約２．５倍以下のサイズ平均を有する。
【００８３】
ある特定の実施形態において、本発明は、水性組成物に関し、ウイルス様粒子は、約４００ｎｍ以下、例えば、約１０ｎｍ〜約３５０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約３００ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約２００ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約１７０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約１２０ｎｍのサイズ平均を有する。本発明の意味の範囲内で、ウイルス様粒子のサイズ平均は、本発明による組成物中のウイルス様粒子のサイズ平均を指す。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、これらのウイルス様粒子は、コーティングしたウイルス様粒子（ＶＬＰ）または周囲の粘膜付着性物質層を有するウイルス様粒子であり、静電気引力のため、これらのウイルス様粒子は、それらの表面上に吸着される粘膜付着性物質を有すると考えられている。サイズ平均とは、試験方法の項で説明されるように、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して液体中で測定されたウイルス様粒子の平均サイズを指し、存在し得る周囲の粘膜付着性物質層を含むウイルス様粒子の平均サイズを指す。
【００８４】
ある特定の実施形態において、本発明は、水性組成物に関し、ウイルス様粒子は、正のゼータ電位を有する。ある特定の好ましい実施形態において、ウイルス様粒子は、少なくとも約１５ｍＶ、または少なくとも約２０ｍＶ、または少なくとも約３０ｍＶ、及び任意に１００ｍＶの最大ゼータ電位の正のゼータ電位を有する。本発明の意味の範囲内で、ウイルス様粒子のゼータ電位は、本発明による組成物中のウイルス様粒子のゼータ電位を指す。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、これらのウイルス様粒子は、コーティングしたウイルス様粒子または周囲の粘膜付着性物質層を有するウイルス様粒子であり、静電気引力のため、これらのウイルス様粒子は、それらの表面上に吸着される粘膜付着性物質を有すると考えられている。ゼータ電位とは、試験方法の項で説明されるように、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して液体中で測定されたウイルス様粒子のゼータ電位を指し、存在し得る周囲の粘膜付着性物質層を含むウイルス様粒子のゼータ電位を指す。
【００８５】
ある特定の実施形態において、本発明は、水性組成物に関し、水性組成物中のウイルス様粒子の濃度は、少なくとも約５０μｇ／ｍＬであるか、または少なくとも約１００μｇ／ｍＬであるか、または少なくとも約２５０μｇ／ｍＬであるか、または少なくとも約５００μｇ／ｍＬであるか、または少なくとも約６００μｇ／ｍＬであるか、または少なくとも約７００μｇ／ｍＬであるか、または少なくとも約８００μｇ／ｍＬである。
【００８６】
ある特定の実施形態において、本発明は、水性組成物に関し、ＶＬＰに対する粘膜付着性物質（キトサングルタメートなど）の重量比率は、約０．５〜約３００、または約０．５〜約１００、または約１０〜約１００、または約２０〜約１００、または約３０〜約１００、または約４０〜約１００、または約１０〜約６０、または約３０〜約６０、または約４０〜約６０、例えば、約５０である。上記の数値は、キトサン粘膜付着性物質の場合、キトサングルタメートの添加に基づいている。また、等モル量の他の種類のキトサン塩またはキトサン塩基を、使用してもよい。他の粘膜付着性物質が使用されている場合、比率は、等モル量を指すと解釈される。
【００８７】
ある特定のそのような実施形態において、ＶＬＰに対する、混合したキトサングルタメート、または等モル量の別の種類のキトサン塩もしくはキトサン塩基の重量比率は、約３０〜約１００、または約４０〜約６０、好ましくは約５０である。
【００８８】
ある特定の実施形態において、本発明は、
−  水と、
−  ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、
−  キトサンと、
−  約２．５〜約５のｐＨを有する少なくとも１つの緩衝液と、を含む、水性組成物に関し、
ウイルス様粒子は、ノロウイルスウイルス様粒子であり、
ウイルス様粒子は、約４００ｎｍ以下のサイズ平均を有し、
ＶＬＰに対する、混合したキトサングルタメート、または等モル量の別の種類のキトサン塩もしくはキトサン塩基の重量比率が、約３０〜約１００、または約４０〜約６０、好ましくは約５０である。
【００８９】
乾燥形態
本発明のさらなる態様によると、組成物は、乾燥組成物の形態である。乾燥組成物は、上記の水性組成物を乾燥させることによって得られる、約５ｗ／ｗ％未満、または約４ｗ／ｗ％未満、または約２ｗ／ｗ％未満、または約１ｗ／ｗ％未満、または約０．１ｗ／ｗ％未満の残留液体／水分含有量を有する。そのような乾燥組成物は、当該技術分野で知られている方法を使用して上記の水性組成物を乾燥させることによって得ることができる。例えば、乾燥組成物は、噴霧乾燥または関連する方法を使用して、または凍結乾燥を介して水性組成物を乾燥させることによって得ることができる。乾燥組成物は、保存し、固体経口剤形などの固体剤形に使用することができる。
【００９０】
治療方法／医学的用途／ワクチン接種
ある特定の実施形態において、本発明は、動物、特に哺乳動物、例えばヒトにおけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための治療において使用するための組成物に関する。ある特定の好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための粘膜投与治療において使用するための組成物に関する。ある特定のより好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための経口投与治療において使用するための組成物に関する。
【００９１】
ある特定の実施形態において、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発する方法に関し、そのような治療を必要とする哺乳動物に、（上記のように）ＶＬＰを含む組成物を投与することを含む。ある特定の好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発する方法に関し、そのような治療を必要とする哺乳動物に、（上記のように）ＶＬＰを含む組成物を粘膜投与することを含む。ある特定のより好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発する方法に関し、そのような治療を必要とする哺乳動物に、（上記のように）ＶＬＰを含む組成物を経口投与することを含む。
【００９２】
ある特定の実施形態において、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための薬物の製造における（上記のような）ＶＬＰを含む組成物の使用に関する。ある特定の好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための粘膜投与薬物の製造における（上記のような）ＶＬＰを含む組成物の使用に関する。ある特定のより好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための経口薬物の製造における（上記のような）ＶＬＰを含む組成物の使用に関する。
【００９３】
ある特定の実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト）におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための治療における本発明による組成物の使用は、哺乳動物に投与された場合、免疫グロビンのレベルの上昇をもたらす。例えば、血清ＩｇＡのレベルの上昇、及び／または血清ＩｇＧレベルの上昇、及び／または糞便ＩｇＡのレベルの上昇、及び／または糞便ＩｇＧのレベルの上昇。
【００９４】
ある特定のそのような実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト）におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための治療における本発明による組成物の使用は、治療を受けていない哺乳動物と比較して、ノロウイルス特異的機能的抗体の血清力価の増加をもたらす。
【００９５】
ある特定の実施形態において、本発明による組成物を哺乳動物に投与することを含む、そのような治療を必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発する方法は、哺乳動物における免疫グロブリンのレベルの上昇をもたらす。例えば、血清ＩｇＡのレベルの上昇、及び／または血清ＩｇＧレベルの上昇、及び／または糞便ＩｇＡのレベルの上昇、及び／または糞便ＩｇＧのレベルの上昇。
【００９６】
ある特定のそのような実施形態において、本発明による組成物を哺乳動物に投与することを含む、そのような治療を必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発する方法は、治療を受けていない哺乳動物と比較して、ノロウイルス特異的機能抗体の血清力価の増加をもたらし得る。
【００９７】
ある特定の実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト）におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための薬物の製造における本発明による組成物の使用は、哺乳動物に投与された場合、免疫グロブリンのレベルの上昇をもたらす。例えば、血清ＩｇＡのレベルの上昇、及び／または血清ＩｇＧレベルの上昇、及び／または糞便ＩｇＡのレベルの上昇、及び／または糞便ＩｇＧのレベルの上昇。
【００９８】
ある特定のそのような実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト）におけるウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための薬物の製造における本発明による組成物の使用は、治療を受けていない哺乳動物と比較して、ノロウイルス特異的機能的抗体の血清力価の増加をもたらし得る。
【００９９】
ある特定の実施形態において、本発明は、組成物に関し、アジュバントは、組成物に含まれない。一般的に使用される医学的アジュバントには、ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）及びミョウバンが含まれる。この文脈では、ミョウバンは、水酸化アルミニウムゲルなどの水酸化アルミニウム［Ａｌ（ＯＨ）３］を含む化合物を指すために使用される。ある特定の実施形態において、アジュバントを含まない哺乳動物に経口投与された場合の組成物は、注射（例えば筋肉内）によって投与されたアジュバントを含有する組成物と比較して、同等または上昇した免疫応答をもたらし得る。免疫応答は、例えば、血清ＩｇＡ応答、血清ＩｇＧ、または糞便ＩｇＡ応答の増加として測定することができる。
【０１００】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、単位剤形として提供される。
【０１０１】
調製プロセス
ある特定の実施形態において、本発明は、
−  水と、
−  ウイルス様粒子と、
−  少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質と、
−  任意に６未満のｐＨを有する少なくとも１つの緩衝液と、を含む、水性組成物を調製するためのプロセスに関し、
組成物中のウイルス様粒子は、水中に当該粘膜付着性物質を含まないウイルス様粒子の比較サンプルのサイズ平均の約４倍以下のサイズ平均を有し、及び／または
ウイルス様粒子は、約４００ｎｍ以下のサイズ平均を有し、当該プロセスは、少なくとも、
（ａ）ウイルス様粒子を提供するステップと、
（ｂ）粘膜付着性物質を含有する水性組成物を得るために、任意に約６未満のｐＨを有する少なくとも１つの緩衝液を有する緩衝水性組成物中に少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質を提供するステップと、
（ｃ）ウイルス様粒子を、粘膜付着性物質を含有する水性組成物に添加するステップと、を含む。
【０１０２】
上の段落のプロセスのある特定の態様において、少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質は、約７未満のｐＫａを有し、水性組成物のｐＨは、粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約１ｐＨ単位、さらに酸性である。上の段落のプロセスの当該ある特定の態様において、ステップ（ｂ）は、粘膜付着性物質を含有する水性組成物を得るために、粘膜付着性物質のｐＫａの値よりも少なくとも約１ｐＨ単位、さらに酸性のｐＨを有する緩衝水性組成物中に少なくとも１つのアミノ基を含有する粘膜付着性物質を提供することを含む。
【０１０３】
ある特定のそのような実施形態において、本発明は、当該水性組成物を調製するためのプロセスに関し、ステップ（ｂ）で添加される粘膜付着性物質は、キトサン塩基またはキトサン塩などのキトサンである。ある特定の好ましい実施形態において、粘膜付着性物質は、キトサングルタメートである。
【０１０４】
ある特定の実施形態において、本発明は、上記の段落［００９９］〜［０１０１］に記載されるプロセスによって得られた生成物に関する。
【実施例】
【０１０５】
以下の実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明のある特定の態様及び実施形態を示すために含まれる。しかしながら、以下の説明は例示にすぎず、決して本発明を制限するものとして解釈されるべきではないことを、当業者らは理解すべきである。
実施例の組成物に使用される材料
【表２】
2021534074.tif 000004
【０１０６】
ノロウイルスＶＬＰとして使用されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）
実施例の項では、ウイルス様粒子は、以下の略語を使用して参照される。
【表３】
2021534074.tif 000005
【０１０７】
試験方法
平均粒径（サイズ平均）、多分散性指数、及びゼータ電位の測定
サンプルに使用した緩衝液で１０倍に希釈した後、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して、平均粒径（サイズ平均）、多分散性指数（ＰＤＩ）、及びゼータ電位を測定した。
【０１０８】
サイズ平均（ゼータ電位及びＰＤＩ）は、使い捨てポリスチレンキュベットで２５℃で測定した。サンプルを含む１ｍＬの試験溶液を、各キュベットに充填した。測定は、サンプルを調製した後、１０分以内に実施した。
【０１０９】
キュベット材料の屈折率は、１．５９０に設定し、分散剤の粘度は、０．８８７２ｃＰに設定した。測定角度は、１７３度の後方散乱として設定した。
【０１１０】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）
ＥＬＩＳＡは、以下のように実施された：ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬの濃度で、ＶＬＰでコーティングした９６ウェルプレートを使用するサンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、各検体の特定の抗ＶＬＰ  ＩｇＡ応答及び特定の抗ＶＬＰ  ＩｇＧ応答を測定した。抗マウスＩｇＡ抗体試薬及び抗マウスＩｇＧ抗体試薬を、二次抗体として使用した。１ステップウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡを、ＩｇＡアッセイの基質として使用し、１ステップＡＢＴＳを、ＩｇＧアッセイの基質として使用した。力価は、４５０ｎｍで０．５のＯＤ（光学密度）に達するための最高希釈として定義した。
【０１１１】
血清ＩｇＡ及び血清ＩｇＧ
マウスを安楽死させる前に、麻酔下で各マウスから約１ｍＬの血液を採取した。これを遠心分離して、血清を得、次いで、上記のようにＥＬＩＳＡプレートに添加して、免疫応答をモニタリングした。
【０１１２】
糞便ＩｇＡ
各マウスケージから２時間ごとに約２００ｍｇの糞便を採取した。次いで、抽出緩衝液（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、１／１０体積プロテアーゼ阻害剤カクテル）を添加し、４℃で１５，０００ｒｐｍで遠心分離した後、これを均質化し、次いで上清を、上記のようにＥＬＩＳＡプレートに添加した。
【０１１３】
実施例１（インビトロ試験）
ＶＬＰ溶液の調製
ノロウイルスＶＬＰは、以下のように調製した：ノロウイルスの異なる群のうちの１つの群のキャプシドドメインの複合配列の合成遺伝子構築物を、組換えバキュロウイルスにクローニングした。Ｓｆ９昆虫細胞の感染は、ＶＬＰの生成物の高収量を示した。複合ＶＬＰ  ＶＰ  １遺伝子のＰ２ｐＦａｓｔＢａｃ組換えバキュロウイルスストックの４０ｍＬのアリコートを、ショ糖密度勾配で処理して、複合ＶＬＰの発現及び組み立てを確認した。馴化培地を、第１に、３０％ショ糖クッション上に重層し、次いで１４０Ｋ  ｘｇで遠心分離して、ＶＬＰをペレット化した。ペレットを再懸濁し、ショ糖密度勾配上に重層し、１４０Ｋ  ｘｇで遠心分離した。遠心分離後、勾配内に目に見える白色層を観察した。勾配から５００μＬの画分を収集し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥＩクーマシーゲルによって分析した。複合ＶＬＰの予想される結合パターンは、約５６ｋＤａで、ショ糖密度勾配画分内で観察された。０．５ｍＬ／分の流量で、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７のランニング緩衝液を備えた高圧液体クロマトグラフィーシステムを使用して、５０μＬのアリコートの複合発現細胞培養上清を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−６サイズ排除カラムに充填した。約１５．３分で無傷のＶＬＰピークを、２８０ｎｍ及び２２０ｎｍで観察し、複合ＶＬＰの完全性を確認した。複合ＶＬＰはまた、カラムクロマトグラフィーを使用する前に濾過された馴化培地から精製した。馴化培地は、陽イオン交換クロマトグラフィーによって処理した。陽イオン交換溶出画分は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によってさらに精製した。ＨＩＣ溶出画分を濃縮し、接線流濾過によって緩衝液を交換した。最終生成物を滅菌濾過し、４℃で保存した。５００ｎｇの精製複合ＶＬＰを、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。１．０ｍＬ／分の流量で、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７のランニング緩衝液を備えた高圧液体クロマトグラフィーシステムを使用して、５０μＬのアリコートの精製したＣＭ３複合ＶＬＰを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−６サイズ排除カラムに充填した。約７．５分で無傷のＶＬＰピークを２８０ｎｍで観察し、複合ＶＬＰの完全性を確認した。
【０１１４】
キトサン溶液は、５３．３６ｍｇのキトサングルタメートを３．３４ｍＬの緩衝液に溶解することによって調製し、表１に指定されているように、１５．９８ｍｇ／ｍＬのキトサングルタメートの濃度で溶液を得た。
【０１１５】
次いで、キトサン溶液を使用して、以下のステップに従ってキトサンでコーティングしたＶＬＰを調製した：
−  容器に、１０５μＬのアリコートのキトサン溶液を充填した。
−  １ｍＭのＮａＣｌ（１１μＬ）を含有する２０ｍＭのヒスチジン緩衝液ｐＨ６．５中の５０μｇのＧＩ  ＶＬＰ、ならびに２００ｍＭのＮａＣｌ及び２０％スクロース（９μＬ）を含有する２０ｍＭのヒスチジン緩衝液ｐＨ６．８中の５０μｇのＧＩＩ  ＶＬＰを添加して、
−  結果として得られた溶液を混合した。
【０１１６】
サンプルの混合は、ボルテックスミキサーを使用して、約１００〜約３，２００ｒｐｍの速度で、約１秒〜約２０秒の期間にわたって実施した。
【０１１７】
これにより、１６．７の製剤中のＶＬＰに対するキトサンの比率を得た。
【０１１８】
裸のＶＬＰを、５０μｇのＧＩ  ＶＬＰ（１１μＬ）及びＧＩＩ  ＶＬＰ（９μＬ）の両方を単純に組み合わせ、表１で指定されているように、１０５μＬのアリコートの緩衝液で希釈することによって調製した。
【０１１９】
この試験の結果を、表１に示す。
【表４】
2021534074.tif 000006
【０１２０】
実施例２（インビトロ試験）
キトサン溶液は、５つの異なる濃度のｐＨ４酢酸緩衝液を使用して実施例１のように調製した。次いで、これらの溶液を使用して、実施例１に記載されているようにキトサンでコーティングしたＶＬＰを生成した。
【０１２１】
これらの試験の結果を、表２に示す。
【表５】
2021534074.tif 000007
【０１２２】
実施例３（インビトロ試験）
１５．９８ｍｇ／ｍＬの濃度のキトサン溶液を、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４）中で実施例１のように調製した。
【０１２３】
キトサンでコーティングしたＶＬＰは、実施例１のように、５０μｇのＧＩ  ＶＬＰ及び５０μｇのＧＩＩ  ＶＬＰを用いて調製したが、各製剤のＶＬＰに対するキトサンの比率を変えるために、添加したキトサン溶液の量は変動した。添加したキトサン溶液の正確な量を、表３に示す。
【０１２４】
次いで、試験方法の項で説明されるように、粒径、ＰＤＩ、及びゼータ電位を測定した。
【０１２５】
この試験の結果を、表３に示す。
【表６】
2021534074.tif 000008
【０１２６】
実施例４（インビボ試験）
薬物溶液の調製
キトサン溶液は、上記の実施例１について記載したのと同様の方法で、それぞれ、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．５）及び５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４）を使用して調製した。２６．６８ｍｇのアリコートのキトサングルタメートを、１．６７３ｍＬの各緩衝液に溶解して、２つの異なるキトサン溶液（１つはｐＨ４、もう１つはｐＨ６．５）を得た。
【０１２７】
次いで、キトサン溶液を使用して、以下のステップに従ってキトサンでコーティングしたＶＬＰを調製した：
−  容器に、１．６７３ｍＬのアリコートのキトサン溶液を充填し、
−  ８００μｇのＧＩ  ＶＬＰ（１８０μＬ）及び８００μｇのＧＩＩ  ＶＬＰ（１４７μＬ）を、それぞれ、添加し、
−  次いで、総体積２ｍＬの結果として得られた溶液を、ボルテックスミキサーを使用して、混合した。
【０１２８】
これにより、１６．７の各溶液中のＶＬＰに対するキトサンの比率を得た。
【０１２９】
陽性対照の調製
陽性対照薬物溶液を、以下のステップに従って調製した：
（１）容器に、それぞれ、６００μｇのＧＩ  ＶＬＰ及び６００μｇのＧＩＩ  ＶＬＰを充填し、
（２）１５ｍｇのアリコートの水酸化アルミニウムゲルを、容器に添加し、
（３）１．５ｍｇのアリコートのモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を、容器に添加し、
（４）２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を添加して、陽性対照の最終体積を最大１．５ｍＬにし、
（５）混合物を、ボルテックスミキサーを使用して混合した。
【０１３０】
動物実験
続いて、２５０μＬのアリコートの各製剤を、０日目及び２２日目に、雌ｂａｌｂ／ｃマウス（１群当たりｎ＝４）に投与した。原薬を、経口投与し、陽性対照を、筋肉内投与した。
【０１３１】
研究の２９日目に、血清及び糞便サンプルを収集した。血清及び糞便中のＧＩ  ＶＬＰ特異的免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を使用して測定した。
【０１３２】
この研究の結果を、表４に示す。
【表７】
2021534074.tif 000009
【０１３３】
実施例５（インビボ試験）
薬物溶液の調製
キトサン溶液は、上記の実施例１について記載したのと同様の方法で、３つの異なる濃度（５０ｍＭ、２００ｍＭ、及び５００ｍＭ）の酢酸緩衝液（ｐＨ４）を使用して調製した。各溶液について、２６．６８ｍｇのアリコートのキトサングルタメートを、１．６７３ｍＬの酢酸緩衝液に溶解し、異なる酢酸緩衝液濃度の３つの異なる溶液を得た。
【０１３４】
次いで、キトサン溶液を使用して、以下のステップに従ってキトサンでコーティングしたＶＬＰを調製した：
（１）容器に、１．６７３ｍＬのアリコートのキトサン溶液を充填し、
（２）８００μｇのＧＩ  ＶＬＰ（１８０μＬ）及び８００μｇのＧＩＩ  ＶＬＰ（１４７μＬ）を、それぞれ、容器に添加し、
（３）次いで、総体積２ｍＬの結果として得られた溶液を、ボルテックスミキサーを使用して、混合した。
【０１３５】
これにより、１６．７の製剤中のＶＬＰに対するキトサンの比率を得た。
【０１３６】
陽性対照の調製
陽性対照薬物溶液を、以下のステップに従って調製した：
（１）容器に、それぞれ、１０００μｇのＧＩ  ＶＬＰ及び１０００μｇのＧＩＩ  ＶＬＰを充填し、
（２）２５ｍｇのアリコートの水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）を、容器に添加し、
（３）２．５ｍｇのアリコートのモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を、容器に添加し、
（４）２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．５）を添加して、最終体積を最大２．５ｍＬにし、
（５）混合物を、ボルテックスミキサーを使用して混合した。
【０１３７】
動物実験
続いて、２５０μＬのアリコートの各製剤を、０日目及び２２日目に、雌ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）に投与した（各製剤を、表５に要約する）。原薬を、経口投与し、陽性対照を、筋肉内投与した。
【０１３８】
研究の２９日目に、血清及び糞便サンプルを収集した。糞便のＧＩ  ＶＬＰ特異的免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）及び血清中のＶＬＰ特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を使用して測定した。
【０１３９】
この研究の結果を、表５に示す。
【表８】
2021534074.tif 000010
【０１４０】
実施例６（インビボ試験）
薬物溶液の調製
キトサン溶液は、上記の実施例１について記載したのと同様の方法で、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４）を使用して調製した。溶液は、１５．９５ｍｇのキトサングルタメートを１ｍＬの緩衝液に溶解することによって調製した。
【０１４１】
次いで、キトサン溶液を使用して、以下のステップに従ってキトサンでコーティングしたＶＬＰを調製した：
（１）容器に、１．６７３ｍＬのアリコートのキトサン溶液を充填し、
（２）次いで、８００μｇのＧＩ  ＶＬＰ（１８０μＬ）及び８００μｇのＧＩＩ  ＶＬＰ（１４７μＬ）を、それぞれ、添加し、
（３）次いで、総体積２ｍＬの結果として得られた溶液を、ボルテックスミキサーを使用して、混合した。
【０１４２】
これにより、１６．７の組成物中のＶＬＰに対するキトサンの比率を得た。
【０１４３】
さらなる溶液を、以下のステップに従って調製した：
（１）容器に、５．６７３ｍＬのアリコートのキトサン溶液を充填し、
（２）次いで、８００μｇのＧＩ  ＶＬＰ（１８０μＬ）及び８００μｇのＧＩＩ  ＶＬＰ（１４７μＬ）を、それぞれ、添加し、
（３）次いで、総体積６ｍＬの結果として得られた溶液を、ボルテックスミキサーを使用して、混合した。
【０１４４】
これにより、５０の組成物中のＶＬＰに対するキトサンの比率を得た。
【０１４５】
陽性対照の調製
陽性対照薬物溶液を、以下のステップに従って調製した：
（１）容器に、それぞれ、１０００μｇのＧＩ  ＶＬＰ及び１０００μｇのＧＩＩ  ＶＬＰを充填し、
（２）２５ｍｇのアリコートの水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）を、溶液に添加し、
（３）２．５ｍｇのアリコートのモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を、溶液に添加し、
（４）１アリコートの２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．５）を添加して、最終体積を最大２．５ｍＬにし、
（５）溶液を、ボルテックスミキサーを使用して混合した。
【０１４６】
動物実験
続いて、２５０μＬまたは７５０μＬのアリコートの各製剤を、２５０μＬの対照物質を使用して、０日目及び２２日目に、雌ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）に投与した。原薬を、経口投与し、陽性対照を、筋肉内投与した。
【０１４７】
研究の２９日目に、血清及び糞便サンプルを収集した。ＧＩ  ＶＬＰ特異的血清及び糞便免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）及び血清中のＶＬＰ特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を、上記のように、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を使用して測定した。
この研究の結果を、表６に示す。
【表９】
2021534074.tif 000011
【０１４８】
参考実施例１
薬物溶液の調製
キトサン溶液は、上記の実施例１について記載したのと同様の方法で、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．５）を使用して調製した。１３．３４ｍｇのアリコートのキトサングルタメートを、０．８３７ｍＬの緩衝液に溶解して、キトサン溶液を調製した。
【０１４９】
次いで、キトサン溶液を使用して、以下のステップに従ってキトサンでコーティングしたＶＬＰを調製した：
（１）容器に、０．８３７ｍＬのアリコートのキトサン溶液を充填し、
（２）４００μｇのＧＩ  ＶＬＰ（９０μＬ）及び４００μｇ（７３μＬ）のＧＩＩ  ＶＬＰも、それぞれ、添加し、
（３）次いで、総体積１ｍＬの結果として得られた溶液を、ボルテックスミキサーを使用して、混合した。
これにより、１６．７の製剤中のＶＬＰに対するキトサンの比率を得た。
【０１５０】
陰性対照の調製
陰性対照では、裸のＶＬＰを、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した：
（１）容器に、４００μｇのＧＩ  ＶＬＰ（９０μＬ）及び４００μｇのＧＩＩ  ＶＬＰ（７３μＬ）を、それぞれ、充填し、
（２）いずれの場合にも、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．５）を添加して、最終体積を最大１ｍＬにし、
（３）次いで、溶液を、ボルテックスミキサーを使用して混合した。
【０１５１】
動物実験
５０μＬのアリコートの各製剤を、０日目及び２２日目に、雌ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）の空腸に直接投与した。
【０１５２】
研究の２９日目に、血清及び糞便サンプルを収集した。ＧＩ  ＶＬＰ特異的血清及び糞便免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）及び血清中のＶＬＰ特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を使用して測定した。
【表１０】
2021534074.tif 000012
【０１５３】
参考実施例２
薬物溶液の調製
キトサン溶液は、上記の実施例１について記載したのと同様の方法で、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．５）を使用して調製した。２６．６８ｍｇのアリコートのキトサングルタメートを、２ｍＬの緩衝液に溶解して、キトサン溶液を調製した。
【０１５４】
次いで、キトサン溶液を使用して、以下のステップに従ってキトサンでコーティングしたＶＬＰを調製した：
（１）容器に、１．６７３ｍＬのアリコートのキトサン溶液を充填し、
（２）８００μｇのＧＩ  ＶＬＰ（１８０μＬ）及び８００μｇのＧＩＩ  ＶＬＰ（１４７μＬ）も、それぞれ、添加し、
（３）次いで、合計２ｍＬの結果として得られた溶液を、ボルテックスミキサーを使用して、混合した。
【０１５５】
これにより、１６．７の製剤中のＶＬＰに対するキトサンの比率を得た。
【０１５６】
陽性対照の調製
陽性対照薬物溶液を、以下のステップに従って調製した：
（１）容器に、それぞれ、１０００μｇのＧＩ  ＶＬＰ及び１０００μｇのＧＩＩ  ＶＬＰを充填し、
（２）２５ｍｇのアリコートの水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）を、容器に添加し、
（３）２．５ｍｇのアリコートのモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を、容器に添加し、
（４）２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を添加して、最終体積を最大２．５ｍＬにし、
（５）混合物を、ボルテックスミキサーを使用して混合した。
【０１５７】
動物実験
５０μＬのアリコートの各製剤を、０日目及び２２日目に、雌ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）に、経口または空腸への注射を介して投与した。陽性対照を、０日目及び２２日目に、雌ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）に筋肉内注射（ＩＭ）した。
【０１５８】
研究の２９日目に、血清及び糞便サンプルを収集した。ＧＩ  ＶＬＰ特異的血清及び糞便免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）を、試験方法の項で説明されるように、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を使用して測定した。
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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