(57)【要約】  真核細胞の選択的ライシス及び微生物細胞の分離のための方法及び組成物が提供される。サンプル中の血液細胞及び／又は他の真核細胞は、サポニンとアルカリ性緩衝剤と、任意選択的にポリアネトールスルホン酸ナトリウムと非イオン性界面活性剤と、を含む血液ライシス試薬をサンプルに添加して混合物を形成することと、混合物をアジテートすることと、により、選択的にライシスされうる。次いで、混合物中の微生物細胞は、たとえば、遠心分離や濾過などの分離方法を用いて分離されうるとともに、任意選択的に成長培地で検出又は培養されうる。サンプルとの混合時の微生物細胞のインタクト性を保存するのに好適な血液ライシス試薬組成物が提供される。サンプルが血液サンプルである実施形態例では、血液ライシス試薬組成物は、遠心分離時又は濾過時の可視血液デブリの存在を回避又は低減するように選択されうる。【選択図】図１６Ｄ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルから微生物細胞を分離する方法であって、
０．７５〜６０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、０．３５〜５０ｍｇ／ｍｌのポリアネトールスルホン酸ナトリウム濃度と、７．８〜１０のｐＨと、を有する混合物が得られるように、血液サンプルと、サポニンとポリアネトールスルホン酸ナトリウムとアルカリ性緩衝剤とを含む血液ライシス試薬である血液ライシス試薬と、を混合することと、
前記混合物から微生物細胞を分離することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記血液ライシス試薬が９．０〜１１の範囲内のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血液ライシス試薬が９．５〜１０．５の範囲内のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記混合物のｐＨが８．０〜１０．０の範囲内にあるように前記血液ライシス試薬が構成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記混合物のｐＨが８．５〜９．５の範囲内にあるように前記血液ライシス試薬が構成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記混合物のｐＨが９．０〜９．５の範囲内にあるように前記血液ライシス試薬が構成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記混合物のｐＨが８．８〜９．８の範囲内にあるように前記血液ライシス試薬が構成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物の有効緩衝剤濃度が２．５〜５００ｍＭの範囲内にあるように前記血液ライシス試薬が構成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記混合物の有効緩衝剤濃度が５〜２５０ｍＭの範囲内にあるように前記血液ライシス試薬が構成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記混合物のサポニン濃度が３〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内にあるように前記血液ライシス試薬が構成される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記混合物のサポニン濃度が１０〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲内にあるように前記血液ライシス試薬が構成される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記混合物のポリアネトールスルホン酸ナトリウム濃度が３〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内にあるように前記血液ライシス試薬が構成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記混合物のポリアネトールスルホン酸ナトリウム濃度が１．５〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲内にあるように前記血液ライシス試薬が構成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記混合物のポリアネトールスルホン酸ナトリウム濃度が５〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内にあるように前記血液ライシス試薬が構成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記サポニンが前記アルカリ性緩衝剤の塩基性成分から分離して貯蔵されるように、少なくとも２つの試薬が分離して貯蔵され、且つ前記血液ライシス試薬と前記血液サンプルとの混合前に後続的に混合されて前記血液ライシス試薬を形成する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記サポニンが３．５〜８のｐＨを有する水性媒体中に貯蔵される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サポニンが４〜５のｐＨを有する水性媒体中に貯蔵される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルカリ性緩衝剤の前記塩基性成分が乾燥形態で貯蔵される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記サポニンが溶液中に貯蔵される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記血液ライシス試薬が非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記混合物の非イオン性界面活性剤濃度が０〜３％ｗ／ｖの範囲内にあるように前記血液ライシス試薬が構成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記混合物の非イオン性界面活性剤濃度が０．５〜２．０％ｗ／ｖの範囲内にあるように前記血液ライシス試薬が構成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記血液ライシス試薬が消泡剤をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記消泡剤が、ポリジメチルシロキサンと水中油型乳化剤として非イオン性界面活性剤とを含むエマルジョンを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記混合物の消泡剤濃度が０．００５〜１％ｗ／ｖの範囲内にあるように前記消泡剤が提供される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記混合物の消泡剤濃度が０．０１〜０．０５％ｗ／ｖの範囲内にあるように前記消泡剤が提供される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記血液サンプルが全血サンプルである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記全血サンプルが１ｍｌを超える体積を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記全血サンプルが５ｍｌを超える体積を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記混合物の遠心分離後又は濾過後の血液デブリの可視存在が回避されるような組成で前記血液ライシス試薬が提供される、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記サンプルが血液培養サンプルである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記血液培養サンプルが微生物細胞の存在が陽性であるとまだみなされていない、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記微生物細胞が遠心分離を介して分離される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記微生物細胞が、濾過、免疫磁気分離、及びマイクロ流体分離からなる群から選択される分離方法を介して分離される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記分離された微生物細胞の少なくとも１つの微生物細胞のタイプを同定するために同定アッセイを実施すること、
をさらに含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記同定アッセイがＭＡＬＤＩアッセイである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記分離された微生物細胞を成長培地の存在下でインキュベートすることをさらに含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
サンプルから微生物細胞を分離する方法であって、
７．８〜１０のｐＨと、サンプル中の血液細胞のライシスを行うのに好適なサポニン濃度と、を有する混合物が得られるように、サンプルと、サポニンとアルカリ性緩衝剤とを含む血液ライシス試薬である血液ライシス試薬と、を混合することと、
前記混合物から微生物細胞を分離することと、
を含む、方法。
【請求項３９】
前記血液ライシス試薬がポリアネトールスルホン酸ナトリウムをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、「真核細胞の選択的ライシスのための方法及び組成物」という名称の２０１８年５月２５日出願の米国仮特許出願第６２／６７６，７７１号（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）に基づく優先権を主張するとともに、さらに「血液細胞の選択的ライシス及び微生物細胞の分離のための方法及び組成物」という名称の２０１８年１２月６日出願の米国仮特許出願第６２／７７６，１２６号（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤耐性病原体の出現は、通常の感染疾患をこれまで以上に強力な抗生物質を用いて治療することを医師に余儀なくする世界的医療危機である。これは主に原因病原体の同定の複雑さ及びそれに要する時間に起因し、培養検体で高い陰性率の知見があっても医師により経験的に処方することが余儀なくされる。最終結果として、耐性株の出現が有意に増加し、治療コストが高くなり、しかも広域スペクトルの不必要な抗生物質の摂取に伴う副作用リスクの増加に起因して回復サイクルが長くなっている。
【０００３】
広域スペクトル抗生物質は、敗血症又は敗血症性ショックの症状を呈している患者を治療するときに通常処方される。これらの病態の重症度を考慮して、医師は、多くの場合、直ちに１種以上の広域スペクトル抗生物質を処方し、薬剤の十分な効果を評価できるまで又は微生物学的結果が得られるまで治療レジメンを変更する可能性は低い。たとえば、文書「Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  Ｓｅｐｓｉｓ  Ｃａｍｐａｉｇｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ」（ＳＳＣＧ）には、可能性のある細菌／真菌病原体に対する１種以上の広域スペクトル剤からなる静脈内抗生物質が、重篤な敗血症及び敗血症性ショックを認識してから１時間以内に開始されるべきであるという治療プロトコルが推奨されている［Ｒ．Ｐ．Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００８］。抗微生物レジメンは毎日再評価されるべきであり、病原体が分かったら、適正規範の問題として、より適切な狭域スペクトル抗微生物薬剤が投与されるべきであると、治療プロトコルに明記されている。
【０００４】
残念ながら、現在の臨床細菌学的方法は、典型的には、病原体同定情報の提供が遅すぎて患者のアウトカムに影響を与えないおそれがある。これは検体採取から病原体同定及び感受性試験の結果報告までの２〜３日間のタイムラグに起因する。タイムラグの原因としては、専門臨床微生物学者が配属された臨床実験室に検体を輸送する必要があること、血液培養及び固形培養培地上での検体の継代培養後の後続コロニー形成に時間を要することが挙げられる。できる限り迅速に、好ましくは２時間以内に臨床微生物学実験室に接種血液培養ボトルを輸送することが推奨されるが、通常の就業時間後に臨床微生物学実験室に到着する検体は、スタッフが翌日到着するまで典型的には一晩保持される。血液培養陽性は、典型的には細菌では少なくとも８〜１８時間及び真菌では１〜３日間かかる。陽性血液培養物を得た後で検体を固形寒天上で継代培養すると、コロニーを形成するために細菌ではさらに少なくとも８〜１２時間及び真菌では１〜４日間必要となる。プレートが検査され、同定及び感受性試験のために適切なコロニーが選択される。プロセスは、解析及び解釈をさらに必要とし、その後、典型的には３日目に報告が出されるので、遅すぎて抗生物質の選択及び患者のアウトカムに有意な影響を与えないおそれがある。
【０００５】
臨床微生物学実験室ワークフローの多くの側面は自動化されているが、臨床細菌学は、依然としてきわめて多くの労力を要する。多くの実験室では、現在、Ｖｉｔｅｋ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）又はＰｈｏｅｎｉｘ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）のどちらかの機器を用いて同定及び感受性試験を自動化している。しかしながら、これらのシステム及び質量分析に基づくより新しいシステムは、依然として専門職員による寒天プレートからの適切なコロニーの選択に依存する。
【０００６】
全血から直接得られるような未処理サンプルで病原体の直接迅速同定を促進する新しい技術が出現している。かかる迅速方法は、典型的には、サンプル中の微生物細胞の完全性への影響を最小限に抑える試みをしつつ、哺乳動物細胞を選択的にライシスする試薬を含む初期細胞ライシス工程を利用する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
真核細胞の選択的ライシス及び微生物細胞の分離のための方法及び組成物が提供される。サンプル中の血液細胞及び／又は他の真核細胞は、サポニンとアルカリ性緩衝剤と、任意選択的にポリアネトールスルホン酸ナトリウムと非イオン性界面活性剤と、を含む血液ライシス試薬をサンプルに添加して混合物を形成することにより、選択的にライシスされうる。次いで、混合物中の微生物細胞は、たとえば、遠心分離や濾過などの分離方法を用いて分離されうるとともに、任意選択的に成長培地で検出又は培養されうる。サンプルとの混合時の微生物細胞のインタクト性を保存するのに好適な血液ライシス試薬組成物が提供される。サンプルが血液サンプルである実施形態例では、血液ライシス試薬組成物は、遠心分離時又は濾過時の可視血液デブリの存在を回避又は低減するように選択されうる。
【０００８】
それゆえ、第１の態様では、サンプルから微生物細胞を分離する方法が提供され、本方法は、
０．７５〜６０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、０．３５〜５０ｍｇ／ｍｌのポリアネトールスルホン酸ナトリウム濃度と、７．８〜１０のｐＨと、を有する混合物が得られるように、血液サンプルと、サポニンとポリアネトールスルホン酸ナトリウムとアルカリ性緩衝剤とを含む血液ライシス試薬である血液ライシス試薬と、を混合することと、
混合物から微生物細胞を分離することと、
を含む。
【０００９】
他の一態様では、サンプルから微生物細胞を分離する方法が提供され、本方法は、
７．８〜１０のｐＨと、サンプル中の血液細胞のライシスを行うのに好適なサポニン濃度と、を有する混合物が得られるように、サンプルと、サポニンとアルカリ性緩衝剤とを含む血液ライシス試薬である血液ライシス試薬と、を混合することと、
混合物から微生物細胞を分離することと、
を含む。
【００１０】
以下の詳細な説明及び図面を参照すれば、本開示の機能的及び有利な側面の理解を深めることが可能である。
【００１１】
次に、単なる例にすぎないが、図面を参照して実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ−１Ｆ】遠心分離を介してサンプル中の微生物細胞をライシス、分離、及び濃縮する方法例を模式的に例示する。
【図１Ｇ−１Ｍ】図１Ａ−１Ｆの続きである。
【図２】インテグレート流体処理カートリッジを用いて自動遠心分離及び洗浄を実施するためのシステム例の模式図を示す。
【図３Ａ】捕集チューブからサンプルを直接抽出し続いて遠心分離及び洗浄を行って濃縮及び精製された微生物細胞のサスペンジョンを得るように構成されたインテグレート流体処理カートリッジ例を例示する。
【図３Ｂ】図３Ａの続きである。
【図３Ｃ】図３Ｂの続きである。
【図４】自動遠心分離及び洗浄を実施する方法例を例示するフローチャートを提供する。
【図５Ａ】サポニンとポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）とを含有する等体積のタイプ１血液ライシス試薬を用いてさまざまな体積の全血サンプルの溶血を実施し続いて２回の遠心洗浄を行った後の遠心分離機チューブの画像を示す。
【図５Ｂ】Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有する等体積のタイプ２血液ライシス試薬を用いてさまざまな体積の全血サンプルの溶血を実施し続いて２回の遠心洗浄を行った後の遠心分離機チューブの画像を示す。
【図６】全血サンプルと、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有するタイプ２血液ライシス試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、微生物細胞インタクト性の尺度としてリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）と、を実施した後に得られたさまざまな細菌種のΔＣＴ値をプロットする。
【図７】スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルと、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とＳＰＳとを含有する試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後のさまざまな細菌種でのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度へのΔＣＴの依存性をプロットする。
【図８】スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルと、炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＳＰＳとを含有する試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後のさまざまな細菌種での緩衝剤濃度へのΔＣＴの依存性をプロットする。
【図９Ａ】スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルと、炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とサポニンＡとＳＰＳとを含有する試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後のさまざまな細菌での緩衝剤濃度へのΔＣＴの依存性をプロットする。
【図９Ｂ】全血サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後に得られたさまざまな細菌種でのΔＣＴ値をプロットする。
【図９Ｃ】全血サンプルと、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有するタイプ２血液ライシス試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後に得られたさまざまな細菌種でのΔＣＴ値をプロットする。（すでに図６に示される）。
【図１０】全血サンプルと、さまざまな濃度のサポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後のさまざまな細菌種でのサポニン濃度へのΔＣＴの依存性をプロットする。
【図１１Ａ】全血サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とさまざまな濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後のさまざまな細菌種でのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度へのΔＣＴの依存性をプロットする。
【図１１Ｂ】全血サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００又はＴｗｅｅｎ−２０とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後のタイプ３血液ライシス試薬中の非イオン性界面活性剤のタイプへのΔＣＴの依存性を比較する。
【図１２Ａ】全血サンプルと、ＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後のさまざまな細菌種での緩衝剤濃度へのΔＣＴの依存性をプロットする。
【図１２Ｂ】初期緩衝剤濃度（混合前の緩衝剤濃度）への混合後のｐＨの依存性をプロットする。
【図１３Ａ−１３Ｂ】スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するさまざまなｐＨ値のタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後のさまざまな細菌種及び３つの異なる血液ライシス試薬ｐＨ値（ｐＨ値は全血との混合前に測定された）でのΔＣＴ値をプロットし、図１３Ａは、０．７５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度でのデータを提示し、且つ図１３Ｂは、０．３８％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度でのデータを提示する。
【図１４Ａ】全血サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するさまざまなｐＨ値のタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後のさまざまな細菌種及び３つの異なる血液ライシス試薬ｐＨ値（ｐＨ値は、血液ライシス試薬の他の成分との混合前の初期緩衝剤のものである）でのΔＣＴ値をプロットする。
【図１４Ｂ】タイプ３血液ライシス試薬の調製に利用された初期炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤のｐＨ（９．５、１０、及び１０．５）の関数として最終混合物（タイプ３血液ライシス試薬＋全血）のｐＨをプロットする。
【図１４Ｃ】タイプ３血液ライシス試薬の調製時及び後続使用時に測定されたｐＨ変化を実証する表である。
【図１４Ｄ】全血サンプルと、サポニンとＳＰＳとさまざまな濃度の炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後のさまざまな細菌種及び３つの異なる血液ライシス試薬ｐＨ値（ｐＨ値は全血との混合前に測定された）でのΔＣＴ値をプロットする。
【図１５Ａ】全血サンプルと、サポニンとＳＰＳとそれぞれ異なる緩衝剤系とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後のさまざまな細菌種及び３つの異なる血液ライシス試薬（各々異なる緩衝剤系を利用する）でのΔＣＴ値をプロットする。
【図１５Ｂ】全血との混合前及び混合後のサポニンとＳＰＳとそれぞれ異なる緩衝剤系ｐＨ１０とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬の測定されたｐＨ変化を実証する表である。
【図１６Ａ】３ｍｌの体積を有する全血サンプルと、サポニンとさまざまな濃度のＳＰＳとを含有する試薬と、を接触させ、続いて２回の遠心洗浄工程を行った後の遠心分離機チューブの画像を示す。
【図１６Ｂ】３ｍｌの体積を有する全血サンプルと、サポニンとさまざまな濃度のＳＰＳとＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有する試薬と、を接触させ、続いて２回の遠心洗浄工程を行った後の遠心分離機チューブの画像を示す。
【図１６Ｃ】３ｍｌの体積を有する全血サンプルと、サポニンとさまざまな濃度のＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有する試薬と、を接触させ、続いて２回の遠心洗浄工程を行った後の遠心分離機チューブの画像を示す。
【図１６Ｄ】３ｍｌの体積を有する全血サンプルと、サポニンとさまざまな濃度のＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、続いて２回の遠心洗浄工程を行った後の遠心分離機チューブの画像を示す。
【図１６Ｅ】全血サンプルと、さまざまな濃度のサポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後のさまざまな細菌種でのＳＰＳ濃度へのΔＣＴの依存性をプロットする。
【図１７Ａ】各種消泡剤を含む血液ライシス試薬の性能をまとめた表である。
【図１７Ｂ】消泡剤なし（左側）及びあり（右側）の遠心分離機チューブでボルテックス後の泡高さを示す画像を提示する。
【図１７Ｃ】消泡剤なし（ＨＲ３）及びあり（ＨＲ５）のチューブで泡高さの時間依存性をまとめた表である。
【図１７Ｄ】消泡剤なし（ＨＲ３）及びあり（ＨＲ５）で血液ライシス試薬の安定性を比較した表である。
【図１８Ａ】さまざまな貯蔵緩衝剤のサポニン溶液でサポニン調製後の室温貯蔵０日目（図１８Ａ）及び２３日目（図１８Ｂ）のサポニンの溶血活性の濃度依存性をプロットする。
【図１８Ｂ】図１８Ａの続きである。
【図１８Ｃ】さまざまな貯蔵緩衝剤のサポニン溶液を用いてサポニン調製後の室温貯蔵０日目及び２３日目のヒツジ赤血球の溶血のＨＣ５０値（μｇ／ｍＬ）を提示する表である。
【図１９Ａ】スパイクリン酸塩緩衝剤サンプル（図１９Ａ）又はスパイク全血サンプル（図１９Ｂ）と、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、熱ライシスと、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと、を実施した後のさまざまな細菌種及び３つの異なる貯蔵条件でのΔＣＴ値をプロットする。
【図１９Ｂ】図１９Ａの続きである。
【図２０Ａ】各種クエン酸塩緩衝剤強度（図２０Ａ）及び酢酸塩緩衝剤強度（図２０Ｂ）でのＮａ２ＣＯ３の測定ｐＨの依存性を表す漸増曲線をプロットする。
【図２０Ｂ】図２０Ａの続きである。
【図２１Ａ】陽性血液培養サンプルと、サポニンとＳＰＳとを含有するタイプ１血液ライシス試薬と、を対流混合により接触させ、続いて２回の遠心洗浄工程を行った後の遠心分離機チューブの画像を示す。
【図２１Ｂ】陽性血液培養サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を対流混合により接触させ、続いて２回の遠心洗浄工程を行った後の遠心分離機チューブの画像を示す。
【図２１Ｃ】陽性血液培養サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とをさまざまな組成で含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、続いて２回の遠心洗浄工程を行った後の細胞サスペンジョン中のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及びＰ．アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の同定でのＭＡＬＤＩ（ＶＩＴＥＫ−ＭＳ−ＩＤ）の性能を示す。
【図２１Ｄ】陽性血液培養サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、続いて１〜４回の遠心洗浄工程を行った後の細胞サスペンジョン中のＫ．ニューモニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）のＭＡＬＤＩ（ＶＩＴＥＫ−ＭＳ−ＩＤ）同定での洗浄サイクル数への依存性を示す。
【図２２Ａ】タイプ２及びタイプ３血液ライシス試薬に接触させ、続いて遠心分離及び濃縮を行った後の全血サンプルから回収されたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の寒天プレーティング結果を示す。
【図２２Ｂ】サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬に接触させ、続いて遠心分離及び濃縮を行った後の全血サンプルから回収されたＰ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）の寒天プレーティング結果を示す。
【図２２Ｃ】サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬に接触させ、続いて遠心分離及び濃縮を行った後の全血サンプルから回収されたＰ．アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の寒天プレーティング結果を示す。
【図２２Ｄ】サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有するタイプ３血液ライシス試薬に接触させ、続いて遠心分離及び濃縮を行った後の全血サンプルから回収されたＰ．アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、Ｐ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）の寒天プレーティング結果（プレートカウント）を示す。
【図２３Ａ】対流混合によりサポニンとＳＰＳとさまざまな濃度の炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有するタイプ３血液ライシス試薬に接触させ、続いて遠心分離及び濃縮を行った後の全血サンプルから回収されたＰ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）の寒天プレーティング結果を示す。
【図２３Ｂ】サポニンとＳＰＳとさまざまな濃度の炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有するタイプ３血液ライシス試薬を用いて対流混合により処理し、続いて遠心分離及び濃縮を行った全血サンプルから回収されたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の寒天プレーティング結果を示す。
【図２３Ｃ】サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤と２つの異なる濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬に対流混合により接触させ、続いて遠心分離及び濃縮を行った後の５ｍＬの体積の全血サンプルから回収されたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の寒天プレーティング結果を示す。
【図２３Ｄ】ＳＰＳとサポニンと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤と２つの異なる濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬に対流混合により接触させ、続いて遠心分離及び濃縮を行った後の５ｍＬの体積の全血サンプルから回収されたＰ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）の寒天プレーティング結果を示す。
【図２３Ｅ】ＳＰＳとサポニンと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤と２つの異なる濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬に対流混合により接触させ、続いて遠心分離及び濃縮を行った後の５ｍＬの体積の全血サンプルから回収されたＰ．アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ−３５５５４）の寒天プレーティング結果を示す。
【図２３Ｆ】ＳＰＳとサポニンと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤と２つの異なる濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬に対流混合により接触させ、続いて遠心分離及び濃縮を行った後の５ｍＬの体積の全血サンプルから回収されたＰ．アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（臨床単離物）の寒天プレーティング結果を示す。
【図２３Ｇ】ＳＰＳとサポニンと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するタイプ３血液ライシス試薬に対流混合により接触させ、続いて５、１０、及び１５分間の３つの異なる遠心分離時間で遠心分離及び濃縮を行った後の５ｍＬの体積の全血サンプルから回収されたＰ．アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（臨床単離物）の寒天プレーティング結果を示す。
【図２４Ａ】１ｍＬの陽性血液培養サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、続いて遠心分離及び濃縮を行った後の陽性血液培養サンプルからのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の回収をＶＩＴＥＫ−ＭＳ−ＩＤ（質量分析同定による同定）、ＶＩＴＥＫ２−ＩＤ（酵素的同定方法）、及びＶＩＴＥＫ２−ＡＳＴ（マイクロ希釈方法による抗微生物剤感受性試験）との関連で示す。
【図２４Ｂ】１ｍＬの陽性血液培養サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、続いて遠心分離及び濃縮を行った後の陽性血液培養サンプルからのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の回収をＶＩＴＥＫ−ＭＳ−ＩＤ、ＶＩＴＥＫ２−ＩＤ、及びＶＩＴＥＫ２−ＡＳＴとの関連で示す。
【図２４Ｃ】１ｍＬの陽性血液培養サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、続いて遠心分離及び濃縮を行った後の陽性血液培養サンプルからのＰ．アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の回収をＶＩＴＥＫ−ＭＳ−ＩＤ、ＶＩＴＥＫ２−ＩＤ、及びＶＩＴＥＫ２−ＡＳＴとの関連で示す。
【図２４Ｄ】１ｍＬの陽性血液培養サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、続いて遠心分離及び濃縮を行った後の陽性血液培養サンプルからのＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の回収をＶＩＴＥＫ−ＭＳ−ＩＤ、ＶＩＴＥＫ２−ＩＤ、及びＶＩＴＥＫ２−ＡＳＴとの関連で示す。
【図２５】４ｍＬの全血サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有するタイプ３血液ライシス試薬と、を接触させ、遠心分離及び濃縮と、コロニー成長のために寒天プレーティングと、を実施した後の全血からの２４株（８種から３株ずつ）のグラム陽性細菌、２４株（８種から３株ずつ）のグラム陰性細菌、及び１２株（４種から３株ずつ）の真菌の生存細胞回収をＶＩＴＥＫ−ＭＳ−ＩＤ、ＶＩＴＥＫ２−ＩＤ、及びＶＩＴＥＫ２−ＡＳＴとの関連でまとめた表である。
【図２６Ａ−２６Ｂ】対流混合を実施する方法を模式的に例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下で考察される詳細を参照して本開示の各種実施形態及び態様を説明する。以下の説明及び図面は本開示の例示であり、本開示の限定と解釈されるべきではない。多くの具体的詳細は、本開示の各種実施形態の十分な理解を提供するために記載される。しかしながら、ある特定の場合には、周知又は従来の詳細は、本開示の実施形態の簡潔な考察を提供するために記載されない。
【００１４】
本明細書で用いられる場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（〜を含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」という用語は、包括的且つオープンエンドであり排他的ではないと解釈されるべきである。具体的には、本明細書及び特許請求の範囲で用いられる場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（〜を含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」という用語並びにその変化形は、指定のフィーチャー、工程、又は成分が含まれることを意味する。これらの用語は、他のフィーチャー、工程、又は成分の存在を排除すると解釈されるべきではない。
【００１５】
本明細書で用いられる場合、「模範的」という用語は、「例、実例、又は例示として機能すること」を意味し、本明細書に開示される他の構成よりも好ましい又は有利であると解釈されるべきではない。
【００１６】
本明細書で用いられる場合、「約」及び「おおよそ」という用語は、値の範囲の上限及び下限で存在しうる変動、たとえば、性質、パラメーター、及び寸法の変動をカバーすることを意味する。とくに明記されていない限り、「約」及び「おおよそ」という用語は、±２５パーセント以下を意味する。
【００１７】
とくに明記されていない限り、いずれの特定の範囲又はグループも、範囲又はグループさらにはそれに包含されるあらゆる可能なサブ範囲又はサブグループの及び同様にその中のいずれかのサブ範囲又はサブグループに関するあらゆるメンバーを個別に意味する簡略表現として理解されるべきである。とくに明記されていない限り、本開示は、サブ範囲又はサブグループのあらゆる具体的メンバー及び組合せに関し、それらを明示的に組み込む。
【００１８】
本明細書で用いられる場合、量又はパラメーターと組み合わせて用いられるときの「〜程度」という用語は、明記された量又はパラメーターのおおよそ１／１０〜１０倍にわたる範囲を意味する。
【００１９】
とくに定義がない限り、本明細書で用いられる科学技術用語はすべて、当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有することが意図される。文脈などを介してとくに指定がない限り、本明細書で用いられる場合、以下の用語は、以下の意味を有することが意図される。
【００２０】
本明細書で用いられる場合、「インタクト細胞」という語句は、核酸を含有する微生物細胞を意味し、この場合、微生物細胞は、限定されるものではないが遠心分離、濾過、マイクロ流体分離、免疫磁気分離などの分離方法を介して分離可能である。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、「サンプル」という語句は、１つ以上の微生物細胞を含有する、含有しうる、又は含有すると推測される液体又はサスペンジョンを意味する。サンプルの例としては、限定されるものではないが、リンパ液、脳脊髄液、血液（たとえば、全血、血液培養物、及び血漿）、尿、痰、唾液などの体液が挙げられる。サンプルの他の例としては、限定されるものではないが糞便を含むホモジナイズされた組織サスペンジョン、筋肉組織、脳組織、及び肝組織のホモジナイズされたサスペンジョンが挙げられる。サンプルは、処理されても処理されなくてもよく、任意選択的に１種以上の試薬又は成長培地を含んでいてもよい。血液培養サンプル（成長培地と全血とを含有するサンプル）の場合には、血液培養サンプルは、検出モダリティーを介して（たとえば、自動血液培養システムを介して）微生物細胞の存在が陽性とみなされる血液培養サンプル、１つ以上の中間培養検出モダリティーを介して行われる測定に基づいて微生物細胞が存在すると推測される中間培養血液培養サンプル、又は初期検出結果を入手できない中間培養血液培養サンプルでありうる。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、「血液細胞」という語句は、血中に存在する哺乳動物細胞、たとえば、限定されるものではないが、赤血球、白血球、及び血小板を意味する。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、「血液サンプル」という語句は、１つ以上の血液細胞を含むいずれかのサンプルを意味する。血液サンプルの例としては、限定されるものではないが、全血サンプル、血液培養サンプル、バフィーコートサンプル、及び血小板サンプルが挙げられる。
【００２４】
本明細書で用いられる場合、「全血」又は「全血サンプル」という語句は、血漿と血液細胞とを含む哺乳動物血液を意味する。「全血」又は「全血サンプル」は、抗凝固試薬などの１種以上の試薬を含みうる。たとえば、全血は、１種以上の試薬、たとえば、限定されるものではないが、ＳＰＳ（ポリアネトールスルホン酸ナトリウム）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、クエン酸ナトリウム、及びヘパリンをはじめとする抗凝固剤を含みうるサンプルボトルに採取されうる。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、「選択的ライシス」という語句は、ライシス後にインタクトな状態を維持する微生物細胞画分がライシス後にインタクトな状態を維持する真核細胞画分を超える血液ライシス試薬又はライシスプロセスを意味し、この場合、真核細胞は、サンプルが採取された被験者に関連付けられる。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、「微生物細胞」及び「微生物」という語句は、細菌（たとえば、グラム陽性及びグラム陰性細菌さらには細菌胞子）及び単細胞真菌（たとえば、酵母及びカビ）を含む。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、「真核細胞」という語句は、真菌を除く真核生物、たとえば、甲殻動物などの無脊椎動物と脊椎動物とを含む動物、とくに、血液を含有する動物を起源とする細胞を意味する。本明細書で用いられる場合、「脊椎動物」は、冷血動物（魚、爬虫動物、両生動物）と温血動物（鳥及び哺乳動物）との両方を含む。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、ある体積のサンプルとある体積の血液ライシス試薬（ただし、血液ライシス試薬は緩衝剤系を含む）とを混合することにより形成される混合物に関連して用いられるときの「有効緩衝剤濃度」という語句は、血液ライシス試薬の緩衝剤濃度と、血液ライシス試薬の体積を血液ライシス試薬の体積とサンプルの体積との和で除算することにより生成される比と、の積を意味する。有効緩衝剤濃度は、最終混合物中の緩衝剤系への血液ライシス試薬の寄与（すなわち、血液ライシス試薬の緩衝剤濃度に適用される稀釈倍率）を表し、サンプル中に存在する緩衝成分に起因して最終混合物中の実際の緩衝剤濃度とは異なることもある。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、「分離プロセス」という語句は、微生物細胞を分離し任意選択的に濃縮するのに好適なプロセスを意味する。分離プロセスの例としては、限定されるものではないが、遠心分離、濾過、免疫磁気分離、及びマイクロ流体分離が挙げられる。
【００３０】
従来的には、微生物細胞を含有すると推測される全血サンプルは、高濃度の細胞を得るために成長培地の存在下で初期培養され、次いで、個別コロニーの成長をサポートするために寒天プレート上で継代培養される。次いで、コロニーからの微生物細胞は、後続アッセイに使用される。残念ながら、かかる成長ベース法は、後続アッセイをサポートするのに十分な微生物成長を達成するために多くの時間又は日数の時間遅延を必要とする。
【００３１】
最近、成長工程を必要とすることなく血液培養の不在下で全血から微生物細胞を直接検出する努力がなされている。全血サンプルから微生物細胞を直接同定するには、典型的には、後続同定アッセイの実施前に微生物細胞の分離及び濃縮が必要となる。たとえば、全血からの微生物細胞の直接同定に使用するのに好適な、微生物細胞の分離及び濃縮の改善された方法は、「微生物サンプルのプレ処理方法」という名称の米国特許第９，７０７，５５５号明細書及び「微生物細胞の抽出のための装置及び方法」という名称の国際特許公報ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレット（両方ともその全体が本願をもって参照により組み込まれる）に開示されている。
【００３２】
国際特許公報ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットに開示される方法によれば、全血や培養血液などの血液ベースサンプルは、血液ライシス試薬（ＢＬＲ）と組み合わされて遠心分離に付される。血液ライシス試薬は、インタクト且つ遠心分離に好適な微生物細胞を残しつつ、残留血液デブリが遠心分離時に有意に沈降しないよう血液細胞をライシス及び消化する。図１Ａ〜１Ｍは、国際特許公報ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットの教示の一実施形態に係るプレ処理デバイス及び方法の実現形態例（クッション液体が利用される）を例示し、これらの教示は以下に簡潔にまとめられる。
【００３３】
図１Ａを参照して、国際特許公報ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットの教示によれば、ある体積の血液ライシス試薬２２とある体積のクッション液体２１とを含有するプレ処理ベッセル２０が提供される。プレ処理ベッセル２０は、マイクロ遠心分離機チューブなどの遠心分離に好適なベッセルである。クッション液体２１は、遠心分離時に微生物が沈降する液体表面３２を形成するように機能する高密度且つ水非混和性の液体である。図１Ａに示されるように、クッション液体２１は、重力の影響下でプレ処理ベッセル２０のボトムに沈降するような密度を有する。クッション液体２１に関連して本明細書で用いられる「高密度」という用語は、標的微生物細胞が支配的遠心力下で実質的にクッション液体を透過しないような十分に高い密度を意味することが理解されよう。したがって、クッション液体２１の密度は、微生物細胞及び他の液体の両方の密度よりも大きくなるように選択される。クッション液体はまた、プレ処理プロセス全体を通して個別の液状相を維持するように、他の液体、たとえば、限定されるものではないが、全血、全血と混合された血液培養培地、血液ライシス試薬２２、及び洗浄液体（以下に記載の通り）に対して非混和性である。
【００３４】
図１Ｂは、血液ライシス試薬２２と血液サンプル２６との混合により混合物３０（図１Ｃに示される）が形成されるプレ処理ベッセル２０へのある体積の血液サンプル２６の添加を例示する。プレ処理ベッセル２０にサンプルを提供した後（たとえば、ピアシング可能なゴムストッパー２５を介して）、プレ処理ベッセルは、サンプルと血液ライシス試薬２２とのさらなる混合を生じるようにアジテートされうる（図１Ｃに示される）。混合物３０を形成しプレ処理ベッセル２０をアジテートした後、プレ処理ベッセル２０は、図１Ｄに例示されるように遠心分離される。プレ処理ベッセル２０は、図１Ｄに示されるように、混合物３０中の微生物細胞をサスペンジョンから排出してクッション液体２１と上清３３との間の界面３２に捕集するのに好適な速度及び好適な時間で遠心分離される。国際特許公報ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットに教示されるように、約３００〜８５０の範囲内の分子量を有するフッ素化炭化水素がクッション液体として好適である。例は、ＦＣ−４０、ＦＣ−４３、ＦＣ−７０、及びＦＣ−７７であり、クッション液体体積は、すべての標的沈殿物が表面上に捕集されるように、適正に大きな沈降表面を提供するのに十分な程度に大きくすべきである。
【００３５】
遠心分離後、プレ処理ベッセル２０は、クッション液体２１がプレ処理ベッセル２０のボトムに移動して重力によりそこに残留するように、後続吸引及びディスペンス操作に好適な位置に、たとえば、図１Ｅに示されるように垂直オリエンテーションでリオリエンされうる。細胞の再懸濁を予防すれば、図１Ｆに示されるように上清のほとんどの除去が可能になるので、保持された微生物細胞を含有するごく小さな体積の残留上清が残るにすぎない。
【００３６】
図１Ｇ〜１Ｋに示されるように、次いで上清を精製するために並びにプレ処理サンプル中に存在する血液細胞デブリ及び血液ライシス試薬の濃度を低減するために、任意選択的に１回以上の洗浄サイクルを実施しうる。図１Ｇを参照して、ある体積の洗浄液体３５をサンプルプレ処理ベッセル２０に添加しうる。洗浄液体３５の添加後、遠心分離時にベッセル壁に沈降又は吸着した可能性のあるデブリを再懸濁するために溶液は混合される。これは、図１Ｈに示されるようにボルテックスするにより達成されうる。プレ処理ベッセル２０は、図１Ｄ〜１Ｆに記載したのと同様に図１Ｉ〜１Ｋに示されるように、続いて遠心分離されリオリエントされ上清の実質的部分が除去される。
【００３７】
（任意選択的）洗浄サイクルの実施後、保持された微生物細胞が残留上清３７に再懸濁されるように、プレ処理ベッセル２０を図１Ｌに示されるようにアジテートしうる。たとえば、以上に記載したように、プレ処理ベッセル２０をロースピードでおおよそ５〜２０秒間ボルテックスしうる。アジテーション後、プレ処理ベッセル２０が保持された微生物細胞のサスペンジョンをクッション液体２１上に含むように、図１Ｍに示されるようにクッション液体２１をプレ処理ベッセル２０のボトムに沈降させる。次いで、抽出サンプル（プレ処理サンプル３８という）が得られるようにこの残留サスペンジョンを除去しうる。
【００３８】
国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットの方法に基づいて微生物細胞の分離及び濃縮を実施するための自動システム例は、「自動遠心分離を実施するための装置、システム、及び方法」という名称の国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号パンフレット（その全体が本出願をもって参照により組み込まれる）に教示される。図２は、自動遠心分離（及び／又は洗浄）を実施するためのインテグレートシステム例１００の例示を提供する。システム例１００は、遠心分離のために１つ以上のインテグレート流体処理カートリッジ１２０を受け取る遠心分離機１１０を含む。遠心分離機１１０は、モーター付きローター１１４に接続されてインテグレート流体処理カートリッジ１２０を受け取るように構成される１つ以上のレセプタクル１１２を含む。カートリッジレセプタクル１１２は、たとえば、実験室遠心分離機では通常の固定角タイプ又はスイングバケットタイプでありうる（たとえば、各レセプタクル１１２は、モーター付きローター１１４にピボット接続されうる）。
【００３９】
カートリッジインターフェースアセンブリー（ユニット）１３０は、インテグレート流体処理カートリッジ１２０内の流体のフローを制御するために、モーター付きローター１１４が静置状態にあるときにインテグレート流体処理カートリッジ１２０に取外し可能にエンゲージ（又はインターフェース）するように構成される。カートリッジインターフェースアセンブリー１３０とインテグレート流体カートリッジとのインターフェーシングは、たとえばカートリッジインターフェースアセンブリーとインテグレート流体カートリッジ１２０との間の直接インターフェースを介して又はたとえば遠心分離機１１０上（たとえば、モーター付きローター１１４上又はカートリッジレセプタクル１１２上）のインターフェース（たとえば、アクチュエーションインターフェース）を介して、行いうる。遠心分離機１１０及びカートリッジインターフェースアセンブリー１３０は、制御及び処理ユニット１４０を介して制御される。
【００４０】
国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号パンフレットの教示によれば、図３Ａの模式図例を参照して、インテグレート流体処理カートリッジ例５００は、濃縮サスペンジョンが得られるように全血からの微生物細胞の自動分離及び洗浄に好適なエレメントが組み込まれて描かれる。インテグレート流体処理カートリッジ例は、サンプル移送レセプタクル５０１と、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２と、希釈剤チャンバー５０４と、上清チャンバー５０６と、を含む。希釈剤チャンバー５０４は、洗浄緩衝剤流体５０５がプレ充填され、シャットアウトバルブ５１２を備えたコンジット５１０を介してマクロ流体遠心分離チャンバー５０２に流体接続され、大気へのベント５１５を含有し、それ以外では閉じている。上清チャンバー５０６は、シャットアウトバルブ５１３を備えたコンジット５１１を介してマクロ流体遠心分離チャンバー５０２に流体接続され、大気へのベント５１６を含有し、それ以外では上清チャンバー５０６は閉じている。マクロ流体遠心分離チャンバー５０２は、遠心分離時に微生物細胞の吸着又はトラッピングを最小限に抑える円錐又は丸底形状と平滑内表面とを有し、それぞれのコンジットへの開口５２２、５２３、５２４、５２５、５２６を除いて閉じている。本実施形態例では、マクロ流体遠心分離チャンバーは、血液含有サンプル（たとえば、全血、血液培養サンプル、又は他の血液含有サンプル）の処理に使用され、微生物細胞の回収を支援するために並びに標的核酸の完全性及び回収を損なうおそれのある細胞のコンパクション傷害を最小限に抑えるために、血液ライシス試薬５０３とクッション流体５２９とを含有する。
【００４１】
サンプル移送レセプタクルは、レセプタクルのボトムに取り付けられたニードル５０７を備える。ニードルは、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２に至るシャットオフバルブ５０９を備えた流体路５０８に接続される。ピアシング可能なキャップ５２１を有するサンプルチューブ又は容器５２０、たとえば、血液サンプルと成長培地とを含有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）血液採取チューブや血液培養チューブなどは、ニードル５０７がキャップ５２１をピアシングしてニードル及び流体路５０８を介してカートリッジへのサンプル流体の移送を可能にするように、サンプル移送レセプタクルに挿入されうる。任意選択的に、ニードル５０７は、ニードルを汚染から保護するピアシング可能なフード５０８でカバーされる。
【００４２】
国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号パンフレットにより教示されるインテグレート流体処理カートリッジ例５００は、閉カートリッジ（以下に記載のベント以外）であり、サンプルの挿入に続いて、カートリッジのチャンバー内及びコンジット内の濃縮サスペンジョンの分離及び洗浄に必要とされるすべての機能を実施し、カートリッジのチャンバーに貯蔵されたすべての試薬及び溶液を有し、且つ廃棄上清をはじめとするすべての過剰の液体をカートリッジのチャンバーに保持する。ベント及びポートの１つ以上は、デバイスの目標範囲内への微生物病原体の進入を予防するのに十分な程度に小さな細孔サイズを有する空気透過性メンブレンにより保護されうる。本実施形態例によれば、すべての過剰及び廃棄の液体は、カートリッジに貯蔵され、ユーザーに触れない。そのため、閉カートリッジは、サンプルとの直接接触からユーザーを保護するとともに分離及び洗浄プロセス時にサンプルが外的因子による汚染を受けにくいデバイスを提供する。
【００４３】
国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号パンフレットにより教示されるように、自動分離及び洗浄プロセスは、図３Ａに示されるインテグレート流体処理カートリッジ例５００を参照して図４に概説される。国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号パンフレットに詳細に記載されるカートリッジインターフェースアセンブリーは、カートリッジポート５１８を介するカートリッジバルブ５０９、５１２、５１３、及び５１７並びにカートリッジ遠心分離チャンバーへの正及び負の両方のゲージ圧の適用が可能な空気置換デバイスのアクチュエーションを含めて必要な動作を実施するのに必要とされるすべてコンポーネントを備える。
【００４４】
サンプルを含有するサンプルチューブ５２０は、カートリッジ５００のサンプル移送レセプタクル５０１に挿入され、それにより、チューブキャップ５２１をピアシングして図４の３００に示されるマクロ流体遠心分離チャンバーへのサンプル移送を実施する。カートリッジインターフェースアセンブリーは、以下に詳細に記載されるカートリッジレセプタクルを介してカートリッジにエンゲージし、バルブ５０９が開且つバルブ５１２、５１３、及び５１７が閉であるようにアクチュエートされ、それにより、サンプルチューブからの経路５０８を除くマクロ流体遠心分離チャンバーから出るすべての流体路をシールする。
【００４５】
空気置換デバイスは、ポートとのシール接続を提供するコネクターを介してポート５１８にエンゲージされる。任意選択的に、リジッド又はフレキシブルチューブは、空気置換デバイスをコネクターに接続する。マクロ流体遠心分離チャンバー５０２へのサンプル移送は、マクロ流体遠心分離チャンバーから空気を抽出して流体路５０８を介してサンプルフローをサンプルチューブ５２０からマクロ流体遠心分離チャンバー５０２に流入させるように空気置換デバイスを操作することにより実施される。ポート５１８のエントリー５２３は、ポート５１８へのエントリー５２３に流体が流入しないように、流体レベルを超えて且つ流体レベルとエントリー５２３との間に十分なエアギャップをもたせて位置決めされなければならない。空気置換アクチベートフローは、あらかじめ決められた体積のサンプルがマクロ流体遠心分離チャンバーに移送されるように制御下で達成される。
【００４６】
国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号パンフレットの教示の一実施形態によれば、流路５０８へのエントリー５２２はまた、流体レベルを超えてエアギャップ中に存在するので、所望の体積のサンプル移送に続いて、空気置換ビアポート５１８を逆転させることにより、マクロ流体遠心分離チャンバー内への少量の空気置換を提供して流路５０８からサンプル流体を除去し、この残留サンプルを移動させてサンプルチューブ５２０中に戻すことが可能である。次いで、バルブ５０９は閉じられ、サンプルチューブ５２０はレセプタクル５０１から任意選択的に除去される。
【００４７】
血液ライシス試薬５０３は、サンプル移送プロセス前に遠心分離チャンバー５０２内に存在しうるか、又は代替的にサンプルと同様に血液ライシス試薬チューブから移送されうる。代替的に、血液ライシス試薬貯蔵チャンバーをカートリッジ上に提供しうるとともに、以下に記載されるマクロ流体遠心分離チャンバーへの洗浄緩衝剤の移動に類似した方法で血液ライシス試薬５０３をマクロ流体遠心分離チャンバーに移動させるために、バルブとエアベントとを備えた流体路を提供しうる。
【００４８】
国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号パンフレットに教示されるように、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２へのサンプルの添加後、サンプル及び血液ライシス試薬５０３は、図４の３０５に示されるように任意選択的に混合されうる。機器がカートリッジのボルテクシング、シェーキング、又は周期的反転を実施する混合機構を提供しうる。この操作は、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２から出るすべての流体路のバルブを閉じて実施される。混合時の空気路への流体の進入を防止するために、ポート５１８への流体路上にバルブを提供しうる。追加的又は代替的に、流体がポート５１８に達するのを防止するために、マクロ流体遠心分離チャンバーとポート５１８との間の空気路に流体の通過を防止する空気透過性メンブレンを配置しうる。このメンブレンはまた、環境又は空気置換デバイスからの微生物の進入を防止するエアフィルターとして機能するように構成されうる。代替的に、支配的条件下で開口５２３への流体の進入が防止されるように又はポート５１８に至る進行が防止されるように、ポート５１８とマクロ流体遠心分離チャンバーへのエントリー開口５２３との間の経路を高流動抵抗をもたせて設計可能である。同様に、希釈剤チャンバー５０５及び上清チャンバー５０６のベント５１５及び５１６はそれぞれ、類似の目的で機能するように高流動抵抗を有する空気透過性メンブレン及び／又は経路を備えうる。
【００４９】
混合工程３０５に続いて、遠心沈降工程３１０が実施され、カートリッジインターフェースアセンブリーは、モーター付きローター１１４からディスエンゲージされ、カートリッジ１２０は、たとえば、以上に記載のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットの方法に従って、マクロ流体遠心分離チャンバー内の微生物細胞がクッション液体上に沈降するように遠心分離される。遠心分離機は、たとえば、アングル遠心分離機又はハンギングバケット遠心分離機でありうるとともに、遠心分離パラメーターは、たとえば、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットに提供される条件に従って選択されうる。
【００５０】
マクロ流体遠心分離ベッセル内の流体に適用される相対遠心力は、たとえば１０００〜１５，０００ｇ、又はたとえば２，０００〜１２，０００ｇ、又はたとえば３０００〜１０，０００ｇ、又はたとえば３０００〜７，０００ｇ、又はたとえば５０００〜１０，０００ｇ、又はたとえば４０００〜８，０００ｇの範囲内でありうる。生物学的サンプルからの細菌細胞及び真菌細胞の分離を含む用途では、好適な相対遠心力（ＲＣＦ）は、１０００ｇ〜１５０００ｇの範囲内、より具体的には３０００ｇ〜７０００ｇの範囲内であることが見いだされている。
【００５１】
図４の遠心沈降工程３１０に続いて、遠心分離機ローターは停止され、カートリッジインターフェースアセンブリーは、３１５に示されるようにモーター付きローターにリエンゲージされ、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２から上清チャンバー５０６への上清５２７の抽出は、３２０に示されるように実施され、それにより、残留物５２８（微生物細胞を含有する）は、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２のボトムに保持される。この動作は、バルブ５０９、５１２、及び５１７を閉じたまま、且つ空気置換デバイスコネクターをポート５１８にエンゲージさせた状態で、且つマクロ流体遠心分離チャンバー内に制御可能に空気置換を行いながら、開放バルブ５１３により実施される。そのため、上清の空気置換誘導フローは、エントリー５２４が上清の最下位の下方に配置された流体路５１１を介して達成される。任意選択的に、エントリー５２４は、マクロ流体遠心分離チャンバーから圧出される上清の最下位に配置され、そのため、マクロ流体遠心分離チャンバーからの残留物５２８の抽出は防止される。
【００５２】
上清抽出工程３２０に続いて、洗浄緩衝剤ディスペンス工程３２５及び３３０が実施され、それにより、洗浄緩衝剤は、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２内にディスペンスされる。この動作は、バルブ５０９、５１３、及び５１７を閉じたまま、且つ空気置換デバイスコネクターをポート５１８にエンゲージさせた状態で、且つマクロ流体遠心分離チャンバー５０２から制御可能に空気排出を行いながら、開放バルブ５１２により実施される。そのため、洗浄緩衝剤の空気置換誘導フローは、流体路５１０を介して達成される。洗浄緩衝剤路５１０のエントリー５２５は、好ましくはマクロ流体遠心分離チャンバー内の流体レベルの最上位の上方に配置される。
【００５３】
洗浄緩衝剤ディスペンス工程５４４に続いて、マクロ流体遠心分離チャンバー内の洗浄緩衝剤と残留流体とを完全に混合するために混合工程３３２が実施される。これは、以上に記載したように、カートリッジのボルテクシング、シェーキング、又は周期的反転により実施されうる。混合工程３３２に続いて、捕集された微生物細胞を再沈降させるために遠心沈降工程３１０が実施され、上清は、工程３２０と同様に遠心分離チャンバーから除去される。工程３２５〜３３５及び３１０〜３２０のシーケンスは、全体として洗浄サイクルを形成し、それにより、細胞サスペンジョンは洗浄緩衝剤で希釈され、微生物細胞は再沈殿され、且つ上清は抽出される。洗浄サイクルは、汚染物及び妨害物が十分に希薄になった最終微生物細胞サスペンジョンを得るのに必要とされる複数の追加の洗浄サイクルを行うために、複数回繰り返されうる。
【００５４】
国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号パンフレットに教示されるように、所望の稀釈倍率は、サンプルの組成及び下流の検出手順に依存する。生物学的サンプルからの細菌細胞及び真菌細胞の分離と、微生物細胞の電気的ライシスと、リボソームＲＮＡの逆転写リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（逆転写ＲＴ−ＰＣＲ）増幅を介する検出と、を含む用途が意図される一実施形態では、稀釈倍率は、１００〜１０００００の範囲内で選択され、より好ましい範囲は、１０００〜５００００である。血液サンプルからの細菌細胞及び真菌細胞の分離と、微生物細胞のライシスと、ＤＮＡのＰＣＲ増幅を介する検出と、を含む他の一実施形態では、稀釈倍率は、適切なアンプリコン検出スキームと共に阻害剤耐性ポリメラーゼ酵素が利用される限り、１程度に小さくしうる。全血でのＤＮＡ増幅及び検出方法の模範的実現形態は、先行技術に報告されている（たとえば、Ｌ．Ａ．Ｎｅｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ５．１８２（２０１３）：１８２ｒａ５４−１８２ｒａ５４）。
【００５５】
最終上清抽出工程３２０に続いて、混合工程３４２は、沈降微生物細胞を最終残留流体５２８に再懸濁して最終サスペンジョンを生成するために実施される。再懸濁工程３４２に続いて、最終サスペンジョンは、流体路５１０を介して空気置換により抽出される。最終サスペンジョンの体積は、用途の性質に依存する。たとえば、意図される用途が全血又は培養血液中の微生物細胞の検出である場合、最終細胞サスペンジョンの体積は、１０μＬ〜５００μＬの範囲内で選択されうるとともに、より好ましい範囲は、２０μＬ〜１２０μＬ又は５０〜１００μＬである。最終細胞サスペンジョンの抽出時、バルブ５１７は開かれ、バルブ５０９、５１２、及び５１３は閉じられ、且つ空気は、ポート５１８を介してマクロ流体遠心分離チャンバー内に置換され、流体路５１６を介して開口５２６から流体を置換する。開口５２６は、クッション流体５２９のトップ表面に位置決めされるので、最終サスペンジョン全体又はサスペンジョンの実質的にすべては、図３Ａに示されるように、クッション流体５２９をなんら圧出することなくマクロ流体遠心分離チャンバーから圧出される。代替的に、開口５２６は、最終サスペンジョン及びクッション流体の一部又は全部が流体路５１６を介してマクロ流体遠心分離チャンバーから圧出されるように位置決めされる。流体路５１６は、その次の下流カートリッジエレメントに至り、このエレメントは、いくつかの実施形態では、カートリッジ外でのさらなる処理のために、カートリッジからの最終サスペンジョンの回収を可能にするように構成された１つ又は複数のチャンバーでありうるとともに、他の実施形態では、これはサスペンジョン捕集チャンバー又はたとえば以下に記載の電気的ライシスチャンバーへの流体路でありうる。
【００５６】
図３Ｂ及び３Ｃは、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号パンフレットに開示されるように、閉システムで自動サンプル調製を実施するための及び任意選択的に１つ以上の追加の後続処理工程（たとえばアッセイ）を実施するためのインテグレートカートリッジ例を例示する。インテグレートカートリッジ例７００は、３つのコンポーネントを有して示されており、第１のコンポーネント６９８は、サンプル移送レセプタクル５０１と、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２と、希釈剤チャンバー５０４と、上清チャンバー５０６と、を含む。第１のコンポーネント６９８は、デバイスの形態及び機能に適合可能な物質から作製された単一プラスチック成形品でありうる。代替的に、第１のコンポーネント６９８は、デバイスの材料、形態、及び機能に一致する手段により成形又は形成されたプラスチック部品であるサブコンポーネントのアセンブリーでありうる。これに関連して、材料は、カートリッジが受ける高遠心力に耐える十分に高い強度のものが選択されるべきであり、且つ材料は、使用される流体に適合可能とすべきであり、且つ分子用途の場合には、下流プロセスを妨害する汚染物をプレ処理細胞サスペンジョンに導入すべきではない。第１のコンポーネント６９８を作製可能な材料の例は、限定されるものではないが、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ＰＥＴ、ポリスチレン、環状オレフィンコポリマー、又はこれらの材料のいくつかのバリアントである。
【００５７】
第２のコンポーネント６９９は、コンポーネント６９８の側面上に取り付けられたマイクロ流体デバイスであり、コンポーネント６９８並びに追加の流体処理、たとえば、限定されるものではないが電気的ライシス、逆転写及びＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のために任意選択的に含まれるコンポーネントのチャンバーに接続する流体路及びバルブを含む。第２のコンポーネント６９９は、ホール、チャネル、及びチャンバーが形成されたいくつかの層から構成されるラミネートである。
【００５８】
層は、必要なフィーチャーを形成するために機械加工、パンチ加工、エンボス加工、又は成形加工されうる。各層は、接着ボンディング、熱ボンディング、超音波ボンディング、又は当業者に公知の他の方法のどれかによりラミネートされるサブ層の機能に基づいて各々先に列挙された異なる材料又は同一材料のどちらかの単一又は複数のサブ層のどちらかで構成されうる。提示された層及びサブ層は、考察される実施形態の理解を容易にする目的でのみグループ化される。分子処理を含む本実現形態例では、材料は、流体に適合可能とすべきであり、分子増幅が実施される場合には、材料は、かかる増幅（たとえばＲＴ−ＰＣＲ）を阻害したり又は標的微生物の検出を妨害したりする物質を導入するべきでなく、且つ非標的アナライト（たとえば非標的微生物細胞）又は核酸で汚染されないようにすべきである。材料はまた、プロセスを妨害する程度まで標的分子、反応剤、及び試薬成分を吸着しないようにすべきである。プラスチック材料及びプラスチックフィルム材料の例としては、限定されるものではないが、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ＰＥＴ、及び環状オレフィンが挙げられる。
【００５９】
チャンバー開口７１０（図３Ｂに示される）は、洗浄緩衝剤及びプレ処理流体をそれぞれ希釈剤チャンバー及びマクロ流体遠心分離チャンバーにディスペンスした後、膜シール、箔シール、又はキャップ６９７（図３Ｃに示される）でシールしうる。シール又はキャップは、熱シーリング、接着ボンディング、超音波ボンディングに適合可能な方法及び材料を用いて接合されうる。代替的に、チャンバーは、これらの液体をディスペンスする前にシールされうる。また、これらの液体をディスペンスする目的で代替ポートを提供しうるとともに、ディスペンス操作後にこれらのポートをシールしうる。キャップ６９７は、成形加工、エンボス加工、機械加工、又は迅速プロトタイプ加工されうるとともに、その形態及び機能に適切なポリカーボネート、ポリスチレン、ＰＥＴポリエステル、又は他の材料から構築されうる。
【００６０】
国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットには、遠心分離前に血液成分の消化に利用しうるいくつかの異なる血液ライシス試薬組成物が開示されている。以上に述べたように、血液ライシス試薬の存在は、血液細胞の選択的ライシスを引き起こす。国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットにより教示される一実現形態例では、血液ライシス試薬は、サポニンとポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ポリアネトールスルホン酸のナトリウム塩であり、ＳＰＳとして知られる）とを含む水性液体でありうるとともに、かかる組成を有する血液ライシス試薬は、これ以降ではタイプ１血液ライシス試薬と呼ばれる。血液ライシス試薬はまた、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ、たとえば、おおよそ２０００の分子量を有するもの）などの消泡剤を含みうる。国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットには、全血と血液ライシス試薬との混合時のタイプ１血液ライシス試薬に対するサポニン及びＳＰＳの濃度範囲例がそれぞれおおよそ１．５〜８０ｍｇ／ｍＬ及び０．５〜２０ｍｇ／ｍＬであると教示されている。
【００６１】
国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットに教示されるように、ＳＰＳは、抗凝固剤及び抗食作用剤であり、抗微生物剤を阻害することが知られる（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｍ．，Ｓｕｔｔｅｒ，Ｖ．Ｌ．，＆  Ｆｉｎｅｇｏｌｄ，Ｓ．Ｍ．（１９７５）．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｂｌｏｏｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１（１），３０−３６）。ＳＰＳが血液細胞ライシスを支援する機序は、十分に理解されていない。理論により限定することを意図するものではないが、ＳＰＳは、血液細胞ライシス時の微生物に対するいくらかの保護レベル、細胞デブリへの細菌閉込め発生の低減、及び／又は沈降物中に他の形で存在しうる凝固成分の量の低減を呈すると考える。
【００６２】
国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットにより教示される血液ライシス試薬組成物の他の一実現形態例では、血液ライシス試薬は、９〜１１の範囲内のｐＨを有する緩衝剤中にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とＳＰＳとを含む水性液体でありうるとともに、かかる組成を有する血液ライシス試薬は、これ以降ではタイプ２血液ライシス試薬と呼ばれる。血液ライシス試薬はまた、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ、たとえば、おおよそ２０００の分子量を有するもの）などの消泡剤を含みうる。国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットには、全血と血液ライシス試薬との混合時のタイプ２血液ライシス試薬に対するＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＳＰＳの濃度範囲例がそれぞれおおよそ０．５〜１．５％ｗ／ｖ及び５〜１０ｍｇ／ｍＬであると教示されている。
【００６３】
以上に述べたように、以上に記載のタイプ１血液ライシス試薬組成物は、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットの教示により、全血からの微生物細胞の手動及び半自動の分離及び濃縮に好適であることが見いだされた。しかしながら、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号パンフレットの自動化方法により国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号パンフレットに開示される試薬配合物を全血からの微生物細胞の自動分離及び濃縮並びに後続同定に適合させたとき、タイプ１血液ライシス試薬組成物は、全血の量がおおよそ１ｍｌ未満である場合に最も好適であることを、本発明者らは見いだした。
【００６４】
これは図５Ａで実証される。この図は、タイプ１血液ライシス試薬を用いてさまざまな体積の全血サンプルの溶血を実施した後の遠心分離機チューブの遠心分離後画像を示す。ＳＰＳ抗凝固剤を有するバキュテナーに全血サンプルを採取し、全血の１ｍｌ〜５ｍｌアリコートをそれぞれ１５ｍＬ遠心分離機チューブに分配した。混合時、サポニン及びＳＰＳの濃度が血液量にかかわらずそれぞれ３７．５ｍｇ／ｍＬ及び７．５ｍｇ／ｍＬになるように、全血サンプルと各種体積のタイプ１血液ライシス試薬とを混合した。得られた混合物を２回の洗浄サイクルに付した。１ｍｌの全血の十分な溶血が観測されたが、より高いサンプル体積の場合には不十分な溶血が観測された。たとえば、３ｍｌの全血の溶血時、血液デブリが沈降し、洗浄サイクルによりサンプル純度を増加させることができなかった。図５Ａに示されるように、１ｍｌを超える全血体積では、遠心分離後、有意な残留血液デブリが存在する。血液デブリの不十分な消化は、遠心分離機チューブの下側領域に見られる暗色残渣により明らかであり、それは全血体積の増加に伴って増加することが分かる。血液デブリは、遠心分離時又は濾過時にケークを形成するので、かかる残渣は、サンプル調製工程の自動化を複雑にする可能性がある。
【００６５】
有意なデブリを発生することなくより大きな体積の全血の自動処理を促進するために、タイプ２血液ライシス試薬組成を有する血液ライシス試薬を利用可能であることを、本発明者らは見いだした。これは図５Ｂで実証される。この図は、タイプ２血液ライシス試薬を用いてさまざまな体積の全血サンプルの溶血を実施した後の遠心分離機チューブの遠心分離後画像を示す。１ｍｌ〜５ｍｌの全血サンプルと、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有する各種体積のタイプ２血液ライシス試薬と、を混合した。２００ｍＭの緩衝剤濃度と１０のｐＨとで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌの濃度のＳＰＳと３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせて、２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、１．５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、９．９のｐＨと、を有する試薬溶液を得ることにより、試薬溶液を調製した。全血サンプルとそれぞれ等体積の試薬溶液とを混合した後、ＳＰＳの濃度は７．５ｍｇ／ｍｌ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度は０．７５％ｗ／ｖ、ｐＨは血液体積にかかわらず９．１、且つ有効緩衝剤濃度は血液体積にかかわらず５０ｍＭであった。得られた混合物を２回の洗浄サイクルに付した。図５Ｂに示されるように、全血体積のいずれにも残留血液デブリは見られない。タイプ２血液ライシス試薬により提供される有意に改善された消化は、高ｐＨ環境によると考えられる。
【００６６】
有意な遠心分離後デブリを回避しつつ血液成分の消化を実施する際のタイプ２血液ライシス試薬の成功にもかかわらず、タイプ２血液ライシス試薬は、多くのタイプの微生物細胞の分離及び濃縮に好適であるが、タイプ２血液ライシス試薬の使用は、いくつかの微生物細胞種では、遠心分離処理後にリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）を実施したとき、シグナル損失をもたらすことが見いだされることを、本発明者らは発見した。たとえば、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）を含有する全血サンプルの処理にタイプ２血液ライシス試薬を使用したとき、血液ライシス試薬は、微生物細胞のインタクト性への影響が現れて、遠心分離処理時にｒＲＮＡの損失をもたらし、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出時に所要のサイクル数の増加をもたらすことを、本発明者らは見いだした。
【００６７】
本発明者らは、以下の通り細胞インタクト性に及ぼすタイプ２血液ライシス試薬の影響を実験的に調べた。実験は、以下の実施例２に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有する３ｍｌの体積のスパイク全血サンプルと、タイプ２血液ライシス試薬と、を接触させることにより実施された。試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、２０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、１．５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、９．９のｐＨと、を有する試薬溶液が得られるように、２００ｍＭの緩衝剤濃度と１０のｐＨとで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、４０ｍｇ／ｍｌの濃度のＳＰＳと３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍＬの試薬と３ｍＬの全血サンプルとを混合した後、ＳＰＳの濃度は１２．５ｍｇ／ｍｌ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度は０．９４％、ｗ／ｖ、ｐＨは９．１、及び有効緩衝剤濃度は６２．５ｍＭであった。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルは、実施例３の方法に従って調製された。サンプルのプレ処理及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、それぞれ、スパイク対照用のスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルで以下の実施例６及び７に提供される方法に従って実施された。閾値サイクル値（ＣＴ値、すなわち、アッセイシグナルがノイズ閾値を超えて増加し始めるときのＰＣＲサイクル数）を測定し、スパイク全血ＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいてＣＴ値の差ΔＣＴを決定した。
【００６８】
図６に示されるように、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）のΔＣＴ値は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）よりも有意に高かったことから、これらの微生物細胞種は、タイプ２血液ライシス試薬との接触により悪影響が現れることが示唆される。理論により限定することを意図するものではないが、タイプ２血液ライシス試薬への全血サンプルの暴露及び遠心分離処理に続いて観測されるＲＴ−ＰＣＲアッセイの性能劣化は、次の原因：（ｉ）遠心分離ベース細胞分離を利用した場合に標的細胞含有率の損失又は沈降係数の低下を引き起こす可能性がある、血液ライシス試薬に起因する微生物細胞損傷、（ｉｉ）遠心分離処理（たとえば、初期遠心分離及び任意選択的な追加の遠心分離細胞洗浄サイクル）時の血液デブリを伴う微生物細胞の除去、及び／又は（ｉｉｉ）最終細胞サスペンジョンへの高レベルの血液デブリの移送による、逆転写（ＲＴ）及び／又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の反応阻害、の１つ以上の結果でありうると考えられる。これらのうち、最初の２つの原因は、アナライトの損失に関連するので、初期サンプル中の微生物細胞の数が不足している場合、たとえば、微生物細胞の数が典型的には１０ＣＦＵ／ｍＬ未満である血流感染の場合、最初の２つの原因は、より深刻であると予想される。これとは対照的に、アッセイ阻害剤に起因する性能劣化（ΔＣＴ）（以上に列挙された第３の原因）は、典型的には標的定量確度の犠牲を払って追加の増幅サイクルを実施することにより補償可能である。
【００６９】
図６に示される結果を考慮して、単一ＣＦＵ／ｍｌレベルで感度良く広範にわたる微生物細胞種の後続（下流）分子増幅を実施する能力を維持しつつ、自動システムで高体積（＞１ｍｌ）の全血を処理するときの血液成分の好適な消化を達成するには、新たなタイプの試薬配合物が必要とされると、本発明者らは判断した。それゆえ、本発明者らは、後続分子増幅を促進するために、広範にわたる微生物細胞タイプ（たとえば種）のインタクト性を保存しつつ、自動システムで高体積（＞１ｍｌ）の全血を処理可能な新たなライシス試薬配合物を開発しようと試みた。
【００７０】
改善された血液ライシス試薬の検索の初期工程として、本発明者らは、細胞インタクト性に及ぼすタイプ１及びタイプ２血液ライシス試薬組成物のさまざまな成分の影響を実験的に調べた。
【００７１】
微生物細胞インタクト性に及ぼすＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の影響の実験研究
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の影響、の１つ、タイプ２血液ライシス試薬の成分、微生物細胞インタクト性上で、実験的に高ｐＨ環境（たとえば、炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤の不在下での）の不在下で研究された。実験は、各種サンプル中のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の最終濃度が０、０．１８８、０．３７５、０．５５、及び０．７５％ｗ／ｖ、並びにＳＰＳ濃度が１５ｍｇ／ｍＬになるように、以下の実施例３に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有するスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルと、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とＳＰＳとを含有する溶液と、を接触させることにより実施された。サンプル調製及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、以下の実施例５に提供される方法に従って実施された。以下の実施例３の方法に従って調製されたスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルはまた、スパイク対照用にも調製され、以下の実施例４の方法に従ってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに付された。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいて決定されるΔＣＴ値は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００への暴露後の微生物細胞インタクト性の代わりに利用された。
【００７２】
図７に提示される得られたΔＣＴ値、すなわち、ＣＴ（スパイクリン酸塩緩衝剤サンプル）−ＣＴ（スパイク対照）は、すべての細胞型（とりわけ、グラム陰性シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ））でΔＣＴ≦２を示すことから、サンプルのプレ処理持続時間の間のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００への暴露は、ｒＲＮＡ含有量の評価可能なリークレベルまでの細菌細胞の有意な損傷を生じないことが示唆される。言い換えると、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在は、遠心分離プロセス時のｒＲＮＡ量の評価可能な損失を引き起こさず、低ＣＦＵ／ｍｌサンプルの検出を促進した。
【００７３】
微生物細胞インタクト性に及ぼす高ｐＨ環境の実験研究
微生物細胞インタクト性に及ぼすタイプ２血液ライシス試薬の性質の１つである高ｐＨ環境の影響を実験的に調べた。この場合、高ｐＨは、タイプ２血液ライシス試薬の炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤成分に基づく。実験は、以下の実施例３に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有するスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルと、炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とＳＰＳとを含有する試薬溶液と、を接触させることにより実施された。試薬溶液は、２ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、それぞれ１０．３、１０．３、１０．３、１０．３、及び１０．２のｐＨ値と、それぞれ９、２８、４５、５０、及び１１０ｍＭの緩衝剤濃度と、を有する試薬溶液が得られるように、各々がそれぞれ１８、５６、９０、１００、及び２２０ｍＭの緩衝剤濃度で調製された各々がそれぞれ１０．４、１０．４、１０．３、１０．３、及び１０．２のｐＨを有する１ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌの濃度のＳＰＳを有する１ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。１ｍｌの試薬溶液と１ｍｌのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルとを混合した後、ＳＰＳ濃度は７．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ値は９．５〜１０の範囲内、及び緩衝剤濃度はそれぞれ４．５、１４、２２．５、２５、及び５５ｍＭであった。サンプル調製及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、以下の実施例５に提供される方法に従って実施された。以下の実施例３の方法に従って調製されたスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルはまた、スパイク対照用にも調製され、以下の実施例４の方法に従ってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに付された。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいて決定されるΔＣＴ値は、微生物細胞インタクト性の代わりに利用された。
【００７４】
図８に提示される得られたΔＣＴ値は、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）の両方でΔＣＴの有意な増加を示すことから、サンプルのプレ処理時の高ｐＨ環境への暴露は、これらの種ではｒＲＮＡ含有量の評価可能なリークレベルまで細菌細胞を有意に損傷しうることが示唆される。比較的低濃度を有する炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤で調製された試薬でさえも（混合時にさらに希釈された）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）で評価可能なΔＣＴ損失をもたらしたことに留意されたい。
【００７５】
サポニンとアルカリｐＨとを有するタイプ３血液ライシス試薬
以上の例は、タイプ２血液ライシス試薬の場合に図６で観測されたシグナル損失が、この試薬タイプに関連付けられる高ｐＨ環境の存在に起因して現れたことを例示する。タイプ２血液ライシス試薬のこの制約の克服さらにはタイプ１血液ライシス試薬の上述した制約の克服を試みるために、本発明者らは、タイプ１及びタイプ２血液ライシス試薬の成分の機序を考慮した。
【００７６】
サポニンの溶血活性がコレステロールとの相互作用に基づき、真核細胞膜では存在するが原核（微生物）細胞膜では不在であることを理解したうえで、界面活性剤としてのサポニンは、微生物細胞に損傷を引き起こすことなく微生物細胞を覆う層を形成しうると、本発明者らは仮定した。理論により限定することを意図するものではないが、サポニンと高ｐＨとの両方を有する試薬を提供すれば、サポニンにより生成される界面活性剤層は保護層として作用し、それがないときの高ｐＨ環境の有害作用から微生物細胞を保護しうると、本発明者らはさらに仮定した。言い換えると、微生物細胞は、サポニンと高ｐＨとの両方を有する試薬に接触したときサポニンにより被覆され、試薬中のアルカリ性緩衝剤の産物による攻撃から効果的に保護されうると、本発明者らは推測した。
【００７７】
この仮説を試験するために、微生物細胞インタクト性に及ぼすサポニンと高ｐＨ環境との組合せの影響をスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルで実験的に調べた。実験は、以下の実施例３に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有するスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有する試薬溶液と、を接触させることにより実施された。試薬溶液は、各々２ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、それぞれ７．２、９．２、９．７、９．９、及び１０のｐＨ値と、それぞれ９、２８、４５、５０、及び１１０ｍＭの緩衝剤濃度と、を有する試薬溶液が得られるように、各々がそれぞれ１８、５６、９０、１００、及び２２０ｍＭの緩衝剤濃度で調製された各々がそれぞれ１０．４、１０．３、１０．３、１０．３、及び１０．２のｐＨを有する１ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌの濃度のＳＰＳと６０ｍｇ／ｍｌの濃度のサポニンとを有する１ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。１ｍｌの試薬溶液と１ｍｌのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルとを混合した後、ＳＰＳ濃度は７．５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ値は７〜１０、及び緩衝剤濃度はそれぞれ４．５、１４、２２．５、２５、及び５５ｍＭであった。続いて、遠心分離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、以下の実施例５に提供される方法に従って実施された。以下の実施例３の方法に従って調製されたスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルはまた、スパイク対照用にも調製され、以下の実施例４の方法に従ってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに付された。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいて決定されるΔＣＴ値は、微生物細胞インタクト性の代わりに利用された。
【００７８】
サポニンの存在は、試験された３つの異なる細菌種の各々でサンプルのプレ処理時の高ｐＨ環境への暴露から微生物細胞をセーフガードするものとして現れることが、図９Ａに提示される得られたΔＣＴ値により実証される。サポニンとＳＰＳとアルカリｐＨ（たとえば、炭酸塩緩衝剤の存在を介する）と任意選択的にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などの非イオン性界面活性剤とを含有する、血液細胞の選択的ライシス用の新たな血液ライシス試薬配合物（これ以降ではタイプ３血液ライシス試薬という）は、多種多様な微生物種のインタクト性を維持しつつ溶血を実施するのに有効でありうると、本発明者らは結論付けた。
【００７９】
次いで、本発明者らは、全血サンプルで細胞インタクト性に及ぼすタイプ３血液ライシス試薬の影響を実験的に調べた。実験は、以下の実施例２に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有する３ｍｌの体積のスパイク全血サンプルと、タイプ３血液ライシス試薬と、を接触させることにより実施された。タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、１０．０のｐＨと、を有する試薬溶液が得られるように、２００ｍＭの緩衝剤濃度と１０．１のｐＨとで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳと６０ｍｇ／ｍＬのサポニンと３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００との濃度を有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌのタイプ３血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとを混合した後、ＳＰＳ濃度は９．３７５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．９４％ｗ／ｖ、ｐＨ値は９．２、及び有効緩衝剤濃度は６２．５ｍＭであった。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルは、実施例３の方法に従って調製された。続いて、遠心分離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、それぞれ、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルで以下の実施例６及び７に提供される方法に従って実施された。閾値サイクル値（ＣＴ値、すなわち、アッセイシグナルがノイズ閾値を超えて増加し始めるときのＰＣＲサイクル数）を測定し、スパイク全血ＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいてＣＴ値の差ΔＣＴを決定した。
【００８０】
図９Ｂに示されるように、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）のΔＣＴ値はすべて、タイプ２血液ライシス試薬を用いて得られたもの（図９Ｃは、図６に最初に示されるようにタイプ２血液ライシス試薬で全血サンプルを処理することにより得られた結果を再度示す）よりも有意に小さいことから、全血サンプルの処理のためのタイプ３型血液ライシス試薬の成功を実証する。さらに、タイプ３血液ライシス試薬は、広範にわたる濃度の全血で可視残渣を伴うことなく（すなわち、可視血液デブリを伴うことなく）溶血を実施することに成功し、それにより、（ｉ）核酸を有するインタクト微生物細胞の回収及び（ｉｉ）遠心分離後でさえも可視血液デブリを伴わない残留血液成分の消化の両方を達成した。
【００８１】
本発明者らは、以下で説明されるように、微生物細胞でスパイクされた全血サンプルを処理するときの試薬の性能に及ぼす新たなタイプ３血液ライシス試薬の各種成分のさまざまな濃度の影響を調べる一連の実験を実施した。
【００８２】
全血サンプルの処理のためのサポニン濃度へのタイプ３血液ライシス試薬性能の依存性の実験研究
実験は、微生物細胞でスパイクされた全血サンプルの処理のためのタイプ３血液ライシス試薬の性能のサポニン濃度への依存性を調べるために実施された。実験は、以下の実施例２に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有する３ｍｌの体積のスパイク全血サンプルと、タイプ３血液ライシス試薬と、を接触させることにより実施された。各種タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、０〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲内のサポニン濃度と、１．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、９．５〜１０の範囲内のｐＨ値と、を有する試薬溶液が得られるように、２００ｍＭの緩衝剤濃度と１０．１のｐＨとで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と０〜８０ｍｇ／ｍｌの範囲内のサポニン濃度と３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌのタイプ３血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとを混合した後、ＳＰＳ濃度は９．３７５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は６．２５〜２５ｍｇ／ｍＬの範囲内、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．９４％ｗ／ｖ、ｐＨ値はおおよそ９．２、及び有効緩衝剤濃度は６２．５ｍＭであった。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルは、実施例３の方法に従って調製された。続いて、遠心分離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、それぞれ、スパイク対照用のスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルで以下の実施例６及び７に提供される方法に従って実施された。閾値サイクル値（ＣＴ値、すなわち、アッセイシグナルがノイズ閾値を超えて増加し始めるときのＰＣＲサイクル数）を測定し、スパイク全血ＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいてＣＴ値の差ΔＣＴを決定した。
【００８３】
図１０に示されるように、３つのすべての微生物種のΔＣＴ値は、１２．５ｍｇ／ｍｌ以上のサポニン濃度で５未満であった。すべての微生物種に対するサポニンの保護効果は、１８．７５ｍｇ／ｍｌ以上のサポニン濃度で十分に実現されるように思われた。
【００８４】
全血サンプルの処理のためのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度へのタイプ３血液ライシス試薬性能の依存性の実験研究
実験は、微生物細胞でスパイクされた全血サンプルの処理のためのタイプ３血液ライシス試薬の性能のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度への依存性を調べるために実施された。実験は、以下の実施例２に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有する３ｍｌの体積のスパイク全血サンプルと、タイプ３血液ライシス試薬と、を接触させることにより実施された。２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、０〜１．１２％ｗ／ｖの範囲内のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、９．５〜１０の範囲内のｐＨ値と、を有する試薬溶液が得られるように、各種タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２００ｍＭの緩衝剤濃度と１０．１のｐＨとで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍＬのサポニン濃度と０〜２．２５％ｗ／ｖの範囲内のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌのタイプ３血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとを混合した後、ＳＰＳ濃度は９．３７５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０〜０．７％ｗ／ｖの範囲内、ｐＨ値は９．２、及び有効緩衝剤濃度は６２．５ｍＭであった。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルは、実施例３の方法に従って調製された。続いて、遠心分離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、それぞれ、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルで以下の実施例６及び７に提供される方法に従って実施された。閾値サイクル値（ＣＴ値、すなわち、アッセイシグナルがノイズ閾値を超えて増加し始めるときのＰＣＲサイクル数）を測定し、スパイク全血ＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいてＣＴ値の差ΔＣＴを決定した。
【００８５】
図１１Ａに示されるように、３つのすべての微生物種のΔＣＴ値は、０．２３％ｗ／ｖ以上のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度で５未満でありＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度に実質的に依存しなかった。
【００８６】
全血サンプルの処理のためのさまざまな非イオン性界面活性剤へのタイプ３血液ライシス試薬性能の依存性の実験研究
実験は、非イオン性界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ  ２０の好適性を実証するために実施された。実験は、以下の実施例２に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有する３ｍｌの体積を有するスパイク全血サンプルと、タイプ３血液ライシス試薬と、を接触させることにより実施された。２つの異なるタイプ３血液ライシス試薬溶液を調製した。一方の血液ライシス試薬は、２００ｍＭの緩衝剤濃度と１０．１のｐＨとで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍＬのサポニン濃度と３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。他方の血液ライシス試薬は、２００ｍＭの緩衝剤濃度と１０．１のｐＨとで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍＬのサポニン濃度と３％のＴｗｅｅｎ−２０濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。得られた血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００又はＴｗｅｅｎ−２０濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、ほぼ１０のｐＨ値と、を有していた。５ｍｌのタイプ３血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとを混合した後、ＳＰＳ濃度は９．３７５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００又はＴｗｅｅｎ−２０濃度は０．９４％ｗ／ｖ、ｐＨ値は９．２、及び有効緩衝剤濃度は６２．５ｍＭであった。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルは、実施例３の方法に従って調製された。続いて、遠心分離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、それぞれ、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルで以下の実施例６及び７に提供される方法に従って実施された。閾値サイクル値（ＣＴ値、すなわち、アッセイシグナルがノイズ閾値を超えて増加し始めるときのＰＣＲサイクル数）を測定し、スパイク全血ＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいてＣＴ値の差ΔＣＴを決定した。図１１Ｂに提示されるΔＣＴ値は、３つのすべての微生物種のΔＣＴ値がＴｗｅｅｎ  ２０及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の場合に非常に類似していたことを例示する。
【００８７】
全血サンプルの処理のための初期炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤濃度へのタイプ３血液ライシス試薬性能の依存性の実験研究
実験は、微生物細胞でスパイクされた全血サンプルの処理のためのタイプ３血液ライシス試薬の性能の初期炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤濃度への依存性を調べるために実施された。実験は、以下の実施例２に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有する３ｍｌの体積のスパイク全血サンプルと、タイプ３血液ライシス試薬と、を接触させることにより実施された。各種タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、それぞれ４．７、７．０、９．８、９．９、及び１０．０のｐＨ値と、０、１０、５０、１００、及び２００ｍＭの緩衝剤濃度と、を有する試薬溶液が得られるように、０、２０、１００、２００、及び４００ｍＭの緩衝剤濃度と９．５〜１０の範囲内のｐＨ値とで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌのタイプ３血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとを混合した後、ＳＰＳ濃度は９．３７５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．９４％ｗ／ｖ、ｐＨ値は７．２、９．２、９．７、９．９、及び１０．０、有効緩衝剤濃度は０、６．２５、３１．２５、６２．５、及び１２５ｍＭであった。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルは、実施例３の方法に従って調製された。続いて、遠心分離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、それぞれ、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルで以下の実施例６及び７に提供される方法に従って実施された。閾値サイクル値（ＣＴ値、すなわち、アッセイシグナルがノイズ閾値を超えて増加し始めるときのＰＣＲサイクル数）を測定し、スパイク全血ＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいてＣＴ値の差ΔＣＴを決定した。
【００８８】
図１２Ａに示されるように、３つのすべての微生物種のΔＣＴ値は、５０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲内の初期炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤濃度で５未満であった。１０ｍＭ以下の初期炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤濃度では、ΔＣＴ値は１０超であることが分かった。理論により限定することを意図するものではないが、この影響は、血液ライシス試薬の緩衝能が不十分であるため、試薬と血液との混合後、混合物ｐＨが約７．４の血液ｐＨ値に向かって低下することにあると考えられる。そのため、培地は塩基性が十分ではないため、血液細胞デブリの十分な消化ができない。ΔＣＴ値はまた、２００ｍＭの初期炭酸塩−重炭酸塩濃度で上昇することが分かった。この原因は、試薬の緩衝能が増加するため、混合物ｐＨが血液ライシス試薬の初期ｐＨ値近くに維持されることにある。このｐＨは、おそらく浸透圧ストレスの上昇により、いくつかの細菌細胞とくにグラム陰性細菌を損傷可能であった。さらに、炭酸塩濃度を高くすると血液ライシス試薬の密度ひいてはライシス血液の密度が増加する。この結果、沈降時間が長くなるとともに最初の洗浄サイクル前に試薬の有害作用への暴露が長くなる。たとえば、１００、２５０、及び５００ｍＭの初期炭酸塩−重炭酸塩濃度を有する血液ライシス試薬の密度は、それぞれ、１．０１、１．０２５、及び１．０５ｇ／ｍＬである。１．０６ｇ／ｍＬの平均密度を有する全血に５：３の比でこれらの試薬を添加すると、それぞれ、１．０２９、１．０３８、及び１．０５４ｇ／ｍＬの密度を有する最終混合物を生じるであろう。そのため、１．１０の密度を有する細菌細胞は、約５０％長い沈降時間を必要とするであろう。
【００８９】
図１２Ｂに示されるように、混合前（すなわち、全血サンプルと他のタイプ３血液ライシス試薬成分との混合前）の炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤の初期ｐＨはほぼ１０であったが、タイプ３血液ライシス試薬と全血との混合後に得られる混合物のｐＨは、試薬の限られた緩衝能に起因して１０未満に低下し、最終ｐＨ値は、初期炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤濃度に依存する（すなわち、緩衝能に依存する）。０ｍＭ及び２００ｍＭの初期炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤濃度に対応する最終混合後ｐＨ値は、それぞれ、７．４及び９．６と測定された。この態様は、以下に記載の一連の追加実験でさらに調べられた。
【００９０】
全血及びリン酸塩緩衝剤サンプルの処理のためのｐＨへのタイプ３血液ライシス試薬性能の依存性の実験研究
実験は、スパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルの処理に基づいてタイプ３血液ライシス試薬で微生物細胞のインタクト性に及ぼすｐＨの影響を研究するために実施された。最初の実験セットは、以下の実施例３に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有するスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルと、各種タイプ３血液ライシス試薬と、を接触させることにより実施された。各種タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、それぞれ９．６、１０．０、及び１０．３のｐＨ値と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、を有する試薬溶液が得られるように、２００ｍＭの緩衝剤濃度とそれぞれ９．５、１０、及び１０．５のｐＨ値とで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度とサポニン濃度６０ｍｇ／ｍＬのサポニンと３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。１ｍｌのタイプ３血液ライシス試薬と１ｍｌのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルとを混合した後、ＳＰＳ濃度は７．５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．７５％ｗ／ｖ、ｐＨ値は９．５〜１０の範囲内、及び有効緩衝剤濃度は５０ｍＭであった。類似の条件下で、ただし０．３７５％ｗ／ｖの混合後Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度を用いて、追加の実験を実施した。続いて、遠心分離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、以下の実施例５に提供される方法に従って実施された。以下の実施例３の方法に従って調製されたスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルはまた、スパイク対照用にも調製され、以下の実施例４の方法に従ってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに付された。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいて決定されるΔＣＴ値は、微生物細胞インタクト性の代わりに利用された。
【００９１】
スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルを含む本実験で得られたΔＣＴ値は、図１３Ａ及び１３Ｂに提示され、図１３Ａは、０．７５％ｗ／ｖの混合後Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度に関し、図１３Ｂは、０．３７５％ｗ／ｖの混合後Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度に関し、水平軸表示は、試薬の他の成分との組合せ前の元の炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤のｐＨを意味する。血液ライシス試薬を調製するために利用された初期炭酸塩−重炭酸塩ｐＨが試験された両方のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度で１０．５未満のｐＨを有するとき、試験されたすべての種で低減されたΔＣＴ値が得られるが、より高濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ではより低いΔＣＴ値が得られたことが、結果から示される。サンプルのプレ処理時に高ｐＨ環境に暴露されると、血液ライシス試薬中にサポニンが存在するときでさえも、シグナル損失をもたらす可能性があり、サポニンは、より低い試薬ｐＨ値でより良好な保護効果を有すると思われることが、これらの結果から示唆される。
本開示のこの態様は以下でさらに調べられる。
【００９２】
第２の実験セットは、以下の実施例２に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有するスパイク全血サンプル（図１３Ａ及び１３Ｂのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルと対比される）と、各種タイプ３血液ライシス試薬と、を接触させることにより実施された。各種タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、それぞれ９．６、１０．０、及び１０．３のｐＨ値と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、を有する試薬溶液が得られるように、２００ｍＭの緩衝剤濃度とそれぞれ９．５、１０、及び１０．５のｐＨ値とで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍＬのサポニンと３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。１ｍｌのタイプ３血液ライシス試薬と１ｍｌの全血サンプルとを混合した後、ＳＰＳ濃度は７．５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．７５％ｗ／ｖ、ｐＨ値は９．０、９．２、及び９．７、並びに有効緩衝剤濃度は５０ｍＭであった。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルは、実施例３の方法に従って調製された。続いて、遠心分離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、それぞれ、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルで以下の実施例５及び８に提供される方法に従って実施された。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいて決定されるΔＣＴ値は、微生物細胞インタクト性の代わりに利用された。
【００９３】
全血サンプルを含む本実験で得られたΔＣＴ値は、図１４Ａに提示され、この場合も、初期血液ライシス試薬が１０．５未満のｐＨを有するとき、すべての試験された種で低減されたΔＣＴ値が得られることが実証される。
【００９４】
血液の緩衝能に起因して、タイプ３血液ライシス試薬の最終ｐＨ値及び初期緩衝剤濃度は、非依存パラメーターではないことに留意されたい。実際に、図１２Ｂに示されるように、タイプ３血液ライシス試薬と全血との混合後、混合物のｐＨ値は、血液ライシス試薬を調製するために利用されたｐＨ値の初期レベルから低下することが観測される。
【００９５】
炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤の初期ｐＨから全血との混合物の最終ｐＨへのｐＨ低下量は、血液ライシス試薬を調製するために利用された初期緩衝剤濃度に依存することが観測された。これをさらに調べるために、さまざまな初期ｐＨ及び緩衝剤濃度値を有する各種タイプ３血液ライシス試薬を調製して全血と混合し、血液ライシス試薬と全血との混合の前及び後でｐＨ測定を行った。タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、ほぼ９．６、１０、及び１０．３のｐＨ値と、それぞれ５０、７５、及び１００ｍＭの緩衝剤濃度と、を有する試薬溶液が得られるように、各々１００、１５０、及び２００ｍＭの３つの緩衝剤濃度で調製されたそれぞれ９．５、１０、及び１０．５のｐＨ値で調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍＬのサポニンと３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。１ｍｌの血液ライシス試薬と１ｍｌの全血サンプルとの混合後、ＳＰＳ濃度は７．５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．７５％ｗ／ｖ、ｐＨ値は９．０〜９．２、９．２〜９．５、及び９．７〜９．９、並びに有効緩衝剤濃度はそれぞれ２５、３７．５、及び５０ｍＭであった。
【００９６】
図１４Ｂは、初期炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤のｐＨのさまざまな値（９．５、１０、及び１０．５）で、タイプ３血液ライシス試薬を調製するために利用された初期炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤濃度の関数として最終混合物（タイプ３血液ライシス試薬＋全血）のｐＨをプロットする。図で観測可能なように、ｐＨ値は、血液ライシス試薬と全血との混合後、血液ライシス試薬の緩衝系と血中ＨＣＯ３−１／Ｈ２ＣＯ３緩衝剤との間の酸−塩基反応の結果として低下する。しかしながら、最も高い緩衝能及び最も高いｐＨを有する血液ライシス試薬は、全血との混合時、ｐＨの減少に対する耐性がより大きかった。全体として、全血との混合時に３７．５〜５０ｍＭの範囲に希釈された緩衝剤濃度を有する１０〜１０．５の出発ｐＨは、全血中でおおよそ９及び９．５の最終ｐＨをもたらすと思われる。
【００９７】
以上の実験は、微生物細胞回収に及ぼす血液ライシス試薬／全血混合物の最終ｐＨの影響を例示する。この最終ｐＨは、血液ライシス試薬の炭酸塩緩衝剤能及び血液ライシス試薬への添加前の緩衝剤の初期ｐＨに依存する。９〜９．５の目標ｐＨ範囲は、低出発ｐＨの高濃度の炭酸塩緩衝剤を用いるか又は高出発ｐＨの低濃度の緩衝剤を用いるかのどちらかにより達成可能であることが、前の実施例から示唆される。この例では、全血で同一ｐＨ値を達成するために、血液ライシス試薬の緩衝剤能及び初期ｐＨの両方を調整した。次いで、炭酸塩緩衝剤濃度の影響を決定するために、これらの混合物を細胞回収実験で試験した。
【００９８】
他の一実験では、全血との混合時におおよそ９．５の最終ｐＨ値が達成されるように、さまざまなｐＨ値及び緩衝剤濃度で血液ライシス試薬セットを調製した。図１４Ｃは、炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤系を用いた好適な血液ライシス試薬の調製を例示する表である。表は、緩衝剤を最初に試薬成分と混合してタイプ３血液ライシス試薬を形成し続いて全血と混合した場合のｐＨ値及び元の緩衝剤濃度の希釈を追跡する。炭酸ナトリウムと重炭酸ナトリウムとを特定の比で混合することにより、９．５及び１０．５のｐＨ値の１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤のストック溶液を調製した。タイプ３血液ライシス試薬を形成するように混合し、次いで全血と混合した後、最終ｐＨが類似するように（おおよそ９．５）、緩衝剤の希釈を行った。タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、９．６５、９．９７、及び１０．２３のｐＨ値と、２００、１００、及び６０ｍＭの緩衝剤濃度と、を有する試薬溶液が得られるように、各々がそれぞれ４００、２００、及び１２０ｍＭの緩衝剤濃度で調製されたそれぞれ９．６６、１０．１９、及び１０．７８のｐＨ値で調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍＬのサポニンと３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌの血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとの混合後、９．４５、９．５２、９．５６のほぼ類似のｐＨ値を有して、ＳＰＳ濃度は９．３７５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．９４％ｗ／ｖ、有効緩衝剤濃度はそれぞれ１２５、６２．５、及び３７．５ｍＭであった。
【００９９】
たとえば、最低ｐＨから出発する緩衝剤は最大濃度で調製され、一方、最低濃度の緩衝剤は最高ｐＨから出発した。緩衝剤が希釈されるにつれて、血液ライシス試薬中の酸性サポニン及び血中のＨＣＯ３−１／Ｈ２ＣＯ３緩衝剤系との反応に起因して、ｐＨ変化が起こるであろう。また、予想通り、最低濃度の炭酸塩緩衝剤（全血への添加前６０ｍＭ、全血との混合後３７．５ｍＭの有効緩衝剤濃度）は、その最も弱い緩衝能に起因して各段階で最大ｐＨ変化を受け、これに対して、最大濃度の緩衝剤は、ｐＨ変化に対する耐性がより大きかった。
【０１００】
追加の実験セットは、以下の実施例２に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有するスパイク全血サンプルと、図１４Ｃに示される表に記載のタイプ３血液ライシス試薬（すなわち、それぞれ９．６５、９、９７、１０．２３、及び２００ｍＭ、１００ｍＭ及び６０ｍＭの血液ライシス試薬ｐＨ値及び炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤濃度を有する）と、を接触させることにより実施された。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルは、実施例３の方法に従って調製された。続いて、遠心分離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、それぞれ、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルで以下の実施例５及び８に提供される方法に従って実施された。スパイク全血サンプルＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいて決定されたΔＣＴ値は、微生物細胞インタクト性の代わりに利用された。
【０１０１】
全血サンプルを含む本実験で得られたΔＣＴ値は、図１４Ｄに提示され、この場合も、初期血液ライシス試薬が１０．５未満のｐＨを有するとき、すべての試験された種で低減されたΔＣＴ値が得られることが実証される。
【０１０２】
本明細書に提供される実施形態例の多くで利用される炭酸塩緩衝剤系例は、単に例示的な例として利用されるにすぎず、代替的に他の緩衝剤系を利用しうることが理解されよう。他の好適なアルカリ性緩衝剤の例としては、限定されるものではないが、ホウ酸塩、炭酸塩、ＣＡＰＳ（Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、ピロリン酸、ＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）、及びエタノールアミンが挙げられる。
【０１０３】
代替緩衝剤系例の操作性を実証するために、以下の実施例２に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有するスパイク全血サンプルと、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とサポニンとＳＰＳと３つの異なる緩衝剤系とを含有する各種タイプ３血液ライシス試薬と、を接触させることにより、実験を実施した。各種タイプ３血液ライシス試薬溶液は、各々に対して２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、それぞれ９．４３、９．４７、及び９．５５のｐＨ値と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、を有するタイプ３血液ライシス試薬溶液が得られるように、各々に対して２００ｍＭの緩衝剤濃度と１０のｐＨ値とで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩、ＣＡＰＳ、及びＣＨＥＳ緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍＬのサポニンと３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌのタイプ３血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとの混合後、３つの異なる緩衝剤系例でそれぞれ９．２９、９．１０、９．０６のほぼ類似のｐＨ値を有して、ＳＰＳ濃度は９．３７５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．９４％ｗ／ｖ、有効緩衝剤濃度は６２．５ｍＭであった。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルは、実施例３の方法に従って調製された。続いて、遠心分離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、それぞれ、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルで以下の実施例６及び７に提供される方法に従って実施された。スパイク全血サンプルＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいて決定されたΔＣＴ値は、微生物細胞インタクト性の代わりに利用された。
【０１０４】
図１５Ａは、さまざまな緩衝剤を用いてさまざまなタイプ３血液ライシス試薬配合物で観測されたΔＣＴ値をプロットする。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイとの関連で回収に関して３つの緩衝剤系間に有意差は存在しないことが、結果から示唆される。
【０１０５】
図１５Ｂは、タイプ３血液ライシス試薬と全血との混合の前及び後のｐＨを提示する表である。これらのｐＨ値はほぼ類似しており、類似の溶血性能及び微生物細胞インタクト性を有してタイプ３血液ライシス試薬で類似のｐＨ値及びイオン強度を有するさまざまな緩衝剤系を利用しうることを実証する。
【０１０６】
全血サンプル処理のためのＳＰＳへのタイプ３血液ライシス試薬性能の依存性の実験研究
本発明者らはまた、血液デブリの排除におけるＳＰＳの役割を実験的に調べた。以上に説明したように、かかるデブリの存在は、微生物細胞の閉込め及び損失をもたら可能性があり、さらにケーク（ケーキング）の存在に伴う問題に起因して自動遠心分離及び／又は濾過を妨害する可能性がある。そのほか、デブリは、遠心洗浄時に沈降して最終細胞サスペンジョンに移送されるおそれがある。このため、微生物細胞又はそのライセートの下流アッセイが阻害されるおそれがある。血液デブリの排除におけるタイプ３血液ライシス試薬のさまざまな成分の役割を調べるために、さまざまな混合後ＳＰＳ濃度で一連の４つの実験を実施した。以下で説明されるように、ＳＰＳの存在は、血液ライシス及び遠心分離の後の血液デブリの低減又は排除に重要な役割を果たすと思われることが分かった。これらの実験の目的は、血液ライシス後の血液デブリの形成を観測して調べることであったので、微生物細胞でスパイクされていない全血サンプルを用いて４つの実験を実施した。
【０１０７】
第１の実験は、混合後、最終サポニン濃度が１８．７５ｍｇ／ｍｌ且つＳＰＳ濃度が０〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内になるように、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び炭酸塩緩衝剤の不在下で、３ｍｌの非スパイク全血サンプルと、サポニンとＳＰＳとを含有する５ｍｌの各種血液ライシス試薬成分と、を実施例９に記載の方法に従って混合することにより実施された。図１６Ａは、４つのサンプルの遠心分離機チューブの写真を示す。炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤により促進される高ｐＨ環境の不在下では、サポニン及びＳＰＳは、血液成分の十分な消化を達成できず、有意な血液デブリが観測されることが容易に分かる。
【０１０８】
第２の実験は、混合後、最終サポニン濃度が１８．７５ｍｇ／ｍｌ、最終Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度が０．７５％ｗ／ｖ、且つＳＰＳ濃度が０〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内になるように、炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤の不在下で、３ｍｌの非スパイク全血サンプルと、サポニンとＳＰＳとＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有する５ｍｌの各種ライシス試薬成分と、を実施例９に記載の方法に従って混合することにより実施された。図１６Ｂは、４つのサンプルの遠心分離機チューブの写真を示す。１０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度ではごく少量の血液デブリが存在するにすぎず、２０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度では血液デブリが完全に排除されると思われることが、写真から示される。
【０１０９】
第３の実験は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の不在下で、３ｍＬの非スパイク全血サンプルと、サポニンとＳＰＳと炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを含有する５ｍＬの各種ライシス試薬成分と、を実施例９に記載の方法に従って混合することにより実施された。ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、０〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内のＳＰＳ濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、を有する試薬溶液が得られるように、９．５〜１０の範囲内のｐＨ値と２００ｍＭの緩衝剤濃度とで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、０〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲内のＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍＬのサポニンとを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌの血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとの混合後、ＳＰＳ濃度は０〜１２．５ｍｇ／ｍＬの範囲内、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、有効緩衝剤濃度は６２．５ｍＭであった。図１６Ｃは、４つのサンプルの遠心分離機チューブの写真を示す。０〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲内のＳＰＳ濃度では中程度の量の血液デブリが存在し、２０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度では血液デブリが完全に排除されると思われることが、写真から示される。
【０１１０】
第４の実験は、３ｍＬの非スパイク全血サンプルと、サポニンとＳＰＳとＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と炭酸塩緩衝剤とを含有する５ｍＬのタイプ３血液ライシス試薬と、を実施例９に記載の方法に従って混合することにより実施された。タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、０〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内のＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、を有する試薬溶液が得られるように、９．５〜１０の範囲内のｐＨ値と２００ｍＭの緩衝剤濃度とで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、０〜４０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のＳＰＳと６０ｍｇ／ｍＬのサポニンと３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌの血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとの混合後、ＳＰＳ濃度は０〜１２．５ｍｇ／ｍＬの範囲内、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．９４％ｗ／ｖ、及び有効緩衝剤濃度は６２．５ｍＭであった。図１６Ｄは、４つのサンプルの遠心分離機チューブの写真を示す。ＳＰＳの不在下では少量の血液デブリが存在し、５〜２０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度では血液デブリが完全に排除されると思われることが、写真から示される。しかしながら、５ｍｇ／ｍｌを超えるＳＰＳ濃度では、図１６Ｄで血液デブリ（ケーキング）の存在が観測不能であるとはいえ、それにもかかわらず５ｍｇ／ｍｌのサンプルでは、下流の分子アッセイの性能に影響を及ぼすのに十分でありうる少量の血液デブリが存在することに留意されたい。したがって、以下に記載のように、後続分子アッセイを含む実施形態では、１０ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度が好ましいであろう。しかしながら、ＳＰＳはいくつかのＰＣＲ酵素の阻害剤であるので、５０ｍｇ／ｍｌ超の濃度は、ケーキングを低減するとはいえ、いくつかの用途では高すぎるおそれがある。
【０１１１】
ＳＰＳは、血液成分の消化並びに血液デブリの低減及び／又は排除に有意な役割を果たすと思われることが、４つ先行実験から視覚的に実証される。このことは、遠心分離、濾過、又は他の方法、たとえば、免疫磁気及びマイクロ流体ベース分離を含む自動サンプル調製方法に重要でありうる。実際に、ＳＰＳの存在は、（ｉ）タイプ３血液ライシス試薬及び（ｉｉ）タイプ３血液ライシス試薬の成分のサブセットを含有する他の血液ライシス試薬で、残留血液デブリの低減に相関することが観測された。
【０１１２】
微生物細胞でスパイクされた全血サンプルの処理のためのタイプ３血液ライシス試薬の性能のＳＰＳ濃度への依存性を調べるために、さらなる実験を実施した。実験は、以下の実施例２に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有する３ｍｌの体積を有するスパイク全血サンプルと、サポニンと炭酸塩緩衝剤とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とＳＰＳとを含有する各種タイプ３血液ライシス試薬と、を接触させることにより実施された。タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、０〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲内のＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、を有するタイプ３血液ライシス試薬溶液が得られるように、２００ｍＭの緩衝剤濃度と９．５〜１０の範囲内のｐＨ値とで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、０〜８０ｍｇ／ｍｌの範囲内の濃度のＳＰＳと６０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを有する１０ｍｌの試薬溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌの各血液ライシス試薬と３ｍｌの全血とを混合した後、ＳＰＳ濃度は０〜２５ｍｇ／ｍＬの範囲内、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．９４％ｗ／ｖ、及び有効緩衝剤濃度は６２．５ｍＭであった。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルは、実施例３の方法に従って調製された。続いて、遠心分離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、それぞれ、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルで以下の実施例６及び７に提供される方法に従って実施された。閾値サイクル値（ＣＴ値、すなわち、アッセイシグナルがノイズ閾値を超えて増加し始めるときのＰＣＲサイクル数）を測定し、スパイク全血ＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいてＣＴ値の差ΔＣＴを決定した。
【０１１３】
図１６Ｅに示されるように、３つのすべての微生物種のΔＣＴ値は、３．１２５ｍｇ／ｍｌ以上の最終（混合後）ＳＰＳ濃度で５未満であった。検出可能シグナルは、ＳＰＳの不在下で血液ライシス試薬に接触させたサンプルでは得られなかった。したがって、ＳＰＳの不在下では、おそらく以上に記載のケーキング現象に起因して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを介するｒＲＮＡの検出が損なわれることが、これら結果から示される。
【０１１４】
本明細書に記載の実施形態例の多くは、非イオン性界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（たとえば、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリエトキシル化４−オクチルフェノール、及びｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールとして知られる）を利用するが、血液成分のライシス及びインタクト微生物細胞の保存に好適なタイプ３血液ライシス試薬は、広範にわたる非イオン性界面活性剤を含みうることが理解されよう。好適な非イオン性界面活性剤の例としては、限定されるものではないが、アルキルグリコシド、Ｂｒｉｊ３５（Ｃ１２Ｅ２３ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル）（１５，７）、Ｂｒｉｊ５８（Ｃｌ６Ｅ２０ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル）（１６）、Ｇｅｎａｐｏｌ（１３〜１９）、アルキルＮ−メチルグルカミド、たとえば、ＭＥＧＡ−８、−９、−１０、オクチルグルコシド（１２，６）、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ），，）（１３，４）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（Ｃ２４Ｈ４２０６）（１２，４）、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０）（１６，７）及びＴｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）（１５）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、ナトリウムデオキシコレート、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び又はＩｇｅｐａｌ  ＣＡ６３０が挙げられる。
【０１１５】
タイプ３血液ライシス試薬配合物は、消泡剤の不在下の各種混合及び貯蔵条件下で起泡しやすい可能性があることが、本発明者らにより観測された。それゆえ、いくつかの実施形態例では、タイプ３血液ライシス試薬は、消泡剤をさらに含みうる。消泡剤は、好ましくは起泡性培地に不溶であり、表面を横切って展延できるように低表面張力を有し、泡空気−液体界面を透過してそれを不安定化し崩潰を引き起こすことが可能である。さらに、カートリッジ内の流体送達を含む自動用途では、消泡剤は、泡生成を完全に排除するか又は実質的に低減するかのどちらかであるべきである。そのほか、血液ライシスプロセス時、理想的消泡剤は、微生物細胞に対する親和性が最小限であるか又はまったくなく、液体中でエマルジョンとして懸濁状態を維持する。分離（たとえば、遠心分離又は濾過）時、消泡剤には微生物細胞を捕集して閉じ込めるリスクがあるため、消泡剤と血液ライシス試薬の残りの部分との間で相分離を生じないようにすべきである。
【０１１６】
本発明者らは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製の２種の市販の消泡配合物：Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４（製品番号Ａ８３１１）及びＳｉｌｉｃｏｎｅ  Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５（製品番号Ａ８５８２）を実験的に調べた。Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４（「ＡＦ２０４」）は、非シリコーンポリプロピレン系ポリエーテルディスパージョンの混合物からなる１００％活性成分を含有する。ＡＦ２０４は、単独で及び４０００Ｄａの平均分子量を有するポリプロピレングリコール（「ＰＰＧ４０００」）との組合せで調べられた。消泡剤ＳＥ−１５は、活性シリコーンポリマーと非イオン性乳化剤との１０％エマルジョンｗ／ｖである。
【０１１７】
以下の例では、３つの基準：１）激しいシェーキング後の泡高さ、２）微生物細胞回収に及ぼす影響（ｒＲＮＡ検出及び増幅に基づく）、及び３）中期的安定性に従って、消泡剤が添加された各種タイプ３血液ライシス試薬を評価した。タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、各々０．０５〜０．２％ｗ／ｖの濃度を有するＡＦ２０４、ＳＥ−１５、ＰＰＧ４０００又はそれらの混合物と、を有するタイプ３血液ライシス試薬溶液が得られるように、２００ｍＭの緩衝剤濃度と９．５〜１０のｐＨ値とで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と各々０．１〜０．４％（ｖ／ｗ）の濃度を有するＡＦ２０４、ＳＥ−１５、ＰＰＧ４０００又はそれらの混合物とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。
【０１１８】
１ｍＬの血液ライシス試薬を１５ｍｌコニカルチューブに分配し、９０°アークで激しく１０秒間シェイクし、次いでチューブラックに置き、そこで液体表面からの泡高さの観測及び測定が可能である（図１７Ａ参照）。いずれの消泡剤も用いない場合、ライシング試薬は、以上に記載したようにシェイクしたきにおおよそ２５ｍｍの高さの泡の生成が観測された。
【０１１９】
非シリコーン系消泡剤を使用した場合、泡高さは、ＡＦ２０４とＰＰＧ４０００とを理想的には１０：１の比で組み合わせたときにより効果的に減少した。しかしながら、連続してシェイクすると消泡剤混合物の効果は減少し、泡高さは１回目のシェイク後の３．５ｍｍから後続シェイク後の１０ｍｍに増加した。シリコーン系エマルジョンＳＥ−１５は、１ｍＬの以上に記載のタイプ３血液ライシス試薬で０．０５〜０．２％（ｖ／ｗ）の濃度で単独で使用された。泡高さは、未処理サンプルの２５ｍｍから０．０５％（ｖ／ｗ）ＳＥ−１５の２．５ｍｍに低下し、０．２％（ｖ／ｗ）ＳＥ−１５では実質上まったく泡がなくなった。
【０１２０】
消泡剤ＳＥ−１５の効果は、血液ライシス試薬の後続アジテーション時に持続して観測された。ＳＥ−１５の消泡性能をさらに例示するために、０．０５％（ｖ／ｗ）ＳＥ−１５を有する上述した各５ｍＬのタイプ３血液ライシス試薬（図１７Ｂの右側）及び消泡試薬不在のタイプ３血液ライシス試薬（図１７Ｂの左側）をそれぞれ１５ｍＬ遠心分離機チューブに入れて標準的ベンチトップ実験室ボルテクサーにより最大スピードで１分間ボルテックスした。これらの実験の結果を図１７Ｂ及び１７Ｃにまとめる。ボルテクシング直後、ＳＥ−１５を有する血液ライシス試薬（図１７Ｂの右側及び図１７ＣのＨＲ５）は、未処理血液ライシス試薬と比較して泡高さがほぼ１／５になった。２０秒間以内に泡はほとんど全部崩潰したが、未処理の血液ライシス試薬（図１７Ｂの左側及び図１７ＣのＨＲ３）では泡は不変の状態を維持した。
【０１２１】
細胞回収に及ぼす消泡剤の影響を評価するために、以下の実施例３に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有するスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル（例外として、１００ＣＦＵ／ｍｌの代わりに２００ＣＦＵ／ｍｌの濃度で微生物細胞にスパイクした）と、消泡剤を含有する各種タイプ３血液ライシス試薬と、を混合した（図１７Ａ）。１ｍｌの血液ライシス試薬と１ｍｌのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルとを混合した後、ＳＰＳ濃度は７．５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．７５％ｗ／ｖ、緩衝剤濃度は５０ｍＭ、消泡剤（ＡＦ２０４、ＳＥ−１５、ＰＰＧ４０００又はそれらの混合物）の濃度は０．００２５〜０．１％（ｗ／ｖ）の範囲内であった。続いて、実施例５に提供される方法に従って遠心分離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。消泡剤ありのタイプ３血液ライシス試薬を用いた実験で測定されたＣＴ値から、消泡剤なしのタイプ３血液ライシス試薬を用いた実験で得られたＣＴ値を減算することにより、ΔＣＴ値を決定した。
【０１２２】
図１７Ａに示される細胞インタクト性の実験の結果は、シリコーン系及び非シリコーン系消泡剤の両方で、消泡剤の不在下の３型試薬と比較して、ＣＴ値の有意な増加は観測されなかったことを実証する。実際に、両方の消泡剤で、血液ライシス試薬で消泡剤により生成されたエマルジョンは、観測可能な相分離を伴うことなく、血液ライシスプロセス全体を通して均一な状態を維持した。さらに、ＳＥ−１５の場合には、遠心分離プロセス例の最終洗浄時に残留するいずれのエマルジョン粒子も微視的評価で観測されなかったことから、作用剤は効果的に除去され、したがって、下流のアッセイを妨害しえないことが示唆される。
【０１２３】
細胞回収に及ぼすタイプ３血液ライシス試薬の短期的安定性を評価するために、以下の実施例３に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有するスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル（例外として、１００ＣＦＵ／ｍｌの代わりに２００ＣＦＵ／ｍｌの濃度で微生物細胞にスパイクした）と、ＳＥ−１５あり（ＨＲ５）及びなし（ＨＲ３）で調製された各種タイプ３血液ライシス試薬と、を図１７Ｄに示されるように混合した。２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、０．０５％のＳＥ−１５（ｗ／ｖ）あり又はなしと、を有するタイプ３血液ライシス試薬溶液を調製した。１ｍｌの血液ライシス試薬と１ｍｌのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルとを混合した後、ＳＰＳ濃度は７．５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．７５％ｗ／ｖ、緩衝剤濃度は５０ｍＭ、及びＳＥ−１５の濃度は０．００２５％（ｗ／ｖ）であった。サンプル調製及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、以下の実施例５に提供される方法に従って実施された。以下の実施例３の方法に従って調製されたスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルはまた、スパイク対照用にも調製され、以下の実施例４の方法に従ってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに付された。スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルＣＴ値とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいて決定されるΔＣＴ値は、微生物細胞インタクト性の代わりに利用された。消泡剤の存在下で調製されたタイプ３血液ライシス試薬の短期的安定性は、細胞回収及び消泡の性質の劣化をなんら示さなかった。
【０１２４】
上述したように、消泡剤ＳＥ−１５は、１０％ケイ素ポリマーと５％非イオン性乳化剤とからなる市販のエマルジョンである。ケイ素ポリマーは、ポリジメチルシロキサン（一般化学式：（Ｈ３Ｃ）３［Ｓｉ（ＣＨ３）２Ｏ］ｎＳｉ（ＣＨ３）３、ＣＡＳ番号：６３１４８−６２−９）であり、乳化剤は、ポリソルベート６５（ＣＡＳ番号：９００５−７１−４）であり、そして希釈剤は水である。一般的には、血液ライシス試薬に適合可能な消泡剤のクラスは、８〜１５の全親水性親油性バランス（ＨＬＢ）値を有する水中油型乳化剤又は乳化剤の混合物の存在下の水中１０〜３０％の濃度のポリジメチルシロキサンの混合物からなる。これらの乳化剤のいくつかの例としては、限定されるものではないが、ポリオキシエチレンエーテル及びソルビタン誘導体系界面活性剤、たとえば、限定されるものではないが、ポリソルベート８５、ポリソルベート６０、ポリソルベート６０、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル、及びポリオキシエチレンステアリルエーテルが挙げられる。
【０１２５】
上述した実験研究は、全血サンプルの効果的分離、精製、及び濃縮が、全血サンプルと、限定されるものではないがサポニンとＳＰＳと非イオン性界面活性剤とアルカリ性緩衝剤と任意選択的消泡剤とを含むタイプ３血液ライシス試薬（血液及び／又は他の真核細胞の選択的ライシス用）と、を混合することにより達成されうることを実証する。以上に記載したように、本発明者らは、界面活性剤としてのサポニンが、微生物細胞に損傷を引き起こすことなく微生物細胞を覆う層を形成しうるとともに、サポニンにより生成された界面活性剤層が、アルカリ性環境で保護層として作用し、それがないときの高ｐＨ環境の有害作用から微生物細胞を保護しうると仮定した。それにもかかわらず、この概念は、高ｐＨ環境とサポニンとの不適合性が予想されるため、この試薬の組合せでの成功の期待値は低いと考える本発明者らによる初期抵抗に遭遇した。具体的には、本発明者らは、サポニンの溶血的役割及び以上に記載のサポニンの潜在的保護的役割が、アルカリ性環境に起因するサポニンの分解により有害な影響を受ける可能性があると推測した。
【０１２６】
サポニンは、典型的には、南アメリカのキラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の木から抽出物として得られ、共通のトリテルペノイド骨格に装着される多糖の性質が異なる３０種を超える構造的に多様なグリコシドの複合混合物で構成される。主要なサポニンＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、及びＱＳ−２１は、全サポニン含有量の９０重量％までを占め、その化学構造、毒性、及び溶血活性に関して最もよく特徴付けられている。単離時、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、及びＱＳ−２１はすべて、おおよそ同一の用量（７〜２５μｇ／ｍＬ）で溶血を引き起こす。
【０１２７】
サポニンは弱酸性であり、２０重量％の濃度で水に溶解させたとき、その純度に依存して４〜５のｐＨを呈するであろう。８超のｐＨでは、主要なサポニン化合物ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、及びＱＳ−２１は、アルカリ加水分解を受けて「脱アセチル化サポニン」ＤＳ−１及びＤＳ−２を生成する。こうした脱アセチル化サポニンは、その親サポニンのおおよそ１／１０の溶血活性を呈する（Ｄ．Ｊ．Ｐｉｌｌｉｏｎ，Ｊ．Ａ．Ａｍｓｄｅｎ，Ｃ．Ｒ．Ｋｅｎｓｉｌ，Ｊ．  Ｒｅｃｃｈｉａ“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ａｍｏｎｇ  Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎｉｎｓ  ｓｅｒｖｉｎｇ  ａｓ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｎａｓａｌ  ａｎｄ  ｏｃｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ．”Ｊ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ  ８５，Ｎｏ．５  １９９６，ｐａｇｅｓ  ５１８−５２４）。かかる高ｐＨレベルでは、サポニン混合物の臨界ミセル濃度もまた、ｐＨ６．５の２００ｍｇ／ＬからｐＨ１０の２０００ｍｇ／Ｌへ１０倍に増加するであろう（Ｗ−Ｊ  Ｃｈｅｎ，Ｌ−Ｃ  Ｈｓｉａｏ，Ｋ  Ｋ−Ｙ  Ｃｈｅｎ“Ｍｅｔａｌ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）／ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）−ｓｐｉｋｅｄ  ｋａｏｌｉｎ  ａｓ  ａ  ｓｏｉｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌａｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓａｐｏｎｉｎ  ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ．”Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ５  ２００８，ｐａｇｅｓ  ４８８−４９８）。アルカリ性環境でのサポニンのこの既知の分解及び関連する溶血活性の低減を考慮して、本発明者らは、タイプ３血液ライシス試薬の有効性が直ちに劣化しなかったので、タイプ３血液ライシス試薬の成功に驚かされた。
【０１２８】
タイプ３試薬のアルカリ性環境の存在下でサポニンの分解をさらに調べるために、本発明者らは、安定性実験セットを実施した。以下に説明したように、これら実験では、（ｉ）溶血能力及び（ｉｉ）ｒＲＮＡ増幅を介して決定される微生物細胞インタクト性の２つの観点からタイプ３血液ライシス試薬の安定性を調べた。
【０１２９】
溶血能力の観点からアルカリ性環境でのサポニンの安定性を調べるために設計された第１の実験では、Ｄｅｓｅｒｔ  Ｋｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  （Ｓａｐｏｎｉｎ−Ｕｌｔｒａ）製のサポニンをタンジェンシャルフロー濾過によりさらに精製し、少量のポリフェノール＜１．５％（ｗ／ｗ）及び多糖＜５％（ｗ／ｗ）の不純物を含む（ＨＰＬＣ）サポニン含有率が＞８０％ｗ／ｗの全サポニン１９７ｍｇ／ｍＬを有する溶液を与えた。３つの異なる緩衝剤：（１）非緩衝（最終ｐＨ約４．３で水に溶解させた）、（２）６０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤（最終ｐＨ約４．９）、及び（３）１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝剤（最終ｐＨ約９．８）で溶液を３０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。シールバイアル中に室温でサポニンサンプルを貯蔵し、次いで次の手順を用いて溶血活性を試験した。０．９％ｗ／ｖ  ＮａＣｌの１ｍＭリン酸塩緩衝剤（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ）でサポニン溶液を４ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。個別の２ｍＬポリプロピレンチューブ中に、ＰＢＳ中１２８０μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬの各サポニン溶液の２００μＬの段階希釈液を調製した。陽性対照は、２００μＬのＰＢＳ中１％ｗ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００であり、一方、陰性対照は、２００μＬのＰＢＳ単独であった。各サンプル及び対照に２００μＬのＰＢＳ中４％ｖ／ｖヒツジ赤血球（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩＣ１００−０２１０）を添加した。ポリプロピレンチューブにキャップをし、次いでローティッセリシェーカー上で室温で２時間インキュベートした。チューブを３０００ＲＰＭで５分間遠心分離し、次いで各上清からの５０μＬを９６ウェルアッセイプレート内で１５０μＬのＰＢＳで希釈した。
【０１３０】
溶血は、ＵＶ／可視マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍの各サンプルの吸光度を測定することにより調べられた。各種希釈にわたり吸光度値から用量−反応曲線を作成し、各サポニンサンプルのＨＣ５０値（５０％完了溶血に達するサポニン濃度）を計算した。溶血試験は、サポニンをさまざまな緩衝剤で希釈した直後に１回、サポニンの短期的安定性を調べるために室温で２３日間貯蔵した後に再度実施された。
【０１３１】
図１８Ａ及び１８Ｂは、それぞれ、０日目及び２３日目に採取された各サポニン溶液の用量反応曲線を示し、図１８Ｃは、曲線から導出されたＨＣ５０計算値を提示する。初日後、低ｐＨ値及び高ｐＨ値での各サポニンの溶血活性は、ほとんど同一である（おおよそ３６μｇ／ｍＬのＨＣ５０値）。２３日間後、酸性緩衝剤（ｐＨ  ＜５）で貯蔵されたサポニンは、それらの用量−反応及びＨＣ５０値（３９〜３８μｇ／ｍＬ）に有意な変化を示さないが、アルカリ性緩衝剤（ｐＨ約１０）でのサポニンは、同一期間（８９μｇ／ｍＬ）にわたり溶血活性の２倍損失を示す。
【０１３２】
この溶血活性の損失は、より低活性の「脱アセチル化サポニン」ＤＳ−１及びＤＳ−２に対して高活性サポニンＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、及びＱＳ−２１の緩徐なアルカリ加水分解に起因する。しかしながら、より高ｐＨでは、サポニンは、０日目の溶血活性により示唆されるように、少なくとも血液ライシス試薬によるライシスを行う典型的時間（たとえば、おおよそ５分間）内でほぼインタクトであると思われる。
【０１３３】
以上の考察は、溶血効率に関して高ｐＨ培地でのサポニンの不安定性を例示する。微生物細胞インタクト性を保持するサポニンの能力に及ぼすアルカリｐＨ及び非イオン性界面活性剤の影響を調べるために、第２の実験セットを実施した。先行実験例のいくつかと同様に、微生物細胞の血液ライシス及び分離の後の細胞インタクト性の代わりに、ΔＣＴにより定量されるインタクト性を用いるｒＲＮＡ増幅を利用した。炭酸塩緩衝剤を血液ライシス試薬の成分の残りの部分と個別又は一緒のどちらかで保持して、経時的にΔＣＴ値をモニターすることにより実験を実施した。２つのタイプ３血液ライシス試薬を用いて実験を実施した。
【０１３４】
第１のタイプ３血液ライシス試薬は、２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、０．０５％ｗ／ｖのＳＥ−１５濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、を有するタイプ３血液ライシス試薬溶液が得られるように、２００ｍＭの緩衝剤濃度と１０のｐＨ値とで調製された２０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌの濃度を有するＳＰＳと６０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と０．１％ｗ／ｖのＳＥ−１５の濃度とを有する１０ｍｌの試薬溶液と、を組み合わせることにより調製された。第２の試薬は、タイプ３血液ライシス試薬がこの試薬と炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤とを使用前に組み合わせて得られるように、これにより、貯蔵時のサポニンの分解が回避されるように、緩衝剤の添加なしにタイプ３血液ライシス試薬に基づいて調製された。この第２の試薬は、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、６０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、０．１％ｗ／ｖのＳＥ−１５濃度と、を有していた。
【０１３５】
第１の試薬（貯蔵前にプレ混合されたすべての試薬成分を有する）及び第２の試薬（炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤の不在下で貯蔵される）を室温で１週間貯蔵した後、第２の試薬と、等体積の２００ｍＭ炭酸塩緩衝剤（ｐＨ１０）と、を混合し、それにより、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、０．０５％ｗ／ｖのＳＥ−１５濃度と、を有するポスト混合タイプ３血液ライシス試薬を提供した。次いで、プレ混合及びポスト混合タイプ３血液ライシス試薬と、（ｉ）以下の実施例２に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有する３ｍｌの体積を有するスパイク全血サンプル、並びに（ｉｉ）以下の実施例３に従って調製されたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）を含有するスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルと、を接触させた。５ｍｌの各血液ライシス試薬と、３ｍｌのスパイクリン酸塩緩衝剤又はスパイク全血と、をそれぞれ合した後、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、ＳＰＳ濃度は９．３７５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．９４％ｗ／ｖ、ＳＥ−１５の濃度は０．０３％ｗ／ｖ、及び有効緩衝剤濃度は６２．５ｍＭであった。続いて、スパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルの両方で、遠心分離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを以下の実施例７に提供される方法に従って実施した。以下の実施例３の方法に従って調製されたスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルはまた、スパイク対照用にも調製され、以下の実施例６の方法に従ってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに付された。
【０１３６】
閾値サイクル値（ＣＴ値、すなわち、アッセイシグナルがノイズ閾値を超えて増加し始めるときのＰＣＲサイクル数）を測定し、スパイクリン酸塩緩衝剤ＣＴ値（図１９Ａ）又はスパイク全血ＣＴ値（図１９Ｂ）とスパイク対照ＣＴ値との差に基づいてＣＴ値の差ΔＣＴを決定した。安定性の参照を提供するために、第１の試薬の新たに調製されたものを用いて個別の実験セットを作製した。
【０１３７】
結果は、スパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルに対してそれぞれ図１９Ａ及び１９Ｂに提示される。観測されるように、サポニンと緩衝剤系とをプレ混合して高ｐＨで貯蔵したタイプ３血液ライシス試薬の性能は、１週間にわたり劣化し、ΔＣＴ値は３〜８サイクル増加する。サポニンは、高ｐＨ環境で貯蔵すると、スパイク弱リン酸塩緩衝剤を用いた場合、おおよそ１週間の時間スケールで、選択的ライシス時のその保護的役割の有意な劣化が現れ、この劣化は、血液ライシス試薬と血液とを混合した場合、有意な影響として現れないことが（すなわち、ΔＣＴのより小さな増加が観測された）、これらの実験結果から示される。
【０１３８】
サポニンの保護有効性は、全血サンプルとの混合直後又はその後しばらくは損なわれず（たとえば、混合後１日まで）、アルカリ性緩衝剤の塩基性成分からサポニン成分を分離して長期的貯蔵（たとえば、何日間か、何週間か、又は何ヵ月かにわたる貯蔵）を実施することにより、改善された試薬性能を達成可能であることが、以上に提示される実験結果から実証される。たとえば、１つ以上の追加の試薬成分との混合時にアルカリ性ｐＨに変換される中性又は酸性環境にサポニンを含有するように、タイプ３血液ライシス試薬の１つの成分を配合しうる。これらの試薬成分は、液状形態、乾燥形態、又は液状形態と乾燥形態との組合せで貯蔵されうる（１つ以上の試薬成分は液状形態され、１つ以上の他の試薬成分は乾燥形態で貯蔵される）。これらの試薬成分は、血液サンプルの血液ライシスを実施する前に混合されうる。たとえば、試薬成分は、血液サンプルとの接触直前（たとえば、血液サンプルと接触の何秒間か以内又は何分間か以内）にタイプ３血液ライシス試薬を形成するように混合されうるか、又は代替的に、試薬成分は、血液サンプルに接触させる前に好適な遅延（たとえば、何時間か）を設けてタイプ３血液ライシス試薬を形成するように混合されうるとともに、遅延は、血液ライシスプロセス時に微生物細胞の十分なインタクト性を維持するように決定される（たとえば、遅延への微生物細胞インタクト性の依存性を評価する一連の実験を介して）。
【０１３９】
試薬成分の分離を含む一実現形態例では、アルカリ塩（たとえば、炭酸ナトリウム又は炭酸カリウム）を含む第１の試薬は、サポニンを含有するｐＨ３．５〜５．５に緩衝された（たとえば、酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、又はリンゴ酸塩緩衝剤を用いて）第２の試薬から分離して貯蔵可能である。第１の試薬は、第２の試薬との混合時に可溶化されるように、乾燥形態で貯蔵可能である。第２の試薬により第１の試薬が十分に溶解されたら（たとえば、混合を介して）、得られた血液ライシス試薬は、血液サンプルに接触可能である。
【０１４０】
上述した例に係るタイプ３血液ライシス試薬のアルカリ性成分の分離は、第１の試薬の成分とくにサポニンが適切な酸性ｐＨ緩衝剤の存在下の弱酸性条件下で室温で長期間安定である限り、達成することが可能である。さらに、第１及び第２の試薬は、酸性緩衝剤に対して適正割合の固形アルカリを溶解可能であるように、その結果、混合タイプ３血液ライシス試薬の最終アルカリ性ｐＨレベルさらには所望の有効緩衝剤濃度を達成可能であるように構成されるべきである。また、十分に迅速な時間スケールで溶解するように、流体フローを妨害しないように（たとえば、自動プロセスで利用する場合、他の場合にはチャネル又はバルブをブロック可能である）、しかもインタクト微生物細胞の回収を損なう可能性のある非溶解微粒子として存在し続けることがないように、アルカリ性塩を選択することが有益である。
【０１４１】
選択される実現形態例では、限定されるものではないが、好適な第１の試薬の形成に使用可能なアルカリ性塩例としては、水への溶解性が相対的に高いことから炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが挙げられ（それぞれ、２５℃で３１ｇ／１００ｍＬ及び１１１ｇ／１００ｍＬ）、これらは第２の試薬の存在下で容易に溶解する。かかる塩は、高濃縮水性溶液として調製可能であり、これはアルカリ性試薬を液体としてディスペンス可能にしうるとともに、次いで、乾燥させて固形試薬を残存可能である（本実現形態例では第１の試薬）。他の一実現形態例では、第１の試薬は、第２の（液状相）試薬と組み合わせたときに迅速に破壊され溶解しうる小さな固形ペレット（たとえば、直径２〜４ｍｍ）に形成（たとえばプレス）可能である。第１の試薬及び第２の試薬は、混合時にタイプ３血液ライシス試薬の目標ｐＨが得られるように及び／又は最大ｐＨ（及び／又は緩衝剤濃度）を超えないように、それぞれの組成で形成可能である。
【０１４２】
以下の例は、貯蔵時のサポニン活性を維持するために、分離して貯蔵し続いて混合してタイプ３血液ライシス試薬を得ることが可能な２つの試薬を生成する方法例を提供する。第１の試薬は、炭酸ナトリウムなどのアルカリ性溶液を提供するように構成され、溶血前は第２の試薬から分離して保持され、且つ液体として又は後続的に第２の試薬との混合時に溶解可能な固体として提供されうる。本実現形態例では、限定されるものではないが、第１の試薬は、炭酸ナトリウム又は炭酸カリウムを含み、固形相で貯蔵される。第２の（液状相）試薬は、サポニンを含み、中性又は酸性ｐＨ、たとえば、３．５〜６．５、３．５〜８、又は４〜５の範囲内のｐＨで緩衝される。
【０１４３】
２つの試薬の混合後に所望のｐＨが得られるように第１の試薬及び第２の試薬の好適な相対量を決定するために、弱酸性緩衝剤で第２の試薬を調製し、次いで、炭酸ナトリウム溶液である第１の試薬で滴定する。酸性緩衝剤及び炭酸ナトリウム滴定剤の添加前、第２の試薬（４．５ｍＬ）は、１．６７体積％の濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と、２２．２ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＰＳと、３３．３ｍｇ／ｍＬの濃度のサポニンと、０．０５６％（ｖ／ｗ）の濃度の消泡剤ＳＥ−１５と、を含んでいた。次いで、さまざまな量の酢酸ナトリウム（ｐＨ５）又はクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５及びｐＨ５）のどちらかで第２の試薬を緩衝した。
【０１４４】
図２０Ａ及び２０Ｂは、それぞれさまざまな量のクエン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムを含有する第２の試薬を炭酸ナトリウムの溶液（１モル）として提供された第１の試薬で滴定したときに測定されたｐＨ変化をプロットする。いずれの場合も、９．５〜１０．０のｐＨを目標とし、炭酸ナトリウムを含む酢酸塩／クエン酸塩の全濃度が８０〜１００ｍＭになるようにした。図に示されるように、試薬混合物は、炭酸ナトリウム溶液の最初の２、３回の添加ではより低いｐＨレベルに弱く緩衝されたまま維持されるが、ｐＨ７〜９では、炭酸塩が新たな緩衝系で優位になるので、ｐＨの急上昇が起こる。
【０１４５】
クエン酸塩緩衝剤（図２０Ａに示される）の場合には、ｐＨ９に達するのに必要な炭酸ナトリウムの量は、第２の試薬の初期ｐＨ及びクエン酸塩の濃度に依存する。たとえば、ｐＨ４．５の４０ｍＭクエン酸塩では、９超のｐＨに増加させるには少なくとも２７ｍｇの炭酸ナトリウム（ほぼ５０ｍＭの緩衝剤濃度に等価）が必要とされるが、３０ｍＭクエン酸塩では、同一ｐＨレベルに達するのに２１ｍｇの炭酸ナトリウム（又はおおよそ４０ｍＭの緩衝剤濃度）で十分である。しかしながら、４０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）と２７ｍｇ炭酸ナトリウムとの組合せは、血液への暴露に起因するｐＨ変化に対する耐性がより大きいと予想されるより高い緩衝濃度を提供する。
【０１４６】
酢酸塩緩衝剤（図２０Ｂに示される）の場合には、初期酢酸塩濃度への依存性は、クエン酸塩緩衝剤よりも明白ではなく、ｐＨに影響を及ぼすことなくより容易に所望の緩衝剤能を目標としうる。
【０１４７】
図２０Ａ及び２０Ｂに示される滴定曲線例は、所望のｐＨレベルに達するように第１の試薬で必要とされる固体炭酸ナトリウムの量を決定するために利用可能である。たとえば、ｐＨ４．５の４０ｍＭクエン酸塩緩衝剤を使用する場合、おおよそｐＨ９．６〜９．７で全緩衝剤濃度１００ｍＭを得るために、第１の試薬で３２ｍｇの炭酸ナトリウム粉末が必要とされるであろう。
【０１４８】
微生物細胞のインタクト性を保存しつつ且つ残留血液デブリの発生を回避しつつ、選択的血液細胞ライシスを達成するタイプ３血液ライシス試薬の有効性は、血液ライシス試薬がどれくらい完全にサンプルと混合されるかに依存することを、本発明者らは見いだした。限定されるものではないが、有効混合方法の例としては、ボルテクシング、撹拌、磁気ビーズベース混合、及び相互接続チャンバー間輸送が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適な混合度及び好適な混合時間は、混合パラメーター及び持続時間を変化させることにより、及び微生物細胞インタクト性を調べる実験（たとえば、ｒＲＮＡ増幅などのプロキシアッセイを介して）及び／又は残留血液デブリを調べる実験を実施して十分な細胞インタクト性及び／又は残留血液デブリの低減又は排除を達成する混合パラメーターを選択することにより、実験的に決定可能である。血液細胞のライシスの事例では、十分な混合が実施される限り、ライシスは混合操作時に行われることを、本発明者らは見いだした。たとえば、ボルテクシング又は流体チャンバー間輸送により混合を実施する場合、好適な混合時間は３０秒間〜２分間の範囲内である。
【０１４９】
本明細書に記載の実施形態例の多くは、微生物細胞分離を達成するために遠心分離を利用するが、本血液ライシス試薬組成物及び関連方法は、他の微生物細胞分離方法、たとえば、限定されるものではないが、濾過、免疫磁気分離、及び他の分離技術、たとえば、マイクロ流体ベース分離との組合せで血液成分及び／又は他の真核細胞の選択的ライシスを実施するために利用しうることが理解されよう。
【０１５０】
さらに、本明細書に記載の血液ライシス試薬は、血液サンプル中の血液細胞の選択的ライシスに有効であることが示されるが、本明細書に記載の血液ライシス試薬及びその変化形態は、多種多様なサンプルタイプに適用されうるとともに、血液細胞以外の追加のタイプの真核細胞の選択的ライシスに有効でありうることが理解されよう。たとえば、本明細書に開示される細胞ライシス試薬（いくつかの実施形態例では「真核細胞ライシス試薬」ということがある）は、サンプル、たとえば、限定されるものではないが、リンパ液、脳脊髄液、痰、唾液、及びホモジナイズ組織サスペンジョン中の真核細胞（血液細胞又は他の真核細胞）のライシス（たとえば、真核生物から得られる体液又は他のサンプルに存在する非微生物内因性細胞のライシス）に利用されうる。
【０１５１】
以上に述べたように、いくつかの実施形態例で「血液サンプル」の定義内に血液培養サンプルが含まれることにより、タイプ３血液ライシス試薬は、陽性血液培養サンプルや中間培養血液培養サンプルなどの血液培養サンプルからのインタクト微生物細胞の抽出に利用されうる。タイプ１血液ライシス試薬は、インタクト微生物細胞の抽出に最も適切な血液ライシス試薬選択であろうと推測されることもある。たとえば、サポニンとＳＰＳとの組合せは一般に細菌細胞を損傷しないので、タイプ１血液ライシス試薬が好ましいと思われることもある。さらに、血液培養ボトル中の血液内容物は、典型的にはすでに少なくとも４倍希釈されており、この希釈の結果として、タイプ１血液ライシス試薬への暴露後の陽性血液培養サンプル中の血液細胞デブリの相対量は、タイプ１血液ライシス試薬への暴露後の類似の体積を有する全血サンプル中に存在する血液細胞デブリのおおよそ１／４であると予想される。したがって、血液細胞デブリのこうした低減を考慮して、タイプ１試薬は、血液培養サンプルの処理に好適でありうると判断されることもある。
【０１５２】
しかしながら、以下に示されるように、本発明者らにより行われた実験観測では、血液培養サンプルの希釈を高めても、必ずしも血液細胞デブリの除去が容易になるとは限らず、タイプ３血液ライシス試薬が血液培養サンプルの処理に好ましいことが示唆される。
【０１５３】
陽性血液培養サンプルでの遠心分離後残渣に及ぼす血液ライシス試薬タイプの影響の実験研究
本実験研究は、陽性血液培養サンプルへの暴露後に存在する残留デブリに及ぼす異なるタイプの血液ライシス試薬組成物の影響を調べるために実施された。エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が接種された陽性血液培養サンプルは、実施例１０の方法を用いて調製された。１ｍｌ〜５ｍＬの範囲内の体積を有するサンプルは、タイプ１又はタイプ３血液ライシス試薬のどちらかを用いて実施例１１の方法に従って処理された。タイプ１血液ライシス試薬の場合には、タイプ１血液ライシス試薬と陽性血液培養サンプルとの混合後、サポニン及びＳＰＳの濃度は、サンプル体積にかかわらず、それぞれ３７．５ｍｇ／ｍＬ及び７．５ｍｇ／ｍＬであった。タイプ３血液ライシス試薬の場合には、タイプ３血液ライシス試薬と陽性血液培養サンプルとの混合後、サポニン、ＳＰＳ、炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ１０）の濃度は、サンプル体積にかかわらず、それぞれ１７．５ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬ、２５ｍＭ（有効緩衝剤濃度）であった。
【０１５４】
図２１Ａ及び２１Ｂは、１ｍｌ〜５ｍｌの範囲内の陽性血液培養サンプル体積に対して、それぞれ、タイプ１及びタイプ３試薬での陽性血液培養サンプルの溶血の実施後の遠心分離機チューブの画像を示す。
【０１５５】
図２１Ａに示されるように、陽性血液培養サンプルとタイプ１血液ライシス試薬との接触後、タイプ１血液ライシス試薬により十分に消化されない血液デブリは、遠心分離時に微生物細胞と一緒の沈降し、複合ネットワークで微生物細胞と血液細胞デブリとの両方を含む粘性ケークを形成する。この細胞−デブリケークは、自動遠心洗浄サイクル時に容易に破壊されず、洗浄微生物細胞を再懸濁したときに大量の血液細胞デブリが残留し、下流プロセス（たとえばアッセイ）の性能に影響を与えるおそれがある。
【０１５６】
きわめて対照的に、図２１Ｂに示されるように、陽性血液培養サンプルとタイプ３血液ライシス試薬との接触後、血液デブリは、上昇ｐＨの存在下で消化され、遠心分離後に得られた生成沈殿は、ほとんど全部が微生物細胞で構成される。クリーン微生物細胞沈殿物は、図２１Ｂで容易に分かり、タイプ１血液ライシス試薬を用いて形成された粘性且つ暗色のケークとは有意に異なる白色沈澱物を示す。また、沈殿物の量は、血液細胞デブリの不在に起因して、タイプ３血液ライシス試薬の場合には有意に低減されることが容易に分かる。タイプ３血液ライシス試薬による処理で得られる容易に再懸濁可能な高純度微生物細胞沈殿物は、他の状況で残留血液細胞デブリにより引き起こされる可能性のある妨害作用が不在であるため、改善された性能を有する下流アッセイが促進されると予想される。
【０１５７】
以上の例は、血液培養サンプルを遠心分離処理して実質的に血液細胞デブリフリーの微生物細胞沈殿物を得るタイプ３血液ライシス試薬に基づく利益を実証するが、血液培養サンプルの処理にタイプ３血液ライシス試薬を使用することは、濾過などの他の分離モダリティーにも有益であると予想されることに留意されたい。さらに、タイプ３血液ライシス試薬を介して処理されたサンプルの消化及び粘度の改善により、流体カートリッジでの自動輸送ベース混合が促進されると予想される。こうした混合は、一方の流体チャネル又は流体チャンバーから他方の流体チャネル又はチャンバーに及びその逆に液体を流動させることにより、任意選択的に、このプロセスを１回以上繰り返すことにより達成する。
【０１５８】
タイプ３血液ライシス試薬を用いた陽性血液培養物からの直接ＭＡＬＤＩを実証する実験研究
以上に述べたように、タイプ３血液ライシス試薬で陽性血液培養サンプルを処理した後に得られたクリーン微生物細胞沈殿物は、追加のサンプル調製工程の不在又は低減を伴って、同定アッセイなどの後続アッセイ工程の実施を促進可能である。本発明者らは、継代培養工程を必要とすることなく、タイプ３血液ライシス試薬を用いた初期血液細胞ライシス工程の後に陽性血液培養サンプルの分離及び精製を実施することにより得られる微生物細胞でＭＡＬＤＩを直接実施する能力を実証するために次の実験を実施した。１ｍＬの陽性血液培養サンプルと等体積のタイプ３血液ライシス試薬とを混合した後、個別成分の濃度が以下の通りになるように、各々異なる組成例を有する３つのタイプ３試薬例を調製した。
タイプ３血液ライシス試薬例１：
血液ライシス試薬と陽性血液培養サンプルとを混合した後、サポニン、ＳＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度、及び炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ１０）の有効濃度は、それぞれ、１７．５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、０．７５％、及び５０ｍＭであった。
タイプ３血液ライシス試薬例２：
血液ライシス試薬と陽性血液培養サンプルとを混合した後、サポニン、ＳＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度、及び炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ１０）の有効濃度は、それぞれ、１７．５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、０％、及び５０ｍＭであった。
タイプ３血液ライシス試薬例３：
血液ライシス試薬と陽性血液培養サンプルとを混合した後、サポニン、ＳＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度、及び炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ１０）の有効濃度は、それぞれ、１７．５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、０％、及び２５ｍＭであった。
【０１５９】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、又はシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含有する陽性血液培養サンプルは、実施例１０の方法に従って調製された。続いて、遠心分離は、４回の洗浄サイクルを利用して、実施例１２に提供される方法に従って実施された。続いて、サスペンジョンで得られた細菌細胞は、実施例１６の手順に従って同定するためにＭＡＬＤＩ（ＶＩＴＥＫ（登録商標）ＭＳ機器）により試験された。
【０１６０】
図２１Ｃは、タイプ３血液ライシス試薬の組成への陽性培養血液サンプルからのスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、又はシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＭＡＬＤＩ（ＶＩＴＥＫ−ＭＳ−ＩＤ）による同定の測定依存性を例示する。３つの細菌種はすべて、すべてのタイプ３血液ライシス試薬組成物例の場合で適正に同定された。ＭＡＬＤＩを介する血液培養サンプルからの正確且つ直接的な同定のために、タイプ３血液ライシス試薬の成分の広範にわたる組成を利用しうることが、結果から例示される。
【０１６１】
本実験的実証では、細胞分離時に４回の洗浄サイクルを利用した。４回の洗浄サイクルの使用は、一般に必要なことではなく、より多くの回数又はより少ない回数の洗浄サイクルを利用しうることが理解されよう。たとえば、より少ない回数の洗浄サイクルでも、ＭＡＬＤＩにより高性能同定を行うのに十分なサンプル純度が提供されることを例示するために、他の一実験を実施した。タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、５０ｍＭの緩衝剤濃度と、９．５〜１０の範囲内のｐＨ値と、を有する試薬溶液が得られるように、１０のｐＨの１００ｍＭの緩衝剤濃度で調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。１ｍｌの血液ライシス試薬と１ｍｌの陽性血液培養サンプルとを混合した後、ＳＰＳ濃度は７．５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ値は９．２〜９．６の範囲内、有効緩衝剤濃度は２５ｍＭであった。クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含有する陽性血液培養サンプルは、実施例１０の方法に従って調製された。続いて、遠心分離は、さまざまな回数の洗浄サイクルを利用して陽性血液培養サンプルに対して以下の実施例１２に提供される方法に従って実施された。サスペンジョンの細菌細胞は、実施例１６の手順に従って同定するためにＭＡＬＤＩ（ＶＩＴＥＫ（登録商標）ＭＳ機器）により試験された。結果は図２１Ｄに提示される。
【０１６２】
観測されるように、細胞サスペンジョンの使用結果は、少なくとも２回の洗浄サイクルを利用したときに高信頼レベルの同定を提供した。所与の処理条件セット（たとえば、１回の洗浄当たりの具体的希釈因子例、タイプ３血液ライシス試薬の具体的組成例、具体的血液培養ボトル配合物例、陽性血液培養サンプルの具体的体積例、タイプ３血液ライシス試薬による陽性血液培養サンプルの具体的希釈例、及び質量分析データに基づいて同定を実施するための具体的分析方法例）では、ＭＡＬＤＩを介して同定を実施するために少なくとも２回の洗浄工程が必要であることが、これらの結果から実証される。しかしながら、他の場合には洗浄工程の所要の回数は異なりうるとともに２回超又は未満でありうることが理解されよう。さらに、以上に述べたように、本方法例は、遠心ベース分離及び他の分離モダリティーに限定することが意図されるものではなく、たとえば、代替的に、濾過、免疫磁気分離、及びマイクロ流体ベース分離が利用されうる。
【０１６３】
以上に例示されるように、タイプ３血液ライシス試薬は、十分に血液細胞を消化し、且つタイプ１血液ライシス試薬を使用したときに他の状況で得られる粘性ネットワークの形成を防止することが示されている。したがって、本開示のいくつかの実施形態例によれば、タイプ３血液ライシス試薬は、後続処理でインタクト微生物細胞を抽出するために陽性血液培養サンプルなどの血液培養サンプルの処理に利用されうる。
【０１６４】
本明細書に提供される例を考慮して、血液ライシス試薬の多種多様な組成例並びに血液細胞及び／又は他の真核細胞の選択的ライシスを実施する方法が次に開示される。一実施形態例では、サンプル中の１つ以上の微生物細胞のインタクト性を保存しつつ、サンプル中の血液細胞及び／又は他の真核細胞の選択的ライシスを実施する方法は、サンプルと、サポニンとＳＰＳとアルカリ性緩衝剤と非イオン性界面活性剤とを含有する血液ライシス試薬と、を接触させることと、サンプルと血液ライシス試薬とを混合することと、サンプル中の血液及び／又は真核細胞のライシスを達成する十分な時間にわたり混合物をインキュベートすることと、微生物細胞を分離することと、により、実施されうる。
【０１６５】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬とサンプルとを混合した後のサポニン濃度が３〜６０ｍｇ／ｍｌにあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中のサポニン濃度は、１０〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲内でありうる。サポニンの好適な濃度は、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時にインタクト性の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物のｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度、並びにサンプルのタイプ及びサンプルの量に依存して変化しうることが理解されよう。好適なサポニン濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞インタクト性に及ぼすサポニン濃度の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０１６６】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬とサンプルとを混合した後のＳＰＳ濃度が１．５〜５０ｍｇ／ｍｌにあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中のＳＰＳ濃度は、５〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内でありうる。ＳＰＳの好適な濃度は、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時にインタクト性の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物のｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度、並びにサンプルのタイプ及びサンプルの量に依存して変化しうることが理解されよう。好適なＳＰＳ濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞インタクト性に及ぼすＳＰＳ濃度の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０１６７】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬とサンプルとを混合した後の非イオン性界面活性剤濃度が０〜３％ｗ／ｖにあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中の非イオン性界面活性剤の濃度は、０．５〜２％の範囲内でありうる。非イオン性界面活性剤の好適な濃度は、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時にインタクト性の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物のｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度、サンプルのタイプ及びサンプルの量に依存して変化しうることが理解されよう。好適な非イオン性界面活性剤濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞インタクト性に及ぼす非イオン性界面活性剤濃度の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０１６８】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬とサンプルとを混合した後のｐＨが７．８〜１０の範囲内にあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物のｐＨは、８．２〜９．５の範囲内でありうる。他の実施形態例では、最終混合物のｐＨは、１０、９．９、９．８、９．７、９．６、又は９．５の上限ｐＨ値により境界付けられる、且つ８．０、８．２、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、及び９．０の下限ｐＨ値により境界付けられる、範囲内にありうる。いくつかの実施形態例では、緩衝剤濃度は、有効緩衝剤濃度が１０〜３００ｍＭの範囲内にあるように選択されうる。他の実施形態例では、緩衝剤濃度は、有効緩衝剤濃度が３０〜１００ｍＭの範囲内にあるように選択されうる。
【０１６９】
好適なｐＨは、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時にインタクト性の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物の有効緩衝剤濃度、サンプルとの混合前の血液ライシス試薬の初期ｐＨ、サンプルのタイプ及びサンプルの量に依存して変化しうることが理解されよう。
【０１７０】
いくつかの実施形態例では、血液ライシス試薬は、９〜１１（又はたとえば９．５〜１０．５）のｐＨを有しうるとともに、緩衝剤濃度（又は緩衝剤能）は、血液ライシス試薬とサンプルとの混合後のｐＨが、１０未満、９．９未満、９．８未満、９．７未満、９．６未満、又は９．５未満、且つ８．２超、８．４超、８．５超、８．６超、８．７超、８．８超、８．９超、又は９．０超の最終ｐＨに減少するように選択されうる。理論により限定することを意図するものではないが、９〜１１の範囲内の初期ｐＨは、血液細胞の効率的消化を実施するのに有益でありうるとはいえ、かかる高ｐＨが血液細胞のライシス後に維持されると、得られる高ｐＨは、いくつかの微生物細胞（たとえば、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）など）のインタクト性に悪影響を及ぼす可能性があると、本発明者らは推測する。
【０１７１】
好適な最終ｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞インタクト性に及ぼすｐＨ及び／又は緩衝剤濃度範囲の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０１７２】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、水中油型乳化剤として適切な非イオン性界面活性剤を含有するポリジメチルシロキサンのエマルジョンを含む消泡剤をさらに含みうるとともに、血液ライシス試薬とサンプルとを混合した後の消泡剤エマルジョンの濃度が０．００５〜１％（ｖ／ｗ）の範囲内にあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中の消泡剤エマルジョンの濃度は、０．０１〜０．０５％の範囲内でありうる。消泡剤の好適な濃度は、限定されるものではないが、血液ライシス試薬の他の成分の濃度、サンプルのタイプ、サンプルの量などの１つ以上の因子に依存して変化しうることが理解されよう。好適な消泡剤の組成及び濃度は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、混合及び／又は分離プロセスを含む自動操作時に発生する泡の量並びに流体の送達に必要な圧力に及ぼす消泡剤の濃度及び組成の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の条件セットに対して決定可能であることが理解されよう。
【０１７３】
一実施形態例では、サンプル中の１つ以上の微生物細胞のインタクト性を保存しつつ、サンプル中の血液細胞及び／又は他の真核細胞の選択的ライシスを実施する方法は、サンプルと、サポニンとＳＰＳとアルカリ性緩衝剤とを含有する血液ライシス試薬と、を接触させることと（たとえば、濃度例及びｐＨ例は、以上の範囲例に従う）、サンプルと血液ライシス試薬とを混合することと、微生物細胞を分離することと、により実施されうる。非イオン性界面活性剤が含まれることは多くの用途に有益であるが、残留デブリの存在の影響を受けにくい用途や下流の分子増幅を含まない用途などのいくつかの用途では、選択的ライシスを達成するのに必要ではない。
【０１７４】
一実施形態例では、サンプル中の１つ以上の微生物細胞のインタクト性を保存しつつ、サンプル中の血液細胞及び／又は他の真核細胞の選択的ライシスを実施する方法は、サンプルと、サポニンとアルカリ性緩衝剤とを含有する血液ライシス試薬と、を接触させることと（たとえば、濃度例及びｐＨ例は、以上の範囲例に従う）、サンプルと血液ライシス試薬とを混合することと、微生物細胞を分離することと、により実施されうる。非イオン性界面活性剤及びＳＰＳが含まれることは多くの用途に有益であるが、これらの成分は、残留デブリの存在の影響を受けにくい用途や下流の分子増幅を含まない用途などのいくつかの用途では、選択的ライシスを達成するのに必要ではない。
【０１７５】
以上に開示される方法例の多くは、血液ライシス試薬とサンプルとの混合物の形成後、微生物細胞の分離を含むが、他の実施形態例では、混合物から微生物細胞を分離することなく、混合物を用いて核酸抽出を実施しうることが理解されよう。たとえば、混合物は、混合物から哺乳動物核酸を除去するために、抽出に好適な固形相、たとえば、シリカで被覆された磁気ビーズや陰イオン交換樹脂などに接触されうるとともに、次いで、得られた混合物は、微生物細胞がライシスされるように、ライシス工程（たとえば、化学的、機械的、電気的、又は超音波）に付されうる。次いで、得られたライセートは、微生物細胞により放出された核酸の抽出に好適な固形相に接触されうる。
【０１７６】
以上に説明したように、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬のサポニン成分が、血液ライシス試薬のアルカリ性成分から分離された酸性環境に貯蔵されるように、個別貯蔵及び使用前混合が可能な２つ以上の試薬として提供されうる。一実現形態例では、最終血液ライシス試薬を形成するために混合される試薬の１つ以上は、固形相で貯蔵されうる。
【０１７７】
以上の例は、血液細胞及び／又は他の真核細胞のライシスと、それに続く微生物細胞の分離と、逆転写ｒＲＮＡ増幅を介する微生物細胞の後続検出及び／又は同定と、を実施するための本タイプ３血液ライシス試薬の有用性を開示しているが、これは本明細書で企図される試薬組成物及び方法の一用途例にすぎないことが理解されよう。微生物細胞の後続（下流）検出を含む用途では、核酸の検出、たとえば、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｔｍＲＮＡの検出は、増幅法（たとえば、限定されるものではないが、ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、及び等温増幅法）、又は非増幅法（たとえば、ハイブリダイゼーションアッセイ及びシーケンシング）、又はそれらの組合せを介して実施されうることが理解されよう。他の方法例では、検出は、微生物細胞表面との親和性反応、質量分析、赤外分光法、顕微鏡法、フローサイトメトリーを介して、及び／又は微生物細胞に関連付けられる揮発性有機物の検出（わずかではあるが代替検出モダリティーの例を挙げると）を介して、実施されうる。
【０１７８】
以上に記載の実施形態例の多くは、全血サンプルの処理を含む。たとえば、以上に記載したように、血液ライシス試薬の組成は、微生物細胞のインタクト性を保存しつつ、且つ全血サンプルと血液ライシス試薬との混合物の遠心分離時又は濾過時に血液デブリの可視形成を回避しつつ、１ｍｌを超えるさらには５ｍｌを超える全血体積を処理できるように、続いて後続洗浄工程を行えるように、選択可能である。しかしながら、本明細書に記載の方法は、多種多様なサンプルタイプ、たとえば、限定されるものではないが、リンパ液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、並びにホモジナイズサスペンジョンたとえば糞便及びホモジナイズ組織サンプルに適合化されうることが理解されよう。
【０１７９】
次に、陽性血液培養サンプルや中間培養サンプルなどの血液培養サンプルの処理に対して、例及び限定されるものではないが組成範囲を以下に提供する。以下の濃度範囲例は、後続ＭＡＬＤＩ遂行を促進するうえでの好適性に基づいて決定されているが、以下に提供される濃度範囲及びその変化形態は、他の下流アッセイ又は下流プロセスを実施するときに血液細胞ライシスを実施するために利用されうることが理解されよう。
【０１８０】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬と血液培養サンプルとを混合した後のサポニン濃度が０．７５〜６０ｍｇ／ｍｌにあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中のサポニン濃度は、２．５〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲内でありうる。サポニンの好適な濃度は、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時にインタクト性の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物のｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度、並びに血液培養サンプル中の微生物細胞の濃度に依存して変化しうることが理解されよう。好適なサポニン濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞インタクト性に及ぼすサポニン濃度の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０１８１】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬と血液培養サンプルとを混合した後のＳＰＳの濃度が０．３５〜５０ｍｇ／ｍｌの間にあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中のＳＰＳ濃度は、１．２５〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内でありうる。ＳＰＳの好適な濃度は、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時にインタクト性の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物のｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度、並びに血液培養サンプル中の微生物細胞の濃度に依存して変化しうることが理解されよう。好適なＳＰＳ濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞インタクト性に及ぼすＳＰＳ濃度の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０１８２】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬と血液培養サンプルとを混合した後の非イオン性界面活性剤の濃度が０〜３％ｗ／ｖの範囲内にあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中の非イオン性界面活性剤の濃度は、０．１６〜２％の範囲内でありうる。非イオン性界面活性剤の好適な濃度は、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時にインタクト性の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物のｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度、並びに血液培養サンプル中の微生物細胞の濃度に依存して変化しうることが理解されよう。好適な非イオン性界面活性剤濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞インタクト性に及ぼす非イオン性界面活性剤濃度の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０１８３】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬と血液培養サンプルとを混合した後のｐＨが７．８〜１０の範囲内にあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物のｐＨは、８．２〜９．５の範囲内でありうる。他の実施形態例では、最終混合物のｐＨは、１０、９．９、９．８、９．７、９．６、又は９．５の上限ｐＨ値により境界付けられる、且つ８．０、８．２、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、及び９．０の下限ｐＨ値により境界付けられる、範囲内にありうる。いくつかの実施形態例では、緩衝剤濃度は、有効緩衝剤濃度が２．５〜５００ｍＭの範囲内にあるように選択されうる。他の実施形態例では、緩衝剤濃度は、有効緩衝剤濃度が５〜２５０ｍＭの範囲内にあるように選択されうる。
【０１８４】
好適なｐＨは、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時にインタクト性の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物の有効緩衝剤濃度、血液培養サンプルとの混合前の血液ライシス試薬の初期ｐＨ、血液培養サンプル中の微生物細胞の濃度に依存して変化しうることが理解されよう。
【０１８５】
いくつかの実施形態例では、血液ライシス試薬は、９〜１１（又はたとえば９．５〜１０．５）のｐＨを有しうるとともに、緩衝剤濃度（又は緩衝剤能）は、血液ライシス試薬と血液培養サンプルとの混合後のｐＨが、１０未満、９．９未満、９．８未満、９．７未満、９．６未満、又は９．５未満、且つ８．２超、８．４超、８．５超、８．６超、８．７超、８．８超、８．９超の、又は９．０超の最終ｐＨに減少するように選択されうる。理論により限定することを意図するものではないが、９〜１１の範囲内の初期ｐＨは、血液細胞の効率的消化を実施するのに有益でありうるとはいえ、かかる高ｐＨが血液細胞のライシス後に維持されると、得られる高ｐＨは、いくつかの微生物細胞（たとえば、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）など）のインタクト性に悪影響を及ぼす可能性があると、本発明者らは推測する。
【０１８６】
好適な最終ｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞インタクト性に及ぼすｐＨ及び／又は緩衝剤濃度範囲の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０１８７】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、水中油型乳化剤として適切な非イオン性界面活性剤を含有するポリジメチルシロキサンのエマルジョンを含む消泡剤をさらに含みうるとともに、血液ライシス試薬と血液培養サンプルとを混合した後の消泡剤エマルジョンの濃度が０．００５〜１％（ｖ／ｗ）又はたとえば０．０５〜０．２％（ｖ／ｗ）の範囲内にあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中の消泡剤エマルジョンの濃度は、０．０１〜０．０５％の範囲内でありうる。消泡剤の好適な濃度は、限定されるものではないが、血液ライシス試薬の他の成分の濃度、血液培養サンプル中の微生物細胞の濃度などの１つ以上の因子に依存して変化しうることが理解されよう。好適な消泡剤の組成及び濃度は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、混合及び／又は分離プロセスを含む自動操作時に発生する泡の量並びに流体の送達に必要な圧力に及ぼす消泡剤の濃度及び組成の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の条件セットに対して決定可能であることが理解されよう。
【０１８８】
タイプ３血液ライシス試薬を用いた生存微生物細胞の回収
サンプル中の血液細胞の有効ライシスを促進しインタクト微生物細胞の自動分離をサポートするタイプ３血液ライシス試薬の上述した成功を考慮して、本発明者らは、タイプ３ライシス試薬との接触後に分離された微生物細胞の生存能を調べた。微生物細胞同定のための核酸検出やＭＡＬＤＩなどを含む用途は、インタクト核酸又はタンパク質を有する分離微生物細胞を分離することを必要としうるにすぎないが、他の用途、たとえば、分離微生物細胞の後続成長を含む用途（たとえば、抗微生物剤感受性試験又は従来の成長ベース同定法）は、分離微生物細胞が生存可能（すなわち細胞分裂可能）であることを必要とする。
【０１８９】
本発明者らは、最初に、血液細胞を含有するサンプルからの生存微生物細胞の分離にタイプ１血液ライシス試薬を使用する実現可能性を検討した。タイプ１血液ライシス試薬は、サポニンとＳＰＳとを利用する。サポニンは、微生物細胞生存能を保持することが知られているが、図５Ａに示されてある、サポニンとＳＰＳとを含むが、非イオン性界面活性剤やアルカリ性ｐＨ緩衝剤を含まないタイプ１血液ライシス試薬組成物は、おおよそ１ｍＬ超の体積を有する全血サンプルでライシス血液細胞を十分に消化することができず、自動分離（たとえば、遠心分離及び濾過）時に問題を起こす可能性のある血液細胞デブリの存在をもたらす。こうした理由から、タイプ１血液ライシス試薬は、生存微生物細胞の自動血液細胞ライシス及び自動分離を含む用途には無効であるとみなされた。
【０１９０】
次いで、本発明者らは、生存微生物細胞の自動血液細胞ライシス及び自動分離を含む用途でのタイプ２血液ライシス試薬の実現可能性を検討した。タイプ２血液ライシス試薬は、広範にわたる全血体積で血液残渣を消化可能であることが示されているが（たとえば、図５Ｂを参照されたい）、かかる試薬は、サポニンの保護寄与の不在下で、広範にわたる微生物細胞種で生存能の損失をもたらす。
【０１９１】
したがって、本発明者らは、タイプ３血液ライシス試薬が血液細胞の自動ライシス及び生存微生物細胞の後続自動分離に最も好適であると結論付けた。全血サンプルを処理したときのグラム陽性菌種及びグラム陰性菌種の生存能に及ぼすタイプ３血液ライシス試薬の各種成分の影響を調べるために、一連の実験を実施した。また、タイプ３血液ライシス試薬を用いた血液培養サンプルからの生存微生物細胞の抽出を実証するために、追加の実験を実施した。これらの実験を以下に詳細に記載し、生存微生物細胞の自動分離に対するタイプ３血液ライシス試薬の好適性を実証する。
【０１９２】
全血中のスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の生存能に及ぼすタイプ２及びタイプ３血液ライシス試薬暴露の影響の実験研究
第１の実験では、タイプ２及びタイプ３血液ライシス試薬への細胞の暴露後のスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）細胞の回収を評価した。このグラム陽性細菌は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びアルカリ性ｐＨにより与えられより過酷な条件に耐えて生きると予想される。そのため、本実験では、タイプ２及びタイプ３の両方の試薬を評価した。
【０１９３】
タイプ３血液ライシス試薬溶液例は、２０ｍｌの体積と、２０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１．５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、９．５〜１０の範囲内のｐＨ値と、を有する試薬溶液が得られるように、２００ｍＭの緩衝剤濃度と１０のｐＨとで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、４０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌの血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとの混合後、ＳＰＳ濃度は１２．５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．９４％ｗ／ｖ、ｐＨ値はおおよそで９．５、及び有効緩衝剤濃度は６２．５ｍＭであった。
【０１９４】
タイプ２血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、２０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、１．５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、９．５〜１０の範囲内のｐＨ値と、を有する試薬溶液が得られるように、２００ｍＭの緩衝剤濃度と１０のｐＨとで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、４０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された、あった。５ｍｌの血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとの混合後、ＳＰＳ濃度は１２．５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０．９４％ｗ／ｖ、ｐＨ値は９．２〜９．５の範囲内、及び有効緩衝剤濃度は６２．５ｍＭであった。
【０１９５】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を含有するスパイク全血サンプル又はスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルは、それぞれ、実施例２及び３の方法に従って調製された。続いて、遠心分離は、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプル（タイプ３及びタイプ２の両方の血液ライシス試薬を用いて）に対して、それぞれ、以下の実施例１３及び１４に提供される方法に従って実施された。細胞サスペンジョンは、５％ヒツジ血液を含むトリプシン大豆寒天上にプレーティングされ、３７℃で一晩インキュベートされた。
【０１９６】
図２２Ａに提示される結果は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）細胞の生存能がタイプ２血液ライシス試薬により損なわれることを明確に実証する。一方、タイプ３血液ライシス試薬中のサポニンの存在は、回収スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）細胞の生存能を保持する。
【０１９７】
全血中の選択されたグラム陰性菌微生物細胞の生存能に及ぼすタイプ３血液ライシス試薬暴露の影響の実験研究
以上の例のグラム陽性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）細菌細胞とは対照的に、グラム陰性細菌細胞は、タイプ３血液ライシス試薬中のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びアルカリ性ｐＨの存在に対する耐性が低いと予想される。それゆえ、実験は、タイプ３血液ライシス試薬のみを用いて実施された。実験は、タイプ３血液ライシス試薬に対するグラム陰性微生物細胞の生存能に及ぼすさまざまな濃度の炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の影響を調べるために実施された。
【０１９８】
タイプ３血液ライシス試薬溶液例は、２０ｍｌの体積と、２０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、０又は０．７５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、５０ｍＭ又は１００ｍＭの緩衝剤濃度と、９．５〜１０の範囲内のｐＨ値と、を有する試薬溶液が得られるように、１００ｍＭ又は２００ｍＭの緩衝剤濃度と１０のｐＨとで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、４０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と０％又は１．５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌの血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとの混合後、ＳＰＳ濃度は１２．５ｍｇ／ｍＬだった。サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０％又は０．４７％ｗ／ｖ、ｐＨ値は９．２〜９．５の範囲内、及び有効緩衝剤濃度は３１．２５又は６２．５ｍＭであった。
【０１９９】
プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）を含有するスパイク全血サンプル又はスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルは、それぞれ、実施例２及び３の方法に従って調製された。続いて、遠心分離は、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルでそれぞれ以下の実施例１３及び１４に提供される方法に従って実施された。細胞サスペンジョンは、５％ヒツジ血液を含むトリプシン大豆寒天上にプレーティングされ、３７℃で一晩インキュベートされた。
【０２００】
図２２Ｂに提示される結果は、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）細胞の生存能がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び／又はアルカリ性緩衝剤の濃度に依存しうることを示唆する。実際に、図に示されるように、最高プレートカウント（つまり最高生存能）は、最低有効緩衝剤濃度（５０ｍＭ）及び最低Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度（０％）の場合に観測された。
【０２０１】
他の一実験は、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞の生存能に及ぼすさまざまな濃度の炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の影響を調べるために実施された。タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、２０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、０又は０．３７５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、５０ｍＭ、７５ｍＭ、又は１００ｍＭの緩衝剤濃度と、９．５〜１０の範囲内のｐＨ値と、を有する試薬溶液が得られるように、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、又は２００ｍＭの緩衝剤濃度と１０のｐＨとで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、４０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と０％又は０．７５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌの血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとの混合後、ＳＰＳ濃度は１２．５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０％又は０．２３％ｗ／ｖ、ｐＨ値は９．２〜９．５の範囲内、及び有効緩衝剤濃度は３１．２５ｍＭ、４７ｍＭ、又は６２．５ｍＭであった。
【０２０２】
シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含有するスパイク全血サンプル又はスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルは、それぞれ、実施例２及び３の方法に従って調製された。続いて、遠心分離は、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルでそれぞれ以下の実施例１３及び１４に提供される方法に従って実施された。細胞サスペンジョンは、５％ヒツジ血液を含むトリプシン大豆寒天上にプレーティングされ、３７℃で一晩インキュベートされた。
【０２０３】
シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞の生存能もまた、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度に依存するとともに、アルカリ性緩衝剤の濃度にも依存すると思われることが、図２２Ｃに提示される結果から示唆される。微生物細胞の分離後生存能は、選択されたグラム陰性微生物細胞ではタイプ３ライシス試薬の非イオン性界面活性剤濃度及び緩衝剤濃度に逆相関すると思われることが、先行実験から示唆される。実際に、改善された分離後生存能は、有効アルカリ性濃度及び非イオン性界面活性剤濃度が十分に低いときに得られうることが、結果から示唆される。アルカリ性緩衝剤及び／又は非イオン性界面活性剤の濃度を低下させて分離後微生物細胞生存能に及ぼすタイプ３ライシス試薬組成物の影響をさらに調べるために、以下の実験を設計した。
【０２０４】
生存微生物細胞の回収に及ぼすタイプ３血液ライシス試薬中の非イオン性界面活性剤不在の影響の実験研究
３ｍｌの体積の全血サンプルの処理で回収微生物細胞の生存能に及ぼすタイプ３ライシス試薬中の非イオン性界面活性剤不在の影響を調べるために、実験を実施した。タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、２０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、５０ｍＭ又は２５ｍＭの緩衝剤濃度と、９．５〜１０の範囲内のｐＨ値と、を有する血液ライシス試薬溶液が得られるように、１００ｍＭ又は５０ｍＭの緩衝剤濃度と１０のｐＨとで調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、４０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌの血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとを混合した後、ＳＰＳ濃度は１２．５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ値は９．２〜９．５の範囲内、及び有効緩衝剤濃度は３１．２５ｍＭ又は１５．６ｍＭであった。シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細胞を含有するスパイク全血サンプル及びスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルは、それぞれ、実施例２及び３の方法に従って調製された。続いて、遠心分離は、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル及びスパイク全血サンプルでそれぞれ実施例１３及び１４に提供される方法に従って実施された。細胞サスペンジョンは、５％ヒツジ血液を含むトリプシン大豆寒天上にプレーティングされ、３７℃で一晩インキュベートされた。
【０２０５】
混合後有効緩衝剤濃度が２５ｍＭ及び５０ｍＭのとき、非イオン性界面活性剤の不在のライシス試薬で、すべての微生物細胞種の微生物細胞の生存回収は、それぞれ８０％超及び６０％超であったことが、図２２Ｄに提示される結果から示される。したがって、この実験研究で図２２Ｂ及び２２Ｃに示される結果が確認されたことから、生存微生物細胞を抽出する目的で中程度（たとえば３ｍｌ）の体積を有する全血サンプルの血液成分のライシスにタイプ３ライシス試薬を使用するとき、非イオン性界面活性剤の不在下（又は低濃度の存在下）でライシス緩衝液を調製することにより、好適な生存細胞回収値を得ることが可能であり、グラム陽性種及びグラム陰性種での回収は、有効緩衝剤濃度が低いほど増加することが示唆される。
【０２０６】
生存グラム陰性微生物細胞の回収に及ぼすタイプ３血液ライシス試薬中のより低い緩衝剤濃度の影響の実験研究
生存微生物細胞の回収は、多くの場合、ライシス試薬の有効緩衝剤濃度を減少させたときに増加することが、先行研究から実証された。サンプル−試薬混合物の粘度は、有効緩衝剤濃度を減少させるにつれて増加することが、その本発明者らにより観測された。本研究は、生存細菌細胞の回収に及ぼすより低い（＜５０ｍＭ）有効緩衝剤濃度の影響を調べるために実施された。
【０２０７】
タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、２０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、５０ｍＭ、２５ｍＭ、又は１０ｍＭの緩衝剤濃度と、９．５〜１０の範囲内のｐＨ値と、を有する試薬溶液が得られるように、１００ｍＭ、５０ｍＭ、又は２０ｍＭの緩衝剤濃度と１０のｐＨとで調製された１０ｍＬの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、４０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と６０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌの血液ライシス試薬と３ｍｌの全血サンプルとの混合後、ＳＰＳ濃度は１２．５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ値は９．２〜９．５の範囲内、有効緩衝剤濃度は３１．２５ｍＭ又は１５．６ｍＭ又は６．２５ｍＭであった。プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）細胞を含有する全血サンプル及びスパイク対照は、それぞれ、実施例２及び３の方法に従って調製された。続いて、遠心分離は、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルでは実施例１３に提供される方法に従って実施された。血液ライシス試薬及びスパイク全血サンプルは、対流混合により混合され、続いて遠心分離は、以下の実施例１５に提供される方法に従って実施された。細胞サスペンジョンは、５％ヒツジ血液を含むトリプシン大豆寒天上にプレーティングされ、３７℃で一晩インキュベートされた。
【０２０８】
プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）細胞は、６．２５ｍＭに低下させた有効炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤濃度で十分に回収されたことが、図２３Ａに提示される結果から示される。
【０２０９】
この低い有効炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤濃度がスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）細胞の回収に依然として適切であることを例示するために、６．２５ｍＭ、１５．５ｍＭ、及び３１．２５ｍＭの有効緩衝剤濃度でスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）細胞を用いて以上の実験を繰り返した。結果は図２３Ｂに提示される。観測されるように、有効緩衝剤濃度を減少させるにつれて、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）細胞の回収のわずかな低下が見られる。理論により限定することを意図するものではないが、より低い有効緩衝剤濃度から生じる生成血液−試薬混合物の粘度増加は、沈降速度の低減に起因して微生物細胞の遠心分離の有効性を損ないうる。したがって、有効緩衝剤濃度の減少により微生物細胞の生存能は影響を受けないかもしれないが、遠心分離時の沈降速度が低くなると、いくらかの生存微生物細胞が上清に残留して洗浄操作時に偶発的に除去されるので、生存微生物細胞の回収の低減をもたらしうる。
【０２１０】
タイプ３血液ライシス試薬での生存微生物細胞の回収に及ぼす高全血体積（＞３ｍｌ）の影響の実験研究
本実験は、タイプ３ライシス試薬への暴露後の微生物細胞の回収に及ぼすより大きな（たとえば、＞３ｍｌ、５ｍｌ）全血体積の影響を調べるために実施された。大きなサンプル体積の場合によく遭遇する溶血血液のより高い粘度は、高回収を達成する能力に影響を及ぼしうるという仮説が立てられた。タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、２０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３５ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、０．１５％又は０％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、５０ｍＭの緩衝剤濃度と、９．５〜１０の範囲内のｐＨ値と、を有する試薬溶液が得られるように、ｐＨ１０、１００ｍＭの緩衝剤濃度で調製された炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、１０ｍＬ、４０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と７０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と０．３％又は０％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。５ｍｌの血液ライシス試薬と５ｍｌの全血サンプルとの混合後、ＳＰＳ濃度は１０ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１７．５ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ濃度は０．０７５％又は０％ｗ／ｖ、ｐＨ値は９．２〜９．５の範囲内、及び有効緩衝剤濃度は２５ｍＭであった。
【０２１１】
プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、又はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細胞を含有するスパイク全血サンプル及びスパイクリン酸塩緩衝剤サンプル並びにスパイク対照は、それぞれ、実施例２及び３の方法に従って調製された。続いて、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルで実施例１３に提供される方法に従って遠心分離が実施されたが、例外として５ｍＬの体積のサンプルが使用され、９．９ｍＬの上清が除去された。血液ライシス試薬及びスパイク全血サンプルは、対流混合により混合され、続いて、以下の実施例１５に提供される方法に従って遠心分離が実施されたが、例外として５ｍＬの体積のサンプルが使用された。細胞サスペンジョンは、５％ヒツジ血液を含むトリプシン大豆寒天上にプレーティングされ、３７℃で一晩インキュベートされた。結果は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、及びシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対して、それぞれ、図２３Ｃ、２３Ｄ、及び２３Ｅに提示される。
【０２１２】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）を含有する５ｍｌ全血サンプルを処理する場合、分離後生存微生物細胞の回収は、試験された０〜０．１５％ｗ／ｖの低濃度範囲のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度に有意に依存しないと思われることが、図２３Ｃ及び２３Ｄにより実証される。
【０２１３】
しかしながら、図２３Ｅに観測されるように、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞の回収は、０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の場合に低かった。この観測は、臨床単離物から得られたシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞のさまざまな株を用いて実験を繰り返すことにより検証された。図２３Ｆに提示される結果は、図２３Ｅのように、少量のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在が生存細胞の回収を改善することを示唆する。理論により限定することを意図するものではないが、この低回収は、こうした大きな（５ｍＬ）全血サンプルサイズでの溶血血液の高い観測粘度から生じると考えられる。特定的には、微生物細胞の生存能は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が不在のときにライシス試薬との接触により有意に損なわれることはないが、得られる血液−試薬混合物の高粘度は、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞の有効遠心分離を妨害するので、本実験で調べられた他の細菌種よりも無効遠心分離を受けやすいのではないかと考えられる。それにもかかわらず、たとえ低濃度（０．１５％ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（すなわち、図２２Ｃで観測される回収損失を回避するのに十分な程度に低い濃度）の添加であっても、粘度を有意に低減しシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の高生存細胞回収を可能にするのに十分であることが、図２３Ｅに示される結果から実証される。
【０２１４】
高体積の全血を含む他の一例では、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞の回収に及ぼす遠心分離時間の影響が調べられた。５ｍＬの体積のタイプ３血液ライシス試薬及び５ｍＬの全血サンプルは、実施例１５の方法を用いて対流混合された。得られた混合物は、１７．５ｍｇ／ｍＬのサポニン濃度と、１０ｍｇ／ｍＬのＳＰＳ濃度と、０．０７５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度と、９．２〜９．５の範囲内のｐＨ値と、２５ｍＭの有効緩衝剤濃度と、を有していた（最終混合物で）。第１の沈降工程時、５、１０、及び１５分間の３つの異なる遠心分離時間が利用された。しかしながら、後続洗浄操作時の遠心分離時間は、２分間に維持された。シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞を含有するスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルもまた、実施例３の方法に従って調製された。続いて、スパイク対照としてのスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルで実施例１３に提供される方法に従って遠心分離が実施されたが、例外として５ｍＬの体積のサンプルが使用され、９．９ｍＬの上清が除去された。回収サスペンジョンをプレーティングした後の寒天プレートの写真は、図２３Ｇに提示される。３つの遠心分離時間に対応する回収は、それぞれ、３９％、８３％、及び８８％であった。図２３Ｅ（及び図２３Ｆ）に見られる生存能の見掛けの低減は、粘度の増加がひいては沈降速度の減少を引き起こすことに起因する遠心分離時の回収損失が主な原因でありうるという仮説は、これらの結果から支持される。図２３Ｇに示される結果によれば、全血サンプルとタイプ３血液ライシス緩衝剤との接触後の遠心分離を介する生存シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞の回収は、遠心分離時間の増加により（及び／又は遠心力の増加により、たとえば、回転速度及び／又はラジアル分離の増加を介して）増加させうる。
【０２１５】
以上に提示される結果を考慮して、タイプ３ライシス試薬への暴露後の生存微生物細胞の自動分離を含むいくつかの用途では、とくにおおよそ５ｍｌ以上の体積を有する全血の処理の場合には、多種多様な微生物種で生存微生物細胞の自動分離を促進するために、微生物細胞生存能（タイプ３血液ライシス試薬への暴露後）と、残留デブリの十分な消化と、粘度と、のバランスのとれたタイプ３ライシス試薬組成物が選択されうる。
【０２１６】
分離微生物細胞の後続成長を介して形成されるコロニーは、下流診断試験に使用されうることに留意されたい。たとえば、図２３Ｃ、２３Ｄ、及び２３Ｅに示されるコロニーは、実施例１６に記載の方法に従ってマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）により試験された。３つのすべての種の細菌細胞は、９９．９％の信頼レベルでＭＡＬＤＩを介して同定された。
【０２１７】
先行結果は、全血サンプルからの生存微生物細胞の抽出の成功を実証したが、タイプ３血液ライシス試薬を含む本明細書に記載の方法例及び組成物例は、多種多様なサンプルタイプに拡張されうることが理解されよう。たとえば、タイプ３血液ライシス試薬は、陽性血液培養サンプルなどの血液培養サンプルからの生存微生物細胞の抽出に利用されうる。それゆえ、タイプ３血液ライシス試薬は、継代培養を必要とすることなく血液培養サンプルからの表現型抗微生物剤感受性試験の直接実施を促進するために利用可能である。
【０２１８】
生存微生物細胞抽出並びに後続の微生物同定及び抗微生物剤感受性試験のためのタイプ３血液ライシス試薬による陽性血液培養サンプル処理の実験実証
陽性血液培養サンプルの処理により得られる細胞サスペンジョンは、微生物細胞のアイデンティティー及び抗微生物剤感受性の一方又は両方の決定に好適な試験などの下流（後続）試験に付されうる。限定されるものではないが、血液培養サンプルから分離された生存微生物細胞で後続試験（アッセイ）を実施する例を例示するために、タイプ３血液ライシス試薬との接触を介して陽性血液培養サンプルを処理し、続いて遠心分離を実施し、そして成長ベース微生物同定（ＩＤ）、抗微生物剤感受性（ＡＳＴ）、又はＶＩＴＥＫ（登録商標）ＭＳ機器によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ同定のために、得られた生存微生物細胞サスペンジョンをＶＩＴＥＫ（登録商標）２により試験した。
【０２１９】
タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、３７．５ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、１００ｍＭの緩衝剤濃度と、９．５〜１０の範囲内のｐＨ値と、を有する試薬溶液が得られるように、ｐＨ１０、２００ｍＭの緩衝剤濃度で調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と７５ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。１ｍｌの血液ライシス試薬と１ｍｌの陽性血液培養サンプルとを混合した後、ＳＰＳ濃度は７．５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は１８．７５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ値は９．２〜９．５の範囲内、及び有効緩衝剤濃度は５０ｍＭであった。
【０２２０】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）でスパイクされた陽性血液培養サンプルは、実施例１０の方法に従って調製された。続いて、遠心分離は、陽性血液培養サンプルで以下の実施例１２に提供される方法に従って実施された。サスペンジョン中の微生物細胞は、実施例１６に記載の方法としてＭＡＬＤＩ（ＶＩＴＥＫ−ＭＳ−ＩＤ）と、実施例１７に記載の方法として代謝ベース同定（ＶＩＴＥＫ２−ＩＤ）及びブロスマイクロ希釈ベース抗生物質感受性試験（ＶＩＴＥＫ２−ＡＳＴ）と、により、微生物細胞同定のために試験された。いずれの場合も、参照陽性対照もまた、実施例１２に記載されるように陽性血液培養物の直接プレーティングから得られるコロニー成長を用いて実施例１６及び１７により試験された。
【０２２１】
結果は、図２４Ａ〜２４Ｄに提示されており、遠心分離微生物細胞の直接処理に基づいて得られた結果と陽性対照コロニーを用いて得られた結果との間の非常に高い一致を実証する。４つすべての微生物細胞のＭＡＬＤＩ同定結果は、４つすべての微生物細胞種にわたり１００％適正ＩＤ及び９９．４％超の同定信頼度で非常に高い一致であった。同様に、４つすべての微生物細胞のＶＩＴＥＫ２システムの代謝同定結果は、４つすべての微生物細胞種にわたり１００％適正ＩＤ及び９５％超の同定確率で非常に高い一致であった。ＶＩＴＥＫ２システム（継代培養の不在下での陽性血液培養物からの直接ＡＳＴに基づく）を用いたＡＳＴ結果もまた、４つすべての微生物細胞種にわたり少なくとも９４％Ｓ／Ｉ／Ｒカテゴリー一致で陽性対照コロニーを用いて得られた結果との優れた一致を実証した。したがって、これらの結果は、陽性血液培養物からのＩＤ及びＡＳＴでこうした直接法例と従来のコロニーベース法例との間の強い臨床的同等性を示唆する。
【０２２２】
生存微生物細胞回収並びに後続の微生物同定及び抗微生物剤感受性試験のためのタイプ３血液ライシス試薬による全血サンプル処理の実験実証
全血から回収され続いて固相成長培地上でコロニー形成された生存細胞は、微生物細胞のアイデンティティー及び抗微生物剤感受性の決定の一方又は両方に好適な試験などの下流（後続）試験に付されうる。限定されるものではないが、全血サンプルから回収された生存微生物細胞で後続試験（アッセイ）を実施する例を例示するために、（ｉ）８種のグラム陽性細菌、（ｉｉ）８種のグラム陰性細菌、及び（ｉｉｉ）４種の真菌の各々を３株ずつ（２つのＡＴＣＣ株及び１つの臨床単離物）用いて多種多様な細菌種及び真菌種の低濃度スパイク全血サンプルを調製した。スパイク全血サンプルとタイプ３血液ライシス試薬とを混合し、サスペンジョン状態で生存細胞を回収するために遠心分離を実施した。回収細胞サスペンジョンを固相成長培地上に接種し、コロニー成長形成のためにインキュベートした。成長ベース微生物同定（ＩＤ）及び抗微生物剤感受性（ＡＳＴ）又はＶＩＴＥＫ（登録商標）ＭＳ機器によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ同定のために、得られたコロニーをＶＩＴＥＫ（登録商標）２により試験した。
【０２２３】
タイプ３血液ライシス試薬溶液は、２０ｍｌの体積と、１５ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と、７５ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度と、５０ｍＭの緩衝剤濃度と、９．５〜１０の範囲内のｐＨ値と、を有する試薬溶液が得られるように、ｐＨ１０、１００ｍＭの緩衝剤濃度で調製された１０ｍｌの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤溶液と、３０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳ濃度と１５０ｍｇ／ｍｌのサポニン濃度とを有する１０ｍｌの溶液と、を組み合わせることにより調製された。４ｍｌの血液ライシス試薬と４ｍｌの全血サンプルとの混合後、ＳＰＳ濃度は７．５ｍｇ／ｍＬ、サポニン濃度は３７．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ値は９．２〜９５の範囲内、及び有効緩衝剤濃度は２５ｍＭであった。
【０２２４】
微生物細胞のそれぞれの株を含有する４ｍｌの体積のスパイク全血サンプルは、１０ＣＦＵ／ｍＬの公称濃度で以下の実施例２に従って調製された。続いて、遠心分離は、実施例１４に提供される方法に従って実施されたが、例外として４ｍＬの体積のスパイク全血サンプル及び血液ライシス試薬が使用された。細胞サスペンジョンは、５％ヒツジ血液を含むトリプシン大豆寒天上にプレーティングされ、それぞれの種で実施例１４に記載のようにインキュベートされた。スパイク対照として、スパイク全血サンプルで使用したのと同一の濃度及び体積の細胞アリコートが、５％ヒツジ血液を含むトリプシン大豆寒天上に直接接種され、実施例１４に記載のようにインキュベートされた。可視コロニーが形成されたら、コロニー数がカウントされ、スパイク全血回収対スパイク対照のコロニー数を比較することにより生存細胞回収のパーセントが計算された。スパイク全血サンプルから得られたコロニーは、実施例１６に記載の方法に従ってＭＡＬＤＩによる微生物細胞同定（ＶＩＴＥＫ−ＭＳ−ＩＤ）並びに実施例１７に記載の方法に従って代謝ベース同定（ＶＩＴＥＫ２−ＩＤ）及びブロスマイクロ希釈ベース抗生物質感受性試験（ＶＩＴＥＫ２−ＡＳＴ）で試験された。いずれの場合も、参照陽性対照もまた、それぞれのスパイク対照から得られたコロニー成長を用いて実施例１６及び１７により試験された。
【０２２５】
生存細胞回収並びにＩＤ及びＡＳＴアッセイの結果は、それぞれ、２４株のグラム陽性細菌、２４株のグラム陰性細菌、及び１２株の真菌に対して図２５にまとめられる。回収結果は、低（＜１０ＣＦＵ／ｍｌ）接種ですべての病原体型にわたり非常に高い平均生存病原体回収（＞９０％）を実証する。ＭＡＬＤＩ同定アッセイは、すべての病原体型にわたり１００％適正同定を達成した。ＶＩＴＥＫ２同定（代謝）アッセイもまた、すべての病原体型にわたり１００％適正同定を達成した。ＡＳＴアッセイは、すべての病原体型にわたり＞９７％Ｓ／Ｉ／Ｒカテゴリー一致を達成した。これらの結果は、低（臨床関連）力価で全血から生存微生物細胞の効率的回収を行うためのタイプ３血液ライシス試薬の実現可能性と、血液培養から分離された生存微生物細胞に基づいて同定及び抗微生物剤感受性アッセイを実施するためのタイプ３血液ライシス試薬の好適性と、を実証する。
【０２２６】
以上に提供された例を考慮して、分離の際に微生物細胞の生存能を保持する血液ライシス試薬の多種多様な組成例と、血液細胞及び／又は他の真核細胞の選択的ライシス並びに生存微生物細胞の抽出を実施する方法と、が以下に開示される。一実施形態例では、サンプル中の１つ以上の微生物細胞の生存能を保存しつつ、全血サンプルなどのサンプル中の血液細胞及び／又は他の真核細胞の選択的ライシスを実施する方法は、サンプルと、サポニンとＳＰＳとアルカリ性緩衝剤と非イオン性界面活性剤とを含有する血液ライシス試薬と、を接触させることと、サンプルと血液ライシス試薬とを混合することと、サンプル中の血液及び／又は真核細胞のライシスを達成する十分な時間にわたり混合物をインキュベートすることと、生存微生物細胞を分離することと、により、実施されうる。
【０２２７】
いくつかのグラム陰性細菌種、たとえば、限定されるものではないが、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、及びアシネトバクター・バウマンニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）の傷害に起因する回収損失を許容可能なとき、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬とサンプルとを混合した後、サポニン濃度が１００ｍｇ／ｍｌまで可能、ＳＰＳの濃度が５０ｍｇ／ｍｌまで可能、非イオン性界面活性剤の濃度が３％ｗ／ｖまで、有効緩衝剤濃度が３００ｍＭまで可能、且つ最終混合物のｐＨが１０．５まで可能であるような組成を有しうる。しかしながら、グラム陰性細菌細胞は、より高濃度の非イオン性界面活性剤、より高い緩衝剤濃度、及び最終混合物ｐＨに対して感受性を有しうる。いくつかの実現形態では、混合物の粘度が高すぎて及び血液細胞デブリからの残渣が多すぎて沈降プロセスに悪影響を及ぼしたり流体カートリッジの流体チャネル中の中間流体のフローを妨害したりしないという制約の下で、これらの量を明記された上限範囲未満に維持することが有益でありうる。
【０２２８】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬とサンプルとを混合した後のサポニン濃度が３〜６０ｍｇ／ｍｌにあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中のサポニン濃度は、１０〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲内でありうる。サポニンの好適な濃度は、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時に生存能の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物のｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度、並びにサンプルのタイプ及びサンプルの量に依存して変化しうることが理解されよう。好適なサポニン濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞生存能に及ぼすサポニン濃度の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０２２９】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬とサンプルとを混合した後のＳＰＳ濃度が１．５〜５０ｍｇ／ｍｌにあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中のＳＰＳ濃度は、５〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内でありうる。ＳＰＳの好適な濃度は、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時に生存能の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物のｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度、並びにサンプルのタイプ及びサンプルの量に依存して変化しうることが理解されよう。好適なＳＰＳ濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞生存能に及ぼすＳＰＳ濃度の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０２３０】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬とサンプルとを混合した後の非イオン性界面活性剤濃度が０〜３％ｗ／ｖにあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中の非イオン性界面活性剤の濃度は、０．５〜２％の範囲内でありうる。非イオン性界面活性剤の好適な濃度は、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時に生存能の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物のｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度、サンプルのタイプ及びサンプルの量に依存して変化しうることが理解されよう。好適な非イオン性界面活性剤濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞生存能に及ぼす非イオン性界面活性剤濃度の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０２３１】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬とサンプルとを混合した後のｐＨが７．８〜１０の範囲内にあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物のｐＨは、８．２〜９．５の範囲内でありうる。他の実施形態例では、最終混合物のｐＨは、１０、９．９、９．８、９．７、９．６、又は９．５の上限ｐＨ値により境界付けられる、且つ８．０、８．２、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、及び９．０の下限ｐＨ値により境界付けられる、範囲内にありうる。いくつかの実施形態例では、緩衝剤濃度は、有効緩衝剤濃度が１０〜３００ｍＭの範囲内にあるように選択されうる。他の実施形態例では、緩衝剤濃度は、有効緩衝剤濃度が３０〜１００ｍＭの範囲内にあるように選択されうる。
【０２３２】
好適なｐＨは、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時に生存能の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物の有効緩衝剤濃度、サンプルとの混合前の血液ライシス試薬の初期ｐＨ、サンプルのタイプ及びサンプルの量に依存して変化しうることが理解されよう。
【０２３３】
いくつかの実施形態例では、血液ライシス試薬は、９〜１１（又はたとえば９．５〜１０．５）のｐＨを有しうるとともに、緩衝剤濃度（又は緩衝剤能）は、血液ライシス試薬とサンプルとの混合後のｐＨが、１０未満、９．９未満、９．８未満、９．７未満、９．６未満、又は９．５未満、且つ８．２超、８．４超、８．５超、８．６超、８．７超、８．８超、８．９超、又は９．０超の最終ｐＨに減少するように選択されうる。理論により限定することを意図するものではないが、９〜１１の範囲内の初期ｐＨは、血液細胞の効率的消化を実施するのに有益でありうるとはいえ、かかる高ｐＨが血液細胞のライシス後に維持されると、得られる高ｐＨは、いくつかの微生物細胞（たとえば、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）など）の生存能に悪影響を及ぼす可能性があると、本発明者らは推測する。
【０２３４】
好適な最終ｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞生存能に及ぼすｐＨ及び／又は緩衝剤濃度範囲の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０２３５】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、水中油型乳化剤として適切な非イオン性界面活性剤を含有するポリジメチルシロキサンのエマルジョンを含む消泡剤をさらに含みうるとともに、血液ライシス試薬とサンプルとを混合した後の消泡剤エマルジョンの濃度が０．００５〜０．５％（ｖ／ｗ）の範囲内にあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中の消泡剤エマルジョンの濃度は、０．０１〜０．０５％の範囲内でありうる。消泡剤の好適な濃度は、限定されるものではないが、血液ライシス試薬の他の成分の濃度、サンプルのタイプ、サンプルの量などの１つ以上の因子に依存して変化しうることが理解されよう。好適な消泡剤の組成及び濃度は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、混合及び／又は分離プロセスを含む自動操作時に発生する泡の量並びに流体の送達に必要な圧力に及ぼす消泡剤の濃度及び組成の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の条件セットに対して決定可能であることが理解されよう。
【０２３６】
一実施形態例では、サンプル中の１つ以上の微生物細胞の生存能を保存しつつ、サンプル中の血液細胞及び／又は他の真核細胞の選択的ライシスを実施する方法は、サンプルと、サポニンとＳＰＳとアルカリ性緩衝剤とを含有する血液ライシス試薬と、を接触させることと（たとえば、濃度例及びｐＨ例は、以上の範囲例に従う）、サンプルと血液ライシス試薬とを混合することと、微生物細胞を分離することと、により実施されうる。非イオン性界面活性剤が含まれることは多くの用途に有益であるが、残留デブリの存在の影響を受けにくい用途や下流の分子増幅を含まない用途などのいくつかの用途では、選択的ライシスを達成するのに必要ではない。
【０２３７】
一実施形態例では、サンプル中の１つ以上の微生物細胞の生存能を保存しつつ、サンプル中の血液細胞及び／又は他の真核細胞の選択的ライシスを実施する方法は、サンプルと、サポニンとアルカリ性緩衝剤とを含有する血液ライシス試薬と、を接触させることと（たとえば、濃度例及びｐＨ例は、以上の範囲例に従う）、サンプルと血液ライシス試薬とを混合することと、微生物細胞を分離することと、により実施されうる。非イオン性界面活性剤及びＳＰＳが含まれることは多くの用途に有益であるが、これらの成分は、残留デブリの存在の影響を受けにくい用途や下流の分子増幅を含まない用途などのいくつかの用途では、選択的ライシスを達成するのに必要ではない。
【０２３８】
次に、生存微生物細胞の抽出のために、陽性血液培養サンプルや中間培養サンプルなどの血液培養サンプルの処理に対して、例及び限定されるものではないが組成範囲を以下に提供する。以下の濃度範囲例は、固相成長培地上でのコロニー成長、ブロスマイクロ希釈ベース抗微生物剤感受性試験を促進するうえでの好適性に基づいて決定されたが、以下に提供される濃度範囲及びその変化形態は、生存微生物細胞を利用する他のプロセスを実施するときに血液細胞ライシスを実施するために利用されうることが理解されよう。
【０２３９】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬と血液培養サンプルとを混合した後のサポニン濃度が０．７５〜６０ｍｇ／ｍｌにあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中のサポニン濃度は、２．５〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲内でありうる。サポニンの好適な濃度は、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時にインタクト性の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物のｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度、並びに血液培養サンプル中の微生物細胞の濃度に依存して変化しうることが理解されよう。好適なサポニン濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞インタクト性に及ぼすサポニン濃度の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０２４０】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬と血液培養サンプルとを混合した後のＳＰＳの濃度が０．３５〜５０ｍｇ／ｍｌの間にあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中のＳＰＳ濃度は、１．２５〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内でありうる。ＳＰＳの好適な濃度は、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時にインタクト性の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物のｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度、並びに血液培養サンプル中の微生物細胞の濃度に依存して変化しうることが理解されよう。好適なＳＰＳ濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞インタクト性に及ぼすＳＰＳ濃度の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０２４１】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬と血液培養サンプルとを混合した後の非イオン性界面活性剤の濃度が０〜３％ｗ／ｖの範囲内にあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中の非イオン性界面活性剤の濃度は、０〜２％の範囲内でありうる。非イオン性界面活性剤の好適な濃度は、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時にインタクト性の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物のｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度、並びに血液培養サンプル中の微生物細胞の濃度に依存して変化しうることが理解されよう。好適な非イオン性界面活性剤濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞インタクト性に及ぼす非イオン性界面活性剤濃度の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０２４２】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、血液ライシス試薬と血液培養サンプルとを混合した後のｐＨが７．８〜１０の範囲内にあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物のｐＨは、８．２〜９．５の範囲内でありうる。他の実施形態例では、最終混合物のｐＨは、１０、９．９、９．８、９．７、９．６、又は９．５の上限ｐＨ値により境界付けられる、且つ８．０、８．２、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、及び９．０の下限ｐＨ値により境界付けられる、範囲内にありうる。いくつかの実施形態例では、緩衝剤濃度は、有効緩衝剤濃度が２．５〜３００ｍＭの範囲内にあるように選択されうる。他の実施形態例では、緩衝剤濃度は、有効緩衝剤濃度が５〜１００ｍＭの範囲内にあるように選択されうる。
【０２４３】
好適なｐＨは、１つ以上の因子、たとえば、限定されるものではないが、分離時にインタクト性の保存が望まれる微生物細胞のタイプ、最終混合物の有効緩衝剤濃度、血液培養サンプルとの混合前の血液ライシス試薬の初期ｐＨ、血液培養サンプル中の微生物細胞の濃度に依存して変化しうることが理解されよう。
【０２４４】
いくつかの実施形態例では、血液ライシス試薬は、９〜１１（又はたとえば９．５〜１０．５）のｐＨを有しうるとともに、緩衝剤濃度（又は緩衝剤能）は、血液ライシス試薬と血液培養サンプルとの混合後のｐＨが、１０未満、９．９未満、９．８未満、９．７未満、９．６未満、又は９．５未満、且つ８．２超、８．４超、８．５超、８．６超、８．７超、８．８超、８．９超の、又は９．０超の最終ｐＨに減少するように選択されうる。理論により限定することを意図するものではないが、９〜１１の範囲内の初期ｐＨは、血液細胞の効率的消化を実施するのに有益でありうるとはいえ、かかる高ｐＨが血液細胞のライシス後に維持されると、得られる高ｐＨは、いくつかの微生物細胞（たとえば、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）など）のインタクト性に悪影響を及ぼす可能性があると、本発明者らは推測する。
【０２４５】
好適な最終ｐＨ及び／又は有効緩衝剤濃度範囲は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、血液ライシス効率、残留血液細胞デブリの量、及び微生物細胞インタクト性に及ぼすｐＨ及び／又は緩衝剤濃度範囲の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の設定条件に対して決定可能であることが理解されよう。
【０２４６】
一実施形態例では、血液ライシス試薬は、水中油型乳化剤として適切な非イオン性界面活性剤を含有するポリジメチルシロキサンのエマルジョンを含む消泡剤をさらに含みうるとともに、血液ライシス試薬と血液培養サンプルとを混合した後の消泡剤エマルジョンの濃度が０．００５〜０．５％（ｖ／ｗ）の範囲内にあるような組成を有しうる。他の実施形態例では、最終混合物中の消泡剤エマルジョンの濃度は、０．０１〜０．０５％の範囲内でありうる。消泡剤の好適な濃度は、限定されるものではないが、血液ライシス試薬の他の成分の濃度、血液培養サンプル中の微生物細胞の濃度などの１つ以上の因子に依存して変化しうることが理解されよう。好適な消泡剤の組成及び濃度は、１つ以上の性能メトリック、たとえば、限定されるものではないが、混合及び／又は分離プロセスを含む自動操作時に発生する泡の量並びに流体の送達に必要な圧力に及ぼす消泡剤の濃度及び組成の影響を調べるために、本明細書に記載の実験方法に従って、所与の条件セットに対して決定可能であることが理解されよう。
【０２４７】
生存及び／又はインタクト微生物細胞の分離を含むタイプ３ライシス試薬の適用例
以上の実施形態例は、血液細胞の選択的ライシスのためにサンプル（たとえば、全血サンプルや血液培養サンプルなどの血液サンプル）とタイプ３血液ライシス試薬とを接触させることと、分離方法、たとえば、限定されるものではないが、遠心分離、濾過、免疫磁気分離、及びマイクロ流体分離を用いた微生物細胞の後続分離と、により生存及び／又はインタクト微生物細胞のサスペンジョンを得た後のタイプ３ライシス試薬の使用のいくつか適用例を例示した。分離微生物細胞の後続処理に関して以上に記載した適用例は、分子増幅アッセイ（微生物細胞のライシスを実施した後）と、生存分離細胞で実施される代謝同定アッセイと、分離生存及び／又はインタクト微生物細胞でのＭＡＬＤＩアッセイと、生存分離細胞で実施される表現型成長ベース抗微生物剤感受性試験アッセイと、を含む。これらの適用例は、アルカリ性溶液中にサポニンとＳＰＳとを含むタイプ３血液ライシス試薬による血液細胞のライシス後の分離微生物細胞の処理を含む可能な用途のサブセットを例示するために提供されることが理解されよう。
【０２４８】
本明細書に記載の適用例は、手動法、半自動法、又は全自動法に従って実施されうることが理解されよう。各種用途向けの半自動及び自動のシステム、デバイス、及び方法の具体例が以下に提供される。
【０２４９】
いくつかの実施形態例では、全自動且つ閉環境で微生物細胞分離及び後続処理を実施するためにインテグレートカートリッジが利用されうる。たとえば、図３Ａ〜３Ｃ又はその変化形態に例示されるように、サンプルとタイプ３血液ライシス試薬との接触と、精製細胞サスペンジョンを得るための微生物細胞の分離と、後続のサンプル調製及びアッセイ工程（たとえば、電気的ライシス及び逆転写ＰＣＲ）の実施と、を含むサンプルの全自動処理のためにインテグレートカートリッジが利用されうる。
【０２５０】
他の一実現形態例では、サンプルからの微生物細胞の自動分離及び濃縮を実施して、分離微生物細胞の外部移送後の後続アッセイ、たとえば、限定されるものではないが、分子同定アッセイ、ＭＡＬＤＩ同定アッセイ、及び成長ベースアッセイたとえば表現型抗微生物剤感受性試験に好適に利用可能な精製微生物細胞サスペンジョンを生成するために、図３Ａ〜３Ｃ（又はその変化形態）に示されるカートリッジなどのカートリッジが利用されうる。
【０２５１】
たとえば、図３Ａ〜３Ｃを参照すると、マイクロ流体デバイス６９９内に位置決めされた抽出チャンバーに流体連通するシールポートは、マイクロ流体デバイス６９９に組み込まれうる。抽出チャンバーは、チャネル５１６及びバルブ５１９を介して遠心分離チャンバー５０１に流体連通しうる。バルブ５１９を開けた後、分離細胞サスペンジョンは、抽出チャンバーに移送されうるとともに、そこでシールを破壊した後、手動又はロボットにより抜き取られうる（たとえば、ピペッター又はシリンジを介して）。他の一実現形態例では、遠心分離チャンバー５０２の上方に取外し可能キャップを形成して後続処理のために微生物細胞サスペンジョンのロボット又は手動取出しを可能にしうる。図３Ａ〜３Ｃに示されるインテグレートカートリッジ例は、分離を実施するために自動遠心分離を利用するが、かかるインテグレートカートリッジは、代替分離モダリティー、たとえば、限定されるものではないが、濾過、免疫磁気分離、及びマイクロ流体ベース分離を含むように改造されうることが理解されよう。
【０２５２】
いくつかの実施形態例では、初期サンプルと比べて精製された微生物細胞のサスペンジョンを得た後、得られた微生物細胞のサスペンジョンは、分離微生物細胞を培養するために成長培地（たとえば、固相又は液相）に接触可能である。かかる方法は、初期サンプル中に存在しうる抗生物質濃度の低減に有益でありうるので、有意に低減された（たとえば、１／１０、１／１０２、１／１０３、１／１０４、又はそれ以下に低減された）抗生物質濃度で分離微生物細胞の後続培養が可能となり、分離なしで達成可能と思われるものと比べて改善された成長速度及び／又は陽性率を達成できる可能性がある。
【０２５３】
一実現形態例では、分離生存微生物細胞を得た後、分離生存微生物細胞は、固相成長培地に接触され（たとえば、その上に又はそれを覆うように分散され）、微生物細胞成長の促進に好適な環境でインキュベートされうる。固相成長培地の例としては、限定されるものではないが、従来の寒天、ゼラチン、グアーガム、キサンタンガムが挙げられる。いくつかの実現形態例では、固相成長培地は、微生物細胞のタイプに応じた色素原性でありうる。いくつかの実施形態では、たとえば、欧州特許出願公開第１０８８８９６Ａ２号明細書に記載されているように、コロニーの特異的染色又は非特異的染色により微生物を同定するために、色素原性基質又はフルオロゲン基質が寒天培地に添加されうる。
【０２５４】
分離微生物細胞からのコロニーの直接形成を含む本実施形態例は、手動法、半自動法、又は全自動法で実施されうることが理解されよう。たとえば、いくつかの実現形態例では、微生物細胞は、図３Ａ〜３Ｃ又はその変化形態に示されるカートリッジなどの自動インテグレートカートリッジ内で分離され、続いて手動又はロボットにより移送され、固相成長培地に接触されうる。代替実現形態例では、プロセスは、閉インテグレートカートリッジ内で全自動化されうるとともに、このことは、固相成長培地に分離微生物細胞を移送するときに汚染物の導入を回避するうえで有益でありうる。
【０２５５】
以下の実施例は、当業者が本開示の実施形態を理解して実践できるようにするために提供される。それらは、本開示の範囲を限定するものとみなされるべきではなく、単にその例示及び代表であるにすぎない。
【実施例】
【０２５６】
実施例１：  微生物細胞培養物の調製
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）及びストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を除くグラム陽性細菌の細胞培養物は、以下のように調製された。
１．  ３０μＬのそれぞれの細菌種及び株のグリセロールストックを３ｍＬのトリプシンダイズブロス（ＴＳＢ）に接種し、１５０ｒｐｍでシェイクしながら３７℃で一晩インキュベートした。
２．  ＴＳＢ中１０倍希釈培養物を３７℃で１時間（エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、及びストレプトコッカス・アガラクティア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａ））又は２時間（スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔｒａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ））インキュベートした。
【０２５７】
シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を除くグラム陰性細菌の細胞培養物は、以下のように調製された。
１．  ３０μＬのそれぞれの細菌種及び株のグリセロールストックを３ｍＬのＴＳＢに接種し、１５０ｒｐｍでシェイクしながら３７℃で一晩インキュベートした。
２．  ＴＳＢ中１０倍希釈培養物を３７℃で１時間（アシネトバクター・バウマンニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、エンテロバクター・クロアケ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）複合体、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ））又は２時間（セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ））インキュベートした。
【０２５８】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）細胞培養物は、以下のように調製された。
３０μＬのそれぞれの株グリセロールストックを３ｍＬのＴＳＢに接種し、１５０ｒｐｍでシェイクしながら３７℃で３時間インキュベートした。
【０２５９】
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細胞培養物は、以下のように調製された。
３０μＬのそれぞれの種又は株のグリセロールストックを３ｍＬのＴＳＢに接種し、ＣＯ２発生パウチの存在下、８０ｒｐｍでシェイクしながら３７℃で３時間インキュベートした。
【０２６０】
シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）：
１．  ５％ヒツジ血液を含むトリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）プレート上に６μＬのシュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株グリセロールストックをストリークし、３７℃で一晩インキュベートした（Ｐ１）。
２．  寒天プレート上に細菌コロニーをもう１回継代培養した（Ｐ２）。
３．  プレートからの１つのコロニーを３ｍｌのＴＳＢに接種し、１５０ｒｐｍでシェイクしながらで３７℃で３時間インキュベートした。
【０２６１】
真菌細胞培養物は以下のように調製された。
１．  ３０μＬのそれぞれの真菌種及び株のグリセロールストックを３ｍＬのＴＳＢに接種し、１５０ｒｐｍでシェイクしながら３０℃で一晩インキュベートした。
２．  ＴＳＢ中１０倍希釈培養物を３０℃で２時間インキュベートした（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、及びカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））。
【０２６２】
ＯＤ測定に基づいて、それぞれの細菌の段階希釈物を１０３ＣＦＵ／ｍＬの公称濃度でＴＳＢで調製した。
【０２６３】
実施例２：  スパイク全血サンプルの調製
５〜８ｍＬの体積の血液サンプルを健常者からＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＳＰＳチューブ中に吸引した。細菌細胞でスパイクする前に平均４時間にわたりチューブを室温で保持した。次いで、約１０３ＣＦＵのそれぞれの細菌細胞を有する５０μＬの細菌細胞サスペンジョンストックを５ｍＬの血液に添加し、穏やかなボルテクシングにより混合した。そのため、微生物細胞の濃度は、公称で約１０ＣＦＵ／ｍＬである。
【０２６４】
実施例３：  スパイクリン酸塩緩衝剤サンプルの調製
約１０３ＣＦＵのそれぞれの細菌細胞を有する５０μＬの細菌細胞サスペンジョンストックを５ｍＬの１ｍＭリン酸塩緩衝剤（ＰＢ）に添加し、穏やかなボルテクシングにより混合した。そのため、微生物細胞の濃度は、公称で約１０ＣＦＵ／ｍＬである。
【０２６５】
実施例４：  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイスパイク対照用の血液ライシス試薬不在下の１ｍＬスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルのサンプル調製
サンプル調製は、以下のようにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲスパイク対照用に実施された。
１．  １５ｍｌ遠心分離機チューブ中で１ｍｌのスパイクリン酸塩緩衝剤と１ｍｌのＰＢとを混合した。
２．  遠心分離機チューブを１分間ボルテックスした。
３．  遠心分離機チューブを４０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
４．  １．９ｍｌの上清を除去した。
５．  ４回の洗浄サイクルを実施し、各洗浄サイクル時、０．９ｍｌのＰＢ（洗浄緩衝剤）を添加し、穏やかなボルテクシングにより溶液を１０秒間混合し、遠心分離を４０００ｒｐｍで３分間実施し、１００μｌの残留液体が保持されるように０．９ｍｌの上清を抜き取って廃棄した。
６．  得られた細胞サスペンジョンを９５℃で１０分間熱ライシスに付した。
７．  １μｌの熱ライセートと３μｌのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲマスターミックスと１μｌの標的特異的プライマーセットとを混合することによりＲＴ−ＰＣＲ反応の準備を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｅｃｏシステムサーマルサイクラー上でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイに付した。
【０２６６】
実施例５：  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイのための血液ライシス試薬成分に接触させた１ｍＬスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルのサンプル調製
サンプル調製は、以下のようにスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルで実施された。
１．  １５ｍｌ遠心分離機チューブ中で１ｍｌのスパイクリン酸塩緩衝剤と１ｍｌの血液ライシス試薬（又は血液ライシス試薬成分のサブセット）とを混合した。
２．  遠心分離機チューブを１分間ボルテックスした。
３．  遠心分離機チューブを４０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
４．  １．９ｍｌの上清を除去した。
５．  ４回の洗浄サイクルを実施し、各洗浄サイクル時、０．９ｍｌの洗浄緩衝剤を添加し、穏やかなボルテクシングにより溶液を１０秒間混合し、遠心分離を４０００ｒｐｍで３分間実施し、１００μｌの残留液体が保持されるように０．９ｍｌの上清を抜き取って廃棄した。
６．  得られた細胞サスペンジョンを９５℃で１０分間熱ライシスに付した。
７．  １μｌの熱ライセートと３μｌのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲマスターミックスと１μｌの標的特異的プライマーセットとを混合することによりＲＴ−ＰＣＲ反応の準備を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｅｃｏシステムサーマルサイクラー上でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイに付した。
【０２６７】
実施例６：  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイスパイク対照用の血液ライシス試薬不在下の３ｍＬスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルのサンプル調製
サンプル調製は、以下のようにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲスパイク対照用に実施された。
１．  １５ｍｌ遠心分離機チューブ中で３ｍｌのスパイクリン酸塩緩衝剤と５ｍｌのＰＢとを混合した。
２．  最高スピードのボルテクサーで１分間ボルテックスすることにより遠心分離機チューブを混合した。
３．  遠心分離機チューブを４０００ｒｐｍで８分間遠心分離した。
４．  ７．９ｍｌの上清を除去した。
５．  ４回の洗浄サイクルを実施し、各洗浄サイクル時、０．９ｍｌの洗浄緩衝剤を添加し、穏やかにボルテックスすることにより溶液を混合し、遠心分離を４０００ｒｐｍで３分間実施し、１００μｌの残留液体が保持されるように０．９ｍｌの上清を抜き取って廃棄した。
６．  得られた細胞サスペンジョンを９５℃で１０分間熱ライシスに付した。
７．  １μｌの熱ライセートと３μｌのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲマスターミックスと１μｌの標的特異的プライマーセットとを混合することによりＲＴ−ＰＣＲ反応の準備を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｅｃｏシステムサーマルサイクラー上でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイに付した。
【０２６８】
実施例７：  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイのための３ｍＬスパイク全血サンプルのサンプル調製
サンプル調製は、以下のようにスパイク全血サンプル用に実施された。
１．  １５ｍＬ遠心分離機チューブ中で５ｍｌの血液ライシス試薬を３ｍｌのサンプルに添加した。
２．  最高スピードのボルテクサーで１分間ボルテックスすることにより遠心分離機チューブを混合した。
３．  遠心分離機チューブを４０００ｒｐｍで８分間遠心分離した。
４．  ７．９ｍｌの上清を除去した。
５．  ４回の洗浄サイクルを実施し、各洗浄サイクル時、０．９ｍｌの洗浄緩衝剤を添加し、穏やかにボルテックスすることにより溶液を混合し、遠心分離を４０００ｒｐｍで３分間実施し、１００μｌの残留液体が保持されるように０．９ｍｌの上清を抜き取って廃棄した。
６．  得られた細胞サスペンジョンを９５℃で１０分間熱ライシスに付した。
７．  １μｌの熱ライセートと３μｌのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲマスターミックスと１μｌの標的特異的プライマーセットとを混合することによりＲＴ−ＰＣＲ反応の準備を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｅｃｏシステムサーマルサイクラー上でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイに付した。
【０２６９】
実施例８：  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイのための１ｍＬスパイク全血サンプルのサンプル調製
サンプル調製は、以下のようにスパイク全血サンプル用に実施された。
１．  １５ｍＬ遠心分離機チューブ中で１ｍｌの血液ライシス試薬を１ｍｌのサンプルに添加した。
２．  最高スピードのボルテクサーで１分間ボルテックスすることにより遠心分離機チューブを混合した。
３．  遠心分離機チューブを４０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
４．  １．９ｍｌの上清を除去した。
５．  ４回の洗浄サイクルを実施し、各洗浄サイクル時、０．９ｍｌの洗浄緩衝剤を添加し、穏やかにボルテックスすることにより溶液を混合し、遠心分離を４０００ｒｐｍで３分間実施し、１００μｌの残留液体が保持されるように０．９ｍｌの上清を抜き取って廃棄した。
６．  得られた細胞サスペンジョンを９５℃で１０分間熱ライシスに付した。
７．  １μｌの熱ライセートと３μｌのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲマスターミックスと１μｌの標的特異的プライマーセットとを混合することによりＲＴ−ＰＣＲ反応の準備を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｅｃｏシステムサーマルサイクラー上でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイに付した。
【０２７０】
実施例９：  血液デブリの形成に関する実験研究のための３ｍＬ全血サンプルのサンプル調製
非スパイク全血サンプルのサンプル調製は、以下のように実施された。
１．  １５ｍＬ遠心分離機チューブ中で５ｍｌの血液ライシス試薬を３ｍｌのサンプルに添加した。
２．  最高スピードのボルテクサーで１分間ボルテックスすることにより遠心分離機チューブを混合した。
３．  混合物を４０００ｒｐｍで７分間遠心分離した。
４．  上清を除去し、１００μＬの残渣をチューブボトムに残存させた。
５．  ２回の洗浄サイクルを実施し、各洗浄サイクル時、０．９ｍｌの洗浄緩衝剤を添加し、遠心分離を４０００ｒｐｍで３分間実施し、最初の洗浄サイクル時、０．９ｍｌの上清を抜き取って廃棄した。
６．  血液デブリの存在を調べるために、得られたチューブの写真を撮った。
【０２７１】
実施例１０：  陽性血液培養サンプルの調製
陽性血液培養サンプルは、以下のように調製された。
１．  ５〜１０ＣＦＵ／ｍｌの公称濃度で細菌を１０ｍＬの全血サンプルにスパイクした。
２．  ＦＡ  Ｐｌｕｓ好気性血液培養ボトルに１０ｍＬのスパイク全血を接種し、培養物が陽性になるまで３７℃でインキュベートした。
【０２７２】
実施例１１：  サンプルと血液ライシス試薬との対流混合による陽性血液培養サンプルの処理
陽性血液培養物の処理に利用された対流ミキサーは、図２６Ａ及び２６Ｂに示される。それは直径１５．９ｍｍの２つの１０ｍＬシリンジ（Ｓ１及びＳ２）を含み、ＩＤ＝０．９１ｍｍ及び長さ１０ｃｍのチューブＴにより接続される。サンプル調製は、以下のように実施された。
１．  図２６Ａに示されるように、一方のシリンジ（Ｓ１）に１ｍＬの血液を吸引する。
２．  図２６Ａに示されるように、他方のシリンジ（Ｓ２）に１ｍＬの血液ライシス試薬を吸引する。
３．  図２６Ｂに示されるように、９０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＳ２からＳ１に１ｍＬの血液ライシス試薬を吸引する。
４．  ２ｍＬの血液＋血液ライシス試薬混合物をＳ２に吸引する。（図示せず）
５．  混合物を吸引してＳ１に戻す。（図示せず）
６．  工程４及び５を５回繰り返す。
７．  溶血サンプルを１５ｍＬ遠心分離機チューブに移送した。
８．  混合物を４０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
９．  上清を除去し、１００μＬの残留液体をチューブボトムに残存させた。
１０．  ２回の洗浄サイクルを実施し、各洗浄サイクル時、０．９ｍｌの洗浄緩衝剤を添加し、遠心分離を４０００ｒｐｍで３分間実施し、最初の洗浄サイクル時、０．９ｍｌの上清を抜き取って廃棄した。
１１．  血液デブリの存在を調べるために、得られたチューブの写真を撮った。
【０２７３】
実施例１２：  細胞サスペンジョン回収のための陽性血液培養サンプルの処理
陽性血液培養サンプルのサンプル調製は、以下の通りであった。
１．  １５ｍＬ遠心分離機チューブ中で１ｍＬの体積の陽性血液培養サンプルと１ｍＬの血液ライシス試薬とを混合した。
２．  最高スピードのボルテクサーで１分間ボルテックスすることにより遠心分離機チューブを混合した。
３．  混合物を４０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
４．  １．９ｍＬの上清を除去し、１００μＬの残留液体をチューブボトムに残存させた。
５．  ４回の洗浄サイクルを実施し、各洗浄サイクル時、０．９ｍｌの洗浄緩衝剤を添加し、穏やかにボルテックスすることにより溶液を混合し、遠心分離を４０００ｒｐｍで３分間実施し、１００μｌの残留液体が保持されるように０．９ｍｌの上清を抜き取って廃棄した。
６．  洗浄サイクルの終了時、上清０．９を除去し、１００μＬの残留液体を再懸濁させ、回収細胞サスペンジョンとして採取した。
７．  陽性対照参照として、５％ヒツジ血液を含むトリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）プレート上に陽性血液培養物を接種し、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。
【０２７４】
実施例１３：  生存細胞寒天プレーティングスパイク対照用の血液ライシス試薬不在下の３ｍＬスパイクリン酸塩緩衝剤サンプルのサンプル調製
サンプル調製は、以下のように生存細胞寒天プレーティングスパイク対照用に実施された。
１．  １５ｍｌ遠心分離機チューブ中で３ｍｌのスパイクリン酸塩緩衝剤と５ｍｌのＰＢとを混合した。
２．  最高スピードのボルテクサーで１分間ボルテックスすることにより遠心分離機チューブを混合した。
３．  遠心分離機チューブを４０００ｒｐｍで８分間遠心分離した。
４．  ７．９ｍｌの上清を除去した。
５．  得られた細胞サスペンジョンを寒天プレート上に接種し、細菌コロニー成長のために３７℃で１８〜２４時間又は真菌コロニー成長のために３０℃で２４〜７２時間インキュベートした。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の寒天プレートは、ＣＯ２発生パウチの存在下、３７℃で１８〜２４時間インキュベートされた。
【０２７５】
実施例１４：  生存細胞回収寒天プレーティング実験のためのボルテックス混合による３ｍＬスパイク全血サンプルのサンプル調製
ボルテックス混合によるサンプル調製は、以下のようにスパイク全血サンプルからの生存微生物細胞回収のために実施された。
１．  １５ｍＬ遠心分離機チューブ中で５ｍｌの血液ライシス試薬を３ｍｌのサンプルに添加した。
２．  最高スピードのボルテクサーで１分間ボルテックスすることにより遠心分離機チューブを混合した。
３．  遠心分離機チューブを４０００ｒｐｍで８分間遠心分離した。
４．  ７．９ｍｌの上清を除去した。
５．  ４回の洗浄サイクルを実施し、各洗浄サイクル時、０．９ｍｌの洗浄緩衝剤を添加し、穏やかにボルテックスすることにより溶液を混合し、遠心分離を４０００ｒｐｍで３分間実施し、１００μｌの残留液体が保持されるように０．９ｍｌの上清を抜き取って廃棄した。
６．  得られた細胞サスペンジョンを寒天プレート上に接種し、細菌コロニー成長のために３７℃で１８〜２４時間又は真菌コロニー成長のために３０℃で２４〜７２時間インキュベートした。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の寒天プレートは、ＣＯ２発生パウチの存在下、３７℃で１８〜２４時間インキュベートされた。
【０２７６】
実施例１５：  生存細胞回収のための対流混合による３ｍＬスパイク全血サンプルの処理
全血サンプル調製に使用された対流ミキサーは、図２６Ａ及び２６Ｂに示される。それは直径１５．９ｍｍの２つの１０ｍＬシリンジを含み、ＩＤ＝０．９１ｍｍ及び長さ１０ｃｍのチューブＴにより接続される。サンプル調製は、以下のように実施された。
１．  一方のシリンジ（Ｓ１）に３ｍＬの血液を吸引する
２．  他方のシリンジ（Ｓ２）に５ｍＬの血液ライシス試薬を吸引する
３．  ９０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＳ２からＳ１に５ｍＬの血液ライシス試薬を吸引する
４．  ８ｍＬの血液＋血液ライシス試薬混合物をＳ２に吸引する
５．  混合物を吸引してＳ１に戻す
６．  工程４及び５を５回繰り返す
７．  混合チャンバーの内容物を１５ｍＬ遠心分離機チューブに排出する
８．  ４０００ＲＰＭで１０分間遠心分離する
９．  上清を除去して１００μＬをチューブボトムに残存させる
１０．  ９００μＬの洗浄緩衝剤を添加してボルテクシングにより混合する
１１．  ４０００ＲＰＭで２分間遠心分離する
１２．  工程９〜１１を３回繰り返す
１３．  上清を除去して１００μＬをチューブボトムに残存させる
１４．  得られた細胞サスペンジョンを寒天プレート上にプレーティングしてコロニー成長のために３７℃でインキュベートする。
【０２７７】
実施例１６：  ＶＩＴＥＫ−ＭＳ（登録商標）による微生物細胞同定
ＶＩＴＥＫ−ＭＳ−ＩＤのために実施例１２で陽性血液培養物から回収された細胞サスペンジョン及び参照対照コロニー並びに実施例１４で全血から回収された生存細胞コロニーの調製は、以下の通りであった。
１．  １μＬの細菌細胞サスペンジョンをＶＩＴＥＫ  ＭＳ−ＤＳ標的スライドの１つのサンプル領域上にスポットし、続いて１μＬのＶＩＴＥＫ  ＭＳ−ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸）を添加し、そして乾燥させた。
２．  無菌１μＬ接種ループを用いて細菌コロニーサンプルをＶＩＴＥＫ  ＭＳ−ＤＳ標的スライドの１つのサンプル領域上の適用し、続いて１μＬのＶＩＴＥＫ  ＭＳ−ＣＨＣＡを添加し、そして乾燥させた。
３．  無菌１μＬ接種ループを用いて真菌コロニーサンプルをＶＩＴＥＫ  ＭＳ−ＤＳ標的スライドの１つのサンプル領域上に適用し、続いて１μＬのＶＩＴＥＫ−ＭＳ−ＦＡ（ギ酸）をサンプル上に添加し、そして空気乾燥させた。１μＬのＶＩＴＥＫ  ＭＳ−ＣＨＣＡを乾燥サンプル上に添加し、そして乾燥させた。
４．  マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いてｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ製ＶＩＴＥＫ（登録商標）ＭＳ質量分析計システムによりスパイク微生物種を同定した。
【０２７８】
実施例１７：  ＶＩＴＥＫ（登録商標）２による微生物細胞同定及び抗微生物剤感受性試験
ＶＩＴＥＫ（登録商標）２のために実施例１２で陽性血液培養物から回収された細胞サスペンジョン及び参照対照コロニー並びに実施例１４で全血から回収された生存細胞コロニーの調製は、以下の通りであった。
１．  ある体積の回収細菌細胞サスペンジョンを提供試験チューブ中の３．０ｍＬの０．４５％無菌生理食塩水に添加して、ＤｅｎｓｉＣｈｅｋ  Ｐｌｕｓ濁度計を用いたＶＩＴＥＫ（登録商標）２のための標準細胞サスペンジョンを調製した。サスペンジョンの濁度は、０．５〜０．６３マクファーランド濁度単位に調整された。
２．  以上に記載のように細菌コロニーサンプルを０．４５％無菌生理食塩水に接種して、０．５〜０．６３マクファーランド濁度単位の細胞サスペンジョンを調製した。
３．  以上に記載のように真菌コロニーサンプルを０．４５％無菌生理食塩水に接種して、１．８〜２マクファーランド濁度単位の細胞サスペンジョンを調製した。
４．  ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＶＩＴＥＫ（登録商標）２  ６０／ＸＬを用いて微生物同定及び抗微生物剤感受性試験を実施した。グラム陽性細菌に対しては、ＧＰ  ＴＥＳＴ  ＫＩＴ  ＶＴＫ２（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＃２１３４２）、ＡＳＴ−ＧＰ６７（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＃２２２２６）、及びＡＳＴ−ＳＴ０３（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＃４２１０４０）を使用した。グラム陰性細菌に対しては、ＧＮ  ＴＥＳＴ  ＫＩＴ  ＶＴＫ２（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＃２１３４１）及びＡＳＴ−Ｎ２１６（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＃４１３０６６）を使用した。酵母に対しては、ＹＳＴ  ＴＥＳＴ  ＫＩＴ  ＶＴＫ２（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＃２１３４３）及びＡＳＴ−ＹＳ０８（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＃４２０７３９）を使用した。
【０２７９】
以上に記載の具体的実施形態は、例として示されており、これらの実施形態は、各種の変更形態及び代替形態が許容されうることが理解されるべきである。特許請求の範囲は、開示された特定形態に限定されることが意図されるのではなく、本開示の趣旨及び範囲に包含されるすべての変更形態、等価形態、及び代替形態をカバーするように意図されることがさらに理解されるべきである。
【図１Ａ−１Ｆ】
2021524259.tif 000003
【図１Ｇ−１Ｍ】
2021524259.tif 000004
【図２】
2021524259.tif 000005
【図３Ａ】
2021524259.tif 000006
【図３Ｂ】
2021524259.tif 000007
【図３Ｃ】
2021524259.tif 000008
【図４】
2021524259.tif 000009
【図５Ａ】
2021524259.tif 000010
【図５Ｂ】
2021524259.tif 000011
【図６】
2021524259.tif 000012
【図７】
2021524259.tif 000013
【図８】
2021524259.tif 000014
【図９Ａ】
2021524259.tif 000015
【図９Ｂ】
2021524259.tif 000016
【図９Ｃ】
2021524259.tif 000017
【図１０】
2021524259.tif 000018
【図１１Ａ】
2021524259.tif 000019
【図１１Ｂ】
2021524259.tif 000020
【図１２Ａ】
2021524259.tif 000021
【図１２Ｂ】
2021524259.tif 000022
【図１３Ａ−１３Ｂ】
2021524259.tif 000023
【図１４Ａ】
2021524259.tif 000024
【図１４Ｂ】
2021524259.tif 000025
【図１４Ｃ】
2021524259.tif 000026
【図１４Ｄ】
2021524259.tif 000027
【図１５Ａ】
2021524259.tif 000028
【図１５Ｂ】
2021524259.tif 000029
【図１６Ａ】
2021524259.tif 000030
【図１６Ｂ】
2021524259.tif 000031
【図１６Ｃ】
2021524259.tif 000032
【図１６Ｄ】
2021524259.tif 000033
【図１６Ｅ】
2021524259.tif 000034
【図１７Ａ】
2021524259.tif 000035
【図１７Ｂ】
2021524259.tif 000036
【図１７Ｃ】
2021524259.tif 000037
【図１７Ｄ】
2021524259.tif 000038
【図１８Ａ】
2021524259.tif 000039
【図１８Ｂ】
2021524259.tif 000040
【図１８Ｃ】
2021524259.tif 000041
【図１９Ａ】
2021524259.tif 000042
【図１９Ｂ】
2021524259.tif 000043
【図２０Ａ】
2021524259.tif 000044
【図２０Ｂ】
2021524259.tif 000045
【図２１Ａ】
2021524259.tif 000046
【図２１Ｂ】
2021524259.tif 000047
【図２１Ｃ】
2021524259.tif 000048
【図２１Ｄ】
2021524259.tif 000049
【図２２Ａ】
2021524259.tif 000050
【図２２Ｂ】
2021524259.tif 000051
【図２２Ｃ】
2021524259.tif 000052
【図２２Ｄ】
2021524259.tif 000053
【図２３Ａ】
2021524259.tif 000054
【図２３Ｂ】
2021524259.tif 000055
【図２３Ｃ】
2021524259.tif 000056
【図２３Ｄ】
2021524259.tif 000057
【図２３Ｅ】
2021524259.tif 000058
【図２３Ｆ】
2021524259.tif 000059
【図２３Ｇ】
2021524259.tif 000060
【図２４Ａ】
2021524259.tif 000061
【図２４Ｂ】
2021524259.tif 000062
【図２４Ｃ】
2021524259.tif 000063
【図２４Ｄ】
2021524259.tif 000064
【図２５】
2021524259.tif 000065
【図２６Ａ−２６Ｂ】
2021524259.tif 000066
【国際調査報告】
2021524259.tif 000067
2021524259.tif 000068