(57)【要約】本明細書では、増殖特性及び生産性特性が改善された、宿主生物から分泌される組換えで発現される産物の分泌を改善するための改変株、ならびに上記改変株の使用方法が開示される。【選択図】図１２Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＣ７２の活性が消失しているかまたはｓｅｃ７２遺伝子が欠失している、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）という微生物であって、組換えタンパク質を発現する、前記微生物。
【請求項２】
前記ＳＥＣ７２が、配列番号１と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記ＳＥＣ７２が配列番号１を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
前記ＳＥＣ７２がｓｅｃ７２遺伝子によりコードされる、請求項１に記載の微生物。
【請求項５】
前記ｓｅｃ７２遺伝子が、配列番号２と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項６】
前記ｓｅｃ７２遺伝子が、配列番号２の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項７】
前記ｓｅｃ７２遺伝子が配列番号２を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項８】
前記ｓｅｃ７２遺伝子が前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ２−１＿０４４８に存在する、請求項１に記載の微生物。
【請求項９】
組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
前記ＳＳＨ１トランスロコン複合体が、配列番号４と少なくとも９５％同一な第１のポリペプチド配列、配列番号６と少なくとも９５％同一な第２のポリペプチド配列、及び配列番号８と少なくとも９５％同一な第３のポリペプチド配列を含む、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
前記ＳＳＨ１トランスロコン複合体が、配列番号４を含む第１のポリペプチド、配列番号６を含む第２のポリペプチド、及び配列番号８を含む第３のポリペプチドを含む、請求項９に記載の微生物。
【請求項１２】
組換えで発現されるトランスロコン複合体をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１３】
前記トランスロコン複合体が、組換えＳＳＨ１遺伝子、組換えＳＳＳ１遺伝子、及び組換えＳＢＨ２遺伝子から発現される、請求項１２に記載の微生物。
【請求項１４】
前記ＳＳＨ１遺伝子が配列番号３を含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１５】
前記ＳＳＨ１遺伝子が、配列番号３と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１６】
前記ＳＳＨ１遺伝子が、配列番号３の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１７】
前記ＳＳＨ１遺伝子が配列番号５を含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１８】
前記ＳＳＨ１遺伝子が、配列番号５と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１９】
前記ＳＳＳ１遺伝子が、配列番号５の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項２０】
前記ＳＢＨ２遺伝子が配列番号７を含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項２１】
前記ＳＢＨ２遺伝子が、配列番号７と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項２２】
前記ＳＢＨ２遺伝子が、配列番号７の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項２３】
前記微生物における前記ＳＳＨ１トランスロコンのレベルを、天然の生物によって発現される前記ＳＳＨ１トランスロコンのレベルを超えて増加させるための前記組換えＳＳＨ１遺伝子の発現が、前記微生物の増殖速度及び／または発酵能力を向上させる、請求項１３に記載の微生物。
【請求項２４】
前記トランスロコン複合体が、ＳＳＨ１タンパク質、ＳＳＳ１タンパク質、及びＳＢＨ２タンパク質を含む、請求項１２に記載の微生物。
【請求項２５】
前記ＳＳＨ１タンパク質が、配列番号４と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項２４に記載の微生物。
【請求項２６】
前記ＳＳＨ１タンパク質が配列番号４を含む、請求項２４に記載の微生物。
【請求項２７】
前記ＳＳＳ１タンパク質が、配列番号６と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項２４に記載の微生物。
【請求項２８】
前記ＳＳＳ１タンパク質が配列番号６を含む、請求項２４に記載の微生物。
【請求項２９】
前記ＳＢＨ２タンパク質が、配列番号８と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項２４に記載の微生物。
【請求項３０】
前記ＳＢＨ２タンパク質が配列番号８を含む、請求項２４に記載の微生物。
【請求項３１】
ＹＰＳ１−１プロテアーゼ及びＹＰＳ１−２プロテアーゼの活性が、減弱または消失している、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項３２】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼが、配列番号１０と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項３１に記載の微生物。
【請求項３３】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼが配列番号１０を含む、請求項３１に記載の微生物。
【請求項３４】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼがＹＰＳ１−１遺伝子によりコードされる、請求項３１に記載の微生物。
【請求項３５】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子が、配列番号９と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載の微生物。
【請求項３６】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子が、配列番号９の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の微生物。
【請求項３７】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子が配列番号９を含む、請求項３４に記載の微生物。
【請求項３８】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子が前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４に存在する、請求項３４に記載の微生物。
【請求項３９】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼが、配列番号１２と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項４０】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼが配列番号１２を含む、請求項３１に記載の微生物。
【請求項４１】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼがＹＰＳ１−２遺伝子によりコードされる、請求項３１に記載の微生物。
【請求項４２】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子が、配列番号１１と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の微生物。
【請求項４３】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子が、配列番号１１の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の微生物。
【請求項４４】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子が配列番号１１を含む、請求項４１に記載の微生物。
【請求項４５】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子が前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７に存在する、請求項４１に記載の微生物。
【請求項４６】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子もしくは前記ＹＰＳ１−２遺伝子またはその両方が、変異しているまたはノックアウトされている、請求項３１〜４５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項４７】
１種以上のさらなるプロテアーゼの活性が減弱または消失している、請求項３１〜４６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項４８】
前記組換えタンパク質が、絹タンパク質由来の少なくとも１つのブロックポリペプチド配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項４９】
前記組換えタンパク質が絹様ポリペプチドを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５０】
前記絹様ポリペプチドが１つ以上の反復配列
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を含み、
式中、
Ｘ１＝ＳＧＧＱＱまたはＧＡＧＱＱまたはＧＱＧＰＹまたはＡＧＱＱまたはＳＱであり、
ｎ１は４〜８であり、
ｎ２は６〜２０であり、かつ
ｎ３は２〜２０である、
請求項４９に記載の微生物。
【請求項５１】
前記絹様ポリペプチドが配列番号２１によりコードされるポリペプチド配列を含む、請求項４９に記載の微生物。
【請求項５２】
前記組換えタンパク質が分泌シグナルペプチドを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５３】
前記分泌シグナルペプチドが、ＰＥＰ４シグナル配列、ＣＰＹ＋４シグナル配列、ＤＡＰ２シグナル配列、及びＭＦα１シグナル配列からなる群より選択される、請求項５２に記載の微生物。
【請求項５４】
前記分泌シグナルペプチドが、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０からなる群より選択される、請求項５２に記載の微生物。
【請求項５５】
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）という微生物であって、
前記微生物のＳＥＣ７２の活性が消失しているか、または配列番号１を含むｓｅｃ７２遺伝子がノックアウトされており、
組換えで発現される配列番号３を含むＳＳＨ１遺伝子、組換えで発現される配列番号５を含むＳＳＳ１遺伝子、及び組換えで発現される配列番号７を含むＳＢＨ２遺伝子を含み、かつ
配列番号２１によりコードされるポリペプチドを含む絹様ポリペプチドを含む、
前記微生物。
【請求項５６】
請求項１〜５５のいずれか１項に記載の微生物を含む、細胞培養物。
【請求項５７】
標準的な細胞培養条件下において、組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体を含まない細胞培養物と比較して、株の増殖速度及び発酵能力が向上している、請求項９〜５５のいずれか１項に記載の微生物を含む細胞培養物。
【請求項５８】
請求項９〜５５のいずれか１項に記載の微生物を含む細胞培養物であって、
標準的な細胞培養条件下において、
機能性ｓｅｃ７２遺伝子を含みかつ組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体を含まない点以外は同一の微生物であって、それぞれの微生物が同一数の組換え絹ポリペプチド遺伝子のコピーを有する、前記微生物
の細胞培養物と比較して、前記組換えタンパク質の収量または比生産性が向上している、
前記細胞培養物。
【請求項５９】
請求項１〜５５のいずれか１項に記載の微生物を、前記組換えで発現されるタンパク質の発現に好適な条件下で、培地中で培養する工程、及び
前記微生物または前記培地から前記組換えタンパク質を単離する工程
を含む、組換えタンパク質の製造方法。
【請求項６０】
前記組換えタンパク質が前記微生物から分泌され、かつ、前記組換えタンパク質を単離する工程が、前記分泌された組換えタンパク質を含む培地を回収することを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ｓｅｃ７２遺伝子が欠失していない点以外は同一な微生物と比較して、前記微生物における前記組換えタンパク質の収量または比生産性が増加する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体を含まない、及び前記ｓｅｃ７２遺伝子が欠失していない点以外は同一な、微生物
と比較して、前記微生物における前記組換えタンパク質の収量または比生産性が増加する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
組換えで発現されるタンパク質の分泌を改善するようにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを改変する方法であって、ＳＥＣ７２タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトする工程を含む、前記方法。
【請求項６４】
前記Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを、組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換する工程をさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記組換えで発現されるタンパク質が絹様ポリペプチドを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記絹様ポリペプチドが、１つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３を含み、
式中、
Ｘ１＝ＳＧＧＱＱまたはＧＡＧＱＱまたはＧＱＧＰＹまたはＡＧＱＱまたはＳＱであり、
ｎ１は４〜８であり、
ｎ２は６〜２０であり、かつ
ｎ３は２〜２０である、
請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記組換えで発現されるタンパク質が、配列番号２１によりコードされるポリペプチド配列を含む、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月１７日出願の米国仮出願第６２／６７３，００１号の優先権を主張し、上記出願の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本開示は、細胞からのタンパク質もしくは代謝物の分泌を増強させるための株の最適化方法に関する。本開示はまた、それらの方法から得られる組成物にも関する。特に、本開示は、酵母細胞であって、該酵母細胞により発現される組換えタンパク質の分泌を増強するよう選択または遺伝子操作された上記酵母細胞、及び有用な化合物を製造するための酵母細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
メチロトローフ酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）は組換えタンパク質の産生に広く使用されている。Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓは高い細胞密度に増殖し、厳密に制御されたメタノール誘導性の導入遺伝子発現を提供し、合成培地中に組換えタンパク質を分泌する能力を有する。
【０００４】
しかしながら、発現される組換えタンパク質のかなりの部分が細胞内に残存し、このことによって回収が困難になり、かつ細胞の増殖及び寿命に悪影響が及ぶ場合がある。さらに、組換えで発現されるタンパク質が分泌される前に細胞中で分解されることもあり、その結果、組換えで発現されるタンパク質の断片と低収量の完全長組換えタンパク質とが含まれるタンパク質混合物が生じる。したがって、Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける分泌を増強させる一方で、如何なる組換えタンパク質の生産性の低下も減弱させる、または該生産性を向上させる手段、及び遺伝子操作された株が必要とされている。
【０００５】
したがって、組換えタンパク質を産生及び分泌する一方で、細胞の増殖及び生産性に及ぼす如何なる悪影響も低減する改変生物、及びこれらの生物の使用方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
いくつかの実施形態において、本明細書では、ＳＥＣ７２の活性が消失した、またはｓｅｃ７２遺伝子が欠失したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓという微生物であって、組換えタンパク質を発現する上記微生物が提供される。いくつかの実施形態では、上記微生物は、組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体をさらに含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＳＥＣ７２は、配列番号１と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＥＣ７２は配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＥＣ７２はｓｅｃ７２遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、上記ｓｅｃ７２遺伝子は、配列番号２と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ｓｅｃ７２遺伝子は、配列番号２の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、上記ｓｅｃ７２遺伝子は配列番号２を含む。いくつかの実施形態では、上記ｓｅｃ７２遺伝子は上記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ２−１＿０４４８に存在する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、上記ＳＳＨ１トランスロコン複合体は、配列番号４と少なくとも９５％同一な第１のポリペプチド配列、配列番号６と少なくとも９５％同一な第２のポリペプチド配列、及び配列番号８と少なくとも９５％同一な第３のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＳＨ１トランスロコン複合体は、配列番号４を含む第１のポリペプチド、配列番号６を含む第２のポリペプチド、及び配列番号８を含む第３のポリペプチドを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、上記微生物は組換えで発現されるトランスロコン複合体をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記トランスロコン複合体は、組換えＳＳＨ１遺伝子、組換えＳＳＳ１遺伝子、及び組換えＳＢＨ２遺伝子から発現される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、上記ＳＳＨ１遺伝子は配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＳＨ１遺伝子は、配列番号３と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＳＨ１遺伝子は、配列番号３の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、上記ＳＳＨ１遺伝子は配列番号５を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＳＨ１遺伝子は、配列番号５と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＳＳ１遺伝子は、配列番号５の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、上記ＳＢＨ２遺伝子は配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＢＨ２遺伝子は、配列番号７と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＢＨ２遺伝子は、配列番号７の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、上記微生物における上記ＳＳＨ１トランスロコンのレベルを、天然の生物によって発現される上記ＳＳＨ１トランスロコンのレベルを超えて増加させるための上記組換えＳＳＨ１遺伝子の発現は、上記微生物の増殖速度及び／または発酵能力を向上させる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、上記トランスロコン複合体は、ＳＳＨ１タンパク質、ＳＳＳ１タンパク質、及びＳＢＨ２タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＳＨ１タンパク質は、配列番号４と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＳＨ１タンパク質は配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＳＳ１タンパク質は、配列番号６と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＳＳ１タンパク質は配列番号６を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＢＨ２タンパク質は、配列番号８と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＢＨ２タンパク質が配列番号８を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、上記微生物中のＹＰＳ１−１プロテアーゼ及びＹＰＳ１−２プロテアーゼの活性は減弱または消失している。
【００１６】
いくつかの実施形態では、上記ＹＰＳ１−１プロテアーゼは、配列番号１０と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ＹＰＳ１−１プロテアーゼは配列番号１０を含む。いくつかの実施形態では、上記ＹＰＳ１−１プロテアーゼはＹＰＳ１−１遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、上記ＹＰＳ１−１遺伝子は、配列番号９と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ＹＰＳ１−１遺伝子は、配列番号９の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、上記ＹＰＳ１−１遺伝子は配列番号９を含む。いくつかの実施形態では、上記ＹＰＳ１−１遺伝子は上記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４に存在する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、上記ＹＰＳ１−２プロテアーゼは、配列番号１２と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ＹＰＳ１−２プロテアーゼは配列番号１２を含む。いくつかの実施形態では、上記ＹＰＳ１−２プロテアーゼはＹＰＳ１−２遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、上記ＹＰＳ１−２遺伝子は、配列番号１１と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ＹＰＳ１−２遺伝子は、配列番号１１の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、上記ＹＰＳ１−２遺伝子は配列番号１１を含む。いくつかの実施形態では、上記ＹＰＳ１−２遺伝子は上記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７に存在する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、上記微生物の上記ＹＰＳ１−１遺伝子もしくは上記ＹＰＳ１−２遺伝子、またはその両方が変異しているかあるいはノックアウトされている。いくつかの実施形態では、上記微生物の１種以上のさらなるプロテアーゼの活性が減弱または消失している。
【００１９】
いくつかの実施形態では、上記組換えタンパク質は、絹タンパク質由来の少なくとも１つのブロックポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記組換えタンパク質は絹様ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、上記絹様ポリペプチドは１つ以上の反復配列
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を含み、式中、Ｘ１＝ＳＧＧＱＱまたはＧＡＧＱＱまたはＧＱＧＰＹまたはＡＧＱＱまたはＳＱであり、ｎ１は４〜８であり、ｎ２は６〜２０であり、かつｎ３は２〜２０である。いくつかの実施形態では、上記絹様ポリペプチドは配列番号２１によりコードされるポリペプチド配列を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、上記組換えタンパク質は分泌シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、上記分泌シグナルペプチドは、ＰＥＰ４シグナル配列、ＣＰＹ＋４シグナル配列、ＤＡＰ２シグナル配列、及びＭＦα１シグナル配列からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、上記分泌シグナルペプチドは、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０からなる群より選択される。
【００２１】
また本明細書では、いくつかの実施形態に従って、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓという微生物であって、上記微生物のＳＥＣ７２の活性が消失し、または配列番号１を含むｓｅｃ７２遺伝子がノックアウトされ、組換えで発現される配列番号３を含むＳＳＨ１遺伝子、組換えで発現される配列番号５を含むＳＳＳ１遺伝子、及び組換えで発現される配列番号７を含むＳＢＨ２遺伝子を含み、配列番号２１によりコードされるポリペプチドを含む絹様ポリペプチドを含む、上記微生物も提供される。
【００２２】
また本明細書では、いくつかの実施形態に従って、本明細書に記載の組換え微生物を含む細胞培養物も提供される。
【００２３】
また本明細書では、いくつかの実施形態に従って、標準的な細胞培養条件下において、組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体を含まない細胞培養物と比較して、株の増殖速度及び発酵能力が向上した、本明細書に記載の組換え微生物を含む細胞培養物も提供される。
【００２４】
また本明細書では、いくつかの実施形態に従って、本明細書に記載の組換え微生物を含む細胞培養物であって、標準的な細胞培養条件下において、機能性ｓｅｃ７２遺伝子を含み、かつ組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体を含まない点以外は同一の微生物であり、それぞれの微生物が同一数の組換え絹ポリペプチド遺伝子のコピーを有する上記微生物の細胞培養物と比較して、上記組換えタンパク質の収量または比生産性が向上した、上記細胞培養物も提供される。
【００２５】
また本明細書では、いくつかの実施形態に従って、本明細書に記載の組換え微生物を、上記組換えで発現されるタンパク質の発現に好適な条件下、培地中で培養すること、及び上記微生物または上記培地から上記組換えタンパク質を単離することを含む、組換えタンパク質の製造方法も提供される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、上記組換えタンパク質は上記微生物から分泌され、かつ、上記組換えタンパク質を単離することは、上記分泌された組換えタンパク質を含む培地を回収することを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、上記ｓｅｃ７２遺伝子が欠失していない点以外は同一な微生物と比較して、上記微生物における上記組換えタンパク質の収量または比生産性が増加する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、上記組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体を含まない、及び上記ｓｅｃ７２遺伝子が欠失していない点以外は同一な微生物と比較して、上記微生物における上記組換えタンパク質の収量または比生産性が増加する。
【００２９】
また本明細書では、いくつかの実施形態に従って、組換えで発現されるタンパク質の分泌が改善するようにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを改変する方法であって、ＳＥＣ７２タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることを含む上記方法も提供される。いくつかの実施形態では、上記組換えで発現されるタンパク質の分泌が改善するようにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを改変する方法は、上記Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを、組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換することをさらに含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、上記組換えで発現されるタンパク質は絹様ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、上記絹様ポリペプチドが１つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３を含み、式中、Ｘ１＝ＳＧＧＱＱまたはＧＡＧＱＱまたはＧＱＧＰＹまたはＡＧＱＱまたはＳＱであり、ｎ１は４〜８であり、ｎ２は６〜２０であり、かつｎ３は２〜２０である。いくつかの実施形態では、上記組換えで発現されるタンパク質は、配列番号２１によりコードされるポリペプチド配列を含む。
【００３１】
前述の及び他の目的、特徴、ならびに利点は、添付の図面で例示する、本発明の個々の実施形態の以下の説明から明らかとなろうが、これらの図面において、異なる視図を通して同様の参照符号は同一の部分を指す。図面は必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではなく、むしろ本発明のさまざまな実施形態の原理を例示することに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】分泌複合体ＳＥＣ、ＳＥＣ６１、ＳＥＣ６３、及びＳＳＨ１における遺伝子の分類を示す図である。また、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とＰ．  ｐａｓｔｏｒｉｓのトランスロコン複合体の間の相同性の値も示す。
【図２】ＳＥＣ７２ホモロジーアームが隣接する酵母選択マーカーを含むＳＥＣ７２欠失のためのベクターのプラスミドマップである。
【図３】ＳＳＨ１複合体を含むタンパク質をコードする過剰発現のためのベクターのプラスミドマップである。プロモーター、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、及びＳＢＨ２、ＳＳＳ１、及びＳＳＨ１用のターミネーター、ならびに酵母選択マーカーを含む。
【図４−１】図４Ａは、標的プロテアーゼ遺伝子欠失のためのホモロジーアームと共に用いるノーセオスリシンマーカーを含むベクターのプラスミドマップである。
【図４−２】図４Ｂは、ノーセオスリシン耐性マーカーに隣接する所望のプロテアーゼ遺伝子を標的指向化するホモロジーアームを有する、プロテアーゼノックアウトのためのカセットを示す図である。図４Ｃは、ノーセオスリシン耐性マーカーに隣接する所望のプロテアーゼ遺伝子を標的指向化するホモロジーアームを有する、プロテアーゼノックアウトのためのカセットを示す図である。
【図５】分泌シグナル及びＦＬＡＧタグを含む、絹様ポリペプチドを発現するためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むベクターのプラスミドマップである。上記ＯＲＦはｐＧＣＷ１４プロモーター及びｔＡＯＸ１ターミネーターに作動可能に連結している。上記ベクターは、形質転換が成功した細胞を選択するための選択マーカーも含む。
【図６】酵素結合免疫吸着測定法（すなわち、ＥＬＩＳＡ）により測定した、２Ｘ、４Ｘ、または６Ｘコピーの１８Ｂを発現する野生型（ＷＴ）株及びΔｓｅｃ７２（Δ）株により発現される、組換え１８Ｂ絹様ポリペプチドの分泌を示す図である。
【図７】野生型（ＷＴ）株及びΔｓｅｃ７２（Δ）株により発現され、ＥＬＩＳＡにより測定したＰＥＰ４（ｓｃ）、ＣＰＹ＋４（ｓｃ）、ＤＡＰ２（ｓｃ）、またはＭＦα１（ｓｃ）シグナルペプチドを含む組換えタンパク質の分泌を示す図である。（ｓｃ）はＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のシグナルペプチドを示す。
【図８】野生型（ＷＴ）株及びΔｓｅｃ７２（Δ）株により発現され、ＥＬＩＳＡにより測定した、長い絹ポリペプチド、アルギオペ・ブルエンニチ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ）大瓶状腺スピドロイン２（すなわち、Ａｂ  ＭａＳｐ２）（１０６ｋＤａ）、及びラトロデクツス・ヘスペルス（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ）大瓶状腺スピドロイン１（すなわち、Ｌｈ  ＭａＳｐ１（５５ｋＤａ））の分泌を示す図である。
【図９Ａ】野生型（ＷＴ）株、Δｓｅｃ７２（Δ）株、ｐＴＨＩ１１の制御下においてｓｅｃ７２を過剰発現する株、及びＤＡｍＰ（Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  Ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｂｙ  ｍＲＮＡ  Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ（ｍＲＮＡ摂動による存在量の減少））によりＳＥＣ７２がノックダウンされた株によって発現され、ＥＬＩＳＡにより測定した組換え１８Ｂ絹様ポリペプチドの分泌を示す図である。
【図９Ｂ】野生型（ＷＴ）株、ＳＥＣ６３複合体（すなわち、ｓｅｃ６２、ｓｅｃ６３、及びｓｅｃ６６）由来の非ＳＥＣ７２タンパク質を過剰発現する株、及びｓｅｃ７２を過剰発現する株によって発現され、ＥＬＩＳＡにより測定した組換え１８Ｂ絹様ポリペプチドの分泌を示す図である。
【図１０Ａ】ＷＴ株からの倍率変化としての、Δｓｅｃ７２株における参照に対して正規化した発現を示す図である。網掛けは範囲を示し、中央の線はｎ＝３の生物学的な繰り返し実験（Δｓｅｃ７２のｎ＝２を除く）間の中央値を表す。
【図１０Ｂ】中心化した、対数スケールでの、参照に対して正規化した発現データの、主成分空間上への投影図（左図＝ＰＣ１対ＰＣ３、右図＝ＰＣ２対ＰＣ３）を示す。株の遺伝子型により繰り返し実験データを色分けし、これにより、遺伝子型間の変動に比較して、遺伝子型内の変動が低いことが示される。
【図１１】ＷＴ株及びΔｓｅｃ７２株について観測された増殖速度、及びそれぞれの増殖速度のＳＳＨ１トランスロコン複合体またはＳＥＣ６１を過剰発現するように改変した株の増殖速度との比較を示す図である。
【図１２Ａ】Δｓｅｃ７２株（４ｘ、Δｓｅｃ７２）及びＳＳＨ１トランスロコン複合体を過剰発現するΔｓｅｃ７２株（４ｘ、Δｓｅｃ７２、２Ｎ  ＳＳＨ１）と比較した、４（４ｘ）または６（４＋２ｘ）コピーの１８Ｂを発現する野生型（ＷＴ）株の、グルコースの関数としての１８Ｂの産生（収量）を示す図である。
【図１２Ｂ】各株の比生産性（バイオマス当りの産生物）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
本発明のさまざまな実施形態の詳細を以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなろう。
【００３４】
定義
本明細書中で別段の定義がない限り、本発明との関連で使用される科学用語及び技術用語は当業者が共通して理解する意味を持つものとする。さらに、文脈に別段の必要性がない限り、単数形の用語には複数形が含まれるものとし、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。用語「ａ」及び「ａｎ」には、文脈上別段の指示がない限り、複数の指示対象が含まれる。一般に、本明細書に記載する生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質及び核酸化学ならびにハイブリダイゼーションとの関連で使用される術語及びそれらに関する技術は、当該技術分野で周知の一般的に使用されるものである。
【００３５】
別段の指示がない限り、以下の用語は以下の意味を持つものと理解されるべきである。
【００３６】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、少なくとも１０塩基長ある、ヌクレオチドの重合体形態を指す。かかる用語には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびに非天然型ヌクレオチド類似体、非天然ヌクレオシド間結合、またはその両方を含有するＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体が含まれる。核酸は、どのような形態学的コンホメーションにあってもよい。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重鎖、部分的二本鎖、分岐鎖、ヘアピン状、環状、またはパドロックドコンホメーションであってもよい。
【００３７】
別段の指示がない限り、「配列番号」という一般形式で本明細書に記載のあらゆる配列についての一例として、「配列番号１を含む核酸」とは、少なくとも一部に、（ｉ）配列番号１に記載の配列を有するか、または（ｉｉ）配列番号１に相補的な配列を有する核酸を指す。二者択一は文脈により決定される。例えば、核酸がプローブとして使用されている場合は、プローブは所望の標的に相補的でなければならないという要件により二者択一が決定される。
【００３８】
用語「組換え型」とは、生体分子、例えば、遺伝子またはタンパク質であって、（１）その天然に生じる環境から除かれているもの、（２）自然界ではその遺伝子が見られるポリヌクレオチドの全部または一部に会合していないもの、（３）自然界では連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているもの、または（４）自然界では生じないものを指す。「組換え型」という用語は、クローン化ＤＮＡ分離物、化学合成ポリヌクレオチド類似体、または、異種系により生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、ならびにかかる核酸によりコードされるタンパク質及び／またはｍＲＮＡに関して用いてもよい。
【００３９】
生物ゲノムの内在性核酸配列（またはその配列によりコードされるタンパク質産物）の発現が変化するよう、この内在性核酸配列に隣接して異種配列が置かれている場合、その内在性核酸配列は本明細書では「組換え型」とみなされる。この場合、異種配列は、その異種配列がそれ自体内在性（同一宿主細胞またはその子孫由来）または外因性（異なる宿主細胞またはその子孫由来）であるか否かにかかわらず、天然では内在性核酸配列に隣接していない配列である。例として、プロモーター配列は、宿主細胞のゲノムに存在する遺伝子の天然プロモーターを（例えば、相同組換えにより）置換して、この遺伝子の発現パターンが変化するようにすることができる。ここで、この遺伝子は、天然ではそれに隣接している配列の少なくともいくつかの配列から分離されているため「組換え型」と考えられるであろう。
【００４０】
核酸もまた、それが、ゲノム中の対応する核酸に対する、天然では生じない何らかの改変を含有する場合に「組換え型」とみなされる。例えば、内在性コード配列は、それが人為的に、例えば、人の介入などによって導入された挿入、欠失または点変異を含有する場合は「組換え型」とみなされる。「組換え核酸」には、宿主細胞染色体内の非相同部位に組み込まれた核酸、及びエピソームとして存在する核酸構築体も含まれる。
【００４１】
本明細書で使用する場合、参照核酸配列の「縮重バリアント」という語句は、標準的遺伝暗号に従って翻訳され、参照核酸配列から翻訳されるアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を提供することができる核酸配列を包含する。用語「縮重オリゴヌクレオチド」または「縮重プライマー」は、必ずしも配列は同一ではないが１つ以上の特定セグメント内部で互いに相同な標的核酸配列とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを意味するために使用される。
【００４２】
核酸配列において「配列同一性（％）」または「同一な」という用語は、２つの配列中の残基で、一致度が最大となるよう整列させた場合に同じになるものを指す。配列同一性を比較する長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より一般には少なくとも約２４ヌクレオチド、一般的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドの領域にわたる場合がある。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用できる当該技術分野で公知の異なるアルゴリズムが多数ある。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  バージョン１０．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ）に同梱のプログラムであるＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡは、問い合わせ配列と検索配列の間で最も重複している領域のアラインメント及び配列同一性（％）を提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）（参照によりその全体が本明細書に援用される）。例えば、核酸配列間の配列同一性（％）は、参照により本明細書に援用されるＧＣＧ  バージョン６．１で提供されるとおり、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトのパラメータ（文字列サイズは６、またスコア行列のファクターはＮＯＰＡＭ）で使用するか、またはＧａｐをそのデフォルトのパラメータを使用して決定することができる。別法として、配列はコンピュータプログラムのＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）、Ｇｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）、Ｍａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７））、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を使用して比較することができる。
【００４３】
核酸またはその断片に言及した際の「実質的な相同性」または「実質的な類似性」という用語は、ヌクレオチドの適切な挿入または欠失を用いて別の核酸（またはその相補鎖）と至適に整列させた場合に、上述のようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなどの周知の配列同一性アルゴリズムのいずれかで測定したヌクレオチド配列同一性が、ヌクレオチド塩基の少なくとも約７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％においてあることを示す。
【００４４】
本発明の核酸（ポリヌクレオチドとも呼ばれる）には、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方、ならびに上記の合成形態及び混合ポリマーが含まれる場合がある。それらは、当業者に容易に理解されるように、化学的または生化学的に改変されてもよく、また非天然または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有してもよい。かかる改変としては、例えば、標識、メチル化、類似体を用いた１つ以上の天然に生じるヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間改変、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホルアミダート、カルバメート等）、荷電結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレン等）、キレート剤、アルキル化剤、及び結合の改変（例えば、アルファアノマー型核酸等）などが挙げられる。また、水素結合及び他の化学的相互作用を介して指定配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も挙げられる。かかる分子は当該技術分野で公知であり、例えば、分子骨格にあるリン酸結合がペプチド結合で置換されるものなどが含まれる。他の改変としては、例えば、リボース環が架橋部分または他の構造、例えば、「ロックド」核酸に見られる改変などを含有している類似体を挙げることができる。
【００４５】
「変異した」という用語は、核酸配列に適用する場合、ある核酸配列内のヌクレオチドが参照核酸配列と比較した場合に挿入、欠失または変更されていることを意味する。ある遺伝子座において単一の変更（点変異）を行ってよく、また複数のヌクレオチドについて単一遺伝子座においける挿入、欠失または変更を行ってもよい。さらに、ある核酸配列内で任意の数の遺伝子座において１つ以上の変更を行ってよい。核酸配列は、当該技術分野で公知の任意の方法で変異させてよく、これには、「エラープローンＰＣＲ」（ＰＣＲ産物の全長にわたり高率の点変異が得られるようＤＮＡポリメラーゼの複製忠実度が低い条件下でＰＣＲを実施する方法であり、例えば、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５（１９８９）及びＣａｌｄｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３（１９９２）を参照のこと）、及び「オリゴヌクレオチド指定突然変異」（対象の任意のクローン化ＤＮＡセグメントにおいて部位特異的変異の発生を可能にする方法であり、例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７（１９８８）を参照のこと）など変異誘発技術が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「減弱させる」とは一般に機能的欠失を指し、これには、変異、部分的欠失もしくは完全欠失、挿入、または遺伝子配列、もしくは遺伝子配列の転写を制御する配列に対して行われる他の変更が含まれ、これにより遺伝子産物の産生を低減もしくは阻害するかまたは遺伝子産物を非機能的にする。いくつかの例では、機能的欠失はノックアウト変異として表される。減弱には、核酸配列を変化させること、遺伝子をより活性が低いプロモーターの制御下に置くこと、下方制御させること、対象遺伝子を標的とする干渉ＲＮＡ、リボザイムもしくはアンチセンスの配列を発現させることによるアミノ酸配列の変更、または当該技術分野で公知の他の任意の技術を介したアミノ酸配列の変更も含まれる。一例では、フィードバック阻害または産物でも反応体でもない組成物によって生じる阻害に対する特定酵素の感受性（経路非特異的フィードバック）を低くして、酵素活性が化合物の存在による影響を受けないようにする。他の場合において、活性が低くなるよう変化させた酵素を減弱しているといってもよい。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「欠失」とは、核酸分子から１つ以上のヌクレオチドを、またはタンパク質から１つ以上のアミノ酸を除去し、その両側の領域が互いに連結されていることを指す。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「ノックアウト」とは、発現または活性のレベルがゼロまで低下させられている遺伝子を指すことが意図される。いくつかの例では、遺伝子は、そのコード配列の一部または全部を欠失させることによりノックアウトされる。他の例では、遺伝子は、１つ以上のヌクレオチドをそのオープンリーディングフレーム内に導入し、それによりナンセンスタンパク質産物の翻訳、そうでない場合は非機能性タンパク質産物の翻訳をもたらすことによりノックアウトされる。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」とは、それに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。ベクターの一種は「プラスミド」であり、これは一般に、環状二本鎖のＤＮＡループで、その中にさらなるＤＮＡセグメントを連結することができるものを指すが、直鎖状二本鎖分子、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅から生じるもの、または環状プラスミドの制限酵素での処理から生じるものなども含まれる。他のベクターとしては、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。ベクターのもう一種はウイルスベクターであり、ウイルスベクターにおいては、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム内に連結されていてもよい（下記で詳述）。特定のベクターは、それが導入されている宿主細胞での自己複製能がある（例えば、宿主細胞で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞内に導入される際にその宿主細胞のゲノムに組み込まれる場合があるため、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定の好ましいベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。かかるベクターを本明細書では「組換えで発現されるベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。
【００５０】
「作動可能に連結された（Ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」または「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」発現制御配列とは、その発現制御配列が対象遺伝子に隣接して、かかる対象遺伝子を制御する連結、ならびにトランスに作用するかまたは離れて作用して対象遺伝子を制御する発現制御配列を指す。
【００５１】
用語「発現制御配列」とは、それが作動可能に連結されたコード配列の発現に影響を与えるために必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、転写開始、転写終結、プロモーター及びエンハンサーの適切な配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシング及びポリアデニル化のシグナルなど；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を高める配列；及び必要に応じ、タンパク質の分泌を高める配列が含まれる。かかる制御配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物では、かかる制御配列には一般にプロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列が含まれる。用語「制御配列」には、最低でも、発現にその存在が不可欠とされる全構成成分が含まれることが意図され、存在していると都合がよい追加の構成成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列などが含まれていてもよい。
【００５２】
用語「調節エレメント」とは、核酸分子の転写または翻訳に影響を与える任意の要素を指す。これらには、例として、調節タンパク質（例えば、転写因子）、シャペロン、シグナル伝達タンパク質、ＲＮＡｉ分子、アンチセンスＲＮＡ分子、マイクロＲＮＡ及びＲＮＡアプタマーが含まれるが、これに限定されない。調節エレメントは宿主生物にとって内在性であってよい。調節エレメントは宿主生物にとって外因性であってもよい。調節エレメントは、合成により発生した調節エレメントであってよい。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」、「プロモーターエレメント」、または「プロモーター配列」とは、対象のヌクレオチド配列に連結させた場合に、その対象ヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは一般的に、必ずその位置というわけではないが、そのプロモーターによってｍＲＮＡへの転写が制御される対象ヌクレオチド配列の５’（すなわち、上流）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写開始用の他の転写因子が特異的に結合する部位を提供する。プロモーターは宿主生物にとって内在性であってよい。プロモーターは宿主生物にとって外因性であってもよい。プロモーターは、合成により発生した調節エレメントであってよい。
【００５４】
本明細書に記載の組換え遺伝子を発現させるために有用なプロモーターには、構成的プロモーター及び誘導性／抑制性プロモーターの両方が含まれる。本発明の遺伝子操作された生物において複数の組換え遺伝子を発現させる場合、かかる異なる遺伝子は、異なるプロモーターによっても、また別々のオペロン中の同一プロモーターによっても制御することができ、また２つ以上の遺伝子の発現を、オペロンの一部としての単一プロモーターにより制御してもよい。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）とは、組換えベクターが導入されている細胞を指すことが意図される。かかる用語により、特定の対象細胞だけではなく、かかる細胞の子孫も指すことが意図されることを理解されるべきである。変異または環境の影響により継代とともに特定の改変が起こり得るため、かかる子孫は事実、親細胞と同一ではない場合があるが、それでも本明細書で使用する用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は単離された細胞であっても培養で増殖させた細胞株であってもよく、または生きている組織もしくは生物中に存在している細胞であってもよい。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「野生型」（すなわち、「ＷＴ」）とは、議論の対象である改変がなされていない比較用の株を指す。野生型は天然株、未改変株を指すのではなく、選択された改変がなされていない株を指す。例えば、組換え絹ポリペプチドを発現するように改変された２つのバージョンの組換え株であって、一方がｓｅｃ７２  ＫＯである上記組換え株を比較する場合には、上記ＫＯ株はΔｓｅｃ７２株と呼ばれる場合がある一方、もう一方のバージョンは「ＷＴ」と呼ばれる。
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」とは、短いポリペプチド、例えば、一般的に約５０アミノ酸長より短い、より一般的には約３０アミノ酸長より短いものを指す。本明細書で使用する用語は、類似体ならびに構造機能を模倣することで生物学的機能を模倣する模倣物を包含する。
【００５８】
用語「ポリペプチド」は、天然に生じるタンパク質と天然に生じないタンパク質の両方、ならびにその断片、変異体、誘導体及び類似体を包含する。ポリペプチドはモノマーでもポリマーでもよい。さらに、ポリペプチドは、各々が１つ以上の別個の活性を有する多数の異なるドメインを含んでよい。
【００５９】
「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」という用語は、その起源または誘導体源という点で、（１）その天然の状態ではそれに付随する天然の会合成分と会合していないタンパク質またはポリペプチド、（２）自然界では見られない純度で存在するタンパク質またはポリペプチドであり、その場合、純度は、他の細胞物質の存在に関して判定可能である（例えば、同一種由来の他のタンパク質を含まない）、（３）異なる種から得た細胞が発現するタンパク質またはポリペプチド、または（４）自然界では生じないタンパク質またはポリペプチド（例えば、自然界に見られるポリペプチドの断片であるか、または自然界では見られないアミノ酸類似体もしくはアミノ酸誘導体または標準ペプチド結合以外の結合が含まれているもの）である。したがって、化学的に合成されたポリペプチド、または天然での起源となる細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然での会合成分から「単離されている」。ポリペプチドまたはタンパク質は、当該技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して単離することにより、天然での会合成分を実質的に含まないようにしてもよい。このように定義した場合、「単離された」とは、そのように記載されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドが必ずしもその天然の環境から物理的に除かれている必要はない。
【００６０】
用語「ポリペプチド断片」とは、完全長ポリペプチドと比較して欠失を有する、例えば、アミノ末端及び／またはカルボキシ末端などの欠失を有するポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、ポリペプチド断片は、その断片のアミノ酸配列が天然に生じる配列での対応する位置と同一な連続配列である。断片は一般的に、少なくとも５、６、７、８、９または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６または１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０または４５アミノ酸、よりさらに好ましくは少なくとも５０または６０アミノ酸長、よりさらに好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。
【００６１】
あるタンパク質をコードする核酸配列が、第２のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有する場合、そのタンパク質は第２のタンパク質に対し「相同性」を有するかまたは「相同」である。あるいは、あるタンパク質が第２のタンパク質に対する相同性を有するのは、その２つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有する場合である。（したがって、「相同タンパク質」という用語は、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される）。本明細書で使用する場合、２つのアミノ酸配列領域間の相同性（特に、予測される構造類似性に関して）は、機能における類似性を意味すると解釈される。
【００６２】
タンパク質またはペプチドに関して「相同」を使用する場合、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なることが多いと認識される。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、化学的性質（例えば、電荷または疎水性）が類似する側鎖（Ｒ基）を持つ別のアミノ酸残基により置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換ではタンパク質の機能特性は実質的に変化しない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なっている場合、配列同一性（％）または相同性の程度を上方修正してその置換の保存的性質について補正してよい。こうした修正を行う手段は当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１及び２５：３６５−８９（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００６３】
２０種の従来のアミノ酸及びそれらの略語は慣例に従う。参照により本明細書に援用されるＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｇｒｅｎ  ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，２ｎｄ  ｅｄ．１９９１）を参照のこと。２０種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然型アミノ酸、例えば、α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など、及び他の非従来型アミノ酸も本発明のポリペプチドの適切な構成成分である場合がある。非従来型アミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で使用するポリペプチド表記では、標準的使用及び慣例に従って左側末端はアミノ末端に対応し、右側末端はカルボキシ末端に対応する。
【００６４】
以下の６群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００６５】
配列同一性（％）とも呼ばれることがあるポリペプチドの配列相同性は一般的に、シークエンス解析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，９１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５を参照のこと。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含めて、さまざまな置換、欠失及び他の改変に対して割り当てられた相同性尺度を使用して類似配列を一致させる。例えば、ＧＣＧには、「Ｇａｐ」及び「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムが同梱されており、それらをデフォルトのパラメータで使用して、密接に関連するポリペプチド同士、例えば、異なる種の生物に由来する相同ポリペプチド同士などの配列相同性または配列同一性を、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧ  バージョン６．１を参照のこと。
【００６６】
異なる生物由来の配列を多数含むデータベースと特定のポリペプチド配列とを比較する際に有用なアルゴリズムはＢＬＡＳＴというコンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）、Ｇｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）、Ｍａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７））、特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））である。
【００６７】
ＢＬＡＳＴｐの好ましいパラメータは、期待値：１０（デフォルト）；フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開くコスト：１１（デフォルト）；ギャップを伸長するコスト：１（デフォルト）；最大アラインメント：１００（デフォルト）；文字列サイズ：１１（デフォルト）；表示件数：１００（デフォルト）；ペナルティー行列：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。
【００６８】
ＢＬＡＳＴｐの好ましいパラメータは、期待値：１０（デフォルト）；フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開くコスト：１１（デフォルト）；ギャップを伸長するコスト：１（デフォルト）；最大アラインメント：１００（デフォルト）；文字列サイズ：１１（デフォルト）；表示件数：１００（デフォルト）；ペナルティー行列：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。相同性を比較するポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約１６アミノ酸残基、通常少なくとも約２０残基、より一般には少なくとも約２４残基、一般的に少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基より多くになる。多数の異なる生物に由来する配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。アミノ酸配列を使用したデータベース検索は、ｂｌａｓｔｐ以外の当該技術分野で公知のアルゴリズムにより測定することができる。例えば、ポリペプチド配列は、ＧＣＧ  バージョン６．１のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡは、問い合わせ配列と検索配列の間で最も重複している領域のアラインメント及び配列同一性（％）を提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）（参照により本明細書に援用されるものとする）。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性（％）は、参照により本明細書に援用されるＧＣＧ  バージョン６．１で提供されるＦＡＳＴＡをそのデフォルトのパラメータで使用して決定することができる（文字列サイズは２、またスコア行列はＰＡＭ２５０）。
【００６９】
本明細書全体及び請求項を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語句、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述されている整数または整数群が包含されることを意味し、他のいかなる整数または整数群も除外されないことを意味することを理解されるであろう。
【００７０】
例示的な方法及び材料を以下に記載するが、本明細書に記載の方法及び材料と類似または同等のものも本発明を実施する際に使用可能であり、当業者には明らかとなるであろう。本明細書で言及される刊行物及び他の参考文献はいずれも、参照によりその全体が援用される。矛盾がある場合は、定義も含め、本明細書が優先する。材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定的ではないことが意図される。
【００７１】
概要
本明細書では、酵母株（例えば，Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における組換えで発現されるタンパク質の分泌及び生産性を改善する組換え株及び上記分泌及び生産性の改善方法が提供される。
【００７２】
分泌されることになるタンパク質は、最初に小胞体の膜を通過する必要がある（ＥＲ転座）。複数の標的経路が伸長を行うリボソームまたは完全に翻訳されたタンパク質をＥＲ膜へとリクルートし、それらのポリペプチド鎖は、トランスロコンと呼ばれる孔形成タンパク質複合体を介して侵入する。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰ．  ｐａｓｔｏｒｉｓを含む酵母は、２種のトランスロコン、ＳＥＣ６１複合体及びＳＳＨ１複合体を発現する。それぞれの複合体は核となる三量体複合体から構成されるが、ＳＥＣ６１トランスロコンは四量体ＳＥＣ６３複合体とも結合する。図１は、それぞれのこれらのトランスロコン複合体内に含まれるタンパク質サブユニットを示す。
【００７３】
ＳＥＣ７２はＳＥＣ６３複合体の必須ではない構成因子をコードするが、ＳＥＣ７２の欠失（Δｓｅｃ７２）により一部の分泌前駆体の蓄積が生じる。驚くべきことに、本明細書において、本発明者らは、Δｓｅｃ７２株の組換え絹ポリペプチドの分泌が改善されたことを明らかにしている。
【００７４】
いくつかの実施形態では、上記株は、ｓｅｃ７２遺伝子（配列番号１）が欠失するように改変される。本発明者らが本明細において説明し、明らかにしたように、タンパク質を分泌するためにＥＲ中に移行させるための補助因子であるＳＥＣ７２（配列番号２）を発現するｓｅｃ７２を欠失させると、ベンチスケールでのブロックモデルアッセイにおいて予想外に絹の分泌を促進する（最大＋７５％）。このことは、発現レベル、シグナル配列、及び異なる絹全体にわたって当てはまる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ｓｅｃ７２の欠失は、例えば図２に示すように、酵母選択マーカーに隣接する、ｓｅｃ７２に対する５’ホモロジーアーム及びｓｅｃ７２に対する３’ホモロジーアームを有するプラスミドを用いて実現される。Δｓｅｃ７２を欠失させることにより、間接的に分泌を促進することができる転写適応（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）が誘発された。ｓｅｃ７２遺伝子及びＳＥＣ７２タンパク質の配列を表１に示す。
【００７６】
（表１）ｓｅｃ７２オープンリーディングフレーム及びＳＥＣ７２タンパク質の配列
2021524227.tif 000004
【００７７】
いくつかの観測を行ったケースでは、ｓｅｃ７２の欠失により株の増殖が遅くなり、Δｓｅｃ７２株の発酵産生スクリーニングはグルコースの蓄積との闘いであった。したがって、本明細書では、いくつかの実施形態によれば、ＳＳＨ１トランスロコン複合体を含むタンパク質を組換えで過剰発現する株も提供される。本明細書において明らかなように、Δｓｅｃ７２菌株におけるＳＳＨ１トランスロコン複合体の過剰発現は、株の増殖速度及び発酵能力を向上させた一方、分泌の改善を維持した。組み換え絹様ブロックポリペプチドを発現する遺伝子（すなわち、１８Ｂ）を４コピーしかもたないこの欠失−過剰発現の組み合わせの株の試験では、６コピーの絹様ブロックポリペプチドを発現する遺伝子（すなわち、１８Ｂ）をもつ株に対して、同様の力価及び比生産性の向上（＋１８％）が示された。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＳＳＨ１トランスロコン複合体は、組換えＳＢＨ２、ＳＳＳ１、及びＳＳＨ１をコードする遺伝子を含むプラスミド（図３）を挿入することにより、宿主細胞において過剰発現される。これらの遺伝子及び発現されたタンパク質の配列を表２に示す。
【００７９】
（表２）ＳＳＨ１トランスロコン複合体のサブユニットのためのオープンリーディングフレーム及びタンパク質の配列
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【００８０】
プロテアーゼノックアウト
いくつかの実施形態では、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるプロテアーゼ活性を減弱させるために、これらの酵素をコードする遺伝子は活性が低下もしくは消失するように不活性化または変異導入されている。これは、その遺伝子自体への変異もしくは挿入を介して、または遺伝子の調節エレメントの改変を介して行うことができる。これは、標準的な酵母の遺伝学的技法によって実現可能である。かかる技法の例としては二重相同組換えによる遺伝子置換が挙げられ、この二重相同組換えにおいては、不活性化すべき遺伝子に隣接する相同領域が、選択マーカー遺伝子（抗生物質耐性遺伝子または酵母株の栄養要求性を相補する遺伝子など）に隣接するベクターにクローニングされる。いくつかの実施形態では、図４Ａに示すノーセオスリシン選択プラスミドをベースプラスミドとして使用することができ、耐性カセットに隣接するホモロジーアーム（ＨＡ）（図４Ｂ及び図４Ｃ）を使用することができ、上記ホモロジーアームはノックアウトすべき所望のプロテアーゼを特異的に標的とする。プロテアーゼノックアウトの説明及び組換えタンパク質の分解を阻害するように宿主細胞を改変する方法は、米国出願第１５／７２４，１９６号及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５４９９７号に提示され、上記出願のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００８１】
別法として、上記相同領域をＰＣＲ増幅し、オーバーラップＰＣＲで選択マーカー遺伝子に連結することができる。その後、当該技術分野で公知の方法、例えば、電気穿孔法によりかかるＤＮＡ断片をＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓに形質転換する。その後、選択的条件下で増殖させる形質転換体を、標準的な技法、例えば、ゲノムＤＮＡのＰＣＲまたはサザンブロットにより遺伝子破壊事象について分析する。代替的実験では、単一相同組換えにより遺伝子不活性化を実現することができ、その場合、例えば、遺伝子のＯＲＦの５’末端を、やはり選択マーカー遺伝子を含有するプロモーター不含ベクター上にクローニングする。かかるベクターが、標的遺伝子相同断片でのみベクターを切断する制限酵素を用いた消化によって線状になった時点で、かかるベクターをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓに形質転換する。標的遺伝子部位への組み込みは、ゲノムＤＮＡのＰＣＲまたはサザンブロットにより確認される。この方法では、ベクター上にクローニングされた遺伝子断片の複製がゲノム内で実現し、それにより標的遺伝子座の２コピー、すなわち、ＯＲＦが不完全なために（発現したとしても）短縮された不活性なタンパク質を発現する第１のコピー、及び転写を誘導するプロモーターがない第２のコピーが生じる。
【００８２】
別法として、トランスポゾン変異誘発を使用して標的遺伝子を不活性化する。かかる変異体のライブラリーは、ＰＣＲで標的遺伝子内の挿入事象についてスクリーニングを行うことができる。
【００８３】
遺伝子操作／ノックアウトを行った株の機能的表現型（すなわち、欠損）は、当該技術分野で公知の技法を使用して評価することができる。例えば、遺伝子操作株のプロテアーゼ活性の欠損は、当該技術分野で公知の多種多様な方法のいずれを使用しても確認することができ、特に、発色プロテアーゼ基質の加水分解活性アッセイ、選択プロテアーゼに対する基質タンパク質のバンドシフトなどがある。
【００８４】
本明細書に記載するプロテアーゼ活性の減弱をノックアウト変異以外の機構によって達成することができる。例えば、核酸配列を変化させること、遺伝子をより活性が低いプロモーターの制御下に置くこと、下方制御させること、対象遺伝子を標的とする干渉ＲＮＡ、リボザイムもしくはアンチセンスの配列を発現させることによるアミノ酸配列の変更、または当該技術分野で公知の他の任意の技術などによるアミノ酸配列の変更によって、所望のプロテアーゼを減弱させることができる。好ましい株では、ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４（ＹＰＳ１−１）及びＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７（ＹＰＳ１−２）（例えば、配列番号１０及び１２を含むポリペプチド）にてコードされるプロテアーゼのプロテアーゼ活性は、上記方法のいずれかで減弱される。いくつかの態様では、本発明は、ＹＰＳ１−１遺伝子及びＹＰＳ１−２遺伝子（例えば、配列番号９及び配列番号１１に記載の）が不活性化されたメチロトローフ酵母菌株、特にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株を対象とする。いくつかの実施形態では、プロテアーゼをコードするさらなる遺伝子を本明細書で提供する方法に従ってノックアウトし、当該の株により発現される所望のタンパク質産物のプロテアーゼ活性をさらに低下させてもよい。
【００８５】
（表３）Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける欠失のために標的とされるプロテアーゼに対するオープンリーディングフレームヌクレオチド配列及びポリペプチド配列
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【００８６】
組換え株の製造
本明細書は、例えば、組換え遺伝子を送達するベクターもしくはノックアウトするベクターを使用するかまたは所望の内在性遺伝子を減弱させる他の方法などで、株を形質転換して活性を低下させる方法を提供する。これらのベクターは、複製起点及び選択マーカー（一般的に抗生物質耐性であるが他の多くの方法が可能）を含有するベクター骨格、または標的細胞の染色体内への組み込みを可能にする線状断片という形態をとっていてもよい。ベクターは、選択した生物及び挿入方法に対応していなければならない。
【００８７】
一旦ベクター要素が選択されたら、多くの異なる方法でベクターの構築を実施することができる。一実施形態では、ＤＮＡ合成サービスを利用しても、全ベクターを個々に作製する方法を使用してもよい。
【００８８】
一旦それぞれのベクターのＤＮＡ（挿入及び操作に必要なさらなる要素を含む）が得られたら、それをアセンブルする必要がある。可能なアセンブリ方法は多数あり、これには、制限酵素クローニング、平滑末端ライゲーション、及びオーバーラップアセンブリ［例えば、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｐ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ，６（５），３４３−３４５（２００９）、及びＧｅｎｅＡｒｔ  Ｋｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｇｅｎｅａｒｔ＿ｓｅａｍｌｅｓｓ＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ａｎｄ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ＿ｍａｎ．ｐｄｆ）を参照のこと］が含まれるが、これに限定されない。オーバーラップアセンブリは、要素のすべてが正しい位置に確実にアセンブルされ、いかなる望ましくない配列も導入されない方法を提供する。
【００８９】
上記で作製されたベクターは、標準の分子生物学技術、例えば、分子クローニングなどを使用して標的細胞に挿入することができる。一実施形態では、標的細胞は、所望産物の産生に必要とされる遺伝子をすでに含有するようすでに遺伝子操作されているかまたは選択されているが、これを、以降のベクターの挿入中または挿入後に行ってもよい。
【００９０】
生物及びライブラリー要素の種類（プラスミドまたはゲノムの挿入）に応じて、ＤＮＡを含むベクターを挿入して細胞内に組み込むいくつかの公知の方法を使用してよい。これらの方法としては、例えば、局所環境からＤＮＡを取り込んで複製することができる微生物の形質転換、電気穿孔法もしくは化学的手段による形質転換、ウイルスもしくはファージを用いた形質導入、２つ以上の細胞の接合（ｍａｔｉｎｇ）、または異なる細胞からの接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を挙げることができる。
【００９１】
細菌細胞に組換えＤＮＡを導入するいくつかの方法が当該技術分野で公知であり、それらには、形質転換、形質導入、及び電気穿孔法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９），Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙを参照のこと）が挙げられるが、これに限定されるものではない。形質転換用の市販のキット及び細菌宿主細胞の非限定的な例としては、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，ＮＪ，ＵＳＡ）、Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５α（商標）、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。電気穿孔法用の市販のキット及び細菌宿主細胞の非限定的な例としては、Ｚａｐｐｅｒｓ（商標）エレクトロコンピテントセル（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，ＮＪ，ＵＳＡ）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅエレクトロポレーション−コンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）が挙げられる。
【００９２】
真核細胞に組換え核酸を導入するいくつかの方法が当該技術分野で公知である。例示的な方法としては、トランスフェクション、電気穿孔法、リポソームによる核酸送達、宿主細胞へのマイクロインジェクション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９），Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙを参照のこと）が挙げられる。真核細胞に組換え核酸をトランスフェクションするための市販のキット及び試薬の非限定的な例としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）試薬、リン酸カルシウムトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ（登録商標）トランスフェクション試薬、ＬｉｐｏＴＡＸＩ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。別法として、組換え核酸は、バキュロウイルスベクターの使用により昆虫細胞（例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標））内に導入されてもよい。
【００９３】
各クローンを別々に試験できるよう形質転換された細胞を単離する。一実施形態では、これは、形質転換された細胞だけが生き残って再生することを保証する選択薬剤を含有する（または欠いている）培地の１つ以上のプレートで塗抹培養することにより行う。この特定薬剤は、抗生物質（ライブラリーが抗生物質耐性マーカーを含有する場合）、代謝物欠如（栄養要求性の相補用）、または他の選択手段であってよい。細胞は増殖して個々のコロニーとなり、その各々が単一クローンを含有する。
【００９４】
タンパク質、代謝物、もしくは他の産物の所望の産生に関して、プロテアーゼ活性の低下に関して、増殖に関して、または分泌活性の増加に関して、コロニーのスクリーニングを行う。一実施形態では、産物の産生力価または産生効率が最も高い（または十分に高い）組換え細胞がスクリーニングにより特定される。これには、分解産物の比率の低下または細胞から分泌され、かつ細胞培養物から回収される所望ポリペプチドの総量の増加が含まれる。
【００９５】
このアッセイは、個々のクローンをマルチウェル培養プレート中、１ウェル当り１クローンで増殖させることにより実施可能である。一旦細胞が適切なバイオマス密度に達した後、それらをメタノールで誘導する。ある時間の経過後、一般的には２４〜７２時間の誘導後、遠心分離機で回転させて細胞をペレット状にし、上清を除去することによって培養物を採取する。その後、それぞれの培養物の上清を試験して、所望の分泌量が達成されているかを判定してもよい。
【００９６】
絹の配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変株は絹様ポリペプチド配列を組換えで発現する。いくつかの実施形態では、上記絹様ポリペプチド配列は、１）絹ポリペプチド配列由来の反復ドメインを混合して一致させることにより生成したブロック共重合体ポリペプチド組成物、及び／または２）組換えで発現された、大きさが、工業的に拡張可能な微生物から分泌させることによって有用な繊維を形成するのに十分に大きい（約４０ｋＤａ）ブロック共重合体ポリペプチドである。公開されているクモ糸ポリペプチドのアミノ酸配列のほぼすべてに由来する配列を含め、絹の反復ドメイン断片を遺伝子操作した大きい（約４０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ）ブロック共重合体ポリペプチドは、本明細書に記載の改変微生物で発現させることができる。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチド配列は、繊維形成能のある、高発現かつ高分泌のポリペプチドを産生するよう一致させ、設計される。いくつかの実施形態では、宿主改変株におけるプロテアーゼ遺伝子のノックアウトまたはプロテアーゼ活性の低下により、絹様ポリペプチドの分解が抑制される。いくつかの実施形態では、ｓｅｃ７２のノックアウト及びＳＳＨ１トランスロコン複合体の過剰発現によって分泌が改善する一方、増殖における欠点が軽減され、当該株の増殖が維持されるかまたは向上する。
【００９７】
本明細書では、いくつかの実施形態において、絹ポリペプチド配列空間全体にわたる絹ポリペプチドドメインを網羅的に組み合わせて混合することにより遺伝子操作したブロック共重合体を発現及び分泌させる組成物が提供され、上記ブロック共重合体は分解が最小限である。本明細書のいくつかの実施形態では、分解が最小限の拡張可能な生物（例えば、酵母、真菌類、及びグラム陽性菌）におけるブロック共重合体の分泌方法が提供される。いくつかの実施形態では、上記ブロック共重合体ポリペプチドは、０以上のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）、１つ以上の反復ドメイン（ＲＥＰ）、及び０以上のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）を含む。上記実施形態のいくつかの態様では、ブロック共重合体ポリペプチドは、１００個を超えるアミノ酸の単鎖ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、上記ブロック共重合体ポリペプチドは、参照によりその全体が援用される国際公開公報第ＷＯ／２０１５／０４２１６４号、‘‘Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｉｌｋ  Ｆｉｂｅｒｓ’’に開示のブロック共重合体ポリペプチドの配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なドメインを含む。
【００９８】
数種の天然クモ糸がこれまでに同定されている。自然に出糸されたクモ糸の各種の機械的性質は、そのクモ糸の分子組成と密接な関係があると考えられている。例えば、Ｇａｒｂ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｔａｎｇｌｉｎｇ  ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ，ＢＭＣ  Ｅｖｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０：２４３（２０１０）、Ｂｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ，ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．，１１：３（２０１２）、Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，６８：２，ｐｇ．１６９−１８４（２０１１）、及びＨｕｍｅｎｉｋ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ：ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｆｉｂｅｒ，Ｐｒｏｇ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｓｃｉ．，１０３，ｐｇ．１３１−８５（２０１１）を参照のこと。例えば：
【００９９】
ブドウ状（ＡｃＳｐ）絹糸は、適度に高い強度と適度に高い伸縮性とが組み合わされた結果、靭性が高い傾向がある。ＡｃＳｐ絹糸は、しばしばポリセリンとＧＰＸのモチーフが組み込まれている大きいブロック（「集合体の反復」）サイズを特徴とする。管状（ＴｕＳｐまたは円筒状）絹糸は、直径が大きく、中程度の強度と高い伸縮性を有する傾向がある。ＴｕＳｐ絹糸は、そのポリセリンとポリスレオニンの含量、及び短いポリアラニン配列を特徴とする。大瓶状（ＭａＳｐ）絹糸は、高い強度と中程度の伸縮性を有する傾向がある。ＭａＳｐ絹糸は、２つのサブタイプであるＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２のいずれか１つである。ＭａＳｐ１絹糸は一般にＭａＳｐ２絹糸より低伸縮性であり、ポリアラニン、ＧＸ、及びＧＧＸのモチーフを特徴とする。ＭａＳｐ２絹糸は、ポリアラニン、ＧＧＸ、及びＧＰＸのモチーフを特徴とする。小瓶状（ＭｉＳｐ）絹糸は、中程度の強度と中程度の伸縮性を有する傾向がある。ＭｉＳｐ絹糸は、ＧＧＸ、ＧＡ、及びポリＡのモチーフを特徴とし、しばしば約１００のアミノ酸からなるスペーサーエレメントを含有する。鞭毛状（Ｆｌａｇ）絹糸は、非常に高い伸縮性と中程度の強度を有する傾向がある。Ｆｌａｇ絹糸は通常、ＧＰＧ、ＧＧＸ、及び短いスペーサーのモチーフを特徴とする。
【０１００】
それぞれの絹糸種の性質は種ごとに異なる場合があり、ライフスタイルが異なるクモ（例えば、動き回らずに巣を張る造網性のクモと、徘徊して捕食するクモ）または進化的に古い方のクモは、上記説明とは異なる絹を産生する場合がある（クモの多様性及び分類についての記載に関しては、Ｈｏｒｍｉｇａ，  Ｇ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｓｗｏｌｄ，  Ｃ．Ｅ．，  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ，  ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ，  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｂ−ｗｅａｖｉｎｇ  ｓｐｉｄｅｒｓ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｅｎｔｏｍｏｌ．  ５９，  ｐｇ．４８７−５１２（２０１４）、及びＢｌａｃｋｅｄｇｅ，  Ｔ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｗｅｂ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｉｄｅｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｒａ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １０６：１３，  ｐｇ．  ５２２９−５２３４（２００９）を参照のこと）。しかしながら、天然絹タンパク質の反復ドメインに対する配列類似性及び／またはアミノ酸組成類似性を有する合成ブロック共重合体ポリペプチドを使用して、天然絹繊維に対応する性質を再現する一貫した絹様繊維を商業規模で製造することが可能である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、推定絹配列の一覧は、例えば、「ｓｐｉｄｒｏｉｎ」、「ｆｉｂｒｏｉｎ」、「ＭａＳｐ」などの関連用語をＧｅｎＢａｎｋで検索して収集することができ、それらの配列を、別個に取り組んだ配列決定により得たさらなる配列と一緒にプールすることができる。その後、配列をアミノ酸に翻訳して重複エントリーをフィルタリングし、手作業で各ドメイン（ＮＴＤ、ＲＥＰ、ＣＴＤ）に分割する。いくつかの実施形態では、候補アミノ酸配列を、Ｐｉｃｈｉａ（コマガテラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ））ｐａｓｔｏｒｉｓでの発現用に最適化されたＤＮＡ配列に逆翻訳する。ＤＮＡ配列をそれぞれ発現ベクターにクローニングし、Ｐｉｃｈｉａ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）ｐａｓｔｏｒｉｓに形質転換する。いくつかの実施形態では、発現及び分泌の成功を示した各種の絹ドメインはその後、組み合わせ様式でアセンブルされ、繊維形成能のある絹分子が構築される。
【０１０２】
絹ポリペプチドは特徴的に、反復ドメイン（ＲＥＰ）に非反復領域（例えば、Ｃ末端ドメイン及びＮ末端ドメイン）が隣接して構成される。一実施形態では、Ｃ末端ドメイン及びＮ末端ドメインのいずれも７５〜３５０アミノ酸長である。上記反復ドメインは階層構造を示す。上記反復ドメインは一連のブロック（反復単位とも呼ばれる）を含む。上記ブロックは、絹の反復ドメイン全体にわたり、ときに完全に、ときに不完全に（準反復ドメインを構成）繰り返される。ブロックの長さ及び組成は、異なる絹の種類間、また異なる種間で変化する。表１は、選択した種及び絹種のブロック配列例の一覧であり、さらなる例が、Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，６８：２，ｐｇ  １６９−１８４（２０１１）、及びＧａｔｅｓｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｔｒｅｍｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｆｉｂｒｏｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：５５１３，ｐｇ．２６０３−２６０５（２００１）に記載されている。場合によっては、ブロックを通常パターンで並べ、絹配列の反復ドメインに複数回（通常２〜８回）出現する、より大きなマクロリピートを形成してよい。反復ドメインまたはマクロリピートの内側で繰り返されるブロックと、反復ドメイン内で繰り返されるマクロリピートとを間隔エレメントで分離してよい。いくつかの実施形態では、ブロック配列はグリシンに富む領域と、それに続くポリＡ領域とを含む。いくつかの実施形態では、短い（約１〜１０）アミノ酸モチーフがブロック内に複数回出現する。本発明の目的上、円順列とは関係なく、異なる天然絹ポリペプチドに由来するブロックを選択することができる（すなわち、同定されたブロックが他の点において絹ポリペプチド間で類似する場合に円順列のため整列しないことがある）。したがって、例えば、ＳＧＡＧＧ（配列番号２３）という「ブロック」は本発明の目的上、ＧＳＧＡＧ（配列番号２４）と同一であり、またＧＧＳＧＡ（配列番号２５）と同一であり、それらはいずれも互いに円順列にすぎない。所与の絹配列について選択された特定順列は、他の何よりも利便性によって決定されてもよい（通常、Ｇで開始）。ＮＣＢＩデータベースから得た絹配列は、ブロック及び非反復領域に分割することができる。
【０１０３】
（表４）ブロック配列の試料
2021524227.tif 000010
2021524227.tif 000011
【０１０４】
本発明特定の実施形態による、ブロック及び／またはマクロリピートドメイン由来の繊維形成ブロック共重合体ポリペプチドは、参照により援用される国際公開公報第ＷＯ／２０１５／０４２１６４号に記載されている。ＧｅｎＢａｎｋなどのタンパク質データベースから得た天然絹配列、または新規に行った配列決定により得た天然絹配列はドメイン（Ｎ末端ドメイン、反復ドメイン、及びＣ末端ドメイン）により破壊される。合成後に集合させて繊維を構築するために選択されるＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインの配列としては、天然アミノ酸配列情報及び本明細書に記載の他の改変が挙げられる。反復ドメインを反復配列に分解するが、この反復配列は、重要なアミノ酸情報を獲得する代表的ブロック（通常は１〜８で、絹の種類による）を含有する一方で、アミノ酸をコードするＤＮＡの大きさを、容易に合成可能な断片まで縮小する。いくつかの実施形態では、適切に形成されたブロック共重合体ポリペプチドは、少なくとも１つの反復配列を含む少なくとも１つの反復ドメインを含み、任意選択で、Ｎ末端ドメイン及び／またはＣ末端ドメインを隣接させる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、反復ドメインは少なくとも１つの反復配列を含む。いくつかの実施形態では、反復配列は１５０〜３００アミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、反復配列は複数のブロックを含む。いくつかの実施形態では、反復配列は複数のマクロリピートを含む。いくつかの実施形態では、ブロックまたはマクロリピートは複数の反復配列全体において分割される。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、反復配列は、ＤＮＡアセンブリ要件を満たすため、グリシンで開始され、かつ、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、メチオニン（Ｍ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で終わることはできない。いくつかの実施形態では、いくつかの反復配列は、天然配列と比べて変化させることができる。いくつかの実施形態では、反復配列は、ポリペプチドのＣ末端へのセリン付加などにより変化させることができる（Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｍ、またはＤでの終止を回避するため）。いくつかの実施形態では、反復配列は、不完全ブロックに別のブロック由来の相同配列を充てんして改変することができる。いくつかの実施形態では、反復配列は、ブロックまたはマクロリピートの順序を再構成して改変することができる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、非反復のＮ末端及びＣ末端のドメインを合成用に選択することができる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ドメインは、リーディングシグナル配列、例えば、ＳｉｇｎａｌＰにより同定されたものなどの除去によるものであり得る（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｎ．，ｅｔ．ａｌ．，ＳｉｇｎａｌＰ  ４．０：ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：１０，ｐｇ．７８５−７８６（２０１１）。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ドメイン配列、反復配列、またはＣ末端ドメイン配列は、アゲレノプシス・アペルタ（Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ  ａｐｅｒｔａ）、アリアチプス・グロサス（Ａｌｉａｔｙｐｕｓ  ｇｕｌｏｓｕｓ）、アフォノペルマ・シーマニー（Ａｐｈｏｎｏｐｅｌｍａ  ｓｅｅｍａｎｎｉ）、アプトスチチュス種（Ａｐｔｏｓｔｉｃｈｕｓ  ｓｐ．）ＡＳ２１７、アプトスチチュス種ＡＳ２２０、アラネウス・ディアデマツス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）、アラネウス・ゲムモイデス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｇｅｍｍｏｉｄｅｓ）、アラネウス・ヴェントリコサス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｓ）、アルギオペ・アモエナ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｍｏｅｎａ）、アルギオペ・アルゲンタタ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｒｇｅｎｔａｔａ）、アルギオペ・ブルエンニチ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ）、アルギオペ・トリファスシアタ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ）、アチポイデス・リヴェルシ（Ａｔｙｐｏｉｄｅｓ  ｒｉｖｅｒｓｉ）、アヴィキュラリア・ジュルエンシス（Ａｖｉｃｕｌａｒｉａ  ｊｕｒｕｅｎｓｉｓ）、ボスリオシルツム・カリフォルニカム（Ｂｏｔｈｒｉｏｃｙｒｔｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）、デイノピス・スピノサ（Ｄｅｉｎｏｐｉｓ  Ｓｐｉｎｏｓａ）、ディグエチア・カニチエス（Ｄｉｇｕｅｔｉａ  ｃａｎｉｔｉｅｓ）、ドロメデス・テネブロサス（Ｄｏｌｏｍｅｄｅｓ  ｔｅｎｅｂｒｏｓｕｓ）、エウアグルス・キソセウス（Ｅｕａｇｒｕｓ  ｃｈｉｓｏｓｅｕｓ）、エウプロスセノプス・オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ガステラキャンタ・マンモサ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｍａｍｍｏｓａ）、ヒポキルス・トレルリ（Ｈｙｐｏｃｈｉｌｕｓ  ｔｈｏｒｅｌｌｉ）、ククルカニア・ヒベルナリス（Ｋｕｋｕｌｃａｎｉａ  ｈｉｂｅｒｎａｌｉｓ）、ラトロデクツス・ヘスペルス（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、メガヘクスラ・フルヴァ（Ｍｅｇａｈｅｘｕｒａ  ｆｕｌｖａ）、メテペイラ・グランディオサ（Ｍｅｔｅｐｅｉｒａ  ｇｒａｎｄｉｏｓａ）、ネフィラ・アンチポディアナ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ａｎｔｉｐｏｄｉａｎａ）、ネフィラ・クラヴァタ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ）、ネフィラ・クラヴィペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）、ネフィラ・マダガスカリエンシス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）、ネフィラ・ピリペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｐｉｌｉｐｅｓ）、ネフィレンギス・クルエンタタ（Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ  ｃｒｕｅｎｔａｔａ）、パラウィキシア・ビストリアタ（Ｐａｒａｗｉｘｉａ  ｂｉｓｔｒｉａｔａ）、ペウセチア・ヴィリダンス（Ｐｅｕｃｅｔｉａ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）、プレクトレウリス・トリスチス（Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ  ｔｒｉｓｔｉｓ）、ポエシロセリア・レガリス（Ｐｏｅｃｉｌｏｔｈｅｒｉａ  ｒｅｇａｌｉｓ）、テトラグナタ・カウアイエンシス（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ  ｋａｕａｉｅｎｓｉｓ）、またはウロボルス・ディヴェルサス（Ｕｌｏｂｏｒｕｓ  ｄｉｖｅｒｓｕｓ）に由来し得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、アルファ接合因子ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、別の内在性または異種の分泌シグナルコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、３Ｘ  ＦＬＡＧヌクレオチドコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、６〜８のＨｉｓ残基などの他のアフィニティータグに作動可能に連結される。絹ポリペプチドヌクレオチドのコード配列を宿主細胞に送達するためのベクターの例を図５に示すが、図５は、分泌シグナル及びとＦＬＡＧタグを含む、絹様ポリペプチドを発現するためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むベクターのプラスミドマップを表している。上記ＯＲＦはｐＧＣＷ１４プロモーター及びｔＡＯＸ１ターミネーターに作動可能に連結されている。ベクターはまた、形質転換に成功した細胞を選択するための選択マーカーも含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、上記絹ポリペプチドは全長クモ糸ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、上記全長クモ糸ポリペプチドは、大瓶状腺スピドロン１（ＭａＳｐｌ）または大瓶状腺スピドロイン２（ＭａＳｐ２）である。
【０１１１】
絹様ポリペプチド
いくつかの実施形態では、本明細書に開示するＰ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ株は絹様ポリペプチドを発現するよう改変されている。好ましい実施形態の絹様ポリペプチドの製造方法は、参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１５／０４２１６４、特に第１１４段落〜第１３４段落に提示されている。ＷＯ２０１５／０４２１６４には、Ａｒｇｉｏｐｅ  ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ種由来などのＭａＳｐ２由来の組換えクモ糸タンパク質断片配列に基づく合成タンパク質性共重合体が開示されている。２〜２０個の反復単位を含む絹様ポリペプチドが記載されており、上記ポリペプチドにおいて、各反復単位の分子量は約２０ｋＤａより大きい。上記共重合体の各反復単位内には、多数の「準反復単位」に組織化されている約６０を超えるアミノ酸残基がある。いくつかの実施形態では、本開示に記載のポリペプチドの反復単位の、ＭａＳｐ２引き綱絹タンパク質の配列に対する配列同一性は、少なくとも９５％である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、絹様ポリペプチドの各「反復単位」は、２〜２０個の「準反復」単位（すなわち、ｎ３は２〜２０である）を含む。準反復は正確な反復である必要はない。各反復は連鎖状の準反復で構成されていてもよい。式１は、本開示及び参照により援用されるＷＯ２０１５／０４２１６４に従った反復単位の組成を示す。各絹様ポリペプチドは、１つ以上の式１によって規定される反復単位を有していてもよい。
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【０１１３】
組成の可変要素Ｘ１（「モチーフ」と呼ばれる）は、以下の式２に示すアミノ酸配列のいずれか１つに従い、Ｘ１は各準反復単位内で無作為に変動する。
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【０１１４】
再び式１に言及すると、式１で
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で表される準反復単位の組成要素は、「第１の領域」と呼ばれる。準反復単位は、一部は、その準反復単位内で第１の領域が４〜８回繰り返されて形成される。すなわち、ｎ１の値は、単一の準反復単位内で繰り返される第１領域単位の数を示し、かかるｎ１の値は４、５、６、７、または８のいずれか１つである。「（Ａ）ｎ２」（配列番号１９）で表される組成要素（すなわち、ポリＡ配列）は「第２の領域」と呼ばれ、それぞれの準反復単位内でアミノ酸配列「Ａ」をｎ２回繰り返すことにより形成される（配列番号１９）。すなわち、ｎ２の値は、単一準反復単位内で繰り返される第２の領域の単位の数を示し、上記ｎ２の値は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドの反復単位の、式１及び２に記載の準反復を含有する配列に対する配列同一性は、少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドの反復単位の、式１及び２に記載の準反復を含有する配列に対する配列同一性は、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。
【０１１５】
さらなる実施形態では、３つの「長い」準反復には、３つの「短い」準反復単位が続く。短い準反復単位は、ｎ１＝４または５のものである。長い準反復単位は、ｎ１＝６、７または８のものと定義される。いくつかの実施形態では、短い準反復のいずれも、反復単位の各準反復単位内の同一の位置に同一のＸ１モチーフを有する。いくつかの実施形態では、６つの準反復単位のうち３つ以下の準反復単位が同一のＸ１モチーフを共有する。
【０１１６】
さらなる実施形態では、反復単位は、反復単位内で同一のＸ１を続けて３回以上出現させて用いない準反復単位で構成される。さらなる実施形態では、反復単位は準反復単位で構成され、ここで、準反復のうち少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の準反復は、反復単位の単一準反復単位内で同一のＸ１を続けて３回以上用いない。
【０１１７】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書では、低分解性の絹様ポリペプチドを組換えで発現して、細胞培養物から単離された産物に存在する完全長ポリペプチドの量を増大させる酵母菌株が提供される。いくつかの実施形態では、絹様ポリペプチドを発現する菌株は、ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４ノックアウト及びＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７ノックアウトを含むＰ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ株である。いくつかの実施形態では、絹様ポリペプチドを発現する菌株は、ｓｅｃ７２ノックアウト及び／または過剰発現されたＳＳＨ１トランスロコン複合体を含むＰ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ株である。
【０１１８】
（表５）１８Ｂベクター
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【０１１９】
等価物及び範囲
当業者であれば、本明細書に記載の本発明に従った特定の実施形態の多くの等価物を認識するであろうし、または慣用の範囲の実験を用いて該等価物を確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の「発明を実施するための形態」に限定されることを意図するものではなく、その範囲は添付の特許請求の範囲に記載されるとおりである。
【０１２０】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、それに反する指示があるかまたは文脈から別段であることが明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味する場合がある。ある群の１つ以上の構成要素の間に「または」が含まれる特許請求の範囲または発明を実施するための形態は、その群の構成要素の１つ、２つ以上、もしくは全部が、所与の製品もしくはプロセス中に存在する、該製品もしくはプロセス中で使用されている、または該製品もしくはプロセスに他の点で関連していれば、それに反する指示があるかまたは文脈から別段であることが明らかでない限り、要件を満たすものとみなされる。本発明は、上記群の正確に１つの構成要素が、所与の製品もしくはプロセス中に存在する、該製品もしくはプロセス中で使用されている、または該製品もしくはプロセスに他の点で関連している実施形態を含む。本発明は、上記群の構成要素の１つ以上、もしくは全部が所与の製品もしくはプロセス中に存在する、該製品もしくはプロセス中で使用されている、または該製品もしくはプロセスに他の点で関連している実施形態を含む。
【０１２１】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非制限的でありかつ許容することを意図するが、さらなる要素またはステップを含むことが必須ではないことにも留意されたい。したがって、本明細書で用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」も包含され開示される。
【０１２２】
範囲が与えられている場合は端点が含まれる。さらに、別段の指示がない、または文脈及び当業者の理解から別段であることが明らかでない限り、範囲として表される値は、本発明のさまざま実施形態において記載される範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、文脈から明らかに別段の指示がなされない限り、当該の範囲の下限の１０分の１の単位までとることができることを理解されたい。
【０１２３】
すべての引用の出所、例えば、参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、及び本明細書で引用した技術は、たとえ引用中に明示的な記述がない場合であっても、参照により本出願に援用される。引用の出所の記述と本出願で矛盾がある場合は、本出願の記述が優先するものとする。
【０１２４】
小見出し及び表の題名は限定することを意図しない。
【実施例】
【０１２５】
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例は、例証することのみを目的として提供されるものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するべく努めたが、実験上の何がしかの誤差及び偏差は当然のことながら許容されるべきものである。
【０１２６】
本発明の実施には、別段の指示がない限り、当技術分野の技術の範囲内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技法、及び薬理学の従来方法が使用される。かかる技法は文献において十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  （Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９３）、Ａ．Ｌ．  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｓ．  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９０）；Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．  （Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）  Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（１９９２）を参照されたい。
【０１２７】
実施例１：  １８Ｂを発現する組換え酵母の製造
以下のようにしてＰ．  ｐａｓｔｏｒｉｓの株を、１８Ｂ絹様ポリペプチドを組換えで発現するように改変した。
【０１２８】
最初に、以降の編集及び工学的操作を容易にするため、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの菌株を形質転換してＫＵ７０機能を抑止した。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（コマガテラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ））株のＨＩＳ＋誘導体であるＧＳ１１５（ＮＲＲＬ  Ｙ１５８５１）を、ゼオシン耐性マーカーに隣接するホモロジーアームからなり、ＫＵ７０座位を標的とするＤＮＡカセットを用いて電気穿孔した。配列を表１２に記載する。ゼオシンを添加したＹＰＤ寒天プレート上に形質転換体を播種した。その結果ＫＵ７０機能が抑止された。
【０１２９】
その後、この株を、絹様ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を発現するよう改変した。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ）株のＨＩＳ＋誘導体であるＧＳ１１５（ＮＲＲＬ  Ｙ１５８５１）を、絹様ポリペプチド（「１８Ｂ」）（配列番号２１）の発現及び分泌が生じるよう組換えベクター（配列番号２０）を用いて形質転換した。形質転換は、参照により本明細書に援用されるＰＭＩＤ  １５６７９０８３に記載の電気穿孔法により実現した。
【０１３０】
各ベクターは、組換えベクター中に絹様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と、それに隣接するプロモーター（ｐＧＣＷ１４）及びターミネーター（ｔＡＯＸ１  ｐＡシグナル）とを有する１８Ｂ発現カセットを含む。上記組換えベクターはさらに、細菌及び酵母の形質転換体を選択するための優性耐性マーカー、ならびに細菌の複製起点を含んでいた。第１の組換えベクターは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゲノム中のＡＯＸ２座位の３’に隣接するよう１８Ｂポリヌクレオチド配列の組み込みを誘導する標的指向化領域を含んでいた。第１のベクターの耐性マーカーはＧ４１８（別名ジェネティシン）に対する耐性を付与した。第２の組換えベクターは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゲノム中のＴＥＦ１座位の３’に隣接するよう１８Ｂポリヌクレオチド配列の組み込みを誘導する標的指向化領域含んでいた。第２のベクターの耐性マーカーはハイグロマイシンＢに対する耐性を付与した。
【０１３１】
実施例２：組換えΔｓｅｃ７２株の製造
１８Ｂを発現するように改変した細胞を、ｓｅｃ７２（配列番号１）を標的指向化した５’及び３’ホモロジーアームを有するＤＮＡカセットを含むベクターで形質転換した。図２のプラスミドマップに示すように、上記ホモロジーアームは酵母選択マーカーに隣接し、ｓｅｃ７２遺伝子中に挿入されると、ｓｅｃ７２遺伝子をノックアウトする。酵母選択培地を添加したＹＰＤ寒天プレート上に形質転換体を播種し、３０℃で４８時間インキュベートした。
【０１３２】
実施例３：ＳＳＨ１トランスロコン複合体を過剰発現する組換えΔｓｅｃ７２株の製造
１８Ｂ（配列番号２１）を発現するように改変したＰ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Δｓｅｃ７２）細胞を、ＳＳＨ１トランスロコン複合体を過剰発現させるためのベクターで形質転換した。上記ベクターのプラスミドマップを図３に示す。上記ベクターは、ＳＳＨ１（配列番号３）、ＳＳＳ１（配列番号５）、及びＳＢＨ２（配列番号７）のオープンリーディングフレームを含む。各オープンリーディングフレームは、プロモーター及びターミネーターに作動可能に連結されている。酵母選択培地を添加したＹＰＤ寒天プレート上に形質転換体を播種し、３０℃で４８時間インキュベートした。
【０１３３】
実施例４：プロテアーゼ二重ノックアウト株の製造
ΔΔプロテアーゼ株（すなわち、二重プロテアーゼノックアウト）を生成させるために、選択した酵母株を、ノーセオスリシン耐性マーカーに隣接する約１１５０ｂｐのホモロジーアームを有するＤＮＡカセットを含むベクターで形質転換した。上記ノーセオスリシン耐性マーカーを含むプラスミドマップを図４Ａに示し、配列を表１３に記載する。それぞれの標的に対して用いるホモロジーアームを表８に記載のプライマーで増幅させ、ノーセオスリシン耐性プラスミドに挿入した。ホモロジーアームをノーセオスリシンプラスミドに挿入して、図４Ｂ及び図４Ｃに示すように、標的プロテアーゼに対する３’及び５’ホモロジーアームに挟まれたノーセオスリシン耐性マーカーを含むカセットを作製した。図４Ｂには、ホモロジーアーム（ＨＡ１及びＨＡ２）に挟まれた耐性カセット（Ｎｏｕｒ耐性カセット）を示す。図４Ｃには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ｐＩＬＶ５）由来のＩＬＶ５遺伝子由来のプロモーター、ストレプトマイセス・ノウルセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ）（ｎａｔ）由来のノーセオスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＣＹＣ１遺伝子由来のポリＡシグナルを含む、ノーセオスリシンマーカーの詳細を示す。
【０１３４】
ＹＰＳ１−１（配列番号７７）を標的指向化したホモロジーアームを有するベクターを用いて改変酵母株を形質転換した。ノーセオスリシンを添加したＹＰＤ寒天プレート上に形質転換体を播種し、３０℃で４８時間インキュベートした。
【０１３５】
（表６）Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ株での欠失のために標的とされるプロテアーゼ
2021524227.tif 000017
【０１３６】
ダブルノックアウトを生じさせるため、上記で製造した単一プロテアーゼノックアウト株からノーセオスリシン耐性を消失させた。ＹＰＳ１−２（配列番号８０）を標的指向化したホモロジーアームを有するベクターを用いて単一プロテアーゼノックアウト株を形質転換した。ノーセオスリシンを添加したＹＰＤ寒天プレート上に形質転換体を播種し、３０℃で４８時間インキュベートした。
【０１３７】
実施例５：Δｓｅｃ７２が組み込みコピー数全体にわたってＭＦα−１８Ｂ分泌を改善
２、４、または６コピーの、ＭＦα１（ｓｃ）プレプロリーダー配列を含む１８Ｂ（ＡｂＭａＳｐ２  ７９ｋＤａ）を発現するように改変したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、実施例１に記載の技法を用いて調製した。
【０１３８】
上記のそれぞれのΔｓｅｃ７２株を実施例２に記載の技法を用いて調製した。２Ｘ、４Ｘ、及び６Ｘ  １８Ｂ発現株のそれぞれについてΔｓｅｃ７２株及びＷＴ株を調製した。２Ｘ、４Ｘ、及び６Ｘの１８Ｂ発現株のそれについて、ＷＴ株及びΔｓｅｃ７２株（すなわち、ＳＥＣ７２ＫＯ株）からのＭＦα−１８Ｂの分泌をＥＬＩＳＡで測定し、その結果を図６に示す。
【０１３９】
図６を参照して、「絹コピー」は、各株におけるＭＦα１（ｓｃ）プレプロリーダー配列を用いた１８Ｂ（Ａｂ  ＭａＳｐ２  ７９ｋＤａ）用の発現カセットの数である。上記１８Ｂは、ＥＬＩＳＡ検出用に３ｘＦＬＡＧエピトープでＣ末端にタグ付けされている。エラーバーは、ｎ≧４の生物学的な繰り返し実験間の平均値の標準誤差を示す。この結果は、ｓｅｃ７２遺伝子を欠失させることにより、組み込みコピー数（すなわち、２Ｘ、４Ｘ、及び６Ｘの絹コピー）全体にわたってＭＦα−１８Ｂの分泌が改善されることを示している。
【０１４０】
実施例６：Δｓｅｃ７２は非ＭＦαシグナルからの分泌を改善
Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ株を実施例１に従って改変して、それぞれが異なる分泌シグナル、すなわち、ＰＥＰ４（ｓｃ）、ＣＰＹ＋４（ｓｃ）、ＤＡＰ２（ｓｃ）、及びＭＦα１（ｓｃ）を含む４種の異なる絹ポリペプチドを発現させた。それぞれの完全リーダー配列は、表示したシグナルペプチドとＭＦα１（ｓｃ）プロペプチド（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅオーソログの系統名：ＹＰＬ１８７Ｗ）から構成されるハイブリッドである。（ｓｃ）は当該シグナルペプチドがＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来であることを示す。ＰＥＰ４（ｓｃ）、ＣＰＹ＋４（ｓｃ）、及びＤＡＰ２（ｓｃ）を用いてポリペプチドを組換えで発現する株は、それぞれ単一の発現カセット（すなわち、１絹コピー）を含む。ＭＦα１（ｓｃ）を組換えで発現する株は、２つの発現カセット（すなわち、２つの絹コピー）を含む。ＷＴ株とΔｓｅｃ７２株からの分泌を比較するために、上記のそれぞれのΔｓｅｃ７２株を実施例２に記載の技法を用いて調製した。ＤＡＰ２（ｓｃ）を含むΔｓｅｃ７２株については、実施例４に記載のように、当該の株をさらに改変して、ＹＰＳ１−１及びＹＰＳ１−２プロテアーゼをノックアウトした。ＷＴ株及びΔｓｅｃ７２株からの各分泌シグナルによるポリペプチドの分泌をＥＬＩＳＡによって測定し、その結果を図７に示す。
【０１４１】
上記の結果は、ｓｅｃ７２遺伝子を欠失させることによってＭＦα１（ｓｃ）ではないシグナルペプチドを含むポリペプチドの分泌を改善することを示している。エラーバーはｎ≧４の生物学的な繰り返し実験間の平均値の標準誤差を示す。
【０１４２】
（表７Ａ）ＭＦα１（ｓｃ）ペプチド配列
2021524227.tif 000018
【０１４３】
（表７Ｂ）絹分泌シグナル
2021524227.tif 000019
【０１４４】
実施例７：Δｓｅｃ７２はより長い絹及び別個の絹配列の分泌を改善
Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、長い絹ポリペプチドＡｒｇｉｏｐｐｅ  ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ  （Ａｂ）  ＭａＳｐ２（１０６ｋＤａ）（配列番号４３）、Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ（Ｌｈ）ＭａＳｐ１（５５ｋＤａ）（配列番号４４）を発現するように、実施例１に従って改変した。Ａｂ  ＭａＳｐ２  １０６ｋＤａ（別名２４Ｂ）は、Ａｂ  ＭａＳｐ２  ７９ｋＤａ（１８Ｂ）のより長いコンカテマーである。Ｌｈ  ＭａＳｐ１  ５５ｋＤａは別の類別のスピドロインとは別個の配列である。
【０１４５】
ＷＴ株及びΔｓｅｃ７２株からの分泌を比較するために、それぞれのΔｓｅｃ７２株を実施例２に記載の技法を用いて調製した。実施例４に記載のように、Ｌｈ  ＭａＳｐｌ（５５ｋＤａ）を含む株をさらに改変して、ＹＰＳ１−１及びＹＰＳ１−２プロテアーゼをノックアウトした。ＷＴ株及びΔｓｅｃ７２株からの長い絹ポリペプチドの分泌をＥＬＩＳＡによって測定、その結果を図８に示す。エラーバーはｎ≧４の生物学的な繰り返し実験間の平均値の標準誤差を示す。
【０１４６】
Ａｒｇｉｏｐｐｅ  ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ  ＭａＳｐ２タンパク質アミノ酸配列（配列番号４３）：
2021524227.tif 000020
【０１４７】
Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ  ＭａＳｐ１タンパク質アミノ酸配列（配列番号４４）：
2021524227.tif 000021
【０１４８】
実施例８：ＳＥＣ７２を欠失させると分泌が改善するが、ノックダウンでも過剰発現でも改善なし
Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、１８Ｂ絹様ポリペプチドを発現する組換え遺伝子を含む４コピーのＤＮＡカセットを含むように、実施例１に従って改変した。Δｓｅｃ７２株は実施例２に記載の技法を用いて調製した。実施例４に記載のように、これらの株をさらに改変して、ＹＰＳ１−１及びＹＰＳ１−２プロテアーゼをノックアウトした。
【０１４９】
この株から、ＴＨＩ１１プロモーター（ｐＴＨＩ１１）に作動可能に連結された組換えｓｅｃ７２遺伝子を含むベクターを用いて形質転換することにより、ｓｅｃ７２を過剰発現する株を調製した。ｐＴＨＩ１１は、ビタミンであるチアミンを含まない最少培地中で抑制解除される。過去のＲＮＡｓｅｑ及びプロモーター融合の研究から、ｐＴＨＩ１１は、チアミンを含まないブロック及びタンク最少培地中で最も強力なプロモーターの１つである。
【０１５０】
さらに、１８Ｂ絹様ポリペプチドを発現する４コピーの組換え遺伝子を発現するように改変したＰ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ株から、ｓｅｃ７２をノックアウトする代わりに、マーカーカセットで遺伝子の３’ＵＴＲを破壊する転写ノックダウン方法であるＤＡｍＰ（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｂｙ  ｍＲＮＡ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ（ｍＲＮＡ摂動による量の減少））を用いて、ＳＥＣ７２の発現をノックダウンした。
【０１５１】
ＷＴ株、Δｓｅｃ７２株、組換えで過剰発現されたｓｅｃ７２（ｐＴＨＩ１１に作動可能に連結されている）を有するΔｓｅｃ７２株、及びｓｅｃ７２ノックダウン株からの１８Ｂ絹様ポリペプチドの分泌をＥＬＩＳＡによって測定し、その結果を図９Ａに示す。
【０１５２】
上記Δｓｅｃ７２表現型は、ｓｅｃ７２の誘導性対立遺伝子により補完されれば元に戻る。同様に、ＳＥＣ７２のノックダウンは、ＷＴと比較して絹の分泌に測定可能な影響を与えなかった。したがって、分泌はｓｅｃ７２を欠失させることによって改善されるが、ｓｅｃ７２のノックダウンや過剰発現によっては改善されない。
【０１５３】
実施例９：ＳＥＣ６３複合体の化学量論に対する他の乱れは絹の分泌に影響せず
Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、１８Ｂ絹様ポリペプチドを発現する組換え遺伝子を含む４コピーのＤＮＡカセットを含むように、実施例１に従って改変した。Δｓｅｃ７２株は実施例２に記載の技法を用いて調製した。
【０１５４】
Δｓｅｃ７２表現型がＳＥＣ７２の除去の直接的な効果であるか、またはＳＥＣ６３複合体の化学量論を乱すことの間接的な効果であるかを試験するために、ｐＴＨＩ１１を用いて、３種の非ＳＥＣ７２複合体メンバー（ＳＥＣ６２、ＳＥＣ６３、及びＳＥＣ６６）を同時に過剰発現させた（ｓｅｃ６２、ｓｅｃ６３、及びｓｅｃ６６を有する３種が鎖状に連結した発現カセットを含むベクターを用いて上記株を形質転換することによって）。さらに、ｐＴＨＩ１１を用いて、ＳＥＣ７２を過剰発現させた。ＥＬＩＳＡを用いて各株からの１８Ｂの分泌を測定し、Δｓｅｃ７２株と比較し、その結果を図９Ｂに示す。
【０１５５】
化学量論的変化（ＳＥＣ６２、ＳＥＣ６３、及びＳＥＣ６６の過剰発現、またはＳＥＣ７２の過剰発現）のいずれも、絹の分泌に測定可能な影響を与えなかった。エラーバーはｎ≧３の生物学的な繰り返し実験間の平均値の標準誤差を示す。
【０１５６】
実施例１０：ＲＴｑＰＣＲによりトランスロコンレベルを始めとするΔｓｅｃ７２に対する転写適応を示す。
Δｓｅｃ７２株を実施例２に記載の技法を用いて調製した。増殖後にｍＲＮＡを単離し、選択したマーカーに対してＲＴｑＰＣＲを実施し、Δｓｅｃ７２に対する転写適応を分析した。
【０１５７】
最少培地中の「ＷＴ」株ＲＭｓ７１からの倍率変化としての参照に対して正規化した発現（ＡＬＧ９またはＡＣＴ１）を図１０Ａに示す。網掛けは範囲を示し、中央の線はｎ＝３の生物学的な繰り返し実験（Δｓｅｃ７２のｎ＝２を除く）間の中央値を表す。ＳＳＨ１転写レベルは３つの摂動すべてにわたって４〜８倍に増加する。Δｓｅｃ７２はＳＥＣ６１トランスロコン成分の発現を１／２〜１／４に減少させる。
【０１５８】
図１０Ｂは、中心化した、対数スケールでの、参照に対して正規化した発現データの、主成分空間上への投影図（左図＝ＰＣ１対ＰＣ３、右図＝ＰＣ２対ＰＣ３）を示す。株の遺伝子型により繰り返し実験データを色分けし、これにより、遺伝子型間の変動に比較して、遺伝子型内の変動が低いことが示される。負荷係数を調べると、ＰＣ１に沿ったほとんどの変動は強力なＳＳＡ３の抑制によって駆動され、ＰＣ３に沿ったほとんどの変動はＳＥＣ６１トランスロコン複合体の抑制によって駆動されることが明らかになった。これらの３ＰＣは元の２０次元由来の変動の９９％を再構築する。
【０１５９】
実施例１１：ＳＳＨ１の過剰発現によりΔｓｅｃ７２絹分泌株の増殖速度が改善
ＳＳＨ１はＥＲ転座においても機能するが、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖及びＳＥＣ６３複合体との相互作用の欠如に対するその非必須性においてＳＥＣ６１とは異なる。ＳＳＨ１は転座基質の優先傾向を示す場合もあるが、それらの優先傾向はＳＥＣ６１の優先傾向と広範に重なり合う。
【０１６０】
ＳＳＨ１の過剰発現がΔｓｅｃ７２株の増殖を促進することができるかどうかを試験するために、Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ  Δｓｅｃ７２株を実施例２に記載の技法を用いて調製した。ＳＥＣ６１及びＳＳＨ１複合体（ＳＳＳ１、ＳＢＨ２、及びＳＥＣ６１またはＳＳＨ１の１つ）の制御配列ならびにコード配列を、ＰＣＲによって組み込みプラスミド上でアセンブルした。結果として生じる組み込みによって、遺伝子コピー数のＳＥＣ６１またはＳＳＨ１複合体の１つが複製される。Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Δｓｅｃ７２）細胞を、実施例３に記載のように、ＳＳＨ１トランスロコン複合体の過剰発現のためのベクターで形質転換した。同様に、Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Δｓｅｃ７２）細胞を、ＳＥＣ６１の過剰発現用のためのベクターで形質転換した。実施例４に記載のように、選択した株（図１１において「ΔΔ」で示す）をさらに改変して、ＹＰＳ１−１及びＹＰＳ１−２プロテアーゼをノックアウトした。
【０１６１】
ＹＰＤ中での前培養物を最少培地（ＲＭｍｌ７）中、１：１６００で希釈した。ＯＤ６００を、希釈後１９時間で開始した８時間の指数関数的増殖期間にわたって６つの時点で記録した。増殖速度を見積もるための線形モデルフィット  ｌｏｇ（ＯＤ６００）対時間及びｎ＝６の生物学的な繰り返し実験間の勾配の標準誤差。各株について測定した増殖を図１１に示す。倍加時間は増殖速度の逆数として表示する。推定値の相反変換に起因してエラーバーは非対称である。
【０１６２】
ＳＥＣ６１及びＳＳＨ１の複製は、ＳＥＣ７２絹産生株のより速い倍加を促進する（図１１、左側）。この効果は、細胞内に蓄積した絹の負荷を減少させることに起因する可能性がある。ただし、Δｓｅｃ７２は顕著な増殖障害をきたし、この増殖障害はＳＳＨ１の複製によって一部が復旧するが、ＳＥＣ６１の複製では復旧しない（図１１、右側）。
【０１６３】
実施例１２：ＳＳＨ１の複製によりΔｓｅｃ７２株の発酵能力が向上
実施例１に従って、Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、１８Ｂ絹様ポリペプチドを発現する組換え遺伝子を含む４コピーまたは６コピーのＤＮＡカセットを含むように改変した。Δｓｅｃ７２株は、実施例２に記載の技法を用いて、４コピーのＤＮＡカセットを発現する組換え細胞から調製した。また、得られたＰ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Δｓｅｃ７２）細胞の一部の、実施例３に記載のように、ＳＳＨ１トランスロコン複合体の過剰発現のためのベクターで形質転換も行った。それぞれの株からの１８Ｂの分泌をＥＬＩＳＡを用いて測定し、その結果を図１２Ａ及び図１２Ｂに示す。
【０１６４】
図１２Ａにおいて、各曲線は独立した流加発酵を表している。印を付けた点は、ブロス中に分泌された絹タンパク質の濃度（「１８Ｂ力価」、ｙ軸）を始めとする分析対象に採取した試料である。供給プログラムは時変であることから、ｘ軸は累積グルコース供給量である。網掛けは、同一の株のすべての実験範囲を示している。Δｓｅｃ７２欠失株は非常に多様な能力を示す。この株においてＳＳＨ１が複製される場合（「２Ｎ  ＳＳＨ１」）、能力が向上し、かつばらつきが減少する。４つの絹発現カセットしかもたないΔｓｅｃ７２  ２Ｎ  ＳＳＨ１株の絹分泌量が、６つの絹発現カセットをもつ参照株の分泌量の範囲に近付く。
【０１６５】
比生産性（バイオマスに対する産生物の比）を各株の培養物について測定し、図１２Ｂに示す。Δｓｅｃ７２のバックグラウンドの増殖がより遅く、バイオマスの生成が少なくなり、それらのメトリクスがより高発現の最高力価の株のメトリクスを越えて上昇する。Δｓｅｃ７２株の変動性が高いために、まとめたデータでは上位ｎ＝２の実験のみを示している。エラーバーは平均値の標準誤差である。
【０１６６】
他の実施形態
使用されている語句は限定する語句ではなく説明する語句であり、添付の特許請求の範囲に記載の範囲内で本発明の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく、そのより広い態様において変更を行ってよいことを理解されるべきである。
【０１６７】
本発明は、いくつかの記載実施形態に関してかなり長く、かなり詳細に説明されているが、かかる個々の詳細もしくは実施形態の任意のもの、または特定の実施形態の任意のものに限定されるべきであるということを意図するものではなく、逆に、先行技術に照らして添付の特許請求の範囲の可能な限り最も広い解釈を得るため、かかる特許請求の範囲を基準にして解釈されるべきであり、そのため、本発明の意図される範囲が有効に包含されるべきである。
【０１６８】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は参照によりその全体が援用される。矛盾がある場合は、定義も含め、本明細書が優先する。さらに、項目見出し、材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定的ではないことが意図される。
【０１６９】
配列
（表８）プロテアーゼＯＲＦを標的化指向する５’及び３’のホモロジーアーム（ＨＡ）のフォワード（Ｆ）及びリバース（Ｒ）プライマー
2021524227.tif 000022
【０１７０】
（表９）改変した配列を増幅させるためのフォワード及びリバースプライマー
2021524227.tif 000023
【０１７１】
（表１０）ｓｅｃ７２ＫＯベクター
2021524227.tif 000024
2021524227.tif 000025
2021524227.tif 000026
2021524227.tif 000027
【０１７２】
（表１１）ＳＳＨ１複合体過剰発現ベクター
2021524227.tif 000028
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2021524227.tif 000033
2021524227.tif 000034
【０１７３】
（表１２）Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＫＵ７０欠失用のＨＡアームを有するゼオシンカセット
2021524227.tif 000035
2021524227.tif 000036
2021524227.tif 000037
【０１７４】
（表１３）Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるプロテアーゼ欠失用のテンプレートノーセオスリシンカセット
2021524227.tif 000038
2021524227.tif 000039
【０１７５】
（表１４）Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＹＰＳ１−１及びＹＰＳ１−２プロテアーゼ欠失用のＨＡアームを有する例示的ノーセオスリシンカセット
2021524227.tif 000040
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2021524227.tif 000044
【０１７６】
（表１５）本明細書に開示の遺伝子及び配列に関する情報
2021524227.tif 000045
【０１７７】
（表１６）ＳＳＨ１複合体遺伝子用のプロモーター及びターミネーターに関する情報
2021524227.tif 000046
【図１】
2021524227.tif 000048
【図２】
2021524227.tif 000049
【図３】
2021524227.tif 000050
【図４−１】
2021524227.tif 000051
【図４−２】
2021524227.tif 000052
【図５】
2021524227.tif 000053
【図６】
2021524227.tif 000054
【図７】
2021524227.tif 000055
【図８】
2021524227.tif 000056
【図９Ａ】
2021524227.tif 000057
【図９Ｂ】
2021524227.tif 000058
【図１０Ａ】
2021524227.tif 000059
【図１０Ｂ】
2021524227.tif 000060
【図１１】
2021524227.tif 000061
【図１２Ａ】
2021524227.tif 000062
【図１２Ｂ】
2021524227.tif 000063
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月23日(2020.12.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＣ７２の活性が消失しているかまたはｓｅｃ７２遺伝子が欠失している、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）という微生物であって、組換えタンパク質を発現する、前記微生物。
【請求項２】
前記ＳＥＣ７２が、配列番号１と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記ＳＥＣ７２が配列番号１を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
前記ＳＥＣ７２がｓｅｃ７２遺伝子によりコードされる、請求項１に記載の微生物。
【請求項５】
前記ｓｅｃ７２遺伝子が、配列番号２と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項６】
前記ｓｅｃ７２遺伝子が、配列番号２の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項７】
前記ｓｅｃ７２遺伝子が配列番号２を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項８】
前記ｓｅｃ７２遺伝子が前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ２−１＿０４４８に存在する、請求項１に記載の微生物。
【請求項９】
組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
前記ＳＳＨ１トランスロコン複合体が、配列番号４と少なくとも９５％同一な第１のポリペプチド配列、配列番号６と少なくとも９５％同一な第２のポリペプチド配列、及び配列番号８と少なくとも９５％同一な第３のポリペプチド配列を含む、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
前記ＳＳＨ１トランスロコン複合体が、配列番号４を含む第１のポリペプチド、配列番号６を含む第２のポリペプチド、及び配列番号８を含む第３のポリペプチドを含む、請求項９に記載の微生物。
【請求項１２】
組換えで発現されるトランスロコン複合体をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１３】
前記トランスロコン複合体が、組換えＳＳＨ１遺伝子、組換えＳＳＳ１遺伝子、及び組換えＳＢＨ２遺伝子から発現される、請求項１２に記載の微生物。
【請求項１４】
前記ＳＳＨ１遺伝子が配列番号３を含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１５】
前記ＳＳＨ１遺伝子が、配列番号３と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１６】
前記ＳＳＨ１遺伝子が、配列番号３の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１７】
前記ＳＳＨ１遺伝子が配列番号５を含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１８】
前記ＳＳＨ１遺伝子が、配列番号５と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１９】
前記ＳＳＳ１遺伝子が、配列番号５の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項２０】
前記ＳＢＨ２遺伝子が配列番号７を含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項２１】
前記ＳＢＨ２遺伝子が、配列番号７と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項２２】
前記ＳＢＨ２遺伝子が、配列番号７の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項２３】
前記微生物における前記ＳＳＨ１トランスロコンのレベルを、天然の生物によって発現される前記ＳＳＨ１トランスロコンのレベルを超えて増加させるための前記組換えＳＳＨ１遺伝子の発現が、前記微生物の増殖速度及び／または発酵能力を向上させる、請求項１３に記載の微生物。
【請求項２４】
前記トランスロコン複合体が、ＳＳＨ１タンパク質、ＳＳＳ１タンパク質、及びＳＢＨ２タンパク質を含む、請求項１２に記載の微生物。
【請求項２５】
前記ＳＳＨ１タンパク質が、配列番号４と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項２４に記載の微生物。
【請求項２６】
前記ＳＳＨ１タンパク質が配列番号４を含む、請求項２４に記載の微生物。
【請求項２７】
前記ＳＳＳ１タンパク質が、配列番号６と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項２４に記載の微生物。
【請求項２８】
前記ＳＳＳ１タンパク質が配列番号６を含む、請求項２４に記載の微生物。
【請求項２９】
前記ＳＢＨ２タンパク質が、配列番号８と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項２４に記載の微生物。
【請求項３０】
前記ＳＢＨ２タンパク質が配列番号８を含む、請求項２４に記載の微生物。
【請求項３１】
ＹＰＳ１−１プロテアーゼ及びＹＰＳ１−２プロテアーゼの活性が、減弱または消失している、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項３２】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼが、配列番号１０と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項３１に記載の微生物。
【請求項３３】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼが配列番号１０を含む、請求項３１に記載の微生物。
【請求項３４】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼがＹＰＳ１−１遺伝子によりコードされる、請求項３１に記載の微生物。
【請求項３５】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子が、配列番号９と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載の微生物。
【請求項３６】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子が、配列番号９の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の微生物。
【請求項３７】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子が配列番号９を含む、請求項３４に記載の微生物。
【請求項３８】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子が前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４に存在する、請求項３４に記載の微生物。
【請求項３９】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼが、配列番号１２と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項４０】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼが配列番号１２を含む、請求項３１に記載の微生物。
【請求項４１】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼがＹＰＳ１−２遺伝子によりコードされる、請求項３１に記載の微生物。
【請求項４２】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子が、配列番号１１と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の微生物。
【請求項４３】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子が、配列番号１１の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０個連続するヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の微生物。
【請求項４４】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子が配列番号１１を含む、請求項４１に記載の微生物。
【請求項４５】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子が前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７に存在する、請求項４１に記載の微生物。
【請求項４６】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子もしくは前記ＹＰＳ１−２遺伝子またはその両方が、変異しているまたはノックアウトされている、請求項３１〜４５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項４７】
１種以上のさらなるプロテアーゼの活性が減弱または消失している、請求項３１〜４６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項４８】
前記組換えタンパク質が、絹タンパク質由来の少なくとも１つのブロックポリペプチド配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項４９】
前記組換えタンパク質が絹様ポリペプチドを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５０】
前記絹様ポリペプチドが１つ以上の反復配列
2021524227.tif 000064
（配列番号１３）を含み、
式中、
Ｘ１＝ＳＧＧＱＱ（配列番号１４）またはＧＡＧＱＱ（配列番号１５）またはＧＱＧＰＹ（配列番号１６）またはＡＧＱＱ（配列番号１７）またはＳＱであり、
ｎ１は４〜８であり、
ｎ２は６〜２０であり、かつ
ｎ３は２〜２０である、
請求項４９に記載の微生物。
【請求項５１】
前記絹様ポリペプチドが配列番号２１によりコードされるポリペプチド配列を含む、請求項４９に記載の微生物。
【請求項５２】
前記組換えタンパク質が分泌シグナルペプチドを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５３】
前記分泌シグナルペプチドが、ＰＥＰ４シグナル配列、ＣＰＹ＋４シグナル配列、ＤＡＰ２シグナル配列、及びＭＦα１シグナル配列からなる群より選択される、請求項５２に記載の微生物。
【請求項５４】
前記分泌シグナルペプチドが、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０からなる群より選択される、請求項５２に記載の微生物。
【請求項５５】
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）という微生物であって、
前記微生物のＳＥＣ７２の活性が消失しているか、または配列番号１を含むｓｅｃ７２遺伝子がノックアウトされており、
組換えで発現される配列番号３を含むＳＳＨ１遺伝子、組換えで発現される配列番号５を含むＳＳＳ１遺伝子、及び組換えで発現される配列番号７を含むＳＢＨ２遺伝子を含み、かつ
配列番号２１によりコードされるポリペプチドを含む絹様ポリペプチドを含む、
前記微生物。
【請求項５６】
請求項１〜５５のいずれか１項に記載の微生物を含む、細胞培養物。
【請求項５７】
標準的な細胞培養条件下において、組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体を含まない細胞培養物と比較して、株の増殖速度及び発酵能力が向上している、請求項９〜５５のいずれか１項に記載の微生物を含む細胞培養物。
【請求項５８】
請求項９〜５５のいずれか１項に記載の微生物を含む細胞培養物であって、
標準的な細胞培養条件下において、
機能性ｓｅｃ７２遺伝子を含みかつ組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体を含まない点以外は同一の微生物であって、それぞれの微生物が同一数の組換え絹ポリペプチド遺伝子のコピーを有する、前記微生物
の細胞培養物と比較して、前記組換えタンパク質の収量または比生産性が向上している、
前記細胞培養物。
【請求項５９】
請求項１〜５５のいずれか１項に記載の微生物を、前記組換えで発現されるタンパク質の発現に好適な条件下で、培地中で培養する工程、及び
前記微生物または前記培地から前記組換えタンパク質を単離する工程
を含む、組換えタンパク質の製造方法。
【請求項６０】
前記組換えタンパク質が前記微生物から分泌され、かつ、前記組換えタンパク質を単離する工程が、前記分泌された組換えタンパク質を含む培地を回収することを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ｓｅｃ７２遺伝子が欠失していない点以外は同一な微生物と比較して、前記微生物における前記組換えタンパク質の収量または比生産性が増加する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体を含まない、及び前記ｓｅｃ７２遺伝子が欠失していない点以外は同一な、微生物
と比較して、前記微生物における前記組換えタンパク質の収量または比生産性が増加する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
組換えで発現されるタンパク質の分泌を改善するようにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを改変する方法であって、ＳＥＣ７２タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトする工程を含む、前記方法。
【請求項６４】
前記Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを、組換えで発現されるＳＳＨ１トランスロコン複合体をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換する工程をさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記組換えで発現されるタンパク質が絹様ポリペプチドを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記絹様ポリペプチドが、１つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３（配列番号１３）を含み、
式中、
Ｘ１＝ＳＧＧＱＱ（配列番号１４）またはＧＡＧＱＱ（配列番号１５）またはＧＱＧＰＹ（配列番号１６）またはＡＧＱＱ（配列番号１７）またはＳＱであり、
ｎ１は４〜８であり、
ｎ２は６〜２０であり、かつ
ｎ３は２〜２０である、
請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記組換えで発現されるタンパク質が、配列番号２１によりコードされるポリペプチド配列を含む、請求項６３に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
[本発明1001]
ＳＥＣ72の活性が消失しているかまたはｓｅｃ72遺伝子が欠失している、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）という微生物であって、組換えタンパク質を発現する、前記微生物。
[本発明1002]
前記ＳＥＣ72が、配列番号1と少なくとも95％同一なポリペプチド配列を含む、本発明1001の微生物。
[本発明1003]
前記ＳＥＣ72が配列番号1を含む、本発明1001の微生物。
[本発明1004]
前記ＳＥＣ72がｓｅｃ72遺伝子によりコードされる、本発明1001の微生物。
[本発明1005]
前記ｓｅｃ72遺伝子が、配列番号2と少なくとも95％同一なポリヌクレオチド配列を含む、本発明1001の微生物。
[本発明1006]
前記ｓｅｃ72遺伝子が、配列番号2の少なくとも15、20、25、30、40、または50個連続するヌクレオチドを含む、本発明1001の微生物。
[本発明1007]
前記ｓｅｃ72遺伝子が配列番号2を含む、本発明1001の微生物。
[本発明1008]
前記ｓｅｃ72遺伝子が前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ2−1＿0448に存在する、本発明1001の微生物。
[本発明1009]
組換えで発現されるＳＳＨ1トランスロコン複合体をさらに含む、先行本発明のいずれかの微生物。
[本発明1010]
前記ＳＳＨ1トランスロコン複合体が、配列番号4と少なくとも95％同一な第1のポリペプチド配列、配列番号6と少なくとも95％同一な第2のポリペプチド配列、及び配列番号8と少なくとも95％同一な第3のポリペプチド配列を含む、本発明1009の微生物。
[本発明1011]
前記ＳＳＨ1トランスロコン複合体が、配列番号4を含む第1のポリペプチド、配列番号6を含む第2のポリペプチド、及び配列番号8を含む第3のポリペプチドを含む、本発明1009の微生物。
[本発明1012]
組換えで発現されるトランスロコン複合体をさらに含む、先行本発明のいずれかの微生物。
[本発明1013]
前記トランスロコン複合体が、組換えＳＳＨ1遺伝子、組換えＳＳＳ1遺伝子、及び組換えＳＢＨ2遺伝子から発現される、本発明1012の微生物。
[本発明1014]
前記ＳＳＨ1遺伝子が配列番号3を含む、本発明1013の微生物。
[本発明1015]
前記ＳＳＨ1遺伝子が、配列番号3と少なくとも95％同一なポリヌクレオチド配列を含む、本発明1013の微生物。
[本発明1016]
前記ＳＳＨ1遺伝子が、配列番号3の少なくとも15、20、25、30、40、または50個連続するヌクレオチドを含む、本発明1013の微生物。
[本発明1017]
前記ＳＳＨ1遺伝子が配列番号5を含む、本発明1013の微生物。
[本発明1018]
前記ＳＳＨ1遺伝子が、配列番号5と少なくとも95％同一なポリヌクレオチド配列を含む、本発明1013の微生物。
[本発明1019]
前記ＳＳＳ1遺伝子が、配列番号5の少なくとも15、20、25、30、40、または50個連続するヌクレオチドを含む、本発明1013の微生物。
[本発明1020]
前記ＳＢＨ2遺伝子が配列番号7を含む、本発明1013の微生物。
[本発明1021]
前記ＳＢＨ2遺伝子が、配列番号7と少なくとも95％同一なポリヌクレオチド配列を含む、本発明1013の微生物。
[本発明1022]
前記ＳＢＨ2遺伝子が、配列番号7の少なくとも15、20、25、30、40、または50個連続するヌクレオチドを含む、本発明1013の微生物。
[本発明1023]
前記微生物における前記ＳＳＨ1トランスロコンのレベルを、天然の生物によって発現される前記ＳＳＨ1トランスロコンのレベルを超えて増加させるための前記組換えＳＳＨ1遺伝子の発現が、前記微生物の増殖速度及び／または発酵能力を向上させる、本発明1013の微生物。
[本発明1024]
前記トランスロコン複合体が、ＳＳＨ1タンパク質、ＳＳＳ1タンパク質、及びＳＢＨ2タンパク質を含む、本発明1012の微生物。
[本発明1025]
前記ＳＳＨ1タンパク質が、配列番号4と少なくとも95％同一なポリペプチド配列を含む、本発明1024の微生物。
[本発明1026]
前記ＳＳＨ1タンパク質が配列番号4を含む、本発明1024の微生物。
[本発明1027]
前記ＳＳＳ1タンパク質が、配列番号6と少なくとも95％同一なポリペプチド配列を含む、本発明1024の微生物。
[本発明1028]
前記ＳＳＳ1タンパク質が配列番号6を含む、本発明1024の微生物。
[本発明1029]
前記ＳＢＨ2タンパク質が、配列番号8と少なくとも95％同一なポリペプチド配列を含む、本発明1024の微生物。
[本発明1030]
前記ＳＢＨ2タンパク質が配列番号8を含む、本発明1024の微生物。
[本発明1031]
ＹＰＳ1−1プロテアーゼ及びＹＰＳ1−2プロテアーゼの活性が、減弱または消失している、先行本発明のいずれかの微生物。
[本発明1032]
前記ＹＰＳ1−1プロテアーゼが、配列番号10と少なくとも95％同一なポリペプチド配列を含む、本発明1031の微生物。
[本発明1033]
前記ＹＰＳ1−1プロテアーゼが配列番号10を含む、本発明1031の微生物。
[本発明1034]
前記ＹＰＳ1−1プロテアーゼがＹＰＳ1−1遺伝子によりコードされる、本発明1031の微生物。
[本発明1035]
前記ＹＰＳ1−1遺伝子が、配列番号9と少なくとも95％同一なポリヌクレオチド配列を含む、本発明1034の微生物。
[本発明1036]
前記ＹＰＳ1−1遺伝子が、配列番号9の少なくとも15、20、25、30、40、または50個連続するヌクレオチドを含む、本発明1034の微生物。
[本発明1037]
前記ＹＰＳ1−1遺伝子が配列番号9を含む、本発明1034の微生物。
[本発明1038]
前記ＹＰＳ1−1遺伝子が前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ4＿0584に存在する、本発明1034の微生物。
[本発明1039]
前記ＹＰＳ1−2プロテアーゼが、配列番号12と少なくとも95％同一なポリペプチド配列を含む、先行本発明のいずれかの微生物。
[本発明1040]
前記ＹＰＳ1−2プロテアーゼが配列番号12を含む、本発明1031の微生物。
[本発明1041]
前記ＹＰＳ1−2プロテアーゼがＹＰＳ1−2遺伝子によりコードされる、本発明1031の微生物。
[本発明1042]
前記ＹＰＳ1−2遺伝子が、配列番号11と少なくとも95％同一なポリヌクレオチド配列を含む、本発明1041の微生物。
[本発明1043]
前記ＹＰＳ1−2遺伝子が、配列番号11の少なくとも15、20、25、30、40、または50個連続するヌクレオチドを含む、本発明1041の微生物。
[本発明1044]
前記ＹＰＳ1−2遺伝子が配列番号11を含む、本発明1041の微生物。
[本発明1045]
前記ＹＰＳ1−2遺伝子が前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ3＿1157に存在する、本発明1041の微生物。
[本発明1046]
前記ＹＰＳ1−1遺伝子もしくは前記ＹＰＳ1−2遺伝子またはその両方が、変異しているまたはノックアウトされている、本発明1031〜1045のいずれかの微生物。
[本発明1047]
1種以上のさらなるプロテアーゼの活性が減弱または消失している、本発明1031〜1046のいずれかの微生物。
[本発明1048]
前記組換えタンパク質が、絹タンパク質由来の少なくとも1つのブロックポリペプチド配列を含む、先行本発明のいずれかの微生物。
[本発明1049]
前記組換えタンパク質が絹様ポリペプチドを含む、先行本発明のいずれかの微生物。
[本発明1050]
前記絹様ポリペプチドが1つ以上の反復配列
2021524227.tif 000065
を含み、
式中、
Ｘ1＝ＳＧＧＱＱまたはＧＡＧＱＱまたはＧＱＧＰＹまたはＡＧＱＱまたはＳＱであり、
ｎ1は4〜8であり、
ｎ2は6〜20であり、かつ
ｎ3は2〜20である、
本発明1049の微生物。
[本発明1051]
前記絹様ポリペプチドが配列番号21によりコードされるポリペプチド配列を含む、本発明1049の微生物。
[本発明1052]
前記組換えタンパク質が分泌シグナルペプチドを含む、先行本発明のいずれかの微生物。
[本発明1053]
前記分泌シグナルペプチドが、ＰＥＰ4シグナル配列、ＣＰＹ＋4シグナル配列、ＤＡＰ2シグナル配列、及びＭＦα1シグナル配列からなる群より選択される、本発明1052の微生物。
[本発明1054]
前記分泌シグナルペプチドが、配列番号84、配列番号86、配列番号88、及び配列番号90からなる群より選択される、本発明1052の微生物。
[本発明1055]
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）という微生物であって、
前記微生物のＳＥＣ72の活性が消失しているか、または配列番号1を含むｓｅｃ72遺伝子がノックアウトされており、
組換えで発現される配列番号3を含むＳＳＨ1遺伝子、組換えで発現される配列番号5を含むＳＳＳ1遺伝子、及び組換えで発現される配列番号7を含むＳＢＨ2遺伝子を含み、かつ
配列番号21によりコードされるポリペプチドを含む絹様ポリペプチドを含む、
前記微生物。
[本発明1056]
本発明1001〜1055のいずれかの微生物を含む、細胞培養物。
[本発明1057]
標準的な細胞培養条件下において、組換えで発現されるＳＳＨ1トランスロコン複合体を含まない細胞培養物と比較して、株の増殖速度及び発酵能力が向上している、本発明1009〜1055のいずれかの微生物を含む細胞培養物。
[本発明1058]
本発明1009〜1055のいずれかの微生物を含む細胞培養物であって、
標準的な細胞培養条件下において、
機能性ｓｅｃ72遺伝子を含みかつ組換えで発現されるＳＳＨ1トランスロコン複合体を含まない点以外は同一の微生物であって、それぞれの微生物が同一数の組換え絹ポリペプチド遺伝子のコピーを有する、前記微生物
の細胞培養物と比較して、前記組換えタンパク質の収量または比生産性が向上している、
前記細胞培養物。
[本発明1059]
本発明1001〜1055のいずれかの微生物を、前記組換えで発現されるタンパク質の発現に好適な条件下で、培地中で培養する工程、及び
前記微生物または前記培地から前記組換えタンパク質を単離する工程
を含む、組換えタンパク質の製造方法。
[本発明1060]
前記組換えタンパク質が前記微生物から分泌され、かつ、前記組換えタンパク質を単離する工程が、前記分泌された組換えタンパク質を含む培地を回収することを含む、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記ｓｅｃ72遺伝子が欠失していない点以外は同一な微生物と比較して、前記微生物における前記組換えタンパク質の収量または比生産性が増加する、本発明1059の方法。
[本発明1062]
前記組換えで発現されるＳＳＨ1トランスロコン複合体を含まない、及び前記ｓｅｃ72遺伝子が欠失していない点以外は同一な、微生物
と比較して、前記微生物における前記組換えタンパク質の収量または比生産性が増加する、本発明1059の方法。
[本発明1063]
組換えで発現されるタンパク質の分泌を改善するようにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを改変する方法であって、ＳＥＣ72タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトする工程を含む、前記方法。
[本発明1064]
前記Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを、組換えで発現されるＳＳＨ1トランスロコン複合体をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換する工程をさらに含む、本発明1063の方法。
[本発明1065]
前記組換えで発現されるタンパク質が絹様ポリペプチドを含む、本発明1063の方法。
[本発明1066]
前記絹様ポリペプチドが、1つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ1］ｎ1−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ2｝ｎ3を含み、
式中、
Ｘ1＝ＳＧＧＱＱまたはＧＡＧＱＱまたはＧＱＧＰＹまたはＡＧＱＱまたはＳＱであり、
ｎ1は4〜8であり、
ｎ2は6〜20であり、かつ
ｎ3は2〜20である、
本発明1063の方法。
[本発明1067]
前記組換えで発現されるタンパク質が、配列番号21によりコードされるポリペプチド配列を含む、本発明1063の方法。
前述の及び他の目的、特徴、ならびに利点は、添付の図面で例示する、本発明の個々の実施形態の以下の説明から明らかとなろうが、これらの図面において、異なる視図を通して同様の参照符号は同一の部分を指す。図面は必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではなく、むしろ本発明のさまざまな実施形態の原理を例示することに重点が置かれている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
いくつかの実施形態では、上記組換えタンパク質は、絹タンパク質由来の少なくとも１つのブロックポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記組換えタンパク質は絹様ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、上記絹様ポリペプチドは１つ以上の反復配列
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（配列番号１３）を含み、式中、Ｘ１＝ＳＧＧＱＱ（配列番号１４）またはＧＡＧＱＱ（配列番号１５）またはＧＱＧＰＹ（配列番号１６）またはＡＧＱＱ（配列番号１７）またはＳＱであり、ｎ１は４〜８であり、ｎ２は６〜２０であり、かつｎ３は２〜２０である。いくつかの実施形態では、上記絹様ポリペプチドは配列番号２１によりコードされるポリペプチド配列を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
いくつかの実施形態では、上記組換えで発現されるタンパク質は絹様ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、上記絹様ポリペプチドが１つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３（配列番号１３）を含み、式中、Ｘ１＝ＳＧＧＱＱ（配列番号１４）またはＧＡＧＱＱ（配列番号１５）またはＧＱＧＰＹ（配列番号１６）またはＡＧＱＱ（配列番号１７）またはＳＱであり、ｎ１は４〜８であり、ｎ２は６〜２０であり、かつｎ３は２〜２０である。いくつかの実施形態では、上記組換えで発現されるタンパク質は、配列番号２１によりコードされるポリペプチド配列を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、アルファ接合因子ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、別の内在性または異種の分泌シグナルコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、３Ｘ  ＦＬＡＧヌクレオチドコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、６〜８のＨｉｓ残基（配列番号１０７）などの他のアフィニティータグに作動可能に連結される。絹ポリペプチドヌクレオチドのコード配列を宿主細胞に送達するためのベクターの例を図５に示すが、図５は、分泌シグナル及びとＦＬＡＧタグを含む、絹様ポリペプチドを発現するためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むベクターのプラスミドマップを表している。上記ＯＲＦはｐＧＣＷ１４プロモーター及びｔＡＯＸ１ターミネーターに作動可能に連結されている。ベクターはまた、形質転換に成功した細胞を選択するための選択マーカーも含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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