(57)【要約】  細胞への遺伝物質及び他の物質の移行が、ハンズフリーで自動化された高スループットの連続プロセスで行われる。マイクロ流体の流体力学的シースフロー構成を使用するシステムは、細胞培養培地を含む側部ストリームからエレクトロポレーションバッファを含む中央部ストリームに細胞を押し出すための配置構成を含む。エレクトロポレーションは、２つ以上のマイクロ流体チャネルが並列構成で提供され、様々な層を一緒に積み重ねて積層体型構造を形成することができるアセンブリで行うことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペイロードを細胞に導入する方法であって、
第１のインキュベータから複数のマイクロ流体装置を含むアセンブリに細胞を誘導する工程と、
細胞培養培地からエレクトロポレーション培地に細胞を駆動する工程と、
前記エレクトロポレーション培地が中央部ストリームで流れるシースフロー構成で前記エレクトロポレーション培地中の細胞に電界を印加する工程と、
前記ペイロードを前記細胞に移行させるか又はその移行を可能にする工程と
を備える方法。
【請求項２】
前記ペイロードを含む細胞を前記エレクトロポレーション流体から細胞培養液に駆動する工程をさらに備える請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペイロードを含む細胞を第２のインキュベータに保存する工程をさらに備える請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ペイロードを含む細胞を、診断、予防又は治療を必要とする対象に投与する工程をさらに備える請求項１に記載の方法。
【請求項５】
免疫療法のための細胞を製造する方法であって、
細胞を第１のバッファからエレクトロポレーションバッファに移す工程であって、前記第１のバッファは細胞培養培地である工程と、
前記細胞をエレクトロポレーションによって透過処理する工程と、
ペイロードが、透過処理した前記細胞に移行することを可能にする工程と、
前記ペイロードを含む前記細胞を第２のバッファに移す工程と
を備え、
前記方法は、自動化された連続フローモードで行われ、
スループットは少なくとも４００万細胞／分となりうる方法。
【請求項６】
細胞へのカーゴの自動化された連続フロー移行のためのシステムであって、
細胞を保存するための第１のインキュベータと、
並列構成で配置された複数のマイクロ流体チャネルを支持する層を含むエレクトロポレーションアセンブリと、
細胞培養培地からエレクトロポレーション培地に細胞を駆動するための第１のバッファ交換器と、
前記エレクトロポレーション培地から培養培地に細胞を駆動するための第２のバッファ交換器と、
コントローラと
を含むシステム。
【請求項７】
エレクトロポレーションバッファを前記エレクトロポレーションアセンブリに送出するため、細胞を前記第１のバッファ交換器に送出するため、及び／又は細胞を前記第２のバッファ交換器から第２のインキュベータに送出するためのポンプシステムをさらに含む請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
各マイクロ流体チャネルが三叉の入口及び出口を有する請求項６に記載のシステム。
【請求項９】
前記エレクトロポレーションアセンブリが電極層をさらに含む請求項６に記載のシステム。
【請求項１０】
各マイクロ流体チャネルが、中央部ストリーム及び側部シースストリームをサポートするように構成されている請求項６に記載のシステム。
【請求項１１】
エレクトロポレーションアセンブリであって、
並列構成で配置された少なくとも２つのマイクロ流体チャネルを含むチャネル層と、
各マイクロ流体チャネルのための一対の電極を含む電極層と、
前記マイクロ流体チャネルの三叉の入口及び出口への流体接続のためのポート層と
を含み、
前記３つの層は積層体構成で積み重ねられているエレクトロポレーションアセンブリ。
【請求項１２】
ウインドウ層及び／又は電極フレーム層をさらに含む請求項１１に記載のエレクトロポレーションアセンブリ。
【請求項１３】
前記３つの層が互いに接着されている請求項１１に記載のエレクトロポレーションアセンブリ。
【請求項１４】
請求項１１に記載のエレクトロポレーションアセンブリを用いて、カーゴを細胞に移行する方法。
【請求項１５】
細胞へのカーゴの一括移行のためのシステムであって、
前記細胞を所望の温度に維持するためのインキュベータと、
前記細胞が前記インキュベータ内で沈降することを防止するための撹拌装置と、
前記細胞をエレクトロポレーションバッファに移動させるためのバッファ交換器と、
前記カーゴを移行するために、エレクトロポレーションバッファ中で前記細胞をエレクトロポレーションするためのフローエレクトロポレーション装置と、
前記フローエレクトロポレーション装置から前記細胞を受け取るためのインキュベータと
を含むシステム。
【請求項１６】
前記撹拌装置が、細胞リザーバ内のインペラを含む請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記インキュベータと前記バッファ交換器との間にポンプをさらに含む請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
エレクトロポレーションバッファを前記バッファ交換器に流すためのポンプをさらに含む請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記インキュベータと前記バッファ交換器との間に流体キャパシタをさらに含む請求項１５に記載のシステム。
【請求項２０】
前記バッファ交換器内でのバッファ交換を駆動するための音響トランスデューサ及び音響ドライバをさらに含む請求項１５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１８年８月３１日に出願された米国仮出願第６２／７２５，３８２号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、この仮出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、細胞の高スループット高効率トランスフェクションのための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物学、医学、薬学研究及び他の領域の多くの用途では、遺伝物質（遺伝子材料）が細胞に導入されるという技術が用いられている。「形質転換」という用語は、細菌又は植物細胞を含む非動物の真核細胞を扱うときにしばしば使用される。「トランスフェクション（形質移入）」は、ほとんどの場合、真核細胞に対する作業を指し、「トランスダクション（形質導入）」は、典型的には、ウイルスを介した真核細胞への遺伝子導入に適用される。
【０００４】
関心のある物質は、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＰ複合体だけでなく、小分子や抗体等のタンパク質も含むことができる。多くの場合、このような「カーゴ」物質の導入には、細胞膜に一過性の孔又は「穴」を開けて、その取り込みを可能にし、その結果、細胞を変化させたり、遺伝的に改変したりすることが伴う。
【０００５】
細胞を一時的に透過性にするために使用される一般的な技術の１つがエレクトロポレーション（電気穿孔）である。エレクトロポレーションの手順を開発する際に考慮されるパラメータには、細胞の特性（例えば、細胞のサイズ、形状、膜構造、表面電荷）、細胞環境、並びに印加される電界の属性（例えば、パルス強度、パルス数、パルス持続時間、パルス形状及び／又は周波数）が含まれる。一般に、エレクトロポレーションの際の膜の透過処理は、印加された電界が膜内外電位差の閾値、すなわち「エレクトロポレーション閾値」を誘導した後に起こると考えられており、また、所定の印加電界において、エレクトロポレーションの成功に必要なパルス数及びパルス長の閾値が存在すると考えられている。印加電界、細胞サイズ、媒体、細胞質ゾル及び細胞膜の電気伝導率、並びに膜厚を含む関連する実験パラメータに応答して発現する細胞の膜内外電位差を推定するために、シュワン（Ｓｃｈｗａｎ）方程式及び関連する微分がしばしば使用される（「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｉｅｌｄｓ  ｏｎ  Ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、第７９巻、２０００年８月、６７０−６７９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｉｅｌｄｓ  ｏｎ  Ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、第７９巻、２０００年８月、６７０−６７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
伝統的に、エレクトロポレーションによる細胞の遺伝子改変は、キュベットを用いたバルク、バッチプロセスとして行われてきた。あまり普及していない、フロー構成を採用する可能性のある市販の装置は、いくつかの自動化機能を欠いている。
【０００８】
例えば、既存のエレクトロポレーションプロセスは、特殊な低電気伝導度バッファを使用することが多く、この特殊な低電気伝導度バッファは、とりわけ長時間の暴露により細胞生存率に悪影響を及ぼす可能性がある。それゆえ、バッチ処理では、いくつかのバッファ交換や洗浄工程が必要となり、このため、このアプローチは非常に多くのタッチ操作（手作業）が必要となり、増大する大規模バッチ製造のニーズに対応するためにスケールアップすることが困難である。手作業による洗浄及び／又は濾過の工程も時間がかかるため、細胞は数分から１時間程度の時間スケールでエレクトロポレーションバッファになお曝されることになる。これらの工程は、しばしば細胞の損失（低い細胞回収率）を伴う。また、高スループットのトランスフェクションシステムも存在しない。
【０００９】
細胞治療が、自己由来ではなく同種の細胞源を用いた大規模生産に向かうにつれて、バルク法を用いた細胞治療のバイオプロセシングはますます困難になってきている。
【００１０】
加えて、市販のエレクトロポレーション装置は、生物製剤を電極に直接接触させるため、局所的な加熱、並びにファラデー副生成物（ヒドロニウムイオン、ヒドロキシルイオン、塩素、フリーラジカル、及び電極破壊副生成物（アルミニウムイオンや微粒子等））による潜在的な損傷が生じる。マイクロ流体力学がないので、従来のエレクトロポレーション法の多くは、熱の影響を受けやすい生体から熱を奪うことができず、またはこれを効率的に行うことができない。場合によっては、細胞（又は他の基質）とペイロード（カーゴ）の共局在ができず、非効率性や（貴重な）物質の損失につながることもある。
【００１１】
それゆえ、上述した問題の少なくともいくつかに対処する装置及び手順の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書には、遺伝物質又は他の物質の細胞への導入が、ハンズフリーの、自動化された、高スループットの連続プロセスで行われるアプローチが記載されている。
【００１３】
いくつかの実施形態は、マイクロ流体の流体力学的シースフロー構成に依っており、例えば細胞培養培地を含む側部ストリーム（側部の流れ）からエレクトロポレーションバッファを含む中央部ストリーム（中央部の流れ）に細胞を押し出すための配置構成を含む。エレクトロポレーションは、２つ以上のマイクロ流体チャネルが並列構成で提供され、様々な層を積み重ねて積層体型構造を形成することができるアセンブリで行うことができる。各マイクロ流体チャネルは、一対の電極を備え、好ましくは、長期間の連続的かつ高スループットの操作に耐えるように構築されている。
【００１４】
１つの実施態様では、装置はシステムの一部であり、そのシステムは、共通のリザーバと、このリザーバへ及び／又はリザーバから流体を駆動する（送り出す）ためのポンプ（圧送）システムと、エレクトロポレーションのための電圧発生器と、このシステムの部分的又は完全な自動化のためのコントローラとを含む。細胞の保存のために、少なくとも１つのインキュベータ（培養器）を使用することができる。具体的な配置構成には、細胞の沈降を防ぐための撹拌が含まれる。
【００１５】
他の実施形態は、インキュベータからの細胞が、細胞培養条件からエレクトロポレーションバッファに駆動され、エレクトロポレーションされる装置に向けられる方法を特徴とする。カーゴ含有細胞は、その後、培養条件に戻したり、収集したりすることができる。特定の実施態様において、ペイロードを含む細胞は、診断、予防又は治療を必要とする対象に投与される。
【００１６】
いくつかの態様において、本発明は、細胞治療製造に使用することができる。一例として、本明細書に記載される技術及び装置は、初代Ｔ細胞にｍＲＮＡをエレクトロトランスフェクションする際に使用することができる。他の態様では、本明細書に記載されるアプローチを用いて製造されたカーゴ含有細胞は、治療、予防又は診断を必要とする対象に投与される。
【００１７】
本発明を実施することで、従来のシステムで遭遇した問題に対処することができ、多くの利点が得られる。例えば、本明細書に記載される装置及び技術は、非理想的な条件（エレクトロポレーションバッファ、室温）に細胞を曝す期間、及び従来のバッファ交換に伴う細胞及び／又は遺伝物質の損失を低減又は最小化することができる。例えば、トランスフェクション効率と細胞の健康の両方が、室温のエレクトロポレーションバッファ中での保存に長期間（約３０分以上）曝されることで有害な影響を受けることが実証されている。本明細書で開示されるアプローチは、これらのタイプの暴露を１分未満に減少させることができ、あるいは、溶液内の細胞の滞留時間を正確に制御して、連続的に正確な所望の長さにすることができる（例えば、溶液Ａ中で２０分、溶液Ｂ中で３分、溶液Ｃ中で１分）。
【００１８】
多くの実施形態では、トランスフェクション手順等、カーゴを細胞又は他の膜結合基質に移行させる（導入する）ためのプロセス全体において、細胞の取り扱いが自動化される。従って、既存の市販装置とは対照的に、本明細書に記載されるシステムは、プロセスフローの一部として自動化された方法で細胞培養条件で細胞を収容することができる。バッファ交換を、細胞の遠心分離と再懸濁を用いて手動で行う必要はもはやない。むしろ、多くの態様において、本発明は、バッファ交換を実現する自動化された方法を提供する。移される細胞及び／又は物質をエレクトロポレーション電極との直接接触から保護することができる構成も可能である。
【００１９】
本明細書に記載される技術により、大量の細胞を連続的に、高いスループットで、長時間処理することができる。複数のマイクロ流体チャネルを、例えば本明細書に記載される並列構成で含むアセンブリ（組立体）は、共通のリザーバ、ポンプシステム、電界発生器等の共通の構成要素を利用することができ、全体のレイアウトを単純化することができる。
【００２０】
堅牢で柔軟性があり、汎用性の高い本発明の実施形態は、様々なタイプのカーゴ、細胞、又は他の膜結合基質（他のタイプのベシクルやエクソソーム等の構造体）に適用又は適応することができる。本明細書に開示されるエレクトロポレーション及び／又は他のモジュールは、（例えば、１回の使用後に）使い捨てにすることができるが、提示された設計は、繰り返し使用するために十分な強度及び頑丈さを有する装置をもたらす。
【００２１】
本明細書に記載されている原理は、細胞又は他の膜結合構造体に保持されている内容物の一部又は全部を除去するためにも採用することができる。すなわち、孔を開き、内部の内容物を受動的に、又は音響泳動力や電気泳動力等の能動的なメカニズムを介して外に拡散させることができる。
【００２２】
一般に、一態様によれば、本発明は、ペイロードを細胞に導入する方法を特徴とする。この方法は、第１のインキュベータから複数のマイクロ流体装置を含むアセンブリに細胞を誘導する工程と、細胞培養培地からエレクトロポレーション培地に細胞を駆動する工程と、エレクトロポレーション培地が中央部ストリームで流れるシースフロー構成でエレクトロポレーション培地中の細胞に電界を印加する工程と、ペイロードを細胞に移行させるか又はその移行を可能にする工程とを備える。
【００２３】
実施形態では、当該方法は、ペイロードを含む細胞をエレクトロポレーション流体から細胞培養液に駆動する工程をさらに備えることができる。加えて、ペイロードを含む細胞は第２のインキュベータに保存される。
【００２４】
多くの場合、ペイロードを含む細胞は、診断、予防又は治療を必要とする対象に投与される。
【００２５】
一般に、別の態様によれば、本発明は、免疫療法のための細胞を製造する方法であって、細胞を第１のバッファからエレクトロポレーションバッファに移す工程であって、この第１のバッファは細胞培養培地である工程と、次にこの細胞をエレクトロポレーションによって透過処理する工程とを備える方法を特徴とする。これにより、ペイロードが、透過処理した細胞に移行することが可能になる。次いで、ペイロードを含む細胞は第２のバッファに移される。本発明は、自動化された連続的なフローモードを伴うものであり、スループットは少なくとも４００万細胞／分となりうる。
【００２６】
一般に、別の態様によれば、本発明は、細胞へのカーゴの自動化された連続フロー移行のためのシステムを特徴とする。このシステムは、細胞を保存するための第１のインキュベータと、並列構成で配置された複数のマイクロ流体チャネルをサポートする層を含むエレクトロポレーションアセンブリと、細胞培養培地からエレクトロポレーション培地に細胞を駆動するための第１のバッファ交換器と、エレクトロポレーション培地から培養培地に細胞を駆動するための第２のバッファ交換器と、コントローラとを含む。
【００２７】
好ましくは、当該システムは、エレクトロポレーションバッファをエレクトロポレーションアセンブリに送出するため、細胞を第１のバッファ交換器に送出するため、及び／又は細胞を第２のバッファ交換器から第２のインキュベータに送出するためのポンプシステムを含む。さらに、各マイクロ流体チャネルは、中央部ストリーム及び側部シースストリームをサポートするように構成されてもよい三叉の入口及び出口を有してもよい。
【００２８】
一般に、別の態様によれば、本発明は、エレクトロポレーションアセンブリであって、並列構成で配置された少なくとも２つのマイクロ流体チャネルを含むチャネル層と、各マイクロ流体チャネルのための一対の電極を含む電極層と、マイクロ流体チャネルの三叉の入口及び出口への流体接続のためのポート層とを含み、これらの層が積層体構成で積み重ねられ（スタックされ）ているエレクトロポレーションアセンブリを特徴とする。
【００２９】
一般に、別の態様によれば、本発明は、細胞へのカーゴの一括移行のためのシステムであって、細胞を所望の温度に維持するためのインキュベータと、この細胞がインキュベータ内で沈降することを防止するための撹拌装置と、細胞をエレクトロポレーションバッファに移すためのバッファ交換器と、カーゴを移行するために、エレクトロポレーションバッファ中で細胞をエレクトロポレーションするためのフローエレクトロポレーション装置と、フローエレクトロポレーション装置から細胞を受け取るためのインキュベータとを含むシステムを特徴とする。
【００３０】
上記撹拌装置は、細胞リザーバ内のインペラを含んでもよい。加えて、インキュベータとバッファ交換器との間にポンプが使用されてもよい。エレクトロポレーションバッファをバッファ交換器に流すためのポンプも役立つ。また、インキュベータとバッファ交換器との間に流体キャパシタがあると便利である。
【００３１】
構造及び部品の組み合わせの様々な新規の詳細を含む本発明の上記及び他の特徴、並びに他の利点は、これから添付の図面を参照してより詳細に説明され、特許請求の範囲で指摘される。本発明を具現化する特定の方法及び装置は、説明のために示されたものであり、本発明を限定するものではないことが理解されるであろう。本発明の原理及び特徴は、本発明の範囲から逸脱しない範囲で、様々かつ多数の実施形態に採用されてよい。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
添付の図面では、参照文字は、異なる図を通して同じ部品を参照している。図面は必ずしも縮尺通りではなく、代わりに本発明の原理を説明することに重点が置かれている。
【００３３】
【図１】図１は、細胞のハンズフリーの連続フロートランスフェクションのための装置を示す模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、インキュベータ内に保持されている間に細胞が沈降するのを防止するために使用することができる撹拌装置の模式図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａの装置の分解図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、図２Ａの撹拌装置に使用することができるインペラの斜視図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、図１のシステムで使用することができる流体キャパシタの分解図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、図２Ｄの組み立てられた流体キャパシタの斜視図である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、図２Ｄ及び図２Ｅの流体キャパシタのプレート部品の斜視図である。
【図２Ｇ】図２Ｇは、図２Ｄ及び図２Ｅの流体キャパシタのプレート部品の斜視図である。
【図２Ｈ】図２Ｈは、図２Ｄ及び図２Ｅの流体キャパシタのプレート部品の斜視図である。
【図３】図３は、中央部ストリーム及び側部ストリームを使用するフロー配置構成をサポートするように構成された装置構成要素を示す上面図である。
【図４Ａ】図４Ａは、細胞のエレクトロポレーションに使用することができる音響駆動型高速バッファ交換配置構成の模式図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、音響駆動型高速バッファ交換及びエレクトロポレーションの配置構成の模式図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、音響駆動型高速バッファ交換及びエレクトロポレーションの配置構成の模式図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、音響駆動型高速バッファ交換及びエレクトロポレーションの配置構成の模式図である。
【図５】図５Ａ（音響オフ）及び図５Ｂ（音響作動）は、音響駆動型高速バッファ交換プロセスを実証する顕微鏡画像である。
【図６】図６は、エレクトロポレーションアセンブリの構成要素の分解図である。
【図７】図７は、図６に示す構成要素を含むエレクトロポレーションアセンブリの斜視図である。
【図８】図８は、図６に示す構成要素を含むエレクトロポレーションアセンブリの斜視図である。
【図９】図９は、図６〜図８の構成要素の上面図である。
【図１０】図１０は、図６〜図８の構成要素の上面図である。
【図１１】図１１は、図６〜図８の構成要素の上面図である。
【図１２】図１２は、図６〜図８の構成要素の上面図である。
【図１３】図１３は、図６〜図８の構成要素の上面図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、本明細書に記載される手順に従ってエレクトロポレーションされたＴ細胞のトランスフェクション効率を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、本明細書に記載される手順に従ってエレクトロポレーションされたＴ細胞の生存率データを示す。
【図１５】図１５は、２人のドナーから得られ、本明細書に記載される手順に従ってエレクトロポレーションされた細胞の生存率及びトランスフェクション効率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明を、本発明の例示的な実施形態が示されている添付の図面を参照して、より完全に説明する。しかしながら、本発明は多くの異なる形態で具現化されてもよく、本明細書に記載される実施形態に限定して解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全なものとなり、当業者に本発明の範囲を十分に伝えることができるように提供されている。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「及び／又は」は、関連する列挙された項目の１つ以上のいずれか及びすべての組み合わせを含む。さらに、単数形並びに冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、明示的に別段の記載がない限り、複数形をも含むことが意図される。さらに、用語、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ及び／又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇは、本明細書で使用されるとき、記載される特徴、整数、工程、操作、要素、及び／又は構成要素の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、及び／又はそれらのグループの存在又は追加を排除しないことが理解されるであろう。さらに、構成要素又はサブシステムを含めて要素が、別の要素に接続又は結合されていると言及及び／又は示されている場合、その要素は他の要素に直接接続又は結合されていてもよいし、介在する要素が存在していてもよいことが理解されるであろう。
【００３６】
本明細書では、様々な要素を説明するために「第１」及び「第２」等の用語が使用されているが、これらの要素はこれらの用語によって限定されるべきではないことが理解されよう。これらの用語は、ある要素を別の要素から区別するためにのみ使用される。従って、以下で議論される要素は、第２の要素と呼ばれる可能性があり、同様に、第２の要素は、本発明の教示から逸脱しない範囲で、第１の要素と呼ばれる可能性がある。
【００３７】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。さらに、一般的に使用されている辞書で定義されているような用語は、関連する技術の文脈における意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書で明示的に定義されていない限り、理想化された、又は過度に形式的な意味で解釈されることはないことが理解されよう。
【００３８】
本発明は、全体として、本明細書で「カーゴ」又は「ペイロード」と呼ばれる１つ以上の物質又は薬剤を、細胞内又は細胞外に移行するためのアプローチに関する。多くの場合、細胞は真核細胞であり、典型的には、約１０〜約１００ミクロン（μｍ）の範囲内の直径を有する。カーゴは、例えば、リポソーム、エクソソーム、ミセル等の他の膜結合構造体に、又はこの他の膜結合構造体から移行させることもできる。
【００３９】
カーゴ物質の例としては、小分子、染色体、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ）、その他の遺伝物質、オリゴマー、バイオマーカー、タンパク質、トランスポゾン、生体分子複合体、小分子、治療剤等が挙げられるが、これらに限定されない。多くの場合、そのカーゴは、ヒト対象又は動物対象における状態の治療、予防又は診断に有用な薬剤である。
【００４０】
多くの態様において、本発明は、細胞又は他の基質へのカーゴのハンズフリーの連続フローの移行をサポートするシステムに関する。当該システムで行われるプロセスは、部分的又は完全に自動化することができる。
【００４１】
例えば、図１に示されているのは、インキュベータ１２、（第１の）バッファ交換器１４、エレクトロポレーションアセンブリ１６、（第２の）バッファ交換器１８、及び（第２の）インキュベータ２０といういくつかの構成要素又はモジュールを含むシステム１０である。このシステムは、例えばリザーバ２２、２４及び２６等の１つ以上のリザーバと、ポンプ３０、３２、３４及び３６とをさらに含むことができる。エレクトロポレーションに必要な電圧は電気機能発生器４０によって提供され、音響エネルギーは音響機能発生器４２によって提供される。このシステムはコントローラ４４によって制御される。多くの場合、このコントローラは、シングルボードコンピュータシステム等のコンピュータシステム内のマイクロプロセッサである。他の場合では、コントローラは、統合されたメモリとアナログ・デジタル変換器とデジタル・アナログ変換器とを備えたマイクロコントローラである。
【００４２】
一方又は両方のインキュベータ１２及び２０（それぞれ、エレクトロポレーションアセンブリ１６の上流及び下流に配置されている）は、エレクトロポレーションの前及び／又は後に細胞を収容するために構成されたベンチトップインキュベーションチャンバであることができ、約０．３〜約５０リットル（Ｌ）の内容積を有することができる。多くの場合、一方又は両方のインキュベータは、小型化された設計を有する。
【００４３】
典型的には、インキュベータ１２及び／又は２０は、これらのインキュベータへ及び／又はそれらのインキュベータから細胞を移すための手段を備える。
【００４４】
例えば、インキュベータ１２は、細胞容器又はリザーバのためのレセプタクル（フラスコ、コニカルチューブ等）を備えることができる。この容器は、例えば、血液バッグ等の密封された無菌容器とすることができる。例示的な例では、容器は、Ｔ細胞用のＴｅｘＭＡＣＳ又はＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ロズウェルパーク記念研究所））培地等の高電気伝導度（例えば、約１〜２Ｓ／ｍ）の培養バッファに懸濁した１０５〜５×１０８細胞／ｍＬの濃度の細胞を提供する。
【００４５】
細胞培養条件、例えば、インキュベータの温度（多くの場合、３７℃に維持される）、インキュベータのガス組成（例えば、ＣＯ２及び／又は湿度レベル）、代謝又は一般的な処理の読み出しのためのセンサー（ｐＨ、Ｏ２等）等を制御するために、閉ループ又は別の適切な配置構成を含むことができる。
【００４６】
インキュベータ１２に収容可能な細胞の例としては、初代Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞等の浮遊細胞、又はＭＳＣ、ＣＨＯ細胞等の付着細胞等が挙げられる。いくつかの実施態様において、インキュベータ１２及び／又は２０は、リポソーム、エクソソーム、ミセル等の膜結合構造体をサポートするように設計又は適合されている。これらのターゲットを安定に保つための好適なバッファ及び条件は、当該技術分野で知られているように選択することができ、かつ／又は実験的に決定することができる。
【００４７】
培養培地中で中性浮力を持たない可能性のある細胞（又は他の膜結合構造体）の場合、インキュベータには、細胞を収容する容器内に（穏やかな）動きを発生させ、沈降又は沈下を低減、最小化、又は防止するための撹拌機構を取り付けることができる。これにより、下流の操作（培地交換やエレクトロポレーション）に送出される細胞の濃度が制御され、一貫性のあるものとなることが確保される。一つの例示的な設計を、図２を参照して以下に説明する。
【００４８】
いくつかの場合では、プロセスの開始と終了に別々のインキュベータチャンバを利用する（例えば、図１の要素１２及び２０を参照）のではなく、システム全体がインキュベータチャンバに収容される。
【００４９】
本明細書に記載されている実施形態の多くにおいて、エレクトロポレーションアセンブリ１６は、例えば、マイクロ流体チャネルにおいて、シースフロー構成を用いて、連続的に行われるエレクトロポレーションプロセスをサポートする。ある特定の実施形態では、細胞とカーゴを中央部のフロー又はストリームで接触させ、このフロー又はストリームは、典型的には、本明細書でエレクトロポレーション流体とも呼ばれる低電気伝導度流体を利用する。中央部ストリームは、典型的には高電気伝導度流体を使用する２つのシース（「側部」又は「側方」とも呼ばれる）ストリームの間を流れる。中央部流体と側部流体との間の電気伝導度の差は、流れの中央部の（低電気伝導度）領域における電界（電圧発生器４０によって供給される）の集中をもたらし、電界強度の効果的な増幅を可能にし、中央部ストリームの中の細胞が電極と物理的に接触することを防止する。
【００５０】
細胞培養のための好ましい培地が典型的に高い電気伝導度を有し、上述のシースフロー配置構成が、エレクトロポレーションの間、好ましくは細胞を低電気伝導度培地（媒体）に置くことを考慮して、システム１０は、細胞培養培地からエレクトロポレーションバッファ培地に細胞を移すためにバッファ交換配置構成１４を使用する。多くの実施形態では、図１の構成要素１４で表される高速バッファ交換は、音響的に細胞を１つのフローストリームから別のフローストリームに駆動することを含み、音響周波数は構成要素４２を介して生成される。
【００５１】
エレクトロポレーションの後、細胞をエレクトロポレーション培地（媒体）から細胞培地に移すことができる。図１に示された１つのアプローチは、細胞濃縮機能をさらに含むことができるバッファ交換モジュール１８を採用する。伝統的に、細胞の濃縮は、典型的には遠心分離を用いたバッチプロセスで達成されるが、音響泳動、誘電泳動、電気泳動、慣性効果、又は統合された多孔質膜若しくはふるいを用いたフロー構成で達成することができよう。
【００５２】
１つの実施形態では、バッファ交換装置１４及び１８の少なくとも１つは、高速バッファ交換装置及び細胞濃縮器である。別の実施形態では、バッファ交換（切り替え）モジュール及びエレクトロポレーション装置１６（上述のシースフロー構成を採用することができる）の一方又は両方が単一の装置に統合されている設計を利用する。さらなる実施形態では、少なくとも１回のバッファ交換が、エレクトロポレーション装置とは別の装置で行われる。このアプローチの一例では、バッファ交換器１４、フローエレクトロポレーションアセンブリ１６、及びバッファ交換器１８は、これらの構成要素の間で流体連通を提供することができる導管、例えば、適切なチューブによって互いに接続される。
【００５３】
本発明のいくつかの態様は、装置１４及び１８の両方において、音響駆動型の高速のバッファ切り替えを採用する。他の態様では、非音響駆動型のバッファ切り替えがバッファ交換装置の少なくとも１つで利用される。１つの実施態様は、音響駆動型のバッファ交換装置１４及び非音響駆動型のバッファ交換装置１８を利用する。
【００５４】
音響駆動型のバッファ交換の構造及び動作の詳細は、２０１９年３月２０日に出願されたＡｃｏｕｓｔｉｃａｌｌｙ−Ｄｒｉｖｅｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（微小粒子用の音響駆動型のバッファ切り替え）という発明の名称の米国特許出願第１６／３５９，６２６号に提供されており、この出願はこの参照により本明細書に組み込まれる。非音響駆動型のバッファ切り替えを得るために採用することができる技術には、慣性技術、統合された多孔質膜又はふるいを有するマイクロチャネル、又は拡散−ｂベースの技術が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
出力細胞はインキュベータ２０に集められる。１つの例では、これらの細胞は、ｍＲＮＡを含む初代ヒトＴ細胞である。このような細胞は、遺伝子編集用途において、又は一過性の治療システム（ｍＲＮＡ  ＣＡＲ−Ｔ）として使用することができる。他の例では、出力細胞は、タンパク質又は細胞外小胞の生産に使用される（例えば、改変されたＣＨＯ細胞又はＭＳＣ）。
【００５６】
システム全体にわたって、流れは、ポンプシステムによって駆動される（作動される）が、このポンプシステムには、蠕動設計であることが多い市販の既製品のポンプが含まれる。他の適切なポンプの種類を採用することもできる。一般的には、１つのポンプを使用して、第１インキュベーションチャンバからシステム全体への細胞懸濁液の流れを、例えば、１００μＬ／分〜２ｍＬ／分の範囲の流量で作動させる。システム内でバッファ交換が行われるたびに、さらに１台のポンプが必要となる。名目上、少なくとも２つのポンプが必要である。１つは細胞をエレクトロポレーションバッファに移動させることに関与し、もう１つは後で細胞を培養バッファに戻すことに関与する。装置間の流量差を防ぐために、バラスト（安定器）として機能する流体キャパシタ又はリザーバを装置間に設置することができる。この場合、各マイクロ流体装置は、流量を制御するための独自のポンプのセットを有する。
【００５７】
システム１０では、エレクトロポレーションされる細胞は、流体の流れを制御できるシリンジポンプとすることができるポンプ２６を用いてインキュベータ１２から引き出される。システム１０は、エレクトロポレーションバッファをエレクトロポレーション配置構成１６に供給するためのリザーバ２２及びポンプ３２（例えばシリンジポンプ）も含む。シースフローのための高電気伝導度流体は、ポンプ３４、例えばシリンジポンプによってリザーバ２４から加えることができる。細胞培地は、ポンプ３６、例えばシリンジポンプを用いて、リザーバ２６からバッファ交換モジュール１８に供給される。
【００５８】
システム１０は、細胞に（又は他のタイプの膜結合構造体に）組み込まれるカーゴを収容するリザーバに関する様々なオプションを提供する。初代ヒトＴ細胞を使用する１つの例では、エレクトロポレーションバッファ中のｍＲＮＡは、リザーバ２２から培地交換装置１４に導入されることが可能で、この培地交換装置１４は、ｍＲＮＡを搭載したエレクトロポレーション培地がエレクトロポレーション装置１６に流入する前に、そのエレクトロポレーション培地に細胞を移動させる。他の配置構成は、プラスミドＤＮＡ、一本鎖線状ＤＮＡ、二本鎖線状ＤＮＡ、線状化プラスミドＤＮＡ、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド、リボヌクレオタンパク質（例えば、ガイドＲＮＡと複合化したＣａｓ９タンパク質）、タンパク質、又は小分子等のカーゴをリザーバ２２から供給する。細胞は、カーゴを搭載したエレクトロポレーション培地に手動で懸濁され、インキュベータ１２に導入され、フローエレクトロポレーション装置１６に直接流されることもできる。
【００５９】
シラスチック又は他の適切なチューブは、様々なモジュール（構成要素）間の流体連通を提供する一部又はすべての接続に採用することができる。
【００６０】
コントローラ４４は、部分的又は完全な自動化に到達するために、システム１０又はその構成要素の動作を制御するための１つ以上のコンピュータ、ハードウェア、ソフトウェア、センサ、インターフェース等を含むことができる。多くの実施形態では、コントローラ４４は、エレクトロポレーションに適用される電気パラメータ、並びに／又はバッファ交換装置１４、及び任意にバッファ交換装置１８で採用される音響周波数を制御する。コントローラ４４は、インキュベータパラメータ、ポンプ３０、３２、３４及び／又は３６のうちの１つ以上のその動作、上述の中央部ストリーム及び／又はシースストリームの流れ並びにパラメータ等を監視又は制御することができる。
【００６１】
システム１０及び／又はその動作に含めることができる様々な実施形態は、以下にさらに記載される。
【００６２】
例えば、上述したように、システム１０は、インキュベータ内に維持された細胞が沈降するのを防止するために、１つ又は複数の撹拌装置を利用することができる。一例は、図２Ａ及び２Ｂに示されている。これらの図面に示されているのは、インキュベータ１２（図１）に収容することができるフロントエンド撹拌装置１１である。撹拌装置１１は、好適な細胞バッファ中の細胞をバッファ交換器１４（図１）に供給するための細胞リザーバ１３と、細胞を撹拌して沈降しないようにするためのインペラ１５とを含む。具体的な実施形態では、細胞リザーバ１３は、円筒状（管状）の上側部分１７と、円錐状の下側部分１９とを含む。出口２１は、細胞リザーバ１３の円錐形の下側部分１９と、図１のポンプ３０との間の流体連通を提供する。蓋２３は、部分１７の上部開口部を覆っている。
【００６３】
細胞リザーバ１３は、約１５ｍＬ〜約１Ｌの範囲内の容積を有することができる。
【００６４】
多くの場合、好適なインペラ設計を選択する際には、細胞リザーバの底部への細胞の沈下を低減、最小化、又は完全に防止するために十分な撹拌を促進する一方で、細胞を細胞リザーバ内の過剰な剪断力から保護する必要性が考慮される。図２Ａ及び図２Ｂの具体的な実施形態では、インペラ１５は、図２Ｃに図示されているように、細胞リザーバ１３と同様のプロファイルを有し、上側部分２５及びテーパ状の下側部分２７を含む。図２Ｃの実施形態では、インペラは、細胞リザーバ１３内に収まるように構成された薄い平坦な構造体である。テーパの程度、部分２５及び２７の相対的な長さ、並びに他のパラメータは、実験的に最適化することができる。さらには、他のタイプのインペラを採用することもできる。
【００６５】
インペラ１５は、磁気カップリング３１を介してモータ２９に接続されている。
【００６６】
モータ、磁気カップリング、及び細胞リザーバは、プラットフォーム３３上に設置することができ、このプラットフォームは、いくつかの実施態様では、アルミニウムブレッドボードから製作される。細胞リザーバ１３は、安定化プレート３５によって安定化され、一方、ホルダプレート３７は、蓋２３で細胞リザーバ１３を保持する。ホルダプレート３７は、例えば、細胞リザーバを出し入れし、それを撹拌中に安定した状態を保つために、Ｕ字型の開口部を有することができる。安定化プレート３５及びホルダプレート３７は、支柱又は他の好適な手段を用いてプラットフォーム３３に装着することができる。図２Ａ及び図２Ｂの実施形態では、装置１１は、６インチ（約１５ｃｍ）の長さを有することができる３つの雄雌（嵌め込み型）の支柱３９を含む。
【００６７】
３つのねじ４３を含むことができるモータサブアセンブリ４１は、例えば、３インチ（約７．６ｃｍ）の長さを有することができる雄雌の支柱４５を使用して、ホルダプレート３７に装着される。モータは、インペラに磁気的に結合する磁石を回転させ、インペラを直接接触することなく細胞リザーバ内で回転させる。
【００６８】
インペラ１５を動作させるためのパラメータは、細胞が細胞リザーバの底に沈下し沈降しないようにしつつ、細胞を過度の剪断から保護する必要性を考慮する。具体的な実施態様では、インペラ１５は毎分１６０回転で動作し、細胞に約２ｄｙｎｅ／ｃｍ２の最大剪断応力を与える。剪断応力が約１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２未満に留まることが重要である。
【００６９】
出口２１から流体を駆動するために蠕動ポンプが使用される場合、ポンプによって生じる流れの振動を減衰させ、上流の装置に一様流を提供するために、コンプライアント構造（柔軟構造）をラインに配置することができる。コンプライアント構造は、例えば、流体キャパシタ、すなわち流体圧力に反応して変形するポリマー膜等のコンプライアント材料から製造された床及び／又は天井を有するマイクロチャネルとすることができる。一例が図２Ｄ（流体キャパシタ６１の分解図）及び図２Ｅ（組み立てられた流体キャパシタの図）に示されている。これらの図面に見られるように、流体キャパシタ６１は、２つのポリマー膜、すなわちシート６９によって分離されたトップ（天井）プレート６３、ミドルプレート６５及びボトム（床）プレート６７を含み、これらは、例えば、高純度の高温シリコーンゴム又は別の適切な材料から作製することができる。トッププレート６３、第１シート６９、ミドルプレート６５、第２シート６９、及びボトムプレート６７は、ねじ穴７３に螺合することができるねじ７１によって一緒に保持される。プレートとシートを一緒にクランプ（締め付け）するための他の配置構成を採用することができる。ポート７５は、他のシステム構成要素との間の、相互の流体連通を提供する。１つの例では、出口２１（図２Ａ及び図２Ｂ）は、第１の（入口）ポート７５に接続され、一方、第２の（出口）ポート７５は、ポンプ３０（図１）に接続される。
【００７０】
図２Ｆ、図２Ｇ及び図２Ｈは、それぞれ、プレート６３、６５及び６７を示す。より詳細には、マイクロチャネル７７が中間プレート６５を貫通してカットされている。貫通孔７９はネジ７１を収容し、一方、貫通孔８１は入口／出口ポート７５に適合するように構成されている。
【００７１】
動作中、マイクロチャネル７７を通って流れる流体は、シート６９の間に挟まれるが、シート６９は柔軟性があり、体積変動に対応して流れを一様にすることができる。
【００７２】
図３は、上述したようなシースフロー構成をサポートすることができる例示的なエレクトロポレーションアセンブリ１６の上面図である。この配置構成は、図３において、三叉の入口（要素４６ａ、４６ｂ、４６ｃ）及び三叉の出口（要素４６ａ’、４６ｂ’、４６ｃ’）を有するマイクロ流体中心チャネル４６を含む。
【００７３】
マイクロ流体チャネル４６は、硬質プラスチック等の基板５２に作製することができる（これは、多くの材料について、当該装置を使い捨てにする）。例としては、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）熱可塑性プラスチック、Ｋａｐｔｏｎ（登録商標）等のポリイミドフィルム、ポリスチレン、ＰＥＩ（ポリエーテルイミド）、例えばＵｌｔｅｍ（登録商標）等、又は様々なポリマーの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ガラス、石英、シリコン、適切なセラミック等の他の材料も採用できる。
【００７４】
チャネルの寸法は、幅が５００マイクロメートル（μｍ）〜３ミリメートル（ｍｍ）、長さが１センチメートル（ｃｍ）〜５ｃｍ、高さが１２５μｍ〜５００μｍの範囲であることができる。マイクロチャネルの床の下のポリマー層には、一対のコプラナー型の菱形の電極（４８ａ及び４８ｂ）がパターニングされており、正方形のワイヤボンド又ははんだパッドの領域がポリマー層中の切り込みによって画定され、外部からアクセスできるように電極が露出している。マスキング層が、電極層とマイクロ流体チャネル４６の間に配置され、マイクロチャネル内の流体に曝される電極の部分を画定する切り込みがある。典型的には、電極は、白金金属（Ｐｔ）等の電気化学的に安定した材料から形成される。チャネル内の流体に曝される電極の部分は、幅が１００〜２５０μｍ、長さが８〜４５ｍｍの寸法を有し、正方形のはんだ付けパッド（図３の要素５０ａ及び５０ｂ）への接続を介して電気機能発生器４０にインターフェースする。
【００７５】
図３のような配置構成では、中央部ストリーム対側部ストリームの相対的な流量を調整することができる。１つの例では、電極が側部ストリームとのみ接触するように、相対的な流量が調整される。合計流量は、３７５μＬ／分〜６ｍｌ／分の範囲とすることができる。具体的な例では、側部ストリームと中央部ストリームの流量比は、典型的には１：０．５〜１：１（１つの側部：中央部）の範囲である。中央部ストリームを構成する溶液の電気伝導率が、側部ストリームを構成する溶液の電気伝導率よりもはるかに低い（例えば、１０倍以上）場合、中央部ストリームが回路の電気抵抗を支配し、電極に電圧が印加されたときに、電圧のほとんどが中央部ストリームを横切って降下するようになる。
【００７６】
（図１の電気機能発生器４０からの）電圧は、正方形のはんだ付けパッド５０ａ及び５０ｂを横断して印加され、この電圧は、１０ナノ秒（ｎｓ）〜１０ミリ秒（ｍｓ）の範囲の周期を有する正弦波、又は１０ｎｓ〜１０ｍｓの範囲のパルス幅を有するパルス列の形態をとってもよい。印加電圧の大きさは、中央部ストリームを横断して約２〜１０００ｋＶ／ｍの範囲の電界、及び１０ｎｓ〜１０ｍｓの範囲のパルス幅を発生させるように変化させることができる。パルス列の周波数も同様に変化させることができ、例えば、細胞の滞留時間あたり１パルスから、滞留時間あたり１０パルス以上の範囲となる。
【００７７】
図３のような配置構成は、異なるバッファの使用をサポートすることができる。特定の実施形態では、シース側部ストリームは、高い電気伝導度（σ）、例えば、約１〜約２シーメンス／メートル（Ｓ／ｍ）の範囲内であることを特徴とし、一方、中央部シースストリームは、低いσ、例えば、１０〜１０００マイクロシーメンス／センチメートル（μＳ／ｃｍ）の範囲内のσを有する。このアプローチは、細胞培養に好適なバッファ及び／又はエレクトロポレーションに好適なバッファの使用と適合性がある。
【００７８】
このように、１つの実施態様では、好ましいバッファに入った細胞は、中央部シースストリーム４６ｃを介して提供される。２つの側部ストリーム４６ａ及び４６ｂは、図１のポンプ３４によって高電気伝導度培地リザーバ２４から供給される。このような細胞の好ましいバッファは、高いσ、例えば、約１０，０００〜約２０，０００（μＳ／ｃｍ）の範囲のσを有することが一般的である。
【００７９】
低σのエレクトロポレーションバッファは、中央部ストリーム４６ｃを流れ、図１のポンプ３２によってエレクトロポレーションリザーバ２２から供給される。
【００８０】
エレクトロポレーションモジュール１６（図３）に入る前に、インキュベータ１２から来る細胞は、図４Ａの音響培地交換モジュールの側部ストリームポート１１０に流れ込み、ここで細胞は、高電気伝導度側部シースストリームから、低σエレクトロポレーションバッファ及びカーゴを含む中央部ストリームに、例えば音響的に駆動され又は押し出される。その結果、細胞は、中央のエレクトロポレーションバッファ（これは、その後、モジュール１６の中央部ストリームポート４６ｃに送出される）に浮遊するようになる。細胞を１つのバッファから別のバッファに駆動するための音響エネルギーは、音響機能発生器４２から、チャネル基板１５２に取り付けられた音響トランスデューサ１５４に供給される。
【００８１】
エレクトロポレーション操作（図１及び図３のエレクトロポレーションアセンブリ１６で行われる）の後、カーゴ含有生成物細胞は、中央部ストリームに浮遊したままでいることができ、出口４６ｃ’から収集することができる。出口４６ａ’及び４６ｂ’から得られた流体は、廃棄物として処理されるか、又はリサイクルされる。他の実施形態では、第２のバッファ交換（図１のバッファ交換器１８を参照）を行って、カーゴ含有生成物細胞を、中央部ストリームの低σエレクトロポレーションバッファから側部ストリームの高σ流体に移動させることができる。この構成では、カーゴ含有生成物細胞は、出口４６ａ’及び４６ｂ’から収集することができる。出口４６ｃ’からの流体は、廃棄物として処理されるか、又は再利用のために収集配置構成に向けられる。
【００８２】
図４Ａに模式的に示されているのは、高電気伝導度細胞バッファを含むシースストリームから、中央部ストリームを流れる低電気伝導度エレクトロポレーションバッファに細胞を移動させるための（第１の）バッファ交換器１４の１つの配置構成である。好ましい培地、すなわち細胞バッファに入った細胞は、細胞入口１１０から導入される。このストリームは、ポンプ３０によってインキュベータ１２から供給される。入口に入力された培地は、２つの細胞サブチャネル１１０Ａ、１１０Ｂに分岐する。細胞サブチャネル１１０Ａ、１１０Ｂは、ｙ軸方向に互いに発散し、その後、正のｘ軸方向に進むにつれて収束する。細胞は、シース細胞バッファストリームから、音響集束領域１１９の中央部エレクトロポレーションバッファストリームに音響的に駆動される。エレクトロポレーションバッファは、ポンプ３２によってエレクトロポレーションバッファリザーバ２２から供給される。音響エネルギーは、音響機能発生器４２から、チャネル基板１５２に取り付けられた音響トランスデューサ１５４に供給される。出力細胞は中央の出口１２１から回収され、一方、細胞バッファは廃棄物として出口１２３Ａ及び１２３Ｂで回収されるか、又は再利用のために収集配置構成に向けられる。前述したように、１つの構成では、出口１２１からの出力細胞は、図３のエレクトロポレーションモジュール１６の中央部シースストリーム４６ｃに供給される。
【００８３】
図４Ｂは、細胞のエレクトロポレーションに使用される２段階の音響駆動型高速バッファ交換システム１００を示しており、このシステムは、図１で説明した第１のバッファ交換器１４、エレクトロポレーションアセンブリ１６、及び第２のバッファ交換器１８の機能を実行する。
【００８４】
この例は、２つ以上の接続されたマイクロチャネル１０２、１０４を含む。典型的には、これらのチャネルは、ポリスチレン等の硬質ポリマー基板（１又は複数）１０８、あるいは、シリコン、ガラス、石英等の他の硬質基板から作製される。ここでは、プロトタイプの２チャネルシステムを説明するが、追加のチャネルを種類に応じて追加することができる。
【００８５】
図示の例では、マイクロチャネル１０２、１０４のそれぞれは、別の基板１０８−１、１０８−２に作製されている。
【００８６】
各マイクロチャネル１０２、１０４は、中央部ストリーム１２４と両側のストリーム１２６とを有するシース又は並行流（コフロー）をサポートする。具体的な例では、中央部ストリーム１２４は、側部ストリーム１２６の組成とは異なる組成を有する。流れは層流領域に維持されるので、ストリーム間の混合は最小限である。
【００８７】
この層流を維持するために、中央部ストリーム１２４及びシース又は側部ストリーム１２６の流体速度は、システム内のレイノルズ数Ｒｅが、収束領域１２７の三叉の入口の領域において小さい（Ｒｅ≪約２０００）ようになっている。好ましくは、Ｒｅは５００未満であり、好ましくは１０未満である。
【００８８】
マイクロチャネル１０２、１０４は、断面が、１００マイクロメートル（μｍ）〜１０００μｍの範囲の幅及び高さの寸法を有する長方形であってもよい。マイクロチャネル１０２、１０４の各々の長さは、５ミリメートル（ｍｍ）〜３０ミリメートルの範囲である。
【００８９】
しかしながら、他の実施形態も可能である。別の例は、シースストリーム１２６が中央部ストリーム１２４を四方から取り囲む同心的な流れの形状を有する。例えば入口ポート１１０等の入力領域で、１つ以上のシースストリーム１２６に最初に導入される細胞１０等の粒子は、直径が１００ナノメートル（ｎｍ）〜２５μｍの範囲であることができる。例えば、エレクトロポレーションによるトランスフェクションのための典型的な粒子であるＴ細胞は、約６μｍ〜１２μｍの範囲の大きさである。
【００９０】
１つの応用例では、システム１００は、細胞を特殊なエレクトロポレーションバッファに高速で出し入れするために使用され、各マイクロチャネルは、２つの入口１１０、１１２及び三叉の出口１１４を有する。エレクトロポレーションバッファは、入口１１２を介して第１のマイクロチャネル１０２に直接導入され、中央部ストリームを形成するか又は構成する。エレクトロポレーションバッファは、図１のポンプ３２によってエレクトロポレーションバッファリザーバ２２から供給される。好ましい培地、すなわち細胞バッファに入った細胞は、細胞入口１１０を介して導入される。この細胞は、ポンプ３０によってインキュベータ１２から供給される。入口に入力された培地は、２つの細胞サブチャネル１１０Ａ、１１０Ｂに分岐する。細胞サブチャネル１１０Ａ、１１０Ｂは、ｙ軸方向に互いに発散し、その後、正のｘ軸方向に進むにつれて収束する。
【００９１】
細胞バッファ及びエレクトロポレーションバッファは、一般的に、細胞がそれぞれのバッファの中でどれだけ長く生存できるかという点で互いに異なる。Ｔ細胞用の細胞バッファの例としては、ＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．（ミルテニーバイオテク）から販売されている）又はＲＰＭＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（サーモフィッシャーサイエンティフィック）から販売されている）が挙げられよう。このような細胞バッファは、典型的には、細胞の浸透圧や栄養分に合わせた生理的な塩濃度を含んでいる。他方、エレクトロポレーションバッファの例としては、ＢＴＸ低電気伝導度バッファ（ＢＴＸ社から販売されている）が挙げられよう。このようなエレクトロポレーションバッファは、典型的には、電気伝導度を低下させるために塩濃度が低いが、細胞への浸透圧ショックを低減するために糖類が添加されている。
【００９２】
細胞サブチャネル１１０Ａ、１１０Ｂは、サブチャネル１１２Ａから流れるエレクトロポレーションバッファの両側で、互いに向かって収束し、収束領域１２７に三叉の入口を形成する。このようにして、３つのサブチャネル１１０Ａ、１１０Ｂ、１１２Ａのすべてが、その流れを切り替えチャネル１２５に送出する。細胞を含むストリーム１２６の流れは、その流れの２つの側部シースストリームとして、中央部ストリーム１２４の周りに収束する。
【００９３】
第１のマイクロチャネル１０２の他方の遠位端において、切り替えチャネル１２５は、発散領域１２９の２つの側部出口サブチャネル１３０Ａ、１３０Ｂに流れを送出する。ここで、サブチャネル１３０Ａ、１３０Ｂは、ｘ軸方向に進むにつれて、ｙ軸方向に互いに発散し、また、中央出口サブチャネル１３２からも発散する。２つの側部出口サブチャネル１３０Ａ、１３０Ｂは、元のシース入力ストリーム１２６から大部分の流れを運び、廃棄物として出るか、又は再利用のために収集される。
【００９４】
中央出口サブチャネル１３２は、切り替えチャネルの中央部ストリームからの流れを運ぶ。それは、エレクトロポレーションバッファ内の細胞１０を含む。
【００９５】
ここでも、好ましくは層流が維持される。発散領域１２９内の流体速度は、システム内のレイノルズ数、Ｒｅが、発散領域１２９内の三叉の出口の領域で小さい（Ｒｅ≪約２０００）ようになっている。好ましくは、Ｒｅは５００未満であり、好ましくは１０未満である。
【００９６】
第１のマイクロチャネル１０２の中央出口サブチャネル１３２は、好ましくは別の基板１０８−２に製造された第２のマイクロチャネル１０４の入口１３４に流れを導く。第２のマイクロチャネルの入口１３４は、２つの細胞サブチャネル１３４Ａ、１３４Ｂに分岐する。細胞サブチャネル１３４Ａ、１３４Ｂは、ｙ軸方向に互いに発散し、その後、正のｘ軸方向に進むにつれて再収束する。
【００９７】
細胞の好ましい培地又は二次的な培地（おそらく、トランスフェクトされるべき異なるバイオマーカー又はカーゴを含む）が、第２のマイクロチャネル１０４の他方の入口１１６に導入される。この培地は、図１のポンプ３６によって細胞培地リザーバ２６から供給される。エレクトロポレーションされた細胞サブチャネル１３４Ａ、１３４Ｂは、正のｘ軸方向に流れる培地を運ぶ細胞バッファサブチャネル１１６Ａの両側で、互いに向かって収束する。
【００９８】
エレクトロポレーションされた細胞サブチャネル１３４Ａ、１３４Ｂ及び細胞バッファサブチャネル１１６Ａは、その流れを第２の切り替えチャネル１４０に送出する。ここで、細胞１０は、側部ストリーム１６２から、第２のマイクロチャネル１０４の第２の切り替えチャネル１４０の中央部ストリーム１６０へと導かれる。上述のように、収束領域１２７の三叉の入口の領域では、レイノルズ数Ｒｅが小さい（Ｒｅ≪約２０００）。好ましくは、Ｒｅは５００未満であり、好ましくは１０未満である。
【００９９】
細胞は、第２のマイクロチャネル１０４の中央出口サブチャネル１４２から収集することができる。マイクロチャネル１４２から収集された細胞は、図１に示すインキュベータ２０に移される。切り替えチャネル１４０の端部で、中央出口サブチャネル１４２の両側にある２つの側方出口サブチャネル１４４Ａ、１４４Ｂは、流体を廃棄物へ又は再利用のために収集配置構成に運ぶ。
【０１００】
あるいは、細胞は、所望されるバッファ交換の回数に応じて、追加のマイクロチャネル等に向けられることができる。典型的な入力流量は、１マイクロリットル／分（μｌ／分）〜１ミリリットル／分（ｍｌ／分）の範囲である。
【０１０１】
１つの例では、基板１０８−１、１０８−２は、シアノアクリレート接着剤を用いて別々のチタン酸ジルコン酸鉛圧電トランスデューサ１１８−１、１１８−２に接着されており、マイクロチャネルよりも短くなっている。トランスデューサ１１８−１、１１８−２は、図１に示された音響機能発生器４２の別々のドライバ１５０−１、１５０−２に接続されて、それらによって駆動され、それぞれのドライバ１５０−１、１５０−２は、それぞれのチャネル１０２、１０４を励振する正弦波信号を生成する機能発生器によって駆動される高周波増幅器を含む。この装置構成は、９００〜９９０ｋＨｚの音響共振周波数をサポートすることが示されており、切り替えチャネル１２５、１４０のそれぞれの幅にわたって安定した定在圧力波が生成される。トランスデューサとマイクロチャネル基板も、ヒートシンクとして機能するアルミニウムプレートに装着されるのが好ましい。アルミニウムプレートの下には、熱電冷却器（ＴＥＣ）素子とベースプレートが置かれている。マイクロチャネルの近くのトランスデューサの上にサーミスタが接続され、ＴＥＣとともにＴＥＣコントローラに接続されて、閉ループの温度制御システムが構築される。温度は、好ましくは約２６℃に保たれる。
【０１０２】
音響アイソレータ１４６は、音響トランスデューサ１１８−１、１１８−２のそれぞれからの音響エネルギーが、他方のマイクロチャネルに影響を与えることを防止する。これにより、２つのマイクロチャネル間のクロストークが防止され、それらを別々に駆動及び調整することができる。本例では、マイクロチャネル１０２、１０４を別々の基板１０８−１、１０８−２に作製し、その後、音響クロストークを避けるために柔軟なチューブでそれらの基板を接続することにより、隔離を実現している。
【０１０３】
これらのトランスデューサ１１８−１、１１８−２は、図１の音響機能発生器４２の別々のドライバ１５０−１、１５０−２によって作動される。これらのドライバの各々は、例えば、別個に調整可能な正弦波状に変化する電圧を印加する。この周波数は、それぞれのマイクロチャネル１０２、１０４の各切り替えチャネル１２５、１４０の幅（流体の流れ方向に対して直角方向）にわたって安定した定在圧力波が発生するように選択される。このようにして、トランスデューサ１１８−１、１１８−２は、図４Ｂの２段階の音響駆動型高速バッファ交換システム１００において、（第１の）バッファ交換器１４（図１）及び第２のバッファ交換器１８（図１）の動作をそれぞれ駆動する。
【０１０４】
基本的な集束モードについては、流体内には単一の圧力ノードが存在する。音響放射圧は、圧力ノードの方向に細胞に力を及ぼす。この結果、チャネルの断面の中心線に向かって、側部ストリームから中央部ストリームに細胞が移動する。第１のマイクロチャネル１０２では、この作用により、細胞がその好ましいバッファからエレクトロポレーションバッファに移動し、そこで細胞はエレクトロポレーションを受ける。第２のマイクロチャネル１０４では、この作用により、細胞がエレクトロポレーションバッファから出て、好ましいバッファ又は新しいバッファに戻る。この結果、エレクトロポレーションバッファ内の細胞の滞留時間は数秒以下となる。
【０１０５】
一対のエレクトロポレーション電極１２０は、図４Ｂの２段階の音響駆動型高速バッファ交換システム１００におけるエレクトロポレーションアセンブリ１６（図１）の動作を駆動する。エレクトロポレーション電極１２０は、第１のマイクロチャネル１０２の三叉の入口と三叉の出口の間の領域に、例えば三叉の入口と三叉の出口の中間に配置することができる。エレクトロポレーションが複数の段階を含み、複数の連続したペイロードが必要な場合、最終的なマイクロチャネルが細胞をその好ましいバッファに戻す限り、電極は、第２及び任意の追加のマイクロチャネルにも作製されてもよい。電極１２０は、細胞が切り替えチャネル１２５内の中央部ストリーム１２４内のエレクトロポレーションバッファに集中した後でエレクトロポレーション場を通過するように、配置される。電極は、図１に示される電気機能発生器４０によって駆動される。
【０１０６】
電極１２０は、フォトリソグラフィプロセスを用いて、切り替えチャネル１２５の床及び天井、又はチャネル１２５の側壁にパターニングされてもよい。電極面積（特に、チャネルの流れ軸（図４Ｂのｘ軸方向）に沿った寸法）及び流量は、電界内の細胞の滞留時間を決定する。選ばれる滞留時間は、１００マイクロ秒（μｓ）〜約１秒の範囲で変わることができる。あるいは、開ポートから主チャネルへの流体接続と、ポート内に配置されたワイヤ電極を含む「リモート電極」を使用することもできる（このような構成では、電極にファラデー電流を流す必要がある）。交流（例えば、周期／パルス幅が１０ナノ秒〜１００マイクロ秒の範囲の正弦波若しくはパルス列）又は直流の電界が確立され、細胞が装置を通過する間、活性を維持する。電界の大きさは、特定の細胞の種類に応じて、透過処理を達成するのに十分な値に調整され、それは、典型的には、２〜２００ｋＶ／ｍの範囲である。
【０１０７】
カーゴは、入口１１２で第１のマイクロチャネル１０２に導入されるエレクトロポレーションバッファか、又は細胞入口１１０に導入される好ましい細胞バッファ中の細胞かのいずれかに混合することができる。前者は、第２のマイクロチャネルへの通過のタイミングを調整することにより、細胞のカーゴへの曝露時間を調整することができる。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、個々のマイクロチャネルは、別々に製造され、ポリマーチューブによって流体的に接続され、独立して音響的に作動される。個々のマイクロチャネルは、同じ基板上に製造され、単一の圧電トランスデューサを使用して一緒に作動させることもできる。いくつかの実施形態では、細胞の好ましい培地を含む、第１のマイクロチャネル１０２からの２つの側部出口サブチャネル１３０Ａ、１３０Ｂの「廃棄物」ストリームは、第２のマイクロチャネル１０４の入口１１６を介して中央部ストリームに導かれ、結合される（第２のポンプが第２のマイクロチャネルの中央部ストリームに直接培地を送出する代わりに）。いくつかの実施形態では、複数の連続マイクロチャネルセットアップが、細胞及びバッファを導入するためのマニホールドと並行してレイアウトされ、スループットを増加させる。
【０１０９】
図４Ｃ及び図４Ｄは、高速バッファ交換システム１００の２つの代替実施形態を示す。ここでは、複合マイクロチャネル１０６において、細胞は、エレクトロポレーションのための中央部ストリームに集束され、その後、収集のために外側の流れに戻って集束される（ここでは「脱集束」と呼ばれる）。
【０１１０】
より詳細には、エレクトロポレーションバッファ（図１のポンプ３２によってエレクトロポレーションバッファリザーバ２２から供給される）は、入口１１２を介して複合マイクロチャネル１０６に直接導入され、図４Ｃに示すように、シースフローの中央部ストリームを構成する。好ましい培地中の細胞（図１のポンプ３０によってインキュベータ２０から供給される）は、細胞入口１１０を介して導入される。入口に投入された培地は、２つの細胞サブチャネル１１０Ａ、１１０Ｂに分岐する。細胞サブチャネル１１０Ａ、１１０Ｂは、ｙ軸方向に互いに発散し、その後、正のｘ軸方向に進むにつれて収束する。
【０１１１】
細胞サブチャネル１１０Ａ、１１０Ｂは、エレクトロポレーションバッファサブチャネル１１２Ａの両側で、互いに向かって収束し、三叉の入口を形成する。このようにして、サブチャネル１１０Ａ、１１０Ｂ、１１２Ａは、その流れを複合切り替えチャネル１２５に送出する。細胞を含む流れ１２６は、これまでの実施形態と同様に、流れの２つの側部シースストリームとして、中央部ストリーム１２４の周りに収束する。
【０１１２】
第１のマイクロチャネル１０２の他方の遠位端において、切り替えチャネル１２５は、ｘ軸方向に進むにつれてｙ軸方向に互いに発散する２つの側部出口サブチャネル１３０Ａ、１３０Ｂに流れを送出する。２つの側部出口サブチャネル１３０Ａ、１３０Ｂは、元のシースストリーム１２６から大部分の流れを運ぶが、この例では、細胞は、側部出口サブチャネル１３０Ａ、１３０Ｂの上流でシースストリーム１２６に移動している。
【０１１３】
長い複合切り替えチャネル１２５は、三叉の入口からｘ軸に沿って測定された距離Ｌ１において、チャネルの両方の側方にあるエレクトロポレーション電極１２０のセットによって２つの領域に分割され、この距離は、例えば、２０〜４０ｍｍの範囲であることができる。チャネルの幅はｗで、４２０〜７４０μｍであることができる。典型的には４００〜１０００ｋＨｚの範囲である周波数ｆ１での音響作動は、図１の音響機能発生器４２によって提供され、第１のドライバ１５０−１によって第１の音響波トランスデューサ１１８−１に印加され、エレクトロポレーション電極１２０の上流で中央の低電気伝導度ストリームへと細胞を駆動する（追い込む）ために使用される。電極１２０の下流の領域では、典型的には例えばｆ１よりも１．５〜２．５倍大きい異なる周波数ｆ２（第２の音響機能発生器、例えば図１の音響機能発生器４２と同様のものによって提供される）が、第２のドライバ１５０−２によって第２の音響波トランスデューサ１１８−２に印加され、これは細胞を中央部ストリームから駆動する（追い出す）ために使用される。
【０１１４】
マイクロチャネル１０２の遠位端にある中央の出口サブチャネル１３２は、切り替えチャネルの中央部ストリームからの流れを、例えば、廃棄物又はリサイクルに運ぶ。
【０１１５】
図４Ｃでは、単一の音響駆動周波数が使用されているが、電極１２０の下流のチャネルはより広く、ｗ１（電極１２０の上流の幅）よりも１．５〜２．５倍大きい幅ｗ２を有している。これにより、チャネル内の音波の節点構造が変化し、細胞の側部ストリームへの同様の強制力が達成される。
【０１１６】
図４Ｃ及び図４Ｄの両実施形態では、流体チャネルの幅ｗ、ｗ１、ｗ２に対する基板１０８の幅ｔが重要なパラメータである。それは、５５０〜１０５０μｍの範囲である。
【０１１７】
さらに別の実施形態では、マイクロチャネル（１つ又は複数）は、マイクロチャネル（１つ又は複数）内の微粒子（又は細胞）に作用する音響定在波モードを生成するための圧電トランスデューサ（又は表面音響波トランスデューサ）の上に引き続き存在する。しかしながら、本実施形態では、流体中に電界を発生させるための一組のエレクトロポレーション用の電極を採用していない。このような構成、すなわちエレクトロポレーション電極を用いない構成は、例えば、細胞を「洗浄」したり、ある培地から別の培地に移したりするのに有用である。これは、遠心分離機で微粒子（細胞）を回転沈降させ、上清を除去し、第２のバッファを加え、微粒子を再懸濁することを含む従来の方法の良い代替手段となり得る。
【０１１８】
図５Ａ及び図５Ｂには、音響駆動型の高速バッファ交換を示す顕微鏡画像が示されている。音響がオフのとき（図５Ａ）、側部ストリーム中の細胞は偏向されることなく通過し、最初のバッファに留まっている。音響が作動すると（図５Ｂ）、細胞は側部ストリームから中央部ストリームへと偏向され、中央部ストリームには異なるバッファが含まれたり、異なる試薬が含まれたりしてもよい。
【０１１９】
本発明のいくつかの実施形態では、図１に示されたシステムは、図３に示されたような少なくとも１つのマイクロチャネル配置構成（装置）から本質的に構成されるか、又はそのようなマイクロチャネル配置構成を含むエレクトロポレーションアセンブリ１６を採用する。
【０１２０】
エレクトロポレーションアセンブリは、以下でさらに説明するように、並列構成の２つ以上（すなわち、複数又は多数の）エレクトロポレーション配置構成を含むこともできる。このようなアセンブリは、図１に例示した高スループット、高効率の連続フローシステムだけでなく、他のシステムでも、又は独立して、従来の手段（例えば、遠心分離及び再懸濁）を用いて適切な、低電気伝導度のエレクトロポレーションバッファにロードされた細胞（又はエクソソーム等の他のターゲット）をトランスフェクションするためのフローエレクトロポレーション装置として使用することができる。この構成では、トランスフェクトされた細胞は出力で回収され、インキュベーション又は保存条件に手動で戻される。さらなる実施態様は、音響駆動型のバッファ交換を採用しないシステムにおいて、並行チャネルを有するエレクトロポレーションアセンブリを利用する。
【０１２１】
図６は、図８〜図１２でさらに説明される複数の層又はプレート（すなわち、層２１０、２３０、２５０、２７０及び２９０）を含むアセンブリ２００の分解図である。これらの層は、図７（上面図）及び図８（底面図）に示すように、積み重ね（スタック）構成で積層することができる。１つの実施態様では、積層体は、隣接するプレート間に配置された適切な接着フィルムを硬化させることによって調製される。
【０１２２】
個々の層に目を向けると、図９に示されているのは、電極（４８ａ及び４８ｂ）へのはんだ接合のためのアクセスを提供する開口部２１２を含み、１０ミリメートル（ｍｍ又はｍｉｌ）の厚さを有することができる層２１０の図である。１つの例では、層２１０はＵｌｔｅｍ（登録商標）材料で作られている。
【０１２３】
図１０は、実質的に図２Ｂを参照して説明したように、中央部ストリーム及び側部ストリームのための三叉の入口及び出口、並びにマイクロ流体中心チャネル４６をそれぞれ有する、複数（図では４つが示されている）の流体マイクロチャネルを含む流体チャネル層２３０を示す。
【０１２４】
上述の特定の実施形態は、４つの並行な流体マイクロチャネルを有する。好ましい配置構成では、これらは、単一の共通インキュベータ１２からの細胞を処理するために並行して使用されるであろう。並列のマイクロチャネルを使用することで、毎分４００万個以上の細胞等、より高いスループットを得ることができる。
【０１２５】
一般に、電界は少数の、あるいは単一の細胞を横切って最適に配置されるので、マイクロチャネルを単純に広くすることはできない。従って、さらなる実施態様では、より多数の並列の流体マイクロチャネルが単一のアセンブリ２００で作製される。１つの実施形態は、共通の入力インキュベータ１２の間で並列に動作して、改変された細胞を共通の出力インキュベータ２０に出力する、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０又はそれ以上の流体マイクロチャネルを含む。
【０１２６】
より詳細には、各流体マイクロチャネルは、三叉の入口２３２ａ、２３２ｂ及び２３２ｃと、三叉の出口２３２ａ’、２３２ｂ’及び２３２ｃ’とを有する。これらの入口／出口に挿入され、エポキシで密封された皮下注射用のステンレス鋼チューブ（例えば、公称２５ゲージのチューブ、０．４インチ（約１ｃｍ）の長さ）は、細胞や流体を導入するための装置のインターフェースとして機能することができる。プラスチックチューブ（例えば、内径０．３８ミリメートルのビニール製）をステンレスチューブに圧入することもできる。図に見られるように、流体マイクロチャネルは、並列構成で配置されている。流体チャネルプレート２３０は、約１０ｍｉｌ（約０．２５ｍｍ）の厚さを有することができ、例えば、Ｕｌｔｅｍ（登録商標）から作製することができる。
【０１２７】
好ましくは、チャネル、とりわけマイクロ流体中心チャネル４６は、流体チャネル層２３０において、層をすべて貫通するスロットを形成することによって作製される。スロットには異なる技術を用いることができる。現在の実施態様では、スロットはレーザー加工で形成されている。他のオプションは、いくつかの例を挙げると、機械的ミリング及びフォトリソグラフィプロセスである。
【０１２８】
図１１に示される層は、電極スロット（又はトレンチ）２５４ａ及び２５４ｂを備えた電極フレーム２５０である。これらのスロットは、前述したような製造技術を用いて、電極フレーム２５０を貫通して形成される。このスロットは、菱形電極のそれぞれの近位（長い）エッジと、マイクロ流体中心チャネル４６内の流体との間の流体連通を可能にする。電極フレームは、例えば、約１ｍｉｌ（約０．０２５ｍｍ）の厚さのＵｌｔｅｍ（登録商標）又はＫａｐｔｏｎ（登録商標）から作製することができる。孔２５６は、積層位置合わせ用ダボピンのために提供される。
【０１２９】
図１２は、一対のコプラナー型の菱形電極（４８ａ及び４８ｂ）を形成する４対の菱形の金属化領域２７２ａ及び２７２ｂを含む電極層２７０を示す。この金属化領域は、電気化学的に安定した材料、例えば白金金属を、例えば５ｍｉｌ（約０．１３ｍｍ）のＵｌｔｅｍ（登録商標）フィルム上に蒸着（例えば、シャドウマスクを介したスパッタリング）することによって作製することができる。電極層の製造に使用される蒸着マスクの位置合わせのために、基準マーカー２７４が設けられている。
【０１３０】
図１３に示されているのは、例えば３／３２インチ（約０．２８ｃｍ）厚のＵｌｔｅｍ（登録商標）材料から作られ、三叉の入口４６ａ、４６ｂ、４６ｃ（図２Ｂ及び図９）にアクセスするための開口部２９２ａ、２９２ｂ、２９２ｃと、三叉の出口４６ａ’、４６ｂ’、４６ｃ’（図２Ｂ及び図１０）にアクセスするための開口部２９２ａ’、２９２ｂ’、２９２ｃ’とを備えるポートプレート２９０である。これらの開口部は、図５に示されるチューブ３００を収容する大きさである。上述したように、皮下注射用のステンレス鋼チューブ（公称２５ゲージのチューブ、長さ０．４インチ（約１ｃｍ））をこれらの開口部から挿入し、マイクロチャネルの入口／出口に接続し、エポキシで封止して、細胞や流体を導入するための装置のインターフェースを形成することができる。好適なゲージのプラスチックチューブをステンレス鋼チューブに圧入することができる。
【０１３１】
組立及び製作中の適切な方向付けのために、プレート２１０、２３０、２５０、２７０及び２９０は、チャンバ２９７によってマークすることができる。プレートは好ましくは互いに接着される。１つの例では、Ｒ／ｆｌｅｘ  １０００シート等の接着フィルムが、レーザー加工の前にいくつかのプレートに取り付けられる。その後、接着シートは、例えば、高温高圧で硬化される。
【０１３２】
（例えば、図２〜図４Ｄ及び図６〜図１３を参照して）上述した１つ以上のサブアセンブリを任意に含む、システム１０（図１）等のシステムは、以下のように動作させることができる。血液バッグ等の細胞容器を第１のインキュベータ１２に導入し、沈降作用による細胞の沈降を防止する撹拌機構に取り付ける。シラスチックチューブは、血液バッグと第１の高速バッファ交換モジュールとの間の流体接続を行い、蠕動ポンプ３０は、バッファ交換装置への細胞の流れを駆動する。バッファ交換装置の入り口で、流れは分岐してシースフローの外側ストリームを形成する。第２のポンプ３２（例えばシリンジポンプ）は、リザーバ２２から細胞に送達されるべきカーゴ（ｍＲＮＡ、ｐＤＮＡ、ＲＮＰ等）を含むエレクトロポレーションバッファの流れを、バッファ交換装置内のシースフローの中央部ストリームに駆動する。この装置に取り付けられた音響機能発生器４２によって駆動される圧電アクチュエータによって駆動される音響場が、外側のストリームから中央部ストリームへ、カーゴを含む低電気伝導度のエレクトロポレーションバッファの中へ細胞を駆動する。その後、シースフロー全体は、フローエレクトロポレーションモジュール（これは、バッファ交換装置に直接組み込むことができる）に入り、ここで、外側のストリームと接触している電極が通電され、細胞が電界に曝される。他の配置構成では、エレクトロポレーション装置に入るのは中央部ストリームだけで、側部ストリームには新鮮な高電気伝導度バッファが導入される。その後、外側のストリームは廃棄物へと流れ、中央部ストリームは第２のバッファ交換装置に導入される。第２のバッファ交換装置の入り口では、エレクトロポレーションモジュールから来る流れが分岐して、シースフローの外側のストリームを形成する。ポンプ３６（例えばシリンジポンプ）は、細胞培養液又は回収バッファを細胞培地リザーバ２６から第２の高速バッファ交換装置に送り込み、シースフローの中央部を形成する。次に、音響機能発生器４２によって駆動される圧電アクチュエータによって駆動される音響場が、外側のストリームから中央部ストリームに細胞を駆動し、細胞を、第１のインキュベータ内の血液バッグ内の最初のバッファと同じであってもよいし異なっていてもよい培養バッファに戻す。その後、細胞は、第２のインキュベーションチャンバ２０内の収集レセプタクルに流れ込む。
【０１３３】
透過処理した細胞へのペイロードの移行を促進又は強化するために、（例えば超音波処理器を使用して）音響エネルギーを加えると、細胞とカーゴ物質との間の衝突を増加させることができ、それによって、細胞とカーゴ物質とを近接させ、カーゴを細胞に装填する確率を増加させることができる。機械的な撹拌等の適切な手段を用いて、細胞とカーゴの衝突率の増加を得ることもできる。これは、音響バッファ交換モジュールにおいて自然に起こるが、追加の音響撹拌を、図３に示されるフローエレクトロポレーション装置に（例えば、装置の外側に接着された圧電トランスデューサを使用して）追加することができる。
【０１３４】
いくつかの実施形態は、細胞がインキュベータ内の培養バッファに戻される前に、複数のバッファ交換及び／又は複数の送出イベント（複数のエレクトロポレーション操作）が行われることを提供する。これは、追加のバッファ交換モジュール、フローエレクトロポレーションモジュール、及びポンプを必要とする可能性がある。エレクトロポレーションバッファ（複数可）への細胞の様々な移動、エレクトロポレーション、及びエレクトロポレーションバッファ（複数可）から適切な細胞培養バッファに戻る細胞の移動の少なくとも一部は、単一のモジュールに統合することができる。
【０１３５】
多くの実施形態では、システム１０で実施されるプロセスは、連続的に行われる。当該システムはモジュール化できるので、応用例に基づいてカスタマイズすることができる。例えば、あるプロセスは単一のバッファ交換のみを必要としてもよく、他のプロセスは、複数のペイロードを連続して送達するために、いくつかの連続したバッファ交換及びいくつかのエレクトロポレーションイベントを必要としてもよい。
【０１３６】
さらに他の実施形態では、細胞及び／又は試薬は、複数のパスのために再循環される。
【０１３７】
本明細書に記載される原理は、細胞又は他の膜結合構造体に保持された内容物の一部又は全部を除去するため、すなわち、孔を開いて、内部の内容物を受動的に又は能動的な力を介して外部へ拡散させるためにも採用することができる。
【０１３８】
従来のバルクエレクトロポレーション技術と同様に、本明細書に記載されるフロー配置構成は、小バッチでの細胞のエレクトロポレーションにも適合している。しかしながら、これは非常に多くの時間とタッチ操作（手作業）が必要であり、大規模な処理には困難であろう。
【０１３９】
本明細書に記載される装置及び技術は、スループットを増加させ、かつ／又はカーゴが細胞又は他の膜結合構造体に移行される効率を改善することができる。記載されているように、エレクトロポレーションプロセスの前、その間、及びその後に細胞を保護するために様々な手段が取られ、細胞の生存率を向上させる。
【０１４０】
従って、いくつかの実施形態では、細胞エレクトロポレーションは、１分あたり少なくとも４００万個の細胞を処理するスループット、例えば、１分あたり約４００万個から約５０００万個の細胞の範囲内のスループットで行うことができる。フローサイトメトリーで測定された蛍光レポータータンパク質の発現によって示されるように、初代ヒトＴ細胞へのｍＲＮＡ等の遺伝子カーゴのトランスフェクション効率は、９０％（細胞生存率の低下が５％未満）と高くすることができ、約６５％〜約９０％の範囲内であることができる。場合によっては、カーゴ濃度を上げること、細胞とカーゴの衝突を促進すること、電界用量を増やすこと（潜在的に生存率を犠牲にする）、及び／又はエレクトロポレーションバッファを最適化することによって、カーゴを細胞に移行させる効率を高めることができる。
【０１４１】
例えば、フローサイトメトリーによって測定される細胞生存率は、初期の細胞生存率の９５％という高さになることができ、例えば、約８０％〜約９５％の範囲内であることができる。
【０１４２】
本明細書に記載される特徴は、スケールアップ及び商業的製造の目標と一致しており、従って、本明細書に記載される実施形態は、多くの用途を見出すことができる。例としては、自己又は同種のＣＡＲ−Ｔ、同種又は自己のＴＣＲ、ＴＲｎＣ細胞、改変ＴＩＬ、ＣＡＲ−ＮＫＴ、ＣＡＲ−ＮＫ、ＣＡＲ−Ｍａｃ、ＣＡＲ−ＣＩＫ、又は改変γδ細胞の製造が挙げられるが、これらに限定されない。また、本明細書に記載される特徴は、カーゴを搭載したエクソソームを操作するため、又は遺伝性の疾患若しくは障害を治療するために遺伝子改変の幹細胞若しくは浮遊細胞を製造するために使用することができる。
【０１４３】
１つの例示的な応用例は、細胞療法製造に関するものである。
【０１４４】
養子細胞移入に基づく免疫療法の最近の進展により、改良された細胞バイオプロセシング及び遺伝子送達技術の需要が高まっている。例えば、ＦＤＡは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子を発現するように改変されたＴ細胞を、特定の血液癌の治療に使用することを承認している。しかしながら、ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いた治療薬の製造チェーンでは、現在、遺伝子送達のためにレンチウイルスを用いた形質導入が行われている。これらのベクターは製造が複雑で高価であり、ペイロード容量が限られている。また、これらのベクターは、制御されていない態様でゲノムに遺伝情報を統合するため、このアプローチは安全性にも懸念がある。
【０１４５】
これらの問題のいくつかに対処するために、細胞療法製造のための初代ヒトＴ細胞のエレクトロトランスフェクションにおいて本明細書に記載される実施形態を使用することの実現可能性を調べるために、以下の非限定的な実施例を行った。
【実施例】
【０１４６】
図６〜図１３を参照して上述したようなアセンブリを用いて実験を行った。
【０１４７】
より詳細には、アセンブリを、機械加工した薄いポリマー層のスタックを一緒に積層することによって構築した。次に、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）のシートを、従来のＣＮＣフライス盤又は紫外線レーザーカッターで機械加工した。各層は接着剤の層で裏打ちされている。
【０１４８】
概念実証のため、使用した配置構成を単純化し、バッファ交換機能は含めなかった。むしろ、初代ヒトＴ細胞及びｍＣｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ  ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（トリリンク・バイオテクノロジーズ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）を含む低電気伝導度エレクトロポレーションバッファを中央の入口（図３の入口４６ｃ）に導くことによって、マイクロ流体の流体力学的シースフロー構成を確立した。高電気伝導度の培養バッファは、２つの側部の入口（図３の４６ａ、４６ｂ）から供給した。
【０１４９】
細胞と培地は、上流端と下流端のポートから、それぞれマイクロチャネルに入り、出た。流体の入口と出口には、ステンレス鋼（ＳＳ）チューブを挿入し、所々エポキシ樹脂で固定した。各出入口は三叉路になっており、これにより、細胞は低電気伝導度の培地の中央の入口に入り、両側の入口には中央部の流れを取り囲んで高電気伝導度のバッファが流れるという安定したシースフロー構成の発生を可能にした。チャネルの床面にスパッタリング成膜された金属電極は、はんだ付けしたリード線で外部制御回路に接続した。パターニングされた電極は長方形の形状で、シース液のみに接触するように位置決めした。この配置構成により、低電気伝導度培地の幅方向に電界が集中しやすくなり（高電気伝導度バッファの電圧降下は無視できる）、細胞が電極及びチャネルの側壁と物理的に接触するのを防いだ。これにより、細胞の回収と生存率が促進されると考えられた。
【０１５０】
与えた電界パルスの大きさ、パルス時間及びパルス数が、初代ヒトＴ細胞へのｍＲＮＡのトランスフェクション効率、並びにそれに伴う細胞の生存率及び全体的な細胞の回収にどのような影響を与えるかを調べる実験を行った。電界パルスの大きさが大きいほど、また曝露時間が長いほど、トランスフェクション効率が高まることがわかった。あるデータセットによると、電界強度が６７ｋＶ／ｍ以下の場合、トランスフェクションは観察されなかった。一方、１０２ｋＶ／ｍからは、いずれの場合も電界強度の増加に伴いトランスフェクション効率が上昇した。このことから、この特定の装置において、初代ヒトＴ細胞へのｍＲＮＡのトランスフェクションには、６７ｋＶ／ｍ〜１０２ｋＶ／ｍの間に臨界的な電界の大きさがあることが示唆された。
【０１５１】
全体として、上記データは、連続的なフロー配置構成で細胞をエレクトロポレーションすることが可能であることを示した。１分間に最大８×１０６個の初代細胞のスループットを処理することができ、ｍＲＮＡ送達の２４時間後に蛍光レポーター（ｍＣｈｅｒｒｙ）を発現させることで測定したエレクトロポレーション効率は７２％であった。また、エレクトロポレーション処理によって細胞の生存率が９％しか低下しないことが確認され、システム全体での細胞の回収率は６１％であった。
【０１５２】
具体的な例では、初代ヒトＴ細胞を、ＢＴＸエレクトロポレーション培地に０分、１５分、又は６０分保持した後、市販のバルクエレクトロポレーションシステムを用いてエレクトロポレーションした。データは図１４Ａ及び図１４Ｂに示されており、３人の独立した健康なドナーからの複製物の平均を示している。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。図１４Ａに見られるように、エレクトロポレーションの２４時間後にフローサイトメトリーで測定したトランスフェクション効率は、Ｔ細胞をｍＲＮＡを含むＢＴＸｐｒｅｓｓ培地中で１５分間保持した場合に低下し、保持時間を６０分に増加させた場合にはさらに低下する。
【０１５３】
エレクトロポレーションの２４時間後にフローサイトメトリーで測定したトランスフェクション後の生存率（図１４Ｂ）は、保持時間の増加とともに減少したが、その減少は統計的に有意ではなかった。
【０１５４】
図１５は、本発明の態様に従って連続フローで同様にエレクトロポレーションした２人の異なるドナーから得られた細胞の生存率及びトランスフェクション効率（細胞のパーセントとして）を示す。
【０１５５】
本発明は、その好ましい実施形態を参照して特に示され、説明されてきたが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱せずに、その中で形態及び詳細の様々な変更がなされ得ることが、当業者によって理解されるであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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