(57)【要約】本開示は、ＢＩ−１調節ペプチドおよび、有効量のＢＩ−１調節ペプチドを投与することにより、対象におけるがんを処置するための方法を提供する。本明細書に開示されるのは、ＢＩ−１調節ドメイン（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を含むＢａｘインヒビター−１（ＢＩ−１）調節ペプチドである。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、哺乳動物細胞の形質膜を横切る能力をＢＩ−１調節ペプチドに対して付与することができる標的化ドメインを含む。これらのＢＩ−１調節ペプチドは、がんを処置するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｂａｘインヒビター−１（ＢＩ−１）調節ドメインと；必要に応じて、
（ｂ）標的化ドメインと；
を含む、単離されたペプチド。
【請求項２】
前記ＢＩ−１調節ドメインが、
配列番号２２の配列もしくは配列番号２２の配列と１つ以下のアミノ酸残基が異なる配列を有するペプチドセグメント；および／または
配列番号２３の配列もしくは配列番号２３の配列と１つ以下のアミノ酸残基が異なる配列を有するペプチドセグメント；
を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
前記ＢＩ−１調節ドメインが、配列番号２２および／または配列番号２３の配列を有するペプチドセグメントを含む、請求項２に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
前記ＢＩ−１調節ドメインが、配列番号２２の配列を有するペプチドセグメントと配列番号２３の配列を有するペプチドセグメントとを含む、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
前記配列番号２２の配列を有する前記セグメントが、前記配列番号２３の配列を有する前記セグメントに対してアミノ末端側にある、請求項４に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
前記ＢＩ−１調節ドメインが、配列番号２２および配列番号２３の配列を有するセグメントを含み、前記配列番号２２および配列番号２３の配列がセグメント内で重複する、請求項４に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
前記ＢＩ−１調節ドメインが配列番号１６の配列を有する、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
前記ＢＩ−１調節ドメインが配列番号１７の配列を有する、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項９】
前記ＢＩ−１調節ドメインが配列番号１８の配列セットを有する、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項１０】
前記ＢＩ−１調節ドメインが配列番号１９の配列を有する、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項１１】
前記ＢＩ−１調節ドメインが配列番号２０の配列を有する、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項１２】
前記ＢＩ−１調節ドメインが配列番号２１の配列を有する、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項１３】
前記ＢＩ−１調節ドメインが配列番号２４の配列を有する、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項１４】
前記ＢＩ−１調節ドメインが配列番号２５の配列を有する、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項１５】
前記ＢＩ−１調節ドメインが配列番号２６の配列を有する、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項１６】
前記ＢＩ−１調節ドメインが配列番号２７の配列を有する、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項１７】
前記ＢＩ−１調節ドメインがＢＩ−１タンパク質に結合することができる、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項１８】
前記ＢＩ−１調節ドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列内のＢＩ−１タンパク質内の部位に結合することができる、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドをリポソームに結びつけることができる、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドをナノ粒子にコンジュゲートすることができる、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項２１】
前記標的化ドメインが細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、抗体または抗体の断片である、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項２２】
前記標的化ドメインが腫瘍関連抗原を結合することができる、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項２３】
前記標的化ドメインが前記ペプチドのアミノ末端にある、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項２４】
前記標的化ドメインが前記ペプチドのカルボキシ末端にある、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項２５】
前記ペプチドが５〜４００アミノ酸の長さである、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項２６】
前記ペプチドが８〜４０アミノ酸の長さである、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項２７】
前記ペプチドが１５〜４５アミノ酸の長さである、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項２８】
前記ペプチドが２２〜５０アミノ酸の長さである、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項２９】
前記ペプチドが３０〜６０アミノ酸の長さである、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項３０】
前記ペプチドが４５〜７５アミノ酸の長さである、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項３１】
前記ペプチドが６０〜１００アミノ酸の長さである、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項３２】
前記ペプチドが８０〜１１０アミノ酸の長さである、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項３３】
前記ペプチドが２８０〜３２０アミノ酸の長さである、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項３４】
配列番号１９〜２３および４８〜８７のいずれか１つの配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３５】
配列番号１９の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３４記載の単離されたペプチド。
【請求項３６】
配列番号２０の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の単離されたペプチド。
【請求項３７】
配列番号２１の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の単離されたペプチド。
【請求項３８】
配列番号２２の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の単離されたペプチド。
【請求項３９】
配列番号２３の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の単離されたペプチド。
【請求項４０】
前記ペプチドが化学修飾をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項４１】
前記化学修飾がリン酸化、グリコシル化および／または脂質化である、請求項４０に記載の単離されたペプチド。
【請求項４２】
前記化学修飾が脂肪酸の共有結合である、請求項４１に記載の単離されたペプチド。
【請求項４３】
前記化学修飾が末端アミン基の化学的封鎖である、請求項４０に記載の単離されたペプチド。
【請求項４４】
前記化学修飾が末端カルボキシ基の化学的封鎖である、請求項４０に記載の単離されたペプチド。
【請求項４５】
前記ペプチドがＦｃポリペプチドまたはドメインをさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項４６】
前記ペプチドが非ペプチドリンカーをさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項４７】
前記ペプチドが１またはそれを超えるＰＥＧ分子にコンジュゲートされている、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項４８】
前記単離されたペプチドが哺乳動物細胞の形質膜を通過することができる、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項４９】
前記細胞がヒト細胞である、請求項４８に記載の単離されたペプチド。
【請求項５０】
先行する請求項のいずれかに記載のペプチドと薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
【請求項５１】
非経口投与に適している、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
静脈内投与に適している、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
皮下投与に適している、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
有効成分の濃度が１００ｎＭまたはそれを超える、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記薬学的に許容され得る担体が、前記ペプチドの溶解度を増加させるのに適している、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
単回投与プレフィルドシリンジ内にある、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
増殖性疾患を有する対象を処置する方法であって、有効量の、先行する請求項のいずれかに記載のペプチドまたは医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５８】
前記増殖性疾患ががんである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記がんが、乳がん、卵巣がん、肺がん、子宮がんおよび結腸がんからなる群の少なくとも１つである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記がんが乳がんである、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記投与することが、前記対象の細胞中の細胞質ゾルのカルシウムレベルの増加をもたらす、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記投与することが、前記対象の細胞中のＨ＋イオンの細胞質ゾル濃度の増加をもたらす、請求項５７〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記投与することが、前記対象における新生物性細胞におけるミトコンドリア膜の透過性の増加をもたらす、請求項５７〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記投与することが、前記対象における新生物性細胞の死を誘導する、請求項５７〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記投与することが、前記対象における新生物性細胞のアポトーシスおよび／またはパラトーシスを誘導する、請求項５７〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ペプチドまたは前記医薬組成物が静脈内投与によって投与される、請求項５４〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ペプチドまたは前記医薬組成物が皮下投与によって投与される、請求項５４〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ペプチドまたは前記医薬組成物が、脳がんの処置のためにくも膜下腔内または大槽内投与によって投与される、請求項５７〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
第２の有効量のさらなる処置を投与することをさらに含む、請求項５７〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記さらなる処置が、化学療法剤、放射線処置および抗体または抗体断片からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記対象が哺乳動物である、請求項５７〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記対象がヒトである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
請求項１〜４９のいずれか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本願は、２０１８年８月２７日に出願された米国仮出願第６２／７２３，４２８号の優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
２．配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０ＸＸ年ＸＸ月に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前であり、サイズはＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。
【背景技術】
【０００３】
３．背景
Ｂａｘインヒビター−１（Ｂａｘ−１）は、細胞内で多様な役割を果たしており、アポトーシス、小胞体ストレス、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生、アクチン細胞骨格の動態および細胞質ゾルのカルシウムレベルを調節することが示されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３０：２３９１−２４００，２０１１）。ＢＩ−１の発現はヒトのがんの種類によって大きく異なり、このタンパク質は乳がん、神経膠腫、前立腺がん、子宮がんおよび卵巣がんでは高度に発現されているが、胃がん、結腸がん、腎臓がん、肺がんおよび直腸がんでは下方調節されている（Ｇｒｚｍｉｌら、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０８：３４０−３４９，２００６；Ｓｃｈｍｉｔｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９８：７３−７７，２００２；およびｄｅｌ  Ｃａｒｍｅｎ  Ｇａｒｃｉａ  Ｍｏｌｉｎａ  Ｗｏｌｇｉｅｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２６：５０１−５０４，２００５）。
乳がんおよび前立腺がん細胞中のＢＩ−１発現をノックダウンするためにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用する以前の研究は、すべての細胞株ではないが、一部の細胞株において自発的アポトーシスをもたらし、ＢＩ−１が一部のがんサブタイプにおけるがん生存に不可欠であることを示している（Ｇｒｚｍｉｌら、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０８：３４０−３４９，２００６；Ｇｒｚｍｉｌら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６３：５４３−５５２，２００３；Ｌｉｍａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１：３０９−３１６，２００４）。ＲＮＡｉによるＢＩ−１ノックダウン後に自発的アポトーシスを起こさなかった細胞は、細胞ストレスの徴候を示し、アポトーシス誘導に対して高度に感作された。したがって、ＢＩ−１は、他に類を見ないが未だ試験が為されていない、がん治療薬の標的候補として提示される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３０：２３９１−２４００，２０１１
【非特許文献２】Ｇｒｚｍｉｌら、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０８：３４０−３４９，２００６
【非特許文献３】Ｓｃｈｍｉｔｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９８：７３−７７，２００２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
４．概要
本明細書に開示されるのは、ＢＩ−１調節ドメイン（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を含むＢａｘインヒビター−１（ＢＩ−１）調節ペプチドである。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、哺乳動物細胞の形質膜を横切る能力をＢＩ−１調節ペプチドに対して付与することができる標的化ドメインを含む。これらのＢＩ−１調節ペプチドは、がんを処置するために使用することができる。
【０００６】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号２２の配列もしくは配列番号２２の配列と１つ以下のアミノ酸残基が異なる配列を有するペプチドセグメントおよび／または配列番号２３の配列もしくは配列番号２３の配列と１つ以下のアミノ酸残基が異なる配列を有するペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号２２および／または配列番号２３のアミノ酸を有するペプチドセグメントを含む。特定の実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号２２の配列を有するペプチドセグメントおよび配列番号２３の配列を有するペプチドセグメントを含む。特定の実施形態において、配列番号２２の配列を有するペプチドセグメントは、配列番号２３の配列を有するセグメントに対してアミノ末端側にある。特定の実施形態において、配列番号２２および配列番号２３の配列は、セグメント内で重複する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号１６の配列を有する。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号１７の配列を有する。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号１８の配列を有する。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号１９の配列を有する。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号２０の配列を有する。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号２１の配列を有する。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号２４の配列を有する。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号２５の配列を有する。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号２６の配列を有する。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号２７の配列を有する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、ＢＩ−１タンパク質に結合することができる。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列内のＢＩ−１タンパク質内の部位に結合することができる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドを、リポソームに結びつけることができる。いくつかの実施形態において、ペプチドを、ナノ粒子にコンジュゲートすることができる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、抗体または抗体の断片である。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、腫瘍関連抗原を結合することができる。特定の実施形態において、標的化ドメインは、ＢＩ−１調節ペプチドのアミノ末端にある。特定の実施形態において、標的化ドメインは、ペプチドのカルボキシ末端にある。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、５〜４００アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、８〜４０アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、１５〜４５アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、２２〜５０アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、３０〜６０アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、４５〜７５アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、６〜１００アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、８０〜１１０アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、２８０〜３２０アミノ酸の長さである。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、配列番号１９〜２３および４８〜８７のいずれか１つの配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、配列番号１９の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２０の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２１の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２２の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２３の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、化学修飾を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、リン酸化、グリコシル化および／または脂質化である。いくつかの実施形態において、化学修飾は、脂肪酸の共有結合である。いくつかの実施形態において、化学修飾は、ペプチドの末端アミン基の化学的封鎖である。いくつかの実施形態において、化学修飾は、ペプチドの末端カルボキシ基の化学的封鎖である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、Ｆｃポリペプチドまたはドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、非ペプチドリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態において、ペプチドを、１またはそれを超えるＰＥＧ分子にコンジュゲートする。
【００１５】
特定の実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、哺乳動物細胞の形質膜を通過することができる。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
【００１６】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、ＢＩ−１調節ペプチドと薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、非経口投与に適している。いくつかの実施形態において、医薬組成物は静脈内投与に適している。いくつかの実施形態において、医薬組成物は皮下投与に適している。
【００１７】
いくつかの実施形態において、医薬組成物中の有効成分の濃度は、１００ｎＭまたはそれを超える。
【００１８】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、単回投与プレフィルドシリンジ内にある。
【００１９】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＢＩ−１調節ペプチドの溶解度を増加させるのに適した薬学的に許容され得る担体を含む。
【００２０】
別の態様において、本明細書では、患者中の増殖性疾患を処置する方法であって、有効量のＢＩ−１調節ペプチドまたはＢＩ−１調節ペプチドを含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性疾患はがんである。いくつかの実施形態において、がんは、乳がん、卵巣がん、肺がん、子宮がんおよび結腸がんのうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態において、がんは乳がんである。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドまたはＢＩ−１調節ペプチドを含む医薬組成物を投与することは、対象の細胞中の細胞質ゾルのカルシウムレベルをもたらす。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはペプチドを含む医薬組成物を投与することは、対象の細胞中のＨ＋イオンの細胞質ゾル濃度の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、投与は、対象における新生物性細胞におけるミトコンドリア膜の透過性の増加をもたらす。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドまたはＢＩ−１調節ペプチドを含む医薬組成物を投与することは、対象における新生物性細胞の死を誘導する。いくつかの実施形態において、投与は、対象における新生物性細胞のアポトーシスおよび／またはパラトーシス（ｐａｒａｐｔｏｓｉｓ）を誘導する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドまたはＢＩ−１調節ペプチドを含む医薬組成物は、静脈内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、ペプチドまたは医薬組成物は、皮下投与によって投与される。いくつかの実施形態において、ペプチドまたは医薬組成物は、くも膜下腔内または大槽内投与によって投与される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、この方法は、第２の有効量のさらなる処置を投与することをさらに含む。特定の実施形態において、さらなる処置は、化学療法剤、放射線処置または抗体もしくは抗体断片を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドまたはＢＩ−１調節を含む医薬組成物が投与される対象は、哺乳動物である。特定の実施形態において、対象はヒトである。
【００２６】
本発明のこれらおよびその他の特徴、態様および利点は、以下の記載および添付の図面に関連してさらによく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１−１】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄおよび図１Ｅは、ＭＱ００１およびＭＱ００２がＢＩ−１と相互作用することを示している。図１Ａは、ＨＡタグを付けたＭＱ００１およびＭＱ００２のＢＩ−１との共免疫沈降後のイムノブロットの結果を示している。図１Ｂは、ＢＩ−１とＭＱ００１との相互作用およびＢＩ−１とＭＱ００２との相互作用を確認する酵母ツーハイブリッド分析の結果を示す。図１Ｃは、ＢＩ−１のＮ末端とＭＱ００１との相互作用およびＢＩ−１のＮ末端とＭＱ００２との相互作用を確認する酵母ツーハイブリッド分析の結果を示す。図１Ｄは、ＭＱ００１とＢＩ−１との相互作用およびＭＱ００１とＢＩ−１のＮ末端４０アミノ酸との相互作用を示すβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果を表す。図１Ｅは、ＨＡタグを付けたＭＱ００１またはＨＡタグを付けたＭＱ００２のいずれかおよびＭｙｃタグを付けたＢＩ−１で共形質移入されたＨｅＬａ細胞の免疫蛍光画像を表し、ＭＱ００１とＢＩ−１の共局在およびＭＱ００２とＢＩ−１の共局在を示している。
【図１−２】同上。
【００２８】
【図２−１】図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃは、ＭＱ００１およびＭＱ００２がヒト乳がん細胞において細胞死を選択的に誘導することを示している。図２Ａのグラフは、正常な乳房組織に由来するＭＣＦ−１０Ｆ細胞と比較した、ＭＱ００１およびＭＱ００２で処理したＭＣＦ−７乳がん細胞において凝縮核および外部アネキシン−ｖを有する細胞のパーセンテージを示す。図２Ｂは、ＭＱ００１およびＧＦＰ−ＣＰＰ（対照）で処理したＭＣＦ−７細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図２Ｃは、ＭＱ００１およびＭＱ００２で処理したＭＣＦ−７およびＭＣＦ−１０Ｆ細胞に対するＭＴＴ細胞生存率アッセイの結果を表す。
【図２−２】同上。
【００２９】
【図３−１】図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、ＭＱ００１およびＭＱ００２がいくつかの乳がんサブタイプにおいて細胞死を誘導し、ＢＩ−１が乳がん細胞に対するペプチドの治療効果にとって重要であることを示すデータを表す。図３Ａは、ＭＱ００１およびＭＱ００２での処理に応答して試験されたすべての乳がん細胞株において凝縮核の増加が見られたことを示すグラフを表す。図３Ｂは、試験された７つの乳がん細胞株が３つの異なる乳がんサブタイプを代表することを示している。図３Ｃは、ＢＩ−１のｓｉＲＮＡノックダウンの結果を示しており、ＭＱ００１およびＭＱ００２が、ＢＩ−１の不存在下では、乳がん細胞における細胞死を誘導しないことを示している。
【図３−２】同上。
【００３０】
【図４】図４は、ＭＱ００１およびＭＱ００２での処理に応答した７つの乳がん細胞株における外部化されたアネキシン−ｖを有する細胞のパーセンテージを示すグラフを表す。
【００３１】
【図５】図５は、定量された細胞死データがＭＱ７０Ｃで処理したＭＣＦ−７細胞の位相差顕微鏡法による画像と相関することを示し、ＭＱ７０Ｃが用量依存的に細胞死を誘導することを示している。
【００３２】
【図６−１】図６Ａおよび図６Ｂは、様々なＢＩ−１調節ペプチドでの処理後におけるＭＣＦ−７細胞の位相差顕微鏡法による画像を表し、試験されたペプチドの全てがＭＣＦ−７細胞において細胞死を誘導することを示している。
【図６−２】同上。
【００３３】
【図７−１】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｅ、図７Ｆ、図７Ｇ、図７Ｈおよび図７Ｉは、ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ００１およびＭＱ００２が乳がん以外のがん細胞において細胞死を誘導することを実証する結果を表す。図７Ａは、ＭＱ００１およびＭＱ００２での処理後に凝縮核を有する肺がんおよび乳がん細胞のパーセンテージを示している。図７Ｂおよび図７Ｃは、ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ３０Ｃで処理した肺がんおよび結腸がん細胞の経時的位相差顕微鏡法による画像を示す。図７Ｄは、ＭＱ１６での処置後の卵巣がん細胞におけるリソソームおよびミトコンドリア膜を評価するために染色された免疫蛍光画像を示す。図７Ｅは、４つの卵巣がん細胞株のそれぞれにおけるＭＱ１６処理の用量反応曲線を示している。図７Ｆは、様々なＢＩ−１調節ペプチドでの処置後の卵巣がん細胞におけるカルシウム流出を示している。図７Ｇは、ＭＱ１６での処理後の子宮がん細胞におけるリソソームの形成とミトコンドリア膜の透過性を示す免疫蛍光画像を表す。図７Ｈは、５つの子宮がん細胞株のそれぞれにおけるＭＱ１６処理の用量反応曲線を示す。図７Ｉは、様々なＢＩ−１調節ペプチドでの処理に応答した子宮がん細胞におけるカルシウム流出を示している。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【図７−４】同上。
【図７−５】同上。
【００３４】
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、ＭＱ００１、ＭＱ００２ならびにアポトーシスの内因性および外因性誘導物質での処理後の、切断されたカスパーゼ３を有するＭＣＦ−７細胞のパーセンテージを示す。図８Ａに示されている結果は、ＭＱ００１およびＭＱ００２が、アポトーシスの内因性誘導物質にさらされたＭＣＦ−７細胞に対して抗アポトーシス効果を有するが、アポトーシスの外因性誘導物質に曝露された細胞に対して同じ保護効果を有さないことを実証する。図８Ｂに示されている結果は、ＢＩ−１発現がＭＱ００１およびＭＱ００２の抗アポトーシス効果に必要であることをさらに実証する。
【００３５】
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、ＭＱ００１およびＭＱ００２での処理後の、凝縮核および外部アネキシン−ｖを有する非がん性細胞のパーセンテージを示す。
【００３６】
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃは、ＭＱ００１またはＭＱ００２での処理後の細胞における（図１０Ａ）、ＢＩ−１を過剰発現している細胞（図１０Ｂ）、および様々なＢＩ−１調節ペプチドでの処理後の細胞（図１０Ｃ）における細胞質カルシウム濃度の相対的変化を示す。
【００３７】
【図１１−１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＭＱ００１およびＭＱ００２での処理後の細胞質ゾルのＲＯＳレベルの変化（図１１Ａ）、ならびにＭＱ１６での処理後の細胞形態および染色の変化（図１１Ｂ）を示す。
【図１１−２】同上。
【００３８】
【図１２】図１２は、ＨＡタグを付けたＭＱ００１またはＨＡタグを付けたＭＱ００２で処理され、生きたミトコンドリアについて染色されたＭＣＦ−１０ＦおよびＭＣＦ−７細胞の免疫蛍光画像を表す。
【００３９】
【図１３】図１３Ａ、図１３Ｂおよび図１３Ｃは、ＭＱ００１およびＭＱ００２で処理した細胞の免疫蛍光および位相状態（ｐｈａｓｅ−ｓｔａｔｅ）顕微鏡法による画像を表し、処理後のＥＲ形態の変化（図１３Ａ）および処理後のアクチン局在化の破壊（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）を示している。
【００４０】
【図１４】図１４Ａ、図１４Ｂおよび図１４Ｃは、ＥＲ（図１４Ａ）、自食作用タンパク質（図１４Ｂ）およびリソソーム（図１４Ｃ）に対するマーカーで染色された細胞の免疫蛍光顕微鏡法による画像を表す。
【００４１】
【図１５−１】図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃおよび図１５Ｄは、ＭＱ００１およびＭＱ００２での処理後のＭＣＦ−１０ＦおよびＭＣＦ−７細胞中でのホスホ−ＪＮＫおよびホスホ−ＥＲＫ発現を評価する免疫ブロット（図１５Ａ）、ＢＣＬ−２ファミリーメンバーおよびＵＰＲによって誘導された転写因子ＣＨＯＰのＲＴ−ＰＣＲ結果を評価するゲル電気泳動（図１５Ｂ）、ＭＱ００１およびＭＱ００２での処理後のＭＣＦ−１０ＦおよびＭＣＦ−７細胞中におけるホスホ−Ｂｃｌ−２発現を評価するイムノブロット（図１５Ｃ）、ならびに対照と比較した、ＭＱ００１またはＭＱ００２での処理後に核凝縮を有する細胞の数（黒い棒）の上に重ね合わされたＥＲ破壊（白い棒）の定量（図１５Ｄ）を示す。
【図１５−２】同上。
【００４２】
【図１６】図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＭＱ００１での処置後のヒト乳がんのマウスモデルにおける腫瘍体積（図１６Ａ）および体重（図１６Ｂ）の変化を示すグラフを表す。
【００４３】
【図１７】図１７は、ヒト乳がんのマウスモデルにおいてＭＱ００１の毒性を評価するＨ＆Ｅ染色の結果を示している。
【００４４】
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは、血漿（図１８Ａ）およびミクロソーム（図１８Ｂ）におけるＭＱ００１の安定性評価の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
６．発明の詳細な説明
定義
別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。
【００４６】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体を指す。特に明記しない限り、「アミノ酸」という用語は、それぞれの構造がそのような立体異性体形態を許容すれば、ＤおよびＬの両方の立体異性体を含む。
【００４７】
天然アミノ酸には、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（Ｓｅｒ
またはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）およびバリン（ＶａｌまたはＶ）が含まれる。
【００４８】
非天然アミノ酸（ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）または非天然のアミノ酸（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）には、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、ナフチルアラニン（「ｎａｐｈ」）、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸（３−ａｍｉｎｏｉｓｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）、２−アミノピメリン酸、第三級ブチルグリシン（「ｔＢｕＧ」）、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン（「ｈＰｒｏ」または「ｈｏｍｏＰ」）、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン（「３Ｈｙｐ」）、４−ヒドロキシプロリン（「４Ｈｙｐ」）、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルアラニン（「ＭｅＡｌａ」または「Ｎｉｍｅ」）、Ｎ−メチルグリシンを含むＮアルキルグリシン（「ＮＡＧ」）、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシンを含むＮ−アルキルペンチルグリシン（「ＮＡＰＧ」）、Ｎ−メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン（「Ｎｏｒｖａｌ」）、ノルロイシン（「Ｎｏｒｌｅｕ」）、オクチルグリシン（「ＯｃｔＧ」）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）、ペンチルグリシン（「ｐＧ」または「ＰＧｌｙ」）、ピペコリン酸、チオプロリン（「ＴｈｉｏＰ」または「ｔＰｒｏ」）、ホモリジン（「ｈＬｙｓ」）およびホモアルギニン（「ｈＡｒｇ」）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
本明細書において使用される場合、「哺乳動物」という用語は、ヒトおよび非ヒトの両方を含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマおよびブタを含むが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸のポリマーを指す。ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体および／または修飾されたアミノ酸を含むことができる。ペプチドは、天然に存在するタンパク質の一部もしくは断片または非天然（合成）タンパク質もしくはポリペプチドであり得る。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「変異体ペプチド」という用語は、「野生型」配列と呼ばれる、自然界に存在する最も一般的なバリアントとは異なるアミノ酸配列を有する天然に存在するペプチドのバリアントを指す。変異体ペプチドは、野生型ペプチドと比較して、１またはそれを超えるアミノ酸の置換、欠失または挿入を含むことができる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「保存的」アミノ酸置換は、ペプチドまたはポリペプチド中のアミノ酸の、サイズまたは電荷などの同様の化学的性質を有する別のアミノ酸による置換を指す。本開示において、以下の８つの群のそれぞれは、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）およびグリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）およびバリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）；ならびに
８）システイン（Ｃ）およびメチオニン（Ｍ）。
【００５３】
天然に存在する残基は、共通する側鎖の特性に基づいてクラスに分類することができる：例えば、極性陽性（ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ））；極性陰性（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ））；極性中性（セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ））；非極性脂肪族（アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ））；非極性芳香族（フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ））；プロリンおよびグリシン；ならびにシステイン。本明細書で使用される場合、「半保存的」アミノ酸置換は、ペプチドまたはポリペプチド中のアミノ酸の、共通の側鎖特性を有する別のアミノ酸による置換を指す。
【００５４】
いくつかの実施形態において、別段の指定がなければ、保存的または半保存的アミノ酸置換は、天然残基と類似の化学的性質を有する天然に存在しないアミノ酸残基も包含することができる。これらの非天然の残基は、典型的には、生体系内での合成によってではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる。これらには、ペプチド模倣物ならびにアミノ酸部分のその他の逆転された（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）または反転された（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）形態が含まれるが、これらに限定されない。本明細書の実施形態には、天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体が含まれる。例えば、メチオニンを置換するためにノルロイシンを使用することができる。
【００５５】
非保存的な置換は、あるクラスのメンバーを別のクラスのメンバーに交換することを含み得る。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が同じ配列組成のモノマーサブユニットを有する程度を指す。「配列類似性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が、保存的および／または半保存的アミノ酸置換によってのみ異なる程度を指す。「パーセント配列同一性」（または「パーセント配列類似性」）は、１）比較のウィンドウ（例えば、より長い配列の長さ、より短い配列の長さ、指定されたウィンドウなど）にわたって２つの最適に整列された配列を比較する、（２）同一の（または類似の）モノマーを含有する（例えば、同じアミノ酸が両配列中に生じる、類似のアミノ酸が両配列中に生じる）位置の数を決定して、一致する位置の数を得る、（３）一致する位置の数を比較ウィンドウ（例えば、より長い配列の長さ、より短い配列の長さ、指定されたウィンドウ）内の位置の総数で割る、（４）結果に１００を掛けて、パーセント配列同一性またはパーセント配列類似性を得ることによって計算される。例えば、ペプチドＡとＢがともに２０アミノ酸の長さであり、１つの位置を除いてすべての位置に同じアミノ酸を有する場合、ペプチドＡとペプチドＢは９５％の配列同一性を有する。非同一位置におけるアミノ酸が同じ生物物理学的特性を共有する場合（たとえば、両方が酸性である場合）、ペプチドＡとペプチドＢは１００％の配列類似性を有する。別の例として、ペプチドＣが２０アミノ酸の長さで、ペプチドＤが１５アミノ酸の長さであり、ペプチドＤ中の１５アミノ酸のうち１４アミノ酸がペプチドＣの一部のアミノ酸と同一である場合、ペプチドＣおよびＤは７０％の配列同一性を有するが、ペプチドＤはペプチドＣの最適な比較ウィンドウに対して９３．３％の配列同一性を有する。本明細書において「パーセント配列同一性」（またはパーセント配列類似性）を計算する目的で、整列された配列中の任意のギャップは、その位置でのミスマッチとして扱われる。
【００５７】
配列比較のために、通例、１つの配列が参照配列として機能し、試験配列が参照配列に対して比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験および参照配列がコンピュータ中に入力され、必要であれば、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した試験配列（複数可）に対するパーセント配列同一性を計算する。
【００５８】
本明細書において、パーセント同一性および配列類似性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して実施される。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に入手可能である。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトおよびヒト以外の動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽、魚、甲殻類など）を含むがこれらに限定されない任意の動物を広く指す。本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、ヒト対象を指す。
【００６０】
別段の明記がない限り、「ＢＩ−１調節ペプチド」は、Ｂａｘインヒビター−１タンパク質（ＢＩ−１）と相互作用するペプチドを指す。ＢＩ−１調節ペプチドは、ＢＩ−１活性を阻害または刺激し得る。一定のＢＩ−１調節ペプチドは、いくつかの細胞において特定の条件下でＢＩ−１を阻害し得、他の細胞においてはＢＩ−１を刺激し得る。ＢＩ−１調節ペプチドは、１またはそれを超えるアミノ酸残基を介してＢＩ−１に直接結合し得る。ＢＩ−１調節ペプチドは、１またはそれを超えるシグナル伝達分子を介してなど、間接的にＢＩ−１と相互作用し、ＢＩ−１を調節し得る。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な組成物（例えば、合成ペプチド）の量を指す。有効量は、１またはそれを超える投与、適用または投与量で投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図するものではない。
【００６２】
「治療有効量」という用語は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。予防は治療と考えることができるので、治療有効量は、「予防有効量」であり得る。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「投与」および「投与する」という用語は、対象またはインビボ、インビトロまたはエクスビボ細胞、組織および臓器に薬物、プロドラッグ、または他の薬剤、または治療的処置（例えば、ペプチド）を与える行為を指す。ヒトの身体への例示的な投与経路は、脳または脊髄のくも膜下の空間（くも膜下腔内）、目（眼）、口（経口）、皮膚（局所または経皮）、鼻（経鼻）、肺（吸入剤）、口腔粘膜（頬側または舌側）、耳、直腸、膣、注射による（例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、腹腔内など）などであり得る。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、有益なまたは意図された臨床結果を得るためのアプローチを意味する。有益なまたは意図された臨床結果には、症状の緩和、疾患の重症度の軽減、疾患もしくは状態の根本的な原因の阻害、非進行状態での疾患の安定化、疾患の進行の遅延および／または病状の改善もしくは緩和が含まれ得る。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、有効成分（例えば、単離されたＢＩ−１調節ペプチド）の、不活性または活性な担体との組み合わせを指し、組成物を、インビトロ、インビボまたはエクスビボでの治療または診断的使用に特に適したものにする。
【００６６】
本明細書で使用される「薬学的に許容され得る」または「薬理学的に許容され得る」という用語は、対象に投与されたときに、有害反応、例えば、毒性、アレルギー性および免疫学的反応を実質的に生じない組成物を指す。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、リン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョンなど）、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドンなどの非プロトン性溶媒、およびこれらの混合物、ならびに様々なタイプの湿潤剤、可溶化剤、酸化防止剤、増量剤、アルブミンなどのタンパク質担体、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、ラウリル硫酸ナトリウム、等張剤および吸収遅延剤、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）などを含むがこれらに限定されない標準的な薬学的担体のいずれをも指す。組成物は、安定剤および防腐剤も含むことができる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（２００５）を参照されたい。
【００６８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に反対の意味を指示しなければ、複数表記を含むことに留意しなければならない。
６．１．ＢＩ−１調節ペプチド
【００６９】
第１の態様において、本明細書に開示されるのは、単離されたＢＩ−１調節ペプチドである。
【００７０】
様々な実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、３２０アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、３４０アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、３２０アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、３１０アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、３００アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、２５０アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、２００アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、１７５アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、１５０アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、１２５アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、１００アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、８０アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、７０アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、６０アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、５０アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、４０アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、３０アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、２５アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、２０アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、１５アミノ酸以下の長さである。特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、１０アミノ酸以下の長さである。
【００７１】
単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、ＢＩ−１調節ドメインを含む。
【００７２】
特定の実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、標的化ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、Ｆｃポリペプチドまたはドメインをさらに含む。
６．１．１．ＢＩ−１調節ドメイン
【００７３】
特定の実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドのＢＩ−１調節ドメインは、ＢＩ−１に結合する１またはそれを超える結合部位を含む。１またはそれを超える結合部位のそれぞれは、１またはそれを超えるアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、１またはそれを超える結合部位の少なくとも１つは、隣接する位置に２またはそれを超えるアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、１またはそれを超える結合部位の少なくとも１つは、隣接しない位置に２またはそれを超えるアミノ酸残基を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、異なる結合親和性を有する２またはそれを超えるＢＩ−１結合部位を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号１８に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号１９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号２０に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号２１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号２２に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ドメインは、配列番号２３に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
６．１．２．標的化ドメイン
【００７６】
いくつかの実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、哺乳動物細胞の形質膜を横切ってＢＩ−１調節ペプチドを輸送することができる標的化ドメインをさらに含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、細胞透過性ペプチドである。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１０４に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、抗体または抗体の断片を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、ＢＩ−１調節ペプチドのＮ末端にある。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、ＢＩ−１調節ペプチドのＣ末端にある。
６．１．３．化学修飾
【００７９】
特定の実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、少なくとも１つの化学修飾を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態において、化学修飾は、結合送達媒体（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ）である。いくつかの実施形態において、結合送達媒体はリポソームである。いくつかの実施形態において、結合送達媒体はナノ粒子である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、化学修飾は非共有結合性修飾である。特定の実施形態において、化学修飾は共有結合されている。様々な実施形態において、化学修飾は、アミド化、アセチル化、グリコシル化、脂質化、リン酸化、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾または硫酸化である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、化学修飾は、脂肪酸の共有結合である。特定の実施形態において、脂肪酸は飽和である。特定の実施形態において、脂肪酸は不飽和である。
【００８３】
いくつかの実施形態において、化学修飾は、アミノ酸側鎖、末端アミン基または末端カルボキシ基に１またはそれを超える修飾を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、末端アミン基の化学的封鎖である。いくつかの実施形態において、化学修飾は、末端カルボキシ基の化学的封鎖である。
６．１．４．変異
【００８４】
特定の実施形態において、ＢＩ−１調節ペプチドは、少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態において、変異は、ＢＩ−１を結合するためのＢＩ−１調節ペプチドの親和性を増加させる。いくつかの実施形態において、変異は、ＢＩ−１を結合するためのＢＩ−１調節ペプチドの親和性を減少させる。いくつかの実施形態において、変異は、ペプチドの治療効果を改善する。
【００８５】
いくつかの実施形態において、変異はアミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、変異はアミノ酸挿入である。いくつかの実施形態において、変異はアミノ酸欠失である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、元のアミノ酸は、天然のアミノ酸によって置換されている。いくつかの実施形態において、元のアミノ酸は、非天然アミノ酸によって置換されている。いくつかの実施形態において、元のアミノ酸は、化学的に修飾されたアミノ酸によって置換されている。
【００８７】
様々な実施形態において、アミノ酸置換は、保存的または半保存的置換である。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、得られるペプチドの活性および／または構造に対して最小限の影響を有する。
【００８８】
様々な実施形態において、アミノ酸置換は非保存的置換である。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ペプチド特性の有意な変化を生じさせる。特定の実施形態において、親水性残基は、疎水性残基によって置換される。特定の他の実施形態において、疎水性残基は、親水性残基によって置換される。特定の実施形態において、かさ高い側鎖を有する残基は、側鎖を有さない残基によって置換される。特定の他の実施形態において、側基を有さない残基は、かさ高い側鎖を有する残基によって置換される。
６．２．ＢＩ−１調節ペプチドの調製
【００８９】
単離されたＢＩ−１調節ペプチドを作製するための方法も本明細書に開示される。
６．２．１．組換え合成
【００９０】
特定の実施形態において、本明細書に開示される単離されたペプチドは、例えば、細菌、酵母または真核生物の発現系を使用して、組換え的に産生される。
【００９１】
組換え産生のために、適切な発現媒体、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメント、またはＲＮＡウイルスベクターの場合には、複製および翻訳のために必要なエレメントを含有するベクター中に、単一またはマルチドメインペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が挿入される。次いで、発現媒体が、単一またはマルチドメインペプチドを発現する適切な標的細胞中に形質移入される。次いで、使用される発現系に応じて、発現されたペプチドは、当技術分野で十分に確立された手順によって単離される。組換えタンパク質およびペプチド産生のための方法は、当技術分野において周知である。
【００９２】
産生の効率を増加させるために、ポリヌクレオチドは、酵素切断部位によって分離された単一またはマルチドメインペプチドの複数のユニットをコードするように設計することができる。得られたポリペプチドは、ペプチドユニットを回収するために（例えば、適切な酵素で処理することによって）切断することができる。これにより、単一のプロモーターによって駆動されるペプチドの収量を増加させることができる。いくつかの実施形態において、各コード領域がキャップ非依存性翻訳制御配列、例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に機能的に連結された、複数のペプチドをコードする単一のｍＲＮＡが転写されるように、ポリシストロン性ポリヌクレオチドを設計することができる。適切なウイルス発現系において使用される場合、ｍＲＮＡによってコードされる各ペプチドの翻訳は、例えばＩＲＥＳによって、転写物の内部で方向づけられる。したがって、ポリシストロン性構築物は、単一の大きなポリシストロン性ｍＲＮＡの転写を指示し、次いで、このポリシストロン性ｍＲＮＡが複数の個々のペプチドの翻訳を指示する。このアプローチは、ポリペプチドの生成と酵素的プロセッシングを取り除き、単一のプロモーターによって駆動されるペプチドの収量を有意に増加させることができる。
【００９３】
本明細書に記載のペプチドを発現させるために、様々な宿主発現ベクター系を利用することができる。これらには、適切なコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌などの微生物；適切なコード配列を含有する組換え酵母もしくは真菌発現ベクターで形質転換させた酵母もしくは糸状菌；適切なコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染させた、もしくは適切なコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
発現系の発現エレメントは、その強度と特異性が異なる。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導性プロモーターを含む、多数の適切な転写および翻訳エレメントのいずれをも発現ベクター中で使用することができる。例えば、細菌系でクローニングする場合、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などの誘導性プロモーターを使用することができる。昆虫細胞系中でクローニングする場合、バキュロウイルス多面体プロモーターなどのプロモーターを使用できる。植物細胞系中でクローニングする場合、植物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットに対するプロモーター、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質に対するプロモーター）または植物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）を使用することができる。哺乳動物細胞系中でクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を使用することができる。
６．２．２．化学合成
【００９５】
いくつかの実施形態において、本開示の単離されたペプチドは、化学合成によって作製される。いくつかの実施形態において、ペプチドは、液相ペプチド合成技術を使用して作製される。いくつかの他の実施形態において、ペプチドは、固相ペプチド合成技術を使用して作製される。
【００９６】
ＤまたはＬ立体配置のいずれかを有するペプチドは、当技術分野で周知の自動化された固相手順によって合成することができる。「Ｂｏｃ」または「Ｆｍｏｃ」手順を利用することにより、適切な合成を行うことができる。固相合成のための技術および手順は、当技術分野において周知である。単一ドメインおよびマルチドメインペプチドは、例えば、Ｌｉｕら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：９３３−９３６，１９９６；Ｂａｃａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１８８１−１８８７，１９９５；Ｔａｍ  ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４５：２０９−２１６，１９９５；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ  ａｎｄ  Ｋｅｎｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：２２１−２２５，１９９２；Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｔａｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：４１４９−４１５３，１９９４；Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｔａｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６５８４−６５８８，１９９４；およびＹａｍａｓｈｉｒｏ  ａｎｄ  Ｌｉ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３１：３２２−３３４，１９８８）に記載されているように、セグメント縮合によって調製することもできる。これは、特にグリシン含有ペプチドに当てはまる。本開示の単一ドメインおよびマルチドメインペプチドを合成するために有用な他の方法は、Ｎａｋａｇａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７０８７−７０９２，１９８５に記載されている。
【００９７】
ペプチドおよびペプチド類似体合成の当業者に公知のさらなる例示的な技術は、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．ａｎｄ  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４；およびＪｏｎｅｓ，Ｊ．，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００２によって教示されている。ＢｏｄａｎｓｚｋｙとＪｏｎｅｓの参考文献は、アミノ酸およびアミノ酸誘導体を活性化し、カップリングするためのパラメーターおよび技術を詳述している。さらに、これらの参考文献は、様々な有用な官能基および保護基を選択、使用および除去する方法を教示する。
【００９８】
Ｄ−またはＬ−立体配置のいずれかを有するペプチドは、合成ペプチドの商業的供給業者から購入することもできる。このような供給業者には、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ），Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ），Ｂａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ），Ａｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）およびＣｅｌｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）が含まれる。
６．２．３．精製
【００９９】
本開示のペプチドまたはペプチド類似体は、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動など、当技術分野で周知の多くの技術によって精製することができる。特定の単一ドメインまたはマルチドメインペプチドを精製するために使用される実際の条件は、部分的には、合成戦略に、および正味電荷、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者には自明である。
【０１００】
様々な実施形態において、単離されたＢＩ−１調節ペプチドは、精製タグをさらに含む。いくつかの実施形態において、精製タグは、ポリヒスチジンタグ、ｍｙｃタグまたはＨＡタグである。
６．３．医薬組成物
【０１０１】
有効成分としての本明細書に記載の１またはそれを超える単離されたＢＩ−１調節ペプチドと薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物も本明細書において提供される。これらの組成物は、１またはそれを超えるＢＩ−１調節ペプチドに加えて、薬学的に許容され得る、賦形剤、担体、バッファー、安定剤、増量剤または当業者に周知の他の賦形剤を含む。このような材料は無毒であるべきであり、有効成分の有効性を妨げるべきではない。医薬組成物内の担体または他の材料の正確な性質は、典型的には、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内経路に依存する。ＢＩ−１調節ペプチドは、例えば、インスリン、ＧＬＰ−１アゴニストならびにＦＤＡ承認治療用ペプチドおよびタンパク質のＴＨＰｄｂデータベース（ｃｒｄｄ．ｏｓｄｄ．ｎｅｔ／ｒａｇｈａｖａ／ｔｈｐｄｂ／）中に開示されている全ての承認されたペプチドなどの治療用ペプチドを製剤化するために現在使用されている任意の製法を使用して製剤化することができる。
【０１０２】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体の形態であり得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含み得る。液体医薬組成物は、一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水溶液、デキストロースもしくは他の糖類溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれ得る。
【０１０３】
静脈内、皮膚もしくは皮下注射、または患部における注射の場合、有効成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容され得る水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射用、リンゲル注射用、乳酸リンゲル注射用などの等張性媒体を使用して、適切な溶液を十分に調製することができる。必要な場合、防腐剤、安定剤、バッファー、酸化防止剤および／または他の添加剤を含めることができる。
６．４．処置の方法
【０１０４】
乳がん、脳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、胃がん、甲状腺がんおよび子宮がんを含むがこれらに限定されないがんを処置するための方法も本明細書で提供される。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、この方法は、本明細書に記載のＢＩ−１調節ペプチドまたは医薬組成物を、がんを有する対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象はがんを発症するリスクがある。
【０１０６】
様々な実施形態において、対象は固形腫瘍がんを有する。
【０１０７】
特定の実施形態において、対象は哺乳動物である。特定の実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は成体である。特定の他の実施形態において、対象は子供である。
【０１０８】
様々な実施形態において、ペプチドまたは医薬組成物は、対象における腫瘍成長を低減するのに十分な量、スケジュールおよび期間で投与される。いくつかの実施形態において、ペプチドは、処置の開始直前のレベルと比較して、腫瘍体積および／または腫瘍直径を１０％、２０％、２５％、３０％またはそれより多く減少させるのに十分な量、スケジュールおよび期間で投与される。特定の実施形態において、ペプチドは、腫瘍体積および／または腫瘍直径を少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多く減少させるのに十分な量、投薬スケジュールおよび期間で投与される。特定の実施形態において、ペプチドは、腫瘍体積および／または腫瘍直径を少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより多く減少させるのに十分な量、スケジュールおよび時間で投与される。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、前記方法は、静脈内投与によって、本明細書に記載されているＢＩ−１調節ペプチドまたは医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、皮下注射によってペプチドを投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、くも膜下腔内または大槽内投与によってペプチドを投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、腫瘍内注射または腫瘍周囲注射によってペプチドを投与することを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、前記方法は、処置されるべき状態に応じて、同時にまたは逐次に、さらなる処置と組み合わせてＢＩ−１調節ペプチドを投与することを含む。さらなる処置には、化学療法剤、放射線処置、小分子阻害剤および抗体または抗体断片が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１１１】
本発明の薬学的に有用なペプチドの投与は、好ましくは「治療有効量」または「予防有効量」（場合によっては、予防は治療と見なすことができるが）であり、これは個体に利益を示すのに十分である。投与される実際の量、および投与の速度と時間経過は、処置されているタンパク質凝集疾患の性質と重症度に依存する。処置の処方、例えば投与量の決定などは、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、処置されるべき疾患または障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法および開業医に公知のその他のエレメントを通例考慮に入れる。上記の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に記載されている。
７．その他の実施形態
１．（ｉ）ＮｌｅＨ部分を含む組成物。
２．（ｉｉ）ＮｌｅＨ部分に結びつけられた標的化部分をさらに含む、実施形態１に記載の組成物。
３．ＮｌｅＨ部分が、
（ｉ）配列番号１もしくは配列番号４として本明細書に開示される配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）（ｉ）の生物学的に活性な断片；または
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の生物学的に活性な配列バリアント
である、またはこれらを含む、実施形態１または２のいずれか１つに記載の組成物。
４．生物学的に活性な断片が、配列番号２、配列番号３、配列番号５または配列番号６として本明細書に開示される配列を有するポリペプチドである、実施形態３に記載の組成物。
５．生物学的に活性な配列バリアントが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６と少なくとも５０％の配列同一性を有する、実施形態３または４のいずれか１つに記載の組成物。
６．標的化部分が腫瘍関連抗原を結合する、実施形態２〜５のいずれか１つに記載の組成物。
７．腫瘍関連抗原がヒトエフリン−Ｂ２またはその相同体である、実施形態６に記載の組成物。
８．標的化部分が、アズリンまたはアズリンの特徴的な結合活性を保持するその断片もしくはバリアントである、実施形態６または７のいずれか１つに記載の組成物。
９．標的化部分が、本明細書に配列番号８として開示される配列を有するポリペプチドである、またはこれを含む、実施形態８に記載の組成物。
０．組成物が、本明細書に配列番号９として開示される配列を有するポリペプチドとの融合タンパク質である、またはこれを含む、実施形態９に記載の組成物。
１１．本明細書に配列番号１０として開示される配列を有するポリペプチドからなる、またはこれを含む、実施形態１に記載の組成物。
１２．標的化部分が抗体または抗体断片である、実施形態６に記載の組成物。
１３．ＢＩ−１（配列番号１１）への結合についてＮｌｅＨ（配列番号または配列番号４）と競合する結合部分。
１４．ＮｌｅＨ（配列番号１または配列番号：４）によって結合されるＢＩ−１（配列番号１１）中の同一のまたは重複するエピトープを結合する結合部分。
１５．結合部分が、配列番号１２として本明細書に開示される配列を有するポリペプチドを結合する、実施形態１３または請求項１４のいずれか１つに記載の結合部分。
１６．結合部分が、配列番号１３として本明細書に開示される配列を有するポリペプチドを結合する、実施形態１３〜１５のいずれか１つに記載の結合部分。
１７．結合部分が抗体または抗体断片である、実施形態１３〜１６のいずれか１つに記載の結合部分。
１８．機能性部分に結びつけられた実施形態１３〜１７のいずれか１つに記載の結合部分を含むコンジュゲート。
１９．機能性部分がコンジュゲートの細胞内内部移行を促進する、実施形態１８に記載のコンジュゲート。
２０．先行する請求項のいずれかに記載の組成物、結合部分またはコンジュゲートをコードするヌクレオチド。
２１．実施形態２０に記載のヌクレオチドを含むベクター。
２２．実施形態２１に記載のベクターで形質転換された細胞。
２３．増殖性障害を有する対象を同定する方法であって、対象中でのまたは対象に由来する試料中でのＢＩ−１の発現または活性のレベルを評価することを含む、方法。
２４．増殖性障害を発症する特定のリスクを有する対象を同定する実施形態２３に記載の方法であって、対象中でのまたは対象に由来する試料中でのＢＩ−１の発現または活性のレベルを評価することを含み、ＢＩ−１発現または活性の増加したレベルが増殖性障害を発症する対象のリスクの増加を示す、方法。
２５．対象における増殖性障害関連の予後を予測する方法であって、対象中でのまたは対象に由来する試料中でのＢＩ−１の活性または発現を評価することを含む、方法。
２６．対照試料と比較したＢＩ−１の活性または発現の増加が、ＢＩ−１活性を阻害することができる薬剤での処置に対する感受性を示す、実施形態２５に記載の方法。
２７．増殖性状態の処置のための患者、好ましくはヒト患者を選択する方法であって、上昇したＢＩ−１活性または発現を有する患者を特定すること、およびこのように特定された患者をＢＩ−１活性を阻害することができる薬剤での処置のために選択することを含む、方法。
２８．ＢＩ−１活性を阻害することができる薬剤が、実施形態１〜１９のいずれかに記載の組成物、結合部分またはコンジュゲートである、実施形態２７に記載の患者を選択する方法。
２９．対象が哺乳動物である、実施形態２３〜２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．対象がヒトである、実施形態２９に記載の方法。
３１．増殖性障害ががんである、実施形態２３〜３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．がんが乳がんである、実施形態３１に記載の方法。
３３．対象または対象に由来する試料中での発現または活性のレベルが、対照試料と比較して決定される、実施形態２３〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．増殖性状態の処置において使用するためのＢＩ−１調節物質。
３５．状態ががんである、実施形態３４に記載のＢＩ−１調節物質。
３６．がんが乳がんである、実施形態３５に記載のＢＩ−１調節物質。
３７．調節物質がＢＩ−１活性の阻害剤である、実施形態３４〜３６のいずれか１つに記載のＢＩ−１調節物質。
３８．増殖性状態の予防、阻害または処置に有用な医薬化合物を選択する方法であって、試験のための候補医薬化合物の群を準備すること、試験系において候補医薬化合物がＢＩ−１を結合する能力を試験すること、およびＢＩ−１を結合する能力に基づいて候補医薬化合物を選択すること、を含む、方法。
３９．インビトロおよび／またはインビボモデルにおいて、乳がん細胞に対する候補化学療法剤の細胞毒性を決定するステップをさらに含む、実施形態３８に記載の方法。
４０．ＢＩ−１を実質的にまたは完全に結合する候補医薬化合物が選択される、実施形態３８または３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．候補によって結合される試験系中のＢＩ−１の割合が９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％または２０％を超える、実施形態４０に記載の方法。
４２．先行する実施形態のいずれか１つに記載の組成物、結合部分、コンジュゲート、ヌクレオチド、ベクターまたはＢＩ−１調節物質と、薬学的に許容され得る、希釈剤、担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
４３．第２の治療剤をさらに含む、実施形態４２に記載の医薬組成物。
４４．処置の方法において使用するための、実施形態４２または４３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
４５．増殖性疾患を処置する方法において使用するための、実施形態４２または４３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
４６．増殖性疾患を処置する方法において使用するための医薬の製造における、実施形態４２または４３のいずれか１つに記載の医薬組成物の使用。
４７．増殖性疾患を有する対象を処置する方法であって、実施形態４２または４３のいずれか１つに記載の医薬組成物を対象、好ましくはヒト対象に投与することを含み、必要に応じて、ＢＩ−１活性または発現の検出されたレベルに従って、対象の処置が調整される、方法。
４８．増殖性疾患ががんである、実施形態４２〜４７のいずれか１つに記載の医薬組成物、使用または方法。
４９．がんが乳がんである、実施形態４８に記載の医薬組成物、使用または方法。
【実施例】
【０１１２】
８．実施例
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。実施例は、例示の目的のためにのみ提示されており、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するために努力が為されたが、当然ながら、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。
【０１１３】
別段の記述がなければ、本発明の実施は、本分野の技術に属する、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の慣用の方法を利用する。このような技術は、文献中に完全に説明されている。
方法
【０１１４】
直接的酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）スクリーン
【０１１５】
ＭＱ００１またはＭＱ００２をコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅し、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインの下流でｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中にクローニングした。クローニングされた産物をＴＯＰ１０（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中で発現させ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用してプラスミドを精製した。ｐＧＢＴ９−ＭＱ００１およびｐＧＢＴ９−ＭＱ００２はいずれも、空のｐＧＡＤ４２４またはＢＩ−１、ＢＩ−１４０（ＢＩ−１の最初の４０アミノ酸）のいずれかを有するｐＧＡＤ４２４のいずれかとともに、酵母株ＡＨ１０９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に形質転換した。陰性対照として、ｐＧＡＤ４２４  ＢＩ−１／ＢＩ−１４０を空のｐＧＢＴ９で形質転換した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＰＴ３０２４−１）に記載されているとおりに、ＡＨ１０９を化学的に形質転換受容性とし、熱ショックを加えた。最初に、アデニンとヒスチジンを欠くＳＤ最小寒天上に形質転換された酵母を播種し、ｐＧＢＴ９とｐＧＡＤＴ７の両方の共形質転換を確認した。アデニン、ヒスチジン、ロイシンおよびチロシンを欠くＳＤ最小寒天プレート上に陽性コロニーを播種して、プラスミドの存在および関心対象の２つのクローニングされたタンパク質間で起こる相互作用の両方を確認した。
【０１１６】
β−ガラクトシダーゼアッセイ
【０１１７】
β−ガラクトシダーゼアッセイは、製造元のプロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＰＴ３０２４−１マニュアル）に従って実行した。簡単に説明すると、ｐＧＡＤＴ７−ＢＩ−１またはｐＧＡＤＴ７−ＢＩ−１４０プラスミドを、単独でまたはｐＧＢＴ−ＭＱ００１（または必要であれば、ｐＧＢＴ９、ｐＧＢＴ９−ＭＱ００２）とともに、酢酸リチウム法を使用してＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＰＪ６９−４Ａ中に形質転換した。形質転換体をＴｒｐ２  Ｌｅｕ２プレート上で選択し、０．６の光学密度（Ｄ６００ｎｍ）まで成長させた後、溶解し、ＯＮＰＧを基質として使用してβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルをアッセイした。報告されたデータは、３つ組で実行された少なくとも３つの生物学的反復物からのものである。
【０１１８】
ＭＴＴ細胞生存率アッセイ
【０１１９】
評価する前に、細胞を未処理にするか、２４ウェル組織培養プレート中で２４時間処理した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、０．１ｍｇ／ｍｌの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭで１時間交換した後、培地を除去し、１００ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに加えた。オービタルシェーカー上で１分間完全に混合した後、ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、各ウェルの５４０ｎｍでの吸光度を取得した。結果は、３つ組で実行された少なくとも３つの生物学的反復物から得られた。
【０１２０】
細胞質ゾルのカルシウム（Ｃａ２＋）レベルの測定
【０１２１】
細胞質ゾルのＣａ２＋レベルは、市販の蛍光指示薬Ｆｌｕｏ−４  Ｄｉｒｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造元の指示に従って測定した。
【０１２２】
細胞を９６ウェルマイクロプレート中で成長させ、Ｆｌｕｏ−４  Ｄｉｒｅｃｔとともに３７℃で１時間インキュベートされたＭＱ００１、ＭＱ００２、対照（ＣＰＰ−ＧＦＰ）または陽性対照（タプシガルジン−Ｆｌｕｏ−４添加後約１００分）で１２時間処理した。蛍光強度は、４９４ｎｍでの励起と５１６ｎｍでの発光用に設定された蛍光光度計を使用して決定された。
【０１２３】
ＲＯＳレベルを評価するためのＮＢＴアッセイ
【０１２４】
ニトロブルーテトラゾリウム塩（ＮＢＴ）の青緑色の生成物への還元を使用して、処理したＭＣＦ−７および対照細胞中で生成された細胞内ＲＯＳレベルを間接的に推定した。処理した細胞にＮＢＴ（１ｍｇ／ｍｌの１００μｌ）を加え、次いで、３７℃で、ＣＯ２チャンバー中にて１時間インキュベートした。形成された結晶を、ＫＯＨ（１２０μｌ）およびＤＭＳＯ（１４０μｌ）の連続添加によって可溶化した。発色した色の強度は、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して６４５ｎｍで測定した。生成されたＲＯＳに反比例するＮＢＴの還元のパーセンテージは、エタノールで処理した対照と比較して計算された。示されている結果は、各細胞のそれぞれの細胞株に対する非処理対照と比較したＲＯＳの代表的なものである。
【０１２５】
ウエスタンブロット分析
【０１２６】
すべての試料を１０〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、従来の方法によってＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜に転写して、誘導性プラスミドの発現レベルを比較した。０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴＢＳで膜を２回洗浄した後、５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）（モノクローナル抗体の場合）または５％市販粉乳（ポリクローナル抗体）を含有するＴＢＳ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）とともに１時間インキュベートした。膜を一次抗体とともに１時間（ＲＴＰ）または一晩（４℃）インキュベートした（使用した希釈倍数は、供給業者の指示にしたがった）。使用した抗体のリストを補足図３に示す。次に、膜をＴＢＳ．０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）中で３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）にコンジュゲートされた抗ウサギまたは抗マウス二次抗体（１：２０００）とともにインキュベートし、１時間インキュベートした（ＲＴＰ）。ＥＣＬ試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて膜を発色させ、ＬＡＳ  ３０００  Ｆｕｊｉ  Ｉｍａｇｅｒ中で検出した。
【０１２７】
イムノブロッティング
【０１２８】
イムノブロッティングのために以下の抗体を使用した、抗Ｈｉｓ（Ｓｉｇｍａ）、抗ＧＳＴ（Ａｂｃａｍ）、抗チューブリン（Ａｂｃａｍ）、抗Ｍｙｃ（Ａｂｃａｍ）、抗Ｂｃｌ−２、抗Ｂｃｌ−２（Ｓｅｒ７０）、抗Ｂｃｌ−２（Ｔｈｒ５６）、抗ホスホＥＲＫ、抗ホスホＪＮＫ、抗ＥＲＫ、抗ＪＮＫ、抗ＣＨＯＰ、抗ＡＴＦ６、抗ＰＥＲＫ、抗ＩＲＥ１αをイムノブロッティングのために使用した。すべてのブロットは、ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）中の５％ＢＳＡを使用して実施した。Ｒｅｓｔｏｒｅ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ウエスタンブロットに最大４回ストリッピングを行い、さまざまな抗体でプローブした。
【０１２９】
組織培養、ＭＱ００１／ＭＱ００２投与量および形質移入
１０００ｍｇ／Ｌグルコースを含有し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、非必須アミノ酸およびｇｌｕｔａｍａｘが補充されたＤＭＥＭ中、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の加湿された雰囲気中で細胞株を成長させた。０．４ｍｇ／ｍｌの最終濃度のＭＱ００１／００２で細胞を処理し、または、メーカーのプロトコルに従い、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＨＭ６−ＢＩ−１またはｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（対照プラスミド）のいずれかで細胞を形質移入し、加湿された雰囲気中で２４時間インキュベートした後に、０．４ｍｇ／ｍｌの最終濃度でＭＱ００１／００２を添加した。次に、細胞をさらに２４時間インキュベートした。ｐＨＭ６−ＢＩ−１の形質移入効率は約３０〜４０％であった。対照プラスミドは、約７０％のより高い効率で形質移入された。形質移入効率の差は、カウント中に制御され、視野内に１００個の形質移入された細胞がカウントされるようにした。ｓｉＲＮＡ形質移入は、メーカーのプロトコルに従ってＨｙｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、２０μＭ  ＢＩ−１または対照ｓｉＲＮＡを用いて行った。７２時間後に、製造元の推奨に従ってＱＩＡＧＥＮ  ＲＮＡｅａｓｙキットを使用するＲＮＡ分離およびＢＩ−１（ｈ）−ＰＲ（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ、ｓｃ−３７２９８−ＰＲ）またはＧＡＤＰＨプライマーを使用する半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、ＢＩ−１発現のノックダウンを試験した。
【０１３０】
免疫蛍光染色と共局在
【０１３１】
半集密状態の細胞単層をカバーガラス上で成長させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ  ７．４中の３％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温で１５分間固定した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、パラホルムアルデヒドを塩化アンモニウム（１０ｍＭ）で１０分間中和した。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳで細胞を４分間透過処理し、ＰＢＳ中でさらに２回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中で１０分間インキュベートした。次いで、室温で１時間、またはメーカーのガイドラインによって推奨されている場合には４℃で一晩、一次抗体とともに細胞をインキュベートした。カバーガラスをＰＢＳ中で２回、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳでさらに１回洗浄し、適切な二次抗体とともに４５分間インキュベートした。共局在の例では、まず、一次抗体とその一次抗体に対応する二次抗体を置いた。第二の一次抗体を加え、二次抗体が異なる源からのものであることが確保された（すなわち、第一の一次抗体がマウス中で産生された場合、第二の一次抗体はウサギ中で産生される）。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒまたはＤＡＰＩなどの色素は、メーカーの指針に従って使用した。
【０１３２】
カバーガラスをＰＢＳ中で３回、高圧滅菌した蒸留水でさらに１回洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してスライド上に載せた。３２倍または１００倍の倍率で、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ免疫蛍光顕微鏡上でカバーガラスを可視化し、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｌ  ４．５ソフトウェアを使用して分析した。細胞は多数の視野内でカウントされ、１つのカバーガラスから少なくとも６００〜９０００個の細胞がカウントされた。すべての実験は３〜５回繰り返された。すべてのカウントは二重盲検形式で行った。特に明記しない限り、すべての抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇからのものであった。抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体＃７０７４、抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体＃７０７６、抗ＢＩ−１抗体（ａｂ１８８５２）（Ａｂｃａｍ）、ＧＳＴ抗体＃２６２２、抗ＧＳＴ抗体（ａｂ１９２５６）（Ａｂｃａｍ）、Ｈｉｓ−タグ（２７Ｅ８）マウスｍＡｂ＃２３６６、ＨＡ−タグ（６Ｅ２）マウスｍＡｂ＃２３６７、抗Ｍｙｃタグ抗体（ａｂ９１０６）（Ａｂｃａｍ）、β−アクチン（８Ｈ１０Ｄ１０）マウスｍＡｂ＃３７００、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ＃９０８２、抗チューブリン抗体−ローディング対照（ａｂ５９６８０）（Ａｂｃａｍ）、α／β−チューブリン抗体＃２１４８、カルネキシン抗体＃２４３３、ＬＣ３Ａ／Ｂ（Ｄ３Ｕ４Ｃ）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４コンジュゲート）＃１４０７９、ホスホ−Ｂｃｌ−２（Ｓｅｒ７０）（５Ｈ２）ウサギｍＡｂ＃２８２７、ホスホ−Ｂｃｌ−２（Ｔｈｒ５６）抗体（ヒト特異的）＃２８７５、Ｂｃｌ−２（Ｄ５５Ｇ８）ウサギｍＡｂ（ヒト特異的）＃４２２３、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（１３７Ｆ５）ウサギｍＡｂ＃４６９５、ホスホ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）抗体＃９２５１、ホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（１９７Ｇ２）ウサギｍＡｂ＃４３７７。
【０１３３】
フローサイトメトリーおよび細胞選別
【０１３４】
Ｔ７５フラスコ中で、細胞を約７０％の集密状態（１．６ｅ１０６細胞）まで成長させ、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度のＭＱ００１または対照で９６時間処理した。２４時間ごとに試料を採取し、すべての細胞をそれらの前方および側方散乱パターンに基づいて評価した。前方散乱は細胞の体積と相関し、側方散乱は細胞の内部の複雑さ（すなわち、核の形状、細胞質顆粒の量または膜の粗さ）と相関する。フラスコ上の付着細胞をＰＢＳ中で洗浄し、トリプシン処理した（ｔｒｙｐｓａｎｉｚｅｄ）後、ＤＭＥＭ中に再懸濁して単一細胞懸濁液を生成した。ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、細胞懸濁液を直ちに評価した。ＭＱ００１と対照はともにＧＦＰタグを有し、ＭＱ００１試料においては、ＭＱ００１が内部移行された細胞の取り込みおよび処理を示しており、これらは黒で強調表示されている。
【０１３５】
アネキシンＶおよび凝縮核のカウント
【０１３６】
Ｔ２５フラスコ内で、１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地低グルコース（１ｇ／リットル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中において、細胞を７０％の集密状態まで成長させた。次に、ＭＱ００１、ＭＱ００２、対照（ＣＰＰ−ＧＦＰ）で細胞を１２時間処理し、または処理せず、アポトーシスを誘導した。次に、浮遊している細胞と付着した細胞の両方を収集し、製造元によって提供されたプロトコルに従って、アネキシンＶ−フルオレセインイソチオシアナートアポトーシス検出キット（カタログ番号Ｋ１０１−１００；ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を使用して標識した。各条件からの１０４個の細胞をＦＡＣＳによって分析して、アネキシンＶ陽性である細胞を特定した。収集された細胞の分割試料も、２ｇ／ｍｌヘキスト色素を加えたＰＢＳ中に１０６細胞／ｍｌで懸濁し、アポトーシス核形態を有する細胞の割合をＵＶ顕微鏡法によって決定した。このデータは、上記のように免疫蛍光を使用した実験の個々のカウントおよび反復によって確認された。
【０１３７】
ＲＴ−ＰＣＲ
【０１３８】
Ｖｅｒｓｏ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造元のプロトコルに従って実行した。プライマーは、アポトーシスマルチプレックスキットの一部としてＳｉｇｍａから購入した。
【０１３９】
免疫沈降／共免疫沈降
【０１４０】
記載したとおりに、Ｔ７５ｃｍ２フラスコ中で細胞を成長させ、ｐＨＭ６−ＭＱ００１またはｐＨＭ６−ＭＱ００２で２４時間形質移入した後、ＩＰ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼカクテル阻害剤）中で溶解した。ＨＡタグを付けたＭＱ００１／００２を捕捉するためにＡｎｔｉ−ＨＡ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、内在性ＢＩ−１を免疫沈降させた。ＩＰ緩衝液でビーズを３回洗浄し、最後に２００μｌのＩＰ緩衝液中に再懸濁した。２０μｌの試料に５μｌのＳＤＳローディング緩衝液を加えた。すべての試料を５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース膜に転写した。必要な場合、以下の一次抗体で膜をプローブした。イムノブロッティングのために、抗ＢＩ−１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、抗チューブリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）および抗ＨＡ（Ｓｉｇｍａ）抗体を使用した。すべての抗体は製造元の指示に従って希釈し、５％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（０．１％）で一晩放置した。画像は、ＭＦＣｈｅｍｉＢｉｓイメージングステーション（ＤＮＲ）を使用して視覚化した。
【０１４１】
ミクロソームの安定性
【０１４２】
ミクロソーム反応系の生存率は、７−エトキシクマリン（ｍ／ｚ  １９１）の喪失ならびに７−ヒドロキシクマリン（７−ＯＨＣ、ｍ／ｚ  １６３）および７−ＯＨＣグルクロニド（ｍ／ｚ  ３３９）の形成によって確認された。溶液Ｂ（ＢＤ  Ｇｅｎｔｅｓｔ）とともに２μＭの反応濃度でのウリジン５’−ジホスホグルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）補因子溶液Ａ（ＢＤ  Ｇｅｎｔｅｓｔ）、脱イオン水中の、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８  ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２５μｇアラメチシンとともに、ミクロソームをインキュベートした。ＭＱ００１を個々の反応混合物に加えて１０μＭの最終濃度とし、３７℃で所定の時間、反応混合物（０．５ｍｌ）を３つ組でインキュベートし、０．１ｍｌの７％過塩素酸でクエンチし、１２，５００ｒｐｍ（１１，０００９ｇ）で５分間遠心分離した。分析のために、上清をオートサンプラバイアルに移した。基質／代謝物陽性対照（７−エトキシクマリン／７−ヒドロキシクマリン；７−エトキシクマリン／７−ヒドロキシクマリングルクロニド）および基質反応の各組と並行して実施された４つの陰性対照反応を使用して、この反応系を検証した。
【０１４３】
動物実験
【０１４４】
すべてのマウスは、１９８６年の動物科学的処置法に従って取り扱い、実験は英国政府内務省が承認したプロジェクトライセンス７０／８５８６の下で実施された。０日目に、すべての動物にＭＣＦ−７またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳がん細胞（ＡＴＣＣ）を与え、５％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するαＭＥＭ中で培養した。両細胞株をＴ−１５０フラスコ中で成長させ、集密状態に応じて５〜１０×１０６細胞／フラスコを得た。ｂａｌｂ／ｃマウス中に接種するために、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、遠心分離し、０．３ｍｌのマトリゲル−αＭＥＭ中に再懸濁した。
【０１４５】
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（乳がんの種類ごとにｎ＝３０、８週齢、１８〜２０ｇ）を各群（ｎ＝１０）に無作為に割り当てた。３つの群はＰＢＳ、対照、ＭＱ００１であった。動物は、２２±５℃で１２時間の明／暗サイクルで飼育し、げっ歯類の餌と水を自由に与えた。同所性の乳房脂肪体移植は、以下のように実施した。メスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、Ｍａｔｒｘ  ＶＭＳ麻酔器（Ｍｉｄｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を介して、２％イソフルランガスを５〜１０分間連続吸入することにより、麻酔下で乳房脂肪体中に前述の細胞懸濁液を接種した。滅菌したピンセットを使用して４番目の乳首を持ち上げ、注射針（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、乳房脂肪体中に細胞または組織懸濁液を直接移植した。すべての研究において、マウスに１７β−エストラジオール徐放性ペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を皮下移植した。腫瘍の取り込み率は９５〜１００％の範囲であった。
【０１４６】
ノギスを使用して、毎週２回、腫瘍の長さ（Ｌ）と幅（Ｗ）を測定し、［Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）／２］として、腫瘍の体積（Ｖ）を計算した。３週間後、平均約２００ｍｍ３の体積を有する担腫瘍マウスを処置のために利用した。研究では、ＰＢＳ、対照または１０ｍｇ／ｋｇ（３．４μｍｏｌ／ｋｇ）の用量のＭＱ００１で、５日間毎日、担腫瘍マウスを処置した。腫瘍の体積は、週に３回測定した。体重は、毎週２回測定した。ＭＱ００１で処置されたマウスの腫瘍のサイズおよび体積が大幅に減少したので、２０日目にマウスを屠殺した。対照群とＭＱ００１処置群の間の有意性（Ｐ＜０．００１）は、統計学的方法において説明されている一連の混合モデル分析を使用して決定された。対数二次混合モデルがデータに適合し、１０ｍｇ／ｋｇのＭＱ００１が対照またはＰＢＳと有意に異なることを明らかにした。
【０１４７】
組織病理学
【０１４８】
各マウスの肺、心臓、脳、腎臓、脾臓および肝臓のセグメントを最終終了点（処置後２０日）において収集し、内容物をすすぎ落とし、顕微鏡検査のために１０％緩衝ホルマリン中で固定した。次に、ホルマリン固定された組織を処理し、パラフィン包埋し、５μｍで切片化し、標準的な手法に従ってヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
［実施例１］ペプチド設計
【０１４９】
細胞調節因子ＢＩ−１と相互作用して、細胞調節因子ＢＩ−１をモジュレートするように、ＢＩ−１調節ペプチドを設計した。ＢＩ−１は、アポトーシス促進性およびアポトーシス抑制性の刺激に適応することにより、細胞経路にシグナルを伝達して、アポトーシスおよび細胞の生存を阻害、遅延または促進することができる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３０：２３９１−２４００，２０１１）。細菌タンパク質エフェクターのＮＩｅＨファミリーは、ＢＩ−１に結合し、アポトーシスシグナル伝達を阻害することが示されている（Ｈｅｍｒａｊａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０７：３１２９−３１３４，２０１０）。
【０１５０】
がん細胞中のＢＩ−１と相互作用してこれをモジュレートする治療上有用なペプチドを作製するために、シュードモナスタンパク質アズリンの２８アミノ酸ドメイン（ｐ２８）およびＮＩｅＨエフェクタータンパク質ＮＩｅＨ１との融合タンパク質を作製した。ｐ２８ドメインは、がん細胞中へのアズリンの優先的な侵入に関与していることが示されている（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．８：２９４７−２９５８，２００９）。
【０１５１】
ＮＩｅＨ１をコードするヌクレオチド配列に対して５’に、ｐ２８をコードするヌクレオチド配列を有する単一の読み枠内に、ｐ２８およびＮＩｅＨ１をコードするポリヌクレオチドを細菌の発現ベクター中へクローニングすることによって、ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ００１を作製した。得られたプラスミドＤＮＡを増幅し、大腸菌中に形質転換した。続いて、プラスミドＤＮＡで形質転換された大腸菌の培養物を、上記の方法を使用して成長、採集および精製して、ｐ２８−ＮＩｅＨ１融合タンパク質を単離した。ｐ２８−ＮＩｅＨ１融合タンパク質ＭＱ００１は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する。
【０１５２】
治療用ペプチド、ＢＩ−１および潜在的に相互作用する他のタンパク質間での干渉を最小限に抑えるために、構造アルゴリズムに基づいて追加のＢＩ−１調節ペプチドを設計した。いくつかのＢＩ−１調節ペプチドは、ＮＩｅＨ１のＣ末端配列を変更することによって作製した。ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ１５７（配列番号１７）は、ＮＩｅＨ１の１５７個のＣ末端アミノ酸を使用して生成された。ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ７０は、ペプチドのＮ末端にアラニン、セリンおよびメチオニンを付加することによって修飾されたＮＩｅＨの７７個のＣ末端アミノ酸を使用して生成された（配列番号１８）。追加のＢＩ−１調節ペプチドＭＱ３０（配列番号１９）、ＭＱ２２（配列番号２０）、ＭＱ１６（配列番号２１）、ＭＱ８Ａ（配列番号２２）、ＭＱ８Ｂ（配列番号２３）、ＭＱ４５（配列番号２４）およびＭＱ６０（配列番号２５）はすべて、ＮＩｅＨ１のＣ末端の一部とアラインするアミノ酸配列を有する。
【０１５３】
さらなるＢＩ−１調節ペプチドは、以前に生成された治療用ペプチドのＮまたはＣ末端のいずれかに９〜２８アミノ酸の範囲のペプチド配列を追加することによって作製した。追加のペプチド配列は、ＢＩ−１調節ペプチドに対してがん細胞標的化および細胞膜浸透特性を付与する。これらの追加のＢＩ−１調節ペプチドの配列は、以下の第１０節中の配列リストの表中に示されている（配列番号３２〜１０３）。
［実施例２］例示的なＢＩ−１調節ペプチドは、ＢＩ−１のアミノ末端と相互作用する
【０１５４】
ＢＩ−１と直接相互作用する能力について、ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ００１およびＭＱ００２を評価した。抗ＨＡ磁気ビーズとのインキュベーション後に、内在性ＢＩ−１が、ＨＡタグを付けたペプチドとともに共免疫沈降したので、ＨＡタグを付けたＭＱ００１、ＭＱ００２またはＧＦＰ（対照）で形質移入されたＨｅＬａ細胞から得た溶解産物の免疫沈降の結果は、ＭＱ００１およびＭＱ００２がいずれもＢＩ−１と相互作用することを示している（図１Ａ）。
【０１５５】
ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ００１、ＭＱ００２の両方とＢＩ−１との間での相互作用を確認するために、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で直接的酵母ツーハイブリッドスクリーニングを実施した。結果は、ＭＱ００１およびＭＱ００２はいずれも、ＢＩ−１と別々に相互作用することを実証した（図１Ｂ）。さらなる酵母ツーハイブリッドスクリーニングは、ＭＱ００１とＭＱ００２の両方がＢＩ−１の４０個のＮ末端アミノ酸の少なくとも一部と別々に相互作用することをさらに実証した（図１Ｃ）。
【０１５６】
ＭＱ００１がＢＩ−１と相互作用することをさらに確認するために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを使用してβ−ガラクトシダーゼレポーターアッセイも実施した。選択された形質転換体のタンパク質−タンパク質相互作用の相対強度を比較するために、所定のアッセイにおいて測定されたβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルを使用することができる。図１Ｄに示されている結果は、ＭＱ００１とＢＩ−１のＮ末端との間の相互作用の強度が、ＭＱ００１と完全長ＢＩ−１との相互作用と比較してわずかに低下するに過ぎないことを実証する。
【０１５７】
ＨＡタグを付けたＭＱ００１またはＭＱ００２のいずれかおよびＭｙｃタグを付けたＢＩ−１で共形質移入されたＨｅＬａ細胞を固定し、蛍光発色団がコンジュゲートされた抗ＨＡおよび抗Ｍｙｃ抗体とともにインキュベートした。処理した細胞の免疫蛍光画像は、ＭＱ００１およびＭＱ００２がそれぞれＢＩ−１と共局在することを示している（図１Ｅ）。
［実施例３］例示的なＢＩ−１調節ペプチドは、乳がんにおいて細胞死を誘導する
【０１５８】
がん性乳房組織（ＭＣＦ−７）および非がん性乳房組織（ＭＣＦ−１０Ｆ）に由来する細胞を、ＭＱ００１、ＭＱ００２またはＧＦＰ（対照）で１２時間別々に処理し、次いで、上記の方法を使用して、凝縮した核などのアポトーシスのマーカーおよび細胞表面上のアネキシンＶの存在に関して評価した。結果（図２Ａ）は、ＭＱ００１およびＭＱ００２はいずれも乳がん細胞にはアポトーシスを誘導するが、健康な乳房組織に由来する乳房細胞にはアポトーシスを誘導しないことを示している。
【０１５９】
ＭＱ００１またはＭＱ００２で処理した後の乳がんおよび非がん性乳房細胞の両方の生存率をさらに評価するために、ＭＱ００１、ＭＱ００２のいずれかで２４時間細胞を処理し、または処理せずに放置して（対照）、次いで、ＭＴＴアッセイによって評価した。図２Ｃの結果は、ＭＱ００１またはＭＱ００２のいずれかで処理したＭＣＦ−７細胞が有意により低いレベルのＭＴＴの還元型を示したことを示し、ＭＱ００１またはＭＱ００２のいずれかでの処理は生存したＭＣＦ−７細胞の数を低減させるが、ＭＣＦ−１０Ｆ細胞は比較的影響を受けないままであることを示唆する。
【０１６０】
その後、ＧＦＰタグを付けたＭＱ００１またはＧＦＰのみ（対照）でＭＣＦ−７細胞を９６時間処理した。２４時間ごとにフローサイトメトリーによって、前方および側方散乱パターンについて、細胞試料を評価した。対照と比較して、ＭＱ００１で処理した細胞ではかなりより多くの前方および側方散乱が見られ、死亡しつつある細胞のより大きな集団がＭＱ００１で処理した細胞中に存在することを示している（図２Ｂ）。
【０１６１】
ＭＱ００１およびＭＱ００２がすべての乳がん由来細胞株に細胞死を誘導するのかまたはＭＣＦ−７細胞のみで細胞死を誘導するのかを評価するために、７つのさらなる乳がん由来細胞株をＭＱ００１、ＭＱ００２またはＧＦＰ（対照）で処理し、次いで、上記のように、凝縮核および外部アネキシン−Ｖの存在について評価した。図３Ａおよび図４に示されている結果は、ＭＱ００１またはＭＱ００２のいずれかでの処理が、９６時間以内に、７つの乳がん細胞株すべてに１００％の細胞死を誘導したことを実証する。評価された７つの乳がん株は、図３Ｂで特定されているように、５つの乳がんサブタイプ由来であった。
【０１６２】
ＭＱ００１およびＭＱ００２がＭＣＦ−７細胞において細胞死を誘導する能力に対するＢＩ−１の重要性を評価するために、ＢＩ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してＢＩ−１発現をノックダウンした（ＢＩ−１ｋｄ）。図３Ｃの結果は、ＭＱ００１またはＭＱ００２での処理がＢＩ−１ｋｄで形質移入されたＭＣＦ−７細胞に影響を及ぼさなかったことを示し、ＢＩ−１がＭＱ００１およびＭＱ００２の乳がん細胞に対する治療効果にとって重要であることを示している。
【０１６３】
乳がん組織に由来する細胞（ＭＣＦ−７）および非がん性乳房組織に由来する細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）に対するＢＩ調節ペプチドＭＱ７０ＣおよびＭＱ３０Ｃでの処理の効果を評価するために、さらなる研究を行った。さまざまな濃度のＭＱ７０ＣまたはＭＱ３０Ｃのいずれかで細胞を２４時間処理した。図５中に示されている定量された結果は、ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ３０ＣおよびＭＱ７０Ｃが用量依存的にＭＣＦ−７細胞死を誘導することを実証する。
【０１６４】
４時間２０分、６時間３０分または１９時間４０分の処理後に、位相差顕微鏡法によって、３μＭ、６μＭ、８．４μＭおよび１２μＭのＭＱ７０Ｃで処理したＭＣＦ−７細胞を画像化した。細胞死と合致する細胞の形態学的変化が、より高濃度のＭＱ７０Ｃで処理した細胞において、より低濃度のＭＱ７０Ｃで処理した細胞と比較して、より短い期間内に見られ（図６Ａ）、ＢＩ−１調節ペプチドが用量依存的に乳がん細胞に細胞死を誘導するという評価と合致した。
【０１６５】
複数のＢＩ−１調節ペプチドを評価し、各ペプチドが細胞死を誘導する能力を比較するために、ＭＣＦ−７細胞を以下のＢＩ−１調節ペプチドのそれぞれで６．５時間別々に処理した。ＭＱ３０−ＴＡＴ（配列番号１０５）、ＭＱ１６Ｃ（配列番号７１）、ＭＱ３０Ｆ１Ｃ（配列番号４９）、ＭＱ７０−ＴＡＴ（配列番号１０６）、ＭＱ２２（配列番号２０）、ＭＱ１６（配列番号２１）、ＦＬＭＱ３１Ｆ１Ｃ（配列番号５７）、ＦＬＦ１ＢＭＱ３１（配列番号５６）、Ｆ１ＮＭＱ３０（配列番号４８）およびＭＱ２２Ｃ（配列番号６３）。高負荷（１ｍｇ／ｍＬペプチド濃度）および中負荷（０．６ｍｇ／ｍＬペプチド濃度）での各ＢＩ−１調節ペプチドで、ＭＣＦ−７細胞を処理した。結果が、図６Ｂに示されている。
［実施例４］例示的なＢＩ−１調節ペプチドは、複数のがんのタイプにおいて細胞死を誘導する
【０１６６】
ＢＩ−１調節ペプチドが乳がん以外のがん細胞に細胞死を誘導するかどうかを決定するために、乳がん以外のがん組織に由来する細胞株をＢＩ−１調節ペプチドで処理し、細胞死のマーカーについて評価した。肺がん細胞株ＨＯＰ６４およびＨ４６０ならびに前立腺がん細胞株ＰＣ３において、ＭＱ００１およびＭＱ００２での処置の効果を評価した。図７Ａ中の結果は、ＭＣＦ−７乳がん細胞での細胞死の誘導が約５０％および６０％であるのと比較して、ＭＱ００１は肺がん細胞の約３０％で細胞死を誘導し、ＭＱ００２は肺がん細胞の約２０％で細胞死を誘導することを示している。これに対して、ＭＱ００１およびＭＱ００２での前立腺がん細胞の処理は細胞死を誘導しなかった（図７Ａ）。
【０１６７】
肺がん細胞（Ａ５４９）および結腸がん細胞（ＨＣＴ−１１６）を、０．１４ｍｇ／ｍＬのＢＩ調節ペプチドＭＱ３０Ｃで処理した。４８時間（肺がん細胞）または２４時間（結腸がん細胞）までの複数の時点で、位相差顕微鏡法によって細胞を画像化した。図７Ｂおよび図７Ｃの結果は、ＭＱ３０Ｃで処理したほとんどの細胞の形態が時間とともに変化することを示している。５時間の処理後に撮影された４０倍画像は、ＣＰＰのみで処理した細胞と比較して、ＭＱ３０Ｃで処理した細胞中でのＥＲの破壊を示しているように見受けられる。ＭＱ３０Ｃで処理したＡ５４９およびＨＣＴ−１１６細胞の８５％より多くが、９６時間の処理後に死滅していた（データは図示せず）。
【０１６８】
卵巣がんパネル（ＡＴＣＣ−１０２１）を、ＢＩ調節ペプチドで攻撃し、核の凝縮、ＥＲ破壊、リソソーム形成およびミトコンドリアの膜透過性などの形態学的変化について、位相差顕微鏡法および免疫蛍光顕微鏡法によって、細胞を評価した。細胞質ゾルのカルシウムレベル、活性酸素種（ＲＯＳ）レベルの変化について、ならびにトリパンブルーおよび細胞生存率アッセイによっても、細胞を評価した。卵巣がん細胞株ＳＷ６２６からの細胞の免疫蛍光画像（図７Ｄ）は、対照と比較した、ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ１６で処理した細胞におけるリソソームの形成およびミトコンドリア膜の透過性を示しており、ＭＱ１６によって誘導された細胞死と合致する。４つの卵巣がん細胞株のそれぞれにおけるＭＱ１６処理の用量反応曲線が図７Ｅに示されている。さまざまなＢＩ−１調節ペプチドでの処理後のＳＷ６２６細胞中で、細胞質ゾルのカルシウムレベルを測定した。図７Ｆの結果は、各ＢＩ−１調節ペプチドでの処理に応答したが、ＣＰＰ−ＧＦＰ（対照）での処理には応答しなかった細胞中でのカルシウム流出を示し、治療ペプチドが細胞内カルシウム貯蔵からのカルシウムの放出を誘導し、これによって細胞死を促進することを示唆している。
【０１６９】
子宮がんパネル（ＡＴＣＣ−１０２３）を、ＢＩ調節ペプチドで攻撃し、核の凝縮、ＥＲ破壊、リソソーム形成およびミトコンドリアの膜透過性などの形態学的変化について、位相差顕微鏡法および免疫蛍光顕微鏡法によって、細胞を評価した。細胞質ゾルのカルシウムレベル、活性酸素種（ＲＯＳ）レベルの変化について、ならびにトリパンブルーおよび細胞生存率アッセイによっても、細胞を評価した。子宮がん細胞株ＣＲＬ−１６７１からの細胞の免疫蛍光画像（図７Ｇ）は、対照と比較した、ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ１６で処理した細胞におけるリソソームの形成およびミトコンドリア膜の透過性を示しており、ＭＱ１６によって誘導された細胞死と合致する。５つの子宮がん細胞株のそれぞれにおけるＭＱ１６処理の用量反応曲線が図７Ｈに示されている。さまざまなＢＩ−１調節ペプチドでの処理後のＣＲＬ−１６７１細胞中で、細胞質ゾルのカルシウムレベルを測定した。図７Ｉの結果は、各ＢＩ−１調節ペプチドでの処理に応答したが、ＣＰＰ−ＧＦＰ（対照）での処理には応答しなかった細胞中でのカルシウム流出を示し、治療ペプチドが細胞内カルシウム貯蔵からのカルシウムの放出を誘導し、これによって細胞死を促進することを示唆している。
［実施例５］例示的なＢＩ−１調節ペプチドは、非がん性、非ストレス誘導性細胞に対して負の効果を示さない
【０１７０】
ＭＱ００１およびＭＱ００２が非がん性細胞において抗アポトーシス効果を誘導するかどうかを評価するために、ＭＣＦ−１０Ｆ細胞をＭＱ００１またはＭＱ００２で２４時間処理し、次いで、アポトーシスの内因性誘導物質であるスタウロスポリン（ＳＴＳ）、ツニカマイシン（ＴＵＮ）もしくはブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）またはアポトーシスの外因性誘導物質であるＴＮＦα（ＴＮＦ）に曝露した。図８Ａの結果は、ＭＱ００１およびＭＱ００２がいずれも、アポトーシスの内因性誘導物質にさらされたＭＣＦ−７細胞におけるアポトーシスを抑制するが、アポトーシスの外因性誘導物質であるＴＮＦにさらされたＭＣＦ−７細胞に対しては抗アポトーシス効果を有さないことを示している。実施例３および４に概説された実験の結果と合わせると、本データは、ＢＩ−１のアポトーシス促進機能およびアポトーシス抑制機能はいずれも、ＢＩ−１相互作用ペプチドによってモジュレートされ得、ＢＩ−１は、細胞の性質に応じて細胞死を誘導または防止するように選択的に機能することを示唆する。
【０１７１】
ＢＩ−１の重要性をさらに調査するために、ＢＩ−１アンチセンス（ＢＩ−１ｋｄ）を使用してＭＣＦ−７およびＭＣＦ−１０Ｆ細胞中でのＢＩ−１発現をノックダウンし、次いで、ＭＱ００１、ＭＱ００２、対照（ＧＦＰ−ＣＰＰ）で２４時間処理し、または未処理のままにした。その後、ストレス誘導剤およびアポトーシス誘導剤ＴＵＮ、ＢＦＡまたはＳＴＳに細胞を曝露した。図８Ｂの結果は、ＢＩ−１を欠如し、ストレス誘導剤ＴＵＮに曝露されたＭＣＦ−１０Ｆ細胞が、ＭＱ００１またはＭＱ００２処理に関係なく、アポトーシスを受けるように誘導されることを示している。本データは、ＭＱ００１およびＭＱ００２によって誘導されるアポトーシス促進応答とアポトーシス抑制応答の両方にＢＩ−１が必要であり、治療応答の種類は処理されている細胞株の性質に依存することをさらに確証する。
【０１７２】
前述のようにＭＱ００１、ＭＱ００２または対照（ＧＦＰ−ＣＰＰ）での処理後にアポトーシスのマーカーを評価するために、非がん性ヒト細胞株ＭＣＦ−１０Ｆ、ＨＭＥＣ−１およびＭＣＦ−１２Ａに対して追加の研究を実施した。図９Ａおよび９Ｂの結果は、ＭＱ００１およびＭＱ００２での処理が、非がん性細胞株ＭＣＦ−１０Ｆ、ＨＭＥＣ−１およびＭＣＦ−１２Ａにおいて細胞死を誘導しなかったことを示している。このデータは、実施例３および４に概説されている実験から得られたデータと合わせると、ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ００１およびＭＱ００２ががん細胞において細胞死を選択的に誘導することを示している。
［実施例６］例示的なＢＩ−１調節ペプチドでの処理は、がん細胞中の細胞質ゾルのカルシウムレベルを特異的に上昇させる
【０１７３】
ＭＱ００１およびＭＱ００２がＥＲカルシウム濃度、したがって細胞質ゾルのカルシウム濃度のＢＩ−１調節をモジュレートする能力を評価するために、乳がん細胞株（ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）および非がん細胞株（ＭＣＦ−１０ＦおよびＨＭＥＣ−１）をＭＱ００１、ＭＱ００２、ＧＦＰ−ＣＰＰ（対照）またはタプシガルジン（陽性対照）で１２時間処理した後、蛍光カルシウム指示薬のＦｌｕｏ−４  Ｄｉｒｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに１時間インキュベートした。蛍光強度は、各処理条件にさらされた細胞中で測定された。図１０Ａの結果は、ＭＱ００１およびＭＱ００１での処理は乳がん細胞中の細胞質ゾルのカルシウム濃度を有意に増加させたのに対し、ＭＱ００１およびＭＱ００２で処理した非がん性細胞では細胞質ゾルのカルシウムの増加が観察されなかったことを示している。非がん性細胞（図１０Ａ）もＰＣ３前立腺がん細胞（データは示さず）も、ＭＱ００１またはＭＱ００２での処理後に細胞質ゾルのカルシウムレベルの増加を示さないので、データは、したがって、ＢＩ−１とのＭＱ００１またはＭＱ００２の相互作用が細胞質ゾルのカルシウム放出を自己誘導しないことを実証する。
【０１７４】
ＢＩ−１の過剰発現を誘導するために乳がん細胞および非がん性細胞にＢＩ−１を形質移入し、続いて、ＢＩ−１調節ペプチドによる処理の不存在下での細胞中で、細胞質ゾルのカルシウムレベルを測定した。図１０Ｂの結果は、ＢＩ−１の過剰発現だけでは、乳がんまたは非がん性細胞のいずれかにおいて細胞内カルシウム放出を誘導するのに十分ではないことを示している。
【０１７５】
さまざまなＢＩ−１調節ペプチドでの処理によって誘導される細胞質ゾルのカルシウム濃度の相対的変化を評価するために、乳がん細胞をさまざまなＢＩ−１調節ペプチドならびにＧＦＰ−ＣＰＰ（対照）およびタプシガルジン（陽性対照）とともに１９時間インキュベートし、次いで、上記のように細胞質ゾルのカルシウムレベルを評価した。図１０Ｃの結果は、細胞を処理するために使用されたＢＩ−１調節ペプチド（ｔｈｅ  ＢＩ−１  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）の濃度の増加が、細胞内カルシウム放出の増加、したがって、細胞質ゾルのカルシウムレベルの増加をもたらしたことを示している。
［実施例７］例示的なＢＩ−１調節ペプチドでの処理は、がん細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）の産生をもたらす
【０１７６】
ＢＩ−１調節ペプチドで処理した細胞における細胞内カルシウム放出がＲＯＳの産生の増加を伴うかどうかを評価するために、乳がん細胞（ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）および非がん性細胞（ＭＣＦ−１０ＦおよびＨＭＥＣ−１）をＭＱ００１、ＭＱ００２またはＧＦＰ−ＣＰＰ（対照）で２４時間処理した後、ＮＢＴアッセイを使用してＲＯＳの細胞内レベルについて評価した。図１１Ａの結果は、ＭＱ００１またはＭＱ００２での処理後の乳がん細胞中での細胞質ゾルのカルシウムレベルの増加と同様に、ＭＱ００１またはＭＱ００２での処理後の乳がん細胞中でのＲＯＳの細胞質ゾルのレベルが同様に増加することを示している。細胞質ゾルのカルシウムと同様に、ＭＱ００１またはＭＱ００２で処理した非がん性細胞中の細胞質ゾルのＲＯＳレベルは変化しないままである（図１１Ａ）。
【０１７７】
ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ１６での処理後のＲＯＳの産生をさらに評価するために、ＭＱ１６ありまたはなしで、ＭＣＦ−７細胞を８時間処理し、次いで、ＣｅｌｌＲｏｘ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で染色して、酸化ストレスの誘導を調べた。ＣｅｌｌＲｏｘ中の弱い蛍光性色素は、ＲＯＳによる酸化時に明るい緑色の光安定性蛍光を示す。図１１Ｂ（右パネル）の結果は、ＭＱ１６での処理後に、酸化ストレスが誘導され、ＭＣＦ−７細胞中に上昇したレベルのＲＯＳが存在したことを示している。
【０１７８】
ミトコンドリアを標的とするＭｉｔｏＳｏｘ  Ｒｅｄ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＭＱ１６での処理後のスーパーオキシドの存在を評価した。ＭｉｔｏＳｏｘ中の赤色蛍光色素は、スーパーオキシドによって酸化されるが、他のＲＯＳおよび活性窒素種（ＲＮＳ）によっては酸化されない。酸化された生成物は、生きたミトコンドリア中では非常に蛍光性である。ＭＣＦ−７細胞をＭＱ１６ありまたはなしで８時間処理した後、ＭｉｔｏＳｏｘ  Ｒｅｄで染色した。図１１Ｂ（左パネル）の結果は、ＢＩ−１調節ペプチドで処理されていない対照細胞中での赤色蛍光のミトコンドリアを示しており、スーパーオキシドの存在を示している。ＭＱ１６で処理した細胞は拡散した赤色蛍光を示し、ミトコンドリア膜の透過性および細胞溶解と一致している。これらの結果は、ＢＩ−１調節ペプチドでのがん細胞の処理が生きたミトコンドリアの喪失を誘導することを実証する。
［実施例８］例示的なＢＩ−１調節ペプチドでの処理は、がん細胞においてミトコンドリア膜の透過性をもたらす
【０１７９】
ＭＱ００１およびＭＱ００２で処理した細胞中のミトコンドリア膜の完全性を評価するために、乳がん細胞株ＭＣＦ−７および非がん性乳がん細胞株ＭＣＦ−１０Ｆからの細胞を、ＨＡタグを付けたＭＱ００１またはＨＡタグを付けたＭＱ００２のいずれかで処理した。生きたミトコンドリア（図１２、上）および蛍光タグを付けた抗ＨＡ抗体（図１２、下）について染色するために、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒとともに細胞をインキュベートした。図１２の結果は、ＭＱ００１またはＭＱ００２で処理したＭＣＦ−１０Ｆ細胞中の無傷のミトコンドリアを示しているが、ＭＱ００１でＭＣＦ−７乳がん細胞を処理すると、細胞内のミトコンドリア膜が透過性になった。
［実施例９］例示的なＢＩ−１調節ペプチドでの処理は、がん細胞中でアクチンの再編成および小胞体（ＥＲ）の歪みをもたらす
【０１８０】
ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ００１およびＭＱ００２がアクチンの動態を破壊するかどうかを評価するために、Ｍｙｃタグを付けたＭＱ００１またはＭｙｃタグを付けたＭＱ００２でＭＣＦ−７細胞を処理し、蛍光発色団にコンジュゲートした抗体を使用してアクチンおよびＭｙｃに対して染色した。免疫蛍光顕微鏡法によって撮影された画像（図１３Ｃ−Ｄ）は、対照と比較して、ＭＱ００１およびＭＱ００２で処理した細胞中ではアクチンの局在が破壊されているようであることを示している。アクチンはＭＱ００１およびＭＱ００２と共局在しているようであり、ＭＱ００１およびＭＱ００２でのＭＣＦ−７細胞の処理は、細胞のアクチン動態の破壊を引き起こし、細胞構造の崩壊をもたらし得ることを示唆している。位相差顕微鏡法による画像（図１３Ａ、右パネル）は、対照と比較して、ＭＱ００１およびＭＱ００２で処理したＭＣＦ−７細胞中でＥＲが歪んでいるようであることを示している。さらに、細胞の免疫蛍光画像は、ＭＱ００１およびＭＱ００２ペプチドが、処理した細胞中のＥＲに局在するようであることを示している。
【０１８１】
細胞形態およびタンパク質局在化を評価するための追加の実験を上記のように実施した。いくつかの研究では、ＥＲマーカーであるカルネキシン、リソソームマーカーおよび自食作用を媒介するタンパク質ＬＣ３を標識するための抗体でも、細胞を染色した。結果は、ＭＱ００１とＭＱ００２とが対照細胞と比較してＥＲの構造を破壊しているようであり、さらに、ＭＱ００１とＭＱ００２の両方がＭＣＦ−７細胞中でＥＲに局在しているようであることを示している（図１４Ａ）。
【０１８２】
ＢＩ−１調節ペプチドで処理したがん細胞での細胞死が自食作用によって媒介されているかどうかを評価するために、抗微小管関連タンパク質１軽鎖３（ＬＣ３）抗体を使用して、細胞を蛍光的に探索した。ＬＣ３は、自食作用の際のオートファゴソーム形成に関与している。図１４Ｂの結果は、対照（ＣＰＰ）での処理後ならびにＭＱ００１およびＭＱ００２での処理後に、ＬＣ３が細胞全体に拡散していることを示す。ＬＣ３は、ＢＩ−１調節ペプチドでの処理後、がん細胞中のオートファゴソームに局在しておらず、ＭＱ００１およびＭＱ００２によって誘導される細胞死がこれらの細胞中での自食作用によって媒介されていないことを示している。染色された細胞の追加の画像は、ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ１６Ｃでの処理がＭＣＦ−７細胞中でリソソームの形成を誘導することを示している（図１４Ｃ）。
【０１８３】
ＢＩ−１調節ペプチドＭＱ００１およびＭＱ００２での処理が、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）として知られるＥＲストレス応答を介してがん細胞での細胞死を誘導するかどうかを評価するために、ＪＮＫ、ＥＲＫ１／２およびＢｃｌ−２のリン酸化の増加に関して、ＭＱ００１およびＭＱ００２で処理した細胞からの溶解産物をウエスタンブロットによって評価した。ＵＰＲによって誘導される転写因子ＣＨＯＰの活性化を、ＰＣＲによってさらに評価した。結果は、ＭＱ００１およびＭＱ００２での処理がＪＮＫのリン酸化の増加をもたらさず（図１５Ａ）、ＣＨＯＰのわずかな活性化のみをもたらすことを実証した（図１５Ｂ）。ＭＱ００１およびＭＱ００２はＭＣＦ−１０Ｆ細胞中でＥＲＫ１／２リン酸化を誘導し（図１５Ａ）、これはＲＯＳ産生を下方調節し、ミトコンドリアの透過性を阻害することによって細胞の生存を促進する上で重要であることが示されている（Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８２３：８７６−８８８，２０１２）。ＭＱ００１またはＭＱ００２で処理した後のＭＣＦ−７細胞では、ＥＲＫリン酸化の上昇は観察されなかった（図１５Ａ）。
【０１８４】
ＭＱ００１およびＭＱ００２がＵＰＲの活性化を抑制することを確認するために、アポトーシス抑制性のＢｃｌ−２を上方調節してアポトーシスを阻害するＵＰＲ転写因子であるＸＢＰ−１のＩＲＥ１スプライシングによって媒介される抗アポトーシス遺伝子の上方調節を評価した。ＭＱ００１およびＭＱ００２処理は、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘＬの発現にいかなる変化ももたらさず（図１５Ｂ）、ＭＱ００１およびＭＱ００２ががん細胞中でＩＲＥ１を阻害するという考えを支持している。さらに、ＭＱ００１またはＭＱ００２での処理後、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘＬのリン酸化の増加も減少も観察されなかった（図１５Ｃ）。
【０１８５】
ＭＱ００１またはＭＱ００２での処理後に破壊されたＥＲ形態を有するＭＣＦ−７細胞、およびＭＱ００１またはＭＱ００２での処理後に凝縮した核を有するＭＣＦ−７細胞（両方とも９６時間にわたって）をカウントした。図１５Ｄは、免疫蛍光によってカウントされた、核凝縮を伴う細胞のカウント（黒い棒）上に重ねたＥＲ破壊（白い棒）の定量を示す。ＭＱ００１およびＭＱ００２で処理した細胞は、同様のＥＲ分解率を示し、対照よりも有意に高い核凝縮を有し、どちらも時間の経過とともに増加した（図１５Ｄ）。
［実施例１０］例示的なＢＩ−１調節ペプチドでの処理は、ヒト乳がんのマウスモデルにおいて腫瘍のサイズおよび体積を９５％より多く減少させた。
【０１８６】
乳がんの生存と腫瘍形成におけるＢＩ−１の役割を評価するために、ルミナルＡ型ＭＣＦ−７またはベーサルＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞のいずれかを８週齢のｂａｌｂ／ｃ雌マウスに注射した。原発腫瘍がマウス中に定着することを可能にする成長期間の後に、ＭＱ００１、対照またはプラセボのいずれかで５日間腫瘍を処置した。ＭＱ００１で処置された腫瘍は、処置から２０日以内に腫瘍のサイズと体積が有意に減少した（図１６Ａ）。ＭＱ００１で処置されたマウスは、当初、体重が減少したが、処置の期間中に体重減少が大幅に回復した（図１６Ｂ）。主要臓器の毒性は、ＭＱ００１処置後のＨ＆Ｅ染色によって評価した。主要臓器のいずれにおいても、出血やその他の毒性の兆候（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）は観察されなかった（図１７）。
［実施例１１］例示的なＢＩ−１調節ペプチドの安定性評価
【０１８７】
ヒト、マウスおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）血漿中でのＭＱ００１の安定性を、本明細書に記載の方法に従ってインビトロで評価した。結果は、ヒト血漿中での５０時間のインキュベーション後にも、ＭＱ００１の約５０％が無傷のままであることを実証する（図１８Ａ）。
【０１８８】
ＭＱ００１の安定性は、本明細書に記載の方法に従ってミクロソーム中においても評価した。結果は、ＭＱ００１の約４０％が６時間後にミクロソーム中で無傷のままであることを示している（図１８Ｂ）。
９．均等物および参照による組み込み
【０１８９】
好ましい実施形態および様々な代替実施形態を参照して、本発明を具体的に示し、説明してきたが、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明中の形態および細部の様々な変更を行うことができることを理解する。
【０１９０】
本明細書の本文内に引用されているすべての参考文献、発行された特許および特許出願は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
１０．非公式の配列表
【表１−１】
2021534826.tif 000002
【表１−２】
2021534826.tif 000003
【表１−３】
2021534826.tif 000004
【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
2021534826.tif 000010
【表１−１０】
2021534826.tif 000011
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021534826.tif 000040
2021534826.tif 000041
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