(57)【要約】  ここに提供されるのは、異種タンパク質の周辺発現のための細菌リーダー配列、細菌リーダー配列を含む融合タンパク質およびその発現方法である。
2021501157.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質またはポリペプチドに操作可能に結合されるリーダーペプチドを含むポリペプチドであって、ここで、該リーダーペプチドが配列番号１、２または３に示すアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
リーダーペプチドが目的のタンパク質またはポリペプチドにとって天然ではない、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
目的のタンパク質またはポリペプチドが抗体または抗体誘導体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子およびワクチン抗原から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
抗体または抗体誘導体がｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ヒト化抗体、修飾抗体、単一ドメイン抗体、異種特異的抗体、三価抗体、二特異的抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、直線状抗体、ダイアボディまたは完全鎖抗体である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
リンカーをさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
開裂ドメインをさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
第一部分が目的のタンパク質またはポリペプチドの発現を原核宿主細胞の周辺質に向ける、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
原核宿主細胞がシュードモナス属菌細胞または大腸菌細胞から選択される、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
原核細胞培養で目的のタンパク質またはポリペプチドを産生する方法であって、(ａ)細胞培養増殖培地で原核細胞を培養し、ここで、原核細胞は、リーダーペプチドに操作可能に結合される目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含むものであり；そして(ｂ)原核細胞の周辺質から目的のタンパク質またはポリペプチドを単離することを含み、ここで、リーダーペプチドは配列番号１、２および３から選択されるアミノ酸配列を含むものである、方法。
【請求項１０】
目的のタンパク質またはポリペプチドが抗体または抗体誘導体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子およびワクチン抗原から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗体または抗体誘導体がｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ヒト化抗体、修飾抗体、単一ドメイン抗体、異種特異的抗体、三価抗体、二特異的抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、直線状抗体、ダイアボディまたは完全鎖抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
核酸がリンカーをコードする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
核酸が開裂ドメインをコードする、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
原核細胞がシュードモナス属菌細胞または大腸菌細胞から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
原核細胞の周辺質で目的のタンパク質またはポリペプチドを発現する方法であって、細胞培養増殖培地でリーダーペプチドに操作可能に結合される目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞を培養することを含み、ここで、リーダーペプチドが配列番号１、２および３から選択されるアミノ酸配列を含むものである、方法。
【請求項１６】
目的のタンパク質またはポリペプチドが抗体または抗体誘導体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子およびワクチン抗原から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抗体または抗体誘導体がｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ヒト化抗体、修飾抗体、単一ドメイン抗体、異種特異的抗体、三価抗体、二特異的抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、直線状抗体、ダイアボディまたは完全鎖抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
核酸がリンカーをコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
核酸が開裂ドメインをコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
原核細胞がシュードモナス属菌細胞または大腸菌細胞から選択される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、引用により本明細書に包含させる、２０１７年１０月２７日出願の米国仮出願６２／５７８,３０４の利益を請求する。
【０００２】
配列表
本願は配列表を含み、それはASCII形式で電子的に提出されており、その全体を引用により本明細書に包含させる。該ASCIIコピーは、２０１８年１０月１６日に作成し、38194-752_601_SL.txtなる名称であり、１３,６９８倍とサイズである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
１５０個を超える組み換えにより産生されたタンパク質およびポリペプチドが、生物工学薬物およびワクチンとしての用途について米国食品医薬品局(ＦＤＡ)により承認されており、さらに３７０個が臨床治験中である。化学合成により製造される小分子治療剤とは異なり、タンパク質およびポリペプチドは、生存細胞で最も効率的に生産される。しかしながら、細菌中で組み換えタンパク質を産生する現行法は、しばしば不適切に折り畳まれた、凝集した、または不活性なタンパク質を産生し、多くのタイプのタンパク質は、既知の方法では効率的に達成できない二次修飾を必要とする。
【０００４】
既知法での主要な問題の一つは、過剰量のタンパク質が細胞に蓄積したときに生じ得る、細胞質内で凝集したタンパク質から成る封入体の形成にある。組み換えタンパク質産生の他の問題は、発現タンパク質の適切な二次および三次構造の形成にある。一つの障害は、細菌細胞質が、しばしば適切なタンパク質折り畳みの基礎となるジスルフィド結合形成に積極的に抵抗することである(Derman et al., 1993, Science, 1744-7)。その結果、多くの組み換えタンパク質、特に真核生物起源のものは、細菌で産生したとき、不適切に折り畳まれ、かつ不活性となる。
【０００５】
組み換え系で適切に折り畳まれた、可溶性および／または活性タンパク質の産生を増加するための多くの試みがなされている。例えば、研究者らは、発酵条件を変え、プロモーター強度を変えまたはしばしば封入体形成の阻止を助ける過発現されたシャペロンタンパク質を使用している。
【０００６】
適切に折り畳まれた、可溶性および／または活性タンパク質の収獲増加の別の試みは、細胞内環境からのタンパク質の分泌である。シグナル配列を有するポリペプチドの分泌のもっとも一般的な形態は、Ｓｅｃ系を含む。Ｓｅｃ系は、Ｓｅｃ系Ｎ末端分泌リーダーを有するタンパク質を、原形質膜を通してする排出させる。
【０００７】
細胞から上清にタンパク質を排出させるための戦略が開発されている。発現増加のための他の戦略は、タンパク質を周辺質(periplasm)に標的化することに関する。いくつかの研究は非Ｓｅｃ型分泌に着目する。しかしながら、研究の大多数は、Ｓｅｃ型分泌系を有する外来性タンパク質の分泌に着目している。組み換えポリペプチドまたはタンパク質発現における使用のために、多数の分泌シグナルが報告されている。
【０００８】
細胞質の外のタンパク質に標的化するシグナル配列を利用する戦略は、しばしば不適切に形成されたタンパク質を産生する。Ｓｅｃ系を介して分泌させるようなアミノ末端分泌シグナルは特にこれに該当する。この系を介して形成されたタンパク質は、しばしば分泌シグナルの一部を維持するか、しばしば不適切に開裂される連結部分を必要とするかまたは末端で短縮される。
【０００９】
上記技術状況から明らかなとおり、宿主細胞の周辺質にタンパク質を標的化するために、多くの戦略が開発されている。しかしながら、既知戦略は、一貫して高収量の適切に形成された、活性組み換えタンパク質をもたらしておらず、しばしば治療使用のために精製される。先の戦略における一つの大きな欠陥は、不充分な細胞系での、分泌不良のシグナル配列を有するタンパク質の発現である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
適切に形成された形態で組み換えポリペプチドを産生するために、それらを分泌し、適切に形成できる、大規模発現系への改善の要請がまだある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
ここに提供されるのは、第一部分および第二部分を有するポリペプチドであって、ここで、第一部分は配列番号１〜３の１以上と相同であるアミノ酸配列を有し、そして第二部分は目的のタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列を有し、かつ第一部分と第二部分は操作可能に結合されている。ある実施態様において、ポリペプチドの第一部分は、目的のタンパク質またはポリペプチドにとって天然ではない。ある実施態様において、目的のタンパク質は抗体または抗体誘導体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子およびワクチン抗原から選択される。ある実施態様において、抗体または抗体誘導体はｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ヒト化抗体、修飾抗体、単一ドメイン抗体、異種特異的抗体、三価抗体、二特異的抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、直線状抗体、ダイアボディまたは完全鎖抗体である。ある実施態様において、ポリペプチドは、さらにリンカーを含む。ある実施態様において、ポリペプチドは、さらに開裂ドメインを含む。ある実施態様において、第一部分は、目的のタンパク質の発現を原核宿主細胞の周辺質に向けるリーダーペプチドである。ある実施態様において、宿主細胞はシュードモナス属菌細胞または大腸菌細胞から選択される。
【００１２】
またここに提供されるのは、リーダーペプチドおよび目的のタンパク質またはポリペプチドを含むポリペプチドであり、ここで、リーダーペプチドは、配列番号１〜３の１以上から選択されるアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、リーダーペプチドは、目的のタンパク質またはポリペプチドにとって天然ではない。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチドは抗体または抗体誘導体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子およびワクチン抗原から選択される。ある実施態様において、抗体または抗体誘導体は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ヒト化抗体、修飾抗体、単一ドメイン抗体、異種特異的抗体、三価抗体、二特異的抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、直線状抗体、ダイアボディまたは完全鎖抗体である。ある実施態様において、ポリペプチドは、さらにリンカーを含む。ある実施態様において、ポリペプチドは、さらに開裂ドメインを含む。ある実施態様において、第一部分は、目的のタンパク質またはポリペプチドの発現を原核宿主細胞の周辺質に向ける、リーダーペプチドである。ある実施態様において、宿主細胞はシュードモナス属菌細胞または大腸菌細胞から選択される。
【００１３】
さらにここに提供されるのは、第一部分および第二部分を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ここで、第一部分は配列番号４〜６の１以上から選択される核酸配列によりコードされ、そして第二部分は目的のタンパク質またはポリペプチドの核酸配列によりコードされ、かつ第一部分と第二部分は操作可能に結合されている。ある実施態様において、ポリペプチドの第一部分は、目的のタンパク質またはポリペプチドにとって天然ではない。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチドは抗体または抗体誘導体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子およびワクチン抗原から選択される。ある実施態様において、抗体または抗体誘導体はｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ヒト化抗体、修飾抗体、単一ドメイン抗体、異種特異的抗体、三価抗体、二特異的抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、直線状抗体、ダイアボディまたは完全鎖抗体である。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、さらにリンカーをコードする核酸を含む。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、さらに開裂ドメインをコードする核酸を含む。ある実施態様において、第一部分は、目的のタンパク質またはポリペプチドの発現を原核宿主細胞の周辺質に向けるリーダーペプチドである。ある実施態様において、宿主細胞はシュードモナス属菌細胞または大腸菌細胞から選択される。
【００１４】
またここに提供されるのは、リーダーペプチドをコードする核酸を含むタンパク質発現のためのベクターであり、ここで、核酸は、配列番号４〜６の１以上から選択される核酸配列を有する。ある実施態様において、ベクターは、さらにリンカーを含む。ある実施態様において、ベクターは、さらに開裂ドメインを含む。ある実施態様において、リーダーペプチドは、目的のタンパク質またはポリペプチドの発現を原核宿主細胞の周辺質に向ける。ある実施態様において、宿主細胞はシュードモナス属菌細胞または大腸菌細胞から選択される。
【００１５】
またここに提供されるのは、原核細胞培養で目的のタンパク質またはポリペプチドを産生する方法である。ある実施態様において、方法は、(ａ)目的のタンパク質またはポリペプチドおよびリーダーペプチドをコードする核酸を含む原核細胞を細胞培養増殖培地で培養し；そして(ｂ)原核細胞の周辺質から目的のタンパク質またはポリペプチドを単離することを含み、ここで、リーダーペプチドは配列番号１〜３の１以上から選択されるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチドは抗体または抗体誘導体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子およびワクチン抗原から選択される。ある実施態様において、抗体または抗体誘導体はｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ヒト化抗体、修飾抗体、単一ドメイン抗体、異種特異的抗体、三価抗体、二特異的抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、直線状抗体、ダイアボディまたは完全鎖抗体である。ある実施態様において、核酸はリンカーをコードする。ある実施態様において、核酸は開裂ドメインをコードする。ある実施態様において、原核細胞はシュードモナス属菌細胞または大腸菌細胞から選択される。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチドの発現は、培養培地にＩＰＴＧを加えることにより誘導される。ある実施態様において、原核細胞は、約５.０〜約８.０のｐＨで培養される。ある実施態様において、原核細胞は、約２２℃〜約３３℃の温度で培養される。
【００１６】
ある実施態様において、本発明の方法は、原核細胞培養で目的のタンパク質またはポリペプチドを産生する方法を含み、該方法は、(ａ)目的のタンパク質またはポリペプチドおよびリーダーペプチドをコードする核酸を含む原核細胞を細胞培養増殖培地で培養し；そして(ｂ)原核細胞の周辺質から目的のタンパク質またはポリペプチドを単離することを含み、ここで、リーダーペプチドは配列番号４〜６の１以上から選択される核酸配列によりコードされる。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチドは抗体または抗体誘導体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子およびワクチン抗原から選択される。ある実施態様において、抗体または抗体誘導体はｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ヒト化抗体、修飾抗体、単一ドメイン抗体、異種特異的抗体、三価抗体、二特異的抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、直線状抗体、ダイアボディまたは完全鎖抗体である。ある実施態様において、核酸はリンカーをコードする。ある実施態様において、核酸は開裂ドメインをコードする。ある実施態様において、原核細胞はシュードモナス属菌細胞または大腸菌細胞から選択される。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチドの発現は、培養培地にＩＰＴＧを加えることにより誘導される。ある実施態様において、原核細胞は、約５.０〜約８.０のｐＨで培養される。ある実施態様において、原核細胞は、約２２℃〜約３３℃の温度で培養される。
【００１７】
ある実施態様において、本発明の方法は、原核細胞の周辺質で目的のタンパク質またはポリペプチドを発現する方法を含み、該方法は、細胞培養増殖培地で目的のタンパク質またはポリペプチドおよびリーダーペプチドをコードする核酸を含む原核細胞を培養することを含み、ここで、リーダーペプチドは配列番号１〜３の１以上から選択されるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチドは抗体または抗体誘導体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子およびワクチン抗原から選択される。ある実施態様において、抗体または抗体誘導体はｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ヒト化抗体、修飾抗体、単一ドメイン抗体、異種特異的抗体、三価抗体、二特異的抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、直線状抗体、ダイアボディまたは完全鎖抗体である。ある実施態様において、核酸はリンカーをコードする。ある実施態様において、核酸は開裂ドメインをコードする。ある実施態様において、原核細胞はシュードモナス属菌細胞または大腸菌細胞から選択される。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチドの発現は、培養培地にＩＰＴＧを加えることにより誘導される。ある実施態様において、原核細胞は、約５.０〜約８.０のｐＨで培養される。ある実施態様において、原核細胞は、約２２℃〜約３３℃の温度で培養される。
【００１８】
ある実施態様において、本発明の方法は、原核細胞の周辺質で目的のタンパク質またはポリペプチドを発現する方法を含み、該方法は目的のタンパク質またはポリペプチドおよびリーダーペプチドをコードする核酸を含む原核細胞を細胞培養増殖培地で培養することを含み、ここで、リーダーペプチドは配列番号４〜６の１以上から選択される核酸配列によりコードされる。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチドは抗体または抗体誘導体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子およびワクチン抗原から選択される。ある実施態様において、抗体または抗体誘導体はｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ヒト化抗体、修飾抗体、単一ドメイン抗体、異種特異的抗体、三価抗体、二特異的抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、直線状抗体、ダイアボディまたは完全鎖抗体である。ある実施態様において、核酸はリンカーをコードする。ある実施態様において、核酸は開裂ドメインをコードする。ある実施態様において、原核細胞はシュードモナス属菌細胞または大腸菌細胞から選択される。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチドの発現は、培養培地にＩＰＴＧを加えることにより誘導される。ある実施態様において、原核細胞は、約５.０〜約８.０のｐＨで培養される。ある実施態様において、原核細胞は、約２２℃〜約３３℃の温度で培養される。
【００１９】
引用による取り込み
本明細書に記載する全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許および特許出願が具体的にかつ個々に引用により本明細書に包含されると記載されているのと同程度に引用により本明細書に包含される。
【００２０】
本開示の新規特性は、添付する特許請求の範囲に、詳細に示す。本開示の特性および利点は、開示の原則に基づく説明的実施態様を示す次の詳細な記載および次の図面を参照してよりよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＴｒｘＡ発現のＳＤＳ−ＣＧＥゲル様の画像を示す。
【００２２】
【図２】Ｇａｌ２発現のＳＤＳ−ＣＧＥゲル様の画像を示す。
【００２３】
【図３】ｍｒＰＡ発現のＳＤＳ−ＣＧＥゲル様の画像を示す。
【００２４】
【図４】クリサンタスパーゼ配列例。クリサンタスパーゼをコードする核酸配列の例(配列番号８)を、対応するアミノ酸配列(配列番号７)と共に示す。図４はまた配列番号２０としてのクローニングサイトを含む完全長ヌクレオチド配列も開示する。
【００２５】
【図５】ＳＤＳ−ＣＧＥゲル様の画像−クリサンタスパーゼ発現プラスミドスクリーニング。ＤＣ４５４(上部パネル)およびＤＣ４４１(下部パネル)からのクリサンタスパーゼ小規模増殖全培養液超音波処理の可溶性サンプルを、還元ＳＤＳ−ＣＧＥにより分析した。最左のレーンは分子量マーカーラダー１(上部パネルＭＷラダー４８KD、２９KD；下部パネルＭＷラダー４８KD、２９KD、２１KD)を示し、最右のレーンには同じラダーを示す。左から右(レーン１から４６)方向で、ラダー１のすぐ右から始まるのは、次の分泌リーダーペプチドをクリサンタスパーゼタンパク質のＮ末端に融合させたときに観察された発現パターンを示すレーンである(他に示さない限り高ＲＢＳ)：リーダーなし；ＤｓｂＤ；リーダーＡ；ＤｓｂＡ；ＤｓｂＡ−中ＲＢＳ；Ａｚｕ；Ａｚｕ−中ＲＢＳ；Ｌａｏ；Ｉｂｐ−Ｓ３１Ａ；ＴｏｌＢ；ＤＣ４３２ヌル(ベクターのみのプラスミドを担持する野生型宿主株)；Ｔｐｒ；Ｔｔｇ２Ｃ；ＦｌｇＩ；ＣｕｐＣ２；ＣｕｐＢ２；Ｐｂｐ；ＰｂｐＡ２０Ｖ；ＤｓｂＣ；リーダーＢ；リーダーＣ；ＤＣ４３２ヌル；リーダーＤ；リーダーＥ；リーダーＦ；リーダーＧ；リーダーＨ；ＰｏｒＥ；リーダーＩ；リーダーＪ；リーダーＫ；リーダーＬ；ＤＣ４３２ヌル；リーダーＭ；リーダーＮ；リーダーＯ；５１９３；リーダーＰ；リーダーＱ；リーダーＲ；８４８４；リーダー；リーダーＴ；ＤＣ４３２ヌル。ゲル画像の右への矢印は、クリサンタスパーゼ標的タンパク質(３５kDa)の泳動を示す。
【００２６】
【図６】ＳＤＳ−ＣＧＥゲル様の画像−大腸菌アスパラギナーゼ発現プラスミドスクリーニング。アスパラギナーゼ小規模(０.５ml)増殖全培養液超音波処理の可溶性(上部パネル)および不溶性(下部パネル)サンプルを還元ＳＤＳ−ＣＧＥにより分析した。最左のレーンは分子量マーカーラダー(上部パネルＭＷラダー１１９kDa、６８KDａ、４８kDa、２９kDa、２１kDa、１６kDa；下部パネルＭＷラダー１１９kDa、６８KDａ、４８kDa、２９kDa、２１kDa、１６kDa)を示し、最右のレーンは同じラダーを示す。左から右方向で、ラダー１のすぐ右から始まるのは、ヌル、ＳＴＲ５５４６７、ＳＴＲ５５６８９、ＳＴＲ５５５５９、ＳＴＲ５５５６１、ＳＴＲ５５５６９、ＳＴＲ５５５７５、ＳＴＲ５５５５５、ＳＴＲ５５５７１、ＳＴＲ５５５６０、ＳＴＲ５５５７０、ＳＴＲ５５５７２、ＳＴＲ５５６０１、ＳＴＲ５５５８５、ＳＴＲ５５５９２、ＳＴＲ５５５０１および対照：Sigma大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼ１０００μg／ml、Sigma大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼ５００μg／ml、Sigma大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼ２５０μg／ml、Sigma大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼ１２５μg／mlおよびSigma大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼ６２.５μg／mlで観察される発現パターンを示すレーンである。ゲル画像の右の矢印は、アスパラギナーゼ標的タンパク質(３５kDa)の泳動を示す。
【００２７】
【図７】ＳＤＳ−ＣＧＥゲル様の画像−クリサンタスパーゼ振盪フラスコ発現分析。可溶性、還元キャピラリーゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＣＧＥ)により測定した、種々の増殖条件下の発現を示す。左から右方向で、次のサンプルで観察される発現パターンを示すレーンである：ラダー１(分子量マーカー６８、４８、２９、２１および１６KD)；Ｉ０でのＳＴＲ５５９８７(リーダーなしでの細胞質発現)；Ｉ２４でのＳＴＲ５５９８７(リーダーなしでの細胞質発現)；Ｉ２４でのＳＴＲ５５９８７(リーダーなしでの細胞質発現)；Ｉ２４でのＳＴＲ５５９８７(リーダーなしでの細胞質発現)；Ｉ０でのＳＴＲ５５９７９(リーダーＯ)；Ｉ２４でのＳＴＲ５５９７９(リーダーＯ)；Ｉ２４でのＳＴＲ５５９７９(リーダーＯ)；Ｉ２４でのＳＴＲ５５９７９(リーダーＯ)；Ｉ０でのＳＴＲ５５９８０(８４８４リーダー)；Ｉ２４でのＳＴＲ５５９８０(８４８４リーダー)；Ｉ２４でのＳＴＲ５５９８０(８４８４リーダー)；Ｉ２４でのＳＴＲ５５９８０(８４８４リーダー)；Ｉ０でのＳＴＲ５５９８２(ヌルプラスミド)；Ｉ２４でのＳＴＲ５５９８２(ヌルプラスミド)；Ｉ２４でのＳＴＲ５５９８２(ヌルプラスミド)；Ｉ２４でのＳＴＲ５５９８２(ヌルプラスミド)；ラダー２(ラダー１と同じマーカー)；Sigma大腸菌ＡｓｐＧ  １,０００μg／ml(標準的大腸菌Ａｓｐ２)；Sigma大腸菌ＡｓｐＧ  ５００μg／ml；Sigma大腸菌ＡｓｐＧ  ２５０μg／ml；Sigma大腸菌ＡｓｐＧ  １２５μg／ml；Sigma大腸菌ＡｓｐＧ  ６２.５μg／ml；およびラダー３(ラダー１と同じマーカー)であり、ここでＩ０サンプルは誘導時にとり、Ｉ２４サンプルは誘導２４時間後にとる。右側の矢印は大腸菌Ｌ−Ａｓｐ２(３５KD)の泳動を示す。
【００２８】
【図８】タンパク質発現サンプル分析のＬＣ−ＭＳアウトプットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な記載
概要
宿主細胞で高レベルの適切に形成された組み換えタンパク質またはポリペプチドを産生するための組成物および方法が提供される。特に、目的の組み換えタンパク質またはポリペプチドのグラム陰性細菌の周辺質もしくは細胞外環境への標的化を促進する新規分泌シグナルが提供される。ここに開示する周辺分泌リーダーは、タンパク質を、グラム陰性細菌の細胞膜周辺腔に内膜を通過して輸送することを可能とする。組み換え発現について、周辺発現は、周辺質におけるジスルフィド結合の形成を可能とし、しばしば高レベル組み換えタンパク質発現を可能とする。細胞膜周辺腔への発現はまた組み換えタンパク質のより効率的な回収／精製も可能とし得る。本開示の目的で、「分泌シグナル」、「分泌リーダー」、「分泌シグナルポリペプチド」、「シグナルペプチド」または「リーダー配列」は、目的のタンパク質またはポリペプチドをグラム陰性細菌の周辺質または細胞外空間に標的化するのに有用である、ペプチド配列(または該ペプチド配列をコードするポリヌクレオチド)を意味することを意図する。本発明の分泌シグナル配列は、ＡｎｓＢ、８４８４および５１９３分泌シグナルならびにそのフラグメントおよびバリアントから選択される分泌リーダーを含む。分泌シグナルのアミノ酸配列は配列番号１〜３に示す。配列番号１〜３をコードし、本方法に有用であるヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号４〜６に提供される(表１)。当業者には知られるとおり、アミノ酸配列は、遺伝子コードの冗長性のために、異なるヌクレオチド配列によりコードされ得る。それ故に、本発明は、同じアミノ酸配列を有するが、異なるヌクレオチド配列によりコードされるペプチドまたはタンパク質の使用を含む。またここに提供されるのは、操作可能に結合される目的の組み換えタンパク質またはポリペプチドの周辺発現を指示できる、これらの分泌シグナル配列のフラグメントおよびバリアントである。
【表１】
2021501157.tif 000003
【００３０】
ここに開示する方法は、しばしば不適切に折り畳まれ、凝集したまたは不活性なタンパク質を産生する、現在の細菌における組み換えタンパク質の産生方法を改善する。さらに、多くのタイプのタンパク質は、既知法を使用して効率的に達成できない二次修飾を必要とする。本発明の方法は、細胞内環境からのタンパク質の分泌により、適切に折り畳まれた、可溶性および／または活性タンパク質の収量を増加させる。グラム陰性細菌において、細胞質から分泌されるタンパク質は、しばしば細胞膜周辺腔に到達し、外膜に結合するかまたは細胞外ブロスに到達する。本方法はまた、凝集したタンパク質から成る封入体の形成も回避する。細胞膜周辺腔への分泌は、適切なジスルフィド結合形成を促進する効果も有する(両者とも引用により本明細書に包含されるBardwell et al., 1994, “Pathways of Disulfide Bond Formation in Proteins In Vivo,” in Phosphate in microorganisms : cellular and molecular biology, eds. Torriani-Gorini et al., pp. 270-5およびManoil, 2000, Methods in Enzymol. 326:35-47)。組み換えタンパク質の分泌の利益は、タンパク質のより効率的な単離；可溶性および／または活性形態のタンパク質のパーセンテージを増加させるトランスジェニックタンパク質の適切な折り畳みおよびジスルフィド結合形成；封入体の形成減少および宿主細胞への毒性低減を含む。目的のタンパク質が培養培地に分泌される能力は、ある場合、タンパク質産生のためのバッチ培養ではなく、連続的培養を促進する。
【００３１】
グラム陰性細菌は、二重膜を通るタンパク質の能動的排出のための多数の系を進化させている。これらの分泌経路は、例えば、原形質膜および外膜両者を通る一段階移行のためのＡＢＣ(タイプＩ)経路、Ｐａｔｈ／Ｆｌａ(タイプIII)経路およびＰａｔｈ／Ｖｉｒ(タイプIV)経路；原形質膜を通る移行のためのＳｅｃ(タイプII)、Ｔａｔ、ＭｓｃＬおよびＨｏｌｉｎｓ経路；ならびに原形質膜および外膜を通る二段階移行のためのＳｅｃ−プラス−線毛アッシャーポリン(ＦＵＰ)、Ｓｅｃ−プラス−オートトランスポーター(ＡＴ)、Ｓｅｃ−プラス−２パートナー分泌(ＴＰＳ)、Ｓｅｃ−プラス−メインターミナルブランチ(ＭＴＢ)およびＴａｔ−プラス−ＭＴＢ経路を含む。全ての細菌がこれら分泌経路全てを有するわけではない。
【００３２】
３つのタンパク質系(タイプＩ、IIIおよびIV)は、単一エネルギー共役段階で両膜を通過してタンパク質を分泌する。４つの系(Ｓｅｃ、Ｔａｔ、ＭｓｃＬおよびＨｏｌｉｎｓ)は、内膜を介してのみ分泌し、他の４つの系(ＭＴＢ、ＦＵＰ、ＡＴおよびＴＰＳ)は外膜を介してのみ分泌する。
【００３３】
ある場合、本発明のシグナル配列はＳｅｃ分泌系を利用する。Ｓｅｃ系は、Ｎ末端分泌リーダーを有するタンパク質の、原形質膜を通る排出を担う(Agarraberes and Dice, 2001, Biochim Biophys Acta. 1513:1-24; Muller et al., 2001, Prog Nucleic Acid Res Mol. Biol. 66:107-157参照)。Ｓｅｃファミリーのタンパク質複合体は、原核生物および真核生物に普遍的にみられる。細菌Ｓｅｃ系は、輸送タンパク質、シャペロンタンパク質(ＳｅｃＢ)またはシグナル認識粒子(ＳＲＰ)およびシグナルペプチダーゼ(ＳＰａｓｅ  ＩおよびＳＰａｓｅ  II)からなる。大腸菌のＳｅｃ輸送複合体は、３つの内在性内膜タンパク質、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥおよびＳｅｃＧおよび細胞質ＡＴＰａｓｅ、ＳｅｃＡからなる。ＳｅｃＡはＳｅｃＹ／Ｅ／Ｇ複合体を補充することにより能動的透過チャンネルを形成する。シャペロンタンパク質ＳｅｃＢは新生ポリペプチド鎖に結合して、それが折り畳まれるのを阻止し、ＳｅｃＡに向ける。直線状ポリペプチド鎖は、その後ＳｅｃＹＥＧチャネルを通って輸送され、シグナルペプチド開裂後、タンパク質は周辺質内で折りたたまれる。３つの補助的タンパク質(ＳｅｃＤ、ＳｅｃＦおよびＹａｊＣ)が、分泌には必須ではないが、多くの条件下、特に低温で分泌を１０倍まで刺激する複合体を形成する。
【００３４】
周辺質に輸送された、すなわち、II型分泌系を介したタンパク質はまたしばしばさらなる段階で細胞外培地にも排出される。機構は一般にオートトランスポーター、２パートナー分泌系、メインターミナルブランチ系または線毛アッシャーポリンを介する。
【００３５】
グラム陰性細菌における１２の既知分泌系中、８つは、発現タンパク質の一部である標的化シグナルペプチドを利用することが知られる。これらのシグナルペプチドは、細胞がそのタンパク質を適切にその適切な目的地に向けるように、分泌系のタンパク質と相互作用する。これらの８つのシグナルペプチドベースの分泌系中５つがＳｅｃ系を利用するものである。これらの５つは、Ｓｅｃ依存性原形質膜移行に関与すると言われ、その中で操作可能なそのシグナルペプチドは、ある場合、Ｓｅｃ依存性分泌シグナルと称される。適切な分泌シグナルを開発する問題の一つは、シグナルが適切に発現され、発現タンパク質から開裂されることを確実にすることである。
【００３６】
ｓｅｃ経路のシグナルペプチドは、一般に(ｉ)正荷電ｎ領域、(ii)疎水性領域および(iii)非荷電であるが、極性のｃ領域の３つのドメインを有する。シグナルペプチダーゼの開裂部位はｃ領域に位置する。しかしながら、シグナル配列の保存および長さの程度ならびに開裂部位の位置は、しばしばタンパク質間で変わる。
【００３７】
Ｓｅｃ依存性タンパク質排出の特徴は、排出されたタンパク質における短く(約３０アミノ酸)、主に疎水性のアミノ末端シグナル配列の存在である。シグナル配列はタンパク質排出を助け、排出されたタンパク質が周辺質に到達したとき、周辺シグナルペプチダーゼにより開裂される。典型的Ｎ末端Ｓｅｃシグナルペプチドは、少なくとも一つのアルギニンまたはリシン残基を有するＮ−ドメイン、続く疎水性残基のストレッチを含むドメインおよびシグナルペプチダーゼの開裂部位を含むＣ−ドメインを含む。
【００３８】
タンパク質を細胞質外に向ける試みにおいて、トランスジェニックタンパク質構築物が目的のタンパク質および分泌シグナルの両方を含む融合タンパク質として操作されている細菌タンパク質産生系が開発されている。
【００３９】
シュードモナス・フルオレッセンス(P. fluorescens)は、多様なタンパク質の産生のための改良されたプラットフォームであることが示されており、数種の効率的分泌シグナルがこの細菌から同定されている(引用によりその全体を本明細書に包含させる米国特許７,９８５,５６４、「Expression Systems with Sec-system Secretion」参照)。シュードモナス・フルオレッセンスは、一般に他の細菌発現系で見られるより高いレベルで正確に形成された形態の外来性タンパク質を産生し、細胞外の周辺質に高レベルでこれらタンパク質を輸送し、完全に形成された組み換えタンパク質の回収を増加させる。それ故に、ある実施態様において、分泌シグナルに操作可能に結合された標的タンパク質を発現させることにより、シュードモナス・フルオレッセンス細胞で外来性タンパク質を産生する方法が提供される。
【００４０】
本発明の分泌シグナル配列は、ある場合、シュードモナスで有用である。シュードモナス系は、他の細菌発現系と比較して、ポリペプチドおよび酵素の商業的発現のために有利である。特に、シュードモナス・フルオレッセンスは、有利な発現系として同定されている。シュードモナス・フルオレッセンスは、土壌、水および植物表面環境にコロニー形成する、通常の非病原性腐生菌群を含む。シュードモナス・フルオレッセンス由来の市販酵素は、環境汚染を減らすための洗剤添加剤として、また立体選択的加水分解用に使用されている。シュードモナス・フルオレッセンスはまた病原体を制御するために農業用にも使用されている。米国特許４,６９５,４６２、「Cellular Encapsulation of Biological Pesticides」は、シュードモナス・フルオレッセンスにおける組み換え細菌タンパク質の発現を記載する。
【００４１】
組成物
分泌リーダー
ここでのある実施態様において、ペプチドが提供され、該ペプチドは、所望のタンパク質またはポリペプチドをグラム陰性細菌の周辺質または細胞外空間に向けるのに有用な新規分泌リーダーまたはシグナルである。ある実施態様において、ペプチドは、ＡｎｓＢ、８４８４または５１９３分泌シグナルまたはそのフラグメントもしくはバリアントであるか、またはそれに実質的に相同であるアミノ酸配列を有する。本発明はまた、標的化目的のタンパク質またはポリペプチドに融合した本発明の分泌シグナルペプチドを含むポリペプチドならびに分泌シグナルペプチドおよび目的のポリペプチドを含む融合タンパク質を産生する発現構築物も提供する。ある実施態様において、分泌シグナルペプチドは目的のポリペプチドに操作可能に結合される。
【００４２】
ある実施態様において、分泌シグナル配列は、配列番号１〜３の何れかに示す分泌シグナルペプチドと相同もしくは実質的に相同であるかまたは配列番号４〜６の何れかに示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる。他の実施態様において、分泌シグナル配列は、配列番号１の少なくともアミノ酸２〜２５、配列番号２の少なくともアミノ酸２〜１８または配列番号３の少なくともアミノ酸２〜２９を含む。さらに他の実施態様において、分泌シグナル配列は、アミノ末端から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸が切断されているが、生物学的活性、すなわち、分泌シグナル活性を保持する、配列番号１〜３の一つのフラグメントを含む。
【００４３】
ある実施態様において、ペプチドのアミノ酸配列は、ある元のペプチドのバリアントであり、ここで、該バリアントの配列は、元のペプチドのアミノ酸残基の最大または約３０％を他のアミノ酸残基で置き換えることにより得られ、これは最大約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％を含むが、該バリアントが元のペプチドの所望の機能を保持することを条件とする。実質的相同性を有するバリアントアミノ酸は、元のペプチドと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または少なくとも約９９％相同である。バリアントアミノ酸配列は、１またはそれ以上、１〜５、１〜１０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせを含む、配列番号１〜３の何れかの１以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、切断および挿入を含む種々の方法により得ることができる。
【００４４】
「実質的に相同」、「実質的に同一」または「実質的に類似」は、ここに記載するまたは当分野で知られる適当なアラインメントプログラムを使用して、標準的パラメータを使用して、対照配列と比較したとき約もしくは少なくとも約６０％、約もしくは少なくとも約６５％、約もしくは少なくとも約７０％、約もしくは少なくとも約７５％、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約８５％、約もしくは少なくとも約８１％、約もしくは少なくとも約８２％、約もしくは少なくとも約８３％、約もしくは少なくとも約８４％、約もしくは少なくとも約８５％、約もしくは少なくとも約８６％、約もしくは少なくとも約８７％、約もしくは少なくとも約８８％、約もしくは少なくとも約８９％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約９１％、約もしくは少なくとも約９２％、約もしくは少なくとも約９３％、約もしくは少なくとも約９４％、約もしくは少なくとも約９５％、約もしくは少なくとも約９６％、約もしくは少なくとも約９７％、約もしくは少なくとも約９８％または約もしくは少なくとも約９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸またはヌクレオチド配列を意図する。当業者は、コドンの縮退、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決めなどを考慮して、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、これらの値が適切に調整され得ることを認識する。
【００４５】
ある実施態様において、本発明で使用するペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、「非必須」アミノ酸残基の１以上の修飾を含み得る。この意味で、「非必須」アミノ酸残基は、元のペプチド、タンパク質またはポリペプチドの活性(例えば、アゴニスト活性)を消失または実質的に減少させることなく、新規アミノ酸配列で改変、例えば、欠失、置換または誘導体化され得る残基である(「アナログ」または「対照」ペプチド、タンパク質またはポリペプチドとも称する)。ある実施態様において、ペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、「必須」アミノ酸残基の１以上の修飾を含み得る。本明細書において、「必須」アミノ酸残基は、新規アミノ酸配列で改変、例えば、欠失、置換または誘導体化させたとき、対照ペプチド、タンパク質またはポリペプチドの活性が実質的に減少または消失する残基である。必須アミノ酸残基が改変されるような実施態様において、修飾ペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、元のペプチド、タンパク質またはポリペプチドの活性を有し得る。置換、挿入および欠失はＮ末端またはＣ末端であってよくまたはペプチド、タンパク質またはポリペプチドの内部部分であってよい。例として、ペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、ペプチド、タンパク質またはポリペプチド分子全体にわたって、連続した方法でまたは間隔を開けて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の置換を含み得る。ペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、単独でまたは該置換と組み合わせて、同様にペプチド、タンパク質またはポリペプチド分子全体にわたって、連続した方法でまたは間隔を開けて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の挿入を含み得る。ペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、単独でまたは該置換および／または挿入と組み合わせて、同様にペプチド、タンパク質またはポリペプチド分子全体にわたって、連続した方法でまたは間隔を開けて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の欠失も含み得る。ペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、単独でまたは該置換、挿入および／または欠失と組み合わせて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸付加も含み得る。
【００４６】
置換は、保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似側鎖または物理化学的特性(例えば、静電気、水素結合、等比体積、疎水性特長)を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。アミノ酸は天然に存在するものでも非天然でもよい。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で知られる。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、メチオニン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン)、β−分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。置換は非保存的変化も含み得る。
【００４７】
ここに包含されるバリアントペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、生物学的に活性である、すなわち、元のペプチド、タンパク質またはポリペプチドの所望の生物学的活性を持ち続けている；例えば、バリアント分泌リーダーペプチドは、分泌シグナル活性を保持する。「活性を保持」は、バリアントが、元のペプチド、タンパク質またはポリペプチドの活性、例えば、分泌シグナル活性の約もしくは少なくとも約３０％、約もしくは少なくとも約３５％、約もしくは少なくとも約４０％、約もしくは少なくとも約４５％、約もしくは少なくとも約５０％、約もしくは少なくとも約５５％、約もしくは少なくとも約６０％、約もしくは少なくとも約６５％、約もしくは少なくとも約７０％、約もしくは少なくとも約７５％、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約８５％、約もしくは少なくとも約８１％、約もしくは少なくとも約８２％、約もしくは少なくとも約８３％、約もしくは少なくとも約８４％、約もしくは少なくとも約８５％、約もしくは少なくとも約８６％、約もしくは少なくとも約８７％、約もしくは少なくとも約８８％、約もしくは少なくとも約８９％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約９１％、約もしくは少なくとも約９２％、約もしくは少なくとも約９３％、約もしくは少なくとも約９４％、約もしくは少なくとも約９５％、約もしくは少なくとも約９６％、約もしくは少なくとも約９７％、約もしくは少なくとも約９８％または約もしくは少なくとも約９９％、約もしくは少なくとも約１００％、約もしくは少なくとも約１１０％、約もしくは少なくとも約１２５％、約もしくは少なくとも約１５０％、約もしくは少なくとも約２００％またはそれ以上を有することを意図する。
【００４８】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、目的のタンパク質またはポリペプチドをグラム陰性細菌の周辺質または細胞外空間に標的化するのに有用な新規分泌シグナルをコードする配列を有する核酸も含む。ある実施態様において、単離ポリヌクレオチドは、ＡｎｓＢ、８４８４または５１９３分泌シグナルペプチドに実質的に相同なペプチド配列をコードする。他の実施態様において、本発明は、配列番号１の少なくともアミノ酸２〜２５、配列番号２の少なくともアミノ酸２〜１８または配列番号２の少なくともアミノ酸２〜２９に実質的に相同であるペプチド配列をコードする核酸を提供するかまたは配列番号４〜６に示すヌクレオチド配列の何れかと実質的に相同である核酸を提供し、その生物学的に活性なバリアントおよびフラグメントを含む。他の実施態様において、核酸配列は、配列番号４〜６に示す核酸配列の何れかと、約もしくは少なくとも約６０％、約もしくは少なくとも約６５％、約もしくは少なくとも約７０％、約もしくは少なくとも約７５％、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約８５％、約もしくは少なくとも約８１％、約もしくは少なくとも約８２％、約もしくは少なくとも約８３％、約もしくは少なくとも約８４％、約もしくは少なくとも約８５％、約もしくは少なくとも約８６％、約もしくは少なくとも約８７％、約もしくは少なくとも約８８％、約もしくは少なくとも約８９％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約９１％、約もしくは少なくとも約９２％、約もしくは少なくとも約９３％、約もしくは少なくとも約９４％、約もしくは少なくとも約９５％、約もしくは少なくとも約９６％、約もしくは少なくとも約９７％、約もしくは少なくとも約９８％または約もしくは少なくとも約９９％またはそれ以上同一である。
【００４９】
ある実施態様において、ここでの分泌シグナルペプチドは、配列番号４〜６に示すヌクレオチド配列の何れかと実質的に相同であるヌクレオチド配列によりコードされる。本発明の分泌シグナル配列と実質的同一性を有する対応する分泌シグナルペプチド配列は、当分野で知られる任意の適切な方法、例えば、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション法を使用して、または文献に記載のとおり同定され得る。例えば、Sambrook J., and Russell, D.W., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; and Innis, et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications; Academic Press, NY参照。バリアントヌクレオチド配列は、例えば、部位特異的変異誘導を使用して産生されている、合成的に誘導されたヌクレオチド配列を含み得る。ある実施態様において、変異誘導配列は、なおここに開示する分泌シグナルペプチドをコードする。バリアント分泌シグナルペプチドは生物学的に活性であり、すなわち、天然タンパク質の所望の生物学的活性を持ち続け、すなわち、分泌シグナル伝達活性を保持する。「活性を保持」により、バリアントが元の分泌シグナルペプチドの活性の約３０％、約もしくは少なくとも約３５％、約もしくは少なくとも約４０％、約もしくは少なくとも約４５％、約もしくは少なくとも約５０％、約もしくは少なくとも約５５％、約もしくは少なくとも約６０％、約もしくは少なくとも約６５％、約もしくは少なくとも約７０％、約もしくは少なくとも約７５％、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約８５％、約もしくは少なくとも約８１％、約もしくは少なくとも約８２％、約もしくは少なくとも約８３％、約もしくは少なくとも約８４％、約もしくは少なくとも約８５％、約もしくは少なくとも約８６％、約もしくは少なくとも約８７％、約もしくは少なくとも約８８％、約もしくは少なくとも約８９％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約９１％、約もしくは少なくとも約９２％、約もしくは少なくとも約９３％、約もしくは少なくとも約９４％、約もしくは少なくとも約９５％、約もしくは少なくとも約９６％、約もしくは少なくとも約９７％、約もしくは少なくとも約９８％または約もしくは少なくとも約９９％、約もしくは少なくとも約１００％、約もしくは少なくとも約１１０％、約もしくは少なくとも約１２５％、約もしくは少なくとも約１５０％、約もしくは少なくとも約２００％またはそれ以上を有することを意味する。ペプチド、タンパク質またはポリペプチド活性、例えば、分泌シグナル活性を測定するための任意の適切な方法を使用し得る。このような方法は当分野で周知であり、例をここに記載する。
【００５０】
当業者は、ある場合、変化がここに提供されるヌクレオチド配列に変異によって導入され、それにより分泌シグナルペプチドの生物学的活性を変えることなく、コードされる分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を変化させることをさらに認識する。それ故に、バリアント単離核酸分子は、しばしば１以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるタンパク質に導入されるように、ここに開示する対応するヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより作製される。変異は、任意の標準的技術、例えば、部位特異的変異誘導およびＰＣＲ介在変異誘導により導入され得る。
【００５１】
核酸およびアミノ酸相同性
核酸およびアミノ酸配列相同性は、ここに記載のものを含むが、それらに限定されない当分野で知られる任意の適当な方法により決定される。
【００５２】
例えば、類似配列のアラインメントおよびサーチは、米国国立生物工学情報センター(NCBI, Bethesda, MD)のプログラム、MegaBLASTを使用して実施され得る。パーセント同一性が、アミノ酸配列について、例えば７０％に設定またはヌクレオチド配列について、例えば、９０％に設定するためのオプションと共にこのプログラムを使用して、クエリー配列に対して７０％または９０％またはそれ以上の配列同一性を有する配列が同定される。当分野で知られる他のソフトウエアも、類似配列、例えば、ここでの分泌シグナル配列を含む情報ストリングと少なくとも７０％または９０％同一である配列のアラインおよび／またはサーチのために利用可能である。例えば、クエリー配列と少なくとも７０％または９０％同一である配列を同定する比較のための配列アラインメントは、しばしば、例えば、GCG Sequence Analysis Software Package(Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705から入手可能)で利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡプログラムの使用により、その中で特定されたデフォルトパラメータと、所望のパーセンテージに設定された配列同一性の程度を用いて実施される。また、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬプログラム(Intelligenetics, Mountain View, Cal.からのPC/Gene software packageで利用可能)が使用され得る。
【００５３】
これらおよび他の配列アラインメント方法は当分野で周知であり、手動アラインメント、目視検査または上記プログラムにより具体化されるいずれかのような、配列アラインメントアルゴリズムの手動もしくは自動適用により実施され得る。種々の有用なアルゴリズムは、例えば、W. R. Pearson & D. J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (April 1988)に記載の類似性サーチ方法；T. F. Smith & M. S. Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482-89 (1981)およびJ. Molec. Biol. 147:195-97 (1981)に記載の局所相同性方法；S. B. Needleman & C. D. Wunsch, J. Molec. Biol. 48(3):443-53 (March 1970)に記載の相同性アラインメント方法；および例えば、W. R. Pearson, Genomics 11(3):635-50 (November 1991); W. R. Pearson, in Methods Molec. Biol. 24:307-31および25:365-89 (1994);およびD. G. Higgins & P. M. Sharp, Comp. Appl'ns in Biosci. 5:151-53 (1989)およびGene 73(1):237-44 (15 Dec. 1988)に記載の種々の方法を含む。
【００５４】
上掲のNeedlemanおよびWunsch (1970)のアルゴリズムを使用するGAP Version 10を使用して、次のパラメータを使用して配列同一性または類似性を決定できる：ＧＡＰ加重５０および長さ加重３およびnwsgapdna.cmpスコアリングマトリクスを使用するヌクレオチド配列についての％同一性および％類似性；ＧＡＰ加重８および長さ加重２およびBLOSUM62スコアリングプログラムを使用するアミノ酸配列についての％同一性または％類似性。同等のまたは類似のプログラムも、当業者に理解されるとおり使用され得る。例えば、任意の問題の２配列について、GAP Version 10により作製された対応するアラインメントと比較したとき、同一ヌクレオチド残基マッチおよび同一パーセント配列同一性を有するアラインメントを作製する、配列比較プログラムが使用され得る。ある実施態様において、配列比較を、クエリー配列もしくは対象配列または両者の全体にわたり実施する。
【００５５】
ハイブリダイゼーション条件
他の態様において、ＡｎｓＢ、８４８４または５１９３分泌シグナルペプチドに実質的に類似する配列を有するペプチドをコードする配列の単離核酸とハイブリダイズする核酸が提供される。ある実施態様において、ハイブリダイズする核酸は、高ストリンジェンシー条件下で結合する。種々の実施態様において、ハイブリダイゼーションは、分泌シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の実質的に全長にわたり、例えば、配列番号４〜６の１以上の実質的に全長にわたり起こる。核酸分子は、核酸分子が配列番号４〜６の１以上の全長の少なくとも８０％、全長の少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％にわたりハイブリダイズするとき、ここに開示する分泌シグナルコード化ヌクレオチド配列の「実質的に全長」とハイブリダイズする。特に断らない限り、「実質的に全長」は、分泌シグナルコード化ヌクレオチド配列の全長の少なくとも８０％をいい、ここで、長さは、連続的ヌクレオチドで計測する(例えば、配列番号４の少なくとも６０連続的ヌクレオチド、配列番号５の少なくとも４３連続的ヌクレオチドまたは配列番号６の少なくとも４３連続的ヌクレオチドなどとハイブリダイズ)。
【００５６】
ハイブリダイゼーション方法において、ある場合、分泌シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の全てまたは一部を使用して、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングする。このようなｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーを構築する方法は当分野で一般に知られ、Sambrook and Russell, 2001に記載される。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメントまたは他のオリゴヌクレオチドであってよく、３２Ｐなどの検出可能基または任意の他の検出可能マーカー、例えば他の放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子で標識し得る。ハイブリダイゼーションのためのプローブは、しばしばここに開示する既知分泌シグナルペプチドコード化ヌクレオチド配列に基づき合成オリゴヌクレオチドを標識することにより製造され得る。ヌクレオチド配列またはコードされたアミノ酸配列における保存ヌクレオチドまたはアミノ酸残基に基づき設計された縮重プライマーがさらに使用されることがある。プローブは、一般にストリンジェントな条件下、ここでの分泌シグナルペプチドコード化ヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくはバリアントの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０またそれ以上の連続ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。ハイブリダイゼーションのためのプローブを製造する方法は、一般に当分野で知られ、引用により本明細書に包含させるSambrook and Russell, 2001に開示される。
【００５７】
ハイブリダイゼーション技術において、既知ヌクレオチド配列の全てまたは一部を、選択生物からのクローン化ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメントの集団(すなわち、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー)に存在する他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用する。ハイブリダイゼーションプローブはゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメントまたは他のオリゴヌクレオチドであってよく、検出可能基、例えば３２Ｐまたは任意の他の検出可能マーカーで標識し得る。それ故に、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、しばしばここでの分泌シグナルペプチドコード化ヌクレオチド配列に基づき合成オリゴヌクレオチドを標識することにより製造される。ハイブリダイゼーションのためのプローブの製造ならびにｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの構築の方法は当分野で一般に知られ、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New Yorkに開示される。
【００５８】
ここに開示する全分泌シグナルペプチドコード化ヌクレオチド配列またはその１以上の部分を、対応するヌクレオチド配列および分泌シグナルペプチドコード化メッセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイズできるプローブとして使用できる。これらのプローブは、独特であり、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長または少なくとも約１５ヌクレオチド長である配列を含み得る。このようなプローブを、ＰＣＲによる選択生物からの対応する分泌シグナルペプチドコード化ヌクレオチド配列の増幅に使用し得る。この技術を、所望の生物からさらなるコード配列を単離するためのまたは生物におけるコード配列の存在を決定するための診断アッセイとして使用し得る。ハイブリダイゼーション技術は、播種ＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを含む(プラークまたはコロニー；例えば、Sambrook et al., 1989参照)。
【００５９】
このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下実施され得る。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、意図される条件であり、その条件下で、プローブが他の配列より検出できるほど大きな程度(例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍)でその標的配列にハイブリダイズする。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、違う状況では異なる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄条件の制御により、該プローブに１００％相補性である標的配列がしばしば同定される(相同プロービング)。あるいは、ストリンジェンシー条件は、低い類似度が検出されるように、配列の一部不整合を可能とするように調節されることがある(異種プロービング)。一般に、プローブは約１０００ヌクレオチド長未満、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。
【００６０】
一般に、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７.０〜８.３で塩濃度が約１.５Ｍ  Ｎａイオン未満、一般に約０.０１〜１.０Ｍ  Ｎａイオン濃度(または他の塩)であり、温度が少なくとも約６０℃である。ある実施態様において、温度は約６８℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。低ストリンジェンシー条件は、例えば、３７℃での３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)の緩衝液でのハイブリダイゼーションおよび５０〜５５℃で１×〜２×  ＳＳＣ(２０×  ＳＳＣ＝３.０Ｍ  ＮａＣｌ／０.３Ｍクエン酸三ナトリウム)での洗浄を含む。中ストリンジェンシー条件の例は、３７℃で４０〜４５％ホルムアミド、１.０Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションおよび５５〜６０℃で０.５×〜１×  ＳＳＣでの洗浄を含む。高ストリンジェンシー条件の例は、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションおよび６０〜６８℃で０.１×  ＳＳＣでの洗浄を含む。所望により、洗浄緩衝液は約０.１％〜約１％ＳＤＳを含む。ハイブリダイゼーション時間は、一般に約２４時間未満であり、一般に約４〜約１２時間である。
【００６１】
特異性は、一般にハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、ＴｍはしばしばMeinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284の式から近似され：Ｔｍ＝８１.５℃＋１６.６(ｌｏｇ  Ｍ)＋０.４１(％ＧＣ)−０.６１(％ホルム)−５００／Ｌ(式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ホルムはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは塩基対中のハイブリッドの長さである)。Ｔｍ(thermal melting point)は、相補性標的配列の５０％が完全に整合しているプローブとハイブリダイズする温度(既定のイオン強度およびｐＨ下で)である。Ｔｍは、不整合１％毎に約１℃下がり、それ故に、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、所望の同一性の配列とハイブリダイズするために調節されることがある。例えば、＞９０％同一性を有する配列が探索されるならば、Ｔｍはしばしば１０℃下げられる。一般に、ストリンジェントな条件は、既定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列およびその相補体の熱的融点(Ｔｍ)より約５℃低いように選択される。しかしながら、厳格にストリンジェントな条件は、しばしば熱的融点(Ｔｍ)より１℃、２℃、３℃または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し；中程度にストリンジェントな条件は、しばしば熱的融点(Ｔｍ)より６℃、７℃、８℃、９℃または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し；低ストリンジェンシー条件は、しばしば熱的融点(Ｔｍ)より１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用する。該式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物ならびに所望のＴｍを使用して、当業者はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄溶液の変化が本質的に記載されていることを理解する。所望の不整合の程度が４５℃(水溶液)または３２℃(ホルムアミド溶液)未満のＴｍをもたらすならば、より高い温度が使用されるようにＳＳＣ濃度を上げるのが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションのためのガイドは、Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, New York; and Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New Yorkに見ることができる。Sambrook et al., 1989参照。
【００６２】
コドン最適化
ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、目的の株におけるコドン使用について最適化されている構築物からの目的の組み換えタンパク質またはポリペプチドの発現を含む。ある実施態様において、株は、シュードモナス宿主細胞、例えば、シュードモナス・フルオレッセンスである。細菌宿主における発現を改善するためのコドンを最適化する方法は当分野で知られ、文献に記載されている。例えば、シュードモナス宿主株における発現のためのコドンの最適化は、例えば、引用により全体として本明細書に包含させる米国特許出願公開２００７／０２９２９１８、「Codon Optimization Method」に記載されている。
【００６３】
異種発現系において、最適化段階は、外来タンパク質を産生する宿主の能力を改善し得る。タンパク質発現は、転写、ｍＲＮＡ形成ならびに翻訳の安定性および開始に影響するものを含む、宿主因子により制御される。ポリヌクレオチド最適化段階は、宿主が外来タンパク質を製造する能力を改善する段階および研究者が発現構築物を効率的に設計するのを助ける段階を含み得る。最適化戦略は、例えば、翻訳開始領域の修飾、ｍＲＮＡ構造要素改変および種々のコドンバイアスの使用を含み得る。細菌宿主における異種タンパク質の発現を改善するために核酸配列を最適化する方法は当分野で知られ、文献に記載される。例えば、シュードモナス宿主株における発現のためのコドン最適化は、例えば、引用により全体として本明細書に包含させる米国特許出願公開２００７／０２９２９１８、「Codon Optimization Method」に記載されている。
【００６４】
最適化は、異種遺伝子の多数の配列特性に取り組む。具体例として、希少コドン誘導翻訳停止は、しばしば異種タンパク質発現減少をもたらす。希少コドン誘導翻訳停止は、目的のポリヌクレオチドにおける、利用可能なｔＲＮＡプールにおける希少性により、宿主生物においてほとんど使用されず、タンパク質翻訳に負の影響を有し得る、コドンの存在を含む。宿主生物における最適翻訳を改善するある方法は、希少宿主コドンを合成ポリヌクレオチド配列から除去する、コドン最適化の実施を含む。
【００６５】
交互の翻訳開始も、異種タンパク質発現を減少させることがある。交互の翻訳開始は、不注意にリボゾーム結合部位(ＲＢＳ)として機能できるモチーフを含む合成ポリヌクレオチド配列を含む。これらの部位は、ある場合、遺伝子内部部位からの切断タンパク質の翻訳開始をもたらす。しばしば精製中に除去することが困難である切断タンパク質が産生される可能性を低減するある方法は、最適化ポリヌクレオチド配列からの推定内部ＲＢＳ配列の除去を含む。
【００６６】
反復誘導ポリメラーゼスリッページは、しばしば異種タンパク質発現を低減させる。反復誘導ポリメラーゼスリッページは、フレームシフト変異をもたらすこともあるＤＮＡポリメラーゼのスリッページまたはスタッターを引き起こすことが示されている、ヌクレオチド配列反復を伴う。このような反復はまたしばしばＲＮＡポリメラーゼのスリッページも引き起こす。高Ｇ＋Ｃ含量バイアスを有する生物において、ＧまたはＣヌクレオチド反復からなる高度の反復の程度が存在する。それ故に、ＲＮＡポリメラーゼスリッページを誘導する可能性を低減する一つの方法は、ＧまたはＣヌクレオチドの伸長反復を変えることを含む。
【００６７】
妨害二次構造も、異種タンパク質発現の減少をもたらすことがある。二次構造は、しばしばＲＢＳ配列または開始コドンを隔離し、タンパク質発現の減少と相関している。ステムループ構造もしばしば転写休止および減衰に関与する。最適化ポリヌクレオチド配列は、通常、転写および翻訳の改善を可能とするために、ヌクレオチド配列のＲＢＳおよび遺伝子コーディング領域に最小二次構造を含む。
【００６８】
異種タンパク質発現に影響することがある他の特性は、制限部位の存在である。転写単位の宿主発現ベクターへのその後のサブクローニングを妨害する制限部位の除去により、ポリヌクレオチド配列は最適化される。
【００６９】
例えば、最適化過程は、しばしば宿主により異種性に発現される所望のアミノ酸配列の同定から始まる。該アミノ酸配列から、候補ポリヌクレオチドまたはＤＮＡが設計される。合成ＤＮＡ配列設計中、コドン使用頻度は、しばしば宿主発現生物のコドン使用と比較され、希少宿主コドンは合成配列から除去される。さらに、合成候補ＤＮＡ配列は、望ましくない酵素制限部位を除去し、何らかの所望のシグナル配列、リンカーまたは非翻訳領域を付加もしくは除去するために、修飾されることがある。合成ＤＮＡ配列は、しばしばＧ／Ｃ反復およびステムループ構造などの翻訳過程を妨害し得る二次構造の存在について分析される。候補ＤＮＡ配列が合成される前に、最適化配列設計は、しばしば配列が所望のアミノ酸配列を正確にコードすることを検証するために検査される。最後に、候補ＤＮＡ配列は、当分野で知られるもののようなＤＮＡ合成技術を使用して、合成される。
【００７０】
他の実施態様において、シュードモナス・フルオレッセンスなどの宿主生物における一般的コドン使用は、しばしば異種ポリヌクレオチド配列発現の最適化のために利用される。宿主発現系において特定のアミノ酸について好ましいとみなされることがほとんどないコドンのパーセンテージおよび分布が評価される。５％および１０％使用の値が、しばしば希少コドンの決定のためのカットオフ値として使用される。例えば、表２に挙げるコドンの出現計算値は、シュードモナス・フルオレッセンスＭＢ２１４ゲノムで５％未満であり、シュードモナス・フルオレッセンス宿主において発現される最適化遺伝子で一般に避けられる。
【表２】
2021501157.tif 000004
【００７１】
本発明は、使用されるシュードモナス宿主細胞での発現に最適化されているあらゆる配列を含み、目的のコード配列のあらゆるポリペプチドまたはタンパク質の使用を考慮する。使用が考慮される配列は、シュードモナス宿主細胞において出現が５％未満のコドン、シュードモナス宿主細胞において出現が１０％未満のコドン、希少コドン誘導翻訳停止、推定内部ＲＢＳ配列、ＧまたはＣヌクレオチドの反復伸長、妨害二次構造、制限部位またはこれらの組み合わせを除去するための最適化を含むが、これらに限定されない、任意の所望の程度までしばしば最適化される。
【００７２】
さらに、ここに提供する方法の実施に有用な任意の分泌リーダーのアミノ酸配列は、任意の適切な核酸配列によりコードされる。大腸菌での発現のためのコドン最適化は、例えば、Welch, et al., 2009, PLoS One, “Design Parameters to Control Synthetic Gene Expression in Escherichia coli,” 4(9): e7002, Ghane, et al., 2008,  Krishna R. et al., (2008) Mol Biotechnology “Optimization of the AT-content of Codons Immediately Downstream of the Initiation Codon and Evaluation of Culture Conditions for High-level Expression of Recombinant Human G-CSF in Escherichia coli,” 38:221-232に記載されている。
【００７３】
発現系
本発明の方法は、ある場合、ＡｎｓＢ、８４８４または５１９３分泌シグナル配列からなる群から選択される分泌シグナルペプチドまたは配列番号１〜３としてここに開示される分泌シグナルペプチド配列に実質的に相同である配列に操作可能に結合される目的のタンパク質またはポリペプチドを含むポリペプチドの発現を含む。ある実施態様において、分泌シグナルペプチド配列は、シュードモナス宿主細胞における発現構築物から、配列番号４〜６として示されるヌクレオチド配列によりコードされる。発現構築物は、ある場合、プラスミドである。ある実施態様において、目的の配列のポリペプチドまたはタンパク質をコードするプラスミドは選択マーカーを含み、該プラスミドを維持する宿主細胞は、選択的条件下で増殖される。ある実施態様において、プラスミドは選択マーカーを含まない。ある実施態様において、発現構築物は宿主細胞ゲノムに統合される。
【００７４】
シュードモナス宿主株を含む宿主株における本発明の方法において有用な制御配列(例えば、プロモーター、分泌リーダーおよびリボゾーム結合部位)を含む、異種タンパク質を発現する方法は、例えば、「Bacterial leader sequences for increased expression」である米国特許７,６１８,７９９、「Expression systems with Sec-system secretion」である米国特許７,９８５,５６４、いずれも「Method for Rapidly Screening Microbial Hosts to Identify Certain Strains with Improved Yield and/or Quality in the Expression of Heterologous Proteins」なる表題の米国特許９,３９４,５７１および９,５８０,７１９、「Expression of Mammalian Proteins in Pseudomonas fluorescens」である米国特許９,４５３,２５１、「Process for Improved Protein Expression by Strain Engineering」である米国特許８,６０３,８２４および「High Level Expression of Recombinant Toxin Proteins」である米国特許８,５３０,１７１に記載され、各々を、その全体として引用により本明細書に包含させる。ある実施態様において、本発明の状況において使用する分泌リーダーは、米国特許７、６１８,７９９、７,９８５,５６４、９,３９４,５７１、９,５８０,７１９、９,４５３,２５１、８,６０３,８２４および８,５３０,１７１の何れかに開示の分泌リーダーである。これらの特許はまた異種タンパク質発現を増加させるために、折り畳みモジュレーターを過発現するように操作されているまたはプロテアーゼ変異が導入されている、本発明の方法の実施に有用な細菌宿主株も記載されている。
【００７５】
ある実施態様において、本発明の方法において使用する発現株は、表１３に挙げる、実施例４に記載の任意の発現株である。ある実施態様において、本発明の方法において使用する発現株は、表１３に挙げる、実施例４に記載する発現株のバックグラウンド表現型を有する微生物発現株である。ある実施態様において、本発明の方法において使用する発現株は、表１３に挙げる、実施例４に記載する発現株のバックグラウンド表現型を有する微生物発現株であり、ここで、該株は、表１３に挙げる、各分泌リーダーと融合した組み換えアスパラギナーゼを発現する。ある実施態様において、本発明の方法において使用する発現株は、表１３に挙げる、実施例４に記載の発現株ＳＴＲ５７８６４、ＳＴＲ５７８６５、ＳＴＲ５７８６６、ＳＴＲ５７８６０、ＳＴＲ５７８６１、ＳＴＲ５７８６２、ＳＴＲ５７８６３のバックグラウンド表現型を有する微生物発現株であるが、該発現株は、折り畳みモジュレーターオーバーエクスプレッサーではない。ある実施態様において、本発明の方法において使用する発現株は、マンニトール非存在下で培養された、表１３に挙げる、実施例４に記載する発現株ＳＴＲ５７８６４、ＳＴＲ５７８６５、ＳＴＲ５７８６６、ＳＴＲ５７８６０、ＳＴＲ５７８６１、ＳＴＲ５７８６２、ＳＴＲ５７８６３のバックグラウンド表現型を有する微生物発現株である。
【００７６】
プロモーター
本発明の方法により使用されるプロモーターは、構成的プロモーターまたは制御プロモーターであり得る。有用な制御プロモーターの一般的な例は、ｌａｃプロモーター(すなわちｌａｃＺプロモーター)由来のファミリーのもの、特にDeBoerの米国特許４,５５１,４３３に記載のｔａｃおよびｔｒｃプロモーターならびにＰｔａｃ１６、Ｐｔａｃ１７、ＰｔａｃII、ＰｌａｃＵＶ５およびＴ７ｌａｃプロモーターを含む。ある実施態様において、プロモーターは宿主細胞生物に由来しない。ある実施態様において、プロモーターは大腸菌生物由来である。
【００７７】
誘導性プロモーター配列は、本発明の方法により目的のポリペプチドまたはタンパク質の発現を制御するために使用される。ある実施態様において、本発明の方法で有用な誘導性プロモーターは、ｌａｃプロモーター(すなわちｌａｃＺプロモーター)由来のファミリーのもの、特にDeBoerの米国特許４,５５１,４３３に記載のｔａｃおよびｔｒｃプロモーターならびにＰｔａｃ１６、Ｐｔａｃ１７、ＰｔａｃII、ＰｌａｃＵＶ５およびＴ７ｌａｃプロモーターを含む。ある実施態様において、プロモーターは宿主細胞生物に由来しない。ある実施態様において、プロモーターは大腸菌生物由来である。ある実施態様において、ｌａｃプロモーターは、プラスミドからの目的のポリペプチドまたはタンパク質の発現制御に使用される。ｌａｃプロモーター誘導体またはファミリーメンバー、例えば、ｔａｃプロモーターの場合、インデューサーはＩＰＴＧ(イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、別名「イソプロピルチオガラクトシド」)である。ある実施態様において、ＩＰＴＧを培養物に加えて、シュードモナス宿主細胞におけるｌａｃプロモーターから目的のポリペプチドまたはタンパク質の発現を誘導する。
【００７８】
本発明の方法による発現系で有用な非ｌａｃ型プロモーターの一般的な例は、例えば、表３に挙げるものを含む。
【表３】
2021501157.tif 000005
【００７９】
例えば、全て引用により本明細書に包含させる、J. Sanchez-Romero & V. De Lorenzo (1999) Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (A. Demain & J. Davies, eds.) pp. 460-74 (ASM Press, Washington, D.C.); H. Schweizer (2001) Current Opinion in Biotechnology, 12:439-445; R. Slater & R. Williams (2000 Molecular Biology and Biotechnology (J. Walker & R. Rapley, eds.) pp. 125-54 (The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK); and L.-M. Guzman, et al., 1995, J. Bacteriol. 177(14): 4121-4130参照。選択細菌宿主細胞にとって天然のプロモーターのヌクレオチド配列を有するプロモーター、例えば、シュードモナスアントラニル酸または安息香酸オペロンプロモーター(Ｐａｎｔ、Ｐｂｅｎ)も、目的の組み換えタンパク質またはポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現制御に使用できる。１個を超えるプロモーターが、配列が同じでも、異なっても(例えば、Ｐａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーター(プロモーター間ハイブリッド)またはＰｌａｃ−Ｐｌａｃタンデムプロモーター)、または由来生物が同じでも、異なっても、他のものと共有結合しているタンデムプロモーターも使用し得る。
【００８０】
制御プロモーターは、該プロモーターが一部である遺伝子の転写を制御するために、プロモーター制御タンパク質を使用する。制御プロモーターがここで使用されるとき、対応するプロモーター制御タンパク質はまた本発明の方法による発現系の一部である。プロモーター制御タンパク質の例は、アクティベータータンパク質、例えば、大腸菌カタボライトアクティベータータンパク質、ＭａｌＴタンパク質；ＡｒａＣファミリー転写アクティベーター；リプレッサータンパク質、例えば、大腸菌ＬａｃＩタンパク質；およびデュアル機能制御タンパク質、例えば、大腸菌ＮａｇＣタンパク質を含む。多くの制御されるプロモーター／プロモーター制御タンパク質対は当分野で知られている。ある実施態様において、標的タンパク質および目的の異種タンパク質のための発現構築物は、同じ制御要素の制御下にある。
【００８１】
プロモーター制御タンパク質は、エフェクター化合物、すなわち、該タンパク質が、プロモーターの制御下にある遺伝子の少なくとも一つのＤＮＡ転写制御領域の放出または結合を可能とし、それにより遺伝子の転写を開始させる転写酵素である酵素の作用を許可するかまたは遮断するように、制御タンパク質と可逆的にまたは不可逆的に結合する化合物と相互作用する。エフェクター化合物はインデューサーまたはコリプレッサーとして分類され、これらの化合物は、天然エフェクター化合物および無償性インデューサー化合物を含む。多くの制御されるプロモーター／プロモーター制御タンパク質／エフェクター化合物トリオは当分野で知られている。ある場合、エフェクター化合物は細胞培養または発酵の間中使用されるが、制御プロモーターが使用されるある実施態様において、所望の量または濃度の宿主細胞バイオマス増殖後、適切なエフェクター化合物を培養に加えて、直接的または間接的に目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする所望の遺伝子の発現させる。
【００８２】
ｌａｃファミリープロモーターが利用されるある実施態様において、ｌａｃＩ遺伝子は系に存在することがある。通常構成的に発現される遺伝子であるｌａｃＩ遺伝子は、Ｌａｃリプレッサータンパク質ＬａｃＩタンパク質をコードし、これはｌａｃファミリープロモーターのｌａｃオペレーターに結合する。それ故に、ｌａｃファミリープロモーターが利用されるとき、ｌａｃＩ遺伝子は発現系に含まれ、発現されることもある。
【００８３】
シュードモナスで有用なプロモーター系は、文献、例えば、上にも引用した米国特許出願公開２００８／０２６９０７０に記載されている。
【００８４】
他の制御要素
ある実施態様において、発現ベクターは、最適リボソーム結合配列を含む。目的のタンパク質の翻訳開始領域の改変による翻訳強度調節を使用して、速すぎる翻訳のために主に封入体として蓄積する異種細胞質タンパク質の産生を改善できる。細菌細胞の細胞膜周辺腔への異種タンパク質の分泌は、タンパク質翻訳レベルを最大化するよりは、翻訳速度がタンパク質分泌速度と同期するように、最適化することによって増強され得る。
【００８５】
翻訳開始領域は、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)の直ぐ上流から、開始コドンの約２０ヌクレオチド下流まで伸びる配列として定義されている(引用により全体として本明細書に包含させるMcCarthy et al. (1990) Trends in Genetics 6:78-85)。原核生物において、交互のＲＢＳ配列を利用して、ShineおよびDalgarno(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:1342-1346, 1974)に記載される正統的またはコンセンサスＲＢＳ配列(ＡＧＧＡＧＧ；配列番号１１)を使用する翻訳レベルに対して低下させた翻訳速度を提供することにより、異種タンパク質の翻訳レベルを最適化できる。「翻訳速度」または「翻訳効率」は、細胞内でのタンパク質へのｍＲＮＡ翻訳速度を意図する。大部分の原核生物において、シャイン・ダルガノ配列は、１６ＳリボソームＲＮＡのピリミジン・リッチ領域との相互作用を介して、ｍＲＮＡの開始コドンに対する３０Ｓリボソーム成分の結合および配置を助ける。ＲＢＳ(ここではシャイン・ダルガノ配列とも称する)は、ｍＲＮＡの転写開始の下流かつ翻訳開始の上流、一般に開始コドンの４〜１４ヌクレオチド上流およびより一般に開始コドンの８〜１０ヌクレオチド上流に位置する。翻訳におけるＲＢＳ配列の役割のため、翻訳効率とＲＢＳ配列の効率(または強度)に直接相関がある。
【００８６】
ある実施態様において、ＲＢＳ配列の修飾は、異種タンパク質の翻訳速度低下をもたらす。翻訳速度のこの低下は、産生されるタンパク質グラムあたりまたは宿主タンパク質グラムあたりの適切に形成されたタンパク質またはポリペプチドのレベルの減少に対応し得る。翻訳速度低下はまた組み換えのグラムあたりまたは宿主細胞タンパク質のグラムあたりの産生される回収可能なタンパク質またはポリペプチドのレベルとも相関し得る。翻訳速度低下はまた発現増加、活性増加、溶解度増加または移行増加(例えば、周辺区画へまたは細胞外空間への分泌)の任意の組み合わせとも相関し得る。この実施態様において、用語「増加」は、目的のタンパク質またはポリペプチドが同じ条件下で発現され、ヌクレオチド配列がコードするポリペプチドが古典的ＲＢＳ配列を含むときに、産生され、適切に形成され、可溶性および／または回収可能であるタンパク質またはポリペプチドに対する増加である。同様に、用語「低下」は、遺伝子がコードするタンパク質またはポリペプチドが古典的ＲＢＳ配列を含む、目的のタンパク質またはポリペプチドの翻訳速度に関連する。翻訳速度は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０、少なくとも約７５％またはそれ以上または少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍またはそれ以上低下し得る。
【００８７】
ある実施態様において、ここに記載するＲＢＳ配列バリアントは、高、中または低翻訳効率をもたらすとして分類され得る。ある実施態様において、配列は古典的ＲＢＳ配列の翻訳活性と比較した翻訳活性のレベルによりランク付けされる。高ＲＢＳ配列は、古典的配列の活性の約６０％〜約１００％を有する。中ＲＢＳ配列は、古典的配列の活性の約４０％〜約６０％を有する。低ＲＢＳ配列は、古典的配列の活性の約４０％未満を有する。
【００８８】
ＲＢＳ配列の例は、表４に示す。配列をレポーター遺伝子としてＣＯＰ−ＧＦＰを使用して翻訳強度についてスクリーニングし、共通ＲＢＳ蛍光のパーセンテージによりランク付けする。各ＲＢＳバリアントを、３つの全般的蛍光ランクの一つに入れた：高(「Ｈｉ」−１００％共通ＲＢＳ蛍光)、中(「Ｍｅｄ」−共通ＲＢＳ蛍光の４６〜５１％)および低(「Ｌｏ」−１６〜２９％共通ＲＢＳ蛍光)。
【表４】
2021501157.tif 000006
【００８９】
本発明の方法の実施に有用な発現構築物は、タンパク質コード配列に加えて、それに操作可能に結合される次の制御要素を含む：プロモーター、リボゾーム結合部位(ＲＢＳ)、転写ターミネーターならびに翻訳開始および停止シグナル。有用なＲＢＳは、例えば、米国特許出願公開２００８／０２６９０７０および米国特許出願１２／６１０,２０７により、発現系の宿主細胞として有用な種の何れかから得られる。多くの具体的なおよび多様な共通ＲＢＳが知られ、例えば、D. Frishman et al., Gene 234(2):257-65 (8 Jul. 1999);およびB. E. Suzek et al., Bioinformatics 17(12):1123-30 (December 2001)に記載され、引用されているものを含む。さらに、天然または合成ＲＢＳ、例えば、ＥＰ０２０７４５９(合成ＲＢＳ)；O. Ikehata et al., Eur. J. Biochem. 181(3):563-70 (1989)に記載のものが使用され得る。本発明の方法で有用な方法、ベクターおよび翻訳および転写要素ならびに他の要素のさらなる例は、例えば、Gilroyの米国特許５,０５５,２９４およびGilroy et al.の米国特許５,１２８,１３０；Rammler et al.の米国特許５,２８１,５３２；Barnes et al.の米国特許４,６９５,４５５および４,８６１,５９５；Gray et al.の米国特許４,７５５,４６５；およびWilcoxの米国特許５,１６９,７６０に記載される。
【００９０】
宿主株
シュードモナス属および密接に関連する細菌生物を含む細菌宿主は、本発明の方法の実施に際して使用が考慮される。ある実施態様において、シュードモナス属菌宿主細胞はシュードモナス・フルオレッセンスである。ある場合、宿主細胞は大腸菌細胞である。
【００９１】
本発明の方法の実施に有用な宿主細胞および構築物は、当分野で知られ、文献、例えば、引用により全体として本明細書に包含させる米国特許出願公開２００９／０３２５２３０、「Protein Expression Systems」に記載された試薬および方法を使用して、同定または製造される。この刊行物は、染色体ｌａｃＩ遺伝子インサートを含む栄養要求性シュードモナス・フルオレッセンス宿主細胞への核酸構築物の導入による、組み換えポリペプチドの産生を記載する。核酸構築物は、宿主細胞における核酸の発現を指示できるプロモーターに操作可能に結合される組み換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、また栄養要求性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。栄養要求性選択マーカーは、栄養要求性宿主細胞に対して原栄養性を回復させるポリペプチドである。ある実施態様において、細胞は、プロリン、ウラシルまたはこれらの組み合わせについて栄養要求性である。ある実施態様において、宿主細胞はＭＢ１０１(ATCC deposit PTA-7841)に由来する。両者とも引用により全体として本明細書に包含させる米国特許出願公開２００９／０３２５２３０、「Protein Expression Systems」およびSchneider, et al., 2005, “Auxotrophic markers pyrF and proC, in some cases, replace antibiotic markers on protein production plasmids in high-cell-density Pseudomonas fluorescens fermentation,” Biotechnol. Progress 21(2): 343-8は、株ＭＢ１０１からｐｙｒＦ遺伝子を欠失させることにより構築したウラシルについて栄養要求性である産生宿主株を記載する。ｐｙｒＦ遺伝子を株ＭＢ２１４(ATCC deposit PTA-7840)からクローン化して、原栄養性の回復のためにｐｙｒＦ欠失を補う、プラスミドを産生する。具体的実施態様において、シュードモナス・フルオレッセンス宿主細胞におけるデュアルｐｙｒＦ−ｐｒｏＣデュアル栄養要求性選択マーカー系を使用する。ｐｙｒＦ欠失産生宿主株は、しばしば本発明の方法の実施において有用であるとしてここに記載するものを含む、他の所望のゲノム変化を導入するためのバックグラウンドとして使用される。
【００９２】
ある実施態様において、宿主細胞はシュードモナス目のものである。宿主細胞がシュードモナス目のものであるとき、シュードモナス属を含む、シュードモナス科のメンバーであり得る。ガンマプロテオバクテリア宿主は、大腸菌種のメンバーおよびシュードモナス・フルオレッセンス種のメンバーを含む。シュードモナス目、シュードモナス科またはシュードモナス属の宿主細胞は当業者により同定可能であり、文献(例えば、Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria(オンライン版、２０１５))に記載されている。さらに、このような株において、当分野で周知の方法を使用して、プロテアーゼは不活性化され、折り畳みモジュレーター過発現構築物が導入され得る。
【００９３】
本発明の方法において有用な産生宿主株は、当分野で知られ、文献に記載される多くの適切な方法の何れかを使用して、一般に入手可能な宿主細胞、例えば、シュードモナス・フルオレッセンスＭＢ１０１を使用して、例えば、ｐｙｒＦ遺伝子の不活性化により、産生できることが当業者に理解される。原栄養性回復プラスミド、例えば、株ＭＢ２１４からのｐｙｒＦ遺伝子を担持するプラスミドを、当分野で知られ、文献に記載される多くの適切な方法の何れかを使用して、株に形質転換できることも理解される。さらに、このような株において、当分野で周知の方法を使用して、プロテアーゼが不活性化され、折り畳みモジュレーター過発現構築物が導入され得る。
【００９４】
他のシュードモナス生物も有用であり得る。シュードモナス属および密接に関連する種は、Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria (オンライン版, 2015)に記載される科および／または属に属するプロテオバクテリア門の群を含むグラム陰性プロテオバクテリア門下位分類１を含む。表５は、これらの生物の科および属を示す。
【表５】
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【００９５】
シュードモナスおよび密接に関連する細菌は、一般に「グラム(−)プロテオバクテリア門下位分類１」または「グラム陰性好気性桿菌および球菌」(Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria (オンライン版, 2015))として定義される群の一部である。シュードモナス宿主株は、文献、例えば、上で引用した米国特許出願公開２００６／００４０３５２に記載される。
【００９６】
「グラム陰性プロテオバクテリア門下位分類１」はまた分類に使用される基準によるこの見出しに分類されるプロテオバクテリア門も含む。見出しはまたアシドボラックス属、ブレブンディモナス属、バークホルデリア属、ハイドロゲノファーガ属、オセアニモナス属、ラルストニア属およびステノトロホモナス属などの、この部分で先に分類された群も含むが、今では、キサントモナス属に属する(そして先にその種と言われていた)生物の再編成により設けられたスフィンゴモナス属(およびそれ由来のブラストモナス属)、Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria (オンライン版, 2015)に定義されたアセトバクター属に属する生物の再編成により設けられたアシドモナス属も含む。加えて、宿主は、それぞれアルテロモナス・ハロプランクティス、アルテロモナス・ニグリファシエンスおよびアルテロモナス・プトレファシエンスとして再分類されているシュードモナス属であるシュードモナス・エナリア(ＡＴＣＣ１４３９３)、シュードモナス・ニグリファシエンス(ＡＴＣＣ１９３７５)およびシュードモナス・プトレファシエンス(ＡＴＣＣ８０７１)からの細胞を含む。同様に、例えば、シュードモナス・アシドボランス(ＡＴＣＣ１５６６８)およびシュードモナス・テストステロニ(ＡＴＣＣ１１９９６)は、それからコマモナス・アシドボランスおよびコマモナス・テストステロニとして再分類されており；そしてシュードモナス・ニグリファシエンス(ＡＴＣＣ１９３７５)およびシュードモナス・ピスキキダ(ＡＴＣＣ１５０５７)は、それぞれシュードアルテロモナス・ニグリファシエンスおよびシュードアルテロモナス・ピスキキダとして再分類されている。「グラム陰性プロテオバクテリア門下位分類１」はまた、シュードモナス科、アゾトバクター科(現在、しばしば、シュードモナス科の「アゾトバクター群」のシノニムで呼ばれる)、リゾビウム科およびメチロモナス科(現在、しばしば「メチロコッカス科」のシノニムで呼ばれる)の何れかの科に属するとして分類されるプロテオバクテリア門も含む。結果として、ここで他に記載する属に加えて、「グラム陰性プロテオバクテリア門下位分類１」内に入るさらなるプロテオバクテリア属は、１)アゾリゾフィルス属のアゾトバクター群細菌；２)セルビブリオ属、オリゲラ属およびテレディニバクター属のシュードモナス科細菌；３)ケラトバクター属、エンシファー属、リベリバクター属(「カンジダタス・リベリバクター」とも称する)およびシノリゾビウム属のリゾビウム科細菌；および４)メチロバクテリウム属、メチロカルダム属、メチロミクロビウム属、メチロサルシナ属およびメチロスファエラ属のメチロコッカス科細菌を含む。
【００９７】
宿主細胞は、ある場合、「グラム陰性プロテオバクテリア門下位分類１６」から選択される。「グラム陰性プロテオバクテリア門下位分類１６」は、次のプロテオバクテリア門のシュードモナス種の群として定義される(例示株のＡＴＣＣまたは他の寄託番号を括弧内に示す)：シュードモナス・アビエタニフィラ(ＡＴＣＣ７００６８９)；シュードモナス・エルギノーサ(ＡＴＣＣ１０１４５)；シュードモナス・アルカリゲネス(ＡＴＣＣ１４９０９)；シュードモナス・アンギリセプチカ(ＡＴＣＣ３３６６０)；シュードモナス・シトロネロリス(ＡＴＣＣ１３６７４)；シュードモナス・フラベッセンス(ＡＴＣＣ５１５５５)；シュードモナス・メンドシナ(ＡＴＣＣ２５４１１)；シュードモナス・ニトロレデュセンス(ＡＴＣＣ３３６３４)；シュードモナス・オレオボランス(ＡＴＣＣ８０６２)；シュードモナスシュード・アルカリゲネス(ＡＴＣＣ１７４４０)；シュードモナス・レジノボランス(ＡＴＣＣ１４２３５)；シュードモナス・ストラミネア(ＡＴＣＣ３３６３６)；シュードモナス・アガリシ(ＡＴＣＣ２５９４１)；シュードモナス・アルカリフィラ；シュードモナス・アルギノボラ；シュードモナス・アンダーソニイ；シュードモナス・アスプレニイ(ＡＴＣＣ２３８３５)；シュードモナス・アゼライカ(ＡＴＣＣ２７１６２)；シュードモナス・ベイジェリンキイ(ＡＴＣＣ１９３７２)；シュードモナス・ボレアリス；シュードモナス・ボレオポリス(ＡＴＣＣ３３６６２)；シュードモナス・ブラッシカセアルム；シュードモナス・ブタノボラ(ＡＴＣＣ４３６５５)；シュードモナス・セルロサ(ＡＴＣＣ５５７０３)；シュードモナス・アウランティアカ(ＡＴＣＣ３３６６３)；シュードモナス・クロロラフィス(ＡＴＣＣ９４４６、ＡＴＣＣ１３９８５、ＡＴＣＣ１７４１８、ＡＴＣＣ１７４６１)；シュードモナス・フラギ(ＡＴＣＣ４９７３)；シュードモナス・ルンデンシス(ＡＴＣＣ４９９６８)；シュードモナス・タエトロレンス(ＡＴＣＣ４６８３)；シュードモナス・シシコーラ(ＡＴＣＣ３３６１６)；シュードモナス・コロナファシエンス；シュードモナス・ディテルペニフィラ；シュードモナス・エロンガータ(ＡＴＣＣ１０１４４)；シュードモナス・フレクテンス(ＡＴＣＣ１２７７５)；シュードモナス・アゾトフォルマンス；シュードモナス・ブレンネリ；シュードモナス・セドレラ；シュードモナス・コルルガタ(ＡＴＣＣ２９７３６)；シュードモナス・イクストレモリエンタリス；シュードモナス・フルオレッセンス(ＡＴＣＣ３５８５８)；シュードモナス・ゲッサーディイ；シュードモナス・リバネンシス；シュードモナス・マンデリイ(ＡＴＣＣ７００８７１)；シュードモナス・マージナリス(ＡＴＣＣ１０８４４)；シュードモナス・ミグラエ；シュードモナス・ムシドレンス(ＡＴＣＣ４６８５)；シュードモナス・オリエンタリス；シュードモナス・ロデシア；シュードモナス・シンキサンサ(ＡＴＣＣ９８９０)；シュードモナス・トラシー(ＡＴＣＣ３３６１８)；シュードモナス・ヴェロニイ(ＡＴＣＣ７００４７４)；シュードモナス・フレデリクスベーゲンシス；シュードモナス・ゲニクラタ(ＡＴＣＣ１９３７４)；シュードモナス・ギンゲリ；シュードモナス・グラミニス；シュードモナス・グリモンティイ；���ュードモナス・ハロデニトリフィカンス；シュードモナス・ハロフィラ；シュードモナス・ヒビシコーラ(ＡＴＣＣ１９８６７)；シュードモナス・フティエンス(ＡＴＣＣ１４６７０)；シュードモナス・ハイドロゲノボラ；シュードモナス・ジェッセニイ(ＡＴＣＣ７００８７０)；シュードモナス・キロネンシス；シュードモナス・ランセオラータ(ＡＴＣＣ１４６６９)；シュードモナス・リニ；シュードモナス・マルギナタ(ＡＴＣＣ２５４１７)；シュードモナス・メフィチカ(ＡＴＣＣ３３６６５)；シュードモナス・デニトリカンス(ＡＴＣＣ１９２４４)；シュードモナス・ペルツシノゲナ(ＡＴＣＣ１９０)；シュードモナス・ピクトラム(ＡＴＣＣ２３３２８)；シュードモナス・サイクロフィラ；シュードモナス・フィルバ(ＡＴＣＣ３１４１８)；シュードモナス・モンテイリイ(ＡＴＣＣ７００４７６)；シュードモナス・モッセリィ；シュードモナス・オリジハビタンス(ＡＴＣＣ４３２７２)；シュードモナス・プレコグロシシダ(ＡＴＣＣ７００３８３)；シュードモナス・プチダ(ＡＴＣＣ１２６３３)；シュードモナス・リアクタンス；シュードモナス・スピノサ(ＡＴＣＣ１４６０６)；シュードモナス・バレアリカ；シュードモナス・ルテオラ(ＡＴＣＣ４３２７３)；シュードモナス・スタッツェリ(ＡＴＣＣ１７５８８)；シュードモナス・アミグダリ(ＡＴＣＣ３３６１４)；シュードモナス・アベルラナエ(ＡＴＣＣ７００３３１)；シュードモナス・カリカパパヤエ(ＡＴＣＣ３３６１５)；シュードモナス・チコリ(ＡＴＣＣ１０８５７)；シュードモナス・フィクセレクタエ(ＡＴＣＣ３５１０４)；シュードモナス・フスコバギナエ；シュードモナス・メリアエ(ＡＴＣＣ３３０５０)；シュードモナス・シリンゲ(ＡＴＣＣ１９３１０)；シュードモナス・ビリディフラバ(ＡＴＣＣ１３２２３)；シュードモナス・サーモカルボキシドボランス(ＡＴＣＣ３５９６１)；シュードモナス・サーモトレランス；シュードモナス・チベルバレンシス；シュードモナス・バンコウベレンシス(ＡＴＣＣ７００６８８)；シュードモナス・ウィスコンシネンシス；およびシュードモナス・キシアメンシス。ある実施態様において、目的のポリペプチドまたはタンパク質の発現のための宿主細胞は、シュードモナス・フルオレッセンスである。
【００９８】
宿主細胞は、ある場合、「グラム陰性プロテオバクテリア門下位分類１７」から選択される。「グラム陰性プロテオバクテリア門下位分類１７」は、例えば、次のシュードモナス種に属するものを含む、当分野で「蛍光シュードモナス属」として知られるプロテオバクテリア門の群として定義される：シュードモナス・アゾトフォルマンス；シュードモナス・ブレンネリ；シュードモナス・セドレラ；シュードモナス・セドリナ；シュードモナス・コルガタ；シュードモナス・イクストレモリエンタリス；シュードモナス・フルオレッセンス；シュードモナス・ゲッサーディイ；シュードモナス・リバネンシス；シュードモナス・マンデリイ；シュードモナス・マージナリス；シュードモナス・ミグラエ；シュードモナス・ムシドレンス；シュードモナス・オリエンタリス；シュードモナス・ロデシア；シュードモナス・シンキサンサ；シュードモナス・トラシー；およびシュードモナス・ヴェロニイ。
【００９９】
プロテアーゼ
ある実施態様において、ここに提供する方法は、目的のポリペプチドまたはタンパク質を産生するために、１以上のプロテアーゼ遺伝子に１以上の変異(例えば、部分的または完全欠失)を含む、シュードモナス宿主細胞の使用を含む。ある実施態様において、プロテアーゼ遺伝子の変異は、目的の可溶性ポリペプチドまたはタンパク質の産生を促進する。
【０１００】
標的プロテアーゼ遺伝子の例は、アミノペプチダーゼ；ジペプチダーゼ；ジペプチジル−ペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼ；ペプチジル−ジペプチダーゼ；セリン型カルボキシペプチダーゼ；メタロカルボキシペプチダーゼ；システイン型カルボキシペプチダーゼ；オメガペプチダーゼ；セリンプロテイナーゼ；システインプロテイナーゼ；アスパラギンプロテイナーゼ；メタロプロテイナーゼ；または未知機構のプロテイナーゼとして分類されるプロテアーゼを含む。
【０１０１】
アミノペプチダーゼは、サイトゾルアミノペプチダーゼ(ロイシルアミノペプチダーゼ)、膜アラニルアミノペプチダーゼ、シスチニルアミノペプチダーゼ、トリペプチドアミノペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、アルギニルアミノペプチダーゼ、グルタミルアミノペプチダーゼ、ｘ−ｐｒｏアミノペプチダーゼ、細菌ロイシルアミノペプチダーゼ、好熱性アミノペプチダーゼ、クロストリジウムアミノペプチダーゼ、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、リシルアミノペプチダーゼ、ｘ−ｔｒｐアミノペプチダーゼ、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、ｄ−立体特異的アミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼｅｙを含む。ジペプチダーゼは、ｘ−ｈｉｓジペプチダーゼ、ｘ−ａｒｇジペプチダーゼ、ｘ−メチル−ｈｉｓジペプチダーゼ、ｃｙｓ−ｇｌｙジペプチダーゼ、ｇｌｕ−ｇｌｕジペプチダーゼ、ｐｒｏ−ｘジペプチダーゼ、ｘ−ｐｒｏジペプチダーゼ、ｍｅｔ−ｘジペプチダーゼ、非立体特異的ジペプチダーゼ、サイトゾル非特異的ジペプチダーゼ、膜ジペプチダーゼ、ベータ−ａｌａ−ｈｉｓジペプチダーゼを含む。ジペプチジル−ペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼは、ジペプチジル−ペプチダーゼｉ、ジペプチジル−ペプチダーゼii、ジペプチジルペプチダーゼiii、ジペプチジル−ペプチダーゼiv、ジペプチジル−ジペプチダーゼ、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ、トリペプチジル−ペプチダーゼIIを含む。ペプチジル−ジペプチダーゼは、ペプチジル−ジペプチダーゼａおよびペプチジル−ジペプチダーゼｂを含む。セリン型カルボキシペプチダーゼは、リソソームｐｒｏ−ｘカルボキシペプチダーゼ、セリン型Ｄ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＣ、カルボキシペプチダーゼＤを含む。メタロカルボキシペプチダーゼは、カルボキシペプチダーゼａ、カルボキシペプチダーゼＢ、リシン(アルギニン)カルボキシペプチダーゼ、ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、アラニンカルボキシペプチダーゼ、ムラモイルペンタペプチドカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼｈ、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＭ、ムラモイルテトラペプチドカルボキシペプチダーゼ、亜鉛ｄ−ａｌａ−ｄ−ａｌａカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ２、膜ｐｒｏ−ｘカルボキシペプチダーゼ、チューブリニル−ｔｙｒカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼｔを含む。オメガペプチダーゼは、アシルアミノアシル−ペプチダーゼ、ペプチジル−グリシンアミダーゼ、ピログルタミル−ペプチダーゼＩ、ベータ−アスパルチル−ペプチダーゼ、ピログルタミル−ペプチダーゼII、ｎ−ホルミルメチオニル−ペプチダーゼ、プテロイルポリ−[ガンマ]−グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、ガンマ−ｇｌｕ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、アシルムラモイル−ａｌａペプチダーゼを含む。セリンプロテイナーゼは、キモトリプシン、キモトリプシンｃ、メトリジン、トリプシン、トロンビン、凝固因子Ｘa、プラスミン、エンテロペプチダーゼ、アクロシン、アルファ−溶菌プロテアーゼ、グルタミル、エンドペプチダーゼ、カテプシンＧ、凝固因子viia、凝固因子ix、ククミシ(cucumisi)、プロリルオリゴペプチダーゼ、凝固因子xi、ブラキウリン、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、膵臓エラスターゼ、白血球エラスターゼ、凝固因子xii、キマーゼ、補体成分ｃ１ｒ５５、補体成分ｃ１ｓ５５、古典的補体経路ｃ３／ｃ５コンベルターゼ、補体因子Ｉ、補体因子Ｄ、補体第二経路ｃ３／ｃ５コンベルターゼ、セレビシン、ヒポデルミンＣ、リシルエンドペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ１ａ、ガンマ−レニン(reni)、ベノンビンａｂ、ロイシルエンドペプチダーゼ、トリプターゼ、スクテラリン、ケキシン、サブチリシン、オリジン、エンドペプチダーゼｋ、テルモミコリン、テルミターゼ、エンドペプチダーゼＳＯ、Ｔ−プラスミノーゲン活性化因子、プロテインＣ、膵臓エンドペプチダーゼＥ、膵臓エラスターゼii、ＩＧＡ特異的セリンエンドペプチダーゼ、Ｕ−プラスミノーゲン、アクティベーター、ベノンビンＡ、フューリン、ミエロブラスチン、セメノゲラーゼ、グランザイムＡまたは細胞毒性Ｔリンパ球プロテイナーゼ１、グランザイムＢまたは細胞毒性Ｔリンパ球プロテイナーゼ２、ストレプトグリシンＡ、ストレプトグリシンＢ、グルタミルエンドペプチダーゼII、オリゴペプチダーゼＢ、カブトガニ凝固因子ｃ、カブトガニ凝固因子、カブトガニ凝固酵素、オンプチン、リプレッサーｌｅｘａ、細菌リーダーペプチダーゼＩ、トガビリン、フラビリンを含む。システインプロテイナーゼは、カテプシンＢ、パパイン、フィシン、キモパパイン、アスクレパイン、クロストリパイン、ストレプトパイン、アクチニド、カテプシン１、カテプシンＨ、カルパイン、カテプシンｔ、グリシル、エンドペプチダーゼ、癌プロコアグラント、カテプシンＳ、ピコルナイン３Ｃ、ピコルナイン２Ａ、カリカイン、アナナイン、ステム・ブロメライン、フルート・ブロメライン、レグマイン、ヒストリサイン、インターロイキン１−ベータ変換酵素を含む。アスパラギンプロテイナーゼは、ペプシンＡ、ペプシンＢ、ガストリクシン、キモシン、カテプシンＤ、ネペンテシン、レニン、レトロペプシン、プロオピオメラノコルチン変換酵素、アスペルギロペプシンＩ、アスペルギロペプシンII、ペニシロペプシン、リゾプスペプシン、エンドチアペプシン、ムコロペプシン、カンジダペプシン、サッカロペプシン、ロドトルラペプシン、フィサロペプシン、アクロシリンドロペプシン、ポリポロペプシン、ピクノポロペプシン、シタリドペプシンａ、シタリドペプシンｂ、キサントモナペプシン、カテプシンｅ、バリアペプシン、細菌リーダーペプチダーゼＩ、シュードモナペプシン、プラスメプシンを含む。メタロプロテイナーゼは、アトロリシンａ、微生物コラゲナーゼ、ロイコリシン、間質性コラゲナーゼ、ネプリライシン、エンベリシン、ｉｇａ特異的メタロエンドペプチダーゼ、プロコラーゲンＮ−エンドペプチダーゼ、チメットオリゴペプチダーゼ、ノイロリシン、ストロメライシン１、メプリンＡ、プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼ、ペプチジル−ｌｙｓメタロエンドペプチダーゼ、アスタシン、ストロメライシン、２、マトリライシンゼラチナーゼ、エアロモノリシン、プソイドリシン、テルモリシン、バシロリシン、オーレオリシン、ココリシン、ミコリシン、ベータ−溶菌メタロエンドペプチダーゼ、ペプチジル−ａｓｐメタロエンドペプチダーゼ、好中球コラゲナーゼ、ゼラチナーゼＢ、レイシマノリシン、サッカロリシン、オートリシン、ドイテロリシン、セラリシン、アトロリシンＢ、アトロリシンＣ、アトロキサーゼ、アトロリシンＥ、アトロリシンＦ、アダマリシン、ホリリシン、ラバリシン、ボソロパシン、ボソロリシン、オヒトリシン、トリメロリシンＩ、トリメロリシンII、ムクロリシン、ピトリリシン、インスリシン、Ｏ−シアログリコタンパク質エンドペプチダーゼ、ルスセリリシン、ミトコンドリア、中間体、ペプチダーゼ、ダクチリシン、ナリジリシン、マグノリシン、メプリンＢ、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ、マクロファージエラスターゼ、コリオリシン、トキシリシンを含む。未知機構のプロテイナーゼは、サーモプシンおよび多触媒性エンドペプチダーゼ複合体を含む。
【０１０２】
ある種のプロテアーゼは、プロテアーゼおよびシャペロン様活性両者を含む。これらのプロテアーゼがタンパク質収量および／または品質に負に影響するとき、しばしばそれらのプロテアーゼ活性を特異的に欠失させるのが有用であり、それらはシャペロン活性がタンパク質収量および／または品質に正に影響し得るとき、過発現される。これらのプロテアーゼは、Ｈｓｐ１００(Ｃｌｐ／Ｈｓｌ)ファミリーメンバーＲＸＦ０４５８７.１(ｃｌｐＡ)、ＲＸＦ０８３４７.１、ＲＸＦ０４６５４.２(ｃｌｐＸ)、ＲＸＦ０４６６３.１、ＲＸＦ０１９５７.２(ｈｓｌＵ)、ＲＸＦ０１９６１.２(ｈｓｌＶ)；ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼファミリーメンバーＲＸＦ０５３４５.２(ｐｐｉＢ)；メタロペプチダーゼＭ２０ファミリーメンバーＲＸＦ０４８９２.１(アミノヒドロｌａｓｅ)；メタロペプチダーゼＭ２４ファミリーメンバーＲＸＦ０４６９３.１(メチオニンアミノペプチダーゼ)およびＲＸＦ０３３６４.１(メチオニンアミノペプチダーゼ)；およびセリンペプチダーゼＳ２６シグナルペプチダーゼＩファミリーメンバーＲＸＦ０１１８１.１(シグナルペプチダーゼ)を含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
これらおよび他のプロテアーゼおよび折り畳みモジュレーターは当分野で知られ、かつ文献、例えば、米国特許８,６０３,８２４に記載される。例えば、該特許の表Ｄは、Ｔｉｇ(ｔｉｇ、トリガーファクター、ＦＫＢＰタイプｐｐｉａｓｅ(ｅｃ  ５.２.１.８)ＲＸＦ０４６５５、UniProtKB-P0A850(TIG_ECOLI))を記載する。「Method for Rapidly Screening Microbial Hosts to Identify Certain Strains with Improved Yield and/or Quality in the Expression of Heterologous Proteins」なる名称であり、全体として引用により本明細書に包含させるＷＯ２００８／１３４４６１および米国特許９,３９４,５７１は、Ｔｉｇ(ＲＸＦ０４６５５.２、その中の配列番号３４)、ＬｅｐＢ(ＲＸＦ０１１８１.１、その中の配列番号５６)、ＤｅｇＰ１(ＲＸＦ０１２５０、その中の配列番号５７)、ＡｐｒＡ(ＲＸＦ０４３０４.１、その中の配列番号８６)、Ｐｒｃ１(ＲＸＦ０６５８６.１、その中の配列番号１２０)、ＤｅｇＰ２(ＲＸＦ０７２１０.１、その中の配列番号１２４)、Ｌｏｎ(ＲＸＦ０４６５３、その中の配列番号９２)；ＤｓｂＡ(ＲＸＦ０１００２.１、その中の配列番号２５)およびＤｓｂＣ(ＲＸＦ０３３０７.１、その中の配列番号２６)を記載する。これらの配列ならびに他のプロテアーゼおよび折り畳みモジュレーターのものも、米国特許９,５８０,７１９に示される(その中のカラム９３〜９８の配列番号の表)。例えば、米国特許９,５８０,７１９は、それぞれ配列番号１８および１９としてＨｓｌＵ(ＲＸＦ０１９５７.２)およびＨｓｌＶ(ＲＸＦ０１９６１.２)をコードする配列を提供する。
【０１０４】
ハイスループットスクリーニング
ある実施態様において、ハイスループットスクリーニングを実施して、目的の組み換えタンパク質またはポリペプチドの発現のための最適条件を決定する。スクリーニングで変わり得る条件は、例えば、宿主細胞、宿主細胞の遺伝的背景(例えば、異なるプロテアーゼの欠失)、発現構築物におけるプロモーターのタイプ、目的のコードされるポリペプチドまたはタンパク質に融合される分泌リーダーのタイプ、増殖温度、誘導性プロモーターを使用するときの誘導ＯＤ、インデューサー添加量(例えばｌａｃＺプロモーターまたはその誘導体を使用するときの誘導に使用するＩＰＴＧ量)、タンパク質誘導期間、培養物に誘導剤添加後の温度、培養物の撹拌速度、プラスミド維持のための選択方法、容器中の培養物体積および細胞溶解方法を含む。
【０１０５】
ある実施態様において、宿主株のライブラリー(または「アレイ」)が提供され、ここで、ライブラリーの各株(または「宿主細胞集団」)は、該宿主細胞における１以上の標的遺伝子の発現を調節するように遺伝的に修飾されている。「最適宿主株」または「最適発現系」は、しばしばアレイにおける表現型的に異なる宿主細胞の他の集団と比較して、目的の発現タンパク質の量、品質および／または位置に基づき同定または選択される。それ故に、最適宿主株は、所望の仕様に従い目的のポリペプチドを産生する株である。所望の仕様は、産生されるポリペプチドより変わるが、仕様は、タンパク質が隔離されていても、分泌されていても、タンパク質の品質および／または量、タンパク質折り畳みなどを含む。例えば、最適宿主株または最適発現系は、可溶性異種タンパク質の量、回収可能異種タンパク質の量、適切に形成された異種タンパク質の量、適切に折り畳まれた異種タンパク質の量、活性異種タンパク質の量および／または異種タンパク質の総量により特徴付けられる、ある絶対的レベルまたはインディケータ株、すなわち、比較のために使用する株により産生されるものに対するあるレベルの収量を提供する。
【０１０６】
異種タンパク質の発現における収量および／または品質が改善した株を同定するための微生物宿主をスクリーニングする方法は、例えば、米国特許出願公開２００８０２６９０７０に記載される。
【０１０７】
細菌増殖条件
本発明の方法に有用な増殖条件は、しばしば約４℃〜約４２℃の温度および約５.７〜約８.８のｐＨを含む。ｌａｃＺプロモーターまたはその誘導体を有する発現構築物が使用されるとき、発現はしばしばＩＰＴＧを約０.０１mM〜約１.０mMの最終濃度で培養物に加えることにより、誘導される。
【０１０８】
培養物のｐＨは、ｐＨ緩衝液および当分野で知られる方法を使用して維持されることがある。培養中のｐＨ管理はしばしばアンモニア水溶液を使用しても達成される。ある実施態様において、培養物のｐＨは約５.７〜約８.８である。ある実施態様において、ｐＨは、約５.７、５.８、５.９、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７、６.８、６.９、７.０、７.１、７.２、７.３、７.４、７.５、７.６、７.７、７.８、７.９、８.０、８.１、８.２、８.３、８.４、８.５、８.６、８.７または８.８である。別の実施態様において、ｐＨは、約５.７〜５.９、５.８〜６.０、５.９〜６.１、６.０〜６.２、６.１〜６.３、６.２〜６.５、６.４〜６.７、６.５〜６.８、６.６〜６.９、６.７〜７.０、６.８〜７.１、６.９〜７.２、７.０〜７.３、７.１〜７.４、７.２〜７.５、７.３〜７.６、７.４〜７.７、７.５〜７.８、７.６〜７.９、７.７〜８.０、７.８〜８.１、７.９〜８.２、８.０〜８.３、８.１〜８.４、８.２〜８.５、８.３〜８.６、８.４〜８.７または８.５〜８.８である。さらに他の実施態様において、ｐＨは、約５.７〜６.０、５.８〜６.１、５.９〜６.２、６.０〜６.３、６.１〜６.４または６.２〜６.５である。ある実施態様において、ｐＨは約５.７〜約６.２５である。
【０１０９】
ある実施態様において、増殖温度は、約４℃〜約４２℃に維持される。ある実施態様において、増殖温度は、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃または約４２℃である。他の実施態様において、増殖温度は、約２５℃〜約２７℃、約２５℃〜約２８℃、約２５℃〜約２９℃、約２５℃〜約３０℃、約２５℃〜約３１℃、約２５℃〜約３２℃、約２５℃〜約３３℃、約２６℃〜約２８℃、約２６℃〜約２９℃、約２６℃〜約３０℃、約２６℃〜約３１℃、約２６℃〜約３２℃、約２７℃〜約２９℃、約２７℃〜約３０℃、約２７℃〜約３１℃、約２７℃〜約３２℃、約２６℃〜約３３℃、約２８℃〜約３０℃、約２８℃〜約３１℃、約２８℃〜約３２℃、約２９℃〜約３１℃、約２９℃〜約３２℃、約２９℃〜約３３℃、約３０℃〜約３２℃、約３０℃〜約３３℃、約３１℃〜約３３℃、約３１℃〜約３２℃、約３０℃〜約３３℃または約３２℃〜約３３℃に維持される。他の実施態様において、培養中温度が変わる。ある実施態様において、培養物に目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする構築物から発現を誘導するための試薬を加える前は約３０℃〜約３２℃の温度に維持し、発現を誘導するための試薬添加後、例えば、ＩＰＴＧを培養物に添加後、温度を約２５℃〜約２７℃に下げる。ある実施態様において、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする構築物から発現を誘導するための試薬を培養物に加える前は、温度を約３０℃に維持し、発現を誘導するための試薬を培養物に加えた後、温度を約２５℃に下げる。
【０１１０】
誘導
本明細書の他の箇所に記載するとおり、誘導性プロモーター、例えば、ｌａｃプロモーターは、目的のポリペプチドまたはタンパク質の発現を制御するために発現構築物においてしばしば使用される。ｌａｃプロモーター誘導体またはファミリーメンバー、例えば、ｔａｃプロモーターの場合、エフェクター化合物は、ＩＰＴＧ(イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、「イソプロピルチオガラクトシド」とも称される)などの無償性インデューサーのようなインデューサーである。ある実施態様において、ｌａｃプロモーター誘導体が使用され、目的のポリペプチドまたはタンパク質の発現が、細胞密度が約２５〜約１６０のＯＤ５７５により決定されるレベルに達したとき、ＩＰＴＧを約０.０１mM〜約１.０mMの最終濃度まで加えることにより誘導される。ある実施態様において、目的のポリペプチドまたはタンパク質の培養誘導時点のＯＤ５７５は、約２５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０である。他の実施態様において、ＯＤ５７５は約８０〜約１００、約１００〜約１２０、約１２０〜約１４０、約１４０〜約１６０である。他の実施態様において、ＯＤ５７５は約８０〜約１２０、約１００〜約１４０または約１２０〜約１６０である。他の実施態様において、ＯＤ５７５は約８０〜約１４０または約１００〜１６０である。細胞密度は、しばしば他の方法により測定され、他の単位、例えば、単位体積あたりの細胞で表される。例えば、シュードモナス・フルオレッセンス培養物の約２５〜約１６０のＯＤ５７５は、約４×１０１０〜約１.６×１０１１コロニー形成単位／mLまたは１１〜７０ｇ／Ｌ乾燥細胞重量と同等である。ある実施態様において、目的のポリペプチドまたはタンパク質の発現は、細胞密度が湿重量約０.０５ｇ／ｇ〜約０.４ｇ／ｇに達したとき、ＩＰＴＧを約０.０１mM〜約１.０mMの最終濃度まで加えることにより誘導する。ある実施態様において、湿重量は約０.０５ｇ／ｇ、約０.１ｇ／ｇ、約０.１５ｇ／ｇ、約０.２ｇ／ｇ、約０.２５ｇ／ｇ、約０.３０ｇ／ｇ、約０.３５ｇ／ｇ、約０.４０ｇ／ｇ、約０.０５ｇ／ｇ〜約０.１ｇ／ｇ、約０.０５ｇ／ｇ〜約０.１５ｇ／ｇ、約０.０５ｇ／ｇ〜約０.２０ｇ／ｇ、約０.０５ｇ／ｇ〜約０.２５ｇ／ｇ、約０.０５ｇ／ｇ〜約０.３０ｇ／ｇ、約０.０５ｇ／ｇ〜約０.３５ｇ／ｇ、約０.１ｇ／ｇ〜約０.４０ｇ／ｇ、約０.１５ｇ／ｇ〜約０.４０ｇ／ｇ、約０.２０ｇ／ｇ〜約０.４０ｇ／ｇ、約０.２５ｇ／ｇ〜約０.４０ｇ／ｇ、約０.３０ｇ／ｇ〜約０.４０ｇ／ｇまたは約０.３５ｇ／ｇ〜約０.４０ｇ／ｇである。ある実施態様において、培養誘導時の細胞密度は、細胞密度を決定するために使用した方法または測定単位に関わらず、ＯＤ５７５での吸光度によりここに特定した細胞密度と同等である。当業者は、任意の細胞培養について、どのように適切な変換を行うかを知っている。
【０１１１】
ある実施態様において、培養物の最終ＩＰＴＧ濃度は、約０.０１mM、約０.０２mM、約０.０３mM、約０.０４mM、約０.０５mM、約０.０６mM、約０.０７mM、約０.０８mM、約０.０９mM、約０.１mM、約０.２mM、約０.３mM、約０.４mM、約０.５mM、約０.６mM、約０.７mM、約０.８mM、約０.９mMまたは約１mMである。他の実施態様において、培養物の最終ＩＰＴＧ濃度は、約０.０８mM〜約０.１mM、約０.１mM〜約０.２mM、約０.２mM〜約０.３mM、約０.３mM〜約０.４mM、約０.２mM〜約０.４mM、約０.０８〜約０.２mMまたは約０.１〜１mMである。
【０１１２】
非ｌａｃタイププロモーターが使用されるある実施態様において、ここにおよび文献に記載されるとおり、他のインデューサーまたはエフェクターがしばしば使用される。ある実施態様において、プロモーターは構成的プロモーターである。
【０１１３】
誘導剤添加後、培養物を、しばしば一定時間、例えば約２４時間増殖させ、その間、目的のポリペプチドまたはタンパク質が発現される。誘導剤添加後、培養物は、しばしば約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約３６時間または約４８時間増殖される。誘導剤が培養物に添加された後、培養物は約１〜４８時間、約１〜２４時間、約１０〜２４時間、約１５〜２４時間または約２０〜２４時間増殖される。細胞培養物は、しばしば遠心分離により濃縮され、培養ペレットは、その後の溶解に適する緩衝液または溶液に再懸濁される。
【０１１４】
ある実施態様において、細胞は、高圧機械的細胞破壊用機器を使用して破壊される(これは商業的に入手可能であり、例えば、Microfluidics Microfluidizer、Constant Cell Disruptor、Niro-Soavi homogenizerまたはAPV-Gaulin homogenizer)。目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞は、しばしば、例えば、超音波処理を使用して破壊される。細胞溶解のための、当分野で知られる任意の適切な方法が、しばしば可溶性フラクションの放出に使用される。例えば、ある実施態様において、化学的および／または酵素的細胞溶解剤、例えば細胞壁溶解酵素およびＥＤＴＡがしばしば使用される。凍結されたまたは予め貯蔵された培養物も、本発明の方法において考慮される。培養物は、溶解前にＯＤ標準化されることがある。例えば、細胞は、しばしば約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０のＯＤ６００に標準化される。
【０１１５】
遠心分離は、任意の適切な機器および方法により実施される。不溶性フラクションから可溶性フラクションを分離する目的での細胞培養物または溶解物の遠心分離は、当分野で周知である。例えば、溶解細胞を、２０,８００×ｇで２０分間(４℃で)遠心分離し、上清を手動または自動化液体処理を使用して除去することができる。ペレット(不溶性)フラクションを緩衝化溶液、例えば、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)、ｐＨ７.４に再懸濁する。再懸濁は、しばしば、例えば、オーバーヘッドミキサーに接続されたインペラ、磁気攪拌棒、ロッキングシェーカーなどの機器を使用して実施される。
【０１１６】
「可溶性フラクション」、すなわち、溶解物の遠心分離後に得た可溶性上清および「不溶性フラクション」、すなわち、溶解物の遠心分離後に得たペレットは、培養物の溶解および遠心分離に由来する。
【０１１７】
発酵形式
ある実施態様において、ここでの目的のポリペプチドおよびタンパク質を産生する方法において発酵が使用される。本発明の発現系は、任意の発酵形式で培養される。例えば、バッチ、フェドバッチ、半連続的および連続的発酵形態がここで用いられ得る。
【０１１８】
ある実施態様において、発酵培地は、リッチ培地、最少培地および無機塩培地から選択され得る。他の実施態様において、最少培地または無機塩培地が選択される。ある実施態様において、無機塩培地が選択される。
【０１１９】
無機塩培地は、無機塩および、例えば、グルコース、スクロースまたはグリセロールなどの炭素源からなる。無機塩培地の例は、例えば、Ｍ９培地、シュードモナス培地(ＡＴＣＣ１７９)およびデイビス・ミンジオリ培地(B D Davis & E S Mingioli (1950) J. Bact. 60:17-28参照)を含む。無機塩培地を調製するために使用される無機塩は、例えば、リン酸カリウム、硫酸もしくは塩化アンモニウム、硫酸もしくは塩化マグネシウムおよび微量金属、例えば塩化カルシウム、ホウ酸塩ならびに鉄、銅、マンガンおよび亜鉛の硫酸塩から選択されるものである。一般に、ペプトン、トリプトン、アミノ酸または酵母エキスなどの有機窒素源は無機塩培地に含まれない。代わりに、無機窒素源が使用され、これは、例えば、アンモニウム塩、アンモニア水溶液およびガス状アンモニアから選択される。無機塩培地は、一般に炭素源としてグルコースまたはグリセロールを含む。無機塩培地と比較して、最少培地は、しばしば無機塩および炭素源を含むが、しばしば、例えば、低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトンまたは他の成分が補われるが、これらは極小レベルで加えられる。培地は、しばしば文献に、例えば、上に引用し、本明細書に包含される米国特許出願公開２００６／００４０３５２に記載の方法を使用して調製される。本発明の方法において有用な培養手順および無機塩培地の詳細は、Riesenberg, D. et al., 1991, “High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate,” J. Biotechnol. 20 (1):17-27に記載される。
【０１２０】
発酵は任意の規模で実施され得る。本発明の発現系は、任意の規模での組み換えタンパク質発現に有用である。それ故に、例えば、マイクロリットル規模、ミリリットル規模、センチリットル規模およびデシリットル規模発酵体積が使用でき、１リットル規模以上の大型発酵体積がしばしば使用される。
【０１２１】
ある実施態様において、発酵体積は、約１リットルまたはそれ以上である。ある実施態様において、発酵体積は約０.５リットル〜約１００リットルである。ある実施態様において、発酵体積は約１リットル、約２リットル、約３リットル、約４リットル、約５リットル、約６リットル、約７リットル、約８リットル、約９リットルまたは約１０リットルである。ある実施態様において、発酵体積は約０.５リットル〜約２リットル、約０.５リットル〜約５リットル、約０.５リットル〜約１０リットル、約０.５リットル〜約２５リットル、約０.５リットル〜約５０リットル、約０.５リットル〜約７５リットル、約１０リットル〜約２５リットル、約２５リットル〜約５０リットルまたは約５０リットル〜約１００リットルである。他の実施態様において、発酵体積は、５リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、５０リットル、７５リットル、１００リットル、２００リットル、５００リットル、１,０００リットル、２,０００リットル、５,０００リットル、１０,０００リットルまたは５０,０００リットルまたはそれ以上である。
【０１２２】
タンパク質分析
ある実施態様において、ここに提供される方法により産生される、目的のポリペプチドおよびタンパク質は分析される。目的のポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な当分野で知られる方法、例えば、バイオレイヤー干渉法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、ファーウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、吸光度またはマススペクトロメトリー(例えば、タンデムマススペクトロメトリー)により分析され得る。
【０１２３】
ある実施態様において、産生された目的のポリペプチドまたはタンパク質の濃度および／または量は、例えば、ブラッドフォードアッセイ、吸光度、クマシー染色、マススペクトロメトリーなどにより決定される
【０１２４】
ここに記載する不溶性および可溶性フラクションにおけるタンパク質収量は、しばしば当分野で知られる方法で、例えば、キャピラリーゲル電気泳動(ＣＧＥ)、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により決定される。可溶性フラクションは、しばしば、例えば、バイオレイヤー干渉法を使用して、評価される。
【０１２５】
タンパク質収量の有用な尺度は、例えば、培養物体積あたりの組み換えタンパク質量(例えば、タンパク質グラムまたはミリグラム／培養物リットル)、溶解後に得た不溶性ペレットで測定される組み換えタンパク質のパーセントまたは分数(例えば、抽出上清中の組み換えタンパク質の量／不溶性フラクション中のタンパク質の量)、活性タンパク質のパーセントまたは分数(例えば、活性タンパク質の量／アッセイに使用したタンパク質量)、総細胞タンパク質(ｔｃｐ)のパーセントまたは分数、タンパク質の量／細胞およびパーセント乾燥バイオマスを含む。
【０１２６】
ある実施態様において、本発明の方法を使用して、総細胞タンパク質の約２０％〜約９０％の収量で目的とする可溶性ポリペプチドまたはタンパク質が得られる。ある実施態様において、目的の可溶性ポリペプチドまたはタンパク質の収量は、約２０％総細胞タンパク質、約２５％総細胞タンパク質、約３０％総細胞タンパク質、約３１％総細胞タンパク質、約３２％総細胞タンパク質、約３３％総細胞タンパク質、約３４％総細胞タンパク質、約３５％総細胞タンパク質、約３６％総細胞タンパク質、約３７％総細胞タンパク質、約３８％総細胞タンパク質、約３９％総細胞タンパク質、約４０％総細胞タンパク質、約４１％総細胞タンパク質、約４２％総細胞タンパク質、約４３％総細胞タンパク質、約４４％総細胞タンパク質、約４５％総細胞タンパク質、約４６％総細胞タンパク質、約４７％総細胞タンパク質、約４８％総細胞タンパク質、約４９％総細胞タンパク質、約５０％総細胞タンパク質、約５１％総細胞タンパク質、約５２％総細胞タンパク質、約５３％総細胞タンパク質、約５４％総細胞タンパク質、約５５％総細胞タンパク質、約５６％総細胞タンパク質、約５７％総細胞タンパク質、約５８％総細胞タンパク質、約５９％総細胞タンパク質、約６０％総細胞タンパク質、約６５％総細胞タンパク質、約７０％総細胞タンパク質、約７５％総細胞タンパク質、約８０％総細胞タンパク質、約８５％総細胞タンパク質または約９０％総細胞タンパク質である。ある実施態様において、目的の可溶性ポリペプチドまたはタンパク質の収量は、約２０％〜約２５％総細胞タンパク質、約２０％〜約３０％総細胞タンパク質、約２０％〜約３５％総細胞タンパク質、約２０％〜約４０％総細胞タンパク質、約２０％〜約４５％総細胞タンパク質、約２０％〜約５０％総細胞タンパク質、約２０％〜約５５％総細胞タンパク質、約２０％〜約６０％総細胞タンパク質、約２０％〜約６５％総細胞タンパク質、約２０％〜約７０％総細胞タンパク質、約２０％〜約７５％総細胞タンパク質、約２０％〜約８０％総細胞タンパク質、約２０％〜約８５％総細胞タンパク質、約２０％〜約９０％総細胞タンパク質、約２５％〜約９０％総細胞タンパク質、約３０％〜約９０％総細胞タンパク質、約３５％〜約９０％総細胞タンパク質、約４０％〜約９０％総細胞タンパク質、約４５％〜約９０％総細胞タンパク質、約５０％〜約９０％総細胞タンパク質、約５５％〜約９０％総細胞タンパク質、約６０％〜約９０％総細胞タンパク質、約６５％〜約９０％総細胞タンパク質、約７０％〜約９０％総細胞タンパク質、約７５％〜約９０％総細胞タンパク質、約８０％〜約９０％総細胞タンパク質、約８５％〜約９０％総細胞タンパク質、約３１％〜約６０％総細胞タンパク質、約３５％〜約６０％総細胞タンパク質、約４０％〜約６０％総細胞タンパク質、約４５％〜約６０％総細胞タンパク質、約５０％〜約６０％総細胞タンパク質、約５５％〜約６０％総細胞タンパク質、約３１％〜約５５％総細胞タンパク質、約３１％〜約５０％総細胞タンパク質、約３１％〜約４５％総細胞タンパク質、約３１％〜約４０％総細胞タンパク質、約３１％〜約３５％総細胞タンパク質、約３５％〜約５５％総細胞タンパク質または約４０％〜約５０％総細胞タンパク質である。
【０１２７】
ある実施態様において、本発明の方法は、約１グラム／リットル〜約５０グラム／リットルの収量で目的とする可溶性ポリペプチドまたはタンパク質を得るために使さ用れる。ある実施態様において、目的とする可溶性ポリペプチドまたはタンパク質の収量は、約１グラム／リットル、約２グラム／リットル、約３グラム／リットル、約４グラム／リットル、約５グラム／リットル、約６グラム／リットル、約７グラム／リットル、約８グラム／リットル、約９グラム／リットル、約１０グラム／リットル、約１１グラム／リットル、約１２グラム／リットル、約１３グラム／リットル、約１４グラム／リットル、約１５グラム／リットル、約１６グラム／リットル、約１７グラム／リットル、約１８グラム／リットル、約１９グラム／リットル、約２０グラム／リットル、約２１グラム／リットル、約２２グラム／リットル、約２３グラム／リットル約２４グラム／リットル、約２５グラム／リットル、約２６グラム／リットル、約２７グラム／リットル、約２８グラム／リットル、約３０グラム／リットル、約３５グラム／リットル、約４０グラム／リットル、約４５グラム／リットル、約５０グラム／リットル、約１グラム／リットル〜約５グラム／リットル、約１グラム〜約１０グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約１２グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約１３グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約１４グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約１５グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約１６グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約１７グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約１８グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約１９グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約２０グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約２１グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約２２グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約２３グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約２４グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約３０グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約４０グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約５０グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約１２グラム／リットル、約１２グラム／リットル〜約１４グラム／リットル、約１４グラム／リットル〜約１６グラム／リットル、約１６グラム／リットル〜約１８グラム／リットル、約１８グラム／リットル〜約２０グラム／リットル、約２０グラム／リットル〜約２２グラム／リットル、約２２グラム／リットル〜約２４グラム／リットル、約２３グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約１１グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約１２グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約１３グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約１４グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約１５グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約１６グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約１７グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約１８グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約１９グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約２０グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約２１グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約２２グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約２３グラム／リットル〜約２５グラム／リットルまたは約２４グラム／リットル〜約２５グラム／リットルである。ある実施態様において、可溶性組み換えタンパク質の収量は、約１０グラム／リットル〜約１３グラム／リットル、約１２グラム／リットル〜約１４グラム／リットル、約１３グラム／リットル〜約１５グラム／リットル、約１４グラム／リットル〜約１６グラム／リットル、約１５グラム／リットル〜約１７グラム／リットル、約１６グラム／リットル〜約１８グラム／リットル、約１７グラム／リットル〜約１９グラム／リットル、約１８グラム／リットル〜約２０グラム／リットル、約２０グラム／リットル〜約２２グラム／リットル、約２２グラム／リットル〜約２４グラム／リットルまたは約２３グラム／リットル〜約２５グラム／リットルである。ある実施態様において、可溶性組み換えタンパク質の収量は、約１０グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約１２グラム／リットル〜約２４グラム／リットル、約１４グラム／リットル〜約２２グラム／リットル、約１６グラム／リットル〜約２０グラム／リットルまたは約１８グラム／リットル〜約２０グラム／リットルである。ある実施態様において、抽出タンパク質収量は、約５グラム／リットル〜約１５グラム／リットル、約５グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約１５グラム／リットル、約１０グラム／リットル〜約２５グラム／リットル、約１５グラム／リットル〜約２０グラム／リットル、約１５グラム／リットル〜約２５グラム／リットルまたは約１８グラム／リットル〜約２５グラム／リットルである。
【０１２８】
ある実施態様において、可溶性フラクションで検出される目的の可溶性ポリペプチドまたはタンパク質の量は、産生される総可溶性ポリペプチドまたはタンパク質の約１０％〜約１００％である。ある実施態様において、この量は、産生される目的の可溶性ポリペプチドまたはタンパク質の量の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％または約１００％である。ある実施態様において、この量は、産生される目的の可溶性ポリペプチドまたはタンパク質の量の約１０％〜約２０％、２０％〜約５０％、約２５％〜約５０％、約２５％〜約５０％、約２５％〜約９５％、約３０％〜約５０％、約３０％〜約４０％、約３０％〜約６０％、約３０％〜約７０％、約３５％〜約５０％、約３５％〜約７０％、約３５％〜約７５％、約３５％〜約９５％、約４０％〜約５０％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約７５％、約５０％〜約９５％、約７０％〜約９５％または約８０〜約１００％である。
【０１２９】
ある実施態様において、目的の可溶性ポリペプチドまたはタンパク質の量は、培養で産生される総可溶性タンパク質のパーセンテージとして表される。目的の可溶性ポリペプチドまたはある細胞密度でのタンパク質重量／細胞培養物体積で示されるデータは、総細胞タンパク質の組み換えタンパク質パーセントで表されるデータに変換できる。例えば、ある細胞密度での細胞培養物の体積あたりの総細胞タンパク質の量を知ることにより、体積タンパク質収量を％総細胞タンパク質に変換することは、当業者の能力の範囲内である。この数値は、１)ある細胞密度での細胞重量／培養物の体積および２)細胞重量に含まれる総タンパク質のパーセントが分かるならば、決定され得る。例えば、１.０のＯＤ５５０で、大腸菌の乾燥細胞重量は０.５グラム／リットルと報告されている(“Production of Heterologous Proteins from Recombinant DNA Escherichia coli in Bench Fermentors,” Lin, N.S., and Swartz, J.R., 1992, METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 4: 159-168)。細菌細胞は、多糖、脂質および核酸ならびにタンパク質からなる。大腸菌細胞は、タンパク質が大腸菌細胞の５２.４重量％を構成すると推定するDa Silva, N.A., et al., 1986, “Theoretical Growth Yield Estimates for Recombinant Cells,” Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXVIII: 741-746および大腸菌のタンパク質含量を５５％乾燥細胞重量と報告する“Escherichia coli and Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology,” 1987, Ed. in Chief Frederick C. Neidhardt, Vol. 1, pp. 3-6を含むが、これらに限定されない文献により、約５２.４〜５５％タンパク質であると報告されている。上記記載を使用して(すなわち、０.５グラム／リットルの乾燥細胞重量および５５％細胞重量のタンパク質)、大腸菌の１.０のＡ５５０での細胞培養物体積あたりの総細胞タンパク質量は、２７５μg総細胞タンパク質／ml／Ａ５５０と計算される。湿細胞重量に基づく細胞培養物体積あたりの総細胞タンパク質の計算は、例えば、大腸菌についての１.０のＡ６００が１.７グラム／リットルの湿細胞重量および０.３９グラム／リットルの乾燥細胞重量をもたらすとする、Glazyrina, et al. の報告(Microbial Cell Factories 2010, 9:42、引用により本明細書に包含)を使用できる。例えば、この湿細胞重量対乾燥細胞重量比較および上記５５％乾燥細胞重量としてのタンパク質を使用して、大腸菌について１.０のＡ６００での細胞培養物体積あたりの総細胞タンパク質量は、２１５μg総細胞タンパク質／ml／Ａ６００と計算される。シュードモナス・フルオレッセンスについて、ある細胞密度での細胞培養物体積あたりの総細胞タンパク質量は大腸菌で見られるものに類似する。シュードモナス・フルオレッセンスは、大腸菌と同様、グラム陰性、桿菌である。Edwards, et al., 1972, “Continuous Culture of Pseudomonas fluorescens with Sodium Maleate as a Carbon Source,” Biotechnology and Bioengineering, Vol. XIV, pages 123-147に報告されているシュードモナス・フルオレッセンスＡＴＣＣ１１１５０の乾燥細胞重量は、０.５グラム／リットル／Ａ５００である。これは、１.０のＡ５５０で大腸菌についてLin, et al.により報告されているのと同じ重量である。５００nmおよび５５０nmで行われる光散乱測定値は、極めて類似すると予測される。シュードモナス・フルオレッセンスＨＫ４４について総細胞タンパク質が占める細胞重量のパーセントは、例えば、Yarwood, et al., July 2002, “Noninvasive Quantitative Measurement of Bacterial Growth in Porous Media under Unsaturated-Flow Conditions,” Applied and Environmental Microbiology 68(7):3597-3605により、５５％と報告されている。このパーセンテージは、上記文献により大腸菌について示されているのに類似するかまたは同じである。
【０１３０】
ある実施態様において、産生される目的の可溶性ポリペプチドまたはタンパク質の量は、培養物中に産生される総可溶性タンパク質の約０.１％〜約９５％である。ある実施態様において、この量は、培養物中に産生される総可溶性タンパク質の約０.１％、０.５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を超える。ある実施態様において、この量は、培養物中に産生される総可溶性タンパク質の約０.１％、０.５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％である。ある実施態様において、この量は、培養物中に産生される総可溶性タンパク質の約５％〜約９５％、約１０％〜約８５％、約２０％〜約７５％、約３０％〜約６５％、約４０％〜約５５％、約１％〜約９５％、約５％〜約３０％、約１％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約５０〜約６０％、約６０％〜約７０％または約８０％〜約９０％である。
【０１３１】
ある実施態様において、産生される目的の可溶性ポリペプチドまたはタンパク質の量は、乾燥細胞重量(ＤＣＷ)の約０.１％〜約５０％である。ある実施態様において、この量は、ＤＣＷの約０.１％、０.５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％または５０％を超える。ある実施態様において、この量は、ＤＣＷの約０.１％、０.５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％または５０％である。ある実施態様において、この量は、培養物中に産生される総可溶性タンパク質の約５％〜約５０％、約１０％〜約４０％、約２０％〜約３０％、約１％〜約２０％、約５％〜約２５％、約１％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％または約４０％〜約５０％である。
【０１３２】
ある実施態様において、本発明の方法を使用して製造される分泌リーダーにとって異種である目的の可溶性ポリペプチドまたはタンパクの量は、宿主細胞を含み、実質的に類似する条件、例えば、増殖条件下で産生したときの分泌リーダーにとって天然であるタンパク質の量より多い。ある実施態様において、本方法により、ＡｎｓＢ、８４８４または５１９３分泌リーダーに操作可能に結合される目的の可溶性異種ポリペプチドまたはタンパク質は、各リーダーにとって天然であるタンパク質の量より多い量で産生される。ある実施態様において、ＡｎｓＢ、８４８４または５１９３分泌リーダーに操作可能に結合される目的の可溶性異種ポリペプチドまたはタンパク質は、実質的に類似する条件下で産生される、該リーダーにとって天然であるタンパク質より約１.２倍〜約５倍多い、約１.２倍〜約２.５倍、約１.２倍〜約２倍、約１.２倍〜約１.５倍、約１.４倍〜約３倍多い、約１.４倍〜約２.５倍、約１.４倍〜約２倍、約１.５倍〜約３倍、約１.５倍〜約２.５倍、約１.５倍〜約２倍、約２倍〜約３倍、約１.２倍、約１.３倍、約１.４倍、約１.５倍、約１.６倍、約１.７倍、約１.８倍、約１.９倍、約２倍、約２.５倍、約３倍、約４倍または約５倍多い収量で産生される。
【０１３３】
ある実施態様において、本発明の方法を使用して、該分泌リーダーに操作可能に結合される目的の可溶性ポリペプチドまたはタンパク質の量は、実質的に類似する条件、例えば、増殖条件下で、該分泌リーダーを用いずにまたは異なる分泌リーダーを用いて産生される目的のポリペプチドまたはタンパク質の量より多い。増殖条件は、例えば、使用する培養培地および宿主細胞を含み得る。ある実施態様において、本方法により、ＡｎｓＢ、８４８４または５１９３分泌リーダーに操作可能に結合される目的の可溶性異種ポリペプチドまたはタンパク質は、分泌リーダーを用いずにまたは異なる分泌リーダーを用いて産生される目的のタンパク質の量より多い量で産生される。ある実施態様において、ＡｎｓＢ、８４８４または５１９３分泌リーダーに操作可能に結合される目的の可溶性異種ポリペプチドまたはタンパク質は、実質的に類似する条件下で、分泌リーダーを用いずにまたは異なる分泌リーダーを用いて産生されるタンパク質の量より約１.２倍〜約２０倍多い、約１.２倍〜約２.５倍、約１.２倍〜約２倍、約１.２倍〜約１.５倍、約１.４倍〜約３倍多い、約１.４倍〜約２.５倍、約１.４倍〜約２倍、約１.５倍〜約３倍、約１.５倍〜約２.５倍、約１.５倍〜約２倍、約２倍〜約５倍、約２倍〜約１０倍、約５倍〜約１５倍、約１０倍〜約２０倍、約１.２倍、約１.３倍、約１.４倍、約１.５倍、約１.６倍、約１.７倍、約１.８倍、約１.９倍、約２倍、約２.５倍、約３倍、約４倍、約５倍多い、約１０倍多い、約１５倍多いまたは約２０倍多い収量で産生される。
【０１３４】
溶解度および活性
タンパク質の「溶解度」および「活性」は、品質に関係するが、一般に種々の手段により決定される。タンパク質、特に疎水性タンパク質の溶解度は、疎水性アミノ酸残基が折り畳まれたタンパク質外側に不適切に位置することを示す。しばしば、例えば、下記のとおり、種々の方法を使用して評価されるタンパク質活性は、適切なタンパク質高次構造の他のインディケータである。ここで使用する「可溶性、活性または両者」は、当分野で知られる方法により、可溶性、活性または可溶性かつ活性両者であることが決定されたタンパク質をいう。
【０１３５】
活性アッセイ
目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の活性を評価するアッセイは当分野で知られ、当業者に利用可能な蛍光定量、比色定量、化学発光、分光光度および他の酵素アッセイを含むが、これらに限定されない。これらのアッセイを使用して、目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の活性を、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の商業的なまたは他の調製物と比較する。
【０１３６】
ある実施態様において、活性は、アッセイした総量と比較した、抽出上清におけるパーセント活性タンパク質により表される。これは、アッセイで使用したタンパク質の総量に対する、アッセイにより活性であると決定された、タンパク質の量に基づく。他の実施態様において、活性は、標準、例えば、天然タンパク質と比較した、タンパク質の％活性レベルにより表される。これは、標準サンプルにおける活性タンパク質の量に対する上清抽出サンプルにおける活性タンパク質の量に基づく(各サンプルから同量のタンパク質をアッセイに使用したとき)。
【０１３７】
ある実施態様において、目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の約４０％〜約１００％が活性であると決定される。ある実施態様において、目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％が活性であると決定される。ある実施態様において、目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％、約９０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約４０％〜約９０％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約９５％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約９０％、約６０％〜約９５％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約９０％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約１００％または約７０％〜約１００％が活性であると決定される。
【０１３８】
他の実施態様において、目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の約７５％〜約１００％が活性であると決定される。ある実施態様において、目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の約７５％〜約８０％、約７５％〜約８５％、約７５％〜約９０％、約７５％〜約９５％、約８０％〜約８５％、約８０％〜約９０％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約９０％、約８５％〜約９５％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約９５％、約９０％〜約１００％または約９５％〜約１００％が活性であると決定される。
【０１３９】
目的のタンパク質
ここでの方法および組成物は、細胞発現系において高レベルの適切に形成された目的の組み換えタンパク質またはポリペプチドを産生するために有用である。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチド(ここでは「標的タンパク質」または「標的ポリペプチド」とも称する)は、任意の種および任意のサイズである。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチドは治療上有用なタンパク質またはポリペプチドである。ある実施態様において、タンパク質は、哺乳動物タンパク質、例えばヒトタンパク質、例えば、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子または血液タンパク質である。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチドは、対照タンパク質またはポリペプチドに類似する方法で形成される。ある実施態様において、タンパク質またはポリペプチドは、コード配列に分泌シグナルを含まない。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチドは、サイズが１００kD未満、５０kD未満または３０kD未満である。ある実施態様において、目的のタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０または１００アミノ酸のものである。
【０１４０】
分子遺伝学および遺伝子工学技術に必要な広範な配列情報は、広く一般に入手可能である。哺乳動物ならびにヒトの完全ヌクレオチド配列、遺伝子、ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびゲノムへのアクセスは、しばしばGenBankから、ウェブサイトwww.ncbi.nlm.nih.gov/Entrezで得られる。さらなる情報は、Weizmann Institute of Science Genome and Bioinformaticsからの遺伝子およびその産物ならびに生物医学的応用に関する情報をまとめた電子百科事典であるGeneCardsからも得られることがあり、ヌクレオチド配列情報はEMBL Nucleotide Sequence Databaseまたは日本ＤＮＡデータバンク(ＤＤＢＪ)から得られることもあり、アミノ酸配列についての情報のさらなるサイトは、Georgetown's protein information resource websiteおよびSwiss-Protを含む。
【０１４１】
本発明の組成物および方法でしばしば発現されるタンパク質の例は、例えば、レニン、ヒト成長ホルモンを含む成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；トロンボポエチン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば第VIIIＣ因子、第IX因子、組織因子およびフォンウィルブランド因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲンアクティベーター(ｔ−ＰＡ)；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子アルファおよびベータ；エンケファリナーゼ；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ポリペプチド；微生物タンパク質、例えばベータ−ラクタマーゼ；Ｄｎａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)；ホルモンまたは増殖因子の受容体；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ様因子；神経栄養因子、例えば脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、ニューロトロフィン−３、−４、−５もしくは−６(ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６)または神経増殖因子、例えばＮＧＦ−β；カルジオトロフィン(心肥大因子)、例えばカルジオトロフィン−１(ＣＴ−１)；血小板由来成長因子(ＰＤＧＦ)；線維芽細胞増殖因子、例えばａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮成長因子(ＥＧＦ)；トランスフォーミング増殖因子(ＴＧＦ)、例えばＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−β；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−II(ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−II)；ｄｅｓ(１−３)−ＩＧＦ−Ｉ(脳ＩＧＦ−Ｉ)、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、−ベータおよび−ガンマ；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン(ＩＬ)、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；抗ＨＥＲ−２抗体；スーパーオキシドディスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレッシン；制御タンパク質；抗体；および上記ポリペプチドの何れかのフラグメントなどの分子を含むが、これらに限定されない。
【０１４２】
ある実施態様において、タンパク質またはポリペプチドはＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｅｌａｓｔｉ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８ＢＰａ、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＶＩＰ、エリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、血小板由来成長因子(ＰＤＧＦ)、ＭＳＦ、ＦＬＴ−３リガンド、ＥＧＦ、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ；例えば、α−ＦＧＦ(ＦＧＦ−１)、β−ＦＧＦ(ＦＧＦ−２)、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６またはＦＧＦ−７)、インスリン様増殖因子(例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２)；腫瘍壊死因子(例えば、ＴＮＦ、リンフォトキシン)、神経増殖因子(例えば、ＮＧＦ)、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)；インターフェロン(例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ)；白血病阻止因子(ＬＩＦ)；毛様体神経栄養因子(ＣＮＴＦ)；オンコスタンチンＭ；幹細胞因子(ＳＣＦ)；トランスフォーミング増殖因子(例えば、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３)；ＴＮＦスーパーファミリー(例えば、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＳＴＡＬＬ−１／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ(ＢＬｙ５、ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ)、ＴＮＦアルファ／ＴＮＦＳＦ２およびＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２)；またはケモカイン(ＢＣＡ−１／ＢＬＣ−１、ＢＲＡＫ／Ｋｅｃ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ３、ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ、エオタキシン−１、エオタキシン−２／ＭＰＩＦ−２、エクソダス−２／ＳＬＣ、フラクタルカイン／ニューロタクチン、ＧＲＯアルファ／ＭＧＳＡ、ＨＣＣ−１、Ｉ−ＴＡＣ、リンホタクチン／ＡＴＡＣ／ＳＣＭ、ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ／ＳＴＣＰ−１／ＡＢＣＤ−１、ＭＩＰ−１.quad.、ＭＩＰ−１.quad.、ＭＩＰ−２.quad.／ＧＲＯ.quad.、ＭＩＰ−３.quad.／エクソダス／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３／エクソダス−３／ＥＬＣ、ＭＩＰ−４／ＰＡＲＣ／ＤＣ−ＣＫ１、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１、ＴＡＲＣ、ＴＥＣＫまたは毒素(例えば、ω−アガトキシン、μ−アガトキシン、アイトキシン、アロプミリオトキシン２６７Ａ、ω−アトラトキシン−ＨＶ１、δ−アトラトキシン−Ｈｖ１ｂ、バトラコトキシン、ボトロセチン、アレノブファギン、ブホタリン、ブフォテニン・シノブファギン、マリノブファギン、ブンガロトキシン、カルシクルジン、カルシスプテイン、カルディオトキシンIII、カトロコラスタチンＣ、カリブドトキシン、コブラ毒細胞毒、コノトキシン、エキノイジン、エレドイシン、エピバチジン、フィブロラーゼ、ヘフトキシン、ヒストリオニコトキシン、フエントキシンＩ、フエントキシンII、Ｊ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｃクニッツ型毒素、デンドロトキシンＫ、デンドロトキシン１、ラトロトキシン、マルガトキシン、マウロトキシン、オンキダール、ＰｈＴｘ３、プミリオトキシン２５１Ｄ、ガラガラヘビ・レクチン、ロブストキシン、サキシトキシン、シラトキシン、スロトキシン、ストロマトキシン、タイカトキシン、タリカトキシン、テトロドトキシン、リシン、ゲロニン、アフラトキシン、アマトキシン、シトリニン、サイトカラシン、エルゴタミン、フマギリン、フモニシン、グリオトキシン、ヘルボール酸、イボテン酸、ムッシモール、オクラトキシン、パツリン、ステリグマトシスチン、トリコテセン、ボミトキシン、ゼラノール、ゼアラレノン、炭疽毒素、アデニル酸シクラーゼ保護抗原、ｒＰＡ、Ｃｒｙトキシン、ボルデテラ・パーツシス毒素、クロストリジウム・ボツリヌム毒素、クロストリジウム・ディフィシル毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンス毒素、破傷風菌毒素、ジフテリア毒素、ベロ毒素／志賀様毒素、熱安定性エンテロトキシン、熱不安定性エンテロトキシン、エンテロトキシン、リステリオリシンＯ、結核菌コードファクター、シュードモナス外毒素、サルモネラ内毒素、サルモネラ外毒素、志賀毒素、黄色ブドウ球菌アルファ毒素、黄色ブドウ球菌ベータ毒素、黄色ブドウ球菌デルタ毒素、エクスフォリアチン毒素、毒素ショック症候群毒素、エンテロトキシン、ロイコシジン、ストレプトリジンＳまたはコレラ毒素)から選択される。
【０１４３】
ここでのある実施態様において、目的のタンパク質は、マルチサブユニットタンパク質またはポリペプチドである。発現されるマルチサブユニットタンパク質は、ホモマーおよびヘテロマータンパク質を含む。マルチサブユニットタンパク質は、同一でも異なってもよい２以上のサブユニットを含み得る。例えば、タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサブユニットを含むホモマータンパク質であり得る。プロテインはまた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサブユニットを含むヘテロマータンパク質であり得る。マルチサブユニットタンパク質の例は、イオンチャネル受容体を含む受容体；コンドロイチンを含む細胞外マトリクスタンパク質；コラーゲン；ＭＨＣタンパク質、完全鎖抗体、抗体誘導体および抗体フラグメントを含む免疫調節剤；ＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼを含む酵素；および膜タンパク質を含む。
【０１４４】
他の実施態様において、目的のタンパク質は、血液タンパク質であることがある。この実施態様で発現される血液タンパク質は、担体タンパク質、例えば、ヒトおよびウシアルブミンを含むアルブミン、トランスフェリン、組み換えトランスフェリン半分子、ハプトグロビン、フィブリノゲンおよび他の凝固因子、補体成分、免疫グロブリン、酵素阻害剤、アンギオテンシンおよびブラジキニンなどの物質の前駆体、インスリン、エンドセリンおよびアルファ、ベータおよびガンマ−グロブリンを含むグロブリンならびに主に哺乳動物血液に見られる他のタイプのタンパク質、ポリペプチドおよびそのフラグメントなどを含むが、これらに限定されない。多数の血液タンパク質についてアミノ酸配列が報告されており(S. S. Baldwin (1993) Comp. Biochem Physiol. 106b:203-218参照)、ヒト血清アルブミン(Lawn, L. M., et al., 1981, Nucleic Acids Research, 6103-6114)およびヒト血清トランスフェリン(Yang, F. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2752-2756)についてのアミノ酸配列を含む。
【０１４５】
他の実施態様において、目的のタンパク質は、組み換え酵素または補因子であることがある。この実施態様で発現される酵素および補因子は、アルドラーゼ、アミンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アスパルターゼ、Ｂ１２依存性酵素、カルボキシペプチダーゼ、カルボキシエステラーゼ、カルボキシリアーゼ、ケモトリプシン、ＣｏＡ要求性酵素、シアノヒドリンシンテターゼ、シスタチオンシンターゼ、デカルボキシラーゼ、デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、ジアホラーゼ、ジオキシゲナーゼ、エノエートレダクターゼ、エポキシドヒドラーゼ、フマラーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ニトリルヒドラーゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、オキシドレダクターゼ、オキシニトリラーゼ、ペプチダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、治療活性ポリペプチドに融合した酵素、組織プラスミノーゲン活性化因子；ウロキナーゼ、レプチラーゼ、ストレプトキナーゼ；カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ；Ｄｎａｓｅ、アミノ酸加水分解酵素(例えば、アスパラギナーゼ、アミド加水分解酵素)；カルボキシペプチダーゼ；プロテアーゼ、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、コラゲナーゼ；ノイラミニダーゼ；ラクターゼ、マルターゼ、スクラーゼおよびアラビノフラノシダーゼを含むが、これらに限定されない。
【０１４６】
他の実施態様において、目的のタンパク質は、抗体または抗体誘導体であることがある。ある実施態様において、抗体または抗体誘導体は、ヒト化抗体、修飾抗体、単一ドメイン抗体(例えば、ナノボディ、サメシングルドメインＩｇＮＡＲまたはＶＮＡＲ抗体、ラクダ類シングルドメイン抗体)、異種特異的抗体、三価抗体、二特異的抗体(例えば、ＢｉＴＥ分子)、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂフラグメント、直線状抗体、ダイアボディ、完全鎖抗体またはそのフラグメントもしくは一部である。一本鎖抗体は、しばしば一つの安定に折り畳まれたポリペプチド鎖上の抗体の抗原結合領域を含む。Ｆａｂフラグメントは、しばしば特定の抗体の一片である。Ｆａｂフラグメント通常は、抗原結合部位を含む。Ｆａｂフラグメントは、しばしば２つの鎖、軽鎖および重鎖フラグメントを含む。これらのフラグメントは、通常リンカーまたはジスルフィド結合を介して連結される。本方法において有用な抗体および抗体誘導体は当分野で知られ、文献、例えば、本明細書の他の箇所で引用し、引用により本明細書に包含させる米国９,５８０,７１９の表９に記載されている。
【０１４７】
目的のタンパク質またはポリペプチドのコード配列は、しばしば、利用可能であれば、標的ポリペプチドにとって天然コード配列であるが、より頻繁には、例えば、シュードモナス・フルオレッセンスなどのシュードモナス種または他の適当な生物のコドン利用バイアスを反映した遺伝子の合成により選択発現宿主細胞における使用のために選択、改善または最適化されているコード配列である。得られる遺伝子は、１以上のベクター内で構築されるかまたはその中に挿入されており、次いで該ベクターが発現宿主細胞に形質転換される。「発現可能形態」で提供されると言われる核酸またはポリヌクレオチドは、選択発現宿主細胞により発現される少なくとも一つの遺伝子を含む、核酸またはポリヌクレオチドをいう。
【０１４８】
ある実施態様において、目的のタンパク質は、天然哺乳動物またはヒトタンパク質などの天然タンパク質であるか、またはそれに実質的に相同である。これらの実施態様において、タンパク質はコンカテマー形態では見られないが、分泌シグナルおよび所望により精製および／または認識用のタグ配列にのみ連結される。
【０１４９】
他の実施態様において、目的のタンパク質は、約２０〜約４２℃の温度で活性であるタンパク質である。ある実施態様において、タンパク質は生理学的温度で活性であり、６５℃を超える温度のような高温または極端な温度に加熱したとき、不活性化される。
【０１５０】
ある実施態様において、目的のタンパク質は、約２０〜約４２℃の温度で活性であるおよび／または６５℃を超える温度のような高温または極端な温度に加熱したとき不活性化される；天然哺乳動物またはヒトタンパク質などの天然タンパク質であるかまたはそれに実質的に相同であり、核酸からコンカテマー形態で発現されない；そしてプロモーターは、シュードモナス・フルオレッセンスの天然プロモーターではなく、大腸菌などの他の生物由来であるタンパク質である。
【０１５１】
他の実施態様において、タンパク質は、産生したとき、またさらなる標的化配列、例えばタンパク質を細胞外培地に標的化する配列も含む。ある実施態様において、さらなる標的化配列は、該タンパク質のカルボキシ末端に操作可能に結合される。他の実施態様において、タンパク質は、オートトランスポーター、２パートナー分泌系、メインターミナルブランチ系または線毛アッシャーポリンのための分泌シグナルを含む。
【０１５２】
次の実施例は、説明として提供され、限定としてではない。
【実施例】
【０１５３】
次の実施例は本発明の種々の実施態様を説明する目的で示し、どのような方式でも本発明を限定することを意図しない。本実施例は、ここに記載する方法と共に、現在代表的な実施態様であり、例示であり、範囲を限定することは意図されない。特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の精神内に含まれるその変更および他の使用は、当業者により容易に想到される。
【０１５４】
実施例１：タンパク質発現分析
３つのシュードモナス・フルオレッセンス分泌リーダー、ＡｎｓＢ、８４８４および５１９３の各々が、３つの異なる組み換えタンパク質の可溶性発現を指示する効率を、０.５mL培養規模で評価した。
【０１５５】
各分泌リーダーコード配列を、大腸菌Ｋ−１２チオレドキシン１(Ｔｒｘ−１またはＴｒｘＡ、１１.９kDa)、Ｇａｌ２一本鎖抗体(ｇａｌ２  ｓｃＦｖ、２９.６kDa)およびバチルス・アンシラシス変異体組み換え保護抗原(ｍｒＰＡ、８３.７kDa)をコードする遺伝子と、インフレームで融合させた。これらの構築物から発現されたタンパク質を、同じ組み換えタンパク質の各々に融合したＰｂｐ分泌リーダーコード配列を有する構築物および各タンパク質の細胞質発現のために構築された株からの発現と比較した。細胞質発現株構築物は、イニシエーターメチオニン、続いて、ＴｒｘＡ、Ｇａｌ２またはｍｒＰＡコード配列に融合したアラニンをコードした。プラスミド構築物でシュードモナス・フルオレッセンス株ＤＣ４５４を形質転換し、選択的培地(Ｍ９グルコース)で増殖させて、陽性クローンを単離した。この試験の結果を、下の表６に示す。ＳＤＳ−ＣＧＥ像例を、図１(ＴｒｘＡ)、図２(Ｇａｌ２ｓｃＦｖ)および図３(ｍｒＰＡ)に示す。
【表６】
2021501157.tif 000008
【０１５６】
各株を、無機塩培地で２４時間、トリプリケートで増殖させ、続いてＩＰＴＧで誘導し、さらに２４時間インキュベートした。ブロスを集め、ＰＢＳで３倍希釈し、超音波処理し、遠心分離した。上清を可溶性タンパク質フラクションとして集め、ＳＤＳ−ＣＧＥ(Caliper LabChip(登録商標)GXII系を使用)により分析した。誘導されたバンドを、系内部ラダーとの比較で定量化した。Ｇａｌ２  ｓｃＦｖおよびｍｒＰＡタンパク質は、ＡｎｓＢ、８４８４および５１９３リーダーと融合させたとき、ＴｒｘＡより高いレベルで発現されたが、該タンパク質を細胞質に標的化させたとき、Ｇａｌ２またはｍｒＰＡの発現は検出されなかった。
【０１５７】
実施例２：９６ウェル形式でのクリサンタスパーゼＴｉｅｒ  １発現プラスミドスクリーニング
さらに、エルウィニア属II型Ｌ−アスパラギナーゼ(クリサンタスパーゼ)−リーダー融合構築物からのタンパク質発現を評価した。
【０１５８】
発現プラスミドスクリーニングのために、最適化クリサンタスパーゼタンパク質コード配列を、シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現のために設計し、合成した。クリサンタスパーゼペプチド配列(図４、アミノ酸配列は配列番号７として示し、核酸配列は配列番号８として示す)をコードするＤＮＡを、シュードモナス・フルオレッセンスのための適切なコドン使用を反映するように設計した。特有の制限酵素部位(ＳａｐＩまたはＬｇｕＩ)を含むＤＮＡ領域を、発現ベクターに存在する分泌リーダーコード配列とのインフレームでの融合を指示するように設計されたクリサンタスパーゼコード配列の上流に加えた。３つの終止コドンおよび特有の制限酵素部位(ＳａｐＩ)を含むＤＮＡ領域を、コード配列下流に加えた。３７の異なるシュードモナス・フルオレッセンス分泌リーダーおよび２つのリボソーム結合部位(ＲＢＳ)親和性に融合した最適化クリサンタスパーゼ遺伝子を担持するプラスミドを構築した(表７)。さらなるプラスミドを構築して、細胞質内にクリサンタスパーゼタンパク質を局在化させるために周辺リーダーを伴わないクリサンタスパーゼタンパク質を発現させた。標的の発現はＰｔａｃプロモーターから駆動され、翻訳は高活性リボゾーム結合部位(ＲＢＳ)から開始された。得られた４０プラスミドを、２つのシュードモナス・フルオレッセンス宿主株、ＤＣ４５４(ＷＴ)およびＤＣ４４１(ＰＤ)に形質転換して、Ｔｉｅｒ  １(発現戦略)スクリーニングのために８０発現株を産生した。発現戦略の等級付けは、クリサンタスパーゼ単量体のＳＤＳ−ＣＧＥ推定力価に基づいた。発現戦略スクリーニングの主要目的は、発現プラスミドおよびその組み込まれた遺伝要素の大サブセットの評価および得られる標的発現の品質が劣悪な発現戦略の除外であった。
【０１５９】
８０形質転換(４０発現戦略×２宿主株)から得られた培養物を、実施例２に記載のとおり９６ウェルプレートで増殖させた。誘導２４時間後に収集した全培養ブロスからの超音波処理フラクションサンプルを、ＳＤＳ−ＣＧＥにより分析した。クリサンタスパーゼ単量体の予測分子量(３５kDa)と一致し、また大腸菌Ｌ−Ａｓｐ(Sigma Product #A3809)と共遊走する誘導タンパク質発現を定量化した。還元サンプルのＳＤＳ−ＣＧＥ定量化を、誘導されたバンドと大腸菌Ｌ−Ａｓｐ標準曲線との比較により達成した。ＤＣ４５４およびＤＣ４４１宿主株両者からの２０の最高収量サンプルを、推定可溶性クリサンタスパーゼ単量体力価に基づきランク付けした(表９)。図５は、９６ウェル培養物可溶性超音波処理サンプルの分析により作成したＳＤＳ−ＣＧＥゲル様の図を示す。表９は、ＤＣ４５４(左の表)およびＤＣ４４１(右の表)宿主株において発現されるプラスミドについて、
還元可溶性超音波処理物のＳＤＳ−ＣＧＥ分析により推定され、Labchip(登録商標)内部ラダーにより定量化された２４時間誘導後(Ｉ２４)力価を示す。各ｐ７４３発現プラスミドから産生された分泌リーダー融合も示す。
【０１６０】
ＤＣ４５４およびＤＣ４４１宿主株両者由来の上位１０位の最高収量発現株で観察された６つのプラスミドおよび組み込まれた分泌リーダー(ｐ７４３−０１３(ＦｌｇＩ)、ｐ７４３−０３８(８４８４)、ｐ７４３−０２０(ＬｏｌＡ)、ｐ７４３−０１８(ＤｓｂＣ)、ｐ７４３−００９(Ｉｂｐ−Ｓ３１Ａ)およびｐ７４３−０３４(５１９３))を、表９で＊＊で示す。さらに、クリサンタスパーゼタンパク質の細胞質発現のために設計されたｐ７４３−００１発現プラスミドは、両宿主について上位２位の最高可溶性収量にランク付けされた。合わせた両宿主株から、上位１０位最高可溶性力価は、５２５〜１,５２３μg／mL範囲であった。全発現で観察された不溶性収量は低く、達成された最高不溶性収量はｐ７４３−０１３プラスミドを使用して２３０μg／mLであった。ＳＤＳ−ＣＧＥバンド形成パターン(図５)の観察は、大部分の完全分泌リーダー処理(周辺質への排出による除去)はｐ７４３−０１３、ｐ７４３−０３３(リーダーＯ)、ｐ７４３−０３８、ｐ７４３−００９およびｐ７４３−０１８発現プラスミドを使用して生じたが、ｐ７４３−０１６およびｐ７４３−０１７プラスミドは、顕著に低い分子量の切断産物を産生することが観察された。表８に示す１０の発現プラスミドは、ＳＤＳ−ＣＧＥ推定高可溶性力価に基づき、９６ウェルＨＴＰ規模でのその後の宿主株スクリーニングに選択した。次いで、１０の選択発現戦略を、クリサンタスパーゼタンパク質力価および品質にさらに影響する２４の特有の宿主株と組み合わせた。
【表７】
2021501157.tif 000009
【表８】
2021501157.tif 000010
【０１６１】
表９は、ＤＣ４５４(左の表)およびＤＣ４４１(右の表)宿主株において発現されるプラスミドについて、還元可溶性超音波処理物のＳＤＳ−ＣＧＥ分析により推定され、Labchip(登録商標)内部ラダーにより定量化された２４時間誘導後(Ｉ２４)の力価を示す。各ｐ７４３発現プラスミドから産生された分泌リーダー融合も示す。
【表９】
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【０１６２】
実施例３：大腸菌アスパラギナーゼ発現構築物の調製
大腸菌アスパラギナーゼ−リーダー融合構築物からのタンパク質発現を評価した。
【０１６３】
大腸菌Ａ−１−３  Ｌ−アスパラギナーゼII遺伝子を、シュードモナス・フルオレッセンスでの発現のために最適化し、細胞質および周辺発現のために一組の発現ベクターにクローン化した。使用するアミノ酸配列は、ここに配列番号９として開示されている。使用する核酸配列は、ここに配列番号１０として開示されている。
【０１６４】
発現を、一連の分泌リーダー配列を使用して評価し、一部は高ＲＢＳ配列および一部は中ＲＢＳ配列であった。さらに、細胞質発現を、リーダーを使用せずに評価した。
【０１６５】
各構築物を、シュードモナス・フルオレッセンス宿主株ＤＣ４５４(ｐｙｒＦ欠損、ＰＤまたはＦＭＯ無し)およびＤＣ４４１(ｐｙｒＦ欠損ＰＤ)に形質転換し、得られた発現株を、０.５mL培養で大腸菌Ａ−１−３  Ｌ−アスパラギナーゼII産生について評価した。全培養液を超音波処理し、遠心分離し、可溶性フラクションをＳＤＳ−ＣＧＥで分析した。
【０１６６】
９６ウェル形式での増殖および発現
発現プラスミドスクリーニングのために、大腸菌Ａ−１−３  Ｌ−アスパラギナーゼII発現プラスミドの各々のライゲーション混合物を、次のとおり、シュードモナス・フルオレッセンス宿主株ＤＣ４５４およびＤＣ４４１細胞に形質転換した。２５マイクロリットルのコンピテント細胞を解凍し、９６マルチウェルNucleovette(登録商標)プレート(Lonza)に移し、ライゲーション混合物を各ウェルに加えた。細胞をNucleofectorTM  ９６ウェルShuttleTM系(Lonza AG)を使用して電気穿孔した。次いで、細胞を９６ディープウェルプレートに、４００μl  Ｍ９塩１％グルコース培地および微量元素と共に移した。９６ウェルプレート(播種プレート)を、３０℃で振盪させながら４８時間インキュベートした。１０マイクロリットルの種培養物を、９６ディープウェルプレートにデュプリケートで移し、各ウェルは、微量元素および５％グリセロールを添加した５００μlのＨＴＰ培地を含み、先のとおり、２４時間インキュベートした。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を、２４時間時点で各ウェルに０.３mMの最終濃度で加えて、標的タンパク質の発現を誘導した。マンニトール(Sigma)を、１％の最終濃度で各ウェルに加えて、折り畳みモジュレーター過発現株における折り畳みモジュレーターの発現を誘導した。細胞密度を、増殖をモニターするために誘導２４時間後光学密度６００nm(ＯＤ６００)で測定した。誘導２４時間後、細胞を集め、１×ＰＢＳで４００μlの最終体積に１：３希釈し、次いで凍結した。下記のとおりサンプルを調製し、分析した。
【０１６７】
発現プラスミドスクリーニングで同定された上位サンプルの発現結果を表１０および１１に示す。
【表１０】
2021501157.tif 000012
【表１１】
2021501157.tif 000013
【０１６８】
宿主株スクリーニングについて、発現プラスミドスクリーニング結果に基づき選択された発現プラスミドを、各々、野生型(ＷＴ)または親ＤＣ４５４株、プロテアーゼ欠失(ＰＤ)株、折り畳みモジュレーター過発現(ＦＭＯ)株およびプロテアーゼ欠失と折り畳みモジュレーター過発現(ＰＤ／ＦＭＯ)株を含む、アレイで２４シュードモナス・フルオレッセンス宿主株の各々に形質転換した。シュードモナス・フルオレッセンスアスパラギナーゼ分泌リーダー(ＡｎｓＢ)に融合した大腸菌アスパラギナーゼをアレイに含めた(配列番号１として示すアミノ酸配列；配列番号４として示すコード配列)。折り畳みモジュレーターは、存在するとき、第二プラスミドにコードされ、発現はシュードモナス・フルオレッセンス−天然マンニトール誘導性プロモーターにより駆動された。宿主株スクリーニング形質転換を次のとおり実施した：２５マイクロリットルのシュードモナス・フルオレッセンス宿主株コンピテント細胞を解凍し、９６マルチウェルNucleovette(登録商標)プレートに移し、１０μlプラスミドＤＮＡ(１０ng)を各ウェルに加えた。プラスミド発現スクリーニングについて上記のとおり、細胞を電気穿孔し、培養し、ＨＴＰ形式で誘導し、集めた。下記のとおりサンプルを調製し、分析した。
【０１６９】
分析用サンプル調製
可溶性フラクションを超音波処理、続いて遠心分離により調製した。培養ブロスサンプル(４００μL)を、次の設定下、２４プローブチップホーンを用いるCell Lysis Automated Sonication System(CLASS, Scinomix)で超音波処理した：パルスあたり１０秒間でウェルあたり２０パルスおよび各パルス間１０秒間６０％出力(Sonics Ultra-Cell)。溶解物を、５,５００×ｇで１５分間(４℃)遠心分離し、上清を集めた(可溶性フラクション)。
【０１７０】
ＳＤＳ−ＣＧＥ分析
タンパク質サンプルを、マイクロチップＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動により、Labchip  GXII装置(PerkinElmer)をHT Protein Expressチップおよび対応する試薬(PerkinElmer)と共に使用して分析した。サンプルを製造業者のプロトコルに従い調製した(Protein User Guide Document No. 450589, Rev. 3)。簡潔には、９６ウェルポリプロピレン円錐形ウェルＰＣＲプレートで、４μLのサンプルを１４μLのサンプル緩衝液、７０mM  ＤＴＴ還元剤と混合し、加熱した。
【０１７１】
誘導２４時間後全培養液サンプルを上記のとおり処理し、可溶性フラクションをＳＤＳ−ＣＧＥにより分析した。
【０１７２】
商業的に入手可能なＬ−アスパラギナーゼ活性アッセイキット(Sigma)により、ヌルサンプルと比較して、有意なＬ−アスパラギナーゼ活性が、最高産生株ＳＴＲ５５３８２(Ｌａｏリーダー)からのＨＴＰ培養溶解物サンプルから検出された。
【０１７３】
発現プラスミドスクリーニング実験でスクリーニングしたプラスミドおよび対応する分泌リーダーは次のものを含む。
ｐ７４２−００６(Ａｚｕ)
ｐ７４２−００８(ＬＡＯ)
ｐ７４２−００９(Ｉｂｐ−Ｓ３１Ａ)
ｐ７４２−０１６(Ｐｂｐ)
ｐ７４２−０１７(ＰｂｐＡ２０Ｖ)
ｐ７４２−０２１(リーダーＤ)
ｐ７４２−０３７(リーダーＲ)
ｐ７４２−０３８(８４８４)
ｐ７４２−０４１(シュードモナス・フルオレッセンスＡｎｓＢ)。
【０１７４】
発現株を上記のとおり培養し、誘導した。可溶性および不溶性フラクションのＳＤＳ−ＣＧＥ分析は、アスパラギナーゼの高レベル発現を示した(図６)。表１２に示すものを含む発現株で高力価が観察された。
【表１２】
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【０１７５】
実施例４：株の構築
次のシュードモナス・フルオレッセンスアスパラギナーゼＫＯ宿主株を産生した。
【０１７６】
ＰＦ１４３３(ＰｙｒＦ、ＡｓｐＧ１およびＡｓｐＧ２欠損)を、宿主株ＤＣ４５４(ＰｙｒＦ欠損)におけるａｓｐＧ２およびａｓｐＧ１遺伝子の連続的欠失により構築した。
【０１７７】
ＰＦ１４３４(ＰｙｒＦ、ＰｒｏＣ、ＡｓｐＧ１およびＡｓｐＧ２欠損)を、宿主株ＤＣ４５５(ｐｙｒＦ  ｐｒｏＣ)におけるａｓｐＧ１およびａｓｐＧ２遺伝子の連続的欠失により構築した。株ＤＣ４５５は、ＤＣ５４２およびＤＣ５４９両者の親株である。
【０１７８】
ＰＦ１４４２(ＰｙｒＦ、ＰｒｏＣ、ＡｓｐＧ１、ＡｓｐＧ２、Ｌｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａ、Ｐｒｃ１およびＡｐｒＡ欠損)は、宿主株ＰＦ１２０１(ＰｙｒＦ、ＰｒｏＣ、プロテアーゼＬｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａ、Ｐｒｃ１およびＡｐｒＡ欠損)におけるａｓｐＧ２およびａｓｐＧ１の連続的欠失により構築した。
【０１７９】
ＰＦ１４４３(ＰｙｒＦ、ＰｒｏＣ、ＡｓｐＧ１およびＡｓｐＧ２欠損；ｐＤＯＷ３７００から発現されたＦＭＯ  ＬｅｐＢ)は、ＬｅｐＢコード化ＦＭＯプラスミドｐＤＯＷ３７００のＰＦ１４３４への形質転換により構築した。
【０１８０】
ＰＦ１４４４(ＰｙｒＦ、ＰｒｏＣ、ＡｓｐＧ１およびＡｓｐＧ２欠損；ｐＤＯＷ３７０７から発現されたＦＭＯ  Ｔｉｇ)を、Ｔｉｇコード化ＦＭＯプラスミドｐＤＯＷ３７０３のＰＦ１４３４への形質転換により構築した。
【０１８１】
ＰＦ１４４５(ＰｙｒＦ、ＰｒｏＣ、ＡｓｐＧ１、ＡｓｐＧ２、Ｌｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｓ２１９Ａ、Ｐｒｃ１およびＡｐｒＡ欠損；ｐＦＮＸ４１４２から発現されたＦＭＯ  ＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐ)を、ＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐコード化プラスミドｐＦＮＸ４１４２でのＰＦ１４４２の形質転換により構築した。
【０１８２】
表１３に記載する株を使用する。
【表１３】
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【０１８３】
実施例５：選択発現株の２Ｌ発酵および可溶性％ＴＣＰ計算
実施例３に記載する株ＳＴＲ５７８６３およびＳＴＲ５７８６０を２Ｌ発酵に調整し、各々８つまでの異なる発酵条件下スクリーニングした。２Ｌ規模発酵(約１Ｌ最終発酵体積)を、酵母エキスおよびグリセロールを添加した６００mLの合成培地を含む振盪フラスコに、選択株の凍結培養貯蔵物を接種することにより産生した。３０℃で１６〜２４時間振盪しながらインキュベートした後、各振盪フラスコ培養物の等量を、高バイオマスを支持するように設計された合成培地を含む８ユニット多重発酵系の各々に無菌的に移した。２Ｌ発酵装置中、グリセロール流加バッチモードでｐＨ、温度および溶存酸素制御条件下、培養を操作した。流加バッチ高細胞密度発酵法は、増殖期と、続く、培養が標的バイオマス(湿細胞重量)に達したときのＩＰＴＧおよび５ｇ／Ｌマンニトール添加により開始される誘導期からなる。誘導期中の条件は、実験計画により変わった。発酵の誘導期は、約２４時間進行させた。分析サンプルを発酵装置から抜いて、細胞密度(５７５nmの光学密度)を決定し、次いで、その後の標的遺伝子発現レベルの決定の分析のために凍結させた。誘導後２４時間の最終時点で、各容器の全発酵ブロスを、１５,９００×ｇで６０〜９０分間の遠心分離により集めた。細胞ペーストと上清を分離し、ペーストを保持し、−８０℃で凍結した。
【０１８４】
表１４は、数発酵条件下の、株ＳＴＲ５７８６３およびＳＴＲ５７８６０での発現結果を示す。示されるとおり、初期株／発酵条件組み合わせのいくつかは、＞３０％ＴＣＰアスパラギナーゼ発現をもたらした。総細胞タンパク質は次のとおり計算した。
Ａ５５０での０.５５  ＤＣＷ総細胞タンパク質×５００μg／mL  ＤＣＷ＝Ａ５５０での２７５μg総細胞タンパク質／ml(またはmg／Ｌ)＝１
最終時点(Ｉ２４)でのＴＣＰ＝ＯＤ５７５＊２７５mg／Ｌ  ＴＣＰ
可溶性％ＴＣＰ＝１００＊(可溶性力価／ＴＣＰ)
【０１８５】
【表１４】
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【０１８６】
実施例６：アスパラギナーゼ振盪フラスコ発現
振盪フラスコ発現(２００mL)をクリサンタスパーゼ、大腸菌II型Ｌ−アスパラギナーゼおよびシュードモナス・フルオレッセンスII型Ｌ−アスパラギナーゼ発現株からのタンパク質産生の評価のために実施した。表１５に示すとおり、アスパラギナーゼ発現プラスミドをアスパラギナーゼ欠損宿主株ＰＦ１４３３に形質転換して、発現株を産生した。振盪フラスコサンプルから産生された溶解物を、ＬＣ−ＭＳ分析による初期活性分析およびインタクト質量の確認に使用した。
【表１５】
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【０１８７】
表１５は、２００mL作業体積振盪フラスコ規模で分析した、ＰＦ１４３３宿主株(天然アスパラギナーゼ欠損、野生型株)を使用して構築した３種のクリサンタスパーゼ発現株の還元可溶性および不溶性超音波処理フラクション(１０の異なる繰り返し)のＳＤＳ−ＣＧＥ分析により決定した平均推定力価を示す。ＳＤＳ−ＣＧＥ力価を、大腸菌Ｌ−Ａｓｐ(Sigma)標準曲線との比較に基づき推定した。各株の可溶性および不溶性超音波処理分析両者から撮ったＳＤＳ−ＣＧＥゲル様画像を図７に示す。ＡｎｓＢリーダーを含む構築物(ＳＴＲ５５９８１、天然分泌リーダー−天然アスパラギナーゼタンパク質融合)から産生されたシュードモナス・フルオレッセンス天然Ｌ−Ａｓｐ２タンパク質の力価が、ＡｎｓＢリーダー(ＳＴＲ５５９７６)を含む構築物、すなわち、ＡｎｓＢリーダーが異種アスパラギナーゼタンパク質に融合したものから産生された大腸菌アスパラギナーゼタンパク質の力価より相当低かったことが顕著である(６７７μg／mlに対して１０１１μg／ml、約１.５倍差)。
【０１８８】
本分析には、２つのヌル株ＳＴＲ５５９８２およびＤＣ４３２からの振盪フラスコ増殖が含まれた。ＤＣ４３２株は、野生型シュードモナス・フルオレッセンス宿主株にクリサンタスパーゼコーディング領域を含まないプラスミドｐＤＯＷ１１６９を担持する。ＳＴＲ５５９８２は、両天然アスパラギナーゼコード配列の染色体欠失を含む、宿主株ＰＦ１４３３にプラスミドｐＤＯＷ１１６９を担持する。産生された全３つのクリサンタスパーゼ発現株は主に可溶性クリサンタスパーゼタンパク質発現を生じ、株ＳＴＲ５５９７８が１４ｇ／Ｌまでの最高可溶性力価を達成した。さらに、増殖ペナルティは全３種のクリサンタスパーゼ発現株で観察されず、誘導２４時間後で類似の細胞密度(ＯＤ６００＝２３.０、２７.０および２７.８)を達成し、それぞれ誘導２４時間後に２１.７および２３.７のＯＤ６００となったＳＴＲ５５９８２およびＤＣ４３２ヌル株と同等であった。
【０１８９】
５つの振盪フラスコ発現株の各々から産生した可溶性超音波処理サンプルを、Sigmaから購入した商業的キット(Asparaginase Activity Assay Kit)を製造業者の指示に従い使用して、アスパラギナーゼ活性を分析した。このキットは、産生されるアスパラギン酸に比例的な比色分析最終産物を産生する共役酵素反応を使用して、活性を測定する。Sigmaからの大腸菌アスパラギナーゼII型(Ａ３８０９)を、陽性対照(最終行)としてＳＴＲ５５９８２ヌル溶解物に添加した。
【０１９０】
活性結果を表１６に示す。
【表１６】
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【０１９１】
ヌルサンプルの両者とも、１：２５,０００希釈係数で測定可能な活性は示さなかったが、１：２５,０００希釈した株ＳＴＲ５５９７６、ＳＴＲ５５９７７、ＳＴＲ５５９７８、ＳＴＲ５５９７９およびＳＴＲ５５９８０からの可溶性超音波処理サンプルは、Sigma(Ａ３８０９)からの２５０μg／mL大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼを添加した同様に希釈したＳＴＲ５５９８２ヌル株サンプルと同等の活性を示した。商業的に入手可能なキットを使用したこれらの初期活性結果は、シュードモナス・フルオレッセンスで発現されるクリサンタスパーゼタンパク質および大腸菌アスパラギナーゼタンパク質が、産生された超音波処理物内で活性、四量体アスパラギナーゼ酵素を容易に形成し得ることを示すと考えられる。
【０１９２】
表１７は、振盪フラスコ内で株ＳＴＲ５５９７８、ＳＴＲ５５９７９およびＳＴＲ５５９８０により産生された可溶性超音波処理物からのクリサンタスパーゼタンパク質ならびに株ＳＴＲ５５９７６およびＳＴＲ５５９７７により産生された可溶性超音波処理物からの大腸菌アスパラギナーゼの分析からのＬＣ−ＭＳインタクト質量結果を示す。各株からのクリサンタスパーゼタンパク質の実測分子量(３５,０５３Da)は、理論的分子量(３５０５４.２Da)と一致し、３株全てが予測アミノ酸配列を産生し、存在するならば、分泌リーダーの完全な処理または除去をすることを示す。各株からの大腸菌アスパラギナーゼの実測分子量(３４５９１)は理論的分子量(３４５９１.９６)と一致し、両株が予測アミノ酸配列を産生し、分泌リーダーの完全な処理または除去が生じたことを示す。Sigma大腸菌Ｌ−Ａｓｐを対照として分析した。図８は、ＳＴＲ５５９７８のマススペクトロメトリー読み出しを示し、ＡｎｓＢリーダーからのクリサンタスパーゼの適切な開裂を示す。ＳＴＲ５５９７６およびＳＴＲ５５９７７で発現される大腸菌Ａｓｐ２は、ＬＣ−ＭＳによると、それぞれＡｎｓＢおよびＩｂｐ−Ｓ３１Ａリーダーから適切に開裂されることが示された。
【表１７】
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【０１９３】
【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【０１９４】
本発明の好ましい実施態様はここに示し、記載しているが、このような実施態様は例としてのみ提供される。多数の変動、変化および置換を、本発明から逸脱することなく、当業者により行われ得る。ここに記載する本発明の実施態様に対する種々の改変を、本発明の方法の実施に際し用い得ることは理解される。添付する特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの請求項の範囲内の方法および構造およびその等価物がそれにより範囲に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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