(57)【要約】  線虫の使用に基づく臭気物質の自動検出のための装置（１０００）および方法であって、中間線虫個体群を得る初期線虫個体群から成虫期の線虫を選択するように構成された機械的選択ユニット（１００）と、中間個体群から成虫期の線虫の最終個体群を選択し、産卵成虫期の線虫から若い成虫期の線虫を選択して、臭気物質の刺激への最終個体群の線虫の反応を検出するように構成された測定ユニット（３００）に送るように構成された線虫光学的選択ユニット（２００）とを備え、機械的選択ユニット（１００）は、少なくとも３路分岐を有する接続チャネルによって光学的選択ユニット（２００）に接続され、光学的選択ユニット（２００）は、ローディングマイクロチャネルによって測定ユニット（３００）に接続される。【選択図】図１
2021500543.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線虫の使用に基づく臭気物質の検出のための自動装置（１０００）であって、中間線虫個体群を得る初期線虫個体群から成虫期の線虫を選択するように構成された機械的選択ユニット（１００）と、前記中間個体群から成虫期の線虫の最終個体群を選択し、産卵成虫期の線虫から若い成虫期の線虫を選択して、臭気物質の刺激への前記最終個体群の線虫の反応を検出するように構成された測定ユニット（３００）に送るように構成された線虫光学的選択ユニット（２００）とを備え、前記機械的選択ユニット（１００）は、少なくとも３路分岐を有する接続チャネルによって前記光学的選択ユニット（２００）に接続され、前記光学的選択ユニット（２００）は、ローディングマイクロチャネルによって前記測定ユニット（３００）に接続され、
−  前記機械的選択ユニット（１００）は、線虫を含むメンテナンス緩衝液を容器（１２）に導入するように構成された少なくとも１つの第１の閉鎖可能な入口ノズルと、追加の緩衝液を前記容器（１２）に導入するように構成された少なくとも１つの第２の閉鎖可能な入口ノズルとを備えた収集容器（１２）を備え、前記容器（１２）には、第１の開口構成および第２の閉鎖構成をとるように構成された閉鎖可能な出口穴（１５）および電動二重格子（１４）が設けられ、前記少なくとも１つの第１のノズルおよび前記少なくとも１つの第２のノズルは、前記容器（１２）の基部付近に配置され、前記基部から始めて前記容器（１２）を満たすように構成され、前記電動二重格子（１４）は、前記容器の前記基部と平行に、これから前記少なくとも１つの第１のノズルおよび前記少なくとも１つの第２のノズルよりも大きい距離に配置され、線虫の卵または幼虫のみがその穴を通過するように構成され；
−  前記光学的選択ユニット（２００）は、前記中間個体群の線虫を１匹ずつチャネリングするように構成された少なくとも３つの測定マイクロ流体チャネルと、前記チャネリングされた線虫の長さ測定を実行するように構成された３つの光センサ（２２、２３、２４）と、前記少なくとも３つの測定マイクロ流体チャネルを照明するように構成され、前記個々のチャネリングされた線虫の自己蛍光測定を実行するように構成されたダブルフォトダイオード（２６）に関連付けられた照明器（２５）と、線虫を前記測定ユニット（３００）または廃液タンク（１６）へと導くように構成された前記光学的選択ユニット（２００）と、前記測定ユニット（３００）内の線虫の通過を妨害するように構成された遮断弁とを備え、；
−  前記測定ユニット（３００）は、線虫を前記マイクロ流体回路（５１）内へと誘導するように構成されたローディングマイクロチャネルに接続されたローディング穴、および前記マイクロ流体回路（５１）からの線虫を除去するように構成された排出穴を備えた柱状マイクロ流体回路（５１）を有するマイクロ流体チップ（５０）を含む中心層であって、前記チップ（５０）は、第１の入口チャネルを介して試験液を受け取り、第２の入力チャネルを介して中性緩衝液を受け取るように構成される、中心層と、前記マイクロ流体回路（５１）を照明する連続光および変調光を放出するように構成された光源を備え、前記放出された変調光は、線虫の蛍光を刺激するように構成され、前記光源は線虫の蛍光を受け取るように構成されたフォトダイオードと関連付けられた、第１の端層と、前記中心層に対して前記第１の端層の反対側にある光センサを備え、前記放出された連続光によって照明されたときに前記マイクロ流体回路（５１）の透過光画像を取得し、臭気物質の存在下および非存在下で運動性線虫を分析するように構成された第２の端層とを備え、
前記装置（１０００）は、前記機械的選択ユニット（１００）、前記光学的選択ユニット（２００）および前記測定ユニット（３００）を制御する制御ユニットをさらに備える、装置。
【請求項２】
前記少なくとも３路の前記接続チャネルおよび前記ローディングマイクロチャネルは、１００μｍ以上のセクションを有する、請求項１に記載の装置（１０００）。
【請求項３】
前記二重格子（１４）の前記穴は、５０μｍ〜５００μｍの範囲のサイズを有する、請求項１または２に記載の装置（１０００）。
【請求項４】
前記少なくとも３つの測定マイクロ流体チャネルのそれぞれについて、前記３つの光センサ（２２、２３、２４）は、前記チャネルの長手方向に沿って配置され、前記第１の光センサ（２２）、前記第２の光センサ（２３）および前記第３の光センサ（２４）のチャネルでの直角投影がそれぞれ第１の目標位置、第２の目標位置および第３の目標位置を特定する距離で互いから平行移動され、前記第２の光センサ（２３）および前記第３の光センサ（２４）は所望により、前記第１の光センサ（２３）からそれぞれ約９００μｍおよび１０００μｍ平行移動されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の装置（１０００）。
【請求項５】
前記少なくとも３つの測定マイクロ流体チャネルのそれぞれに関して、各光センサ（２２、２３、２４）は第１の高さに配置され、前記照明器（２５）は前記第１の高さと反対の第２の高さに配置され、前記照明器（２５）は前記第３の目標位置に対する中心位置、所望により前記第１の目標位置および前記第２の目標位置に対して中心に配置される、請求項４に記載の装置（１０００）。
【請求項６】
前記第１の端層の前記光源は、所望により変調周波数が１ＫＨｚを超えない、所望によりそれぞれ５５０ｎｍおよび４７０ｎｍで連続光および変調光を放出するように二重アレイで配置されたＬＥＤである、請求項１から５のいずれか一項に記載の装置（１０００）。
【請求項７】
請求項１に記載の装置を使用した線虫の使用に基づいて臭気物質を自動的に検出する方法であって、前記方法は、
線虫の初期個体群を含む初期量のメンテナンス緩衝液を、前記少なくとも１つの第１の閉鎖可能な入口ノズルを開いて、マイクロチャネル構造（１１）を通る過圧システムを介して前記機械的選択ユニット（１００）の前記容器（１２）に注入する（６００）ステップであって、前記初期量のメンテナンス緩衝液は、開口構成で前記二重格子（１４）に触れるようなものである、ステップと；
ある時間の経過後、ある量の追加の緩衝液を、前記少なくとも１つの第２の閉鎖可能な入口ノズルを開いて、マイクロチャネルの前記構造（１１）を通る前記機械的選択ユニット（１００）の前記容器（１２）にパルス状に注入する（６１０）ステップであって、最低比重、および前記開いた二重格子（１４）の穴のサイズよりも小さな特定のサイズを有する前記初期個体群のメンバーが前記二重格子を通過するように前記開いた二重格子（１４）へと前記初期線虫個体群を押し込むステップと、
前記二重格子（１４）ならびに前記少なくとも１つの第１の閉鎖可能な入口ノズルおよび前記少なくとも１つの第２の閉鎖可能な入口ノズルを閉鎖する（６１１）ことにより、前記収集容器（１２）が、大部分が成虫期である線虫の中間個体群を含む中間量のメンテナンス緩衝液を含む、ステップと；
前記閉鎖可能な出口穴（１５）を開き（６１２）、線虫を前記少なくとも３つの測定マイクロ流体チャネルに個別にチャネリングするように、少なくとも３路分岐を有する前記接続チャネルを通して前記中間量の液体を前記光学的選択ユニット（２００）に注入するステップと、
個々のチャネリングされた線虫を光学的に選択する（６２０）ステップであって、
−  個々のチャネリングされた線虫の長さｌを光学的に測定し（６２１）、前記長さｌが決定された長さの範囲Δｌに含まれるかどうかを確認し（６２２）、前記長さｌが前記決定された範囲Δｌに含まれない場合、前記少なくとも３つの測定チャネル出口にいる前記個々のチャネリングされた線虫を前記廃液タンク（１６）へと破棄する（６３０）、サブステップと；
−  前記個々のチャネリングされた線虫の緑色自己蛍光Ｆgreenおよび赤色自己蛍光Ｆredを測定し（６２３）、比率Δ（Ｆgreen／Ｆred）が決定された閾値εよりも小さいかどうかを確認し（６２４）、前記比率Δ（Ｆgreen／Ｆred）が前記閾値εよりも大きい場合、前記少なくとも３つの測定チャネル出口にいる前記個々のチャネリングされた線虫を前記廃液タンク（１６）へと破棄する（６３０）、サブステップと；
−  前記長さｌが、前記範囲Δｌ内にあり、前記比率Δ（Ｆgreen／red）が前記決定された閾値εよりも小さい場合、前記個々のチャネリングされた線虫を、前記ローディングマイクロチャネルおよび前記ローディング穴に向けて前記測定ユニット（３００）の前記柱状マイクロ流体回路（５１）に送り（６４０）、前記測定ユニット（３００）に送られた線虫数Ｎを数えるサブステップと；
を含む光学的に選択するステップ（６２０）と：
Ｎが所定の値Ｎtot以上であるかどうかを確認し（６５０）、ＮがＮtot以上であれば、前記遮断弁を作動させることによって前記測定ユニット（３００）内の線虫の通過を遮断する（６６０）ステップと；
前記柱状マイクロ流体回路（５１）内のＮ匹の線虫の臭気物質に対する反応を分析するステップ（６７０）であって、
−  前記柱状ピラーマイクロ流体回路（５１）の領域を、前記第１の端層の前記光源によって放出した光で照明する（６７１）サブステップと；
−  前記光源に関連付けられた前記フォトダイオードを介して前記柱状マイクロ流体回路（５１）の前記領域全体で積分した第１の自己蛍光信号を測定し（６７２）、蛍光バックグラウンド値を取得し、前記柱状マイクロ流体回路（５１）の前記領域の光センサ、ｓＣＭＯＳまたはＣＣＤを介して透過光画像を取得し、前記マイクロ流体回路（５１）内の線虫の数および運動性を確認するサブステップと；
−  少なくとも１種の臭気物質を含み得る試験液を、第３のタンク（１７）から前記チップ（５０）に注入する（６７３）サブステップと；
−  中性緩衝液を第４のタンク（１８）から前記チップ（５０）内に注入し（６７４）、前記試験液を前記出口タンクに排出するサブステップと；
−  前記第１の端層の前記光源に関連付けられた前記フォトダイオードを介して、第２の積分蛍光信号を測定する（６７５）サブステップと；
−  立上がり時間τriseおよび立下がり時間τfall等、前記第２の蛍光信号のパラメータを計算する（６７６）サブステップと；
−  τriseが第１の時間範囲Ｔ1に含まれているか（τrise∈Ｔ1）、かつτfallが第２の時間範囲Ｔ2に含まれているか（τfall∈Ｔ2）を確認し（６７７）、Ｔ1およびＴ2は、臭気物質の存在下で線虫によって感知される刺激の不足によって活性化するニューロン中のカルシウム濃度の再構成の標準時間範囲であり、
【数１】
2021500543.tif 000007
かつ
【数２】
2021500543.tif 000008
の場合、前記方法は、前記試験液に臭気物質が存在しないことを認識するが、τrise∈Ｔ1かつτfall∈Ｔ2の場合、前記方法は走化性に起因する線虫の運動性があるかどうかを確認する（６７９）サブステップと；
−  前記マイクロ流体回路（５１）の前記領域のｓＣＭＯＳまたはＣＣＤ光センサを通じて透過光画像を取得する（６７８）サブステップと；
−  前記取得した画像を分析して（６７９）、走化性に起因する運動性があるかどうかを確認する（６８０）ために、線虫の運動性を決定するサブステップであって、
−  走化性に起因する運動性がない場合、前記方法は、前記試験液に臭気物質が存在しないことを認識するが、
−  走化性に起因する運動性がある場合、前記方法は、前記試験液に臭気物質が存在することを認識する、サブステップと；
−  前記中性緩衝液を前記チップ（５０）から前記出口タンク内に排出する（６９０）サブステップと
を通して行うステップと
を含む、方法。
【請求項８】
前記Ｎ匹の線虫の反応を分析する前記ステップ（６７０）は、ｍ回実行され（ｍ＝１，２，…、所望により２に等しい）、その後前記方法が終了する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記長さの範囲Δ１は、前記第２の光センサ（２３）から前記第１の光センサ（２２）までの距離と前記第３の光センサ（２４）から前記第１の光センサ（２２）までの距離との間の範囲であり、所望により、９００μｍ〜１０００μｍの範囲である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記閾値εは０．５に等しい、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｎtotは２０〜５０の範囲である、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記取得された画像を分析する前記ステップ（６７９）は、後続の透過画像を比較することによって、バイナリ画像を生成する弁別閾手順を通して実行され、それにより、画素は、強度が決定された閾値を超えているか否かに応じてバックグラウンドまたは線虫に関連付けられる、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、効率的で確実、簡単かつ安価な多細胞微生物の使用に基づく、溶液中の分子化合物を自動で検出する装置および方法に関する。
【０００２】
特に、本装置は、高い化学的感受性および走化性（単細胞または多細胞微生物が、周囲環境における化学物質の存在に応じて自身の移動を誘導する現象）を示す特定の分子化合物を認識し、これと相互作用することに高度に効率的な、線虫のカエノラブディティスエレガンスまたはＣ．エレガンスの使用に基づく。このような分子化合物は、線虫Ｃ．エレガンスの感覚器の嗅覚系と相互作用するため、これらは臭気物質（ｏｄｏｒａｎｔ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅまたはｏｄｏｒａｎｔ）とも呼ばれる。
【０００３】
本発明は、添付の特許請求の範囲で定義される保護の範囲内に留まりながらも、例えば、腫瘍マーカーおよび他の疾患の早期検出のための医療分野におけるスクリーニング、特定の化学化合物または毒素の存在を検出するための環境汚染の制御、行動力学に関連付けられた分子の検出を通じた人工知能および人間とロボットの相互作用の開発等のさまざまな適用状況に適用されてよい。
【背景技術】
【０００４】
Ｃ．エレガンスは、その遺伝子組み換え系統が特定の分子標的への誘引に関して極めて高効率であることが文献により知られており、その嗅覚系を刺激する分子に反応してニューロン活動可能という性質を持つ。その神経系の大部分およびその遺伝子の５％超は、環境中の化学物質認識に特化している。化学物質感受性刺激は、走化性、全体的な運動性の変化および各種発達期間の遷移を誘発し得る。これらの挙動は、１１対の化学感覚ニューロンを含む、感覚器官である双器によって制御される。各感覚ニューロンは、特定の候補受容体遺伝子のセットを発現し、誘引分子、忌避分子、またはフェロモンの特定のセットを識別する。約５００〜１０００の異なるＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）が化学感覚ニューロンで発現される。したがって、Ｃ．エレガンスは高度に発達した化学感覚系を有し、これにより、さまざまな種類の揮発性または水溶性化合物を識別できるようにする。“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ”  ｂｙ  Ｎ．Ｂａｋｈｔｉｎａ，Ｊ．Ｋｏｒｖｉｎｋ，ＲＳＣ  Ａｄｖ．，２０１４，４，４６９１の論文では、著者はＣ．エレガンスが、多様な分子、例えば塩化ナトリウムＮａＣｌ、エタノール、イソアミルアルコール、塩化銅ＣｕＣｌ２、イベルメクチン、シアン化物、グリセロール、抗生物質、重金属を識別することを示している。Ｈｉｒｏｔｓｕ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５），Ａ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｔｅｓｔ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０（３）：ｅ０１１８６９９，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１１８６９９では、腫瘍代謝産物へのＣ．エレガンス感受性が示されている。今までのところニューロン活動を刺激すると思われない分子に関して、必要な受容体が嗅覚ニューロンの一部で発現される線虫の遺伝子組換え変異体を開発することが可能である。すなわち、Ｃ．エレガンスに適用される遺伝子工学技術のおかげで、所定の臭気物質に高い感受性を持つトランスジェニックワーム系統を作成することが可能である。
【０００５】
現在の臭気物質の識別技術は、実験中の臭気物質による刺激から線虫が分離されるときに発する蛍光パルス（ニューロン活動）の測定に基づく。主な欠点は、線虫が高速で繁殖するため、先に選択した個体群が数時間後には非常に不均一になることである。Ｃ．エレガンスの発達期は、胚期、４つの幼虫期（Ｌ１〜Ｌ４）、成虫期に体系化できる。成虫期では、若い成虫期と産卵を始める成虫期を区別することができる。卵、産卵期の成虫、または死期が近い（またはすでに死んでいる）個体が存在すると、線虫に典型的な非常に高レベルの自己蛍光が生じるため、ニューロン反応の測定が特に複雑になる。したがって、１回の測定と比較した１／２時間の精度での同時線虫飼育が必要となり、化合物の検出が線虫飼育と無関係である可能性は低い。上記の欠点により、線虫Ｃ．エレガンス等の多細胞微生物の使用に基づく分子化合物検出技術の長時間の自動の、すなわち工業規模実験による使用が困難になる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、これまでに記載された欠点を克服し、線虫Ｃ．エレガンス等の微小多細胞微生物を使用することにより特定の分子化合物を確実、安全かつ安価に検出する方法を可能にすることである。
【０００７】
本発明の特定の主題は、線虫の使用に基づく臭気物質の検出のための自動装置であって、中間線虫個体群を得る初期線虫個体群から成虫期の線虫を選択するように構成された機械的選択ユニットと、中間個体群から成虫期の線虫の最終個体群を選択し、産卵成虫期の線虫から若い成虫期の線虫を選択して、臭気物質の刺激への最終個体群の線虫の反応を検出するように構成された測定ユニットに送るように構成された線虫光学的選択ユニットとを備え、機械的選択ユニットは、少なくとも３路分岐を有する接続チャネルによって光学的選択ユニットに接続され、光学的選択ユニットは、ローディングマイクロチャネルによって測定ユニットに接続され、
−  機械的選択ユニットは、線虫を含むメンテナンス緩衝液を容器に導入するように構成された少なくとも１つの第１の閉鎖可能な入口ノズルと、追加の緩衝液を容器に導入するように構成された少なくとも１つの第２の閉鎖可能な入口ノズルとを備えた収集容器を備え、容器には、第１の開口構成および第２の閉鎖構成をとるように構成された閉鎖可能な出口穴および電動二重格子が設けられ、当該少なくとも１つの第１のノズルおよび当該少なくとも１つの第２のノズルは、容器の基部付近に配置され、基部から始めて容器を満たすように構成され、電動二重格子は、容器の基部と平行に、基部から当該少なくとも１つの第１のノズルおよび当該少なくとも１つの第２のノズルよりも大きい距離に配置され、線虫の卵または幼虫のみがその穴を通過するように構成され；
−  光学的選択ユニットは、中間個体群の線虫を１匹ずつチャネリングするように構成された少なくとも３つの測定マイクロ流体チャネルと、チャネリングされた線虫の長さ測定を実行するように構成された３つの光センサと、少なくとも３つの測定マイクロ流体チャネルを照明するように構成され、個々のチャネリングされた線虫の自己蛍光測定を実行するように構成されたダブルフォトダイオードに関連付けられた照明器と、線虫を測定ユニットまたは廃液タンクへと導くように構成された光学的選択ユニットと、測定ユニット内の線虫の通過を妨害するように構成された遮断弁とを備え；
−  測定ユニットは、線虫をマイクロ流体回路内へと誘導するように構成されたローディングマイクロチャネルに接続されたローディング穴、およびマイクロ流体回路からの線虫を除去するように構成された排出穴を備えた柱状マイクロ流体回路を有するマイクロ流体チップを含む中心層であって、チップは、第１の入口チャネルを介して試験液を受け取り、第２の入力チャネルを介して中性緩衝液を受け取るように構成される、中心層と、マイクロ流体回路を照明する連続光および変調光を放出するように構成された光源を備え、放出された変調光は、線虫の蛍光を刺激するように構成され、光源は線虫の蛍光を受け取るように構成されたフォトダイオードと関連付けられた、第１の端層と、中心層に対して第１の端層の反対側にある光センサを備え、放出された連続光によって照明されたときにマイクロ流体回路の透過光画像を取得し、臭気物質の存在下および非存在下で運動性線虫を分析するように構成された第２の端層とを備え；
装置は、機械的選択ユニット、光学的選択ユニットおよび測定ユニットを制御する制御ユニットをさらに備える。
【０００８】
本発明の別の態様によれば、当該少なくとも３路の接続チャネルおよび当該ローディングマイクロチャネルは、１００μｍ以上のセクションを有することができる。
【０００９】
本発明のさらなる態様によれば、二重格子の当該穴は、５０μｍ〜５００μｍの範囲のサイズを有することができる。
【００１０】
本発明の追加の態様によれば、当該少なくとも３つの測定マイクロ流体チャネルのそれぞれについて、当該３つの光センサは、チャネルの長手方向に沿って配置されてよく、第１の光センサ、第２の光センサおよび第３の光センサのチャネルでの直角投影がそれぞれ第１の目標位置、第２の目標位置および第３の目標位置を特定する距離で互いから平行移動されてよく、第２の光センサおよび第３の光センサは所望により、第１の光センサからそれぞれ約９００μｍおよび１０００μｍ平行移動されている。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、当該少なくとも３つの測定マイクロ流体チャネルのそれぞれに関して、各光センサは第１の高さに配置されてよく、当該照明器は第１の高さと反対の第２の高さに配置されてよく、当該照明器は第３の目標位置に対する中心位置、所望により第１の目標位置および第２の目標位置に対して中心に配置される。
【００１２】
本発明のさらなる態様によれば、第１の端層の当該光源は、所望によりに変調周波数が１ＫＨｚを超えない、所望によりそれぞれ５５０ｎｍおよび４７０ｎｍで連続光および変調光を放出するように二重アレイで配置されたＬＥＤであってよい。
【００１３】
本発明のさらなる特定の主題は、本発明の自動検出装置を使用した線虫の使用に基づいて臭気物質を自動的に検出する方法であって、本方法は、
線虫の初期個体群を含む初期量のメンテナンス緩衝液を、当該少なくとも１つの第１の閉鎖可能な入口ノズルを開いて、マイクロチャネル構造を通る過圧システムを介して機械的選択ユニットの容器に注入するステップであって、当該初期量のメンテナンス緩衝液は、開口構成で二重格子に触れるようなものである、ステップと；
ある時間の経過後、ある量の追加の緩衝液を、当該少なくとも１つの第２の閉鎖可能な入口ノズルを開いて、マイクロチャネルの構造を通る機械的選択ユニットの容器にパルス状に注入するステップであって、最低比重、および開いた二重格子通路の穴のサイズよりも小さな特定のサイズを有する初期個体群のメンバーが二重格子を通過するように開いた二重格子へと初期線虫個体群を押し込む、注入するステップと；
二重格子ならびに少なくとも１つの第１の閉鎖可能な入口ノズルおよび少なくとも１つの第２の閉鎖可能な入口ノズルを閉鎖することにより、収集容器が、大部分が成虫期である線虫の中間個体群を含む中間量のメンテナンス緩衝液を含むステップと；
閉鎖可能な出口穴を開き、線虫を少なくとも３つの測定マイクロ流体チャネルに個別にチャネリングするように、少なくとも３路分岐を有する接続チャネルを通して中間量の液体を光学的選択ユニットに注入するステップと；
個々のチャネリングされた線虫を光学的に選択するステップであって、
−  個々のチャネリングされた線虫の長さｌを光学的に測定し、長さｌが決定された長さの範囲Δｌに含まれるかどうかを確認し、長さｌが決定された範囲Δｌに含まれない場合、少なくとも３つの測定チャネル出口にいる個々のチャネリングされた線虫を廃液タンクへと破棄する、サブステップと；
−  個々のチャネリングされた線虫の緑色自己蛍光Ｆgreenおよび赤色自己蛍光Ｆredを測定し、比率Δ（Ｆgreen／Ｆred）が決定された閾値εよりも小さいかどうかを確認し、比率Δ（Ｆgreen／Ｆred）が閾値εよりも大きい場合、少なくとも３つの測定チャネル出口にいる個々のチャネリングされた線虫を廃液タンクへと破棄する、サブステップと；
−  長さｌが、範囲Δｌ内にあり、比率Δ（Ｆgreen／Ｆred）が決定された閾値εよりも小さい場合、個々のチャネリングされた線虫を、ローディングマイクロチャネルおよびローディング穴に向けて測定ユニットの柱状マイクロ流体回路に送り、測定ユニットに送られた線虫数Ｎを数えるサブステップと；
を含む光学的に選択するステップと：
Ｎが所定の値Ｎtot以上であるかどうかを確認し、数ＮがＮtot以上であれば、遮断弁を作動させることによって測定ユニット内の線虫の通過を遮断するステップと；
柱状マイクロ流体回路内のＮ匹の線虫の臭気物質に対する反応を、
−  柱状ピラーマイクロ流体回路の領域を、第１の端層の光源から放出した光で照明するサブステップと；
−  光源に関連付けられたフォトダイオードを介して柱状マイクロ流体回路の領域全体で積分した第１の自己蛍光信号を測定し、蛍光バックグラウンド値を取得し、柱状マイクロ流体回路の領域の光センサ、ｓＣＭＯＳまたはＣＣＤを介して透過光画像を取得し、マイクロ流体回路内の線虫の数および運動性を確認するサブステップと；
−  少なくとも１種の臭気物質を含み得る試験液を、第３のタンクからチップに注入するサブステップと；
−  中性緩衝液を第４のタンクからチップ内に注入し、試験液を出口タンクに排出するサブステップと；
−  第１の端層の光源に関連付けられたフォトダイオードを介して、第２の積分蛍光信号を測定するサブステップと；
−  立上がり時間τriseおよび立下がり時間τfall等、第２の蛍光信号のパラメータを計算するサブステップと；
−  τriseが第１の時間範囲Ｔ1に含まれているか（τrise∈Ｔ1）かつτfallが第２の時間範囲Ｔ2に含まれているか（τfall∈Ｔ2）を確認し、Ｔ1およびＴ2は、臭気物質の存在下で線虫によって感知される刺激の不足によって活性化するニューロン中のカルシウム濃度の再構成の標準時間範囲であり、
【数１】
2021500543.tif 000003
かつ
【数２】
2021500543.tif 000004
の場合、本方法は、試験液に臭気物質が存在しないことを認識するが、τrise∈Ｔ1かつτfall∈Ｔ2の場合、本方法は走化性に起因する線虫の運動性があるかどうかを確認するサブステップと；
−  マイクロ流体回路の領域のｓＣＭＯＳまたはＣＣＤ光センサを通じて透過光画像を取得するサブステップと；
−  取得した画像を分析して、走化性に起因する運動性があるかどうかを確認するために、線虫の運動性を決定するサブステップであって、
−  走化性に起因する運動性がない場合、本方法は、試験液に臭気物質が存在しないことを認識するが、
−  走化性に起因する運動性がある場合、本方法は、試験液に臭気物質が存在することを認識する、サブステップと；
−  中性緩衝液をチップから出口タンク内に排出するサブステップと
を通して分析するステップと
を含む。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、Ｎ匹の線虫の反応を分析する当該ステップは、ｍ回実行されてもよく（ｍ＝１，２，…、所望により２に等しい）、その後本方法が終了する。
【００１５】
本発明の追加の態様によれば、当該長さの範囲Δ１は、第２の光センサから第１の光センサまでの距離と第３の光センサから第１の光センサまでの距離との間の範囲であってよく、所望により、９００μｍ〜１０００μｍの範囲である。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、当該閾値εは、０．５に等しくてもよい。
【００１７】
本発明のさらなる態様によれば、当該Ｎtotは２０〜５０の範囲であってよい。
【００１８】
本発明の追加の態様によれば、取得された画像を分析する当該ステップは、後続の透過画像を比較することによって、バイナリ画像を生成する弁別閾手順を通して実行でき、それにより、画素は、強度が決定された閾値を超えているか否かに応じてバックグラウンドまたは線虫に関連付けられ得る。
【００１９】
従来技術の解決策に関して本発明による装置によって提供される利点は数多くあり、重要である。
【００２０】
サイズおよび比重による線虫の分離単位の発達期の流れに基づいた線虫の分離単位により、不均一な個体群に関して分子化合物を検出するための非常に効率的な線虫の個体群を確保する。これには、例えば、飼育センターから合理的な距離に位置する複数の測定ラボに毎日配送できるように線虫を飼育および分配するシステムを編成することによって、線虫の同時飼育の問題を克服するという第１の利点がある。第２の利点は、分子化合物に対する線虫のニューロン反応の測定における信号雑音比が増加するにつれて、分子化合物の検出の信頼性が高まることである。臭気物質の刺激に対する反応の測定単位は、行動測定、すなわち走化性、およびニューロン活動の測定、すなわちカルシウムイメージングを可能にする。これは、有利には、分子化合物を検出する際の装置の信頼性、すなわちその感度を高め、偽陽性または陰性を低減する。別の重要な利点は、装置が完全に自動化され、選択および準備に２日以上かかるラボ試験で今日起こっていることとは対照的に、数分程度の反応時間を提供することである。さらなる利点は、装置がコンパクトで携帯可能であるため、非常に用途が広いことである。さらに別の利点は、Ｃ．エレガンスが原料として大量に利用できること、または大量に低コストでＣ．エレガンスを生産でき、いかなる倫理的問題も提起しないことである。
【００２１】
本発明は、特に添付の図面の図を参照することによって、その好ましい実施形態に従って、限定ではなく例示としてここで説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明に係る装置の好ましい実施形態を概略的に示す。
【図２】図２は、図１の装置の線虫の機械的選択のためのユニットの概略図を示す。
【図３】図３は、図１の装置の線虫の光学的選択のためのユニットの概略図を示す。
【図４】図４は、図１の装置の臭気物質刺激への反応測定のためのユニットの概略図を示す。
【図５】図５は、図１の装置のマイクロ流体チップの斜視図（ａ）および正面図（ｂ）を示す。
【図６】図６は、本発明に係る方法の好ましい実施形態の概略的フローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
図面において、同一の参照番号は類似の要素に使用される。
【００２４】
図１は、初期線虫個体群から成虫の線虫を機械的に選択して中間線虫個体群を得るユニット１００を含む、本発明による装置１０００の好ましい実施形態を示す。このような機械的選択ユニット１００は、中間個体群から線虫を光学的に選択して最終個体群を得るユニット２００に接続され、これは、臭気物質の刺激に対する最終個体群の線虫の反応を検出するように構成された測定ユニット３００に接続される。そのような第１、第２および第３のユニットは、図２〜４を参照して以下で詳細に説明される。装置１０００は、流体管理用のサービスユニット、例えば、液体貯蔵タンクと、液体の流れを制御および調整し、機械式選択ユニットおよび光学的選択ユニット１００、２００ならびに測定ユニット３００を制御し、測定ユニット３００から取得したデータを分析するための、少なくとも１つの制御モジュール（図示せず）とをさらに備える。図２を参照すると、装置１０００は、Ｃ．エレガンスを、例えばＭ９、Ｓ  ｂａｓａｌ等のメンテナンス緩衝液中に溶解して貯蔵するための第１貯蔵タンク５と、追加の、すなわち線虫を含まない緩衝液を貯蔵するための第２の貯蔵タンク１０とを備える。第１の貯蔵タンク５および第２の貯蔵タンク１０は、第１の端部でポンプによって作動される過圧システム（図示せず）に接続され、第２の端部で入口マイクロチャネル構造１１に接続される。１００μｍ以上、所望により２００μｍに等しいセクションの第１のマイクロチャネル構造１１は、第１の貯蔵タンク５および第２の貯蔵タンク１０を線虫機械的選択ユニット１００に接続する。このような入口マイクロチャネル構造１１は、線虫を含むメンテナンス緩衝液または追加の緩衝液をそれぞれの貯蔵タンクから図中には示されないポンプによって作動される過圧システムを通じてユニット１００へと通過させる機能を持つ。図中には示されていない制御ユニットがポンプを制御する。機械的選択ユニット１００は、初期線虫個体群から成虫期の線虫を選択するように構成される。機械的選択ユニット１００は、線虫を含むメンテナンス緩衝液を容器１２に導入するように構成された第１の閉鎖可能な入口ノズルと、追加の緩衝液を容器１２に導入するように構成された第２の閉鎖可能な入口ノズルとを備えた収集容器１２を含む。図中には示されない第１および第２の閉鎖可能な入口ノズルは、容器の基部に配置され、制御ユニットによって制御される。他の実施形態では、容器１２は、３つ以上の閉鎖可能な入口ノズルを備えていてもよい。さらなる実施形態では、少なくとも２つのノズルは、容器１２の基部付近に配置されてよい。制御ユニットによって制御されるポンプによって作動される過圧機構を通じて、初期線虫個体群を含む初期量のメンテナンス緩衝液は、第１の貯蔵タンク５から排出され、入口マイクロチャネル構造１１内を通過し、開いた第１の閉鎖可能な入口ノズルを通じて収集容器１２内に注入される。容器１２は、その容量が第１のタンク５から排出される初期量の液体よりも多いようにサイズ決めされる。収集容器１２は、容器１２の基部からある距離をおいて容器１２の基部に平行に配置された二重格子１４を備える。少なくとも２つの閉鎖可能な入口ノズルが容器基部付近に配置される実施形態では、二重格子は、基部から、少なくとも２つの閉鎖可能な入口ノズルの距離よりも長い距離に配置される。二重格子は、線虫の卵または幼虫のみが通過できるように構成される。二重格子１４は電動式であり、制御ユニットによって制御される。二重格子１４は、第１の格子およびこれに平行な第２の格子から構成される。このような第１および第２の格子は、それぞれの穴が整列し、すなわち、二重格子１４が開いており、それによって容器１２に含まれる溶液が容器１２内部から穴を通って外に通過し得る第１の位置と、それぞれの穴がずれており、すなわち二重格子１４が閉じられ、それによって容器１２に含まれる溶液が穴を通過できない第２の位置とをとるように、線形アクチュエータ１９を通して互いに平行移動し得る。本発明の他の実施形態では、第１の有孔格子が固定され、線形アクチュエータによって作動される第２のスライド格子が二重格子１４を開閉させる。二重格子は、５０μｍ〜５００μｍの範囲であり得る穴を有する正方形アレイである。他の実施形態では、穴は、正方形とは異なる形状をとってもよい。二重格子１４は、容器１２に導入された初期量のメンテナンス液の体積に等しい液体体積に触れるように、容器１２の接触高さに配置される。したがって、初期量のメンテナンス液が導入されると、二重格子１４はこのような液量に触れる。追加の緩衝液が初期量のメンテナンス液を含む容器１２に注入されると、前者は初期線虫個体群を開いた二重格子１４に向けて押す。追加の緩衝液は、容器１２の下部から溶液が流れ、溶液を開いた二重格子１４へと押すように設計される。したがって、最低比重および開いた二重格子１４の穴のサイズよりも小さい特定のサイズを有する初期個体群のメンバー、すなわち卵および幼虫は、大部分が成虫期である中間線虫個体群を含んだ中間量のメンテナンス液が容器１２に残るまでそのような格子を通過する。実際、穴のサイズよりも大きなサイズを有する、９００〜９４０μｍの範囲のサイズ（長さ）の若い成虫期、および１１１０〜１１５０μｍの範囲のサイズ（長さ）の成虫期の線虫は、開いた二重格子の外に通過できない。容器１２は、液体を容器１２から排出させて容器１２を空にするように構成された、図３に見ることができる第１の電磁弁アセンブリ２０によって閉鎖可能な出口穴１５を備える。本発明の好ましい実施形態では、注入される溶液の量は、約２００ｍｍ3の体積に等しい約２００μＬであり、容器１２は、約６×６ｍｍ2の正方形の底面を有し、二重格子１４は、容器１２内の初期溶液の量に触れるように、約６ｍｍの高さに配置される。別の好ましい実施形態では、容器１２は、より大きな面積の正方形または長方形の底面を有し、より大きな面積を持つ（より容易に製造できる）二重格子１４を容器１２の下部により近い、より低い位置で配置させるようにする。容器は格子の上にさらに１１ｍｍの高さだけ延び、約４００μＬの追加の緩衝液を収容する。他の実施形態では装置のサイズが異なり、したがって、装置のサイズに応じて、注入される溶液の量が２００μＬよりも少なくまたは多くなり得る。機械的選択ユニット１００は、図中に示されない３路分岐を備えた接続チャネルを介して線虫の光学的選択ユニット２００に接続され、３路分岐のセクションそれぞれは１００μｍ以上であり、第１の電磁弁アセンブリ２０を介して容器１２の閉鎖可能な出口穴１５に接続される。さらなる実施形態では、接続チャネルは、３つよりも多い数の進路を備えた分岐を有していてもよい。接続チャネルは、中間量の液体、すなわち大部分が成虫期である中間線虫個体群を、制御ユニットによって制御されるポンプによって作動される過圧機構を通じて、機械的選択ユニット１００から図３に示す線虫光学的選択ユニット２００に通過させ、その後、当該制御ユニットが、第１および第２の閉鎖可能な入口ノズルおよび出口ノズルならびに二重格子１４を閉鎖する機能を有する。光学的選択ユニット２００は、中間個体群に含まれる個々の線虫の第１の光学的測定および第２の光学的測定を介して、中間個体群から成虫期の線虫の最終個体群を選択し、産卵成虫期の線虫から若い成中期の線虫を選択するように構成される。光学的選択ユニット２００は、互いに平行な３つの測定マイクロ流体チャネルを含み、３路接続チャネルが分岐し、線虫は、ポンプによって作動される過圧システムを通じて１匹ずつチャネリングされる。少なくとも３つの測定マイクロ流体チャネルの存在により、そのチャネルのうちの１つで線虫により閉塞されても、閉塞により生じ得る装置の動作中断が回避される。さらなる実施形態では、光学的選択ユニットの測定チャネルの数は、３つよりも多い。３つの測定マイクロ流体チャネルのうちの１つを線虫が通過する間に、線虫の発達期を確認するために第１および第２の光学的測定が行われる。第１の光学的測定は、チャネリングされた線虫の長さを識別し、第２の光学的測定は、赤色自己蛍光に対する緑色自己蛍光の強度を識別する。実際、線虫の長さが分かれば、産卵成虫期の線虫から若い成中期の線虫を選択できる。一方、線虫の年齢が高くなるにつれて自己蛍光の比率が増加するため、緑色と赤色の自己蛍光の比率の測定により線虫が選択される。実行された第１および第２の光学的測定の結果に応じて、臭気物質の刺激に対するそれらの反応の測定ユニット３００に送られる線虫が選択される。光学的選択ユニット２００は、線虫の長さの第１の光学的測定を実行するために３つの測定マイクロ流体チャネルのそれぞれに対して第１の光センサ２２、第２の光センサ２３および第３の光センサ２４を備える。各測定チャネルについて、第１の光センサ２２、第２の光センサ２３および第３の光センサ２４は、チャネルから第１の高さで、チャネルの長手方向に沿って配置され、それらは、関連チャネルの第１の光センサ２２の直角投影が第１の目標位置を特定し、関連チャネルの第２の光センサ２３の直角投影が第２の目標位置を特定し、関連チャネルの第３の光センサ２４の直角投影が第３の目標位置を特定するように、互いから平行移動している。装置の好ましい実施形態では、第１の光センサからの第２および第３の光センサの距離は、それぞれ約９００μｍおよび１０００μｍに等しい。３つの光センサ２２、２３および２４は、制御ユニットによって制御される。３つの測定マイクロ流体チャネルそれぞれについて、第１の光学的測定によって与えられ、以下に示される線虫の選択の論理は、第１のセンサ２２が、個々のチャネリングされた線虫の第１の目標位置への到着により作動すると、第１の光センサ２２からの電気信号は、第２の目標位置に到達したときに個々のチャネリングされた線虫によって引き起こされる第２の光センサ２３の作動までゼロに落ち込んではならず、第２の目標位置に到達するときに個々のチャネリングされた線虫によって引き起こされる第３の光センサ２４の作動前にゼロに戻さなければならない。これらの条件が発生した場合、すなわち測定中の個々のチャネリングされた線虫が、第１と第２の目標位置間の距離によって特定される第１の長さから、第１と第３の目標位置間の距離によって特定され、若い成虫期の長さに起因する第２の長さまでの範囲の長さを有する場合にのみ、若年成人の長さに対して、個々のチャネリングされた線虫は、機械的選択ユニット１００から出る中間個体群から選択可能である。光学的選択ユニット２００は、４００〜４４０ｎｍの波長範囲内に白色光または青色光を有する照明器２５、所望によりＬＥＤ照明器を備える。照明器２５は、３つの測定マイクロ流体チャネルを照明するように構成され、チャネリングされた線虫の自己蛍光の第２の光学的測定を実行するように構成された測定マイクロ流体チャネルそれぞれのためのダブルフォトダイオード２６に関連付けられている。ダブルフォトダイオード２６は、それぞれ緑色波長および赤色波長の光を検出するための２つの検出素子と、検出素子の表面に配置された２つの干渉フィルタと、２つの検出素子それぞれに放出された光を集光する２つの収集光学系とを有する。第２の光学的測定によって与えられ、以下に示す線虫選択論理は、緑色自己蛍光と赤色自己蛍光の比率が所定の閾値よりも小さい、所望により０．５よりも小さいことを示す。この条件および上記の長さに関する条件が発生した場合にのみ、個々のチャネリングされた線虫は、最終個体群の機械的選択ユニット１００から出る中間個体群から選択される。照明器２５は、３つの測定マイクロ流体チャネルから第２の高さに配置される。図３の本発明の好ましい実施形態では、第２の高さは３つの光センサ２２、２３および２４の第１の高さと反対側にあり、照明器２５は、線虫が３つの目標に対する中心位置、所望により第１および第２の目標に対して中心にあるときに自己蛍光の第２の光学的測定を行うような位置にある。光センサ２２、２３および２
４は、制御ユニットによって制御される。他の実施形態では、蛍光の第２の測定は、第１の長さ測定の後に段階的に実行される。制御ユニットによって制御される第２の電磁弁アセンブリ２１は、３つの測定マイクロ流体チャネルの出口に配置され、チャネリングされた線虫を、測定ユニット３００または廃液タンク１６に向けて、所望により約１００μｍ以上の直径の光学的選択ユニット２００を測定ユニット３００に接続するローディングマイクロチャネルへと導く。追加の計数光センサは、線虫ローディングマイクロチャネルに対応して配置され、制御ユニットにより制御される。装置１０００は、所定数、所望により２０〜５０匹の線虫の通過後、測定ユニット３００内の線虫の通過を遮断する遮断弁を備える。遮断弁によって遮断された中間個体群の線虫は、測定ユニット３００によって行われる次の測定を待ちながらユニット２００とユニット３００の間でローディングチャネル内に数分程度残るか、または第２の電磁弁アセンブリ２１を介して廃液タンク１６に送られる。臭気物質刺激への反応の測定ユニット３００の概略図を図４に示す。測定ユニット３００は、走化性およびニューロン活動、すなわち運動性および蛍光の測定を通じて臭気物質刺激に対する線虫の反応を検出するように構成される。測定ユニット３００は、少なくとも３層デバイスを備える。中心層は、柱状マイクロ流体回路５１が作製されているマイクロ流体チップ５０を含み、そこには最終個体群の線虫が導入される。図５は、マイクロ流体チップ５０の実施形態を示す。マイクロ流体チップ５０は、線虫をマイクロ流体回路５１に導入するように構成された、ローディングマイクロチャネルに接続されたローディング穴５２を柱状マイクロ流体回路５１の第１の縁部付近に備える。マイクロ流体チップ５０は、第１の入口チャネルを介して第３の貯蔵タンク１７から試験液を受け取るように構成された第１の入口穴５３と、第２の入口チャネルを介して第４の貯蔵タンク１８から中性緩衝液を受け取るように構成された第２の入口穴５４とを第１の縁部付近にさらに備える。試験液は、臭気物質の存在の可能性を検出する必要がある液体であり、緩衝液は、例えばＭ９、Ｓ  ｂａｓａｌ等の臭気物質を含まない液体である。マイクロ流体チップ５０は、柱状マイクロ流体回路の第１の縁部の反対側の第２の縁部の付近に、液体を回路５１から出すように構成された、出口チャネルを介して廃液タンク１６に接続された排出穴５５を備える。さらなる実施形態では、出口チャネルは、廃液タンク１６とは異なる出口タンクに接続される。本発明による装置の好ましい実施形態では、マイクロ流体チップは、柱が７０μｍ高、直径が２００μｍ、および間隔が３００μｍの２０ｍｍ×２０ｍｍまでのサイズを有し、液体入口チャネルは約１００μｍの直径を有する。本発明のさらなる実施形態は、異なるサイズおよび間隔を有してよい。第１の端層は、中心層のマイクロ流体チップを照明する連続光源および変調光源を含み、第２の端層（中心層に対して第１の端層の反対側）は、第１の端層の光源からの照明時、すなわち走化性を測定するように構成された透過光イメージングの測定時に、マイクロ流体チップの透過光画像を取得するｓＣＭＯＳま���はＣＣＤ等の光センサを含む。特に、走化性測定を得るために、試験液がワームローディングマイクロチャネルに注入された後、後続の画像を比較することによって得られたシェード画像が分析される。装置の好ましい実施形態では、第２の端層の光センサと層のチップとの間の距離は、約３００μｍである。装置の好ましい実施形態では、第１の端層の光源は、ダブルアレイで配置されたＬＥＤであり、透過画像、すなわち透過光イメージングの測定を取得するための５５０ｎｍでの連続光と、利用される特定のトランスジェニック線虫により発現される緑色蛍光タンパク質ＧＦＰの蛍光を刺激するための、所望により１ｋＨｚを超えない変調波長数での、４７０ｎｍの変調光とを放出するように構成される。装置の他の実施形態では、連続光源は、白色光を放出するランプまたはＬＥＤであってよい。反応測定の第３のユニット３００は、変調光源に関連付けられた適切な収集光学系を備えたフォトダイオードをさらに備え、その検知面には、利用されるトランスジェニック系統の特定のＧＦＰの発光ピークに対応する約５２５／５０ｎｍの干渉フィルタが配置される。実際、適切な遺伝的改変に続いて、利用される線虫は受容体ニューロンでカルシウムと結合する特定のタンパク質を発現する。図６に示すフローチャートを参照して、本発明による線虫の使用に基づいて試験液中の臭気物質を自動的に検出する方法の好ましい実施形態のステップを以下で説明する。このような方法は、上記装置１０００を使用することによって実行される。最初のステップ６００では、ポンプによって作動される過圧システムを介して、初期線虫個体群を含む初期量のメンテナンス緩衝液は第１の貯蔵タンク５から排出され、機械的選択ユニット１００に注入されて初期個体群から成虫線虫を選択する。初期線虫個体群は、入口マイクロチャネル構造１１を通して、開いている第１の閉鎖可能な入口ノズルを備えた収集容器１２に注入される。初期量は、収集容器１２に収容されたときに開いた二重格子１４に接触する液体量に相当する。ステップ６１０にて、数分程度、所望により１分に等しい所定の時間の後、線虫を含まない追加緩衝液の量は、ポンプにより作動される過圧システムを介して第２の貯蔵タンク１０からパルス状に排出され、開いている第２の閉鎖可能な入口ノズルを備えた入口マイクロチャネル構造１１を介して収集容器１２に注入される。このようにして、追加の緩衝液は、容器１２に含まれる初期量の液体を開いた二重格子１４を通るように押し、その結果、線虫の卵および幼虫は、二重格子１４を通過する。本発明の装置の好ましい実施形態を用いた本方法の実行において、パルス数は４であり、追加の緩衝液の量の体積流量は、約１００μＬ／秒に等しい。他の実施形態では、追加の緩衝液のパルス数および体積流量は、機械的選択ユニット１００のサイズ、特に収集容器１２のサイズに応じて変化し得る。ステップ６１１では、二重格子１４は、パルスの終わりに、二重格子１４を通過したばかりのメンバーの落下を回避するために閉鎖され、収集容器１２の第１および第２の入口ノズルが閉鎖される。したがって、収集容器１２は、大部分が成虫期である中間線虫個体群を含む中間量のメンテナンス液を含む。次のステップ６１２では、第１の電磁弁アセンブリ２０が閉鎖可能な出口穴１５を開き、中間量の液体が、３路分岐を有する接続チャネルを介してポンプで作動される過圧システムによって光学的選択ユニット２００に注入され、中間個体群の線虫は、３つの測定マイクロ流体チャネルに１匹ずつチャネリングされる。次のステップ６２０では、成虫期の線虫および若い成虫期の線虫は、産卵成虫期の線虫から光学的に選択される。このような選択は、中間個体群に含まれる個々の線虫を光学的に分析することによって行われる。線虫の光学的選択のステップ６２０は、２回の光学的測定６２１および６２３を含み、これらは同時にまたは段階的に実行されてよい。サブステップ６２１において、前述のように、個々のチャネルリングされた線虫の長さｌが光学的に測定され、サブステップ６２２において、そのような長さｌが、決定された長さの範囲Δｌ内に含まれるかどうかが確認される。長さｌが決定された範囲Δｌに含まれない場合、フローは「ＮＯ」の分岐を通って線虫を廃棄するステップ６３０に続き、それにより、光学的選択ユニット２００の測定チャネルの出口で、第２の電磁弁アセンブリ２１は、個々のチャネリングされた線虫を廃棄タンク１６へと導く。長さｌが所定の範囲Δｌ内に含まれる場合、フローは「ＹＥＳ」の分岐を通って、前述のように個々のチャネリングされた線虫の緑色自己蛍光Ｆgreenおよび赤色自己蛍光Ｆredが測定されるサブステップ６２３に続き、サブステップ６２４では、緑色自己蛍光Ｆgreenと赤色自己蛍光Ｆredとの比率Δ（Ｆgreen／Ｆred）が所望により０．５に等しい所定の閾値εよりも小さいかどうかを確認する。比率Δ（Ｆgreen／Ｆred）が閾値εより大きい場合、フローは「ＮＯ」の分岐を通って廃棄するステップ６３０に続く。比率Δ（Ｆgreen／Ｆred）が閾値ε以下である場合、フローは「ＹＥＳ」の分岐を通って、個々のチャネリングされた線虫を測定ユニット３００に送る後続のステップ６４０へと続き、それにより、光学的選択ユニット２００の測定チャネルの出口で、第２の電磁弁アセンブリ２１は、個々のチャネリングされた線虫を測定ユニット３００のマイクロ流体チップ５０に向かうローディングマイクロチャネル内へと導く。ステップ６４０では、測定ユニット３００に送られた個々の線虫は、線虫ローディングマイクロチャネルに対応して配置された計数光センサによってさらに計数され、送られた線虫の数Ｎを得る。後続のステップ６５０では、ステップ６４０で測定された、測定ユニット３００に送られた線虫の数Ｎが、所望により２０〜５０の範囲の決定された値Ｎtot以上であるかどうかを確認する。測定ユニット３００に送られた線虫の数ＮがＮtot未満である場合、フローは続いて「ＮＯ」の分岐を介してステップ６４０に戻る。測定ユニット３００に送られた線虫の数ＮがＮtot以上である場合、フローは「ＹＥＳ」の分岐を介して、遮断弁によって測定ユニット３００内の線虫の通過を遮断するステップ６６０に続き、反応測定ユニット３００内の臭気物質に対するＮtot匹の線虫の反応を分析する後続のステップ６７０へと続く。臭気物質に対する線虫の反応の分析６７０は、以下に説明するサブステップを含む。まず、サブステップ６７１では、柱状マ��クロ流体回路５１の領域は第１の端層の光源によって放出された光で照明され、サブステップ６７２では、柱状マイクロ流体回路５１の領域全体で積分された第１の自己蛍光信号が後続の蛍光測定の分析に使用するためのバックグラウンド値を取得するために、光源に関連付けられたフォトダイオードによって測定される。サブステップ６７２では、個々の線虫の位置は、透過光イメージングの測定によりさらに記憶され、測定の質を保証するためにそれらの数および運動性が確認される。サブステップ６７３では、試験液が第３のタンク１７からマイクロ流体チップ５０に注入され、後続のサブステップ６７４では、中性緩衝液が第４のタンク１８からマイクロ流体チップ５０に注入される。中性緩衝液を柱状マイクロ流体回路５１に注入すると、試験液がチップから廃液タンク１６内に排出され、この中性緩衝液によって置き換えられる。サブステップ６７５では、第２の積分蛍光信号、すなわち線虫のニューロン信号が、例えば測定感度を高めるロックイン技法等の技法を用いて、変調光源と同期した光源に関連付けられたフォトダイオードによって検出される。サブステップ６７６では、立上がり時間τriseおよび立下がり時間τfall等のニューロン信号のパラメータが計算され、サブステップ６７７では、積分された第２の蛍光信号の時間プロットが、第１の時間範囲Ｔ1に含まれる立上がり時間および第２の時間範囲Ｔ2に含まれる立下がり時間を持つパルスに対応するかどうかを確認する。このような第１の時間範囲Ｔ1および第２の時間範囲Ｔ2は、線虫によって以前に感知された刺激の欠如によって活性化されたニューロンにおけるカルシウム濃度の再構成の標準的な時間範囲であり、それらの値は、使用される特定のカルシウムインジケータに依存し、それぞれ数百ミリ秒および数百秒程度である。
【数３】
2021500543.tif 000005
かつ
【数４】
2021500543.tif 000006
である場合、本発明による方法は、試験液中に臭気物質が存在しないことを認識し、フローは、「ＮＯ」の分岐を介して、ステップ６７７から、中性緩衝液がマイクロ流体回路５１から出口タンクへと排出される本方法のステップ６９０に続く。τrise∈Ｔ1かつτfall∈Ｔ2である場合、フローは、ステップ６７７から「ＹＥＳ」の分岐を介して、以下で説明する線虫の走化性に起因する運動性を確認するステップ６８０に続く。
【００２５】
サブステップ６７４に続いて、サブステップ６７５と同時にサブステップ６７８では、柱状マイクロ流体回路５１の領域の透過画像が、測定ユニット３００の第２の端層の光センサ、すなわちｓＣＭＯＳまたはＣＣＤによって取得される。サブステップ６７９では、取得した画像を分析して、サブステップ６８０で線虫の走化性に起因する可能性のある運動性を確認し、それにより、走化性に起因する運動性がある場合、本方法は臭気物質が試験液中に存在することを認識するが、線虫が関心を示さない、すなわち走化性に起因する運動性がない場合、本方法は、臭気物質が試験液中に存在しないことを示す。ステップ６７７では、τrise∈Ｔ1かつτfall∈Ｔ2であることが確認され、ステップ６８０では、走化性に起因する運動性の欠如が確認され、本方法は、それが偽陽性であると認識する。好ましい実施形態では、サブステップ６７９の分析は、ワーム追跡技術を通じて実行され、それにより、取得されたシェード画像が分析され、すなわち、後続の透過画像が比較される。この技法を用いると、信号雑音比を改善すること、およびマイクロ流体チップの固定バックグラウンドをなくすことの両方のために、線虫の形状は、異なる画像間の弁別閾手順を用いてバックグラウンド雑音から推測される。このような手順により、線虫を白いバックグラウンド上のコントラストの高い（黒い）オブジェクトとして簡単に認識できるように、ビデオの品質を最適化できる。上記弁別閾操作は、強度が所定の閾値を超えるかどうかに応じて画素を線虫またはバックグラウンドに割り当て、それにより線虫を頭から尾端まで画定することを可能にするバイナリ画像を生成する。したがって、このバイナリ画像が利用可能であることにより、線虫の数または線虫の質量中心としてさまざまなパラメータを取得でき、それにより、時間に沿った質量中心の変位速度としてそれらの速度を取得することもできる。走化性に起因する運動性の確認６８０の終わりに、フローは、中性緩衝液がチップから出口タンクに排出されるステップ６９０に続く。本方法の好ましい実施形態では、ステップ６７０は、方法が終了する前にｍ回（ｍ＝１，２，…）実行される、すなわち、方法フローのステップ６９０から、ｍ回ステップ６７０に戻った後、方法を終了する。好ましい実施形態では、ｍ＝２であり、液体の流量は約５０μＬ／分〜１００μＬ／分であり、試験液は３０秒間注入され、中性緩衝液は３０秒間注入される。本方法の好ましい実施形態のサイズを用いると、約３秒で、毎分５０μＬの流量により、柱状マイクロ流体回路５１の内容物を完全に変化させ、次に試験液から中性緩衝液に通過させるか、または試験液を変化させることができる。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態を記述し、複数の変形例を上記で提案したが、当業者においては、添付の特許請求の範囲に定義されるその保護範囲から逸脱することなく他の変形および変更を行うことができることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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