(57)【要約】  本出願は、生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法およびその応用を開示し、遺伝子コドンの最適化、工学菌の構築、工学菌の培養、基質の変換および生成物の調製を含んでおり、工学菌により基質を直接発酵および変換してタウロウルソデオキシコール酸を調製し、基質はタウロケノデオキシコール酸である。基質の濃度を２５０ｇ／Ｌに達させることができ、反応時間は短く、基質への変換率は９８％以上に達し、得られた製品の純度は９９％以上である。反応系でＮＡＤ＋を循環再生させ、補酵素ＮＡＤ＋の使用量を大幅に減らし、酵素触媒反応のコストを削減し、工業規模の拡大に資する。ステロイドデヒドロゲナーゼと補酵素再生酵素は、柔軟なポリペプチド配列によって結合されて融合タンパク質多量体として構築され、基質と補酵素への結合距離をより近づけ、変換反応を促進し、工業生産において発酵の回数を減らし、プロセスを簡素化し、時間コストと原料コストを節約する。
2021509804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子コドンの最適化、工学菌の構築、工学菌の培養、基質の変換および生成物の調製を含んでおり、工学菌により基質を直接発酵および変換してタウロウルソデオキシコール酸を調製し、
前記基質はタウロケノデオキシコール酸であり、前記工学菌は、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現できる工学菌株から選択されることを特徴とする生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項２】
前記７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記乳酸デヒドロゲナーゼの発現酵素は、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ単一発現酵素、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ共発現酵素、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ二重四量体融合酵素、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ二重四量体融合酵素と乳酸デヒドロゲナーゼ共発現酵素、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ二重四量体融合酵素と７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ共発現酵素の中から一つ選択され、
前記７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼの発現酵素は、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ単一発現酵素、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ共発現酵素、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ四量体融合酵素、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ四量体融合酵素とグルコースデヒドロゲナーゼ共発現酵素、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ四量体融合酵素と７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ共発現酵素の中から一つ選択されることを特徴とする請求項１に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項３】
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１であり、乳酸デヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であり、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５であり、およびグルコースデヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７であることを特徴とする請求項１に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項４】
７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子のＡ７８およびＶ１１６の部位を変異させることを特徴とする請求項３に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項５】
前記７α−ステロイドデヒドロゲナーゼのタンパク質配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２であり、前記乳酸デヒドロゲナーゼのタンパク質配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、前記７β−ステロイドデヒドロゲナーゼのタンパク質配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であり、前記グルコースデヒドロゲナーゼのタンパク質配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８であることを特徴とする請求項３または４に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項６】
前記工学菌を構築する方法は、
遺伝子発現ベクターを構築し、構築された７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１のコンピテント細胞に変換して、工学菌を得ること、を含むことを特徴とする請求項１に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項７】
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼを発現する遺伝子は７α−ＨＳＤＨと表記され、乳酸デヒドロゲナーゼを発現する遺伝子はＬＤＨと表記され、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼを発現する遺伝子は７β−ＨＳＤＨと表記され、グルコースデヒドロゲナーゼを発現する遺伝子はＧＤＨと表記され、前記遺伝子発現ベクターを構築する方法は、以下のとおりである：
７α−ＨＳＤＨ、ＬＤＨ、７β−ＨＳＤＨおよびＧＤＨをそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＧＤＨをそれぞれ取得し、または
７α−ＨＳＤＨおよびＬＤＨ、７β−ＨＳＤＨおよびＧＤＨをそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、二重遺伝子発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨ／ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨ／ＧＤＨをそれぞれ取得し、または
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）をそれぞれ取得し、または
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子とグルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）／ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）／ＧＤＨをそれぞれ取得し、または
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子と７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）／７α−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）／７β−ＨＳＤＨをそれぞれ取得することを特徴とする請求項６に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項８】
前記７α−ＨＳＤＨは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ（ＵｎｉＰｒｏｔ：ＣＤＱ６７＿０２４４５）に由来し、前記ＬＤＨは、Ｈｕｍａｎ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ００３３８）に由来し、前記７β−ＨＳＤＨは、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５９８６（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ａ４ＥＣＡ９）に由来し、および、前記ＧＤＨは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  （ｓｔｒａｉｎ  １６８）  （ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１２３１０）に由来することを特徴とする請求項７に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項９】
前記７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子のＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９であり、前記７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子のＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１であることを特徴とする請求項７に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項１０】
前記７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子のタンパク質配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０であり、前記７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子のタンパク質配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２であることを特徴とする請求項７に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項１１】
前記基質の濃度は２０ｇ／Ｌ−２５０ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項１に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項１２】
前記基質の変換方法は、
タウロケノデオキシコール酸を２０−１００ｍＭグリシン緩衝液に溶解し、０．０１−０．８ｍＭのＮＡＤ＋を添加し、５−６０ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、２０−１００ｍＭグリシン緩衝液を最終体積まで追加し、水酸化ナトリウムでｐＨを６．５−８．５に調整し、２５℃で、６−１８ｈ反応させ、そして、１．８−１００ｇ／Ｌのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、水酸化ナトリウムでｐＨを６．５−８．５に調整し、２５℃で、６−１８ｈ反応させることを、含むことを特徴とする請求項１１に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項１３】
前記タウロウルソデオキシコール酸の調製方法は、
変換した反応液をペースト状に回転蒸発し、２−１０倍の無水エタノールまたは９５％エタノールを添加し、遠心分離または濾過によって沈殿物を除去し、上澄みを乾燥してタウロウルソデオキシコール酸の粗生成物を得て、タウロウルソデオキシコール酸の粗生成物をアセトニトリルによって溶解し、０．２２ｕｍの濾過膜で濾過して不溶物を除去してローディング液を形成し、そして、前記ローディング液を分取型高速液相調製装置によって、シリカゲルクロマトグラフィーパッキングを充填した高圧ステンレスカラムに注入し、その後、異なる濃度のメタノール−水移動相を使用して段階的に溶出させ、収集された溶出液をロータリーエバポレーターに注ぎ、粘性のある状態まで回転蒸発しながら、メタノールを回収し、その後、真空乾燥オーブンに入れて乾燥させ、高速液体クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタウロウルソデオキシコール酸の純度を測定することを、含むことを特徴とする請求項１２に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項１４】
遺伝子配列に対して大腸菌発現用コドンを最適化し、アフィニティータグを追加し、かつ全遺伝子合成を実行し、それぞれ７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子７α−ＨＳＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＬＤＨ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子７β−ＨＳＤＨ、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子ＧＤＨと表記される遺伝子コドンの最適化ステップ（１）と、
遺伝子発現ベクターを構築し、構築された７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１のコンピテント細胞に変換して、工学菌を得る工学菌の構築ステップ（２）と、
工学菌の小規模発酵発現：工学菌の菌液をアンピシリン耐性のＬＢプレートにコーティングし、モノクローナルを選別し、アンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで培養し、ＯＤ値が０．８−１．２の場合、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して２ｈ誘導し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで発現レベルを検出し、発現レベルの高いクローンを選択して菌種を保存し、そして、２０μＬの菌種を２００ｍＬのアンピシリン耐性ＬＢ培地に接種して一晩培養し、ＯＤ値が２．５−４．０の場合、２ｍＬの培養液をアンピシリン耐性培地に接種して培養し、ＯＤ値が１の場合、ＩＰＴＧを添加して一晩の発現を誘導し、菌体を収集し、
工学菌の大規模発酵発現：工学菌を選別してアンピシリン耐性ＬＢ培地の１Ｌの三角フラスコに接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩培養し、ＯＤ６００値が２．５−４．０の場合、培養液２０ｍＬをそれぞれ、１Ｌのアンピシリン耐性培地１０本が入った３Ｌの三角フラスコに接種し、３７℃、１４０ｒｐｍで一晩培養し、そして、１０Ｌの種液を、２００Ｌの大腸菌高密度発酵培地が入った発酵槽に無菌的に接種し、３７℃で、通気撹拌しながら８時間培養し、８時間通気撹拌培養した後、発酵槽に最終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧ溶液を添加して誘導し、１０−１２ｈ誘導した後、発酵が完了し、ドレンし、菌体を遠心分離によって収集して４℃で保存し、少量の菌体を取り、１００ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁し、超音波破砕し、粗酵素液を得る工学菌の培養ステップ（３）と、
タウロケノデオキシコール酸を２０−１００ｍＭグリシン緩衝液に溶解し、０．０１−０．８ｍＭのＮＡＤ＋を添加し、５−６０ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、２０−１００ｍＭグリシン緩衝液を最終体積まで追加し、水酸化ナトリウムでｐＨを６．５−８．５に調整し、２５℃で、６−１８ｈ反応させ、そして、１．８−１００ｇ／Ｌのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、水酸化ナトリウムでｐＨを６．５−８．５に調整し、２５℃で、６−１８ｈ反応させる基質の変換ステップ（４）と、
ステップ（４）で変換した反応液をペースト状に回転蒸発し、２−１０倍の無水エタノールまたは９５％エタノールを添加し、遠心分離または濾過によって沈殿物を除去し、上澄みを乾燥してタウロウルソデオキシコール酸の粗生成物を得て、タウロウルソデオキシコール酸の粗生成物をアセトニトリルによって溶解し、０．２２ｕｍの濾過膜で濾過して不溶物を除去してローディング液を形成し、そして、前記ローディング液を分取型高速液相調製装置によって、シリカゲルクロマトグラフィーパッキングを充填した高圧ステンレスカラムに注入し、その後、異なる濃度のメタノール−水移動相を使用して段階的に溶出させ、収集された溶出液をロータリーエバポレーターに注ぎ、粘性のある状態まで回転蒸発しながら、メタノールを回収し、その後、真空乾燥オーブンに入れて乾燥させ、高速液体クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタウロウルソデオキシコール酸の純度を測定する生成物の調製ステップ（５）と、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項１５】
前記遺伝子発現ベクターを構築する方法は、以下のとおりである：
７α−ＨＳＤＨ、ＬＤＨ、７β−ＨＳＤＨおよびＧＤＨをそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＧＤＨをそれぞれ取得し、または
７α−ＨＳＤＨおよびＬＤＨ、７β−ＨＳＤＨおよびＧＤＨをそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、二重遺伝子発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨ／ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨ／ＧＤＨをそれぞれ取得し、または
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）をそれぞれ取得し、または
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子とグルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）／ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）／ＧＤＨをそれぞれ取得し、または
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子と７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）／７α−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）／７β−ＨＳＤＨをそれぞれ取得することを特徴とする請求項１４に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項１６】
前記７α−ステロイドデヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１であり、前記乳酸デヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であり、前記７β−ステロイドデヒドロゲナーゼＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５であり、前記グルコースデヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７であることを特徴とする請求項１に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項１７】
前記７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、前記乳酸デヒドロゲナーゼ、前記７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼは、液体酵素または固定化酵素から独立して選択され、前記７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、前記乳酸デヒドロゲナーゼ、前記７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼは、全細胞、未精製酵素または精製酵素から独立して選択されることを特徴とする請求項１に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項１８】
生体内変換法の具体的なステップは、以下の（１）〜（１０）のとおりである：
（１）遺伝子コドンの最適化
遺伝子配列に対して大腸菌発現用コドンを最適化し、アフィニティータグを追加し、かつ全遺伝子合成を実行し、それぞれ７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子７α−ＨＳＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＬＤＨ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子７β−ＨＳＤＨ、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子ＧＤＨと表記され、
（２）単一遺伝子発現ベクターの構築
７α−ＨＳＤＨ、ＬＤＨ、７β−ＨＳＤＨおよびＧＤＨをそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＧＤＨを取得し、
（３）二重遺伝子発現ベクターの構築
７α−ＨＳＤＨおよびＬＤＨ、７β−ＨＳＤＨおよびＧＤＨをそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨ／ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨ／ＧＤＨを取得し、
（４）単一遺伝子融合タンパク質発現ベクターの構築
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）を取得し、
（５）単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現ベクターの構築
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子とグルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）／ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）／ＧＤＨを取得し、
（６）単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現ベクターの構築
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子と７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）／７α−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）／７β−ＨＳＤＨを取得し、
（７）工学菌の構築
ステップ（２）−ステップ（６）で構築されたすべての発現ベクターをそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテント細胞に変換し、工学菌を得て、
（８）工学菌の小規模発酵発現
工学菌の菌液をアンピシリン耐性のＬＢプレートにコーティングし、モノクローナルを選別し、アンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで培養し、ＯＤ値が０．８−１．２の場合、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して２ｈ誘導し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで発現レベルを検出し、発現レベルの高いクローンを選択して菌種を保存し、そして、２０μＬの菌種を２００ｍＬのアンピシリン耐性ＬＢ培地に接種して一晩培養し、ＯＤ値が２．５−４．０の場合、２ｍＬの培養液をアンピシリン耐性培地に接種して培養し、ＯＤ値が１の場合、ＩＰＴＧを添加して一晩の発現を誘導し、菌体を収集し、
（９）工学菌の大規模発酵発現
工学菌を選別してアンピシリン耐性ＬＢ培地の１Ｌの三角フラスコに接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩培養し、ＯＤ６００値が２．５−４．０の場合、培養液２０ｍＬをそれぞれ、１Ｌのアンピシリン耐性培地１０本が入った３Ｌの三角フラスコに接種し、３７℃、１４０ｒｐｍで一晩培養し、そして、１０Ｌの種液を、２００Ｌの大腸菌高密度発酵培地が入った発酵槽に無菌的に接種し、３７℃で、通気撹拌しながら８時間培養し、８時間通気撹拌培養した後、発酵槽に最終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧ溶液を添加して誘導し、１０−１２ｈ誘導した後、発酵が完了し、ドレンし、菌体を遠心分離によって収集して４℃で保存し、少量の菌体を取り、１００ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁し、超音波破砕し、粗酵素液を得て、
（１０）酵素活性の測定
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである：タウロケノデオキシコール酸を基質とし、３ｍＬの反応系に２．９７ｍＬの１００ｍＭ  ｐＨ８．０のリン酸緩衝液、最終濃度０．５ｍＭのタウロケノデオキシコール酸、１０μＬの希釈酵素溶液、最終濃度０．５ｍＭのＮＡＤＰ＋を添加し、ｐＨ８．０と２５℃で１ｍｉｎ反応させ、３４０ｎｍでの吸光値の増加を測定し、
乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである：ピルビン酸ナトリウムを基質とし、３ｍＬの反応系に２．７ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２ｍＬの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＬの希釈酵素溶液、最終濃度０．２ｍＭのＮＡＤＨを添加し、ｐＨ８．０と２５℃で１ｍｉｎ反応させ、３４０ｎｍでの吸光値の減少を測定し、
７β−ステロイドデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである：タウロウルソデオキシコール酸を基質とし、３ｍＬの反応系に２．９７ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、最終濃度０．５ｍＭのタウロウルソデオキシコール酸、１０μＬの希釈酵素溶液、最終濃度０．５ｍＭのＮＡＤＰ＋を添加し、ｐＨ８．０と２５℃で１ｍｉｎ反応させ、３４０ｎｍでの吸光値の増加を測定し、
グルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである：グルコースを基質とし、３ｍＬの反応系に２．７ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２ｍＬの１．５Ｍグルコース、５０μＬの希釈酵素溶液、最終濃度２ｍＭのＮＡＤＰ＋を添加し、ｐＨ８．０と２５℃で２ｍｉｎ反応させ、３４０ｎｍでの吸光値の増加を測定し、
（１１）タウロケノデオキシコール酸のタウロウルソデオキシコール酸への変換
タウロケノデオキシコール酸を２０−１００ｍＭグリシン緩衝液に溶解し、０．０１−０．８ｍＭのＮＡＤ＋を添加し、５−６０ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、２０−１００ｍＭグリシン緩衝液を最終体積まで追加し、水酸化ナトリウムでｐＨを６．５−８．５に調整し、２５℃で、６−１８ｈ反応させ、そして、１．８−１００ｇ／Ｌのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、水酸化ナトリウムでｐＨを６．５−８．５に調整し、２５℃で、６−１８ｈ反応させ、
（１２）タウロウルソデオキシコール酸の調製
ステップ（１１）で変換した反応液をペースト状に回転蒸発し、２−１０倍の無水エタノールまたは９５％エタノールを添加し、遠心分離または濾過によって沈殿物を除去し、上澄みを乾燥してタウロウルソデオキシコール酸の粗生成物を得て、タウロウルソデオキシコール酸の粗生成物をアセトニトリルによって溶解し、０．２２ｕｍの濾過膜で濾過して不溶物を除去してローディング液を形成し、そして、前記ローディング液を分取型高速液相調製装置によって、シリカゲルクロマトグラフィーパッキングを充填した高圧ステンレスカラムに注入し、その後、異なる濃度のメタノール−水移動相を使用して段階的に溶出させ、収集された溶出液をロータリーエバポレーターに注ぎ、粘性のある状態まで回転蒸発しながら、メタノールを回収し、その後、真空乾燥オーブンに入れて乾燥させ、高速液体クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタウロウルソデオキシコール酸の純度を測定することを特徴とする請求項１に記載の生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法。
【請求項１９】
ウルソデオキシコール酸の調製における請求項１−１８のいずれか一項に記載の方法の応用。
【請求項２０】
前記調製プロセスは、
水酸化ナトリウムを変換したタウロウルソデオキシコール酸溶液に添加し、ｐＨを８−１１に調整し、温度を８０−１００℃に上げ、１８−２４ｈ反応させ、温度を１０−１５℃に下げ、塩酸を添加してｐＨを３−５に調整し、ウルソデオキシコール酸を析出することであることを特徴とする請求項１９に記載の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年１１月２９日に中国特許庁に提出された、出願番号２０１８１１４４６６８９．５、発明の名称「生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法およびその応用」の中国特許出願の優先権を主張し、そのすべての内容は引用により本出願に組み込まれる。
本出願は、バイオテクノロジーの分野に属し、遺伝子工学的方法により生体酵素を修飾した後、タウロケノデオキシコール酸の生体内変換を効率的に触媒する方法に関し、具体的には、生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法、および生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タウロウルソデオキシコール酸は、その化学名が３α，７β−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸Ｎ−（２−スルホエチル）アミドであり、鎮痙、抗けいれん、抗炎症および胆石溶解などの効果がある。タウロウルソデオキシコール酸は、クロクマの胆汁に主に存在し、クマの胆汁の代表的な有効成分である。２００７年、商品名Ｔａｕｒｏｌｉｔｅのタウロウルソデオキシコール酸カプセルは、中国での販売が承認された。それは、主にコレステロール結石を溶解するために使用される。ウルソデオキシコール酸は、親水性の胆汁酸で、結石溶解率が制限され、安全性が高く、副作用が少ないため、臨床で広く使用されている。タウロウルソデオキシコール酸は、ウルソデオキシコール酸とタウリンの共役化合物であり、ウルソデオキシコール酸よりも、親水性が強く、結石の溶解が早く、安全性が高い。
【０００３】
最初、タウロウルソデオキシコール酸は、「人為的に排出された」クロクマの胆汁から抽出されたが、供給源が制限され、収量が低く、バッチごとにばらつきが大きく、動物にとって非人道的であった。その後、人工合成法により取って代わられてきた。人工化学合成法は主に、以下の３種類に分けられ、すなわち、１つ目は、混合無水物、活性チオエステルなどの活性中間体を形成してから、タウリンナトリウムと反応させる方法、２つ目は、縮合剤の作用下でアミドを形成する方法、３つ目は、シスタミン類物質によって硫化アシルを形成してから、酸化して対象生成物を得る方法。これらの方法は、選択性が低く、有機試薬を大量に使用し、環境を汚染する。
【０００４】
「人為的に排出された」クマの胆汁の抽出および人工化学合成法の欠陥を解消するために、生体内変換の方法によるタウロウルソデオキシコール酸の調製は徐々に開発されてきている。タウロケノデオキシコール酸は、ニワトリ、アヒル、ガチョウなどの家畜の胆汁中に広く存在し、タウロウルソデオキシコール酸と７位水酸基のエピマーである。中国の発明特許ＣＮ１０２９９４６０４Ａは、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび７β−ステロイドデヒドロゲナーゼの２段階触媒作用により、タウロケノデオキシコール酸をタウロウルソデオキシコール酸に変換する方法を開示している。このような方法では、基質の濃度が低く（１ｇ／Ｌ）、基質変換が不完全であり、大量の高価な補酵素が必要であり、反応中間体であるタウリン７−ケトリトコール酸は副産物として除去することが困難である。中国の発明特許ＣＮ１０７２８７２７２Ａは、タウロウルソデオキシコール酸を調製する方法を開示している。このような方法においては、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび７β−ステロイドデヒドロゲナーゼを含む発現ベクター、または両者の共発現ベクターをそれぞれ構築し、培地に基質を添加し、発酵中に変換し、タウロケノデオキシコール酸をタウロウルソデオキシコール酸に変換する。しかしながら、このような方法では、基質の濃度が低く、変換率が低く、反応中間体であるタウリン７−ケトリトコール酸の含有量が高く、変換期間が長く、工業生産が容易ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本出願の実施例は、生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法およびその応用を提供することを１つの目的とし、従来の生体内変換技術を使用してタウロウルソデオキシコール酸を調製する場合、基質の濃度が低く、変換率が低く、反応中間体であるタウリン７−ケトリトコール酸の含有量が高く、変換期間が長く、工業生産が容易ではないという技術的課題を解決することを目指す。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の技術的課題を解決するために、本出願の実施例で採用される技術的解決手段は以下のとおりである：
第１の態様では、生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法を提供し、遺伝子コドンの最適化、工学菌の構築、工学菌の培養、基質の変換および生成物の調製を含んでおり、工学菌により基質を直接発酵変換してタウロウルソデオキシコール酸を調製し、ここで、前記基質はタウロケノデオキシコール酸であり、前記工学菌は、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現できる工学菌株から選択される。
【０００７】
第２の態様では、上記方法のウルソデオキシコール酸の調製における応用を提供する。
本出願の実施例が提供した生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法の有益な効果は、以下のとおりである：
（１）本出願が提供した生体内変換方法を使用すると、変換される基質の濃度を高め、基質の濃度を２５０ｇ／Ｌに達させることができ、反応時間は短く、かつ基質への変換率は９８％以上に達し、得られた製品の純度は９９％以上である；
（２）上記の特定発現した大腸菌を生物工学菌として使用すると、生体内変換プロセス中、反応中間体であるタウリン７−ケトリトコール酸は高効率でタウロウルソデオキシコール酸に変換され、最終製品にはほとんど副産物が含まれない；
（３）７α−ステロイドデヒドロゲナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼおよび７β−ステロイドデヒドロゲナーゼとグルコースデヒドロゲナーゼを使用すると、反応系でＮＡＤ＋を循環再生させ、補酵素ＮＡＤ＋の使用量を大幅に減らし、酵素触媒反応のコストを削減し、工業規模の拡大に資する；
（４）ステロイドデヒドロゲナーゼと補酵素再生酵素は、柔軟なポリペプチド配列によって結合されて融合タンパク質多量体として構築され、基質と補酵素への結合距離をより近づけ、変換反応を促進し、工業生産において発酵の回数を減らし、プロセスを簡素化し、時間コストと原料コストを節約する；
（５）本出願では、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼおよび７β−ステロイドデヒドロゲナーゼとグルコースデヒドロゲナーゼの全細胞をタウロケノデオキシコール酸の変換に使用でき、細胞の破砕、細胞液の清澄化、酵素のアフィニティ精製などの高費用のかかる工業ステップを回避し、コストを大幅に節約し、かつプロセスは簡単で制御可能である。
【０００８】
本出願の実施例が提供した生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法の応用の有益な効果は、以下のとおりである：生体内変換法によって調製されたタウロウルソデオキシコール酸の変換液において、アルカリ溶解してウルソデオキシコール酸を調製し、化学法でウルソデオキシコール酸を合成する場合に大量の有機溶剤を使用することを回避し、かつこの方法では、反応時間が短く、反応が穏やかで制御可能で、操作が簡単である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本出願の実施例における技術的解決手段をより明確に説明するために、以下、実施例または例示的な技術的説明で使用される図面を簡単に紹介する。当然のことながら、以下の説明における図面は、本出願のいくつかの実施例に過ぎず、当業者にとって、創造的な労力を要することなく、これらの図面に基づき他の図面を得ることができる。
【００１０】
【図１】本出願の実施例が提供した生体内変換方法によるタウロウルソデオキシコール酸の調製の原理図である。
【図２】本出願の一実施例が提供したステロイドデヒドロゲナーゼと補酵素再生酵素との融合発現により基質を触媒する模式図である。
【図３】本出願の実施例９で調製されたタウロウルソデオキシコール酸のＨＰＬＣチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本出願の目的、技術的解決手段および利点をより明らかにするために、以下、図面および実施例を組み合わせて本出願をさらに詳細に説明する。ここで説明される具体的な実施例は本発明を解釈するためのものに過ぎず、本出願を限定するためのものではないことを理解すべきである。
「第一」、「第二」などの用語は説明上の便宜を図るためのものに過ぎず、相対的な重要度を指示や示唆するもの、或いは技術的特徴を指示する数を実質的に含むものとして理解できない。別途、明確かつ具体的に限定されていない限り、「複数」は二つ以上を意味する。
【００１２】
本出願の実施例の明細書で言及された関連する成分の重量は、各成分の特定の含有量を指示するだけでなく、各成分間の重量の比例関係を表すこともでき、従って、本出願の実施例の明細書における関連する成分の含有量に従って、比例で拡大または縮小される限り、いずれも本発明の実施例の明細書に開示された範囲内に含まれる。具体的には、本出願の実施例の明細書に記載の重量は、μｇ、ｍｇ、ｇ、ｋｇなど、化学工業の分野で知られている質量単位であってよい。
【００１３】
本出願に記載の技術的解決手段を説明するために、以下、具体的な図面および実施例と組み合わせて詳細に説明する。
第１の態様では、本出願のいくつかの実施例は、生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法を提供し、遺伝子コドンの最適化、工学菌の構築、工学菌の培養、基質の変換および生成物の調製を含んでおり、工学菌により基質を直接発酵変換してタウロウルソデオキシコール酸を調製し、ここで、前記基質はタウロケノデオキシコール酸であり、前記工学菌は、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現できる工学菌株から選択される。
【００１４】
本出願の実施例が提供した生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法の有益な効果は、以下のとおりである：
（１）本出願が提供した生体内変換方法を使用すると、変換される基質の濃度を高め、基質の濃度を２５０ｇ／Ｌに達させることができ、反応時間は短く、かつ基質への変換率は９８％以上に達し、得られた製品の純度は９９％以上である；
（２）上記の特定発現した大腸菌を生物工学菌として使用すると、生体内変換プロセス中、反応中間体であるタウリン７−ケトリトコール酸は高効率でタウロウルソデオキシコール酸に変換され、最終製品にはほとんど副産物が含まれない；
（３）７α−ステロイドデヒドロゲナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼおよび７β−ステロイドデヒドロゲナーゼとグルコースデヒドロゲナーゼを使用すると、反応系でＮＡＤ＋を循環再生させ、補酵素ＮＡＤ＋の使用量を大幅に減らし、酵素触媒反応のコストを削減し、工業規模の拡大に資する；
（４）ステロイドデヒドロゲナーゼと補酵素再生酵素は、柔軟なポリペプチド配列によって結合されて融合タンパク質多量体として構築され、基質と補酵素への結合距離をより近づけ、変換反応を促進し、工業生産において発酵の回数を減らし、プロセスを簡素化し、時間コストと原料コストを節約する；
（５）本出願では、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼおよび７β−ステロイドデヒドロゲナーゼとグルコースデヒドロゲナーゼの全細胞をタウロケノデオキシコール酸の変換に使用でき、細胞の破砕、細胞液の清澄化、酵素のアフィニティ精製などの高費用のかかる工業ステップを回避し、コストを大幅に節約し、かつプロセスは簡単で制御可能である。
【００１５】
図１に示すように、本出願が提供した生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法の原理は、以下のとおりである：タウロケノデオキシコール酸を基質とし、遺伝子工学的手段で修飾された７α−ステロイドデヒドロゲナーゼにより、タウリン７−ケトリトコール酸に変換すると同時に、共発現または融合発現した乳酸デヒドロゲナーゼは、ピルビン酸ナトリウムの存在下で補酵素ＮＡＤ＋を循環再生させ、その後、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼによりタウリン７−ケトリトコール酸をタウロウルソデオキシコール酸に変換すると同時に、共発現または融合発現したグルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースの存在下でＮＡＤ＋を循環再生させる。上記の方法では、融合発現タンパク質は、ステロイドデヒドロゲナーゼと補酵素再生酵素を柔軟なポリペプチド配列によって結合して融合タンパク質多量体として構築し、基質と補酵素の結合距離をより近づけ、変換反応をさらに促進し、それによって、タウロウルソデオキシコール酸を高収率、高純度で調製できる。
【００１６】
前記工学菌は、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現できる工学菌株から選択されることは、以下を意味する：７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの四つの酵素は、必ずしも同じ工学菌で完全に発現されるわけではなく、二つ以上の工学菌で形成された工学菌株により、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼのうちの一つ以上を発現でき、最後に、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの四つの酵素の発現を実現する。また、多くの場合、二つ以上の的工学菌で形成された工学菌株により、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの四つの酵素の発現を実現する。当然のことながら、前記工学菌株における複数の工学菌は、同じ工学菌であってもよい。いくつかの実施例において、工学菌株は、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを発現できる工学菌と、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現できる工学菌とを含む。当然のことながら、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現できれば、工学菌株における工学菌の構成方法は、これに限定されるものではないと理解すべきである。そして、いくつかの実施例において、上記の酵素を発現する工学菌は大腸菌であってよい。
【００１７】
いくつかの実施例において、前記７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記乳酸デヒドロゲナーゼの発現酵素は、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ単一発現酵素、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ共発現酵素、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ二重四量体融合酵素、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ二重四量体融合酵素と乳酸デヒドロゲナーゼ共発現酵素、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ二重四量体融合酵素と７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ共発現酵素の中から一つ選択される。
【００１８】
いくつかの実施例において、前記７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼの発現酵素は、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ単一発現酵素、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ共発現酵素、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ四量体融合酵素、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ四量体融合酵素とグルコースデヒドロゲナーゼ共発現酵素、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ四量体融合酵素と７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ共発現酵素の中から一つ選択される。
【００１９】
いくつかの実施例において、前記工学菌は、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ単一発現酵素、または７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ共発現酵素、または７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ二重四量体融合酵素、または７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ二重四量体融合酵素と乳酸デヒドロゲナーゼ共発現酵素、または７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ二重四量体融合酵素と７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ共発現酵素を発現できる工学菌、および、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ単一発現酵素、または７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ共発現酵素、または７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ四量体融合酵素、または７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ四量体融合酵素とグルコースデヒドロゲナーゼ共発現酵素、または７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ四量体融合酵素と７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ共発現酵素を発現できる工学菌から選択される。
【００２０】
本出願の実施例において、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１であり、乳酸デヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であり、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５であり、およびグルコースデヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７である。
【００２１】
いくつかの実施例において、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子のＡ７８およびＶ１１６の部位を変異させる。
本出願の実施例において、前記７α−ステロイドデヒドロゲナーゼのタンパク質配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２であり、前記乳酸デヒドロゲナーゼのタンパク質配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、前記７β−ステロイドデヒドロゲナーゼのタンパク質配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であり、前記グルコースデヒドロゲナーゼのタンパク質配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８である。
【００２２】
本出願の実施例において、上記の原理を利用して生体内変換によってタウロウルソデオキシコール酸を調製する場合、工学菌が７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現するために使用される遺伝子を構築する必要があり、かつ遺伝子コドンを最適化する。
【００２３】
いくつかの実施例において、前記遺伝子コドンの最適化方法は、以下のとおりである：遺伝子配列に対して大腸菌発現用コドンを最適化し、アフィニティータグを追加し、かつ全遺伝子合成を実行し、それぞれ７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子７α−ＨＳＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＬＤＨ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子７β−ＨＳＤＨ、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子ＧＤＨと表記される。
【００２４】
遺伝子コドンを最適化した後、最適化されたコドン遺伝子を含む工学菌を構築し、構築された発現ベクターをそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテント細胞に変換して工学菌を得て、かつそれを培養する。
いくつかの実施例において、前記工学菌を構築する方法は、以下を含む：
遺伝子発現ベクターを構築し、構築された７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１のコンピテント細胞に変換して、工学菌を得る。
【００２５】
いくつかの実施例において、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼを発現する遺伝子は７α−ＨＳＤＨと表記され、乳酸デヒドロゲナーゼを発現する遺伝子はＬＤＨと表記され、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼを発現する遺伝子は７β−ＨＳＤＨと表記され、グルコースデヒドロゲナーゼを発現する遺伝子はＧＤＨと表記され、前記遺伝子発現ベクターを構築する方法は、以下のとおりである：
７α−ＨＳＤＨ、ＬＤＨ、７β−ＨＳＤＨおよびＧＤＨをそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＧＤＨをそれぞれ取得し、または
７α−ＨＳＤＨおよびＬＤＨ、７β−ＨＳＤＨおよびＧＤＨをそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、二重遺伝子発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨ／ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨ／ＧＤＨをそれぞれ取得し、または
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）をそれぞれ取得し、または
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子とグルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）／ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）／ＧＤＨをそれぞれ取得し、または
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子と７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）／７α−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）／７β−ＨＳＤＨをそれぞれ取得する。
【００２６】
いくつかの実施例において、前記７α−ＨＳＤＨは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ（ＵｎｉＰｒｏｔ：ＣＤＱ６７＿０２４４５）に由来し、前記ＬＤＨは、Ｈｕｍａｎ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ００３３８）に由来し、前記７β−ＨＳＤＨは、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５９８６（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ａ４ＥＣＡ９）に由来し、および、前記ＧＤＨは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  （ｓｔｒａｉｎ  １６８）  （ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１２３１０）に由来する。
【００２７】
いくつかの実施例において、前記７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子のＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９であり、前記７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子のＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１である。
いくつかの実施例において、前記７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子のタンパク質配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０であり、前記７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子のタンパク質配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２である。
【００２８】
前記工学菌を構築した後、それを大規模で発酵発現できるように培養する。いくつかの実施例において、前記工学菌の培養は、工学菌の小規模発酵発現および工学菌の大規模発酵発現を含む。そのうち、工学菌の小規模発酵発現の方法は、以下のとおりである：工学菌の菌液をアンピシリン耐性のＬＢプレートにコーティングし、モノクローナルを選別し、アンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで培養し、ＯＤ値が０．８−１．２の場合、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して２ｈ誘導し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで発現レベルを検出し、発現レベルの高いクローンを選択して菌種を保存し、そして、２０μＬの菌種を２００ｍＬのアンピシリン耐性ＬＢ培地に接種して一晩培養し、ＯＤ値が２．５−４．０の場合、２ｍＬの培養液をアンピシリン耐性培地に接種して培養し、ＯＤ値が１の場合、ＩＰＴＧを添加して一晩の発現を誘導し、菌体を収集する。工学菌の大規模発酵発現の方法は、以下のとおりである：工学菌を選別してアンピシリン耐性ＬＢ培地の１Ｌの三角フラスコに接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩培養し、ＯＤ６００値が２．５−４．０の場合、培養液２０ｍＬをそれぞれ、１Ｌのアンピシリン耐性培地１０本が入った３Ｌの三角フラスコに接種し、３７℃、１４０ｒｐｍで一晩培養し、そして、１０Ｌの種液を、２００Ｌの大腸菌高密度発酵培地が入った発酵槽に無菌的に接種し、３７℃で、通気撹拌しながら８時間培養し、８時間通気撹拌培養した後、発酵槽に最終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧ溶液を添加して誘導し、１０−１２ｈ誘導した後、発酵が完了し、ドレンし、菌体を遠心分離によって収集して４℃で保存し、少量の菌体を取り、１００ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁し、超音波破砕し、粗酵素液を得る。
【００２９】
工学菌を培養して大規模で発酵発現した後、工学菌が発現した酵素の活性を測定できる。
本出願の実施例において、７α−ステロイドデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである：タウロケノデオキシコール酸を基質とし、３ｍＬの反応系に２．９７ｍＬの１００ｍＭ  ｐＨ８．０のリン酸緩衝液、最終濃度０．５ｍＭのタウロケノデオキシコール酸、１０μＬの希釈酵素溶液、最終濃度０．５ｍＭのＮＡＤＰ＋を添加し、ｐＨ８．０と２５℃で１ｍｉｎ反応させ、３４０ｎｍでの吸光値の増加を測定する。
【００３０】
本出願の実施例において、乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである：ピルビン酸ナトリウムを基質とし、３ｍＬの反応系に２．７ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２ｍＬの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＬの希釈酵素溶液、最終濃度０．２ｍＭのＮＡＤＨを添加し、ｐＨ８．０と２５℃で１ｍｉｎ反応させ、３４０ｎｍでの吸光値の減少を測定する。
【００３１】
本出願の実施例において、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである：タウロウルソデオキシコール酸を基質とし、３ｍＬの反応系に２．９７ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、最終濃度０．５ｍＭのタウロウルソデオキシコール酸、１０μＬの希釈酵素溶液、最終濃度０．５ｍＭのＮＡＤＰ＋を添加し、ｐＨ８．０と２５℃で１ｍｉｎ反応させ、３４０ｎｍでの吸光値の増加を測定する。
【００３２】
本出願の実施例において、グルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである：グルコースを基質とし、３ｍＬの反応系に２．７ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２ｍＬの１．５Ｍグルコース、５０μＬの希釈酵素溶液、最終濃度２ｍＭのＮＡＤＰ＋を添加し、ｐＨ８．０と２５℃で２ｍｉｎ反応させ、３４０ｎｍでの吸光値の増加を測定する。
【００３３】
本出願の実施例において、工学菌は標的酵素を安定して発現できるように培養した後、工学菌により基質を直接変換してタウロウルソデオキシコール酸を調製する。そのうち、前記基質はタウロケノデオキシコール酸である。いくつかの実施例において、前記基質の濃度は２０ｇ／Ｌ−２５０ｇ／Ｌである。前記基質を低濃度で反応させると、反応体積が大きく、補酵素の使用量が多い。７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの使用量を最適化し、基質の濃度を２５０ｇ／Ｌに増加させることによって、反応体積および補酵素の使用量を減少させた。前記基質の濃度が増加し続け、２５０ｇ／Ｌを超えると、基質の溶解度が低下し、基質の変換が不十分になる。
【００３４】
いくつかの実施例において、前記タウロケノデオキシコール酸を基質とし、工学菌により基質を直接変換する方法は、以下を含む：
タウロケノデオキシコール酸を２０−１００ｍＭグリシン緩衝液に溶解し、０．０１−０．８ｍＭのＮＡＤ＋を添加し、５−６０ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、２０−１００ｍＭグリシン緩衝液を最終体積まで追加し、水酸化ナトリウムでｐＨを６．５−８．５に調整し、２５℃で、６−１８ｈ反応させ、そして、１．８−１００ｇ／Ｌのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、水酸化ナトリウムでｐＨを６．５−８．５に調整し、２５℃で、６−１８ｈ反応させる。
【００３５】
本出願の実施例において、基質が変換した後、工学菌からの生成物であるタウロウルソデオキシコール酸を抽出する。いくつかの実施例において、前記タウロウルソデオキシコール酸の調製方法は、以下を含む：変換した反応液をペースト状に回転蒸発し、２−１０倍の無水エタノールまたは９５％エタノールを添加し、遠心分離または濾過によって沈殿物を除去し、上澄みを乾燥してタウロウルソデオキシコール酸の粗生成物を得て、タウロウルソデオキシコール酸の粗生成物をアセトニトリルによって溶解し、０．２２ｕｍの濾過膜で濾過して不溶物を除去してローディング液を形成し、そして、前記ローディング液を分取型高速液相調製装置によって、シリカゲルクロマトグラフィーパッキングを充填した高圧ステンレスカラムに注入し、その後、異なる濃度のメタノール−水移動相を使用して段階的に溶出させ、収集された溶出液をロータリーエバポレーターに注ぎ、粘性のある状態まで回転蒸発しながら、メタノールを回収し、その後、真空乾燥オーブンに入れて乾燥させ、高速液体クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタウロウルソデオキシコール酸の純度を測定する。
【００３６】
いくつかの実施例において、前記生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法は、以下のステップを含む：
（１）遺伝子コドンの最適化
遺伝子配列に対して大腸菌発現用コドンを最適化し、アフィニティータグを追加し、かつ全遺伝子合成を実行し、それぞれ７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子７α−ＨＳＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＬＤＨ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子７β−ＨＳＤＨ、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子ＧＤＨと表記される。
（２）工学菌の構築
遺伝子発現ベクターを構築し、構築された７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１のコンピテント細胞に変換して、工学菌を得る。
（３）工学菌の培養
工学菌の小規模発酵発現：工学菌の菌液をアンピシリン耐性のＬＢプレートにコーティングし、モノクローナルを選別し、アンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで培養し、ＯＤ値が０．８−１．２の場合、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して２ｈ誘導し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで発現レベルを検出し、発現レベルの高いクローンを選択して菌種を保存し、そして、２０μＬの菌種を２００ｍＬのアンピシリン耐性ＬＢ培地に接種して一晩培養し、ＯＤ値が２．５−４．０の場合、２ｍＬの培養液をアンピシリン耐性培地に接種して培養し、ＯＤ値が１の場合、ＩＰＴＧを添加して一晩の発現を誘導し、菌体を収集する。
工学菌の大規模発酵発現：工学菌を選別してアンピシリン耐性ＬＢ培地の１Ｌの三角フラスコに接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩培養し、ＯＤ６００値が２．５−４．０の場合、培養液２０ｍＬをそれぞれ、１Ｌのアンピシリン耐性培地１０本が入った３Ｌの三角フラスコに接種し、３７℃、１４０ｒｐｍで一晩培養し、そして、１０Ｌの種液を、２００Ｌの大腸菌高密度発酵培地が入った発酵槽に無菌的に接種し、３７℃で、通気撹拌しながら８時間培養し、８時間通気撹拌培養した後、発酵槽に最終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧ溶液を添加して誘導し、１０−１２ｈ誘導した後、発酵が完了し、ドレンし、菌体を遠心分離によって収集して４℃で保存し、少量の菌体を取り、１００ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁し、超音波破砕し、粗酵素液を得る。
（４）基質の変換
タウロケノデオキシコール酸を２０−１００ｍＭグリシン緩衝液に溶解し、０．０１−０．８ｍＭのＮＡＤ＋を添加し、５−６０ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、２０−１００ｍＭグリシン緩衝液を最終体積まで追加し、水酸化ナトリウムでｐＨを６．５−８．５に調整し、２５℃で、６−１８ｈ反応させ、そして、１．８−１００ｇ／Ｌのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、水酸化ナトリウムでｐＨを６．５−８．５に調整し、２５℃で、６−１８ｈ反応させる。
（５）生成物の調製
ステップ（４）で変換した反応液をペースト状に回転蒸発し、２−１０倍の無水エタノールまたは９５％エタノールを添加し、遠心分離または濾過によって沈殿物を除去し、上澄みを乾燥してタウロウルソデオキシコール酸の粗生成物を得て、タウロウルソデオキシコール酸の粗生成物をアセトニトリルによって溶解し、０．２２ｕｍの濾過膜で濾過して不溶物を除去してローディング液を形成し、そして、前記ローディング液を分取型高速液相調製装置によって、シリカゲルクロマトグラフィーパッキングを充填した高圧ステンレスカラムに注入し、その後、異なる濃度のメタノール−水移動相を使用して段階的に溶出させ、収集された溶出液をロータリーエバポレーターに注ぎ、粘性のある状態まで回転蒸発しながら、メタノールを回収し、その後、真空乾燥オーブンに入れて乾燥させ、高速液体クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタウロウルソデオキシコール酸の純度を測定する。
【００３７】
いくつかの実施例において、ステップ（２）では、前記遺伝子発現ベクターを構築する方法は、以下のとおりである：
７α−ＨＳＤＨ、ＬＤＨ、７β−ＨＳＤＨおよびＧＤＨをそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＧＤＨをそれぞれ取得し、または
７α−ＨＳＤＨおよびＬＤＨ、７β−ＨＳＤＨおよびＧＤＨをそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、二重遺伝子発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨ／ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨ／ＧＤＨをそれぞれ取得し、または
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）をそれぞれ取得し、または
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子とグルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）／ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）／ＧＤＨをそれぞれ取得し、または
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子と７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現ベクターのｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）／７α−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）／７β−ＨＳＤＨをそれぞれ取得する。
【００３８】
本出願の実施例において、前記７α−ステロイドデヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１であり、前記乳酸デヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であり、前記７β−ステロイドデヒドロゲナーゼＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５であり、前記グルコースデヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７である。
【００３９】
本出願の実施例において、前記７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、前記乳酸デヒドロゲナーゼ、前記７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼは、液体酵素または固定化酵素から独立して選択され、前記７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ、前記乳酸デヒドロゲナーゼ、前記７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび前記グルコースデヒドロゲナーゼは、全細胞、未精製酵素または精製酵素から独立して選択される。
【００４０】
いくつかの実施例において、生体内変換法の具体的なステップは、以下のとおりである：
（１）遺伝子コドンの最適化
遺伝子配列に対して大腸菌発現用コドンを最適化し、アフィニティータグを追加し、かつ全遺伝子合成を実行し、それぞれ７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子７α−ＨＳＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＬＤＨ、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子７β−ＨＳＤＨ、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子ＧＤＨと表記される。
（２）単一遺伝子発現ベクターの構築
７α−ＨＳＤＨ、ＬＤＨ、７β−ＨＳＤＨおよびＧＤＨをそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＧＤＨを取得する。
（３）二重遺伝子発現ベクターの構築
７α−ＨＳＤＨおよびＬＤＨ、７β−ＨＳＤＨおよびＧＤＨをそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨ／ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨ／ＧＤＨを取得する。
（４）単一遺伝子融合タンパク質発現ベクターの構築
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）を取得する。
（５）単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現ベクターの構築
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子とグルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）／ＬＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）／ＧＤＨを取得する。
（６）単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現ベクターの構築
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子と７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ単一遺伝子をそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターに構築し、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）／７α−ＨＳＤＨ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）／７β−ＨＳＤＨを取得する。
（７）工学菌の構築
ステップ（２）−ステップ（６）で構築されたすべての発現ベクターをそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテント細胞に変換し、工学菌を得る。
（８）工学菌の小規模発酵発現
工学菌の菌液をアンピシリン耐性のＬＢプレートにコーティングし、モノクローナルを選別し、アンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで培養し、ＯＤ値が０．８−１．２の場合、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して２ｈ誘導し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで発現レベルを検出し、発現レベルの高いクローンを選択して菌種を保存し、そして、２０μＬの菌種を２００ｍＬのアンピシリン耐性ＬＢ培地に接種して一晩培養し、ＯＤ値が２．５−４．０の場合、２ｍＬの培養液をアンピシリン耐性培地に接種して培養し、ＯＤ値が１の場合、ＩＰＴＧを添加して一晩の発現を誘導し、菌体を収集する。
（９）工学菌の大規模発酵発現
工学菌を選別してアンピシリン耐性ＬＢ培地の１Ｌの三角フラスコに接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩培養し、ＯＤ６００値が２．５−４．０の場合、培養液２０ｍＬをそれぞれ、１Ｌのアンピシリン耐性培地１０本が入った３Ｌの三角フラスコに接種し、３７℃、１４０ｒｐｍで一晩培養し、そして、１０Ｌの種液を、２００Ｌの大腸菌高密度発酵培地が入った発酵槽に無菌的に接種し、３７℃で、通気撹拌しながら８時間培養し、８時間通気撹拌培養した後、発酵槽に最終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧ溶液を添加して誘導し、１０−１２ｈ誘導した後、発酵が完了し、ドレンし、菌体を遠心分離によって収集して４℃で保存し、少量の菌体を取り、１００ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁し、超音波破砕し、粗酵素液を得る。
（１０）酵素活性の測定
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである：タウロケノデオキシコール酸を基質とし、３ｍＬの反応系に２．９７ｍＬの１００ｍＭ  ｐＨ８．０のリン酸緩衝液、最終濃度０．５ｍＭのタウロケノデオキシコール酸、１０μＬの希釈酵素溶液、最終濃度０．５ｍＭのＮＡＤＰ＋を添加し、ｐＨ８．０と２５℃で１ｍｉｎ反応させ、３４０ｎｍでの吸光値の増加を測定する。
【００４１】
乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである：ピルビン酸ナトリウムを基質とし、３ｍＬの反応系に２．７ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２ｍＬの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＬの希釈酵素溶液、最終濃度０．２ｍＭのＮＡＤＨを添加し、ｐＨ８．０と２５℃で１ｍｉｎ反応させ、３４０ｎｍでの吸光値の減少を測定する。
【００４２】
７β−ステロイドデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである：タウロウルソデオキシコール酸を基質とし、３ｍＬの反応系に２．９７ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、最終濃度０．５ｍＭのタウロウルソデオキシコール酸、１０μＬの希釈酵素溶液、最終濃度０．５ｍＭのＮＡＤＰ＋を添加し、ｐＨ８．０と２５℃で１ｍｉｎ反応させ、３４０ｎｍでの吸光値の増加を測定する。
【００４３】
グルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法は、以下のとおりである：グルコースを基質とし、３ｍＬの反応系に２．７ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２ｍＬの１．５Ｍグルコース、５０μＬの希釈酵素溶液、最終濃度２ｍＭのＮＡＤＰ＋を添加し、ｐＨ８．０と２５℃で２ｍｉｎ反応させ、３４０ｎｍでの吸光値の増加を測定する。
（１１）タウロケノデオキシコール酸のタウロウルソデオキシコール酸への変換
タウロケノデオキシコール酸を２０−１００ｍＭグリシン緩衝液に溶解し、０．０１−０．８ｍＭのＮＡＤ＋を添加し、５−６０ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、２０−１００ｍＭグリシン緩衝液を最終体積まで追加し、水酸化ナトリウムでｐＨを６．５−８．５に調整し、２５℃で、６−１８ｈ反応させ、そして、１．８−１００ｇ／Ｌのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌菌体を添加し、水酸化ナトリウムでｐＨを６．５−８．５に調整し、２５℃で、６−１８ｈ反応させる。
（１２）タウロウルソデオキシコール酸の調製
ステップ（１１）で変換した反応液をペースト状に回転蒸発し、２−１０倍の無水エタノールまたは９５％エタノールを添加し、遠心分離または濾過によって沈殿物を除去し、上澄みを乾燥してタウロウルソデオキシコール酸の粗生成物を得て、タウロウルソデオキシコール酸の粗生成物をアセトニトリルによって溶解し、０．２２ｕｍの濾過膜で濾過して不溶物を除去してローディング液を形成し、そして、前記ローディング液を分取型高速液相調製装置によって、シリカゲルクロマトグラフィーパッキングを充填した高圧ステンレスカラムに注入し、その後、異なる濃度のメタノール−水移動相を使用して段階的に溶出させ、収集された溶出液をロータリーエバポレーターに注ぎ、粘性のある状態まで回転蒸発しながら、メタノールを回収し、その後、真空乾燥オーブンに入れて乾燥させ、高速液体クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタウロウルソデオキシコール酸の純度を測定する。
【００４４】
第２の態様では、本出願の実施例は、上記方法のウルソデオキシコール酸の調製における応用を提供する。
本出願の実施例が提供した生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法の応用の有益な効果は、以下のとおりである：生体内変換法によって調製されたタウロウルソデオキシコール酸の変換液において、アルカリ溶解してウルソデオキシコール酸を調製し、化学法でウルソデオキシコール酸を合成する場合に大量の有機溶剤を使用することを回避し、かつこの方法では、反応時間が短く、反応が穏やかで制御可能で、操作が簡単である。
【００４５】
いくつかの実施例において、前記調製プロセスは、以下のとおりである：水酸化ナトリウムを変換したタウロウルソデオキシコール酸溶液に添加し、ｐＨを８−１１に調整し、温度を８０−１００℃に上げ、１８−２４ｈ反応させ、温度を１０−１５℃に下げ、塩酸を添加してｐＨを３−５に調整し、ウルソデオキシコール酸を析出する。生体内変換法によって調製されたタウロウルソデオキシコール酸の変換液において、水酸化ナトリウムを添加してｐＨを８−１１に調整してアルカリ溶解し、続いて塩酸を添加して中和し、ウルソデオキシコール酸を析出し、それによって、化学法でウルソデオキシコール酸を合成する場合に大量の有機溶剤を使用することを回避し、また、反応時間が短く、反応が穏やかで制御可能で、操作が簡単である。
【００４６】
上記の生体内変換反応の間、基質の濃度は２０−２５０ｇ／Ｌである。
上記の酵素はすべて、液体酵素または固定化酵素であってもよく、全細胞、未精製酵素または精製酵素であってもよい。
以下、具体的な実施例と組み合わせて説明する。
【００４７】
以下の具体的な実施例において、組換えプラスミドの構築方法は具体的に、以下のとおりである：
単一遺伝子発現ベクターの構築
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨの調製
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓに由来する７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤＮＡ配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、コードされたタンパク質配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）については、プライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）５´−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ−３´および（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）５´−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＣＡ−３´を使用してＰＣＲで増幅し、ＢａｍＨ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで切断し、Ｄｐｎ  Ｉ酵素でテンプレートを消化する。ＢａｍＨ  ＩおよびＥｃｏＲ  ＩでｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターを切断する。リガーゼを使用して７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をＤＨ５αに変換し、アンピシリン耐性のＬＢプレートにコーティングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、５ｍＬ  ＬＢに接種して一晩培養する。菌体を収集し、ＴＩＡＮＧＥＮ製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＬＤＨの調製
Ｈｕｍａｎに由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤＮＡ配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、コードされたタンパク質配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）については、プライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）５´−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ−３´および（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）５´−ＴＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＣＴ−３´を使用してＰＣＲで増幅し、Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  Ｉで切断し、Ｄｐｎ  Ｉ酵素でテンプレートを消化する。Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  ＩでｐＥＴＤｕｅｔ−１プラスミドを切断し、リガーゼを使用して乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をＤＨ５αに変換し、アンピシリン耐性のＬＢプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、５ｍＬ  ＬＢに接種して一晩培養する。菌体を収集し、ＴＩＡＮＧＥＮ製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨの調製
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５９８６に由来する７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子の変異体（Ａ７８Ｃ、Ｖ１１６Ｃ）（ＤＮＡ配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、コードされたタンパク質配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）については、プライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）５´−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ−３´および（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）５´−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＣＧＧＴＡＧＡＡＡＧＡＡＣ−３´を使用してＰＣＲで増幅し、ＢａｍＨ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで切断し、Ｄｐｎ  Ｉ酵素でテンプレートを消化する。ＢａｍＨ  ＩおよびＥｃｏＲ  ＩでｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターを切断する。リガーゼを使用して７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をＤＨ５αに変換し、アンピシリン耐性のＬＢプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、５ｍＬ  ＬＢに接種して一晩培養する。菌体を収集し、ＴＩＡＮＧＥＮ製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＧＤＨの調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  （ｓｔｒａｉｎ  １６８）に由来するグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤＮＡ配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、コードされたタンパク質配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）については、プライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）５´−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ−３´および（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）５´−ＴＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＣＴ−３´を使用してＰＣＲで増幅し、Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  Ｉで切断し、Ｄｐｎ  Ｉ酵素でテンプレートを消化する。Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  ＩでｐＥＴＤｕｅｔ−１プラスミドを切断し、リガーゼを使用して乳酸デヒドロゲナーゼ断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をＤＨ５αに変換し、アンピシリン耐性のＬＢプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、５ｍＬ  ＬＢに接種して一晩培養する。菌体を収集し、ＴＩＡＮＧＥＮ製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
双遺伝子共発現ベクターの構築
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプ  ラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨ／ＬＤＨの調製
Ｈｕｍａｎに由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子については、プライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）５´−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ−３´および（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）５´−ＴＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＣＴ−３´を使用してＰＣＲで増幅し、Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  Ｉで切断し、Ｄｐｎ  Ｉ酵素でテンプレートを消化する。Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  Ｉで上記の正しく配列決定されたｐＥＴＤｕｅｔ−１−７α−ＨＳＤＨプラスミドを切断し、リガーゼを使用して乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をＤＨ５αに変換し、アンピシリン耐性のＬＢプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、５ｍＬ  ＬＢに接種して一晩培養する。菌体を収集し、ＴＩＡＮＧＥＮ製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨ／ＧＤＨの調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  （ｓｔｒａｉｎ  １６８）に由来するグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子については、プライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）５´−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ−３´および（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）５´−ＴＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＣＴ−３´を使用してＰＣＲで増幅し、Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  Ｉで切断し、Ｄｐｎ  Ｉ酵素でテンプレートを消化する。Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  Ｉで上記の正しく配列決定されたｐＥＴＤｕｅｔ−１−７β−ＨＳＤＨプラスミドを切断し、リガーゼを使用して乳酸デヒドロゲナーゼ断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をＤＨ５αに変換し、アンピシリン耐性のＬＢプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、５ｍＬ  ＬＢに接種して一晩培養する。菌体を収集し、ＴＩＡＮＧＥＮ製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
単一遺伝子発現融合タンパク質ベクターの構築
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）の調製
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子（ＤＮＡ配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、コードされたタンパク質配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）については、プライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）５´−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ−３´および（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）５´−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＣＡ−３´を使用してＰＣＲで増幅し、ＢａｍＨ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで切断し、Ｄｐｎ  Ｉ酵素でテンプレートを消化する。ＢａｍＨ  ＩおよびＥｃｏＲ  ＩでｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターを切断する。リガーゼを使用して７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をＤＨ５αに変換し、アンピシリン耐性のＬＢプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、５ｍＬ  ＬＢに接種して一晩培養する。菌体を収集し、ＴＩＡＮＧＥＮ製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）の調製
７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子（ＤＮＡ配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、コードされたタンパク質配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）については、プライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）５´−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ−３´および（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）５´−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＣＧＧＴＡＧＡＡＡＧＡＡＣ−３´を使用してＰＣＲで増幅し、ＢａｍＨ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで切断し、Ｄｐｎ  Ｉ酵素でテンプレートを消化する。ＢａｍＨ  ＩおよびＥｃｏＲ  ＩでｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターを切断する。リガーゼを使用して７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をＤＨ５αに変換し、アンピシリン耐性のＬＢプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、５ｍＬ  ＬＢに接種して一晩培養する。菌体を収集し、ＴＩＡＮＧＥＮ製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現ベクターの構築
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子共発現を含む組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）／ＬＤＨの調製
Ｈｕｍａｎに由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子については、プライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）５´−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ−３´および（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）５´−ＴＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＣＴ−３´を使用してＰＣＲで増幅し、Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  Ｉで切断し、Ｄｐｎ  Ｉ酵素でテンプレートを消化する。Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  ＩでｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）プラスミドを切断し、リガーゼを使用して乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をＤＨ５αに変換し、アンピシリン耐性のＬＢプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、５ｍＬ  ＬＢに接種して一晩培養する。菌体を収集し、ＴＩＡＮＧＥＮ製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子とグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子共発現を含む組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）／ＧＤＨの調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  （ｓｔｒａｉｎ  １６８）に由来するグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子については、プライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）５´−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ−３´および（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）５´−ＴＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＣＴ−３´を使用してＰＣＲで増幅し、Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  Ｉで切断し、Ｄｐｎ  Ｉ酵素でテンプレートを消化する。Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  ＩでｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）プラスミドを切断し、リガーゼを使用してグルコースデヒドロゲナーゼ断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をＤＨ５αに変換し、アンピシリン耐性のＬＢプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、５ｍＬ  ＬＢに接種して一晩培養する。菌体を収集し、ＴＩＡＮＧＥＮ製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現発現ベクターの構築
７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ単一遺伝子と７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子共発現を含む組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）／７α−ＨＳＤＨの調製
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓに由来する７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子については、プライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）５´−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ−３´および（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）５´−ＴＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＡＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＣＡ−３´を使用してＰＣＲで増幅し、Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  Ｉで切断し、Ｄｐｎ  Ｉ酵素でテンプレートを消化する。Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  ＩでｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＬＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７α−ＨＳＤＨ）プラスミドを切断し、リガーゼを使用して７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をＤＨ５αに変換し、アンピシリン耐性のＬＢプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、５ｍＬ  ＬＢに接種して一晩培養する。菌体を収集し、ＴＩＡＮＧＥＮ製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ単一遺伝子と７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子共発現を含む組換えプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）／７β−ＨＳＤＨの調製
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５９８６に由来する７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子の変異体（Ａ７８Ｃ、Ｖ１１６Ｃ）については、プライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）５´−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ−３´および（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）５´−ＴＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＴＣＡＣＧＧＴＡＧＡＡＡＧＡＡＣ−３´を使用してＰＣＲで増幅し、Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  Ｉで切断し、Ｄｐｎ  Ｉ酵素でテンプレートを消化する。Ｎｄｅ  ＩおよびＡｖａ  ＩでｐＥＴＤｕｅｔ−１−（ＧＤＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−７β−ＨＳＤＨ）プラスミドを切断し、リガーゼを利用して７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ断片とベクターのライゲーションを行う。ライゲーション産物をＤＨ５αに変換し、アンピシリン耐性のＬＢプレートにコーディングしてスクリーニングする。モノクローナルを選別し、５ｍＬ  ＬＢに接種して一晩培養する。菌体を収集し、ＴＩＡＮＧＥＮ製プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、配列決定に送られる。正しく配列決定されたプラスミドを保存する。
【００４８】
実施例１  三角フラスコでの組換えプラスミドを含む大腸菌の発酵発現
組換えプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌種を２０μＬ取り、２００ｍＬのアンピシリン耐性ＬＢ培地に接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで、一晩培養し、ＯＤ６００値は２．５−４．０である。２０ｍＬの培養液を１Ｌアンピシリン耐性培地に接種し、３７℃、１４０ｒｐｍで、３時間培養し、ＯＤ６００値が１の場合、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して一晩の発現を誘導する。遠心分離して菌体を収集する。少量の菌体を取り、１００ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁し、超音波破砕し、粗酵素液を得る。技術的解決手段における方法により、酵素活性を測定する。
実施例２  発酵槽での組換えプラスミドを含む大腸菌の発酵発現
組換えプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌種を２０μＬ取り、２００ｍＬアンピシリン耐性ＬＢ培地に接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで、一晩培養し、ＯＤ６００値は２．５−４．０である。２０ｍＬの培養液を１Ｌアンピシリン耐性培地に接種し、３７℃、１４０ｒｐｍで、一晩培養する。１０Ｌの種液を、２００Ｌの大腸菌高密度発酵培地が入った発酵槽に無菌的に接種し、３７℃で、通気撹拌しながら８時間培養する。大腸菌高密度発酵培地には、１８ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム十二水和物、６．８ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、０．７ｇ／Ｌの無水硫酸ナトリウム、０．４８ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、２．２５ｇ／Ｌのグリセリン、２．５ｇ／Ｌの酵母粉末、５ｇ／Ｌのペプトンが含まれている。８時間通気撹拌培養した後、発酵槽に最終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧ溶液を添加して誘導し、１０−１２ｈ誘導した後、発酵が完了し、ドレンし、菌体を遠心分離によって収集して４℃で保存する。少量の菌体を取り、１００ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁し、超音波破砕し、粗酵素液を得る。技術的解決手段における方法により、酵素活性を測定する。
実施例３  １Ｌ反応系での単一遺伝子発現タンパク質によるタウロウルソデオキシコール酸の変換
２５０ｇのタウロケノデオキシコール酸を７００ｍＬの１００ｍＭグリシン緩衝液に溶解し、０．２５ｍＭのＮＡＤ＋を添加し、６０ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ（約５ｇの純粋な酵素を含む）および乳酸デヒドロゲナーゼ（約２ｇの純粋な酵素を含む）を添加し、１００ｍＭグリシン緩衝液を１Ｌまで追加し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。２５℃で、６−１８ｈ反応させる。１００ｇ／Ｌのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ（約５ｇの純粋な酵素を含む）およびグルコースデヒドロゲナーゼ（約２ｇの純粋な酵素を含む）の大腸菌を添加し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。２５℃で、６−１８ｈ反応させる。基質変換率は９８％以上であり、完成品の含有量は９６．８％以上であり、収量は８５％を超える。
実施例４  １Ｌ反応系での双遺伝子共発現タンパク質によるタウロウルソデオキシコール酸の変換
２５０ｇのタウロケノデオキシコール酸を７００ｍＬの１００ｍＭグリシン緩衝液に溶解し、０．２５ｍＭのＮＡＤ＋を添加し、６０ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての共発現７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ（合計約１０ｇの酵素を含む）を添加し、１００ｍＭグリシン緩衝液を１Ｌまで追加し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。２５℃で、６−１８ｈ反応させる。１００ｇ／Ｌのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての共発現７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ（合計約１０ｇの酵素を含む）を添加し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。２５℃で、６−１８ｈ反応させる。基質変換率は９８％以上であり、完成品の含有量は９６．８％以上であり、収量は８５％を超える。
実施例５  １Ｌ反応系での単一遺伝子発現融合タンパク質によるタウロウルソデオキシコール酸の変換
２５０ｇのタウロケノデオキシコール酸を７００ｍＬの１００ｍＭグリシン緩衝液に溶解し、０．２５ｍＭのＮＡＤ＋を添加し、６０ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ（約５ｇの酵素を含む）を添加し、１００ｍＭグリシン緩衝液を１Ｌまで追加し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。２５℃で、６−１８ｈ反応させる。１００ｇ／Ｌのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ（約５ｇの酵素を含む）を添加し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。２５℃で、６−１８ｈ反応させる。基質変換率は９９．７％以上であり、完成品の含有量は９６．８％以上であり、収量は８５％を超える。
実施例６  １Ｌ反応系での単一遺伝子融合タンパク質とデヒドロゲナーゼ共発現タンパク質によるタウロウルソデオキシコール酸の変換
２５０ｇのタウロケノデオキシコール酸を７００ｍＬの１００ｍＭグリシン緩衝液に溶解し、０．２０ｍＭのＮＡＤ＋を添加し、６０ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての共発現７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼ（合計約７ｇの酵素を含む）を添加し、１００ｍＭグリシン緩衝液を１Ｌまで追加し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。２５℃で、６−１８ｈ反応させる。１００ｇ／Ｌのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての共発現７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼとグルコースデヒドロゲナーゼ（合計約７ｇの酵素を含む）を添加し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。２５℃で、６−１８ｈ反応させる。基質変換率は９８．５％以上であり、完成品の含有量は９６．８％以上であり、収量は８５％を超える。
実施例７  １Ｌ反応系での単一遺伝子融合タンパク質とステロイドデヒドロゲナーゼ共発現タンパク質によるタウロウルソデオキシコール酸の変換
２５０ｇのタウロケノデオキシコール酸を７００ｍＬの１００ｍＭグリシン緩衝液に溶解し、０．５０ｍＭのＮＡＤ＋を添加し、６０ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての共発現７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼと７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ（合計約７ｇの酵素を含む）を添加し、１００ｍＭグリシン緩衝液を１Ｌまで追加し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。２５℃で、６−１８ｈ反応させる。１００ｇ／Ｌのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての共発現７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼと７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ（合計約７ｇの酵素を含む）を添加し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。２５℃で、６−１８ｈ反応させる。基質変換率は９９．５％以上であり、完成品の含有量は９６．８％以上であり、収量は８５％を超える。
実施例８  １００Ｌ反応系での単一遺伝子発現融合タンパク質によるタウロウルソデオキシコール酸の変換
２５Ｋｇのタウロケノデオキシコール酸を７０Ｌの１００ｍＭグリシン緩衝液に溶解し、０．２５ｍＭのＮＡＤ＋を添加し、６０ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合乳酸デヒドロゲナーゼ（約５００ｇの酵素を含む）を添加し、１００ｍＭグリシン緩衝液を１００Ｌまで追加し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。２５℃で、６−１８ｈ反応させる。１００ｇ／Ｌのグルコースを添加し、精製または部分的に精製された酵素液または細胞溶解液または菌体再懸濁液としての７β−ステロイドデヒドロゲナーゼ融合グルコースデヒドロゲナーゼ（約５００ｇの酵素を含む）を添加し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。２５℃で、６−１８ｈ反応させる。基質変換率は９９．５％以上であり、完成品の含有量は９６．８％以上であり、収量は８５％を超える。
実施例３−８における７α−ステロイドデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼの使用量、７β−ステロイドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの使用量、ＮＡＤ＋の添加量および基質変換率は、以下の表１に示す。
【表１】
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実施例９  タウロウルソデオキシコール酸の調製
上記の変換した反応液を、ペースト状に回転蒸発し、１０倍の体積の無水エタノールまたは９５％エタノールを添加し、遠心分離または濾過によって沈殿物を除去する。上澄みを真空乾燥して、タウロウルソデオキシコール酸の粗生成物を得る。反応後のタウロウルソデオキシコール酸の粗生成物をアセトニトリルによって溶解し、０．２２ｕｍの濾過膜で濾過して不溶物を除去してローディング液を形成し、そして、前記ローディング液を分離用ＨＰＬＣによってＣ１８シリカゲルパッキングを充填した高圧ステンレスカラムに注ぎ（カラムサイズ  １５＊２５５ｍｍ）、その後、３０％メタノール−水溶液で調製した移動相Ａをステンレスカラムに注入して溶出させ、溶出速度を２４０ｍＬ／ｈとし、溶出時間を１７５分間とし、溶出液１を収集し、続いて、移動相の勾配を５０分間以内に直線的に５０％移動相Ｂ（８０％メタノール−水溶液）に増加して溶出させ、５０％移動相Ｂで７５分間溶出させ、溶出液２を収集し、そして、溶出勾配を４０分間以内に直線的に１００％移動相Ｂに増加し、１００％移動相Ｂで７０分間溶出させ、溶出液３を収集し、そして、収集された溶出液をロータリーエバポレーターに注ぎ、粘性のある状態まで回転蒸発しながら、メタノールを回収し、その後、真空乾燥オーブンに入れて乾燥させ、高速液体クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタウロウルソデオキシコール酸胆酸の純度を測定し、質量部として、そこで、溶出液１におけるタウロウルソデオキシコール酸の含有量は５．７７％であり、回収量は８．２％であり、溶出液２におけるタウロウルソデオキシコール酸の含有量は９９．３％であり、回収量は８１．５％であり、溶出液３におけるタウロウルソデオキシコール酸の含有量は１４．９％であり、回収量は１０．３％である。実施例９で調製されたタウロウルソデオキシコール酸のＨＰＬＣチャートは図３に示す。
実施例１０  ウルソデオキシコール酸の調製
上記の変換した反応液に水酸化ナトリウムを添加し、ｐＨを１０に調整し、温度を１００℃に上げ、２４ｈ反応させ、温度を１０℃に下げ、塩酸を添加してｐＨを４に調整し、ウルソデオキシコール酸を析出する。つまり、ウルソデオキシコール酸の粗生成物を得る。
【００４９】
上記は本出願の好ましい実施例に過ぎず、本出願を制限するためのものではない。当業者にとって、本出願に対して様々な変更および修正を行うことができる。本出願の精神および原則においてなされたあらゆる変更、等価取替や改良等は、本出願の保護範囲に含まれるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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