(57)【要約】  ポリヌクレオチドを選択するための方法であって、核酸処理酵素が試料中の複数のポリヌクレオチドに沿って定義された期間移動することを可能にすることであって、酵素は、複数のポリヌクレオチドの各々に負荷され、酵素の１つ以上の分子が複数のポリヌクレオチドの各々に沿って移動する、移動することを可能にすることと；酵素が、定義された期間内にポリヌクレオチドの末端に到達するかどうか、および／またはポリヌクレオチドから結合解除されるかどうかに基づいて、ポリヌクレオチドを選択することと、を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドを選択するための方法であって、
（ｉ）核酸処理酵素が試料内の複数のポリヌクレオチドに沿って定義された期間移動することを可能にすることであって、前記酵素が、前記複数のポリヌクレオチドの各々に負荷され、前記酵素の１つ以上の分子が、前記複数のポリヌクレオチドの各々に沿って移動する、ことと、
（ｉｉ）前記酵素が、前記定義された期間内に前記ポリヌクレオチドの末端に到達するかどうか、および／または前記ポリヌクレオチドから結合解除されるかどうかに基づいて、ポリヌクレオチドを選択することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記酵素が、同じ方法で前記複数のポリヌクレオチドの各々に負荷される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アダプタが、前記複数のポリヌクレオチドの各々の一端または両端に付着している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、前記酵素を前記複数のポリヌクレオチドに結合させる初期工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、前記複数のポリヌクレオチドの一端または両端にアダプタを付着させ、次いで、前記酵素を前記アダプタに結合させる初期工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、前記酵素が前記ポリヌクレオチドに沿って移動しない条件下で、前記酵素が予め結合されたアダプタを、前記複数のポリヌクレオチドの各々の一端または両端に付着させる初期工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉ）において、前記酵素のさらなる分子が前記複数のポリヌクレオチドに結合することが防止される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉ）において、前記酵素に結合する捕捉鎖が、前記試料に添加される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記定義された期間が、前記酵素の移動を開始させることによって開始される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素の移動が、前記酵素、補酵素、および／または補因子にエネルギーを提供するヌクレオチドを添加することによって開始される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記定義された期間が、前記酵素の移動を阻害することによって停止される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素の移動が、（ａ）前記酵素、補酵素、および／もしくは補因子にエネルギーを提供するヌクレオチドを除去することによって、（ｂ）酵素阻害剤を添加することによって、（ｃ）ｐＨ、温度、もしくは塩濃度を変化させることによって、ならびに／または（ｄ）前記酵素を変性させることによって、停止される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉ）の開始時に、前記酵素の１分子のみが、前記複数のポリヌクレオチドの各々に結合している、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉ）の開始時に、前記酵素の複数の分子が、前記複数のポリヌクレオチドの各々に結合している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｉ）の開始時に、前記酵素の分子が、前記複数のポリヌクレオチドのいずれにも結合していない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記定義された期間が、前記複数のポリヌクレオチドを前記酵素と接触させることによって開始される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｉ）の間に、前記酵素の複数の分子が、前記複数のポリヌクレオチドに沿って移動する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、前記選択されたポリヌクレオチドを選択されていないポリヌクレオチドから分離することを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｉｉ）において、酵素が前記末端から離れるように移動したポリヌクレオチドが、酵素が前記末端から離れるように移動しなかったポリヌクレオチドから分離される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
末端シグナルを含むアダプタが、前記複数のポリヌクレオチドの各々の一端または両端に付着している、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記末端シグナルが、選択タグ、さらなるポリヌクレオチドを付着させるための隠れた部位、さらなるポリヌクレオチドを付着させるための露出した部位、またはエキソヌクレアーゼによる消化を防ぐキャップであり；工程（ｉ）において、前記酵素の分子が前記ポリヌクレオチドの前記末端に到達すると、前記選択タグが解離させられるか、前記隠れた部位が現れるか、前記露出した部位が除去されるか、または前記キャップが除去され；工程（ｉｉ）において、前記選択タグ、隠れた部位、露出した部位、またはキャップされていない末端が、前記ポリヌクレオチドを分離するために使用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数のポリヌクレオチドが前記選択タグを介してビーズ、カラムまたは表面に結合し、前記酵素による前記選択タグの解離により、前記酵素がもはや付着していない前記ポリヌクレオチドが前記ビーズ、カラムまたは表面から放出される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記表面が膜貫通孔を含む膜である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
洗浄後に前記ビーズ、カラムまたは表面に結合したままである前記ポリヌクレオチドが、工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことにより分離される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵素の移動を再開させて、前記酵素が前記ポリヌクレオチドの前記末端に到達することを可能にするか、または前記ビーズ、カラムもしくは表面から前記ポリヌクレオチドを結合解除することにより、前記ビーズ、カラムもしくは表面に結合したままである前記ポリヌクレオチドが、前記ビーズ、カラムまたは表面から回収される、請求項２２または２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｉ）の開始時に、前記酵素の分子が前記複数のポリヌクレオチドのいずれにも結合せず、前記定義された期間が、前記酵素と、前記酵素、補酵素、および／または補因子にエネルギーを提供するヌクレオチドとを前記試料に添加することよって開始される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記酵素がタグ付けされている、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記酵素が、ビーズ、カラムまたは表面に結合している、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記定義された期間が、前記ビーズ、カラムまたは表面をフラッシュすることによって停止される、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｉｉ）において、前記酵素が結合したままであるポリヌクレオチドが、前記酵素が結合していないポリヌクレオチドから分離される、請求項１〜１８および２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ビーズ、カラムまたは表面に結合していないポリヌクレオチドが、洗浄によって除去または溶出される、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
洗浄後に前記ビーズ、カラムまたは表面に結合したままである前記ポリヌクレオチドが、工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことにより分離される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記酵素の移動を再開させて、前記酵素が前記ポリヌクレオチドの前記末端に到達することを可能にするか、前記ビーズ、カラムもしくは表面から前記酵素を結合解除するか、または前記ポリヌクレオチドから前記酵素を結合解除することにより、前記ビーズ、カラムもしくは表面に結合したままである前記ポリヌクレオチドが、前記ビーズ、カラムまたは表面から回収される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記選択されたポリヌクレオチドが、前記選択されていないポリヌクレオチドよりも長いまたは短い、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記選択されたポリヌクレオチドが損傷を受け、かつ前記選択されたポリヌクレオチドが損傷を受けていない、または前記選択されたポリヌクレオチドが損傷を受けておらず、かつ前記選択されたポリヌクレオチドが損傷を受けている、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記選択されたポリヌクレオチドが、選択的に修飾されるか、または特徴付けられる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ニックの入った鎖を有するポリヌクレオチドが無傷のポリヌクレオチドから分離されるか、前記選択的に修飾されたポリヌクレオチドにニックが入っており、かつ前記無修飾のポリヌクレオチドが無傷であるか、または前記選択的に修飾されたポリヌクレオチドが無傷であり、かつ前記無修飾のポリヌクレオチドにニックが入っている、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ｉ）において、前記定義された期間が、前記酵素のさらなる分子が前記複数のポリヌクレオチドに結合するのを防止するために、前記酵素に結合する捕捉鎖を添加することによって開始され、工程（ｉｉ）において、前記酵素が結合したままであるポリヌクレオチドが、前記酵素が結合していないポリヌクレオチドから分離される、請求項１〜１５および２６〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｉ）における前記定義された期間が１秒〜１４日である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
アダプタが前記複数のポリヌクレオチドの各々に付着し、第２の核酸処理酵素が前記アダプタに付着し、工程（ｉ）において前記ポリヌクレオチドに沿って移動しないように前記アダプタ上で抑止されている、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
工程（ｉｉ）が、前記隠れた部位または露出した部位を、一本鎖リーダー配列および任意選択的に膜アンカーもしくは膜貫通孔アンカーを含むアダプタに結合することであって、第２の核酸処理酵素が前記アダプタに付着されており、前記アダプタ上で停止している、結合することと、前記試料を膜貫通孔と接触させることと、を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記酵素が、トランスロカーゼ、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、またはエキソヌクレアーゼである、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＤＮＡが二本鎖である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料が、
（ａ）ＰＣＲ反応の産物を含み、
（ｂ）ＤＮＡライブラリであり、
（ｃ）ゲノムＤＮＡを含み、
（ｄ）エンドヌクレアーゼ消化の産物を含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
以下のさらなる工程：
−所望の長さのポリヌクレオチドを選択すること；
−損傷を受けていないポリヌクレオチドを選択すること；
−無傷のポリヌクレオチドを選択すること；
−所望の長さのポリヌクレオチド、損傷を受けていないポリヌクレオチド、および／または無傷のポリヌクレオチドを特徴付けること；
−所望の長さのポリヌクレオチド、損傷を受けていないポリヌクレオチド、および／または無傷のポリヌクレオチドの配列決定をすること；
−所望の長さのポリヌクレオチド、損傷を受けていないポリヌクレオチド、および／または無傷のポリヌクレオチドからプライマーまたはアダプタを除去すること；ならびに
−所望の長さのポリヌクレオチド、損傷を受けていないポリヌクレオチド、および／または無傷のポリヌクレオチドを使用して、遺伝子型同定、ＤＮＡフィンガープリンティング、またはプロファイリングを行うこと；のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
（ｉ）請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法を実行することと、
（ｉｉ）膜貫通孔を前記選択されたポリヌクレオチドと接触させることと、
（ｉｉｉ）前記膜貫通孔にわたって電位差を適用することと、
（ｉｖ）前記膜貫通孔に対して移動するポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す１つ以上の測定を行い、それによって前記ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む、方法。
【請求項４８】
前記方法が、前記ポリヌクレオチドが前記膜貫通孔に対して移動する際に前記膜貫通孔を通過する電流を測定することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ポリマーアダプタであって、
（ａ）第１の核酸処理酵素；
（ｂ）第２の核酸処理酵素であって、前記ポリマーに沿ったその移動が膜貫通孔と接触するまで妨げられるように結合されており、前記第２の核酸処理酵素が、前記第１の核酸処理酵素の移動を妨げないものである、第２の核酸処理酵素；および任意選択的に、
（ｃ）膜アンカーまたは孔アンカー；に結合した、ポリマーアダプタ。
【請求項５０】
タグを含む、請求項４９に記載のアダプタ。
【請求項５１】
前記タグが前記アダプタにハイブリダイズされるか、または前記酵素に付着される、請求項５０に記載のアダプタ。
【請求項５２】
さらなるポリヌクレオチドを付着させるための隠れた部位、またはさらなるポリヌクレオチドを付着させるための露出した部位を含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載のアダプタ。
【請求項５３】
ポリヌクレオチドを分離するためのキットであって、（ａ）ポリヌクレオチドおよび末端シグナルを含むアダプタ、ならびに／または（ｂ）請求項４７〜５０のいずれか一項に記載のアダプタを含み、以下の構成要素：
−抽出媒体；
−核酸処理酵素；
−前記酵素、酵素補因子、および／もしくは補酵素にエネルギーを提供する、ヌクレオチド；
−前記核酸処理酵素のための燃料および／もしくは補因子を含む、溶液；
−前記核酸処理酵素のための燃料および／もしくは補因子を含有しない、洗浄溶液；
−部位特異的エンドヌクレアーゼ；ならびに／または
−シーケンスアダプタ；のうちの任意の組み合わせを含む任意の１つ以上を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ポリヌクレオチドを選択する方法に関する。本発明はまた、一般に、選択されたポリヌクレオチドを修飾、分離、および／または特徴付ける方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイズに基づくポリヌクレオチドの選択は、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列決定などの多くのアプリケーションにとって重要である。幅広いアプリケーションにわたって、迅速かつ安価なポリヌクレオチドの特徴付け、同定、増幅、および配列決定技術が必要とされている。ポリヌクレオチドの長さは、ポリヌクレオチドの同定の補助となり得る。ポリヌクレオチドの長さおよび完全性も、下流の同定、増幅、または配列決定アプリケーションの成功および迅速性に影響を与えることができる。多くのハイスループットＤＮＡシーケンサーは、最適なパフォーマンスのために特定のサイズの挿入ライブラリを必要とする。ポリヌクレオチドのサイズ選択が重要であるアプリケーションの他の例には、正確なＰＣＲ産物の形成を確実にすること、遺伝子型同定、ＤＮＡフィンガープリンティング、遺伝子プロファイリング、およびポリヌクレオチドの酵素消化後などに所定のサイズの断片を抽出すること、が挙げられる。
【０００３】
従来、サイズの異なるＤＮＡはゲル電気泳動で検出されてきた。手動ゲル電気泳動法には多くの欠点があり、１００ｂｐ〜５０ｋｂの間の望ましいサイズ範囲のＤＮＡを分離および選択する自動電気泳動装置が開発された。
【０００４】
異なる反応条件下での官能化された常磁性シリカ粒子およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ＤＮＡサイズの選択のために使用できる。通常、これらの方法では、長さが１ｋｂ未満のＤＮＡしか分離できない。固体マトリックスを使用したサイズ排除法も使用できるが、これらも通常、１０００ｋｂ以上の断片から１ｋｂ未満の短いＤＮＡ断片を除去するためのものである。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、複数のポリヌクレオチドを含む試料中のポリヌクレオチドを選択する酵素に基づく方法を考案した。本発明者らは、ポリヌクレオチドの長さに沿った核酸処理酵素の移動速度は一貫しており、ポリヌクレオチドの長さに依存しないことを認識した。本発明者らは、核酸処理酵素のこの特性を使用して、核酸処理酵素の移動を使用して異なる長さのポリヌクレオチドを選択する方法を考案した。この方法は、酵素が定義された期間後にポリヌクレオチドに結合したままであるかどうか、および／または酵素がポリヌクレオチドの末端に到達したかおよび／またはポリヌクレオチドから脱落したかどうかに基づいてポリヌクレオチドを選択することを含む。この方法は、所望の長さのポリヌクレオチドを選択するために使用され得る。この方法はまた、損傷を受けていないポリヌクレオチドおよび／または無傷なポリヌクレオチドを選択するために使用され得る。この方法の別の用途は、一端のみにアダプタを含むポリヌクレオチドから、および／またはアダプタを含まないポリヌクレオチドから、両端にアダプタを含むポリヌクレオチドを選択することである。
【０００６】
したがって、本明細書で提供されるのは、ポリヌクレオチドを選択するための方法であり、この方法は以下：
（ｉ）核酸処理酵素が試料内の複数のポリヌクレオチドに沿って定義された期間移動することを可能にすることであって、酵素が、複数のポリヌクレオチドの各々に負荷され、酵素の１つ以上の分子が複数のポリヌクレオチドの各々に沿って移動するものである、移動を可能にすることと、
（ｉｉ）酵素が、定義された期間内にポリヌクレオチドの末端に到達するかどうか、および／またはポリヌクレオチドから結合解除されるかどうかに基づいて、ポリヌクレオチドを選択することと、を含む。
【０００７】
試料は、例えば、ＰＣＲ反応の産物、ゲノムＤＮＡ、エンドヌクレアーゼ消化の産物、またはＤＮＡライブラリを含み得る。
【０００８】
この方法は、以下のうちの１つ以上を含み得る：
−所望の長さのポリヌクレオチドを選択的に修飾するか、または望ましくない長さのポリヌクレオチドを選択的に修飾すること；
−損傷を受けていないポリヌクレオチドを選択的に修飾するか、損傷を受けたポリヌクレオチドを選択的に修飾すること；
−無傷のポリヌクレオチドを選択的に修飾するか、またはニックの入ったポリヌクレオチドを選択的に修飾すること；
−所望の長さのポリヌクレオチドを他のポリヌクレオチドから分離すること；
−損傷を受けていないポリヌクレオチドを損傷を受けたポリヌクレオチドから分離すること；
−無傷のポリヌクレオチドをニックの入ったポリヌクレオチドから分離すること；
−所望の長さのポリヌクレオチド、損傷を受けていないポリヌクレオチド、および／または無傷のポリヌクレオチドを特徴付けること；
−所望の長さのポリヌクレオチド、損傷を受けていないポリヌクレオチド、および／または無傷のポリヌクレオチドの配列決定をすること；
−所望の長さのポリヌクレオチド、損傷を受けていないポリヌクレオチド、および／または無傷のポリヌクレオチドからプライマーまたはアダプタを除去すること；ならびに
−所望の長さのポリヌクレオチド、損傷を受けていないポリヌクレオチド、および／または無傷のポリヌクレオチドを使用した遺伝子型同定、ＤＮＡフィンガープリンティング、またはプロファイリング。
【０００９】
以下も提供される：
−ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
（ｉ）本明細書に記載の方法を実行することと、
（ｉｉ）膜貫通孔を選択されたポリヌクレオチドと接触させることと、
（ｉｉｉ）膜貫通孔にわたって電位差を適用することと、
（ｉｖ）膜貫通孔に対して移動するポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す１つ以上の測定を行い、それによってポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む、方法；
−ポリマーアダプタであって、以下：
（ａ）第１の核酸処理酵素、
（ｂ）第２の核酸処理酵素であって、ポリマーに沿ったその移動が膜貫通孔と接触するまで妨げられるように結合されており、第２の核酸処理酵素が、第１の核酸処理酵素の移動を妨げないものである、第２の核酸処理酵素、任意選択的に、
（ｃ）膜アンカーまたは孔アンカー、に結合したポリマーアダプタ；
−ポリヌクレオチドを分離および／または選択的に修飾するためのキットであって、（ａ）ポリヌクレオチドおよび末端シグナルを含むアダプタ、および／または（ｂ）上記のアダプタを含み、および以下の構成要素：抽出媒体；核酸処理酵素；酵素、酵素補因子および／または補酵素にエネルギーを提供するヌクレオチド；核酸処理酵素のための燃料および／または補因子を含む溶液；核酸処理酵素のための燃料および／または補因子を含有しない洗浄溶液；部位特異的エンドヌクレアーゼ；および／またはシーケンスアダプタ；のうちの任意の組み合わせを含む任意の１つ以上の構成要素とを含む、キット。
図は、説明を目的としており、限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】核酸処理酵素が分離媒体（例えば、ビーズ）に、例えば、結合タグ（例えば、ｈｉｓ−タグまたはｓｔｒｅｐ−タグのようなタンパク質タグ）を介して結合される基本的なスキームを示す。（Ａ）抽出媒体（例えば、ビーズ）に結合した酵素アダプタ複合体。（Ｂ）アダプタに（例えば、ライゲーションにより）付着したポリヌクレオチド（例えば、二本鎖ＤＮＡ）。（Ｃ）燃料および補因子が追加され、システムが定義された期間稼働する。ポリヌクレオチドは酵素に対して動く（ポリヌクレオチドの方向は矢印で示されている）。酵素は、ニックに遭遇したり、鎖の末端に到達したりすると、ポリヌクレオチドから解離する。すべての酵素が結合していない場合、ポリヌクレオチドは溶液中に拡散することができる。放出されたポリヌクレオチドは、様々な手段によって遊離酵素への再結合を防ぐことができる。例えば、溶液中のトラップオリゴヌクレオチドは、酵素に結合してトラップするか、または遊離ポリヌクレオチドに結合してトラップするように設計することができる。あるいは、アダプタの末端は、酵素が負荷できないように設計することができる（例えば、遊離の一本鎖部位が存在しない）。（Ｄ）システムがクエンチされると、より長いポリヌクレオチド鎖が酵素に結合したままになり、より短い鎖または損傷を受けた鎖が解離する。非結合ポリヌクレオチド（例えば、短い鎖または損傷を受けた鎖）は、従来の手段により、例えば、ビーズを洗浄することにより、結合したポリヌクレオチドから分離し、任意に回収することができる。結合したポリヌクレオチド（例えば、より長い鎖）は、様々な方法で放出および回収することができる。例えば、酵素は燃料を追加することで再開でき、鎖の端に到達させることができる（工程Ｄから工程Ｃに戻る）；酵素はビーズから結合解除することができる（例えば、酵素の変性、タグ結合の阻害、タグ／酵素の切断など）；または、酵素はＤＮＡから結合解除することができる（例えば、変性、高塩濃度、閉鎖複合体の閉鎖解除など）。サイズ画分の選択では、工程Ｃ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｄ…をループさせることにより、所望の時間の稼働＞クエンチング＞洗浄から溶出液を回収するというループで、任意の所望のサイズ画分を回収することが可能となる。損傷を受けた鎖の選択では、工程Ｄの後に、燃料を再度追加し、酵素をポリヌクレオチドの遠端から離れるように稼働させることによって長い鎖が溶出される場合、酵素が行き詰まる原因となる損傷のある任意の鎖（例えば、脱塩基領域、チミジン二量体など）はビーズに結合したままであり、酵素が鎖の末端に到達することによって放出された非結合の鎖から分離することができる。ニックの選択では、酵素は末端に到達する前に脱落するので、ニックのある鎖はより短い鎖と共に溶出する。したがって、工程Ｄの後の長い鎖の回収では、（両端に酵素が負荷されている場合、二本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも１つの鎖に）ニックが含まれていない鎖も選択される。
【図２】ポリヌクレオチド（例えば、二本鎖ＤＮＡ）がビーズに、例えば、結合タグを介して結合される基本的なスキームを示し、ポリヌクレオチドの遠端に到達する酵素は、タグを改変／解離させることができ、したがって、ビーズからポリヌクレオチドを結合解除するために使用されることができる。簡単にするために、この図は、二本鎖ポリヌクレオチドに２つの異なるアダプタを備えた一実施形態を示しており、一方の端は酵素、もう一方の端は結合タグである。（Ａ）タグを介して抽出媒体に結合したＤＮＡ複合体（例えば、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに結合するビオチン化オリゴヌクレオチド）。（Ｂ）燃料および補因子が追加され、システムが定義された期間稼働する。酵素はポリヌクレオチドに沿って移動する（酵素の移動方向は矢印で示されている）。酵素は、ニックに遭遇したり、鎖の末端に到達したりすると、ポリヌクレオチドから解離する。酵素がポリヌクレオチドの末端に到達すると、それは結合タグを解離させ、ポリヌクレオチドがビーズから解離することが可能となる。放出されたポリヌクレオチドは、さまざまな方法で、例えば、タグまたはポリヌクレオチドのいずれかに結合する（図はポリヌクレオチドへの結合を示す）過剰な捕捉鎖を溶液に追加することにより、タグに再結合するのを防ぐことができる。（Ｃ）システムがクエンチされると、酵素が（ニックのために）末端に到達できなかった長い鎖または鎖は、タグを介してビーズに結合したままであり、短い鎖は結合されていない。非結合ポリヌクレオチド（例えば、短い鎖）は、例えば、ビーズを洗浄することにより、結合したヌクレオチドから分離することができ、任意で回収することができる。結合したポリヌクレオチド（例えば、より長い鎖）は、様々な方法で放出および回収することができる。例えば、酵素は燃料を追加することで再開でき、鎖の端に到達できる（効果的に工程Ｃにループバックする）；または、ポリヌクレオチドは、他の従来の手段（例えば、結合解除タグ、切断、ｐＨ／温度の変化などの溶出条件など）によってビーズから結合解除することができる。サイズ画分の選択では、工程Ｂ＞Ｃ＞Ｂ＞Ｃ…をループさせることにより、所望の時間の稼働＞クエンチング＞洗浄から溶出液を回収するというループで、任意の所望のサイズ画分を回収することが可能となる。損傷を受けた鎖の選択では、工程Ｃの後に、燃料を再度追加し、酵素を遠端から離れるように稼働させることによって長い鎖が溶出される場合、酵素が末端に到達するのを妨げる損傷のある任意の鎖（例えば、脱塩基領域、チミジン二量体、ニックなど）はビーズに結合したままであり、酵素が末端に到達した未結合の鎖から分離することができる。
【図３】エキソヌクレアーゼ（Ａ）またはポリメラーゼ（Ｂ）を使用して選択基準を作成する方法の例を示している。エキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドの一方の鎖を消化する。ポリメラーゼは補体を合成するが、それ以外はトランスロカーゼと同様の方法で使用できる。図に示されている例では、エキソヌクレアーゼとポリヌクレオチドにタグが付けられており、このタグを使用して、エキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼが解離した短いポリヌクレオチドを、エキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼが結合したままの長いポリヌクレオチドから分離する。
【図４】酵素が鎖の遠端に到達した場合にどのようにシグナルが生成されるかの例を示す。図４Ａは、タグの解離を示す。図４Ｂは、酵素がアダプタの遠端を（例えば、構成要素を解凍または解離させることにより）、例えばその構造などをどのように改変し得るかを示す。改変された端と無傷の端との違いは、その後のアダプタまたは構成要素の付着において利用され得る。例えば、図４Ｂは、構造変化を使用して、鎖の端にある相補的なハイブリダイゼーション部位をトラップしてシーケンスアダプタのライゲーションを防ぎ、シーケンスアダプタが無傷の末端を有するより長い鎖に優先的にライゲーションできるようにする方法を示している。この図では、シーケンスアダプタの付着の前にオリゴヌクレオチドを分離する必要はない。
【図５】例えば、試料中のポリヌクレオチドに付着したアダプタに予め負荷されているのではなく、酵素を溶液中で使用する方法の例を示している。この方法では、アダプタの使用は任意であり、代わりに、酵素は試料中のポリヌクレオチドに、鎖の両端または真ん中のいずれかで自然に結合することができる。酵素は、任意選択的に、酵素がポリヌクレオチドに沿って自由に移動できる条件下で、例えば、ＡＴＰなどの燃料の存在下で、ポリヌクレオチドに自由に結合することができる。酵素をこのように結合させると、酵素による鎖の最終的な飽和がもたらされる。酵素をポリヌクレオチドに結合させた後、酵素を溶液から除去し、および／または大過剰の捕捉鎖を追加して、酵素のさらなる分子がポリヌクレオチドに結合するのを防ぐことにより、定義された期間を開始する。酵素は通常、試料中のポリヌクレオチドよりも優先的に捕捉鎖に結合する。定義された期間の終わりに、酵素の移動は、典型的にはクエンチングによって停止され、酵素が結合したままであるポリヌクレオチドは、酵素がもはや結合していないより短いポリヌクレオチドから分離される。
【図６】方法が溶液中の酵素を使用してどのように実行され得るかについてのさらなる例を示している。この方法では、タグ付きアダプタが使用される。酵素がポリヌクレオチドに沿って移動するために必要な補因子および燃料を含有する溶液中で、ポリヌクレオチドを酵素と接触させることにより、定義された期間が開始される。この例では、酵素は、付着したアダプタを介して、試料中のポリヌクレオチドの末端にのみ負荷できる。明確にするために、図は、左のアダプタの一本鎖オーバーハングに負荷され、ポリヌクレオチドのトップ鎖に沿って走る酵素のみを示している。ポリヌクレオチドの末端に到達する酵素は、ポリヌクレオチドの末端にあるアダプタの選択タグを解離させる。この期間の終わりに、酵素の移動が停止し、選択タグを保持しているポリヌクレオチドが、選択タグが解離させられた短いポリヌクレオチドから分離される。
【図７】本手法により分離可能なポリヌクレオチドの例を示す。ポリヌクレオチドは、一端または両端にヘアピンアダプタを含み得る。一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドは、この方法によって分離され得る。
【図８】（１）サイズ選択用のタグ付き酵素と、（２）ナノポアシーケンス用のリーダー配列、抑止された酵素、および膜テザーとを含む二重目的アダプタを使用して、膜貫通孔を使用する特徴付けのためにポリヌクレオチドを選択および調製するために方法がどのように使用され得るかということについて特定の一例を示している。図８Ａは、分離方法において使用され得、次いで膜貫通孔を使用して選択されたポリヌクレオチドの特徴付けを容易にするために使用され得るアダプタを示す。アダプタは、抑止された核酸処理酵素および抑止されていないタグ付き酵素を含む。図８Ｂは、抑止されていないタグ付き酵素のポリヌクレオチドに沿った移動を開始するために燃料を加える前に、アダプタがポリヌクレオチドにどのように付着され得るかを示す。定義された期間の終わりに、タグ付き酵素の移動が停止し、タグ付き酵素がなお結合しているより長いポリヌクレオチドが、タグ付き酵素が放出されたより短いポリヌクレオチドから分離される。すべてのポリヌクレオチドは、抑止された酵素が付着したアダプタを保持している。したがって、目的のポリヌクレオチド（より長いポリヌクレオチドまたはより短いポリヌクレオチドであり得る）は、膜貫通孔を使用してすぐに配列決定され得る形態である。抑止された酵素は、膜貫通孔を通るポリヌクレオチドの移動を制御する働きをする。抑止された酵素が燃料の存在下で膜貫通孔と接触すると、抑止は打ち負かされる。
【図９】抑止されていないヘリカーゼを伴うアダプタが結合した雑多な長さのＤＮＡのライブラリから選択したポリヌクレオチドのサイズ分布を示す。ポリヌクレオチドのサイズは、ナノポアシーケンスによって決定された。ヘリカーゼを停止して、ヘリカーゼが結合したままのＤＮＡ鎖を選択する前に、ＡＴＰおよびＭｇをライブラリに１２０秒または２４０秒追加した。図９Ａは、初期ライブラリ（０秒のインキュベーション時間）の開始サイズ分布と、ヘリカーゼを２４０秒間実行した後のライブラリから選択されたＤＮＡのサイズ分布を比較している。図９Ｂは、分布をビニングされたヒストグラムとして個別のパネルに示している。ヒストグラムは、１〜３キロ塩基の範囲のより短い鎖の鎖数の減少と、１２０秒または２４０秒のインキュベーション時間のライブラリについて長さが約３キロ塩基より大きい鎖の鎖数の相対的な増加を明確に示している。
【００１１】
配列表の説明
配列番号１は、実施例１および２で使用されるサイズ選択アダプタのトップ鎖のヌクレオチド配列である。
配列番号２は、実施例１および２で使用されるサイズ選択アダプタのボトム鎖のヌクレオチド配列である。
配列番号３は、実施例１で使用されるサイズ選択アダプタのブロッカー鎖のヌクレオチド配列である。
配列番号４は、実施例１および２で使用されるＤＮＡヘリカーゼに付着したｓｔｒｅｐ−ＳＵＭＯタグのアミノ酸配列である。
配列番号５は、実施例１で使用される３．６ｋｂのＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号６は、実施例２で使用されるサイズ選択アダプタのブロッカー鎖のヌクレオチド配列である。
【００１２】
配列は限定を意図するものではないことを理解されたい。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
開示される方法および生産物の異なる適用が、当該技術分野における特定の必要性に合わせられ得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、方法および産物の特定の実施形態を説明する目的のためだけのものであり、限定を意図するものではないことも理解されたい。
【００１４】
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は、２つ以上のポリヌクレオチドを含み、「アンカー（ａｎ  ａｎｃｈｏｒ）」への言及は、２つ以上のアンカーを含み、「ヘリカーゼ（ａ  ｈｅｌｉｃａｓｅ）」への言及は、２つ以上のヘリカーゼを含み、「膜貫通孔（ａ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｒｅ）」への言及は、２つ以上の孔を含み、他も同様である。
【００１５】
上記または下記の本明細書に引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１６】
本発明者らは、ポリヌクレオチドを選択するための方法を考案し、その方法は以下：
（ｉ）核酸処理酵素が試料内の複数のポリヌクレオチドに沿って定義された期間移動することを可能にすることであって、酵素が、複数のポリヌクレオチドのそれぞれに負荷され、酵素の１つ以上の分子が複数のポリヌクレオチドのそれぞれに沿って移動するものである、移動を可能にすることと、
（ｉｉ）酵素が、定義された期間内にポリヌクレオチドの末端に到達するかどうか、および／またはポリヌクレオチドから結合解除されるかどうかに基づいて、ポリヌクレオチドを選択することと、を含む。
【００１７】
この方法は、選択されたポリヌクレオチドを選択されていないポリヌクレオチドから分離すること、および／または選択されたポリヌクレオチドまたは選択されていないポリヌクレオチドを選択的に修飾することをさらに含み得る。典型的には、酵素は、同じ方法で複数のポリヌクレオチドの各々に負荷される。
【００１８】
核酸処理酵素
この方法は、核酸処理酵素を利用して、異なる物理的特性を有するポリヌクレオチドを選択的に修飾および／または分離することを可能にする。核酸処理酵素は、選択基準を満たす試料内のポリヌクレオチドをタグ付けするためのマーカーとして、または代替的に、選択基準を満たさない試料内のポリヌクレオチドにタグ付けするためのマーカーとして使用され得る。別の実施形態では、核酸処理酵素の作用により、ポリヌクレオチドの末端のシグナルが変化し、そのシグナルを使用して、選択基準を満たすポリヌクレオチドを、選択基準を満たさないポリヌクレオチドから分離することができる。ポリヌクレオチドの末端におけるシグナルは、例えば、酵素がポリヌクレオチドの末端に到達したときに露出される隠れたシグナルであり得る。あるいは、シグナルは、酵素がポリヌクレオチドの末端に到達したときに除去される露出されたシグナルであってもよい。
【００１９】
核酸処理酵素は、ポリヌクレオチドに結合し、ポリヌクレオチドを処理することができる任意のタンパク質であってよい。ポリヌクレオチドの処理において、核酸処理酵素はポリヌクレオチドに沿って移動する。酵素の移動の方向は一貫している。一貫した動きとは、酵素がポリヌクレオチドの５’末端から３’末端に、またはその逆に移動することを意味する。酵素は、ポリヌクレオチドを処理するときにポリヌクレオチドを修飾することができる。ポリヌクレオチドの修飾が起こることは必須ではない。したがって、核酸処理酵素は、ポリヌクレオチドに沿って移動するその能力を保持する修飾された酵素であり得る。
【００２０】
核酸処理酵素は、例えば、トランスロカーゼ、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、またはエキソヌクレアーゼであってよい。
【００２１】
核酸処理酵素は、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡなどの一本鎖ポリヌクレオチドに沿って移動してもよく、または二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドなどの二本鎖ポリヌクレオチドに沿って移動してもよい。例えば、一本鎖または二本鎖ＤＮＡのいずれかに作用するヘリカーゼまたはトランスロカーゼを使用することができる。
【００２２】
ヘリカーゼは、例えば、スーパーファミリー１またはスーパーファミリー２のメンバーであり得る。ヘリカーゼは、以下のファミリー：Ｐｉｆ１−様、Ｕｐｆ１−様、ＵｖｒＤ／Ｒｅｐ、Ｓｋｉ−様、Ｒａｄ３／ＸＰＤ、ＮＳ３／ＮＰＨ−ＩＩ、ＤＥＡＤ、ＤＥＡＨ／ＲＨＡ、ＲｅｃＧ−様、ＲＥｃＱ−様、Ｔ１Ｒ−様、Ｓｗｉ／Ｓｎｆ−様、およびＲｉｇ−Ｉ−様のうちの１つのメンバーであることが好ましい。これらのファミリーの最初の３つはスーパーファミリー１にあり、第２の１０ファミリーはスーパーファミリー２にある。ヘリカーゼは、より好ましくは、ＲｅｃＤ、Ｕｐｆ１（ＲＮＡ）、ＰｃｒＡ、Ｒｅｐ、ＵｖｒＤ、Ｈｅｌ３０８、Ｍｔｒ４（ＲＮＡ）、ＸＰＤ、ＮＳ３（ＲＮＡ）、Ｍｓｓ１１６（ＲＮＡ）、Ｐｒｐ４３（ＲＮＡ）、ＲｅｃＧ、ＲｅｃＱ、Ｔ１Ｒ、ＲａｐＡ、およびＨｅｆ（ＲＮＡ）のうちの１つのメンバーであるこれらのサブファミリーの最初の５つはスーパーファミリー１にあり、第２の１１のサブファミリーはスーパーファミリー２にある。Ｕｐｆ１、Ｍｔｒ４、ＮＳ３、Ｍｓｓ１１６、Ｐｒｐ４３、およびＨｅｆサブファミリーのメンバーは、ＲＮＡヘリカーゼである。他のサブファミリーのメンバーは、ＤＮＡヘリカーゼである。
【００２３】
ヘリカーゼは、多量体またはオリゴマーヘリカーゼであり得る。言い換えれば、ヘリカーゼは、機能するために、多量体またはオリゴマー、例えば二量体を形成する必要があるかもしれない。ヘリカーゼは、好ましくは単量体である。言い換えれば、ヘリカーゼは、好ましくは、機能するために、多量体またはオリゴマー、例えば二量体を形成する必要がないかもしれない。例えば、Ｈｅｌ３０８、ＲｅｃＤ、ＴｒａＩ、およびＸＰＤヘリカーゼはすべて単量体ヘリカーゼである。これらは、以下により詳細に論じられる。ヘリカーゼがオリゴマー／多量体または単量体であるかどうかを決定する方法は、当技術分野で知られている。例えば、ヘリカーゼを使用して巻き戻された放射標識または蛍光標識されたポリヌクレオチドの動態を調べることができる。あるいは、ヘリカーゼはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して分析することができる。
【００２４】
単量体ヘリカーゼは、一緒に付着したいくつかのドメインを含み得る。例えば、ＴｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、２つのＲｅｃＤヘリカーゼドメイン、リラクゼースドメインおよびＣ末端ドメインを含有し得る。ドメインは、典型的には、オリゴマーを形成することなく機能することができる単量体ヘリカーゼを形成する。
【００２５】
適切なヘリカーゼの特定の例には、Ｈｅｌ３０８、ＮＳ３、Ｄｄａ、ＵｖｒＤ、Ｒｅｐ、ＰｃｒＡ、Ｐｉｆ１、およびＴｒａＩが含まれる。これらのヘリカーゼは通常、一本鎖ＤＮＡに作用する。二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に沿って移動できるヘリカーゼの例には、ＦｔｆＫおよび六量体酵素複合体、またはＲｅｃＢＣＤなどのマルチサブユニット複合体が含まれる。
【００２６】
ヘリカーゼは、例えば、ＷＯ２０１３／０５７４９５、ＷＯ２０１３／０９８５６２、ＷＯ２０１３０９８５６１、ＷＯ２０１４／０１３２６０、ＷＯ  ２０１４／０１３２５９、ＷＯ２０１４／０１３２６２、およびＷＯ／２０１５／０５５９８１に開示されているヘリカーゼ、修飾されたヘリカーゼ、またはヘリカーゼ構造体のいずれかであり得る。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、好ましくは、ＷＯ２０１４／０１３２６０に開示されている修飾のいずれか１つまたは複数を含む。Ｄｄａヘリカーゼは、好ましくは、ＷＯ２０１５／０５５９８１および／またはＷＯ２０１６／０５５７７７に開示されている修飾のいずれか１つまたは複数を含む。
【００２７】
核酸処理酵素は、ポリメラーゼであってもよい。ポリメラーゼは通常、ポリヌクレオチドに沿って移動するときに相補的なポリヌクレオチド鎖を合成する。そうでなければ、ポリメラーゼはトランスロカーゼと同様の方法で使用されてもよい。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドに沿って移動する能力を保持するが、相補鎖を合成しない修飾されたポリメラーゼであってもよい。ポリメラーゼは、例えば、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏｎ（登録商標）から市販されている）、またはそれらのバリアントであり得る。酵素は、好ましくは、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼまたはそのバリアントである。
【００２８】
相補鎖の合成は、ポリヌクレオチドの量を増加させるという点で有利であり得る。ポリヌクレオチドの量を増やすと、この方法で選択されたポリヌクレオチドを使用する、その後の任意のアッセイの感度が向上する可能性がある。ポリヌクレオチドが修飾塩基を含有する場合、ポリメラーゼを使用して、通常の塩基を含有する相補鎖を合成することができ、これは、ポリヌクレオチドを使用するその後のアッセイにも有利であり得る。
【００２９】
ポリメラーゼを使用すると、損傷を受けたポリヌクレオチドを損傷を受けていないポリヌクレオチドと区別するために使用できるという利点があり得る。例えば、ポリメラーゼがＤＮＡの脱塩基ヌクレオチドまたはチミジン二量体を通過できない場合がある。したがって、ポリメラーゼを使用する方法を使用して、損傷を受けたポリヌクレオチドを損傷を受けていないポリヌクレオチドから分離することができる。
【００３０】
核酸処理酵素は、エキソヌクレアーゼであってもよい。エキソヌクレアーゼは通常、ポリヌクレオチドに沿って移動するときに、ポリヌクレオチドを消化する。エキソヌクレアーゼは、典型的には、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖を切断して、個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドのより短い鎖、例えば、ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを形成する。エキソヌクレアーゼが使用される場合、最終的に選択されるポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドの未消化の鎖、または一方の鎖が部分的に消化され、他方の鎖が無傷であるポリヌクレオチドである。この方法では、任意のエキソヌクレアーゼ酵素を使用することができる。この方法での使用に好ましい酵素には、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩ、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ、およびＥ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素由来の酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩ、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼが含まれる。これらのエキソヌクレアーゼのうちの１つに由来する酵素は、好ましくは、核酸への結合および核酸の消化に関与するドメイン（触媒ドメイン）を含む。
【００３１】
核酸処理酵素は、好ましくは、ポリヌクレオチドから結合解除することなく長いポリヌクレオチド鎖を処理することができるものである。典型的には、核酸処理酵素は、５００ヌクレオチド塩基対〜２億５０００万ヌクレオチド塩基対、例えば、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００または１００，０００ヌクレオチド塩基対〜２億、１億、１千万、１００万ヌクレオチド塩基対のポリヌクレオチド鎖に沿って移動することができる。
【００３２】
酵素は、修飾されていても、修飾されていなくてもよい。酵素は修飾されて、閉鎖複合体を形成し得る。閉鎖複合体は、酵素がポリヌクレオチドの末端に到達する場合を除き酵素がポリヌクレオチドから脱落しないように酵素がポリヌクレオチドの周りで閉鎖されるようにポリヌクレオチド結合部位が修飾されている酵素である。適切な閉鎖複合体酵素および閉鎖複合体を生成するために酵素を修飾する方法の例は、例えば、ＷＯ２０１４／０１３２６０およびＷＯ２０１５／０５５９８１に開示されている。
【００３３】
核酸処理酵素が非修飾ポリメラーゼである場合、酵素は、典型的には、最大３０ｋｂのポリヌクレオチドに沿って移動することができる。酵素がポリヌクレオチドに沿って中途にある場合にポリヌクレオチドが結合解除することができる開口部を閉鎖するようにポリメラーゼを修飾することにより、移動距離を増加させることができる。そのような修飾されたポリメラーゼについては、上記で特定されたより長いポリヌクレオチド長は、ポリメラーゼによって処理され得る。
【００３４】
この方法の工程（ｉ）の間、酵素の１つの分子が、複数のポリヌクレオチドの各々に沿って移動してもよい。代替的なの実施形態では、酵素の複数の分子が、複数のポリヌクレオチドの各々に沿って移動してもよい。複数のポリヌクレオチドの各々に沿って移動する酵素の分子の数は、酵素をポリヌクレオチドに負荷する方法に依存する。
【００３５】
酵素の複数の分子が複数のポリヌクレオチドに沿って移動する場合、分子の正確な数は重要ではない。例えば、酵素の少なくとも１つ、好ましくは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０分子がポリヌクレオチドに沿って移動することができる。複数のポリヌクレオチドの各々に対して酵素の複数の分子を使用する方法に必要なすべてのことは、定義された期間の終わりに、酵素の１つ以上の分子が結合したままであるポリヌクレオチドを、酵素のいずれもが結合していないポリヌクレオチドから分離できること、または代替的には、酵素の少なくとも１つの分子が末端を通過したポリヌクレオチドを、結合した酵素のいずれの分子も末端に到達していないポリヌクレオチドから分離できることである。これらの方法において、酵素は、工程（ｉ）の前に、または工程（ｉ）で定義された期間を開始する前に、溶液中に加えられる。溶液からの酵素結合は、試料の調製が簡単になるという利点がある。酵素が溶液中にある場合、酵素のポリヌクレオチドの開始部への結合は自由に起こり得る。最初のポリヌクレオチドに対する溶液中の酵素の結合は、例えば、捕捉ポリヌクレオチド（捕捉鎖）またはヘパリンなどの他の捕捉分子を加えることなどによって、溶液中の遊離酵素を隔離することによって停止または防止することができる。捕捉ポリヌクレオチドまたは分子は、特徴付けられているポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチドよりも、遊離酵素に対するその相対的親和性が高いため、遊離酵素によって優先的に結合される。より高い親和性は、特徴付けられているポリヌクレオチドよりも高い濃度で捕捉ポリヌクレオチドまたは分子を提供することによって達成することができる。
【００３６】
捕捉鎖は、通常、ヘリカーゼが結合するＤＮＡまたはＲＮＡの短い鎖である。捕捉鎖は、約１５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、例えば、約２０、約２５、または約３０ヌクレオチドの長さを有し得る。捕捉鎖は、通常、溶液中に高濃度で加えられ、溶液中のヘリカーゼの、分離されるポリヌクレオチドに優先した、捕捉鎖への結合を促進する。当業者は、捕捉鎖の適切な濃度を容易に特定することができるであろう。濃度は、例えば、約１０ｎＭ〜約１Ｍ、例えば、約５０ｎＭ〜約５００ｍＭ、または約１ｍＭ〜１００ｍＭであってよい。
【００３７】
図５および６は、方法がどのように酵素を溶液中で利用することができるかについての概略例を示している。酵素が溶液中にある場合、通常、より多くの酵素が結合し続ける。したがって、選択は、単一の酵素の使用に基づかない。選択は、末端に到達してシグナルを作成または破壊する酵素に基づくことができる（図６）。選択は、タグ付き酵素に基づくことができる（図５）。簡単にするために、鎖の一方の端のみからの結合を図５および６に示す。
【００３８】
ポリヌクレオチドへの酵素の負荷
一実施形態では、方法は、酵素を複数のポリヌクレオチドに結合する初期工程を含む。したがって、工程（ｉ）の開始時に、酵素の１つ以上の分子が、複数のポリヌクレオチドの各々に結合され得る。酵素の１分子のみが工程（ｉ）の開始時に複数のポリヌクレオチドの各々に結合されてもよく、または酵素の複数の分子が工程（ｉ）の開始時に複数のポリヌクレオチドの各々に結合されてもよい。
【００３９】
酵素の１分子のみが複数のポリヌクレオチドの各々に結合している場合、酵素は通常アダプタに予め結合している。したがって、酵素を複数のポリヌクレオチドに結合する初期工程は、酵素が結合しているアダプタを複数のポリヌクレオチドの一端または両端に付着させることを含み得る。
【００４０】
酵素の複数の分子が工程（ｉ）の前に複数のポリヌクレオチドの各々に結合される場合、酵素は、酵素を複数のポリヌクレオチドに結合する初期工程の間に溶液中のポリヌクレオチドに添加される。この実施形態では、溶液中に酵素を添加する前に、アダプタをポリヌクレオチドに付着させることもできる。この実施形態では、アダプタの使用は必須ではない。多くの酵素、特にヘリカーゼは、一連の利用可能な末端を有するゲノムＤＮＡに結合できる。典型的には、末端アダプタを使用しない一実施形態では、核酸処理酵素は選択タグを含み、例えば、選択タグは酵素に結合される。アダプタが使用される場合、アダプタは、例えば、１つのヘリカーゼのための、または２つ以上のヘリカーゼのためのポリＴローディング部位を含み得る。アダプタは、必要に応じて５’−３’または３’−５’方向に移動する酵素用に設計され得る。
【００４１】
代替の一実施形態では、工程（ｉ）の開始時に、複数のポリヌクレオチドのいずれにも酵素の分子が結合していない場合がある。この実施形態では、定義された期間は、酵素を溶液中の試料に加えることによって開始される。酵素の移動に必要なあらゆる燃料、補酵素または補因子は、酵素の前に、または酵素と一緒に加えることができる。
【００４２】
試料
試料は、ポリヌクレオチドを含む任意の適切な試料であり得る。ポリヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ反応の産物、ゲノムＤＮＡ、エンドヌクレアーゼ消化の産物、および／またはＤＮＡライブラリを含み得る。
【００４３】
試料は生体試料であってもよい。本発明は、任意の有機体または微生物から得られたかまたは抽出された試料上でインビトロで実施され得る。有機体または微生物は、典型的には、古細菌、原核生物、または真核生物であり、典型的には、植物界、動物界、真菌界、モネラ界、および原生生物界の５つの界のうちの１つに属する。本発明は、任意のウイルスから得られたかまたは抽出された試料上でインビトロで実施され得る。
【００４４】
試料は、好ましくは、流体試料である。試料は、通常は、体液を含む。体液はヒト又は動物から取得してもよい。ヒト又は動物は、疾患を有する、疾患を有する疑いがある、又は疾患の危険性があるものであってもよい。試料は尿、リンパ液、唾液、粘液、精液、又は羊水であってもよいが、好ましくは、全血、血漿、又は血清である。通常は、試料はヒト由来のものであるが、代わりに、別の哺乳動物由来のもの、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ又はブタなどの商業的に飼育されている動物由来のもの、あるいはネコ又はイヌなどのペットであってもよい。
【００４５】
あるいは、植物由来の試料は、通常は、穀物、豆類、果物、又は野菜などの市販の作物、例えば、小麦、大麦、オート麦、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、大豆、米、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、豆、レンズ豆、サトウキビ、ココア、綿、茶又はコーヒーから取得する。
【００４６】
試料は非生体試料であってもよい。非生体試料は、好ましくは、液状試料である。非生物学的試料の例としては、外科用流体、水、例えば飲料水、海水、または河川水、および臨床検査用の試薬が挙げられる。
【００４７】
試料は、方法を実施する前に、例えば、遠心分離によって、または不必要な分子もしくは細胞、例えば赤血球を濾過して取り除く膜を通過させることによって処理され得る。この方法は、採取された直後に試料に対して実行されてもよい。試料は通常、方法の前に、好ましくは−７０℃未満で保存することもできる。
【００４８】
試料は、ゲノムＤＮＡを含み得る。ゲノムＤＮＡは、断片化されてもよい。ＤＮＡは任意の適当な方法によって断片化してもよい。例えば、ＤＮＡを断片化する方法は当技術分野で公知であり、そのような方法は、ＭｕＡトランスポザーゼなどのトランスポザーゼを使用することができる。好ましくは、ゲノムＤＮＡは断片化されていない。
【００４９】
ポリヌクレオチドは修飾されていなくてもよい。アダプタは、試料中のポリヌクレオチドの一端または両端に付加することができる。適切なアダプタを以下に定義する。
【００５０】
一実施形態では、ヘアピンアダプタをポリヌクレオチドの一端または両端に付加することができる。ヘアピンアダプタがポリヌクレオチドの両端に付加される場合、酵素は好ましくはアダプタに予め結合される。この実施形態では、ヘアピンは、典型的には、酵素がポリヌクレオチドの末端から脱落するのを防ぐ。したがって、アダプタは、酵素がポリヌクレオチドの一端のアダプタからポリヌクレオチドの他端のアダプタに移動するときに除去または活性化されるシグナルを含むことが好ましい。ヘアピンアダプタを使用した実施形態の例を図７に示す。
【００５１】
複数のポリヌクレオチド
開示された方法は、複数のポリヌクレオチドを含む試料からポリヌクレオチドを選択するために使用される。「複数」という用語は、本明細書では、少なくとも約２、少なくとも３、または少なくとも４〜約１００，０００以上、例えば、約５〜約５０，０００以上、約１０〜約１０，０００以上のポリヌクレオチドなどの２つ以上の異なるポリヌクレオチドを意味するために使用される。
【００５２】
特定の例示的な実施形態では、試料は、少なくとも約２０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約５００、または少なくとも約１，０００の異なるポリヌクレオチドを含み得る。
【００５３】
この方法により分離されたポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい。試料は、例えば、異なるＤＮＡ、異なるＲＮＡ、または異なるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドなど、同じタイプの異なるポリヌクレオチドを含み得る。試料は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの任意の２つ以上などの複数のタイプのポリヌクレオチドを含み得る。
【００５４】
ポリヌクレオチドは、任意の適切な形態であり得る。アダプタは、ポリヌクレオチドの一端または両端に付加され得る。アダプタは、例えば、試料内の異なるポリヌクレオチドへの酵素の同等の負荷を確実にするために、および／または試料中のポリヌクレオチドが同じ形態であることを確実にするために使用され得る。任意の適切なアダプタ設計を使用することができる。例えば、アダプタは、片端または両端付着用に設計され得る。
【００５５】
アダプタ
方法の一実施形態では、アダプタは、複数のポリヌクレオチドの各々の一端または両端に付着され得る。この方法は、複数のポリヌクレオチドの一端または両端にアダプタを付着させる初期工程を含み得る。初期工程は、酵素をアダプタに結合することをさらに含み得る。あるいは、酵素はアダプタに予め結合されていてもよい。したがって、本方法は、酵素がポリヌクレオチドに沿って移動しない条件下で、酵素が予め結合されたアダプタを複数のポリヌクレオチドの各々の一端または両端に付着させる初期工程を含み得る。酵素は、アダプタ上で抑止され得る。アダプタは、燃料および／または必要な補因子の不在のために抑止され得る。酵素の移動を開始するために（例えば、トーホールド解離により）取り外せる／克服できる抑止物を使用して、アダプタは燃料の存在下で抑止されてもよい。
【００５６】
複数のポリヌクレオチドの両端に同じアダプタを付加してもよい。あるいは、複数のポリヌクレオチドの各々の２つの末端に異なるアダプタを付加してもよい。アダプタは、複数のポリヌクレオチドの各々の一端にのみ追加することができる。アダプタをポリヌクレオチドに追加する方法は、当技術分野で知られている。アダプタは、例えば、ライゲーションによって、クリックケミストリーによって、タグ付けによって、トポイソメラーゼ変換によって、または任意の他の適切な方法によって、ポリヌクレオチドに付着され得る。
【００５７】
アダプタは、好ましくは、核酸処理酵素が結合することができるポリヌクレオチドの末端に付着することができる。アダプタは、好ましくは合成または人工のものである。アダプタは、好ましくはポリマーを含む。ポリマーは、好ましくはポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドアダプタは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ（塩基性ＤＮＡなど）、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡおよび／またはＰＥＧを含み得る。アダプタは、より好ましくは、一本鎖および／または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、任意の適切な長さ、例えば、約４〜約３００、例えば約５〜約２００、約１０〜約１００、または約２０〜約５０のヌクレオチド長であり得る。
【００５８】
アダプタは、核酸処理酵素が結合する一本鎖ポリヌクレオチドを含み得る。
【００５９】
選択に使用されるアダプタは、シーケンスアダプタなどのさらなるアダプタへの選択されたポリヌクレオチドのその後の付着を容易にするように設計されてもよい。アダプタは、例えば、さらなるアダプタへの効率的な付着のために、一本鎖オーバーハングまたは化学基（例えば、クリックケミストリー）を含み得る。
【００６０】
一実施形態では、アダプタは、Ｙアダプタである。Ｙアダプタおよび／または架橋部分アダプタは、典型的にはポリヌクレオチドアダプタである。Ｙアダプタは通常二本鎖で、（ａ）一端に２つの鎖がハイブリダイズする領域と、（ｂ）もう一端に２つの鎖が相補的でない領域と、を含む。鎖の非相補的な部分がオーバーハングを形成する。Ｙアダプタ中の非相補領域の存在は、二本鎖部分とは異なり２本の鎖が典型的には互いにハイブリダイズしないため、アダプタにＹ形状を与える。核酸処理酵素は、オーバーハングおよび／または二本鎖領域に結合され得る。一実施形態では、第１の酵素は二本鎖領域に結合され、第２の酵素はオーバーハングに結合される。オーバーハング上の第２の酵素は、好ましくはスペーサにより抑止される。一実施形態では、Ｙアダプタは、膜アンカーまたは孔アンカーを含む。アンカーは、酵素が結合していないオーバーハングに相補的であり、したがってそれとハイブリダイズするポリヌクレオチドに付着することができる。
非相補鎖Ｙアダプタの１つは、典型的にはリーダー配列を含み、これは膜貫通孔と接触すると、孔に通すことができる。リーダー配列は、通常は、ポリマーを含む。ポリマーは、好ましくは、負に荷電されている。ポリマーは、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどのポリヌクレオチド、（無塩基ＤＮＡなどの）修飾ポリヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリペプチドである。
【００６１】
リーダーは、好ましくは、ポリヌクレオチドを含み、より好ましくは、一本鎖ポリヌクレオチドを含む。一本鎖リーダー配列は、最も好ましくは、ポリｄＴ切片などのＤＮＡの一本鎖を含む。リーダー配列は、好ましくは、一つ以上のスペーサーを含む。
【００６２】
リーダー配列は、任意の長さであり得るが、典型的には、１０〜１５０ヌクレオチド長、例えば、２０〜１２０、３０〜１００、４０〜８０、または５０〜７０ヌクレオチド長である。
【００６３】
一実施形態では、アダプタは、ヘアピンループアダプタである。ヘアピンループアダプタは、単一のポリヌクレオチド鎖を含むアダプタであり、ポリヌクレオチド鎖の末端は、互いにハイブリダイズすることができるか、または互いにハイブリダイズし、ポリヌクレオチドの中央部分はループを形成する。好適なヘアピンループアダプタは、当該技術分で既知の方法を使用して設計することができる。ループは、任意の長さであり得る。ループは、好ましくは、約２〜４００、５〜３００、１０〜２００、２０〜１００ヌクレオチド、または３０〜５０ヌクレオチド長である。ポリヌクレオチド鎖の２つのハイブリダイズしたセクションによって形成されるアダプタの二本鎖セクションは、ステムと呼ばれる。ヘアピンループのステムは、好ましくは４〜２００、例えば、５〜１５０、１０〜１００、２０〜９０、３０〜８０、４０〜７０、または５０〜６０ヌクレオチド対の長さである。核酸処理酵素がヘアピンアダプタに結合しているか、または結合する場合、それは通常、ステムではなくヘアピンのループに結合する。
【００６４】
複数のポリヌクレオチドが二本鎖である場合、Ｙアダプタを一端に、ヘアピンループアダプタを他端に追加することができる。この実施形態において、酵素は、Ｙアダプタおよび／またはヘアピンアダプタに結合され得る。
【００６５】
アダプタは、第２の核酸処理酵素、好ましくは、例えば、スペーサによって、またはスペーサ上で、アダプタに抑止されたヘリカーゼを含み得る。
【００６６】
アダプタは、任意の方法で複数のポリヌクレオチドに付着させることができる。アダプタは、好ましくは、標的ポリヌクレオチドに共有結合される。
【００６７】
アダプタは、標的ポリヌクレオチドに連結され得る。アダプタは、ポリヌクレオチドのいずれかの末端、すなわち、５’もしくは３’末端、またはポリヌクレオチドの両方の末端、すなわち、５’末端および３’末端に連結することができる。ヘアピンループは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用してポリヌクレオチドに連結され得る。アダプタは、ＡＴＰの不在下で、またはＡＴＰの代わりにガンマ−Ｓ−ＡＴＰ（ＡＴＰγＳ）を使用して、ポリヌクレオチドに連結することができる。核酸処理酵素がアダプタに結合しているＡＴＰの不在下で、アダプタをポリヌクレオチドに連結することが好ましい。
【００６８】
アダプタは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡリガーゼ、および９ｏＮ  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼを使用して連結され得る。リガーゼは、方法の工程（ｉ）の前に試料から除去されてもよい。アダプタは、トポイソメラーゼを使用して付着することができる。トポイソメラーゼは、例えば、部分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９．１．３のうちのいずれかのメンバーであり得る。
【００６９】
本発明者らは、第１の核酸酵素と；第２の核酸処理酵素であって、ここで、第２の核酸酵素は、アダプタに沿ったその移動が、適用された電位下で膜貫通孔と接触するまで妨げられるかまたは防止されるように結合されており、第２の核酸処理酵素が、第１の核酸処理酵素の移動を妨げないものである、第２の核酸処理酵素と、に結合するアダプタを考案した。この実施形態では、アダプタは、好ましくは、ポリヌクレオチドを含み、および／または第２の核酸酵素は、好ましくは、トランスロカーゼもしくはヘリカーゼである。第１および第２の核酸処理酵素は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、第１の酵素は、トランスロカーゼ、ヘリカーゼまたはポリメラーゼであり得、第２の酵素は、トランスロカーゼまたはヘリカーゼであり得る。第１および第２の酵素の両方がトランスロカーゼまたはヘリカーゼの両方である場合、それらは同じまたは異なるトランスロカーゼまたはヘリカーゼであり得る。
【００７０】
第２の酵素の移動は、例えば、ＷＯ２０１４／１３５８３８に開示されているように、スペーサで抑止されることにより妨害または防止することができる。ポリヌクレオチドを分離する方法では、ＷＯ２０１４／１３５８３８に開示されている酵素およびスペーサの任意の構成を使用することができる。
【００７１】
スペーサは、好ましくはアダプタの一部であり、例えば、スペーサはアダプタ中のポリヌクレオチド配列を妨害し得る。任意の数のスペーサ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のスペーサがアダプタ中にあってもよい。好ましくは、１、２、４、または６つのスペーサが標的ポリヌクレオチド中にある。１つ以上のスペーサは、好ましくは、アダプタ上の第１の酵素と第２の酵素との間に配置される。第１の酵素は、好ましくは、ポリヌクレオチドに付着するか、または付着するためのアダプタの末端に向かうスペーサの側にある。スペーサは、好ましくは、第２の酵素と、ポリヌクレオチドに付着するか、または付着するためのアダプタの末端との間に配置される。あるいは、第２の酵素はスペーサ上に配置され得る。
【００７２】
スペーサは、燃料および必要な補酵素および／または補因子の存在下でさえも第２酵素が克服できないエネルギー障壁を提供する。スペーサは、酵素の牽引力を減らすことによって（例えば、スペーサのヌクレオチドからの塩基が失われている場合がある）、または１つ以上のヘリカーゼの動きを物理的に遮断することによって（例えば、スペーサがかさ高い化学基を含む場合がある）、第２の酵素を抑止し得る。
【００７３】
スペーサは、第２の酵素が標的ポリヌクレオチドに沿って移動するのを妨害または防止する任意の分子または分子の組み合わせを含み得る。膜貫通孔および適用電位の不在下で、酵素がスペーサにて抑止されているかどうかを判断するのは、簡単である。例えば、酵素がスペーサを通過し、ＤＮＡの相補鎖を解離させる能力は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により測定できる。
【００７４】
スペーサは、典型的には、ポリマーなどの線状分子を含む。スペーサは、典型的には、標的ポリヌクレオチドとは異なる構造を有する。例えば、標的ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、１つ以上のスペーサは、典型的には、ＤＮＡではない。とりわけ、標的ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、スペーサは、好ましくは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有する合成ポリマーを含む。スペーサは、アダプタ中の他のヌクレオチドと反対方向に１つ以上のヌクレオチドを含み得る。例えば、ポリヌクレオチドが５’から３’の方向にある場合、スペーサは、１つ以上のヌクレオチドを３’から５’の方向に含み得る。
【００７５】
スペーサは、好ましくは、１つ以上のニトロインドール、例えば、５−ニトロインドール、イノシン、アクリジン、２−アミノプリン、２−６−ジアミノプリン、５−ブロモ−デオキシウリジン、逆位チミジン（逆位ｄＴ）、逆位ジデオキシ−チミジン（ｄｄＴ）、ジデオキシ−シチジン（ｄｄＣ）、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソデオキシシチジン（Ｉｓｏ−ｄＣ）、イソデオキシグアノシン（Ｉｓｏ−ｄＧ）、ｉＳｐＣ３基（すなわち、糖および塩基を欠失しているヌクレオチド）、光開裂性（ＰＣ）基、ヘキサンジオール基、スペーサ９（ｉＳｐ９）基、スペーサ１８（ｉＳｐ１８）基、ポリマーまたはチオール接続を含む。スペーサは、これらの基の任意の組み合わせを含み得る。これらの基の多くは、ＩＤＴ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））から市販されている。
【００７６】
スペーサは、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上の２−アミノプリン、２−６−ジアミノプリン、５−ブロモ−デオキシウリジン、逆位ｄＴ、ｄｄＴ、ｄｄＣ、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソ−ｄＣ、イソ−ｄＧ、ｉＳｐＣ３基、ＰＣ基、ヘキサンジオール基、およびチオール接続、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上を含み得る。スペーサは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のｉＳｐ９基および／または２、３、４、５または６またはそれ以上のｉＳｐ１８基を含む。最も好ましいスペーサは、４個のｉＳｐ１８基である。
【００７７】
スペーサがポリマーを含む場合、ポリマーは、好ましくは、ポリペプチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリペプチドは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれ以上のアミノ酸を含む。ＰＥＧは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれ以上のモノマー単位を含む。
【００７８】
スペーサは、１つ以上の脱塩基ヌクレオチド（すなわち、核酸塩基を欠くヌクレオチド）、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれ以上の脱塩基ヌクレオチドを含む。核酸塩基は、脱塩基ヌクレオチドにおいて、−Ｈ（ｉｄＳｐ）または−ＯＨによって置き換えられ得る。脱塩基スペーサは、１つ以上の隣接するヌクレオチドから核酸塩基を除去することによって、標的ポリヌクレオチド中に挿入され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、３−メチルアデニン、７−メチルグアニン、１，Ｎ６−エテノアデニンイノシン、またはヒポキサンチンを含むように修飾され得、核酸塩基は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）を使用してこれらのヌクレオチドから除去され得る。代替的には、ポリヌクレオチドは、ウラシルを含むように修飾され得、核酸塩基は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）によって除去され得る。一実施形態では、１つ以上のスペーサは、脱塩基ヌクレオチドを一切含まない。
【００７９】
第２の酵素は、線状分子スペーサの前または上で抑止することができる。線状分子スペーサが使用される場合、アダプタは、好ましくは、ポリヌクレオチドに付着するかまたは付着するためのアダプタの末端に最も近いスペーサの末端に隣接するポリヌクレオチドの二本鎖領域を含む。ハイブリダイズした二本鎖領域は好ましくはスペーサで終結し、スペーサを含まない鎖は好ましくはスペーサに隣接するオーバーハングを形成する。さらなるポリヌクレオチド鎖をオーバーハングにハイブリダイズして、さらなる二本鎖領域を形成することができる。さらなる二本鎖領域は、典型的には、スペーサ上の第２の酵素を抑止するのに役立つ。さらなるポリヌクレオチドは、典型的には、標的ポリヌクレオチドと同じヌクレオチドから形成されるが、異なるヌクレオチドから形成されてもよい。例えば、さらなるポリヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）または架橋型核酸（ＢＮＡ）から形成され得る。
【００８０】
線状分子スペーサが使用される場合、アダプタは好ましくはスペーサの末端に封鎖分子を含む。封鎖分子は、第２の酵素がスペーサ上で抑止されたままであることを確実にするために役立つことができる。封鎖分子は、１つ以上のヘリカーゼの物理的な抑止を引き起こす任意の化学基であり得る。封鎖分子は、ポリヌクレオチドの二本鎖領域であり得る。適切な封鎖ポリヌクレオチドの例は、実施例に開示されている。
【００８１】
適切な化学基には、ペンダント化学基が含まれる。化学基は、標的ポリヌクレオチド中の１つ以上の核酸塩基および／またはポリヌクレオチド骨格に結合することができる。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれ以上などの任意の数の化学基が存在し得る。好適な基の例には、フルオロフォア、ストレプトアビジンおよび／またはビオチン、コレステロール、メチレンブルー、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニンおよび／または抗ジゴキシゲニン、ならびにジベンジルシクロオクチン基が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
アダプタに複数のスペーサが存在する場合、それらは同じでも異なっていてもよい。例えば、１つのスペーサは、上記の線状分子のうちの１つを含んでもよく、別のスペーサは、第２の酵素を物理的に抑止する１つ以上の化学基を含んでもよい。スペーサは、上記の線状分子のいずれか、および１つ以上の化学基、例えば、１つ以上の脱塩基およびフルオロフォアを含み得る。
【００８３】
ヘリカーゼなどのほとんどの核酸処理酵素は、ＤＮＡに結合し、それに沿って移動するため、ＤＮＡではない任意のものを使用して抑止することができる。
【００８４】
膜貫通孔および適用電位の不在下で、スペーサは、好ましくは、遊離ヌクレオチドの存在下および／または補因子の存在下で第２の酵素を抑止することができる。
【００８５】
ポリヌクレオチドを分離する方法の工程（ｉ）は、燃料（遊離ヌクレオチド）および補因子の存在下で行われる。スペーサの長さと特性は、通常、１つ以上のヘリカーゼが方法中にアダプタ上で確実に抑止されるように選択される。
【００８６】
スペーサが酵素を抑止する能力は、塩濃度によって影響を受ける可能性がある。本発明の方法において使用される塩濃度が高くなるほど、必要とされる１つ以上のスペーサが短くなる。膜貫通孔および適用電位の不在下で、スペーサは、好ましくは、約１００ｍＭ未満の塩濃度で第２の酵素を抑止することができる。
【００８７】
遊離ヌクレオチドおよび補因子の存在下でＤＮＡを処理する酵素を抑止するために使用できるスペーサの例には、１Ｍの塩、４つのｉＳｐＣ３基または２つのｉＳｐ１８基；１００〜１０００ｍＭの塩、４つのｉＳｐ１８基または６つのｉＳｐ９基；＜１００〜１０００ｍＭの塩、６つのｉＳｐ１８基、１２のｉＳｐＣ３基、または２０のｉＳｐＣ３基、が含まれる。
【００８８】
酵素は、例えば、トーホールド解離によって、酵素の後ろのＤＮＡ鎖をアニーリングすることにより、抑止されたケミストリーを「押しのける」ことができる。あるいは、酵素は、転位できない状態を使用して「抑止」されることができる。例えば、アダプタは、酵素が転位および／または燃料に結合することができないｐＨで維持されてもよい。あるいは、小分子阻害剤を使用して酵素を抑止することができる。
【００８９】
一実施形態では、アダプタは、膜アンカーまたは孔アンカーをさらに含む。アンカーは、好ましくは、第１の酵素および第２の抑止された酵素がアダプタに結合する場合に存在する。適切なアンカーは、例えば、ＷＯ２０１２／１６４２７０およびＷＯ２０１５／１５０７８６に記載されているように、当技術分野で知られている。
【００９０】
選択方法において有用なアダプタは、タグを含み得る。タグは、アダプタにハイブリダイズしてもよいし、酵素に付着されてもよい。
【００９１】
適切なタグは当技術分野で知られている。適切なタグの例には、ビオチン、ポリヌクレオチド配列、抗体、抗体断片、例えば、ＦａｂおよびＳｃＳｖ、抗原、ポリヌクレオチド結合タンパク質、ポリヒスチジンテール、ならびにＧＳＴタグが含まれるが、これらに限定されない。ビオチンは、ストレプトアビジンなどのアビジンでコーティングされた表面に特異的に結合する。選択的ポリヌクレオチド配列は、相補的配列でコーティングされた表面に特異的に結合する（すなわち、ハイブリダイズする）。
【００９２】
アダプタおよび／またはタグは、切りこみを入れる、ニックを入れる、切断する、または加水分解することができる領域を含み得る。そのような部位は、選択基準を満たすポリヌクレオチド、または選択基準を満たさないポリヌクレオチドを、それらが結合している表面、ビーズまたはカラムから除去できるように設計することができる。適切な部位は当技術分野で知られている。適切な部位には、ＲＮＡ領域、デスチオビオチンおよびストレプトアビジンを含む領域、ジスルフィド結合、光切断性領域および制限酵素部位、または酵素によって選択的に切断される他の部位が含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
アダプタは、タグに加えて、またはタグの代わりに、さらなるポリヌクレオチドおよび／または例えばタンパク質などの他の分子を付着させるための隠れた部位を含み得る。アダプタは、タグに加えて、またはタグの代わりに、さらなるポリヌクレオチドおよび／または例えばタンパク質などの他の分子を付着させるための露出した部位を含み得る。さらなるポリヌクレオチドまたは例えばタンパク質などの他の分子は、選択バイアスを作成するために使用される。
【００９４】
さらなるポリヌクレオチドを付着させるための部位は、例えば、相補的ポリヌクレオチド鎖またはイノシンなどのユニバーサル塩基を含むかまたはそれらからなる鎖にハイブリダイズすることができる一本鎖領域であり得る。相補的ポリヌクレオチド鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、および／または修飾された塩基を含むまたはそれらからなる鎖であってもよい。修飾された塩基は、例えば、核酸塩基が−Ｈ（ｉｄＳｐ）または−ＯＨで置き換えられているヌクレオチドなどの脱塩基ヌクレオチドであってもよい。修飾された塩基は、３−メチルアデニン、７−メチルグアニン、１，Ｎ６−エテノアデニンイノシン、またはヒポキサンチンを含んでもよく、核酸塩基は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）を使用してこれらのヌクレオチドから除去され得る。ポリヌクレオチドは、ウラシルを含むように修飾され得、核酸塩基は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）によって除去され得る。修飾された塩基は、例えば、２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）および／または２’−フルオロ塩基であり得る。相補的またはユニバーサル鎖は、膜貫通孔を使用して選択されたポリヌクレオチドを特徴付けるためにＹアダプタなどのアダプタ中に存在してもよく、例えば、さらなるポリヌクレオチドは、Ｙアダプタなどのアダプタであり得る。
【００９５】
分子を付着させるための部位は、例えば、露出される場合に、Ｅ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質などの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）に結合することができる一本鎖ＤＮＡセクションであってもよい。
【００９６】
例えば、選択バイアスを作成するために使用されるタンパク質などの、さらなるポリヌクレオチドまたは他の分子は、例えば、タグ付けされてもよく、鎖がハイブリダイズされるポリヌクレオチドへのライゲーションを可能にし、または逆に、鎖がハイブリダイズするポリヌクレオチドへのライゲーションを妨げて、消化を可能にするか、または逆に消化を妨げる。ライゲーションは、例えばリガーゼを使用する直接的ライゲーション、またはクリックケミストリーを使用するなどの間接的ライゲーションであり得る。
【００９７】
アダプタは、タグに加えて、またはタグの代わりに、部位が露出したときに別の鎖に連結され得る隠れた部位を含むことができる。アダプタは、タグに加えて、またはタグの代わりに、別の鎖に連結され得るさらなるポリヌクレオチドを付着させるための露出した部位を含むことができる。
【００９８】
アダプタは、タグに加えて、またはタグの代わりに、鎖が露出したときに鎖の消化を可能にする隠れた部位を含むことができる。アダプタは、タグに加えて、またはタグの代わりに、鎖が露出したときに鎖の消化を可能にする露出した部位を含むことができる。
【００９９】
アダプタは、タグに加えて、またはタグの代わりに、クリックケミストリー付着に適した隠れたまたは露出している化学基を含むことができる。
【０１００】
隠れた部位は、ヘアピンなどの二次構造を含み得る。例えば、ヘアピンは、例えば、シーケンスアダプタの付着を防止するために、または特定の鋳型のローリングサークル増幅を可能にするために、酵素の作用によって連結閉鎖され得る。
【０１０１】
露出した部位は、分離方法の間にセクション基準を満たさないポリヌクレオチドから除去されてもよい。隠れた部位は、通常、選択基準を満たすポリヌクレオチドにおいて現れる。
【０１０２】
アダプタは、一本鎖および／または二本鎖であり得る。アダプタは、例えば、一本鎖および二本鎖セクションの両方を含有し得る。アダプタは、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖、または好ましくは両方の鎖に付着することができる。アダプタは、複数のポリヌクレオチドの各々の一端または両端に付着することができる。
【０１０３】
定義された期間
選択方法の工程（ｉ）では、酵素は、定義された期間、複数のポリヌクレオチドに沿って移動することができる。定義された期間の長さは、選択／選択解除を望んでいるポリヌクレオチドの長さや、選択基準、例えば、核酸操作酵素として選択された酵素および反応条件に基づく。適切な定義された期間を決定することは、当業者の日常的技術の範囲内である。例えば、当業者は、所望の長さのポリヌクレオチドを含む試料を採取し、方法で使用される条件下で、様酵素が対照ポリヌクレオチドに沿って様々な時間で移動することを可能にすることができる。次に、当業者は、酵素がポリヌクレオチドの末端から離れるように移動した時間を決定することができる。次に、定義された期間は、酵素が所望の長さの対照ポリヌクレオチドの末端から離れるように移動した時間よりも短くなるように選択することができる。次に、選択方法を使用して、所望の長さのポリヌクレオチドをより短いポリヌクレオチドから分離することができる。
【０１０４】
定義された期間は、任意の長さ、例えば、約１秒〜約１４日以上、約５秒〜約１０日、約１０秒〜約７日、約２０秒〜約５日、約２５秒〜約２日、または約１分〜約１日であり得る。
【０１０５】
開始時間
複数のポリヌクレオチドに沿った酵素の移動は、任意の適切な方法で開始することができる。移動を開始する方法は、方法がどのように実行されているかによって異なる。酵素の１つ以上の分子が工程（ｉ）の前に複数のポリヌクレオチドに付着される一実施形態では、定義された期間は、典型的には酵素の移動を開始することによって開始される。酵素の移動は、例えば、酵素が移動できるように条件を変更することによって開始することができる。例えば、酵素、補酵素および／または補因子にエネルギーを提供するヌクレオチドを加えて、酵素の移動を開始することができる。酵素の移動を開始する方法の代替例には、ｐＨ、温度、および／または塩濃度を変更すること、および／またはトーホールド解離などによる酵素の後ろの鎖のハイブリダイゼーションにより酵素の抑止に使用されるスペーサ上に酵素を押し込むこと、が含まれる。
【０１０６】
酵素が工程（ｉ）の前に複数のポリヌクレオチドに予め結合されていない一実施形態では、定義された期間は、典型的には、複数のポリヌクレオチドを酵素と接触させることによって開始される。この実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、酵素がヌクレオチドに沿って移動するのに適した条件下で酵素と接触される。例えば、酵素は、酵素の移動に影響されやすいｐＨ、温度および塩の条件下で添加される。酵素および任意の必要な補酵素および／または補因子にエネルギーを提供するヌクレオチドもまた、典型的には酵素と共に加えられるか、またはすでに試料中に存在している。
【０１０７】
工程（ｉ）の前に酵素が溶液からの複数のポリヌクレオチドに結合することができる本発明の一実施形態では、定義された期間の開始時に、酵素のさらなる分子が複数のポリヌクレオチドに結合することが防止される。これは、任意の適切な方法で実現できる。例えば、複数のポリヌクレオチドに結合されていない酵素は、定義された期間の開始時に混合物に添加される捕捉鎖に結合することにより隔離され得る。一実施形態では、非結合酵素を隔離する捕捉鎖または別の分子を、例えば、酵素、補酵素および／または補因子にエネルギーを提供するヌクレオチドと一緒に加えることができる。あるいは、またはさらに、塩濃度は、ポリヌクレオチドへの酵素の再結合が防止されるように、典型的には塩を加えることによって調整することができる。あるいは、またはさらに、酵素は、定義された期間の開始前に、ポリヌクレオチドの周りで閉鎖され得る。これは、例えば、酵素結合部位を含有するアダプタを鎖の末端に連結し、次に酵素を溶液に加え、すべての酵素を、例えばテトラメチルアゾジカルボキサミド（ＴＭＡＤ）を用いて閉鎖して、塩濃度を増加させて、溶液中の他の酵素の結合を防止することにより、達成できる。
【０１０８】
捕捉鎖を追加する代わりに、複数のポリヌクレオチドがビーズ、カラム、または表面にアダプタを介して結合している場合、未結合の酵素を洗い流し、任意の必要な燃料、補酵素、および／または補因子を溶液中に追加する。
【０１０９】
遊離ヌクレオチドおよび補因子
燃料および／または補酵素／補因子を追加または削除することにより、酵素の移動を制御できる。燃料は通常、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似体である。酵素は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似体の不在下で、および酵素の移動に必要ないずれの補酵素および／または補因子の不在下で、複数のポリヌクレオチドに添加／結合することができる。遊離ヌクレオチドとしては、１つ以上の、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、又はｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、ポリヌクレオチド結合タンパク質が機能することを可能にする因子である。酵素補因子は、好ましくは、二価金属カチオンである。二価金属カチオンは、好ましくは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、又はＣｏ２＋である。酵素補因子は、最も好ましくは、Ｍｇ２＋である。
【０１１０】
停止時間
定義された期間は、酵素の移動を阻害することによって停止される。
【０１１１】
酵素の移動は、任意の適切な方法により、例えば、（ａ）酵素、補酵素および／または補因子にエネルギーを提供するヌクレオチドを除去することにより、（ｂ）酵素阻害剤を添加することにより、（ｃ）ｐＨ、温度、または塩濃度を変化させることにより、および／または（ｄ）酵素を変性させることにより、停止される。
【０１１２】
複数のポリヌクレオチドが、例えば酵素上のタグまたはアダプタ中のタグを介してビーズ、カラムまたは表面に結合される一実施形態では、定義された期間は、ビーズ、カラムまたは表面を洗浄することによって停止され得る。これは、選択基準を満たさないポリヌクレオチドを除去するのに役立ち得る。次に、ビーズ、カラムまたは表面上に残っている複数のポリヌクレオチドをさらに分離するために、燃料、補酵素および／または補因子を加えることによって反応を再開することができる。このことが望ましい状況を図に示す。
【０１１３】
一実施形態では、定義された期間は、燃料の量、例えば、酵素にエネルギーを提供するヌクレオチドの量が枯渇すると停止し、それにより酵素の移動を停止させる。燃料は、複数のポリヌクレオチドに沿って酵素が移動することによって消耗する可能性がある。あるいは、例えば、燃料に対してより高い親和性を有する酵素などの競合酵素を添加することにより、燃料を別の方法で枯渇させて、燃料を枯渇させ、酵素の移動を停止させることができる。
【０１１４】
酵素の分子がポリヌクレオチドの末端に到達したときに現れる隠れたタグをアダプタが含む一実施形態では、定義された期間は、反応混合物をビーズ、カラムまたは表面と接触させて、タグが現れたより短いポリヌクレオチドが除去され、溶液中の選択基準を満たすより長いポリヌクレオチドが残る。
【０１１５】
アダプタまたは酵素がタグ付けされる一実施形態において、複数のポリヌクレオチドは、工程（ｉ）の開始時に、ビーズ、カラムまたは表面に結合され得る。次に、ビーズ、カラム、または表面を洗浄することで反応を停止させることができる。これにより、酵素の移動に必要とされる燃料、補酵素、補因子が除去される。同時に、ポリヌクレオチドはビーズ、表面またはカラムに結合されず、結合されたものから分離され得る。
【０１１６】
一実施形態では、定義された期間は、選択の間に反応条件に存在する燃料および／または補因子の量によって決定される。この時間は、酵素が燃料および／または補因子を使い果たし、ポリヌクレオチドに沿って移動できなくなると終了する。酵素による燃料の代謝回転の速度を決定することは、当業者の日常的な技能の範囲内である。反応中に存在する燃料、ポリヌクレオチドおよび／または酵素の量を制御することにより、当業者は、酵素が活性である時間の長さを制御でき、したがって酵素の移動が起こる期間を定義できる。典型的には、この実施形態では、燃料の量は、燃料が定義された期間内に枯渇するように制限される。
【０１１７】
選択
この方法を使用して、選択基準を満たす複数のポリヌクレオチドを選択することができる。試料中の複数のポリヌクレオチドのサブグループを選択することができる。この方法では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、例えば約１０〜約１００，０００、約２０〜約１０，０００、約３０〜約１，０００、または約５０〜約５００のポリヌクレオチドなど、複数のポリヌクレオチドを選択することができる。
【０１１８】
選択方法は、異なる物理的特性を有するポリヌクレオチドを区別するために使用される。一実施形態では、方法は、選択されたポリヌクレオチドを選択されていないポリヌクレオチドから分離する工程を含む。いくつかの異なる選択を組み合わせて実行できる。一実施形態では、本方法は、ポリヌクレオチドの長さに基づいて分離および／または選択的に修飾することができるポリヌクレオチドを選択する。好ましくは、この方法は、長いポリヌクレオチドを選択するために使用される。選択されたポリヌクレオチドの長さは、何が望まれるかによって異なり得る。この方法は、望ましい長さのポリヌクレオチドが選択されるように調整することができる。例えば、この方法は、少なくとも１ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、１，０００ｋｂ、１０，０００ｋｂ、１００，０００ｋｂ、２００，０００ｋｂまたは２５０，０００ｋｂの長さを有するポリヌクレオチドを選択するために使用され得る。
【０１１９】
一実施形態では、この方法を使用して、損傷を受けたポリヌクレオチドを損傷を受けていないポリヌクレオチドから区別することができる。損傷を受けていないまたは損傷を受けたポリヌクレオチドを選択して分離することができる。損傷を受けたまたは損傷を受けていないポリヌクレオチドは、選択的に修飾されることができる。損傷を受けたポリヌクレオチドは、その化学構造の変化、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡの化学構造の変化を含む任意のポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの損傷には、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断、ポリヌクレオチドから失われた１つ以上の塩基、または１つ以上の化学的に変化した塩基が含まれる。したがって、この方法は、ニックの入った鎖を有するポリヌクレオチドを無傷のポリヌクレオチドから分離するために使用することができる。ニックの入った鎖を有するポリヌクレオチドは、一実施形態では、ＤＮＡ鎖の１つに少なくとも１つの切断が存在する二本鎖ＤＮＡであり得る。この方法を使用して、無傷のポリヌクレオチドを選択することができる。損傷を受けたポリヌクレオチドを損傷を受けていないポリヌクレオチドから分離するために方法がどのように実施され得るかについての例が図に示されている。図はまた、異なる長さのポリヌクレオチドがどのように分離され得るかを示している。
【０１２０】
この方法を使用して、特定の「ウィンドウ」内にあるポリヌクレオチドを選択することができる。例えば、方法は、所定の長さの範囲内でポリヌクレオチドを選択するために、すなわち、所望の長さより短いポリヌクレオチドを除去し、次に所望の長さより長いポリヌクレオチドを除去することにより、またはその逆で、２回以上実行されてもよい。さらに、またはあるいは、方法工程は、損傷を受けたポリヌクレオチドを損傷を受けていないポリヌクレオチドから分離し、所望の長さのポリヌクレオチドを選択するために２回以上実行されてもよい。この方法の工程（ｉ）および（ｉｉ）は、１回、２回、３回またはそれ以上、例えば、４回、５回または６回繰り返すことができる。この方法を繰り返すことにより、ポリヌクレオチド画分を得ることができ、各画分は、他の画分とは異なる長さのポリヌクレオチドを含有する。
【０１２１】
この方法は、酵素がポリヌクレオチドの末端に到達するかどうか、および／または酵素がポリヌクレオチドから結合解除するかどうかに基づいて、ポリヌクレオチドを選択する。この選択は、任意の適切な方法で達成することができる。したがって、ポリヌクレオチドの選択は、試料中の他のポリヌクレオチドとは異なって、定義された期間の終わりに酵素が結合している試料中の特定のポリヌクレオチドに基づくことができる。選択を達成する方法の他の例には、末端修飾および酵素タグ付けが含まれる。一実施形態では、この方法は、両端にアダプタを含むポリヌクレオチドを、アダプタを含まないポリヌクレオチドおよび／または一端のみにアダプタを含むポリヌクレオチドから分離するために使用される。
【０１２２】
末端修飾により、酵素が末端から離れるように移動したポリヌクレオチドを、酵素が末端から離れるように移動しなかったポリヌクレオチドから分離したり、または試料内の他のポリヌクレオチドから物理的に分離することなく、さらなる処理および／または特性評価のために選択することが可能になる。末端修飾の一実施形態では、末端シグナルを含むアダプタは、複数のポリヌクレオチドの各々の一端または両端に付着される。末端シグナルは、例えば、選択タグ、さらなるポリヌクレオチドを付着させるための隠れた部位、さらなるポリヌクレオチドを付着させるための露出した部位、またはエキソヌクレアーゼによる消化を防ぐキャップであり得る。そのような末端シグナルが使用される場合、工程（ｉ）において、酵素の分子がポリヌクレオチドの末端に到達すると、知れは選択タグを解離させるか、隠れた部位が明らかになるか、露出した部位が除去されるか、またはキャップが除去される。工程（ｉｉ）では、次に、選択タグ、隠れた部位、露出した部位、またはキャップされていない末端を使用して、ポリヌクレオチドを分離することができる。
【０１２３】
末端シグナルが選択タグである場合、複数のポリヌクレオチドは、選択タグを介してビーズ、カラムまたは表面に結合され得る。次に、酵素による選択タグの解離により、酵素がもはや付着していないポリヌクレオチドがビーズ、カラム、または表面から放出される。この実施形態では、洗浄後にビーズ、カラムまたは表面に結合したままであるポリヌクレオチドが、工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことにより分離される。工程（ｉ）および（ｉｉ）が繰り返される場合、選択基準を満たすポリヌクレオチドは、ビーズ、カラムまたは表面から溶出されたものであってもよく、またはビーズ、カラムまたは表面に結合したままのものであってもよい。選択基準を満たすポリヌクレオチドのみがビーズ、カラム、または表面に結合したままである場合、これらのポリヌクレオチドは、例えば、酵素の移動を再開させて、酵素がポリヌクレオチドの末端に到達することを可能にするか、またはビーズ、カラムもしくは表面からポリヌクレオチドを結合解除することにより、ビーズ、カラム、または表面から回収できる。結合解除は、当技術分野で知られている標準的な方法によって達成することができる。例えば、アダプタは、ポリヌクレオチドを放出するために使用され得る切断部位を含み得る。
【０１２４】
選択タグである末端シグナルを使用する別の実施形態では、選択タグはアダプタ内に隠されてもよい。例えば、選択タグは、結合パートナーに結合されることによって隠されることができる。例えば、タグがビオチンの場合、それは、ＤＮＡまたはストレプトアビジンなどのアビジンに結合できる。酵素がポリヌクレオチドの末端に到達すると、結合タグのパートナーが除去され得る。次に、結合タグパートナーが付着しているビーズ、表面またはカラムを使用して、末端タグが現れたポリヌクレオチドを選択または除去することができる。
【０１２５】
末端シグナルとして機能する隠れた部位は、任意の方法でＤＮＡをさらなるポリヌクレオチドまたは別の分子にライゲーションまたは付着させることを可能にする、ＤＮＡ配列などの任意の部位であり得る。例えば、隠れた部位は、クリックケミストリーを介して別の分子への付着を可能にする部位であり得る。クリックケミストリー付着を使用する方法は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１７／０５１４９３号で説明されている。
【０１２６】
クリックケミストリーは、通常、酵素の使用を含まないために、有利である（Ｋｏｌｂら、（２００１）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０  ２００４−２０２１）。クリックケミストリーの適切な例には、緊張下で、例えば、シクロオクタン環内で、アジドがアルキンと反応する、１，３二極性環状付加反応の銅不含の変形版；一方のリンカー上の酸素求核試薬と、もう一方のエポキシドまたはアジリジン反応性部分との反応；およびアルキン部分を任意のアリールホスフィンで置換して、アジドとの特異的反応をもたらして、アミド結合を付与することができる、シュタウディンガーライゲーション、が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
好ましくは、クリックケミストリー反応は、アルキンとアジドとの間のＣｕ（Ｉ）触媒による１，３二極性環状付加反応である。好ましい実施形態では、第１の基はアジド基であり、第２の基はアルキン基である。好ましい位置にアジド基およびアルキン基を組み込んだ核酸塩基は知られている（例えば、Ｋｏｃａｌｋａら（２００８）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ。９（８）：１２８０−５）。アルキン基はＢｅｒｒｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）から市販されており、アジド基はＡＴＤＢｉｏによって合成される。
【０１２８】
銅不含クリックケミストリーを使用できる。それは、迅速、クリーンで、タンパク質に対して有毒ではない。この良い例は、シクロオクチン官能基（ＤＩＢＯ）と結合するマレイミドまたはヨードアセトアミドである。他の適切な生体直交型ケミストリーには、シュタウディンガーケミストリー、ヒドラジンまたはヒドラジド／アルデヒドまたはケトン試薬（ＨｙＮｉｃ＋４ＦＢケミストリー、すべてのＳｏｌｕｌｉｎｋ（商標）試薬を含む）、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ試薬対およびボロン酸／サリチルヒドロキサメート試薬が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２９】
好ましくは、反応基は、アジドおよびヘキシニル基、例えば、３アジドＮおよび５’−ヘキシニル−Ｇである。非共有反応性基の好ましい対には、（ｉ）Ｎｉ−ＮＴＡおよび６ｘＨｉｓなどのポリヒスチジン、ならびに（ｉｉ）シクロデキストリンおよびアダマンチンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
隠れた部位は、何らかの方法で隠されたり、保護されたりする。例えば、分子を使用して、クリック反応基を隠す、または閉塞することができる。酵素の移動は分子を除去し、反応基を明らかにすることができる。任意の適切な分子を使用することができる。例えば、ピレンを使用して、ＤＢＣＯを積み上げることができる。隠れた部位がＮｉ−ＮＴＡ基（６ｘＨｉｓなどのポリヒスチジンに結合できる）を含む場合、隠れた部位は同じ標的ポリヌクレオチド内の６ｘＨｉｓなどのポリヒスチジンで保護されてもよく、逆もまた同様であり、すなわち、隠れた部位は６ｘＨｉｓなどのポリヒスチジンを含んでもよく、Ｎｉ−ＮＴＡ基で保護されてもよい。隠れた部位がシクロデキストリン（後続のポリヌクレオチドのアマンタジンに結合できる）を含む場合、隠れた部位は同じ標的ポリヌクレオチドのアマンタジンによって保護されてもよく、またはその逆である。隠れた部位および保護分子は、アダプタの反対の鎖上、したがってアダプタが付着しているポリヌクレオチドの反対の鎖上に存在し得る。次に、酵素による鎖の分離は、保護分子を隠れた部位から分離し、隠れた部位を明らかにし得る。
【０１３１】
隠れた部位は、保護ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって保護され得る。保護ポリヌクレオチドは、酵素がポリヌクレオチドの末端に到達したときに除去され得る。一例では、保護ポリヌクレオチドは、隠れた部位に対する一本鎖リガーゼの作用を防止することができる。保護ポリヌクレオチドの放出は、隠れた部位をリガーゼの基質として明らかにするであろう。
【０１３２】
ポリヌクレオチドの二次または三次構造を変化させるポリヌクレオチドの末端でのアダプタ上での酵素の移動により、末端シグナルを生成することができる。例えば、酵素の移動は、ヘアピンまたは四重鎖をほどき、アダプタがさらなるポリヌクレオチドを移動する能力を変化させることができる。
【０１３３】
一実施形態では、方法の工程（ｉｉ）において、酵素が結合したままであるポリヌクレオチドは、酵素が結合していないポリヌクレオチドから分離される。これを達成する１つの方法は、タグ付き酵素を使用することである。
【０１３４】
一実施形態では、方法の工程（ｉ）の開始時に、酵素の１分子がポリヌクレオチドに沿って移動するか、または酵素の１分子がポリヌクレオチドの各鎖に沿って反対方向に移動するように、タグ付き酵素がアダプタに付着される。タグ付けされた酵素が定義された期間の終わりにポリヌクレオチドに残っている場合、ポリヌクレオチドは酵素上のタグを介してタグ付けされ、酵素が見出されなかったより短いポリヌクレオチドから分離することができる。
【０１３５】
タグ付き酵素の複数の分子が複数のポリヌクレオチドに結合している別の実施形態では、ポリヌクレオチド上に存在するタグ付き酵素の分子のすべてがポリヌクレオチドに沿って移動する。タグ付き酵素の任意の分子が定義された期間の終わりにポリヌクレオチドに残っている場合、ポリヌクレオチドは酵素上のタグを介してタグ付けされ、タグ付き酵素のすべての分子が離れて移動したより短いポリヌクレオチドから分離することができる。
【０１３６】
一実施形態では、酵素上のタグを使用して、酵素をビーズ、カラムまたは表面に結合することができる。酵素は、方法の工程（ｉ）を実施する前に、ビーズ、カラムまたは表面に結合され得る。あるいは、ビーズ、カラムまたは表面は、タグ付き酵素を保持するポリヌクレオチドを結合するための方法の工程（ｉｉ）において使用され得る。工程（ｉ）の前に酵素がビーズ、カラム、または表面に結合している一実施形態では、工程（ｉ）の定義された期間は、溶液をクエンチすることによって、あるいは酵素の移動に必要である必須燃料、補酵素、および／または補因子を含む反応溶液からビーズ、カラム、または表面をビーズから取り除くことによって終了することができる。工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返して、異なる長さの複数の画分を収集し、および／または特定の長さのポリヌクレオチドを選択し、および／または損傷を受けた、および損傷を受けていないポリヌクレオチドを分離することができる。
【０１３７】
一実施形態では、アダプタは、例えば、ビオチンまたはデスチオビオチンで相補鎖がタグ付けされた相補的ポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズすることができる配列を含んでもよい。相補鎖は、アダプタの一部を含んでもよく、および／またはビーズ、カラムまたは表面に予め結合されてもよい。アダプタは、複数のポリヌクレオチドをビーズ、カラムまたは表面に結合するために使用することができる。次に、工程（ｉ）における酵素の移動は、ビーズ、カラムまたは表面からの選択基準を満たすには短すぎるポリヌクレオチドを解離させる。ビーズ、カラム、または表面に結合したままのポリヌクレオチドは、損傷を受けた、または損傷を受けていないポリヌクレオチドであり得る。工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返して、損傷を受けていない鎖のみを選択できる。損傷を受けた鎖はビーズ、カラム、または表面に結合したままであり、損傷を受けていない鎖は解放される。
【０１３８】
１つの特定の実施形態では、アダプタは、鎖解離ＤＮＡポリメラーゼの結合部位およびプライミング部位を含有するＤＮＡにライゲーションされ得るか、またはそれを含み得る。ポリメラーゼが定義された期間内に末端に到達するのに十分短いポリヌクレオチドに沿ったポリメラーゼの移動を使用して、ビオチン化鎖ポリヌクレオチドを解離させることができる。あるいは、ポリメラーゼにタグを付けてもよい。
【０１３９】
選択タグを使用する方法では、抽出媒体を使用して、タグなしポリヌクレオチドからタグ付きポリヌクレオチドを分離するのが一般的である。任意の適切な抽出媒体を使用することができる。適切な抽出媒体の例には、ビーズ、カラムおよび表面が含まれる。一実施形態では、表面は、膜貫通孔を含む膜であり得る。
【０１４０】
酵素またはアダプタは、抽出媒体に予め結合することができる。抽出媒体を使用すると、フラッシュによりクエンチするための；選択基準を満たさない不要なポリヌクレオチドを除去するための；および／または選択基準を満たさない所望のポリヌクレオチドを溶出するための、洗浄が可能になる。
【０１４１】
したがって、定義された期間は、ビーズ、カラムまたは表面をフラッシュすることによって停止することができ、および／またはビーズ、カラムまたは表面に結合していないポリヌクレオチドは、定義された期間の終わりにビーズ、カラムまたは表面を洗浄することによって除去または溶出することができる。
【０１４２】
一実施形態では、洗浄後にビーズ、カラムまたは表面に結合したままであるポリヌクレオチドが、工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことにより分離される。
【０１４３】
ビーズ、カラム、または表面に結合したままのポリヌクレオチドは、次のような適切な方法でビーズ、カラム、または表面から回収できる。酵素をビーズ、カラム、または表面から結合解除する。または酵素をポリヌクレオチドから結合解除する。
【０１４４】
アダプタの露出した部位の一例は、シーケンスアダプタなどのさらなるポリヌクレオチドへの効率的なライゲーションを可能にするオーバーハングである。酵素が定義された期間内に鎖の末端に到達する場合（つまり、鎖が短い場合）、アダプタは、ライゲーションのためのオーバーハングが利用できなくなるコンフォメーションに折りたたまれる可能性がある。これにより、所望の長さの鎖を選択できるが、ニックのない鎖を選択することはできない。あるいは、酵素は特定のオーバーハングを含有する鎖を解離させる可能性がある。この代替案は、選択したポリヌクレオチドに５’オーバーハングを持つシーケンスアダプタを付加するために特に有用である。
【０１４５】
末端シグナルは、一実施形態では、エキソヌクレアーゼによる消化を防ぐキャップであり得る。エキソヌクレアーゼによる消化は、例えば、アダプタに以下：５’末端および／または３’末端にホスホロチオエート（ＰＳ）結合、通常は５’および／または３’末端に少なくとも３つのＰＳ結合末端；５’末端および／または３’末端に２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド；５’末端および／または３’末端に２’−フルオロ塩基；５’端および／または３’端に逆位ｄＴおよびｄｄＴ；リン酸化された５’および／または３’ヌクレオチド；５’末端および／または３’末端にホスホラミダイトＣ３スペーサなどのスペーサ、の１つ以上を含めることで防止できる。
【０１４６】
選択されたＤＮＡは任意の目的に使用できる。多くのプラットフォームは、無傷の／長いＤＮＡポリヌクレオチド、または実際には短いポリヌクレオチド断片のみを必要とする。例えば、ポリヌクレオチドは、任意の適切なシーケンス方法を使用して配列決定されるなどで特徴付けられ得る。典型的には、任意のハイスループットシーケンス法が使用され得る。
【０１４７】
特定の一実施形態では、この方法を使用して、膜貫通孔への送達のための標的ポリヌクレオチドを選択することができる。
【０１４８】
これを達成するために、アダプタが、複数のポリヌクレオチドの各々に付着されてもよく、第２の核酸処理酵素がアダプタに付着し、工程（ｉ）においてポリヌクレオチドに沿って移動しないようにアダプタ上で抑止されている。
【０１４９】
あるいは、工程（ｉｉ）は、隠れた部位または露出した部位を、一本鎖リーダー配列および任意選択的に膜アンカーもしくは膜貫通孔アンカーを含むアダプタに結合することであって、第２の核酸処理酵素がアダプタに付着されており、アダプタ上で停止している、結合することと、試料を膜貫通孔と接触させることと、を含んでもよい。
【０１５０】
選択されたポリヌクレオチドがビーズに結合される場合、ポリヌクレオチドは、ビーズにまだ結合している間に孔と接触し得る。ビーズは、例えばＷＯ  ２０１６／０５９３７５に開示されているように、孔への選択されたポリヌクレオチドの送達を容易にするために使用されてもよい。
【０１５１】
ポリヌクレオチドが表面に結合している場合、表面は、孔を含む膜であり得る。選択タグは、この実施形態では、コレステロールなどの膜アンカーであり得る。膜アンカーは、例えば、酵素に結合することができ、アダプタ中に隠されて、末端に到達する酵素によって明らかにされることができ、またはアダプタ中に存在し、アダプタを除去することができる切断部位が、末端に到達する酵素により明らかにされることができる。
【０１５２】
膜アンカーは、膜に挿入することができるポリペプチドアンカーおよび／または疎水性アンカーであり得る。疎水性アンカーは、好ましくは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ、ポリペプチド、タンパク質又はアミノ酸、例えばコレステロール、パルミテート又はトコフェロールである。アンカーは、チオール、ビオチンまたは界面活性剤を含み得る。
【０１５３】
一態様では、アンカーは、（ストレプトアビジンへの結合のための）ビオチン、（マルトース結合タンパク質または融合タンパク質への結合のための）アミロース、（ポリ−ヒスチジンまたはポリ−ヒスチジンタグ付きタンパク質への結合のための）Ｎｉ−ＮＴＡ、または（抗原などの）ペプチドであり得る。
【０１５４】
アンカーは、リンカー、または２、３、４もしくはそれ以上のリンカーを含み得る。好ましいリンカーはポリマー、例えばポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖類、及びポリペプチドを含むが、これらに限定されない。これらのリンカーは直鎖状、分岐状又は環状であってもよい。例えば、リンカーは環状ポリヌクレオチドであってもよい。アダプタは、環状ポリヌクレオチドリンカー上の相補的配列にハイブリダイズし得る。１つ以上のアンカーまたは１つ以上のリンカーは、切断または分解することができる成分、例えば制限部位または光解離性基を含み得る。リンカーは、マレイミド基で官能化されて、タンパク質のシステイン残基に結合する。好適なリンカーは、ＷＯ２０１０／０８６６０２に記載されている。
【０１５５】
アンカーは、好ましくはコレステロールまたは脂肪アシル鎖である。例えば、ヘキサデカン酸などの６〜３０個の炭素原子の長さを有する任意の脂肪アシル鎖を使用することができる。
【０１５６】
適切なアンカーの例およびアンカーをアダプタに取り付ける方法は、ＷＯ２０１２／１６４２７０に開示されている。
【０１５７】
ポリヌクレオチドを特徴付ける方法が提供される。特徴付け方法は、
（ｉ）本明細書に記載の選択方法を実行することと、
（ｉｉ）膜貫通孔を選択されたポリヌクレオチドと接触させることと、
（ｉｉｉ）膜貫通孔にわたって電位差を適用することと、
（ｉｖ）膜貫通孔に対して移動するポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す１つ以上の測定を行い、それによってポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む。
【０１５８】
１つ以上の特徴は、（ｉ）ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される。
【０１５９】
方法の特徴付けは、通常、ポリヌクレオチドが膜貫通孔に対して移動する際に膜貫通孔を通過する電流を測定することを含む。
【０１６０】
膜貫通孔および核酸処理酵素は、当技術分野で知られている。ポリヌクレオチドの配列および他の特性を決定するために電流シグナルを分析する方法と同様に、適切な膜およびデバイスもまた知られている。
【０１６１】
キット
ポリヌクレオチドを分離するためのキットであって、本明細書で定義されるような分離方法において使用されるための１つ以上のアダプタと、以下の構成要素：
−抽出媒体；
−核酸処理酵素；
−酵素、酵素補因子、および／または補酵素にエネルギーを提供するヌクレオチド；
−核酸処理酵素のための燃料および／または補因子を含む溶液；
−核酸処理酵素のための燃料および／または補因子を含有しない洗浄溶液；
−部位特異的エンドヌクレアーゼ；および／または
−シーケンスアダプタ；のうちの任意の組み合わせを含む任意の１つ以上の構成要素とを含む、キットが提供される。
【０１６２】
アダプタは、例えば、末端シグナルを含むアダプタであってよい。末端シグナルは、例えば、選択タグ、さらなるポリヌクレオチドを付着させるための隠れた部位、さらなるポリヌクレオチドを付着させるための露出した部位、またはエキソヌクレアーゼによる消化を防ぐキャップであり得る。
【０１６３】
選択タグは、アダプタ中に隠れている場合がある。例えば、選択タグは、結合パートナーに結合されることによって隠されることができる。例えば、タグがビオチンの場合、それは、ＤＮＡまたはストレプトアビジンなどのアビジンに結合できる。選択タグは、コレステロールなどの膜アンカーであり得る。選択タグは、例えば、（ストレプトアビジンへの結合のための）ビオチン、（マルトース結合タンパク質または融合タンパク質への結合のための）アミロース、（ポリ−ヒスチジンまたはポリ−ヒスチジンタグ付きタンパク質への結合のための）Ｎｉ−ＮＴＡ、または（抗原などの）ペプチドである。キットは、選択タグに結合する分子をさらに含み得る。選択タグに結合する分子は、抽出媒体にカップリングされてもよい。
【０１６４】
隠れた部位は、任意の方法でＤＮＡをさらなるポリヌクレオチドまたは別の分子にライゲーションまたは付着させることを可能にする、ＤＮＡ配列などの任意の部位であり得る。アダプタは、例えば、さらなるポリヌクレオチド中の相補的配列にハイブリダイズすることができる一本鎖オーバーハングを有し得る。オーバーハングは、約４〜約１５ヌクレオチド、例えば、約６、８、１０、または１２ヌクレオチドの長さを有し得る。隠れた部位は、クリックケミストリーを介して別の分子への付着を可能にする部位であり得る。適切な部位は上記に開示されている。
【０１６５】
隠れた部位は、例えばクリック反応基を閉塞する分子によって隠すことも、保護することもできる。例えば、ピレンを使用して、ＤＢＣＯを積み上げることができる。隠れた部位がＮｉ−ＮＴＡ基（６ｘＨｉｓなどのポリヒスチジンに結合できる）を含む場合、隠れた部位は同じ標的ポリヌクレオチド内の６ｘＨｉｓなどのポリヒスチジンで保護されてもよく、逆もまた同様であり、すなわち、隠れた部位は６ｘＨｉｓなどのポリヒスチジンを含んでもよく、Ｎｉ−ＮＴＡ基で保護されてもよい。隠れた部位がシクロデキストリン（後続のポリヌクレオチドのアマンタジンに結合できる）を含む場合、隠れた部位は同じ標的ポリヌクレオチドのアマンタジンによって保護されてもよく、またはその逆である。アダプタは、一方の鎖に隠れた部位を含み、反対の鎖に保護分子を含み得る。
【０１６６】
隠れた部位は、保護ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって保護され得る。保護ポリヌクレオチドは、酵素がポリヌクレオチドの末端に到達したときに除去され得る。保護ポリヌクレオチドは、例えば、アダプタ中の一本鎖オーバーハング配列に少なくとも部分的に相補的であり得、例えば、保護ポリヌクレオチドは、オーバーハング配列に対して約７０％〜１００％の同一性、例えば、約７５％、８０％、８０％または９５％の同一性を有し得る。一例では、保護ポリヌクレオチドは、隠れた部位に対する一本鎖リガーゼの作用を防止することができる。保護ポリヌクレオチドの放出は、隠れた部位をリガーゼの基質として明らかにするであろう。
【０１６７】
末端シグナルは、酵素の移動によって巻き戻しされるなどの除去可能なヘアピンまたは四重鎖などの二次または三次構造であってもよい。
アダプタの露出した部位の一例は、シーケンスアダプタなどのさらなるポリヌクレオチドへの効率的なライゲーションを可能にするオーバーハングである。酵素が所定の時間内に鎖の末端に到達する場合（つまり、鎖が短い場合）、アダプタは、ライゲーションのためのオーバーハングが利用できなくなるコンフォメーションに折りたたまれる可能性がある。これにより、所望の長さの鎖を選択できるが、ニックのない鎖を選択することはできない。あるいは、酵素は特定のオーバーハングを含有する鎖を解離させる可能性がある。この代替案は、選択したポリヌクレオチドに５’オーバーハングを持つシーケンスアダプタを付加するために特に有用である。
【０１６８】
末端シグナルは、一実施形態では、エキソヌクレアーゼによる消化を防ぐキャップであり得る。エキソヌクレアーゼによる消化は、例えば、アダプタに以下：５’末端および／または３’末端にホスホロチオエート（ＰＳ）結合、通常は５’および／または３’末端に少なくとも３つのＰＳ結合末端；５’末端および／または３’末端に２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド；２’−フルオロ塩基；５’端および／または３’端に逆位ｄＴおよびｄｄＴ；リン酸化された５’および／または３’ヌクレオチド；５’末端および／または３’末端にホスホラミダイトＣ３スペーサなどのスペーサ、の１つ以上を含めることで防止できる。
【０１６９】
核酸処理酵素は、上で論じた酵素のいずれであってもよい。
【０１７０】
抽出媒体は、ビーズ、カラムまたは表面であってよい。核酸酵素またはアダプタにタグを付けてもよい。タグ（選択タグ）は抽出媒体に結合できる。タグの結合を容易にするために、抽出媒体を修飾することができる。例えば、タグがｓｔｒｅｐタグであるビオチンでコーティングされている。
【０１７１】
一実施形態では、アダプタは、例えば、ビオチンまたはデスチオビオチンで相補鎖がタグ付けされた相補的ポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズすることができる配列を含んでもよい。相補鎖は、アダプタの一部を含んでもよく、および／またはビーズ、カラムまたは表面に予め結合されてもよい。
【０１７２】
１つの特定の実施形態では、アダプタは、鎖解離ＤＮＡポリメラーゼの結合部位およびプライミング部位を含有するＤＮＡにライゲーションされ得るか、またはそれを含み得る。
【０１７３】
キット内の酵素またはアダプタは、抽出媒体に予め結合しておくことができる。
【０１７４】
隠れたまたは露出した部位は、ポリヌクレオチドの分離後、１つ以上のシーケンスアダプタに結合するか、または別の方法で、ポリヌクレオチド（複数可）を特徴付ける方法またはポリヌクレオチド（複数可）を必要とする任意の他の方法で使用するために修飾することができる。キットには、１つ以上のシーケンスアダプタが含まれる。適切なシーケンスアダプタは当技術分野で知られており、他のものは本明細書に記載されている。末端シグナルを含むアダプタは、シーケンスアダプタであり得る。
【０１７５】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【０１７６】
実施例１
この実施例は、ポリヌクレオチドが、ＤＮＡトランスロカーゼを使用してその長さに基づいて選択され得ることを実証する。使用される方法は、図１に概要が示されている実施形態に対応している。
【０１７７】
材料および方法
サイズ選択アダプタの調製
サイズ選択アダプタは、１分あたり９５℃〜２２℃、２℃で、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ８、１００ｍＭの酢酸カリウム中、各々４．７２μＭ、５．６６μＭおよび５．６６μＭで一緒にアニールされた、トップ鎖（配列番号１）、ボトム鎖（配列番号２）、およびブロッカー鎖（配列番号３）を含む。４０μＬのアニールしたＤＮＡを、Ｓｔｒｅｐ−ＳＵＭＯタグ（以下の配列番号４）を含有する３６０μＬの４μＭのＤＮＡヘリカーゼ（Ｄｄａ）に添加した。ヘリカーゼをサイズ選択アダプタに室温で４５分間結合させ、５μＬの８．１ｍＭのジアミド（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を添加した。試料を３５℃で６０分間インキュベートした。５ＭのＮａＣｌ  ４０μＬおよびヌクレアーゼ不含水（Ａｍｂｉｏｎ（商標））１５μＬを試料に添加した。試料を室温で３０分間インキュベートした。試料をＨＱ１０カラムで精製し、遊離のアニール済みＤＮＡとヘリカーゼが結合したアニール済みＤＮＡを異なる画分に分離した。ヘリカーゼ結合ＤＮＡは、以下「サイズ選択アダプタ」と呼ばれる。
【０１７８】
ＤＮＡへのサイズ選択アダプタのライゲーション
１５０μＬの３５ｎＭのサイズ選択アダプタ、１５μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、６０μＬのライゲーション緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＡＴＰγＳ、３２％のＰＥＧ８０００）、および７１μＬのヌクレアーゼ不含水を有する３００μＬ中、３６０８ｎｇの末端修復およびｄＡ−末端化した３．６ｋｂのＤＮＡ（配列番号５）を、室温で６０分間ライゲーションした。これを、以下「ライゲーション混合物」と呼ぶ。
【０１７９】
サイズ選択アダプタに連結されたＤＮＡのビーズへの結合
５０μＬのＭａｇＳｔｒｅｐ「タイプ３」ビーズ（ＩＢＡ）を、１５０μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０＠４℃）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡで２回洗浄した。ビーズを１５０μＬの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０＠４℃、２０ｍＭのＮａＣｌ中に再懸濁し、ライゲーション混合物に添加した。
【０１８０】
ビーズを磁性ラック上でペレット化した。上澄みを除去した。ビーズを、１５０μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０＠４℃）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡで２回洗浄した。ビーズを１５０μＬの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０＠４℃、２０ｍＭのＮａＣｌに再懸濁した。
【０１８１】
ヘリカーゼの移動
試料を１２個の１０μＬ画分に分割した。ビーズをペレット化し、緩衝液を除去した。５μＬのＡＴＰ緩衝液（１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＡＴＰ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０）中にビーズを再懸濁することにより、ヘリカーゼの移動を開始するために燃料を添加した。試料を放置して、ＡＴＰ緩衝液と共に１５、３０、６０、７５、９０、１２０、３００、６００、９００、１８００、または３６００秒間インキュベートした。定義された期間の終わりに、ビーズをペレット化し、試料に５μＬの０．５ＭのＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡ）を添加することによりヘリカーゼの移動を停止し、完全に混合した。ビーズをペレット化し、１０μＬの上清を別のチューブに移した。ＡＴＰ緩衝液が試料に添加されていない０秒の試料を作成し、代わりに、１０の０．５ＭのＥＤＴＡを添加した。
【０１８２】
３．６ｋｂのＤＮＡがビーズから放出された時点の特定
２μＬの紫色のローディング色素（ＮＥＢ）を上清に加え、完全に混合した。これは、「ビーズから溶出した」試料と呼ばれる。
【０１８３】
ビーズのペレットを１０μＬのＩＢＡ  ＸＴビオチン溶出緩衝液に再懸濁した。次に、２μＬの紫色のローディング色素（ＮＥＢ）を懸濁液に加え、完全に混合した。この試料は「ビーズに残った」試料と呼ばれる。
【０１８４】
試料を４〜２０％のＴＢＥゲルに１８０Ｖで９０分間負荷した。ＳＹＢＲゴールド核酸ゲル染色（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色し、ＵＶゲルｄｏｃ  ｉｔ（ＧｅｌＤｏｃ−Ｉｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｕｓｔｅｍｓ（ＵＶＰ））で画像化した。
【０１８５】
結果
結果は、３．６ｋｂの分析物が３１〜６０秒の定義された期間の後にビーズから放出されることを示している。これは、ヘリカーゼがこの温度でこれらの緩衝液条件で毎秒６０〜１１６塩基対の速度でＤＮＡに沿って移動していることを示している。ヘリカーゼが鎖の端に到達すると、鎖はビーズから放出される。この実施例は、この方法を使用して、所望のサイズのＤＮＡを、他のサイズのＤＮＡから独立してまたは優先的に分離および／または特徴付けできることを示している。ヘリカーゼは、異なる時間の後に異なるサイズの断片の末端に到達し、これらの画分を別々に収集して、異なる長さのＤＮＡを収集することができる。ヘリカーゼは、ＡＴＰ濃度を低くしたり、高くしたりすることで、速度を落としたり、速度を上げたりして、より高度な分離を可能にしたり、非常に長い鎖の分離を高速化したりできる。
【０１８６】
３．６ｋｂの一部は６０秒後にビーズから放出されないが、これは、ヘリカーゼが鎖上である種のＤＮＡ損傷を受け、一時停止したことを示す可能性がある。これは、この方法が損傷を受けていないＤＮＡから損傷を受けたＤＮＡの分離に使用できることを示している。
【０１８７】
実施例２
この実施例は、特徴付けのためのポリヌクレオチドを選択するためにタグ付きＤＮＡトランスロカーゼを使用してポリヌクレオチドの長さを選択的に特徴付けるための方法を説明する。使用される方法は、図１に概要が示されている実施形態に対応している。
【０１８８】
材料および方法
サイズ選択アダプタの調製
サイズ選択アダプタは、１分あたり９５℃〜２２℃、２℃で、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ８、１００ｍＭの酢酸カリウム、１  ｍＭのＥＤＴＡ中、各々４．７２μＭ、５．６６μＭおよび５．６６μＭで一緒にアニールされた、トップ鎖（配列番号１）、ボトム鎖（配列番号２）、およびブロッカー鎖（配列番号６）を含む。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１００ｍＭの酢酸カリウム中の、Ｓｔｒｅｐ−ＳＵＭＯタグ（以下のＩＤ４）を含有する４μＭのＤＮＡヘリカーゼ（Ｄｄａ）、３６０μＬ。１ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液を４０μＬのアニーリングしたＤＮＡに添加した。ヘリカーゼをサイズ選択アダプタに室温で４５分間結合させ、５μＬの８．１ｍＭのジアミド（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を添加した。試料を３５℃で６０分間インキュベートした。５ＭのＮａＣｌ  ４０μＬとヌクレアーゼ不含水１５μＬを添加し、試料を室温で３０分間放置した。試料はＨＱ１０カラムで精製した。ヘリカーゼに結合したアニールされたＤＮＡは、非結合ＤＮＡから分離された。ヘリカーゼ結合ＤＮＡは、「サイズ選択アダプタ」と呼ばれる。
【０１８９】
異なるサイズのラムダライブラリの調製
製造元のガイドラインに従って、ＮＥＢ  ＤＮＡ断片分解酵素を使用して、１ｋｂ未満のライブラリを調製した。製造元のガイドラインに従って、約６ｋｂ、約１０ｋｂ、および約２０ｋｂのライブラリをＣｏｖａｒｉｓ  Ｇ−チューブを使用して別々に調製した。断片化されていないラムダＤＮＡを使用して、約４８．５ｋｂのライブラリを調製した。簡単に言えば、ＮＥＢ（Ｎ３０１３）からのラムダゲノムＤＮＡを、ヌクレアーゼ不含水で、製造元が指定した濃度に希釈した。ＤＮＡを６５℃に５分間加熱した後、氷上に置いた。ＤＮＡは、製造元のガイドラインに従って処理され、以前に指定された中央値を有する長さのライブラリが作成された。次に、製造元のガイドラインに従って、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ末端修復およびｄＡテーリングキット（Ｅ７５４６）を使用して、ＤＮＡを末端修復およびｄＡ末端化した。製造元のガイドラインに従ってＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩビーズを使用して、試料を洗浄した。ライブラリはＴＥ緩衝液で溶出され、４℃で保存された。
【０１９０】
混合ライブラリの調製
１３８ｎｇの１ｋｂ未満ライブラリ、１６４９ｎｇの６ｋｂライブラリ、２７６２ｎｇの１０ｋｂライブラリ、５５６５ｎｇの２０ｋｂライブラリ、および１４００１ｎｇの４８．５ｋｂライブラリを共に混合した。これは「混合ＤＮＡライブラリ」と呼ばれる。
【０１９１】
ビーズへのアダプタの結合
１３０μＬのＩＢＡタイプ３ビーズを２００μＬの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０＠４℃）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡで２回洗浄した。サイズ選択アダプタを４℃で一晩ビーズに結合させた。ビーズを、３００μＬの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０＠４℃）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡで２回洗浄した。ビーズを磁石上でペレット化した。
【０１９２】
アダプタを介する混合ライブラリのビーズへの結合
緩衝液を５５  μＬの３００ｎｇ／μＬ混合ＤＮＡライブラリと交換した。１０μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）および２０μＬのライゲーション緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＡＴＰγＳ、３２％のＰＥＧ８０００）を加え、その後４℃で一晩インキュベートした。
【０１９３】
ヘリカーゼの移動
試料を５つの２０μＬの容量に分割した。ビーズを磁石に結合させ、１２０μＬの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０＠４℃）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡで洗浄した。ビーズを２５μＬの２５ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、５００ｍＭのＫＣｌに再懸濁した。４つの試料に２５μＬの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０＠４℃）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＡＴＰおよび２ｍＭのＭｇＣｌ  ２を加えた。試料を、２０、４０、１２０、または２４０秒間放置した。２５μＬの０．５ＭのＥＤＴＡは、定義された期間の後に添加された。ビーズをペレット化し、１２０μＬの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０＠４℃）、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡで洗浄した。ビーズをペレット化し、１２０μＬの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０＠４℃）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡで２回洗浄した。
【０１９４】
シーケンスアダプタの付加
ビーズを２０μＬの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０＠４℃）、２０ｍＭのＮａＣｌに再懸濁した。Ｏｘｆｏｒｄ  ＮａｎｏｐｏｒｅシーケンスキットＥＸＰ−ＮＢＤ１０３からの１０μＬのバーコードアダプタミックス（ＢＡＭ）および３０μＬのＢｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスターミックス（ＮＥＢ）を加え、試料を室温で１０分間インキュベートした。
【０１９５】
ビーズからの残存ＤＮＡの除去
ビーズから残存するＤＮＡを除去するために、Ｏｘｆｏｒｄ  ＮａｎｏｐｏｒｅシーケンスキットＳＱＫ−ＬＳＫ１０８からの６０μＬのＲＢＦ（燃料混合液を含むランニング緩衝液）を添加し、試料を室温で５分間インキュベートすることにより、ヘリカーゼを再活性化した。これにより、ビーズに結合したヘリカーゼが、それが結合していたＤＮＡの端から流れ出て、ＤＮＡを放出することができた。
【０１９６】
シーケンス
ＤＮＳを浄化するために、６０μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩビーズを加え、試料を室温で１０分間インキュベートした。試料は、Ｏｘｆｏｒｄ  ＮａｎｏｐｏｒｅシーケンスキットＳＱＫ−ＬＳＫ１０８からのＡＢＢ１２０μＬで２回洗浄した。２１．５μＬの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０＠４℃）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ中で試料を１０分間溶出した。Ｏｘｆｏｒｄ  ＮａｎｏｐｏｒｅシーケンスキットＳＱＫ−ＬＳＫ１０８からの１６μＬの溶出緩衝液（ＥＬＢ）を添加し、続いてＯｘｆｏｒｄ  ＮａｎｏｐｏｒｅシーケンスキットＳＱＫ−ＬＳＫ１０８からの３７．５μＬのＲＢＦを添加した。次に、ＳｐｏｔＯｎフローセルポートを使用して、このシーケンスミックスの７５μＬをＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｍｉｎｉｏｎに添加した。実験は−１８０  ｍＶで行い、ヘリカーゼ制御のＤＮＡ移動を監視した。
【０１９７】
結果
図９Ａに示される結果は、試料がＡＴＰと２４０秒間インキュベートされると、持続時間が５秒未満の鎖が枯渇することを示している。図９Ｂの結果は、ＡＴＰでのインキュベーションが長くなると、より短い鎖がより多く枯渇する一方で、より長い鎖は枯渇しないことを示している。
【０１９８】
表１は、初期対照試料（０秒のインキュベーション）と、１２０秒および２４０秒のヘリカーゼインキュベーションから調製されたライブラリについて、３０００キロ塩基未満、３０００〜８０００キロ塩基、および８０００キロ塩基超のカテゴリーに分類された鎖のパーセンテージを示している。データは、１２０秒および２４０秒のインキュベーション時間から調製されたライブラリについて、３０００ｋｂ未満の範囲の鎖における減少、および３０００〜８０００および８０００超の範囲の鎖における増加を示している。
【表１】
2021509284.tif 000002
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021509284.tif 000009
【図８】
2021509284.tif 000010
【図９】
2021509284.tif 000011
【配列表】
2021509284000001.app
【国際調査報告】
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