(57)【要約】  本発明は、ＧＭ３ガングリオシドの異なる合成バリアントによって形成されたナノ粒子アジュバントをどのようにして得るかを記載する。合成ＧＭ３のセラミド中の脂肪酸の細かい構造に応じて、付随する抗原に対する液性または細胞性免疫応答を特異的に特化して刺激するためのアジュバントを得ることが可能になる。特に、本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、および、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜複合体（ＯＭＣ）の疎水性タンパク質をＧＭ３ガングリオシドの完全合成バリアントを含有する溶液中に分散させることによって形成される上述のナノ粒子を含む免疫原性ワクチン組成物を提供する。
2021501792.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＭ３ガングリオシドの完全合成バリアントと、細菌Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜複合体の疎水性タンパク質との会合によって形成されたナノ粒子を含むアジュバント。
【請求項２】
ＧＭ３ガングリオシドのセラミド中の脂肪酸が、ステアリン酸（１８：０）である、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項３】
ＧＭ３ガングリオシドのセラミド中の脂肪酸が、オレイン酸（１８：１）である、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノ粒子アジュバントの１つ、および抗原としてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含むワクチン組成物。
【請求項５】
アラム、および
油性アジュバント
を含む群から選択される別のアジュバントを含んでもよい、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
抗原が、増殖因子受容体の細胞外ドメインまたはその一部である、請求項４〜５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
増殖因子受容体が、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３単独またはこれらの組合せである、請求項４〜６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
抗原が、ＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴペプチドである、請求項４〜６に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
がんを処置するための医薬を製造するための、請求項４〜８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
腫瘍形成ウイルスによる慢性ウイルス感染症を治療するための医薬を製造するための、請求項４〜８に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
抗原特異的液性免疫応答を刺激するための、請求項２に記載のアジュバントの使用。
【請求項１２】
抗原特異的細胞性免疫応答を刺激するための、請求項３に記載のアジュバントの使用。
【請求項１３】
患者における抗原特異的液性免疫応答および細胞性免疫応答を最適化するための、請求項２および３に記載のアジュバントの組合せの使用。
【請求項１４】
それを必要とする対象を治療するための方法であって、請求項４〜８に記載のワクチン組成物を、１５日毎に少なくとも合計５回の誘導用量、その後、毎月の維持用量を少なくとも６カ月にわたり、ＳＣ経路、皮内経路、筋肉内経路、結節内経路、腫瘍内経路によって、または粘膜への直接適用によって投与することを含む、方法。
【請求項１５】
前記ワクチン組成物が、同時に、時差的にまたは交互に投与される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫ナノテクノロジーおよびがん免疫療法の分野、特に、腫瘍形成ウイルスによって引き起こされるがんおよび／または慢性感染症を有する個体を治療するための治療用ワクチンに関する。具体的には、本発明は、これらの患者における細胞性または液性免疫エフェクターを特異的に刺激することに特化したナノ粒子アジュバントを記載し、対応するワクチン組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
数十年にわたって臨床試験の結果が失敗に終わり、治療用がんワクチンは患者の利益になる有効かつ低毒性の治療になることができなかった。免疫チェックポイント阻害剤抗体（Ａｂ）を用いて得られた最近の臨床的成功により、がんワクチンを含めたがん免疫療法への商業的関心および科学的関心が刺激された。これらの治療用ワクチンの失敗は、抗原の間違った選択、比較的非効率的なビヒクル／アジュバントの使用、および前記ワクチンの単独療法の使用、すなわち、腫瘍微小環境によって発揮された負の影響の補正を可能にする他の免疫調節剤と組み合わせない使用などの因子に起因している可能性がある（Branca MA et al (2016) Nat Biotech 34(10): 1019-24）。
【０００３】
伝統的に、がんワクチンは、腫瘍細胞において異常に発現されるが正常組織にも存在する自己会合腫瘍抗原に分類される製剤タンパク質として使用されてきた。これらのワクチンの診療所における効果に関する信頼できるエビデンスの欠如は、これらの抗原の大部分に対して高い結合活性を有する受容体を有するＴ細胞の排除による中心寛容プロセスが起こることに一部起因し得る（Tran E. et al (2017) Nat Immunol 18 (3): 255-62）。したがって、この型の抗原に基づくがんワクチンの成功は、最初は比較的弱いがその後腫瘍が天然のネオ抗原の供給源になるように増大するエフェクターＴ細胞の特異的応答を強化することができる新規の特化アジュバントの使用に依存する。これにより、悪性病変を根絶させることができる細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の強力な多重特異性かつ個別化された作用を動員することが可能になる。
【０００４】
最近、最先端では、腫瘍ネオ抗原の導入を伴う上首尾のがんワクチンのための抗原の選択に関する展望の変化が反映されている。これらのネオ抗原の魅力的な供給源は、個々の腫瘍突然変異の個別化された検出である。この型の抗原の別のより限定された供給源は、ウイルス性腫瘍形成タンパク質の配列によってもたらされる。これらの突然変異したペプチドには、免疫系に対して新しいものであり（正常組織内には存在しない）、したがって免疫原性がより大きいという利点があるが、これらのネオ抗原を用いて設計された新しいワクチンの成功はまた、ＣＴＬ応答を最大にする新規アジュバントの能力にも依存し、抗原が上首尾の成熟化の状況で抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示されることを可能にし、さらに、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の免疫抑制効果を回避する局所持続性を通じた抗原の最適な利用可能性が求められる。他方では、真のネオエピトープの同定は、実際には効果のない手順である。配列決定試験により、個々の腫瘍における何千もの体細胞突然変異が同定され、バイオインフォマティクスプログラムにより、特異的なＭＨＣに結合することができる突然変異したペプチドが数百予測されるが、これらのネオエピトープの大部分は、実際の腫瘍においては、腫瘍を単離し、質量分析によって試験した際に見いだされず、さらに悪いことに、ＣＴＬ応答を刺激することができるものはほんのわずかしかない。これは、ネオエピトープを予測および検証する現行の方法体系が、診療に個別化された免疫療法をもたらすために常套的に使用されることからかけ離れていることを意味する（Editorial, (2017) Nat Biotech 35 (2): 97）。
【０００５】
全ての型のワクチンに関して、適正なアジュバントの選択は所望の成功を実現するための重大な要素である。治療用がんワクチンの主目的は、Ｂリンパ球、Ｔ細胞および自然免疫のメディエーターの活性化および増殖を、誘導された液性および細胞性免疫エフェクターが腫瘍細胞を認識し、破壊することができるように刺激し、したがって、患者の生存および生活の質を増大させることである。この目的を実現するために、理想的なアジュバントは、第１に、ＡＰＣの抗原の利用可能性が最適化されていなければならない。第２に、理想的なアジュバントは、これらのＡＰＣを、必要な共刺激シグナルを発現し、特定のサイトカインおよびケモカインを分泌するように有効に刺激するものでなければならない。第３に、理想的なアジュバントは、ＴＭＥを、免疫抑制効果が中和されるようにモジュレートするものでなければならない。現在、これらの特性の全てを有するアジュバントは利用不可能である。
【０００６】
Ｋｈｏｎｇ  Ｈ．ら（Khong H. et al (2016) J. Immunother. Cancer 4: 56）により説明された通り、当技術分野におけるがんワクチンのためのアジュバントの最も有望なバリアントとしては、マイクロ粒子およびナノ粒子が挙げられ、これは、これらがワクチン接種増強物質としての所望の性質をいくつか示すからである。これらの粒子調製物は、粒子サイズ、剛性および正味の電荷を調節することにより、付随する抗原が特異的ＡＰＣを有効に標的とすることができるように設計することができる。直径が５００〜２０００ｎｍの範囲の粒子ワクチンは注射部位においてＡＰＣによって優先的に捕捉され、リンパ節（ＬＮ）に移動するが、一方、２０〜２００ｎｍの粒子は、ＬＮに受動的に流出され、そこで内在するＡＰＣによって捕捉される。これらの目的のために最も使用されるマイクロ粒子およびナノ粒子は、リポソーム、プロテオリポソーム、合成ポリマーおよび天然ポリマーである。これらのナノ粒子のそれぞれの利点および限界は、当技術分野において詳細に記載されている。
【０００７】
本発明に特に関係するのは、Ｘｕ  Ｆ．ら（Xu F. et al (2016) ACS Nano Vol. 10: 1189-1200）による、組成物中にＧＭ３ガングリオシドを含有する合成ナノ粒子アジュバントに関する記載である。このアジュバントは、直径４０〜８０ｎｍの金ナノ粒子を、ＧＭ３ガングリオシドが挿入された脂質膜でコーティングすることによって得られた。このように、糖脂質−受容体特異的相互作用、特にシアリル−ラクトースと、ＬＮにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞とのシナプスのプロタゴニストである活性化された樹状細胞（ＤＣ）において過剰発現されるＳｉｇｌｅｃ１（ＣＤ１６９）との相互作用の原理に有利に対処することができる。ＧＭ３でコーティングされたこれらのナノ粒子はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて膝窩ＬＮのＣＤ１６９+ＤＣに選択的に蓄積されるが、それらのアジュバントとしての潜在性または腫瘍モデルにおけるそれらの有効性に関する参照抗原を用いた免疫実験によるエビデンスは存在しない。他方では、この原理は、直径が４０〜８０ｎｍにわたるナノ粒子においてのみ機能的である。
【０００８】
Ｍｏｌｉｎａらは、米国特許第７，７７６，３４６号において、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ細菌の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）とガングリオシドＧＭ３との疎水性コンジュゲーションによって形成される非常に小さなサイズのプロテオリポソーム（ＶＳＳＰ）を、ある特定の免疫原性が低い抗原と会合させることによる有効な免疫原の調製のやり方を記載しており、これは、本発明と最も近い技術的解決とみなすことができる。また、これらのＶＳＳＰを得るやり方は、ＵＳ６，１４９，９２１においてＲｏｄｒｉｇｕｅｚらによっていくらか詳細に記載されており、これらのプロテオリポソームを得るために使用されるＧＭ３ガングリオシドが、生物学的供給源から、主にモノクローナルＡｂの工業生産に由来するハイブリドーマの集団から得られなければならないことが強調される。Ｅｓｔｅｖｅｚら（Estevez et al (2000) Vaccine Vol. 18: 90-197）は、これらのＶＳＳＰを、イヌ科動物の赤血球から得られたＧＭ３を使用して作製することもできることを教示している。Ｌｅｅ  Ｈら（Lee H et al (2011) Int J Mass Spectr Vol 305: 138-150）によって説明されている通り、あらゆる天然の供給源から得られたＧＭ３ガングリオシドは、異なる分子種の変動する混合物で構成され、オリゴ糖の構造は同じであるが、セラミドの構造が脂肪酸組成に関して変動することが当技術分野で公知である。医薬調製物を作製するために動物または腫瘍起源の成分を使用することの不自由は別として、生物学的起源のＧＭ３の使用では、必要とされる高度に再現性のある特性を有するＶＳＳＰを得ることが主に妨げられる。
【０００９】
化学的に定義された構造を有する異なる完全合成ＧＭ３を使用した製造プロセスによって得られるＶＳＳＰバリアントが記載されている技術的解決または科学的刊行物は以前には存在しないことが本発明を記載する前に確証されるべきである。これらの合成バリアントはまた、調製に使用されるＧＭ３ガングリオシドの分子の細かい構造に応じて治療用ワクチンに対する特化アジュバントとして機能するという驚くべき性質も有し、この特化により、生物学的供給源由来のＧＭ３を用いて作製されたＶＳＳＰと比較して有利な性質を有する新しいアジュバントがもたらされる。したがって、発明の新規性は、基本的に、主に付随する抗原に対する強力な抗体応答を誘導するためのステアリン酸、ＧＭ３（１８：０）、または特異的ＣＴＬエフェクター応答の誘導において特に有効であるオレイン酸、ＧＭ３（１８：１）のいずれかを含有するセラミドを有するＧＭ３の構造であるがこれに制限されない、完全合成ＧＭ３ガングリオシドを含有する新しいＶＳＳＰナノ粒子アジュバントを提供することにある。
【発明の概要】
【００１０】
本発明のある実施形態では、基本的にＧＭ３ガングリオシドのセラミド中にステアリン酸またはオレイン酸を有する組成であるがこれに制限されないＧＭ３ガングリオシドの完全合成バリアントと、細菌Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜複合体の疎水性タンパク質との会合によって形成されたナノ粒子を含むアジュバントを記載する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、上述のナノ粒子アジュバントを含み、アラムまたは油性アジュバントであってよいがこれらに限定されない別のアジュバントを含んでもよいペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質ワクチン組成物に関する。特に、これらのワクチン組成物中の抗原は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３などの増殖因子受容体の細胞外ドメインもしくはその一部単独もしくはこれらの組合せ；またはＧｎＲＨホルモンに関連するペプチドＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴである。前記ワクチン組成物をがんまたは腫瘍形成ウイルスによる慢性ウイルス感染症を処置するための医薬の製造に使用することができる。
特定の実施形態では、本発明は、患者の抗原特異的液性または細胞性免疫応答の刺激における、本発明の目的のナノ粒子アジュバントを単独でまたは組合せで含むワクチン組成物の使用に関する。
さらに、そのような治療を必要とする対象に、本発明のワクチン組成物を、少なくとも合計５回の誘導用量の間は２週間に１回の頻度で、その後、毎月の維持用量を少なくとも６カ月にわたり、皮下（ＳＣ）、皮内、筋肉内、結節内、腫瘍内に、または粘膜への直接適用によって投与する治療方法も本発明の目的である。前記組成物は、同時に、時差的にまたは交互に投与することもできる。
【００１２】
ワクチン組成物
本発明において使用されるワクチン組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＯＭＰＣ由来の疎水性タンパク質をＧＭ３ガングリオシドの完全合成バリアントの溶液中に分散させることによって形成されたナノ粒子アジュバントを、抗原としてのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と会合させることによって形成される。特に、これらのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、増殖因子受容体の完全細胞外ドメインまたはその一部であり得、ある特定のステージにおける腫瘍増悪に関連するホルモン、例えば、これだけに限定されないがＧｎＲＨなどにも関連する。
【００１３】
本発明のＶＳＳＰのうちの１つに含まれるＧＭ３ガングリオシドのセラミド中に存在する脂肪酸の型は、ワクチンの目的に依存する；所望の効果がＡｂ応答を有利にすることである場合にはステアリン酸（ＧＭ３  １８：０）が使用され、一方、所望の効果がＣＴＬ応答を有利にすることである場合にはオレイン酸（ＧＭ３  １８：１）が使用される。両方のワクチン製剤を用いた免疫を適切に組み合わせることによって宿主において同じ抗原に対してＡｂとＣＴＬの二重応答を誘導することも可能である。ＧＭ３（１８：０）を含有するＶＳＳＰおよびＧＭ３（１８：１）を有するＶＳＳＰはどちらも、単独で使用することもでき、これだけに限定されないが、アラムまたは油性製剤などの他のアジュバントと組み合わせることもできる。
【００１４】
ＧＭ３（１８：０）を有するＶＳＳＰをアジュバントとして使用する本発明のワクチン組成物は、天然の供給源から得られたガングリオシドを含有するナノ粒子をアジュバントとするワクチン製剤と比較して、誘導される体液性応答、腫瘍細胞株の血清学的認識、腫瘍細胞における受容体の活性化の血清学的阻害ならびにこれらの細胞の生存率の低下に関して優れた質を有する。
ＧＭ３（１８：１）を有するＶＳＳＰをアジュバントとして使用する本発明のワクチン組成物は、天然の供給源から得られたガングリオシドを含有するナノ粒子をアジュバントとするワクチン製剤と比較して、より強力なＣＴＬ応答を誘導する。
【００１５】
治療への適用および治療方法
本発明は、増殖因子受容体のファミリーに対するＡｂまたはＣＴＬ応答の誘導に特化したワクチン組成物を提供し、これは、がん免疫療法におけるこの目的の抗原系のために特に有用な解法を構成するものであり、その理由は、Ａｂ応答と特異的なＣＴＬ応答はどちらも有効であるが、単一のワクチン製剤中に、および単一の投与スキームを用いて最適化するのが難しいことが公知であるからである。
ある特定のステージにおける腫瘍増悪に関連するホルモン、具体的には、これだけに限定されないが、ＧｎＲＨホルモンに対する高力価の中和Ａｂの生成に特化したワクチン製剤を導入することも本発明の目的である。
本発明の別の目的は、特にがんまたは腫瘍形成ウイルスによる慢性ウイルス感染症に罹患している免疫無防備状態の患者においてＡｂまたはＣＴＬの強力な特異的応答を生じさせることができる治療用ワクチン組成物を提供することである。
本発明のワクチン組成物は、患者に、ＳＣ経路、皮内経路、筋肉内経路、結節内経路、腫瘍内経路によって、または粘膜に直接適用することによって投与することができる。
【００１６】
本発明の目的のワクチン組成物を用いて治療することができるがんの型は、上皮起源の癌腫である。より詳細には、これらのがんの例として、肺がん（小細胞型および非小細胞型）、肝細胞がん、胃がん、膵がん、頭頸部がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、唾液腺癌、腎がん、外陰部および甲状腺腫瘍、肛門癌ならびに陰茎癌が挙げられる。
本発明のワクチン組成物中の増殖因子受容体の細胞外ドメインまたはその一部のヒトに使用される用量の範囲は、２００μｇ〜１ｍｇ、好ましくは４００μｇ〜９００μｇの範囲内である。本発明のワクチン組成物中に使用されるＧｎＲＨペプチド用量の範囲は、（ＯＭＰＣ含有量に応じて）５００μｇ〜３ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜２．５ｍｇの範囲内である。ＶＳＳＰは、１００μｇ〜１ｍｇ、好ましくは２００μｇ〜６００μｇの範囲で投与される。
前記組成物を、対象に、少なくとも合計５回の誘導用量の間は２週間に１回の頻度で投与し、その後、毎月の維持用量を少なくとも６カ月にわたり投与する。所望の効果が宿主において同じ抗原に対してＡｂとＣＴＬの二重応答を誘導することである場合、免疫化は、両方のワクチン製剤を同時に、またはその代わりに時差で組み合わせることができる。
【００１７】
ナノ粒子アジュバントＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）を得ること
まず、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＯＭＰＣを、反応器中、デオキシコール酸ナトリウム（１０〜４０ｍＭ）とドデシル硫酸ナトリウム（１〜１０ｍＭ）の混合物を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に分散させ、１〜３６時間にわたって撹拌する。次に、ＯＭＰＣの添加質量の０．１〜３倍の質量の合成ガングリオシド（ＧＭ３  １８：０）を添加し、撹拌を持続させる。その後、界面活性剤を限外濾過または透析によって除去する。限外濾過した残余溶液を濃縮して、ＯＭＰＣの濃度を０．１〜１ｍｇ／ｍｌである所望の投与量に調整し、孔径０．２μｍの滅菌カプセル中で濾過することによって滅菌する。
ナノ粒子アジュバントＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）を得ること
まず、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＯＭＰＣを、反応器中、デオキシコール酸ナトリウム（１０〜４０ｍＭ）とドデシル硫酸ナトリウム（１〜１０ｍＭ）の混合物を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に分散させ、１〜３６時間にわたって撹拌する。次に、ＯＭＰＣの添加質量の０．１〜３倍の質量の合成ガングリオシド（ＧＭ３  １８：１）を添加し、撹拌を持続させる。その後、界面活性剤を限外濾過または透析によって除去する。限外濾過した残余溶液を濃縮して、ＯＭＰＣの濃度を０．１〜１ｍｇ／ｍｌである所望の投与量に調整し、孔径０．２μｍの滅菌カプセル中で濾過することによって滅菌する。
【００１８】
ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）をアジュバントとして伴うＨＥＲ１、ＨＥＲ１＋ＨＥＲ２およびＨＥＲ３ワクチン組成物の調製
強力な特異的液性免疫応答を誘導するための、ＨＥＲ１またはＨＥＲ１＋ＨＥＲ２またはＨＥＲ３を増殖因子受容体として含有し、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）をアジュバントとして含有する本発明において好ましいワクチン組成物を以下の通り調製する：溶液中のまたはフリーズドライされたＨＥＲ１またはＨＥＲ１＋ＨＥＲ２またはＨＥＲ３抗原、および予め４〜２０℃で保管しておいたＶＳＳＰ  ＧＭ３  １８：０溶液の個々のバイアルの内容物を、抗原の質量とＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）の質量（ＯＭＰＣ含有量に応じる）の最終的な割合が３００μｇ〜２ｍｇの範囲内に入るように、患者のベッドの隣で別々に１０〜３０分にわたって混合した後、注射する。
【００１９】
ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）をアジュバントとして伴うＨＥＲ１、ＨＥＲ１＋ＨＥＲ２およびＨＥＲ３ワクチン組成物の調製
強力な特異的細胞性免疫応答を誘導するための、ＨＥＲ１またはＨＥＲ１＋ＨＥＲ２またはＨＥＲ３を増殖因子受容体として含有し、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）をアジュバントとして含有する本発明の好ましいワクチン組成物を以下の通り調製する：溶液中のまたは凍結乾燥されたＨＥＲ１、ＨＥＲ１＋ＨＥＲ２またはＨＥＲ３抗原、および４〜２０℃の温度範囲で保管していたＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）溶液の個々のバイアルの内容物を、抗原の質量とＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）の質量（ＯＭＰＣ含有量に応じる）の最終的な割合が３００μｇ〜２ｍｇの範囲内に入るように、患者のベッドサイドの隣で別々に１０〜３０分にわたって混合した後、注射する。
【００２０】
ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）をアジュバントとして伴うＧｎＲＨｍ１−ＴＴペプチドワクチン組成物の調製
ＧｎＲＨｍ１−ＴＴペプチドを、生合成プロセスにおいて、通常は天然のＧｎＲＨ（ＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧ）の配列が占めている第６位のアミノ酸Ｌ−グリシンをＬ−プロリンによって置換すること（ＥＨＷＳＹＰＬＲＰＧ）によって調製した。構築を完了させるために、破傷風トキソイドのＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬエピトープ（Junco JA et al (2007) Vaccine 25: 8460-68）を合成のプロセス中に添加し、その後、固相法を行った（Hougten et al., (1986) Biotechniques 4: 522-6）；本発明の目的のためにしたがって調製されたペプチドは、以下ＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴと称される。
【００２１】
強力な特異的液性免疫応答を誘導するための、ＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴおよびアジュバントとしてＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）を含有する本発明において好ましいワクチン組成物は以下の通り調製することができる：ＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴ溶液中のまたは凍結乾燥された抗原、および予め４〜２０℃の温度範囲で保管しておいたＶＳＳＰ  １８：０の個々のバイアルの内容物を、抗原の質量とＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）の質量（ＯＭＰＣ含有量に応じる）の最終的な割合が６００μｇ〜４ｍｇの範囲内に入るように、患者のベッドサイドで別々に１０〜３０分にわたって混合した後、注射する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】フローサイトメトリーによって測定した、ＭＣＡ２０３腫瘍を有し、異なるＧＭ３分子種を含有するＶＳＳＰナノ粒子を用いて処置したマウスの脾臓におけるＣＤ１１ｂ+ＧＲ１+細胞の蓄積を示すグラフである。
【図２】ＯＶＡ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）、ＯＶＡ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）およびＯＶＡ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）を用いて免疫化したマウスにおいて誘導されたｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原特異的ＣＴＬ応答のフローサイトメトリーによる測定を示すグラフである。
【図３】異なるＧＭ３分子種を含有するアジュバントとしてＶＳＳＰナノ粒子を使用したＯＶワクチンを用いて処置したＥＧ７モデルにおける抗腫瘍効果を示す図である。グラフは、実験の２０日目の各群の腫瘍体積の個々の値およびその平均を示す。点線は、それを下回ると腫瘍が増悪していないと分類される値を表す。右側には、各群における処置により腫瘍増悪を有さなかった動物の頻度が示されている。
【図４】ＥＬＩＳＡによって測定される、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）をアジュバントとするＨＥＲ３ワクチン調製物によって誘導されるＩｇＧ価を示すグラフである。
【図５ａ】ＥＬＩＳＡによって測定された、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）をアジュバントとするＨＥＲ１＋ＨＥＲ２二価ワクチン調製物によって誘導されるＨＥＲ１およびＨＥＲ２に対する特異的なＡｂの力価の、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）をアジュバントとするＨＥＲ１＋ＨＥＲ２二価ワクチン調製物との比較を示すグラフである。
【図５ｂ】ＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）をアジュバントとする二価ＨＥＲ１＋ＨＥＲ２ワクチン調製物によって誘導されるＤＥＣ−ＨＥＲ２サブドメインに対する特異的Ａｂの力価の、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）をアジュバントとする二価ＨＥＲ１＋ＨＥＲ２ワクチン調製物との、ＥＬＩＳＡによって測定された比較を示すグラフである。
【図６】フローサイトメトリーによって測定された、ＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）をアジュバントとする二価ワクチン調製物ＨＥＲ１＋ＨＥＲ２を用いて誘導されたＡｂによる腫瘍株ＨＥＲ１＋／ＨＥＲ２＋の認識の、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）をアジュバントとする二価ワクチン調製物ＨＥＲ１＋ＨＥＲ２との比較を示すグラフである。
【図７】ＭＴＴ比色定量アッセイによって測定された、ＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）をアジュバントとする二価ＨＥＲ１＋ＨＥＲ２ワクチン調製物によって誘導されるＡｂのＨ１２５  ＨＥＲ１＋／ＨＥＲ２＋腫瘍株の生存率に対する影響の、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）をアジュバントとする二価ＨＥＲ１＋ＨＥＲ２ワクチン調製物との比較を示すグラフである。
【図８】フローサイトメトリーによって測定された、ＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）をアジュバントとするＨＥＲ１ワクチン調製物を用いて誘導されたＡｂによる腫瘍株ＭＤＡ−ＭＢ４６８（ＨＥＲ１＋）の認識の、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）をアジュバントとするＨＥＲ１ワクチン調製物との比較を示すグラフである。
【図９】ウエスタンブロットによって測定された、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）またはＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）をアジュバントとするＨＥＲ１ワクチン調製物を用いて誘導されたＡｂによるＨＥＲ１活性化の阻害の比較を示す図である。
【図１０】ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）を伴う、および伴わないＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴペプチドを用いた免疫化の、コペンハーゲンラット前立腺の質量（ｗｅｉｇｈｔ）に対する影響を示すグラフである。
【図１１】Ｄｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７−Ｈ腫瘍株が埋め込まれたコペンハーゲンラットにおける腫瘍成長速度の評価を示すグラフである。
【実施例】
【００２３】
（実施例１）
ＭＣＡ２０３腫瘍を有するマウスにおいてＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）の投与により脾臓内のＣＤ１１ｂ+ＧＲ１+細胞の数は増加しない。
４群の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり３匹の動物）に、ＭＣＡ２０３の細胞１×１０6個を０日目にＳＣ経路によって接種した。その後、１１日目、１２日目および１８日目に、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）およびＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）（ＯＭＰＣ  ２００μｇ）を３群のマウスにＳＣ経路によって注射し、第４のマウス群は無処置の対照として残し、リン酸緩衝剤を投与した。２２日目に、動物を屠殺し、抽出した脾臓をフローサイトメトリーによって個別に分析して、ＣＤ１１ｂ+Ｇｒ１+細胞の数を決定した。ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）を用いて処置した動物（図１）では、緩衝剤のみを受けた腫瘍担持マウスと比較して、同様の数量のこれらの調節細胞が示された。他方では、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）を注射した動物およびＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）を注射した動物の脾臓ではＣＤ１１ｂ+Ｇｒ１+細胞が有意に増加した（等しい文字ｐ＞０．０５、異なる文字ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ検定）。
【００２４】
（実施例２）
ＯＶＡ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）を用いたワクチン接種によりＯＶＡ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）およびＯＶＡ／ＶＳ３  ＧＭ３（１８：０）と比較して３倍のＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的細胞傷害性が誘導される。
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＴＬ抗原特異的応答を、３つの異なるＯＶＡ抗原の製剤：アジュバントとしてＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）ナノ粒子を用いた製剤、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）を用いた他の製剤、およびＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）を使用した第３の製剤を用いて免疫化した雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり３匹の動物）において比較した。０日目、１日目および７日目にワクチンをＳＣ投与した（ＯＭＰＣ  ２００μｇ）。並行して、ＣＦＳＥを用いて示差的に標識された（３７℃で５分間）ナイーブな動物から脾細胞を得た。高度に標識された細胞（５μＭ）をＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドとのインキュベーション（１μＭ、３７℃および５％ＣＯ2で９０分間）後に標的細胞として使用し、一方、ペプチド負荷を伴わない低度に標識された細胞（０．３３μＭ）を対照として使用した。最後の免疫化後、洗浄を行って遊離のペプチドを除去し、両方の型の脾細胞を等しい割合で混合し、ワクチン接種した動物に注射した。１６時間後に、ワクチン接種したマウスの鼠径リンパ節を取り出し、２つの蛍光強度をフローサイトメトリーによって測定した。特異的溶解のパーセンテージを式：１００−［（ＣＦＳＥ高／ＣＦＳＥ低）×１００］に従って算出した。ＯＶＡ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）ワクチン（図２）では６０％の特異的溶解が誘導され、これは、ＯＶＡ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）ワクチンを用いて実現されたものおよびＯＶＡ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）ワクチンを用いて実現されたもののほぼ３倍の値である。
【００２５】
（実施例３）
アジュバントとしてＧＭ３（１８：１）を含有するＶＳＳＰのナノ粒子を治療用がんワクチンに使用することにより、天然の供給源から得られたＧＭ３を含むナノ粒子と比較して治療用ワクチンの抗腫瘍効果が改善される。
３群の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり１０匹の動物）に、ＥＧ．７腫瘍（ネオ抗原としてＯＶＡを発現するように遺伝子改変されたＥＬ４胸腺腫のバリアント）の細胞３×１０5個を０日目にＳＣ接種した。その後、４日目、５日目および１１日目に、２つの異なるＯＶＡのワクチン製剤：第１の製剤（２００μｇ／用量）はＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）をアジュバントとするものであり、第２の製剤はＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）をアジュバントとするものである（２００μｇ／用量）を用いてＳＣ経路による免疫化を３回連続して実施した。マウスの第３群にはリン酸緩衝剤を同じスキームで注射し、実験の対照として使用した。腫瘍を接種した７日後から腫瘍体積（ＴＶ）を週に２回測定した。腫瘍が壊死を示したら、または腫瘍サイズが直径１７ｍｍを超えたら、動物を屠殺した。実験の２０日目に（図３）、ＯＶＡ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）製剤に対するＯＶＡ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）治療用ワクチンの優位性が観察された（ＴＶ平均：ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）５６０ｍｍ3；天然７４０ｍｍ3；対照１６４０ｍｍ3）（ｐ＝０．０３７、ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ検査）。より重要なことに、ＥＧ７は侵攻性モデルであるにもかかわらず、ＯＶＡ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：１）調製物を用いて処置した群では動物の５０％で腫瘍増悪が示されないことが見いだされた（対照群では動物の１００％で増悪が観察された）。ＯＶＡ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）を用いてワクチン接種した動物では、２０％のみが増悪を示した（ｐ＝０．０１２、カイ二乗検定）。
【００２６】
（実施例４）
ＨＥＲ３／ＶＳＳＰ  ＧＭ３ワクチン調製物（１８：０）による高力価のＨＥＲ３特異的Ａｂの誘導。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、ＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）２００μｇと混合したＨＥＲ３  ＥＣＤ、２００μｇを含有するワクチン調製物を用いてＳＣにより免疫化した。０日目、１４日目、２８日目および４２日目に免疫化を行った。３５日目（第１の抽出）および５６日目（第２の抽出）に血液を抽出して血清を処理し、ＨＥＲ３  ＥＣＤに対する特異的なＡｂの力価をＥＬＩＳＡによって決定した。プレートを、１０μｇ／ｍＬのＨＥＲ３  ＥＣＤでコーティングし、３７℃でインキュベートした。ブロッキング後、血清希釈物（１／１００、１／１０００、１／５０００、１／１００００）を添加した。反応を、抗マウスＩｇＧ  Ａｂ／ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）および対応する基質を使用して可視化した。
免疫化したマウスでは特異的ＩｇＧが生じ、力価は１／５０００に至った（図４）。この結果から、自己腫瘍抗原などの非常に免疫原性が低い抗原に対する液性免疫応答を活性化するＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）の潜在性が実証される。
【００２７】
（実施例５）
ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）またはＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）のいずれかをアジュバントとする二価ＨＥＲ１＋ＨＥＲ２ワクチンによる特異的ＩｇＧの誘導の比較。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）２００μｇ（群１）またはＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）２００μｇ（群２）をアジュバントとするＨＥＲ１  ＥＣＤ、１００μｇとＨＥＲ２  ＥＣＤ、１００μｇの混合物を含有するワクチン調製物を用いて免疫化した。０日目、１４日目および２８日目にＳＣ経路によって免疫化を行った。血液の抽出および処理を３５日目に行った。ＨＥＲ１  ＥＣＤおよびＨＥＲ２  ＥＣＤに対する特異的なＡｂの力価をＥＬＩＳＡによって決定した。このために、プレートを５μｇ／ｍＬのＨＥＲ１  ＥＣＤまたは５μｇ／ｍＬのＨＥＲ２  ＥＣＤでコーティングし、３７℃でインキュベートした。ブロッキング後、血清希釈物を添加した（１／１００、１／１０００、１／１００００、１／５００００、１／１０００００）。反応を、抗マウスＩｇＧ  Ａｂ／アルカリホスファターゼコンジュゲートおよび対応する基質を使用して可視化した。免疫前の血清を陰性対照として使用した。
【００２８】
免疫化したマウス全てで特異的ＩｇＧ  Ａｂが生じた。ＨＥＲ１  ＥＣＤに特異的なＡｂの力価は、使用したアジュバントがＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）であった群である群２において、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）をアジュバントとして使用した群１において生じたＡｂの力価と比較して高かった（図５ａ）。他方では、ＨＥＲ２  ＥＣＤに対して生じた特異的Ａｂに関して、群１および群２において誘導されたＡｂの力価に有意差がなかったとしても、ワクチン調製物がＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）をアジュバントとして有した群である群２における力価が増大する傾向があった。ＨＥＲ２  ＥＣＤの認識において観察された傾向を考慮して、ＨＥＲ２  ＥＣＤサブドメイン（サブドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ、繊維状ファージ上に発現される）に対する力価測定を免疫血清から単離された精製ポリクローナル抗体（ＰｃＡｂ）を用いて実施した。この目的のために、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍＬのＰｃＡｂでコーティングし、３７℃でインキュベートした。次いで、ＨＥＲ２の異なるサブドメインを発現するファージ試料を添加し、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ファージ抗体（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて比色定量シグナルを検出した。ＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）をアジュバントとして使用した動物由来のＰｃＡｂは、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）を使用した動物から精製された抗体よりもＨＥＲ２  ＥＣＤサブドメインＩ、ＩＩＩおよびＩＶに対する反応性が大きかったことを示した（図５ｂ）。
【００２９】
（実施例６）
ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）をアジュバントとするＨＥＲ１＋ＨＥＲ２二価ワクチンを用いて誘導されたＡｂによる、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）をアジュバントとして使用したワクチンと比較して高いＨＥＲ１＋／ＨＥＲ２＋腫瘍細胞株の認識。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）２００μｇをアジュバントとするまたはＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）２００μｇをアジュバントとするＨＥＲ１  ＥＣＤ、１００μｇとＨＥＲ２  ＥＣＤ、１００μｇの混合物を含有するワクチン調製物を用いてＳＣにより免疫化した。０日目、１４日目および２８日目に免疫化を実施し、３５日目に対応する血清を使用して、ＨＥＲ１およびＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞株（Ａ４３１外陰部上皮癌（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ１５５５）、Ｈ１２５非小細胞肺癌（ＡＴＣＣ−ＣＲＣ５８０１）およびＳＫＢＲ３乳癌（ＡＴＣＣ−ＨＴＢ３０）の認識をフローサイトメトリーによって評価した。測定を実施するために、各細胞株由来の細胞１０5個をリン酸緩衝食塩水中２％ウシ胎仔血清でブロッキングし、その後、各処置群由来の血清の混合物の１／２００希釈物と一緒にインキュベートした。特異的Ａｂの腫瘍細胞におけるＨＥＲ１およびＨＥＲ２受容体への結合を抗マウスＩｇＧ  Ａｂ／ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）コンジュゲートを使用し、フローサイトメーターで少なくとも５０００個の細胞を獲得することによって可視化した。評価した各群における免疫前の血清の混合物を陰性対照として使用した。ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）をアジュバントとするワクチン調製物によって誘導された血清は評価された腫瘍細胞株をより高い強度で認識した（図６）。
【００３０】
（実施例７）
ＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）をアジュバントとする二価ＨＥＲ１＋ＨＥＲ２ワクチンにより、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然起源）を使用した組成物と比較してＨ１２５腫瘍細胞株の生存率に対する影響が増大した抗体が誘導される
Ｈ１２５細胞（１０5個）を、ＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）またはＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然起源）をアジュバントとするＨＥＲ１  ＥＣＤ、１００μｇとＨＥＲ２  ＥＣＤ、１００μｇの混合物を１／２０の希釈度で含有する二価ワクチン調製物を１５日毎に３回投薬して免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスから得た血清の混合物と一緒に７２時間インキュベートした。陰性対照として、免疫前の血清の混合物を同じ希釈で使用し、一方、陽性対照として、１０μＭのＡＧ１４７８チロシンキナーゼ阻害剤を使用した。免疫血清の細胞生存率に対する影響の決定をＭＴＴ比色定量アッセイを使用して実施し、吸光度の読み取りを５４０ｎｍおよび６３０ｎｍで実施した。細胞生存率を式：
【００３１】
【数１】
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によって決定した。
ＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）をアジュバントとするワクチンによって誘導された血清により、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然起源）を使用した組成物と比較して細胞生存率が有意に低下した（図７）。
【００３２】
（実施例８）
ＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）をアジュバントとするＨＥＲ１ワクチンにより、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然起源）を使用した調製物と比較してＨＥＲ１＋腫瘍細胞株に対する反応性がより高いＡｂが誘導される。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）を、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然起源）４００μｇまたはＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）４００μｇをアジュバントとするＨＥＲ１  ＥＣＤ、２００μｇを含有するワクチン調製物を用いてＳＣにより免疫化した。０日目、１４日目、２８日目および４２日目に免疫化を実施し、他方では、強力なＨＥＲ１発現ＭＤＡ−ＭＢ４６８乳癌細胞株（ＡＴＣＣ−ＨＴＢ１３２）に対する血清反応性をフローサイトメトリーによって評価するために、５６日目の動物から採血した。基本的に、１０5個の細胞をリン酸緩衝食塩水中２％ウシ胎仔血清でブロッキングし、その後、各処置群由来の血清の１／１００の希釈度の混合物と一緒にインキュベートした。腫瘍細胞のＨＥＲ１受容体への特異的Ａｂの結合を抗マウスＩｇＧ  Ａｂ／ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）コンジュゲートを使用し、少なくとも５０００個の細胞をフローサイトメーターで獲得することによって可視化した。陰性対照として、評価した各群の免疫前の血清の混合物を使用した。ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）をアジュバントとするワクチンによって誘導された血清は、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然起源）を使用した組成物と比較して腫瘍細胞とより強く反応した（図８）。
【００３３】
（実施例９）
ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）をアジュバントとするＨＥＲ１ワクチンにより、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然起源）を使用した組成物と比較してＨＥＲ１の活性化を阻害する能力が増大したＡｂが誘導される。
４群のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）を、以下のワクチン調製物のうちの１つを用いてＳＣにより免疫化した：
群１：ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然起源）２００μｇをアジュバントとするＨＥＲ１−ＥＣＤ、２００μｇ
群２：ＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）２００μｇをアジュバントとするＨＥＲ１−ＥＣＤ、２００μｇ
群３：ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然起源）４００μｇをアジュバントとするＨＥＲ１−ＥＣＤ、２００μｇ
群４：ＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）４００μｇをアジュバントとするＨＥＲ１−ＥＣＤ、２００μｇ
【００３４】
０日目、１４日目、２８日目、４２日目に免疫化を行い、５６日目に対応する血清を使用して、生成したＡｂのＥＧＦの存在下でＨＥＲ１リン酸化を阻害する能力を評価した。簡単に述べると、Ｈ２９２肺癌細胞（ＣＲＬ１８４８）を１／１００の希釈度の血清の混合物と一緒に２時間インキュベートした。その後、細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを用いて１０分間刺激してＨＥＲ１の活性化を誘導した。ＨＥＲ１にリン酸化に対する血清の影響を、リン酸化ＨＥＲ１およびβ−アクチンを検出するための特異的Ａｂを使用してウエスタンブロットによって測定した。ＥＧＦで処理した細胞をＨＥＲ１活性化の対照として使用した。１／１００の希釈度の免疫前の血清の混合物をＨＥＲ１阻害の陰性対照として使用し、１０μＭのＡＧ１４７８チロシンキナーゼ阻害剤を陽性阻害対照として使用した。データ正規化のために実験の写真をデンシトメトリー解析に提出した。ＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）をアジュバントとして使用したワクチンを用いて免疫化した動物から得た血清では、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（天然の供給源）を２００μｇおよび同様に４００μｇ用量で使用した組成物を注射したマウスの群に由来する血清よりも強力な、リン酸化に関したＨＥＲ１受容体活性化の阻害が示された（図９）。この結果から、誘導される液性免疫応答の質に関してＧＭ３  ＶＳＳＰ（１８：０）をアジュバントとして含有するワクチンの優位性が実証される。
【００３５】
（実施例１０）
ＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）ワクチン製剤のコペンハーゲンラットの前立腺に対する影響。
８〜１２週齢の雄コペンハーゲンラットを使用した。動物をそれぞれ動物１０匹の３群に分けた。
群１：プラセボ（モンタニドＩＳＡ  ５１  ＶＧ）／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）を注射した
群２：ＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴ／モンタニドＩＳＡ  ５１  ＶＧを用いて免疫化した
群３：ＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴ／モンタニドＩＳＡ  ５１  ＶＧ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）を用いて免疫化した
【００３６】
免疫原を調製するために、ＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴペプチドを蒸留水およびＶＳＳＰナノ粒子中に、２５０μＬ中ペプチド７５０μｇおよびＶＳＳＰ、１２０μｇの最終濃度に到達するまで分散させた。次いで、この混合物をモンタニドＩＳＡ  ５１  ＶＧと５０：５０（ｖ／ｖ）に比例的に製剤化した。ラットは、２週間に１回の頻度で４回の免疫化を受けた。
モンタニドＩＳＡ  ５１  ＶＧ中に乳化させたＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴペプチドを用いた免疫化により、プラセボを用いた免疫化と比較して前立腺のサイズの有意な減少が生じた（ｐ＜０．０５）。しかし、この差は、ペプチドＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴをＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）の存在下で乳化した場合にはるかに大きかった（ｐ＜０．０１）（図１０）。
【００３７】
（実施例１１）
ＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴペプチドを使用したＲ３３２７−Ｈダニングモデルにおける抗腫瘍応答の誘導
成体コペンハーゲンラットの右後肢の遠位帯域にダニングＲ３３２７−Ｈマウス腫瘍モデルの（２×２×２ｍｍ）の腫瘍断片をＳＣ移植した。動物を異なる処置を受ける４群に分けた：
群１：プラセボ：モンタニドＩＳＡ  ５１  ＶＧ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）
群２：去勢した
群３：ＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴペプチド／モンタニドＩＳＡ  ５１  ＶＧを用いて免疫化した
群４：ＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴペプチド／モンタニドＩＳＡ  ５１  ＶＧ／ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）を用いて免疫化した
【００３８】
腫瘍が直径およそ１０ｍｍに達したら対応するワクチンを用いた免疫化を開始した。１５日毎に、合計７回の免疫化を施行した。プラセボ群（群１）における明白な腫瘍の成長が観察され（図１１）、去勢群および免疫化群（群２、３および４）では、腫瘍成長の顕著な阻害が示された（ｐ＜０．０１）。この効果は、ＶＳＳＰ  ＧＭ３（１８：０）の存在下で乳化したＰｙｒＧｎＲＨｍ１−ＴＴペプチドを用いて免疫化したラットにおいてより有意であった（ｐ＝０．００５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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