(57)【要約】  本開示は、畳み込みニューラルネットワークなどのニューラルネットワークを利用して、シーケンサによって生成されたゲノム配列データを分析し、配列データ内の生殖細胞系列および／または体細胞変異を特定および記述する正確な予測データを生成するシステムおよび方法を提供する。
2021534492.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生殖細胞変異を呼び出す方法であって、
参照配列、複数の配列読み取り、および配列読み取り内の候補変異の位置を取得することと、
１つ以上の配列読み取りに１つ以上のスペースを挿入することによって拡張配列読み取りを取得することと、
前記参照配列に１つ以上のスペースを挿入することによって拡張参照配列を取得することと、
前記候補変異の周りの前記拡張配列読み取りのセグメントをサンプル行列に変換することと、
前記候補変異の周りの前記拡張参照配列のセグメントを参照行列に変換することと、
トレーニング済みニューラルネットワークに前記サンプル行列および前記参照行列を提供することと、
前記トレーニング済みニューラルネットワークの出力において、前記複数の配列読み取り内の変異に関連する予測データを取得することと、を含む、方法。
【請求項２】
さらに、前記複数の配列読み取り内に挿入された１つ以上の塩基を検出することを含み、前記配列読み取りおよび前記参照配列を拡張することが、
前記配列読み取りのいずれかにおいて検出された挿入塩基ごとに、前記挿入塩基の位置において前記参照サンプルにスペースを挿入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、
前記配列読み取りのいずれかにおいて検出された挿入塩基ごとに、前記挿入塩基の位置において挿入が検出されなかった全ての配列読み取りにおける前記挿入塩基位置にスペースを挿入することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプル行列が、
４つのタイプのヌクレオチド塩基を表す少なくとも４つのラインであって、各ラインが、前記拡張配列読み取りのセグメント内の異なる位置におけるそれぞれのヌクレオチド塩基タイプの塩基数を表す、ラインと、
前記拡張配列読み取りのセグメント内の異なる位置に挿入されたスペースの数を表す少なくとも１つのラインと、を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記参照行列が、前記サンプル行列と同じ次元を有し、前記参照行列が、前記拡張参照配列内の異なるヌクレオチド塩基およびスペースの前記位置の完全な表現を提供する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記トレーニング済みニューラルネットワークがトレーニング済み畳み込みニューラルネットワークを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
さらに、前記トレーニング済みニューラルネットワークに、
前記拡張配列読み取りのセグメント内の前記候補変異の位置を表す変異位置行列、
前記拡張配列読み取りのセグメントのカバレッジまたは深さを表すカバレッジ行列、
前記拡張配列読み取りの位置合わせ特徴を表す位置合わせ特徴行列、
１つ以上の変異に関する公に知られている情報を表す知識ベース行列、のうちの少なくとも１つを提供することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記変異に関連する前記予測データが、
前記変異の予測タイプ、
前記変異の予測位置、
前記変異の予測長、および
前記変異の予測ゲノムタイプ、のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記変異に関連する前記予測データが前記変異の予測タイプを含み、前記ニューラルネットワークが、前記変異の予測タイプの複数の値のうちの１つを生成するように構成され、前記複数の値が、
前記変異が偽陽性である確率を示す第１の値、
前記変異が単一ヌクレオチド多型変異である確率を示す第２の値、
前記変異が欠失変異である確率を示す第３の値、および
前記変異が挿入変異である確率を示す第４の値、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
体細胞変異を呼び出す方法であって、
複数の正常配列読み取りおよび複数の腫瘍配列読み取りを取得することと、
前記正常配列読み取りのセグメントおよび前記腫瘍配列読み取りのセグメントを、それぞれ正常サンプル行列および腫瘍サンプル行列に変換することと、
前記正常サンプル行列および前記腫瘍サンプル行列をトレーニング済み畳み込みニューラルネットワークに供給することと、
前記トレーニング済み畳み込みニューラルネットワークの出力において、前記複数の腫瘍配列読み取り内の体細胞変異の予測タイプを取得することと、を含む、方法。
【請求項１１】
前記複数の腫瘍配列読み取りが、患者の腫瘍サンプルのゲノム情報を表し、前記複数の正常配列読み取りが、前記患者の正常サンプルのゲノム情報を表す、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記正常配列読み取りのセグメントを前記正常サンプル行列に変換することが、１つ以上の正常配列読み取りに１つ以上のスペースを挿入することによって前記正常配列読み取りのセグメントを拡張することを含み、
前記腫瘍配列読み取りのセグメントを前記腫瘍サンプル行列に変換することが、１つ以上の腫瘍配列読み取りに１つ以上のスペースを挿入することによって前記腫瘍配列読み取りのセグメントを拡張することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍サンプル行列が、
各ヌクレオチド塩基タイプについて少なくとも１つのラインであって、各ラインが、前記腫瘍配列読み取りのセグメント内の各位置における前記それぞれのヌクレオチド塩基タイプの出現数を表す、ラインと、
前記腫瘍配列読み取りのセグメント内の各位置に挿入されたスペースの数を表す少なくとも１つのラインと、を備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、前記複数の腫瘍配列読み取りおよび／または前記複数の正常配列読み取りを分析した１つ以上の他の変異呼び出し元から取得された１つ以上の特徴を表す１つ以上の行列を前記トレーニング済み畳み込みニューラルネットワークに提供することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、
参照配列を取得することと、
前記参照配列を参照行列に変換することと、
前記正常サンプル行列および前記腫瘍サンプル行列とともに、前記参照行列を前記トレーニング済み畳み込み行列に供給することと、を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
コンピューティングシステムの１つ以上のプロセッサによって実行されると、前記コンピューティングシステムに、
複数の正常配列読み取りおよび複数の腫瘍配列読み取りを取得することと、
前記正常配列読み取りのセグメントおよび前記腫瘍配列読み取りのセグメントを、それぞれ正常サンプル行列および腫瘍サンプル行列に変換することと、
前記正常サンプル行列および前記腫瘍サンプル行列をトレーニング済み畳み込みニューラルネットワークに供給することと、
前記トレーニング済み畳み込みニューラルネットワークの出力において、前記複数の正常配列読み取り内の体細胞変異の予測タイプを取得することと、を含む動作を実行させる命令を備える、非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１７】
１つ以上のプロセッサを備え、命令を記憶する１つ以上の非一時的コンピュータ可読メモリに結合されたコンピューティングシステムであって、前記命令は、前記コンピューティングシステムによって実行されると、前記コンピューティングシステムに、
複数の腫瘍配列読み取りを取得することと、
１つ以上の腫瘍配列読み取りに１つ以上のスペースを挿入することによって拡張腫瘍配列読み取りを取得することと、
前記腫瘍配列読み取りのセグメントを腫瘍サンプル行列に変換することと、
前記正常サンプル行列および前記腫瘍サンプル行列をトレーニング済みニューラルネットワークに供給することと、
前記トレーニング済みニューラルネットワークの出力において、前記複数の腫瘍配列読み取り内の体細胞変異の予測タイプを取得することと、を含む動作を実行させる、コンピューティングシステム。
【請求項１８】
変異呼び出し方法であって、
参照配列および複数の配列読み取りを取得することと、
前記取得された複数の配列読み取りおよび参照配列が既に位置合わせされた構成で取得されない限り、必要に応じて、前記複数の配列読み取りと前記参照配列との第１の位置合わせを実行することと、
前記位置合わせされた配列読み取りおよび参照配列から候補変異位置を特定することと、
前記複数の配列読み取りと前記参照配列との第２の位置合わせを達成するために、前記候補変異位置の周りの前記配列読み取りおよび／または前記参照配列を拡張することと、
前記拡張参照配列から前記候補変異位置の参照行列を生成し、前記複数の拡張配列読み取りから前記候補変異位置のサンプル行列を生成することと、
前記参照行列および前記サンプル行列をニューラルネットワークに入力することと、
前記候補変異位置において変異タイプが存在するかどうかを前記ニューラルネットワークによって判定することと、を含む、方法。
【請求項１９】
前記配列読み取りおよび／または前記参照配列を拡張するステップが、前記配列読み取りにおける挿入および／または欠失を構成するために前記配列読み取りおよび／または前記参照配列に１つ以上のスペースを導入することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、
トレーニングデータセットから複数のトレーニング行列を生成することであって、前記トレーニング行列が、前記サンプル行列および前記参照行列に対応する構造を有し、前記トレーニングデータセットが、複数の変異を含む配列データを含み、前記変異が、単一ヌクレオチド変異、挿入、および欠失を含む、生成することと、
前記複数のトレーニング行列を使用して前記ニューラルネットワークをトレーニングすることと、を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記トレーニングデータセットが複数のサブセットを含み、各サブセットが０％から１００％の範囲の腫瘍純度レベルを含み、前記サブセットのうちの少なくとも２つがそれぞれ異なる腫瘍純度レベルを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記サブセットのうちの少なくとも３つがそれぞれ異なる腫瘍純度レベルを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数のサブセットが、腫瘍純度レベルが約３０％未満の第１のサブセット、腫瘍純度レベルが約３０％から７０％の第２のサブセット、および第３の腫瘍純度レベルが少なくとも約７０％の第３のサブセットを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数のサブセットが、腫瘍純度レベルが約４０％未満の第１のサブセット、腫瘍純度レベルが約４０％から６０％の第２のサブセット、および腫瘍純度レベルが少なくとも約６０％の第３のサブセットを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数のサブセットが、腫瘍純度レベルが約１０％未満のサブセットを含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数のサブセットが、腫瘍純度レベルが約５％未満のサブセットを含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記トレーニングデータセットが合成データを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記合成データが、人工的に生成された変異を含み、前記人工的に生成された変異が、単一ヌクレオチド変異、挿入、および欠失を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記トレーニングデータセットが実際のデータを含み、前記実際のデータが実際の変異を含み、前記実際の変異が、単一ヌクレオチド変異、挿入、および欠失を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記トレーニングデータセットが複数のサブセットを含み、各サブセットが０％から１００％の範囲の変異対立遺伝子頻度を含み、前記サブセットのうちの少なくとも２つがそれぞれ異なる変異対立遺伝子頻度レベルを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記サブセットのうちの少なくとも３つがそれぞれ異なる変異対立遺伝子頻度レベルを有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記サブセットのうちの少なくとも１つが少なくとも２．５％の変異対立遺伝子頻度を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記サブセットのうちの少なくとも１つが少なくとも５％の変異対立遺伝子頻度を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記サブセットのうちの少なくとも１つが少なくとも１０％の変異対立遺伝子頻度を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
さらに、少なくとも１つの変異呼び出しアルゴリズムからの少なくとも１つの予測を前記ニューラルネットワークに入力することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの予測が、少なくとも３つの別個の変異呼び出しアルゴリズムからの少なくとも３つの予測を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの予測が、少なくとも５つの別個の変異呼び出しアルゴリズムからの少なくとも５つの予測を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記トレーニングデータセットが、合成データと実際のデータとの混合を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３９】
前記トレーニングデータセットが少なくとも５％の合成データを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記トレーニングデータセットが少なくとも１０％の合成データを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記トレーニングデータセットが全ゲノムシーケンシングデータを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４２】
前記トレーニングデータセットが全エクソームシーケンシングデータを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４３】
前記トレーニングデータセットが標的化シーケンシングデータを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４４】
前記トレーニングデータセットが、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから取得されたデータを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４５】
前記トレーニングデータセットが、全ゲノムシーケンシングデータ、全エクソームシーケンシングデータ、標的化シーケンシングデータ、およびホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから取得されたデータのうちの少なくとも２つを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４６】
前記トレーニングデータセットが、全ゲノムシーケンシングデータ、全エクソームシーケンシングデータ、標的化シーケンシングデータ、およびホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから取得されたデータのうちの少なくとも３つを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４７】
前記トレーニングデータセットが、全ゲノムシーケンシングデータ、全エクソームシーケンシングデータ、標的化シーケンシングデータ、およびホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから取得されたデータを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４８】
変異呼び出し方法であって、
参照配列、複数の腫瘍配列読み取り、および複数の正常配列読み取りを取得することと、
前記取得された複数の腫瘍配列読み取りおよび前記複数の正常配列読み取りおよび前記参照配列が既に位置合わせされた構成で取得されない限り、必要に応じて、前記複数の腫瘍配列読み取りおよび前記複数の正常配列読み取りと前記参照配列との第１の位置合わせを実行することと、
前記位置合わせされた腫瘍配列読み取り、正常配列読み取り、および参照配列から候補変異位置を特定することと、
前記複数の腫瘍配列読み取りおよび前記複数の正常配列読み取りと前記参照配列との第２の位置合わせを達成するために、前記腫瘍配列読み取りおよび／または前記正常配列読み取り、および／または前記候補変異位置の周りの前記参照配列を拡張することと、
前記拡張参照配列から前記候補変異位置の参照行列を生成し、前記複数の拡張腫瘍配列読み取りから前記候補変異位置の腫瘍行列を生成し、前記複数の拡張正常配列読み取りから前記候補変異位置の正常行列を生成することと、
前記参照行列、前記腫瘍行列、および前記正常行列をニューラルネットワークに入力することと、
前記候補変異位置において変異タイプが存在するかどうかを前記ニューラルネットワークによって判定することと、を含む、方法。
【請求項４９】
さらに、
トレーニングデータセットから複数のトレーニング行列を生成することであって、前記トレーニング行列が、腫瘍行列、正常行列、および参照行列に対応する構造を有し、前記トレーニングデータセットが、腫瘍配列データおよび正常配列データを含む、生成することと、
前記複数のトレーニング行列を使用して前記ニューラルネットワークをトレーニングすることと、を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記腫瘍配列データおよび前記正常配列データの双方が複数の変異を含み、前記変異が、単一ヌクレオチド変異、挿入、および欠失を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記正常配列データが最大５％の腫瘍配列データを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記正常配列データが最大１０％の腫瘍配列データを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記腫瘍配列データが、約１０％から１００％の腫瘍純度レベルを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記トレーニングデータセットが複数の腫瘍配列データサブセットを含み、各腫瘍配列データサブセットが、１０％から１００％の範囲の腫瘍純度レベルを含み、前記腫瘍配列データサブセットのうちの少なくとも２つが、それぞれ異なる腫瘍純度レベルを有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記腫瘍配列データサブセットのうちの少なくとも３つがそれぞれ異なる腫瘍純度レベルを有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記複数の腫瘍配列データサブセットが、腫瘍純度レベルが約３０％未満の第１の腫瘍配列データサブセット、腫瘍純度レベルが約３０％から７０％の第２の腫瘍配列データサブセット、および腫瘍純度レベルが少なくとも約７０％の第３の腫瘍配列データサブセットを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記複数の腫瘍配列データサブセットが、腫瘍純度レベルが約４０％未満の第１の腫瘍配列データサブセット、腫瘍純度レベルが約４０％から６０％の第２の腫瘍配列データサブセット、および腫瘍純度レベルが少なくとも約６０％の第３の腫瘍配列データサブセットを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記トレーニングデータセットが合成データを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記合成データが人工的に生成された変異を含み、前記人工的に生成された変異が、単一ヌクレオチド変異、挿入、および欠失を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
前記トレーニングデータセットが実際のデータを含み、前記実際のデータが実際の変異を含み、前記実際の変異が、単一ヌクレオチド変異、挿入、および欠失を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
前記トレーニングデータセットが全ゲノムシーケンシングデータを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
前記トレーニングデータセットが全エクソームシーケンシングデータを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６３】
前記トレーニングデータセットが標的化シーケンシングデータを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６４】
前記トレーニングデータセットが、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから取得されたデータを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６５】
システムであって、
請求項１８〜６４のいずれか一項に記載のステップを実行するように構成されたプロセッサを備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本特許出願は、２０１８年８月１３日出願の米国仮特許出願第６２／７１８，３３８号および２０１９年５月３１日出願の米国仮特許出願第６２／８５５，５４１号の利益を主張するものであり、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
参照による組み込み
本明細書で述べられる全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように同程度に参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００３】
本発明の実施形態は、一般に、変異呼び出しのためのシステムおよび方法、より具体的には、変異呼び出しのための機械学習アルゴリズムの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
シーケンシングデータを使用して遺伝子変異を特定することは、癌を含む複数の疾患の診断、予後、および治療に影響を与えるバイオインフォマティクスの重要なタスクである。特に、シーケンシングデータの生成に使用されるシーケンシング技術が高いエラー率を有する場合（単一分子シーケンシング技術に共通）、または変異が低頻度で（これは特に癌の変異の場合にあてはまる）または複雑なゲノム領域で発生する場合、タスクは重要である。シーケンシングサンプルでの癌変異の頻度が低いのは、サンプルの汚染（腫瘍サンプルは、正常細胞からのＤＮＡを含む場合があるため）または腫瘍の不均一性が原因である可能性がある。
【０００５】
従来のアプローチでは、特定の技術と検出する変異タイプに限定することで、問題の範囲を絞り込んでいる。したがって、変異が小さいか大きいかによってさらに階層化される、生殖細胞変異と癌変異を特定するための異なるツールとフレームワークのセットが存在する。さらに、低エラーシーケンシング技術（例えば、ショートリードシーケンシング）に使用されるアプローチは、高エラーシーケンシング技術（例えば、単一分子シーケンシング）に使用されるアプローチとは異なる。相違は、主にデータシグネチャと、エラーを真の変異と区別するために使用される統計モデルとに現れる。明示的なデータシグネチャと統計モデルとの使用は、複数の技術に対する従来のアプローチの一般化を制限する。さらにまた、従来のアプローチでさえも、サンプルの特定の特性をキャプチャするためのパラメータ調整を必要とし、これは、使用する技術、シーケンシングプロトコル、シーケンシングサンプル、サンプル純度などを含む多数の要因に依存する可能性がある。
【０００６】
深層学習は、適切なトレーニングデータが利用可能である限り、複数のデータ層を使用して、データシグネチャと統計モデルを暗黙的にキャプチャする機械学習技術である。これは、変異検出問題の一般化可能性の観点から、深層学習を潜在的に魅力的な解決策にする。生殖細胞変異を分類するためのいくつかの深層学習解決策が知られている。
【０００７】
Ｐｏｐｌｉｎ，Ｒ．ら（「Ｃｒｅａｔｉｎｇ  ａ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＮＰ  ａｎｄ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｄｅｌ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ｃａｌｌｅｒ  Ｗｉｔｈ  Ｄｅｅｐ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ」、ｂｉｏＲｘｉｖ，０９２８９０（２０１６））は、候補変変異位置が最初にゲノムスキャンによって特定され、次に、候補変異のゲノムタイプを予測する畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）への入力としてそれぞれの特定された候補の周りに位置合わせされた読み取りのパイルアップ画像が提供される方法を提案している。そのようなアプローチは、複雑なニューラルネットワークアーキテクチャと大量のメモリを必要とするため、あまり実用的ではない。
【０００８】
Ｌｕｏ，Ｒ．ら（「Ｃｌａｉｒｖｏｙａｎｔｅ：ａ  Ｍｕｌｔｉ−ｔａｓｋ  Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｅｐ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｆｏｒ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ｃａｌｌｉｎｇ  Ｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、ｂｉｏＲｘｉｖ，３１０４５８（２０１８））は、データ要約アプローチを使用し、これは、ゲノムをスキャンして候補変異部位を特定し、各候補位置の複数の入力行列である変異のタイプごとに１つの行列を準備する。Ｃｈｉｎ、Ｊ．（「Ｓｉｍｐｌｅ  Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ｃａｌｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＴｅｎｓｏｒＦｌｏｗ」、ｈｔｔｐｓ：／／ｔｏｗａｒｄｓｄａｔａｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｓｉｍｐｌｅ−ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ−ｎｅｕｒａｌ−ｎｅｔｗｏｒｋ−ｆｏｒ−ｇｅｎｏｍｉｃ−ｖａｒｉａｎｔ−ｃａｌｌｉｎｇ−ｗｉｔｈ−ｔｅｎｓｏｒｆｌｏｗ−ｃ０８５ｄｂｃ２０２６ｆ、２０１７年７月１６日公開）には、同様の技術が記載されている。これらのアプローチはまた、ウィンドウ全体に挿入された全ての配列を明確に表すことができないため、最適ではない。例えば、Ｃｌａｉｒｖｏｙａｎｔｅシステムは、ウィンドウ内の他の位置での実際の／誤った挿入を無視して、変異位置での挿入のみをキャプチャする挿入イベント用の個別の入力行列を使用する。ウィンドウ全体の挿入配列の正確な位置に関する全体像の情報は、実際の挿入変異を背景ノイズから区別する上で重要になる可能性がある。
【０００９】
Ｔｏｒｒａｃｉｎｔａ，Ｒ．ら（「Ａｄａｐｔｉｖｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｃａｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｅｐ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｍｉ−ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｄａｔａ」、ｂｉｏＲｘｉｖ，７９０８７（２０１６））は、手動で抽出された特徴のセットに６層の完全に接続されたニューラルネットワークを適用することを記載している。しかしながら、完全に接続された層のみを有するシステムは、候補変異のローカルゲノムコンテキストで見られるパターンを使用して生の配列データから直接特徴表現を学習する畳み込みニューラルネットワークによって提供されるパワーを活用することができない。さらに、完全に接続されたネットワークは、より複雑であるため、このアプローチは、ＣＮＮの使用によって可能にされる場合よりも低い一般化およびスケーラビリティが可能になる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、一般に、変異呼び出しのためのシステムおよび方法、より具体的には、変異呼び出しのための機械学習アルゴリズムの使用に関する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、生殖系列変異の呼び出しの方法が提供される。この方法は、参照配列、複数の配列読み取り、および配列読み取り内の候補変異の位置を取得することと、１つ以上の配列読み取りに１つ以上のスペースを挿入することにより、拡張配列読み取りを取得することと、参照配列に１つ以上のスペースを挿入することにより、拡張参照配列を取得することと、候補変異の周りの拡張配列読み取りのセグメントをサンプル行列に変換することと、候補変異の周りの拡張参照配列のセグメントを参照行列に変換することと、トレーニング済みニューラルネットワークにサンプル行列および参照行列を提供することと、トレーニング済みニューラルネットワークの出力において、複数の配列読み取り内の変異に関連する予測データを取得することと、を含むことができる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、この方法は、さらに、複数の配列読み取り内の１つ以上の挿入塩基を検出することを含み、配列読み取りの拡張および参照配列は、以下を含む：配列読み取りのいずれかにおいて検出された各挿入塩基について、挿入塩基の位置において参照サンプルにスペースを挿入すること。
【００１３】
いくつかの実施形態では、この方法は、さらに、配列読み取りのいずれかにおいて検出された各挿入塩基について、挿入塩基の位置において挿入が検出されなかった全ての配列読み取りにおける挿入塩基の位置にスペースを挿入することを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、サンプル行列は、４つのタイプのヌクレオチド塩基を表す少なくとも４つのラインを含み、各ラインは、拡張配列読み取りのセグメント内の異なる位置におけるそれぞれのヌクレオチド塩基タイプの塩基の数を表し、少なくとも１つのラインは、拡張配列読み取りのセグメント内の異なる位置に挿入されたスペースの数を表す。
【００１５】
いくつかの実施形態では、参照行列は、サンプル行列と同じ次元を有し、参照行列は、拡張参照配列内の異なるヌクレオチド塩基およびスペースの位置の完全な表現を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、トレーニング済みニューラルネットワークは、トレーニング済み畳み込みニューラルネットワークを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、この方法は、さらに、トレーニング済みニューラルネットワークに、以下のうちの少なくとも１つを提供することを含む：拡張配列読み取りのセグメント内の候補変異の位置を表す変異位置行列、拡張配列読み取りのセグメントのカバレッジまたは深さを表すカバレッジ行列、拡張配列読み取りの位置合わせ特徴を表す位置合わせ特徴行列、１つ以上の変異に関する公に知られている情報を表す知識ベース行列。
【００１８】
いくつかの実施形態では、変異に関連する予測データは、以下のうちの少なくとも１つを含む：変異の予測タイプ、変異の予測位置、変異の予測長、変異の予測ゲノムタイプ。
【００１９】
いくつかの実施形態では、変異に関連する予測データは、変異の予測タイプを含み、ニューラルネットワークは、変異の予測タイプについて複数の値のうちの１つを生成するように構成され、複数の値は、以下を含む：変異が偽陽性である確率を示す第１の値、変異が単一ヌクレオチド多型変異である確率を示す第２の値、変異が削除変異である確率を示す第３の値、および変異が挿入変異である確率を示す第４の値。
【００２０】
いくつかの実施形態では、体細胞変異呼び出しのための方法が提供される。この方法は、複数の正常配列読み取りおよび複数の腫瘍配列読み取りを取得することと、正常配列読み取りのセグメントおよび腫瘍配列読み取りのセグメントを、それぞれ正常サンプル行列および腫瘍サンプル行列に変換することと、正常サンプル行列および腫瘍サンプル行列をトレーニング済み畳み込みニューラルネットワークに供給することと、トレーニング済み畳み込みニューラルネットワークの出力において、複数の腫瘍配列読み取り内の体細胞変異の予測タイプを取得することと、を含むことができる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、複数の腫瘍配列読み取りは、患者の腫瘍サンプルの遺伝情報を表し、複数の正常配列読み取りは、患者の正常サンプルの遺伝情報を表す。
【００２２】
いくつかの実施形態では、正常配列読み取りのセグメントを正常サンプル行列に変換することは、１つ以上の正常配列読み取りに１つ以上のスペースを挿入することによって正常配列読み取りのセグメントを拡張することを含み、腫瘍配列読み取りのセグメントを腫瘍サンプル行列に変換することは、１つ以上の腫瘍配列読み取りに１つ以上のスペースを挿入することによって腫瘍配列読み取りのセグメントを拡張することを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、腫瘍サンプル行列は、各ヌクレオチド塩基型について少なくとも１つのラインを含み、各ラインは、腫瘍配列読み取りのセグメント内の各位置でのそれぞれのヌクレオチド塩基型の出現数を表し、少なくとも１つのラインは、腫瘍配列読み取りのセグメント内の各位置に挿入されたスペースの数を表す。
【００２４】
いくつかの実施形態では、この方法は、さらに、トレーニング済み畳み込みニューラルネットワークに、複数の腫瘍配列読み取りおよび／または複数の正常配列読み取りを分析した１つ以上の他の変異呼び出し元から取得された１つ以上の特徴を表す１つ以上の行列を提供することを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、この方法は、さらに、参照配列を取得することと、参照配列を参照行列に変換することと、正常サンプル行列および腫瘍サンプル行列とともに、参照行列をトレーニング済み畳み込み行列に供給することと、を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、非一時的コンピュータ可読媒体は、コンピューティングシステムの１つ以上のプロセッサによって実行されると、コンピューティングシステムに、複数の正常配列読み取りおよび複数の腫瘍配列読み取りを取得することと、正常配列読み取りのセグメントおよび腫瘍配列読み取りのセグメントを、それぞれ正常サンプル行列および腫瘍サンプル行列に変換することと、正常サンプル行列および腫瘍サンプル行列をトレーニング済み畳み込みニューラルネットワークに供給することと、トレーニング済み畳み込みニューラルネットワークの出力において、複数の正常配列読み取り内の体細胞変異の予測タイプを取得することと、を含む動作を実行させる命令を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、コンピューティングシステムは、１つ以上のプロセッサを含み、命令を記憶する１つ以上の非一時的コンピュータ可読メモリに結合され、命令は、コンピューティングシステムによって実行されると、コンピューティングシステムに、複数の腫瘍配列読み取りを取得することと、１つ以上の腫瘍配列読み取りに１つ以上のスペースを挿入することによって拡張腫瘍配列読み取りを取得することと、腫瘍配列読み取りのセグメントを腫瘍サンプル行列に変換することと、正常サンプル行列および腫瘍サンプル行列をトレーニング済みニューラルネットワークに供給することと、トレーニング済みニューラルネットワークの出力において、複数の腫瘍配列読み取り内の体細胞変異の予測タイプを取得することと、を含む動作を実行させる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、変異呼び出しのための方法が提供される。この方法は、参照配列および複数の配列読み取りを取得することと、取得された複数の配列読み取りおよび参照配列が既に位置合わせされた構成で取得されない限り、必要に応じて、複数の配列読み取りと参照配列との第１の位置合わせを実行することと、位置合わせされた配列読み取りおよび参照配列から候補変異位置を特定することと、複数の配列読み取りと参照配列との第２の位置合わせを達成するために、候補変異位置の周りの配列読み取りおよび／または参照配列を拡張することと、拡張参照配列から候補変異位置の参照行列を生成し、複数の拡張配列読み取りから候補変異位置のサンプル行列を生成することと、参照行列およびサンプル行列をニューラルネットワークに入力することと、ニューラルネットワークを使用して、変異タイプが候補変異位置に存在するかどうかを判定することと、を含むことができる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、配列読み取りおよび／または参照配列を拡張するステップは、配列読み取りにおける挿入および／または欠失を構成するために、配列読み取りおよび／または参照配列に１つ以上のスペースを導入することを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、この方法は、さらに、トレーニングデータセットから複数のトレーニング行列を生成することであって、トレーニング行列が、サンプル行列および参照行列に対応する構造を有し、トレーニングデータセットが、複数の変異を含む配列データを含み、変異が、単一ヌクレオチド変異、挿入、および欠失を含む、生成することと、複数のトレーニング行列を使用してニューラルネットワークをトレーニングすることと、を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、複数のサブセットを含み、各サブセットは、０％から１００％の範囲の腫瘍純度レベルを含み、サブセットの少なくとも２つは、それぞれ異なる腫瘍純度レベルを有する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、サブセットのうちの少なくとも３つは、それぞれ異なる腫瘍純度レベルを有する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、複数のサブセットは、腫瘍純度レベルが約３０％未満の第１のサブセット、腫瘍純度レベルが約３０％から７０％の第２のサブセット、および第３の腫瘍純度レベルが少なくとも約７０％の第３のサブセットを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、複数のサブセットは、腫瘍純度レベルが約４０％未満の第１のサブセット、腫瘍純度レベルが約４０％から６０％の第２のサブセット、および腫瘍純度レベルが少なくとも約６０％の第３のサブセットを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、複数のサブセットは、腫瘍純度レベルが約１０％未満のサブセットを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、複数のサブセットは、腫瘍純度レベルが約５％未満のサブセットを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、合成データを含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、合成データは、人工的に生成された変異を含み、人工的に生成された変異は、単一ヌクレオチド変異、挿入、および欠失を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、実際のデータを含み、実際のデータは、実際の変異を含み、実際の変異は、単一ヌクレオチド変異、挿入、および欠失を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、複数のサブセットを含み、各サブセットは、０％から１００％の範囲の変異対立遺伝子頻度を含み、サブセットのうちの少なくとも２つは、それぞれ、異なる変異対立遺伝子頻度レベルを有する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、サブセットのうちの少なくとも３つは、それぞれ、異なる変異対立遺伝子頻度レベルを有する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、サブセットの少なくとも１つは、少なくとも２．５％の変異対立遺伝子頻度を有する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、サブセットの少なくとも１つは、少なくとも５％の変異対立遺伝子頻度を有する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、サブセットの少なくとも１つは、少なくとも１０％の変異対立遺伝子頻度を有する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、この方法は、さらに、少なくとも１つの変異呼び出しアルゴリズムからの少なくとも１つの予測をニューラルネットワークに入力することを含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの予測は、少なくとも３つの別個の変異呼び出しアルゴリズムからの少なくとも３つの予測を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの予測は、少なくとも５つの別個の変異呼び出しアルゴリズムからの少なくとも５つの予測を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、合成データと実際のデータとの混合を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、少なくとも５％の合成データを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、少なくとも１０％の合成データを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、全ゲノムシーケンシングデータを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、全エクソームシーケンシングデータを含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、標的化シーケンシングデータを含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから取得されたデータを含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、全ゲノムシーケンシングデータ、全エクソームシーケンシングデータ、標的化シーケンシングデータ、およびホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから取得されたデータのうちの少なくとも２つを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、全ゲノムシーケンシングデータ、全エクソームシーケンシングデータ、標的化シーケンシングデータ、およびホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから取得されたデータのうちの少なくとも３つを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、全ゲノムシーケンシングデータ、全エクソームシーケンシングデータ、標的化シーケンシングデータ、およびホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから取得されたデータを含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、変異呼び出しのための方法が提供される。この方法は、参照配列、複数の腫瘍配列読み取り、および複数の正常配列読み取りを取得することと、取得された複数の腫瘍配列読み取りおよび複数の正常配列読み取りおよび参照配列が既に位置合わせされた構成で取得されない限り、必要に応じて、複数の腫瘍配列読み取りおよび複数の正常配列読み取りと参照配列との第１の位置合わせを実行することと、位置合わせされた腫瘍配列読み取り、正常配列読み取り、および参照配列から候補変異位置を特定することと、複数の腫瘍配列読み取りおよび／または複数の正常配列読み取りと参照配列との第２の位置合わせを達成するために、腫瘍配列読み取りおよび／または正常配列読み取り、および／または候補変異位置の周りの参照配列を拡張することと、拡張参照配列から候補変異位置の参照行列を生成し、複数の拡張腫瘍配列読み取りから候補変異位置の腫瘍行列を生成し、複数の拡張正常配列読み取りから候補変異位置の正常行列を生成することと、参照行列、腫瘍行列、および正常行列をニューラルネットワークに入力することと、ニューラルネットワークを使用して、変異タイプが候補変異位置に存在するかどうかを判定することと、を含むことができる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、この方法は、さらに、トレーニングデータセットから複数のトレーニング行列を生成することであって、トレーニング行列が、腫瘍行列、正常行列、および参照行列に対応する構造を有し、トレーニングデータセットが、腫瘍配列データおよび正常配列データを含む、生成することと、複数のトレーニング行列を使用してニューラルネットワークをトレーニングすることと、を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、腫瘍配列データおよび正常配列データの双方は、複数の突然変異を含み、突然変異は、単一ヌクレオチド変異、挿入、および欠失を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、正常配列データは、最大５％の腫瘍配列データを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、正常配列データは、最大１０％の腫瘍配列データを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、腫瘍配列データは、約１０％から１００％の腫瘍純度レベルを含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、複数の腫瘍配列データサブセットを含み、各腫瘍配列データサブセットは、１０％から１００％の範囲の腫瘍純度レベルを含み、腫瘍配列データサブセットのうちの少なくとも２つは、それぞれ異なる腫瘍純度レベルを有する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、腫瘍配列データサブセットのうちの少なくとも３つは、それぞれ異なる腫瘍純度レベルを有する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、複数の腫瘍配列データサブセットは、腫瘍純度レベルが約３０％未満の第１の腫瘍配列データサブセット、腫瘍純度レベルが約３０％から７０％の第２の腫瘍配列データサブセット、および腫瘍純度レベルが少なくとも約７０％の第３の腫瘍配列データサブセットを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、複数の腫瘍配列データサブセットは、腫瘍純度レベルが約４０％未満の第１の腫瘍配列データサブセット、腫瘍純度レベルが約４０％から６０％の第２の腫瘍配列データサブセット、および腫瘍純度レベルが少なくとも約６０％の第３の腫瘍配列データサブセットを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、合成データを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、合成データは、人工的に生成された変異を含み、人工的に生成された変異は、単一ヌクレオチド変異、挿入、および欠失を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、実際のデータを含み、実際のデータは、実際の変異を含み、実際の変異は、単一ヌクレオチド変異、挿入、および欠失を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、全ゲノムシーケンシングデータを含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、全エクソームシーケンシングデータを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、標的化シーケンシングデータを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、トレーニングデータセットは、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから取得されたデータを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、システムが提供される。システムは、請求項１８〜６４のいずれかに記載のステップを実行するように構成されたプロセッサを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
本発明の新規の特徴は、以下の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、およびその添付の図面を参照することによって得られるであろう：
【図１】いくつかの実施形態にかかる、シーケンシング装置およびコンピューティングシステムを備える例示的なシステムを示している。
【図２ａ】いくつかの実施形態にかかる、生殖系列変異呼び出しの例示的な方法を示している。
【図２ｂ】いくつかの実施形態にかかる、生殖系列変異呼び出しの例示的な方法を示している。
【図３】いくつかの実施形態にかかる、図２の例示的な方法の拡張ステップを示している。
【図４】いくつかの実施形態にかかる、ニューラルネットワークに提供され、ニューラルネットワークから取得されることができる例示的なデータを示している。
【図５】いくつかの実施形態にかかる、ニューラルネットワークの例示的なアーキテクチャを示している。
【図６】いくつかの実施形態にかかる、体細胞変異呼び出しのための例示的な方法を示している。
【図７】いくつかの実施形態にかかる、図６の例示的な方法の一部として実行されることができる拡張ステップを示している。
【図８】いくつかの実施形態にかかる、ニューラルネットワークに提供され、ニューラルネットワークから取得されることができるデータの別の例を示している。
【図９】いくつかの実施形態にかかる、ニューラルネットワークの例示的なアーキテクチャを示している。
【図１０ａ】所与の候補体細胞ＳＮＶについての入力行列の生成を示している。
【図１０ｂ】入力行列およびネットワークアーキテクチャを示している。
【図１０ｃ】所与の候補体細胞欠失についての入力行列の生成を示している。
【図１０ｄ】所与の候補体細胞挿入についての入力行列の生成を示している。
【図１１ａ】プラチナ２サンプル混合データセットに対する異なる検出方法の性能を示している。
【図１１ｂ】プラチナ２サンプル混合データセットに対する異なる検出方法の性能を示している。
【図１１ｃ】プラチナ２サンプル混合データセットに対する異なる検出方法の性能を示している。
【図１２ａ】Ｄｒｅａｍステージ３データセットに対する異なる検出方法の性能を示している。
【図１２ｂ】Ｄｒｅａｍステージ３データセットに対する異なる検出方法の性能を示している。
【図１２ｃ】Ｄｒｅａｍステージ３データセットに対する異なる検出方法の性能を示している。
【図１３ａ】Ｄｒｅａｍステージ４データセットに対する異なる検出方法の性能を示している。
【図１３ｂ】Ｄｒｅａｍステージ４データセットに対する異なる検出方法の性能を示している。
【図１３ｃ】Ｄｒｅａｍステージ４データセットに対する異なる検出方法の性能を示している。
【図１４ａ】ＰａｃＢｉｏデータセットに対する２つの異なる検出方法の性能を示している。
【図１４ｂ】ＰａｃＢｉｏデータセットに対する２つの異なる検出方法の性能を示している。
【図１４ｃ】ＰａｃＢｉｏデータセットに対する２つの異なる検出方法の性能を示している。
【図１５ａ】全エクソームサンプル混合データセットに対する異なる検出方法の性能における配列カバレッジの影響を示している。
【図１５ｂ】全エクソームサンプル混合データセットに対する異なる検出方法の性能における配列カバレッジの影響を示している。
【図１６ａ】プラチナ腫瘍スパイクデータセットに対する異なる検出方法の性能を示している。
【図１６ｂ】プラチナ腫瘍スパイクデータセットに対する異なる検出方法の性能を示している。
【図１６ｃ】プラチナ腫瘍スパイクデータセットに対する異なる検出方法の性能を示している。
【図１６ｄ】プラチナ腫瘍スパイクデータセットに対する異なる検出方法の性能を示している。
【図１７ａ】全エクソームデータセットに対する異なる体細胞変異検出方法の性能を示している。
【図１７ｂ】標的化パネルデータセットに対する体細胞変異検出法の性能を示している。
【図１７ｃ】全エクソームデータセットに対する異なる体細胞変異検出方法の性能を示している。
【図１７ｄ】標的化パネルデータセットに対する体細胞変異検出法の性能を示している。
【図１８ａ】全ゲノムおよび全エクソームに対するトレーニング済みモデルを使用してエクソーム混合データセットに対してテストする性能分析を示している。
【図１８ｂ】全ゲノムおよび全エクソームに対するトレーニング済みモデルを使用して標的化パネル混合データセットに対してテストする性能分析を示している。
【図１９】Ｄｒｅａｍステージ３、Ｄｒｅａｍステージ４、プラチナ２サンプル混合、プラチナ腫瘍スパイク、ＰａｃＢｉｏ、およびエクソームデータセットにおけるグラウンドトゥルースＩＮＤＥＬのサイズ分布を示している。
【図２０ａ】様々なデータセットについて予測された体細胞変異の位置およびタイプに基づく、ＩＮＤＥＬに対する様々な検出方法の性能分析を示している。
【図２０ｂ】様々なデータセットについて予測された体細胞変異の位置およびタイプに基づく、ＩＮＤＥＬに対する様々な検出方法の性能分析を示している。
【図２１】Ｄｒｅａｍチャレンジステージ３データセットのクロスサンプルトレーニングの性能分析を示している。
【図２２ａ】実際のデータセットＣＯＬＯ−８２９に対する様々な体細胞変異検出方法の性能を示している。
【図２２ｂ】実際のデータセットＣＬＬ１に対する様々な体細胞変異検出方法の性能を示している。
【図２２ｃ】実際のデータセットＴＣＧＡ−ＡＺ−６６０１に対する様々な体細胞変異検出方法の性能を示している。
【図２３】マイクロソフトＡｚｕｒｅの実験に使用された２６１のＴＣＧＡ癌サンプルのリストである。
【図２４ａ】テストされた異なるネットワークアーキテクチャを示している。
【図２４ｂ】テストされた異なるネットワークアーキテクチャを示している。
【図２４ｃ】テストされた異なるネットワークアーキテクチャを示している。
【図２４ｄ】テストされた異なるネットワークアーキテクチャを示している。
【図２４ｅ】テストされた異なるネットワークアーキテクチャを示している。
【図２４ｆ】テストされた異なるネットワークアーキテクチャを示している。
【図２４ｇ】テストされた異なるネットワークアーキテクチャを示している。
【図２４ｈ】テストされた異なるネットワークアーキテクチャを示している。
【図２４ｉ】テストされた異なるネットワークアーキテクチャを示している。
【図２４ｊ】テストされた異なるネットワークアーキテクチャを示している。
【図２４ｋ】テストされた異なるネットワークアーキテクチャを示している。
【図２４ｌ】テストされた異なるネットワークアーキテクチャを示している。
【図２４ｍ】テストされた異なるネットワークアーキテクチャを示している。
【図２５】図２４ａ〜図２４ｍに示される異なるネットワークアーキテクチャの性能分析を示している。
【図２６ａ】異なる体細胞変異検出アルゴリズムの実行時間比較を示している。
【図２６ｂ】異なる体細胞変異検出アルゴリズムの実行時間比較を示している。
【図２７】ＳＥＱＣ−ＩＩコンソーシアムによって４つの信頼レベル（高、中、低、および未分類）に分類されたＨＣＣ１３９５の呼び出しのスーパーセットにおけるグラウンドトゥルースＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ体細胞変異のＶＡＦ分布を示している。
【図２８ａ】ＳＥＱＣ−ＩＩデータセットにおける１２３回の複製に対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの全体的な性能を示している。
【図２８ｂ】ＳＥＱＣ−ＩＩデータセットにおける１２３回の複製に対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの全体的な性能を示している。
【図２８ｃ】ＳＥＱＣ−ＩＩデータセットにおける１２３回の複製に対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの全体的な性能を示している。
【図２８ｄ】ＳＥＱＣ−ＩＩデータセットにおける１２３回の複製に対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの全体的な性能を示している。
【図２８ｅ】ＳＥＱＣ−ＩＩデータセットにおける１２３回の複製に対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの全体的な性能を示している。
【図２９ａ】２１個のＷＧＳ複製データセットに対する様々なモデルの性能比較を示している。図２９ａは、Ｆ１−スコア（％）を示し、図２９ｂは、異なる体細胞変異呼び出し元間の適合率−再現率の比較を示している。ここでは、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルがＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓに使用された。図２９ｃは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図２９ｄは、ＷＧＳデータセットに対する異なる体細胞変異検出方法およびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃネットワークトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）性能を示している。
【図２９ｂ】２１個のＷＧＳ複製データセットに対する様々なモデルの性能比較を示している。図２９ａは、Ｆ１−スコア（％）を示し、図２９ｂは、異なる体細胞変異呼び出し元間の適合率−再現率の比較を示している。ここでは、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルがＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓに使用された。図２９ｃは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図２９ｄは、ＷＧＳデータセットに対する異なる体細胞変異検出方法およびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃネットワークトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）性能を示している。
【図２９ｃ】２１個のＷＧＳ複製データセットに対する様々なモデルの性能比較を示している。図２９ａは、Ｆ１−スコア（％）を示し、図２９ｂは、異なる体細胞変異呼び出し元間の適合率−再現率の比較を示している。ここでは、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルがＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓに使用された。図２９ｃは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図２９ｄは、ＷＧＳデータセットに対する異なる体細胞変異検出方法およびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃネットワークトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）性能を示している。
【図２９ｄ】２１個のＷＧＳ複製データセットに対する様々なモデルの性能比較を示している。図２９ａは、Ｆ１−スコア（％）を示し、図２９ｂは、異なる体細胞変異呼び出し元間の適合率−再現率の比較を示している。ここでは、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルがＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓに使用された。図２９ｃは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図２９ｄは、ＷＧＳデータセットに対する異なる体細胞変異検出方法およびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃネットワークトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）性能を示している。
【図３０ａ】腫瘍純度データセットの性能比較を示している。図３０ａは、異なるカバレッジ（１０×−３００×）および腫瘍純度（５％−１００％）にわたる異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３０ｂは、一致した正常値が５％の腫瘍で汚染された場合の一致した正常値：Ｆ１−スコア（％）の変化における腫瘍汚染に対するロバスト性を示しており、８０倍のカバレッジの純粋な正常値および５〜１００％の腫瘍純度におけるＦ１−スコア（％）が示されている。図３０ａおよび図３０ｂでは、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−ＳにＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルが使用された。図３０ｃは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３０ｄは、異なるＩＮＤＥＬサイズの性能分析を示している。負のＩＮＤＥＬサイズは、欠失を反映している。
【図３０ｂ】腫瘍純度データセットの性能比較を示している。図３０ａは、異なるカバレッジ（１０×−３００×）および腫瘍純度（５％−１００％）にわたる異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３０ｂは、一致した正常値が５％の腫瘍で汚染された場合の一致した正常値：Ｆ１−スコア（％）の変化における腫瘍汚染に対するロバスト性を示しており、８０倍のカバレッジの純粋な正常値および５〜１００％の腫瘍純度におけるＦ１−スコア（％）が示されている。図３０ａおよび図３０ｂでは、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−ＳにＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルが使用された。図３０ｃは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３０ｄは、異なるＩＮＤＥＬサイズの性能分析を示している。負のＩＮＤＥＬサイズは、欠失を反映している。
【図３０ｃ】腫瘍純度データセットの性能比較を示している。図３０ａは、異なるカバレッジ（１０×−３００×）および腫瘍純度（５％−１００％）にわたる異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３０ｂは、一致した正常値が５％の腫瘍で汚染された場合の一致した正常値：Ｆ１−スコア（％）の変化における腫瘍汚染に対するロバスト性を示しており、８０倍のカバレッジの純粋な正常値および５〜１００％の腫瘍純度におけるＦ１−スコア（％）が示されている。図３０ａおよび図３０ｂでは、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−ＳにＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルが使用された。図３０ｃは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３０ｄは、異なるＩＮＤＥＬサイズの性能分析を示している。負のＩＮＤＥＬサイズは、欠失を反映している。
【図３０ｄ】腫瘍純度データセットの性能比較を示している。図３０ａは、異なるカバレッジ（１０×−３００×）および腫瘍純度（５％−１００％）にわたる異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３０ｂは、一致した正常値が５％の腫瘍で汚染された場合の一致した正常値：Ｆ１−スコア（％）の変化における腫瘍汚染に対するロバスト性を示しており、８０倍のカバレッジの純粋な正常値および５〜１００％の腫瘍純度におけるＦ１−スコア（％）が示されている。図３０ａおよび図３０ｂでは、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−ＳにＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルが使用された。図３０ｃは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３０ｄは、異なるＩＮＤＥＬサイズの性能分析を示している。負のＩＮＤＥＬサイズは、欠失を反映している。
【図３０ｅ】腫瘍純度データセットの適合率−再現率分析を示している。図３０ｅは、ＳＮＶを示し、図３０ｆは、異なるカバレッジ（１０×−３００×）および腫瘍純度（５％−１００％）にわたる異なる体細胞変異呼び出し元についてＩＮＤＥＬの精度が比較されていることを示している。
【図３０ｆ】腫瘍純度データセットの適合率−再現率分析を示している。図３０ｅは、ＳＮＶを示し、図３０ｆは、異なるカバレッジ（１０×−３００×）および腫瘍純度（５％−１００％）にわたる異なる体細胞変異呼び出し元についてＩＮＤＥＬの精度が比較されていることを示している。
【図３０ｇ】腫瘍正常滴定データセットに対する様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓトレーニング済みモデルの適合率−再現率の比較を示している。
【図３０ｈ】腫瘍正常滴定データセットに対する異なる体細胞変異検出方法およびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃネットワークトレーニングモデルのＦ１−スコア（％）性能を示している。
【図３１ａ】ライブラリ準備、ＷＥＳ、およびＡｍｐｌｉＳｅｑデータセットの性能比較を示している。図３１ａは、異なるライブラリキットおよびＤＮＡ量にわたる異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ｂは、異なるライブラリキットおよびＤＮＡ量に対する様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルの適合率−再現率の比較を示している。図３１ｃおよび図３１ｅは、異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ｄおよび図３１ｆは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ａ、図３１ｃ、および図３１ｅについて、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルがＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓに使用された。
【図３１ｂ】ライブラリ準備、ＷＥＳ、およびＡｍｐｌｉＳｅｑデータセットの性能比較を示している。図３１ａは、異なるライブラリキットおよびＤＮＡ量にわたる異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ｂは、異なるライブラリキットおよびＤＮＡ量に対する様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルの適合率−再現率の比較を示している。図３１ｃおよび図３１ｅは、異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ｄおよび図３１ｆは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ａ、図３１ｃ、および図３１ｅについて、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルがＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓに使用された。
【図３１ｃ】ライブラリ準備、ＷＥＳ、およびＡｍｐｌｉＳｅｑデータセットの性能比較を示している。図３１ａは、異なるライブラリキットおよびＤＮＡ量にわたる異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ｂは、異なるライブラリキットおよびＤＮＡ量に対する様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルの適合率−再現率の比較を示している。図３１ｃおよび図３１ｅは、異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ｄおよび図３１ｆは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ａ、図３１ｃ、および図３１ｅについて、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルがＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓに使用された。
【図３１ｄ】ライブラリ準備、ＷＥＳ、およびＡｍｐｌｉＳｅｑデータセットの性能比較を示している。図３１ａは、異なるライブラリキットおよびＤＮＡ量にわたる異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ｂは、異なるライブラリキットおよびＤＮＡ量に対する様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルの適合率−再現率の比較を示している。図３１ｃおよび図３１ｅは、異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ｄおよび図３１ｆは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ａ、図３１ｃ、および図３１ｅについて、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルがＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓに使用された。
【図３１ｅ】ライブラリ準備、ＷＥＳ、およびＡｍｐｌｉＳｅｑデータセットの性能比較を示している。図３１ａは、異なるライブラリキットおよびＤＮＡ量にわたる異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ｂは、異なるライブラリキットおよびＤＮＡ量に対する様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルの適合率−再現率の比較を示している。図３１ｃおよび図３１ｅは、異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ｄおよび図３１ｆは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ａ、図３１ｃ、および図３１ｅについて、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルがＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓに使用された。
【図３１ｆ】ライブラリ準備、ＷＥＳ、およびＡｍｐｌｉＳｅｑデータセットの性能比較を示している。図３１ａは、異なるライブラリキットおよびＤＮＡ量にわたる異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ｂは、異なるライブラリキットおよびＤＮＡ量に対する様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルの適合率−再現率の比較を示している。図３１ｃおよび図３１ｅは、異なる体細胞変異呼び出し元のＳＮＶ  Ｆ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ｄおよび図３１ｆは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３１ａ、図３１ｃ、および図３１ｅについて、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルがＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓに使用された。
【図３１ｇ】ライブラリ準備データセットにおける様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓトレーニング済みモデルの適合率−再現率の比較を示している。
【図３１ｈ】ライブラリ準備データセットにおける異なる体細胞変異検出方法およびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃネットワークトレーニングモデルのＦ１−スコア（％）性能を示している。
【図３１ｉ】ＷＥＳデータセットにおける異なる体細胞変異検出方法およびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃネットワークトレーニングモデルのＦ１−スコア（％）性能を示している。
【図３１ｊ】ＡｍｐｌｉＳｅｑデータセットにおける異なる体細胞変異検出方法およびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃネットワークトレーニングモデルのＦ１−スコア（％）性能を示している。
【図３２ａ】ＦＦＰＥデータセットの性能比較を示している。図３２ａおよび図３２ｂは、１６個のＦＦＰＥ  ＷＧＳ複製における性能を示している。図３２ｃおよび図３２ｄは、１４個のＦＦＰＥ  ＷＥＳ複製における性能を示している。図３２ａおよび図３２ｃは、ＦＦＰＥおよび新鮮な正常サンプルにわたる異なる体細胞変異呼び出し元のＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３２ｂおよび図３２ｄは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３２ｂは、ＦＦＰＥおよび新鮮な正常を使用した異なる体細胞変異呼び出し元についての１６個のＦＦＰＥ  ＷＧＳ複製の適合率−再現率プロットを示している。図３２ａおよび図３２ｃについて、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルがＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓに使用された。
【図３２ｂ】ＦＦＰＥデータセットの性能比較を示している。図３２ａおよび図３２ｂは、１６個のＦＦＰＥ  ＷＧＳ複製における性能を示している。図３２ｃおよび図３２ｄは、１４個のＦＦＰＥ  ＷＥＳ複製における性能を示している。図３２ａおよび図３２ｃは、ＦＦＰＥおよび新鮮な正常サンプルにわたる異なる体細胞変異呼び出し元のＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３２ｂおよび図３２ｄは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３２ｂは、ＦＦＰＥおよび新鮮な正常を使用した異なる体細胞変異呼び出し元についての１６個のＦＦＰＥ  ＷＧＳ複製の適合率−再現率プロットを示している。図３２ａおよび図３２ｃについて、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルがＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓに使用された。
【図３２ｃ】ＦＦＰＥデータセットの性能比較を示している。図３２ａおよび図３２ｂは、１６個のＦＦＰＥ  ＷＧＳ複製における性能を示している。図３２ｃおよび図３２ｄは、１４個のＦＦＰＥ  ＷＥＳ複製における性能を示している。図３２ａおよび図３２ｃは、ＦＦＰＥおよび新鮮な正常サンプルにわたる異なる体細胞変異呼び出し元のＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３２ｂおよび図３２ｄは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３２ｂは、ＦＦＰＥおよび新鮮な正常を使用した異なる体細胞変異呼び出し元についての１６個のＦＦＰＥ  ＷＧＳ複製の適合率−再現率プロットを示している。図３２ａおよび図３２ｃについて、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルがＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓに使用された。
【図３２ｄ】ＦＦＰＥデータセットの性能比較を示している。図３２ａおよび図３２ｂは、１６個のＦＦＰＥ  ＷＧＳ複製における性能を示している。図３２ｃおよび図３２ｄは、１４個のＦＦＰＥ  ＷＥＳ複製における性能を示している。図３２ａおよび図３２ｃは、ＦＦＰＥおよび新鮮な正常サンプルにわたる異なる体細胞変異呼び出し元のＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３２ｂおよび図３２ｄは、様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）の比較を示している。図３２ｂは、ＦＦＰＥおよび新鮮な正常を使用した異なる体細胞変異呼び出し元についての１６個のＦＦＰＥ  ＷＧＳ複製の適合率−再現率プロットを示している。図３２ａおよび図３２ｃについて、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０トレーニング済みモデルがＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓに使用された。
【図３２ｅ】ＦＦＰＥ  ＷＧＳデータセットにおける異なる体細胞変異検出方法およびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃネットワークトレーニングモデルのＦ１−スコア（％）性能を示している。
【図３２ｆ】ＦＦＰＥ  ＷＥＳデータセットにおける様々な体細胞変異検出方法およびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃネットワークトレーニングモデルのＦ１−スコア（％）性能を示している。
【図３３ａ】（図３３ａ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよび（図３３ｂ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓを使用した異なるデータセットからの９個の複製についての標的サンプルに対するトレーニングの影響を分析するチャートである。各サンプルについて、以下の２つのサンプル固有のモデルが使用された：一方は、標的サンプルに対してのみトレーニングされ、他方は、ＳＥＱＣ−ＷＧＳスパイクモデルからのトレーニングデータの１０％が追加されている。
【図３３ｂ】（図３３ａ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよび（図３３ｂ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓを使用した異なるデータセットからの９個の複製についての標的サンプルに対するトレーニングの影響を分析するチャートである。各サンプルについて、以下の２つのサンプル固有のモデルが使用された：一方は、標的サンプルに対してのみトレーニングされ、他方は、ＳＥＱＣ−ＷＧＳスパイクモデルからのトレーニングデータの１０％が追加されている。
【図３３ｃ】ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−スパイクモデルおよび２つのサンプル固有のＮｅｕＳｏｍａｔｉｃネットワークトレーニング済みモデルのＦ１−スコア（％）性能を示している。
【図３４ａ】異なるＩＮＤＥＬサイズ、異なるＶＡＦ分布、および困難な領域での性能分析を示している。図３４ａおよび図３４ｂは、異なる呼び出し元および異なるトレーニングアプローチを使用した、ＳＥＱＣ−ＩＩデータセットにわたる異なるＩＮＤＥＬサイズの性能分析を示している。負のＩＮＤＥＬサイズは、欠失を反映している。
【図３４ｂ】異なるＩＮＤＥＬサイズ、異なるＶＡＦ分布、および困難な領域での性能分析を示している。図３４ａおよび図３４ｂは、異なる呼び出し元および異なるトレーニングアプローチを使用した、ＳＥＱＣ−ＩＩデータセットにわたる異なるＩＮＤＥＬサイズの性能分析を示している。負のＩＮＤＥＬサイズは、欠失を反映している。
【図３４ｃ】異なる呼び出し元を使用した、ＳＥＱＣデータセットにわたる異なるＶＡＦ範囲を有する変異の性能分析を示している。
【図３４ｄ】異なるサイズのタンデムリピート（ＴＲ）やセグメント重複を含む困難な領域における異なる体細胞呼び出し元の性能分析を示している。
【図３５】異なる呼び出し元を使用した、ＳＥＱＣデータセットにわたる異なるＶＡＦ範囲を有する変異の性能分析を示している。
【図３６ａ】（図３６ａ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよび（図３６ｂ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの異なるトレーニングアプローチを使用した、ＳＥＱＣデータセットにわたる異なるＶＡＦ範囲を有する変異の性能分析を示している。
【図３６ｂ】（図３６ａ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよび（図３６ｂ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの異なるトレーニングアプローチを使用した、ＳＥＱＣデータセットにわたる異なるＶＡＦ範囲を有する変異の性能分析を示している。
【図３７ａ】異なる（図３７ａ）呼び出し元および（図３７ｂ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよび（図３７ｃ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの（図３７ｂおよび図３７ｃ）トレーニングアプローチを使用した、腫瘍／正常滴定データセットにおける異なるＶＡＦ範囲を有する変異の性能分析を示している。
【図３７ｂ】異なる（図３７ａ）呼び出し元および（図３７ｂ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよび（図３７ｃ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの（図３７ｂおよび図３７ｃ）トレーニングアプローチを使用した、腫瘍／正常滴定データセットにおける異なるＶＡＦ範囲を有する変異の性能分析を示している。
【図３７ｃ】異なる（図３７ａ）呼び出し元および（図３７ｂ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよび（図３７ｃ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの（図３７ｂおよび図３７ｃ）トレーニングアプローチを使用した、腫瘍／正常滴定データセットにおける異なるＶＡＦ範囲を有する変異の性能分析を示している。
【図３８】異なるサイズのタンデムリピート（ＴＲ）および異なる呼び出し元を使用したセグメント重複を含む、全ゲノム対困難なゲノム領域における性能比較を示している。
【図３９ａ】（図３９ａ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよび（図３９ｂ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの異なるサイズのタンデムリピート（ＴＲ）およびセグメント重複を含む異なる領域における異なるトレーニングアプローチの性能分析を示している。
【図３９ｂ】（図３９ａ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよび（図３９ｂ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの異なるサイズのタンデムリピート（ＴＲ）およびセグメント重複を含む異なる領域における異なるトレーニングアプローチの性能分析を示している。
【図４０ａ】（図４０ｂ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよび（図４０ｃ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの異なるトレーニングアプローチを使用した、異なるサイズのタンデムリピート（ＴＲ）およびセグメント重複を含む全ゲノム対困難なゲノム領域における性能比較を示している。
【図４０ｂ】（図４０ｂ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよび（図４０ｃ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの異なるトレーニングアプローチを使用した、異なるサイズのタンデムリピート（ＴＲ）およびセグメント重複を含む全ゲノム対困難なゲノム領域における性能比較を示している。
【図４１ａ】異なる（図４１ａ）呼び出し元および（図４１ｂ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよび（図４１ｃ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの（図４１ｂおよび図４１ｃ）トレーニングアプローチを使用した、異なるサイズのタンデムリピート（ＴＲ）および腫瘍／正常滴定データセットにおけるセグメント重複を含む困難な領域における性能分析を示している。
【図４１ｂ】異なる（図４１ａ）呼び出し元および（図４１ｂ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよび（図４１ｃ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの（図４１ｂおよび図４１ｃ）トレーニングアプローチを使用した、異なるサイズのタンデムリピート（ＴＲ）および腫瘍／正常滴定データセットにおけるセグメント重複を含む困難な領域における性能分析を示している。
【図４１ｃ】異なる（図４１ａ）呼び出し元および（図４１ｂ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよび（図４１ｃ）ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの（図４１ｂおよび図４１ｃ）トレーニングアプローチを使用した、異なるサイズのタンデムリピート（ＴＲ）および腫瘍／正常滴定データセットにおけるセグメント重複を含む困難な領域における性能分析を示している。
【図４２】ＷＧＳデータセットにおけるプライベートＦＮ呼び出しのＶＡＦ分布のバイオリン−プロットの比較を示している。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
本開示は、とりわけ、参照配列、複数の配列読み取り、および配列読み取り内の候補変異の位置を取得することと、１つ以上の配列読み取りに１つ以上のスペースを挿入することにより、拡張配列読み取りを取得することと、参照配列に１つ以上のスペースを挿入することにより、拡張参照配列を取得することと、候補変異の周りの拡張配列読み取りのセグメントをサンプル行列に変換することと、候補変異の周りの拡張参照配列のセグメントを参照行列に変換することと、トレーニング済みニューラルネットワークにサンプル行列および参照行列を提供することと、トレーニング済みニューラルネットワークの出力において、複数の配列読み取り内の変異に関連する予測データを取得することと、を含むことができる、生殖系列変異を呼び出す方法を記載している。開示されたシステムおよび方法は、生データから直接重要な変異信号をキャプチャすることを可能にし、異なるシーケンシング技術、サンプル純度、および全ゲノム対標的濃縮などのシーケンシング戦略に対して一貫して高精度を達成することを可能にする。
【００７８】
図１は、コンピューティングシステム１０２に通信可能に結合されたシーケンシング装置１１０を含む例示的なシステム１００を示している。シーケンシング装置１１０は、直接（例えば、１つ以上の通信ケーブルを介して）、または、インターネットまたはワイドエリア、ローカルエリア、有線、および／または無線ネットワークの他の任意の組み合わせとすることができるネットワーク１３０を介してコンピューティングシステム１０２に結合されることができる。いくつかの実施形態では、コンピューティングシステム１０２は、シーケンシング装置１１０に含まれるか、またはそれと統合されることができる。いくつかの実施形態では、シーケンシング装置１１０は、遺伝物質を含むサンプルをシーケンシングし、結果として得られるシーケンシングデータを生成することができる。シーケンシングデータは、コンピューティングシステム１０２に（例えば、ネットワーク１３０を介して）送信されるか、または記憶装置に記憶され、後の段階でコンピューティングシステム１０２に（例えば、ネットワーク１３０を介して）転送されることができる。いくつかの実施形態では、コンピューティングシステム１０２は、ディスプレイ１０８、およびユーザまたはオペレータ（例えば、技術者または遺伝学者）からコマンドを受信するための１つ以上の入力装置（図示せず）を含んでも含まなくてもよい。いくつかの実施形態では、コンピューティングシステム１０２および／またはシーケンシング装置１１０は、ネットワーク１３０を介してリモートでユーザまたは他の装置によってアクセスされることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される様々な方法は、コンピューティングシステム１０２上でリモートで実行されることができる。
【００７９】
コンピューティングシステム１０２は、装置の一部または全てが相互接続されることができる、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、ネットワークサーバ（例えば、ローカルサーバまたはパブリック／プライベート／ハイブリッドクラウドに含まれるサーバ）、モバイル装置などの任意のタイプの１つのコンピューティング装置またはいくつかのコンピューティング装置の組み合わせを含むことができる。コンピューティングシステム１０２は、１つ以上のプロセッサ（図示せず）を含むことができ、各プロセッサは、１つ以上のコアを有することができる。いくつかの実施形態では、コンピューティングシステム１０２は、１つ以上の汎用プロセッサ（例えば、ＣＰＵ）、グラフィックプロセッサ（ＧＰＵ）などの専用プロセッサ、デジタル信号プロセッサ、またはこれらおよび他のタイプのプロセッサの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、コンピューティングシステム内のいくつかまたは全てのプロセッサは、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）またはフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などのカスタマイズされたまたはカスタマイズ可能な回路を使用して実装されることができる。コンピューティングシステム１０２はまた、いくつかの実施形態では、コンピューティングシステム１０２に統合された、またはそうでなければ通信可能に結合された１つ以上のメモリまたはストレージ装置（図示せず）に記憶された非一時的コンピュータ可読命令を検索および実行することができる。メモリ／ストレージ装置は、様々なタイプの半導体メモリチップ（ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＳＤＲＡＭ、フラッシュメモリ、プログラム可能な読み取り専用メモリ）などを含む、非一時的コンピュータ可読記憶媒体の任意の組み合わせを含むことができる。磁気ディスクおよび／または光ディスクも使用可能である。メモリ／ストレージ装置は、読み取り可能および／または書き込み可能であり得るリムーバブル記憶媒体を含むことができ、そのような媒体の例は、コンパクトディスク（ＣＤ）、読み取り専用デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ−ＲＯＭ、２層ＤＶＤ−ＲＯＭなど）、読み取り専用および記録可能なＢｌｕ−ｒａｙ（登録商標）ディスク、超高密度光ディスク、フラッシュメモリカード（ＳＤカード、ミニＳＤカード、マイクロＳＤカードなど）などを含む。いくつかの実施形態では、データおよび他の情報（例えば、配列データ）は、１つ以上の遠隔場所、例えば、クラウドストレージに記憶され、システム１００の他のコンポーネントと同期されることができる。
生殖細胞変異呼び出し
【００８０】
図２ａは、いくつかの実施形態にかかる、生殖系列変異呼び出しの例示的な方法２００を示している。方法２００は、例えば、ソフトウェア（すなわち、例えば、コンピューティングシステム１０２の１つ以上のプロセッサによってアクセスおよび実行可能である１つ以上の非一時的媒体に記憶された命令のセット）の形態で、またはファームウェア、ハードウェア、またはそれらの任意の組み合わせの形態で実装されることができる。
【００８１】
方法２００は、参照配列を取得することができるステップ２１０において開始することができる。参照配列は、例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって構築されたヌクレオチド塩基配列のオープンアクセスの注釈付きおよびキュレートされたコレクションである参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）などの１つ以上のプライベートまたはパブリックリポジトリ、または異なる生物の完全なゲノムのセットを記憶するＮＣＢＩ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  ＦＴＰサイトから取得されることができる。いくつかの実施形態では、参照配列の特定のコピーは、ローカルに（例えば、コンピューティングシステム１０２のメモリに）記憶されることができるが、他の実施形態では、参照配列は、例えば、ネットワーク１３０を介してリモートサーバから取得されることができることを理解されたい。さらにまた、いくつかの実施形態では、参照配列全体を取得することができ、他の実施形態では、参照配列の１つ以上のセクション−例えば、特定のアッセイである／特定のアッセイに関連するセクションのみを取得することができる。したがって、本明細書で使用される「参照配列」は、一般に、参照配列の１つ以上のセクションを指し、これは、参照配列全体を含んでも含まなくてもよい。
【００８２】
ステップ２２０において、シーケンシング装置１１０によってシーケンシングされた遺伝子サンプル（例えば、患者のＤＮＡまたはＲＮＡ材料を含むサンプル）に対応する複数の配列読み取りを取得することができる。上記のように、配列読み取りは、シーケンシング装置１１０から直接、またはコンピューティングシステム１０２に通信可能に結合された１つ以上のローカルもしくはリモートの揮発性もしくは不揮発性メモリ、ストレージ装置、またはデータベースから取得されることができる。取得された配列読み取りは、既に前処理されている（例えば、事前位置合わせされている）可能性があるか、または「生」である可能性があり、その場合、方法２００は、前処理（例えば、事前位置合わせ）ステップ（図示せず）も含むことができる。また、いくつかの実施形態では、（シーケンシング装置１１０によって生成されるような）配列読み取り全体を取得することができるが、他の実施形態では、配列読み取りのセクションのみを取得することができる。したがって、本明細書で使用される「配列読み取りの取得」は、一般に、１つ以上の（例えば、隣接する）配列読み取りの１つ以上のセクションを取得することを指す。
【００８３】
ステップ２３０において、読み取られた配列内の複数の候補変異位置を取得することができる。いくつかの実施形態では、これは、複数の取得された配列読み取りをスキャンし、それらを取得された参照配列と比較し、あるタイプの変異（例えば、挿入または欠失変異（ＩＮＤＥＬ）、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、または構造変異（ＳＶ））を含むように見える配列読み取り内の１つ以上の位置のセットを判定することを含む。候補変異位置の検索は、例えば、参照内の全ての位置をチェックし、配列読み取りの少なくとも１つが参照と異なる位置を判定することを含むことができる。候補位置を判定する際に、例えば、特定の位置が候補変異位置と見なされるために参照とは異なる必要がある読み取りの数またはパーセンテージに対するフィルタであるいくつかのフィルタを使用することもできる。他の実施形態では、配列読み取りは、（例えば、別個のソフトウェアおよび／またはハードウェアモジュールによって）既にスキャンおよび分析されることができ、その場合、複数の候補位置は、コンピューティングシステム１０２に結合されたメモリまたはデータベースから取得されることができる。ステップ２４０において、方法は、複数の特定された候補変異位置から次の候補変異位置に進むことができる。
【００８４】
ステップ２５０において、現在の候補変異位置の周りの配列読み取りおよび参照配列は、正確なマルチプル位置合わせ（ＭＳＡ）を達成するために拡張される。このステップは、複数の例示的な配列読み取り３１１、例示的な参照配列３１０、および例示的な候補変異位置３５０を示す図３と併せてよりよく説明することができる。図３に示されるように、参照配列３１０および配列読み取り３１１を拡張することは、参照配列３１０内および／または１つ以上の配列読み取り３１１内に１つ以上のギャップまたはスペース（例えば、スペース３２５）を挿入することを含むことができ、それにより、拡張参照配列３２０および拡張参照配列３２０に正確に位置合わせされた複数の拡張配列読み取り３２１を生成する。
【００８５】
具体的には、図３に示されるように、いくつかの実施形態では、拡張は、以下を含むことができる：特定の配列で挿入塩基を判定または検出すること、参照サンプルの挿入塩基の位置にスペースを挿入すること、同じ位置（いくつかの場合、挿入が検出された特定の配列読み取り以外の全ての配列読み取りに対応する）で挿入が検出されなかった全ての配列読み取りの同じ位置にスペースを挿入すること、および、読み取られた各配列において検出された挿入塩基ごとにプロセスを繰り返すこと。２塩基以上の潜在的な挿入が検出された場所では、それぞれ２つ以上のスペースを挿入できることが理解される。最後に正確なマルチプル位置合わせ（ＭＳＡ）を達成することができるように、配列読み取りおよび参照配列にスペースを挿入するために他の適切な技術を使用することができること、すなわち、拡張配列読み取り内の全ての塩基（または少なくとも欠失または挿入が発生しなかった場所）は、相互におよび拡張参照配列に正確に位置合わせされることが理解される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、拡張はまた、読み取られた特定の配列において欠失した塩基を検出し、潜在的な欠失変異の位置において読み取られたその配列にスペースを挿入することを含むことができる。欠失塩基が検出された場合、参照配列を拡張する必要がないことを理解されたい。
【００８７】
「スペースの挿入」は、配列読み取りおよび参照配列が記憶されるメモリの実際の変更を含んでも含まなくてもよく、代わりに、同じ最終結果を達成する他の動作（例えば、方法２００の他のステップ）の固有のまたは暗黙の部分としてもよいことがさらに理解される。例えば、配列読み取りおよび参照配列の元の場所を変更する代わりに、配列読み取りおよび参照配列を、新たなコピーにスペースを全ての正しい位置に記憶させるような方法で、元の場所から別のメモリ位置に選択的にコピーすることができる。本明細書で使用される「スペースを記憶する」は、４つのタイプのヌクレオチド塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＧ）に対応する４つの値以外の任意のランダムまたは事前定義された値（例えば、０）を記憶することを意味することができる。別の例として、スペースは、いずれのステップでも物理的に挿入されない場合があるが、以下で説明するように、配列が読み取られて参照配列がカウント行列に変換されるときにアルゴリズム的に考慮されることができる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、候補変異位置の周りの配列読み取りおよび参照配列を拡張することは、候補変異位置を含む可変または事前定義された長さの一部のみを拡張することを意味することができる。しかしながら、他の実施形態では、利用可能な配列読み取りおよび参照配列の全長を一度に拡張することができ、その場合、ステップ２５０は、一度だけ（例えば、ステップ２４０の前さらにはステップ２３０の前）実行されることができ、全ての候補変異位置に対して繰り返されることはできない。
【００８９】
ステップ２６０において、拡張配列読み取りのセグメント（すなわち、ウィンドウ）をサンプル行列に変換（または「要約」）することができる。セグメントは、固定長にすることができ、候補変異位置を中央に配置する場合と配置しない場合がある。例えば、図３に示される例では、拡張セグメントは、１６列（位置）の長さであり、候補変異位置３５０の左側に７列および右側に８列を含み、候補変異位置３５０を実質的に拡張セグメントの中央に配置する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、サンプル行列は、変換されるセグメントと同じ数の列を有するカウント行列とすることができる。行列は、ヌクレオチド塩基のタイプ（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ）ごとに１つの行を含むことができ、各行は、拡張配列読み取り内の各位置（列）にそれぞれのヌクレオチド塩基が出現した回数を表す。図３の例を参照すると、サンプル行列３３１の行「Ａ」は、値「６００００００３０６５２００００」を含み、これは、ベース「Ａ」が、拡張読み取りのセグメント内の最初の位置に６回、８番目の位置に３回、１０番目の位置に６回、１１番目の位置に５回、１２番目の位置に２回、セグメント内の他の位置に０回（表示されなかった）出現したことを示す。
【００９１】
いくつかの実施形態では、サンプル行列はまた、拡張配列読み取り内の各位置にスペース（図３では「−」として表される）が現れた回数を表す行を含むことができる。例えば、図３では、サンプル行列３３１の最初の行（「−」としてマークされる）は、値「０００００１４０００１４００００」を含み、これは、拡張配列読み取りが、それぞれセグメント内の位置６、７、１１、および１２に１つ、４つ、１つ、および４つのスペースを含むことを示す。図３の例では、スペース行「−」が行列の最初の行として示されているが、他の実施形態では、スペース行は、行列内の他の場所（例えば、最後）に配置されることができることを理解されたい。行／列表記は、任意であり、他の実施形態では表記を逆にすることができ、これは、サンプル行列が５つの列（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、−）およびセグメントの長さに対応する行数を有することができることを意味することも理解されたい。したがって、行列は、一般に、少なくとも５つの「ライン」（行または列）、各ヌクレオチドタイプのカウントを表す１つのライン、および拡張配列読み取り内のスペースカウントを表す少なくとも１つのラインを有すると記述されることができる。
【００９２】
ステップ２７０において、配列読み取りのセグメントに対応する拡張参照配列のセグメントは、同様に、サンプル行列と同じ次元を有する参照行列に変換されることができる。例えば、図３では、拡張参照３２０は、参照行列３３０に変換される。サンプル行列３３１と同様に、参照行列３３０は、拡張参照配列内の各位置での各タイプのヌクレオチドの出現数を示す４つの行と、拡張参照配列内の各位置でのスペースの数を示すスペース行とを有することができる。しかしながら、他の実施形態では、参照マトリックス３３０は、図３に示されるものとは異なる参照配列の異なる塩基の異なる要約／表現を有することができることが理解される。
【００９３】
図３に示される実施形態では、参照行列３２０はまた、サンプル行列３３１と同じ範囲の値を有するように正規化される。図３に示されるように、正規化は、各カウントに、配列読み取りの総数（この例では、６）などの正規化係数を掛けることを含むことができる。他の実施形態では、参照行列を正規化する代わりに、正規化をサンプル行列、または双方の行列に対して実行できることが理解される。さらに他の実施形態では、行列は、正規化する必要が全くない場合がある。ステップ２７０は、ステップ２６０に続く必要はなく、いくつかの実施形態では、ステップ２６０の前に、または並行して実行できることも理解されたい。
【００９４】
ステップ２８０において、参照行列およびサンプル行列をトレーニング済み深層ニューラルネットワークへの入力として提供することができ、ステップ２９０において、トレーニング済み深層ニューラルネットワークの出力を取得することができ、出力は、以下により詳細に説明するように、サンプル行列によって表される配列読み取りに含まれる変異に関連する様々な予測を含むことができる。
【００９５】
また、反対に明確に示されない限り、方法２００のステップの数および順序は、図２ａに示されるようなステップの数および順序に必ずしも限定されないことが当業者によって理解されるべきである。したがって、異なる実施形態では、方法２００のいくつかのステップは、並べ替えられるか、または並行して実行されることができ、一部のステップは、任意にすることも省略してもよく、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、いくつかの追加のステップを追加することができる。
【００９６】
例えば、図２ｂは、ステップ２１０’において、参照配列および複数の対応する配列読み取りが取得される別の実施形態を示している。参照配列および複数の対応する配列読み取りは、任意の順序で（すなわち、順次または同時に）取得されることができる。次に、ステップ２２０’において、参照配列および複数の対応する配列読み取りが位置合わせされる。いくつかの実施形態では、参照配列および複数の対応する配列読み取りは、位置合わせされたフォーマットで取得されることができ、これは、第１の位置合わせステップを実行する必要性を排除することができる。ステップ２３０’において、候補変異位置が、位置合わせされた配列読み取りおよび参照配列から特定される。ステップ２４０’において、配列読み取りおよび／または参照配列は、上記と同じ方法で（すなわち、挿入および／または欠失を構成するためにギャップを挿入することによって）、複数の配列読み取りと参照配列との第２の位置合わせを達成するために、候補変異位置の周りに拡張される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、候補変異位置のいずれかにおける約２から５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個の塩基のウィンドウは、拡張および位置合わせされることができる。いくつかの実施形態では、候補変異位置のいずれかの側における少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００の塩基のウィンドウは、拡張および位置合わせされることができる。いくつかの実施形態では、候補変異位置の両側における約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００の塩基が拡張および位置合わせされることができる。
【００９８】
次に、ステップ２５０’において、拡張参照配列からの候補変異位置の参照行列と、複数の拡張配列読み取りからの候補変異位置のサンプル行列が生成される。上記のように、行列は、各配列位置での各塩基またはギャップ（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはギャップ）の頻度を含む。ステップ２６０’において、参照行列およびサンプル行列は、トレーニング済みニューラルネットワークに入力される。
【００９９】
ステップ２７０’において、ニューラルネットワークは、変異タイプが候補変異位置に存在するかどうかを判定する。例えば、ニューラルネットワークは、参照行列およびサンプル行列を処理し、変異タイプ、サイズ、および位置を判定する１つ以上の分類器および回帰器（すなわち、変異タイプの分類器、長さ分類器、および位置回帰器）によって処理される出力を生成する複数の畳み込み層を含むことができる。いくつかの実施形態では、ニューラルネットワークは、最大約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００層を含むことができる。いくつかの実施形態では、畳み込み層は、ブロックに構造化されることができる。いくつかの実施形態では、ブロックの数は、層の数の約半分である。
【０１００】
参照配列および対応する配列読み取りが複数の変異候補位置を含む場合、ステップ２３０’から２６０’を各変異候補位置に対して繰り返すことができる。さらに、追加の参照配列および追加の対応する配列読み取りを取得することにより、ステップ２１０’から２６０’を繰り返すことができる。
【０１０１】
図２ａおよび図２ｂに示される例は、生殖細胞変異の呼び出しのセクションで説明されているが、これらの例は、体細胞変異の呼び出しに適合させることができる。逆に、体細胞変異の呼び出しのセクションで説明されている実施形態は、生殖細胞変異の呼び出しにも適合させることができる。例えば、図２ｂに記載されている複数の配列読み取りは、正常配列読み取りおよび腫瘍配列読み取りの２つのグループに細分類されることができる。正常配列読み取りは、被検体からの正常組織のサンプルから取得されることができる一方で、腫瘍配列読み取りは、被検体からの腫瘍組織のサンプルから取得されることができる。単一のサンプル行列を生成する代わりに、正常行列および腫瘍行列が参照行列とともに生成される。方法の残りの部分も同様に進行する。
【０１０２】
図４は、参照行列３３０およびサンプル行列３３１が（以下に説明する他の任意の入力とともに）トレーニング済み深層ニューラルネットワーク３５０に供給され、サンプル行列３３１によって表される配列読み取りに関連する１つ以上の予測を出力する例示的な実施形態を示している。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ネットワーク３５０は、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）とすることができ、その例示的な例が図５に示されている。図５に示されるように、ネットワーク３５０は、最終的に第１の完全に接続された層５２０Ａに供給され、その出力が様々な予測を出力する４つの別個の完全に接続された層５２０Ａ〜５２０Ｃに供給される複数の直列接続された畳み込み層（５１０Ａ〜５１０Ｉ）を含むことができる。図５の例では、異なる畳み込み層５１０は、異なるフィルタサイズ（例えば、１×３、３×３、または５×５）を有することができ、修正線形ユニット（ＲｅＬＵ）、プーリング層、バッチ正規化（ＢＮ）層など、追加の処理層（明示的に示されていない）を介して相互接続されることができる。さらにまた、図５に示されるように、いくつかの実施形態では、特定の層への入力は、ネットワークのより深い層において信号を維持するのを助けるために、アイデンティティショートカット接続５１５を介して後続の層の出力に接続されることができる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ネットワーク３５０は、拡張配列読み取りのセグメント内の候補変異に関連する１つ以上の予測を出力することができる。図５の例に示されているように、そのような予測の１つは、完全に接続された層５２０Ｂの出力において取得されることができ、候補変異位置が変異に対応するかどうか、もしそうであれば、その変異のタイプを示すことができる。より具体的には、いくつかの実施形態では、予測は、以下の４つの可能なタイプの変異に関連する少なくとも４つの確率値を含むことができる：ＮＯＮＥ（変異なし、すなわち偽陽性の呼び出し）；ＳＮＰ／ＳＮＶ（一塩基多型／変異）；ＩＮＳ（挿入変異）；およびＤＥＬ（欠失変異）。これらの確率値に基づいて、どのタイプの変異が最も可能性が高いか、および特定の予測の信頼レベルを判定することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ニューラルネットワーク３５０はまた、サンプル行列３３１によって表される拡張配列読み取りのセグメント内の変異の予測位置を出力することもできる（例えば、完全に接続された層５２０Ｃの出力において）。他の実施形態では、この出力は省略されることができ、上記のように配列読み取りのセグメントが所与の候補変異に対して選択される方法に基づいて、変異の位置が既知である（例えば、セグメントの中心において）と仮定することができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ニューラルネットワーク３５０はまた、変異の予測長を出力することができる（例えば、完全に接続された層５２０Ｄの出力において）。例えば、予測される変異が１塩基長の場合、「１」の長さを出力することができ（例えば、ＳＮＰ変異または１塩基のＤＥＬまたはＩＮＳ変異）、予測される変異が２塩基長のＤＥＬまたはＩＮＳ変異である場合、長さ「２」を出力することができる、などである。いくつかの実施形態では、出力が、変異が２塩基長以上であることを示している場合、後処理ステップは、挿入または欠失されている正確な配列を解決することができる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ニューラルネットワーク３５０はまた、例えば、１）ホモ接合参照（非変異）、２）ヘテロ接合変異（母方または父方のコピーの１つのみが変異を有する場合）、３）ホモ接合変異（双方のコピーが同じ変異を有する場合）、または４）その他（各コピーが異なる変異を有する場合）である変異を有する確率を表す、変異に関連する予測されたゲノムタイプを出力することができる（例えば、完全に接続された層５２０Ｅの出力において）。他の実施形態では、これらの出力のいくつかを省略することができ、および／または追加の出力を追加することができることが理解される。
【０１０８】
ここで、ネットワークの入力を参照すると、上記の参照行列３３０およびサンプル行列３３１に加えて、いくつかの実施形態では、予測の精度をさらに改善するため、および／またはネットワークの出力において取得することができる情報の量を拡大するために、他の入力を提供することができる。図４の例に示されているように、追加の入力は、例えば、変異位置行列３４０、カバレッジ行列３４３、および１つ以上の位置合わせ特徴行列３４４を含むことができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、全ての入力行列は、１つの大きな３次元行列としてネットワーク３５０に提供されることができる。行列の次元は、例えば５×ｓ×ｋとすることができ、５は行／列の数（−、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）に対応し、ｓはセグメントの長さに対応し（例えば、１６）、ｋは、上記の異なる２次元（例えば、５×ｓ）行列の数に対応する。いくつかの実施形態では、ｋは、３０まで、またはそれ以上とすることができる。
【０１１０】
変異位置行列３４０は、参照行列およびサンプル行列内の候補変異位置の２次元表現を含むことができる。例えば、行列は、５つの行（−、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）を有することができ、各列は、セグメント内の位置を表すことができる。例えば、変異位置行列３４０は、候補変異位置に対応する列の全ての行に１つの値（例えば、１）を含むことができ、他の全ての列の全ての行に別の値（例えば、０）を含むことができる。
【０１１１】
カバレッジ行列３４３は、配列読み取りの特定のセグメントのカバレッジまたは深さを表すことができる。例えば、いくつかの実施形態では、カバレッジ行列３４３は、その全ての要素に同じ値を含むことができ、その値は、セグメント内の異なる読み取りのカバレッジ／深さ（例えば、平均カバレッジ／深さ）を表す。他の実施形態では、カバレッジ行列３４３は、異なる列での異なる値を含むことができ、各値は、各列でのそれぞれのカバレッジ／深さを表す。位置合わせ特徴行列３４４は、配列読み取りの品質およびそれらの位置合わせに関連する様々なメトリックを表すことができる。そのようなメトリックは、例えば、基本品質、マッピング品質、ストランドバイアス、クリッピング情報などを含むことができる。これらの位置合わせ特徴は、例えば、配列塩基および／またはそれらのマッピングの品質についてネットワークに通知することにより、配列読み取りにより多くのコンテキストを提供することにより、予測精度を向上させるのに役立つことができる。ネットワーク３５０への追加の入力（簡潔にするために図示されていない）は、既知の変異に関連する様々なデータを含むことができる。そのようなデータは、例えば、ｄｂＳＮＰ、ＣＯＳＭＩＣ、ＥｘＡＣなどのパブリックおよび／またはプライベート知識ベースから取得されることができる。
【０１１２】
図５は、ネットワーク３５０の１つの例示的な構成のみを示し、本開示の範囲および精神から逸脱することなく、他の適切な構成／アーキテクチャを有するニューラルネットワークを使用して、拡張配列読み取り（サンプル行列によって表される）を分析し、変異のタイプおよびその他の特性を予測することができることを示すことが理解される。そのような代替構成は、より少ない層、追加の層、異なるパラメータを有する層、追加の入力または出力、より少ない入力または出力などを含むことができる）。さらに、いくつかの実施形態では、ネットワーク３５０は、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）ではなくてもよく、代わりに、本開示の範囲および精神から逸脱することなく、別のタイプの深層ニューラルネットワーク（ＤＮＮ）、すなわち、入力層と出力層との間に複数の層を有する別のタイプの人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）とすることができる。
体細胞変異呼び出し
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ニューラルネットワーク３５０はまた、体細胞変異呼び出しを実行するようにトレーニングされることができる。図６は、トレーニング済みニューラルネットワーク３５０を使用する体細胞変異呼び出しのための例示的な方法６００を示している。
【０１１４】
ステップ６１０において、方法６００は、例えば、方法２００のステップ２１０に関連して上記に記載されたものと同様の方法で、参照配列を取得することを含む。ステップ６２０において、方法６００は、複数の腫瘍配列読み取りおよび複数の対応する正常（非腫瘍）配列読み取りを取得することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、腫瘍配列読み取りは、患者の腫瘍（癌性）組織のシーケンシング結果を含むことができ、正常配列読み取りは、同じ患者から採取された正常（非癌性）組織のシーケンシング結果を含むことができる。他の実施形態では、正常配列読み取りは、異なる患者から採取された正常組織のシーケンシング結果を含むことができる。双方のタイプの配列読み取りは、例えば、方法２００のステップ２２０に関連して上記で説明されたのと同様の方法で取得されることができる。
【０１１５】
ステップ６３０において、複数の候補体細胞変異位置は、−メモリまたはパブリック／プライベートデータベース、ホワイトリスト候補位置のセットから事前に判定された変異位置を取得することによって、または例えば、方法２００のステップ２３０に関連して上述した方法での腫瘍配列読み取りと参照配列との間の比較を実行することによって−取得されることができる。
【０１１６】
ステップ６４０において、方法は、複数の候補体細胞変異位置のうちの１つに進む。ステップ６６０において、候補体細胞変異位置の周りの正常配列読み取りのセグメントが、正常サンプル行列に変換される。同様に、ステップ６６５において、候補体細胞変異位置の周りの腫瘍配列読み取りのセグメント（長さおよび位置が正常配列読み取りのセグメントに実質的に対応する）が腫瘍サンプル行列に変換される。ステップ６７０において、候補体細胞変異位置の周りの参照配列のセグメント（長さおよび位置が正常配列読み取りのセグメントに実質的に対応する）が参照行列に変換される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、上記の３つのセグメントがそれらのそれぞれの参照行列に変換される前に、それらのそれぞれは、方法２００のステップ２５０に関連して上記の拡張技術を使用して拡張されることができる。他の実施形態では、行列に変換する前に、セグメントに対して異なるタイプの拡張技術を実行することができ、例えば、長さＬ＞ｋのホモポリマーが長さｋに折り畳まれる場合、ｋ−ｍｅｒ折り畳みアプローチを使用することができ、ｋは１以上の任意の数である。さらに他の実施形態では、拡張ステップは、完全に省略されることができ、元の未処理の配列読み取りおよび参照配列は、それらのそれぞれの行列に直接変換されることができる。
【０１１８】
図７に示される例では、方法２００のステップ２５０において実行されるものと同様の拡張が実行される。この例では、参照配列３１０、腫瘍配列読み取り３１１−Ａ、および正常配列読み取り３１１−Ｂのセグメントが最初に拡張されて、拡張参照配列３２０、拡張腫瘍配列読み取り３２１−Ａ、および拡張正常配列読み取り３２１−Ｂを生成し、次に、それぞれ、参照行列３３０、腫瘍サンプル行列３３１−Ａ、および正常サンプル行列３３１−Ｂにそれぞれ変換される。
【０１１９】
ここで方法６００に戻ると、ステップ６８０において、３つの行列がトレーニング済みニューラルネットワークに供給され（入力として提供され）、ステップ６９０において、トレーニング済みニューラルネットワークの出力が取得され、出力は、腫瘍配列読み取りに含まれる体細胞変異タイプの少なくとも予測（確率的推定）（例えば、候補体細胞変異位置またはその周辺）を含む。
【０１２０】
図８は、体細胞変異呼び出しに使用されているトレーニング済みニューラルネットワーク３５０の例示的な図を示している。この例では、ネットワーク３５０は、その入力参照行列３３０、腫瘍サンプル行列３３１−Ａ、および正常サンプル行列３３１−Ｂを受信する。
【０１２１】
図８は、ネットワーク３５０に入力される３つのタイプの行列全てを示しており、いくつかの実施形態では、参照行列３３０および／または正常サンプル行列３３１−Ｂは、省略されることができ、ネットワーク３５０に提供されることができず、ネットワーク３５０は、依然として体細胞変異呼び出しを実行することができる。正常サンプル行列が省略される実施形態では、正常配列読み取りの取得は、方法６００のステップ６２０から省略されることができ、正常配列読み取りを行列に変換するステップ６６０は、完全に省略されることができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、予測の精度をさらに改善するため、および／またはネットワークの出力において取得されることができる情報の量を拡大するために、ネットワークはまた、候補体細胞変異の位置を表す体細胞変異位置行列３４０、腫瘍配列読み取りおよび正常配列読み取りセグメントのそれぞれのカバレッジを表す腫瘍カバレッジ行列３４３−Ａおよび正常カバレッジ行列３４３−Ｂ、および１つ以上の位置合わせ特徴行列３４４などの追加の行列を入力として受信することができ、行列は、図４に関連して上記で説明したのと同様の方法で配列読み取りの様々な特徴を表す。さらに、図８には示されていないが、簡潔にするために、いくつかの実施形態では、既知の変異に関連するデータは、ｄｂＳＮＰ、ＣＯＳＭＩＣ、ＥｘＡＣなどのパブリックおよび／またはプライベート知識ベースから取得され、ネットワーク３５０への入力として提供されることができる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、体細胞変異呼び出しの精度をさらに改善するために、ニューラルネットワーク３５０にはまた、その入力において１つ以上の他の呼び出し元特徴行列３４５が提供されることができる。これらの行列は、配列読み取りの同じセグメントを既に処理した１つ以上の他の（例えば、サードパーティの）変異呼び出しアプリケーションまたはアルゴリズムから取得した１つ以上の特徴を表す（例えば、要約する）ことができる。そのような特徴は、他のアプリケーション／アルゴリズムによって予測された変異タイプ、長さ、位置、品質スコア、マッピングスコア、変異有意性スコア、および他の位置合わせ特徴を含む。図４に関連して上述したように、いくつかの実施形態では、ネットワーク３５０に供給される全ての入力行列は、「結合」され、１つの大きな３次元行列として提供されることができる。
【０１２４】
図９は、上記の様々な入力を受信し、その入力として体細胞サンプル行列３３１−Ａによって表される体細胞配列読み取りのセグメント内に含まれる体細胞変異の少なくとも変異タイプ、位置、および長さを示す予測を出力する例示的なトレーニング済みニューラルネットワーク３５０を示している。いくつかの実施形態では、ネットワーク３５０はまた、変異のゲノムタイプを出力する完全に接続された層５２０Ｅ（図５に示される）を含むことができるが、ゲノムタイプを呼び出す体細胞変異の場合、重要ではなく、したがってネットワークから省略されることができる。
【０１２５】
図９および図５の例に基づいて、いくつかの実施形態では、同じまたは実質的に同じアーキテクチャを有するネットワーク３５０を使用して、ネットワークがトレーニングされたデータのタイプに応じて（以下に説明するように）およびそれに提供される入力のタイプに応じて、生殖細胞系列および体細胞変異の双方を予測することができることが理解される。しかしながら、いくつかの実施形態では、ネットワーク３５０のアーキテクチャは、生殖細胞系列または体細胞変異呼び出しのいずれかのために修正および最適化されることができる。
ニューラルネットワークトレーニング
【０１２６】
ニューラルネットワーク３５０が正確な生殖細胞系列または体細胞変異の呼び出しを実行し始める前に、最初に生殖細胞系列または体細胞のトレーニングデータ（すなわち、トレーニング配列）についてそれぞれトレーニングする必要があることが当業者によって理解される。トレーニングは、例えば、多数のトレーニング配列に対して方法２００または６００の全てのステップを実行することだけでなく、「バックプロパゲーション」と呼ばれるプロセスを実行するたびに、トレーニング可能なフィルタやその他のトレーニング可能なパラメータを調整することによって、ネットワークが出力エラーを徐々に最小化することができるように、ネットワークに「グラウンドトゥルース」データ（例えば、実際の既知の変異タイプとそれらの位置、長さ、ゲノムタイプなど）を提供することを含むことができる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、ネットワーク３５０は、ＮＡ１２８７８ゲノムなどの十分に特徴付けられたグラウンドトゥルース変異を有するゲノム上でトレーニングされることができる。いくつかの実施形態では、実際のゲノムの代わりに、または実際のゲノムに加えて、様々なシミュレーションベースの戦略を使用して、ネットワークをトレーニングすることができる。例えば、生殖細胞系列変異呼び出しのためにネットワークをトレーニングするために、Ｍｕ，Ｊ．Ｃ．ら（「ＶａｒＳｉｍ：ａ  ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３１，１４６９−１４７１（２０１５））に記載されている方法を使用して、特定の変異のセットを含む合成サンプルをシミュレートすることができる。別の例として、体細胞変異呼び出しのためにネットワークをトレーニングするために、例えば、Ｅｖｉｎｇ，Ａ．ら（「Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｒｏｗｄｓｏｕｒｃｉｎｇ  ｔｏ  ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｖａｒｉａｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１５））に記載された方法を使用して、ランダム変異がスパイクされた正常サンプルを供給することができる。代替的に、または追加的に、異なる比率の２つの異なる正常な生殖細胞系列サンプルを混合して、合成腫瘍／正常トレーニングサンプルを生成することができる。別の例として、異なる位置にある２つの生殖細胞系列サンプル間で読み取りを切り替えることにより、望ましい対立遺伝子頻度分布を有する仮想腫瘍／正常トレーニングサンプルを生成することができる。
実施例１
【０１２８】
序文
【０１２９】
体細胞変異は、癌の発生、進行、および治療における重要な兆候である。体細胞変異の正確な検出は、腫瘍−正常交差汚染、腫瘍の不均一性、シーケンシングアーティファクト、およびカバレッジのために困難である。一般に、前述の問題によって導入された偽陽性呼び出しを効果的にフィルタリングし、低対立遺伝子頻度（ＡＦ）で発生したり、低複雑度領域で発生したりする可能性のある、キャッチしにくい真陽性呼び出しを正確に維持することは、正確な体細胞変異検出アルゴリズムにとって重要である。
【０１３０】
これまで、ＭｕＴｅｃｔ２１、ＭｕＳＥ２、ＶａｒＤｉｃｔ３、ＶａｒＳｃａｎ２４、Ｓｔｒｅｌｋａ２５、ＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒ６など、体細胞変異検出の問題に対処するための様々なツールが開発されてきた。これらのツールは、異なる統計的およびアルゴリズム的アプローチを採用しており、これは、それらが設計された特定の癌またはサンプルタイプでうまく機能する。しかしながら、一般化においてより広い範囲のサンプルタイプとシーケンシング技術に限定されているため、そのようなシナリオ７、８、９では最適ではない精度を示す可能性がある。以前の研究であるＳｏｍａｔｉｃＳｅｑ１０では、アンサンブルアプローチを使用して、アルゴリズム的に直交する方法を統合することで感度を最大化した。また、機械学習を使用してほぼ１００の特徴を統合し、精度を高く維持した。これにより、個々の全ての方法で精度が向上した。それにもかかわらず、ＳｏｍａｔｉｃＳｅｑで使用される機械学習バックボーンは、変異の場所について抽出された特徴のセットに依存している。その結果、体細胞変異のゲノムコンテキストで生の情報を完全にキャプチャして、真の体細胞変異をバックグラウンドエラーからさらに区別することができず、低複雑度領域や低腫瘍純度などの困難な状況での性能が制限される。
【０１３１】
ここでは、深層畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）を活用することにより、腫瘍配列データの統計モデリングの一般化可能性と複雑さの制限に対処する。ＣＮＮは、最近、生殖細胞変異呼び出し１１、１２、１３、および皮膚がんの分類１４を含む様々なドメインの分類問題で大きな性能を示している。それでも、体細胞変異検出の困難な問題にＣＮＮを適用することは検討されていない。以前の深層学習ベースの試み１５は、手動で抽出された特徴のセットに６層の完全に接続されたニューラルネットワークを適用することのみであった。このアプローチには、ローカル領域で見られるパターンを使用して生データから直接特徴表現を学習するＣＮＮアーキテクチャによって提供される能力を欠いている。さらに、完全に接続されたネットワークは複雑であるため、ＣＮＮに見られるような一般化可能性とスケーラビリティが低くなる。
【０１３２】
体細胞変異を正確に特定するために、配列位置合わせや他の方法から導出された信号を効果的に活用することができる、体細胞変異検出のための最初のＣＮＮベースのアプローチであるＮｅｕＳｏｍａｔｉｃを導入する。生殖細胞変異に焦点を当てた他の深層学習ベースの方法とは異なり、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、腫瘍サンプルの複雑さのために、精度の点で満たされていないより大きなニーズに対応している。生データから直接重要な変異信号を効果的にキャプチャし、異なるシーケンシング技術、サンプル純度、および全ゲノム対標的濃縮などのシーケンシング戦略で一貫して高精度を実現することができる。
【０１３３】
結果
【０１３４】
ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの概要
【０１３５】
ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのネットワークへの入力は、腫瘍サンプルと一致した正常サンプルの配列位置合わせをスキャンすることによって特定された体細胞変異の候補である（図１０ａ〜図１０ｄ）。他の方法によって報告された体細胞変異も、この候補リストに含めることができる。各候補軌跡について、それぞれサイズ５×３２のｋ個のチャネルから構成される３次元特徴行列Ｍ（サイズｋ×５×３２）を構築し、その軌跡を中心とする領域から信号をキャプチャする。行列Ｍの各チャネルは、４つのヌクレオチド塩基とギャップのある塩基（「−」）を表す５つの行と、候補位置の周囲の位置合わせ列を表す３２の列とを有する。
【０１３６】
図１０ａは、所与の候補体細胞ＳＮＶについての入力行列準備のちょっとした例を示している。候補体細胞変異の周りの７塩基のウィンドウ内の配列位置合わせ情報が抽出される。次に、読み取りへの挿入を説明するためにギャップを追加することにより、参照配列が拡張される。次に、拡張された位置合わせは、参照行列、腫瘍カウント行列、および正常カウント行列に要約される。カウント行列は、位置合わせの各列のＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔおよびギャップ（「−」）文字の数を記録し、参照行列は、各列の参照塩基を記録する。次に、カウント行列は、各列の塩基頻度を反映するようにカバレッジによって正規化される。腫瘍および正常のカバレッジを記録するために、別々のチャネルが予約されている。
【０１３７】
図１０ｂは、入力３次元行列および提案されたＮｅｕＳｏｍａｔｉｃネットワークアーキテクチャを示している。入力行列は、参照チャネル、腫瘍および正常頻度チャネル、カバレッジおよび位置チャネルから構成され、その後に位置合わせ特徴を要約するいくつかのチャネルが続く。アンサンブルモードで使用する場合、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃはまた、他の個々の方法特徴用の追加チャネルも含む。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃネットワークアーキテクチャは、ショートカットアイデンティティ接続を備えた４つのブロックで構造化された９つの畳み込み層から構成されている。最終層で２つのｓｏｆｔｍａｘ分類器と１つの回帰器とを使用して、変異のタイプ、サイズ、および位置を予測する。
【０１３８】
図１０ｃは、所与の候補体細胞欠失のための入力行列準備のちょっとした例を示している。候補体細胞変異の周りの７塩基のウィンドウ内の配列位置合わせ情報が抽出される。次に、読み取りへの挿入を説明するためにギャップを追加することにより、参照配列が拡張される。次に、拡張された位置合わせは、参照行列、腫瘍カウント行列、および正常カウント行列に要約される。カウント行列は、位置合わせの各列のＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔおよびギャップ（「−」）文字の数を記録するとともに、参照行列は、各列の参照ベースを記録する。次に、カウント行列は、各列の塩基頻度を反映するようにカバレッジによって正規化される。腫瘍と正常な範囲を記録するために、別々のチャネルが予約されている。
【０１３９】
図１０ｄは、所与の候補体細胞挿入のための入力行列準備のちょっとした例を示している。候補体細胞変異の周りの７塩基のウィンドウ内の配列位置合わせ情報が抽出される。次に、読み取りへの挿入を説明するためにギャップを追加することにより、参照配列が拡張される。次に、拡張された位置合わせは、参照行列、腫瘍カウント行列、および正常カウント行列に要約される。カウント行列は、位置合わせの各列のＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔおよびギャップ（「−」）文字の数を記録するとともに、参照行列は、各列の参照ベースを記録する。次に、カウント行列は、各列の塩基頻度を反映するようにカバレッジによって正規化される。腫瘍と正常な範囲を記録するために、別々のチャネルが予約されている。
【０１４０】
最初の３つのチャネルは、それぞれ、候補軌跡周辺の参照塩基と、その領域内の異なる塩基の頻度を要約する参照、腫瘍頻度、および正常頻度チャネルである。挿入をキャプチャするために、読み取り位置合わせ（図１０ａ、図１０ｃ、および図１０ｄ）の挿入に対応するギャップで候補遺伝子座の周りの参照配列を拡張する。したがって、腫瘍および正常頻度行列の各列は、それぞれ腫瘍および正常サンプルの対応するマルチプル位置合わせ（ＭＳＡ）列のＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔ／ギャップ塩基の頻度を表す。残りのチャネルは、カバレッジ、塩基品質、マッピング品質、ストランドバイアス、様々な塩基をサポートする読み取りのクリッピング情報など、他の機能を要約する。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃがアンサンブルモードで使用される場合、個々の体細胞変異検出方法によって報告される特徴のために追加のチャネルも使用する。この簡潔でありながら包括的な構造化表現により、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、腫瘍、正常、および参照で必要な情報を使用して、ＡＦの低い体細胞変異、ならびにシーケンシングエラーを生殖細胞変異から区別することができる。この設計はまた、ＣＮＮにおいて畳み込みフィルタを使用して、行列のサブブロック内のコンテキストパターンをキャプチャすることを可能にする。
【０１４１】
ゲノミクスの問題で使用される他のＣＮＮアプローチと比較するために、ＤｅｅｐＶａｒｉａｎｔ１１は、生殖細胞系列変異呼び出しの入力として読み取りパイルアップを使用する。対照的に、ネットワークへの入力として、各列の基本頻度要約を使用する。これは、ＣＮＮ構造を単純化し、大幅に効率的な実装が可能になる。例えば、ＤｅｅｐＶａｒｉａｎｔは、３０倍の全ゲノムサンプルの生殖細胞変異を呼び出すために約１０００ＣＰＵコア時間を要する１６が、スタンドアロンバージョンのＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、１つではなく２つの（腫瘍−正常）サンプルを処理し、生殖細胞系列の５０または１００％ＡＦよりも低い体細胞ＡＦで候補を探しているにもかかわらず、約１５６ＣＰＵコア時間で３０倍の腫瘍正常ペアサンプルから体細胞変異を検出することができる。別の生殖細胞変異呼び出し方法であるＣｌａｉｒｖｏｙａｎｔｅ１２は、３つのチャネルを使用して、ウィンドウの中央での対立遺伝子数、欠失、および挿入の塩基数を要約する。対照的に、前述の参照拡張アプローチを使用して、これら全てのイベントを単一の塩基頻度行列に要約し、これは、ウィンドウ全体の全ての挿入および欠失（ＩＮＤＥＬ）イベントを明確に表すことができる。
【０１４２】
ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、特徴行列Ｍが与えられた場合の候補体細胞変異のタイプと長さを予測する新たなＣＮＮ構造を採用している（図１０ｂ）。提案されたＣＮＮは、ＲｅｓＮｅｔ１７によって触発されたショートカットアイデンティティ接続を備えた４つのブロックで構造化された９つの畳み込み層から構成されているが、提案された入力構造に適応するために異なる構成を有する。最終層で２つのｓｏｆｔｍａｘ分類器と１つの回帰器とを使用する。第１の分類器は、候補が非体細胞呼び出し、ＳＮＶ、挿入、または欠失のいずれであるかを特定する。第２の分類器は、４つのクラス（０は非体細胞、または１、２、または２よりも大きい長さを示す）で体細胞変異の長さを予測し、回帰器は、体細胞変異の位置を予測する。これらの分類器の出力を使用して、体細胞変異のセットを特定する。ＩＮＤＥＬの長さが２よりも大きいと予測される場合、その位置にオーバーラップする読み取りに対して単純な後処理ステップを実行して、読み取り位置合わせＣＩＧＡＲ文字列からＩＮＤＥＬ配列を解決する。これは、イルミナシーケンサによって生成されたデータに対して良好に機能することが示されている。エラー率の高い配列データの場合、ＩＮＤＥＬ配列を解決するために、より複雑なローカル再調整後処理が実行される。
【０１４３】
ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、スタンドアロンモードおよびアンサンブルモードで使用されることができるため、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓを使用してスタンドアロンモードを示し、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃを予約してアンサンブルモードを示す。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓを、ＭｕＴｅｃｔ２１、ＭｕＳＥ２、ＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒ６、Ｓｔｒｅｌｋａ２５、ＶａｒＤｉｃｔ３、ＶａｒＳｃａｎ２４などの最先端の体細胞変異検出法、およびアンサンブルアプローチであるＳｏｍａｔｉｃＳｅｑ１０と比較した。複数の合成データセットと実際のデータセットとを使用して、性能を比較対照した。以下に、データセット内の体細胞変異のＡＦを考慮して、体細胞変異検出の難易度の高い順に合成データセットを報告する。
【０１４４】
プラチナサンプル混合データセットの比較
【０１４５】
第１の合成データセットでは、以前の研究５、１０と同様に、２つの通常のＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｇｅｎｏｍｅｓ１８サンプル、ＮＡ１２８７７およびＮＡ１２８７８を、７０：３０、５０：５０、および２５：７５の腫瘍純度比で混合して３つの腫瘍汚染プロファイルを作成し、５：９５の比率で、汚染された正常サンプルを作成した。また、１００％純粋正常および５０％純粋腫瘍を使用したテストも含めた。評価の真セットとしてＮＡ１２８７７の参照呼び出しであったＮＡ１２８７８の生殖細胞変異を使用した。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−ＳとＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、双方とも、他の全ての方法を大幅に上回った（図１１ａ、図１１ｂ、図１１ｃ）。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの性能の向上は、他のアプローチよりも低く、より困難な腫瘍純度（２５：７５混合）で増加した。要約すると、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、ＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ全体でそれぞれ最大９９．６および９７．２％のＦ１−スコアを生成し、このデータセットの最低サンプル純度で最良の方法よりも最大７．２％向上した。腫瘍純度が５０％のサンプルの場合、正常純度を１００から９５％に下げると、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの性能に僅かな影響（＜０．３％）が発生したが、ＳｏｍａｔｉｃＳｅｑの精度は、約３％低下した。
【０１４６】
図１１ａおよび図１１ｂは、プラチナ２サンプル混合データセットの性能分析のためのチャートである。このデータセットでは、４つの腫瘍および正常純度のシナリオ（５０％Ｔ：１００％Ｎ、７０％Ｔ：９５％Ｎ、５０％Ｔ：９５％Ｎ、および２５％Ｔ：９５％Ｎ）が使用されている。図１１ａは、適合率−再現率分析のためのグラフである：信頼度または品質スコアは、適合率−再現率曲線を導出するために使用される。各アルゴリズムによって達成された最高のＦ１−スコアが曲線に印刷され、黒丸でマークされている。図１１ｂは、異なるＩＮＤＥＬサイズに対するＩＮＤＥＬ精度（Ｆ１−スコア）の性能分析のためのグラフである。図１１ｃは、プラチナ２サンプル混合データセットでの様々な体細胞変異検出方法の性能を示す表である。各方法について、最高のＦ１を達成する適合率−再現率曲線の品質スコア閾値の適合率、再現率、およびＦ１−スコアを報告する。（ＲＣ：再現率、ＰＲ：適合率、Ｆ１：Ｆ１−スコア）。
【０１４７】
ＩＣＧＣ−ＴＣＧＡ  ＤＲＥＡＭチャレンジデータセットの比較
【０１４８】
第２の合成データセットには、異なるＡＦを有するペアの正常サンプルの正常なゲノムに変異をコンピュータでスパイクすることによって構築された（方法を参照）ＩＣＧＣ−ＴＣＧＡ  ＤＲＥＡＭチャレンジステージ３およびステージ４データセット１９を使用した。腫瘍と正常サンプルを混合して、５つの腫瘍／正常純度のシナリオを作成した。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓは、ステージ３とステージ４の双方のデータセットで他の全てのスタンドアロン方法を平均してＳＮＶで８％以上、ＩＮＤＥＬで２２％上回った（図１２ａ、図１２ｂ、図１２ｃ、図１３ａ、図１３ｂ、図１３ｃ）。この性能の向上は、腫瘍の純度が低下するにつれて増加した。さらに、２５：７５混合のＳＮＶや２５：７５および５０：５０混合のＩＮＤＥＬなど、より困難なシナリオでは、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−ＳがＳｏｍａｔｉｃＳｅｑを上回っていたにもかかわらず、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ（アンサンブルモード）がＳｏｍａｔｉｃＳｅｑとＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの双方を明らかに上回っていることを観察した。要約すると、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、ＳＮＶとＩＮＤＥＬに対してそれぞれ最大９６．２および９３．５％のＦ１−スコアをもたらし、最低のサンプル純度で最良の方法よりも最大３４．６％向上した。腫瘍純度が５０％のサンプルの場合、正常純度を１００から９５％に下げると、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの性能に僅かな影響があった（平均で約１．２％）が、ＳｏｍａｔｉｃＳｅｑとＳｔｒｅｌｋａ２では、Ｆ１−スコアが＞３％低下した。
【０１４９】
図１２ａおよび図１２ｂは、ＤＲＥＡＭステージ３データセットの性能分析のためのグラフである。このデータセットでは、５つの腫瘍および正常純度のシナリオ（１００％Ｔ：１００％Ｎ、５０％Ｔ：１００％Ｎ、７０％Ｔ：９５％Ｎ、５０％Ｔ：９５％Ｎ、および２５％Ｔ：９５％  Ｎ）が使用される。図１２ａは、適合率−再現率分析のグラフである：適合率または品質スコアを使用して、適合率−再現率曲線を導出する。各アルゴリズムによって達成された最高のＦ１−スコアが曲線に印刷され、黒丸でマークされている。図１２ｂは、異なるＩＮＤＥＬサイズのＩＮＤＥＬ適合率（Ｆ１−スコア）の性能分析のグラフである。図１２ｃは、Ｄｒｅａｍチャレンジステージ３データセットでの異なる体細胞変異検出方法の性能を示す表である。各方法について、最高のＦ１を達成する適合率−再現率曲線の品質スコア閾値の適合率、再現率、およびＦ１−スコアを報告する。（ＲＣ：再現率、ＰＲ：適合率、Ｆ１：Ｆ１−スコア）。
【０１５０】
図１３ａおよび図１３ｂは、ＤＲＥＡＭステージ４データセットの性能分析のためのグラフである。このデータセットでは、５つの腫瘍および正常純度のシナリオ（１００％Ｔ：１００％Ｎ、５０％Ｔ：１００％Ｎ、７０％Ｔ：９５％Ｎ、５０％Ｔ：９５％Ｎ、および２５％Ｔ：９５％  Ｎ）が使用される。図１３ａは、適合率−再現率分析のグラフである：適合率または品質スコアを使用して、適合率−再現率曲線を導出する。各アルゴリズムによって達成された最高のＦ１−スコアが曲線に印刷され、黒丸でマークされている。図１３ｂは、異なるＩＮＤＥＬサイズのＩＮＤＥＬ適合率（Ｆ１−スコア）の性能分析のグラフである。図１３ｃは、Ｄｒｅａｍチャレンジステージ４データセットでの異なる体細胞変異検出方法の性能を示す表である。各方法について、最高のＦ１を達成する適合率−再現率曲線の品質スコア閾値の適合率、再現率、およびＦ１スコアを報告する。（ＲＣ：再現率、ＰＲ：適合率、Ｆ１：Ｆ１−スコア）。
【０１５１】
プラチナ腫瘍スパイクデータセットの比較
【０１５２】
第３の合成データセットについては、以前の研究１、１０と同様に、平均［０．０５、０．１、０．２、０．３］の二項分布からサンプリングされた頻度のスパイクを使用して、ＮＡ１２８７８の変異位置でＮＡ１２８７８からＮＡ１２８７７に読み取りをスパイクすることによって腫瘍サンプルを構築し、ＮＡ１２８７７読み取りの独立したセットを純粋正常として使用した。固定比率でサンプルを混合して固定ＡＦで体細胞変異を生じさせる以前の戦略とは異なり、この混合アプローチでは、０．０２５から０．３の範囲の様々なＡＦでサンプルを生成したことに留意されたい。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、ＳＮＶとＩＮＤＥＬに対してそれぞれ８０．９および６６．７％のＦ１−スコアをもたらし、最良の方法よりも最大４％向上した（図１６ａ〜図１６ｄ）。低ＡＦ体細胞変異の場合、性能の改善は、さらに高かった（ＡＦ＝０．０２５で１１％の改善、ＡＦ＝０．０５で８％の改善）（図１６ｂ）。図１６ａは、適合率または品質スコアを使用して適合率−再現率曲線を導出する適合率−再現率分析を示している。各アルゴリズムによって達成された最高のＦ１−スコアが曲線に印刷され、黒丸でマークされている。図１６ｂは、異なるＡＦの性能分析を示している。図１６ｃは、異なるＩＮＤＥＬサイズのＩＮＤＥＬ適合率（Ｆ１−スコア）の性能分析を示している。図１６ｄは、各方法について、最高のＦ１を達成する適合率−再現率曲線の品質スコア閾値の適合率、再現率、およびＦ１−スコアを示している。（ＲＣ：再現率、ＰＲ：適合率、Ｆ１：Ｆ１−スコア）。
【０１５３】
全エクソームパネルおよび標的化パネルの比較
【０１５４】
異なる標的濃縮でのＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの性能を評価するために、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  Ｊｅｗｉｓｈ  ｔｒｉｏ２０からの全エクソームおよび標的化パネルデータセットを使用した（図１７ａ〜図１７ｄ）。全エクソームデータセットでＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＳｏｍａｔｉｃＳｅｑをトレーニングし、トレーニングしたモデルを全エクソームとパネルの双方に適用した。全エクソームの場合、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、ＳＮＶとＩＮＤＥＬでそれぞれ最大９９．３および８８．６％のＦ１−スコアを達成した。標的化パネルでは、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃとＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓは、ＳＮＶのＦ１−スコアが＞９９．２％であり、他の方法を一貫して上回っていた。
【０１５５】
図１７ａは、エクソームサンプル混合に対する様々な方法の性能分析を示している。このデータセットでは、４つの腫瘍および正常純度のシナリオ（５０％Ｔ：１００％Ｎ、７０％Ｔ：９５％Ｎ、５０％Ｔ：９５％Ｎ、および２５％Ｔ：９５％Ｎ）が使用されている。信頼度または品質スコアは、適合率−再現率曲線を導出するために使用される。各アルゴリズムによって達成された最高のＦ１−スコアが曲線に印刷され、黒丸でマークされている。ここでは、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓ、およびＳｏｍａｔｉｃＳｅｑのエクソームデータに関するトレーニングが行われる。
【０１５６】
図１７ｂは、標的パネルサンプル混合に対する様々な方法の性能分析を示している。このデータセットでは、４つの腫瘍および正常純度のシナリオ（５０％Ｔ：１００％Ｎ、７０％Ｔ：９５％Ｎ、５０％Ｔ：９５％Ｎ、および２５％Ｔ：９５％Ｎ）が使用されている。信頼度または品質スコアは、適合率−再現率曲線を導出するために使用される。各アルゴリズムによって達成された最高のＦ１−スコアが曲線に印刷され、黒丸でマークされている。ここでは、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓ、およびＳｏｍａｔｉｃＳｅｑのエクソームデータに関するトレーニングが行われる。
【０１５７】
図１７ｃは、全エクソームサンプルミックスデータセットでの様々な体細胞変異検出方法の性能を示している。各方法について、最高のＦ１を達成する適合率−再現率曲線の品質スコア閾値の適合率、再現率、およびＦ１−スコアを報告する。（ＲＣ：再現率、ＰＲ：適合率、Ｆ１：Ｆ１−スコア）。
【０１５８】
図１７ｄは、標的化パネルデータセットに対する異なる体細胞変異検出方法の性能を示している。各方法について、最高のＦ１を達成する適合率−再現率曲線の品質スコア閾値の適合率、再現率、およびＦ１−スコアを報告する。（ＲＣ：再現率、ＰＲ：適合率、Ｆ１：Ｆ１−スコア）。
【０１５９】
全ゲノムプラチナ混合データでトレーニングされたモデルを双方の標的濃縮セットに適用すると、同様の性能が得られ、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのロバスト性が確認された（図１８ａおよび図１８ｂ）。他のデータセットと同様に、腫瘍純度が５０％のサンプルの場合、全エクソームデータセットで正常純度を１００から９５％に下げると、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのＦ１−スコアが最小限に低下する可能性がある（平均で約０．３％）が、ＳｏｍａｔｉｃＳｅｑおよびＳｔｒｅｌｋａ２は、Ｆ１−スコアで＞５％の減少であった。
【０１６０】
図１８ａは、全ゲノム（プラチナデータ、ゲノム混合）および全エクソーム（ＨＧ００３−ＨＧ００４エクソーム混合）でトレーニングされたモデルを使用してエクソーム混合データセットでテストする性能分析を示している。信頼度または品質スコアは、適合率−再現率曲線を導出するために使用される。各アルゴリズムによって達成された最高のＦ１−スコアは凡例に示され、曲線上に黒丸でマークされている。
【０１６１】
図１８ｂは、全ゲノム（プラチナデータ、ゲノム混合）および全ゲノム（ＨＧ００３−ＨＧ００４エクソーム混合）でトレーニングされたモデルを使用して、標的パネル混合データセットでテストする性能分析を示している。信頼度または品質スコアは、適合率−再現率曲線を導出するために使用される。各アルゴリズムによって達成された最高のＦ１−スコアは凡例に示され、曲線上に黒丸でマークされている。
【０１６２】
ＰａｃＢｉｏデータセットの比較
【０１６３】
さらに、エラー率の高い読み取り、特にロングリード配列プラットフォームからの読み取りに対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの性能を評価した。生のＰａｃＢｉｏ読み取りに基づいて２０、３０、および５０％のＡＦ体細胞変異によってシミュレートされた腫瘍正常ペアサンプルを使用した（図１４ａ、図１４ｂ、および図１４ｃ）。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、Ｆ１−スコアがそれぞれ最大９８．１および８６．２％の体細胞ＳＮＶおよびＩＮＤＥＬを特定し、これは、ＳＮＶで最大３４．４％、ＩＮＤＥＬで最大５３．２％、ＶａｒＤｉｃｔ３を上回った。この分析により、ＰａｃＢｉｏの長い生の読み取りのように配列読み取りのエラー率が高い場合であっても、体細胞変異を検出するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの能力が確認される。
【０１６４】
異なるＩＮＤＥＬサイズの比較
【０１６５】
ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃが様々なデータセットの様々なＩＮＤＥＬサイズで他の方法を一貫して上回っていたことは注目に値する（図１１ｂ、図１２ｂ、図１３ｂ、図１４ｂ、図１６ｃ、および図１９）。大きな（＞５０塩基）ＩＮＤＥＬの場合、体細胞ＩＮＤＥＬを使用した短い読み取りのほとんどはソフトクリップされるため、ＩＮＤＥＬ情報は、パイルアップカウント行列で失われる。そのような場合、ＶａｒＤｉｃｔやＭｕＴｅｃｔ２などの一部の方法は予測にローカルアセンブリを使用したため、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、他の方法の予測から恩恵を受けた。
【０１６６】
図１４ａおよび図１４ｂは、ＰａｃＢｉｏデータセットにおける異なる体細胞変異検出法の性能分析のためのグラフである。このデータセットでは、３つの腫瘍および正常純度のシナリオ（７０％Ｔ：９５％Ｎ、５０％Ｔ：９５％Ｎ、および２５％Ｔ：９５％Ｎ）が使用されている。図１４ａは、適合率−再現率分析のためのグラフである：信頼度または品質スコアは、適合率−再現率曲線を導出するために使用される。各アルゴリズムによって達成された最高のＦ１−スコアが曲線に印刷され、黒丸でマークされている。図１４ｂは、異なるＩＮＤＥＬサイズのＩＮＤＥＬ適合率（Ｆ１−スコア）の性能分析のグラフである。図１４ｃは、各方法について、最高のＦ１を達成する適合率−再現率曲線の品質スコア閾値の適合率、再現率、およびＦ１−スコアを示している。（ＲＣ：再現率、ＰＲ：適合率、Ｆ１：Ｆ１−スコア）。図１９は、Ｄｒｅａｍステージ３、Ｄｒｅａｍステージ４、プラチナ２サンプル混合、プラチナ腫瘍スパイク、ＰａｃＢｉｏ、およびエクソームデータセットにおけるグラウンドトゥルースＩＮＤＥＬのサイズ分布を示している。負のサイズは欠失に対応する。
【０１６７】
ＩＮＤＥＬタイプと位置精度
【０１６８】
説明した全てのデータセットについて、体細胞ＩＮＤＥＬの位置を正しく予測する（正確なＩＮＤＥＬ配列を無視する）というよりも緩和された基準を使用して、様々な体細胞変異検出方法によるＩＮＤＥＬ呼び出しの性能も評価した。繰り返すが、他のスキームに対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの同様の優位性を観察し、これは、主な改善が、後処理ＩＮＤＥＬ解決ステップではなく提案されたＣＮＮ構造によってもたらされることを示している（図２０ａおよび図２０ｂ）。
【０１６９】
図２０ａは、３つの腫瘍純度シナリオ（５０％、３０％および２０％）および９５％正常純度でのＰａｃＢｉｏデータセットの予測された体細胞変異の位置とタイプとに基づくＩＮＤＥＬの性能分析を示している（正確に予測されたＩＮＤＥＬ配列の精度を無視する）。信頼度または品質スコアは、適合率−再現率曲線を導出するために使用される。各アルゴリズムによって達成された最高のＦ１−スコアが曲線に印刷され、黒丸でマークされている。
【０１７０】
図２０ｂは、Ｄｒｅａｍステージ３、Ｄｒｅａｍステージ４、プラチナ２サンプル混合、全エクソーム、およびプラチナ腫瘍スパイクデータセットの予測された体細胞変異の位置とタイプとに基づくＩＮＤＥＬの性能分析を示している（正確な予測ＩＮＤＥＬ配列の精度を無視する）。最初の４つのデータセットでは、３つの腫瘍純度シナリオ（７０％、５０％、および２５％）が使用されるが、正常サンプルは、９５％純度を有する。信頼度または品質スコアは、適合率−再現率曲線を導出するために使用される。各アルゴリズムによって達成された最高のＦ１−スコアが曲線に印刷され、黒丸でマークされている。
【０１７１】
読み取りカバレッジ分析
【０１７２】
配列カバレッジが異なる技術に与える影響を評価するために、全エクソームデータセットをダウンサンプリングして、２０倍から１００倍の範囲の配列カバレッジを有するサンプルを取得した（図１５ａおよび図１５ｂ）。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、異なるカバレッジで他の技術を一貫して上回った。カバレッジの低いサンプルで問題がより困難になるにつれて、改善は増加した。さらに、カバレッジを１００倍から５０倍に減らすと、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃへの影響はごく僅かであった（ＳＮＶでは約１．５％、ＩＮＤＥＬＳでは約５％）が、ＳｏｍａｔｉｃＳｅｑのＦ１−スコアは、ＳＮＶとＩＮＤＥＬの双方で約２０％低下し、Ｓｔｒｅｌｋａ２のＦ１−スコアは、ＳＮＶで約１３％、ＩＮＤＥＬで約１５％低下した。この分析により、カバレッジの摂動に対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのロバスト性と、より低いカバレッジで見られる可能性のある困難なシナリオでの利点の双方が明らかになった。
【０１７３】
図１５ａは、全エクソームサンプル混合データセットに対する配列カバレッジの影響の性能分析のためのグラフである。この例では、腫瘍は、５０％純度を有し、正常は、９５％純度を有する。Ｙ軸は、２０倍から１００倍の範囲のサンプル位置合わせカバレッジに対して各アルゴリズムによって達成された最高のＦ１−スコアを示している。
【０１７４】
図１５ｂは、全エクソームサンプル混合データセットに対する配列カバレッジの影響の性能分析のためのグラフである。この例では、腫瘍は、５０％純度を有し、正常は、９５％純度を有する。腫瘍および正常の位置合わせの範囲は、２０倍から１００倍の範囲である。信頼度または品質スコアは、適合率−再現率曲線を導出するために使用される。各アルゴリズムによって達成された最高のＦ１−スコアは凡例に示され、曲線上に黒丸でマークされている。
【０１７５】
トレーニングのロバスト性
【０１７６】
ＤＲＥＡＭチャレンジステージ３データセットの異なる純度でトレーニングとテストを行うことにより、特定の純度に対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのトレーニングのロバスト性を評価した。図２１は、非常に異なる腫瘍純度でトレーニングおよびテストを行った場合であっても、性能が僅かに低下することを示している。また、複数の腫瘍純度から集計されたデータを使用したトレーニングは、標的腫瘍純度に関するトレーニングと同じくらい優れていることも観察された（図２１）。これは、複数の腫瘍純度を組み込んだトレーニングセットが、腫瘍純度の変動に対してロバストなモデルを取得するのに十分であることを示唆している。
【０１７７】
図２１は、ＤＲＥＡＭチャレンジステージ３データセットのクロスサンプルトレーニングの性能分析を示している。異なる純度でトレーニングされたＮｅｕＳｏｍａｔｉｃモデル、および全ての異なる純度からの集合入力でトレーニングされたモデルを使用して、７０％、５０％、および２５％の腫瘍純度で各サンプルをテストした。信頼度または品質スコアは、適合率−再現率曲線を導出するために使用される。各アルゴリズムによって達成された最高のＦ１−スコアは凡例に印刷され、曲線上に黒丸でマークされている。
【０１７８】
実際のデータとの比較
【０１７９】
生殖細胞変異２２のＧｅｎｏｍｅ−ｉｎ−ａ−Ｂｏｔｔｌｅゴールドセットのように、体細胞変異２１の高品質で包括的なグラウンドトゥルースデータセットがない場合、合成データ以外ではＦ１精度を計算することができない。幸いなことに、実際のデータに対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの精度性能を推定するために使用できる、検証済み体細胞変異を有する既存のデータセットが存在する（実際のデータでＦ１−スコアを推定する方法の詳細については、方法を参照）。以下の２つのデータセットを使用した：ＣＬＬ１２３、９６１個の検証済み体細胞ＳＮＶを含む慢性リンパ性白血病患者の全ゲノムデータ、およびＣＯＬＯ−８２９２４、２５、４５４個の検証済み体細胞ＳＮＶを含む不死の転移性悪性黒色腫細胞株由来の全ゲノムデータセット。これら２つの実際のＷＧＳサンプルでＮｅｕＳｏｍａｔｉｃを評価するために、ＤＲＥＡＭチャレンジステージ３でトレーニングされたモデルを使用した。図２２ａおよび図２２ｂに示されるように、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、ＣＯＬＯ−８２９悪性黒色腫サンプルおよびＣＬＬ１慢性リンパ性白血病サンプルについて、それぞれ９９．７および９３．２％という最高の外挿Ｆ１−スコアを達成した。また、結腸直腸腺癌（ＴＣＧＡ−ＡＺ−６６０１）のＴＣＧＡ２６、２７全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）サンプルに対してＮｅｕＳｏｍａｔｉｃを評価し、９９．６％を超える最高の外挿Ｆ１−スコアを達成した（図２２ｃ）。
【０１８０】
図２２ａは、実際のデータセットＣＯＬＯ−８２９に対する様々な体細胞変異検出方法の性能を示している。図２２ｂは、実際のデータセットＣＬＬ１に対する異なる体細胞変異検出方法の性能を示している。図２２ｃは、実際のデータセットＴＣＧＡ−ＡＺ−６６０１に対する異なる体細胞変異検出方法の性能を示している。
【０１８１】
クラウド上でＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのスケーラビリティと費用対効果を実証するために、アンサンブルモードとスタンドアロンモードの双方を使用して、マイクロソフトＡｚｕｒｅクラウドプラットフォーム上でＴＣＧＡから２６１個の全エクソーム配列癌サンプル（図２３）も処理した。これらのサンプルは、結腸直腸腺癌、卵巣漿液性腺癌、子宮頸部扁平上皮癌、および子宮頸部腺癌を含む複数の癌タイプにわたって採取された。クラウドプラットフォームを使用すると、コンピューティングインスタンスをオンデマンドで自動的に起動することができたが、各サンプルの処理には、アンサンブルモードおよびスタンドアロンモードでそれぞれ平均２．４２時間および０．７２時間かかった。Ａｚｕｒｅのプリエンプティブルコンピューティングインスタンスを使用すると（標準のＨ１６インスタンスタイプは、それぞれ１６コアで使用された）、アンサンブルモードおよびススタンドアロンモードのサンプルあたりの処理コストは、それぞれ０．７７米ドルおよび０．２３米ドルと低くなった。また、これらのサンプルで検証された４４，２７０のＳＮＰと比較することにより、これらのサンプルのＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの精度を評価した。これは、アンサンブルモードおよびスタンドアロンモードでそれぞれ９８．９および９７．２％の再現率を提供した。したがって、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、異なるシーケンシング技術やシーケンシング戦略で使用できるだけでなく、ローカルＨＰＣクラスタやエラスティッククラウドコンピューティングインフラストラクチャなどの様々なコンピューティングプラットフォームで実行されることもできる。
【０１８２】
図２３は、マイクロソフトＡｚｕｒｅの実験に使用された２６１のＴＣＧＡ癌サンプルのリストである。サンプルは、結腸直腸腺癌（ＣＯＡＤ）、卵巣漿液性腺癌（ＯＶ）、子宮頸部扁平上皮癌および子宮頸部腺癌（ＣＥＳＣ）の３種類の癌にわたって採取される。
【０１８３】
考察
【０１８４】
ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、体細胞変異を検出するための最初の深層学習ベースのフレームワークであり、高性能で普遍的である。同じＣＮＮアーキテクチャを使用しながら、合成から実数までの複数のデータセット、全ゲノムから標的までの複数のシーケンシング戦略、およびショートリードから高エラーロングリードまでの複数のシーケンシング技術にわたって、腫瘍の純度を変化させるための最高の精度を実現する。具体的には、腫瘍の純度が低く、対立遺伝子の頻度が低い場合、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、他の最先端の体細胞変異検出法を大幅に上回り、困難な問題に対処する能力を示している。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、畳み込みニューラルネットワークの効率的な実装を利用して、体細胞変異検出の問題を迅速かつ正確に解決する。それは、腫瘍／正常位置合わせ情報の新たな要約を、ゲノムコンテキストで主要な信号を効果的にキャプチャすることができる入力行列のセットとして使用する。これらの行列で提案されたＣＮＮアーキテクチャをトレーニングすると、生データから直接特徴表現を学習することができる。観察されたトレーニングデータから学習した深い特徴は、シーケンシングエラー、相互汚染、またはカバレッジバイアスによって導入されたアーティファクトから真の呼び出しを区別することができる重要な変異シグネチャを正確に特定することができる。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、体細胞変異の検出に非常に広く適用することができるアプローチを提供することにより、最先端技術を大幅に進歩させると考えている。
【０１８５】
方法
【０１８６】
ＩＣＧＣ−ＴＣＧＡ  ＤＲＥＡＭチャレンジデータ
【０１８７】
ステージ３データは、合成的であるが現実的な腫瘍正常ペアを作成するために、７，９０３のＳＮＶと７，６０４のＩＮＤＥＬとの変異を、５０、３３、２０％の３つの異なるＡＦを有する同じ正常サンプルの健康なゲノムにコンピュータでスパイクして構築された正常サンプルおよび腫瘍サンプルから構成される。ステージ４データも同様の構成であるが、３０および１５％のＡＦの２つのサブクローンに１６，２６８のＳＮＶと１４，１９４のＩＮＤＥＬを有する。次に、９５％の正常読み取りと５％の腫瘍読み取りを混合することにより、不純な正常を構築した。また、腫瘍と正常をそれぞれ１００：０、７０：３０、５０：５０、２５：７５の比率で混合することにより、４つの腫瘍混合を構築した。したがって、これら４つの腫瘍混合比にわたる体細胞変異のＡＦは、ステージ３データセットでは５から５０％、ステージ４データセットでは３．７５から３０％の範囲である。
【０１８８】
プラチナ合成腫瘍データ
【０１８９】
２００×プラチナゲノムサンプルＮＡ１２８７８およびＮＡ１２８７７、ならびにそれらの真生殖細胞変異（ｖ２０１７−１．０）１８をダウンロードして、仮想腫瘍および正常ペア（ＥＮＡアクセッション番号ＰＲＪＥＢ３２４６）を構築した。正常については、ＮＡ１２８７７を５０倍にダウンサンプリングした。腫瘍については、ＮＡ１２８７７をそれぞれ１５倍、２５倍、および３７．５倍で個別にダウンサンプリングし、それぞれをダウンサンプリングしたＮＡ１２８７８と３５倍、２５倍、および１２．５倍で混合することにより、腫瘍純度が７０、５０、および２５％の３つの５０倍インシリコ混合サンプルを作成した。ＮＡ１２８７８のヘテロ接合型およびホモ接合型の変異を使用し、これらは、ＮＡ１２８７７の参照呼び出しであり、ＮＡ１２８７７変異から少なくとも５塩基離れており、トレーニングおよび評価ステップの真セットとして互いに３００塩基離れている（１，１０３，２８５ＳＮＶおよび１７４，７５４ＩＮＤＥＬ）。したがって、ＮＡ１２８７８の生殖細胞変異の接合性に応じて、これら３つの腫瘍混合比にわたる体細胞変異のＡＦは、１２．５から７０％の範囲になる。
【０１９０】
また、ＮＡ１２８７７の参照呼び出しであるＮＡ１２８７８のヘテロ接合およびホモ接合変異の場所でダウンサンプリングされた（５０倍のカバレッジまで）ＮＡ１２８７８からダウンサンプリングされた（５０倍のカバレッジまで）ＮＡ１２８７７データに読み取りをランダムにスパイクすることにより、別の５０倍の仮想腫瘍サンプルを生成した。各変異について、平均［０．０５、０．１、０．２、０．３］を使用して二項分布からスパイクされた読み取りの頻度をランダムに割り当てた。したがって、変異の接合性に応じて、平均体細胞変異ＡＦは、２．５から３０％の範囲である。真セットのあいまいさを避けるために、関連するペアエンドリードが他の変異と重複しない変異（３１６，０５０ＳＮＶおよび４６，９７８ＩＮＤＥＬ）のみを使用した。これは、ＮＡ１２８７８からの読み取りで汚染された腫瘍を生成した。また、ＮＡ１２８７７の別の独立したダウンサンプリング（５０倍）データを純粋正常として使用した。
【０１９１】
どちらの実験でも、ＦａｓｔＱファイルと真生殖細胞系列変異とがダウンロードされ、ＢＷＡ−ＭＥＭ（ｖ０．７．１５）２８、続いてＰｉｃａｒｄ  ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓ（ｖ２．１０．１０）（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ）、およびＧＡＴＫ  ＩｎｄｅｌＲｅａｌｉｇｎｅｒおよび塩基品質スコアの再調整（ｖ３．７）２９と位置合わせされた。
【０１９２】
実際の腫瘍と正常のペアデータ
【０１９３】
ＣＬＬ１慢性リンパ性白血病データセット２３（アクセッション：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｇａ／ｄａｔａｓｅｔｓ／ＥＧＡＤ００００１００００２３）とＣＯＬＯ−８２９不死転移性悪性黒色腫細胞株データセット２４、２５（アクセッション：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｇａ／ｓｔｕｄｉｅｓ／ＥＧＡＳ０００００００００５２）とを使用して、検証済み体細胞変異の公開リストによる実際の腫瘍と正常のペアデータに対するアプローチを評価した。
【０１９４】
ＣＯＬＯ−８２９データセットは、８０倍の全ゲノム配列腫瘍サンプルとそれに対応する６０倍の正常血液ＣＯＬＯ−８２９ＢＬサンプルから構成され、４５４個の検証済み体細胞ＳＮＶを有する。ＣＬＬ１は、それぞれ５３倍および４２倍のカバレッジで、９６１個の公開された体細胞ＳＮＶを有する、全ゲノム配列腫瘍サンプルおよび一致する正常を有する。
【０１９５】
ＴＣＧＡ−ＡＺ−６６０１２６、２７データセットは、結腸腺癌腫瘍サンプルと、ＴＣＧＡからの対応する正常組織との全エクソーム配列である。腫瘍サンプルおよび正常サンプルは、それぞれ１４５倍および１６５倍の深さでシーケンシングされた。このサンプルのグラウンドトゥルース体細胞変異として、ＴＣＧＡ３０およびＣＯＳＭＩＣ３１データベースで９５２個の検証済みＳＮＶを使用した。
【０１９６】
実際のデータについては、少なくとも２つのスタンドアロンの方法で呼び出された、またはＣＯＳＭＩＣデータベースの同じ癌タイプの少なくとも２つのサンプルで検証済みの体細胞変異として報告された、予測された体細胞変異のパーセンテージとして外挿適合率を計算する。次に、再現率の調和平均とこの外挿適合率とに基づいて、外挿されたＦ１−スコアを計算する。
【０１９７】
全エクソームおよび標的化パネルデータ
【０１９８】
様々な標的濃縮実験でＮｅｕＳｏｍａｔｉｃを評価するために、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  Ｊｅｗｉｓｈ  ｔｒｉｏ２０の全エクソームデータセットを使用した。ＨＧ００３およびＨＧ００４（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｔｒａｃｅ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｉａｂ／ｆｔｐ／）の深層配列（２００倍カバレッジ）全エクソーム位置合わせファイルを、信頼性の高い生殖系列変異（Ｇｅｎｏｍｅ−ｉｎ−ａ−Ｂｏｔｔｌｅリリースｖ３．３．２）とともにダウンロードした。次に、ＨＧ００４のランダムな７０倍、５０倍、および２５倍のダウンサンプルとＨＧ００３の３０倍、５０倍、および７５倍のダウンサンプルとの混合を使用して、それぞれ７０、５０、および２５％の純粋腫瘍サンプルを構築した。また、９５倍ＨＧ００３と５倍ＨＧ００４とのダウンサンプリングされた位置合わせを混合することにより、９５％純粋正常を構築した。分析には、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｌｌ  Ｅｘｏｎ  Ｖ５  ＢＥＤファイルを使用した。グラウンドトゥルースの体細胞変異は、プラチナ合成腫瘍データ（１１，７２０  ＳＮＶ、８７８  ＩＮＤＥＬ）と同様に特定された。ＨＧ００４の生殖細胞変異の接合性に応じて、これら３つの腫瘍混合比にわたる体細胞変異のＡＦは、１２．５から７０％の範囲である。
【０１９９】
標的パネルでの性能を検証するために、上記の位置合わせと真データをイルミナのＴｒｕＳｉｇｈｔ継承疾患パネルＢＥＤファイル（２１６  ＳＮＶ、５  ＩＮＤＥＬ）に制限した。標的パネル領域の真のＩＮＤＥＬの数が限られているため、ＳＮＶの性能のみを評価した。
【０２００】
ＰａｃＢｉｏデータ
【０２０１】
長期にわたる分析のために、ＨＧ００２サンプル（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｔｒａｃｅ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｉａｂ／ｆｔｐ／）２０用の信頼性の高い生殖細胞系列変異（Ｇｅｎｏｍｅ−ｉｎ−ａ−Ｂｏｔｔｌｅリリースｖ３．３．２）をダウンロードした。ＣＨＭ１データセット３２（ＳＲＡアクセッションＳＲＸ５３３６０９）を使用して、ロングリードエラープロファイルを作成した。次に、ＶａｒＳｉｍシミュレーションフレームワーク３３をＬｏｎｇＩＳＬＮＤインシリコロングリードシーケンサシミュレータ３４と組み合わせて使用して、１００倍の純粋正常サンプルをシミュレートした。ランダム体細胞変異のセットを使用して、同じエラープロファイルで１００倍の純粋腫瘍サンプルもシミュレートした。ＮＧＭＬＲ（ｖ０．２．６）３５を使用して配列を位置合わせした。次に、純粋な正常位置合わせの４７．５倍のダウンサンプルと純粋な腫瘍位置合わせの２．５倍のダウンサンプルとを混合して、純度９５％の５０倍の正常ペアを形成し、それぞれ４０倍、３５倍、２５倍の独立した正常のダウンサンプルを混合し、純粋な腫瘍の１０倍、１５倍、および２５倍のダウンサンプルを使用して、２０、３０、および５０％の純度の５０倍の腫瘍混合を構築した。トレーニングセットを第１染色体の１２０メガベース領域（３９，８１８の真の体細胞ＳＮＶと３８，８０４の真の体細胞ＩＮＤＥＬ）に制限し、テストセットを第２２染色体全体（１２，２０１の真の体細胞ＳＮＶと１２，１８５の真の体細胞ＩＮＤＥＬ）に制限した。３つの腫瘍混合比にわたる体細胞変異のＡＦは、２０から５０％の範囲である。
【０２０２】
候補変異の準備
【０２０３】
第１のステップとして、腫瘍読み取り位置合わせをスキャンして、変異の証拠がある候補位置を見つける。これらの位置の多くは、ゲノム領域の複雑さ、または配列アーティファクトのために行われた生殖細胞変異または誤った呼び出しのいずれかを有する。候補となる場所のセットにリベラルなフィルタのセットを適用して、そのような場所の数が適切であることを確認する。一般に、ＳＮＶの場合、最小要件として、ＡＦ≧０．０３またはＳＮＶをサポートする２つ以上の読み取り、および１９よりも大きい（実際のＷＥＳデータセットの場合は１４よりも大きい）Ｐｈｒｅｄスケーリングされた塩基品質スコアが必要であった。１塩基のＩＮＤＥＬの場合、ＡＦ≧０．０２または複数の読み取りサポートが必要であった。１塩基よりも大きいＩＮＤＥＬの場合、ＡＦ≧０．０３が必要である。アンサンブルアプローチでは、他の体細胞変異検出方法で検出された体細胞変異も入力候補として含めた。ＰａｃＢｉｏデータセットでは、ＳＮＶおよび１塩基よりも大きいＩＮＤＥＬには、ＡＦ≧０．１を使用し、１塩基ＩＮＤＥＬには、ＡＦ≧０．１５を使用した。
【０２０４】
ＤＲＥＡＭチャレンジデータセットでは、ｄｂＳＮＰ３６に存在する変異を入力候補から除外した。公正な比較のために、他の全ての体細胞変異検出ツールに対するｄｂＳＮＰ呼び出しもフィルタリングした。
【０２０５】
入力変異行列
【０２０６】
各候補位置について、サイズ５×３２のｋチャネルを有する３次元行列Ｍを準備する（図１０ａ、図１０ｃ、および図１０ｄ）。各チャネルの５行は、４つのＤＮＡ塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびギャップ文字（「−」）に対応する。行列の３２列のそれぞれは、位置合わせの１列を表す。
【０２０７】
候補となる場所ごとに、腫瘍および正常読み取り位置合わせを抽出する。図１０ａに示されるように、次に、ＭＳＡとして、参照に対する腫瘍および正常サンプルの読み取り位置合わせを検討する。この目的のために、読み取りに挿入がある場合、参照配列にギャップを追加することによって参照配列を拡張する。このプロセスでは、入力ＢＡＭファイルの元の読み取り位置合わせをさらに再調整する必要はなく、挿入が発生した場所に追加の列を割り当てることによって、位置合わせをＭＳＡ形式に再構築するだけであることに留意する必要がある。特定の位置の後の複数の読み取りに複数の異なる挿入がある場合、それらを左揃えの配列と見なし、同じ列のセットに配置する（例えば、図１０ａのちょっとした例の第９の列のＡおよびＣ塩基の挿入を参照）。この読み取り表現を使用して、各列のＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔ／−文字の頻度を見つけ、腫瘍サンプルと正常サンプルの個別の行列を記録する（行列ＭのチャネルＣ２およびＣ３）。チャネルＣ１では、各列に参照塩基（またはギャップ）を記録する。チャネルＣｉ（４≦ｉ≦ｋ）は、カバレッジ、塩基品質、マッピング品質、ストランド、クリッピング情報、編集距離、位置合わせスコア、ペアエンド情報など、腫瘍および正常サンプルの他の位置合わせ信号を記録する。例えば、塩基品質チャネルの場合、サンプルごとにサイズ５×３２の行列を有し、各列に特定の塩基（特定の行）を有する読み取りの平均塩基品質を記録する。別の例として、編集距離チャネルの場合、サンプルごとにサイズ５×３２の行列を有し、これは、各列に特定の塩基（特定の行）を有する読み取りの平均編集距離を記録する。行列Ｍの１つのチャネルは、候補が配置されている列を指定するために使用される。現在の実装では、スタンドアロンのＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓアプローチで合計２６のチャネルを使用した。
【０２０８】
ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのアンサンブル拡張のために、使用された６つの個別の方法のそれぞれによって報告された特徴をキャプチャするための追加のチャネルも含めた。この実装では、９３個の追加チャネルを使用して、他の方法から抽出された特徴を表し、ＳｏｍａｔｉｃＳｅｑによって位置合わせが報告された。したがって、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのアンサンブルモードは、候補行列ごとに１１９個の入力チャネルを有した。
【０２０９】
候補の場所ごとに、候補の周囲の７つの塩基のウィンドウに配置情報を報告する。挿入による拡張された配置を考慮に入れるために、３２列を予約する。挿入が大きいまれなケースでは、３２列では位置合わせを表すのに十分でない場合がある。そのような場合、候補の近くに少なくとも３つの塩基を記録することができるように、挿入を切り捨てる。
【０２１０】
ＣＮＮアーキテクチャ
【０２１１】
提案されたＣＮＮ（図１０ｂ）は、以下のように構造化された９つの畳み込み層からなる。入力行列は、６４個の出力チャネル、１×３カーネルサイズ、およびＲｅｌｕアクティベーションを備えた第１の畳み込み層に供給され、その後にバッチ正規化および最大プーリング層が続く。次に、この層の出力は、ＲｅｓＮｅｔ構造と同様のショートカットアイデンティティ接続を有する４つのブロックのセットに供給される。これらのブロックは、３×３カーネルの畳み込み層とそれに続くバッチ正規化および５×５カーネルの畳み込み層から構成される。これらのショートカットブロック間で、バッチ正規化層と最大プーリング層を使用する。最終ブロックの出力は、サイズ２４０の完全に接続された層に供給される。結果の特徴ベクトルは、２つのｓｏｆｔｍａｘ分類器および１つの回帰器に供給される。第１の分類器は、非体細胞、ＳＮＶ、挿入、および欠失の４つのクラスから変異タイプを予測する４方向分類器である。第２の分類器は、０、１、２、および≧３の４つのカテゴリから予測される変異長を予測する。非体細胞呼び出しは、ゼロサイズの変異として注釈が付けられ、ＳＮＶおよび１塩基のＩＮＤＥＬは、サイズ１として注釈が付けられ、２塩基および≧３サイズのＩＮＤＥＬは、それぞれ２および≧３サイズの変異として注釈が付けられる。回帰器は、行列内の変異の列を予測して、予測が正しい位置を標的とし、滑らかなＬ１損失関数を使用して最適化されるようにする。
【０２１２】
ＣＮＮは、９００Ｋ未満のパラメータを有するため、大きなバッチサイズを使用することで非常に効率的な実装が可能になる。全ゲノムトレーニングプロセスは、８台のＴｅｓｌａ  Ｋ８０  Ｎｖｉｄｉａ  ＧＰＵを搭載したマシンで約８時間かかった。
【０２１３】
ＣＮＮトレーニング
【０２１４】
ＤＲＥＡＭチャレンジ、プラチナ、および標的濃縮データセットの場合、ゲノム領域をランダムに５０％のトレーニングセットと５０％のテストセットとに分割する。ＰａｃＢｉｏデータセットについては、第１染色体の１２０メガベース領域でＮｅｕＳｏｍａｔｉｃをトレーニングし、第２２染色体の全てでテストした。
【０２１５】
データセットごとに、全ての異なる腫瘍／正常純度シナリオから生成されたトレーニング入力行列を組み合わせ、ネットワークのトレーニングに組み合わせたセットを使用した。次に、この統一されたトレーニング済みモデルを適用して、個々の腫瘍／正常純度設定でテストした。
【０２１６】
ＤＲＥＡＭチャレンジデータセットは、ステージ３で１５，５０７の体細胞変異を有し、ステージ４で３０，４６２の体細胞変異を有する。より良いネットワークトレーニングのために、ＢＡＭＳｕｒｇｅｏｎ１９を使用して、ステージ３および４の腫瘍サンプルに元のＤＲＥＡＭデータと同様のＡＦ分布を有する約９５Ｋ以上のＳＮＶおよび約９５Ｋ以上のＩＮＤＥＬをスパイクした。
【０２１７】
学習率０．０１、運動量０．９のＳＧＤオプティマイザによってバッチサイズ１０００を使用してネットワークをトレーニングし、４００エポックごとに学習率に０．１を掛けた。
【０２１８】
一般に、入力候補の場所は、真の体細胞変異よりもはるかに多くの非体細胞（参照または生殖細胞系列）呼び出しを有するため、各エポックでは、トレーニングセット内の全ての真の体細胞変異と、真の体細胞変異の数２倍のランダムに選択された非体細胞候補とを使用する。加重ｓｏｆｔｍａｘ分類損失関数を使用して、各カテゴリの候補数のバランスを取った。ＤＲＥＡＭチャレンジデータの場合、トレーニングセットに合成変異を追加したため、非体細胞カテゴリの重みを増やして、テストセットの精度を高めた。
【０２１９】
合成標的濃縮データセットを評価するために、トレーニングセットとして全エクソームおよび全ゲノムデータを使用した。
【０２２０】
実際のＷＧＳサンプルＣＬＬ１およびＣＯＬＯ−８２９でテストするために、ＳｏｍａｔｉｃＳｅｑおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのＤＲＥＡＭチャレンジステージ３でトレーニングされたモデルを使用した。実際のＷＥＳサンプルＴＣＧＡ−ＡＺ−６６０１については、別のＴＣＧＡ  ＷＥＳデータセットであるＴＣＧＡ−ＡＺ−４３１５３０のデータを使用してトレーニングセットを準備した。このデータセットからの腫瘍および正常位置合わせを混合し、混合を２つの等しい位置合わせに分割した。次に、１つの位置合わせを純粋な正常として使用し、ＢＡＭＳｕｒｇｅｏｎを使用して約９１ＫのランダムＳＮＶと約９ＫのランダムＩＮＤＥＬとを他の位置合わせにスパイクして、トレーニング用の合成腫瘍サンプルを生成した。この合成腫瘍正常ＷＥＳデータセットでトレーニングされたモデルを使用して、実際のＷＥＳデータセットであるＴＣＧＡ−ＡＺ−６６０１でＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＳｏｍａｔｉｃＳｅｑをテストした。２６１の実際のＴＣＧＡサンプルでの実験では、同様のアプローチを使用して、１２のＴＣＧＡサンプルを使用してトレーニングセットを準備した。この合成データセットでトレーニングされたモデルは、２６１個のＴＣＧＡサンプルでテストするために使用された。
【０２２１】
ハイパーパラメータチューニング
【０２２２】
ハイパーパラメータの調整では、ＤＲＥＡＭチャレンジステージ３の実験でゲノムの１０％を使用し、他の全ての実験で派生パラメータを使用した。
【０２２３】
さらに、４から１６個のＲｅｓＮｅｔブロックを備えたアクティブ化前のＲｅｓＮｅｔアーキテクチャ（ＲｅｓＮｅｔ−１８およびＲｅｓＮｅｔ−３４アーキテクチャを含む）などの異なるネットワークアーキテクチャ（図２４ａ〜図２４ｅ）、および提案された残りのＮｅｕＳｏｍａｔｉｃアーキテクチャ（図２４ｆ〜図２４ｍ）のいくつかの変異を調査した。これらのネットワークを評価するために、ＤＲＥＡＭステージ３データセットのトレーニングデータを２つに分割し、一方を使用して異なるアーキテクチャをトレーニングし、他方を使用してスタンドアロンモードでそれらを評価した。図２５は、精度、ネットワークパラメータの数、メモリ使用量、および速度の観点からこれらのアーキテクチャを比較している。一般に、これらのネットワークは、全て、従来の体細胞変異検出アプローチと比較して、比較的高い精度を得ることができる。この観察により、候補のゲノムコンテキストで主要な信号をキャプチャし、体細胞変異検出問題での畳み込みネットワークの効率的な実装を容易にする、提案されたデータ要約アプローチの重要性が明らかになった。２つの３×３畳み込みフィルタを備えたデフォルトのＲｅＳＮｅｔアーキテクチャ（図２４ａ〜図２４ｅ）は、提案された残差ブロックを備えたアーキテクチャ（図２４ｆ〜図２４ｍ）と比較して平均精度が低くなっている。さらに、ストライド畳み込みを備えたネットワーク（図２４ａ〜図２４ｇ）は、より多くのネットワークパラメータと実行時要件を有する。要約すると、各ネットワークアーキテクチャは、比較された態様のいくつかで利点を示しているが、他のネットワークは、それらの使用例と時間／計算上の制約を考慮してユーザによって容易に適応することができる一方で、提案されたＮｅｕＳｏｍａｔｉｃネットワークアーキテクチャ（図１０ｂ；図２４ｋ）をデフォルトのネットワークアーキテクチャとして選択した。
【０２２４】
図２４ａ〜図２４ｍは、テストされた異なるネットワークアーキテクチャを示している。図２４ａ〜図２４ｅは、デフォルトの３×３畳み込み層を使用したアクティブ化前の残余ブロックの数が異なるＲｅｓＮｅｔアーキテクチャを示している。ここでは、ストライド畳み込みがチャネル拡張で使用される。図２４ｆおよび図２４ｇは、３×３と５×５の畳み込み層といくつかの拡張された畳み込みを有する複数のカスタマイズされた残余ブロックを示している。ここでは、ストライド畳み込みがチャネル拡張で使用される。図２４ｈは、３×３および５×５の畳み込み層といくつかの拡張された畳み込みを有する４つのカスタマイズされた残余ブロックを示している。ここでは、ストライド畳み込みは、使用されていない。図２４ｉ〜図２４ｍは、異なる残余ブロックと完全に接続されたサイズを有するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ残余アーキテクチャを示している。
【０２２５】
図２５は、図２４ａ〜図２４ｍに示される異なるネットワークアーキテクチャの性能分析を示している。ここでは、全てのネットワークが１０００のバッチサイズで６００エポックのトレーニング後に評価される。
【０２２６】
他の体細胞変異検出アルゴリズム
【０２２７】
分析において、Ｓｔｒｅｌｋａ２（ｖ２．８．４）、Ｍｕｔｅｃｔ２（ｖ４．０．０．０）、ＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒ（ｖ１．０．５．０）、ＭｕＳＥ（ｖ１．０ｒｃ）、ＶａｒＤｉｃｔ（ｖ１．５．１）、ＶａｒＳｃａｎ２（ｖ２．３．７）、およびＳｏｍａｔｉｃＳｅｑ（ｖ２．７．０）体細胞変異検出アルゴリズムをそれらのデフォルト設定で使用した。
【０２２８】
ＰａｃＢｉｏデータに対してＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの代替アプローチとしてＶａｒＤｉｃｔを使用した。高エラー率のロングリードで体細胞変異を検出できるようにするために、「−ｍ  １００００  −Ｑ  １  −ｑ  ５  −Ｘ  １  −ｃ  １  −Ｓ  ２  −Ｅ  ３  −ｇ  ４  −ｋ  ０」パラメータ設定でＶａｒＤｉｃｔを使用した。また、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃと同様に、ＳＮＶにはＡＦ≧０．１、ＩＮＤＥＬにはＡＦ≧０．１５を使用した。
【０２２９】
ＳｏｍａｔｉｃＳｅｑをトレーニングするために、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃで使用されたものと同じ５０％のトレーニング／テスト領域分割も実行した。さらに、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの場合と同様に、各データセットについて、全ての異なる腫瘍／正常純度シナリオからのトレーニングデータを組み合わせて、ＳｏｍａｔｉｃＳｅｑ  ＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ分類器をトレーニングした。次に、これらの統一された分類器を使用して、個々の腫瘍／正常純度設定を予測した。
【０２３０】
適合率−再現率分析では、各ツールによって割り当てられた信頼度または品質スコアに基づいて体細胞変異がソートされた。ＭｕＳＥの場合、ソート基準として層の割り当てを使用した。ＶａｒＤｉｃｔ、ＶａｒＳｃａｎ２、ＭｕＴｅｃｔ２、Ｓｔｒｅｌｋａ２、およびＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒの場合、それぞれ、ソートにＶＣＦファイルで報告されたＳＳＦ、ＳＳＣ、ＴＬＯＤ、ＳｏｍａｔｉｃＥＶＳ、およびＳＳＣの値を使用した。ＳｏｍａｔｉｃＳｅｑおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃについては、ＱＵＡＬフィールドで体細胞変異の品質スコアを使用した。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、ＣＮＮによる予測の確率に基づいて、予測された体細胞変異の品質スコアを報告する。
【０２３１】
実際のサンプルの性能を分析するために、様々な方法からのＰＡＳＳ体細胞呼び出しを使用した（ＶａｒＤｉｃｔの場合、ＳｔｒｏｎｇＳｏｍａｔｉｃステータスによる呼び出しに制限した）。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの場合、ＷＧＳの品質スコアの閾値として０．９７を使用し、ＷＥＳの閾値として０．６を使用した。
【０２３２】
計算の複雑さ
【０２３３】
全ゲノムデータの場合、３０倍の腫瘍と正常位置合わせをスキャンして候補を見つけ、特徴を抽出し、入力行列を準備するのに、デュアル１４コアＩｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ  ＣＰＵ  Ｅ５−２６８０  ｖ４  ２．４０ＧＨｚマシンで約３．９時間かかることができる。全ゲノムトレーニングプロセスは、８台のＴｅｓｌａ  Ｋ８０  Ｎｖｉｄｉａ  ＧＰＵを搭載したマシンで約８時間かかる可能性がある（サイズ５８０，０００のエポックあたり約９０秒）。候補体細胞変異のカットオフＡＦに応じて、３０倍の全ゲノムデータで候補変異のネットワーク予測を計算するには、８台のＴｅｓｌａ  Ｋ８０  ＮｖｉｄｉａＧＰＵにより、約３５分（０．０５，３．９Ｍ候補のＡＦカットオフ）から約１００分（０．０３，１１．５Ｍ候補のＡＦカットオフ）かかることができる。１２５倍の全エクソームデータの場合、ネットワーク予測のスキャン、準備、および計算全体に約３０分かかる可能性がある。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃアンサンブルとスタンドアロンアプローチ（ＣＰＵのみのモード）を使用して、１２５倍の全エクソームデータセットと３０倍の全ゲノムデータセットに対する体細胞変異を予測するためのエンドツーエンドの実行時間が、図２６ａおよび図２６ｂの他の体細胞変異検出技術と比較された。
【０２３４】
図２６ａは、異なる体細胞変異検出アルゴリズムの実行時比較を示している。１２５倍の全エクソーム配列データセットで体細胞変異を予測するためのＣＰＵコア時間が示されている。図２６ｂは、異なる体細胞変異検出アルゴリズムの実行時比較を示している。ＣＰＵコア時間は、３０倍の全ゲノムシーケンシングデータセットで体細胞変異を予測するために示されている。
【０２３５】
コードの可用性
【０２３６】
ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、ＰｙｔｈｏｎおよびＣ＋＋で書かれている。その深層学習フレームワークは、ＰｙＴｏｒｃｈ  ０．３．１を使用して実装され、トレーニング．テスト用のＧＰＵアプリケーションを有効にする。ソースコードは、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ／ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃにおいて、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｍｏｎｓ  Ａｔｔｒｉｂｕｔｉｏｎ−ＮｏｎＣｏｍｍｅｒｃｉａｌ−ＳｈａｒｅＡｌｉｋｅ  ４．０国際ライセンスの下で入手可能である。このホワイトペーパーの結果は、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ  ｖ０．１．３に基づいていた。
【０２３７】
報告の概要
【０２３８】
実験設計の詳細については、この記事にリンクされているネイチャーリサーチレポート概要において入手可能である。
【０２３９】
データの可用性
【０２４０】
この研究の配列データは、様々なソース、すなわち、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｃｈｉｖｅ（アクセッション：ＰＲＪＥＢ３２４６；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅａｄ  Ａｒｃｈｉｖｅ（アクセッション：ＳＲＸ１０２６０４１；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｒａ）、国際がんゲノムコンソーシアム（プロジェクト：ＩＣＧＣ−ＴＣＧＡ  ＤＲＥＡＭ変異呼び出しチャレンジ、制御されたアクセス：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｃｇｃ．ｏｒｇ／）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（アクセッション：ＴＣＧＡ−ＡＺ−６６０１，ＴＣＧＡ−ＡＺ−４３１５；制御されたアクセス：ｈｔｔｐｓ：／／ｇｄｃ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ−ｐｈｅｎｏｍｅ  Ａｒｃｈｉｖｅ（アクセッション：ＥＧＡＳ０００００００００５２、ＥＧＡＤ００００１００００２３；制御されたアクセス：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｇａ／）、およびＧｅｎｏｍｅ−ｉｎ−ａ−Ｂｏｔｔｌｅ（アクセッション：ＨＧ００２、ＨＧ００３、ＨＧ００４；ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｔｒａｃｅ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｉａｂ／ｆｔｐ／）から収集された。合成データは、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ／ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ／ｂｌｏｂ／ｐａｐｅｒ／ｅｔｃ／ｄａｔａ＿ｓｃｒｉｐｔｓ．ｚｉｐのスクリプトを使用して、上記のデータセットから生成された。他の全ての関連データは、要求に応じて入手可能である。
【０２４１】
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【０２４２】
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【０２５９】
１８．Ｅｂｅｒｌｅ，Ｍ．Ａ．ら、Ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｄａｔａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ５．４  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｐｈａｓｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｂｙ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａ  ｔｈｒｅｅ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  １７−ｍｅｍｂｅｒ  ｐｅｄｉｇｒｅｅ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２７，１５７−１６４（２０１７）。
【０２６０】
１９．Ｅｗｉｎｇ，Ａ．Ｄ．ら、Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｒｏｗｄｓｏｕｒｃｉｎｇ  ｔｏ  ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｖａｒｉａｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，６２３（２０１５）。
【０２６１】
２０．Ｚｏｏｋ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｔｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｓｃｉ．Ｄａｔａ  ３，１６００２５（２０１６）。
【０２６２】
２１．Ｘｕ，Ｃ．Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１６，１５−２４（２０１８）。
【０２６３】
２２．Ｚｏｏｋ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ  ｓｅｔｓ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ＳＮＰ  ａｎｄ  ｉｎｄｅｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｃａｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，２４６（２０１４）。
【０２６４】
２３．Ｐｕｅｎｔｅ，Ｘ．Ｓ．ら、Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７５，１０１（２０１１）。
【０２６５】
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【０２６６】
２５．Ｐｌｅａｓａｎｃｅ，Ｅ．Ｄ．ら、Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６３，１９１（２０１０）。
【０２６７】
２６．Ｎｅｔｗｏｒｋ，Ｃ．Ｇ．Ａ．ら、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８７，３３０（２０１２）。
【０２６８】
２７．Ｇｒａｓｓｏ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｖａｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．８，７３０−７４９（２０１８）。
【０２６９】
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【０２７０】
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【０２７１】
３０．Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｓｈａｒｅｄ  ｖｉｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄａｔａ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７５，１１０９−１１１２（２０１６）。
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【０２７５】
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【０２７６】
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【０２７７】
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実施例２
【０２７８】
体細胞変異の正確な検出は困難であるが、癌の形成、進行、および治療を理解するために重要である。最近、最初の深層畳み込みニューラルネットワークベースの体細胞変異検出アプローチであるＮｅｕＳｏｍａｔｉｃを提案し、インシリコデータで性能上の利点を実証した。この研究では、ＳＥＱＣ−ＩＩコンソーシアムからの最初の包括的で十分に特徴付けられた体細胞参照サンプルを使用して、癌変異検出で深層学習フレームワークを利用するためのベストプラクティスを調査した。コンソーシアムによってこれらの参照サンプルに対して確立された信頼性の高い体細胞変異を使用して、実際のシナリオを表すサンプルから派生した複数のデータセットでロバストなモデルを構築するための戦略を特定した。提案された戦略は、ＷＧＳ、ＷＥＳ、新鮮なＦＦＰＥ  ＤＮＡ入力のＡｍｐｌｉＳｅｑ標的配列、様々な腫瘍／正常純度、および様々なカバレッジ（１０倍から２０００倍の範囲）などの複数のシーケンシング技術にわたって高いロバスト性を実現した。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、一般的な従来の検出アプローチを大幅に上回り、カバレッジが低い、変異頻度が低い、ＤＮＡ損傷、ゲノム領域が困難などの困難な状況でも優れていた。
【０２７９】
序文
【０２８０】
体細胞変異は、重要な癌の原動力である。正確な体細胞変異の検出により、癌患者の正確な診断、予後、および治療が可能になる１．次世代シーケンシング技術から体細胞変異を特定するために、いくつかのツールが開発されている２−１１。一般に、従来の手法では、腫瘍および正常のペアの配列データで抽出された一連の手作りの配列特徴を使用する様々な統計／アルゴリズムモデリングアプローチを通じて、背景ノイズ、生殖細胞変異、および／または相互汚染から体細胞変異を特定する２−１０。これらの手動で設計されたアプローチは、それらが開発された特定の癌の種類、サンプルの種類、またはシーケンシング戦略を超えて簡単に一般化することはできない。
【０２８１】
最近、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃと呼ばれる深層学習ベースの体細胞変異検出アプローチが提案され、これは、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）を使用して、生データから直接特徴表現を学習する１１。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、腫瘍／正常位置合わせ情報の新たな要約を入力行列のセットとして使用し、これを採用して、真の体細胞変異をアーティファクトから効果的に区別する方法を学習するモデルを効率的にトレーニングすることができる。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃによってトレーニングされたネットワークモデルは、手動の介入なしに、リード位置合わせとゲノムコンテキストから直接重要な変異信号をキャプチャすることができる。したがって、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、適切なデータのトレーニングを通じて、様々なシーケンシング技術、癌の種類、腫瘍および正常純度、変異対立遺伝子の頻度など、様々な問題ステートメントに簡単に適用できるフレームワークを提供する。さらに、スタンドアロンの体細胞変異検出法として、または既存の方法のアンサンブルを使用して実装し、最高の精度を実現することができる。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、インシリコデータセットで従来の手法を大幅に上回っていることが示されている。既知の「グラウンドトゥルース」体細胞変異を伴う完全に特徴付けられたベンチマークサンプルがないため、実際のサンプルの性能評価は、検証済みの少数の体細胞変異の部分感度分析に制限されていた。したがって、インシリコデータにＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのＣＮＮベースのフレームワークを実装することで得られる利点にもかかわらず、実際の癌サンプルでのＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの精度と再現性はこれまで包括的に評価されていなかった。
【０２８２】
最近、ＦＤＡ主導の配列品質管理フェーズＩＩ（ＳＥＱＣ−ＩＩ）コンソーシアムの体細胞変異ワーキンググループが、参照一致腫瘍正常サンプルを開発した：ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株（ＨＣＣ１３９５）および一致Ｂリンパ球由来正常細胞株（ＨＣＣ１３９５ＢＬ）１２、１３。ＳＥＱＣ−ＩＩコンソーシアムは、直交シーケンシング技術、複数のシーケンシング複製、および複数のバイオインフォマティクス分析パイプラインを使用して、ＨＣＣ１３９５の体細胞単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）および挿入／欠失（ＩＮＤＥＬ）の明確な「ゴールドセット」を開発した。
【０２８３】
最初の包括的でよく特徴付けられたペアの腫瘍正常参照癌サンプルとして、このデータセットは、複数のサイトおよび技術で準備された付随するシーケンシングデータとともに、２つの重要な目的を達成するための独自のリソースを提供する。まず、コンソーシアムがこれらの参照サンプル用に開発した信頼性の高い体細胞変異コールセットを使用して、従来のスキームと比較して、実際の癌サンプルにおける深層学習ベースの体細胞変異検出の詳細な分析を実行した。第２に、ＳＥＱＣ−ＩＩデータを使用して様々なモデル構築戦略を検討し、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃでＣＮＮをトレーニングし、実際のシナリオを表すサンプルから派生した複数のデータセットで効果的なトレーニングアプローチを特定した。全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）、全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）、および１０倍−２０００倍の範囲の収束を伴うＡｍｐｌｉＳｅｑ標的化シーケンシングデータセットで提案された戦略を評価した。ＷＧＳおよびＷＥＳデータは、様々な入力量の３つのライブラリ準備プロトコルを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）および新鮮なＤＮＡから、および複数のプラットフォーム／配列サイトから導出された。腫瘍および正常な滴定を使用して、５％〜１００％の腫瘍純度、５％の汚染された一致正常、および１０倍〜３００倍ＷＧＳカバレッジについて様々なアプローチを評価した。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃで深層学習フレームワークをトレーニングおよび実装するために提案された戦略は、前述の全ての実際のシナリオで高いロバスト性を実現し、従来のペアの腫瘍および正常の体細胞変異検出アプローチを大幅に上回った。
【０２８４】
ＳＥＱＣ−ＩＩ参照癌サンプルに関する分析では、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃに実装された深層学習スキームが、従来の手法では簡単に解決できない体細胞変異検出の主な課題を克服するのに役立つことが示されている。したがって、我々の研究から導出された深層学習モデルおよび戦略は、強力な癌変異検出のための実用的なベストプラクティスの推奨事項を研究コミュニティに提供することができる。
【０２８５】
結果
【０２８６】
参照サンプルおよびデータセット
【０２８７】
体細胞変異検出問題のフルスペクトル分析には、ＳＥＱＣ−ＩＩコンソーシアムの体細胞変異ワーキンググループによって開発された、最初の包括的な全ゲノム特性を備えた参照腫瘍正常ペア乳癌細胞株（ＨＣＣ１３９５およびＨＣＣ１３９５ＢＬ）を使用した１２、１３。ＳＥＱＣ−ＩＩコンソーシアムによって４つの信頼水準（高、中、低、および未分類）に分類されたＨＣＣ１３９５の呼び出しのスーパーセットにおけるグラウンドトゥルースＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ体細胞変異のＶＡＦ分布を示している図２７に示されるように、我々は、コンソーシアムによって導出された信頼性の高い体細胞変異（３９，５３６ＳＮＶおよび２，０２０  ＩＮＤＥＬ）を、我々のグラウンドトゥルースセットとして利用した。高信頼性および中信頼性の呼び出しは、体細胞変異の「真のセット」としてグループ化される。予測の一貫性と再現性を幅広く評価するために、ＦＦＰＥで、実際のＷＧＳ、ＷＥＳ、ＡｍｐｌｉＳｅｑ標的シーケンシングおよび６つの中心で複数のプラットフォームを使用して配列された新鮮なＤＮＡ（方法を参照）など、様々なカバレッジ、腫瘍純度、ライブラリ準備を含む現実的な癌検出アプリケーションを表す様々なデータセットからの合計１２３の複製を使用した。
【０２８８】
図２７は、ＳＥＱＣ−ＩＩコンソーシアムによって４つの信頼レベル（高、中、低、および未分類）に分類されたＨＣＣ１３９５の呼び出しのスーパーセットにおけるグラウンドトゥルースＳＮＶおよびＩＮＤＥＬ体細胞変異のＶＡＦ分布を示している。高信頼性および中信頼性の呼び出しは、体細胞変異の「真のセット」としてグループ化される。
【０２８９】
分析の概要
【０２９０】
様々なトレーニング済みネットワークモデルを使用して、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの深層学習ベースの体細胞変異検出アプローチを評価し、ＭｕＴｅｃｔ２２、ＭｕＳＥ３、ＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒ４、Ｓｔｒｅｌｋａ２５、ＶａｒＤｉｃｔ６、ＴＮｓｃｏｐｅ７、Ｌａｎｃｅｔ８などの広く使用されている７つの従来の体細胞変異呼び出しアルゴリズムと比較した。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃをスタンドアロンモード（ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓとして表示）とアンサンブルモードとの双方で評価し、アンサンブルモードでは、ＭｕＴｅｃｔ２、ＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒ、ＶａｒＤｉｃｔ、ＭｕＳＥ、Ｓｔｒｅｌｋａ２によって報告された予測も、生データに加えて入力チャネルとして含まれている。
【０２９１】
図２８ａ〜図２８ｅは、ＳＥＱＣ−ＩＩデータセットの１２３回の複製に対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの全体的な性能を示している。図２８ａは、ＤＲＥＡＭチャレンジステージ３データセットでトレーニングされたＮｅｕＳｏｍａｔｉｃモデルが、ＳＥＱＣ−ＩＩデータに適用されたときに他の手法よりも優れていることを示している。図２８ｂは、ＳＥＱＣ−ＩＩ参照サンプルを使用して様々なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃモデルをトレーニングすると、平均Ｆ１−スコアがさらに４〜５％向上したことを示している。図２８ｃは、ＳＥＱＣ−ＩＩデータでトレーニングされたモデルを使用して、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃが、ＷＧＳ、ＷＥＳ、ＦＦＰＥ、ＡｍｐｌｉＳｅｑ、および様々なライブラリ準備データセットの様々な純度／カバレッジの複製の多様なセットにわたって、他の手法よりも一貫した優位性を実現することを示している。この副図では、各複製について、異なるアプローチで最良のＦ１−スコアが計算された。ヒートマップは、体細胞変異検出アプローチのいずれかのＦ１−スコアと最良のＦ１−スコアとの絶対差を示している。各パネルには、１２３回の繰り返しにわたる各アプローチの平均Ｆ１−スコアが示されている。図２８ｄは、ＳＮＶおよびＩＮＤＥＬの６つのデータセットにおける１２３個の複製にわたる様々な手法の性能を比較している。各複製について、様々なアプローチで最良のＦ１−スコアが計算された。ヒートマップは、最良のＦ１−スコアに対する体細胞変異検出アプローチのいずれかのＦ１−スコア間の絶対差を示している。１２３回の繰り返しにわたる各アプローチの平均Ｆ１−スコアが示されている。
【０２９２】
分析では、いくつかの異なるトレーニングモデルを使用した。まず、ＤＲＥＡＭチャレンジステージ３データセット１３からのインシリコスパイクインを使用してトレーニングされた、最近公開された既に利用可能なモデル１１を使用した。サンプルタイプ、シーケンシングプラットフォーム、カバレッジ、スパイクイン変異頻度、およびＤＲＥＡＭ３モデルのトレーニングに使用されるサンプルの不均一性の間の大きな不一致にもかかわらず、このモデルは、ＳＮＶとＩＮＤＥＬの双方の異なるサンプル間で平均された平均Ｆ１−スコアで約４％だけ様々な特性の実際の癌データセット全体で他の従来の手法を上回った（図２８ａ）。この優位性は、前述のバリエーションに対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのロバスト性をサポートするが、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃで使用される深層学習フレームワークは、特にＩＮＤＥＬを予測し、ＡｍｐｌｉＳｅｑのようなＰＣＲが豊富なデータセットのより高いカバレッジを実現するために、実際の癌サンプルからシーケンシング特徴と変異シグネチャを学習することで、さらに優れた性能を発揮できることも示唆している。
【０２９３】
実際の癌サンプルを使用してネットワークモデルを構築するための最も効果的な戦略を特定するために、ＳＥＱＣ−ＩＩ参照サンプルを使用してＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのさらに１０のトレーニングアプローチを評価した（図２８ｅ）。
【０２９４】
第１のモデル（ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−スパイク）は、インシリコ腫瘍−正常複製のＷＧＳペアのセットでトレーニングされ、インシリコ腫瘍は、異なる正常な複製に変異をスパイクすることによって設計された。第２のモデル（ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ−５０）は、ゲノムの５０％にある実際のＷＧＳ腫瘍−正常の複製ペアのセットでＨＣＣ１３９５のグラウンドトゥルース体細胞変異を使用してトレーニングされた。第３のモデル（ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０）は、第１のモデルのトレーニングデータの１０％を第２のモデルのトレーニングデータに追加して、多数のスパイクイン変異と現実的な体細胞変異の双方を利用することによって作成された。これらの３つのモデルは、全てのデータセットでテストされた。ＦＦＰＥやＷＥＳなどの特定のデータセットについては、インシリコ腫瘍および正常の複製の合成ペアのセットを使用して、６つの追加の特殊モデルも準備した。全てのモデルについて、ゲノムの５０％ホールドアウト領域（ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ−５０モデルには使用されていない）での性能を評価した。また、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ−５０モデルと同様であるが、ゲノム全体で全てのグラウンドトゥルース変異を使用してモデル（ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ−ＡＬＬ）をトレーニングした。ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ−ＡＬＬは、全ての真の変異が確認されたＷＧＳデータセットに直接適用できるのではなく、ＨＣＣ１３９５以外の他のデータセットまたはサンプルの性能分析に役立つ。
【０２９５】
ＳＥＱＣ−ＩＩサンプルでトレーニングされたモデルを使用して、平均Ｆ１−スコアが約４〜５％向上することにより、平均ＤＲＥＡＭ３モデルの性能が向上した（図２８ｂ）。提案されたモデル構築戦略は、様々なサンプルタイプと配列戦略にわたって一貫して最良であり、ＳＮＶとＩＮＤＥＬとの平均Ｆ１−スコアに関して従来のアプローチをそれぞれ５．７％および７．８％以上上回った。同様に、全てのサンプルにわたって、他の従来の手法の中央値Ｆ１−スコアと比較して５．６％を超える改善が観察された（図２８ｃおよび図２８ｄ）。
【０２９６】
ＷＧＳデータセット
【０２９７】
ＨｉＳｅｑＸ１０、ＨｉＳｅｑ４０００、およびＮｏｖａＳｅｑ  Ｓ６０００プラットフォームを使用して６つの配列中心に配列された２１個のＷＧＳ複製に対して前述の体細胞呼び出し技術およびネットワークモデルの性能を評価した（図２９ａ〜図２９ｄ）。
【０２９８】
ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ  ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０モデルは、他のスキームよりも一貫して優れた性能を示したが、複製間で僅かな相違があり、ロバスト性と再現性とが実証されている（図２９ａ）。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、ＳＮＶおよびＩＮＤＥＬの平均Ｆ１−スコアが９４．６％および８７．９％であり、他の従来の体細胞変異検出スキームの平均Ｆ１−スコアよりもＳＮＶおよびＩＮＤＥＬでそれぞれ５．６％および１０．２％以上優れている。適合率−再現率分析により、他の手法と比較したＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの高精度が、この優位性を促進したことが明らかになった（図２９ｂ）。異なるモデルトレーニング戦略を比較すると、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓ  ＩＮＤＥＬ呼び出しは、グラウンドトゥルース体細胞変異を使用したトレーニングからより多くの利益を得ることが明らかになったが、一般に、ＤＲＥＡＭ３モデルと比較してＳＥＱＣ−ＩＩ参照サンプルを使用すると最大１１％の大幅な改善が見られた（図２９ｃ）。
【０２９９】
腫瘍純度および汚染された正常
【０３００】
腫瘍の純度と一致する正常なサンプルの腫瘍細胞の汚染は、変異の検出精度に大きく影響するため、ＷＧＳサンプルの腫瘍−正常滴定によって、様々な配列深度とサンプル純度におけるモデルのロバスト性を調査した。我々は、最初に、５％〜１００％の純度の腫瘍サンプルを純粋な正常サンプルと組み合わせて１０倍〜３００倍のカバレッジ範囲で研究した（図３０ａ〜図３０ｈ）。一般に、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、腫瘍の純度とカバレッジの変動にもかかわらず、他のスキームよりも優れていることを維持した。これは、そのロバスト性を反映している（図３０ａ、図３０ｅ、および図３０ｆ）。それは、カバレッジが低いなどのより困難な場合には、従来のスキームに比べて最大の利点があった（例えば、カバレッジが１０倍で純度が１００％のサンプルのＦ１−スコアの利点は約２０％である）。
【０３０１】
さらに、８０倍のカバレッジで１０％〜１００％の範囲の腫瘍サンプル純度について、正常サンプルの５％腫瘍汚染に対するロバスト性を分析した（図３０ｂ）。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、Ｆ１−スコアの絶対変化の中央値が５％未満で、腫瘍の正常な相互汚染に対して高いロバスト性をもたらした。純粋な正常でＦ１−スコアが高い他の手法の中でも、Ｓｔｒｅｌｋａ２は、腫瘍汚染に対して高いロバスト性を示した（Ｆ１−スコアの中央値の変化は８．４％）。ＭｕＴｅｃｔ２、ＭｕＳＥ、Ｌａｎｃｅｔ、およびＴＮｓｃｏｐｅは、純粋な正常シナリオではＦ１−スコアが高いにもかかわらず、汚染された正常シナリオを使用した場合、Ｆ１−スコアが最大約５０％大幅に低下した。
【０３０２】
グラウンドトゥルース変異でトレーニングされたモデルは、主に精度が高いため、一般にＤＲＥＡＭ３モデルよりも高い利点が得られた（図３０ｃおよび図３０ｇ）。インシリコ腫瘍でトレーニングされたＳＥＱＣ−ＷＧＳ−スパイクモデルも、グラウンドトゥルースでトレーニングされたモデルと比較して精度が低くなった。一般に、ＩＮＤＥＬ、低純度、低カバレッジのサンプルは、ＳＥＱＣ−ＩＩデータのトレーニングから最も恩恵を受けた。
【０３０３】
様々なカバレッジと純度設定とにわたる様々なＩＮＤＥＬサイズのＦ１−スコアを分析すると、挿入と欠失との双方のサイズ変動に対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのロバスト性が明らかになった（図３０ｄ）。
【０３０４】
ライブラリの準備およびＤＮＡ入力
【０３０５】
ライブラリ準備が予測のロバスト性に与える影響を測定するために、モデルを使用して、ＴｒｕＳｅｑ−ＮａｎｏおよびＮｅｘｔｅｒａ  Ｆｌｅｘプロトコルと３つのＤＮＡ入力量：１ｎｇ、１０ｎｇ、および１００ｎｇを使用して準備した６つの複製をテストした（図３１ａ〜図３１ｆおよび図３１ｈ）。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、様々なライブラリ準備アプローチで他の手法を一貫して上回った。１ｎｇのＴｒｕＳｅｑ−Ｎａｎｏライブラリの場合、冗長な読み取りを欠失した後の有効なカバレッジが制限されているため（約７倍）、全ての方法の性能が低下した。平均して、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、従来の体細胞変異検出技術と比較して、ＳＮＶに対して８．４％のＦ１−スコアの改善をもたらした。ＩＮＤＥＬの場合、ＬａｎｃｅｔのアセンブリベースのＩＮＤＥＬ呼び出し元は、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ  ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０モデルを約４％上回った（図３１ａ）。対照的に、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０モデルは、ＩＮＤＥＬのＬａｎｃｅｔと同様の性能を達成した（図３１ｂおよび図３１ｇ）。ＳＥＱＣ−ＩＩスパイクインまたはグラウンドトゥルースデータのトレーニングにより、ＤＲＥＡＭ３モデルと比較してＳＮＶのＦ１−スコアが全体で約８．４％向上した。この利点は、１ｎｇの入力を有するＴｒｕＳｅｑ−Ｎａｎｏライブラリを含むより困難なケースでより顕著であった。また、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓがこれらのモデルからより多くの恩恵を受けていることも観察した。
【０３０６】
キャプチャ（ＷＥＳ）および標的化（ＡｍｐｌｉＳｅｑ）パネル
【０３０７】
６つのシーケンシングサイトで配列された１６個のＷＥＳ複製、およびＡｍｐｌｉＳｅｑデータセットの３つの複製（図３１ｃ〜図３１ｆ、図３１ｉ、および図３１ｊ）でモデルをテストした。ＳＥＱＣ−ＩＩ  ＷＧＳサンプルでトレーニングされたモデルは、カバレッジとプラットフォームバイアスが異なるが、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、カバレッジが２０００倍のＷＥＳデータセットとＡｍｐｌｉＳｅｑデータセットとの双方で良好に機能した。ＷＥＳの場合、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、９５．４％の平均ＳＮＶ  Ｆ１−スコアを達成し、代替スキームの平均Ｆ１−スコアを２．６％以上改善した。ＷＥＳデータセットでは、ＷＥＳおよびＷＧＳデータでトレーニングされたモデルは、約９５％のＦ１−スコアで同様に実行された。ＡｍｐｌｉＳｅｑデータセットでは、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ  ＳＥＱＣ−ＷＧ−ＧＴ５０およびＳＥＱＣ−ＷＥＳ−スパイクモデルが９０％を超える平均Ｆ１−スコアを達成した。これは、Ｓｔｒｅｌｋａ２とともに他のモデル／スキームと比較して最高であった。
【０３０８】
ＦＦＰＥ処理の効果
【０３０９】
ＦＦＰＥ処理サンプルに対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの予測のロバスト性を測定するために、１時間、２時間、６時間、および２４時間の４つの異なるホルムアルデヒド固定時間で準備された８つのＷＧＳおよび７つのＷＥＳ  ＦＦＰＥ複製を使用した。ＦＦＰＥと新鮮な正常一致サンプルとの双方を使用して各ＦＦＰＥ複製を評価した。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、ＦＦＰＥアーティファクトが存在するにもかかわらず、他の手法よりも一貫して優れた性能を維持し、固定時間と使用された一致する正常サンプルに対してほとんど不変であった（図３２ａ、図３２ｅ、および図３２ｆ）。ＷＧＳ  ＦＦＰＥデータでは、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、ＳＮＶおよびＩＮＤＥＬでそれぞれ８６．１％および７６．９％の平均Ｆ１−スコアを生成し、代替手法の平均Ｆ１−スコアよりも４％および６％以上改善した。同様に、ＦＦＰＥ  ＷＥＳデータの場合、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、７８．９％の平均Ｆ１−スコアを生成し、従来のスキームの平均Ｆ１−スコアよりも４％以上優れている（図３２ｃ）。
【０３１０】
一般に、トレーニングにＳＥＱＣ−ＩＩサンプルを活用した場合、ＤＲＥＡＭ３モデルよりも大幅なブーストが観察された（図３２ｂおよび図３２ｄ）。ＦＦＰＥサンプルでトレーニングされたモデルは、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃを使用したＩＮＤＥＬ予測についてのみ、新鮮なサンプルでトレーニングされたモデルを改善するように見えたが、ＳＮＶの場合、新鮮なサンプルでトレーニングされたモデルが優れていた。
【０３１１】
サンプル固有のモデル
【０３１２】
ＳＥＱＣ−ＩＩでトレーニングされたユニバーサルモデルは、他の従来の体細胞変異検出スキームよりも一貫して優れて実行することが示されているが、ここでは、異なるＳＥＱＣ−ＩＩデータセット全体で９つの複製ペアを使用して、サンプル固有のトレーニングされたモデルが追加の精度向上をもたらすかどうかを調査した。各サンプルについて、そのサンプル用に準備されたインシリコ腫瘍−正常複製を使用して、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃモデルおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓモデルをトレーニングした。また、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−スパイクモデルに使用されるトレーニング候補の１０％と、各サンプルから導出されたトレーニングデータを組み合わせて、個別のモデルをトレーニングした。これらの２つのサンプル固有のモデルをユニバーサルＳＥＱＣ−ＷＧＳ−スパイクモデルと比較した（図３３ａ〜図３３ｃ）。平均して、サンプル固有のモデルは、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃのＳＥＱＣ−ＷＧＳ−スパイクモデルに比べて約０．５％ＳＮＶおよび約５％のＩＮＤＥＬ  Ｆ１−スコアを生み出した。ライブラリ準備サンプルおよびＦＦＰＥサンプルは、サンプル固有のトレーニングから最も恩恵を受けた。例えば、１ｎｇのＤＮＡ量でＮｅｘｔｅｒａ  Ｆｌｅｘプロトコルを使用して準備したライブラリ準備サンプルでは、ＳＮＶおよびＩＮＤＥＬについてそれぞれ１．６％および１９．４％の絶対Ｆ１−スコアの改善が見られた。同様に、一致した新鮮な正常値を有する２４時間のＦＦＰＥ  ＷＧＳサンプルは、ＳＮＶおよびＩＮＤＥＬについてそれぞれＦ１−スコアの改善において１．８および１４．８パーセントポイントを獲得した。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの場合、サンプル固有のトレーニングの恩恵を受けるのはＩＮＤＥＬのみのようであった。
【０３１３】
ＩＮＤＥＬの性能
【０３１４】
さらに、複数のデータセットにわたって異なるサイズのＩＮＤＥＬを検出するための精度を評価した（図３４ａおよび図３４ｂ）。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、ＩＮＤＥＬ検出にローカルアセンブリを明示的に使用しなかったが、それでも、広範囲のＩＮＤＥＬサイズ、カバレッジ、および腫瘍純度にわたって、Ｌａｎｃｅｔなどのアセンブリベースの手法を含む他のアプローチを一貫して上回った（図３４ａおよび図３０ｄ）。全体として、２塩基対（ｂｐｓ）を超える挿入および欠失の場合、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、それぞれ、従来の最良の代替手法であるＬａｎｃｅｔよりもＦ１−スコアで２４．４％および６．５％の優位性をもたらした。異なるＮｅｕＳｏｍａｔｉｃトレーニングアプローチ間でＩＮＤＥＬの精度を比較すると、ＤＲＥＡＭ３モデルは、主に挿入検出精度が低いという問題があったが、ＳＥＱＣ−ＩＩトレーニングモデルは、異なるサイズの挿入および欠失の双方を確実に特定した（図３４ｂ）。
【０３１５】
異なる変異対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）の性能分析
【０３１６】
体細胞変異ＶＡＦ全体の様々なアプローチの精度を分析した（図３４ｃおよび図３５〜図３７ｃ）。異なるデータセットにおいて、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、２０％未満のＶＡＦの他のスキームよりも優れていることを観察している（図３４ｃおよび図３５）。また、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、ＶＡＦの変動に対して高いロバスト性を有し、５％という低いＶＡＦの一貫した予測があることも観察した。ＳＥＱＣ−ＩＩトレーニング済みモデルは、５％〜２０％のＶＡＦを含む変異について、ＤＲＥＡＭ３モデルよりも明らかに優れた性能を示した（図３６ａおよび図３６ｂ）。同様のロバスト性が、全てのカバレッジおよび腫瘍純度設定で観察された（図３７ａ〜図３７ｃ）。
【０３１７】
困難なゲノム領域での性能
【０３１８】
ゲノムコンテキストの複雑さに対するロバスト性を説明するために、様々な長さのタンデムリピート（ＴＲ）やセグメントの重複を含む困難なゲノム領域での異なる体細胞呼び出しスキームの性能を評価した（図３４ｄおよび図３８〜図４１ｃ）。他の多くのスキームは、困難なゲノム領域での性能の大幅な低下を示したが（図３８）、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、非常にロバストなままであり、全ゲノム解析と比較して他のスキームよりもさらに大幅な改善をもたらした（図３４ｄおよび図３８）。平均して、これらの困難なゲノム領域について、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、ＳＮＶとＩＮＤＥＬの双方について、従来の最良の体細胞呼び出し元よりも１５％以上高いＦ１−スコアを生成した。ＳＥＱＣ−ＩＩサンプルを使用してＮｅｕＳｏｍａｔｉｃをトレーニングすると、これらの困難なゲノム領域の精度が大幅に向上し、最大の利点は、グラウンドトゥルース変異でトレーニングされたモデルを使用したタンデムリピート領域であった（図３９ａ〜図４０ｂ）。困難なゲノム領域における同様の性能が、様々な範囲および腫瘍純度にわたって観察された（図４１ａ〜図４１ｃ）。
【０３１９】
考察
【０３２０】
ＦＦＰＥと６つの中心に複数のプラットフォームによって配列された新鮮なＤＮＡとにおいて、様々なカバレッジ、サンプル純度、ライブラリの準備を行った実際のＷＧＳ、ＷＥＳ、ＡｍｐｌｉＳｅｑサンプルで見られる様々な実験設定で体細胞変異を検出する際の、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの深層学習フレームワークのロバスト性を調査した。実験により、生データから真の体細胞変異シグネチャをキャプチャして、真の呼び出しと配列アーティファクトとを区別するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの可能性が確認された。スパイクイン変異と、ＳＥＱＣ−ＩＩ研究によって取得されたグラウンドトゥルース体細胞変異のセットとの双方を使用して、ＳＥＱＣ−ＩＩ参照サンプルでトレーニングされたＮｅｕＳｏｍａｔｉｃモデルは、最高の精度を達成するために性能を向上させた。この分析は、様々なシナリオでの有用性のモデル構築のベストプラクティス戦略を浮き彫りにした。ベースラインのＤＲＥＡＭ３ネットワークモデルと比較して、ＳＥＱＣ−ＩＩ参照サンプルから派生した提案モデルは、ＳＮＶとＩＮＤＥＬの双方の誤検出を減らし、挿入呼び出しの精度を向上させ、正しい変異信号を学習することで困難なゲノム領域の体細胞検出を強化することが示された。
【０３２１】
ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、一致正常では腫瘍汚染に対してロバストなままであったが、ＭｕＴｅｃｔ２、Ｌａｎｃｅｔ、ＭｕＳＥ、ＴＮｓｃｏｐｅなどの多くの体細胞呼び出しアプローチは、正常読み取りに対応する真の体細胞変異を拒否したため、大きな影響を受けた。したがって、それらの再現率は、大幅に低下した。ＷＧＳでトレーニングされたＮｅｕＳｏｍａｔｉｃモデルは、標的化シーケンシングデータでも同様に良好に機能した。一方、ＴＮｓｃｏｐｅは、機械学習（ランダムフォレスト）モデルを採用しているが、Ｌａｎｃｅｔは、ローカライズされた色付きのｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフアプローチを使用して変異を検出している。どちらのツールも、ゲノム全体の体細胞変異検出用に設計されているため、標的化シーケンシングには適していない（通常、ゲノムの１ＭＢ未満をカバーする）。
【０３２２】
変異タイプ、ＩＮＤＥＬ長さ、ＶＡＦ、ゲノム領域など、様々な仕様にわたる予測精度を分析すると、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、カバレッジが低い、ＶＡＦが２０％未満、タンデムリピートなどの困難なゲノム領域、２ｂｐを超えるＩＮＤＥＬＳ長、ＤＮＡ損傷のあるＦＦＰＥ、または汚染された一致正常などの困難な状況で、他のスキームに比べて最大の改善をもたらしたことが明らかになった。シーケンシングまたはサンプル固有のアーティファクトを真の体細胞変異と混同した結果、従来のスキームでは、複雑度の低いゲノム領域でよく見られる多くの偽陽性があった（したがって、精度が低い）（図３４ｄおよび図３８）。しかしながら、複数のプラットフォームと複数の中心からのＷＧＳサンプルでトレーニングすることにより、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、エラーが発生しやすいゲノムコンテキストを学習し、呼び出しが困難な低複雑度のゲノムコンテキストを含む様々な条件で一貫して精度を向上させた。同様に、異なるアプローチによる誤った呼び出しの分析により、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃによって正しく予測されたＳｔｒｅｌｋａ２などの従来のスキームによるプライベートな偽陰性呼び出しのほとんどが低いＶＡＦを有することが明らかになった（図４２）。これにより、低ＶＡＦ変異の検出における他のスキームの劣りが明らかになった。一方、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃは、生データから正しいシグネチャを学習することにより、困難な低ＶＡＦ呼び出しをアーティファクトからより正確に区別した。
【０３２３】
図４２は、ＷＧＳデータセットにおけるプライベートＦＮ呼び出しのＶＡＦ分布のバイオリン−プロットの比較を示している。各副図では、従来の体細胞変異検出スキームの１つをＮｅｕＳｏｍａｔｉｃと比較した。Ｘ−対−Ｙ副図の場合、２１個のＷＧＳ複製のうち少なくとも１１個でアルゴリズムＸ（ＸのＦＮ）によって見逃されたグラウンドトゥルースＳＮＶのセットであるＸＦＮを特定した。同様に、２１個のＷＧＳ複製のうち少なくとも１１個でアルゴリズムＹ（ＹのＦＮ）によって見逃されたグラウンドトゥルースＳＮＶのセットであるＹＦＮを特定した。そして、この図は、ＸおよびＹに対するプライベートＦＮ呼び出しのＶＡＦ分布を示している。換言すれば、バイオリン−プロットは、セットＸＦＮ／ＹＦＮ内の呼び出しのＶＡＦ分布を青で示し、セットＹＦＮ／ＸＦＮ内の呼び出しのＶＡＦ分布を赤で示している。Ｓｔｒｅｌｋａ２のような従来のスキームのほとんどでは、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃによって正しく予測されたプライベートＦＮのＶＡＦが低く、低ＶＡＦ変異の検出におけるそのようなアプローチの劣りが明らかになった。各Ｘ−対−Ｙ副図では、ＸとＹのプライベートＦＮの数が上部に報告されている。
【０３２４】
方法
【０３２５】
ＳＥＱＣ−ＩＩ腫瘍−正常シーケンシングデータとグラウンドトゥルース
【０３２６】
分析では、ＳＥＱＣ−ＩＩ参照一致サンプル、ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株（ＨＣＣ１３９５）、および一致Ｂリンパ球由来正常細胞株（ＨＣＣ１３９５ＢＬ）を使用した。詳細なサンプル情報は、ＳＥＱＣ−ＩＩ参照サンプルの原稿１２、１３に記載されている。ＳＥＱＣ−ＩＩ体細胞変異ワーキンググループは、これらのサンプルの体細胞変異のゴールドスタンダードの真セットを確立した１３（図２７）。真セットは、異なる配列中心からの複数の腫瘍正常配列複製、および直交変異検出バイオインフォマティクスパイプラインを使用して定義された。信頼スコアを変異呼び出しに割り当て、プラットフォーム、中心、パイプライン固有のバイアスを最小限に抑えるために、ＳｏｍａｔｉｃＳｅｑ１０機械学習フレームワークを実装して、合成変異をＨＣＣ１３９５ＢＬ位置合わせファイルにスパイクすることによって生成された、各複製ペアの別のＨＣＣ１３９５ＢＬと一致するインシリコ腫瘍−正常複製ペアにおいて分類器のセットをトレーニングした。これらの分類器を使用して、変異呼び出しは、クロス位置合わせおよびクロスシーケンシング中心の再現性に基づいて、４つの信頼レベル（ＨｉｇｈＣｏｎｆ、ＭｅｄＣｏｎｆ、ＬｏｗＣｏｎｆ、および未分類）に分類された。ＨｉｇｈＣｏｎｆおよびＭｅｄＣｏｎｆの呼び出しは、合計３９，５３６のＳＮＶと２，０２０のＩＮＤＥＬを含む体細胞変異（ｖ１．０）の「真セット」としてグループ化された。ＨＣＣ１３９５の体細胞変異の真セットは、ＮＣＢＩのｆｔｐサイト（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｔｒａｃｅ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｅｑｃ／ｆｔｐ／Ｓｏｍａｔｉｃ＿Ｍｕｔａｔｉｏｎ＿ＷＧ／）においてコミュニティで入手可能である。
【０３２７】
この研究で使用された全てのシーケンシングデータは、ＮＣＢＩのＳＲＡデータベース（ＳＲＰ１６２３７０）を通じて公開されている。全てのサンプルについて、ＦａｓｔＱファイルは、最初にＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ１５を使用してトリミングされ、次にＢＷＡ−ＭＥＭ（ｖ０．７．１５）１６、続いてＰｉｃａｒｄ  ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ）を使用して位置合わせされた。
【０３２８】
トレーニングデータセットおよびモデル
【０３２９】
異なるトレーニングデータセットを使用して、合成スパイクイン変異で準備されたインシリコ腫瘍複製と、既知の高信頼性の体細胞変異セットを備えた実際の腫瘍複製との双方を使用して、効果的なＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ  ＣＮＮモデルを導出した（図２８ｅ）：
【０３３０】
ＤＲＥＡＭ３モデル
【０３３１】
ベースラインのＷＧＳモデルとして、ＩＣＧＣ−ＴＣＧＡ  ＤＲＥＡＭチャレンジステージ３データ１４のトレーニングによって最近開発されたＤＲＥＡＭ３モデルを採用した１１。ステージ３データセットは、合成であるが現実的な腫瘍正常ペアを形成するために、７，９０３個のＳＮＶと７，６０４個のＩＮＤＥＬの変異を、５０％、３３％、２０％の３つの異なるＡＦを有する同じ正常サンプルの正常ゲノムに計算的にスパイクして構築された正常サンプルおよび腫瘍サンプルから構成されている。ネットワークトレーニングを改善するために、元のＤＲＥＡＭデータと同様のＡＦ分布を有するＢＡＭＳｕｒｇｅｏｎ１７を使用して、追加の約９５Ｋ  ＳＮＶと約９５Ｋ  ＩＮＤＥＬとを腫瘍サンプル１１にスパイクインした。このモデルは、１００Ｔ：１００Ｎ、５０Ｔ：１００Ｎ、７０Ｔ：９５Ｎ、５０Ｔ：９５Ｎ、および２５Ｔ：９５Ｎ１１の５つの異なる腫瘍−正常純度設定からのトレーニングデータ（ゲノムの５０％）を組み合わせることによってトレーニングされた。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓは、これら５つの複製ペアで特定された約２９．２Ｍの候補変異についてトレーニングされ、これは、体細胞ＳＮＶ／ＩＮＤＥＬラベルが付いた約４５０Ｋの候補と、非体細胞としてラベル付けされた約２８．７Ｍの候補とを含む。
【０３３２】
ＴＣＧＡモデル
【０３３３】
ベースラインのＷＥＳモデルとして、１２個のＴＣＧＡサンプルのセットでトレーニングすることによって最近開発された１１ＴＣＧＡモデル１８を使用した。これらの各サンプルの腫瘍および正常位置合わせを混合し、２つの等しい位置合わせに分割した。一方の位置合わせは正常複製として扱われ、他方の位置合わせは腫瘍の複製を構築するために変異をスパイクするために使用された。各サンプルについて、約８８ＫのＳＮＶと約４４ＫのＩＮＤＥＬとをスパイクして、トレーニング用の合成腫瘍サンプルを生成した。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓは、これらの１２個の複製ペアで特定された約５．９Ｍの候補変異についてトレーニングされ、これは、体細胞ＳＮＶ／ＩＮＤＥＬラベルが付いた約１．５Ｍの候補と、非体細胞としてラベル付けされた約４．４Ｍの候補とを含む。
【０３３４】
ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−スパイクモデル
【０３３５】
このモデルの構築に使用されるトレーニングデータを準備するために、ＢＡＭＳｕｒｇｅｏｎを使用して、ＨＣＣ１３９５ＢＬ複製の１つにインシリコ変異をスパイクし、それを別個のＨＣＣ１３９５ＢＬ複製と正常一致としてペアリングすることによって合成腫瘍を構築した。このアプローチを使用して、１０個のインシリコ腫瘍−正常ペアを準備した。１０個の複製ペアのうち８個は、平均カバレッジが４０倍から９５倍の４つの異なるサイトで配列されたＷＧＳ複製から選択された。他の２つの複製ペアは、イルミナからの複数のＮｏｖａＳｅｑ配列複製をマージして、インシリコで約２２０倍の腫瘍サンプルカバレッジと約１７０倍の正常な一致サンプルカバレッジを取得することによって作成された。各インシリコ腫瘍では、約９２ＫのＳＮＶと約２２ＫのＩＮＤＥＬとが急増した。スパイクイン変異のＡＦは、ベータ分布からランダムに選択された（形状パラメータα＝２およびβ＝５）。１０個の複製ペアのそれぞれについて、９５％の正常の読み取りと５％の腫瘍の読み取りとを混合することにより、不純な正常を構築した。したがって、合計２０個のインシリコ腫瘍−正常ペアを使用して、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−スパイクモデルをトレーニングした。次に、これらの２０の複製ペアで特定された約２７２Ｍの候補変異について、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃとＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓをトレーニングし、これは、体細胞ＳＮＶ／ＩＮＤＥＬラベルが付いた約２Ｍの候補と、非体細胞としてラベル付けされた約２７０Ｍの候補とを含む。
【０３３６】
ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ−５０モデル
【０３３７】
このモデルは、グラウンドトゥルース体細胞変異として設定されたＳＥＱＣ−ＩＩ  高信頼トゥルースを伴う実際のＷＧＳ腫瘍正常複製を使用して構築された。このモデルをトレーニングするためのベースサンプルとして、８つのＷＧＳ腫瘍正常複製を使用した。最初の７つのＷＧＳ複製ペアは、ＨｉＳｅｑおよびＮｏｖａＳｅｑプラットフォーム上の６つの異なる配列中心からのものであり、平均カバレッジは、４０倍から９５倍であり、最後のペアは、イルミナからの９つのＮｏｖａＳｅｑ配列複製を組み合わせて、約３９０倍のカバレッジで複製ペアを取得することによって構築された。これらの８つの複製ペアのそれぞれについて、他の２つの純度バリエーションを作成し、一方は、９５％の正常読み取りと５％の腫瘍読み取りを混合した９５％の正常純度であり、他方は、１０％の腫瘍と９０％の正常読み取りを混合した１０％の腫瘍純度である。したがって、複製ペアのそれぞれについて、１００％純粋な腫瘍と正常とのバージョン、１００％純粋な腫瘍が９５％の純粋な正常と一致するバージョン、および１０％の純粋な腫瘍が１００％純粋な正常と一致するバージョンを有した。したがって、合計で２４個の腫瘍−正常複製を使用して、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ−５０モデルをトレーニングした。偏りのない評価を行うために、このモデルのトレーニングにはゲノムの５０％のみを使用し、残りの５０％は評価用に保持した。トレーニング領域と評価領域を準備するために、ゲノムをサイズが約９２Ｋｂｐｓの小さな領域に分割し、破壊された領域の半分をトレーニング用に、残りの半分を評価用にランダムに選択する。ＳＥＱＣ−ＩＩ呼び出しのスーパーセットに低信頼ラベルが付いた呼び出し、および３０％以上のＶＡＦを有するＳＥＱＣ−ＩＩ呼び出しのスーパーセットに未分類ラベルが付いた呼び出しなど、トレーニング領域から、各グレーゾーン変異の周囲の５塩基のパディング領域を除外した。そして、これらの２４の複製ペアで特定された約１３７Ｍの候補変異について、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃとＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓをトレーニングし、これは、体細胞ＳＮＶ／ＩＮＤＥＬラベル付きの約４１６Ｋの候補と、非体細胞としてラベル付けされた約１３６．５Ｍの候補とを含む。
【０３３８】
ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ−ＡＬＬモデル
【０３３９】
このモデルは、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ−５０モデルと同様に作成されたが、ゲノム全体にわたって全ての高信頼グラウンドトゥルース体細胞変異を使用している。したがって、トレーニング目的で使用されたＷＧＳサンプルの評価には使用することができず、また、全てがトレーニングに使用されていることを考えると、真セットの変異に偏っている可能性がある。このモデルは、他のデータセットまたは非ＳＥＱＣ−ＩＩサンプルの性能分析になおも役立つ。このモデルをＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓについて、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ−５０モデルに使用される２４個の複製ペアで特定された約２７２Ｍの候補変異についてトレーニングし、これは、体細胞ＳＮＶ／ＩＮＤＥＬラベル付きの約８３９Ｋの候補と、非体細胞ラベル付きの約２７１Ｍの候補とを含む。
【０３４０】
ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ５０−スパイクＷＧＳ１０モデル
【０３４１】
このモデルのトレーニングデータは、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−スパイクモデルに使用されるトレーニング候補の１０％と、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ−５０の全ての候補とを組み合わせて作成された。この組み合わせは、多数のスパイクイン変異と、実際の腫瘍正常データに見られる実際の体細胞変異の特徴の双方を利用している。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃとＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓを、体細胞ＳＮＶ／ＩＮＤＥＬラベル付きの約５７４Ｋ候補と、非体細胞としてラベル付けされた約１６３．５Ｍ候補とを含む、１６４Ｍ候補変異の組み合わせセットでトレーニングした。
【０３４２】
ＳＥＱＣ−ＷＥＳ−スパイクモデル
【０３４３】
ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−スパイクモデルと同様に、ＢＡＭＳｕｒｇｅｏｎを使用して７つのインシリコ腫瘍正常ＷＥＳ複製を構築し、このモデルをトレーニングした。複製ペアは、平均カバレッジが６０倍から５５０倍の４つの異なるサイトで配列されたＷＥＳデータセットから選択された。各インシリコ腫瘍では、約９７ＫのＳＮＶと約１９ＫのＩＮＤＥＬとが急増した。スパイクイン変異のＡＦは、ベータ分布からランダムに選択された（形状パラメータα＝２およびβ＝５）。次に、これらの７つの複製ペアで特定された約３．７Ｍの候補変異について、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃとＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓをトレーニングし、これは、体細胞ＳＮＶ／ＩＮＤＥＬラベル付けされた約７５５Ｋの候補と、非体細胞としてラベル付けされた約３Ｍの候補とを含む。
【０３４４】
ＳＥＱＣ−ＦＦＰＥ−スパイクモデル
【０３４５】
ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−スパイクモデルと同様に、ＢＡＭＳｕｒｇｅｏｎを使用して、このモデルをトレーニングするために８つのインシリコ腫瘍正常ＷＧＳ  ＦＦＰＥ複製を構築した。複製ペアは、４つの異なる準備時間で２つの異なるサイトで配列されたＦＦＰＥデータセットから選択された。各インシリコ腫瘍では、約９２ＫのＳＮＶと約２２ＫのＩＮＤＥＬとが急増した。スパイクイン変異のＡＦは、ベータ分布からランダムに選択された（形状パラメータα＝２およびβ＝５）。また、各インシリコ腫瘍を新鮮なＷＧＳ複製と照合して、ＦＦＰＥ腫瘍対新鮮な正常のシナリオをトレーニングに含めた。したがって、合計で１６個のインシリコ腫瘍−正常ペアを使用して、ＳＥＱＣ−ＦＦＰＥ−スパイクモデルをトレーニングした。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃとＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓを、これら７つの複製ペアで特定された約１９１Ｍの候補変異についてトレーニングし、これは、体細胞ＳＮＶ／ＩＮＤＥＬラベル付けされた約１．７Ｍの候補と、非体細胞としてラベル付けされた約１９０Ｍの候補とを含む。
【０３４６】
ＳＥＱＣ−ＦＦＰＥ−ＷＥＳ−スパイクモデル
【０３４７】
他のスパイクインモデルと同様に、ＢＡＭＳｕｒｇｅｏｎを使用して、このモデルをトレーニングするために７つのインシリコ腫瘍正常ＷＥＳ  ＦＦＰＥ複製を構築した。複製ペアは、２つの異なるサイトで配列されたＷＥＳ  ＦＦＰＥデータセットから選択され、４つの異なる時間間隔で準備された。このデータセットのＦＦＰＥ準備時間と配列サイトが同じである２つの正常複製がないため、各複製ペアの腫瘍および正常位置合わせを混合し、混合を２つの等しい位置合わせに分割した。次に、一方の位置合わせを他方の正常複製およびスパイクイン変異として扱い、腫瘍複製を構築する。各インシリコ腫瘍では、約９０ＫのＳＮＶと約１９ＫのＩＮＤＥＬとが急増した。スパイクイン変異のＡＦは、ベータ分布からランダムに選択された（形状パラメータα＝２およびβ＝５）。また、各インシリコ腫瘍を新鮮なＷＥＳ複製と照合して、ＦＦＰＥ腫瘍対新鮮な正常のシナリオをトレーニングに含めた。したがって、合計で１４個のインシリコ腫瘍−正常ペアを使用して、ＳＥＱＣ−ＦＦＰＥ−ＷＥＳスパイクモデルをトレーニングした。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃとＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓを、これらの７つの複製ペアで特定された約９．６Ｍの候補変異についてトレーニングした。これには、体細胞ＳＮＶ／ＩＮＤＥＬラベル付けされた約１．４Ｍの候補と、非体細胞としてラベル付けされた約８．２Ｍの候補とを含む。
【０３４８】
ＳＥＱＣ−ＷＥＳ−スパイクＷＧＳ１０、ＳＥＱＣ−ＦＦＰＥ−スパイクＷＧＳ１０、ＳＥＱＣ−ＦＦＰＥ−ＷＥＳ−スパイクＷＧＳ１０モデル
【０３４９】
これらのモデルのトレーニングデータは、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−スパイクモデルに使用されるトレーニング候補の１０％と、それぞれＳＥＱＣ−ＷＥＳ−スパイク、ＳＥＱＣ−ＦＦＰＥ−スパイク、およびＳＥＱＣ−ＦＦＰＥ−ＷＥＳ−スパイクの全ての候補を組み合わせて作成された。この組み合わせは、多数のスパイクインＷＧＳ変異と、ＷＥＳおよびＦＦＰＥサンプルのサンプルバイアスの双方を利用する。
【０３５０】
サンプル固有のモデル
【０３５１】
上記の汎用モデルに加えて、複数のデータ型にわたる９つのサンプルのセットについて、サンプル固有のモデルを導出した。選択されたサンプルは、ＮｏｖａＳｅｑ機器で配列したＷＧＳサンプル、ＷＥＳサンプル、１ｎｇのＤＮＡ量を含むＮｅｘｔｅｒａ  Ｆｌｅｘライブラリ準備キットで準備したサンプル、腫瘍純度５０％の３０倍ＷＧＳサンプル、腫瘍純度１０％の１００倍ＷＧＳサンプルを含み、２つのＷＧＳおよび２つのＷＥＳ  ＦＦＰＥサンプルをそれぞれホルマリンで２４時間処理し、新鮮な／ＦＦＰＥ正常サンプルと一致させた。各サンプルについて、ランダムスパイクを使用してインシリコ腫瘍を準備した。１０％腫瘍サンプルの場合、スパイクイン変異のＡＦは、ベータ分布からランダムに選択された（形状パラメータα＝２およびβ＝１８）。他のサンプルでは、ベータ分布（形状パラメータα＝２およびβ＝５）を使用してＡＦを選択した。次に、各サンプルについて、インシリコ腫瘍正常複製を使用してＮｅｕＳｏｍａｔｉｃモデルおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓモデルをトレーニングした。さらに、各サンプルについて、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−スパイクモデルに使用されるトレーニング候補の１０％と、そのサンプルから導出されたトレーニングデータとを組み合わせて、個別のモデルをトレーニングした。
【０３５２】
体細胞変異検出アルゴリズム
【０３５３】
ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃに加えて、７つの体細胞変異呼び出し元ＭｕＴｅｃｔ２（４．ｂｅｔａ．６）２、ＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒ（１．０．５．０）４、Ｌａｎｃｅｔ（１．０．７）８、Ｓｔｒｅｌｋａ２（２．８．４）５、ＴＮｓｃｏｐｅ（２０１７１１．０３）７、ＭｕＳＥ（ｖ１．０ｒｃ）３、およびＶａｒＤｉｃｔ（ｖ１．５．１）６を使用し、デフォルトのパラメータまたはユーザズマニュアルで推奨されているパラメータを使用してそれぞれを実行した。ＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒには、「−ｑ  １−Ｑ  １５−ｓ１ｅ−０５」を使用した。ＴＮｓｃｏｐｅ（２０１７１１．０３）の場合、Ｓｅｖｅｎ  ＢｒｉｄｇｅｓのＣＧＣに実装されているバージョンを以下のコマンドで使用した「ｓｅｎｔｉｅｏｎ  ｄｒｉｖｅｒ−ｉ  ＄ｔｕｍｏｒ＿ｂａｍ−ｉ  ＄ｎｏｒｍａｌ＿ｂａｍ−ｒ  ＄ｒｅｆ  ――ａｌｇｏ  ＴＮｓｃｏｐｅ  ――ｔｕｍｏｒ＿ｓａｍｐｌｅ  ＄ｔｕｍｏｒ＿ｓａｍｐｌｅ＿ｎａｍｅ  ――ｎｏｒｍａｌ＿ｓａｍｐｌｅ  ＄ｎｏｒｍａｌ＿ｓａｍｐｌｅ＿ｎａｍｅ−ｄ  ＄ｄｂｓｎｐ  ＄ｏｕｔｐｕｔ＿ｖｃｆ」。Ｌａｎｃｅｔには、「−ｃｏｖ−ｔｈｒ  １０――ｃｏｖ−ｒａｔｉｏ  ０．００５――ｍａｘ−ｉｎｄｅｌ−ｌｅｎ  ５０−ｅ  ０．００５」を使用した。結果のＶＣＦファイルで「ＰＡＳＳ」としてフラグが立てられた信頼性の高い出力が、比較分析に適用された。ＶａｒＤｉｃｔの場合、「体細胞」ステータスの呼び出しにも制限した。比較に使用された各呼び出し元からの結果は、ユーザがこの呼び出し元によって検出された「実際の」変異と見なす全ての変異候補であった。
【０３５４】
アンサンブルモードとスタンドアロンモードの双方でＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ（０．１．４）を使用した。アンサンブルモードでは、ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの「位置合わせスキャン」ステップで特定された候補変異に加えて、５つの個別の呼び出し元（ＭｕＴｅｃｔ２、ＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒ、Ｓｔｒｅｌｋａ２、ＭｕＳＥ、およびＶａｒＤｉｃｔ）からの呼び出しも組み込み、それぞれの候補変異の追加の入力チャネルとしてそれらの発生を表した。ＮｅｕＳｏｍａｔｉｃおよびＮｅｕＳｏｍａｔｉｃ−Ｓの場合、前処理ステップ中に「――ｓｃａｎ＿ｍａｆ  ０．０１――ｍｉｎ＿ｍａｐｑ  １０  ――ｓｎｐ＿ｍｉｎ＿ａｆ  ０．０３  ――ｓｎｐ＿ｍｉｎ＿ｂｑ  １５  ――ｓｎｐ＿ｍｉｎ＿ａｏ  ３  ――ｉｎｓ＿ｍｉｎ＿ａｆ  ０．０２  ――ｄｅｌ＿ｍｉｎ＿ａｆ  ０．０２  ――ｎｕｍ＿ｔｈｒｅａｄｓ  ２８  ――ｓｃａｎ＿ｗｉｎｄｏｗ＿ｓｉｚｅ  ５００  ――ｍａｘ＿ｄｐ  １０００００」を使用した。トレーニングには、「−ｃｏｖｅｒａｇｅ＿ｔｈｒ  ３００――ｂａｔｃｈ＿ｓｉｚｅ  ８０００」を使用した。
【０３５５】
困難なゲノム領域
【０３５６】
Ｇｅｎｏｍｅ−ｉｎ−ａ−Ｂｏｔｔｌｅコンソーシアム１９によって派生した一連の困難なゲノム領域を使用した。これらの領域は、５０ｂｐ未満と５０ｂｐを超えるリピートの２つの異なるカテゴリのタンデムリピートと、セグメント重複領域とを含んでいた。ゲノムコンテキストの複雑さに対するロバスト性を説明するために、これらの領域で様々な手法を評価した。
【０３５７】
偽陰性呼び出しの分析
【０３５８】
異なる手法の性能の違いをよりよく理解するために、ＷＧＳデータセット上の他のスキームに対するＮｅｕＳｏｍａｔｉｃの偽陰性ＳＮＶのＶＡＦ分布間のペアワイズ比較のセットを実行した（図４２）。各Ｘ−対−Ｙ分析では、２１個のＷＧＳ複製のうち少なくとも１１個でアルゴリズムＸ（Ｘの偽陰性）によって見逃されたグラウンドトゥルースＳＮＶのセットであるＸＦＮを特定した。同様に、２１個のＷＧＳ複製のうち少なくとも１１個でアルゴリズムＹ（Ｙの偽陰性）によって見逃されたグラウンドトゥルースＳＮＶのセットであるＹＦＮを特定した。次に、ＸＦＮ／ＹＦＮとして定義されるＸのプライベート偽陰性と、ＹＦＮ／ＸＦＮとして定義されるＹのプライベート偽陰性とを計算した。次に、これらの各セットの体細胞変異について、変異のＶＡＦの分布を計算した。
【０３５９】
評価プロセス
【０３６０】
公正な比較のために、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ−５０モデルのトレーニングに使用されなかった５０％ホールドアウトゲノム領域で全てのモデルと体細胞変異アルゴリズムとを評価した。この約１．４ＧＢの領域には、ＨＣＣ１３９５のＳＥＱＣ−ＩＩ真セットからの約２１ＫのＳＮＶと約１．３ＫのＩＮＤＥＬとを含み、ＳＥＱＣ−ＷＧＳ−ＧＴ−ＡＬＬモデルを除くＮｅｕＳｏｍａｔｉｃモデルのトレーニングには使用されなかった。
【０３６１】
ＨＣＣ１３９５のＳＥＱＣ−ＩＩコンソーシアムによってＨｉｇｈＣｏｎｆおよびＭｅｄＣｏｎｆとラベル付けされた呼び出しは、ここで使用される体細胞変異の「真のセット」としてグループ化された。この真セットを使用して、全てのパイプラインのＨＣＣ１３９５の全ての複製にわたる真陽性および偽陰性を計算した。ＳＥＱＣ−ＩＩコンソーシアムが推奨するように、検証率が低いため、ＬｏｗＣｏｎｆ呼び出しもブラックリストに登録した。コンソーシアムによって提供されたこの真セットは、ＶＡＦ検出限界が５％、深度検出限界が５０倍であったため、より高いカバレッジデータまたはより低いＶＡＦでの通話では、実際の体細胞の状態を確認することができない。したがって、真セットに含まれていないパイプラインによって報告されたプライベート呼び出しについては、評価のためにあいまいであると見なされた呼び出しを除外した。要約すると、Ｃの平均カバレッジとＰの腫瘍純度を有していた手持ちの腫瘍複製について、パイプラインがサポートリードの数を有するこの複製のプライベートな体細胞変異を報告した場合（これは真セットにはなかった）、１００％の純度と５０倍のカバレッジでのサポートリードの予測数が≧３の場合にのみ、この呼び出しを偽陽性としてラベル付けした。換言すれば、ｄ≧３ＣＰ／５０の場合、この呼び出しは偽陽性であり、それ以外の場合は、この呼び出しを評価から除外する。
【０３６２】
ＷＥＳおよびＡｍｐｌｉＳｅｑデータの場合、評価領域の真のインデルの数が非常に限られているため、ＳＮＶ評価のみを報告した。
【０３６３】
参考文献
【０３６４】
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【０３６８】
５．Ｋｉｍ，Ｓ．ら、Ｓｔｒｅｌｋａ２：ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｃａｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５，５９１−５９４（２０１８）。
【０３６９】
６．Ｌａｉ，Ｚ．ら、ＶａｒＤｉｃｔ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌｅｒ  ｆｏｒ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４４，ｅ１０８−ｅ１０８（２０１６）。
【０３７０】
７．Ｆｒｅｅｄ，Ｄ．，Ｐａｎ，Ｒ．＆Ａｌｄａｎａ，Ｒ．ＴＮｓｃｏｐｅ：Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ−ｂａｓｅｄ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ．ｂｉｏＲｘｉｖ  ２５０６４７
【０３７１】
８．Ｎａｒｚｉｓｉ，Ｇ．ら、Ｌａｎｃｅｔ：ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｃｏｌｏｒｅｄ  ＤｅＢｒｕｉｊｎ  ｇｒａｐｈｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １，２０（２０１８）。
【０３７２】
９．Ｋｏｂｏｌｄｔ，Ｄ．Ｃ．ら、ＶａｒＳｃａｎ  ２：ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２２，５６８−５７６（２０１２）。
【０３７３】
１０．Ｆａｎｇ，Ｌ．Ｔ．ら、Ａｎ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ  ｄｅｔｅｃｔ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ＳｏｍａｔｉｃＳｅｑ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１６，１９７（２０１５）。
【０３７４】
１１．Ｓａｈｒａｅｉａｎ，Ｓ．Ｍ．Ｅ．，Ｌｉｕ，Ｒ．，Ｌａｕ，Ｂ．，Ｐｏｄｅｓｔａ，Ｋ．，Ｍｏｈｉｙｕｄｄｉｎ，Ｍ．，＆Ｌａｍ，Ｈ．Ｙ．Ｄｅｅｐ  ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｆｏｒ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．１０，１０４１（２０１９）。
【０３７５】
１２．Ｔｈｅ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ＳＥＱＣ−ＩＩ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ａｃｈｉｅｖｉｎｇ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  ｗｈｏｌｅ−ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６２６４４０（２０１９）。
【０３７６】
１３．Ｆａｎｇ，Ｌ．Ｔ．ら、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＮＧＳ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６２５６２４（２０１９）。
【０３７７】
１４．Ｅｗｉｎｇ，Ａ．Ｄ．ら、Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｒｏｗｄｓｏｕｒｃｉｎｇ  ｔｏ  ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｖａｒｉａｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，６２３（２０１５）。
【０３７８】
１５．Ｂｏｌｇｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｌｏｈｓｅ，Ｍ．＆Ｕｓａｄｅｌ，Ｂ．Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ：ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｔｒｉｍｍｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０，２１１４−２１２０（２０１４）。
【０３７９】
１６．Ｌｉ，Ｈ．Ａｌｉｇｎｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅａｄｓ，ｃｌｏｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｃｏｎｔｉｇｓ  ｗｉｔｈ  ＢＷＡ−ＭＥＭ．ｈｔｔｐｓ：／／ａｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ａｂｓ／１３０３．３９９７（２０１３）。
【０３８０】
１７．Ｅｗｉｎｇ，Ａ．Ｄ．ら、Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｒｏｗｄｓｏｕｒｃｉｎｇ  ｔｏ  ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｖａｒｉａｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，６２３（２０１５）。
【０３８１】
１８．Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｓｈａｒｅｄ  ｖｉｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄａｔａ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７５，１１０９−１１１２（２０１６）。
【０３８２】
１９．Ｋｒｕｓｃｈｅ，Ｐｅｔｅｒ，Ｌｅｎ  Ｔｒｉｇｇ，Ｐａｕｌ  Ｃ．Ｂｏｕｔｒｏｓ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｅ．Ｍａｓｏｎ，Ｍ．Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌ．Ｍｏｏｒｅ，Ｍａｒ  Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｏｒｔａら、「Ｂｅｓｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｂｅｎｃｈｍａｒｋｉｎｇ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｍａｌｌ−ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １（２０１９）。
【０３８３】
本開示は、いくつかの例示的な実施形態を参照して説明されてきたが、本開示の原理の精神および範囲内に含まれるであろう多くの他の変更および実施形態が当業者によって考案されることができることを理解されたい。より具体的には、合理的な変形および変更は、本開示の精神から逸脱することなく、前述の開示、図面、および添付の特許請求の範囲内の主題の組み合わせ構成の構成部品および／または配置において可能である。構成部品および／または配置の変形および変更に加えて、代替の使用法も当業者にとって明らかであろう。
【０３８４】
本明細書中で言及されるおよび／または出願データシートにおいてリスト化される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて、様々な特許、出願、および刊行物の概念を使用してさらに別の実施形態を提供するように修正することができる。
【０３８５】
特徴または要素が本明細書で別の特徴または要素「上」にあると言及される場合、それは、他の特徴または要素上に直接存在することができ、または介在する特徴および／または要素も存在してもよい。対照的に、特徴または要素が別の特徴または要素に「直接」あると呼ばれる場合、介在する特徴または要素は存在しない。特徴または要素が別の特徴または要素に「接続されている」、「取り付けられている」または「結合されている」と呼ばれる場合、それは他の特徴または要素に直接接続、取り付け、または結合されることができ、または介在する特徴または要素が存在することができることも理解されよう。対照的に、特徴または要素が別の特徴または要素に「直接接続されている」、「直接接続されている」、または「直接結合されている」と呼ばれる場合、介在する特徴または要素は存在しない。一実施形態に関して説明または示されているが、そのように説明または示されている特徴および要素は、他の実施形態に適用することができる。別の特徴に「隣接して」配置された構造または特徴への言及は、隣接する特徴と重複するか、またはその下にある部分を有することができることも当業者には理解されるであろう。
【０３８６】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定することを意図するものではないことを理解するべきである。例えば、本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形も含むことを意図している。本明細書で使用される場合、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載された特徴、ステップ、動作、要素、および／またはコンポーネントの存在を指定するが、１つ以上の他の特徴、ステップ、動作、要素、コンポーネント、および／またはそれらのグループの存在または追加を排除するものではないことがさらに理解される。本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、関連するリストされた項目の１つ以上のありとあらゆる組み合わせを含み、「／」と省略されることができる。
【０３８７】
「下（ｕｎｄｅｒ）」、「下（ｂｅｌｏｗ）」、「下（ｌｏｗｅｒ）」、「上（ｏｖｅｒ）」、「上（ｕｐｐｅｒ）」などのような空間的に相対的な用語は、説明を容易にするために、ある要素または特徴と別の要素または図に示されている特徴との関係を説明するために本明細書で使用されることができる。空間的に相対的な用語は、図に示されている方向に加えて、使用中または動作中の装置の異なる方向を包含することを意図していることが理解されよう。例えば、図の装置が裏返されている場合、他の要素または特徴の「下」または「下方」として記述されている要素は、他の要素または特徴の「上」または「上方」になる。したがって、「下」という例示的な用語は、上と下の双方の方向を包含することができる。装置は、他の方法で方向付けられ（例えば、９０度回転または他の方向に）、本明細書で使用される空間的に相対的な記述子がそれに応じて解釈されることができる。同様に、「上向き」、「下向き」、「垂直」、「水平」などの用語は、特に明記しない限り、説明の目的でのみ本明細書で使用される。
【０３８８】
「第１」および「第２」という用語は、本明細書では様々な特徴／要素（ステップを含む）を説明するために使用されることができるが、文脈が別段の指示をしない限り、これらの特徴／要素はこれらの用語によって制限されるべきではない。これらの用語は、ある特徴／要素を別の特徴／要素から区別するために使用される場合がある。したがって、以下で論じる第１の特徴／要素は、第２の特徴／要素と呼ぶことができ、同様に、以下で論じる第２の特徴／要素は、本発明の教示から逸脱することなく、第１の特徴／要素と呼ぶことができる。
【０３８９】
本明細書および以下の特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の定めがない限り、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、および「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変異は、方法および物品（例えば、組成物ならびに装置および方法を含む装置）において共同で使用されることができることを意味する。例えば、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、述べられた要素またはステップの包含を意味するが、他の要素またはステップの除外を意味しないと理解されるであろう。
【０３９０】
実施例で使用されるものを含め、本明細書で本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、特に明示的に指定されない限り、全ての番号は、その用語が明示的に表示されない場合でも、「約」または「およそ」という単語で始まるかのように読むことができる。「約」または「およそ」という句は、大きさおよび／または位置を説明するときに使用されて、説明される値および／または位置が値および／または位置の合理的な予想範囲内にあることを示すことができる。例えば、数値は、記載された値（または値の範囲）の＋／−０．１％、記載された値（または値の範囲）の＋／−１％、記載された値（または値の範囲）の＋／−２％の値、記載された値（または値の範囲）の＋／−５％、記載された値（または値の範囲）の＋／−１０％などを有することができる。本明細書で与えられる数値はまた、文脈が別段の指示をしない限り、その値についてまたはほぼその値を含むと理解されるべきである。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。本明細書に記載されている任意の数値範囲は、そこに含まれる全てのサブ範囲を含むことを意図している。また、当業者が適切に理解するように、値が「以下」であると開示される場合、「値以上」および値間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値「Ｘ」が開示される場合、「Ｘ以下」ならびに「Ｘ以上」（例えば、Ｘは数値である）も開示される。また、本特許出願全体で、データは様々な形式で提供され、このデータは、終了点と開始点、およびデータポイントの任意の組み合わせの範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント「１５」が開示される場合、１０および１５よりも大きい、それ以上、それよりも小さい、それ以下、およびそれに等しいことが、１０から１５の間とともに開示されていると見なされることが理解される。２つの特定のユニット間の各ユニットもまた開示されていることも理解される。例えば、１０と１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。
【０３９１】
様々な例示的な実施形態が上に記載されているが、特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態にいくつかの変更を加えることができる。例えば、記載された様々な方法ステップが実行される順序は、代替の実施形態ではしばしば変更されることができ、他の代替の実施形態では、１つ以上の方法ステップが完全にスキップされることができる。様々な装置およびシステムの実施形態の任意の特徴は、いくつかの実施形態に含まれることができ、他の実施形態には含まれることができない。したがって、前述の説明は、主に例示的な目的で提供されており、特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０３９２】
本明細書に含まれる例および図は、限定ではなく例示として、主題が実施されることができる特定の実施形態を示している。前述のように、他の実施形態を利用してそこから導き出すことができ、その結果、本開示の範囲から逸脱することなく、構造的および論理的な置換および変更を行うことができる。本発明の主題のそのような実施形態は、複数のものが実際に開示されている場合、単に便宜のために、そして本特許出願の範囲を任意の単一の発明または発明の概念に自発的に限定することを意図することなく、本明細書において個別にまたは集合的に「発明」という用語によって言及されることができる。したがって、特定の実施形態が本明細書で例示および説明されてきたが、同じ目的を達成するために計算された任意の構成を、示された特定の実施形態の代わりに使用することができる。本開示は、様々な実施形態のありとあらゆる適応または変形をカバーすることを意図している。上記の実施形態、および本明細書に具体的に記載されていない他の実施形態の組み合わせは、上記の説明を検討すると、当業者にとって明らかであろう。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１６ｄ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２２ｃ】
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【図２３】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２４ｄ】
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【図２４ｅ】
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【図２４ｆ】
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【図２４ｇ】
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【図２４ｈ】
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【図２４ｉ】
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【図２４ｊ】
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【図２４ｋ】
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【図２４ｌ】
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【図２４ｍ】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２７】
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【図２８ａ】
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【図２８ｂ】
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【図２８ｃ】
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【図２８ｄ】
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【図２８ｅ】
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【図２９ａ】
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【図２９ｂ】
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【図２９ｃ】
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【図２９ｄ】
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【図３０ａ】
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【図３０ｂ】
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【図３０ｃ】
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【図３０ｄ】
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【図３０ｅ】
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【図３０ｆ】
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【図３０ｇ】
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【図３０ｈ】
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【図３１ａ】
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【図３１ｂ】
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【図３１ｃ】
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【図３１ｄ】
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【図３１ｅ】
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【図３１ｆ】
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【図３１ｇ】
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【図３１ｈ】
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【図３１ｉ】
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【図３１ｊ】
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【図３２ａ】
2021534492.tif 000093
【図３２ｂ】
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【図３２ｃ】
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【図３２ｄ】
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【図３２ｅ】
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【図３２ｆ】
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【図３３ａ】
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【図３３ｂ】
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【図３３ｃ】
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【図３４ａ】
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【図３４ｂ】
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【図３４ｃ】
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【図３４ｄ】
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【図３５】
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【図３６ａ】
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【図３６ｂ】
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【図３７ａ】
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【図３７ｂ】
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【図３７ｃ】
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【図３８】
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【図３９ａ】
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【図３９ｂ】
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【図４０ａ】
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【図４０ｂ】
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【図４１ａ】
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【図４１ｂ】
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【図４１ｃ】
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【図４２】
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【国際調査報告】
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