(57)【要約】ＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶまたはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原に特異的な結合タンパク質および高親和性組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が本明細書で提供される。また、結合タンパク質および／または高親和性組換えＴＣＲをコードするおよび／または発現する組成物および組換え宿主細胞が提供される。組成物および組換え宿主細胞は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、胆道がん、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である適応症、またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原が治療標的である適応症を有する対象の処置に使用することができる。関連するワクチン、ワクチン療法、およびワクチン接種レジメンも提供される。
2021534752.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変ドメイン（Ｖα）、および
配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖可変ドメイン（Ｖβ）を含む結合タンパク質であって、
前記結合タンパク質は、ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱ（配列番号１）：ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体に、および／またはペプチド：ＨＬＡ複合体に結合することが可能であり、前記ペプチドは、配列番号１の７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる、結合タンパク質。
【請求項２】
前記Ｖαは、配列番号２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβは、配列番号３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項３】
前記Ｖαは、配列番号１２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβは、配列番号１３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項４】
（ｉ）配列番号４８もしくは５４によるＣＤＲ１αアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号４９もしくは５５によるＣＤＲ２αアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号５１もしくは５７によるＣＤＲ１βアミノ酸配列、および／または
（ｉｖ）配列番号５２もしくは５８によるＣＤＲ２βアミノ酸配列
をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項５】
それぞれ、配列番号４８、４９、２、５１、５２、および３に示されているＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、およびＣＤＲ３βアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
それぞれ、配列番号５４、５５、１２、５７、５８、および１３に示されているＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、およびＣＤＲ３βアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の結合タンパク質。
【請求項７】
前記ＨＬＡは、ＤＲＢ１−１１０１またはＤＲＢ１−１１０４を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
前記Ｖαは、配列番号６、１６、６６、または７０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項９】
前記Ｖβは、配列番号９、１９、６８、または７２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
前記Ｖαおよび／または前記Ｖβの相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの少なくとも３つまたは４つは配列に変化がなく、配列変化を有するＣＤＲは、最大でわずか２つのアミノ酸置換、最大で連続した５つのアミノ酸欠失、またはそれらの組合せを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
前記Ｖαは、ＴＲＡＶ８−３またはＴＲＡＶ８−１によるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
前記Ｖβは、ＴＲＢＶ３０またはＴＲＢＶ１２−４によるアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
ＴＲＡＪ１３またはＴＲＡＪ３８によるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列、および
ＴＣＲβ鎖連結（Ｊβ）遺伝子セグメントによるアミノ酸配列
をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
ＴＲＢＪ２−４またはＴＲＢＪ２−３によるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
前記Ｖαは、配列番号６または６６に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記Ｖβは、配列番号９または６８に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
前記Ｖαは、配列番号１６または７０に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記Ｖβは、配列番号１９または７２に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１７】
ＴＣＲβ鎖定常ドメイン（Ｃβ）、ＴＣＲα鎖定常ドメイン（Ｃα）、または両方をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１８】
（ｉ）前記Ｃαは、配列番号６７もしくは７１に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一性を有するか、配列番号６７もしくは７１に示されているアミノ酸配列を含むか、または配列番号６７もしくは７１に示されているアミノ酸配列からなり、および／あるいは
（ｉｉ）前記Ｃβは、配列番号６９もしくは７３に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一性を有するか、配列番号６９もしくは７３に示されているアミノ酸配列を含むか、または配列番号６９もしくは７３に示されているアミノ酸配列からなる
請求項１７に記載の結合タンパク質。
【請求項１９】
前記結合タンパク質は、ＣＤ４とは独立に、またはＣＤ４の非存在下、細胞表面上で、（配列番号１）：ＨＬＡ複合体および／またはペプチド：ＨＬＡ複合体に結合することが可能であり、前記ペプチドは、配列番号１の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項２０】
配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変ドメイン（Ｖα）、および
配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖可変ドメイン（Ｖβ）を含む結合タンパク質であって、
前記結合タンパク質は、ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ（配列番号２２）：ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体に、および／またはペプチド：ＨＬＡ複合体に結合することが可能であり、前記ペプチドは、配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる、結合タンパク質。
【請求項２１】
前記Ｖαは、配列番号２３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβは、配列番号２４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の結合タンパク質。
【請求項２２】
配列番号６０によるＣＤＲ１α、配列番号６１によるＣＤＲ２α、配列番号６３によるＣＤＲ１β、および／または配列番号６４によるＣＤＲ２βをさらに含む、請求項２０または２１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項２３】
それぞれ、配列番号６０、６１、２３、６３、６４、および２４に示されているＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、およびＣＤＲ３βアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の結合タンパク質。
【請求項２４】
前記ＨＬＡは、ＤＱＢ１−０５：０１またはＤＱＢ１−０５：０２を含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項２５】
前記Ｖαは、配列番号２７または７４のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項２６】
前記Ｖβは、配列番号３０または７６のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項２７】
前記相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの少なくとも３つまたは４つは配列に変化がなく、配列変化を有するＣＤＲは、最大でわずか２つのアミノ酸置換、最大で連続した５つのアミノ酸欠失、またはそれらの組合せを有する、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項２８】
前記Ｖαは、ＴＲＡＶ８−６によるアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項２９】
前記Ｖβは、ＴＲＢＶ２０によるアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項３０】
ＴＲＡＪ３４によるアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列、および
ＴＣＲβ鎖連結（Ｊβ）遺伝子セグメントによるアミノ酸配列
をさらに含む、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項３１】
ＴＲＢＪ２−５によるアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の結合タンパク質。
【請求項３２】
前記Ｖαは、配列番号２７または７４に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記Ｖβは、配列番号３０または７６に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項３３】
ＴＣＲβ鎖定常ドメイン（Ｃβ）、ＴＣＲα鎖定常ドメイン（Ｃα）、または両方をさらに含む、請求項２０〜３２のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項３４】
（ｉ）前記Ｃαは、配列番号７５に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一性を有するか、配列番号７５に示されているアミノ酸配列を含むか、もしくは配列番号７５に示されているアミノ酸配列からなり、および／または
（ｉｉ）前記Ｃβは、配列番号７７に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一性を有するか、配列番号７７に示されているアミノ酸配列を含むか、もしくは配列番号７７に示されているアミノ酸配列からなる、
請求項３３に記載の結合タンパク質。
【請求項３５】
前記結合タンパク質は、ＣＤ４とは独立に、またはＣＤ４の非存在下、細胞表面上で、（配列番号２２）：ＨＬＡ複合体に、および／またはペプチド：ＨＬＡ複合体に結合することが可能であり、前記ペプチドは、配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる、請求項２０〜３４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項３６】
ＴＣＲ、キメラ抗原受容体、またはＴＣＲの抗原結合性断片である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項３７】
前記ＴＣＲ、前記キメラ抗原受容体、または前記ＴＣＲの前記抗原結合性断片は、キメラであるか、ヒト化されているか、またはヒトである、請求項３６に記載の結合タンパク質。
【請求項３８】
前記ＴＣＲの前記抗原結合性断片は、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）を含む、請求項３６または請求項３７に記載の結合タンパク質。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む組成物。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４１】
コドン最適化されている、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４２】
配列番号４、５、７、８、１０、１４、１５、１７、１８、２０、２５、２６、２８、２９、または３１のいずれか１つに示されているヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、請求項４０または４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
コードされる前記結合タンパク質は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含み、前記ポリヌクレオチドは、前記α鎖をコードするポリヌクレオチドと前記β鎖をコードするポリヌクレオチドとの間に配置された自己切断性ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４４】
発現制御配列に作動可能に連結した請求項４０〜４３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４５】
前記ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することが可能である、請求項４４に記載の発現ベクター。
【請求項４６】
前記宿主細胞は、造血前駆細胞またはヒト免疫系細胞である、請求項４５に記載の発現ベクター。
【請求項４７】
前記免疫系細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せである、請求項４６に記載の発現ベクター。
【請求項４８】
前記Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである、請求項４７に記載の発現ベクター。
【請求項４９】
ウイルスベクターである、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項５０】
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはγ−レトロウイルスベクターである、請求項４９に記載の発現ベクター。
【請求項５１】
請求項４０〜４３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞は、その細胞表面上に、コードされる前記結合タンパク質を発現することが可能であり、前記ポリヌクレオチドは前記宿主細胞に対して異種である、組換え宿主細胞。
【請求項５２】
造血前駆細胞、または免疫系細胞、必要に応じてヒト免疫系細胞である、請求項５１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５３】
前記免疫系細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せである、請求項５２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５４】
前記免疫系細胞はＴ細胞である、請求項５２または５３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５５】
前記Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである、請求項５３または５４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５６】
前記結合タンパク質は、内因性ＴＣＲと比較して、ＣＤ３タンパク質とより効率的に会合することが可能である、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５７】
前記結合タンパク質は、内因性ＴＣＲと比較してより高い表面発現を有するす、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５８】
ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体が存在する場合は、ＩＦＮ−γを産生することが可能であるが、参照ペプチド：ＨＬＡ複合体が存在する場合は、より少ない量のＩＦＮ−γを産生するかまたは検出可能なＩＦＮ−γを産生せず、
前記ペプチド抗原は、配列番号１もしくは２２によるものであるか、または前記ペプチド抗原は、それぞれ配列番号１もしくは２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなり、
前記参照ペプチドは、それぞれ配列番号３３または３４によるものである、請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５９】
前記ペプチド抗原が、１０、１、０．１、または約０．０１μｇ／ｍＬの濃度で存在する場合、ＩＦＮ−γを産生することが可能である、請求項５８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６０】
前記ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体が存在する場合、少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを産生することが可能であり、前記ペプチド抗原は、０．０１μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項５８または５９のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６１】
（ａ）ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド：ＨＬＡ複合体、および
（ｂ）（ｉ）抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体または（ｂ）（ｉｉ）抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体
の存在下でＩＦＮγを産生することが可能である、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６２】
（ｉ）ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド抗原および／またはＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドをコードするＲＮＡ、ならびに（ｉｉ）ＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０１またはＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１０４を発現し、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ抗原を宿主免疫細胞に提示することが可能な細胞の存在下で、ＩＦＮγを産生することが可能な、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６３】
（ｉ）前記ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体が存在する場合、少なくとも約５０ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを産生することが可能であり、前記ペプチド抗原は、配列番号２２によるものであるか、または配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１個の連続するアミノ酸を含むかもしくはそれからなり、約０．０１μｇ／ｍＬまたは約０．０５μｇ／ｍＬで存在し、および／あるいは
（ｉｉ）前記ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体が存在する場合、少なくとも約１００、５００、１０００、５，０００、または１０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを産生することが可能であり、前記ペプチド抗原は、配列番号２２によるものであるか、または配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１個の連続するアミノ酸を含むかもしくはそれからなり、約０．０２、０．２、２、または２０μｇ／ｍＬで存在する、
請求項５８〜６２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６４】
ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体が存在する場合、少なくとも約１０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを産生することが可能であり、前記ペプチド抗原は、配列番号２２によるものであるか、または配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１個の連続するアミノ酸を含むかもしくはそれからなり、少なくとも約０．０１μｇ／ｍＬで存在する、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６５】
ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体および抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体および／または抗ＨＬＡクラスＩ抗体が存在する場合、ＩＦＮ−γを産生することが可能であり、前記ペプチド抗原は、配列番号２２によるものであるか、または配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１個の連続するアミノ酸を含むかもしくはそれからなる、請求項５８〜６４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６６】
（ｉ）配列番号２２によるものであるか、または配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１個の連続するアミノ酸を含むかもしくはそれからなるＨｅｒ２−ＩＴＤペプチド抗原、および／あるいは配列番号２２または配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１個の連続するアミノ酸を含むかもしくはそれからなるペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）ＨＬＡ−ＤＱＢ１−０５０１またはＨＬＡ−ＤＱＢ１−０５０２を発現し、前記Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチド抗原を前記宿主免疫細胞に提示することが可能である細胞株が存在する場合、ＩＦＮ−γを産生することが可能である、請求項５８〜６５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６７】
免疫細胞であり、内因性免疫細胞タンパク質の染色体遺伝子ノックアウトを含む、請求項５８〜６６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６８】
ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡ成分、ＴＣＲ成分、またはそれらの任意の組合せの染色体遺伝子ノックアウトを含む、請求項６７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６９】
処置することを必要とする対象を処置するための方法であって、
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質、または請求項５８〜６８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を含む有効量の組成物を前記対象に投与することを含み、前記対象は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、胆道がん、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である適応症、またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原が治療標的である適応症を有する、方法。
【請求項７０】
前記組成物は、非経口でまたは静脈内に投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記組成物の複数用量を前記対象に投与することを含む、請求項６９または請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記複数用量は、約２〜約４週間の投与間で間隔を置いて投与される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象にサイトカインを投与することをさらに含む、請求項６９〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２１を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記対象は、免疫抑制療法をさらに受けている、請求項６９〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
免疫抑制因子阻害剤、必要に応じてＰＤ−１阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項６９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＰＤ−１阻害剤は、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））；ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））；イピリムマブ＋ニボルマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）＋ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））；セミプリマブ；ＩＢＩ−３０８；ニボルマブ＋リラトリマブ；ＢＣＤ−１００；カムレリズマブ；ＪＳ−００１；スパルタリズマブ；チスレリズマブ；ＡＧＥＮ−２０３４；ＢＧＢＡ−３３３＋チスレリズマブ；ＣＢＴ−５０１；ドスタルリマブ；デュルバルマブ＋ＭＥＤＩ−０６８０；ＪＮＪ−３２８３；パゾパニブ塩酸塩＋ペムブロリズマブ；ピジリズマブ；ＲＥＧＮ−１９７９＋セミプリマブ；ＡＢＢＶ−１８１；ＡＤＵＳ−１００＋スパルタリズマブ；ＡＫ−１０４；ＡＫ−１０５；ＡＭＰ−２２４；ＢＡＴ−１３０６；ＢＩ−７５４０９１；ＣＣ−９０００６；セミプリマブ＋ＲＥＧＮ−３７６７；ＣＳ−１００３；ＧＬＳ−０１０；ＬＺＭ−００９；ＭＥＤＩ−５７５２；ＭＧＤ−０１３；ＰＦ−０６８０１５９１；Ｓｙｍ−０２１；チスレリズマブ＋パミパリブ；ＸｍＡｂ−２０７１７；ＡＫ−１１２；ＡＬＰＮ−２０２；ＡＭ−０００１；アルツハイマー病に関してＰＤ−１をアンタゴナイズする抗体；ＢＨ−２９２２；ＢＨ−２９４１；ＢＨ−２９５０；ＢＨ−２９５４；固形腫瘍に関してＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１をアンタゴナイズする生物製剤；腫瘍学に関してＰＤ−１およびＬＡＧ−３を標的とする二重特異性モノクローナル抗体；ＢＬＳＭ−１０１；ＣＢ−２０１；ＣＢ−２１３；ＣＢＴ−１０３；ＣＢＴ−１０７；細胞免疫療法＋ＰＤ−１阻害剤；ＣＸ−１８８；ＨＡＢ−２１；ＨＥＩＳＣＯＩＩＩ−００３；ＩＫＴ−２０２；ＪＴＸ−４０１４；ＭＣＬＡ−１３４；ＭＤ−４０２；ｍＤＸ−４００；ＭＧＤ−０１９；腫瘍学に関してＰＤＣＤ１をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害する腫瘍溶解性ウイルス；ＯＴ−２；ＰＤ−１アンタゴニスト＋ロープギンターフェロンアルファ−２ｂ；ＰＥＧＭＰ−７；ＰＲＳ−３３２；ＲＸＩ−７６２；ＳＴＩＡ−１１１０；ＴＳＲ−０７５；腫瘍学に関してＨＥＲ２およびＰＤ−１を標的とするワクチン；腫瘍学および自己免疫障害に関してＰＤ−１を標的とするワクチン；ＸｍＡｂ−２３１０４；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＡＴ−１６２０１；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害する二重特異性モノクローナル抗体；ＩＭＭ−１８０２；固形腫瘍および血液腫瘍に関してＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；ニボルマブバイオシミラー；腫瘍学に関してＣＤ２７８およびＣＤ２８をアゴナイズし、ＰＤ−１をアンタゴナイズする組換えタンパク質；自己免疫障害および炎症性障害に関してＰＤ−１をアゴナイズする組換えタンパク質；ＳＮＡ−０１；ＳＳＩ−３６１；ＹＢＬ−００６；ＡＫ−１０３；ＪＹ−０３４；ＡＵＲ−０１２；ＢＧＢ−１０８；固形腫瘍に関してＰＤ−１、Ｇａｌ−９、およびＴＩＭ−３を阻害する薬物；ＥＮＵＭ−２４４Ｃ８；ＥＮＵＭ−３８８Ｄ４；ＭＥＤＩ−０６８０；転移性黒色腫および転移性肺がんに関してＰＤ−１をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害するモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１を標的とするモノクローナル抗体；ＮＳＣＬＣに関してＰＤ−１をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１およびＴＩＭ−３を阻害するモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害するモノクローナル抗体；血液悪性腫瘍および固形腫瘍に関してＰＤ−１およびＶＥＧＦ−Ａを阻害する組換えタンパク質；腫瘍学に関してＰＤ−１をアンタゴナイズする小分子；Ｓｙｍ−０１６；イネビリズマブ＋ＭＥＤＩ−０６８０；転移性黒色腫に関してＰＤＬ−１およびＩＤＯを標的とするワクチン；膠芽腫に関する抗ＰＤ−１モノクローナル抗体＋細胞免疫療法；腫瘍学に関してＰＤ−１をアンタゴナイズする抗体；血液悪性腫瘍および細菌感染症に関してＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１を阻害するモノクローナル抗体；ＨＩＶに関してＰＤ−１を阻害するモノクローナル抗体；または固形腫瘍に関してＰＤ−１を阻害する小分子を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記組成物は、組換えＣＤ４＋  Ｔ細胞、組換えＣＤ８＋  Ｔ細胞、または両方を含む、請求項６９〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記組換え宿主細胞は、同種異系、自己性、または同系である、請求項６９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、胆道がん、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である適応症、またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原が治療標的である適応症の処置に使用するための、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質、請求項３９に記載の組成物、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の発現ベクター、または請求項５１〜６８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８１】
非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、胆道がん、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である適応症、またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原が治療標的である適応症の養子免疫療法に使用するための、請求項５１〜６８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８２】
非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、胆道がん、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である適応症を処置するための医薬の製造に使用するための、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質、請求項３９に記載の組成物、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の発現ベクター、または請求項５１〜６８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８３】
（ｉ）ＭＴＥ  ＹＫＬ  ＶＶＶ  ＧＡＶ  ＧＶＧ  ＫＳＡ  ＬＴＩ  ＱＬＩ  Ｑ（配列番号１）またはＳＰＫ  ＡＮＫ  ＥＩＬ  ＤＥＡ  ＹＶＭ  ＡＹＶ  ＭＡＧ  ＶＧＳ  ＰＹＶ  ＳＲＬ  ＬＧ（配列番号２２）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するペプチド、および
（ｉｉ）天然に存在しない薬学的に許容される担体
を含む免疫原性組成物。
【請求項８４】
前記天然に存在しない薬学的に許容される担体は、クリーム、エマルジョン、ゲル、リポソーム、ナノ粒子、または軟膏を含む、請求項８３に記載の免疫原性組成物。
【請求項８５】
（ｉ）ＭＴＥ  ＹＫＬ  ＶＶＶ  ＧＡＶ  ＧＶＧ  ＫＳＡ  ＬＴＩ  ＱＬＩ  Ｑ（配列番号１）またはＳＰＫ  ＡＮＫ  ＥＩＬ  ＤＥＡ  ＹＶＭ  ＡＹＶ  ＭＡＧ  ＶＧＳ  ＰＹＶ  ＳＲＬ  ＬＧ（配列番号２２）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するペプチド、および
（ｉｉ）免疫有効量のアジュバント
を含む免疫原性組成物。
【請求項８６】
前記アジュバントは、ポリＩＣＬＣ、ＣｐＧ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはミョウバンを含む、請求項８４に記載の免疫原性組成物。
【請求項８７】
処置することを必要とする対象を処置するための、または対象に免疫応答を誘導するための方法であって、請求項８３〜８６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含み、
前記対象は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、胆道がん、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である適応症、またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原が治療標的である適応症を有するかまたは有する疑いがある、方法。
【請求項８８】
前記免疫原性組成物は、前記対象に２回またはそれよりも多く投与される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
養子細胞療法を前記対象に投与することをさらに含む、請求項８７または請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
アジュバントまたはチェックポイント阻害剤のうちの少なくとも１つを前記対象に投与することをさらに含み、前記アジュバントまたは前記チェックポイント阻害剤は、必要に応じて、ＩＬ−２、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤のうちの少なくとも１つを含む、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、または７個以下のアミノ酸のポリペプチドを含む、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発することが可能な単離されたペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号１に示されているＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖアミノ酸配列に由来する少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続するアミノ酸の配列を含む、単離されたペプチド。
【請求項９２】
３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、または７個以下のアミノ酸のポリペプチドを含む、Ｈｅｒ２−ＩＴＤに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発することが可能な単離されたペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号２２に示されているＨｅｒ２−ＩＴＤアミノ酸配列に由来する少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２個の連続するアミノ酸の配列を含む、単離されたペプチド。
【請求項９３】
抗原パルス抗原提示細胞を調製するための方法であって、
抗原提示細胞による抗原プロセシングおよび抗原提示が起こるのに十分な条件下および時間にわたって、（ｉ）抗原提示細胞の集団、および（ｉｉ）請求項４０〜４３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の発現ベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、それによりＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶまたはＨｅｒ２−ＩＴＤに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発することが可能な抗原パルス抗原提示細胞を得ることを含む方法。
【請求項９４】
ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞またはＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞を生成するのに十分な条件下および時間にわたって、前記抗原パルス抗原提示細胞を１つまたは複数の免疫適合性Ｔ細胞と接触させることをさらに含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
請求項９３に記載のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞またはＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖させて、それによりそれぞれ前記ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞または前記Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞の１つまたは複数のクローンを得ること、および前記１つまたは複数のクローンの１つまたは複数の核酸配列をコードするＴ細胞受容体ポリペプチドを決定することを含む方法。
【請求項９６】
そのようにして決定された前記Ｔ細胞受容体ポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドを、Ｔ細胞集団にｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトまたは形質導入し、それにより抗原特異的Ｔ細胞応答を養子移入するのに有効な量の操作されたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞または操作されたＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞の集団を得ることをさらに含む、請求項９５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する宣言
本出願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供されており、これにより参照により本明細書に組み入れられる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、３６００５６＿４７２ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは６１．６ＫＢであり、２０１９年８月２１日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【０００２】
技術分野
本開示は、生物医学の分野に関し、具体的には、がんなどの、ＫＲＡＳ抗原またはＨＥＲ２抗原により特徴付けられるかまたは関連付けられる疾患を処置するために有用な組成物および方法に関する。本開示のある特定の実施形態は、抗原特異的結合タンパク質をコードするおよび／または発現するように修飾された免疫細胞を含む細胞性免疫療法のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
Ｔ細胞は、非変異または変異タンパク質のプロセシングに由来し、細胞表面主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合して提示されるペプチドを認識することによりがん細胞を排除することができる。変異遺伝子によりコードされるネオ抗原に特異的なＴ細胞は、チェックポイント遮断抗体（McGranahan  N,  et  al.  Science.  2016;  351(6280):  1463-69を参照）および養子Ｔ細胞移入（Lu  Y-C,  et  al.  Clinical  Cancer  Research.  2014;  20(13):  3401-10を参照）を受けた患者における抗腫瘍免疫の重要なメディエーターとしての関与が示唆されている。ネオ抗原は、自己抗原に特異的なＴ細胞の頻度および機能を制限する中枢性および末梢性寛容機序の影響を受けないため、Ｔ細胞の魅力的な標的である（Schumacher  TN,  et  al.  Science.  2015;  348(6230):  69-74を参照）。実際、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および他のがんタイプに存在する体細胞変異の負荷は、免疫チェックポイント阻害剤に対する応答と相関する（Rizvi  NA,  et  al.  Science.  2015;  348(6230):  124-8およびYatim  N,  et  al.  Science.  2015;  350(6258):  328-34を参照）。これは、内因性ネオ抗原反応性Ｔ細胞の再活性化が有効性に寄与することを示唆する。腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）で処置された黒色腫および子宮頸がんを有する患者における臨床応答も、ＴＩＬ産物中のネオ抗原反応性Ｔ細胞の存在と相関する（Lu  Y-C,  et  al.  Clinical  Cancer  Research.  2014;  20(13):  3401-10を参照）。ほとんどのネオ抗原は、ランダムであり、患者特異的であり、および／または腫瘍において異種性に発現されるため、操作されたＴ細胞による養子移入の標的としての複数の患者にわたる有用性が制限され（Schumacher  TN,  et  al.  Science.  2015;  348(6230):  69-74を参照）、ＮＳＣＬＣ進行中に免疫原性ネオ抗原を喪失する腫瘍細胞の回避が可能になってしまう場合がある（Anagnostou  V,  et  al.  Cancer  discovery.  2017;  7(3):  264-76を参照）。対照的に、再発性発がんドライバー変異は、多くの患者のがんではクローン性および同種性に発現される。残念ながら、おそらくは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子型に基づく免疫選択の帰結として（Marty  R,  et  al.  Cell.  2017を参照）または機能アッセイを使用した単離を妨げる不可逆的なＴ細胞枯渇の発生の帰結として（Philip  M,  et  al.  Nature.  2017;  545(7655):  452を参照）、ごくわずかなドライバー変異に対するＴ細胞応答しか報告されていない。
発がん性変異から生じるものを含む、Ｔ細胞により認識されるネオ抗原を同定するための努力は、主に、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するクラスＩ  ＭＨＣ上に提示されるエピトープに集中している。それは、ＣＤ８＋Ｔ細胞には直接的な細胞傷害性機能があるためである。多くの腫瘍にはクラスＩＩ  ＭＨＣが存在しないにも関わらず、ヒト抗腫瘍免疫におけるＣＤ４＋クラスＩＩ  ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の役割が、次第に理解されつつある。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞により提示される腫瘍抗原を認識し、リンパ組織におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の初回抗原刺激および拡大増殖、ならびに腫瘍微小環境におけるＣＤ８＋Ｔ細胞および自然免疫細胞のエフェクター機能を支援する。マウスモデルでの最近の研究は、腫瘍部位のＣＤ４＋Ｔ細胞が、免疫媒介性腫瘍拒絶の重要な成分であること（Spitzer  MH,  et  al.  Cell.  2017;  168(3):  487-502.  e15を参照）およびネオ抗原に対してクラスＩＩ  ＭＨＣ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞を増強するためのワクチン接種が、強力な治療効果をもたらすことができること（Kreiter  S,  et  al.  Nature.  2015;  520(7549):  692-6を参照）を示唆している。さらに、ネオ抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、黒色腫を有する患者に一般的であり（Linnemann  C,  et  al.  Nature  medicine.  2015;  21(1):  81を参照）、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することを意図してネオ抗原ペプチド候補をワクチン接種した黒色腫患者での最近の研究は、むしろペプチドの６０％に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答に結び付き、抗腫瘍活性の証拠を示した（Ott  PA,  et  al.  Nature.  2017;  547(7662):  217を参照）。腫瘍周囲ＣＤ４＋Ｔ細胞とＮＳＣＬＣの予後向上とが関連することは（Al-Shibli  KI,  et  al.  Clinical  cancer  research.  2008;  14(16):  5220-7；Hiraoka  K,  et  al.  British  journal  of  cancer.  2006;  94(2):  275；およびWakabayashi  O,  et  al.  Cancer  science.  2003;  94(11):  1003-9を参照）、抗腫瘍ＣＤ４＋Ｔ細胞応答が臨床的関連性を有する可能性があることを示唆している。にもかかわらず、ヒト抗腫瘍免疫におけるＣＤ４＋ネオ抗原特異的Ｔ細胞の役割は大部分が未知であり、ＮＳＣＬＣにおけるネオ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を具体的に調査した報告はほとんどない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】McGranahan  N,  et  al.  Science.  2016;  351(6280):  1463-69
【非特許文献２】Lu  Y-C,  et  al.  Clinical  Cancer  Research.  2014;  20(13):  3401-10
【非特許文献３】Schumacher  TN,  et  al.  Science.  2015;  348(6230):  69-74
【非特許文献４】Rizvi  NA,  et  al.  Science.  2015;  348(6230):  124-8
【非特許文献５】Yatim  N,  et  al.  Science.  2015;  350(6258):  328-34
【非特許文献６】Anagnostou  V,  et  al.  Cancer  discovery.  2017;  7(3):  264-76
【非特許文献７】Marty  R,  et  al.  Cell.  2017
【非特許文献８】Philip  M,  et  al.  Nature.  2017;  545(7655):  452
【非特許文献９】Spitzer  MH,  et  al.  Cell.  2017;  168(3):  487-502.  e15
【非特許文献１０】Kreiter  S,  et  al.  Nature.  2015;  520(7549):  692-6
【非特許文献１１】Linnemann  C,  et  al.  Nature  medicine.  2015;  21(1):  81
【非特許文献１２】Ott  PA,  et  al.  Nature.  2017;  547(7662):  217
【非特許文献１３】Al-Shibli  KI,  et  al.  Clinical  cancer  research.  2008;  14(16):  5220-7
【非特許文献１４】Hiraoka  K,  et  al.  British  journal  of  cancer.  2006;  94(2):  275；
【非特許文献１５】Wakabayashi  O,  et  al.  Cancer  science.  2003;  94(11):  1003-9
【発明の概要】
【０００５】
本明細書で開示の実施形態は、添付の図面と併せて、以下の説明および添付の特許請求の範囲を参照すると、より完全に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｅは、肺がん患者におけるＣＤ４＋ネオ抗原反応性Ｔ細胞の検出および試験を示す。（Ａ）ネオ抗原反応性Ｔ細胞を検出するための概要。５人の異なる肺がん患者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、変異を含有するペプチドのプールで刺激した（Ｂ）。単一の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベーションした後、刺激した培養物中のＩＦＮ−γ分泌細胞をＥＬＩＳｐｏｔで定量した。すべての実験には、２つまたは３つの技術的反復試料が含まれていた。（Ｃ）変異体ＳＲＥＫペプチドと共にインキュベーションした後の患者１４９０に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｄ）ＺＮＦ２９２ペプチドと共にインキュベーションした患者１３４７に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｅ）患者１４９０および１３４７に由来する培養物中の総Ｔ細胞の割合としてのネオ抗原特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞の定量。
【図１Ｂ−１】図１Ａ〜１Ｅは、肺がん患者におけるＣＤ４＋ネオ抗原反応性Ｔ細胞の検出および試験を示す。（Ａ）ネオ抗原反応性Ｔ細胞を検出するための概要。５人の異なる肺がん患者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、変異を含有するペプチドのプールで刺激した（Ｂ）。単一の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベーションした後、刺激した培養物中のＩＦＮ−γ分泌細胞をＥＬＩＳｐｏｔで定量した。すべての実験には、２つまたは３つの技術的反復試料が含まれていた。（Ｃ）変異体ＳＲＥＫペプチドと共にインキュベーションした後の患者１４９０に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｄ）ＺＮＦ２９２ペプチドと共にインキュベーションした患者１３４７に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｅ）患者１４９０および１３４７に由来する培養物中の総Ｔ細胞の割合としてのネオ抗原特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞の定量。
【図１Ｂ−２】図１Ａ〜１Ｅは、肺がん患者におけるＣＤ４＋ネオ抗原反応性Ｔ細胞の検出および試験を示す。（Ａ）ネオ抗原反応性Ｔ細胞を検出するための概要。５人の異なる肺がん患者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、変異を含有するペプチドのプールで刺激した（Ｂ）。単一の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベーションした後、刺激した培養物中のＩＦＮ−γ分泌細胞をＥＬＩＳｐｏｔで定量した。すべての実験には、２つまたは３つの技術的反復試料が含まれていた。（Ｃ）変異体ＳＲＥＫペプチドと共にインキュベーションした後の患者１４９０に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｄ）ＺＮＦ２９２ペプチドと共にインキュベーションした患者１３４７に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｅ）患者１４９０および１３４７に由来する培養物中の総Ｔ細胞の割合としてのネオ抗原特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞の定量。
【図１Ｂ−３】図１Ａ〜１Ｅは、肺がん患者におけるＣＤ４＋ネオ抗原反応性Ｔ細胞の検出および試験を示す。（Ａ）ネオ抗原反応性Ｔ細胞を検出するための概要。５人の異なる肺がん患者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、変異を含有するペプチドのプールで刺激した（Ｂ）。単一の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベーションした後、刺激した培養物中のＩＦＮ−γ分泌細胞をＥＬＩＳｐｏｔで定量した。すべての実験には、２つまたは３つの技術的反復試料が含まれていた。（Ｃ）変異体ＳＲＥＫペプチドと共にインキュベーションした後の患者１４９０に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｄ）ＺＮＦ２９２ペプチドと共にインキュベーションした患者１３４７に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｅ）患者１４９０および１３４７に由来する培養物中の総Ｔ細胞の割合としてのネオ抗原特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞の定量。
【図１Ｂ−４】図１Ａ〜１Ｅは、肺がん患者におけるＣＤ４＋ネオ抗原反応性Ｔ細胞の検出および試験を示す。（Ａ）ネオ抗原反応性Ｔ細胞を検出するための概要。５人の異なる肺がん患者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、変異を含有するペプチドのプールで刺激した（Ｂ）。単一の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベーションした後、刺激した培養物中のＩＦＮ−γ分泌細胞をＥＬＩＳｐｏｔで定量した。すべての実験には、２つまたは３つの技術的反復試料が含まれていた。（Ｃ）変異体ＳＲＥＫペプチドと共にインキュベーションした後の患者１４９０に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｄ）ＺＮＦ２９２ペプチドと共にインキュベーションした患者１３４７に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｅ）患者１４９０および１３４７に由来する培養物中の総Ｔ細胞の割合としてのネオ抗原特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞の定量。
【図１Ｂ−５】図１Ａ〜１Ｅは、肺がん患者におけるＣＤ４＋ネオ抗原反応性Ｔ細胞の検出および試験を示す。（Ａ）ネオ抗原反応性Ｔ細胞を検出するための概要。５人の異なる肺がん患者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、変異を含有するペプチドのプールで刺激した（Ｂ）。単一の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベーションした後、刺激した培養物中のＩＦＮ−γ分泌細胞をＥＬＩＳｐｏｔで定量した。すべての実験には、２つまたは３つの技術的反復試料が含まれていた。（Ｃ）変異体ＳＲＥＫペプチドと共にインキュベーションした後の患者１４９０に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｄ）ＺＮＦ２９２ペプチドと共にインキュベーションした患者１３４７に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｅ）患者１４９０および１３４７に由来する培養物中の総Ｔ細胞の割合としてのネオ抗原特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞の定量。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｅは、肺がん患者におけるＣＤ４＋ネオ抗原反応性Ｔ細胞の検出および試験を示す。（Ａ）ネオ抗原反応性Ｔ細胞を検出するための概要。５人の異なる肺がん患者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、変異を含有するペプチドのプールで刺激した（Ｂ）。単一の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベーションした後、刺激した培養物中のＩＦＮ−γ分泌細胞をＥＬＩＳｐｏｔで定量した。すべての実験には、２つまたは３つの技術的反復試料が含まれていた。（Ｃ）変異体ＳＲＥＫペプチドと共にインキュベーションした後の患者１４９０に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｄ）ＺＮＦ２９２ペプチドと共にインキュベーションした患者１３４７に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｅ）患者１４９０および１３４７に由来する培養物中の総Ｔ細胞の割合としてのネオ抗原特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞の定量。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｅは、肺がん患者におけるＣＤ４＋ネオ抗原反応性Ｔ細胞の検出および試験を示す。（Ａ）ネオ抗原反応性Ｔ細胞を検出するための概要。５人の異なる肺がん患者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、変異を含有するペプチドのプールで刺激した（Ｂ）。単一の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベーションした後、刺激した培養物中のＩＦＮ−γ分泌細胞をＥＬＩＳｐｏｔで定量した。すべての実験には、２つまたは３つの技術的反復試料が含まれていた。（Ｃ）変異体ＳＲＥＫペプチドと共にインキュベーションした後の患者１４９０に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｄ）ＺＮＦ２９２ペプチドと共にインキュベーションした患者１３４７に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｅ）患者１４９０および１３４７に由来する培養物中の総Ｔ細胞の割合としてのネオ抗原特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞の定量。
【図１Ｅ−１】図１Ａ〜１Ｅは、肺がん患者におけるＣＤ４＋ネオ抗原反応性Ｔ細胞の検出および試験を示す。（Ａ）ネオ抗原反応性Ｔ細胞を検出するための概要。５人の異なる肺がん患者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、変異を含有するペプチドのプールで刺激した（Ｂ）。単一の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベーションした後、刺激した培養物中のＩＦＮ−γ分泌細胞をＥＬＩＳｐｏｔで定量した。すべての実験には、２つまたは３つの技術的反復試料が含まれていた。（Ｃ）変異体ＳＲＥＫペプチドと共にインキュベーションした後の患者１４９０に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｄ）ＺＮＦ２９２ペプチドと共にインキュベーションした患者１３４７に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｅ）患者１４９０および１３４７に由来する培養物中の総Ｔ細胞の割合としてのネオ抗原特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞の定量。
【図１Ｅ−２】図１Ａ〜１Ｅは、肺がん患者におけるＣＤ４＋ネオ抗原反応性Ｔ細胞の検出および試験を示す。（Ａ）ネオ抗原反応性Ｔ細胞を検出するための概要。５人の異なる肺がん患者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、変異を含有するペプチドのプールで刺激した（Ｂ）。単一の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベーションした後、刺激した培養物中のＩＦＮ−γ分泌細胞をＥＬＩＳｐｏｔで定量した。すべての実験には、２つまたは３つの技術的反復試料が含まれていた。（Ｃ）変異体ＳＲＥＫペプチドと共にインキュベーションした後の患者１４９０に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｄ）ＺＮＦ２９２ペプチドと共にインキュベーションした患者１３４７に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なＩＦＮ−γ細胞内染色。（Ｅ）患者１４９０および１３４７に由来する培養物中の総Ｔ細胞の割合としてのネオ抗原特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞の定量。
【０００７】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄは、患者１４９０に由来する腫瘍浸潤性リンパ球に由来するネオ抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の検出および試験を示す。患者１４９０の腫瘍切除に由来する腫瘍浸潤性リンパ球を、ＰＷＰ２に由来する変異体配列または野生型配列を含有するペプチドと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ分泌をインターフェロン捕捉により測定した（Ａ）。（Ｂ）腫瘍浸潤性リンパ球培養後およびＴＩＬ産物のＩＦＮ−γ捕捉後の非隣接肺組織および腫瘍におけるＰＷＰ２反応性ＣＤ８＋ＴＣＲ  ＶβのＴＣＲ  Ｖβクロノタイプ頻度。ＰＷＰ２特異的細胞を含有するＴ細胞株を、表記濃度の変異体（ＴＥＲＷＤＮＬＩＹＹ（配列番号３９））ペプチドまたは野生型（ＡＥＲＷＤＮＬＩＹＹ（配列番号４０））ペプチドと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した（Ｃ、Ｄ）。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｄは、患者１４９０に由来する腫瘍浸潤性リンパ球に由来するネオ抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の検出および試験を示す。患者１４９０の腫瘍切除に由来する腫瘍浸潤性リンパ球を、ＰＷＰ２に由来する変異体配列または野生型配列を含有するペプチドと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ分泌をインターフェロン捕捉により測定した（Ａ）。（Ｂ）腫瘍浸潤性リンパ球培養後およびＴＩＬ産物のＩＦＮ−γ捕捉後の非隣接肺組織および腫瘍におけるＰＷＰ２反応性ＣＤ８＋ＴＣＲ  ＶβのＴＣＲ  Ｖβクロノタイプ頻度。ＰＷＰ２特異的細胞を含有するＴ細胞株を、表記濃度の変異体（ＴＥＲＷＤＮＬＩＹＹ（配列番号３９））ペプチドまたは野生型（ＡＥＲＷＤＮＬＩＹＹ（配列番号４０））ペプチドと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した（Ｃ、Ｄ）。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｄは、患者１４９０に由来する腫瘍浸潤性リンパ球に由来するネオ抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の検出および試験を示す。患者１４９０の腫瘍切除に由来する腫瘍浸潤性リンパ球を、ＰＷＰ２に由来する変異体配列または野生型配列を含有するペプチドと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ分泌をインターフェロン捕捉により測定した（Ａ）。（Ｂ）腫瘍浸潤性リンパ球培養後およびＴＩＬ産物のＩＦＮ−γ捕捉後の非隣接肺組織および腫瘍におけるＰＷＰ２反応性ＣＤ８＋ＴＣＲ  ＶβのＴＣＲ  Ｖβクロノタイプ頻度。ＰＷＰ２特異的細胞を含有するＴ細胞株を、表記濃度の変異体（ＴＥＲＷＤＮＬＩＹＹ（配列番号３９））ペプチドまたは野生型（ＡＥＲＷＤＮＬＩＹＹ（配列番号４０））ペプチドと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した（Ｃ、Ｄ）。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｄは、患者１４９０に由来する腫瘍浸潤性リンパ球に由来するネオ抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の検出および試験を示す。患者１４９０の腫瘍切除に由来する腫瘍浸潤性リンパ球を、ＰＷＰ２に由来する変異体配列または野生型配列を含有するペプチドと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ分泌をインターフェロン捕捉により測定した（Ａ）。（Ｂ）腫瘍浸潤性リンパ球培養後およびＴＩＬ産物のＩＦＮ−γ捕捉後の非隣接肺組織および腫瘍におけるＰＷＰ２反応性ＣＤ８＋ＴＣＲ  ＶβのＴＣＲ  Ｖβクロノタイプ頻度。ＰＷＰ２特異的細胞を含有するＴ細胞株を、表記濃度の変異体（ＴＥＲＷＤＮＬＩＹＹ（配列番号３９））ペプチドまたは野生型（ＡＥＲＷＤＮＬＩＹＹ（配列番号４０））ペプチドと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した（Ｃ、Ｄ）。
【０００８】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｇは、野生型ペプチドと比べた、変異体ペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞株を示す。ＩＦＮ−γ捕捉により抗原特異的細胞が富化された患者１３４７および１４９０に由来するモノクローナルＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖し、次いで自己Ｂ細胞および表記濃度の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ａ）ＭＰ３ＫＰペプチドに反応性である、患者１３４７に由来するＴ細胞の反応性。（Ｂ〜Ｄ）ＳＲＥＫ１ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。（Ｅ、Ｆ）ＧＵＣＹ１Ａ３ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。（Ｇ）ＡＧＯ２ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｇは、野生型ペプチドと比べた、変異体ペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞株を示す。ＩＦＮ−γ捕捉により抗原特異的細胞が富化された患者１３４７および１４９０に由来するモノクローナルＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖し、次いで自己Ｂ細胞および表記濃度の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ａ）ＭＰ３ＫＰペプチドに反応性である、患者１３４７に由来するＴ細胞の反応性。（Ｂ〜Ｄ）ＳＲＥＫ１ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。（Ｅ、Ｆ）ＧＵＣＹ１Ａ３ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。（Ｇ）ＡＧＯ２ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｇは、野生型ペプチドと比べた、変異体ペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞株を示す。ＩＦＮ−γ捕捉により抗原特異的細胞が富化された患者１３４７および１４９０に由来するモノクローナルＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖し、次いで自己Ｂ細胞および表記濃度の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ａ）ＭＰ３ＫＰペプチドに反応性である、患者１３４７に由来するＴ細胞の反応性。（Ｂ〜Ｄ）ＳＲＥＫ１ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。（Ｅ、Ｆ）ＧＵＣＹ１Ａ３ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。（Ｇ）ＡＧＯ２ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｇは、野生型ペプチドと比べた、変異体ペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞株を示す。ＩＦＮ−γ捕捉により抗原特異的細胞が富化された患者１３４７および１４９０に由来するモノクローナルＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖し、次いで自己Ｂ細胞および表記濃度の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ａ）ＭＰ３ＫＰペプチドに反応性である、患者１３４７に由来するＴ細胞の反応性。（Ｂ〜Ｄ）ＳＲＥＫ１ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。（Ｅ、Ｆ）ＧＵＣＹ１Ａ３ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。（Ｇ）ＡＧＯ２ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｇは、野生型ペプチドと比べた、変異体ペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞株を示す。ＩＦＮ−γ捕捉により抗原特異的細胞が富化された患者１３４７および１４９０に由来するモノクローナルＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖し、次いで自己Ｂ細胞および表記濃度の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ａ）ＭＰ３ＫＰペプチドに反応性である、患者１３４７に由来するＴ細胞の反応性。（Ｂ〜Ｄ）ＳＲＥＫ１ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。（Ｅ、Ｆ）ＧＵＣＹ１Ａ３ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。（Ｇ）ＡＧＯ２ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。
【図３Ｆ】図３Ａ〜３Ｇは、野生型ペプチドと比べた、変異体ペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞株を示す。ＩＦＮ−γ捕捉により抗原特異的細胞が富化された患者１３４７および１４９０に由来するモノクローナルＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖し、次いで自己Ｂ細胞および表記濃度の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ａ）ＭＰ３ＫＰペプチドに反応性である、患者１３４７に由来するＴ細胞の反応性。（Ｂ〜Ｄ）ＳＲＥＫ１ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。（Ｅ、Ｆ）ＧＵＣＹ１Ａ３ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。（Ｇ）ＡＧＯ２ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。
【図３Ｇ】図３Ａ〜３Ｇは、野生型ペプチドと比べた、変異体ペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞株を示す。ＩＦＮ−γ捕捉により抗原特異的細胞が富化された患者１３４７および１４９０に由来するモノクローナルＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖し、次いで自己Ｂ細胞および表記濃度の変異体ペプチドまたは野生型ペプチドと共にインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ａ）ＭＰ３ＫＰペプチドに反応性である、患者１３４７に由来するＴ細胞の反応性。（Ｂ〜Ｄ）ＳＲＥＫ１ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。（Ｅ、Ｆ）ＧＵＣＹ１Ａ３ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。（Ｇ）ＡＧＯ２ペプチドに対する、患者１４９０に由来するＴ細胞の反応性。
【０００９】
【図４Ａ−１】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ａ−２】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ａ−３】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ａ−４】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ａ−５】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ａ−６】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ｆ】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ｇ】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ｈ】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ｉ】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ｊ】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【図４Ｋ】図４Ａ〜４Ｋは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性および試験を示す。（Ａ）患者１１３９に由来する３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン（クローン番号３、５、および９）を、表記濃度のＫＲＡＳのＮ末端２６個アミノ酸の存在下で、Ｖ１２（変異体）またはＧ１２（野生型）のいずれかと共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）Ｔ細胞クローンを、表記のクラスＩＩ  ＨＬＡ遮断抗体の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートした。（Ｃ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドまたは対照でパルスし、患者１１３９と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ  ＤＱＢ１−１１０４／１３０１  ＤＱＢ１  ０３０１／０６０３）を発現させたＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｄ）ＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１：０４＋  ＬＣＬをＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドと共にインキュベートしたか、またはＬＣＬに野生型配列もしくはＧ１２Ｖ  ＫＲＡＳ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｅ）Ｔ細胞クローンを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１μｇ／ｍＬ）でパルスしたＨＬＡＤＲＢ１＊１１：０４＋  ＬＣＬと共にインキュベートしたか、またはＴ細胞クローンに、野生型配列もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｆ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３および＃９に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４＋  ＬＣＬ細胞とインキュベートした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｇ〜Ｋ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｔ細胞クローン＃３（別名ＴＣＲ１３２）および＃９（別名ＴＣＲ１３６）に由来するＴ細胞受容体ＶαおよびＶβ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、併せて内因性ＴＣＲαのエクソン１のＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊を行い（Ｊ）、次いでＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０４＋  ＬＣＬ細胞（Ｇ、Ｈ）または変異体ＫＲＡＳ配列もしくは野生型ＫＲＡＳ配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞（Ｉ）とインキュベートし、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡで測定した（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）。
【００１０】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｌは、Ｈｅｒ２エクソン２０挿入（ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）内部縦列重複（ＩＴＤ）；本明細書ではＨｅｒ２−ＩＴＤとも呼ばれる）に特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞を示す。（Ａ、Ｂ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株（５０，０００細胞）を、表記濃度のＨｅｒ２−ＩＴＤ（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号２２）または対応する野生型ペプチド（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号３４）の存在下で自己Ｂ細胞（１００，０００細胞）と共培養し、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ、Ｄ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、表記のクラスＩＩ  ＭＨＣ遮断抗体の存在下で、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドと共にインキュベートした。（Ｅ、Ｆ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスした自己Ｂ細胞と共にインキュベートしたか、またはＣＤ４＋  Ｔ細胞株に、野生型配列もしくはＨｅｒ２−ＩＴＤ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｇ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、患者１２３８と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−ＤＱＢ１−１２０２／１５０２  ＤＱＢ１  ０３０１／０５０１）を発現するＨｅｒ２−ＩＴＤペプチドパルスＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｈ〜Ｊ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞から得られたＴＣＲ配列を形質導入し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスしたＢ細胞と共に（Ｈ、Ｉ）または野生型もしくは変異体Ｈｅｒ−２配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞と共に（Ｊ）インキュベートし、上清でのＩＦＮ−γ産生を測定した。（Ｋ）Ｖβ２特異的抗体で染色することにより測定した移入ＴＣＲの発現は、内因性ＴＣＲα定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のＣＲＩＳＰＲ媒介性欠失により向上した。（Ｌ）腫瘍および非隣接肺をディープＴＣＲ  Ｖβシーケンシングに供し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＶβをＴＣＲ  Ｖβ鋳型のパーセンテージとして定量した。肺と比べた腫瘍での富化は、フィッシャー直接検定によるとｐ＝０．００４だった。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｌは、Ｈｅｒ２エクソン２０挿入（ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）内部縦列重複（ＩＴＤ）；本明細書ではＨｅｒ２−ＩＴＤとも呼ばれる）に特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞を示す。（Ａ、Ｂ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株（５０，０００細胞）を、表記濃度のＨｅｒ２−ＩＴＤ（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号２２）または対応する野生型ペプチド（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号３４）の存在下で自己Ｂ細胞（１００，０００細胞）と共培養し、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ、Ｄ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、表記のクラスＩＩ  ＭＨＣ遮断抗体の存在下で、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドと共にインキュベートした。（Ｅ、Ｆ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスした自己Ｂ細胞と共にインキュベートしたか、またはＣＤ４＋  Ｔ細胞株に、野生型配列もしくはＨｅｒ２−ＩＴＤ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｇ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、患者１２３８と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−ＤＱＢ１−１２０２／１５０２  ＤＱＢ１  ０３０１／０５０１）を発現するＨｅｒ２−ＩＴＤペプチドパルスＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｈ〜Ｊ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞から得られたＴＣＲ配列を形質導入し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスしたＢ細胞と共に（Ｈ、Ｉ）または野生型もしくは変異体Ｈｅｒ−２配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞と共に（Ｊ）インキュベートし、上清でのＩＦＮ−γ産生を測定した。（Ｋ）Ｖβ２特異的抗体で染色することにより測定した移入ＴＣＲの発現は、内因性ＴＣＲα定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のＣＲＩＳＰＲ媒介性欠失により向上した。（Ｌ）腫瘍および非隣接肺をディープＴＣＲ  Ｖβシーケンシングに供し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＶβをＴＣＲ  Ｖβ鋳型のパーセンテージとして定量した。肺と比べた腫瘍での富化は、フィッシャー直接検定によるとｐ＝０．００４だった。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｌは、Ｈｅｒ２エクソン２０挿入（ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）内部縦列重複（ＩＴＤ）；本明細書ではＨｅｒ２−ＩＴＤとも呼ばれる）に特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞を示す。（Ａ、Ｂ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株（５０，０００細胞）を、表記濃度のＨｅｒ２−ＩＴＤ（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号２２）または対応する野生型ペプチド（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号３４）の存在下で自己Ｂ細胞（１００，０００細胞）と共培養し、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ、Ｄ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、表記のクラスＩＩ  ＭＨＣ遮断抗体の存在下で、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドと共にインキュベートした。（Ｅ、Ｆ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスした自己Ｂ細胞と共にインキュベートしたか、またはＣＤ４＋  Ｔ細胞株に、野生型配列もしくはＨｅｒ２−ＩＴＤ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｇ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、患者１２３８と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−ＤＱＢ１−１２０２／１５０２  ＤＱＢ１  ０３０１／０５０１）を発現するＨｅｒ２−ＩＴＤペプチドパルスＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｈ〜Ｊ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞から得られたＴＣＲ配列を形質導入し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスしたＢ細胞と共に（Ｈ、Ｉ）または野生型もしくは変異体Ｈｅｒ−２配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞と共に（Ｊ）インキュベートし、上清でのＩＦＮ−γ産生を測定した。（Ｋ）Ｖβ２特異的抗体で染色することにより測定した移入ＴＣＲの発現は、内因性ＴＣＲα定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のＣＲＩＳＰＲ媒介性欠失により向上した。（Ｌ）腫瘍および非隣接肺をディープＴＣＲ  Ｖβシーケンシングに供し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＶβをＴＣＲ  Ｖβ鋳型のパーセンテージとして定量した。肺と比べた腫瘍での富化は、フィッシャー直接検定によるとｐ＝０．００４だった。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｌは、Ｈｅｒ２エクソン２０挿入（ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）内部縦列重複（ＩＴＤ）；本明細書ではＨｅｒ２−ＩＴＤとも呼ばれる）に特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞を示す。（Ａ、Ｂ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株（５０，０００細胞）を、表記濃度のＨｅｒ２−ＩＴＤ（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号２２）または対応する野生型ペプチド（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号３４）の存在下で自己Ｂ細胞（１００，０００細胞）と共培養し、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ、Ｄ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、表記のクラスＩＩ  ＭＨＣ遮断抗体の存在下で、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドと共にインキュベートした。（Ｅ、Ｆ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスした自己Ｂ細胞と共にインキュベートしたか、またはＣＤ４＋  Ｔ細胞株に、野生型配列もしくはＨｅｒ２−ＩＴＤ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｇ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、患者１２３８と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−ＤＱＢ１−１２０２／１５０２  ＤＱＢ１  ０３０１／０５０１）を発現するＨｅｒ２−ＩＴＤペプチドパルスＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｈ〜Ｊ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞から得られたＴＣＲ配列を形質導入し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスしたＢ細胞と共に（Ｈ、Ｉ）または野生型もしくは変異体Ｈｅｒ−２配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞と共に（Ｊ）インキュベートし、上清でのＩＦＮ−γ産生を測定した。（Ｋ）Ｖβ２特異的抗体で染色することにより測定した移入ＴＣＲの発現は、内因性ＴＣＲα定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のＣＲＩＳＰＲ媒介性欠失により向上した。（Ｌ）腫瘍および非隣接肺をディープＴＣＲ  Ｖβシーケンシングに供し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＶβをＴＣＲ  Ｖβ鋳型のパーセンテージとして定量した。肺と比べた腫瘍での富化は、フィッシャー直接検定によるとｐ＝０．００４だった。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｌは、Ｈｅｒ２エクソン２０挿入（ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）内部縦列重複（ＩＴＤ）；本明細書ではＨｅｒ２−ＩＴＤとも呼ばれる）に特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞を示す。（Ａ、Ｂ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株（５０，０００細胞）を、表記濃度のＨｅｒ２−ＩＴＤ（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号２２）または対応する野生型ペプチド（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号３４）の存在下で自己Ｂ細胞（１００，０００細胞）と共培養し、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ、Ｄ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、表記のクラスＩＩ  ＭＨＣ遮断抗体の存在下で、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドと共にインキュベートした。（Ｅ、Ｆ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスした自己Ｂ細胞と共にインキュベートしたか、またはＣＤ４＋  Ｔ細胞株に、野生型配列もしくはＨｅｒ２−ＩＴＤ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｇ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、患者１２３８と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−ＤＱＢ１−１２０２／１５０２  ＤＱＢ１  ０３０１／０５０１）を発現するＨｅｒ２−ＩＴＤペプチドパルスＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｈ〜Ｊ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞から得られたＴＣＲ配列を形質導入し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスしたＢ細胞と共に（Ｈ、Ｉ）または野生型もしくは変異体Ｈｅｒ−２配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞と共に（Ｊ）インキュベートし、上清でのＩＦＮ−γ産生を測定した。（Ｋ）Ｖβ２特異的抗体で染色することにより測定した移入ＴＣＲの発現は、内因性ＴＣＲα定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のＣＲＩＳＰＲ媒介性欠失により向上した。（Ｌ）腫瘍および非隣接肺をディープＴＣＲ  Ｖβシーケンシングに供し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＶβをＴＣＲ  Ｖβ鋳型のパーセンテージとして定量した。肺と比べた腫瘍での富化は、フィッシャー直接検定によるとｐ＝０．００４だった。
【図５Ｆ】図５Ａ〜５Ｌは、Ｈｅｒ２エクソン２０挿入（ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）内部縦列重複（ＩＴＤ）；本明細書ではＨｅｒ２−ＩＴＤとも呼ばれる）に特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞を示す。（Ａ、Ｂ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株（５０，０００細胞）を、表記濃度のＨｅｒ２−ＩＴＤ（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号２２）または対応する野生型ペプチド（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号３４）の存在下で自己Ｂ細胞（１００，０００細胞）と共培養し、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ、Ｄ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、表記のクラスＩＩ  ＭＨＣ遮断抗体の存在下で、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドと共にインキュベートした。（Ｅ、Ｆ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスした自己Ｂ細胞と共にインキュベートしたか、またはＣＤ４＋  Ｔ細胞株に、野生型配列もしくはＨｅｒ２−ＩＴＤ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｇ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、患者１２３８と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−ＤＱＢ１−１２０２／１５０２  ＤＱＢ１  ０３０１／０５０１）を発現するＨｅｒ２−ＩＴＤペプチドパルスＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｈ〜Ｊ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞から得られたＴＣＲ配列を形質導入し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスしたＢ細胞と共に（Ｈ、Ｉ）または野生型もしくは変異体Ｈｅｒ−２配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞と共に（Ｊ）インキュベートし、上清でのＩＦＮ−γ産生を測定した。（Ｋ）Ｖβ２特異的抗体で染色することにより測定した移入ＴＣＲの発現は、内因性ＴＣＲα定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のＣＲＩＳＰＲ媒介性欠失により向上した。（Ｌ）腫瘍および非隣接肺をディープＴＣＲ  Ｖβシーケンシングに供し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＶβをＴＣＲ  Ｖβ鋳型のパーセンテージとして定量した。肺と比べた腫瘍での富化は、フィッシャー直接検定によるとｐ＝０．００４だった。
【図５Ｇ】図５Ａ〜５Ｌは、Ｈｅｒ２エクソン２０挿入（ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）内部縦列重複（ＩＴＤ）；本明細書ではＨｅｒ２−ＩＴＤとも呼ばれる）に特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞を示す。（Ａ、Ｂ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株（５０，０００細胞）を、表記濃度のＨｅｒ２−ＩＴＤ（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号２２）または対応する野生型ペプチド（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号３４）の存在下で自己Ｂ細胞（１００，０００細胞）と共培養し、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ、Ｄ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、表記のクラスＩＩ  ＭＨＣ遮断抗体の存在下で、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドと共にインキュベートした。（Ｅ、Ｆ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスした自己Ｂ細胞と共にインキュベートしたか、またはＣＤ４＋  Ｔ細胞株に、野生型配列もしくはＨｅｒ２−ＩＴＤ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｇ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、患者１２３８と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−ＤＱＢ１−１２０２／１５０２  ＤＱＢ１  ０３０１／０５０１）を発現するＨｅｒ２−ＩＴＤペプチドパルスＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｈ〜Ｊ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞から得られたＴＣＲ配列を形質導入し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスしたＢ細胞と共に（Ｈ、Ｉ）または野生型もしくは変異体Ｈｅｒ−２配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞と共に（Ｊ）インキュベートし、上清でのＩＦＮ−γ産生を測定した。（Ｋ）Ｖβ２特異的抗体で染色することにより測定した移入ＴＣＲの発現は、内因性ＴＣＲα定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のＣＲＩＳＰＲ媒介性欠失により向上した。（Ｌ）腫瘍および非隣接肺をディープＴＣＲ  Ｖβシーケンシングに供し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＶβをＴＣＲ  Ｖβ鋳型のパーセンテージとして定量した。肺と比べた腫瘍での富化は、フィッシャー直接検定によるとｐ＝０．００４だった。
【図５Ｈ】図５Ａ〜５Ｌは、Ｈｅｒ２エクソン２０挿入（ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）内部縦列重複（ＩＴＤ）；本明細書ではＨｅｒ２−ＩＴＤとも呼ばれる）に特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞を示す。（Ａ、Ｂ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株（５０，０００細胞）を、表記濃度のＨｅｒ２−ＩＴＤ（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号２２）または対応する野生型ペプチド（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号３４）の存在下で自己Ｂ細胞（１００，０００細胞）と共培養し、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ、Ｄ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、表記のクラスＩＩ  ＭＨＣ遮断抗体の存在下で、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドと共にインキュベートした。（Ｅ、Ｆ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスした自己Ｂ細胞と共にインキュベートしたか、またはＣＤ４＋  Ｔ細胞株に、野生型配列もしくはＨｅｒ２−ＩＴＤ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｇ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、患者１２３８と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−ＤＱＢ１−１２０２／１５０２  ＤＱＢ１  ０３０１／０５０１）を発現するＨｅｒ２−ＩＴＤペプチドパルスＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｈ〜Ｊ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞から得られたＴＣＲ配列を形質導入し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスしたＢ細胞と共に（Ｈ、Ｉ）または野生型もしくは変異体Ｈｅｒ−２配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞と共に（Ｊ）インキュベートし、上清でのＩＦＮ−γ産生を測定した。（Ｋ）Ｖβ２特異的抗体で染色することにより測定した移入ＴＣＲの発現は、内因性ＴＣＲα定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のＣＲＩＳＰＲ媒介性欠失により向上した。（Ｌ）腫瘍および非隣接肺をディープＴＣＲ  Ｖβシーケンシングに供し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＶβをＴＣＲ  Ｖβ鋳型のパーセンテージとして定量した。肺と比べた腫瘍での富化は、フィッシャー直接検定によるとｐ＝０．００４だった。
【図５Ｉ】図５Ａ〜５Ｌは、Ｈｅｒ２エクソン２０挿入（ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）内部縦列重複（ＩＴＤ）；本明細書ではＨｅｒ２−ＩＴＤとも呼ばれる）に特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞を示す。（Ａ、Ｂ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株（５０，０００細胞）を、表記濃度のＨｅｒ２−ＩＴＤ（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号２２）または対応する野生型ペプチド（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号３４）の存在下で自己Ｂ細胞（１００，０００細胞）と共培養し、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ、Ｄ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、表記のクラスＩＩ  ＭＨＣ遮断抗体の存在下で、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドと共にインキュベートした。（Ｅ、Ｆ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスした自己Ｂ細胞と共にインキュベートしたか、またはＣＤ４＋  Ｔ細胞株に、野生型配列もしくはＨｅｒ２−ＩＴＤ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｇ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、患者１２３８と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−ＤＱＢ１−１２０２／１５０２  ＤＱＢ１  ０３０１／０５０１）を発現するＨｅｒ２−ＩＴＤペプチドパルスＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｈ〜Ｊ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞から得られたＴＣＲ配列を形質導入し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスしたＢ細胞と共に（Ｈ、Ｉ）または野生型もしくは変異体Ｈｅｒ−２配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞と共に（Ｊ）インキュベートし、上清でのＩＦＮ−γ産生を測定した。（Ｋ）Ｖβ２特異的抗体で染色することにより測定した移入ＴＣＲの発現は、内因性ＴＣＲα定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のＣＲＩＳＰＲ媒介性欠失により向上した。（Ｌ）腫瘍および非隣接肺をディープＴＣＲ  Ｖβシーケンシングに供し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＶβをＴＣＲ  Ｖβ鋳型のパーセンテージとして定量した。肺と比べた腫瘍での富化は、フィッシャー直接検定によるとｐ＝０．００４だった。
【図５Ｊ】図５Ａ〜５Ｌは、Ｈｅｒ２エクソン２０挿入（ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）内部縦列重複（ＩＴＤ）；本明細書ではＨｅｒ２−ＩＴＤとも呼ばれる）に特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞を示す。（Ａ、Ｂ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株（５０，０００細胞）を、表記濃度のＨｅｒ２−ＩＴＤ（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号２２）または対応する野生型ペプチド（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号３４）の存在下で自己Ｂ細胞（１００，０００細胞）と共培養し、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ、Ｄ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、表記のクラスＩＩ  ＭＨＣ遮断抗体の存在下で、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドと共にインキュベートした。（Ｅ、Ｆ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスした自己Ｂ細胞と共にインキュベートしたか、またはＣＤ４＋  Ｔ細胞株に、野生型配列もしくはＨｅｒ２−ＩＴＤ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｇ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、患者１２３８と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−ＤＱＢ１−１２０２／１５０２  ＤＱＢ１  ０３０１／０５０１）を発現するＨｅｒ２−ＩＴＤペプチドパルスＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｈ〜Ｊ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞から得られたＴＣＲ配列を形質導入し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスしたＢ細胞と共に（Ｈ、Ｉ）または野生型もしくは変異体Ｈｅｒ−２配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞と共に（Ｊ）インキュベートし、上清でのＩＦＮ−γ産生を測定した。（Ｋ）Ｖβ２特異的抗体で染色することにより測定した移入ＴＣＲの発現は、内因性ＴＣＲα定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のＣＲＩＳＰＲ媒介性欠失により向上した。（Ｌ）腫瘍および非隣接肺をディープＴＣＲ  Ｖβシーケンシングに供し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＶβをＴＣＲ  Ｖβ鋳型のパーセンテージとして定量した。肺と比べた腫瘍での富化は、フィッシャー直接検定によるとｐ＝０．００４だった。
【図５Ｋ】図５Ａ〜５Ｌは、Ｈｅｒ２エクソン２０挿入（ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）内部縦列重複（ＩＴＤ）；本明細書ではＨｅｒ２−ＩＴＤとも呼ばれる）に特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞を示す。（Ａ、Ｂ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株（５０，０００細胞）を、表記濃度のＨｅｒ２−ＩＴＤ（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号２２）または対応する野生型ペプチド（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号３４）の存在下で自己Ｂ細胞（１００，０００細胞）と共培養し、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ、Ｄ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、表記のクラスＩＩ  ＭＨＣ遮断抗体の存在下で、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドと共にインキュベートした。（Ｅ、Ｆ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスした自己Ｂ細胞と共にインキュベートしたか、またはＣＤ４＋  Ｔ細胞株に、野生型配列もしくはＨｅｒ２−ＩＴＤ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｇ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、患者１２３８と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−ＤＱＢ１−１２０２／１５０２  ＤＱＢ１  ０３０１／０５０１）を発現するＨｅｒ２−ＩＴＤペプチドパルスＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｈ〜Ｊ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞から得られたＴＣＲ配列を形質導入し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスしたＢ細胞と共に（Ｈ、Ｉ）または野生型もしくは変異体Ｈｅｒ−２配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞と共に（Ｊ）インキュベートし、上清でのＩＦＮ−γ産生を測定した。（Ｋ）Ｖβ２特異的抗体で染色することにより測定した移入ＴＣＲの発現は、内因性ＴＣＲα定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のＣＲＩＳＰＲ媒介性欠失により向上した。（Ｌ）腫瘍および非隣接肺をディープＴＣＲ  Ｖβシーケンシングに供し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＶβをＴＣＲ  Ｖβ鋳型のパーセンテージとして定量した。肺と比べた腫瘍での富化は、フィッシャー直接検定によるとｐ＝０．００４だった。
【図５Ｌ】図５Ａ〜５Ｌは、Ｈｅｒ２エクソン２０挿入（ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）内部縦列重複（ＩＴＤ）；本明細書ではＨｅｒ２−ＩＴＤとも呼ばれる）に特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞を示す。（Ａ、Ｂ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株（５０，０００細胞）を、表記濃度のＨｅｒ２−ＩＴＤ（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号２２）または対応する野生型ペプチド（ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ；配列番号３４）の存在下で自己Ｂ細胞（１００，０００細胞）と共培養し、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ、Ｄ）患者１２３８に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、表記のクラスＩＩ  ＭＨＣ遮断抗体の存在下で、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドと共にインキュベートした。（Ｅ、Ｆ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスした自己Ｂ細胞と共にインキュベートしたか、またはＣＤ４＋  Ｔ細胞株に、野生型配列もしくはＨｅｒ２−ＩＴＤ配列をコードするＲＮＡをトランスフェクトした。（Ｇ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞株を、患者１２３８と共有する個々のクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−ＤＱＢ１−１２０２／１５０２  ＤＱＢ１  ０３０１／０５０１）を発現するＨｅｒ２−ＩＴＤペプチドパルスＢ−ＬＣＬ細胞株と共にインキュベートした。（Ｈ〜Ｊ）２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞に、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞から得られたＴＣＲ配列を形質導入し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドでパルスしたＢ細胞と共に（Ｈ、Ｉ）または野生型もしくは変異体Ｈｅｒ−２配列をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬ細胞と共に（Ｊ）インキュベートし、上清でのＩＦＮ−γ産生を測定した。（Ｋ）Ｖβ２特異的抗体で染色することにより測定した移入ＴＣＲの発現は、内因性ＴＣＲα定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のＣＲＩＳＰＲ媒介性欠失により向上した。（Ｌ）腫瘍および非隣接肺をディープＴＣＲ  Ｖβシーケンシングに供し、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＶβをＴＣＲ  Ｖβ鋳型のパーセンテージとして定量した。肺と比べた腫瘍での富化は、フィッシャー直接検定によるとｐ＝０．００４だった。
【００１１】
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、複数の例示的なＨｅｒ２−ＩＴＤ反応性Ｔ細胞株が、共通のＴＣＲ  Ｖβクロノタイプを共有することを示す。（Ａ）PloS  One  12.2  (2017):  e0171225から取ったＨｅｒ２エクソン２０挿入（内部縦列重複（ＩＴＤ））の概略図。（Ｂ）患者１２３８に由来する１０個の異なるＨｅｒ２−ＩＴＤ反応性Ｔ細胞株を、ＴＣＲ  Ｖβディープシーケンシングにより分析し、各Ｔ細胞株のＴＣＲ  Ｖβ鋳型のパーセンテージ（ｙ軸）を示す。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、複数の例示的なＨｅｒ２−ＩＴＤ反応性Ｔ細胞株が、共通のＴＣＲ  Ｖβクロノタイプを共有することを示す。（Ａ）PloS  One  12.2  (2017):  e0171225から取ったＨｅｒ２エクソン２０挿入（内部縦列重複（ＩＴＤ））の概略図。（Ｂ）患者１２３８に由来する１０個の異なるＨｅｒ２−ＩＴＤ反応性Ｔ細胞株を、ＴＣＲ  Ｖβディープシーケンシングにより分析し、各Ｔ細胞株のＴＣＲ  Ｖβ鋳型のパーセンテージ（ｙ軸）を示す。
【００１２】
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、バリアント対立遺伝子頻度およびｍＲＮＡ発現は、発現された変異の免疫原性と相関しなかったことを示す図である。（Ａ）この系列の５人の患者に由来する免疫原性であると同定された変異および非免疫原性であると同定された変異を、患者１１３９、１２３８、１４９０、および５１１の、分布の上位および下位２０％が除外された肺腺癌のがんゲノムアトラスデータベースの平均発現により、および患者１３４７に由来する患者由来異種移植片で測定されたｍＲＮＡ発現により定義されたＴＰＭでのｍＲＮＡ発現と比較した（マンホイットニー検定によりｐ＝０．５）。（Ｂ）免疫原性および非免疫原性がスクリーニングされた５人の患者に由来する変異のバリアント対立遺伝子配列決定リードの割合。マンホイットニー検定によりｐ＝０．７８。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、バリアント対立遺伝子頻度およびｍＲＮＡ発現は、発現された変異の免疫原性と相関しなかったことを示す図である。（Ａ）この系列の５人の患者に由来する免疫原性であると同定された変異および非免疫原性であると同定された変異を、患者１１３９、１２３８、１４９０、および５１１の、分布の上位および下位２０％が除外された肺腺癌のがんゲノムアトラスデータベースの平均発現により、および患者１３４７に由来する患者由来異種移植片で測定されたｍＲＮＡ発現により定義されたＴＰＭでのｍＲＮＡ発現と比較した（マンホイットニー検定によりｐ＝０．５）。（Ｂ）免疫原性および非免疫原性がスクリーニングされた５人の患者に由来する変異のバリアント対立遺伝子配列決定リードの割合。マンホイットニー検定によりｐ＝０．７８。
【００１３】
【図８】図８は、健常ＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４ドナーの血液に由来するＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞クロノタイプを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
一部の態様では、本開示は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原に対する結合タンパク質および／または高親和性組換えＴＣＲを提供する。また、結合タンパク質および／または高親和性組換えＴＣＲを含む（つまり、コードするおよび／または発現する）組成物および組換え宿主細胞が提供される。本開示による組成物および組換え宿主細胞は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、膵臓がん、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である他の適応症（本明細書では疾患または障害とも呼ばれる）、およびＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原が治療標的である適応症を有する対象の処置に有用である。一部の実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原に対して特異性を有する組成物および組換え宿主細胞（例えば、本明細書に開示のようなＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲをコードするおよび／または発現するように修飾されている、Ｔ細胞などの免疫細胞）は、胆道がんを有する対象の処置に有用である。ある特定の実施形態では、Ｈｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原に対して特異性を有する組成物および組換え宿主細胞（例えば、本明細書に開示のようなＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲをコードするおよび／または発現するように修飾されている、Ｔ細胞などの免疫細胞）は、例えば、卵巣がんまたは乳がんなどの、Ｈｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原に関連付けられる疾患または障害を有する対象の処置に使用することができる。例えば、ワクチンなどの免疫原性組成物、ならびに関連使用も提供される。
【００１５】
本明細書に概して記載のような実施形態は例示であることが容易に理解される。種々の実施形態の以下の説明は、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、種々の実施形態を代表するものに過ぎない。さらに、本明細書に開示のある特定の方法のステップまたは行為の順序は、当業者であれば、本開示の範囲から逸脱することなく変更することができる。言い換えれば、ステップまたは行為の特定の順序が、実施形態の適切な作業のために必要とされない限り、特定のステップまたは行為の順序または使用は改変することができる。
【００１６】
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で使用されるある特定の用語の定義を提供することはその理解に有益であり得る。追加の定義は、本開示全体にわたって示されている。
【００１７】
特に別様の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語は、当技術分野で理解される通常の意味を有する。
【００１８】
本明細書では、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、別様の指示がない限り、挙げられている範囲内の任意の整数の値および適切な場合はその分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解されるべきである。また、ポリマーサブユニット、サイズ、または厚さなど、任意の物理的特徴に関して本明細書に挙げられている任意の数範囲は、別様の指示がない限り、挙げられている範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。
【００１９】
測定可能な値を指す際の「約」は、本明細書で使用される場合、別様の指示がない限り、指定のまたは表記の値、範囲、または構造から±２０％、±１０％、±５％、±１％、または±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００２０】
用語「ａ」および「ａｎ」は、本明細書で使用される場合、列挙されている成分の「１つまたは複数」を指すことが理解されるべきである。選択肢の使用（例えば、「または」）は、選択肢のいずれか一方、両方、または任意の組合せを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は同義的に使用され、これらの用語およびその変化形は、非限定的であると解釈されることが意図されている。
【００２１】
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、後に記載される要素、成分、事象、または状況が生じてもよくまたは生じなくともよいこと、ならびに本明細書は、要素、成分、事象、または状況が生じる場合およびそれらが生じない場合を含むことを意味する。
【００２２】
加えて、本明細書に記載の構造およびサブユニットの種々の組合せに由来する個々の構築物または構築物の群は、各構築物または構築物の群が個々に示されている場合と同程度に、本出願により開示されることが理解されるべきである。したがって、特定の構造または特定のサブユニットの選択は、本開示の範囲内にある。
【００２３】
用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と等価ではなく、請求項の指定の材料もしくはステップまたは特許請求されている主題の基本的特色に実質的に影響を及ぼさないものを指す。例えば、タンパク質ドメイン、領域、もしくはモジュール（例えば、結合性ドメイン、ヒンジ領域、またはリンカー）、またはタンパク質（１つまたは複数のドメイン、領域、またはモジュールを有してもよい）は、ドメイン、領域、モジュール、またはタンパク質のアミノ酸配列が、ドメイン、領域、モジュール、またはタンパク質の長さの、組合せで多くとも２０％（例えば、多くとも１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％）に寄与する伸長、欠失、変異、またはそれらの組合せ（例えば、アミノ末端またはカルボキシ末端またはドメイン間のアミノ酸）を含み、ドメイン（複数可）、領域（複数可）、モジュール（複数可）、またはタンパク質（複数可）の活性（例えば、結合タンパク質の標的結合親和性）に実質的な影響を及ぼさない（つまり、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または１％以下など、活性を５０％以上には低減させない）場合、特定のアミノ酸配列「から本質的になる」。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるもの、ならびに後で修飾されるもの、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物、つまり水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα−炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのようなアナログは、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を維持している。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを指す。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに該当する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、単一の鎖に少なくとも２つの別個のドメインを有するタンパク質であって、これらドメインは自然界ではタンパク質中に一緒には見出されないタンパク質を指す。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ＰＣＲまたは組換え操作などを使用して構築してもよく、またはそのような融合タンパク質を合成してもよい。融合タンパク質は、タグ、リンカー、または形質導入マーカーなど、他の成分をさらに含有してもよい。ある特定の実施形態では、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）により発現または産生されるタンパク質は細胞表面に位置し、その場合、融合タンパク質は、細胞膜に係留され（例えば、膜貫通ドメインを介して）、細胞外部分（例えば、結合性ドメインを含有する）および細胞内部分（例えば、シグナル伝達ドメイン、エフェクタードメイン、共刺激ドメイン、またはそれらの組合せを含有する）を含む。
【００２７】
「接合部アミノ酸（junction  amino  acid）」または「接合部アミノ酸残基」は、結合性ドメインと隣接する定常ドメインとの間またはＴＣＲ鎖と隣接する自己切断性ペプチドとの間など、ポリペプチドの２つの隣接するモチーフ、領域、またはドメイン間にある１つまたは複数（例えば、約２〜１０個）のアミノ酸残基を指す。接合部アミノ酸は、融合タンパク質の構築物設計に起因する場合がある（例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子の構築中に制限酵素部位を使用することに起因するアミノ酸残基）。
【００２８】
「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、天然サブユニット（例えば、プリン塩基またはピリミジン塩基）または非天然サブユニット（例えば、モルホリン環）で構成されていてもよい、共有結合で連結されているヌクレオチドを含むポリマー化合物を指す。プリン塩基としては、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、およびキサンチンが挙げられ、ピリミジン塩基としては、ウラシル、チミン、およびシトシンが挙げられる。核酸分子としては、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含むポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が挙げられ、これらはいずれも一本鎖であってもよくまたは二本鎖であってもよい。一本鎖の場合、核酸分子は、コード鎖であってもよくまたは非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。アミノ酸配列をコードする核酸分子は、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。また、ヌクレオチド配列の一部のバージョンは、イントロン（複数可）が共転写機序または転写後機序により除去される限り、イントロン（複数可）を含んでいてもよい。言い換えれば、異なるヌクレオチド配列は、遺伝子コードの冗長性または縮重の結果として、またはスプライシングにより、同じアミノ酸配列をコードすることができる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「変異」は、それぞれ、参照または野生型核酸分子またはポリペプチド分子と比較した、核酸分子またはポリペプチド分子の配列の変化を指す。変異は、ヌクレオチド（複数可）またはアミノ酸（複数可）の置換、挿入、または欠失を含む、幾つかの異なるタイプの変化を配列にもたらすことができる。
【００３０】
「保存的置換」は、特定のタンパク質の結合特色に著しくは影響を与えず、変更もしないアミノ酸置換を指す。一般に、保存的置換は、置換されるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。保存的置換としては、以下の群の１つに見出される置換が挙げられる：群１：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；群２：アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＺ）；群３：アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；群４：アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；群５：イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）；群６：フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）。それに加えてまたはその代わりに、アミノ酸は、類似の機能、化学構造、または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、または硫黄含有）により、保存的置換群にグループ分けすることができる。例えば、脂肪族グループ分けは、置換の目的では、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅを含んでいてもよい。他の保存的置換群には、以下のものが挙げられる：硫黄含有：Ｍｅｔおよびシステイン（ＣｙｓまたはＣ）；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ；小型脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｙ；極性負電荷残基とそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、およびＧｌｎ；極性正電荷残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；大型脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、およびＣｙｓ；ならびに大型芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ。追加の情報は、Creighton  (1984)  Proteins,  W.H.  Freeman  and  Companyに見出すことができる。ある特定の実施形態では、プロリンは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシン、およびアラニン）とある特定の特性を共有する。ある特定の状況では、グルタミン酸のグルタミンへの置換またはアスパラギン酸のアスパラギンへの置換は、グルタミンおよびアスパラギンが、それぞれグルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であるという点で、類似の置換とみなすことができる。本開示のバリアントタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、およびアミノ酸配列は、ある特定の実施形態では、参照アミノ酸配列に対して１つまたは複数の保存的置換を含んでいてもよい。
【００３１】
当技術分野で理解されているように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列およびそれに対する保存的アミノ酸置換を、第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される（例えば、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ（商標）、Ａｌｉｇｎ、Ｃｌｕｓｔａｌ（商標）、またはＢＬＡＳＴアルゴリズムなどを使用して）。
【００３２】
本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのバリアントも企図される。バリアント核酸分子またはポリヌクレオチドは、本明細書に記載の定義されたまたは参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと（それぞれ）、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．９％同一であるか、またはポリヌクレオチドの場合、約６５〜６８℃にて０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、もしくは約４２℃にて０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオチドとハイブリダイズする。核酸分子バリアントは、標的分子と特異的に結合するなど、本明細書に記載の機能を有する融合タンパク質またはその結合性ドメインをコードする能力を維持する。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの追加の詳細および説明については、Ausubel,  F.  M.  (1995),  Current  Protocols  in  Molecular  Biology.  John  Wiley  &  Sons,  Inc.を参照されたい。さらに、当業者であれば、ハイブリダイゼーションによりＤＮＡ配列を同定するための方法に関するマニュアルであるBoehringer  Mannheim  GmbH  (1993)  The  DIG  System  Users  Guide  for  Filter  Hybridization,  Boehringer  Mannheim  GmbH,  Mannheim,  GermanyおよびLiebl,  W.,  Ehrmann,  M.,  Ludwig,  W.,  and  Schleifer,  K.  H.  (1991)  International  Journal  of  Systematic  Bacteriology  41:  255-260に記載されている指示に従うことができる。
【００３３】
バリアントは、定義された配列または参照配列の断片（例えば、短縮化または切断などに起因する部分）も指し、断片は、定義された配列または参照配列の長さよりも短い任意の長さであってもよい。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「機能的部分」または「機能的断片」は、親化合物または参照化合物のドメイン、部分、または断片のみを含むポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指し、ポリペプチドまたはコードされるポリペプチドは、親化合物または参照化合物のドメイン、部分、または断片に関連付けられる活性の少なくとも５０％、好ましくは、親ポリペプチドの活性の少なくとも５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％レベルを維持するか、または生物学的利益（例えば、エフェクター機能）を提供する。本開示のポリペプチドまたはコードされるポリペプチドの「機能的部分」または「活性部分」または「機能的断片」または「活性断片」は、機能的部分または機能的断片が、親ポリペプチドまたは参照ポリペプチドと比較して、結合親和性を測定するためのアッセイまたはエフェクター機能（例えば、サイトカイン放出）を測定するためのアッセイなど、選択されたアッセイにおいて５０％以下（親和性に関しては、好ましくは、親または参照と比較して２０％以下または１０％以下または１ｌｏｇ差以下）の性能低減を示す場合、「類似の結合性」または「類似の活性」を有する。ある特定の実施形態では、機能的部分は、エフェクター分子、エフェクタードメイン、共刺激分子、または共刺激ドメインの「シグナル伝達部分」を指す。
【００３５】
ある特定の実施形態では、バリアント結合タンパク質またはその部分もしくは断片（例えば、結合性ドメイン）は、存在する場合、親または参照結合タンパク質またはドメインと比べて、親または参照結合性ドメインまたはタンパク質から、潜在的に望ましくない特徴または特色を除去、変化、または減弱させる１つまたは複数のアミノ酸置換；例えば、潜在的に免疫原性であるアミノ酸配列、あるいは望ましくないグリコシル化部位、望ましくない脱アミド化部位、望ましくない酸化部位、望ましくない異性化部位、もしくは熱力学的安定性の低減を提供し得るか、または結合タンパク質の誤対形成（例えば、近傍の誤対形成システイン残基）もしくはミスフォールディングをもたらし得るアミノ酸配列を含んでいてもよい。望ましくない特徴または特色を提供し得るアミノ酸配列、パターン、およびモチーフは公知である（例えば、Seeliger  et  al.,  mAbs  7(3):  505-515  (2015)を参照）。
【００３６】
ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、例えば、生殖系列においてコードされるアミノ酸への復帰などの体細胞変異を除去するための置換を含む。例えば、ある特定の実施形態では、参照ＣＤＲアミノ酸配列またはＴＣＲ可変ドメイン配列またはＴＣＲ定常領域配列のバリアントは、潜在的に望ましくない特徴または特色を除去または減弱するための置換を含む。そのようなバリアントは、所望の機能（例えば、ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体に対する結合特異性および／または親和性）を損なわないか、または実質的に損なわないように選択されることが理解される。
【００３７】
「配列同一性」または「配列同一性パーセント」は、本明細書で使用される場合、配列をアラインし、必要な場合、好ましい方法では、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せず、最大配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後で（例えば、ギャップは、最適なアラインメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入することができる）、別の参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である一方の配列のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。さらに、非相同性配列は、比較の目的では無視してもよい。本明細書で参照される配列同一性パーセントは、別様の指示がない限り、参照配列の長さにわたって計算される。本開示の状況内では、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合、分析の結果は、参照されるプログラムの「初期値」に基づくことが理解される。「初期値」は、最初に初期化した際にソフトウェアに元々ロードされる値またはパラメーターの任意のセットを意味する。例えば、配列同一性パーセント値は、  Altschul,  et  al.  (1997)  "Gapped  BLAST  and  PSI-BLAST:  a  new  generation  of  protein  database  search  programs,"  Nucleic  Acids  Res.  25:  3389-3402に定義されているＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ２．０ソフトウェアを使用し、初期値に設定されたパラメーターを用いて生成することができる。配列アラインメントおよび同一性パーセントを決定または算出するための他のプログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＢＬＡＳＴＸが挙げられる。
【００３８】
「機能的バリアント」は、本開示の親化合物または参照化合物と構造的に類似するかまたは実質的に構造的に類似するが、組成がわずかに異なり（例えば、１つの塩基、原子、または官能基が、異なるか、追加されているか、または除去されている）、ポリペプチドまたはコードされるポリペプチドが、コードされる親ポリペプチドの少なくとも１つの機能を、親ポリペプチドの活性の少なくとも５０％の効率で、好ましくは、少なくとも５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％レベルで果たすことが可能であるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。言い換えれば、本開示のポリペプチドまたはコードされるポリペプチドの機能的バリアントは、機能的バリアントが、結合親和性（例えば、会合定数（Ｋａ）または解離定数（ＫＤ）を測定するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）または四量体染色）もしくは結合力を測定するためのアッセイ；または例えば、Ｌｃｋ、ＺＡＰ７０、もしくはＦｙｎなどの免疫細胞タンパク質のもしくは免疫細胞タンパク質によるリン酸化もしくは活性化を測定するアッセイなど、本明細書に記載のアッセイを含む、選択されたアッセイにて、親ポリペプチドまたは参照ポリペプチドと比較して５０％以下の性能低減を示す場合、「類似の結合性」、「類似の親和性」、または「類似の活性」を有する。本開示のポリペプチドまたはコードされるポリペプチド（またはその機能的バリアント）が、１つまたは複数の細胞シグナル伝達事象（例えば、抗原結合に応答したＴ細胞シグナル伝達）を開始、継続、関与、伝達、または増幅する能力は、活性、構造、化学状態（例えば、リン酸化）、またはバリアントポリペプチドおよびそれと共に直接作用する（例えば、結合する）免疫細胞タンパク質のもしくはそれらの間の相互作用を調査することにより決定してもよく、あるいは活性、局在化、構造、発現、分泌、化学状態（例えば、リン酸化）、または１つもしくは複数の細胞シグナル伝達事象に関与するかもしくはそれにより影響を受けることが公知であるかもしくはそのように考えられている他の生体分子のもしくはそれらの間の相互作用を調査することにより決定してもよい。また、本開示のポリペプチドまたはコードされるポリペプチド（またはその機能的バリアント）が、１つまたは複数の細胞シグナル伝達事象を開始、継続、関与、伝達、または増幅する能力は、宿主細胞が、サイトカインを放出するか、増殖するか、標的細胞を選択的に死滅させるか、または本開示の結合タンパク質が結合する抗原を発現するかもしくはそうでなければそれに関連付けられる疾患もしくは状態を有する対象を処置する宿主細胞の能力を測定するための本明細書に記載のものを含む、宿主細胞活性の機能的アッセイを使用することにより決定していてもよい。
【００３９】
本開示のバリアントポリペプチドは、ある特定の実施形態では、化学修飾、例えば、同位体標識、またはグリコシル化、リン酸化、アセチル化、脱炭酸、シトルリン化、およびヒドロキシル化などの共有結合修飾を含んでいてもよい。ポリペプチドを修飾するための方法は、当技術分野で公知である。修飾は、バリアントの所望の生物活性を消失または実質的に棄損することがないように設計される。
【００４０】
「変更されたドメイン」または「変更されたタンパク質」は、野生型モチーフ、領域、ドメイン、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（例えば、野生型のＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲα定常ドメイン、またはＴＣＲβ定常ドメイン）と、少なくとも８５％（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％）の非同一配列同一性（ｎｏｎ−ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するモチーフ、領域、ドメイン、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「内因性」または「天然」は、宿主細胞に通常存在する遺伝子、タンパク質、または活性を指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「異種」、「非内因性」、および「外因性」は、操作（例えば、遺伝子操作）により導入されている任意の遺伝子、タンパク質、化合物、分子、または活性を指す。ある特定の実施形態では、異種、非内因性、または外因性分子（例えば、受容体、リガンドなど）は、宿主細胞または対象に対して内因性ではなくともよく、その代わりにそのような分子をコードする核酸が、コンジュゲーション、形質転換、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションなどにより宿主細胞に追加されていてもよく、その場合、追加された核酸分子は、宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよく、または染色体外遺伝物質として（例えば、プラスミドまたは他の自己複製ベクターとして）存在してもよい。用語「相同的」または「相同体」は、宿主細胞、種、または菌株に見出されるかまたはそれらに由来する分子または活性を指す。例えば、異種、非内因性、もしくは外因性分子、またはそうした分子をコードする遺伝子は、それぞれ天然宿主または宿主細胞分子もしくはそのような分子をコードする遺伝子と相同的であってもよいが、変更された構造、配列、発現レベル、またはそれらの組合せを有してもよい。非内因性分子は、同じ種、異なる種、またはそれらの組合せに由来してもよい。
【００４３】
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドが遺伝子などの核酸分子のコード配列に基づいて産生されるプロセスを指す。このプロセスは、転写、転写後制御、転写後修飾、翻訳、翻訳後制御、翻訳後修飾、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。発現される核酸分子は、典型的には、発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結している。
【００４４】
用語「作動可能に連結した」は、一方の機能が他方により影響を受けるように、２つまたはそれよりも多くの核酸分子が単一の核酸断片において関連付けられていることを指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合（つまり、コード配列が、プロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列と作動可能に連結している。「連結されていない」は、互いに密接に関連付けられておらず、一方の機能が他方に影響を及ぼさない遺伝子エレメントを指す。
【００４５】
用語「構築物」は、組換え核酸分子を含有する任意のポリヌクレオチドを指す。構築物は、ベクター（例えば、細菌ベクターまたはウイルスベクター）に存在してもよく、またはゲノムに組み込まれてもよい。「ベクター」は、別の核酸分子を輸送することが可能な核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＲＮＡベクター、または染色体核酸分子、非染色体核酸分子、半合成核酸分子、または合成核酸分子を含んでいてもよい線状または環状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってもよい。例示的なベクターは、自律複製（エピソームベクター）またはそれらに連結されている核酸分子の発現（発現ベクター）が可能なものである。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、好適な宿主において核酸分子の発現をもたらすことが可能である好適な制御配列に作動可能に連結した核酸分子を含有するＤＮＡ構築物を指す。そのような制御配列としては、転写をもたらすプロモーター、そのような転写を制御するための必要に応じたオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、ウイルス、または単に潜在的なゲノムインサートであってもよい。好適な宿主へと形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムとは独立して複製および機能してもよく、または一部の場合では、ゲノム自体へと組み込まれてもよい。本明細書では、「プラスミド」、「発現プラスミド」、「ウイルス」、および「ベクター」は、置き換え可能に使用されることが多い。
【００４７】
核酸分子を細胞へと挿入するという状況における「導入される」という用語は、「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸分子の取り込みに対する言及を含み、その場合、核酸分子は、細胞のゲノムへと組み込まれてもよく（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）、自律性レプリコンに変換されてもよく、または一過性に発現されてもよい（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。本明細書で使用される場合、用語「操作された」、「組換えの」、または「非天然の」は、少なくとも１つの遺伝的変更を含むか、または外因性核酸分子の導入により修飾されている生物、微生物、細胞、核酸分子、またはベクターを指し、そのような変更または修飾は、遺伝子工学（つまり、人為的介入）により導入される。遺伝的変更としては、例えば、タンパク質、融合タンパク質、もしくは酵素をコードする発現可能な核酸分子を導入する修飾、または他の核酸分子の追加、欠失、置換、または細胞の遺伝物質の他の機能的破壊が挙げられる。追加の修飾としては、例えば、修飾が、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはオペロンの発現を変更する非コード調節領域が挙げられる。
【００４８】
本明細書に記載のように、２種以上の異種、非内因性、または外因性核酸分子は、別々の核酸分子として、複数の個々に制御される遺伝子として、ポリシストロン性核酸分子として、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子として、またはそれらの任意の組合せとして宿主細胞へと導入されていてもよい。例えば、宿主細胞は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原ペプチドまたはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原ペプチドに特異的な所望のＴＣＲ（例えば、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）をコードする２種またはそれよりも多くの種の異種、非内因性、または外因性核酸分子を発現するように修飾されていてもよい。２種またはそれよりも多くの種の外因性核酸分子が宿主細胞へと導入される場合、２種またはそれよりも多くの種の外因性核酸分子は、単一の核酸分子として（例えば、単一のベクターにて）、別々のベクターで導入されてもよく、単一の部位もしくは複数の部位にて宿主染色体へと組み込まれてもよく、またはそれらの任意の組合せであってもよいと理解される。参照される異種核酸分子またはタンパク質活性の数は、宿主細胞へと導入される別々の核酸分子の数ではなく、コード核酸分子の数またはタンパク質活性の数を指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「宿主」または「宿主細胞」は、目的のポリペプチド（例えば、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質またはＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質）を産生するための異種または外因性核酸分子による遺伝子改変の標的となる細胞（例えば、Ｔ細胞などの免疫系細胞）または微生物を指す。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、必要に応じて、異種または外因性タンパク質の生合成に関連するまたは関連しない所望の特性を付与する他の遺伝子改変を既に保有していてもよくまたは含むように修飾されていてもよい（例えば、検出可能なマーカーの包含；内因性ＴＣＲの欠失、変更、または短縮化；共刺激因子の発現増加など）。宿主細胞としての使用に好適な例示的な宿主細胞および細胞のタイプは、本明細書にさらに記載されている。
【００５０】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）は、ＭＨＣ受容体に結合している抗原ペプチドと特異的に結合することが可能な免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（可変結合性ドメイン、定常ドメイン、膜貫通領域、および短い細胞質内尾部を有する；例えば、Janeway,  et  al.,  Immunobiology:  The  Immune  System  in  Health  and  Disease,  3rd  Ed.,  Current  Biology  Publications,  p.  4:33,  1997を参照）を指す。ＴＣＲは、細胞の表面上に見出されてもよく、または可溶性形態であってもよく、一般に、α鎖およびβ鎖（それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られている）もしくはγ鎖およびδ鎖（それぞれＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても知られている）を有するヘテロ二量体で構成されている。他の免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖の細胞外部分（例えば、α鎖およびβ鎖）は、２つの免疫グロブリンドメイン：Ｎ末端の可変ドメイン（例えば、α鎖可変ドメインすなわちＶα、β鎖可変ドメインすなわちＶβ；典型的にはカバット付番（Kabat  numbering）に基づきアミノ酸１〜１１６（Kabat,  et  al.,  "Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,"  US  Dept.  Health  and  Human  Services,  Public  Health  Service  National  Institutes  of  Health,  1991,  5th  ed.））および細胞膜に隣接する１つの定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインすなわちＣα、典型的にはカバットに基づきアミノ酸１１７〜２５９、β鎖定常ドメインすなわちＣβ、典型的にはカバットに基づきアミノ酸１１７〜２９５）を含有する。また、他の免疫グロブリンと同様に、可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）により隔てられている相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する（例えば、Jores,  et  al.,  Proc.  Nat'l  Acad.  Sci.  U.S.A.  57:9138,  1990；Chothia,  et  al.,  EMBO  J.  7:3745,  1988を参照；また、Lefranc,  et  al.,  Dev.  Comp.  Immunol.  27:55,  2003を参照）。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面に見出され、ＣＤ３複合体と会合する。本開示で使用されるＴＣＲの供給源は、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマ、または他の哺乳動物など、種々の動物種に由来してもよい。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ複合体は、ＴＣＲまたはその機能的部分；２つのＣＤ３ζ鎖またはそれらの機能的部分もしくはバリアントを含む二量体；ＣＤ３δ鎖およびＣＤε鎖またはそれらの機能的部分もしくはバリアントを含む二量体；ＣＤ３γ鎖およびＣＤε鎖またはそれらの機能的部分もしくはバリアントを含む二量体を含み、それらのいずれか１つまたは複数は、Ｔ細胞に対して内因性であってもよくまたは異種であってもよい。
【００５１】
「ＣＤ３」は、６つの鎖の多タンパク質複合体である（Borst  J,  et  al.,  J  Biol  Chem,  258(8):  5135-41,  1983および上記のJaneway,  et  al.,  p.172  and  178,  1999を参照）。哺乳動物では、複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、およびＣＤ３ζ鎖のホモ二量体を含む。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの関連細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は負に荷電されており、それにより、こうした鎖がＴＣＲ鎖の正荷電領域と会合することが可能になると考えられている。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖の細胞内尾部は各々、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られている単一の保存されたモチーフを含有するが、各ＣＤ３ζ鎖は３つを有する。理論により束縛されないが、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力にとって重要であると考えられている。本開示で使用されるＣＤ３は、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物を含む、種々の動物種に由来してもよい。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ複合体」は、ＣＤ３とＴＣＲとの会合により形成される複合体を指す。例えば、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲα鎖、およびＴＣＲβ鎖で構成されていてもよい。あるいは、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲγ鎖、およびＴＣＲδ鎖で構成されていてもよい。「ＴＣＲ複合体の成分」は、本明細書で使用される場合、ＴＣＲ鎖（つまり、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、またはＴＣＲδ）、ＣＤ３鎖（つまり、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、またはＣＤ３ζ）、または２つもしくはそれよりも多くのＴＣＲ鎖もしくはＣＤ３鎖により形成される複合体（例えば、ＴＣＲαおよびＴＣＲβの複合体、ＴＣＲγおよびＴＣＲδの複合体、ＣＤ３εおよびＣＤ３δの複合体、ＣＤ３γおよびＣＤ３εの複合体、またはＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、および２つのＣＤ３ε鎖の部分ＴＣＲ複合体）を指す。
【００５３】
「主要組織適合複合体」（ＭＨＣ）は、ペプチド抗原を細胞表面へと送達する糖タンパク質を指す。ＭＨＣクラスＩ分子は、膜を跨ぐα鎖（３つのαドメインを有する）および非共有結合で会合しているβ２ミクログロブリンを有するヘテロ二量体である。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、どちらも膜を跨ぐ２つの膜貫通糖タンパク質αおよびβで構成されている。各鎖は２つのドメインを有する。ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞質ゾルを起源とするペプチドを細胞表面に送達し、そこでペプチド：ＭＨＣ複合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、小胞系を起源とするペプチドを細胞表面に送達し、そこでペプチドはＣＤ４＋Ｔ細胞により認識される。ヒトＭＨＣは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。
【００５４】
「ＣＤ４」は、ＴＣＲが抗原提示細胞とやり取りすることを支援する免疫グロブリン共受容体糖タンパク質を指す（Campbell  &  Reece,  Biology  909  (Benjamin  Cummings,  Sixth  Ed.,  2002);  UniProtKB  P01730を参照）。ＣＤ４は、ヘルパーＴ細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞などの免疫細胞の表面に見出され、細胞表面に発現される４つの免疫グロブリンドメイン（Ｄ１〜Ｄ４）を含む。抗原提示中、ＣＤ４は、ＴＣＲ複合体と共に動員され、ＭＨＣＩＩ分子の異なる領域に結合する（ＣＤ４はＭＨＣＩＩ  β２に結合し、ＴＣＲ複合体はＭＨＣＩＩ  α１／β１に結合する）。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ８共受容体」または「ＣＤ８」は、アルファ−アルファホモ二量体またはアルファ−ベータヘテロ二量体のいずれかとしての細胞表面糖タンパク質ＣＤ８を意味する。ＣＤ８共受容体は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）の機能を支援し、細胞質チロシンリン酸化経路を介したシグナル伝達により機能する（Gao  and  Jakobsen,  Immunol.  Today  21:  630-636,  2000；Cole  and  Gao,  Cell.  Mol.  Immunol.  1:81-88,  2004）。ヒトでは、５つの異なるＣＤ８ベータ鎖（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子Ｐ１０９６６を参照）および単一のＣＤ８アルファ鎖（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子Ｐ０１７３２を参照）が存在する。
【００５６】
「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、天然に存在しないかまたは宿主細胞では天然に存在しない様式で一緒に連結された２つまたはそれよりも多くの天然に存在するアミノ酸配列を含有するように操作された融合タンパク質を指し、融合タンパク質は、細胞の表面に存在する場合、受容体として機能することができる。本開示のＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン（必要に応じて共刺激ドメイン（複数可）を含む）に連結された抗原結合性ドメイン（つまり、がん抗原に特異的な抗体もしくはＴＣＲに由来するｓｃＦｖもしくはｓｃＴＣＲ、またはＮＫ細胞のキラー免疫受容体に由来するかもしくはそれから得られる抗原結合性ドメインなど、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子から得られるかまたはそれらに由来する）を含む細胞外部分を含む（例えば、Sadelain  et  al.,  Cancer  Discov.,  3(4):  388  (2013)を参照；またHarris  and  Kranz,  Trends  Pharmacol.  Sci.,  37(3):  220  (2016)；Stone  et  al.,  Cancer  Immunol.  Immunother.,  63(11):  1163  (2014)を参照）。ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、抗原特異的ＴＣＲ結合性ドメインを含むＣＡＲを含む（例えば、Walseng  et  al.,  Scientific  Reports  7:  10713,  2017を参照；この文献のＴＣＲ  ＣＡＲ構築物および方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５７】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗原との結合に関与する、ＴＣＲα鎖またはβ鎖（またはγδＴＣＲの場合は、γ鎖およびδ鎖）の、または抗体重鎖もしくは抗体軽鎖のドメインを指す。天然ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶαおよびＶβ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインは、４つの概して保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む。また、抗体重鎖（ＶＨ）および抗体軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインは各々、一般に、４つの概して保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む。一部の場合では、ＴＣＲα鎖もしくはβ鎖（またはγδＴＣＲの場合は、γ鎖およびδ鎖）の両方の、または抗体重鎖もしくは抗体軽鎖の可変ドメインが、結合に関与する。一部の場合では、ＴＣＲα鎖もしくはβ鎖（またはγδＴＣＲの場合は、γ鎖およびδ鎖）の一方の、または抗体重鎖もしくは抗体軽鎖の可変ドメインが、結合に関与する。
【００５８】
用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義であり、当技術分野では、抗原特異性および／または結合親和性を付与し、一次配列においてはフレームワークアミノ酸により互いに隔てられている、ＴＣＲ可変領域内または抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指すことが知られている。一般に、各可変領域には３つのＣＤＲが存在する（つまり、ＴＣＲα鎖およびβ鎖可変領域の各々に３つのＣＤＲが存在する；抗体重鎖および軽鎖可変領域の各々に３つのＣＤＲが存在する）。ＴＣＲの場合、ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識に関わる主要ＣＤＲであると考えられる。一般に、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、主に、または一部の場合では排他的に、ＭＨＣと相互作用する。可変ドメイン配列は、付番スキーム（例えば、Kabat,  EU,  International  Immunogenetics  Information  System  (IMGT),  Contact,  and  Aho）に対してアラインすることができ、それにより、等しい残基位置に注釈を付けること、およびＡｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＡＮＡＲＣＩ）ソフトウェアツール（2016,  Bioinformatics  15:  298-300）を使用して異なる分子を比較することを可能にすることができる。本開示のある特定の実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ付番を使用して決定される。ＴＣＲ配列由来のＣＤＲのＩＭＧＴ決定は、例えば、ＩＭＧＴ  Ｖ−Ｑｕｅｓｔ（imgt.org/IMGTindex/V-QUEST.php）を使用して達成することができる。例えば、ＴＣＲ  ＶαまたはＶβ領域またはドメインのＣＤＲは、特定の付番スキームでは特定の配列を有していてもよく、異なる付番スキームでは、より短い、より長い、またはシフトした（例えば、部分的に重複する）配列を有してもよいことが理解される。
【００５９】
「抗原」または「Ａｇ」は、本明細書で使用される場合、免疫応答を引き起こす免疫原性分子を指す。この免疫応答は、抗体産生、特定の免疫担当細胞（Ｔ細胞など）の活性化、または両方を伴ってもよい。抗原（免疫原性分子）は、例えば、ペプチド、糖ペプチド、ポリペプチド、糖ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、または脂質などであってもよい。抗原は、合成してもよく、組換えにより産生してもよく、または生物学的試料に由来してもよいことは容易に明らかである。１つまたは複数の抗原を含有し得る例示的な生物学的試料としては、組織試料、腫瘍試料、細胞、生物学的流体、またはそれらの組合せを挙げることができる。抗原は、抗原を発現するように修飾または操作された細胞により産生することができる。
【００６０】
「ネオ抗原」は、本明細書で使用される場合、対象のゲノム（つまり、対象の健常組織の試料）に以前は観察されていないか、または宿主の免疫系により「感知」または認識されていない新しい抗原または抗原性エピトープを作出し、（ａ）細胞の抗原プロセシングおよび輸送機序によりプロセシングされ、ＭＨＣ（例えば、ＨＬＡ）分子と会合して細胞表面に提示され得る；および（ｂ）免疫応答（例えば、細胞性（Ｔ細胞）応答）を誘発し得る構造的変化、変更、または変異を含有する宿主細胞産物を指す。ネオ抗原は、例えば、変更されたもしくは変異した産物をもたらす変更（置換、付加、欠失）を有するコードポリヌクレオチド、または外因性核酸分子もしくはタンパク質の細胞への挿入、または遺伝子変化をもたらす環境因子（例えば、化学的、放射線学的）への曝露を起源としてもよい。ネオ抗原は、腫瘍抗原とは別に生じてもよく、または腫瘍抗原から生じてもよく、または腫瘍抗原に付随していてもよい。「腫瘍ネオ抗原」（または「腫瘍特異的ネオ抗原」）は、腫瘍細胞または腫瘍内の複数の細胞に付随するか、それらから生じるか、またはそれら内で生じるネオ抗原決定基を含むタンパク質を指す。腫瘍ネオ抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞のＤＮＡによりコードされる１つまたは複数の体細胞変異または染色体再編成を含有する抗原性腫瘍タンパク質またはペプチドに、ならびにウイルス関連腫瘍（例えば、子宮頸がん、一部の頭頸部がん）に関連付けられるウイルスオープンリーディングフレームからのタンパク質またはペプチドに見出される。用語「抗原」および「ネオ抗原」は、本明細書に開示のような変異を含むＫＲＡＳ抗原（例えば、Ｇ１２Ｖ）またはＨＥＲ２−ＩＴＤ抗原を指す場合、本明細書では置き換え可能に使用される。
【００６１】
用語「エピトープ」または「抗原性エピトープ」は、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体、または他の結合分子、ドメイン、もしくはタンパク質などの同種結合分子により認識され、特異的に結合する任意の分子、構造、アミノ酸配列、またはタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般に、アミノ酸または糖側鎖などの、化学的に活性な分子の表面基を含有し、特定の三次元構造特色ならびに特定の電荷特色を有することができる。エピトープは、連続するアミノ酸（例えば、線状エピトープ）であってもよく、またはタンパク質フォールディングにより近接するタンパク質の異なる部分のアミノ酸（例えば、不連続または立体構造エピトープ）、またはタンパク質フォールディングおよび／もしくは細胞免疫系によるプロセシングに関わりなく近傍にある非連続アミノ酸で構成されていてもよい。
【００６２】
「結合性ドメイン」（「結合性領域」または「結合性部分」とも呼ばれる）は、本明細書で使用される場合、標的分子（例えば、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（配列番号１、または配列番号１の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなるその免疫原性断片）；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド：ＭＨＣ複合体であって、ＭＨＣ対立遺伝子はＤＲＢ１−１１０１またはＤＲＢ１−１１０４であってもよい複合体、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ（配列番号２２；または配列番号２２の７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなるその免疫原性断片）、またはＨｅｒ２−ＩＴＤペプチド：ＭＨＣ複合体であって、ＭＨＣ対立遺伝子はＤＱＢ１−０５：０１またはＤＱＢ１−０５：０２であってもよい複合体）と特異的におよび非共有結合で会合、合体、または組み合わせる能力を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質などの分子を指す。結合性ドメインは、生物学的分子または他の目的の標的に対する、任意の天然に存在する、合成の、半合成の、または組換え的に産生された結合パートナーを含む。一部の実施形態では、結合性ドメインは、抗体またはＴＣＲまたは機能的結合性ドメインまたはそれらの抗原結合性断片などの抗原結合性ドメインである。例示的な結合性ドメインとしては、一本鎖抗体可変領域（例えば、単一ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、およびＦａｂ）、受容体外部ドメイン（例えば、ＴＮＦ−α）、リガンド（例えば、サイトカインおよびケモカイン）、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）などのＴＣＲの抗原結合性領域、生物学的分子、アプタマー、または単一ドメイン抗体（例えば、ラクダまたは魚由来の単一ドメイン抗体；例えば、Arbabi-Ghahroudi  M  (2017)  Front.  Immunol.  8:  1589を参照）に結合する特異的能力について選択された合成ポリペプチドが挙げられる。
【００６３】
「リンカー」は、２つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ドメイン、領域、またはモチーフを接続するアミノ酸配列を指し、得られるポリペプチドが、標的分子に対する特異的結合親和性を維持するか（例えば、ｓｃＴＣＲ）、またはシグナル伝達活性を維持する（例えば、ＴＣＲ複合体）ように、２つの部分結合性ドメインの相互作用と適合性であるスペーサー機能を提供することができる。ある特定の実施形態では、リンカーは、約２〜約３５個のアミノ酸、約４〜約２０個のアミノ酸、約８〜約１５個のアミノ酸、約１５〜約２５個のアミノ酸、または別の好適な数のアミノ酸で構成される。例示的なリンカーとしては、１つまたは複数の連続するグリシンの後にセリンが続き、その配列は、２回、３回、４回、またはそれよりも多く反復されていてもよいグリシン−セリンリンカーが挙げられる。
【００６４】
本開示の任意の結合性ドメインは、第１のドメインのＣ末端が短いペプチド配列により第２のドメインのＮ末端に連結されるように、またはその逆になるように（例えば、ｓｃＴＣＲの場合、（Ｎ）Ｖβ（Ｃ）−リンカー−（Ｎ）Ｖα（Ｃ）または（Ｎ）Ｖα（Ｃ）−リンカー−（Ｎ）Ｖβ（Ｃ））、一本鎖形式で操作されていてもよい。ある特定の実施形態では、結合性ドメインは、キメラであるか、ヒトであるか、またはヒト化されている。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質」は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原と特異的に結合するおよび／または特異的であるタンパク質またはポリペプチドを指す。背景として、ＫＲＡＳ（Ｃ−Ｋ−ＲＡＳ、ＣＦＣ２、Ｋ−ＲＡＳ２Ａ、Ｋ−ＲＡＳ２Ｂ、Ｋ−ＲＡＳ４Ａ、Ｋ−ＲＡＳ４Ｂ、ＫＩ−ＲＡＳ、ＫＲＡＳ１、ＫＲＡＳ２、ＮＳ、ＮＳ３、ＲＡＬＤ、ＲＡＳＫ２、Ｋ−ｒａｓ、ＫＲＡＳプロトオンコジーン、ＧＴＰａｓｅ、およびｃ−Ｋｉ−ｒａｓ２とも呼ばれる）は、細胞増殖のシグナルトランスダクションに関与するｐ２１  ＧＴＰａｓｅである。負の成長シグナル伝達を妨害するＫＲＡＳの変異は、細胞の継続的な増殖をもたらし得る。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異は、ＮＳＣＬＣの４％、結腸直腸がんの１０％、膵臓がんの３０％、および卵巣がんの８％に見出されることが報告されている（Forbes  S,  et  al.  Current  protocols  in  human  genetics.  2016:10.1.  1-.1.  37を参照）。
【００６６】
一部の実施形態では、結合タンパク質またはポリペプチドは、ＭＨＣ分子またはＨＬＡ分子と複合体化するＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドなどのＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖと、例えば、細胞表面上で、特定の親和性でまたは少なくともほぼ特定の親和性で結合する。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原、そのバリアント、またはその断片に結合することができる。例えば、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質は、配列番号１によるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列に結合することができ、配列番号１の残基１２に対応する残基はバリン（Ｖ）である。ある特定の実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ由来ペプチド：ＨＬＡ複合体（またはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ由来ペプチド：ＭＨＣ複合体）と、例えば、同じアッセイで測定して、本明細書で提供されるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的ＴＣＲのいずれかなど、本明細書で提供される例示的なＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質が表す親和性とほぼ同じか、少なくともほぼ同じか、またはそれよりも高いかもしくはほぼ高い親和性で結合する。Ｋｄを測定して、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質の親和性を評価することができる。
【００６７】
用語「Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質」は、Ｈｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原に特異的に結合するおよび／または特異的であるタンパク質またはポリペプチドを指す。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、ＭＨＣ分子またはＨＬＡ分子と複合体化した場合、Ｈｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原ペプチドなどのＨｅｒ２−ＩＴＤ抗原に、例えば、細胞表面上で、特定の親和性でまたは少なくともほぼ特定の親和性で結合する。Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質は、Ｈｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原、そのバリアント、またはその断片に結合することができる。例えば、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列に、または配列番号２２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列に結合することができる。ある特定の実施形態では、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質は、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ由来ペプチド：ＨＬＡ複合体（またはＨｅｒ２−ＩＴＤ由来ペプチド：ＭＨＣ複合体）と、例えば、同じアッセイで測定して、本明細書で提供されるＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＴＣＲのいずれかなど、本明細書で提供される例示的なＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質が表す親和性とほぼ同じか、少なくともほぼ同じか、またはそれよりも高いかもしくはほぼ高い親和性で結合する。Ｋｄを測定して、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質の親和性を評価することができる。
【００６８】
親和性または見掛けの親和性または相対的親和性を評価するためのアッセイは公知である。例えば、抗原：ＨＬＡに対するＴＣＲの見掛けの親和性は、例えば、標識四量体を使用したフローサイトメトリーにより、種々の濃度の四量体に対する結合を評価することにより測定することができる。一部の例では、一連の濃度の標識四量体の２倍希釈物を使用してＴＣＲの見掛けのＫｄを測定し、続いて非線形回帰により結合曲線を決定する。見掛けのＫｄは、最大半量結合をもたらすリガンドの濃度として決定される。ある特定の実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質またはＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質は、それぞれ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶまたはＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的免疫グロブリンスーパーファミリー結合タンパク質またはその結合性部分を含む。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」は、結合タンパク質（例えば、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体）または結合性ドメイン（またはその融合タンパク質）が、試料中のいかなる他の分子または成分とも有意に会合も合体もしないが、１０５Ｍ−１と等しいかまたはそれよりも高い親和性またはＫａ（つまり、特定の結合相互作用の１／Ｍの単位での平衡会合定数）で標的分子と会合または結合することを指す。結合性ドメイン（またはその融合タンパク質）は、「高親和性」結合性ドメイン（またはその融合タンパク質）または「低親和性」結合性ドメイン（またはその融合タンパク質）に分類することができる。「高親和性」結合性ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１のＫａを有する結合性ドメインを指す。「低親和性」結合性ドメインは、最大で１０７Ｍ−１、最大で１０６Ｍ−１、または最大で１０５Ｍ−１のＫａを有する結合性ドメインを指す。あるいは、親和性は、特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）としてＭの単位で定義することができる（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）。ある特定の実施形態では、結合性ドメインは、「増強された親和性」を有してもよく、その場合、標的抗原との結合が野生型（または親）結合性ドメインよりも強力である、選択されたまたは操作された結合性ドメインを指す。例えば、増強された親和性は、標的抗原に対するＫａ（平衡会合定数）が野生型結合性ドメインよりも高いことによるものであってもよく、または標的抗原に対するＫｄが野生型結合性ドメインのＫｄよりも低いことによるものであってもよく、または標的抗原のオフレート（Ｋｏｆｆ）が野生型結合性ドメインのオフレートよりも低いことによるものであってもよい。特定の標的に特異的に結合する本開示の結合性ドメインを同定するための、ならびにウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、およびＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析など、結合性ドメインまたは融合タンパク質の親和性を決定するための様々なアッセイが公知である（例えば、Scatchard,  et  al.,  Ann.  N.  Y.  Acad.  Sci.  57:  660,  1949；および米国特許第５，２８３，１７３号明細書または米国特許第５，４６８，６１４号明細書なども参照されたい）。
【００７０】
本明細書に記載のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原特異的結合タンパク質、ＴＣＲ、またはドメイン、およびそれらのバリアントは、宿主細胞の結合、活性化、または誘導を決定することを含み、抗原特異的である宿主細胞応答を決定することも含む、宿主細胞活性をアッセイするための多数の当技術分野で認められている方法論のいずれかに従って機能的に特徴付けることができる。例としては、宿主細胞増殖、宿主細胞サイトカイン放出、抗原特異的宿主細胞刺激、ＭＨＣ拘束性宿主細胞刺激、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性（例えば、事前に負荷された標的細胞からの５１Ｃｒ放出を検出することによる）、Ｔ細胞表現型マーカー発現の変化、およびＴ細胞機能の他の尺度を決定することが挙げられる。こうしたおよび類似のアッセイを実施するための手順は、例えば、Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ（Immunology  Methods  Manual:  The  Comprehensive  Sourcebook  of  Techniques,  1998；Current  Protocols  in  Immunology;  Weir,  Handbook  of  Experimental  Immunology,  Blackwell  Scientific,  Boston,  MA  (1986)；Mishell  and  Shigii（eds.）  Selected  Methods  in  Cellular  Immunology,  Freeman  Publishing,  San  Francisco,  CA  (1979)；およびGreen  and  Reed,  Science  281:1309  (1998)、およびそれらに引用されている文献も参照）に見出すことができる。
【００７１】
さらなる例示として、本開示の結合タンパク質を発現する宿主細胞の場合、抗原に対する宿主細胞の結合力は、例えば、宿主細胞を、ペプチドに、またはペプチド：ＨＬＡ複合体（例えば、四量体または他の多量体として組織化される）に、または必要に応じてペプチド：ＨＬＡ複合体にてペプチドを宿主細胞に提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）に曝露し、次いで、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ；ＴＮＦα）の産生もしくは分泌；宿主細胞シグナル伝達または活性化成分（例えば、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ））の発現増加；宿主細胞の増殖；またはＡＰＣの殺滅（例えば、標識クロム放出アッセイを使用して）などの宿主細胞の活性を測定することにより決定することができる。
【００７２】
「ＭＨＣ−ペプチド四量体染色」は、ＴＣＲ可変ドメインまたは結合性ドメインを含む結合タンパク質を発現する抗原特異的細胞を検出するために使用されるアッセイを指し、このアッセイは、各々が、同種の（例えば、同一であるかまたは関連する）少なくとも１つのネオ抗原（例えば、ＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶまたはＨｅｒ２−ＩＴＤ）であるアミノ酸配列を有する同一のペプチドを含む（提示する）ＭＨＣ分子の四量体を含み、複合体は、同種ネオ抗原に特異的なＴＣＲと会合することが可能である。ＭＨＣ分子の各々を、ビオチン分子でタグ化することができる。ストレプトアビジンを添加することによりビオチン化ＭＨＣ／ペプチド複合体を多量体化（例えば、四量体化）することができ、一部の実施形態では、それを蛍光標識することができる。四量体は、フローサイトメトリーにより蛍光標識で検出することができる。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ−ペプチド四量体アッセイを使用して、本開示の結合タンパク質またはＴＣＲを検出または選択する。サイトカインのレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色、およびフローサイトメトリー、およびそれらの組合せ（例えば、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー）を含む、本明細書に記載の方法および当技術分野で実施される方法に従って決定することができる。免疫応答の抗原特異的誘発または刺激に起因する免疫細胞増殖およびクローン性拡大増殖は、末梢血細胞またはリンパ節に由来する細胞の試料中の循環リンパ球などのリンパ球を単離し、細胞を抗原で刺激し、トリチウム標識チミジンの取り込み、またはＭＴＴアッセイなどの非放射性アッセイなどにより、サイトカイン産生、細胞増殖、および／または細胞生存率を測定することにより決定することができる。Ｔｈ１免疫応答とＴｈ２免疫応答とのバランスに対する本明細書に記載の免疫原の効果は、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−βなどのＴｈ１サイトカインの、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３などの２型サイトカインのレベルを決定することにより調査することができる。
【００７３】
本開示の結合性ドメインが特異的に結合する標的分子は、目的の細胞（「標的細胞」）上に見出されてもよくまたはそれに付随していてもよい。例示的な標的細胞としては、例えば、がん細胞、自己免疫疾患もしくは障害に関連付けられるかまたは炎症性疾患もしくは障害に関連付けられる細胞、および感染性生物もしくは細胞（例えば、細菌、ウイルス、またはウイルス感染細胞）など、本開示の抗原（ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ；ＨＥＲ２  ＩＴＤ）を発現する、対象中のもしくは対象に由来する試料中の任意の望ましくない細胞、または研究目的の細胞が挙げられる。哺乳動物寄生虫などの感染性生物の細胞も、標的細胞として企図される。
【００７４】
ある特定の実施形態では、本開示の任意の宿主細胞（例えば、本明細書で提供されるような異種結合タンパク質を発現するおよび／またはコードする組換え宿主細胞）は、免疫系細胞であってもよい。本明細書で使用される場合、用語「免疫系細胞」および「免疫細胞」は、２つの主要な系統：骨髄系前駆細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、巨核球、および顆粒球などの骨髄系細胞を生じさせる）およびリンパ系前駆細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ系細胞を生じさせる）を生じさせる、骨髄の造血幹細胞を起源とする免疫系の任意の細胞を指す。例示的な免疫系細胞としては、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、γδＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞が挙げられる。マクロファージおよび樹状細胞は、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」と呼ばれる場合があり、ペプチドと複合体化した、ＡＰＣ表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）受容体が、Ｔ細胞の表面上にあるＴＣＲと相互作用すると、Ｔ細胞を活性化できる特殊な細胞である。
【００７５】
「Ｔ細胞」は、胸腺で成熟しＴＣＲを産生する免疫系細胞である。Ｔ細胞は、ナイーブ（抗原に曝露されていない；ＴＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、およびＣＤ４５ＲＡの発現が増加、ならびにＣＤ４５ＲＯの発現が減少）、メモリーＴ細胞（ＴＭ）（抗原を経験し、長命である）、およびエフェクター細胞（抗原を経験し、細胞傷害性である）であってもよい。ＴＭは、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ、ナイーブＴ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ９５の発現増加、およびＣＤ５４ＲＡの発現減少）およびエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ、ナイーブＴ細胞またはＴＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡの発現減少、およびＣＤ１２７の発現増加）のサブセットにさらに分けることができる。エフェクターＴ細胞（ＴＥ）は、ＴＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現減少を示し、グランザイムおよびパーフォリンに対して陽性である、抗原を経験したＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を指す。他の例示的なＴ細胞としては、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋（Ｆｏｘｐ３＋）調節性Ｔ細胞およびＴｒｅｇ１７細胞などの調節性Ｔ細胞、ならびにＴｒ１、Ｔｈ３、ＣＤ８＋ＣＤ２８−、およびＱａ−１拘束性Ｔ細胞が挙げられる。
【００７６】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ヒト造血前駆細胞である。「造血前駆細胞」は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または胎児組織に由来する細胞であり、成熟細胞型（例えば、Ｔ細胞系統の細胞）へとさらに分化することが可能である。ある特定の実施形態では、ＣＤ２４ｌｏＬｉｎ−ＣＤ１１７＋造血前駆細胞が有用である。本明細書で定義されているように、造血前駆細胞は、Ｔ細胞系統の細胞へとさらに分化することが可能な胚性幹細胞を含んでいてもよい。造血前駆細胞は、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物を含む種々の動物種に由来してもよい。「胸腺前駆細胞」または「胸腺細胞」は、胸腺に存在する造血前駆細胞である。
【００７７】
「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」は、ｉｎ  ｖｉｖｏで自己再生が可能であるか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで本質的に無限の増殖（unlimited  propagation）ことが可能であるかのいずれかであり、Ｔ細胞系統の細胞を含む他の細胞型へと分化することが可能である未分化造血細胞を指す。ＨＳＣは、例えば、これらに限定されないが、胎児肝臓、骨髄、および臍帯血から単離することができる。
【００７８】
「胚性幹細胞」、「ＥＳ細胞」、または「ＥＳＣ」は、発生中の胚の生殖系列に組み込まれ、その一部となる能力を有する未分化胚性幹細胞を指す。胚性幹細胞は、造血前駆細胞および任意の組織または器官へと分化することが可能である。本明細書での使用に好適な胚性幹細胞としては、Ｊ１  ＥＳ細胞株、１２９Ｊ  ＥＳ細胞株、マウス幹細胞株Ｄ３（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関）に由来する細胞、１２９／Ｓｖマウスに由来するＲ１またはＥ１４Ｋ細胞株、Ｂａｌｂ  ／ｃおよびＣ５７Ｂ１／６マウスに由来する細胞株、ならびにヒト胚性幹細胞（例えば、ＷＩＣＥＬＬ（登録商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＷＩ；またはＥＳ  ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）が挙げられる。
【００７９】
「Ｔ細胞系統の細胞」は、細胞を、他のリンパ系細胞および赤血球系統または骨髄系統の細胞から区別する、Ｔ細胞またはその前駆体もしくは前駆細胞の少なくとも１つの表現型特色を示す細胞を指す。そのような表現型特色としては、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋）に特異的な１種または複数種のタンパク質の発現、またはＴ細胞に特異的な生理学的、形態学的、機能的、もしくは免疫学的特徴を挙げることができる。例えば、Ｔ細胞系統の細胞は、Ｔ細胞系統に関係づけられる前駆体もしくは前駆細胞；ＣＤ２５＋未成熟および不活化Ｔ細胞；ＣＤ４もしくはＣＤ８系統拘束を受けている細胞；ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブである胸腺前駆細胞；シングルポジティブＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋；ＴＣＲαβもしくはＴＣＲγδ；または成熟した機能性もしくは活性化Ｔ細胞であってもよい。
【００８０】
用語「単離された」は、その元の環境（例えば、天然で存在する場合は、自然環境）から取り出されている物質を指す。例えば、生体動物に存在する天然に存在する核酸またはポリペプチドは単離されていないが、天然系にて共存する物質の一部またはすべてから分離されている同じ核酸またはポリペプチドは単離されている。そのような核酸は、ベクターの一部であってもよく、および／またはそのような核酸またはポリペプチドは、組成物（例えば、細胞溶解物）の一部であってもよく、そのようなベクターまたは組成物は、核酸またはポリペプチドにとって自然環境の一部ではないという点で依然として単離されていると言える。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを指す。遺伝子は、コード領域「リーダーおよびトレーラー」前後の領域、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００８１】
細胞、微生物、核酸分子、またはベクターを説明するために本明細書で使用される場合、用語「組換えの」または「修飾された」または「操作された」は、外因性核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）もしくはタンパク質の導入により修飾されている細胞、微生物、核酸分子、もしくはベクターを指すか、または内因性核酸分子もしくは遺伝子の発現が、制御されるか、調節解除されるか、もしくは構成的になるように変更されている細胞もしくは微生物を指し、そのような変更または修飾は遺伝子工学により導入することができる。遺伝的変更としては、例えば、１種もしくは複数種のタンパク質もしくは酵素をコードする核酸分子（プロモーターなどの発現制御エレメントを含んでいてもよい）を導入する修飾、または他の核酸分子の付加、欠失、置換、または細胞の遺伝物質の他の機能的破壊もしくはそれに対する他の機能的追加を挙げることができる。例示的な修飾としては、参照分子または親分子の異種または相同性ポリペプチドのコード領域またはそれらの機能的断片における修飾が挙げられる。
【００８２】
本開示全体にわたって、追加の定義が提供される。
ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原に特異的な結合タンパク質
【００８３】
一態様では、本開示は、ＴＣＲ  ＶαドメインおよびＶβドメインを含む結合タンパク質（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー結合タンパク質またはその部分）であって、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原に結合するように構成され、それに結合することが可能であり、および／またはそれに特異的である結合タンパク質を提供する。
【００８４】
ある特定の実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質は、ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱ（配列番号１）：ＨＬＡ複合体、またはペプチド：ＨＬＡ複合体であって、ペプチドは、配列番号１の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる複合体に結合するように構成されているか、それに結合することが可能であるか、またはそれに特異的である。一部の実施形態では、ＨＬＡは、ＤＲＢ１−１１０１またはＤＲＢ１−１１０４を含む。
【００８５】
一部の実施形態では、ＴＣＲ  Ｖαドメインは、配列番号２または配列番号１２に示されているアミノ酸配列と、少なくとも約８５％（つまり、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ  ＶαドメインＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号２または配列番号１２に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ  Ｖβドメインは、配列番号３または配列番号１３に示されているアミノ酸配列と、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ  ＶαドメインＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号３または配列番号１３に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００８６】
本開示の実施形態のいずれかでは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質は、配列番号４８もしくは５４に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるＣＤＲ１αアミノ酸配列、配列番号４９もしくは５５に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるＣＤＲ２αアミノ酸配列、配列番号５１もしくは５７に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるＣＤＲ１βアミノ酸配列、および／または配列番号５２もしくは５８に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるＣＤＲ２βアミノ酸配列を含む。
【００８７】
さらなる実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質は、それぞれ配列番号４８、４９、２、５１、５２、および３に示されているか、またはそれぞれ配列番号５４、５５、１２、５７、５８、および１３に示されているＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、およびＣＤＲ３βアミノ酸配列を含む。
【００８８】
ある特定の実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質は、配列番号９または配列番号１９に示されているアミノ酸配列と、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＴＣＲ  Ｖαドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質は、配列番号６または配列番号１６に示されているアミノ酸配列と、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＴＣＲ  Ｖβドメインを含む。さらなる実施形態では、本明細書で提供されるβＣＤＲアミノ酸配列またはαＣＤＲアミノ酸配列のいずれか１つまたは複数は、それぞれＶβドメインおよび／またはＶαドメインに存在してもよい。
【００８９】
ある特定の実施形態では、相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも３つまたは４つは配列に変化がなくてもよく、配列変化を有するＣＤＲは、最大でわずか２つのアミノ酸置換、最大で連続する５つのアミノ酸欠失、またはそれらの組合せを有していてもよい。
【００９０】
ある特定の実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質は、それぞれ配列番号６および９によるか、またはそれぞれ配列番号１６および１９によるＴＣＲ  ＶαドメインおよびＴＣＲ  Ｖβドメインを含む。
【００９１】
本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、結合タンパク質（例えば、本明細書で考察されているような、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質；ＨＥＲ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質）は、「シグナルペプチド」（リーダー配列、リーダーペプチド、またはトランジットペプチドとしても知られている）を含んでいてもよい。シグナルペプチドは、新たに合成されたポリペプチドを、細胞内部または細胞外部の適切な位置へと向かわせる。シグナルペプチドは、局在化もしくは分泌中に、または局在化もしくは分泌が完了したら、ポリペプチドから除去されてよい。シグナルペプチドを有するポリペプチドは、本明細書では「プレタンパク質」と呼ばれ、シグナルペプチドが除去されたポリペプチドは、本明細書では「成熟」タンパク質またはポリペプチドと呼ばれる。ある特定の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、成熟Ｖβドメイン、成熟Ｖαドメイン、または両方を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、成熟ＴＣＲβ鎖、成熟ＴＣＲα鎖、または成熟ＴＣＲβ鎖、および成熟ＴＣＲα鎖を含む。
【００９２】
細胞により発現される本開示の例示的な結合タンパク質および融合タンパク質は、シグナルペプチド（例えば、結合性プレタンパク質として）を含んでいてもよく、細胞は、シグナルペプチドを除去して、成熟結合タンパク質を生成してもよい。ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、細胞表面上で会合して機能的結合タンパク質を形成することができるα鎖およびβ鎖などの２つの成分を含む。２つの会合した成分は、成熟タンパク質を含んでいてもよい。
【００９３】
シグナルまたはリーダーペプチドは、一部の実施形態では、配列番号５０、５３、５６、または５９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列と、少なくとも約８５％（つまり、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよくまたはそれからなっていてもよい。しかしながら、本開示のＴＣＲ  ＶαドメインおよびＴＣＲ  Ｖβドメインまたはそれらを含む結合タンパク質はいずれも、例示的なシグナルもしくはリーダーペプチド配列を欠如してもよく、または異なるシグナルもしくはリーダーペプチド配列を含んでいてもよいことが理解される。
【００９４】
したがって、本開示では、例えば、それぞれ配列番号５０、５３、５６、または５９に対応する配列番号６、９、１６、または１９内に含有されているアミノ酸配列が存在しなくともよいＴＣＲ  Ｖαドメインおよび／またはＴＣＲ  Ｖβドメインを含むＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質が企図されることが理解される。
【００９５】
ある特定の実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質は、配列番号６８もしくは７２に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％（つまり、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一性を有するか、配列番号６８もしくは７２に示されているアミノ酸配列を含むか、または配列番号６８もしくは７２に示されているアミノ酸配列からなるＴＣＲ  Ｖαドメインを含み、および／あるいは配列番号６６もしくは７０に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一性を有するか、配列番号６６もしくは７０に示されているアミノ酸配列を含むか、または配列番号６６もしくは７０に示されているアミノ酸配列からなるＴＣＲ  Ｖβドメインを含む。
【００９６】
ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、ヒトＴＣＲ  Ｖ、Ｄ、および／またはＪ対立遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を含むＴＣＲ可変ドメインを含む。背景として、リンパ球発生中、Ｖαエクソンは、異なる可変および連結遺伝子セグメント（Ｖ−Ｊ）から組み立てられ、Ｖβエクソンは、異なる可変、多様性、および連結遺伝子セグメント（Ｖ−Ｄ−Ｊ）から組み立てられる。ＴＣＲα染色体遺伝子座は、７０〜８０個の可変遺伝子セグメントおよび６１個の連結遺伝子セグメントを有する。ＴＣＲβ染色体遺伝子座は、６つまたは７つの連結遺伝子セグメントと共に、５２個の可変遺伝子セグメントおよび各々が単一の多様性遺伝子セグメントを含有する２つの別々のクラスターを有する。機能的なＶαおよびＶβ遺伝子エクソンは、Ｖαの場合には可変遺伝子セグメントと連結遺伝子セグメントとを組換えることにより、Ｖβの場合には、可変遺伝子セグメントと多様性遺伝子セグメントおよび連結遺伝子セグメントとを組換えることにより生成される。種々の対立遺伝子のＴＣＲ遺伝子セグメントによるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は当技術分野で公知であり、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓウェブサイト；例えば、imgt.org/IMGTrepertoire/LocusGenes/listIG_TR/TR/human/Hu_TRgroup.htmlに見出すことができる。
【００９７】
結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に開示のようなＴＣＲ遺伝子セグメントによる同じヌクレオチド配列を含んでいてもよいが、参照される遺伝子セグメントのアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列を使用することができることが理解される。
【００９８】
本明細書に開示される実施形態のいずれかでは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質のＴＣＲ  Ｖαドメインは、ＴＲＡＶ８−３またはＴＲＡＶ８−１によるアミノ酸配列（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０個の連続するアミノ酸、またはそれよりも多く）、またはそれらと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質のＴＣＲ  Ｖβドメインは、ＴＲＢＶ３０またはＴＲＢＶ１２−４のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供される対立遺伝子を含むヒトＴ細胞受容体可変領域対立遺伝子（例えば、ＴＲＡＶ、ＴＲＢＶ、ＴＲＡＪ、ＴＲＢＪ、ＴＲＢＤ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は公知であり、例えば、ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）から、以下のアドレスで入手可能である：例えば、imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/list_alleles.php?species=Homo%20sapiens&group=TRAV;imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/list_alleles.php?species=Homo%20sapiens&group=TRBV;imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/list_alleles.php?species=Homo%20sapiens&group=TRAJにて;imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/list_alleles.php?species=Homo%20sapiens&group=TRBJ;およびimgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/list_alleles.php?species=Homo%20sapiens&group=TRBD。
【００９９】
一部の実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質は、ＴＣＲα鎖連結（Ｊα）ドメイン遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列、およびＴＣＲβ鎖連結（Ｊβ）遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む。ＴＣＲ  Ｊαドメインは、ＴＲＡＪ１３またはＴＲＡＪ３８によるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。ＴＣＲ  Ｊβドメインは、ＴＲＢＪ２−４またはＴＲＢＪ２−３によるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０１００】
こうしたヒトＴ細胞受容体可変ドメイン対立遺伝子ポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
本開示の実施形態（つまり、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質；Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質）のいずれかでは、結合タンパク質は、ＴＣＲβ鎖定常ドメイン（Ｃβ）、ＴＣＲα鎖定常ドメイン（Ｃα）、または両方をさらに含んでいてもよい。ヒトＴＣＲ  ＣαおよびＣβの例示的なアミノ酸配列は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫｂ  Ｐ０１８４８（Ｃα）ならびにＵｎｉＰｒｏｔＫｂ  Ｐ０１８５０およびＡ０Ａ５Ｂ９（Ｃβ）に見出すことができる。マウスＴＣＲ定常領域の例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫｂ  Ａ０Ａ０Ａ６ＹＷＶ４、Ａ０Ａ０７５Ｂ５Ｊ４、およびＡ０Ａ０７５Ｂ５Ｊ３に見出すことができる。こうしたアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
本開示の実施形態（つまり、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質；Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質）のいずれかでは、結合タンパク質は、ＣβおよびＣαをさらに含み、ＶβおよびＣβは共にＴＣＲβ鎖を含み、ＶαおよびＣαは共にＴＣＲα鎖を含み、ＴＣＲβ鎖およびＴＣＲα鎖は、会合して二量体を形成することが可能である。
【０１０３】
さらなる実施形態では、ＴＣＲ  Ｃβは、アミノ酸５７位において天然セリンの代わりにシステインアミノ酸を含み（例えば、ＧＶ（Ｓ→Ｃ）ＴＤ）、ＴＣＲ  Ｃαは、アミノ酸４８位において天然トレオニンの代わりにシステインアミノ酸を含む（例えば、ＤＫ（Ｔ→Ｃ）ＶＬ；例えば、Cohen  et  al.,  Cancer  Res.  67(8):  3898-3903  (2007)を参照）。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、ＴＣＲ  Ｃαは、配列番号６７もしくは７１に示されているアミノ酸配列と、少なくとも約８５％（つまり、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一性を有するか、配列番号６７もしくは７１に示されているアミノ酸配列を含むか、または配列番号６７もしくは７１に示されているアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ  Ｃβは、配列番号６９もしくは７３に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一性を有するか、配列番号６９もしくは７３に示されているアミノ酸配列を含むか、または配列番号６９もしくは７３に示されているアミノ酸配列からなる。
【０１０５】
それぞれ配列番号１１または２１に含まれるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一性を有するＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖を含む結合タンパク質であって、それぞれ配列番号５０、５３、５６、または５９によるアミノ酸配列は存在しなくともよい結合タンパク質も企図される。そのような結合タンパク質は、「成熟」ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖を含む。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質（またはＨＥＲ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質）は、ＴＣＲ、キメラ抗原受容体、またはＴＣＲの抗原結合性断片であってもよい。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ、キメラ抗原受容体、またはＴＣＲの抗原結合性断片は、キメラであってもよく、ヒト化されていてもよく、またはヒトであってもよい。さらなる実施形態では、ＴＣＲの抗原結合性断片は、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）を含むかまたはそれからなる。
【０１０７】
本明細書には、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原に結合するように構成されており、それに結合することが可能であり、および／またはそれに特異的である高親和性組換えＴＣＲも提供される。高親和性組換えＴＣＲは、配列番号６、９、１６、または１９のアミノ酸配列と、少なくとも約８５％（つまり、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一であるＶαドメインを含んでいてもよい。一部の実施形態では、高親和性組換えＴＣＲは、配列番号６８もしくは７２に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一性を有するか、配列番号６８もしくは７２に示されているアミノ酸配列を含むか、または配列番号６８もしくは７２に示されているアミノ酸配列からなるＴＣＲ  Ｖαドメインを含み、および／あるいは配列番号６６もしくは７０に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一性を有するか、配列番号６６もしくは７０に示されているアミノ酸配列を含むか、または配列番号６６もしくは７０に示されているアミノ酸配列からなるＴＣＲ  Ｖβドメインを含む。
【０１０８】
一部の実施形態では、ＴＣＲ  Ｖαドメインは、配列番号２または配列番号１２に示されているアミノ酸配列と、少なくとも約８５％（つまり、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ  ＶαドメインＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号２または配列番号１２に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ  Ｖβドメインは、配列番号３または配列番号１３に示されているアミノ酸配列と、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ  ＶαドメインＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号３または配列番号１３に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも３つまたは４つは配列に変化がなくてもよく、配列変化を有するＣＤＲは、最大でわずか２つのアミノ酸置換、最大で連続する５つのアミノ酸欠失、またはそれらの組合せを有していてもよい。
【０１１０】
本開示の実施形態のいずれかでは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的高親和性組換えＴＣＲは、配列番号４８もしくは５４によるＣＤＲ１αアミノ酸配列、配列番号４９もしくは５５によるＣＤＲ２αアミノ酸配列、配列番号５１もしくは５７によるＣＤＲ１βアミノ酸配列、および／または配列番号５２もしくは５８によるＣＤＲ２βアミノ酸配列を含む。
【０１１１】
さらなる実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的高親和性組換えＴＣＲは、それぞれ配列番号４８、４９、２、５１、５２、および３に示されているか、またはそれぞれ配列番号５４、５５、１２、５７、５８、および１３に示されているＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、およびＣＤＲ３βアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
本開示の実施形態のいずれかでは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲは、ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱ（配列番号１）：ＤＲＢ１−１１０１もしくは（配列番号１）：ＤＲＢ１−１１０４複合体、またはペプチド：ＤＲＢ１−１１０１もしくはＤＲＢ１−１１０４複合体に結合することが可能であり、ペプチドは、配列番号１の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる。
【０１１３】
本開示の実施形態のいずれかでは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲは、ＣＤ８および／もしくはＣＤ４とは独立に、またはＣＤ８および／もしくはＣＤ４の非存在下、細胞表面上で、ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱ（配列番号１）：ＤＲＢ１−１１０１もしくは（配列番号１）：ＤＲＢ１−１１０４複合体、またはペプチド：ＤＲＢ１−１１０１もしくはＤＲＢ１−１１０４複合体に結合することができ、ペプチドは、配列番号１の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる。
【０１１４】
Ｈｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原に特異的な結合タンパク質
本開示の別の態様は、ＴＣＲ  ＶαドメインおよびＶβドメインを含む結合タンパク質であって、Ｈｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原に結合するように構成されており、それに結合することが可能であり、および／またはそれに特異的である結合タンパク質に関する。
【０１１５】
一部の実施形態では、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質のＴＣＲ  Ｖαドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列と、少なくとも約８５％（つまり、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ  Ｖβドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列と、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ  Ｖαドメインは、配列番号２３に記載されているＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、ＴＣＲ  Ｖβドメインは、配列番号２４に示されているＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質は、配列番号６０によるＴＣＲ  Ｖα  ＣＤＲ１、配列番号６１によるＴＣＲ  Ｖα  ＣＤＲ２、配列番号６３によるＴＣＲ  Ｖβ  ＣＤＲ１、および／または配列番号６４によるＴＣＲ  Ｖβ  ＣＤＲ２を含む。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質は、それぞれ、配列番号６０、６１、２３、６３、６４、および２４によるＴＣＲ  Ｖα  ＣＤＲ１〜３およびＴＣＲ  Ｖβ  ＣＤＲ１〜３を含む。
【０１１８】
本開示の実施形態のいずれかでは、Ｈｅｒ−ＩＴＤ特異的結合タンパク質は、ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ（配列番号２２）：ＨＬＡ複合体またはペプチド：ＨＬＡ複合体に結合するように構成されていてもよく、それらに結合することが可能であり、および／またはそれらに特異的であり、ペプチドは、配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ＨＬＡは、ＤＱＢ１−０５：０１またはＤＱＢ１−０５：０２を含む。本開示の実施形態のいずれかでは、Ｈｅｒ−ＩＴＤ特異的結合タンパク質は、ＣＤ８および／もしくはＣＤ４とは独立に、またはＣＤ８および／もしくはＣＤ４の非存在下、細胞表面上で、ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ（配列番号２２）：ＨＬＡ複合体に、またはペプチド：ＨＬＡ複合体に結合することができ、ペプチドは、配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる。
【０１１９】
本開示の実施形態のいずれかでは、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質は、配列番号２７のアミノ酸配列と、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるＴＣＲ  Ｖαドメインを含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号３０のアミノ酸配列と、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるＶβドメインを含む。ある特定の実施形態では、結合タンパク質のＣＤＲの少なくとも３つまたは４つは配列に変化がなくてもよく、配列変化を有するＣＤＲは、最大でわずか２つのアミノ酸置換、最大で連続する５つのアミノ酸欠失、またはそれらの組合せを有していてもよい。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質は、配列番号７４に示されているアミノ酸配列と少なくとも８５％同一性を有するアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなるＴＣＲ  Ｖαドメイン、および／または配列番号７６に示されているアミノ酸配列と少なくとも８５％同一性を有するアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなるＴＣＲ  Ｖβドメインを含む。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、結合タンパク質のＣＤＲの少なくとも３つまたは４つは配列の変化を含まず、配列変化を有するＣＤＲは、最大でわずか２つのアミノ酸置換、最大で連続する５つのアミノ酸欠失、またはそれらの組合せを有していてもよい。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質のＴＣＲ  Ｖαドメインは、ＴＲＡＶ８−６によるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質のＴＣＲ  Ｖβドメインは、ＴＲＢＶ２０によるアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、ＴＣＲ  Ｊαドメイン遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列、およびＴＣＲ  Ｊβドメイン遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはさらに含む。Ｊαドメインは、ＴＲＡＪ３４によるアミノ酸配列を含んでいてもよい。Ｊβドメインは、ＴＲＢＪ２−５によるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％同一である配列を含んでいてもよい。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号７５に示されているアミノ酸配列と少なくとも８５％同一性を有するＣαアミノ酸配列、および／または配列番号７７に示されているアミノ酸配列と少なくとも８５％同一性を有するＣβアミノ酸配列をさらに含む。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、ＣβおよびＣαを含み、ＶβおよびＣβはＴＣＲβ鎖を含み、ＶαおよびＣαはＴＣＲα鎖を含み、ＴＣＲβ鎖およびＴＣＲα鎖は、会合して二量体を形成することが可能である。
【０１２６】
本開示の実施形態のいずれかでは、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質は、ＴＣＲ、キメラ抗原受容体、もしくはＴＣＲの抗原結合性断片であってもよくまたは含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ、キメラ抗原受容体、またはＴＣＲの抗原結合性断片は、キメラであるか、ヒト化されているか、またはヒトである。一部の実施形態では、ＴＣＲの抗原結合性断片は、ｓｃＴＣＲを含む。
【０１２７】
本開示の別の態様は、Ｈｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原に結合するように構成されているか、それに結合することが可能であるか、またはそれに特異的である高親和性組換えＴＣＲに関する。ある特定の実施形態では、高親和性組換えＴＣＲは、配列番号７４のアミノ酸配列と、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶαドメインを含むα鎖を含む。さらに、本開示の実施形態のいずれかでは、ＴＣＲは、ＣＤ８および／もしくはＣＤ４とは独立に、またはＣＤ８および／もしくはＣＤ４の非存在下、細胞表面上で、ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ（配列番号２２）：ＤＱＢ１−０５：０１もしくは（配列番号２２）：ＤＱＢ１−０５：０２複合体に、またはペプチド：ＤＱＢ１−０５：０１もしくはペプチド：ＤＱＢ１−０５：０２複合体に結合することが可能であり、ペプチドは、配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、高親和性組換えＴＣＲは、配列番号７６のアミノ酸配列と、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶβドメインを含むβ鎖を含む。本開示の実施形態のいずれかでは、ＴＣＲは、ＣＤ８および／もしくはＣＤ４とは独立に、またはＣＤ８および／もしくはＣＤ４の非存在下、細胞表面上で、ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ（配列番号２２）：ＤＱＢ１−０５：０１もしくはＤＱＢ１−０５：０２複合体に、またはペプチド：ＤＱＢ１−０５：０１もしくはペプチド：ＤＱＢ１−０５：０２複合体に結合することが可能であり、ペプチドは、配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的高親和性組換えＴＣＲは、本明細書に示されている例示的なＨｅｒ２−ＩＴＤ  ＣＤＲ配列によるＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、および／もしくはＣＤＲ３β、またはそれらに対して少なくとも８５％同一性を有するＣＤＲを含む。ある特定の実施形態では、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＴＣＲは、配列番号６０によるＴＣＲ  Ｖα  ＣＤＲ１、配列番号６１によるＴＣＲ  Ｖα  ＣＤＲ２、配列番号６３によるＴＣＲ  Ｖβ  ＣＤＲ１、および／または配列番号６４によるＴＣＲ  Ｖβ  ＣＤＲ２を含む。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＴＣＲは、それぞれ、配列番号６０、６１、２３、６３、６４、および２４によるＴＣＲ  Ｖα  ＣＤＲ１〜３およびＴＣＲ  Ｖβ  ＣＤＲ１〜３を含む。
【０１３１】
本開示の実施形態のいずれかでは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的またはＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲは、可溶性形態で提供することができ（例えば、Walseng  et  al.,  PLoS  One  doi:10.1371/journal.pone.0119559  (2015)を参照）、必要に応じて、細胞傷害性薬剤および／または検出可能な薬剤にコンジュゲートされていてもよい。組換え的に産生された可溶性ＴＣＲを単離および精製するために有用な方法は、例として、組換え可溶性ＴＣＲを培養培地へと分泌する好適な宿主細胞／ベクター系から上清を得ること、および次いで市販のフィルターを使用して培地を濃縮することを含んでいてもよい。濃縮した後、濃縮物を、単一の好適な精製マトリックスに、または親和性マトリックスもしくはイオン交換レジンなどの一連の好適なマトリックスにアプライしてもよい。１つまたは複数の逆相ＨＰＬＣステップを使用して、組換えポリペプチドをさらに精製してもよい。こうした精製方法は、免疫原をその天然環境から単離する際にも使用することができる。本明細書に記載の単離／組換え可溶性ＴＣＲの１種または複数種を大規模産生するための方法は、適切な培養条件を維持するためにモニターおよび制御されるバッチ細胞培養を含む。可溶性ＴＣＲの精製は、本明細書に記載されており、当技術分野で公知であり、国内外の規制当局の法律およびガイドラインに適合する方法に従って実施することができる。
【０１３２】
本開示の別の態様は、上記に記載のような結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲを含む組成物に関する。組成物は、本明細書にさらに記載のように、薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤をさらに含んでいてもよい。
免疫原性組成物
【０１３３】
本明細書には、免疫原性組成物（例えば、ワクチンに使用するため）も提供される。ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ＭＴＥＹＫＬＶＶＶ  ＧＡＶＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱ（配列番号１）またはＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳ  ＰＹＶＳＲＬＬＧ（配列番号２２）またはそれらの免疫原性断片と、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、免疫原性組成物は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発できるかまたは誘発することが可能である単離されたペプチドを含む。単離されたペプチドは、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、または７アミノ酸以下のポリペプチドを含んでいてもよくまたはそれに含有されていてもよい。さらに、ポリペプチドは、配列番号１に示されているＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖアミノ酸配列の少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続するアミノ酸の配列を含んでいてもよい。
【０１３５】
一部の実施形態では、免疫原性組成物は、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発できるかまたは誘発することが可能である単離されたポリペプチドを含む。単離されたペプチドは、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、または７アミノ酸以下のポリペプチドを含むかまたはそれに含有されている。さらに、ポリペプチドは、配列番号２２に示されているＨｅｒ２−ＩＴＤアミノ酸配列の少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２個の連続するアミノ酸の配列を含んでいてもよい。
【０１３６】
一部の実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書でさらに考察されている薬学的に許容される担体をさらに含む。薬学的に許容される担体は、天然に存在しない薬学的に許容される担体であってもよい。ある特定の実施形態では、天然に存在しない薬学的に許容される担体としては、クリーム、エマルジョン、ゲル、リポソーム、ナノ粒子、または軟膏を挙げることができる。一部の他の実施形態では、ワクチンは、ポリＩＣＬＣ、ＣｐＧ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはミョウバンなど、免疫有効量のアジュバントを含んでいてもよい。
【０１３７】
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本明細書に開示のような結合タンパク質、高親和性組換えＴＣＲ、免疫原性組成物、またはそれらの機能的断片もしくは部分をコードするポリヌクレオチドも提供される。当業者であれば、遺伝子コードの縮重のため、本明細書に記載のような結合タンパク質、ＴＣＲ、または免疫原性組成物をコードする多数のヌクレオチド配列が存在することを理解する。一部のそのようなポリヌクレオチドは、天然の、元の、または同定されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列と、限定的なまたは最小限の配列同一性しか有しない場合がある。にもかかわらず、コドン使用頻度の違いにより異なるポリヌクレオチドは、本開示により明示的に企図される。ある特定の実施形態では、哺乳動物宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている配列が具体的に企図される。コドン最適化は、公知の技法およびツールを使用して、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＯｐｔｉｍｉｕｍＧｅｎｅ（商標）ツールを使用して実施することができる。コドン最適化された配列としては、部分的にコドン最適化された（つまり、少なくとも１つのコドンが宿主細胞での発現のために最適化された）配列および完全にコドン最適化された配列が挙げられる。ある特定の免疫宿主細胞で発現させるためのコドン最適化は、例えば、Scholten  et  al.,  Clin.  Immunol.  119:  135,  2006に開示されている。
【０１３８】
一部の実施形態では、単一のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のような結合タンパク質をコードするか、またはその代わりに結合タンパク質は、１つよりも多くのポリヌクレオチドによりコードされてもよい。言い換えれば、結合タンパク質の成分または部分は、単一の核酸分子に含有されていてもよくまたは２つもしくはそれよりも多くの核酸分子に含有されていてもよい２つまたはそれよりも多くのポリヌクレオチドによりコードされてもよい。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、本開示の結合タンパク質またはＴＣＲの２つまたはそれよりも多くの成分または部分をコードするポリヌクレオチドは、単一のオープンリーディングフレームに機能的に関連している２つまたはそれよりも多くのコード配列を含む。そのような配置は、有利には、例えば、それらが約１：１比で産生されるようにＴＣＲのアルファ鎖およびベータ鎖を同時発現させるなど、所望の遺伝子産物の協調的発現を可能にすることができる。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ（例えば、アルファ鎖およびベータ鎖）など、本開示の結合タンパク質の２つまたはそれよりも多くの置換遺伝子産物は、別々の分子として発現され、翻訳後に会合する。さらなる実施形態では、本開示の結合タンパク質の２つまたはそれよりも多くの置換遺伝子産物は、切断可能なまたは除去可能なセグメントにより隔てられている部分を有する単一のペプチドとして発現される。例えば、単一のポリヌクレオチドまたはベクターによりコードされた分離可能なポリペプチドの発現に有用な自己切断性ペプチドは、当技術分野で公知であり、例えば、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチド、トセアアシグナ（Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）ペプチド、および口蹄疫ウイルス２Ａ（Ｆ２Ａ）ペプチドが挙げられる。例示的な自己切断性ペプチド（「リボソームスキップエレメント」とも呼ばれる）としては、配列番号３５〜３８のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるものが挙げられる。
【０１４０】
したがって、ある特定の実施形態では、ＴＣＲα鎖をコードする異種ポリヌクレオチドおよびＴＣＲβ鎖をコードする異種ポリヌクレオチドは、単一のオープンリーディングフレームに含有されており、単一のオープンリーディングフレームは、α鎖をコードするポリヌクレオチドとβ鎖をコードするポリヌクレオチドとの間に配置された自己切断性ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いずれの方向性（例えば、β鎖をコードするポリヌクレオチド−自己切断性ペプチド−α鎖をコードするポリヌクレオチド；α鎖をコードするポリヌクレオチド−自己切断性ペプチド−β鎖をコードするポリヌクレオチド）も企図されることが理解される。そのようなコードされる結合タンパク質の例示的なアミノ酸配列は、配列番号１１、２０、および３２に提供されている。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号４、５、７、８、１０、１４、１５、１７、１８、２０、２５、２６、２８、２９、または３１のいずれか１つに示されているヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一性を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。
【０１４２】
本明細書に記載のようなＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶまたはＨｅｒ２−ＩＴＤに特異的な結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲをコードする単離または組換え核酸分子は、分子生物学またはポリペプチド精製技術の種々の方法および技法に従って産生および調製することができる。
【０１４３】
さらなる実施形態では、結合タンパク質またはＴＣＲは、セーフティスイッチタンパク質などの１つもしくは複数の追加のアクセサリータンパク質；タグ、選択マーカー；ＣＤ８共受容体β鎖；ＣＤ８共受容体α鎖もしくは両方；またはそれらの任意の組合せをコードする導入遺伝子構築物の一部として発現され、および／あるいは宿主免疫細胞は、セーフティスイッチタンパク質などの１つもしくは複数の追加のアクセサリータンパク質；タグ、選択マーカー；ＣＤ８共受容体β鎖；ＣＤ８共受容体α鎖もしくは両方；またはそれらの任意の組合せをさらにコードすることができる。結合タンパク質およびアクセサリー成分（例えば、セーフティスイッチタンパク質、選択マーカー、ＣＤ８共受容体β鎖、またはＣＤ８共受容体α鎖の１つまたは複数）をコードおよび発現するのに有用なポリヌクレオチドおよび導入遺伝子構築物は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５３１１２号パンフレットに記載されており、この文献のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、導入遺伝子構築物、およびアクセサリー成分は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示の結合タンパク質、セーフティスイッチタンパク質、タグ、選択マーカー、ＣＤ８共受容体β鎖、またはＣＤ８共受容体α鎖のいずれかまたはすべては、単一の核酸分子にコードされていてもよく、または別々の核酸分子であるかまたは別々の核酸分子に存在するポリヌクレオチド配列によりコードされていてもよいことが理解される。
【０１４４】
例示的なセーフティスイッチタンパク質としては、以下のものが挙げられる：例えば、細胞外Ｎ末端リガンド結合性ドメインおよび細胞内受容体チロシンキナーゼ活性を欠くが、その天然アミノ酸配列を維持し、Ｉ型膜貫通細胞表面局在化を示し、医薬品等級の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）ｔＥＧＦ受容体（ｔＥＧＦｒ；Wang  et  al.,  Blood  118:  1255-1263,  2011）に対する立体構造的にインタクトな結合性エピトープを有する短縮型ＥＧＦ受容体ポリペプチド（ｈｕＥＧＦＲｔ）；カスパーゼポリペプチド（例えば、ｉＣａｓｐ９；Straathof  et  al.,  Blood  105:  4247-4254,  2005；Di  Stasi  et  al.,  N.  Engl.  J.  Med.  365:  1673-1683,  2011；Zhou  and  Brenner,  Exp.  Hematol.  pii:  S0301-472X  (16)  30513-6.  doi:10.1016/j.exphem.2016.07.011）、ＲＱＲ８（Philip  et  al.,  Blood  124:  1277-1287,  2014）；ヒトｃ−ｍｙｃタンパク質（Ｍｙｃ）に由来する１０個アミノ酸のタグ（Kieback  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  105:  623-628,  2008）；ならびにＲＱＲ（ＣＤ２０＋ＣＤ３４；Philip  et  al.,  2014）などのマーカー／セーフティスイッチポリペプチド。
【０１４５】
本開示の修飾免疫細胞に有用な他のアクセサリー成分は、細胞の同定、選別、単離、富化、または追跡を可能にするタグまたは選択マーカーを含む。例えば、所望の特色を有するマークされた免疫細胞（例えば、抗原特異的ＴＣＲおよびセーフティスイッチタンパク質）を試料中の非標識化細胞から選別して、所望の純度の産物に包含させるためにより効率的に活性化および拡大増殖することができる。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、用語「選択マーカー」は、選択マーカーを含むポリヌクレオチドを形質導入した免疫細胞の検出および正の選択を可能にする同定可能な変化を細胞に付与する核酸構築物（およびコードされる遺伝子産物）を含む。ＲＱＲは、ＣＤ２０の主要な細胞外ループおよび２つの最小ＣＤ３４結合部位を含む選択マーカーである。一部の実施形態では、ＲＱＲをコードするポリヌクレオチドは、１６個アミノ酸のＣＤ３４最小エピトープをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３４最小エピトープは、ＣＤ８共受容体ストークドメイン（Ｑ８）のアミノ末端位置に組み入れられる。さらなる実施形態では、ＣＤ３４最小結合部位配列は、ＣＤ２０に対する標的エピトープと一緒になって、Ｔ細胞（ＲＱＲ８）に対するコンパクトなマーカー／自殺遺伝子を形成することができる（Philip  et  al.,  2014、この文献は参照により本明細書に組み込まれる）。この構築物は、臨床的に承認されている医薬品抗体リツキシマブを使用し、導入遺伝子を発現するように操作されたＴ細胞の選択的欠失を可能にする、例えば磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に結合されているＣＤ３４特異的抗体を用いた、この構築物を発現する免疫細胞の選択を可能にする（Philip  et  al.,  2014）。
【０１４７】
また、さらなる例示的な選択マーカーとしては、以下のものが挙げられる：通常はＴ細胞上では発現されない幾つかの短縮型Ｉ型膜貫通タンパク質：短縮型低親和性神経成長因子、短縮型ＣＤ１９、および短縮型ＣＤ３４（例えば、Di  Stasi  et  al.,  N.  Engl.  J.  Med.  365:  1673-1683,  2011；Mavilio  et  al.,  Blood  83:  1988-1997,  1994；Fehse  et  al.,  Mol.  Ther.  1:  448-456,  2000を参照；これらの文献の各々は全体が本明細書に組み込まれる）。ＣＤ１９およびＣＤ３４の有用な特徴は、臨床等級選別（clinical-grade  sorting）のためのこうしたマーカーを標的とすることができる既製のＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭＡＣｓ（商標）選択系が利用できることである。しかしながら、ＣＤ１９およびＣＤ３４は、組込みベクターのベクターパッケージング能力および転写効率に負担をかけ得る比較的大きな表面タンパク質である。細胞外非シグナル伝達ドメインまたは種々のタンパク質（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＬＮＧＦＲ）を含有する表面マーカーも使用することができる。任意の選択マーカーを使用することができ、それは医薬品等の製造管理及び品質管理に関する基準に適合しなければならない。ある特定の実施形態では、選択マーカーは、目的の遺伝子産物（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲなど、本開示の結合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドと共に発現される。選択マーカーのさらなる例としては、例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β−ｇａｌ、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのレポーターが挙げられる。ある特定の実施形態では、例えばＣＤ３４などの選択マーカーを細胞で発現させ、ＣＤ３４を使用して、本明細書に記載の方法で使用するための目的の形質導入細胞を選択的に富化または単離することができる（例えば、免疫磁気選択により）。本明細書で使用される場合、ＣＤ３４マーカーは、抗ＣＤ３４抗体、または例えば、ＣＤ３４に結合するｓｃＦｖ、ＴＣＲ、または他の抗原認識部分とは区別される。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、選択マーカーは、ＲＱＲポリペプチド、短縮型低親和性神経成長因子（ｔＮＧＦＲ）、短縮型ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）、短縮型ＣＤ３４（ｔＣＤ３４）、またはそれらの任意の組合せを含む。
【０１４９】
本開示によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供される。本明細書で開示のような例示的な発現ベクターを含む、任意の好適な発現ベクターを使用することができる。さらに、発現ベクターは、ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達するように構成されていてもよく、または送達することが可能であってもよい。
【０１５０】
典型的なベクターは、それに連結されているか、または宿主生物にて複製が可能である別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を含んでいてもよい。本明細書で考察されているように、ベクターの一部の例としては、プラスミド、ウイルスベクター、およびコスミドなどが挙げられる。一部のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製が可能であってもよいが（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）、他のベクターは、宿主細胞へと導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。加えて、一部のベクターは、それらが機能的に連結している遺伝子の発現を指図することが可能である（こうしたベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる場合がある）。関連実施形態によると、１種または複数種の作用物質（agent）（例えば、本明細書に記載のような、ＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶまたはＨｅｒ２−ＩＴＤに特異的な免疫グロブリンスーパーファミリー結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲまたはそれらのバリアントをコードするポリヌクレオチド）を対象に共投与する場合、その各作用物質は、別々のまたは同じベクターに存在してもよく、複数のベクター（各々が異なる作用物質または同じ作用物質を含有する）が、細胞もしくは細胞集団に導入されてもよく、または対象に投与されていてもよいことがさらに理解される。
【０１５１】
ウイルスベクターとしては、以下のものが挙げられる：レトロウイルス；アデノウイルス；パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）；コロナウイルス；オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）などのマイナス鎖ＲＮＡウイルス；ピコルナウイルスおよびアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス；ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタインバーウイルス、およびサイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルス。他のウイルスとしては、これらに限定されないが、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病−肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、およびスプマウイルスが挙げられる（Coffin,  J.  M.,  Retroviridae:  The  viruses  and  their  replication,  In  Fundamental  Virology,  Third  Edition,  B.  N.  Fields,  et  al.,  Eds.,  Lippincott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  1996）。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、ベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターまたはγ−レトロウイルスベクターから選択されるベクター）を含む。ウイルスベクターとしては、以下のものが挙げられる：レトロウイルス；アデノウイルス；パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）；コロナウイルス；オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）などのマイナス鎖ＲＮＡウイルス；ピコルナウイルスおよびアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス；ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルス。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病−肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、およびスプマウイルスが挙げられる（Coffin,  J.  M.,  Retroviridae:  The  viruses  and  their  replication,  In  Fundamental  Virology,  Third  Edition,  B.  N.  Fields,  et  al.,  Eds.,  Lippincott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  1996）。
【０１５３】
「レトロウイルス」は、逆転写酵素を使用してＤＮＡへと逆転写されるＲＮＡゲノムを有するウイルスであり、次いで、逆転写されたＤＮＡは宿主細胞ゲノムへと組み込まれる。「ガンマレトロウイルス」は、レトロウイルス科の属を指す。ガンマレトロウイルスの例としては、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、およびトリ細網内皮症ウイルスが挙げられる。「レンチウイルスベクター」は、本明細書で使用される場合、遺伝子送達用のＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターを意味し、組込み型であってもよくまたは非組込み型であってもよく、比較的大きなパッケージング容量を有してもよく、一連の異なる細胞型に形質導入することができる。レンチウイルスベクターは、通常は、３つ（パッケージング、エンベロープ、およびトランスファー）またはそれよりも多くのプラスミドを産生細胞へと一過性にトランスフェクトした後で生成される。ＨＩＶと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と細胞表面にある受容体との相互作用を介して標的細胞に進入する。進入すると、ウイルスＲＮＡは逆転写を受け、逆転写はウイルス逆転写酵素複合体により媒介される。逆転写の産物は、二本鎖線状ウイルスＤＮＡであり、これは、感染細胞のＤＮＡへのウイルス組込みの基質である。「レンチウイルス」は、分裂細胞および非分裂細胞に感染することが可能なレトロウイルスの属を指す。レンチウイルスの幾つかの例としては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：１型ＨＩＶおよび２型ＨＩＶを含む）；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびマエディ・ビスナウイルス（ヒツジレンチウイルス）が挙げられる。
【０１５４】
キメラ抗原受容体導入遺伝子を含有するウイルス粒子を哺乳動物宿主細胞に形質導入するためにレトロウイルスおよびレンチウイルスウイルスベクターおよびパッケージング細胞を使用するための方法は、当技術分野で公知であり、以下の文献において以前に記載されている：例えば、米国特許第８，１１９，７７２号明細書；Walchli,  et  al.,  PLoS  One  6:327930,  2011；Zhao,  et  al.,  J.  Immunol.  174:4415,  2005；Engels,  et  al.,  Hum.  Gene  Ther.  14:  1155,  2003；Frecha,  et  al.,  Mol.  Ther.  75:  1748,  2010；およびVerhoeyen,  et  al.,  Methods  Mol.  Biol.  506:91,  2009。レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物および発現系も市販されている。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ガンマレトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクターであってもよい。他の実施形態では、ウイルスベクターは、より複雑なレトロウイルス由来ベクター、例えば、レンチウイルス由来ベクターであってもよい。ＨＩＶ−１由来ベクターは、この範疇に属する。他の例としては、ＨＩＶ−２、ＦＩＶ、ウマ伝染性貧血ウイルス、ＳＩＶ、およびマエディ・ビスナウイルス（ヒツジレンチウイルス）に由来するレンチウイルスベクターが挙げられる。ＴＣＲまたはＣＡＲ導入遺伝子を含有するウイルス粒子を哺乳動物宿主細胞に形質導入するためにレトロウイルスおよびレンチウイルスウイルスベクターおよびパッケージング細胞を使用するための方法は、当技術分野で公知であり、以下の文献において以前に記載されている：例えば、米国特許第８，１１９，７７２号明細書；Walchli  et  al.,  PLoS  One  6:  327930,  2011；Zhao  et  al.,  J.  Immunol.  174:  4415,  2005；Engels  et  al.,  Hum.  Gene  Ther.  14:1155,  2003；Frecha  et  al.,  Mol.  Ther.  18:1748,  2010；およびVerhoeyen  et  al.,  Methods  Mol.  Biol.  506:  97,  2009。レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物および発現系も市販されている。例えば、アデノウイルスに基づくベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターを含むＤＮＡウイルスベクター；アンプリコンベクター、複製欠損ＨＳＶ、および弱毒化ＨＳＶを含む単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に由来するベクターを含む他のウイルスベクターも、ポリヌクレオチド送達に使用することができる（Krisky  et  al.,  Gene  Ther.  5:  1517,  1998）。
【０１５６】
遺伝子治療に使用するために開発された他のベクターも、本開示の組成物および方法と共に使用することができる。そのようなベクターとしては、バキュロウイルスおよびαウイルスに由来するもの（Jolly,  D  J.  1999.  Emerging  Viral  Vectors.  pp  209-40  in  Friedmann  T.  ed.  The  Development  of  Human  Gene  Therapy.  New  York:  Cold  Spring  Harbor  Lab）、またはプラスミドベクター（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙまたは他のトランスポゾンベクターなど）が挙げられる。
【０１５７】
ウイルスベクターゲノムが、宿主細胞において別々の転写物として発現される複数のポリヌクレオチドを含む場合、ウイルスベクターはまた、バイシストロン性またはマルチシストロン性発現を可能にする２つ（またはそれよりも多く）の転写物間に追加の配列を含んでいてもよい。ウイルスベクターで使用されるそのような配列の例としては、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、フューリン切断部位、ウイルス２Ａペプチド、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶまたはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原に特異的な結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲをコードする核酸は、ベクターの１つまたは複数のある特定のエレメントに機能的に連結していてもよい。例えば、それらがライゲートされているコード配列の発現およびプロセシングをもたらすために必要なポリヌクレオチド配列が、機能的に連結していてもよい。発現制御配列としては、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（つまり、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；およびおそらくはタンパク質分泌を増強する配列を挙げることができる。発現制御配列は、それらが目的の遺伝子、およびトランスでまたは遠隔で作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列と隣接している場合、機能的に連結していてもよい。一部の実施形態では、ウイルスまたはプラスミドベクターは、形質導入マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質、ｔＥＧＦＲ、ｔＣＤ１９、ｔＮＧＦＲなど）をさらに含む。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチド構築物を宿主細胞（例えば、造血前駆細胞またはヒト免疫系細胞）に送達することが可能である。具体的な実施形態では、ベクターは、構築物を、例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せなどのヒト免疫系細胞に送達することが可能である。さらなる実施形態では、ベクターは、構築物を、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せに送達することが可能である。一部の実施形態では、本開示の構築物をコードするベクターは、宿主細胞にて染色体ノックアウトを実施するために使用することができる（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたは本明細書に開示のような別のエンドヌクレアーゼ）、または遺伝子治療の代替もしくは遺伝子修復療法において治療用導入遺伝子もしくはその部分を宿主細胞に送達するために使用することができるヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。あるいは、染色体ノックアウトまたは遺伝子置換または遺伝子修復療法に使用されるヌクレアーゼは、本開示の構築物をコードするベクターとは独立して宿主細胞に送達してもよい。
【０１６０】
ＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶまたはＨｅｒ２−ＩＴＤペプチド抗原に特異的な結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲを組換え的に産生するために使用される発現ベクターの構築は、例えば、Sambrook,  et  al.  (1989  and  2001  editions;  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  NY)およびAusubel,  et  al.  (Current  Protocols  in  Molecular  Biology  (2003))に記載のような、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡ配列決定の使用を含む、当技術分野で公知の任意の好適な分子生物学操作技法を使用することにより達成することができる。効率的な転写および翻訳を得るために、各組換え発現構築物中のポリヌクレオチドは、目的のタンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に（つまり、機能的に）連結したリーダー配列、特にプロモーターなど、少なくとも１つの適切な発現制御配列（調節配列とも呼ばれる）を含む。
【０１６１】
本明細書に開示のような結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲをコードする（例えば、異種ポリヌクレオチドコードを含む）および／または発現する宿主細胞も提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、造血前駆細胞、またはヒト免疫系細胞など、本明細書に開示のような免疫系細胞であってもよい。本開示の実施形態のいずれかでは、免疫系細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せである。加えて、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せであってもよい。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示のようなベクターを使用して、異種ポリヌクレオチドを含むかまたは含有するように修飾されている。
【０１６２】
組換え宿主細胞は、同種異系、同系、または自己性であってもよい（例えば、治療のために宿主細胞を受ける対象に対して）。宿主細胞が内因性ＴＣＲをコードするある特定の実施形態では、Ｔ細胞により発現される異種結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲは、内因性ＴＣＲと比較して、ＣＤ３タンパク質とより効率的に会合することが可能である。一部の実施形態では、宿主Ｔ細胞により発現される結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲは、ＣＤ３複合体と会合することができ、機能的表面発現および免疫活性、例えば、サイトカインの産生および／または抗原発現標的細胞の殺滅を示す。ある特定の実施形態では、結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲは、内因性ＴＣＲと比較して、より高い細胞表面発現を有してもよい。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、ＫＲＡＳ  Ｖ１２Ｇペプチド抗原に特異的な結合タンパク質または高親和性ＴＣＲを発現するおよび／またはコードする本開示による組換え宿主免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫ−Ｔ細胞など）は、ペプチド抗原またはそれをコードするポリヌクレオチドの存在下でＩＦＮ−γなどのサイトカインを産生することが可能であるが、対照または参照分子（例えば、野生型ペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチド）の存在下では産生はより少ないかまたはまったく産生されない。ある特定の実施形態では、ペプチド抗原が１０、１、０．１、または約０．０１μｇ／ｍＬで存在する場合（例えば、ペプチド抗原を提示することが可能な標的細胞にペプチドが導入される場合、および標的細胞の存在下で組換え宿主免疫細胞が存在する場合）、組換え宿主免疫細胞は、ＩＦＮ−γを産生することが可能である。さらなる実施形態では、組換え宿主免疫細胞は、（ａ）標的細胞（例えば、１：２の組換え宿主免疫細胞：標的細胞比）および（ｂ）０．０１μｇ／ｍＬ（またはそれ未満）〜約１００μｇ／ｍＬの抗原が存在する場合、少なくとも約１００、２００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを産生することが可能である。サイトカイン産生は、例えば、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのヒトＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキットなどのサイトカインＥＬＩＳＡキット、またはＭａｂｔｅｃｈのＥＬＩＳｐｏｔ−Ｐｒｏキットを使用して測定することができる。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、組換え宿主免疫細胞は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドおよび抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、または両方の存在下でＩＦＮγを産生することが可能である。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、組換え宿主免疫細胞は、（ａ）ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド抗原および／またはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ）および（ｂ）（ｉ）ＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０１またはＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１０４を発現し（ｉｉ）ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ抗原を宿主免疫細胞に提示することが可能な細胞株の存在下で、ＩＦＮγを産生することが可能である。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、組換え宿主免疫細胞は、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチド抗原またはそれをコードするポリヌクレオチドが存在する場合は、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲをコード（つまり、異種ポリヌクレオチドコードを含む）および／または発現し、サイトカイン、例えばＩＦＮ−γを産生することが可能であるが、野生型配列を有する参照Ｈｅｒ２ペプチド（つまり、内部縦列重複を含まない野生型ポリヌクレオチドによりコードされるペプチド）または野生型Ｈｅｒ２ペプチドをコードする参照ポリヌクレオチドが存在する場合は、より低いレベルのサイトカインを産生する。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、組換え宿主免疫細胞は、標的（抗原提示細胞）が約１組換え宿主免疫細胞：２標的細胞の比で存在する場合、およびさらに約０．０１〜約０．０５μｇ／ｍＬのＨｅｒ２−ＩＴＤペプチド抗原が存在する場合、少なくとも約５０、６０、７０、８０ｐｇ／ｍＬ、またはそれよりも多くのＩＦＮ−γを産生することが可能であり、ならびに／または（ａ）標的細胞および（ｂ）ペプチド抗原が存在する場合、ペプチド抗原が、それぞれ約０．０２、０．２、２、または２０μｇ／ｍＬで存在すると、少なくとも約１００、５００、１０００、５，０００、または１０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを産生することが可能である。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、宿主免疫細胞は、標的細胞、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチド抗原またはそれをコードするポリヌクレオチド、ならびに抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体および／または抗ＨＬＡクラスＩ抗体が存在する場合、ＩＦＮ−γを産生することが可能である。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、宿主免疫細胞は、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチド抗原および／またはＨｅｒ２−ＩＴＤペプチドをコードするＲＮＡ、ならびにＨＬＡ−ＤＱＢ１−０５０１またはＨＬＡ−ＤＱＢ１−０５０２を発現する細胞株の存在下で、ＩＦＮγを産生することが可能であり、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチド抗原を宿主免疫細胞に提示することが可能である。
【０１７０】
本開示の実施形態のいずれかでは、宿主免疫細胞などの宿主細胞は、例えば、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡ成分、またはＴＣＲ成分、またはそれらの任意の組合せなどの内因性免疫細胞タンパク質の染色体遺伝子ノックアウトを含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、用語「染色体遺伝子ノックアウト」は、宿主細胞による機能的に活性な内因性のポリペプチド産物の産生を防止する（例えば、低減、遅延、抑制、または阻止する）遺伝的変更または宿主細胞に導入された阻害剤を指す。染色体遺伝子ノックアウトをもたらす変更としては、例えば、ナンセンス変異の導入（未成熟終止コドンの形成を含む）、ミスセンス変異、遺伝子欠失、および鎖切断、ならびに宿主細胞における内因性遺伝子発現を阻害する阻害性核酸分子の異種発現を挙げることができる。
【０１７１】
染色体遺伝子ノックアウトは、ノックアウト手順または作用物質の使用後に、宿主免疫細胞のＤＮＡを配列決定することにより直接的に確認することができる。染色体遺伝子ノックアウトは、ノックアウト後に、遺伝子発現の非存在（例えば、遺伝子によりコードされるｍＲＮＡまたはポリペプチド産物の非存在）から推測することもできる。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、染色体遺伝子ノックアウトまたは遺伝子ノックインは、宿主細胞の染色体編集により行われる。染色体編集は、例えば、エンドヌクレアーゼを使用して実施することができる。本明細書で使用される場合、「エンドヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を触媒切断することが可能な酵素を指す。ある特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、標的遺伝子を切断することが可能であり、それにより標的遺伝子を不活性化または「ノックアウト」する。エンドヌクレアーゼは、天然に存在する、組換えの、遺伝子改変された、または融合エンドヌクレアーゼであってもよい。エンドヌクレアーゼによって引き起こされる核酸鎖切断は、一般的に、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の異なる機序により修復される。相同組換え中、ドナー遺伝子「ノックイン」のために、標的遺伝子「ノックアウト」のために、および必要に応じてドナー遺伝子ノックイン事象または標的遺伝子ノックアウト事象により標的遺伝子を不活性化するために、ドナー核酸分子を使用することができる。ＮＨＥＪは、切断部位のＤＮＡ配列に変化、例えば、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失、または付加をもたらすことが多い誤りがちな修復プロセスである。ＮＨＥＪを使用して、標的遺伝子を「ノックアウト」してもよい。エンドヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびｍｅｇａＴＡＬが挙げられる。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」（ＺＦＮ）は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの非特異的ＤＮＡ切断ドメインに融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を指す。約３０個アミノ酸の各ジンクフィンガーモチーフは、約３塩基対のＤＮＡに結合し、ある特定の残基のアミノ酸を変化させて、トリプレット配列特異性を変更することができる（例えば、Desjarlais  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  90:2256-2260,  1993;  Wolfe  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  285:  1917-1934,  1999を参照）。複数のジンクフィンガーモチーフを縦列に連結して、約９〜約１８塩基対の範囲の長さを有する領域など、所望のＤＮＡ配列への結合特異性を作出することができる。背景として、ＺＦＮは、ゲノムにおける部位特異的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の形成を触媒することによりゲノム編集を媒介し、ＤＳＢ部位のゲノムに相同性であるフランキング配列を含む導入遺伝子の標的化組込みは、相同組換え修復により促進される。あるいは、ＺＦＮによる生成されるＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復を介して標的遺伝子のノックアウトをもたらすことができる。これは、切断部位におけるヌクレオチドの挿入または欠失をもたらす誤りがちな細胞修復経路である。ある特定の実施形態では、遺伝子ノックアウトは、ＺＦＮ分子を使用して行われる、挿入、欠失、変異、またはそれらの組合せを含む。
【０１７４】
本明細書で使用される場合、「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、およびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどのＤＮＡ切断ドメインを含む融合タンパク質を指す。「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、各々が、一般に１２番目および１３番目のアミノ酸が多様である高度に保存された３３〜３５個アミノ酸の配列を有する１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／ユニットで構成されている。ＴＡＬＥ反復ドメインは、ＴＡＬＥと標的ＤＮＡ配列との結合に関与する。こうした多様なアミノ酸残基は、反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれ、特異的なヌクレオチド認識と関連する。こうしたＴＡＬＥのＤＮＡ認識のための天然（標準）コードは、ＴＡＬＥの１２位および１３位のＨＤ（ヒスチン−アスパラギン酸）配列が、シトシン（Ｃ）に対するＴＡＬＥ結合に結び付き、ＮＧ（アスパラギン−グリシン）がＴヌクレオチドに結合し、ＮＩ（アスパラギン−イソロイシン）がＡに結合し、ＮＮ（アスパラギン−アスパラギン）がＧまたはＡヌクレオチドに結合し、ＮＧ（アスパラギン−グリシン）がＴヌクレオチドに結合するように決定されている。非標準（非定型）ＲＶＤも公知である（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書を参照。この文献の非定型ＲＶＤは、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。ＴＡＬＥＮを使用して、Ｔ細胞のゲノムの部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を指図することができる。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、アニーリングのための配列の重複がほとんどまたはまったくない二本鎖切断の両側からＤＮＡをライゲートし、それにより遺伝子発現をノックアウトするエラーを導入する。あるいは、相同組換え修復は、導入遺伝子に相同性フランキング配列が存在する場合、導入遺伝子をＤＳＢ部位に導入することができる。ある特定の実施形態では、遺伝子ノックアウトは、ＴＡＬＥＮ分子を使用して行われる、挿入、欠失、変異、またはそれらの組合せを含む。
【０１７５】
本明細書で使用される場合、「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／Ｃａｓ」（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼ系は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）誘導性Ｃａｓヌクレアーゼを使用して、塩基対相補性によりゲノム内の標的部位（プロトスペーサーとして知られている）を認識し、短い保存されたプロトスペーサー関連モチーフ（ＰＡＭ）が相補性標的配列の３’直後に続く場合はＤＮＡを切断する系を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓヌクレアーゼの配列および構造に基づいて３つの型（つまり、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）に分類される。Ｉ型およびＩＩＩ型のｃｒＲＮＡ誘導性監視複合体は、複数のＣａｓサブユニットを必要とする。最も研究されているＩＩ型系は、少なくとも３つの成分：ＲＮＡ誘導性Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ、およびトランス作用性ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、二重鎖形成領域を含む。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと相互作用し、ｃｒＲＮＡのスペーサーとＰＡＭの上流にある標識ＤＮＡのプロトスペーサーとの間のワトソンクリック塩基対形成によりＣａｓ９／ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を標的ＤＮＡの特定の部位へと誘導することが可能な二重鎖を形成する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡスペーサーにより定義される領域内で二本鎖切断（double-stranded  break）を切断する。ＮＨＥＪによる修復は、標的遺伝子座の発現を妨害する挿入および／または欠失をもたらす。あるいは、相同性フランキング配列を有する導入遺伝子を、相同組換え修復によりＤＳＢ部位に導入することができる。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）へと操作することができる（例えば、Jinek  et  al.,  Science  337:  816-21,  2012を参照）。さらに、標的部位に相補的なガイドＲＮＡの領域は、所望の配列を標的とするように変更またはプログラムすることができる（Xie  et  al.,  PLOS  One  9:  e100448,  2014；米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０１８６８４３号明細書；米国特許第８，６９７，３５９号明細書、および国際公開第２０１５／０７１４７４号パンフレット；これらの文献の各々は参照により組み込まれる）。ある特定の実施形態では、遺伝子ノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を使用して行われる、挿入、欠失、変異、またはそれらの組合せを含む。
【０１７６】
免疫細胞タンパク質をコードする内因性遺伝子をノックアウトするための例示的なｇＲＮＡ配列およびそれを使用するための方法としては、Ren  et  al.,  Clin.  Cancer  Res.  23(9):  2255-2266  (2017)に記載のものが挙げられる。この文献のｇＲＮＡ、ＣＡＳ９  ＤＮＡ、ベクター、および遺伝子ノックアウト技法は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」は、「ホーミングエンドヌクレアーゼ」とも呼ばれ、大きな認識部位（約１２〜約４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）により特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼは、配列および構造モチーフに基づいて、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１５９）、ＧＩＹ−ＹＩＧ（配列番号１６０）、ＨＮＨ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックス、およびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫ（配列番号１６１）の５つのファミリーに分けることができる。例示的なメガヌクレアーゼとしては、以下のものが挙げられる：Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられ、これらの認識配列は公知である（例えば、米国特許第５，４２０，０３２号明細書および米国特許第６，８３３，２５２号明細書；Belfort  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  25:  3379-3388,  1997；Dujon  et  al.,  Gene  82:  115-118,  1989；Perler  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  22:  1125-1127,  1994；Jasin,  Trends  Genet.  12:  224-228,  1996；Gimble  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  263:  163-180,  1996；Argast  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  280:  345-353,  1998を参照）。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、天然に存在するメガヌクレアーゼを使用して、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡをコードする遺伝子、またはＴＣＲ成分をコードする遺伝子から選択される標的の部位特異的ゲノム修飾を促進することができる。他の実施形態では、標的遺伝子に対する新規の結合特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼが、部位特異的ゲノム修飾に使用される（例えば、Porteus  et  al.,  Nat.  Biotechnol.  23:  967-73,  2005；Sussman  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  342:  31-41,  2004；Epinat  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  31:  2952-62,  2003；Chevalier  et  al.,  Molec.  Cell  10:  895-905,  2002；Ashworth  et  al.,  Nature  441:  656-659,  2006；Paques  et  al.,  Curr.  Gene  Ther.  7:  49-66,  2007；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号明細書；米国特許出願公開第２００６／０２０６９４９号明細書；米国特許出願公開第２００６／０１５３８２６号明細書；米国特許出願公開第２００６／００７８５５２号明細書；および米国特許出願公開第２００４／０００２０９２号明細書を参照）。さらなる実施形態では、染色体遺伝子ノックアウトは、ｍｅｇａＴＡＬとして知られている融合タンパク質を作製するためにＴＡＬＥＮのモジュラーＤＮＡ結合ドメインで修飾されているホーミングエンドヌクレアーゼを使用して生成される。ｍｅｇａＴＡＬは、１つまたは複数の標的遺伝子をノックアウトするだけでなく、目的のポリペプチドをコードする外因性ドナー鋳型と組み合わせて使用する場合は、異種または外因性ポリヌクレオチドを導入（ノックイン）するためにも使用することができる。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、染色体遺伝子ノックアウトは、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗原特異的受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞（例えば、免疫細胞）に導入される阻害性核酸分子を含み、阻害性核酸分子は、標的特異的阻害剤をコードし、コードされる標的特異的阻害剤は、宿主免疫細胞において、内因性遺伝子発現（つまり、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡ成分、またはＴＣＲ成分、またはそれらの任意の組合せの）を阻害する。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、目的の結合タンパク質またはＴＣＲを、内因性ＴＣＲ遺伝子座にノックインして、それにより内因性ＴＣＲをノックアウトし、目的のタンパク質をノックインしてもよい。例えば、Eyquem  et  al.,  Nature  543  (7643):  113-117  (2017)を参照されたい。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、本開示の結合タンパク質または組換え高親和性ＴＣＲをコードするおよび／または発現する宿主免疫細胞は、腫瘍など、同種抗原（ＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶまたはＨｅｒ２−ＩＴＤ）を発現する標的組織にｉｎ  ｖｉｖｏで優先的に遊走または局在化することが可能であるが、同じタイプの非隣接組織には統計的に有意に低減された量で存在する。実例として、宿主免疫細胞は、肺腫瘍に存在してもよいが（例えば、コードされる結合タンパク質のＴＣＲ  Ｖ領域のディープシーケンシングを使用して決定される）、腫瘍に隣接していない同じ肺の組織ではより低いレベルで存在するか、またはまったく存在しない。一部の実施形態では、非隣接組織は、疾患組織または悪性組織から少なくとも３ｃｍ離れた組織を含むかまたはそれを指す。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、対象に投与することができるものなど、細胞の組成物中で富化されている。本明細書で使用される場合、混合物中の細胞型の量に関する「富化」または「枯渇」は、１つまたは複数の富化または枯渇プロセスまたはステップに起因する細胞の混合物中の「富化」型の数の増加、「枯渇」細胞の数の減少、または両方を指す。したがって、富化プロセスに供される細胞の原集団の供給源に応じて、混合物または組成物は、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれよりも多くの（数またはカウントで）「富化」細胞を含有してもよい。枯渇プロセスに供された細胞は、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％パーセント、またはそれ未満の（数またはカウントで）「枯渇」細胞を含有する混合物または組成物をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋細胞を富化させるがＣＤ８＋細胞は枯渇させること、またはＣＤ６２Ｌ＋細胞を富化させるがＣＤ６２Ｌ−細胞は枯渇させること、またはそれらの組合せなど、混合物中の特定の細胞型の量を富化させることになり、異なる細胞型の量を枯渇させる。
本明細書には、有効量の修飾免疫細胞または修飾免疫細胞を含む組成物を含む単位用量も提供される。ある特定の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の修飾されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の修飾されたＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１比の組合せで含み、単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない（つまり、同等数のＰＢＭＣを有する患者試料と比較して、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満のナイーブＴ細胞の集団が単位用量中に存在する）。
一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約５０％の修飾されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約５０％の修飾されたＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１比の組合せで含み、単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。さらなる実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約６０％の修飾されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約６０％の修飾されたＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１比の組合せで含み、単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。またさらなる実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約７０％の操作されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約７０％の操作されたＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１比の組合せで含み、単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約８０％の修飾されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約８０％の修飾されたＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１比の組合せで含み、単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約８５％の修飾されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約８５％の修飾されたＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１比の組合せで含み、単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約９０％の修飾されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約９０％の修飾されたＣＤ８＋  Ｔ細胞とを含む組成物を約１：１比の組合せで含み、単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。
本開示の単位用量は、本明細書に記載のような結合タンパク質、ＴＣＲ、または組換え宿主細胞（つまり、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ抗原またはＨＥＲ２−ＩＴＤ抗原に特異的な結合タンパク質を発現するもの、および異なる抗原（例えば、異なるＫＲＡＳ抗原もしくはＨＥＲ２抗原、あるいは、例えばＢＣＭＡ、ＢＲＡＦ、ＣＤ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１５１、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、ルイスＡ、ルイスＹ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ−Ａ（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、およびＭＡＧＥ−Ａ４を含む）、メソセリン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＴＷＥＡＫ−Ｒ、ＨＬＡ、ＨＬＡに結合した腫瘍関連もしくは病原体関連ペプチド、ＨＬＡに結合したｈＴＥＲＴペプチド、ＨＬＡに結合したチロシナーゼペプチド、ＬＴβＲ、ＬＩＦＲβ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＯＳＭＲβ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、Ｂ７Ｈ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ−１、ＨＡ１−Ｈ、Ｒｏｂｏ１、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、ＰＲＡＭＥ、またはＳＳＸ−２などの、異なるタンパク質もしくは標的に由来する抗原）に特異的な結合タンパク質を発現する修飾免疫細胞）を含んでいてもよいことが理解される。例えば、単位用量は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ：ＨＬＡ複合体またはＨＥＲ２−ＩＴＤ：ＨＬＡ複合体に特異的に結合する結合タンパク質を発現する修飾されたＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびＢＲＡＦＶ６００Ｅ抗原に特異的に結合する結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）を発現する修飾されたＣＤ４＋  Ｔ細胞（および／または修飾されたＣＤ８＋  Ｔ細胞）を含んでいてもよい。
【０１８３】
本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、単位用量は、等しいかまたはおおよそ等しい数の操作されたＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３＋ＣＤ８＋および修飾されたＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＭ細胞を含む。
【０１８４】
本開示の種々の実施形態の実施では、標準的な技法を、組換えＤＮＡ、ペプチド、およびオリゴヌクレオチド合成；イムノアッセイ；組織培養；および形質転換（例えば、エレクトロポレーションおよびリポフェクション）に使用することができる。酵素反応および精製技法は、製造業者の仕様に従って、または当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載のように実施することができる。こうしたおよび関連する技法および手順は、一般に、当技術分野で周知の従来方法に従って、微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学、および免疫学技法における種々の基本的でより具体的な文献に記載のように実施することができる。これらの文献は、本明細書全体にわたって引用および考察されている（例えば、以下のものを参照：Sambrook,  et  al,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  3d  ed.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.；Current  Protocols  in  Molecular  Biology  (John  Wiley  and  Sons,  updated  July  2008)；Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience；Glover,  DNA  Cloning:  A  Practical  Approach,  vol.  I  &  II  (IRL  Press,  Oxford  Univ.  Press  USA,  1985)；Current  Protocols  in  Immunology  (Edited  by:  John  E.  Coligan,  Ada  M.  Kruisbeek,  David  H.  Margulies,  Ethan  M.  Shevach,  Warren  Strober  2001  John  Wiley  &  Sons,  NY,  NY)；Real-Time  PCR:  Current  Technology  and  Applications,  Edited  by  Julie  Logan,  Kirstin  Edwards  and  Nick  Saunders,  2009,  Caister  Academic  Press,  Norfolk,  UK；Anand,  Techniques  for  the  Analysis  of  Complex  Genomes,  (Academic  Press,  New  York,  1992)；Guthrie  and  Fink,  Guide  to  Yeast  Genetics  and  Molecular  Biology  (Academic  Press,  New  York,  1991)；Oligonucleotide  Synthesis  (N.  Gait,  Ed.,  1984)；Nucleic  Acid  Hybridization  (B.  Hames  &  S.  Higgins,  Eds.,  1985)；Transcription  and  Translation  (B.  Hames  &  S.  Higgins,  Eds.,  1984)；Animal  Cell  Culture  (R.  Freshney,  Ed.,  1986)；Perbal,  A  Practical  Guide  to  Molecular  Cloning  (1984)；Next-Generation  Genome  Sequencing  (Janitz,  2008  Wiley-VCH)；PCR  Protocols  (Methods  in  Molecular  Biology)  (Park,  Ed.,  3rd  Edition,  2010  Humana  Press)；Immobilized  Cells  And  Enzymes  (IRL  Press,  1986)；the  treatise,  Methods  In  Enzymology  (Academic  Press,  Inc.,  N.Y.)；Gene  Transfer  Vectors  For  Mammalian  Cells  (J.  H.  Miller  and  M.  P.  Calos  eds.,  1987,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory)；Harlow  and  Lane,  Antibodies,  (Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.,  1998)；Immunochemical  Methods  In  Cell  And  Molecular  Biology  (Mayer  and  Walker,  eds.,  Academic  Press,  London,  1987)；Handbook  Of  Experimental  Immunology,  Volumes  I-IV  (D.  M.  Weir  and  CC  Blackwell,  eds.,  1986)；Roitt,  Essential  Immunology,  6th  Edition,  (Blackwell  Scientific  Publications,  Oxford,  1988)；Embryonic  Stem  Cells:  Methods  and  Protocols  (Methods  in  Molecular  Biology)  (Kurstad  Turksen,  Ed.,  2002)；Embryonic  Stem  Cell  Protocols:  Volume  I:  Isolation  and  Characterization  (Methods  in  Molecular  Biology)  (Kurstad  Turksen,  Ed.,  2006)；Embryonic  Stem  Cell  Protocols:  Volume  II:  Differentiation  Models  (Methods  in  Molecular  Biology)  (Kurstad  Turksen,  Ed.,  2006)；Human  Embryonic  Stem  Cell  Protocols  (Methods  in  Molecular  Biology)  (Kursad  Turksen  Ed.,  2006)；Mesenchymal  Stem  Cells:  Methods  and  Protocols  (Methods  in  Molecular  Biology)  (Darwin  J.  Prockop,  Donald  G.  Phinney,  and  Bruce  A.  Bunnell  Eds.,  2008)；Hematopoietic  Stem  Cell  Protocols  (Methods  in  Molecular  Medicine)  (Christopher  A.  Klug,  and  Craig  T.  Jordan  Eds.,  2001)；およびHematopoietic  Stem  Cell  Protocols  (Methods  in  Molecular  Biology)  (Kevin  D.  Bunting  Ed.,  2008)  Neural  Stem  Cells:  Methods  and  Protocols  (Methods  in  Molecular  Biology)  (Leslie  P.  Weiner  Ed.,  2008)）。
使用
【０１８５】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のような有効量の組成物（例えば、結合タンパク質、ＴＣＲ、組換え宿主細胞、免疫原性組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または関連組成物）を対象に投与することにより、処置を必要とする対象（つまり、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ抗原および／またはＨｅｒ２−ＩＴＤ抗原に関連付けられる疾患または障害を有するかまたは有することが疑われる）を処置するための方法を提供する。そのような疾患としては、固形がんおよび血液悪性腫瘍など、種々の形態の増殖性疾患または過剰増殖性疾患が挙げられる。
【０１８６】
「処置する」、「処置」、または「軽快させる」は、対象（例えば、ヒト、または霊長類、ウマ、イヌ、マウス、もしくはラットなどの非ヒト哺乳動物）の疾患、障害、または状態の医学的管理を指す。一般に、本開示の宿主細胞および必要に応じてアジュバントを含む適切な用量または処置レジメンは、治療的または予防的利益の誘発に十分な量で投与される。治療的または予防的／防止的利益としては、臨床転帰の向上；疾患に関連付けられる症状の軽減または緩和；症状の発生の減少；生活の質の向上；より長い無病状態；疾患の程度の縮小；疾患状態の安定化；疾患進行の遅延；寛解；生存；長期生存；またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１８７】
本開示の組成物（例えば、結合タンパク質またはそれを発現またはコードする宿主細胞）の「治療有効量」または「有効量」は、処置中の疾患の１つまたは複数の症状の軽快を統計的に有意な様式でもたらすのに十分な化合物または細胞の量を指す。単独で投与される個々の活性成分または単一の活性成分を発現する細胞を参照する場合、治療有効用量は、その成分またはその成分のみを発現する細胞の効果を指す。組合せを参照する場合、治療有効用量は、連続投与かまたは同時投与かに関わらず、活性成分または組み合わせる補助活性成分と治療効果をもたらす活性成分を発現する細胞とを組み合わせた量を指す。また、組合せは、同じまたは異なる抗原に特異的に結合する２つの異なる結合タンパク質など、１つよりも多くの活性成分を発現する細胞であってもよい。
【０１８８】
本明細書で使用される場合、「統計的に有意な」は、スチューデントｔ検定を使用して計算した場合にｐ値が０．０５０またはそれ未満であることを指し、測定されている特定の事象または結果が偶然に生じた可能性が低いことを示す。
【０１８９】
本明細書で使用される場合、用語「養子免疫治療法（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）」または「養子免疫療法（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」は、天然に存在するかまたは遺伝子操作された疾患抗原特異的免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を投与することを指す。養子細胞免疫療法は、自己性（免疫細胞はレシピエントに由来する）であってもよく、同種異系（免疫細胞は同じ種のドナーに由来する）であってもよく、または同系（免疫細胞はレシピエントと遺伝的に同一のドナーに由来する）あってもよい。
【０１９０】
本明細書で使用される場合、「過剰増殖性障害」は、正常細胞または非疾患細胞と比較して過剰な成長または増殖を指す。例示的な過剰増殖性障害としては、腫瘍、がん、新生物性組織、癌、肉腫、悪性細胞、前悪性細胞、ならびに非新生物性または非悪性過剰増殖性障害（例えば、腺腫、線維腫、脂肪腫、平滑筋腫、血管腫、線維症、再狭窄、ならびに関節リウマチ、骨関節炎、乾癬、または炎症性腸疾患などの自己免疫疾患）が挙げられる。過剰増殖性疾患の状況よりもゆっくりと生じる異常なまたは過剰な成長を伴うある特定の疾患は「増殖性疾患」と呼ばれる場合があり、ある特定の腫瘍、がん、新生物性組織、癌、肉腫、悪性細胞、前悪性細胞、ならびに非新生物性または非悪性障害が挙げられる。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、方法は、本明細書に記載のような結合タンパク質、高親和性組換えＴＣＲ、宿主細胞、免疫原性組成物、ポリヌクレオチド、またはベクターを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、対象は、ＮＳＣＬＣ、結腸直腸がん、膵臓がん、胆管がん、乳がん、卵巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、およびＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である別の（他の）適応症、またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原が治療標的である別の（他の）適応症を有していてもよくまたは有する疑いがあってもよい。ある特定の実施形態では、対象（または対象疾患）は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原の少なくとも１つを発現する。
【０１９２】
一般に、適切な投与量および処置レジメンは、利益を提供するのに十分な量の活性分子または細胞を提供する。そのような反応は、未処置対象と比較して、処置した対象の臨床転帰の向上（例えば、より頻繁な寛解、完全なもしくは部分的なまたはより長い無病生存期間）を確立することによりモニターすることができる。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答の増加は、一般に、臨床転帰の向上と相関する。そのような免疫応答は、一般に、日常的である標準的な増殖、細胞傷害性、またはサイトカインアッセイを使用して評価することができる。
【０１９３】
予防的使用の場合、用量は、疾患または障害に関連付けられる疾患の予防、発症遅延、または重症度の減弱に十分であるべきである。本明細書に記載の方法に従って投与される免疫原性組成物の予防的利益は、前臨床研究（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究およびｉｎ  ｖｉｖｏ動物研究を含む）および臨床研究を実施し、そこから得られたデータを、適切な統計的、生物学的、および臨床的な方法および技法で分析することにより決定することができ、これらはすべて当業者であれば容易に実施することができる。
【０１９４】
また、本明細書に開示のような結合タンパク質、高親和性組換えＴＣＲ、宿主（つまり、修飾された）免疫細胞、免疫原性組成物、ポリヌクレオチド、またはベクター、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物（組成物）も企図される。好適な賦形剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、またはグリセロールなど、およびそれらの組合せが挙げられる。実施形態では、本明細書に開示のような融合タンパク質または宿主細胞を含む組成物は、好適な注入媒体をさらに含む。好適な注入媒体は、任意の等張性媒体配合物であり得、典型的には生理食塩水（normal  saline）、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ  Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）またはＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）、水中５％デキストロース、乳酸リンゲル液が使用され得る。注入媒体は、ヒト血清アルブミンまたは他のヒト血清成分を補充されていてもよい。
【０１９５】
医薬組成物は、医学分野の当業者により決定されるように、処置（または予防）しようとする疾患または状態に適切な様式で投与することができる。組成物の適切な用量ならびに好適な投与期間および投与頻度は、患者の健康状態、患者の大きさ（つまり、体重、嵩、または体面積）、患者の状態のタイプおよび重症度、活性成分の特定の形態、および投与方法などの要因により決定される。一般に、適切な用量および処置レジメンは、治療的および／または予防的利益を（より頻繁な完全なまたは部分的な寛解、またはより長い無病生存期間および／もしくは全生存期間、または症状重症度の軽減など、臨床転帰の向上を含む、本明細書に記載のものなど）提供するのに十分な量の組成物を提供する。
【０１９６】
医薬組成物の有効量は、本明細書に記載のように、必要な投与量および期間にわたって所望の臨床結果または有益な処置を達成するのに十分な量を指す。有効量は、１回または複数回の投与で送達してもよい。投与が、疾患または疾患状態を有することが既知であるかまたは確認されている対象に対するものである場合、処置に関しては用語「治療量」を使用することができるが、防止過程として、疾患または疾患状態（例えば、再発）を発症し易いかまたは発症するリスクがある対象に有効量を投与することを記述するためには、「予防的有効量」を使用することができる。
【０１９７】
養子細胞療法の場合、治療有効用量は、処置されたヒトまたは非ヒト哺乳動物において臨床的に望ましい結果（つまり、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原を発現する細胞に対する特異的なＴ細胞免疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答を統計的に有意な様式で誘導または増強するのに十分な量）を生み出すことが可能である、養子移入に使用されるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原に特異的な結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲをコードするおよび／または発現する宿主細胞の量である。種々の実施形態では、治療有効用量は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞のみの量である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである。
【０１９８】
組成物または単位用量中の細胞の量は、少なくとも１つの細胞（例えば、１つの組換えＣＤ８＋  Ｔ細胞部分集団（例えば、必要に応じてメモリーおよび／またはナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む）；１つの組換えＣＤ４＋  Ｔ細胞部分集団（例えば、必要に応じてメモリーおよび／またはナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む））であるか、またはより典型的には１０２個よりも多くの細胞、例えば、最大で１０４個、最大で１０５個、最大で１０６個、最大で１０７個、最大で１０８個、最大で１０９個、または１０１０個よりも多くの細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、約１０４〜約１０１０細胞／ｍ２の範囲で、好ましくは、約１０５〜約１０９細胞／ｍ２の範囲で投与される。一部の実施形態では、投与される用量は、最大で約３．３×１０５細胞／ｋｇを含む。一部の実施形態では、投与される用量は、最大で約１×１０６細胞／ｋｇを含む。一部の実施形態では、投与される用量は、最大で約３．３×１０６細胞／ｋｇを含む。一部の実施形態では、投与される用量は、最大で約１×１０７細胞／ｋｇを含む。ある特定の実施形態では、組換え宿主細胞は、最大で約５×１０４細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ、または最大で約５×１０７細胞／ｋｇを含む用量で対象に投与される。ある特定の実施形態では、組換え宿主細胞は、少なくとも約５×１０４細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ、または最大で約５×１０７細胞／ｋｇを含む用量で対象に投与される。細胞の数は、組成物が意図される最終的な使用、ならびにそこに含まれる細胞のタイプに依存する。例えば、結合タンパク質を発現またはコードするように修飾された細胞は、そのような細胞の少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも多くを含有する細胞集団を含む。本明細書で提供される使用の場合、細胞は、一般に、１リットルもしくはそれ未満、５００ｍｌもしくはそれ未満、２５０ｍｌもしくはそれ未満、または１００ｍｌもしくはそれ未満の容積である。実施形態では、所望の細胞の密度は、典型的には１０４細胞／ｍｌよりも大きく、一般に１０７細胞／ｍｌよりも大きく、一般に１０８細胞／ｍｌまたはそれよりも大きい。細胞は、単回注入として投与してもよく、またはある時間範囲にわたる複数回注入で投与してもよい。ある特定の実施形態では、臨床的に関連する数の細胞を、累積で１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１個に等しいかまたはそれを超える細胞の複数回の注入に配分してもよい。ある特定の実施形態では、細胞の単位用量は、同種異系ドナーに由来する造血幹細胞と共に共投与してもよい（例えば、同時に（simultaneously）または同時に（contemporaneously））。一部の実施形態では、単位用量に含まれる細胞の１つまたは複数は、対象に対して自己性である。
【０１９９】
本明細書に記載の医薬組成物は、密封されたアンプルまたはバイアルなど、単位用量または複数用量の容器で提供することができる。そのような容器は、患者に注入されるまで製剤の安定性を保存するために凍結されていてもよい。
【０２００】
本明細書で使用される場合、組成物の投与は、例えば、静脈内、経口、膣、直腸、または皮下などの送達経路または送達モードに関わらず、それを対象に送達することを指す。投与は、継続的または断続的におよび非経口的に行うことができる。投与は、認識されている状態、疾患、または疾患状態を有することが既に確認されている対象を処置するためであってもよく、またはそのような状態、疾患、もしくは疾患状態を発症し易いかもしくは発症するリスクがある対象を処置するためのものであってもよい。補助療法剤との共投与は、任意の順序および任意の投与スケジュールでの複数の薬剤の同時送達および／または順次送達を含んでいてもよい（例えば、組換え宿主細胞を、１種または複数種のサイトカイン；カルシニューリン阻害剤、コルチコステロイド、微小管阻害剤などの免疫抑制療法剤、低用量のミコフェノール酸プロドラッグ、またはそれらの任意の組合せと共に）。
【０２０１】
本主題の組成物が非経口的に投与される場合、組成物は、滅菌水性または油性溶液または懸濁物も含むことができる。好適な非毒性で非経口的に許容される希釈剤または溶媒としては、水、リンゲル液、等張性塩溶液、１，３−ブタンジオール、エタノール、プロピレングリコール、または水との混合物中のポリエチレングリコールが挙げられる。水性溶液または懸濁物は、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、または酒石酸ナトリウムなど、１種または複数種の緩衝剤をさらに含んでいてもよい。無論、任意の投与量単位製剤を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に純粋であり、使用される量において実質的に無毒性であるべきである。加えて、活性化合物は、徐放性調製物および製剤に組み込まれてもよい。投与量単位形態は、本明細書で使用される場合、処置しようとする対象のための１単位の投与量に適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、適切な医薬担体と共に、所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の組換え細胞または活性化合物を含有してもよい。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、組換え宿主細胞）の複数の用量を対象に投与し、組成物は、約２〜約４週間の投与間隔で対象に投与してもよい。
【０２０３】
本開示の処置方法または予防方法は、処置過程またはレジメンの一部として対象に施すことができ、本開示の単位用量、細胞、または組成物の投与前または投与後の追加の処置を含んでいてもよい。例えば、ある特定の実施形態では、例えば、組換え宿主細胞の単位用量を受ける対象は、造血細胞移植（ＨＣＴ；骨髄破壊的および非骨髄破壊的ＨＣＴを含む）を受けているかまたは以前に受けたことがある。ＨＣＴを実施するための技法およびレジメンは、当技術分野で公知であり、臍帯血、骨髄、もしくは末梢血に由来する細胞、造血幹細胞、動員された幹細胞、または羊水に由来する細胞など、任意の好適なドナー細胞の移植を含んでいてもよい。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の１つの組換え宿主細胞は、改変型ＨＣＴ療法では造血幹細胞と共にまたはその直ぐ後で投与することができる。一部の実施形態では、ＨＣＴは、ＨＬＡ成分をコードする遺伝子の染色体ノックアウト、ＴＣＲ成分をコードする遺伝子の染色体ノックアウト、または両方を含むドナー造血細胞を含む。
【０２０４】
ＣＴＬ免疫応答のレベルは、本明細書に記載されており、当技術分野で日常的に実施されている多数の免疫学的方法のいずれか１つにより決定することができる。ＣＴＬ免疫応答のレベルは、本明細書に記載のＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶもしくはＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的結合タンパク質もしくはＴＣＲ（またはそれらをコードするおよび／または発現する宿主細胞）または免疫原性組成物のいずれか１つの投与前にまたは投与後に決定してもよい。ＣＴＬ活性を決定するための細胞傷害性アッセイは、当技術分野で日常的に実施されている幾つかの技法および方法のいずれか１つを使用して実施することができる（例えば、Henkart,  et  al.,  "Cytotoxic  T-Lymphocytes"  in  Fundamental  Immunology,  Paul  (ed.)  (2003  Lippincott  Williams  &  Wilkins,  Philadelphia,  PA),  pages  1127-50、およびそこに引用されている文献を参照）。
【０２０５】
抗原特異的Ｔ細胞応答は、典型的には、本明細書に記載のＴ細胞機能パラメーター（例えば、増殖、サイトカイン放出、ＣＴＬ活性、細胞表面マーカー表現型の変更など）のいずれかにより観察されるＴ細胞応答を比較することにより決定され、比較は、適切な状況にて同種抗原に曝露されたＴ細胞（例えば、免疫適合性の抗原提示細胞により提示された場合にＴ細胞を初期刺激または活性化するために使用される抗原）と、その代わりに構造的に異なるかまたは無関連の対照抗原に曝露された同じ供給源集団に由来するＴ細胞との間で行ってもよい。同種抗原に対する応答が、対照抗原に対する応答よりも統計的に有意に大きいことは、抗原特異性であることを意味する。
【０２０６】
本明細書に記載のようなＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶまたはＨｅｒ２−ＩＴＤ由来ネオ抗原ペプチドに対する免疫応答の存在およびレベルを決定するために、対象から生物学的試料を得ることができる。「生物学的試料」は、本明細書で使用される場合、血液試料（それから血清または血漿を調製することができる）、生検標本、体液（例えば、肺洗浄液、腹水、粘膜洗浄液、滑液など）、骨髄、リンパ節、組織外植片、臓器培養物、または対象もしくは生物学的供給源に由来する任意の他の組織もしくは細胞調製物であってもよい。また、生物学的試料は、いずれの免疫原性組成物も受ける前の対象から得ることができ、この生物学的試料は、ベースライン（つまり、免疫前）データを確立するための対照として有用である。
【０２０７】
一部の実施形態では、本主題の組成物を受ける対象は、リンパ球枯渇化学療法を以前に受けたことがある。さらなる実施形態では、リンパ球枯渇化学療法は、シクロホスファミド、フルダラビン、抗胸腺細胞グロブリン、オキサリプラチン、またはそれらの組合せを含む。
【０２０８】
本開示による方法は、併用療法において疾患または障害を処置するために１種または複数種の追加の薬剤を投与することをさらに含んでいてもよい。例えば、ある特定の実施形態では、併用療法は、組成物（例えば、結合タンパク質；高親和性組換えＴＣＲ；それら、免疫原性組成物、ポリヌクレオチド、ベクターをコードするおよび／または発現する修飾宿主細胞）を、免疫チェックポイント阻害剤と共に（併せて、同時に、または順次）投与することを含む。一部の実施形態では、併用療法は、本開示の組成物を、刺激性免疫チェックポイント剤のアゴニストと共に投与することを含む。さらなる実施形態では、併用療法は、本開示の組成物を、化学療法剤、放射線療法、外科手術、抗体、またはそれらの任意の組合せなどの二次療法と共に投与することを含む。
【０２０９】
本明細書で使用される場合、用語「免疫抑制因子（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）」または「免疫抑制作用物質（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）」は、免疫応答の制御または抑制を支援するための阻害シグナルを提供する１つまたは複数の細胞、タンパク質、分子、化合物、または複合体を指す。例えば、免疫抑制因子としては、免疫刺激を部分的または完全に遮断する；免疫活性化を減少、防止、もしくは遅延させる；または免疫抑制を増加、活性化、もしくは上方制御する分子が挙げられる。標的とする（例えば、免疫チェックポイント阻害剤を用いて）例示的な免疫抑制作用物質としては、以下のものが挙げられる：ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ２４４／２Ｂ４、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、ＰＶＲ１Ｇ（ＣＤ１１２Ｒ）、ＰＶＲＬ２、アデノシン、Ａ２ａＲ、免疫抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−３５）、ＩＤＯ、アルギナーゼ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、Ｔｒｅｇ細胞、またはそれらの任意の組合せ。
【０２１０】
免疫抑制因子阻害剤（免疫チェックポイント阻害剤とも呼ばれる）は、化合物、抗体、抗体断片、または融合ポリペプチド（例えば、ＣＴＬＡ４−ＦｃまたはＬＡＧ３−ＦｃなどのＦｃ融合）、アンチセンス分子、リボザイム、またはＲＮＡｉ分子、または低分子量有機分子であってもよい。本明細書に開示の実施形態のいずれかでは、方法は、以下の免疫抑制成分のいずれか１つの１つまたは複数の阻害剤を単独でまたは任意の組合せと共に、本開示の組成物を含んでいてもよい。
【０２１１】
したがって、ある特定の実施形態では、本開示による処置方法は、ＰＤ−１阻害剤を対象に投与することをさらに含んでいてもよい。ＰＤ−１阻害剤は、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））；ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））；イピリムマブ＋ニボルマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）＋ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））；セミプリマブ；ＩＢＩ−３０８；ニボルマブ＋リラトリマブ；ＢＣＤ−１００；カムレリズマブ；ＪＳ−００１；スパルタリズマブ；チスレリズマブ；ＡＧＥＮ−２０３４；ＢＧＢＡ−３３３＋チスレリズマブ；ＣＢＴ−５０１；ドスタルリマブ；デュルバルマブ＋ＭＥＤＩ−０６８０；ＪＮＪ−３２８３；パゾパニブ塩酸塩＋ペムブロリズマブ；ピジリズマブ；ＲＥＧＮ−１９７９＋セミプリマブ；ＡＢＢＶ−１８１；ＡＤＵＳ−１００＋スパルタリズマブ；ＡＫ−１０４；ＡＫ−１０５；ＡＭＰ−２２４；ＢＡＴ−１３０６；ＢＩ−７５４０９１；ＣＣ−９０００６；セミプリマブ＋ＲＥＧＮ−３７６７；ＣＳ−１００３；ＧＬＳ−０１０；ＬＺＭ−００９；ＭＥＤＩ−５７５２；ＭＧＤ−０１３；ＰＦ−０６８０１５９１；Ｓｙｍ−０２１；チスレリズマブ＋パミパリブ；ＸｍＡｂ−２０７１７；ＡＫ−１１２；ＡＬＰＮ−２０２；ＡＭ−０００１；アルツハイマー病に関してＰＤ−１をアンタゴナイズする抗体；ＢＨ−２９２２；ＢＨ−２９４１；ＢＨ−２９５０；ＢＨ−２９５４；固形腫瘍に関してＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１をアンタゴナイズする生物製剤；腫瘍学に関してＰＤ−１およびＬＡＧ−３を標的とする二重特異性モノクローナル抗体；ＢＬＳＭ−１０１；ＣＢ−２０１；ＣＢ−２１３；ＣＢＴ−１０３；ＣＢＴ−１０７；細胞免疫療法＋ＰＤ−１阻害剤；ＣＸ−１８８；ＨＡＢ−２１；ＨＥＩＳＣＯＩＩＩ−００３；ＩＫＴ−２０２；ＪＴＸ−４０１４；ＭＣＬＡ−１３４；ＭＤ−４０２；ｍＤＸ−４００；ＭＧＤ−０１９；腫瘍学に関してＰＤＣＤ１をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害する腫瘍溶解性ウイルス；ＯＴ−２；ＰＤ−１アンタゴニスト＋ロープギンターフェロンアルファ−２ｂ；ＰＥＧＭＰ−７；ＰＲＳ−３３２；ＲＸＩ−７６２；ＳＴＩＡ−１１１０；ＴＳＲ−０７５；腫瘍学に関してＨＥＲ２およびＰＤ−１を標的とするワクチン；腫瘍学および自己免疫障害に関してＰＤ−１を標的とするワクチン；ＸｍＡｂ−２３１０４；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＡＴ−１６２０１；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害する二重特異性モノクローナル抗体；ＩＭＭ−１８０２；固形腫瘍および血液腫瘍に関してＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；ニボルマブバイオシミラー；腫瘍学に関してＣＤ２７８およびＣＤ２８をアゴナイズし、ＰＤ−１をアンタゴナイズする組換えタンパク質；自己免疫障害および炎症性障害に関してＰＤ−１をアゴナイズする組換えタンパク質；ＳＮＡ−０１；ＳＳＩ−３６１；ＹＢＬ−００６；ＡＫ−１０３；ＪＹ−０３４；ＡＵＲ−０１２；ＢＧＢ−１０８；固形腫瘍に関してＰＤ−１、Ｇａｌ−９、およびＴＩＭ−３を阻害する薬物；ＥＮＵＭ−２４４Ｃ８；ＥＮＵＭ−３８８Ｄ４；ＭＥＤＩ−０６８０；転移性黒色腫および転移性肺がんに関してＰＤ−１をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害するモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１を標的とするモノクローナル抗体；ＮＳＣＬＣに関してＰＤ−１をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１およびＴＩＭ−３を阻害するモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害するモノクローナル抗体；血液悪性腫瘍および固形腫瘍に関してＰＤ−１およびＶＥＧＦ−Ａを阻害する組換えタンパク質；腫瘍学に関してＰＤ−１をアンタゴナイズする小分子；Ｓｙｍ−０１６；イネビリズマブ＋ＭＥＤＩ−０６８０；転移性黒色腫に関してＰＤＬ−１およびＩＤＯを標的とするワクチン；膠芽腫に関する抗ＰＤ−１モノクローナル抗体＋細胞免疫療法；腫瘍学に関してＰＤ−１をアンタゴナイズする抗体；血液悪性腫瘍および細菌感染症に関してＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１を阻害するモノクローナル抗体；ＨＩＶに関してＰＤ−１を阻害するモノクローナル抗体；および／または固形腫瘍に関してＰＤ−１を阻害する小分子を含み得る。
【０２１２】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、ＬＡＧ５２５、ＩＭＰ３２１、ＩＭＰ７０１、９Ｈ１２、ＢＭＳ−９８６０１６、またはそれらの任意の組合せなどのＬＡＧ３阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、ＣＴＬＡ４の阻害剤と組み合わせて使用される。ある特定の実施形態では、組成物は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、アバタセプト、ベラタセプト）、またはそれらの任意の組合せなど、ＣＴＬＡ４特異的抗体またはその結合性断片と組み合わせて使用される。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、エノブリツズマブ（ＭＧＡ２７１）、３７６．９６、または両方など、Ｂ７−Ｈ３特異的抗体またはその結合性断片と組み合わせて使用される。Ｂ７−Ｈ４抗体結合性断片は、例えば、Dangaj  et  al.,  Cancer  Res.  73:4820,  2013に記載のようなｓｃＦｖまたはその融合タンパク質、ならびに米国特許第９，５７４，０００号明細書および国際公開第２０１６４０７２４号Ａ１パンフレットおよび国際公開第２０１３／０２５７７９号Ａ１パンフレットに記載のものであってもよい。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、ＣＤ２４４の阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、ＢＬＴＡ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、またはそれらの任意の組合せの阻害剤と組み合わせて使用される。抗ＣＤ−１６０抗体は、例えば、国際公開第２０１０／０８４１５８号パンフレットに記載されている。
【０２１７】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、ＴＩＭ３の阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、Ｇａｌ９の阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、デコイアデノシン受容体など、アデノシンシグナル伝達の阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、Ａ２ａＲの阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、リリルマブ（ＢＭＳ−９８６０１５）など、ＫＩＲの阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２２２】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、阻害性サイトカイン（典型的には、ＴＧＦβ以外のサイトカイン）またはＴｒｅｇ発生もしくは活性の阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２２３】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、ｌｅｖｏ−１−メチルトリプトファン、エパカドスタット（ＩＮＣＢ０２４３６０；Liu  et  al.,  Blood  115:3520-30,  2010）、エブセレン（Terentis  et  al.,  Biochem.  49:591-600,  2010）、インドキシモド、ＮＬＧ９１９（Mautino  et  al.,  American  Association  for  Cancer  Research  104th  Annual  Meeting  2013;  Apr  6-10,  2013）、1−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）−チラ−パザミン、またはそれらの任意の組合せなどのＩＤＯ阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、Ｎ（オメガ）−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）、Ｎ−オメガ−ヒドロキシ−ノル−ｌ−アルギニン（ノル−ＮＯＨＡ）、Ｌ−ＮＯＨＡ、２（Ｓ）−アミノ−６−ボロノヘキサン酸（ＡＢＨ）、Ｓ−（２−ボロノエチル）−Ｌ−システイン（ＢＥＣ）、またはそれらの任意の組合せなどのアルギナーゼ阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２２５】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、ＣＡ−１７０（Ｃｕｒｉｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）など、ＶＩＳＴＡの阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、例えばＣＯＭ９０２（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ  Ｃａｎａｄａ）など、ＴＩＧＩＴの阻害剤、例えばＣＯＭ７０１（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ）など、ＣＤ１５５の阻害剤、または両方と組み合わせて使用される。
【０２２７】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ２、または両方の阻害剤と組み合わせて使用される。抗ＰＶＲＩＧ抗体は、例えば、国際公開第２０１６／１３４３３３号パンフレットに記載されている。抗ＰＶＲＬ２抗体は、例えば、国際公開第２０１７／０２１５２６号パンフレットに記載されている。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、ＬＡＩＲ１阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２２９】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、またはそれらの任意の組合せの阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、刺激性免疫チェックポイント分子の活性を増加させる（つまり、アゴニストである）薬剤と組み合わせて使用される。例えば、組成物は、以下のものと組み合わせて使用することができる：ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）アゴニスト（例えば、ウレルマブなど）、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）アゴニスト（例えば、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３、またはＭＥＤＩ０５６２など）、レナリドミド、ポマリドミド、ＣＤ２７アゴニスト（例えば、ＣＤＸ−１１２７など）、ＣＤ２８アゴニスト（例えば、ＴＧＮ１４１２、ＣＤ８０、またはＣＤ８６など）、ＣＤ４０アゴニスト（例えば、ＣＰ−８７０，８９３、ｒｈｕＣＤ４０Ｌ、またはＳＧＮ−４０など）、ＣＤ１２２アゴニスト（例えば、ＩＬ−２など）、ＧＩＴＲのアゴニスト（例えば、国際公開第２０１６／０５４６３８号パンフレットに記載のヒト化モノクローナル抗体など）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）のアゴニスト（例えば、ＧＳＫ３３５９６０９、ｍＡｂ８８．２、ＪＴＸ−２０１１、Ｉｃｏｓ１４５−１、Ｉｃｏｓ３１４−８、またはそれらの任意の組合せなど）。本明細書に開示の実施形態のいずれかでは、方法は、上述のもののいずれかを単独でまたは任意の組合せで含む、刺激性免疫チェックポイント分子の１種または複数種のアゴニストと共に、本開示の組成物を投与することを含んでいてもよい。
【０２３１】
ある特定の実施形態では、併用療法は、本開示の組成物と、非炎症性固形腫瘍により発現されるがん抗原に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片、放射線処置、外科手術、化学療法剤、サイトカイン、ＲＮＡｉ、またはそれらの任意の組合せの１つまたは複数を含む二次療法とを含む。
【０２３２】
ある特定の実施形態では、併用療法方法は、本開示の組成物を投与すること、および放射線処置または外科手術をさらに施すことを含む。放射線療法は、当技術分野で周知であり、ガンマ線照射などのＸ線療法、および放射性医薬品療法を含む。対象における所与のがんを処置するのに適切な外科手術および外科的技法は、当業者に周知である。
【０２３３】
免疫抗がんまたは抗腫瘍応答の促進に有用なサイトカインとしては、本開示の組成物と共に単独でまたは任意の組合せで用いられる、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２４、およびＧＭ−ＣＳＦが挙げられる。さらなる実施形態では、サイトカインは順次投与されるが、ただし対象には、サイトカイン投与前に、抗ＨＥＲ２−ＩＴＤ組成物および／または抗ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ組成物が少なくとも３回または４回投与されていた。ある特定の実施形態では、サイトカインは皮下投与される。一部の実施形態では、対象は、カルシニューリン阻害剤、コルチコステロイド、微小管阻害剤、低用量のミコフェノール酸プロドラッグ、またはそれらの任意の組合せなどの免疫抑制療法を受けたことがあるか、またはさらに受けている。またさらなる実施形態では、治療されている対象は、非骨髄破壊的または骨髄破壊的造血細胞移植を受けたことがあり、処置は、非骨髄破壊的造血細胞移植の少なくとも２か月後〜少なくとも３か月後に施されてもよい。
【０２３４】
ある特定の実施形態では、併用療法方法は、本開示に従って本開示の組成物を投与すること、および化学療法剤をさらに投与することを含む。化学療法剤としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：クロマチン機能の阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害薬、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗剤（葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、および糖修飾アナログなど）、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ相互作用剤（挿入剤など）、およびＤＮＡ修復阻害剤。例示的な化学療法剤としては、これらに限定されないが、以下の群が挙げられる：ピリミジンアナログ（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン、およびシタラビン）、およびプリンアナログ、葉酸アンタゴニスト、および関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））などの代謝拮抗剤／抗がん剤；ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）などの天然産物、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン、およびナベルビンなどの微小管破壊剤、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、サイトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド（ｉｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メルファラン、メクロレタミン（ｍｅｒｃｈｌｏｒｅｈｔａｍｉｎｅ）、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テモゾラミド（temozolamide）、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびエトポシド（ＶＰ１６））を含む抗増殖剤／抗有糸分裂剤；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシンなどの抗生物質；酵素（Ｌ−アスパラギンを全身性に代謝し、それら自体のアスパラギンを合成する能力を有しない細胞を欠乏させるＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；窒素マスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよびアナログ、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソ尿素（カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびアナログ、ストレプトゾシン）、トラゼン−ダカルバジニン（ｔｒａｚｅｎｅｓ−ｄａｃａｒｂａｚｉｎｉｎｅ）（ＤＴＩＣ）などの抗増殖性／抗有糸分裂性アルキル化剤（ＤＴＩＣ）；葉酸アナログ（メトトレキセート）などの抗増殖性／抗有糸分裂性代謝拮抗剤；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモンアナログ（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）、およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩、およびトロンビンの他の阻害剤）；線維素溶解剤（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、およびウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌剤（ブレベルジン）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（ＴＮＰ４７０、ゲニステイン）および成長因子阻害剤（血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断剤；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ、リツキシマブ）；キメラ抗原受容体；細胞周期阻害剤および分化誘導剤（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド（eniposide）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、およびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルペドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾン、およびプレニゾロン（prenisolone））；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能障害誘導剤、コレラ毒素、リシン、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）アデニル酸シクラーゼ毒素、またはジフテリア毒素などの毒素、およびカスパーゼ活性化因子；ならびにクロマチン破壊因子。
【０２３５】
本開示の別の態様は、ＮＳＣＬＣ、結腸直腸がん、膵臓がん、ＡＭＬ、胆道がん、乳がん、卵巣がん、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である別の（他の）適応症、またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原が治療標的である別の（他の）適応症のいずれか１つまたは複数の処置に使用するための、および／または処置用の医薬の調製に使用するための、および／または養子免疫療法に使用するための、本明細書に記載のような本開示の組成物（例えば、結合タンパク質、ＴＣＲ、宿主細胞、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫原性組成物）に関する。本明細書で企図されるある特定の処置方法または予防方法は、本明細書に開示のような結合タンパク質またはＴＣＲをコードするおよび／または発現する宿主細胞（自己性、同種異系、または同系であってもよい）を投与することを含む。
【０２３６】
処置することを必要とする対象を処置するための、および／または対象において免疫応答を誘導するための方法であって、本明細書に記載のような有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法も提供される。対象は、ＮＳＣＬＣ、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、胆道がん、ＡＭＬ、およびＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である別の（他の）適応症、またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原が治療標的である別の（他の）適応症を有してもよくまたは有する疑いがあってもよい。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、２回またはそれよりも多く対象に投与してもよい。
【０２３７】
ある特定の実施形態では、本方法は、養子細胞療法（例えば、本明細書に開示のような）を対象に投与することをさらに含んでいてもよい。種々の実施形態では、本方法は、アジュバントまたはチェックポイント阻害剤のうちの少なくとも１つを対象に投与することをさらに含んでいてもよく、アジュバントまたはチェックポイント阻害剤は、ＩＬ−２、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、もしくはＣＴＬＡ−４阻害剤、または本明細書に開示のような別の阻害剤もしくは組成物の少なくとも１つを含む。
【０２３８】
一部の実施形態では、Ｔ細胞に基づくネオ抗原ワクチンを含む免疫原性組成物を使用することができる（例えば、国際公開第２０１７／１９２９２４号パンフレットを参照。この文献のＴ細胞ワクチン、免疫原性エンハンサー、トランスポゾン発現構築物、および関連方法は全体が参照により組み込まれる）。ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、リポソームＲＮＡ調製物を含む（例えば、Kreiter,  et  al,  Nature  520:  692,  2015を参照。この文献の調製物およびそれを作製するための方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ペプチドパルス樹状細胞（apeptide-pulsed  dendritic  cell）または他の抗原提示細胞を調製するために使用され、調製は、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。
【０２３９】
また、本開示は、抗原パルス抗原提示細胞を調製するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、抗原提示細胞による抗原プロセシングおよび抗原提示が生じるのに十分な条件下および時間にわたって、（ｉ）対象と免疫適合性である抗原提示細胞の集団ならびに（ｉｉ）本明細書に記載のようなポリヌクレオチド、ペプチド、免疫原性組成物、および／または発現ベクターを接触させ、それによりＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶまたはＨｅｒ２−ＩＴＤに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発することが可能な抗原パルス抗原提示細胞を得ることを含む。本方法は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞またはＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞を生成するのに十分な条件下および時間にわたって、抗原パルス抗原提示細胞を１つまたは複数の免疫適合性Ｔ細胞と接触させることをさらに含んでいてもよい。
【０２４０】
本明細書の上記に開示のようなＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的免疫細胞またはＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的免疫細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで拡大増殖させて、それぞれＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的免疫細胞またはＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的免疫細胞の１つまたは複数のクローンを得ることを含む方法も提供される。ある特定の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞を含み、本方法は、Ｔ細胞をＴ細胞受容体構造特徴付けに十分な量に拡大増殖させること、および上記１つまたは複数のクローンの１つまたは複数のＴ細胞受容体ポリペプチドコード核酸配列を決定することを含む。
【０２４１】
ある特定の実施形態では、本方法は、免疫細胞の集団に、そのようにして決定されたＴ細胞受容体ポリペプチドコード核酸配列を含むポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクトまたは形質導入し、それにより細胞が対象に投与された際に、それぞれＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶまたはＨｅｒ２−ＩＴＤに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を養子移入または付与するのに有効な量の操作されたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的免疫細胞または操作されたＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的免疫細胞の集団を得ることをさらに含む。
【０２４２】
ＴＣＲ配列決定の進歩は、記載されており（例えば、Robins,  et  al,  2009  Blood  114:  4099;  Robins,  et  al,  2010  Sci.  Translat.  Med.  2:47ra64,  PMID:  20811043；Robins,  et  al.  2011  (Sept.  10)  J.  lmm.  Meth.  Epub  ahead  of  print,  PMID:  21945395；およびWarren,  et  al.,  2011  Genome  Res.  21:  790）、本開示による実施形態を実施する過程で使用することができる。同様に、Ｔ細胞に所望の核酸をトランスフェクト／形質導入するための方法は、所望の抗原特異性のＴ細胞を使用する養子移入手順を有するものとして記載されており（例えば、米国特許出願公開第２００４／００８７０２５号明細書）（例えば、Schmitt,  et  al.,  Hum.  Gen.  20:  1240,  2009;  Dossett,  et  al.,  Mol.  Ther.  77:  742,  2009；Till  et  al,  Blood  112:  2261,  2008；Wang,  et  al.,  Hum.  Gene  Ther.  18:  112,  2007；Kuball  et  al,  Blood  109:  2331,  2007；米国特許出願公開第２０１１／０２４３９７２号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０１８９１４１号明細書；およびLeen,  et  al.,  Ann.  Rev.  Immunol.  25:  243,  2007）、こうした方法論の本開示の実施形態への応用は、ＨＬＡ受容体と複合体を形成したＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ（配列番号１）ネオ抗原またはＨｅｒ２−ＩＴＤ（配列番号２２）ネオ抗原に特異的な親和性増強ＴＣＲに関するものを含む、本明細書の教示に基づいて企図される。
【０２４３】
一部の実施形態では、免疫細胞株は、Hoら（2006  J  Immunol  Methods  310  (1-2):  40-52)を参照）により記載のように生成することができる。例えば、樹状細胞（ＤＣ）は、ＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）を補充したＤＣ培地（ＣＥＬＬＧＥＮＩＸ（商標）、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で２日間にわたって（−２日目〜０日目）培養することにより、ＰＢＭＣのプラスチック付着画分から得ることができる。−１日目に、成熟サイトカインＴＮＦα（１１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（２０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）、およびＰＧＥ２（１μｇ／ｍｌ）を添加してもよい。０日目に、ＤＣを回収し、洗浄し、無血清ＤＣ培地中にて２〜４時間にわたってペプチド（１０μｇ／ｍｌの単一ペプチドまたは２μｇ／ｍｌのペプチドプール）でパルスしてもよい。ＣＤ８  Ｔ細胞を、抗ＣＤ８マイクロビーズ（ＭＩＬＴＥＮＹＩ  ＢＩＯＴＥＣ（商標）、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆ．）を使用してＰＢＭＣから単離し、ＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で１：５〜１：１０のエフェクター標的（Ｅ：Ｔ）比のＤＣで刺激してもよい。３日目に、ＩＬ−２（１２．５Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）を添加してもよい。細胞を、ＩＬ−２１の存在下で２時間にわたってペプチドパルスした後、照射された自己ＰＢＭＣのプラスチック付着画分を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用して１０日目〜１４日目に再刺激してもよい。再刺激後、細胞を１日目からＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）を補充してもよい。限界希釈の細胞をプレーティングし、ＯＫＴ３（ＯＲＴＨＯ  ＢＩＯＴＥＣＨ（商標）、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、Ｎ．Ｊ．）でコーティングしたＴＭ−ＬＣＬおよびフィーダーとしての同種異系ＰＢＭＣを用いて拡大増殖させることにより（ＲＥＰプロトコール）、（Ho,  et  al.,  2006  J  Immunol  Methods  310  (1-2):  40-52を参照）に記載のようにＴ細胞クローンを生成することができる。
【実施例】
【０２４４】
以下の例は、本開示の方法、使用、および組成物の例示である。本開示に照らすと、当業者であれば、過度の実験作業を行わずに本開示の方法および組成物のこうした例および他の例のバリエーションが可能であることを認識する。
【０２４５】
（実施例１）
ＮＳＣＬＣ研究のための臨床プロトコール
施設内審査委員会により承認された第Ｉ相〜第ＩＩＩ相ＮＳＣＬＣの治癒目的切除を受けた患者を含むプロトコールに登録されていた４人の患者（１３４７、１４９０、１２３８、および１１３９）からインフォームドコンセントを取った後に得たＮＳＣＬＣ組織および非隣接肺組織（悪性病変から可能な限り少なくとも３ｃｍ遠く離れた）を使用して、Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒにて単一施設研究を実施した。リンパ節切除に由来するホルマリン固定パラフィン包埋組織を、施設内審査委員会により承認された別のプロトコールに登録されていた１人の患者（５１１）から得た。末梢血試料を、患者５１１、１１３９、および１２３８から得た。白血球アフェレーシス産物を、施設内審査委員会により承認されたプロトコール下にあった患者１３４７および１４９０から得た。すべての研究は、血液採取または白血球アフェレーシスが医学的に禁忌である患者を除外し、ベルモントレポートに従って実施した。
【０２４６】
患者５１１は、７０歳でリンパ節および骨に転移性の肺腺癌を呈した７３歳女性元喫煙者であった。この女性は、カルボプラチンおよびペメトレキセドで処置され、続いてペメトレキセド単剤療法で処置され、血液採取が行われた時点では診断から３年後の長期疾患安定期間にあった。
【０２４７】
患者１３４７は、ステージＩＩＢの扁平上皮癌を呈し、それが外科的に切除され、続いてアジュバントであるカルボプラチンおよびパクリタキセルで処置された６４歳男性元喫煙者であった。血液採取の時点で、この男性は、経過観察下にあり、疾患の証拠はなかった。
【０２４８】
患者１４９０は、最初にｐＴ２ａ肺腺癌を呈し、それが切除されたが、その後肺門周囲および縦隔局所再発を示した６２歳女性元喫煙者であった。この女性は、カルボプラチンおよびパクリタキセルによる根治的化学放射線処置の開始後に血液採取した。
【０２４９】
患者１１３９は、最初にステージＩ肺腺癌の切除を受け、その後定位放射線外科療法で処置され、続いてカルボプラチンおよびペメトレキセドで４サイクル、続いてペメトレキセド維持で６サイクル処置されたが局所再発および脳転移を示した６９歳女性元喫煙者である。疾患進行が生じ、この女性はニボルマブで処置されたが、その後も疾患が進行した。この患者は、ニボルマブでの処置中に血液採取した。
【０２５０】
患者１２３８は、最初にステージＩＩＩＡの肺腺癌を呈し、それが切除され、続いてアジュバントであるペメトレキセドおよびシスプラチンで処置され、その後１年後に転移性疾患へと進行した６８歳非喫煙男性だった。この患者は、アファタニブで処置された後で進行し、ペムブロリズマブで処置された後で進行した。次いで、この患者には、ドセタキセルおよびラミシルマブが投与され、続いてラミシルマブで維持された。血液採取の時点ではこの男性はラミシルマブ下にあった。
【０２５１】
患者１４９０は、最初にｐＴ２ａ肺腺癌を呈し、それが切除されたが、その後、肺門周囲および縦隔局所再発を示した６２歳女性元喫煙者だった。この女性は、カルボプラチンおよびパクリタキセルによる根治的化学放射線処置の開始後に血液採取した。
【表１】
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【０２５２】
（実施例２）
エクソーム解析およびＲＮＡ配列決定のための核酸調製
非腫瘍ＤＮＡを、患者１４９０、１２３８、および１１３９の非隣接肺から単離した。患者５１１および１３４７の場合、非腫瘍ＤＮＡとして血液を使用した。腫瘍、肺組織、または血液由来のＰＢＭＣに由来する単一細胞懸濁物を、ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ  ＡＬＬＰＲＥＰ（商標）Ｍｉｃｒｏキットで処理して、エクソーム解析のためにＤＮＡを単離し、その後ＲＮＡ−ｓｅｑプロファイリングのためにＲＮＡを取っておいた。初期腫瘍切除から単離されたＤＮＡに加えて、患者１３４７の腫瘍から患者由来異種移植片（ＰＤＸ）を確立し、ＰＤＸ腫瘍をＤＮＡおよびＲＮＡの調製に使用した。ゲノムＤＮＡ濃度は、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）ＱＵＢＩＴ（登録商標）２．０蛍光光度計（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ−ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＴＲＩＮＥＡＮ（商標）ＤＲＯＰＳＥＮＳＥ９６（商標）分光光度計（ＣＡＬＩＰＥＲ（商標）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）で定量した。
【０２５３】
（実施例３）
全エクソーム配列決定
ＡＧＩＬＥＮＴ（商標）ＳＵＲＥＳＥＬＥＣＴＸＴ（商標）試薬キットを使用してエクソーム配列決定ライブラリーを調製し、ＡＧＩＬＥＮＴ（商標）Ａｌｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  ｖ６（ＡＧＩＬＥＮＴ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してエクソン標的を単離した。ＣＯＶＡＲＩＳ（登録商標）ＬＥ２２０集束超音波処理装置（ＣＯＶＡＲＩＳ（登録商標），Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して２００ｎｇのゲノムＤＮＡを断片化し、ＳＣＩＣＬＯＮＥ（登録商標）ＮＧＳｘワークステーション（ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）でライブラリーを作成および解析した。ＡＧＩＬＥＮＴ（商標）２２００  ＴＡＰＥＳＴＡＴＩＯＮ（商標）を使用してライブラリーサイズ分布を検証した。追加ライブラリーのＱＣ、プールされたインデックス付きライブラリーのブレンディング、およびクラスター最適化は、ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ−ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）ＱＵＢＩＴ（登録商標）２．０蛍光光度計を使用して実施した。
【０２５４】
得られたライブラリーを、ペアエンド１００ｂｐ（ＰＥ１００）戦略を使用してＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）ＨＩＳＥＱ（商標）２５００で配列決定した。ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）のＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖ１．１８ソフトウェアを使用して画像解析およびベースコーリングを実施し、続いてＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）のｂｃｌ２ｆａｓｔｑ変換ソフトウェアｖ１．８．４（support_illumina_com/downloads/bcl2fastq_conversion_software_184_html）を使用してインデックス付きリードの「脱多重化」およびＦＡＳＴＱファイルの生成を行った。
【０２５５】
標準的なＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）品質フィルターを通過したリードペアをさらなる分析のために保持し、ここで報告されている試料中の腫瘍については平均６５．２Ｍのリードペアおよび正常なものについては６４．４Ｍのリードペアを得た。ＢＷＡ−ＭＥＭショートリードアライナーを用いてペアリードを、ヒトゲノム参照（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）に対してアラインした（Li  H.  arXiv  preprint  arXiv:13033997.  2013およびLi  H,  et  al.  Bioinformatics.  2009;  25(14):  1754-60を参照）。標準ＢＡＭ形式の得られたアライメントファイルを、推奨される最良慣行に従って（Van  der  Auwera  GA,  et  al.  Current  protocols  in  bioinformatics.  2013:  11.0.  1-.0.  33を参照）品質スコアの再較正、インデル再アライメント、および重複削除のためにＰｉｃａｒｄ２．０．１およびＧＡＴＫ３．５（McKenna  A,  et  al.  Genome  research.  2010;  20(9):  1297-303を参照）で処理した。
【０２５６】
分析の準備ができた腫瘍ＢＡＭファイルおよび正常ＢＡＭファイルから体細胞変異をコールするために、２つの独立したソフトウェアパッケージを使用した：ＭｕＴｅｃｔ  １．１．７（Cibulskis  K,  et  al.  Nature  biotechnology.  2013;31(3):  213を参照）、Ｓｔｒｅｌｋａ  １．０．１４（Saunders  CT,  et  al.  Bioinformatics.  2012;  28(14):  1811-7を参照）。両ツールからのＶＣＦ形式でのバリアントコールをＯｎｃｏｔａｔｏｒ（Ramos  AH,  et  al.  Human  mutation.  2015;  36(4)を参照）で注釈した。注釈付きのミスセンス体細胞バリアントを、以下のように試料毎に単一の要約にまとめた。まず、「体細胞」と注釈付けられたがｄｂＳＮＰに存在するあらゆる変異は、ＣＯＳＭＩＣにも存在しない場合、またはそのマイナー対立遺伝子頻度が１％よりも大きい場合（ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｓｎｐ１５０共通表に従って）削除した。両バリアントコーラーによりサポートされたバリアントを保持し、１つのバリアントコーラーにしかサポートされなかったバリアントを手作業での検査に供した。
【０２５７】
（実施例４）
ＲＮＡ配列データ処理
患者１３４７の場合、ＰＤＸに由来する腫瘍細胞を使用して、変異候補のＲＮＡ発現の直接測定を実施した。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを、ＴＲＵＳＥＱ（商標）ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  ｖ２  Ｋｉｔ（ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標），Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＳＣＩＣＬＯＮＥ（登録商標）ＮＧＳｘワークステーション（ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して全ＲＮＡから調製した。ライブラリーサイズ分布を、ＡＧＩＬＥＮＴ（商標）２２００  ＴＡＰＥＳＴＡＴＩＯＮ（商標）（ＡＧＩＬＥＮＴ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して検証した。追加ライブラリーのＱＣ、プールされたインデックス付きライブラリーのブレンディング、およびクラスター最適化は、ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ−ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）ＱＵＢＩＴ（登録商標）２．０蛍光光度計を使用して実施した。ライブラリーをＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）ＨＩＳＥＱ（商標）２５００で配列決定し、６１Ｍのリードペアを生成した（１ペア当たり２つの５０ｎｔリード）。リードを、まずマウス参照アセンブリ（ｍｍ９）に対してアラインして、移植腫瘍ではなくマウスに由来するリードを削除した。残りのリードを、ＲＳＥＭ  １．２．１９を用いてヒトＲｅｆＳｅｑ由来参照トランスクリプトームに対してアラインして（Li  B,  et  al.  BMC  bioinformatics.  2011;  12(1):  323を参照）、各遺伝子の存在量を１００万当たりの転写物（ＴＰＭ）単位で得た。
【０２５８】
（実施例５）
スクリーニングのための変異の選択
各患者について、正常なＤＮＡ試料と比較することにより一塩基バリアント（ＳＮＶ）を決定し、バリアント対立遺伝子頻度および発現によりランク付けして、スクリーニングの候補ペプチドを選択した。患者５１１の場合、バリアント対立遺伝子頻度が２０％よりも大きな、ＭｕＴｅｃｔ  １．１．７（Cibulskis  K,  Lawrence  MS,  Carter  SL,  Sivachenko  A,  Jaffe  D,  Sougnez  C,  et  al.  Sensitive  detection  of  somatic  point  mutations  in  impure  and  heterogeneous  cancer  samples.  Nat  Biotechnol  2013;  31:  213）およびＳｔｒｅｌｋａ  １．０．１４(Saunders  CT,  Wong  WS,  Swamy  S,  Becq  J,  Murray  LJ,  Cheetham  RK.  Strelka:  accurate  somatic  small-variant  calling  from  sequenced  tumor-normal  sample  pairs.  Bioinformatics  2012;  28:  1811-7)によりコールされた変異を、肺腺癌のＴＣＧＡにおける平均発現でランク付けし、上位４５個の変異をスクリーニングした。
【０２５９】
患者１４９０の場合、ＭｕＴｅｃｔ  １．１．７およびＳｔｒｅｌｋａ  １．０．１４の両方により同定されたすべてのＳＮＶは、１０〜４０％のバリアント対立遺伝子頻度を有していた。これらを、肺腺癌のＴＣＧＡにおける平均発現によりランク付けし、上位４６個の変異をスクリーニングした。
【０２６０】
患者１１３９の場合、２０％よりも大きなバリアント対立遺伝子頻度を有する、ＭｕＴｅｃｔ  １．１．７およびＳｔｒｅｌｋａ  １．０．１４の両方によりコールされたＳＮＶを、肺腺癌のＴＣＧＡにおける平均発現によりランク付けし、上位４６個の変異をスクリーニングした。患者１２３８の場合、検出された変異が＜５０個だったため、ＭｕＴｅｃｔ１．１．７またはＳｔｒｅｌｋａ１．０．１４のいずれかによりコールされたＳＮＶを、肺腺癌のＴＣＧＡにおける平均発現によりランク付けし、１００万当たりの転写物（ＴＰＭ）が３個よりも大きな発現を示したＳＮＶをスクリーニングした。
【０２６１】
患者１３４７の体細胞バリアントコーリングにより、バリアント対立遺伝子頻度が低い多数（＞１０，０００個）のＣ＞Ａ／Ｇ＞Ｔトランスバージョンが明らかになった。同様の特性を有する同様の数のバリアントが対応する正常試料にも見出され、それらが、ＤＮＡ剪断中の酸化によるものである可能性があるアーティファクトであることが示唆された（Wakabayashi  O,  Yamazaki  K,  Oizumi  S,  Hommura  F,  Kinoshita  I,  Ogura  S,  et  al.  CD4b  T  cells  in  cancer  stroma,  not  CD8b  T  cells  in  cancer  cell  nests,  are  associated  with  favorable  prognosis  in  human  nonsmall  cell  lung  cancers.  Cancer  Sci  2003;  94:  1003-9）。この特定の試料によるこの問題を回避するため、対応する患者由来異種移植片（ＰＤＸ）からのＲＮＡ−ｓｅｑデータを活用した。ＰＤＸ  ＲＮＡ−ｓｅｑをマウスゲノム（マウスゲノムのｍｍ９リリース）に対してアラインして、マウスから生じるリードを抑制した。残りのリードに対するバリアントコーリングを、ｔｗｏ−ｐａｓｓ  ＳＴＡＲアライメント、スプライスリードの分割、およびＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒの適用を含む（McKenna  A,  Hanna  M,  Banks  E,  Sivachenko  A,  Cibulskis  K,  Kernytsky  A,  et  al.  The  Genome  Analysis  Toolkit:  a  MapReduce  framework  for  analyzing  next-generation  DNA  sequencing  data.  Genome  Res  2010;  20:  1297-303）、Ｂｒｏａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＧＡＴＫ「最良慣行」ＲＮＡ−ｓｅｑバリアントコーリングワークフローに従って実施し、ソフトマスクされた塩基を無視した（software.broadinstitute.org/gatk/documentation/article.php?id=3891）。また、ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒを使用して、対応する正常血液エクソーム試料の生殖系列バリアントをコールした。ＲＮＡ−ｓｅｑにより見出され、生殖系列エクソーム解析で観察されなかったバリアントを保持した。また、追加の候補バリアントを捕捉するため、ＭｕＴｅｃｔ体細胞バリアントコーラーを使用して、分析の準備ができたＰＤＸ  ＲＮＡ−ｓｅｑＢＡＭファイルまたはＰＤＸエクソーム解析ＢＡＭファイルを正常血液エクソームＢＡＭファイルを比較した。上記の過程のすべてにわたって同定されたミスセンス変異を、２３５個の候補バリアントのセットに統合し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）（McKenna  et  al.,  (2010)）を用いてすべて手作業で点検して、切除腫瘍エクソームおよびＰＤＸによりサポートされたが、正常血液エクソームデータでは観察されなかったものを保持した。バリアントを、各位置において別の対立遺伝子をサポートするＲＮＡ−ｓｅｑリードの数によりランク付けし、上位５７個の変異をペプチド合成のために選択した。ＭｕＴｅｃｔ  １．１．７とは異なり、Ｓｔｒｅｌｋａバリアントコーラーは、体細胞性挿入および欠失候補を報告する。報告された２５個未満のインデルを手作業で点検し、バリアント対立遺伝子頻度および含有遺伝子の発現予想を含む、上記の点変異と同様のフィルタリング基準に供した（ＴＣＧＡ  ＬＵＡＤから集計したか、または１３４７個のＰＤＸから直接的に測定した）。得られたタンパク質をナンセンス変異依存分解の影響下におく可能性があるフレームシフトも除外した。患者１２３８に見出されたＨｅｒ２−ＩＴＤを除いて、ナンセンス変異依存分解の影響を受けることが予測されないタンパク質コードインデルは同定されなかった。ナンセンス変異依存分解の誘導基準は、転写物の末端エクソン前に終止コドンが作出されることである。
【０２６２】
（実施例６）
Ｔ細胞培養
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、リンパ球分離培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用した密度勾配遠心分離により得られたものを使用して患者および正常ドナーの血液から単離し、ＥＤＴＡ（３．６ｍＭ）を補充したＰＢＳで３回洗浄した。
【０２６３】
患者ＰＢＭＣを、ＥＬＩＭ  ＢＩＯＰＨＡＲＭ（商標）から得られた重複する２０マーペプチドで刺激した。２０個アミノ酸の配列の＋７位または＋１３位に変異残基を有する各変異を跨ぐ２つのペプチドを刺激に使用し、５０個の変異を包含する最大で１００個のペプチドのプールを刺激に使用した。Ｔ細胞反応性を分析するためのその後の実験は、＋１３位に変異アミノ酸を有する＞８０％純度の２７マーペプチドで実施した。
【０２６４】
凍結保存ＰＢＭＣを解凍し、１０％ヒト血清（自家製）、５０μＭベータ−メルカプトエタノール、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充した、Ｌ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ（商標））を有するＲＰＭＩ培地（ＣＴＬ培地と呼ばれる）、ならびに２ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−７（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ（登録商標））中で一晩静置した。翌朝、ＰＢＭＣを洗浄し、１０７個の細胞を、６ウェルプレートの個々のウェルの、サイトカインを有しない各ペプチドの１μｇ／ｍｌのプールを含有する５ｍｌのＣＴＬ培地に播種した。＋３日目に、組換えＩＬ−２（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ（登録商標））を、終濃度が１０Ｕ／ｍｌになるように添加し、＋３、＋６、および＋９日目に、ＩＬ−２の補充を伴って、培地の半分の交換を実施した。１３日目に、個々のウェルから細胞を回収し、ＥＬＩＳＡおよび／またはサイトカイン染色アッセイによりアッセイした。
【０２６５】
初期アッセイで反応性であると同定された抗原特異的Ｔ細胞の富化を、１つまたは幾つか（最大で５つのプールされた）精製変異ペプチドおよび追加のサイトカインを使用してＰＢＭＣを刺激した後で実施した。これにより、初期刺激による成長およびその後の限界希釈培養での効率が向上した。手短に言うと、まずＰＢＭＣを、ＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−２  １０Ｕ／ｍｌの存在下にて、１μｇ／ｍｌの２７マー変異ペプチドで１３日間刺激し、次いで培養物を、２０μｇ／ｍｌの単一の２７マーペプチドでパルスした自己Ｂ細胞で５時間再刺激し、続いてＦＡＣＳＡＲＩＡ（商標）ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、生細胞ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞を染色および選別した（インターフェロン分泌キットＡＰＣ、Ｍｉｌｔｅｎｉｉカタログ番号１３０−０９０−７６２。含まれている捕捉および検出試薬、ならびに抗ＣＤ４パシフィックブルー（クローンＲＰＡ１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３００５２１）および抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ（クローンＨＩＴ８ａ、ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｇｅｎカタログ番号５５５６３４）を用いた）。
【０２６６】
選別したＴ細胞は、抗原特異的細胞、ならびにＩＦＮγを非特異的に産生した細胞を含んでいた。純度は未知だった。抗原特異的だったクローンまたはオリゴクローン細胞集団を単離するために、選別した細胞（１ウェルあたり３個または１０個の細胞）を、１．０×１０５個の照射した同種異系ＰＢＭＣ、２μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（ＳＩＧＭＡ（登録商標））、およびＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下にて、限界希釈の９６ウェルプレートで１４〜２０日間にわたって拡大増殖させ、１４日目に追加のＩＬ２を補充した。拡大増殖した後、Ｔ細胞株（１０，０００〜１００，０００個の細胞）を、変異体ペプチド（１０μｇ／ｍＬ）でパルスした自己Ｂ細胞（１００，０００個の細胞）と共にインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定して、抗原特異性を有するＴ細胞を同定した。次いで、反応性株を、以前に記載の急速拡大増殖プロトコール（rapid  expansion  protocol）を使用して拡大増殖し、凍結保存した（Riddell  SR,  et  al.  Journal  of  immunological  methods.  1990;  128(2):  189-201を参照）。凍結保存した細胞を解凍し、１０％ＤＭＳＯおよび追加の１０％ヒト血清（終濃度２０％のヒト血清の場合）を補充したＣＴＬ培地中で一晩静置した（Riddell  SR,  Greenberg  PD.  The  use  of  anti-CD3  and  anti-CD28  monoclonal  antibodies  to  clone  and  expand  human  antigen-specific  T  cells.  J  Immunol  Methods  1990;  128:  189-201）。凍結保存した細胞を解凍し、アッセイ前に、ＩＬ２（１０Ｕ／ｍＬ）を補充したＣＴＬ培地中で一晩静置した。
【０２６７】
ＴＩＬ培養の場合、患者由来腫瘍組織の６〜１２断片（２×２×２ｍｍ）を、ＩＬ２（６，０００Ｕ／ｍＬ）の存在下にて、２４ウェルプレートのＴ細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、５０μＭベータ−メルカプトエタノール）で３５日間にわたって培養した。コンフルエントになったらＴＩＬを継代した。３５日間の拡大増殖プロトコールが終了した後、免疫学的アッセイで使用する前に細胞を凍結保存した。
【０２６８】
（実施例７）
抗原提示細胞
自己Ｂ細胞を、ＣＤ１９を認識する抗体でコーティングした磁気ビーズ（ＭＩＬＴＥＮＹＩ  ＢＩＯＴＥＣ（商標）、カタログ番号１３０−０５０−３０１）による正の選択を、製造業者の指示（ＭＩＬＴＥＮＹＩ  ＢＩＯＴＥＣ（商標））に従って使用して、ＰＢＭＣから単離した。Ｂ細胞を、記載のような（Tran  E,  et  al.  Science.  2014;  344  (6184):  641-5を参照）ヒトＣＤ４０Ｌを発現する３Ｔ３細胞の存在下にて、１０％ヒト血清（自家製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（商標））、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（商標））を補充したＩＭＤＭ培地（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（商標））、ならびに２００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ（登録商標））で構成されるＢ細胞培地中で７日間にわたって培養した。次いで、Ｂ細胞を、照射した（５０００Ｇｙ）３Ｔ３発現ヒトＣＤ４０Ｌ細胞で再刺激し、ＩＬ−４を含有する新鮮な培地を３日毎に添加した。刺激後＋３日目に、Ｂ細胞をアッセイに使用した。ＫＲＡＳ特異的Ｔ細胞の場合、一部の実験では、ＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０４であるＢ−ＬＣＬ細胞株（ＣＬＣ）を抗原提示細胞として使用した。ＨＬＡ型のＬＣＬ細胞株ＢＭ１４、ＤＥＭ、ＬＵＹ、ＣＢ６Ｂ、およびＤＥＵは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）から入手した。残りのＬＣＬ株は、Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｅｎｔｅｒのＭａｒｉｅ  Ｂｌｅａｋｌｅｙ氏から寄贈されたものである。
【０２６９】
（実施例８）
ＭＲＮＡ発現およびトランスフェクション
エンドソームを標的とするＲＮＡ発現を、Ｓａｈｉｎグループにより記載の方法を使用して実施した（Kreiter  S,  Selmi  A,  Diken  M,  Sebastian  M,  Osterloh  P,  Schild  H,  et  al.  Increased  antigen  presentation  efficiency  by  coupling  antigens  to  MHC  class  I  trafficking  signals.  J  Immunol  2008;  180:  309-18）。この方法では、抗原をクラスＩ  ＭＨＣ選別シグナルと融合させることにより、抗原をエンドソームへと標的化する。
【０２７０】
ｍＲＮＡ発現構築物ｐＪＶ５７（Veatch  JR,  Lee  SM,  Fitzgibbon  M,  Chow  IT,  Jesernig  B,  Schmitt  T,  et  al.  Tumor  infiltrating  BRAFV600E-specific  CD4  T  cells  correlated  with  complete  clinical  response  in  melanoma.  J  Clin  Invest  2018;  128:  1563-8）を遺伝子合成により構築した（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。これは、ヒトＨＬＡ−Ｂ遺伝子のＮ末端２５個アミノ酸に融合したＴ７プロモーター、それに続いてＢａｍＨＩ制限部位、高感度ＧＦＰのコード配列、ＡｇｅＩ制限部位、ヒトＨＬＡ−Ｂ遺伝子のＣ末端５５個アミノ酸、それに続いてヒトベータ−グロビン非翻訳領域、それに続いて３０個ヌクレオチドのポリＡテール、および次いでポリＡテールの切断を指図するＳａｐＩ制限部位を含有していた。
【０２７１】
ｐＪＶ１２６を、以下のもの：５’ＡｇｅＩおよび３’ＢａｍＨＩ部位により挟まれたＨｅｒ２アミノ酸７６０〜７８７をコードするアニールしたオリゴヌクレオチド（Ｕｌｔｒａｍｅｒｓ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＡｇｅＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＪＶ５７にライゲーションすることによりクローニングした。ｐＪＶ１２７は、ＹＶＭＡ縦列重複を含有する５’ＡｇｅＩおよび３’ＢａｍＨＩ部位により挟まれたＨｅｒ２アミノ酸７６０〜７８７をコードするアニールしたオリゴヌクレオチド（Ｕｌｔｒａｍｅｒｓ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をライゲーションすることにより作製した。
【０２７２】
ｐＪＶ１２８およびｐＪＶ１２９を、それぞれＫＲＡＳの最初の２５個アミノ酸またはＧ１２Ｖ置換を有するＫＲＡＳの最初の２５個アミノ酸を用いて同じように合成した。ｐＪＶ１２６およびＪＶ５７に基づく他のプラスミドを、ＳａｐＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で線形化し、ｍＲＮＡを、Ｈｉｇｈｓｃｒｉｂｅ  Ｔ７  ＡＲＣＡ  ｍＲＮＡキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写し、製造業者の指示に従ってリチウム沈殿により精製した。
【０２７３】
ＲＮＡトランスフェクションのため、Ｂ細胞またはＢ−ＬＣＬを回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、次いでＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に３０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。ＩＶＴ  ＲＮＡ（１０ｍｇ）を２ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベットの底部にアリコートし、１００ｍＬのＡＰＣをキュベットに直接添加した。エレクトロポレーションに使用した最終ＲＮＡ濃度は１００ｍｇ／ｍＬだった。エレクトロポレーションは、ＢＴＸ−８３０矩形波エレクトロポレーター：１５０Ｖ、２０ｍｓ、および１回のパルスを使用して実施した。次いで、共培養する前に、細胞を、ＩＬ４を補充したＢ細胞培地に１６時間移した（Tran  E,  Turcotte  S,  Gros  A,  Robbins  PF,  Lu  YC,  Dudley  ME,  et  al.  Cancer  immunotherapy  based  on  mutation-specific  CD4b  T  cells  in  a  patient  with  epithelial  cancer.  Science  2014;  344:  641-5）。
【０２７４】
（実施例９）
サイトカイン放出アッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイは、５０，０００個のＴ細胞を、５％熱不活化ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ（ＧＩＢＣＯ（商標））中にて指定濃度のペプチドでパルスした１００，０００個の自己Ｂ細胞またはＢ−ＬＣＬ株と共に、９６ウェル丸底プレートでインキュベートすることにより実施した。上清中のＩＦＮ−γを、１：１、１：１０、および１：１００に希釈し、ヒトＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（商標））を使用して技術的な二連または三連で定量した。ＨＬＡ遮断実験は、ペプチドを添加する１時間前に、２０μｇ／ｍｌの抗体  抗クラスＩ（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標）、カタログ番号３１１４１１）、抗ＨＬＡ  ＤＲ（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標）クローンＬ２４３、カタログ番号３０７６１１）、またはＨＬＡ−ＤＱ（ＡＢＣＡＭ（商標）、クローンｓｐｖ−ｌ３、カタログ番号ａｂ２３６３２）を抗原提示細胞に添加することにより実施した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、ヒトＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ−ＰＲＯ（商標）キット（ＭＡＢＴＥＣＨ（商標））を製造業者の指示に従って使用して、ＣＴＬ培地中で２０μｇ／ｍｌの各ペプチドでパルスした２００，０００個の自己Ｂ細胞と共に２０，０００〜１００，０００個のＴ細胞をインキュベートすることにより実施した。細胞内ＩＦＮ−γ染色の場合、ＰＢＭＣ（１００，０００個）を、ブレフェルジンＡ（ＧＯＬＧＩＰＬＵＧ（商標）、ＢＤ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（商標））の存在下で、表記のペプチド（２０μｇ／ｍｌ）でパルスした自己Ｂ細胞（１００，０００個）と共にインキュベートし、次いで固定し、ＢＤ（商標）細胞内染色キット（ＢＤ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（商標））を使用して透過処理し、ＦＡＣＳＣＡＮＴＯ（商標）ＩＩフローサイトメーターを使用して分析した。
【０２７５】
（実施例１０）
ＴＣＲ同定および構築
ＴＣＲアルファおよびベータ配列を、実施例１１〜１２に記載のように５’ＲＡＣＥによるクローンＴ細胞集団から得た。コドン最適化配列のＴＣＲ配列を合成し、以前に報告されているような翻訳スキップ配列により連結されたレンチウイルスベクターにクローニングした（Veatch  JR,  et  al.  The  Journal  of  clinical  investigation.  2018;  128(4)  1563-68を参照）。試料中のＴＣＲ  Ｖβ配列の頻度は、ＡＤＡＰＴＩＶＥ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）のＩＭＭＵＮＯＳＥＱ（商標）ヒトＴＣＲＢキット、およびＡＤＡＰＴＩＶＥ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）ソフトウェアプラットフォームでの分析を使用して得た。
【０２７６】
（実施例１１）
ＴＣＲ  ＶβおよびＶα配列決定
ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＤＮＥＡＳＹ（商標）またはＱＩＡＭＰ（商標）マイクロＤＮＡキットを製造業者の指示に従って使用して、ＤＮＡを単離した。ヒトＴＣＲＢ配列決定キット（ＡＤＡＰＴＩＶＥ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標））を製造業者の指示に従って使用して、ＴＣＲＢ配列決定を実施し、ＭｉＳｅｑ（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｃｏｒｅ）を使用して配列決定し、ＡＤＡＰＴＩＶＥ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）ソフトウェアを使用してデータを分析した。
【０２７７】
（実施例１２）
ＴＣＲ配列の同定
ＲＮＥＡＳＹ（商標）ＰｌｕｓミニＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（商標））を用いて、全ＲＮＡをＴ細胞株から抽出した。RACE-ready  cDNAは、ＳＭＡＲＴＥＲ（登録商標）ＲＡＣＥ５’／３’キット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ（商標））を製造業者のプロトコールに従って使用してＲＮＡから生成した。ＣＬＯＮＥＡＭＰ（商標）ＨｉＦｉ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ（商標））を使用して、３’ｃＤＮＡ断片を増幅した。アルファおよびベータＴＣＲバンド（１Ｋｂ）を検出するように、遺伝子特異的プライマー（ヒトＴＣＲ  Ｃｂｅｔａ１リバース：５’−ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＧＡＡ  ＡＴＣ−３’  配列番号４１；ヒトＴＣＲ  Ｃｂｅｔａ２リバース：５’−ＴＧＧ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＴＧＧ−３’  配列番号４２；ヒトＴＣＲ  Ｃａｌｐｈａリバース：５’−ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＣＧＴ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＡＴＴ  Ａ−３’  配列番号４３）を設計した。３ステップのタッチダウンＰＣＲ反応は、９５℃で１０秒間、６０℃で１５秒間（各サイクルで０．２℃ずつ低下）、および７２℃で１分間の３５サイクルを経た。断片を１％アガロースゲルに流し、ＰＥＮＴＲ（商標）ディレクショナルＴＯＰＯ（商標）クローニング（ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ（商標））用に精製した（ＱＩＡＱＵＩＣＫ（商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ（商標））。ＤＮＡを、各ＴＣＲアルファおよびベータの８〜１０個のクローンから抽出し（ＱＩＡＰＲＥＰ（商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ（商標））、続いてサンガー配列決定を行った（ＪＶ２９８：５’−ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＴＴ−３’  配列番号４４；ＪＶ３００：５’−ＡＡＣ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＡＣＧ  ＣＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣ−３’  配列番号４５）。
（実施例１３）
ＴＣＲベクター構築
ＴＣＲ構築は、記載のような（Lim  CS,  et  al.  RNA  biology.  2016;  13(9):  743-7を参照）ウッドチャック肝炎ウイルスＸタンパク質の開始コドンおよび推定プロモーター領域に６つの点変異を導入することによりさらに修飾されたベクターＰＲＲＬ（Jones  S,  et  al.  Human  gene  therapy.  2009;  20(6):  630-40を参照）において行い、ＴＣＲβ遺伝子は、ＴＣＲアルファ遺伝子の前にあり、Ｐ２Ａ翻訳スキップ配列で隔てられていた。記載のように（Kuball  J,  et  al.  Blood.  2007;  109(6):  2331-8を参照）、導入されたＴＣＲ鎖の対形成を容易にするためにシステイン残基を導入した。特異的な可変領域およびＣＤＲ３配列は表１に示されている。ＴＲＢＶおよびＣＤＲ３およびＴＲＢＪ配列、それに続いて残基５７がシステインで置換されたＴＣＲＢ配列、それに続いてＰ２Ａスキップ配列ならびにＴＲＡＶおよびＣＤＲ３配列、それに続いてＴＲＡＪおよびＴＲＡＣ配列を含有するコドン最適化ＤＮＡ断片を、遺伝子ストリングとして合成し（ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（商標））、ＮＥＢＵＩＬＤＥＲ（登録商標）クローニングキット（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標））を使用して、ＰｓｔＩおよびＡｓｃＩで線形化したレンチウイルスベクターＰＲＲＬ−ＳＩＮ（ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ（商標））にクローニングし、配列を検証した。残基５７で置換したシステインは、組換えＴＣＲのα鎖およびβ鎖の対形成を保証し、内因性ＴＣＲα鎖およびβ鎖との誤対形成を回避することができる。形質導入の１週間後、細胞を、特異的抗体を使用してＶβ発現に基づいて選別し（表２）、上記に記載のように拡大増殖した。Ｔ細胞は、拡大増殖後の１４日目にアッセイに使用したかまたは凍結保存した。
【表２】
2021534752.tif 000004
【０２７８】
（実施例１４）
ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９媒介性遺伝子欠失
等容積の８０μＭ  ＴｒａｃＲＮＡ（ＩＤＴ）を、二重鎖緩衝液（ＩＤＴ）中で８０μＭのｇＲＮＡ  ＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ（Kargl  J,  Busch  SE,  Yang  GH,  Kim  KH,  Hanke  ML,  Metz  HE,  et  al.  Neutrophils  dominate  the  immune  cell  composition  in  non-small  cell  lung  cancer.  Nat  Commun  2017;  8:  14381）と混合し、加熱ブロックにて９５℃に５分間加熱し、ゆっくりとした冷却を可能にすることにより、ＴＣＲアルファ定常領域の最初のエクソンを標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ＲＮＰを、以前に記載のように作出した（Ren  J,  Liu  X,  Fang  C,  Jiang  S,  June  CH,  Zhao  Y.  Multiplex  genome  editing  to  generate  universal  CAR  T  cells  resistant  to  PD1  inhibition.  Clin  Cancer  Res  2016;  23:  2255-66）。次いで、得られた４０μＭの二重鎖ＲＮＡを、等容積の２４μＭ  Ｃａｓ９タンパク質（ＩＤＴ）および１／２０容積の４００μＭ  Ｃａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（ＩＤＴ）と混合し、エレクトロポレーション前に室温で１５分間インキュベートした。
【０２７９】
０日目に、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＩＲＢ承認プロトコールについてインフォームドコンセントを提供した４人の患者に由来する凍結保存された健常ヒトドナーＰＢＭＣから、ＥａｓｙＳＥＰヒトＣＤ４＋単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用した負の免疫選択により単離し、ＣＴＬ培地中にてＩＬ２（５０Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ７（５ｎｇ／ｍＬ）の存在下にて、３：１のビーズ：細胞比の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８マイクロビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２日間刺激した。また、０日目に、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に、ＴＣＲベクター、ならびにｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号１２２６０）およびｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号１２２５９）パッケージングプラスミドを一過性にトランスフェクトした。＋２日目に、磁気ビーズを除去し、１×１０６細胞を、２０μｌの緩衝液Ｐ３中でＬｏｎｚａ４Ｄ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒでプログラムＥＨ−１１５を使用してヌクレオフェクトした。レンチウイルス形質導入の前に、細胞を培地中で４時間にわたって静置した。レンチウイルス上清をＬｅｎｔｉ−Ｘ細胞から回収し、０．４５μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）シリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過し、９００μＬを、４８ウェル組織培養プレート中の５０，０００個の活性化Ｔ細胞に添加した。ポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、終濃度が４．４μｇ／ｍＬになるように添加し、細胞を、８００×ｇおよび３２℃で９０分間遠心分離した。１６時間後に、ウイルス上清を、ＩＬ２（５０ＩＵ／ｍＬ）およびＩＬ７（５ｎｇ／ｍＬ）を補充した新鮮なＣＴＬで置き換えた。次いで、ＩＬ２およびＩＬ７を補充したＣＴＬを使用して、４８〜７２時間毎に培地半分の交換を実施した。形質導入したＴ細胞を、刺激の＋７日目または＋８日目に、形質導入したＴＣＲ  Ｖｂに特異的な抗体を使用して選別し、免疫アッセイを実施する前に、上記に記載の急速拡大増殖プロトコールを使用して１２〜１４日間成長させた。
【０２８０】
（実施例１５）
統計分析
統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ７．０を使用して実施した。Ｅｌｉｓｐｏｔデータを、一元配置ＡＮＯＶＡで分析し、多重比較のためにシダック補正を行った。腫瘍組織内のＴＣＲ  Ｖβ鋳型の富化は、フィッシャー直接検定を使用して評価した。
【０２８１】
（実施例１６）
結果
肺腺癌を有する４人の患者および扁平上皮癌を有する１人の患者から腫瘍標本を得た（表１）。腫瘍および正常生殖系列ＤＮＡの全エクソーム配列決定を実施した。タンパク質をコードするバリアントを、バリアント対立遺伝子頻度およびｍＲＮＡ発現によりランク付けした。
【０２８２】
こうした結果および実行可能性に基づき、Ｔ細胞応答の分析のために、１患者当たり２０〜５７個の変異を選択した（表１；他のデータは示されていない）。候補ネオ抗原に対するＴ細胞応答の初期スクリーニングアッセイは、変異の各々を包含する重複する２０個アミノ酸のペプチドのプールでＰＢＭＣを刺激し、ＩＦＮγ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイで反応性を評価することにより実施した（図１Ａ）。次いで、候補ネオ抗原に対するバックグラウンドよりも大きな反応性を有するＴ細胞培養物を、変異体配列および野生型配列に対応する精製２７マーペプチドに応答したＩＦＮ−γ産生について再アッセイした（例示的なデータを図１Ｂに示す）。合計で、スクリーニングした２３８個のネオ抗原のうち２１個（８．８％）に対するＴ細胞応答が検出され、Ｔ細胞応答は、野生型ペプチド応答と比較して有意に上昇していた（ｐ＜０．０５）。ＫＲＡＳおよびＨｅｒ２−ＩＴＤにおける変異に対する追加の弱い応答が観察された。これらは、カットオフ基準を満たしていなかったが、こうした変異は腫瘍形成に重要な役割を果たすため、さらなる研究のために選択した。
【０２８３】
追加の凍結保存試料およびＴＩＬが入手可能だった患者１４９０および１３４７に由来する血液から拡大増殖した潜在的なネオ抗原反応性Ｔ細胞を特徴付けた。こうした患者のＰＢＭＣを、応答を誘発した変異体（上記の基準を満たした）の各々の精製２７マーペプチドで刺激し、再刺激後に、ＩＦＮ−γ＋細胞を選別し、限界希釈クローニングにより拡大増殖した。変異ＧＵＣＹ１Ａ３に反応性である単一のＣＤ４＋クローン、ならびに患者１４９０に由来するＳＲＥＫ１における変異に反応性である２つの異なるＣＤ４＋クローンを単離した。こうしたクローンの各々は、野生型ペプチドと比べて、変異体に対する特異性を示した（図３Ｂ〜３Ｆ）。
【０２８４】
他の単離されたＴ細胞クローンは、変異体ＳＲＥＫ１ペプチドに対して反応性だったが、応答は、ＳＲＥＫ１野生型ペプチドでみられるものと類似していた（データ非表示）。これは、潜在的に、スクリーニングＥｌｉｓｐｏｔで観察された野生型ペプチドに対する反応性を説明する（図１Ｂ）。患者１４９０および１３４７に由来する他のネオ抗原に特異的なＴ細胞株またはクローンは、単離することができなかった。異なるＴＣＲ  Ｖβ配列を有するＳＲＥＫ１に特異的な２つのクローンが、初期腫瘍切除で検出され（８／２４０９５鋳型）、同じ切除に由来する非隣接肺組織と比べて富化されていた（非隣接肺では１／６２４２４鋳型、ｐ＝０．０００２）。ＧＵＣＹ１Ａ３  ＴＣＲ  Ｖβは、腫瘍切除試料または肺では検出されなかった。
【０２８５】
こうした観察は、ネオ抗原に対して反応性であるＣＤ４＋Ｔ細胞を、腫瘍組織に細胞を局在化させることができる血液から単離することができることを示唆した。
【０２８６】
患者１４９０および１３４７の場合、高用量のＩＬ２で腫瘍断片を培養することにより、ＴＩＬ培養物を初期切除試料から作製した（Kargl  et  al  (2017)）。ＴＩＬを、Ｅｌｉｓｐｏｔによるネオ抗原反応性および以前に記載の２０マー重複ペプチドによる細胞内ＩＦＮ−γについてアッセイした。患者１３４７に由来するスクリーニングされた抗原に対する反応性は見出されなかったが、患者１４９０に由来するＴＩＬ中のＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＰＷＰ２の変異に反応性だった（図２Ａ）。
【０２８７】
選別されたＰＷＰ２反応性ＣＤ８＋  Ｔ細胞により発現されたＴＣＲ  Ｖβを同定し、ＰＷＰ２反応性ＴＣＲ  Ｖβの頻度を、初期腫瘍切除試料、非隣接肺において、ＴＩＬの培養後に決定した。ＴＣＲ  Ｖβ配列は、非隣接肺と比べて腫瘍切除において富化されており（０．２％、５４／２４０９５鋳型対０．０３％、１８／６２４２４鋳型、ｐ＜０．０００１）、ＴＩＬ培養によりさらに富化されていた（鋳型の４．８％、図２Ｂ）。
【０２８８】
ＰＷＰ２反応性Ｔ細胞株を、ＩＦＮγ捕捉後にＴＩＬから拡大増殖した。変異体に対する反応性は確認されたが、野生型１０マーペプチドに対する反応性は確認されなかった（図２Ｃおよび２Ｄ）。ＴＣＲ  Ｖβを配列決定することにより、末梢血刺激後にＴＣＲ  Ｖβ鋳型の０．０７％の頻度でＴＣＲ  Ｖβクロノタイプが同定された。これは、ＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイで検出するには低すぎた可能性がある。したがって、潜在的には、この方法の感度が低いため、または慢性抗原が存在することにより機能的に損なわれ得るＴ細胞を拡大増殖することが困難であるため、異なる特異性を有するＴ細胞が培養ＴＩＬ産物および血液から単離される可能性がある。
【０２８９】
この分析により血液または腫瘍にて同定された潜在的なネオ抗原特異的Ｔ細胞の大部分は、他のがんにおける以前の研究と一致する個人的な患者特異的変異を認識した。患者１１３９の再発ドライバー変異ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖおよび患者１２３８のＨｅｒ２−ＩＴＤに対する、血液における比較的弱いＴ細胞応答は、統計的有意性に到達しなかったが、悪性表現型に対するこうしたタンパク質の重要性を考慮して、特異性を特徴付けるための追加の努力に供した。患者１１３９に由来するＰＢＭＣを、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドで２回刺激し、次いでＩＦＮγ分泌ＣＤ４＋  Ｔ細胞を同定および選別した。Ｔ細胞を限界希釈培養で拡大増殖した。低濃度のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドに特異的に応答してＩＦＮ−γを分泌したが、対応する野生型ＫＲＡＳペプチドには応答しなかった４つのＴ細胞培養物が得られた。
【０２９０】
ＴＣＲ  Ｖβを配列決定することにより、こうしたＴ細胞が、クローン３、５、および９と呼ばれる３つの個別のＴＣＲ  Ｖβクロノタイプを有するモノクローナル集団であることが明らかになった（図４Ａ）。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖに対するＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−ＤＲにより部分的に遮断されたが、抗ＨＬＡ−ＤＱでは遮断されなかった。これは、ＨＬＡ−ＤＲによる拘束を示唆する（図４Ｂ）。患者のＨＬＡ遺伝子型は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０４／１３：０１、ＨＬＡＤＱＢ１＊０３：０１／０６：０３だった。３つのＴ細胞クローンはすべて、ＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１または１１：０４を発現するＬＣＬ細胞株との反応性を示したが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１の非存在下でＤＱＢ１＊０３：０１またはＤＱＢ１＊０６：０１を発現するペプチドパルスＬＣＬとの反応性は示さなかった。これは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１によるＨＬＡ拘束を示す（図４Ｃ）。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的ＴＣＲ  Ｖβクロノタイプは、腫瘍に由来する切除標本または非隣接肺では、各々１０，０００個のＴＣＲ  Ｖβ鋳型の深さまで配列決定しても検出されなかった。
【０２９１】
非常に高いペプチド濃度の野生型ペプチドでパルスしたＡＰＣに対するＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞クローンの反応性が観察された。抗原は、通常は、エンドソームで内因性にプロセシングされた後、ＣＤ４＋  Ｔ細胞に提示される（Kreiter  et  al.（2017））。したがって、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ反応性Ｔ細胞クローンが、プロセシングされた抗原を認識したかどうかを決定するため、ＨＬＡ一致Ｂ−ＬＣＬに、エンドソーム標的化配列を有するＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖまたは野生型ＫＲＡＳのいずれかをコードするミニ遺伝子構築物をトランスフェクトした。３つのクローンの各々は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを発現する細胞を特異的に認識したが、野生型ＫＲＡＳ配列を認識しなかった（図４Ｄ、４Ｅ）。これは、内因的にプロセシングされたネオ抗原に対して特異性であることを示す。Ｔ細胞クローンに由来するＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的ＴＣＲ  ＶβおよびＶα配列を５’ＲＡＣＥにより得、こうしたＴＣＲをコードするレンチウイルスベクターを構築した。クローン３および９に由来するＴＣＲを、２人の正常ドナーに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞へと形質導入することにより、ペプチドでパルスした標的細胞またはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを発現するものに対する特異性が付与されたが、野生型ＫＲＡＳ配列を発現するものに対する特異性は付与されなかった（図４Ｆ〜４Ｉ）。
【０２９２】
こうした実験では、ドナーＴ細胞は、トランスジェニックＴＣＲの遺伝子導入前に、内因性ＴＣＲα定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）のエクソン１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性破壊を受けたため（図４Ｊ）、同種異系抗原提示細胞によるこうした細胞のバックグラウンド活性化は最小限に抑えられた（図４Ｋ）。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的ＴＣＲで操作されたＴ細胞は、野生型ＫＲＡＳペプチドよりも＞２ｌｏｇ１０低かった低濃度の変異体ペプチドでパルスした標的細胞の認識を示した。
【０２９３】
患者１２３８は、アミノ酸ＹＶＭＡ（Ｈｅｒ２−ＩＴＤ）のインフレーム複製物を作出する反復性Ｈｅｒ２エクソン２０挿入に応答して弱いＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示した（図６Ａおよび１Ｂ）。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞を単離するための上記に記載のものと同じ手法を、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞株の単離に使用することに成功した。
【０２９４】
ＴＣＲ  Ｖβ配列決定による複数のＴ細胞株の分析は、１０個のＴ細胞株すべてに存在する単一の反復性ＴＣＲ  Ｖβクロノタイプを明らかにした（図６Ｂ；ＫＲＡＳクロノタイプのデータは図８に示されている）。これは、１つのＴ細胞株（＃３５）ではほぼクローン性だった。この株は、低ペプチド濃度の変異体Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチドを認識したが、対応する野生型Ｈｅｒ２ペプチドは認識しなかった（図５Ａ、５Ｂ）。反応性は、抗ＨＬＡ−ＤＱにより完全に遮断されたが、抗ＨＬＡ−ＤＲや抗クラスＩでは遮断されなかった（図５Ｃ、５Ｄ）。遮断データと一致して、Ｔ細胞は、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５：０１および０５：０２を発現するＨｅｒ２−ＩＴＤペプチドパルスＢ−ＬＣＬ株とのみ反応した。これは、ＨＬＡ  ＤＱＢ１−０５によるＨＬＡ拘束を示唆する（図５Ｇ）。また、こうしたＴ細胞は、エンドソームに標的化された野生型Ｈｅｒ２配列ではなく、変異体をトランスフェクトしたＭＨＣクラスＩＩ＋細胞を特異的に認識した（図５Ｅ、５Ｆ）。Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的株のＴＣＲ  ＶβおよびＶα配列を、５’ＲＡＣＥにより得た。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性遺伝子欠失により内因性ＴＣＲαを破壊した後でＴＣＲ配列をレンチウイルスに遺伝子導入することにより、Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチド、および野生型ではなく変異体Ｈｅｒ２配列をトランスフェクトしたＭＨＣクラスＩＩ＋細胞に対する特異性が付与された（図５Ｈ〜５Ｊ）。Ｖβ２特異的抗体で染色することにより測定した移入ＴＣＲの発現は、内因性ＴＣＲα定常領域遺伝子ＴＲＡＣのＣＲＩＳＰＲ媒介性欠失により向上した（図５Ｋ）。
【０２９５】
患者１２３８に由来する初期肺切除試料のＴＣＲ  Ｖβディープシーケンシングは、腫瘍切除における２０１７９個の鋳型のうちの３つにおいてＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＴＣＲ  Ｖβクロノタイプを同定した。切除に由来する非隣接肺組織を５倍深くディープシーケンシングしたにも関わらず、Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的クロノタイプは観察されず、腫瘍においてＨｅｒ２反応性ＣＤ４＋  Ｔ細胞が富化されたことが示された（図５Ｌ、富化はｐ＝０．００４）。腫瘍切除の２年後の血液中にＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞が存在することは、こうした細胞が、腫瘍に対する持続的なメモリーＴ細胞応答の一部であることと一致する。
また、本開示は、以下の例示的な実施形態を提供する：
実施形態１．  配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変ドメイン（Ｖα）、および
配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖可変ドメイン（Ｖβ）を含む結合タンパク質であって、
前記結合タンパク質は、ＭＴＥＹＫＬＶＶＶ  ＧＡＶＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱ（配列番号１）：ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体に、および／またはペプチド：ＨＬＡ複合体に結合することが可能であり、前記ペプチドは、配列番号１の７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる、結合タンパク質。
実施形態２．  前記Ｖαは、配列番号２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβは、配列番号３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の結合タンパク質。
実施形態３．  前記Ｖαは、配列番号１２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβは、配列番号１３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の結合タンパク質。
実施形態４．  （ｉ）配列番号４８もしくは５４によるＣＤＲ１αアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号４９もしくは５５によるＣＤＲ２αアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号５１もしくは５７によるＣＤＲ１βアミノ酸配列、および／または
（ｉｖ）配列番号５２もしくは５８によるＣＤＲ２βアミノ酸配列
をさらに含む、実施形態１〜３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態５．  それぞれ、配列番号４８、４９、２、５１、５２、および３に示されているＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、およびＣＤＲ３βアミノ酸配列を含む、実施形態４に記載の結合タンパク質。
実施形態６．  それぞれ、配列番号５４、５５、１２、５７、５８、および１３に示されているＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、およびＣＤＲ３βアミノ酸配列を含む、実施形態５に記載の結合タンパク質。
実施形態７．  前記ＨＬＡは、ＤＲＢ１−１１０１またはＤＲＢ１−１１０４を含む、実施形態１〜６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態８．  前記Ｖαは、配列番号６、１６、６６、または７０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態９．  前記Ｖβは、配列番号９、１９、６８、または７２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１〜８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態１０．  前記Ｖαおよび／または前記Ｖβの相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの少なくとも３つまたは４つは配列に変化がなく、配列変化を有するＣＤＲは、最大でわずか２つのアミノ酸置換、最大で連続した５つのアミノ酸欠失、またはそれらの組合せを有する、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態１１．  前記Ｖαは、ＴＲＡＶ８−３またはＴＲＡＶ８−１によるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態１２．  前記Ｖβは、ＴＲＢＶ３０またはＴＲＢＶ１２−４によるアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態１３．  ＴＲＡＪ１３またはＴＲＡＪ３８によるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列、および
ＴＣＲβ鎖連結（Ｊβ）遺伝子セグメントによるアミノ酸配列
をさらに含む、実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態１４．  ＴＲＢＪ２−４またはＴＲＢＪ２−３によるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１３に記載の結合タンパク質。
実施形態１５．  前記Ｖαは、配列番号６または６６に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記Ｖβは、配列番号９または６８に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態１６．  前記Ｖαは、配列番号１６または７０に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記Ｖβは、配列番号１９または７２に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態１７．  ＴＣＲβ鎖定常ドメイン（Ｃβ）、ＴＣＲα鎖定常ドメイン（Ｃα）、または両方をさらに含む、実施形態１〜１６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態１８．  （ｉ）前記Ｃαは、配列番号６７もしくは７１に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一性を有するか、配列番号６７もしくは７１に示されているアミノ酸配列を含むか、または配列番号６７もしくは７１に示されているアミノ酸配列からなり、および／あるいは
（ｉｉ）前記Ｃβは、配列番号６９もしくは７３に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一性を有するか、配列番号６９もしくは７３に示されているアミノ酸配列を含むか、または配列番号６９もしくは７３に示されているアミノ酸配列からなる
実施形態１７に記載の結合タンパク質。
実施形態１９．  前記結合タンパク質は、ＣＤ４とは独立に、またはＣＤ４の非存在下、細胞表面上で、（配列番号１）：ＨＬＡ複合体および／またはペプチド：ＨＬＡ複合体に結合することが可能であり、前記ペプチドは、配列番号１の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる、実施形態１〜１８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態２０．  配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変ドメイン（Ｖα）、および
配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖可変ドメイン（Ｖβ）を含む結合タンパク質であって、
前記結合タンパク質は、ＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧ（配列番号２２）：ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体に、および／またはペプチド：ＨＬＡ複合体に結合することが可能であり、前記ペプチドは、配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる、結合タンパク質。
実施形態２１．  前記Ｖαは、配列番号２３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβは、配列番号２４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、実施形態２０に記載の結合タンパク質。
実施形態２２．  配列番号６０によるＣＤＲ１α、配列番号６１によるＣＤＲ２α、配列番号６３によるＣＤＲ１β、および／または配列番号６４によるＣＤＲ２βをさらに含む、実施形態２０または２１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態２３．  それぞれ、配列番号６０、６１、２３、６３、６４、および２４に示されているＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、およびＣＤＲ３βアミノ酸配列を含む、実施形態２２に記載の結合タンパク質。
実施形態２４．  前記ＨＬＡは、ＤＱＢ１−０５：０１またはＤＱＢ１−０５：０２を含む、実施形態２０〜２３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態２５．  前記Ｖαは、配列番号２７または７４のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態２０〜２４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態２６．  前記Ｖβは、配列番号３０または７６のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態２０〜２５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態２７．  前記相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの少なくとも３つまたは４つは配列に変化がなく、配列変化を有するＣＤＲは、最大でわずか２つのアミノ酸置換、最大で連続した５つのアミノ酸欠失、またはそれらの組合せを有する、実施形態２０〜２６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態２８．  前記Ｖαは、ＴＲＡＶ８−６によるアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態２０〜２７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態２９．  前記Ｖβは、ＴＲＢＶ２０によるアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態２０〜２８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態３０．  ＴＲＡＪ３４によるアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列、および
ＴＣＲβ鎖連結（Ｊβ）遺伝子セグメントによるアミノ酸配列
をさらに含む、実施形態２０〜２９のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態３１．  ＴＲＢＪ２−５によるアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態３０に記載の結合タンパク質。
実施形態３２．  前記Ｖαは、配列番号２７または７４に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記Ｖβは、配列番号３０または７６に示されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１〜３１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態３３．  ＴＣＲβ鎖定常ドメイン（Ｃβ）、ＴＣＲα鎖定常ドメイン（Ｃα）、または両方をさらに含む、実施形態２０〜３２のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態３４．  （ｉ）前記Ｃαは、配列番号７５に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一性を有するか、配列番号７５に示されているアミノ酸配列を含むか、もしくは配列番号７５に示されているアミノ酸配列からなり、および／または
（ｉｉ）前記Ｃβは、配列番号７７に示されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一性を有するか、配列番号７７に示されているアミノ酸配列を含むか、もしくは配列番号７７に示されているアミノ酸配列からなる、
実施形態３３に記載の結合タンパク質。
実施形態３５．  前記結合タンパク質は、ＣＤ４とは独立に、またはＣＤ４の非存在下、細胞表面上で、（配列番号２２）：ＨＬＡ複合体に、および／またはペプチド：ＨＬＡ複合体に結合することが可能であり、前記ペプチドは、配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなる、実施形態２０〜３４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態３６．  ＴＣＲ、キメラ抗原受容体、またはＴＣＲの抗原結合性断片である、実施形態１〜３５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
実施形態３７．  前記ＴＣＲ、前記キメラ抗原受容体、または前記ＴＣＲの前記抗原結合性断片は、キメラであるか、ヒト化されているか、またはヒトである、実施形態３６に記載の結合タンパク質。
実施形態３８．  前記ＴＣＲの前記抗原結合性断片は、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）を含む、実施形態３６または実施形態３７に記載の結合タンパク質。
実施形態３９．  実施形態１〜３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む組成物。
実施形態４０．  実施形態１〜３９のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
実施形態４１．  コドン最適化されている、実施形態４０に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４２．  配列番号４、５、７、８、１０、１４、１５、１７、１８、２０、２５、２６、２８、２９、または３１のいずれか１つに示されているヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、実施形態４０または４１に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４３．  コードされる前記結合タンパク質は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含み、前記ポリヌクレオチドは、前記α鎖をコードするポリヌクレオチドと前記β鎖をコードするポリヌクレオチドとの間に配置された自己切断性ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態４０〜４２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４４．  発現制御配列に作動可能に連結した実施形態４０〜４３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
実施形態４５．  前記ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することが可能である、実施形態４４に記載の発現ベクター。
実施形態４６．  前記宿主細胞は、造血前駆細胞またはヒト免疫系細胞である、実施形態４５に記載の発現ベクター。
実施形態４７．  前記免疫系細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せである、実施形態４６に記載の発現ベクター。
実施形態４８．  前記Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである、実施形態４７に記載の発現ベクター。
実施形態４９．  ウイルスベクターである、実施形態４４〜４８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
実施形態５０．  前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはγ−レトロウイルスベクターである、実施形態４９に記載の発現ベクター。
実施形態５１．  実施形態４０〜４３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは実施形態４４〜５０のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞は、その細胞表面上に、コードされる前記結合タンパク質を発現することが可能であり、前記ポリヌクレオチドは前記宿主細胞に対して異種である、組換え宿主細胞。
実施形態５２．  造血前駆細胞、または免疫系細胞、必要に応じてヒト免疫系細胞である、実施形態５１に記載の組換え宿主細胞。
実施形態５３．  前記免疫系細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せである、実施形態５２に記載の組換え宿主細胞。
実施形態５４．  前記免疫系細胞はＴ細胞である、実施形態５２または５３に記載の組換え宿主細胞。
実施形態５５．  前記Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである、実施形態５３または５４に記載の組換え宿主細胞。
実施形態５６．  前記結合タンパク質は、内因性ＴＣＲと比較して、ＣＤ３タンパク質とより効率的に会合することが可能である、実施形態５２〜５５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
実施形態５７．  前記結合タンパク質は、内因性ＴＣＲと比較してより高い表面発現を有するす、実施形態５２〜５５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
実施形態５８．  ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体が存在する場合は、ＩＦＮ−γを産生することが可能であるが、参照ペプチド：ＨＬＡ複合体が存在する場合は、より少ない量のＩＦＮ−γを産生するかまたは検出可能なＩＦＮ−γを産生せず、
前記ペプチド抗原は、配列番号１もしくは２２によるものであるか、または前記ペプチド抗原は、それぞれ配列番号１もしくは２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれからなり、
前記参照ペプチドは、それぞれ配列番号３３または３４によるものである、実施形態５２〜５７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
実施形態５９．  前記ペプチド抗原が、１０、１、０．１、または約０．０１μｇ／ｍＬの濃度で存在する場合、ＩＦＮ−γを産生することが可能である、実施形態５８に記載の組換え宿主細胞。
実施形態６０．  前記ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体が存在する場合、少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを産生することが可能であり、前記ペプチド抗原は、０．０１μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの濃度で存在する、実施形態５８または５９のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
実施形態６１．  （ａ）ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド：ＨＬＡ複合体、および
（ｂ）（ｉ）抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体または（ｂ）（ｉｉ）抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体
の存在下でＩＦＮγを産生することが可能である、実施形態５８〜６０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
実施形態６２．  （ｉ）ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド抗原および／またはＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドをコードするＲＮＡ、ならびに（ｉｉ）ＨＬＡ−ＤＲＢ１−１１０１またはＨＬＡ  ＤＲＢ１−１１０４を発現し、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ抗原を宿主免疫細胞に提示することが可能な細胞の存在下で、ＩＦＮγを産生することが可能な、実施形態５８〜６１のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
実施形態６３．  （ｉ）前記ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体が存在する場合、少なくとも約５０ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを産生することが可能であり、前記ペプチド抗原は、配列番号２２によるものであり、約０．０１μｇ／ｍＬまたは約０．０５μｇ／ｍＬで存在し、および／あるいは
（ｉｉ）前記ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体が存在する場合、少なくとも約１００、５００、１０００、５，０００、または１０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを産生することが可能であり、前記ペプチド抗原は、配列番号２２によるものであり（または配列番号２２の約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１個の連続するアミノ酸を含むかもしくはそれからなり）、約０．０２、０．２、２、または２０μｇ／ｍＬで存在する、
実施形態５８〜６２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
実施形態６４．  ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体が存在する場合、少なくとも約１０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを産生することが可能であり、前記ペプチド抗原は、配列番号２２によるものであり、少なくとも約０．０１μｇ／ｍＬで存在する、実施形態５８〜６３のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
実施形態６５．  ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体および抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体および／または抗ＨＬＡクラスＩ抗体が存在する場合、ＩＦＮ−γを産生することが可能であり、前記ペプチド抗原は、配列番号２２によるものである、実施形態５８〜６４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
実施形態６６．  （ｉ）配列番号２２によるものであるＨｅｒ２−ＩＴＤペプチド抗原、および／あるいは配列番号２２をコードするポリヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）ＨＬＡ−ＤＱＢ１−０５０１またはＨＬＡ−ＤＱＢ１−０５０２を発現し、前記Ｈｅｒ２−ＩＴＤペプチド抗原を前記宿主免疫細胞に提示することが可能である細胞株が存在する場合、ＩＦＮ−γを産生することが可能である、実施形態５８〜６５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
実施形態６７．  免疫細胞であり、内因性免疫細胞タンパク質の染色体遺伝子ノックアウトを含む、実施形態５８〜６６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
実施形態６８．  ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡ成分、ＴＣＲ成分、またはそれらの任意の組合せの染色体遺伝子ノックアウトを含む、実施形態６７に記載の組換え宿主細胞。
実施形態６９．  処置することを必要とする対象を処置するための方法であって、
実施形態１〜３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質、または実施形態５８〜６８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を含む有効量の組成物を前記対象に投与することを含み、前記対象は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、胆道がん、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である適応症、またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原が治療標的である適応症を有する、方法。
実施形態７０．  前記組成物は、非経口でまたは静脈内に投与される、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７１．  前記組成物の複数用量を前記対象に投与することを含む、実施形態６９または実施形態７０に記載の方法。
実施形態７２．  前記複数用量は、約２〜約４週間の投与間で間隔を置いて投与される、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３．  前記対象にサイトカインを投与することをさらに含む、実施形態６９〜７２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７４．  前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２１を含む、実施形態７３に記載の方法。
実施形態７５．  前記対象は、免疫抑制療法をさらに受けている、実施形態６９〜７４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７６．  免疫抑制因子阻害剤、必要に応じてＰＤ−１阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、実施形態６９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７７．  前記ＰＤ−１阻害剤は、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））；ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））；イピリムマブ＋ニボルマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）＋ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））；セミプリマブ；ＩＢＩ−３０８；ニボルマブ＋リラトリマブ；ＢＣＤ−１００；カムレリズマブ；ＪＳ−００１；スパルタリズマブ；チスレリズマブ；ＡＧＥＮ−２０３４；ＢＧＢＡ−３３３＋チスレリズマブ；ＣＢＴ−５０１；ドスタルリマブ；デュルバルマブ＋ＭＥＤＩ−０６８０；ＪＮＪ−３２８３；パゾパニブ塩酸塩＋ペムブロリズマブ；ピジリズマブ；ＲＥＧＮ−１９７９＋セミプリマブ；ＡＢＢＶ−１８１；ＡＤＵＳ−１００＋スパルタリズマブ；ＡＫ−１０４；ＡＫ−１０５；ＡＭＰ−２２４；ＢＡＴ−１３０６；ＢＩ−７５４０９１；ＣＣ−９０００６；セミプリマブ＋ＲＥＧＮ−３７６７；ＣＳ−１００３；ＧＬＳ−０１０；ＬＺＭ−００９；ＭＥＤＩ−５７５２；ＭＧＤ−０１３；ＰＦ−０６８０１５９１；Ｓｙｍ−０２１；チスレリズマブ＋パミパリブ；ＸｍＡｂ−２０７１７；ＡＫ−１１２；ＡＬＰＮ−２０２；ＡＭ−０００１；アルツハイマー病に関してＰＤ−１をアンタゴナイズする抗体；ＢＨ−２９２２；ＢＨ−２９４１；ＢＨ−２９５０；ＢＨ−２９５４；固形腫瘍に関してＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１をアンタゴナイズする生物製剤；腫瘍学に関してＰＤ−１およびＬＡＧ−３を標的とする二重特異性モノクローナル抗体；ＢＬＳＭ−１０１；ＣＢ−２０１；ＣＢ−２１３；ＣＢＴ−１０３；ＣＢＴ−１０７；細胞免疫療法＋ＰＤ−１阻害剤；ＣＸ−１８８；ＨＡＢ−２１；ＨＥＩＳＣＯＩＩＩ−００３；ＩＫＴ−２０２；ＪＴＸ−４０１４；ＭＣＬＡ−１３４；ＭＤ−４０２；ｍＤＸ−４００；ＭＧＤ−０１９；腫瘍学に関してＰＤＣＤ１をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害する腫瘍溶解性ウイルス；ＯＴ−２；ＰＤ−１アンタゴニスト＋ロープギンターフェロンアルファ−２ｂ；ＰＥＧＭＰ−７；ＰＲＳ−３３２；ＲＸＩ−７６２；ＳＴＩＡ−１１１０；ＴＳＲ−０７５；腫瘍学に関してＨＥＲ２およびＰＤ−１を標的とするワクチン；腫瘍学および自己免疫障害に関してＰＤ−１を標的とするワクチン；ＸｍＡｂ−２３１０４；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＡＴ−１６２０１；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害する二重特異性モノクローナル抗体；ＩＭＭ−１８０２；固形腫瘍および血液腫瘍に関してＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；ニボルマブバイオシミラー；腫瘍学に関してＣＤ２７８およびＣＤ２８をアゴナイズし、ＰＤ−１をアンタゴナイズする組換えタンパク質；自己免疫障害および炎症性障害に関してＰＤ−１をアゴナイズする組換えタンパク質；ＳＮＡ−０１；ＳＳＩ−３６１；ＹＢＬ−００６；ＡＫ−１０３；ＪＹ−０３４；ＡＵＲ−０１２；ＢＧＢ−１０８；固形腫瘍に関してＰＤ−１、Ｇａｌ−９、およびＴＩＭ−３を阻害する薬物；ＥＮＵＭ−２４４Ｃ８；ＥＮＵＭ−３８８Ｄ４；ＭＥＤＩ−０６８０；転移性黒色腫および転移性肺がんに関して���Ｄ−１をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害するモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１を標的とするモノクローナル抗体；ＮＳＣＬＣに関してＰＤ−１をアンタゴナイズするモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１およびＴＩＭ−３を阻害するモノクローナル抗体；腫瘍学に関してＰＤ−１を阻害するモノクローナル抗体；血液悪性腫瘍および固形腫瘍に関してＰＤ−１およびＶＥＧＦ−Ａを阻害する組換えタンパク質；腫瘍学に関してＰＤ−１をアンタゴナイズする小分子；Ｓｙｍ−０１６；イネビリズマブ＋ＭＥＤＩ−０６８０；転移性黒色腫に関してＰＤＬ−１およびＩＤＯを標的とするワクチン；膠芽腫に関する抗ＰＤ−１モノクローナル抗体＋細胞免疫療法；腫瘍学に関してＰＤ−１をアンタゴナイズする抗体；血液悪性腫瘍および細菌感染症に関してＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１を阻害するモノクローナル抗体；ＨＩＶに関してＰＤ−１を阻害するモノクローナル抗体；または固形腫瘍に関してＰＤ−１を阻害する小分子を含む、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８．  前記組成物は、組換えＣＤ４＋  Ｔ細胞、組換えＣＤ８＋  Ｔ細胞、または両方を含む、実施形態６９〜７７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７９．  前記組換え宿主細胞は、同種異系、自己性、または同系である、実施形態６９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８０．  非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、胆道がん、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である適応症、またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原が治療標的である適応症の処置に使用するための、実施形態１〜３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質、実施形態３９に記載の組成物、実施形態４０〜４３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、実施形態４４〜５０のいずれか一項に記載の発現ベクター、または実施形態５１〜６８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
実施形態８１．  非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、胆道がん、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である適応症、またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原が治療標的である適応症の養子免疫療法に使用するための、実施形態５１〜６８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
実施形態８２．  非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、胆道がん、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である適応症を処置するための医薬の製造に使用するための、実施形態１〜３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質、実施形態３９に記載の組成物、実施形態４０〜４３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、実施形態４４〜５０のいずれか一項に記載の発現ベクター、または実施形態５１〜６８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
実施形態８３．  （ｉ）ＭＴＥ  ＹＫＬ  ＶＶＶ  ＧＡＶ  ＧＶＧ  ＫＳＡ  ＬＴＩ  ＱＬＩ  Ｑ（配列番号１）またはＳＰＫ  ＡＮＫ  ＥＩＬ  ＤＥＡ  ＹＶＭ  ＡＹＶ  ＭＡＧ  ＶＧＳ  ＰＹＶ  ＳＲＬ  ＬＧ（配列番号２２）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するペプチド、および
（ｉｉ）天然に存在しない薬学的に許容される担体
を含む免疫原性組成物。
実施形態８４．  前記天然に存在しない薬学的に許容される担体は、クリーム、エマルジョン、ゲル、リポソーム、ナノ粒子、または軟膏を含む、実施形態８３に記載の免疫原性組成物。
実施形態８５．  （ｉ）ＭＴＥ  ＹＫＬ  ＶＶＶ  ＧＡＶ  ＧＶＧ  ＫＳＡ  ＬＴＩ  ＱＬＩ  Ｑ（配列番号１）またはＳＰＫ  ＡＮＫ  ＥＩＬ  ＤＥＡ  ＹＶＭ  ＡＹＶ  ＭＡＧ  ＶＧＳ  ＰＹＶ  ＳＲＬ  ＬＧ（配列番号２２）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するペプチド、および
（ｉｉ）免疫有効量のアジュバント
を含む免疫原性組成物。
実施形態８６．  前記アジュバントは、ポリＩＣＬＣ、ＣｐＧ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはミョウバンを含む、実施形態８４に記載の免疫原性組成物。
実施形態８７．  処置することを必要とする対象を処置するための、または対象に免疫応答を誘導するための方法であって、実施形態８３〜８６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含み、
前記対象は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、胆道がん、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖネオ抗原が治療標的である適応症、またはＨｅｒ２−ＩＴＤネオ抗原が治療標的である適応症を有するかまたは有する疑いがある、方法。
実施形態８８．  前記免疫原性組成物は、前記対象に２回またはそれよりも多く投与される、実施形態８７に記載の方法。
実施形態８９．  養子細胞療法を前記対象に投与することをさらに含む、実施形態８７または実施形態８８に記載の方法。
実施形態９０．  アジュバントまたはチェックポイント阻害剤のうちの少なくとも１つを前記対象に投与することをさらに含み、前記アジュバントまたは前記チェックポイント阻害剤は、必要に応じて、ＩＬ−２、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤のうちの少なくとも１つを含む、実施形態８６〜８８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態９１．  ２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、または７個以下のアミノ酸のポリペプチドを含む、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発することが可能な単離されたペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号１に示されているＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖアミノ酸配列に由来する少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続するアミノ酸の配列を含む、単離されたペプチド。
実施形態９２．  ３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、または７個以下のアミノ酸のポリペプチドを含む、Ｈｅｒ２−ＩＴＤに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発することが可能な単離されたペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号２２に示されているＨｅｒ２−ＩＴＤアミノ酸配列に由来する少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２個の連続するアミノ酸の配列を含む、単離されたペプチド。
実施形態９３．  抗原パルス抗原提示細胞を調製するための方法であって、
抗原提示細胞による抗原プロセシングおよび抗原提示が起こるのに十分な条件下および時間にわたって、（ｉ）抗原提示細胞の集団、および（ｉｉ）実施形態４０〜４３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは実施形態４４〜５０のいずれか一項に記載の発現ベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、それによりＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶまたはＨｅｒ２−ＩＴＤに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発することが可能な抗原パルス抗原提示細胞を得ることを含む方法。
実施形態９４．  ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞またはＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞を生成するのに十分な条件下および時間にわたって、前記抗原パルス抗原提示細胞を１つまたは複数の免疫適合性Ｔ細胞と接触させることをさらに含む、実施形態９３に記載の方法。
実施形態９５．  実施形態９３に記載のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞またはＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖させて、それによりそれぞれ前記ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞または前記Ｈｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞の１つまたは複数のクローンを得ること、および前記１つまたは複数のクローンの１つまたは複数の核酸配列をコードするＴ細胞受容体ポリペプチドを決定することを含む方法。
実施形態９６．  そのようにして決定された前記Ｔ細胞受容体ポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドを、Ｔ細胞集団にｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトまたは形質導入し、それにより抗原特異的Ｔ細胞応答を養子移入するのに有効な量の操作されたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞または操作されたＨｅｒ２−ＩＴＤ特異的Ｔ細胞の集団を得ることをさらに含む、実施形態９５に記載の方法。
上記に記載の種々の実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。２０１８年８月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／７２１，４３９号明細書を含む、本明細書で言及されているおよび／または出願データシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物はすべて、参照により全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要な場合、種々の特許、出願、および刊行物の概念を使用して、またさらなる実施形態を提供するように改変することができる。
上記の詳細な説明に照らして、こうしたおよび他の変化を実施形態になすことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、特許請求の範囲を、明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定するものとは解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲の権利内にある均等物の完全な範囲と共にすべての考え得る実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示により限定されない。
【図１Ａ】
2021534752.tif 000005
【図１Ｂ−１】
2021534752.tif 000006
【図１Ｂ−２】
2021534752.tif 000007
【図１Ｂ−３】
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【図１Ｂ−４】
2021534752.tif 000009
【図１Ｂ−５】
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【図１Ｃ】
2021534752.tif 000011
【図１Ｄ】
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【図１Ｅ−１】
2021534752.tif 000013
【図１Ｅ−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ａ−３】
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【図４Ａ−４】
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【図４Ａ−５】
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【図４Ａ−６】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
2021534752000001.app
【国際調査報告】
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