(57)【要約】例示的な実施形態において、生細胞におけるゲノム編集を自動化するために、１つ以上のフロースルー型エレクトロポレーションデバイス又はモジュールを含む自動化マルチモジュール細胞編集機器が提供される。
2021509803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自動化マルチモジュール細胞編集機器であって、
モジュールのすべて又は一部を含むように構成されたハウジング；
細胞を受け取るように構成されたレセプタクル；
核酸を受け取るように構成された１つ以上のレセプタクル；
核酸を細胞に導入するように構成されたフロースルー型エレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）モジュール；
ＦＴＥＰモジュールでの細胞形質転換後に細胞を回復させるように構成された回復モジュール；
導入された核酸に、その細胞内の核酸を編集させるように構成された編集モジュール；及び、
ユーザ入力及び／又は事前にプログラムされたスクリプトの選択に基づいて自動化マルチモジュール細胞編集機器を操作するように構成されたプロセッサ
を含む、自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項２】
ＦＴＥＰモジュールは、
ａ．細胞及び外来性物質を含む流体をＦＴＥＰモジュールに導入するための１つ以上の入口及び入口チャネル；
ｂ．形質転換された細胞及び外来性物質を含む流体をＦＴＥＰモジュールから取り出すための出口及び出口チャネル；
ｃ．第１の入口チャネルと出口チャネルとの間を横断するように配置されたフローチャネルであって、第１の入口チャネルとフローチャネルの中心との間及び出口チャネルとフローチャネルの中心との間で幅が減少するフローチャネル；及び、
ｄ．フローチャネルが第１の入口チャネルと交差する部分とフローチャネルが出口チャネルと交差する部分との間のフローチャネルに配置された２つ以上の電極であって、前記電極はフローチャネル内の流体と連通しているが、フローチャネル内の細胞の主流経路内にはなく、流体中の細胞がフローチャネル内を通過する際に、細胞に１つ以上の電気パルスを印加することにより、外来性物質を流体中の細胞に導入する電極
を含む、請求項１に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項３】
ＦＴＥＰモジュールは、流体中の細胞をＦＴＥＰモジュールに導入するための入口に接続されたリザーバと、形質転換された細胞をＦＴＥＰモジュールから取り出すための出口に接続されたリザーバとをさらに含む、請求項２に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項４】
ＦＴＥＰモジュールは、２つの入口及び２つの入口チャネルを含み、外来性物質をＦＴＥＰモジュールに導入するための第２の入口に接続されたリザーバをさらに含む、請求項２に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項５】
ＦＴＥＰモジュールの第２の入口及び第２の入口チャネルは、ＦＴＥＰモジュールの第１の入口及び第１の入口チャネルと電極との間に配置されている、請求項４に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項６】
ＦＴＥＰモジュールの第２の入口及び第２の入口チャネルは、ＦＴＥＰモジュールの電極と、出口チャネル及び出口との間に配置されている、請求項４に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項７】
ＦＴＥＰモジュールのチャネル幅の最も狭い部分は１０μΜ〜５ｍｍである、請求項２に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項８】
ＦＴＥＰモジュールは、１つ以上の入口チャネルと電極との間にフィルタをさらに備える、請求項２に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項９】
デバイスが細菌細胞、酵母細胞及び哺乳類細胞に用いられるように構成されている、請求項１に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１０】
１つの電極は、入口チャネルとフローチャネルの幅が狭くなっている部分との間に配置され、第２の電極は、フローチャネルの幅が狭くなっている部分と出口チャネルと間に配置されている、請求項２に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１１】
試薬カートリッジをさらに含む、請求項１に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１２】
ＦＴＥＰモジュールは、
ａ．細胞及び外来性物質を含む流体をＦＴＥＰモジュールに導入するための少なくとも１つの入口及び少なくとも１つの入口チャネル；
ｂ．ＦＴＥＰモジュールから形質転換された細胞及び外来性物質を取り出すための出口及び出口チャネル；
ｃ．第１の入口チャネルと出口チャネルとの間に配置されたフローチャネルであって、第１の入口チャネル及び出口チャネルと交差し、フローチャネルの一部は、入口チャネルとの交差部分及び出口チャネルとの交差部分の間で狭くなるフローチャネル；及び、
ｄ．フローチャネルの両側に配置され、フローチャネル内の流体と直接接触する電極であって、電極はフローチャネルの狭められた部分を画定しており、流体中の細胞がフローチャネル内を通過する際に、細胞に１つ以上の電気パルスを印加することにより、外来性物質を流体中の細胞に導入する電極
を備える、請求項１に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１３】
ＦＴＥＰモジュールは、流体中の細胞をＦＴＥＰモジュールに導入するための入口に接続されたリザーバと、形質転換された細胞をＦＴＥＰモジュールから取り出すための出口に接続されたリザーバとをさらに含む、請求項１２に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１４】
ＦＴＥＰモジュールは、２つの入口及び２つの入口チャネルを含み、外来性物質をＦＴＥＰモジュールに導入するための第２の入口に接続されたリザーバをさらに含む、請求項１２に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１５】
ＦＴＥＰモジュールの第２の入口及び第２の入口チャネルは、ＦＴＥＰモジュールの第１の入口及び第１の入口チャネルと電極との間に配置されている、請求項１４に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１６】
ＦＴＥＰモジュールの第２の入口及び第２の入口チャネルは、ＦＴＥＰモジュールの電極と、出口チャネル及び出口との間に配置されている、請求項１４に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１７】
ＦＴＥＰモジュールのチャネル幅の最も狭い部分は１０μΜ〜５ｍｍである、請求項１２に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１８】
ＦＴＥＰモジュールは、１つ以上の入口チャネルと電極との間にフィルタをさらに備える、請求項１２に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１９】
ＦＴＥＰモジュールは試薬カートリッジ上に配置されている、請求項１８に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項２０】
試薬カートリッジをさらに含む、請求項１２に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、フロースルー型エレクトロポレーションデバイスを含む自動細胞処理方法、モジュール、機器、及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の説明では、背景及び導入のために特定の物品及び方法を説明する。ここに含まれる内容は、従来技術の「承認」と解釈されるべきではない。出願人は、必要に応じて、ここで参照されている物品及び方法が、適用される法定条項の下で先行技術を構成しないことを実証する権利を明示的に留保する。
【０００３】
遺伝子操作されたヌクレアーゼによるゲノム編集は、生きている生物のゲノムで核酸の変更が行われる方法である。特定のヌクレアーゼは、ゲノムの標的領域で部位特異的な二本鎖切断を生じさせ、これは非相同末端結合又は相同組換えにより修復され、標的化された編集をもたらすことができる。しかし、これらの方法は、効率が低く、細胞形質転換、増殖測定、及び細胞選択の課題があるため、自動化には向いていなかった。さらに、従来のベンチトップデバイスは、自動化されたモジュール式の機器又はシステムに必ずしも適切に拡張及び統合できるとは限らない。そのため、編集された細胞集団を作成する方法及び機器は、自動化された細胞形質転換のための方法及び機器を含めて厄介なままであり、再帰的手法を使用して複数ラウンドの編集を導入するという課題により、作成できる細胞集団の性質及び複雑さが制限されてきた。
【０００４】
したがって、アセンブリされた核酸及び他の生体分子を、自動化された方法で生細胞に導入するための自動化された機器、システム及び方法であって、編集された細胞が自動化された機器の外部でさらに実験を行うために使用可能なものが必要である。
【発明の概要】
【０００５】
例示的な実施形態の概要
特定の実施形態では、自動化されたモジュール、機器、システム、及び方法は、複数の細胞の１つ以上の標的ゲノム領域のヌクレアーゼによるゲノム編集に使用され、方法は自動化マルチモジュール細胞編集機器で実行される。これらの方法を使用して、目的のゲノム変化を有する目的の生細胞のライブラリを生成できる。本明細書に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用して実行される自動化方法は、ヌクレアーゼによる様々なゲノム編集技術を利用することができ、１つ以上の選択可能なマーカーの使用の有無にかかわらず使用できる。
【０００６】
したがって、本開示は、選択された実施形態において、ヌクレアーゼによるゲノム編集を含む自動化されたマルチモジュール細胞編集のためのモジュール、機器、及びシステムを提供する。特に、機器及びシステムは、編集する細胞を形質転換するためのフロースルー型エレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）デバイスを備える。本開示の自動化マルチモジュール細胞編集機器の他の特定の実施形態は、再帰的ゲノム編集用に、例えば、２つ以上の編集操作を通じて細胞集団の１つ以上の細胞内のゲノムに複数の編集を連続的に導入するように設計されている。
【０００７】
したがって、本明細書では、以下を含む自動化マルチモジュール細胞編集機器の実施形態が提供される：モジュールのすべて又は一部を含むように構成されたハウジング；細胞を受け取るように構成されたレセプタクル；核酸を受け取るように構成された１つ以上のレセプタクル；核酸を細胞に導入するように構成された形質転換モジュールであって、１つ以上のＦＴＥＰデバイスを含む形質転換モジュール；形質転換モジュールでの細胞形質転換後に細胞を回復させるように構成された回復モジュール；細胞の形質転換で導入された核酸に、その細胞内の核酸を編集させるように構成された編集モジュール；及び、ユーザ入力及び／又は適切なコントローラスクリプトの選択に基づいて自動化マルチモジュール細胞編集機器を操作するように構成されたプロセッサ。
【０００８】
いくつかの実施形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、流体中の細胞に外来性物質を導入するためのフロースルー型エレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）デバイスを含み、ＦＴＥＰデバイスは：細胞及び外来性物質を含む流体をＦＴＥＰデバイスに導入するための１つ以上の入口及び入口チャネル；形質転換された細胞及び外来性物質を含む流体をＦＴＥＰデバイスから取り出すための出口及び出口チャネル；第１の入口チャネルと出口チャネルとの間を横断するように配置されたフローチャネルであって、第１の入口チャネルとフローチャネルの中心との間及び出口チャネルとフローチャネルの中心との間で幅が減少するフローチャネル；及び、フローチャネルが第１の入口チャネルと交差する部分とフローチャネルが出口チャネルと交差する部分との間のフローチャネルに配置された２つ以上の電極であって、電極はフローチャネル内の流体と連通しているが、フローチャネル内の細胞の主流経路内にはなく、流体中の細胞がフローチャネル内を通過する際に、細胞に１つ以上の電気パルスを印加することにより、外来性物質を流体中の細胞に導入する電極を含む。
【０００９】
この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰデバイスにおける２つの電極は、０．５ｍｍ〜１０ｍｍ離れて、又は１ｍｍ〜８ｍｍ離れて、又は３ｍｍ〜７ｍｍ離れて、又は４ｍｍ〜６ｍｍ離れて位置している。
【００１０】
他の実施形態において、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、流体中の細胞に外来性物質を導入するためのフロースルー型エレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）デバイスを含み、ＦＴＥＰデバイスは：細胞及び外来性物質を含む流体をＦＴＥＰデバイスに導入するための少なくとも１つの入口及び少なくとも１つの入口チャネル；ＦＴＥＰデバイスから形質転換細胞及び外来性物質を含む流体を取り出すための出口及び出口チャネル；第１の入口チャネルと出口チャネルとの間に配置されたフローチャネルであって、第１の入口チャネル及び出口チャネルと交差し、フローチャネルの一部は、入口チャネルとの交差部分及び出口チャネルとの交差部分の間で狭くなるフローチャネル；及び、フローチャネルの両側に配置され、フローチャネル内の流体と直接接触する電極であって、電極はフローチャネルの上記狭められた部分を画定しており、流体中の細胞がフローチャネル内を通過する際に、細胞に１つ以上の電気パルスを印加することにより、外来性物質を流体中の細胞に導入する電極を含む。
【００１１】
この実施形態のいくつかの態様では、複数の電極がフローチャネルの両側に配置され、フローチャネル内の流体と直接接触し、フローチャネルの幅の減少を画定する。この態様のいくつかの構成では、電極同士は１０μｍ〜５ｍｍ離れているか、又は２５μｍ〜２ｍｍ離れている。
【００１２】
これらの実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰデバイスは、長さが３ｃｍ〜１５ｃｍ、又は長さが４ｃｍ〜１２ｃｍ、又は長さが４．５ｃｍ〜１０ｃｍ、又は長さが５ｃｍ〜８ｃｍである。これらの実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰデバイスのこの実施形態は、幅が０．５ｃｍ〜５ｃｍ、又は幅が０．７５ｃｍ〜３ｃｍ、又は幅が１ｃｍ〜２．５ｃｍ、又は幅が１ｃｍ〜１．５ｃｍである。これらの実施形態のいくつかの態様において、ＦＴＥＰデバイスのチャネル幅の最も狭い部分は１０μΜ〜５ｍｍであり、このため、形質転換される細胞がどのような種類であっても、ＦＴＥＰデバイスの特徴によって物理的にゆがめられたり圧迫されることはない。
【００１３】
また、これらの実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰにおける流量は、毎分０．１ｍｌ〜５ｍｌ、又は毎分０．５ｍｌ〜３ｍｌ、又は毎分１ｍｌ〜２．５ｍｌの範囲である。これらの実施形態のいくつかの態様では、電極は、１〜２５Ｋｖ／ｃｍ、又は１０〜２０Ｋｖ／ｃｍを送達するように構成される。
【００１４】
これらの実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰデバイスは、１つ以上の入口チャネルと出口チャネルとの間に１つ以上のフィルタをさらに備える。いくつかの態様では、２つのフィルタがあり、１つは入口チャネルとフローチャネルの狭められた部分との間にあり、もう１つはフローチャネルの狭められた部分と出口フローチャネルとの間にある。これらの実施形態のいくつかの態様では、フィルタは孔サイズにおいて段階的になっており、入口チャンバ又は出口チャンバに近いほど孔が大きく、フローチャネルの狭められた部分に近いほど孔が小さくされている。いくつかの態様において、小さい孔は、フローチャネルの狭められた部分のサイズと同じか又はそれよりも大きいサイズである。これらの実施形態のいくつかの態様では、フィルタはＦＴＥＰデバイスの本体とは別個に形成され、ＦＴＥＰデバイスが組み立てられるときにその中に配置される。あるいは、これらの実施形態のいくつかの態様では、フィルタはＦＴＥＰデバイスの本体の一部として形成され、本体と一体化されてもよい。
【００１５】
これらの実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰデバイスは、流体中の細胞をＦＴＥＰデバイスに導入するための入口に接続されたリザーバと、ＦＴＥＰデバイスから形質転換細胞を取り出すための出口に接続されたリザーバとをさらに含み、いくつかの態様では、ＦＴＥＰデバイスは、２つの入口及び２つの入口チャネルを含み、外来性物質をＦＴＥＰデバイスに導入するための第２の入口に接続されたリザーバをさらに含む。いくつかの態様では、ＦＴＥＰデバイスは、流体中の細胞及び外来性物質の両方をＦＴＥＰデバイスに導入するための入口に接続されたリザーバと、ＦＴＥＰデバイスから形質転換細胞を取り出すための出口に接続されたリザーバを含む。これらの実施形態のいくつかの態様では、入口及び出口に接続されたリザーバの容量は、１００μＬ〜１０ｍｌ、又は０．５ｍｌ〜７ｍｌ、又は１ｍｌ〜５ｍｌの範囲である。
【００１６】
これらの実施形態のいくつかの態様において、ＦＴＥＰデバイスは、毎分１０３〜１０１２細胞、又は毎分１０４〜１０１０細胞、又は毎分１０５〜１０９細胞、又は毎分１０６〜１０８細胞の細胞形質転換率を提供することができる。典型的には、毎分１０８個の酵母細胞を形質転換することができ、毎分１０１０〜１０１１個の細菌細胞を形質転換することができる。これらの実施形態のいくつかの態様において、細胞の形質転換は、少なくとも９０％の生存細胞、又は９５％の生存細胞、及び最大９９％の生存細胞をもたらす。
【００１７】
これらの実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰデバイスは、結晶スチレン、シクロオレフィンポリマー、又はシクロオレフィンコポリマーから射出成形によって製造され、この実施形態のいくつかの態様では、電極はステンレス鋼から製造される。これらの実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰデバイスは、単一基板上に並列した複数のＦＴＥＰデバイスとして製造され、その後ＦＴＥＰデバイスは使用のために分離される。
【００１８】
ＦＴＥＰが一部を構成する自動化マルチモジュール細胞処理システムのいくつかの実施形態では、１つ以上のレセプタクル内の核酸は、ベクター骨格及び編集カセット（例えば、細胞で発現されるとヌクレアーゼによる編集を指向するように設計されたオリゴヌクレオチド）を含み、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、核酸アセンブリモジュールをさらに含む。いくつかの態様では、核酸アセンブリモジュールは磁石を含み、いくつかの態様では、核酸アセンブリモジュールは、単一の等温反応を使用して核酸アセンブリを実行するように構成される。他の態様では、核酸アセンブリモジュールは、増幅及び／又はライゲーション法を実行するように構成される。いくつかの態様では、核酸アセンブリモジュールは、アセンブリされた核酸を単離、洗浄、濃縮、希釈、及び／又は再懸濁するための手段も含む。
【００１９】
ＦＴＥＰがその一部を構成する自動化マルチモジュール細胞編集機器のいくつかの実施形態では、編集モジュールと回復モジュールが組み合わされる。
いくつかの実施形態では、ＦＴＥＰを含む自動化マルチモジュール細胞編集機器は、細胞を成長させるように構成された成長モジュールをさらに含んでもよく、いくつかの実装形態では、成長モジュールは連続的に又は断続的に、成長中の細胞の光学密度を測定する。いくつかの実装形態では、機器を制御するプロセッサは、細胞がユーザによって要求された時間に目標光学密度に達するように、成長モジュール内の成長条件を調整するように構成される。さらに、いくつかの実施形態では、例えば自動化マルチモジュール細胞編集機器のユーザインターフェースを介して、又は自動化マルチモジュール細胞編集機器と通信するポータブルコンピューティングデバイスアプリケーションを介して、成長プロセスに関してユーザをアップグレードすることができる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＦＴＥＰを含む自動化マルチモジュール細胞編集機器は、細胞を受け取るように構成された１つ以上の容器及び核酸を受け取るように構成された１つ以上のレセプタクルを有する試薬カートリッジも含む。いくつかの実施形態では、ＦＴＥＰを含む自動化マルチモジュール細胞編集機器は、細胞及び核酸の両方を受け取るように構成された１つ以上のレセプタクルを有する試薬カートリッジも含む。さらに、試薬カートリッジは、細胞編集に必要な一部又はすべての試薬を含んでもよい。いくつかの実装形態では、試薬カートリッジに含まれる試薬は、プロセッサに読み取られるスクリプトによって配置可能であり、いくつかの実装形態では、試薬カートリッジは試薬を含み、キットとして提供される。いくつかの実施形態では、ＦＴＥＰデバイス（例えば、形質転換モジュール）は試薬カートリッジ内に含まれる。
【００２１】
自動化マルチモジュール細胞編集機器のいくつかの実施形態は、細胞が懸濁されている液体媒体を交換しかつ／又は細胞を濃縮するように構成された濾過モジュールをさらに含む。特定の態様では、濾過システムを使用して、細胞をエレクトロコンピテントにすることができる。
【００２２】
他の実施形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器が提供され、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、モジュールの一部又はすべてを収容するように構成されたハウジング；細胞を受け取るように構成されたレセプタクル；ベクター骨格及び編集カセットを受け取るように構成された少なくとも１つのレセプタクル；ａ）ベクター骨格と編集カセットをアセンブリし、ｂ）アセンブリした核酸をアセンブリ後に脱塩するように構成された核酸アセンブリモジュール；細胞を成長させ、細胞の光学密度（ＯＤ）を測定するように構成された成長モジュール；細胞を濃縮し、細胞をエレクトロコンピテントにするように構成された濾過モジュール；アセンブリした核酸を細胞に導入するためのＦＴＥＰデバイスを含む形質転換モジュール；形質転換モジュールでのエレクトロポレーション後に細胞を回復させ、アセンブリした核酸に細胞内の核酸を編集させるように構成された回復及び編集の組合せモジュール；及び、ユーザ入力及び／又は適切なコントローラスクリプトの選択に基づいて自動化マルチモジュール細胞編集機器を操作するように構成されたプロセッサを含む。
【００２３】
いくつかの実装形態では、ＦＴＥＰデバイスは試薬カートリッジの一部として提供される。これは、複数の試薬リザーバと、複数の試薬リザーバに配置された試薬を分配し、フロースルー型エレクトロポレーションデバイスを制御するためのプロセッサで読み取り可能なスクリプトも含む。
【００２４】
いくつかの態様では、成長モジュールは、温度制御された回転成長バイアル、バイアルを回転させるモータアセンブリ、バイアル内のＯＤなどを測定するための分光光度計、及びユーザからの入力を受けて細胞の成長速度を制御するプロセッサを含む。成長モジュールは、回転成長バイアル内で成長中の細胞のＯＤを連続的又は設定された間隔で自動的に測定し、ユーザが指定した目標ＯＤ及び目標時間まで細胞の成長を制御する。すなわち、本明細書に記載の方法及びデバイスは、細胞の成長をリアルタイムで監視し、パラメータ（例えば、回転成長バイアルの温度）をリアルタイムで調整して、ユーザが指定した目標時間に目標ＯＤに到達させるフィードバックループを提供する。
【００２５】
自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用して、細胞内でゲノム編集操作を実行するシステムも提供される。これらのシステムは任意選択で、細胞の準備、核酸の準備、編集された細胞集団の選択、編集された細胞集団の機能分析、編集された細胞集団の保存などのための他のデバイス又はレセプタクルと機器との間の１つ以上のインターフェースを含む。
【００２６】
さらに、ＦＴＥＰデバイスを含む自動化マルチモジュール細胞編集機器の使用方法も提供される。いくつかの方法では、エレクトロコンピテントセルが機器に直接提供され、形質転換モジュールに移される。いくつかの方法では、細胞は成長モジュールに移され、そこで所望の光学密度まで増殖する。次に、細胞は成長バイアルから濾過モジュールに移され、そこで濃縮され、任意選択でエレクトロコンピテントにされる。その後、細胞はＦＴＥＰデバイスに移される。
【００２７】
いくつかの態様において、形質転換のためにアセンブリされた核酸は機器に直接提供され、形質転換モジュールに移される。いくつかの態様において、ベクター骨格や１つ以上のオリゴヌクレオチド編集カセットなどの核酸は、細胞の導入又は準備と同時に又は連続して核酸アセンブリモジュールに移される。この態様において、核酸はアセンブリされ、脱塩され（例えば、液体交換又は浸透により）、ＦＴＥＰデバイスに移されてエレクトロポレーションによりエレクトロコンピテントセルにされる。エレクトロポレーション（例えば、形質転換又はトランスフェクション）はＦＴＥＰデバイスで行われ、その後、形質転換された細胞は、１つ以上のゲノム編集を含む細胞の選択を任意選択で含む回復／編集モジュールに移される。回復、編集、及び／又は選択後、細胞を回収して研究に直接使用したり、さらなる研究のために保存したり、機器内で編集ステップを繰り返して別のラウンド（又は複数ラウンド）のゲノム編集を行ったりすることができる。
【００２８】
また、自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用して作成された細胞ライブラリも提供され、その機器は、ハウジング；細胞及び細胞内でのヌクレアーゼによるゲノム編集事象を促進する配列を含む１つ以上の合理的に設計された核酸を受け取るように構成されたレセプタクル；核酸を細胞に導入するためのＦＴＥＰデバイス；ヌクレアーゼによるゲノム編集事象を細胞内で生じさせる編集モジュール、及びユーザ入力に基づいて自動化マルチモジュール細胞編集機器を操作するように構成されたプロセッサを含み、自動化機器によって作成されたヌクレアーゼによるゲノム編集事象は、合理的に設計された編集を有する個々の細胞を含む細胞ライブラリをもたらす。
【００２９】
いくつかの態様では、本開示の機器及び方法を使用して作成された細胞ライブラリは、飽和突然変異誘発細胞ライブラリを含む。いくつかの態様では、本開示の機器及び方法を使用して作成された細胞ライブラリは、プロモータースワップ細胞ライブラリを含む。他の態様では、本開示の機器及び方法を使用して作成された細胞ライブラリは、ターミネータースワップ細胞ライブラリを含む。さらに他の態様では、本開示の機器及び方法を使用して作成された細胞ライブラリは、一塩基多型（ＳＮＰ）スワップ細胞ライブラリを含む。さらに他の態様では、本開示の機器及び方法を使用して作成された細胞ライブラリは、プロモータースワップ細胞ライブラリを含む。いくつかの実装形態では、本開示の機器及び方法を使用して作成されたライブラリは少なくとも１００，０００個の編集細胞を含み、さらに他の実装形態では、本開示の機器及び方法を使用して作成されたライブラリは少なくとも１，０００，０００個の編集細胞を含む。いくつかの実装形態では、ヌクレアーゼによるゲノム編集はＲＧＮによるゲノム編集である。好ましい態様において、機器は、誘導性ヌクレアーゼ又はガイド核酸を使用するように構成される。ヌクレアーゼは、例えば、化学的に誘導されてもよく、ウイルスによって誘導されてもよく、光によって誘導されてもよく、温度によって誘導されてもよく、熱によって誘導されてもよい。
【００３０】
再帰的編集を伴ういくつかの実施形態では、本開示の自動化マルチモジュール細胞編集機器は、２つ以上のゲノム編集を細胞に導入し、１サイクルにつき細胞集団のゲノムに１つのゲノム編集が追加される。あるいは、本開示の自動化マルチモジュール細胞編集機器のいくつかの態様は、１サイクルにつき細胞集団の１細胞当たり２つ以上の編集、細胞集団の１細胞当たり３つ以上の編集、集団の１細胞当たり５つ以上の編集、又は細胞集団に対し単一サイクルで１細胞当たり１０以上の編集を提供するのに有用である。いずれのシナリオでも、１回以上の連続した編集サイクルを実行できる。
【００３１】
特定の実施形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、１サイクルにつき編集モジュールに導入された細胞の少なくとも１０％の編集効率、好ましくは１サイクルにつき編集モジュールに導入された細胞の少なくとも２０％の編集効率、より好ましくは１サイクルにつき編集モジュールに導入された細胞の少なくとも２５％の編集効率、さらにより好ましくは１サイクルにつき編集モジュール細胞編集機器に導入された細胞の少なくとも３０％の編集効率、さらに好ましくは１サイクルにつき編集モジュールに導入された細胞の少なくとも４０％、さらにより好ましくは１サイクルにつき編集モジュールに導入された細胞の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の編集効率を提供することができる。
【００３２】
他の特徴、利点、及び態様については、以下でさらに詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付図面は、１つ以上の実施形態を示し、明細書と共にこれらの実施形態を説明する。添付の図面は必ずしも縮尺通りに描かれていない。添付のグラフ及び図に示されている寸法は、説明のみを目的としており、実際の値又は推奨値又は寸法を表している場合と表していない場合がある。可能な場合、下にある特徴の説明を助けるために、一部又はすべての特徴を図示していない場合がある。
【図１Ａ】機器の一部として交換可能なカートリッジを用いた、複数の細胞の多重ゲノム編集のための自動化マルチモジュール細胞編集機器の例示的な実施形態の平面図を示す。
【図１Ｂ】機器の一部として交換可能なカートリッジを用いた、複数の細胞の多重ゲノム編集のための自動化マルチモジュール細胞編集機器の例示的な実施形態の斜視図を示す。
【図２Ａ】図１Ａ及び１Ｂの自動化マルチモジュール細胞編集機器の側面図を示す。
【図２Ｂ】図１Ａ及び１Ｂの自動化マルチモジュール細胞編集機器の正面図を示す。
【図２Ｃ】自動化マルチモジュール細胞編集機器の第２の例示的な筐体を示している。
【図２Ｄ】自動化マルチモジュール細胞編集機器の第２の例示的な筐体を示している。
【図３】自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的な組合せ核酸アセンブリモジュール及び精製モジュールを示す。
【図４Ａ】本開示のＦＴＥＰデバイスの一実施形態の上面図を示す。
【図４Ｂ】図４Ａに示されるデバイスの実施形態の断面の上面図を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ及び４Ｂに示されるデバイスの実施形態の断面の側面図を示す。
【図４Ｄ】本開示のＦＴＥＰデバイスの別の実施形態の上面図を示す。
【図４Ｅ】図４Ｄに示されるデバイスの実施形態の断面の上面図を示す。
【図４Ｆ】図４Ｄ及び４Ｅに示されるデバイスの実施形態の断面の側面図を示す。
【図４Ｇ】本開示のＦＴＥＰデバイスのさらに別の実施形態の上面図を示す。
【図４Ｈ】図４Ｇに示されるデバイスの実施形態の断面の上面図を示す。
【図４Ｉ】図４Ｇ及び４Ｈに示されるデバイスの実施形態の断面の側面図を示す。
【図５Ａ】細胞及び外来性物質のための別個の入口を有する、本明細書に記載のＦＴＥＰデバイスのさらなる実施形態の断面の上面図を示す。
【図５Ｂ】図５Ａに示されるデバイスの実施形態の断面の上面図を示す。
【図５Ｃ】図５Ｂに示されるデバイスの実施形態の断面の側面図を示す。
【図５Ｄ】図５Ａ及び５Ｂに示されるデバイスの実施形態の変形例の断面の側面図を示す。
【図５Ｅ】図５Ｃ及び５Ｄに示されるデバイスの実施形態の別の変形例の断面の側面図を示す。
【図５Ｆ】本開示のＦＴＥＰデバイスのさらに別の実施形態の断面の上面図を示し、ＦＴＥＰは、細胞及び外来性物質のための２つの別個の入口を含む。
【図５Ｇ】図５Ｆに示されるデバイスの実施形態の断面の上面図を示す。
【図５Ｈ】図５Ｆ及び５Ｇに示されるデバイスの実施形態の断面の側面図を示す。
【図６】本開示のＦＴＥＰデバイスのさらに追加の実施形態の断面の上面図を示し、ここでは、入力チャネルからの流体の流れ集束を含む。
【図７Ａ】本開示のＦＴＥＰデバイスの第１の多重化された実施形態の断面の上面図を示す。
【図７Ｂ】本開示のデバイスの第２の多重化された実施形態の断面の上面図を示す。
【図７Ｃ】本開示のデバイスの第３の多重化された実施形態の断面の上面図を示す。
【図７Ｄ】本開示のデバイスの第４の多重化された実施形態の断面の上面図を示す。
【図７Ｅ】本開示のデバイスの第５の多重化された実施形態の断面の上面図を示す。
【図８Ａ】本開示のＦＴＥＰデバイスのさらに別の実施形態の上面図を示し、電極は、フローチャネルの狭められた領域の両側というよりはむしろ両端に配置され、フローチャネルの狭められた領域を画定している。
【図８Ｂ】図８Ａに示されるデバイスの実施形態の断面の上面図を示す。
【図８Ｃ】図８Ａ及び８Ｂに示されるデバイスの実施形態の断面の側面図を示す。
【図８Ｄ】図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃに示されるデバイスの実施形態の下半分の断面の側面図を示す。
【図８Ｅ】図８Ａ〜８Ｄに示されるデバイスの実施形態の変形例の断面の側面図を示し、ここでは、電極は、ＦＴＥＰデバイスの底部、入口及び出口とは反対側の表面上に配置されている。
【図８Ｆ】本開示のＦＴＥＰデバイスのさらに別の実施形態の上面図を示す。
【図８Ｇ】図８Ｆに示されるデバイスの実施形態の断面の上面図を示す。
【図８Ｈ】図８Ｆ及び８Ｇに示されるデバイスの実施形態の一変形例の断面の側面図を示す。
【図８Ｉ】本開示のＦＴＥＰデバイスの実施形態の上面図を示す。
【図８Ｊ】図８Ｉに示されるデバイスの実施形態の断面の上面図を示し、ここで、この実施形態では、ＦＴＥＰデバイスはフィルタを含む。
【図８Ｋ】図８Ｉ及び８Ｊに示されるデバイスの実施形態の変形例の断面の上面図を示す。
【図８Ｌ】図８Ｉ〜８Ｋに示されるデバイスの実施形態の断面の側面図を示す。
【図８Ｍ】図８Ｉ〜８Ｌに示されるデバイスの実施形態の下半分の断面の側面図を示す。
【図８Ｎ】本開示のＦＴＥＰデバイスのさらに別の実施形態の上面図を示す。
【図８Ｏ】図８Ｎに示されるデバイスの実施形態の断面の上面図を示す。
【図８Ｐ】図８Ｎ〜８Ｏに示される本開示のデバイスの実施形態の断面の側面図を示す。
【図８Ｑ】図８Ｎ〜８Ｏに示されるデバイスの実施形態の変形例の断面の側面図を示す。
【図８Ｒ】図８Ｎ〜８Ｑに示されるデバイスの実施形態の別の変形例の断面の側面図を示す。
【図８Ｓ】本開示のＦＴＥＰデバイスのさらに別の実施形態の断面の上面図を示す。
【図８Ｔ】図８Ｓに示されるデバイスの実施形態の断面の上面図を示す。
【図８Ｕ】図８Ｓ及び８Ｔに示されるデバイスの実施形態の断面の側面図を示す。
【図９Ａ】本開示のＦＴＥＰデバイスの別の実施形態の断面の側面図を示す。
【図９Ｂ】図９Ａに示されるデバイスの実施形態の断面の上面図を示す。
【図９Ｃ】流れ集束構成を備えたＦＴＥＰデバイスの実施形態の断面の上面図を示す。
【図１０Ａ】自立型ＦＴＥＰモジュールの一部であるか、自動化マルチモジュール細胞処理システムの１つのモジュールとしてのフロースルー型エレクトロポレーションデバイスの上面斜視図である。
【図１０Ｂ】自立型ＦＴＥＰモジュールの一部であるか、自動化マルチモジュール細胞処理システムの１つのモジュールとしてのフロースルー型エレクトロポレーションデバイスの底面斜視図である。
【図１０Ｃ】自立型ＦＴＥＰモジュールの一部であるか、自動化マルチモジュール細胞処理システムの１つのモジュールとしてのフロースルー型エレクトロポレーションデバイスの底面図である。
【図１０Ｄ】図１０Ｃに示されたＦＴＥＰユニットの走査型電子顕微鏡写真を示す。
【図１０Ｅ】図１０Ｂ及び１０Ｃにおいて黒いバーとして描かれたフィルタ１０７０及び１５０２の走査電子顕微鏡写真を示す。
【図１０Ｆ】（ｉ）ＦＴＥＰデバイスへの挿入前の電極；（ｉｉ）１つの電極；及び（ｉｉｉ）電極チャネルに挿入された電極を、フローチャネルに隣接した電極及び電極チャネルとして示す。
【図１０Ｇ】電極チャネルがフローチャネルと出会う開口の２つの異なる構成の２つの走査型電子顕微鏡写真を示す。
【図１１Ａ】自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的な洗浄カートリッジの分解図を示す。
【図１１Ｂ】自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的な洗浄カートリッジの上面図を示す。
【図１１Ｃ】自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的な試薬カートリッジを示す。
【図１１Ｄ】自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的な試薬カートリッジを示す。
【図１１Ｅ】自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的な試薬カートリッジを示す。
【図１２Ａ】自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的な濾過モジュールの機能ブロック図を提供する。
【図１２Ｂ】自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的な濾過モジュールの斜視図を提供する。
【図１２Ｃ】自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的な濾過モジュールの斜視図を提供する。
【図１２Ｄ】自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的なフィルタカートリッジの斜視図である。
【図１３Ａ】自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的な細胞成長モジュールコンポーネントを示す。
【図１３Ｂ】自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的な細胞成長モジュールコンポーネントを示す。
【図１３Ｃ】自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的な細胞成長モジュールコンポーネントを示す。
【図１４】自動化マルチモジュール細胞編集の例示的な方法のフローチャートである。
【図１５Ａ】自動化マルチモジュール細胞編集機器による細菌細胞の自動編集のための第１の例示的なワークフローのフロー図である。
【図１５Ｂ】自動化マルチモジュール細胞編集機器による細菌細胞の自動編集のための第２の例示的なワークフローのフロー図である。
【図１５Ｃ】自動化マルチモジュール細胞編集機器による酵母細胞の自動化された細胞編集のための例示的なワークフローのフロー図である。
【図１６】自動化マルチモジュール細胞編集機器に指示を提供し、そこからフィードバックを受信するための例示的なグラフィカルユーザインターフェースを示す。
【図１７Ａ】複数の細胞の多重ゲノム編集のための自動化マルチモジュール細胞編集機器の別の例示的な実施形態の機能ブロックシステム図である。
【図１７Ｂ】複数の細胞の再帰的な多重ゲノム編集のための自動化マルチモジュール細胞編集機器のさらに別の例示的な実施形態の機能ブロックシステム図である。
【図１８】自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用される例示的な制御システムである。
【図１９Ａ】本開示のデバイス及びコンパレータエレクトロポレーションデバイスを使用した大腸菌のエレクトロポレーションの結果を示す棒グラフである。
【図１９Ｂ】コンパレータエレクトロポレーションデバイスに対してベンチマークされた、本明細書に記載のＦＴＥＰを介して形質転換された大腸菌細胞の取り込み、切断、及び編集効率を示す棒グラフである。
【図２０】本開示のＦＴＥＰデバイス及びコンパレータエレクトロポレーション法を使用したＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエレクトロポレーションの結果を示す棒グラフである。
【図２１】ＦＴＥＰ流量及び圧力対経過時間のグラフ（上）、ならびに圧力システム及びＦＴＥＰの簡単な描写（下）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
図面は必ずしも縮尺通りではなく、同様の参照番号は同様の特徴を指すことを理解されたい。
添付の図面に関連して以下に記載される説明は、開示される主題の様々な例示的な実施形態の説明であることを意図している。特定の特徴及び機能が、各例示的実施形態に関連して説明される。しかし、開示された実施形態は、それらの特定の特徴及び機能の各々がなくても実施され得ることは、当業者には明らかであろう。さらに、１つの実施形態に関連して説明されるすべての機能は、本明細書に記載の追加の実施形態に適用可能であることが意図されている。ただし、明示的に述べられている場合、又はその特徴又は機能がその追加の実施形態と互換性がない場合を除く。例えば、特定の機能又は機能が１つの実施形態に関連して明示的に説明されているが、代替実施形態に関連して明示的に言及されていない場合、その特徴又は機能は、代替実施形態と互換性がない場合を除き、代替実施形態に関連して展開、利用、又は実装できるものと理解されるべきである。
【００３５】
本明細書に記載の技術の実践は、そうでないことが特に明記されない限り、当業者の実務の範囲内である有機化学、高分子技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、及び配列決定技術の従来の技術及び説明を使用し得る。そのような従来の技術には、ポリヌクレオチドの合成、アセンブリ、ハイブリダイゼーション及びライゲーション、ならびに標識を用いたハイブリダイゼーションの検出が含まれる。本明細書に記載の例を参照することにより、適切な技術の具体的な説明を得ることができる。ただし、他の同等の従来の手順ももちろん使用できる。そのような従来の技術及び説明は、以下のような標準的実験室マニュアルに記載されている：Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．（１９９９），Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）；Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇａｂｒｉｅｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｅｄｓ．（２００７），Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｅｄｓ．（２００３），ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｂｏｗｔｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２００３），ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ；Ｍｏｕｎｔ（２００４），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００６），Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ａｌｌ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ  Ｅｄ．）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．；Ｇａｉｔ，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”１９８４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｘ（２０００），Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８）；Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｇ．Ｈａｄｌａｃｚｋｙ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１１）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，（Ｌａｎｚａ  ａｎｄ  Ｋｌｉｍａ��ｓｋａｙａ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１１）。これらはすべて、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ特有の技術は、例えば、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｒｏｍ  ＴＡＬＥＮｓ  ａｎｄ  ＣＲＩＳＰＲｓ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ａｐｐａｓａｎｉ  ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，２０１８；及びＣＲＩＳＰＲ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｌｉｎｄｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，２０１５に記載されており、両方とも、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つ」及び「その」、「前記」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「１つのオリゴ」への言及は、同じ機能を果たす１つ又は複数のオリゴを指し、「方法」には、同等のステップ及び当業者に知られている方法への言及などが含まれる。すなわち、そうでないことが特に明記されない限り、本明細書で使用する「１つ」、「その」、「前記」という言葉は「１つ以上」の意味を持つ。さらに、本明細書で使用する「左」、「右」、「上」、「下」、「前」、「後」、「側方」、「高さ」、「長さ」、「幅」、「上部」、「下部」、「内部」、「外部」、「内側」、「外側」などの用語も、単に参照する場所を説明するものであり、本開示の実施形態を特定の向き又は構成に必ずしも限定するものではないことを理解されたい。さらに、「第１」、「第２」、「第３」などの用語も同様に、本明細書で開示されるいくつかの部分、構成要素、ステップ、操作、機能、及び／又は参照点の１つを単に特定するものであり、本開示の実施形態を特定の構成又は向きに必ずしも限定するものではない。
【００３７】
さらに、用語「約」、「近位」、「小さい」、及び類似の用語は、一般に、指定した値の２０％、１０％、又は好ましくは特定の実施形態では５％の差の範囲内、及びそれらの間の任意の値を含む範囲を指す。
【００３８】
別様に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書で言及するすべての出版物（特許、公開された出願、及び非特許文献を含む）は、現在記載されている方法、モジュール、機器、及びシステムに関連して使用又は変更される可能性のあるデバイス、システム、及び方法を説明及び開示する目的を含むがこれらに限定されない、あらゆる目的のために参照により援用される。
【００３９】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の各介在値、及びその記載された範囲内の他の記載された値又は介在値は、本開示に含まれることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、その小さい範囲に独立して含まれてもよく、記載された範囲内の具体的に除外された制限を条件として、本開示内に含まれる。記載された範囲に境界値の一方又は両方が含まれる場合、それらの含まれる境界値の両方のいずれかを除外した範囲も開示に含まれる。
【００４０】
明細書全体にわたる「一実施形態」又は「実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、又は特性が、開示される主題の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な場所における「一実施形態では」又は「実施形態では」という句の出現は、必ずしも同じ実施形態を指すものではない。
【００４１】
さらに、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。さらに、開示された主題の実施形態は、その変更例及び変形例を網羅することが意図されている。
【００４２】
導入及び概説
選択された実施形態では、本明細書に記載のＦＴＥＰデバイスを含む自動化マルチモジュール細胞編集機器及びシステムは、生細胞の多重ゲノム編集、及び編集された細胞集団のライブラリを構築する方法に使用することができる。本明細書で開示される自動化マルチモジュール細胞編集機器は、様々なゲノム編集技術、特にヌクレアーゼによるゲノム編集技術に使用することができる。本開示の自動化マルチモジュール細胞編集機器は、生細胞内の標的ゲノム部位に核酸配列を導入するための新規な方法及びモジュールを提供する。この方法は、コーディング領域、非コーディング領域、又はそれらの両方に対する様々なクラスのゲノム編集を含むライブラリの構築を含む。自動化マルチモジュール細胞編集機器は、単一のサイクルで複数の細胞にゲノム編集を導入することにより、自動化され多重化された方法で１つ以上のゲノム編集を有する細胞のライブラリを生成するのに特に適している。自動化マルチモジュール細胞編集機器は、２つ以上の編集、例えば、細胞集団の個々の細胞の異なる標的ゲノム部位への編集を導入するのにも適している。
【００４３】
ゲノム編集は、１つであれ複数であれ、合理的に設計された編集であることが好ましい。つまり、細胞のゲノム内の標的領域に特定の編集を導入するように設計及び作成された核酸である。ゲノム編集事象を容易にするために使用される配列には、ヌクレアーゼによる切断の誘導、対象領域へのゲノム編集の導入、及び／又はそれれの両方を支援する配列が含まれる。配列には、細胞のゲノムにおける特定の合理的に設計された編集を追跡できるようにするための、細胞のゲノムの領域に対する編集も含まれる場合がある。細胞に編集を導入するそのような方法は、例えば、「ＣＲＩＳＰＲが可能にした多重ゲノム編集」と題された米国特許第９，９８２，２７８号、及び「バーコード付きコンビナトリアルライブラリを生成する方法」と題された米国特許第１０，０１７，７６０号に教示されている。
【００４４】
ヌクレアーゼによるゲノム編集
選択された実施形態では、本明細書に記載されるＦＴＥＰデバイスを含む自動化マルチモジュール細胞編集機器は、ヌクレアーゼによるゲノム編集システムを利用する。生物のゲノムを編集するための複数の異なるヌクレアーゼベースのシステムが存在し、それぞれを単一の編集システム、連続的編集システム（例えば、細胞内で２つ以上のゲノム編集を提供するために異なるヌクレアーゼによるシステムを連続して使用する）及び／又は再帰的編集システム（例えば、細胞に２つ以上のゲノム編集を導入するために単一のヌクレアーゼによるシステムを利用する）のいずれかで使用することができる。例示的なヌクレアーゼによるゲノム編集システムが本明細書に記載されているが、当業者は、本開示を読めば、他の酵素による編集システムも、例示的な実施形態の自動化マルチモジュール細胞編集機器及びＦＴＥＰデバイスによってサポートされることを認識するであろう。すなわち、本明細書に記載の自動化された機器及びシステムは、導入されたヌクレアーゼを使用してゲノムを切断し、標的ゲノム領域に編集を導入することができることに留意すべきである。
【００４５】
例示的な実施形態の特定の態様では、ヌクレアーゼ編集システムは、編集のタイミングの制御を可能にする誘導性システムである。誘導性システムは、ヌクレアーゼの誘導性発現、編集カセットの誘導性発現、又はそれらの両方を含み得る。ヌクレアーゼ活性を調節する能力は、オフターゲット切断を減らし、正確なゲノム編集を促進することができる。さらに、誘導性システムは、２０１８年８月１４日に提出された米国特許仮出願第６２／７１８，４４９号；及び２０１８年８月３０日に提出された第６２／７２４，８５１号（どちらも参照によりその全体が組み込まれる）に記載されているように編集された細胞を選択するときに役立つ。
【００４６】
特定の態様において、ヌクレアーゼによる切断は、説明され請求項に記載されている自動化マルチモジュール細胞編集機器において、標的領域にゲノム編集を有する細胞を選択するためにも使用することができる。例えば、特定のヌクレアーゼ認識部位又はヌクレアーゼ認識部位を除去するＲＮＡ指向性ヌクレアーゼを用いてゲノム編集を行った細胞は、そのような編集に続いて細胞をヌクレアーゼに曝露することにより、例示的な実施形態の自動化マルチモジュール細胞編集機器及びシステムを用いて選択することができる。ゲノム編集のない細胞内のＤＮＡは切断され、その後、成長が制限され、かつ／又は消滅するが、ヌクレアーゼ認識部位を除去するゲノム編集を受けた細胞は、その後のヌクレアーゼへの曝露の影響を受けない。
【００４７】
核酸誘導型ヌクレアーゼ編集システムの１つ以上の構成要素（例えば、ヌクレアーゼ及びガイド核酸の一方又は両方）の転写を駆動するプロモーターは誘導性であってもよく、選択が行われる場合は誘導性システムが採用される可能性が高い。植物、微生物、及び哺乳類細胞を含む動物細胞における遺伝子の発現を制御するために、ｐＬプロモーター（ＣＩ８５７リプレッサーの熱不活性化により誘導される）、ｐＢＡＤプロモーター（細胞増殖培地へのアラビノースの添加により誘導される）、及びラムノース誘導性プロモーター（細胞増殖培地へのラムノースの添加により誘発される）を含む多くの遺伝子調節制御システムが開発されている。その他のシステムには、テトラサイクリン制御性転写活性化システム（Ｔｅｔ−Ｏｎ／Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州パロアルト）；Ｂｕｊａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｏｓｓｅｎ，ＰＮＡＳ，８９（１２）：５５４７−５５５１（１９９２））、Ｌａｃスイッチ誘導性システム（Ｗｙｂｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｏｌ  Ｍｕｔａｇｅｎ，２８（４）：４４７−５８（１９９６）；ＤｕＣｏｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ５（３）：７０−７２（１９９２）；米国特許第４，８３３，０８０号）、エクジソン誘導性遺伝子発現システム（Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９３（８）：３３４６−３３５１（１９９６））、Ｃｕｍａｔｅ遺伝子スイッチシステム（Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４３（２００６））、及びタモキシフェン誘導性遺伝子発現（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４：５４３−５４８（１９９６））他が含まれる。
【００４８】
ＦＴＥＰデバイスを使用して形質転換又はトランスフェクションし、自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用して編集できる細胞には、任意の原核細胞、古細菌細胞、又は真核細胞が含まれる。例えば、本例示的実施形態で使用するための原核細胞は、グラム陽性細菌細胞、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はグラム陰性細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞であり得る。例示的な実施形態の自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための真核細胞には、任意の植物細胞及び任意の動物細胞、例えば、真菌細胞、昆虫細胞、両生類細胞、線虫細胞、又は哺乳類細胞が含まれる。
【００４９】
選択された実施形態では、本明細書に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器は、ジンクフィンガーヌクレアーゼゲノム編集を行う。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより生成される人工的な制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、生物のゲノム内の特定の領域を標的とするように作ることができる。（Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：６３６−６４６（２０１０）；２００３年１月２２日に出願された、Ｃａｒｒｏｌｌらの「ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる、標的化された染色体変異誘発」と題された国際公開第２００３／０８７３４１号）。生物の内因性ＤＮＡ修復機構を用いると、ゲノムの標的領域をＺＦＮを用いて正確に変更できる。ＺＦＮを用いて、変異型対立遺伝子のＤＮＡに二本鎖切断（「ＤＳＢ」）を生成することにより、ヘテロ接合体の優性変異を無効にすることができる。これは、相同テンプレートがない場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される。ＮＨＥＪは、２つの端部を結合することでＤＳＢを修復し、切断部が整っていて複雑でない限り、通常は突然変異を発生させない。（Ｄｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：ｃｕｓｔｏｍ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｃｉｓｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３３（１８）：５９７８−９０（２００５））。この修復メカニズムを使用して、インデル又は染色体再配列を介してゲノムにエラーを誘発させることができ、これはしばしば、その場所にコード化された遺伝子産物を機能させなくする。
【００５０】
ＺＦＮの複数のペアを使用して、ゲノム配列の大きなセグメント全体を完全に除去することもできる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｌ，２０（１）：８１−９（２００９）；及び２０１０年７月２８日に出願され、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」と題されたＧｒｅｇｏｒｙらの米国特許出願公開第２０１１／００８２０９３号）。ＣＡＧ／ＣＴＧリピートトラクトの拡大は、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー、及びいくつかの脊髄小脳性運動失調を含む１２を超える遺伝性神経障害の遺伝的基盤である。ＺＦＮがＣＡＧリピートにＤＳＢを誘導し、リピートを長い病的な長さから、短い、毒性の少ない長さに縮小できることがヒト細胞で実証されている（Ｍｉｔｔｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ＣＡＧ  ｒｅｐｅａｔ  ｔｒａｃｔｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｒｅｐｅａｔ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１０６（２４）：９６０７−１２（２００９）；及び２０１３年２月２８日に出願され、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」と題されたＭｉｌｌｅｒらの米国特許出願公開第２０１３／０２５３０４０号）。
【００５１】
別の実施形態では、本明細書に記載の自動化マルチモジュール細胞編集モジュール、機器、及びシステムは、メガヌクレアーゼゲノム編集を行う。メガヌクレアーゼは１９９０年代に同定され、その後の研究により、メガヌクレアーゼは相同組換えを効率的に誘導し、ゲノムのコーディング領域又は非コーディング領域に突然変異を生成し、ゲノムのコーディング領域のリーディングフレームを変更できるため、ゲノム編集に特に有望なツールであることが示された。（例えば、Ｅｐｉｎａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１（１１）：２９５２−６２（２００３）；及び２０１４年１２月３０日に発行されたＣｈｏｕｌｉｋａらの「Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅ」と題された米国特許第８，９２１，３３２号を参照。）メガヌクレアーゼの高い特異性により、他の天然の制限酵素よりも高い精度及びはるかに低い細胞毒性が得られる。
【００５２】
さらに別の実施形態では、本明細書に記載の自動化マルチモジュール細胞編集モジュール、機器及びシステムは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ編集を行う。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、特定のＤＮＡ配列を切断するように作ることができる制限酵素である。それらは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合させることによって作られる。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、実際に任意のＤＮＡ配列に結合するように作ることができるため、ヌクレアーゼと組み合わせると、特定の位置でＤＮＡを切断できる。（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９（２）：１４３−８（２０１１）；Ｂｏｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２９（２）：１３５−６（２０１１）；２０１０年１月１２日に出願されたＢｏｎａｓらの「モジュラーＤＮＡ結合ドメインおよび使用方法」と題された国際公開第２０１０／０７９４３０号；２０１０年１２月１０日に出願されたＶｏｙｔａｓらの「ＴＡＬエフェクターに媒介されるＤＮＡ修飾」と題された国際公開第２０１１／０７２２４６号を参照）。
【００５３】
これに代えて、相同性依存修復（ＨＤＲ）を使用して、外因性の二本鎖ＤＮＡ断片の存在下でＤＮＡをゲノムに導入することができる。ＤＳＢを修復するための相同配列へのＨＤＲの依存性は、ＤＳＢの隣接配列と相同な配列内に望ましい配列を挿入することで活用できる。これは、ＨＤＲシステムによってテンプレートとして使用された場合に、目的のゲノム領域内に望ましい変化を生じさせる。
【００５４】
ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮはＤＳＢを誘導することでゲノムを編集することができる。標的領域でＴＡＬＥＮが生じさせた部位特異的ＤＳＢは、ＮＨＥＪ又はＨＤＲを介して修復され、標的のゲノム編集がもたらされる。ＴＡＬＥＮは、インデル、再編成の導入、又は外因性二本鎖ＤＮＡ断片の存在下でのＮＨＥＪを介したゲノムへのＤＮＡの導入に使用することができる。
【００５５】
他の実施形態では、例示的実施形態の自動化マルチモジュール細胞編集機器のゲノム編集は、クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）技術を利用する。ＣＲＩＳＰＲ技術では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）が生物のゲノムの特定の標的領域を編集するために使用される。合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化したＲＧＮを細胞に送達することにより、細胞のゲノムを所望の位置で切断し、ゲノムの標的領域を編集することができる。ガイドＲＮＡは、ＲＧＮタンパク質が標的ゲノム領域のＤＮＡを認識し切断するのを助ける。ガイドＲＮＡのヌクレオチド配列を操作することにより、ＲＧＮシステムは、切断のために任意のＤＮＡ配列を標的とするようにプログラムすることができる。
【００５６】
例示的な実施形態の自動化マルチモジュール細胞編集機器と共に使用されるＲＧＮシステムは、所望の標的ゲノム領域で切断及び結合の両方が可能な任意のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムを用いてゲノム編集を行うことができる。特定の態様では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムは、ｇＲＮＡとして２つの別個のＲＮＡ分子、例えばＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を使用してもよい。他の態様では、ｇＲＮＡはｃｒＲＮＡ配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列の両方を含む単一のｇＲＮＡであってもよい。
【００５７】
特定の態様では、ゲノム編集は、標的領域に所望のＤＮＡ変化を導入し、さらに、プロトスペーサーモチーフ（ＰＡＭ）領域を標的領域から除去する。これにより、例えば標的領域に相補的な合成ｇＲＮＡと複合体化されたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼへの曝露時に、その標的領域でのゲノムの追加の編集を妨げる。（例えば、米国特許第９，９８２，２７８号及び第１０，０１７，７６０号参照。両方ともその全体が本明細書に組み込まれる。）この態様では、最初の編集事象は、例えばＲＧＮによる編集事象又は相同組換え事象であり得、所望の編集を有する細胞が、標的領域に相補的な合成ｇＲＮＡと複合体化されたＲＧＮを使用して選択され得る。最初の編集事象を受けなかった細胞は切り捨てられるため、適切な選択基準の下では存続できない。所望の突然変異を含む細胞は、必要なＰＡＭ部位を含まないため切り捨てられず、自動化マルチモジュール細胞編集機器の中で成長し増殖し続ける。
【００５８】
ＲＧＮシステムを選択に使用する場合、主に必要なのは切断作用である。したがって、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼタンパク質システムは、編集に使用されるものと同じであってもよいし、特定のＰＡＭ部位を用いて切断するのに効率的であるがその部位での編集には必ずしも効率的ではないＲＧＮシステムであってもよい。選択に使用されるヌクレアーゼの重要な側面の１つは、先のゲノム編集操作の編集アプローチを使用して置換されるＰＡＭ部位の認識である。
【００５９】
さらに別の実施形態では、例示的な実施形態の自動化マルチモジュール細胞編集機器のゲノム編集は、ｃｒｅ−ｌｏｘ技術及びＦＲＥＴ技術を含む相同組換え法を利用することができる。部位特異的相同組換えは、リコンビナーゼ認識に必要な短い特異的ＤＮＡ配列が、組換えの起こる唯一の部位であるという点で、一般的な相同組換えとは異なる。部位特異的組換えには、部位を認識し、これらの部位で組換えを触媒するための特殊なリコンビナーゼが必要である。それぞれがリコンビナーゼ及び特定の同族部位を含む多くのバクテリオファージ及び酵母由来の部位特異的組換えシステムが、ＤＮＡインテグレーションの目的で真核細胞において機能することが示されており、したがって、本発明での使用に適用可能である。これらには、バクテリオファージＰ１  Ｃｒｅ／ｌｏｘ、酵母ＦＬＰ−ＦＲＴシステム、及び部位特異的リコンビナーゼのチロシンファミリーのＤｒｅシステムが含まれる。そのようなシステム及び使用方法は、例えば、米国特許第７，４２２，８８９号；第７，１１２，７１５号；第６，９５６，１４６号；第６，７７４，２７９号；第５，６７７，１７７号；第５，８８５，８３６号；第５，６５４，１８２号；及び第４，９５９，３１７号に記載されており、これらは、そのようなリコンビナーゼを使用する方法を教示するために参照により本明細書に組み込まれる。バクテリオファージラムダＩｎｔインテグラーゼ、ＨＫ２０２２インテグラーゼなどのチロシンファミリーの他のシステム、及びバクテリオファージｐｈｉＣ３１、Ｒ４Ｔｐ９０１インテグラーゼなどのリコンビナーゼの別のセリンファミリーに属するシステムは、それぞれの組換え部位を使用して哺乳類細胞で機能することが知られており、本発明での使用にも適用可能である。相同組換えの例示的な方法論は、米国特許第６，６８９，６１０号；第６，２０４，０６１号；第５，６３１，１５３号；第５，６２７，０５９号；第５，４８７，９９２号；及び第５，４６４，７６４号に記載されており、これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる。
【００６０】
機器の構成
図１Ａ及び１Ｂは、カートリッジベースの原材料（例えば、試薬、酵素、核酸、洗浄液など）を利用する自動化マルチモジュール細胞編集機器１００の一例を示す。機器１００は、例えば、実験室環境で使用するためのデスクトップ機器として設計されてもよい。機器１００は、細胞内で自動化ゲノム切断及び／又は編集を行う際の様々な段階的操作を実行するための再利用可能な要素と使い捨ての要素の組合せを組み込むことができる。カートリッジベースの原材料は、例えば、ロボットハンドリング器具１０８によってアクセスできるように、機器１００のデッキ１０２上の指定された領域に配置されてもよい。図１Ｂに示されるように、デッキ１０２は、機器１００のモジュールのいずれかからこぼれ出る、滴下する、又は溢れ出る汚染物質が保護シンクの縁部内に含まれるように、保護シンクを含み得る。
【００６１】
図１Ａに戻って、いくつかの実装形態では、機器１００は、ＤＮＡ試料及び他の原料を機器１００に導入するための試薬カートリッジ１０４、ＦＴＥＰデバイス１１０ｃ（ここでは試薬カートリッジ１０４の一部として）、溶離液及び他の原料を機器１００に導入するための洗浄カートリッジ１０６、及び、及び自動化されたゲノム切断及び／又は編集を行うために、機器１００のモジュール（例えば、モジュール１１０ａ、１１０ｂ、及び１１０ｃ）、カートリッジレセプタクル（例えば、カートリッジ１０４及び１０６のレセプタクル）、及び保管ユニット（例えば、ユニット１１２、１１４、１１６、及び１１８）の間で材料を移動させるためのロボットハンドリングシステム１０８を含む。細胞供給部の処理が完了すると、いくつかの実施形態では、細胞出力は、ロボットハンドリング器具１０８によって、一時的な保管及びその後の回収のために、例えば保管ユニット又は試薬カートリッジ１０４又は洗浄カートリッジ１０６に配置されたレセプタクルに移され得る。
【００６２】
ロボットハンドリングシステム１０８は、例えば、カートリッジ１０４、１０６の様々な試薬リザーバから様々なモジュール１１０ａ〜１１０ｃ及び保管ユニット（１１２、１１４、１１６又は１１８）に液体を移送するための空気容積型ポンプ１２０を含むことができる。他の実施形態では、ロボットハンドリングシステム１０８は、試薬カートリッジ１０４及び／又は洗浄カートリッジ１０６から様々なモジュール１１０ａ〜１１０ｃに原料の容器（例えば、チューブ又はバイアル）を移送するためのピックアンドプレースヘッド（図示略）を含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上のカメラ又は他の光学センサ（図示略）が、ガントリー１２２に沿ったロボットハンドリング装置の適切な動き及び位置を確認する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ロボットハンドリングシステム１０８は、移送チップ供給部１１６（例えば、ピペットチップラック）に提供された使い捨て移送チップを使用して、機器１００内の原料、試薬（例えば、核酸、酵素、緩衝液）、及び細胞を移送する。使用済みの移送チップは、例えば、固形廃棄物ユニット１１２内に廃棄されてもよい。いくつかの実装形態では、固形廃棄物ユニット１１２は、ロボットハンドリングシステム１０８のピックアンドプレースヘッドからチューブ、チップ、バイアル、及び／又はフィルタを取り外すためのキッカーを含む。例えば、図示されるように、ロボットハンドリングシステム１０８はフィルタピックアップヘッド１２４を含む。
【００６４】
いくつかの実装形態では、機器１００は、図１８の処理システム１８１０などの処理システム１２６によって制御される。処理システム１２６は、ユーザ入力に基づいて機器１００を操作するように構成されてもよい。例えば、ユーザ入力は、タッチスクリーン制御ディスプレイ１２８を介して機器１００によって受信され得る。処理システム１２６は、機器１００の様々なモジュール１１０ａ〜１１０ｃのタイミング、持続時間、温度、及び他の動作を制御することができる。図１Ｂに戻って、処理システム１２６は、機器１００の動作のために電源１５０に接続され得る。
【００６５】
図１Ａに戻って、図示される試薬カートリッジ１０４は、１６個のリザーバ（５×３個のリザーバの行列と追加の１個のリザーバ）及びフロースルー型ＦＴＥＰデバイス１１０ｃ（例えば、図４Ａ〜４Ｉ、５Ａ〜５Ｇ、６、７Ａ〜７Ｅ、８Ａ〜８Ｕ、９Ａ〜９Ｃ及び１０Ａ〜１０Ｇに関して以下で詳細に説明する形質転換モジュール）を含む。洗浄カートリッジ１０６は、例えば、洗浄液、又は反復プロセスを通して頻繁に使用される溶液を保管するための大きいチューブ又はリザーバを収容するように構成されてもよい。さらに、いくつかの実施形態では、洗浄カートリッジ１０６は、例えば原料培地、及び編集された細胞のためのレセプタクル又は保管場所を保持するための、より小さい容積の複数の小さいチューブ、バイアル、又はリザーバを含み得る。例えば、洗浄カートリッジ１０６は、２つ以上の試薬カートリッジ１０４が連続して使用され交換されるときに所定の位置に留まるように構成されてもよい。図１Ａには試薬カートリッジ１０４及び洗浄カートリッジ１０６が別個のカートリッジとして示されているが、他の実施形態では、洗浄カートリッジ１０６の内容物は、試薬カートリッジ１０４に組み込まれてもよい。さらなる実施形態では、３つ以上のカートリッジが自動化マルチモジュール細胞編集機器１００に搭載されてもよい。特定の実施形態では、試薬カートリッジ１０４、洗浄カートリッジ１０６、及び自動化マルチモジュール細胞編集機器１００のモジュール１１０ａ〜１１０ｃの他の構成要素は、キットとして一緒にパッケージ化される。
【００６６】
洗浄及び試薬カートリッジ１０４、１０６は、いくつかの実装形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器１００で使用するために提供される使い捨てキットである。例えば、ユーザは、細胞処理を起動する前に、自動化マルチモジュール細胞編集機器の筐体内に試薬カートリッジ１０４及び洗浄カートリッジ１０６のそれぞれを開封して配置することができる。筐体の例は、図２Ａから２Ｄに関連して以下でさらに詳細に説明される。
【００６７】
いくつかの実装形態では、カートリッジ１０４、１０６の構成要素は、ロボットハンドリングシステム１０８による認識のために、バーコードなどの機械可読表示でマークされている。例えば、ロボットハンドリングシステム１０８は、各カートリッジ１０４、１０６内の容器をスキャンして、内容物を確認することができる。他の実装形態では、機械可読表示は各カートリッジ１０４、１０６にマークされ、自動化マルチモジュール細胞編集機器１００の処理システムが、機械可読表示に基づいて保存された材料マップを識別してもよい。（例えば、図１１Ｂの要素１１１２及び図１１Ｄの要素１１３０を参照。）
いくつかの実施形態では、洗浄カートリッジ１０６（図１Ａ）は、いくつかの実施形態では、図１１Ａ〜１１Ｂに示されるような洗浄カートリッジである。カートリッジ１１００は、一対の容器１１０２ａ、ｂ、１組の４つの小さいチューブ１１０４ａ、ｂ、ｃ、ｄ、及びカートリッジ本体１１０８に保持されたより大きいチューブ１１０６を含む。いくつかの実施形態では、容器１１０２ａ、ｂ、及びチューブ１１０４ａ、ｂ、ｃ、ｄ、及び１１０６のうちの１つ以上は、シッパー又はピペッターなどの自動液体ハンドリングシステムによってアクセスできるように、穿孔可能なホイルで密封される。他の実施形態では、容器１１０２ａ、ｂ、及びチューブ１１０４ａ、ｂ、ｃ、ｄ、及び１１０６のうちの１つ以上は、密封可能なアクセスガスケットを含む。容器１１０２ａ、ｂ、及びチューブ１１０４ａ、ｂ、ｃ、ｄ、及び１１０６のうちの１つ以上の上部は、いくつかの実施形態では、内容物の自動識別のために機械可読表示（図示略）でマークされる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、容器１１０２ａ、ｂは洗浄液を含む。洗浄液は同じ洗浄液でも異なる洗浄液でもよい。いくつかの例では、洗浄液は、例えば、緩衝液、緩衝液及び１０％グリセロール、８０％エタノールを含んでもよい。
【００６９】
いくつかの実装形態では、カバー１１２０は、カートリッジ本体１１０８内に容器１１０２ａ、ｂ及びチューブ１１０４ａ、ｂ、ｃ、ｄ及び１１０６を固定する。図１１Ｂに移って、カバー１１２０は、容器１１０２ａ、ｂ及びチューブ１１０４ａ、ｂ、ｃ、ｄ及び１１０６のそれぞれにアクセスするための開口部を含むことができる。さらに、カバー１１２０は、カートリッジの種類を識別するための（例えば、カートリッジ内容物のマップにアクセスするための）機械可読表示１１１２を含み得る。あるいは、開口部に個々の内容物を別々にマークすることもできる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、図１Ａの試薬カートリッジ１０４は、図１１Ｃに示すような試薬カートリッジである。図１１Ｃは、１８個のチューブ又はバイアル１１４０のセットを含む試薬カートリッジ１１２２を示す。ただし、図１１Ｃに示す実施形態はＦＴＥＰデバイスを含んでいない。図１１Ｅを見ると、試薬カートリッジは、カートリッジ本体１１２２に保持された１６個のチューブ又はバイアル１１２６ａ〜ｐ及びＦＴＥＰデバイス１１２４を含む。チューブ又はバイアル１１４０（図１１Ｃ）又は１１２６ａ〜ｐ（図１１Ｅ）の１つ以上は、いくつかの実施形態では、シッパー又はピペッターなどの自動液体ハンドリングシステムによるアクセスのために、穿孔可能なホイルで密封される。図１１Ｅに示すような他の実施形態では、チューブ又はバイアル１１２６ａ〜１１２６ｐのうちの１つ以上は、密閉可能なアクセスガスケットを含む。いくつかの実施形態では、小さいチューブ又はバイアル１１２６ａ〜１１２６ｐのそれぞれの上部は、内容物の自動識別のために機械可読表示（図示略）でマークされている。機械可読表示は、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、又は他の機械可読コードを含み得る。特定の容器を識別する他の自動化された手段には、色分け、記号認識（例えば、文字列、画像、アイコンなど）、及び／又は形状認識（例えば、容器の相対的な形状）が含まれる。いくつかの実施形態では、入れ物自体をマークするのではなく、カートリッジ本体及び／又はカートリッジカバーの上面に、内容物を識別するための機械可読表示を含めてもよい。小さいチューブ又はバイアルは、それぞれ同じサイズにすることができる。あるいは、試薬カートリッジ１１２０に複数の容積のチューブ又はバイアルを提供してもよい。例示的な例では、各チューブ又はバイアルは、２〜２０ｍＬ、４〜１０ｍＬ、又は約５ｍＬを保持するように設計してもよい。少量の試薬のみが必要ないくつかの実施形態では、チューブ挿入物を使用して、より大きいレセプタクルに小さい（例えば、微量遠心管）チューブを収容することができる。
【００７１】
例示的な例では、チューブ又はバイアル１１２６ａ〜１１２６ｐはそれぞれ、次の材料の１つを保持してもよい：ベクター骨格、オリゴヌクレオチド、核酸アセンブリ用試薬、ユーザ提供の細胞試料、誘導剤、緩衝液中の磁気ビーズ、エタノール、細胞選択用の抗生物質、細胞及び核酸を溶出するための試薬、オイルオーバーレイ、その他の試薬、ならびに細胞成長及び／又は回復培地。
【００７２】
いくつかの実装形態では、図１１Ｄに見られるカバー１１２０は、図１１Ｃのカートリッジ本体１１２２内にチューブ又はバイアル１１４０を固定する。図１１Ｄ３に移って、カバー１１２０は、小さいチューブ又はバイアル１１２６のそれぞれにアクセスするための開口部を含むことができる。３つの大きい開口部１１３２は、ユーザ提供の材料を追加する位置を示すために太線で囲まれている。例えば、ユーザ提供の材料には、ベクター骨格、オリゴヌクレオチド、細胞試料が含まれる。さらに、カバー１１２０は、カートリッジの種類を識別するための（例えば、カートリッジ内容物のマップにアクセスするための）機械可読表示１１３０を含み得る。あるいは、各開口部に個々の内容物を別々にマークすることができる。いくつかの実装形態では、ユーザ提供の材料の配置を確実にするために、実験室環境で充填するために提供されるバイアル又はチューブは、細胞試料のバイアル又はチューブは細胞試料用の開口部にのみ収まり、オリゴヌクレオチドのバイアル又はチューブはオリゴヌクレオチド用の開口部にのみ収まるといったように、特定の形状又はサイズを有し得る。
【００７３】
図１Ａに戻って、ここにはガントリー１２２を含むロボットハンドリングシステム１０８も示されている。いくつかの例では、ロボットハンドリングシステム１０８は、スイス、マンネドルフのＴｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．、ネバダ州リノのＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ（例えば、「ピペット装置、液処理システムおよび液処理システムの操作方法」と題されたＯｔｔの国際公開第２０１８０１５５４４号を参照）、又はコロラド州フォートコリンズのＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．（例えば、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｕｂｅ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｌｅｖｅｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」と題されたＳｔｒｉｅｂｌらの米国特許出願公開第２０１６００１８４２７号を参照）によって製造されるものなどの自動液体ハンドリングシステムを含み得る。ロボットハンドリングシステム１０８は、空気置換式ピペッター１２０を含んでもよい。試薬カートリッジ１０４、１０６は、空気置換式ピペッター１２０などのロボットハンドリングシステム１０８の液体ハンドリング機器との特に容易な統合を可能にする。いくつかの実施形態では、空気置換式ピペッター１２０のみがガントリー１２２によって動かされ、様々なモジュール１１０ａ〜１１０ｃ及びカートリッジ１０４、１０６は静止したままである。ピペットチップは、空気置換式ピペッター１２０で使用するためにピペット移送チップ供給部１１６に提供されてもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態では、自動化機械運動システム（アクチュエータ）（図示略）が、自動化マルチモジュール細胞編集機器１００の１つ以上のモジュール１１０ａ〜１１０ｃ及び／又はカートリッジ１０４、１０６にＸＹ軸運動制御又はＸＹＺ軸運動制御をさらに提供する。例えば、使用済みピペットチップは、ロボットハンドリングシステムによって廃棄物保管場所１１２に置かれてもよい。例えば、作動中のモジュールを持ち上げて、ロボットハンドリングシステムが接触してアクセスできる位置に配置したり、逆に、使用後に下ろすことで、ロボットハンドリングシステムが自動化マルチモジュール細胞編集機器１００内の他のモジュールに材料を移動する際にロボットハンドリングシステムと衝突するのを避けることができる。
【００７５】
自動化マルチモジュール細胞編集機器１００は、いくつかの実装形態では、試薬カートリッジ１０４に含まれるＦＴＥＰデバイス１１０ｃ（例えば、形質転換又はトランスフェクションモジュール）を含む。例えば、細胞及び核酸が入力チャネルを介してデバイスに移された後、フロースルー型エレクトロポレーション接続ブリッジ１３２をフロースルー型エレクトロポレーションデバイスに係合させる。ブリッジ１３２は、液密シール及び電極への電気接続の両方、ならびにＦＴＥＰデバイス１１０ｃ内でエレクトロポレーションを行うための制御を提供する。例えば、エレクトロポレーション接続ブリッジ１３２は、自動化マルチモジュール細胞編集機器１００の電子機器ラック１３６内のＦＴＥＰコントロール１３４に接続されてもよい。
【００７６】
いくつかの実装形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器１００は、一対の細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂを含む。図示されているように、細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂはそれぞれ、回転細胞成長バイアル１３０ａ、１３０ｂを含む。細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂの少なくとも一方は、一体化された濾過モジュール（図示略）をさらに含むことができる。代替実施形態では、代わりに、濾過モジュール又は細胞洗浄及び濃縮モジュールが、細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂから分離されていてもよい（例えば、図１７Ａ及び１７Ｂの細胞成長モジュール１７１０ａ及び濾過モジュール１７１０ｂに関連して説明されているように）。細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂは、例えば、図１３Ａ〜Ｃの細胞成長モジュール１３００に関連して説明される特徴及び機能をそれぞれ含むことができる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂの一方又は両方の濾過部分は、フィルタカセット１１８に保存された交換可能なフィルタを使用する。例えば、ロボットハンドリングシステムは、細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂの一方又は両方で使用するためのフィルタを取り上げて係合するフィルタピックアップヘッド１２４を含むことができる。フィルタピックアップヘッドはフィルタを成長モジュールに移し、成長モジュールから細胞をピペットで採取し、その後細胞を洗浄してエレクトロコンピテントにする。細胞からの培地、及び洗浄液は、廃棄物モジュール１１４に配置される。
【００７８】
いくつかの実装形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器１００は、試薬カートリッジ１０４内に提供された材料を、細胞編集のためにアセンブリされた核酸と合わせるための核酸アセンブリ及び精製機能（例えば、核酸アセンブリモジュール）を含む。さらに、脱塩又は精製操作により、アセンブリされた核酸が精製され、緩衝液が脱塩されるため、核酸はより効率的に細胞にエレクトロポレーションされる。核酸アセンブリ及び精製機能は、反応チャンバ又はチューブ容器（図示略）及び磁石（図示略）を含んでもよい。
【００７９】
例示的な機器１００は、モジュール１１０の特定の配置を含むものとして示されているが、この実装は例示目的のみのためである。例えば、他の実施形態では、より多い又はより少ないモジュール１１０を機器１００内に含めることができ、異なるモジュール、例えばハイブリドーマを生成するための細胞融合用モジュール及び／又は発現及び／又はタンパク質生成用モジュールなどを含めることができる。さらに、図１Ａの一対の細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂなど、特定の実施形態では特定のモジュールを複数設けることができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器に導入する前に、細胞が改変される。例えば、対象とする細菌細胞は、ゲノム修復を促進するためにλレッドシステムを保有する場合があり、及び／又は上記細胞は抗生物質耐性遺伝子を保有する場合があるため、それらは容易に選択され得る。図２Ａから２Ｄは、自動化マルチモジュール細胞編集機器のデスクトップバージョンで使用するための例示的な筐体２００及び２３０を示している。例えば、筐体２００及び２３０は、約６１〜１２２ｃｍ（約２４〜４８インチ）の幅、約６１〜１２２ｃｍ（約２４〜４８インチ）の高さ、及び約６１〜１２２ｃｍ（約２４〜４８インチ）の深さを有し得る。筐体２００及び２３０のそれぞれは、自動細胞処理で使用される複数のモジュール及び使い捨て消耗品を保持するように設計されてもよい。さらに、各筐体２００及び２３０は、モジュール間で材料を移動させるためのロボットハンドリングシステムを搭載してもよい。
【００８１】
図２Ａ及び２Ｂは、自動化マルチモジュール細胞編集機器の第１の例示的な筐体２００を示す。図示のように、筐体２００は、カバー２０２を持ち上げて筐体２００の内部にアクセスするためのハンドル２０４及びヒンジ２０６ａ〜２０６ｃを有するカバー２０２を含む。冷却格子２１４は、内部ファン（図示略）を介した空気の流れを可能にし得る。さらに、筐体２００は、調節可能な足２２０によって持ち上げられる。例えば、足２２０ａ〜２２０ｃは、筐体２００の下に追加の空気流を提供し得る。いくつかの実施形態では、制御ボタン２１６は、筐体２００内での細胞処理を単一のボタンで自動的に開始及び／又は停止することを可能にする。
【００８２】
いくつかの実装形態では、筐体２００の内部において、ロボットハンドリングシステム２０８が材料カートリッジ２１２ａ、２１２ｂの上方にガントリー２１０に沿って配置される。いくつかの実施形態では、制御回路要素、液体ハンドリングチューブ、空気ポンプ制御器、バルブ、熱ユニット（例えば、加熱及び冷却ユニット）、及び他の制御機構が、筐体２００のデッキの下の制御ボックス領域２１８に配置される。
【００８３】
図示されていないが、いくつかの実施形態では、ディスプレイ画面が、筐体２００の前面に配置され、例えばカバー２０２の一部を覆ってもよい。ディスプレイ画面は、自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理状況に関する情報をユーザに提供してもよい。別の例では、ディスプレイ画面は、細胞処理を行うためのユーザからの入力を受け入れてもよい。
【００８４】
図２Ｃ及び２Ｄは、自動化マルチモジュール細胞編集機器の第２の例示的な筐体２３０を示す。図示されるように、筐体２３０は、ヒンジ２３４を備えた透明ドア２３２を含む。例えば、ドアは筐体の作業領域にアクセスできるように、紙面の左にスイングしてもよい。ユーザは、例えば透明なドア２３２を開いて、試薬カートリッジや洗浄カートリッジなどの消耗品を筐体２３０に装填することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、筐体２３０の前面は、ドア２３２の右側に示されるディスプレイ（例えば、タッチスクリーンディスプレイデバイス）２３６をさらに含む。ディスプレイ２３６は、自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理状況に関する情報をユーザに提供してもよい。別の例では、ディスプレイ２３６は、例えば細胞処理を一時停止又は実行するために、ユーザからの入力を受け入れてもよい。
【００８６】
筐体２３０の右側面上の空気格子２３８は、筐体２３０の（例えば、デッキの上方の）作業領域内（例えば、デッキの上方）に空気の流れを提供し得る。筐体２３０の左側にある第２の空気格子２４０は、筐体２３０の制御ボックス領域２４２（例えば、デッキの下）内に空気の流れを提供し得る。図示されていないが、いくつかの実施形態では、筐体２００の足２２０ａ〜２２０ｃなどの足は、筐体２３０を作業面の上に持ち上げて、さらなる空気流を提供し得る。
【００８７】
いくつかの実装形態では、筐体２３０の内部において、ロボットハンドリングシステム２４８がガントリー２５０に沿って、カートリッジ２５２ａ、２５２ｂ、材料供給部２５４ａ、２５４ｂ（例えば、ピペットチップ及びフィルタ）、及びモジュール（例えば、一対の成長バイアル、ＦＴＥＰデバイス、核酸アセンブリモジュール（図示略））の上方に配置される。いくつかの実施形態では、制御回路要素、液体ハンドリングチューブ、空気ポンプ制御器、バルブ、及び他の制御機構が、筐体２３０のデッキの下の制御ボックス領域２４２に配置される。
【００８８】
いくつかの実施形態では、液体廃棄ユニット２４６が筐体２３０の左側外壁に取り付けられる。液体廃棄ユニット２４６は、例えば、潜在的な汚染を回避し、液体廃棄ユニット２４６の迅速な排出及び交換を確実にするために、筐体２３０の外部に取り付けられてもよい。
【００８９】
核酸アセンブリモジュール
本開示の自動化マルチモジュール細胞編集機器の特定の実施形態は、核酸アセンブリモジュール器具を含む。核酸アセンブリモジュールは、所望のゲノム編集事象を促進するために必要な核酸を受け入れてアセンブリするように構成されている。核酸アセンブリモジュールはまた、ベクターアセンブリ及びその後の目的の細胞へのエレクトロポレーションのために適切なベクター骨格を受け入れるように構成されてもよい。
【００９０】
一般に、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターには、限定するものではないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の自由端を含む核酸分子、自由端を含まない核酸分子（例、環状）；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその両方を含む核酸分子；及び当技術分野で知られている他の種類のポリヌクレオチドが含まれる。ベクターの１種は「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術などによって追加のＤＮＡセグメントを挿入できる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルス由来のＤＮＡ又はＲＮＡ配列がウイルスにパッケージングするためにベクターに存在するウイルスベクターである（例えば、レトロウイルス、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠陥アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）。ウイルスベクターには、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含まれる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及び哺乳類エピソーマルベクター）。他のベクター（例えば、哺乳類非エピソーマルベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術で有用な一般的な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形をしている。追加のベクターには、フォスミド、ファージミド、及び合成染色体が含まれる。
【００９１】
組換え発現ベクターは、形質転換に適した形態の核酸を含むことができ、一部の核酸配列については、宿主細胞におけるその核酸の翻訳及び発現に適した形態の核酸を含むことができる。これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節要素（発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される）を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、転写を可能にする態様で、及び一部の核酸配列については、（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写／翻訳システムで、又はベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞で）そのヌクレオチド配列の翻訳及び発現を可能にする態様で調節要素に連結されているという意味である。適切な組換え及びクローニング方法は、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅｓ」と題され、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４−０１７１１５６号として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号に開示されており、その内容はすべての目的で参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、調節要素は、転写を駆動するために、及び一部の核酸配列については、標的化可能なヌクレアーゼシステムの１つ以上のコンポーネントの翻訳及び発現を駆動するために、標的化可能なヌクレアーゼシステムの１つ以上の要素に作動可能に連結される。
【００９３】
さらに、核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞又は真核細胞などの特定の細胞での発現のためにコドン最適化することができる。真核細胞は、酵母、真菌、藻類、植物、動物、又はヒト細胞であり得る。真核細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、又は非ヒト霊長類を含む非ヒト哺乳類を含むがこれらに限定されない哺乳類などの特定の生物のもの又はそれに由来するものであり得る。それに加えて、又はそれに代えて、ベクターは、転写されるとガイドＲＮＡを形成するポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節要素を含んでもよい。
【００９４】
核酸アセンブリモジュールは、自動化された方法で多種多様な異なる核酸アセンブリ技術を実行するように構成することができる。開示された自動化マルチモジュール細胞編集機器の核酸アセンブリモジュールで実行できる核酸アセンブリ技術には、限定するものではないが、ＰＣＲ、ＢｉｏＢｒｉｃｋアセンブリ（２０１６年６月７日発行の「Ｓｃａｒ−ｌｅｓｓ  Ｍｕｌｔｉ−ｐａｒｔ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｄｅｓｉｇｎ」と題されたＨｉｌｌｓｏｎの米国特許第９，３６１，４２７号）、Ｔｙｐｅ  ＩＩＳクローニング（例えば、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアセンブリ、２０１０年７月６日出願の「Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」と題されたＷｅｂｅｒらの欧州特許出願公開第２３９５０８７号）、及びリガーゼサイクリング反応（ｄｅ  Ｋｏｋ  Ｓ，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．，３（２）：９７−１０６（２０１４）；Ｅｎｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，３（１１）：ｅ３６４７（２００８）；２０００年１１月７日発行の「Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｂｒｉｄｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ」と題されたＰａｃｈｕｋらの米国特許第６，１４３，５２７号）を含む、制限エンドヌクレアーゼを使用するアセンブリ方法が含まれる。他の実施形態では、開示された自動化マルチモジュール細胞編集機器によって実行される核酸アセンブリ技術は、ギブソンアセンブリ（商標）、ＣＰＥＣ、ＳＬＩＣ、リガーゼサイクリングなどの核酸の隣接部分間の重複に基づいている。さらなるアセンブリ方法には、酵母のギャップ修復（Ｂｅｓｓａ，Ｙｅａｓｔ，２９（１０）：４１９−２３（２０１２））、ゲートウェイクローニング（Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０（２）：２４４−５１（２００９）；１９９９年３月３０日発行の「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅｓ」と題されたＨａｒｔｌｅｙらの米国特許第５，８８８，７３２号、２００１年８月２１日発行の「Ｒｅｃｏｍｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅｓ」と題されたＨａｒｔｌｅｙらの米国特許第６，２７７，６０８号）、及びトポイソメラーゼを介したクローニング（Ｕｄｏ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，１０（９）：ｅ０１３９３４９（２０１５）；２００５年７月１２日発行の「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」と題されたＣｈｅｓｔｎｕｔらの米国特許第６，９１６，６３２号）が含まれる。これら及び他の核酸アセンブリ技術は、例えば、Ｓａｎｄｓ  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｔ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，１１３：３．２６．１−３．２６．２０（２０１６）；Ｃａｓｉｎｉ  ｅｔａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，（９）：５６８−７６（２０１５）；Ｐａｔｒｏｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．，１９：１４−９（２０１４））に開示されている。
【００９５】
核酸アセンブリモジュールは、自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用される核酸アセンブリの種類に応じて温度制御される。例えば、ＰＣＲが核酸アセンブリモジュールで利用される場合、モジュールは、変性、アニーリング、及び伸長の間で温度を循環させることができるサーモサイクリング機能を有するであろう。核酸アセンブリモジュールで単一温度アセンブリ法が利用される場合、モジュールは実行される特定のアセンブリプロセスを最適化する温度に到達させ、保持する能力を有するであろう。これらの温度ならびにこれらの温度を維持する期間は、スクリプトによって実行されるパラメータの事前設定されたセットによって決定されるか、自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理システムを使用してユーザが手動で制御することができる。
【００９６】
一実施形態では、核酸アセンブリモジュールは、図３に示されるような単一の等温反応を使用してアセンブリを実行するモジュールである。特定の等温アセンブリ法は、配列同一性に基づいて最大１５個の核酸フラグメントを同時に組み合わせることができる。アセンブリ法は、いくつかの実施形態では、隣接する核酸フラグメントとの約２０〜４０塩基の重複を含むアセンブリされる核酸を提供する。フラグメントは、３つの酵素すなわちエキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、及びリガーゼのカクテルと、バッファー成分と共に混合される。このプロセスは等温であり、単一の反応容器を用いて１ステップ法又は２ステップ法で実行できるため、等温アセンブリ反応は自動化マルチモジュール細胞編集機器での使用に最適である。１ステップ法では、１ステップの等温プロセスを使用して、最大５つの異なるフラグメントをアセンブリすることができる。フラグメントと酵素のマスターミックスを組み合わせて、５０℃で最大１時間インキュベートする。１５フラグメントまでのより複雑な構築物の作成、又は１００ｂｐから１０ｋｂまでのフラグメントの組み込みには、通常２ステップが使用される。２ステップ反応では、マスターミックスを２回別々に追加する必要がある：１つはエキソヌクレアーゼ及びアニーリングのステップ、２回目はポリメラーゼ及びライゲーションのステップである。
【００９７】
図３は、一体化された精製を備える例示的な核酸アセンブリモジュール３００を示す。核酸アセンブリモジュール３００は、核酸アセンブリモジュール３００との間で（例えば、ピペット又はシッパーを介して）液体を移送するためのアクセスガスケット３０４を有するチャンバ３０２を含む。いくつかの実施形態では、アクセスガスケット３０４は、チャンバ３０２内に配置される交換可能なバイアルに接続される。例えば、ユーザ又はロボット操作システムは、処理のためにバイアルを核酸アセンブリモジュール３００内に配置してもよい。
【００９８】
チャンバ３０２は、抵抗加熱器３０８とハウジング３０６を共有する。試料が核酸アセンブリモジュール３００のチャンバ３０２に導入されると、抵抗加熱器３０８を使用して、チャンバ３０２の内容物を所望の温度に加熱することができる。温度の立ち上がりは、チャンバ３０２の内容に基づいて設定され得る（例えば、ロボット操作システムのピペッター又はシッパーユニットを介してアクセスガスケット３０４を通して供給される材料）。自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理システムは、目標温度と温度立ち上がり計画を決定することができる。温度の立ち上がり及び目標温度は、ハウジング３０６内に含まれるサーミスタ３１０などの熱センサを監視することにより制御され得る。特定の実施形態では、抵抗加熱器３０８は、ハウジング３０６内の温度を２０°〜８０℃、２５°〜７５℃、３７°〜６５℃、４０°〜６０℃、４５°〜５５℃、又は好ましくは約５０℃に維持するように設計されている。
【００９９】
精製モジュール
いくつかの実施形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器に核酸アセンブリモジュールが含まれる場合、機器は、核酸アセンブリ混合物の望ましくない成分（例えば、塩、ミネラル）を除去するための精製モジュールを含むこともでき、特定の実施形態では、アセンブリされた核酸を濃縮する。核酸アセンブリ後に液体を交換する方法の例には、磁気ビーズ（例えば、カリフォルニア州カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．のＳＰＲＩ又はＤｙｎａｌ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ））、シリカビーズ、シリカスピンカラム、ガラスビーズ、（例えばエタノール又はイソプロパノールを用いた）沈殿、アルカリ溶解、浸透圧精製、ブタノールでの抽出、膜ベースの分離技術、濾過などが含まれる。
【０１００】
一態様では、精製モジュールは、濾過、例えば限外濾過を提供する。例えば、様々な多孔度の異方性親水性セルロース膜を備えた一連のマイクロ濃縮器が利用可能である。別の例では、精製及び濃縮は、アセンブリされた核酸及びイオン塩を含む液体試料を不溶性リン酸塩を含むイオン交換体と接触させ、液体を除去し、イオン交換体から核酸を溶出することを含む。
【０１０１】
精製モジュールの特定の態様では、ＳＰＲＩビーズを使用でき、０．６〜２．０倍の体積のＳＰＲＩビーズを核酸アセンブリに追加できる。核酸アセンブリ生成物はＳＰＲＩビーズに結合し、ＳＰＲＩビーズが入っているチューブ、容器、又はチャンバの近くに磁石を自動的に配置することにより、ＳＰＲＩビーズはペレット化される。例えば、０．６〜２．０倍の体積のＳＰＲＩビーズを核酸アセンブリに追加できる。例えば、ＳＰＲＩビーズをエタノールで洗浄してもよく、結合した核酸アセンブリ生成物は、例えば水、トリス緩衝液、又は１０％グリセロールで溶出される。
【０１０２】
特定の態様では、磁石は、磁石を配置する線形アクチュエータに結合される。いくつかの実装形態において、核酸アセンブリモジュールは、統合されたアセンブリ及び精製のために設計されたアセンブリ及び精製の組合せモジュールである。例えば、図３に示される核酸アセンブリモジュールに関連して上記で議論されたように、核酸アセンブリ反応が起きるのに十分な時間が経過すると、チャンバ３０２の内容物（例えば、核酸アセンブリ試薬及び核酸）は、いくつかの実施形態では、磁気ビーズ（図示略）と組み合わされて精製プロセスを始動させる。緩衝液中のＳＰＲＩビーズは、例えばロボットハンドリングシステムによって核酸アセンブリモジュールの内容物に送達される。その後、いくつかの実施形態では、ソレノイド３１２が磁石によって作動され、チャンバ３０２内に含まれる磁気ビーズを励起する。特定の例では、ソレノイドは、チャンバ３０２内の磁気ビーズに８．９〜２２．２Ｎ（２〜５ポンド）の磁力、又は約１８Ｎ（約４ポンド）の磁力を付与することができる。チャンバ３０２の内容物は、アセンブリされたベクター及びオリゴヌクレオチドが磁気ビーズに結合するのに十分な時間インキュベートされてもよい。
【０１０３】
結合後、いくつかの実装形態では、結合した核酸アセンブリミックス（例えば、核酸アセンブリ試薬＋アセンブリされたベクター及びオリゴヌクレオチド）が核酸アセンブリモジュールから取り出され、ビーズに付着した核酸が８０％エタノールで１回から数回洗浄される。洗浄後、ビーズに付着した核酸をバッファーに溶出させ、形質転換モジュールに移す。すなわち、いくつかの実施形態では、核酸アセンブリモジュールと精製モジュールとは組み合わされる。
【０１０４】
いくつかの実装形態では、処理のためにバイアルがチャンバ３０２内の所定の位置に固定される。例えば、ユーザは、ピペッター又はシッパーとの係合時にバイアルを保持するように設計されたチャンバ３０２の戻り止めを超えてバイアルを押してもよい。別の例では、ユーザはバイアルを所定の位置にねじることで対応するチャネルに突起を係合させ、上向きの動きを禁じることができる。位置センサ（図示略）により、バイアルの引き込みを確かめてもよい。特定の実施形態では、位置センサは、チャンバ３０２の一部とバイアルとの間の係合を検出する磁気センサである。他の実施形態では、位置センサは、引き込まれた位置にあるバイアルの存在を検出する光学センサである。チャネル及び突起を使用する実施形態では、突起によって押し下げられた機械的スイッチがバイアルの係合を検出してもよい。
【０１０５】
成長モジュール
核酸がアセンブリされている間、編集の準備として細胞を成長させることができる。細胞成長は、成長モジュールで測定される光学密度（例えばＯＤ６００ｎｍ）で監視でき、フィードバックループを使用して、目標時間に目標ＯＤに到達するように細胞成長を調整する。測定可能な細胞密度及び生理学的状態の他の測定値には、限定するものではないが、ｐＨ、溶存酸素、放出された酵素、音響特性、及び電気特性が含まれる。
【０１０６】
いくつかの態様では、成長モジュールは、分光光度計又は蛍光光度計によって調べられるシェーカー又はボルテックス内の培養チューブを含む。シェーカー又はボルテックスは細胞を加熱又は冷却でき、細胞の成長はリアルタイムの吸光度又は蛍光測定によって監視される。一態様では、細胞を２５℃〜４０℃で１〜１０ＯＤのＯＤ６００吸光度まで成長させる。細胞は、２５℃〜３５℃、２５℃〜３０℃、３０℃〜４０℃、３０℃〜３５℃、３５℃〜４０℃、４０℃〜５０℃、４０℃〜４５℃又は４４℃〜５０℃の範囲の温度で成長させてもよい。別の態様において、細胞は、４２℃〜５０℃で加熱することにより、又は誘導剤を添加することにより誘導される。細胞は、４２℃〜４６℃、４２℃〜４４℃、４４℃〜４６℃、４４℃〜４８℃、４６℃〜４８℃、４６℃〜５０℃、又は４８℃〜５０℃の範囲で加熱することによっても誘導される。いくつかの態様において、細胞は誘導後に０℃〜１０℃に冷却される。細胞は、誘導後０℃〜５℃、０℃〜２℃、２℃〜４℃、４℃〜６℃、６℃〜８℃、８℃〜１０℃、又は５℃〜１０℃に冷却されてもよい。
【０１０７】
図１３Ａは、図１３Ｂ〜Ｃに示される細胞成長デバイス１３５０などの細胞成長デバイスと共に使用するための回転成長バイアル１３００の一実施形態を示す。回転成長バイアル１３００は、いくつかの実装形態では、液体培地及び細胞を受け入れるための開口端１３０４、細胞を成長させるための主要な容器を画定する中央バイアル領域１３０６、少なくとも１つの光路１３０８、１３１０を画定する先細ないし狭められた領域１３１８、閉端部１３１６、及び駆動係合機構１３１２を有する透明な容器である。回転成長バイアル１３００は、バイアル１３００がその周りを回転する中心縦軸１３２０を有してもよく、光路１３０８、１３１０は、バイアルの縦軸に対しほぼ直角であってもよい。いくつかの例では、第１の光路１３１０は、先細ないし狭められた領域１３１８の下側の狭められた部分に配置されてもよい。駆動係合機構１３１２は、いくつかの実装形態では、駆動機構（例えば、アクチュエータ、モータ（図示略））と係合して、バイアル１３００を回転させる。アクチュエータは、駆動モータ（図示略）用の駆動シャフト１３７４を含んでもよい。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、回転成長バイアル１３００は、例えば、先細ないし狭められた領域１３１８の上部先細領域に第２の光路１３０８を含む。いくつかの例では、先細ないし狭められた領域１３１８の第２の光路１３０８のための上部先細領域を画定する壁は、先細ないし狭められた領域１３１０の第１の光路１３１０のための下部の狭められた部分を画定する壁よりも縦軸１３２０に対して大きい角度で配置されてもよい。両方の光路１３０８、１３１０は、例えば、細胞培養物（細胞＋成長培地）で常に満たされ、成長バイアル１３００の回転速度の影響を受けない回転成長バイアル１３００の領域に配置されてもよい。図示されるように、第２の光路１３０８は第１の光路１３１０よりも短く、バイアル内の細胞培養物のＯＤ値が高レベル（例えば、細胞成長過程の後期）にあるときに光学密度（ＯＤ）値の高感度測定を可能にし、一方、第１の光路１３１０は、バイアル内の細胞培養物のＯＤ値が低レベル（例えば、細胞成長過程の初期）にあるときにＯＤ値の高感度測定を可能にする。
【０１０９】
回転成長バイアル１３００は再利用可能であってもよく、又は好ましくは、回転成長バイアルは消耗品である。いくつかの実施形態では、回転成長バイアル１３００は消耗品であり、成長培地で予め満たされた状態でユーザに提供することができ、その場合、バイアル１３００は開口端１３０４をホイルシールで密封される。このような方法で包装された培地充填回転増殖バイアルは、自立型細胞成長デバイス、又は自動化マルチモジュール細胞編集機器の一部である細胞成長モジュールと共に使用するキットの一部であり得る。バイアルに細胞を導入するために、ユーザは所望の量の細胞をピペットで採取し、ピペットチップでバイアル１３００のホイルシールを打ち抜くだけで済む。あるいは、当然、自動化された機器が、例えば試薬カートリッジから成長バイアルに細胞を移してもよい。成長培地は、成長バイアルに入れて提供してもよいし、細胞を加える前に試薬カートリッジから成長バイアルに移してもよい。開口端１３０４は、細胞成長デバイス１３５０（図１３Ｂ）と重なって係合する延長リップ１３０２を含むことができる。自動化された機器において、回転成長バイアル１３００は、図１８に示されるように、処理システム１８１０の一部であるスキャナ又はカメラによって読み取ることができるバーコード又は他の識別手段でタグ付けされてもよい。
【０１１０】
いくつかの実装形態では、回転成長バイアル１３００の容積及び細胞培養物（成長培地を含む）の体積は大きく異なる場合があるが、回転成長バイアル１３００の容積は、成長バイアル１３００での細胞培養において、バイアル１３００が回転している間に適切な通気を得るために十分な大きさでなければならない。実際には、回転成長バイアル１３００の容積は、１〜２５０ｍｌ、２〜１００ｍｌ、５〜８０ｍｌ、１０〜５０ｍｌ、又は１２〜３５ｍｌの範囲であり得る。同様に、細胞培養物（細胞＋成長培地）の体積は、回転成長バイアル１３００で適切な通気を可能にするのに適したものでなければならない。したがって、細胞培養物の体積は、成長バイアル８００の容積の約１０〜８５％、又は成長バイアルの容積の１５〜８０％、又は成長バイアルの容積の２０〜７０％、３０〜６０％、又は４０〜５０％とすべきである。一例では、３５ｍｌの成長バイアル１３００の場合、細胞培養物の体積は約４ｍｌ〜約２７ｍｌになるであろう。
【０１１１】
回転成長バイアル１３００は、いくつかの実施形態では、生体適合性の透明材料から製造されるか、又は光路を含むバイアル１３００の少なくとも一部が透明である。加えて、回転成長バイアル１３００が製造される材料は、温度ベースの細胞アッセイ及び低温での長期保存の両方に対応するように、約０℃以下に冷却可能であり、約７５℃以上に加熱可能でなければならない（例えば約２℃又は約７０℃に、約４℃又は約６０℃に、あるいは約４℃又は約５５℃に）。さらに、バイアルの製造に使用される材料は、回転中に変形することなく５５℃までの温度に耐えられることが好ましい。適切な材料には、ガラス、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリスルホン、ポリウレタン、及びこれら及び他のポリマーのコポリマーが含まれる。好ましい材料には、ポリプロピレン、ポリカーボネート、又はポリスチレンが含まれる。いくつかの実施形態では、回転成長バイアル８００は、例えば射出成形又は押出成形によって安価に製造される。
【０１１２】
図１３Ｂ〜Ｃは、回転成長バイアル１３００を受け入れる例示的な細胞成長デバイス１３５０の図を示す。いくつかの実施形態において、細胞成長デバイス１３５０は、バイアル１３００内の細胞又は細胞増殖を所定の温度範囲に加熱又は冷却するために回転する。いくつかの実装形態では、回転成長バイアル１３００をメインハウジング１３５２の内側に配置することができ、バイアル１３００の延長リップ１３０２はメインハウジング１３５２の上面を越えて延びる。いくつかの態様では、延長リップ１３０２は、ユーザがデバイス１３５０のメインハウジング１３５２にバイアル１３００を挿入し又はそこから引き抜くための把持面を提供する。さらに、メインハウジング１３５２に完全に挿入されると、延長リップ１３０２の下面はメインハウジング１３５２の上面に当接する。いくつかの例では、細胞成長デバイス１３５０のメインハウジング１３５２は、回転成長バイアル１３００の外面がメインハウジング１３５２の内面に当接し、それによってバイアル１３００をメインハウジング１３５２内に固定するようなサイズにされる。いくつかの実装形態では、細胞成長デバイス１３５０は、メインハウジング１３５４の各側に配置された端部ハウジング１３５４と、メインハウジング１３５２の下端に配置された下部ハウジング１３５６とを含むことができる。いくつかの例では、下部ハウジング１３５６は、細胞成長デバイス１３５０を温度制御（例えば、加熱／冷却）機構又は自動細胞処理システムの筐体などの他の構造に取り付けるのに使用可能なフランジ１３５８を含んでもよい。
【０１１３】
図１３Ｃに示されるように、いくつかの実装形態では、細胞成長デバイス１３５０は、メインハウジング１３５２に挿入された回転成長バイアル１３００の垂直荷重を支持するメインハウジング１３５２内に配置された上部軸受１３６０及び下部軸受１３６２を含むことができる。いくつかの例では、細胞成長デバイス１３５０はまた、メインハウジング１３５２に挿入されたときにバイアル１３００の第１の光路１３１０及び第２の光路１３０８と位置合わせされる一次光ポート１３６６及び二次光ポート１３６８を含み得る。いくつかの例では、一次及び二次光ポート１３６６、１３６８は、光がバイアル１３００を通過して細胞成長ＯＤ測定を行うことを可能にする隙間、開口部、又は透明材料から構成されたメインハウジングの一部である。光ポート１３６６、１３６８に加えて、細胞成長デバイス１３５０は、光路に１つ以上の照明源を提供する放射ボード１３７０と、光が回転成長バイアル１３００内の細胞培養液を通過した後の光を検出する検出器ボード１３７２とを含み得る。一例では、放射ボード１３７０上に配置される照明源には、細胞培養で一般的に使用される成長培地（例えば、哺乳類細胞、細菌細胞、動物細胞、酵母細胞）に見合った１つ以上の目標波長で照明を提供する発光ダイオード（ＬＥＤ）又はフォトダイオードが含まれ得る。
【０１１４】
いくつかの実装形態では、放射ボード１３７０及び／又は検出器ボード１３７２は、放射ボード１３７０によって出力される光の波長を制御し、検出器ボード１３７２で感知された照明を受信して処理する処理システム（例えば、処理システム１２６、１７２０、１８１０）に、有線又は無線接続を介して通信可能に結合される。いくつかの態様では、遠隔制御可能な放射ボード１３７０及び検出器ボード１３７２が、細胞成長の過程で自動ＯＤ測定を実施することを可能にする。例えば、処理システム１２６、１７２０は、所定の間隔で、又はユーザ要求に応じて、ＯＤ測定が実施される周期性を制御することができる。さらに、処理システム１２６、１７２０は、検出器ボード１３７２から受信したセンサデータを使用してリアルタイムのＯＤ測定を実行し、細胞成長条件（例えば温度、速度／回転方向）を調整することができる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、下部ハウジング１３５６は、回転成長バイアル１３００を細胞成長デバイス１３５０内で回転させる回転運動を生成する駆動モータ（図示略）を含み得る。いくつかの実装形態では、駆動モータは、回転成長バイアル１３００の下端と係合する駆動シャフト１３７４を含んでもよい。回転成長バイアル１３００の回転運動を生成する駆動モータは、いくつかの実施形態では、０から約３０００ＲＰＭの間の一定の毎分回転数（ＲＰＭ）を維持するように構成可能な駆動制御器を内蔵したブラシレスＤＣタイプの駆動モータである。あるいは、ステッパー、サーボ、又はブラシ付きＤＣモータなど、他のタイプのモータを使用することもできる。任意選択で、駆動モータは、回転方向の反転を可能にする方向制御器、及び実際のＲＰＭを感知して報告する回転速度計も備えている。他の例では、駆動モータは、所定の周波数で回転方向を反転させることにより振動運動を生成することができる。一例では、バイアル１３００は、３５０ＲＰＭの速度で各方向に１秒間回転する。駆動モータは、いくつかの実装形態では、有線又は無線通信ネットワークを介して、駆動モータの動作を制御するように構成された処理システム（例えば、処理システム１２６、１７２０）に通信可能に結合される。駆動モータの動作は、例えば図１８のモジュールコントローラ１８３０に関して説明するように、プロセッサにプログラムされた、及び／又はユーザ入力によって提供されるプロトコルを実行することを含み得る。例えば、駆動モータは、バイアル１３００の速度及び／又は回転方向を変化させて細胞培養物の軸方向歳差運動を引き起こし、それにより混合を促進して細胞凝集を防ぎ、通気を増加させるように構成することができる。いくつかの例では、駆動モータの回転の速度又は方向は、検出器ボード１３７２から受信した光学密度センサのデータに基づいて変更することができる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、細胞成長デバイス１３５０のメインハウジング１３５２、端部ハウジング１３５４及び下部ハウジング１３５６は、アルミニウム、ステンレス鋼、及びプラスチックを含む他の熱伝導性材料を含む頑丈な材料から製造され得る。これらの構造又はその一部は、様々な技術、例えば、金属加工、射出成形、融合された構造層の作成などによって作成できる。いくつかの例では、回転成長バイアル１３００は再利用可能であるが、他の実施形態では、バイアル１３００は消耗品であることが好ましい。いくつかの態様では、細胞成長デバイス１３５０の他のコンポーネントは、再利用可能であることが好ましく、自立型ベンチトップデバイスとして、又は自動化マルチモジュール細胞編集機器のモジュールとして機能することができる。
【０１１７】
いくつかの実装形態では、細胞成長モジュールに通信可能に結合される処理システムは、成長させている細胞培養物の「ブランク」又は対照として使用される情報でプログラムされてもよい。「ブランク」又は対照は、いくつかの例では、細胞成長培地のみを含む容器であり、１００％の透過率と０ＯＤをもたらすのに対し、細胞試料は光線を偏向させ、透過率を低くしＯＤを高くする。細胞が培地で成長し、密度が高くなると、透過率が低下し、ＯＤが上昇する。いくつかの実装形態では、細胞成長モジュールのプロセッサは、細胞培養で通常使用される成長培地（例えば、哺乳類細胞、細菌細胞、動物細胞、酵母細胞）に見合った波長の値をブランクに使用するようにプログラムされ得る。あるいは、第２の分光光度計及び容器を細胞成長モジュールに含めることができ、第２の分光光度計を使用して指定された間隔でブランクを読み取る。
【０１１８】
ゲノム編集を受けていない細胞のバックグラウンドを減らすために、成長モジュールは、選択プロセスが編集された細胞を濃縮することも可能にする。例えば、導入された核酸は、抗生物質耐性又は別の選択可能なマーカーを与える遺伝子を含むことができる。一連のラウンドの編集に対して選択マーカーの導入を交互に行うことで、未編集の細胞のバックグラウンドを排除することもでき、自動化マルチモジュール細胞編集機器の複数のサイクルが連続したゲノム編集を有する細胞を選択できるようにする。
【０１１９】
適切な抗生物質耐性遺伝子には、限定するものではないが、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナバニン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子などの遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態において、死細胞バックグラウンドの除去は、洗浄剤、浸透圧ストレス、温度、酵素、プロテアーゼ、バクテリオファージ、還元剤、又はカオトロープなどの溶解エンハンサーの使用により補助される。他の実施形態では、細胞除去及び／又は培地交換を使用して、死細胞バックグラウンドを低減する。
【０１２０】
細胞洗浄及び／又は濃縮モジュール
細胞洗浄及び／又は濃縮モジュールは、自動化マルチモジュール細胞処理機器内の液体を交換するための任意の方法を利用することができ、細胞を濃縮するか、又は核酸アセンブリモジュールで用いられるのと本質的に同じ又はそれ以上の体積の液体として保つことができる。さらに、いくつかの態様では、細胞洗浄モジュールで実行されるプロセスは、例えば洗浄でグリセロールを使用することにより、細胞をエレクトロコンピテントにする。
【０１２１】
密度勾配精製、透析、イオン交換カラム、濾過、遠心分離、希釈、精製用ビーズの使用など、様々な方法で細胞を洗浄することができる。
いくつかの態様において、細胞洗浄及び／又は濃縮モジュールは遠心分離装置を利用する。他の態様では、細胞洗浄及び／又は濃縮モジュールは濾過モジュールを利用する。さらに他の態様において、ビーズが細胞表面に結合する部分（ｍｏｉｅｔｙ）に結合される。これらの部分（ｍｏｉｅｔｙ）には、限定するものではないが、抗体、レクチン、コムギ胚芽凝集素、変異リゾチーム、及びリガンドが含まれる。
【０１２２】
他の態様では、細胞は磁化されるように操作され、洗浄ステップ後に磁石で細胞をペレット化することができる。細胞の磁化のメカニズムには、フェリチンタンパク質の発現が含まれるが、これに限定されない。
【０１２３】
いくつかの実装形態では、細胞洗浄及び／又は濃縮モジュールは濾過モジュールである。図１２Ａに移って、ブロック図は、濾過モジュール１２００の例示的な機能ユニットを示している。いくつかの実装形態では、濾過モジュール１２００の主制御器１２０２は、洗浄流体１２０６を取り込む第１の液体ポンプ１２０４ｂと、液体廃棄物ユニット１２０８に液体廃棄物を取り出す第２の液体ポンプ１２０４ａ（例えば、図１Ａの液体廃棄物ユニット１１４又は図１７Ａ及び１７Ｂの液体廃棄物ユニット１７２８など）とを含む。流量センサ１２１２は、濾過モジュールからの液体廃棄物の放出を監視するために、液体廃棄物ユニット１２０８へのコネクタ１２１４上に配置されてもよい。バルブ１２１６（図示の三方バルブ）は、洗浄液１２０６と濾過モジュール１２００を選択的に接続するために、洗浄カートリッジ１２１０内の洗浄液１２０６へのコネクタ１２１８上に配置されてもよい。
【０１２４】
濾過モジュール１２００は、いくつかの実装形態では、細胞試料を濾過及び濃縮するためのフィルタマニホールド１２２０を含む。フィルタマニホールド１２２０は、洗浄流体及び／又は液体廃棄物の流れ及び温度を監視するために、１つ以上の温度センサ１２２２及び圧力センサ１２２４を含むことができる。いくつかの実施形態では、センサ１２２２、１２２４は、図１８の処理システム１８１０などの自動化マルチモード細胞処理システムの処理システムによって監視及び分析される。フィルタマニホールド１２２０は、洗浄流体及び／又は液体廃棄物の流れを方向付けるための１つ以上のバルブ１２２６及び１１２６ｂを含むことができる。自動化マルチモード細胞処理機器の処理システムは、例えば、濾過モジュール１２００による濾過を指示するための一連の指示に従ってバルブを作動させてもよい。
【０１２５】
濾過モジュール１２００は、少なくとも１つのフィルタ１２３０を含む。濾過モジュール１２００での使用に適したフィルタの例には、膜フィルタ、セラミックフィルタ、及び金属フィルタが含まれる。フィルタは任意の形状で使用できる。フィルタは、例えば、円筒形又は本質的に平坦であってもよい。いくつかの実施形態において、所定の操作又は所定のワークフロー用に選択されるフィルタは、ワークフローの種類（例えば、細菌、酵母、ウイルスなど）又は処理される材料の量に依存する。例えば、平坦なフィルタは比較的低コストで一般的に使用されるが、円筒形フィルタなどの表面積の大きいフィルタは、より大きい流量を受け入れることができる。別の例では、中空フィルタは、少量の試料（例えば、約１０ｍｌ未満）を処理する場合に低い回収率を示す場合がある。例えば、細菌に使用する場合、使用するフィルタは膜フィルタ、特に中空糸フィルタであることが好ましい場合がある。用語「中空繊維」とは、管状の膜を意味する。いくつかの例では、管の内径は少なくとも０．１ｍｍ、より好ましくは少なくとも０．５ｍｍ、最も好ましくは少なくとも０．７５ｍｍであり、好ましくは管の内径は最大１０ｍｍ、より好ましくは最大６ｍｍ、最も好ましくは最大１ｍｍである。中空繊維を有するフィルタモジュールは、様々な会社から、例えばＧ．Ｅ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州マールボロ）及びＩｎｎｏｖａＰｒｅｐ（ミズーリ州ドレクセル）（例えば、「Ｌｉｑｕｉｄ  ｔｏ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｆｌｕｉｄ  Ｐａｔｈ」と題されたＰａｇｅらの米国特許出願公開第２０１１００６１４７４号を参照）から購入できる。
【０１２６】
いくつかの実装態様では、濾過モジュール１２００は、使用後にフィルタ１２３０を排出するためのフィルタ排出手段１２２８（例えば、アクチュエータ）を含む。例えば、ユーザ又はロボットハンドリングシステムは、フィルタ１２３０を使用のための位置まで押して、フィルタが濾過中にフィルタマニホールド１２２０によって保持されるようにすることができる。濾過後、使用済みフィルタ１２３０を除去するために、フィルタ排出アクチュエータ１２２８はフィルタ１２３０を排出し、ユーザ又はロボットハンドリングシステムが使用済みフィルタ１２３０を濾過モジュール１２００から除去できるようにフィルタ１２３０を解放することができる。いくつかの例では、使用済みフィルタ１２３０は、図１Ａ〜１Ｂの固形廃棄物ユニット１１２内、図１７Ａ及び１７Ｂの固形廃棄物ユニット１７１８内に配置されてもよく、又は図１２Ｄに示されるように、フィルタカートリッジ１２４０に戻されてもよい。
【０１２７】
図１２Ｄに移って、いくつかの実装形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器の筐体内に配置されたフィルタカートリッジ１２４０に設けられたフィルタ１２３０ａ、ｂ、ｃ、ｄは、使用前にロボットハンドリングシステム（例えば、図１Ａ及び１Ｂに関連して説明されたロボットハンドリングシステム１０８、又は図１７Ａ及び１７Ｂのロボットハンドリングシステム１７０８）によって濾過モジュール１２００に移送され、濾過モジュール１２００内に配置される。
【０１２８】
濾過モジュール１２００は、いくつかの実装形態では、定期的な清掃が必要である。例えば、清掃が必要な場合、処理システムは自動化マルチモジュール細胞編集機器のユーザインターフェース及び／又はワイヤレスメッセージング手段（例えば、テキストメッセージ、電子メール、及び／又はパーソナルコンピューティングデバイスアプリケーション）を通じてユーザに警告してもよい。例えば、汚染除去フィルタを濾過モジュール１２００に装填し、濾過モジュール１２００を洗浄液及び／又はアルコール混合物で洗浄することができる。
【０１２９】
いくつかの実装形態では、濾過モジュール１２００は、洗浄流体１２０６を含む洗浄カートリッジ１２１０（図１１Ａの洗浄カートリッジ１１００など）とコネクタ１２１８を介して連通している。例えば、ユーザが自動化マルチモジュール細胞編集機器の筐体内に洗浄カートリッジ１２１０を配置すると、コネクタ１２１８は洗浄カートリッジ１２１０の底部入口と嵌合し、洗浄流体１２０６と濾過モジュール１２００との間に液体通路を形成する。
【０１３０】
図１２Ｂ及び１２Ｃに移って、いくつかの実装形態では、一対のフィルタ濾過モジュール１２５０は、一対の洗浄リザーバ１２５４ａ及び１２５４ｂ上に配置された一対のフィルタ１２５２ａ及び１２５２ｂを含む。一例では、各フィルタは、０．４５μｍの細孔及び８５ｃｍ２を超える面積を有する中空コア繊維フィルタであり得る。洗浄リザーバ１２５４ａ及び１２５４ｂは、いくつかの例では、容積が５０ｍＬ、１００ｍＬ、又は２００ｍＬを超えてもよい。いくつかの実施形態では、洗浄リザーバ１２５４ａ及び１２５４ｂは、図１１Ａの洗浄又は試薬カートリッジ１１００などの洗浄カートリッジ１２５６に配置される。
【０１３１】
自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理システムは、いくつかの実装形態では、Ｘ（水平）及びＺ（垂直）方向の一対のフィルタ１２５２ａ及び１２５２ｂの作動を制御して、フィルタ１２５２ａ、１２５２ｂを洗浄リザーバ１２５４ａ及び１２５４ｂに配置する。特定の例では、一対のフィルタ１２５２ａ及び１２５２ｂは、Ｘ軸に沿って協調して移動してもよいが、Ｚ軸の範囲の運動については独立していてもよい。
【０１３２】
図示のように、濾過モジュール１２５０の一対のフィルタ１２５２ａ及び１２５２ｂは、細いアーム本体１２５８に接続されている。いくつかの実施形態において、濾過モジュール１２５０の任意のポンプ及びバルブは、本体１２５８から離れて（例えば、自動化マルチモジュール細胞編集機器の筐体の床内に）配置され得る。このようにして、濾過モジュール１２５０は、従来のはるかに嵩高い市販の濾過モジュールに取って代わることができる。
【０１３３】
さらに、いくつかの実施形態では、濾過モジュール１２５０は、図１２Ａの液体廃棄物容器１２０８又は図１Ａの液体廃棄物容器１１４又は図１７Ａ及び１７Ｂの１７２８などの液体廃棄物保管ユニットに液体廃棄物を放出するように設計された廃棄物パージシステムと連通している。
【０１３４】
ＦＴＥＰモジュール
ＦＴＥＰ（形質転換）モジュールは、エレクトロポレーションによって日常的に行われる任意の細胞形質転換又はトランスフェクション技術を実装できる。エレクトロポレーションは、電気刺激により細胞膜に一時的に細孔を生成することにより機能する、細胞膜の透過化に広く使用されている方法である。エレクトロポレーションの応用には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、抗体、薬物又はその他の物質の、哺乳類細胞（ヒト細胞を含む）、植物細胞、古細菌、酵母、その他の真核細胞、細菌、及びその他の細胞種などの様々な細胞への送達が含まれる。電気刺激は、ハイブリドーマ又は他の融合細胞の生産における細胞融合にも使用できる。典型的なエレクトロポレーション手順の間、細胞は、細胞の生存に有利な緩衝液又は培地に懸濁される。細菌細胞のエレクトロポレーションでは、水、グリセロール溶液などの低コンダクタンスの培地を使用して、一時的な高電流による発熱を減らすことがよくある。次いで、細胞及び細胞にエレクトロポレーションされる材料（集合的に「細胞試料」）を、放電のために２つの平らな電極が埋め込まれたキュベットに入れる。例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（カリフォルニア州ハーキュリーズ）は、キュベット内の細胞をエレクトロポレーションするためのＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ  ＸＣＥＬＬ（商標）製品ラインを製造している。従来、エレクトロポレーションには高い電界強度が必要である。
【０１３５】
一般的に、マイクロ流体エレクトロポレーション（約２０ｍｌ未満かつ１μｍほどの少なさの細胞懸濁液を使用）は、トランスフェクション又は形質転換プロセスをより正確に制御でき、ベンチスケールのエレクトロポレーションデバイスよりも、他の細胞処理ツールと柔軟に統合できる。したがって、マイクロ流体エレクトロポレーションは、例えば、単回の細胞形質転換、処理、及び分析；マルチユニットＦＴＥＰデバイス構成；ならびに統合された自動化マルチモジュール細胞編集及び分析に独自の利点を提供する。
【０１３６】
本開示は、低毒性で高効率の細胞エレクトロポレーションを達成するエレクトロポレーションデバイス、モジュール、及び方法を提供し、そのエレクトロポレーションデバイス及びシステムは他の自動細胞処理ツールと統合することができる。さらに、本開示のエレクトロポレーションデバイスは、２つから多数のエレクトロポレーションユニットが並行して構築及び使用される多重化を可能にし、ロボット式液体ハンドリング機器との特に容易な統合を可能にする。このような自動化機器には、限定するものではないが、Ｔｅｃａｎ（スイス、マンネドルフ）、Ｈａｍｉｌｔｏｎ（ネバダ州リノ）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（コロラド州フォートコリンズ）などの既製の自動液体ハンドリングシステムが含まれる。
【０１３７】
エレクトロポレーションプロセス中、細胞への物質のエレクトロポレーションを達成するのに十分な電圧を使用することが重要であるが、電圧が高すぎると細胞の生存率が低下するため、電圧を上げすぎてはいけない。例えば、ヒト細胞株の懸濁液をエレクトロポレーションするには、４ｍｍギャップのキュベット内の０．２ｍｌの試料に対して２００ボルト及び約１０００μＦのコンデンサからの指数関数的放電が必要である。しかし、同じ０．２ｍｌの細胞懸濁液をもっと長い２ｃｍの電極距離（キュベットギャップ距離の５倍）の容器に入れると、必要な電圧は１０００ボルトになるが、コンデンサからの電気エネルギーは次の方程式に従うため、コンデンサはわずか４０μＦ（１０００μＦの１／２５）のものでよい。
【０１３８】
Ｅ＝０．５Ｕ２Ｃ
ここで、Ｅは電気エネルギー、Ｕは電圧、Ｃは静電容量である。したがって、高電圧パルス発生器は、同程度の量のエネルギーを保存するのに必要なコンデンサがはるかに小さくてよいため、実際に製造が簡単である。同様に、より高い電圧の他の波形を生成することも困難ではない。
【０１３９】
本開示のエレクトロポレーションデバイスは、比較的短い時間で高い比率の細胞形質転換を可能にする。細胞の形質転換率は、形質転換される細胞の種類及び細胞数に依存する。例えば、大腸菌の場合、エレクトロポレーションデバイスは、毎秒１０３〜１０１２細胞、毎秒１０４〜１０１０、毎秒１０５〜１０９、又は毎秒１０６〜１０８の細胞形質転換率を提供できる。典型的には、毎分１０８個の酵母細胞が形質転換され、毎分１０１０〜１０１２個の細菌細胞が形質転換され得る。エレクトロポレーションデバイスはまた、並列装置を使用した１回の形質転換手順で１細胞から１０１２細胞の範囲の細胞のバッチの形質転換を可能にする。
【０１４０】
本明細書に記載されるＦＴＥＰデバイスの一実施形態は、図４Ａ〜４Ｃに示されている。図４Ａは、細胞及び細胞に送達される外来性物質を含む流体をＦＴＥＰデバイス４００に導入するための入口４０２と、エレクトロポレーション後に形質転換細胞を取り出すための出口４０４とを有するＦＴＥＰデバイス４００の平面上面図を示す。楕円電極４０８は、電極の湾曲に基づいてチャネルが狭くなるフローチャネル（図示略）の中央部分を画定するように配置される。図４Ｂは、入口チャネル４０２、出口チャネル４０４、及びフローチャネル４０６に対して配置された電極４０８を有するデバイス４００の上面から見た破断図を示す。電極４０８は、フローチャネル４０６の狭窄部を画定することに留意されたい。図４Ｃは、デバイス４００の破断側面図を、入口４０２及び入口チャネル４１２、ならびに出口４０４及び出口チャネル４１４と共に示す。電極４０８は、形状が楕円形であり、フローチャネル４０６の狭められた部分を画定するように配置されている。
【０１４１】
本開示のＦＴＥＰデバイスでは、形質転換の毒性レベルは、細胞の種類及び細胞に導入される核酸に応じて、エレクトロポレーション後に３０％を超える生存細胞、好ましくは形質転換後に３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、さらには９９％を超える生存細胞をもたらす。
【０１４２】
ＦＴＥＰデバイスのハウジングは、ＦＴＥＰデバイスを再利用するか、オートクレーブするか、使い捨てにするかに応じて多くの材料から形成することができ、それらの材料にはステンレス鋼、シリコン、ガラス、樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリルブタジエン、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホン及びポリウレタン、これらのコポリマー及びその他のポリマーが含まれる。同様に、デバイスのチャネルの壁は、シリコーン、樹脂、ガラス、ガラス繊維、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリルブタジエン、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホン及びポリウレタン、これらのコポリマー及び他のポリマーを含む任意の適切な材料から形成することができる。好ましい材料には、結晶スチレン、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）及び環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）が含まれ、これらは、電極及び例えば底部密封フィルム（存在する場合）を除いて、射出成形によりデバイスを完全に一体成形できるようにする。
【０１４３】
本明細書に記載のＦＴＥＰデバイス（又はＦＴＥＰデバイスの一部）は、例えばデバイス全体として、又は融合又は他の方法で結合される構造層の作成により、様々な技術を介して作成又は製造することができる。例えば、金属ＦＴＥＰデバイスの場合、製造には精密機械加工又はレーザー加工が含まれる。シリコンＦＴＥＰデバイスの場合、製造にはドライ又はウェットエッチングが含まれる。ガラスＦＴＥＰデバイスの場合、製造にはドライ又はウェットエッチング、パウダーブラスト、サンドブラスト、又はフォトストラクチャリング（ｐｈｏｔｏｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ）が含まれる。プラスチックＦＴＥＰデバイスの場合製造には熱成形、射出成形、ホットエンボス、又はレーザー加工が含まれる。ＦＴＥＰデバイスの構成要素は、個別に製造してから組み立ててもよいし、ＦＴＥＰデバイスの特定の構成要素（又は電極を除くＦＴＥＰデバイス全体）を単一の物体として（例えば、３Ｄプリントを使用して）製造又は（例えば、射出成形を使用して）成形し、成形後に他の構成要素を追加してもよい。例えば、ハウジング及びチャネルを単一の物体として製造又は成形し、電極（及び、例えば底部密封フィルム）を後で追加してＦＴＥＰユニットを形成してもよい（図１０Ｆ（ｉ）を参照）。あるいは、ＦＴＥＰデバイスは、２つ以上の平行な層、例えば、水平チャネル及びフィルタを備えた層、垂直チャネルを備えた層、及び入口ポート及び出口ポートを備えた層に形成されてもよく、これらは個別に製造及び／又は成形され、製造後に組み立てられる。（例えば、図９Ａを参照。）
特定の態様において、ＦＴＥＰデバイスは、回路基板をベースとして使用して製造することができ、電極、フィルタ及び／又はフローチャネルが回路基板上に所望の構成で形成され、残るデバイスのハウジングは、例えば、別個の層として形成されて後に回路基板上に封止される１つ以上の入口チャネル及び出口チャネル、及び／又はフローチャネルを含む。ハウジングの上部の回路基板への封止は、本開示のＦＴＥＰデバイスの異なる要素の望ましい構成を提供する。また、２つから多数のＦＴＥＰデバイスを単一の基板上に製造し、その後互いに分離するか、並列配置で使用することもできる。特定の実施形態では、ＦＴＥＰデバイスは再利用可能であり、いくつかの実施形態では、ＦＴＥＰデバイスは使い捨てである。追加の実施形態では、ＦＴＥＰデバイスはオートクレーブ可能であってもよい。
【０１４４】
電極４０８は、銅、ステンレス鋼、チタン、アルミニウム、真鍮、銀、ロジウム、金又は白金、又はグラファイトなどの任意の適切な金属から形成することができる。１つの好ましい電極材料は、合金３０３（ＵＮＳ３３０３００）オーステナイト系ステンレス鋼である。電界をかけると、アルミニウムなどの金属でできた電極は破壊される可能性がある。使い捨ての１回使用式フロースルー型ＦＴＥＰデバイスとは対照的に、複数回使用の（つまり、使い捨てではない）フロースルー型ＦＴＥＰデバイスが望ましい場合、電極プレートは電気化学的腐食に耐える金属でコーティングできる。電極板を保護するために、貴金属のような導電性コーティング、例えば金を使用することができる。
【０１４５】
さらに、ＦＴＥＰデバイスは、マルチパスエレクトロポレーション手順を可能にするプッシュプル空気圧手段を備えてもよい。すなわち、エレクトロポレーションされる細胞は、１回目のエレクトロポレーションのために入口から出口に向かって「引っ張られ」、次にフロースルー型ＦＴＥＰデバイスの出口端から入口端に向かって「押し出され」、さらなるエレクトロポレーションのために電極間を再び通過する。このプロセスは１回から複数回繰り返され得る。
【０１４６】
エレクトロポレーションする細胞の種類（例えば、細菌、酵母、哺乳類）及び電極の構成に応じて、フローチャネル内の電極間の距離は大きく異なり得る。例えば、図４Ａ〜４Ｉ、５Ａ〜５Ｈ、６、及び７Ａ〜７Ｅに示す実施形態では、電極が、フローチャネルの幅が減少するフローチャネルの壁の一部を形成し、フローチャネル内の電極間の距離は１０μｍ〜５ｍｍ、又は２５μｍ〜３ｍｍ、又は５０μｍ〜２ｍｍ、又は７５μｍ〜１ｍｍであってもよい。電極がチャネル狭窄部の両端に配置された図８Ａ〜８Ｕ、９Ａ〜９Ｃ、及び１０Ａ〜１０Ｄに示すような他の実施形態では、フローチャネル内の電極間の距離は１ｍｍ〜１０ｍｍ、又は２ｍｍ〜８ｍｍ、又は３ｍｍ〜７ｍｍ、又は４ｍｍ〜６ｍｍであってもよい。ＦＴＥＰデバイスの全体サイズは、３ｃｍ〜１５ｃｍの長さ、４ｃｍ〜１２ｃｍの長さ、又は４．５ｃｍ〜１０ｃｍの長さである。ＦＴＥＰデバイスの全体の幅は、０．５ｃｍ〜５ｃｍ、又は０．７５ｃｍ〜３ｃｍ、又は１ｃｍ〜２．５ｃｍ、又は１ｃｍ〜１．５ｃｍであってもよい。
【０１４７】
狭められたフローチャネルの領域は、通常、少なくとも２つの細胞が並んで狭められた部分に収まるのに十分な広さである。例えば、典型的な細菌細胞は直径１μｍであるため、そのような細菌細胞を形質転換するために使用されるＦＴＥＰデバイスのフローチャネルの狭められた部分は、少なくとも２μｍの幅になる。別の例では、哺乳類細胞の直径が約５０μｍである場合、そのような哺乳類細胞を形質転換するために使用されるＦＴＥＰデバイスのフローチャネルの狭められた部分は少なくとも１００μｍの幅になる。すなわち、ＦＴＥＰデバイスの狭められた部分は、形質転換される細胞を物理的にゆがめることも圧迫することもない。
【０１４８】
リザーバを使用して細胞及び外来性物質をＦＴＥＰデバイスに導入するＦＴＥＰデバイスの実施形態では、リザーバの容積は１００μＬ〜１０ｍＬ、又は５００μＬ〜７５ｍＬ、又は１ｍＬ〜５ｍＬの範囲である。ＦＴＥＰの流量は、毎分０．１ｍＬ〜５ｍＬ、又は毎分０．５ｍＬ〜３ｍＬ、又は毎分１．０ｍＬ〜２．５ｍＬの範囲である。ＦＴＥＰデバイスの圧力は６．９〜２０７ｋＰａ（１〜３０ｐｓｉ）、１４〜６９ｋＰａ（２〜１０ｐｓｉ）、又は２０〜３５ｋＰａ（３〜５ｐｓｉ）の範囲である。
【０１４９】
電極間の異なる電界強度を避けるために、電極は平行に配置する必要がある。さらに、電極の表面は、ピンホールや尖端のないように、できるだけ滑らかであるべきである。１〜１０μｍの粗さＲｚを有する電極が好ましい。本発明の別の実施形態では、フロースルー型エレクトロポレーションデバイスは、ＦＴＥＰデバイスに接地電位を印加する少なくとも１つの追加の電極を含む。
【０１５０】
電極は、１〜２５Ｋｖ／ｃｍ、又は５〜２０Ｋｖ／ｃｍ、又は１０〜２０Ｋｖ／ｃｍを供給するように構成される。電極が離れているほど、より多くの電圧を供給する必要がある。また、供給される電圧はもちろん、穿孔される細胞の種類、細胞が懸濁されている培地、エレクトロポレーションチャネルのサイズ、ならびに電極の長さ及び直径に依存する。指数関数的減衰波、方形波又は矩形波、任意の波形、又は選択された波形の組合せなど、ＦＴＥＰデバイスで使用できる様々なパルス形式がある。一般的なパルス形式の１つに、指数関数的減衰波がある。これは、通常、負荷のかかったコンデンサを細胞試料に放電することによって生成される。指数関数的減衰波は、初期ピーク電流が減衰されるようにインダクタを細胞試料につなぐことにより、よりなだらかにすることができる。指定したシーケンスで複数の波形を使用する場合、それらは同じ方向（直流）でも異なる方向（交流）でもよい。交流を使用すると、１つだけではなく細胞の２つの局所表面を分子輸送に使用でき、交流が電気分解を防ぐことができるという点で有益である。パルス発生器は、デジタル又はアナログパネルで制御できる。いくつかの実施形態では方形波形状が好ましく、他の実施形態では、方形波の前の初期波スパイクがあることが好ましい。
【０１５１】
ＦＴＥＰデバイスは、１μｌ〜５ｍｌ、１０μｌ〜２ｍｌ、２５μｌ〜１ｍｌ、又は５０μｌ〜７５０μｌの量の細胞試料をエレクトロポレーションするように構成することができる。エレクトロポレーションプロセスのために細胞及び細胞にエレクトロポレーションされる材料（試薬）を懸濁するために使用される培地又は緩衝液は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、ハンクス、ＰＢＳ及びリンゲル液などの任意の適切な培地又は緩衝液であり得る。培地は、キットの一部として試薬カートリッジで提供される場合がある。さらに、形質転換又はトランスフェクションの前に細胞をエレクトロコンピテントにする必要があるため、緩衝液はグリセロール又はソルビトールを含んでもよく、界面活性剤を含んでもよい。ほとんどの真核細胞のエレクトロポレーションでは、通常、培地又は緩衝液は適切な浸透圧を維持するために塩を含んでいる。培地又は緩衝液中の塩も培地を導電性にする。細菌などの非常に小さい原核細胞のエレクトロポレーションでは、非常に高い電界強度を可能にするために、水又は１０％グリセロールを低コンダクタンス培地として使用する場合がある。その場合、送達される荷電分子は、依然として脂質ベースの細胞膜よりも水性培地をより導電性にし、特に細胞膜と比較して、培地は依然として導電性であるとおおよそ考えることができる。
【０１５２】
細胞にエレクトロポレーションされる化合物は、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、ならびにホルモン、サイトカイン、ケモカイン、薬物、又は薬物前駆体などの小分子といった、エレクトロポレーションに有用であることが当技術分野で知られている任意の化合物であり得る。核酸誘導型ヌクレアーゼ編集の実施形態では、細胞にエレクトロポレーションされる化合物は核酸及びタンパク質である。
【０１５３】
本明細書に記載されるＦＴＥＰデバイスの別の実施形態は、図４Ｄ〜４Ｆに示されている。図４Ｄは、細胞及び外来性物質を含む流体をＦＴＥＰデバイス４１０に導入するための入口４０２と、エレクトロポレーション後に形質転換細胞を取り出すための出口４０４とを有するＦＴＥＰデバイス４１０の上面図を示す。円筒形電極４０８は、フローチャネル（図示略）の中央部分を画定するように配置され、そこでは電極の湾曲の結果としてフローチャネルが狭くなる。図４Ｅは、ＦＴＥＰデバイス４１０の上面から見た破断図を示しており、入口４０２、出口４０４、及び電極４０８がフローチャネル４０６に対して配置されている。繰り返しになるが、電極４０８は、フローチャネル４０６の狭められた部分又は領域を画定している。図４Ｆは、入口４０２及び入口チャネル４１２、ならびに出口４０４及び出口チャネル４１４を備えたＦＴＥＰデバイス４１０の破断側面図を示す。電極４０８は円筒形であり、フローチャネル４０６内に配置され、フローチャネル４０６の狭められた部分を画定する。
【０１５４】
本開示のＦＴＥＰデバイスのさらに別の実施形態が図４Ｇ〜４Ｉに示されている。図４Ｇは、細胞及び外来性物質を含む流体をＦＴＥＰデバイス４２０に導入するための入口４０２と、エレクトロポレーション後に形質転換細胞を取り出すための出口４０４とを有するＦＴＥＰデバイス４２０の上面図を示す。半円筒形電極４０８は、フローチャネル（図示略）の狭められた部分を画定するように配置され、そこでは電極の湾曲に基づいてチャネルが両端から狭くなる。図４Ｈは、入口４０２、出口４０４、及びフローチャネル４０６に対して配置された電極４０８を有するＦＴＥＰデバイス４２０の上面から見た破断図を示す。図４Ｉは、入口４０２及び入口チャネル４１２、ならびに出口４０４及び出口チャネル４１４を備えたＦＴＥＰデバイス４２０の破断側面図を示す。半円筒形電極４０８は、フローチャネル４０６に配置されてフローチャネル４０６の狭められた部分を画定する。図４Ａ〜４Ｉに示されたデバイスは、フローチャネルに沿って実質的に中央に配置された電極を示すが、デバイスの他の態様では、電極はフローチャネルの狭められた領域において、ＦＴＥＰデバイスのもっと入口寄りに、又はＦＴＥＰデバイスのもっと出口寄りに配置されてもよい。
【０１５５】
図５Ａ〜５Ｅは、細胞及び外来性物質用の別個の入口を備えた本開示のＦＴＥＰデバイスの実施形態を示す。図５Ａは、細胞を含む流体をＦＴＥＰデバイス５００に導入するための第１の入口５０２；細胞にエレクトロポレーションされる外来性物質を含む流体をＦＴＥＰデバイス５００に導入するための第２の入口５１８；電極５０８；及びエレクトロポレーション後に形質転換細胞を取り出すための出口５０４を有するＦＴＥＰデバイス５００の上面図を示す。これらの実施形態は、図５Ａに示されるように、円筒形電極と共に示されているが、湾曲した縁部を有する他の形状の電極、例えば、図４Ａ〜４Ｉに関連して示されるような楕円、半円筒形などを用いてフローチャネルを画定してもよい。図５Ｂは、第１の入口５０２、第２の入口５１８、出口５０４、及びフローチャネル５０６に対して配置された電極５０８を有するＦＴＥＰデバイス５００の上面から見た破断図を示す。
【０１５６】
図５Ｃは、図５Ａ及び５Ｂに示すように配置された第１の入口５０２及び第２の入口５１８を備えたＦＴＥＰデバイス５００の実施形態の破断図を示す。図５Ｃでは、第１の入口チャネル５１２及び第２の入口チャネル５２２は、独立してフローチャネル５０６と出会い、液体（細胞及び細胞に穿孔又は送達される材料）は、フローチャネル５０６を通って出口チャネル５１４及び出口５０４に流れ、そこで形質転換された細胞はＦＴＥＰデバイスから取り出される。電極５０８は、フローチャネル５０６の狭められた部分を画定するようにフローチャネル５０６内に配置される。図５Ｄは、図５Ａ及び５Ｂに示されるＦＴＥＰデバイス５００の実施形態の変形例５１０の破断側面図を示す。ここでは、第１の入口チャネル５１２及び第２の入口チャネル５２４は、三方接合部でフローチャネル５０６と交わり、液体（細胞及び細胞に穿孔される又は送達される材料）は、フローチャネル５０６を通って出口チャネル５１４及び出口５０４に流れ、そこで形質転換された細胞がＦＴＥＰデバイスから取り出される。電極５０８は、フローチャネル５０６内に配置されてフローチャネル５０６の狭められた部分を画定する。図５Ｅは、図５Ａ及び５Ｂに示されるＦＴＥＰデバイス５００のさらに別の変形例の第１の破断側面図５２０を示す。ここでは、第１の入口チャネル５１２及び第２の入口チャネル５２６は、細胞と外来性物質が混ざりあう接合部で交わった後に、合流した流体がフローチャネル５０６に導入される。流体は、フローチャネル５０６を通って出口フローチャネル５１４及び出口５０４に流れ、そこで形質転換細胞がＦＴＥＰデバイスから取り出される。電極５０８は、フローチャネル５０６の狭められた部分を画定するようにフローチャネル５０６内に配置される。
【０１５７】
図５Ｆ〜５Ｈは、細胞及び外来性物質用の別個の入口を有する本開示のＦＴＥＰデバイスの別の実施形態を示す。図５Ｆは、細胞を含む流体を導入するための第１の入口５０２、細胞にエレクトロポレーションされる外来性物質を導入するための第２の出口５１８、及びエレクトロポレーション後に形質転換細胞を取り出すための出口５０４を有するエレクトロポレーションデバイス５３０の上面図を示す。電極５０８は、細胞がＦＴＥＰデバイスに導入される第１の入口５０２と、外来性物質がＦＴＥＰデバイスに導入される第２の入口５１８との間に配置される。図５Ｇは、第１の入口５０２、第２の入口５１８、及び出口５０４を備え、電極５０８が第１の入口チャネル５０２と第２の入口チャネル５１８との間に配置され、電極５０８がフローチャネル５０６の狭められた部分を形成しているＦＴＥＰデバイス５３０の上面から見た破断図を示す。図５Ｈは、細胞がＦＴＥＰデバイスに導入される第１の入口５０２及び第１の入口チャネル５１２、外来性物質がＦＴＥＰデバイスに導入される第２の入口５１８及び第２の入口チャネル５３２、ならびに形質転換細胞がＦＴＥＰデバイスから取り出される出口チャネル５１４及び出口５０４を備えたＦＴＥＰデバイス５３０の破断側面図を示す。電極５０８は、フローチャネル５０６内に配置されてフローチャネル５０６の狭められた部分を画定し、細胞に導入される材料が、エレクトロポレーションされた後の細胞を含む流体に加えられるように、第１の入口チャネル５１２と第２の入口チャネル５３２との間に配置される。
【０１５８】
図６は、入力チャネルからフローチャネルに導入される流体の流れが電極の横を通過する際に、細胞及び外来性物質を含む流体の流れを狭めるために、例えば油や空気の流れなどの不混和性流体を使用して集束されるＦＴＥＰデバイスを示す。図６は、入口６０２、出口６０４、及び電極６０８が第１の入口チャネル６０２と出口６０４との間に配置された、ＦＴＥＰデバイス６００の上面から見た破断図を示す。流れ集束６３０は不混和性流体によってもたらされ、電極６０８は、フローチャネル６０６の狭められた部分を形成する。（流れ集束に関連する方法及び入口の構成については、例えば、Ｋｕｍａｃｈｅｖａの米国特許出願公開第２０１０／０１８４９２８号を参照。）
例示的なＦＴＥＰデバイスの多重化された実施形態は、図７Ａ〜７Ｅに示されている。図７Ａは、本開示のＦＴＥＰデバイスの第１の多重化された態様の断面の上面図を示す。図７ＡのＦＴＥＰデバイスは、各ＦＴＥＰユニットの並列フローチャネル７０６が、デバイス（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）を形成する共有円筒形電極７０８ａ〜７０８ｆによって部分的に画定される多重化ＦＴＥＰデバイス７００である。各フローチャネル７０６は、細胞及び／又は外来性物質の異なるセットをＦＴＥＰユニットに導入するための入口７０２と、ＦＴＥＰユニットから形質転換細胞を取り出すための出口７０４とを有する。隣接するユニットは電極を共有し、電極は交互に、例えば、＋／−／＋／−／＋（つまり、電極７０８ａが＋であれば、電極７０８ｂは−であり、電極７０８ｃは＋であり、電極７０８ｄは−である、など）に帯電する。図７Ｂは、本開示のＦＴＥＰデバイス７１０の第２の多重化された実施形態の断面の上面図である。これは、並列フローチャネル７０６が共有楕円形電極７０８ａ〜７０８ｆによって部分的に定義される多重化デバイス７１０である。各フローチャネル７０６は、異なるセットの細胞及び／又は外来性物質をフローチャネル７０６に導入するための入口７０２と、ＦＴＥＰユニット（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）から形質転換細胞を取り出すための出口とを有する。繰り返しになるが、隣接するデバイスは電極を共有し、電極は、例えば＋／−／＋／−／＋のように交互に荷電している。
【０１５９】
図７Ｃは、本開示のＦＴＥＰデバイスの第３の多重化された実施形態の断面の上面図である。この例示的な多重化ＦＴＥＰデバイス７２０では、個々のＦＴＥＰユニットはずらして配置されている。平行フローチャネル７０６は、図７Ａ及び７Ｂに示されるように共有されない個々の円筒形電極７０８ａ〜７０８ｊによって部分的に画定される。各フローチャネル７０６は、それ専用の電極対７０８、異なるセットの細胞及び／又は外来性物質をＦＴＥＰデバイスに導入するための入口７０２、及びＦＴＥＰユニットから形質転換細胞を取り出すための出口（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）を有する。図７Ｄは、別の例示的な多重化ＦＴＥＰデバイスの断面の上面図である。この多重化ＦＴＥＰデバイス７３０では、ずらされて配置された平行なフローチャネル７０６は、個々の楕円形電極７０８ａ〜７０８ｊによって部分的に画定される。各フローチャネル７０６は、それ専用の非共有電極対７０８（例えば、７０８ａ／７０８ｂ、７０８ｃ／７０８ｄ、７０８ｅ／７０８ｆ、７０８ｇ／７０８ｈ、及び７０８ｉ／７０８ｊ）、異なる細胞及び／又は外来性物質のセットをＦＴＥＰユニットに導入するための入口７０２、及びＦＴＥＰユニットから形質転換細胞を取り出すための出口７０４を有する。図７Ｅは、別の例示的な多重化ＦＴＥＰデバイスの断面の上面図である。この例示的な多重化デバイス７４０では、ずらされた配置の平行フローチャネル７０６は、個々の半円筒形電極７０８ａ〜７０８ｊによって部分的に画定される。各フローチャネル７０６は、それ専用の電極対７０８、異なるセットの細胞及び／又は外来性物質をＦＴＥＰユニットに導入するための別個の入口７０２、及びＦＴＥＰユニットから形質転換細胞を取り出すための出口７０４を有する。
【０１６０】
本開示のＦＴＥＰデバイスの追加の実施形態は、図８Ａ〜８Ｕに示されている。図８Ａ〜８ＵのＦＴＥＰデバイスでは、電極は、フローチャネルを狭めるためにフローチャネルの両側に配置されていない。代わりに、電極は、第１の電極が入口とフローチャネルの狭められた領域との間に配置され、第２の電極がフローチャネルの狭められた領域と出口との間に配置されるように位置決めされる。図８Ａは、細胞及び外来性物質を含む流体をＦＴＥＰデバイス８００に導入するための入口８０２と、エレクトロポレーション後にＦＴＥＰから形質転換細胞を取り出すための出口８０４とを有するＦＴＥＰデバイス８００の上面図を示す。電極８０８は、デバイスのチャネル（図示略）を通して導入される。図８Ｂは、ＦＴＥＰデバイス８００の上部からの断面図を示し、入口８０２、出口８０４、及び電極８０８は、フローチャネル８０６に対して配置されている。図８Ｃは、入口８０２及び入口チャネル８１２、ならびに出口８０４及び出口チャネル８１４を備えたＦＴＥＰデバイス８００の破断側面図を示す。電極８０８は、フローチャネル８０６と連通するが、フローチャネル８０６を通って移動する細胞の経路には直接連通しないように、電極チャネル８１６に配置される。繰り返しになるが、第１の電極はフローチャネルの入口と狭められた領域との間に配置され、第２の電極はフローチャネルの狭められた領域と出口との間に配置される。
【０１６１】
図８Ｄのデバイス８００の底部の拡大破断側面図は、デバイスのこの態様の電極８０８が、細胞及び外来性物質を含む流体が入口チャネル８１２からフローチャネル８０６を通って出口チャネル８１４に流れるように、そしてプロセスにおいて流体が電極チャネル８１６に流れ込み、電極８０８と接触するように、フローチャネル８０６にほぼ垂直な電極チャネル８１６内に配置されることを示す。この態様において、入口チャネル、出口チャネル及び電極チャネルはすべて、図８Ｃ及び８Ｄに示されるように、デバイスの同じ平面側から生じる。しかしながら、図８Ｅに示されるような特定の態様では、電極は、入口チャネル及び出口チャネルとは異なるＦＴＥＰデバイスの異なる平面側から導入される。ここで、ＦＴＥＰデバイス８１０のこの代替態様の電極８０８は、細胞及び外来性物質を含む流体が入口チャネル８１２からフローチャネル８０６を通って出口チャネル８１４に流れるように、フローチャネル８０６に垂直な電極チャネル８１６内に配置される。緩衝液中の細胞及び外来性物質は電極チャネル８１６に流れ込み、両方の電極８０８と接触する。しかし電極８０８は、直接的にフローチャネル８０６内にはない。この態様において、入口チャネル及び出口チャネルは、デバイスの電極及び電極チャネルとは異なる平面側から生じる。
【０１６２】
図８Ｆ〜８Ｈは、本開示のＦＴＥＰデバイスのさらに別の態様を示している。図８Ｆは、細胞を含む流体をＦＴＥＰデバイス８２０に導入するための第１の入口８０２と、エレクトロポレーション後にＦＴＥＰデバイス８２０から形質転換細胞を取り出すための出口８０４とを有するＦＴＥＰデバイス８２０の上面図を示す。しかしながら、このＦＴＥＰデバイスには、細胞にエレクトロポレーションされる外来性物質を導入するための第２の入口８２２がある。電極８０８は、チャネル（図示略）を通して導入される。図８Ｇは、ＦＴＥＰデバイス８２０の上面から見た破断図を示し、第１の入口８０２、第２の入口８２２、出口８０４、及び電極８０８がフローチャネル８０６に対して配置されている。図８Ｈは、入口８０２、８２２及び入口チャネル８１２、８２４ならびに出口８０４及び出口チャネル８１４を備えたＦＴＥＰデバイス８２０の破断側面図を示す。電極８０８は、フローチャネル８０６と連通するが、フローチャネル８０６を通って移動する細胞の経路内には実質的にないように、電極フローチャネル８１６内に配置される。ＦＴＥＰデバイス８２０のこの態様の電極８０８は電極チャネル８１６内に配置され、電極チャネル８１６は細胞を含む流体及び外来性物質を含む流体が入口８０２、８２２から入口チャネル８１２、８２４を通ってフローチャネル８０６に、及び出口チャネル８１４まで流れるように、ならびにプロセスにおいて培地中の細胞及び外来性物質が電極チャネル８１６に流れ込み、電極８０８と接触するように、フローチャネル８０６に対してほぼ垂直である。２つの電極８０８及び電極チャネル８１６の一方は、入口８０２及び８２２及び入口チャネル８１２及び８２４とフローチャネル８０６の狭められた領域（図示略）との間に配置され、他方の電極８０８及び電極チャネル８１６は、フローチャネル８０６の狭められた領域（図示略）と出口チャネル８１４及び出口８０４との間に配置される。図８Ｈでは、入口チャネル、出口チャネル、及び電極チャネルはすべてデバイスの同じ平面側から生じているが、電極（及び入口及び出口）は、図８Ｅに示すようにＦＴＥＰデバイスの異なる平面側から生じるように構成することもできる。
【０１６３】
図８Ｉ〜８Ｍは、本開示のデバイスのさらに別の実施形態を示す。図８Ｉは、細胞及び外来性物質を含む流体をＦＴＥＰデバイス８３０に導入するための入口８０２と、エレクトロポレーション後にＦＴＥＰデバイス８３００から形質転換細胞を取り出すための出口８０４とを有するエレクトロポレーションデバイス８３０の上面図を示す。電極８０８は、デバイスに機械加工されたチャネル（図示略）を通して導入される。図８Ｊは、デバイス８３０の上面から見た破断図を示し、入口８０２、出口８０４、実質的に均一な密度のフィルタ８５０、及びフローチャネル８０６に対して配置された電極８０８を示す。図８Ｋは、入口８０２、出口８０４、密度が漸増するフィルタ８５０、及びフローチャネル８０６に対して配置された電極８０８を有するデバイス８３０の代替構成８４０の上面から見た破断図を示す。図８Ｉ〜８Ｍでは、図８Ｆ〜８Ｈと同様に、第１の電極は入口とフローチャネルの狭められた領域との間に配置され、第２の電極はフローチャネルの狭められた領域と出口との間に配置される。図８Ｉ〜８Ｍに示されるようないくつかの実施形態では、ＦＴＥＰデバイスは、入口チャネルの後かつ第１の電極チャネルの前のフローチャネルに配置されたフローチャネル内に配置されたフィルタを含む。フィルタは、多孔性が実質的に均一であってもよい（例えば、図８Ｊのように均一な密度を有する）。あるいは、フィルタは、入口に近いフィルタの端部の密度が低く、出口に近いフィルタの端部の密度が高い漸増する密度を有してもよい（図８Ｋに示すように）。フィルタは、多孔性プラスチック、疎水性ポリエチレン、綿、ガラス繊維を含む、任意の適切な、好ましくは安価な材料から作られてもよいし、フィルタは、ＦＴＥＰデバイス本体の一部として組み込まれ、製造されてもよい（例えば、図１０Ｅを参照）。
【０１６４】
図８Ｌは、入口８０２及び入口チャネル８１２、ならびに出口８０４及び出口チャネル８１４を備えたデバイス８４０の破断側面図を示す。電極８０８は、フローチャネル８０６と連通するように電極チャネル８１６内に配置されるが、フローチャネル８０６を通って移動する細胞の経路内には直接的にはない。フィルタ８５０は、入口８０２及び入口チャネル８１２と電極８０８及び電極チャネル８１６との間に配置されることに留意されたい。図８ＭのＦＴＥＰデバイス８４０の底部の拡大破断側面図は、ＦＴＥＰデバイス８４０のこの態様の電極８０８が電極チャネル８１６内に配置され、細胞及び外来性物質を含む流体が入口チャネル８１２からフローチャネル８０６を通って出口チャネル８１４に流れ、プロセス中、流体が電極チャネル８１６に流れ込み、両方の電極８０８と接触するように、フローチャネル８０６に対して垂直であることを示す。図８Ｌ及び８Ｍでは、入口チャネル、出口チャネル、及び電極チャネルはすべてデバイスの同じ平面側から生じるが、電極（及び入口及び出口）は、図８Ｅに示すように、異なる平面側から生じるように構成することもできる。
【０１６５】
図８Ｎ〜８Ｒは、本開示のＦＴＥＰデバイスの他の実施形態を示す。図８Ｎは、細胞を含む流体をＦＴＥＰデバイスに導入するための第１の入口８０２と、細胞に導入される外来性物質を含む流体をＦＴＥＰデバイスに導入するための第２の入口８１８と、電極チャネル（図示略）に配置された電極８０８と、エレクトロポレーション後に形質転換細胞を取り出すための出口８０４とを有するＦＴＥＰデバイス８６０の上面図を示す。図８Ｏは、デバイス８６０の上面から見た破断図を示し、第１の入口８０２、第２の入口８１８、出口８０４、フィルタ８５０、及びフローチャネル８０６に対して配置された電極８０８を含む。ここでも、電極８０８は、第１の電極がフローチャネル８０６の狭められた領域の「入口端」にあり、第２の電極がフローチャネル８０６の狭められた領域の「出口端」にあるように配置されることに留意されたい。図８Ｐは、図８Ｎに示されるように配置された第１の入口８０２及び第２の入口８１８を有するデバイス８６０の実施形態の第１の破断側面図を示す。第１の入口チャネル８１２及び第２の入口チャネル８２４は、フィルタ８５０に到達する前にフローチャネル８０６と別々に出会い、液体は、入口チャネル８１２及び８２４からフローチャネル８０６（及びフィルタ８５０）を通って出口チャネル８１４及び出口８０４に流れる。いくつかの実施形態では、電極８０８がフローチャネル８０６の壁と同一平面になるように、電極８０８を電極チャネル８１６に配置することができることに留意されたい（例えば、図１０Ｆ（ｉｉｉ）を参照）。あるいは、電極８０８はフローチャネル８０６内に最小距離だけ延びていてもよい。しかしながら、そうする場合、電極８０８は、電極がフローチャネルを通る細胞の流れを妨げる程にはフローチャネル８０６内に延びない。
【０１６６】
図８Ｑは、図８Ｎに示すように配置された第１の入口８０２及び第２の入口８１８を有する図８Ｎ〜８Ｐに示されるＦＴＥＰデバイス８６０の実施形態の変形例の破断側面図を示す。第１の入口チャネル８１２及び第２の入口チャネル８２４は、フィルタ８５０に到達する前に、フローチャネル８０６との三方接合部でフローチャネル８０６と交わる。液体は、フローチャネル８０６を通って出口チャネル８２４及び出口８０４に流れる。電極８０８は、それらがフローチャネル８０６と連通するように電極チャネル８１６に配置されるが、フローチャネル８０６を通って移動する細胞の経路内には直接的にはない。ここでも、電極８０８は、第１の電極がフローチャネル８０６の狭められた領域の「入口端」にあり、第２の電極がフローチャネル８０６の狭められた領域の「出口端」にあるように配置される。図８Ｒは、図８Ｎ〜８Ｐに示されるＦＴＥＰデバイス８６０の実施形態のさらに別の変形例の破断側面図を示す。第１の入口チャネル８１２及び第２の入口チャネル８２６は、フローチャネル８０６と交わる前に接合部で交わって単一のチャネルになる。流体は、入口８０２及び８１８から、入口チャネル８１２及び８２６を通り、フローチャネル８０６及びフィルタ８５０を通過し、電極チャネル８１６に流れ込み（電極８０８がフローチャネル８０６と連通するように）、フローチャネル８０６を流れ続けて出口チャネル８１４に向かい、最終的に出口８０４まで流れ、そこで形質転換された細胞がＦＴＥＰデバイス８６０から取り出される。再びこの実施形態では、電極８０８は、フローチャネル８０６と連通するように電極チャネル８１６に配置されるが、フローチャネル８０６を通って移動する細胞の流れ経路内には直接配置されない。図８Ｐ〜８Ｒのそれぞれは、デバイスの同じ平面側から生じる入口チャネル、出口チャネル及び電極チャネルを示すが、これらの態様のそれぞれにおいて、入口、出口及び電極はすべて、ＦＴＥＰデバイスの異なる平面側から生じるように構成することもできる。
【０１６７】
図８Ｓ〜８Ｕは、本開示のＦＴＥＰデバイスの別の実施形態を示す。図８Ｓは、細胞を含む流体をＦＴＥＰデバイス８７０に導入するための第１の入口８０２、細胞に穿孔される外来性物質をＦＴＥＰデバイス８７０に導入するための第２の入口８１８、及びエレクトロポレーション後にＦＴＥＰデバイス８７０から形質転換細胞を取り出すための出口８０４を有するエレクトロポレーションデバイス８７０の上面図を示す。電極８０８は、デバイスに機械加工されたチャネル（図示略）を通して導入され、第１の入口８０２と第２の入口８１８との間に配置される。図８Ｔは、第１の入口８０２、第２の入口８１８、出口８０４、及びフローチャネル８０６に対して配置された電極８０８を有する装置８７０の上面から見た破断図を示す。さらに、図８Ｔに示されたＦＴＥＰデバイスは、図８Ｔは、第１の入口８０２と第１の電極８０８との間に、かつフローチャネル８０６の狭められた領域の前に配置されたフィルタ８５０を含む。この実施形態のフィルタ８５０は、大きいものから小さいものへの（入口８０２からフローチャネル８０６の狭められた部分に向かって）孔径の勾配を有する。図８Ｕは、第１の入口８０２及び第１の入口チャネル８１２、フィルタ８５０、第２の入口８１８及び第２の入口チャネル８３２、ならびに出口８０４及び出口チャネル８１４を有するＦＴＥＰデバイス８７０の破断側面図を示す。電極８０８は、フローチャネル８０６に垂直な電極チャネル８１６内かつ第１及び第２の入口の間に配置される。電極８０８は、フローチャネル８０６と連通しているが、フローチャネル内にはなく、したがって、フローチャネル８０６を通って移動する細胞の経路内にはない。外来性物質は、第２の入口８１８及び第２の入口チャネル８３２を介してＦＴＥＰデバイス８７０に加えられ、細胞がエレクトロポレーションされた後に細胞に遭遇する。図８Ｕでは、入口チャネル、出口チャネル及び電極チャネルはすべてデバイスの同じ平面側から生じるが、これらの特徴はＦＴＥＰデバイス８７０の異なる平面側から生じるように構成することもできる。
【０１６８】
図９Ａ及び図９Ｂは、それぞれ、本発明のさらに別の実施形態の破断側面図及び破断上面図を示す。図９Ａは、入口９０２及び入口チャネル９１２、フローチャネル９０６、ならびに出口９０４及び出口チャネル９１４を有する最上層９５２を備えた多層デバイス９００を示す。電極９０８は、底部層９５６上にあり、例えば、固体基板上のストリップとして提供される。中間層９５４は、内部に電極チャネル９１６が設けられた固体基板であり、この態様の電極チャネル９１６は、底部層９５６の電極９０８と最上層９５２のフローチャネル９０６との間を連通させる。流体中の細胞及び外来性物質は、入口９０２を介してＦＴＥＰデバイス９００に導入され、入口チャネル９１２を通ってフローチャネル９０６に流れ込み、次いで出口チャネル９１４に流れる。このプロセスにおいて、電極９０８がフローチャネル９０６と流体接触するように、流体は電極チャネル９１６に流れ込む。細胞は、２つの電極９０８の間のフローチャネル９０６を通過するときに穿孔される。図９Ｂは、フローチャネル９０６に対する入口９０２、出口９０４、電極９０８及び電極チャネル９１６の位置を示すＦＴＥＰデバイス９００の実施形態の断面図９１０の上面図を示す。電極はここではストリップとして示されているが、他の形状、例えば円形、円筒形、非対称、長方形、又は正方形になるように構成することもできる。
【０１６９】
図９Ｃは、細胞及び外来性物質を含む流体が電極チャネル及び電極に到達したときに流体の流れを集束（狭める）するために、例えば、油などの不混和性流体を使用するか、又は空気を使用することにより、入力チャネルからフローチャネルに導入される流体の流れ集束９３０が行われるＦＴＥＰデバイスを示す。図９Ｃは、第１の入口９０２、入口チャネルを出てフローチャネル９０６に入った後の流体の流れ集束９３０、及び入口９０２と出口９０４との間に配置された電極９０８を有するデバイス９２０の上面から見た破断図を示す。ここで、電極９０８は、フローチャネル９０６の狭められた部分の両端に配置されている。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用される試薬カートリッジ（例えば、図１Ａのカートリッジ１０４）は、１つ以上のＦＴＥＰデバイス（例えば、図１Ａのエレクトロポレーションモジュール１１０ｃ、図１１Ｅの１１２４も参照）を含む。図１０Ａから１０Ｃはそれぞれ、例えば、以下の図１１Ｅの試薬カートリッジ１１２２の一部であり得る６つの共接合ＦＴＥＰデバイス１０５０の上面斜視図、底面斜視図、及び底面図である（すなわち、試薬カートリッジ１１２２内のＦＴＥＰ１１２４として機能する）。図１０Ａは、単一の一体成形された射出成形環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）基板１０５６上に配置された６つのＦＴＥＰユニット１０５０（すなわち、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ））を示す。図１０Ｂに示すチャネル１００６は、５０ミクロンから１ｍｍの厚さを有するＣＯＣフィルムで封止されている（図示略）。ＣＯＣフィルムは、組立体１０００のベース（図１０Ｂに最も顕著に示されている表面）に熱的に結合されてもよい。図１０Ｂ及び１０Ｃにおいて、共接合ＦＴＥＰデバイスは、様々な用途で有利な異なるチャネルアーキテクチャ及び電極配置を有する。例えば、デバイス（ｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の湾曲したチャネルは、慣性を利用して、流体内の細胞を電極から遠ざける。電極は、細胞の流れをさらに促進し、細胞への損傷の可能性を減らすために、チャネルの中心から外して配置することができる。これは、電極付近の電解作用又はｐＨの局所変化に特に敏感な細胞又は材料にとって特に重要である。これらの作用をさらに低減するために、実施形態（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）に示されるように、電極は少なくとも部分的にチャネル壁に埋め込まれてもよい。
【０１７１】
６つのＦＴＥＰユニット１０５０のそれぞれは、細胞試料入口を画定するウェル又はリザーバ１０５２と、細胞試料出口を画定するウェル１０５４とを有する。図１０Ｂは、図１５Ａの６つの共接合ＦＴＥＰデバイス１０５０の底面斜視図であり、単一の基板１０５６上に配置された６つのＦＴＥＰユニット１０５０（すなわち、（ｉ）〜（ｖｉ））も示している。各フロースルー型エレクトロポレーションユニット１０５０に１つずつ、６つの入口ウェル１０５２を見ることができ、１つの出口ウェル１０５４を見ることができる。図１０Ｂにはまた、各ＦＴＥＰユニット１０５０につき、入口１００２、出口１００４、フローチャネル１００６、及びフローチャネル１００６の狭められた領域の両端にある２つの電極１００８が見られる。特にフローチャネルの狭められた領域でのチャネルの詰まりを防ぐために、フローチャネルにはフィルタ１０７０及び１０７２が含まれている。図１０Ｃは、図１０Ａ及び図１０Ｂの６つの共接合ＦＴＥＰデバイス１０５０の底面図である。図１０Ｃには、単一の基板１０５６上に配置された６つのＦＴＥＰユニット１０５０（すなわち、（ｉ）〜（ｖｉ））が示され、各ＦＴＥＰユニット１０５０は、入口１００２、出口１００４、フローチャネル１００６及び各ＦＴＥＰユニット１０５０のフローチャネル１００６の狭められた領域の両端の２つの電極１５０８を含む。一旦６つのＦＴＥＰユニット１０５０が製造されると、それらは、引かれた刻み線に沿って互いに分離され（例えば、「切り離され」）、図１１Ｅに示されたカートリッジに見られるように一度に１つ使用され得る。あるいは、ＦＴＥＰユニットは、２つ以上のＦＴＥＰユニット１０５０が並列配置で使用される実施形態で使用されてもよい。
【０１７２】
図１０Ｄは、図１０に示されたＦＴＥＰユニットの走査型電子顕微鏡写真を示し、図１０Ｄのユニット（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）は、図１０Ｃのユニット（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）に対応する。図１０Ｄでは、各ユニットについて、電極チャネル１０１６とフローチャネル１００６の両方を見ることができる。
【０１７３】
図１０Ｅは、図１０Ｂ及び図１０Ｃにおいて黒いバーとして描かれたフィルタ１０７０及び１０７２の走査型電子顕微鏡写真を示す。この実施形態では、フィルタ１０７２の多孔度は、大きい孔（入口１００２の近く）からフローチャネル（図示略）に向かって小さい孔まで変化することに留意されたい。この実施形態では、チャネルは任意選択で狭くなるが、これは必須ではない。第２のフィルタが存在する場合、第２のフィルタも多孔度に変化を有し得る。第２の電極と出口チャネルとの間の第２のフィルタの場合、フィルタは、大きい孔（第２の電極の近く）から出口チャネルに向かって小さい孔まで変化し得る。スケール情報は各顕微鏡写真に示されている。
【０１７４】
特定の実施形態では、フィルタは、細胞及びＤＮＡを含む流体がフローチャネルの狭められた部分に到達する前に、流体を濾過する目的に役立つ。したがって、フィルタは、細胞又は他の物質がフローチャネルの狭められた部分を詰まらせない可能性を減らす。代わりに、フローチャネルの狭められた部分を詰まらせる恐れのある粒子状物質がある場合、フィルタは粒子状物質を捕捉し、細胞／ＤＮＡ／流体の残りが通過して移動できる他の細孔を残す。描かれた構造（チャネル壁との一体成形）は、デバイスのコストと複雑さを抑えると同時に、フィルタの破片自体が遊離してチャネルを詰まらせるなどしてデバイスの動作を妨げるリスクを減らすため、特に有利である。この実施形態では、フィルタは勾配のある細孔サイズ（入口付近の大きい孔から、フローチャネルの狭められた部分の付近のより小さい孔まで）を有することに留意されたい。しかし、代替の実施形態では、細孔は同じサイズであってもよいし、サイズに勾配がなくてもよい。
【０１７５】
さらに、さらに他の実施形態では、フローチャネルは狭められなくてもよい。これらの特定の実施形態では、細孔自体がエレクトロポレーションを促進するためのそのような狭窄化機能を提供するのに役立ち、流体がチャネルを流れる際にフローチャネル壁は狭くならないか、又は最小限に狭くなる。これらの実施形態は、デバイスを通る細胞の流量の制御を可能にして、外来性物質の様々な細胞種への導入を最適化することができる。
【０１７６】
さらに、図１０Ｅの走査電子顕微鏡写真は、フィルタ要素を丸い「ペグ」として示しているが、フィルタ要素は、三角形、正方形、長方形、五角形、六角形、長円形、楕円形、又は他のファセット形状のペグであってもよいことを理解されたい。
【０１７７】
図１０Ｆは、（ｉ）入口リザーバ１０５２及び出口リザーバ１０５４を有するＦＴＥＰデバイス１０００（ここでは、６ユニットのＦＴＥＰデバイス）に挿入する前の電極１００８を示す。好ましい実施形態では、デバイス１０００は、図１０Ｆ（ｉ）に示される向きに対して反転した向きで使用される。図１０Ｆ（ｉｉ）は、シース内に含まれ、シースから突出する電極１００８を示す。図１０Ｆ（ｉｉｉ）は、電極チャネル１０１６（及び電極１００８）がフローチャネル１００６に隣接した状態で、電極チャネル１０１６に挿入された電極１００８を示す。図１０Ｆ（ｉｉｉ）に示す実施形態では、電極はフローチャネルの壁と平らにされている。すなわち、電極は、フローチャネル１００６を通って流れる細胞／ＤＮＡ／流体の経路にはないが、電極は電極チャネル１０１６内に引き込められてもいない。実際は、電極１００８は、電極チャネル１０１６内に引き込められていてもよく、電極チャネル１０１６の端まで延びてもよく、それによってフローチャネル１００６の壁と平らであってもよく、又は電極１００８はフローチャネル１００６内に、電極がフローチャネルを通る細胞の動きを妨げない最短距離だけ延びていてもよい。フローチャネル１００６の開口の丸みを帯びた又は斜めの縁部は、空気の閉じ込めを防ぎ、電界の不連続性を低減するのに役立つ。
【０１７８】
図１０Ｇは、電極チャネル１０１６がフローチャネル１００６と出会う開口の２つの異なる構成の２つの走査電子顕微鏡写真を示す。図１０Ｇ（ｉ）（上）では、電極チャネル１０１６とフローチャネル１５０６との接合部の縁部は鋭い縁部を含む。対照的に、図１０Ｇ（ｉｉ）（下）では、電極チャネル１０１６とフローチャネル１００６との接合部の縁部は丸められた縁部を含む。両方の構成を試験したところ（データは示していない）、丸められた縁部の構成により、フローチャネル１００６と電極チャネル１０１６の電極（この図には示していない）との間に空気が閉じ込められる可能性が低くなることが分かった。この実施形態では、入口開口は丸められた縁部を有し、その利点には、空気の閉じ込め難さ、層流の促進、及び細胞損傷のリスクの低減が含まれることがわかる。丸められた縁部は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００又は２５０ミクロンの曲率半径を有してもよい。実際、ＦＴＥＰデバイスの電極は「濡れている」、つまり、流体／細胞／ＤＮＡに浸される必要がある。
【０１７９】
形質転換後、細胞に導入された核酸の形質転換及び発現の結果として起こるゲノム編集プロセスを促進する条件下で、細胞を回復させることができる。
自動化マルチモジュール細胞編集の方法
図１４は、図１Ａ〜１Ｂ及び１７Ａ〜１７Ｂに示されるシステムなどの自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用するための例示的な方法１４００のフローチャートである。さらに、図１８の処理システムは、例えば、方法１４００の処理段階を指示し得る。例えば、ソフトウェアスクリプトは、各処理段階の設定と、方法１４００のアクションを実行するためのロボットハンドリングシステムの動作のための指示を識別してもよい。いくつかの実施形態では、ソフトウェア命令スクリプトは、自動化マルチモジュール細胞編集機器に供給されるカートリッジによって識別されてもよい。例えば、カートリッジは、自動化マルチモジュール細胞編集機器のメモリ（例えば、図１８のメモリ１８０２など）に格納されたスクリプトの識別を含む、バーコード又はＱＲコード（登録商標）などの機械可読表示を含み得る。別の例では、カートリッジは、無線周波数（ＲＦ）タグなどの機械可読表示に埋め込まれたダウンロード可能なスクリプトを含み得る。他の実施形態では、ユーザが、例えば、自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理システムへの有線又は無線接続を介してスクリプトをダウンロードすることにより、又は自動化マルチモジュール細胞編集機器のユーザインターフェースを介して保存されたスクリプトを選択することにより、スクリプトを識別してもよい。特定の例では、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、ユーザ設定を送信し、細胞処理をアクティブにするためのタッチスクリーンインターフェースを含んでもよい。
【０１８０】
いくつかの実装形態では、方法１４００は、細胞を成長モジュールに移すことから始まる（１４０２）。成長モジュールは、自動化に修正可能な任意の成長モジュールとすることができ、例えば、図１３Ｂ及び１３Ｃに関連して説明した成長モジュール１３５０とすることができる。特定の例では、処理システム１７２０は、図１７Ａ及び１７Ｂに関連して説明したように、細胞１７０６を成長モジュール１７１０ａに移すようにロボットハンドリングシステム１７０８に指示することができる。別の例では、図１Ａに関連して説明したように、ロボットハンドリングシステム１０８により、カートリッジ１０４、１０６のうちの１つから成長モジュール１１０ａ、１１０ｂに細胞を移すことができる。いくつかの実施形態では、成長バイアルは成長培地を含み、例えばキットの一部として供給されてもよい。他の実施形態では、成長バイアルは、例えば液体ハンドリングデバイスを介して試薬容器から移送された培地で満たされてもよい。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、（例えば、試薬カートリッジ又は機器に追加されたバイアルから）細胞を移す前に、細胞用に指定された位置にあるバイアル又は他の容器上の機械可読表示をスキャンして、そのバイアル又は容器が細胞を含むものとしてマークされていることを確認してもよい。さらに、機械可読表示は、機器に提供される細胞の種類を示してもよい。いくつかの実施形態において、機器は、細胞の種類に応じて特定の処理スクリプト（例えば、ロボットハンドリングシステム及び設定及び様々なモジュールの起動のための一連の指示）を選択してもよい。
【０１８２】
いくつかの実装形態では、細胞を成長モジュール内で所望の光学密度まで成長させる（１４０４）。例えば、図１Ａ〜１Ｂの処理システム１２６又は図１７Ａ〜Ｂの処理システム１７２０は、成長サイクル中に細胞をインキュベートするための成長モジュール１１０ａの温度設定を管理してもよい。処理システム１２６、１７２０はさらに、光学密度を示す成長モジュール１１０ａ、１１０ｂ、１７１０ａからセンサ信号を受信し、センサ信号を分析して細胞の成長を監視してもよい。いくつかの実施形態では、ユーザは、細胞の成長を管理するための成長パラメータを設定してもよい。例えば、温度、及び細胞の攪拌の程度。さらに、いくつかの実施形態では、成長プロセスに関してユーザをアップグレードすることができる。いくつかの実施形態では、アップグレードには、自動化マルチモジュール細胞編集機器のユーザインターフェースに表示されるメッセージ、ユーザの携帯電話番号へのテキストメッセージ、電子メールアカウントへの電子メールメッセージ、又はポータブル電子デバイス（携帯電話、タブレットなど）で実行するアプリに送られるメッセージが含まれ得る。メッセージに応答して、いくつかの実施形態では、ユーザは、温度などのパラメータを変更して、細胞成長を調整することができる。例えば、ユーザは、自動化マルチモジュール細胞編集機器のユーザインターフェースを通じて、又は図１６のユーザインターフェース１６００などの自動化マルチモジュール細胞編集機器と通信するポータブルコンピューティングデバイスアプリケーションを通じて、アップグレードされたパラメータを提示することができる。
【０１８３】
光学密度に関連して説明したが、他の実装形態では、成長モジュール内の細胞成長は、いくつかの例では、ｐＨ、溶存酸素、放出酵素、音響特性、及び電気特性などの細胞密度及び生理学的状態の様々な測定値を使用して監視することができる。
【０１８４】
いくつかの実装形態では、所望の光学密度に到達すると（１４０４）、細胞は成長モジュールから濾過モジュール又は細胞洗浄及び濃縮モジュールに移される（１４０６）。図１Ａ〜１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８又は図１７Ａ〜１７Ｂの１７０８は、例えば、細胞を成長モジュール１７１０ａから濾過モジュール１７１０ｂに移すことができる。濾過モジュールは、例えば、細胞をエレクトロコンピテントにするように設計されてもよい。さらに、濾過モジュールは、細胞試料の体積をエレクトロポレーションに適切な体積に減らすように構成されてもよい。別の例では、濾過モジュールは、細胞試料から塩などの不要な成分を除去するように構成されてもよい。いくつかの例では、濾過システムは前述のタスクの２つを実行し、特定の好ましい実施形態では、前述の３つのタスクをすべて実行して、細胞をエレクトロコンピテントにし、細胞を含む流体の体積を減らし、不要な成分を除去する。いくつかの実施形態では、ロボットハンドリングシステム１７０８は、細胞を洗浄するために洗浄液を濾過モジュール１７１０ｂに移送する。
【０１８５】
いくつかの実装形態では、細胞はエレクトロコンピテントにされ、濾過モジュール又は細胞洗浄及び濃縮モジュールで溶出される（１４０８）。細胞は洗浄液を使用して溶出され得る。例えば、細胞は、試薬供給部からの試薬を使用して溶出され得る。濾過モジュール又は細胞洗浄及び濃縮モジュールは、例えば、図１２Ａ〜１２Ｄに関連して説明した濾過モジュール１２００と同様であってもよい。上記で述べたように、密度勾配精製、透析、イオン交換カラム、濾過、遠心分離、希釈、精製用ビーズの使用など、様々な方法で細胞を洗浄することができる。いくつかの態様では、細胞洗浄及び濃縮モジュールは遠心分離装置を利用する。他の態様において、濾過モジュールは濾過器具を利用する。さらに他の態様では、ビーズは細胞表面に結合する部分に結合している。これらの部分には、限定するものではないが、抗体、レクチン、コムギ胚芽凝集素、変異リゾチーム、及びリガンドが含まれる。他の態様では、細胞は磁化されるように操作され、洗浄ステップ後に磁石で細胞をペレット化することができる。細胞の磁化のメカニズムには、フェリチンタンパク質の発現が含まれるが、これに限定されない。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、溶出の前に洗浄液が濾過モジュールに移される。例えば、図１７Ａ〜１７Ｂのロボットハンドリングシステム１７０８が、洗浄液用に指定された位置にあるバイアル又は容器から洗浄液を移してもよい。洗浄液を移す前に、洗浄液用に指定された位置にあるバイアル又は他の容器又はリザーバ上の機械可読表示をスキャンして、そのバイアル、容器、又はリザーバの内容物を確認してもよい。さらに、機械可読表示は、機器に提供される洗浄液の種類を示してもよい。いくつかの実施形態では、システムは、洗浄液の種類に応じて特定の処理スクリプト（例えば、特定の洗浄液に適した濾過モジュールの設定及び起動）を選択してもよい。
【０１８７】
他の実施形態では、細胞は、洗浄カートリッジの細胞洗浄モジュールで溶出される。例えば、溶出された細胞は、図１Ａに示される洗浄カートリッジ１０６の空の容器に集められてもよく、ロボットハンドリングシステム１０８は、溶出した細胞に試薬カートリッジ１０４（又は洗浄カートリッジ１０６の試薬ウェル）から培地を移送してもよい。
【０１８８】
細胞がエレクトロコンピテントにされ、５０μＬ〜１０ｍＬ、又は１００μＬ〜８０ｍＬ、又は１５０μＬ〜８ｍＬ、又は２５０μＬ〜７ｍＬ、又は５００μＬ〜６ｍＬ、又は７５０μＬ〜５ｍＬなどの、濾過モジュール（１４０６）による形質転換に適切な体積に懸濁されたら、いくつかの実装形態では、細胞はＦＴＥＰモジュール（１４１８）に移される。例えば、図１Ａ〜１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８は、細胞を濾過モジュールからＦＴＥＰデバイス１１０ｃに移すことができる。濾過モジュールはＦＴＥＰデバイスに物理的に結合されていてもよいし、これらのモジュールは分離されていてもよい。カートリッジベースの供給物を有する図１Ａの機器１００のような実施形態では、細胞は形質転換モジュールに移される前に、試薬カートリッジ１０４などのカートリッジ内のリザーバに溶出され得る。
【０１８９】
いくつかの実装形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器の外部で核酸が用意される。例えば、方法１４００の形質転換プロセス及び他のプロセスを実行する前に、アセンブリされたベクター又は他の核酸アセンブリがユーザによって試薬として含まれてもよい。
【０１９０】
ただし、他の実装形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器によって核酸が用意される。いくつかの実施形態では、以下のステップ１４１０から１４１６の一部は、ステップ１４０２から１４０８の一部と並行して実行される。いくつかの実施形態では、以下のステップの少なくとも一部は、ステップ１４０２から１４０８の前及び／又は後に実行される。
【０１９１】
いくつかの実装形態では、編集オリゴヌクレオチド及びベクター骨格などの核酸、ならびにいくつかの例では、酵素及び他の反応成分が、核酸アセンブリモジュールに移される（１４１０）。核酸アセンブリモジュールは、自動化された様式で多種多様な異なる核酸アセンブリ技術のうちの１つ以上を実行するように構成され得る。核酸アセンブリモジュールで実行できる核酸アセンブリ技術には、限定するものではないが、ＰＣＲ、ＢｉｏＢｒｉｃｋアセンブリ、ＴｙｐｅＩＩＳクローニング、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアセンブリ、及びリガーゼサイクリング反応などの制限エンドヌクレアーゼを使用するアセンブリ方法が含まれ得る。他の例では、核酸アセンブリモジュールは、ギブソンアセンブリ（商標）、ＣＰＥＣ、ＳＬＩＣ、リガーゼサイクリングなどの、核酸の隣接部分間の重複に基づくアセンブリ技術を実行してもよい。核酸アセンブリモジュールによって実行され得る追加の例示的なアセンブリ方法には、酵母におけるギャップ修復、ゲートウェイクローニング及びトポイソメラーゼを介したクローニングが含まれる。核酸アセンブリモジュールは、例えば、図３に関連して説明した核酸アセンブリモジュール３００であってもよい。特定の例では、処理システム１７２０は、図１７Ｂに関連して説明したように、核酸１７０４を核酸アセンブリモジュール１７１０ｇに移すようにロボットハンドリングシステム１７０８に指示することができる。別の例では、図１Ａに関連して説明したように、核酸は、ロボットハンドリングシステム１０８によってカートリッジ１０４、１０６のうちの１つから核酸アセンブリモジュールに移され得る。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、（核酸試料、酵素、及び他の反応成分の各々を移す前に）機械可読表示がこれらの材料用に指定された位置にあるバイアル又は他の容器上でスキャンされ、そのバイアル又は容器が想定される材料を含むものとしてマークされていることを確認してもよい。さらに、機械可読表示は、機器に提供される核酸試料、酵素、及び他の反応成分の１つ以上の種類を示してもよい。いくつかの実施形態では、機器は、材料の種類に応じて特定の処理スクリプト（例えば、さらなる材料及び／又は核酸アセンブリモジュールの設定及び起動を識別するためのロボットハンドリングシステムに対する一連の指示）を選択してもよい。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、核酸アセンブリモジュールは、使用される核酸アセンブリの種類に応じて温度制御される。例えば、ＰＣＲが核酸アセンブリモジュールで使用される場合、モジュールは、変性、アニーリング、及び伸長の間で温度を循環させることができるサーモサイクリング機能を有することができる。核酸アセンブリモジュールで単一温度アセンブリ法が利用される場合、モジュールは実行される特定のアセンブリプロセスを最適化する温度に到達させ、保持する能力を有することができる。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、温度制御は、図１８の処理システム１８１０などの自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理システムによって管理される。これらの温度及びこれらの温度を維持する期間は、事前にプログラムされた一連のパラメータ（例えば、処理スクリプト内又は処理システムからアクセス可能な別のメモリ空間内で特定される）によって決定されるか、処理システムとのインターフェースを通じてユーザが手動で制御することができる。
【０１９５】
アセンブリ反応が起きるのに十分な時間が経過すると、いくつかの実装形態では、核酸アセンブリは精製モジュールに移される（１４１４）。処理システムは、例えば、反応の種類、材料の種類、及び自動化マルチモジュール細胞編集機器に提供されたユーザ設定のうちの１つ以上に基づいて、アセンブリ反応のタイミングを監視してもよい。図１Ａ〜１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８又は図１７Ａ〜１７Ｂの１７０８は、例えば、シッパー又はピペッターインターフェースを介して、核酸アセンブリを精製モジュールに移してもよい。別の例では、図１Ａ〜１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８又は図１７Ａ〜１７Ｂの１７０８は、核酸アセンブリを含むバイアルを、核酸アセンブリモジュールのチャンバから脱塩／精製モジュールのチャンバに移してもよい。
【０１９６】
いくつかの実装形態では、核酸アセンブリは精製モジュールで脱塩され、溶出される（１４１６）。精製モジュールは、例えば、核酸アセンブリ混合物の不要な成分（例えば、塩、ミネラルなど）を除去し得る。いくつかの実施形態では、精製モジュールは、アセンブリされた核酸を、核酸アセンブリ体積よりも小さい体積に濃縮する。核酸アセンブリ後に液体を交換する方法の例には、磁気ビーズ（例えば、カリフォルニア州カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．のＳＰＲＩ又はＤｙｎａｌ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ））、シリカビーズ、シリカスピンカラム、ガラスビーズ、（例えばエタノール又はイソプロパノールを用いた）沈殿、アルカリ溶解、浸透圧精製、ブタノールでの抽出、膜ベースの分離技術、濾過などが含まれる。例えば、様々な多孔度の異方性親水性セルロース膜を備えた１つ以上のマイクロ濃縮器を使用してもよい。別の例では、脱塩／精製モジュールは、混合物を不溶性リン酸塩を含むイオン交換体と接触させ、液体を除去し、イオン交換体から核酸を溶出することにより、核酸及びイオン塩を含む液体試料を処理することができる。
【０１９７】
例示的な実施形態では、核酸アセンブリは、精製モジュールのチャンバ内で、ＳＰＲＩビーズなどの磁気ビーズと組み合わせることができる。核酸アセンブリは、アセンブリされた核酸が磁気ビーズに結合するのに十分な時間、設定温度でインキュベートされてもよい。インキュベーション後、磁石をチャンバに近接させて、核酸アセンブリを洗浄及び溶出できるようにする。このプロセスの例示的な例は、図３の核酸アセンブリ及び精製モジュールの組合せに関連して述べられている。
【０１９８】
核酸アセンブリが溶出されると、核酸アセンブリは、いくつかの実装形態では、形質転換モジュールに移される（１４１８）。図１Ａ〜１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８又は図１７Ａ〜１７Ｂの１７０８は、例えば、上記のように、ＦＴＥＰへのシッパー又はピペッターインターフェースを介して、アセンブリされた核酸を形質転換モジュールに移すことができる。例えば、脱塩されたアセンブリされた核酸は、移動中にステップ１４０８からのエレクトロコンピテントセルと組み合わされてもよい。他の実施形態では、形質転換モジュールは、エレクトロコンピテントセル及び核酸アセンブリのそれぞれを別々に受け入れ、混合を可能にし得る（例えば、共有チャンバ内で材料を合わせるために１つ以上のチャネルを開く）。
【０１９９】
細胞はＦＴＥＰモジュール（１４２０）で形質転換される。細胞がエレクトロポレーション中の細胞の生存に有利な緩衝液又は培地に懸濁されるように、緩衝液又は培地を形質転換モジュールに移し、細胞に加えてもよい。緩衝液又は培地を移す前に、緩衝液又は培地用に指定された位置にあるバイアル又は他の容器又はリザーバ上の機械可読表示をスキャンして、そのバイアル又は容器の内容物を確認してもよい。さらに、機械可読表示は、機器に提供される緩衝液又は培地の種類を示してもよい。いくつかの実施形態では、機器は、緩衝液又は培地の種類に応じて特定の処理スクリプト（例えば、特定の緩衝液又は培地に適した形質転換モジュールの設定及び起動）を選択してもよい。細菌細胞のエレクトロポレーションでは、水やグリセロール溶液などの低コンダクタンスの培地を使用して、一時的な高電流による熱産生を減らすことができる。酵母細胞の場合はソルビトール溶液が用いられ得る。哺乳類細胞のエレクトロポレーションの場合、細胞は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、ハンクス、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＨｅＢＳ及びリンゲル液などの高伝導性の培地又は緩衝液に懸濁され得る。特定の例では、ロボットハンドリングシステム１０８（図１Ａ）は、カートリッジ１０４、１０６のうちの１つからＦＴＥＰモジュール１１０ｃに緩衝液を移してもよい。図４Ａ〜４Ｉ、５Ａ〜５Ｈ、６、７Ａ〜７Ｅ、８Ａ〜８Ｕ、及び９Ａ〜９Ｃに関連して説明したように、ＦＴＥＰデバイスは使い捨てＦＴＥＰデバイスであってもよく、及び／又はＦＴＥＰデバイス１１０ｃは図１Ａのカートリッジ１０４を備え得る（又は図１１Ｅのカートリッジ１１２２のＦＴＥＰデバイス１１２４）。
【０２００】
形質転換されると、細胞は第２の成長／回復／編集モジュールに移される（１４２２）。図１Ａ〜１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８又は図１７Ａ〜１７Ｂの１７０８は、例えば、シッパー又はピペッターインターフェースを介して、形質転換された細胞を第２の成長モジュールに移してもよい。別の例では、図１Ａ〜１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８又は図１７Ａ〜１７Ｂの１７０８は、形質転換モジュールのチャンバから第２の成長モジュールのチャンバへ、形質転換された細胞を含むバイアルを移してもよい。
【０２０１】
第２の成長モジュールは、いくつかの実施形態では、回復モジュールとして機能し、細胞が形質転換プロセスから回復することを可能にする。他の実施形態では、細胞は、第２の成長モジュールに移される前に別個の回復モジュールに提供されてもよい。回復中、第２の成長モジュールは、形質転換された細胞が導入された核酸を取り込み、特定の態様では、細胞のゲノムに組み込むのを可能にする。第２の成長モジュールは、細胞成長に最適な任意のユーザ設定温度、好ましくは２５°、３０°、又は３７℃で細胞をインキュベートするように構成され得る。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、第２の成長モジュールは選択モジュールとして動作し、抗生物質又は他の試薬に基づいて形質転換細胞を選択する。一例では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）タンパク質システムを使用して、目的の編集を受けていない細胞のゲノムを切断する。選択に使用されるＲＧＮタンパク質システムは、編集に使用したＲＧＮと同じでも異なっていてもよい。抗生物質選択剤の例では、選択を行うために抗生物質を第２の成長モジュールに追加してもよい。適切な抗生物質耐性遺伝子には、限定するものではないが、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナバニン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、又はクロラムフェニコール耐性遺伝子などの遺伝子が含まれる。図１Ａ〜１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８又は図１７Ａ〜１７Ｂの１７０８は、例えば、シッパー又はピペッターインターフェースを介して抗生物質を第２の成長モジュールに移してもよい。いくつかの実施形態において、死細胞バックグラウンドの除去は、洗浄剤、低浸透圧洗浄による浸透圧ストレス、温度、酵素、プロテアーゼ、バクテリオファージ、還元剤、又はカオトロープなどの溶解エンハンサーの使用により補助される。図１８の処理システム１８１０は、例えば温度などの環境変数を変更して選択を誘導してもよく、図１Ａ〜１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８又は図１７Ａ〜１７Ｂの１７０８は、選択を補助する追加の材料（例えば、洗浄剤、酵素、還元剤など）を送達してもよい。他の実施形態では、死細胞バックグラウンドを低減するために、細胞除去及び／又は濾過による培地交換が用いられる。
【０２０３】
さらなる実施形態では、選択を適用することに加えて、又はそれに代えて、第２の成長モジュールは編集モジュールとして機能し、形質転換された細胞におけるゲノム編集を可能にする。あるいは、他の実施形態では、回復及び選択後（実行される場合）の細胞は、別個の編集モジュールに移される。編集モジュールとして、第２の成長モジュールは、例えば、導入された核酸の発現を促進することにより、細胞のゲノムの編集を誘導する。ヌクレアーゼ及び／又は編集カセット核酸の発現は、化学、光、ウイルス、又は温度による誘導法の１つ以上を伴い得る。第２の成長モジュールは、例えば、温度誘導プロセス中に細胞を加熱又は冷却するように構成されてもよい。特定の実例では、細胞は４２℃〜５０℃に加熱することにより誘導され得る。例示に加えて、誘導後、細胞を０〜１０℃に冷却してもよい。化学的又はウイルスによる誘導の例では、誘導剤を第２の成長モジュールに移送して編集を誘導することができる。編集中に誘導性ヌクレアーゼ及び／又は編集カセットが細胞に導入された場合、図１７Ａに関連して説明した誘導分子１７２４などの誘導分子の導入により誘導することができる。誘導剤又は誘導剤分子は、いくつかの実装形態では、図１Ａ〜１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８又は図１７Ａ〜１７Ｂの１７０８によって第２の成長モジュールに移される（例えば、ピペッター又はシッパーインターフェースを介して）。
【０２０４】
いくつかの実装形態において、追加の細胞編集が望まれない場合（１４２４）、細胞を細胞成長モジュールから保管ユニットに移しておき、後で自動化マルチモジュール細胞編集機器から取り出すことができる（１４２６）。保管ユニットは、例えば、図１７Ａ〜１７Ｂの保管ユニット１７１４を含み得る。図１Ａ〜１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８又は図１７Ａ〜１７Ｂの１７０８は、例えば、シッパー又はピペッターインターフェースを介して、細胞を保管ユニット１１４に移してもよい。別の例では、図１Ａ〜１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８又は図１７Ａ〜１７Ｂの１７０８は、細胞を含むバイアルを、第２の成長モジュールのチャンバから保管ユニット内のバイアル又はチューブに移してもよい。
【０２０５】
いくつかの実装形態では、追加の細胞編集が望まれる場合（１４２４）、細胞を同じ又は異なる濾過モジュールに移し、エレクトロコンピテントにすることができる（１４０８）。さらに、いくつかの実施形態では、この時点で核酸アセンブリモジュールによって新しいアセンブリ核酸試料を調製してもよく、あるいは、第２の完全にアセンブリされた核酸を細胞に直接導入してもよい。再帰的編集の前に、いくつかの実施形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、例えば１つ以上の別個の試薬バイアル又はカートリッジの導入を通じて、ユーザによる追加材料の供給を必要とし得る。
【０２０６】
工程は、第２ラウンドの編集中に同じでも異なっていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ステップ１４０４の実行の後に、選択成長培地が成長モジュールに移送され、第１ラウンドの編集からの編集された細胞の選択が可能になる。図１Ａ〜１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８又は図１７Ａ〜１７Ｂの１７０８は、例えば、選択成長培地用に指定された位置にある試薬カートリッジ内のバイアル又は容器から選択成長培地を移すことができる。選択成長培地を移す前に、選択成長培地用に指定された位置にあるバイアル又は他の容器又はリザーバ上の機械可読表示をスキャンして、そのバイアル、容器、又はリザーバの内容物を確認してもよい。さらに、機械可読表示は、機器に提供される選択成長培地の種類を示してもよい。いくつかの実施形態では、機器は、選択成長培地の種類に応じて特定の処理スクリプト（例えば、特定の選択成長培地に適切な成長モジュールの設定及び起動）を選択してもよい。再帰的編集ワークフローの特定の例については、図１５Ａから１５Ｃに関連して説明されている。
【０２０７】
いくつかの実装形態では、方法１４００は、ユーザのスケジュールに合わせて材料を導入し、及び／又は編集サイクル又は成長サイクルを完了するようにタイミングを合わせることができる。例えば、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、１つ以上の細胞処理サイクル（例えば１つ以上の再帰的編集）の完了のスケジュールを決める能力をユーザに提供することができ、方法１４００は、ユーザの希望する時間に完了することを目標に制定される。例えば、時間スケジュールは、図１８のユーザインターフェース１８１６などのユーザインターフェースを介して設定されてもよい。例示のみを目的として、ユーザは最初のサイクルの完了を午後４：００に設定し、ユーザが追加の材料カートリッジを自動化マルチモジュール細胞編集機器に供給して、別のラウンドの細胞編集を一晩かけて処理できるようにすることができる。したがって、ユーザは、特定の期間、例えば２４時間で２回以上のサイクルがプログラムされるように、プログラムの時間を設定することができる。
【０２０８】
いくつかの実装形態では、方法１４００全体を通して、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、ユーザに現在の状態を警告してもよい。例えば、図１８のユーザインターフェース１８１６は、処理の現在の段階のグラフィック表示を提示し得る。特定の例では、自動化マルチモジュール細胞処理機器の前面に、細胞処理の現在の状態を表すアニメーション画像を表示するユーザインターフェース（例えばタッチスクリーン）を重ねることができる。ユーザインターフェースは、現在の処理段階に関連付けられたユーザ及び／又はデフォルト設定（例えば、温度設定、時間設定など）をさらに提示してもよい。特定の実装形態では、状況は、ワイヤレス通信コントローラを介してユーザに通信され得る。
【０２０９】
特定の一連の動作として示されているが、他の実施形態では、より多くの又はより少ないステップが方法１４００に含まれてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、編集の各ラウンドに入る前に、処理を進めるために適切な材料が利用可能であることを確認するために、リザーバ、カートリッジ、及び／又はバイアルの内容物がスクリーニングされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上の画像センサ（例えば、バーコードスキャナ、カメラなど）が、自動化マルチモジュール細胞編集機器のハウジング内の様々な場所で内容物を確認し得る。一例では、自動化マルチモジュール細胞編集機器のハウジング内に複数の画像センサを配置することができ、各画像センサは１つ以上の材料（例えば、バーコードやＱＲコード（登録商標）などの機械可読表示、材料の形状／サイズなど）を検出するように構成されている。別の例では、ロボットハンドリングシステムによって少なくとも１つの画像センサを複数の場所に移動させて、１つ以上の材料を検出することができる。さらなる実施形態では、１つ以上の重量センサが、使い捨て又は交換可能な材料の有無を検出してもよい。例示的な例では、移送チップ供給ホルダは、チップが領域に装填されたか否かを検出するための重量センサを含んでもよい。別の例示的な例では、光学センサが、液体廃棄物のレベルが閾値レベルに達したことを検出し、細胞処理を続ける前に、又は続行の最低レベルに達していない場合は液体の添加前に、廃棄することを求めてもよい。いくつかの実装形態では、追加材料、廃棄物の除去、又は他のユーザの介入（例えば、１つ以上の要素の手動清掃など）の要求が、自動化マルチモジュール細胞編集機器のグラフィカルユーザインターフェースに表示される。いくつかの実装形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、例えばソフトウェアアプリ、電子メール、又はテキストメッセージを介して、新しい材料又は他の手動による介入の要求をユーザに連絡する。
【０２１０】
自動化マルチモジュール細胞編集機器での細胞処理のワークフロー
自動化マルチモジュール細胞編集機器は、同じモジュールを使用して様々な細胞処理ワークフローを実行するように設計されている。例えば、個々の容器又はカートリッジ形式の原料は異なる場合があり、それに応じて、同じ基本的な計装及びロボットハンドリングシステムを使用して、対応する指示（ソフトウェアスクリプトなど）を選択することができる。つまり、マルチモジュール細胞編集機器は、細胞試料及び異なる種類の細胞試料を処理するための様々なワークフローを実行するように構成することができる。実施形態では、同じワークフローを繰り返し実行して、細胞試料を再帰的に編集することができる。他の実施形態では、細胞試料は再帰的に編集されるが、ワークフローは反復ごとに変わる場合がある。
【０２１１】
図１５Ａから１５Ｃは、２つの細胞成長モジュール１５０２、１５０８、２つの濾過モジュール１５０４及び１５１０、ならびにフロースルー型エレクトロポレーションモジュール１５０６を含む自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用して実行することができる例示的なワークフローを示す。別個の成長モジュール１５０２、１５０８及び濾過モジュール１５０４、１５１０として説明されているが、代わりにそれぞれが対の又は統合されたモジュールとして設計されてもよい。例えば、成長モジュール１５０２及び１５０８を含む一対の成長モジュールは、いくつかの回路要素、制御器、及び電源を共有し、同じハウジングに配置された一対の回転成長バイアルを含み得る。同様に、一対の濾過モジュールは、２つの別個のフィルタ及び液体供給チューブを含むが、回路要素、制御器、電源、及びハウジングを共有する濾過モジュール１５０４及び１５１０を含むことができる。モジュール１５０２、１５０４、１５０６、１５０８、及び１５１０は、例えば、図１Ａ及び１Ｂに関連して説明された機器１００の一部であり得る。
【０２１２】
図１５Ａに移って、フロー図は、同一の処理ステップを有する２段階の処理を含む第１の細菌ゲノム編集ワークフロー１５００を示し、細胞ストック１５１２に２つの編集をもたらす。各段階は、異なる原材料のカートリッジに基づいて動作し得る。例えば、第１のカートリッジは、第１のオリゴライブラリ１５１４ａ及び第１のベクター骨格、例えば発現プラスミド１５１６ａを含み得る。処理段階間に又は処理の前に、自動化マルチモジュール細胞編集機器の第１のカートリッジとは異なる位置に導入される第２のカートリッジは、第２のオリゴライブラリ１５１４ｂ及び第２のベクター骨格１５１６ｂを含み得る。各カートリッジは、編集細胞のライブラリを構築するための「ライブラリカートリッジ」と見なすことができる。細胞ストック１５１２は、いくつかの実施形態では、第１のライブラリカートリッジに含まれる。細胞ストック１５１２は、２つのカートリッジを含むキット中に供給されてもよい。あるいは、ユーザは、細胞ストック１５１２の容器（例えば、バイアル又はチューブ）を購入済みのカートリッジに追加してもよい。
【０２１３】
ワークフロー１５００は、いくつかの実施形態では、図１８の処理システム１８１０などの自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理システムによって実行されるスクリプトに基づいて実行される。スクリプトには、第１の例では、第１のカートリッジに追加された機械可読マーカー又はタグを介してアクセスできる。いくつかの実施形態では、各処理段階は別個のスクリプトを使用して実行される。例えば、各カートリッジは、カートリッジの内容物を処理するためのスクリプトの指示又はスクリプト自体を含んでもよい。
【０２１４】
いくつかの実装形態では、第１の段階は、接種、成長、及び監視のために細胞ストック１５１２を第１の成長モジュール１５０２に導入することから始まる（１５１８ａ）。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１５１２のバイアルを、第１の成長モジュール１５０２の回転成長バイアルに含まれる培地に追加する。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１のカートリッジから細胞ストック１５１２をピペットで採取し、細胞ストック１０１２を回転成長バイアルに含まれる培地に追加する。この時点で、細胞は４℃の温度に維持されていてもよい。特定の例では、２０ｍｌの細胞ストックを、第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアル内で、３０℃の温度で０．５０のＯＤまで成長させることができる。第１の成長モジュール１５０２に追加された細胞ストック１０１２は、成長バイアルの自動監視を介して０．５０のＯＤが感知されるまで経時的に監視されてもよい。監視は定期的又は継続的であり得る。これには、例えば約９００分（推定）かかる場合があるが、正確な時間は所望のＯＤの検出に依存する。
【０２１５】
いくつかの実装形態では、細胞を所望のＯＤまで成長させた後、細胞を誘導するために誘導剤が第１の成長モジュール１５０２に追加される。特定の例では、１００μｌの誘導剤を追加することができ、成長モジュール１５０２は混合物の温度を４２℃まで上げ、１５分間保持することができる。
【０２１６】
いくつかの実装形態では、細胞ストック１５１２は、成長及び誘導後、細胞をエレクトロコンピテントにするため（１５２０ａ）、及び形質転換のために細胞の体積を減らすために、第１の濾過モジュール１５０４に移される。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１５１２のバイアルを、第１の成長モジュール１５０２の回転成長バイアルから第１の濾過モジュール１５０４のバイアルホルダに移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の成長モジュール１５０２の回転成長バイアルから細胞ストック１５１２をピペットで採取し、それを第１の濾過モジュール１５０４に送達する。例えば、細胞ストック１５１２を第１の成長モジュール１５０２に移すために使用される使い捨てピペットチップを使用して、細胞ストック１５１２を第１の成長モジュール１５０２から第１の濾過モジュール１５０４に移すことができる。いくつかの実施形態では、細胞ストック１５１２を第１の成長モジュール１５０２から第１の濾過モジュール１５０４に移す前に、第１の成長モジュール１５０２を４℃に冷却して、細胞ストック１５１２を同様にこの温度まで低下させる。特定の例では、第１の成長モジュール１５０２の温度を約８分間にわたって約４℃まで低下させてもよく、細胞ストック１５１２の温度を確実に低下させるため、成長モジュール１５０２は、４℃の温度を約１５分間維持してもよい。
【０２１７】
細胞ストックを移送する前に、いくつかの実装形態では、第１の濾過モジュール１５０４のフィルタは、洗浄液を使用して予備洗浄される。洗浄液は、例えば、図１Ａに関連して説明したカートリッジ１０６などの洗浄カートリッジで供給することができる。
【０２１８】
第１の濾過モジュール１５０４は、例えば、図１２Ｂ及び１２Ｃに関連して説明した濾過モジュール１２５０などの一対の濾過モジュールの一部であってもよい。特定の例では、第１の濾過モジュール１５０４は、洗浄及び溶出プロセスの間、細胞材料を溶出バイアルと第１の濾過モジュール１５０４との間で移送しながら、４℃に維持されてもよい。
【０２１９】
いくつかの実装形態では、濾過モジュール１５０４で細胞をエレクトロコンピテントにすると、細胞ストック１５１２は、形質転換のために形質転換モジュール１５０６（例えば、フロースルー型エレクトロポレーションモジュール）に移される。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１５１２のバイアルを第１の濾過モジュール１５０４のバイアルホルダからフロースルー型エレクトロポレーションモジュール１５０６のリザーバに移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の濾過モジュール１５０２又は一時的なリザーバから細胞ストック１５１２をピペットで採取し、それを第１の濾過モジュール１５０４に送達する。特定の例において、第１の濾過モジュール１５０４からの４００μｌの濃縮細胞ストック１５１２は、形質転換モジュール１５０６への移送の前に混合リザーバに移送される。例えば、細胞ストック１５１２は、アセンブリされた核酸と混合するためにカートリッジ内のリザーバに移され、次にピペットチップを使用してロボットハンドリングシステムにより移送されてもよい。特定の例では、形質転換モジュールは４℃に維持される。細胞ストック１５１２は、例示的な例では、約４分で形質転換され得る。
【０２２０】
細胞が成長し及び／又はエレクトロコンピテントにされている間、いくつかの実装形態では、例えばサーマルサイクラー及びライゲーションプロセスを使用して、又は核酸アセンブリマスターミックス中で、核酸アセンブリプロセスを使用して第１のオリゴライブラリ１５１４ａ及びベクター骨格１５１６ａがアセンブリされ、アセンブリされた核酸が作成される（１５２２ａ）。アセンブリされた核酸は、ワークフロー１５００の第１の段階の第１の処理ステップ１５１８ａ、１５２０ａのある時点で作成されてもよい。あるいは、アセンブリされた核酸は、第１の処理ステップ１５１８を開始する前に作成されてもよい。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器の核酸アセンブリモジュールを使用して、核酸がアセンブリされる。例えば、ロボットハンドリングシステムは、第１のオリゴライブラリ１５１４ａ及びベクター骨格１５１６ａを、自動化マルチモジュール細胞編集機器の試薬カートリッジのライブラリ容器から、図１７Ｂに関連して説明した核酸アセンブリモジュール１７１０ｇなどの核酸アセンブリモジュール（図示略）に追加してもよい。特定の実施形態では、核酸アセンブリモジュールで実行される核酸アセンブリは等温核酸アセンブリである。核酸アセンブリ混合物は、例えば、特定の例において、５０μｌのＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（商標）マスターミックス、２５μｌのベクター骨格１５１６ａ、及び２５μｌのオリゴ１５１４ａを含んでもよい。核酸アセンブリモジュールは、室温又は別の所望の温度で保持することができる。
【０２２２】
他の実施形態では、核酸は、マルチモジュール細胞編集機器の外部でアセンブリされ、機能的原料として追加される。例えば、接種、成長、及び細胞処理の第１のステップ１５１８ａを起動する前に、アセンブリされた核酸のバイアル又はチューブを試薬カートリッジに追加してもよい。特定の例では、１００μｌのアセンブリされた核酸が提供される。
【０２２３】
他の実施形態において、核酸は構成要素中の細胞に導入され、形質転換細胞の機構は、例えば酵母細胞のギャップ修復機構を使用して、細胞内でアセンブリを実施する。
いくつかの実装形態において、アセンブリされた核酸は、さらなる使用の前に精製される（１５２４ａ）。アセンブリに続いて、例えば、核酸は、ロボットハンドリングシステムによって核酸アセンブリモジュールから精製モジュール（図示略）に移されてもよい。他の実施形態では、核酸アセンブリモジュールは、精製機能（例えば、核酸アセンブリと精製モジュールの組合せ）を含み得る。さらなる実施形態では、アセンブリされた又は別個の核酸は、マルチモジュール細胞編集機器の外部で精製され、機能的原料として追加される。例えば、細胞処理の第１のステップ１５１８ａを起動する前に、細胞ストック１０１２と共に、精製されたアセンブリされた核酸のバイアル又はチューブを試薬カートリッジに追加してもよい。
【０２２４】
特定の例では、核酸アセンブリ混合物中の１００μｌのアセンブリされた核酸がアセンブリされ、その後精製される。いくつかの実施形態では、磁気ビーズが核酸アセンブリモジュールに追加され、例えば、懸濁液中の１８０μｌの磁気ビーズがロボットハンドリングシステムによって核酸アセンブリモジュールに追加されてもよい。核酸アセンブリモジュールに機能的に結合された磁石を活性化し、試料を２００μｌのエタノールで洗浄してもよい（例えば、ロボットハンドリングシステムがエタノールを核酸アセンブリモジュールに移してもよい）。いくつかの実施形態では、この操作からの液体廃棄物は、カートリッジの廃棄物レセプタクルに移される（例えば、ロボットハンドリングシステムにより、エタノールを移すのに使用されるのと同じピペットチップを使用して）。この時点で、脱塩されたアセンブリされた核酸は、カートリッジのリザーバなどの保持容器に移されてもよい。脱塩されたアセンブリされた核酸は、細胞が形質転換の準備ができるまで、例えば４℃の温度で保持される。特定の例では、１００μｌのアセンブリされた核酸を、形質転換モジュール１５０６に移す前に、混合リザーバ内の４００μｌの濃縮細胞ストック１５１２に加えてもよい。いくつかの実施形態では、精製プロセスは約１６分かかる場合がある。
【０２２５】
いくつかの実装形態では、アセンブリされた核酸及び細胞ストック１５１２がフロースルー型エレクトロポレーションモジュール１５０６に追加され、細胞ストック１５１２が形質転換される（１５２６ａ）。ロボットハンドリングシステムは、例えば、細胞ストック１５１２及びアセンブリされた核酸の混合物を、例えばピペットチップを使用して、あるいはバイアル又はチューブを移すことにより、混合リザーバからフロースルー型エレクトロポレーションモジュール１５０６に移し得る。いくつかの実施形態では、図４Ａ〜４Ｉ、５Ａ〜５Ｈ、６、８Ａ〜８Ｕ、及び９Ａ〜９Ｃに示されたフロースルー型エレクトロポレーションモジュールなどの組み込みフロースルー型エレクトロポレーションモジュールを使用して、細胞ストック１５１２を形質転換する。他の実施形態では、図１０Ａ〜１０Ｃ及び１０Ｅに示されるようなカートリッジベースのエレクトロポレーションモジュールを使用して、細胞ストック１５１２を形質転換する。エレクトロポレーションモジュール１５０６は、例えば、４℃の温度に保持されてもよい。例示的な例では、エレクトロポレーションプロセスは約４分かかる場合がある。
【０２２６】
いくつかの実装形態では、形質転換された細胞ストック１５１２は、回復のために第２の成長モジュール１５０８に移される（１５２８ａ）。特定の例では、形質転換された細胞は、第２の成長モジュール１５０８において３０℃の温度で回復プロセスを受ける。形質転換された細胞は、例えば、所定の期間、例えば、回復のために約１時間、第２の成長モジュール１５０８に維持されてもよい。
【０２２７】
いくつかの実装形態では、選択培地を第２の成長バイアル（図示略）に移し、選択プロセスで細胞をさらに一定期間インキュベートする。例示的な例では、抗生物質を第２の成長バイアルに移し、細胞を３０℃の温度でさらに２時間インキュベートして、外来性物質を受け取った細胞を選択する。
【０２２８】
回復後、細胞は、別のラウンドの編集ができる状態にあるか、又は例えば自動細胞処理環境の外部で行われるさらなる実験のために、容器内で保存できる状態になっている場合がある。あるいは、細胞の一部を細胞ライブラリ出力として保管ユニットに移し、細胞の別の部分を第２ラウンドの編集用に準備することもできる。
【０２２９】
いくつかの実装形態では、第２ラウンドの編集の準備において、形質転換された細胞は、培地交換及び濾過のために第２の濾過モジュール１５１０に移される（１５３０ａ）。形質転換された細胞ストックを移す前に、いくつかの実施において、第２の濾過モジュール１５０４のフィルタは、洗浄液を使用して予備洗浄される。洗浄液は、例えば、図１Ａに関連して説明したカートリッジ１０６などの洗浄カートリッジで供給することができる。例えば、第２の濾過モジュール１５１０は、図１２Ａに関して説明したように、洗浄カートリッジの洗浄液が流れように接続されてもよい。
【０２３０】
第２の濾過モジュール１５１０は、例えば、図１２Ｂ及び１２Ｃに関連して説明した濾過モジュール１２５０などの一対の濾過モジュールの一部であってもよい。特定の例では、洗浄及び溶出プロセスの間、第２の濾過モジュール１５１０は、溶出バイアルと第２の濾過モジュール１５１０との間で細胞材料を移動させながら、所定の温度（例えば、４℃）に維持され得る。特定の例では、この濾過プロセスの出力はバイアル又はチューブに入れられ、さらなる処理、例えば形質転換モジュールに移送されるまで待機する。バイアル又はチューブは、保管ユニットにおいて４℃の温度で維持されてもよい。
【０２３１】
処理の第１の段階は、１日で行われてもよい。１つの例示的な実施形態では、処理の第１の段階は、完了するまでに１９時間未満かかると推定される（例えば、約１８．７時間）。ワークフロー１５００のこの時点で、いくつかの実装形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器に新しい材料が手動で追加される。例えば、新しい試薬カートリッジが追加され得る。さらに、この時点で、新しい洗浄カートリッジ、取換え用フィルタ、及び／又は取換え用ピペットチップを自動化マルチモジュール細胞編集機器に追加することができる。さらに、いくつかの実施形態では、次のラウンドの処理に備えて、フィルタモジュールは洗浄プロセスを受けてもよく、及び／又は固形及び液体廃棄物ユニットが空にされてもよい。さらに他の実施形態では、試薬カートリッジは２サイクル分以上の編集用の試薬を提供してもよい。したがって、２回以上の編集ラウンド間で変更を行う必要はない。
【０２３２】
いくつかの実装形態では、第２ラウンドの編集には、上述した第１の処理段階と同じモジュール１５０２、１５０４、１５０６、１５０８、及び１５１０、同じ処理ステップ１５１８、１５２０、１５２２、１５２４、１５２６、１５２８、及び１５３０、ならびに同じ温度範囲及び時間範囲が含まれる。例えば、第２のオリゴライブラリ１５１４ｂ及び第２のベクター骨格１５１６ｂを使用して、上記とほぼ同じ方法で形質転換細胞を編集することができる。２段階プロセスとして示されているが、他の実施形態では、最大２、４、６、８、又はそれ以上の繰り返しを行って、同じ細胞ストック１５１２を編集し続けることができる。
【０２３３】
図１５Ｂに移って、他の実施形態では、ワークフロー１５４０は、プロセスの第１の段階について同じモジュール１５０２、１５０４、１５０６、１５０８、及び１５１０ならびに同じ処理ステップ１５１８、１５２０、１５２２、１５２４、１５２６、１５２８、及び１５３０を含む。しかし、図１５Ａのワークフロー１５００とは異なり、図１５Ｂのワークフロー１５４０の第２の段階はキュアリングステップを含む。「キュアリング」とは、ベクター、例えば、前のラウンドの編集で使用された編集ベクター、ヌクレアーゼの発現配列を含む「エンジン」ベクター、又はそれらの両方が、形質転換された細胞から除去されるプロセスである。キュアリングは、例えば、キュアリングプラスミドを使用して編集ベクターを切断し、それにより編集及び／又はエンジンベクターを機能させなくするか（図１５ｂのワークフローで例示）、細胞成長により細胞集団内のベクターを希釈する（つまり、細胞がより多くの成長サイクルを経るほど、編集又はエンジンベクターを保持する娘細胞が少なくなる）か（図示略）、又は、例えば編集ベクター又はエンジンベクター上の熱感受性複製起点を利用する（図示略）ことにより達成することができる。一例では、「キュアリングプラスミド」は、自動化機器の試薬カートリッジ内に含まれるか、又は処理の第２の段階の前に機器に手動で追加されてもよい。ワークフロー１５００と同様に、いくつかの実施形態では、ワークフロー１５４０は、図１８の処理システム１８１０などの自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理システムによって実行されるスクリプトに基づいて実行される。スクリプトには、第１の例では、第１のカートリッジに追加された機械可読マーカー又はタグを介してアクセスできる。いくつかの実施形態では、各処理段階は別個のスクリプトを使用して実行される。例えば、各カートリッジは、カートリッジの内容物を処理するためのスクリプトの指示又はスクリプト自体を含んでもよい。このように、例えば、キュアリングカートリッジを含む第２の段階は、キュアリングに適した設定（例えば、温度、時間、材料の量など）用に設計されたスクリプトを使用して実行できる。キュアリングの条件は、キュアリングに使用されるメカニズム、つまりこの例では、キュアリングプラスミドがどのように編集及び／又はエンジンプラスミドを切断するかに依存するであろう。
【０２３４】
いくつかの実装形態では、ワークフロー１５４０の第２の段階は、第１の成長モジュール１５０２でワークフロー１５４０の第１の段階から最初に編集された細胞を受け取ることから始まる。例えば、最初に編集された細胞は、細胞ストック１５４２、オリゴライブラリ１５４４、及びベクター骨格１５４６を使用して、ステップ１５１８、１５２０、１５２２、１５２４、１５２６、１５２８、及び１５３０を図１５Ａのワークフロー１５００に関連して説明したように適用することにより編集されたものであり得る。最初に編集された細胞ストック１５４２は、例えば、ロボットハンドリングシステムによって第１の成長モジュール１５０２に移されてもよい。一例では、ロボットハンドリングシステムは、最初に編集された細胞ストック１５４２のバイアルを第１の成長モジュール１５０２の回転成長バイアルに追加する。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、保管ユニットのレセプタクルから最初に編集された細胞ストック１５４２をピペットで採取し、細胞ストック１５４２を回転成長バイアルに加える。この時点で、細胞は４℃の温度に維持されていてもよい。
【０２３５】
いくつかの実装形態では、最初に編集された細胞は、第１の成長モジュール１５０２で接種、成長、及び監視される（１５１８ｄ）。特定の例では、最初に編集した細胞ストック１５４２のアリコートを、例えば３０℃の温度で０．５０のＯＤまでの２０ｍＬの成長培地を含む回転成長バイアルに移すことができる。第１の成長モジュール１５０２に追加された細胞ストック１５４２は、自動監視を介して０．５０のＯＤが感知されるまで経時的に監視され得る。監視は定期的又は継続的であってもよい。これには、例えば約９００分（推定）かかる場合があるが、正確な時間は所望のＯＤの検出に依存する。
【０２３６】
いくつかの実装形態では、細胞を所望のＯＤまで成長させた後、細胞を誘導するために誘導剤が第１の成長モジュール１５０２に追加される。特定の例では、１００μｌの誘導剤を追加することができ、成長モジュール１５０２は混合物の温度を４２℃まで上げ、１５分間保持することができる。
【０２３７】
いくつかの実装形態では、最初に編集された細胞ストック１５４２は、成長及び誘導の後、最初に編集された細胞をエレクトロコンピテントにするために（１５２０ｄ）第１の濾過モジュール１５０４に移される。一例では、ロボットハンドリングシステムは、最初に編集された細胞ストック１５４２のバイアルを、第１の成長モジュール１５０２の回転成長バイアルから第１の濾過モジュール１５０４のバイアルホルダに移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の成長モジュール１５０２の回転成長バイアルから最初に編集された細胞ストック１５４２をピペットで採取し、それを第１の濾過モジュール１５０４に送達する。例えば、最初に編集された細胞ストック１５４２を第１の成長モジュール１５０２に移すために使用される使い捨てピペットチップを使用して、細胞ストック１５４２を第１の成長モジュール１５０２から第１の濾過モジュール１５０４に移すことができる。いくつかの実施形態では、細胞ストック１５４２を第１の成長モジュール１５０２から第１の濾過モジュール１５０４に移す前に、第１の成長モジュール１５０２を４℃に冷却して、細胞ストック１５４２を同様にこの温度まで低下させる。特定の例では、第１の成長モジュール１５０２の温度を約８分間にわたって約４℃まで低下させてもよく、細胞ストック１５１２の温度を確実に低下させるため、成長モジュール１５０２は、４℃の温度を約１５分間維持してもよい。
【０２３８】
第１の編集された細胞ストック１５４２を濾過モジュールに移す前に、いくつかの実装態様では、第１の濾過モジュール１５０４のフィルタは、洗浄液を使用して予備洗浄される。例えば、洗浄液は、図１Ａに関連して説明したカートリッジ１０６などの洗浄カートリッジで供給することができる。第１の濾過モジュール１５０４は、例えば、洗浄カートリッジの洗浄液が流れるように接続されてもよい。
【０２３９】
第１の濾過モジュール１５０４は、例えば、図１２Ｂ及び１２Ｃに関連して説明した濾過モジュール１２５０などの一対の濾過モジュールの一部であってもよい。特定の例では、第１の濾過モジュール１５０４は、洗浄及び溶出プロセスの間、細胞材料を溶出バイアルと第１の濾過モジュール１５０４との間で移送しながら、所定の温度（例えば、４℃）に維持されてもよい。
【０２４０】
いくつかの実装形態では、濾過モジュール１５０４で最初に編集された細胞をエレクトロコンピテントにすると（１５２０ｄ）、最初に編集された細胞ストック１５４２は、形質転換のために形質転換モジュール１５０６（例えば、ＦＴＥＰモジュール）に移される。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１５４２のバイアルを第１の濾過モジュール１５０４のバイアルホルダからフロースルー型エレクトロポレーションモジュール１５０６のリザーバに移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の濾過モジュール１５０２又は一時的なリザーバから細胞ストック１５４２をピペットで採取し、それを第１の濾過モジュール１５０４に送達する。特定の例では、第１の濾過モジュール１５０４からの４００μｌの濃縮細胞ストック１５４２は、形質転換モジュール１５０６への移送の前に混合リザーバに移送される。例えば、細胞ストック１５４２は、キュアリングプラスミド１５５０と混合するためにカートリッジ内のリザーバに移され、次にピペットチップを使用してロボットハンドリングシステムにより混合及び移送されてもよい。特定の例では、形質転換モジュール１５０６は、所定の温度、例えば４℃に維持される。細胞ストック１５４２は、例示的な例では、約４分で形質転換され得る。
【０２４１】
いくつかの実装形態では、形質転換された細胞ストック１５４２は、回復／キュアリングのために第２の成長モジュール１５０８に移される（１５２８ｄ）。特定の例では、２０ｍｌの形質転換された細胞は、第２の成長モジュール１５０８において３０℃の温度で回復プロセスを受ける。形質転換された細胞は、例えば、回復のために約１時間、第２の成長モジュール１５０８で維持されてもよい。別のラウンドの編集が望まれる場合は、第１の編集プラスミド又はベクターがキュアリングされる。別のラウンドの編集が望まれない場合は、第１の編集プラスミド及びエンジンプラスミドがキュアリングされ得る。
【０２４２】
回復及びキュアリング後、細胞は、別のラウンドの編集ができる状態にあるか、又は自動細胞処理機器の外部でのさらなる研究で使用するために、保存できる状態になっている場合がある。例えば、細胞の一部を細胞ライブラリ出力として保管ユニットに移し、細胞の別の部分を第２ラウンドの編集用に準備することができる。
【０２４３】
いくつかの実装形態では、第２ラウンドの編集の準備において、形質転換された細胞は、細胞をエレクトロコンピテントにするためのグリセロールを含む培地交換及び濾過（１５３０ｄ）のために第２濾過モジュール１５１０に移される。形質転換された細胞ストックを移す前に、いくつかの実装形態では、洗浄液を使用して第２の濾過モジュール１５０４のフィルタを予備洗浄する。洗浄液は、例えば、図１Ａに関連して説明したカートリッジ１０６などの洗浄カートリッジで供給することができる。例えば、第２の濾過モジュール１５１０は、図１２Ａに関して説明したように、洗浄カートリッジの洗浄液が流れるように接続されてもよい。
【０２４４】
第２の濾過モジュール１５１０は、例えば、図１２Ｂ及び１２Ｃに関連して説明した濾過モジュール１２５０などの一対の濾過モジュールの一部であってもよい。特定の例では、第２の濾過モジュール１５１０は、洗浄及び溶出プロセスの間、細胞材料を溶出バイアルと第２の濾過モジュール１５１０との間で移送しながら４℃に維持されてもよい。特定の例では、この濾過プロセスの出力はチューブに入れられたエレクトロコンピテントセルであり、さらなる処理まで待機する。バイアル又はチューブは、保管ユニットにおいて４℃の温度で維持されてもよい。
【０２４５】
図１５Ｃに移って、フロー図は、同一の処理ステップを有する２段階の処理を含む酵母ワークフロー１５６０を示し、細胞ストック１５６２に２つの編集をもたらす。各段階は、異なる原材料のカートリッジに基づいて動作し得る。例えば、第１のカートリッジは、第１のオリゴライブラリ１５７０ａ及び第１のベクター骨格１５７２ａを含み得る。処理段階間に又は処理の前に、自動化マルチモジュール細胞編集機器の第１のカートリッジとは異なる位置に導入される第２のカートリッジは、第２のオリゴライブラリ１５７０ｂ及び第２のベクター骨格１５７２ｂを含み得る。各カートリッジは、編集細胞のライブラリを構築するための「ライブラリカートリッジ」と見なすことができる。あるいは、ユーザは、細胞ストック１５６２ａの容器（例えば、バイアル又はチューブ）を、酵母細胞キットに含まれる購入済みのカートリッジのそれぞれに追加してもよい。
【０２４６】
ワークフロー１５６０は、いくつかの実施形態では、図１８の処理システム１８１０などの自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理システムによって実行されるスクリプトに基づいて実行される。スクリプトには、第１の例では、第１のカートリッジに追加された機械可読マーカー又はタグを介してアクセスできる。いくつかの実施形態では、各処理段階は別個のスクリプトを使用して実行される。例えば、各カートリッジは、カートリッジの内容物を処理するためのスクリプトの指示又はスクリプト自体を含んでもよい。
【０２４７】
いくつかの実装形態では、第１の段階は、接種、成長、及び監視のために細胞ストック１５６２を第１の成長モジュール１５０２に導入することから始まる（１５１８ｅ）。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１５６２のバイアルを、第１の成長モジュール１５０２の回転成長バイアルに追加する。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１のカートリッジから細胞ストック１５６２をピペットで採取し、細胞ストック１５６２を回転成長バイアルに追加する。この時点で、細胞は４℃の温度に維持されていてもよい。特定の例では、２０ｍｌの細胞ストックを、第１の成長モジュール１５０２の回転成長バイアル内で、３０℃の温度で０．７５のＯＤまで成長させることができる。第１の成長モジュール１５０２に追加された細胞ストック１５１２は、自動監視を介して０．７５のＯＤが感知されるまで、成長モジュール１５０２内で経時的に自動監視されてもよい。監視は定期的又は継続的であり得る。
【０２４８】
いくつかの実装形態では、誘導性発現システムが使用されてもよい。したがって、所望のＯＤまで成長させた後、細胞を誘導するために誘導剤が第１の成長モジュール１５０２に追加される。誘導剤は、小分子又や、ガラクトースなどの異なる糖を含む培地への培地交換であり得る。
【０２４９】
いくつかの実装形態では、細胞ストック１５６２は、成長及び誘導後、培地交換（１５６４ａ）のために第１の濾過モジュール１５０４に移される。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１５６２のバイアルを、第１の成長モジュール１５０２の回転成長バイアルから第１の濾過モジュール１５０４のバイアルホルダに移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の成長モジュール１５０２の回転成長バイアルから細胞ストック１５６２をピペットで採取し、それを第１の濾過モジュール１５０４に送達する。例えば、細胞ストック１５６２ａを第１の成長モジュール１５０２に移すために使用される使い捨てピペットチップを使用して、細胞ストック１５６２を第１の成長モジュール１５０２から第１の濾過モジュール１５０４に移すことができる。いくつかの実施形態では、細胞ストック１５６２を第１の成長モジュール１５０２から第１の濾過モジュール１５０４に移す前に、第１の成長モジュール１５０２を４℃に冷却して、細胞ストック１５６２を同様にこの温度まで低下させる。特定の例では、第１の成長モジュール１５０２の温度を約８分間にわたって約４℃まで低下させてもよく、細胞ストック１５６２の温度を確実に低下させるため、成長モジュール１５０２は、４℃の温度を約１５分間維持してもよい。例示的な例では、培地交換中に、０．４ｍｌの１Ｍソルビトールを細胞ストック１５６２に加えてもよい。
【０２５０】
細胞ストック１５６２を移送する前に、いくつかの実装形態では、第１の濾過モジュール１００４のフィルタは、洗浄液を使用して予備洗浄される。洗浄液は、例えば、図１Ａに関連して説明したカートリッジ１０６などの洗浄カートリッジで供給することができる。例えば、第１の濾過モジュール１５０４は、図１２Ａに関連して説明したように、洗浄カートリッジの洗浄液が流れるように接続されてもよい。
【０２５１】
第１の濾過モジュール１５０４は、例えば、図１２Ｂ及び１２Ｃに関連して説明した濾過モジュール１２５０などの一対の濾過モジュールの一部であってもよい。特定の例では、第１の濾過モジュール１５０４は、洗浄及び溶出プロセスの間、細胞材料を溶出バイアルと第１の濾過モジュール１５０４との間で移送しながら、４℃に維持されてもよい。
【０２５２】
培地交換操作の後、いくつかの実装形態では、細胞ストック１５６２は、コンディショニングのために第１の成長モジュール１５０２に戻される（１５６６ａ）。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１５６２のバイアルを第１の濾過モジュール１５０４から第１の成長モジュール１５０２に移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の濾過モジュール１５０４から細胞ストック１５６２をピペットで採取し、それを第１の成長モジュール１５０２の回転成長バイアルに送達する。例えば、コンディショニング中に、５ｍｌ  ＤＴＴ／ＬＩＡｃ及び８０ｍＭのソルビトールを細胞ストック１５６２に追加してもよい。例えば、ロボットハンドリングシステムは、ＤＴＴ／ＬＩＡｃ及びソルビトールを、個別に又は同時に、第１の成長モジュール１５０２に移すことができる。細胞ストック１５６２は、例えば、第１の成長モジュール１５０２の回転成長バイアルの回転を介して、ＤＴＴ／ＬＩＡｃ及びソルビトールと混合され得る。コンディショニング中、細胞ストック１５６２は４℃の温度に維持されてもよい。
【０２５３】
いくつかの実装形態では、細胞ストック１５６２は、コンディショニング後、細胞を洗浄及び準備（１５６８）するために第１の濾過モジュール１５０４に移される。例えば、このステップで細胞をエレクトロコンピテントにすることができる。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１５６２のバイアルを、第１の成長モジュール１５０２の回転成長バイアルから第１の濾過モジュール１５０４のバイアルホルダに移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の成長モジュール１５０２の回転成長バイアルから細胞ストック１５６２をピペットで採取し、それを第１の濾過モジュール１００４に送達する。
【０２５４】
細胞ストックを移送する前に、いくつかの実装形態では、第１の濾過モジュール１５０４のフィルタは、洗浄液を使用して予備洗浄される。洗浄液は、例えば、図１Ａに関連して説明したカートリッジ１０６などの洗浄カートリッジで供給することができる。第１の濾過モジュール１５０４は、例えば、図１２Ａに関連して説明したように、洗浄カートリッジの洗浄液が流れるように接続されてもよい。他の実施形態では、ステップ１５６４ａで培地交換に使用したフィルタと同じフィルタがエレクトロコンピテントにするために使用される。いくつかの実施形態では、酵母細胞をエレクトロコンピテントにするために１Ｍソルビトールが使用される。
【０２５５】
いくつかの実装形態では、濾過モジュール１５０４でエレクトロコンピテントにされると、細胞ストック１５６２は、形質転換のために形質転換モジュール１５０６（例えば、フロースルー型エレクトロポレーションモジュール）に移される。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１５６２のバイアルを第１の濾過モジュール１５０４のバイアルホルダからフロースルー型エレクトロポレーションモジュール１５０６のリザーバに移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、濾過モジュール１５０４又は一時的なリザーバから細胞ストック１５６２をピペットで採取し、それを第１の濾過モジュール１５０４に送達する。特定の例では、第１の濾過モジュール１５０４からの４００μｌの濃縮細胞ストック１５６２は、形質転換モジュール１５０６への移送の前に混合リザーバに移送される。例えば、細胞ストック１５６２は、核酸成分（ベクター骨格及び編集オリゴヌクレオチド）と混合するためにカートリッジ内のリザーバに移され、次にピペットチップを使用してロボットハンドリングシステムにより混合及び移されてもよい。ベクター骨格及び編集オリゴヌクレオチドは細胞内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でアセンブリされるため、核酸アセンブリモジュールは酵母の編集に必須の構成要素ではない。特定の例では、形質転換モジュールは４℃に維持される。
【０２５６】
いくつかの実装形態では、アセンブリされた核酸及び細胞ストック１５６２がＦＴＥＰモジュール１５０６に追加され、細胞ストック１５６２が形質転換される（１５２６ｅ）。ロボットハンドリングシステムは、例えば、細胞ストック１５６２ｅ及び核酸アセンブリの混合物を、例えばピペットチップを使用して、あるいはバイアル又はチューブを移すことにより、混合リザーバからフロースルー型エレクトロポレーションモジュール１５０６に移し得る。いくつかの実施形態では、図４Ａ〜４Ｉ、５Ａ〜５Ｇ、６、８Ａ〜８Ｕ、９Ａ〜９Ｃ、及び１０Ａ〜１０Ｃのフロースルー型エレクトロポレーションモジュールなどの組み込みＦＴＥＰモジュール（つまり、単一ユニットＦＴＥＰ）を使用して、細胞ストック１５６２ｅを形質転換する。他の実施形態では、カートリッジベースのエレクトロポレーションモジュールを使用して、細胞ストック１５６２ｅを形質転換する。例えば、ＦＴＥＰモジュール１５０６は、４℃の温度に保持されてもよい。
【０２５７】
いくつかの実装形態では、形質転換された細胞ストック１５６２ｅは、回復のために第２の成長モジュール１５０８に移される（１５２８ａ）。特定の例では、２０ｍｌの形質転換された細胞は、第２の成長モジュール１５０８で回復プロセスを受ける。
【０２５８】
いくつかの実装形態では、選択培地、例えば栄養要求性成長培地又は薬物を含む培地を第２の成長バイアル（図示略）に移し、細胞を選択プロセスでさらに一定時間インキュベートする。例示的な例では、抗生物質を第２の成長バイアルに移し、細胞を３０℃の温度でさらに２時間インキュベートしてもよい。
【０２５９】
回復後、細胞は、別のラウンドの編集ができる状態にあるか、又は細胞ライブラリに保存できる状態になっている場合がある。例えば、細胞の一部を細胞ライブラリ出力として保管ユニットに移し（１５７６ａ）、細胞の別の部分を第２ラウンドの編集用に準備することができる（１５７８ａ）。細胞は、例えば、４℃の温度で保管されてもよい。
【０２６０】
いくつかの実装形態では、第２ラウンドの編集の準備において、形質転換された細胞は、培地交換（１５７８ａ）のために第２の濾過モジュール１５１０に移される。形質転換された細胞ストック１５６２ａを移す前に、いくつかの実装形態では、洗浄液を使用して第２の濾過モジュール１５０４のフィルタを予備洗浄する。洗浄液は、例えば、図１Ａに関連して説明したカートリッジ１０６などの洗浄カートリッジで供給することができる。例えば、第２の濾過モジュール１５１０は、図１２Ａに関して説明したように、洗浄カートリッジの洗浄液が流れるように接続されてもよい。
【０２６１】
第２の濾過モジュール１５１０は、例えば、図１２Ｂ及び１２Ｃに関連して説明した濾過モジュール１２５０などの一対の濾過モジュールの一部であってもよい。特定の例では、第２の濾過モジュール１５１０は、洗浄及び溶出プロセスの間、細胞材料を溶出バイアルと第２の濾過モジュール１５１０との間で移送しながら４℃に維持されてもよい。
【０２６２】
濾過プロセス中のいくつかの実装形態では、酵素製剤が細胞ストック１５６２ａの細胞壁を溶解するために追加される。例えば、細胞壁を溶解するために、Ｚｙｌｏｍａｓｅ（商標）などの酵母溶解酵素を添加してもよい。特定の例では、酵母溶解酵素は、細胞ストック１５２６ａ中３０℃の温度で５〜６０分間インキュベートされてもよい。特定の例では、この濾過プロセスの出力はバイアル又はチューブに入れられ、さらなる処理まで待機する。バイアル又はチューブは、保管ユニットにおいて４℃の温度で維持されてもよい。
【０２６３】
処理の第１の段階は、１日で行われてもよい。ワークフロー１５６０のこの時点で、いくつかの実装形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器に新しい材料が手動で追加される。例えば、新しい細胞ストック１５６２ｂ及び新しい試薬カートリッジが追加され得る。さらに、この時点で、新しい洗浄カートリッジ、取換え用フィルタ、及び／又は取換え用ピペットチップを自動化マルチモジュール細胞編集機器に追加することができる。さらに、いくつかの実施形態では、次のラウンドの処理に備えて、フィルタモジュールは洗浄プロセスを受けてもよく、及び／又は固形及び液体廃棄物ユニットが空にされてもよい。
【０２６４】
いくつかの実装形態では、第２ラウンドの編集には、上述した第１の処理段階と同じモジュール１５０２、１５０４、１５０６、１５０８、及び１５１０、同じ処理ステップ１５１８、１５６４、１５６６、１５２６、１５２８、及び１５７６及び／又は１５７８、ならびに同じ条件（例えば、温度、時間範囲など）が含まれる。例えば、第２のオリゴライブラリ１５７０ｂ及び第２のベクター骨格１５７２ｂを使用して、上記とほぼ同じ方法で形質転換細胞の組合せを編集することができる。２段階プロセスとして示されているが、他の実施形態では、最大２、３、４、６、８、又はそれ以上の繰り返しを行って、細胞ストック１５６２を編集し続けることができる。
【０２６５】
機器アーキテクチャの代替実施形態
図１７Ａ及び図１７Ｂは、自動細胞処理、例えば、単一サイクルでの複数の細胞の編集を実行するための自動化マルチモジュール細胞編集機器の例示的な代替実施形態を示す。自動化マルチモジュール細胞編集機器は、例えば、実験室環境で使用するために設計されたデスクトップ機器であってもよい。自動化マルチモジュール細胞編集機器は、細胞内で自動化ゲノム切断及び／又は編集を行う際の様々な段階的操作を実行するための再利用可能な要素及び使い捨ての要素の両方を組み込むことができる。
【０２６６】
図１７Ａは、本開示の一実施形態による、自動細胞処理、例えば単一サイクルでの複数の細胞の編集を行うための第１の例示的な機器１７００のブロック図である。いくつかの実装形態では、機器１７００は、デッキ、機器１７００にＤＮＡ試料成分を導入するための試薬供給レセプタクル１７０４、機器１７００に細胞を導入するための細胞供給レセプタクル１７０６、及び、自動細胞処理を行うために機器１７００のモジュール（例えば、モジュール１７１０ａ、１７１０ｂ、１７１０ｃ、１７１０ｄ）、レセプタクル（例えば、レセプタクル１７０４、１７０６、１７１２ａ〜ｃ、１７２２、１７２４、及び１７２６）、及び保管ユニット（例えば、ユニット１７１８、１７２８、及び１７１４）の間で材料を移動させるためのロボットハンドリングシステム１７０８を含む。細胞供給部１７０６の編集が完了すると、いくつかの実施形態では、細胞出力１７１２は、一時的な保管及びその後の回収のために、ロボットハンドリングシステム１７０８によって保管ユニット１７１４に移され得る。
【０２６７】
ロボットハンドリングシステム１７０８は、例えば、様々な材料源から様々なモジュール１７１０ａ〜ｄ及び保管ユニット１７１４に液体を移送するための空気容積型ポンプを含むことができる。他の実施形態では、ロボットハンドリングシステム１７０８は、供給カートリッジ（図示略、図１Ａに関連して説明したもの）から様々なモジュール１７１０に原料の容器（例えば、チューブ）を移送するためのピックアンドプレースヘッドを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のカメラ又は他の光学センサ（図示略）が、ガントリーの適切な動き及び位置を確認する。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、ロボットハンドリングシステム１７０８は、移送チップ供給部１７１６に提供された使い捨て移送チップを使用して、機器１７００内の原料、試薬１７０４（例えば、核酸アセンブリ用）、及び細胞１７０６を移送する。使用済みの移送チップは、例えば、固形廃棄物ユニット１７１８内に廃棄されてもよい。いくつかの実装形態では、固形廃棄物ユニット１７１８は、ロボットハンドリングシステム１７０８のピックアンドプレースヘッドからチューブを取り外すためのキッカーを含む。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、機器１７００は、空気容積型ポンプに接続するシッパーを備えたエレクトロポレーターキュベットを含む。いくつかの実装形態では、細胞１７０６及び試薬１７０４は、シッパーを介してエレクトロポレーションキュベットに吸引され、キュベットは機器１７００の１つ以上のモジュール１７１０ａ〜ｄへ移送される。
【０２７０】
いくつかの実装形態では、機器１７００は、図１８の処理システム１８１０などの処理システム１７２０によって制御される。処理システム１７２０は、ユーザ入力に基づいて機器１７００を操作するように構成されてもよい。処理システム１７２０は、機器１７００の様々なモジュール１７１０のタイミング、持続時間、温度、及び他の動作を制御することができる。処理システム１７２０は、機器１７００の動作のために電源（図示略）に接続され得る。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、機器１７００は、細胞１７０６に核酸を導入するためのＦＴＥＰデバイス１７１０ｃを含む。例えば、ロボットハンドリングシステム１７０８は、試薬１７０４及び細胞１７０６をＦＴＥＰデバイス１７１０ｃに移し得る。ＦＴＥＰデバイス１７１０は、エレクトロポレーションにより細胞の形質転換又はトランスフェクションを行う。処理システム１７２０は、ＦＴＥＰデバイス１７１０ｃの温度及び動作を制御してもよい。いくつかの実装形態では、処理システム１７２０は、ユーザによって設定された１つ以上の可変制御に従ってＦＴＥＰデバイス１７１０ｃを動作させる。
【０２７２】
形質転換後、いくつかの実装形態では、細胞を回復モジュール１７１０ｄに移してもよい。いくつかの実施形態では、回復モジュール１７１０ｄは、回復及び編集モジュールの誘導の組合せである。回復モジュール１７１０ｄでは、細胞を回復させ、核酸を発現させ、誘導性ヌクレアーゼシステムにおいて、例えば一時的に制御された誘導（いくつかの例では、化学、光、ウイルス、又は温度による誘導、又はヌクレアーゼの発現のための誘導分子１７２４の導入）により、ヌクレアーゼ又はガイドＲＮＡを細胞内で誘導する。
【０２７３】
編集に続いて、いくつかの実装形態では、細胞は保管ユニット１７１４に移され、そこで、編集された細胞集団、例えば編集細胞ライブラリのさらなる研究又は回収のために細胞が取り出されるまで、細胞出力１７１２ａ〜ｄとして細胞を保管することができる。
【０２７４】
いくつかの実装形態では、機器１７００は、細胞集団の細胞内のゲノムに複数の編集が順次導入される再帰的ゲノム編集用に設計されている。いくつかの実装形態では、再帰的処理のために保管ユニットから細胞出力１７１２ａ〜ｄにアクセスする前に、試薬供給部１７０４が補充される。他の実装形態では、複数の試薬供給部１７０４及び／又はその大容量を機器１７００に導入して、後続の処理サイクルの前にユーザとのやり取りが必ずしも必要とされないようにすることができる。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、細胞出力１７１２ａの一部は、自動細胞成長モジュール１７１０ａに移される。例えば、細胞出力１７１２ａのすべてが移されてもよいし、機器が漸進的に変更された試料を保持するようにアリコートのみが移されてもよい。細胞成長モジュール１７１０ａは、いくつかの実装形態では、編集の誘導前に細胞が所望の濃度にあることを確認するために、成長中に細胞のＯＤを測定する。使用できる細胞密度及び生理学的状態の他の測定値には、限定するものではないが、ｐＨ、溶存酸素、放出された酵素、音響特性、及び電気特性が含まれる。
【０２７６】
ゲノム編集を受けていない細胞のバックグラウンドを減らすために、いくつかの実施形態では、成長モジュール１７１０ａは、選択成長培地１７２６を使用して編集された細胞を濃縮する選択プロセスを実行する。例えば、導入された核酸は、抗生物質耐性又は他の選択可能なマーカーを与える遺伝子を含むことができる。いくつかの実装形態では、複数の選択遺伝子又はマーカー１７２６を再帰的編集中に細胞に導入することができる。例えば、一連のラウンドの編集に対して選択可能なマーカーの導入を交互に行うことで、未編集の細胞のバックグラウンドを排除し、機器１７００の複数のサイクルが一連のゲノム編集を有する細胞を選択できるようにする。適切な抗生物質耐性遺伝子には、限定するものではないが、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナバニン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子などの遺伝子が含まれる。
【０２７７】
成長モジュール１７１０ａから、細胞を濾過モジュール１７１０ｂに移すことができる。濾過モジュール１７１０ｂ、あるいは細胞洗浄及び濃縮モジュールは、培地交換を可能にし得る。いくつかの実施形態において、死細胞バックグラウンドの除去は、洗浄剤、浸透圧ストレス、温度、酵素、プロテアーゼ、バクテリオファージ、還元剤、又はカオトロープなどの溶解エンハンサーの使用により補助される。他の実施形態では、細胞除去及び／又は培地交換を使用して、死細胞バックグラウンドを低減する。いくつかの実施形態では、濾過モジュール１７１０ｂからの廃棄物は、液体廃棄物ユニット１７２８に集められる。
【０２７８】
濾過後、細胞はＦＴＥＰデバイス（形質転換モジュール）１７１０ｃに、次に回復モジュール１７１０ｄに、最後に上記の保管ユニット１７１４に提供され得る。
図１７Ｂに移って、図１７Ａと同様に、単一サイクルで複数の細胞の自動ゲノム切断及び／又は編集を行うための第２の例示的な機器１７４０は、デッキ１７０２、１つ以上の核酸成分を機器１７４０に導入するための試薬供給レセプタクル１７０４、細胞を機器１７４０に導入する細胞供給レセプタクル１７０６、及び、自動細胞処理を行うために機器１７４０のモジュール（例えば、モジュール１７１０ａ、１７１０ｂ、１７１０ｃ、１７１０ｆ、１７１０ｇ、１７１０ｍ、及び１７１０ｈ）、レセプタクル（例えば、レセプタクル１７０４、１７０６、１７１２ａ〜ｃ、１７２４、１７４２、１７４４、及び１７４６）、及び保管ユニット（例えば、ユニット１７１４、１７１８、及び１７２８）の間で材料を移動させるためのロボットハンドリングシステム１７０８を含む。細胞供給部１７０６の処理が完了すると、いくつかの実施形態では、細胞出力１７１２ａ〜ｃは、一時的な保管及び後の回収のために、ロボットハンドリングシステム１７０８によって保管ユニット１７１４に移され得る。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、ロボットハンドリングシステム１７０８は、図１７Ａに関連して説明したように、移送チップ供給部１７１６に提供された使い捨て移送チップを使用して、機器１７４０内の原料、ベクター骨格１７４２、編集オリゴ１７４４、試薬１７０４（例えば、核酸アセンブリ用、細胞をエレクトロコンピテントにするための核酸精製用など）、及び細胞１７０６を移送する。
【０２８０】
図１７Ａに関連して説明したように、いくつかの実装形態では、機器１７４０は、図１８の処理システム１８１０などの処理システム１７２０によって制御される。
機器１７４０は、いくつかの実施形態では、核酸アセンブリモジュール１７１０ｇを含み、特定の例示的な自動化マルチモジュール細胞編集機器では、核酸アセンブリモジュール１７１０ｇは、いくつかの実施形態では核酸アセンブリを実行し得る。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、核酸のアセンブリ後、核酸（例えば、核酸アセンブリの例では、核酸アセンブリミックス（核酸＋核酸アセンブリ試薬））は精製モジュール１７１０ｈに移される。ここで、核酸アセンブリ混合物の不要な成分（例えば、塩）が除去され、特定の実施形態では、アセンブリされた核酸が濃縮される。例えば、例示的な実施形態では、精製モジュール１７１０ｈにおいて、核酸アセンブリ混合物を、無塩バッファー及び固相可逆固定法（ＳＰＲＩ）磁気ビーズ又はＡＭＰｕｒｅ（商標）ビーズなどの磁気ビーズと組み合わせることができる。核酸アセンブリ混合物は、アセンブリされた核酸が磁気ビーズに結合するのに十分な時間（例えば、３０秒〜１０分）インキュベートされてもよい。いくつかの実施形態では、精製モジュールは、磁気ビーズを引きつけるように構成された磁石を含む。磁石は、結合したアセンブリされた核酸から上清を除去し、結合したアセンブリされた核酸を例えば８０％エタノールで洗浄できるように引きつけさせることができる。再び、磁石を引きつけさせて、８０％エタノール洗浄液を除去することができる。磁気ビーズ／アセンブリされた核酸を乾燥させてから、アセンブリされた核酸を溶出させ、磁石を再び引きつけさせて、今度はビーズを捕捉し、溶出されたアセンブリされた核酸を含む上清を除去する。次いで、アセンブリさた核酸は、形質転換モジュール（例えば、好ましい実施形態ではエレクトロポレーター）に移され得る。移送の際に、形質転換モジュールはエレクトロコンピテントセルを既に含む場合がある。
【０２８２】
機器１７４０は、図１７Ａに関連して説明したように、細胞１７０６に核酸を導入するためのＦＴＥＰデバイス１７１０ｃを含む。しかしながら、この状況では、精製モジュール１７１０ｈから出力されたアセンブリされた核酸１７０４は、細胞１７０６と合わせるためにＦＴＥＰデバイス１７１０ｃに移される。
【０２８３】
ＦＴＥＰデバイス１７１０ｃでの形質転換に続いて、いくつかの実装形態では、細胞は回復モジュール１７１０ｍに移され得る。回復モジュール１７１０ｅでは、細胞を回復させ、外因性核酸を発現させ、細胞にエレクトロポレーションし、誘導システムにおいて、例えば一時的に制御された誘導（いくつかの例では、化学、光、ウイルス、又は温度による誘導、又は編集コンポーネントの発現のための誘導分子の導入）により、ヌクレアーゼ、又はガイド核酸などの他の編集コンポーネントを誘導する。
【０２８４】
回復に続いて、いくつかの実装形態では、細胞は編集モジュール１７１０ｆに移される。編集モジュール１７１０ｆは、例えば、導入された核酸の発現及び誘導性ヌクレアーゼ又はガイド核酸の誘導を通じて、細胞のゲノムの編集を誘導するための適切な条件を提供する。編集コンポーネントは、いくつかの例では、編集モジュール１７１０ｆ内で化学的誘導、生物学的誘導（例えば、誘導性プロモーターを介して）、ウイルスによる誘導、光による誘導、温度による誘導、及び／又は熱による誘導がなされ得る。
【０２８５】
編集に続いて、いくつかの実装形態では、図１７Ａに関して説明したように、細胞は保管ユニット１７１４に移される。
いくつかの実装形態では、機器１７４０は再帰的ゲノム編集用に設計されており、複数の編集が細胞集団内の細胞のゲノムに順次導入される。いくつかの実装形態では、再帰的処理のために保管ユニットから細胞出力１７１２にアクセスする前に、試薬供給部１７０４が補充される。例えば、追加のベクター骨格１７４２及び／又は編集オリゴ１７４４は、核酸アセンブリモジュール１７１０ｇ及び精製モジュール１７１０ｈを介してアセンブリ及び調製のために機器１７４０に導入され得る。他の実装形態では、複数のベクター骨格ボリューム１７４２及び／又は編集オリゴ１７４４を機器１７００に導入して、後続の処理サイクルの前にユーザとのやり取りが必ずしも必要とされないようにすることができる。後続の各サイクルでは、ベクター骨格１７４２及び／又は編集オリゴ１７４４が変更される場合がある。核酸アセンブリの調製時に、核酸アセンブリを試薬供給部１７０４又は別の保管領域に提供してもよい。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、図１７Ａに関連して説明したように、細胞出力１７１２ａの一部が自動細胞成長モジュール１７１０ａに移される。
ゲノム編集を受けていない細胞のバックグラウンドを減らすために、いくつかの実施形態では、成長モジュール１７１０ａは、図１７Ａに関連して説明したように、選択成長培地１７２６を使用して編集された細胞を濃縮する選択プロセスを実行する。
【０２８７】
図１７Ａに関して説明したように、細胞は成長モジュール１７１０ａから濾過モジュール１７１０ｂに移されてもよい。図示されるように、溶出供給部１７４６からの溶出液（例えば、緩衝液、グリセロール）は、培地交換のために濾過モジュール１７１０ｂに移され得る。
【０２８８】
濾過後、細胞は、上記で詳述したように、形質転換のためにＦＴＥＰデバイス１７１０ｃに、次に回復モジュール１７１０ｍに、そして編集モジュール１７１０ｆに、最後に保管ユニット１７１４に移され得る。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、図１７Ａ及び／又は１７Ｂの自動化マルチモジュール細胞編集機器は、図１Ａ及び図１Ｂに関連して説明したように、１つ以上の交換可能な供給カートリッジ及びロボットハンドリングシステムを含む。各カートリッジは、核酸アセンブリミックス、オリゴヌクレオチド、ベクター、成長培地、選択剤（例えば抗生物質）、誘導剤、固相可逆固定法（ＳＰＲＩ）ビーズなどの核酸精製試薬、エタノール、及び１０％グリセロールのうちの１つ以上を含むことができる。
【０２９０】
例示的な機器１７００、１７４０が、モジュール１７１０の特定の配置を含むものとして示されているが、これらの配置は例示目的のみのためである。例えば、他の実施形態では、より多い又はより少ないモジュール１７１０を各機器１７００、１７４０に含めることができる。また、例えばハイブリドーマを提供するための細胞融合を促進するモジュール、アセンブリ前に核酸を増幅するモジュール、及び／又はタンパク質発現及び／又は分泌を促進するモジュールなど、異なるモジュールを機器に含めることができる。さらに、特定の実施形態では、特定のモジュール１７１０を、図１Ａの一対の細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂなどのように複数設けてもよい。別の例では、機器１７００及び１７４０のそれぞれは、図１Ａのカートリッジ１０４及び１０６などの培地カートリッジを受け入れるように設計されてもよい。さらなる変更も可能である。
【０２９１】
自動化マルチモジュール細胞編集機器の制御システム
図１６に移って、スクリーンショットは、自動化マルチモジュール細胞編集機器とやり取りするための例示的なグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）１６００を示している。インターフェースは、例えば、図２Ｃ及び図２Ｄのディスプレイ２３６上に提示されてもよい。一例では、ＧＵＩ１６００は、図１８の処理システム１８１０によってタッチスクリーン１８１６上に提示されてもよい。
【０２９２】
いくつかの実装形態では、ＧＵＩ１６００は、プロトコルペイン１６０２、温度ペイン１６０６、エレクトロポレーションペイン１６０８、及び細胞成長ペイン１６１０などの複数の情報及びデータ入力ペインに分割される。さらなるペインが可能である。例えば、いくつかの実施形態では、ＧＵＩ１６００は、各モジュールのためのペイン、例えばいくつかの例では、核酸アセンブリモジュール、精製モジュール、細胞成長モジュール、濾過モジュール、形質転換モジュール、編集モジュール、及び回復モジュールのそれぞれの１つ以上のためのペインを含む。いくつかの実施形態では、ＧＵＩ１６００の下側のペインは、現在の（例えば、プロトコルペイン１６０２で選択される、又はスクリプトインターフェース（図示略）を通じてロードされるスクリプト内で指定される）ワークフローに適用可能なモジュールを表す。いくつかの実施形態では、スクロール又はページング機能により、ユーザが図１６のスクリーンショット内に示されていない追加のペインにアクセスすることを可能にしてもよい。
【０２９３】
ＧＵＩ１６００は、いくつかの実施形態では、図示されたスクリーンショットなどの様々な画面にアクセスするための一連の制御部１６２０を含む（例えば、ホームコントロール１６２０ａを使用することにより）。例えば、編集コントロール１６２０ｂを選択することにより、ユーザに１つ、２つ、又は一連の細胞編集ステップを提供するためのオプションが提供される。スクリプトコントロール１６２０ｃを選択することにより、ユーザに新しい編集スクリプトを追加し、又は既存の編集スクリプトを変更する機会が提供される。いくつかの実施形態では、ユーザは、ヘルプコントロール１６２０ｄを選択して、ＧＵＩ１６００及び自動化マルチモジュール細胞編集機器の機能に関するさらなる情報を取得することができる。いくつかの実装形態では、ユーザは設定コントロール１６２０ｅを選択して、いくつかの例では、時間帯、言語、単位、ネットワークアクセスオプションなど、所望のプロセス及び／又はＧＵＩ１６００の設定オプションにアクセスする。電源コントロール１６２０ｆを選択すると、ユーザは自動化マルチモジュール細胞編集機器の電源を切ることができる。
【０２９４】
プロトコルペイン１６０２に移って、いくつかの実装形態では、ユーザは、プロトコル入力フィールド１６１２にプロトコルを入力すること（又は、代替としてドロップダウンメニュー）により、自動化マルチモジュール細胞編集機器による実行のためのプロトコル（例えば、スクリプト又はワークフロー）を選択する。他の実施形態では、プロトコルは、例えばスクリプトコントロール１６２０ｂを選択することによりアクセスされる別個のユーザインターフェース画面を通じて選択されてもよい。別の例では、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、プロトコルを選択し、それをプロトコル入力フィールド１６１２に提示してもよい。例えば、自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理システムは、自動化マルチモジュール細胞編集機器に装填された１つ以上のカートリッジ上に配置された機械可読表示をスキャンして適切なプロトコルを決定してもよい。図示されるように、「微生物＿キット１（１．０．２）」プロトコルが選択されている。これは、自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するために購入したカートリッジ及びその他の使い捨て消耗品のキットに対応し得る。
【０２９５】
いくつかの実装形態では、プロトコルペイン１６０２は、プロトコル入力フィールド１６１２に提示されたプロトコルの実行を制御するための開始コントロール１６１４ａ及び停止コントロール１６１４ｂをさらに含む。ＧＵＩ１６００はタッチスクリーンインターフェース上に提供されてもよく、例えば、そこで開始コントロール１６１４ａのタッチ選択により細胞処理を開始し、停止コントロール１６１４ｂの選択により細胞処理を停止してもよい。
【０２９６】
実施状況スペイン１６０４に移って、いくつかの実装形態では、チャート１６１６は、プロトコルペイン１６０２で特定されたプロトコルの処理の段階を示す。例えば、実施完了１６１８ａの部分は青で示され、現在の段階１６１８ｂの部分は緑で示され、エラー１６１８ｃには、エラーが発生した時点から実施完了１６１８ａの部分の経過に沿って伸びるマーカーでフラグが付けられる。メッセージ領域１６１８ｄは、実施が完了した割合、完了した段階の割合、及びエラーの総数を示す。いくつかの実施形態では、チャート１６１６の選択時に、ユーザに実施状況に関するより詳細な情報、例えばいくつかの例では、エラーのタイプの特定、現在の処理段階の名前（例えば、核酸アセンブリ、精製、細胞成長、濾過、形質転換、回復、編集など）、及び実施中の処理段階のリストが提示されてもよい。さらに、いくつかの実施形態では、実施完了時間メッセージは、実施が完了すると推定される日時を示す。実施は、いくつかの例では、ユーザの介入なしに実行するようにスケジュールされた単一の細胞編集プロセス、又は一連の再帰的な細胞編集プロセスを示す場合がある。いくつかの実施形態（図示略）では、実施状況ペイン１６０４は、ユーザの介入が必要となる推定時間（例えば、カートリッジ交換、固形廃棄物の廃棄、液体廃棄物の廃棄など）をさらに示す。
【０２９７】
いくつかの実装形態では、実施状況ペイン１６０４は細胞処理を一時停止するための一時停止コントロール１６２４を含む。ユーザは、例えば、特定されたエラーを修正するため、又は廃棄物除去などの手動介入を行うために、現在の実施の一時停止を選択することができる。
【０２９８】
温度ペイン１６０６は、いくつかの実施形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器の様々な装置の温度設定を示す対応するメッセージ１６２８と共に一連のアイコン１１２６を示す。アイコンは、左から右に、ＦＴＥＰモジュール１６２６ａ（例えば、図１Ａの試薬カートリッジ１１０ｃに関連付けられたＦＴＥＰデバイス）、精製モジュール１６２６ｂ、第１の成長モジュール１６２６ｃ、第２の成長モジュール１６２６ｄ、及び濾過モジュール１６２６ｅを表し得る。対応するメッセージ１６２８ａ〜ｅは、対応するモジュールの現在の温度、低温、及び高温を特定する（例えば、現段階又は現実施について）。アイコン１６２６のうちの１つを選択する際に、いくつかの実施形態では、時間の温度のグラフィック表示を再確認することができる。
【０２９９】
いくつかの実装形態では、温度ペインの下で一連のペインが複数のモジュールの現在の状況を特定する。例えば、エレクトロポレーションペイン１６０８は、形質転換モジュールの状況を表し、細胞成長ペイン１６１０は、成長モジュールの状況を表す。いくつかの実施形態では、ここに提示されるペインは、現在動作中のモジュール（例えば、現在の段階での細胞処理に関与するモジュール）の状況、及び現在の実施において既に利用された任意のモジュールの状況を示す（図示のように、例えば、実施状況ペイン１６０４において）。例えば、過去の状況の情報は、細胞処理の先行する段階で使用されたパラメータに関する情報をユーザに提示し得る。
【０３００】
エレクトロポレーションペイン１６０８に移って、いくつかの実装形態では、ボルト、ミリアンペア、及びジュールの動作パラメータ１６３０ａが提示される。さらに、状況メッセージ１６３２ａは、いくつかの例では、エラー状況、処理の残り時間、又はモジュールの内容物（例えば、モジュールに追加された材料）などの、形質転換モジュールの機能に関する追加情報を特定してもよい。いくつかの実装形態では、対応するモジュールが処理の動作中であるとき、状況メッセージ１６３２ａの上のアイコン１６３４ａがアクティブモード（例えば、色付きで、明るく、太字で、等）で提示される。アイコン１６３４ａを選択すると、いくつかの実施形態では、動作パラメータ１６３０ａに関する詳細情報のグラフィック表示が提示される。
【０３０１】
細胞成長ペイン１６１０に移って、いくつかの実装形態では、ＯＤ及び成長時間の動作パラメータ１６３０ｂが提示される。さらに、状況メッセージ１６３２ｂは、いくつかの例では、エラー状況、処理の残り時間、又はモジュールの内容物（例えば、モジュールに追加された材料）などの、成長モジュールの機能に関する追加情報を特定してもよい。いくつかの実装形態では、対応するモジュールが処理の動作中であるとき、状況メッセージ１６３２ｂの上のアイコン１６３４ｂがアクティブモード（例えば、色付きで、明るく、太字で、等）で提示される。アイコン１６３４ｂを選択すると、いくつかの実施形態では、動作パラメータ１６３０ｂに関する詳細情報のグラフィック表示が提示される。
【０３０２】
次に、例示的な実施形態による例示的な処理システム及び処理環境のハードウェア記述を、図１８を参照して説明する。図１８では、処理システム１８１０は、上述したプロセスの一部を実行するＣＰＵ１８０８を含む。例えば、ＣＰＵ１８０８は、図１４の方法１４００及び／又は図１５Ａ〜Ｃのワークフローの処理段階を管理することができる。プロセスデータと、スクリプト、命令、及び／又はユーザ設定は、メモリ１８０２に保存されてもよい。これらのプロセスデータ及びスクリプト、命令、及び／又はユーザ設定は、ポータブルストレージメディアなど（例えば、ＵＳＢドライブ、光ディスクドライブなど）のストレージメディアディスク１８０４に保存することも、リモートで保存することもできる。例えば、プロセスデータ及びスクリプト、命令、及び／又はユーザ設定は、ネットワーク１８２８を介して処理システム１８１０にアクセス可能な場所に保存されてもよい。さらに、請求される進歩は、本発明のプロセスの命令が格納されるコンピュータ可読媒体の形態によって制限されない。例えば、命令は、フラッシュメモリ、ＲＡＭ、ＲＯＭ、又は処理システム１８１０が通信する他の情報処理デバイス、例えばサーバ、コンピュータ、スマートフォン、又は他の携帯用コンピューティングデバイスなどに格納されてもよい。
【０３０３】
さらに、主張される進歩の構成要素は、ユーティリティアプリケーション、バックグラウンドデーモン、又はオペレーティングシステムのコンポーネント、又はそれらの組合せとして提供され、ＣＰＵ１８０８及び当業者に知られている他のコンピューティングシステムなどのオペレーティングシステムと連動して実行される。
【０３０４】
ＣＰＵ１８０８は、ＡＲＭプロセッサ、システムオンチップ（ＳＯＣ）、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、デジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）であってもよく、又は当業者によって認識される他のプロセッサタイプであってもよい。さらに、ＣＰＵ１８０８は、上述した本発明のプロセスの命令を実行するために並行して協調して動作する複数のプロセッサとして実装されてもよい。
【０３０５】
処理システム１８１０は処理環境１８００の一部である。図１８の処理システム１８１０は、処理環境１８００内の追加の要素にアクセスするためにネットワーク１８２８とやり取りするためのネットワークコントローラ１８０６も含む。理解できるように、ネットワーク１８２８は、インターネットなどのパブリックネットワーク、又はＬＡＮ又はＷＡＮネットワークなどのプライベートネットワーク、又はそれらの任意の組合せとすることができ、ＰＳＴＮ又はＩＳＤＮサブネットワークも含むことができる。ネットワーク１８２８は、ＥＤＧＥ、３Ｇ及び４Ｇ無線セルラーシステムを含むセルラーネットワークなどの無線であり得る。ワイヤレスネットワークは、Ｗｉ−Ｆｉ、ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ（登録商標）、又はその他の既知のワイヤレス形式の通信とすることもできる。
【０３０６】
処理システム１８１０は、ユーザインターフェース（例えば、タッチスクリーン）１８１６、１つ以上のセンサ１８１４、及び１つ以上の周辺機器１８１８とやり取りする汎用Ｉ／Ｏインターフェース１８１２をさらに含む。周辺Ｉ／Ｏデバイス１８１８は、いくつかの例では、ビデオ記録システム、オーディオ記録システム、マイクロホン、外部記憶装置、及び／又は外部スピーカーシステムを含み得る。１つ以上のセンサ１８１４は、ジャイロスコープ、加速度計、重力センサ、線形加速度計、全地球測位システム、バーコードスキャナ、ＱＲコード（登録商標）スキャナ、ＲＦＩＤスキャナ、温度モニタ、及び照明システム又は照明要素のうちの１つ以上を含み得る。
【０３０７】
汎用ストレージコントローラ１８２４は、記憶媒体ディスク１８０４を、処理システムのすべてのコンポーネントを相互接続するためのパラレルバスやユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）といったシリアルバスなどの通信バス１８４０に接続する。ストレージコントローラ１８２４、ネットワークコントローラ１８０６、及び汎用Ｉ／Ｏインターフェース１８１２の一般的な特徴及び機能は知られているため、本明細書では簡潔にするために、これらの説明を省略する。
【０３０８】
処理システム１８１０は、いくつかの実施形態では、１つ以上の内蔵及び／又は周辺センサ１８１４を含む。例えば、センサ１８１４は、自動化マルチモジュール処理機器の内部電子機器及び／又はハウジングに直接組み込むことができる。センサ１８１４の一部は、例えばワイヤを介してＩ／Ｏインターフェース１８１２と直接物理的に接触し、又は、ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ（登録商標）、Ｗｉ−Ｆｉ又はＮＦＣ接続などにより無線接続することができる。例えば、無線通信コントローラ１８２６は、１つ以上の無線センサ１８１４とＩ／Ｏインターフェース１８１２との間の通信を可能にし得る。さらに、１つ以上のセンサ１８１４は、例えばネットワーク１８２８に基づく中間サーバ又は記憶装置を介して間接的に接触していてもよいし、又は、自動化マルチモジュール細胞編集機器内のどこかにある信号アキュムレータと（有線、無線、又は間接）接触し、これはＩ／Ｏインターフェース１８１２と（有線又は無線又は間接）接触していてもよい。
【０３０９】
Ｉ／Ｏインターフェース１８１２と通信する一群のセンサ１８１４を組み合わせて使用して、複数の場所から所与の信号タイプを収集し、信号のより完全なマップを生成することができる。Ｉ／Ｏインターフェース１８１２と通信する１つ以上のセンサ１８１４は、例えば他の信号をフィルタリング、キャンセル、又は拒否するためのコンパレータ又は検証要素として使用することができる。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、処理環境１８００は、無線通信コントローラ１８２６を介して処理システム１８１０と通信するコンピューティングデバイス１８３８を含む。例えば、無線通信コントローラ１８２６は、ユーザのスマートフォン又は他のパーソナルコンピューティングデバイスに対して指定された電子メールメッセージ、テキストメッセージ、及び／又はソフトウェアアプリケーションアラートの交換を可能にし得る。
【０３１１】
処理環境１８００は、いくつかの実装形態では、ロボットマテリアルハンドリングシステム１８２２を含む。処理システム１８１０は、ガントリーの位置の操作、シッパー又はピペッター要素の下降又は上昇、及び／又は自動化マルチモジュール細胞編集機器内でのポンプ及びバルブの駆動によるシッパー／ピペッターと様々な容器（例えば、チャンバ、バイアルなど）との間の液体移動など、ロボットマテリアルハンドリングシステムの要素を作動させる制御信号を発するためのロボットコントローラ１８２０を含み得る。ロボットコントローラ１８２０は、いくつかの例では、処理システム１８１０をロボットマテリアルハンドリングシステム１８２２とやり取りさせるためのハードウェアドライバ、ファームウェア要素、及び／又は１つ以上のアルゴリズム又はソフトウェアパッケージを含み得る。
【０３１２】
いくつかの実装形態では、処理環境１８１０は、１つ以上のモジュールインターフェース１８３２、例えばいくつかの例では、１つ以上のセンサインターフェース、電力制御インターフェース、バルブ及びポンプインターフェース、及び／又は自動化マルチモジュール処理システムの各モジュールの処理を起動及び制御するためのアクチュエータインターフェースを含む。例えば、モジュールインターフェース１８３２は、回転細胞成長デバイス１３５０（図８Ｃ及び８Ｄ）の駆動モータ用のアクチュエータインターフェース、及び回転成長バイアル１３００内の細胞成長の光学密度を感知する検出器ボード１３７２用のセンサインターフェースを含み得る。モジュールコントローラ１８３０は、いくつかの実施形態では、モジュールインターフェース１８３２とやり取りするように構成される。モジュールコントローラ１８３０は、１つ又は多くのコントローラを含むことができる（例えば、１つのモジュールに１つのコントローラであり得るが、いくつかのモジュールが１つのコントローラを共有してもよい）。モジュールコントローラ１８３０は、いくつかの例では、処理システム１８１０をモジュールインターフェース１８３２とやり取りさせるためのハードウェアドライバ、ファームウェア要素、及び／又は１つ以上のアルゴリズム又はソフトウェアパッケージを含み得る。
【０３１３】
処理環境１８１０は、いくつかの実装形態では、自動化マルチモジュール処理システムのハウジング内の気候条件を制御するための熱管理システム１８３６を含む。熱管理システム１８３６は、自動化マルチモジュール細胞編集機器の１つ以上のモジュール内の気候条件をさらに制御してもよい。処理システム１８１０は、いくつかの実施形態では、熱管理システム１８３６とやり取りするための温度コントローラ１８３４を含む。温度コントローラ１８３４は、いくつかの例では、処理システム１８１０を熱管理システム１８３６とやり取りさせるためのハードウェアドライバ、ファームウェア要素、及び／又は１つ以上のアルゴリズム又はソフトウェアパッケージを含み得る。
【０３１４】
自動編集方法、モジュール、機器、及びシステムを使用した細胞ライブラリの作成
一態様において、本開示は、本明細書でさらに詳細に説明するように、様々な編集戦略を用いて様々な細胞種において目的のＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現、レベル及び／又は活性を変化させる細胞のライブラリを作成するための自動編集方法、モジュール、機器、及び自動化マルチモジュール細胞編集機器を提供する。したがって、本開示は、本開示の自動編集方法、自動化マルチモジュール細胞編集機器によって作成された編集細胞ライブラリを包含することを意図している。これらの細胞ライブラリには、様々な生物の細胞での遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、挿入、欠失、単一ヌクレオチド編集、ショートタンデムリピート編集、フレームシフト、トリプレットコドン拡張などを含むがこれらに限定されない様々なターゲット編集がある。これらの編集は、ゲノムのコーディング領域又は非コーディング領域を対象とすることができ、合理的に設計されることが好ましい。
【０３１５】
他の態様では、本開示は、ＤＮＡ結合プロセスを変化させる細胞のライブラリを作成するための自動編集方法、自動化マルチモジュール細胞編集機器を提供する。例えば、細胞ライブラリは、ＤＮＡ結合部位に、選択された遺伝子の発現を調節する調節要素のＤＮＡ結合を妨害する編集を有する個々の細胞を含み得る。さらに、細胞ライブラリは、ヘテロクロマチン形成、スイッチクラス組換え及びＶＤＪ組換えなどの細胞プロセスに影響を与えるゲノムＤＮＡの編集を含み得る。
【０３１６】
特定の態様では、細胞ライブラリは、細胞集団内の個々の細胞の多重編集を使用して作成され、細胞集団内の複数の細胞は単一ラウンドの編集で編集される。つまり、細胞ライブラリの細胞内の複数の変更は単一の自動操作で生じる。単一の多重化自動操作で作成できるライブラリは、５００個の編集細胞、１０００個の編集細胞、２０００個の編集細胞、５０００個の編集細胞、１０，０００個の編集細胞、５０，０００個の編集細胞、１００，０００個の編集細胞、２００，０００個の編集細胞、３００，０００個の細胞、編集細胞、４００，０００個の編集細胞、５００，０００個の編集細胞、６００，０００個の編集細胞、７００，０００個の編集細胞、８００，０００個の編集細胞、９００，０００個の編集細胞、１，０００，０００個の編集細胞、２，０００，０００個の編集細胞、３，０００，０００個の編集細胞、４，０００，０００個の編集細胞、５，０００，０００個の編集細胞、６，０００，０００個の編集細胞、７，０００，０００個の編集細胞、８，０００，０００個の編集細胞、９，０００，０００個の編集細胞、１０，０００，０００個の編集細胞、又はそれ以上を含むことができる。
【０３１７】
他の特定の態様では、細胞ライブラリは、細胞集団内の個々の細胞の再帰的編集を使用して作成され、編集は２ラウンド以上の編集で個々の細胞に追加される。再帰的編集を使用すると、ライブラリの個々の細胞のゲノム内の２つ以上の部位を標的とする２つ以上の編集が統合される。自動再帰操作で作成できるライブラリは、５００個の編集細胞、１０００個の編集細胞、２０００個の編集細胞、５０００個の編集細胞、１０，０００個の編集細胞、５０，０００個の編集細胞、１００，０００個の編集細胞、２００，０００個の編集細胞、３００，０００個の編集細胞、４００，０００個の編集細胞、５００，０００個の編集細胞、６００，０００個の編集細胞、７００，０００個の編集細胞、８００，０００個の編集細胞、９００，０００個の編集細胞、１，０００，０００個の編集細胞、２，０００，０００個の編集細胞、３，０００，０００個の編集細胞、４，０００，０００個の編集細胞、５，０００，０００個の編集細胞、６，０００，０００個の編集細胞、７，０００，０００個の編集細胞、８，０００，０００個の編集細胞、９，０００，０００個の編集細胞、１０，０００，０００個の編集細胞、又はそれ以上を含み得る。
【０３１８】
本明細書に基づいて自動化されたシステムを利用するように変更することができる非自動化編集戦略の例は、例えば、米国特許第８，１１０，３６０号、第８，３３２，１６０号、第９，９８８，６２４号、第２０１７０３１６３５３号、及び第２０１２０２７７１２０号に見出すことができる。
【０３１９】
特定の態様では、最初に細胞表現型を作成するために再帰的編集を用いることができ、その後、表現型を逆にし、及び／又は他の細胞特性を促進するために複数ラウンドの編集を用いることができる。
【０３２０】
いくつかの態様において、細胞ライブラリは、細胞における非天然アミノ酸の作成のための編集を含む。
特定の態様では、本開示は、本開示の自動編集方法、自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用して作成された１つ以上の調節要素における編集を有する編集細胞ライブラリを提供する。「調節要素」という用語は、特定の環境及び／又は状況において作動可能に連結されたコーディング配列の転写及び／又は翻訳に影響を与えることができる核酸分子を指す。この用語は、転写、及びプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的な相互作用に必要なコア要素、上流要素、エンハンサー、及び応答要素を含むＲＮＡ安定性を促進又は調節するすべての要素を含むことを意図している（例えば、Ｌｅｗｉｎ，“Ｇｅｎｅｓ  Ｖ”（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード）８４７〜８７３頁を参照）。原核生物における例示的な調節要素には、プロモーター、オペレーター配列及びリボソーム結合部位が含まれるが、これらに限定されない。真核細胞で使用される調節要素には、プロモーター、エンハンサー、絶縁体、スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルが含まれるが、これらに限定されない。
【０３２１】
好ましくは、編集細胞ライブラリは、特定の細胞種におけるタンパク質構造、発現及び／又は活性の予測に基づいて設計された合理的に設計された編集を含む。例えば、合理的な設計は、ヌクレアーゼ発現及び／又は結合、成長条件、及びその他の実験条件を含む異なる編集パラメータがどのようにヌクレアーゼ編集のダイナミクスを集合的に制御するかを予測するために、特定のヌクレアーゼ及び遺伝子調節によるゲノム編集のシステム全体の生物物理学モデルに基づいていてもよい。例えば、Ｆａｒａｓａｔ  ａｎｄ  Ｓａｌｉｓ，ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．，２９：１２（１）：ｅ１００４７２４（２０１６）を参照。
【０３２２】
一態様では、本開示は、本発明の自動編集機器、システム及び方法を使用して作成された様々な合理的に設計された調節配列を有する編集細胞のライブラリの作成を提供する。例えば、編集細胞ライブラリは、構成的及び／又は誘導性プロモーター、エンハンサー配列、オペレーター配列及び／又はリボソーム結合部位のセットを使用して作成された原核細胞集団を含むことができる。別の例では、編集細胞ライブラリは、目的のタンパク質の発現のための構成的及び／又は誘導性プロモーター、エンハンサー配列、オペレーター配列、及び／又は様々なコザック配列のセットを使用して作成された真核生物配列を含むことができる。
【０３２３】
いくつかの態様では、本開示は、生物のゲノム全体にわたって対象配列の編集の１つ以上のクラスを含む合理的に設計された編集を有する細胞を含む細胞ライブラリを提供する。特定の態様では、本開示は、ゲノムのサブセットにわたって対象配列の編集の１つ以上のクラスを含む合理的に設計された編集を有する細胞を含む細胞ライブラリを提供する。例えば、細胞ライブラリは、エクソームにわたり、対象配列、例えば、ゲノムのすべての又はほとんどのオープンリーディングフレームの編集の１つ以上のクラスを含む合理的に設計された編集を有する細胞を含み得る。例えば、細胞ライブラリは、キノームにわたって対象配列の編集の１つ以上のクラスを含む合理的に設計された編集を有する細胞を含み得る。さらに別の例では、細胞ライブラリは、セクレトームにわたって対象配列の編集の１つ以上のクラスを含む合理的に設計された編集を有する細胞を含み得る。さらに他の態様では、細胞ライブラリは、エクソームにエンコードされたタンパク質の様々なアイソフォームを分析するために作成された合理的に設計された編集を有する細胞を含んでもよく、細胞ライブラリは、例えばトランスクリプトーム分析のために、１つ以上の特定のアイソフォームの発現を制御するように設計することができる。
【０３２４】
重要なことに、特定の態様において、細胞ライブラリは、ライブラリ内の個々の細胞における１つ以上のタンパク質の発現間の類似性を減らすために、ランダム化配列、例えばランダム化プロモーター配列を使用する編集を含み得る。さらに、細胞ライブラリ内のプロモーターは構成的、誘導的、又はその両方とすることができ、強力な及び／又は滴定可能な発現を可能にすることができる。
【０３２５】
他の態様において、本開示は、選択された遺伝子標的の最適な発現を識別するための編集を含む細胞のライブラリを作成するための自動編集方法、自動化マルチモジュール細胞編集機器を提供する。例えば、代謝工学による生化学物質の生産には多くの場合、経路酵素の発現が必要であり、最高の生産収率は、必ずしも細胞内の最大量の標的経路酵素によって達成されるわけではなく、むしろ、個々の酵素及び関連する調節タンパク質及び／又は経路の発現レベルの微調整によって達成される。同様に、異種タンパク質の発現レベルは、最適な収率のために実験的に調整できる場合がある。
【０３２６】
転写が遺伝子発現レベルに及ぼす最も明白な方法は、ＰｏｌＩＩの開始速度によるものであり、これはプロモーター又はエンハンサーの強度とトランス活性化因子との組合せによって調節することができる（Ｋａｄｏｎａｇａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１６（２）：２４７−５７（２００４））。真核生物では、伸長速度が選択的スプライシングに影響を与えることにより遺伝子発現パターンを決定することもある（Ｃｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９４（２１）：１１４５６−６０（１９９７））。遺伝子上で終結に失敗すると、ＰｏｌＩＩへのプロモーターのアクセシビリティが低下して、下流の遺伝子の発現が損なわれる可能性がある（Ｇｒｅｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９７（１５）：８４１５−２０（２０００））。転写干渉として知られるこのプロセスは、近接した遺伝子を有するものが多い下等真核生物に特に関係がある。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞遺伝子転写を最適化する方法を提供する。遺伝子転写は、転写開始（ＲＮＡｐの動員及び転写複合体の形成）、伸長（鎖合成／伸長）、及び転写終結（ＲＮＡｐの脱離及び終結）を含むいくつかの異なる生物学的現象の結果である。
【０３２８】
部位特異的突然変異誘発
細胞ライブラリは、部位特異的突然変異誘発を使用する自動編集方法、モジュール、機器、及びシステムを使用して作成することができる。つまり、タンパク質又は他のゲノム特徴のアミノ酸配列が、そのタンパク質又はゲノム特徴を変異させることにより、意図的かつ正確に変更される可能性がある場合である。これらの細胞株は、細胞内でのタンパク質機能の決定、細胞内の酵素活性部位の同定、及び新規タンパク質の設計などの様々な目的に役立つ。例えば、部位特異的突然変異誘発を多重化された様式で使用して、タンパク質の配列内の単一のアミノ酸を、異なる化学的性質を持つ別のアミノ酸に交換することができる。これにより、細胞集団内の個々の細胞における合理的に設計された、又はランダムに生成された突然変異の効果を判断できる。例えば、Ｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第６版（ニューヨーク：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（２００７）を参照。
【０３２９】
別の例では、細胞ライブラリ内の個々の細胞を編集して、タンパク質複合体内での相互作用のためのタンパク質結合部位の１つ以上のアミノ酸の置換、又は、補因子又はリガンドを収容できる酵素ポケット内の１つ以上のアミノの置換など、結合部位のアミノ酸を置換することができる。このクラスの編集では、タンパク質複合体内の他の補因子、リガンドなどとの相互作用を含む、１つ以上のタンパク質の特定の性質を測定するために、タンパク質に特定の操作を作成できる。
【０３３０】
さらに別の例では、発現定量的形質遺伝子座（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｉ：ｅＱＴＬ）を研究するために部位特異的突然変異誘発を使用して、細胞ライブラリ内の個々の細胞に対して様々な編集タイプを作成できる。ｅＱＴＬは、遺伝子発現表現型の遺伝的分散の一部を説明する遺伝子座である。本発明のライブラリは、ｅＱＴＬを評価し、実際の疾患状態に関連付けるのに有用であろう。
【０３３１】
特定の態様において、本開示の細胞ライブラリに導入される編集は、タンパク質の既知の又は予測される構造に基づいた合理的な設計を使用して作成され得る。例えば、Ｃｈｒｏｎｏｐｏｕｌｏｕ  ａｎｄ  Ｌａｂｒｏｕ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．；チャプター２６：ユニット２６．６（２０１１）を参照。そのような部位特異的突然変異誘発は、細胞集団内において１つ以上の部位特異的編集、好ましくは２つ以上の部位特異的編集（例えば、組合せ編集）をライブラリ内の個々の細胞に提供することができる。
【０３３２】
他の態様において、本開示の細胞ライブラリは、遺伝子のコード領域内のすべて又は実質的にすべてのコドンの部位特異的コドン突然変異「スキャニング」を使用して作成される。このようにして、特定のコドンの個々の編集を、遺伝子の１つ以上のコドンの特定の多型に基づいて、機能喪失又は機能獲得について調べることができる。これらのライブラリは、細胞又は細胞集団の特定の表現型のサイレントとなる又は原因となる遺伝的変化を特定するための強力なツールとなる。コドンの編集はランダムに生成されてもよいし、分析対象の遺伝子で特定されている既知の多型及び／又は突然変異に基づいて合理的に設計されてもよい。さらに、細胞内の単一の経路内の２つ以上の遺伝子に対してこれらの技術を使用すると、潜在的なタンパク質：タンパク質の相互作用又は細胞機能又は経路の冗長性を決定できる。
【０３３３】
例えば、アラニンスキャニングを使用して、特定のタンパク質の安定性又は機能に対する特定の残基の寄与を決定できる。例えば、Ｌｅｆｅｖｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ２５（２）：４４７−４４８（１９９７）を参照。アラニンは、他の多くのアミノ酸が持つ二次構造の選好を模擬することができる、かさばらず、化学的に不活性なメチル官能基を有するため、このコドンスキャニング技術でよく使用される。コドンスキャニングを使用して、特定の残基の側鎖が細胞の機能や活性に重要な役割を果たすか否かを判断することもできる。変異された残基のサイズの保存が必要な場合、バリンやロイシンなどの他のアミノ酸をコドンスキャニング細胞ライブラリの作成に使用できる場合がある。
【０３３４】
他の特定の態様では、酵素やホルモンなどのタンパク質の活性部位を決定し、細胞ライブラリにおけるこれらのタンパク質のうちの１つ以上の作用機構を解明するために、本発明の自動編集方法、自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用して細胞ライブラリを作成することができる。分子モデリング研究に関連付けられた部位特異的突然変異誘発を使用して、酵素の活性部位構造、及びその結果としての作用メカニズムを発見することができる。これらの細胞ライブラリの分析により、タンパク質複合体のサブユニット間に接触しているタンパク質の活性部位における特定のアミノ酸残基が、細胞内輸送及び様々な遺伝的背景におけるタンパク質の安定性／半減期に及ぼす役割を理解できる。
【０３３５】
飽和突然変異誘発
いくつかの態様では、本開示の自動編集方法及び自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用して作成された細胞ライブラリは、特定の遺伝子又は目的とする遺伝子の位置で、単一のコドン又はコドンのセットが、可能なすべてのアミノ酸を生成するようにランダム化された飽和突然変異誘発ライブラリであり得る。これらの細胞ライブラリは、例えば、有向進化などのバリアントを生成するのに特に役立つ。例えば、Ｃｈｉｃａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６（４）：３７８−３８４（２００５）；及びＳｈｉｖａｎｇｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３（１）：１９−２５（２００９）を参照。
【０３３６】
いくつかの態様において、異なる縮重コドンを含む編集を使用して、ライブラリの個々の細胞にアミノ酸のセットをコード化することができる。一部のアミノ酸は他のアミノ酸よりも多くのコドンによってコード化されているため、アミノ酸の正確な比率は等しくならない。特定の態様において、より制限された縮重コドンが使用される。「ＮＮＫ」及び「ＮＮＳ」には、２０すべてのアミノ酸をエンコードする利点があるが、それでも３％の確率で終止コドンをエンコードする。「ＮＤＴ」、「ＤＢＫ」などの代替コドンは終止コドンを完全に回避しつつ、すべての主要な生物物理学的タイプ（アニオン性、カチオン性、脂肪族疎水性、芳香族疎水性、親水性、小さい）を含むアミノ酸の最小セットをエンコードする。
【０３３７】
特定の態様では、非冗長飽和突然変異誘発において、特定の生物に最も一般的に使用されるコドンが飽和突然変異誘発編集プロセスで使用される。
プロモータースワップ及びラダー
１つ以上の目的の遺伝子の発現を分析及び／又は最適化するための１つのメカニズムは、「プロモータースワップ」細胞ライブラリの作成を介したものである。このライブラリでは、細胞は１つ以上の目的の遺伝子に結合した特定のプロモーターを有する遺伝子編集を含む。したがって、本開示の方法、自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用して作成された細胞ライブラリは、例えば、代謝又は遺伝経路を最適化するように目的の遺伝子の発現を増加又は減少させるために使用できるプロモータースワップ細胞ライブラリであり得る。いくつかの態様では、プロモータースワップ細胞ライブラリを使用して、細胞の活力又は生存率に影響する遺伝子、例えば細胞の成長速度又は細胞の全体的な健康に影響を与えるタンパク質をコードする遺伝子の発現の増加又は減少を特定することができる。いくつかの態様において、プロモータースワップ細胞ライブラリを使用して、合成遺伝子ネットワークを作成するためのプロモーター間に依存性及びロジックを有する細胞を作成することができる。いくつかの態様では、プロモータースワップを使用して、天然の同種及び異種（複合組織）集団の両方の細胞間の細胞対細胞のコミュニケーションを制御することができる。
【０３３８】
細胞ライブラリは、一連の発現強度及び任意の数の標的遺伝子の提示に基づいてグループ化された任意の数のプロモーターを利用することができる。プロモーター配列のラダーは、少なくとも１つの条件下で少なくとも１つの遺伝子座の発現を変化させる。次いで、このラダーは、本開示の自動化された編集方法、自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用して、生物内の遺伝子のグループに体系的に適用される。
【０３３９】
特定の態様において、本開示の自動編集プロセス、モジュール、及びシステムを使用して形成される細胞ライブラリは、他の点では同一の遺伝的背景にある目的の１つ以上の標的遺伝子に作動可能に連結された所与のプロモーターを代表する個々の細胞を含む。自動化されたシステムを利用するように変更することができる非自動化編集戦略の例は、例えば、米国特許第９，９８８，６２４号に見出すことができる。
【０３４０】
特定の態様において、プロモータースワップ細胞ライブラリは、目的の遺伝子の発現のための「プロモーターラダー」として作用する予め選択されたプロモーターのセットに作動可能に連結されるように標的遺伝子のセットを編集することにより作製される。例えば、目的の１つ以上の個々の遺伝子が編集されて、プロモーターラダー内の異なるプロモーターと作動可能に連結されるように、細胞が編集される。内因性プロモーターが存在しないか、その配列が不明であるか、又は以前に何らかの方法で変更されている場合、プロモーターラダーの個々のプロモーターを目的の遺伝子の手前に挿入することができる。これらの生産された細胞ライブラリは、他の点では同一の遺伝的背景にある１つ以上の標的遺伝子に作動可能に連結されたラダーの個々のプロモーターを持つ個々の細胞を有する。
【０３４１】
プロモーターは、一般に、異なる遺伝子座にわたって可変発現をもたらすように選択され、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又はその両方を含み得る。
プロモーターラダーを使用して編集された標的遺伝子のセットは、ゲノム内のすべて又はほとんどのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又はゲノムの選択されたサブセット、例えば、キノーム又はセクレトームのＯＲＦを含むことができる。いくつかの態様では、標的遺伝子は遺伝子の様々なアイソフォームのコード領域を含むことができ、細胞ライブラリは、例えば様々なプロモーターを使用したトランスクリプトーム分析のために、１つ以上の特定のアイソフォームの発現用に設計することができる。
【０３４２】
標的遺伝子のセットは、特定の細胞経路に、例えば調節経路又はシグナル伝達経路に関与することが知られているか疑われる遺伝子とすることもできる。標的遺伝子のセットは、以前に実証された有益な編集（以前のプロモータースワップ又は以前のＳＮＰスワップ）との関連により、以前に生成された編集間のエピスタティックな相互作用に基づくアルゴリズム選択により、標的に対する有益なＯＲＦに関する仮説に基づく他の選択基準により、又はランダム選択により、機能に関連するＯＲＦとすることができる。特定の実施形態では、標的遺伝子は、ノンコーディングＲＮＡを含む非タンパク質コード遺伝子を含むことができる。
【０３４３】
インシュレーター要素及び他のゲノム構成要素を含む他の機能的遺伝要素の編集も、標的遺伝子のセットの発現レベルを体系的に変更するために使用でき、本開示の方法、自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用して導入することができる。一態様において、細胞の集団は、エンハンサー配列のラダーを単独で、又は選択されたプロモーター又はプロモーターラダーと組み合わせて使用して編集され、これらのエンハンサー要素に様々な編集を有する細胞ライブラリを作成する。別の態様において、細胞の集団は、単独で、又は選択されたプロモーター又はプロモーターラダーと組み合わせて、リボソーム結合配列のラダーを使用して編集され、これらのリボソーム結合配列に様々な編集を有する細胞ライブラリを作成する。
【０３４４】
別の態様では、細胞の集団を編集することにより、転写物又はタンパク質の５’又は３’末端、又は他の任意の位置への、様々なｍＲＮＡ及び／又はタンパク質安定化又は不安定化配列の付着が可能になる。
【０３４５】
特定の態様では、以前に確立された細胞株の細胞集団を、本開示の自動編集方法、モジュール、機器、及びシステムを使用して編集して、細胞の機能、健康、及び／又は生存率を改善する細胞ライブラリを作成することができる。例えば、現在大規模製造に使用されている多くの産業株は、長年、時には数十年にわたってランダム突然変異誘発プロセスを繰り返し使用することで開発されてきた。望ましくない中立及び有害な変異が有益な変化とともに株に導入され、時間が経つにつれて、全体的な安定性及び成長率などの重要な特性に欠陥のある株を生じた。別の例では、哺乳類細胞株は長期間にわたり細胞の継代を通じて変異し続け、同様にこれらの細胞株は不安定になり、望ましくない形質を獲得する可能性がある。本開示の自動編集方法、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、細胞の望ましい特性を維持しながら、欠陥に対処するために、ＳＮＰ及び／又はＳＴＲスワッピング、インデル作成、又はその他の手法などの編集戦略を使用して、望ましくないゲノム配列を削除又は変更し、及び／又は新しいゲノム配列を導入することができる。
【０３４６】
再帰的編集が使用される場合、編集細胞ライブラリ内の個々の細胞の編集は、ゲノムの異所性部位（例えば、ＣａｒＴ遺伝子座）に「ランディングパッド」を含めることで、発現、安定性、及び／又は制御を最適化できる。
【０３４７】
いくつかの実施形態において、１つ以上の編集（導入であれ除去であれ）を含む個々の細胞を有する作成された各ライブラリは、１つ以上の基準の下で培養及び分析される（例えば、目的の化学物質又は製品の生産）。特定の基準を有する細胞は、次いで細胞内の１つ以上の特定の編集に関連付けられる。このようにして、任意の数の目的とする遺伝的又は表現型の特性に対する所定の編集の効果を決定することができる。特定の基準又は強化された機能／安定性に関連する複数の編集の特定は、非常に望ましい特性を持つ細胞につながる可能性がある。
【０３４８】
ノックアウト又はノックインライブラリ
特定の態様において、本開示は、目的とする様々な遺伝子の「ノックアウト」（ＫＯ）又は「ノックイン」（ＫＩ）編集を有する細胞のライブラリを作成するための自動編集方法、モジュール、機器及びシステムを提供する。したがって、本開示は、本開示の自動編集方法、自動化マルチモジュール細胞編集機器によって作成された編集細胞ライブラリであって、目的とする選択された遺伝子の発現を除去又は低減する１つ以上の変異を有し、細胞ライブラリ内の個々の細胞の遺伝子機能に関するこれらの編集の効果を調べるための編集細胞ライブラリを包含することを意図している。
【０３４９】
細胞ライブラリは、標的遺伝子ＫＯ（例えば、挿入／欠失による）又は複数のＫＯ（例えば、相同性指向修復による）を使用して作成することができる。例えば、二本鎖切断は、非相同末端結合ＤＮＡ修復経路を介して修復されることがよくある。修復はエラーを起こしやすいことが知られているため、遺伝子機能を破壊する可能性のある挿入や欠失が導入され得る。好ましくは、編集は、目的の遺伝子に特異的に影響するように合理的に設計され、１つ以上の目的の遺伝子座のＫＩ又はＫＩを有する個々の細胞を作成することができる。２つ以上の目的の遺伝子座のＫＯ又はＫＩを有する細胞は、本開示の自動再帰的編集を使用して作成され得る。
【０３５０】
特定の態様では、ＫＯ又はＫＩ細胞ライブラリは、細胞集団内の細胞の同時多重編集を使用して作成され、細胞集団内の複数の細胞は、単一ラウンドの編集で編集される。つまり、細胞ライブラリの細胞内の複数の変更は単一の自動操作で生じる。他の特定の態様では、細胞ライブラリは、細胞集団内の個々の細胞の再帰的編集を使用して作成され、ゲノム内の２つ以上の部位の複数の編集が単一の細胞に統合される。
【０３５１】
ＳＮＰ又はショートタンデムリピートスワップ
一態様では、細胞ライブラリは、本開示の自動編集方法、自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用して、個々の細胞のゲノムに一塩基多型（「ＳＮＰ」）を体系的に導入又は置換して「ＳＮＰスワップ」細胞ライブラリを作成することにより作成される。いくつかの実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、有益なＳＮＰの追加、ならびに有害な及び／又は中立のＳＮＰの除去の両方を含む。ＳＮＰスワップは、コーディング配列、ノンコーディング配列、又はそれらの両方を標的とすることができる。
【０３５２】
別の態様では、細胞ライブラリは、本開示の自動編集方法、モジュール、機器、機器、及びシステムを使用して、個々の細胞のゲノムにショートタンデムリピート（「ＳＴＲ」）を体系的に導入又は置換して「ＳＴＲスワップ」細胞ライブラリを作成することにより作成される。いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＲスワッピング方法は、有益なＳＴＲの追加、ならびに有害な及び／又は中立のＳＴＲの除去の両方を含む。ＳＴＲスワップは、コーディング配列、ノンコーディング配列、又はそれらの両方を標的とすることができる。
【０３５３】
いくつかの実施形態では、細胞ライブラリを作成するために使用されるＳＮＰ及び／又はＳＴＲスワッピングが多重化され、細胞集団内の複数の細胞が単一ラウンドの編集で編集される。つまり、細胞ライブラリの細胞内の複数の変更は単一の自動操作で生じる。他の実施形態では、細胞ライブラリを作成するために使用されるＳＮＰ及び／又はＳＴＲスワッピングは再帰的であり、統合された複数の有益な配列及び／又は有害な配列の除去が単一細胞にもたらされる。複数の変更は、定義された変更の特定のセット、又は突然変異の部分的にランダム化された組合せライブラリのいずれでもあり得る。有害な突然変異の除去及び有益な突然変異の統合は、様々な細胞プロセスを即座に改善することができる。遺伝的負担の除去又は有益な変化の遺伝的負担のない株への統合も、さらなる改善を可能にし得る追加のランダム突然変異誘発の新しい強力な出発点を提供する。
【０３５４】
ＳＮＰスワッピングは、ランダムアプローチではなく、細胞全体の個々の変異の体系的な導入又は除去であるため、ランダム突然変異誘発アプローチの基本的な制限を克服する。
【０３５５】
スプライス部位の編集
ＲＮＡスプライシングは、イントロンが切除され、エキソンがスプライシングされてタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡが生成されるプロセスである。細胞の機構によるスプライシングシグナルの正確な認識は、このプロセスにとって重要である。したがって、いくつかの態様において、様々な遺伝子座のスプライス部位変異体のライブラリを作成するために、細胞の集団は、様々な遺伝子座の既知の及び／又は予測されたスプライスドナー及び／又はアクセプター部位に対する体系的な編集を使用して編集される。このような編集は、細胞の状況における遺伝子の様々なアイソフォームの生物学的関連性を解明するのに役立つ。Ｎａｌｌａ  ａｎｄ  Ｒｏｇａｎ，Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ，２５：３３４−３４２（２００５）；Ｄｉｖｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，１７：７５９−７６５（２００９）；Ｄｅｓｍｅｔ，ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３７：ｅ６７（２００９）；Ｆａｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１２（ｓｕｐｐｌ４）：Ｓ２（２０１１）に見られるような分析技術を使用して、様々な哺乳類の疾患に関連する実際の又は予測される突然変異を含む、様々なコーディング領域のスプライシング部位の合理的な設計のための配列を予測することができる。
【０３５６】
開始／終止コドン交換及び核酸アナログの取り込み
いくつかの態様では、本開示は、本開示の自動編集方法、モジュール、機器及びシステムを使用した細胞ライブラリの作成を提供し、このライブラリは、生物のゲノム全体又はゲノム内のコーディング領域の選択されたサブセット、例えば、キノーム又はセクレトームについて、開始及び終止コドンバリアントをスワッピングすることにより作成される。細胞ライブラリでは、個々の細胞は、目的とする１つ以上の遺伝子の天然の開始又は終止コドンを置き換える１つ以上の開始又は終止コドンを有するであろう。
【０３５７】
例えば、真核生物が使用する典型的な開始コドンはＡＴＧ（ＡＵＧ）であり、原核生物はＡＴＧ（ＡＵＧ）を最も多く使用し、ＧＴＧ（ＧＵＧ）及びＴＴＧ（ＵＵＧ）がそれに続く。細胞ライブラリは、目的とする１つ以上の遺伝子の天然の開始コドンの置換を有する個々の細胞を含んでもよい。
【０３５８】
いくつかの態様では、本開示は、目的とする選択された遺伝子の手前でＡＴＧ開始コドンをＴＴＧで置き換えることにより、細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＡＴＧ開始コドンをＧＴＧで置き換えることにより、細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＧＴＧ開始コドンをＡＴＧで置き換えることにより、細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＧＴＧ開始コドンをＴＴＧで置き換えることにより、細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＴＴＧ開始コドンをＡＴＧで置き換えることにより、細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＴＴＧ開始コドンをＧＴＧで置き換えることにより、細胞ライブラリの自動作成を提供する。
【０３５９】
他の例では、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び哺乳類の典型的な終止コドンは、それぞれＴＡＡ（ＵＡＡ）及びＴＧＡ（ＵＧＡ）である。単子葉植物の典型的な終止コドンはＴＧＡ（ＵＧＡ）であるが、昆虫及び大腸菌は一般に終止コドンとしてＴＡＡ（ＵＡＡ）を使用する（Ｄａｌｐｈｉｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４：２１６−２１８（１９９６））。細胞ライブラリは、目的とする１つ以上の遺伝子の天然の終止コドンの置換を有する個々の細胞を含んでもよい。
【０３６０】
いくつかの態様では、本開示は、ＴＡＡ終止コドンをＴＡＧで置き換えることにより、細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＴＡＡ終止コドンをＴＧＡで置き換えることにより、細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＴＧＡ終止コドンをＴＡＡで置き換えることにより、細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＴＧＡ終止コドンをＴＡＧで置き換えることにより、細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＴＡＧ終止コドンをＴＡＡで置き換えることにより、細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本発明は、ＴＡＧ終止コドンをＴＧＡで置き換えることにより、細胞ライブラリの自動作成を教示する。
【０３６１】
ターミネーターのスワップ及びラダー
目的の１つ以上の遺伝子のプレスプライシングされたｍＲＮＡの最適な終結を特定するための１つのメカニズムは、「ターミネータースワップ」細胞ライブラリの作成を介するものである。ここでは、細胞は１つ以上の目的の遺伝子に連結された特定のターミネーター配列を有する遺伝子編集を含む。したがって、本開示の方法、モジュール、機器及びシステムを使用して作成された細胞ライブラリは、例えば、合成部位から転写産物を放出することによりｍＲＮＡ安定性に影響を与えるために使用できるターミネータースワップ細胞ライブラリであり得る。他の実施形態では、ターミネータースワップ細胞ライブラリを使用して、転写終結の効率の上昇又は低下、ひいてはスプライシングされていないプレｍＲＮＡの蓄積（例えば、Ｗｅｓｔ  ａｎｄ  Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．；３３（３−９）；３５４−３６４（２００９））及び／又は３’末端プロセシング（例えば、Ｗｅｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２９（５）：６００−１０（２００８））を特定することができる。遺伝子が複数のターミネーション部位に連結されている場合、編集は、遺伝子に関連付けられている複数のターミネーターに対する編集の組合せを編集できる。追加のアミノ酸をタンパク質の末端に追加して、ターミネーターのタンパク質長への影響を判断することもできる。
【０３６２】
細胞ライブラリは、標的遺伝子の一連の活性及び任意の数の提示に基づいてターミネーターラダー用に選択されたターミネーターの任意の数の編集を利用できる。ターミネーター配列のラダーは、少なくとも１つの条件下で少なくとも１つの遺伝子座の発現を変化させる。次いで、このラダーは、本開示の自動編集方法、モジュール、機器、及びシステムを使用して、生物の遺伝子のグループに体系的に適用される。
【０３６３】
いくつかの態様では、本開示は、本開示の自動編集方法、モジュール、機器、及びシステムを使用した細胞ライブラリの作成を提供し、ライブラリは、ライブラリの個々の細胞のゲノムの１つ以上の領域のターミネーターシグナルを編集するために作成される。真核生物の転写終結は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに関連するタンパク質因子によって認識されるターミネーターシグナルを介して作動する。例えば、細胞ライブラリには、ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）及び切断刺激因子（ＣｓｔＦ）をコードする遺伝子、及び／又はＣＰＳＦ及びＣｓｔＦ因子によって終結部位にリクルートされるタンパク質をコードする遺伝子を編集した個々の真核細胞が含まれ得る。原核生物では、Ｒｈｏ非依存性終結及びＲｈｏ依存性終結と呼ばれる２つの主要なメカニズムが転写終結を媒介する。例えば、細胞ライブラリは、これらの終結経路の結合、効率、及び／又は活性に影響を与えるタンパク質をコードする遺伝子が編集された個々の原核細胞を含んでもよい。
【０３６４】
特定の態様において、本開示は、最適な特性を有する終結配列（「ターミネーター」）を選択する方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本開示は、宿主細胞内で１つ以上のターミネーターを導入及び／又は編集し、及び／又は１つ以上のターミネーターのバリアントを生成して、広範囲の活性を提示する方法を提供する。ターミネーターの特定の組合せは、ターミネーターラダーとしてグループ化することができ、本開示の細胞ライブラリは、他の点では同一の遺伝的背景にある目的の１つ以上の標的遺伝子に作動可能に連結されたターミネーターを代表する個々の細胞を含む。自動化された機器を利用するように変更することができる非自動化編集戦略の例は、例えば、Ｓｅｒｂｅｒらの「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｔｒａｉｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ａ  ＨＴＰ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ」と題された米国特許第９，９８８，６２４号に見出すことができる。
【０３６５】
特定の態様において、ターミネータースワップ細胞ライブラリは、目的遺伝子の発現のための「ターミネーターラダー」として作用するターミネーターの事前に選択されたセットに作動可能に連結される標的遺伝子のセットを編集することにより生成される。例えば、細胞は、内因性プロモーターが目的の個々の遺伝子に作動可能に連結されるように編集され、プロモーターラダー内の異なるプロモーターで編集される。内因性プロモーターが存在しないか、その配列が不明であるか、又は以前に何らかの方法で変更されている場合、プロモーターラダーの個々のプロモーターを目的の遺伝子の手前に挿入することができる。これらの生産された細胞ライブラリは、他の点では同一の遺伝的背景にある１つ以上の標的遺伝子に作動可能に連結されたラダーの個々のプロモーターを持つ個々の細胞を有する。対象のターミネーターラダーはその後、目的とする所与の遺伝子に関連付けられる。
【０３６６】
ターミネーターラダーは、ゲノム内のすべて又はほとんどのＯＲＦ、又はゲノムの選択されたサブセット、例えば、キノーム又はセクレトームのＯＲＦの終結に対し、より一般的に影響を与えるために用いることができる。標的遺伝子のセットは、特定の細胞経路に、例えば調節経路又はシグナル伝達経路に関与することが知られているか疑われる遺伝子とすることもできる。標的遺伝子のセットは、以前に実証された有益な編集（以前のプロモータースワップ又は以前のＳＮＰスワップ）との関連により、以前に生成された編集間のエピスタティックな相互作用に基づくアルゴリズム選択により、標的に対する有益なＯＲＦに関する仮説に基づく他の選択基準により、又はランダム選択により、機能に関連するＯＲＦとすることができる。特定の実施形態では、標的遺伝子は、ノンコーディングＲＮＡを含む非タンパク質コード遺伝子を含むことができる。
【０３６７】
実施例
以下の実施例は、当業者に本発明の実施及び使用の完全な開示及び説明を提供するために提示され、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図するものではない。また、以下の実験が実施されたすべての又は唯一の実験であることを表したり暗示したりすることも意図していない。広く記載された本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の態様に示されるように、本発明に対して多数の変形及び／又は変更を行うことができることを当業者は認識するであろう。したがって、本態様は、あらゆる点で例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。
【０３６８】
実施例１：エレクトロコンピテント大腸菌の産生及び形質転換。
図１０Ｂ〜１０Ｄ（ｖｉ）に示すように構成されたＦＴＥＰデバイスなどのＦＴＥＰデバイスの形質転換を試験するために、エレクトロコンピテント大腸菌細胞を作成した。スターター培養物を作成するために、６ｍｌのＬＢｃｈｌｏｒ−２５（２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ）を１４ｍｌ培養チューブに移した。大腸菌の２５μｌアリコートを使用して、ＬＢｃｈｌｏｒ−２５チューブに接種した。接種後、チューブを２５０ＲＰＭ及び３０℃に設定した振とうインキュベーター内に４５°の角度で置き、１２〜１６時間一晩成長させた。ＯＤ６００の値は２．０〜４．０である必要がある。１：１００接種量の２５０ｍｌのＬＢｃｈｌｏｒ−２５チューブを、４本の滅菌５００ｍｌバッフル付き振とうフラスコ（すなわち２５０ｍｌ容量の振とうフラスコあたり２．５ｍｌ）に移した。フラスコを２５０ＲＰＭ及び３０℃に設定された振とうインキュベーターに入れた。１〜２時間ごとにＯＤ６００を測定することにより、成長を監視した。培養物のＯＤ６００が０．５〜０．６（約３〜４時間）になったら、フラスコをインキュベーターから取り出した。細胞を４３００ＲＰＭ、１０分、４℃で遠心分離した。上清を除去し、氷冷した１０％グリセロール１００ｍｌを各試料に移した。細胞を穏やかに再懸濁し、洗浄手順を３回実施し、そのたびに細胞を１０％グリセロールに再懸濁した。４回目の遠心分離後、細胞の再懸濁物を５０ｍｌコニカルファルコンチューブに移し、氷冷した１０％グリセロールを追加して体積を３０ｍｌにした。細胞を再度４３００ＲＰＭ、１０分間、４℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを１０ｍｌの氷冷グリセロールに再懸濁した。細胞を、細胞懸濁液：氷冷グリセロールが１：１００の希釈液のアリコートに分けた。
【０３６９】
図１０Ｂ及び１０Ｃの（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｖｉ）、ならびに図１０Ｄの（ｉｉ）及び（ｖｉ）に示されるＦＴＥＰデバイスの実施形態を使用して比較エレクトロポレーション実験を実施し、エレクトロコンピテント大腸菌の形質転換の効率を決定した。流量は圧力制御システムで制御した。ＤＮＡを含む細胞の懸濁液をＦＴＥＰ入口リザーバに投入した。形質転換された細胞は、入口及び入口チャネルから直接、フローチャネルを通り、出口チャネルを通り、回復培地を含む出口へと流れた。細胞を追加の回復培地を含むチューブに移し、３０℃のインキュベーターシェーカーに入れ、２５０ｒｐｍで３時間振とうした。細胞をプレート播種して、エレクトロポレーションを生き延び、プラスミドを取り込まなかったコロニー形成単位（ＣＦＵ）及びエレクトロポレーションを生き延び、プラスミドを取り込んだＣＦＵを決定した。プレートは３０℃でインキュベートした。大腸菌コロニーを２４時間後に数えた。
【０３７０】
フロースルー型エレクトロポレーション実験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ高電圧エレクトロポレーター（ＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）ＥＬＥＰＯ２１）を使用して、２ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Ｂｕｌｌｄｏｇ  Ｂｉｏ、ニューハンプシャー州ポーツマス）に対してベンチマークされた。ＤＮＡを含む細胞懸濁液のストックチューブを準備し、ＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）及びフロースルー型エレクトロポレーションを使用したサイドトゥサイド実験に使用した。結果を図１９Ａに示す。図１９Ａにおいて、左端の／／／でハッチングされたバーは細胞入力を示し、左寄りの＼＼＼でハッチングされたバーは形質転換を生き延びた細胞の数を示し、右寄りの／／／でハッチングされたバーは実際に形質転換された細胞の数を示す。ＦＴＥＰデバイスは、ＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）エレクトロポレーターと比較して、様々な電圧でエレクトロコンピテント大腸菌細胞の同等の形質転換を示した。図から分かるように、形質転換生存率は少なくとも９０％であり、いくつかの実施形態では少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。回復率（形質転換及び回復に成功した導入細胞の割合）は、特定の実施形態では、少なくとも０．００１、好ましくは０．００００１〜０．０１である。図１９Ａでは、回復率は約０．０００１である。
【０３７１】
さらに、形質転換（取り込み）、切断、及び編集の効率に関してＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）ＥＬＥＰＯ２１とＦＴＥＰデバイスとの比較を行った。図１９Ｂにおいて、トリプリケートの実験を実施した。ここで、／／／でハッチングされたバーは形質転換のために入力された細胞数を示し、＼＼＼でハッチングされたバーは形質転換された（取り込みを行った）細胞数、細胞に形質転換されたベクターから転写及び翻訳されたヌクレアーゼによって細胞のゲノムが切断された細胞の数（切断）、及び編集が行われた細胞の数（細胞に形質転換されたベクターから転写及び翻訳されたヌクレアーゼを使用し、細胞に形質転換されたベクターから転写されたガイドＲＮＡ及びドナーＤＮＡ配列を使用した切断及び修復）を示す。加えて、非編集細胞株では、ＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）エレクトロポレーター及びＦＴＥＰの両方のコロニー数が同等の形質転換効率を示したことに留意されたい。さらに、ＦＴＥＰはＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）エレクトロポレーターと同等の形質転換、切断、編集効率を示したことが分かる。
【０３７２】
実施例２：エレクトロコンピテントＳ．セレビシエの産生及び形質転換
図１０Ｂ〜１０Ｄ（ｖｉ）に示すように構成されたＦＴＥＰデバイスなどのＦＴＥＰデバイスの形質転換をさらに試験するために、Ｓ．セレビシエ細胞を、Ｂｅｒｇｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，５２９：３１１−２０（２０１３）に概して記載されている方法を使用して調製した。簡単に説明すると、ＹＦＡＰ培地に３ｍｌを接種して一晩成長させ、１００ｍｌの細胞を生産した。処理した培養物は１００ｍｌあたり約１ｍｌのコンピテント細胞を生じた。細胞を、１．５＋／−０．１のＯＤ６００に達するまで、振とうインキュベーターで３０℃でインキュベートした。
【０３７３】
室温で成長及び維持された細胞１００ｍＬごとに、１００ｍＭの酢酸リチウム、１０ｍＭのジチオトレイトール、及び５０ｍＬのバッファーを使用してコンディショニングバッファーを調製した。細胞を２５０ｍｌボトルに４３００ｒｐｍで３分間収集し、上清を除去した。細胞ペレットを１００ｍｌの冷１Ｍソルビトールに懸濁し、４３００ｒｐｍで３分間回転させ、上清を再度除去した。細胞をコンディショニングバッファーに懸濁し、次いで懸濁液を適切なフラスコに移し、２００ＲＰＭ及び３０℃で３０分間振とうした。懸濁液を５０ｍｌコニカルバイアルに移し、４３００ｒｐｍで３分間回転させた。上清を除去し、ペレットを冷１Ｍソルビトールに再懸濁した。これらのステップを３回繰り返し、合計３回の洗浄−スピン−デカントステップを行った。ペレットをソルビトールに懸濁して、最終ＯＤを１５０＋／−２０にした。
【０３７４】
ＦＴＥＰデバイスを使用して比較エレクトロポレーション実験を実施し、エレクトロコンピテントＳ．セレビシエの形質転換の効率を決定した。流量はシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄの装置ＰＨＤ  ＵＬＴＲＡ（商標）４４００）で制御した。ＤＮＡを含む細胞の懸濁液を、１ｍＬのガラス製シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ８１３２０シリンジ、ＰＴＦＥルアーロック）に装填し、ポンプに取り付けた。ファンクションジェネレータからの出力は、フローを開始した直後にオンにした。処理した細胞は、カルベニシリンを含む１Ｍソルビトールを含むチューブに直接流入した。ＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）でエレクトロポレーションされたものと同じ体積が処理されるまで細胞を収集し、その時点でファンクションジェネレータからのフロー及び出力を停止した。３０℃、２５０ｒｐｍのインキュベーターシェーカーで３時間回復させた後、細胞をプレート播種して、エレクトロポレーションを生き延び、プラスミドを取り込まなかったコロニー形成単位（ＣＦＵ）及びエレクトロポレーションを生き延び、プラスミドを取り込んだＣＦＵを決定した。プレートは３０℃でインキュベートした。酵母コロニーは４８〜７６時間後にカウントされる。
【０３７５】
フロースルー型エレクトロポレーション実験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ高電圧エレクトロポレーター（ＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）ＥＬＥＰＯ２１）を使用して、２ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Ｂｕｌｌｄｏｇ  Ｂｉｏ、ニューハンプシャー州ポーツマス）に対してベンチマークされた。ＤＮＡを含む細胞懸濁液のストックチューブを準備し、ＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）及びフロースルー型エレクトロポレーションを使用したサイドトゥサイド実験に使用した。結果を図２０に示す。このデバイスは、ＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）法と比較して、２．５ｋＶ電圧でエレクトロコンピテントＳ．セレビシエのより良好な形質転換及び生存を示した。入力は、処理された細胞の総数である。
【０３７６】
実施例３：ＦＴＥＰ圧力センシング及び流量
圧力及び検知も、図１Ａに示されるカートリッジデバイスの一部として実質的に図１−Ｂ〜１０Ｄ（ｖｉ）に示されるようなＦＴＥＰデバイスを使用して試験した。インラインフローセンサ測定を使用して、細胞及びＤＮＡを含む液体がＦＴＥＰチップを流れた後、入口リザーバが空になった時点を示した。約６５μＬの液体を入力リザーバに投入し、自動ＦＴＥＰモジュールの電源を入れた。図２１の上部のグラフを見ると、数回の短いスタートアップトランジェントの後、流量は２４ＳＣＣＭに跳ね上がるまでほぼ８秒（８０００ｍｓ）の間、約３ＳＣＣＭ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｕｂｉｃ  ｃｅｎｔｉｍｅｔｅｒｓ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）の流量を示すことが分かる。この遷移は実行トリガーの終了時に発生し、これは細胞及びＤＮＡを含む液体がＦＴＥＰデバイスを介して処理され、空気がＦＴＥＰデバイスを流れていないことを示す指標である。このトリガーは、増加した流量又は（シリンジポンプからつながる導管などにおける）空気の圧力の突然の変動（増加又は減少）の検出を構成し得る。一つの好ましい実施形態では、図２７の流量センサは、流体が入力リザーバから完全に排出されることを示す空気流量の増加を検出する。この時点で、マルチパスエレクトロポレーション手順を可能にするために、圧力を逆にすることができる。つまり、エレクトロポレーションされる細胞は、１回のエレクトロポレーションのために入口から出口に向かって「引っ張られ」、入口リザーバが空になると、センサは圧力を逆転させて、液体及び細胞／ＤＮＡがフロースルー型ＦＴＥＰデバイスの出口端から入口端に向かって「押し出され」、さらなるエレクトロポレーションのために電極間を再び通過するようにしてもよい。このプロセスは１回から複数回繰り返され得る。あるいは、圧力を完全に止めて、出口の形質転換細胞を回収してもよい。
【０３７７】
マルチサイクルアプローチは、電場内の細胞及び外来性物質の滞留時間を制限することで、細胞の損傷を防ぎ、生存率を高める可能性があるという点で特に有利であり得る。この往復させるプロセスは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回繰り返され得る。図２７の下部は、圧力システムとＦＴＥＰの簡単な図を示している。圧力マニホールドは、マニホールド又はリザーバに配置された１つ以上の補完的なシール又はガスケットを介して、上方に延びるリザーバに結合される。
【０３７８】
実施例４：完全に自動化されたシングルプレックスＲＧＮによる編集の実行
本開示の自動化マルチモジュール装置を使用して、ＭＡＤ７ヌクレアーゼを使用したシングルプレックス自動ゲノム編集が正常に実行された。米国特許第９，９８２，２７９号を参照されたい。
【０３７９】
自動化機器に含まれる等温核酸アセンブリモジュール内で、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（商標）を介して、ａｍｐＲプラスミド骨格及びｌａｃＺ＿Ｆ１７２＊編集カセットを「編集ベクター」にアセンブリした。ｌａｃＺ＿Ｆ１７２は、ｌａｃＺ遺伝子を機能的にノックアウトする。「ｌａｃＺ＿Ｆ１７２＊」は、ｌａｃＺアミノ酸配列の１７２番目の残基で編集が生じることを示す。アセンブリに続いて、ＡＭＰｕｒｅビーズを使用して等温核酸アセンブリモジュール内で生成物を脱塩し、８０％エタノールで洗浄し、緩衝液に溶出させた。アセンブリされた編集ベクター及びリコンビニアリングに対応したエレクトロコンピテント大腸菌細胞を、エレクトロポレーションのため形質転換モジュールに移した。形質転換モジュールはＡＤＰ−ＥＰＣキュベットを含んでいた。例えば、米国特許第６２／５５１０６９号を参照されたい。細胞と核酸を合わせて１分間混合し、エレクトロポレーションを３０秒間行った。穿孔パルスのパラメータは次のとおりである：電圧、２４００Ｖ；長さ、５ミリ秒；間隔、５０ミリ秒；パルス数、１；極性、＋。トランスファーパルスのパラメータは次のとおりである：電圧、１５０Ｖ；長さ、５０ミリ秒；間隔、５０ミリ秒；パルス数、２０；極性、＋／−。エレクトロポレーション後、細胞を回復モジュール（別の成長モジュール）に移し、クロラムフェニコールを含むＳＯＣ培地で回復させた。１時間後にカルベニシリンを培地に加え、細胞をさらに２時間回復させた。回復後、ユーザが回収するまで細胞を４℃で保持した。
【０３８０】
自動化されたプロセス及び回復後、細胞のアリコートを、ラクトース（糖基質として）、クロラムフェニコール及びカルベニシリンを添加したＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天ベースを含むペトリ皿に播種し、目に見えるコロニーが現れるまで接種物を成長させた。白いコロニーは機能的に編集された細胞を表し、紫色のコロニーは未編集の細胞を表した。すべての液体移送は、自動化マルチモジュール細胞編集機器の自動化された液体ハンドリングデバイスによって実行された。
【０３８１】
自動処理の結果、合計約１．０Ｅ−０３の細胞が形質転換され（従来のベンチトップの結果と同等）、編集効率は８３．５％であった。白いコロニーのｌａｃＺ＿１７２の編集は、細胞のゲノムの編集された領域の配列決定によって確認された。さらに、自動細胞処理のステップはウェブカメラによってリモートで観察され、自動処理手順の状況を更新するためにテキストメッセージが送信された。
【０３８２】
実施例５：完全に自動化された再帰的編集の実行
自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用して、再帰的な編集が成功した。自動化機器に含まれる等温核酸アセンブリモジュール内で、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（商標）を介して、ａｍｐＲプラスミド骨格及びｌａｃＺ＿Ｖ１０＊編集カセットを「編集ベクター」にアセンブリした。ｌａｃＺ＿Ｆ１７２編集と同様に、ｌａｃＺ＿Ｖ１０編集はｌａｃＺ遺伝子を機能的にノックアウトする。「ｌａｃＺ＿Ｖ１０」は、ｌａｃＺアミノ酸配列の１０位のアミノ酸で編集が生じることを示す。アセンブリに続いて、ＡＭＰｕｒｅビーズを使用して等温核酸アセンブリモジュール内で生成物を脱塩し、８０％エタノールで洗浄し、緩衝液に溶出させた。最初にアセンブリされた編集ベクター及びリコンビニアリングに対応したエレクトロコンピテント大腸菌細胞を、エレクトロポレーションのために、図１Ａに示されるカートリッジデバイスの一部として実質的に図１−Ｂ〜１０Ｄ（ｖｉ）に示されるようなＦＴＥＰデバイスなどの形質転換モジュールに移した。形質転換モジュールはＡＤＰ−ＥＰＣキュベットを含んでいた。細胞と核酸を合わせて１分間混合し、エレクトロポレーションを３０秒間行った。穿孔パルスのパラメータは次のとおりである：電圧、２４００Ｖ；長さ、５ミリ秒；間隔、５０ミリ秒；パルス数、１；極性、＋。トランスファーパルスのパラメータは次のとおりである：電圧、１５０Ｖ；長さ、５０ミリ秒；間隔、５０ミリ秒；パルス数、２０；極性、＋／−。エレクトロポレーション後、細胞を回復モジュール（別の成長モジュール）に移し、クロラムフェニコールを含むＳＯＣ培地で回復させた。１時間後にカルベニシリンを培地に加え、細胞をさらに２時間成長させた。次に、細胞を遠心分離モジュールに移してから培地交換を行った。細胞をクロラムフェニコール及びカルベニシリンを含むＴＢに再懸濁し、細胞を２．７のＯＤ６００まで成長させ、その後濃縮し、エレクトロコンピテントにした。
【０３８３】
細胞成長中に、第２の編集ベクターを等温核酸アセンブリモジュール内で準備した。第２の編集ベクターはカナマイシン耐性遺伝子を含み、編集カセットはｇａｌＫ  Ｙ１４５＊編集を含んでいた。成功した場合、ｇａｌＫ  Ｙ１４５＊編集は細胞にガラクトースを取り込み代謝する能力を与える。ｇａｌＫ  Ｙ１５４＊カセットによって生成された編集により、１５４番目のアミノ酸残基に終止コドンが導入され、チロシンアミノ酸が終止コドンに変わる。この編集により、ｇａｌＫ遺伝子産物は機能しなくなり、細胞がガラクトースを代謝することができなくなる。アセンブリに続いて、ＡＭＰｕｒｅビーズを使用して等温核酸アセンブリモジュール内で第２の編集ベクター生成物を脱塩し、８０％エタノールで洗浄し、緩衝液に溶出させた。アセンブリされた第２の編集ベクター及びエレクトロコンピテント大腸菌細胞（第１の編集ベクターで形質転換され、選択されたもの）を、上記と同じパラメータを使用したエレクトロポレーションのために、形質転換モジュール、図１Ａに示されるカートリッジデバイスの一部として実質的に図１−Ｂ〜１０Ｄ（ｖｉ）に示されるようなＦＴＥＰデバイスに移した。エレクトロポレーション後、細胞を回復モジュール（別の成長モジュール）に移し、カルベニシリンを含むＳＯＣ培地で回復させた。回復後、細胞を回収するまで４℃で保持した後、細胞のアリコートをクロラムフェニコール、及びカナマイシンを添加したＬＢ寒天に播種した。ｌａｃＺ及びｇａｌＫの両方の編集を定量化するために、レプリカパッチプレートを２つの培地タイプで生成した：１）ラクトース（糖基質として）、クロラムフェニコール、及びカナマイシンを添加したＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天ベース、及び２）ガラクトース（糖基質として）、クロラムフェニコール、及びカナマイシンを添加したＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天ベース。すべての液体移送は、自動化マルチモジュール細胞編集機器の自動化された液体ハンドリングデバイスによって実行された。
【０３８４】
この再帰的な編集実験では、スクリーニングされたコロニーの４１％がｌａｃＺ及びｇａｌＫの両方の編集を有し、その結果は「ベンチトップ」又は手動のアプローチを使用して得られた二重編集効率に匹敵した。
【０３８５】
特定の実施形態を説明したが、これらの実施形態は例としてのみ提示したものであり、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。実際、本明細書で説明される新規な方法、装置、モジュール、機器、及びシステムは、様々な他の形態で具体化することができる。さらに、本開示の趣旨から逸脱することなく、本明細書に記載の方法、装置、モジュール、機器、及びシステムの形態の様々な省略、置換、及び変更を行うことができる。添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物は、そのような形態又は変更例を、本開示の範囲及び趣旨に含まれるものとして包含することを意図している。
【図１Ａ】
2021509803.tif 000003
【図１Ｂ】
2021509803.tif 000004
【図２Ａ】
2021509803.tif 000005
【図２Ｂ】
2021509803.tif 000006
【図２Ｃ】
2021509803.tif 000007
【図２Ｄ】
2021509803.tif 000008
【図３】
2021509803.tif 000009
【図４Ａ】
2021509803.tif 000010
【図４Ｂ】
2021509803.tif 000011
【図４Ｃ】
2021509803.tif 000012
【図４Ｄ】
2021509803.tif 000013
【図４Ｅ】
2021509803.tif 000014
【図４Ｆ】
2021509803.tif 000015
【図４Ｇ】
2021509803.tif 000016
【図４Ｈ】
2021509803.tif 000017
【図４Ｉ】
2021509803.tif 000018
【図５Ａ】
2021509803.tif 000019
【図５Ｂ】
2021509803.tif 000020
【図５Ｃ】
2021509803.tif 000021
【図５Ｄ】
2021509803.tif 000022
【図５Ｅ】
2021509803.tif 000023
【図５Ｆ】
2021509803.tif 000024
【図５Ｇ】
2021509803.tif 000025
【図５Ｈ】
2021509803.tif 000026
【図６】
2021509803.tif 000027
【図７Ａ】
2021509803.tif 000028
【図７Ｂ】
2021509803.tif 000029
【図７Ｃ】
2021509803.tif 000030
【図７Ｄ】
2021509803.tif 000031
【図７Ｅ】
2021509803.tif 000032
【図８Ａ】
2021509803.tif 000033
【図８Ｂ】
2021509803.tif 000034
【図８Ｃ】
2021509803.tif 000035
【図８Ｄ】
2021509803.tif 000036
【図８Ｅ】
2021509803.tif 000037
【図８Ｆ】
2021509803.tif 000038
【図８Ｇ】
2021509803.tif 000039
【図８Ｈ】
2021509803.tif 000040
【図８Ｉ】
2021509803.tif 000041
【図８Ｊ】
2021509803.tif 000042
【図８Ｋ】
2021509803.tif 000043
【図８Ｌ】
2021509803.tif 000044
【図８Ｍ】
2021509803.tif 000045
【図８Ｎ】
2021509803.tif 000046
【図８Ｏ】
2021509803.tif 000047
【図８Ｐ】
2021509803.tif 000048
【図８Ｑ】
2021509803.tif 000049
【図８Ｒ】
2021509803.tif 000050
【図８Ｓ】
2021509803.tif 000051
【図８Ｔ】
2021509803.tif 000052
【図８Ｕ】
2021509803.tif 000053
【図９Ａ】
2021509803.tif 000054
【図９Ｂ】
2021509803.tif 000055
【図９Ｃ】
2021509803.tif 000056
【図１０Ａ】
2021509803.tif 000057
【図１０Ｂ】
2021509803.tif 000058
【図１０Ｃ】
2021509803.tif 000059
【図１０Ｄ】
2021509803.tif 000060
【図１０Ｅ】
2021509803.tif 000061
【図１０Ｆ】
2021509803.tif 000062
【図１０Ｇ】
2021509803.tif 000063
【図１１Ａ】
2021509803.tif 000064
【図１１Ｂ】
2021509803.tif 000065
【図１１Ｃ】
2021509803.tif 000066
【図１１Ｄ】
2021509803.tif 000067
【図１１Ｅ】
2021509803.tif 000068
【図１２Ａ】
2021509803.tif 000069
【図１２Ｂ】
2021509803.tif 000070
【図１２Ｃ】
2021509803.tif 000071
【図１２Ｄ】
2021509803.tif 000072
【図１３Ａ】
2021509803.tif 000073
【図１３Ｂ】
2021509803.tif 000074
【図１３Ｃ】
2021509803.tif 000075
【図１４】
2021509803.tif 000076
【図１５Ａ】
2021509803.tif 000077
【図１５Ｂ】
2021509803.tif 000078
【図１５Ｃ】
2021509803.tif 000079
【図１６】
2021509803.tif 000080
【図１７Ａ】
2021509803.tif 000081
【図１７Ｂ】
2021509803.tif 000082
【図１８】
2021509803.tif 000083
【図１９Ａ】
2021509803.tif 000084
【図１９Ｂ】
2021509803.tif 000085
【図２０】
2021509803.tif 000086
【図２１】
2021509803.tif 000087
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月29日(2020.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自動化マルチモジュール細胞編集機器であって、
モジュールのすべて又は一部を含むように構成されたハウジング；
細胞を受け取るように構成されたレセプタクル；
核酸を受け取るように構成された１つ以上のレセプタクル；
核酸を細胞に導入するように構成されたフロースルー型エレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）モジュールであって、
ａ．細胞及び外来性物質を含む流体をＦＴＥＰモジュールに導入するための１つ以上の入口及び入口チャネル；
ｂ．形質転換された細胞及び外来性物質を含む流体をＦＴＥＰモジュールから取り出すための出口及び出口チャネル；
ｃ．第１の入口チャネルと出口チャネルとの間を横断するように配置されたフローチャネルであって、第１の入口チャネルとフローチャネルの中心との間及び出口チャネルとフローチャネルの中心との間で幅が減少するフローチャネル；及び、
ｄ．フローチャネルが第１の入口チャネルと交差する部分とフローチャネルが出口チャネルと交差する部分との間のフローチャネルに配置された２つ以上の電極であって、前記電極はフローチャネル内の流体と連通しているが、フローチャネル内の細胞の主流経路内にはなく、流体中の細胞がフローチャネル内を通過する際に、細胞に１つ以上の電気パルスを印加することにより、外来性物質を流体中の細胞に導入する電極
を含むＦＴＥＰモジュール；
ＦＴＥＰモジュールでの細胞形質転換後に細胞を回復させるように構成された回復モジュール；
導入された核酸に、その細胞内の核酸を編集させるように構成された編集モジュール；
ユーザ入力及び／又は事前にプログラムされたスクリプトの選択に基づいて自動化マルチモジュール細胞編集機器を操作するように構成されたプロセッサ；及び、
細胞のレセプタクルから成長モジュールへ、成長モジュールからＦＴＥＰモジュールへ、及びＦＴＥＰモジュールから編集モジュールへ、ならびに核酸の１つ以上のレセプタクルからＦＴＥＰモジュールへ、いずれもユーザの介入なしに液体を移動させるための自動液体ハンドリングシステム
を含む、自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項２】
ＦＴＥＰモジュールは、流体中の細胞をＦＴＥＰモジュールに導入するための入口に接続されたリザーバと、形質転換された細胞をＦＴＥＰモジュールから取り出すための出口に接続されたリザーバとをさらに含む、請求項１に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項３】
ＦＴＥＰモジュールは、２つの入口及び２つの入口チャネルを含み、外来性物質をＦＴＥＰモジュールに導入するための第２の入口に接続されたリザーバをさらに含む、請求項１に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項４】
ＦＴＥＰモジュールの第２の入口及び第２の入口チャネルは、ＦＴＥＰモジュールの第１の入口及び第１の入口チャネルと電極との間に配置されている、請求項３に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項５】
ＦＴＥＰモジュールの第２の入口及び第２の入口チャネルは、ＦＴＥＰモジュールの電極と、出口チャネル及び出口との間に配置されている、請求項３に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項６】
ＦＴＥＰモジュールのチャネル幅の最も狭い部分は１０μｍ〜５ｍｍである、請求項１に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項７】
ＦＴＥＰモジュールは、１つ以上の入口チャネルと電極との間にフィルタをさらに備える、請求項１に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項８】
デバイスが細菌細胞、酵母細胞及び哺乳類細胞に用いられるように構成されている、請求項１に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項９】
１つの電極は、入口チャネルとフローチャネルの幅が狭くなっている部分との間に配置され、第２の電極は、フローチャネルの幅が狭くなっている部分と出口チャネルと間に配置されている、請求項１に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１０】
試薬カートリッジをさらに含む、請求項１に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１１】
ＦＴＥＰモジュールを備える自動化マルチモジュール細胞編集機器であって、
モジュールのすべて又は一部を含むように構成されたハウジング；
細胞を受け取るように構成されたレセプタクル；
細胞を成長させるための成長モジュール；
核酸を受け取るように構成された１つ以上のレセプタクル；
核酸を細胞に導入するように構成されたＦＴＥＰモジュールであって、
ａ．細胞及び核酸を含む流体をＦＴＥＰモジュールに導入するための少なくとも１つの入口及び少なくとも１つの入口チャネル；
ｂ．ＦＴＥＰモジュールから形質転換された細胞及び外来性物質を取り出すための出口及び出口チャネル；
ｃ．第１の入口チャネルと出口チャネルとの間に配置されたフローチャネルであって、第１の入口チャネル及び出口チャネルと交差し、フローチャネルの一部は、入口チャネルとの交差部分及び出口チャネルとの交差部分の間で狭くなるフローチャネル；及び、
ｄ．フローチャネルの両側に配置され、フローチャネル内の流体と直接接触する電極であって、電極はフローチャネルの狭められた部分を画定しており、流体中の細胞がフローチャネル内を通過する際に、細胞に１つ以上の電気パルスを印加することにより、外来性物質を流体中の細胞に導入する電極
を備えるＦＴＥＰモジュール；
導入された核酸に、その細胞内の核酸を編集させるように構成された編集モジュール；
ユーザ入力及び／又は事前にプログラムされたスクリプトの選択に基づいて自動化マルチモジュール細胞編集機器を操作するように構成されたプロセッサ；及び
細胞のレセプタクルから成長モジュールへ、成長モジュールからＦＴＥＰモジュールへ、及びＦＴＥＰモジュールから編集モジュールへ、ならびに核酸の１つ以上のレセプタクルからＦＴＥＰモジュールへ、いずれもユーザの介入なしに液体を移動させるための自動液体ハンドリングシステム
を含む、自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１２】
ＦＴＥＰモジュールは、流体中の細胞をＦＴＥＰモジュールに導入するための入口に接続されたリザーバと、形質転換された細胞をＦＴＥＰモジュールから取り出すための出口に接続されたリザーバとをさらに含む、請求項１１に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１３】
ＦＴＥＰモジュールは、２つの入口及び２つの入口チャネルを含み、核酸をＦＴＥＰモジュールに導入するための第２の入口に接続されたリザーバをさらに含む、請求項１１に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１４】
ＦＴＥＰモジュールの第２の入口及び第２の入口チャネルは、ＦＴＥＰモジュールの第１の入口及び第１の入口チャネルと電極との間に配置されている、請求項１３に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１５】
ＦＴＥＰモジュールの第２の入口及び第２の入口チャネルは、ＦＴＥＰモジュールの電極と、出口チャネル及び出口との間に配置されている、請求項１３に記載の自動化マルチモジュール細胞編集機器。
【国際調査報告】
2021509803.tif 000088