(57)【要約】  ヘキサマー４面体コアを含むリボ核酸（ＲＮＡ）スキャフォールドを含むナノ構造が開示される。４面体コアは、一緒に連接された４個のヘキサマーＲＮＡナノリングを含み得る。関連する医薬組成物、哺乳動物において標的遺伝子の発現を調節する方法、哺乳動物において疾患を治療または予防する方法、およびヘキサマー４面体ＲＮＡナノ構造を産生する方法もまた開示される。【選択図】図２Ｂ
2021524735.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘキサマー４面体コアを含むリボ核酸（ＲＮＡ）スキャフォールドを含むナノ構造であって、前記４面体コアは、一緒に連接された４個のヘキサマーＲＮＡナノリングを含む、ナノ構造。
【請求項２】
連接された４個のヘキサマーＲＮＡナノリングが「Ｈ」形交差モノマーを介して一緒にされており、
各「Ｈ」形交差モノマーは、「Ｈ」形交差モノマーを形成するように７塩基対ブリッジによって一緒に連接された２個のＵＡハンドル３方ジャンクション（３ＷＪ）を含む、請求項１に記載のナノ構造。
【請求項３】
ヘキサマー４面体コアを含むリボ核酸（ＲＮＡ）スキャフォールドを含むナノ構造であって、前記４面体コアは以下を含み：
第１、第２、第３、第４、第５、および第６の交差モノマー；
第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、および第１２のダンベルモノマー；
前記第１、第２、および第３のダンベルモノマーならびに前記第１、第２、および第６の交差モノマーは、第１のヘキサマーナノリングを一緒に形成し；
前記第４、第５、および第６のダンベルモノマーならびに前記第４、第５、および第６の交差モノマーは、第２のヘキサマーナノリングを一緒に形成し；
前記第７、第８、および第９のダンベルモノマーならびに前記第１、第３、および第５の交差モノマーは、第３のヘキサマーナノリングを一緒に形成し；
前記第１０、第１１、および第１２のダンベルモノマーならびに前記第２、第３、および第４の交差モノマーは、第４のヘキサマーナノリングを一緒に形成し；そして
各交差モノマーは、ヘキサマーナノリングを一緒に連接するようにヘキサマーリングの２個によって共有されて、ヘキサマー４面体コアを形成する、ナノ構造。
【請求項４】
各ダンベルモノマーが第１および第２の末端を含むヘリックスを含み、各ダンベルモノマーのヘリックスが両方の末端においてキッシングループでキャップされている、請求項３に記載のナノ構造。
【請求項５】
各ダンベルモノマーのヘリックスが１５塩基対（ｂｐ）ヘリックスであり、そして各ダンベルモノマーの各キッシングループが７ヌクレオチド（ｎｔ）キッシングループである、請求項４に記載のナノ構造。
【請求項６】
各キッシングループが、ナノリングのいずれか１個において特有であるヌクレオチド配列を有する、請求項４または５に記載のナノ構造。
【請求項７】
各交差モノマーが、第１、第２、第３、および第４のキッシングループならびに第１および第２のＵＡハンドル３方ジャンクション（ＵＡｈ−３ＷＪ）を含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載のナノ構造。
【請求項８】
第１のＵＡｈ−３ＷＪが、各交差モノマーにおいて第２のＵＡｈ−３ＷＪに対して対称に配置されている、請求項７に記載のナノ構造。
【請求項９】
第１のＵＡｈ−３ＷＪが第１の８ｂｐ側ヘリックスと第１の６ｂｐ側ヘリックスとの間に配置されており、そして
第２のＵＡｈ−３ＷＪが第２の８ｂｐ側ヘリックスと第２の６ｂｐ側ヘリックスとの間に配置されている、
請求項７または８に記載のナノ構造。
【請求項１０】
各交差モノマーの４個のキッシングループの第１の対が、各々、同じ第１のヌクレオチド配列のコピーを含み、そして
各交差モノマーの４個のキッシングループの第２の対が、各々、前記第１のヌクレオチド配列と異なる同じ第２のヌクレオチド配列のコピーを含む、
請求項７〜９のいずれか１項に記載のナノ構造。
【請求項１１】
各交差モノマーの４個のキッシングループの第１の対が、互いに対して対称に配置されており、そして
各交差モノマーの４個のキッシングループの第２の対が、互いに対して対称に配置されている、
請求項１０に記載のナノ構造。
【請求項１２】
ＵＡｈ−３ＷＪが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ＵＡｈ−３ＷＪである、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のナノ構造。
【請求項１３】
各交差モノマーの第１および第２のＵＡｈ−３ＷＪが、ブリッジヘリックスによって連結されている、請求項７〜１２のいずれか１項に記載のナノ構造。
【請求項１５】
各交差モノマーが一本ＲＮＡ鎖である、請求項７〜１４のいずれか１項に記載のナノ構造。
【請求項１６】
（ｉ）各交差モノマーの４個のキッシングループの２個、および各交差モノマーの２個のＵＡｈ−３ＷＪの１個が、ヘキサマーナノリングの１個の中に配置されており、そして
（ｉｉ）各交差モノマーのキッシングループの他の２個、および各交差モノマーのＵＡｈ−３ＷＪの他の１個が、（ｉ）のヘキサマーナノリングに近接し、そしてそれに直接連接しているヘキサマーナノリングの別の１個の中に配置されている、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のナノ構造。
【請求項１７】
６個の交差モノマーの第１の対が、同じ第１の交差モノマーヌクレオチド配列のコピーを含み；
６個の交差モノマーの第２の対が、同じ第２の交差モノマーヌクレオチド配列のコピーを含み； そして
６個の交差モノマーの第３の対が、同じ第３の交差モノマーヌクレオチド配列のコピーを含み、
第１、第２、および第３の交差モノマーヌクレオチド配列は互いに異なる、
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のナノ構造。
【請求項１８】
１２個のダンベルモノマーの第１の４個が、同じ第１のダンベルモノマーヌクレオチド配列のコピーを含み；
１２個のダンベルモノマーの第２の４個が、同じ第２のダンベルモノマーヌクレオチド配列のコピーを含み；
１２個のダンベルモノマーの第３の４個が、同じ第３のダンベルモノマーヌクレオチド配列のコピーを含み；
第１、第２、および第３のダンベルモノマーヌクレオチド配列は互いに異なる、
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のナノ構造。
【請求項１９】
第１および第２のＵＡｈ−３ＷＪを連結するブリッジヘリックスが７ｂｐヘリックスである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のナノ構造。
【請求項２０】
４面体コアが、４個、８個、または１２個のモノマーアームを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のナノ構造。
【請求項２１】
４個、８個、または１２個のモノマーアームが、各々、（ａ）ＲＮＡｉ基質、（ｂ）標的化部分、（ｃ）イメージングプローブ、（ｄ）複合タンパク質、および（ｅ）ポリマーの１個以上で機能付与されている、請求項２０に記載のナノ構造。
【請求項２２】
ＲＮＡｉ基質が、ダイサー基質ＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）を含む、請求項２１に記載のナノ構造。
【請求項２３】
１２個のモノマーアームが、各々、ＤｓｉＲＮＡで機能付与されている、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のナノ構造。
【請求項２４】
（ａ）第１、第２、第３、第４、第５、および第６の交差モノマーの少なくとも１個、および／または（ｂ）第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、および第１２のダンベルモノマーの少なくとも１個が、連続的な配列を含む、請求項３〜２２のいずれか１項に記載のナノ構造。
【請求項２５】
（ａ）請求項１〜２４のいずれか１項に記載のナノ構造、および（ｂ）薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２６】
哺乳動物における標的遺伝子の発現の調節における使用のための、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のナノ構造または請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
哺乳動物における疾患の治療または予防における使用のための、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のナノ構造または請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
疾患がガンである、請求項２５に記載の使用のためのナノ構造または組成物。
【請求項２９】
ガンが乳ガンである、請求項２８に記載の使用のためのナノ構造または組成物。
【請求項３０】
疾患がウイルス性疾患である、請求項２７に記載の使用のためのナノ構造または組成物。
【請求項３１】
ヘキサマー４面体ＲＮＡナノ構造を産生する方法であって：
（ａ）「Ｈ」形交差モノマーを形成する工程であって、各「Ｈ」形交差モノマーは、「Ｈ」形交差モノマーを形成するように７塩基対ブリッジによって一緒に連接された２個のＵＡハンドル３方ジャンクション（３ＷＪ）を含む、工程；
（ｂ）ヘキサマーＲＮＡナノリングを形成する工程であって、各ヘキサマーＲＮＡナノリングは、「Ｈ」形交差モノマーの３個を含む、工程；および
ヘキサマー４面体ＲＮＡナノ構造をアセンブルする工程であって、前記ヘキサマー４面体ＲＮＡナノ構造は、「Ｈ」形交差モノマーを介して一緒に連接されたヘキサマーＲＮＡナノリングの４個を含む、工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、米国仮特許出願第６２／６６８，６５３号（２０１８年５月８日出願）、および同第６２／６９６，６１９号（２０１８年７月１１日出願）（その全体が本明細書に参照により組み込まれる）の利益を請求する。
【０００２】
連邦政府により資金提供された研究または開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所、国立癌研究所によりプロジェクト番号Ｚ０１ＢＣ０１１０６１０９および国立衛生研究所、国立一般医科学研究所によりプロジェクト番号Ｒ０１ＧＭ０７９６０４の下、政府の支援でなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
電子提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出され、そして以下のように特定されるコンピューター読取可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表はその全体が本明細書に参照により組み込まれる：１個の１４，００７バイトＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイル、名称「７４２３８１＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」、２０１９年５月８日付。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ＲＮＡナノ構造は、種々のナノ生物学的適用のために有用であり得る。そのような適用は、例えば、リガンド結合モチーフまたは遺伝子発現調節因子のような、機能性部分の送達を含み得る。ＲＮＡナノ構造の分野における進歩にかかわらず、ＲＮＡナノ構造の適用の成功には種々の課題が残されている。例えば、ナノ構造の不十分な細胞取り込みは、機能性（例えば、治療的）部分を有するナノ構造の機能性（例えば、治療的）効力を限定し得る。従って、改善されたＲＮＡナノ構造に対する満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
発明の簡単な要旨
本発明の実施形態は、ヘキサマー４面体コアを含むリボ核酸（ＲＮＡ）スキャフォールドを含むナノ構造を提供し、ここで、４面体コアは、一緒に連接された４個のヘキサマーＲＮＡナノリング面を含む。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、ヘキサマー４面体コアを含むリボ核酸（ＲＮＡ）スキャフォールドを含むナノ構造を提供し、ここで、４面体コアは、第１、第２、第３、第４、第５、および第６の交差モノマー（cross-over monomer）；第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、および第１２のダンベルモノマーを含み；第１、第２、および第３のダンベルモノマーならびに第１、第２、および第６の交差モノマーは、第１のヘキサマーナノリングを一緒に形成し；第４、第５、および第６のダンベルモノマーならびに第４、第５、および第６の交差モノマーは、第２のヘキサマーナノリングを一緒に形成し；第７、第８、および第９のダンベルモノマーならびに第１、第３、および第５の交差モノマーは、第３のヘキサマーナノリングを一緒に形成し；第１０、第１１、および第１２のダンベルモノマーならびに第２、第３、および第４の交差モノマーは、第４のヘキサマーナノリングを一緒に形成し；そして各交差モノマーは、ヘキサマーナノリングを一緒に連接するようにヘキサマーリングの２個によって共有されて、ヘキサマー４面体コアを形成する。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、本発明のナノ構造を含む組成物を提供する。
【０００８】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のナノ構造または組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において標的遺伝子の発現を調節する方法、および哺乳動物において疾患を治療または予防する方法を提供する。
【０００９】
本発明のさらに別の実施形態は、本発明のナノ構造を産生する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、構造化されていないＲＮＡモノマー単位から開始し（上）、構造化されたダンベル形モノマーへ（中）、そして形成されたＲＮＡナノリングで終了する（下）という順序の、ＲＮＡナノリングの熱フォールディングおよびアセンブリを示す模式図である。モノマーが変性される温度は９４℃である。文字Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦは、より低い温度で分子内接触を形成して、工程１に示される構造化されたダンベル形モノマーを生じる、別個のＲＮＡ配列を表す。各モノマー単位は、Ａ〜Ｆからの２つの異なる文字として示される２個の別個のＲＮＡ配列を含む。工程１：構造化されたモノマー単位の形成、すなわち、ダンベル形モノマーの形成は、示されるように、ＲＮＡモノマー単位が氷上で急冷されるときに起こる。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦと名付けられたＲＮＡ配列の領域は、ダンベルの環状末端を形成する。図１Ａに示されるように、各ダンベルモノマー単位は、別個のＲＮＡ配列に対応する２つの末端を有する。工程２、分子間接触を通したアセンブリ（これは、Ｍｇ２＋の存在下、３０℃で起こる）は、ＲＮＡナノリングの形成をもたらす。工程２の間に、別個のＲＮＡ配列「ダンベル」は、逆ＣｏｌＥ１キッシング複合体（kissing complex）の構造およびジオメトリ（geometry）を模倣する、キッシング複合体とも呼ばれる、ループ−ループ相互作用を形成する。個々のナノリングアセンブリは約３０℃のインキュベーション工程を必要とするが、約４５℃の上昇したインキュベーション温度が本発明の４面体ナノ構造のために好ましい。
【図１Ｂ】図１Ｂは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）研究を通して導き出された逆ＣｏｌＥ１キッシング複合体（すなわち、ＣｏｌＥ１  ＲＮＡループ−ループ相互作用）の構造の模式図である。この相互作用は、近接するＲＮＡヘリックス間で１２０°の結合を形成する。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の実施形態による、二次元（平面）ＵＡハンドル３方ジャンクション（UA-handle three-way junction）（ＵＡｈ−３ＷＪ）の、それが各ダンベルモノマー中に埋め込まれているときの、クローズアップの模式図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の実施形態による、４面体スキャフォールドの三次元モデルの二次構造を示す模式図である。二次構造は、三次元モデルが、４個のナノリング（各リングの内側で１〜４と表示される）、６個のＨ形交差モノマー（外側の連結線上の数字１ｂ、２ｂ、および３ｂ、ならびに図の中央付近の数字４ｂ、５ｂ、および６ｂとして表示される）、および各ナノリング中の３個のダンベル形モノマー（リング番号１における１ａ、２ａ、および３ａ（上）、リング番号２における４ａ、５ａ、および６ａ（中）、リング番号３における７ａ、８ａ、および９ａ（左下）、ならびにリング番号４における１０ａ、１１ａ、および１２ａ（右下）として表示される）から構成されることを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＵＡｈ３方ジャンクションにおける塩基対形成の位置および生じるＨ形モノマーのジオメトリのモデリングを示す模式図である。理想的な４面体ジオメトリへの隣接するリングの配置に最もよく適合する位置を見出すために、ダンベルモノマー内の接合部を１塩基対ずつ移動させることによって、ＵＡｈ３方ジャンクションの位置を、近接するモノマー中の種々の位置においてモデリングした。図２Ｃは、＋１塩基対の移動を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明の実施形態による、ＵＡｈ３方ジャンクションにおける塩基対形成の位置および生じるＨ形モノマーのジオメトリのモデリングを示す模式図である。理想的な４面体ジオメトリへの隣接するリングの配置に最もよく適合する位置を見出すために、ダンベルモノマー内の接合部を１塩基対ずつ移動させることによって、ＵＡｈ３方ジャンクションの位置を、近接するモノマー中の種々の位置においてモデリングした。図２Ｄは、Ｈ形モノマーの理想的なジオメトリを示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＵＡｈ３方ジャンクションにおける塩基対形成の位置および生じるＨ形モノマーのジオメトリのモデリングを示す模式図である。理想的な４面体ジオメトリへの隣接するリングの配置に最もよく適合する位置を見出すために、ダンベルモノマー内の接合部を１塩基対ずつ移動させることによって、ＵＡｈ３方ジャンクションの位置を、近接するモノマー中の種々の位置においてモデリングした。図２Ｅは、−１塩基対の移動を示す。
【図３−１】図３Ａは、本発明の実施形態による、交差モノマー内で可能な５’／３’切断の３、２、１、０分布を示す模式図である。図３Ｂは、本発明の実施形態による、交差モノマー内で可能な５’／３’切断の２、２、２、０分布を示す模式図である。
【図３−２】図３Ｃは、本発明の実施形態による、交差モノマー内で可能な５’／３’切断の２、２、１、１分布を示す模式図である。図３Ｄは、本発明の実施形態による、二次構造で示される、Ｈモノマーに起因する５’／３’切断を示す分子動力学シミュレーションに供された３Ｄモデルの模式図である。
【図４−１】図４Ａは、本発明の実施形態による、大気中でイメージングされた、アセンブルされた４面体ナノ構造の、ｎｍでの、原子間力顕微鏡観察の間に使用された高さスケールである。図４Ｂは、本発明の実施形態による、大気中でイメージングされた、原子間力顕微鏡観察によって特徴付けられた、アセンブルされた４面体ナノ構造のイメージである。示される白色の形状は、アセンブルされた４面体ナノ構造である。図４Ｃは、本発明の実施形態による、大気中でイメージングされた、原子間力顕微鏡観察によって特徴付けられた、アセンブルされた４面体ナノ構造の拡大イメージである。白色の形状は、アセンブルされた４面体ナノ構造である。拡大イメージは、構造の４面体形状を示す。図４Ｄは、本発明の実施形態による、大気中でイメージングされた、原子間力顕微鏡観察によって特徴付けられた、アセンブルされた４面体ナノ構造のイメージである。示される白色の形状は、アセンブルされた４面体ナノ構造である。５つの円は、複数の４面体構造の断面測定値を取得した領域を示す。測定値を、４面体構造の平均粒子径を計算するために使用した。
【図４−２】図４Ｅは、本発明の実施形態による、図４Ｄの説明に記載の白色の形状の、取得した断面測定値のグラフである。平均粒子径（ｄａｆｍ）は約２０ｎｍである。
【図５Ａ】図５Ａは、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳ガン細胞において実施したｅＧＦＰのサイレンシングの結果を示す棒グラフである。ＤｓｉＲＮＡアームのその完全な相補物を有する種々のナノ粒子形状（Ｘ軸に列挙される）を、ｅＧＦＰ発現をノックダウンするその能力について評価した。トランスフェクションを、アセンブルされた粒子の等モル濃度および利用可能なＤｓｉＲＮＡの等モル濃度の両方で実施した。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示し、Ｐ値は＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳ガン細胞において実施したｅＧＦＰのサイレンシングの結果を示す棒グラフである。Ｘ軸に列挙するナノ粒子形状を、各々、４個のＤｓｉＲＮＡアームを用いてアセンブルさせ、ｅＧＦＰ発現をノックダウンするその能力について評価した。トランスフェクションを、アセンブルされた粒子の等モル濃度（およびそれゆえ利用可能なＤｓｉＲＮＡの等モル濃度も）の両方で実施した。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示し、Ｐ値は＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ｅＧＦＰを発現しないＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を使用して実施した細胞取り込み研究のフローサイトメトリー結果を示すヒストグラムである。種々のＲＮＡ粒子（形状を四角中に示す）を、ＤｓｉＲＮＡアームのその完全な相補物を用いて、各々の、蛍光標識された粒子上に４個のＤｓｉＲＮＡセンス鎖となるように、アセンブルした。蛍光標識ナノ粒子の取り込みをフローサイトメトリーによって決定した。
【図５Ｄ】図５Ｄは、図５Ｃの説明に記載の種々のＲＮＡ粒子の平均蛍光シグナルを示す棒グラフである。
【図６】図６は、細胞生存率（Ｙ軸）によって評価した、治療効力におけるＰＬＫ−１標的化４面体ナノ粒子の使用の結果を示すグラフである。Ｘ軸は利用可能なＤｓｉＲＮＡの濃度（ｎＭ）である。ＲＮＡナノリング（黒色菱形）、ナノキューブ（黒色四角）、および４面体ナノ粒子（黒色丸）を、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ−１）を標的にするＤｓｉＲＮＡアームを用いてアセンブルさせた。ナノ粒子の治療潜在力を、トランスフェクションの３日後に決定した。ｅＧＦＰ標的化ナノリング（白色菱形）、ｅＧＦＰ標的化ナノキューブ（白色四角）、ｅＧＦＰ標的化４面体ナノ粒子（白色丸）、および遊離ｅＧＦＰ標的化ＤｓｉＲＮＡ（白色三角）を、ナノ粒子自体が細胞毒性である程度を決定するための陰性対照として使用した。エラーバーはＳＤを示す。
【図７】図７は、原子間力顕微鏡観察によって決定した、本発明の４面体ナノ粒子の平均直径（ｎｍ）を示す棒グラフである。
【図８】図８は、動的光散乱によって決定した、３０℃および４５℃の両方でアセンブルさせた本発明の４面体ナノ粒子の水力学的直径を示す線グラフである。
【図９】図９は、ライゲーションされた５’／３’ニックを有する（これは、環状化されたスキャフォールドモノマーを作り出す）（右の列）、ダンベルモノマー（上の行）および「Ｈ」交差モノマー（下の行）を示す。
【図１０】図１０は、陰性対照トランスフェクション実験の結果を示すヒストグラムである。いかなるＤｓｉＲＮＡアームも欠いた「裸」ＲＮＡコアスキャフォールドは、ｅＧＦＰの発現をサイレンシングしなかった。機能付与されていないナノリング、ナノキューブまたは４面体コアスキャフォールドを用いてトランスフェクトされた細胞のｅＧＦＰ蛍光を、トランスフェクションの３日後にフローサイトメトリー分析によって非処理細胞（黒色）と比較した。いずれのナノ粒子も蛍光タンパク質の発現をサイレンシングしなかったので、線は区別不能である。
【図１１】図１１は、１２個のＤｓｉＲＮＡアーム有りおよび無しの本発明の４面体ナノ粒子の３Ｄモデルを示すイメージである。回転半径を、２５０ｎｓの分子動力学トラジェクトリ（trajectory）にわたって各フレームでアーム無しの本発明の４面体ナノ粒子の３Ｄモデルについて計算した。その結果、２１．８ｎｍ±０．５の平均粒子径が得られた。１２個のＤｓｉＲＮＡアームを有する本発明の４面体ナノ粒子の初期最小化３Ｄモデルの直径は、３２．８ｎｍであると決定された。
【図１２】図１２は、本発明の実施形態による、大気中でイメージングされた、ＡＦＭによって特徴付けられた、本発明の４面体ナノ粒子の別のイメージである。示される白色の形状は、相対的に均一なサイズおよび形状を示す、アセンブルされた４面体ナノ構造である。
【図１３】図１３は、スクランブルされたＤｓｉＲＮＡ配列を持つ４面体ナノ粒子がｅＧＦＰ発現をダウンレギュレーションしないことを示す、別の陰性対照トランスフェクション実験の結果を示すヒストグラムである。２つの異なるスクランブルされたＤｓｉＲＮＡ配列を、それぞれの４面体ナノ粒子中に組み込み、そして細胞中にトランスフェクトした。ｅＧＦＰ蛍光を、トランスフェクションの３日後にフローサイトメトリーによって測定し、そして非処理細胞およびｅＧＦＰ標的化４面体ナノ粒子を用いてトランスフェクトした細胞と比較した。
【図１４】図１４は、蛍光標識ナノ粒子の細胞取り込みを示すヒストグラムである。ＲＮＡナノ粒子を、ＤｓｉＲＮＡ部分（ナノリングおよびナノキューブナノ粒子については６個のＤｓｉＲＮＡ；４面体ナノ粒子については１２個のＤｓｉＲＮＡ）のその完全な相補物を用いて、アセンブルされたナノ粒子当たり４個の６−ＦＡＭ蛍光標識となるように、アセンブルさせた。これらの標識ＲＮＡナノ粒子を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中に、各トランスフェクション実験においてＤｓｉＲＮＡの数が等しくなるように規準化された濃度で、トランスフェクトした。ＲＮＡナノ粒子取り込みの程度を、４時間後にフローサイトメトリーによって評価した。
【図１５】図１５は、示すＮＰ濃度でのトランスフェクション後の、ＲＮＡナノ粒子で処理した細胞の６−ＦＡＭ蛍光の平均シグナルを示すグラフである。エラーバーはＳＥＭを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明のＲＮＡナノ構造は、種々の利点のいずれか１つ以上を提供し得る。例えば、本発明のＲＮＡナノ構造のヘキサマー４面体ジオメトリは、（ｉ）増加した（例えば、２倍の）機能性容量、および（ｉｉ）ヘキサマー４面体ジオメトリを欠いたＲＮＡナノ構造（例えば、ナノリングおよびナノキューブ技術のような）と比較して増強された細胞取り込み、の一方または両方を有する高次ＲＮＡスキャフォールドを提供し得る。本発明のヘキサマー４面体ＲＮＡナノ構造は、種々の機能性部分のいずれかで機能付与されてもよい１２個までのモノマーアームを含み得る。ＲＮＡ干渉基質で機能付与されたＲＮＡナノ構造は、ヘキサマー４面体ジオメトリを欠いたＲＮＡナノ構造と比較して増強された遺伝子サイレンシング効力を提供し得る。本発明のＲＮＡナノ構造は、有利なことに、治療薬送達および細胞取り込みの一方または両方を容易にし得るナノスケールサイズを維持している。本発明のナノ構造の大きな機能性容量に起因して、将来の治療薬開発のための種々の道のいずれもが可能であり得る。これは、例えば、（ｉ）複数のｓｉＲＮＡコピーを用いた１つ、２つまたはそれ以上の遺伝子の標的化、（ｉｉ）単一のナノ構造を用いた１２個までの遺伝子の標的化（および関連する相乗効果の探索）、および（ｉｉｉ）治療的（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）機能性を維持しながら診断的要素（標的化部分、イメージングプローブなど）を含めること、の１つ以上を含み得る。
【００１２】
本発明の実施形態は、ＲＮＡスキャフォールドを含むナノ構造を提供する。スキャフォールドは、ヘキサマー４面体コアを含み得る。４面体コアは、一緒に連接された４個のヘキサマーＲＮＡナノリングを含み得る。各ヘキサマーナノリングは、以下でより詳細に記載するように、ダンベルモノマーおよび交差モノマーを含み得る。
【００１３】
各ダンベルモノマーは、第１および第２の末端を含むＲＮＡヘリックスを含み得る。各ダンベルモノマーのヘリックスは、両方の末端においてキッシングループ（kissing loop）でキャップされ得る。キッシングループは、ＲＮＡステム−ループ、ヘアピン、またはヘアピンループともいわれる。キッシングループは、同じＲＮＡ鎖の２つの領域（通常、逆方向に読まれた場合にヌクレオチド配列が相補的である）が塩基対形成して、対形成していないループにおいて終了する二重らせんを形成するときに生じる。ＲＮＡキッシング複合体（キッシング相互作用ともいう）は、１つのキッシングループにおける対形成していないヌクレオチドが、別のキッシングループにおける対形成していないヌクレオチドと塩基対形成するときに生じる。キッシングループが別々のＲＮＡ分子上に位置する場合、それらの分子間相互作用は、キッシング複合体またはキッシング相互作用と呼ばれる。全てのステム−ループヘアピンがキッシングループであるわけではない。ステム−ループヘアピンが別のステム−ループヘアピンと対形成しない場合、それはキッシングループではない。キッシング複合体は、限定するものではないが、ＲＮＡ  Ｉおよび／またはＲＮＡ  ＩＩモチーフ、ＲＮＡ  Ｉ逆（ＲＮＡ  Ｉ）および／またはＲＮＡ  ＩＩ逆（ＲＮＡ  ＩＩ）モチーフを含む種々のＲＮＡモチーフから形成され得る。
【００１４】
６個のダンベルモノマーが存在する場合、キッシング複合体の形成は、近接するヘリックスの間に約１２０度の角度をもたらし、これはナノリングに６角形の形状を提供する（Yingling et al., Nano. Lett., 7(8): 2328-2334 (2007); Lee et al., Structure, 6(8): 993-1005 (1998)）。各６角形ＲＮＡナノリングは、６個のキッシング複合体を含む。本発明の実施形態において、各ダンベルモノマーのヘリックスは、約１０塩基対（ｂｐ）〜約２０ｂｐのヘリックスである。例えば、各ダンベルモノマーのヘリックスは、約１０ｂｐ、約１１ｂｐ、約１２ｂｐ、約１３ｂｐ、約１４ｂｐ、約１５ｂｐ、約１６ｂｐ、約１７ｂｐ、約１８ｂｐ、約１９ｂｐ、もしくは約２０ｂｐ、または前記の値の任意の２つによって規定される範囲のヘリックスであり得る。各ダンベルモノマーの各キッシングループは、約５ｎｔ〜約１０ｎｔのキッシングループであり得る。例えば、各ダンベルモノマーの各キッシングループは、約５ｎｔ、約６ｎｔ、約７ｎｔ、約８ｎｔ、約９ｎｔ、約１０ｎｔ、または前記の値の任意の２つによって規定される範囲であり得る。本発明の好ましい実施形態において、各ダンベルモノマーのヘリックスは１５ｂｐヘリックスであり、そして各ダンベルモノマーの各キッシングループは７ｎｔキッシングループである。
【００１５】
ヘキサマー４面体コアは、交差モノマーをさらに含み得る。本発明の実施形態において、各交差モノマーは、第１、第２、第３、および第４のキッシングループを含む。交差モノマーキッシングループは、本発明の他の態様に関して記載されるようであり得る。
【００１６】
上記で説明されるように、キッシング複合体は、キッシングループが、相補的な配列を有する別のキッシングループと対形成するときに形成される。本発明の実施形態において、所定の６角形ナノリング中のキッシングループ（ダンベルモノマー中または交差モノマー中のいずれであっても）の各々は、異なるヌクレオチド配列を有する。従って、６角形ナノリングの各々は、６個のキッシング複合体を有し、ここで、６個のキッシング複合体の各々は、同じナノリング中の相補的なキッシングループ配列に対して対形成される特有のキッシングループ配列を含む。これに関連して、キッシングループヌクレオチド配列は、有利には、それにおいて各モノマーの同一性および位置が予め決定され得る「プログラム可能な」システムを提供する（Grabow et al., Nano. Lett., 11: 878-887 (2011)）。ナノリングは自己アセンブルされ得、ここで、キッシングループは、配列特異的に、予測されるように、互いにアニールする。ナノリング中の特有のキッシングループ配列の各々は、有利には、ナノリング中のそれぞれの相補的キッシングループ配列に対する強い親和性を有し得る。特有のキッシングループ配列は、ヘキサマーナノリングジオメトリの形成を容易にする。従って、本発明の実施形態において、各キッシングループは、ナノリングのいずれか１つにおいて特有であるヌクレオチド配列を有する。キッシングループヌクレオチド配列は所定のナノリング内で特有であり得るが、同じ特有のキッシングループヌクレオチド配列が、ヘキサマー４面体コアの複数の別々のナノリング（例えば、２、３、または４個のナノリング）に共通し得る。各キッシングループは、例えば、ＣｏｌＥ１様キッシングループであり得る。表２Ａ〜２Ｅにおいて、本発明のナノ構造において有用であり得るキッシングループ配列の例に下線を付している。
【００１７】
本発明の実施形態において、各交差モノマーは、第１、第２、第３、および第４のキッシングループならびに第１および第２のＵＡハンドル３方ジャンクション（ＵＡｈ−３ＷＪ）を含む。ＵＡｈ−３ＷＪは、例えば、Jaeger et al., Nucleic Acids Res., 37(1): 215-230 (2009)に記載されている。ＵＡｈ−３ＷＪの例の模式図を図２Ａに示す。ＵＡｈ−３ＷＪは、中央のＵ−Ａ  ＷＣ：ＨＧトランスｂｐによって特徴付けられ得、そして１４個の３級Ｈ結合および９ｎｔスタッキング相互作用を含み得る。その天然のリボソームの状況で、ＵＡｈ−３ＷＪは、一般にＴ形である、３個のヘリックスの配置を形成し得（例えば、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉにおけるＨ７５−Ｈ７６−Ｈ７９）、ここで、２個のヘリックスの同軸性スタッキングが強制され得、そして第３のステムがおおよそ９０°の角度で突出し得る。本発明の実施形態において、ＵＡｈ−３ＷＪは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ＵＡｈ−３ＷＪである。
【００１８】
各交差モノマーの第１および第２のＵＡｈ−３ＷＪは、ブリッジヘリックスによって連結され得る。第１および第２のＵＡｈ−３ＷＪを連結するブリッジヘリックスは、任意の長さ、例えば、約５ｂｐ、約６ｂｐ、約７ｂｐ、約８ｂｐ、約９ｂｐ、約１０ｂｐ、約１１ｂｐ、約１２ｂｐ、約１３ｂｐ、約１４ｂｐ、約１５ｂｐ、または前記の値の任意の２つによって規定される範囲を有し得る。好ましい実施形態において、第１および第２のＵＡｈ−３ＷＪを連結するブリッジヘリックスは、７ｂｐヘリックスであり得る。第１のＵＡｈ−３ＷＪは、各交差モノマーにおいて第２のＵＡｈ−３ＷＪに対して対称に配置され得る。本発明の実施形態による交差モノマーの例の模式図を図２Ｄに示す。
【００１９】
各交差モノマーは、文字「Ｈ」の一般的形状を有し得る。本発明の実施形態において、４個のヘキサマーＲＮＡナノリングは、「Ｈ」形交差モノマーを介して一緒に連接される。各「Ｈ」形交差モノマーは、「Ｈ」形交差モノマーを形成するように７塩基対ブリッジによって一緒に連接された２個のＵＡハンドル３方ジャンクション（３ＷＪ）を含み得る。
【００２０】
第１および第２のＵＡｈ−３ＷＪは、交差モノマーにおいて、４面体ジオメトリを提供するように配置され得る。例えば、第１のＵＡｈ−３ＷＪは、側ヘリックス（side hekix）の第１の対の間に配置され得、その各々は、独立して、約５ｂｐ、約６ｂｐ、約７ｂｐ、約８ｂｐ、約９ｂｐ、約１０ｂｐ、または前記の値の任意の２つによって規定される範囲の長さを有し得る。本発明の実施形態において、側ヘリックスの第１の対における各側ヘリックスの長さは、互いに等しくない。さらに、例えば、第２のＵＡｈ−３ＷＪは、側ヘリックスの第２の対の間に配置され得、その各々は、独立して、約５ｂｐ、約６ｂｐ、約７ｂｐ、約８ｂｐ、約９ｂｐ、約１０ｂｐ、または前記の値の任意の２つによって規定される範囲の長さを有し得る。本発明の実施形態において、側ヘリックスの第２の対における各側ヘリックスの長さは、互いに等しくない。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、第１のＵＡｈ−３ＷＪは、第１の８ｂｐ側ヘリックスと第１の６ｂｐ側ヘリックスとの間に配置され得る。さらに、第２のＵＡｈ−３ＷＪは、第２の８ｂｐ側ヘリックスと第２の６ｂｐ側ヘリックスとの間に配置され得る。特定の理論または機構に縛られるものではないが、８ｂｐおよび６ｂｐ側ヘリックスに関する第１および第２のＵＡｈ−３ＷＪのこの配置は、４面体コアの４面体ジオメトリを促進すると考えられる。
【００２２】
上記のように、各交差モノマーは、４個のキッシングループを含む。本発明の実施形態において、各交差モノマーの４個のキッシングループの第１の対は、各々、同じ第１のヌクレオチド配列のコピーを含み得る。さらに、各交差モノマーの４個のキッシングループの第２の対は、各々、同じ第２のヌクレオチド配列のコピーを含み得る。第２のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列と異なり得る。表２Ｅにおいて、本発明のナノ構造において有用であり得る交差モノマーキッシングループ配列の例に下線を付している。
【００２３】
キッシングループの第１および第２の対は、交差モノマーにおいて、４面体ジオメトリを提供するように配置され得る。本発明の実施形態において、各交差モノマーの４個のキッシングループの第１の対は、互いに対して対称に配置され得る。さらに、各交差モノマーの４個のキッシングループの第２の対は、互いに対して対称に配置され得る。
【００２４】
本発明の実施形態において、各交差モノマーは、一本ＲＮＡ鎖（single RNA strand）である。一本ＲＮＡ鎖は、任意の所望の長さを有し得る。例えば、一本ＲＮＡ鎖は、約５０〜約１５０ヌクレオチド、約６０〜約１４０ヌクレオチド、約７０〜約１３０ヌクレオチド、約８０〜約１２０ヌクレオチド、または約９０〜約１１０ヌクレオチドの長さを有し得る。本発明の実施形態において、一本ＲＮＡ鎖は、約１００ｎｔ、約１０１ｎｔ、約１０２ｎｔ、約１０３ｎｔ、約１０４ｎｔ、約１０５ｎｔ、または前記の値の任意の２つによって規定される範囲の長さを有する。好ましい実施形態において、一本ＲＮＡ鎖は、１０２ヌクレオチドの長さを有する。本発明の実施形態において、一本ＲＮＡ鎖は、フォールディングされて、交差モノマーを形成する。
【００２５】
本発明の実施形態によるヘキサマー４面体コアの例の模式図を図２Ｂに示す。図２Ｂを参照して、４面体コアは、第１（１ｂ）、第２（２ｂ）、第３（３ｂ）、第４（４ｂ）、第５（５ｂ）、および第６（６ｂ）の交差モノマーを含み得る。４面体コアは、第１（１ａ）、第２（２ａ）、第３（３ａ）、第４（４ａ）、第５（５ａ）、第６（６ａ）、第７（７ａ）、第８（８ａ）、第９（９ａ）、第１０（１０ａ）、第１１（１１ａ）、および第１２（１２ａ）のダンベルモノマーを含み得る。第１（１ａ）、第２（２ａ）、および第３（３ａ）のダンベルモノマーならびに第１（１ｂ）、第２（２ｂ）、および第６（６ｂ）の交差モノマーは、第１のヘキサマーナノリング（１）を一緒に形成する。第４（４ａ）、第５（５ａ）、および第６（６ａ）のダンベルモノマーならびに第４（４ｂ）、第５（５ｂ）、および第６（６ｂ）の交差モノマーは、第２のヘキサマーナノリング（２）を一緒に形成する。第７（７ａ）、第８（８ａ）、および第９（９ａ）のダンベルモノマーならびに第１（１ｂ）、第３（３ｂ）、および第５（５ｂ）の交差モノマーは、第３のヘキサマーナノリング（３）を一緒に形成する。第１０（１０ａ）、第１１（１１ａ）、および第１２（１２ａ）のダンベルモノマーならびに第２（２ｂ）、第３（３ｂ）、および第４（４ｂ）の交差モノマーは、第４のヘキサマーナノリング（４）を一緒に形成する。各交差モノマーは、ヘキサマーナノリングを一緒に連接するようにヘキサマーリングの２個によって共有されて、ヘキサマー４面体コアを形成する。
【００２６】
６個の交差モノマーおよび１２個のダンベルモノマーは、アセンブルして、ヘキサマー４面体コアを形成する。これに関連して、各交差モノマーの４個のキッシングループの２個、および各交差モノマーの２個のＵＡｈ−３ＷＪの１個は、ヘキサマーナノリングの第１の１個の中に配置されている。さらに、各交差モノマーのキッシングループの他の２個、および各交差モノマーのＵＡｈ−３ＷＪの他の１個は、ヘキサマーナノリングの第１の１個に近接し、そしてそれに直接連接しているヘキサマーナノリングの別の１個に中に配置されている。
【００２７】
ヘキサマー４面体コアは、３つの異なる交差モノマーヌクレオチド配列の各々の２つのコピーを含み得る。これに関連して、６個の交差モノマーの第１の対は、同じ第１の交差モノマー配列のコピーを含み得る。６個の交差モノマーの第２の対は、同じ第２の交差モノマー配列のコピーを含み得る。６個の交差モノマーの第３の対は、同じ第３の交差モノマー配列のコピーを含み得る。第１、第２、および第３の交差モノマー配列は、互いに異なり得る。本発明のナノ構造において有用であり得る交差モノマー配列の例が表２Ｅにおいて提供される。
【００２８】
ヘキサマー４面体コアは、３つの異なるダンベルモノマーヌクレオチド配列の各々の４つのコピーを含み得る。これに関連して、１２個のダンベルモノマーの第１の４個は、同じ第１のダンベルモノマー配列のコピーを含み得る。１２個のダンベルモノマーの第２の４個は、同じ第２のダンベルモノマー配列のコピーを含み得る。１２個のダンベルモノマーの第３の４個は、同じ第３のダンベルモノマー配列のコピーを含み得る。第１、第２、および第３のダンベルモノマー配列は、互いに異なり得る。本発明のナノ構造において有用であり得るダンベルモノマー配列の例が表２Ａ〜２Ｄにおいて提供される。
【００２９】
本発明のナノ構造は、種々の機能性部分のいずれかの送達のために有用であり得る。これに関連して、ナノ構造の４面体コアは、それに機能性部分が結合され得るモノマーアームをさらに含み得る。モノマーアームは、ナノ構造のナノリングのいずれかにおけるヌクレオチド配列のいずれかの伸長であり得る。４面体コアは、モノマーアームを含まなくてもよく、または任意の数のモノマーアームを含んでもよい。本発明の実施形態において、４面体コアは、約１個〜約１２個のモノマーアームを含む。例えば、４面体コアは、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、または前記の値の任意の２つによって規定される範囲を含み得る。本発明の好ましい実施形態において、４面体コアは、４個、８個、または１２個のモノマーアームを含む。ＲＮＡナノ構造への機能性部分の結合のためのモノマーアームは記載されている（例えば、Afonin et al., Nano Lett., 14: 5662-71 (2014); Grabow et al., Nano Lett., 11: 878-887 (2011)を参照のこと）。
【００３０】
本発明の実施形態において、モノマーアーム（例えば、４個、８個、または１２個のモノマーアーム）は、各々、１つ以上の機能性部分で機能付与される。機能性部分は、例えば、治療的、標的化、および／またはイメージング機能のような、任意の所望の機能を有し得る。機能性部分の例は、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）基質、アプタマー、小分子、標的化部分、イメージングプローブ、タンパク質（例えば、複合タンパク質）、ポリマー、プロドラッグ、診断剤、治療剤（例えば、化学療法剤）、医薬剤、薬物、合成有機分子、ペプチド、ビタミン、およびステロイド、蛍光色素、分割された機能性を有するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、分割リパーゼ（split lipase）、および分割ＧＦＰ（split GFP）を含み得る。治療剤（例えば、化学療法剤）の例は、ＷＯ２０１５／１７１８２７に記載されている。
【００３１】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）基質は、哺乳動物細胞に投与したときに標的遺伝子の発現の減少（例えば、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または約９０〜約１００％さえ）をもたらす、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはアンチセンスＲＮＡ、または、その部分、またはその模倣物を含み得る。典型的には、ＲＮＡｉ基質は、標的核酸分子、またはそのオルソログの少なくとも一部を含むか、または、標的核酸分子の相補鎖の少なくとも一部を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ基質は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ｍｉＲＮＡ（ｓｈＭＩＲ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）、またはアンチセンス核酸を含み得る。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、例えば、トランス作動性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）および／またはリピート関連ｓｉＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）を含み得る。別の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、例えば、低分子ヘアピン型ｍｉＲＮＡ（ｓｈＭＩＲ）を含み得る。好ましい実施形態において、ＲＮＡｉ基質は、ＤｓｉＲＮＡを含む。例えば、４面体コアは１２個のモノマーアームを含み得、ここで、１２個のモノマーアームは、各々、ＤｓｉＲＮＡで機能付与される。
【００３２】
本発明のナノ構造は、連続的な配列を有するモノマー（例えば、ダンベルモノマーまたは交差モノマー）を含み得る。これに関連して、（ａ）第１、第２、第３、第４、第５、および第６の交差モノマーの少なくとも１個、および／または（ｂ）第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、および第１２のダンベルモノマーの少なくとも１個は、連続的な配列を含み得る。連続的な配列は、５’／３’切断を有しない配列である。５’／３’切断は、それを環状化する（すなわち、配列の５’末端を配列の３’末端に連結することによって５’／３’切断を有する配列を連続的にする）ためにライゲーションされ得る。
【００３３】
本発明のＲＮＡナノ構造を、組成物、例えば、医薬組成物に製剤化し得る。これに関連して、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡナノ構造のいずれかおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明のＲＮＡナノ構造のいずれかを含む本発明の医薬組成物は、１つより多くの本発明のＲＮＡナノ構造（例えば、異なる機能性部分を含むＲＮＡナノ構造）を含み得る。あるいは、医薬組成物は、本発明のＲＮＡナノ構造を、別の薬学的に活性な薬剤（単数もしくは複数）または薬物（単数もしくは複数）、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキセート、パクリタクセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどと組み合わせて含み得る。
【００３４】
好ましくは、担体は、薬学的に許容される担体である。医薬組成物に関して、担体は、ＲＮＡナノ構造のために従来使用されているもののいずれかであり得る。投与可能な組成物を調製するための方法は、当業者に公知であるかまたは明白であり、そして例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22ndEd., Pharmaceutical Press (2012)においてより詳細に記載されている。薬学的に許容される担体は、使用の条件下で有害な副作用または毒性を有しないものであることが好ましい。
【００３５】
担体の選択は、部分的には、特定の本発明のＲＮＡナノ構造、ＲＮＡナノ構造に結合される特定の機能性部分（単数または複数）、ならびに本発明のＲＮＡナノ構造を投与するために使用される特定の方法によって決定される。従って、本発明の医薬組成物の種々の適切な処方が存在する。適切な処方は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、腫瘍内、または腹腔内投与のためのもののいずれかを含み得る。本発明のＲＮＡナノ構造を投与するために、１つより多い経路を使用することができ、そして一定の場合、特定の経路は、別の経路より速効性かつ有効な応答を提供し得る。好ましくは、本発明のＲＮＡナノ構造は、注射によって、例えば静脈内で投与される。
【００３６】
本発明の目的のために、投与される本発明のＲＮＡナノ構造の量または用量（例えば、ＲＮＡナノ構造の数）は、合理的な時間枠にわたって対象または動物において、例えば治療的または予防的応答をもたらすために十分であるべきである。例えば、本発明のＲＮＡナノ構造の用量は、投与の時から約２時間以上、例えば、１２〜２４時間またはそれ以上の期間、標的遺伝子の発現を低下させるか、または疾患（例えば、ガンもしくはウイルス性疾患）を検出、治療もしくは予防するために十分であるべきである。一定の実施形態において、期間はさらに長くあり得る。用量は、特定の本発明のＲＮＡナノ構造の効力、ナノ構造に結合される特定の機能性部分（単数または複数）、および動物（例えば、ヒト）の状態、ならびに治療しようとする動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。
【００３７】
ヒトの投薬量は、最初に、マウスにおいて使用されるＲＮＡナノ構造の量から外挿することによって決定され得る。なぜなら、当業者は、動物モデルに比較してヒトのための投薬量を修正することが当該技術分野において日常的であることを認識しているからである。一定の実施形態において、投薬量が、約１ｍｇＲＮＡナノ構造／Ｋｇ体重から約５０００ｍｇＲＮＡナノ構造／Ｋｇ体重まで；または約５ｍｇ／Ｋｇ体重から約４０００ｍｇ／Ｋｇ体重まで；または約１０ｍｇ／Ｋｇ体重から約３０００ｍｇ／Ｋｇ体重まで；または約５０ｍｇ／Ｋｇ体重から約２０００ｍｇ／Ｋｇ体重まで；または約１００ｍｇ／Ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／Ｋｇ体重まで；または約１５０ｍｇ／Ｋｇ体重から約５００ｍｇ／Ｋｇ体重までの間で変動し得ることが想定される。他の実施形態において、この用量は、約１、約５、約１０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１０５０、約１１００、約１１５０、約１２００、約１２５０、約１３００、約１３５０、約１４００、約１４５０、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００ｍｇ／Ｋｇ体重、または前記の値の任意の２つによって規定される範囲であり得る。他の実施形態において、より高い用量が使用され得ることが想定され、そのような用量は、約５ｍｇＲＮＡナノ構造／Ｋｇ体重〜約２０ｍｇＲＮＡナノ構造／Ｋｇ体重の範囲内であり得る。他の実施形態において、用量は、約８、約１０、約１２、約１４、約１６または約１８ｍｇ／Ｋｇ体重であり得る。もちろん、この投薬量は、初期臨床治験の結果および特定の患者の必要性に依存して、そのような治療プロトコルにおいて日常的に行われるように、上方または下方に調整され得る。
【００３８】
本発明のＲＮＡナノ構造の用量はまた、特定の本発明のＲＮＡナノ構造の投与に付随し得る任意の有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。典型的には、担当医師は、種々の要因（例えば、年齢、体重、全般的な健康、食事、性別、投与しようとする本発明のＲＮＡナノ構造、投与経路、および治療される疾患（例えば、ガン）の重篤度）を考慮して、それを用いて各々の個々の患者を治療する本発明のＲＮＡナノ構造の投薬量を決定する。
【００３９】
本発明のＲＮＡナノ構造は、哺乳動物において標的遺伝子の発現を調節するために有用であり得ることが意図される。これに関連して、本発明の実施形態は、哺乳動物において標的遺伝子の発現を調節する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のＲＮＡナノ構造のいずれかまたは本明細書に記載の医薬組成物のいずれかを、標的遺伝子を調節するために有効な量で投与することを含む。本発明の実施形態において、標的遺伝子の発現は、ＲＮＡナノ構造が投与される哺乳動物における標的遺伝子の発現を、ＲＮＡナノ構造が投与されていない哺乳動物における標的遺伝子の発現に比較して、増加させることによって調節される。本発明の別の実施形態において、標的遺伝子の発現は、ＲＮＡナノ構造が投与される哺乳動物における標的遺伝子の発現を、ＲＮＡナノ構造が投与されていない哺乳動物における標的遺伝子の発現に比較して、減少させるかまたは除去することによって調節される。標的遺伝子の発現の量は、当該技術分野において公知の方法によってアッセイされ得る。
【００４０】
本発明のＲＮＡナノ構造は、哺乳動物において疾患を治療または予防するために有用であり得ることもまた意図される。これに関連して、本発明の実施形態は、哺乳動物において疾患を治療または予防する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のＲＮＡナノ構造のいずれかまたは本明細書に記載の医薬組成物のいずれかを、哺乳動物において疾患を治療または予防するために有効な量で投与することを含む。
【００４１】
本発明の実施形態において、疾患はガンである。ガンは、肉腫（例えば、滑膜肉腫、骨肉腫、子宮平滑肉腫、および胞巣状横紋筋肉腫）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、肝細胞ガン、神経膠腫、頭頸部ガン、急性リンパ性ガン、急性骨髄性白血病、骨ガン、脳ガン、乳ガン、肛門、肛門管、もしくは肛門直腸のガン、眼ガン、肝内胆管ガン、関節ガン、頸部、胆嚢、もしくは胸膜のガン、鼻部、鼻腔、もしくは中耳のガン、口腔ガン、外陰部ガン、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性ガン、大腸ガン（例えば、結腸ガン）、食道ガン、子宮頸ガン、消化管カルチノイド腫瘍、下咽頭ガン、喉頭ガン、肝ガン、肺ガン、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭ガン、卵巣ガン、膵ガン、腹膜、網、および腸間膜のガン、咽頭ガン、前立腺ガン、直腸ガン、腎ガン、小腸ガン、軟部組織ガン、胃ガン、精巣ガン、甲状腺ガン、尿管ガン、および膀胱ガンのいずれかを含む任意のガンであり得る。本発明の実施形態において、ガンは乳ガンである。
【００４２】
本発明の実施形態において、疾患はウイルス性疾患である。ウイルス性疾患は、任意のウイルスによって引き起こされ得る。本発明の実施形態において、ウイルス性疾患は、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、フラビウイルス、およびカリシウイルスからなる群より選択されるウイルスによって引き起こされる。一実施形態において、ウイルス性疾患は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、水痘ウイルス、サイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、カリシウイルス、アデノウイルス、およびアレナウイルスからなる群より選択されるウイルスによって引き起こされる。
【００４３】
ウイルス性疾患は、身体の任意の部分を冒す任意のウイルス性疾患であり得る。本発明の実施形態において、ウイルス性疾患は、インフルエンザ、肺炎、ヘルペス、肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢性疲労症候群、突発性急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、胃腸炎、腸炎、心炎、脳炎、細気管支炎、呼吸器乳頭腫、髄膜炎、および単核球症からなる群より選択される。
【００４４】
本明細書において使用する場合、用語「治療する」および「予防する」ならびにそれらに由来する単語は、必ずしも１００％のまたは完全な治療または予防を意味するわけではない。むしろ、潜在的な恩恵または治療効果を有すると当業者が認識する、治療または予防の変動する程度が存在する。これに関連して、本発明の方法は、哺乳動物における疾患の治療または予防の任意のレベルの任意の量を提供し得る。さらに、本発明の方法によって提供される治療または予防は、治療または予防されるウイルス性疾患の１つ以上の状態または症状の治療または予防を含み得る。また、本明細書における目的のために、「予防」は、疾患、またはその症状もしくは状態の発生を遅延させることを包含し得る。
【００４５】
本発明の方法において言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。本明細書において使用する場合、用語「哺乳動物」は、限定するものではないが、齧歯目の哺乳動物（例えば、マウスおよびハムスター）、ならびにウサギ目の哺乳動物（例えば、ウサギ）を含む任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、食肉目（ネコ科（ネコ）およびイヌ科（イヌ）を含む）からのものであることが好ましい。、哺乳動物は、偶蹄目（ウシ科（雌ウシ）およびブタ科（ブタ）を含む）からのもの、または奇蹄目（ウマ科（ウマ）を含む）のものであることがより好ましい。哺乳動物は、霊長目、セボイド目、もしくはシモイド目（サル）、または類人猿目（ヒトおよび類人猿）のものであることが最も好ましい。特に好ましい哺乳動物はヒトである。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載の本発明のヘキサマー４面体ＲＮＡナノ構造のいずれかを産生する方法を提供する。方法は、「Ｈ」形交差モノマーを形成することを含み得る。各「Ｈ」形交差モノマーは、「Ｈ」形交差モノマーを形成するように７塩基対ブリッジによって一緒に連接された２個のＵＡハンドル３方ジャンクション（３ＷＪ）を含み得る。
【００４７】
方法は、ヘキサマーＲＮＡナノリングを形成することをさらに含み得る。各ヘキサマーＲＮＡナノリングは、「Ｈ」形交差モノマーの３個を含む。
【００４８】
方法は、ヘキサマー４面体ＲＮＡナノ構造をアセンブルすることをさらに含み得る。ヘキサマー４面体ＲＮＡナノ構造は、「Ｈ」形交差モノマーを介して一緒に連接されたヘキサマーＲＮＡナノリングの４個を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、方法は、核酸（例えば、一本鎖核酸、またはオリゴヌクレオチド）を単一の容器中で合わせること、および、配列相補性に基づいて、核酸を互いにアニールさせることを含む。いくつかの実施形態において、このアニーリングプロセスは、配列特異的結合を助けるために、上昇した温度に核酸を置くこと、および次いで温度を徐々に低下させることを含む。種々の核酸ナノ構造または自己アセンブリ方法が知られている。
【００５０】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、もちろん、いかにしてもその範囲を限定するように解釈されるべきでない。
【実施例】
【００５１】
三次元モデルを、ＲＮＡアーキテクトニクスアプローチ（RNA architectonics approach）を使用して構築した。分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを実施した。ＲＮＡスキャフォールド鎖を、ＰＣＲ増幅したＤＮＡからインビトロで転写させた。４面体ＲＮＡナノ粒子を、１ポット反応（single-pot reaction）においてアセンブルさせた。動的光散乱および原子間力顕微鏡観察を実施した。細胞培養研究、細胞取り込み研究、およびＰｌｋ１ノックダウン研究を実施した。以下の実施例１〜８において記載する実験において、以下の材料および方法を用いた。
【００５２】
三次元モデリング
三次元モデルを、ＲＮＡアーキテクトニクスアプローチを使用して構築した。ＲＮＡナノリングの以前に構築されたモデルを、４面体スキャフォールドモデルをアセンブルするための基礎として使用した。最初に、インターネット上で利用可能なＰＹＭＯＬ分子可視化プログラム（SchrodingerによるPyMOL）を使用して、４コピーのナノリングを、ｘ、ｙおよびｚ軸に沿って、適正な４面体ジオメトリに回転させた。次いで、ＵＡハンドル３方ジャンクション（タンパク質データベース（ＰＤＢ）識別：２ＡＷ４；ｎｔ  ２０９０−２０９５、２１９４−２２０１、２２２０−２２２９）を適切なリングモノマー中に挿入し、その後、ＳＷＩＳＳ  ＰＤＢ−ＶＩＥＷＥＲ（The SIB Swiss Institute of Bioinformatics、ExPASy Bioinformatics Resource Portalのウェブサイト上で利用可能）を使用して、接合部を連結するようにヘリックスセグメントを挿入した。ダイサー基質アームで機能付与された４面体スキャフォールドをモデリングするために、ナノリング面を、以前に得られたクライオ電子顕微鏡観察（ｃｒｙｏ−ＥＭ）データにフィットするダイサー基質機能付与リングモデルに置き換えた。全ての完成したモデルは、ＰＹＭＯＬ（SchrodingerによるPyMOL）を使用して得られた。
【００５３】
分子動力学シミュレーション
分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを、ＡＭＢＥＲ１４生体分子シミュレーションパッケージ（AMBER molecular simulationsウェブサイト）を用いて実施した。ＲＮＡ特異的力場ｆｆ１４ＳＢをｆｆ９９ｂｓｃ０およびχＯＬ３パラメーターとともに使用した。トポロジーおよび初期座標ファイルを、ＡＭＢＥＲ  ＬＥＡＰモジュール（AMBER molecular simulationsウェブサイト）を用いて生成した。１，１４０ｎｔおよび３６，５０４原子の４面体モデルのサイズを考慮して、ジェネラライズドボーンモデル（Generalized Born model）（ＧＢ）を利用した比較的早い陰溶媒シミュレーションを用いた。ＧＢアプローチを用いてさえ、ＭＤシミュレーションは、ＮＶＩＤＩＡ  ＴＥＳＬＡ  Ｋ４０グラフィック処理ユニット（ＧＰＵ）（NVIDIA, Santa Clara, CA）上で１．６ｎｓ／日で進行した。ＬＥＡＰの固有Ｂｏｒｎ半径パラメーターｍｂｏｎｄｉ３およびｉｇｂ＝８  Ａｍｂｅｒ  ＭＤフラッグを含めて、最新のＧＢ−ｎｅｃｋ２パラメーターを使用した（AMBER molecular simulationsウェブサイト）。溶質（この場合、ＲＮＡナノ分子）の陰溶媒動力学陽原子表示（implicit solvent dynamics explicit atomic representation）を、極性および非極性項の合計に基づく溶媒自由エネルギー近似と組み合わせる。ＭＤシミュレーションは、３００Ｋの温度を維持するように１．０ｐｓ−１の衝突頻度でランジュバンサーモスタットを用い、そして２ｆｓの時間ステップおよび１．０のデバイ−ヒュッケル一価塩スクリーニング濃度でランした。非結合相互作用に対して距離カットオフをかけなかった（カット＝９９９）。全ての水素結合を拘束するためにＳＨＡＫＥアルゴリズムを用いた。６工程の平衡化プロトコルを用いた。まず、初期モデルをエネルギー最小化でほどいた。次に、１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Å２の調和拘束（harmonic restraint）をＲＮＡに適用して、３００Ｋのプロダクションラン標的温度（production run target temperature）への加熱を実施した。これらの最初の２工程の後に、調和拘束を１０．０（０．２５ｎｓ）から１．０、０．１、および０．０１ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Å２（０．５ｎｓ）まで、２．０ｎｓの総平衡化時間で徐々に低下させた、短いＭＤ段階を行った。非拘束２５０ｎｓ長プロダクションＭＤシミュレーションを実施した。
【００５４】
結果の分析を、Ａｍｂｅｒのｃｐｐｔｒａｊプログラムを利用したスクリプトを用いて実施した。平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）計算（ｃｐｐｔｒａｊを使用）は、第１のＭＤトラジェクトリフレーム、および完全な４面体のための骨格の全Ｃ４’原子（１，１４０）、および各ヘキサマー面についての２６４個の原子（すなわち、純粋なダンベル、および４個の面を連接する「Ｈ」形ビルディングブロックの面特異的ダンベル部分について、６×４４個の骨格原子、）のコンホメーションに関する平衡化後ＭＤトラジェクトリ（プロダクションラン）に基づいた。回転半径の計算を、ｃｐｐｔｒａｊにより（コマンドｒａｄｇｙｒ）、全体のＭＤプロダクショントラジェクトリについて、ならびにダイサー基質アームを有する４面体スキャフォールドのエネルギー最小化モデルについて、モデルの全ての原子を含めて、実施した。
【００５５】
ＲＮＡ合成
ＲＮＡスキャフォールド鎖を、ＰＣＲ増幅したＤＮＡからインビトロで転写した。ＰＣＲのための鋳型およびプライマーを、Integrated DNA Technologies, Skokie, ILから購入した。一般に、インビトロ転写反応を、約５０ｐｍｏｌのＤＮＡ鋳型とともに５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２．５ｍＭ  ＮＴＰ、２ｍＭジチオスレイトール、０．０１ｕ／μＬ無機ピロホスファターゼを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０緩衝液中で、自家製Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して実施した。転写産物を、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用して精製した。生成物バンドをゲルから切り出し、そして一晩４℃で、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５緩衝液中で、８００ｒｐｍで振盪しながら溶出した。翌日、ＲＮＡをエタノール沈殿に供し、そしてエンドトキシン不含水中で再構成した。ダイサー基質ＲＮＡを形成させるために使用した短いセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Integrated DNA Technologies（Skokie, IL）から、ＲＮａｓｅ不含ＨＰＬＣ精製で購入した。
【００５６】
ナノ粒子アセンブリ
４面体ＲＮＡナノ粒子を、１ポット反応においてアセンブルさせた。モノマー鎖を化学量論的量で合わせ、９４℃まで２分間加熱し（約９０℃〜約９４℃の範囲を使用し得る）、続いて氷上で５分間急冷して、構造化されたモノマー単位を形成させた（工程１）。次いで、アセンブリ緩衝液を１×濃度（２ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１×ＴＢ緩衝液［８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸、ｐＨ８．２］）に添加し、そしてサンプルを４５℃に３０分間加熱して、分子間接触を通したアセンブリを行った（工程２）。４面体ナノ粒子のアセンブリを、４．５％アクリルアミド非変性ＰＡＧＥ（１×ＴＢ、２ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２）によって評価した。ＲＮＡナノリング（表３Ａ）およびナノキューブ（表３Ｂ）を、Afonin, et al.,  Nat. Protoc. 6(12): 2022-2034 (2011)に以前に記載されたように、同一の１×アセンブリ緩衝液中での１ポット反応を使用してアセンブルさせた。細胞培養実験の目的のために、全てのＲＮＡナノ粒子を、４．５％アクリルアミド非変性ＰＡＧＥ（１×ＴＢ、２ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２）上でゲル精製した。生成物バンドをゲルから切り出し、そして１×アセンブリ緩衝液中で一晩４℃で溶出した。バンド強度の定量を、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ５．１ソフトウェアを使用して実施した。
【００５７】
コア４面体スキャフォールドの同時転写アセンブリを、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２．５ｍＭ  ＮＴＰ、２ｍＭジチオスレイトール、０．０１ｕ／μＬ無機ピロホスファターゼ、および自家製Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０緩衝液中で実施した。反応物は、３個のダンベルモノマーおよび３個のＨ形交差モノマーを含む、６個の異なるＤＮＡ鋳型を含有した（表３Ｃを参照のこと）。各々の個々の鋳型の転写効率および最終アセンブリにおける各モノマーの化学量論に基づいて、各ＤＮＡ鋳型の量は、１０μＬの反応物当たり２〜１０ｐｍｏｌの間で変動した。転写反応を３７℃で４時間進行させた。４時間後に、転写混合物のアリコートを４．５％アクリルアミドネイティブゲル（２ｍＭ  Ｍｇ２＋）にロードして、個別に精製されたモノマーの熱変性／再生によって生成された対照アセンブリとともに、４面体スキャフォールドのアセンブリについてチェックした。
【００５８】
動的光散乱
サンプル（７５μＬ）を、アセンブルされたナノ粒子の濃度１μＭで調製した。アセンブルさせてすぐに、サンプルを１４，０００×ｇで１時間４℃で遠心分離して、いかなるデブリもペレット化させた。遠心分離の後、上の７０μＬをサイズ測定（sizing）のためにキュベットに移した。サイズ測定実験を、ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ  ＮＡＮＯ  ＺＳ（Malvren Instruments, Malvern, UK.）を使用して実施した。粒子サイズを、３つの別々の測定値からの平均±測定値の標準偏差として報告する。
【００５９】
原子間力顕微鏡観察
原子間力顕微鏡観察（ＡＦＭ）基板を、Lyubchenko et al., Methods, 54(2): 274-283 (2011)に記載のように調製した。簡潔に記載すると、１００μＬの１６７μＭ  １−（３−アミノプロピル）シラトラン（ＡＰＳ）を、新鮮に切断したＶ−１グレードのマイカディスク（Ted Pella Inc., Redding, CA）上に沈着させ、カバーし、そして室温で２０分間インキュベートした。次いで、ディスクをＰＩＣＯ−ＰＵＲＥ水（Hydro, Duram, NC）下で十分にリンスし、窒素流下で乾燥させ、そして真空下に少なくとも２０分間置いた。基板を、使用するまで乾燥ボックス中で貯蔵した。
【００６０】
ＲＮＡ構築物を、アセンブリ緩衝液中で１０ｎＭに希釈した。次いで、２０μＬの１０ｎＭ溶液を、新鮮に調製したＡＰＳマイカ基板上に沈着させ、そして３分間室温でインキュベートし、ＰＩＣＯ−ＰＵＲＥ水（Hydro, Duram, NC）中でリンスし、そしてイメージングの直前に圧縮窒素で乾燥させた。
【００６１】
構築物のＡＦＭイメージを、ＡＣ２４０ＴＳ−Ｒ３プローブ（Olympus, Center Valley, PA）を使用する、環境タッピングモード（ambient tapping mode）で作動するＣＹＰＨＥＲ−ＶＲＳ  ＡＦＭビデオレートＡＦＭ（Asylum Research, Santa Barbara, CA）を使用して収集した。イメージを、Asylumのソフトウェアを使用して処理および分析した。簡潔に記載すると、生イメージを一次平板化して、サンプルの傾きを取り除き、そして単一の構築物をイメージからセグメント化した（凝集物および不完全にアセンブルした粒子を分析から除外した）。各々のセグメント化された粒子について、特徴的な長さ、面積、高さ、およびそれらの値から導き出される特性を測定し、そしてソフトウェアの粒子分析モジュールによって計算した。報告される直径は、セグメント化された粒子のものに等しい周囲長を有する円の直径である。測定される、構築物の平面寸法は、チップの広がりに起因して、真の値より大きい。プローブチップは、７ｎｍの公称半径を有する。
【００６２】
細胞培養研究
本研究のために使用したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１００ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（Millipore Sigma, Kankakee, IL）中で培養し、そして加湿インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。別段の記述がない限り、トランスフェクション反応物を以下のように調製した。ｅＧＦＰサイレンシング研究のために、ｅＧＦＰを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、２４ウェルプレート中に、ウェル当たり３０，０００細胞で、トランスフェクションの２４時間前に播種した。２０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉａ（Thermo Fisher）中２μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００トランスフェクション試薬（Thermo Fisher, Waltham, MA）のアリコートを調製し、それにＲＮＡサンプルを添加し、そして２０分間室温で複合体形成させた。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉａ（Thermo Fisher）を最終体積５００μＬまで添加し、増殖培地をウェルから吸引し、そしてＲＮＡ／Ｌ２Ｋ／ＯＰＴＩＭＥＭトランスフェクションサンプルを細胞に添加した。トランスフェクションを３７℃で４時間行い、その後、トランスフェクション培地を除去し、そして完全増殖培地に置き換えた。トランスフェクションの３日後に、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、プレートからはずし、そしてｅＧＦＰ蛍光を、ＢＤ  ＡＣＣＵＲＩ  Ｃ６フローサイトメーター（BD Biosciences US, San Jose, CA）を使用して評価した。
【００６３】
細胞取り込み研究
細胞取り込み研究を、非ｅＧＦＰ発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を使用して実施した。細胞を、２４ウェルプレート中に、ウェル当たり５０，０００細胞で、トランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクション実験を、上記のように準備した。トランスフェクションの４時間後に、トランスフェクション培地を除去し、細胞をはずし、そして細胞取り込みの程度を、ＢＤ  ＡＣＣＵＲＩ  Ｃ６フローサイトメーター（BD Biosciences US）を使用して細胞の６−ＦＡＭ蛍光を測定することによって評価した。
【００６４】
Ｐｌｋ１ノックダウン研究
Ｐｌｋ１ノックダウン研究を、非ｅＧＦＰ発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を使用して実施した。細胞を、９６ウェルプレート中に、７，５００細胞／ウェルで、トランスフェクションの２４時間前に播種した。１５μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉａ（Thermo Fisher）中１．５μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００トランスフェクション試薬（Thermo Fisher）のアリコートを調製し、それにＲＮＡサンプルを添加し、そして２０分間室温で複合体形成させた。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉａ（Thermo Fisher）を最終体積３００μＬまで添加し、増殖培地をウェルから吸引し、そしてＲＮＡ／Ｌ２Ｋ／ＯＰＴＩＭＥＭトランスフェクションサンプルを細胞に添加した。トランスフェクションを３７℃で４時間行い、その後、トランスフェクション培地を除去し、そして完全増殖培地に置き換えた。トランスフェクションの３日後に、細胞生存率を、ＶＩＡＳＴＡＩＮ  Ｈｏｅｃｈｓｔ／ＰＩ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA）を使用して細胞を染色することによって評価し、そしてＣＥＬＩＧＯ  ＩＭＡＧＥサイトメーター（Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA）を使用してイメージングした。染色およびイメージングを、製造業者の説明書に従って実施した。サンプルについての相対的細胞生存率を、モック（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉａのみ）トランスフェクションを受けたサンプルに関しての生存細胞の割合として計算した。
【００６５】
実施例１
本実施例は、本発明の４面体ナノ粒子の設計および計算モデリングを示す。
【００６６】
４面体スキャフォールドを、ＲＮＡアーキテクトニクスアプローチを使用して設計した。ここで、天然に生じる構造モチーフを、分子間アセンブリについての特異的ジオメトリおよび接触を規定するために使用する。４面体スキャフォールドのモノマー単位、ならびにモノマー自己アセンブリの方法は、Grabow, et al., Nano Lett., 11(2): 878-887 (2011)、およびYingling, et al., Nano Lett., 7(8): 2328-2334 (2007)に記載のような、以前に特徴付けられたＲＮＡナノリングの設計および構造に基づいた。ＲＮＡナノリングは、図１Ａおよび１Ｂに示すように、逆位ＣｏｌＥ１様キッシング複合体の形成を通してアセンブルする６個のダンベル形モノマー単位を含んだ。各ダンベルモノマーは、両方の末端において７ヌクレオチド（ｎｔ）ＣｏｌＥ１様キッシングループでキャップされた、中央の１５塩基対（ｂｐ）ヘリックスを含んだ。キッシング複合体の形成は、近接するヘリックス間に約１２０度の角度をもたらした（図１Ｂ）。これは、６個のモノマーが存在する場合に、ＲＮＡナノリングに６角形の形状を与える。ナノリングを規定する６個のキッシング複合体の各々は、その一次ヌクレオチド配列が異なり、その結果、各モノマー単位の同一性および位置が予め決定された完全にプログラム可能なシステムがもたらされる。
【００６７】
新たに開発された４面体スキャフォールドは、４個の改変されたＲＮＡナノリングから構造化された（図２Ｂ）。４個のナノリングの各々は、完全な本発明の４面体構造の個々の面を含んだ。各ナノリング面は、非共有的キッシング複合体形成を通してアセンブルされたが、各々の面は、新たに設計されたモノマー単位の組み込みを通して互いに共有的に繋ぎ止められた。新たな「Ｈ」形交差モノマーは、ＲＮＡの一本鎖としてフォールディングされ、そして、３Ｄ空間では近接していたが、２個の別々のナノリング面の一部としてアセンブルされた２個のダンベルモノマーに置き換わった。各交差モノマーは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ由来のＵＡハンドル３方ジャンクション（ＵＡｈ−３ＷＪ）を２個含む（図２Ａ）。ＵＡｈ−３ＷＪを選択した。なぜなら、この３ＷＪは、超分子ＲＮＡナノ構造の状況で構造的に強固なモノマーを形成することができると仮定されたからである。１個のＵＡｈ−３ＷＪが、最終的に新たな交差モノマーに置き換えられた近接するダンベルの各々に組み入れられた（表３Ｃ）。これらの３ＷＪから発出して、２個の近接するダンベルの間のギャップにまたがる７ｂｐヘリックスが挿入された。その結果は、２個の４４ｎｔダンベルモノマーに置き換わった、単一の１０２ｎｔ  ＲＮＡ鎖であった。各交差モノマー単位は、４個のキッシングループを含んでいた。これは、２個の隣接するナノリングのアセンブリ中に組み込まれることを可能にし、従って、アセンブルされた４面体構造において隣接する面を共有的に連接した（図２Ｂ）。ナノリングは６角形のジオメトリを示すので、ナノリング間のネガティブスペースは３角形であり、これは、アセンブルされた構造に、トランケートされた４面体ジオメトリを与えた。合計で、アセンブルされた４面体スキャフォールドは、１２個のダンベルモノマーおよび６個の「Ｈ」形交差モノマーを含んだ（図２Ｂ、表３Ｃ）。
【００６８】
４面体スキャフォールドの三次元モデルを、ＳＷＩＳＳ  ＰＤＢ−ＶＩＥＷＥＲ（The SIB Swiss Institute of Bioinformatics、ExPASy Bioinformatics Resource Portalのウェブサイト上で利用可能）、およびＰＤＢにおいて利用可能な既存のＲＮＡ構造データを使用して、手動で構築した。隣接するナノリング面を連結するために必要とされる交差モノマーを構築するために、近接するダンベルモノマーに沿った種々の位置で、ＵＡｈ−３ＷＪを挿入およびモデリングした。連結されたリングを４面体ジオメトリの角度にするために、３ＷＪを、１塩基対（ｂｐ）ずつダンベルモノマーを下ってスライドさせて、３ＷＪの至適な方向を決定した（図２Ｃ、２Ｄ、および２Ｅ）。ナノリング面の４面体ジオメトリを促進するために有利な３ＷＪの位置は、接合部の両側に８ｂｐおよび６ｂｐのヘリックスを有することが見出された（図２Ｄ）。交差モノマーが１８０°回転され、そして同一の構造を維持することができるように、２個の３ＷＪは、ダンベルエレメント内で対称に配置された。ダンベルエレメントの両方が同じ２個のループ配列をコードするように、各交差モノマー内に組み込まれる４個のキッシングループ配列は、対称に配置された。これにより、各々の特有の交差モノマーが、各ナノリング面内で同じ位置を占めることが確実にされ、そして最小数の特有のキッシング複合体配列で、構築物アセンブリに最大の程度のプログラム可能な制御を与えた。３ＷＪおよびキッシングループ配列の対称性はまた、交差モノマーが、より大きなアセンブリに対して相対的に短いジャンクションにまたがるヘリックスの位置を変えることなしに、いずれの可能な方向でも（０°または回転した１８０°）アセンブルすることを可能にした。機能付与された４面体ナノ粒子の３’ダイサー基質アームのモデリングは、Afonin et al., Nano Lett 14(10): 5662-5671 (2014)に記載のヘキサマーナノリングから発出するダイサー基質アームの方向に基づいた。完成した初期モデルを、それから一次ヌクレオチド配列を設計する二次構造ダイアグラムを描くために使用した。規定された配列制約は、ＵＡｈ−３ＷＪモチーフ、ならびに６個のＣｏｌＥ１様キッシング複合体を含んだ。次いで、個々のモノマー単位の適正な二次構造フォールディングを促進するように、ヘリックス領域の配列を設計した。
【００６９】
実施例２
本実施例は、分子動力学シミュレーションが、本発明の４面体ナノ粒子について、構造的に頑強なスキャフォールドを示唆することを示す。
【００７０】
４面体スキャフォールドの構造的完全性を研究するために、陰溶媒分子動力学（ＭＤ）を使用した。構築されたモデルに対して初期最小化を実施し、続いて２５０ｎｓのＭＤランを行った。ＭＤランの過程にわたって、４面体スキャフォールドはインタクトで、かつ大きな構造摂動に対して耐性なままであり、１０．９Åの平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を維持した。いくらかの構造的変形が、個々のモノマー単位内で観察され、そして理想的なヘキサマージオメトリから離れてナノリング面の歪みをもたらした。しかし、これらの歪みは、ナノ粒子アセンブリを容易にするキッシング複合体を破壊するために十分には著しくなかった。ＭＤランの２５ｎｓ毎に取られた構造スナップショットのオーバーレイは、個々のモノマーの明確な運動が存在する一方で、４面体ジオメトリは終始持続することを強調した。ランの１３６．７４ｎｓで得られた最大ＲＭＳＤ構造（１６．２Å）でさえ、初期最小化モデルに高度に類似した構造を示した。これは、この４面体超分子構造が、著しい熱力学的安定性を示すようであることを示唆する。最小ＲＭＳＤ構造（７．７０Å）は、ランの約９５ｎｓで得られた。
【００７１】
一本ＲＮＡ鎖が２個のナノリングのアセンブリ中に組み込まれる、３ＷＪ含有交差モノマーの使用に起因して、図３Ａ〜３Ｄに示すように、４個のナノリング面の間での５’／３’鎖切断の分布は等しくない。上記のように、交差モノマーの対称性の設計は、各々が２つの可能な方向（０°または回転した１８０°）でアセンブルし得ることを意味し、これは、その５’／３’鎖切断が、その中にモノマーが組み込まれる２個のナノリングアセンブリのいずれか一方に存在し得ることを意味する。各ナノリング面はアセンブルするために３個のダンベルモノマーを必要とするので、これらのダンベルモノマーに起因する５’／３’鎖切断の数は各面において等しい。しかし、アセンブルされた４面体は、４個のナノリングを一緒に連接するために６個の交差モノマーを利用するので、交差モノマーに起因する５’／３’切断の３つの異なる分布が可能である（ダンベルモノマーに起因する５’／３’切断は各面において等しく；各々は３個のダンベル切断を含む）（図３Ａ〜３Ｄ）。交差モノマー５’／３’切断の１つの可能な分布は、各ナノリング面が異なる数の５’／３’切断を有する４面体アセンブリである：第１の面において３個の切断、第２の面において２個の切断、第３の面において１個の切断、第４の面において切断無し（３、２、１、０分布、図３Ａ）。しかし、アセンブリが２個の鎖切断を有する３個の面を含み、第４の面はいかなる交差モノマー鎖切断も含まないこと（２、２、２、０分布、図３Ｂ）、または２個の面が各々２個の差切断を有し、そして２個の面が各々１個を有するというシナリオ（２、２、１、１分布、図３Ｃ）も可能である。
【００７２】
４面体スキャフォールド全体についての総ＲＭＳＤのモニタリングに加えて、各々の個々のナノリング面のＲＭＳＤもまた、ＭＤランの過程にわたって検討した（表１）。ＭＤシミュレーションのために使用した３Ｄモデルは、交差モノマーに付随する５’／３’鎖切断の３、２、１、０分布を含んだ（図３Ａ）。しかし、ナノリング内の交差モノマー５’／３’切断の数は、ＲＭＳＤによって測定したところ、ＭＤの過程にわたって、構造的歪みの程度に対する相関を示さなかった。これは、アセンブリについての５’／３’鎖切断の特定の分布に向けた熱力学的バイアスは存在しなさそうであること、および５’／３’鎖切断の分布は、４面体アセンブリの安定性に有意には影響しなさそうであることを示唆する。交差モノマー構造、全体の粒子構造、およびプログラム可能なモノマー単位の相対的位置は、交差に付随する５’／３’鎖切断の位置の変化によって影響されない。
【００７３】
【表１】
2021524735.tif 000003
【００７４】
実施例３
本実施例は、本発明の４面体スキャフォールドのアセンブリおよび特徴付けを示す。
【００７５】
コア４面体スキャフォールドは、ダンベルモノマー対交差モノマー  ２：１の化学量論を使用して、６個の特有のＲＮＡ配列からアセンブルされる（表３Ｃ）。４面体コアをアセンブルするために６個の特有な配列のみが使用されるので、４個のナノリング面の各々は、モノマーおよびキッシングループの組成に関して同一である。４面体スキャフォールドは、アセンブルされる個々のナノリングに使用されるプロトコルを厳密に反映する１ポット反応（one-pot reaction）においてアセンブルされ得る。モノマー鎖をその化学量論的量で混合し、熱変性し、氷上で急冷して、分子内二次構造形成を促進し、続いて、４５℃でインキュベートして、スキャフォールドの超分子アセンブリをさせた。非変性ＰＡＧＥによって評価したスキャフォールドアセンブリは、この１ポットプロトコルが単一のアセンブリ産物を生じさせたことを示した。インキュベーション工程のための４５℃より高いかまたは低い温度は、スキャフォールドアセンブリに有害であるようであった。興味深いことに、電気泳動の間にウェルに固着することが観察される材料は、ミスフォールディングされたかまたは大きなオリゴマーの構造ではなさそうである。それどころか、それらは、おそらく４面体ナノ構造の大きなサイズに起因して、ゲル／緩衝液境界面において凝集し、さらなる材料がゲルに入ることを妨げる、適正にアセンブルされた構造であるようであった。
【００７６】
４面体スキャフォールドはまた、同時転写アセンブリアプローチを使用してアセンブルされ得る。ここで、６個のモノマー配列をコードする６個のＤＮＡ鋳型は、単一の反応容器中で同時に転写され、その中でそれらは規定されたナノ構造にアセンブルする。４面体スキャフォールドは転写の間に３７℃で等温でアセンブルするが、アセンブリ収率は、転写後に温度を４５℃に上昇させることによってわずかに改善されるようであった。同時転写アセンブリの場合、反応混合物中の個々の鋳型の濃度は、最終アセンブリ中の転写されるモノマー単位の比率に対して化学量論的ではない。なぜなら、各ＤＮＡ鋳型は、異なる効率で転写されるからである。鋳型濃度および緩衝液条件の至適化が、完全な、適正にアセンブルされたスキャフォールドの収率を増強するために必要とされる。
【００７７】
アセンブルされた４面体スキャフォールドの検証および特徴付けを、いくつかの技術を使用して実施した。非変性ＰＡＧＥによる最初の特徴付けは、コアスキャフォールドのアセンブリが、単一の規定された生成物を生成したことを示した。これは、動的光散乱（ＤＬＳ）測定によって検証され、ここで、単一サイズのピークが、測定されたシグナルの約９０％を占めた。これらのＤＬＳ測定は、コア４面体スキャフォールドが約２５ｎｍの水力学的直径を有することを示した。これは、スキャフォールドを、分子動力学シミュレーションの過程にわたる３Ｄモデルの平均回転半径として計算される、予想される２１．８ｎｍ±０．５の直径よりもわずかに大きくした（表４）。コアスキャフォールドの可視化を、ＡＦＭを使用して実施し、そしてこれは、相対的に均一なサイズおよび形状を示す分離したナノスケールの物体の形成をさらに検証した（図４Ａ〜４Ｄおよび１２）。
【００７８】
ＡＦＭによってイメージングされた７２個の非重複ナノ構造のさらなるサイズ測定分析により、吸着された４面体スキャフォールドが、２４．６±３．４ｎｍの平均長さおよび２２．５±３．２ｎｍの幅を有する長方形であることが結論付けられた。これは、２２．５ｎｍ±１．８の平均等価直径を有する円に相当し（図７、１１、および１２）、３Ｄモデリングに基づく予測されるスキャフォールドサイズ、およびＤＬＳによって測定される水力学的直径の両方とよく一致している。
【００７９】
実験はまた、４面体スキャフォールドが、２個のナノリングを一緒に連接するために単一の交差モノマーを使用してアセンブルされる、より単純な２ナノ構造よりも熱力学的に安定であることを示す。ナノリング「ダイマー」は、４個のリング構造からアセンブルされる、より複雑な三次元４面体構造よりも、熱融解に対して感受性である。
【００８０】
総合すると、コアスキャフォールドの特徴付けは、分離した安定な４面体ナノ構造の頑強なアセンブリを示唆する。
【００８１】
実施例４
本実施例は、ダイサー基質ｓｉＲＮＡでの本発明の４面体スキャフォールドの機能付与を示す。
【００８２】
４４ｎｔダンベルモノマー鎖を、ダンベルの５’または３’末端に付加されたさらなる配列エレメントを含む配列で置換することによって、４面体ナノ粒子に機能付与することができる（表３Ｃ）。１個、２個、または３個全てのダンベルモノマーの、その３’末端にｓｉＲＮＡアンチセンス伸長を含む配列での置換は、対応するセンスコード鎖がアセンブリ混合物中に存在するときに、それぞれ４個、８個または１２個のダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）を有する４面体ナノ粒子を生成する。得られる１２個のＤｓｉＲＮＡ修飾４面体ナノ粒子もまた、裸コアスキャフォールドに対して実施したものと同一のＤＬＳ特徴付けに供した。完全にＤｓｉＲＮＡ機能付与された粒子は、ＤＬＳによって決定したところ、３２．８ｎｍ±０．５の水力学的直径を示し、これは、機能付与されたナノ粒子の３Ｄモデルから予測される直径と一致する。コアスキャフォールドの場合と同様に、ＤｓｉＲＮＡで機能付与された４面体ナノ粒子は、非変性ＰＡＧＥ、およびＤＬＳ実験の間に観察された単一ピークの両方によって示されるように、アセンブリに際して単一の分離した種を形成するようである。
【００８３】
実施例５
本実施例は、本発明の４面体ナノ粒子が、増強されたＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングを引き起こすことを示す。
【００８４】
ＲＮＡｉベースの治療薬送達のためのスキャフォールドとして使用される４面体ナノ粒子の潜在力を、まず、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を安定に発現する培養ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳ガン細胞中へのトランスフェクションによって評価した。ｅＧＦＰを標的にするＤｓｉＲＮＡを持つ４面体ナノ粒子を、遊離ＤｓｉＲＮＡに加えて、以前に開発されたＲＮＡナノリングおよびＲＮＡナノキューブ送達スキャフォールドと比較した（図５Ａ）。等モル濃度のアセンブルされた粒子を用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のトランスフェクションは、ｅＧＦＰサイレンシングに関して、４面体ＮＰが、ナノリング、ナノキューブ、および遊離ＤｓｉＲＮＡ二重鎖より優れていることを明らかにした（図５Ａ、左）。しかし、送達される材料の濃度を、アセンブルされる粒子に対して規準化した場合、４面体ＮＰは、リングおよびキューブと比較して、２倍の数のＤｓｉＲＮＡ二重鎖を（１２対６）、そして遊離ＤｓｉＲＮＡ単独より１２倍多くを有効に送達する。利用可能なＤｓｉＲＮＡ濃度におけるこの食い違いを説明するために、さらなるトランスフェクション実験を、規準化された濃度のＤｓｉＲＮＡを用いて実施した。全ての１個の４面体ナノ粒子について、２倍量のナノリングまたはナノキューブナノ粒子を使用し、トランスフェクション混合物中に存在するＤｓｉＲＮＡ二重鎖の数を均一にした。ナノリングおよびナノキューブの濃度を２倍にした後でさえ、４面体ナノ粒子は、試験した他の構築物より高い程度のｅＧＦＰサイレンシングを示した（図５Ａ、右）。注目すべきことに、フローサイトメトリーによって評価したところ、３つ全てのナノ粒子は、等モル濃度の遊離ＤｓｉＲＮＡより大きな、ｅＧＦＰ発現のサイレンシングを示す。
【００８５】
２つの可能なシナリオが、４面体ナノ粒子について観察された、増加したＲＮＡｉ効力を説明し得る：（１）単一のナノ粒子に送達されるダイサー基質ｓｉＲＮＡの数の増加が、そのサイレンシング効力を増強し得る、または（２）スキャフォールドのなんらかの物理的特徴（サイズ、形状、ＤｓｉＲＮＡの相対的位置など）が、それによってその修飾ＤｓｉＲＮＡが最終的にＲＮＡｉ経路に入る効率に影響を及ぼす。単一のナノ粒子が持つＤｓｉＲＮＡの数がその下流のＲＮＡｉの効力に影響を及ぼす可能性に、４面体、ナノリングおよびナノキューブナノ粒子を、各ナノ粒子が４個のダイサー基質ｓｉＲＮＡのみで機能付与されるようにアセンブルすることによって取り組んだ。
【００８６】
以下の表２Ａ〜２Ｊは、本研究において使用したＲＮＡ配列（名称および配列番号によって示す）を提供する。
表２Ａは、ナノリングダンベルスキャフォールドモノマーを提供する（５’から３’）。表２Ａにおいて、キッシングループ配列に下線を付す。
【００８７】
【表２】
2021524735.tif 000004
【００８８】
表２Ｂは、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）ＤｓｉＲＮＡアンチセンスで機能付与されたナノリングダンベルモノマーを提供する（５’から３’）。表２Ｂにおいて、キッシングループ配列に下線を付し；ｅＧＦＰアンチセンス配列を太字で示す。
【００８９】
【表３】
2021524735.tif 000005
【００９０】
表２Ｃは、陰性対照（ｎｃｌ）ＤｓｉＲＮＡアンチセンスで機能付与されたナノリングダンベルモノマーを提供する（５’から３’）。表２Ｃにおいて、キッシングループ配列に下線を付し；ｎｃｌアンチセンス配列を太字で示す。
【００９１】
【表４】
2021524735.tif 000006
【００９２】
表２Ｄは、ポロ様キナーゼ１（ｐｌｋ１）ＤｓｉＲＮＡアンチセンスで機能付与されたナノリングダンベルモノマーを提供する（５’から３’）。表２Ｄにおいて、キッシングループ配列に下線を付し；ｐｌｋ１アンチセンス配列を太字で示す。
【００９３】
【表５】
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【００９４】
表２Ｅは、４面体ナノ粒子「交差」モノマーを提供する（５’から３’）。表２Ｅにおいて、キッシングループ配列に下線を付し；接合部配列をイタリックで示す。
【００９５】
【表６】
2021524735.tif 000008
【００９６】
表２Ｆは、ナノキューブスキャフォールドモノマーを提供する（５’から３’）。
【００９７】
【表７】
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【００９８】
表２Ｇは、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）ＤｓｉＲＮＡアンチセンスで機能付与されたナノキューブモノマーを提供する（５’から３’）。ｅＧＦＰアンチセンス配列を太字で示す。
【００９９】
【表８】
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【０１００】
表２Ｈは、陰性対照（ｎｃｌ）ＤｓｉＲＮＡアンチセンスで機能付与されたナノキューブモノマーを提供する（５’から３’）。表２Ｈにおいて、ｎｃｌアンチセンス配列を太字で示す。
【０１０１】
【表９】
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【０１０２】
表２Ｉは、ポロ様キナーゼ１（ｐｌｋ１）ＤｓｉＲＮＡアンチセンスで機能付与されたナノキューブモノマーを提供する（５’から３’）。表２Ｉにおいて、ｐｌｋ１アンチセンス配列を太字で示す。
【０１０３】
【表１０】
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【０１０４】
図２Ｊは、対応するＤｓｉＲＮＡセンスおよび蛍光標識鎖を提供する（５’から３’）。表２Ｊにおいて、（ｐ）は５’一リン酸を示し；ｄＮはデオキシヌクレオチドを示す。
【０１０５】
【表１１】
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【０１０６】
以下の表３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、本明細書に記載の種々のＲＮＡナノ構造をアセンブルするために使用したモノマーを提供する。アセンブルされたナノ粒子当たりのコピー数を各鎖について示す。表３Ａ〜３Ｃにおいて言及されるモノマーの各々についての配列番号は、表２Ａ〜２Ｊにおいて提供される。
【０１０７】
表３Ａは、ナノリング構造を提供する。
【０１０８】
【表１２】
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【０１０９】
表３Ｂは、ナノキューブ構造を提供する。
【０１１０】
【表１３】
2021524735.tif 000015
【０１１１】
表３Ｃは、４面体構造を提供する。
【０１１２】
【表１４】
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【０１１３】
以下の表４は、対応する三次元モデルの回転半径測定に基づく、４面体スキャフォールドおよび機能付与４面体ナノ粒子のサイズ概算値を提供する。
【０１１４】
【表１５】
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【０１１５】
等モル濃度のナノ粒子（およびそれゆえ等しいＤｓｉＲＮＡ）を用いたトランスフェクションの後、４面体ＮＰは、等しい数のＤｓｉＲＮＡアームを持つナノリングおよびナノキューブと比較して、優れたｅＧＦＰのノックダウンを再び示した（図５Ｂ）。これは、４面体ナノ粒子のなんらかの物理的特徴が、その増加したサイレンシング効力に寄与していることを示唆する。
さらなる対照遺伝子サイレンシング実験を実施して、ｅＧＦＰ蛍光を測定した。いかなるＤｓｉＲＮＡ伸長も無しのナノ粒子を、ｅＧＦＰを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳ガン細胞中にトランスフェクトした。詳細には、４面体ナノ粒子、ナノキューブ、ナノリング、および対照（ＲＮＡ無し）を使用した。図１０において見られるように、ナノ粒子は、蛍光タンパク質の発現をサイレンシングしなかった。これは、以前に観察されたサイレンシングがＤｓｉＲＮＡアームの活性に起因することを意味する。
さらに、スクランブルされたＤｓｉＲＮＡ配列（表５Ａおよび５Ｂを参照のこと）は蛍光タンパク質の発現をサイレンシングしなかったことが見出された。これは、以前に観察されたサイレンシングがＤｓｉＲＮＡアームの配列に起因することを意味する（図１３）。
【０１１６】
【表１６】
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【０１１７】
【表１７】
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【０１１８】
表５Ａおよび５Ｂにおいて、キッシングループ配列に下線を付し、そしてスクランブルされたアンチセンス配列をイタリックで示す。
【０１１９】
次いで、ｅＧＦＰを発現しないＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を使用して、細胞取り込み実験を実施した。取り込み研究のために使用したナノリング、ナノキューブおよび４面体ナノ粒子は、各々、ＤｓｉＲＮＡ付属物のその完全な相補物を含んだ（それぞれ６個、６個、および１２個）。しかし、各ナノ粒子の４個のＤｓｉＲＮＡのみを蛍光タグで標識し、ナノ粒子当たりの蛍光強度を規準化した。各ナノ粒子上のＤｓｉＲＮＡアームのサブセットのみを標識するために、２つの異なるＤｓｉＲＮＡアンチセンス伸長をコードするモノマー単位の組み合わせを使用した。ｅＧＦＰアンチセンス伸長を、その５’末端において蛍光標識でタグ付加されたＤＮＡセンスコード鎖と対形成させ、一方、残りのＤｓｉＲＮＡは、非標的化陰性対照配列（ｎｃｌ）をコードした。驚くべきことに、４面体ナノ粒子は、等しいナノ粒子濃度のナノリングまたはナノキューブナノ粒子のいずれよりもずっと高い程度の細胞取り込みを示した。そして、取り込みのために使用した濃度をＤｓｉＲＮＡの数に基づいて規準化した場合、４面体ナノ粒子より多くのナノリングおよびナノキューブが取り込まれる（これらの条件において、２倍ほど多くのナノリングおよびナノキューブがトランスフェクション混合物中に存在する、なぜなら、それらは４面体ナノ粒子と比較して、１／２の数のＤｓｉＲＮＡを有するからである）（図５Ｃ、５Ｄ、１４および１５）。
【０１２０】
この証拠は、４面体ナノ粒子のサイズおよび／または形状が、細胞中への侵入の獲得における重大な役割を担っており、従って、最終的にＲＮＡｉ治療薬の有効性に影響を及ぼすことを示唆する。驚くべきことに、ナノ粒子の細胞取り込みのレベルにかかわらず、本発明の４面体ナノ粒子は、増加したサイレンシングを示した。これは、それが他の形状のナノ粒子より有効であることを意味する。
【０１２１】
実施例６
本実施例は、本発明の４面体ナノ粒子を用いたポロ様キナーゼ１の標的化が、細胞生存率の実質的な喪失をもたらすことを示す。
【０１２２】
最終的に、ＲＮＡｉベースの治療薬を使用することのゴールは、標的遺伝子（単数または複数）のダウンレギュレーションを通して細胞の機能および／または生存を変化させることができることである。ｅＧＦＰ蛍光の相対的ノックダウンによって証明されるように、４面体ＲＮＡナノ粒子の使用は、検討した他のＲＮＡナノ粒子に比較して、優れたＲＮＡｉ応答を引き起こすことは明らかなようであるが、遺伝子サイレンシングの程度の増加が、細胞機能の変化の増加に転換されるかどうかは、この系内では不明である。ＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングを通したエンドポイント細胞機能の調節を評価するために、ＲＮＡナノ粒子を、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）ｍＲＮＡを標的にするダイサー基質エレメントを用いて設計した（図６）。
【０１２３】
ＰＬＫ１は、紡錘体形成および染色体分離のレベルでの細胞周期の調節における役割を担っており、そして多くの形態のガンにおいて過剰発現されている。ＰＬＫ１の欠乏は、増殖阻害およびアポトーシス誘導をもたらすことが知られている。本研究において、ｅＧＦＰを発現しないＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＰＬＫ１標的化ナノ粒子を用いてトランスフェクトした。ここで、各ＮＰはその最大数のＤｓｉＲＮＡアームを有した。送達した各ナノ粒子の濃度を、トランスフェクション培地中に存在するＤｓｉＲＮＡの濃度が、異なる数のＤｓｉＲＮＡアームを有するＲＮＡナノ粒子の間で等しくなるように規準化した。細胞を、トランスフェクションの３日後の生存率について評価した。検討した３つのｐｌｋ１標的化ＲＮＡナノ粒子のうち、４面体ナノ粒子が最も強力であり、アッセイした各濃度にわたって細胞生存率の最大の低下を示した（図６）。ｅＧＦＰ標的化ＤｓｉＲＮＡを持つナノ粒子の陰性対照トランスフェクションは、４面体ＲＮＡナノ粒子が、４面体ＮＰの著しく大きな質量にかかわらず、検討した他のナノ粒子のいずれか、または遊離ＤｓｉＲＮＡ以上には細胞毒性でないことを明らかにした。
【０１２４】
実施例７
本実施例は、本発明の４面体ナノ粒子をさらに特徴付ける。
【０１２５】
ＤＳＬを使用して、本発明の４面体ナノ粒子、およびその構成要素のアセンブリ温度を評価および確認した。
【０１２６】
図８において見られるように、本発明の４面体ナノ粒子は４５℃および３０℃においてアセンブルするが、しかし、４５℃における本発明の４面体ナノ粒子のアセンブリが好ましい。なぜなら、３０℃における本発明の４面体ナノ粒子のアセンブリは、動的光散乱によって決定したところ、より大きく、より均質でない粒子の形成をもたらしたからである。
【０１２７】
実施例８
本実施例は、本発明の４面体ナノ粒子内のスキャフォールドモノマーの環状化が、付加された熱力学的安定性、および、増加した、エキソヌクレアーゼ分解に対する耐性を提供することを示す。
【０１２８】
図９において見られるように、ダンベルモノマーおよび「Ｈ」交差モノマー（下行）を、５’／３’ニックをライゲーションすることによって環状化した。スキャフォールドモノマーの環状化を、確立されたプロトコルを使用して完成させた。スキャフォールドの環状化は、熱力学的安定性およびエキソヌクレアーゼ分解に対する耐性を増加させた。
【０１２９】
本明細書において引用される全ての参考文献（刊行物、特許出願、および特許を含む）は、各々の参考文献が参照により組み込まれることが個別かつ具体的に示され、そして本明細書においてその全体が記載されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
発明の説明の文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および「少なくとも１つ」および類似の指示物の使用は、本明細書中に別段示されるかまたは文脈によって明確に否認されない限り、単数および複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。１つ以上の項目のリストがその後に続く用語「少なくとも１つ」（例えば、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」）の使用は、本明細書中に別段示されるかまたは文脈によって明確に否認されない限り、列挙される項目から選択される１つの項目（ＡもしくはＢ）または列挙される項目の２つ以上の任意の組み合わせ（ＡおよびＢ）を意味すると解釈されるべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、および「含む（containing）」は、別段言及しない限り、無制限の用語（すなわち、「限定するものではないが、含む」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において別段示さない限り、単に、範囲内に入る各々の別々の値に個別に言及することの簡略標記法として作用することが意図され、そして各々の別々の値は、それが本明細書において個別に記載されるかのように明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書中に別段示されるかまたは文脈によって明確に否認されない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書において提供される任意のそして全ての例、または例示的な語（例えば、「のような」）の使用は、別段請求されない限り、単に、発明をより良く明らかにすることが意図されており、そして発明の範囲に対する限定を課すことはない。明細書中の語は、いずれかの請求されていない要素を、発明の実行に不可欠であるとして示すと解釈されるべきでない。
【０１３１】
発明の実施のための本発明者らが知っているベストモードを含めて、本発明の好ましい実施形態を本明細書に記載している。それらの好ましい実施形態の変形は、上記の説明を読んだ際に当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が、そのような変形を適宜用いることを予想しており、そして本発明者らは、発明が、本明細書に具体的に記載される以外で実行されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許可されるような本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される事項の全ての改変および等価物を含む。さらに、本明細書中に別段示されるかまたは文脈によって明確に否認されない限り、その全ての可能な変形における上記要素の任意の組み合わせは本発明によって包含される。
【図１Ａ】
2021524735.tif 000020
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５Ａ】
2021524735.tif 000031
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
2021524735.tif 000036
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2021524735.tif 000040
【図１２】
2021524735.tif 000041
【図１３】
2021524735.tif 000042
【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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