(57)【要約】【解決手段】  本開示は、５−アミノレブレン酸（５−ＡＬＡ）又はそのエステルにコンジュゲートされた量子ドットナノ粒子に関し、また、前記量子ドットナノ粒子を、追加の遊離した内因性５−アミノレブレン酸又はそのエステルと併せて使用することに関する。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のＰｐＩＸ蛍光発光を向上させる方法であって、
５−アミノレブレン酸（５−ＡＬＡ）又は５−ＡＬＡのエステルにコンジュゲートされた量子ドット（ＱＤｓ）を組織に投与するステップと、
遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルを前記組織に共投与するステップと、
前記ＱＤ−５−ＡＬＡ又はＱＤ−５−ＡＬＡエステルと前記共投与された遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステとのコンジュゲートが、前記組織内の細胞によって取り込まれることで、細胞内にＰｐＩＸを生成するステップと、
前記ＱＤ−５−ＡＬＡコンジュゲート又はＱＤ−５−ＡＬＡエステルコンジュゲートを物理的に励起して、ＰｐＩＸ蛍光を生じさせるステップと、を含む、方法。
【請求項２】
ＱＤｓは、水溶性重金属を含まないＱＤｓである、請求項１の方法。
【請求項３】
ＱＤ−５−ＡＬＡコンジュゲート又はＱＤ−５−ＡＬＡエステルコンジュゲートを物理的に励起するステップは、照射することを含む、請求項１の方法。
【請求項４】
細胞内に取り込まれたＰｐＩＸの蛍光は、異常組織の増殖、新生物発生前の組織、新生物組織の光線力学的療法、及び腫瘍サイズの縮小、又は腫瘍のラベリングに利用される、請求項１の方法。
【請求項５】
細胞内に取り込まれたＰｐＩＸの蛍光は、異常組織の増殖、新生物発生前の組織、新生物組織のラベリング及び可視化に利用される、請求項１の方法。
【請求項６】
新生物組織のラベリング及び可視化は、新生物組織を取り除くための外科処置と併せて用いられる、請求項５の方法。
【請求項７】
投与は、５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルの処理に感受性であり得る組織をスクリーニングするために用いられる、請求項１の方法。
【請求項８】
５−ＡＬＡのエステルは、５−ＡＬＡヘキシルエステルと、５−ＡＬＡメチルエステルと、脂肪族アルコール５−ＡＬＡエステルと、５−ＡＬＡのα−グルコースエステル、α−マンノースエステル又はβ−ガラクトースエステルを含むグリコシド５−ＡＬＡエステルと、５−ＡＬＡのアルキルエステルと、から選択される、請求項１の方法。
【請求項９】
ＱＤｓは、さらに、少なくとも１つの腫瘍特異性リガンドにコンジュゲートされる、請求項１乃至８の何れかの方法。
【請求項１０】
腫瘍特異性リガンドは、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、テロメラーゼタンパク質及びサブユニット、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ１０９、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４、及びＲＡＮＫリガンドに対して特異性である、請求項９の方法。
【請求項１１】
ＱＤｓは、前記ＱＤｓを物理的励起することによってＱＤが凝集する重合性リガンドをさらに含む、請求項１乃至８の何れかの方法。
【請求項１２】
ＱＤｓは、細胞取込みエンハンサー、組織浸透エンハンサー、又はそれらの任意の組合せをさらに含む、請求項１乃至８の何れかの方法。
【請求項１３】
細胞取込みエンハンサーは、トランス活性化転写アクチベータ（ＴＡＴ）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）トリペプチド、ＲＧＤモチーフを含む直鎖及び環状ペプチド、又はポリアルギニンペプチドの１種又は２種以上から選択される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
組織浸透エンハンサーは、サポニン、カチオン性脂質、及びストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）の１種又は２種以上から選択される、請求項１２の方法。
【請求項１５】
細胞死を促進する方法であって、
５−アミノレブレン酸（５−ＡＬＡ）又は５−ＡＬＡのエステルにコンジュゲートされた量子ドット（ＱＤｓ）を、好ましくない細胞に投与するステップと、
遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルを、前記好ましくない細胞に共投与するステップと、
前記ＱＤ−５−ＡＬＡ又はＱＤ−５−ＡＬＡエステルにコンジュゲートされたＱＤｓを励起して、細胞死を促進する活性酸素種について、ＰｐＩＸの蛍光及び生成を誘導する、方法。
【請求項１６】
好ましくない細胞は、前癌細胞、腫瘍細胞、又は炎症性組織であり、方法は、インビボで行われる請求項１５の方法。
【請求項１７】
５−アミノレブレン酸（５−ＡＬＡ）又は５−ＡＬＡのエステルにコンジュゲートされた量子ドット（ＱＤｓ）の細胞内取込みの向上を判定するための分析キットであって、
５−アミノレブレン酸（５−ＡＬＡ）又は５−ＡＬＡのエステルにコンジュゲートされたＱＤｓと、
５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡのエステルにコンジュゲートされたＱＤｓと共投与するための追加の遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルと、を含む、分析キット。
【請求項１８】
キットは、ＱＤに対する５−ＡＬＡコンジュゲート及び５−ＡＬＡエステルコンジュゲートのパネルを含み、前記パネルは、５−ＡＬＡ−ＱＤ、５−ＡＬＡヘキシルエステル−ＱＤ、５−ＡＬＡメチルエステル−ＱＤ、脂肪族アルコール５−ＡＬＡエステル−ＱＤ、グリコシド５−ＡＬＡエステル−ＱＤ、及び５−ＡＬＡアルキルエステル−ＱＤからなる群の少なくとも２種と、追加の遊離５−ＡＬＡ、遊離５−ＡＬＡヘキシルエステル、遊離５−ＡＬＡメチルエステル、遊離脂肪族アルコール５−ＡＬＡエステル、遊離グリコシド５−ＡＬＡエステル、及び遊離５−ＡＬＡアルキルエステルの１種又は２種以上と、を含む、請求項１７の分析キット。
【請求項１９】
グリコシド５−ＡＬＡエステルは、５−ＡＬＡのα−グルコースエステル、α−マンノースエステル又はβ−ガラクトースエステルから選択される、請求項１７の分析キット。
【請求項２０】
５−アミノレブレン酸（５−ＡＬＡ）又は５−ＡＬＡのエステルにコンジュゲートされた量子ドット（ＱＤｓ）と、
前記ＱＤｓと共投与される、コンジュゲートされていない遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルと、を含む、組成物。
【請求項２１】
ＱＤｓは、水溶性重金属を含まないＱＤｓである、請求項２０の組成物。
【請求項２２】
５−ＡＬＡのエステルは、５−ＡＬＡヘキシルエステルと、５−ＡＬＡメチルエステルと、脂肪族アルコール５−ＡＬＡエステルと、５−ＡＬＡのα−グルコースエステル、α−マンノースエステル又はβ−ガラクトースエステルを含むグリコシド５−ＡＬＡエステルと、５−ＡＬＡのアルキルエステルと、から選択される、請求項２０の組成物。
【請求項２３】
ＱＤｓは、さらに、少なくとも１つの腫瘍特異性リガンドにコンジュゲートされる、請求項２０乃至２２の何れかの組成物。
【請求項２４】
腫瘍特異性リガンドは、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、テロメラーゼタンパク質及びサブユニット、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ１０９、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４、及びＲＡＮＫリガンドに対して特異性である、請求項２３の組成物。
【請求項２５】
ＱＤｓは、前記ＱＤｓを物理的励起することによってＱＤが凝集する重合性リガンドをさらに含む、請求項２０乃至２２の何れかの組成物。
【請求項２６】
ＱＤｓは、細胞取込みエンハンサー、組織浸透エンハンサー、又はそれらの任意の組合せをさらに含む、請求項２０乃至２２の何れかの方法。
【請求項２７】
細胞取込みエンハンサーは、トランス活性化転写アクチベータ（ＴＡＴ）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）トリペプチド、ＲＧＤモチーフを含む直鎖及び環状ペプチド、又はポリアルギニンペプチドの１種又は２種以上から選択される、請求項２６の組成物。
【請求項２８】
組織浸透エンハンサーは、サポニン、カチオン性脂質、及びストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）の１種又は２種以上から選択される、請求項２６の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の記載＞
この出願は、２０１７年１０月１８日に出願された米国仮出願第６２／５７３，９７１号に基づく優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
＜発明の分野＞
本明細書に開示される実施形態は、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）にコンジュゲートされた量子ドットナノ粒子に関し、特に、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）に基づく医用画像処理及び光線療法を、量子ドットナノ粒子（ＱＤｓ）を使用して向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜発明の背景＞
光線力学的療法（ＰＤＴ）は、光増感剤（ＰＳ）と呼ばれる感光性の薬剤を光と共に使用して、前癌細胞や癌細胞を含む望ましくない細胞を殺す治療法である。薬剤は、光によって活性化されて初めて作用する。適当な光を照射すると、光増感剤は、望ましくない組織、特に新生物組織等を破壊するための活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する。
【０００３】
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）は、ＰＤＴ用に承認されたＰＳであり、広く使用されている。また、グリオーマ、膀胱癌、メラノーマ等の特定の炎症性組織や癌の蛍光誘導手術におけるマーカーとしても使用されている。５−ＡＬＡはプロドラッグであり、一度腫瘍細胞に内包されると、５−ＡＬＡは天然の光増感剤であるフォトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）に変換される。体外から投与されたＰＳ、例えばポルフィリン剤ポルフィマーナトリウム（ＰＨＯＴＯＦＲＩＮ（登録商標））は、周囲の光に曝露されると皮膚や眼の感光反応を引き起こす可能性があるのに対して、５−ＡＬＡは、光力学的に不活性で、非選択的かつ非毒性の化合物であり、細胞内で光力学的に活性で蛍光性のＰｐＩＸに代謝される。その後、腫瘍部位に赤色光を照射すると、ＰｐＩＸが活性化され、酸化的損傷を誘発し、細胞毒性を誘導する。光力学的に活性で蛍光性のＰｐＩＸは、特定の炎症性組織やグリオーマ、膀胱癌、メラノーマ等の多くの癌の蛍光誘導手術のマーカーとしても使用されることができる。
【０００４】
しかしながら、５−ＡＬＡは極性分子である。５−ＡＬＡの双性イオン性及び親水性は、無傷の皮膚、結節性皮膚病変等の組織、及び細胞膜を通過する浸透を大きく制限するため、細胞への取込みが遅く、腫瘍細胞におけるＰｐＩＸの蓄積に一貫性がなくなる。それゆえ、５−ＡＬＡは、細胞膜を通る浸透及び腫瘍細胞への標的送達が、ＰＤＴの有効性及び特異性を改善する上での課題である。これらの課題は、例えば脳腫瘍の特定種類の腫瘍において、５−ＡＬＡを使用した治療を不満足のものにしている。そのため、５−ＡＬＡ治療の有効性を向上させる必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
＜発明の要旨＞
開示される実施形態は、５−ＡＬＡの性能を向上させるための方法を記載するもので、量子ドットナノ粒子（ＱＤｓ）が５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルにコンジュゲートされ（例えば、ＱＤ表面にテザリングされ）、遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルと共投与される。
【０００６】
特定の実施形態において、５−ＡＬＡエステルは、５−ＡＬＡヘキシルエステルと、５−ＡＬＡメチルエステルと、脂肪族アルコール５−ＡＬＡエステルと、５−ＡＬＡのα−グルコースエステル、α−マンノースエステル、又はβ−ガラクトースエステルを含むグリコシド５−ＡＬＡエステルと、５−ＡＬＡのアルキルエステルと、から選択される。
【０００７】
驚くべきことに、これら２種類の５−ＡＬＡ（コンジュゲートされた５−ＡＬＡと遊離している５−ＡＬＡの両方）を組み合わせると、相乗効果により、形成されるＰｐＩＸ分子からの発光(emission)が向上し、結果として５−ＡＬＡ処理の性能が向上することがわかった。
【０００８】
開示される実施形態は、量子ドットナノ粒子を含み、ここで、各ＱＤは、５−ＡＬＡに結合（例えば、共有結合又は物理的結合（イオンペアリング又はファンデルワールス相互作用））されており、前記結合は、例えば、例えば、脂肪族鎖、π−π積層、π相互作用、アミド、エステル、チオエステル、又はチオールアンカリング基により、ＱＤの無機表面に直接結合されるか、又はＱＤを水溶性及び生体適合性にするために使用される有機コロナ層に結合される。特定の実施形態では、水溶性ＱＤは、幾つかの実施形態において、１つの半導体材料のコアと、異なる半導体材料の少なくとも１つのシェルとを含む。一方、他の実施形態では、水溶性ＱＤは、合金化された半導体材料を含み、前記材料は、組成的に傾斜する合金化によって外向きに増加するバンドギャップ値を有する。そのような実施形態は、例えば、癌の可視化及び治療において、生体外(エクスビボ)及び生体内（インビボ)の両方で有用である。
【０００９】
一実施形態において、各ＱＤは、５−ＡＬＡ又はそのエステルにコンジュゲートされ、これらは光源によって活性化されることができる。
【００１０】
一実施形態において、本明細書に記載される各ＱＤは、アミド結合を介して、共有結合により、５−ＡＬＡ又はそのエステルにリンクされている。
【００１１】
一実施形態において、各ＱＤは、コア半導体材料と、外層と、を含み、外層は、粒子を水溶性及び生体適合性にするための有機コーティング（官能基化有機コーティング）からなるコロナと、５−ＡＬＡ又はそのエステルと、を含む。一実施形態において、各ＱＤは、半導体材料からなる１又は複数のシェルを外側に含み、外側シェルは外層を含み、外層は、粒子を水溶性及び生体適合性にするための有機コーティング（官能基化有機コーティング）からなるコロナと、５−ＡＬＡ又はそのエステルと、を含む。
【００１２】
一実施形態において、各ＱＤは、合金化された量子ドットと、５−ＡＬＡ又はそのエステルと、を含む。一実施形態において、各ＱＤは、ドープされた量子ドットと、５−ＡＬＡ又はそのエステルと、を含む。本明細書に記載されるＱＤの任意のＱＤに関する実施形態において、ナノ粒子は、ＩＩ−ＶＩ材料、ＩＩＩ−ＶＩ材料、又はＩ−ＩＩＩ−ＩＶ材料、又はあらゆる合金若しくはドープされた誘導体を含む。
【００１３】
一実施形態において、本明細書に記載されるＱＤはすべて、約３５０ｎｍ〜約１００００ｎｍ、さらには約４５０ｎｍ〜約８００ｎｍの範囲の発光スペクトルと関連づけられる。
【００１４】
追加の実施形態では、本明細書に記載されるＱＤはすべて、細胞取込みエンハンサー、組織浸透エンハンサー、又はそれらの任意の組合せをさらに含むことができる。細胞取込みエンハンサーの例として、例えば、トランス活性化転写アクチベータ（ＴＡＴ）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）トリペプチド、ＲＧＤモチーフを含む直鎖及び環状ペプチド、又はポリアルギニンペプチドが挙げられる。組織浸透エンハンサーの例としては、サポニン、カチオン性脂質、及びストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）が挙げられる。
【００１５】
他の実施形態において、少なくとも１つの標的特異性リガンドは、５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルのコンジュゲーションと共に、水溶性非毒性ＱＤにコンジュゲートされる。標的特異性リガンドが特異性である標的の例として、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、テロメラーゼタンパク質及びサブユニット、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ１０９、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４、及びＲＡＮＫリガンドが挙げられる。
【００１６】
別の実施形態では、細胞死を誘導する方法を提供する。さらに別の実施形態では、細胞死を誘導し、影響を受けた組織を画像化する方法を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、腫瘍（悪性と良性の両方）、炎症性組織、及び／又は望ましくない細胞を可視化して治療する方法を提供する。さらなる実施形態において、腫瘍は軟質(soft)又は中実(solid)である。さらに、腫瘍及び／又は炎症性組織を可視化する方法は、腫瘍及び／又は炎症性組織の術中イメージング及び蛍光ガイド付き手術に使用されることができる。炎症性組織として、例えば、関節炎、クローン病、炎症性腸疾患、乾癬、にきび、多発性硬化症、アルツハイマー、パーキンソン、又はＰｐＩＸ合成が増加する傾向にある他の疾患又は状態が挙げられる。例えば、５−ＡＬＡ−ＱＤ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せは、動脈硬化性プラーク、アテローム性病変及び狭窄レベル、特に頸動脈の病変を検出するために使用される。５−ＡＬＡ−ＱＤと遊離５−ＡＬＡの組合せは、アテローム性動脈硬化プラーク、アテローム性病変及び狭窄レベル、特に頸動脈のそれらを治療するために使用される。
【００１８】
別の実施形態では、血液又は体液中の循環細胞を可視化して治療する方法を提供する。
【００１９】
一実施形態において、本明細書に記載される方法はどちらも（ｉ）本明細書に記載の実施形態の何れかの実施形態に係るＱＤコンジュゲート（例えば、複数のＱＤコンジュゲート又はコンジュゲートのパネル）を、細胞、腫瘍又は望ましくない組織に接触させること、及び（ｉｉ）遊離５−ＡＬＡ又はその誘導体を細胞に接触させること、を含む。
【００２０】
実施形態のさらなる態様において、重合可能なリガンドが、５−ＡＬＡ−ＱＤ、又は５−ＡＬＡエステル等の５−ＡＬＡの誘導体に結合されており、リガンドは、量子ドットナノ粒子を、エネルギー源（例えば、ＵＶ又は可視光源等の光源）で励起することによって重合される。幾つかの実施形態において、５−ＡＬＡエステルは、５−ＡＬＡヘキシルエステル、５−ＡＬＡメチルエステル、脂肪族アルコール５−ＡＬＡエステル、グリコシド５−ＡＬＡエステル（５−ＡＬＡのα−グルコースエステル、α−マンノースエステル又はβ−ガラクトースエステルを含む）、及び５−ＡＬＡアルキルエステルから選択される。
【００２１】
本明細書に記載される方法における何れかの方法の一実施形態では、ＱＤ−５−ＡＬＡコンジュゲートは、マルチ光子励起（例えば、２光子励起）を用いて励起される。そのような実施形態では、特定のＱＤ−５−ＡＬＡコンジュゲートを励起するために、２以上の光ビームの結合エネルギーが使用される。
【００２２】
一実施形態において、本明細書に記載される方法における何れかの方法は、体液（例えば、血液、膵液、血漿、細針吸引液）の中で、及び／又は、組織試料の中で、インビボで、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを、遊離５−ＡＬＡと共に、生体組織の中に共投与(co-administration)することによって行われる。
【００２３】
一実施形態において、本明細書に記載される方法における何れかの方法は、生体外で採取され検査された体液及び／又は組織試料において行われる。例えば、発光信号の検出は、生体外で採取され検査された生体試料について、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、又は蛍光光度計を用いて行われることができる。
【００２４】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ(free 5-ALA)又はそのエステルとの組合せが提供される。
【００２５】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せを、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物が提供される。
【００２６】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せが、医薬品として使用するために提供される。
【００２７】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せが、画像処理(imaging)のために提供される。
【００２８】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せが、細胞死を誘導する方法における使用のために提供される。
【００２９】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せが、腫瘍（悪性及び良性の両方）、炎症性組織、及び／又は望ましくない細胞を治療する方法における使用のために提供され、前記方法は、前記治療を必要とする患者に対し、治療上有効な量のＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルを投与することを含む。
【００３０】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せが、患部組織を画像処理する方法における使用のために提供される。
【００３１】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せが、腫瘍（悪性及び良性の両方）、炎症性組織、及び／又は望ましくない細胞を可視化し、治療する方法における使用のために提供され、前記方法は、前記治療を必要とする患者に対し、治療上有効な量のＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルを投与することを含む。
【００３２】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せが、血液又は体液中の循環細胞を可視化し、治療する方法における使用のために提供される。
【００３３】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せが、細胞内ＰｐＩＸ蛍光を増強する方法における使用のために提供される。
【００３４】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せの使用が、細胞死を誘導するための医薬品を製造するために提供される。
【００３５】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せの使用が、腫瘍（悪性及び良性の両方）、炎症性組織、及び／又は望ましくない細胞を治療するための医薬を製造するために提供される。
【００３６】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せの使用が、患部組織を画像処理するための医薬を製造するために提供される。
【００３７】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せの使用が、腫瘍（悪性及び良性の両方）、炎症性組織、及び／又は望ましくない細胞を可視化し、治療するための医薬を製造するために提供される。
【００３８】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せの使用が、血液又は体液中の循環細胞の可視化し治療するための医薬を製造するために提供される。
【００３９】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルとの組合せの使用が、細胞内ＰｐＩＸ蛍光を増強するための医薬を製造するために提供される。
【００４０】
一実施形態において、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルと共投与するための説明書と、を含むキットを提供する。さらなる実施形態では、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルと、任意選択的に患者を治療するための説明書と、を含むキットを提供する。さらなる実施形態では、遊離５−ＡＬＡ又はそのエステルと、ＱＤ−５−ＡＬＡ又はそのエステルと共投与するための説明書と、を提供する。
【００４１】
一実施形態において、細胞内ＰｐＩＸ蛍光を増強するための方法で使用するために、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）にコンジュゲートされた量子ドット（ＱＤｓ）を提供するもので、前記方法は、
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）又は５−ＡＬＡのエステルにコンジュゲートされた量子ドット（ＱＤｓ）を組織に投与することと、
遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡのエステルを組織に共投与することと、
ＱＤ−５−ＡＬＡ又はＱＤ−５−ＡＬＡエステルのコンジュゲートと、共投与された遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルとが、組織内の細胞によって取り込まれて、細胞内にＰｐＩＸを生成することと、
ＱＤ−５−ＡＬＡ又はＱＤ−５−ＡＬＡエステルコンジュゲートを物理的に励起してＰｐＩＸ蛍光発光を誘導することと、を含む。
【００４２】
一実施形態において、細胞内ＰｐＩＸ蛍光発光を増強するための医薬の製造において、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）にコンジュゲートされた量子ドット（ＱＤｓ）の使用を提供するもので、前記使用は、
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）又は５−ＡＬＡのエステルにコンジュゲートされた量子ドット（ＱＤｓ）を組織に投与することと、
遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡのエステルを組織に共投与することと、
ＱＤ−５−ＡＬＡ又はＱＤ−５−ＡＬＡエステルのコンジュゲートと、共投与された遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルとが、組織内の細胞によって取り込まれて細胞内にＰｐＩＸを生成することと、
ＱＤ−５−ＡＬＡ又はＱＤ−５−ＡＬＡエステルコンジュゲートを物理的に励起してＰｐＩＸ蛍光発光を誘導することと、を含む。
【００４３】
一実施形態において、細胞死を促進する方法で使用するために、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）にコンジュゲートされた量子ドット（ＱＤｓ）を提供するもので、前記方法は、
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）又は５−ＡＬＡのエステルにコンジュゲートされた量子ドット（ＱＤｓ）を組織に投与することと、
遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡのエステルを組織に共投与することと、
５−ＡＬＡ又はそのエステルにコンジュゲートされたＱＤｓを物理的に励起して、ＰｐＩＸ蛍光発光及び細胞死を促進する活性酸素種（ＲＯＳ）の発生を誘導することと、を含む。
【００４４】
一実施形態において、細胞死を促進するための医薬の製造で使用するために、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）にコンジュゲートされた量子ドット（ＱＤｓ）の使用を提供するもので、前記方法は、
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）又は５−ＡＬＡのエステルにコンジュゲートされた量子ドット（ＱＤｓ）を組織に投与することと、
遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡのエステルを組織に共投与することと、
５−ＡＬＡ又はそのエステルにコンジュゲートされたＱＤｓを物理的に励起して、ＰｐＩＸ蛍光発光及び細胞死を促進する活性酸素種（ＲＯＳ）の発生を誘導することと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ＱＤを５−ＡＬＡとコンジュゲートする説明図である。
【００４６】
【図２】図２Ａ〜図２Ｆは、パッシブＱＤｓ（図２Ａ）、ｃＲＧＤ−ＱＤｓ（図２Ｂ）、遊離５−ＡＬＡ（図２Ｃ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（図２Ｄ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図２Ｅ）、及びｃＲＧＤ−ＱＤ＋遊離５−ＡＬＡ（図２Ｆ）について、ＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞における細胞内取込みを示しており、インキュベーション時間は５時間で、倍率は５倍である。また、図２Ｇ〜図２Ｌは、パッシブＱＤｓ（図２Ｇ）、ｃＲＧＤ−ＱＤｓ（図２Ｈ）、遊離５−ＡＬＡ（図２Ｉ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（図２Ｊ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図２Ｋ）、及びｃＲＧＤ−ＱＤ＋遊離５−ＡＬＡ（図２Ｌ）の細胞内取込みを示しており、インキュベーション時間は５時間で、倍率は１００倍である。
【００４７】
【図３】図３Ａ〜図３Ｅは、パッシブＱＤｓ（図３Ａ）、ｃＲＧＤ−ＱＤｓ（図３Ｂ）、遊離５−ＡＬＡ（図３Ｃ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（図３Ｄ）、及び５−ＡＬＡ−ＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図３Ｅ）について、ＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞における細胞内取込みを示しておりインキュベーション時間は１６時間で、倍率は５倍である。また、図３Ｆ〜図３Ｊは、パッシブＱＤｓ（図３Ｆ）、ｃＲＧＤ−ＱＤｓ（図３Ｇ）、遊離５−ＡＬＡ（図３Ｈ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（図３Ｉ）、及び５−ＡＬＡ−ＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図３Ｊ）の細胞内取込みを示しており、インキュベーション時間は１６時間で、倍率は１００倍である。
【００４８】
【図４】図４Ａ〜図４Ｆは、パッシブＱＤｓ（図４Ａ）、ハーセプチン−ＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図４Ｂ）、遊離５−ＡＬＡ（図４Ｃ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（図４Ｄ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図４Ｅ）、及びパッシブＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図４Ｆ）について、ＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞における細胞内取込みを示しており、インキュベーション時間は３時間、倍率は５倍である。また、図４Ｇ〜図４Ｌは、パッシブＱＤｓ（図４Ｇ）、ハーセプチンＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図４Ｈ）、遊離５−ＡＬＡ（図４Ｉ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（図４Ｊ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図４Ｋ）、及びパッシブＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図４Ｌ）の細胞内取込みを示しており、インキュベーション時間は３時間で、倍率は１００倍である。
【００４９】
【図５】図５は、信号増強メカニズムの一例を示す説明図である。
【００５０】
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、ＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞による取込み後、１分間の照射後における光漂白に対する抵抗性を示しており、図６Ａは５−ＡＬＡ−ＱＤ＋遊離５−ＡＬＡであり、図６Ｂは遊離５−ＡＬＡである。
【００５１】
【図７】図７Ａ〜図７Ｄは、プレーンＱＤｓ（図７Ａ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（５０μｇ／ｍＬ）（図７Ｂ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（５０μｇ／ｍＬ）＋遊離５−ＡＬＡ（０．５ｍＭ）（図７Ｃ）、及び５−ＡＬＡ単独（０．５ｍＭ）（図７Ｄ）で５時間処理した後におけるメラノーマヒトＡ３７５癌細胞検出の比較を示す。
【００５２】
【図８】図８Ａ〜図８Ｃは、プレーンＱＤｓ（図８Ａ）、５−ＡＬＡ単独（０．５ｍＭ）（図８Ｂ）、及び５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（５０μｇ／ｍＬ）＋遊離５−ＡＬＡ（０．５ｍＭ）（図８Ｃ）で５時間処理した後におけるヒト扁平上皮癌Ａ４３１検出の比較を示す。
【００５３】
【図９】図９Ａ〜図９Ｃは、プレーンＱＤ（図９Ａ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（（１００μｇ／ｍＬ）＋５−ＡＬＡ（１ｍＭ）（図９Ｂ）、及び遊離５−ＡＬＡ（１ｍＭ）（図９Ｃ）で５時間処理した後におけるヒト脳癌細胞ＧＩＮ３膠芽腫の共焦点顕微鏡的検出の比較を示す。
【００５４】
【図１０】図１０は、プレーンＱＤ（１００μｇ／ｍＬ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（１００μｇ／ｍＬ）＋５−ＡＬＡ（１ｍＭ）、及び遊離５−ＡＬＡ（１ｍＭ）で５時間処理した後のヒト脳癌細胞ＧＩＮ３膠芽腫のフローサイトメトリーの結果について、未処理及び無標識の対照細胞との比較を示している。
【００５５】
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｄは、プレーンＱＤ（５０μｇ／ｍＬ）（図１１Ａ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（５０μｇ／ｍＬ）（図１１Ｂ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（５０μｇ／ｍＬ）＋遊離５−ＡＬＡ（０．２ｍＭ）（図１１Ｃ）、及び遊離５−ＡＬＡ単独（０．２ｍＭ）（図１１Ｄ）で１６時間処理した後の正常ヒト線維芽細胞（ＨＦＦ）の標識の欠如を示す。
【００５６】
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｈは、プレーンＱＤ（５０μｇ／ｍＬ）（図１２Ａ及び図１２Ｅ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（５０μｇ／ｍＬ）（図１２Ｂ及び図１２Ｆ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（５０μｇ／ｍＬ）＋遊離５−ＡＬＡ（０．２ｍＭ）（図１２Ｃ及び図１２Ｇ）、及び遊離５−ＡＬＡ単独（０．２ｍＭ）（図１２Ｄ及び図１２Ｈ）で１６時間処理した後の３Ｄインキュベーションヒト膵臓Ｍｉａ−Ｐａｃａ−２癌（スフェロイド）のラベリングを示す。ＩｍａｇｅＪ  １．５１ｗソフトウェアを使用して、各画像から赤色チャンネル強度の表面プロットを作成し、その結果は、下段パネルの図１２Ｅ〜図１２Ｈに示されている。
【００５７】
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｄは、プレーンＱＤ（図１３Ａ）、ＨＡＬＡ−ＱＤｓコンジュゲート（５０μｇ／ｍＬ）（図１３Ｂ）、ＨＡＬＡ−ＱＤｓコンジュゲート（５０μｇ／ｍＬ）＋遊離ＨＡＬＡ（０．５ｍＭ）（図１３Ｃ）、又は遊離ＨＡＬＡ単独（０．５ｍＭ）（図１３Ｄ）を用いて、インキュベーションヒト膵臓Ｍｉａ−Ｐａｃａ−２癌を５時間処理したもので、ＱＤコンジュゲートが、５−ＡＬＡの誘導体（すなわち、５アミノレブレニン酸のヘキシルエステル（ＨＡＬＡ）に対しても同様な性能を有することを示している。
【００５８】
【図１４】Ｍｉａ  Ｐａｃａ−２ヒト膵臓腫瘍を、免疫抑制されたヌードマウスの脇腹で成長させて、次いで、２５０ｍｇ／Ｋｇの５−ＡＬＡ（図１４Ａ及び図１４Ｃ）又は２０ｍｇ／Ｋｇの５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（図１４Ｂ及び図１４Ｄ）を腫瘍内注入による処理を行ったもので、腫瘍が６３０ｎｍで発光するように寸法合わせをしたＭｉａ  Ｐａｃａ−２ヒト膵臓のインビボ画像を示す。画像処理は、注入５時間後の生動物について実施し、図１４Ａ及び図１４Ｂは、動物全体のイメージャを使用し、図１４Ｃは、手持ち式の青色フラッシュライトを使用し、図１４Ｄはデジタルカメラを使用した。
【００５９】
＜発明の詳細な説明＞
既存の光線力学的療法（ＰＤＴ）は、光増感剤（ＰＳ）を光と共に用いて、不要な組織及び癌細胞を可視化し、殺すものであるが、本発明者らは、その欠点を認識した上で、アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）の活性、及び量子ドット（ＱＤｓ）にコンジュゲートされた５−ＡＬＡエステル等の５−ＡＬＡ誘導体の活性を増強することに取り組んだ。本明細書で提供する特定の実施形態で提供するＱＤコンジュゲートは、高い安全性及び生体適合性プロファイルを特徴とする。本明細書では、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）でコンジュゲートされたＱＤｓ及びＨＡＬＡ等のその誘導体を開示する。また、ＱＤｓを用いて、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）を利用した医用画像化及び光治療を強化するための方法を開示する。特定の実施形態では、生体適合性で、毒性のない蛍光性のＱＤｓは、５−ＡＬＡとコンジュゲートされる。他の実施形態では、５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲートは、それ自体は毒性を有し、システムの細胞毒性に寄与する半導体材料から形成される。
【００６０】
同時係属中の米国特許出願第１５／２３５，３６２号には、ＱＤｓが、標的リガンドで修飾され、さらに、外部連結された５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）、５−ＡＬＡ誘導体、又は５−ＡＬＡアナログにコンジュゲートされている。同時係属中の米国特許出願第１５／２３５，３６２号の発明者は、その後の研究において、驚くべきことに、５−ＡＬＡとコンジュゲートされたＱＤｓが、例えば、ＢＥＴＡ輸送体（ＧＡＴ−１〜ＧＡＴ−３、ＢＧＴ−１及びＴＡＵＴ）、ＧＡＢＡ輸送体、ＰＥＰＴ１及びＰＥＰＴ２等の５−ＡＬＡ特異性の膜輸送体(membrane transporters)を介して、５−ＡＬＡの細胞内取込みを増加させることを見い出した。本明細書に開示されているように、５−ＡＬＡにコンジュゲートされたＱＤｓが追加の遊離５−ＡＬＡ（非内因性でコンジュゲートされていない５−ＡＬＡ）と共投与されると、６３０ｎｍでの発光シグナルが有意に向上することは、非常に驚くべきことであった。
【００６１】
＜略語＞
本発明の理解を容易にするため、また、特許請求の範囲を解釈する上で疑義を回避するために、幾つかの用語を以下に定義する。本明細書で定義する用語は、本発明に関連する分野において通常の知識を有する者によって一般的に理解される意味を有する。本発明の特定の実施形態を説明するために使用される用語は、特許請求の範囲に概説されている場合を除き、発明を限定するものではない。
ＤＣＣ：  ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ：  ジクロロメタン
ＤＩＣ：  ジイソプロピルカルボジイミド
ＥＤＣ：  １−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＨＭＭＭＭ：  ヘキサメトキシメチルメラミン  
Ｉｎ（ＭＡ）３：  ミリスチン酸インジウム
ＱＤ：  量子ドット
スルホ−ＮＨＳ：  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのスルホ誘導体
ＳＭＣＣ：  サクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（ＴＭＳ）３Ｐ：  トリス（トリメチルシリル）ホスフィン
５−ＡＬＡ：  ５−アミノレブリン酸
【００６２】
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」等の用語は、明示的に定義されない限り、単数の実体を指すことを意図するものでなく、特定の例示を例示するために使用され得る一般的な種類のものを含む。特許請求の範囲及び／又は明細書において“ｃｏｍｐｌｉｓｉｎｇ”と共に使用される場合の“ａ”又は“ａｎ”という用語は、「１つ」を意味することもあるが、「１つ又はそれより多く」、「少なくとも１つ」及び／又は「１つ又は２つ以上」を意味することもある。
【００６３】
特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、選択肢が相互に排他的であることを明示的に言及しない場合は、「及び／又は」を意味するものとして使用される。それゆえ、別段の記載がない限り、選択肢群における「又は」という用語は、その群の構成要素の「何れか一つ又は組合せ」を意味するものとする。さらに、選択肢が相互に排他的であることを明示的に言及しない場合は、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」という語句は、要素Ａ単独、要素Ｂ単独、要素Ｃ単独、又はＡ、Ｂ、及びＣの任意の組合せを有する実施形態を意味する。
【００６４】
同様に、疑義を回避するために、選択肢が相互に排他的であることが明示されていない場合は、項目のリストと共に使用される「少なくとも１つの」という語句は、当該リストの単一の項目、又は当該リスト内の項目の任意の組合せを意味する。例えば、別段の定義がない限り、「Ａ、Ｂ、Ｃのうち少なくとも１つ」という語句は、「Ａ、Ｂ、Ｃの群の少なくとも１つ、又はＡ、Ｂ、Ｃの任意の組合せ」を意味する。それゆえ、別段の定義がない限り、この語句は、リストされた項目の１つ又は２つ以上を意味するが、必ずしもすべてを意味する訳ではない。
【００６５】
「含む(comprising)」（「compries」及び「comprises」等の形態がある）、「有する(having)」（「have」及び「has」等の形態がある）、「含む(inluding)」（「include」及び「includes」等の形態がある）、又は「含む(containing)」（「contain」及び「contains」等の形態がある）という用語は、包括的(inclusive)であるか又は制限の無い(open-ended)用語であり、追加の又は記載されていない要素又は方法のステップを排除するものではない。
【００６６】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される「効果的(effective)」という用語は、もたらされる結果が、所望され、期待され、又は意図された結果を達成するのに適当なものであることを意味する。
【００６７】
「約(about)」又は「約(approximately)」という用語は、当該技術分野の通常の能力を有する者による理解に近いものとして定義され、非限定的な実施形態において、当該用語は、１０％以内、以内、５％以内、１％以内、及び特定の態様では０．５％以内であると定義される。
【００６８】
投与の形態は、例えば滅菌懸濁液又はエマルジョンのように、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与又は静脈内投与（例えば、注射による投与）による非経口投与のための調製物を含むことができる。例えば消化管癌性状態及びバレット食道のような前癌性状態に対する投与については、消化管経路を採用することができる。組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース等の適当な担体、希釈剤、又は賦形剤と混和させて局所的に投与することができる。組成物は、所望される投与経路及び製剤に応じて、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化又は粘性増強添加剤、防腐剤、香料、着色剤等の補助物質を含むことができる。必要以上の実験を行わずに適当な製剤を調製するには、例えば、標準的な薬学的テキスト（Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990）を参照することができる。
【００６９】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」及び「薬学的に許容されるビヒクル」という用語は、互いに互換性があり、副作用無く宿主に注入することができる５−ＡＬＡ−ＱＤ又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤが含まれる流体ビヒクルのことをいう。当該技術分野で知られている適当な薬学的に許容される担体には、滅菌水、生理食塩水、グルコース、ブドウ糖、又は緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。担体は、限定するものではないが、希釈剤、安定化剤、糖及びアミノ酸、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、粘度増強添加剤、着色料等の補助剤を挙げることができる。
【００７０】
「共投与(co-administered)」、「組合せ(a combination of)」、及び「併用(in combination with)」という用語は、「共投与」された薬剤が、一人の患者の中で、所定時間、測定可能な量で存在する限りにおいて、５−ＡＬＡ−ＱＤ又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤを、外因性投与された遊離５−ＡＬＡ又は遊離５−ＡＬＡエステルと共に、同時に又は具体的な時間制限のない任意の順序で投与することを含む。幾つかの実施形態において、治療剤は、同じ組成物又は単位投与形態であるが、他の実施形態では、治療剤は、別個の組成物又は単位投与形態である。また、本明細書においては、「活性剤」、「薬物」及び「治療剤」の用語、並びに当該技術分野の当業者による同義語は、互いに置き換え可能で使用される。
【００７１】
ＱＤｓは、独特の光学特性を有する蛍光性半導体ナノ粒子である。ＱＤは、半導体材料の中でも特に小さなサイズ形態を表し、粒子の大きさと形状が光励起時の量子力学的効果をもたらす。一般的に、半径５〜６ｎｍのような大きなＱＤｓは、オレンジ色や赤色発光色の長波長を発し、半径２〜３ｎｍのような小さなＱＤｓは青色や緑色発光色の短波長を発するが、その具体的な色や大きさはＱＤの組成に依存する。ＱＤｓは、従来の蛍光色素（インドシアニングリーン（ＩＣＧ）等）に比べて、約２０倍の明るさを有し、光安定性は何倍も高い。重要なことは、それらの化学的性質とナノサイズのために、ＱＤの滞留時間が長いことである。ＱＤｓは、はるかに強い光強度を吸収し発光することができる。幾つかの実施形態において、ＱＤは、２つ以上の結合タグを備えることができ、二元(bi-)又は三元(tri-)の特定ナノデバイスを形成する。ＱＤｓの独特の特性は、これまで満たされていないニーズに応える幾つかの医療用途を可能にする。
【００７２】
本明細書に示される実施形態において、ＱＤｓは、親水性外層又はコロナが存在するように官能基化されており、例えば、生体細胞におけるインビボ及びエクスビボ用途等の水性環境でのＱＤの使用が可能になる。このようなＱＤは水溶性ＱＤと称される。
【００７３】
腫瘍治療における５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲートの全身送達の一実施例では、５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲートは非経口的に投与され、薬物を担持したＱＤが腫瘍の中で濃縮されるまで循環させることができる。腫瘍の海綿体血管系がトラップする微粒子は、循環中の方が、全身に存在するものよりも高いレベルでトラップすることが知られている。それゆえ、ＱＤｓのような微粒子は、循環を繰り返して通過した後、腫瘍の血管系に蓄積することが期待される。この現象は、拡張透過性及び保持効果（ＥＰＲ）として知られている。一実施形態において、ＱＤはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部位を含み、前記ＰＥＧ部位は、ＱＤが循環すると、網状内皮系によってＱＤの除去を減少させるので、ＱＤは腫瘍内に蓄積することが可能になる。ＱＤが腫瘍に送達されると、ＱＤに含まれる薬剤は、開放的又は閉鎖的な方法の何れかの方法により、標的組織の局所環境に光を投与することによって放出される。腫瘍の局所環境に投与される光の一実施形態では、腫瘍は腹腔内腫瘍であり、光源は内視鏡的に腹腔内に導入される。他の実施形態では、５−ＡＬＡ  ＱＤコンジュゲートは、腫瘍組織の中に直接注入され、薬物は、開放的又は閉鎖的方法の何れかの方法により、標的腫瘍の局所環境に光を投与することによって放出される。
【００７４】
一実施形態において、ＱＤｓは、表面に、コンジュゲーション能力を有する官能基（例えば、ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、アジド、アルキン）を有する表面を備えることができる。例示的な一実施形態では、水溶性で非毒性のＱＤは、カルボキシル基で官能化されているか、又は官能化される。例えば、ＣＯＯＨ−ＱＤは、水溶性の１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を使用するカルボジイミド結合技術を用いて、５−ＡＬＡのアミン末端に結合されることができる。カルボキシル基で官能化されたＱＤは、ＥＤＣと混合され、活性Ｏ−アシルイソ尿素中間体を形成し、この中間体は、反応混合物中の５−ＡＬＡの第一級アミノ基からの求核性攻撃によって置換される。所望により、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのスルホ誘導体（sulfo-NHS）が第一級アミン担持分子との反応中に添加される。スルホ−ＮＨＳを添加すると、ＥＤＣにより、ＮＨＳはカルボキシルに結合し、Ｏ−アシルイソ尿素中間体よりも安定なＮＨＳエステルを形成する。これにより、生理学的ｐＨで、第一級アミンへの効率的なコンジュゲーションが可能になる。どちらの場合も、結果として、ＱＤとアミン担持分子との間に共有結合が形成される。鈴木−宮浦クロスカップリング、（サクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（ＳＭＣＣ）、又はアルデヒドベースの反応のような他の化学反応が代替的に使用することもできる。
【００７５】
コア及びコアシェルナノ粒子を合成する方法は、例えば、共有する米国特許第７，８６７，５５６号、第７，８６７，５５７号、第７，８０３，４２３号、第７，５８８，８２８号、及び第６，３７９，６３５号に開示されている。前記各特許の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるものとする。また、米国特許第９，１１５，０９７号、第８，０６２，７０３号、第７，９８５，４４６号、第７，８０３，４２３号、及び第７，５８８，８２８号、及び米国公開第２０１０／０２８３００５号、第２０１４／０２６４１９６号、第２０１４／０２７７２９７号、及び第２０１４／０３７０６９０号は、高品質の単分散ＱＤを大量に製造する方法を開示しており、それぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【００７６】
特定の実施形態において、光応答性５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲートは、「コアオンリー(core only)」ナノ粒子と考えられる水溶性ＱＤナノ粒子を利用する。前記ナノ粒子は、半導体材料から形成されるが、異なる半導体材料からなる無機シェルを有しない。コアオンリーＱＤは光を吸収することはできるが、強い蛍光を発しない場合があるため、発光を目的とするＱＤとしては適していなかった。５−ＡＬＡの送達に使用される場合、強い蛍光はないが、構造摂動(structural perturbation)や光励起時の５−ＡＬＡ放出のために十分なエネルギー吸収を有するコアオンリーＱＤｓが、使用される。
【００７７】
他の実施形態では、コア／シェル粒子が用いられる、前記コア／シェル粒子は、少なくとも１つの半導体組成物の中心領域又は「コア」が、明らかに異なる半導体組成物からなる１又は複数の外層又は「シェル」の中に埋められるか又は被覆されている。一例として、コアは、Ｉｎ、Ｐ、Ｚｎ及びＳの合金で構成され、ＺｎＳ分子クラスターにインジウムベースのＱＤｓを分子播種し、次いでＺｎＳのシェルを形成することができる。
【００７８】
さらなる他の実施形態では、使用される水溶性ＱＤナノ粒子は、コア／シェルＱＤの製造の代わりに、合金化が外向きに傾斜して増加するバンドギャップ値又はエネルギー（Ｅｇ）を有する合金化された半導体材料を含む。バンドギャップエネルギー（Ｅｇ）は、電子を基底状態の価電子エネルギー帯から空の伝導エネルギー帯に励起するのに必要な最小エネルギーである。
【００７９】
傾斜合金(graded alloy)ＱＤの組成は、コアの上に独立したシェル層が別個に重ねられているのではなく、元素の組成が、粒子の中心又はその近傍からＱＤの最外表面まで傾斜して「段階的」である。一例として、Ｉｎ１−ｘＰ１−ｙＺｎｘＳｙがあり、ｘとｙが、ＱＤの中心から表面に向かって０から１へと徐々に増加するような傾斜合金ＱＤを挙げることができる。この例では、ＱＤのバンドギャップは、中心側の純ＩｎＰのバンドギャップ値から、表面の純ＺｎＳの大きなバンドギャップ値に徐々に変化する。ナノ粒子のバンドギャップは粒子径に依存するが、ＺｎＳのバルクバンドギャップはＩｎＰのバンドギャップよりも広いため、傾斜合金のバンドギャップは、ＱＤの内側から表面に向かって徐々に大きくなっていく。
【００８０】
本明細書の実施例１に記載された分子播種プロセスの変形として、ワンポット合成プロセスを採用することができる。実施例１の「コア」粒子の生成するプロセスでは、亜鉛及び硫黄前駆体の量を増加させることを記載しているが、このワンポット合成プロセスでは、粒子成長を維持するために、反応溶液に添加するミリスチン酸インジウム（Ｉｎ（ＭＡ）３）及びトリス（トリメチルシリル）ホスフィン（ＴＭＳ）３Ｐの量を徐々に減少させることによって達成されることができる。それゆえ、一実施例では、ジブチルエステル及び飽和脂肪酸を反応フラスコに入れ、加熱しながら脱気する。窒素を導入し、温度を上昇させる。分子クラスター、例えばＺｎＳ分子クラスター［Ｅｔ３ＮＨ］４［Ｚｎ１０Ｓ４（ＳＰｈ）ｌ６］を撹拌しながら添加する。ランピングプロトコル(ramping protocol)に基づいて、傾斜合金前駆体溶液を加えると温度が上昇する。ランピングプロトコルは、第１の半導体材料の濃度を徐々に減少させ、第２の半導体材料の濃度を徐々に増加させる。例えば、ランピングプロトコルは、ジカルボン酸エステル（例えばジ−ｎ−ブチルセバシン酸エステル等）に溶解したＩｎ（ＭＡ）３及び（ＴＭＳ）３Ｐを添加することから始まり、添加されたＩｎ（ＭＡ）３及び（ＴＭＳ）３Ｐの量は、時間の経過とともに徐々に減少し、その代わりに、（ＴＭＳ）２Ｓ及び酢酸亜鉛等の硫黄及び亜鉛化合物の濃度を徐々に増加する。Ｉｎ（ＭＡ）３及び（ＴＭＳ）３Ｐの添加量が減少すると、飽和脂肪酸（例えばミリスチン酸やオレイン酸等）及びジカルボン酸エステル（例えばジ−ｎ−ブチルセバシン酸エステル等）に溶解した（ＴＭＳ）２Ｓと（ＴＭＳ）２Ｓが徐々に増加し、酢酸亜鉛と共に添加される。以下の反応により、ＺｎＳ化合物の生成が増加する。添加が続くと、最大発光の波長が徐々に増加して所望サイズのＱＤ粒子が形成され、ＩｎＰとＺｎＳの濃度は傾斜して、ＩｎＰの濃度はＱＤ粒子の中心に向かって最も高く、ＺｎＳの濃度はＱＤ粒子の外層に向かってが最も高くなる。所望の最大発光が得られると反応物へのさらなる添加を停止し、得られた傾斜合金粒子は、アニーリングされ、その後、沈殿と洗浄によって粒子が分離される。
【００８１】
媒体との適合性や、ナノ粒子の凝集、光酸化及び／又はクエンチングに対する感受性は、主にナノ粒子の表面組成によってもたらされる。あらゆるコア、コアシェル又はコアマルチシェルのナノ粒子の最終的な無機表面原子についての配位は、不完全であって、表面が反応性の高い「ダンブリングボンド」であり、粒子の凝集を引き起こすことがある。この問題は、本明細書でキャッピングリガンド又はキャッピング剤と呼ばれる保護有機グループで「裸(bare)」の表面原子を不動態化（キャッピング）することによって克服される。粒子のキャッピング又は不動態化は、粒子の凝集の発生を防止するだけでなく、粒子をその周囲の化学環境から保護し、コア材料の場合には粒子に電子安定化（不動態化）をもたらす。キャッピングリガンドは、粒子の最外層の無機層の表面金属原子に結合されたルイス塩基であってもよいが、これに限定されるものではない。キャッピングリガンドの性質は、特定の媒体とのナノ粒子の適合性を大きく決定する。キャッピングリガンドは、所望される特性に応じて選択されることができる。採用され得るキャッピングリガンドの種類には、チオール基、カルボキシル基、アミン基、ホスフィン基、ホスフィンオキシド基、ホスホン酸基、ホスフィン酸基、イミダゾール基、ＯＨ基、チオエーテル基、及びカリックスアレーン基が含まれるが、これらに限定されない。カリックスアレーン基を除いて、これらのキャッピングリガンドは全て、ヘッド基を有し、粒子表面にキャッピングリガンドのアンカーリングセンターを形成することができる。キャッピングリガンドの本体は、直鎖、環状、又は芳香族であり得る。キャッピングリガンド自体は、大、小、オリゴマー、又は多価体であり得る。リガンドの本体及び粒子に結合されていない突出する側の両方の性質により、リガンドが親水性、疎水性、両親媒性、陰性、陽性、又は双性イオン性であるかどうかが決定される。
【００８２】
多くのＱＤ材料では、キャッピングリガンド（例えば、アルキルチオール、脂肪酸、アルキルホスフィン、アルキルホスフィンオキシド等）は疎水性である。それゆえ、ナノ粒子は、典型的には、ナノ粒子の合成及び単離の後、トルエン等の疎水性溶媒の中で分散される。そのようなキャッピングされたナノ粒子は、典型的には、極性の高い媒体の中では分散されない。ＱＤの表面修飾が所望される場合、最も広く使用されている手順は、リガンド交換として知られている。コア合成及び／又はシェル化工程の際、ナノ粒子の表面に配位する親油性リガンド分子は、極性／荷電リガンド化合物と交換されることができる。代替的な表面修飾戦略は、極性／荷電リガンド分子又はポリマー分子を、ナノ粒子の表面に既に配位されているリガンド分子とインターカレートする。しかしながら、リガンド交換及びインターカレーション工程により、ナノ粒子の水性媒体との適合性が向上することもあるが、それらは、修飾されていない対応するナノ粒子と比べて、材料の量子収率（ＱＹ）が低く、及び／又はサイズが大きくなることがある。
【００８３】
インビボ及びエクスビボを目的とする場合、必須ではないにしても、ＱＤｓの毒性は低いことが望ましい。それゆえ、目的によっては、ＱＤは、カドミウム、鉛及びヒ素のような毒性の重金属を実質的に含まないと定義される「非毒性」である（例えば、カドミウム、鉛、ヒ素のような重金属の含有量は、例えば５重量％未満、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、又は０．０１重量％未満）か、又はカドミウム、鉛、ヒ素のような重金属を含まない。一実施形態におけるＱＤｓは、カドミウム、鉛及びヒ素等の重金属を含まない低毒性ＱＤｓである。
【００８４】
ＱＤｓの独特な特性により、生体細胞における未解決のインビボ診断やエクスビボ診断等の幾つかの潜在的な医療応用が可能になる。ＱＤｓの医療応用に関する大きな問題の１つとして、研究の大部分がカドミウム、鉛、ヒ素等の毒性重金属を含有するＱＤｓに焦点を当てられていた。本明細書の幾つかの実施形態に記載されるＱＤｓは、生物学的に適合性があり、水溶性の重金属を含まないＱＤｓであり、インビボ及びエクスビボの両方の医療用途で安全に使用されることができる。幾つかの実施形態において、インビボ適合性で水分散性のカドミウムフリーＱＤｓは、流体力学的サイズが１０〜２０ｎｍ（比較のために説明すると、完全なＩｇＧ２抗体の寸法サイズの範囲内）である。一実施形態では、インビボ適合性の水分散性カドミウムフリーＱＤｓが生成される。幾つかの実施形態では、インビボ適合性の水分散性カドミウムフリーＱＤｓは、カルボキシル官能化され、リガンド又はリガンド結合部位でさらに誘導体化されている。
【００８５】
幾つかの態様において、リガンドは、抗体、ストレプトアビジン、核酸、脂質、糖化物、薬物分子、タンパク質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群のうちの１又は複数から選択される。幾つかの態様において、検出器が、血管形成、腫瘍分画、腫瘍転移、生体内診断、及びリンパ節進行の１又は２以上をイメージング及び検出するために使用される。他の態様において、検出器は、免疫化学、免疫蛍光、ＤＮＡ配列解析、蛍光共鳴エネルギー移動、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞ソーティング、及びハイスループットスクリーニングの１又は２以上において使用される。幾つかの態様において、リガンドのうちの少なくとも１つは、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、テロメラーゼタンパク質及びサブユニット、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ１０９、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４、及びＲＡＮＫリガンドからなる群から選択される標的に対して特異性を有する。幾つかの態様において、少なくとも１つの５−ＡＬＡ及び少なくとも１つの標的特異性リガンドを有するマルチリガンドナノデバイスが提供される。
【００８６】
特定の実施形態では、標的リガンドは抗体である。本明細書で使用される「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子、並びにその一部分、断片(fragments)及び誘導体の両方を含み、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｓｃ、ＣＤＲの領域がある。また、抗体の一部が、二特異性のキメラ抗体を含む抗原又はエピトープを結合することができる抗体、又は抗体に由来する抗原結合ドメインを別の種類のポリペプチドと結合する抗体を含む。従って、抗体という用語は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体の他に、例えば、酵素切断及び組換え技術を含むあらゆる既知の技術によって得られるそれら抗体の断片、一部分、領域、又はそれらの誘導体を含む。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、重鎖抗体の単一単量体可変抗体ドメイン（ＶＨ）を有する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）及びその断片を含む。可変の軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び一定の軽鎖（ＣＬ）ドメインを欠くｓｄＡｂは、ラクダ類（ＶＨＨ）及び軟骨魚類（ＶＮＡＲ）に生来的に存在しており、ラマの中に特異性抗原結合ｓｄＡｂを最初に開発した製薬会社Ａｂｌｙｎｘによる「ナノボディ(Nanobodies)」と呼ばれることがある。修飾因子「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の性質を示しており、任意の具体的方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。
【００８７】
本明細書に開示されるインビボ適合性の水分散性カドミウムフリー又は非毒性のＱＤｓを用いたインビトロ及びインビボ毒性試験は、市販のカドミウムベースのＱＤｓと比べて、細胞毒性が少なくとも２０倍低く、有効投与量よりも複数倍多く投与した動物モデルで毒性の徴候は観察されなかった。さらに、本明細書で提供されるインビボ適合性水分散性カドミウムフリーＱＤナノ粒子は、溶血作用及び補体Ｃ３活性化を示さず、良好な臨床適合性プロファイルを示した。
【００８８】
カドミウム、鉛及びヒ素を含まないナノ粒子の例は、半導体材料を含むナノ粒子であり、例えば、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＳｂ、ＡｌＰ、ＡｌＳ、ＡｌＳｂ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＳｂ、ＡｇＩｎＳ２、ＣｕＩｎＳ２、Ｓｉ、Ｇｅ、並びにそれらの合金及びドープされた誘導体を含むナノ粒子であり、特に、これらの材料からなる１つのコアと、これらの材料の別の１つ又は複数のシェルと、を含むナノ粒子である。
【００８９】
単一の半導体材料を含むナノ粒子、例えば、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＩｎＰ、ＧａＮ等を含むナノ粒子は、ナノ粒子の表面の欠陥及びダングリングボンドで発生する非放射性電子−正孔再結合のために、粒子効率が比較的低いことが指摘されている。これらの問題に少なくとも部分的に対処するために、ナノ粒子コアの少なくとも一部分を、コアとは異なる材料、例えば「コア」とは異なる半導体材料の１又は複数の層（本明細書では「シェル」ということもある）で被覆することもできる。１又は複数のシェルに含まれる材料は、周期表の第２族から第１６族までの任意の１又は２以上のイオンを含むことができる。ナノ粒子が２又は３以上のシェルを有する場合、各シェルは異なる材料で形成されることができる。例示的なコア／シェル材料では、コアは、上記材料のうちの１つから形成されることができ、シェルは、コア材料よりもバンドギャップエネルギーが大きく、同様の格子寸法を有する半導体材料を含む。シェル材料の例として、限定するものでないが、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＺｎＳｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ及びＧａＮを挙げることができる。マルチシェルナノ粒子の一例は、ＩｎＰ／ＺｎＳ／ＺｎＯである。電荷キャリアをコア内に閉じ込めて、表面状態から遠ざけることにより、ナノ粒子の安定性を向上させ、量子収率を高めることができる。
【００９０】
毒性の重金属を含まないＱＤｓが望ましいが、カドミウムを含まないナノ粒子の表面を改質することは特に困難であることが立証されている。カドミウムフリーのナノ粒子の表面を修飾するために前述のリガンド交換法を使用すると、カドミウムを含まないナノ粒子は容易に分解する。例えば、カドミウムフリーのナノ粒子の表面を改質する試みでは、そのようなナノ粒子の発光ＱＹの有意な低下を引き起こすことが観察されている。本明細書に開示される特定のインビボ目的のためには、高いＱＹを有する表面改質されたカドミウムフリーのナノ粒子が必要である。本明細書に開示されるカドミウムフリーの水分散性ナノ粒子は、高いＱＹを有し、約２０％より多いＱＹ、約２５％より多いＱＹ、約３０％より多いＱＹ、約３５％より多いＱＹ、又は約４０％より多いＱＹを有する。特定のインビボの実施形態では、重金属を含まない半導体インジウムベースのナノ粒子か、インジウム及び／又はリンを含有するナノ粒子が好ましい。
【００９１】
特定の実施形態において、非毒性のＱＤナノ粒子は、表面が、水溶性になるように改質され、また、リガンド相互作用剤に曝露することによってリガンド相互作用剤とＱＤの表面とが会合(association)するように誘導することができる表面部位を有するように改質される。リガンド相互作用剤は、後述するように、連結／架橋剤に対して特異的親和性又は反応性を有する鎖部分と官能基とを有することができる。鎖部分は、例えば、アルカン鎖であってよい。官能基の例としては、チオ基、ヒドロキシル基、カルボキサミド基、エステル基、カルボキシル基等の求核基が挙げられる。また、リガンド相互作用剤は、ＱＤの表面に親和性を有する部位を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。このような部位の例として、チオール基、アミン基、カルボキシル基、ホスフィン等が挙げられる。リガンド相互作用基がそのような部位を含まない場合、リガンド相互作用基は、キャッピングリガンドとインターカレートすることにより、ナノ粒子の表面と会合させることができる。リガンド相互作用剤の例としては、Ｃ８−２０脂肪酸及びそのエステルが挙げられ、例えばミリスチン酸イソプロピルがある。
【００９２】
リガンド相互作用剤は、ナノ粒子の合成に使用されるプロセスの単なる結果として、ＱＤナノ粒子と会合させることができるので、ナノ粒子を、さらなる量のリガンド相互作用剤に曝露させる必要性を省略できることに留意すべきである。そのような場合、更なるリガンド相互作用剤をナノ粒子に会合させる必要はない。代替として、又はそれに加えて、ＱＤナノ粒子は、ナノ粒子が合成され、単離された後に、リガンド相互作用剤に曝露されてもよい。例えば、ナノ粒子は、リガンド相互作用剤が含まれる溶液中で所定時間培養されることができる。そのような培養、又は培養期間の一部は、リガンド相互作用剤のナノ粒子表面との会合を促進するために、高温で行なってもよい。ナノ粒子の表面とリガンド相互作用剤の会合に続いて、ＱＤナノ粒子を、連結／架橋剤及び表面改質リガンドに曝露する。連結／架橋剤は、リガンド相互作用剤の基に対して特異的親和性を有する官能基を、表面改質リガンドと共に含む。リガンド相互作用剤−ナノ粒子の会合コンプレックスは、連結／架橋剤及び表面改質リガンドに順次曝露されることができる。例えば、ナノ粒子は、ある時間、連結／架橋剤に曝露して架橋し、その後、ナノ粒子のリガンドシェルに組み入れるために、表面改質リガンドに曝露することができる。あるいは、ナノ粒子は、連結／架橋剤と表面改質リガンドの混合物に曝露することにより、架橋と表面改質リガンドの組込みを単一のステップで行うこともできる。
【００９３】
一実施形態において、ＱＤ前駆体は、分子クラスター化合物の存在下で、分子クラスターの完全性が維持される条件で提供され、分子クラスターは、予め決められた作製済みのシード又はテンプレートとして機能し、化学的前駆体と反応する核生成中心となって、高品質のナノ粒子を、産業的に適用するのに十分な大規模で生成することができる。
【００９４】
本発明に有用なＱＤｓとして好適な種類のＱＤｓは、限定するものではないが、以下に記載の種類（任意の組合せ又はその合金若しくはドープされた誘導体を含む）のＱＤｓを含むコア材料である。
【００９５】
ＩＩＡ−ＶＩＢ（２−１６）材料であって、周期表第２族の第１の元素及び周期表第１６族の第２の元素を含み、三元系材料及び四元系材料及びドープされた材料をも含む。好適なナノ粒子材料として、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅを挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
ＩＩ−Ｖ材料であって、周期表第１２族の第１の元素及び周期表第１５族の第２の元素を含み、三元系材料及び四元系材料及びドープされた材料をも含む。好適なナノ粒子材料として、Ｚｎ３Ｐ２、Ｚｎ３Ａｓ２、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、Ｃｄ３Ｎ２、Ｚｎ３Ｎ２を挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
ＩＩ−ＶＩ材料であって、周期表第１２族の第１の元素及び周期表第１６族の第２の元素を含み、三元系材料及び四元系材料及びドープされた材料をも含む。好適なナノ粒子材料として、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＺｎＯ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＣｄＳｅＳ、ＣｄＳｅＴｅ、ＣｄＳＴｅ、ＺｎＳｅＳ、ＺｎＳｅＴｅ、ＺｎＳＴｅ、ＨｇＳｅＳ、ＨｇＳｅＴｅ、ＨｇＳＴｅ、ＣｄＺｎＳ、ＣｄＺｎＳｅ、ＣｄＺｎＴｅ、ＣｄＨｇＳ、ＣｄＨｇＳｅ、ＣｄＨｇＴｅ、ＨｇＺｎＳ、ＨｇＺｎＳｅ、ＨｇＺｎＴｅ、ＣｄＺｎＳｅＳ、ＣｄＺｎＳｅＴｅ、ＣｄＨｇＳｅＳ、ＣｄＨｇＳｅＴｅ、ＣｄＨｇＳｔｅ、ＨｇＺｎＳｅＳ及びＨｇＺｎＳｅＴｅを挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
ＩＩＩ−Ｖ材料であって、周期表第１３族の第１の元素及び周期表第１５族の第２の元素を含み、三元系材料及び四元系材料及びドープされた材料をも含む。好適なナノ粒子材料として、ＢＰ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ；ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＳｂ；ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＳｂ、ＡＩＮ、及びＢＮを挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
ＩＩＩ−ＩＶ材料であって、周期表第１３族の第１の元素及び周期表第１４族の第２の元素を含み、三元系材料及び四元系材料及びドープされた材料をも含む。
好適なナノ粒子材料として、Ｂ４Ｃ、Ａｌ４Ｃ３、Ｇａ４Ｃ、Ｓｉ、ＳｉＣを挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
ＩＩＩ−ＶＩ材料であって、周期表第１３族の第１の元素及び周期表第１６族の第２の元素を含み、三元系材料及び四元系材料をも含む。好適なナノ粒子材料として、Ａｌ２Ｓ３、Ａｌ２Ｓｅ３、Ａｌ２Ｔｅ３、Ｇａ２Ｓ３、Ｇａ２Ｓｅ３、ＧｅＴｅ；Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｇａ２Ｔｅ３、Ｉｎ２Ｔｅ３、ＩｎＴｅを挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
ＩＶ−ＶＩ材料であって、周期表第１４族の第１の元素及び周期表第１６族の第２の元素を含み、三元系材料及び四元系材料及びドープされた材料をも含む。好適なナノ粒子材料としてＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＰｂＴｅ、Ｓｂ２Ｔｅ３、ＳｎＳ、ＳｎＳｅ、ＳｎＴｅを挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
適当なナノ粒子材料は、周期表の遷移金属の任意の族の第１の元素と、周期表第１６族の第２の元素とを含むことができ、また、３元系材料及び４元系材料及びドープ材料を含むことができる。例えば、Ｉ−ＩＩＩ−ＶＩ材料は、周期表第１１族の第１の元素、周期表第１３族の第２の元素、及び周期表第１６族の第３の元素を含み、四元系材料、さらに高次元の材料及びドープされた材料も含む。好適なナノ粒子材料として、ＣｕＩｎＳ２、ＣｕＩｎＳｅ２、ＣｕＧａＳ２、ＣｕＧａＳｅ２、ＡｇＩｎＳ２、ＡｇＩｎＳｅ２、ＮｉＳ、ＣｒＳ及びＡｇＳを挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
一実施形態において、本発明で有用なＱＤｓは、ＡｇＳを含むコア材料を挙げることができるが、これに限定されない。
【０１０４】
本明細書に記載される任意のＱＤｓの実施形態において、ナノ粒子は、ＩＩ−ＩＶ材料、ＩＩＩ−Ｖ材料、Ｉ−ＩＩＩ−ＶＩ材料、又はそれらの合金又はドープされた誘導体を含む。
【０１０５】
一実施形態において、ナノ粒子材料は、ＩＩ−ＩＶ材料、ＩＩＩ−Ｖ材料、及びそれらの任意の合金又はドープされた誘導体を含む。
【０１０６】
本明細書に記載される任意のＱＤｓの実施形態において、ナノ粒子は、ＩＩＩ−Ｖ材料又はその合金又はドープされた誘導体を含む。
【０１０７】
明細書及び特許請求の範囲の目的のためにドープされたナノ粒子という用語は、上記のナノ粒子及び１又は複数の主要な基又は希土類元素を含むドーパントのことを言う。これは多くの場合、遷移金属又は希土類元素であり、例えばマンガンを有する硫化亜鉛であり、より具体的にはＭｎ＋でドープされたＺｎＳナノ粒子であるが、これに限定されるものではない。
【０１０８】
一実施形態において、ＱＤｓは、カドミウム等の重金属を実質的に含まない（例えば、５重量％未満、例えば、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、又は０．０１重量％未満）か、又はカドミウム等の重金属を含まない。
【０１０９】
インビボ用途のためには、重金属を含まない半導体インジウムベースのナノ粒子、又はインジウム及び／又はリンを含むナノ粒子が好ましい。
【０１１０】
一実施形態では、本明細書に記載される任意のＱＤｓは、ナノ粒子コアに配備される第１の半導体材料を含む第１の層を含む。また、第１の層の上に、第２の半導体材料を含む第２の層を配備されることができる。
【０１１１】
＜合成＞
コンジュゲート生成には、以下の合成ステップを使用することができる。ナノ粒子上のカルボキシル官能基と５−ＡＬＡ上のアミン末端基との間にアミド基を形成するためにリンカーを使用されることができる。公知のリンカー、例えばチオール基を、アンカー基として、ＱＤｓの無機表面上に直接使用することができる。当業者に知られている標準的なカップリング条件を採用することができる。適当なカップリング剤として、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等のカルボジイミドを挙げることができるが、これらに限定されない。一実施形態において、カップリング剤はＥＤＣである。
【０１１２】
一実施例において、図１に示されるように、カルボキシル末端基を有するＱＤｓと５−ＡＬＡは溶媒中で混合されることができる。この混合物にＥＤＣ等のカップリング剤を添加することができる。反応混合物は培養されることができる。カップリングには、標準的な培養条件が用いられる。例えば、カップリング条件は、０．５〜４時間の溶液であってよい。カップリング条件の温度範囲は、０℃〜２００℃の範囲であってよい。カップリング条件は、反応中、一定であってよく、変化してもよい。例えば、反応条件は、１３０℃で１時間であり、次いで、１４０℃に昇温し、３時間反応させてもよい。
【０１１３】
重合性の粗リガンドナノ粒子コンジュゲートは、精製及び／又は単離が行われる。標準的な固相精製(solid state purification)方法を使用することができる。過剰な未反応の官能化リガンド及び／又はカップリング剤を除去するために、適当な溶媒でろ過及び洗浄を数回繰り返す必要があるかもしれない。
【０１１４】
別の態様において、一実施形態では、本明細書に記載された何れかの実施形態に従って、リガンドナノ粒子コンジュゲートを調製するためのプロセスが提供される。一実施形態において、プロセスは、ｉ）ＱＤｓを５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルとカップリングしてＱＤ−５−ＡＬＡ（又は５−ＡＬＡエステル）コンジュゲート及び外層を生成することを含み、ＱＤは、コア半導体材料を含み、外層は、カルボキシル基を含む。一実施形態では、カップリングステップｉ）は、（ａ）外層のカルボキシル基をカルボジイミドリンカーと反応させてカルボキシル基を活性化することと、（ｂ）活性化されたカルボキシル基を５−ＡＬＡと反応させること、とを含む。
【０１１５】
追加の実施形態において、工程はさらに、ｉｉ）ＱＤ−５−ＡＬＡ（又は５−ＡＬＡエステル）コンジュゲートを精製することを含む。さらなる実施形態では、プロセスはさらに、ｉｉｉ）ＱＤ−５−ＡＬＡ（又は５−ＡＬＡエステル）コンジュゲートを単離することを含む。一実施形態において、プロセスは、ステップｉ）、ｉｉ）及びｉｉｉ）を含む。
【０１１６】
以下の実施例は、開示を完全にするために、及び本発明の組成物及び複合物の製造方法を例示するために、また組成物の特定の特徴を示すために提供される。これらの実施例は、いかなる意味においても、本開示の範囲又は教唆を制限することを意図していない。
【実施例】
【０１１７】
＜実施例１＞
［非毒性の量子ドットの合成］
非毒性の量子ドットの生成に、分子シーディングプロセスを用いた。５００〜７００ｎｍの発光を有する非官能化インジウムベースの量子ドットの調製を簡単に説明すると次のとおりである。ジブチルエステル（約１００ｍｌ）とミリスチン酸（ＭＡ）（１０．０６ｇ）を三口フラスコに入れ、真空下の約７０℃の温度で１時間脱気した。その後で、窒素を導入し、温度を約９０℃に上昇させた。約４．７ｇのＺｎＳ分子クラスター［Ｅｔ３ＮＨ］４［Ｚｎ１０Ｓ４（ＳＰｈ）ｌ６］を添加し、混合物を約４５分間撹拌した。次いで、温度を約１００℃まで上昇させ、次いで、Ｉｎ（ＭＡ）３（１Ｍ，１５ｍｌ）を滴下し、次いで、トリメチルシリルホスフィン（ＴＭＳ）３Ｐ（１Ｍ，１５ｍｌ）を加えた。反応混合物を撹拌しながら、温度を約１４０℃まで上昇させた。１４０℃の温度で、ジ−ｎ−ブチルセバシン酸エステル（１Ｍ，３５ｍｌ）に溶解したＩｎ（ＭＡ）３（５分間放置）と、ジ−ｎ−ブチルセバシン酸エステル（１Ｍ，３５ｍｌ）に溶解した（ＴＭＳ）３Ｐと、をさらに滴下した。その後、１８０℃までゆっくりと昇温し、Ｉｎ（ＭＡ）３（１Ｍ、５５ｍｌ）を滴下し、さらに（ＴＭＳ）３Ｐ（１Ｍ、４０ｍｌ）を滴下した。このようにして前駆体を添加することにより、最大発光が５００ｎｍから７２０ｎｍまで徐々に増加するインジウムベースの粒子が形成された。所望の発光最大値が得られた時点で反応を停止し、その反応温度で３０分間攪拌した。この後、混合物を最長約４日間（反応温度より低い約２０〜４０℃の温度で）アニーリングした。この段階では、アニーリングを補助するためにＵＶランプを使用した。
【０１１８】
カニューレ法により、乾燥脱気メタノール（約２００ｍｌ）を加えることにより、粒子を単離した。析出物を沈降させた後、フィルタースティックを使用し、カニューレを介してメタノールを除去した。乾燥脱気クロロホルム（約１０ｍｌ）を加えて、固体を洗浄した。固体は、１日間真空下で乾燥させた。この手順により、ＺｎＳ分子クラスター上にインジウムベースのナノ粒子が形成された。さらに、希釈されたフッ化水素酸（ＨＦ）で洗浄することにより、インジウムベースナノ粒子の量子収率はさらに向上した。インジウムベースのコア材料の量子効率は約２５％〜５０％であった。この組成物は、Ｉｎ、Ｐ、Ｚｎ及びＳを含む合金構造と考えられる。
【０１１９】
ＺｎＳシェルの成長について説明する。ＨＦでエッチングしたインジウムベースのコア粒子２０ｍｌを三口フラスコの中で乾燥させた。１．３ｇのミリスチン酸と２０ｍｌのジ−ｎ−ブチルセバシン酸エステルを加えて、３０分間脱気した。この溶液を２００℃に加熱し、１Ｍ（ＴＭＳ）２Ｓを２ｍｌ滴下した（７．９３ｍｌ／ｈの速度）。この添加が完了した後、溶液を２分間放置し、無水酢酸亜鉛１．２ｇを加えた。この溶液を２００℃で１時間保持した後、室温まで冷却した。得られた粒子を無水脱気メタノール４０ｍｌを加え、遠心分離によって単離した。上澄み液を捨てて、残った固体に無水脱気ヘキサン３０ｍｌを加えた。この溶液を５時間沈降させた後、再び遠心分離した。上澄み液を回収し、残りの固体を廃棄した。官能化されていない最終のインジウムベースのナノ粒子材料のＱＹは、有機溶媒中で約６０％〜９０％であった。
【０１２０】
＜実施例２＞
［水溶性表面が改質されたＱＤ］
本明細書で提供される一実施形態の方法は、メラミンヘキサメトキシメチルメラミン（ＨＭＭＭ）で改質された蛍光ナノ粒子を使用して、５−ＡＬＡとのコンジュゲーションに適した水溶性ＱＤを生成する。メラミンをベースにした独特のコーティングは、優れた生体適合性、低い毒性、非常に低い非特異的結合作用を有する。これら独特の特徴により、インビトロ及びインビボの両方で広範な生物医学的応用が可能になる。
【０１２１】
好適な水溶性ナノ粒子の調製の一実施例を以下に記載する。実施例１に記載のＺｎ含有シェルを有するインジウム及びリンからなる合金をコア材料として有する６０８ｎｍの赤色発光を有するカドミウムフリーＱＤ２００ｍｇを、トルエン（１ｍＬ）中にミリスチン酸イソプロピル（１００マイクロリットル）と共に分散させた。このミリスチン酸イソプロピルはリガンド相互作用剤として含有させる。混合物を５０℃で約１〜２分間加熱した後、室温で１５時間ゆっくりと揺さぶった。  ＨＭＭＭＭ（ＣＹＭＥＬ３０３、Cytec Industrions,Inc. West Paterson, NJ）（４００ｍｇ）のトルエン溶液（４ｍＬ）、モノメトキシポリエチレンオキサイド（ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ２０００−ＯＨ）（４００ｍｇ）、及びサリチル酸（５０ｍｇ）を、ナノ粒子分散液に添加した。官能化反応に含まれるサリチル酸は、触媒、架橋剤及びＣＯＯＨの供給源として３つの役割を果たす。ＨＭＭＭはＯＨ基に優先することもあって、サリチル酸が提供する多くのＣＯＯＨ基は、架橋後もＱＤ上で依然として利用可能である。
【０１２２】
ＨＭＭＭは、次の構造を有するメラミンベースの連結／架橋剤である。
【化１】
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【０１２３】
ＨＭＭＭＭは、酸触媒反応における反応により、アミド基、カルボキシル基、水酸基、及びチオール等の様々な官能基は架橋される。
【０１２４】
混合物を脱気し、１３０℃で１時間還流した後、磁気攪拌機を用いて３００ｒｐｍで撹拌しながら１４０℃で３時間還流した。ＨＭＭＭと求核剤との反応により発生する揮発性副生成物を確実に除去するために、最初の１時間、窒素の流れをフラスコに通した。混合物を室温まで冷却し、不活性ガス下で保存した。表面改質ナノ粒子は、修飾されていないナノ粒子と比較して、蛍光量子収率の損失がほとんど又は全くなく、発光ピーク又は半値全幅（ＦＷＨＭ）の値に変化は全くなかった。表面改質ナノ粒子のアリコートを真空下で乾燥し、脱イオン水を残渣に加えた。表面改質ナノ粒子は水性媒体中でよく分散し、恒久的に分散したままであった。これに対し、未修飾ナノ粒子は、水性媒体中に懸濁することができなかった。上記の手順に従った表面改質ナノ粒子の蛍光ＱＹは、４０〜５０％である。典型的なバッチでは、４７％±５％の量子収率が得られる。
【０１２５】
別の実施形態では、６０８ｎｍでの赤色発光を有するカドミウムフリーＱＤ（２００ｍｇ）を、コレステロール（７１．ｍｇ）と共にトルエン（１ｍＬ）中に分散させた。この混合物を５０℃で約１〜２分間加熱した後、室温で１５時間ゆっくりと揺さぶった。ＨＭＭＭ（ＣＹＭＥＬ  ３０３）（４００ｍｇ）、モノメトキシポリエチレンオキサイド（ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ２０００−ＯＨ）（４００  ｍｇ）、グアイフェネシン（１００  ｍｇ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（２ｍＬ）及びサリチル酸（５０ｍｇ）のトルエン溶液（４ｍＬ）を、ナノ粒子分散液に添加した。
【０１２６】
本明細書で使用される化合物「グアイフェネシン(guaifenesin)」は、次の化学構造を有する。
【化２】
2021500329.tif 000004
【０１２７】
本明細書で使用されるように化合物「サリチル酸」は、次の化学構造を有する。
【化３】
2021500329.tif 000005
【０１２８】
混合物を脱気し、磁気攪拌機で３００ｒｐｍで撹拌しながら１４０℃で４時間還流した。前記方法と同じ様に、ＨＭＭＭと求核剤との反応により発生する揮発性の副生成物を確実に除去するために、最初の１時間は、窒素の流れをフラスコに通した。混合物を室温まで冷却し、不活性ガス下で保存した。表面改質されたナノ粒子のアリコートを真空下で乾燥し、残渣に脱イオン水を加えた。溶液のｐＨを１００ｍＭのＫＯＨ溶液を用いて６．５に調整し、アミコンフィルター（３０ｋＤ）を用いて３サイクルの限外ろ過により、反応されていない材料を除去した。最終水溶液は使用するまで冷蔵保存した。
【０１２９】
ナノ粒子の水溶性を増加させるためにナノ粒子を改質する従来の方法（例えば、メルカプト官能化された水溶性リガンドとのリガンド交換）では、ナノ粒子を水溶性にするための条件が緩やかな場合に効果がないことは注目に値する。熱や超音波等の過酷な条件下では、水溶性になる画分はＱＹが非常に低い（＜２０％）。これに対し、本発明の方法は、高い量子収率を有する水溶性ナノ粒子を提供する。本明細書で定義される高い量子収率とは、４０％に等しいか又は４０より大きい。幾つかの実施形態では、高い量子収率は、４５％に等しいか又は４５％より大きい。本実施例において調製された表面改質ナノ粒子は、良好に分散し、例えば、エタノール、プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、ブタノール、トリプロピルメチルメタクリレート、又はメチルメタクリレートなどの他の極性溶媒中では永久的に分散する。
【０１３０】
＜実施例３＞
［インビボで適合性を有する水分散性カドミウムフリーＱＤｓの抗体との共有結合コンジュゲーション］
エッペンドルフチューブ中で、１．２ｍｇのカルボキシル官能化された水溶性ＱＤｓを１００μｌのＭＥＳ活性化緩衝液（すなわち、５０ｍｇ／ｍｌストック２５μｌを１００μｌのＭＥＳに混合）と混合した。ＭＥＳ緩衝液は、ＤＩ水の中で、ｐＨ４．５の２５ｍＭ溶液（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ヘミソジウム塩（ＭＥＳ）、Sigma Aldrich）として調製した。これに、新鮮なＥＤＣ溶液（ＤＩ水中に３０ｍｇ／ｍｌストック、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ），Fisher Scientific）を３３μｌ添加し、その溶液を混合した。これに、新鮮なスルホ−ＮＨＳ（ＤＩ水中に１００ｍｇ／ｍｌストック、ThermoFisher Scientific）４μｌを加えて、その溶液を混合した。１００μｌのＭＥＳ中で、ナノセップ３００Ｋフィルター（PALL NanoSep 300K オメガウルトラフィルター）を予め湿潤させた。ＭＥＳ／ＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ／ＱＤ溶液をナノセップ３００Ｋフィルターに加えて、ＭＥＳを５００μｌ補充した(topped up)。フィルターを５００００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した。分離されたドット(retained dots)を、活性化緩衝液５０μｌ中に再分散させ、１０μｌのトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ＨＥＰＥＳ緩衝液の２５ｍＭ溶液中のストック１００ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ８．５）＋４０μｌのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５が入れられたエッペンドルフチューブに移した。溶液を十分混合し、ＲＴで一晩（約１６〜１８時間）インキュベートした。溶液を１６μｌの６−アミノカプロン酸（６ＡＣ）（１９．７ｍｇ／１００ｍＭ）で急冷した。急冷は、第一級アミンを有する他の化合物に行うこともできるが、この実施形態では、６ＡＣを選択した。その理由は、６ＡＣは、ＣＯＯＨを有し、生成物のコロイド安定性を維持することができるからである。溶液を、予め湿潤したナノセップ３００Ｋフィルター（１００μｌ  １ｘＰＢＳ）に移し、１ｘ  ＰＢＳで５００μｌラインまで補充した。過剰の反応物は、ナノセップ３００Ｋフィルターと、１ｘＰＢＳ緩衝液を用いて、限外濾過を３サイクル実施して除去した。遠心分離の各サイクルは、５０００ｒｐｍで２０分間であり、各サイクルの後に約４００μｌの１ｘＰＢＳで再分散した。最終濃縮物は１００μｌのＰＢＳの中に再分散した。
【０１３１】
＜実施例４＞
［重合性リガンドの添加］
一実施形態において、重合性リガンドは、ＨＡＬＡ−ＱＤ（ＨＡＬＡは５アミノレブレン酸のヘキシルエステルである）等の５−ＡＬＡ−ＱＤ又は５−ＡＬＡエステルに結合され、前記重合性リガンドは、量子ドットナノ粒子をエネルギー源（例えば、紫外線又は可視光源等の光源）で励起することによって重合される。
【０１３２】
適当な重合性リガンドには、アクリレート、メタクリレート、ジアセチレン、シアノアクリレート、アジド／アルキン対（クリックケミストリー）、及びそれらの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、重合性リガンドは、メタクリレート（例えば、２−アミノエチルメタクリレート）又はその塩、例えば塩酸塩である。好適なアクリルベースの重合性リガンドは、例えば、メタクリロイル−Ｌ−リジン、４−メタクリロイル−２−ヒドロキシベンゾフェノン、及びそれらの塩、並びにそれらの任意の組合せを含む。
【０１３３】
一実施形態では、重合性リガンドは、アクリレートリガンド及びメタクリレートリガンドを含む。例えば、メタクリレートリガンドを含む量子ドットナノ粒子は、励起光を用いて重合され、架橋されることができ、励起の形成を誘導し、それによってアクリレート重合を開始することができる。
【０１３４】
追加の実施形態において、量子ドットナノ粒子の重合を促進するために、光活性モノマー（例えば、メタクリロイル−Ｌ−リジン、４−メタクリロキシ−２−ヒドロキシベンゾフェノン等）を単独で、又は１又は２種以上の標準モノマーと組み合わせて使用することもできる。一実施形態では、重合性リガンドはシアノアクリレートである。別の実施形態では、重合性リガンドは、グリシジルシナメート又はその誘導体である。さらに別の実施形態では、重合性リガンドは、ジアセチレン、例えばトリコサ−１０，１２−ジイノイン酸である。
【０１３５】
カルボキシ官能化されたＱＤは、標準的なＥＤＣ化学を用いて２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩に連結される。得られたドットは、ペンダントメタクリレート基を有し、これは標的とする組織に送達され、エネルギー源によるＱＤの励起によって重合される。
【０１３６】
他の実施形態において、カルボキシ官能化された赤色ＱＤは、標準的なＥＤＣ化学を用いてメタクリロイル−Ｌ−リジンに連結される。得られたＱＤは、３００〜５００ｎｍの紫外線／可視励起によって重合可能なペンダントメタクリレート基を有する。１０００×倍率での蛍光顕微鏡イメージングでは、３２０ｎｍのＵＶを照射すると、ナノ粒子が凝集することがわかった。これは、照射されていないナノ粒子とは異なる。このＱＤｓは標的とする組織に送達され、エネルギー源でＱＤｓを励起することによって重合される。
【０１３７】
一実施例において、カルボキシ官能化されたＱＤｓを、以下のように疎水性相互作用力を用いて、４−メタクリロキシ−２−ヒドロキシベンゾフェノン（式Ｉ）を表面担持した。実施例１及び２に従って作製された水溶性ドット１００ｍｇを１ｍＬのＨ２Ｏに分散させた量に、１００ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯに溶解された４−メタクリロキシ−２−ヒドロキシベンゾフェノンの溶液１００μＬを、勢いよく混合しながら添加した。
【化４】
2021500329.tif 000006
【０１３８】
透明溶液が生成され、該透明溶液に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）１ｍＬを加えた。４−メタクリロキシ−２−ヒドロキシベンゾフェノンが水に不溶であるにも拘わらず、溶液は透明なままであった。４−メタクリロキシ−２−ヒドロキシベンゾフェノンは水に不溶であるにもかかわらず、溶液は透明であった。これは、モノマーである４−メタクリロキシ−２−ヒドロキシベンゾフェノンがナノ粒子の表面に疎水的相互作用を形成することができ、ナノ粒子と共に分散したことを示している。次いで、透明溶液は、０．２２μｍのシリンジフィルターを用いて滅菌した。
【０１３９】
重合性ＱＤ調製物の小滴を顕微鏡スライドの上に載せて、ガラス製カバースリップで覆い、その後、６ワットの手持ちＵＶランプ（ＵＶＰ、ＬＬＣ）を用いて、波長３６５ｎｍで５分間照射した。対照スライドを同様に調製したが、照射しなかった。次いで、スライドを蛍光顕微鏡を用いて調べた。照射された試料は、有意な凝集を示した（データは示されていない）。
【０１４０】
＜実施例５＞
［ＱＤ−５−ＡＬＡコンジュゲートの調製］
一実施例において、カルボキシ官能化ＱＤｓには、以下のように疎水性相互作用力を用いて表面に５−ＡＬＡを付加した。実施例１及び２に従って調製し、６３０ｎｍで発光するように寸法を調整した１００ｍｇまでの水溶性ＱＤを１ｍＬのＨ２Ｏに分散させ、１００ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯに溶解した１００μＬの５−ＡＬＡ溶液を勢いよく混合しながら添加した。生成された溶液に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）１ｍＬを直ちに加えた。
【０１４１】
別の合成例では、カルボキシ官能基化ＱＤｓの表面に、以下のように５−ＡＬＡを付加した。実施例１及び２に従って調製し、６３０ｎｍで発光するように寸法を調整した１０  ｍｇの水溶性ドットを０．５ｍＬのＭＥＳ緩衝液［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（２５ｍＭ，ｐＨ４．５）］に分散させた。１００μＬのＥＤＣ水溶液（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、ＥＤＡＣ又はＥＤＣＩ）３０ｍｇ／ｍＬ）を加え、次いで２０μＬのスルホ−ＮＨＳ溶液（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド１００ｍｇ／ｍＬの水溶液）を加えた。混合物を室温（ＲＴ）で１０分間放置した後、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）３０ｋＤａ遠心分離フィルターに移し、３ｍＬのＭＥＳ緩衝液で希釈し、３５００ＲＣＦで３０分間回転した。フィルターに保持されたナノ粒子が活性化され、除去し、５０ｍｇ／ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液［ＨＥＰＥＳ  ５０ｍＭ、ｐＨ７．５］に溶解した１００μＬの５−ＡＬＡと混合した。４℃で一晩インキュベートした後、混合物をＡＭＩＣＯＮ３０ｋＤａ遠心分離フィルター及びＰＢＳ、ｐＨ７．２を用いて、２サイクルの遠心分離で再度洗浄した。最終的なアリコートを必要に応じて希釈し、１０ｍｇ／ｍＬのＱＤ−５−ＡＬＡコンジュゲートを生成し、使用するまで冷蔵保存した。
【０１４２】
ｃＲＧＤ−ＱＤコンジュゲートも調製した。ＲＧＤはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの配列を持つペプチドであり、細胞膜上のインテグリンに特異的に結合し、細胞内への取込みをトリガすることが知られている。ｃＲＧＤは、以下に示される配列周期（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）（ＣＡＳ番号：［161552-03-0］）を有する周期バージョンであり、より強力な細胞取込みを可能にすることが知られている。
【化５】
2021500329.tif 000007
上記構造に示されるアミン官能化リンカーアームを有するｃＲＧＤを用いて、ＱＤコンジュゲートを調製した［Peptides International, Inc. Louisville, Kentucky, USA］。
【０１４３】
５−ＡＬＡコンジュゲートを調製するための直上のプロトコルにおいて、５−ＡＬＡ溶液（５０ｍｇ／ｍＬ溶液）を１ｍｇ／ｍＬのｃＲＧＤ溶液に代えて、上記ｃＲＧＤをＱＤｓにコンジュゲートした。ｃＲＧＤ−ＱＤコンジュゲートを使用する主な目的は、ｃＲＧＤコンジュゲートによってＱＤの取込みが増加した場合でも、５−ＡＬＡシグナルの増加が、５−ＡＬＡコンジュゲートされたＱＤほど高くないことを示すことであり、その増加は、ＱＤ表面上又はその近傍でＰｐＩＸの合成によることを示すことである。Ｈｅｌｅｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Trastuzumab）ＱＤコンジュゲートを、実施例３に記載したプロトコルと同様のプロトコルを用いて調製した。
【０１４４】
［５−ＡＬＡの細胞内取込みの比較］
ＳＫＢＲ３ヒト乳がん細胞を、ＡＴＣＣのＭｃＣｏｙ５ａ培地（ウェルあたり３ｍＬ）を使用して、ガラスカバースリップが付属した６ウェルプレートで培養した。最終濃度を約５０ｕｇ／ｍＬにするために、ＱＤ又はＱＤコンジュゲートは、約５０％の細胞増殖コンフルエントで各ウェルに加えられる。
【０１４５】
１００ｍＭの脱イオンＨ２Ｏ中で５−ＡＬＡ溶液を調製し、必要に応じて、最終濃度２００ｕＭ（１ウェルあたり６ｕＬ）で添加した。所定のインキュベーション時間後、細胞は、以下のプロトコルを用いて固定される。培地を除去し、細胞をＰＢＳ緩衝液（１ウェルあたり２ｍＬ）で静かに洗浄し、２ｍＬの固定培地（ＰＢＳ中にホルムアルデヒド３．７％）を加え、室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした後、室温（ＲＴ）でインキュベートした。固定培地を除去し、新鮮なＰＢＳを加えて細胞を静かに洗浄した。カバースリップをウェルから除去し、ガラススライドに載置した。載置用培地（３５ｕＬのグリセロール：ＰＢＳ＋０．１２５ｕｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）を添加し、細胞を、適当なフィルターキューブを使用して、オリンパスＢＸ５１蛍光顕微鏡で観察した。各試験において、顕微鏡設定（フィルター、光強度、露光時間、及び倍率）は全て同じであった。様々な種類のＱＤｓ及び／又は５−ＡＬＡで処理した後の細胞の顕微鏡画像を、図２Ａ〜２Ｌ乃至図４Ａ〜４Ｋに示す。
【０１４６】
図２Ａ〜図２Ｆは、パッシブＱＤｓ（図２Ａ）、ｃＲＧＤ−ＱＤｓ（図２Ｂ）、遊離５−ＡＬＡ（図２Ｃ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（図２Ｄ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図２Ｅ）、及びｃＲＧＤ−ＱＤ＋遊離５−ＡＬＡ（図２Ｆ）のＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞について、インキュベーション５時間後の細胞内取込みを５倍の倍率で示す。パッシブＱＤｓ（図２Ｇ）、ｃＲＧＤ−ＱＤｓ（図２Ｈ）、遊離５−ＡＬＡ（図２Ｉ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（図２Ｊ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図２Ｋ）、及びｃＲＧＤ−ＱＤ＋遊離５−ＡＬＡ（図２Ｌ）について、インキュベーション５時間後の細胞内取込みを１００倍の倍率で示す。
【０１４７】
図３Ａ〜図３Ｅは、パッシブＱＤｓ（図３Ａ）、ｃＲＧＤ−ＱＤｓ（図３Ｂ）、遊離５−ＡＬＡ（図３Ｃ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（図３Ｄ）、及び５−ＡＬＡ−ＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図３Ｅ）のＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞について、インキュベーション１６時間後の細胞内取込みを５倍の倍率で示す。パッシブＱＤｓ（図３Ｆ）、ｃＲＧＤ−ＱＤｓ（図３Ｇ）、遊離５−ＡＬＡ（図３Ｈ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（図３Ｉ）、及び５−ＡＬＡ−ＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図３Ｊ）について、インキュベーション１６時間後の細胞内取込みを１００倍の倍率で示す。
【０１４８】
図４Ａ〜図４Ｆは、パッシブＱＤｓ（図４Ａ）、ハーセプチン−ＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図４Ｂ）、遊離５−ＡＬＡ（図４Ｃ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（図４Ｄ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図４Ｅ）、及びパッシブＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図４Ｆ）のＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞について、インキュベーション３時間後の細胞内取込みを５倍の倍率で示す。パッシブＱＤｓ（図４Ｇ）、ハーセプチンＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図４Ｈ）、遊離５−ＡＬＡ（図４Ｉ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（図４Ｊ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図４Ｋ）、及びパッシブＱＤｓ＋遊離５−ＡＬＡ（図４Ｌ）のＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞について、インキュベーション３時間後の細胞内取込みを１００倍の倍率で示す。
【０１４９】
図２Ａ〜図２Ｆ乃至図４Ａ〜図４Ｆに示されるように、ＱＤｓの細胞内取込みは、ＱＤを５−ＡＬＡにコンジュゲートすることによって向上する。図２Ａと図２Ｄの比較、図３Ａと図３Ｄの比較を参照。理論に束縛されることなしに、取込みの増加は、活性５−ＡＬＡの膜輸送体によるものと思われる。
【０１５０】
驚くべきことに、ＱＤ−５−ＡＬＡコンジュゲートは両方とも、遊離５−ＡＬＡ（非内因性）と共投与された場合、６３０ｎｍでの発光が最大であることが判った。図２、３、４のパネルＥと、図２、３、４のパネルＡ〜Ｄ及びＦとの比較を参照。５−ＡＬＡ単独（図２、３及び４のパネルＣ）、パッシブＱＤｓ（図２、３及び４のパネルＡ）、又は遊離５−ＡＬＡの追加無しの５−ＡＬＡ−ＱＤ単独（図２、３及び４のパネルＤ）はすべて、遊離５−ＡＬＡ（非内因性）と共投与されたＱＤ−５−ＡＬＡコンジュゲート（図２、３及び４のパネルＥ）と比較して、６３０ｎｍでの発光は弱かった。理論に束縛されることなしに、内因性の遊離５−ＡＬＡは限られており、ＰｐＩＸの合成を増大させるには追加の遊離５−ＡＬＡが必要であると考えられる。
【０１５１】
この結果は驚くべきもので、ＱＤ−５−ＡＬＡコンジュゲートと遊離の５−ＡＬＡ（非内因性）との共投与において、相互に相乗効果があることを示している。理論に束縛されることなしに、相乗効果は、例えば図５に示されているように、粒子の表面で行われるＰｐＩＸの合成に起因している可能性が高い。遊離５−ＡＬＡ処理は、急速な光退色(photo-bleaching)と信号の消失を示すが、遊離５−ＡＬＡにＱＤ−５−ＡＬＡコンジュゲートを組み合わせると、強い発光が継続することを示す。図２、３、４のパネルＥ及び図６Ａと、図６Ｂとの比較を参照。
【０１５２】
図６Ａ及び図６Ｂは、５−ＡＬＡ−ＱＤ＋遊離５−ＡＬＡ（図６Ａ）と、遊離５−ＡＬＡ（図６Ｂ）について、ＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞による取込み後で、照射１分後における光退色に対する抵抗の観察結果を示している。
【０１５３】
ＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞の他に、他の幾つかの種類の癌細胞においても、遊離５−ＡＬＡの追加による５−ＡＬＡ−ＱＤ取込みの増大が観察された。図７Ａ〜図７Ｄは、プレーンＱＤ（図７Ａ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（５０μｇ／ｍＬ）（図７Ｂ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（５０μｇ／ｍＬ）＋遊離５−ＡＬＡ（０．５ｍＭ）（図７Ｃ）、及び５−ＡＬＡ単独（０．５ｍＭ）（図７Ｄ）で５時間処理した後のメラノーマヒトＡ３７５癌細胞の検出を比較したものである。
【０１５４】
図８Ａ〜図８Ｃは、プレーンＱＤｓ（図８Ａ）、５−ＡＬＡ単独（０．５ｍＭ）（図８Ｂ）、及び５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（５０μｇ／ｍＬ）＋遊離５−ＡＬＡ（０．５ｍＭ）（図８Ｃ）で５時間処理した後のヒト扁平上皮癌Ａ４３１の検出を比較したものである。
【０１５５】
図９Ａ〜図９Ｃは、プレーンＱＤ（図９Ａ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（（１００μｇ／ｍＬ）＋５−ＡＬＡ（１ｍＭ）（図９Ｂ）、及び遊離５−ＡＬＡ（１ｍＭ）（図９Ｃ）で５時間処理した後のヒト脳癌細胞ＧＩＮ３膠芽腫の共焦点顕微鏡の検出結果を比較したものである。
【０１５６】
図１０は、プレーンＱＤ（１００μｇ／ｍＬ）、５−ＡＬＡ−ＱＤ（１００μｇ／ｍＬ）＋５−ＡＬＡ（１ｍＭ）、及び遊離５−ＡＬＡ（１ｍＭ）で５時間処理した後のヒト脳癌細胞ＧＩＮ３膠芽腫のフローサイトメトリーの結果を、未処理及び無標識の対照細胞と比較して示している。
【０１５７】
図１１Ａ〜図１１Ｄは、プレーンＱＤ（５０μｇ／ｍＬ）（図１１Ａ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（５０μｇ／ｍＬ）（図１１Ｂ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（５０μｇ／ｍＬ）＋遊離５−ＡＬＡ（０．２ｍＭ）（図１１Ｃ）、及び遊離５−ＡＬＡ単独（０．２ｍＭ）（図１１Ｄ）で１６時間処理した後の正常ヒト線維芽細胞（ＨＦＦ）の標識の欠如を示す。
【０１５８】
図１２Ａ〜図１２Ｈは、プレーンＱＤ（５０μｇ／ｍＬ）（図１２Ａ及び図１２Ｅ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（５０μｇ／ｍＬ）（図１２Ｂ及び図１２Ｆ）、５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（５０μｇ／ｍＬ）＋遊離５−ＡＬＡ（０．２ｍＭ）（図１２Ｃ及び図１２Ｇ）、及び遊離５−ＡＬＡ単独（０．２ｍＭ）（図１２Ｄ及び図１２Ｈ）で１６時間処理した後の３Ｄ培養ヒト膵臓Ｍｉａ−Ｐａｃａ−２癌（スフェロイド）のラベリングを示す。ＩｍａｇｅＪ  １．５１ｗソフトウェアを使用して、各画像から赤色チャンネル強度の表面プロットを作成し、その結果は、下段パネルの図１２Ｅ〜図１２Ｈに示されている。
【０１５９】
図１３Ａ〜図１３Ｄは、プレーンＱＤ（図１３Ａ）、ＨＡＬＡ−ＱＤｓコンジュゲート（５０μｇ／ｍＬ）（図１３Ｂ）、ＨＡＬＡ−ＱＤｓコンジュゲート（５０μｇ／ｍＬ）＋遊離ＨＡＬＡ（０．５ｍＭ）（図１３Ｃ）、又は遊離ＨＡＬＡ単独（０．５ｍＭ）（図１３Ｄ）を用いて、培養されたヒト膵臓Ｍｉａ−Ｐａｃａ−２癌を５時間処理したもので、ＱＤコンジュゲートが、５−ＡＬＡの誘導体（すなわち、５アミノレブレニン酸のヘキシルエステル（ＨＡＬＡ）に対しても同様な性能を有することを示している。５−アミノレブリン酸ヘキシルエステル塩酸塩は、ヘキサミノレブリン酸塩酸塩としても知られており、次の構造を有する。
【化６】
2021500329.tif 000008
【０１６０】
特定の実施形態において、５−アミノレブレン酸の他のエステルは、５−ＡＬＡのヘキシルエステル、５−ＡＬＡのメチルエステル、脂肪族アルコール５−ＡＬＡのエステル、グリコシドＡＬＡのエステル（５−ＡＬＡのα−グルコースエステル、α−マンノースエステル、又はβ−ガラクトースエステルを含む）、及び５−ＡＬＡのアルキルエステルを含むＱＤにコンジュゲートされている。
【０１６１】
図１４Ａ〜図１４Ｄは、Ｍｉａ  Ｐａｃａ−２ヒト膵臓腫瘍を、免疫抑制されたヌードマウスの脇腹で成長させて、次いで、２５０ｍｇ／Ｋｇの５−ＡＬＡ（図１４Ａ及び図１４Ｃ）又は２０ｍｇ／Ｋｇの５−ＡＬＡ−ＱＤｓ（図１４Ｂ及び図１４Ｄ）を腫瘍内注入による処理を行ったもので、腫瘍が６３０ｎｍで発光するように寸法合わせをしたＭｉａ  Ｐａｃａ−２ヒト膵臓のインビボ画像を示す。画像処理は、注入５時間後の生きた動物について実施し、図１４Ａ及び図１４Ｂは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｎ−ｖｉｖｏＭＳ  ＦＸＰＲＯの動物全体イメージャを使用し、図１４Ａは４１０ｎｍで励起し、図１４Ｂは６４０ｎｍでの発光を捕らえたものである。図１４Ｃは、手持ち式の青色フラッシュライトを使用し、図１４Ｄはデジタルカメラを使用した。
【０１６２】
理論に束縛されることなしに、この向上メカニズムは、１）５−ＡＬＡ輸送体によりＱＤの取込みが増加したこと；２）生成されたＰｐＩＸのＱＤ粒子の表面合成及びＱＤ粒子に接近したことにより、励起波長における全体的な分子消滅係数が増加したこと；３）ＱＤｓと５−ＡＬＡの合成部位（例えば、ミトコンドリア）の共局在(co-localization)；４）粒子表面での合成により合成されたＰｐＩＸの取込みの増加；及び／又は５）粒子によるＰｐＩＸのヘムへの変換の阻害に起因していると考えられる。ミトコンドリア）；４）粒子の表面上での合成による合成されたＰｐＩＸの巻き込みの増加；及び／又は５）ＰｐＩＸのヘムへの変換について粒子による阻害、によるものであり得る。
【０１６３】
［量子ドット５−ＡＬＡコンジュゲートの使用］
遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルと共投与された遊離５−ＡＬＡコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートは、複数目的の使用のために送達されることができる。第１に、遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルと共投与された５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートは、光線力学的療法（ＰＤＴ）に使用されることができる。５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルが細胞内でＰｐＩＸに変換され、例えば光子によって物理的に励起されると、活性酸素種（ＲＯＳ）を生成し、これが細胞死につながる。これまで、５−ＡＬＡは、光退色やシグナル消失を起こす傾向にあり、ＲＯＳ経路が十分に活性化されていなかった。例えば、上述したように、脳のような特定種類の腫瘍は、５−ＡＬＡを用いたＰＤＴによって治療することができなかった。遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルと共投与された５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートを共投与することにより、光退色が減少する。開示された実施形態は、シグナル放出を持続、それゆえＲＯＳ経路を持続することにより、５−ＡＬＡ  ＰＤＴ処理の有効性を向上させるために用いられることができ、５−ＡＬＡ  ＰＤＴへの適用が容易でなかった種類の腫瘍を治療し、これまで５−ＡＬＡ  ＰＤＴで治療されていた種類の腫瘍の治療をより効果的な方法で向上させることができる。ＲＯＳ経路の活性化が増加すると、細胞死をもたらし、これは腫瘍を減少及び／又は除去することができる。本発明は、様々な異常組織増殖、癌及び前癌状態の治療及び画像化を提供するもので、前記癌には、例えば、例えば、グリオーマ、膀胱癌、メラノーマ、食道癌、内膜癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、胆管癌、胃癌、口癌、咽頭癌、喉頭癌、喉頭癌、子宮頸癌、膣癌、及び外陰部癌等が挙げられる。本発明の幾つかの実施形態において、遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルの共投与による５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートを有するＰＤＴは、メラノーマ、基底及び扁平上皮癌を含む癌性皮膚癌の治療や、皮膚の前癌性病変（光線性角化症を含む）の治療に利用される。本明細書に開示される改良されたＰＤＴはまた、現在、ＰＤＴの使用が適応外となっている悪性胸膜中皮腫、菌状息肉腫等の治療への適用可能になることが期待される。幾つかの実施形態において、皮膚及び消化管の増殖性炎症性疾患は、本明細書に開示される遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルの共投与による５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートを有するＰＤＴを使用して治療される。
【０１６４】
現在、ＦＤＡに承認されているＰＤＴは、食道癌又はバレット食道の治療において、ポルフィマーナトリウム（ＰＨＯＴＯＦＲＩＮ（登録商標））を投与し、内視鏡を介して光ファイバーストランドを喉の下を通して、組織を照射するものである。また、現在、ＦＤＡに承認されているＰＤＴは、肺癌治療において、ポルフィマーナトリウム（ＰＨＯＴＯＦＦＲＩＮ）を投与し、気管支鏡を介して画像化及び照射するものである。本発明明細書で開示される改良は、遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルの共投与による５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートを用いることにより、上述の治療を行うものである。５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートと遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルとを組み合わせることにより、ＰｐＩＸへの変換の増加と光退色の減少により、ＱＤの取込みを大幅に増加させることができるので、既存のＰＤＴでは効果的に治療されなかった多くの疾患の治療に適したものとなる。腫瘍特異性リガンドにコンジュゲートされる幾つかの実施形態において、ＱＤｓは、５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートを腫瘍特異性の標的とするために投与される５−ＡＬＡと共に、開示される。
【０１６５】
第２に、本明細書に開示される遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルの共投与による５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートは、ＱＤの取込みを増加させ、細胞内で検出可能な蛍光ＰｐＩＸの生成を増加させて、長時間に亘って高発光を持続することができるので、前述した様々な異常増殖組織増殖、癌及び前癌状態の蛍光誘導手術、治療及び画像処理におけるマーカー（又は標識）として使用することができる。
【０１６６】
第３に、本明細書に開示される遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルの共投与による５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートは、炎症性組織タイプの腫瘍が５−ＡＬＡ  ＰＤＴに対して感受性かどうかを決定するためのスクリーニング用の腫瘍及び炎症性組織サンプルとして、投与することができる。一実施形態において、スクリーニングキットは、５−ＡＬＡ−ＱＤ、５−ＡＬＡヘキシルエステル−ＱＤ、５−ＡＬＡメチルエステル−ＱＤ、脂肪族アルコール５−ＡＬＡエステル−ＱＤ、グリコシド５−ＡＬＡエステル−ＱＤ、及び５−ＡＬＡアルキルエステル−ＱＤの１種又は２種以上を、遊離５−ＡＬＡ、遊離５−ＡＬＡヘキシルエステル、遊離５−ＡＬＡメチルエステル、遊離脂肪族アルコール５−ＡＬＡエステル、遊離グリコシド５−ＡＬＡエステル、及び遊離５−ＡＬＡアルキルエステルの１種又は２種以上と共に含む。グリコシド−５−ＡＬＡエステルの例として、５−ＡＬＡのα−グルコースエステル、α−マンノースエステル、又はβ−ガラクトースエステルが挙げられる。スクリーニングキットは、処理される細胞の種類に応じて、また、処理される特定の細胞で最も活性の高い５−ＡＬＡ取込み機構を選択して、最適な種類の５−ＡＬＡ−ＱＤと遊離５−ＡＬＡを決定し、選択するために使用される。本明細書の実施形態において、遊離ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルの共投与による５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートは、分析キットとして提供することができ、組織、腫瘍（又はそれらの生検）をスクリーニングして、試験された腫瘍の５−ＡＬＡ治療に対する感受性(susceptibility)を決定するために、予め混合された組成物として販売することができる。
【０１６７】
本明細書に開示される実施形態において、５−ＡＬＡ−ＱＤを遊離５−ＡＬＡと共に行われる投与は、経腸的又は非経口的であってよい。例えば、５−ＡＬＡ−ＱＤ及び遊離５−ＡＬＡは、様々な投与の実施形態では、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、及び経口投与である。この例には、ボーラス注射又は点滴静脈注射を含む。遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルの共投与による５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートの投与については、治療される組織に供給され、照射前に、ＰｐＩＸへの変換が可能な十分な時間をかけて、細胞内に取り込まれるようにする。この時間は、治療される組織に応じて経験的に決定される。特定の実施形態では、遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルと共投与される５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートは、照射の１０〜２０時間前に投与される。特定の実施形態では、遊離５−ＡＬＡ又は５−ＡＬＡエステルと共投与される５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートは、照射の１４〜１８時間前に投与される。
【０１６８】
本明細書に開示される実施形態において、５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲート及び遊離５−ＡＬＡは、それを必要とする患者に容易に投与することができるように、予め混合された組成物として提供される。
【０１６９】
一実施形態において、５−ＡＬＡ−ＱＤコンジュゲート又は５−ＡＬＡエステル−ＱＤコンジュゲートは、５−ＡＬＡ又はそれに対応する５−ＡＬＡエステルと共に製剤化され、例えば、単一の投与手順で皮膚から腫瘍組織に入るように、単位投与量にしてパッケージングされる。一実施形態において、単位用量当たりの容積は、投与部位の生体構造や所望される分布領域に基づいて決定される。
【０１７０】
本発明のこれらの利点及び他の利点は、当業者であれば、前記記載から明らかであろう。それゆえ、当業者であれば、本発明の広範な発明的概念から逸脱することなく、上述の実施形態に変更又は修正を加えることができるかもしれない。本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲及び精神の範囲内にあるすべての変更及び修正を含むことを意図されていることは理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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