(57)【要約】  本発明は、シンシチンタンパク質に結合した少なくとも1つの治療薬又は遺伝子を含む、再生筋組織への遺伝子送達を含む標的化薬物送達のための医薬組成物、並びに筋傷害又は筋疾患の予防及び/又は治療、特にシンシチンタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子又はレンチウイルス様粒子を使用した前記疾患の遺伝子療法におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患の生理病理学的過程の一部として再生期を含む筋傷害又は筋疾患の予防及び/又は治療において使用するための、シンシチンタンパク質に結合した少なくとも1つの治療薬を含む、再生筋組織を標的とする医薬組成物。
【請求項２】
シンシチンタンパク質が、ヒト又はマウスシンシチンであり、好ましくは、シンシチンが、ヒトシンシチン1、ヒトシンシチン2、マウスシンシチンA及びマウスシンシチンBからなる群から選択される、請求項1に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項３】
薬物及びシンシチンタンパク質が、リポソーム、エクソソーム、ウイルス粒子及びウイルス様粒子からなる群から好ましくは選択される粒子に組み込まれる、請求項1又は2に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項４】
シンシチンタンパク質が、粒子の表面に提示される、請求項3に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５】
粒子が、シンシチンタンパク質で偽型化されたレンチウイルス又はレンチウイルス様粒子である、請求項4に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項６】
薬物が、治療的遺伝子、並びに治療的抗体又は抗体断片及びゲノム編集酵素等の治療的タンパク質又はペプチド、干渉RNA、ゲノム編集のためのガイドRNA及びエクソンスキップすることができるアンチセンスRNA等の治療的RNAをコードする遺伝子を含む、筋疾患又は筋傷害の治療のための目的とする遺伝子;筋細胞再生を刺激することができる薬物からなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項７】
薬物が、ウイルスベクター粒子にパッケージングされた目的とする遺伝子である、請求項3から6のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項８】
目的とする遺伝子が、シンシチンタンパク質、好ましくはマウスシンシチンA又はヒトシンシチン2で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子にパッケージングされる、請求項7に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項９】
筋傷害又は筋疾患が、ジストロフィン異常症等の筋ジストロフィー、遠位型ミオパチー、筋原線維性ミオパチー、その他のミオパチー、筋強直症候群、先天性ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、代謝性ミオパチー、家族性周期性四肢麻痺等のイオンチャネル筋疾患、先天性筋無力症候群、神経原性ミオパチー、自己免疫性ミオパチー、脂質蓄積病、遺伝性心筋症、神経筋障害、炎症性ミオパチー、横紋筋融解症、コンパートメント症候群又はミオグロビン尿症、悪性高熱症、筋感染症、筋筋膜痛及び筋攣縮、並びに直接外傷、薬物乱用、薬物療法、毒性薬剤、虚血、高温若しくは低温、及び/又は身体運動若しくは過剰使用によって引き起こされた筋傷害を含む群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
筋疾患が、ジストロフィン異常症等の筋ジストロフィー、遠位型ミオパチー、筋原線維性ミオパチー、その他のミオパチー、筋強直症候群、先天性ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、代謝性ミオパチー、家族性周期性四肢麻痺等のイオンチャネル筋疾患、先天性筋無力症候群、神経原性ミオパチー、脂質蓄積病、遺伝性心筋症、神経筋障害、ミオグロビン尿症、及び悪性高熱症を含む群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１１】
筋疾患の遺伝子療法における用途である、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１２】
目的とする遺伝子が、DMD、MYOT、LMNA、CAV3、DES、DNAJB6、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、CAPN3、DYSF、TCAP、TRIM32、FKRP、POMT1、FKTN、POMGNT1、POMT2、ANO5、TTN、PLEC、EMD、FHL1、LMNA、SMN1、SMN2、PABPN1、NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KBTBD13、KLHL40、KLHL41、RYR1、SEPN1、KBTKD13、MTM1、MTMR2、DUX4、FRG1、GYS1、GAA、GBE1、PYGM、PKFM、ALDOA、ENO3、GYG1及びそれらの機能的バリアントからなる遺伝子の群から選択される、請求項6から11のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
注射による投与のための、請求項1から12のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
再生筋組織を標的とする医薬組成物であって、遺伝子DMD、MYOT、LMNA、CAV3、DES、DNAJB6、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、CAPN3、DYSF、TCAP、TRIM32、FKRP、POMT1、FKTN、POMGNT1、POMT2、ANO5、TTN、PLEC、EMD、FHL1、LMNA、SMN1、SMN2、PABPN1、NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KBTBD13、KLHL40、KLHL41、RYR1、SEPN1、KBTKD13、MTM1、DUX4、FRG1、MTMR2、GYS1、GAA、AGL、PYGM、PKFM、ALDOA、ENO3、GYG1及びそれらの機能的バリアント、並びに治療的RNAが前記リストの遺伝子を標的とする、干渉RNA、ゲノム編集のためのガイドRNA、及びエクソンスキップすることができるアンチセンスRNA等の治療的RNAをコードする遺伝子を含む群から選択される目的とする遺伝子をパッケージングする、シンシチンタンパク質で偽型化されたウイルス粒子を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
ウイルス粒子が、レンチウイルスベクター粒子である、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
再生筋組織を標的とする医薬組成物であって、干渉RNA、ゲノム編集のためのガイドRNA、及びエクソンスキップすることができるアンチセンスRNA等の治療的RNAをパッケージングする、シンシチンタンパク質で偽型化されたウイルス様粒子、好ましくはレンチウイルス様粒子を含み、前記治療的RNAは、DMD、MYOT、LMNA、CAV3、DES、DNAJB6、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、CAPN3、DYSF、TCAP、TRIM32、FKRP、POMT1、FKTN、POMGNT1、POMT2、ANO5、TTN、PLEC、EMD、FHL1、LMNA、SMN1、SMN2、PABPN1、NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KBTBD13、KLHL40、KLHL41、RYR1、SEPN1、KBTKD13、MTM1、DUX4、FRG1、MTMR2、GYS1、GAA、AGL、PYGM、PKFM、ALDOA、ENO3及びGYG1を含む遺伝子の群から選択される目的とする遺伝子を標的とする、医薬組成物。
【請求項１７】
シンシチンタンパク質がマウスシンシチンA又はヒトシンシチン2である、請求項14から16のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生筋組織を標的とする医薬組成物、並びに筋傷害又は筋疾患の予防及び/又は治療におけるその使用に関する。より詳細には、本発明は、注射による再生筋組織への遺伝子送達を含む標的化薬物送達のためのシンシチンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子療法は、遺伝的原因による多くの異なるタイプのミオパチーを治癒し得るが、このアプローチは難しい試みであることが判明している。骨格筋への遺伝子導入には多くの問題がある。筋肉でテストされた様々なベクターは免疫原性であることが判明しており、筋肉への遺伝子導入を目的とする前臨床及び臨床試験において依然として使用されているのは、今のところ非炎症性組換えアデノ随伴ベクター(rAAV)のみである。これらのrAAVは標的細胞ではエピソーム性のままであり、組み込まれないことから複製細胞に伝達することができない。この作用様式は、成体骨格筋線維等の分化した有糸分裂後組織への遺伝子導入に有用であるが、高い増殖能を有する筋前駆細胞又は高い再生過程を経る筋組織では長期遺伝子発現ができない場合がある。rAAVの第2の限界は、現在4.5Kbに限定されるその小さな積載量であり、ジストロフィン等の大きな遺伝子に対するこのベクター系の使用を妨げている。更に、rAAVは炎症性ベクターではないが、それにもかかわらず、前臨床モデル及び治験で実証されているようにそのウイルスカプシドに対する強い免疫応答を誘導することができる。同じ血清型のrAAVの再投与は、現在、免疫抑制治療が患者に施行されない限り不可能であり、これは遺伝子療法のベネフィット/リスク分析において常に可能とは限らない。そのため、積載量が高く、再生筋肉又は筋前駆細胞への遺伝子導入を可能にし得る、更なる新規のより生理学的な遺伝子療法ベクターが必要である。
【０００３】
サイズ約120nmのエンベロープRNA粒子であるレンチウイルスベクター(LV)は、効率のいい薬物送達ツールであり、より具体的には安定な長期形質導入のための効率のいい遺伝子送達ツールである。LVは、LVの偽型を与えるそのエンベロープタンパク質を通じて標的細胞に結合し、侵入する。LVは細胞に侵入すると、カプシド成分を放出し、レンチウイルスRNAの逆転写を受けた後、プロウイルスDNAを標的細胞のゲノムに永久に組み込む。故に、LVは複製細胞への安定な遺伝子導入を可能にする。非組込みレンチウイルスベクターがベクター組込み機構の特性を修飾することによって生成されており、一過性の遺伝子発現に使用することができる。プロウイルスを欠くウイルス様粒子も生成されており、タンパク質又はメッセンジャーRNAを送達するのに使用することができる。LVは、例えば、遺伝子付加、RNA干渉、エクソンスキッピング又は遺伝子編集に使用することができる。これらのアプローチの全ては、LVのその偽型を介した組織又は細胞標的化によって促進することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許出願EP2385058
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Cireら  Plos One 9、e101644頁、2014
【非特許文献２】Counsellら  Sci. Report、2017、7:46880頁  doi: 10.1038
【非特許文献３】Dupressoirら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、2005、102、725〜730頁
【非特許文献４】Lavialleら、Phil. Trans. R. Soc. B.、2013、368:20120507頁
【非特許文献５】Redelspergerら、PLOS Genetics、2016、12(9): e1006289頁  doi: 10.1371
【非特許文献６】Bacquinら、J. Virol.、2017、91(18):e00832〜17頁  doi:10.1128
【非特許文献７】Cornelisら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、2013、110、E828〜E837頁
【非特許文献８】Muratoriら、Methods Mol. Biol.、2010、614、111〜24頁
【非特許文献９】Burneyら、Curr. HIV Res.、2006、4、475〜484頁
【非特許文献１０】Kaczmarczykら、Proc. Natl. Aca. Sci;U.S.A.、2011、108、16998〜17003頁
【非特許文献１１】Aokiら、Gene Therapy、2011、18、936〜941頁
【非特許文献１２】Wangら、Gene Therapy、2008、15、1489〜1499頁
【非特許文献１３】Karalaki M、Fili S、Philippou A、Koutsilieris M. Muscle regeneration: cellular and molecular events. In Vivo. 2009 9〜10月;23(5):779〜96頁
【非特許文献１４】Meryem B Baghdadi、Shahragim Tajbakhsh. Regulation and phylogeny of skeletal muscle regeneration. Developmental Biology、Elsevier、20172018
【非特許文献１５】編者Pagon RA、Adam MP、Ardinger HHら  GeneReviews(登録商標)[インターネット].シアトル(WA):ワシントン大学、シアトル;1993〜2017頁のDarras BT、Miller DT、Urion DK. Dystrophinopathies. 2000年9月5日[2014年11月26日更新]
【非特許文献１６】Nichols JE、Niles JA、Cortiella J. Design and development of tissue engineered muscle: Progress and challenges. Organogenesis. 2009、5、57〜61頁
【非特許文献１７】Cuiら  J. Clin. Invest. 2015年11月2日;125(11):4255〜68頁
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【非特許文献１９】Human gene therapy、2011、22、343〜356頁
【非特許文献２０】Bacquinら、J. Virol.、2017、doi: 10.1128/JVI.00832〜17
【非特許文献２１】Goyenvalleら  Science、2004、3;306(5702):1796〜9頁
【非特許文献２２】Farsonら、Hum Gene Tuer. 2001、20、981〜97頁
【非特許文献２３】Charrierら、Gene therapy、2011、18、479〜487頁
【非特許文献２４】Dupressoirら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、2005、102、725〜730頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
LVの最も一般的に使用される偽型は、水疱性口内炎ウイルスのG糖タンパク質(VSVg)である。VSVgの幅広い指向性は、多くの異なるタイプの細胞へのインビトロでの広範な遺伝子送達を可能にする。LV-VSVgは、造血遺伝子療法の場合に、又はCAR T細胞を生成するためにエクスビボで主に使用される。LVはまた、少量のベクターが脳又は眼に投与されるいくつかの用途においてインビボでも使用される。LV-VSVgの全身投与は、これらのベクターがマウスのインビボで免疫原性であることが知られているため、通常は行われない。実際、インビボでのVSVgは補体を結合し、インビボで使用されると肝臓及びリンパ器官への導入遺伝子送達を標的とし、抗導入遺伝子免疫応答の引き金を引く(Cireら  Plos One 9、e101644頁、2014)。故に、導入遺伝子発現細胞を失うことなく安定なインビボでの遺伝子送達を提供することができるLVの新たな偽型が必要である。これは、筋肉、特に再生筋組織及び筋前駆細胞への遺伝子導入に有用であり得る。実際、LVは大きな積載量を有しており、ジストロフィンcDNA(11kb)がLVカセットにフィットし得ることが最近示され(Counsellら  Sci. Report、2017、7:46880頁  doi: 10.1038)、全てのデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者を治療するための可能性のある戦略を提供している。
【０００７】
シンシチンは、膜融合特性を有する内在性レトロウイルス(ERVシンシチン)エンベロープ糖タンパク質である(Dupressoirら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、2005、102、725〜730頁;Lavialleら、Phil. Trans. R. Soc. B.、2013、368:20120507頁)。ERVW-1遺伝子によってコードされるヒト内在性レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質(ENSG00000242950;シンシチン1又はHERV-Wとしても知られる)は、特許出願EP2385058にその膜融合特性が記載されている。前記出願は、シンシチウムの形成による癌治療でのその使用を記載する。マウスシンシチンは、マウスシンシチンA(すなわち:ハツカネズミ(mus musculus)シンシチンA、synA)及びマウスシンシチンB(すなわち:ハツカネズミシンシチンB、synB)を包含する。
【０００８】
最近、マウスシンシチンが骨格筋で発現されること、及び特に、シンシチンBはオスのマウスにおける筋線維再生に重要であるが、メスのマウスでは、まだ説明のつかない理由のために重要でないことが示された(Redelspergerら、PLOS Genetics、2016、12(9): e1006289頁  doi: 10.1371)。
【０００９】
また、シンシチンは、おそらくはウイルス粒子への不適切な組込みのために機能的偽型を生成しないことも報告された(Bacquinら、J. Virol.、2017、91(18):e00832〜17頁  doi:10.1128)。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
驚くべきことに、及び先行技術から予想されることに反して、本発明者らは、LVを偽型化するのにシンシチンが使用され得ること、そのため、他の器官に拡散することなく再生筋組織への安定な標的化遺伝子送達に使用され、それによって肝毒性のリスクを回避し得ることを見出した。
【００１１】
実際、マウスシンシチンA糖タンパク質は、いくつかの導入遺伝子配列、すなわち、生物発光による導入遺伝子発現の検出を容易にするためのルシフェラーゼLucII、又は機能的効果を示すためのジストロフィンエクソン23スキッピング(U7mex23)若しくはヒトアルファサルコグリカン遺伝子に対する小さなアンチセンス配列のいずれかをコードするHIV-1由来レンチウイルスベクターを偽型化するのに使用された。偽型化LVは、正常な骨格筋を有するマウス(C57Bl6)、骨格筋線維の再生性が高いデュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデルである、ジストロフィンが欠損しているmdxマウス、及び筋肉再生しているアルファ-サルコグリカン欠損マウスに筋肉内注射された。これらの異なるモデルでシンシチンA-偽型LV(LV-SynA)の効果を比較することにより、シンシチンAで偽型化されたLVは、再生している筋肉を優先的に形質導入することが示された。対照的に、筋肉へのLV-SynAの直接注射は、正常なマウスにおいて骨格筋組織の有意な形質導入をもたらさない。LV-SynAによる再生筋肉の形質導入は、筋芽細胞から筋管への分化のモデルとして一般的に使用されるマウス筋芽細胞(C2C12)を用いたインビトロデータからは予測することができない。実際には、安定な導入遺伝子発現は、肝臓で発現することなく再生筋細胞で長期にわたって、少なくとも50日間再現性よく得られた。これに対して、VSVg等の他のエンベロープで偽型化されたLVは一時的な発現のみをもたらす。更に、筋肉内又は全身投与後に導入遺伝子特異的免疫応答をあまり誘導しなかったことから、LV-SynAベクターはLV-VSVgより免疫原性が少ない。更に、ジストロフィンエクソンスキッピングの誘導の証拠が、シンシチンA LVベクターを用いてmdxマウスで得られた。sgca欠損マウスの遺伝子欠損のインビボ修正は、LV-SynA Sgcaベクターを用いた遺伝子導入によって実現可能であり、治療的導入遺伝子の発現は、同じ筋肉にベクターを反復注射することによって増強することができる。シンシチン2等のヒトシンシチンで偽型化されたLVが、導入遺伝子を安定に発現させるようにヒト骨格筋を形質導入するのに使用され得る。
【００１２】
これらの結果は、シンシチンで偽型化されたレンチウイルスベクター粒子を使用して、治療的遺伝子又は治療薬をコードする遺伝子等の治療薬を再生筋組織に標的化送達するため、特に、例えば、限定するものではなく、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及び肢帯型筋ジストロフィー等のミオパチーの遺伝子療法のために、シンシチンが確実に使用され得るという概念実証を提供するものである。
【００１３】
比較すると、rAAVは筋肉内注射されたものの、筋肉をはるかに越えて広まり、肝臓で高レベルで見出された。更に、LV-シンシチンを用いるインビボ遺伝子送達は、LVベクターの組込み性及びシンシチンで偽型化されたLVのより低い免疫原性のためにエピソームrAAVより安定であることが予想される。更に、LVは、rAAVより大きな積載量を有しており、ジストロフィンcDNA等の大きな導入遺伝子を組み込むことができる。全てのこれらの利点を考えると、シンシチンで偽型化されたLVは、ミオパチーの遺伝子療法のためのrAAVに代わる極めて有望な手段となる。
【００１４】
故に本発明は、筋傷害又は筋疾患の予防及び/又は治療において使用するための、シンシチンタンパク質に結合した少なくとも薬物を含む、再生筋組織を標的とする医薬組成物に関する。
【００１５】
本発明は、これより、添付図面を参照しながら、限定的ではない以下の例により例示される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】LV-SynA又はAAV2/8の筋肉内注射後の、ジストロフィーマウス(MDX)又は対照マウス(C57Bl/6)における生物発光導入遺伝子発現を示す図である。各マウスで、右前脛骨筋(TA)に25μL PBSを注射し、左TAに25μLのベクターを注射した。数マウスではベクターは、rAAV8-Luc2の2.5×1011ベクターゲノム(vg)であった(AAV血清型2 ITR及びAAV血清型8カプシドに相当するAAV2/8(パネル右のC57BL/6マウス))。他のマウスでは、LV-SA-Luc2の7.5×105感染性ゲノム(ig)に相当する物理的粒子1.4×1011個(pp)を注射した(LV-SynA;左のパネルC57BL/6及び真ん中のパネルmdxマウス)。生物発光を、注射後4週間でIVIS Lumina器具を使用して測定した。各群の代表的なマウスの全身生物発光画像が示されている。各マウスにおける関心領域(ROI)を手動で定義し、報告して、リビングイメージ3.2ソフトウェア(Xenogen社)を使用してシグナル強度を計算し、1秒あたりの光子として表した。バックグラウンド光子束を、ベクターを投与しなかった対照マウスに描かれたROIから定義した。代表的なマウスごとに、PBS対照に対応する右TA筋肉(TA-R光子束)、及びベクターに対応する左TA筋肉(TA-L光子束)における1秒あたりの光子として表した生物発光シグナルが示されている。
【図２】LV-SynA  ベクターを注射したMDXマウスの筋肉で発現された導入遺伝子の免疫組織化学的検出を示す図である。PBSを注射したMDXマウスの筋肉の代表的な切片(左パネル)、又はLV-SA-Luc2(LV-SynA-LucII;右パネル)。両方の切片を、ルシフェラーゼ及びラミニンに対する抗体並びにDAPIで染色した。ラミニン染色は筋線維の輪郭を示し、DAPIは核を示す。ルシフェラーゼの発現は、LV-SA-Luc2注射後に筋線維の細胞質で見出される。
【図３】mdx及びC57BL/6マウスの骨格筋で得られた比較生物発光を示す図である。25μL PBSを注射した右前脛骨筋及び25μLのLV-SA-Luc2ベクター(0.75〜1×106形質導入単位(TU)/TAに相当する物理的粒子1〜1.4×1011個/TA)を注射した左TAを有する1群あたり7〜8マウス。Mdxマウスは、注射の時点で4.5〜5.5週齢であった。C57BL/6(B6)マウスは、注射の時点で6〜8週齢であった。TAの生物発光を注射1カ月後に測定した。
【図４】PCR及び、注射TA中のベクターコピー数のqPCRを使用した定量化によって決定された、正常なマウスと比べて有意なレベルの形質導入がMDXマウスの筋肉で得られることを示す図である。各マウスで、右前脛骨筋(TA)に25μLのPBSを注射し、左TAに5×105感染性ゲノム(ig)に相当する25μLのベクターLVSynA(LVSynA-Luc)を注射した。DNA試料を、ベクター注射後4及び6週間でq-PCR(A、C)及びPCR(B、D)によって分析した。マウスtitin遺伝子レベルに正規化したPsiベクター配列をqPCRを使用して増幅することにより、2倍体核あたりのベクターコピー数(VCN)のレベルを定量化した。A及びCでは、四角形は全てのマウスについて得られた平均化VCN値を表し、線は得られた最小及び最大値を示す。B及びDでは、組み込まれたベクターに対応する489bpバンドは、LVSynAベクターを注射したMDXマウス筋肉でのみ検出される。PBSを注射した対照筋肉では489bpのバンドは検出されない。データは、条件あたり12マウスを代表している。PBS群とLVSynA群の間の比較を、マンホイットニー両側分析を使用して行った。0.05未満のP値を統計的に有意とみなした。
【図５】シンシチンAで偽型化されたLVを用いたsgca-/-マウス筋肉への遺伝子導入6週齢sgca-/-マウス(n=2)に、25μL容量でTAあたり106igのLV-SynA Luc2ベクターを注射した。左TAにルシフェラーゼコードベクターを注射し、右TAに対照ベクターを注射した。ベクター注射後14日で生物発光を測定した。2マウスのうち1マウスの代表的なマウスの全身生物発光画像を示す。各マウスにおける関心領域(ROI)を手動で定義し、報告して、リビングイメージ3.2ソフトウェア(Xenogen社)を使用してシグナル強度を計算し、1秒あたりの光子として表した。バックグラウンド光子束を、ベクターを投与しなかった対照マウスに描かれたROIから定義した。光子8.5×103個/秒のシグナルがPBSを注射した左の筋肉で検出され、光子1.96×106個/秒のシグナルがLV-SA Luc2ベクターを注射した右の筋肉で検出された。
【図６】q-PCRによる注射TA中のベクターコピー数の定量化測定、及びqPCRを使用した注射TA中のベクターコピー数の検出によって示された、LV-SynAベクターを用いた別のジストロフィーモデル、sgca欠損マウスの有意な形質導入を示す図である。各6週齢sgca-/-マウスで、右前脛骨筋(TA)に25μLのPBSを注射し、左TAに5×105感染性ゲノム(ig)に相当する25μLのベクターLVSynA(LVSynA-Luc)を注射した。DNA試料を、ベクター注射後4週間でq-PCR(A)及びPCR(B)によって分析した。TAにおけるVCNのレベルをq-PCRによって測定し、Titinレベルに正規化した。四角形(A)及び線は、マウスごとに得られたVCN値と得られた平均並びに最小及び最大値を表す。(B)では、組み込まれたベクターに対応する489bpバンドは、LVSynAベクターを注射したsgca欠損マウス筋肉で検出される。PBSを注射した対照筋肉では489bpのバンドは検出されない。データは、条件あたり少なくとも11マウスを代表している。PBS群とLVSynA群の間の比較を、マンホイットニー両側分析を使用して行った。0.05未満のP値を統計的に有意とみなした。
【図７】エクソン23スキップジストロフィンmRNAの検出を示す図である。Mdxマウスに、シンシチンAで偽型化され、U7プロモーター(LV-SA U7mex23)から発現されたmex23アンチセンス配列をコードするレンチウイルスベクター、又はU7由来アンチセンスmex23配列をコードするAAV1ベクター(rAAV U7mex23)を筋肉内注射(IM)した。RNA試料を、ベクター注射後2週間時点でエクソン20及び26のプライマーを用いるネステッドRT-PCRによって分析した。完全長のジストロフィンmRNAに対応する901bpバンドが全ての筋肉で検出され、エクソン23スキップmRNAに対応する688bp断片が、AAVベクター(レーン4、5及び6)又はLV-SynAベクター(レーン1、2及び3)を注射した筋肉でのみ検出された。688bpのバンドは、PBS又はLuc2をコードするベクターを注射した対照筋肉では検出されなかった。
【図８】生物発光シグナル動態によって決定した場合、LVVsvgとは対照的にLV SynAによりMDXマウスの安定な形質導入が得られることを示す図である。MDX及びC57BL/6マウスの右前脛骨筋(R-TA)に25μLのPBSを注射し、左TA(L-TA)に、ルシフェラーゼ(Luc2)導入遺伝子を発現し、マウス1マウスあたり5×105感染性ゲノム(IG)の注射に相当する、25μLのLVSynA(LV-SYNA LUC2)又はLVVsvg(LV-VSVg LUC2)を注射した。生物発光を示された時点でR-TA及びL-TAで測定した。Living Image 3.3ソフトウェアを使用してIvis Luminaで定量化を行った。点線は定量化限界領域である(検出限界ではない)。データは、LVSynA条件について各々が1群あたり少なくとも3マウスを含むC57Bl/6マウスでの3つの独立した実験、及びMDXマウスでの5つの独立した実験、並びにLVVsvg条件に関する1群あたり4マウスでの1実験を表す。
【図９】生物発光動態によって示された、筋ジストロフィーの動物モデルでのLV-SynA筋肉内送達後の導入遺伝子発現の安定性を示す図である。  Sgca欠損及びMDXマウスの右前脛骨筋(R-TA、黒い線)に25μL PBSを注射し、左TA(L-TA、グレーの線)に、2〜7.5×105感染性ゲノム(ig)に相当する用量である、Luc2をコードするLVSynA(LVSynALuc2)25μLを注射した。生物発光を示された時点でR-TA及びL-TAで測定した。Living Image 3.3ソフトウェアを使用してIvis Luminaで定量化を行った。データは、各々が1群あたり少なくとも3マウスを含むSgca欠損マウスでの3つの独立した実験、及びMDXマウスでの5つの独立した実験を表す。
【図１０】Elispot抗IFNg、PCR、q-PCR及び免疫組織化学的検査によって決定された、LVVsvgと比べたLVSynAの筋肉内(IM)注射後の筋ジストロフィーの動物モデルにおける免疫応答の低下を示す図である。  GFP-HY導入遺伝子は、抗導入遺伝子CD4及びCD8 T細胞免疫応答を検出するのに使用されるモデルである。GFP-HY導入遺伝子は、HYオスポリペプチド(HYオスpolypeptide)でタグ付けされた蛍光タンパク質GFPから成る融合タンパク質をコードする。遺伝子導入後、CD4及びCD8 T細胞に対するそれぞれDby及びUtyペプチド提示によって、導入遺伝子産物の抗原提示を特異的に検出することができる。4週齢MDXマウスに、PBS、物理的粒子5×109個のLVSynA_GFP-HY又はLVVsvg_GFP-HYベクターをTAにIM注射した。(A)14日後、脾臓細胞を回収して、ペプチドインビトロ刺激後にDby特異的CD4+ T細胞及びUty特異的CD8+ T細胞応答をγIFN-ELISPOTによって測定した。データは、1群あたり3マウスを含む1実験を表す。(B)及び(C)筋肉DNA試料を、ベクター注射後2週間時点でPCR(B)及びq-PCR(C)によって分析した。(B)では、組み込まれたベクターに対応する489bpバンドが、ベクターのどちらかを注射したMDXマウス筋肉で検出されるが、LVVsvgと比べてLVSynAを注射した筋肉でより強いようである。(C)では、TAにおけるVCNのレベルをq-PCRによって測定し、Titinレベルに正規化した。レベルは、LVVsvgと比べてLVSynAを注射した筋肉でより高かった。(D)Dapiによる核の染色前に、CD3発現の免疫組織化学的分析を、示されたベクターを注射したMDX筋肉の凍結切片で行った。各核を次いで分割し、画像jソフトウェアを用いてdapi染色強度(空のグレーの円)に基づきカウントした。CD3シグナル強度を各核で定量化して、筋肉切片のCD3陽性核(全面的に黒い円)の分布及びパーセンテージを決定した。画像は、1群あたり3マウスを分析した1群あたり3つの筋肉断面を代表している。
【図１１】Elispot抗IFNg及びCBAを使用して測定された、LVVsvgと比べてLVSynAを使用した全身送達後の導入遺伝子に対する免疫応答の低下を示す図である。6週齢C57BL/6マウスに、PBS、7.5×105Ig/マウスのLVSynA_GFP-HY又はLVVsvg_GFP-HYベクターを尾静脈にIV注射した。(A)21日後、脾臓細胞を回収して、ペプチドインビトロ刺激後にDby特異的CD4+ T細胞及びUty特異的CD8+ T細胞応答をγIFN-ELISPOTによって測定した。データは、1群あたり3マウスを含む1実験を表す。T細胞によって分泌されるサイトカインの滴定に関する。(B)免疫3週間後、全脾臓細胞をDby、Utyペプチド、又は陽性対照としてのコンカナバリンA(conA)によってインビトロで再刺激した。培養の36時間後、上清を除去し、示されたサイトカインについて滴定した(3マウス/群/実験)。各点は、1マウスあたり少なくとも2つの測定値で個々の測定値を表す。
【図１２】sgca欠損マウスの遺伝子欠損のインビボ修正は、Lv-SynA Sgcaベクターを用いた遺伝子導入によって実現可能であり、治療的導入遺伝子の発現は、同じ筋肉へのベクターの反復注射によって増強され得ることを示す図である。各Sgca欠損マウスで、右前脛骨筋(TA)に25μL PBSを注射し、左TAに、TAあたり2.5×105感染性ゲノム(ig)に相当する25μLのベクターLVSynA(LVSynA-PGK-アルファ-サルコグリカン)を1回又は2回を注射した。DNA及びRNA試料をベクター注射後16日時点で分析した。(A)組み込まれたベクターに対応する489bpバンドが、LVSynAベクターを1回及び2回注射したSgca欠損マウス筋肉で検出される。489bpのバンドは、PBSを注射した対照筋肉では検出されない。(B)アルファ-サルコグリカンmRNAの発現レベルをqRT-PCRによって測定し、P0レベルに正規化した。(C)TA中のベクターゲノムコピーq-PCRによって測定し、両方のケース(HIV及びAAV)でTitinに正規化した。
【図１３】再生筋肉の形質導入は、Lv-Synベクターを用いた異なる段階でのC2C12細胞のインビトロでの形質導入によって示されるインビトロデータからは予測することができないことを示す図である。C2C12マウス筋芽細胞株を(A)増殖培地(DMEM+10% FCS+1%グルタミン+1% PS)で培養し、ベクトフシン(Vectofusin)-1(12μg/mL)の存在下で示されたLVシンシチン(1×E+05IG/mL)又はLV VSVg(1E+06IG/mL)を用いて形質導入した。使用したベクターは、LVSynA-ΔNGFR、LVSynB-ΔNGFR、LVSyn1-ΔNGFR、LVSyn2-ΔNGFR、LVVsvg-ΔNGFRであった。導入遺伝子発現細胞のパーセンテージを、LSRII装置を使用してフローサイトメトリーによって測定し、7日目にDivaソフトウェアで分析し、データを3つの実験から平均化した。(B)では、培地を交換し、分化培地(DMEM+2%ウマ血清+1%グルタミン+1 PS)でC2C12細胞を培養して分化するように細胞を誘導した。異なる時点、培地交換の直後(d0)又は1又は3日間後(d1又はd3)のどちらかで、細胞を示されたベクターの漸増容量で形質導入した。導入遺伝子発現を、Divaソフトウェア分析によるLSRII装置でのフローサイトメトリーを使用して3日後に測定した。データは、2つの異なる実験を代表している。
【図１４】異なる細胞株でのmLy6e mRNAの発現のレベルと形質導入のレベルとの比較(A)異なる細胞株(A20IIA、C2C12、NIH/3T3)からmRNAを抽出し、cDNAに変換してmLy6eでPOをハウスキーピング遺伝子として使用してqRT-PCRを行った。相対的レベルを、式存在量=2-ΔCtを用いて計算した。C57BL/6マウスの肺、脾臓又は骨髄からの総細胞をテストしてqRT-PCRを検証し、Bacquinら、J. Virol.、2017、doi: 10.1128/JVI.00832〜17によって発表されているように、mLy6e発現レベルは肺細胞で最も高いことを確認した。(B)図14(A)と同じ細胞株に、105IG/mLの用量でΔNGFRをコードするLV-シンシチンAベクターを形質導入した。形質導入のレベルを、形質導入後7日時点でフローサイトメトリーによって分析した。
【図１５】ヒトシンシチン2 LVベクターを用いたヒト骨格筋筋芽細胞のインビトロでの形質導入を示す図である。出生後ヒト筋肉から得られ、Creative Bioarray社から購入した初代CSC-C3196ヒト骨格筋筋芽細胞に、ベクトフシンの存在下でLVSyn2-GFP及びLVSynB-GFPを含む5×105ig/mLのLVシンシチンベクターを形質導入した。5日間培養した後、形質導入細胞の数(GFP陽性細胞)及びHIVベクターコピー数を、EVOS FL装置(Life Technologies社)を使用する顕微鏡(A)、及びq-PCR(B)によってそれぞれ観察した。各視野は、2つの培養ウェルを代表している。データは、2つの異なる実験を代表している。倍率10×。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明によるシンシチン(ERVシンシチンとも名付けられた)は、内在性レトロウイルス(ERV)のファミリーに属する、有胎盤哺乳類由来の高度に膜融合性のエンベロープ糖タンパク質を指す。これらのタンパク質は、胎盤において優先的発現を示し、培養細胞に導入されるとシンシチウム形成を誘導する遺伝子によってコードされる(Lavialleら、Phil. Trans. R. Soc. B.、2013、368:20120507頁)。
【００１８】
本発明によるシンシチンは、ヒトシンシチン(例えば、HERV-W及びHERV-FRD)、マウスシンシチン(例えば、シンシチンA及びシンシチンB)、シンシチンOry1、シンシチンCar1、シンシチンRum1又はそれらの機能的オルソログ(Dupressoirら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、2005、102、725〜730頁;Lavialleら、Phil. Trans. R. Soc. B.、2013、368:20120507)、及び少なくとも受容体結合ドメイン(シンシチン1の残基117〜144に対応する)を含むそれらの機能的断片から選択することができる。
【００１９】
機能的オルソログとは、オルソログ遺伝子によってコードされ、及び膜融合特性を示すオルソログタンパク質が意図される。膜融合特性は、Dupressoirら(PNAS 2005)に記載されている融合アッセイで評価され得る。簡単には、例えば、細胞は、リポフェクタミン(Invitrogen)及び5×105細胞に対して約1〜2μgのDNA、又はリン酸カルシウム沈殿(Invitrogen、5×105細胞に対して5〜20μgのDNA)を使用してトランスフェクトされる。プレートは一般的に、トランスフェクション24〜48時間後に細胞融合について調べられる。シンシチウムは、メイグリュンワルドギムザ染色(Sigma)を使用して可視化することができ、融合指数は、[(N-S)/T]×100(ここで、Nはシンシチウムの核の数であり、Sはシンシチウムの数であり、及びTはカウントされた核の合計数である)として計算することができる。
【００２０】
ヒトシンシチンは、HERV-W及びHERV-FRDを包含する。これらのタンパク質の機能的オルソログはヒト科で見出され得る。HERV-Wは、ヒト内在性レトロウイルス(HERV)のファミリーに属する高度に膜融合性の膜糖タンパク質を指す。HERV-Wは、エンベロープ糖タンパク質であり、シンシチン1とも呼ばれる。HERV-Wは、転写物ERVW-1-001、ENST00000493463に対応するEnsemblデータベースに示された配列を有する。対応するcDNAは、配列番号1にリストされた配列を有する。HERV-FRDもまた、ヒト内在性レトロウイルス(HERV)のファミリーに属する高度に膜融合性の膜糖タンパク質を指す。HERV-FRDは、シンシチン2とも呼ばれるエンベロープ糖タンパク質である。HERV-FRDは、転写物ERVFRD-1、ENSG00000244476に対応する、Ensemblデータベースに示された配列を有する。対応するcDNAは、配列番号2にリストされた配列を有する。
【００２１】
マウスシンシチンは、マウスシンシチンA(すなわち、ハツカネズミシンシチンA、synA)及びマウスシンシチンB(すなわち、ハツカネズミシンシチンB、synB)を包含する。これらのタンパク質の機能的オルソログは、ネズミ科ファミリーに見出すことができる。マウスシンシチンAは、シンシチンA遺伝子によってコードされる。シンシチンAは、Ensemblデータベースに示された配列Syna ENSMUSG00000085957を有する。対応するcDNAは、配列番号3にリストされた配列を有する。マウスシンシチンBは、シンシチンB遺伝子によってコードされる。シンシチンBは、Ensemblデータベースに示された配列Synb ENSMUSG00000047977を有する。対応するcDNAは、配列番号4にリストされた配列を有する。
【００２２】
シンシチンOry1は、シンシチンOry1遺伝子によってコードされる。シンシチンOry1の機能的オルソログは、ウサギ科ファミリー(典型的にはウサギ及びノウサギ)に見出すことができる。
【００２３】
シンシチンCar1は、シンシチンCar1遺伝子によってコードされる。シンシチンCar1の機能的オルソログは、ローラシア獣上目からの肉食哺乳類に見出すことができる(Cornelisら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、2013、110、E828〜E837頁;Lavialleら、Phil. Trans. R. Soc. B.、2013、368:20120507頁)。
【００２４】
シンシチンRum1は、シンシチンRum1遺伝子によってコードされる。シンシチンRum-1の機能的オルソログは、反芻哺乳類に見出すことができる。
【００２５】
本発明の様々な実施形態において、本発明によるシンシチンは、典型的には、HERV-W(シンシチン1)、HERV-FRD(シンシチン2)、シンシチンA、シンシチンB、シンシチンOry1、シンシチンCar1及びシンシチンRum1並びにそれらの機能的オルソログからなる群から選択されてもよく、好ましくはシンシチンは、HERV-W、HERV-FRD、マウスシンシチンA、マウスシンシチンB及びそれらの機能的オルソログからなる群から選択され、より好ましくはシンシチンは、HERV-W、HERV-FRD、マウスシンシチンA及びマウスシンシチンBからなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、シンシチンは、シンシチンA、シンシチン1又はシンシチン2であり、好ましくはシンシチンA又はシンシチン2である。
【００２６】
本発明の様々な実施形態において、治療薬は、当技術分野で公知である標準的な結合方法を使用した共有又は非共有結合(coupling)又は結合(bonding)を介して、直接又は間接的にシンシチンタンパク質に結合される。
【００２７】
いくつかの実施形態において、薬物はシンシチンタンパク質に共有結合される。例えば、薬物は、シンシチンにコンジュゲートされてもよい。シンシチンへの薬物の共有結合は、反応基をシンシチンタンパク質に組み込み、次いで該基を使用して薬物を共有結合することによって達成されてもよい。或いは、シンシチン及び薬物アミノ酸配列が直接又はペプチドスペーサー若しくはリンカーを介して連結される融合タンパク質を形成するように、タンパク質である薬物がシンシチンに融合されてもよい。
【００２８】
いくつかの他の実施形態において、薬物及びシンシチンタンパク質は、ミセル、リポソーム、エクソソーム、デンドリマー、微粒子、ナノ粒子、ウイルス粒子、ウイルス様粒子等を限定せずに含む、例えばポリマーベース又は粒子ベースの送達ビヒクル等の薬物送達ビヒクルに組み込まれる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「ウイルスベクター」は、遺伝子材料を細胞に送達するために操作された非複製、非病原性ウイルスを指す。ウイルスベクターでは、複製及び病原性に不可欠なウイルス遺伝子が、目的とする異種遺伝子で置き換えられている。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「組換えウイルス」は、組換えDNA技術によって作製されたウイルス、特にウイルスベクターを指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「ウイルス粒子(virus particle)」又は「ウイルス粒子(viral particle)」は、カプシドと呼ばれるタンパク質の外被、及び場合によっては宿主細胞膜の部分に由来し、ウイルス糖タンパク質を含むエンベロープで囲まれたDNA又はRNAのどちらかから作られた遺伝子材料から成る、非病原性ウイルス、特にウイルスベクターの細胞外形態を意味することが意図される。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「ウイルス様粒子」又は「VLP」は、インタクトな感染性ウイルス粒子とサイズ及び立体配座が類似した自己集合性、非複製、非病原性、ゲノムレス粒子を指す。
【００３３】
いくつかの好ましい実施形態において、薬物及びシンシチンタンパク質は、例えばリポソーム、エクソソーム、微粒子、ナノ粒子、ウイルス粒子及びウイルス様粒子等の粒子に組み込まれる。粒子は、有利には、リポソーム、エクソソーム、ウイルス粒子及びウイルス様粒子からなる群から選択される。ウイルス粒子及びウイルス様粒子には、ウイルスカプシド及びエンベロープウイルス又はウイルス様粒子が挙げられる。エンベロープウイルス又はウイルス様粒子には、偽型化ウイルス又はウイルス様粒子が挙げられる。ウイルス又はウイルス様粒子は、好ましくはレトロウイルス、より好ましくはレンチウイルス由来である。ウイルス粒子は、有利には、ウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクター由来である。
【００３４】
レトロウイルスには、特にガンマレトロウイルス、スプーマウイルス、及びレンチウイルスが挙げられる。レンチウイルスには、特にHIV 1型(HIV1)及びHIV 2型(HIV2)等のヒト免疫不全ウイルス、並びにウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)が挙げられる。
【００３５】
レンチウイルス様粒子は、例えば、Muratoriら、Methods Mol. Biol.、2010、614、111〜24頁;Burneyら、Curr. HIV Res.、2006、4、475〜484頁;Kaczmarczykら、Proc. Natl. Aca. Sci;U.S.A.、2011、108、16998〜17003頁;Aokiら、Gene Therapy、2011、18、936〜941頁に記載されている。レンチウイルス様粒子の例は、シンシチンタンパク質をgag融合タンパク質(目的とする遺伝子と融合されたGag)とプロデューサー細胞において同時発現させて生成されたVLPである。
【００３６】
薬物及び/又はシンシチンは、粒子の表面に提示されるか、又は粒子に封入(パッケージング)されるかのどちらかであってもよい。シンシチンタンパク質は、有利には粒子の表面に提示されて、例えば粒子に結合され又は(エンベロープ)ウイルス粒子若しくはウイルス様粒子のエンベロープに組み込まれて、偽型化エンベロープウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成する。薬物は、粒子に結合され又は粒子にパッケージングされる。例えば、薬物は、ウイルスカプシドに結合され又はウイルスカプシドにパッケージングされ、前記ウイルスカプシドは、好ましくはシンシチンで偽型化されたエンベロープを更に含んでもよい。いくつかの好ましい実施形態において、薬物は、シンシチンタンパク質で偽型化された粒子にパッケージングされる。粒子にパッケージングされる薬物は、ウイルスベクター粒子、好ましくはレトロウイルスベクター粒子、より好ましくはレンチウイルスベクター粒子にパッケージングされる、有利には目的とする(異種)遺伝子である。
【００３７】
いくつかのより好ましい実施形態において、粒子は、エンベロープウイルス粒子又はウイルス様粒子、好ましくはシンシチンタンパク質で偽型化されたエンベロープウイルス粒子又はウイルス様粒子、更により好ましくはシンシチンタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子又はシンシチンタンパク質で偽型化されたレンチウイルス様粒子である。シンシチンタンパク質で偽型化されたエンベロープウイルス粒子、好ましくはシンシチンタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子は、有利には、目的とする(異種)遺伝子をパッケージングしている。いくつかの好ましい実施形態において、好ましくは目的とする(異種)遺伝子をパッケージングしているレンチウイルスベクター粒子は、シンシチンA、シンシチン1又はシンシチン2、好ましくはシンシチンA又はシンシチン2で偽型化される。
【００３８】
本発明の様々な実施形態において、筋傷害又は筋疾患(ミオパチー)は、疾患の生理病理学的過程の一部として再生期を含む。薬物は、再生筋組織の細胞、特に筋細胞、筋管、筋芽細胞、及び/又はサテライト細胞、並びにより好ましくは筋管、筋芽細胞、及び/又はサテライト細胞への標的化送達によって筋傷害又は筋疾患を治療するための、目的とする任意の薬物である。そのような薬物には、筋肉再生、特に骨格筋再生を刺激することができる任意の薬物、例えば、限定するものではなく:増殖因子及びプロスタグランジン抗炎症薬;免疫調節薬、免疫抑制薬、抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬又は免疫刺激薬を含む免疫治療薬;抗菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬又は抗寄生虫薬等の抗感染薬;抗癌薬;治療的抗体又は抗体断片及びゲノム編集酵素を含む治療的タンパク質、治療的ペプチド、治療的RNA、並びに治療的遺伝子、及び上記にリストされた治療的タンパク質、治療的ペプチド、及び/又は治療的RNAをコードする遺伝子を含む、筋疾患又は筋傷害の治療のための目的とする遺伝子等が挙げられる。薬物は、核酸、ペプチド核酸(PNA)、抗体及び抗体断片を含むタンパク質、ペプチド、リン脂質、リポタンパク質及びリン酸脂質タンパク質を含む脂質、糖、小分子、他の分子若しくは薬剤、又はそれらの混合物等の、天然、合成又は組換え分子又は薬剤であってもよい。免疫抑制薬には、例えばインターロイキン10(IL10)、CTLA4-Ig、及び他の免疫抑制タンパク質又はペプチドが挙げられる。治療的抗体には、例えばミオスタチンに対する抗体が挙げられる。治療的RNA等の治療的核酸には、修飾核内低分子RNA(snRNA)等のエクソンスキップすることができるアンチセンスRNA、遺伝子編集のためのガイドRNA又はテンプレート、並びにshRNA及びマイクロRNA等の干渉RNAが挙げられる。
【００３９】
「治療のための目的とする遺伝子」、「治療上の目的とする遺伝子」、「目的とする遺伝子」又は「目的とする異種遺伝子」とは、疾患の生理病理学的過程の一部として再生期を含む筋傷害又は筋疾患を処置するための治療的遺伝子、又は治療的タンパク質、ペプチド若しくはRNAをコードする遺伝子を意味する。
【００４０】
治療的遺伝子は、遺伝子又はその断片の機能的バージョンであり得る。機能的バージョン又は変異型には、前記遺伝子の野生型バージョン、同じファミリーに属する変異型遺伝子、又はコードされたタンパク質の機能性を保存する切断バージョンが挙げられる。遺伝子の機能的バージョンは、患者において欠損している又は機能しない遺伝子を置き換えるための置換又は付加遺伝子療法に有用である。遺伝子の機能的バージョン又は変異型の断片は、ゲノム編集酵素と組み合わせて使用する組換えテンプレートとして有用である。
【００４１】
或いは、目的とする遺伝子は、治療的抗体若しくは抗体断片、ゲノム編集酵素、又は治療的RNAを含む治療的タンパク質をコードしてもよい。目的とする遺伝子は、コードされたタンパク質、ペプチド又はRNAを、再生筋組織の細胞、特に筋細胞、筋管、筋芽細胞、及び/又はサテライト細胞、並びにより好ましくは筋管、筋芽細胞、及び/又はサテライト細胞で産生することができる機能的遺伝子である。治療的タンパク質は、上記に記載の筋肉再生を刺激することができる任意の薬物であってもよい。
【００４２】
治療的RNAは、有利には標的DNA又はRNA配列に相補的である。例えば、治療的RNAは、shRNA、マイクロRNA等の干渉RNA、ゲノム編集のためのCas酵素若しくは類似の酵素と組み合わせて使用するガイドRNA(gRNA)、又は修飾核内低分子RNA(snRNA)等のエクソンスキップすることができるアンチセンスRNAである。干渉RNA又はマイクロRNAは、筋疾患に関与する標的遺伝子の発現を調節するのに使用され得る。ゲノム編集のためのCas酵素又は類似の酵素と複合体を形成するガイドRNAは、標的遺伝子の配列を修飾して、特に変異/欠損遺伝子の配列を修正する、又は筋疾患に関与する標的遺伝子の発現を修飾するのに使用され得る。エクソンスキップすることができるアンチセンスRNAは、特にリーディングフレームを修正し、破壊されたリーディングフレームを有する欠損遺伝子の発現を回復させるのに使用される。
【００４３】
本発明によるゲノム編集酵素は、標的ゲノム遺伝子座で遺伝子修飾を誘導する酵素又は酵素複合体である。ゲノム編集酵素は、有利には、例えば、限定するものではなく、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターベースのヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート(clustered regularly interspaced palindromic repeats)(CRISPR)-Cas系由来のCas酵素及び類似の酵素等の、標的ゲノム遺伝子座に二本鎖切断(DSB)を生成する操作されたヌクレアーゼである。ゲノム編集酵素、特に操作されたヌクレアーゼは、二本鎖切断(DSB)誘導相同組換えによって標的ゲノム遺伝子座を修飾する相同組換え(HR)マトリックス又はテンプレート(DNAドナーテンプレートとも名付けられた)と組み合わせて通常使用されるが、必ずしも使用されるわけではない。特に、HRテンプレートは、目的とする導入遺伝子を標的ゲノム遺伝子座に導入する、又は標的ゲノム遺伝子座の、好ましくは筋疾患を引き起こす異常又は欠損遺伝子の変異を修復することができる。
【００４４】
目的とする遺伝子は、有利には、シンシチンタンパク質で偽型化されたエンベロープウイルスベクター粒子、好ましくはシンシチンタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子にパッケージングされる。ウイルスベクターは、筋細胞で発現可能な形態で目的とする遺伝子を含む。特に、目的とする遺伝子は、脾フォーカス形成ウイルス(SFFV)プロモーター又は合成筋肉特異的プロモーターC5-12(Wangら、Gene Therapy、2008、15、1489〜1499頁)等の、筋細胞で機能性である普遍的、組織特異的又は誘導性プロモーターに作動可能に連結される。
【００４５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、筋傷害又は筋疾患を治療するための目的とする遺伝子を含む目的とする薬物は、筋細胞、特に骨格筋細胞で特異的に発現される筋疾患に関与する遺伝子又は遺伝子産物(タンパク質/ペプチド)を標的とするという点で筋疾患に特異的である。特に、標的遺伝子又は遺伝子産物は、他の細胞タイプと比べて筋細胞で高度に発現される。標的遺伝子又は遺伝子産物はまた、例えば、限定するものではなく、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、カンジダ属種、トリキネラ属種、A型及びB型インフルエンザ等のウイルス、並びにコクサッキー等のエンテロウイルス等の、感染性筋炎に関与する細菌、真菌、寄生虫及びウイルス病原体由来の遺伝子及び遺伝子産物も含む。
【００４６】
本発明は、シンシチンタンパク質に結合した2つ以上の薬物を含む医薬組成物、及び/又は少なくとも2つの異なるシンシチンタンパク質が1つ又は複数の薬物に結合した組成物を包含する。
【００４７】
本発明の様々な実施形態において、医薬組成物、特に、シンシチンが表面に提示された以前に定義されている粒子、及び更により好ましくは、目的とする遺伝子を含む目的とする薬物をパッケージングするシンシチンで偽型化されたレンチウイルス粒子を含む組成物は、再生筋組織の細胞、例えば、特に筋細胞、筋管、筋芽細胞及び/又はサテライト細胞、並びにより好ましくは筋管、筋芽細胞及び/又はサテライト細胞を形質導入することによって、疾患の生理病理学的過程の一部として再生期を含む筋傷害又はミオパチーの任意の標的療法において使用される。
【００４８】
筋細胞(muscle cell)(筋細胞(myocyte))は、長さ数ミリメートルから約10センチメートル、幅10〜100マイクロメートルにわたる細長い細胞である。これらの細胞は、筋フィラメントと呼ばれる筋原線維の収縮タンパク質の整然とした規則的に反復する配列の有無に応じて、それぞれ横紋又は平滑のどちらかであり得る組織中で結合している。横紋筋は、骨格筋又は心筋のどちらかに更に分類される。
【００４９】
腱によって骨に付着されている骨格筋は末梢神経系によって制御され、身体の随意運動と関連している。骨格筋は横紋筋である。骨格筋細胞は、筋線維束を保護及び支持する結合組織に覆われている。血管及び神経は、酸素及び筋収縮を可能にする神経インパルスを筋細胞に供給する結合組織を通っている。
【００５０】
心筋では、細胞は心拍の同期を可能にする介在板によって互いに結合している。心筋は分枝状の横紋筋である。心臓壁は、三つの層、すなわち心外膜、心筋層、及び心内膜からなる。心筋層は、心臓の真ん中の筋層である。心筋の筋線維は、心伝導に動力を供給する心臓を通じた電気インパルスを運ぶ。
【００５１】
内臓筋(平滑筋)は、血管、膀胱、消化管を含む身体の様々な部分、及び多くの他の管腔器官で見出される。心筋と同じように、ほとんどの内臓筋は自律神経系によって調節され、不随意の制御下にある。内臓筋は横紋がない。内臓筋は骨格筋よりゆっくり収縮するが、収縮は長期間にわたって持続することができる。心血管系、呼吸器系、消化器系、及び生殖器系の器官は平滑筋で覆われている。
【００５２】
傷害後の筋肉再生は、胚形成時の筋肉発生と類似性を有する。骨格筋修復は、様々な細胞応答及び分子応答の活性化を伴う高度な同期過程であり、そこでは、炎症と再生の間の強調が筋損傷後の修復過程の有益な転帰に欠かせない。損傷後の筋組織修復は、2つの相互依存的段階、すなわち変性及び再生からなる過程とみなすことができ、そこでは、増殖及び分化因子の役割とは別に、筋肉と浸潤炎症性細胞の間の損傷及び相互作用の程度が筋肉修復過程の転帰の成功に影響を与えるようである。筋肉再生は、筋線維置換及び機能的収縮装置の再構成、又は瘢痕形成により損傷が回復されるかどうかを決定する、炎症促進性因子と抗炎症性因子の間のバランスに依存する。
【００５３】
筋線維の損傷後、静止状態のサテライト細胞は活性化されて細胞周期に入り、増殖し、筋原細胞集団の拡大を可能にする。この段階では、サテライト細胞は筋形成前駆細胞と呼ばれる。増殖期の後には、筋芽細胞(分化したサテライト細胞)の分化及び、線維の修復には損傷筋線維と、又は新たな筋線維形成には互いとの融合が続く。
【００５４】
Myf5及びMyoDを発現させる筋原細胞は、筋芽細胞と呼ばれる。二次的筋原性調節因子(MRF)ミオゲニン及びMRF4の上方制御は、ミオゲニン及びMRF4だけでなく、今やミオシン重鎖(MHC)及び筋クレアチンキナーゼ(MCK)等の筋細胞にとって重要な遺伝子も発現する筋細胞へと筋芽細胞の最終分化を誘導する。最終的には、単核筋細胞が融合して多核シンシチウム(筋管)を形成し、最後は収縮筋線維(筋細胞)へと成熟する。
【００５５】
サテライト細胞活性化は損傷部位に限定されないことから、傷害は、筋線維全てにわたってサテライト細胞を活性化し、サテライト細胞の増殖及び再生部位への遊走をもたらす。
【００５６】
サテライト細胞(筋原細胞)は、筋線維の細胞膜と基底膜の間、個々の筋線維を取り囲む基底板内に位置する。成体筋線維と比べると、サテライト細胞は、豊富な細胞質、ヘテロクロマチン量が増加した小さな核、及びオルガネラ含量の低下を含む特有の形態学的特徴を有する。これらの特徴は、サテライト細胞が有糸分裂静止状態であり、筋核より転写活性が低いという事実を反映している。
【００５７】
骨格筋は、反復傷害後の完全な再生及び修復能力を有する。この能力は、あらゆる再生過程後にサテライト細胞プールが再生されることを示している。しかし、サテライト細胞の自己再生能は限定されることが提案された。故に、数回の再生後のサテライト細胞プールの消耗が、ミオパチーを有する高齢者又は患者で観察される臨床的増悪に寄与している可能性がある。筋肉再生に関する詳細な概説については、Karalaki M、Fili S、Philippou A、Koutsilieris M. Muscle regeneration: cellular and molecular events. In Vivo. 2009 9〜10月;23(5):779〜96頁;Baghdadi及びTajbakhsh 2018(Meryem B Baghdadi、Shahragim Tajbakhsh. Regulation and phylogeny of skeletal muscle regeneration. Developmental Biology、Elsevier、20172018)を参照のこと。
【００５８】
本発明の組成物は、再生筋組織、特に骨格筋組織及び/又は心筋組織の細胞への標的化送達を可能にする。典型的には、該組成物は、再生筋組織の細胞、例えば、特に筋細胞、筋管、筋芽細胞及び/又はサテライト細胞、並びにより好ましくは筋管、筋芽細胞及び/又はサテライト細胞等への標的化送達を可能にする。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「再生筋組織」は、再生している、すなわち筋形成(myogenesis)及び新たに筋肉形成(muscle formation)している筋組織を指す。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物、特に、シンシチンが表面に提示された以前に定義されている粒子、及び更により好ましくは、目的とする薬物又は遺伝子、好ましくは目的とする遺伝子をパッケージングするシンシチンで偽型化されたレンチウイルスベクター粒子を含む組成物は、筋疾患の(標的)遺伝子療法に使用される。
【００６１】
遺伝子療法は、核、ミトコンドリア中に、又は共生核酸(例えば、限定するものではなく、細胞に含有されるウイルス配列)として含まれる配列を含む、細胞中の任意のコード配列又は制御配列の遺伝子導入、遺伝子編集、エクソンスキッピング、RNA干渉、トランススプライシング、又は任意の他の遺伝子修飾によって行われ得る。
【００６２】
遺伝子療法の2つの主なタイプは、以下の通りである:
- 欠損/異常遺伝子に対する機能的置換遺伝子を提供することを目的とした療法であって、これは、置換又は付加遺伝子療法であり;
- 遺伝子又はゲノム編集を目的とした療法:そのような場合、機能的遺伝子が発現されるように配列を修正する、又は欠損/異常遺伝子の発現若しくは調節を修飾するための必要なツールを細胞に提供することが目的であって、これは、遺伝子編集療法である。
【００６３】
付加遺伝子療法では、目的とする遺伝子は、例えば遺伝子疾患の場合と同様に、患者における欠損又は変異遺伝子の機能的バージョンであってもよい。そのような場合、目的とする遺伝子は、機能的遺伝子の発現を回復させるであろう。そのような実施形態においてより好ましくは、本発明の組成物は、目的とする遺伝子をコードするウイルスベクターを好ましくは含む。更により好ましくは、ウイルスベクターは、レトロウイルス、とりわけ以前に記載されているレンチウイルス等の組込みウイルスベクターである。
【００６４】
遺伝子又はゲノム編集は、1つ又は複数の目的とする遺伝子、例えば、(i)shRNA若しくはマイクロRNAのような干渉RNA、Cas酵素若しくは類似の酵素と組み合わせて使用するガイドRNA(gRNA)、又は修飾核内低分子RNA(snRNA)等のエクソンスキップすることができるアンチセンスRNA等の、上記に記載の治療的RNAをコードする遺伝子;(ii)メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターベースのヌクレアーゼ(TALEN)、Cas酵素又は類似の酵素のような操作されたヌクレアーゼ等の、上記に記載のゲノム編集酵素をコードする遺伝子;又はそのような遺伝子の組み合わせを使用し、最終的には、上記に記載の、組換えテンプレートとして使用する遺伝子の機能的バージョンの断片も使用する。遺伝子編集は、非組込みレンチウイルスベクター等の非組込みウイルスベクターを使用して行われてもよい。
【００６５】
特に興味深いのは、再生筋組織由来の細胞で修正されると患者の疾患又は症状を改善する、筋疾患を示す患者における欠損又は変異遺伝子である。再生筋組織、特に骨格筋及び/又は心筋組織由来の細胞は、好ましくは筋細胞、筋管、筋芽細胞、及び/又はサテライト細胞、並びにより好ましくは筋管、筋芽細胞、及び/又はサテライト細胞である。
【００６６】
本発明による筋疾患には、以下にリストされる疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
ミオパチーとも名付けられた筋疾患は、筋線維が正しく機能せず、一般的に筋損傷と関連する疾患である。本発明によるミオパチーには以下が挙げられるが、これらに限定されない:
- 先天性筋ジストロフィーを含むジストロフィー(又は筋ジストロフィー)は、筋肉の変性及び再生を特徴とするミオパチーのサブグループである。先天性筋ジストロフィー(CMD)は、顕著なジストロフィー変化の免疫組織化学的所見、すなわち筋線維壊死及び再生、筋内膜結合組織の増加、及び脂肪組織による筋肉の置換によって区別される。古典的CMDは筋骨格系に臨床的に限局されるが、他のCMDは著しい脳神経細胞移動異常及び眼異常を特徴とする。ジストロフィーには、以下が挙げられる:
- ジストロフィン異常症タンパク質ジストロフィンをコードするDMD遺伝子の病原性バリアントに起因するX連鎖性筋疾患のスペクトルを含む。ジストロフィン異常症は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー(BMD)、及びDMD関連拡張型心筋症を含む。DMDは、病原性バリアントがジストロフィン異常症を引き起こす唯一の遺伝子である。5,000個を超える病原性バリアントが、DMD又はBMDを有する者において同定されている。疾患を引き起こす対立遺伝子は、遺伝子全体の欠失、1つ若しくは複数のエクソンの欠失若しくは重複、及び小欠失、挿入、又は単一塩基変化を含め、高度に可変的である(編者Pagon RA、Adam MP、Ardinger HHら  GeneReviews(登録商標)[インターネット].シアトル(WA):ワシントン大学、シアトル;1993〜2017頁のDarras BT、Miller DT、Urion DK. Dystrophinopathies. 2000年9月5日[2014年11月26日更新]を参照のこと。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1119/、及びOMIM Entries for Dystrophinopathies 300376、300377、302045及び310200から入手可能)。
- 肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)DMDと臨床的に類似した障害群であるが、常染色体劣性及び常染色体優性遺伝の結果、両方の性別で生じる。肢帯型ジストロフィーは、ジストロフィンと相互作用する、筋細胞膜と関連するサルコグリカン及び他のタンパク質をコードする遺伝子の変異に起因する。用語LGMD1は、優性遺伝(常染色体優性)を示す遺伝子型を指すのに対し、LGMD2は、常染色体劣性遺伝を伴うタイプを指す。50を超える遺伝子座の病原性バリアントが報告されている。
【００６８】
常染色体優性LGMD(LGMD1)には、以下が挙げられる:
- LGMD1A(ミオチリン異常症) MYOTの変異に起因する。
- LGMD1B LMNAの変異に起因する。LMNAにおける病原性バリアントは、LGMD1B、常染色体優性及び常染色体劣性エメリー-ドレフュス型筋ジストロフィー、ダニガン型家族性部分型リポジストロフィー(FPLD)、下顎末端異形成症、ハッチンソン-ギルフォード早老症候群、及びシャルコー-マリー-トゥース病2B1型を含む少なくとも11個の対立遺伝子状態もたらす。
- LGMD1C(カベオリン異常症)  カベオリン-3をコードする遺伝子CAV3の変異に起因する。
- LGMD1D  タンパク質合成又は細胞ストレス中の不可逆的凝集からのタンパク質の保護に関与する分子コシャペロンのHSP/DNAJファミリーのメンバーであるタンパク質をコードするDNAJB6の変異に起因する。
- LGMD1E  デスミン遺伝子(DES)における変異に起因する。
- LGMD1F(TNPO3遺伝子)、LGMD1G(HNRNPDL遺伝子)、及びLGMD1H。
【００６９】
常染色体劣性LGMDには、以下が挙げられる:
- サルコグリカン異常症  SGCAの変異に起因するα-サルコグリカン異常症(LGMD2D);遺伝子SGCBの変異に起因するβ-サルコグリカン異常症(LGMD2E);遺伝子SGCGの変異に起因するγ-サルコグリカン異常症(LGMD2C);遺伝子SGCDの変異に起因するδ-サルコグリカン異常症(LGMD2F)を含む。
- カルパイン異常症(LGMD2A)  記載された450個を超える病原性バリアントを含む遺伝子CAPN3の変異に起因する。
- ジスフェリン異常症(LGMD2B)。ジスフェリン(DYSF遺伝子)は、筋線維鞘とのカルシウム媒介小胞融合及び骨格筋線維の膜修復に重要と考えられているC2ドメインを含む筋線維鞘タンパク質である。
- LGMD2G TCAP病原性バリアントを含む。
- LGMD2H 2個のミスセンスバリアント、1個のコドン欠失、及び2個のフレームシフトバリアントを含む、TRIM32で報告されている病原性バリアントを含む。
- ジストログリカン異常症  LGMD2I(FKRP遺伝子の変異に起因、LGMD2K(POMT1遺伝子の変異に起因)、LGMD2M(FKTNの変異に起因)、LGMD2O(POMGNT1遺伝子の変異に起因)、LGMD2N(POMT2遺伝子の変異に起因)を含む、O連鎖性グリコシル化酵素の異常に関連。
- LGMD2L  筋ジストロフィーの膜修復機構に関与している可能性がある推定カルシウム活性化クロライドチャネル、アノクタミン(actonamin)をコードするANO5の欠損バリアントに起因する。
- LGMD2J TTN遺伝子の欠損バリアントに起因する。
- LGMD2P DAG1遺伝子の欠損バリアントに起因する。
- LGMD2Q PLECの欠損バリアントに起因する。
- LGMD2R DESの欠損バリアントに起因する。
- LGMD2S TRAPPC11の欠損バリアントに起因する。
- LGMD2T GMPPBの欠損バリアントに起因する。
- LGMD2U ISPDの欠損バリアントに起因する。
- LGMD2V GAAの欠損バリアントに起因する。
- LGMD2W LIMS2の欠損バリアントに起因する。
- LGMD2X BVESの欠損バリアントに起因する。
- LGMD2Y TOR1AIP1の欠損バリアントに起因する。
【００７０】
- エメリー-ドレフュス型筋ジストロフィー(EDMD) EMD遺伝子(エメリンをコードする)、FHL1遺伝子、及びLMNA遺伝子(ラミンA及びCをコードする)を含む遺伝子の1つにおける異常に起因する。
- ネスプリン-1及びネスプリン-2関連筋ジストロフィー  それぞれ、SYNE1及びSYNE2遺伝子の異常に起因;LUMA関連筋ジストロフィー  TMEM43遺伝子の異常に起因;LAP1B関連筋ジストロフィー  TOR1AIP1遺伝子の異常に起因する。
- 顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、1型(FSHD1A)、例えばDUX4遺伝子(染色体4q35のサブテロメア領域のD4Z4マクロサテライト反復の収縮)又はFRG1遺伝子の異常に関連するもの等;顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、2型(FSHD1B)SMCHD1遺伝子の異常に起因する。
- 全身性リポジストロフィーを伴う筋ジストロフィー  PTRF遺伝子の異常に起因する。
- 先天性グリコシル化障害Io型を伴う筋ジストロフィー  DPM3遺伝子の異常に起因する。
- 肩甲腓骨型筋ジストロフィー及び首下がり症候群  VCP遺伝子の異常に起因する。
- 脊髄性筋萎縮症  SMN1及び/又はSMN2の病原性バリアントに起因する。
- 眼咽頭型筋ジストロフィー(OPMD)  ポリアデニル化結合核タンパク質1をコードする遺伝子PABPN1の病原性バリアントに起因する。
- 先天性筋ジストロフィー  メロシン欠損を伴う先天性筋ジストロフィー(LAMA2遺伝子);ベスレム型ミオパチー(COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL12A1遺伝子);ウルリッヒ症候群(COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL12A1遺伝子)、並びにCOL12A1、COL6A2、SEPN1、FHL1、ITGA7、DMM2、TCAP及びLMNA遺伝子の異常による他の先天性筋ジストロフィー;グリコシル化欠損による先天性筋ジストロフィー(FKTN、POMPT1、POMPT2、FKRP、POMGNT1、POMGNT2、ISPD、B3GNT1、GMPPB、LARGE、DPM1、DMP2、ALG13、B3GALNT2、TMEM5、POMK遺伝子);他の先天性筋ジストロフィー(CHKB、ACTA1、TRAPPC11、GOLGA2、TRIP4遺伝子)を含む。
【００７１】
- 先天性ミオパチー  筋肉の収縮能力の低減に関連した筋力低下を主に特徴とする。先天性ミオパチーには、限定するものではないが、以下が挙げられる:
- ネマリンミオパチー  筋肉中の「ネマリン小体(nemaline rod)」の存在を特徴とし、10個の遺伝子(NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KBTBD13、KLHL40、及びKLHL41)における病原性バリアントが同定されている。
- コアミオパチー(中心核ミオパチー、及びマルチミニコアミオパチー)、筋線維中の複数の小さな「コア」又は破壊領域を特徴とする)。コアミオパチーは、先天性ミオパチーの最も一般的な形態であり、RYR1変異と最も一般的に関連している。遺伝子SEPN1(SELENONをコードする)又はトロポミオシンをコードする遺伝子及びKBTKD13遺伝子の変異が、それぞれ、マルチミニコア及びコアロッドミオパチーで観察されている。MEGF10遺伝子の変異も、ミニコアを伴う先天性ミオパチーで明らかにされている。
- 筋線維タイプ不均等を伴う先天性ミオパチー(MYH7遺伝子);眼筋麻痺近位型ミオパチー(Myopathy proximal to ophtalmoplegia)(MYH2遺伝子);孤立性封入体(isolated inclusion body)ミオパチー(HNRNPA1遺伝子);先天性骨格筋ミオパチー及び致死性心筋症(MYBPC3遺伝子);先天性致死性ミオパチー(congenital  lethal myopathy)(CTCN1遺伝子;筋細管ミオパチー(TRIM32遺伝子);PTPLA関連先天性ミオパチー(PTPLA遺伝子);CACNA1Sに関連する眼筋麻痺を伴う先天性ミオパチー(CACNA1S遺伝子)。
- 中心核ミオパチー(又は筋細管ミオパチー) MTM1(ミオチューブラリンをコードする)、DNM2、BIN1、TNN、SPEG遺伝子のバリアントと関連する。
- 遠位型ミオパチー  DYSF、TTN、GNE、MYH7、MATR3、TIA1、MYOT、NEB、CAV3、LDB3、ANO5、DNM2、KLHL9、FLNC、VCP、ADSSL1遺伝子の異常に関連する。
- 筋原線維性ミオパチー  CRYAB、DES、SEPN1、LDB3、MYOT、FLNC、BAG3、TRIM54、TRIM63、KY遺伝子の異常と関連する。
- その他のミオパチー(miscellaneous myopathies) LAMP2、VMA21、CLN3、PABPN1、TNN、PLEC、MSTN、ACVR1、CAV3、FHL1、VCP、ISCU、RYR1、PYRODX1遺伝子の異常と関連する。
- 筋強直症候群  DMPK、CNPB、CLCN1、CAV3、HSPG2、ATP2A1遺伝子の異常と関連する;筋強直症は、先天性筋強直症、先天性パラミオトニー及び筋強直性ジストロフィーを含む。
- イオンチャネル筋疾患  クロライドチャネル(CLCN1)、ナトリウムチャネル(SCN4A、SCN5A)、カルシウムチャネル(CACNA1S、CACNA1A)、カリウムチャネル(KCNE3、KCNA1、KCNJ18、KCNJ2、KCNH2、KCNQ1、KCNE2、KCNE1)遺伝子の異常と関連する。イオンチャネル筋疾患の例は周期性四肢麻痺である。
- 悪性高熱症  RYR1、CACNA1S遺伝子及び他の未知遺伝子の異常と関連する。
- 代謝性ミオパチー、主に筋肉に影響を与える生化学的代謝の異常から生じ、以下が挙げられる:
【００７２】
【表１】
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【００７３】
- 解糖系の疾患  PGK1、PGAM2、LDHA、ENO3遺伝子異常と関連する。
- 脂質代謝の障害  CPT2、SLC22A5、LC25A20、ETFA、ETFB、ETFDH、ACADVL、ACAD9、ABHD5、PNPLA2、LPIN1、PNPLA8遺伝子の異常による。
- 先天性筋無力症候群  GMPPB、MYO9A、SLC5A7、COL13A1、LRP4、PREPL、ALG14、ALG2、PLEC、SCN4A、LAMB2、DPAGT1、GFPT1、AGRN、DOK7、MUSK遺伝子の異常と関連する。
- ミトコンドリアミオパチー、CHKB、MRPL3、NDUAF1、AARS2、MRPL44、MTO1、TSFM、CHCHD10、SLC25A42、PUS1、ADCK3、MARS2、MTPAP、YARS2、TK2及びSUCLA2等のミトコンドリア遺伝子の異常による。例には、カーンズ-セイヤー症候群(KSS)、リー症候群及び母性遺伝リー症候群(MILS)、ミトコンドリアDNA欠失症候群、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群(MELAS);赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん(MERFF)、神経障害、運動失調、網膜色素変性症(NARP);ピアソン症候群及び進行性外眼筋麻痺が挙げられる。
- 脂質蓄積病  ニーマン-ピック病(A、B、E、F型: SMPD1遺伝子;C、D型: NPC1遺伝子)、ファブリ病(アルファ-ガラクトシダーゼAをコードするGLA遺伝子)、クラッベ病(GALC遺伝子)、コーシェ病(GBA遺伝子)、テイ-サック病(HEXA遺伝子)、異染性白質ジストロフィー(ARSA遺伝子)、多種スルファターゼ欠損症(SUMF1遺伝子)、及びファーバー病(ASAH1遺伝子)を含む。
- 遺伝性心筋症  MYH6、MYH7、TNNT2、TPM1、MYBPC3、PRKAG2、TNNI3、MYL3、TTN、MYL2、ACTC1、CSRP3、TNNC1、VCL、MYLK2、CAV3、MYOZ2、JPH2、PLN、NEXN、ANKRD1、ACTN2、NDUAF1、TSFM、AARS2、MRPL3、COX15、MTO1、MRPL44、LMNA、LDB3、SCN5A、DES、EYA4、SGCD、TCAP、ABCC9、PLN、TMPO、PSEN2、CRYAB、FKTN、TAZ、DMD、LAMA4、ILK、MYPN、RBM20、SYNE1、MURC、DOLK、GATAD1、SDHA、GAA、DTNA、FLNA、TGFB3、RYR2、TMEM43、DSP、PKP2、DSG2、DSC2、JUP、CTNNA3、CASQ2、ANK2、KCNE1、KCNE2、KCNJ2、CACNAC1、SCN4B、AKAP9、SNTA1、KCNJ5、KCNH2、KCNQ1、NPPA、KCNA5、GJA5、SCN1B、SCN2B、NUP155、GPD1L、CACNA1、CACNB2、KCNE3、SCN3B、HCN4遺伝子の異常と関連する。
- 神経筋障害  TOR1A、SGCE、IKBKAP、KIF21A、PHOX2A、TUBB3、TPM2、MYH3、TNNI2、TNNT3、SYNE1、MYH8、POLG、SLC25A4、C10orf2、POLG2、RRMB2、TK2、SUCLA2、SLC25A42、OPA1、STIM1、ORAI1、PUS1、CHCHD10、CASQ1、YARS2、FAM111B遺伝子の異常に起因する。
- 神経原性ミオパチー  筋萎縮を特徴とし、DNM2、YARS、MP2、INF2、GNB4及びMTMR2を含む様々な遺伝子の変異に起因するシャルコー-マリー-トゥース病の様々なタイプ、特に、MTMR2遺伝子の異常によるシャルコー-マリー-トゥース病4B1型;筋萎縮を特徴とし、DCTN1、PRPH、SOD1及びNEFHを含む様々な遺伝子の変異に起因する筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含む。
- 炎症性ミオパチー、筋肉の免疫系攻撃成分の問題に起因し、筋肉の炎症徴候をもたらす。炎症性ミオパチーには、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、及び重症筋無力症等の自己免疫性ミオパチーが挙げられる。
- 横紋筋融解症、コンパートメント症候群、又はミオグロビン尿症  横紋筋融解症は、損傷した骨格筋が急速に崩壊する状態である。ミオグロビン尿症は、横紋筋融解症又は筋肉の破壊と通常は関連する、尿中にミオグロビンが存在する状態である。外傷、血管の問題、悪性高熱症、及び特定の薬物が、筋肉を破壊又は損傷し、ミオグロビンを循環に放出し得る状況の例である。また、ミオグロビン尿症の他の原因には、マッカードル病、ホスホフルクトキナーゼ欠損症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼII欠損症、悪性高熱症、多発性筋炎、乳酸脱水素酵素欠損症、熱傷又は電気熱傷も挙げられる。
- 筋壊死(とりわけ代謝不全及び/又は膜損傷による)、捻挫、膨満、痙攣、腱炎、フォルクマン阻血性拘縮又はデュピュイトラン拘縮)等の拘縮、筋感染症、筋筋膜痛、及び筋攣縮。
【００７４】
本発明による筋疾患は、好ましくは、筋肉再生周期を伴う疾患、例えば、限定されるものではないが、筋ジストロフィー、横紋筋融解症、筋萎縮症、筋壊死、並びに例えば重症筋無力症、及び筋損傷と関連する他のミオパチー等の自己免疫性ミオパチー等を含む。
【００７５】
筋傷害は、
- 直接外傷;
- 身体の運動又は過剰使用;
- コンパートメント症候群;
- 薬物乱用(アルコール性ミオパチー等)、又は薬物療法(筋萎縮をもたらすグルココルチコイドミオパチー等)、又は放射線を含む筋毒性薬剤への曝露;
- 悪性高熱症;
- 虚血;
- 高温若しくは低温への曝露又は電気熱傷
によって引き起こされた筋損傷を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
上記に記載されている筋肉に影響を与える遺伝子疾患の変異遺伝子の例には、以下が挙げられる:
- 筋ジストロフィーに関与する遺伝子、例えば、DMD、MYOT、LMNA、CAV3、DES、DNAJB6、TNPO3、HNRNPDL、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、CAPN3、DYSF、TCAP、TRIM32、FKRP、POMT1、FKTN、POMGNT1、POMT2、ANO5、TTN、DAG1、DES、TRAPPC11、GMPPB、ISPD、GAA、LIMS2、BVES、TOR1AIP1,PLEC、EMD、FHL1、LMNA、SYNE1、SYNE2、TMEM43、DUX4、FRG1、SMCHD1、PTRF、DPM3、VCP、SMN1、SMN2、PABPN1、COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL12A1、FHL1、ITGA7、DMM2、TCAP、LMNA、FKTN、POMPT1、POMPT2、FKRP、POMGNT1、POMGNT2、ISPD、B3GNT1、GMPPB、LARGE、DPM1、DMP2、ALG13、B3GALNT2、TMEM5、POMK、CHKB、ACTA1、TRAPPC11、GOLGA2及びTRIP4等;
- 先天性ミオパチーに関与する遺伝子、例えば、NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KBTBD13、KLHL40、KLHL41、RYR1、SEPN1、KBTKD13、MTM1、MEGF10,MYH7、MYH2、HNRNPA1、MYBPC3、CTCN1 TRIM32 PTPLA、CACNA1S、MTM1、DNM2、BIN1、TNN及びSPEG等;
- 遠位型ミオパチーに関与する遺伝子、例えば、DYSF、TTN、GNE、MYH7、MATR3、TIA1、MYOT、NEB、CAV3、LDB3、ANO5、DNM2、KLHL9、FLNC、VCP及びADSSL1等;
- 筋原線維性ミオパチーに関与する遺伝子、例えば、CRYAB、DES、SEPN1、LDB3、MYOT、FLNC、BAG3、TRIM54、TRIM63及びKY等;
- その他のミオパチーに関与する遺伝子、例えば、LAMP2、VMA21、CLN3、PABPN1、TNN、PLEC、MSTN、ACVR1、CAV3、FHL1、VCP、ISCU、RYR1及びPYRODX1等;
- 筋強直症候群に関与する遺伝子、DMPK、CNPB、CLCN1、CAV3、HSPG2及びATP2A1;
- イオンチャネル筋疾患に関与する遺伝子、例えば、CLCN1、SCN4A、SCN5A,CACNA1S、CACNA1A、KCNE3、KCNA1、KCNJ18、KCNJ2、KCNH2、KCNQ1、KCNE2及びKCNE1等;
- 悪性高熱症に関与する遺伝子、例えば、RYR1及びCACNA1S等;
- 代謝性ミオパチーに関与する遺伝子、例えば、糖原病:GYS1、GAA、GBE1、AGL、PYGM、PKFM、PHKA1、PGM1、GYG1、ALDOA、ENO3、PRKAG2及びRBCK1;解糖系の疾患: PGK1、PGAM2、LDHA及びENO3;脂質代謝の障害、例えば、CPT2、SLC22A5、LC25A20、ETFA、ETFB、ETFDH、ACADVL、ACAD9、ABHD5、PNPLA2、LPIN1及びPNPLA8等;
- ミトコンドリアミオパチーに関与する遺伝子、例えば、CHKB、MRPL3、NDUAF1、AARS2、MRPL44、MTO1、TSFM、CHCHD10、SLC25A42、PUS1、ADCK3、MARS2、MTPAP、YARS2、TK2及びSUCLA2等;
- 先天性筋無力症候群に関与する遺伝子、例えば、GMPPB、MYO9A、SLC5A7、COL13A1、LRP4、PREPL、ALG14、ALG2、PLEC、SCN4A、LAMB2、DPAGT1、GFPT1、AGRN、DOK7及びMUSK等;
- 遺伝性心筋症に関与する遺伝子、例えば、MYH6、MYH7、TNNT2、TPM1、MYBPC3、PRKAG2、TNNI3、MYL3、TTN、MYL2、ACTC1、CSRP3、TNNC1、VCL、MYLK2、CAV3、MYOZ2、JPH2、PLN、NEXN、ACTN2、NDUAF1、TSFM、AARS2、MRPL3、COX15、MTO1、MRPL44、LMNA、LDB3、DES、EYA4、SGCD、TCAP、ABCC9、PLN、TMPO、PSEN2、CRYAB、FKTN、TAZ、DMD、LAMA4、ILK、MYPN、RBM20、ANKRD1、SYNE1、MURC、DOLK、GATAD1、SDHA、GAA、DTNA、FLNA、TGFB3、RYR2、TMEM43、DSP、PKP2、DSG2、DSC2、JUP、CTNNA3、CASQ2、ANK2、KCNE1、KCNE2、KCNJ2、CACNAC1、SCN4B、AKAP9、SNTA1、KCNJ5、KCNH2、KCNQ1、NPPA、KCNA5、GJA5、SCN1B、SCN2B、NUP155、SCN5A、GPD1L、CACNA1、CACNB2、KCNE3、SCN3B及びHCN4等;
- 神経筋障害に関与する遺伝子、例えば、TOR1A、SGCE、IKBKAP、KIF21A、PHOX2A、TUBB3、TPM2、MYH3、TNNI2、TNNT3、SYNE1、MYH8、POLG、SLC25A4、C10orf2、POLG2、RRMB2、TK2、SUCLA2、SLC25A42、OPA1、STIM1、ORAI1、PUS1、CHCHD10、CASQ1、YARS2及びFAM111B等;並びに
- 神経原性ミオパチーに関与する遺伝子、例えば、MTMR2、DNM2、YARS、MP2、INF2、GNB4及びMTMR2(シャルコー-マリー-トゥース病);DCTN1、PRPH、SOD1及びNEFH(筋萎縮性側索硬化症(ALS))等。
【００７７】
好ましくは、本発明による目的とする遺伝子は、DMD、MYOT、CAV3、DES、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、CAPN3、DYSF、TCAP、POMT1、POMGNT1、POMT2、ANO5、FKTN、FKRP、TTN、EMD、FHL1、NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KHL40、KHL41、RYR1、MTM1、SEPN1、DUX4、FRG1、MTMR2、筋グリコーゲンホスホリラーゼ(PYGM)及び筋ホスホフルクトキナーゼ(PKFM)を含む群を含むが、これらに限定されない、筋肉で主に又は特異的に発現される遺伝子から選択される。
【００７８】
そのような遺伝子は、置換遺伝子療法において再生筋組織で標的とすることができ、目的とする遺伝子は、欠損又は変異遺伝子の機能的バージョンである。
【００７９】
或いは、これらの遺伝子は、遺伝子編集の標的として使用され得る。遺伝子編集の特定の例は、α-サルコグリカン遺伝子(SGCA)の変異に起因する肢帯型筋ジストロフィー2D(LGMD2D)の治療であろう。最も頻繁に報告される変異、SGCAのエクソン3の229CGC>TGC(R77C)は、システインによるアルギニンの置換をもたらす。故に、罹患した患者でこの遺伝子の修正バージョンを遺伝子編集することにより、これはこの疾患に対する有効な療法に寄与し得る。上記にリストされている筋肉の他の遺伝子疾患は、同じ原理を使用して遺伝子編集によって治療され得る。
【００８０】
遺伝子療法では、以前に記載されている本発明の組成物、及びより具体的には、本発明によるシンシチンで偽型化された安定なレンチウイルス粒子を、筋組織工学、好ましくはサテライト細胞を含む内在性筋幹細胞工学に関する療法において、前記細胞を形質導入して使用することが可能であり得る(Nichols JE、Niles JA、Cortiella J. Design and development of tissue engineered muscle: Progress and challenges. Organogenesis. 2009、5、57〜61頁)。
【００８１】
また、遺伝子スプライシング、発現若しくは調節、又は遺伝子編集に好都合な配列を挿入することも可能であり得る。CRISPR/Cas9等のツールがこの目的のために使用されてもよい。自己免疫又は癌の場合、これは、再生筋組織の細胞での遺伝子発現を修飾する、又はそのような細胞でのウイルス周期を撹乱するのに使用され得る。そのような場合、好ましくは、目的とする異種遺伝子は、ガイドRNA(gRNA)、部位特異的エンドヌクレアーゼ(TALEN、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Casヌクレアーゼ)、DNAテンプレート、並びにshRNA及びマイクロRNA等のRNAi成分をコードするものから選択される。
【００８２】
筋肉の感染症を治療するために、目的とする遺伝子はまた、筋肉病原体の生活環の不可欠な成分を標的とすることもできる。
【００８３】
本発明による安定な偽型化レンチウイルス粒子を含む医薬組成物は、同じ細胞を標的とするのに一緒に又は連続して使用され得る。遺伝子編集プラットフォームの複数の成分を細胞に付加する必要がある遺伝子編集等の戦略では、これは利点であり得る。
【００８４】
本発明のいくつかの他の実施形態において、シンシチンタンパク質に結合した薬物、特にシンシチンが表面に提示された以前に定義されている粒子を含む組成物、及び更により好ましくは、目的とする薬物又は遺伝子をパッケージングするシンシチンで偽型化されたレンチウイルス粒子、好ましくは目的とする遺伝子を含む本発明の医薬組成物は、とりわけ、外傷性傷害、癌切除術、又は熱傷に続発する広範な組織喪失を含む複合再建術のための可能性のある臨床治療として最近導入されている複合組織同種移植のケースで、免疫調節、又は筋肉移植寛容を調節するのに使用される。複合組織同種移植片(CTAs)は、異なる抗原性を有する皮膚、脂肪、筋肉、神経、リンパ節、骨、軟骨、靭帯、及び骨髄を含む異種組織からなる。故に、複合組織構造は、固形臓器移植より免疫原性であると考えられる。故に、組成物は、筋移植拒絶反応の予防のために移植ドナーに投与される。これらの使用に関して、薬物は、特に、IL-10、CTLA4-Ig若しくは他の免疫抑制ペプチド等の免疫抑制薬、又はリンパ管新生を改善するVEGF変異体(Cuiら  J. Clin. Invest. 2015年11月2日;125(11):4255〜68頁)であり、目的とする遺伝子は、前記免疫抑制薬又はVEGF変異体をコードする遺伝子である。
【００８５】
本発明の様々な実施形態において、医薬組成物は、シンシチンタンパク質に結合した薬物の治療有効量を含む。
【００８６】
本発明の文脈において、用語「治療する」又は「治療」は、本明細書で使用される場合、そのような用語が適用される障害若しくは状態の進行を逆転、軽減若しくは阻害する、又はそのような用語が適用される障害若しくは状態の1つ若しくは複数の症状の進行を逆転、軽減若しくは阻害することを意味する。
【００８７】
同様に、治療有効量は、そのような用語が適用される障害若しくは状態の進行を逆転、軽減若しくは阻害する、又はそのような用語が適用される障害若しくは状態の1つ若しくは複数の症状の進行を逆転、軽減若しくは阻害するのに十分な用量を指す。
【００８８】
有効用量は、使用される組成物、投与経路、検討中の個体の身体的特徴、例えば、性別、年齢及び体重等、併用薬物、並びに他の要因等の、医学分野の当業者が認識する要因に応じて決定及び調整される。
【００８９】
本発明の様々な実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体及び/又はビヒクルを含む。
【００９０】
「薬学的に許容される担体」は、哺乳類、特にヒトに必要に応じて投与される場合に、有害な、アレルギー性又は他の厄介な反応を生じないビヒクルを指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、任意のタイプの非毒性の固体、半固体若しくは液体充填剤、希釈剤、被包材又は補助製剤を指す。
【００９１】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤用の薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に、等張性滅菌生理食塩溶液(リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウム等、又はそのような塩の混合物)、又は場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を添加すると、注射可能な溶液の構成が可能になる乾燥、特に凍結乾燥組成物であってもよい。
【００９２】
注射可能な用途に適した薬学的形態には、滅菌水溶液又は懸濁液が挙げられる。溶液又は懸濁液は、エンベロープウイルスと適合し、標的細胞へのウイルスの侵入を妨げない添加剤を含んでもよい。全ての場合において、形態は滅菌されなければならず、容易に注射可能な程度に流動性でなければならない。形態は、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。適当な溶液の例は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)等の緩衝液である。
【００９３】
本発明はまた、上記に記載されている医薬組成物の治療有効量を患者に投与する工程を含む、筋疾患を治療するための方法も提供する。シンシチンで偽型化されたLVのより低い免疫原性は、該医薬組成物の反復投与によって再生筋組織由来の細胞での長期の遺伝子発現を可能にすると予想される。
【００９４】
本明細書で使用される場合、用語「患者」又は「個体」は哺乳類を意味する。好ましくは、本発明による患者又は個体はヒトである。
【００９５】
本発明の医薬組成物、特に、シンシチンが表面に提示された以前に定義されている粒子、及び更により好ましくは、目的とする遺伝子を含む目的とする薬物をパッケージングするシンシチンで偽型化されたレンチウイルス粒子を含む組成物は、一般的に、既知の手順に従って、患者において治療効果を誘導するために有効な投与量及び期間で投与される。
【００９６】
投与は、注射、経口又は局所投与によってもよい。注射は、皮下(SC)、筋肉内(IM)、静脈内(IV)、腹腔内(IP)、皮内(ID)、又はその他であってもよい。好ましくは、投与は注射による。好ましくは、注射は筋肉内である。
【００９７】
本発明はまた、上記に記載したように、シンシチンタンパク質に結合した筋疾患に特異的な目的とする薬物を含み、目的とする遺伝子を含む目的とする薬物が、上記に記載したように、筋細胞で特異的に又は主に発現される筋疾患に関与する遺伝子又は遺伝子産物(タンパク質/ペプチド)を標的とする、再生筋組織を標的とする医薬組成物にも関する。
【００９８】
いくつかの好ましい実施形態において、医薬組成物は、筋疾患の遺伝子療法のための目的とする遺伝子を含む。好ましくは、目的とする遺伝子は、例えば:ジストロフィン異常症、肢帯型筋ジストロフィー、例えば、サルコグリカン異常症、カルパイノパチー及びジスフェリノパチー等、エメリー-ドレフュス型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、眼咽頭型筋ジストロフィー、ネスプリン-1、ネスプリン-2及びLUMA関連筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSDH;1型及び2型)、全身性リポジストロフィーを伴う筋ジストロフィー、先天性グリコシル化障害Io型を伴う筋ジストロフィー、肩甲腓骨型筋ジストロフィー及び首下がり症候群、並びに先天性筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィー;遠位型ミオパチー;筋原線維性ミオパチー;その他のミオパチー;筋強直症候群;家族性周期性四肢麻痺等のイオンチャネル筋疾患;悪性高熱症;ネマリンミオパチー、コアミオパチー及び中心核ミオパチーを含む先天性ミオパチー;ミトコンドリアミオパチー;ポンペ病、コリ病、マッカードル病、垂井病、赤血球アルドラーゼ欠損症、GSD XIII型、GSD XV型等の糖原病及び脂質蓄積病を含む代謝性ミオパチー;先天性筋無力症候群;シャルコー-マリー-トゥース病、例えばシャルコー-マリー-トゥースニューロパチー型4B1、及び筋萎縮性側索硬化症(ALS)等の神経原性ミオパチー;脂質蓄積病;遺伝性心筋症;神経筋障害を含む群から特に選択される、筋組織に影響を与える遺伝子疾患に関与する遺伝子を標的とする。
【００９９】
筋肉の遺伝子疾患に関与する標的遺伝子は、DMD、MYOT、LMNA、CAV3、DES、DNAJB6、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、CAPN3、DYSF、TCAP、TRIM32、FKRP、POMT1、FKTN、POMGNT1、POMT2、ANO5、TTN、PLEC、EMD、FHL1、LMNA、SMN1、SMN2、PABPN1、NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KBTBD13、KLHL40、KLHL41、RYR1、SEPN1、KBTKD13、MTM1、DUX4、FRG1及びMTMR2、グリコーゲン合成酵素遺伝子(GYS1)、酸アルファ-グルコシダーゼ遺伝子(GAA)、グリコーゲン脱分枝酵素(AGL)、筋グリコーゲンホスホリラーゼ(PYGM)、筋ホスホフルクトキナーゼPKFM、アルドラーゼA遺伝子(ALDOA)、β-エノラーゼ遺伝子(ENO3)、グリコゲニン-1(GYG1)遺伝子を含む群から選択されてもよく、とりわけ標的遺伝子は、筋肉で特異的に又は主に発現される遺伝子、例えば、限定されるものではないが、DMD、MYOT、CAV3、DES、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、CAPN3、DYSF、TCAP、POMT1、POMGNT1、POMT2、ANO5、FKTN、FKRP、TTN、EMD、FHL1、NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KHL40、KHL41、RYR1、MTM1、SEPN1、筋グリコーゲンホスホリラーゼ(PYGM)、筋ホスホフルクトキナーゼPKFM等から選択されてもよい。目的とする遺伝子は、上記に記載したように、遺伝子置換又は遺伝子編集による前記遺伝子疾患の遺伝子療法に適している。
【０１００】
いくつかの他の好ましい実施形態において、医薬組成物は、筋肉病原体の必須遺伝子を標的とする目的とする遺伝子を含む。病原体は旋毛虫属種、エンテロウイルス、例えばコクサッキーウイルス等、A型及びB型インフルエンザウイルス、黄色ブドウ球菌、カンジダ属種等を含む群から選択されてもよい(様々な筋肉病原体の概説については、Crum-Cianflone NF. Bacterial, Fungal, Parasitic, and Viral Myositis. Clinical Microbiology Reviews. 2008;21(3):473〜494頁を参照のこと)。
【０１０１】
様々な実施形態において、医薬組成物は好ましくは、シンシチンが表面に提示された粒子、及び更により好ましくは、再生筋組織で発現される遺伝子を特異的に標的とすることによる筋疾患の遺伝子療法のための目的とする遺伝子をパッケージングする、シンシチンで偽型化されたレンチウイルス粒子を含む。
【０１０２】
本発明の実施は、特に指示のない限り、当業者の技能の範囲内である従来の手法を使用する。そのような手法は、文献で十分に説明されている。
【０１０３】
様々な実施形態において、ウイルス粒子、特にウイルスベクター粒子、及びウイルス様粒子は、標準的な組換えDNA技術法を使用して作製することができる。
【０１０４】
特に、本発明における使用のための目的とする異種遺伝子を含む安定な偽型化レンチウイルス粒子は、以下の工程:
a)少なくとも1つのプラスミドが、目的とする異種遺伝子、レトロウイルスrev、gag及びpol遺伝子、及びERVシンシチンをコードする核酸を含む、前記少なくとも1つのプラスミドを適当な細胞株にトランスフェクトする工程と;
b)a)で得られたトランスフェクト細胞が、それぞれERVシンシチンで偽型化され、及び目的とする異種遺伝子をパッケージングする安定なレンチウイルス粒子を産生するように、該細胞をインキュベートする工程と;
c)b)で得られた安定なレンチウイルス粒子を回収し、濃縮する工程と
を含む方法によって得ることができる。
【０１０５】
該方法により、目的とする異種遺伝子を含む安定な偽型化レンチウイルス粒子の高い物理的力価、及び高い感染力価が得られるようになる。好ましくは、方法の工程c)は、工程b)で産生された安定なレンチウイルス粒子を上清から回収、濃縮及び/又は精製する工程を含む。故に、好ましくは、工程c)の濃縮は、b)で得られた回収された安定なレンチウイルス粒子を遠心分離及び/又は精製する工程を含む。前記回収は、当技術分野で周知の方法に従って行うことができる。好ましくは、レンチウイルスベクターは、トランスフェクト細胞の融合前に、より好ましくはトランスフェクション後20時間〜72時間の間、好ましくは24時間後に回収される。好ましくは、回収工程は、好ましくはトランスフェクション後20〜72時間の間、好ましくはトランスフェクション後20〜30時間の間、より好ましくは24時間後に実施される、単回のレンチウイルス回収からなる。
【０１０６】
工程a)では、適当な細胞株が、少なくとも1つのプラスミドでトランスフェクトされる。好ましくは、トランスフェクションは、一過性のトランスフェクションである。好ましくは、適当な細胞株は、少なくとも1つ、2つ、3つ又は4つのプラスミドでトランスフェクトされる。これらの細胞タイプには、レンチウイルスの生活環を支持する任意の真核細胞が挙げられる。好ましくは、適当な細胞株は、粒子を産生する間増殖し続けるように、安定な細胞株、又はシンシチンの膜融合効果の破壊的結果に不応性の細胞株である。前記適当な細胞株は、哺乳類細胞株、好ましくはヒト細胞株である。そのような細胞の代表的な例には、ヒト胎児腎臓(HEK)293細胞及びその誘導体、HEK293 T細胞、並びに接着細胞として増殖する能力について選択された、又は無血清条件下の懸濁液で増殖するように適合した細胞のサブセットが挙げられる。そのような細胞は、高度にトランスフェクト可能である。
【０１０７】
適当な細胞株は、目的とする異種遺伝子、レトロウイルスrev、gag及びpol遺伝子、並びに好ましくは誘導型でHERV-W、HERV-FRD又はマウスシンシチンA等のERVシンシチンをコードする核酸である5つの配列の少なくとも1つ、及び多くて4つを既に発現していてもよい。そのような場合、工程a)は、前記細胞株で既に発現されていない少なくとも1つの配列を含む少なくとも1つのプラスミドで前記細胞株をトランスフェクトする工程を含む。プラスミド混合物、又は単一のプラスミド(1つのみのプラスミドが使用されるならば)は、工程a)で前記細胞株にトランスフェクトされる場合、前記細胞株が5つの上記の配列全てを発現するように選択される。例えば、適当な細胞株が、レトロウイルスrev、gag及びpol遺伝子を発現するならば、トランスフェクトされるプラスミド又はプラスミドの混合物は、発現される残りの配列、すなわち、目的とする異種遺伝子及びHERV-W、HERV-FRD又はマウスシンシチンA等のERVシンシチンをコードする核酸を含む。
【０１０８】
1つのプラスミドが使用される場合、該プラスミドは、5つの目的とする配列全て、すなわち:
- 目的とする異種遺伝子、
- rev、gag及びpol遺伝子、並びに
- 以前に記載されているERVシンシチンをコードする、及びとりわけHERV-W、HERV-FRD又はマウスシンシチンAをコードする核酸
を含む。
【０１０９】
2つ又は3つのプラスミドが使用される場合(プラスミド混合物)、プラスミド混合物が上記の目的とする配列全てを含むように、それらの各々は、前段落にリストされた目的とする配列のいくつかを含む。
【０１１０】
好ましくは4つのプラスミドが使用され、四重トランスフェクションは以下を含む:
- 第1のプラスミドは目的とする遺伝子を含み、
- 第2のプラスミドはrev遺伝子含み、
- 第3のプラスミドは、gag及びpol遺伝子を含み、並びに
- 第4のプラスミドは、以前に記載されているERVシンシチンをコードする、及びとりわけHERV-W、HERV-FRD又はマウスシンシチンAをコードする核酸を含む。
【０１１１】
前記四重トランスフェクションは、好ましくは、4つのプラスミド間の特定の比で行われる。異なるプラスミド間のモル比は、産生のスケールアップを最適化するために適合され得る。当業者は、目的とするレンチウイルスを作製するために使用する特異的プラスミドに、このパラメーターを適合させることができる。特に、第1、第2、第3、第4のプラスミドの質量比は、好ましくは(0.8〜1.2):(0.1〜0.4):(0.5〜0.8):(0.8〜1.2)、より好ましくはおよそ1:0.25:0.65:0.9である。
【０１１２】
rev、gag及びpol遺伝子は、レトロウイルス、好ましくはレンチウイルスである。好ましくは、これらはHIV遺伝子、好ましくはHIV-1遺伝子であるが、EIAV(ウマ伝染性貧血ウイルス)、SIV(サル免疫不全ウイルス)、泡沫状ウイルス、又はMLV(マウス白血病ウイルス)ウイルス遺伝子でもあってもよい。
【０１１３】
以前に定義され、及びより優先的にはHERV-W、HERV-FRD又はマウスシンシチンAをコードするERVシンシチン等のERVシンシチンをコードする核酸は、DNA又はcDNA  配列である。好ましくは、該核酸は、配列番号1、2若しくは3にそれぞれリストされたcDNA配列、又はそのような配列番号1、2、若しくは3と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも99%の同一性をそれぞれ示す配列に対応する。好ましくは、工程a)は、配列番号5又は6にリストされたcDNA配列を含む、好ましくは該配列からなる少なくともプラスミドのトランスフェクションを含む。
【０１１４】
用語「同一性」は、2つのポリペプチド分子間、又は2つの核酸分子間の配列類似性を指す。比較される両方の配列中の位置が、同じ塩基又は同じアミノ酸残基によって占められる場合、それぞれの分子はその位置において同一である。2つの配列間の同一性のパーセンテージは、2つの配列によって共有される一致する位置の数を、比較される位置の数で割り、100を掛けたものに相当する。一般的に、比較は、2つの配列が最大の同一性を与えるように整列されるときになされる。同一性は、例えば、GCG(Genetics Computer Group社、GCGパッケージ用プログラムマニュアル、バージョン7、マジソン、ウィスコンシン)パイルアッププログラム、又はBLAST、FASTA又はCLUSTALW等の配列比較アルゴリズムのいずれかを使用するアライメントによって計算することができる。
【０１１５】
使用され得るエンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドは、例えば、市販のpCDNA3バックボーン、又は類似の発現系を使用する、例えばCMVプロモーターを使用する任意の他のプラスミドカセット、例えばMertenら(Human gene therapy、2011、22、343〜356頁)に記載されたpKGプラスミド等、当業者に公知である。
【０１１６】
工程a)に従って、当技術分野で公知の様々な手法が細胞への核酸分子の導入に使用され得る。そのような手法には、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー等の化合物を使用して化学的に促進されるトランスフェクション、リポフェクタミン(リポフェクタミン2000又は3000)、ポリエチレンイミン(PEI)のようなカチオン性リポソーム等のリポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、粒子銃又はマイクロインジェクション等の非化学的方法が挙げられる。工程a)のトランスフェクションは、好ましくは、リン酸カルシウムを使用して実施される。
【０１１７】
典型的には、工程a)は、リン酸カルシウムの存在下で4つのプラスミド(四重トランスフェクション)を用いた293T細胞の一過性のトランスフェクションによって行うことができる。4つのプラスミドは、好ましくは: HIV-1 gag及びpol遺伝子を発現するpKLプラスミド、HIV-1 rev遺伝子を発現するpKプラスミド、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター等の細胞性プロモーターの制御下で目的とする異種遺伝子を発現するpCCLプラスミド、並びに以前に定義され、及びより優先的にはHERV-W(シンシチン1)、HERV-FRD(シンシチン2)又はマウスシンシチンA(シンシチンA)若しくはシンシチンB(シンシチンB)糖タンパク質をCMVプロモーターから発現するERVシンシチン等のERVシンシチンを発現するpCDNA3プラスミドである。
【０１１８】
次いで、工程a)後、方法は、a)で得られたトランスフェクト細胞が、以前に定義され、及びより優先的にはHERV-W、HERV-FRD又はマウスシンシチンAで偽型化されたERVシンシチン等のERVシンシチンで偽型化された、目的とする異種遺伝子を含むレンチウイルス粒子を好ましくは上清で産生するように、該細胞をインキュベートする工程b)工程を含む。実際、工程a)が行われたら、得られた細胞のインキュベーションが行われる。これにより、以前に定義され、及びより優先的にはHERV-W、HERV-FRD又はマウスシンシチンAで偽型化されたERVシンシチン等のERVシンシチンで偽型化され、並びに目的とする異種遺伝子を含む、安定なレンチウイルス粒子の上清での産生がもたらされる。
【０１１９】
トランスフェクション後、トランスフェクト細胞は故に、トランスフェクション後20〜72時間の間、特に24時間後に含まれ得る時間にわたって増殖される。
【０１２０】
細胞を培養するために使用される培地は、グルコース等の糖を含むDMEM等の古典的培地であってもよい。好ましくは、培地は無血清培地である。培養は、懸濁液での細胞の培養に適合したマルチスタックシステム又はバイオリアクター等のいくつかの培養装置で実施されてもよい。バイオリアクターは、単回使用(使い捨て)又は再利用可能なバイオリアクターであってもよい。バイオリアクターは、例えば、培養容器又はバッグ及びタンクリアクターから選択されてもよい。非限定的な代表的なバイオリアクターには、ガラスバイオリアクター(例えばB-DCU(登録商標)2L-10L、Sartorius社)、ウェーブバイオリアクター等のロッキングモーション攪拌を利用する単回使用バイオリアクター(例えばCultibag RM(登録商標)10L-25L、Sartorius社)、単回使用攪拌タンクバイオリアクター(Cultibag STR(登録商標)50L、Sartorius社)、又はステンレススチールタンクバイオリアクターが挙げられる。
【０１２１】
インキュベーション後、得られた安定なレンチウイルス粒子は、回収され、濃縮される;これが工程c)である。好ましくは、b)で得られた安定なレンチウイルス粒子は、トランスフェクト細胞の融合前に、より好ましくはトランスフェクション後24時間で回収される。好ましくは、b)で得られた上清に存在する安定なレンチウイルス粒子は、遠心分離され及び/又は精製される。前記濃縮工程c)は、遠心分離、限外濾過/透析及び/又はクロマトグラフィー等の当技術分野で任意の公知の方法によって行うことができる。
【０１２２】
上清は、安定な偽型化ウイルス粒子の遠心分離物を得るために、40000〜60000gの間に含まれる速度で、1時間〜3時間、1℃〜5℃の間に含まれる温度で遠心分離され得る。好ましくは、遠心分離は、45000〜55000gの速度で、1時間30分〜2時間30分、2℃〜5℃、好ましくはおよそ4℃の温度で行われる。この工程の最後に、粒子は遠心分離物の形態で濃縮され、これが使用され得る。
【０１２３】
工程c)は、陰イオン交換クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーであってもよい。陰イオン交換クロマトグラフィーは、限外濾過、特に接線流濾過を含む限外濾過/透析の工程に先行又は後行することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、例えば弱陰イオン交換クロマトグラフィー(DEAE(D)-ジエチルアミノエチル、PI-ポリエチレンイミンを含む)である。
【実施例１】
【０１２４】
安定な及び感染性のLV-SynA粒子の作製
材料及び方法
細胞株
ヒト胎児腎臓293T細胞を、10%の熱不活性化ウシ胎仔血清(FCS)(Life Technologies社)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM+グルタマックス)(Life Technologies社、サントーバン、フランス)で、37℃、5% CO2で培養した。
【０１２５】
シンシチンAのクローニング及びLV-Syn Aの作製。
a. マウスシンシチンAを発現するプラスミドの生成。
マウスシンシチンA cDNAを、標準的な手法を使用してpCDNA3プラスミドにクローニングした。
b. Syn-A偽型化レンチウイルスベクターの作製。
HEK293T細胞を、リン酸カルシウムを使用して以下の4つのプラスミド(フラスコあたりの量)で同時トランスフェクトした: HIV-1 gagpol遺伝子を発現するpKLgagpol(14.6μg)、HIV-1 rev配列(5.6μg)、pcDNA3.1SynA(20μg)を発現するpKRev、及び遺伝子導入プラスミド(22.5μg)。LV-SA-Luc2は、脾フォーカス形成ウイルス(SFFV)プロモーターの制御下でルシフェラーゼ2導入遺伝子を発現する遺伝子導入プラスミドPRRL-SFFV LucIIを使用して作製した。LV-SA U7mex23は、以前に記載されている構築物(Goyenvalleら  Science、2004、3;306(5702):1796〜9頁)から得られたU7プロモーターの制御下でmex23アンチセンス配列をコードする遺伝子導入ベクターを使用して作製した。24時間後、細胞を洗浄し、新鮮な培地追加した。翌日、培地を回収し、遠心分離1500rpm、5分間によって清澄化し、0.45μm濾過し、次いで超遠心分離50000gによって12℃、2時間濃縮し、使用されるまで-80℃で保管した。
c. シンシチンA偽型化LVの滴定
物理的力価をp24 ELISA(Alliance(著作権)HIV-1 Elisaキット、Perkin-Elmer社、ヴィルボン/イヴェット、フランス)によって決定し、その後、他のタイプのLVについて以前に報告されているように(Charrierら、Gene therapy、2011、18、479〜487頁)、p24の1fgがLVの12ppに相当すると仮定して(Farsonら、Hum Gene Tuer. 2001、20、981〜97頁)、物理的粒子(pp)としての力価を計算した。感染性力価を、マウスリンパ腫細胞株A20を使用して感染性ゲノム力価(IG/mL)として決定した。ベクターの連続希釈物を、ベクトフシン-1(登録商標)(12μg/μL)の存在下でA20細胞に6時間添加した。培地を新しくし、細胞を7日間インキュベートし、ゲノムDNAを得て、プライマー: PSIフォワード5'CAGGACTCGGCTTGCTGAAG3'(配列番号7)、PSIリバース5'TCCCCCGCTTAATACTGACG3'(配列番号8)、及びFAM(6-カルボキシフルオレセイン)で標識したPSIプローブ5'CGCACGGCAAGAGGCGAGG3'(配列番号9)、Titinフォワード5'AAAACGAGCAGTGACGTGAGC3'(配列番号10)、Titinリバース5'TTCAGTCATGCTGCTAGCGC3'(配列番号11)、及びVICで標識したTitinプローブ5'TGCACGGAAGCGTCTCGTCTCAGTC3'(配列番号12)を用いたiCycler 7900HT(Applied Biosystems社)での二本鎖qPCRを使用して細胞あたりのベクターコピー数を測定する。
【０１２６】
結果
マウスシンシチンを、インビボ適用のためのHIV-1由来LVに対する可能性のある新たな偽型として調査した。シンシチンAは、ヒトシンシチン1及び2の非オルソログであるが、機能的に類似したマウスの対応物である(Dupressoirら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、2005、102、725〜730頁)。
【０１２７】
マウスSynAを発現プラスミドにクローニングし、293T細胞でレンチウイルスベクター粒子を産生するのに使用した。シンシチンAは、rHIV由来LVを成功裡に偽型化できることが見出された。トランスフェクション工程に向けたシンシチンAプラスミドの量の最適化により、培地のp24レベルに基づきLV粒子の産生が増加した。定義した条件(プレートあたり20μg DNA、1回の回収のみ;材料及び方法を参照のこと)で、マウスシンシチンで偽型化された安定な及び感染性の粒子を作製することが可能であった。このエンベロープで偽型化されたレンチウイルス粒子は、VSVg偽型化粒子(Charrierら、Gene therapy、2011、18、479〜487頁)に使用されるのと同じ条件を使用して、超遠心分離によって成功裡に濃縮することができた。濃縮ストックを-80℃で凍結保存し、数カ月間にわたり安定であった。LV-Syn Aは、ベクトフシン-1(VF1)の存在下でマウスA20 Bリンパ腫細胞株を形質導入するのに極めて効率が良かった。A20細胞株を使用して、シンシチンA偽型化LVの感染性力価を生成する。
【実施例２】
【０１２８】
LV-SynA粒子を使用した再生骨格筋へのインビボでの遺伝子送達
材料及び方法
動物
6〜8週齢のオスC57/Bl6マウスを実験に使用し、Charles River社から購入した。4〜5.5週齢のオスmdxマウスをGenethon繁殖コロニーから入手した。アルファサルコグリカンが欠損している6週齢sgca-/-マウスを、Genethon繁殖コロニーから入手した。マウスは、25μL容量を使用して前脛骨筋(TA)に注射した。ルシフェラーゼベクターを注射したマウスを異なる時点で生物発光によって分析し、屠殺した。核内低分子RNA mex23発現ベクターを注射したマウスを分析のために屠殺した。右及び左前脛骨筋(TA)筋肉を屠殺後取り出した。qPCR及びRT-PCRを凍結TA筋肉の一部で行った。ミクロトームスライス及び免疫組織染色を行うために、TA筋肉の他の部分を固定し、パラフィンに包埋した。
【０１２９】
インビボでのルシフェラーゼイメージング
C57BL/6マウスをケタミン(120mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)により麻酔し、100μL(150μg/mL)のD-ルシフェリン(Interchim社、参照番号FP-M1224D)を腹腔内投与し、10分後にCCDカメラISO14N4191(IVIS Lumina、Xenogen社、MA、USA)で撮像した。10cm視野、ビニング(解像度)係数4、1/fストップ及びオープンフィルターを使用して、3分間の生物発光画像を得た。関心領域(ROI)を手動で定義し(どの場合も標準的な面積を使用)、リビングイメージ3.2ソフトウェア(Xenogen社)を使用してシグナル強度を計算し、1秒あたりの光子として表した。バックグラウンド光子束を、ベクターを投与しなかった右前脛骨筋(TA-R)に描かれたROIから定義した。
【０１３０】
qPCR
Wizard(登録商標)ゲノムDNA Purification Kit(Promega社、参照番号A1125)を使用して、ゲノムDNAを細胞から抽出した。TitinMex5を正規化遺伝子として用いて、多重qPCRをPSIプロウイルス配列又はWPREプロウイルス配列のどちらかで行った。以下のプライマー及びプローブを0.1μMの濃度で使用した:
【０１３１】
【表２】
2021501137.tif 000003
【０１３２】
【表３】
2021501137.tif 000004
【０１３３】
【表４】
2021501137.tif 000005
【０１３４】
使用するqPCRミックスは、ABsolute qPCR ROXミックス(Thermo Scientific社、参照番号CM-205/A)である。分析は、SDS 2.4ソフトウェアを用いてiCycler 7900HT(Applied Biosystems社)で行う。
【０１３５】
PCR
組み込まれたレンチウイルスベクターで、以下のプライマーを使用して0.1μMの濃度でPCRを行った: Psi-F: AGCCTCAATAAAGCTTGCC(配列番号20)、及びRRE-R:TCTGATCCTGTCGTAAGGG(配列番号21)。
【０１３６】
筋肉切片の免疫組織染色
マウス筋肉を、パラフィン包埋する前に少なくとも2時間、10%ホルムアルデヒド(VWR社)を含むホルマリン溶液で固定する。筋肉のミクロトーム切片(4μm)を、次いで、一次抗体として1/100で希釈したポリクロナール抗体抗ルシフェラーゼ(Promega社、参照番号G7451)、及び二次抗体として1/1000で希釈したロバ抗ヤギAlexaFluor 594(Invitrogen社、参照番号A11058)で染色する。一次抗体を湿度チャンバーで4℃、一晩インキュベートし、二次抗体を湿度チャンバーで2時間インキュベートする。
【０１３７】
ジストロフィンエクソンスキッピングの検出
全RNAを、TRIzol試薬(Life Technologies社)を使用してプールした中間筋肉切片から単離した。ジストロフィンmRNAを検出するために、アクセスRT-PCRシステム(Promega社)を使用してネステッドRT-PCRを200ngの全RNAで実施した。最初の反応は、Ex20ext(5'-CAGAATTCTGCCAATTGATGAG-3'、配列番号16)及びEx26ext(5'-TTCTTCAGCTTGTGTCATCC-3'、配列番号17)プライマーを用いて30サイクル(94℃/30秒;55℃/1分;72℃2分)行った。次いで2μLの最初の反応物を、Ex20int(5'-CCCAGTCTACCACCCTATCAGAGC-3'、配列番号18)及びEx26int(5'-CCTGGCTTTAAGGCTTCCTT-3'、配列番号19)を用いて23サイクル増幅した。PCR産物を2%アガロースゲルで分析した。
【０１３８】
統計分析(ルシフェラーゼ及びqPCR実験)
全体試験で、マンホイットニー両側分析を使用して2つの実験群間の比較を行った。0.05未満のP値を統計的に有意とみなした。
【０１３９】
結果
目的は、シンシチンAで偽型化されたLVは再生筋肉の筋線維に侵入できるが、定常状態の正常な筋肉には侵入できないのかどうかをテストすることであった。したがって、ジストロフィンが欠損している筋肉が恒常的な再生期にあることが知られているデュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデルである、ジストロフィンが欠損している若齢mdx(又はMDX)マウス(12週齢未満)を使用した。筋肉再生しているサルコグリカン欠損マウスも使用した。マウスシンシチンA糖タンパク質を、いくつかの導入遺伝子配列、すなわち、生物発光による導入遺伝子発現の検出を容易にするためのルシフェラーゼLucII(又はLuc2)、又は機能的効果を示すためのジストロフィンエクソン23スキッピング(U7mex23)に対する小さなアンチセンス配列のいずれかをコードするHIV-1由来レンチウイルスベクターを偽型化するのに使用した。
【０１４０】
LucIIをコードするLV-SynAベクターを、オスmdxマウス又はC57BL/6アルビノ対照の前脛骨筋(TA)に筋肉内注射した。陽性対照として、LucIIをコードするrAAV2/8(AAV8カプシドにパッケージングされたAAV2ゲノム)の同じ容量を、同じ経路を使用して注射した。IM注射後マウスで得られる生物発光を経時的に調べるために、2つのプロトコールを行った。
【０１４１】
代表的な写真が示され、右及び左のTA筋肉の生物発光が各写真の下に示されている(図1)。結果は、LV-SynAにより、MDXマウスの筋肉で局所的に導入遺伝子発現が可能になるが、rAAV2/8とは対照的にC57Bl/6対照及びマウスの肝臓では可能にならないことを示している。注射後4週間でここに表された、LV-SynAを筋肉内注射したMDXマウスにおけるシグナルは、遺伝子導入が安定であり、マウスによる忍容性が良好であることを示している。シグナルは注射後6日目に目に見え始めた。これに対して、LV-SynAを筋肉内注射した正常なマウスで調べたいずれの時点においても、生物発光シグナルの証拠は観察されなかった。LV-SA-Luc2で得られたシグナルは、rAAV2/8-Luc2で得られたシグナルより低いが、rAAV2/8ベクターは、筋肉内注射された場合でも筋肉をはるかに越えて広まり、肝臓で高レベルで見出され、マウス肝臓に対するrAAV2/8の既知の指向性と一致した(Table I(表5))。
【０１４２】
【表５】
2021501137.tif 000006
【０１４３】
生物発光導入遺伝子ルシフェラーゼの発現を、肝臓及び右及び左前脛骨筋で定量化した。2つの異なるプロトコールでの平均値、SD、及びテストしたマウス数(n)。生物発光をベクターの注射4週間後に測定した。定量化は、最も高いシグナルによって検出された最大面積に基づき器官面積を定義するためのマスクを描いて行った。同じマスクを、同じプロトコールからの全てのマウスに適用した。(*)C57BL/6マウスとMDXマウスのLV-SynA注射筋肉間の統計的有意差(p=0.03)。
【０１４４】
生物発光シグナルがルシフェラーゼに起因し、炎症に起因しないことを確実にするため、及び筋肉中の導入遺伝子の存在を確認するために、免疫組織化学的検査を行ってルシフェラーゼの位置を特定した。図2は、ルシフェラーゼが、ベクターを注射したmdxマウスの筋肉の筋線維内部で見出されたことを示している。
【０１４５】
TAの生物発光シグナルを定量化した2つの実験の概要は、正常なC57Bl6マウスと比べて、有意により高いレベルのシグナルがLV-SAベクターを注射したmdxマウスで見出されることを示している(図3)。統計分析(マンホイットニー)は、LV-SA-Luc2で得られるシグナルがPBSで得られるシグナルより有意に高く(p=0.0009)、C57BL/6マウスよりmdxマウスで高いことを示した(p=0.03)。
【０１４６】
MDX及び正常なマウスの注射TA中のベクターコピー数もqPCRによって測定し(図4A及び図4C)、組み込まれたベクターの存在をより感度が高い古典的PCRによって検証した(図4B及び図4D)。結果は、シンシチンA偽型化LV(LV-SynA)の筋肉への直接注射は、正常なマウスには骨格筋組織の有意な形質導入をもたらさないが(C57Bl/6;図4A及び図4B)、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデルとなるMDXマウスでは有意な形質導入を可能にすることを確認するものである(図4C及び図4D)。
【０１４７】
これらの所見が別のジストロフィーマウスモデルにも当てはまり得ることを確認するために、ルシフェラーゼ遺伝子導入をアルファ-サルコグリカン欠損マウス(sgca-/-マウス)でテストした。7匹のsgca-/-マウス(6週齢)に、LV-SA Luc2ベクターを左TAに、別のベクターを右TAに注射した。8マウスを陰性対照として使用した。結果は、ルシフェラーゼベクターを注射した筋肉中の明確な生物発光シグナルを示した(図5及びTable II(表6))。
【０１４８】
【表６】
2021501137.tif 000007
【０１４９】
生物発光導入遺伝子ルシフェラーゼの発現を、左及び右前脛骨筋で定量化した。平均値、SD、及びテストしたマウス数(n)を2つの異なるプロトコールで得た。生物発光をベクターの注射2週間後に測定した。定量化は、最も高いシグナルによって検出された最大面積に基づき器官面積を定義するためのマスクを描いて行った。同じマスクを、同じプロトコールからの全てのマウスに適用した。マンホイットニーp値TAR vs TAL: p=0.0006。
【０１５０】
図6は、LV-SynAが、検出可能なレベルの導入遺伝子カセットをアルファ-サルコグリカン欠損マウス(sgca-/-マウス)の骨格筋に組み込むのに使用できることを示している。MDXマウスと同程度に、sgca-/-マウスは骨格筋組織の高い再生率を有する。これらのデータは、LV-SynAベクターは再生筋組織を優先的に形質導入するという概念を確認するものである。データはまた、LV-SynAベクターが1つを超えるジストロフィー疾患、ことによると、高レベルの骨格筋再生が生じている全てのジストロフィー疾患を治療するのに使用され得ることも示している。
【０１５１】
遺伝子導入が、可能性のある治療上の利益を有し得るかを決定するために、mdxマウスを使用して、Goyenvalleら(Science、2004、306(5702):1796〜9頁)によって既に報告されている構築物を使用するジストロフィンエクソンスキッピングを行った。核内低分子RNA mex23の発現は、mdxマウスで変異しているジストロフィン遺伝子のエクソン23のスキッピングを誘導し、わずかに切断されたジストロフィンの産生を可能にするアンチセンス配列であった。シンシチンAで偽型化され、U7プロモーターから発現されるmex23アンチセンス配列をコードするレンチウイルスベクター(LV-SA U7mex23)を生成した。対照として、本発明者らは、U7由来アンチセンスmex23配列をコードする、既に記載されているAAV1ベクター(Goyenvalleら  Science 2004)を使用した。ベクターを左TAでmdxマウスに注射した。対照として、右TAにPBS又はLuc2をコードするベクターを注射した。図7は、mdxマウスへのLV-SA U7mex23の注射2週間後、エクソン23スキップジストロフィンRNAに対応する688bp配列の存在を注射した筋肉で検出することができ、対照筋肉では検出できなかったことを示している。LV-SAベクターは、rAAVより効率的でないように思われるが、ベクター用量及び検出のタイミングを最適化するために更なる実験が必要である。
【実施例３】
【０１５２】
安定な形質導入及び免疫原性の低下が、LV-VSVgとは対照的にLV-SynA粒子で得られる。
材料及び方法
遺伝子導入によって誘導される導入遺伝子特異的T細胞免疫応答を測定するELISPOT
導入遺伝子特異的免疫応答を測定するために、本発明者らは以前に記載されたGFP-HY導入遺伝子(Cireら  Plos One 2014 PLoS One. 2014年7月24日;9(7):e101644. doi: 10.1371/journal.pone.0101644. eCollection 2014)をコードするレンチウイルスベクターを使用した。赤血球枯渇脾臓細胞の細胞懸濁液をマウスの屠殺後に得た。1μMのDby又はUtyペプチドを含む又は含まない1ウェルあたり106脾臓細胞をIFN-γ酵素結合免疫スポットプレート(MAHAS45、Millipore社、モルスアイム、フランス)で培養して、IFN-γ酵素結合免疫スポットアッセイ(ELISPOT)を行った。陽性対照として、細胞をコンカナバリンA(Sigma社、リヨン、フランス)(5μg/ml)で刺激した。+37℃での培養の24時間後、プレートを洗浄し、ビオチニル化抗IFNγ抗体(eBiosciences社)、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ(Roche Diagnostics社、マンハイム、ドイツ)、及びBCIP/NBT(Mabtech社、レジュリス、フランス)を用いてIFNγの分泌を明らかにした。スポットを、AIDリーダー(Cepheid Benelux社、ルーヴェン、ベルギー)及びAID ELISpot Reader v6.0ソフトウェアを使用してカウントした。スポット形成単位(SFU)は、非パルス脾臓細胞で得られたバックグラウンド値を差し引いた後に表される。
【０１５３】
遺伝子導入後、導入遺伝子特異的免疫応答によって誘導されるサイトカインを滴定するためのサイトメトリービーズアレイ(CBA)
刺激培地[培地、UTY(2μg/mL)、DBY(2μg/mL)、又はコンカナバリンA(5μg /mL)]を播種し、106脾臓細胞/ウェルを添加した。+37℃での培養の36時間後、上清を滴定まで-80℃で凍結した。サイトメトリービーズアレイを、BD Biosciencesフレックスキット(IL-6、IFN-γ、TNFα、及びRANTES)を用いて行った。簡単には、明確に異なる蛍光強度を有し、サイトカイン特異的捕捉抗体でコーティングされた捕捉ビーズ集団を一緒に混合した。次に、ビーズのビーズミックス25μLを分配し、及び25μLの各試料(上清)を添加した。室温でのインキュベーションの1時間後、サイトカイン特異的PE抗体を一緒に混合し、このミックス25μLを添加した。室温でのインキュベーションの1時間後、ビーズを1mLの洗浄緩衝液で洗浄し、データをLSRIIフローサイトメーターで取得した。
【０１５４】
結果
LV-SynA粒子の安定な形質導入及び免疫原性の低下が、LV-VSVgによる比較アッセイで実証された。
【０１５５】
結果は、LV-SynAがMDX筋肉に長期の及び安定な遺伝子導入をもたらすのに対し、VSVg等の他のエンベロープで偽型化されたLVは一時的な発現のみをもたらし、シグナルは経時的に低下することを示している(図8)。更に、図8は、LV-SynAが、いずれの時点においても正常な骨格筋組織を形質導入できないことを確認するものである。図8は、サテライト細胞等のおそらく長期筋前駆細胞が、MDXマウスに形質導入されることを示唆している。安定な導入遺伝子発現は、sgca-/-マウス及びMDXマウスでのLV-SynAベクターの筋肉内送達後でも観察された(図9)。MDXマウスのデータは、図8で既に示されたデータを確認するものである。LV-SynAベクターは、MDXマウスに筋肉内注射される場合、導入遺伝子特異的免疫応答をあまり誘導しなかったことから、LV-VSVgベクターより免疫原性が少ない(図10)。LV-VSVgベクターは、ELISPOT-IFNg(図10A及び図10B)及び組織へのCD3+ T細胞の浸潤レベル(図10D)によって測定される、強い導入遺伝子特異的CD4及びCD8 T細胞応答を誘導する。LV-SynAベクターで得られる免疫応答の低下は、組織における組み込まれたベクターレベルがより高いと解釈される(図10B及び図10C)。
【０１５６】
LV-VSVgベクターと比べたLV-SynAベクターの免疫原性の低下は、全身投与後にも観察された(図11)。LV-VSVgと比べて、より低いレベルの導入遺伝子特異的CD4及びCD8 T細胞応答(図11A)、並びにより低いレベルのサイトカイン(図11B)が、正常なマウスへのLV-SynAベクターの静脈内注射後に観察される。
【実施例４】
【０１５７】
LV-SynA粒子を使用した再生骨格筋への治療的遺伝子のインビボでの遺伝子送達
材料及び方法
qPCR
AAVでのqPCR AAVを、実施例2に記載したプロトコールに従って、以下のプライマー及びプローブを使用して決定した:
AAV-フォワオード: CCAGGCGAGGAGAAACCA(配列番号22)
AAV-リバース: CTTGACTCCACTCAGTTCTCTTGCT(配列番号23)
AAV-プローブ: CTCGCCGTAAAACATGGAAGGAACACTTC(配列番号24)。
【０１５８】
マウスにおける遺伝子導入後のヒトアルファ-サルコグリカンmRNAの定量化
組織の凍結及び切片化後、全RNAをテストしたマウスの前脛骨筋(TA)筋肉から抽出し、凍結組織切片からRNAをTrizol(Invitrogen社)で抽出した。RNAを25μl  無RNアーゼ水に溶出し、Free DNAキット(Ambion社)で処理して残留DNAを除去した。試料ごとに抽出した全RNAを、Nanodrop分光光度計(ND8000 Labtech社、ウィルミントン、デラウェア)を使用して定量化した。
【０１５９】
アルファ-サルコグリカン発現の定量化のために、SuperScript II第1鎖合成キット(Invitrogen社)及びランダムオリゴヌクレオチドとオリゴdTの混合物を使用して、RNA 1μgを逆転写した。プロトコールAbsolute QPCR Rox Mix(ABgene社)に従って、各プライマー0.2μM及びプローブ0.1μMを用いるLightCycler480(Roche社)を使用してリアルタイムPCRを行った。ヒトα-サルコグリカン増幅に使用したプライマー対及びTaqmanプローブは: 920hasarco. F: 5'-TGCTGGCCTATGTCATGTGC-3'(配列番号25)、991hasarco.R: 5'-TCTGGATGTCGGAGGTAGCC-3'(配列番号26)、及び946hasarco.P: 5'-CGGGAGGGAAGGCTGAAGAGAGACC-3'(配列番号27)であった。広範なacidic ribosomal phosphoprotein(P0)を使用して試料間でデータを正規化した。P0増幅に使用したプライマー対及びTaqmanプローブは: m181P0.F(5'-CTCCAAGCAGATGCAGCAGA-3';(配列番号28))、m267P0.R(5'-ACCATGATGCGCAAGGCCAT-3';(配列番号29))、及びm225P0.P(5'-CCGTGGTGCTGATGGGCAAGAA-3';(配列番号30))であった。結果を、式:相対的存在量=2^-ΔΔCt(ΔCt=Ct hasarco-Ct P0、及びΔΔCt=ΔCt試料-ΔCt検量用試料)を使用して倍変化で表す。
【０１６０】
結果
LV-syn2ベクターを使用する治療的遺伝子の遺伝子導入を達成する可能性が、肢帯型筋ジストロフィーのモデルであるsgca-/-マウスにおいてヒトアルファサルコグリカンを用いて実証された(図12)。
【０１６１】
結果は、ベクターの反復投与により、組み込まれたベクターのレベルを増加させ(図12A及び図12C)、導入遺伝子発現レベルを増加させる(図12B)ことができることを示している。用量を増加させるように再注射する可能性は、LV-SynA投与後に導入遺伝子に対して得られる低免疫応答による可能性がある。
【０１６２】
図12は、LV-SynAベクターが、rAAVベクターと比べて筋組織でより低いレベルのコピー及びより低いレベルの導入遺伝子発現を達成することを示している。しかし、LV及びrAAVは異なる特徴を有し、異なる分子機構を使用する。エピソーム性のままであるrAAVとは対照的に、LV-SynAベクターは、標的細胞のゲノムに安定に組み込まれることから持続性の点でより有利であり得る。LV-SynAベクターは、rAAVに対して血清陽性であるためこのベクターを受け取ることができない人を治療するのに使用され得る。LV-SynAはまた、LVの積載量がrAAVsの4.5Kbより大きい約10〜13Kbであることから、大きなサイズの導入遺伝子もパッケージングし得る。
【実施例５】
【０１６３】
再生筋肉の形質導入は、インビトロデータからは予測することができない
材料及び方法
マウス及びヒト筋芽細胞の形質導入及びフローサイトメトリーによる分析
C2C12マウス筋芽細胞株を、10%ウシ胎仔血清又は2%ウマ血清を補充したDMEM培地(Life Technologies社)で分化過程にわたって培養した。細胞の形質導入を、ベクトフシン(12μg/ml)の存在下、1mLあたり105又は5×105感染性ゲノムでLV-Syn A又はLV-VSVgベクターを用いて6時間行った。
【０１６４】
細胞死亡率及び形質導入効率を、3又は5日後にフローサイトメトリー(FACS LSRII、BD Biosciences社)を使用して、7-アミノ-アクチノマイシンD標識及びNGFR又はGFP発現の測定によりそれぞれ評価した。
【０１６５】
異なるヒト及びマウス細胞株並びにマウス初代細胞でのLy6e mRNA発現
異なるマウス細胞株(A20IIA、C2C12、NIH/3T3)、並びにC57BL/6マウスの肺、脾臓及び骨髄由来の全細胞からのmRNAを、Qiagen社製RNeasy(登録商標)ミニキットを使用して抽出した。Thermofischer社製Verso cDNA合成キットを使用して、mRNAの逆転写を行った。以下のプライマーを使用してcDNAでqPCRを行った: mLy6eフォワードプライマー5' CGGGCTTTGGGAATGTCAAC 3'(配列番号31)、mLy6eリバースプライマー5' GTGGGATACTGGCACGAAGT 3'(配列番号32)、POリバースプライマー5' CTCCAAGCAGATGCAGCAGA 3'(配列番号33)、及びPOフォワードプライマー5' ACCATGATGCGCAAGGCCAT 3'(配列番号34)。POはウェアハウス遺伝子(warehouse gene)として使用した。存在量を式存在量=2-ΔCtを用いて計算する。
【０１６６】
結果
筋芽細胞から筋管への分化のモデルとして一般的に使用されるマウス筋芽細胞であるC2C12細胞を、LV-SynA及びLV-VSVgベクターで形質導入した。複製筋芽細胞として培養した細胞がベクターに曝露した場合、LV-VSVg陽性対照のみが形質導入を達成した(図13A)。図13Bでは、筋管への分化の誘導後、異なる時点でのベクター、及び異なる用量のベクターに細胞を曝露した。LV-VSVg陽性対照のみが、テストしたどの時点においても形質導入を達成した(図13B)。図13は、再生筋肉の形質導入が、インビトロデータからは予測することができないことを実証している。図13は、全てのタイプの筋細胞をLv-Synベクターで形質導入できるわけではないという、図4に示されていることを更に確認するものである。マウスシンシチンAの受容体として報告されるmLy6eの発現レベル、及びΔNGFRをコードするLV-シンシチンAベクターによる形質導入のレベルを、C2C12細胞及び対照細胞(A20)において比較した。結果は、筋細胞でのmLy6eの発現により、SynAで偽型化されたLVによる筋細胞を形質導入する能力を予測することはできないことを示している(図14)。C2C12細胞は相対的に十分なレベルのLy6eを発現するが、形質導入されない。図13及び図14は、全てのタイプの筋細胞をLv-Synベクターで形質導入できるわけではないという、図4に示されていることを更に確認するものである。
【実施例６】
【０１６７】
ヒトシンシチン2 LVベクターを用いたヒト骨格筋筋芽細胞のインビトロでの形質導入
材料及び方法
ヒト筋芽細胞の形質導入及びフローサイトメトリーによる分析
CSC-C3196ヒト骨格筋筋芽細胞(Creative Bioarray社、シャーリー、NY、USA)を、コラーゲンコート24ウェルプレート、及び線維芽細胞増殖因子2(20ng/mL)を補充したSuperculture Skeletal Muscle Cell培養培地で培養した。細胞の形質導入を、ベクトフシン(12μg/ml)の存在下、1mLあたり105又は5×105感染性ゲノムでLV-Syn A又はLV-VSVgベクターを用いて6時間行った。
【０１６８】
細胞死亡率及び形質導入効率を、3又は5日後にフローサイトメトリー(FACS LSRII、BD Biosciences社)を使用して、7-アミノ-アクチノマイシンD標識及びNGFR又はGFP発現の測定によりそれぞれ評価した。
【０１６９】
結果
ヒトシンシチン2は、ヒト初代筋芽細胞を形質導入するのに使用することができる(図14)。導入遺伝子発現(ここではGFP)は、LV-Syn2ベクターによる感染後5日で顕微鏡によって細胞の約5〜10%で検出される(図14A)。qPCRによる分析は形質導入を確認し、有意なVCNが得られることを示した(図14B)。LV-SYnBベクターは幾らかの形質導入をもたらしたが、効率ははるかに劣った。これらの結果は、シンシチン2等のヒトシンシチンで偽型化されたLVは、ヒト骨格筋を形質導入して導入遺伝子を安定に発現させるのに使用され得る可能性があることを示している。
【０１７０】
これらの結果は、まとめると、シンシチン偽型化LVが遺伝子を再生骨格筋に優先的に送達するのに使用できることを初めて示すものである。LVは、効率的でないか又は免疫原性であることから筋肉への遺伝子導入には一般的に使用されないため、これは新規である。これらの所見は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する、及び潜在的には、アルファ-サルコグリカン欠損症等のような例えば肢帯型筋ジストロフィー等の再生筋肉期を伴う全てのミオパチーに対しても治療的可能性を持つ。
【０１７１】
これらの結果はまた、LV-SAベクターが、筋肉への遺伝子送達のゴールドスタンダードなベクター、rAAVとは極めて異なる挙動をすることも示している。LV-シンシチンベクターは、rAAVより低いベクターコピー及び導入遺伝子レベルをもたらし得るが、LV-シンシチンベクターには考慮すべき3つの可能性のある利点がある。第一に、筋肉でのLV-SAの使用は局所にとどまり、他の器官には広がらないらしく、潜在的毒性を制限する。投与が筋肉になされたとしても、rAAV8が極めて効果的に肝臓へ行っている図1に見られるように、これはrAAVには当てはまらない。第2に、LV-シンシチンによるインビボでの遺伝子送達は、LVベクターの組込み性及びシンシチンで偽型化されたLVのより低い免疫原性により、エピソーム性rAAVより安定であると予想される。内在性レトロウイルス由来のエンベロープタンパク質の使用により、rAAVより生理的であるシンシチンで偽型化されたLVベクターは、rAAVより免疫原性が少ないという可能性がある。rAAVより肝臓に対する毒性が少なく、免疫原性が少なく、より安定であるため、シンシチンで偽型化されたLVは、有利には反復投与されて、導入遺伝子発現細胞を失うことなく安定なインビボでの遺伝子送達を達成することができる。第三に、LVはrAAVより大きな積載量を有し、ジストロフィンcDNA等の大きな導入遺伝子を組み込むことができる。これらの利点を考えると、シンシチンで偽型化されたLVは、ミオパチーの遺伝子療法のためのrAAVに代わる極めて有望な手段となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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