(57)【要約】  本発明は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせた腫瘍標的二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０抗体を用いた併用療法、がんの治療のためのこれらの併用療法の使用、及び併用療法の使用方法に関する。【選択図】図１９Ａ
2021501162.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、腫瘍関連抗原に特異的な二重特異性ＯＸ４０抗体が、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用される、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体である、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体及びＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、単一組成物で一緒に投与されるか、又は二つ以上の異なる組成物で別々に投与される、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と相乗的に作用する、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）／抗ＯＸ４０二重特異性抗体である、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、
（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、
ＦＡＰへの特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、
二重特異性ＯＸ４０抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰへの特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、又はＦＡＰへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、
（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｅ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｆ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｇ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）
を含むＯＸ４０への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、
（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ａ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ａ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）
を含むＯＸ４０への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減する一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、腫瘍関連標的への一価結合及びＯＸ４０への四価結合を含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、ＣＨ１ドメインのＣ末端でＯＸ４０への特異的結合が可能な第２のＦａｂ断片のＶＨドメインに融合した、ＯＸ４０への特異的結合が可能な第１のＦａｂ断片と、ＣＨ１ドメインのＣ末端でＯＸ４０への特異的結合が可能な第４のＦａｂ断片のＶＨドメインに融合した、ＯＸ４０への特異的結合が可能な第３のＦａｂ断片とを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、
（ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号５５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む四つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号５８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む四つの軽鎖、又は
（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む四つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む四つの軽鎖
を含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号６３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号６５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；並びに／又は配列番号６６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、
（ａ）配列番号７１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号７２のＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号７３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに／又は配列番号７４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号７５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号７６のＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）配列番号７９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号８０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号８１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに／又は配列番号８２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号８３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号８４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む第２の抗原結合ドメインを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメイン、又は配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減する一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項２３】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体である、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項２４】
請求項１から１４、又は２３のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）及び共通軽鎖可変領域を含む第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項２５】
請求項１から１４、又は２３又は２４のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号９５のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号９６のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号９７のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン；配列番号９８のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号９９のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１００のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第２の抗原結合ドメイン；並びに配列番号１０１のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１０２のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０３のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む共通軽鎖を含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項２６】
請求項１から１４、又は２３から２５のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号１０４の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン；配列番号１０５の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第２の抗原結合ドメイン；及び配列番号１０６の配列を含む共通軽鎖を含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項２７】
請求項１から１４、又は２３から２６のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＦｏｌＲ１に結合する第３の抗原結合ドメインを含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項２８】
請求項１から１４、又は２３から２７のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、がんの腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１０９の共通軽鎖を含む、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、腫瘍関連抗原に特異的な腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体が、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて、及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤と組み合わせて使用される、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項３０】
請求項２９に記載の、方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体であって、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤が抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である、二重特異性ＯＸ４０抗体。
【請求項３１】
疾患、特にがんの、逐次的又は同時的な併用治療における使用のための、（Ａ）活性成分として抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び薬学的に許容される添加剤を含む第１の組成物；並びに（Ｂ）抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び薬学的に許容される添加剤を含む第２の組成物を含む、薬学的製品。
【請求項３２】
抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む薬学的組成物。
【請求項３３】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤をさらに含む、請求項３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
固形腫瘍の治療における使用のための、請求項３２又は３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体であって、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤と組み合わせて使用される、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体。
【請求項３６】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤が抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である、請求項３５に記載の、方法における使用のための抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体。
【請求項３７】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤が抗ＰＤ１抗体である、請求項３５又は３６に記載の、方法における使用のための、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体。
【請求項３８】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤がアテゾリズマブである、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の、方法における使用のための、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍標的抗ＣＤ３二重特異性抗体及び標的ＯＸ４０アゴニスト、特に腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体を用いる併用療法、がんの治療のためのこれらの併用療法の使用、及び併用療法を使用する方法に関する。腫瘍標的抗ＣＤ３二重特異性との、及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤、特にＰＤ−Ｌ１抗体との腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニストを用いる併用療法も含まれる。
【背景技術】
【０００２】
がんは世界中で主要な死因の一つである。治療オプションの進歩にもかかわらず、進行がんを有する患者の予後は依然として不良である。その結果、許容できない毒性を引き起こすことなくがん患者の生存を延ばすための最適な治療法に対する持続的且つ緊急の医学的必要性がある。臨床試験の最近の結果は、免疫療法、特に免疫チェックポイント阻害剤ががん患者の全生存を延ばし、持続的な反応につながることを示している。これらの有望な結果にもかかわらず、現在の免疫ベースの療法は一部の患者でのみ有効であり、治療効果を改善するには併用法が必要である。
【０００３】
がんと闘うために患者自身の免疫系を採用する一つの方法は、Ｔ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）の使用である。これらの分子は、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に特異的なアゴニスト抗ＣＤ３ユニット、及び特有のがん抗原に特異的な標的部分で構成される。例えば、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、腫瘍細胞で発現するＣＥＡ及びＴ細胞に存在するＣＤ３イプシロン鎖（ＣＤ３ε）を標的とする分子である。ＴＣＢは、ポリクローナルＴ細胞をリダイレクトして、細胞表面にそれぞれの標的抗原を発現しているがん細胞を溶解させる。そのような標的抗原が存在しないと、Ｔ細胞活性化は生じない。ＣＥＡ陽性がん細胞の存在下では、循環又は組織内にかかわらず、薬理学的に活性な用量がＴ細胞の活性化及び関連するサイトカインの放出を引き起こす。腫瘍細胞枯渇と平行して、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、最初の投与後２４時間以内に末梢血中のＴ細胞を一過的な減少と、サイトカイン放出のピークをもたらし、その後急速なＴ細胞の回復をもたらし、７２時間以内にサイトカインレベルをベースラインに戻す。よって、腫瘍細胞の完全な除去を達成するために、Ｔ細胞の活性化及びがん細胞に対する免疫応答を保護する追加の薬剤が必要である。
【０００４】
ＴＣＲの誘発は、この一次刺激の強度及び持続期間に応じて、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーである共刺激分子、例えばＯＸ４０の発現を増加させる。それぞれのリガンドによるこの受容体の付随するアゴニストライゲーションは、特定の炎症性サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α）の増殖、生存及び分泌などの特徴的なＴ細胞エフェクター機能を促進するが、抑制メカニズム、例えばＦｏｘＰ３の発現及びＩＬ−１０の分泌を阻害する（M. Croft et al., Immunol. Rev. 2009, 229(1), 173-191, I. Gramaglia et al., J. Immunol. 1998, 161(12), 6510-6517; S. M. Jensen et al., Seminars in Oncology 2010, 37(5), 524-532）。この共刺激は、特に弱い腫瘍抗原プライミングに関連して、腫瘍細胞に対するＴ細胞の潜在能力を最大限に高めるため、及び保護記憶形成を可能にする最初の攻撃を超えて抗腫瘍応答を維持するために必要である。
【０００５】
しかしながら、特定の腫瘍における免疫抑制微小環境は、共阻害シグナル、例えばＰＤ−Ｌ１が高いが、ＯＸ４０リガンドの十分な発現が欠如している。このような中でのＴ細胞の持続的なプライミングは、Ｔ細胞活性化の希薄化、消耗、及び免疫監視の回避をもたらし得る（Sharpe et al., Nat Rev 2002) (Keir ME et al., 2008 Annu. Rev. Immunol. 26:677）。
【０００６】
特に腫瘍の微小環境でＯＸ４０共刺激を回復する一つの手段は、腫瘍関連抗原の少なくとも一つの抗原結合ドメイン、例えば腫瘍間質の線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）と、ＯＸ４０の少なくとも一つの抗原結合ドメインで構成される二重特異性抗体である。例えば、そのような二重特異性抗体は、国際公開第２０１７／０５５３９８号及び同第２０１７／０６０１４４に記載されている。細胞表面ＦＡＰによるそのような二重特異性分子の架橋及び表面固定化は、ＯＸ４０陽性Ｔ細胞の高度にアゴニストなマトリックスを作成し、ＮＦκＢ媒介エフェクター機能をサポートし、ＯＸ４０リガンドによりライゲーションを置き換えることができる。腫瘍細胞自体又は免疫抑制がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）のいずれかで、大量のヒト腫瘍の徴候について高いＦＡＰ発現が報告されている。
【０００７】
強い免疫抑制又は消耗した表現型を有する特定の患者では、ポリクローナルである、腫瘍特異的Ｔ細胞動員（シグナル１）と腫瘍拘束性の正の共刺激の回復（シグナル２）の組み合わせのみが、十分な抗腫瘍効果及び適応免疫保護の延長を促進し得る。これは、持続的に、腫瘍の微小環境をより免疫活性化し、免疫抑制性の低い状態にすることができる。ＯＸ４０のＦＡＰ依存性共刺激は、全身曝露及び相関する副作用の低減を可能にする低い腫瘍内濃度での腫瘍細胞のＴＣＢ媒介殺傷も促進し得る。さらに、より低いＴＣＢ濃度が依然として有効である可能性があるため、治療間隔は延長され得る。
【０００８】
本特許出願では、ＴＣＢ（抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＦｏｌＲ／抗ＣＤ３二重特異性抗体）と二重特異性抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０抗体の組み合わせについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  及びｉｎ  ｖｉｖｏのデータが提供され、これは、Ｔ細胞リクルーターと腫瘍標的ＯＸ４０アゴニストを組み合わせて、抗腫瘍反応の量及び質を改善する論理的証拠をサポートする。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）／抗ＯＸ４０二重特異性抗体、及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたそれらの使用、特にがんの進行を治療する又は遅延させるための、より具体的には固形腫瘍の進行を治療する又は遅延させるための方法におけるそれらの使用に関する。本明細書に記載の併用療法は、腫瘍成長の阻害及び腫瘍細胞の除去において、抗ＣＤ３二重特異性抗体単独での治療よりもより効果的であることがわかった。
【００１０】
一態様では、本発明は、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体を提供し、ここで腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用される。一態様では、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体が提供され、ここで腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体は、別の腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用される。一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。特に、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。
【００１１】
さらなる態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体は、本明細書で先述の方法における使用を目的とし、ここで腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、単一組成物で一緒に投与されるか、又は二つ以上の異なる組成物で別々に投与される。
【００１２】
別の態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体は、本明細書上記の方法における使用を目的とし、ここで腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と相乗的に作用する。
【００１３】
別の態様では、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体が提供され、ここで腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と同時に、それより前に、又はそれに続いて投与される。
【００１４】
特に、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体は、抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）／抗ＯＸ４０二重特異性抗体である。一態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０抗体はＯＸ４０アゴニストである。一態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０抗体は、Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０抗体は、Ｆｃγ受容体結合及び／又はエフェクターを低下させる修飾を有するＦｃドメインを含む抗原結合分子である。腫瘍関連抗原による架橋は、不特定のＦｃγＲ媒介架橋を回避することを可能にし、よって、一般的なＯＸ４０抗体と比較して、より高用量でより有効な用量の抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０抗体が投与され得る。
【００１５】
一態様では、本発明は、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体を提供し、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用され、二重特異性ＯＸ４０抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰへの特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【００１６】
さらなる態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰへの特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメイン、又は配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインを含む。特定の態様では、二重特異性ＯＸ４０抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰへの特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。別の態様では、二重特異性ＯＸ４０抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰへの特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【００１７】
さらなる態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は（ｂ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は（ｃ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は（ｄ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は（ｅ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は（ｆ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は（ｇ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含むＯＸ４０への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【００１８】
より具体的には、二重特異性ＯＸ４０抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含むＯＸ４０への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【００１９】
さらなる態様では、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は（ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は（ａ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は（ａ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含むＯＸ４０への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【００２０】
特定の態様では、二重特異性ＯＸ４０抗体は、（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含むＯＸ４０への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【００２１】
一態様では、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体は、安定的会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である。特に、二重特異性ＯＸ４０抗体は、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。より具体的には、二重特異性ＯＸ４０抗体は、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、二重特異性ＯＸ４０抗体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【００２２】
本発明の別の態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、腫瘍関連標的への一価結合及びＯＸ４０への少なくとも二価の結合を含む。一態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体は、腫瘍関連標的への一価結合及びＯＸ４０への二価結合を含む。特定の態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体は、腫瘍関連標的への一価結合及びＯＸ４０への四価結合を含む。
【００２３】
別の態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、二重特異性ＯＸ４０抗体は、ＣＨ１ドメインのＣ末端でＯＸ４０への特異的結合が可能な第２のＦａｂ断片のＶＨドメインに融合した、ＯＸ４０への特異的結合が可能な第１のＦａｂ断片と、ＣＨ１ドメインのＣ末端でＯＸ４０への特異的結合が可能な第４のＦａｂ断片のＶＨドメインに融合した、ＯＸ４０への特異的結合が可能な第３のＦａｂ断片とを含む。
【００２４】
一態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、（ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号５５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む四つの軽鎖、又は（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号５８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む四つの軽鎖、又は（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む四つの軽鎖、又は（ｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む四つの軽鎖を含む。
【００２５】
別の態様では、本発明は、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体を提供し、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用され、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。
【００２６】
一態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここでＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む。
【００２７】
一態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここでＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号６５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；並びに／又は配列番号６６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。
【００２８】
さらなる態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここでＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。一態様では、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体が提供され、ここでＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、（ａ）配列番号７１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号７２のＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号７３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに／又は配列番号７４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号７５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号７６のＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｂ）配列番号７９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号８０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号８１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに／又は配列番号８２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号８３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号８４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【００２９】
特定の態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここでＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメイン、又は配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【００３０】
別の態様では、本発明は、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体をさらに提供し、ここで抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインをさらに含む。特に、第３の抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号７１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号７２のＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号７３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに／又は配列番号７４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号７５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号７６のＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｂ）配列番号７９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号８０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号８１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに／又は配列番号８２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号８３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号８４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＥＡ）を含む。より具体的には、第３の抗原結合ドメインは、配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、又は第２の抗原結合ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【００３１】
さらなる態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体であり、ここで第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている交差Ｆａｂ分子であり、第２及び第３の（存在する場合）抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
【００３２】
さらなる態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体であり、ここで（ｉ）第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合し、第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合し、第３の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
【００３３】
一態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインを含む。さらなる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、安定的会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む。より具体的には、抗ＣＥＡ／  抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【００３４】
別の態様では、本発明は、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体を提供し、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用され、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。
【００３５】
一態様では、本発明は、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体を提供し、ここでＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン、重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）及び共通軽鎖可変領域を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【００３６】
本発明の別の態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号９５のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号９６のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号９７のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン；配列番号９８のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号９９のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１００のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第２の抗原結合ドメイン；並びに配列番号１０１のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１０２のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０３のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む共通軽鎖を含む。
【００３７】
さらなる態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここでＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１０４の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン及び配列番号１０５の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第２の抗原結合ドメインを含み；共通軽鎖は、配列番号１０６の配列を含む。
【００３８】
一態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＦｏｌＲ１に結合する第３の抗原結合ドメインを含む。
【００３９】
さらなる態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、がんの腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１０９の共通軽鎖を含む。
【００４０】
別の態様では、本発明は、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体を提供し、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用され、その組み合わせは、１週間から３週間の間隔で投与される。
【００４１】
さらに別の態様では、本発明は、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体を提供し、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて、及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤と組み合わせて使用される。特に、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。より具体的には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。特定の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、アテゾリズマブである。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、特にがんの治療のための、疾患の併用、逐次又は同時治療における使用のための（Ａ）活性成分として腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体、及び薬学的に許容される添加剤を含む第１の組成物；並びに（Ｂ）活性成分として腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び薬学的に許容される添加剤を含む第２の組成物を含む薬学的製品を提供する。
【００４３】
別の態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体、及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む。一態様では、薬学的組成物は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤をさらに含む。特に、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。より具体的には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。特定の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、アテゾリズマブである。特定の一態様では、薬学的組成物は、固形腫瘍の治療における使用を目的とする。
【００４４】
さらなる態様では、本発明は、（Ａ）活性成分として腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体、及び薬学的に許容される添加剤を含む第１の組成物；（Ｂ）活性成分として腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び薬学的に許容される添加剤を含む第２の組成物；並びに（Ｃ）併用療法において組成物使用するための指示書を含む包装物を含む、対象におけるがんの進行を治療する又は遅延させるためのキットを提供する。一態様では（Ａ）活性成分として腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体、及び薬学的に許容される添加剤を含む第１の組成物；（Ｂ）活性成分として腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び薬学的に許容される添加剤を含む第２の組成物、（Ｃ）活性成分としてＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１をブロックする薬剤、特にアテゾリズマブ、及び薬学的に許容される添加剤を含む第３の組成物、並びに（Ｃ）併用療法において組成物を使用するための指示書を含む包装物を含む、対象におけるがんの進行を治療する又は遅延させるためのキットが提供される。
【００４５】
さらなる態様では、本発明は、増殖性疾患、特にがんの進行を治療する又は遅延させるための医薬の製造における、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体と、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせの使用に関する。
【００４６】
特定の態様では、結腸がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、子宮内膜がん、乳がん、腎臓がん、食道がん、又は前立腺がんからなる群より選択される疾患を治療するための医薬の製造における、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体と、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせの使用が提供される。
【００４７】
別の態様では、本発明は、対象におけるがんの進行を治療する又は遅延させるための方法であって、有効量の、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体、及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を、対象に投与することを含む、方法を提供する。別の態様では、対象におけるがんの進行を治療する又は遅延させるための方法であって、有効量の、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤、特に抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体を、対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００４８】
さらなる態様では、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体であって、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤と組み合わせて使用される、抗体が提供される。特に、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。より具体的には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。特定の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、アテゾリズマブである。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ−Ｃ】Ａ及びＢは、それぞれ実施例で使用される、特定の抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び特定の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を示す。これらの分子は、それぞれ、実施例１及び２でより詳細に記載される。太い黒い点は、ノブ・イントゥ・ホール修飾を表す。＊は、ＣＨ１及びＣＬドメインにおけるアミノ酸修飾を象徴する（いわゆる荷電残基）。Ａは、ＯＸ４０への四価結合及びＦＡＰ（４＋１フォーマット、ＦＡＰ  ＶＨ及びＶＬはＦｃドメインのＣ末端に融合）への一価結合を有する特定の抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体を示す。分子は、ここではＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂと呼ばれる。Ｂでは、２＋１フォーマットの例示的な二重特異性抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体が示される（ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢと称される）。２＋１フォーマットの別の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと呼ばれる）がＣで示される。
【図２】様々なヒト免疫細胞調製物によるＭＫＮ４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  ｒｅｄ  腫瘍細胞のＴＣＢ媒介溶解が示される（実施例３）。異なるヒト免疫エフェクター細胞調製物（休止ＰＢＭＣ、ＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞）が、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））の段階希釈列の存在下で、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで４８時間共培養した。生存腫瘍細胞の量は、３時間の間隔で４８時間にわたって３７℃及び５％  ＣＯ２で、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＨＤ位相コントラスト、緑色蛍光及び赤色蛍光、１０×対物）を使用して、蛍光顕微鏡法ハイコンテントライフイメージングにより数値化した。３組（中央値）の健康な腫瘍細胞の集積赤色蛍光（ＲＣＵｘμｍ２／画像）を使用して、使用したＴＣＢ濃度に対してプロットされた特異的溶解を計算し、Ｔ細胞の細胞溶解能を示した。
【図３Ａ−Ｄ】ＴＣＢ刺激時のＴ細胞上のＯＸ４０の発現を示す。異なるヒト免疫エフェクター細胞調製物（静止ＰＢＭＣ、ＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞）が、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））の段階希釈列の存在下で、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで４８時間共培養した。ＯＸ４０の発現は、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞で決定された。３組（中央値）の陽性細胞（Ａ及びＣ）及びＭＦＩ（Ｂ及びＤ）の割合は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ａ及びＢ）及びＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｃ及びＤ）に使用したＴＣＢ濃度に対してプロットされた。エラーバーはＳＥＭを示す。ＴＣＢは、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞上のＯＸ４０の用量依存性細胞表面発現を媒介し、その程度はＣＤ４＋Ｔ細胞でより高かった。
【図４Ａ−Ｃ】ＯＸ４０共刺激は、ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢの細胞溶解能に影響を及ぼさなかったことを示す。休止ＣＤ４  Ｔ細胞は、４８時間にわたって、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり（Ｂ）又はなし（Ａ）でのＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢの段階希釈列の存在下で、ＨｅＬａ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで共培養した。生存腫瘍細胞の量は、３時間の間隔で４２時間にわたって３７℃及び５％  ＣＯ２で、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＨＤ位相コントラスト、緑色蛍光及び赤色蛍光、１０×対物）を使用して、蛍光顕微鏡法ハイコンテントライフイメージングにより数値化した。３組（中央値）の健康な腫瘍細胞の集積赤色蛍光（ＲＣＵｘμｍ２／画像）は、様々なタイムポイントについての使用されたＴＣＢ濃度に対してプロットされ、Ｔ細胞の細胞溶解能が示された。エラーバーはＳＥＭを示す。各タイムポイントの曲線下面積は、細胞傷害性の指標として計算され、そのタイムポイントに対してプロットされた。Ｃでは、ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ単独とＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢと組み合わせたＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢの両方のＡＵＣ値を、比較のために、時間に対してプロットし、これは、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂの添加が、ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢの細胞溶解能に影響を及ぼさなかったことを示す。
【図５Ａ−Ｃ】ＯＸ４０共刺激は、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））の細胞溶解能に影響を及ぼさなかったことを示す。異なるヒト免疫エフェクター細胞調製物（ｃの休止ＰＢＭＣ、ＡのＣＤ４  Ｔ細胞及びＢのＣＤ８  Ｔ細胞）が、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂの固定濃度あり又はなしのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの段階希釈列の存在下で、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで４８時間共培養した。生存腫瘍細胞の量は、３時間の間隔で４８時間にわたって３７℃及び５％  ＣＯ２で、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＨＤ位相コントラスト、緑色蛍光及び赤色蛍光、１０×対物）を使用して、蛍光顕微鏡法ハイコンテントライフイメージングにより数値化した。３組（中央値）の健康な腫瘍細胞の集積赤色蛍光（ＲＣＵｘμｍ２／画像）を使用して、使用したＴＣＢ濃度に対してプロットされた特異的溶解を計算し、Ｔ細胞の細胞溶解能を示した。ここでは、４２時間のタイムポイントが例示的に示されている。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図６Ａ−Ｄ】ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ共刺激は、ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介ＴＮＦ−α分泌を増加させず、アゴニストＴＣＲ刺激に依拠していたことを示す。休止ＣＤ４  Ｔ細胞は、４８時間にわたって、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり又はなしのＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢの段階希釈列の存在下で、照射ＴＮＦ−αセンサー細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰ及びＨｅＬａ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞で共培養した。ＴＮＦ−αは、３時間の間隔で４２時間にわたって３７℃及び５％  ＣＯ２で、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＨＤ位相コントラスト、緑色蛍光及び赤色蛍光、１０×対物）を使用して、蛍光顕微鏡法ハイコンテントライフイメージングにより、ＧＦＰ誘導として数値化した。３組（中央値）のＴＮＦ−αセンサー細胞の集積緑色蛍光（ＲＣＵｘμｍ２／画像）は、使用されたＴＣＢ濃度に対してプロットされ、Ｔ細胞のＴＮＦα分泌が数値化された。エラーバーはＳＥＭを示す。ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢの結果は、Ａ（共刺激なし）及びＣ（ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ共刺激あり）に示されるのに対して、Ｂ及びＤはネガティブコントロールＣＤ３  ＴＣＢの結果を示す。
【図７Ａ−Ｄ】ＦＡＰＯｘ４０ｉＭＡＢ共刺激は、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ又はＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介ＴＮＦ−ａ分泌を増加させなかったことを示す。休止ＣＤ４  Ｔ細胞は、４８時間にわたって、それぞれＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり又はなしのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの段階希釈列の存在下で、ＴＮＦ−αセンサー細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰ及びＭＫＮ−４５  ＮＬＲ細胞で共培養した。ＴＮＦ−αの量は、上記の蛍光顕微鏡法ハイコンテントライフイメージングにより、ＴＮＦ−αセンサー細胞中のＧＦＰ誘導として数値化された。３組（中央値）のＴＮＦ−αセンサー細胞の集積緑色蛍光（ＧＣＵｘｕｍ２／画像）は、使用されたＴＣＢ濃度に対してプロットされ、Ｔ細胞のＴＮＦ−α分泌が数値化された。エラーバーはＳＥＭを示す。ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））の結果は、Ａ（共刺激なし）及びＣ（ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ共刺激あり）に示される。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの結果は、Ｂ（共刺激なし）及びＤ（ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ共刺激あり）に示される。
【図８Ａ−Ｄ】それぞれ異なるＴＣＢ又は異なる細胞株でみられる効果を要約する。休止ＣＤ４  Ｔ細胞は、４８時間にわたって、ＦＡＰ  Ｏｘ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり又はなしで、ＦｏｌＲ  ＣＤ３  ＴＣＢ（Ｂ及びＤ）、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（８Ｃ）又はＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（Ａ）の段階希釈列の存在下で、ＴＮＦ−αセンサー細胞、照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰ及び異なる標的細胞株ＨｅＬａ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞（８Ｂ）、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞（Ａ及びＣ）又はＳｋｏｖ−３細胞（Ｄ）で共培養した。ＴＮＦ−αの量は、蛍光顕微鏡法ハイコンテントライフイメージング２により、ＴＮＦ−αセンサー細胞中のＧＦＰ誘導として数値化された。ＧＦＰのＡＵＣは各条件及びタイムポイントについて計算され、各タイムポイントに対してプロットされて、Ｔ細胞のＴＮＦ−α分泌が数値化された。ＯＸ４０共刺激は、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＦｏｌＲ  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介ＴＮＦ−α放出を増加させなかった。
【図９Ａ−Ｄ】ＯＸ４０共刺激は、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介サイトカイン分泌を調節しなかったことを示す。休止ＣＤ４  Ｔ細胞は、４８時間にわたって、ＦＡＰ  Ｏｘ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり又はなしのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの段階希釈列の存在下で、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで共培養した。ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−９及びＩＬ−１７Ａの分泌量は、サイトメトリービーズアレイ技術を使用して、４８時間エンドポイントで数値化された。それぞれのサイトカイン濃度は、ＴＣＢ濃度に対してプロットされた。オフノート−炎症性サイトカインＴＮＦ−α（Ａ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）及びＩＬ−２（Ｂ）の分泌はＯＸ４０共刺激により増強されたのに対して、免疫抑制ＩＬ−１０（Ｄ）の炎症性サイトカインは減少した。
【図１０Ａ−Ｄ】ＯＸ４０共刺激は、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介サイトカイン分泌を調節しなかった。休止ＣＤ４  Ｔ細胞は、４８時間にわたって、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり又はなしのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの段階希釈列の存在下で、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで共培養した。ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０（Ｄ）、ＩＬ−９及びＩＬ−１７Ａの分泌量は、サイトメトリービーズアレイ技術を使用して、４８時間エンドポイントで数値化された。それぞれのサイトカイン濃度は、ＴＣＢ濃度に対してプロットされた。オフノート−炎症性サイトカインＴＮＦ−α（Ａ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）及びＩＬ−２（Ｂ）の分泌はＯＸ４０共刺激により増強された。
【図１１Ａ−Ｄ】ＯＸ４０共刺激は、ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介サイトカイン分泌を調節しなかったことを示す。休止ＣＤ４  Ｔ細胞は、４８時間にわたって、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり又はなしのＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢの段階希釈列の存在下で、ＨｅＬａ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで共培養した。ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＩＬ−１０の分泌量は、サイトメトリービーズアレイ技術を使用して、４８時間エンドポイントで数値化された。それぞれのサイトカイン濃度は、ＴＣＢ濃度に対してプロットされた。オフノート−炎症性サイトカインＴＮＦ−α（Ａ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）及びＩＬ−２（Ｂ）の分泌はＯＸ４０共刺激により増強されたのに対して、免疫抑制ＩＬ−１０（Ｄ）の炎症性サイトカインは大きく減少した。
【図１２Ａ−Ｄ】図１１Ａ−１１Ｄに示されるのと同じ実験の結果を示すが、ここではＨｅＬａ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞はＳｋｏｖ−３細胞に置き換えられた。この実験では、炎症性サイトカインＴＮＦ−α（Ａ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）及びＩＬ−２（Ｂ）及びＩＬ−１０（Ｄ）は、ＯＸ４０共刺激によりあまり変化しなかった。
【図１３】図９Ａ−９Ｄ、図１０Ａ−１０Ｄ、図１１Ａ−１１Ｄ及び図１２Ａ−１２Ｄの要約を示す。サイトカイン濃度の変化は百分率で計算され、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ共刺激なしのそれぞれの試料は１００％とみなされた。変化の程度は、腫瘍細胞株及び使用されるそれぞれのＴＣＢに依拠した。
【図１４Ａ−Ｄ】休止ＣＤ４  Ｔ細胞中のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介サイトカインを調節するＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ共刺激の能力（図Ａ−Ｄ）が比較された。グラフは、サイトカインＩＬ−２（Ａ）、ＩＦＮ−γ（Ｂ）、ＴＮＦ−α（Ｃ）、及びＩＬ−４（Ｄ）の分泌量を示す。休止ＣＤ４若しくはＣＤ８  Ｔ細胞又はＰＢＭＣは、７２時間にわたって、ＦＡＰ  Ｏｘ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり又はなしのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））の段階希釈列の存在下で、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで共培養した。ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＩＬ−４の分泌量は、サイトメトリービーズアレイ技術を使用して、４８時間エンドポイントで数値化された。それぞれのサイトカイン濃度は、ＴＣＢ濃度に対してプロットされた。
【図１４Ｅ−Ｈ】休止ＣＤ４  Ｔ細胞中のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介サイトカインを調節するＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ共刺激の能力（図Ｅ−Ｈ）が比較された。グラフは、サイトカインＩＬ−９（Ｅ）、ＭＩＰ−１α（Ｆ）、ＩＬ−１７ａ（Ｇ）及びＩＬ−１０（Ｈ）の分泌量を示す。休止ＣＤ４若しくはＣＤ８  Ｔ細胞又はＰＢＭＣは、７２時間にわたって、ＦＡＰ  Ｏｘ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり又はなしのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））の段階希釈列の存在下で、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで共培養した。ＩＬ−１０、ＩＬ−９、Ｍｉｐ−１α及びＩＬ−１７Ａの分泌量は、サイトメトリービーズアレイ技術を使用して、４８時間エンドポイントで数値化された。それぞれのサイトカイン濃度は、ＴＣＢ濃度に対してプロットされた。
【図１５Ａ−Ｄ】休止ＣＤ８  Ｔ細胞中のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介サイトカインを調節するＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ共刺激の能力（Ａ−Ｄ）が比較された。グラフは、サイトカインＩＬ−２（Ａ）、ＩＦＮ−γ（Ｂ）、ＴＮＦ−α（Ｃ）、及びＩＬ−４（Ｄ）の分泌量を示す。静止ＣＤ４若しくはＣＤ８  Ｔ細胞又はＰＢＭＣは、７２時間にわたって、ＦＡＰ  Ｏｘ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり又はなしのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））の段階希釈列の存在下で、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで共培養した。ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＩＬ−４の分泌量は、サイトメトリービーズアレイ技術を使用して、４８時間エンドポイントで数値化された。それぞれのサイトカイン濃度は、ＴＣＢ濃度に対してプロットされた。
【図１５Ｅ−Ｈ】休止ＣＤ８  Ｔ細胞中のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介サイトカインを調節するＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ共刺激の能力（Ｅ−Ｈ）が比較された。グラフは、サイトカインＩＬ−９（Ｅ）、ＭＩＰ−１α（Ｆ）、ＩＬ−１７ａ（Ｇ）及びＩＬ−１０（Ｈ）の分泌量を示す。静止ＣＤ４若しくはＣＤ８  Ｔ細胞又はＰＢＭＣは、７２時間にわたって、ＦＡＰ  Ｏｘ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり又はなしのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））の段階希釈列の存在下で、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで共培養した。ＩＬ−１０、ＩＬ−９、Ｍｉｐ−１α及びＩＬ−１７Ａの分泌量は、サイトメトリービーズアレイ技術を使用して、４８時間エンドポイントで数値化された。それぞれのサイトカイン濃度は、ＴＣＢ濃度に対してプロットされた。
【図１６Ａ−Ｄ】休止ヒトＰＭＢＣ中のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介サイトカインを調節するＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ共刺激の能力（Ａ−Ｄ）が比較された。グラフは、サイトカインＩＬ−２（Ａ）、ＩＦＮ−γ（Ｂ）、ＴＮＦ−α（Ｃ）、及びＩＬ−４（Ｄ）の分泌量を示す。休止ＣＤ４若しくはＣＤ８  Ｔ細胞又はＰＢＭＣは、７２時間にわたって、ＦＡＰ  Ｏｘ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり又はなしのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））の段階希釈列の存在下で、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで共培養した。ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＩＬ−４の分泌量は、サイトメトリービーズアレイ技術を使用して、４８時間エンドポイントで数値化された。それぞれのサイトカイン濃度は、ＴＣＢ濃度に対してプロットされた。
【図１６Ｅ−Ｈ】休止ヒトＰＭＢＣ中のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介サイトカインを調節するＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ共刺激の能力（Ｅ−Ｈ）が比較された。グラフは、サイトカインＩＬ−９（Ｅ）、ＭＩＰ−１α（Ｆ）、ＩＬ−１７ａ（Ｇ）及びＩＬ−１０（Ｈ）の分泌量を示す。休止ＣＤ４若しくはＣＤ８  Ｔ細胞又はＰＢＭＣは、７２時間にわたって、ＦＡＰ  Ｏｘ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり又はなしのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））の段階希釈列の存在下で、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで共培養した。ＩＬ−１０、ＩＬ−９、Ｍｉｐ−１α及びＩＬ−１７Ａの分泌量は、サイトメトリービーズアレイ技術を使用して、４８時間エンドポイントで数値化された。それぞれのサイトカイン濃度は、ＴＣＢ濃度に対してプロットされた。
【図１７】ＴＣＢ最高濃度についての、ＦＡＰ  Ｏｘ４０  ｉＭＡＢ共刺激により引き起こされるサイトカイン濃度の増加の比較を示す。
【図１８Ａ】実施例４．４に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ実験における治療の第１週の間の注射した化合物の薬物動態プロファイルを示す。１群あたり２匹のマウスから第１の治療の１０分後、６時間後、２４時間後、９６時間後、７日後に採血し、注射した化合物の曝露を分析した。血液を血清に処理し、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、第１週の間のＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂの曝露を決定した。全身曝露は、単剤療法を受けているマウス又は併用療法を受けているマウスと同等であった。
【図１８Ｂ】実施例４．４に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ実験１における治療の第１週の間の注射した化合物の薬物動態プロファイルを示す。１群あたり２匹のマウスから第１の治療の１０分後、６時間後、２４時間後、９６時間後、７日後で採血し、注射した化合物の曝露を分析した。血液を血清に処理し、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、第１週の間のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの曝露を決定した。全身曝露は、単剤療法を受けているマウス又は併用療法を受けているマウスと同等であった。
【図１９Ａ−Ｂ】Ａは、他のすべての群と比較して、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ（４Ｂ９）ＯＸ４０  ｉＭａｂの組み合わせのみが、皮下腫瘍の縮小を媒介したことを示す。これは、Ｂに示されるウォーターフォールプロットから明らかにわかる。幹細胞ヒト化ＮＯＧマウスに、ＭＫＮ４５胃腫瘍細胞と３Ｔ３ｈｕＦＡＰ線維芽細胞との混合物をマトリゲルで皮下注射した。第１０日にマウスを腫瘍サイズについて無作為化し、１４０の平均Ｔ細胞数／μｌ血液及び１７０ｍｍ３の平均腫瘍サイズでヒトＴ細胞を計算した。５週間連続して週１回、無作為化の日に、マウスにビヒクル、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ又はそれらの組み合わせを静脈内注射した。腫瘍体積を週３回測定し、研究時間に対してプロットした。エラーバーは、１群当たり６から８の動物についての標準誤差を示す（Ａ）。治療開始時の腫瘍体積と比較した実験第４１日の腫瘍体積の増減率を各動物について計算し、ウォーターフォールプロットとしてプロットした（Ｂ）。
【図２０Ａ】実施例４．５に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ実験２における治療の第１週の間の注射した化合物の薬物動態プロファイルを示す。１群あたり２匹のマウスから第１の治療の１０分後、６時間後、２４時間後、９６時間後、７日後に採血し、注射した化合物の曝露を分析した。血液を血清に処理し、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、第１週の間のＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ及びそのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせの異なる用量の曝露を決定した。Ａでは、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂの異なる投与量の明らかな用量依存性がみられる。ＣＥＡＣＡＭ  ＣＤ３  ＴＣＢの曝露は、単剤療法を受けているマウス又は併用療法を受けているマウスと同等であった。
【図２０Ｂ】実施例４．５に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ実験２における治療の第１週の間の注射した化合物の薬物動態プロファイルを示す。１群あたり２匹のマウスから第１の治療の１０分後、６時間後、２４時間後、９６時間後、７日後に採血し、注射した化合物の曝露を分析した。血液を血清に処理し、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、第１週の間の異なる用量のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ及び異なる用量のＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂとＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの組み合わせの曝露を決定した。ＣＥＡＣＡＭ  ＣＤ３  ＴＣＢの曝露は、単剤療法を受けているマウス又は併用療法を受けているマウスと同等であった。
【図２１Ａ−Ｃ】ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢと最高用量のＦＡＰ（４Ｂ９）ＯＸ４０  ｉＭａｂ（１２．５ｍｇ／ｋｇ、図Ｃ）の組み合わせのみが、他のすべて群と比較して、腫瘍増殖阻害に関する有効性の改善を示したことを示す。幹細胞ヒト化ＮＯＧマウスに、ＭＫＮ４５胃腫瘍細胞と３Ｔ３ｈｕＦＡＰ線維芽細胞との混合物をマトリゲルで皮下注射した。第２６日にマウスを腫瘍サイズについて無作為化し、１１５の平均Ｔ細胞数／μｌ血液及び４９０ｍｍ３の平均腫瘍サイズでヒトＴ細胞を計算した。無作為化の１日後、マウスにビヒクル、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））、及び異なる用量のＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ（それぞれ１２．５ｍｇ／ｋｇ、４．２ｍｇ／ｋｇ及び１．４ｍｇ／ｋｇ）、又はＯＸ４０標的分子とＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの組み合わせを４週間にわたって静脈内注射した。腫瘍体積を週３回測定し、研究時間に対してプロットした。エラーバーは、１群当たり８から１０の動物についての標準誤差を示す。Ａは、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ  １．４ｍｇ／ｋｇで得られた腫瘍縮小を示し、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ  ４．２ｍｇ／ｋｇ又はＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ  １２．５ｍｇ／ｋｇで観察された腫瘍縮小をそれぞれ、ＢとＣの図で示す。
【図２２】ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢと異なる量のＦＡＰ（４Ｂ９）ＯＸ４０  ｉＭａｂの組み合わせ抗腫瘍効果の用量依存性を要約する。治療開始時の腫瘍体積と比較した実験２の治療第３５日の腫瘍体積の増減率を各動物について計算し、ウォーターフォールプロットとしてプロットした。
【図２３Ａ−Ｂ】ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ（４Ｂ９）ＯＸ４０  ｉＭａｂの組み合わせが、すべての単剤療法と比較して、腫瘍内白血球の数を有意に増加させることを示す。実施例４．５に記載の実験２の第５０日に、腫瘍浸潤リンパ球を分離し、フローサイトメトリーによってヒト白血球及びＴ細胞の存在を評価した。生存ヒト白血球（ＤＡＰＩ−、ＣＤ４５＋）、ＮＯＮ−ＣＤ３白血球（ＤＡＰＩ−、ＣＤ４５＋、ＣＤ３−）、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞（ＤＡＰＩ−、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４又はＣＤ８＋）をゲートし、数を正規化し（腫瘍当たり又は腫瘍１μｇ当たり）、計算し、それぞれの治療群についてプロットした：Ａは生存ヒト白血球、及びＢはＮＯＮ−ＣＤ３白血球。エラーバーは、１群当たり５から８の動物についての標準誤差を示す。
【図２３Ｃ−Ｄ】ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ（４Ｂ９）ＯＸ４０  ｉＭａｂの組み合わせが、すべての単剤療法と比較して、腫瘍内白血球の数を有意に増加させることを示す。実施例４．５に記載の実験２の第５０日に、腫瘍浸潤リンパ球を分離し、フローサイトメトリーによってヒト白血球及びＴ細胞の存在を評価した。生存ヒト白血球（ＤＡＰＩ−、ＣＤ４５＋）、ＮＯＮ−ＣＤ３白血球（ＤＡＰＩ−、ＣＤ４５＋、ＣＤ３−）、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞（ＤＡＰＩ−、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４又はＣＤ８＋）をゲートし、数を正規化し（腫瘍当たり又は腫瘍１μｇ当たり）、計算し、それぞれの治療群についてプロットした：ＣはＣＤ４  Ｔ細胞、及びＢはＣＤ８  Ｔ細胞。エラーバーは、１群当たり５から８の動物についての標準誤差を示す。
【図２４Ａ−Ｂ】ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ共刺激及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２）が、腫瘍特異的に作用し、脾臓（Ａ）及び血液（Ｂ）における全身性白血球の数を変えないことを示す。
【図２５Ａ】ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ（４Ｂ９）ＯＸ４０  ｉＭａｂの組み合わせは、すべての単剤療法と比較して、腫瘍内Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞の数を有意に増加させた。ｈｕＣＤ３免疫組織化学により検出されたＣＤ３陽性Ｔ細胞の数をＡに示す。ＨｕＣＤ８及びＨｕＣＤ３の免疫組織化学を４μｍパラフィン切片で実施した。
【図２５Ｂ】ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ（４Ｂ９）ＯＸ４０  ｉＭａｂの組み合わせは、すべての単剤療法と比較して、腫瘍内Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞の数を有意に増加させた。ｈｕＣＤ８免疫組織化学により検出されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の数をＢに示す。ＨｕＣＤ８及びＨｕＣＤ３の免疫組織化学を４μｍパラフィン切片で実施した。
【図２６Ａ−Ｃ】ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ（４Ｂ９）ＯＸ４０  ｉＭａｂの組み合わせが、すべての単剤療法と比較して、腫瘍内サイトカインの濃度を有意に増加させたことを示す。末梢では有意な変化は検出されなかった。実験２の第５０日に、腫瘍、脾臓及び血液を採取し、急速冷凍した。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ＰｒｏＴＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １７−ｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙを使用して、ホモジネートでサイトカイン濃度を決定した。全タンパク質含有量をＢＣＡタンパク質アッセイキットにより分析し、試料のタンパク質含有量に対して濃度を正規化した。治療群当たり４匹の動物の中央サイトカイン濃度を、腫瘍についてはＡに、脾臓についてはＢに、血液についてはＣに示す。
【図２７Ａ−Ｄ】腫瘍内サイトカイン濃度を示し（腫瘍内白血球数は示さず）、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂとＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの組み合わせで治療された動物における腫瘍増殖の進行と逆の相関関係がある。これは、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法で治療された動物では観察されなかった。それぞれの無色の印はＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法で治療された個々の動物を表し、色が塗られた印は、組み合わせで治療された個々の動物を表す。Ａでは、Ｔ細胞の数は腫瘍体積の変化［％］に対してプロットされ、ＴＮＦ−ａの濃度（Ｂ）、ＩＦＮ−ｇの濃度（Ｃ）、及びＭＣＰ−１の濃度（Ｄ）も、腫瘍体積の変化［％］に対してプロットされる。
【図２７Ｅ−Ｆ】腫瘍内サイトカイン濃度を示し（腫瘍内白血球数は示さず）、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂとＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの組み合わせで治療された動物における腫瘍増殖の進行と逆の相関関係がある。これは、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法で治療された動物では観察されなかった。それぞれの無色の印はＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法で治療された個々の動物を表し、色が塗られた印は、組み合わせで治療された個々の動物を表す。ＩＬ−８の濃度（Ｅ）及びＩＬ−６の濃度（Ｆ）は、腫瘍体積の変化［％］に対してプロットされる。
【図２８Ａ−Ｂ】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの抗ＰＤ−Ｌ１及びＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂとの組み合わせが、他のすべての療法と比較して、腫瘍増殖阻害に関する有効性の改善を媒介したことを示す（実施例５）。Ａ及びＢはそれぞれ、腫瘍体積の平均として、又は腫瘍体積の平均倍率変化としての経時的な腫瘍増殖を示す。
【図２９Ａ】実施例５に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ実験における治療の第１週の間の注射した化合物の薬物動態プロファイルを示す。１群あたり２匹のマウスから第１及び第３の治療の１時間後に採血し、注射した化合物の曝露を分析した。血液を血清に処理し、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせ又は三つの組み合わせの曝露を決定した（Ａ）。三つすべての化合物の曝露は、単剤療法を受けているマウス又は併用療法を受けているマウスと同等であった。
【図２９Ｂ】実施例５に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ実験における治療の第１週の間の注射した化合物の薬物動態プロファイルを示す。１群あたり２匹のマウスから第１及び第３の治療の１時間後及び７２時間後で採血し、注射した化合物の曝露を分析した。血液を血清に処理し、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びその異なる組み合わせの曝露を決定した（Ｂ）。三つすべての化合物の曝露は、単剤療法を受けているマウス又は併用療法を受けているマウスと同等であった。
【図２９Ｃ】実施例５に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ実験における治療の第１週の間の注射した化合物の薬物動態プロファイルを示す。１群あたり２匹のマウスから第１及び第３の治療の１時間後及び７２時間後で採血し、注射した化合物の曝露を分析した。血液を血清に処理し、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせ又は三つの組み合わせの曝露を決定した（Ｃ）。三つすべての化合物の曝露は、単剤療法を受けているマウス又は併用療法を受けているマウスと同等であった。
【図３０Ａ】ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの抗ＰＤ−Ｌ１及びＦＡＰ（４Ｂ９）ＯＸ４０  ｉＭａｂの組み合わせは、すべての単剤療法又は二剤療法と比較して、腫瘍内Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞の数を有意に増加させた。ｈｕＣＤ３免疫組織化学により検出されたＣＤ３陽性Ｔ細胞の数をＡに示す。ＨｕＣＤ８及びＨｕＣＤ３の免疫組織化学を４μｍパラフィン切片で実施した。
【図３０Ｂ】ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの抗ＰＤ−Ｌ１及びＦＡＰ（４Ｂ９）ＯＸ４０  ｉＭａｂの組み合わせは、すべての単剤療法又は二剤療法と比較して、腫瘍内Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞の数を有意に増加させた。ｈｕＣＤ８免疫組織化学により検出されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の数をＢに示す。ＨｕＣＤ８及びＨｕＣＤ３の免疫組織化学を４μｍパラフィン切片で実施した。
【図３１Ａ−Ｂ】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ  ＯＸ４０ｉＭＡｂの組み合わせ並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＦＡＰ−４−１ＢＢＬと抗ＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）の３剤組み合わせの有効性を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  アッセイの結果に関する。ＭＫＮ４５−ＰＤ−Ｌ１及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞並びにＴ細胞活性剤ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、チェックポイント阻害剤ａ−ＰＤ−Ｌ１（アテゾリズマブ）及び免疫調節剤ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂの異なる組み合わせの存在下でＰＢＭＣを４日間インキュベートした。実験のエンドポイントである第４日に、細胞を表面又は細胞内マーカーについて染色し、上清をサイトカイン分析のために保管した。各印は個々のドナーを示し（各群は三重で試験された）、それぞれの色／パターンは特定の治療組み合わせを示し、バーはＳＥＭの平均を示した。ＣＤ４  Ｔ細胞上の（Ａ）及びＣＤ８  Ｔ細胞上（Ｂ）のＣＤ２５の表面発現に対する、単一成分及びそれらの組み合わせと比較した、組み合わせの効果を、それぞれ、６人の異なるドナーについて示す。元配置ＡＮＯＶＡ（テューキーの多重比較検定）を使用して異なる治療群間の統計的有意性を計算し、ここで、１群当たり３つの実験を行う６人のドナーの平均を計算した。グラフで示される星印（＊）はｐ値を示し、＊はｐ値＜０．０５を、＊＊はｐ値＜０．０１を、＊＊＊はｐ値＜０．００１を示す。１００ｎＭ  ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと２ｎＭ  ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢでの併用治療、又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体との３剤併用治療は、ＣＤ２５発現ＣＤ４  Ｔ細胞（Ａ）及びＣＤ８  Ｔ細胞（Ｂ）の割合を増加させることを示す。
【図３２Ａ−Ｂ】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ  ＯＸ４０ｉＭＡｂの組み合わせ並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＦＡＰ−４−１ＢＢＬと抗ＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）の３剤組み合わせの有効性を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果に関する。ＭＫＮ４５−ＰＤ−Ｌ１及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞並びにＴ細胞活性剤ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、チェックポイント阻害剤ａ−ＰＤ−Ｌ１（アテゾリズマブ）及び免疫調節剤ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂの異なる組み合わせの存在下でＰＢＭＣを４日間インキュベートした。実験のエンドポイントである第４日に、細胞を表面又は細胞内マーカーについて染色し、上清をサイトカイン分析のために保管した。各印は個々のドナーを示し（各群は三重で試験された）、それぞれの色／パターンは特定の治療組み合わせを示し、バーはＳＥＭの平均を示した。ＣＤ４  Ｔ細胞上の（Ａ）及びＣＤ８  Ｔ細胞上（Ｂ）の増殖に対する、単一成分及びそれらの組み合わせと比較した、組み合わせの効果を、それぞれ、６人の異なるドナーについて示す。元配置ＡＮＯＶＡ（テューキーの多重比較検定）を使用して異なる治療群間の統計的有意性を計算し、ここで、１群当たり３つの実験を行う６人のドナーの平均を計算した。グラフで示される星印（＊）はｐ値を示し、＊はｐ値＜０．０５を、＊＊はｐ値＜０．０１を、＊＊＊はｐ値＜０．００１を示す。１００ｎＭ  ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと２ｎＭ  ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢでの併用治療、又は８０ｎＭ  抗ＰＤ−Ｌ１抗体との３剤併用治療は、増殖するＣＤ４  Ｔ細胞細胞（Ａ）及びＣＤ８  Ｔ細胞（Ｂ）の割合を増加させることを示す。実験の開始前にＰＢＭＣを増殖染料ＣＦＳＥで標識し、ＦＡＣＳを使用してＣＦＳＥ染料を希釈することにより増殖を測定した。
【図３３Ａ−Ｂ】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ  ＯＸ４０ｉＭＡｂの組み合わせ並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＦＡＰ−４−１ＢＢＬと抗ＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）の３剤組み合わせの有効性を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果に関する。ＭＫＮ４５−ＰＤ−Ｌ１及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞並びにＴ細胞活性剤ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、チェックポイント阻害剤ａ−ＰＤ−Ｌ１（アテゾリズマブ）及び免疫調節剤ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂの異なる組み合わせの存在下でＰＢＭＣを４日間インキュベートした。実験のエンドポイントである第４日に、細胞を表面又は細胞内マーカーについて染色し、上清をサイトカイン分析のために保管した。各印は個々のドナーを示し（各群は三重で試験された）、それぞれの色／パターンは特定の治療組み合わせを示し、バーはＳＥＭの平均を示した。ＣＤ４  Ｔ細胞上の（Ａ）及びＣＤ８  Ｔ細胞上（Ｂ）のＴ−ｂｅｔの細胞内発現に対する、単一成分及びそれらの組み合わせと比較した、組み合わせの効果を、それぞれ、６人の異なるドナーについて示す。元配置ＡＮＯＶＡ（テューキーの多重比較検定）を使用して異なる治療群間の統計的有意性を計算し、ここで、１群当たり３つの実験を行う６人のドナーの平均を計算した。グラフで示される星印（＊）はｐ値を示し、＊はｐ値＜０．０５を、＊＊はｐ値＜０．０１を、＊＊＊はｐ値＜０．００１を示す。１００ｎＭ  ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと２ｎＭ  ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢでの併用治療、又は８０ｎＭ  抗ＰＤ−Ｌ１抗体との３剤併用治療は、Ｔ−ｂｅｔ発現ＣＤ４  Ｔ細胞細胞（Ａ）の割合及びＣＤ８  Ｔ細胞（Ｂ）上のＴ−ｂｅｔのＭＦＩ（平均蛍光強度）増加させることを示す。
【図３３Ｃ−Ｄ】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ  ＯＸ４０ｉＭＡｂの組み合わせ並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＦＡＰ−４−１ＢＢＬと抗ＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）の３剤組み合わせの有効性を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果に関する。ＭＫＮ４５−ＰＤ−Ｌ１及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞並びにＴ細胞活性剤ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、チェックポイント阻害剤ａ−ＰＤ−Ｌ１（アテゾリズマブ）及び免疫調節剤ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂの異なる組み合わせの存在下でＰＢＭＣを４日間インキュベートした。実験のエンドポイントである第４日に、細胞を表面又は細胞内マーカーについて染色し、上清をサイトカイン分析のために保管した。各印は個々のドナーを示し（各群は三重で試験された）、それぞれの色／パターンは特定の治療組み合わせを示し、バーはＳＥＭの平均を示した。ＣＤ４  Ｔ細胞上の（Ａ）及びＣＤ８  Ｔ細胞上（Ｂ）のグランザイムＢの細胞内発現に対する、単一成分及びそれらの組み合わせと比較した、組み合わせの効果を、それぞれ、６人の異なるドナーについて示す。元配置ＡＮＯＶＡ（テューキーの多重比較検定）を使用して異なる治療群間の統計的有意性を計算し、ここで、１群当たり３つの実験を行う６人のドナーの平均を計算した。グラフで示される星印（＊）はｐ値を示し、＊はｐ値＜０．０５を、＊＊はｐ値＜０．０１を、＊＊＊はｐ値＜０．００１を示す。１００ｎＭ  ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと２ｎＭ  ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢの併用治療は、グランザイムＢ発現ＣＤ４  Ｔ細胞（Ｃ）及びグランザイムＢ発現ＣＤ８  Ｔ細胞（Ｄ）の割合を増加させることを示す。抗ＰＤ−Ｌ１抗体との３剤組み合わせは、統計的有意性を有するＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂ併用治療と比較して、グランザイムＢ発現ＣＤ４  及びＣＤ８  Ｔ細胞の割合をさらに増加させる。インキュベーションの４日後に、製造業者の指示に従ってサイトメトリービーズアレイを使用して、分泌されたサイトカインＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、グランザイムＢ、及びＩＬ−１０を上清中で分析した。各印は一人のドナーを示し（１群当たり三つの試験にプール）、それぞれの色／パターンは特定の治療組み合わせを示し、バーはＳＥＭの平均を示した。
【図３４Ａ−Ｃ】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ  ＯＸ４０ｉＭＡｂの組み合わせ並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＦＡＰ−４−１ＢＢＬと抗ＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）の３剤組み合わせの有効性を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  アッセイの結果に関する。ＭＫＮ４５−ＰＤ−Ｌ１及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞並びにＴ細胞活性剤ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、チェックポイント阻害剤ａ−ＰＤ−Ｌ１（アテゾリズマブ）及び免疫調節剤ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂの異なる組み合わせの存在下でＰＢＭＣを４日間インキュベートした。実験のエンドポイントである第４日に、細胞を表面又は細胞内マーカーについて染色し、上清をサイトカイン分析のために保管した。各印は個々のドナーを示し（各群は三重で試験された）、それぞれの色／パターンは特定の治療組み合わせを示し、バーはＳＥＭの平均を示した。グラフで示される星印（＊）はｐ値を示し、＊はｐ値＜０．０５を、＊＊はｐ値＜０．０１を、＊＊＊はｐ値＜０．００１を示す。１００ｎＭ  ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと２ｎＭ  ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢでの併用治療は、ＩＦＮγ（Ａ）、グランザイムＢ（Ｂ）及びＩＬ−８（Ｃ）の分泌を増加させることを示す。ＰＤ−Ｌ１との３剤組み合わせは、上記の三つすべてのサイトカインの分泌を有意に増加させる。
【図３５Ａ−Ｃ】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ  ＯＸ４０ｉＭＡｂの組み合わせ並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＦＡＰ−４−１ＢＢＬと抗ＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）の３剤組み合わせの有効性を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果に関する。ＭＫＮ４５−ＰＤ−Ｌ１及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞並びにＴ細胞活性剤ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、チェックポイント阻害剤ａ−ＰＤ−Ｌ１（アテゾリズマブ）及び免疫調節剤ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂの異なる組み合わせの存在下でＰＢＭＣを４日間インキュベートした。実験のエンドポイントである第４日に、細胞を表面又は細胞内マーカーについて染色し、上清をサイトカイン分析のために保管した。各印は個々のドナーを示し（各群は三重で試験された）、それぞれの色／パターンは特定の治療組み合わせを示し、バーはＳＥＭの平均を示した。グラフで示される星印（＊）はｐ値を示し、＊はｐ値＜０．０５を、＊＊はｐ値＜０．０１を、＊＊＊はｐ値＜０．００１を示す。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとａＰＤ−Ｌ１の組み合わせ（ベースラインとみなす）での治療後のサイトカインと比較した、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂ、及びａ−ＰＤ−Ｌ１の３剤組み合わせでの治療後の６人のドナーにおけるサイトカインの倍率増加を示す。黒い実線は２倍の変化を示す。ＩＦＮγ（Ａ）、グランザイムＢ（Ｂ）及びＩＬ−８（Ｃ）の倍率増加を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
定義
別に規定されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数で使用される用語はまたその逆も複数形を含む。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合分子」とは、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片及び骨格抗原結合タンパク質である。
【００５２】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００５３】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、通常少量存在し得る、例えば、自然発生的な変異を含む、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生するような、起こり得る変異体抗体を除いて同一であり、且つ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００５４】
本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体とは、同一抗原の同一エピトープにそれぞれが結合する一又は複数の結合部位を有する抗体を表す。用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が、少なくとも二つの抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、二つの抗原結合部位を含み、そのそれぞれは、異なる抗原決定基に対して特異的である。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、二つの抗原決定基、特に二つの異なる細胞に発現した二つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００５５】
本出願内で使用される用語「価」とは、抗原結合分子中の特定の数の結合部位の存在を表す。したがって、用語「二価」、「四価」、及び「六価」とは、抗原結合分子における、それぞれ二つの結合部位、四つの結合部位、及び六つの結合部位の存在を表す。
【００５６】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧクラス抗体は、ジスルフィド結合している二つの軽鎖と二つの重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、三つの、重鎖定常領域とも呼ばれる定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、各軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）の５つのタイプのいずれかに割り当てられ、そのいくつかは、サブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）にさらに分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、二つのタイプの何れかに割り当てることができる。
【００５７】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、交差Ｆａｂ断片；直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al., Nat Med. 9, 129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、ＰｌｕｃｋｔｈｕｎのThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。所定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６，２４８，５１６  Ｂ１号を参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌やファージ）による産生を含む。
【００５８】
インタクトな抗体のパパイン消化は、二つの同一の抗原結合断片を生成し、それらは「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、重鎖と軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。よって、本明細書で使用される場合、用語「Ｆａｂ断片」とは、ＶＬドメイン及び軽鎖（ＣＬ）の定常ドメインを含む軽鎖断片、並びにＶＨドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆａｂ’断片であり、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つ。ペプシン処理は、二つの抗原組み合わせ部位（二つのＦａｂ断片）及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片を生み出す。
【００５９】
用語「交差Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」はＦａｂ断片を指し、ここでは重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されている。クロスオーバーＦａｂ分子の二つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる：一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は交換されており、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも称される。他方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されているとき、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも称される。
【００６０】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬの一つを有し；前記リンカーは、少なくとも３０のアミノ酸、好ましくは３２から５０の間のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化している。さらに、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入を介して鎖間ジスルフィド結合の生成によりさらに安定化されている可能性がある（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けの可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）。
【００６１】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬの一つを有し；ＶＨ及びＶＬは一緒に、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記リンカーは、少なくともから３０のアミノ酸のポリペプチドである。さらに、これらのｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入を介して鎖間ジスルフィド結合の生成によりさらに安定化されている可能性がある（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けの可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）。
【００６２】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０から約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドと結合した、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、同様に可溶性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に結合することができ、その逆も可能である。このたんぱく質は、定常領域の除去及びリンカーの誘導にかかわらず、元の抗体の特性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特徴、すなわち、ＶＬドメインと共に会合することができるという特徴、又はＶＬドメインの特徴、すなわち、ＶＨドメインと共に機能性抗原結合部位と会合し、その結果、完全長抗体の抗原結合特性を提供するという特徴、を有する単鎖ポリペプチドを含む。
【００６３】
「骨格抗原結合タンパク質」は、当該技術分野で知られており、例えば、フィブロネクチン及び設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）が抗原結合ドメインの代替的な骨格として使用された。例えばGebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)及びStumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)を参照のこと。本発明の一態様では、骨格抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）、リポカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、プロテインＡ由来分子、例えばプロテインＡのＺドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、Ａドメイン（Ａｖｉｍｅｒ／Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ）；設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、Ｃ型レクチンドメイン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）；新たな抗原受容体ベータラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトガンマクリスタリン又はユビキチン（Ａｆｆｉｌｉｎ分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ノッティンファミリーのタンパク質、ペプチドアプタマー、フィブロネクチン（アドネクチン）などのマイクロボディからなる群より選択される。
【００６４】
リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するように操作され得る円錐構造の開放端に多数のループを備えた剛性のベータシート二次構造を有する。アンチカリンは、サイズが１６０から１８０の間のアミノ酸であり、リポカリンに由来する。さらなる詳細については、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、米国特許第７２５０２９７号、及び米国特許公開第２００７０２２４６３３号を参照のこと。
【００６５】
設計アンキリンリピートタンパク質Ｄ（ＤＡＲＰｉｎ）は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への結合を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、二つのアルファヘリックス及びベータターンからなる３３残基モチーフである。それらは、各リピートの第１のアルファヘリックス及びベータターンの残基を無作為することにより、異なる標的抗原に結合するよう操作され得る。それらの結合界面は、モジュール数を増加させること（親和性成熟法）により、増加し得る。さらなる詳細については、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)及びJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)及び米国特許公開第２００４０１３２０２８号を参照のこと。
【００６６】
単一ドメイン抗体は、単一モノマー可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科の動物の抗体重鎖の可変ドメインに由来する（ナノボディ又はＶＨＨ断片）。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律型ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメに由来するＶＮＡＲ断片が含まれる。
【００６７】
参照分子として「同一のエピトープに結合する抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照分子のその抗原への結合をブロックする抗原結合分子、また逆に競合アッセイにおいて５０％以上、抗原結合分子のその抗原への結合をブロックするその参照分子を指す。
【００６８】
用語「抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、抗原の一部又は全部に補完的である部分を含む抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみを結合することができ、この部分はエピトープと言われる。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続ストレッチ又は非連続アミノ酸の異なる領域で構成されるコンフォメーション構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、血液血清、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が存在しない、腫瘍細胞の表面、ウイルス感染細胞の表面、他の疾患細胞の表面、免疫細胞の表面上にみられる。本明細書において抗原として有用なタンパク質は、特に明記されていない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳類を含む、あらゆる脊椎動物由来の天然型のタンパク質であり得る。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書で特定のタンパク質が参照される場合、該用語は、「完全長」、未処理のタンパク質、細胞でのプロセシングから生じたタンパク質の任意の形態を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００７０】
「特異的結合」とは、結合が抗体について選択的であり、不要又は非特異的な相互作用と区別され得ることを意味する。抗原結合分子の特定の抗原へ結合する能力は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られる他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び従来の結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）のいずれかにより測定することができる。一実施態様において、抗原結合分子の、無関係なタンパク質への結合の程度は、例えば、ＳＰＲによって測定される場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ未満、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００７１】
「親和性」又は「結合親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができ、これは、解離及び会合の速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比率である。よって、速度定数の比が同じままである限り、同等の親和性は異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）である。
【００７２】
用語「腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）」とは、腫瘍細胞により又は腫瘍間質中で高度に発現する任意の抗原を意味する。腫瘍関連という用語は、ＴＡＡが完全には特異的ではなく、むしろ腫瘍又はその間質で過剰発現していることを示す。特定の腫瘍関連抗原はＣＥＡ又はＦＡＰであるが、他の標的、例えば葉酸受容体（ＦｏｌＲ１）、ＭＣＳＰ、ＥＧＦＲファミリー（ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲ／ＨＥＲ１）、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＴｅｎＣ、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ１、ＭＵＣ１（ＣＡ１５−３）ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）及び５Ｔ４（トロホブラスト糖タンパク質）でもある。特定のＴＡＡは、ＦＡＰ、ＣＥＡ及びＦｏｌＲ１を含む。
【００７３】
プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ  ３．４．２１）としても知られる用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」とは、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物由来のあらゆるネイティブＦＡＰを指す。その用語は、「完全長」、未処理のＦＡＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＦＡＰを包含する。その用語はまた、天然に存在するＦＡＰの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合することができる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号１２０）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４４５１．２に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸の位置２６から７６０へ延びる。Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄヒトＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号１２１に示されている。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ  アクセッション番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号１２２）、又はＮＣＢＩ    ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸の位置２６から７６１へ延びる。配列番号１２３は、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄマウスＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。配列番号１２４は、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄカニクイザルＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子は、ＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。例示的な抗ＦＡＰ結合分子は、国際公開第２０１２／０２０００６  Ａ２号に記載されている。
【００７４】
癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られる用語「癌胎児性抗原（ＣＥＡ）」は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物由来のあらゆるネイティブＣＥＡを指す。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ  アクセッション番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号１２５）に示されている。ＣＥＡは腫瘍関連抗原として長く同定されてきた（Gold and Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002）。元来胎児組織でのみ発現するタンパク質として分類されていたＣＥＡは、現在いくつかの正常な成人組織で同定された。これらの組織は、消化管、呼吸器、及び泌尿生殖器の細胞、並びに結腸、子宮頸部、汗腺、及び前立腺の細胞を含む、主に上皮由来である（Nap et al., Tumour Biol., 9(2-3):145-53, 1988; Nap et al., Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992）。上皮由来の腫瘍及びそれらの転移は、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを含有する。ＣＥＡそれ自体の存在はがん性細胞への形質転換を示すものではないが、ＣＥＡの分布が示す。正常組織では、ＣＥＡは一般的に細胞の頂端表面で発現し（Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)）、血流中の抗体に到達できないようにする。正常組織とは対照的に、ＣＥＡは、がん性細胞の表面全体にわたって発現する傾向がある（Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)）。この発現パターンの変化により、ＣＥＡはがん性細胞における抗体結合にアクセスしやすくなる。さらに、ＣＥＡ発現はがん性細胞において増加する。さらに、ＣＥＡ発現の増加は、細胞間接着の増加を促進し、これは転移につながる可能性がある（Marshall J., Semin Oncol., 30(a Suppl. 8):30-6, 2003）。様々な腫瘍実体におけるＣＥＡ発現の有病率は、一般的に非常に高い。公表されたデータと一致して、組織試料中で行われた独自の分析は、その高い有病率を確認し、結腸直腸癌（ＣＲＣ）ではおよそ９５％、膵臓がんでは９０％、胃がんでは８０％、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ、ＨＥＲ３と共発現）では６０％、及び乳がんでは４０％であった；小細胞肺がん及び神経膠芽腫では低い発現率がみられた。
【００７５】
ＣＥＡは細胞表面から容易に切断され、腫瘍から直接又はリンパ管を介して血流に放出される。この特性により、血清ＣＥＡのレベルは、がんの診断及びがん、特に結腸直腸がんの再発のスクリーニングのための臨床マーカーとして使用されてきた（Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006）。
【００７６】
用語「ＦｏｌＲ１」とは、葉酸受容体アルファを指し、それは、多くのがんの潜在的な予後及び治療標的として同定されてきた。該用語は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物起源からのあらゆるネイティブＦｏｌＲ１を指す。ヒトＦｏｌＲ１のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１５３２８（配列番号１２６）に示され、マウスＦｏｌＲ１はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３５８４６（配列番号１２７）のアミノ酸配列を有し、カニクイザルＦｏｌＲ１は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｇ７ＰＲ１４（配列番号１２８）に示されるアミノ酸配列を有する。ＦｏｌＲ１は、細胞の細胞膜に発現するＮ−グリコシル化タンパク質である。ＦｏｌＲ１は、葉酸及びいくつかの還元葉酸誘導体に対して高い親和性を有し、細胞内への生理的葉酸、５−メチルテトラヒドロ葉酸の送達を媒介する。ＦＯＬＲ１は、卵巣がんの大部分、並びに多くの子宮、子宮内膜、膵臓、腎臓、肺、及び乳がんで過剰発現されるが、正常組織でのＦＯＬＲ１の発現は、腎臓近位尿細管の上皮細胞の頂端膜、肺の肺胞肺細胞、膀胱、精巣、脈絡叢、及び甲状腺に限定されているため、ＦＯＬＲ１対象がん療法の望ましい標的である。最近の研究では、ＦｏｌＲ１発現は、トリプルネガティブ乳がんにおいて特に高いことが同定された（Necela et al. PloS One 2015, 10(3), e0127133）。
【００７７】
用語「ＭＣＳＰ」とは、コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）としても知られるメラノーマ関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカンを指す。該用語は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物起源からのあらゆるネイティブＦｏｌＲ１を指す。ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ  アクセッション番号Ｑ６ＵＶＫ１（配列番号１２９）に示されている。ＭＣＳＰは、細胞膜上に発現するＮ結合２８０ｋＤａ糖タンパク質成分及び４５０ｋＤａコンドロイチン硫酸プロテオグリカン成分からなる、高度にグリコシル化された内在性膜コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである（Ross et al., Arch. Biochem. Biophys. 1983, 225:370-38）。ＭＣＳＰは、多くの正常及び形質転換細胞においてより広く分布している。特に、ＭＣＳＰは、表皮のほぼすべての基底細胞にみられる。ＭＣＳＰは、メラノーマ細胞で異なって発現し、分析された良性母斑及びメラノーマ病変の９０％以上で発現することがわかった。ＭＣＳＰはまた、基底細胞癌を含む非メラニン細胞起源の腫瘍、神経堤期限の様々な腫瘍、及び乳癌に発現することがわかった。
【００７８】
本明細書で使用される場合の「Ｔ細胞抗原」とは、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に存在する抗原決定基を指す。
【００７９】
本明細書で使用される場合の「Ｔ細胞活性化治療剤」とは、対象におけるＴ細胞活性化を誘導することができる治療剤、特に対象におけるＴ細胞活性化を誘導するために設計された治療剤を指す。Ｔ細胞活性化治療剤の例は、ＣＤ３等の活性化Ｔ細胞抗原、及びＣＥＡ又は葉酸受容体等の標的細胞抗原に特異的に結合する二重特異性抗体を含む。
【００８０】
本明細書で使用される場合の「活性化Ｔ細胞抗原」とは、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球により表される抗原決定基を指し、これは抗原結合分子との相互作用時にＴ細胞活性を誘発又は増強することができる。具体的には、抗原結合分子の活性化Ｔ細胞抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを引き起こすことにより、Ｔ細胞活性化を誘発し得る。例示的な活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。
【００８１】
用語「ＣＤ３」は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物起源からのあらゆるネイティブＣＤ３を指す。その用語は、「完全長」、未処理のＣＤ３並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＣＤ３を包含する。その用語はまた、天然に存在するＣＤ３の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。一実施態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のエプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０００７２４．１に示されている。配列番号１３０も参照のこと。カニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］のアミノ酸配列ＣＤ３εは、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１に示されている。配列番号１３１も参照のこと。
【００８２】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは、一般的に同様の構造を有し、各ドメインは、四つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び三つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照のこと。単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。
【００８３】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲＳを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称され、これらの用語は、本明細書では、抗原結合領域を形成する可変領域の部分を参照して互換的に使用される。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) and by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記載されており、定義は、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。ただし、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及するためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内であることが意図されている。上記の引用文献のそれぞれにより定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下表Ｂに示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及びサイズに依拠する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮してどの残基が特定のＣＤＲを含むかを常套的に決定することができる。
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１表ＡのすべてのＣＤＲ定義は、Ｋａｂａｔ等により規定された番号付け規約に準拠する（以下を参照）。
２表Ａで使用される小文字の「ｂ」を用いる「ＡｂＭ」は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「ＡｂＭ」抗体モデリングソフトウェアにより定義されるＣＤＲを指す。
【００８４】
Ｋａｂａｔ等はまた、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列のための番号付けシステムも定義した。当業者は、配列自体を超えるいかなる実験データに依存することなく、この「カバット番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」とは、Ｋａｂａｔ等、U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983)に規定される番号付けシステムを指す。別途明記しない限り、抗体可変領域における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに準拠する。
【００８５】
ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、略称（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ−）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照のこと）別途指示がない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
【００８６】
本明細書で使用される場合、抗原結合分子（例えば抗体）に関連する用語「親和性成熟」とは、例えば突然変異により参照抗原結合分子に由来し、参照抗体と同じ抗原に結合し、好ましくは同じエピトープに結合する抗原結合分子を指し；抗原に対して、参照抗原結合分子よりも高い親和性を有する。親和性成熟は、一般に、抗原結合分子の一又は複数のＣＤＲにおける一又は複数のアミノ酸残基の修飾を含む。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、当初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
【００８７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００８８】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【００８９】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
【００９０】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００９１】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全て又は実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、定常領域が元の抗体のそれからさらに改変又は変更されて、本発明による特性が生成されたものである。
【００９２】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００９３】
本明細書における用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、およそ２３１の位置のアミノ酸残基からおよそ３４０の位置のアミノ酸残基へ延びる。一実施態様では、炭水化物鎖はＣＨ２ドメインに結合している。本明細書におけるＣＨ２ドメインは、ネイティブ配列  ＣＨ２ドメイン又は変異ＣＨ２ドメインであり得る。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域における残基Ｃ末端からＣＨ２ドメインの残基のストレッチ（すなわち、ＩｇＧのおよそ３４１の位置のアミノ酸残基からおよそ４４７の位置のアミノ酸残基）を含む。本明細書におけるＣＨ３領域は、ネイティブ配列  ＣＨ３ドメイン又は変異ＣＨ３ドメインであり得る（例えば、ＣＨ３ドメインは、一方の鎖に、導入された「突起」（「ノブ」）を有し、他方に対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有する；米国特許第５，８２１，３３３号を参照。この文献は参照により本明細書に明示的に援用される）。そのような変異ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載の二つの非同一抗体重鎖のヘテロ二量化を促進するために使用され得る。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al.,sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う（Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991）。
【００９４】
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；同第７，６９５，９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般的に、該方法は、突起が空洞中に位置し、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモダイマー形成を妨げることができるように、第１のポリペプチドの界面の突起（「ノブ」）を第２のポリペプチドの界面の空洞（「ホール」）に導入することを含む。突起は、第１ポリペプチドの界面由来の小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより、構成される。突起と同一又は類似のサイズの代償的な空洞は、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの界面に創出される。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を改変することによって、例えば部位特異的変異誘発、又はペプチド合成によって作製することができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方でアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方でアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらに具体的な実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これら二つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の二つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、よってダイマーをさらに安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【００９５】
「免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域」とは、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、並びに置換、付加、又は欠失を生じるが、エフェクター機能を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に減少させない変異体（抗体依存性細胞傷害など）が含まれる。例えば、一又は複数のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に損失することなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失され得る。そのような変異体は、活性への影響が最小になるように、当該技術分野で知られる一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)を参照）。
【００９６】
用語「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化を含む。
【００９７】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による関与に続いて、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を実施するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１を参照）。
【００９８】
用語「ペプチドリンカー」とは、一又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載される。適切な、非免疫原性ペプチドリンカーは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は一般的に１から１０の間、典型的には２から４の間の数、特に２であり、すなわち、ペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３３）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１３４）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１３５）からなる群より選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１３６）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１３７）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１３８）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１３９）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号１４０）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１４１）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１４２）、ＧＧＳＧ（配列番号１４３）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１４４）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１４５）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号１４６）も含む。特に対象となるペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号１３２）、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１３３）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１３７）及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１３８である。
【００９９】
本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を示す。
【０１００】
「融合した」又は「結合した」とは、構成要素（例えば、４−１ＢＢＬのポリペプチド及びエクトドメイン）が、直接又は一若しくは複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合により結合されていることを意味する。
【０１０１】
「参照ポリペプチド（タンパク質）配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ．ＳＡＷＩ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：分数Ｘ／Ｙの１００倍。ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように、得られる。
【０１０２】
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作成され得る。置換突然変異の対象となる部位は、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）を含む。保存的置換が、表Ｃの「好ましい置換」の見出しの下に提供され、アミノ酸側鎖のクラス（１）から（６）を参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の分子に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされた。
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【０１０３】
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１０４】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスに交換することを必要とするであろう。
【０１０５】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親の抗原結合分子（例えばヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般的には、さらなる研究のために選択され得られた変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の減少）を有し、及び／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持することになる。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイベースの親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔には、一又は複数のＣＤＲ残基は変異し、変異体抗原結合分子は、ファージディスプレイされ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、そのような改変が、抗原結合分子の抗原へ結合する能力を実質的に低下させない限り、置換、挿入、又は欠失は、一又は複数のＣＤＲで生じ得る。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＣＤＲ内で行うことができる。突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造が、抗体と抗原との間の接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１０６】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗原結合分子が含まれる。分子の他の挿入変異体は、抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドに対するＮ末端又はＣ末端への融合を含む。
【０１０７】
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。分子のグリコシル化変異体は、一又は複数のグリコシル化部位が創出又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に得ることができる。抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合には、それに結合する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に結合した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばＷｒｉｇｈｔらのTIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。いくつかの実施態様において、抗原結合分子におけるオリゴ糖の改変は一定の改善された特性を有する抗体変異型を作成するために行われ得る。一態様において、抗原結合分子の変異体は、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）結合されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。このようなフコシル化変異体は、ＡＤＣＣ機能を改善した可能性がある。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ、Ｌ．）又は米国特許公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照のこと。本発明の抗原結合分子のさらなる変異体は、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を有するものを含む。そのような変異体は、フコシル化を低下させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善した可能性がある。例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairet et al.）；米国特許第６，６０２，６８４号（Umana et al.）；及び米国特許公開第２００５／０１２３５４６号（Umana et al.）を参照のこと。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善した可能性があり、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【０１０８】
特定の実施態様では、本発明の抗原結合分子のシステイン改変変異体、例えば、分子の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭＡｂ」を作成することが望ましいことがある。特定の実施態様において、置換された残基は、分子のアクセス可能な部位で起きる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。特定の実施態様では、以下の残基の一又は複数がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗原結合分子は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０１０９】
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子は、当技術分野で知られ、容易に入手されている追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を含有する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーはいずれかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合している場合、ポリマーは同一又は異なる分子であり得る。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのか等を考慮しながら決定することができる。別の態様では、放射線への曝露により選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。別の態様では、本明細書で提供される４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子のイムノコンジュゲートを得ることができる。「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性剤を含むがこれらに限定されない、一又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【０１１０】
用語「ポリヌクレオチド」とは、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は非従来の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」とは、ポリヌクレオチドに存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１１１】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、天然環境から除去された、核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞で維持された組み換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含むポリヌクレオチド分子に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのＲＮＡ転写物、並びに正及び負の鎖形態、並びに二本鎖形態が含まれる。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成的に生成されたそのような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネータのような制御因子であり得るか、又はそれらを含み得る。
【０１１２】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一の」ポリヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり最大５つの点変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、参照配列中最大５％のヌクレオチドが欠失されるか若しくは別のヌクレオチドで置換されてもよく、又は参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％のヌクレオチドの数が参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこれらの改変は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置、又はそれらの末端位置の間のどこかに生じる可能性があり、参照配列内の残基間又は参照配列内の一又は複数の隣接するグループ内に個別に散在する。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかは、ポリペプチドについて上述されるものなどのコンピュータプログラム（例えば、ＡＬＩＧＮ−２）を使用して決定することができる。
【０１１３】
用語「発現カセット」とは、標的細胞中の特定の核酸の転写を許可する一連の特定の核酸要素と組み換えて又は合成して生成されたポリヌクレオチドを指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分は、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１１４】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞において作用可能に関連している特定の遺伝子の発現を導入及び指示するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、多量の安定的なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞の転写及び／又は翻訳機構によって生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
【０１１５】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が本明細書において含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができる任意の種類の細胞系である宿主細胞は、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞だけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内に含まれる細胞も含む。
【０１１６】
薬剤の「有効量」とは、それが投与される細胞又は組織に生理学的変化をもたらすのに必要な量を指す。
【０１１７】
本発明に従った併用療法は、相乗効果を有する。二つの化合物の「相乗効果」は、二つの薬剤の組み合わせの効果が、それらの個別の効果の合計よりも大きく、コントロール及び単剤とは統計的に異なるものである。別の実施態様では、本明細書に開示される併用療法は追加の効果を有する。二つの化合物の「追加の効果」は、二つの薬剤の組み合わせの効果が、それらの個別の効果の合計であり、コントロール及び／又は単剤のいずれかとは統計的に異なるものである。
【０１１８】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、例えば、疾患の悪影響を排除、減少、遅延、最小化又は防止する。
【０１１９】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１２０】
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する対象にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【０１２１】
「薬学的に許容される担体」とは、対象に対して非毒性である、活性成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容される添加剤は、限定されないが、バッファー、安定剤、又は保存剤を含む。
【０１２２】
用語「添付文書」は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに使用され、このような治療製品の使用に関する指示、使用法、用量、投与、併用療法、禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（又は「治療する（ｔｒｅａｔ）」若しくは「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」等のその文法的変化形）は、治療されている個体の自然の経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過においての何れかで実施できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。いくつかの実施態様において、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【０１２４】
本明細書で使用される用語「がん」は、固形腫瘍又はメラノーマなどの増殖性疾患を指す。
【０１２５】
本発明における使用のための例示的な標的ＯＸ４０アゴニスト
特に、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用される標的ＯＸ４０アゴニストは、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体である。
【０１２６】
特に、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体は、抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）／抗ＯＸ４０二重特異性抗体である。一態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０抗体はＯＸ４０アゴニストである。一態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０抗体は、Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０抗体は、Ｆｃγ受容体結合及び／又はエフェクターを低下させる修飾を有するＦｃドメインを含む抗原結合分子である。腫瘍関連抗原による架橋は、不特定のＦｃγＲ媒介架橋を回避することを可能にし、よって、一般的なＯＸ４０抗体と比較して、より高用量でより有効な用量の抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０抗体が投与され得る。
【０１２７】
一態様では、本発明は、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体を提供し、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用され、二重特異性ＯＸ４０抗体は、
（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含むＦＡＰへの特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１２８】
さらなる態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰへの特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメイン、又は配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインを含む。
【０１２９】
特定の態様では、二重特異性ＯＸ４０抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰへの特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。別の態様では、二重特異性ＯＸ４０抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰへの特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１３０】
さらなる態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、
（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｅ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｆ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｇ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）
を含むＯＸ４０への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１３１】
より具体的には、二重特異性ＯＸ４０抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含むＯＸ４０への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１３２】
さらなる態様では、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、
（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ａ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ａ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）
を含むＯＸ４０への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１３３】
特定の態様では、二重特異性ＯＸ４０抗体は、（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含むＯＸ４０への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１３４】
より具体的には、二重特異性ＯＸ４０抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含むＯＸ４０への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む。
【０１３５】
一態様では、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体は、安定的会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である。特に、二重特異性ＯＸ４０抗体は、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。より具体的には、二重特異性ＯＸ４０抗体は、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、二重特異性ＯＸ４０抗体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【０１３６】
本発明の別の態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、腫瘍関連標的への一価結合及びＯＸ４０への少なくとも二価の結合を含む。一態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体は、腫瘍関連標的への一価結合及びＯＸ４０への二価結合を含む。特定の態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体は、腫瘍関連標的への一価結合及びＯＸ４０への四価結合を含む。
【０１３７】
別の態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、二重特異性ＯＸ４０抗体は、ＣＨ１ドメインのＣ末端でＯＸ４０への特異的結合が可能な第２のＦａｂ断片のＶＨドメインに融合した、ＯＸ４０への特異的結合が可能な第１のＦａｂ断片と、ＣＨ１ドメインのＣ末端でＯＸ４０への特異的結合が可能な第４のＦａｂ断片のＶＨドメインに融合した、ＯＸ４０への特異的結合が可能な第３のＦａｂ断片とを含む。
【０１３８】
一態様では、本明細書上記のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、（ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号５５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む四つの軽鎖、又は（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号５８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む四つの軽鎖、又は（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む四つの軽鎖、又は（ｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む四つの軽鎖を含む。
【０１３９】
特定の一態様では、本明細書に記載のがんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用のための、がんの腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、特に抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体が提供され、ここで二重特異性ＯＸ４０抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号５５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む四つの軽鎖を含む。
【０１４０】
本発明における使用のための例示的な抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体
本発明は、標的ＯＸ４０アゴニスト、及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたそれらの使用、特にがんの進行を治療する又は遅延させるための、より具体的には固形腫瘍の進行を治療する又は遅延させるための方法におけるそれらの使用に関する。特に、腫瘍関連抗原はＣＥＡである。本明細書で使用される抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びＣＥＡに結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体である。
【０１４１】
よって、本明細書で使用される抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン、並びに重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０１４２】
特定の態様では、組み合わせでの使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号６５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；並びに／又は配列番号６６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。より具体的には、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。さらなる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
【０１４３】
一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、完全長抗体である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、ヒトＩｇＧクラスの抗体、特にヒトＩｇＧ１クラスの抗体である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、抗体断片、特にＦａｂ分子又はｓｃＦｖ分子、より具体的にはＦａｂ分子である。特定の態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、交差Ｆａｂ分子であり、ここでＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインは交換される（すなわち、互いに置き換えられる）。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、ヒト化抗体である。
【０１４４】
別の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３  二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号７１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号７２のＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号７３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに／又は配列番号７４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号７５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号７６のＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）配列番号７９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号８０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号８１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに／又は配列番号８２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号８３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号８４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＥＡ）
を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０１４５】
より具体的には、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号７８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。さらなる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。別の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号８６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。さらなる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０１４６】
別の特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインを含む。特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号７１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号７２のＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号７３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに／又は配列番号７４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号７５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号７６のＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）配列番号７９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号８０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号８１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに／又は配列番号８２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号８３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号８４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む第３の抗原結合ドメインを含む。
【０１４７】
より具体的には、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号７８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。さらなる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。別の特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号８６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。さらなる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。
【０１４８】
さらなる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている交差Ｆａｂ分子であり、第２及び第３の（存在する場合）抗原結合ドメインが、従来のＦａｂ分子である、二重特異性抗体である。
【０１４９】
別の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合し、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合し、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、二重特異性抗体である。
【０１５０】
Ｆａｂ分子は、Ｆｃドメインに、又は、互いに直接又は一若しくは複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０のアミノ酸を含むペプチドリンカーを通じて融合され得る。ペプチドリンカーは当該技術分野で知られており、本明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーは、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーを含む。概して、「ｎ」は、１から１０、典型的には２から４の整数である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸の長さを有し、一実施態様では５から１００の長さ、さらなる実施態様では１０から５０アミノ酸の長さを有する。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリンであり、（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、及びｍ＝０、１、２又は３であり）、一実施態様では、ｘ＝４及びｎ＝２又は３であり、さらなる実施態様では、ｘ＝４及びｎ＝２である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合するのに特に適切なペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖を結合するに適した例示的なペプチドリンカーは、配列（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２を含む。別の適切なそのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含むさらに、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含み得る。特に、Ｆａｂ分子は、ＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合している場合、追加のペプチドリンカーの有無にかかわらず、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して融合され得る。
【０１５１】
さらなる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【０１５２】
特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号８７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の二つのポリペプチド、配列番号８８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド、配列番号８９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド、及び配列番号９０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗体は、配列番号８７の二つのポリペプチド、配列番号８８のポリペプチド、配列番号８９のポリペプチド、及び配列番号９０のポリペプチド（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ）を含む。
【０１５３】
さらなる特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号９１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の二つのポリペプチド、配列番号９２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド、配列番号９３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド、及び配列番号９４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗体は、配列番号９１の二つのポリペプチド、配列番号９２のポリペプチド、配列番号９３のポリペプチド、及び配列番号９４のポリペプチド（ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ）を含む。
【０１５４】
特定の二重特異性抗体は、ＰＣＴ出願の国際公開第２０１４／１３１７１２  Ａ１号に記載されている。
【０１５５】
さらなる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））も含み得る。さらなる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、国際公開第２００７／０７１４２６号又は同第２０１４／１３１７１２号に記載されている二重特異性抗体である。別の態様では、二重特異性抗体はＭＥＤＩ５６５（ＡＭＧ２１１）である。
【０１５６】
本発明における使用のための例示的な抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体
本発明は、抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３抗体、及び標的ＯＸ４０アゴニストと組み合わせたそれらの使用、特にがんの進行を治療する又は遅延させるための、より具体的には固形腫瘍の進行を治療する又は遅延させるための方法におけるそれらの使用に関する。本明細書で使用される抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びＦｏｌＲ１に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体である。特に、本明細書に記載される抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＦｏｌＲ１に結合する第３の抗原結合ドメインを含む。
【０１５７】
一態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン、重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第２の抗原結合ドメイン、重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第３の抗原結合ドメイン、及び三倍の共通軽鎖可変領域を含む。
【０１５８】
別の態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号９５のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号９６のＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号９７のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含み；第２の抗原結合ドメインは、配列番号９８のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号９９のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１００のＣＤＲ−Ｌ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含み；第３の抗原結合ドメインは、配列番号９８のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号９９のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１００のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含み；共通軽鎖は、配列番号１０１のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１０２のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０３のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。別の態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１０４の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含み；第２の抗原結合ドメインは、配列番号１０５の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含み；第３の抗原結合ドメインは、配列番号１０５の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含み；共通軽鎖は、配列番号１０６の配列を含む。
【０１５９】
特定の態様では、抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１０９の三倍の共通軽鎖を含む。
【０１６０】
本発明における使用のためのＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤
本発明の一態様では、標的ＯＸ４０アゴニスト、特に腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体は、がんの進行を治療する又は遅延させるための方法における使用を目的とし、ここで標的ＯＸ４０アゴニストは、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用され、さらに、それらは、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤と組み合わせされる。一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト又はＰＤ−１結合アンタゴニストである。特に、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体である。
【０１６１】
ＣＤ２７４又はＢ７−Ｈ１としても知られる用語「ＰＤ−Ｌ１」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物由来のあらゆるネイティブＰＤ−Ｌ１、特に「ヒトＰＤ−Ｌ１」を指す。完全ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７（配列番号１１０）に示されている。用語「ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト」は、ＰＤ−Ｌ１とその結合パートナーの一又は複数（ＰＤ−１、Ｂ７−１など）との相互作用から生じるシグナル伝達を減少させ、ブロックし、阻害し、抑止し、又は妨害する分子を指す。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１のその結合パートナーへの結合を阻害する分子を指す。特定の態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１及び／又はＢ７−１への結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、及びＰＤ−Ｌ１とその結合パートナーの一又は複数（ＰＤ−１、Ｂ７−１など）との相互作用から生じるシグナル伝達を減少させ、ブロックし、阻害し、抑止し、又は妨害するその他の分子を含む。一実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１を通じたＴリンパ球媒介シグナル伝達に発現される細胞表面タンパク質を介して、又はそれを通じて負の共刺激シグナルを低減し、機能不全のＴ細胞の機能不全を軽減します（たとえば、抗原認識に対するエフェクター応答の増強）。特に、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。用語「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」又は「ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体」又は「ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体」又は「アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１」は、ＫＤ値が、１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、一実施態様においては１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性でヒトＰＤ−Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、スウェーデン、ウプサラ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の標準的な結合アッセイにより決定される。
【０１６２】
特定の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）及びＭＤＸ−１１０５からなる群より選択される。特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載のＹＷ２４３．５５  Ｓ７０である。別の特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載のＭＤＸ−１１０５である。さらに別の特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）である。またさらなる態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）である。より具体的には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）である。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、配列番号１１２の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ−１）及び配列番号１１３の軽鎖可変ドメイン  ＶＬ（ＰＤＬ−１）を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、配列番号１１４の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ−１）及び配列番号１１５の軽鎖可変ドメイン  ＶＬ（ＰＤＬ−１）を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０１６３】
ＣＤ２７９、ＰＤ１又はプログラム細胞死タンパク質１としても知られる用語「ＰＤ−１」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物起源からのあらゆるネイティブＰＤ−Ｌ１、特にＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｑ１５１１６（配列番号１１１）に示されるアミノ酸配列を有する  「ヒトタンパク質ＰＤ−１」を指す。用語「ＰＤ−１結合アンタゴニスト」は、ＰＤ−１のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子を指す。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ２への結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２両方への結合を阻害する。特に、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。用語「抗ＰＤ−１抗体」又は「ヒトＰＤ−１に結合する抗体」又は「ヒトＰＤ−１に特異的に結合する抗体」又は「アンタゴニスト抗ＰＤ−１」は、ＫＤ値が、１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、一実施態様においては１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性でヒトＰＤ−１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、スウェーデン、ウプサラ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の標準的な結合アッセイにより決定される。
【０１６４】
一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、抗ＰＤ−１抗体である。特定の態様では、抗ＰＤ−１抗体は、ＭＤＸ  １１０６（ニボルマブ）、ＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）、ＣＴ−０１１（ピジリズマブ）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、及びＢＧＢ−１０８から、特にペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、配列番号１１６の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ−１）及び配列番号１１７の軽鎖可変ドメイン  ＶＬ（ＰＤ−１）を含む抗ＰＤ−１抗体である。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、配列番号１１８の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ−１）及び配列番号１１９の軽鎖可変ドメイン  ＶＬ（ＰＤ−１）を含む抗ＰＤ−１抗体である。
【０１６５】
本発明における使用のための二重特異性抗体の調製
特定の態様では、組み合わせて使用される治療剤は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体を含む。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、結合特異性は異なる抗原に対するものである。特定の態様では、結合特異性は、同一抗原上の異なるエピトープに対するものである。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１６６】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello、Nature 305:537(1983)）、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び「ノブ・イントゥ・ホール」技術（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）、二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）、二重特異性抗体断片を作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）、及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０１６７】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）。
【０１６８】
本明細書中の抗体又は断片は、二つの異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用性ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えば、米国特許公開第２００８／００６９８２０号参照）。「Ｃｒｏｓｓｍａｂ」抗体も本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、同第２００９／０８０２５２号、同第２００９／０８０２５３号、同第２００９／０８０２５４号を参照）。
【０１６９】
二重特異性抗体断片を作製するための別の技術は、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」又はＢｉＴＥ（登録商標）手法である（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、同第２００５／０６１５４７号、同第２００７／０４２２６１号、及び同第２００８／１１９５６７号を参照）。この手法は、単一ポリペプチドに配置される二つの抗体可変ドメインを用いる。単一ポリペプチド鎖は、二つの単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含み、それらはそれぞれ、二つのドメイン間の分子内会合を可能にするのに十分な長さのポリペプチドリンカーにより分離された可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（Ｖｌ）ドメインを有する。この単一ポリペプチドは、二つのｓｃＦｖ断片間のポリペプチドスペーサー配列をさらに含む。各ｓｃＦｖは異なるエピトープを認識し、これらのエピトープは異なる細胞タイプに特異的である可能性があるため、各ｓｃＦｖがその同族のエピトープに関与するとき、二つの異なる細胞タイプの細胞が近接又はテザーされる。この手法の特定の一実施態様は、悪性又は腫瘍細胞等の標的細胞により発現される細胞表面抗原を認識する別のｓｃＦｖに結合した免疫細胞、例えばＴ細胞上のＣＤ３ポリペプチド、により発現された細胞表面抗原を認識するｓｃＦｖｒを含む。
【０１７０】
それは単一ポリペプチドであるため、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、当該技術分野で知られる任意の原核生物又は真核生物細胞発現系、例えばＣＨＯ細胞株、を使用して発現され得る。しかしながら、特定の精製技術（例えばＥＰ１６９１８３３を参照）は、モノマーの意図した活性以外の生物活性を有し得る他の多量体種からモノマーの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを分離する必要がある可能性がある。例示的な一精製スキームでは、分泌されたポリペプチドを含有する溶液は、最初に金属アフィニティークロマトグラフィーにかけられ、ポリペプチドはイミダゾール濃度の勾配で溶出される。この溶出液はアニオン交換クロマトグラフィーを使用してさらに精製され、ポリペプチドは塩化ナトリウム濃度の勾配を使用して溶出される。最後に、この溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーにかけて多量体種からモノマーを分離する。一態様では、本発明で使用される二重特異性抗体は、ペプチドリンカーにより互いに融合した二つの単鎖ＦＶ断片（ｓｃＦＶ）を含む単一ポリペプチド鎖から構成される。
【０１７１】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減するＦｃドメイン修飾
本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含むポリペプチド鎖の対からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインはダイマーであり、その各サブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの二つのサブユニットは、互いに安定した会合が可能である。
【０１７２】
Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に、標的組織における良好な蓄積及び好ましい組織血液分布比に寄与する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態特性を付与する。しかしながら、同時に、それは、好ましい抗原保有細胞ではなく、本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を、Ｆｃ受容体を発現する細胞にもたらし得る。したがって、特定の態様では、本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を示す。一態様では、Ｆｃは、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインは、エフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低減には、限定されないが、以下の一又は複数が含まれ得る：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞への結合の低減、マクロファージへの結合の低減、単球への結合の低減、多形核細胞への結合の低減、アポトーシスを誘発する直接シグナル伝達の低減、樹状細胞の成熟の低減、又はＴ細胞のプライミングの低減。
【０１７３】
特定の態様では、一又は複数のアミノ酸修飾は、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによりＦｃ領域変異体が生成され得る。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置でアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１７４】
特定の態様では、本発明は抗体を提供し、ここでＦｃドメインは、Ｆｃ受容体へ、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる一又は複数のアミノ酸配列を含む。
【０１７５】
一態様では、本発明の抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能に対するＦｃドメインの結合親和性を減少させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸変異が、Ｆｃドメインの二つのサブユニットのそれぞれに存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＥＵ番号付け）の位置でアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の位置２３４及び２３５（ＥＵ番号付け）及び／又３２９（ＥＵ番号付け）でアミノ酸置換を含む。より具体的には、ＩｇＧ重鎖にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む本発明の抗体が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ突然変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」組み合わせは、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全になくし、国際出願第２０１２／１３０８３１  Ａ１号に記載されており、これは、そのような変異Ｆｃドメインを調製する方法及びその特性、例えばＦｃ受容体結合又はエフェクター機能を決定するための方法も記載する。
【０１７６】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低減したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一又は複数の置換を有するものも含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１７７】
別の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及びエフェクター機能の低減を示す。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ番号付け）でアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。そのようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン変異体及びそれらのＦｃγ受容体も国際公開２０１２／１３０８３１号に記載されている。
【０１７８】
変異Ｆｃドメインは、当該技術分野でよく知られる遺伝的又は化学的方法を使用して、アミノ酸欠失、置換、挿入又は修飾により調製することができる。遺伝的方法には、コードするＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などが含まれ得る。正確なヌクレオチド交換は、例えば配列決定により検証され得る。
【０１７９】
Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な機器、及び組み換え発現により得ることができるようなＦｃ受容体を使用して表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により、容易に決定することができる。あるいは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化抗体の結合親和性は、ヒトＮＫ細胞発現ＦｃγＩＩＩａ受容体等の特定のＦｃ受容体を発現させると知られている細胞株を使用して評価され得る。
【０１８０】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で知られる方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)； U.S. Patent No. 5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリーのＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照）。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 95, 652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価され得る。
【０１８１】
いくつかの態様では、補体成分、特にＣ１ｑへのＦｃドメインの結合は低減する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能の低減を有するように操作されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低減は、ＣＤＣの低減を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイは、本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、よってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために行われ得る。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び同第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003);及びCragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照）。
【０１８２】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なる抗原結合部位を含み、よって、Ｆｃドメインの二つのサブユニットは、二つの非同一ポリペプチド鎖に含まれ得る。これらのポリペプチドの組み換え共発現、及びその後の二量体化は、二つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせをもたらす。よって、組み換え生成において本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を改善するために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することは有利であろう。
【０１８３】
したがって、特定の態様では、本発明は、（ａ）腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメイン、（ｂ）ＯＸ４０への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメイン、及び（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインであって、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、Ｆｃドメインに関する。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの二つのサブユニット間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。よって、一態様では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
【０１８４】
特定の態様では、前記修正は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」であり、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの二つのサブユニットのもう一方に「ホール」修飾を含む。よって、本発明は、（ａ）腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメイン、（ｂ）ＯＸ４０への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメイン及び（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインであって、ノブ・イントゥ・ホール法に従ってＦｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む、Ｆｃドメインを含む抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従って番号付け）を含む。
【０１８５】
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；同第７，６９５，９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般的に、該方法は、突起が空洞中に位置し、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモダイマー形成を妨げることができるように、第１のポリペプチドの界面の突起（「ノブ」）を第２のポリペプチドの界面の空洞（「ホール」）に導入することを含む。突起は、第１ポリペプチドの界面由来の小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより、構成される。突起と同一又は類似のサイズの代償的な空洞は、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの界面に創出される。
【０１８６】
したがって、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置可能な第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成する。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を改変することによって、例えば部位特異的変異誘発、又はペプチド合成によって作製することができる。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基はトリプトファン残基（Ｔ３６６Ｗ）で置き換えられ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基はバリン残基（Ｙ４０７Ｖ）で置き換えられる。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに、３６６位のスレオニン残基はセリン残基（Ｔ３６６Ｓ）で置き換えられ、３６８位のロイシン残基はアラニン残基（Ｌ３６８Ａ）で置き換えられる。
【０１８７】
またさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３５４位のセリン残基はさらにシステイン残基（Ｓ３５４Ｃ）で置き換えられ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、３４９位のチロシン残基はさらにシステインン残基（Ｙ３４９Ｃ）で置き換えられる。これら二つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの二つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、ダイマーをさらに安定化する（Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従って番号付け）を含む。
【０１８８】
代替的な態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、ＰＣＴ出願の国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、二つのＦｃドメインサブユニットの界面にある一又は複数のアミノ酸残基の荷電アミノ酸残基での置換を含み、ホモダイマーの形成が静電的に好ましくないが、ヘテロ二量体化が静電的に好ましいようになる。
【０１８９】
本明細書で報告される二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終結する完全なＣ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基の一つ又は二つが除去されている短縮型Ｃ末端であり得る。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は、ＰＧを終結させる短縮型Ｃ末端である。本明細書で報告されるすべての態様の一態様では、本明細書に明記されるＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従って番号付け）を含む。本明細書で報告されるすべての態様の一実施態様では、本明細書に明記されるＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従って番号付け）を含む。
【０１９０】
Ｆａｂドメインにおける修飾
一態様では、本発明は、可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬのいずれかが交換されている少なくとも一つのＦａｂ断片を含む二重特異性抗体に関する。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
【０１９１】
一つの結合アーム（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ−ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ−ＣＬ）にドメイン置き換え／交換を有する多重特異性抗体は、国際公開第２００９／０８０２５２号及びSchaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191に詳細に記載される。それらは、第１の抗原に対する軽鎖と第２の抗原に対する誤った重鎖のミスマッチによって引き起こされる副産物を明らかに減少させる（そのようなドメイン交換なしのアプローチと比較して）。
【０１９２】
一態様では、本発明は、Ｆａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子であって、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、ＣＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置き換えられている、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０１９３】
別の態様では、本発明は、Ｆａｂ断片を含む抗原結合分子であって、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置き換えられている、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０１９４】
別の態様では、正しいペアリングをさらに改善するために、二重特異性抗原結合は、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これらの修飾は、交差又は非交差ＣＨ１及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、ＣＬドメインの一つで、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）により置換されており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、且つＣＨ１ドメインの一つで、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０１９５】
ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記載の抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。
【０１９６】
本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現する多数（例えば二つ以上）のポリヌクレオチドとして、発現し得る。共発現したポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、ジスルフィド結合又はその他の手段を通じて会合し、機能性抗原結合分子を形成し得る。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別個のポリヌクレオチドによりコードされ得る。重鎖ポリペプチドは、共発現するとき、軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成する。
【０１９７】
いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明による抗体全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明による抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
【０１９８】
特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であり得る。
【０１９９】
組み換え方法
本明細書で使用される場合の二重特異性は、例えば、固体状態ペプチド合成（例：Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え生産により得られる。組換え生産のために、例えば上記のような、抗体又はそのペプチド断片をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが、単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。そのようなポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して、容易に単離及び配列決定され得る。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法は、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に抗体（断片）のコーディング配列を含有する発現ベクターを構成するのに使用することができる。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏ組み合わせ／遺伝子組み換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載の技術を参照のこと。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であり得、核酸断片である可能性がある。発現ベクターは、抗体又はそのポリペプチド断片（すなわち、コード領域）をコードするポリヌクレオチドは、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御要素との作用可能な会合でクローニングされる発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されたコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合はコード領域の一部と考えられる。ただし、隣接する配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネータ、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。二つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクトに、例えばシングルベクター上、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクトに、例えば別個の（異なる）ベクター上、に存在し得る。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含有してもよく、又は二つ以上のコード領域を含んでもよい。例えば、本発明のベクターは、タンパク質分解的切断を介して、最終タンパク質に翻訳後又は同時翻訳で分離される一又は複数のポリペプチドをコードし得る。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合のいずれかの異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインなどの特殊化された要素又はモチーフを含む。作用可能な会合とは、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのコード領域が遺伝子産物の発現を調節配列の影響又は制御下に置くような方法で、一又は複数の調節配列と会合している。プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び二つのＤＮＡ断片間の結合の性質が遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨害しない、又��転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨害しない場合、二つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域及びそれに会合するプロモーター等）は、「作用可能に会合」している。したがって、プロモーターがその核酸の転写に影響を与えることができる場合、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と作用可能に会合している。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写制御因子、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルは、細胞特異的転写を指示するためにポリヌクレオチドと作用可能に会合し得る。
【０２００】
適切なプロモーター及び他の転写制御領域が本明細書に開示される。様々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス（例えば、イントロンＡと組み合わせた最初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば、初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルスなど）で機能する転写制御領域が含まれる。その他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギα‐グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来するものや、真核細胞での遺伝子発現を制御できる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）が含まれる。同様に、様々な翻訳制御因子が当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、並びにウイルス系に由来する要素（特に内部リボソーム侵入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットは、複製開始点、及び／又はレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、若しくはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆末端反復（ＩＴＲ）などの染色体組み込み要素などの他の機能も含まれ得る。
【０２０１】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合し得る。例えば、抗体又はそのポリペプチド断片の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗い小胞体にわたる成長タンパク質鎖の輸送が開始されると、成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、翻訳されたポリペプチドから切断されてポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成する、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又はそれに作用可能に会合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換され得る。
【０２０２】
後の精製（例えばヒスチジンタグ）を容易にするために、又は融合タンパク質の標識を助けるために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの内部又は末端に含まれ得る。
【０２０３】
本発明のさらなる態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリペプチド及びベクターに関して、本明細書に記載の特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込んでもよい。一態様では、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、形質転換又はトランスフェクトされた）。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」とは、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するよう操作され得るあらゆる種類の細胞系を指す。複製及び抗原結合分子の発現のサポートに適した宿主細胞が、当該技術分野でよく知られている。そのような細胞は、特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を増殖させて、大規模発酵槽に播種して、臨床用途に十分な量の抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞は、原核微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でないとき、ポリペプチドは細菌内で生成され得る。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製され得る。原核生物に加えて、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす、「ヒト化」されたグリコシル化経路を有する真菌及び酵母の株を含む、糸状菌又は酵母のような真核微生物も、ポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主である。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)、及びLiら、Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。
【０２０４】
グリコシル化ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。今まで多数のバキュロウイルス株が同定されたが、これらは特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用され得る。植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（遺伝子組み換え植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように適合した哺乳動物細胞株は有用であり得る。他の有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児腎臓株（例えば、Graham et al.、J Gen Virol 36、59(1977)に記載の２９３又は２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載のＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)に記載）；ＭＲＣ  ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)）；並びにＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki 及びWu, Methods in Molecular Biology, ２４８巻（B.K.C. Lo, 編., Humana Press, Totowa, NJ), 255-268頁 (2003）を参照。宿主細胞には、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞などの培養細胞が含まれるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内に含まれる細胞も含まれる。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）等の哺乳動物細胞である。これらの系において外来遺伝子を発現させるための標準的な技術が当技術分野で知られている。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現産物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、他の免疫グロブリン鎖も発現するように操作され得る。
【０２０５】
一態様では、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を生成するための方法であって、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で本明細書で提供される本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培地）から回収することを含む方法が提供される。
【０２０６】
特定の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する標的細胞抗原（例えばＦａｂ断片）は、抗原決結合が可能な少なくとも一つの免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然に存在する又は天然に存在しない抗体及びその断片の一部を形成することができ、それに由来することができる、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Harlow and Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用してコンストラクトすることができ、組み換えて生成することができ（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載されるように）、又は、例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５，９６９，１０８号を参照）、得ることができる。
【０２０７】
本発明では任意の動物種の免疫グロブリンが使用され得る。本発明で有用な非制限的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト由来のものであり得る。融合タンパク質がヒトでの使用を目的とする場合、免疫グロブリンの定常領域がヒトに由来するキメラ型の免疫グロブリンが使用され得る。免疫グロブリンのヒト化又は完全なヒト形態も当該技術分野でよく知られる方法に従って調製され得る（例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，５６５，３３２を参照）。ヒト化は、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）ＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能の保持に重要なもの）の保持を伴う又は伴わないヒト（例えば、レシピエント抗体）フレームワーク及び定常領域へグラフトすること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）を、ヒトフレームワーク及び定常領域へグラフトすること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面の残基の置き換えにより、ヒト様切片で「クローキング」することを含む様々な方法により、達成され得る。ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えばAlmagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)に総説され、例えばRiechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び第７，０８７，４０９号； Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)；Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)；Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (SDR (a-CDR)グラフティングを記述）；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）；Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)（「ＦＲシャッフリング」を記載）；並びにOsbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005)及びKlimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）でさらに記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol. 5, 368-74 (2001)及びLonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法により作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成し、それに由来し得る（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原投与時に応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することにより生成され得る（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001);及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)を参照）。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のいずれかとして、抗体断片をディスプレイする。
【０２０８】
特定の態様では、抗体は、例えば、ＰＣＴ出願の国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟については実施例を参照）又は米国特許公開第２００４／０１３２０６６号に開示される方法による結合親和性の増強を有するように操作される。本発明の抗原結合分子の特定の抗原決定基へ結合する能力は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られる他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴法技術（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び従来の結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）のいずれかにより測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、そのような競合する抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ）に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定化抗原は、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合する能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗原結合分子はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体の抗原への結合を可能にする条件下でのインキュベーション後、余剰の非結合抗体が除去され、固定化抗原との標識会合の量が測定される。固定化抗原との標識会合の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で減少した場合、それは、第２の抗原結合分子が、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示す。Harlow and Lane (1988) Antibodies:  A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照。
【０２０９】
本明細書に記載の通りに調製される本発明の抗体は、クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等のような当該技術分野で知られる技術により精製され得る。特定のタンパク質を精製するのに使用される実際の条件は、部分的には、正味電荷、疎水性、親水性などの要因に依拠し、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製については、抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の二重特異性抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製については、プロテインＡ及びプロテインＧを有するマトリックスを使用してもよい。逐次的なプロテインＡｍａｔａｈａ  Ｇのアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、実施例に記載されるように実質的に抗原結合分子を単離することができる。抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含むよく知られた様々な分析法のいずれかにより決定することができる。例えば、実施例に記載されるような二重特異性抗体は、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実証されるように、インタクトで適切に組み立てられることが示された。
【０２１０】
アッセイ  
本明細書で提供される抗原結合分子は、当該技術分野で知られる様々なアッセイにより、その物理的／化学的特性及び／又は生物活性について同定され、スクリーニングされ、特徴付けられる。
【０２１１】
１．親和性アッセイ
対応する受容体についての本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な機器、及び組み換え発現によって得られるような受容体又は標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、実施例に記載の方法に従って決定することができる。標的細胞抗原についての二重特異性抗原結合分子の親和性も、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な機器、及び組み換え発現によって得られるような受容体又は標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、実施例に記載の方法に従って決定することができる。ＦＡＰ−ＯＸ４０二重特異性抗体について、該方法は、国際公開第２０１７／０５５３９８  Ａ２号及び同第２０１７／０６０１４４  Ａ１号でさらに詳細に記載されている。一態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２１２】
２．結合アッセイとその他のアッセイ
一態様では、本明細書で報告されるＦＡＰ−ＯＸ４０二重特異性抗体は、国際公開第２０１７／０５５３９８  Ａ２号又は同第２０１７／０６０１４４  Ａ１号でさらに詳細に記載されるような、その抗原結合活性について試験される。
【０２１３】
３．活性のアッセイ
一態様では、標的ＯＸ４０二重特異性抗原結合分子の生物活性を同定するためにアッセイが提供される。
【０２１４】
特定の実施態様では、本明細書で報告される抗体は、そのような生物活性について試験される。
【０２１５】
薬学的組成物、配合物及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、本明細書で提供される、例えば以下の治療法のいずれかにおける使用のための、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体及び少なくとも一つの薬学的に許容される添加剤を含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体及び少なくとも一つの、例えば以下に記載されるような、治療剤を含む。
【０２１６】
一態様では、本発明は、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む薬学的組成物を提供する。
【０２１７】
別の態様では、本発明は、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性、及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤を含む薬学的組成物を提供する。特に、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はアンタゴニスト抗ＰＤ１抗体である。より具体的には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。特定の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤は、アテゾリズマブである。
【０２１８】
本発明の薬学的組成物は、治療的有効量の、薬学的に許容される添加剤に溶解又は分散した一又は複数の抗体を含む。「薬学的又は薬理的に許容される」という語句は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して一般的に無毒である分子実体及び組成物を指し、すなわち、必要に応じて、動物、例えばヒトに投与された場合に、有害反応、アレルギー反応又は他の望ましくない反応を引き起こさない。活性成分（例えば、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＯＸ４０抗体、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体及び／又はＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤）を含む薬学的組成物の調製は、参照により本明細書に援用されるRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990により例示されるように、本開示に照らして当業者に知られることになる。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される添加剤」は、当業者が知っているであろう、ありとあらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、塩、安定剤及びそれらの組み合わせを含む。
【０２１９】
非経口組成物には、注射、例えば、皮下、皮内、病変内、静脈内、動脈内、筋肉内、くも膜下腔内又は腹腔内注射による投与のために設計されたものが含まれる。注射のために、本発明の抗原結合分子は、水溶液、好ましくは生理学的に適合するバッファー、例えば、ハンクス溶液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーで製剤化され得る。溶液は、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤等の調合剤を含有してもよい。あるいは、融合タンパク質は、使用前に、適切なビヒクル、例えば滅菌のパイロジェン非含有水で構成するために粉末形態であってもよい。滅菌注射用溶液は、必要量の本発明の融合タンパク質を、必要に応じて、以下に列挙する他の様々な成分を有する適切な溶媒に、組み込むことにより調製される。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通じた濾過により、容易に達成することができる。一般に、分散体は、様々な滅菌活性成分を塩基性分散媒及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液又はエマルジョンの調製のための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、以前に滅菌濾過された液体媒体から、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を生成する減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要に応じて適切にバッファー化されるべきであり、液体希釈剤は、十分な生理食塩水又はグルコースを注射する前に、最初に等張にされる。組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定である必要があり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護される必要がある。エンドトキシン汚染は、最低でも安全なレベル、例えば０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に保つ必要があることが理解されよう。適切な薬学的に許容される添加剤には、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる化合物を含有し得る。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤又は化合物の溶解度を増加させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁液としても調製され得る。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
【０２２０】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンなどの調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示される。徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形をしている。特定の実施態様では、注射可能な組成物の長期吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせなどの吸収を遅延させる薬剤の組成物における使用によってもたらされ得る。
【０２２１】
本明細書における例示的な薬学的に許容される添加剤は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標））、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質をさらに含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、一又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組み合わされる。
【０２２２】
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸バッファーを含む。
【０２２３】
先述の組成物に加えて、活性成分もデボー調製物として調合され得る。このような長時間作用型製剤は、埋め込み（例えば、皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与され得る。したがって、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー材料若しくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂とともに、又は難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として製剤化され得る。
【０２２４】
本発明の活性成分を含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥のプロセスにより製造され得る。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、添加剤又は薬学的に使用することができる調製物へのタンパク質の加工を容易にする補助剤を使用する従来の方法で製剤化され得る。適切な製剤化は、選択した投与経路に依拠する。
【０２２５】
本発明の抗体は、遊離の酸又は塩基、中性又は塩の形態で組成物に配合され得る。薬学的に許容される塩は、遊離の酸又は塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらは、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸などの有機酸で形成されたものを含む。遊離カルボキシル基で形成された塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム若しくは水酸化第二鉄などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインなどの有機塩基に由来し得る。薬学的な塩は、対応する遊離塩基の形態よりも水性溶媒及び他のプロトン性溶媒に溶解しやすい傾向がある。
【０２２６】
本明細書の組成物はまた、治療される特定の兆候に必要な場合に複数の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
【０２２７】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通じた濾過により、容易に達成することができる。
【０２２８】
抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与
抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体と、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の両方（どちらも本明細書で物質と呼ばれる）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療が必要な場合は病変内投与を含む、任意の適切な手段により投与され得る。しかしながら、本発明の方法は、非経口、特に静脈内注入により投与される治療剤に関して特に有用である。
【０２２９】
非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々なタイムポイントにわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。一実施態様では、治療剤は、非経口投与、特に静脈内投与される。特定の実施態様では、治療剤は、静脈内注入により投与される。
【０２３０】
抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体と、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の両方は、良き臨床上の基準に一致したやり方で製剤化され、投薬され、投与される。この観点において考慮すべき要因には、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程、及び医療従事者に知られる他の要因が含まれる。抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体と、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の両方は、対象の傷害を予防又は治療するのに現在使用される一又は複数の薬剤と製剤化される必要はないが、任意選択的にされてもよい。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する治療剤の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０２３１】
疾患の予防又は治療について、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（それらの組み合わせで、又は一又は複数の他の追加の治療剤と使用されるとき）の適切な投与量は、治療される疾患の種類、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体の種類、疾患の重症度及び経過、両薬剤が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴及び治療剤に対する反応、並びに主治医の裁量に依拠することになる。各物質は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）の物質が、例えば、一又は複数の別々の投与によるか、又は連続的注入によるかに関わらず、対象への投与のための初期候補投薬量であり得る。一つの典型的な１日の投薬量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲にあり得る。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。各物質の一つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲にあり得る。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はそれらの任意の組み合わせ）の一又は複数の用量が、対象に投与され得る。このような用量は断続的に、例えば毎週、２週毎、又は３週毎（例えば対象が約２から約２０、又は例えば治療剤の約６用量を受けるように）投与され得る。初回のより高い負荷用量、それに続く一又は複数回のより低い用量、又は初回のより低い用量、それに続く一又は複数回のより高い用量を投与することができる。例示的な投与レジメンは、約１０ｍｇの初回用量、それに続いて治療剤の２週に一度の約２０ｍｇの用量を投与することを含む。しかしながら、他の用量用法も使用してよい。この治療法の進行は従来の手法及び試験により容易にモニタリングされる。
【０２３２】
一態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の両方の投与は、単回投与である。特定の態様では、治療剤の投与は、二回以上の投与である。そのような一態様では、物質は、毎週、２週毎、又は３週毎、特に２週毎に投与される。一態様では、物質は、治療的有効量で投与される。一態様では、物質は、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、約７００μｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ又は約１０００μｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体の投与を伴わない対応する治療レジメンにおける抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の用量よりも高い用量で投与される。一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第１の用量の初回の投与、及び抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第２の用量の一又は複数の後に続く投与を含み、ここで第２の用量は第１の用量よりも高い。一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第１の用量の初回の投与、及び抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第２の用量の一又は複数の後に続く投与を含み、ここで第１の用量は第２の用量よりも低くはない。
【０２３３】
一態様では、本発明による治療レジメンにおける抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の対象への第１の投与である（少なくとも同じ治療過程内で）。一態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体の投与は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与前には、対象に対してなされない。
【０２３４】
本発明では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体の組み合わせは、治療においてさらなる薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、少なくとも一つの追加の治療剤が共投与され得る。特定の態様では、追加の治療剤は免疫療法剤である。
【０２３５】
一態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体と抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の組み合わせは、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストと組み合わせて使用することができる。一態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ−１結合アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト及びＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストからなる群より選択される。特定の態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ−１結合アンタゴニスト、特にアンタゴニストＰＤ−１抗体である。一態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＭＤＸ  １１０６（ニボルマブ、ＣＡＳ登録番号９４６４１４−９４−４）、ＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）、ＣＴ−０１１（ピジリズマブ）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、及びＢＧＢ−１０８から選択される。別の特定の態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト、特にアンタゴニストＰＤ−Ｌ１抗体である。一態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）から選択される。一態様では、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト抗体は、アテゾリズマブアテゾリズマブ、デュルバルマブ及びアベルマブからなる群より選択される。より具体的には、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体と抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の組み合わせは、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）と組み合わせて使用することができる。いくつかの態様では、アテゾリズマブは、３週間毎に約８００ｍｇから約１５００ｍｇ（例えば、２週間ごとに約１０００ｍｇから約１３００ｍｇ、例えば３週間毎に約１１００ｍｇから約１２００ｍｇ）の用量で投与され得る。特定の一態様では、アテゾリズマブは、３週間毎に約１２００ｍｇの用量で投与される。
【０２３６】
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストの投与と抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体を含む併用療法の投与との間の期間並びに用量は、併用療法の投与前に対象における腫瘍を効果的に縮小させるように選択される。
【０２３７】
上記のそのような併用療法は、組み合わせ投与（二つ以上の治療剤が同じ又は別個の製剤に含まれる場合）と、別々の投与（この場合、治療剤の投与は、追加の治療剤の投与の前に、同時に、及び／又はそれに続いて生じ得る）とを包含する。一実施態様では、治療剤の投与及び追加の治療剤の投与は、互いに、約１か月以内、又は約１、２又は３週以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に生じる。
【０２３８】
治療的方法及び組成物
異なる細胞集団の二つの細胞表面タンパク質を認識する二重特異性抗体は、病原性標的細胞の破壊のために細胞傷害性免疫細胞をリダイレクトすることが期待される。
【０２３９】
一態様では、対象に有効量の抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体を投与することを含む、対象におけるがんの進行を治療する又は遅延させるための方法が提供される。
【０２４０】
そのような一態様では、該方法は、対象に有効量の少なくとも一つの追加の治療剤を投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、対象に有効量の抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体を投与することを含む、腫瘍縮小のための方法が提供される。上記の態様のいずれかによる「個体」又は「対象」は、好ましくはヒトである。
【０２４１】
さらなる態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体を含む、がん免疫療法における使用のための組成物が提供される。特定の実施態様では、がん免疫療法の方法における使用のための、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体を含む組成物が提供される。
【０２４２】
さらなる態様では、医薬の製造又は調製における、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体を含む組成物の使用が、本明細書で提供される。一実施態様では、医薬は固形腫瘍の治療のためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、固形腫瘍を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、腫瘍縮小の方法における使用のためのものである。そのような一実施態様では、該方法は、個体に有効量の少なくとも一つの追加の治療剤を投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は固形腫瘍を治療するためのものである。いくつかの態様では、個体はＣＥＡ陽性がんを有する。いくつかの態様では、ＣＥＡ陽性がんは、結腸がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、子宮内膜がん、乳がん、腎臓がん、食道がん、又は前立腺がんである。いくつかの態様では、乳がんは乳癌又は乳腺癌である。いくつかの態様では、乳癌は浸潤性腺管癌である。いくつかの態様では、肺がんは肺腺癌である。いくつかの実施態様では、結腸がんは結腸直腸腺癌である。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
【０２４３】
上記の併用療法は、組み合わせ投与（二つ以上の治療剤が同じ又は別個の製剤に含まれる場合）と、別々の投与（この場合、本明細書で報告される抗体の投与は、追加の治療剤の投与の前に、同時に、及び／又はそれに続いて生じ得る）とを包含する。一態様では、抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体の投与並びに任意選択的に追加の治療剤の投与は、互いに約１か月以内、又は約１、２若しくは３週以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に生じる。
【０２４４】
本明細書で報告される抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体と抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の両方（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療が必要な場合は病変内投与を含む、任意の適切な手段により投与され得る。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々なタイムポイントにわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
【０２４５】
本明細書で報告される抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体と抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の両方は、良き臨床上の基準に一致したやり方で製剤化され、投薬され、投与される。この観点において考慮すべき要因には、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程、及び医療従事者に知られる他の要因が含まれる。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０２４６】
製造品（キット）
本発明の他の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含むキットが提供される。キットは、少なくとも一つの容器及び容器上に又は容器に付属するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。一態様では、キット中の少なくとも二つの活性薬剤は、本発明の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体である。
【０２４７】
特定の態様では、（Ａ）活性成分として抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び薬学的に許容される添加剤を含む第１の組成物、（Ｂ）活性成分として抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び薬学的に許容される添加剤を含む第２の組成物、並びに（Ｃ）併用療法において組成物を使用するための指示書を含むパッケージを含む、対象におけるがんの進行を治療する又は遅延させるためのキットが提供される。
【０２４８】
さらなる態様では、（Ａ）活性成分として抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体及び薬学的に許容される添加剤を含む第１の組成物（Ｂ）活性成分として抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び薬学的に許容される添加剤を含む第２の組成物、（Ｃ）活性成分としてＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用をブロックする薬剤及び薬学的に許容される添加剤を含む第３の組成物、並びに（Ｃ）併用療法において組成物を使用するための指示書を含むパッケージを含む、対象におけるがんの進行を治療する又は遅延させるためのキットが提供される。
【０２４９】
ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態を治療するためにどのように使用されるかを示し、併用療法において組成物を使用するための指示を提供する。さらに、キットは、（ａ）第１の容器であって、本発明の抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体を含む組成物がその中に含有される、第１の容器；及び（ｂ）第２の容器であって、本発明の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む組成物がその中に含有される、第２の容器を含み得る。さらに、キットは、組み合わせて使用することができるさらなる活性成分を含む、一又は複数のさらなる容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。
【０２５０】
代替的に、又は追加的に、きっとは、薬学的に許容されるバッファー、例えば無菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストローズ溶液を含む第２（又は第３）の容器をさらに含み得る。キットは、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含むことができる。
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ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は：Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載される。抗体鎖のアミノ酸は、上記のＫａｂａｔによる番号付けシステム（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）に従って番号付け及び参照される。
【実施例】
【０２５１】
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得る。
【０２５２】
組み換えＤＮＡ技術
Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。製造業者の指示に従って、分子生物学的試薬を使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は： Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に示される。
【０２５３】
ＤＮＡ配列決定
二本鎖配列決定によりＤＮＡ配列を決定した。
【０２５４】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、適切なテンプレートを使用したＰＣＲによって生成したか、又はＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（レーゲンスブルク、ドイツ）によって合成オリゴヌクレオチド及び自動化遺伝子合成によるＰＣＲ産物から合成した。正確な遺伝子配列が利用できない場合、オリゴヌクレオチドプライマーを最も近い相同体からの配列に基づいて設計し、ＲＴ−ＰＣＲによって適切な組織に由来するＲＮＡから遺伝子を分離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の側面の遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクターにクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、ＵＶ分光法で濃度を測定した。サブクローン遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。適切な制限部位で遺伝子セグメントを設計し、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にした。すべてのコンストラクトを、真核細胞での分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計した。
【０２５５】
細胞培養技術
標準的な細胞培養技術を、Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.のCurrent Protocolsに記載の通りに使用した。
【０２５６】
タンパク質精製
標準的なプロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体をプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用して、ＰＢＳで洗浄した。ｐＨ２．８で抗体の溶出を達成し、その後すぐに試料を中和した。凝集したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200, GE Healthcare）により、ＰＢＳ中又は２０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０中で、モノマー抗体から分離した。モノマー抗体断片をプールし、例えばMILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO)遠心濃縮器を使用して（必要な場合）濃縮し、冷凍し、−２０℃又は−８０℃で貯蔵した。例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析による、後続のタンパク質分析及び分析特性評価のために、試料の一部を提供した。
【０２５７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用した。特に、１０％若しくは４−１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
【０２５８】
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施した。簡潔には、プロテインＡ精製抗体をＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システムで３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５中Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ−Ｓｙｓｔｅｍで２ｘＰＢＳ中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムに適用した。溶出したタンパク質をＵＶ吸光度及びピーク面積の統合により数量化した。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ規格１５１−１９０１が標準として機能した。
【０２５９】
質量分析
このセクションは、正しいアセンブリに重点を置いて、ＶＨ／ＶＬ交換（ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂｓ）を有する多重特異性抗体の特性について記載する。予想される一次構造を、脱グリコシル化されたインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂｓ及び脱グリコシル化／プラスミン消化された、あるいは脱グリコシル化／制限されたＬｙｓＣ消化されたＣｒｏｓｓＭａｂｓのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって分析した。
【０２６０】
ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂｓは、リン酸バッファー又はＴｒｉｓバッファー中でＮ−グリコシダーゼＦを用いて、３７℃で最大１７時間、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌで脱グリコシル化した。プラスミン又は制限されたＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化を、ＴｒｉｓバッファーｐＨ８中１００μｇの脱グリコシル化ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂｓを用いて、それぞれ、室温で１２０時間、及び３７℃で４０分間実施した。質量分析の前に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＨＰＬＣを介して試料を脱塩した。ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ源（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＵＨＲ−ＱＴＯＦ  ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でＥＳＩ−ＭＳを介して合計質量を決定した。
【０２６１】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用した、多重特異性抗体のそれぞれの抗原への結合及び結合親和性の決定
生成された抗体のそれぞれの抗原への結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ機器（GE Healthcare Biosciences AB、ウプサラ、スウェーデン）を使用して表面プラズモン共鳴により調査した。簡潔には、親和性の測定では、ヤギ−抗ヒト  ＩｇＧ、ＪＩＲ  １０９−００５−０９８抗体を、それぞれの抗原に対する抗体の提示のためにアミン結合を介してＣＭ５チップに固定化する。ＨＢＳバッファー（ＨＢＳ−Ｐ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐｈ７．４）中、２５℃（あるいは３７℃）で結合を測定する。抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ又は自社精製）を様々な濃度で溶液に添加した。８０秒から３分の抗原注入によって会合を測定し；チップ表面をＨＢＳバッファーで３〜１０分間洗浄することにより解離を測定し、１：１ラングミュア結合モデルを使用してＫＤ値を推定した。システム固有のベースラインドリフトの補正とノイズ信号の低減のために、ネガティブコントロールデータ（バッファー曲線）を試料曲線から差し引く。センサーグラムの分析及び親和性データの計算に、それぞれのＢｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用する。
【０２６２】
実施例１
抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体の調製、精製及び特性評価
抗ＦＡＰ／抗ＯＸ４０二重特異性抗体を、国際公開第２０１７／０５５３９８  Ａ２号又は同第２０１７／０６０１４４  Ａ１号に記載の通りに調製した。
【０２６３】
特に、ＯＸ４０への四価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する、国際公開第２０１７／０６０１４４  Ａ１号の実施例４．４による分子を作製した。ノブ・イントゥ・ホール技術を適用して、二つの異なる重鎖のアセンブルを可能にした。４＋１フォーマットの二重特異性抗体の概略スキームを図１Ａに示す。
【０２６４】
分子Ａでは、第１の重鎖（ＨＣ  １）は、抗ＯＸ４０結合剤４９Ｂ４の二つのＦａｂユニット（ＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１）と、その後に（Ｇ４Ｓ）リンカーにより、抗ＦＡＰ結合剤４Ｂ９のＶＨドメインに融合したＦｃノブ鎖から構成された。コンストラクトの第２の重鎖（ＨＣ  １）は、抗ＯＸ４０結合剤４９Ｂ４の二つのＦａｂユニット（ＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１）と、その後に（Ｇ４Ｓ）リンカーにより、抗ＦＡＰ結合剤４Ｂ９のＶＬドメインに融合したＦｃホール鎖から構成された。よって、分子Ａ（ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ）は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号５５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号５６の四倍の軽鎖を含む。
【０２６５】
分子Ｂは分子Ａと同様に調製したが、ＦＡＰ結合剤４Ｂ９は、ＦＡＰ結合剤２８Ｈ１で置き換えた。分子Ｂは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号５８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号５６の四倍の軽鎖を含む。
【０２６６】
分子Ｃでは、第１の重鎖（ＨＣ  １）は、抗ＯＸ４０結合剤４９Ｂ４の二つのＦａｂユニット（ＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１）と、その後に（Ｇ４Ｓ）リンカーにより、抗ＦＡＰ結合剤４Ｂ９のＶＬドメインに融合したＦｃノブ鎖から構成された。コンストラクトの第２の重鎖（ＨＣ  ２）は、抗ＯＸ４０結合剤４９Ｂ４の二つのＦａｂユニット（ＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１）と、その後に（Ｇ４Ｓ）リンカーにより、抗ＦＡＰ結合剤４Ｂ９のＶＨドメインに融合したＦｃホール鎖から構成された。分子Ｃは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号５６の四倍の軽鎖を含む。
【０２６７】
これら三つすべての分子では、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａの変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されて、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従ってＦｃガンマ受容体への結合を抑止するのに対して、分子Ｄでは、ノブ・イントゥ・ホール変異を有する野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインが使用される。分子Ｄは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号５６の四倍の軽鎖を含む。
【０２６８】
分子の産生及び特性評価は、国際公開第２０１７／０６０１４４  Ａ１号に詳述される。
【０２６９】
実施例２
Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の調製、精製及び特性評価
国際公開第２０１４／１３１７１２  Ａ１号又は同第２０１６／０７９０７６  Ａ１号に記載の方法に従って、ＴＣＢ分子を調製した。
【０２７０】
実験に使用する抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ又はＣＥＡ  ＴＣＢ）の調製は、国際公開第２０１４／１３１７１２  Ａ１号の実施例３に記載されている。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢは「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ」抗体であり、二つの異なる重鎖及び二つの異なる軽鎖（その一つは、分子内に二つ存在する）から構成されている。ＣＨ３ドメインの点突然変異（「ノブ・イントゥ・ホール」）は、二つの異なる重鎖のアセンブリを促進させるために導入された。ＣＤ３結合ＦａｂにおけるＶＨ及びＶＬドメインの交換は、二つの異なる軽鎖の正確なアセンブリを促進させるためになされた。２＋１は、分子がＣＥＡに特異的な二つの抗原結合ドメイン及びＣＤ３に特異的な一つの抗原結合ドメインを有することを意味する。ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢは同様のフォーマットを有するが、別のＣＥＡ結合剤を含み、軽鎖の正確なペアリングをサポートするためにＣＤ３結合剤のＣＨ及びＣＬドメインの点変異を含む。
【０２７１】
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢは、配列番号８７のアミノ酸配列の二つの軽鎖、配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号９０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。２＋１フォーマットの二重特異性抗体の概略スキームを図１Ｃに示す。ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ  ＴＣＢは、配列番号９１のアミノ酸配列の二つの軽鎖、配列番号９２のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。２＋１フォーマットの二重特異性抗体の概略スキームを図１Ｂに示す。
【０２７２】
実験に使用する抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ又はＦｏｌＲ１  ＴＣＢ）の調製は、国際公開第２０１６／０７９０７６  Ａ１号に記載されている。ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢは、「ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ  ２＋１古典的（共通軽鎖）」として国際公開第２０１６／０７９０７６号の図１Ｄに示され、二つの異なる重鎖及び三倍の同じＶＬＣＬ軽鎖（共通軽鎖）から構成される。ＣＨ３ドメインの点突然変異（「ノブ・イントゥー・ホール」）は、二つの異なる重鎖のアセンブリを促進させるために導入された。２＋１は、分子がＦｏｌＲ１に特異的な二つの抗原結合ドメイン及びＣＤ３に特異的な一つの抗原結合ドメインを有することを意味する。ＣＤ３結合剤は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ノブ変異を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合する。
【０２７３】
ＦｏｌＲ１ＣＤ３  ＴＣＢは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１０９の三倍の軽鎖を含む。
【０２７４】
実施例３
ヒト免疫エフェクター細胞とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養アッセイ
Ｔ細胞の免疫機能を、ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ）及びＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂの存在下でヒト免疫エフェクター細胞（休止ＰＢＭＣ、ＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞）、標的抗原陽性腫瘍細胞及びＦＡＰ陽性線維芽細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養アッセイで試験した。評価された腫瘍細胞株は、胃がん細胞株ＭＫＮ−４５、卵巣腺癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３及び子宮頸がん細胞株ＨｅＬａであった。ヒトＦＡＰを発現させるよう形質導入されたマウス胎児性線維芽細胞細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３をＦＡＰ陽性線維芽細胞として使用した。エフェクター細胞は、休止ヒトＰＢＭＣ及び単離された休止ＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞であった。いくつかのアッセイでは、ＴＮＦ−αセンサー細胞を添加して、ＴＮＦ−α誘導をモニターした。腫瘍細胞溶解（動的ハイコンテントライフイメージング、エンドポイントフローサイトメトリー）、細胞表面活性化及び変異マーカーの発現（エンドポイントフローサイトメトリー）及びサイトカイン分泌（動的ハイコンテントライフイメージング、エンドポイントサイトメトリービーズアレイ）を使用して、ＴＣＢにより誘導され、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ（分子Ａ）により調節されたＴ細胞の機能の程度をモニターした。
【０２７５】
ａ）標的細胞株及び線維芽細胞
ＳＫ−ＯＶ−３細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号、ＨＴＰ−７７）は、葉酸受容体を自然に発現させる。ＨｅＬａ  ＮＬＲ細胞（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号、４４８９）は葉酸受容体を自然に発現させ、ＭＫＮ４５  ＮＬＲ細胞はＣＥＡを自然に発現させる。両細胞株は、核に限定されたＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ蛍光タンパク質を安定して発現させるＥｓｓｅｎ  ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ(Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４４７６；ＥＦ１α、ピューロマイシン）を担持する。これは、非蛍光エフェクターＴ細胞又は線維芽細胞からの容易な分離を可能にする。ウェル当たりで測定される赤色蛍光は赤核の数、つまり健康な腫瘍細胞の数に正比例するため、高スループットの蛍光寿命顕微鏡による腫瘍細胞の溶解又は増殖のリアルタイム評価が可能である。
【０２７６】
ＨｅＬａ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ（ＮＬＲ）細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号１６０００−０４４、Ｌｏｔ  ９４１２７３、ガンマ照射、マイコプラズマ非含有及び５６℃で３５分間熱不活性化）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０  ０３８）及び１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号  Ｓ８６３６）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４３０−０８２）中で培養した。
【０２７７】
ＭＫＮ４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ（ＮＬＲ）細胞は、ＣＥＡを自然に発現させる。ＭＫＮ４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ  細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号１６０００−０４４、ガンマ照射、マイコプラズマ非含有及び５６℃で３５分間熱不活性化）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０  ０３８）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）及び０．５μｇ／ｍＬ  ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ａｎｔ−ｐｒ−１）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４３０−０８２）中で培養した。ＭＫＮ−４５（ＤＳＭＺ；ＡＣＣ４０９）を、製造業者の指示に従って、８μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下、５（ＴＵ／細胞）のＭＯＩでＥｓｓｅｎ  ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４４７６；ＥＦ１α、ピューロマイシン）を用いて形質導入して、核に限定されたＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ蛍光タンパク質を安定して発現させた。これは、非蛍光エフェクターＴ細胞又は線維芽細胞からの容易な分離を可能にし、高スループットの蛍光寿命顕微鏡による腫瘍細胞成長のモニタリングを可能にする。よって、経時的なウェル当たりの数量化は、腫瘍細胞の溶解又は増殖のリアルタイムで評価を可能にする。
【０２７８】
細胞表面ＦＡＰによるＦＡＰ−結合抗体の架橋は、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９を発現させるヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）によりなされる。この細胞株は、マウス胎児性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）の、ｈｕＦＡＰを発現させる発現ベクターでのトランスフェクションにより生成した。細胞を、１０％仔ウシ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｃ８０５６−５００ｍｌ、ガンマ照射、マイコプラズマ非含有、及び５６℃で３５分間熱不活性化）及び１．５μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ａｎｔ−ｐｒ−１）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４３０−０８２）で培養した。
【０２７９】
ｂ）エフェクター細胞の調製
バフィーコートをチューリッヒ献血センターから入手した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを同じ容量のＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０  ３２６）で希釈した。５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に１５ｍＬ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）を供給し、バフィーコート溶液をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７の上に重ねた。４００×ｇで３０分間にわたって、室温、低速、ブレーキなしで、管を遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを界面から回収し、ＤＰＢＳで三回洗浄し、１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号１６０００−０４４、Ｌｏｔ  ９４１２７３、ガンマ照射、マイコプラズマ非含有、及び５６℃で３５分間熱不活性化）が供給されたＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号４２４０１−０４２）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０  ０３８）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭ  β−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）からなるＴ細胞培地に再懸濁させた。いくつかの場合、ＲＰＭＩ１６４０は、バックグラウンド蛍光の減少を伴うハイコンテント寿命顕微鏡法のために、ＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ  ＤＭＥＭ  培地（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１８９６７−０１）により置き換えられた。
【０２８０】
ＰＢＭＣは、単離直後にエフェクター細胞として使用し（休止ヒトＰＢＭＣ）、又は休止ＣＤ４  Ｔ細胞若しくはＣＤ８  Ｔ細胞としての特定の副画分は、それぞれ製造業者の指示に従って何もしていないヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｃａ．Ｎｏ．  １３０−０９６−５３３）及び何もしていないヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｃａ．Ｎｏ．  １３０−０９６−４９５）を使用して、単離した。簡潔には、ヒトＰＢＭＣを、４℃、４００×ｇで８分間遠心分離し、ＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋ＢＳＡ（０．５％  ｖ／ｗ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ９４１８）＋ＥＤＴＡ（［２ｎＭ］、Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ９２６１））で一度洗浄した。ペレットを、それぞれ提供されたストレプトアビジン標識陰性抗体カクテルで再懸濁し、４℃で５分間インキュベートし（１＊１０７細胞当たり４０μＬ  ＭＡＣＳバッファー及び１０μＬ抗体混合）、その後、ビオチン化磁気捕捉ビーズ（１＊１０７細胞当たり３０μＬ  ＭＡＣＳバッファー及び２０μＬビーズ混合）で４℃で１０分間にわたって次のインキュベーションをした。製造業者の指示に従ってＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）を使用して、標識非ＣＤ４又は非Ｃ８  Ｔ細胞を磁気分離により除去した。それぞれ非標識休止ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞を含有するカラムフロースルーを遠心分離し、上記の通りＭＡＣＳバッファーで一度洗浄した。ＲＰＭＩ１６４０又はＦｕｏｒｏｂｒｉｇｈｔ  ＤＭＥＭベースのＴ細胞培地で、細胞を２Ｍｉｏ細胞／ｍＬに調整した。
【０２８１】
ｃ）ＴＮＦ−αセンサー細胞
ＴＮＦ−αセンサー細胞は、ＮＦκＢ感受性プロモーターエレメントの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするレポータープラスミドｐＥＴＲ１４３２７で形質導入されたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ｘｘｘ）である。ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞により分泌されたＴＮＦ−αが結合することができるＴＮＦ受容体を自然に発現させる。これは、ＮＦκＢの用量依存性の活性化及び核への転座をもたらし、次に、用量依存的なＧＦＰ生成のスイッチを入れる。ＧＦＰ蛍光性は、経時的に高スループット蛍光寿命顕微鏡法により数量化することができ、よって、ＴＮＦ−α分泌のリアルタイム評価を可能にする。
【０２８２】
ＴＮＦ−αセンサー細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−３２１６）のレンチウイルス形質導入により生成された。レンチウイルスベースのウイルスベクターは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とレンチウイルスパッケージングプラスミド及びＮＦκＢコンセンサス転写反応エレメントと併せて最小限のサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）プロモーターと結合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするレンチウイルス発現ベクター（ｐＥＴＲ１４３７２）の共トランスフェクションにより生成された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのプラスミドトランスフェクションは、製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。トランスフェクションの前日に６×１０５細胞／ウェルで播種された６ウェルプレート及び２．５μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクションを行った。レンチウイルスベクター含有上清を４８時間後に回収し、０．４５μｍの細孔サイズのポリエーテルスルホン膜を通して濾過した。安定した発現細胞株を生成するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート中１．０×１０６細胞／ウェルで播種し、１ｍＬのウイルスベクター含有上清を重ねた。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離５８１０テーブルトップ遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で８００×ｇ及び３２℃で３０分間のスピノキュレーションにより、形質導入を行った。ＴＮＦ−α誘導細胞クローンを、ＦＡＣＳソーティング（ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）により得た。
【０２８３】
ｄ）細胞傷害性及びＴ細胞活性化アッセイ
マウス胎児性線維芽細胞  ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞、ＴＮＦ−αセンサー細胞及びＭＫＮ４５  ＮＬＲ細胞を、細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１−０１４）を使用して３７℃で１０分間採取した。細胞をＤＰＢＳで一度洗浄した。ＴＮＦαセンサー細胞又は線維芽細胞を、４５００ＲＡＤの線量を使用してＸ線照射器で照射して、エフェクター又は腫瘍細胞株の後の異常成長を防止した。滅菌９６ウェル平底接着組織培養プレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２０９７）中Ｔ細胞培地で、１ウェル当たり０．１＊１０５細胞の密度で、標的細胞株、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ及びいくつかのアッセイではＴＮＦ−αセンサー細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）中３７℃及び５％  ＣＯ２で一晩培養した。
【０２８４】
休止ヒトＰＢＭＣ、ヒトＣＤ４  Ｔ細胞、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞又はＮＬＶ特異性Ｔ細胞を上記の通り調製し、１ウェル当たり０．５＊１０５細胞の密度で添加した。ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ又はＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））及びＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ（２ｎＭ）の固定濃度の段階希釈列を、１ウェル当たり合計２００ｕＬの容量になるように添加した。インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）中、細胞を最大７２時間にわたって３７℃及び５％  ＣＯ２で共培養した。
【０２８５】
いくつかのアッセイでは、プレートを、３時間の間隔で７２時間にわたって３７℃及び５％  ＣＯ２で、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＨＤ位相コントラスト、緑色蛍光及び赤色蛍光、１０×対物）を使用して、蛍光顕微鏡法ハイコンテントライフイメージングによりモニターした。健康な腫瘍細胞の集積赤色蛍光（ＲＣＵｘｕｍ２／画像）（１ウェル当たりのＮＬＲ＋細胞の量に比例する）を、ＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して数量化して、Ｔ細胞による溶解に対する腫瘍細胞成長をモニターした。使用したＴＣＢ濃度に対するそれぞれのタイムポイント及び条件について値をプロットして、Ｔ細胞の細胞溶解能に対する効果を分析した。
【０２８６】
ＴＮＦ−αセンサー細胞が存在したいくつかのアッセイでは、集積緑色ＲＣＵｘｕｍ２／画像をＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して数量化して、ＴＮＦ−αセンサー細胞によるＧＦＰのＴＮＦ−α誘導生成をモニターした。使用したＴＣＢ濃度に対するそれぞれのタイムポイント及び条件について値をプロットして、Ｔ細胞によるＴＮＦ−α分泌に対する効果を分析した。
【０２８７】
７２時間後、製造業者の指示に従ってサイトメトリービーズアレイを使用して、選択したサイトカインの後続の分析のために上清を回収した。評価したサイトカインは、ＩＬ−２（ヒトＩＬ−２  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ａ４）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５８２７０）、ＩＬ−１７Ａ（ヒトＩＬ−１７Ａ  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｂ５）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５６０３８３）、ＴＮＦ−α（ヒトＴＮＦ−α  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｃ４）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５６０１１２）、ＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−γ  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｅ７）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５８２６９）、ＩＬ−４（ヒトＩＬ−４  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ａ５）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５８２７２）、ＩＬ−１０（ヒトＩＬ−１０  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｂ７）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５８２７４）及びＩＬ−９（ヒトＩＬ−９  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｂ６）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５８３３３）であった。
【０２８８】
その後、細胞解離バッファーを用いて３７℃で１０分間インキュベートした後、４００ｘｇ、４℃で遠心分離することにより、すべての細胞をウェルから分離した。ペレットを、ＢＳＡ（０．１％ｖ／ｗ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ９４１８）を含む氷冷ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０  ３２６）で洗浄した。蛍光染料−コンジュゲート抗体  抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、ＣＤ８（クローンＲＰａ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）、ＣＤ６２Ｌ（クローンＤＲＥＧ−５６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４８３４）、ＣＤ１２７（クローン０１９Ｄ５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号Ａ０１９Ｄ５）、ＣＤ１３４（クローンＢｅｒ−ＡＣＴ３５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５０００８）、ＣＤ１３７（クローン４Ｂ４−１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０９８１４）、ＧＩＴＲ（クローン６２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３１１６０８）及びＣＤ２５（クローンＭ−Ａ２５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５６１１２）を用いて、細胞をＦＡＣＳバッファー中４℃で２０分間表面染色した。その後、それらを５−レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＤＩＶＡソフトウェア搭載、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して回収し、その後同日にＦＡＣＳバッファーで一度洗浄し、その後０．２μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含有する８５μＬ／ウェル  ＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。Ｔ活性化に対する効果を分析するために、生存ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞をゲートして（ＤＡＰＩ−、ＮｕｃＬｉｇｈｔ  ＲＥＤ−、ＣＤ４又はＣＤ８＋）、数え、活性化マーカー（ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２５）若しくは成熟マーカー（ＣＤ１２７、ＣＤ６２Ｌ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）又は陽性細胞の割合を使用したＴＣＢ濃度に対するそれぞれの条件についてプロットした。
【０２８９】
結果
３．１  Ｔ細胞二重特異性抗体は、ＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞のＯＸ４０の用量依存性情報制御を誘導する
異なるヒト免疫エフェクター細胞調製物（休止ＰＢＭＣ、ＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞、ＮＬＶ特異性ＣＤ８  Ｔエフェクター記憶細胞）を、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞と共培養し、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの段階希釈列の存在下で４８時間にわたってＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰ照射した。腫瘍性細胞の量を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して蛍光顕微鏡ハイコンテントライフイメージングにより数量化し、健康な腫瘍細胞の集積赤色蛍光を使用して、特異的溶解を計算した（図２）。ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞のフローサイトメトリーによりＯＸ４０の発現を評価した（図３Ａ−３Ｄ）。
【０２９０】
ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢは、４２時間のタイムポイントで図２に示すように、使用したすべての免疫エフェクター細胞調製物においてＭＫＮ４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  ｒｅｄ細胞の溶解を誘導することができた。ＥＣ５０値及び溶解の大きさは、エフェクター細胞調製物間でわずかに異なり、単離されたＣＤ８  Ｔ細胞で最も高かった。腫瘍細胞溶解と同時に、Ｔ細胞はＯＸ４０を含む活性化マーカーの表面発現を増加させた（図３Ａ−３Ｄ）。ＯＸ４０の表面発現は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞で最も高かったが、ＣＤ８陽性Ｔ細胞でもより低い程度で検出された。ＯＸ４０発現の程度は、ヘルパー細胞の存在に依拠していなかった（ＰＢＭＣとＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞の単離された集団では発現レベルに差異はなかった）。
【０２９１】
３．２  ＦＡＰ−標的ＯＸ４０アゴニストの存在はＴ細胞の細胞溶解能に影響を及ぼさなかった
次に、我々は、ＴＣＢ媒介腫瘍細胞溶解に対するＯＸ４０共刺激の影響を評価した。３．１に記載の通り、Ｔ細胞は、４８時間にわたって、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり又はなしのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの段階希釈列の存在下で、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで共培養した。
【０２９２】
生存腫瘍細胞の量を、３時間の間隔で、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して蛍光顕微鏡ハイコンテントライフイメージングにより数量化し、健康な腫瘍細胞の集積赤色蛍光を使用して特異的溶解を計算した。
【０２９３】
評価したすべてのタイムポイントで、腫瘍細胞溶解の程度に対するＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ共刺激の影響は、ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢでは観察されなかった（図４Ａ−４Ｃ）。経時的な比較を容易にするために、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ共刺激あり又はなしの各タイムポイントについて曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、時間に対してプロットした。ＴＣＢの非存在下では腫瘍細胞が増殖していたため、ＡＵＣは経時的に増加していたが、ＡＵＣの共刺激依存性の差異は明らかに検出されなかった。
【０２９４】
ＯＸ４０共刺激の存在はまた、腫瘍細胞溶解を加速することも、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢによる腫瘍細胞溶解の大きさを増加させることも、特定の割合の腫瘍細胞の溶解を達成するために必要なＴＣＢ濃度を低下させること（ＥＣ５０値のシフトなど）もなかった。これは、評価したすべてのエフェクター細胞調製物に当てはまり、４２時間のタイムポイントについて図５Ａ−５Ｃで例示的に示される。
【０２９５】
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢを使用して、同様の発見が得られた（データは非表示）。
【０２９６】
３．３  ＦＡＰ標的ＯＸ４０アゴニストの存在はサイトカインの分泌に影響を及ぼさなかった
いくつかのアッセイでは、上記の設定に加えて、ＴＮＦ−αセンサー細胞を培養した。ＴＮＦ−αセンサー細胞はＴＮＦ−α受容体を自然に発現させ、ＮＦκＢ感受性プロモーターエレメントの制御下で、ＧＦＰで遺伝子組み換えされた。活性化Ｔ細胞により分泌されたＴＮＦ−αの結合は、ＮＦκＢの用量依存性活性化と、続いてＧＦＰの発現をもたらす。ＧＦＰ蛍光性は、経時的に高スループット蛍光寿命顕微鏡法により数量化することができ、よって、ＴＮＦ−α分泌のリアルタイム評価を可能にする。上の３．１に記載の通り、それぞれＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢの固定濃度並びにＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ、ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ及び  ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ，の段階希釈列の存在下で、ＣＤ４  Ｔ細胞を４８時間にわたって、標的細胞としてのＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで共培養した。
【０２９７】
存在するＴＣＢによるＴ細胞の活性化は、ＴＮＦ−αの用量依存性放出のもたらし、これは、ＴＮＦ−αセンサー細胞における経時的なＧＦＰ蛍光の用量依存性増加をもたらした。ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂでの追加の共刺激は、ＧＦＰ蛍光をさらに増加させ、よって、活性化Ｔ細胞によるＴＮＦ−α分泌を増加させた（図６Ａ−６Ｄ及び７Ａ−７Ｄ）。この効果は、主にＴＣＢ媒介ＴＮＦ−α分泌の程度によるが、ＴＮＦ−α分泌が誘導されたＴＣＢ濃度を低減させた（ＥＣ５０値のシフト）。また、アゴニストＴＣＲ刺激も、サイトカイン分泌へのこの正の影響を観察するために必要であり、非特異的なＴＮＦ−α分泌はコントロールＴＣＢ処理試料では検出されなかった。
【０２９８】
経時的な比較を容易にするために、ＯＸ４０共刺激あり又はなしの各タイムポイントについて曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、時間に対してプロットした（図８Ａ−８Ｄ）。ＡＵＣの増加は、試験されたすべてのＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ及びＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ）について及び異なる腫瘍細胞株（ＭＫＮ４５  ＮＬＲ、ＨｅＬａ  ＮＬＲ  ｒｅｄ、Ｓｋｏｖ−３）の存在下で観察された。
【０２９９】
すべての試料の上清を、ビーズアレイシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してエンドポイント（４８時間）で評価し、ＴＮＦ−αを超えるいくつかのサイトカインの分泌への影響を数量化した。特定のＴｈサブクラス、及び免疫抑制サイトカインとしてのＩＬ−１０への文化をモニターするための、評価したサイトカインは、一般的なＴ細胞活性化のマーカーとしてのＩＬ−２及びＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１サイトカイン）、ＩＬ−４（Ｔｈ２サイトカイン）、ＩＬ−９（Ｔｈ９サイトカイン）及びＩＬ−１７Ａ（Ｔｈ１７サイトカイン）であった。
【０３００】
存在するＴＣＢによるＴ細胞の活性化は、次に、評価したすべてのサイトカイン、すなわちＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７ａ及びＩＬ−１０の用量依存性放出をもたらした（図９Ａ−９Ｄ、図１０Ａ−１０Ｄ、図１１Ａ−１１Ｄ及び図１２Ａ−１２Ｄ）。同じ標的細胞株を使用した場合、このサイトカイン放出の程度はＴＣＢで異なった。これは、図９Ａ−９Ｄ（ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ）と図１０Ａ−１０Ｄ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ）の比較からわかる。しかし、同じＴＣＢ（ＦｏｌＲ  ＣＤ３  ＴＣＢ）を使用した場合も、異なる標的細胞株を使用したときに差異を観察することができた。図１１Ａ−１１Ｄは、ＨｅＬａ  ＮＬＲ細胞でのサイトカイン放出を示すのに対して、Ｓｋｏｖ−３細胞は図１２Ａ−１２Ｄで使用された。
【０３０１】
ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂとの追加の共刺激は、用量依存性のサイトカイン分泌の程度を調節したが、サイトカイン分泌に必要なＴＣＢ閾値の濃度を低下させなかった。それにより、炎症性ＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの増加が観察されたのに対して、免疫抑制性ＩＬ−１０の濃度は低下した。比較を容易にするために、ＯＸ４０共刺激ありの試料中のサイトカイン濃度の変化を、ＴＣＢプラトー濃度について、共刺激なしのものと比較して計算した（図１３）。
【０３０２】
それにより、炎症性ＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの増加が明白であったに対して、免疫抑制性ＩＬ−１０の濃度は、いくつかの標的細胞／ＴＣＢ組み合わせにおいてのみ低下した。強い用量依存性サイトカイン分泌を伴うより強力なＴ細胞活性化もＯＸ４０共刺激により強く調節される傾向が見られた。特に、免疫抑制性ＩＬ−１０放出の減少は、強力なＴ細胞活性化に結びついていた。
【０３０３】
我々は、休止ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞と休止ヒトＰＢＭＣのサイトカイン分泌を調節するＯＸ４０共刺激の能力についても試験した。３．１に記載のように、休止ヒトＰＢＭＣ、単離されたＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞は、７２時間にわたって、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢの固定濃度あり又はなしのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの段階希釈列の存在下で、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰで共培養した。上記のようにサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）を使用して、上清を７２時間で評価した。
【０３０４】
ＯＸ４０共刺激は、休止ヒトＰＢＭＣにおける炎症性サイトカインの分泌をサポートし、ＣＤ８  Ｔ細胞においても低い程度でサポートした（用量依存性、休止ＣＤ４  Ｔ細胞については図１４Ａ−図１４Ｈを、休止ＣＤ８  Ｔ細胞については図１５Ａ−１５Ｈを、休止ＰＢＭＣについては図１６Ａ−図１６Ｈを参照）。ＴＣＢ最高濃度の比較を図１７に示す。注目すべきは、特に休止ＣＤ８  Ｔ細胞によるＩＬ−２及びＴＮＦ−α産生への影響であった。
【０３０５】
よって、ＯＸ４０を介した共刺激は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイにおいて４８−７２時間でＴ細胞の細胞溶解能を直接増加させないが、サイトカインを分泌する能力を増加させ、サイトカイン微小環境を調節した。腫瘍におけるより炎症性のサイトカイン環境は、腫瘍の微小環境をより免疫活性化し、免疫抑制性の低い状態にシフトさせることができる。例えば、ＩＬ−１０のレベルに低下及びＩＦＮ−γの濃度の増加は、腫瘍内の骨髄細胞がＴ抗原提示細胞をサポートする細胞傷害性Ｔ細胞及びＴｈ１を成熟させることを可能にすることができる。補助的なサイトカインネットワークへのシフトは、腫瘍が免疫制御を逃れる前に、成功した持続的な腫瘍細胞の排除を回復する。ＣＤ４  Ｔ細胞でのＯＸ４０の優先的発現に沿って、ＣＤ４  Ｔ細胞でのサイトカイン分泌とＣＤ８  Ｔ細胞でのサイトカイン分泌の強い調節を観察した。しかしながら、両方の細胞タイプが影響を受けた。
【０３０６】
実施例４
ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂとＣＥＡＣＡＭ５  ＴＣＢのｉｎ  ｖｉｖｏでの併用療法
４．１  方法
以下の実施例では、我々は、ＴＣＢとＦＡＰ  Ｏｘ４０  ｉＭＡｂの組み合わせがそれぞれの単剤療法と比較してｉｎ  ｖｉｖｏでの優れた抗腫瘍効果をもたらすかどうかを試験した。
【０３０７】
ヒト一価ＦＡＰ標的、四価ＯＸ４０二重特異性抗体（ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ）を、単剤として、及びヒトＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））との組み合わせにおいて、ビヒクル及びＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢでのみ治療された動物に対して試験した。ヒト胃がんＭＫＮ４５細胞に、ＮＯＧヒト化マウスのマウス線維芽細胞株（３Ｔ３）を皮下移植した。
【０３０８】
４．２細胞株及び腫瘍モデル
ヒトＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌）は元来ＡＴＣＣから入手し、拡張後、Ｇｌｙｃａｒｔ内部の細胞バンクに寄託した。５％  ＣＯ２の水飽和雰囲気中で、１０％  ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中３７℃で細胞を培養した。インビトロ継代７を、生存率９８％で皮下注射に使用した。ヒト線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３は元来ＡＴＣＣから入手し、Ｒｏｃｈｅ  Ｎｕｔｌｅｙで操作してヒトＦＡＰを発現させ、１０％  仔ウシ血清、１ｘ  ピルビン酸ナトリウム及び１．５ｕｇ／ｍｌピューロマイシンを含有するＤＭＥＭで培養した。クローン３９を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代番号９（実験１、表１）及び７（実験２、表２）でそれぞれ使用し、それぞれの生存率は９８．８％及び９８．４％であった。
【０３０９】
５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（１ｘ１０６  ＭＫＮ４５細胞＋１ｘ１０６  ３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ）を、２２Ｇから３０Ｇの針で麻酔をかけたマウスの脇腹に皮下注射した。
【０３１０】
４．３  マウスモデル
ＮＯＧメスマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃから調達し、社内でヒト幹細胞を移入した。関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従い、マウスを毎日、１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体がない条件下で保持した。実験的な研究プロトコールが審査され、地方自治体により承認された（Ｐ  ＺＨ１９３／２０１４）。動物は到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０３１１】
４．４  実験１の治療及び実験的取り扱い
ＯＸ４０（ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ、実施例１に記載の分子Ａ）への四価結合を有するヒト一価ＦＡＰ−標的ＯＸ４０二重特異性抗体を、単剤として、及びヒトＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢと組み合わせて試験した。ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂコンストラクトに使用したＦＡＰ結合剤は４Ｂ９であった。ヒト胃ＭＫＮ４５がん細胞に、ＮＯＧヒト化マウスのマウス線維芽細胞株（３Ｔ３）を皮下移植した。
【０３１２】
細胞注射の７日前に、マウスから採血し、血液中のヒトＴ細胞の量をスクリーニングした。研究第０日に、マウスに１ｘ１０６  ３Ｔ３  線維芽細胞と混合した１ｘ１０６  ＭＫＮ４５細胞を皮下注射した。全実験期間中、腫瘍を１週間に２から３回Ｃａｌｉｐｅｒで測定した。第１０日にマウスを腫瘍サイズについて無作為化し、１４０の平均Ｔ細胞数／μｌ血液及び１７０ｍｍ３の平均腫瘍サイズでヒトＴ細胞を計算した。無作為化の日に、５週間にわたって、マウスにビヒクル、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ、ＦＡＰ（４Ｂ９）ＯＸ４０  ｉＭａｂ又はＦＡＰ（４Ｂ９）ＯＸ４０  ｉＭａｂとＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの組み合わせをｉ．ｖ．注射した。
【０３１３】
全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液をｉ．ｖ．注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジンバッファーを注射し、治療群にＯＸ４０拮抗コンストラクト、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ又は組み合わせを注射した。２００μｌ当たりの適切な量の化合物を得るために、必要に応じて原液をヒスチジンバッファーで希釈した。ＣＥＡＣＡＭ５  ＴＣＢに使用する用量及びスケジュールは、０．５ｍｇ／ｋｇ、１回／週であるのに対し、ＦＡＰ  ＯＸ４０ｉＭａｂは１２．５ｍｇ／ｋｇの用量、１回／週で投与された。
【０３１４】
最初の治療から１０分、４時間、７２時間、及び１６８時間後に２匹のマウス／群から採血し、最初の週の間の化合物の曝露を測定した。サンドイッチＥＬＩＳＡ、ヒトＯＸ４０へのコンストラクトの結合、及びｈｕＣＨ１−ドメインの検出によりＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂを測定した。サンドイッチＥＬＩＳＡ、抗ＣＤ３−ＣＤＲ特異性抗体へのＴＣＢの結合、及びヒトＦｃの検出により、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢを検出した（図１８Ａ及び１８Ｂを参照）。
【０３１５】
研究第４４日に実験を終了した。腫瘍、血液及び脾臓をＰＢＳで採取し、単一細胞懸濁液を生成し、異なる免疫細胞マーカーで染色し、ＦＡＣＳによって分析した。製造業者の指示に従って、ＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅバッファー（ＢＤ、カタログ番号５５５８９９）を使用して、全血試料の赤血球溶解を室温で３分間行った。脾臓細胞を、細胞ストレーナー（ナイロンフィルター７０ｕｍ、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を通じて脾臓を均質化し、続いて上記のように赤血球溶解することにより、単離した。腫瘍単一細胞懸濁液を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して調製し、ＤＮＡｓｅ  Ｉ（［０．０２５ｍＧ／ｍＬ］、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号１１２８４９３２００１）及びＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｄ（［１ｍＧ／ｍＬ］、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号１１０８８８８２００１を用いて３７℃で３０分間ホモジネートを消化した。その後、細胞懸濁液を細胞ストレーナー（ナイロンフィルター７０ｕｍ、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を通じて濾過して、残屑を除去した。すべての調製物を余剰の氷冷ＦＡＣＳバッファーで洗浄した。細胞を、蛍光染料−コンジュゲート抗体  抗マウスＣＤ４（クローンＧＫ  １．５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００４２２）、ＣＤ８（クローン５３−６．７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７３０）、ＣＤ４５（クローン３０−Ｆ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０３１１６）、及びＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００３５１）を用いて、精製したラット抗マウス  ＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ、カタログ番号５５３１４２）の存在下、ＦＡＣＳバッファー中、暗所、４℃で３０分間表面染色した。試料を５−レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＤＩＶＡソフトウェア搭載ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して回収し、その後同日にＦＡＣＳバッファーで一度洗浄し、その後０．２μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。生存ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞をゲートし（ＤＡＰＩ−、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４又はＣＤ８＋）、数を正規化し（血液１μＬ当たり、脾臓１ｍｇ当たり又は腫瘍１ｍｇ当たり）、値を計算し、それぞれの治療群についてプロットした。
2021501162.tif 000017
【０３１６】
４．５  実験２の治療及び実験的取り扱い
ヒト一価抗ＦＡＰ（４Ｂ９）／抗ＯＸ４０  二重特異性（ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ）を、単剤として及びヒトＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとの組みあわせにおいて、３つの異なる用量で試験した。ヒト胃ＭＫＮ４５がん細胞に、上記のヒト幹細胞を有するＮＯＧヒト化マウスのマウス線維芽細胞株（３Ｔ３）を皮下移植した。
【０３１７】
細胞注射の７日前に、マウスから採血し、血液中のヒトＴ細胞の量をスクリーニングした。研究第０日に、マウスに１ｘ１０６  ３Ｔ３  線維芽細胞と混合した１ｘ１０６  ＭＫＮ４５細胞を皮下注射した。全実験期間中、腫瘍を１週間に２から３回Ｃａｌｉｐｅｒで測定した。第２６日にマウスを腫瘍サイズについて無作為化し、１１５の平均Ｔ細胞数／μｌ血液及び４９０ｍｍ３の平均腫瘍サイズでヒトＴ細胞を計算した。無作為化の日の翌日に、４週間にわたって、マウスにビヒクル、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ又はＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂとＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの組み合わせをｉ．ｖ．注射した。
【０３１８】
全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液をｉ．ｖ．注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジンバッファーを注射し、治療群にＯＸ４０拮抗コンストラクト、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ又は組み合わせを注射した。２００μｌ当たりの適切な量の化合物を得るために、必要に応じて原液をヒスチジンバッファーで希釈した。ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢに使用する用量及びスケジュールは、０．５ｍｇ／ｋｇ、１回／週であるのに対し、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂは１２．５ｍｇ／ｋｇ、４．２ｍｇ／ｋｇ又は１．４ｍｇ／ｋｇの用量、１回／週で投与された。
【０３１９】
研究第５０日に実験を終了した。腫瘍、血液及び脾臓をＰＢＳで採取し、単一細胞懸濁液を生成し、異なる免疫細胞マーカーで染色し、ＦＡＣＳによって分析した。
【０３２０】
残りすべてのマウス／群の脾臓及び腫瘍を終了時にフローサイトメトリーにより分析した。単一細胞懸濁液をＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８ついて染色し、細胞の量を分析した。終了時の及び実験中の動物からの腫瘍の一部をホルマリン固定し、その後パラフィン包埋した。試料を切断し、ＣＤ３及びＣＤ８について染色した。血漿並びに脾臓及び腫瘍の一部を、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘを介したサイトカイン分析のために凍結した。終了時の腫瘍の一部をホルマリン固定し、その後パラフィン包埋した。試料を切断し、ＣＤ３及びＣＤ８について染色した。
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【０３２１】
第１週中の注射された化合物の薬物動態プロファイルを決定するために、最初の治療の１０分後、４時間後、７２時間後及び７日後に、１群当たり２匹のマウスから採血し、注射した化合物をＥＬＩＳＡによって分析した。ＯＸ４０結合を介してＯＸ４０  ｉＭＡｂを検出した（Ａ）のに対して、抗ＣＤ３  ＣＤＲ抗体への結合を介してＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢを検出した（Ｂ）。
【０３２２】
（Ａ）ビオチン化ヒトＯＸ４０、試験試料、ジゴキシゲニン標識抗ｈｕＣＨ１抗体及び抗ジゴキシゲニン検出抗体（ＰＯＤ）を９６ウェルストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートに段階的に添加し、各段階後に室温で１時間インキュベートした。各段階後にプレートを３回洗浄し、未結合の物質を除去した。最後に、ＡＢＴＳ基質溶液を添加することによりペルオキシダーゼ結合複合体を視覚化して、有色の反応生成物を形成した。反応生成物の強度を４０５ｎＭで（４９０ｎＭの基準波長）測光的に決定したが、これは血清試料中の被分析物濃度に比例する。
【０３２３】
（Ｂ）ビオチン化抗ｈｕＣＤ３−ＣＤＲ抗体、試験試料、ジゴキシゲニン標識抗ｈｕＦｃ抗体及び抗ジゴキシゲニン検出抗体（ＰＯＤ）を９６ウェルストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートに段階的に添加し、各段階後に室温で１時間インキュベートした。各段階後にプレートを３回洗浄し、未結合の物質を除去した。最後に、ＡＢＴＳ基質溶液を添加することによりペルオキシダーゼ結合複合体を視覚化して、有色の反応生成物を形成した。反応生成物の強度を４０５ｎＭで（４９０ｎＭの基準波長）測光的に決定したが、これは血清試料中の被分析物濃度に比例する。
【０３２４】
４．６  腫瘍、脾臓及び血清試料のサイトカイン分析
血清を回収し、皮下腫瘍及び脾臓を、最後のＡｂ投与の２日後、終了時（第５０日）に動物から採取した。研究終了時に、２０−３０ｍｇの急速冷凍した脾臓及び腫瘍組織を、総タンパク質単離のために処理した。簡潔には、総容量１５０μｌの溶解バッファー中でＴｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒシステム及びステンレス鋼ビーズを使用して組織試料をメッシュ状にした。メッシュ状の試料を遠心分離により清澄化し、製造業者の指示に従って上清中でＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって総タンパク質含有量を分析した。製造業者の指示に従ったＢｉｏ−Ｐｌｅｘシステム（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ＰｒｏＴＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １７−ｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ、ＢｉｏＲａｄ）による異なるサイトカイン／ケモカインの分析のために、腫瘍及び脾臓溶解物の合計２００μｇの総タンパク質並びに１：１０希釈の血清試料を使用した。
【０３２５】
４．７  免疫組織化学
免疫組織化学分析を、ヒト化ＮＯＧマウスの示された治療群に由来する３Ｔ３マウス線維芽細胞が移植されたヒトＭＫＮ４５胃皮下腫瘍に対して実施した。皮下腫瘍は、最後のＡｂ投与の２日後、終了時に動物から採取し、１０％ホルマリン固定し（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）、その後ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０、ドイツ）のために処理した。続いて４μｍのパラフィン切片をミクロトームに切断した（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５、ドイツ）。製造業者のプロトコールに従い、Ｌｅｉｃａオートステイナー（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０、ドイツ）で、抗ヒトＣＤ８（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及び抗ヒトＣＤ３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して、ＨｕＣＤ８及びＨｕＣＤ３の免疫組織化学を実施した。Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェア（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ、ドイツ）を用いてｈｕＣＤ３及びｈｕＣＤ８陽性Ｔ細胞の数量化を実施した。複数の比較試験を用いる一元配置分散分析によって統計を分析した。
【０３２６】
４．８  実験１の結果
ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂがＴ細胞活性化状態及びサイトカイン放出を変更することができることをｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験はすでに示すことができた。ＯＸ４０の影響はＣＤ８陽性Ｔ細胞よりもＣＤ４陽性Ｔ細胞においてより強いようであることも確認された。
【０３２７】
ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂがｉｎ  ｖｉｖｏで免疫状態をより有益な結果に変更することができるかを試験するために、我々は、ヒト幹細胞を免疫不全マウスに移入するヒト化マウスモデルを使用し、よって、主にＴ細胞及びＢ細胞からなる部分的にヒトの免疫系を生成した。我々は、腫瘍中の間質成分及びＦＡＰ発現を改善する、ＭＫＮ４５、ＣＥＡ発現ヒト胃がん細胞株、及び３Ｔ３線維芽細胞を共注入した。ＣＥＡは、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢによって標的とされ、Ｔ細胞を腫瘍細胞と架橋させ、Ｔ細胞媒介性の腫瘍細胞の殺傷及びＴ細胞活性化を誘導する。Ｔ細胞活性化時にＯＸ４０は上方制御される。ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂは、ＦＡＰ発現線維芽細胞及びＯＸ４０発現Ｔ細胞を架橋し、よってＯＸ４０シグナル伝達を誘導している。これは、Ｔ細胞生存及びサイトカイン放出の改善につながる。
【０３２８】
我々は、この研究で、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂとＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの併用療法が、単剤療法と比較して有効性の改善をもたらすことを証明することができた。また、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂ単剤療法は、ビヒクルと比較して有効性の改善を示した。
【０３２９】
我々は、有効性の差異の原因としての曝露の差異を除外するために、それぞれの単剤療法及び併用群の最初の治療でのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ並びにＦＡＰＯｘ４０ｉＭＡＢの血清濃度を評価した。図１８Ａ及び１８Ｂに示すように、すべてのコンストラクトの曝露は、単剤療法及び併用療法で同等であった。
【０３３０】
図１９で示すように、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂ単剤で治療された動物は、腫瘍、より顕著なものであるＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの進行がわずかに遅延したことを示した。しかしながら、併用療法においてのみ、皮下腫瘍の縮小を達成された（表３を参照）。
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【０３３１】
４．９  実験２の結果
第２の研究では、我々は、単剤療法としての、又はＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））と組み合わせたＦＡＰＯＸ４０ｉＭＡＢの異なる用量について試験した。ここでは、最初の研究の１７０ｍｍ３と比較して、腫瘍サイズの中央値が４９０ｍｍ３に達するまで、治療の開始を遅らせた。
【０３３２】
化合物を注射したすべての群は、ＯＸ４０標的化合物又はＴＣＢのいずれかの、異なる群の間で、分子の同等の最高濃度を示した。図２０Ａ及び２０Ｂでは、第１の週の間に注射した化合物の薬物動態プロファイルを示す。
【０３３３】
図２１Ａ−２１Ｃでプロットされるように、単剤療法に対する併用療法の優れた抗腫瘍効果を再度確認することができた。試験した用量のいずれのＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂと、単剤療法としてのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢはどちらも、腫瘍増殖の進行を原則させることはできず、これは、これはおそらく、治療の初めにすでにかなりの腫瘍負荷があったためである。研究時間全体で、併用治療のみが、腫瘍成長の進行を有意に予防した（表４）。１２．５ｍｇ／ｋｇの用量のＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢで強力な長期にわたる有効性を観察したが、低用量（４．２及び１．４ｍｇ／ｋｇ）では、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法と比較して、一時的にのみ進行を低減させることができた（図２２）。明白な用量依存性を観察した。図２０Ａ及び２０Ｂに示すように、すべてのコンストラクトの曝露は、単剤療法及び併用療法で同等であった。
【０３３４】
中央値に基づく腫瘍成長阻害を研究第４０日及び第４９日に計算した。値は表４にみられる。
2021501162.tif 000020
【０３３５】
多重比較の群平均の有意差を試験するために、ダネット法を使用して、標準的な分散分析（ＡＮＯＶＡ）を自動的に生成した。ダネット法は、平均がコントロール群の平均と異なるかを試験する。
2021501162.tif 000021
【０３３６】
フローサイトメトリー（図２３Ａ−２３Ｄ）及び組織病理学的（図２５Ａ及び２５Ｂ）評価は、それは、ヒト白血球による腫瘍塊への浸潤の増加を示した。これは、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法ですでに観察されたが、４．２又は１２．５ｍｇ／ｋｇ  ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢとのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの組み合わせで非常に拡大した。ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ単剤療法自体は、腫瘍内白血球数を最小限にしか増加させなかった。検出した細胞タイプは、ヒトＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞であったが、非Ｔ細胞（例えば、Ｂ細胞又は骨髄由来細胞）も検出した。興味深いことに、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法と比較して、併用療法の倍率増加は、主にＣＤ４  Ｔ細胞に発現しているＯＸ４０の生物学と一致して、ＣＤ８  Ｔ細胞数よりもＣＤ４  Ｔ細胞数でより顕著であった。末梢では細胞数の有意な変化は検出されず、両方の化合物の腫瘍標的性を強調している（図２４Ａ及び２４Ｂ）。
【０３３７】
脾臓、血液及び腫瘍内サイトカインの濃度も評価した（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ＰｒｏＴＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １７−ｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ、ＢｉｏＲａｄ）。最も高い抗腫瘍効果を有する群は、腫瘍内サイトカインで最大の全体的な増加を示し（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１β（図２６Ａ−２６Ｃ）、ＦＡＰ  Ｏｘ４０  ｉＭＡＢ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）とＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの組み合わせであった。末梢（脾臓又は血液）では有意な変化は観察されなかった。よって、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ及びＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ処理により引き起こされた免疫学的変化は、ヒトＴ細胞の架橋及び活性化がＣＥＡ発現腫瘍で排他的に生じるが、ＣＥＡ様血液及び脾臓ではネガティブである他の部分では生じないことを示す腫瘍特異性であった。
【０３３８】
我々は、腫瘍進行と腫瘍内サイトカイン濃度との間に直接的な負の相関関係が見られたが、併用治療を受けた動物の腫瘍内白血球数との間には相関関係がなかったことを、さらに発見した（図２７Ａ−２７Ｆ）。存在するサイトカインの量も、すべての動物の浸潤白血球の数と厳密には相関していなかった。特に、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法で治療を受けた動物を、併用治療を受けた動物と比較したとき、同様の白血球数は同じ抗腫瘍効果又は存在するサイトカイン含有量を必ずしも意味するものではなかったことを観察した。これは、腫瘍内Ｔ細胞の単に増加した数を超えると、細胞当たりの機能と、腫瘍内Ｔ細胞のサイトカインを分泌する可能性の増加は、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢとＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの組み合わせの抗腫瘍活性の増強の原因となるという想定につながる。
【０３３９】
サイトカイン環境の改善は、抗腫瘍効果の媒介に重要な役割を果たす。それはより多くのリンパ球を腫瘍に動員し、増殖をサポートし、それらのＴ細胞の生存を増加させ、抑制と消耗の確立を防止する。われわれは、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、異なる腫瘍細胞株、エフェクター集団及び腫瘍標的に対するサイトカインのＴＣＢ媒介性分泌を、より炎症性で抑制性の低いものに調節することができることを、示すことができた。さらに、我々は、これがヒトの免疫系をシミュレートするヒト化マウスモデルにおける抗腫瘍効果の改善につながることを、示すこともできた。
【０３４０】
実施例５
ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ、ＣＥＡ  ＴＣＢ及びＰＤ−Ｌ１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの併用療法
５．１  実験手順
以下の実施例では、ヒト胃がんＭＫＮ４５モデルにおいて、ヒトＦＡＰ標的ＯＸ４０アゴニスト  ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂ（ＦＡＰ結合剤４Ｂ９）を、１２．５ｍｇ／ｋｇの濃度で、ヒトＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ａ−ＰＤ−Ｌ１）と組み合わせて試験した。ＭＫＮ４５細胞に、ＮＳＧヒト化マウスのマウス線維芽細胞株（３Ｔ３）を皮下移植した。
【０３４１】
ヒトＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌）は元来ＤＳＭＺから入手し、拡張後、Ｇｌｙｃａｒｔ内部の細胞バンクに寄託した。５％  ＣＯ２の水飽和雰囲気中で、１０％  ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中３７℃で細胞を培養した。インビトロ継代１３を、生存率９９．１％で皮下注射に使用した。ヒト線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３は元来ＡＴＣＣから入手し、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．で操作してヒトＦＡＰを発現させ、１０％  仔ウシ血清、１ｘ  ピルビン酸ナトリウム及び１．５μｇ／ｍｌピューロマイシンを含有するＤＭＥＭで培養した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代数８及び９７．６％の生存率でクローン３９を使用した。
【０３４２】
５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（１ｘ１０６  ＭＫＮ４５細胞＋１ｘ１０６  ３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ）を、２２Ｇから３０Ｇの針で麻酔をかけたマウスの脇腹に皮下注射した。実験の開始時に５週齢のＮＳＧメスのマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入）を、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従い、毎日、１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体がない条件下で保持した。実験的な研究プロトコールが審査され、地方自治体により承認された。動物は到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが毎日実施された。
【０３４３】
ヒト化のために、マウスにブスルファン（２０ｍｇ／ｋｇ）を注射し、続いて２４時間後に１００，０００のヒトＨＳＣ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）を注射した。
【０３４４】
細胞注射の７−１４日前に、マウスから採血し、血液中のヒトＴ細胞の量をスクリーニングした。１３１の平均Ｔ細胞数／ｕｌ血液で、マウスをヒト化Ｔ細胞について無作為化した。研究第０日に、マウスに１ｘ１０６  ３Ｔ３  線維芽細胞と混合した１ｘ１０６  ＭＫＮ４５細胞を皮下注射した。全実験期間中、腫瘍を１週間に２から３回Ｃａｌｉｐｅｒで測定した。第１７日に、２０５ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを腫瘍サイズについて無作為化した。無作為化の日に、ビヒクル、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとａ−ＰＤ−Ｌ１、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂ、又はＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、ａ−ＰＤ−Ｌ１及びＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂの３剤組み合わせを、最大４週間にわたってマウスに毎週注射した。全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液をｉ．ｖ．注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジンバッファーを注射し、治療群にＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及び／又はＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂの組み合わせを注射した。２００μｌ当たりの適切な量の化合物を得るために、必要に応じて原液をヒスチジンバッファーで希釈した。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢに使用する用量及びスケジュールは、２．５ｍｇ／ｋｇ、２回／週であるのに対し、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂは１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、及びａ−ＰＤ−Ｌ１は１０ｍｇ／ｋｇの用量、１回／週で投与された（表７）。研究第４４日に実験を終了した。一部のマウスは、実験中の健康状態の悪さにより犠牲にしなければならなかった。
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【０３４５】
腫瘍及び血液をＰＢＳで採取し、単一細胞懸濁液を生成し、異なる免疫細胞マーカーで染色し、ＦＡＣＳによって分析した。血漿、及び腫瘍の一部を、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘを介したサイトカイン分析のために凍結した。終了時の腫瘍の一部をホルマリン固定し、その後パラフィン包埋した。試料を切断し、ＣＤ３及びＣＤ８について染色した。
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【０３４６】
５．２  結果
この研究では、我々は、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂがＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとａ−ＰＤ−Ｌ１の組み合わせにより媒介される有効性を改善することができることを初めて証明することを望んだ。ａ−ＰＤ−Ｌ１は、免疫チェックポイント阻害剤であり、がん免疫療法の分野においてよく確立されている。ａ−ＰＤ−Ｌ１結合剤は、マウスＰＤ−Ｌ１に対して交差反応性であり、マウスＩｇＧフォーマットにおいて生成された。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢは、がん細胞に発現する標的ＣＥＡであり、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂは、腫瘍基質のＦＡＰ発現線維芽細胞に結合する。ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂは１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で毎週投与され、ａ−ＰＤ−Ｌ１は１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されるのに対して、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢは２．５ｍｇ／ｋｇの量で週２回投与される。
【０３４７】
我々のヒトコンストラクトを試験するためには、ヒト免疫細胞、特にＴ細胞がマウス系に存在している必要がある。この理由のため、我々は、ヒト化マウス、つまりヒト幹細胞を移植したマウスを使用した。これらのマウスは、経時的に、主にＴ細胞及びＢ細胞からなる部分的にヒトの免疫系を発達させる。
【０３４８】
我々は、腫瘍中の間質成分を改善する、ＭＫＮ４５、ＣＥＡ発現ヒト胃がん細胞株、及び３Ｔ３線維芽細胞を共注入した。ＣＥＡは、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢによって標的とされ、Ｔ細胞を腫瘍細胞と架橋させ、Ｔ細胞媒介性の腫瘍細胞の殺傷及びＴ細胞活性化を誘導する。Ｔ細胞活性化時に、ＯＸ４０及びＰＤ−１は上方制御される。ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂは、ＦＡＰ発現間質細胞及びＯＸ４０発現Ｔ細胞を架橋し、よってＯＸ４０シグナル伝達を誘導している。これは、サイトカイン分泌、生存、及びＴ細胞の増殖の改善につながる。ＰＤ−Ｌ１は主に腫瘍細胞により発現し、ＰＤ−Ｌ１のブロックは、ＰＤ−１発現Ｔ細胞との架橋を防止し、したがって、Ｔ細胞のＰＤ−１依存性の活性化を防止する。
【０３４９】
ａ−ＰＤ−Ｌ１及びＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂと組み合わせたＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢが、ビヒクル群と比較して腫瘍成長阻害に関する有効性の改善を媒介することを、我々はこの研究で示すことができた（図２８Ａ及び２８Ｂ）。中央値に基づく腫瘍成長阻害を研究第３６、第３８日、第４１日及び第４３日に計算した。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ＋ａ−ＰＤ−Ｌ１＋ＦＡＰ  ＯＸ４０ｉＭＡｂは、腫瘍成長の最も強力な阻害を示す。
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【０３５０】
第４３日までの曲線下面積（ＡＵＣ）を考慮すると、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとａ−ＰＤ−Ｌ１とＦＡＰ  ＯＸ４０ｉＭＡｂの組み合わせのみが、ビヒクル単剤療法とは有意に異なる。
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【０３５１】
他のすべての群（単剤療法及び二剤療法）は、ビヒクルと比較して、有効性を有意に改善できなかった。
【０３５２】
第１週の間に注射された化合物の薬物動態プロファイルを、実施例４に記載のとおりに研究した。さらに、ａ−ＰＤ−Ｌ１ビオチン化抗ヒトＦｃを検出するために、ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＦｃ、試験試料及びポリクローナル抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ）を９６ウェルストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートに段階的に添加し、各段階後に１時間室温でインキュベートする。各段階後にプレートを３回洗浄し、未結合の物質を除去した。最後に、ＡＢＴＳ基質溶液を添加することによりペルオキシダーゼ結合複合体を視覚化して、有色の反応生成物を形成する。４０５ｎＭで（４９０ｎＭの基準波長）測光的に決定された反応生成物の強度は、血清試料中の被分析物濃度に比例する。１群あたり２匹のマウスから第１及び第３の治療の１時間後及び７２時間後に採血し、注射した化合物をＥＬＩＳＡにより分析した。化合物を注射したすべての群は、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂ、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ又はａ−ＰＤ−Ｌ１のいずれかの異なる群の間で分子の同等の曝露を示す（図２９Ａ、２９Ｂ及び２９Ｃを参照）。
【０３５３】
第４４日のＩＨＣ（免疫組織化学）による終了時の腫瘍におけるＴ細胞浸潤は、他のすべての群と比較して、３剤組み合わせ群で有意に増加した（図３０Ａ及び３０Ｂを参照）。
【０３５４】
実施例６
ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ、ＣＥＡ  ＴＣＢ及びＰＤ−Ｌ１抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの併用療法
６．１  実験手順
このアッセイでは、実施例５の記載と同様に、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びアテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、抗ヒトＰＤ−Ｌ１特異的ヒト化ＩｇＧ１κ抗体）の存在下又は不存在下で、ヒトＰＢＭＣ（バフィーコートから単離し、凍結し、液体窒素中で貯蔵）の活性化を達成する能力についてＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂを試験した。腫瘍環境を模倣するために、６人の異なるドナーのＰＢＭＣに、２ｎＭ  ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭａｂ及び／又は１００ｎＭ  ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及び／又は８０ｎＭ  アテゾリズマブの存在下又は不存在下で、ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ線維芽細胞細胞株及びＣＥＡ発現ＭＫＮ４５−ＦｏｌＲ１−ＰＤＬ１胃がん細胞株を四日間インキュベートした。ＰＢＭＣ活性化を決定するために、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞を増殖（ＣＦＳＥ希釈）、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、Ｔ−ｂｅｔ（Ｔボックス転写因子）、Ｅｏｍｅｓ（エオメソダーミン）、グランザイムＢ、及びＰＤ−１発現についてフローサイトメトリーにより分析した。Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘにより、上清をＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、グランザイムＢ、ＩＬ−２、ＩＬ−８及びＩＬ−１０について分析した。
【０３５５】
ａ）ＰＢＭＣの調製
バフィーコートをチューリッヒ献血センターから入手した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを同じ容量のＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号Ｎｏ．１４１９０３２６）で希釈した。５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ遠心分離管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に１５ｍＬ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）を供給し、バフィーコート溶液をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７の上に重ねた。４００×ｇで３０分間にわたって、室温、低速、ブレーキなしで、管を遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを界面から回収し、ＤＰＢＳで三回洗浄し、９０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号１６０００−０４４、Ｌｏｔ  ９４１２７３、ガンマ照射、マイコプラズマ非含有、及び５６℃で３５分間熱不活性化）及び１０％  ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２６５０）１０％（ｖ／ｖ）からなるＴ細胞凍結培地に再懸濁させた。１ｍＬを滅菌クライオバイアルにすばやく移し、クライオボックスに移し、−８０℃で２４時間貯蔵した。その後、バイアルを液体窒素容器又は蒸気相容器に移した。
【０３５６】
６人のドナーからのバイアルを３７℃の水浴で解かし、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が供給されたＲＰＭＩ  １６４０培地、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ、１  ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭ  β−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）からなるアッセイ培地で洗浄した。解かした後、細胞インキュベーター中３７℃及び５％  ＣＯ２で２時間静置した。細胞を数え、ＤＰＢＳで洗浄し、３７℃のＤＰＢＳに再懸濁させて１ｘ１０６細胞／ｍＬにした。ＣＦＤＡ−ＳＥを添加して２００ｎＭの最終濃度にし、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、ＦＢＳを添加し、細胞を洗浄し、アッセイ培地に設置し、２ｘ１０６細胞／ｍＬ）にした。
【０３５７】
Ｂ）標的細胞株
ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ  クローン１９を含有するＴ１５０フラスコをＤＰＢＳで洗浄し、酵素非含有のＰＢＳベースの解離バッファーで３７℃で８分間インキュベートした。細胞を回収し、洗浄し、アッセイ培地に再懸濁させ、Ｘ−Ｒａｙ  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ  ＲＳ  ２０００を使用して５０Ｇｙで照射した。細胞をアッセイ培地に設置し、１ｘ１０６細胞／ｍＬにした。
【０３５８】
ＭＫＮ４５−ＦｏｌＲ１−ＰＤＬ胃がん細胞株を含有するＴ１５０フラスコをＤＰＢＳで洗浄し、酵素非含有のＰＢＳベースの解離バッファーで３７℃で８分間インキュベートした。細胞を回収し、ＤＰＢＳで洗浄し、Ｃ希釈剤に再懸濁させた（少なくとも２５０μＬ、８ｘ１０７細胞／ｍＬ以下）。同量のＣ希釈剤に４μＬ／ｍＬ  ＰＫＨ−２６染料を供給し、よく混合した。この染料溶液を細胞に添加し、すぐによく混合した。細胞を室温で５時間インキュベートした。その後、ＦＢＳを添加し、細胞をアッセイ中で洗浄し、アッセイ培地に再懸濁させ、Ｘ−Ｒａｙ  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ  ＲＳ  ２０００（Ｒａｄ  ｓｏｕｒｃｅ）を使用して５０Ｇｙで照射した。細胞をアッセイ培地に設置し、１ｘ１０６細胞／ｍＬにした。
【０３５９】
Ｃ）アッセイセットアップ
試験化合物については、以下のようにアッセイ培地中で各成分のマスター溶液を調製した：１６ｎＭ  ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ、８００ｎＭ  ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及び６４０ｎＭ  アテゾリズマブ。５０μＬのＰＫＨ−２６赤色標識ＭＫＮ４５−ＦｏｌＲ１  −ＰＤ−Ｌ１（１００００細胞／ウェル）、５０μＬのＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ  クローン１９（１００００細胞／ウェル）、２５μＬの一人のドナーのＰＢＭＣ（５００００細胞／ウェル）、２５μＬの１６ｎＭ  ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ溶液又はアッセイ培地（２ｎＭの最終濃度）、２５μＬの８００ｎＭ  ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ溶液又はアッセイ培地（１００ｎＭの最終濃度）、及び２５μＬの６４０ｎＭ  アテゾリズマブ溶液又はアッセイ培地（８０ｎＭの最終濃度）の量で、細胞及び成分を９６ウェル丸底組織培養プレート（ＴＴＰ、カタログ番号９２０９７）で組み合わせた。その後、加湿細胞インキュベーター中で、プレートを３７℃及び５％  ＣＯ２で４日間インキュベートした。
【０３６０】
４日後、５０μＬの上清を除去し、−８０℃で貯蔵して、サイトカイン含有量について後に分析した（以下を参照）。Ｔ細胞増殖及びＴ細胞活性化マーカーの表面発現のフローサイトメトリー分析を実施するために、プレート遠心分離し、冷ＤＰＢＳで一回洗浄した。２つの個別の染色パネルについて、試料を２つの９６ウェルプレートで等量に分けた。パネル１の染色については、１：８００に希釈したＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎを供給した５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中で細胞を室温（ＲＴ）で１５分間染色した。細胞を２００μＬ／ウェルＦＡＣＳバッファーで一度洗浄した（３５０ｘｇ、４分間、４℃、フリックオフ）。その後、抗体抗ヒトＣＤ４（クローンＡ１６１Ａ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５７４１０）、ＣＤ８（クローンＲＰＡ−Ｔ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４０）、ＣＤ２５（クローンＢＣ９６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２６３６）、ＰＤ−１（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２９９２０）、ＣＤ１３４（クローンＢｅｒ−ＡＣＴ３５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５０００８）、ＣＤ１３７（クローン４Ｂ４−１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号  ３０９８１４）を含有するＦＡＣＳバッファーから構成された２５μＬ／ウェル染色溶液に再懸濁させ、４℃で２０分間インキュベートした。２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーで細胞を一度洗浄し（遠心分離３５０ｘｇ、４分、４℃、フリックオフ）、１２０μＬ／ウェルＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、その後、４−レーザーＬＳＲＩＩ（ＤＩＶＡソフトウェアを搭載したＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して同日に得た。
【０３６１】
パネル２の染色については、１：８００に希釈したＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎを供給した５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中で細胞を室温（ＲＴ）で１５分間染色し、２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーで一度洗浄した（遠心分離３５０ｘｇ、４分、４℃、フリックオフ）。抗体抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５５８）、ＣＤ８（ＳＫ−１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４７１０）、ＣＣＲ７（クローンＧ０４３Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５３２０４）、ＣＤ４５ＲＯ（クローンＢＣ９６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４２３６）を含有するＦＡＣＳバッファーから構成された２５μＬ／ウェル染色溶液に再懸濁させ、４℃で２０分間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーで一度洗浄し（遠心分離３５０ｘｇ、４分、４℃、フリックオフ）、Ｆｏｘｐ３  Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅの１部をＦｏｘｐ３  Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＦｏｘＰ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号００５５２３−００）の３部と室温で６０分間混合することにより、１００μＬ／ウェルのＦｏｘｐ３  Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ標準溶液中に再懸濁させた。その後、１部のＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎバッファーと９部の水を混合することにより（ＦｏｘＰ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号００５５２３−００）、細胞をＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ標準溶液で一度洗浄し、抗体ヒトＥＯＭＥＳ（クローンＤａｎ１１ｍａｇ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号−２５−４８５７−８０）、Ｔ−ｂｅｔ（クローン４Ｂ１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号−６４４８１５）及びグランザイムＢ（クローンＧＢ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号５１５４０６）を含有するＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎバッファー標準溶液から構成された５０μＬ／ウェル染色溶液に室温で４０分間再懸濁させた。その後、２００μＬ／ウェルのＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ標準溶液で細胞を二回洗浄し、１２０μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、その後、４−レーザーＬＳＲＩＩ（ＤＩＶＡソフトウェアを搭載したＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して同日に得た。ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０．３  ｆｏｒ  ＰＣ（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｐｌｕｓ  ２０１０）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６．０７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を使用してデータを分析した。生存ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞をゲートし（Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ−、ＣＤ４又はＣＤ８＋）、数え、活性化マーカー（ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２５、ＰＤ−１）又は成熟マーカー（ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ）又は転写因��（Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ）又はサイトカイン（グランザイムＢ）の平均蛍光発光強度（ＭＦＩ）及び陽性細胞の割合又は平均蛍光発光（ＭＦＩ）を各条件についてプロットした。
【０３６２】
上清中の放出サイトカインを分析するには、先の凍結試料を取り、製造業者の指示に従ってサイトメトリービーズアレイを使用して、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、グランザイムＢ、ＩＬ−８及びＩＬ−１０について分析した。評価したサイトカインは、ＩＬ−２（ヒトＩＬ−２  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ａ４）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５８２７０）、ＴＮＦ−α（ヒトＴＮＦ−α  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｃ４）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５６０１１２）、ＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−γ  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｅ７）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５８２６９）、ＩＬ−１０（ヒトＩＬ−１０  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｂ７）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５８２７４）、ＴＮＦ（ヒトＴＮＦ  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｃ４）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５６０１１２）、ＩＬ−８（ヒトＩＬ−８  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ａ９）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５８２７７）、グランザイムＢ（ヒトグランザイムＢ  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｄ７）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５６０３０４）であった。
【０３６３】
６．２  結果
６．２．１  ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂの組み合わせは、ａ−ＰＤ−Ｌ１との組み合わせよりも優れていた
図３１Ａ及び３１Ｂに示すように、１００ｎＭ  ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（点で埋めたバー、黒の三角）は、活性化マーカーＣＤ２５の発現と、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の増殖とを増加させることができたが、２ｎＭ  ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂ単独（白のバー、白丸）ではできなかった。ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂとＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの組み合わせ（グレーのバー、白の四角）及び／又はａＰＤ−Ｌ１（黒のバー、グレーの四角）は、図３１Ａ及び３１Ｂに示すＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとａＰＤ−Ｌ１の併用治療（白のバー、黒丸）と比較して、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の活性化及び増殖が最も高くなった。さらに、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢとＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの併用治療により、ＣＤ４  Ｔ細胞のＴ細胞転写因子（Ｔ−ｂｅｔ）の割合は高くなり、ＣＤ８  Ｔ細胞のＴ−ｂｅｔの発現は高くなった（図３２Ａ及び３２Ｂ）。Ｔ−ｂｅｔ発現は、Ｔヘルパー１細胞系統コミットメントを制限し、これらの結果は、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂ治療によりＴｈ１  Ｔ細胞反応が引き起こされることを示す。さらに図３３Ａから３３Ｄで示すように、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡとＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ治療の組み合わせにより、グランザイムＢ発現ＣＤ４及びＣＤ４  Ｔ細胞の割合は高くなり、これはＴ細胞の細胞溶解能が高くなることを示唆する。実験のエンドポイントでの上清中のサイトカインの分析は、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びａＰＤ−Ｌ１治療と比較して、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂ中で多量の炎症性サイトカインＩＦＮ−γ及びグランザイムＢ  を示したが、ドナー間のばらつきが大きいため、差異は統計的に有意ではなかった。まとめると、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂの組み合わせは、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の両方の優れた活性化、増殖、及びＴｈ１分化をもたらした。
【０３６４】
６．２．２  ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂ及びＰＤ−Ｌ１の３剤組み合わせは最も高いサイトカイン分泌をもたらした  
図３４Ａから３４Ｃに示すように、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、ＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂ及びＰＤ−Ｌ１（黒のバー、グレーの四角）の３剤組み合わせは、ＩＦＮ−γ、グランザイムＢ及びＩＬ−８等の免疫細胞活性化炎症性サイトカインの放出において、他のすべての治療群と比較して、最も効果的であった。図３４Ｃに示すように、３剤併用治療はまた、分泌されたサイトカインを測定する我々の結果と一致して、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の両方において、細胞溶解酵素グランザイムＢの細胞内発現が最も高くなった。３剤組み合わせとＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びａＰＤ−Ｌ１の組み合わせとを比較するサイトカインの倍率増加を、図３５Ａから３５Ｃに示す。異なるドナー間でのサイトカイン分泌レベルの強力な差異にも関わらず、３剤組み合わせは、試験されたドナーの大多数で２倍以上の差異をもたらした。ＩＬ−８及びＩＦＮγで最も高い倍率変化を観察した。図３１Ａ及び３１Ｂで示すように、３剤組み合わせ（黒いバー、グレーの丸）は、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡｂの併用治療と比較して、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の増殖及び活性化に変化をもたらさなかった。まとめると、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと組み合わせたときのＦＡＰ  ＯＸ４０  ｉＭＡＢ共刺激は、Ｔ細胞活性化、増殖及びＴｈ１系統の細胞内発現の促進、転写因子Ｔ−ｂｅｔ及びグランザイムＢ発現の刺激に強力な効果をもたらす。このように、この組み合わせへのＰＤ−Ｌ１の添加は、細胞内及び分泌グランザイムＢ及び炎症性サイトカインＩＦＮ−γの発現の増加により、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の両方の細胞傷害性能をさらに増強する。
【図１Ａ−Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図５Ａ−Ｃ】
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【図６Ａ−Ｄ】
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【図７Ａ−Ｄ】
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【図８Ａ−Ｄ】
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【図９Ａ−Ｄ】
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【図１０Ａ−Ｄ】
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【図１１Ａ−Ｄ】
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【図１２Ａ−Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ−Ｄ】
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【図１４Ｅ−Ｈ】
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【図１５Ａ−Ｄ】
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【図１５Ｅ−Ｈ】
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【図１６Ａ−Ｄ】
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【図１６Ｅ−Ｈ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ−Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ−Ｃ】
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【図２２】
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【図２３Ａ−Ｂ】
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【図２３Ｃ−Ｄ】
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【図２４Ａ−Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ−Ｃ】
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【図２７Ａ−Ｄ】
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【図２７Ｅ−Ｆ】
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【図２８Ａ−Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ−Ｂ】
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【図３２Ａ−Ｂ】
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【図３３Ａ−Ｂ】
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【図３３Ｃ−Ｄ】
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【図３４Ａ−Ｃ】
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【図３５Ａ−Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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