(57)【要約】  食用植物のプラスチドでマーカーフリーのバイオ医薬品タンパク質を製造するための組成物および方法が開示されている。また、病気の治療のために、必要としている対象にそのようなタンパク質を経口投与する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオ医薬品タンパク質をプラスチドで発現する抗生物質フリーのトランスプラストミック植物であって、前記タンパク質は、ＣＴＢ−ｐｒｏＩＧＦ１、ＰＴＤ−ｐｒｏＩＧＦ１、ＣＴＢ−プロインスリン、ＣＴＢ−ＡＭＡ、ＣＴＢ−ＭＳＰ、ＣＴＢ−ＦＩＸ，ＣＴＢ−ＦＩＸ−ｆｕｒｉｎ、ＣＴＢ−Ｅｘｅｎｄｉｎ、ＣＴＢ−ＥＳＡＴ６、ＣＴＢ−Ｍｔｂ７２Ｆ、ＣＴＢ−ＶＰ１、ＣＴＢ−ＭＢＰ、ＣＴＢ−Ａｃｅ  ２、ＣＴＢ−Ａｎｇ１−７、ＣＴＢ−ＧＡＡ、ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＨＣ、ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−Ｃ２、コドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＨＣ、コドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＬＣ、およびコドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＳＣである、抗生物質フリーのトランスプラストミック植物。
【請求項２】
前記タンパク質が、ＣＴＢ−ｐｒｏＩＧＦ１およびＰＴＤ−ｐｒｏＩＧＦ１から選択され、前記タンパク質の各々がｅ−ペプチドを含む、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記ＩＧＦ１が、グリコシル化部位を除去するように改変されている、請求項２に記載の植物。
【請求項４】
前記タンパク質が、プラスチド発現にコドン最適化された核酸によってコードされている、請求項１に記載の植物。
【請求項５】
請求項２に記載の植物から得られる単離された植物細胞。
【請求項６】
高等植物のプラスチドにおいて、経口摂取用の抗生物質フリーのバイオ医薬品を生産する植物の製造方法であって、
ａ）  植物細胞にプラスチド形質転換ベクターを導入することであって、前記ベクターは、プラスチドプロモーターに作動可能に連結された、抗生物質をコードする選択可能なマーカー遺伝子を含み、前記遺伝子およびプロモーターは、６００〜８００ヌクレオチドの長さの間でダイレクトリピートしているＤＮＡ配列によって挟まれており、前記ベクターは、目的のバイオ医薬品タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２のプラスチドプロモーターを含む異種核酸をさらに含み、前記目的のタンパク質は、任意にターゲティングペプチドを含み、または、前記タンパク質をコードする核酸は、前記植物における発現のためにコドン最適化されている、導入すること、
ｂ）  工程ａ）の植物細胞を、前記抗生物質の存在下で、再生培地中で、シュートの生産が起こるのに適した期間、培養すること、
ｃ）  選択可能なマーカー遺伝子の切除について、前記シュートを評価すること、
ｄ）  選択可能なマーカー遺伝子の切除を示したシュートを、根の成長を誘導するのに適した抗生物質を含まない培地に移すこと、
ｅ）  工程ｄ）で誘導された根から、前記選択可能なマーカー遺伝子を欠いた、前記目的のタンパク質を発現するトランスプラストミック植物を作製すること、を含む方法。
【請求項７】
工程ｅ）の植物がホモプラスミーについて評価される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記選択可能なマーカー遺伝子がａａｄＡ遺伝子であり、前記抗生物質がスペクチノマイシンである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ダイレクトリピートが、配列番号１６によってコードされている、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種核酸が、ＰＴＤペプチドおよびｅ−ペプチドと作動可能に連結されたコドン最適化ＩＧＦ１をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記異種核酸が、ＣＴＢペプチドに作動可能に連結されたコドン最適化ＩＧＦ１をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的の異種タンパク質が、ＣＴＢ−プロインスリン、ＣＴＢ−ＡＭＡ、ＣＴＢ−ＭＳＰ、ＣＴＢ−ＦＩＸ、ＣＴＢ−ＦＩＸ−ｆｕｒｉｎ、ＣＴＢ−Ｅｘｅｎｄｉｎ、ＣＴＢ−ＥＳＡＴ６、ＣＴＢ−Ｍｔｂ７２Ｆ、ＣＴＢ−ＶＰ１、ＣＴＢ−ＭＢＰ、ＣＴＢ−Ａｃｅ  ２、ＣＴＢ−Ａｎｇ１−７、ＣＴＢ−ＧＡＡ、ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＨＣ、ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−Ｃ２、コドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＨＣ、コドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＬＣ、およびコドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＳＣから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記植物が、レタス、トマト、ニンジンおよび大豆から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記植物がレタス植物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｂ）における前記期間が４〜６週間である、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記期間が４週間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記異種タンパク質の発現が次の世代に維持される、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
切除物の有無を検出するプライマーを用いたＰＣＲにより、前記植物のマーカー切除を評価する、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ダイレクトリピートＤＮＡ配列がａｔｐＢ遺伝子由来であり、図６に示す１つ以上の内因性プロモーターエレメントを欠く、請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２のプロモーターが、形質転換される植物種に内因性のｐｓｂＡプロモーターおよび５’ＵＴＲを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオ医薬品タンパク質を工程ｅ）の植物から分離することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項２２】
ＩＧＦ−１療法を必要とする対象の治療方法であって、ＰＴＤペプチドとｅ−ペプチドに作動可能に連結されたＩＧＦ−１タンパク質を含む抗生物質フリーのレタス植物またはレタス植物製品の有効量を経口投与することを含み、前記ｅ−ペプチドはＩＧＦ−１の機能を増強し、前記投与は遺伝的筋肉疾患、急性萎縮、傷害、または骨損失もしくは骨折の症状を緩和または改善するのに有効である、方法。
【請求項２３】
投与により、血清、筋肉、骨のうち１つ以上でＩＧＦ−１濃度が上昇する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
投与により、ＡＬＰ、Ｏｓｘ、および／またはＲＵＮＸ２の発現レベルの増加によって示される骨芽細胞の増殖および／または分化が起こる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
投与が骨量、密度、および／または面積の増加に有効である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
プラスチドプロモーターに作動可能に連結された抗生物質をコードする選択マーカー遺伝子を含む植物プラスチド形質転換ベクターであって、前記遺伝子およびプロモーターは、長さ６００〜８００ヌクレオチドの間でダイレクトリピートしているＤＮＡ配列によって挟まれており、前記ベクターは、目的のバイオ医薬品タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２プラスチドプロモーターを含む異種核酸をさらに含み、前記目的のタンパク質が、任意にターゲティングペプチドを含み、または、前記タンパク質をコード化する核酸が、前記植物での発現のためにコドン最適化されており、前記異種核酸が、ＰＴＤおよびｅ−ペプチドをコード化する核酸配列に作動可能に結合したコドン最適化ＩＧＦ−１である、植物プラスチド形質転換ベクター。
【請求項２７】
バイオ医薬品タンパク質をプラスチドで発現する、単離されたトランスプラストミック、抗生物質フリーの植物細胞であって、前記タンパク質は、ＣＴＰ−ｐｒｏＩＧＦ１−ＰＴＤ、ＣＴＢ−プロインスリン、ＣＴＢ−ＡＭＡ、ＣＴＢ−ＭＳＰ、ＣＴＢ−ＦＩＸ、ＣＴＢ−ＦＩＸ−ｆｕｒｉｎ、ＣＴＢ−Ｅｘｅｎｄｉｎ、ＣＴＢ−ＥＳＡＴ６、ＣＴＢ−Ｍｔｂ７２Ｆ、ＣＴＢ−ＶＰ１、ＣＴＢ−ＭＢＰ、ＣＴＢ−Ａｃｅ  ２、ＣＴＢ−Ａｎｇ１−７、ＣＴＢ−ＧＡＡ、ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＨＣ、ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−Ｃ２、コドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＨＣ、コドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＬＣ、コドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＳＣからなる群から選択され、選択可能なマーカー遺伝子を欠くベクターから発現される、植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月２２日に出願された米国仮特許第６２／７２１１７４号の優先権を主張するものであり、その開示内容全体は、完全に記載されているかのように参照により援用される。
【０００２】
電子的形式で提出された資料の参照による援用
出願人は、電子形式で提出された配列表の資料を参照により本明細書に援用する。ファイルのラベルは「６６１０ＷＯ００．ｔｘｔ」、作成日は２０１９年８月１８日、バイト数は５，８８１である。
【０００３】
連邦政府支援研究に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所のＲＯ１  ＧＭ  ６３８７９、ＲＯ１  ＥＹ０２４５６４、ＲＯ１、  ＨＬ  １０７９０４、Ｒ０１  ＨＬ  １０９４４２、ＲＯ１  １３３１９１の政府支援を受けて行われた。  政府は発明に対して一定の権利を持っている。
【０００４】
発明の分野
本発明は、高等植物の葉緑体におけるバイオ医薬品の製造に関するものである。より具体的には、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を欠く高等植物のプラスチドにおいて治療用タンパク質を製造するための組成物および方法を提供するものである。
【０００５】
発明の背景
本発明が関連する技術の状態を説明するために、いくつかの出版物や特許文書が本明細書中に引用されている。これらの引用のそれぞれは、完全に記載されているかのように、参照により本明細書に援用される。
【０００６】
ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子−１）はＩＧＦ−１受容体に結合し、、筋肉形成、筋肉量と筋力、損傷後の再生、および筋肉の健康の維持において重要な役割を果たす。ＩＧＦ１は、筋繊維の形成に関わるタンパク質合成を調節したり、筋繊維上の衛星細胞の増殖を促進することで、骨格筋の増殖と回復を促す。衛星細胞は分化した後、筋線維上の損傷部位に融合し、新たな線維細胞を修復または生成する（Ｂｉｋｌｅら、２０１５）。実際、げっ歯類の筋肉モデルでＩＧＦ−１レベルを高めると、筋力の機能的向上と線維化の抑制が実証された（Ｂａｒｔｏｎら、２００２）。また、筋強直性ジストロフィー１型患者に皮下の注射を介してＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１結合タンパク質の複合体を２４週間投与したところ、体重と代謝が増加した（Ｈｅａｔｗｏｌｅら、２０１１）。
【０００７】
ＩＧＦ−１は、筋肉の形成だけでなく、骨のリモデリングや生成を活性化する働きがある。ＩＧＦ−１を条件付きで欠失させると、マウスでは骨芽細胞の数、活性、骨量が減少する（Ｇｉｖｏｎｉら、２００７）。一方、ＩＧＦ−１の過剰発現は、骨量とリモデリングを増加させた（Ｊｉａｎｇら、２００６）。また、ＩＧＦ−１を局所的に投与すると、ラットの骨折治癒モデルにおいて骨形成が促進される（Ｓｃｈｍｉｄｍａｉｅｒら、２００２）。さらに、ＩＧＦ−１を患者に投与すると、骨の治癒が促進され、股関節または脛骨の骨折による臨床的改善が急速に進んだ（Ｌｏｃａｔｅｌｌｉら、２０１４）。さらに、ＩＧＦ−１は、骨吸収性破骨細胞および骨形成性骨芽細胞の生存、増殖、分化を促進する。以前の研究では、循環ＩＧＦ−１の減少が骨密度の減少をもたらすことが示された（Ｔａｈｉｍｉｃら、２０１３）。ＩＧＦ−１はまた、歯根の発達と歯根象牙質幹細胞を調節する。外因性ＩＧＦ−１は、単離されたヒト歯根幹細胞の増殖と分化を刺激した（Ｗａｎｇら、２０１２）。衛星細胞の増殖／分化および筋肉形成におけるＩＧＦ−１の前述の役割は、歯根の発達を含む骨の増殖／リモデリングとともに、骨格骨および歯周病だけでなく、複数の筋肉障害の治療薬としての可能性を高めることができる。
【０００８】
ＩＧＦ−１は、細胞外マトリックスに３つの形態、ｅ−ペプチドを保持する前駆体ＩＧＦ−１（Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１）、Ｎ−グリコシル化を伴うＰｒｏ−ＩＧＦ−１（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１）、および成熟したＩＧＦ−１で存在する（Ｐｈｉｌｉｐｐｏｕら、２０１４）。その保持のために、ｅ−ペプチドの潜在的な生物学的活性は、ｅ−ペプチド単独または前駆体のいずれかに対して現れた。以前の研究では、ｅ−ペプチドを含むＰｒｏ−ＩＧＦ−１は、筋肉障害の治療にプラスの効果を示し、成熟したＩＧＦ−１よりもＩＧＦ−１Ｒへの結合が増加したのに対し、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１はＩＧＦ−１Ｒ活性化での効率が低いことが示された（Ｄｕｒｚｙｎｓｋａら、２０１３；ＰｈｉｌｉｐｐｏｕおよびＢａｒｔｏｎ、２０１４）。筋肉療法の臨床試験における現行のＩＧＦ−１は、毎日の皮下注射によって送達されるが、機能能率に必要なｅ−ペプチドを含まない（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０１２０７９０８、Ｐｈｉｌｉｐｐｏｕ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｏｎ、２０１４）。経口送達可能な植物細胞中のＩＧＦ−１は、患者の毎日の注射を避け、それによって患者のコンプライアンスを増加させるため、特に長期間にわたって投与される筋肉障害または骨治癒に必要な治療に好ましい。トランスプラストミック植物で発現させたタンパク質薬物は、凍結乾燥後に常温で数年間保存しても有効性が維持される（Ｓｕら、２０１５およびＨｅｒｚｏｇら、２０１７）。細胞壁によって与えられる消化器系からの保護は、そのような薬物の経口送達を可能にする。それらは、腸内細菌が植物細胞壁を溶解するときに、標的細胞または組織に送達できる（Ｄａｎｉｅｌｌら、２０１６およびＫｗｏｎら、２０１６）。この自然なプロセスにより、法外に高価な発酵、精製、冷蔵／輸送の必要がなくなる（Ｄａｎｉｅｌｌら、２０１６ａ；  Ｄａｎｉｅｌｌら、２０１６ｂ）。葉緑体遺伝子工学は、価値のある農業的形質、酵素の発現、バイオ医薬品、またはその他の高価値製品を導入するために、過去３０年間に開発されおよび進歩してきた（Ｃｌａｒｋｅら、２０１７；  Ｄａｎｉｅｌｌら、２０１６ａ；  Ｄａｎｉｅｌｌら、２０１６ｂ；  Ｊｉｎ  ａｎｄ  Ｄａｎｉｅｌｌ、２０１５）。
【０００９】
上記のアプローチの重大な欠点は、トランスプラストミック株の選択とホモプラスミーの達成に必要なトランスプラストミックゲノムに抗生物質耐性遺伝子（ａａｄＡ）が存在することである（Ｄａｎｉｅｌｌら、２０１６ａ；  Ｊｉｎ  ａｎｄ  Ｄａｎｉｅｌｌ、２０１５）。これらの抗生物質耐性遺伝子は、これらの薬物をヒトの臨床試験に進めるための重要なハードルとなっている。これは、ａａｄＡ遺伝子の何千ものコピーが各細胞に存在する場合に課題となる可能性がある。トランスプラストミックタバコゲノムから選択可能なマーカー遺伝子を除去するために、これまでに２つの異なるアプローチが使用されてきた。フランキング配列からのダイレクトリピートの使用は、葉緑体内に存在する内因性相同組換えシステムによってａａｄＡ遺伝子をループアウトするために使用されてきた（Ｄａｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ、２０１１）。あるいは、ＣＲＥ（Ｃｏｒｎｅｉｌｌｅら、２００１）またはＢｘｂ１リコンビナーゼ（Ｓｈａｏら、２０１４）およびＬｏｘまたはａｔｔＰ／ａｔｔＢ部位が、タバコ葉緑体ゲノムの小さな単一コピー領域または逆方向反復領域からａａｄＡ遺伝子を除去するために使用されてきた。しかし、ＬｏｘまたはａｔｔＰ／ａｔｔＢとリコンビナーゼの使用は、核ゲノムの非相同組換えによるネイティブ遺伝子の意図しない切除または改変、組み込みまたは外因性リコンビナーゼの使用、およびリコンビナーゼ発現のための植物病原体または病原体配列（ウイルスプロモーター）の使用のため、マーカー遺伝子切除プロセスの規制承認を複雑にする。対照的に、葉緑体形質転換プロセスは、植物病原体または植物病原体配列の使用がないため、ＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  ７ＣＦＲ  ｐａｒｔ  ３４０の規制から除外されている。しかし、葉緑体ゲノムを介してバイオ医薬品を発現している食用作物では、シングルステップでのマーカー遺伝子の除去はまだ達成されていない。
【００１０】
発明の概要
本発明によれば、プラスチドで経口摂取用の抗生物質フリーのバイオ医薬品を生産するトランスプラストミック植物を製造するための方法が提供される。例示的な方法は、プラスチド形質転換ベクターを植物細胞に導入することを含み、該ベクターは、プラスチドプロモーターに作動可能に連結された、抗生物質をコードする選択可能なマーカー遺伝子を含み、該選択可能なマーカー遺伝子およびプロモーターは、長さ５００〜８００ヌクレオチドの間のダイレクトリピートＤＮＡ配列によって挟まれており、前記ベクターは、配列をコードするバイオ医薬品タンパク質に作動可能に連結された第２のプラスチドプロモーターを含む異種核酸をさらに含み、目的のタンパク質は任意にターゲティングペプチドを含むか、または、タンパク質をコードする核酸は前記植物の発現に対してコドン最適化されている。次に、ベクターを含む植物細胞を、抗生物質の存在下で、再生培地中で、シュート形成が起こるのに適切な期間培養する。シュートは、選択可能なマーカー遺伝子の切除を確認するために評価され、その後、根の成長を誘導するのに適した抗生物質を含まない培地に移される。その後、根を培養して、選択可能なマーカー遺伝子を欠く、目的のタンパク質を発現するトランスプラストミック植物を生成し、次の世代で目的の異種タンパク質を発現させる。特定の実施形態では、タンパク質がＩＧＦ１であり、配列をコーディングしているタンパク質からグリコシル化部位が除去されている。他の実施形態では、目的のタンパク質は、前記植物から精製される。
【００１１】
目的の異種タンパク質としては、限定されないが、ＰＴＤ−ＩＧＦ１、ＣＴＢ−ＩＧＦ１、ＣＴＢ−プロインスリン、ＣＴＢ−ＡＭＡ、ＣＴＢ−ＭＳＰ、ＣＴＢ−ＦＩＸ、ＣＴＢ−ＦＩＸ−ｆｕｒｉｎ、ＣＴＢ−Ｅｘｅｎｄｉｎ、ＣＴＢ−ＥＳＡＴ６、ＣＴＢ−Ｍｔｂ７２Ｆ、ＣＴＢ−ＶＰ１、ＣＴＢ−ＭＢＰ、ＣＴＢ−Ａｃｅ  ２、ＣＴＢ−Ａｎｇ１−７、ＣＴＢ−ＧＡＡ、ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＨＣ、ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−Ｃ２、コドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＨＣ、コドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＬＣ、およびコドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＳＣを含むことができる。特に好ましい実施形態では、タンパク質は、それぞれがｅ−ペプチドを含むＰＴＤ−ｐｒｏＩＧＦ１のＣＴＢ−ｐｒｏＩＧＦ１から選択される。
【００１２】
植物は、消費に適しており、色素体の形質転換に適している任意の植物であり得る。特定の実施形態では、レタス、トマト、ニンジン、低ニコチンタバコ、または大豆から選択される。特定の実施形態において、植物はレタスである。
【００１３】
さらに別の態様において、上記のエレメントを含む植物形質転換ベクターもまた、本発明の範囲内にある。
【００１４】
そのようなベクターを含み、上記の方法を使用して生成された目的のバイオ医薬品タンパク質を生産するトランスプラストミック植物も提供される。
【００１５】
特定の態様では、ＩＧＦ−１療法を必要とする対象の治療のための方法も提供される。例示的な方法は、ＩＧＦ１の機能を高めるＰＴＤペプチドおよびｅペプチドと作動可能に連結されたＩＧＦ１タンパク質を含む、抗生物質フリーのレタス植物またはレタス植物製品の有効量の経口投与を伴い、前記投与は、遺伝性筋疾患、急性萎縮症、傷害または骨量減少の症状を緩和または改善するのに有効である。本明細書ではＩＧＦ−１が例示されているが、本明細書に記載されているマーカーフリーの植物では、上記に挙げたタンパク質のいずれも発現させることができる。そのような植物や植物製品は、糖尿病、凝固障害、先天性代謝異常などの治療に様々な有用性を発揮するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａ〜１Ｇ。ネイティブのＣＴＢに融合されたコドン最適化された合成Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を発現するレタス／タバコトランスプラストミック株の生成。（図１Ａ）レタス葉緑体形質転換用ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１発現カセットの模式図。（図１Ａおよび図１Ｅ）１６ｓｒＲＮＡおよび２３ｓｒＲＮＡ、１６ｓおよび２３ｓリボソームＲＮＡ；ｔｒｎＩ、イソロイシル−ｔＲＮＡ；  ｔｒｎＡ、アラニル−ｔＲＮＡ；  Ｐｒｒｎ、ｒＲＮＡオペロンプロモーター；  ａａｄＡ、アミノグリコシド３’−アデニリルトランスフェラーゼ（ａｄｅｎｙｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）；  ＴｒｂｃＬ、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ大サブユニットの３’ＵＴＲ；ＰｐｓｂＡ、ｐｓｂＡのプロモーター；  ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１（ｃｏ）、ＣＴＢ（コレラ非毒性Ｂサブユニット）融合体を伴うヒトインスリン様増殖因子−１のコドン最適化未成熟型；ＴｐｓｂＡ、ｐｓｂＡの３’−ＵＴＲ；  ＳＢ−Ｐ、サザンブロットプローブ。ＰＣＲスクリーニングに使用したプライマーセットは矢印で示している。（図１Ｂ）ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲスクリーニングおよび（図１Ｃ）サザンブロット分析、および（図１Ｄ）タンパク質発現ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を発現するレタス株。予想されるサイズ（２４．３ｋＤａ）は矢印で示されている。（図１Ｂ−図１Ｄ）レーン１から４、個々のトランスプラストミック株；  ＷＴ、形質転換されていない野生型。ＬＳ、レタス。（図１Ｅ）タバコ葉緑体形質転換用のＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１  発現カセットの概略図。（図１Ｆ）ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ１タバコトランスプラストミック株のサザンブロット分析。レーン１および２、個々の野生型植物またはトランスプラストミック株。ＷＴ、形質転換されていない野生型；  ＰＨ、ｔｏｂａｃｃｏ  Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ（ハバナタバコ）。（図１Ｇ）ネイティブ（Ｎ；配列番号１２）およびコドン最適化（Ｃ；配列番号１３）Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の配列アラインメント。最適化されたコドンは黄色でマークされている。Ｎａｔ：ネイティブ配列；  ＣＨ：コドン最適化配列。グリコシル化を回避するために、Ｌｓｙ６８（ＡＡＧ）、Ａｒｇ７４（ＣＧＴ）、およびＡｒｇ７７（ＣＧＣ）は、それぞれ赤でマークされたＧｌｙ６８（ＧＧＴ）、Ａｌａ７４（ＧＣＡ）、およびＡｌａ７７（ＧＣＴ）に変更された。
【００１７】
【図２】図２Ａ−２Ｊ。コドン最適化ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−Ｉを発現するレタスマーカーフリートランスプラストミック株の生成。（図２Ａ）ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１  発現カセットとマーカー切除プロセスを含む葉緑体形質転換ベクターの概略図を示す。１６ｓｒＲＮＡおよび２３ｓｒＲＮＡ、１６ｓおよび２３ｓリボソームＲＮＡ；  ｔｒｎＩ、イソロイシル−ｔＲＮＡ；  ａｔｐＢ；葉緑体にコードされたＣＦ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットベータ；Ｐｒｒｎ、ｒＲＮＡオペロンプロモーター；  ａａｄＡ、アミノグリコシド３’−アデニリルトランスフェラーゼ（ａｄｅｎｙｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）；  ＴｒｂｃＬ、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ大サブユニットの３’ＵＴＲ；ＰｐｓｂＡ、ｐｓｂＡのプロモーター；  ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１（ｃｏ）、ＰＴＤ（タンパク質形質導入ドメイン）融合体を伴うヒトインスリン様増殖因子−１のコドン最適化未成熟型；ＴｐｓｂＡ、ｐｓｂＡの３’−ＵＴＲ；  ｔｒｎＡ、アラニル−ｔＲＮＡ；  ＳＢ−Ｐ、サザンブロットプローブ。（図２Ｂ）ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１株のゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ  スクリーニング、（図２Ｃ）サザンブロット、および（図２Ｄ）タンパク質発現。予想されるサイズは矢印（１４．５ｋＤａ）で示されている。（図２Ｂから図２Ｄ）レーン１から４、４つの個別のＴ０  トランスプラストミック株；ＷＴ、形質転換されていない野生型；  ＭＦ、レタスマーカーフリー。予想されるサイズは矢印で示されている。（図２Ｅ）抗生物質を含まないＴ１世代におけるＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１のＰＣＲ  スクリーニング、（図２Ｆ）サザンブロット、および（図２Ｇ）タンパク質発現。（図２Ｅおよび図２Ｆ）レーン１から１０；１０個の個別のＴ１  トランスプラストミック植物、ＷＴ；形質転換されていない野生型レタス；ＰＣ、マーカーを伴う陽性対照。予想されるサイズは矢印で示されている（３．３／２．４／２．４ｋｂのＰＣＲ産物と１４．５ｋＤａのＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１）。（図２Ｈ）抗生物質フリーＴ２世代におけるＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１のサザンブロットおよび（図２Ｉ）タンパク質発現。（図２Ｈおよび図２Ｉ）レーン１から４；４つの個別のＴ２  トランスプラストミック植物、ＷＴ；  形質転換されていない野生型レタス。予想されるサイズは矢印（１４．５ｋＤａ）で示されている。（図２Ｊ）マーカーフリーレタス葉緑体形質転換ベクター（ｐＬｓＬＦ−ＭＦ）を構築するためのクローニングプロセスの概略図を示す。図に示すように、２つの繰り返されるＤＮＡ配列（６４９ｂｐ、ａｔｐＢ）がａａｄＡ発現カセットに隣接していた。ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１  ＤＮＡ配列は、葉緑体での発現のためＰｐｓｂＡとＴｐｓｂＡの間に挿入された。１６ｓｒＲＮＡおよび２３ｓｒＲＮＡ、１６ｓおよび２３ｓリボソームＲＮＡ；  ｔｒｎＩ、イソロイシル−ｔＲＮＡ；  ａｔｐＢ；葉緑体にコードされたＣＦ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットベータ；Ｐｒｒｎ、ｒＲＮＡオペロンプロモーター；  ａａｄＡ、アミノグリコシド３’−アデニリルトランスフェラーゼ（ａｄｅｎｙｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）；  ＴｒｂｃＬ、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ大サブユニ��トの３’ＵＴＲ；ＰｐｓｂＡ、ｐｓｂＡのプロモーター；  ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１（ｃｏ）、ＰＴＤ（タンパク質形質導入ドメイン）融合体を伴うヒトインスリン様増殖因子−１のコドン最適化未成熟型；ＴｐｓｂＡ、ｐｓｂＡの３’−ＵＴＲ；  ｔｒｎＡ、アラニル−ｔＲＮＡ。
【００１８】
【図３】図３Ａ−３Ｐ。凍結乾燥後のレタス／タバコトランスプラストミック株におけるＣＴＢ／ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の特性評価。（図３Ａ〜図３Ｄ）（図３Ａと図３Ｂ）レタスおよび（図３Ｃと図３Ｄ）タバコ凍結乾燥細胞で発現させたＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の、（図３Ａと図３Ｃ）抗ＣＴＢおよび（図３Ｂと図３Ｄ）抗ＩＧＦ−１抗体を用いたイムノブロットアッセイ。（図３Ｅ）凍結乾燥したマーカーフリーレタス細胞で発現したＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の定量化。（図３Ｆおよび図３Ｇ）ＣＴＢ／ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１  発現の等量（１Ｘ）の生葉と凍結乾燥した葉の材料の比較。（図３Ｆ）レタスＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１および（図３Ｇ）マーカーフリーのレタスＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１  トランスプラストミック株。ＲｂｃＬはローディング対照として使用された。（図３Ａ−図３Ｇ、図３Ｋおよび図３Ｌ）それぞれ２４．３ｋＤａおよび１４．５ｋＤａのＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１およびＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の予想サイズは矢印で示されている。ＰＨ、ｔｏｂａｃｃｏ  Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ；  ＬＳ、レタス；  ＭＦ、マーカーフリーのレタス；ＷＴ、形質転換されていない野生型タバコまたはレタス。ＣＴＢまたはＩＧＦ−１ペプチドを対照として使用した。（図３Ｈおよび図３Ｉ）ＣＴＢ−ＧＭ１  受容体結合のための（図３Ｈ）レタスおよび（図３Ｉ）タバコにおけるＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１五量体形態のＥＬＩＳＡ。データは、三重（ｔｒｉｐｌｅｔｓ）で実行される２つの生物学的反復を表している。データは平均±ＳＥＭとして表される（＊＊＊  Ｐ値＜０．００１  ｖｓ．野生型、ＡＮＯＶＡによる）。ＣＴＢは陽性対照として使用された。Ｌｙｏ、凍結乾燥した葉。（図３Ｊ）抗ＣＴＢ抗体を使用したＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を発現するタバコの非還元イムノブロット分析。（図３Ｋおよび図３Ｌ）Ｔ０世代とＴ１世代の間の（図３Ｋ）ＣＴＢＰｒｏ−ＩＧＦ−１発現と（図３Ｌ）ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１発現の比較。ＲｂｃＬはローディング対照として使用された。データは平均±ＳＥＭとして表される（＊＊Ｐ値≦０．０１、ＡＮＯＶＡによる）。（図３Ｍ−図３Ｎ）ウエスタンブロットアッセイを使用した、凍結乾燥レタスにおける、保存期間の指定された時点での（図３Ｍ）ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１および（図３Ｎ）ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の発現レベル。データは平均±ＳＥＭとして表される（グループ間のＡＮＯＶＡによるＰ値＞０．５）。（図３Ｏ）マーカーを除去したＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１レタス株の発芽。ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の種子５個と野生型レタスの種子５個をスペクチノマイシン含有培地で発芽させた。写真はそれぞれ発芽後６日目（上）と１５日目（下）に撮影した。Ｓｐｅｃ２５、２５μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン、Ｓｐｅｃ５０、５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン。（図３Ｐ）凍結乾燥した植物から精製されたＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１細胞。総タンパク質、精製前のＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１発現凍結乾燥植物細胞から抽出した総可溶性タンパク質；Ｃｏ、クーマシーブルー染色；Ｗ、抗ＣＴＢに対するウエスタンブロット。矢印はＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の単量体��ある約２４．３ｋＤａを示す。
【００１９】
【図４】図４Ａ〜４Ｅ。ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１は、ケラチノサイト、ＧＭＳＣと骨芽細胞の細胞増殖と骨芽細胞の分化を促進する。（図４Ａ−図４Ｄ）精製ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１とのインキュベーション後の、生存（図４Ａ）ＨＯＫ（ヒト口腔ケラチノサイト）、（図４Ｂ）ＧＭＳＣ（ヒト歯肉由来間葉系幹細胞）、（図４Ｃ）ＳＣＣ（ヒト頭頸部扁平上皮癌細胞）、および（図４Ｄ）ＭＣ３Ｔ３（マウス骨芽細胞）の相対吸光度。陽性対照としてＩＧＦ−１ペプチドを利用した。データは、三重（ｔｒｉｐｌｅｔｓ）で実行される２つの生物学的反復を表している。データは平均±ＳＥＭで表される。＊  ＡＮＯＶＡによるＩＧＦ−１に対するＰ値＜０．０５を示す。（図４Ｅ）骨形成マーカー遺伝子のｑＰＣＲ分析：アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ｒｕｎｔ関連転写因子２（ＲＵＮＸ２）、およびＯｓｔｅｒｉｘ（Ｏｓｘ）。マウス骨芽細胞細胞株ＭＣ３Ｔ３＃４細胞は骨形成培地（ＯＳ、ＤＭＥＭ、ＦＢＳ１０％、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸および１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート）および１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌの精製ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１で、それぞれ５日間誘導された。＊、Ｐ  ＜０．０５  ｖｓ．ＣＯＮ；＃、Ｐ  ＜０．０５  ｖｓ．ＯＳ。
【００２０】
【図５】図５Ａ−５Ｃ。強制経口投与によるＩＧＦ−１の送達。（図５Ａ）強制経口投与２時間後の血清中のＩＧＦ−１の吸光度。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝１４〜１６マウス／グループ）に、凍結乾燥した細胞で発現させたＣＴＢ／ＰＴＤ−ＩＧＦ−１を５μｇ投与した。データポイントは、雄（青のドット）または雌（ピンクのドット）のマウスの個体を表す。＊＊は、ベースラインと比較してＰ値≦０．０１であることを示す。（図５Ｂ）ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を経口投与した５時間後の腓腹筋におけるＩＧＦ−１の増加（左）と、ＧＡＰＤＨを内部ローディング対照としたウエスタンブロットを用いたデンシトメトリーによる定量（右）を示している。データは平均±ＳＤで表した。（図５Ｃ）抗ＩＧＦ−１に対するイムノブロットによるＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の経口投与後５時間でのヒラメ筋の抗ＩＧＦ−１の増加（左）、β−アクチンに正規化した後（右）。データは平均±ＳＤとして表される。＊＊は、ＡＮＯＶＡによるＰ値＜０．０１対ｕｎｆｅｄを示す。
【００２１】
【図６】図６Ａ〜６Ｂ。強制経口投与によるＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の投与は、糖尿病性骨折治癒における骨再生を促進する。（図６Ａ）骨折後６週間目の骨折部位のマイクロＣＴスキャンの断面から３Ｄ再構成した代表的な画像と、骨折の隙間で新たに形成された骨の定量的な測定結果。（図６Ｂ）組織学的分析と相対的な骨は各グループのものである。データは平均±ＳＥＭで表される。＊グループ間でＰ＜０．０５。＊＊グループ間でＰ＜０．０１。非Ｄｉａ  ＷＴグループ（非糖尿病マウス、凍結乾燥野生型植物細胞の強制経口投与）、非Ｄｉａ  ＩＧＦグループ（非糖尿病マウス、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を含む凍結乾燥植物細胞の強制経口投与）、Ｄｉａ  ＷＴグループ（糖尿病マウス、凍結乾燥野生型植物細胞の強制経口投与）、Ｄｉａ  ＩＧＦグループ（糖尿病マウス、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を含む凍結乾燥植物細胞の強制経口投与）。
【００２２】
【図７】図７Ａ〜７Ｂ。抗生物質フリーのバイオ医薬品の発現用の植物葉緑体ベクターを構築するためのクローニング戦略。（図７Ａ）ａａｄＡベースの形質転換を使用して、ａｔｐＢプロモーター領域に対応するプラスチドＤＮＡの６４９ｂｐ領域を複製した。相同性に基づく切除は、機能性ａａｄＡ遺伝子の完全な除去を確実にする。（左側の配列番号１４および右側の配列番号１５）（図７Ｂ）は、最終的なベクターコンストラクトを示す。（図７Ｃ）は、６４９塩基対リピートの配列を提供する（配列番号１６）。ネイティブａｔｐＢリピート配列（６４９ｂｐ）は、反対方向にｒｂｃＬおよびａｔｐＢプロモーター領域を含み、トランスジーンカセットが転写活性スペーサー領域に導入されるとアンチセンスＲＮＡを生成することにより、遺伝子発現を破壊する。しかし、トランスジーン発現レベルは転写的にサイレントなスペーサー領域よりも高いため、このようなスペーサー領域が好ましい（Ｊｉｎ  ａｎｄ  Ｄａｎｉｅｌｌ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１５；  Ｄａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１６）。したがって、一方または両方のプロモーター領域が、マーカーフリーの発現カセットの異なるバージョンで削除された。
【００２３】
【図８】図８は、ｐｓｂＡ、ネイティブＰｒｏ−ＩＧＦ−１、およびコドン最適化Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１のコドン使用頻度を示す表である。
【００２４】
発明の詳細な説明
ヒトインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）は、骨格筋と骨の発達と再生に重要な役割を果たすが、歯科用途では毎日の注射または外科的移植が必要である。現行の臨床ＩＧＦ−１はｅ−ペプチドを欠いており、グリコシル化されているため、機能的有効性が低下している。以前の研究では、種子、非食用植物、または細胞培養物中のＩＧＦ−１発現が報告されたが、ｅ−ペプチドを保持するＰｒｏ−ＩＧＦ−１は、強制経口送達後の適切な動物モデルで発現または機能評価されたことはない。
【００２５】
本明細書に記載されるように、（細胞浸透性ペプチドに融合された）ｅ−ペプチドを有するＰｒｏ−ＩＧＦ−１は、コドン最適化され、抗生物質耐性遺伝子なしでレタス葉緑体で発現された。抗生物質耐性（ａａｄＡ）遺伝子は、ダイレクトリピートの相同組換えによって迅速に切除され、マーカーフリーの葉緑体ゲノムは次世代のレタス植物で維持され、高いＰｒｏ−ＩＧＦ−１発現レベル；折り畳み、組み立て、安定性および機能性は、凍結乾燥植物細胞で周囲温度で数ヶ月／年維持された。ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１は、培養ヒト口腔ケラチノサイト、歯肉由来間葉系間質細胞およびマウス骨芽細胞の増殖を用量依存的に刺激し、ＡＬＰ、ＯＳＸ、およびＲＵＮＸ２を含む骨芽細胞マーカー遺伝子の発現をアップレギュレートした。凍結乾燥植物細胞が強制経口投与されたマウスは、糖尿病性骨折治癒モデルにおいて、雄と雌マウスの血清と筋肉のＩＧＦ−１が同等の効率で有意に増加され、骨再生が促進された。抗生物質耐性遺伝子を持たない植物細胞でのバイオ医薬品発現ははじめてであり、常温での長期保存が可能で、繰り返し経口投与できる利便性があるため、毎日の注射や外科的な移植が不要となり、手頃な価格と患者のコンプライアンスを高めることができる。
【００２６】
定義
前述の一般的な説明と以下の詳細な説明は、いずれも例示的かつ説明的なものであり、現在の教示の範囲を限定することを意図したものではないことを理解していただきたい。本願では、特に明記されていない限り、単数形の使用には複数形が含まれる。たとえば、「少なくとも１つ」は、複数が存在する可能性をあることを意味する。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」の使用、またはこれらのルートワードの変更、たとえば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎｅｄ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は、限定を意図するものではなく、「以下の要素を含むが他の要素を除外しない」ことを意味する。  本明細書で使用される「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆまたはｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、他の要素がその組み合わせに対して本質的な重要性を有することを除外する。「または」の使用は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。「および／または」という用語は、前後の用語をまとめて、または別々に使用できることを意味する。説明の目的で、ただし限定ではないが、「Ｘおよび／またはＹ」は、「Ｘ」または「Ｙ」または「ＸおよびＹ」を意味できる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、対象への薬剤、薬物、またはペプチドの「投与」または「投与」という用語は、化合物の意図された機能を実行するために化合物を対象に導入または送達する任意の経路を含む。投与は、経口、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）、直腸、局所など、任意の適切な経路で行うことができる。投与することまたは投与には、自己投与と他の人による投与が含まれる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、または「合併症」という用語は、対象における正常な状態からの逸脱を指す。
【００２９】
本明細書で使用される「抗生物質フリーのバイオ医薬品」は、抗生物質をコードする選択可能なマーカー遺伝子を欠く高等植物の葉緑体で産生されるバイオ医薬品を指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ、ａｍｏｕｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」などの用語は、所望の結果を達成するために必要な投与量および期間を意味する。
【００３１】
本明細書では、「抑制する」または「治療する」という用語は、病気の状態にさらされているか、その素因があるかもしれないが、まだ病気の状態の症状を経験していない、または表示していない対象において、病気の状態の臨床症状を悪化させない、または発症させないこと、例えば、病気の発症を抑制することを意味している。
【００３２】
本明細書では、「ＣＴＢ」という用語は、コレラ毒素Ｂサブユニットを意味する。コレラ毒素は、１つのＡサブユニットと５つのＢサブユニットからなるタンパク質複合体である。Ｂサブユニットは無毒であり、ガングリオシドの五糖鎖を介してタンパク質が細胞表面に結合することを可能にするため、タンパク質複合体にとって重要である。
【００３３】
「レプリコン」は、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルスなど、主にそれ自体の制御下で複製できる任意の遺伝的要素である。レプリコンはＲＮＡでもＤＮＡでもよく、一本鎖でも二本鎖でもよい。
【００３４】
「ベクター」とは、別の遺伝子配列または要素（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が添付され、添付された配列または要素の複製をもたらすことができる任意のビークルのことである。
【００３５】
「発現オペロン」とは、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（ＡＴＧコドンやＡＵＧコドンなど）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの転写・翻訳制御配列を有し、宿主細胞や生物におけるポリペプチドコード配列の発現を促進する可能性のある核酸セグメントをいう。
【００３６】
「プロモーター領域」という用語は、遺伝子の５’制御領域、例えば５’ＵＴＲ配列、例えばｐｓｂＡ配列、プロモーター、例えばユニバーサルＰｒｎｎプロモーターまたは形質転換される植物に内在するｐｓｂＡプロモーター、および任意のエンハンサーエレメントを指す。
【００３７】
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、本発明の配列、プライマーおよびプローブを指し、２つ以上のリボまたはデオキシリボヌクレオチド、好ましくは３つ以上のリボまたはデオキシリボヌクレオチドで構成される核酸分子と定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、さまざまな要因や、オリゴヌクレオチドの特定の用途や使用方法によって異なる。
【００３８】
「特異的にハイブリダイズする」というフレーズは、当技術分野で一般的に使用される所定の条件下でそのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な配列の２つの一本鎖核酸分子の間の会合を指す（「実質的に相補的」と呼ばれることもある）。特に、本発明の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることを指し、非相補的な配列の一本鎖核酸とオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることを実質的に排除している。
【００３９】
本明細書では、「レポーター」、「レポーターシステム」、「レポーター遺伝子」、または「レポーター遺伝子産物」という用語は、核酸が、発現したときに生物学的アッセイ、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、または熱量測定、蛍光測定、化学発光測定などの方法によって容易に測定可能なレポーターシグナルを生成する産物をコードする遺伝子を含んでいる作動可能な遺伝システムを意味する。核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、直鎖または環状、一本鎖または二本鎖、アンチセンス極性またはセンス極性のいずれかであり、レポーター遺伝子産物の発現に必要な制御エレメントに作動可能に連結されているものである。必要とされる制御エレメントは、レポーターシステムの性質やレポーター遺伝子がＤＮＡの形態であるかＲＮＡの形態であるかによって異なるが、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終了シグナルなどのエレメントが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）」、「トランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）」、「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）」という用語は、核酸が細胞または宿主生物に導入される任意の方法または手段を指し、同じ意味を伝達するために交換可能に使用され得る。そのような方法には、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＰＥＧ融合などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
「選択可能なマーカー遺伝子」という用語は、発現されたときに、形質転換された細胞または植物に抗生物質耐性などの選択可能な表現型を与える遺伝子を指す。プラスチド形質転換ベクターで有用な選択可能なマーカーには、スペクチノマイシン耐性、グリホサート耐性、ＢＡＤＨ耐性、およびカナマイシン耐性をコードするものが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
「動作可能に連結されている」とは、コーディング配列の発現を実現するために、コーディング配列に対する適切な位置のＤＮＡ分子に、コーディング配列の発現に必要な調節配列が配置されていることを意味する。この同じ定義は、発現ベクターにおける転写ユニットやその他の転写制御エレメント（エンハンサーなど）の配置にも適用されることがある。
【００４３】
「ＤＮＡコンストラクト」とは、植物を形質転換し、子孫のトランスジェニック植物を生成するために使用される遺伝子配列を指す。これらのコンストラクトは、ウイルスやプラスミドのベクターで植物に投与できる。しかし、本発明で使用するのに最も好ましいのはプラスチド形質転換のベクターである。アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ媒介性形質転換やバイオリスティックプロセスを用いた形質転換など、他の送達法も本発明の範囲内であることが企図される。形質転換ＤＮＡは、”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  ｅｄｓ．  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９５”に記載されているような標準プロトコルに従って調製できる。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「葉緑体」という用語は、植物細胞および光合成を行う他の真核生物に見られる細胞小器官またはプラスチドを含む。葉緑体は、光合成という複雑な過程を経て、光エネルギーを捕らえてＡＴＰという形で自由エネルギーを保存し、ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する。葉緑体にはクロロフィルが含まれている。葉緑体はコピー数が多く、トランスジーンの発現レベルが高い。各葉緑体には最大１００個のゲノムが含まれる場合があり、各植物細胞には最大１００個の葉緑体が含まれる場合がある。したがって、各植物細胞には１０００００もの葉緑体ゲノムが含まれている可能性があり、その結果、葉緑体ゲノムを介して発現されるタンパク質の発現レベルが高くなる。葉緑体は、核のゲノムＤＮＡとは異なり、花粉を介して葉緑体のゲノムが伝達されないため、母系遺伝による遺伝子の封じ込めが可能である。葉緑体はポリシストロンＲＮＡを転写する能力を持ち、ジスルフィド結合、多量体の組み立て、脂質の修飾などの翻訳後修飾を行う能力を含む真核生物のタンパク質の正しいプロセシングを行うことができる。
【００４５】
本明細書で使用される「組成物」、「医薬組成物」または「治療薬」はすべて、本明細書に記載されているＩＧＦ−１を構成する構築物を含む組成物を含む。任意で、「組成物」、「医薬組成物」または「治療薬」は、薬学的に許容される希釈剤または担体をさらに含む。
【００４６】
本明細書では、遺伝子またはポリヌクレオチドの文脈における「発現」という用語は、遺伝子またはポリヌクレオチドのＲＮＡへの転写を含む。また、この用語には、その後のＲＮＡのポリペプチド鎖への翻訳と、タンパク質への組み立ても含まれるが、必ずしもそうではない。
【００４７】
植物残余物は、目的のタンパク質が発現された植物に由来する１つ以上の分子（例えば、タンパク質とその断片、ミネラル、ヌクレオチドとその断片、植物構造成分など）を含むことができる。したがって、植物材料全体（例えば、植物の葉、茎、果実などの全体または一部）や粗植物抽出物に係る組成物は、確実に高濃度の植物残余物を含んでおり、また、１つ以上の検出可能な植物残余物を有する目的のタンパク質を精製してなる組成物も同様である。特定の実施形態では、植物の残余物はｒｕｂｉｓｃｏである。
【００４８】
別の実施形態では、本発明は、植物葉緑体で生成された治療的融合タンパク質の投与を介して疾患を治療または予防するための投与可能な組成物に関する。組成物は、植物によって発現された融合タンパク質の治療的有効量と植物残余物を含む。
【００４９】
本明細書で教示される特定の実施形態に従って発現されるタンパク質は、様々な方法による対象、ヒトまたは動物への投与によってｉｎ  ｖｉｖｏで使用できる。医薬組成物は、経口または非経口的に、すなわち、皮下、筋肉内、静脈内に投与されうるが、経口投与が好ましい。
【００５０】
本発明の実施形態によって製造された経口組成物は、プラスチド由来の治療用融合タンパク質を生産するトランスジェニック植物を用いて製造された食品を摂取することによって投与できる。植物の可食部またはその一部を食用成分として使用する。治療組成物は、目的の投与方法に適した固体または液体ビヒクル、希釈剤、および添加剤を使用して、古典的な方法で処方できる。経口的には、組成物は、少なくとも１種のビヒクル、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、ショ糖、乳糖、ゼラチンなどと一緒に、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、チュアブルガムなどの形態で投与できる。また、本製剤は乳化されていてもよい。免疫活性成分や治療活性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合性のある賦形剤と混合されることが多い。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどおよびその組み合わせである。さらに、必要に応じて、組成物は、湿潤剤や乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバントなどの補助物質を少量含んでいてもよい。好ましい実施形態では、医薬品を生産するトランスジェニック植物の食用植物、ジュース、穀物、葉、塊茎、種子、根などの植物部分をヒトや動物が摂取することで、非常に安価な病気の治療や免疫の手段を提供できる。
【００５１】
具体的には、治療用融合タンパク質を発現する葉緑体を有する植物体（レタス、トマト、ニンジン、大豆、低ニコチンタバコ原料など）をホモジナイズしてカプセル化する。ある具体的な実施形態では、レタス材料の抽出物がカプセル化される。別の実施形態では、カプセル化の前にレタスの材料を粉末化する。
【００５２】
代替の実施形態において、組成物は、投与の便宜のためにトランスジェニック植物のジュースにより提供され得る。前記目的のために、形質転換される植物は、好ましくは、とりわけトマト、ニンジンおよびリンゴからなる食用植物から選択され、これらは通常、ジュースの形で消費される。
【００５３】
別の実施形態によれば、本発明は、本明細書に開示される治療用融合タンパク質またはペプチドを発現する異種遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換葉緑体ゲノムに関する。
【００５４】
本明細書におけるタンパク質配列の言及は、既知の全長アミノ酸配列だけでなく、そのようなアミノ酸配列から選択された少なくとも１２、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、または２６５個の連続したアミノ酸、またはその生物学的に活性なバリアントに関するものである。通常、ポリペプチド配列は、配列の既知のヒトバージョンに関連している。
【００５５】
同一性パーセントの変動は、たとえば、アミノ酸置換、挿入、または欠失が原因である可能性がある。アミノ酸置換は、１対１のアミノ酸置換として定義される。置換アミノ酸が同様の構造的および／または化学的性質を持っている場合、それらは本質的に保存的である。保守的置換の例としては、ロイシンのイソロイシンまたはバリンと置換との置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との置換、またはスレオニンのセリンとの置換がある。
【００５６】
アミノ酸挿入または削除は、アミノ酸配列への変更またはアミノ酸内の変更である。それらは通常、約１〜５アミノ酸の範囲にある。ポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を損なうことなく置換、挿入、または削除できるアミノ酸残基を決定する際のガイダンスは、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアなどの当技術分野で周知のコンピュータープログラムを使用して見つけることができる。アミノ酸の変化が生物学的に活性な治療用融合ポリペプチドをもたらすかどうかは、例えば、以下の特定の実施例に記載されるように、ネイティブ活性についてアッセイすることによって容易に決定できる。
【００５７】
本明細書における遺伝的配列への言及は、一本鎖または二本鎖核酸配列を指し、目的のポリペプチドに対するコーディング配列またはコーディング配列の相補鎖を含む。本明細書の教示に従って、ポリペプチドをコードする縮重（degenerate）核酸配列、ならびにｃＤＮＡと少なくとも約５０、５５、６０、６５、６０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％同一である相同性ヌクレオチド配列を使用できる（ポリヌクレオチド）。２つのポリヌクレオチドの配列間のパーセント配列の同一性は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを採用するＡＬＩＧＮなどのコンピュータープログラムを使用して、ギャップオープンペナルティ−１２およびギャップ拡張ペナルティ−２のアフィンギャップ検索を使用して決定される。生物学的活性ポリペプチドをコードする核酸配列の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種ホモログおよびバリアントも有用なポリヌクレオチドである。
【００５８】
上述の核酸配列のバリアントとホモログも有用な核酸配列である。通常、相同性のあるポリヌクレオチド配列は、当技術分野で知られているように、候補のポリヌクレオチドと既知のポリヌクレオチドをストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって同定できる。例えば、以下の洗浄条件を使用して最大で約２５〜３０％の塩基対のミスマッチを含む相同性の高い配列を同定できる：２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ，０．０３Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、室温で２回、各３０分、次に２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で１回、３０分、次に２×ＳＳＣ、室温で２回、各１０分。より好ましくは、相同な核酸鎖は、１５〜２５％の塩基対のミスマッチ、さらにより好ましくは５〜１５％の塩基対のミスマッチを含む。
【００５９】
本明細書で言及されるポリヌクレオチドの種ホモログはまた、適切なプローブまたはプライマーおよびスクリーニングｃＤＮＡ  発現ライブラリを作成することによって同定され得る。二本鎖ＤＮＡのＴｍは、相同性が１％低下するごとに１〜１．５℃低下することがよく知られている（Ｂｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８１，  １２３  （１９７３）。ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件による目的のポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列、またはそれらの相補鎖も有用なポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は当技術分野で周知であり、理解されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  ２nd  ｅｄ．，  １９８９，  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ９．５０−９．５１に開示されている。
【００６０】
一般的に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、研究対象となるハイブリッドの計算上のＴmから約１２〜２０℃低い温度と塩濃度の組み合わせを選択する必要がある。目的のポリヌクレオチドまたはその相補鎖と、それらのヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも約５０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％同一であるポリヌクレオチド配列とのハイブリッドのＴmは、例えば、Ｂｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｈｙ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ４８，  １３９０  （１９６２）の式を用いて算出できる。
Ｔm＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｌ），
式中、ｌ＝塩基対でのハイブリッドの長さ。
ストリンジェントな洗浄条件には、例えば、６５℃で４ＸＳＳＣ、または５０％ホルムアミド、４２℃で４ＸＳＳＣ、または６５℃で０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが含まれる。高度にストリンジェントな洗浄条件には、たとえば、６５℃で０．２ＸＳＳＣが含まれる。
以下の材料および方法は、本発明の実施を容易にするために提供される。
【００６１】
（コドン最適化）
葉緑体における異種遺伝子の発現を最大化するために、種子植物１３３種のｐｓｂＡ遺伝子のコドン嗜好性に基づいて、葉緑体コドンオプティマイザープログラムを開発した。すべての配列はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ，  ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＧｅｎｏｍｅｓＧｒｏｕｐ．ｃｇｉ？ｔａｘｉｄ＝２７５９＆ｏｐｔ＝ｐｌａｓｔｉｄ）からダウンロードした。１３３のｐｓｂＡ遺伝子から得られた合計４６，５００のコドンを解析し、各アミノ酸の同義コドン間の使用優先度を決定した。最適化アルゴリズム（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ  ｖ２．１）は、ＪＡＶＡを用いて、希少なコドンから葉緑体で頻繁に使用されるコドンへの変更を容易にするために作られた。
【００６２】
（マーカーフリーの食用植物）
上記のように、プラスチドで経口摂取するための抗生物質フリーのバイオ医薬品を生産する食用のトランスプラストミック植物を生成するための方法が提供される。この目的のためのいくつかの例示的なプラスチド形質転換ベクターが図面に提供されている。特定の実施形態では、方法が実行されると、得られた植物のホモプラスミーが評価される。本明細書に例示されるように、選択可能なマーカー遺伝子は、ａａｄＡ遺伝子であり得、抗生物質は、スペクチノマイシンであり得る。ａａｄＡおよびスペクチノマイシン耐性が本明細書で例示されているが、選択可能なマーカー遺伝子および抗生物質をコードする他の抗生物質もまた、本発明の組成物および方法で使用され得る。
【００６３】
記載されているベクターに使用されているネイティブａｔｐＢリピート配列（６４９ｂｐ）またはそのバリアントは、ｒｂｃＬプロモーター領域とａｔｐＢプロモーター領域を逆向きに含んでおり、これにより、トランスジーンカセットを転写活性のあるスペーサー領域に導入すると、アンチセンスＲＮＡを作って遺伝子発現を破壊する。ただし、トランスジーン発現レベルは転写的にサイレントなスペーサー領域よりも高いため、このようなスペーサー領域が好ましい（Ｊｉｎ  ａｎｄ  Ｄａｎｉｅｌｌ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１５；  Ｄａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１６）。そのため、マーカーフリーの発現カセットの異なるバージョンのリピート配列では、少なくとも一方または両方のプロモーター領域が削除された。
【００６４】
特定の実施形態では、ベクター内のダイレクトリピート配列は配列番号１６でコードされている。他の実施形態では、ダイレクトリピートは、配列番号１６によってコードされ、太字、下線、または青または赤で示された配列の１、２、３、４、またはすべてが削除される。
【００６５】
本発明のバイオ医薬品タンパク質は、融合タンパク質としてコード化できる。特定の態様では、ＰＴＤペプチドは目的のタンパク質に機能的に結合される。他の特定の態様では、ＣＴＢペプチドが使用される。
【００６６】
マーカーフリーＩＧＦ−１産生植物の生産の成功は、ＣＴＢ−プロインスリン、ＣＴＢ−ＡＭＡ、ＣＴＢ−ＭＳＰ、ＣＴＢ−ＦＩＸ、ＣＴＢ−ＦＩＸ−ｆｕｒｉｎ、ＣＴＢ−Ｅｘｅｎｄｉｎ、ＣＴＢ−ＥＳＡＴ６，ＣＴＢ−Ｍｔｂ７２Ｆ、ＣＴＢ−ＶＰ１、ＣＴＢ−ＭＢＰ、ＣＴＢ−Ａｃｅ  ２、ＣＴＢ−Ａｎｇ１−７、ＣＴＢ−ＧＡＡ、ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＨＣ、ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−Ｃ２、コドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＨＣ、コドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＬＣ、およびコドン最適化されたＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ−ＳＣを含むがこれらに限定されない追加の治療上有益なタンパク質の生産への道を開く。
【００６７】
以下の材料および方法は、本発明の実施を容易にするために提供される。
【００６８】
（ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を発現するタバコおよびレタスのトランスプラストミック株の作製）
上記のコドン最適化および合成されたＰｒｏ−ＩＧＦ−１は、以下を用いてオーバーラップＰＣＲ増幅された。
ＮｄｅＩ−ＣＴＢ−Ｆ，  ５’−ＴＴＣＡＴＡＴＧＡＣＡＣＣＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＡＴＴ  （配列番号１）；
ＣＴＢ−ＩＧＦ−１，  ５’−ＴＴＧＣＣＧＣＡＡＴＴＡＧＴＡＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＧＴＣＧＴＡＡＡＣＧＣＴＣＴＧＴＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＡＴＧＴＧＧＴＧＣＴ  （配列番号２）；
ＩＧＦ−１−ＰｓｈＡＩ−Ｒ，  ５’−ＣＡＡＴＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＴＡＣＧＡＴＡＡＴＴ  ＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣ  （配列番号３）；  および
ＩＧＦ−１−ＸｂａＩ−Ｒ，  ５’−ＣＡＡＴＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＴＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣ  （配列番号４）。
【００６９】
増幅されたＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１は、タバコ葉緑体形質転換ベクター（ｐＬＤ−ｕｔｒ）およびレタスベクター（ｐＬｓＬＦ）にクローン化された（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７；  Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。クローン化されたＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１は、タバコ（Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ）とレタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）栽培品種  シンプソン・エリートに、以前に記載されているようにボンバードメントにより形質転換された（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７；  Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。  ボンバードメント後、以前に記載されたように再生が誘導された（Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。一次シュートは以下を用いてＰＣＲスクリーニングされた。
１６ｓ−Ｆ，  ５′−ＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＧＡＴＧＣＡＡＧＣ  （配列番号５）；
ａａｄＡ−Ｒ，  ５’−ＣＣＧＣＧＴＴＧＴＴＴＣＡＴＣＡＡＧＣＣＴＴＡＣＧＧＴＣＡＣＣ  （配列番号６）  ；
ＮｄｅＩ−ＣＴＢ−Ｆ，  ５’−ＴＴＣＡＴＡＴＧＡＣＡＣＣＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＡＴＴ  （配列番号１）；
ＩＧＦ−１−ＰｓｈＡＩ−Ｒ，  ５’−ＣＡＡＴＡＡＧＡＣＣＡＡＡ  ＧＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＴＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣ  （配列番号３）；
ＵＴＲ−Ｆ，  ５’−ＡＧＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＴＴＧＡＴＡＡＡＡ  Ｃ  （配列番号７）；  および
２３ｓ−Ｒ，  ５’−ＴＧＣＡＣＣＣＣＴＡＣＣＴＣＣＴＴＴＡＴＣＡＣＴＧＡＧＣ  （配列番号８）。
ＰＣＲ陽性の葉は、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬを含む再生培地（Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）上で２回目の再生のために誘導された。二次シュートは、第１ラウンドの選択で使用したのと同じプライマーセットを使用した第２ラウンドのＰＣＲによってスクリーニングされた。スクリーニングされた陽性シュートは、根を形成するように誘導された。それらがホモプラスミックであることを確認し、タンパク質発現をそれぞれサザンブロットとウエスタンブロットで確認した後、以前記載されているように水耕栽培システムおよび温室に移した（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７）。
【００７０】
（マーカーフリーのＰＴＤ−ＩＧＦ−１レタス葉緑体発現ベクターの作成）
ヘンリー・ダニエルの研究室で以前に作成されたレタス葉緑体形質転換のベクター、ｐＬｓＬＦがテンプレートとして使用された（Ｄａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６ａ）。これにはスペクチノマイシン耐性遺伝子（ａａｄＡ、アミノグリコシド３’−アデノリトランスフェラーゼ遺伝子）が含まれている。マーカー遺伝子を切除するために、ダイレクトリピートのＤＮＡ配列（ＰａｔｐＢおよび５’ＵＴＲ、６４９ｂｐ（Ｋｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）をタバコの全ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅し、配列を確認したダイレクトリピートをａａｄＡ発現カセットの隣接するようにクローニングした。葉緑体の形質転換の後にマーカーフリーのベクターの動作を検証するために、ｐｓｂＡプロモーターの制御下でシュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）のｐｔｘＤ（ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ，  ＧｅｎＢａｎｋ：  ＡＡＣ７１７０９．１）遺伝子をクローニングした。リン酸塩培地でのマーカーフリーの形質転換体の選択を容易にするために、コドンを最適化したｐｔｘＤをネイティブ配列のｐｔｘＤと一緒にテストした（データは示されていない）。単一消化されたａｔｐＢ断片のベクターバックボーンへの挿入については、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）アセンブリキットを使用して、断片の逆方向へのライゲーションの可能性を回避した。以前に記載されたようにコドン最適化した後（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）、Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で合成された。Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１は以下でオーバーラップＰＣＲ増幅された。
ＮｄｅＩ−ＰＴＤ−Ｆ，  ５’−ＡＴＴＴＴＡＣＡＴＡＴＧＡＧＡＣＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＡＡＣＣＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡ  （配列番号９）；
ＰＴＤ−ＩＧＦ−１−Ｆ，  ５’−ＣＣＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡ  ＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＧＴＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴ  （配列番号  １０）；  および
ＩＧＦ−１−ＰｓｈＡＩ−Ｒ，  ５’−ＣＡＡＴＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡ  ＴＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣ  （配列番号  ３）。
葉緑体形質転換のため、ｐＬｓＬＦ−ＭＦベクターにＮｄｅＩ部位とＰｓｈＡＩ部位の間に、おいて、ＰＴＤ融合Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１がｐｔｘＤに置き換えられた。レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）栽培品種  シンプソン・エリートの葉は、以前に記載されているように形質転換のためボンバードメントされた（Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。
【００７１】
（ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を含む抗生物質遺伝子欠失レタスのスクリーニング）
ボンバードメントの後、レタスの葉を細かく切り（１ｃｍ2未満）、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬを含む再生培地［ＭＳ塩（Ｃａｉｓｓｏｎ、Ｓｍｉｔｈｆｉｅｌｄ、ＵＴ）、ガンボーグビタミン（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｅｎｅｘａ  ＫＳ）、ＢＡＰ  ０．２ｍｇ（Ｓｉｇｍａ  、セントルイス、ミズーリ州）、ＮＡＡ  ０．１ｍｇ（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）、ミオイノシトール１００ｍｇ（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）、ＰＶＰ  ５００ｍｇ（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）、スクロース３０ｇ（シグマ、セントルイスミズーリ州ルイス）、ｐｈｙｔａｂｌｅｎｄ５ｇ（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カンザス州レネクサ）］で育成した。生成された一次シュート（４〜６週間）は、以下の特定のＰＣＲ  プライマーセットを使用してスクリーニングされた。
（１６ｓ−Ｆ，  ５′−ＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＧＡＴＧＣＡＡＧＣ  （配列番号５）；
ａａｄＡ−Ｒ，  ５’−ＣＣＧＣＧＴＴＧＴＴＴ  ＣＡＴＣＡＡＧＣＣＴＴＡＣＧＧＴＣＡＣＣ  （配列番号６）；
ａｔｐＢ−Ｒ，  ５’−ＧＡＡＴＴＡＡＣＣＧＡＴＣＧＡＣＧＴＧＣＴＡＧＣＧＧＡＣＡＴＴ  （配列番号１１）；
ＵＴＲ−Ｆ，  ５’−Ａ  ＧＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＴＴＧＡＴＡＡＡＡＣ  （配列番号７）；
２３ｓ−Ｒ，  ５’−ＴＧＣＡＣＣＣＣＴＡＣＣＴＣＣＴＴＴＡＴＣＡＣＴＧＡＧＣ  （配列番号８）。
【００７２】
陽性シュートは、５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンで次のラウンドのために再生された。シュートが白化し始めるとすぐに、ＰＣＲでａａｄＡ遺伝子の切除を評価し、根を誘導するためにスペクチノマイシンを含まない培地に移した。根ができたら、ウェスタンブロットとサザンブロットでそれぞれ導入遺伝子の発現とホモプラズムを確認した。ウェスタンブロットのために、生葉を液体窒素で粉砕した後、粉砕した粉末１００ｍｇを３００μＬの抽出バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，  １０ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ２００ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，  ｐＨ８，  ０．０５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０，  ０．１％  ｖ／ｖ  ＳＤＳ，  ４００ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅ，  １４ｍＭ  β−メルカプトエタノール，  １００ｍＭ  ＤＴＴ，  ２ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド、およびプロテイナーゼ阻害剤カクテル）に懸濁した。その後の詳細な手順は以下の通りである。サザンブロットは、ＤＩＧ  ｈｉｇｈ  ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｔａｒｔｅｒ  ｋｉｔ  ＩＩ  （Ｒｏｃｈｅ，  Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）の製造元のプロトコールに基づいて行った。トランスプラストミック植物は、ＡｅｒｏｇａｒＧａｒｄｅｎ液体植物フード（Ｍｉｒａｃｌｅ−Ｇｒｏ、Ｍａｒｙｓｖｉｌｌｅ、ＯＨ）を使用して水耕栽培システムで２週間栽培し、温室に移して収穫した。温室では，ガーデンソイル（Ｍｉｒａｃｌｅ−Ｇｒｏ，  Ｍａｒｙｓｖｉｌｌｅ，  ＯＨ）とポッティングソイル（Ｅｒｔｈｇｒｏ）を１：１の割合で混合した土壌を用い，２２℃で１６時間：８時間の光サイクルの条件下で，Ｍｉｒａｃｌｅ−Ｇｒｏ  Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ａｌｌ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｆｏｏｄを週に１〜２回施肥した。収穫した葉は、以前に記載されたように凍結乾燥した（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１６）。
【００７３】
（凍結乾燥した細胞内のＣＴＢ／ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の定量化と特性評価）
ＣＴＢ／ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の発現レベルを確認するために、凍結乾燥した葉の粉末１０ｍｇを５００μＬの抽出バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，  １０ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ２００ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，  ｐＨ８，  ０．０５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０，  ０．１％  ｖ／ｖ  ＳＤＳ，  ４００ｍＭスクロース、１４ｍＭβ−メルカプトエタノール、１００ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、およびプロテイナーゼ阻害剤カクテル）で４℃で１時間再水和した後、超音波処理［Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ  ３０００  （Ｍｉｓｏｎｉｘ，  Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，  ＮＹ）で５秒ｏｎ／１０秒ｏｆｆを３回］を行った。抽出したタンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で定量した後、１Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で７０℃で１０分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％）で分離した。ウェスタンブロット分析は、ウサギ抗ＣＴＢ（１：１０，０００）（Ｇｅｎ  Ｗａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、ウサギ抗ＩＧＦ−１（１：４，０００）（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（１：４，０００）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，  ＡＬ）に対して行った。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｐｌｕｓタンパク質標準試料は、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）（１：５０００）（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で結合・標識されたＰｒｅｃｉｓｉｏｎタンパク質Ｓｔｒｅｐ  Ｔａｃｔｉｎを用いて検出した。化学発光検出キットを用いてＨＲＰのシグナルをＸ線フィルムに取り込み、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩＪ  １．４６；  ＮＩＨ）を用いて定量分析を行った。ＣＴＢペプチド（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）またはＩＧＦ−１ペプチド（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）を用いて標準曲線を作成した。
【００７４】
（非還元ゲルでのＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１のイムノブロット）
凍結乾燥した粉末１０ｍｇを５００μＬの抽出バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，  １０ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ２００ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，  ｐＨ８，  ０．０５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０，  ０．２％  ｖ／ｖ  ＳＤＳ，  ４００ｍＭ  スクロース，  ２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、およびプロテイナーゼ阻害剤カクテル）で、４℃で１時間再水和し、超音波処理した後、上記の方法で定量した。抽出したタンパク質をサンプルバッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉ−Ｃｌ、ｐＨ  ６．５、１０％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、５０％ｖ／ｖグリセロール、０．２ｍＭブロモフェノールブルー）と混合した後、電気泳動とウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロットのその後の詳細なステップは上記の通りである。
【００７５】
（生葉および凍結乾燥葉におけるＰｒｏ−ＩＧＦ−１の定量）
等量の生葉および凍結乾燥葉を同量の抽出バッファーで抽出し、次にそれらを段階希釈をして上記のようにイムノブロットを実行した。レタスのＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１およびマーカーフリーのＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１については、１Ｘは１０ｍｇの凍結乾燥粉末を３００μＬのタンパク質抽出バッファーに懸濁させたものを１０μｌロードしたものを示す。タバコＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１については、１Ｘは１０ｍｇの凍結乾燥粉末を３００μｌのタンパク質抽出バッファーに懸濁したものを１μｌロードしたものを示す。ローディング対照については、膜をＷｅｓｔｅｒｎ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）で３７℃で１０分間インキュベートした後、ＰＴＭ  １：４０，０００でウサギ抗ＲｂｃＬ（Ｒｕｂｉｓｃｏ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ）（Ａｇｒｉｓｅｒａ，  Ｖａｎｎａｓ，  Ｓｗｅｄｅｎ）で１時間免疫標識した。その後のウエスタンブロットの手順は、上述のとおりである。
【００７６】
（ＧＭ１−ガングリオシド受容体結合アッセイ）
タバコとレタスで発現したＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を、凍結乾燥後にＧＭ１−ガングリオシド受容体に結合するＣＴＢ五量体の形態を評価した。タンパク質は上記のように抽出した。ＣＴＢ−ＧＭ１結合アッセイは、以前に説明されているように実行された（Ｋｗｏｎ  ら、２０１７）。
【００７７】
（ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の精製と細胞増殖アッセイ）
ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を含む４００ミリグラムの凍結乾燥および粉砕タバコトランスプラストミック株を２０ｍＬの植物タンパク質抽出バッファー（５０ｍＭ  ＮａＰ（ｐＨ  ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．４ｍＭベータメルカプトエタノール、０．５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０、および２錠のプロテアーゼ阻害剤カクテル）で、４℃１時間で再水和し、ホモジナイズした。超音波処理後、ホモジネートをスピンダウンした。上清は２ｍＬのＮｉ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｆｒｅｍｏｎｔ，  ＣＡ）と一晩インキュベートした。カラムに積み上げた後、１０ｍＬの結合バッファー（５０ｍＭ  ＮａＰ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）、１０ｍＬの洗浄バッファー１（５０ｍＭ  ＮａＰ（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）、１０ｍＬの洗浄バッファー２（５０ｍＭ  ＮａＰ（ｐＨ６．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）で順に洗浄した。その後、溶出バッファー（５０ｍＭ（ｐＨ６．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール）で溶出した。精製したＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１は、クーマシーブルーで染色したゲルで評価し、その濃度は、既知の濃度のＩＧＦ−１ペプチド（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）を用いて同じタンパク質ゲルで作成した標準曲線に基づいて算出し、その後、上記のようにイムノブロット分析を行った。一定数の細胞［１００μＬの増殖培地中、ＨＯＫ（ヒト口腔ケラチノサイト）２，５００個、ＧＭＳＣ（ヒト歯肉由来間葉系幹細胞）５，０００個、ＳＣＣ（ヒト頭頸部扁平上皮癌細胞）３，０００個、ＭＣ３ＴＣ（マウス骨芽細胞）４，０００個］を３枚の９６ウェルプレートに播種した。３７℃、５％ＣＯ2で１６時間培養した後、精製したＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１とヒトＩＧＦ−１市販ペプチド（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）のシリーズ濃度を１０μＬのＰＢＳで希釈した後、細胞とインキュベートした。細胞に添加した１０μＬのＰＢＳを、０ｎｇのペプチドの陰性対照として使用した。２４時間後、４８時間後、７２時間後に、ＭＴＴアッセイ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、５７０ｍｍの波長で、６５５ｎｍのリファレンスを用いて、生存増殖細胞の吸光度を測定した。このデータは三重（ｔｒｉｐｌｅｔｓ）で生物学的には２回繰り返された。
【００７８】
骨形成の分化を調べるために、ＭＣ３Ｔ３細胞を骨形成用の培地（ＯＳ培地）で処理した。ＯＳ培地は、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭβ−グリセロホスフェート（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、および１０-8  Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）を含むα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）である。ＯＳ培地および１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌの精製ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１で５日間処理した後、細胞をＲＮＡ抽出および骨形成マーカ（アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ｒｕｎｔ関連の転写因子２（ＲＵＮＸ２）およびＯｓｔｅｒｉｘ（Ｏｓｘ））のｑＰＣＲ分析のために単離した。
【００７９】
（動物実験）
８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入し、ペンシルバニア大学において機関で承認されたプロトコールに基づいて病原体のない環境で飼育した。凍結乾燥植物細胞をＰＢＳで再水和し、強制経口投与あたり２００μＬの最終容量（５μｇのＣＴＢまたはＰＴＤタグ付きＩＧＦ−１を含む）にし、３〜４秒間短時間ボルテックスした。３グループのマウス、１グループ１８匹（雄９匹、雌９匹）に、２０ゲージの胃洗浄用針を用いて給餌した。強制経口投与の前と２時間後に顎下静脈から血液（５０〜８０μＬ）を採取し、室温で２時間凝固させた。続いて、血清を３０００ＲＰＭで１５分間４℃で遠心分離することにより分離し、−８０℃で保存した。血清中のＩＧＦ−１のレベルはＥＬＩＳＡ  アッセイによって評価された。ヒラメ筋または腓腹筋を対照およびＣＴＢまたはＰＴＤタグ付きＩＧＦ−１を与えたマウスの後肢から解剖し、液体窒素で急速凍結し、ウエスタンブロットによってＩＧＦ−１について評価した。
【００８０】
（血清中のＩＧＦ−１のＥＬＩＳＡアッセイ）
ＩＧＦ−１標準品（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）および血清サンプルをコーティングバッファー（１５ｍＭ  Ｎａ2ＣＯ3，  ３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ3，  ３ｍＭ  ＮａＨ3，  ｐＨ９．６）で希釈し、Ｃｏｓｔａｒ（３５９０）社製の高結合ＥＩＡ／ＲＩＡプレートに一晩かけて結合させた。その後、ＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、ＰＢＳＴ（ＰＴＭ）中の３％ミルクで１時間ブロッキングし、１：２０００で一次抗体のウサギ抗ＩＧＦ−１を含むＰＴＭ（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）で３７℃で２時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１：４０００でＨＲＰを含むＰＴＭ  （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，  ＡＬ）を結合させた二次抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧ１を３７℃で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ  ペルオキシダーゼ基質（ロックランド）で室温で１０分間インキュベートした後、停止溶液（２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4）でインキュベートした。４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【００８１】
（筋肉組織のイムノブロッティング分析）
ヒラメ筋と腓腹筋の組織を液体窒素から解凍し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．４；０．２５％デオキシコール酸ナトリウム；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；  プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）からなる溶解バッファー（筋肉の湿潤重量あたり１０容量）でホモジナイズした。組織のホモジネートは、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）によりタンパク質を評価した。組織は上述のように電気泳動とウェスタンブロッティングで分析した。ローディング対照については、膜をＷｅｓｔｅｒｎ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）で３７℃で５分間インキュベートした後、一次抗体のマウス抗アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｄａｌｌａｓ  ＴＸ）を１：４０００で含むか、またはマウス抗ＧＡＰＤＨ  （Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）を１：４０００で含むＰＴＭでインキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，  ＡＬ）  １：４０００でインキュベートし、化学発光で現像した。
【００８２】
（ネズミの糖尿病性大腿骨骨折モデル）
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社  の８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス２５匹を無作為に４つのグループに振り分けた：ＣＯＮグループ（雄の非糖尿病マウス６匹、凍結乾燥野生型（ＷＴ）植物細胞の強制経口投与）、ＩＧＦ−１グループ（雄の非糖尿病マウス６匹、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を含む凍結乾燥植物細胞の強制経口投与）、Ｄｉａグループ（雄の糖尿病マウス７匹、凍結乾燥ＷＴ植物細胞の強制経口投与）、Ｄｉａ−ＩＧＦ−１グループ（雄の糖尿病マウス６匹、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を含む凍結乾燥植物細胞の強制経口投与）。ＷＴ植物細胞の粉末と、５μｇのＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を含む凍結乾燥植物細胞（２０ｍｇ）を、それぞれＰＢＳで再水和して、１回の強制経口投与で３００μｌの最終容量にした。経口投与の期間は６週間で、頻度は１日１回であった。
【００８３】
ＤｉａおよびＤｉａ−ＩＧＦ−１グループのマウスは、骨折の３週間前に糖尿病を誘発するために、ＳＴＺ（０．１Ｍ  クエン酸バッファー中５０μｇ／ｇ体重）を５日間毎日腹腔内注射した。血糖値は、ストレプトゾトシン最終注射の７日後に尾静脈から血液を採取し、グルコメーター（ＯＮＥ  ＴＯＵＣＨ  Ｕｌｔｒａ  ２，  ＬｉｆｅＳｃａｎ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定した。血糖値が３００ｍｇ／ｄｌ以上のマウスを糖尿病とした。
【００８４】
髄内釘固定を伴う閉鎖性大腿骨骨折は、上記の１２週齢（ｗｋ）のマウスで実施された。簡単に説明すると、落下した重りで駆動する３点式の鈍いギロチンによって、大腿骨に均一な横方向の骨折を起こす閉塞骨折を発生させた。骨折した大腿骨は、分析のために骨折後６週間で採取された。
【００８５】
（マイクロコンピューター断層撮影（ｍｉｃｒｏＣＴ）撮像とＸ線撮影）
マウスをイソフルランで麻酔し、骨折部位をＤ０、Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１でＦａｘｉｔｒｏｎ  ＭＸ−２０（Ｆａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ線）を使用してＸ線撮影し、骨折治癒の進行を監視した。この研究の最後に、骨折した大腿骨の骨マイクロアーキテクチャーを、Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ＤｉｓｏｒｄｅｒｓのＩｍａｇｉｎｇ  ＣｏｒｅでＳｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  μＣＴ  ３５を用いて検査した。スキャンは５５ｋｅＶで行い、近位と遠位に少なくとも３ｍｍ延びた骨折線で３Ｄ画像を再構成した。骨折カルスでは、の閾値を３００ｍｇ／ｃｍ3  ＨＡに設定して、全体積に対する骨体積の比率（ＢＶ／ＴＶ）と骨密度を測定した。
【００８６】
（組織学的分析）
骨折カルスを摘出し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で４℃で最低３週間脱灰した。その後、サンプルをＯＣＴに包埋した。カルスの中央部から縦断切片（厚さ８μｍ）を切り出し，ゼラチンを塗布したスライドグラスに連続してマウントし，ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色して組織学的検査を行った。骨癒合の形態的特徴をライカ蛍光顕微鏡（ＤＭＩ６０００Ｂ，  Ｌｅｉｃａ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
【００８７】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明するために提供される。これらは、本発明を何ら限定するものではない。
【００８８】
（実施例１）
（葉緑体における抗生物質フリーのＩＧＦ−１の生成）
本研究では、経粘膜キャリアーであるコレラ無毒化Ｂサブユニット（ＣＴＢ）または細胞浸透性タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）を融合したｅ−ペプチドを含む、コドン最適化されたＰｒｏ−ＩＧＦ−１を葉緑体で発現するレタスとタバコ株を作成した。抗生物質耐性遺伝子（ａａｄＡ）の完全な欠失を達成し、次の世代でＰｒｏ−ＩＧＦ−１を安定的に維持および発現することを確認した。葉緑体由来のＰｒｏ−ＩＧＦ−１の生物活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで４種類のヒト／マウス口腔細胞の増殖促進を観察することで確認された。雌雄のマウスを用いて、トランスプラストミック植物で生産されたＩＧＦ−１が、循環系や骨組織への経口投与に成功したことを確認した。ＩＧＦ−１を強制経口投与することで、骨芽細胞の分化と糖尿病性骨折の治癒が有意に促進されたことから、このユニークなバイオ医薬品のヒトへの応用の可能性が確認された。抗生物質耐性遺伝子が完全に除去されたこの新しいプラットフォームは、バイオカプセル化されたバイオ医薬品の臨床研究に使用でき、安価な経口薬物送達と患者のコンプライアンス向上に貢献する。
【００８９】
（結果）
（ＣＴＢ／ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を発現するレタス／タバコのトランスプラストミック株の生成）
ヒトＩＧＦ−１の前駆体とｅ−ペプチド（Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１）は、ｐｓｂＡ遺伝子を参照として使用して、葉緑体の発現レベルを改善するためにコドン最適化後に合成された  （Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の合計１０５コドンのうち、６５コドンが最適化され、ＡＴ含有量が４３％から５７％に増加した。さらに、エンドプロテアーゼによる認識を回避してｅ−ペプチド切断を防ぐために、３つのアミノ酸Ｌｓｙ６８、Ａｒｇ７４、およびＡｒｇ７７をそれぞれＧｌｙ６８、Ａｌａ７４、およびＡｌａ７７に変更した（Ｄｕｇｕａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）（図１Ｇおよび図８）。葉緑体はグリコシル化フリーゾーンであり、潜在的なグリコシル化部位があってもグリコシル化から保護されることがよく知られているため、予測されたグリコシル化部位は本研究では編集しなかった。
【００９０】
コドンが最適化されたＰｒｏ−ＩＧＦ−１を、ヒンジ（ＧＰＧＰ）とｆｕｒｉｎ配列（ＫＫＲＫＳＶ）を介してＣＴＢに融合させ、この融合体をレタス（ｐＬｓＬＦ）（図１Ａ）およびタバコ（ｐＬＤ−ｕｔｒ）（図１Ｅ）の葉緑体形質転換ベクターにクローニングした。以前に記載されているように（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７；  Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、プラスミドをレタス／タバコ葉緑体ゲノムにボンバードメントした。  ボンバードメントの後、第１ラウンドの選抜で再生したシュートを、特定のプライマーセットを用いたＰＣＲ分析でテストし（図１Ｂおよび図１Ｅ）、発現カセットの部位特異的な組み込みを確認した（図１Ｂ）。ＰＣＲ陽性のシュートは、ホモプラスミーを達成するために別のラウンドの選択にかけられた。ホモプラスミック状態は、適切なプローブ（ＳＢ−Ｐ）を使用したサザンブロットアッセイによって確認され（図１Ｃおよび図１Ｆ）、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の発現はウエスタンブロットで検出された（図１Ｄ）。形質転換された葉緑体ゲノムには、レタスでは１１．６ｋｂ、タバコでは６．７ｋｂの明瞭な断片が見られ、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１発現カセットが部位特異的に組み込まれていることが確認された。一方、形質転換されていない葉緑体ゲノムには、より小さな断片（レタスでは９．１ｋｂ、タバコでは４．４ｋｂ）が見られた。ウェスタンブロットでは、期待通りのサイズ（２４．３ｋＤａ）のＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１タンパク質の発現が確認された。これらの結果から、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を発現するレタス／タバコのホモプラズム株の作製が確認された。
【００９１】
（マーカーフリーのＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１ホモプラズムレタス株の作出）
マーカーフリーの葉緑体ベクター（ｐＬｓＬＦ−ＭＦ）は、複数のクローニングステップによって生成された（図２Ｊ）。このベクターには、プラスチドリボソームＲＮＡプロモーター（Ｐｒｒｎ）の制御下にあるスペクチノマイシン耐性アミノグリコシド−３’−アデニル−トランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子が含まれており、それに続く３’ＵＴＲ、ＴｒｂｃＬが含まれていた。ａａｄＡは、図２Ａに示すように、葉緑体にコードされたＣＦ１  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｂｅｔａ（ａｔｐＢ）のプロモーター領域（６４９ｂｐ）の２つのコピーの間に位置している。ＰＴＤに融合したコドン最適化合成Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を、ｐｓｂＡプロモーター／５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの制御下で、マーカーフリーの葉緑体発現カセットにクローニングした。ボンバードメントしたレタスの葉は、スペクチノマイシン（３０Ｓリボソームと結合するプラスチドタンパク質合成の阻害剤）を含む培地で再生され、その後、１回目（データは示されていない）と２回目の選択の際に、特定のＰＣＲプライマーのセットでスクリーニングされた（図２Ｂ）。１６ｓ−Ｆ／ａａｄＡ−Ｒプライマーセットは、内在性の葉緑体ゲノム配列とカセット内のａａｄＡトランスジーンにアニーリングし（図２Ａ）、３．３ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（図２Ｂ）。ＵＴＲ−Ｆ／２３ｓ−Ｒ  プライマーのセットを使用して、発現カセットの３’側を確認し（図２Ａ）、２．４ｋｂの断片を作成した（図２Ｂ）。
【００９２】
レタスの葉緑体形質転換体をスペクチノマイシンで選択する際に、選択マーカーが切除され、ダイレクトリピートの２つのａｔｐＢフラグメント間の相同組換えにより、ａｔｐＢ領域のコピーがトランスプラストミックゲノムに１つ残された。ホモロジーベースのマーカー切除が起こると、１６ｓ−Ｆ／ａｔｐＢ−Ｒのプライマーセットは２．４ｋｂのＰＣＲ産物を増幅し、１６ｓ−Ｆ／ａａｄＡ−ＲはＰＣＲ産物を生成しないはずである。図２Ｂに示すように、トランスプラストミック株１は、１６ｓ−Ｆ／ａａｄＡ−Ｒプライマーセットで増幅してもＰＣＲ産物が得られず、ａａｄＡ遺伝子が切除された結果、１６ｓ−Ｆ／ａｔｐＢ−Ｒで増幅された２．４ｋｂの断片が存在することがわかった。この切除は、ＰＴＤ−ＩＧＦ−１発現カセットの安定した組み込みには影響を与えず、ＵＴＲ−Ｆ／２３ｓ−Ｒプライマーセットを用いたＰＣＲによる２．４ｋｂの断片の増幅によって確認された。株２、３、４では、１６ｓ−Ｆ／ａａｄＡ−Ｒで３．３ｋｂのＰＣＲ産物が得られ、ａａｄＡマーカー遺伝子が葉緑体ゲノムに残っていることがわかった（図２Ｂ）。３つの一次シュートが１回目のＰＣＲスクリーニングで陽性の結果を示した。３つの一次シュートの１つから２回目のセレクションでスクリーニングされた９つのシュートのうち、６つのシュートがトランスジーンカセットの組み込みに陽性で、１つのシュートがａａｄＡ遺伝子の完全な除去を示した。
【００９３】
図２ＢのＰＣＲ陽性のシュート（株２、３、４）を、抗生物質耐性遺伝子を持たないシュート（株１）および形質転換していない野生型レタスとともに、サザンブロット解析で調べた（図２Ｃ）。サザンブロットでは、形質転換されていないレタスは９．１ｋｂ断片を１本示したが、トランスプラストミック株１は１０．７ｋｂ断片を示し、ＰＣＲ結果（図２Ｂ）とホモプラスミック  マーカーフリー株（葉緑体ゲノムのすべてのコピーからのマーカー遺伝子切除）の達成を裏付けた。興味深いことに、株２、３、４では、サイズが１２．７ｋｂと１０．７ｋｂの２つの断片が検出された。これは、マーカーの切除がある場合とない場合のヘテロプラスミック状態を表している。ａａｄＡ遺伝子の欠失にかかわらず、ＩＧＦ−１抗体を用いて調べたすべての株で、ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１タンパク質の発現が期待通りのサイズ（１４．５ｋＤａ）で検出されたが、形質転換していない野生型レタスではバンドは検出されなかった（図２Ｄ）。
【００９４】
次の世代におけるマーカーフリーのホモプラズムの安定性を評価するために、１０個のマーカーフリー種子をスペクチノマイシンを含まない培地で発芽させた。Ｔ１植物からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｔ０トランスプラストミック株の評価で用いたのと同じプライマーセットを用いてＰＣＲで調べ、サザンブロットを行った（図２Ｅ、図２Ｆ）。調べたすべての実生は抗生物質遺伝子の切除を示し、ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１発現カセットの組み込みを維持していた。Ｔ１世代のＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の発現は、抗ＩＧＦ−１に対するウエスタンブロットによっても確認された（図２Ｇ）。Ｔ０植物（図２Ｄ）に示されているように、調べたすべてのＴ１植物は、マーカー遺伝子切除後にＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を発現した。また、Ｔ１の抗生物質フリートランスプラストミック株を抗生物質含有培地（スペクチノマイシン２５および５０μｇ／ｍＬ）で発芽させた場合、発芽後６日で葉が白化し、発芽後１５日で植物の成長が停止した（図３Ｏ）。また、Ｔ２のマーカーフリー植物からランダムに選んだ４株は、サザンブロット法とイムノブロット法でそれぞれ確認したところ、Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を発現する抗生物質耐性遺伝子フリーのホモプラスティック状態を示した（図２Ｈ、図２Ｉ）。これらのデータから、外来タンパク質であるＰｒｏ−ＩＧＦ−１の発現を維持したまま、マーカーフリーの状態がその後のＴ１、Ｔ２世代で安定的に維持されることが確認された。
【００９５】
（凍結乾燥植物細胞のＣＴＢ／ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１発現の特性評価）
レタス（図３Ａ、３Ｂ）とタバコ（図３Ｃ、３Ｄ）の両方の葉緑体におけるＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の発現を、ＣＴＢまたはＩＧＦ−１に対する抗体を用いて評価したところ、２つの異なる抗体が同じサイズの標的タンパク質を検出した。既知の量のＩＧＦ−１ペプチドを用いて作成した標準曲線に基づいて、凍結乾燥したレタスの葉に発現したＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の濃度を２７０μｇ／ｇ乾燥重量と外挿した（図３Ｅ）。同様に、ＣＴＢ標準曲線を使用した場合、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の発現量は、凍結乾燥したレタスＴ０株で３７０μｇ／ｇと推定された（データは示されていない）。発現した治療用タンパク質の濃度を、ＣＴＢまたはＩＧＦ−１に対する抗体を用いたイムノブロット分析により、新鮮な細胞と凍結乾燥した細胞の間で比較した（図３Ｆおよび３Ｇ）。ＣＴＢ−およびＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の発現レベルは、凍結乾燥したサンプルでは、生葉のものと比較して、重量ベースで１０倍程度高かった。
【００９６】
ＣＴＢモノマー間のジスルフィド結合、３０の水素結合、７つの塩橋、およびいくつかの疎水性相互作用によって形成されるＣＴＢの五量体は、ＧＭ１受容体に結合できる（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。ＣＴＢは、ＧＭ１受容体に結合することにより、腸上皮細胞を横切って融合タンパク質を運び、遍在するプロテアーゼｆｕｒｉｎによるＣＴＢからの切断後に、融合タンパク質を循環系に送達できるようにする（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。五量体ＣＴＢ構造の形成を調べるために、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を発現する各レタス（図３Ｈ）およびタバコ（図３Ｉ）植物細胞の生葉および凍結乾燥葉材料を使用してＧＭ１結合ＥＬＩＳＡを実施した。ＣＴＢ融合タンパク質を発現する生および凍結乾燥した細胞の４５０ｎｍの吸光度値はＣＴＢ標準タンパク質（陽性対照）と同じくらい高く、陰性対照では有意なシグナルはあらなかった。これらの結果は、葉緑体で発現したＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１融合体タンパク質が五量体形態で適切に折りたたまれ、凍結乾燥後も五量体構造の完全性を維持できることを示している。タバコ凍結乾燥材料中の五量体ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１構造の存在も、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して確認された（図３Ｊ）。ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の五量体形態のサイズは約１２１．５ｋＤａであるが、より大きなサイズが観察された。これはおそらく五量体構造の二量体である。これは、還元剤の非存在下でのＣＴＢ五量体間の強い相互作用（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）  および／またはＣＴＢ−ＩＧＦ−１の分子間または分子内ジスルフィド結合が原因である可能性がある。最も重要なことは、図３Ｊの単一のタンパク質バンドが、植物細胞内に組み立てられたＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１五量体のみが存在し、顕著な安定性を備えた切断または単量体産物が存在しないことを支持していることである。
【００９７】
トランスプラストミック株におけるＰｒｏ−ＩＧＦ−１の発現レベルは、次世代で有意に増加した（図３Ｋおよび３Ｌ）。ＣＴＢ−およびＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１のレベルは、マーカーの除去や融合タグの種類にかかわらず、Ｔ１株ではＴ０株よりも高く、ＣＴＢ−では平均１５倍、ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１では平均７倍であった。凍結乾燥させたレタス材料のＣＴＢ−およびＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１融合タンパク質は、いずれも常温で１２カ月間安定していた（図３Ｍおよび３Ｎ）。同じバッチの植物粉末を異なる保存時点でウェスタンブロットで調べたところ、ＣＴＢ−の平均値は３７０μｇ／ｇ、ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の平均値は２７０μｇ／ｇであり、選択可能なマーカーの切除にかかわらず、長期保存中の凍結乾燥粉末に発現するＩＧＦ−１のレベル（ＩＧＦ−１  μｇ／ｇ乾燥重量）には、大きな変化は見られなかった。
【００９８】
（葉緑体で発現させたＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１による細胞増殖の促進）
植物由来のＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖効果を評価するために、ＨＯＫ（ヒト口腔ケラチノサイト）、ＧＭＳＣ（ヒト歯肉由来間葉系幹細胞）、ＳＣＣ（ヒト頭頸部扁平上皮癌細胞）、マウス骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３）の４種類のヒトおよびマウス細胞を用いてＭＴＴアッセイを行った。ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１は、凍結乾燥した植物細胞から、ＣＴＢモノマーが接近して五量体ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１構造を形成するときにヒスチジン残基が近接することによって作成されるイミダゾール環のクラスターに結合するニッケルの親和性を使用して精製した。精製した葉緑体由来のタンパク質を、対照としてヒトＩＧＦ−１ペプチドを用いたイムノブロット分析で評価した後（データは示されていない）、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の連続希釈液を異なる口腔細胞タイプの細胞とインキュベートした。葉緑体由来のＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１は、市販のＩＧＦ−１と比較してＨＯＫ（〜１．２倍）、ＧＭＳＣ（〜１．７倍）、マウス骨芽細胞（〜１．７倍）の増殖を促進し（図４Ａ、４Ｂ、４Ｄ）、ＳＣＣでは増殖に対して同様の効果が見られた（図４Ｃ）。
【００９９】
これらの結果から、植物由来のＰｒｏ−ＩＧＦ−１は、口腔内の４種類の細胞すべてにおいて用量依存的に増殖を促進し、成熟したＩＧＦ−１と比較して、ＨＯＫ、ＧＭＳＣ、マウス骨芽細胞でその割合が高いことから、植物の葉緑体で発現したＰｒｏ−ＩＧＦ−１が完全に機能し、市販のＩＧＦ−１製品よりも強力であることがわかった。ＩＧＦ−１が骨芽細胞の分化を促進するかどうかを調べるために、ＭＣ３Ｔ３細胞を、精製したＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を添加したＯＳ培地または添加しないＯＳ培地で５日間処理した後、骨形成マーカー（ＡＬＰ、ＯＳＸ、ＲＵＮＸ２）の遺伝子発現を調べた。予想通り、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を３００ｎｇ／ｍｌで処理すると、ＡＬＰ、ＯＳＸ、およびＲＵＮＸ２の発現が有意に上昇し、ＩＧＦ−１がＯＢの分化を促進することを示すデータが得られた（図４Ｅ）。
【０１００】
（ＩＧＦ−１の経口投与の評価）
ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１およびＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１またはＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１をそれぞれ発現する凍結乾燥タバコおよびレタスの植物細胞をＰＢＳに懸濁し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに強制経口投与した。ＩＧＦ−１のレベルは、給餌後２時間で循環系で有意に増加した（図５Ａ）。増加は２倍から３倍（６７％から２００％）の範囲であり、マーカーフリーレタス由来のＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１およびレタスまたはタバコ由来のＣＴＢＰｒｏ−ＩＧＦ−１では、ＩＧＦ−１が平均１００％増加した。雄と雌の取り込みに差は見られなかった。これらの発見は、ＧＭ１受容体に結合した五量体ＣＴＢ融合タンパク質が受容体を介した経上皮輸送経路を介して上皮バリアを通過したことを示している。また、正に帯電したＰＴＤドメインは、受容体に依存しない液相マイクロピノサイトーシスによって、融合したタンパク質を細胞に運ぶことができる。両方の輸送システムは、ＩＧＦ−１の血液への送達に効果的だった。さらに、強制経口投与の５時間後の腓腹筋（図５Ｂ）およびヒラメ筋（図５Ｃ）におけるＩＧＦ−１の増加の存在は、ＣＴＢおよびＰＴＤが筋肉組織へのＩＧＦ−１の送達のための経粘膜担体として作用することを示している。ＩＧＦ−１は、腓腹筋とヒラメ筋の両方で、摂食後５時間で約２８％増加した（図５Ｂおよび５Ｃ）。
【０１０１】
（ＩＧＦ−１の全身投与は、糖尿病性骨折治癒における骨再生を促進する）
ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１のｉｎ  ｖｉｖｏ骨再生への影響をさらに特徴づけるために、糖尿病（Ｄｉａ）の年齢と性別が一致する野生型（ＣＯＮ）マウスの両方で骨折モデルを作成した。骨折部位の近位約３ｍｍと遠位３ｍｍをカバーするマイクロＣＴ画像は、骨折後６週間で取得された。予想通り、ｍｉｃｒｏＣＴ画像の３Ｄ再構成では、ＣＯＮマウスと比較してＤｉａマウスの骨形成が大幅に減少していることが示された。Ｄｉａマウスは、ＣＯＮマウスと比較して、骨量がはるかに少なく、骨密度が低く、骨折部位に多孔性の線維性骨があった（図６Ａ）。したがって、ＢＶ／ＴＶと骨密度の比率はそれぞれ５４％と３９％減少した。さらに、組織学的分析の結果は、相対的な骨面積が、ＣＯＮマウスと比較してＤｉａマウスで３１％減少したことを示した（図６Ｂ）。骨の体積、密度、および面積は、ＷＴ植物で処理されたＤｉａマウスと比較した場合、ＩＧＦ−１処理後に有意に増加した（図６Ａおよび図６Ｂ）。
【０１０２】
（議論）
植物細胞でのバイオ医薬品の生産は、２０１２年５月にＦＤＡによって承認され（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）、植物を分子農学的応用に使用するという大きな目標の１つが達成された。残念ながら、植物細胞で作られたグルコセレブロシダーゼ（Ｄｅｖｅｓｃｏｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）は、イミグルセラーゼ（ＣＨＯ細胞で作られたもの）やベラグルセラーゼ（ヒト線維肉腫細胞で作られたもの）などの競合品と比較すると、精製、コールドチェーン、注射可能な送達などのコストが高いため、ゴーシェ病患者に期待された費用対効果を提供できなかった（Ｔａｌｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ  ｆｏｒ  Ｇａｕｃｈｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ２０１２）。グルコセレブロシダーゼの経口投与によるコスト削減の試みは、発現レベルが低いため成功しなかった（Ｓｈａａｌｔｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１５）。少量での早期導入によりピーナッツアレルギーが抑制されることが画期的な臨床試験で示され、ＦＤＡの承認がまもなく見込まれている（Ｔｉｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１８）。この経口投与のアプローチにより、植物細胞抗原と腸管免疫系を利用して、多くの食物や花粉のアレルギーを治療したり、注射されたタンパク質医薬品に対する抗体を抑制したり、機能性タンパク質を送達したりすることが可能になった。
【０１０３】
同様に、植物の葉緑体システムは、高レベルの発現や経口投与の容易さなど、さまざまな利点を持つ治療用タンパク質を提供するために進歩している。ただし、トランスプラストミック株での抗生物質耐性遺伝子の保持は、規制当局の承認プロセスに障害をもたらす可能性がある。以前の研究では、６００ｂｐを超えるダイレクトＤＮＡリピートがタバコ葉緑体ゲノムの相同性に基づくマーカー切除を促進することが示されている（Ｉａｍｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。我々は、さらに最近では、食品／飼料用酵素を発現するマーカーフリーのトランスプラストミックレタスを初めて応用したことを実証した（Ｄａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１９  ａｎｄ  Ｋｕｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１９）。そこで、Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を作るために、我々は２つのａｔｐＢプロモーター領域の６４９ｂｐを使って、レタスの葉緑体ゲノムからマーカーの切除を開始した。興味深いことに、第１ラウンドの選択でもａａｄＡ遺伝子の切除に成功した。これは、８００を超える配列決定された葉緑体ゲノムに見られる同一の逆方向反復領域（スペーサー領域を含む）を維持するコピー補正メカニズムが原因である可能性がある（Ｄａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。レタスの初期選択プロセスでａａｄＡ遺伝子が切除されない場合、抗生物質含有培地で種子を発芽させることによる次世代でのａａｄＡ遺伝子の除去は非常に困難である。
【０１０４】
これらの結果から、マーカーフリーのトランスプラストミック食用植物の作製は効率的であり、追加の形質転換ステップを必要とせず、短時間の簡便な方法で選択可能なマーカー遺伝子を正確に除去できることが示唆された。さらに、抗生物質耐性遺伝子の切除は、トランスプラストミック作物の代謝負荷を低減するだけでなく、同じ選択マーカーをその後の追加遺伝子の形質転換に再利用することも可能にする。
【０１０５】
以前の研究は、ｅ−ペプチドの潜在的な生物学的役割を示唆した。Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１およびＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１は、骨格筋組織において成熟ＩＧＦ−１よりも優勢であり、この比率は、Ｉｇｆ１遺伝子のウイルス過剰発現後も維持されていた。若いマウスにＩＧＦ−１を過剰発現させても筋肥大が改善されないことや、Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１をウイルスで過剰発現させるとカスケードタンパク質のリン酸化が増加することから、筋肉量に対するｅ−ペプチドの必要性が提唱された（Ｐｈｉｌｉｐｐｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。さらに、独立したｅ−ペプチドは、様々なヒトの細胞や細胞株において、ＩＧＦ−１Ｒシグナルを刺激し、細胞の増殖や分化を制御している（Ｐｈｉｌｉｐｐｏｕ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１４）。したがって、本研究で作成したトランスプラストミック株にＰｒｏ−ＩＧＦ−１を発現するｅ−ペプチドが保持されていれば、ＩＧＦ−１治療の効果が高まると考えられる。
【０１０６】
ＩＧＦ−１は、複数の筋肉疾患の治療薬候補として使用されている。
主に肝臓で産生される循環型ＩＧＦ−１は、筋肥大を改善するのに十分ではないため、効果を得るためには筋組織への導入が必要となる。血清中のＩＧＦ−１レベルが上昇すると、筋肉組織へのトランスローカリゼーションにより筋肉量の増加が見られたことから、循環系のＩＧＦ−１レベルを高めることは適切な戦略である（Ｐｈｉｌｉｐｐｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。タグ無しのＩＧＦ−１を経口投与した場合、血清中のＩＧＦ−１はほとんど、あるいは全く検出されないことが確立されているため、臨床試験ではＩＧＦ−１を注射で投与している。１日あたり３．４ｍｇ／ｋｇのＩＧＦ−１を４日間摂取させた豚の血清には、検出可能なＩＧＦ−１は見られなかった（Ｂｕｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。組換えＩＧＦ−１は、栄養不良の持続的携帯型腹膜透析（ＣＡＰＤ）患者への１２時間ごとの注射の２０日間で、ヒトの血清レベルが約１００％増加した（Ｆｏｕｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。
【０１０７】
一方、本研究では、マウスにＰｒｏ−ＩＧＦ−１を経口投与したところ、１回の経口投与で、２時間後には血中のＩＧＦ−１濃度が１００％上昇し、５時間後には局所の筋肉組織で２８％の上昇が認められた。ＩＧＦ−１の血中半減期が１２時間であることから、患者に必要とされる毎日の注射よりも経口投与が望ましい。これらの結果から、葉緑体由来のＰｒｏ−ＩＧＦ−１は、その機能的特性を維持したまま、腸管上皮細胞からの吸収と筋肉組織への導入による経口投与の容易さを実現し、筋肉疾患の治療に有効なアプローチとなることが期待される。
【０１０８】
ＩＧＦ−１シグナル伝達経路は、ＩＧＦ−１が結合するとＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）がリン酸化されることで開始される。ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔおよびＭＥＫ／Ｅｒｋ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ，  ＭＡＰＫ）シグナル経路が関与しており、衛星細胞や筋芽細胞におけるＩＧＦ−１の増殖促進効果を高めることで、筋肉の増殖につながることが示された（Ｂｉｋｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）。  我々の研究では、市販のＩＧＦ−１とＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１にさらされた扁平上皮癌細胞の増殖に差は見られなかったが、これはＩＧＦ−１Ｒの数が非常に多く（Ｒｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１５）、それによって細胞表面上のＣＴＢ−ＧＭ１の結合と効果的に競合しているためと考えられる。ＩＧＦ−１とその受容体との相互作用が細胞増殖を引き起こす別の経路には、受容体を介したエンドサイトーシスが関与している。現在のところ、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合し、ＩＧＦ−１Ｒが内在化することで、ＳＨｃ／ＭＡＰＫ経路が制御されることが示唆されている。本研究では、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１に反応して、ヒト口腔ケラチノサイト（ＨＯＫ）、ヒト歯肉由来間葉系細胞（ＧＭＳＣ）、マウス骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３）の増殖が、市販のＩＧＦ−１に比べて増加したことを確認した。これは、細胞表面でのＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒの相互作用に加えて、ＧＭ１受容体に結合したＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の内在化による複数の経路の活性化によるものと考えられる。あるいは、市販のＩＧＦ−１製剤には、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１に含まれる、ＩＧＦ−１のシグナル伝達経路を強化する可能性のあるｅ−ペプチドが含まれていない（Ｐｈｉｌｉｐｐｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。ＩＧＦ−１は、軟骨形成細胞や骨形成細胞の増殖・分化による骨の増殖など、複数の増殖シグナル経路に関与している（Ｂｉｋｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。その結果、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１は骨芽細胞の増殖を促進するだけでなく、ＡＬＰ、ＯＳＸ、ＲＵＮＸ２などの骨芽細胞マーカー遺伝子の発現を有意に増加させることがわかり、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の骨形成に対する有効性が示された。本研究では、骨芽細胞の増殖により骨形成・再生が促進されること、移植したＧＭＳＣにより障害のある歯周組織の再生や骨芽細胞への分化が見られること、ケラチノサイトの形成・分化を制御するケラチノサイト増殖因子によりヒト口腔上皮の増殖が促進されることなど、既存のエビデンスに基づいて、葉緑体由来Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の歯科治療への応用を進めている。最近の臨床試験では、組換えヒト線維芽細胞（ＦＧＦ）−２とテリパラチド（副甲状腺１−３４（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  １−３４））をオープンフラップデブリードメント手術によって歯周病部に投与したところ、骨形成が認められた（Ｒｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。しかし、このような有望な技術が登場したにもかかわらず、歯科医療において治療用タンパク質を投与するためには、外科手術が必要である。葉緑体システムは、患者のコンプライアンスを向上させ、手頃な価格で提供するための新しい歯周病治療薬のプラットフォームを提供する。
【０１０９】
骨折の修復は非常に複雑でダイナミックな生理学的プロセスであり、炎症、骨のカルス形成、骨のリモデリングといった特徴的な段階を経る（Ｍａｒｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。ＴＧＦ−β、ＢＭＰ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦなどのいくつかの生物学的増殖因子は、細胞の増殖、遊走、分化、その他の細胞プロセスを調節することにより、骨治癒のプロセスに影響を与えることが示されている（Ｄｅｖｅｓｃｏｖｉら、２００８）。これらの増殖因子の中で、ＩＧＦ−１は骨折治癒における骨再生にも強い影響を示す。ＩＧＦ−１の局所投与と全身投与の両方により、骨治癒の改善と迅速な臨床的改善がもたらされる（Ｇｏｖｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｓｃｈｍｉｄｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  ａｎｄ  Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。糖尿病状態の骨再生に対する経口送達されたＩＧＦ−１の効果をｉｎ  ｖｉｖｏで調べるために、本研究では糖尿病性骨折治癒モデルを適用した。内因性ＩＧＦ−１レベルは正常であったため、非糖尿病マウスではＩＧＦ−１治療後の骨折治癒への有意な影響は観察されなかった。非常に興味深いことに、病的な糖尿病の状態で、骨の再生が低下している場合、ＩＧＦ−１は糖尿病によって引き起こされた骨の再生不良を回復させることができる。その結果、ＷＴ植物を投与した糖尿病マウスと比較して、ＩＧＦ−１投与後に骨の体積、密度、面積が有意に増加することがわかった。本研究では、ＩＧＦ−１を投与した糖尿病マウスとしなかった糖尿病マウスの間で、血糖値に差がないことは注目に値する。このことから、骨形成の改善は、糖尿病の改善によるものではなく、骨への影響によるものであることがわかった。糖尿病による骨格障害のメカニズムはまだ完全には解明されていない。軟骨細胞のアポトーシスの不均衡、軟骨の早期除去、骨芽細胞の分化と機能の低下、血管新生の変化など、一連の分子および細胞の変化を伴う。糖尿病骨におけるＩＧＦ−１治療のメカニズムを解明するためには、さらなる研究が必要である。
【０１１０】
さらに、ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１摂食マウスとＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１摂食マウスの血清および筋肉中のＩＧＦ−１の増加を比較し、受容体を介さない送達と受容体を介した送達の効率を区別した。ＰＴＤ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１とＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を摂取したマウスでは、筋肉組織中のＩＧＦ−１が約２８％増加していた。受容体を介したＣＴＢによるあらゆる種類の細胞への薬物の輸送とは対照的に、ＰＴＤはマクロピノサイトーシスを刺激することで細胞膜を貫通し、免疫調整細胞には入らない（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１６）。ＰＴＤを使用してＰｒｏ−ＩＧＦ１を筋肉組織に送達できることは、血友病やその他の疾患におけるいくつかの注射されたタンパク質薬剤でしばしば課題となる、抗体の発生を防止するためのドラッグデリバリーにおいて、ユニークな利点を提示する（Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７  ａｎｄ  Ｄａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。
【０１１１】
結論として、本研究は、植物の葉緑体で発現し、植物の細胞壁によってバイオカプセル化されたＰｒｏ−ＩＧＦ−１が、完全に機能する形で経口投与可能であることを示している。凍結乾燥された植物細胞は、数ヶ月間室温で保存しても機能的な有効性を失わないため、歯科医療におけるタンパク質医薬品の外科的投与とは対照的に、手頃な価格で患者のコンプライアンスを向上させることができる。形質転換されたレタスの葉緑体のゲノムから抗生物質耐性遺伝子を正確に切り出し、現在の臨床製品にはないＩＧＦ１の機能を高めるためのｅ−ペプチドを含み、繰り返し経口投与が可能であることから、様々な遺伝的筋肉疾患、急性萎縮、怪我、骨折などに苦しむ患者に大きな改善をもたらす。
【０１１２】
実施例２
（抗生物質フリー、経口摂取用バイオ医薬品タンパク質の発現と精製）
実施例１は、抗生物質を使用しない高等植物のプラスチドで、ＩＧＦ−１の生産に例示されるようなバイオ医薬品を生産するためのパラダイムを提供する。図７Ａは、本発明に従ってマーカーを含まないバイオ医薬品を製造するために使用される分子クローニング戦略の簡単な概略図を提供する。図７Ｂは、最終的なクローニングベクターの概略図を提供する。図７Ｃは、実施例に記載された６４９ｂｐリピートの配列を提供する。抗生物質で選択可能なマーカー除去プロセスには、ｒｂｃＬプロモーターの一部を削除し、ｐＬＳ−ＭＦベクター内のａｔｐＢの方向を反転させるステップが含まれる。実施例１で説明したように、ｐＬＳ−ＭＦ−ｐｔｘＤベクターには、ａｔｐＢ配列を削除するための固有のＰｆｏＩ／ＳｔｕＩおよびＰｖｕＩＩ／ＮｄｅＩサイトが含まれ、プロモーター領域を欠く短い（＜５０）ｒｂｃＬに置き換えられた。一部の実験では６４９ｂｐ配列リピート（配列番号１６、図７Ｃ）を使用したが、この配列は特定のプロモーターエレメントを削除するように変更された。ネイティブａｔｐＢリピート配列（６４９ｂｐ）は、反対方向にｒｂｃＬおよびａｔｐＢプロモーター領域を含み、トランスジーンカセットが転写活性スペーサー領域に導入されるとアンチセンスＲＮＡを生成することにより、遺伝子発現を破壊する。ただし、トランスジーン発現レベルは転写的にサイレントなスペーサー領域よりも高いため、このようなスペーサー領域が好ましい（Ｊｉｎ  ａｎｄ  Ｄａｎｉｅｌｌ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１５；  Ｄａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１６）。したがって、マーカーフリー発現カセットの異なるバージョンで一方または両方のプロモーター領域が削除された。
【０１１３】
抗生物質レタス植物におけるＩＧＦ−１の成功した発現は、以下の表にリストされているものを含むがこれらに限定されない、さまざまなバイオ医薬品タンパク質の発現を可能にする。
【表１】
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【０１１４】
特定の態様では、ＩＧＦ−１療法を必要とする対象の治療のための方法も提供されている。例示的な方法は、抗生物質を含まないレタス植物、またはＩＧＦ１機能を高めるＰＴＤペプチドとｅペプチドに作動可能に連結されたＩＧＦ−１タンパク質を含むレタス植物製品の有効量を経口投与することを含み、前記投与は、遺伝的な筋肉疾患、急性萎縮、傷害または骨損失の症状を緩和または改善するのに有効である。本明細書ではＩＧＦ−１を例示しているが、本明細書に記載されているマーカーフリー植物では、上記のタンパク質のいずれも発現させることができる。そのような植物や植物製品は、糖尿病、凝固障害、先天性代謝異常などの治療にさまざまな有用性を発揮するであろう。
【０１１５】
参考文献
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2021534754.tif 000004
2021534754.tif 000005
【０１１６】
以上、本発明の好ましい実施形態の一部を説明し、具体的に例示してきたが、本発明がこのような実施形態に限定されることを意図しているわけではない。以下の特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲と精神から逸脱することなく、これに様々な変更を加えることができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2021534754.tif 000007
【図１Ｃ】
2021534754.tif 000008
【図１Ｄ】
2021534754.tif 000009
【図１Ｅ】
2021534754.tif 000010
【図１Ｆ】
2021534754.tif 000011
【図１Ｇ−１】
2021534754.tif 000012
【図１Ｇ−２】
2021534754.tif 000013
【図２Ａ】
2021534754.tif 000014
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2021534754.tif 000016
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
2021534754.tif 000020
【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
2021534754.tif 000034
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
2021534754.tif 000038
【図６Ｂ】
2021534754.tif 000039
【図７Ａ−１】
2021534754.tif 000040
【図７Ａ−２】
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【図７Ｂ】
2021534754.tif 000042
【図７Ｃ】
2021534754.tif 000043
【図８−１】
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【図８−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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