(57)【要約】１つまたは複数の微量栄養素、例えば鉄補給剤、例えば硫酸鉄、脂溶性または油溶性ビタミン、例えばビタミンＡ、ＤおよびＥ、水溶性ビタミン、例えばビタミンＢファミリー、ならびに他の微量栄養素を含有する微粒子製剤を開発した。これらの製剤は、処理、保存および調理中の酸化および生物活性の喪失に抵抗する。粒子は、１つまたは複数の腸溶ポリマー、例えばｐＨ感受性ポリマーを含む。酸化を防止するために、鉄補給剤は、好ましくは１：４〜１：１０の間の鉄：ＨＡの比で、ポリマー、例えばヒアルロン酸（「ＨＡ」）によってカプセル化され、またはビタミンＣなどの化合物と混合される。次に、得られた混合物は、腸溶ポリマーの溶液に分散され、噴霧乾燥またはスピニングディスク微粒化などの技術を使用して、粒子に製造される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面上の湿気および空気に対する腸溶ポリマーバリアを含む粒子であって、前記粒子において、デンプンまたはヒアルロン酸を含む不活性マトリクス内に脂溶性微量栄養素および水溶性微量栄養素が同時カプセル化されている、粒子。
【請求項２】
有機溶媒中の前記脂溶性微量栄養素の乳化および水性溶媒中の前記水溶性微量栄養素の乳化によって製剤化されている、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
噴霧乾燥またはスピンディスク処理によって形成される、請求項１または２に記載の粒子。
【請求項４】
前記粒子が、鉄微量栄養素を含み、前記腸溶ポリマーバリアが、前記鉄の酸化を防止する、請求項１から３のいずれかに記載の粒子。
【請求項５】
前記微量栄養素が、カプセル化の前またはカプセル化のときに、ヒアルロン酸と混合される、請求項１から４のいずれかに記載の粒子。
【請求項６】
必要に応じて溶媒中の微量栄養素を、デンプン、ヒアルロン酸、シクロデキストリン、コラーゲン、アルギネート、キチン、またはそれらの誘導体に噴霧乾燥またはスピンディスク処理することによって形成される、請求項１から５のいずれかに記載の粒子。
【請求項７】
鉄微量栄養素を含む、請求項１から６のいずれかに記載の粒子。
【請求項８】
ヒアルロン酸と混合された硫酸鉄を、約１：４〜約１：１０の間の鉄：ヒアルロン酸の比で含む、請求項７に記載の粒子。
【請求項９】
前記脂溶性微量栄養素が、ビタミンＡ、ビタミンＥ、およびビタミンＤからなる群より選択される１つまたは複数のビタミンである、請求項１から８のいずれかに記載の粒子。
【請求項１０】
前記水溶性微量栄養素が、ビタミンＣ、Ｂ３、Ｂ７、Ｂ９およびＢ１２、ならびに微量元素、例えば亜鉛およびヨウ素からなる群より選択される、請求項１から９のいずれかに記載の粒子。
【請求項１１】
前記水溶性微量栄養素が、親水性または両親媒性ポリマー、例えばヒアルロン酸またはゼラチンによって形成された第１のマトリクス内にカプセル化され、次に、腸溶ポリマーによって形成された第２のマトリクスによってさらにコーティングまたはカプセル化される、請求項１から１０のいずれかに記載の粒子。
【請求項１２】
前記微量栄養素が、前記粒子の凝集および変形を防止するデンプン粉末などの粉末に、噴霧乾燥またはスピニングディスク微粒化などのマイクロカプセル化技術を使用してカプセル化される、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１３】
製剤が、１００℃で１時間まで、または４０℃で湿度７５％において少なくとも６０日間安定である、請求項１から１２のいずれかに記載の粒子。
【請求項１４】
１ミクロン〜１ミリメートルの間、好ましくは約１５０ミクロンの直径を有する、請求項１から１３のいずれかに記載の粒子。
【請求項１５】
ｐＨ感受性ポリマーが、約１〜５、好ましくは約１〜３、より好ましくは約１〜２のｐＨで溶解する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１６】
前記ｐＨ感受性ポリマーが、約５〜８、好ましくは約５〜７、より好ましくは約５〜６のｐＨで溶解する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１７】
前記ｐＨ感受性ポリマーが、ポリメタクリレートである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１８】
有効量の請求項１から１７のいずれか一項に記載の製剤を、それを必要とする個体に提供するステップを含む、鉄および／または他の微量栄養素を提供する方法。
【請求項１９】
必要に応じて塩と混合されたか、または塩でコーティングされた前記製剤が、食品と混合される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記製剤が、農業用動物にバルク形態で提供される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から１７のいずれかに記載の粒子を作製するための方法であって、
抗酸化ポリマー、例えばヒアルロン酸および／または１つもしくは複数の脂溶性ビタミンと混合された鉄補給剤の粒子を提供するステップと、
鉄混合物またはビタミンを、ｐＨ感受性腸溶ポリマーに分散させるステップと、
噴霧乾燥またはスピンディスク処理によって粒子を形成するステップと
を含み、
前記粒子が脂溶性ビタミンを含有する場合、前記粒子が、デンプンまたは他の非凝集性ポリマー粉末に噴霧されて、粉末コーティングが形成される、方法。
【請求項２２】
水溶性微量栄養素および脂溶性微量栄養素を、腸溶ポリマーバリアでコーティングされた請求項１から１７のいずれかに記載の粒子内に同時カプセル化する方法であって、
前記水溶性微量栄養素を、水性溶媒に溶解および／または分散させて、必要に応じてデンプン、ヒアルロン酸、シクロデキストリン、コラーゲン、アルギネート、キチン、またはそれらの誘導体を含む水溶性微量栄養素溶液を形成するステップと、
前記微量栄養素を前記水性溶媒に溶解もしくは分散させるとき、またはその後に、油を添加するステップと、
前記脂溶性微量栄養素を、有機溶媒および／または油および腸溶ポリマーに溶解および／または分散させて、脂溶性微量栄養素ポリマー溶液を形成するステップと、
前記水溶性微量栄養素溶液を、前記脂溶性微量栄養素ポリマーで乳化するステップと、
噴霧乾燥、スピンディスク処理または溶媒除去などの方法を使用して、前記溶媒を除去するステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、Ａａｒｏｎ  Ａｎｓｅｌｍｏ、Ｘｉａｎ  Ｘｕ、Ｗｅｎ  Ｔａｎｇ、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓ．  ＬａｎｇｅｒおよびＡｎａ  Ｊａｋｌｅｎｅｃによる２０１８年１月４日出願の米国仮出願第６２／６１３，４８５号「ＳＴＡＢＬＥ  ＶＩＴＡＭＩＮ  Ａ  ＡＮＤ  ＩＲＯＮ  ＳＵＰＰＬＥＭＥＮＴＡＬ  ＰＡＲＴＩＣＬＥＳ」の利益を主張するものであり、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、熱的に安定な微粒子微量栄養素製剤の分野にあり、特に、噴霧乾燥させたビタミンおよび鉄微粒子微量栄養素製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
栄養障害／微量栄養素（ＭＮ）欠乏は、発展途上国世界において深刻な問題であり、ほぼ２０億人に影響を及ぼしており、毎年２百万人もの小児の死亡を引き起こしている。発展途上国世界では、ＭＮ欠乏は、個人の様々な疾病および能力障害と関連し、ひいては、地域の集団的社会経済発展に劇的に影響を与えている。
【０００４】
微量栄養素欠乏に対処する試みには、補給および強化が含まれる。補給によって、短期間でより高用量の微量栄養素を特定の個体に提供することができる。しかし、補給には、必要な微量栄養素のすべてを送達できないこと、標的とされていない群の個体が見過ごされること、ならびに制御の効かない条件下（高温多湿の倉庫、ずさんな記録管理）での生成物保存の困難に起因してコンプライアンスが低いこと、補給剤の流通および定期的な摂取が必要な最終使用者の説得が困難であることを含めた制限がある。
【０００５】
ＭＮ欠乏に対処するために、２２種までのＭＮを含むように製剤化されたＭＮ粉末および脂質ベースの栄養補給剤（ＬＮＳ）を使用する家庭強化手法が、６〜２４カ月齢の小児を標的にして使用されてきた。家庭強化プログラムは、ＭＮ状態を改善し、貧血を低減するための有効な介入手法となり得ることが、数々の研究によって示されてきた。
【０００６】
しかし、大半の非侵襲的な経口送達手法は、感覚および吸収の問題を有するという欠点があるため、広範な強化は、大きな科学技術的課題となっている。例えば、これらの強化手法は、これらの生成物の最終用途、例えば調理中のＭＮの分解、保存中のＭＮの分解、または感覚的に検出可能なレベルのＭＮおよび／もしくはカプセル化材料の添加によって生じる味の問題を考慮しておらず、または対処していない。科学技術的課題とは独立に、これらのプログラムは、社会的および経済的制約、例えば補償が限られていること、遵守の問題、および技術採用を妨げる文化的問題によって、さらに制限される。したがって、使用者の最終用途および供給者による合成の両方に関する強化の問題を軽減することができる技術は、世界的に強化プログラムを改善することができる。
【０００７】
塩は、普遍的に消費される生成物であり、したがって、発展途上国の人々にビタミンおよびミネラルを届けられる潜在可能性を有する。ヨード添加塩としても公知の強化塩は、ヨウ素欠乏を防止するために微量の様々なヨウ化物塩と混合された食卓塩（ＮａＣｌ）である。鉄およびヨウ化物を含有する食卓塩である二重強化塩も、開発された。鉄は、塩においてヨウ素と反応しないように、ステアリンでマイクロカプセル化される。しかし、鉄をヨード添加塩に添加することは、空気の存在下での鉄の酸化傾向を含むいくつかの化学的、技術的および感覚受容的問題によって、複雑化している。
【０００８】
脂溶性ビタミン、例えばビタミンＡ、ＤおよびＥは、これらの条件下で保存し、流通させるには特に問題がある。それらのビタミンは、典型的に、数日以内に生物活性の喪失を示し、凝集を引き起こす分子の油性性質に起因して製剤化が困難である。
【０００９】
他には、ポリマーおよび食品添加物、例えばポリ（メタ）アクリレートへのカプセル化が試みられたが、成功していない。例えば、”Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＥＰＯ  ｉｓ  ｕｎｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｉｒｏｎ  ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ａｓ  ｅｖｅｎ  ｌｏｗ  ｐａｙｌｏａｄｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ  ｓｏｌｉｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．”  Ｄｕｅｉｋ，  Ｖ．  ａｎｄ  Ｄｉｏｓａｄｙ，  Ｌ．  Ｌ．  （２０１６），  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊｆｐｅ．１２３７６を参照されたい。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、鉄、油溶性もしくは脂溶性ビタミン、例えばビタミンＡ、ＤおよびＥ、水溶性ビタミン、例えばビタミンＢ、ならびに／または他の微量栄養素を含有する、微量栄養素含有組成物、ならびにそれを作製し、使用する方法を提供することである。微量栄養素を含有する組成物は、処理および保存中に安定である。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、食品の調製および調理中に安定であり、胃腸管の所望の部位で微量栄養素を放出する組成物、ならびにそれを作製し、使用する方法を提供することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｄｕｅｉｋ，  Ｖ．  ａｎｄ  Ｄｉｏｓａｄｙ，  Ｌ．  Ｌ．  （２０１６），  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊｆｐｅ．１２３７６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
広範な微量栄養素（「ＭＮ」）強化に関連する科学技術的（例えば、調理安定性、保存安定性、感覚的検出）および社会経済的（例えば、履行、遵守）課題に対処するために、保存および調理条件中の様々な水溶性および脂溶性ＭＮの安定性を増強するＭＮ送達技術を開発した。この技術は、水溶性および脂溶性微量栄養素の両方を含む複数の異なるＭＮをカプセル化し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方の胃の酸性条件でＭＮペイロードの急速な放出を容易にすることができる、ｐＨ応答性微粒子送達系である。この技術を臨床試験で使用して、生体利用可能な鉄をヒトに送達することに成功した。さらに、商業的に利用可能な／商業規模の装置を使用する、この送達系の規模拡張合成（ｓｃａｌｅｄ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）のための方法も開発した。
【００１４】
鉄補給剤、例えば硫酸鉄、脂溶性もしくは油溶性ビタミン、例えばビタミンＡ、ＤおよびＥ、ならびに／または水溶性ビタミン、例えばビタミンＢを含有する微粒子製剤を開発した。これらは、処理中の酸化および生物活性の喪失に抵抗し、湿気および調理温度に対して抵抗性がある。その粒子は、腸溶ポリマー、例えば規定されたｐＨ範囲で分解または溶解してカプセル化微量栄養素を放出するｐＨ感受性ポリマーを含む。好ましいｐＨ感受性ポリマーは、胃内に見出される通りの低ｐＨ、例えばｐＨ１〜３、好ましくは１〜２で溶解または分解する。
【００１５】
酸化を防止するために、鉄補給剤または鉄補給剤を含有する鉄粒子は、好ましくは１：４〜１：１０の間の鉄：ＨＡの比で、保護ポリマー、例えばヒアルロン酸（「ＨＡ」）によってカプセル化され、またはビタミンＣなどの保護化合物と混合される。次に、得られた混合物を、腸溶ポリマー、例えばＢＡＳＦによってＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）として販売されているポリ（メタ）アクリレート、好ましくはＥＰＯの溶液に分散させ、噴霧乾燥またはスピニングディスク微粒化などの技術を使用して、典型的に直径１ミクロン〜１ｍｍの間、好ましくは直径約１５０ミクロンの粒径を有する粒子に製造する。最終製剤の典型的な範囲は、Ｆｅ：０．５〜３．２％、ＨＡ：２．５〜３２％、およびＥＰＯ：９７〜６４．８％である。
【００１６】
１つまたは複数の脂溶性ビタミン、例えばビタミンＡ、ＤおよびビタミンＥを含有する安定な粒子を作製するために、ビタミンを腸溶ポリマーの溶液に溶解または分散させ、次に、粒子の凝集および変形を防止する粉末、例えばデンプン粉末への噴霧乾燥またはスピニングディスク微粒化などの技術を使用して、粒子に製造する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａは、水溶性ＭＮ−ＭＰを合成するための２ステップ乳化プロセスの概略図である。図１Ｂは、脂溶性ＭＮ−ＭＰを合成するための１ステップ乳化プロセスの概略図である。
【００１８】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｋは、１１種の個々にカプセル化された異なる微量栄養素の、室温の水（丸）、１００℃の沸騰水（四角）、および３７℃の模擬胃液（「ＳＧＦ」）（三角）中でのＥＰＯ−ＭＰからの累積放出のグラフである。図２Ａ：ビタミンＡ、図２Ｂ：ビタミンＤ、図２Ｃ：ビタミンＢ２、図２Ｄ：ビタミンＣ、図２Ｅ：亜鉛（ＺｎＳＯ４）、図２Ｆ：ヨウ素（ＫＩＯ３）、図２Ｇ：ビタミンＢ７（ビオチン）、図２Ｈ：ビタミンＢ３（ナイアシン）、図２Ｉ：ビタミンＢ９（葉酸）、図２Ｊ：ビタミンＢ１２、図２Ｋ：鉄（ＦｅＳＯ４）。エラーバーはＳＤを表す（ｎ＝３）。
【図２Ｂ−２Ｄ】同上。
【図２Ｅ−２Ｇ】同上。
【図２Ｈ−２Ｊ】同上。
【図２Ｋ】同上。
【００１９】
【図３】図３は、ビタミンＢ１２の、ＳＧＦ（四角）、ｐＨ２のＨＣｌ溶液（丸）、およびｐＨ３のＨＣｌ溶液（三角）中でのＨＡ−ＥＰＯのＭＰからの累積放出のグラフである。エラーバーはＳＤを表す（ｎ＝３）。
【００２０】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、非カプセル化（遊離）微量栄養素に対する個々にカプセル化した微量栄養素の、（Ａ）沸騰水および（Ｂ）光に曝露した後の回収率（回収％）を示すグラフである。図４Ｃは、非カプセル化（遊離）鉄に対する実験室規模のＦｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰの、バナナミルク中に存在する鉄とポリフェノールの化学反応の指標である変色の時間履歴（ΔＥ）を示す棒グラフである。図４Ｄは、非カプセル化（遊離）鉄に対するカプセル化（Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ）の、沸騰水に２時間曝露した後の回収率（回収％）を示す棒グラフである。図４Ｅは、カプセル化（Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ）鉄の、焼成後の回収率（回収％）を示す棒グラフである。エラーバーはＳＤを表す（ｎ＝３）。「＊」記号は、スチューデントｔ検定によって決定される通り、統計的有意性（ｐ＜０．０５）を示す。
【図４Ｃ−４Ｄ】同上。
【図４Ｅ】同上。
【００２１】
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ〜５Ｈは、単一製剤における脂溶性および水溶性微量栄養素の同時カプセル化に関する。図５Ａは、同時カプセル化された水溶性ビタミンＢ９およびビタミンＢ１２、ならびに脂溶性ビタミンＡおよびビタミンＤ微量栄養素を微粒子に合成するための乳化プロセスの概略図である。  図５Ｂ〜５Ｄは、ビタミンＢ１２（丸）、Ｂ９（四角）、Ａ（三角）およびＤ（逆三角）の、３７℃の模擬胃液（図５Ｂ）、室温の水（図５Ｃ）、および沸騰水（図５Ｄ）中での累積放出パーセントのグラフである。  図５Ｅ〜５Ｇは、光に曝露した後のカプセル化および非カプセル化脂溶性ＭＮ（図５Ｅ）、水中で２時間沸騰させた脂溶性ＭＮ（図５Ｆ）、水中で２時間沸騰させた水溶性ＭＮ（図５Ｇ）についてＨＰＬＣによって決定される通り、微量栄養素の回収パーセントの棒グラフである。図５Ｈは、水中で２時間沸騰させた後の脂溶性および水溶性の同時カプセル化ＭＮの両方について生物学的アッセイによって決定される通り、微量栄養素の回収パーセントの棒グラフである。エラーバーはＳＤを表す（ｎ＝３）。
【図５Ｃ−５Ｅ】同上。
【図５Ｆ−５Ｇ】同上。
【図５Ｈ】同上。
【００２２】
【図６Ａ】図６Ａは、胃内のカプセル化色素、胃内の放出色素、腸内のカプセル化色素、および腸内の放出色素の定量的分析を示す棒グラフである。エラーバーはＳＤを表す（ｎ＝３）。図６Ｂは、遊離ビタミンＡ（「遊離ＶｉｔＡ」、丸）またはビタミンＡ負荷ＥＰＯのＭＰ（「ＶｉｔＡ−ＢＭＣ」、四角）の経口胃管栄養後６時間にわたる、放射標識ビタミンＡの血中含量（胃管栄養用量の％）を示すグラフである。エラーバーはＳＥＭを表す（ｎ＝６）。
【図６Ｂ】同上。
【００２３】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ヒトにおける微粒子カプセル化鉄の吸収を実証する。図７Ａは、未調理非カプセル化鉄（三角）および未調理鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰ（丸）を比較する、相対的な鉄吸収のグラフである。図７Ｂは、未調理鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰ（丸）および調理済み鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰ（四角）を比較する、相対的な鉄吸収を示すグラフである。値は、幾何平均＋／−ＳＤを表す（ｎ＝２０）。＊は、事後対応スチューデントｔ検定によってボンフェローニ補正を用いて決定される通り、統計的有意性を示す。
【００２４】
【図８Ａ−８Ｃ】図８Ａ〜８Ｅは、プロセス展開および規模拡大（ｓｃａｌｅ−ｕｐ）生成に関する。図８Ａは、Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ１ｋｇの規模拡張合成のためのプロセスを示す概略図である。図８Ｂは、３７℃のＳＧＦ、ｐＨ１．５（三角）、室温の水（丸）、および沸騰水（四角）における、規模拡張（ｓｃａｌｅｄ）Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰからの鉄放出を示すグラフである。図８Ｃは、３７℃のＳＧＦ、ｐＨ１．５（三角）、室温の水（丸）、および沸騰水（四角）における、３．１９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ（「３．１９％Ｆｅ−ＨＡ−ＢＭＣ−ＭＰ」）からの鉄放出を示すグラフである。図８Ｄは、３７℃のＳＧＦ、ｐＨ１．５（三角）、室温の水（丸）、および沸騰水（四角）における、１８．２９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ（「１８．２９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ」）からの鉄放出を示すグラフである。図８Ｅは、６０ｐｐｍのＦｅのＦｅＳＯ４およびＦｅＰＰ（ピロリン酸鉄）と比較した、食品マトリクス（バナナミルク）における規模拡張Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰおよびそれらの個々の構成要素の感覚的性能を示すグラフである。「ＢＭＣ」は、ＥＰＯを指す。絶対的変色ΔＥ±ＳＤを、非強化マトリクスに対して１２０分目に得る。水平線は、それ未満ではΔＥが検出できない閾値を表す。
【図８Ｄ−８Ｅ】同上。
【００２５】
【図９Ａ−９Ｃ】図９Ａは、３７℃のＳＧＦ、ｐＨ１．５（三角）、室温の水（丸）、および沸騰水（四角）における、デンプンへのスピニングディスク微粒化によって製造されたビタミン負荷ＥＰＯのＭＰ（「ＶｉｔＡ−ＥＰＯ−デンプン」）からビタミンＡの放出を示すグラフである。図９Ｂは、ＶｉｔＡ−ＥＰＯ−デンプンのＭＰにカプセル化したビタミンＡまたは遊離ビタミンＡの、水中で２時間沸騰させた後の回収パーセントを比較する棒グラフである。図９Ｃ〜９Ｇは、（１）４０℃、湿度７５（図９Ｃ）、（２）室温で太陽光に曝露（図９Ｄ）、（３）室温の水に懸濁（図９Ｅ）、（４）４℃の水に懸濁（図９Ｆ）、および（５）１５℃、湿度７５％（図９Ｇ）を含む異なる条件下での、４つの異なる製剤からのビタミンＡの回収パーセントを示す棒グラフである。４つの製剤は、実験室規模のビタミンＡ負荷ＥＰＯのＭＰ（「ＶｉｔＡ−ＥＰＯ」、丸）、商業的に利用可能なビタミンＡ製剤（「ＢＡＳＦ  ２５０」、四角）、および規模拡大したビタミンＡ負荷ＥＰＯのＭＰ（「ＶｉｔＡ−ＥＰＯ−デンプン」、三角形）、および遊離ビタミンＡ（逆三角）である。
【図９Ｄ−９Ｆ】同上。
【図９Ｇ】同上。
【００２６】
【図１０】図１０は、押出しによってビタミンＡ負荷ＥＰＯ粉末を製造するワークフローを示す概略図である。
【００２７】
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａは、ヒトにおける高負荷のＦｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰからの鉄のバイオアベイラビリティを示す。ＦｅＳＯ４（丸）としての遊離鉄、３．１９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ（四角）、および１８．２９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ（三角）の摂取後の、若年女性（ｎ＝２４）における赤血球鉄取り込みによって評価される通りの鉄バイオアベイラビリティ。「ＢＭＣ」は、ＥＰＯを指す。値は、摂取した鉄の総量のパーセンテージとして表される。バーは、幾何平均（ｎ＝２４）および９５％信頼区間を表す。＊（ｐ＜０．０５）または＊＊（ｐ＜０．０１）。線形混合モデル、ランダム切片（ｒａｎｄｏｍ  ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）としての参加者、反復固定因子（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｆｉｘｅｄ  ｆａｃｔｏｒ）としての食事、およびボンフェローニ補正による事後対応比較によって決定した、鉄吸収に対する食事の有意な効果（ｐ＜０．０５）。  図１１Ｂは、ヒトにおける３．１９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰからの、他のＥＰＯのＭＰと併用投与した場合の鉄のバイオアベイラビリティを示す。３．１９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ（丸）、３．１９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰとＶｉｔＡ−ＥＰＯのＭＰ（四角）、および３．１９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰとＶｉｔＡ−ＥＰＯのＭＰおよび遊離葉酸の摂取後の、若年女性（ｎ＝２４）における赤血球鉄取り込みによって評価される通りの鉄バイオアベイラビリティ。「ＢＭＣ」は、ＥＰＯを指す。これらの値は、摂取した鉄の総量のパーセンテージとして表される。バーは、幾何平均（ｎ＝２４）を表す。線形混合モデル、ランダム切片としての参加者、反復固定因子としての食事、およびボンフェローニ補正による事後対応比較によって決定した、鉄吸収に対する食事の有意な効果（ｐ＜０．０５）。  図１１Ｃは、３．１９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰと各ＭＰ構成要素からの鉄吸収の、個々のおよび組合せの両方による比較を示す。３．１９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ（丸）、８．７５％Ｆｅ−ＨＡのＭＰ（四角）、遊離鉄と遊離ＨＡ（三角）、遊離鉄と遊離ＥＰＯ（ひし形）、遊離鉄と遊離ＨＡおよび遊離ＥＰＯ（星）、遊離鉄（クロスバー）の摂取後の、若年女性（ｎ＝２４）における赤血球鉄取り込みによって評価される通りの鉄バイオアベイラビリティ。「ＢＭＣ」は、ＥＰＯを指す。これらの値は、摂取した鉄の総量のパーセンテージとして表される。バーは、幾何平均（ｎ＝２４）および９５％信頼区間を表す。線形混合モデル、ランダム切片としての参加者、反復固定因子としての食事、およびボンフェローニ補正による事後対応比較によって決定した、鉄吸収に対する食事の有意な効果＊（ｐ＜０．０５）または＊＊（ｐ＜０．００５）。
【図１１Ｃ】同上。
【００２８】
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、様々な量のＭＰ構成要素であるＨＡ（図１２Ａ）およびＥＰＯ（図１２Ｂ）の存在下で、鉄を添加した後のヒトｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸管バリアモデルを横断して輸送された、輸送された遊離鉄のパーセンテージとして表される鉄に関する。エラーバーはＳＤを表す（ｎ＝３）。
【図１２Ｂ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
Ｉ．定義
「ｐＨ感受性」は、本明細書で使用される場合、一般に、その溶解特性がｐＨ依存性である、ポリマーなどの材料を指す。
【００３０】
「水不溶性」は、本明細書で使用される場合、ポリマーなどの材料が、ｐＨ５を超える水溶液または緩衝液に溶解しないことを意味する。
【００３１】
「水溶性」は、本明細書で使用される場合、水に溶解できるビタミンなどの材料を意味する。水溶性ビタミンは、身体組織に運搬されるが、体内には保存されない。水溶性ビタミンは、植物および動物性の食物または食事性の補給剤に見出され、毎日摂取しなければならない。ビタミンＣおよびビタミンＢ複合体のメンバーは、水溶性である。
【００３２】
「脂溶性」は、本明細書で使用される場合、脂肪および油に溶解することができるビタミンなどの材料を意味する。脂溶性ビタミンは、食事の脂肪と共に吸収され、身体の脂肪組織内に保存され得る。脂溶性ビタミンは、植物および動物性の食物または食事性の補給剤から得られる。ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫは、脂溶性である。
【００３３】
「熱的に安定な」は、本明細書で使用される場合、一般に、材料が、食品の調製および／または調理中に受ける温度（例えば、沸騰温度を含めてその温度まで）などの所与の温度で、少なくとも約１０〜２０分間、例えば約２〜約４時間まで、化学的および／または物理的に安定である（例えば、分解しない）ことを意味する。一部の形態では、熱的に安定なポリマーコーティングは、調理温度で分解せず、コアから材料を漏出させない。
【００３４】
鉄微量栄養素製剤の安定性の基準は、鉄が、沸騰水に２時間に曝露されるか、または湿度７５％および４０℃に長期間（６０日）曝露された場合、カプセル化された場合の生物活性と比較して、その生物活性の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％超を喪失する点まで酸化しないことである。
【００３５】
脂溶性ビタミン、例えばビタミンＡ、ビタミンＤまたはビタミンＥ微量栄養素製剤の安定性の基準は、ビタミンが、沸騰水に２時間に曝露されるか、または湿度７５％および４０℃に長期間（６０日）曝露された場合、カプセル化された場合の生物活性と比較して、その生物活性の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％超を喪失しないことである。
【００３６】
「保存温度で安定な」は、本明細書で使用される場合、一般に、材料が、約−４℃（例えば、冷蔵庫の温度）から約２５〜３５℃で、約４０〜６０％の湿度において化学的および／または物理的に安定な（例えば、分解しない）ことを意味する。
【００３７】
「微量栄養素」は、本明細書で使用される場合、一般に、ヒトなどの生物の適切な成長および代謝にとって微量（例えば、１００ｍｇ未満／日）で必須の、ビタミンまたはミネラルなどの物質を指す。「微量栄養素」は、微量ミネラルまたは微量元素、および微量ビタミンの両方を含む。
【００３８】
用語「直径」は、当技術分野において認識されており、本明細書では、物理的直径または流体力学直径のいずれかを指すために使用される。本明細書で使用される場合、非球形粒子の直径は、粒子の表面上の２点の間の最大直線距離を指すことができる。複数の粒子に言及する場合、粒子またはカプセルの直径は、典型的に、粒子の平均直径を指す。粒子の直径は、それに限定されるものではないが、光学顕微鏡法または電子顕微鏡法、ならびに動的光散乱および濾過を含む様々な技術を使用して測定することができる。
【００３９】
用語「生体適合性」は、本明細書で使用される場合、宿主（例えば、非ヒト動物またはヒト）にとってそれら自体が毒性でもなく、宿主においてモノマーもしくはオリゴマーサブユニットまたは他の副生成物を毒性濃度で生成する速度で分解もしない（材料が分解する場合）、１つまたは複数の材料を指す。
【００４０】
用語「生分解性」は、本明細書で使用される場合、材料が、その構成成分のサブユニットに分解もしくは崩壊すること、または材料が、例えば生化学的プロセスによって、より小さい（例えば、非ポリマー）サブユニットに消化されることを意味する。
【００４１】
用語「微粒子」は、当技術分野において認識されており、ミクロスフェアおよびマイクロカプセル、ならびにそれらの２つの分類のいずれかに容易に分けることができない構造を含むが、すべて約１０００ミクロン未満の平均寸法を有する。微粒子は、球形または非球形であってよく、任意の規則的なまたは不規則な形状を有することができる。構造が、直径約１ミクロン未満である場合、対応する分野において認識されている用語「ナノスフェア」、「ナノカプセル」および「ナノ粒子」を利用することができる。ある特定の実施形態では、ナノスフェア、ナノカプセルおよびナノ粒子は、約５００ｎｍ、約２００ｎｍ、約１００ｎｍ、約５０ｎｍ、約１０ｎｍ、または約１ｎｍの平均直径を有する。
【００４２】
「マトリクス」は、本明細書で使用される場合、一般に、他の１つまたは複数の材料が包埋される１つまたは複数の固体または半固体材料を指す。
【００４３】
「ヒドロゲル」は、本明細書で使用される場合、時として、水が分散媒であるコロイドゲルとして見出される、親水性のポリマー鎖の網目構造である。ヒドロゲルは、吸収性が高い（９０％を超える水を含有することができる）天然または合成ポリマー網目構造である。ヒドロゲルはまた、それらの著しい含水量に起因して、天然組織に非常に類似の可撓性の程度を有する。
【００４４】
ＩＩ．安定化微量栄養素製剤
１つまたは複数の微量栄養素、例えば鉄補給剤、例えば硫酸鉄、水溶性ビタミン、例えばビタミンＣおよびビタミンＢのメンバー、ならびに脂溶性または油溶性ビタミン、例えばビタミンＡ、ＤおよびＥを含有する微粒子製剤を開発した。これらは、処理中の酸化および生物活性の喪失に抵抗し、湿気および調理温度に対して抵抗性がある。その粒子は、１つまたは複数の腸溶ポリマー、例えば規定されたｐＨ範囲で分解／溶解し、カプセル化微量栄養素を放出するｐＨ感受性ポリマーを含む。好ましいｐＨ感受性ポリマーは、胃内に見出される通りの低ｐＨ、例えばｐＨ１〜３、好ましくは１〜２で放出する。
【００４５】
酸化を防止するために、鉄補給剤または鉄補給剤を含有する鉄粒子は、好ましくは１：４〜１：１０の間の鉄：ＨＡの比で、保護ポリマー、例えばヒアルロン酸（「ＨＡ」）によってカプセル化され、またはビタミンＣなどの保護化合物と混合される。次に、得られた混合物を、腸溶ポリマー、例えばＢＡＳＦによってＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）として販売されているポリ（メタ）アクリレート、好ましくはＥＰＯの溶液に分散させ、噴霧乾燥またはスピニングディスク微粒化などの技術を使用して、典型的に直径１ミクロン〜１ｍｍの間、好ましくは直径約１５０ミクロンの粒径を有する粒子に製造する。最終製剤の典型的な範囲は、Ｆｅ：０．５〜３．２％、ＨＡ：２．５〜３２％、およびＥＰＯ：９７〜６４．８％である。
【００４６】
１つまたは複数の脂溶性微量栄養素、例えば脂溶性ビタミン、例えばビタミンＡ、ＤおよびビタミンＥを含有する安定な粒子を作製するために、微量栄養素を腸溶ポリマーの溶液に溶解または分散させ、次に、マイクロカプセル化技術、例えば粒子の凝集および変形を防止する粉末、例えばデンプン粉末への噴霧乾燥またはスピニングディスク微粒化を使用して、粒子に製造する。
【００４７】
１つまたは複数の水溶性微量栄養素、例えば水溶性ビタミン、例えばビタミンＣ、Ｂ３、Ｂ７、Ｂ９およびＢ１２、ならびに微量元素、例えば亜鉛およびヨウ素を含有する安定な粒子を作製するために、微量栄養素を、親水性または両親媒性ポリマー、例えばヒアルロン酸またはゼラチンによって形成された第１のマトリクス内にカプセル化する。水溶性微量栄養素を含有する粒子は、腸溶ポリマーによって形成された第２のマトリクスによって、マイクロカプセル化技術、例えば粒子の凝集および変形を防止する粉末、例えばデンプン粉末への噴霧乾燥またはスピニングディスク微粒化を使用して、さらにコーティングまたはカプセル化される。
【００４８】
製剤は、１つまたは複数のｐＨ感受性の熱的に安定な材料によって形成された第２のマトリクスによってコーティングまたはカプセル化される、第１のマトリクスに分布した１つまたは複数の微量栄養素から構成される。一部の形態では、微量栄養素を、１つまたは複数のｐＨ感受性の熱的に安定な材料で直接的にコーティングまたはカプセル化して、微粒子を形成する。ｐＨ感受性の熱的に安定な材料は、特に、調製および調理中などの高温でビタミンおよび微量ミネラルを安定化し、摂取後に所望の位置（例えば、胃、小腸等）でビタミンおよび微量栄養素を有効に放出する一助になる。
【００４９】
脂溶性ＭＮを水溶性ＭＮと同時カプセル化することを可能にする方法を開発した。
【００５０】
粒子またはシードは、１つまたは複数の微量栄養素から形成される。粒子またはシードの直径は変わり得る。しかし、一部の実施形態では、平均直径は、約数ナノメートル〜約１０００ミクロンまで、好ましくは数ナノメートル〜約５００ミクロンである。
Ａ．微量栄養素
【００５１】
例示的な微量栄養素として、それに限定されるものではないが、鉄、コバルト、亜鉛、マンガン、銅、ヨウ素、セレン、モリブデン、クロム、ビタミンＡ、ベータカロテン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸）、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、パントテン酸、およびそれらの組合せが挙げられる。ほとんどの微量栄養素の必要な１日投与量は、１００ｍｇ／日未満である。推奨値は、アメリカ合衆国農務省２０１３年から得た表１に示されている。
【００５２】
ビタミンＡは、細胞分化、細胞成熟、および細胞特異性をもたらす生理的プロセスに関与する。ビタミンＡは、妊娠、授乳または病状によって引き起こされるものなどの生理的にストレスの多い状態において、被験体にとって栄養補給剤の重要な構成成分である。ビタミンＡは、酢酸塩の形態で含まれ得る。６〜５９カ月齢の小児の１００％栄養所要量（ＲＤＡ）は、０．９ｍｇ／日である。成人女性の５０％ＲＤＡは、０．４５ｍｇ／日である。開示される製剤のためのビタミンＡの有用な形態には、パルミチン酸レチニル、酢酸レチニル、およびベータ−カロテンが含まれる。
【００５３】
ベータ−カロテンは、必要に応じて体内でビタミンＡに変換される。ベータ−カロテンは、強力な抗酸化特性も有する。抗酸化物質は、生理的にストレスの多い事象中に、数々の理由で重要である。例えば、脂質過酸化は、２００を超える疾患プロセスと関連付けられている。妊娠初期における絨毛間腔への血流の確立は、酸化ストレスのバーストに関連するので、抗酸化物質は、妊娠中、特に重要である。このバーストに対して有効な抗酸化防御を備えることができないと、初期の妊娠喪失が生じる。さらに、酸化ストレスは、妊娠中毒症である子かん前症の病態生理に関与するとされている。最後に、妊娠中の酸化ストレスは、胎児の成長において重要な役割を演じ、健康な抗酸化レベルは、出生時の体重および身長と正に相関する。
【００５４】
Ｂ複合体は、一般には体内に保存されない水溶性栄養素を含有する。Ｂ複合体は、妊娠中の女性、授乳中の女性、および胎児の健康にとって非常に重要な様々な生物学的プロセス、例えばホモシステイン代謝などにおいて役割を演じる。Ｂ複合体ビタミンは、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、およびビタミンＢ１２の１つまたは複数を含有する。ビタミンＢは、しばしば互いに協力して働き、単一のビタミンＢ欠乏よりも一般的に、複数のビタミンＢ欠乏が想定される。
【００５５】
ビタミンＢ１は、炭水化物代謝および神経機能においてある役割を演じる。ビタミンＢ１は、アルファ−ケト酸（例えば、アルファ−ケトグルタレートおよびピルベート）の酸化的脱炭酸、およびペントースリン酸経路の構成成分であるトランスケトラーゼのための補酵素である。ビタミンＢ１は、チアミン硝酸塩の形態で含まれ得る。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
ビタミンＢ２は、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の２つのフラビン補酵素の構成成分である。これらのフラビン酵素は、ピリドキシンおよびナイアシンの変換を含むいくつかの酸化還元反応に関与する。フラビン酵素はまた、いくつかの代謝経路、例えばアミノ酸脱アミノ化、プリン分解および脂肪酸酸化においてある役割を演じ、したがって、炭水化物、アミノ酸および脂質の代謝を維持する一助になる。ビタミンＢ２は、リボフラビンの形態で含まれ得る。
【００５８】
ビタミンＢ３、または「ナイアシン」は、ニコチン酸（ナイアシンとも呼ばれる）およびナイアシンアミド（ニコチンアミドとも呼ばれる）の２つの化合物の一般名である。ビタミンＢ３は、健康なレベルおよびタイプの脂肪酸を維持するのに重要である。ビタミンＢ３はまた、ピロキシジン、リボフラビン、および葉酸の合成に必要である。ビタミンＢ３を投与すると、総コレステロール（ＬＤＬ）および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）レベルを低減し、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールレベルを上昇させることもできる。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびＮＡＤリン酸（ＮＡＤＰ）は、ナイアシンの活性な補酵素である。これらの補酵素は、数々の酵素反応、例えば解糖、脂肪酸代謝、およびステロイド合成に関与する。ビタミンＢ３は、ナイアシンアミドの形態で含まれ得る。別の実施形態では、製剤は、等モル量のナイアシン、またはナイアシンおよびニコチンアミドの組合せを含むことができる。
【００５９】
ビタミンＢ６は、ホモシステインのレベルを低減することができる。ビタミンＢ６の活性形態であるピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）およびピリドキサミン−５’−リン酸は、数々の酵素のための補酵素であり、したがって、糖新生、ナイアシン形成、および赤血球代謝にとって重要である。ビタミンＢ６は、メチオニンからのシステインの形成を触媒する酵素である、シスタチオニンシンターゼおよびシスタチオナーゼの両方のための補酵素である。ホモシステインは、このプロセスの中間体であり、血管疾患および神経管欠損の両方の危険因子として、高レベルの血漿ホモシステインが認識されている。ビタミンＢ６は、ピリドキシン塩酸塩の形態で含まれ得る。
【００６０】
ビタミンＢ９は、神経管欠損、例えばホモシステイン代謝妨害によって引き起こされる二分脊椎を防止することができる。ビタミンＢ９はまた、骨髄内の赤血球および白血球の形成にとって重要であり、ヘム形成においてある役割を演じる。さらに、葉酸欠乏は、ビタミンＢ１の活性を阻害する。ビタミンＢ９は、葉酸、フォラシン、メタフォリン、葉酸塩、ならびに／または（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸もしくはそのポリグルタミル誘導体、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸もしくはそのポリグルタミル誘導体、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸もしくはそのポリグルタミル誘導体、１０−ホルミル−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸もしくはそのポリグルタミル誘導体、５，１０−メチレン−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸もしくはそのポリグルタミル誘導体、５，１０−メテニル−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸もしくはそのポリグルタミル誘導体、および５−ホルムイミノ−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸もしくはそのポリグルタミル誘導体を含む、葉酸塩の１つもしくは複数の天然異性体の形態で含まれ得る。６〜５９カ月齢の小児の１００％ＲＤＡは、０．１５ｍｇ／日である。成人女性の５０％ＲＤＡは、０．２ｍｇ／日である。開示される製剤のためのビタミンＢ９の有用な形態は、葉酸である。
【００６１】
ビタミンＢ１２は、活性な補酵素であるメチルコバラミンおよび５’−デオキシアデノシルコバラミンに変換され得る。これらの補酵素は、葉酸代謝、補酵素Ａの変換およびミエリン合成にとって必要である。メチルコバラミンはまた、ＤＮＡ合成に関与する、葉酸補因子の脱メチル化を触媒する。脱メチル化が欠如すると、葉酸欠乏が生じるおそれがある。デオキシアデノシルコバラミンは、クエン酸サイクルにおいてある役割を演じる、メチルマロニル−ＣｏＡからスクシニル−ＣｏＡへの変換のための補酵素である。コバラミンは、ピリドキシンおよび葉酸と共に、内皮機能に対して悪影響を及ぼすことに起因して心疾患のリスク増大と相関する、アミノ酸メチオニンの分解生成物であるホモシステインの適切な代謝にも関与する。ビタミンＢ１２は、シアノコバラミンの形態で含まれ得る。６〜５９カ月齢の小児の１００％ＲＤＡは、０．０００９ｍｇ／日である。成人女性の５０％ＲＤＡは、０．００１２ｍｇ／日である。開示される製剤のためのビタミンＢ１２の有用な形態には、シアノコバラミンおよびメチルコバラミンが含まれる。
【００６２】
ビタミンＣは、金属触媒水酸化における補助基質である。ビタミンＣは、ベータ−カロテンと同様に抗酸化特性を有する。ビタミンＣは、スーパーオキシドヒドロキシルラジカルおよび一重項酸素と直接的に相互作用し、また、葉酸塩およびビタミンＥに抗酸化保護を提供して、ビタミンＥをその最も強力な形態で維持する。ビタミンＣは、フリーラジカル除去に関与することによって、子かん前症に対して保護効果をもたらすことができる。実際、対照よりも子かん前症の女性において、著しく低レベルのビタミンＣが観察された。
【００６３】
ビタミンＣはまた、鉄の吸収を増強する。さらに、ビタミンＣは、コラーゲン合成、エピネフリン合成、および胆汁酸形成にとって必要である。さらに、ビタミンＣは、動脈壁の細胞外液中に存在し、一酸化窒素活性を増強し、したがって血管機能を正常化することによって、アテローム性動脈硬化症の阻害に関与するとされている。ビタミンＣは、アスコルビン酸の形態で含まれ得る。６〜５９カ月齢の小児の１００％ＲＤＡは、３０ｍｇ／日である。成人女性の５０％ＲＤＡは、３７．５ｍｇ／日である。開示される製剤のためのビタミンＣの有用な形態には、アスコルビン酸およびアスコルビン酸ナトリウムが含まれる。
【００６４】
ビタミンＤ３は、健康な骨の維持に重要な、脂溶性「ホルモン様」物質である。このビタミンは、胃腸管からのカルシウムおよびリンの吸収を増大し、骨組織へのミネラル再吸収を改善する。ビタミンＤは、皮膚が太陽光に曝露されることにより、その活性形態に変換され得る。ビタミンＤ３の欠乏は、骨代謝回転および骨喪失、ならびに重症の場合には骨軟化症、または骨の軟化を増大するおそれがある。ビタミンＤ３の補給は、骨喪失を中程度に低減し、血清２５−ヒドロキシビタミンＤを増大し、血清副甲状腺ホルモンレベルを低下することが示されている。ビタミンＤ３はまた、カルシウムおよびリンのホメオスタシスの維持においてある役割を演じるが、細胞分化および免疫機能においても活性である。ビタミンＤ３は、コレカルシフェロールの形態で含まれ得る。６〜５９カ月齢の小児の１００％ＲＤＡは、０．００５ｍｇ／日である。成人女性の５０％ＲＤＡは、０．００７５ｍｇ／日である。開示される製剤のためのビタミンＤの有用な形態には、コレカルシフェロールおよびエルゴカルシフェロールが含まれる。
【００６５】
ビタミンＥは、生体膜に見出される脂溶性ビタミン抗酸化物質であり、生体膜において、リン脂質膜を酸化ストレスから保護する。ビタミンＥは、ペルオキシルフリーラジカルを捕捉することによって、不飽和脂肪酸の酸化を阻害する。ビタミンＥはまた、アテローム産生抑制剤であり、研究により、ビタミンＥの摂取を増大すると冠状動脈性心疾患のリスクが低下することが実証されている。さらに、ビタミンＥは、ベータ−カロテンおよびビタミンＣと同様に、フリーラジカルの除去に関与することによって、子かん前症に対して保護効果をもたらすことができる。ビタミンＣと同様に、対照よりも子かん前症の女性において、著しく低レベルのビタミンＥが観察された。ビタミンＥは、ｄ−アルファ−トコフェロールアセテートまたはｄ−アルファトコフェロールスクシネートの形態で含まれ得る。
【００６６】
鉄は、赤血球のヘモグロビン部分を介して身体組織に酸素を運搬するために必要である。例えば、妊娠または寄生生物の高度外寄生を含む、様々な生理状態に関連する障害である貧血を防止するために、補給的な鉄摂取は非常に重要である。製剤は、鉄を、キレート化または非キレート化形態のいずれかで含むことができる。鉄は、多糖鉄複合体の形態で含まれ得る。別の実施形態では、鉄は、等モル量のフマル酸鉄または硫酸鉄の形態で含まれ得る。６〜５９カ月齢の小児の１００％ＲＤＡは、１０ｍｇ／日である。成人女性の５０％ＲＤＡは、９ｍｇ／日である。鉄の有用な形態には、ＮａＦｅＥＤＴＡ、硫酸鉄、グルコン酸鉄、フマル酸鉄、およびピロリン酸鉄が含まれる。
【００６７】
マグネシウムは、主に骨および筋肉に見出され、３００を超える様々な酵素反応にとって重要である。マグネシウムの主な機能は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のリン酸基に結合し、それによって、ＡＴＰリン酸の輸送を助ける複合体を形成することである。マグネシウムは、細胞内で膜安定剤としても機能する。マグネシウムは、核酸合成、解糖、ＤＮＡおよびＲＮＡの転写、アミノ酸活性化、膜輸送、トランスケトラーゼ反応、ならびにタンパク質合成において役割を演じる。マグネシウムは、細胞シグナル伝達機序においてある役割を演じる細胞質の第２のメッセンジャーであるｃＡＭＰの形成にも関与する。マグネシウムはまた、神経筋伝達において、カルシウムと相乗的かつ拮抗的に機能する。具体的には、マグネシウムは、心臓において特に重要な、神経および筋肉の膜の電気化学ポテンシャル、ならびに神経筋接合部伝達の維持に非常に重要である。当然のことながら、マグネシウム欠乏は、心血管疾患および高血圧と関係している。実際、経口マグネシウム治療により、冠状動脈疾患を有する患者の内皮機能が改善される。
【００６８】
マグネシウムは、様々な塩で利用可能であり、キレート化または非キレート化形態のいずれかで製剤に含まれ得る。一実施形態では、マグネシウムは、酸化マグネシウムの形態で含まれる。
【００６９】
亜鉛は、数々の代謝活性、例えば核酸生成、タンパク質合成、および免疫系の発達においてある役割を演じる。アルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、およびタンパク質キナーゼＣを含む、２００を超える亜鉛金属酵素が存在する。亜鉛は、ＲＮＡおよびＤＮＡ構造を安定化し、核内受容体においてジンクフィンガーを形成し、転写および複製に関与するクロマチンタンパク質の構成成分である。妊娠中の亜鉛欠乏は、胎児の重症異常に寄与することが示されている。亜鉛は、多くの形態で利用可能であり、キレート化または非キレート化形態のいずれかで製剤に含まれ得る。一実施形態では、亜鉛は、酸化亜鉛の形態で含まれ得る。６〜５９カ月齢の小児の１００％ＲＤＡは、４．１ｍｇ／日である。成人女性の５０％ＲＤＡは、８ｍｇ／日である。開示される製剤のための亜鉛の有用な形態には、酢酸亜鉛、グルコン酸亜鉛、ピコリン酸亜鉛、および硫酸亜鉛が含まれる。
【００７０】
セレンは、動物にとって必須微量栄養素である。セレンは、アミノ酸であるセレノシステインおよびセレノメチオニンの構成成分である。セレンは、抗酸化酵素、例えばグルタチオンペルオキシダーゼおよびある特定の形態のチオレドキシンレダクターゼを低減するための補因子として機能する。グルタチオンペルオキシダーゼファミリーの酵素（ＧＳＨ−Ｐｘ）は、反応性酸素種、例えば過酸化水素および有機ヒドロペルオキシドを除去するある特定の反応を触媒する。
【００７１】
セレンはまた、甲状腺ホルモン脱ヨード酵素の公知の４つのタイプのうち３つのための補因子として関与することによって、甲状腺の機能および甲状腺ホルモンを使用するすべての細胞においてある役割を演じ、それによって、様々な甲状腺ホルモンおよびそれらの代謝産物を活性化し、次に不活化する。ヨードチロニン脱ヨード酵素は、それ以外では稀なアミノ酸であるセレノシステインをセレンとして使用する、脱ヨード酵素のサブファミリーである。セレンは、身体自体の甲状腺細胞が異物として攻撃される橋本病を阻害することができる。
【００７２】
マンガンは、必須微量栄養素である。マンガン補因子を有するクラスの酵素は、非常に広範であり、それには、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、レクチン、およびインテグリンが含まれる。
【００７３】
銅は、動物の必須微量元素である。銅には、鉄取込みを容易にする役割があるので、銅欠乏は、貧血様症状、好中球減少症、骨異常、色素脱失、成長障害、感染発生の増大、骨粗鬆症、甲状腺機能亢進症、ならびにグルコースおよびコレステロール代謝異常をもたらすおそれがある。
【００７４】
コバルトは、必須微量元素である。コバルトは、「超微量」元素としてのコバルトの主な生物学的リザーバーであるビタミンＢ１２としても公知のコバラミンの、非常に重要な構成要素である。コバラミンベースのタンパク質は、コバルトを保持するためにコリンを使用する。補酵素Ｂ１２は、その反応に関与する反応性Ｃ−Ｃｏ結合を特徴とする。ヒトでは、Ｂ１２は、メチルおよびアデノシルの２つのタイプのアルキルリガンドと共に存在する。ＭｅＢ１２は、メチル（−ＣＨ３）基の輸送を促進する。Ｂ１２のアデノシルバージョンは、水素原子が２つの隣接する原子の間で直接的に移動すると同時に、炭素原子であってよい第２の置換基であるＸが、置換基であるアルコールの酸素原子またはアミンと交換される転位を触媒する。メチルマロニル補酵素Ａムターゼ（ＭＵＴ）は、ＭＭｌ−ＣｏＡをＳｕ−ＣｏＡに変換するが、これは、タンパク質および脂肪からのエネルギー抽出における重要なステップである。
【００７５】
動物生物学におけるヨウ素の主な役割は、甲状腺ホルモンであるチロキシン（Ｔ４）およびトリヨードチロニンの構成要素としての役割である。これらは、アミノ酸であるチロシンの付加重合生成物から作製され、放出される前に、サイログロブリンと呼ばれるヨウ素含有タンパク質に保存される。Ｔ４およびＴ３は、それぞれ分子１個当たり４個および３個のヨウ素原子を含有する。甲状腺は、血液からヨウ化物を能動的に吸収して、これらのホルモンを作製し、血中に放出するが、その作用は、二次ホルモンによって調節される。甲状腺ホルモンは、生物学において基本的な役割を演じており、遺伝子転写に対して作用して、基礎代謝率を調節する。甲状腺ホルモンが完全に欠乏すると、基礎代謝率は５０％まで低減する場合があり、一方、甲状腺ホルモンが過度に生成されると、基礎代謝率は１００％上昇する場合がある。
【００７６】
ヨウ素は、セレンと栄養的な関係を有する。脱ヨード酵素と呼ばれるファミリーのセレン依存性酵素は、チロシンの外側環からヨウ素原子を除去することによって、Ｔ４をＴ３（活性なホルモン）に変換する。これらの酵素はまた、内側環のヨウ素原子を除去することによって、Ｔ４を逆Ｔ３（ｒＴ３）に変換し、また内側環の原子を除去することによって、Ｔ３を３，３’−ジヨードチロニン（Ｔ２）に変換する。ヨウ素は、胎児および新生児の発達にとっても重要である。６〜５９カ月齢の小児の１００％ＲＤＡは、０．０９ｍｇ／日である。成人女性の５０％ＲＤＡは、０．０７５ｍｇ／日である。開示される製剤のためのヨウ素の有用な形態には、ヨウ化ナトリウムおよびヨウ素酸カリウムが含まれる。
【００７７】
他の治療的、栄養的、予防的または診断用の薬剤を含むこともできる。一実施形態では、抗寄生生物剤が、粒子に組み込まれる。抗寄生生物剤、例えば抗原虫剤、駆虫薬、およびそれらの組合せには、それに限定されるものではないが、抗線虫薬、抗条虫薬、抗吸虫薬、抗アメーバ薬、抗原虫薬、およびそれらの組合せが含まれる。
【００７８】
適切な抗線虫薬物には、それに限定されるものではないが、ベンゾイミダゾール（例えば、メベンダゾール、チアベンダゾール）、エバーメクチン（例えば、イベルメクチン）、ピランテルパモ酸塩、ジエチルカルバマジン、およびそれらの組合せが含まれる。
【００７９】
適切な抗条虫薬には、それに限定されるものではないが、ニクロサミン（ｎｉｃｌｏｓａｍｉｎｅ）、プラジカンテル、アルベンダゾール、およびそれらの組合せが含まれる。
【００８０】
適切な抗吸虫薬には、それに限定されるものではないが、プラジカンテルが含まれる。
【００８１】
適切な抗アメーバ薬には、それに限定されるものではないが、リファンピン、アンホテリシンＢ、およびそれらの組合せが含まれる。
【００８２】
適切な抗原虫薬には、それに限定されるものではないが、メラルソプロール、エフロルニチン、メトロニダゾール、チニダゾール、ミルテホシン、およびそれらの組合せが含まれる。
【００８３】
粒子は、１つまたは複数の抗ウイルスおよび／または抗微生物剤を含有することができる。適切な薬剤には、抗インフルエンザ剤、抗ポリオウイルス剤、抗肝炎剤、抗アルボウイルス（ａｒｂｏｒｏｖｉｒａｌ）剤（節足動物（ａｎｔｈｒｏｐｏｄ）媒介性ウイルス、例えばデング熱、黄熱、およびマラリア）、抗ロタウイルス剤、抗エボラウイルス剤、抗マールブルグウイルス剤、抗ラッサウイルス剤、およびそれらの組合せが含まれる。適切な抗微生物剤には、それに限定されるものではないが、抗コレラ剤、抗大腸菌剤、抗結核剤、抗ハンセン病剤、およびそれらの組合せが含まれる。
【００８４】
異なる薬剤、および薬剤の異なる組合せを、同じ製剤、異なる製剤、またはそれらの組合せに組み合わせることができる。このことは、例えば、異なる薬剤を異なる製剤に組み合わせるもしくは混合するのに便宜上異なる薬剤のために別々の製剤を有するという便宜的な理由で、または製剤の組成に基づいて薬剤の安定性もしくは形態を増大もしくは最適化するために行うことができる。
【００８５】
製剤は、プロバイオティクス、成長または体重増加を増強する酵素、例えばフィターゼ、プロテアーゼ、例えばＲＯＮＯＺＹＭＥ（登録商標）ＰｒｏＡｃｔ、および炭水化物を含むこともできる。このような多くの生成物は、動物飼料製剤において広く使用されている。
【００８６】
異なる薬剤、および薬剤の異なる組合せを、同じ粒子、異なる粒子、またはそれらの組合せに分散させることができる。このことは、例えば、異なる薬剤を異なる製剤に組み合わせるもしくは混合するのに便宜上異なる薬剤のために別々の粒子を有するという便宜的な理由で、または粒子の組成に基づいて薬剤の安定性もしくは形態を増大もしくは最適化するために行うことができる。
【００８７】
ｐＨ感受性の熱的に安定なポリマーによってカプセル化する際に、薬剤は、保存、食品の調製、および／または調理中に受ける条件に対して安定であるべきである。
【００８８】
一部の形態では、粒子における微量栄養素の量は、粒子１ｍｇ当たり少なくとも０．１μｇ（０．０１％）、粒子１ｍｇ当たり少なくとも０．４μｇ（０．０４％）、粒子１ｍｇ当たり少なくとも１μｇ（０．１％）、粒子１ｍｇ当たり少なくとも１０μｇ（１％）、粒子１ｍｇ当たり少なくとも５０μｇ（５％）、粒子１ｍｇ当たり少なくとも８０μｇ（８％）、または粒子１ｍｇ当たり少なくとも１８０μｇ（１８％）であってよい。
【００８９】
Ｂ．安定化材料
デンプン
脂溶性のｐＨ感受性ポリマーをデンプンタイプの材料に噴霧乾燥させることにより、凝集が防止され、微粒子のサイズおよび形状が維持されることが発見された。好ましい材料は、食品グレードのデンプンである。
【００９０】
ヒアルロン酸およびビタミンＣ
ヒアルロン酸またはその誘導体、およびビタミンＣの２つの材料は、鉄補給剤を安定化して、酸化を防止することが見出された。一部の形態では、これらは、１：４〜１：１０の間の鉄：ヒアルロン酸の好ましい比で添加される。一部の形態では、鉄補給剤は、ヒアルロン酸によって形成された微粒子によってカプセル化される。
【００９１】
水溶性微量栄養素のためのマトリクスポリマー
１つまたは複数の生体適合性の親水性または両親媒性ポリマーは、水溶性微量栄養素、例えばビタミンＢ９およびＢ１２をカプセル化するためのマトリクスとして使用することもできる。好ましくは、マトリクスポリマーは、水溶性である。適切なマトリクスポリマーには、それに限定されるものではないが、多糖類、例えばヒアルロン酸またはその誘導体、コラーゲン、および加水分解コラーゲン、例えばゼラチンが含まれる。マトリクスポリマーの微粒子を作製して、水溶性微量栄養素をカプセル化することができる。このような微粒子は、１つまたは複数のｐＨ感受性の熱的に安定な生体適合性ポリマーによって、さらにコーティングまたはカプセル化することができる。
【００９２】
Ｃ．ｐＨ感受性の熱的に安定なポリマー
微量栄養素は、１つまたは複数のｐＨ感受性の熱的に安定な生体適合性ポリマーでコーティングまたはカプセル化される。一部の形態では、微量栄養素を、第１のマトリクス（例えば、ヒアルロン酸またはゼラチンによって形成されたもの）に分散させて、微粒子を形成する。このような微粒子は、１つまたは複数のｐＨ感受性の熱的に安定な生体適合性ポリマーによって形成された第２のマトリクスによってさらにコーティングまたはカプセル化される。ポリマーの溶解度は、適切なポリマーを選択することによって胃腸管における望ましい放出点が達成され得るように、ｐＨ依存性である。例えば、胃内での放出が望ましい場合、ｐＨ感受性ポリマーは、理想的には、３未満、好ましくは２未満、例えば１〜２のｐＨで溶解する。他の実施形態では、小腸での放出が望ましい場合があり、この場合ポリマーは、十二指腸のｐＨ（ｐＨ６〜６．５）または小腸のｐＨ、例えば６〜８、より好ましくは７〜８で溶解する。農業への適用、例えば、ウシ、ヒツジおよびヤギのような反芻動物へのミネラル補給剤では、第一胃内で放出を達成するために、ｐＨ５〜６の間での放出が望ましい。
【００９３】
ポリマーは、熱的に安定である。好ましいポリマーは、調理中、熱的に安定であり、したがって製剤は、通常の塩のような食品に添加することができる。典型的に、食品は、１０分間〜数時間沸騰させるもしくはぐつぐつ煮るか、ポットもしくは鍋を火にかけて調理するか、または１５分間〜１時間オーブンで焼成することによって調製される。製剤は、典型的に、塩製剤が流通される地理的地域において最も一般的な調理条件に合わせて設計される。
【００９４】
ポリマーは、ｐＨがトリガーｐＨ範囲を上回る場合は、ポリマーコーティングが、経口投与の前、例えば保存または調理中に湿気または水または水溶液と接触しても溶解しないように、好ましくは水不溶性である。ポリマーコーティングは、カプセル化された薬剤が放出されず、かつ／または変性しないように、例えば、約１時間までまたは少なくとも約１時間、十分に無傷なままであるべきである。ポリマーは、水または他の水性媒体がポリマー中に拡散することができず、材料をコアに溶解させることができないように、十分に非多孔質である。非多孔質は、空気感受性材料の酸化を防止することによって、コア内の材料を安定化するように働くこともできる。材料は、保存条件下で数週間〜数カ月、ならびに食品の調製および／または調理条件下で少なくとも約２０分間〜約４時間、好ましくは少なくとも約２０分間〜約２時間、より好ましくは少なくとも約２０分間〜約１時間、非多孔質のままであるべきである。
【００９５】
例示的なポリマーには、ポリメタクリレートおよびその誘導体、例えばエチルメタクリレート−メタクリル酸コポリマー、ならびに商標ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）で販売されているもの、天然に存在するセルロースポリマー（例えば、セルロースアセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート）および他の多糖類（例えば、アルギン酸（ａｌｉｇｎａｔｅ）ナトリウム、ペクチン、キトサン）またはその半合成もしくは合成誘導体、ポリ（２−ビニルピリジン−コ−スチレン）、ポリビニルアセテートフタレート、セラック、脂肪酸（例えば、ステアリン酸）、ワックス、プラスチック、ならびに植物繊維が含まれる。
【００９６】
一部の実施形態では、１つまたは複数のポリマーは、ポリメタクリレートまたはその誘導体、例えば商標ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）で販売されているものである。一部の実施形態では、ポリマーは、６未満、好ましくは５、４、または３未満、例えば１〜３、または１〜２のｐＨで溶解する。このようなポリマーは、典型的に、低ｐＨでプロトン化される官能基、例えばアミンを有し、それによって、荷電基が形成されることに起因して水性媒体への溶解度が増大する。このようなポリマーの例として、それに限定されるものではないが、ポリメタクリレートまたはそれらの誘導体、例えばＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＥＰＯ（ポリ（ブチルメタクリレート−コ−（２−ジメチルアミノエチル）メタクリレート−コ−メチルメタクリレート）（１：２：１）、「ＥＰＯ」または「ＢＭＣ」）、キトサン、およびカチオン性であるか、またはある特定の条件下（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ）でカチオン性になるポリマーが挙げられる。一部の形態では、ポリメタクリレートポリマーは、スキーム１に示される通りの構造を有しており（式中、ｘ＞０、ｙ≧０、ｚ≧０であり、ｎは、整数を表す）、そのモノマーは、コポリマー鎖に沿って無作為に分布している。一部の形態では、ｘ対ｙ対ｚの比は、約２：１：１である。一部の形態では、ポリメタクリレートポリマーの平均分子量は、約１０，０００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの間、約２０，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの間、約４０，０００Ｄａ〜約６０，０００Ｄａの間、または約４７，０００Ｄａである。
【化１】
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【００９７】
他の実施形態では、ポリマーは、胃のｐＨを超えるｐＨ、例えばｐＨ５〜６超で溶解する腸溶ポリマーである。このようなポリマーは、典型的に、溶解度を増大するためにより高いｐＨで荷電基（例えば、カルボン酸）を形成する官能基を有する。一部の実施形態では、ポリマー、例えばＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ３０Ｄ−５５およびＬ１００−５５は約５．５超のｐＨで、例えばＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００およびＬ１２，５は約６．０超で、例えばＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｓ１００、Ｓ１２，５、およびＦＳ３０Ｄは約７．０超で溶解する。
【００９８】
ポリマーコーティングまたはカプセル化材料の厚さは、望ましい放出速度を達成するために変わってよい。一部の実施形態では、コーティングの厚さは、約１オングストローム〜数百ミクロンである。一部の実施形態では、コーティングの厚さは、約５〜約２００ミクロン、好ましくは約１０〜約１００ミクロン、より好ましくは約１０ミクロン〜約７５ミクロン、最も好ましくは約２０ミクロン〜約５０ミクロンである。
【００９９】
Ｄ．塩コーティングおよび他のコーティング
１つまたは複数の微量栄養素をカプセル化する粒子は、塩、糖、または他のコーティング材料、好ましくは塩、好ましくは動物、例えばヒトによる消費に適した塩でコーティングされ得る。例示的な塩として、それに限定されるものではないが、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウム、塩化マグネシウム、ヨウ化カリウム、リン酸塩、およびそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、コーティングの厚さは、約１オングストローム〜数百ミクロンである。一部の実施形態では、コーティングの厚さは、約５〜約２００ミクロン、好ましくは約１０〜約１００ミクロン、より好ましくは約１０ミクロン〜約７５ミクロン、最も好ましくは約２０ミクロン〜約５０ミクロンである。塩は、精製することができ、または不純であってよく、塩水または汽水の蒸発によって得られた塩などであってよい。塩の濃度は、粒子の約１０重量％〜約８０重量％、好ましくは約１０重量％〜約７０重量％、より好ましくは約２０重量％〜約６０重量％、最も好ましくは約４０重量％〜約６０重量％であってよい。
【０１００】
他のコーティング材料には、コーティングとして適した糖および他の食品構成成分が含まれる。好ましいコーティング材料は、食品および生成物、ならびに食品に含まれる構成成分と（例えば、食品の調製または調理中に）適合性があってよく、かつ／またはそれらと適合性がある製剤を作製する一助になり得る。
【０１０１】
バインダーとして働く組成物を使用して、塩、糖、または他のコーティング材料を用いる粒子のコーティングを容易にすることができる。バインダーは、塩結晶を互いに結合し、塩結晶を粒子の表面に結合するために使用される。バインダーとして使用される例示的な組成物として、それに限定されるものではないが、デンプン、例えば小麦デンプン、トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、カルボキシメチルセルロース、ならびにメチルセルロースが挙げられる。
【０１０２】
ＩＩＩ．作製方法
水溶性微量栄養素をｐＨ感受性ポリマー材料内にカプセル化するためのプロセスは、図１Ａに示されている（すなわち、２ステップ法）。脂溶性微量栄養素をｐＨ感受性材料内にカプセル化するためのプロセスは、図１Ｂに示されている（すなわち、１ステップ法）。これらのプロセスは、実施例でより詳細に記載される。
【０１０３】
Ａ．微量栄養素をカプセル化するための方法
１つまたは複数の微量栄養素をカプセル化する微粒子を作製するための一般的なマイクロカプセル化技術には、それに限定されるものではないが、噴霧乾燥、界面重合、熱溶融カプセル化、相分離カプセル化（自然発生的乳化マイクロカプセル化、溶媒蒸発マイクロカプセル化、および溶媒除去マイクロカプセル化）、コアセルベーション、低温キャスティング、位相反転ナノカプセル化、および遠心微粒化（例えば、スピニングディスク微粒化）が含まれる。
【０１０４】
一部の形態では、ＨＡベースの微粒子は、溶媒除去マイクロカプセル化または噴霧乾燥によって形成される。
【０１０５】
一部の形態では、ｐＨ感受性ポリマーベースの微粒子は、位相反転ナノカプセル化またはスピニングディスク微粒化によって形成される。
【０１０６】
１つまたは複数の微量栄養素をカプセル化する微粒子を作製する例示的な方法を、以下に簡潔に記載する。
【０１０７】
１．噴霧乾燥
１つまたは複数の微量栄養素をカプセル化する微粒子は、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚらの米国特許第６，６２０，６１７号に記載されている噴霧乾燥技術によって作製することができる。この方法では、微粒子を形成する化合物（「カプセル化材料」、「粒子形成化合物」、または「粒子形成ポリマー」とも呼ばれる）は、溶媒系、例えば水性媒体（例えば、水）、有機媒体（例えば、塩化メチレン）、または溶媒媒体混合物（例えば、水およびｔｅｒｔ−ブチルアルコールの混合物）に溶解される。前述の溶媒系には、微粒子に組み込まれる公知の量の１つまたは複数の微量栄養素が、懸濁されるか（不溶性微量栄養素の場合）または同時溶解される（可溶性微量栄養素の場合）。好ましくは、微量栄養素は、溶媒系に同時溶解する。溶液または分散物を、圧縮ガス流によって駆動される微粒子化ノズルを介して送り出し、得られたエアロゾルを、空気の加熱サイクロンに懸濁させて、微小液滴から溶媒を蒸発させて粒子を形成する。
【０１０８】
この方法を使用して、０．１〜１０ミクロンの間の範囲のミクロスフェア／ナノスフェアを得ることができる。好ましくは、この方法によって形成された粒子は、サイズが約１〜約１０μｍの範囲である。
【０１０９】
一部の形態では、この方法を使用して、ＨＡベースの微粒子、例えばＨＡ−Ｆｅ微粒子が形成される。例えば鉄補給剤（例えば、硫酸鉄、無水または含水）、ＨＡまたはその誘導体（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム）、および必要に応じて１つまたは複数の水溶性微量栄養素を含有する水溶液を、噴霧乾燥機に供給して、ＨＡ−Ｆｅ微粒子を作製することができる。
【０１１０】
２．遠心微粒化
遠心微粒化（「回転微粒化」とも呼ばれる）では、ノズルによって、スピニングカップまたはディスクの中心に流体を導入する。遠心力によって流体がディスク端部に運ばれ、端部から流体が放散する。液体は、間膜（ｌｉｇａｍｅｎｔ）またはシートを形成して、それが微細な液滴に分裂する。微細な液滴は、空気および／または医薬賦形剤、例えば粉末化デンプンに曝露されることにより、固化して微粒子を形成することができる。遠心微粒化、特にスピニングディスク微粒化の方法は、例えば、ＳｐａｒｋｓおよびＭａｓｏｎの米国特許第４，６７５，１４０号、ならびにＰＣＴ特許出願ＷＯ２０１２／０７５３０９に記載されている。一部の形態では、ｐＨ感受性ポリマーベースの微粒子は、遠心微粒化、例えばスピニングディスク微粒化によって形成される。例えば、ｐＨ感受性ポリマーを、最初に、有機溶媒、例えば塩化メチレンに溶解させる。組み込まれる１つまたは複数の微量栄養素、例えば脂溶性ビタミン、ＨＡ−Ｆｅ微粒子、および１つまたは複数の水溶性微量栄養素を含有する微粒子を、表面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）  ８０の存在下で、ポリマー溶液中で混合し、またはポリマー溶液に溶解させる。次に、得られたエマルションを、ｐＨ感受性ポリマーベースの微粒子を生成するための条件下でスピニングディスク微粒化装置に導入し、それによって微量栄養素をカプセル化する。
【０１１１】
Ｂ．鉄補給剤のカプセル化
鉄補給剤を含有する鉄粒子は、当技術分野で公知の技術、例えば製粉を使用して調製することができる。鉄補給剤、好ましくは硫酸鉄（ＦｅＳＯ４）、または鉄補給剤の鉄粒子は、ヒアルロン酸もしくはその誘導体などの材料と、好ましくは約１：４〜１：１０の間の比の鉄：ＨＡで混合され、またはビタミンＣと混合され、かつ／または鉄補給剤の酸化を防止するための腸溶ポリマーでカプセル化される。次に、混合物を、ｐＨ感受性ポリマー、好ましくはＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）、最も好ましくはＥＰＯの溶液に分散させる。好ましい形態では、ｐＨ感受性ポリマーの溶液のための溶媒は、有機溶媒、例えば塩化メチレンである。鉄補給剤をカプセル化するｐＨ感受性ポリマーベースの微粒子は、１ミクロン〜１ｍｍの間、最も好ましくは平均１５０ミクロンの粒子を生成する条件下で、マイクロカプセル化技術、例えば噴霧乾燥およびスピニングディスク微粒化によって作製される。
【０１１２】
一部の形態では、鉄補給剤は、図１Ａに示される通り、２ステップ法によって微粒子にカプセル化することができる。例えば、鉄補給剤は、最初に、ＨＡまたはその誘導体によって形成された微粒子にカプセル化される。一部の形態では、Ｆｅ−ＨＡ微粒子は、鉄補給剤、例えば硫酸鉄を、ＨＡまたはその誘導体、例えばヒアルロン酸ナトリウムと一緒に水性媒体、例えば水に溶解させた後、噴霧乾燥および溶媒除去マイクロカプセル化などの技術を使用してマイクロカプセル化することによって形成される。得られたＦｅ−ＨＡ微粒子は、ｐＨ感受性ポリマー、好ましくはＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）、最も好ましくはＥＰＯによってさらにコーティングまたはカプセル化される。一部の形態では、水溶性ビタミンおよび微量ミネラルを含む他の水溶性微量栄養素は、鉄補給剤と一緒にカプセル化され得る。例えば、このような微量栄養素は、Ｆｅ−ＨＡ微粒子の生成中に鉄補給剤と同時に溶解させることができる。
【０１１３】
Ｃ．脂溶性微量栄養素のカプセル化
脂溶性微量栄養素、例えば脂溶性ビタミンは、図１Ｂに示される通り、１ステップ法によって微粒子にカプセル化することができる。
【０１１４】
１つまたは複数の脂溶性ビタミン、例えばビタミンＡ、ＤおよびＥは、ビタミンを、ｐＨ感受性ポリマー、好ましくはＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）、最も好ましくはＥＰＯの溶液に溶解または分散させた後、噴霧乾燥またはスピンディスク処理などによって、デンプン粉末（デンプンに等価な他の医薬賦形剤は公知であり、利用可能である）内にマイクロカプセル化することによって、ｐＨ感受性ポリマー粒子内にカプセル化される。デンプンは、マイクロカプセル化後の粒子の凝集を防止し、粒子形状を維持する。
【０１１５】
好ましい形態では、ｐＨ感受性ポリマーの溶液のための溶媒は、有機溶媒、例えば塩化メチレンである。
【０１１６】
Ｄ．水溶性微量栄養素のカプセル化
水溶性微量栄養素、例えば水溶性ビタミンおよび微量ミネラルは、図１Ａに示される通り、２ステップ法によって微粒子にカプセル化することができる。
【０１１７】
１つまたは複数の水溶性微量栄養素は、最初に、親水性または両親媒性マトリクスポリマー、例えばＨＡ、ゼラチン、およびその誘導体によって形成された微粒子にカプセル化される（第１のステップ）。微粒子は、水溶性微量栄養素を、マトリクスポリマーと一緒に水性媒体、例えば水に溶解させた後、噴霧乾燥および溶媒除去マイクロカプセル化などの技術を使用してマイクロカプセル化することによって形成され得る。得られた微粒子を、ｐＨ感受性ポリマー、好ましくはＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）、最も好ましくはＥＰＯによってさらにコーティングまたはカプセル化して、最終的な微粒子を得る（第２のステップ）。一部の形態では、最終的な微粒子は、第１のステップからの微粒子を、ｐＨ感受性ポリマー、好ましくはＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）、最も好ましくはＥＰＯの溶液に分散させることによって形成される。好ましい形態では、ｐＨ感受性ポリマーの溶液のための溶媒は、有機溶媒、例えば塩化メチレンである。ｐＨ感受性ポリマーベースの微粒子は、マイクロカプセル化技術、例えば位相反転ナノカプセル化、噴霧乾燥、およびスピニングディスク微粒化によって作製することができる。
【０１１８】
Ｅ．水溶性および脂溶性微量栄養素の同時カプセル化
水溶性および脂溶性微量栄養素の同時カプセル化は、図１Ａに示されるものに類似の２ステッププロセスを使用して実施することができる。１つまたは複数の水溶性微量栄養素、例えば水溶性ビタミンおよび微量ミネラルは、最初に、親水性または両親媒性マトリクスポリマー、例えばＨＡ、ゼラチン、およびその誘導体によって形成された微粒子にカプセル化される（第１のステップ）。水溶性微量栄養素が、鉄補給剤、例えば硫酸鉄であるか、またはそれを含有する場合、鉄補給剤の酸化を回避するためにビタミンＣが含まれてよく、あるいは、ＨＡまたはその誘導体を、マトリクスポリマーとして使用して、微粒子を形成することができる。
【０１１９】
第２のステップでは、第１のステップからの水溶性微量栄養素をカプセル化する微粒子を、ｐＨ感受性ポリマー、好ましくはＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）、最も好ましくはＥＰＯを含有する溶液に分散させる。好ましい形態では、ｐＨ感受性ポリマーの溶液のための溶媒は、有機溶媒、例えば塩化メチレンである。次に、第１のステップからの微粒子を添加する前または添加した後に、脂溶性微量栄養素、例えば脂溶性ビタミンをポリマー溶液に添加する。水溶性および脂溶性微量栄養素の両方をカプセル化する、ｐＨ感受性ポリマーベースの微粒子は、マイクロカプセル化技術、例えば位相反転ナノカプセル化、噴霧乾燥、およびスピニングディスク微粒化によって作製することができる。
【０１２０】
Ｆ．押出しおよび／または製粉
一部の形態では、１つまたは複数の微量栄養素のコーティングまたはカプセル化は、押出しを使用した後、必要に応じて製粉することによって達成することができる。押出しは、溶媒を用いない／非水性プロセスである。噴霧乾燥と比較して、この方法は、ハイスループットを達成することができ、利用性がより高い。押出しは、固体繊維を作製することができ、その後それを製粉して、粉末化生成物を得ることができる。
【０１２１】
一部の形態では、固体形態または液体形態のいずれかの１つまたは複数の微量栄養素が、ＥＰＯと混合される。混合物の凍結乾燥を実施して、溶媒を除去することができる。得られた固体混合物の製粉を実施して、均一な粉末を得ることができ、それを乾燥するまでさらに凍結乾燥させることができる。均一な粉末を、必要に応じて加熱条件下で、例えば約８０〜約１５０℃の間、約９０〜約１２０℃の間、または１００〜約１０５℃の間で押出し機に充填する。押し出された繊維をさらに製粉して、微量栄養素含有粉末を作製することができ、それを乾燥するまで凍結乾燥させることができる。
【０１２２】
製粉プロセスは、異なる物理的特性を有する微量栄養素含有粉末を作製するために、多種多様な条件下で実施することができる。例えば、製粉プロセスは、室温または低温で実施することができる。製粉プロセスは、Ｆｉｔｚミリングまたはジェットミリングによって実施することができる。
【０１２３】
保存安定性を改善するため、すなわちケーキングを回避するために、最終製粉ステップの前、その最中、または後に、乾燥（ｄｙｉｎｇ）助剤を添加することができる。
【０１２４】
Ｇ．薬物動態および安定性
微量栄養素は、マイクロカプセル化技術、例えば噴霧乾燥およびスピンディスク微粒化を使用して、ｐＨ応答性ポリマー内にカプセル化される。粒子中の微量栄養素の放出動態は、ポリマーが溶解するｐＨおよびコーティング厚さなどの様々な因子に依存して変わる。一部の実施形態では、コーティングの厚さは、約１オングストローム〜数百ミクロンである。一部の実施形態では、コーティングの厚さは、約５〜約２００ミクロン、好ましくは約１０〜約１００ミクロン、より好ましくは約１０ミクロン〜約７５ミクロン、最も好ましくは約２０ミクロン〜約５０ミクロンである。
【０１２５】
粒子の活性および安定性は、当技術分野で公知の技術、例えばＥＬＩＳＡ、比色アッセイ、元素分析、質量分析法、および／またはＨＰＬＣを使用して評価することができる。粒子中の薬剤のいずれかが、互いに有害に反応するかどうかを決定するために、コンビナトリアル栄養カプセル化研究を実施することができる。
【０１２６】
好ましい実施形態では、粒子は、調理に等価な条件（例えば、水中１００℃で２時間沸騰させる）、ならびに／または高湿度（７５％）および熱（４０℃）条件下での長期保存（少なくとも６０日）に等価な条件下で、安定性について試験される。ビタミンおよび他の生物活性化合物は、出発生物活性（すなわち、粒子形成前の生物活性）の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００％を保持しているべきである。
【０１２７】
一部の形態では、粒子は、ｐＨ１．５の模擬胃液中３７℃で２時間以内、１時間以内、または３０分以内に、微量栄養素ペイロードの＞８０％を放出する。一部の形態では、粒子は、ｐＨ１．５の模擬胃液中３７℃で２時間以内、１時間以内、または３０分以内に、微量栄養素ペイロードの＞９０％を放出する。一部の形態では、粒子は、ｐＨ１．５の模擬胃液中３７℃で２時間以内、１時間以内、または３０分以内に、微量栄養素ペイロードの＞９５％を放出する。
【０１２８】
一部の形態では、粒子は、１００℃の水に２時間曝露された後、微量栄養素ペイロードの＞８０％を保持している。一部の形態では、粒子は、１００℃の水に２時間曝露された後、微量栄養素ペイロードの＞８５％を保持している。一部の形態では、粒子は、１００℃の水に２時間曝露された後、微量栄養素ペイロードの＞９０％を保持している。
【０１２９】
一部の形態では、粒子は、カプセル化微量栄養素ペイロードを安定化する。鉄を含有する微量栄養素製剤の安定性の基準は、鉄補給剤が、沸騰水に２時間曝露されるか、または高湿度（例えば、６０〜７５％、例えば７５％）において保存温度（例えば、−４〜４０℃、例えば４０℃）に長期間（例えば、１４〜６０日、例えば１４、２８、および６０日）曝露された後、カプセル化された場合の生物活性と比較して、その生物活性の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％超を喪失する点まで酸化しないことである。ビタミンを含有する微量栄養素製剤の安定性の基準は、ビタミンが、沸騰水に２時間曝露されるか、または高湿度（例えば、６０〜７５％、例えば７５％）において保存温度（例えば、−４〜４０℃、例えば４０℃）に長期間（例えば、１４〜６０日、例えば１４、２８、および６０日）曝露された後、カプセル化された場合の生物活性と比較して、その生物活性の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％超を喪失しないことである。
【０１３０】
Ｈ．塩のコーティング
１つまたは複数の微量栄養素をカプセル化する微粒子は、当技術分野で公知の技術を使用して、１つまたは複数の塩（または他のコーティング材料）でコーティングすることができる。好ましい方法は、流動床を使用する。他の適切な技術には、ポリマージャケット上での塩の結晶化、ならびに湿式および乾式塩製造技術が含まれる。塩でコーティングされた最終的な粒子の直径は、変わり得るが、典型的に約５００ミクロン〜約１０００ミクロン（１ｍｍ）である。
【０１３１】
ＩＶ．使用方法
製剤、例えば強化塩製剤は、食品の調製および調理中に使用するためにパッケージされ、流通させることができる。製剤は、小麦粉および他の食物を強化するための塩コーティング（または他のコーティング）を伴わずに使用することができる。製剤は、液体および固体滅菌に耐えることができ、それによって、飲料、液体食品、または固体食品の調製に有用となる。
【０１３２】
製剤は、特に栄養障害および／または微量栄養素欠乏の影響を受けやすい集団、例えば発展途上国および深刻な干ばつに苦しむ国の小児および成人において、このような病弊を処置または防止するために使用することができる。製剤は、それを必要とする集団によって使用されるように、食品ビヒクルに組み込むことができる。それを必要とする集団によって一般に消費される食品ビヒクルには、高い変動性があるため、製剤を、小麦粉、調理油、糖、および塩を含む様々な食品ビヒクルと共に使用し、それらに組み込むことができる。
【０１３３】
一部の実施形態では、粒子は、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ、ＤおよびＥ、モリブデン、クロム、セレン、ヨウ素、銅、マンガン、亜鉛および鉄を含む必須微量栄養素の１つまたは複数を含有する。粒子に組み込まれる微量栄養素の量は、特定の微量栄養素のＲＤＡに基づき得る。例えば、微量栄養素の量は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％ＲＤＡに基づき得る。
【０１３４】
一部の実施形態では、製剤は、標的集団が健康な個体を含む母集団である、普遍的強化のために使用される。製剤は、ヨウ素については１００％ＲＤＡまで、他のすべての微量栄養素については５０％ＲＤＡまたはそれ未満含有することができる。他の実施形態では、製剤は、標的集団が、微量栄養素が欠乏する家庭である、標的化された強化のために使用される。製剤は、例えば、６〜５９カ月齢の小児については１００％ＲＤＡまで含有することができる。
【０１３５】
特定の実施形態では、２ｇ／日の製剤は、小児については１００％ＲＤＡまで、微量栄養素であるヨウ素（０．０９ｍｇ／日）、亜鉛（４．１ｍｇ／日）、葉酸（０．１５ｍｇ／日）、ビタミンＢ１２（０．０００９ｍｇ／日）、ビタミンＡ（０．４ｍｇ／日）、ビタミンＣ（３０ｍｇ／日）、ビタミンＤ（０．００５ｍｇ／日）、および／または鉄（１０ｍｇ／日）を提供することができる。
【０１３６】
他の実施形態では、５ｇ／日の製剤は、成人女性については５０％ＲＤＡまで、微量栄養素であるヨウ素（０．０７５ｍｇ／日）、亜鉛（８ｍｇ／日）、葉酸（０．２ｍｇ／日）、ビタミンＢ１２（０．００１２ｍｇ／日）、ビタミンＡ（０．４５ｍｇ／日）、ビタミンＣ（３７．５ｍｇ／日）、ビタミンＤ（０．００７５ｍｇ／日）、および／または鉄（９ｍｇ／日）を提供することができる。
【０１３７】
他の実施形態では、製剤は、様々な食物および必需品に使用することができる。例えば、製剤は、食品成分、例えば塩、糖、油、小麦粉、重曹、ベーキングパウダー、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン）、バター、ショートニング、ミール（例えば、コーンミールまたは他の穀類ミール）、コーヒー、茶、香辛料、香味料、エキス等を構成することができ、またはそれらに含まれ得る。製剤を組み込むことができる食品の例として、飲料、例えば乳、水、ソーダおよび他の炭酸飲料、スポーツドリンク、ジュース、焼成品、例えばパン、ケーキ、クッキーおよびパイ、加工食品、例えばヨーグルト、チーズ、ならびに栄養バーまたはエネルギーバーが含まれる。
【０１３８】
他の実施形態では、製剤は、供給原料に組み込むなどの農業的目的のために使用される。ミネラルおよび塩は、動物の健康にとって必須であり、有害な気候条件および保存下でこれらの製剤の完全性を維持することは困難である。これらの製剤は、天候に対して抵抗性があり、熱および高湿度での保存において安定である。ｐＨ依存性放出の利点は、取込みが最も有効な胃腸管領域、例えば第一胃で最大限放出するように製剤を設計できることである。そうでなければ別個に投与しなければならないはずのビタミンおよび薬、例えば駆虫剤を組み込むことによって、さらなる利益が得られる。
【０１３９】
本発明は、以下の非限定的な例を参照することによって、さらに理解されよう。
【０１４０】
保存および調理条件中にカプセル化ＭＮペイロードを保護することができるｐＨ応答性微粒子（「ＭＰ」）を開発した。ＭＮ−ＭＰは、胃腸管、例えば胃の条件下での急速な可溶化によってペイロード放出を制御して、下流の腸内でのＭＮ吸収を容易にするように設計した。
【０１４１】
別個の物理的および化学的特性を有する複数のＭＮ（すなわち、脂溶性および水溶性ＭＮの両方）の、組合せ強化のための単一粒子での同時カプセル化、保護、および放出を、例えばビタミンＡ、Ｄ、Ｂ９およびＢ１２について達成した。次に、この実験室規模の技術を使用して、鉄をカプセル化し、ヒトに吸収させた。鉄欠乏は、先進国および発展途上国世界の両方の集団に影響を及ぼす、世界的に最も甚大な被害をもたらす栄養欠乏である。例えば、十分な鉄の摂取は、乳児および小さい小児の発達（例えば、行動、認知および精神運動技能）にとって非常に重要なので、鉄欠乏は、発展途上国世界では特に破壊的である。慢性腎疾患に罹患している患者は、鉄欠乏性貧血に罹患することが多いので、鉄欠乏は、先進国世界にも影響を及ぼす。したがって、著しく多くの努力が、先進国および発展途上国の両方における鉄欠乏に取り組んでいる。
【０１４２】
このＭＮ−ＭＰ技術は、ヒト治験では実験室から診療所へ、鉄の非侵襲的送達のための１ｋｇを超えるバッチの合成では実験室規模から工業的に関連するプロセスへと橋渡しされてきた。
【０１４３】
治療技術の臨床的および商業的橋渡しは、実験室レベル（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ）、臨床レベル（例えば、ヒトにおける臨床研究）、および商業／工業レベル（例えば、実験室規模の合成手法から工業規模への橋渡し）での試験から生じる課題によって、しばしば制限される。ＭＮ−ＭＰ送達系は、実験室規模の乳化プロセスを使用して開発され、水溶性および脂溶性ＭＮの両方を同時にカプセル化し、ＭＮペイロードの漏出を防止し、制御されたｐＨ応答性放出をもたらし、調理条件（水中１００℃）下でカプセル化ＭＮの化学的および生物学的安定性を維持することが示された。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ペイロードを胃内で部位特異的に制御放出して、ペイロードと腸の相互作用を容易にすることが確認された。実験室で合成された鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰを、ヒトの臨床試験による吸収研究で調査すると、ＭＰは、食事による経口送達によって鉄を送達するのに有効であることが示された。臨床試験後に、実験室規模の乳化プロセスからの粒子合成を、工業的に関連するプロセス、例えば噴霧乾燥およびスピニングディスク微粒化法へと橋渡しすることに成功した。噴霧乾燥およびスピニングディスク微粒化から合成した鉄ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰは、実験室規模と類似の性能を示した。
【０１４４】
カプセル化、放出、およびＭＮ保護挙動の成功に基づいて、（ｉ）脂溶性ビタミンＡ、（ｉｉ）脂溶性ビタミンＤ、（ｉｉｉ）水溶性ビタミンＢ９、および（ｉｖ）水溶性ビタミンＢ１２の４種の別々のビタミンの同時カプセル化による複数のＭＮの同時送達のためのＭＮ送達プラットフォームを使用することもできる。ビタミンＡは、形態形成、成長、成熟、視覚、生殖および免疫に関与する多くを含めて、ヒトの体内で非常に重要な生理的プロセスを調節するので、ビタミンＡを選択した。「ホルモン様」と説明されることが多いビタミンＤは、健康な骨を維持し、カルシウムおよびリン吸収を増大し、骨組織へのミネラル再吸収を改善するのに必須なので、ビタミンＤを選択した。ビタミンＢ９は、骨髄における循環赤血球および白血球の形成を媒介し、ヘム形成の担体として作用する。ビタミンＢ１２は、ＤＮＡの合成および修復において非常に重要な役割を果たし、神経機能に対して不可欠な影響を有する。
【０１４５】
まとめると、これらのＭＮの世界的な欠乏は、推定２０億人に生じており、世界的なそれらの強化への必要性は、まだ満たされていない。さらに、単一ＭＮ欠乏に罹患している個体は、少なくとも１〜５種の他のＭＮ欠乏に罹患していることが多い。したがって、単一製剤で複数のＭＮを送達することができる送達手法は、著しい影響を及ぼす潜在可能性を有する。
【０１４６】
同時カプセル化されたＭＮ製剤について、室温水および沸騰水の両方で観察されたＭＮペイロード漏出の制限は、同時カプセル化されたビタミンと、調理に関与する化学的に反応性の他の化合物との相互作用が防止されることを示している。ビタミンＡおよびＤの２種の脂溶性ＭＮの分解についても、様々な条件下で十分に研究され、報告されている。ビタミンＡは、５個のコンジュゲートした二重結合を含有しており、したがって、高温におけるおよび光曝露中の酸化の影響を受けやすい。ビタミンＡが酸化すると、そのバイオアベイラビリティが低下し、不快な味ももたらす。ビタミンＡ、Ｂ９、およびＢ１２と共に同時カプセル化されたビタミンＤも、高温において、および光に曝露すると不安定になり、それによって、摂取時にバイオアベイラビリティが低下する。研究では、熱処理および光曝露後のカプセル化ビタミンＡおよびＤの両方の回収が、同一条件下での等量の非カプセル化ビタミンＡおよびＤの回収よりも著しく高かったことが示された。同時カプセル化された水溶性ビタミンＢ９およびＢ１２については、カプセル化または非カプセル化形態のいずれでも、調理条件下での分解は記録されなかった。これらの結果は、ビタミンＢ９およびＢ１２の両方が熱的に安定であることを示した、既に報告されている研究と合致する。全体的に、ＭＰ送達系は、模擬調理条件下で水溶性ＭＮの安定性を有効に維持し、脂溶性ＭＮの場合には調理安定性および光に対する保護を増大した。
【０１４７】
単一鉄ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰカプセル化について、類似の安定性結果が示された。具体的には、水中で２時間沸騰させた後、ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰについて、生体利用可能な第一鉄のより高い保持が示された。さらに、ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰカプセル化の結果として、食品の色をマイナスに変色させるバナナミルクのポリフェノールとの相互作用が、著しく低減した。つまり、ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰへの鉄のカプセル化は、カプセル化鉄の安定性を劇的に改善し、鉄と、食品中に存在する他の分子との間の相互作用も防止した。早すぎるペイロード漏出および熱媒介性ＭＮ分解の制限に加えて、胃の酸性環境における鉄の急速な放出は、非常に重要な要件である。これは、鉄吸収が、胃を空腸につなぐ短いセグメント（２５〜３８ｃｍ）である小腸の十二指腸でほぼ排他的に生じるからである。したがって、十二指腸の長さが短く、十二指腸における食品の通過時間が短いことを考慮すると、鉄が十二指腸内で放出される場合、吸収される量は制限される。したがって、胃内でのペイロードの急速な制御放出は、非常に重要である。研究では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの鉄の急速な放出が、調理前および調理後（水中で２時間沸騰）で示された。
【０１４８】
これをマウスでｉｎ  ｖｉｖｏにおいても調査すると、胃内での粒子の溶解が急速に生じ（＜６０分）、放出されたペイロードは、主に小腸と相互作用した。全体的に、ＭＰは、胃内でカーゴを効率的に放出すると予測され、そのことは、有効性研究における最適な吸収に橋渡しすることができる。鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰがヒトに鉄を送達する有効性を試験して、このことを実証した。
【０１４９】
ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰ技術は、非カプセル化鉄と比較して、著しく低い相対的バイオアベイラビリティ（ＲＢＶ）を示した。このＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰ鉄のＲＢＶの低下は、非カプセル化鉄の約４５％であったが、このことは、カプセル化が、鉄吸収に対して阻害効果を有することを示唆している。鉄のポリマーカプセル化は、６０：４０のポリマー：鉄比を使用する場合、鉄の吸収をおよそ２０％阻害し得ることが周知である。この研究では、ポリマー：鉄比は劇的に高かった（約９９．５：０．５）。マイクロカプセル化鉄製剤は、調理条件および未調理条件で統計上差がないことを示したが、このことは、ＥＰＯ−マトリクスが調理中にカプセル化鉄を保護することを示している。
【実施例】
【０１５０】
（実施例１：保存および調理条件中にカプセル化ＭＮペイロードを保護することができるｐＨ応答性ＭＰ）
材料および方法
この研究は、調理中のＭＮの安定性を改善すると同時に、胃内環境でのペイロードの放出を制御することができる、ＭＰベースのＭＮ送達系を開発するために行った。ＭＮの放出プロファイルおよび熱安定性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで研究し、ポリマー性ＭＰの溶解をマウスで調査し、最後に、鉄強化粒子の吸収を、ヒト被験体で評価した。動物研究は、マサチューセッツ工科大学（ＭＩＴ）の動物管理委員会によって承認され、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｋｏｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈで実施された。ヒト被験体を含む臨床研究は、ＭＩＴのＣｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎｓ  ａｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ（ヒト研究１：ＣＯＵＨＥＳ番号１５０２００６９３２、ヒト研究２：ＣＯＵＨＥＳ番号１８０１２０１４４８／１８０１２０１４４８Ａ００１）およびＥＴＨ  Ｚｕｒｉｃｈの倫理委員会の両方によって承認され、ＥＴＨ  Ｚｕｒｉｃｈ（ヒト研究１：ＫＥＫ−ＺＨ−Ｎｒ．２０１５−００９４、ヒト研究２：ＫＥＫ−ＺＨ−Ｎｒ．２０１７−０１６２４）で実施された。すべてのヒト被験体には、インフォームドコンセントが提供された。これらの研究は、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖに、ヒト研究１では識別番号ＮＣＴ０２３５３３２５で、ヒト研究２ではＮＣＴ０３３３２６０２で登録された。ヒト研究１で使用した粒子は、ＭＩＴで生成し、ヒト研究２で使用した粒子は、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸのＳｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳｗＲＩ）で生成した。
【０１５１】
ＨＡ−ＭＰの製剤化
ＨＡ−ＭＰを、改変逆乳化技術を使用して製剤化した（Ｊｈａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ，  ｄｏｕｂｌｙ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２，  ２４６６−２４７８  （２０１１））。特定のポリマー、溶媒および界面活性剤、ならびに微量栄養素に関して記載するが、これらは、他の材料の代表的なものであり、ごく日常的な最適化により使用することができると理解される。
【０１５２】
簡潔には、１２０μｌのＳＰＡＮ（登録商標）８０を含有する鉱物油（３０ｍｌ）中ＨＡ溶液（低分子量ＨＡ、Ｍｎ＝３８４ｋＤａ、Ｍｗ＝８０３ｋＤａ、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、脱イオン水２ｍｌ中１ｗｔ％）を、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｌ５Ｍ−Ａ実験室ミキサー（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して１０分間ホモジナイズすることによって、ブランクＨＡ−ＭＰのエマルションを調製した。ＭＮカプセル化ＨＡ−ＭＰを調製するために、ビタミンＢ９、Ｂ１２および硫酸鉄七水和物を、それぞれ５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌおよび７３．８ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＨＡ水溶液（脱イオン水２ｍｌ中１ｗｔ％）に溶解した。次に、得られた溶液を、前述の通りエマルションの調製のために使用した。
【０１５３】
エマルションの水相を、常に撹拌しながら４５℃で２４時間蒸発させた。次に、得られたＨＡ−ＭＰを、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって単離した。ＨＡ−ＭＰを、ヘキサンおよびアセトンで十分に洗浄した後、真空下で一晩乾燥させた。蛍光標識ＨＡ−ＭＰを調製するために、アルデヒド基を含有するＨＡ誘導体（ＨＡ−ＣＨＯ）を、最初に、報告されている手順に従って過ヨウ素酸ナトリウムを使用して合成した（Ｊｉａ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏｇｅｌｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｇｅｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｆｏｒ  ｖｏｃａｌ  ｆｏｌｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ７，  ３３３６−３３４４  （２００６）。酸化によって、ＨＡの鎖開裂が引き起こされるので、高分子量ＨＡ（Ｍｎ＝１０９６ｋＤａ、Ｍｗ＝２６９８ｋＤａ、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用した。得られたＨＡ−ＣＨＯの分子量を、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって分析した。修飾度は、ヨード滴定法によって６５％と定量化された（Ｊｈａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｏｕｂｌｙ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ４２，  ５３７−５４６  （２００９））。
【０１５４】
蛍光性ＨＡ−ＭＰを製剤化するために、ＨＡ−ＣＨＯおよび非修飾ＨＡを、重量比（１：１）で混合し、次にそれを使用して、前述の通り逆乳化法によってＭＰを調製した。色素標識するために、アルデヒド基を含有するＨＡ−ＭＰ１ミリグラムを、ＣＦ（商標）４０５Ｍ（アミノオキシ基を含有する蛍光色素、Ｂｉｏｔｉｕｍ  Ｉｎｃ．）のメタノール溶液に分散させた。酢酸（５μｌ）を添加して、反応を加速させた。次に、反応を室温で１２時間進行させた。色素標識粒子を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）によって収集し、メタノールを使用して十分に洗浄した後、真空下で乾燥させた。
【０１５５】
ＥＰＯ−ＭＰおよびＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰの製剤化
ＥＰＯ−ＭＰを、改変Ｏ／Ｗ乳化法（Ｋｅｍａｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒａｂｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５，  １０３−１０８  （２０１２））によって調製した。微量栄養素を、１ステップ（図１Ａ）または２ステップ（図１Ｂ）乳化プロセスを使用して、ＥＰＯ−ＭＰに個々にカプセル化した。特定のポリマー、溶媒および界面活性剤、ならびに微量栄養素に関して記載するが、これらは、ごく日常的な最適化により使用することができる他の材料の代表的なものであると理解される。
【０１５６】
エマルションの有機相は、（ａ）塩化メチレン中１００ｍｇ／ｍｌのＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＥＰＯ（Ｍｎ＝１５３ｋＤａ、Ｍｗ＝２４９８１ｋＤａ、およびガラス転移温度＝４５℃、Ｅｖｏｎｉｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）溶液１ｍｌに均一に分散させたブランクもしくは色素標識ＨＡのＭＰ１ミリグラム、（ｂ）４種の異なる種類の微量栄養素と同時カプセル化されたＥＰＯのＭＰを調製するための、塩化メチレン中ＥＰＯ溶液（１００ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌ）に溶解させたビタミンＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）、ビタミンＤ（２ｍｇ／ｍｌ）、葉酸負荷ＨＡのＭＰ（１．３ｍｇ）およびＢ１２負荷ＨＡのＭＰ（１．３ｍｇ）、（ｃ）様々な微量栄養素負荷を有するＨＡ−ＥＰＯのＭＰおよびＧｅのＭＰを合成するための、表２に記載される通りの様々な微量栄養素とカプセル化したＨＡのＭＰもしくはＧｅのＭＰ、（ｄ）様々な微量栄養素負荷を有するＥＰＯのＭＰを合成するための、表２に記載される通りの遊離微量栄養素、または（ｅ）蛍光標識ＥＰＯのＭＰを合成するための、塩化メチレン中１ｍｇ／ｍｌの親油性カルボシアニンＤｉＯＣ１８（７）色素（ＤｉＲ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１００ｍｇ／ｍｌのＥＰＯのいずれかからなっていた。次に、得られた有機相を、３００ｒｐｍの速度で１０分間撹拌しながら１０ｍｇ／ｍｌのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液２０ｍｌ中で乳化させた。得られたエマルションを、撹拌下で（５００ｒｐｍで１０分間）脱イオン水１００ｍｌに添加して、ＭＰを固化させた。得られたＭＰを、重力によって沈降させ、水で十分に洗浄した。最終的な乾燥ＭＰを、凍結乾燥によって得た。
【０１５７】
特に、４種の異なるＭＮと同時カプセル化されたＥＰＯ−ＭＰを調製するために、ビタミンＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）およびビタミンＤ（２ｍｇ／ｍｌ）を塩化メチレン中ＥＰＯ溶液（１００ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌ）に直接的に溶解させ、次に、Ｂ９負荷ＨＡ−ＭＰ（１．３ｍｇ）およびＢ１２負荷ＨＡ−ＭＰ（１．３ｍｇ）を上述の溶液に分散させた。
【０１５８】
ＭＰの形態学的特徴付け
３つの異なる顕微鏡的方法、すなわち、光学顕微鏡法（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＭＸ４０）、走査電子顕微鏡法（ＪＥＯＬ  ５９１０  ＳＥＭ）、および共焦点顕微鏡法（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００共焦点レーザー走査型）を使用して、ＭＰのサイズ、形態、および横断面を特徴付けた。乾燥ＭＰを、Ｐｔ／Ｐｄでコーティングした後、ＳＥＭイメージングを行った。色素標識ＨＡ−ＭＰを、共焦点顕微鏡によって、４２０〜４７５ｎｍのバンドパスフィルタを用いて、励起波長４０５ｎｍで可視化した。記録された平均粒子直径を、ＳＥＭ画像からの少なくとも２０カウントの粒子に基づいて、ＩｍａｇｅＪを使用して推定した。
【０１５９】
ＭＮ負荷含量およびカプセル化効率
ビタミンＢ２、Ｂ３（ナイアシン）、Ｂ９（葉酸）、Ｂ１２、ＡおよびＤを、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）によって、Ｃ−１８カラム（Ａｃｃｌａｉｍ（商標）ＰｏｌａｒＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＩＩ、３μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を使用して分析し、フォトダイオード検出器によってそれぞれ２６５、２６５、２８６、５５０、３２５、および２６４ｎｍで検出した。鉄、ビオチン、亜鉛およびビタミンＣを、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ比色アッセイキットによって分析し、ビタミンＢ７（ビオチン）を、Ｓｉｇｍａ比色アッセイキットによって分析した。ヨウ素を、２８８ｎｍにおけるＵＶ−Ｖｉｓ吸光度を使用して測定した。
【０１６０】
微量栄養素負荷ＨＡのＭＰを水に溶解させ、微量栄養素含量を、それぞれの微量栄養素ごとに前述の通り決定した。
【０１６１】
ＥＰＯのＭＰにおける微量栄養素負荷を定量化するために、公知の質量のＥＰＯのＭＰを、最初にＳＧＦに溶解させ、次に１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液を添加して、ｐＨを中和した。沈殿したＥＰＯを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離機フィルター（３０００ＮＭＷＬ）を使用す１４０００×ｇで３０分間にわたるる遠心分離によって、除去し、上清に溶解した微量栄養素を分離し、前述の通り定量化した。
【０１６２】
ビタミンＡおよびＤ負荷を定量化するために、ＥＰＯのＭＰを塩化メチレンに溶解させ、溶解したビタミンＡおよびＤを分離し、前述の通り定量化した。
【０１６３】
公知の量のＤｉＲ負荷ＥＰＯ−ＭＰを、ＤＭＳＯに溶解させ、次に溶解したカーゴを、マルチモードリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ２００  ＰＲＯ）を７５０ｎｍで使用して定量化した。
【０１６４】
負荷含量（ＬＣ）を、粒子１ｍｇ当たりのＭＮの量（μｇ）として定義した。カプセル化効率（ＥＥ）を、粒子に負荷されたＭＮの量を、乳化プロセス中に最初に添加されたＭＮの量で割ることによって算出した。
【０１６５】
ＭＮのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出
ＭＰからの微量栄養素の放出プロファイルを、３つの異なる環境で研究した。
（ａ）室温の水、
（ｂ）１００℃の沸騰水、および
（ｃ）３７℃のＳＧＦ（ｐＨ１．２）。
【０１６６】
所定の時点において、すべての試料を、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、分析のために上清９００μｌを収集し、次に試料に、新しい放出媒体９００μｌを補充した。具体的には、ビタミンＡおよびＤでは、水性放出媒体を塩化メチレンの層と接触させ、次に有機相内の抽出脂溶性ビタミンを、分析のために使用した。ＭＮごとの定量化法は、先に記載される。累積放出は、最初に負荷された量に対する、特定の時点に放出されたＭＮの総量として算出した。
【０１６７】
ＭＮの安定性
乾燥微量栄養素負荷ＭＰを、水に分散させ、次に１００℃で２時間加熱した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清およびＭＰの両方における、化学的に安定なＭＮを、前述の通りの方法を使用して定量化した。安定性パーセンテージは、ＭＰ中のＭＮの実際の負荷含量に対してＨＰＬＣによって決定される通りの加熱後の安定なＭＮの比に等しい。非カプセル化形態の試料については、水に溶解させるか（水溶性ビタミン、例えばビタミンＢ９およびＢ１２）、または水に分散させた（脂溶性ビタミン、例えばビタミンＡおよびＤ）後、２時間加熱した。鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰを水に分散させ、次に１００℃で２時間加熱し、前述の通り、第一鉄および第二鉄含量について分析した。
【０１６８】
バナナミルク実験では、強化濃度は、食品の生重量当たり１５ｐｐｍの鉄であり、したがって、可食部１００ｇは、Ｆｅ１．５ｍｇを含有するはずである。バナナミルク試験を室温で実施した。色測定を、Ｍｉｎｏｌｔａ  Ｃｈｒｏｍａ  ｍｅｔｅｒ  ＣＲ−３００、コニカミノルタ）を使用して０、１５、３０、６０、１２０、および１４４０分（２４時間）目に行った。試料を、２００ｒｐｍで２時間撹拌し、４℃で一晩保存した。変色は、色差の方向ではなく、絶対的な色差であるΔＥで表される。ＦｅＳＯ４およびピロリン酸鉄（ＦｅＰＰ、２０％Ｆｅ、微粒子化粉末）を、陽性対照および陰性対照として使用した。
【０１６９】
結果
粒子合成および特徴付け
水溶性ＭＮ（図１Ａ）および脂溶性ＭＮ（図１Ｂ）について、物理的および化学的に別個のＭＮに関する製剤化の課題に対処するために、別々の乳化ベースのカプセル化手法を開発した。カプセル化マトリクスのためのポリマーの選択は、最終的に性能を決定し、したがって、ＭＰ強化物（ｆｏｒｔｉｆｉｃａｎｔ）の潜在的な影響を決定する。ＭＰの外側マトリクスは、胃の酸性条件での急速な分解およびその後のペイロード放出を容易にする、食品グレードのｐＨ応答性のメタクリレートベースのコポリマーであるＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＥＰＯからなる。酸性条件でのＭＰ分解は、胃内でペイロードの放出を達成して、適切な腸管吸収を確保するために必須である。中性条件でのＭＰ安定性は、しばしば見落とされる強化物の要件であり、この要件が達成されると、ＭＮを分解させ、したがって強化によって得られる健康上の利益を最小限に抑えるおそれがある調理条件（例えば、沸騰水中）における早すぎるペイロード放出が防止される。
【０１７０】
個々のＭＮをカプセル化する実験室規模のＭＰごとの製剤パラメーターおよび負荷を、表２に示す。
【０１７１】
【表２】
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【０１７２】
水溶性ＭＮのカプセル化では、２ステップ乳化プロセス（図１Ａ）を使用し、最初に油中水（Ｗ／Ｏ）乳化ステップを使用してヒアルロン酸（ＨＡ）−ＭＰ（ＨＡ−ＭＰ）またはゼラチン（Ｇｅ）−ＭＰ（Ｇｅ−ＭＰ）に水溶性ＭＮをカプセル化した。ＨＡは、ヒトの身体の至る所に見出される普遍的な非硫酸化グリコサミノグリカンであり、ＨＡの経口補給およびビタミン安定性の増強のために使用されることが多い。ＨＡ−ＭＰおよびＧｅ−ＭＰをＳＥＭによって調査すると、滑らかな表面を有する球形粒子の存在が明らかになった。ＨＡ−ＭＰおよびＧｅ−ＭＰの平均サイズは、直径およそ５μｍであると決定された。例えば、ＨＡ−ＭＰの平均サイズは、４±２μｍと推定された。第２のステップでは、水中油（Ｏ／Ｗ）乳化を使用して、ＨＡ−ＭＰまたはＧｅｌ−ＭＰをＥＰＯマトリクス内にカプセル化して、最終的なＥＰＯのＭＰ中ＨＡ（ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰ）またはＥＰＯのＭＰ中Ｇｅ（Ｇｅ−ＥＰＯ−ＭＰ）を合成した。ＨＡの横断面のＳＥＭおよび蛍光標識により、ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰは、粒子の中に粒子が存在する階層的構造を示していることが明らかになった。
【０１７３】
脂溶性ＭＮのカプセル化では、単一ステップ乳化プロセス（図１Ｂ）を利用して、ＭＮをＥＰＯマトリクスに直接的にカプセル化した（ＥＰＯ−ＭＰ）。この場合、横断面のＳＥＭにより、ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰの階層的構造は、ＨＡ−ＭＰなしのＥＰＯ−ＭＰには存在しないことが明らかになった。
【０１７４】
ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰ、Ｇｅ−ＥＰＯ−ＭＰ、およびＥＰＯ−ＭＰは、滑らかな表面および直径およそ２００μｍのサイズを有する球形の形状を示した。例えば、ＥＰＯ−ＭＰおよびＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰのサイズは、２１４±１６μｍと算出された。
【０１７５】
特に、図１Ｂに示される単一ステップ乳化プロセスは、水溶性ＭＮをカプセル化するために使用することもできる。ビタミンＣ、ビタミンＢ２、亜鉛およびヨウ素を含む個々の水溶性ＭＮをカプセル化するＥＰＯ−ＭＰを生成した（表２）。
脂溶性および水溶性微量栄養素の個々のカプセル化および放出
【０１７６】
ビタミンＡおよびＤを含む代表的な脂溶性ＭＮ、ならびにビタミンＢ２、Ｂ３（ナイアシン）、Ｂ７（ビオチン）、Ｂ９（葉酸）およびＢ１２、亜鉛、ヨウ素を含む代表的な水溶性ＭＮ、ならびに鉄を、モデルＭＮとして使用して、脂溶性および水溶性ＭＮのためのカプセル化手法を確立した。これらの代表的なＭＮをカプセル化するＭＰの製剤を、表２にまとめる。ビタミンＡ、Ｂ２、ＣおよびＤ、亜鉛、ならびにヨウ素を、１ステップ乳化プロセスによって個々にカプセル化し、ビタミンＢ３（ナイアシン）、Ｂ７（ビオチン）、Ｂ９（葉酸）およびＢ１２、ならびに鉄を、２ステップ乳化プロセスによって個々にカプセル化した。
【０１７７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出研究により、室温（ＲＴ）水および沸騰（１００℃）水の両方に曝露した後のＭＰにおける微量栄養素の保持を確認した（図２Ａ〜２Ｋ）。粒子を、ｐＨ１．５における３７℃の模擬胃液（ＳＧＦ）に曝露すると、ｐＨ応答性バースト放出が示された。ビタミンＡなどの微量栄養素は、高温または多湿に曝露されると化学的分解を受けるので、沸騰水中２時間の間の微量栄養素の保持を、模擬調理条件下のＭＰ安定性のベースライン指数として使用した。１ステッププロセスでは、個々にカプセル化されたほとんどの微量栄養素について、１００℃またはＲＴの水中での保持が達成され（１２０分目に＞８０％）、３７℃のＳＧＦでは急速な放出が達成される（３０分目に＞８０％）ことが確認された（図２Ａ〜２Ｆ）。ＥＰＯマトリクス内の水溶性の高い微量栄養素をさらに安定化するために、２ステッププロセスを開発した（図２Ｇ〜２Ｋ）。より具体的には、安定化バイオポリマーとしてＨＡを含む２ステッププロセスを使用してＦｅＳＯ４をカプセル化する場合、ペイロードは、１００℃またはＲＴの水中でかなり保持され（１２０分目で＞９０％）、３７℃のＳＧＦでは急速に放出され（３０分目で＞８０％）（図２Ｋ）、一方、１ステッププロセスによって合成されたＦｅＳＯ４製剤は、ＲＴの水中でもペイロードの放出を示した。脂溶性ＭＮのためのカプセル化手法を確立するためのモデルＭＮとして、パルミチン酸レチニル（ビタミンＡ）を使用した。ビタミンＡを、Ｏ／Ｗ乳化によってＥＰＯ−ＭＰに直接的に組み込んだ。ビタミンＡのＥＰＯ−ＭＰは、胃内の酸性条件を模倣する３７℃のＳＧＦ中で、急速なペイロードの放出を示した（図２Ａ）。ビタミンＡのＥＰＯ−ＭＰを、室温および１００℃の沸騰条件の両方で水に２時間晒すと、ビタミンＡの放出は検出できなかった（図２Ａ）。ビタミンＡのＥＰＯ−ＭＰは、ＭＮを含まないＭＰに類似の滑らかな表面を示したが、これは、ＥＰＯおよびビタミンＡの両方の脂溶性特性による可能性が高い。室温でＳＧＦに晒した場合のＥＰＯ−ＭＰからのビタミンＡの放出を可視化するために、タイムラプス顕微鏡法を使用した。ＥＰＯ−ＭＰの急速な溶解（＜１分）により、ビタミンＡペイロードの放出が促進されたが、これは、経時的にサイズが増大する水溶性ビタミンＡの拡散の輪（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｃｉｒｃｌｅ）として見ることができる。
【０１７８】
最初にＨＡ内に鉄をカプセル化し、次にＥＰＯマトリクス内にカプセル化して鉄のＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰを形成する２ステップ乳化プロセスによって合成した鉄負荷ＭＰ（図１Ａ）は、ビタミンＡのＥＰＯ−ＭＰと比較して、類似の放出プロファイルを示した。鉄ペイロードの大部分は、ＳＧＦ中３０分以内に急速に放出され、５％未満が、沸騰水および室温の水中で２時間後に放出された（図２Ｋ）。滑らかなビタミンＡのＥＰＯ−ＭＰ表面とは対照的に、鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰは、粗い表面を示した。ＳＥＭによって鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰの横断面を可視化すると、負荷された鉄は、明らかにＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰの内部に見ることができ、これはＭＮを含まないＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰの内部階層的構造と類似している。鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰは、ビタミンＡのＥＰＯ−ＭＰと同様に、室温でＳＧＦに曝露すると１分以内に急速に溶解し、鉄−ＨＡ−ＭＰペイロードを放出する。
【０１７９】
これらの結果は、ＥＰＯ−ＭＰに基づく水溶性または脂溶性ＭＮのいずれかのための２つの別個のカプセル化手法が、どのように胃の条件で急速な放出を容易にし、一方で水条件では早すぎる放出を制限するかについて強調している。
【０１８０】
放出動態をモジュレートすることにおけるｐＨの役割を、代表的な微量栄養素としてビタミンＢ１２を使用して調査すると、低いｐＨ値ほど、ペイロード放出が急速に達成された（図３）。
【０１８１】
熱、水、紫外線、および酸化剤の下での微量栄養素の安定性
多くの微量栄養素、例えばビタミンＡおよび鉄は、高温、湿気、紫外線、または酸化性化学物質に対して感受性であり、これらは、酸化状態では分解または変化をもたらし、したがって摂取後の吸収を制限するおそれがある。したがって、ＥＰＯカプセル化が、これらの課題に対する微量栄養素の安定性の改善において演じる役割を、個々にカプセル化した製剤について調査した。微量栄養素ペイロードの保護を、沸騰水に２時間曝露し、それによってペイロードを高温および多湿に曝露した後、調査した。カプセル化脂溶性微量栄養素であるビタミンＡおよびＤでは、沸騰水条件に２時間曝露した後、非カプセル化対応物と比較して、それぞれ５倍および１８倍を超えて増強された回収が観察された（図４Ａ）。同様に、水溶性ビタミンＣおよびＢ２は、非カプセル化対照と比較して回収の著しい増強を示したので、カプセル化によって両方の水溶性ビタミンは沸騰中に保護された（図４Ａ）。
【０１８２】
ビタミンＡおよびビタミンＤは共に、それらの非カプセル化形態では紫外線によって急速に分解されるので、２４時間の光曝露（２８０μＷ／ｃｍ２）後の微量栄養素ペイロードの保護も調査した（図４Ｂ）。ＥＰＯのＭＰへのカプセル化後、ビタミンＡおよびＤについての光曝露後の回収は、非カプセル化対照と比較して、それぞれ１５倍および３倍超えて著しく改善された（図４Ｂ）。
【０１８３】
強化生成物における微量栄養素と、食品供給源に天然に存在する微量栄養素との間の自然発生的な酸化還元反応は、容易に生じることができ、これらの反応は、吸収およびバイオアベイラビリティにマイナスの影響を及ぼすおそれがある。例えば、食品中に存在するポリフェノールは、鉄酸化を触媒して、高度に生体利用可能な第一鉄（Ｆｅ２＋）状態から低いバイオアベイラビリティを示す第二鉄状態（Ｆｅ３＋）に、劇的に変色させる（Ｍｏｏｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，  ２３，  ７５５  （１９４４）；  Ｍｅｌｌｉｃａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５１，  ２３０４−２３１６  （２００３））。ＥＰＯカプセル化が、カプセル化鉄と酸化性化学物質との間の相互作用を防止するかどうかを調査するために、ＥＰＯ−カプセル化鉄および非カプセル化鉄を、ポリフェノールが豊富なバナナミルクに添加し、変色を経時的に定量化した。ＨＡ−ＥＰＯのＭＰへの鉄のカプセル化は、非カプセル化鉄と比較して著しく少ない変色を示し、したがって、バナナミルク中の少ない酸化を示した（図４Ｃ）。これらの結果は、ＥＰＯのＭＰマトリクスが、カプセル化鉄と食品中の遊離ポリフェノールとの相互作用を制限し得ることを示している。
【０１８４】
より高温および大気の両方への曝露によって、鉄の酸化が加速するので、ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰへの鉄のカプセル化が、開放容器中、水中で沸騰させる間の酸化に対してどのように影響を及ぼすかについて調査した。カプセル化鉄では、２％未満が第二鉄に酸化し、非カプセル化鉄では、１５％超が第二鉄に酸化する（図４Ｄ）。この場合、鉄のカプセル化は、酸化に対する抵抗性を著しく改善して、生体利用可能な第一鉄状態を維持する。
【０１８５】
焼成条件での粒子からの鉄の回収も測定した。焼成後、鉄の＞６５％が回収され（図４Ｅ）、無傷粒子が保持されたが、このことは、焼成が粒子形態に影響を及ぼさないことを示している。
【０１８６】
高温、湿気および酸素への曝露後の鉄のｐＨ制御放出能の維持を実証するために、最初に２時間沸騰させ、次にＳＧＦに浸漬させた鉄負荷ＭＰを、リアルタイム顕微鏡法を使用して可視化し、鉄負荷ＭＰが、低ｐＨでそれらの鉄ペイロードを急速に放出する能力を維持することを確認した。沸騰後、ＨＡ−ＥＰＯのＭＰは、沸騰前と類似の形態を保持していた。
【０１８７】
全体的に、これらの結果は、ＥＰＯへのカプセル化により、高温、湿気、紫外線、および酸化性化学物質への曝露中、微量栄養素ペイロードが保護されることを示している。
【０１８８】
脂溶性および水溶性微量栄養素の同時カプセル化
さらに２ステップ手法を使用して、ステップ１で導入した４種のビタミン、水溶性ビタミンＢ１２およびＢ９（葉酸）の同時カプセル化を可能にして、ビタミンＢ１２および／またはビタミンＢ９をカプセル化するＨＡ−ＭＰを形成した。これらのＨＡ−ＭＰ、ならびに脂溶性ビタミンＡおよびＤを、ＥＰＯと一緒に油相に添加した後、Ｏ／Ｗ乳化を行った（図５Ａ）。同時カプセル化粒子を、ＳＧＦにおけるそれらの放出、ならびに室温水および沸騰水における安定性について試験した。調理中の加熱は、ＭＮを分解し、それによってそれらの吸収および代謝を制限することが公知である。カプセル化ＥＰＯマトリクスは、ビタミンＡのＥＰＯ−ＭＰおよび鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰと同様に、３７℃のＳＧＦ中、同時カプセル化されたペイロードの急速な同時放出を容易にした（図５Ｂ）。これらのペイロードは、安定なままであり、室温の水中でＭＮのいずれについても放出しなかった（図５Ｃ）。同時カプセル化ＭＮの３つ（ビタミンＢ１２、Ａ、およびＤ）は、水中沸騰条件下で２時間後に、それらのペイロードの＜５％を放出した（図５Ｄ）。しかし、放出Ｂ９およびカプセル化Ｂ９の両方の安定性は、これらの条件の影響を受けないにもかかわらず、個々にＭＮ負荷された粒子とは異なり、ビタミンＢ９の約２５％が、水中沸騰条件下で２時間後に放出された（図５Ｄ）。これらの結果は、微量栄養素をモジュラー方式（ｍｏｄｕｌａｒ  ｍａｎｎｅｒ）で同時カプセルするために使用されるＥＰＯのＭＰ系が、沸騰水中で２時間の保持をもたらし、３７℃のＳＧＦ中でバースト放出を可能にすることを示している。
【０１８９】
光に１６時間曝露した後（２８０μＷ／ｃｍ２）、非カプセル化ビタミンＡおよびＤは共に、それぞれ４±２％および２７±２％の低い回収を示した（図５Ｅ）。しかし、ＥＰＯ−ＭＰへのカプセル化後、光感受性は、ビタミンＡおよびＤについてそれぞれ１５倍および３倍を超えて著しく改善された（図５Ｅ）。
【０１９０】
水中で２時間沸騰させた後、ＥＰＯ−ＭＰカプセル化製剤から得られたビタミン回収は、それぞれビタミンＡおよびＤについては６倍および１８倍を超えて増大した（図５Ｆ）。水溶性ビタミンＢ９およびＢ１２の場合、ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰカプセル化は、調理条件中のビタミン安定性を増大する利点を提供しなかったが（図５Ｇ）、これは、ビタミンＢ９およびＢ１２が、カプセル化なしでも調理条件下で既に安定であることによる可能性が高い。
【０１９１】
最後に、ＥＰＯ−ＭＰカプセル化ＭＮを、水中で２時間沸騰させた後、生物活性を維持するそれらの能力について試験した。脂溶性ビタミンＡおよびＤの場合、放出されたＭＮの生物活性を確認するためにＥＬＩＳＡアッセイを使用し、一方、水溶性ビタミンＢ９およびＢ１２については、微生物学的アッセイを使用した。
【０１９２】
すべての場合において、カプセル化ＭＮの少なくとも７５％は、生物学的実体と相互作用する能力を維持した（図５Ｈ）。まとめると、これらの結果は、複数の脂溶性および水溶性ＭＮを同時カプセル化するＥＰＯ−ＭＰ系は、脂溶性ＭＮの光安定性および熱安定性の両方を増強し、同時カプセル化されたすべてのビタミンの生物活性の保存を容易にすることを示している。
【０１９３】
（実施例２：ＥＰＯ−ＭＰからのペイロードの放出に関するｉｎ  ｖｉｖｏ研究）
材料および方法
マウスにおけるＤｉＲ負荷ＥＰＯ−ＭＰの溶解研究
８〜１２週齢の雌ＳＫＨ１−Ｅｌｉｔｅマウス（Ｃｒｌ：ＳＫＨ１−ｈｒ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。マウスに、食品に関係する自己蛍光を低減するために、アルファルファを含まないバランス食（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＡＩＮ−７６Ａ）を１０日間与えた後に処置した。
【０１９４】
実施例１に記載される通り調製したＤｉＲ負荷ＥＰＯ−ＭＰおよそ２００ｍｇを、水１００μｌで胃管栄養法によって投与した（ｎ＝３）。１５、３０、または６０分後、マウスを、二酸化炭素による窒息を使用して安楽死させた。すぐに胃腸管を外植し、Ｉｎ  Ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して画像化した。ＤｉＲ負荷ＥＰＯ−ＭＰを摂取していたマウスからの蛍光シグナルを、ＭＰを摂取していなかったマウスと比較した。次に、カプセル化ＤｉＲおよび放出ＤｉＲに関連するスペクトルシグニチャを、組織自己蛍光（対照試料で特定した）からコンピュータにより分離して、色素放出の位置および状態を決定した。定量化シグナル／バックグラウンド比を、胃または腸のいずれかにおけるカプセル化色素または放出色素シグナルを、ＥＰＯのＭＰを受けていない対照動物のバックグラウンドに対して正規化することによって決定した。
【０１９５】
ラットにおけるビタミンＡのｉｎ  ｖｉｖｏ吸収
トリチウム標識パルミチン酸レチニル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、吸収されたビタミンＡの血中量を検出した。放射標識ＶｉｔＡ−ＥＰＯのＭＰを、前述のＯ／Ｗ乳化法によって調製した。雌Ｗｉｓｔａｒラット（約２５０ｇ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ラットを、（ｉ）遊離ビタミンＡおよび（ｉｉ）ＶｉｔＡのＥＰＯ−ＭＰの２つの群に分けた。遊離群では、ビタミンＡが可溶化できるように、ビタミンＡを４％ｖ／ｖエタノール／水混合物で送達した。ＶｉｔＡのＥＰＯ−ＭＰを水に分散させ、ボルテックスして、懸濁物を形成した。各ラットに、エタノール／水混合物またはすべて水のいずれか３５０μＬ中、その遊離形態またはカプセル化ＭＰのいずれかのビタミンＡ１０μＣｉを、経口胃管栄養法により与えた。シリンジおよび胃管栄養針内の残留ビタミンＡを保存し、シンチレーションカウンターによって定量化して、ラットごとの実際のＴ−ＲＰの給餌量を算出した。０．５、１、２、３、４、５、６時間目に、ラットをイソフルランで麻酔し、外側尾静脈から血液２００μＬを収集した。試料の放射能を、液体シンチレーション計数によって、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  ２８１０  ＴＲ液体シンチレーションカウンターを用いて定量化した。ＶｉｔＡのＥＰＯ−ＭＰ中のビタミンＡの負荷を算出するために、ＭＰを、最初にジクロロメタン１ｍＬに溶解させ、次に溶液５μＬを、Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ（商標）Ｆ液体シンチレーションカクテル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．）１０ｍＬと混合した。血液（２００μＬ）を、推奨プロトコールに従ってＳＯＬＶＡＢＬＥ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．）に溶解させ、次に、溶解させた血液１ｍＬを、試料溶液としてのＨｉｏｎｉｃ−Ｆｌｕｏｒ液体シンチレーションカクテル１０ｍＬに添加した。
【０１９６】
結果
マウスにおけるＤｉＲ負荷ＥＰＯ−ＭＰの溶解研究
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＥＰＯ−ＭＰ溶解を確認するために、雌ＳＫＨ１−Ｅｌｉｔｅマウスを使用して、ＥＰＯ−ＭＰカプセル化ＮＩＲ蛍光色素ＤｉＲ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド）をモデルペイロードとして使用し、ペイロード放出を追跡した。ＤｉＲ負荷ＥＰＯ−ＭＰを経口胃管栄養法により与え、完全な胃腸管組織を、ｅｘ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングのために切除した。カプセル化色素または放出色素のいずれかの物理的状態、および胃腸管における色素の生理学的位置の両方を可視化し、１時間まで３つの異なる時点で定量化した。
【０１９７】
ＤｉＲは、ＤｉＲの蛍光特性に対する環境条件の影響を、確立されたイメージング技術を使用して調査することによって、カプセル化状態および放出状態に区別できることが確認された（Ｒａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １４，  ２９３−３００  （２０１２））。ＤｉＲ負荷ＥＰＯ−ＭＰを水に懸濁させた場合のＤｉＲ負荷ＥＰＯ−ＭＰの１４点のスペクトルフィンガープリントを得た。それとは対照的に、ＤｉＲがＳＧＦ中でＥＰＯ−ＭＰから放出されると、ＤｉＲは、青色シフトを示した。このシフトは、カプセル化ＤｉＲとは別個のスペクトルプロファイルを示し、したがって、カプセル化ＤｉＲおよび放出ＤｉＲは、それらの別個の蛍光性フィンガープリントを使用して区別することができた。カプセル化形態または放出形態の色素の２つのフィンガープリントを使用して、ＥＰＯ−ＭＰの溶解をｉｎ  ｖｉｖｏで間接的に反映させた。
【０１９８】
１５分目に、胃は、カプセル化ＤｉＲおよび放出ＤｉＲの混合物を含有していたが、このことは、ＥＰＯ−ＭＰが、部分的に溶解し、ペイロードの一部が放出されたものの、腸にはまだ入っていなかったことを示唆している。
【０１９９】
３０分目に、ＤｉＲシグナルの大部分が、腸内で放出された色素として検出された。
【０２００】
６０分目に、ＥＰＯ−ＭＰカプセル化ＤｉＲの最小シグナルが検出可能になったが、このことは、すべての粒子がどのようにそれらのペイロードを１時間で放出したかを強調している。さらに、放出色素シグナルは、腸内で排他的に存在していたが、このことは、放出されたペイロードが胃を有効に離れ、吸収のために腸に入ることを暗示している。
【０２０１】
図６Ａは、胃内のカプセル化色素、胃内の放出色素、腸内のカプセル化色素、および腸内の放出色素の定量的分析を示す。
【０２０２】
これらの知見により、経口投与したＭＰからモデルペイロードがマウス胃腸管に急速に放出されたことが確認される。
【０２０３】
ラットにおけるｉｎ  ｖｉｖｏビタミンＡ吸収
ＥＰＯ−ＭＰからのペイロードの急速なｉｎ  ｖｉｖｏ放出が、カプセル化微量栄養素の吸収を容易にし得るかどうかを決定するために、雌ＷｉｓｔａｒラットにおけるビタミンＡの吸収を調査した。トリチウム標識ビタミンＡを、遊離形態およびＥＰＯカプセル化形態の両方で胃管栄養法によってラットに経口投与し、血液試料を採取して、６時間にわたるビタミンＡ含量を評価した（図６Ｂ）。カプセル化ビタミンＡは、遊離ビタミンＡと比較して統計的に識別不能な吸収率を示したが（図６Ｂ）、このことは、ＥＰＯへのカプセル化が、吸収に影響を及ぼさなかったことを強調している。
【０２０４】
（実施例３：臨床研究１：実験室規模のＦｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰの鉄バイオアベイラビリティ）
材料および方法
参加者
ヒト研究は、無作為化単盲検クロスオーバー設計を有していた。研究１および研究２では、参加者は、ＺｕｒｉｃｈのＳｗｉｓｓ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＥＴＨ）およびチューリッヒ大学（ＵＺＨ）の女性生徒の中から採用された。組入れ基準は、以下であった。女性、明らかに健康な１８〜４０歳、低鉄貯蔵量（血漿フェリチン＜２５μｇ／Ｌ）、体重＜６５ｋｇ、肥満度指数１８．５〜２５ｋｇ／ｍ２、妊娠中でなく（妊娠試験によって評価した）、授乳中でないこと、ヘモグロビン＞９０ｇ／Ｌ、正常なＣ反応性タンパク質（＜５．０ｍｇ／Ｌ）、慢性疾患または服薬なし（経口避妊薬を除く）、最初の試験食投与前２週間以内にミネラルおよびビタミン補給剤を消費していないこと、過去４カ月の間に輸血、献血または著しい失血（事故、手術）がないこと、インフォームドコンセントに署名すること。
【０２０５】
両方の研究の倫理上の承認は、ＺｕｒｉｃｈのＣａｎｔｏｎａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎの倫理審査委員会（ヒト研究１：ＫＥＫ−ＺＨ−Ｎｒ．２０１５−００９４、ヒト研究２：ＫＥＫ−ＺＨ−Ｎｒ．２０１７−０１６２４）およびＭＩＴのＣｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎｓ  ａｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ（ヒト研究１：ＣＯＵＨＥＳ番号１５０２００６９３２、ヒト研究２：ＣＯＵＨＥＳ番号１８０１２０１４４８／１８０１２０１４４８Ａ００１）によって提供された。両方の治験は、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖに、ヒト研究１では識別番号ＮＣＴ０２３５３３２５で、ヒト研究２ではＮＣＴ０３３３２６０２で登録された。
【０２０６】
研究設計
２つの研究を、単盲検無作為化クロスオーバー設計を使用して実施した。研究１では、トウモロコシ粥からなる３回の試験食を投与し、研究２では、参加者は、小麦パン試験食９回を消費した。すべての試験食を、安定な鉄同位体（５４Ｆｅ、５７Ｆｅ、または５８Ｆｅ）を使用して、Ｆｅ４ｍｇでＦｅＳＯ４として標識した。標識ＦｅＳＯ４は、Ｄｒ．Ｐａｕｌ  Ｌｏｈｍａｎｎ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、同位体的に５４Ｆｅ−５８Ｆｅおよび５７Ｆｅが豊富な元素鉄から調製された（Ｃｈｅｍｇａｓ、Ｂｏｕｌｏｇｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）。ビタミンＡ（ＢＡＳＦ）、ＨＡ（Ｂｌｏｏｍａｇｅ  Ｆｒｅｄａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、および葉酸（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）は、すべて食品グレードであった。各研究に異なる参加者が含まれ、各参加者は、登録後に、無作為化釣合い型ブロック設計（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｂｌｏｃｋ  ｄｅｓｉｇｎ）で試験食の組合せの予め規定されたスケジュールに割り当てられ、各参加者は、参加者自身の対照として働いた。研究１では、試験食は、調理前または調理後のいずれかに強化塩が添加されたトウモロコシ粥であった。研究は、対数変換した鉄吸収から０．２３の標準偏差、５％および８０％検出力の第一種過誤率に基づいて、鉄吸収において３５％の群内差異を検出するように検出力を与えた。この算出により、被験体２０人の試料サイズを得た。被験体は、３回の安定な鉄同位体標識試験食を無作為順で消費した（無作為化釣合い型ブロック設計）。２回の食事は、鉄負荷ＥＰＯ−ＨＡ−ＭＰにおいて標識ＦｅＳＯ４（５４Ｆｅまたは５８Ｆｅのいずれか）としてＦｅ４ｍｇを含有しており、１回の食事は、標識鉄（５７Ｆｅ）を含有していた。試験食は、調理前または調理後のいずれかに強化塩が添加されたトウモロコシ粥であった。強化塩を介して粥に添加された鉄の量は、直接的に強化されたトウモロコシ粉における６０ｐｐｍの鉄レベルに大体相当するはずである。強化塩は、ａ）ＦｅＳＯ４（参照）、ｂ）調理前に添加された鉄負荷ＥＰＯ−ＨＡ−ＭＰ、またはｃ）調理後に添加された鉄負荷ＥＰＯ−ＨＡ−ＭＰのいずれかを含有していた。試験食は、１週間以内に３日連続で投与した。スクリーニングから最終的な静脈穿刺までの研究期間は、２４日であった。
【０２０７】
研究２では、試験食は、焼成前に強化した小麦パンであった。パンに添加された鉄の量は、小麦粉中６７ｐｐｍの鉄であった。試験食は、（ａ）鉄負荷ＥＰＯ−ＨＡ−Ｆｅ（３．１９％）、（ｂ）鉄負荷ＥＰＯ−ＨＡ−Ｆｅ（１８．２９％）、（ｃ）鉄負荷ＨＡ−Ｆｅ（８．７５％）、（ｄ）鉄負荷ＥＰＯ−ＨＡ−Ｆｅ（３．１９％）とＶｉｔＡ−ＥＰＯ（３．４％、ｖｉｔＡ３７．６５ｍｇ）、（ｅ）鉄負荷ＥＰＯ−ＨＡ−Ｆｅ（３．１９％）とＶｉｔＡ−ＥＰＯ（３．４％、ｖｉｔＡ３７．６５ｍｇ）と遊離葉酸（０．３４ｍｇ）、（ｆ）ＦｅＳＯ４、（ｇ）ＦｅＳＯ４とＨＡ（（ａ）群のＨＡに合致する２５．６８ｍｇ）、（ｈ）ＦｅＳＯ４とＥＰＯ（（ａ）群のＥＰＯに合致する８５．１９ｍｇ）、または（ｉ）ＦｅＳＯ４とＥＰＯ（（ａ）群のＥＰＯに合致する８５．１９ｍｇ）とＨＡ（（ａ）群のＨＡに合致する２５．６８ｍｇ）のいずれかを含有していた。
【０２０８】
研究手順
研究１は、ＺｕｒｉｃｈのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（ＨＮＬ）で２０１６年３月〜４月に実施された。参加者１１８人は、試験食投与の１〜２週間前にスクリーニングに出席し、体重および身長を測定され、Ｈｂ、ＰＦおよびＣＲＰ測定のために血液試料を収集され、組入れ基準および除外基準を満たす参加者２０人が、参加を勧められた。被験体の３分の２は、鉄欠乏であったが、貧血ではなかった。すべての食事が、標識ＦｅＳＯ４として鉄４ｍｇを含有していた。ＥＰＯ−ＨＡ−Ｆｅミクロスフェアを含む食事は、ＥＰＯ８００ｍｇおよびＨＡ４０ｍｇを含有していた。投与前に、鉄負荷ＥＰＯ−ＨＡ−ＭＰを試験し、米国薬局方に従って、溶媒残留物、エンドトキシンおよび微生物バイオバーデンについて陰性であることが公表された。
【０２０９】
標準試験食を、各研究日に新しく調製した。標準試験食は、野菜ソース３０ｇ（キャベツ４４％、ニンジン２１％、ズッキーニ２１％、タマネギ１２％、油２％）および塩２．５ｇを添えた、全粒トウモロコシ粉５０ｇから作製した粥からなっていた。試験食に応じて、塩２．５ｇを、試験食に添加されるＦｅＳＯ４または鉄負荷ＥＰＯ−ＨＡ−ＭＰのいずれかで、調理（１００℃で１時間焼成）前または後に強化した。トウモロコシ粉は、Ｆｅ１．５２ｍｇ／１００ｇおよびフィチン酸７３６．８ｍｇ／１００ｇを含有していた。各試験食は、トウモロコシ粉５０ｇおよび追加の強化鉄４ｍｇを含有しており、したがって、試験食における鉄およびフィチン酸の全含量は、Ｆｅ４．８ｍｇおよびフィチン酸３６８ｍｇであり、鉄とフィチン酸の比は１：６．５であった。試験食のアスコルビン酸含量は、ごくわずかであり、０．４ｍｇ／食事であった。したがって、試験食マトリクスは、鉄吸収に関して阻害マトリクスであった。野菜ソースは、バルクで調製し、投与するまで数回に分けて凍結保存した。トウモロコシ粉は、以下の通り事前調理した。試験食投与の前夜、それぞれ個々のトウモロコシ部分を、加温した１８ＭΩ／ｃｍの水と混合し、マイクロ波（１分、６００Ｗ）で予熱し、次に１００℃のオーブンで６０分間焼成した。
【０２１０】
一晩冷蔵した後、投与当日に、トウモロコシ粥を、マイクロ波で６００Ｗにおいて１分間予熱し、次にオーブン（１００℃）でさらに３０分間調理した。調理済み鉄負荷ＥＰＯ−ＨＡのＭＰを含む試験食は、マイクロ波ステップの前に強化した。未調理鉄負荷ＥＰＯ−ＨＡのＭＰを含む試験食は、ミクロスフェアを添加する前に、１０分間５０℃弱に冷却した。食事を提供する直前に、解凍し予熱した野菜ソースを添加した。試験食と共に、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水（３００ｍｌ）を飲料として提供した。
【０２１１】
試験食Ａ、ＢおよびＣを、３日連続で投与した（研究１日目、２日目および３日目）。被験体は、試験食投与の前夜２１：００以降は固体食を消費せず、２４：００以降は流体を消費しないよう指示された。被験体は、各朝７：００〜９：００の間に、直接的な監視の下で試験食を消費した。被験体は、全食事を消費し、ボウルを水１０ｍｌで２回すすぎ、参加者は、すすぎ液を飲み、試験食投与後３時間、絶食を維持した（食品も飲料もなし）。１７日目に、Ｈｂ、ＰＦ、ＣＲＰを決定し、赤血球への安定な鉄同位体比を決定するために、静脈血液試料を採取した。
【０２１２】
研究２を、２０１８年４月〜７月の間にＨＮＬで実施した。試験食の前に、参加者７７人がスクリーニングに出席し、体重および身長を測定され、Ｈｂ、ＰＦおよびＣＲＰ測定のために血液試料を収集され、適格参加者２４人が、参加を勧められた。参加者は、研究１と同じ絶食状態になるよう指示された。全パン試験食を消費した後、参加者は、皿に落ちたすべてのパンくずを消費するよう指示された。研究１と同様に、参加者は、試験食投与後３時間、絶食を維持した。最初の１週間以内に３ブロックで試験食９回を投与し、試験食３回を３日連続で投与した（１日目、２日目および３日目）。２２日目に、Ｈｂ、ＰＦ、ＣＲＰを決定し、赤血球への安定な鉄同位体比を決定するために、血液試料を採取した。次のブロックの試験食は、２２日目、２３日目および２４日目に投与し、４３日目に再び血液試料を採取し、その週の中で、４３日目、４４日目および４５日目に、最終ブロックの試験食を投与した。最終血液試料を、６４日目に採取した。すべてのロールパン試験食を、試験食投与の前の午後に調製し、それぞれ精製小麦粉１ｋｇ、塩５．５ｇ、乾燥酵母１４ｇおよびｎａｎｏｐｕｒｅ水６５０ｇから２つの生地を調製し、生地を、家電機械を使用して１０分間混錬した。次に１００ｇの部分に秤量して分けた。その部分の１／３をミクロスフェアで強化し、部分の２／３を使用して、強化コアを被覆した。ロールパンを形成した後、３０℃および８０％相対湿度で４５分間発酵させ、次に１９０℃で２０分間焼成した。それらのパンを冷却ラック上で冷却し、紙に包み、翌朝消費されるまでＲＴで保存した。ロールパンは、小麦粉５９．９ｇ、塩０．３ｇおよび乾燥酵母０．８ｇからなっていた。ｎａｎｏｐｕｒｅ水３００ｍｌを、飲料として提供した。
【０２１３】
試験食分析および血液分析
研究を開始する前に、標識鉄化合物を、同位体逆希釈質量分析によって、以下に概説する実験技術を使用することによって、鉄同位体組成およびトレーサー鉄濃度について分析した。Ｈｂを、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを使用することによって測定した（研究１：Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ、研究２：Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＮ−３５０）。血漿フェリチン（ＰＦ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を、イムノアッセイによって測定した（研究１：Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＩＭＭＵＬＩＴＥ  ２０００、研究２：ＩＭＭＵＬＩＴＥ１０００）。貧血は、Ｈｂ＜１２ｇ／ｄＬと定義し、鉄欠乏（ＩＤ）はＰＦ＜１５ｍｇ／Ｌと定義し、ＩＤ性貧血はＨｂ＜１２ｇ／ｄＬかつＰＦ＜１５ｍｇ／Ｌと定義した。
【０２１４】
試験食の試料分析を、三連で実施した。トウモロコシ粉およびロールパンの鉄濃度を、マイクロ波分解（ＭＬＳ  ＥＴＨＯＳｐｌｕｓ、ＭＬＳ）によってミネラル化した後、黒鉛炉原子吸光分光法（ＡＡ２４０Ｚ、Ｖａｒｉａｎ）によって測定した。トウモロコシ粉およびロールパンのフィチン酸濃度を、分光法によって、鉄を沈殿ステップでセリウムによって置き換えるＭａｋｏｗｅｒ方法を使用して測定した（Ｍａｋｏｗｅｒ，  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ，  ４７，  ２８８−＆  （１９７０））。試験食におけるアスコルビン酸濃度を、１０％メタリン酸中で安定化した後、ＨＰＬＣ（Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＧ）によって測定した。
【０２１５】
１７日目（研究１）、ならびに研究２の２２日目、４３日目および６４日目に収集した全血試料を、ＨＮＯ３／Ｈ２Ｏ２混合物およびマイクロ波分解を使用してミネラル化した後、アニオン交換クロマトグラフィーおよび水酸化アンモニウムを用いる沈殿ステップによって、血液マトリクスから鉄を分離した。すべての同位体分析を、ＭＣ−ＩＣＰ−ＭＳ（Ｎｅｐｔｕｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ）を使用することによって実施した。試験食投与後１４日目の血中の５７Ｆｅ、５４Ｆｅおよび５８Ｆｅ同位体標識の量を、鉄同位体比のシフトおよび体内の推定鉄循環量に基づいて算出した。体内の循環鉄は、参加者の身長および体重から導出した、ヘモグロビンおよび血液量に基づいて算出した。吸収率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）（ＦＩＡ）は、吸収された鉄が赤血球に８０％取り込まれるという前提に基づいて算出した。研究２では、２２日目および４３日目の同位体比の値は、試験食投与後についての新しいベースライン値として働いた。鉄の相対的バイオアベイラビリティ（ＲＢＶ）を、次式：１００／ＦＩＡｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍｅａｌ×ＦＩＡｔｅｓｔ  ｍｅａｌとして算出した。
【０２１６】
統計的分析
統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定を使用して評価した。Ｐ値＜０．０５を、統計的に異なっているとみなした。両方のヒト研究は、対数変換した鉄吸収から０．３５の標準偏差、５％（両側）および８０％検出力の第一種過誤率に基づいて、鉄吸収において栄養的に関連する３０％の群内差異を検出するように検出力を与えた。この算出により、被験体１８人の試料サイズを得た。研究１では、１０％の脱落率が予測され、したがって参加者２０人が採用され、研究２では研究期間がより長いことに起因して、３０％の脱落率が予測され、したがって被験体２４人が採用された。
【０２１７】
統計的分析は、ＳＰＳＳバージョン２２（ヒト研究１）およびバージョン２４（ヒト研究２）（ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）を使用して行った。すべてのデータを、分析前に正規分布についてチェックし、年齢、体重、身長、Ｈｂ、ＣＲＰは正規であった。データは平均および標準偏差として表される。ＰＦおよびＦｅ吸収率は、非正規であり、幾何平均および９５％ＣＩとして表される。食事間の比較は、線形混合モデルにフィットさせた平方根変換データを使用して行った。食事を、反復固定因子（共分散タイプの尺度化されたアイデンティティ（ｓｃａｌｅｄ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ））として入力し、被験体を、ランダム因子（切片）として入力した。食事の有意な全体的効果が見られる場合、多重比較のためにボンフェローニ補正を使用して、異なる食事内での事後検定を実施した。有意性のレベルは、ｐ値＜０．０５に設定した。
【０２１８】
研究１では、一般線形混合モデルを、対数変換データに対してＳＰＳＳ（バージョン２２、ＩＢＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、データにフィットさせた。食事を、固定因子［トウモロコシのＦｅＳＯ４、トウモロコシの鉄負荷ＥＰＯ−ＨＡ−ＭＰ（調理前）、トウモロコシの鉄負荷ＥＰＯ−ＨＡ−ＭＰ（調理後）］として入力し、被験体を、ランダム因子（切片）として入力した。食事の有意な全体的効果が見られる場合、多重比較のためにボンフェローニ補正を使用して、異なる食事内での事後検定を実施した。
【０２１９】
結果
鉄欠乏性貧血は、発展途上国世界において最も蔓延しているＭＮ欠乏の１つであり、慢性腎疾患に罹患している患者に鉄を送達するために多くの新しい技術が開発されつつある通り、先進国世界でも問題になっている。したがって、ヒトにおける鉄吸収を容易にすることにおけるそれらの有効性を調査するために、鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰをさらに評価した。ＥＰＯ−ＭＰマトリクスは、脂溶性ＭＮを熱分解から保護する。しかし、Ｂ９およびＢ１２の両方は、本来的に熱に安定なので、Ｂ９およびＢ１２などの水溶性ＭＮの保護は確立されなかった。Ｂ９およびＢ１２とは異なり、鉄は、高度に生体利用可能な第一鉄（Ｆｅ２＋）状態から低いバイオアベイラビリティを示す第二鉄状態（Ｆｅ３＋）に酸化し得る。したがって、経口鉄補給における鉄の酸化防止は必須である。
【０２２０】
実験室規模のＦｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰを、ヒトにおいて生体利用可能な鉄を送達するそれらの能力について調査した。ヒトにおける鉄吸収は、絶食状態の若年女性（ｎ＝２０、ヘモグロビン（Ｈｂ）＝１３．４±０．８５ｇ／Ｌ、および幾何平均（９５％ＣＩ）、血漿フェリチン（ＰＦ）１１．６（９．４、１４．５）μｇ／Ｌ）に、無作為化単盲検クロスオーバー設計で投与した３回の安定な鉄同位体標識試験食の消費によって調査した（表３）。２回の食事は、ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰにおいて標識ＦｅＳＯ４（５４Ｆｅまたは５８Ｆｅのいずれか）として鉄４ｍｇを含有しており、１回の食事は、標識鉄（５７Ｆｅ）を含有していた。試験食は、調理前または調理後のいずれかに鉄強化塩が添加されたトウモロコシ粥であった。未調理カプセル化鉄を、未調理非カプセル化鉄と直接比較した。鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰは、遊離非カプセル化鉄と比較して、約４５％の相対的鉄吸収を示した（Ｐ＜０．０１）（図７Ａ）。データ拡散はかなり広範であり、遊離未調理鉄の幾何平均は３．３６であり、一方、未調理マイクロカプセル化（ＥＰＯ−ＨＡ−Ｆｅ）鉄の幾何平均は１．４６であった（表４）。
【０２２１】
【表３】
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【０２２２】
【表４】
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【０２２３】
次に、鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰを、調理済み条件および未調理条件で比較した。この場合、未調理鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰの鉄吸収幾何平均は、１．４６であり、一方、調理済み鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰのＦｅ吸収幾何平均は、１．４１であった（表４）。調理済みまたは未調理のマイクロカプセル化鉄について鉄吸収に有意差がなかったので、これらの結果は、ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰ−カプセル化鉄を調理しても、鉄の吸収がいかに損なわれないかについて強調している（図７Ｂ）。臨床研究では、ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰへの鉄カプセル化が、調理しなかった場合の非カプセル化と比較して、鉄吸収を阻害することが明らかに示されたが、実験室規模および実験室で開発された製剤によって、調理条件とは独立に、ヒトに生体利用可能な鉄を送達することにおける有効性を実証した。
【０２２４】
（実施例４：規模拡大生成）
ここまでに記載したすべてのＭＰは、小規模研究実験室製剤として想定し、合成した。乳化ベースのマイクロカプセル化法は、生体材料および製剤化実験室の大部分において学問的レベルで必需品であるが、それらは、多くの興味深い技術の臨床および商業への橋渡しを制限する。したがって、この実験室規模の技術を、工業に移行するために大規模な鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰおよびビタミンＡ負荷ＥＰＯのＭＰの合成に規模拡大した。
【０２２５】
材料および方法
Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰの規模拡大生成
１ｋｇまたはそれを超えるＦｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰを製造するために使用したプロセスは、図８Ａに示されている。初期のＷ／Ｏ乳化の代わりに商業的に利用可能な噴霧乾燥機を使用して、鉄ＨＡ−ＭＰを製剤化した。実験室規模の製剤化のために使用した第２の乳化ステップを、商業的に利用可能なスピニングディスク微粒化装置で置き換えた。
【０２２６】
Ｎｉｒｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｉｎｏｒパイロットスケール噴霧乾燥機を使用して、最初にＦｅ−ＨＡのＭＰを調製した。供給溶液は、ヒアルロン酸ナトリウム５２５．５ｇ、硫酸鉄一水和物１３０９．５ｇ、および脱イオン水７７Ｌを含有していた。この溶液を、乾燥機に２５０ｇ／分で供給し、２ｍｍの二流体ノズルで微粒化した。乾燥機の入口温度を２５７℃に設定して、出口温度が９０℃になるようにした。ＭＰ１２１５ｇを回収した。
【０２２７】
Ｆｅ−ＨＡのＭＰを、カスタムスピニングディスク微粒化システムを使用してＥＰＯでカプセル化した。供給溶液を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）１２０００ｇに溶解させた１１５２ｇのＥＰＯおよび１．８７ｇのポリソルベート８０で調製した。Ｆｅ−ＨＡのＭＰ４８ｇを、ＤＣＭ溶液に添加し、超音波処理浴に１０分間入れて、安定な懸濁物を形成した。懸濁物を、１３００ｒｐｍでスピンする直径４インチのステンレス鋼のカスタムディスク上に１１０ｇ／分で供給した。ディスクを高さ３０フィート、２０フィート×２０フィートの塔に設置した。部屋を３５〜４０℃に加熱した。粒子を、塔の底部に位置する帯電防止プラスチック上に収集した。ＭＰ１０５９ｇを回収した。
【０２２８】
これらのプロセスを、Ｆｅ−ＨＡのＭＰのためにＰｒｏ−ＣｅｐＴ  ４Ｍ８実験室噴霧乾燥機を使用することによって、ヒト研究２で使用したバッチに合わせて修正した。
【０２２９】
濡れたすべての部品を石けん水および７０％ＩＰＡ水溶液で清浄にすることに加えて、すべての新しい管状材料およびフィルターを噴霧乾燥機と共に使用した。噴霧乾燥機の入口温度を１６０℃に設定して、出口温度がおよそ５３℃になるようにした。溶液を、０．４ｍｍ空気微粒化ノズルを介して８ｍＬ／分で乾燥させた。
【０２３０】
ＥＰＯ内のＦｅ−ＨＡのＭＰをカプセル化するために、同じスピニングディスク設定を使用した。塔をモップで拭き、清浄にした後、Ｖｅｓｐｈｅｎｅ  ＩＩｓｅで処理した。
【０２３１】
ビタミンＡ負荷ＥＰＯのＭＰの規模拡大生成
供給研究のためのカプセル化ビタミンＡも、同じスピニングディスクシステムを使用して調製した。パルミチン酸レチニルの形態のビタミンＡを、ＥＰＯと一緒に有機溶媒に溶解させた後、スピニングディスク微粒化によってデンプン粉末にした。供給溶液を、４インチのスピニングディスクにおよそ１１５または８５ｇ／分で供給するので、１６７５ｒｐｍのディスク速度を使用した。材料を、粉末化ＤｒｙＦｌｏ（登録商標）デンプンで収集した。次に、試料から過剰のデンプンをふるいにかけて、ビタミンＡのＭＰを回収した。すべての試料を、１週間、真空下で緩慢なＮ２パージで置き換えて、残留ＤＣＭを除去した。
【０２３２】
一部の形態では、製剤は、パルミチン酸レチニル２ｇ、ＥＰＯ（Ｅｖｏｎｉｋ製）１８ｇ、および塩化メチレン２７０ｇを含有する。
【０２３３】
塩化メチレンをアセトンで直接置き換えて、微粒化に対する溶媒の効果を試験した。得られたＥＰＯのＭＰを、前述の方法と同じ方法を使用して生成した。
【０２３４】
また、Ｅｖｏｎｉｋ  ＥＰＯを代替のＶｉｋｒａｍ  ＥＰＯ（Ｖｉｋ−ＥＰＯ）で直接置き換えた。得られたＥＰＯのＭＰを、前述の方法と同じ方法を使用して生成した。
【０２３５】
ＥＰＯへのビタミンＡの押出しを実施して、ビタミンＡを含有する粒子または粉末を生成した。押出しは、溶媒を用いない／非水性プロセスである。噴霧乾燥と比較して、この方法は、ハイスループットを達成することができ、利用性がより高い。
【０２３６】
結果
Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰの規模拡大生成
ここまでに記載したＭＰは、実験室規模の研究製剤として想定し、合成した。乳化ベースのマイクロカプセル化法は、多くの生体材料および製剤実験室において学問的レベルで必需品であるが、ＥＰＯにおいてカプセル化する場合、鉄負荷の増大において著しく大きな課題に直面した。このことに対処し、第１のヒト研究で直面した吸収の問題を克服するために、微量栄養素製剤における鉄負荷を増大するための新しいプロセスを開発した（図８Ａ）。商業的に利用可能な噴霧乾燥機およびカスタマイズされたスピニングディスク微粒化装置を使用して、Ｆｅ−ＨＡのＭＰおよびＦｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰを、それぞれキログラム規模で製剤化した。初期の規模拡張製剤は、第１のヒト研究で使用した０．６％鉄負荷を再作製するように設計した。パイロット規模（＞１ｋｇ）および第１のヒト研究で使用したものと同じ組成で生成したＦｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰのバッチは、ヒトで試験した実験室規模の製剤と同じ負荷、安定性およびｐＨ制御放出基準を満たした（図８Ｂ）。
【０２３７】
大規模バッチへの移行において、鉄負荷ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰは、（ｉ）実験室規模の製剤と類似のサイズを示し、（ｉｉ）粒子形態がここではわずかにしぼんだ／へこんだ球形になるので、構造的変化を示し、（ｉｉｉ）３７℃のＳＧＦ、室温および１００℃の水においてほぼ同一の放出プロファイルを示し（図８Ｂ）、（ｉｖ）開放容器での沸騰中に酸化に対して同様の鉄保護を示した。
【０２３８】
第２の水溶性ＭＮである酸化亜鉛を添加して、色マスキング剤として作用させ、かつ２つの別個のＭＮの単一粒子への規模拡大した同時カプセル化を強調するための初期の例として作用させた。全微量栄養素の０％〜９５％の、広範なパーセンテージ範囲の酸化亜鉛を試験した。より低いパーセンテージの酸化亜鉛を含むＭＰは、ＭＰ中の鉄濃度が高いことに起因して褐色を示し、一方、より高いパーセンテージの酸化亜鉛を含むＭＰは、鉄濃度が低いことに起因して、薄い白色を示した。
【０２３９】
プロセスではＥＰＯ粒子の鉄負荷を３．１９％（図８Ｃ）および１８．２９％（図８Ｄ）に増大し、それによってＥＰＯ量がさらに減少した（表５）。これらの規模拡張ＭＰを、ポリフェノールが豊富なバナナミルクに関して先に記載される通り、カプセル化鉄と食品中に存在する酸化性化学物質との間の相互作用を防止するそれらの能力についても調査した。規模拡張Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰは、その他のＭＰ構成要素（すなわちＨＡ、ＥＰＯ、およびＨＡとＥＰＯ）を伴っても伴わなくても、鉄のすべての遊離形態と比較して、変色を誘導しにくかったことが実証された（図８Ｅ）。
【０２４０】
ビタミンＡ負荷ＥＰＯのＭＰの規模拡大生成
スピニングディスク微粒化を使用するデンプン粉末への規模拡大生成により、実験室規模の方法によって生成されたものとは異なるビタミンＡ負荷ＥＰＯのＭＰを生成した。
【０２４１】
大規模バッチへの移行において、ビタミンＡ負荷ＥＰＯのＭＰは、（ｉ）粒子がデンプンでコーティングされるので、構造的変化を示し、（ｉｉ）３７℃のＳＧＦ、室温の水および１００℃の水において類似の放出プロファイルを示し（図９Ａ）、（ｉｉｉ）水中で２時間沸騰させた後に、類似の回収率を示した（図９Ｂ）。
【０２４２】
実験室規模のビタミンＡ負荷ＥＰＯのＭＰ、商業的に利用可能なＢＡＳＦのビタミンＡ製剤、および規模拡大したビタミンＡ負荷ＥＰＯのＭＰの安定性を、（１）４０℃、湿度７５（図９Ｃ）、（２）室温で太陽光に曝露（図９Ｄ）、（３）室温の水に懸濁（図９Ｅ）、（４）４℃の水に懸濁（図９Ｆ）、および（５）１５℃、湿度７５％（図９Ｇ）を含む様々な条件下で比較した。規模拡大したビタミンＡ負荷ＥＰＯ製剤のＭＰは、カプセル化ビタミンＡの安定化において最良の性能を有することが明らかである。
【０２４３】
スピニングディスク微粒化プロセス中、有機溶媒を塩化メチレンからアセトンに変更しても、粒子の形成および収集にいかなる有意差も引き起こされなかった。
【０２４４】
代替ＥＰＯバッチを、異なる供給業者から、すなわちＥｖｏｎｉｋ  ＥＰＯからＶｉｋｒａｍ  ＥＰＯに変更しても、形成および収集にいかなる有意差も引き起こされなかった。
【０２４５】
１０％ビタミンを含有する粉末は、図１０に示される通り、押出しの後に製粉を行うことによって調製することに成功した。粉末の平均粒径は、製粉条件、例えば製粉温度（例えば、室温製粉または低温製粉）および製粉方法（例えば、Ｆｉｔｚミリングまたはジェットミリング）の影響を受けやすかった。平均粒径は、直径およそ３０μｍ〜およそ５００μｍの範囲であった。粉末（ｐｏｗｅｒ）は、経時的にケーキングの影響を受けやすかった。
【０２４６】
（実施例５：ヒト研究２−ヒトにおけるより高負荷の鉄粒子のバイオアベイラビリティ）
材料および方法
ヒト研究２の詳細な手順を、実施例３に記載する。ヒト研究２で使用した鉄負荷微粒子は、実施例４に記載され、表５に列挙されている。
【０２４７】
【表５】
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【０２４８】
結果
第１のヒト治験で使用した実験室規模のバッチと比較して、それぞれ５倍および３０倍を超える高い鉄負荷のＦｅのＨＡ−ＥＰＯのＭＰ、すなわち３．１９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰおよび１８．２９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰを、第２のヒト研究において、生体利用可能な鉄をヒトに送達するそれらの能力について調査した。
【０２４９】
この研究では、非鉄阻害性食品マトリクス（小麦パン）を使用して、吸収、および鉄とキレートを形成するまたは反応する小分子に対する粒子媒介性保護の両方とは対照的に、吸収だけに集中することによって、非カプセル化鉄およびカプセル化鉄をより良好に比較することができた。この研究では、同用量の鉄（Ｆｅ４ｍｇ）を含有する試験食９回を、絶食状態の若年女性（ｎ＝２４、Ｈｂ：１３．２±０．９５ｇ／ｌ、およびＰＦ：１３．２（１０．５、１６．５）μｇ／Ｌ）に、部分的無作為化単盲検クロスオーバー設計で投与した（表３）。３回の食事は、標識硫酸鉄としての鉄を、３．１９％５４Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ、１８．２９％５７Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ、および非カプセル化硫酸鉄４ｍｇ（５８Ｆｅ、参照食）で含有していた。すべての場合において、鉄を添加した後、パンを１９０℃で２０分間焼成した。第１のヒト研究とは対照的に、１８．２９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯ−ＭＰ（ＦＩＡ：１７．０（１３．２、２１．９）％）は、非カプセル化鉄（ＦＩＡ：１９．２（１５．３、２４．２９）％）と統計的に異ならない鉄吸収を示した（図１１Ａ）。５倍高い負荷の３．１９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ（ＦＩＡ：１３．７（１１．１、１６．８）％）は、非カプセル化および最高負荷の１８．２９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰと比較して、著しく低い吸収を示した。参照食と比較して、３．１９％および１８．２９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰは、それぞれ、７１（６２、８２）％および８９（７４、１０７）％の相対的鉄バイオアベイラビリティを示した。この同じヒト研究において、Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰと共に他の微量栄養素またはＥＰＯ−カプセル化微量栄養素を同時送達することに関する競合的吸収が、Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰからの鉄の吸収にどのように影響を及ぼし得るかについて調査した。（ｉ）ＶｉｔＡ−ＥＰＯのＭＰ（ＦＩＡ：１２．７（９．２９、１７．５）％）、または（ｉｉ）ＶｉｔＡ−ＥＰＯのＭＰと遊離葉酸（ＦＩＡ：１４．３（１１．２、１８．３）％）の同時送達は、鉄吸収に影響を及ぼさなかったことが実証されたが（図１１Ｂ）、このことは、同時送達された微量栄養素間またはＥＰＯ−カプセル化微量栄養素間の競合が、ここで研究した組合せについては大きな問題ではないことを示している。４回の追加の試験食で、各ＭＰ構成成分の個々の役割、および遊離形態のこれらの構成成分の同時投与が、Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ製剤と比較して鉄の吸収にどのように影響を及ぼすかについて調査した。結果は、遊離硫酸鉄からの吸収が、いずれのＨＡ（ＦＩＡ：２０．７（１６．１、２６．７）％）、ＥＰＯ（ＦＩＡ：１６．６（１２．０、２３．２）％）またはＨＡ−ＥＰＯ（ＦＩＡ：１６．３（１１．７、２２．８）％）によっても著しく影響を受けないことを示している。同様に、ＦｅがＨＡにカプセル化される場合（ＦＩＡ：１５．１（１１．３、２０．３）％）、鉄吸収は、参照食と有意に異ならない（図１１Ｃ）。結果は、吸収が、遊離鉄と比較してＨＡまたはＥＰＯのいずれによっても著しく影響を受けないことを示している。しかし、ＨＡおよびＥＰＯがＭＰとして製剤化される場合、遊離鉄および遊離鉄とＨＡと比較して、吸収の��下が観察される（図１１Ｃ）。重要なことに、この現象は、最高負荷の１８．２９％Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰ製剤については、参照に対して同等の吸収が実証される通り、生じる可能性が低い（図１１Ｃ）。まとめると、これらの結果は、第１のヒト研究で観察された吸収を制限するカプセル化が、ＨＡ−ＥＰＯのＭＰにおける鉄負荷の増大およびＥＰＯ含量の低減、ならびにその開発によって克服され、対処され得ることを明らかに示している。
【０２５０】
（実施例６：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸管バリアモデルにおける鉄輸送）
材料および方法
ＥｐｉＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ組織を、ＭａｔＴｅｋ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入し、推奨される通り使用した。輸送実験のために、粒子構成要素であるＥＰＯ、ＦｅおよびＨＡを別個に調製し、添加して、記録される通りの最終的な質量パーセンテージを達成した。３７℃および５％ＣＯ２で１時間インキュベーションした後、輸送鉄をトランスウェルチャンバ底部に入れて、既に説明されているＢｉｏＶｉｓｉｏｎ比色アッセイを使用して分析した。
【０２５１】
結果
第１のヒト研究では、ＨＡ−ＥＰＯのＭＰへのＦｅカプセル化によって、非カプセル化鉄と比較して鉄バイオアベイラビリティが低下することが示されたが、カプセル化系は、調理条件とは独立に、生体利用可能な鉄をヒトに送達することにおいて有効性が実証された。微量栄養素をカプセル化する材料は、吸収を妨害するおそれがあることが既に報告されている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｖｉｔａｍ  Ｎｕｔｒ  Ｒｅｓ，  ７４，  ４５３−４６１  （２００４））。したがって、腸管での鉄吸収においてＨＡおよびＥＰＯが独立に演じる役割を調査した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を、Ｆｅ−ＨＡ−ＥＰＯのＭＰを経口摂取した後のヒトにおける腸上皮細胞バリアへの鉄透過条件を模擬するように設計した。商業的に利用可能なヒト腸上皮細胞バリアモデル（ＥｐｉＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ、ＭａｔＴｅｋ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）により、鉄、ＨＡおよびＥＰＯの相対濃度を系統的に変えることによって、ＭＰ構成要素が腸管での鉄吸収に対して有する効果を調査するための試験プラットフォームを提供した。モデルは、健康なヒトドナーから得た初代小腸上皮細胞からなっており、ここで細胞を、酵素的に解離させ、１２ウェルプレート内でカスタマイズされた培地中、細胞培養インサート上で培養して、円柱様の機能的３Ｄ上皮バリア層を形成した（Ｍａｓｃｈｍｅｙｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ，  ９５，  ７７−８７  （２０１５））。ウェルプレートの上方コンパートメントにおける細胞培養インサートとして接近可能な腸管バリアの頂端膜側に試料を添加し、１時間のインキュベーション期間後、組織バリアを通過し、ウェルプレートの下方コンパートメントにおける培養培地の分析によって決定され得る量として鉄輸送を定量化することによって、鉄製剤の経口投与をモデル化した。ＨＡおよび／またはＥＰＯと組み合わせて添加した鉄の輸送を、ＨＡまたはＥＰＯがない状態で添加した遊離鉄の輸送のパーセンテージとして表した。ＨＡの存在は、腸管バリアを介する鉄輸送に対して著しい影響を示さなかった（図１２Ａ）。さらに、鉄は、この第１のヒト研究で試験したＭＰにおいて使用したＦｅ：ＨＡ比で、バリアを介して容易に輸送された。それとは対照的に、鉄にパーセンテージを増大して添加した非カプセル化ＥＰＯは、腸管バリアを介する鉄輸送を著しく低減した（図１２Ｂ、丸）。特に、鉄は、ヒト被験体で試験したＭＰにおけるＥＰＯパーセントに相当する９６％のＥＰＯパーセンテージで存在する場合、バリアを介して輸送されにくかった。現在のＭＰ製剤に存在するＥＰＯのパーセンテージでは、鉄輸送は、遊離鉄と比較して３７％に低下した。同様に、鉄輸送は、ＳＧＦにおいてインキュベーションによって解離されたＭＰの中和内容物が腸管バリアに添加されると、遊離鉄について測定された鉄輸送の３３％に低下した（図１２Ｂ、黒色四角）。興味深いことに、ＥＰＯパーセンテージが低下すると、ＥＰＯの鉄輸送阻害効果は無視することができ、このことは、より低いパーセンテージのＥＰＯを含有する製剤が、腸を介する鉄輸送を阻害し得ないことを示している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−２Ｄ】
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【図２Ｅ−２Ｇ】
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【図２Ｈ−２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図４Ｃ−４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図５Ｃ−５Ｅ】
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【図５Ｆ−５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ−８Ｃ】
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【図８Ｄ−８Ｅ】
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【図９Ａ−９Ｃ】
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【図９Ｄ−９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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