(57)【要約】細胞のコンパートメント中の標的ポリヌクレオチドの空間的配置を制御するためのシステムおよび方法が、本明細書において提供される。2021534205.tif 000017
2021534205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のコンパートメント中の標的ポリヌクレオチドの空間的および時間的配置を制御するためのシステムであって、
(a)第1の二量体化ドメインに連結されているコンパートメント特異的タンパク質；および
(b)標的ポリヌクレオチドを標的にするアクチュエータ部分であって、第1の二量体化ドメインとアセンブルして二量体となることができる第2の二量体化ドメインに連結されている、アクチュエータ部分
を含む、前記システム。
【請求項２】
前記標的ポリヌクレオチドがゲノムDNAを含む、請求項1記載のシステム。
【請求項３】
前記標的ポリヌクレオチドがRNAを含む、請求項1記載のシステム。
【請求項４】
前記アクチュエータ部分がCasタンパク質を含み、かつ
前記システムが、
(c)前記アクチュエータ部分と複合体を形成しかつ前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ガイドRNA
をさらに含む、
請求項1〜3のいずれか一項記載のシステム。
【請求項５】
前記アクチュエータ部分がRNA結合タンパク質を含み、かつ
前記システムが、
(c)前記アクチュエータ部分と複合体を形成しかつ前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ガイドRNA
をさらに含み、任意で、
(d)前記ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質
をさらに含む、
請求項1〜3のいずれか一項記載のシステム。
【請求項６】
前記Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠いている、請求項4記載のシステム。
【請求項７】
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質、Cas12タンパク質、Cas13タンパク質、CasXタンパク質、またはCasYタンパク質である、請求項4記載のシステム。
【請求項８】
前記Cas12タンパク質が、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、およびCas12eからなる群より選択される、請求項7記載のシステム。
【請求項９】
前記Cas13タンパク質が、Cas13a、Cas13b、Cas13c、およびCas13dからなる群より選択される、請求項7記載のシステム。
【請求項１０】
前記RNA結合タンパク質がADAR1またはADAR2であり、かつ前記ガイドRNAがADARリクルーティングRNA（arRNA）を含む、請求項5記載のシステム。
【請求項１１】
前記アクチュエータ部分が、前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする結合タンパク質を含み、かつ該結合タンパク質がジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALEヌクレアーゼである、請求項1〜3のいずれか一項記載のシステム。
【請求項１２】
前記アクチュエータ部分が、ガイドポリヌクレオチドと複合体を形成しているアルゴノートタンパク質を含み、該ガイドポリヌクレオチドがガイドRNAまたはガイドDNAであり、かつ該ガイドポリヌクレオチドが前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項1〜3のいずれか一項記載のシステム。
【請求項１３】
前記コンパートメント特異的タンパク質が、前記コンパートメントに内在性のタンパク質、調節タンパク質、モータータンパク質、DNA修復タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載のシステム。
【請求項１４】
前記コンパートメントが核コンパートメントである、請求項1記載のシステム。
【請求項１５】
前記核コンパートメントが核内膜を含む、請求項14記載のシステム。
【請求項１６】
前記コンパートメント特異的タンパク質がエメリン、Lap2ベータ、ラミンB、またはこれらの組み合わせを含む、請求項15記載のシステム。
【請求項１７】
前記核コンパートメントがCajal体を含む、請求項14記載のシステム。
【請求項１８】
前記コンパートメント特異的タンパク質がコイリン、SMN、Gemin3、SmD1、SmE、またはこれらの組み合わせを含む、請求項17記載のシステム。
【請求項１９】
前記核コンパートメントが核スペックルを含む、請求項14記載のシステム。
【請求項２０】
前記コンパートメント特異的タンパク質がSC35を含む、請求項19記載のシステム。
【請求項２１】
前記核コンパートメントがPML体を含む、請求項14記載のシステム。
【請求項２２】
前記コンパートメント特異的タンパク質がPML、SP100、またはこれらの組み合わせを含む、請求項21記載のシステム。
【請求項２３】
前記核コンパートメントが核コア複合体を含む、請求項14記載のシステム。
【請求項２４】
前記コンパートメント特異的タンパク質がNup50、Nup98、Nup53、Nup153、Nup62、またはこれらの組み合わせを含む、請求項23記載のシステム。
【請求項２５】
前記核コンパートメントが核小体を含む、請求項14記載のシステム。
【請求項２６】
前記コンパートメント特異的タンパク質が核小体タンパク質B23を含む、請求項25記載のシステム。
【請求項２７】
前記核コンパートメントがヘテロクロマチンを含む、請求項14記載のシステム。
【請求項２８】
前記コンパートメント特異的タンパク質がHP1、KRAB-ZFP、これらの切断型、またはこれらの組み合わせを含む、請求項27記載のシステム。
【請求項２９】
前記核コンパートメントが核内構造体（nuclear body）を含む、請求項14記載のシステム。
【請求項３０】
前記コンパートメント特異的タンパク質が53BP1、Rad51、またはこれらの組み合わせを含む、請求項29記載のシステム。
【請求項３１】
前記コンパートメントが細胞質コンパートメントである、請求項1記載のシステム。
【請求項３２】
前記細胞質コンパートメントが細胞骨格成分を含む、請求項31記載のシステム。
【請求項３３】
前記コンパートメント特異的タンパク質がキネシン、ダイニン、ミオシン、またはこれらの組み合わせを含む、請求項32記載のシステム。
【請求項３４】
前記コンパートメント特異的タンパク質が蛍光タンパク質にさらに連結されている、請求項1記載のシステム。
【請求項３５】
前記アクチュエータ部分が蛍光タンパク質にさらに連結されている、請求項1記載のシステム。
【請求項３６】
前記第1の二量体化ドメインおよび前記第2の二量体化ドメインが、リガンド、光、または酵素の存在下でのみアセンブルして二量体を形成する、請求項1記載のシステム。
【請求項３７】
前記第1の二量体化ドメインおよび前記第2の二量体化ドメインが、前記リガンドの存在下で前記リガンドにそれぞれ結合する、請求項36記載のシステム。
【請求項３８】
前記リガンドが化学的誘導物質またはオプトジェネティック誘導物質である、請求項36または37記載のシステム。
【請求項３９】
細胞のコンパートメント中の標的ポリヌクレオチドの空間的および時間的配置を制御する方法であって、
(a)第1の二量体化ドメインに連結されているコンパートメント特異的タンパク質を提供する工程；
(b)第2の二量体化ドメインに連結されているアクチュエータ部分を提供する工程；
(c)該アクチュエータ部分と該標的ポリヌクレオチドとを含む複合体を形成する工程；ならびに
(d)該第1の二量体化ドメインと該第2の二量体化ドメインとを含む二量体をアセンブルして、それによって、該コンパートメント中に該標的ポリヌクレオチドを配置する工程
を含む、前記方法。
【請求項４０】
前記標的ポリヌクレオチドが前記コンパートメントに内在性ではない、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
前記標的ポリヌクレオチドの配置が、前記標的ポリヌクレオチドの発現を調節することを含む、請求項39または40記載の方法。
【請求項４２】
前記調節が、前記標的ポリヌクレオチドの発現を低下させることを含む、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
前記調節が、前記標的ポリヌクレオチドの発現を増大させることを含む、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
前記標的ポリヌクレオチドの配置が、前記コンパートメントに内在性である1種または複数種のさらなるポリヌクレオチドの発現を調節することをさらに含む、請求項39記載の方法。
【請求項４５】
前記標的ポリヌクレオチドの配置が、細胞機能、細胞運命、細胞増殖、アポトーシス、および／または細胞分化を変化させることを含む、請求項39記載の方法。
【請求項４６】
前記標的ポリヌクレオチドがテロメアを含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
前記標的ポリヌクレオチドの配置が、前記細胞内に1つまたは複数のさらなるコンパートメントを作製することをさらに含む、請求項39記載の方法。
【請求項４８】
前記標的ポリヌクレオチドの配置が、DNA切断を修復することをさらに含む、請求項39記載の方法。
【請求項４９】
前記修復が、外来性DNAを導入することを含む、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
前記導入が、組換え、非相同末端結合（non-homologous end joining）、または相同組換え修復（homology-directed repair）を含む、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
前記標的ポリヌクレオチドの配置が、前記コンパートメントを形成するための相分離を誘導する、請求項39記載の方法。
【請求項５２】
前記コンパートメントが、タンパク質、RNA、DNA、またはこれらの組み合わせを含む人工の凝集体である、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
前記コンパートメントが核内構造体または細胞体である、請求項51または52記載の方法。
【請求項５４】
前記標的ポリヌクレオチドの前記配置が、DNA修復を促進しかつ遺伝子編集効率を改善する核内構造体の形成を誘導する、請求項39記載の方法。
【請求項５５】
前記標的ポリヌクレオチドがゲノムDNAを含む、請求項39記載の方法。
【請求項５６】
前記標的ポリヌクレオチドがRNAを含む、請求項39記載の方法。
【請求項５７】
前記アクチュエータ部分がCasタンパク質を含み、かつ
前記方法が、
(c)前記アクチュエータ部分と複合体を形成しかつ前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするガイドRNAを提供する工程
をさらに含む、
請求項39記載の方法。
【請求項５８】
前記アクチュエータ部分がRNA結合タンパク質を含み、かつ
前記方法が、
(c)前記アクチュエータ部分と複合体を形成しかつ前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするガイドRNAを提供する工程
をさらに含み、任意で、
(d)前記ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質を提供する工程
をさらに含む、
請求項39記載の方法。
【請求項５９】
前記Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠いている、請求項57または58記載の方法。
【請求項６０】
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質、Cas12タンパク質、Cas13タンパク質、CasXタンパク質、またはCasYタンパク質である、請求項57記載の方法。
【請求項６１】
前記Cas12タンパク質が、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、およびCas12eからなる群より選択される、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
前記Cas13タンパク質が、Cas13a、Cas13b、Cas13c、およびCas13dからなる群より選択される、請求項60記載の方法。
【請求項６３】
前記RNA結合タンパク質がADAR1またはADAR2であり、かつ前記ガイドRNAがADARリクルーティングRNA（arRNA）を含む、請求項58記載の方法。
【請求項６４】
前記アクチュエータ部分が、前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする結合タンパク質を含み、かつ該結合タンパク質がジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALEヌクレアーゼである、請求項39記載の方法。
【請求項６５】
前記アクチュエータ部分が、ガイドポリヌクレオチドと複合体を形成しているアルゴノートタンパク質を含み、該ガイドポリヌクレオチドがガイドRNAまたはガイドDNAであり、かつ該ガイドポリヌクレオチドが前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項39記載の方法。
【請求項６６】
前記コンパートメント特異的タンパク質が、前記コンパートメントに内在性のタンパク質、調節タンパク質、モータータンパク質、DNA修復タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項39記載の方法。
【請求項６７】
前記コンパートメントが核コンパートメントである、請求項39記載の方法。
【請求項６８】
前記核コンパートメントが核内膜を含む、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
前記コンパートメント特異的タンパク質がエメリン、Lap2ベータ、ラミンB、またはこれらの組み合わせを含む、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
前記核コンパートメントがCajal体を含む、請求項67記載の方法。
【請求項７１】
前記コンパートメント特異的タンパク質がコイリン、SMN、Gemin3、SmD1、SmE、またはこれらの組み合わせを含む、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
前記核コンパートメントが核スペックルを含む、請求項67記載の方法。
【請求項７３】
前記コンパートメント特異的タンパク質がSC35を含む、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
前記核コンパートメントがPML体を含む、請求項67記載の方法。
【請求項７５】
前記コンパートメント特異的タンパク質がPML、SP100、またはこれらの組み合わせを含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
前記核コンパートメントが核コア複合体を含む、請求項67記載の方法。
【請求項７７】
前記コンパートメント特異的タンパク質がNup50、Nup98、Nup53、Nup153、Nup62、またはこれらの組み合わせを含む、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
前記核コンパートメントが核小体を含む、請求項67記載の方法。
【請求項７９】
前記コンパートメント特異的タンパク質が核小体タンパク質B23を含む、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
前記核コンパートメントがヘテロクロマチンを含む、請求項67記載の方法。
【請求項８１】
前記コンパートメント特異的タンパク質がHP1、KRAB-ZFP、これらの切断型、またはこれらの組み合わせを含む、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
前記核コンパートメントが核内構造体を含む、請求項67記載の方法。
【請求項８３】
前記コンパートメント特異的タンパク質が53BP1、Rad51、またはこれらの組み合わせを含む、請求項82記載の方法。
【請求項８４】
前記コンパートメントが細胞質コンパートメントである、請求項39記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞質コンパートメントが細胞骨格成分を含む、請求項84記載の方法。
【請求項８６】
前記コンパートメント特異的タンパク質がキネシン、ダイニン、ミオシン、またはこれらの組み合わせを含む、請求項85記載の方法。
【請求項８７】
前記コンパートメント特異的タンパク質が蛍光タンパク質にさらに連結されている、請求項39記載の方法。
【請求項８８】
前記アクチュエータ部分が蛍光タンパク質にさらに連結されている、請求項39記載の方法。
【請求項８９】
前記アセンブルすることが、リガンド、光、または酵素の存在下でのみ生じる、請求項39記載の方法。
【請求項９０】
前記第1の二量体化ドメインおよび前記第2の二量体化ドメインが、前記リガンドの存在下で前記リガンドにそれぞれ結合する、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
前記リガンドが化学的誘導物質またはオプトジェネティック誘導物質である、請求項89または90記載の方法。
【請求項９２】
前記コンパートメントが相同組み換え修復（HDR）を促進することができるタンパク質を含む核コンパートメントである、請求項1記載のシステム。
【請求項９３】
前記コンパートメント特異的タンパク質が相同組み換え修復（HDR）を促進することができるタンパク質を含む、請求項1記載のシステム。
【請求項９４】
前記HDRを促進することができるタンパク質が、RPA、Rad51、Rad52、MRN複合体、MRX複合体、CtlP、Sae2、Sgs1、BRCA2、Exo1、OsExo1、ATM、BRCA2、RAD54、またはMDC1を含む、請求項92または93記載のシステム。
【請求項９５】
HDRのためのテンプレートポリヌクレオチドをさらに含む、請求項92または93記載のシステム。
【請求項９６】
前記テンプレートポリヌクレオチドが外来性ポリヌクレオチドである、請求項95記載のシステム。
【請求項９７】
前記テンプレートポリヌクレオチドが内在性ポリヌクレオチドである、請求項95記載のシステム。
【請求項９８】
前記内在性ポリヌクレオチドが染色分体である、請求項97記載のシステム。
【請求項９９】
前記テンプレートポリヌクレオチドが前記第1の二量体化ドメインに融合されている、請求項95記載のシステム。
【請求項１００】
前記コンパートメント特異的タンパク質が非相同末端結合（NHEJ）を促進することができる、請求項1記載のシステム。
【請求項１０１】
前記コンパートメント特異的タンパク質がKU70、KU80、Artemis、PKcs、LigIV、またはXRCC4を含む、請求項100記載のシステム。
【請求項１０２】
前記二量体をアセンブルすることが、前記コンパートメントへの前記標的ポリヌクレオチドの配置をもたらす、請求項1記載のシステム。
【請求項１０３】
前記二量体をアセンブルすることが、前記標的ポリヌクレオチドへの前記コンパートメントの配置をもたらす、請求項1記載のシステム。
【請求項１０４】
前記コンパートメントが相同組み換え修復（HDR）を促進することができるタンパク質を含む核コンパートメントである、請求項39記載の方法。
【請求項１０５】
前記コンパートメント特異的タンパク質が相同組み換え修復（HDR）を促進することができるタンパク質を含む、請求項39記載の方法。
【請求項１０６】
前記HDRを促進することができるタンパク質が、RPA、Rad51、Rad52、MRN複合体、MRX複合体、CtlP、Sae2、Sgs1、BRCA2、Exo1、OsExo1、ATM、BRCA2、RAD54、またはMDC1を含む、請求項104または105記載の方法。
【請求項１０７】
HDRのためのテンプレートポリヌクレオチドを提供する工程をさらに含む、請求項104または105記載の方法。
【請求項１０８】
前記テンプレートポリヌクレオチドが外来性ポリヌクレオチドである、請求項107記載の方法。
【請求項１０９】
前記テンプレートポリヌクレオチドが内在性ポリヌクレオチドである、請求項107記載の方法。
【請求項１１０】
前記内在性ポリヌクレオチドが染色分体である、請求項109記載の方法。
【請求項１１１】
前記テンプレートポリヌクレオチドが前記第1の二量体化ドメインに融合されている、請求項107記載の方法。
【請求項１１２】
前記コンパートメント特異的タンパク質が非相同末端結合（NHEJ）を促進することができる、請求項39記載の方法。
【請求項１１３】
前記コンパートメント特異的タンパク質がKU70、KU80、Artemis、PKcs、LigIV、またはXRCC4を含む、請求項112記載の方法。
【請求項１１４】
前記二量体をアセンブルすることが、前記コンパートメントへの前記標的ポリヌクレオチドの配置をもたらす、請求項39記載の方法。
【請求項１１５】
前記二量体をアセンブルすることが、前記標的ポリヌクレオチドへの前記コンパートメントの配置をもたらす、請求項39記載の方法。
【請求項１１６】
細胞のコンパートメントと標的ポリヌクレオチドとを共局在させるための方法であって、
(a)(i)コンパートメントの一部である、または(ii)コンパートメントの形成をもたらすのに十分である、第1の二量体化ドメインに連結されているコンパートメント特異的タンパク質
を提供する工程；
(b)標的ポリヌクレオチドと複合体を形成することができる、第2の二量体化ドメインに連結されているアクチュエータ部分
を提供する工程；および
(c)該第1の二量体化ドメインと該第2の二量体化ドメインを含む二量体をアセンブルして、該コンパートメントおよび該標的ポリヌクレオチドの共局在をもたらす工程
を含む、前記方法。
【請求項１１７】
細胞中で標的ポリヌクレオチドとテンプレートポリヌクレオチドとを共局在させるための方法であって、
(a)テンプレートポリヌクレオチドと共に第1の複合体を形成することができる、第1の二量体化ドメインに連結されている第1のアクチュエータ部分
を提供する工程；
(b)標的ポリヌクレオチドと共に第2の複合体を形成することができる、第2の二量体化ドメインに連結されている第2のアクチュエータ部分
を提供する工程；および
(c)該第1の二量体化ドメインと該第2の二量体化ドメインを含む二量体をアセンブルして、該標的ポリヌクレオチドおよび該テンプレートポリヌクレオチドの共局在をもたらす工程
を含む、前記方法。
【請求項１１８】
(i)前記第1のアクチュエータ部分と前記テンプレートポリヌクレオチドを含む、第1の複合体、および(ii)前記第2のアクチュエータ部分と前記標的ポリヌクレオチドを含む、第2の複合体を形成する工程をさらに含む、請求項117記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2018年8月24日に出願された米国特許仮出願第62/722,684号に対する優先権を主張し、その開示は、すべての目的のために、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の下で行われた発明に対する権利に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた助成金番号EB021240の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
生細胞内のポリヌクレオチドの3次元（3D）の空間的構成は、遺伝子発現、ゲノム安定性、および細胞機能を調節および維持するなどのプロセスにおいて重要な役割を果たす。例えば、核ラミナまたは核周辺部と結合するゲノム配列は低い転写活性を示すことが多いが、核内部に局在化するゲノム配列は比較的高い活性を示すことが多い。さらに、真核細胞の核は、様々な生物学的プロセスで機能的に重要な、多くの非膜系核内構造体（nuclear body）、例えば、Cajal体、PML体、核小体、およびスペックルを含む。ゲノミクスおよび細胞生物学において中心となる目標は、ゲノム構造と様々な核コンパートメント内のその構成と遺伝子発現との間の関係性を理解することであり続けるが、この目標は現在利用可能な方法に制約されている。
【０００４】
ゲノム構成と細胞運命決定の間の関係は、顕微鏡ベースのイメージング（例えば、FISH）および染色体コンフォメーションキャプチャ（3C）技法を使用する多数の研究によって示唆されている。例えば、リンパ球の発生の間、前駆細胞の核周辺部に配置されているIgHおよびIgκ遺伝子座は、プロB細胞において核内部に移ることが多く、これは、免疫グロブリン遺伝子座の活性化および再編成と同調的なプロセスである。同様に、前神経の転写因子Ascl1のゲノム遺伝子座は、未分化胚性幹細胞の核周辺部に位置するが、ニューロンの分化の間、核内部に移る。さらに、3Cベースの研究は、発生および疾患プロセス間の高解像度クロマチン相互作用（例えば、トポロジー的に結合したドメイン）の変化を明らかにした。全体的に見て、ゲノム構成をマッピングする、およびクロマチン要素の物理的な相互作用を測定するための強力な方法が存在するが、それらは、ゲノムの配置と機能の間の因果関係を提供することができないことが多く、それらは、生細胞における動的変化を測定することができない。
【０００５】
核コンパートメントは、ゲノムの構成および機能において重要な役割を果たすことが観察された。核内構造体は、タンパク質とRNAの間の多価相互作用によって引き起こされる液−液相分離を介してアセンブルすることが提唱されている。デノボ核内構造体形成は、クロマチンにおけるタンパク質またはRNA成分の固定化によって核形成され得る。核内構造体の中で、Cajal体（CB）は、脊椎動物の胚形成に必須であり、腫瘍細胞およびニューロン中に豊富である。CBはスキャフォールドタンパク質成分、コイリン（Coilin）を特徴とし、核内低分子RNA（snRNA）生合成、リボ核タンパク質（RNP）アセンブリー、およびテロメラーゼ生合成において重要な役割を果たす。腫瘍抑制因子タンパク質、PMLを特徴とする前骨髄球性白血病（PML）核内構造体は、腫瘍およびウイルス感染を含めた疾患プロセスと関連する豊富な核ドット構造である。しかし、核内構造体とクロマチンの共局在がどのようにして遺伝子発現および細胞機能に因果的に影響を及ぼすかは、ほとんど理解しにくいままである。
【０００６】
そのような因果関係を理解するために、配列特異的なDNA-タンパク質相互作用が、標的化されたゲノム再構成を媒介するために開発された。この技法は、ゲノム遺伝子座に挿入されたLacOリピートのアレイを利用し、これは、核膜タンパク質に融合したLacIと結合した場合に、隣接するゲノム配列を核周辺部に係留するのを促進する。この技法を使用して、いくつかの研究が、核周辺部へ遺伝子を再配置することが、遺伝子抑制につながることを報告した。しかし、この技法はプログラム可能なゲノム標的化に適しておらず、かつ冗長であり、実行するのが難しい。例えば、安定なLacOリピート含有細胞株を作製することがこの技法にとって前提条件であり、これは、ゲノム中への大きなLacOリピートアレイのランダムな挿入、単一挿入遺伝子座を含む細胞のスクリーニング、安定細胞株の生成、およびFISHによるゲノム挿入部位の特徴づけなどの多くの工程を既に含む。プログラム可能な、正確な、かつ標的化された様式で、ゲノムの空間的および時間的構成を操作するために、新しいツールが必要とされる。
【０００７】
原核生物のクラスII CRISPR-Cas（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート-CRISPR関連（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated））システムは、遺伝子編集、遺伝子調節、エピゲノム編集、クロマチンルーピング、および生細胞ゲノムイメージングのためのツールボックス（例えば、Cas9およびCpf1）として、別の目的で使われている。転写エフェクターまたはエピジェネティック修飾ドメインと結合したヌクレアーゼ不活性化Cas（dCas）タンパク質は、単一のガイドRNA（sgRNA）標的部位に隣接する遺伝子の発現の調節を可能にする。ゲノム構成を媒介すること、および哺乳類の核内の様々な核コンパートメントに対してクロマチンDNAの位置を再配置することにCRISPR-Casシステムを使用することができるかどうかは不明のままである。
【０００８】
前述のことを考慮すると、標的ポリヌクレオチドの空間的構成を行うための代替のシステムおよび方法の必要性がある。本開示はこの必要性および他の必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００９】
簡単な概要
一般に、プログラム可能なポリヌクレオチド再構成のためのシステムおよび方法が本明細書において提供される。本システムおよび方法は、化学的に誘導可能なシステムなどの誘導可能なシステムを介してアクチュエータ部分を細胞内コンパートメント特異的タンパク質と結合させることができ、かつ特定の細胞位置、例えば、核周辺部、Cajal体、およびPML核内構造体へのポリヌクレオチド、例えばゲノム遺伝子座の効率的、誘導可能、かつ動的な再配置を可能にすることができる（図1）。本システムおよび方法は、既存のポリヌクレオチド編集および調節ツールを拡張することができ、細胞内コンパートメントに対するポリヌクレオチドの3D構成を操作するための、およびマクロスケールの空間的ポリヌクレオチド構成と細胞機能の間の関係性を研究するための、改善された技術をもたらす。
【００１０】
一局面では、細胞のコンパートメントにおいて標的ポリヌクレオチドの空間的配置を制御するためのシステムが提供される。本システムは、第1の二量体化ドメインに連結されている（例えば、融合されている）コンパートメント特異的タンパク質を含む。システムは、標的ポリヌクレオチドを標的にするアクチュエータ部分をさらに含み、アクチュエータ部分は、第1の二量体化ドメインとアセンブルして二量体となることができる第2の二量体化ドメインに連結されている（例えば、融合されている）。いくつかの態様では、細胞は真核細胞である。
【００１１】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドはゲノムDNAを含む。いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドはRNAを含む。いくつかの態様では、アクチュエータ部分はCasタンパク質を含み、システムは、アクチュエータ部分と複合体を形成しかつ標的ポリヌクレオチド（例えば、ゲノムDNA）にハイブリダイズするガイドRNAをさらに含む。いくつかの態様では、アクチュエータ部分はRNA結合タンパク質を含み、システムは、アクチュエータ部分と複合体を形成しかつ標的ポリヌクレオチド（例えば、RNA）にハイブリダイズする、ガイドRNAをさらに含む。特定の場合では、システムは、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質をさらに含む。いくつかの態様では、RNA結合タンパク質はADAR1またはADAR2であり、かつガイドRNAはADARリクルーティングRNA（arRNA）を含む。いくつかの態様では、Casタンパク質はDNA切断活性を実質的に欠いている。いくつかの態様では、Casタンパク質は、Cas9タンパク質、Cas12タンパク質、Cas13タンパク質、CasXタンパク質、またはCasYタンパク質である。いくつかの態様では、Cas12タンパク質は、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、およびCas12eからなる群より選択される。いくつかの態様では、Cas13タンパク質は、Cas13a、Cas13b、Cas13c、およびCas13dからなる群より選択される。特定の場合では、Cas13dタンパク質はCasRxである。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする結合タンパク質を含み、かつ結合タンパク質はジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALEヌクレアーゼである。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、ガイドポリヌクレオチドと複合体を形成しているアルゴノートタンパク質を含み、ガイドポリヌクレオチドはガイドRNAまたはガイドDNAであり、かつガイドポリヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。
【００１２】
いくつかの態様では、コンパートメント特異的タンパク質は、コンパートメントに内在性のタンパク質、調節タンパク質、モータータンパク質、DNA修復タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の場合では、コンパートメントに内在性のタンパク質は、コンパートメントに局在するタンパク質、コンパートメントの成分、コンパートメント内に見出されるタンパク質、および／またはコンパートメントと関連するタンパク質である。特定の場合では、調節タンパク質は遺伝子発現のアクチベーターまたはリプレッサーである。特定の場合では、モータータンパク質は、微小管またはアクチンフィラメントに沿った分子の輸送を促進する任意のタンパク質である。特定の場合では、DNA修復タンパク質は二本鎖切断を修復する任意のタンパク質である。
【００１３】
いくつかの態様では、コンパートメントは核コンパートメント（例えば、核内構造体）である。いくつかの態様では、核コンパートメントは核内膜を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はエメリン、Lap2ベータ、ラミンB、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、核コンパートメントはCajal体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はコイリン、SMN、Gemin3、SmD1、SmE、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、核コンパートメントは核スペックルを含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はSC35を含む。いくつかの態様では、核コンパートメントはPML体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はPML、SP100、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、核コンパートメントは核コア複合体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はNup50、Nup98、Nup53、Nup153、Nup62、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、核コンパートメントは核小体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は核小体タンパク質B23を含む。いくつかの態様では、核コンパートメントはヘテロクロマチンを含み、ならびに／あるいはコンパートメント特異的タンパク質は、調節タンパク質、例えばヘテロクロマチンタンパク質1（例えば、切断型および完全長を含めた、HP1α、HP1β、および／もしくはHP1γ）、クルッペル関連ボックス−ジンクフィンガータンパク質（KRAB-ZFP）、KRAB関連タンパク質1（KAP1）、ヌクレオソームリモデリング脱アセチル化酵素複合体（NuRD）、SETドメイン分岐1（SET domain bifurcated 1）（SETDB1）、DNAメチルトランスフェラーゼ（例えば、DNMT3A、DNMT3L、DNMT3B）、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）、SUV39H1（切断型、完全長）、G9α（切断型、完全長）、Ezh1/2、EED、Suz12、JARID2、AEBP2、RbAp48、PCL1、RBBP7/4、C17orf96、C10orf12、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、核コンパートメントは核内構造体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、DNA修復タンパク質、例えば、53BP1、Rad51、Rad52、Ubc9、UBL1、BLM、c-Abl、BCR/Abl、BRCA1/2、PALB2、RPA、Rad51AP1、Chk1、Arg、Hop2、Mnd1、DMC1、もしくはこれらの組み合わせを含む。
【００１４】
いくつかの態様では、コンパートメントは細胞質コンパートメント（例えば、細胞体（cellular body））である。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはP顆粒を含み、ならびに／あるいはコンパートメント特異的タンパク質は、1種もしくは複数種のRGGドメインタンパク質（例えば、PGL-1およびPGL-3）、Deadボックスタンパク質、GLH-1-4、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはGW体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はGW182を含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはストレス顆粒を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はG3BP（Ras-GAP SH3結合タンパク質）、TIA-1（T細胞細胞内抗原）、eIF2、eIF4E、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはスポンジ体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、EXu、Btz、Tral、Cup、eIF4E、Me31B、Yps、Gus、Dcp1/2、Sqd、BicC、Hrb27C、Bru、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントは細胞質プリオンタンパク質誘導性リボ核タンパク質（cytoplasmic prion protein induced ribonucleoprotein）（CyPrP-RNP）顆粒を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、Dcp1a、DDX6/Rck/p54/Me31B/Dhh1、ダイサー、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはU体を含み、ならびに／あるいはコンパートメント特異的タンパク質は、1種もしくは複数種のウリジンリッチ核内低分子リボ核タンパク質U1、U2、U4/U6、およびU5；LSm1-7；運動神経細胞生存（SMN）タンパク質、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントは小胞体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、カルレティキュリン、カルネキシン、PDI、GRP78、GRP94、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはミトコンドリアを含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はHIF1A、PLN、Cox1、ヘキソキナーゼ、TOMM40、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントは原形質膜を含み、および／あるいはコンパートメント特異的タンパク質は、ナトリウム・カリウムATPアーゼ、CD98、1種もしくは複数種のカドヘリン、原形質膜カルシウムATPアーゼ（PMCA）、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはゴルジ装置を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、GM130、MAN2A1、MAN2A2、GLG1、B4GALT1、RCAS1、GRASP65、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはリボソームを含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、AGO2、MTOR、PTEN、RPL26、FBL、RPS3、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはプロテアソームを含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、PSMA1、PSMB5、PSMC1、PSMD1、PSMD7、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはエンドソームを含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、CFTR、ADRB1、EGFR、IGF2R、AP2S1、CD4、HLA-A、カベオリン（Coveolin）、RAB5、ErbB2、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはリポソームを含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、EEA1、LAMTOR2、LAMTOR4、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントは細胞骨格成分（例えば、微小管および／もしくはアクチンフィラメント）を含み、ならびに／またはコンパートメント特異的タンパク質は、モータータンパク質、例えば、キネシン、ダイニン、ミオシン、もしくはこれらの組み合わせを含む。
【００１５】
いくつかの態様では、コンパートメント特異的タンパク質は、蛍光タンパク質にさらに連結されている（例えば、融合されている）。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、蛍光タンパク質にさらに連結されている（例えば、融合されている）。いくつかの態様では、第1の二量体化ドメインおよび第2の二量体化ドメインは、リガンド、光、または酵素の存在下でのみアセンブルして二量体を形成する、誘導可能な二量体化システムを含む。いくつかの態様では、第1の二量体化ドメインおよび第2の二量体化ドメインは、リガンドの存在下でリガンドにそれぞれ結合する。いくつかの態様では、リガンドは化学的誘導物質またはオプトジェネティック誘導物質である。いくつかの態様では、第1の二量体化ドメインおよび第2の二量体化ドメインは自発的二量体化システムを含む。
【００１６】
いくつかの態様では、システムは、第1の二量体化ドメインに連結されているコンパートメント特異的タンパク質をコードする核酸配列を含む第1のポリヌクレオチド（例えば、ベクター）および第2の二量体化ドメインに連結されているアクチュエータ部分をコードする核酸配列を含む第2のポリヌクレオチド（例えば、ベクター）を含む。
【００１７】
別の局面では、細胞のコンパートメントにおいて標的ポリヌクレオチドの空間的配置を制御する方法が提供される。本方法は、第1の二量体化ドメインに連結されている（例えば、融合されている）コンパートメント特異的タンパク質を提供すること（例えば、細胞中に導入すること）を含む。方法は、第2の二量体化ドメインに連結されている（例えば、融合されている）アクチュエータ部分を提供すること（例えば、細胞中に導入すること）をさらに含む。方法は、アクチュエータ部分と標的ポリヌクレオチドとを含む複合体を形成することをさらに含む。方法は、第1の二量体化ドメインと第2の二量体化ドメインとを含む二量体をアセンブルして、それによって、コンパートメント中に標的ポリヌクレオチドを配置することをさらに含む。いくつかの態様では、細胞は真核細胞である。
【００１８】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドはコンパートメントに内在性ではない。いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドの配置は、標的ポリヌクレオチドの発現を調節することを含む。いくつかの態様では、調節することは、標的ポリヌクレオチドの発現を低下させることを含む。いくつかの態様では、調節することは、標的ポリヌクレオチドの発現を増大させることを含む。いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドの配置は、コンパートメントに内在性である1種または複数種のさらなるポリヌクレオチドの発現を調節することをさらに含む。いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドの配置は、例えば、異なる細胞内コンパートメントに標的ポリヌクレオチド（例えば、テロメア）を再配置することによって、細胞機能、細胞運命、細胞増殖、アポトーシス、および／または細胞分化を変化させることを含む。特定の場合では、核周辺部またはCajal体などの核コンパートメントへの標的ポリヌクレオチド（例えば、テロメア）の配置は、細胞生存率を増加または減少させる。いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドの配置は、細胞内に1つまたは複数のさらなるコンパートメントを作製することをさらに含む。いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドの配置は、DNA切断を修復することをさらに含む。ある特定の態様では、DNA切断は一本鎖切断または二本鎖切断である。いくつかの態様では、修復することは外来性DNAを導入することを含む。いくつかの態様では、導入することは、組換え、非相同末端結合（non-homologous end-joining）（NHEJ）、または相同組換え修復（homology-directed repair）（HDR）を含む。いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドの配置は、コンパートメントを形成するための相分離を誘導する。ある特定の態様では、コンパートメントは、タンパク質、RNA、DNA、またはこれらの組み合わせを含む人工の凝集体である。ある場合では、コンパートメントは核内構造体（例えば、Cajal体）または細胞体である。いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドの配置は、DNA修復を促進する（例えば、二本鎖切断の修復を促進する）および遺伝子編集効率を改善する（例えば、HDRを増強する）核内構造体の形成を誘導する。
【００１９】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドはゲノムDNAを含む。いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドはRNAを含む。いくつかの態様では、アクチュエータ部分はCasタンパク質を含み、方法は、アクチュエータ部分と複合体を形成しかつ標的ポリヌクレオチド（例えば、ゲノムDNA）にハイブリダイズするガイドRNAを提供することをさらに含む。いくつかの態様では、アクチュエータ部分はRNA結合タンパク質を含み、方法は、アクチュエータ部分と複合体を形成しかつ標的ポリヌクレオチド（例えば、RNA）にハイブリダイズするガイドRNAを提供することをさらに含む。特定の場合では、方法は、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質を提供することをさらに含む。いくつかの態様では、RNA結合タンパク質はADAR1またはADAR2であり、かつガイドRNAはADARリクルーティングRNA（arRNA）を含む。いくつかの態様では、Casタンパク質はDNA切断活性を実質的に欠いている。いくつかの態様では、Casタンパク質は、Cas9タンパク質、Cas12タンパク質、Cas13タンパク質、CasXタンパク質、またはCasYタンパク質である。いくつかの態様では、Cas12タンパク質は、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、およびCas12eからなる群より選択される。いくつかの態様では、Cas13タンパク質は、Cas13a、Cas13b、Cas13c、およびCas13dからなる群より選択される。特定の場合では、Cas13dタンパク質はCasRxである。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする結合タンパク質を含み、かつ結合タンパク質はジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALEヌクレアーゼである。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、ガイドポリヌクレオチドと複合体を形成しているアルゴノートタンパク質を含み、ガイドポリヌクレオチドはガイドRNAまたはガイドDNAであり、かつガイドポリヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。
【００２０】
いくつかの態様では、コンパートメント特異的タンパク質は、コンパートメントに内在性のタンパク質、調節タンパク質、モータータンパク質、DNA修復タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の場合では、コンパートメントに内在性のタンパク質は、コンパートメントに局在するタンパク質、コンパートメントの成分、コンパートメント内に見出されるタンパク質、および／またはコンパートメントと関連するタンパク質である。特定の場合では、調節タンパク質は遺伝子発現のアクチベーターまたはリプレッサーである。特定の場合では、モータータンパク質は、微小管またはアクチンフィラメントに沿った分子の輸送を促進する任意のタンパク質である。特定の場合では、DNA修復タンパク質は二本鎖切断を修復する任意のタンパク質である。
【００２１】
いくつかの態様では、コンパートメントは核コンパートメント（例えば、核内構造体）である。いくつかの態様では、核コンパートメントは核内膜を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はエメリン、Lap2ベータ、ラミンB、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、核コンパートメントはCajal体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はコイリン、SMN、Gemin3、SmD1、SmE、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、核コンパートメントは核スペックルを含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はSC35を含む。いくつかの態様では、核コンパートメントはPML体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はPML、SP100、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、核コンパートメントは核コア複合体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はNup50、Nup98、Nup53、Nup153、Nup62、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、核コンパートメントは核小体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は核小体タンパク質B23を含む。いくつかの態様では、核コンパートメントはヘテロクロマチンを含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、調節タンパク質、例えばヘテロクロマチンタンパク質1（例えば、切断型および完全長を含めた、HP1α、HP1β、および／またはHP1γ）、クルッペル関連ボックス−ジンクフィンガータンパク質（KRAB-ZFP）、KRAB関連タンパク質1（KAP1）、ヌクレオソームリモデリング脱アセチル化酵素複合体（NuRD）、SETドメイン分岐1（SETDB1）、DNAメチルトランスフェラーゼ（例えば、DNMT3A、DNMT3L、DNMT3B）、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）、SUV39H1（切断型、完全長）、G9α（切断型、完全長）、Ezh1/2、EED、Suz12、JARID2、AEBP2、RbAp48、PCL1、RBBP7/4、C17orf96、C10orf12、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、核コンパートメントは核内構造体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、DNA修復タンパク質、例えば、53BP1、Rad51、Rad52、Ubc9、UBL1、BLM、c-Abl、BCR/Abl、BRCA1/2、PALB2、RPA、Rad51AP1、Chk1、Arg、Hop2、Mnd1、DMC1、もしくはこれらの組み合わせを含む。
【００２２】
いくつかの態様では、コンパートメントは細胞質コンパートメント（例えば、細胞体）である。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはP顆粒を含み、および／あるいはコンパートメント特異的タンパク質は、1種もしくは複数種のRGGドメインタンパク質（例えば、PGL-1およびPGL-3）、Deadボックスタンパク質、GLH-1-4、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはGW体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はGW182を含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはストレス顆粒を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はG3BP（Ras-GAP SH3結合タンパク質）、TIA-1（T細胞細胞内抗原）、eIF2、eIF4E、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはスポンジ体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、EXu、Btz、Tral、Cup、eIF4E、Me31B、Yps、Gus、Dcp1/2、Sqd、BicC、Hrb27C、Bru、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントは細胞質プリオンタンパク質誘導性リボ核タンパク質（CyPrP-RNP）顆粒を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、Dcp1a、DDX6/Rck/p54/Me31B/Dhh1、ダイサー、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはU体を含み、ならびに／あるいはコンパートメント特異的タンパク質は、1種もしくは複数種のウリジンリッチ核内低分子リボ核タンパク質U1、U2、U4/U6、およびU5；LSm1-7；運動神経細胞生存（SMN）タンパク質、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントは小胞体を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、カルレティキュリン、カルネキシン、PDI、GRP78、GRP94、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはミトコンドリアを含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質はHIF1A、PLN、Cox1、ヘキソキナーゼ、TOMM40、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントは原形質膜を含み、および／あるいはコンパートメント特異的タンパク質は、ナトリウム・カリウムATPアーゼ、CD98、1種もしくは複数種のカドヘリン、原形質膜カルシウムATPアーゼ（PMCA）、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはゴルジ装置を含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、GM130、MAN2A1、MAN2A2、GLG1、B4GALT1、RCAS1、GRASP65、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはリボソームを含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、AGO2、MTOR、PTEN、RPL26、FBL、RPS3、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはプロテアソームを含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、PSMA1、PSMB5、PSMC1、PSMD1、PSMD7、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはエンドソームを含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、CFTR、ADRB1、EGFR、IGF2R、AP2S1、CD4、HLA-A、コベオリン、RAB5、ErbB2、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントはリポソームを含み、および／またはコンパートメント特異的タンパク質は、EEA1、LAMTOR2、LAMTOR4、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞質コンパートメントは細胞骨格成分（例えば、微小管および／もしくはアクチンフィラメント）を含み、ならびに／またはコンパートメント特異的タンパク質は、モータータンパク質、例えば、キネシン、ダイニン、ミオシン、もしくはこれらの組み合わせを含む。
【００２３】
いくつかの態様では、コンパートメント特異的タンパク質は、蛍光タンパク質にさらに連結されている（例えば、融合されている）。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、蛍光タンパク質にさらに連結されている（例えば、融合されている）。いくつかの態様では、第1と第2の二量体化ドメインをアセンブルすることは誘導可能であり、リガンド、光、または酵素の存在下でのみ生じる。いくつかの態様では、第1の二量体化ドメインおよび第2の二量体化ドメインは、リガンドの存在下でリガンドにそれぞれ結合する。いくつかの態様では、リガンドは化学的誘導物質またはオプトジェネティック誘導物質である。いくつかの態様では、第1の二量体化ドメインおよび第2の二量体化ドメインは自発的二量体化システムを含む。
【００２４】
いくつかの態様では、方法は、第1の二量体化ドメインに連結されているコンパートメント特異的タンパク質をコードする核酸配列を含む第1のポリヌクレオチド（例えば、ベクター）および第2の二量体化ドメインに連結されているアクチュエータ部分をコードする核酸配列を含む第2のポリヌクレオチド（例えば、ベクター）を含む本明細書において記載されるシステムを細胞中に導入することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図1は、様々な核コンパートメントにゲノム遺伝子座を標的化するためのプログラム可能な、誘導可能な、かつ汎用性のあるシステムの概略図である。dCas9および核コンパートメント特異的なタンパク質は、ヘテロ二量体化ドメインの相補的対に融合しており、これらは、化学的誘導物質の存在下でのみアセンブルする。ゲノム標的はsgRNA配列によって特定され、核コンパートメントは、CRISPR-GOをコンパートメント特異的な分子と融合することにより、プログラムされる。
【図２】図2は、ヒト細胞におけるABI-dCas9およびPYL1-GFP-エメリンの共発現を介して核エンベロープ（NE）にゲノム遺伝子座を標的化するための、アブシジン酸（ABA）で誘導可能なCRISPR-GOシステムの概略図である。ABAの存在下で、ABIとPYL1は二量体化し、核エンベロープのPYL1-GFP-エメリンへのABI-dCas9で標的化されたゲノム遺伝子座の再局在を引き起こす。ABAの除去後、ABIとPYL1は解離し、ゲノム遺伝子座は、もはやNEに係留されていない。
【図３】図3は、ヒト細胞におけるABI-BFP-dCas9とPYL1-GFP-エメリンの共発現を用いるABAで誘導可能なCRISPR-GOシステムの概略図である。ABA処理は、ABIとPYL1を二量体化し、PYL1-GFP-エメリンを含む核周辺部にABI-BFP-dCas9で標的化されたゲノム遺伝子座を再局在させる。
【図４】図4は、ヒト細胞におけるdCas9-EGFP-HaloTagとDHFR-エメリン-mCherryの共発現を用いる、TMP-HTagで誘導可能なCRISPR-GOシステムの概略図である。TMP-HTag処理はDHFRとHaloTagを二量体化し、DHFR-エメリン-mCherryを含む核周辺部にdCas9-EGFP-HaloTagで標的化されたゲノム遺伝子座を再局在させる。
【図５】図5は、生細胞において、CRISPR-GOシステムによって標的化された反復性ゲノム遺伝子座を可視化するために、CRISPR-Cas9イメージングを使用するための方法の概略図である。AB1-dCas9とdCas9-HaloTagの両方とも、同じ反復性ゲノム遺伝子座に結合する。AB1-dCas9はPYL1-エメリンと二量体化して、ゲノム遺伝子座を再局在させるが、dCas9-HaloTagは細胞透過性JF549-HaloTag色素リガンドに結合して、生細胞において、標的化されたゲノム遺伝子座の可視化を可能にする。
【図６】図6は、sgRNA無しで、AB1-BFP-dCas9、PYL1-GFP-エメリン、およびdCas9-HaloTagの共発現を示すU2OS細胞の代表的な顕微鏡画像を示す。AB1-BFP-dCas9は、ABA処理無しで、おそらく核小体中に蓄積する。ABA処理で誘導されたヘテロ二量体化は、PYL1-GFP-エメリンによってマークされるように、核エンベロープ（NE）および小胞体（ER）にAB1-BFP-dCas9を移した。dCas9-HaloTagは発現レベルが低く、核全体にわたって均等に分布しており；その位置は、ABA処理の影響を受けないままであった。スケールバー、10μm。
【図７】図7は、図8および図9においてCRISPR-GOによって標的化される高度反復性領域の染色体位置の概要である。単一sgRNAは標的化された領域内の複数の反復（塗りつぶされた灰色のボックス）に結合する。標的化された部位に隣接する遺伝子を灰色の外枠で囲まれたボックス中にイタリック体で示す。
【図８】図8は、高度反復性ゲノム遺伝子座のCRISPR−GO誘導性ゲノム再配置効率の定量化のグラフを示す。Chr3、Chr13、およびLacO遺伝子座は、生細胞において、CRISPR-Cas9イメージングを使用して標識する。テロメアは、テロメアマーカー、すなわちTRF1-mCherryによって標識する。核エンベロープはGFP-エメリンによって可視化する。各遺伝子座について、左の棒グラフは核周辺部のゲノム遺伝子座のパーセンテージを示し、右の棒グラフは少なくとも1つの核周辺部結合遺伝子座を含む細胞のパーセンテージを示す。解析した遺伝子座と細胞の数は下部にある。
【図９】図9は、低度反復性の内在性ゲノム遺伝子座のCRISPR−GO誘導性核再配置効率の定量化のグラフを示す。ゲノム遺伝子座は3D-FISHによって可視化し、核はDAPIにより染色する。各遺伝子座について、左の棒グラフは核周辺部のゲノム遺伝子座のパーセンテージを示し、右の棒グラフは少なくとも1つの核周辺部結合遺伝子座を含む細胞のパーセンテージを示す。解析した遺伝子座と細胞の数は下部にある。
【図１０】図10は、ABA有りまたは無しの、CRISPR-Cas9イメージングによって標識した標的化されたゲノム遺伝子座（矢印）の局在を比較する、代表的な顕微鏡画像を示す。PYL1-GFP-エメリンは、核エンベロープ（NE）および小胞体（ER）に局在していることが示される。核周辺部は、係留されているゲノム遺伝子座の隣の領域を除いて、白い点線で囲まれている。挿入図は、周辺部に係留されているゲノム遺伝子座の拡大画像を示す。スケールバー、10μm。
【図１１】図11は、ABA有りまたは無しの、標的化されたゲノム遺伝子座（矢印）と核周辺部（点線）の局在を比較する、図10の代表的な顕微鏡画像の個々のチャネルを示す。上部の列は、核エンベロープ（NE）および小胞体（ER）に局在しているPYL1-GFP-エメリンを示す。核周辺部は、係留されているゲノム遺伝子座の隣の領域を除いて、白い点線で囲まれている（下部）。スケールバー、10μm。
【図１２】図12は、図11の上部のエメリン画像に示す点線に沿った、ABA処理無し（上部）および有り（下部）の、標識されたChr3遺伝子座および標識されたPYL1-GFP-エメリンの蛍光強度のラインスキャンのグラフを示す。Chr3遺伝子座は、JF549-HaloTag色素の添加によるCRISPR-Cas9イメージングによって標識した。
【図１３】図13は、示される点線に沿った、ABA処理無し（上部）および有り（下部）の、標識されたLacO遺伝子座（FISH、Alexa646）および標識された核（DAPI）の蛍光強度のラインスキャンのグラフを示す。
【図１４】図14は、図8および図9においてCRISPR-GOによって標的化される低度反復性領域の染色体位置の概要である。単一sgRNAは標的化された領域内の複数の反復（塗りつぶされた灰色のボックス）に結合する。標的化された部位に隣接する遺伝子を灰色の枠で囲まれたボックス中にイタリック体で示す。
【図１５】図15は、ABA有りまたは無しの、3D-FISHによって標識された標的化されたゲノム遺伝子座（矢印）の局在を比較する、代表的な顕微鏡画像を示す。DAPIによって標識された核を示す。核周辺部は、係留されているゲノム遺伝子座の隣の領域を除いて、白い点線で囲まれている。挿入図は、周辺部に係留されているゲノム遺伝子座の拡大画像を示す。個々のチャネルについて図11を参照されたい。スケールバー、10μm。
【図１６】図16は、非標的化sgRNAがトランスフェクトされたCRISPR-GO細胞における核周辺部局在型ゲノム遺伝子座（Chr7、ChrX、およびCXCR4）のパーセンテージの定量化のグラフを示す。各遺伝子座について、左の棒グラフは核周辺部局在型ゲノム遺伝子座のパーセンテージを示し、右の棒グラフは少なくとも1つの周辺部関連遺伝子座を含む細胞のパーセンテージを示す。
【図１７】図17は、図18および図19においてCRISPR-GOによって標的化される非反復性領域の染色体位置の概要を示す。複数のsgRNAは、標的化された遺伝子（XIST、PTEN、CXCR4）の遺伝子本体の上流または遺伝子本体内の領域に沿ってタイリングするように設計される。sgRNA標的化領域を塗りつぶされた灰色のボックスで示す。上部の灰色のボックスはフォワード鎖内のsgRNA標的を示し、下部の灰色のボックスはリバース鎖内のsgRNA標的を示す。標的化された部位に隣接する遺伝子を灰色のボックス中にイタリック体で示す。
【図１８】図18は、非反復性内在性ゲノム遺伝子座のCRISPR−GO誘導性核再配置効率の定量化のグラフを示す。単一sgRNAまたは一緒にプールされた複数のsgRNAでCXCR4に隣接する非反復性遺伝子座を標的化した。ゲノム遺伝子座は3D-FISHによって可視化し、核はDAPIにより染色する。各遺伝子座について、左の棒グラフは核周辺部のゲノム遺伝子座のパーセンテージを示し、右の棒グラフは少なくとも1つの核周辺部結合遺伝子座を含む細胞のパーセンテージを示す。解析した遺伝子座と細胞の数は下部にある。
【図１９】図19は、単一sgRNA（sgCXCR4-1、左；sgCXCR4-2、中央）または6種のsgRNA（右）を使用してCXCR4遺伝子座を標的化する再局在効果の比較のグラフを示す。各遺伝子座について、左の棒グラフは核周辺部のゲノム遺伝子座のパーセンテージを示し、右の棒グラフは少なくとも1つの核周辺部結合遺伝子座を含む細胞のパーセンテージを示す。解析した遺伝子座と細胞の数は下部にある。
【図２０】図20は、ABAの添加または除去によって媒介される、内在性遺伝子座Chr3:q29の誘導可能かつ可逆的な再配置のタイムコースのグラフである。Y軸は周辺部局在型Chr3:q29遺伝子座のパーセンテージを示す。X軸は、ABA添加または除去からの、時間での経過時間を示す。データは、平均±SEMとして示される。
【図２１】図21は、ABA添加後の異なる時点でのS期停止細胞（+ABA、+HU）および対照細胞（+ABA、-HU）におけるゲノム再配置効果の比較のグラフである。Y軸は、異なる時点での周辺部局在型Chr3:q29遺伝子座のパーセンテージを示す。データは、平均±SEMとして示される。左のボックスはタイムコース実験の概略を示す。
【図２２】図22は、核エンベロープへの内在性Chr3:q29遺伝子座（矢印）の有糸分裂非依存性係留を示す代表的な顕微鏡画像を示す。Chr3:q29遺伝子座（矢印）は、記録の最初の4時間で核エンベロープから分離し始める。核周辺部の係留は4.5時間で生じ、記録の残りの8時間にわたって安定なままである。ここの画像は図23の挿入図である。スケールバー、2μm。
【図２３】図23は、核周辺部への内在性ゲノム遺伝子座の有糸分裂非依存性係留を示す代表的な顕微鏡画像を示す。挿入図は図22でも示される。PYL1-GFP-エメリンは核エンベロープ（NE）および小胞体（ER）に局在しており、核エンベロープは点線で囲まれている。Chr3遺伝子座は、記録の最初の4時間では核エンベロープに隣接していない。核周辺部の係留は4.5時間で起こり、記録の残りの8時間にわたってとどまる。核の回転は、10時間〜12時間の間に起こる。スケールバー、10μm。
【図２４】図24は、異なる時点での、図22のゲノム遺伝子座と最も近い核周辺部との間の距離を示すグラフである。画像は30分ごとに撮った。
【図２５】図25は、係留されていない（1&2）および係留されている（3&4）Chr3遺伝子座の段階変位（dx、dy）の散布図を示す。段階変位は、前の時点の位置を新しい位置から引くこと、すなわち、dxt=(xt-xt-1)およびdyt=yt-yt-1によって計算される。6分にわたって4秒ごとに移動を追跡した。
【図２６】図26は、係留されていない（19個の細胞で1696段階）および係留されている（14個の細胞で1669段階）Chr3:q29遺伝子座の平均段階距離の比較のグラフである。不等分散を用いた両側t検定によって、p<0.0001。データは平均±SDとして示される。
【図２７】図27は、ガンマ分布を使用した場合の、係留されていないおよび係留されているChr3:q29遺伝子座の段階距離の適合のグラフである。適合パラメーター：係留されていない遺伝子座に対して形状パラメーターk=2.4、および係留されている遺伝子座に対して1.9；速度パラメーターβ=係留されていない遺伝子座に対して21.9、および係留されている遺伝子座に対して46.3。
【図２８】図28は、ヒト細胞におけるABI-dCas9とPYL1-GFP-コイリンの共発現を介してCBにゲノム遺伝子座を標的化するための、ABAで誘導可能なCRISPR-GOシステムの概略図である。ABA処理は、ABIとPYL1を二量体化し、PYL1-GFP-コイリンを含むCBにABI-dCas9で標的化されたゲノム遺伝子座を係留する。
【図２９】図29は、ABA有りまたは無しの、標的化されたLacO遺伝子座（上部パネル、FISHによる）とコイリン-GFP標識CB（中央パネル）の共局在を示す代表的な顕微鏡画像を示す。
【図３０】図30は、LacO遺伝子座のCRISPR−GO誘導性CB係留効率の定量化のグラフを示す。左の棒グラフはコイリン-GFP標識CBと共局在するLacO遺伝子座のパーセンテージを示し、右の棒グラフは少なくとも1つのCB共局在型LacO遺伝子座を含む細胞のパーセンテージを示す。解析した遺伝子座と細胞の数は下部に表示される。データは、平均±SEMとして示される。
【図３１】図31は、LacO遺伝子座をCBに係留するためにCRISPR-GOシステムを使用した場合の、LacO遺伝子座（FISHによる）と他のCB成分（SMN、フィブリラリン、Gemin2、免疫染色による）の共局在を示す代表的な顕微鏡画像を示す。
【図３２】図32は、ABA有りまたは無しの、標的化されたChr3:q29遺伝子座（上部パネル、CRISPR-Cas9イメージングによる）とコイリン-GFP標識CB（中央パネル）の共局在を示す代表的な顕微鏡画像を示す。
【図３３】図33は、Chr3:q29遺伝子座のCRISPR-GO誘導性CB係留効率の定量化のグラフを示す。左の棒グラフはCBと共局在するChr3:q29遺伝子座のパーセンテージを示し、右の棒グラフは少なくとも1つのCB共局在型Chr3:q29遺伝子座を含む細胞のパーセンテージを示す。遺伝子座および細胞の数は下部にある。データは、平均±SEMとして示される。
【図３４】図34は、ABI-dCas9とPYL1-GFP-PMLの共発現を介してPML体にゲノム遺伝子座を標的化するための、ABAで誘導可能なCRISPR-GOシステムの概略図である。
【図３５】図35は、ABA有りまたは無しの、標的化されたChr3:q29遺伝子座（上部パネル、CRISPR-Cas9イメージングによる）とPML-GFP標識されたPML体（中央パネル）の共局在を示す代表的な顕微鏡画像を示す。
【図３６】図36は、標的化されたChr3:q29遺伝子座へのCRISPR−GO誘導性PML体係留効率の定量化のグラフを示す。左の棒グラフはPML体と共局在するChr3:q29遺伝子座のパーセンテージを示し、右の棒グラフは少なくとも1つのPML体共局在型Chr3:q29遺伝子座を含む細胞のパーセンテージを示す。遺伝子座および細胞の数は下部にある。データは、平均±SEMとして示される。
【図３７】図37は、PML体にChr3:q29遺伝子座を係留するためにCRISPR-GOを使用した後の、別のPML体マーカー、SP100（免疫染色）とChr3:q29遺伝子座（CRISPR-Cas9イメージングによる）の共局在を示す代表的な顕微鏡画像を示す。スケールバー、10μm。
【図３８】図38は、ABAの添加を介して迅速に誘導可能なクロマチン-CB結合のグラフである。Y軸は、CB共局在型LacO遺伝子座のパーセンテージを示す。データは、平均±SEMとして示される。
【図３９】図39は、ABAの除去後のクロマチン-CBの解離の動態を示すプロット図である。Y軸は、CB共局在型LacO遺伝子座のパーセンテージを示す。X軸は、ABA除去からの、時間での経過時間を示す。データは、平均±SEMとして示される。
【図４０】図40は、ABAで処理した細胞（上部）およびABA除去後6時間の細胞（下部の2列）における標的化されたLacO遺伝子座でのGFP-コイリン蛍光の比較を示す。薄暗いCBを有する細胞（中央）またはGFP-コイリンCBが見えなくなった細胞（下部）について、2つの代表的な顕微鏡画像を示す。ラインスキャン（右）は、左に示される点線に沿って、GFP-コイリンおよびLacO遺伝子座の生の蛍光強度を測定する。
【図４１】図41は、CRISPR-GOによって媒介される、標的化されたLacO遺伝子座におけるデノボCB（コイリン）の迅速な形成を示す代表的なリアルタイム顕微鏡画像を示す。ABA処理前（-150秒）に、選択された細胞を最初にイメージングした。-150秒〜0秒の間に、培養培地にABAを加え、0秒は、ABA添加の直後に撮った同じ細胞の最初の画像を示す。
【図４２】図42は、Cajal体共局在による、標的化された遺伝子座に隣接し、長距離にわたった内在性遺伝子発現の抑制を示す。左：U2OS細胞においてChr3:q29遺伝子座をCBに共局在させるためのCRISPR-GOシステムの概略図。ACAP2は、sgRNA標的部位の約35kb上流に位置し、PPP1R2はsgRNA標的部位の約36kb下流に位置する。右：+/-ABA条件において、Chr3:q29遺伝子座をCBに共局在させるためにCRISPR-GOを使用する場合の、ACAP2とPPP1R2の遺伝子発現（RT-qPCRによって測定した）の比較のグラフ。対照について、図43を参照されたい。
【図４３】図43は、内在性Chr3遺伝子座をCBと共局在させるためにCRISPR-GOを使用することに対する対照のグラフを示す。左：ABA有りおよび無しで、CRISPR-GOシステムを用いるが、標的化sgRNAを用いない場合の、ACAP2とPPP1R2のmRNA発現の測定；右：ABA有りおよび無しで、ABI-dCas9およびChr3標的化sgRNAを用いるが、PYL1-GFP-コイリンを用いない場合の、ACAP2とPPP1R2のmRNA発現の測定。mRNAは、異なる条件下でRT-qPCRを使用して測定した。
【図４４】図44は、図41に示される標的化されたLacO遺伝子座におけるコイリン-GFP蛍光強度の定量化のグラフである。-150秒でのABA添加前の蛍光強度を0（バックグラウンド）に設定した。
【図４５】図45は、CRISPR-GOによって媒介される、隣接する標的化されたLacO遺伝子座への既存のCB（コイリン、矢印）の共局在を示すリアルタイム顕微鏡画像を示す。選択された細胞をABA処理前（-200秒）にイメージングした。-200秒と0秒の間で培養培地にABAを加え、0秒はABA添加の直後に撮った最初の画像を示す。スケールバー、10μm。
【図４６】図46は、核周辺部への標的化されたクロマチンDNAの再配置によって抑制される、隣接するレポーター遺伝子の発現を示す。左：CFP-SKLレポーター遺伝子を駆動するドキシサイクリン（Dox）で誘導可能なTRE-ミニCMVプロモーターに隣接して挿入されているLacOリピートアレイをU2OS 2-6-3細胞において核周辺部に再配置するためのCRISPR-GOシステムの概略図。右：+/-Doxおよび+/-ABA条件において、核周辺部にLacO遺伝子座を再配置するためにCRISPR-GOシステムを使用した場合の、CFPレポーターの発現レベルの比較のグラフ。データは平均±SDとして示される。代表的なヒストグラムおよび対照について、図47を参照されたい。
【図４７】図47は、異なる条件下で核周辺部へのLacO遺伝子座のCRISPR-GO係留を使用した場合の、CFPレポーターの発現の蛍光強度を比較する代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを示す。統計図を図46に示す。右の図は、+/-DoxについてABA処理有りまたは無しで非標的化sgRNAを用いた場合の、相対的CFP蛍光の定量化を示す。データは平均±SDとして示される。
【図４８】図48は、核周辺部にChr3遺伝子座を再配置するためにCRISPR-GOシステムを使用した場合の、ACAP2とPPP1R2の遺伝子発現の比較のグラフを示す。異なる条件下でRT-qPCRを使用してmRNAを測定した。非標的化sgRNA（sgNT）がトランスフェクトされた細胞を対照として使用した。データは平均±SDとして示される。
【図４９】図49は、Cajal体共局在によって抑制された、標的化された遺伝子座に隣接するレポーター遺伝子の発現を示す。左：U2OS 2-6-3細胞においてLacOリピートアレイをCBに共局在させるためのCRISPR-GOシステムの概略図。右：+/-Doxおよび+/-ABA条件について、LacO遺伝子座をCBに共局在させるためにCRISPR-GOシステムを使用した場合の、CFPレポーターの発現の比較のグラフ。代表的なヒストグラムおよび対照について、図50を参照されたい。
【図５０】図50は、異なる条件下でLacO遺伝子座をCBに係留するCRISPR-GOを使用した場合の、CFPレポーターの発現の蛍光強度を比較する代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを示す。統計図を図49に示す。右の図は、+/-DoxについてABA処理有りまたは無しで非標的化sgRNAを用いた場合の、相対的CFP蛍光の定量化を示す。非標的化sgRNAを用いた場合、ABA処理は、CFPレポーター発現の軽微であるが重要でない減少（p>0.05）をもたらす。データは平均±SDとして示される。
【図５１】図51は、ABA有りまたは無しで処理した例示的細胞の間期の間の、テロメアと最も近い核エンベロープ地点との間の距離のヒストグラムを示す。
【図５２】図52は、核エンベロープにテロメアを再配置するためにCRISPR-GOシステムを使用した後にAlamar blueアッセイによって測定した場合の、相対的細胞生存率の比較のグラフである。データは平均±SDとして示される。
【図５３】図53は、核周辺部にテロメアを再配置するためにCRISPR-GOを使用した細胞の細胞周期解析を示す。ABAで細胞を3日間処理した。上部：代表的なフローサイトメトリーヒストグラム（左）は、テロメア標的化ABA処理細胞（処理した）および非標的化sgRNA対照細胞における蛍光Hoechst 33342で染色されたDNA成分を比較する。下部：3つの実験反復の定量化。データは平均±SDとして示される。
【図５４】図54は、ABA有りまたは無しの、テロメア（TRF1-mCherry、上部）とCB（GFP-コイリン、中央）を共局在させるためにCRISPR-GOを使用したU2OS細胞の代表的な顕微鏡画像を示す。スケールバー、10μm。
【図５５】図55は、ABA有りまたは無しの、テロメア（TRF1-mCherry、上部）とCB（GFP-コイリン、中央）を共局在させるためにCRISPR-GOを使用したHeLa細胞の代表的な顕微鏡画像を示す。スケールバー、10μm。
【図５６】図56は、ABA有りまたは無しの、テロメアをCBに標的化するためにCRISPR-GOシステムを使用した場合の、Alamar blueアッセイによって測定したU2OSの相対的細胞生存率の比較のグラフである。細胞をABAで2日間処理した。データは平均±SDとして示される。
【図５７】図57は、ABA有りまたは無しの、Alamar blueアッセイによって測定したU2OS細胞の相対的細胞生存率の比較のグラフである。細胞をABAで2日間処理した。データは平均±SDとして示される。
【図５８】図58は、他の核コンパートメントに対して3Dゲノム構成のプログラム可能な制御を可能にし、したがって、ゲノム工学のためにCRISPR-Casツールボックスを拡張する、CRISPR-GOシステムを示す。CRISPR-GO方法は、多様な核コンパートメントに対して、標的化されたクロマチン遺伝子座の3Dゲノム配置および構成のプログラム可能な制御を可能にする。これは、遺伝子編集、転写調節、エピジェネティック改変などの適用を超えて、CRISPR-Casツールボックスの有用性を拡張する。
【図５９】図59は、ヒト細胞におけるABI-dCas9とPYL1-GFP-HP1αの共発現を介してヘテロクロマチンにゲノム遺伝子座を標的化するための、ABAで誘導可能なCRISPR-GOシステムの概略図である。ABA処理がABIとPYL1を二量体化し、ABI-dCas9で標的化されたゲノム遺伝子座をPYL1-GFP-HP1αに共局在させることを示す代表的な顕微鏡画像も示される。スケールバー、10μm。
【図６０】図60は、各ヒト染色体についての反復性配列（4以上）の分布およびそれらの相対的座標のグラフである。
【図６１】図61は、隣接する反復性配列までの所与の距離内に位置するヒト遺伝子のパーセンテージを明らかにする、ゲノムワイドなバイオインフォマティックス解析のグラフである。
【図６２】図62は、CRISPR-GOシステム3Dゲノム構成プラットフォームの概説を示す。
【図６３】図63は、核周辺部にテロメアを再配置した後にRNAシークエンシングによって遺伝子発現変化を比較するグラフを示す。
【図６４】図64は、テロメアとCajal体を共局所させた後にRNAシークエンシングによって遺伝子発現変化を比較するグラフを示す。
【図６５】図65A〜65Cは、DNA修復成分（例えば、53BP1）を動員するCRISPR編集がDNA修復およびより良い遺伝子編集結果を促進する核内構造体を作製することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
I.序文
真核細胞は、多数の生化学反応を空間および時間で調整することができる複雑な構造体である。そのような調整の鍵は、ゲノムなどのポリヌクレオチドの3D構成と機能的コンパートメントへの細胞内空間の細分化の両方である。コンパートメント化は、オルガネラを囲み、物理的バリアとして働く細胞内膜によって達成され得る。さらに、細胞は、堅固に調節された様式でその内部物質を分割するための洗練されたメカニズムを発達させた。最近の研究は、非膜系コンパートメント化が、結果的に液−液相分離および相境界形成になるプロセスである液体脱混合（liquid demixing）によって達成され得るという説得力のある証拠を提供する。
【００２７】
本発明者らは、驚いたことに、核周辺部、Cajal体、および前骨髄球性白血病（PML）体などの核コンパートメントを含めた機能的コンパートメントに対するポリヌクレオチドの空間的配置を効率的に制御することができる、汎用性のあるシステムおよび方法を発見した。本システムおよび方法はまた、細胞内に構成または分配されるタンパク質、RNA、および／またはDNA分子の超分子アセンブリーを形成することによって合成的相分離を生成するのに有用であり得る。本明細書において開示されるシステムおよび方法は、核／細胞質中のゲノムDNAおよびRNA成分の時空間的構成を操作するのに、ならびに多様な細胞機能を調節するのに有用であり得る。提供されるシステムおよび方法はまた、空間的ゲノム構成のプログラム可能な制御のために、ならびにこの構成を適用して、ポリヌクレオチド調節および細胞機能に影響を及ぼすために、ならびに標的化されたポリヌクレオチドと異なる細胞内コンパートメントとの間の相互作用動態を媒介するために使用することができる。開示されるシステムは、例えば、癌および神経変性を含めた疾患おける病的なタンパク質アセンブリーを操作するためのフレームワークとして、細胞内空間の動的再構成を達成するために使用することができる。
【００２８】
開示されるシステムは、化学的に誘導可能かつ可逆的であり得、例えば、生細胞において、核コンパートメントとのクロマチン相互作用のリアルタイム動態のインタロゲーション（interactions）を可能にする。さらなる例として、核周辺部へのゲノム遺伝子座の誘導可能な再配置は、有糸分裂依存的および非依存的再局在イベントの精査、遺伝子の位置と発現の間の関係性のインタロゲーション、および細胞増殖に対するテロメア再配置の影響を理解することを可能にし得る。本明細書において記載されるシステムは、標的クロマチン遺伝子座においてCajal体の迅速なデノボ形成を媒介することができ、長距離（>30kb）にわたって、隣接する内在性遺伝子の発現の有意な抑制を引き起こす。したがって、提供されるシステムは、大規模な空間的ポリヌクレオチド構成および機能を標的化された様式で研究するための新規なプラットフォームを提供する。
【００２９】
いくつかの態様では、異なるsgRNAの使用は、異なるゲノム配列を柔軟に標的にするために、システムをプログラムすることを可能にする。核周辺部へのゲノム遺伝子座の再配置は、有糸分裂依存的と非依存的の両方の様式で可能にされ得る。Cajal体との標的DNAの共局在は、迅速なデノボCajal体形成を介して、または既存のCajal体への標的DNAの再配置を介して誘発され得る。提供されるシステムおよび方法を使用した、核周辺部またはCajal体へのゲノム遺伝子座の標的化は、隣接するレポーター遺伝子の発現を抑制することもできる。重要なことに、Cajal体とのゲノム遺伝子座の共局在は、隣接する内在性遺伝子（>30kb）の発現を抑制することもできる。さらに、本開示の局面を使用した、核周辺部へテロメアを捕捉することは、細胞増殖に負の影響を及ぼし得る。
【００３０】
II.定義
本明細書において使用する場合、特に明記しない限り、以下の用語は、それらに与えられた意味を有する。
【００３１】
明細書および特許請求の範囲で使用する場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈において別段明記しない限り、複数形の意味を含む。例えば、用語「1つの細胞（a cell）」は複数の細胞を含む。
【００３２】
用語「コンパートメント」は、単一または二重脂質層膜に囲まれた膜封入領域ならびに相分離および相境界形成によって達成される核内構造体および細胞体などの非膜系領域を含めた細胞内コンパートメントを指す。コンパートメントは、核コンパートメントおよび細胞質コンパートメントを含む。核コンパートメントの非限定例としては、核周辺部、核内膜、核膜孔複合体、およびヘテロクロマチン、ならびに核内構造体、例えば、Cajal体、前骨髄球性白血病（PML）体、核スペックル、および核小体などが挙げられる。細胞質コンパートメントの非限定例としては、膜結合および非膜結合オルガネラ、例えば、ミトコンドリア、葉緑体、ペルオキシソーム、リソソーム、小胞体、ゴルジ装置、小胞、液胞、リソソーム、エンドソーム、リボソーム、プロテアソーム、中心小体、および細胞骨格、ならびに細胞体、例えば、P顆粒、GW体、ストレス顆粒、スポンジ体、CyPrP-RNP顆粒、およびU体などが挙げられる。
【００３３】
用語「コンパートメント特異的タンパク質」は、コンパートメント中に標的ポリヌクレオチドを配置すること、標的ポリヌクレオチドを含むコンパートメントの形成もしくは局在を誘導もしくはモジュレートすること、および／または細胞内の特定の位置に標的ポリヌクレオチドを送達することができるタンパク質を指す。標的ポリヌクレオチドをコンパートメント中に配置するコンパートメント特異的タンパク質は、一般に、そのコンパートメントの内在成分である。標的ポリヌクレオチドを含むコンパートメントの形成または局在を誘導またはモジュレートするコンパートメント特異的タンパク質は、一般に、遺伝子アクチベーターまたはリプレッサーなどの調節タンパク質である。細胞内の特定の位置に標的ポリヌクレオチドを送達するコンパートメント特異的タンパク質は、一般に、モータータンパク質または細胞内輸送に関与するタンパク質である。
【００３４】
本明細書において使用する場合、「細胞」は、一般に、生物学的な細胞を指すことができる。細胞は、生きている生物の基本的な構造的、機能的、および／または生物学的単位であり得る。細胞は、1つまたは複数の細胞を有する任意の生物に由来し得る。いくつかの非限定例としては、以下のものが挙げられる：原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原生動物の細胞、植物の細胞（例えば、作物（plant crops）、果実、野菜、穀物、ダイズ、コーン、トウモロコシ、コムギ、種子、トマト、イネ、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、乾草、ジャガイモ、ワタ、大麻、タバコ、顕花植物、球果植物、裸子植物、シダ、ヒカゲノカズラ類、ツノゴケ類、苔類、蘚類の細胞）、藻類細胞（例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）、ナンノクロロプシス・ガディタナ、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、ヤツマタモク（Sargassum patens C. Agardh）など）、海藻（例えば、ケルプ）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコの細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）の細胞、脊椎動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥、哺乳動物）の細胞、哺乳動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）の細胞など。細胞が天然の生物に由来していないこともある（例えば、合成的に細胞を作製することができ、これは、人工細胞と呼ばれることもある）。
【００３５】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は互換的に使用されて、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかの、一本鎖、二本鎖、または多重鎖形態のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、細胞にとって外来性でもよく、または内在性でもよい。ポリヌクレオチドは、無細胞環境に存在してもよい。ポリヌクレオチドは遺伝子でもよく、またはその断片でもよい。ポリヌクレオチドはDNAでもよい。ポリヌクレオチドはRNAでもよい。ポリヌクレオチドは任意の3次元構造を有することができ、公知であるか、または公知でない任意の機能を果たすことができる。ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の類似体（例えば、変化した骨格、糖、または核酸塩基）を含むことができる。存在する場合、ポリマーのアセンブリーの前または後に、ヌクレオチド構造への改変を与えることができる。類似体のいくつかの非限定例としては、以下が挙げられる：5-ブロモウラシル、ペプチド核酸、ゼノ核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コーディセピン、7-デアザ-GTP、フルオロフォア（例えば、糖に連結されているローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン連結ヌクレオチド、蛍光性塩基類似体、CpGアイランド、メチル-7-グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシン、およびワイオシン。ポリヌクレオチドの非限定例としては、遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から定められた遺伝子座（loci）（遺伝子座（locus））、エクソン、イントロン、伝令RNA（mRNA）、転移RNA（tRNA）、リボソームRNA（rRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）、低分子ヘアピン型RNA（shRNA）、マイクロRNA（miRNA）、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、無細胞DNA（cfDNA）および無細胞RNA（cfRNA）を含めた無細胞ポリヌクレオチド、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分で中断され得る。
【００３６】
用語「標的ポリヌクレオチド」は、本開示のアクチュエータ部分によって標的化されるポリヌクレオチドまたは核酸を指す。標的ポリヌクレオチドはDNAでもよい。標的ポリヌクレオチドはRNAでもよい。標的ポリヌクレオチドは、染色体配列または染色体外配列（例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列など）を指すことができる。標的ポリヌクレオチドは、単一のヌクレオチド置換によって、核酸試料中の任意の他の配列に関連しない可能性がある核酸配列であり得る。標的ポリヌクレオチドは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドの置換によって、核酸試料中の任意の他の配列に関連しない可能性がある核酸配列であり得る。いくつかの態様では、置換は、標的ポリヌクレオチドの5’末端の5、10、15、20、25、30、または35ヌクレオチド以内で生じ得ない。いくつかの態様では、置換は、標的ポリヌクレオチドの3’末端の5、10、15、20、25、30、35ヌクレオチド以内で生じ得ない。一般に、用語「標的配列」は、標的ポリヌクレオチドの一本鎖上の核酸配列を指す。標的配列は、遺伝子の一部、調節配列、ゲノムDNA、cfDNAおよび／またはcfRNAを含めた無細胞核酸、cDNA、融合遺伝子、ならびにmRNA、miRNA、rRNAなどを含めたRNAでもよい。
【００３７】
本明細書において使用する場合、用語「アクチュエータ部分」は、外来性であろうと内在性であろうと、遺伝子の発現または活性を調節することができる、および／または核酸配列を編集することができる部分を指す。アクチュエータ部分は、転写レベルおよび／または翻訳レベルで遺伝子の発現を調節することができる。アクチュエータ部分は、例えば、DNA、例えば染色体DNAまたはcDNAからmRNAの生成を調節することによって、転写レベルで遺伝子発現を調節することができる。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、特定のDNA配列に結合し、それによって、DNAからmRNAへの遺伝情報の転写の速度を制御する、少なくとも1つの転写因子を動員する。アクチュエータ部分は、それ自体で、DNAに結合することができ、物理的妨害によって、例えば、RNAポリメラーゼおよび他の結合タンパク質などのタンパク質がDNAテンプレート上でアセンブルすることを妨げることによって、転写を調節することができる。アクチュエータ部分は、例えば、mRNAテンプレートからのタンパク質の生成を調節することによって、翻訳レベルで遺伝子の発現を調節することができる。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、mRNAの転写産物の安定性に影響を及ぼすことによって遺伝子発現を調節する。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、核酸配列（例えば、ゲノムの領域）を編集することによって遺伝子の発現を調節する。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、mRNAテンプレートを編集することによって遺伝子の発現を調節する。核酸配列の編集は、ある場合には、遺伝子発現の基礎となるテンプレートを変化させることができる。
【００３８】
本明細書で言及されるCasタンパク質は、いかなるタイプのタンパク質またはポリペプチドでもよい。Casタンパク質はヌクレアーゼを指すことができる。Casタンパク質はエンドリボヌクレアーゼを指すことができる。Casタンパク質は、Casタンパク質の任意の改変された（例えば、短縮された、変異を受けた、延長された）ポリペプチド配列または相同体を指すことができる。Casタンパク質はコドン最適化することができる。Casタンパク質は、Casタンパク質のコドン最適化された相同体でもよい。Casタンパク質な、酵素的に不活性、部分的に活性、構成的に活性、完全に活性、誘導的に活性、および／またはより活性（例えば、該タンパク質またはポリペプチドの野生型相同体を超える）でもよい。Casタンパク質はCas9でもよい。Casタンパク質はCas12a（Cpf1）でもよい。Casタンパク質はCas13a（C2c2）でもよい。Casタンパク質（例えば、変異体、変異を受けた、酵素的に不活性な、および／または条件的に酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は、標的ポリヌクレオチドに結合することができる。Casタンパク質（例えば、変異体、変異を受けた、酵素的に不活性なおよび／または条件的に酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）は標的RNAまたはDNAに結合することができる。
【００３９】
本明細書において記載されるタンパク質またはポリペプチドは、リンカー（例えば、ペプチドまたはポリペプチドリンカー）によって、またはペプチド結合によって、互いに「連結」され得る。ペプチドまたはポリペプチドリンカーは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、またはこれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの態様では、ペプチドまたはポリペプチドリンカーは、例えば、アミノ酸、例えば、Gly、Asn、Ser、Thr、Alaなどを含む可動性リンカーでもよい。そのようなリンカーは、公知のパラメーターを使用して設計され、任意の長さのものでもよく、任意の長さの任意の数の反復単位（例えば、GlyおよびSer残基の反復単位）を含む。例えば、リンカーは、反復、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは以上のGly4-Ser反復、または単一のGly4-Serを有することができる。
【００４０】
III.CRISPR-GOシステム
CRISPR-Casシステムは柔軟なゲノム工学プラットフォームとして別の目的で使われており、遺伝子編集、転写調節、エピジェネティック改変、DNAルーピング、およびゲノムイメージングなどの用途に使用されている。細胞内コンパートメント内で標的化されたポリヌクレオチド配置のプログラム可能な制御を可能にするポリヌクレオチド構成システムの形態のCRISPR-Casツールボックスに対するさらなる拡大が、本明細書において提供される。ある特定の局面では、標的化されたポリヌクレオチドはゲノムDNAを含み、システムはCRISPR-GOと称され（図58）、GOはゲノム構成（Genome Organization）を指す。本明細書において開示されるシステムおよび方法は、標的ポリヌクレオチド（例えば、内在性ゲノム遺伝子座）を様々な細胞内コンパートメント（例えば、核周辺部、Cajal体、およびPML体）に効率的に標的化することができる。提供されるシステムは誘導可能かつ可逆的であり得、例えば、標的化されたクロマチンDNAと核コンパートメントの間の相互作用動態のインタロゲーションを可能にする。この特色を使用して、有糸分裂依存的と非依存的の両方の、核周辺部へのゲノム遺伝子座の再配置が達成され、標的遺伝子座におけるCajal体のデノボ形成と標的化されたクロマチン遺伝子座との既存のCajal体の共局在の両方が実証されている。本明細書において開示されるシステムおよび方法を使用した、核周辺部またはCajal体とのゲノム遺伝子座の共局在は、隣接遺伝子の発現に影響を及ぼすために使用されている。特に、提供されるシステムおよび方法を使用した、Cajal体との内在性遺伝子座の共局在は、近くの遺伝子の発現を、たとえこれらの遺伝子が標的部位から遠く離れていても（>30kb）、有意に抑制することができる。最後に、本明細書において開示されるシステムおよび方法を用いて核周辺部にテロメアを再配置することが、テロメア動態を破壊することができ、細胞生存率を低減させることが見出された。提供される方法は、様々な細胞（例えば、核）コンパートメントとのポリヌクレオチド（例えば、ゲノムDNA）の相互作用のプログラム可能な制御のためのプラットフォームを提供し、これは、調節、安定性、および細胞機能における時空間ポリヌクレオチド構成の機能的役割をより深く理解することを促進することができる。
【００４１】
細胞生物学の主な目標は、異なる核コンパートメントとのゲノムの相互作用が遺伝子発現、クロマチンコンフォメーション、および細胞機能にどのように影響を及ぼすかを理解することである。CRISPR-GOシステムは、特定のゲノム遺伝子座を核周辺部、Cajal体、およびPML体に効率的に標的にすることができ、核小体、核膜孔複合体、および核スペックルなどの他の核コンパートメントに拡張される可能性もある。他の核コンパートメントへのゲノム遺伝子座の標的化は、CRISPR-GOを異なるコンパートメント特異的タンパク質、例えばヘテロクロマチンタンパク質1α（HP1α）と結合させることによって達成され得る（図59）。同様に、本明細書において開示されるシステムおよび方法は、様々な細胞内コンパートメントの研究に適用することができる汎用性のあるモジュラープラットフォームを提供する。
【００４２】
提供されるシステム（例えば、CRISPR-GO）は、正確かつ標的化された様式で、ポリヌクレオチド（例えばゲノム遺伝子座）のプログラム可能な再局在を可能にする。例えば、CRISPR-GOシステムは、異なる染色体に位置する反復性および非反復性のクロマチン遺伝子座を核コンパートメントへ効率的に標的化することができる。LacI-LacOシステムと異なって、CRISPR-GOシステムのゲノム標的は、sgRNAと標的DNA配列の間の塩基対形成相互作用によって柔軟に定めることができ、sgRNAの約20nt領域を単に変えるだけで、異なるゲノム遺伝子座の標的化を可能にする。このプログラム可能な特色は、タンパク質をコードする遺伝子、ノンコーディングRNA遺伝子、および調節エレメントを含めた様々なゲノム要素を標的化するためにCRISPR-GOを使用することを可能にし得る。これに対して、LacO-LacI技法は、高度反復性LacOアレイを含むよく特徴づけられた細胞株でのみ行うことができるので、プログラム可能なゲノム標的化に適さない。有用なLacO含有細胞株を作製し、特徴づけることは難しく、労力を要する。LacOアレイは、通常ゲノム中にランダムに挿入され、その後、単一コピー挿入を含む細胞を選択して安定細胞株を作ってから、正確なゲノム組込み部位がFISHおよび他の方法によって特徴づけられる。さらに、ゲノム中への大きなLacOアレイの組込みが、局部的クロマチンコンフォメーションを変える可能性があり得る。全体的に見て、本明細書において開示されるシステムおよび方法の汎用性は、細胞構成を研究するための従来の方法を超える主要な技術的利点を提供する。
【００４３】
本明細書において開示されるシステムおよび方法を用いてポリヌクレオチドの新しい遺伝子座を標的化することの全体的な容易さは、3Dポリヌクレオチド構成の撹乱と細胞表現型の変化の間の関係性のより幅広い研究を促進することができる。例えば、反復性および非反復性のゲノム遺伝子座を標的にするために、異なるsgRNA設計ストラテジーを使用することができる。定義されたゲノム領域内に複数の標的を有する単一sgRNAを使用して、反復性ゲノム遺伝子座を容易に標的化することができる。ヒトゲノムは、大量の反復性配列または反復由来配列を有し、それらの多くは、ゲノム構成の重要な役割をおそらく有する。これらの反復性配列は、大規模スクリーニング実験の候補であり、核コンパートメントに対するゲノム構成と細胞表現型の間の関係性を研究するためのよりハイスループットなアプローチへの扉を開く。さらに、複数のsgRNAを使用して、または単一sgRNAを使用して、非反復性ゲノム遺伝子座を標的化することができる。非反復性遺伝子座を標的化するために、タイリングsgRNAのプールを出発点として使用することができる。
【００４４】
提供されるシステムおよび方法は、生細胞において、ポリヌクレオチド再配置のリアルタイム動態、ならびに特定の領域からの細胞内コンパートメントの結合および解離を研究するのにも有用であり得る。CRISPR-GOシステムでは、ゲノム遺伝子座は、dCas9に結合したゲノム遺伝子座とコンパートメント特異的タンパク質の間の化学誘導性物理的相互作用を介して、望ましいコンパートメントに標的化される。CRISPR-GOの誘導可能かつ可逆的な特色は、クロマチンDNAを所与の核コンパートメントに連続的に再配置することからの潜在的な有害作用を防止する。
【００４５】
一例として、CRISPR-Cas9生細胞ゲノムイメージングとCRISPR-GOの組み合わせた使用によって、核周辺部への内在性ゲノム遺伝子座の再局在が、有糸分裂依存的と非依存的の両方の様式で生じることが示された。有糸分裂の間、核膜は前中期で壊れ、次いで、終期で再形成される。有糸分裂の間のクロマチンおよび核構造の劇的な変化は、ゲノム遺伝子座と核膜の間の相互作用を促進して、核エンベロープ係留をもたらすことができる。間期の間、クロマチン構造は比較的安定なままであるであるが、ゲノム遺伝子座は、極めて近接している場合に、依然として核周辺部と相互作用を形成することができる。間期の間の核周辺部の係留は、標的化された遺伝子座と核周辺部の間の近接に依拠する可能性があり、核周辺部に対して遠位に位置するゲノム遺伝子座は、有糸分裂非依存的様式によって係留されにくい可能性がある。
【００４６】
いくつかの提供される態様の化学的誘導プロセスは、生細胞における、標的ポリヌクレオチド遺伝子座と細胞内コンパートメントのリアルタイム結合の研究も可能にする。例えば、核周辺部への比較的遅い再配置（数時間以内）と比較して、ゲノム遺伝子座とCajal体の間の共局在は、はるかに速い速度（数分以内）で生じ、これは、おそらく、Cajal体成分が核全体にわたってより拡散しているからである。開示されるシステムおよび方法を使用して、CBと標的ゲノム遺伝子座の共局在が2つの方法で生じ得ることが観察され：1つはゲノム遺伝子座におけるデノボCajal体の迅速な形成であり、もう1つは、以前に報告されていない現象である、標的ゲノム遺伝子座をともなう既存のCBの再局在である。以前の研究によって、Cajal体は相分離によって形成されることが示唆された。標的化されたゲノム遺伝子座へのCRISPR-GOによる核内構造体成分（例えば、CBのためのコイリン）の動員は、標的クロマチン遺伝子座で合成的相分離を引き起こすことができる。
【００４７】
提供される方法およびシステムは、ゲノム遺伝子座を核周辺部に再配置する場合に、隣接する蛍光レポーター遺伝子の抑制を観察するためにも使用された。以前の研究によって、LacO遺伝子座を核周辺部に係留させた後の遺伝子発現に対して異なる影響が報告された。特に、初期の研究では、LacI-ラミンBによってLacOリピートを核周辺部に動員した後に転写の変化は観察されず、LacI-エメリンによる核周辺部へのLacOリピートの係留が、隣接遺伝子の抑制を引き起こしたことが示された。本明細書において開示されるシステムは、エメリンへのレポーター遺伝子の再配置が遺伝子抑制（約59％）を引き起こすことを示した。
【００４８】
本明細書において開示されるシステムおよび方法は、CBへのクロマチン遺伝子座のCRISPR-GO媒介性共局在後に、隣接するレポーターと内在性遺伝子の両方を抑制するためにも使用された。重要なことに、内在性遺伝子座とのCajal体の標的化された共局在は、隣接遺伝子の発現を長距離（>30kb）にわたって抑制する。CBへのゲノム遺伝子座の標的化後に観察されたこの遺伝子抑制は、まだ報告されていない。これに対して、CRISPRi/a方法は、標的部位の周囲の数キロベース内の局部的遺伝子の発現に主として影響を及ぼす転写エフェクターを動員することによって機能する。したがって、提供される方法およびシステムは、長距離にわたってポリヌクレオチド発現を調節するための重要な新しい方法を提供する。方法およびシステムは、細胞の影響を研究する、およびポリヌクレオチド調節をプログラムするために、多様な細胞内コンパートメントへの標的ポリヌクレオチドの再配置を体系的な方法で制御する能力も提供する。
【００４９】
いくつかの態様では、遺伝子（例えば、標的ポリヌクレオチド）の発現調節のために調節タンパク質（例えば、活性化または抑制的エフェクター）を動員する目的で、CRISPR-GOシステムをプログラムすることができる。調節タンパク質の非限定例としては、ヘテロクロマチンタンパク質1（例えば、HP1α、HP1β、および／またはHP1γ）、クルッペル関連ボックス−ジンクフィンガータンパク質（KRAB-ZFP）、KRAB関連タンパク質1（KAP1）、ヌクレオソームリモデリング脱アセチル化酵素複合体（NuRD）、SETドメイン分岐1（SETDB1）、DNAメチルトランスフェラーゼ（例えば、DNMT3A、DNMT3L、DNMT3B）、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）、SUV39H1、G9α、Ezh1/2、EED、Suz12、JARID2、AEBP2、RbAp48、PCL1、RBBP7/4、C17orf96、C10orf12、これらの切断型、これらの断片、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００５０】
いくつかの態様では、細胞機能、細胞運命、細胞増殖、アポトーシス、および／または細胞分化を変化させるために、CRISPR-GOシステムをプログラムすることができ、これは、発生調節ゲノム領域およびRNAを異なる細胞内コンパートメントに再配置することによって達成することができる。これは、細胞運命の変化を誘導するために培地ベースのアプローチを使用すること、または細胞運命を変えるために転写因子カクテルを使用することの代替方法としての役目を果たす。実施例12に記載されているように、核周辺部へのテロメアの標的化は細胞生存率の低下をもたらし、アポトーシス遺伝子、分化遺伝子、および細胞機能遺伝子を含めて、遺伝子発現レベルの体系的変化を引き起こすが、Cajal体へのテロメアの標的化は、増殖遺伝子および細胞機能遺伝子の上方制御などの遺伝子発現変化をともなう、細胞生存率の増加をもたらす。
【００５１】
大抵の非対称細胞の細胞質では、mRNAは、コンパートメント特異的タンパク質としてキネシン、ダイニン、およびミオシンなどのモータータンパク質を使用して、微小管およびアクチンフィラメントに沿って輸送される。いくつかの態様では、これらのモータータンパク質を使用して細胞骨格に沿ってmRNAを再配置するために、CRISPR-GOシステムをプログラムすることができる。実施例13に記載されているように、例えばカーゴ結合尾部ドメインを有さないキネシン-1重鎖（KIF5B）などのモータータンパク質を使用して、微小管のプラス端（MT+）にmRNAを再配置することができ、またはダイニン媒介性カーゴ輸送を誘導するBicaudal D2（例えば、N末端断片）などのモータータンパク質を使用して、微小管のマイナス端（MT-）にmRNAを再配置することができ、またはミオシン5a（MYO5A）などのモータータンパク質を使用して、アクチンフィラメント（AF）に沿ってmRNAを再配置することができる。
【００５２】
いくつかの態様では、DNA修復を促進する（例えば、DNA二本鎖切断（DSB）を修復するための複合体の形成を促進する）核内構造体などの核コンパートメントを形成しかつ改善された遺伝子編集結果（例えば、増強された相同組換え修復（HDR））をもたらすために、CRISPR-GOシステムをプログラムすることができる。核内構造体の形成を促進することができるコンパートメント特異的タンパク質の非限定例としては、DNA修復遺伝子、例えば、53BP1、Rad51、Rad52、Ubc9、UBL1、BLM、c-Abl、BCR/Abl、BRCA1/2、PALB2、RPA、Rad51AP1、Chk1、Arg、Hop2、Mnd1、DMC1、またはこれらの組み合わせが挙げられる。特定の場合では、DNA二本鎖切断（DSB）を修復するための複合体の形成を促進するために、53BP1（切断型、例えばアミノ酸1207〜1711、または完全長）の多量体化を使用することができる。特定の場合では、相同組換え修復（HDR）を増強するために、Rad51、Rad52、Ubc9、UBL1、BLM、c-Abl、BCR/Abl、BRCA1/2、PALB2、RPA、Rad51AP1、Chk1、Arg、Hop2、Mnd1、および／またはDMC1を使用することができる。実施例14に記載されているように、CRISPR媒介性遺伝子編集後のDSB回復およびDNA修復を促進することができる53BP1巣の形成が遺伝子編集の際に観察される。
【００５３】
いくつかの態様では、本明細書において開示されるシステムおよび方法は、自己凝集して、1つまたは複数のユニークな化学的、物理的、または生物学的特性（例えば、特定のタンパク質、RNA、もしくはDNAの選択的拡散；他の分子との結合もしくは解離；遺伝子調節機構の促進もしくは阻害；またはDNA組換えもしくは安定性機構の促進もしくは阻害）を保有することができる人工タンパク質/RNA/DNA凝集体を形成する、内在性または合成の多量体化タンパク質とともに使用される。そのような凝集体は、合成細胞相（SCP）と本明細書で言及される。これらの凝集体は、遺伝子調節に対して強い作用を有し得る。いくつかの態様では、タンパク質、タンパク質ドメイン、RNA、RNAドメイン、またはこれらの組み合わせは、提供されるシステムに結合して、望ましいクロマチンDNAまたはRNAの周囲に望ましいSCPを特異的に形成する。いくつかの態様では、提供されるシステムは、核および／または細胞質でゲノムDNAおよびRNA成分の時空間的構成を操作するのに、および多様な細胞機能を調節するのに有用なである。
【００５４】
いくつかの態様では、システムおよび方法は誘導可能な二量体化を含み、二量体化は、化学誘導性二量体化、光（例えば、オプトジェネティックもしくは化学オプトジェネティック（chemo‐optogenetically））誘導性二量体化、または酵素触媒性タンパク質ライゲーショである。二量体化は、同一の二量体化ドメインのホモ二量体化または2つの異なる二量体化ドメインのヘテロ二量体化を含むことができる。
【００５５】
ある特定の態様では、二量体化は、分子リガンド、例えば化学的誘導物質によって媒介される化学誘導性二量体化である。ある特定の局面では、二量体化システムは、ABA誘導性ABI/PYL1二量体化システム、ジベレリン（GA）誘導性GID1/GAI二量体化システム、ラパマイシン誘導性FRB/FKBP二量体化システム、TMP-HTag誘導性HaloTag/DHFR二量体化システム、FK1012誘導性FKBP/FKBP二量体化システム、FK506誘導性FKBP/カルシニューリンA（CNA）二量体化システム、FKCsA誘導性FKBP/CyP-Fas二量体化システム、クーママイシン誘導性GyrB/GyrB二量体化システム、HaXS誘導性SnapTag/HaloTag二量体化システム、およびABT-737誘導性BCL-xL/Fab（AZ1）二量体化システムより選択される。他の化学誘導性二量体化システムも意図される。
【００５６】
ある特定の態様では、二量体化は光誘導性二量体化である。光誘導性二量体化の非限定例としては、オプトジェネティックおよび化学オプトジェネティック二量体化システムが挙げられる。オプトジェネティック二量体化システムは、典型的には、照明時にコンホメーション変化を受け、その結果、タンパク質相互作用を誘導する感光性タンパク質を用いる。化学オプトジェネティック二量体化システムは、光によって近接性が誘導される、および／または破壊されるように、光で活性化可能なおよび／または切断可能な小分子二量体化物質を典型的には使用する。例えば、Klewer et al., “Light‐Induced Dimerization Approaches to Control Cellular Processes,” Chem. Eur. J. (2019) 25:1-13を参照されたい。他の光誘導性二量体化システムも意図される。
【００５７】
ある特定の態様では、二量体化は、例えば酵素触媒性タンパク質ライゲーションなどの酵素触媒性反応を使用して達成される。非限定例として、二量体化は、サブチリガーゼ（subtiligase）またはその変異体などのペプチドリガーゼによって触媒される二量体化ドメインのライゲーションによって媒介され得る。例えば、Henager, S., “Enzyme-catalyzed expressed protein ligation,” Nat Methods (2016) 13(11):925-927を参照されたい。他の二量体化システム使用する酵素触媒性反応も意図される。
【００５８】
いくつかの態様では、提供されるシステムおよび方法の標的化されたポリヌクレオチドは、DNA、例えばゲノムDNAを含む。いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドはRNA、例えば、mRNA、マイクロRNA、siRNA、またはノンコーディングRNAを含む。提供されるシステムおよび方法を用いた使用に適したアクチュエータ部分および関連した標的化システムとしては、例えば、CRISPR-Cas（CRISPRのすべてのタイプ、タイプI、II、III、IV、V、VI、例えば、Cas9、Cas12、Cas13を含める）；アルゴノート媒介性標的化またはジンクフィンガー標的化；TALE（転写活性化因子様エフェクター）；LacO-LacIまたはTetO-TetR；およびDNA相互作用タンパク質またはRNAドメインの特異的な対が挙げられる。Cas9およびCas13は、配列依存的方法でRNAを標的にすることもでき、RNA分子を異なる細胞内コンパートメントに再局在させるために、提供されるシステムとともにこの方法で使用することができる。Casタンパク質は、DNA切断活性を欠いていてもよい。標的化システムは、配列特異的なガイドRNAまたはガイドDNAを含むことができる。
【００５９】
アクチュエータ部分は、ヌクレアーゼ（例えば、DNAヌクレアーゼおよび／もしくはRNAヌクレアーゼ）、ヌクレアーゼ欠損性であるか、もしくは野生型ヌクレアーゼと比較してヌクレアーゼ活性が低減した改変ヌクレアーゼ（例えば、DNAヌクレアーゼおよび／もしくはRNAヌクレアーゼ）、これらの誘導体、これらの変異体、またはこれらの断片を含むことができる。アクチュエータ部分は、遺伝子の発現もしくは活性を調節する、ならびに／または核酸（例えば、遺伝子および／もしくは遺伝子産物）の配列を編集することができる。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、標的DNA配列のゲノム編集を誘導するために、操作された（例えば、プログラム可能なまたは標的化可能な）DNAヌクレアーゼなどのDNAヌクレアーゼを含む。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、標的RNA配列の編集を誘導するために、操作された（例えば、プログラム可能なまたは標的化可能な）RNAヌクレアーゼなどのRNAヌクレアーゼを含む。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は低減しているかまたは最小限のヌクレアーゼ活性を有する。低減しているかまたは最小限のヌクレアーゼ活性を有するアクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制するまたは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、遺伝子の発現および／または活性を調節することができる。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、標的DNA配列の転写活性化または抑制を誘導することができる、DNAヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルのDNA結合タンパク質を含む。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、標的RNA配列の転写活性化または抑制を誘導することができる、RNAヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルのRNA結合タンパク質を含む。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は核酸ガイド型アクチュエータ部分である。いくつかの態様では、アクチュエータ部分はDNAガイド型アクチュエータ部分である。いくつかの態様では、アクチュエータ部分はRNAガイド型アクチュエータ部分である。アクチュエータ部分は、外来性であろうと内在性であろうと、遺伝子の発現もしくは活性を調節するおよび／または核酸配列を編集することができる。
【００６０】
任意の適切なヌクレアーゼをアクチュエータ部分に使用することができる。適切なヌクレアーゼとしては、限定されないが、タイプI CRISPR関連（Cas）ポリペプチド、タイプII CRISPR関連（Cas）ポリペプチド、タイプIII CRISPR関連（Cas）ポリペプチド、タイプIV CRISPR関連（Cas）ポリペプチド、タイプV CRISPR関連（Cas）ポリペプチド、およびタイプVI CRISPR関連（Cas）ポリペプチドを含めた、CRISPR関連（Cas）タンパク質またはCasヌクレアーゼ；ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）；転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）；メガヌクレアーゼ；RNA結合タンパク質（RBP）；CRISPR関連RNA結合タンパク質；リコンビナーゼ；フリッパーゼ；トランスポゼース；アルゴノート（Ago）タンパク質（例えば、原核生物のアルゴノート（pAgo）、古細菌のアルゴノート（aAgo）、および真核生物のアルゴノート（eAgo））；これらの任意の誘導体；これらの任意の変異体；ならびにこれらの任意の断片が挙げられる。
【００６１】
いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、非天然のCRISPR（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Cas（CRISPR関連）システムで機能する、CRISPR関連（Cas）タンパク質またはCasヌクレアーゼを含む。細菌では、このシステムは、外来DNAに対する適応免疫を提供することができる（Barrangou, R., et al, “CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes,” Science (2007) 315: 1709-1712；Makarova, K.S., et al, “Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems,” Nat Rev Microbiol (2011) 9:467-477；Garneau, J. E., et al, “The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA,” Nature (2010) 468:67-71；Sapranauskas, R., et al, “The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli,” Nucleic Acids Res (2011) 39: 9275-9282）。
【００６２】
多様な哺乳動物、動物、植物、および酵母を含めた多種多様の生物において、（例えば、改変および／または非改変）CRISPR/Casシステムはゲノム工学ツールとして利用可能である。CRISPR/Casシステムは、遺伝子の発現および／もしくは活性の標的化された調節または核酸編集のために、Casタンパク質と複合体化されたガイドRNA（gRNA）などのガイド核酸を含むことができる。RNAガイド型Casタンパク質（例えば、Cas9ヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼ）は、配列依存的様式で、標的ポリヌクレオチド（例えば、DNA）に特異的に結合することができる。Casタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を保有する場合、DNAを切断することができ（Gasiunas, G., et al, “Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria,” Proc Natl Acad Sci USA (2012) 109： E2579-E2 86；Jinek, M., et al, “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity,” Science (2012) 337:816-821；Sternberg, S. H., et al, “DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9,” Nature (2014) 507:62；Deltcheva, E., et al, “CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III,” Nature (2011) 471 :602-607）、様々な生物およびモデルシステムにおいてプログラム可能なゲノム編集のために広く使用されている（Cong, L., et al, “Multiplex genome engineering using CRISPR Cas systems,” Science (2013) 339:819-823；Jiang, W., et al, “RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems,” Nat. Biotechnol. (2013) 31: 233-239；Sander, J. D. & Joung, J. K, “CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes,” Nature Biotechnol. (2014) 32:347-355)。
【００６３】
ある場合には、Casタンパク質は、ヌクレアーゼ欠損タンパク質または野生型Casタンパク質と比較してヌクレアーゼ活性が低下したタンパク質をもたらすように、変異および／または改変を受ける。ヌクレアーゼ欠損タンパク質は、DNAに結合する能力を保持することができるが、核酸切断活性を欠いているか、核酸切断活性が低減していてもよい。（例えば、野生型ヌクレアーゼ活性を保持する、ヌクレアーゼ活性が低減した、および／またはヌクレアーゼ活性を欠いている）Casヌクレアーゼを含むアクチュエータ部分は、標的遺伝子またはタンパク質のレベルおよび／または活性を調節する（例えば低下、増大、または排除）ように、CRISPR/Casシステムで機能することができる。Casタンパク質は、標的ポリヌクレオチドに結合し、物理的妨害によって転写を妨げること、または核酸配列を編集して非機能性遺伝子産物をもたらすことができる。
【００６４】
いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、ガイド核酸、例えばガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質を含む。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、単一のガイド核酸、例えば単一のガイドRNA（sgRNA）と複合体を形成するCasタンパク質を含む。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、Casタンパク質と複合体を形成することができるガイド核酸、例えばガイドRNA（例えば、sgRNA）と任意で複合体化されたRNA結合タンパク質（RBP）を含む。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、標的DNA配列の転写活性化または抑制を誘導することができる、DNAヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルのDNA結合タンパク質を含む。いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、標的RNA配列の転写活性化または抑制を誘導することができる、RNAヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルのRNA結合タンパク質を含む。
【００６５】
任意の適切なCRISPR/Casシステムを使用することができる。CRISPR/Casシステムは、様々なネーミングシステムを使用して言及され得る。例示的なネーミングシステムは、Makarova, K.S. et al, “An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems,” Nat Rev Microbiol (2015) 13:722-736、およびShmakov, S. et al, “Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems,” Mol Cell (2015) 60:1-13に提供されている。CRISPR/Casシステムは、タイプI、タイプII、タイプIII、タイプIV、タイプV、タイプVIシステム、または任意の他の適切なCRISPR/Casシステムでもよい。本明細書において使用するCRISPR/Casシステムは、クラス1、クラス2、または任意の他の適切に分類されるCRISPR/Casシステムでもよい。クラス1またはクラス2の決定は、エフェクターモジュールをコードする遺伝子に基づくことができる。クラス1システムは、一般に、多サブユニットのcrRNA-エフェクター複合体を有するが、クラス2システムは、一般に、単一タンパク質、例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、または1つのcrRNA-エフェクター複合体を有する。クラス1 CRISPR/Casシステムは、調節を行うために、複数のCasタンパク質の複合体を使用することができる。クラス1 CRISPR/Casシステムは、タイプI（例えば、I、IA、IB、IC、ID、IE、IF、IU）、タイプIII（例えば、III、IIIA、IIIB、IIIC、IIID）、およびタイプIV（例えば、IV、IVA、IVB）CRISPR/Casタイプを含むことができる。クラス2 CRISPR/Casシステムは、調節を行うために、単一の大きなCasタンパク質を使用することができる。クラス2 CRISPR/Casシステムは、例えば、タイプII（例えば、II、IIA、IIB）およびタイプV CRISPR/Casタイプを含むことができる。CRISPRシステムは、互いに相補的であり得、および／またはCRISPRの遺伝子座標的化を促進するために、トランスで機能単位を与えることができる。
【００６６】
Casタンパク質を含むアクチュエータ部分は、クラス1またはクラス2 Casタンパク質でもよい。Casタンパク質は、タイプI、タイプII、タイプIII、タイプIV、タイプV Casタンパク質、またはタイプVI Casタンパク質でもよい。Casタンパク質は、1つまたは複数のドメインを含むことができる。ドメインの非限定例としては、ガイド核酸認識および／または結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、DNaseまたはRNaseドメイン、RuvC、HNH）、DNA結合ドメイン、RNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、および二量体化ドメインが挙げられる。ガイド核酸認識および／または結合ドメインは、ガイド核酸と相互作用することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断のための触媒活性を含むことができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断を防止するために、触媒活性を欠くことができる。Casタンパク質は、他のタンパク質またはポリペプチドに融合しているキメラCasタンパク質でもよい。Casタンパク質は、例えば異なるCasタンパク質由来のドメインを含む、様々なCasタンパク質のキメラでもよい。
【００６７】
Casタンパク質の非限定例としては、c2c1、C2c2、c2c3、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e（CasD）、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9（CsnlまたはCsxl2）、Cas10、Cas10d、CaslO、CaslOd、CasF、CasG、CasH、Cpf1、Csyl、Csy2、Csy3、Csel（CasA）、Cse2（CasB）、Cse3（CasE）、Cse4（CasC）、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、およびCul966、ならびにこれらの相同体または改変バージョンが挙げられる。
【００６８】
Casタンパク質は、任意の適切な生物由来であり得る。非限定例としては、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス属の種（Streptococcus sp.）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）、ストレプトマイセス・プリスチナエ・スピラリス（Streptomyces pristinae spiralis）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲンス（Streptomyces viridochromo genes）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲンス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトスポランジウム・ロゼウム（Streptosporangium roseum）、ストレプトスポランジウム・ロゼウム、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（AlicyclobacHlus acidocaldarius）、バチルス・シュードマイコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バチルス・セレニティレデュセンス（Bacillus selenitireducens）、エクシグオバクテリウム・シビリカム（Exiguobacterium sibiricum）、ラクトバシラス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・サリヴァリゥス（Lactobacillus salivarius）、ミクロシラ・マリナ（Microscilla marina）、バークホルデリア目の細菌（Burkholderiales bacterium）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）、ポラロモナス属の種（Polaromonas sp.）、クロコスファエラ・ワトソニイ（Crocosphaera watsonii）、シアノセイス属の種（Cyanothece sp.）、ミクロキスティス・アエルギノーサ（Microcystis aeruginosa）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シネココッカス属の種（Synechococcus sp.）、アセトハロビウム・アラビティカム（Acetohalobium arabaticum）、アンモニフェクス・デゲンシイ（Ammonifex degensii）、カルジセルロシルプトル・ベクシイ（Caldicelulosiruptor becscii）、カンジダツス・デサルホルディス（Candidatus Desulforudis）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、ナトラナエロビウス・サーモフィラス（Natranaerobius thermophilus）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Pelotomaculum thermopropionicum）、アシジチオバチルス・カルダス（Acidithiobacillus caldus）、アシジチオバチルス・フェロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）、アロクロマチウム・ビノスム（Allochromatium vinosum）、マリノバクター属の種（Marinobacter sp.）、ニトロソコッカス・ハロフィラス（Nitrosococcus halophilus）、ニトロソコッカス・ワトソニイ（Nitrosococcus watsoni）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）、クテドノバクター・ラセミファー（Ktedonobacter racemifer）、メタノハロビウム・エベスチガタム（Methanohalobium evestigatum）、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）、ノジュラリア・スプミゲナ（Nodularia spumigena）、ノストック属の種（Nostoc sp.）、アルスロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、アルスロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）、アルスロスピラ属の種（Arthrospira sp.）、リングビア属の種（Lyngbya sp.）、ミクロコレウス・クソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、オシラトリア属の種（Oscillatoria sp.）、ペトロトガ・モビリス（Petrotoga mobilis）、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、アカリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina）、レプトトリキア・シャヒイ（Leptotrichia shahii）、およびフランシセラ・ノビサイダ（Francisella novicida）が挙げられる。いくつかの局面では、生物は化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）である。いくつかの局面では、生物は黄色ブドウ球菌（S. aureus）である。いくつかの局面では、生物はストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）である。
【００６９】
Casタンパク質は、限定されないが、ベイロネラ・アティピカル（Veillonella atypical）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、フィリファクター・アロシス（Filifactor alocis）、ソロバクテリウム・モオレイ（Solobacterium moorei）、コプロコッカス・カツス（Coprococcus catus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Peptoniphilus duerdenii）、カテニバクテリウム・ミツオカイ（Catenibacterium mitsuokai）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、スタフィロコッカス・シュードインテルメジウス（Staphylococcus pseudintermedius）、アシダミノコッカス・インテスチン（Acidaminococcus intestine）、オルセネラ・ウリ（Olsenella uli）、オエノコッカス・キタハラエ（Oenococcus kitaharae）、ビフィズス菌（Bifidobacterium bifidum）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、フィネゴルディア・マグナ、マイコプラズマ・モービレ（Mycoplasma mobile）、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Mycoplasma gallisepticum）、マイコプラズマ・オビニューモニエ（Mycoplasma ovipneumoniae）、マイコプラズマ・カニス（Mycoplasma canis）、マイコプラズマ・シノビエ（Mycoplasma synoviae）、ユーバクテリウム・レクタレ（Eubacterium rectale）、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ユーバクテリウム・ドリクム（Eubacterium dolichum）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルケンス（Lactobacillus coryniformis subsp. Torquens）、イリオバクター・ポリトロパス（Ilyobacter polytropus）、ルミノコッカス・アルブス（Ruminococcus albus）、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）、アシドサーマス・セルロリチカス（Acidothermus cellulolyticus）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Bifidobacterium dentium）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheria）、エルシミクロビウム・ミヌツム（Elusimicrobium minutum）、ニトラチフラクター・サルスギニス（Nitratifractor salsuginis）、スフェロケタ・クロブス（Sphaerochaeta globus）、フィブロバクター・スクシノゲネス亜種スクシノアゲネス（Fibrobacter succinogenes subsp. Succinogenes）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、カプノシトファガ・オクラチエ（Capnocytophaga ochracea）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、プレボテラ・ミカンス（Prevotella micans）、プレボテラ・ルミニコラ（Prevotella ruminicola）、フラボバクテリウム・カラムナーレ（Flavobacterium columnare）、アミノモナス・パウシボランス（Aminomonas paucivorans）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、カンジダトス・プニセイスピリナム・マリナム（Candidatus Puniceispirillum marinum）、ベルミネフロバクター・エイセニアエ（Verminephrobacter eiseniae）、ラルストニア・シジギイ（Ralstonia syzygii）、ジノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter shibae）、アゾスピリルム属（Azospirillum）、ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Nitrobacter hamburgensis）、ブラディリゾビウム属（Bradyrhizobium）、ウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）、カンピロバクター・ジェジュニ亜種ジェジュニ（Campylobacter jejuni subsp. Jejuni）、ヘリコバクター・ムステラエ（Helicobacter mustelae）、セレウス菌（Bacillus cereus）、アシドボラクス・エブレウス（Acidovorax ebreus）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）、ロゼブリア・インテスチナリス（Roseburia intestinalis）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、パスツレラ・マルトシダ亜種ムルトシダ（Pasteurella multocida subsp. Multocida）、ステレラ・ワズワルテンシス（Sutterella wadsworthensis）、プロテオバクテリウム、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、パラステレラ・エクスクレメンチホミニス（Parasutterella excrementihominis）、ウォリネラ・サクシノゲネス、およびフランシセラ・ノビサイダを含めた様々な細菌種に由来し得る。
【００７０】
本明細書において使用されるCasタンパク質は、Casタンパク質の野生型でもよく、または改変形態でもよい。Casタンパク質は、野生型または改変Casタンパク質の活性変異体、不活性変異体、または断片でもよい。Casタンパク質は、Casタンパク質の野生型バージョンに対して、欠失、挿入、置換、変異体、突然変異、融合、キメラ、またはこれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸変化を含むことができる。Casタンパク質は、野生型の例示的なCasタンパク質に対して少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性または配列類似性を有するポリペプチドでもよい。Casタンパク質は、野生型の例示的なCasタンパク質に対して最大で約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドでもよい。変異体または断片は、野生型もしくは改変Casタンパク質またはそれらの一部に対して少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性または配列類似性を含むことができる。変異体または断片は、ガイド核酸と複合体を形成して核酸遺伝子座に標的化され得るが、核酸切断活性を欠いている。
【００７１】
Casタンパク質は、1つまたは複数のヌクレアーゼドメイン、例えばDNaseドメインを含むことができる。例えば、Cas9タンパク質は、RuvC様ヌクレアーゼドメインおよび／またはHNH様ヌクレアーゼドメインを含むことができる。RuvCおよびHNHドメインは、それそれ、二本鎖DNAの異なる鎖を切断して、DNA中に二本鎖切断を生成する。Casタンパク質は、1つのヌクレアーゼドメインのみを含むことができる（例えば、Cpf1は RuvCドメインを含むが、HNHドメインを欠いている）。
【００７２】
Casタンパク質は、野生型Casタンパク質のヌクレアーゼドメイン（例えば、RuvCドメイン、HNHドメイン）に対して少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性または配列類似性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００７３】
遺伝子発現の調節を最適化するようにCasタンパク質を改変することができる。核酸結合親和性、核酸結合特異性、および／または酵素活性を増大または低下させるようにCasタンパク質を改変することができる。Casタンパク質の任意の他の活性または特性、例えば安定性を変化させるようにCasタンパク質を改変することもできる。例えば、Casタンパク質の1つまたは複数のヌクレアーゼドメインを改変する、欠失させる、または不活性化することができ、あるいはCasタンパク質を切断して、タンパク質の機能に必須でないドメインを除去する、または遺伝子発現を調節するためにCasタンパク質の活性を最適化する（例えば、増強するもしくは低減させる）ことができる。
【００７４】
Casタンパク質は融合タンパク質でもよい。例えば、切断ドメイン、エピジェネティック改変ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写リプレッサードメインにCasタンパク質を融合させることができる。安定性を増大または低下させる異種ポリペプチドにCasタンパク質を融合させることもできる。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、Casタンパク質の内のN末端、C末端、または内部に位置し得る。
【００７５】
Casタンパク質は任意の形態で提供され得る。例えば、Casタンパク質は、タンパク質、例えば、単独の、またはガイド核酸と複合体化されたCasタンパク質の形態で提供され得る。Casタンパク質は、Casタンパク質をコードする核酸、例えば、RNA（例えば、伝令RNA（mRNA））またはDNAの形態で提供され得る。特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のために、Casタンパク質をコードする核酸をコドン最適化することができる。
【００７６】
Casタンパク質をコードする核酸を細胞のゲノム中に安定して組み込むことができる。Casタンパク質をコードする核酸を細胞で活性なプロモーターに機能的に連結することができる。Casタンパク質をコードする核酸を発現コンストラクト中のプロモーターに機能的に連結することができる。発現コンストラクトは、遺伝子の発現を指示することができる任意の核酸コンストラクト、または関心対象の他の核酸配列（例えば、Cas遺伝子）を含むことができ、関心対象のそのような核酸配列を標的細胞に移行させることができる。
【００７７】
いくつかの態様では、Casタンパク質はデッド（dead）Casタンパク質である。デッドCasタンパク質は核酸切断活性を欠いているタンパク質でもよい。
【００７８】
Casタンパク質は、野生型Casタンパク質の改変形態を含むことができる。野生型Casタンパク質の改変形態は、Casタンパク質の核酸切断活性を低減させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含むことができる。例えば、Casタンパク質の改変形態は、野生型Casタンパク質（例えば、化膿性連鎖球菌のCas9）の90％未満、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満、または1％未満の核酸切断活性を有し得る。Casタンパク質の改変形態は、実質的な核酸切断活性を有し得ない。Casタンパク質が実質的な核酸切断活性を有さない改変形態である場合、これは、酵素的に不活性および／または「デッド」（「d」で省略される）と称され得る。デッドCasタンパク質（例えば、dCas、dCas9）は標的ポリヌクレオチドに結合することができるが、標的ポリヌクレオチドを切断しない可能性がある。いくつかの局面では、デッドCasタンパク質はデッドCas9タンパク質である。
【００７９】
dCas9ポリペプチドは、単一のガイドRNA（sgRNA）と結合して、標的DNAの転写を活性化する、または抑制することができる。操作されたキメラ受容体ポリペプチドを発現する細胞にsgRNAを導入することができる。ある場合には、そのような細胞は、同じ核酸を標的にする1つまたは複数の異なるsgRNAを含む。他の場合では、sgRNAは細胞中の異なる核酸を標的にする。ガイドRNAによって標的化される核酸は、免疫細胞などの細胞で発現しているいかなるものでもよい。標的化される核酸は、免疫細胞調節に関与する遺伝子でもよい。いくつかの態様では、核酸は癌と関係がある。癌と関係がある核酸は、細胞周期遺伝子、細胞応答遺伝子、アポトーシス遺伝子、または食作用遺伝子でもよい。組換えガイドRNAは、CRISPRタンパク質、ヌクレアーゼヌルのCRISPRタンパク質、これらの変異体、またはこれらの誘導体によって認識され得る。
【００８０】
酵素的に不活性は、配列特異的な様式でポリヌクレオチド中の核酸配列に結合することができるが、標的ポリヌクレオチドを切断しない可能性があるポリペプチドを指すことができる。酵素的に不活性な部位特異的なポリペプチドは、酵素的に不活性なドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）を含むことができる。酵素的に不活性は、無活性を指すことができる。酵素的に不活性は、実質的に無活性を指すことができる。酵素的に不活性は、本質的に無活性を指すことができる。酵素的に不活性は、野生型の例示的な活性（例えば、核酸切断活性、野生型Cas9活性）と比較して1％未満、2％未満、3％未満、4％未満、5％未満、6％未満、7％未満、8％未満、9％未満、または10％未満の活性の活性を指すことができる。
【００８１】
Casタンパク質の1つまたは複数のヌクレアーゼドメイン（例えば、RuvC、HNH）を、これらがもはや機能的でない、または低減したヌクレアーゼ活性を含むように、欠失または変異させることができる。例えば、少なくとも2つのヌクレアーゼドメインを含むCasタンパク質（例えば、Cas9）では、ヌクレアーゼドメインのうちの1つが欠失または変異させられる場合、ニッカーゼとして公知である、得られたCasタンパク質は、二本鎖DNA内のCRISPR RNA（crRNA）認識配列で一本鎖切断を引き起こすことができるが、二本鎖切断を引き起こすことはできない。そのようなニッカーゼは、相補鎖または非相補鎖を切断することができるが、両方を切断しない可能性がある。Casタンパク質のヌクレアーゼドメインのすべて（例えば、Cas9タンパク質中のRuvCとHNHヌクレアーゼドメインの両方；Cpf1タンパク質中のRuvCヌクレアーゼドメイン）が欠失または変異させられる場合、得られたCasタンパク質は、二本鎖DNAの両鎖を切断する能力が低減しているか、該能力を有さない。Cas9タンパク質をニッカーゼに変換することができる突然変異の例は、化膿性連鎖球菌のCas9のRuvCドメインにおけるD10A（Cas9の位置10におけるアスパルテートからアラニン）突然変異である。化膿性連鎖球菌のCas9のH939A（アミノ酸位置839におけるヒスチジンからアラニン）またはHNHドメインにおけるH840A（アミノ酸位置840におけるヒスチジンからアラニン）は、Cas9をニッカーゼに変換することができる。Cas9タンパク質をデッドCas9に変換することができる突然変異の例は、RuvCドメインにおけるD10A（Cas9の位置10におけるアスパルテートからアラニン）突然変異、および化膿性連鎖球菌のCas9のHNHドメインにおけるH939A（アミノ酸位置839におけるヒスチジンからアラニン）またはH840A（アミノ酸位置840におけるヒスチジンからアラニン）である。
【００８２】
デッドCasタンパク質は、該タンパク質の野生型バージョンに対して1つまたは複数の突然変異を含むことができる。突然変異は、野生型Casタンパク質の複数の核酸切断ドメインのうちの1つまたは複数において、90％未満、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満、または1％未満の核酸切断活性をもたらし得る。突然変異は、標的核酸の相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の非相補鎖を切断するその能力を低減させる、複数の核酸切断ドメインのうちの1つまたは複数をもたらし得る。突然変異は、標的核酸の非相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の相補鎖を切断するその能力を低減させる、複数の核酸切断ドメインのうちの1つまたは複数をもたらし得る。突然変異は、標的核酸の相補鎖および非相補鎖を切断する能力を欠いている、複数の核酸切断ドメインのうちの1つまたは複数をもたらし得る。ヌクレアーゼドメイン中の変異させられる残基は、ヌクレアーゼの1つまたは複数の触媒残基に対応し得る。例えば、野生型の例示的な化膿性連鎖球菌Cas9ポリペプチド中の残基、例えば、Asp10、His840、Asn854、およびAsn856を変異させて、複数の核酸切断ドメインのうちの1つまたは複数（例えば、ヌクレアーゼドメイン）を不活性化することができる。Casタンパク質のヌクレアーゼドメイン中の変異させられる残基は、例えば、配列および／または構造アライメントによって決定した場合に、野生型化膿性連鎖球菌Cas9ポリペプチド中の残基Asp10、His840、Asn854、およびAsn856に対応し得る。
【００８３】
非限定例として、残基D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、および／もしくはA987（またはCasタンパク質のいずれかの対応する突然変異）を変異させることができる。例として、例えば、D10A、G12A、G17A、E762A、H840A、N854A、N863A、H982A、H983A、A984A、および／またはD986Aである。アラニン置換以外の突然変異も適切であり得る。
【００８４】
D10A突然変異をH840A、N854A、またはN856A突然変異の1つまたは複数と組み合わせて、DNA切断活性を実質的に欠いているCas9タンパク質（例えば、デッドCas9タンパク質）を生成することができる。H840A突然変異をD10A、N854A、またはN856A突然変異の1つまたは複数と組み合わせて、DNA切断活性を実質的に欠いている部位特異的ポリペプチドを生成することができる。N854A突然変異をH840A、D10A、またはN856A突然変異の1つまたは複数と組み合わせて、DNA切断活性を実質的に欠いている部位特異的ポリペプチドを生成することができる。N856A突然変異をH840A、N854A、またはD10A突然変異の1つまたは複数と組み合わせて、DNA切断活性を実質的に欠いている部位特異的ポリペプチドを生成することができる。
【００８５】
いくつかの態様では、Casタンパク質はクラス2 Casタンパク質である。いくつかの態様では、Casタンパク質はタイプII Casタンパク質である。いくつかの態様では、Casタンパク質は、Cas9タンパク質である、Cas9タンパク質の改変バージョンある、またはCas9タンパク質に由来する。例えば、切断活性を欠いているCas9タンパク質である。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は化膿性連鎖球菌のCas9タンパク質（例えば、SwissProt受託番号Q99ZW2）である。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は黄色ブドウ球菌のCas9（例えば、SwissProt受託番号J7RUA5）である。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、化膿性連鎖球菌または黄色ブドウ球菌のCas9タンパク質の改変バージョンである。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、化膿性連鎖球菌または黄色ブドウ球菌のCas9タンパク質に由来する。例えば、切断活性を欠いている、化膿性連鎖球菌または黄色ブドウ球菌のCas9タンパク質である。
【００８６】
Cas9は、一般に、野生型の例示的なCas9ポリペプチド（例えば、化膿性連鎖球菌のCas9）に対して少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指すことができる。Cas9は、野生型の例示的な（例えば、化膿性連鎖球菌に由来する）Cas9ポリペプチドに対して最大で約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指すことができる。Cas9は、欠失、挿入、置換、変異体、突然変異、融合、キメラ、またはこれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸変化を含むことができる、Cas9タンパク質の野生型または改変形態を指すことができる。
【００８７】
いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするガイドRNAと複合体を形成しているRNA結合タンパク質を含む。RNA結合タンパク質の非限定例としてはADAR1またはADAR2が挙げられ、ガイドRNAの非限定例としては、ADARリクルーティングRNA（arRNA）（Qu, L., et al, “Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs,” Nat Biotechnol. (2019) Jul 15. doi: 10.1038/s41587-019-0178-z）が挙げられる。
【００８８】
いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ZFN」を含む。ZFNは、FokIの切断ドメインなどの切断ドメインとDNAおよびRNAなどのポリヌクレオチドに結合することができる少なくとも1つのジンクフィンガーモチーフ（例えば、少なくとも2つ、3つ、4つ、または5つのジンクフィンガーモチーフ）との融合体を指す。ある特定の配向および間隔での2つの個々のZFNのポリヌクレオチド中のある特定の位置におけるヘテロ二量体化は、ポリヌクレオチドの切断をもたらすことができる。例えば、DNAへのZFNの結合は、DNA中で二本鎖切断を誘導することができる。2つの切断ドメインが二量体化し、DNAを切断することを可能にするために、2つの個々のZFNは、ある特定の距離を置いて、それらのC末端でDNAの逆鎖に結合することができる。ある場合には、ジンクフィンガードメインと切断ドメインの間のリンカー配列は、各結合部位の5’エッジが約5〜7塩基対離れることを必要し得る。ある場合には、切断ドメインは、各ジンクフィンガードメインのC末端に融合される。例示的なZFNとしては、限定されないが、Urnov et al., Nature Reviews Genetics, 2010, 11:636-646；Gaj et al., Nat Methods, 2012, 9(8):805-7；米国特許第6,534,261号；第6,607,882号；第6,746,838号；第6,794,136号；第6,824,978号；第6,866,997号；第6,933,113号；第6,979,539号；第7,013,219号；第7,030,215号；第7,220,719号；第7,241,573号；第7,241,574号；第7,585,849号；第7,595,376号；第6,903,185号；第6,479,626号；ならびに米国特許出願公開第2003/0232410号および第2009/0203140号に記載されているものが挙げられる。
【００８９】
いくつかの態様では、ZFNを含むアクチュエータ部分は、DNAなどの標的ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を引き起こすことができる。DNA中の二本鎖切断は、遺伝子改変（例えば、核酸編集）の導入を可能にするDNA切断修復をもたらすことができる。DNA切断修復は、非相同末端結合（NHEJ）または相同組換え修復（HDR）を介して生じ得る。HDRでは、標的DNAの相同性アーム隣接部位を含むドナーDNA修復テンプレートを提供することができる。いくつかの態様では、ZFNは、部位特異的な一本鎖DNA切断またはニックを誘導し、したがってHDRをもたらす、ジンクフィンガーニッカーゼである。ジンクフィンガーニッカーゼの説明は、例えば、Ramirez et al., Nucl Acids Res, 2012, 40(12):5560-8；Kim et al., Genome Res, 2012, 22(7):1327-33に見られる。いくつかの態様では、ZFNはポリヌクレオチド（例えば、DNAおよび／またはRNA）に結合するが、ポリヌクレオチドを切断することができない。
【００９０】
いくつかの態様では、ZFNを含むアクチュエータ部分の切断ドメインは野生型切断ドメインの改変形態を含む。切断ドメインの改変形態は、切断ドメインの核酸切断活性を低減させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含むことができる。例えば、切断ドメインの改変形態は、野生型切断ドメインの90％未満、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満、または1％未満の核酸切断活性を有し得る。切断ドメインの改変形態は実質的な核酸切断活性を有し得ない。いくつかの態様では、切断ドメインは酵素的に不活性である。
【００９１】
いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、「TALEN」または「TAL-エフェクターヌクレアーゼ」を含む。TALENは、DNA結合タンデムリピートの中央ドメインおよび切断ドメインを一般に含む、操作された転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合することによって生成することができる。ある場合には、DNA結合タンデムリピートは、33〜35アミノ酸の長さを含み、少なくとも1つの特定のDNA塩基対を認識することができる2つの超可変アミノ酸残基を位置12および13に含む。転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質を、野生型もしくは変異を受けたFokIエンドヌクレアーゼまたはFokIの触媒ドメインなどのヌクレアーゼに融合させることができる。TALENにおけるその使用のために、FokIに対するいくつかの突然変異が作製され、これは、例えば、切断特異性または活性を改善する。そのようなTALENは、任意の望ましいDNA配列に結合するように操作され得る。TALENを使用して、標的DNA配列中に二本鎖切断を作製し、次にこれが、NHEJまたはHDRを受けることによって、遺伝子改変（例えば、核酸配列編集）を引き起こすことができる。ある場合には、HDRを促進するために、一本鎖のドナーDNA修復テンプレートが提供される。TALENおよび遺伝子編集のためのその使用の詳細な説明は、例えば、米国特許第8,440,431号；第8,440,432号；第8,450,471号；第8,586,363号；および第8,697,853号；Scharenberg et al., Curr Gene Ther, 2013, 13(4):291-303；Gaj et al., Nat Methods, 2012, 9(8):805-7；Beurdeley et al., Nat Commun, 2013, 4:1762；およびJoung and Sander, Nat Rev Mol Cell Biol, 2013, 14(1):49-55に見られる。
【００９２】
いくつかの態様では、TALENは、ヌクレアーゼ活性の低減のために操作される。いくつかの態様では、TALENのヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインの改変形態を含む。ヌクレアーゼドメインの改変形態は、ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性を低減させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼドメインの改変形態は、野生型ヌクレアーゼドメインの90％未満、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満、または1％未満の核酸切断活性を有し得る。ヌクレアーゼドメインの改変形態は実質的な核酸切断活性を有し得ない。いくつかの態様では、ヌクレアーゼドメインは酵素的に不活性である。
【００９３】
いくつかの態様では、転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質は、転写をモジュレートすることができ、ヌクレアーゼを含まないドメインに融合される。いくつかの態様では、転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質は転写活性化因子として機能するように設計される。いくつかの態様では、転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質は転写リプレッサーとして機能するように設計される。例えば、転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質のDNA結合ドメインを、1つもしくは複数の転写活性化ドメインに、または1つもしくは複数の転写抑制ドメインに融合させる（例えば、連結させる）ことができる。転写活性化ドメインの非限定例としては、単純ヘルペスVP16活性化ドメインおよびVP16活性化ドメインの四量体リピート、例えば、VP64活性化ドメインが挙げられる。転写抑制ドメインの非限定例としては、クルッペル関連ボックスドメインが挙げられる。
【００９４】
いくつかの態様では、アクチュエータ部分はメガヌクレアーゼを含む。メガヌクレアーゼは、一般に、非常に特異的であり得る、レアカッティングエンドヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼは、少なくとも12塩基対の長さ、例えば、12〜40塩基対、12〜50塩基対、または12〜60塩基対の長さの範囲のDNA標的部位を認識することができる。メガヌクレアーゼは、モジュラーDNA結合ヌクレアーゼ、例えば、エンドヌクレアーゼの少なくとも1つの触媒ドメインおよび核酸標的配列を特定する少なくとも1つのDNA結合ドメインまたはタンパク質を含む、任意の融合タンパク質でもよい。DNA結合ドメインは、一本鎖または二本鎖DNAを認識する少なくとも1つのモチーフを含むことができる。メガヌクレアーゼは単量体でもよく、または二量体でもよい。いくつかの態様では、メガヌクレアーゼは天然に存在する（天然に見られる）か、または野生型であり、他の場合では、メガヌクレアーゼは、非天然である、人工的である、操作されている、合成である、合理的に設計されている、または人造である。いくつかの態様では、本開示のメガヌクレアーゼとしては、I-CreIメガヌクレアーゼ、I-CeuIメガヌクレアーゼ、I-MsoIメガヌクレアーゼ、I-SceIメガヌクレアーゼ、これらの変異体、これらの誘導体、およびこれらの断片が挙げられる。有用なメガヌクレアーゼおよび遺伝子編集におけるその適用の詳細な説明は、例えば、Silva et al., Curr Gene Ther, 2011, 11(1):11-27；Zaslavoskiy et al., BMC Bioinformatics, 2014, 15:191；Takeuchi et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(11):4061-4066、ならびに米国特許第7,842,489号；第7,897,372号；第8,021,867号；第8,163,514号；第8,133,697号；第8,021,867号；第8,119,361号；第8,119,381号；第8,124,36号；および第8,129,134号に見られる。
【００９５】
いくつかの態様では、メガヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインは野生型ヌクレアーゼドメインの改変形態を含む。ヌクレアーゼドメインの改変形態は、ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性を低減させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼドメインの改変形態は、野生型ヌクレアーゼドメインの90％未満、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満、または1％未満の核酸切断活性を有し得る。ヌクレアーゼドメインの改変形態は実質的な核酸切断活性を有し得ない。いくつかの態様では、ヌクレアーゼドメインは酵素的に不活性である。いくつかの態様では、メガヌクレアーゼはDNAに結合することができるが、DNAを切断することができない。
【００９６】
いくつかの態様では、アクチュエータ部分は、1つまたは複数の転写リプレッサードメイン、アクチベータードメイン、エピジェネティックドメイン、リコンビナーゼドメイン、トランスポゼースドメイン、フリッパーゼドメイン、ニッカーゼドメイン、またはこれらの任意の組み合わせに融合される。アクチベータードメインは、酵素のカルボキシル末端に位置する1つまたは複数のタンデム型活性化ドメインを含むことができる。他の場合では、アクチュエータ部分は、タンパク質のカルボキシル末端に位置する1つまたは複数のタンデム型リプレッサードメインを含む。非限定な例示的活性化ドメインは、GAL4、単純ヘルペス活性化ドメインVP16、VP64（単純ヘルペス活性化ドメインVP16の四量体）、NF-κB p65サブユニット、エプスタイン−バーウイルスRトランスアクチベーター（Rta）が挙げられ、Chavez et al., Nat Methods, 2015, 12(4):326-328および米国特許出願公開第20140068797号に記載されている。非限定な例示的抑制ドメインは、Kox1のKRAB（クルッペル関連ボックス）ドメイン、Mad mSIN3相互作用ドメイン（SID）、ERFリプレッサードメイン（ERD）が挙げられ、Chavez et al., Nat Methods, 2015, 12(4):326-328および米国特許出願公開第20140068797号に記載されている。安定性を増大または低下させる異種ポリペプチドにアクチュエータ部分を融合させることもできる。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、アクチュエータ部分内のN末端、C末端、または内部に位置し得る。
【００９７】
アクチュエータ部分は、追跡または精製をしやすくするために、蛍光タンパク質、精製用タグ、またはエピトープタグなどの異種ポリペプチドを含むことができる。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、eGFP、Emerald、Azami Green、単量体Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1）黄色蛍光タンパク質（例えば、YFP、eYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1）、青色蛍光タンパク質（例えば、eBFP、eBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire）、シアン蛍光タンパク質（例えば、eCFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan）、赤色蛍光タンパク質（mKate、mKate2、mPlum、DsRed単量体、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRaspberry、mStrawberry、Jred）、オレンジ蛍光タンパク質（mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato）、および任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、キチン結合タンパク質（CBP）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（TRX）、ポリ（NANP）、タンデムアフィニティ精製（TAP）タグ、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、ヘマグルチニン（HA）、nus、Softag1、Softag3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、SI、T7、V5、VSV-G、ヒスチジン（His）、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（BCCP）、およびカルモジュリンが挙げられる。
【００９８】
ポリペプチドおよび／またはポリペプチドをコードする核酸を含む本開示のシステムを細胞に導入するために、任意の適切な送達方法を使用することができる。システム成分（例えば、第1の二量体化ドメインに連結されているコンパートメント特異的タンパク質、第2の二量体化ドメインに連結されているアクチュエータ部分）は、同時に、または時間的に離れて送達され得る。遺伝子改変方法の選択は、形質転換される細胞のタイプおよび／または形質転換が行われる状況（例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存し得る。
【００９９】
送達の方法は、本開示のシステム成分（例えば、第1の二量体化ドメインに連結されているコンパートメント特異的タンパク質、第2の二量体化ドメインに連結されているアクチュエータ部分）をコードする核酸配列を含む1種または複数種のポリヌクレオチドを細胞（または、細胞の集団）に導入することを含み得る。本開示のシステム成分をコードする核酸配列を含む適切なポリヌクレオチドは発現ベクターを含むことができ、本開示の1つまたは複数のシステム成分（例えば、第1の二量体化ドメインに連結されているコンパートメント特異的タンパク質、第2の二量体化ドメインに連結されているアクチュエータ部分）をコードする核酸配列を含む発現ベクターは組換え発現ベクターである。
【０１００】
送達方法または形質転換の非限定例としては、ウイルスまたはバクテリオファージの感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（PEI）媒介性トランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、細胞透過性ペプチドの使用、およびナノ粒子媒介性核酸送達が挙げられる。
【０１０１】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書において記載される1種もしくは複数種のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、もしくはベクター、またはそれらの1種もしくは複数種の転写産物、および／あるいはそれらから転写される1種または複数種のタンパク質を細胞に送達することを含む方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、さらに、そのような方法によって生成された細胞、およびそのような細胞を含む、またはそのような細胞から生成される生物（例えば、動物、植物、または真菌）を提供する。ある特定の態様では、そのような方法によって生成される細胞は、第1の二量体化ドメインに連結されているコンパートメント特異的タンパク質および第2の二量体化ドメインに連結されているアクチュエータ部分をコードするポリヌクレオチド（例えば、ベクター）を含む。
【０１０２】
細胞に適合する任意の適切なベクターを本開示の方法とともに使用することができる。真核細胞用のベクターの非限定例としては、pXT1、pSG5（Stratagene（商標））、pSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVLSV40（Pharmacia（商標））が挙げられる。
【０１０３】
いくつかの態様では、システム成分（例えば、第1の二量体化ドメインに連結されているコンパートメント特異的タンパク質、第2の二量体化ドメインに連結されているアクチュエータ部分）をコードするポリヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、プロモーターなどの転写制御エレメントに機能的に連結される。転写制御エレメントは、真核細胞、例えば哺乳動物細胞、または原核細胞（例えば、細菌細胞もしくは古細菌細胞）のいずれかで機能的であり得る。いくつかの態様では、システム成分をコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞および／または真核細胞でポリヌクレオチド配列の発現を可能にする複数の制御エレメントに機能的に連結される。
【０１０４】
本開示のシステムおよび方法とともに使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト以外の哺乳動物細胞、またはヒト細胞で活性なプロモーターが挙げられる。プロモーターは、誘導可能なプロモーターまたは構成的に活性なプロモーターであり得る。あるいは、またはさらに、プロモーターは組織特異的または細胞特異的であり得る。
【０１０５】
適切な真核プロモーター（すなわち、真核細胞で機能的なプロモーター）の非限定例としては、サイトメガロウイルス（CMV）最初期、単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のロングターミナルリピート（LTR）、ヒト伸長因子-1プロモーター（EF1）、ニワトリベータ−活性プロモーター（CAG）に融合されたサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサーを含むハイブリッドコンストラクト、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（MSCV）、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1遺伝子座プロモーター（PGK）、およびマウスメタロチオネイン-Iからのものを挙げることができる。プロモーターは真菌プロモーターでもよい。プロモーターは植物プロモーターでもよい。植物プロモーターのデータベースを見出すことができる（例えば、PlantProm）。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネータを含むこともできる。発現ベクターは、発現を増幅するのに適切な配列を含むこともできる。
【０１０６】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によって核内膜に配置される。核内膜を標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、エメリン、Lap2ベータ、およびラミンBが挙げられる。
【０１０７】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によってCajal体に配置される。Cajal体を標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、コイリン、SMN、Gemin3、SmD1、およびSmEが挙げられる。
【０１０８】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によって核スペックルに配置される。核スペックルを標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、SC35が挙げられる。
【０１０９】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によってPML体に配置される。PML体を標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、PMLおよびSP100が挙げられる。
【０１１０】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によって核膜孔複合体に配置される。核膜孔複合体を標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、Nup50、Nup98、Nup53、Nup153、およびNup62が挙げられる。
【０１１１】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によって核小体に配置される。核小体を標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、核タンパク質B23が挙げられる。
【０１１２】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によってP顆粒に配置される。P顆粒を標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、RGGドメインタンパク質（例えば、PGL-1およびPGL-3）、Deadボックスタンパク質、ならびにGLH-1-4が挙げられる。
【０１１３】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によってGW体に配置される。GW体を標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、GW182が挙げられる。
【０１１４】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によってストレス顆粒に配置される。ストレス顆粒を標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、G3BP（Ras-ギャップSH3結合タンパク質）、TIA-1（T細胞細胞内抗原）、eIF2、およびeIF4Eが挙げられる。
【０１１５】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によってスポンジ体に配置される。スポンジ体を標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、EXu、Btz、Tral、Cup、eIF4E、Me31B、Yps、Gus、Dcp1/2、Sqd、BicC、Hrb27C、およびBruが挙げられる。
【０１１６】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によって細胞質プリオンタンパク質誘導性リボ核タンパク質（CyPrP-RNP）顆粒に配置される。CyPrP-RNP顆粒を標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、Dcp1a、DDX6/Rck/p54/Me31B/Dhh1、およびダイサーが挙げられる。
【０１１７】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によってU体に配置される。U体を標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、1種または複数種のウリジンリッチ核内低分子リボ核タンパク質U1、U2、U4/U6、およびU5；LSm1-7；ならびに運動神経細胞生存（SMN）タンパク質が挙げられる。
【０１１８】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によって小胞体に配置される。小胞体を標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、カルレティキュリン、カルネキシン、PDI、GRP78、およびGRP94が挙げられる。
【０１１９】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によってミトコンドリアに配置される。ミトコンドリアを標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、HIF1A、PLN、Cox1、ヘキソキナーゼ、およびTOMM40が挙げられる。
【０１２０】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によって原形質膜に配置される。原形質膜を標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、ナトリウム・カリウムATPアーゼ、CD98、カドヘリン、および原形質膜カルシウムATPアーゼ（PMCA）が挙げられる。
【０１２１】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によってゴルジに配置される。ゴルジを標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、GM130、MAN2A1、MAN2A2、GLG1、B4GALT1、RCAS1、およびGRASP65が挙げられる。
【０１２２】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によってリボソームに配置される。リボソームを標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、AGO2、MTOR、PTEN、RPL26、FBL、およびRPS3が挙げられる。
【０１２３】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によってプロテアソームに配置される。プロテアソームを標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、PSMA1、PSMB5、PSMC1、PSMD1、およびPSMD7が挙げられる。
【０１２４】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によってエンドソームに配置される。エンドソームを標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、CFTR、ADRB1、EGFR、IGF2R、AP2S1、CD4、HLA-A、コベオリン、RAB5、およびErbB2が挙げられる。
【０１２５】
いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドは提供されるシステムおよび方法によってリポソームに配置される。リポソームを標的化するのに適したコンパートメント特異的タンパク質としては、限定されないが、EEA1、LAMTOR2、およびLAMTOR4が挙げられる。
【０１２６】
本明細書において開示されるシステムおよび方法で標的化することができる他の細胞コンパートメントとしては、RNP体、有糸分裂紡錘体、ヒストン遺伝子座体、ヘテロクロマチン領域、および細胞骨格が挙げられる。さらなるコンパートメントも意図される。
【０１２７】
標的ポリヌクレオチドは、それが配置される細胞コンパートメントに対して内在性でもよく、または外来性でもよい。標的ポリヌクレオチドは細胞に対して内在性でもよく、または外来性でもよい。標的ポリヌクレオチドはヒトでもよく、または非ヒトでもよい。標的ポリヌクレオチドは、ウイルス由来、プラスミド、リボ核タンパク質、または合成されたRNAもしくはDNA鎖でもよい。
【０１２８】
本明細書において開示される方法およびシステムは、複数のポリヌクレオチドが同じまたは異なる細胞内コンパートメントに再配置される多重プロセスでの使用に適する。
【０１２９】
いくつかの態様では、提供されるシステムおよび方法は、標的化されたポリヌクレオチド（例えば、ゲノム）遺伝子座でデノボ細胞内コンパートメント（例えば、核内構造体）形成を媒介するために使用され、液−液相分離を介して非膜系オルガネラ形成を開始するための潜在的な方法を提供する。細胞内空間の非膜系コンパートメント化は、液−液相分離によって生じる。異型の協力的な弱い相互作用は、液体コンパートメント内の迅速な再編成を可能にする。天然変性タンパク質は、その構造的可塑性およびプリオン様特性のために、相転移において重要な役割を果たす。細胞は相転移の程度および持続時間を動的に制御する。DNA、RNAまたはポリ（ADP-リボース）（PAR）などの分子シードは、刺激特異的および状況特異的な様式で相転移を誘発することができる。シャペロン、ディスインテグラーゼ（disintegrase）機構、および翻訳後修飾は、協力して相転移を制御する。一連の凝集性が存在し、細胞は、タンパク質のアセンブリーにおいて予期せぬ広範囲の物質状態を用いる。これらは、神経変性疾患と関係がある病的な凝集体に進行する可能性がある。
【０１３０】
本明細書において開示されるシステムおよび方法を使用して形成することができる合成相の例としては、限定されないが、ウイルス防御およびテロメア維持で役割を有し得る合成PML体、ストレス誘導性抗アポトーシス構造体であり得る合成の核スペックルおよびパラスペックル、神経変性に関与する因子のためのハブであり得る合成gem、核内構造体を播種することができる合成アーキテクチュラルRNA、合成核小体、合成ヘテロクロマチンまたはユークロマチン、FLASH蓄積の部位であり得、ヒストンmRNAのプロセシングを増強することができる合成ヒストン遺伝子座体、Xistの使用をともなって、染色体全体をシスでサイレンスさせることができる合成クロマチンパッキングシステム、合成エピジェネティック相、合成（細胞質）P体、合成ストレス体、発達中の胚において減数分裂の際に性細胞を生成することができる合成生殖顆粒、神経変性疾患における合成mRNP顆粒、非膜系オルガネラの構造および動態を調節することができる合成の翻訳後修飾（PTM）、凝集体を形成する合成IDP（天然変性タンパク質）、ならびに合成プリオン様ドメイン（PLD）またはRGGリッチの低複雑性ドメイン（LCD）が挙げられる。ポリヌクレオチドを配置することができる他の非内在性のタンパク質／RNA凝集体としては、β-アミロイド体、mRNA凝集体、Xistパッケージング複合体などが挙げられる。
【０１３１】
本明細書において記載される、ポリヌクレオチドの制御された配置は、例えば、RNAポリメラーゼ、転写因子、パイオニア因子、メディエーター、DNAルーピング分子、および他のDNA結合タンパク質とのDNA相互作用；エピジェネティック改変マークまたはユークロマチン／ヘテロクロマチンモジュレート酵素（例えば、HP1）；クロマチンのコンパクト性、および他の生物物理学／生化学的特性；組換え、NHEJ、またはHDRを含めた遺伝子編集；ゲノム安定性および癌；DNA修復プロセス；ならびにスプライシング、分解、翻訳、メチル化、局在、ならびに他のシャペロンおよびRNA結合タンパク質との相互作用によるmRNA代謝を調節する、これらを改変する、またはこれらに影響を及ぼすために、使用することができる。
【０１３２】
疾患メカニズムを理解する目的で、誘導可能かつ可逆的な疾患モデルを確立するために、本明細書において開示される方法およびシステムを使用することができる。例えば、提供されるシステムおよび方法は、タンパク質／RNAミスフォールディングまたはアグリゲーションによって引き起こされる疾患を研究するために使用することができる。プロテオーム不均衡は老化と関係があり、溶解度を超え、細胞内および細胞外凝集体を形成する傾向がある大量のタンパク質をともなうことが多い。老化は、いくつかのタンパク質ミスフォールディング障害（PMD）の発症、特に進行性神経変性の危険因子である。タンパク質の凝集は、ほんの数例を挙げると、アルツハイマー病（AD）におけるアミロイドベータ（Ab）およびタウの凝集、パーキンソン病（PD）および多系統萎縮症における細胞内のアルファシヌクレイン凝集体、ハンチントン病（HD）におけるポリQによって引き起こされるタンパク質凝集体、プリオン病におけるPrPSc、ならびに筋萎縮性側索硬化症（ALS）および前頭側頭型認知症（FTD）におけるTDP-43およびFETタンパク質凝集体を含めた、神経変性の主要な顕著な特徴である。プラーク形成に関与するタンパク質の化学的性質および（病態）生理学的トポロジーは異なるが、それらの凝集を支配する原理は驚いたことに類似していると思われ、これらのプラークまたは凝集体に標的ポリヌクレオチドを配置するために、提供される方法およびシステムを使用することができる。
【０１３３】
本明細書において開示されるシステムおよび方法は、鍵となるドライバー遺伝子を異なる核コンパートメント中に再配置することによって細胞分化を制御するために使用することができる。システムおよび方法は、内在性VD(J)遺伝子座において組換え率を制御することによって抗体産生を増強するために使用することができる。システムおよび方法は、ミスフォールディングタンパク質体の形成を排除することによってアルツハイマー病を緩和するために使用することができる。
【０１３４】
本明細書において開示されるシステムおよび方法は、植物、細菌、古細菌、酵母、魚、昆虫、鳥、哺乳動物、マウス、ブタ、およびヒトを含めた生物のすべての界に広く適用可能である。システムおよび方法は、生きている生物全体で、または組織もしくは細胞内で、使用することができる。
【実施例】
【０１３５】
IV.実施例
以下の実施例は、本開示の様々な態様を例示する目的で示され、いかなる方法でも本開示を制限することを意味しない。本実施例は、本明細書において記載される方法とともに、現在好ましい態様を代表し、例示的であり、本開示の範囲に対する制限として意図されない。
【０１３６】
実施例1.標的特異的ゲノム再配置のための化学的に誘導可能なCRISPR-GOプラットフォームの開発
誘導可能なCRISPR媒介性クロマチン再配置システムを実行するために、2つの化学的に誘導可能なヘテロ二量体化システムを試験した。第1のものはアブシジン酸（ABA）で誘導可能なABI/PYL1システムであり、第2のものはTMP-HTag（トリメトプリム-ハロリガンド）で誘導可能なDHFR/HaloTagシステムであった。両方システムについて、化膿性連鎖球菌のdCas9（D10A & H840A）タンパク質を1つのヘテロ二量体に融合し、内部核エンベロープ（NE）タンパク質、エメリンを同種のヘテロ二量体に融合した（図2〜4）。EMD遺伝子にコードされるエメリンは、核内膜でクロマチン構成を媒介するLEM（LAP2、エメリン、MAN1）ドメインタンパク質のグループの中の1つである。エメリンは細胞質で合成され、小胞体（ER）に挿入され、次いで、近接しているER/NE膜内の拡散を通してNEに転位置させられる（Berk et al., 2013）。レンチウイルス形質導入を使用して、各二量体化システムを安定して発現するU2OSヒト骨肉腫上皮細胞株を作製した。これらの細胞株では、ABAの添加により、核内部中からNEおよびERへのABI-BFP-dCas9タンパク質の空間的再局在が引き起こされ、これは、PYL1-GFP-エメリンとのその二量体化による（図5および図6）。これに対して、TMP-HTagで誘導可能なシステムは、リガンドとのdCas9-EGFP-HaloTagおよびDHFR-mCherry-エメリンの共局在に対して明らかな作用を示さなかった。したがって、ABAで誘導可能なABI/PYL1ヘテロ二量体化システムを後の実験に使用した。
【０１３７】
ABAで誘導可能なCRISPR-GOシステムが染色体の位置を変えることができるかどうかを試験するために、染色体3（Chr3）の内在性遺伝子座を標的化した。染色体3内の高度反復性（約500×）領域（3q29）を標的化するsgRNAを、ABI-BFP-dCas9およびPYL1-GFP-エメリンを安定して発現するU2OS細胞株にレンチウイルスで形質導入した（図2および図7）。ABA処理後に、AB1-BFP-dCas9がPYL-GFP-エメリン局在（NEおよびER）に主に動員されたことを考えて、別の独立したCRISPR-Cas9イメージング成分、dCas9-HaloTag融合タンパク質を加えて、標的化されたChr3ゲノム遺伝子座の位置を可視化した（図5および図6）。sgChr3の存在下で、JF549-HaloTag色素を培養培地に加えて、dCas9-HaloTagに結合させ、生細胞において、標的化されたChr3:q29遺伝子座の可視化を可能にした。sgChr3は、同じChr3:q29ゲノム領域内の複数の反復を標的化することによって、CRISPR-Cas9イメージング（dCas9-HaloTagを介する）とCRISPR-GOゲノム再局在（AB1-dCas9を介する）の両方を媒介する。sgRNAの非存在下で、dCas9-HaloTagの局在は、AB1-BFP-dCas9とPYL-GFP-エメリンの間のABA媒介性ヘテロ二量体化の影響を受けないことも確証された（図6）。
【０１３８】
2日間のABA処理後に、ABA処理無しの細胞と比較して、核周辺部への標的化されたChr3遺伝子座の係留の有意な増加が観察された（図8および図10〜12）。ABA処理無しでは、19％のdCas9-HaloTag標識されたChr3遺伝子座がPYL1-GFP-エメリンによってマークされた核周辺部に配置されたが、標識された遺伝子座の大部分は核内部に残った（142遺伝子座を解析した。図8）。これに対して、ABA処理した細胞において、87％の標識されたChr3遺伝子座が核周辺部へ再配置された（163遺伝子座、図8）。ABA処理は、27％（77細胞）から95％（76細胞、図8）まで、核膜に局在している少なくとも1つのChr3遺伝子座を示す細胞のパーセンテージも増加させた。化学処理による、再配置されたゲノム遺伝子座（p<0.0001）と細胞（p<0.0001）の両方の有意な増加は、本明細書において開示されるシステムが、細胞中の内在性ゲノム遺伝子座などの高度反復性ポリヌクレオチドを再配置するのに効率的であることを示唆する。
【０１３９】
実施例2.CRISPR-GOシステムによる反復性ゲノム遺伝子座の効率的な再配置
Chr3:q29遺伝子座に加えて、Chr13遺伝子座およびテロメアを含めた他の高度反復性内在性ゲノム遺伝子座を核周辺部に再配置することを試験した。染色体13q34の反復性領域（約350×反復）（Chr13）（図7）を標的化するsgRNAを使用して、係留されたChr13遺伝子座のパーセンテージは13％（n=103）から69％に増加し（n=157、p<0.0001）、少なくとも1つの周辺部局在型遺伝子座を含む細胞のパーセンテージは34％（n=30）から94％（n=53、図8、p<0.0001）に増加した。同様に、テロメア標的化sgRNAを有するCRISPR-GO含有細胞を形質導入して、本発明者らのシステムを用いてテロメアも再配置することができるかどうかを試験した。テロメアマーカーであるTRF1-mCherryも共発現させて、テロメアを可視化した。この場合、周辺部局在型テロメア遺伝子座のパーセンテージは26％（n=1255）から65％（n=491、図8、p<0.0001）に増加した。
【０１４０】
染色体再配置を研究するために以前に使用したU2OS 2-6-3レポーター細胞株において、染色体1p36に位置する合成的に組み込んだLacOアレイも標的化した（図7）。LacO配列を標的化するsgRNAを使用して、生細胞におけるCRISPR-Cas9イメージングによって、核周辺部に係留される標的化されたゲノム遺伝子座のパーセンテージが4％（n=73）から60％（n=161、p<0.0001）に増加し、少なくとも1つの周辺部局在型遺伝子座を含む細胞のパーセンテージが4.5％（n=66）から65％（n=133）に増加したことが明らかになった（図8、1G、p<0.0001）。DAPIを用いた固定細胞における蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）染色によって、ABA処理後にLacO遺伝子座の大部分が核周辺部に局在することがさらに確証された（図13）。
【０１４１】
低度反復性（<100反復）配列を再配置する際のCRISPR-GOシステムの効率を次に試験した。約71種のsgRNAが標的にすることができる反復を含むChr7 q36.3上のゲノム領域および約15種のsgRNAが標的にすることができる反復を含むChrX p21.2上のゲノム領域を標的として選択した（図14）。本発明者らは可視化し、3D-FISHを使用して標的化されたゲノム遺伝子座の位置を可視化し、DAPIによって核を染色した（図15）。3日間のABA処理後に、周辺部局在型遺伝子座のパーセンテージは、Chr7について28％（n=97）から68％（n=142、p<0.0001）に、ChrXについて33％（n=230）から62％（n=123、p<0.0001）に増加した。少なくとも1つの周辺部隣接性遺伝子座を含む細胞のパーセンテージは、Chr7について32％（n=68）から79％（n=76、p<0.0001）に、ChrXについて41％（n=136）から76％（n=74、p<0.0001）に増加した（図9）。対照として非標的化sgRNAを使用した場合、核周辺部のChr7およびChrXのパーセンテージは非ABA処理試料で見られるものと類似しており、ABA処理後も変化しないままであった（図16）。まとめると、これらの結果は、本明細書において提供される化学物質で誘導可能なシステムは、高度反復性および低度反復性配列を核周辺部などの細胞内コンパートメントに再配置するのに効率的であることを示唆する。
【０１４２】
実施例3.CRISPR-GOシステムによる非反復性ゲノム遺伝子座の効率的な再配置
反復性配列はヒトゲノム中に大量に存在するが、CRISPR-GOシステムが非反復性ゲノム遺伝子座の再配置を可能にしたかどうかはさらに興味深い。ChrX q13.2に位置する非反復性遺伝子XISTを最初に標的化し、XISTゲノム領域をタイリングする13種のsgRNAを設計した（図17）。すべてのコンストラクトをCRISPR-GOシステムを安定して発現するU2OS細胞中にレンチウイルスで形質導入した。ABA処理で、周辺部局在型XIST遺伝子座のパーセンテージは39％（n=83）から79％（n=71、p<0.0001）に増加し、周辺部局在型遺伝子座を含む細胞のパーセンテージは59％（n=39）から90％（n=33）に増加した（図18、1H、p=0.0028）。Chr10の遺伝子PTENに隣接する領域、および該遺伝子内の領域を標的化する9種のsgRNA（図17）のプールを使用して、CRISPR-GOシステムは、周辺部局在型PTEN遺伝子座のパーセンテージを39％（n=128）から61％（n=308、p<0.0001）増加させ、少なくとも1つの周辺部隣接性遺伝子座を含む細胞のパーセンテージは、62％（n=60）から88％（n=106、p=0.0002）に増加した（図15および図18）。
【０１４３】
非反復性領域を標的化する単一sgRNAがゲノム遺伝子座を再再配置するのに十分であるかどうかも試験した。Chr2のCXCR4遺伝子座を標的化する単一sgRNA（sgCXCR4-1）を使用して、周辺部局在型CXCR4遺伝子座のパーセンテージは、20％（n=241）から50％（n=425、p<0.0001）に増加し、周辺部局在型遺伝子座を含む細胞のパーセンテージは、52％（n=69）から85％（n=131、p<0.0001）に増加した（図19）。同様に、別の単一sgRNA（sgCXCR4-2）は、局在型CXCR4遺伝子座を25％（n=202）から47％（n=284）に、細胞を49％（n=74）から82％（n=84、p<0.0001）に増加させた（図19）。単一sgRNAおよび6種のsgRNAのプールを使用してCXCR4遺伝子座を標的化する場合の効率を比較した。複数のsgRNAを使用した場合、CRISPR-GOシステムは、局在型CXCR4遺伝子座のパーセンテージを32％（n=270）から62％（n=402、p<0.0001）に、細胞のパーセンテージを46％（n=170）から90％（n=168、p<0.0001）にそれぞれ増加させた（図15および図19）。対照として非標的化sgRNAを使用した場合、核周辺部のCXCR4遺伝子座のパーセンテージは非ABA処理試料で見られるものと類似しており、ABA処理後も変化しないままであった（図16）。これらの結果は、ともに、本明細書において開示されるシステムが核周辺部などの細胞内コンパートメントへの非反復性遺伝子座の効率的な再局在を媒介することができることを確証した。
【０１４４】
実施例4.化学的に誘導可能かつ可逆的なCRISPR-GO媒介性ゲノム再配置
提供されるシステムおよび方法の1つの利点は、培養培地に化学的誘導物質を加える、または培養培地から化学的誘導物質を除去することによって、ポリヌクレオチドの再配置を容易にスイッチオンまたはオフする能力である。化学的な誘導および除去実験を行って、ABAで誘導可能なCRISPR-GOシステムの動態および可逆性を研究した（図20）。化学的誘導を研究するために、Chr3遺伝子座を標的化するCRISPR-GOシステムを含むU2OS細胞をABAで処理し、異なる時点で調べた。化学的逆転については、Chr3遺伝子座を標的化するCRISPR-GOシステムを含むU2OS細胞を最初にABAで2日間処理し、次いでABAを含まない培地に移した。ABA誘導性ゲノム再局在は、核膜に係留されているChr3遺伝子座のパーセンテージが、ABA添加の16時間以内に19％（n=142）から75％（n=93、p<0.0001）に増加し、ABA添加の72時間後に91％（n=160）に達したように、比較的速く生じた。ABA除去後、核膜に係留されているChr3遺伝子座のパーセンテージは、24時間後に、82％（n=163）から45％（n=84、p<0.0001）に減少し、48時間および72時間後に、それぞれ27％（n=146）および26％（n=159）にさらに減少した。ABA除去の48時間および72時間後に、核周辺部のChr3のパーセンテージは、同時にイメージングしたABA処理無しの対照試料（25％、n=106、p=0.77）と区別不能であり、これは、ABA除去は、48時間以内に、CRISPR-GOシステムによって媒介されるゲノム再配置作用を完全に逆転させたことを示唆する（図20）。これらの結果は、本明細書において開示されるシステムおよび方法によって媒介される核再配置を、例えば、ABAなどの化学的誘導物質を加えるまたは除去することによって、容易にスイッチオンおよびオフすることができることを示唆する。
【０１４５】
実施例5.CRISPR-GOシステム媒介性核周辺部再配置のための有糸分裂依存的および有糸分裂非依存的メカニズム
CRISPR-GOシステムを使用して、内在性Chr3遺伝子座を標的にした。Chr3標的化sgRNAを含むCRISPR-GO細胞を、血清飢餓およびヒドロキシ尿素（HU）処理によって同調させ、S期に停止させ、次いで、化学的誘導のためにABAで処理した（図21）。興味深いことに、24時間のABA処理後に、核周辺部に係留されているChr3遺伝子座のパーセンテージは、HU処理したS期停止細胞において17％（n=175）から33％（n=177、p=0008）に増加し、これは、非同調細胞のパーセンテージ（75％、n=251、p=0.0001）より有意に低かった。48時間のABA処理後に、核周辺部に係留されているChr3遺伝子座のパーセンテージは、HU処理したS期停止細胞において、54％（n=177、p<0.0001）に増加し、これも、非同調細胞（83％、n=178、p<0.0001）より低かった。したがって、HU処理したS期停止細胞において、核周辺部の再配置は依然として観察されたが、有糸分裂を経た細胞と比較して程度は低かった。これらの結果は、本明細書において開示されるシステムおよび方法を使用した、核周辺部などの細胞内コンパートメントへの内在性遺伝子座の再配置は、有糸分裂依存的と有糸分裂非依存的メカニズムの両方を介して起こり得ることを示唆する。
【０１４６】
有糸分裂非依存性周辺部再配置は、本発明者らが知る限りまだ報告されていない。間期の間にゲノム遺伝子座を核周辺部に係留することができるかどうかを探索するために、生細胞CRISPR-Cas9イメージングを使用して、核周辺部の係留の動態を追跡した。間期の間に核周辺部に係留される内在性Chr3遺伝子座の動的プロセスを検出した。図22および図23に示す代表的な例では、Chr3:q29遺伝子座（矢印）は、記録の最初の4時間の間に、核周辺部（GFP-エメリン）から分離し始め、4.5時間で核周辺部に係留され、次いで、10時間〜12時間の間に核が回転を起こした間でさえも、記録の残り8時間にわたって係留されたままであった。本発明者らは、このChr3遺伝子座と最も近い核周辺部との間の距離を経時的に定量化し、距離は、4.5時間で係留が生じた後、0としてとどまることを見出した（図24）。これらの結果は、間期の間、比較的安定なクロマチン構造の構成にもかかわらず、本明細書において開示されるシステムおよび方法を使用して、核周辺部の近くに位置するゲノム遺伝子座を有糸分裂非依存的に核周辺部に合成的に係留させることができることを示唆する。
【０１４７】
実施例6.核周辺部に係留させることによる、内在性ゲノム遺伝子座の移動の抑制
CRISPR-GOシステムと生細胞におけるCRISPR-Cas9イメージングを組み合わせることによって、ゲノム係留後のゲノム遺伝子座の短時間の移動キネティクスを研究した。核周辺部に係留されているChr3遺伝子座の短期間の動態を、係留されていない遺伝子座と比較して調べた（図25）。共焦点顕微鏡下で4〜6秒ごとに画像を撮った。係留されていないChr3遺伝子座は、係留されているChr3遺伝子座よりも移動性であることが観察された（図25）。2次元空間における各遺伝子座の連続した移動段階間の変位（dxt=xt-xt-1 & dyt=yt-yt-1。式中、（xt、yt）は、時間tにおける遺伝子座の座標である）を特徴づけ、それらの分布を移動振幅の尺度としてプロットした（図25）。係留されていないChr3遺伝子座は、周辺部に係留されている遺伝子座と比較して振幅がより高い、段階変位のより幅広い分布を示した。係留されているゲノム遺伝子座がより限られた移動を示したという観察によって、核エンベロープへのこれらの遺伝子座の物理的係留が確証される。平均ユークリッド段階距離
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をさらに定量化した。係留されていないChr3遺伝子座が0.11±0.07μm（19個の遺伝子座について1696段階）という段階距離を示し、周辺部に係留されているChr3遺伝子座は、0.04±0.03μm（14遺伝子座について1669段階）というはるかに低い段階距離を示すことを見出した（p<0.0001、図26）。係留されていない遺伝子座および係留されている遺伝子座の段階距離は、両方とも別々のガンマ分布によって十分に近似し得る（図27）。これらの結果は、本明細書において開示されるシステムおよび方法によって媒介される細胞内コンパートメントの係留が標的化されたポリヌクレオチドの移動性および動態を抑制することができることを示唆する。
【０１４８】
実施例7.ゲノム遺伝子座とCajal体およびPML体を含めた非膜系核内構造体との共局在
CRISPR-GOシステムがクロマチン遺伝子座と非膜系核内構造体の共局在を媒介することができるかどうかを次に試験した。Cajal体（CB）に動員するためにゲノム遺伝子座を選択した。これを行うために、PYL1をCajal体のマーカーであるコイリンと融合することによって、Cajal体標的化CRISPR-GOシステムを設計した。レンチウイルス形質導入を介して、PYL1-GFP-コイリンおよびABI-dCas9をU2OS細胞に導入した（図28）。Chr1:p36に挿入されたLacOリピートアレイを含むU2OS 2-6-3細胞において、動員効率を試験した。
【０１４９】
LacO配列を標的化するsgRNAを使用して、2日間のABA処理後に、3D-FISHを使用してLacOアレイの空間的配置を、およびGFP-コイリンによってCBの位置を可視化した（図29）。GFP-コイリン標識されたCBと共局在したLacO遺伝子座のパーセンテージは、ABA処理無しの9％（n=78）からABA処理後に64％（n=84）に増加し、LacO遺伝子座と共局在した少なくとも1つのCBを含む細胞のパーセンテージは、10％（n=68）から65％（n=77）に増加した（図30、p<0.0001）。FISHと組み合わせた免疫染色は、20時間のABA処理後に、他のCB成分（SMN、フィブリラリン、およびGemin2）もLacO遺伝子座と共局在することを示し（図31）、これは、標的化されたゲノム遺伝子座とCBのCRISPR-GO媒介性共局在を確証するものである。
【０１５０】
内在性ゲノム遺伝子座をCBに標的化するために、Cajal体標的化CRISPR-GOシステムを発現するU2OS細胞にChr3:q29標的化sgRNAを導入した。ABA処理後24時間で、Chr3遺伝子座（CRISPR-Cas9イメージングで可視化される）とCB（GFP-コイリンで可視化される）の間に有意な共局在が観察された（図32）。CBと共局在したChr3遺伝子座のパーセンテージは、ABA処理前の2％（n=149）からABA処理後の94％（n=229、p<0.0001）に増加し、Chr3遺伝子座と共局在した少なくとも1つのCBを含む細胞のパーセンテージは、6％（n=50）から96％（n=101、p<0.0001）に増加した（図33）。
【０１５１】
CRISPR-GOがクロマチン遺伝子座とPML核内構造体の共局在を媒介することができるかどうかも試験した。これを行うために、PYL1をPML体のスキャフォールドタンパク質であるPML遺伝子と融合することによって、PML体標的化CRISPR-GOシステムを設計した。内在性ゲノム遺伝子座をPML体に標的化するために、PYL1-GFP-PMLとABI-dCas9の両方を発現する細胞に、Chr3:q29標的化sgRNAを導入し、CRISPR-Cas9イメージングによってChr3遺伝子座の配置を可視化し、GFP-PMLによってPML体の位置を可視化した（図34および図35）。興味深いことに、ABA処理無しで、高いパーセンテージ（52.6％、n=300）のChr3:q29遺伝子座がPML体と共局在し、これは、天然のChr3:q29-PML体共局在を示唆する可能性がある（図35および図36）。ABA処理後に、PML体と共局在した標的Chr3遺伝子座のパーセンテージは94％（n=196、p<0.0001）に増加し、Chr3遺伝子座と共局在した少なくとも1つのPML体を含む細胞のパーセンテージは75％（n=100）から96％（n=69、p=0.0003）に増加した（図35および図36）。免疫染色によって、Chr3遺伝子座が別のPML体マーカーであるSP100と共局在することも確証された（図37）。
【０１５２】
実施例8.標的ゲノム遺伝子座とCajal体の間の迅速、誘導可能、かつ可逆的なCRISPR-GO媒介性結合
化学的誘導および除去実験を行って、CBとのCRISPR-GO媒介性クロマチン共局在の動態および可逆性を研究した。一例として、U2OS 2-6-3細胞のChr1:p36に挿入されたLacO遺伝子座を使用して、LacO遺伝子座とGFP-コイリンでマークしたCBの間の結合が迅速に生じることが観察され：ABA添加後30分以内で、CBと共局在したLacO遺伝子座のパーセンテージは2.6％（n=78）から89％（n=85、p<0.0001）に増加した（図38）。
【０１５３】
ABAで1日前処理した細胞では、ABA除去は、LacO遺伝子座からのCBの解離をもたらすことが観察された。ABA除去後、CBと共局在した標的化されたLacO遺伝子座のパーセンテージは、6時間後に、89％（n=85）から22％（n=60、p<0.0001）に減少し、24時間後に、4.6％（n=45、p<0.0001）にさらに減少した（図39）。ABA除去後6時間で、LacO共局在型GFP-コイリンを依然として保有していた細胞集団（22％）の中で、残存GFP-コイリン強度は、持続的ABA処理を受ける細胞のものよりもはるかに薄暗く（図40）、これは、ABA除去後のCBの段階的分解プロセスを示唆する可能性がある。
【０１５４】
実施例9.標的化されたクロマチン遺伝子座におけるデノボCB形成および既存のCBの再配置
標的化されたゲノム遺伝子座とのCajal体のCRISPR-GO媒介性結合の動態をさらに特徴づけるために、個々の細胞の低速度撮影顕微鏡イメージングをABA処理前後に行った。理論的に、ゲノム遺伝子座と核内構造体の間の共局在は、ゲノム遺伝子座での核内構造体のデノボ形成を通して、または既存の核内構造体へのゲノム遺伝子座の再配置を通して生じ得る。LacO-LacI係留システムを使用した以前の報告は、Cajal体は、標的化されたDNA部位でデノボで生じることを示唆する。
【０１５５】
LacO遺伝子座をCajal体に標的化するためにCRISPR-GOシステムを使用して、ABAの添加後に、迅速な（数分以内）デノボCB形成が、解析した大抵の細胞のLacO遺伝子座で観察された（図41）。例えば、ABA無しで、LacO遺伝子座において最初のGFP-コイリン蓄積がない細胞（図41、-150秒）において、ABA処理（-150秒〜0秒の間に加えた。図42）は、LacO遺伝子座にGFP-コイリンを迅速に動員し（図41、150秒）、Cajal体のデノボ形成をもたらした。LacO遺伝子座でのGFP-コイリンの蛍光強度は、ABA添加後10分以内に飽和に近づいた（図44）。
【０１５６】
興味深いことに、既存のCBをともなう標的化されたクロマチン遺伝子座の動的な再配置が、2つが最初に空間的に互いに近接してした場合に観察された。例えば、ABA処理無しで、既存のCBがLacO遺伝子座に隣接していた細胞（図45、-200秒）において、ABA処理（-200秒〜0秒の間に加えられた。図45）は、既存のCBとLacO遺伝子座の迅速な共局在をもたらし、これは、本明細書において開示されるシステムが、以前にまだ報告されていない現象である、ポリヌクレオチド（例えばゲノム遺伝子座）と細胞内コンパートメント（例えば、既存の核内構造体）の間の直接結合を媒介することもできることを示唆する。
【０１５７】
実施例10.核周辺部へのゲノム遺伝子座のCRISPR-GO媒介性再局在によって生じるレポーター遺伝子の発現の低減
以前の研究は、核周辺部へのゲノム再局在が遺伝子発現に及ぼす影響についての異なる証拠を提供する。いくつかの研究は、LacI-エメリンまたはLacI-Lap2βを使用する核周辺部へのLacOリピートの係留が隣接遺伝子の抑制を引き起こすことを示した。他の研究では、U2OS 2-6-3細胞においてLacI-ラミンB1融合タンパク質を使用して、核周辺部へのLacOアレイの再局在を示したが、隣接遺伝子の発現の明白な変化は観察されなかった。CRISPR-GOは、核周辺部への異なる染色体遺伝子座の動員の影響を試験するのがはるかに容易であるので、この疑問を研究するための別の方法を提供する。
【０１５８】
核周辺部へのLacOアレイのCRISPR-GO媒介性再配置が遺伝子発現に影響を及ぼすことができるかどうかを調べた。U2OS 2-6-3細胞のLacO遺伝子座は、CFPレポーターの発現を駆動するドキシサイクリン（Dox）で誘導可能なTRE（テトラサイクリン応答性エレメント）-CMVプロモーターの上流に位置する（図46）。ABA処理した細胞および処理していない細胞の両方における隣接するCFPレポーターの発現をフローサイトメトリーによって測定し、ABA処理した細胞は、処理していない細胞と比較してレポーター遺伝子の発現の一貫した低下（59％の低減、図46および図47）を示すことが観察された。この遺伝子抑制作用は、LacI-エメリン融合タンパク質を使用した場合の核周辺部へのLacO遺伝子座の再配置と類似していた。遺伝子抑制が標的特異的であったことを確証するための対照として、非標的化sgRNAも試験し、レポーター遺伝子の発現の低下は観察されなかった（図47）。
【０１５９】
核周辺部への内在性ゲノム遺伝子座の再配置が遺伝子発現を変化させることができるかどうかを次に試験した。Chr3、XIST、およびCXCR4遺伝子座を個々に核周辺部へ再配置し、RT-qPCRを行って、隣接遺伝子の発現（Chr3：ACAP2 & PPP1R2；CXCR4 XIST）の変化を検出した。驚いたことに、これらの遺伝子について遺伝子発現変化の証拠は見られなかった（例えば、図48のACAP2 & PPP1R2）。したがって、これは、核周辺部に隣接する遺伝子の再配置が内在性遺伝子の発現変化を引き起こすのに十分であるであるかどうかという疑問を提起し、再配置誘導性の遺伝子発現変化は遺伝子座依存的であるということは可能なままである。
【０１６０】
実施例11.CBへのゲノム遺伝子座のCRISPR-GO媒介性再局在によって生じるレポーター遺伝子の発現の低減
U2OS 2-6-3細胞株においてCRISPR-GOシステムを使用したCBへのLacO遺伝子座の共局在が隣接遺伝子の発現に影響を及ぼすのに十分であるかどうかを次に試験した（図49）。細胞をABAで2日間処理し、Doxで1日誘導し、フローサイトメトリーによってCFP発現を測定した。処理していない細胞と比較して、ABA処理した細胞においてレポーター遺伝子の発現の一貫した低下が観察された（45％の平均低減、図49および図50、p<0.0001）。この遺伝子抑制作用が標的特異的であることを確証するために、非標的化sgRNAを試験し、レポーター遺伝子の軽微であるが有意でない（p>0.05）発現の低下が観察された（図50）。
【０１６１】
CBへの内在性ゲノム遺伝子座の共局在が隣接遺伝子の発現を変化させることができるかどうかを次に試験した。CRISPR-GOシステムを使用して、CBとのChr3:q29の共局在を誘導し（図32および図33）、次いで、RT-qPCRを行って、4日間のABA処理後に隣接遺伝子の発現（Chr3：ACAP2 & PPP1R2）の変化を検出した。驚いたことに、処理していない細胞と比較して、両方の隣接遺伝子の有意な抑制が観察された。Chr3のCB標的化遺伝子座の約35kb上流に位置するACAP2は、ABA処理後に3.3倍の抑制を示し（p<0.0001、図42）、Chr3のCB標的化遺伝子座の約36kb下流に位置するPPP1R2は、7.7倍の抑制を示した（p<0.0001、図42）。sgRNAを有さない、またはPYL-GFP-コイリン成分を有さない細胞は、ACAP2とPPP1R2の遺伝子発現の変化を示さないと確証された（図43）。まとめると、これらの結果は、細胞内コンパートメント（例えば、CB）との所与のポリヌクレオチド（例えばゲノム遺伝子座）の標的化された共局在が、隣接するポリヌクレオチドの発現を抑制することができることを示す。例えば本明細書において開示されるシステムおよび方法を使用した遺伝子発現撹乱媒介の長距離の効果は、dCas9結合部位から比較的短距離の遺伝子発現で撹乱を引き起こすだけであるCRISPRiまたはCRISPRaと対照的である。提供される方法およびシステムが長距離のポリヌクレオチド発現撹乱を媒介することができるという観察は、例えば遺伝子調節の有用な新しい手段を提供し得る。
【０１６２】
実施例12.CRISPR-GO媒介性テロメア再配置によって生じる細胞表現型の変化
CRISPR-GOシステムを使用して、核コンパートメントへのテロメア再構成が細胞表現型にどのように影響を及ぼすかを研究した。試験したすべてのゲノム遺伝子座の中で、テロメアの動態が最も良く研究され、細胞周期のある特定のステージで核周辺部およびCBと結合していることが示される。ゲノム完全性に対するテロメアの重要な役割を考慮すると、核コンパートメントとのその相互作用は、機能上の密接な関係がある可能性がある。例えば、細胞周期の間、テロメアは、核膜が有糸分裂後の細胞において再びアセンブルする場合に核エンベロープに動的に係留されており、次いで、G1期の間に核の内部に移り、残りの細胞周期の間そこにとどまる。核エンベロープへのテロメアの係留および非係留のサイクルは、クロマチン構成および細胞周期／生存率に重要であり得る。
【０１６３】
このことを試験するために、CRISPR-GOシステムを使用して、細胞周期の間、テロメア非係留プロセスを破壊し、間期の間、核コンパートメントにテロメアを保持した（図51）。細胞の代謝活性を測定することによって細胞増殖を定量化するAlamar blue細胞生存率アッセイを使用して、CRISPR-GOによる核周辺部でのテロメアの維持は、処理していない細胞と比較した場合、6日間のABA処理後に、細胞生存率の有意な減少をもたらすことが分かった（図52、平均72％の低減、p<0.0001）。3日間のABA処理後に、細胞周期解析によって、核周辺部へのテロメアの係留はG0/G1期の細胞のパーセンテージを増加させ、S期およびG2/M期の細胞のパーセンテージを低減させることが示され、これは、G0/G1期停止をおそらく示唆する（図53）。図63は、核周辺部にテロメアを再配置した後にRNAシークエンシングによって遺伝子発現変化を比較するグラフを示し、核周辺部にテロメアを再配置することが、細胞生存率を低減させる、遺伝子発現の多くの変化を引き起こしたことを示す。テロメアをCBと共局在させることの影響も調べ、これによって、CRISPR-GOシステムがテロメアとCBの共局在を誘導することができることが確証され、ABAで2日間処理した細胞と処理していない細胞を比較した場合に、共局在が細胞生存率を増加させる（平均50％の増加、図54〜56）ことを発見した。図64は、テロメアとCajal体を共局所させた後にRNAシークエンシングによって遺伝子発現変化を比較するグラフを示し、テロメアとCajal体を共局在させることが、細胞生存率を変える、遺伝子発現の多くの変化を引き起こしたことを示す。対照として、ABA処理単独は、U2OS細胞の細胞生存率に影響を与えない（図57）。全体的に見て、これらの観察は、様々な細胞内コンパートメント（例えば、核コンパートメント）に対するポリヌクレオチド（例えば、テロメア）の空間的構成が細胞機能において重要な役割を果たすことを示唆する。
【０１６４】
実施例13.CRISPR-GOシステムを使用した、細胞骨格に沿ったmRNAの再配置
キネシン、ダイニン、およびミオシンなどのモータータンパク質を用いて、細胞骨格に沿ったmRNAの再配置にCRISPR-GOシステムを使用することができる。微小管のプラス端（MT+）にmRNAを再配置するために、カーゴ結合尾部ドメインを有さないPYL1-EGFPでタグされたキネシン-1重鎖（KIF5B）を発現するプラスミド構築することができる（Kapitein et al., 2010）。微小管のマイナス端（MT-）にmRNAを再配置するために、ダイニン媒介性カーゴ輸送を誘導する、PYL1-EGFPでタグされたBicaudal D2のN末端部（BICDN）を発現するプラスミドを構築することができる（Hoogenraad et al., 2003）。アクチンフィラメント（AF）に沿ってmRNAを再配置するために、PYL1-EGFPでタグされたミオシン5a（MYO5A）を発現するプラスミドを構築することができる。MYO5Aは3クラスのVミオシンの中で最も良く特徴づけられており、反矢じり端に向かった、アクチンフィラメントに沿ったmRNAの輸送で役割を果たす（Gross et al., 2007；McCaffrey and Lindsay, 2012）。ABI-BFP-dCas13を発現するプラスミドおよびPYL1-EGFP-KIF5/BICDN/MYO5Aを発現するプラスミドをMS2-MCP（MS2結合タンパク質）細胞に形質導入することができる。続いて、BFPおよびEGFP陽性細胞について細胞を選別して、MS2-MCP-CRISPR-GO-MT+/MT-/AF安定細胞株を作製する。MS2でタグされたRNAを標的化するgRNAを発現するレンチウイルスを安定な細胞に形質導入することができ、gRNA陽性細胞をピューロマイシンで選択する。選択した細胞をABAで処理することができ、生細胞蛍光イメージングを行って、標的化されたRNAの位置を示すmCherryの局在を追跡することができる。
【０１６５】
実施例14.CRISPR-GOシステムを使用した、DNA修復を促進しかつ遺伝子編集の結果を改善するための核内構造体の形成
CRISPR-GOシステムを使用して、DNA修復を促進しかつ改善された遺伝子編集の結果をもたらす核内構造体を形成することができる。図65A〜65Cは、CRISPR媒介性遺伝子編集後の53BP1巣の形成を示す。これらのデータは、CRISPR遺伝子編集が動員するDNA修復タンパク質が核内構造体を形成して、CRISPR媒介性遺伝子編集後の二本鎖切断（DSB）の回復およびDNA修復を促進することを実証する。
【０１６６】
実施例15.プラスミドの収集および構築
pHR-SFFV-PYL1-sfGFP-エメリンは、pHR-SFFV-scFv-sfGFPプラスミド（Tanenbaum et al., 2014）のscFv配列をPYL1と置き換え、sfGFPの後にエメリンを挿入することによってクローニングした。エメリン（EMD遺伝子にコードされる）は、Eric Schirmer（Zuleger et al., 2011)からの贈り物であるエメリンpEGFP-C1（637）（Addgeneプラスミド61993）からクローニングした。pHR-SFFV-PYL1-sfGFP-コイリンは、pHR-SFFV-PYL1-sfGFP-エメリンプラスミドのエメリンをコイリンと置き換えることによってクローニングした。コイリンは、Greg Matera博士からの贈り物であるpEGFP-コイリン（Addgeneプラスミド36906）からクローニングした。pHR-PGK-PYL1-sfGFP-コイリンは、pHR-SFFV-PYL1-sfGFP-コイリンプラスミドのSFFVプロモーターをPGKプロモーターと置き換えることによってクローニングした。pHR-TRE3G-PYL1-sfGFP-PMLまたはpHR-TRE3G-PYL1-sfGFP-HP1aは、PGKプロモーターをTRE3Gプロモーターと置き換え、コイリンをpHR-PGK-PYL1-sfGFP-コイリンプラスミドのPMLまたはHP1aと置き換えることによってクローニングした。PMLは、Gerardo Ferbeyre（Vernier et al., 2011）からの贈り物であるpLPC-Flag-PML-IV（addgeneプラスミド62804）からクローニングした。HP1aは、Tom Misteli（Cheutin et al., 2003）からの贈り物であるGFP-HP1a（Addgeneプラスミド17652）からクローニングした。
【０１６７】
pHR-SFFV-ABI-tagBFP-dCas9は以前に記載された（Gao et al., 2016）。pHR-SFFV-ABI-tagBFP-dCas9は、SFFVプロモーターをpHR-SFFV-ABI-tagBFP-dCas9のPGKプロモーターと置き換えることによってクローニングした。pHR-PGK-ABI-dCas9-P2A-CherryまたはpHR-PGK-ABI-dCas9-P2A-Puroは、SFFVをPGKプロモーターと置き換え、tagBFPを削除し、dCas9 pHR-SFFV-ABI-tagBFP-dCas9にP2A-mCherryまたはP2A-Puroを加えることによってクローニングした。ABIおよびPYL1は、StanfordのJ. Crabtree博士からの贈り物であるAddgeneプラスミド38247（Liang et al., 2011）からクローニングした。
【０１６８】
pHR-TRE3G-dCas9-HaloTagは、SunTag10-P2A-mCherryをプラスミドpHR-TRE3G-dCas9-HA-SunTag10-P2A-mCherry（Tanenbaum et al., 2014）のHaloTagと置き換えることによってクローニングした。pHR-TRE3G-dCas9-EGFP-HaloTagは、pHR-TRE3G-dCas9-EGFP（Chen et al., 2013）のEGFPの後にHaloTagを挿入することによってクローニングした。pHR-SFFV-DHFR-mCherry-エメリンは、pHR-SFFV-PYL1-sfGFP-エメリンのPYL1-sfGFP配列をmCherry-DHFRと置き換えることによってクローニングした。HaloTagおよびmCherry-DHFRは、David Chenoweth & Michael Lampson（Ballister et al., 2014）からの贈り物であるpERB221（Addgeneプラスミド61502）からクローニングした。
【０１６９】
すべてのsgRNAは、P2A-mCherryを除去した後のpHR-U6-sgTel-CMV-puro-P2A-mCherryベクター（Chen et al, 2013）にクローニングした。TRF1-mCherryは、mCherryの代わりにpHR-U6-sgTel-CMV-puro-P2A-mCherryベクターにクローニングした。TRF1は、Titia de Lange博士からの贈り物であるpLPC-NFLAG TRF1（Smogorzewska and de Lange, 2002）（Addgeneプラスミド#16058）からクローニングした。
【０１７０】
実施例16.細胞培養および安定細胞株の生成
U2OS（ヒト骨肉腫上皮、女性）細胞およびHeLa細胞（女性）は、Tetシステムで認められたFBS（Life Technologies）10％に入れたGlutaMAX（Life Technologies）を含むDMEMで培養した。U2OS 2-6-3細胞株は、Cold Spring Harbor LaboratoryのDavid L. Spector博士からの贈り物であり、同じ条件下で培養した（Kumaran and Spector, 2008）。すべての細胞は、加湿インキュベーター中で37℃および5％CO2で培養した。
【０１７１】
内在性遺伝子座を核コンパートメントに標的化する安定なCRISPR-GO細胞株を作製するために、U2OS細胞を24ウェルプレートに1日前にプレーティングして、50％培養密度に到達させ、次いで、レンチウイルス混合物によって形質導入した。安定細胞株を作製するために、PYL1-sfGFP-エメリン、PYL1-sfGFP-コイリン、PYL1-sfGFP-PML、またはPYL1-sfGFP-HP1a、およびABI-tagBFP-dCas9を発現するレンチウイルスによって形質導入した細胞を、Stanford共有FACS施設で蛍光標識細胞分取（FACS）によって、BFPおよびGFP陽性の細胞について選別した。核周辺部の係留について、高いBFPおよびGFP発現レベルの細胞を選択した。他の核コンパートメントの係留について、高いBFPおよびGFP発現レベルの細胞を選択した。標的化sgRNAを発現するレンチウイルスでCRISPR-GO細胞株を形質導入した後に、2μg/mlのピューロマイシンでsgRNA陽性細胞を選択した。
【０１７２】
U2OS 2-6-3細胞株（Kumaran and Spector, 2008）においてLacO遺伝子座を標的化するために、PYL1-sfGFP-エメリンまたはPYL1-sfGFP-コイリンおよびABI-dCas9-P2A-mCherryを含むレンチウイルス混合物によって細胞を形質導入した。安定細胞株を作製するために、PYL1-sfGFP-コイリンおよびABI-dCas9-P2A-mCherryを含む細胞をGFPおよびmCherry陽性細胞について選別した。2μg/mlのピューロマイシンでSgRNA陽性細胞を選択した。
【０１７３】
CRISPRイメージングによってLacO核周辺部再配置の効果を定量化するために、ABI-dCas9-P2A-mCherryの代わりにABI-dCas9-P2A-PuroをコードするレンチウイルスをU2OS 2-6-3細胞に形質導入し、これを2μg/mlのピューロマイシンで選択した。
【０１７４】
実施例17.CRISPR-GOシステムによって標的化されるゲノム遺伝子座
U2OS細胞の異なる染色体領域を標的化するCRISPR-GOシステムの効果を試験した。反復性領域と非反復性遺伝子の両方を試験した（図7、図14、および図17）。内在性の反復性領域としては、Chr3.q29：195478324〜195506987；CH13.q34：112,277485〜112,319169；Ch7:q36.3：158,122,661〜158,135,328；ChX p21.2：30,806,671〜30,824,818、およびテロメアが挙げられる。U2OS 2-6-3細胞のChr1.p36領域に挿入された合成LacOリピートも標的化のために使用した。反復性領域については、領域内の複数の反復を標的化する単一sgRNA設計を使用した。（表1）。非反復性遺伝子としては、Chr2.q22.1に位置するCXCR4、ChrX.q13.2に位置するXIST、およびChr10.q23.31に位置するPTENが挙げられる。各非反復性遺伝子を標的化するために、その遺伝子本体および上流領域を標的化する複数のsgRNAを設計した（表2）。
【０１７５】
（表１）反復性領域を標的化するsgRNA
2021534205.tif 000004
【０１７６】
（表２）非反復性領域を標的化するsgRNA
2021534205.tif 000005
【０１７７】
実施例18.レンチウイルスの産生
レンチウイルスを産生するために、HEK293T細胞に関心対象のpHRコンストラクトを一過的にトランスフェクトし、プラスミドpCMV-dR8.91およびPMD2.Gをパッケージングした。0.45μmのフィルターを通して上清を濾過することによって、トランスフェクションから72時間後にレンチウイルスを収集した。必要な場合、ウイルス上清を4℃で一晩Lenti-X濃縮器を使用して濃縮することができ、1500gで、4℃で30分間遠心分離して、ウイルスペレットを収集することができる。ペレットを冷却培養培地に懸濁し、細胞に直接加えるか、または-80℃で凍結する。
【０１７８】
実施例19.CRISPRイメージングおよびFISHによるゲノム遺伝子座の可視化
生細胞において、Chr3、Chr13、およびLacO遺伝子座の局在を可視化するために、CRISPRイメージングを行った（図5）。生細胞CRISPRイメージングのために、ibidiの24ウェルマイクロプレート（Ibidi.inc）中で、CRISPR-GO成分を発現する安定細胞株にdCas9-HaloTagおよび標的化sgRNAをコードするレンチウイルスを形質導入した。標的化されたゲノム遺伝子座は、dCas9-HaloTagによって標識し、これを、培養培地中で、0.1〜0.5μMのJF549-HaloTagリガンドによって37℃で15分間染色する。染色後、培養培地で細胞を2回洗浄し、次いで、顕微鏡観察の間、フェノールレッドを含まない培養培地中でこの細胞をインキュベートした。JF549-HaloTagは、Janelia Research CampusのLuke D. Lavis博士からの贈り物であった（Grimm et al., 2015）。テロメア遺伝子座は、テロメア結合タンパク質であるTRF1-mCherryの発現によって、生細胞において標識される。
【０１７９】
他のゲノム遺伝子座は、固定細胞においてDNA FISHによって標識する。取外し可能な12ウェルシリコーンチャンバーを有するibidiチャンバースライド中で細胞を増殖させ、この細胞を4％PFAで20分間固定した。記載されたFISHプロトコール（Takei et al., 2017）に従って合成蛍光ヌクレオチドプローブ（Integrated DNA Technologies Redwood City、CA）を使用して、LacO、Chr7、およびChrX遺伝子座を標識した。LacO遺伝子座は、Alexa Fluor 647で標識された10nM濃度のFISHプローブ
2021534205.tif 000006
で標識した。Chr7遺伝子座は、Cy3標識された200nMのFISHプローブ
2021534205.tif 000007
によって標識し、ChrX遺伝子座は、200nMの
2021534205.tif 000008
によって標識した。CXCR4 FISHプローブはEmpire Genomicsから購入した。PTENおよびXISTのFISHプローブはCell Line Geneticsから購入した。FISHは、小売業者のプロトコールに従って行った。
【０１８０】
実施例20.核内構造体マーカーの免疫染色
Cajal体マーカーと標的化されたLacO遺伝子座の共局在を検出するために、0日目に、低レベルのPYL1-sfGFP-コイリンを発現するU2OS 2-6-3細胞にPGK-ABI-dCas9-P2A-PuroおよびsgLacOをコードするレンチウイルスをトランスフェクトし、この細胞を、1日目に、ピューロマイシンおよび3mM ABAで処理し、2日目に、20時間のABA処理後に固定した。FISHを固定した試料で行って、Alexa Fluor 647で標識されたFISHプローブを使用してLacO遺伝子座を検出し、次いで、マウスモノクローナル抗SMN、抗フィブリラリン、および抗Gemin2抗体、ならびにロバ抗マウスAlex Fluor 594二次抗体を使用して、免疫染色を行った。
【０１８１】
PML体マーカーと標的化されたChr3遺伝子座の共局在を検出するために、0日目に、PYL1-sfGFP-コイリンおよびPGK-ABI-dCas9を発現するU2OS細胞にdCas9-HaloTag（CRISPRイメージング用）およびsgChr3をコードするレンチウイルスをトランスフェクトし、この細胞を、1日目に、ピューロマイシンおよび3mM ABAで処理し、3日目に、JF549-HaloTagによって染色し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）中に固定した。ウサギポリクローナル抗SP100、およびロバ抗ウサギAlex Fluor 647二次抗体を用いて、固定した試料で免疫染色を行った。
【０１８２】
免疫染色のために、固定した試料を透過処理緩衝液（PBS、1％Triton-X100）中で15分間透過処理し、これを、ブロッキング緩衝液（PBS、0.3％Triton-X100、5％ロバ正常血清）中で1時間ブロッキングし、ブロッキング緩衝液中で希釈した一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートし、PBS中で3回洗浄し、次いで、二次抗体とともに室温で1〜2時間インキュベートし、PBS中で4回洗浄した。
【０１８３】
実施例21.化学的誘導および逆転実験
再局在実験のために、イメージングまたは固定の前に、化学的に誘導可能な再局在システムおよびsgRNAを含むU2OS細胞を3mMのアブシジン酸（ABA、Sigma-Aldrich、A1049）によって2日間処理する。
【０１８４】
核周辺部にChr3を標的化するタイムコース化学的誘導実験のために、CRISPR-GOとCRISPRイメージングシステムとChr3を標的化するsgRNAとを含むU2OS細胞を3mM ABA有りまたは無しで処理し、JF549-HaloTagによって染色し、異なる時点で固定した。タイムコース逆転実験のために、Chr3標的化U2OS細胞を3mM ABAで2日間前処理し、5回洗浄し、ABAを含まない培地に移した。細胞をCRISPRイメージングのためにJF549-HaloTagリガンドによって染色し、異なる時点で、4％パラホルムアルデヒド中で20分間この細胞を固定した。
【０１８５】
Cajal体にLacOを標的化するタイムコース化学的誘導実験のために、0日目に、低レベルのPYL1-sfGFP-コイリンを発現するU2OS 2-6-3細胞にPGK-ABI-BFP-dCas9およびsgLacOをコードするレンチウイルスをトランスフェクトし、1日目にピューロマイシンで処理し、2日目に3mM ABA有りまたは無しで処理し、および30分のABA処理後に固定した。タイムコース逆転実験のために、細胞を3mM ABAで2日間前処理し、5回洗浄し、ABAを含まない培地に移した。異なる時点で、4％パラホルムアルデヒド中で20分間細胞を固定した。
【０１８６】
実施例22.細胞周期の同調化
ゲノム再局在の有糸分裂依存的作用を精査するために、CRISPR-GOとCRISPRイメージングシステムとChr3を標的化するsgRNAとを含むU2OS細胞を本実験に使用した。3日目に、細胞を培地中の0.5％FBSで2日間飢餓させた。1日目に、細胞を10％FBSを含む通常の増殖培地に移し、G1/S期遮断のために2mMヒドロキシ尿素（HU）で1日処理した。0日目に、HU処理を維持しながら、細胞をABA有りまたは無しで処理した。対照細胞は、同じ方法であるがHU無しで処理した。細胞をCRISPRイメージングのためにJF549-HaloTagによって染色し、ABA処理から24時間または48時間後に4％パラホルムアルデヒド中でこの細胞を固定した。
【０１８７】
実施例23.顕微鏡観察
図22を除いては、すべての顕微鏡観察は、100×PLAN APO油対物レンズ（NA=1.49）、60×PLAN APO油対物レンズ（NA=1.40）または60×PLAN APO IR水対物レンズ（NA=1.27）、Andor iXon Ultra-897 EM-CCDカメラ、ならびに405nm、488nm、561nm、および642nmのレーザーを備えたNikon TiE倒立共焦点顕微鏡で行った。画像は、Zスタックが0.2μmまたは0.4μm段階の低速度撮影顕微鏡によって、NIS Elementsバージョン4.60ソフトウェアを使用して撮った。生細胞イメージングのために、加湿チャンバー中で37℃および5％CO2で細胞を維持した。
【０１８８】
図22に示す長期の生細胞イメージングについては、顕微鏡観察は、63×HC PLAN APO油対物レンズ（NA=1.40）、Leica DFC9000 CTカメラおよびLumoncor SOLA SM II 405光源を備えたLeica DMI8倒立顕微鏡で行った。画像は、GFPおよびTXRフィルターキューブを使用して、20時間にわたって30分ごとに、低速度撮影顕微鏡によってLAS Xソフトウェアを使用して撮った。イメージングの間、加湿チャンバー（Okolab Cage incubation system）中で37℃および5％CO2で細胞を維持した。
【０１８９】
個々の細胞におけるクロマチン-Cajal体結合の動態を可視化するために（図38〜41、図44、および図45）、0日目に、低レベルのPYL1-sfGFP-コイリンを発現するU2OS 2-6-3細胞にPGK-ABI-BFP-dCas9およびsgLacOをコードするレンチウイルスをトランスフェクトし、1日目にピューロマイシンで処理し、ibidiの96ウェルuプレートに播種した。各ウェルを共焦点顕微鏡下でイメージングして、選択された細胞において、ABI-BFP-dCas9で標識されたLacO遺伝子座に焦点を合わせた。比較のために、ABA処理前に画像を取得した。共焦点顕微鏡下で試料を動かすことなく、10倍のABAを含む培養培地をイメージングウェルに加えて、1mM ABAの終濃度にし、次いで、以前に焦点を合わせたLacO遺伝子座を含む同じ細胞を、ABAを加えた後直ちにイメージングした。ABA添加後に撮った最初の画像をt=0とし、それに応じて、すべての他の画像を取得時間によって整列させた。
【０１９０】
実施例24.イメージング処理およびデータ解析
画像処理は、Fiji（image J）（Schindelin et al., 2012）またはMetaMorph（Molecular devices、CA）で行った。標識されたゲノム遺伝子座の最大蛍光を示す単一顕微鏡平面、または最大遺伝子座蛍光を示す2つ／3つの隣接するZ平面の平均を本明細書の図面に示す。いくつかの画像は、Fijiの「スムーズ」機能を使用して処理して、可視化のためだけにノイズを低減させた。
【０１９１】
ラインスキャンをFijiの「解析／プロットプロファイル」機能を使用して行い、Excelで解析し、GraphPad Prism（Mac OS用バージョン7.00、GraphPad Software、La Jolla California USA、www.graphpad.com）でプロットした。ラインに沿った各ポイントの蛍光強度をラインに沿った最大（=1）および最小（=0）蛍光強度に対して正規化した。
【０１９２】
実施例25.ゲノム再配置イベントの定量化
U2OS生細胞における周辺部動員効果を決定するために、Chr3、Chr13、およびChr1/LacO遺伝子座をCRISPRイメージングによって標識し、テロメアをTRF1-mCherryによって標識し、一方で、核膜をPYL1-sfGFP-エメリンによって標識する。共焦点平面のZ-スタックをスキャンした後、標識された各遺伝子座の位置をスライスビューア（NIS element viewer）で見て、XY、XZ、およびYZ平面において、その位置を決定する。いかなる遺伝子座も二重カウンすることなく、遺伝子座を以下の3つのカテゴリーにカテゴリー化した：XY、YZおよびYZ平面においてPYL1-GFP-エメリンと共局在する核周辺部に直接位置する遺伝子座、PYL1-GFP-エメリンと共局在しない遺伝子座、ならびに核周辺部ではなく内部のPYL1-GFP-エメリンと共局在する遺伝子座（まれなケース）。個々の細胞のそれぞれについて、各カテゴリーの遺伝子座の数を記録した。核エンベロープでPYL1-GFP-エメリンと共局在する第1のカテゴリーの遺伝子座のみ、核周辺部に位置する遺伝子座としてカウントした。少なくとも1つの核周辺部に位置する遺伝子座を含む細胞を定量化した。
【０１９３】
固定したU2OS細胞で周辺部動員効果を決定するために（例えば、Chr7、ChrX、PTEN、CXCR4、XIST）、標的化されたゲノム遺伝子座をFISHによって標識し、核をDAPIにより染色する。共焦点平面のZ-スタックをスキャンした後、標識された各遺伝子座の位置を3D空間で見て、XY、XZ、およびYZ平面におけるその位置を決定する。3D空間で核（DAPI）のエッジに位置するゲノム遺伝子座を周辺部に位置する遺伝子座としてカテゴリー化する。そうでなければ、これは、内部に位置する遺伝子座とみなされる。個々の細胞のそれぞれについて、各カテゴリーの遺伝子座の数を記録した。少なくとも1つの核周辺部に位置する遺伝子座を含む細胞も定量化もした。
【０１９４】
固定したU2OS 2-6-3細胞においてCajal体共局在効果を決定するために、標的化されたLacO遺伝子座をFISHによって標識し、核をHoechst 33342によって染色し、Cajal体をPYL1-GFP-コイリンによって標識した。共焦点平面のZ-スタックをスキャンした後、3D空間における各LacO遺伝子座の位置を特定した。二重カウントすることなく、遺伝子座を以下の2つのカテゴリーにカテゴリー化した：PYL1-GFP-コイリンと共局在する遺伝子座、およびPYL1-GFP-コイリンと共局在しない遺伝子座。個々の細胞のそれぞれについて、各カテゴリーの遺伝子座の数を記録した。少なくとも1つのCajal体共局在型遺伝子座を含む細胞も定量化した。
【０１９５】
実施例26.フローサイトメトリー解析を使用した蛍光アッセイ
CFP-SKL発現の定量化のために、ABI-dCas9-P2A-mCherryおよびPYL1-sfGFP-エメリンまたはPYL1-sfGFP-コイリンを含むU2OS 2-6-3細胞にlacO遺伝子座を標的化するsgRNAまたは非標的化sgRNAを形質導入し、3mMのABAで2日間処理し、次いで、50ng/mlのドキシサイクリンで40時間（核周辺部の係留）または24時間（Cajal体の係留）誘導した。処理後、U2OS 2-6-3細胞を0.25％トリプシンEDTA（Life Technologies）を使用して解離させ、405nm、488nm、および561nmのレーザーを使用して、CytoFlex S（Beckman Coulter Life Sciences）でフローサイトメトリーによって解析した。各試料について、少なくとも8,000個の細胞を解析した。陽性のdCas9（mCherry）およびエメリン（GFP）発現について細胞をゲートした。405nmのレーザーおよび450/45フィルターを使用して、CFP-SKL蛍光を検出した。相対的蛍光を定量化するために、未処理（DoxおよびABA無し）細胞の平均全蛍を0に設定し、一方で、ドキシサイクリン誘導性細胞（Doxのみ有り）の平均全蛍光を1に設定する。3つの独立した実験における技術的反復を報告する。
【０１９６】
実施例27.内在性遺伝子発現に対するリアルタイムRT-PCR
リアルタイムRT-PCRを行って、ゲノム再構成後に、標的化されたChr3遺伝子座に隣接するPPP1R2およびACAP2遺伝子の発現変化を決定した。各試料について、RNeasy Plusミニキット（Qiagenカタログ番号74134）を使用して全RNAを単離し、製造業者のプロトコールに従ってiScriptcDNA合成キット（BioRad、カタログ番号1708890）を使用して、cDNAを合成した。定量的PCRは、SYBR Greenマスターミックス（BioRad）を用いてPrimePCRアッセイを使用して行い、製造者の指示書に従って、Biorad CFX384リアルタイムシステム（C1000 Touch Thermal Cycler）で実施した。Cq値を使用して、遺伝子発現を定量化した。PPP1R2およびACAP2遺伝子の相対的発現をGAPDH対照に対して正規化した。相対的mRNA発現レベルを計算するために、非ABA処理試料の平均値を1と設定することによって、各処理の相対的発現を正規化した。3実験の反復を報告する。
【０１９７】
実施例28.細胞生存率アッセイ
細胞生存率アッセイは、細胞の代謝活性を測定するAlamar blue細胞生存率試薬（ThermoFisher Scientific）を使用して行った。各条件について、ABA有りおよび無しで処理した100μlの細胞を同じ96ウェルプレート中に等濃度（500〜1000細胞／ウェル）で播種した。検出時に、10μlのAlamar blue試薬を各ウェルに加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした。その後、540nmの励起波長および585nmの発光波長を使用して、Synergy H1マイクロプレートリーダー（Biotek Inc.）中で蛍光強度を測定した。100μl培養培地（ABA有りおよび無し）のみを含むウェルの平均蛍光強度をブランクとして使用した。各ウェルについて、相対的蛍光強度を、その生の蛍光強度からバックグラウンド（ブランクウェルの平均強度）を引くことによって計算する。相対的細胞生存率を計算するために、非ABA処理ウェルの平均値を1と設定することによって、各ウェルの相対的蛍光強度を正規化した。3実験の反復を報告する。
【０１９８】
実施例29.細胞周期サイトメトリー解析
テロメアの核周辺部係留が細胞周期の進行にどのように影響を及ぼすかを定量化するために、核周辺部係留システムを含むU2OS細胞をsgTelomereおよびTRF1-mCherryをコードするレンチウイルス混合物または非標的化sgRNAをコードするレンチウイルスで処理した。テロメアの係留は、2日間のABA処理後に顕微鏡観察によって確証した。3日間のABA処理後、対照および処理細胞を0.25％トリプシンEDTAを使用して解離し、1:1000希釈のHoechst 33342で1時間染色し、405nmのレーザーを使用して、CytoFlex S（Beckman Coulter Life Sciences）でフローサイトメトリーによって解析した。各試料について、少なくとも20,000個の細胞を解析した。FlowJOを使用して、細胞周期解析を行った。
【０１９９】
実施例30.ヒト反復性配列クラスターの特定
ソフトウェアTandem Repeats Finder（Benson, 1999）を使用して、ヒトゲノム（hg38）から、14ヌクレオチド以上の配列のすべてのタンデムリピートを特定した。10以上の同一のタンデムリピートを含む領域は、「反復性配列クラスター」と定義された。これらの反復性配列クラスターは、各ヒト染色体に対するものであった。BEDToolスイートを使用して、反復性配列クラスターと遺伝子の間の距離を計算した。
【０２００】
実施例31.内在性遺伝子座の短期間の動的追跡
FijiのTrackMateプラグイン（Tinevez et al., 2017）を使用して、ゲノム遺伝子座の追跡を行った。ゲノム遺伝子座を追跡するために、推定ブロブ直径を0.5〜1μmの間に設定した。リンキング最大距離（Linking max distance）を2μmに設定し、およびギャップクロージング（gap closing）距離を3μmに設定し、ギャップクロージング最大フレームを2に設定した。異なる時点（t）での各遺伝子座の位置（xt、yt）を測定し、Excelで解析し、GraphPad Prism 7でプロットした。移動段階（dx、dy）は、前の時点の位置を新しい位置から引くこと、すなわち、dxt=xt-xt-1およびdyt=yt-yt-1（式中、（xt、yt）は時間tの遺伝子座の位置であり、一方で、（xt-1、yt-1）は前の時点（t-1）の遺伝子座の位置である）によって計算した。
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は、遺伝子座が前の時点のその位置からどのくらい離れるかとして計算される。
【０２０１】
段階距離を比較するために、19個の内部局在型Chr3遺伝子座の1696段階距離および14個の周辺部局在型Chr3遺伝子座の1669段階距離を解析した。不等分散を用いた両側t検定を行った。Excelのヒストグラム関数を使用してヒストグラムを解析し、これをGraphPad Prism 7でプロットした。
【０２０２】
実施例32.統計解析
再局在効果の定量化のために（図8、図9、図16、図18〜21、図30、図33、図36、図38、および図39）、GraphPadのフィッシャーの正確確率検定を使用してp値を計算し、エラーバーは、ベルヌーイ分布に従って計算した平均値の標準誤差（SEM）を示す。カウントした遺伝子座／細胞の数を各図の下部に列挙する。図26、図42、図43、図46〜51、図53、図56、および図57については、Excelで不等分散を用いる両側t検定を使用してp値を計算し、エラーバーは標準偏差を示す。3実験における2連物を解析した。図27については、適合ガンマ分布は、Rパッケージfitdistrplusを使用して、最大尤度によって適合させ、コルモゴロフ−スミルノフ検定を使用して適合度を検定した（周辺部遺伝子座についてp=0.06&内部遺伝子座についてp=0.77）。
【０２０３】
V.参考文献
2021534205.tif 000010
2021534205.tif 000011
2021534205.tif 000012
2021534205.tif 000013
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2021534205.tif 000015
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【０２０４】
VI.例示的態様
本開示の主題に従って提供される例示的態様としては、これらに限定されないが、特許請求の範囲および以下の態様が挙げられる。
【０２０５】
1．細胞のコンパートメント中の標的ポリヌクレオチドの空間的および時間的配置を制御するためのシステムであって、
(a)第1の二量体化ドメインに連結されているコンパートメント特異的タンパク質；および
(b)標的ポリヌクレオチドを標的にするアクチュエータ部分であって、第1の二量体化ドメインとアセンブルして二量体となることができる第2の二量体化ドメインに連結されている、アクチュエータ部分
を含む、前記システム。
2．前記標的ポリヌクレオチドがゲノムDNAを含む、態様1のシステム。
3．前記標的ポリヌクレオチドがRNAを含む、態様1のシステム。
4．前記アクチュエータ部分がCasタンパク質を含み、かつ
前記システムが、
(c)前記アクチュエータ部分と複合体を形成しかつ前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ガイドRNA
をさらに含む、
態様1〜3のいずれか一つのシステム。
5．前記アクチュエータ部分がRNA結合タンパク質を含み、かつ
前記システムが、
(c)前記アクチュエータ部分と複合体を形成しかつ前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ガイドRNA
をさらに含み、任意で、
(d)前記ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質
をさらに含む、
態様1〜3のいずれか一つのシステム。
6．前記Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠いている、態様4または5のシステム。
7．前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質、Cas12タンパク質、Cas13タンパク質、CasXタンパク質、またはCasYタンパク質である、態様4〜6のいずれか一つのシステム。
8．前記Cas12タンパク質が、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、およびCas12eからなる群より選択される、態様7のシステム。
9．前記Cas13タンパク質が、Cas13a、Cas13b、Cas13c、およびCas13dからなる群より選択される、態様7のシステム。
10．前記RNA結合タンパク質がADAR1またはADAR2であり、かつ前記ガイドRNAがADARリクルーティングRNA（arRNA）を含む、態様5のシステム。
11．前記アクチュエータ部分が、前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする結合タンパク質を含み、かつ該結合タンパク質がジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALEヌクレアーゼである、態様1〜3のいずれか一つのシステム。
12．前記アクチュエータ部分が、ガイドポリヌクレオチドと複合体を形成しているアルゴノートタンパク質を含み、該ガイドポリヌクレオチドがガイドRNAまたはガイドDNAであり、かつ該ガイドポリヌクレオチドが前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、態様1〜3のいずれか一つのシステム。
13．前記コンパートメント特異的タンパク質が、前記コンパートメントに内在性のタンパク質、調節タンパク質、モータータンパク質、DNA修復タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、態様1〜12のいずれか一つのシステム。
14．前記コンパートメントが核コンパートメントである、態様1〜13のいずれか一つのシステム。
15．前記核コンパートメントが核内膜を含む、態様14のシステム。
16．前記コンパートメント特異的タンパク質がエメリン、Lap2ベータ、ラミンB、またはこれらの組み合わせを含む、態様15のシステム。
17．前記核コンパートメントがCajal体を含む、態様14のシステム。
18．前記コンパートメント特異的タンパク質がコイリン、SMN、Gemin3、SmD1、SmE、またはこれらの組み合わせを含む、態様17のシステム。
19．前記核コンパートメントが核スペックルを含む、態様14のシステム。
20．前記コンパートメント特異的タンパク質がSC35を含む、態様19のシステム。
21．前記核コンパートメントがPML体を含む、態様14のシステム。
22．前記コンパートメント特異的タンパク質がPML、SP100、またはこれらの組み合わせを含む、態様21のシステム。
23．前記核コンパートメントが核コア複合体を含む、態様14のシステム。
24．前記コンパートメント特異的タンパク質がNup50、Nup98、Nup53、Nup153、Nup62、またはこれらの組み合わせを含む、態様23のシステム。
25．前記核コンパートメントが核小体を含む、態様14のシステム。
26．前記コンパートメント特異的タンパク質が核小体タンパク質B23を含む、態様25のシステム。
27．前記核コンパートメントがヘテロクロマチンを含む、態様14のシステム。
28．前記コンパートメント特異的タンパク質がHP1、KRAB-ZFP、これらの切断型、またはこれらの組み合わせを含む、態様27のシステム。
29．前記核コンパートメントが核内構造体（nuclear body）を含む、態様14のシステム。
30．前記コンパートメント特異的タンパク質が53BP1、Rad51、またはこれらの組み合わせを含む、態様29のシステム。
31．前記コンパートメントが細胞質コンパートメントである、態様1〜13のいずれか一つのシステム。
32．前記細胞質コンパートメントが細胞骨格成分を含む、態様31のシステム。
33．前記コンパートメント特異的タンパク質がキネシン、ダイニン、ミオシン、またはこれらの組み合わせを含む、態様32のシステム。
34．前記コンパートメント特異的タンパク質が蛍光タンパク質にさらに連結されている、態様1〜33のいずれか一つのシステム。
35．前記アクチュエータ部分が蛍光タンパク質にさらに連結されている、態様1〜34のいずれか一つのシステム。
36．前記第1の二量体化ドメインおよび前記第2の二量体化ドメインが、リガンド、光、または酵素の存在下でのみアセンブルして二量体を形成する、態様1〜35のいずれか一つのシステム。
37．前記第1の二量体化ドメインおよび前記第2の二量体化ドメインが、前記リガンドの存在下で前記リガンドにそれぞれ結合する、態様36のシステム。
38．前記リガンドが化学的誘導物質またはオプトジェネティック誘導物質である、態様36または37のシステム。
39．細胞のコンパートメント中の標的ポリヌクレオチドの空間的および時間的配置を制御する方法であって、
(a)第1の二量体化ドメインに連結されているコンパートメント特異的タンパク質を提供する工程；
(b)第2の二量体化ドメインに連結されているアクチュエータ部分を提供する工程；
(c)該アクチュエータ部分と該標的ポリヌクレオチドとを含む複合体を形成する工程；ならびに
(d)該第1の二量体化ドメインと該第2の二量体化ドメインとを含む二量体をアセンブルして、それによって、該コンパートメント中に該標的ポリヌクレオチドを配置する工程
を含む、前記方法。
40．前記標的ポリヌクレオチドが前記コンパートメントに内在性ではない、態様39の方法。
41．前記標的ポリヌクレオチドの配置が、前記標的ポリヌクレオチドの発現を調節することを含む、態様39または40の方法。
42．前記調節が、前記標的ポリヌクレオチドの発現を低下させることを含む、態様41の方法。
43．前記調節が、前記標的ポリヌクレオチドの発現を増大させることを含む、態様41の方法。
44．前記標的ポリヌクレオチドの配置が、前記コンパートメントに内在性である1種または複数種のさらなるポリヌクレオチドの発現を調節することをさらに含む、態様39〜43のいずれか一つの方法。
45．前記標的ポリヌクレオチドの配置が、細胞機能、細胞運命、細胞増殖、アポトーシス、および／または細胞分化を変化させることを含む、態様39〜44のいずれか一つの方法。
46．前記標的ポリヌクレオチドがテロメアを含む、態様45の方法。
47．前記標的ポリヌクレオチドの配置が、前記細胞内に1つまたは複数のさらなるコンパートメントを作製することをさらに含む、態様39〜46のいずれか一つの方法。
48．前記標的ポリヌクレオチドの配置が、DNA切断を修復することをさらに含む、態様39〜47のいずれか一つの方法。
49．前記修復が、外来性DNAを導入することを含む、態様48の方法。
50．前記導入が、組換え、非相同末端結合（non-homologous end joining）、または相同組換え修復（homology-directed repair）を含む、態様49の方法。
51．前記標的ポリヌクレオチドの配置が、前記コンパートメントを形成するための相分離を誘導する、態様39〜50のいずれか一つの方法。
52．前記コンパートメントが、タンパク質、RNA、DNA、またはこれらの組み合わせを含む人工の凝集体である、態様51の方法。
53．前記コンパートメントが核内構造体または細胞体である、態様51または52の方法。
54．前記標的ポリヌクレオチドの前記配置が、DNA修復を促進しかつ遺伝子編集効率を改善する核内構造体の形成を誘導する、態様39〜53のいずれか一つの方法。
55．前記標的ポリヌクレオチドがゲノムDNAを含む、態様39〜54のいずれか一つの方法。
56．前記標的ポリヌクレオチドがRNAを含む、態様39〜54のいずれか一つの方法。
57．前記アクチュエータ部分がCasタンパク質を含み、かつ
前記方法が、
(c)前記アクチュエータ部分と複合体を形成しかつ前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするガイドRNAを提供する工程
をさらに含む、
態様39〜56のいずれか一つの方法。
58．前記アクチュエータ部分がRNA結合タンパク質を含み、かつ
前記方法が、
(c)前記アクチュエータ部分と複合体を形成しかつ前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするガイドRNAを提供する工程
をさらに含み、任意で、
(d)前記ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質を提供する工程
をさらに含む、
態様39〜56のいずれか一つの方法。
59．前記Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠いている、態様57または58の方法。
60．前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質、Cas12タンパク質、Cas13タンパク質、CasXタンパク質、またはCasYタンパク質である、態様57〜59のいずれか一つの方法。
61．前記Cas12タンパク質が、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、およびCas12eからなる群より選択される、態様60の方法。
62．前記Cas13タンパク質が、Cas13a、Cas13b、Cas13c、およびCas13dからなる群より選択される、態様60の方法。
63．前記RNA結合タンパク質がADAR1またはADAR2であり、かつ前記ガイドRNAがADARリクルーティングRNA（arRNA）を含む、態様58の方法。
64．前記アクチュエータ部分が、前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする結合タンパク質を含み、かつ該結合タンパク質がジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALEヌクレアーゼである、態様39〜56のいずれか一つの方法。
65．前記アクチュエータ部分が、ガイドポリヌクレオチドと複合体を形成しているアルゴノートタンパク質を含み、該ガイドポリヌクレオチドがガイドRNAまたはガイドDNAであり、かつ該ガイドポリヌクレオチドが前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、態様39〜56のいずれか一つの方法。
66．前記コンパートメント特異的タンパク質が、前記コンパートメントに内在性のタンパク質、調節タンパク質、モータータンパク質、DNA修復タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、態様39〜65のいずれか一つの方法。
67．前記コンパートメントが核コンパートメントである、態様39〜66のいずれか一つの方法。
68．前記核コンパートメントが核内膜を含む、態様67の方法。
69．前記コンパートメント特異的タンパク質がエメリン、Lap2ベータ、ラミンB、またはこれらの組み合わせを含む、態様68の方法。
70．前記核コンパートメントがCajal体を含む、態様67の方法。
71．前記コンパートメント特異的タンパク質がコイリン、SMN、Gemin3、SmD1、SmE、またはこれらの組み合わせを含む、態様70の方法。
72．前記核コンパートメントが核スペックルを含む、態様67の方法。
73．前記コンパートメント特異的タンパク質がSC35を含む、態様72の方法。
74．前記核コンパートメントがPML体を含む、態様67の方法。
75．前記コンパートメント特異的タンパク質がPML、SP100、またはこれらの組み合わせを含む、態様74の方法。
76．前記核コンパートメントが核コア複合体を含む、態様67の方法。
77．前記コンパートメント特異的タンパク質がNup50、Nup98、Nup53、Nup153、Nup62、またはこれらの組み合わせを含む、態様76の方法。
78．前記核コンパートメントが核小体を含む、態様67の方法。
79．前記コンパートメント特異的タンパク質が核小体タンパク質B23を含む、態様78の方法。
80．前記核コンパートメントがヘテロクロマチンを含む、態様67の方法。
81．前記コンパートメント特異的タンパク質がHP1、KRAB-ZFP、これらの切断型、またはこれらの組み合わせを含む、態様80の方法。
82．前記核コンパートメントが核内構造体を含む、態様67の方法。
83．前記コンパートメント特異的タンパク質が53BP1、Rad51、またはこれらの組み合わせを含む、態様82の方法。
84．前記コンパートメントが細胞質コンパートメントである、態様39〜66のいずれか一つの方法。
85．前記細胞質コンパートメントが細胞骨格成分を含む、態様84の方法。
86．前記コンパートメント特異的タンパク質がキネシン、ダイニン、ミオシン、またはこれらの組み合わせを含む、態様85の方法。
87．前記コンパートメント特異的タンパク質が蛍光タンパク質にさらに連結されている、態様39〜86のいずれか一つの方法。
88．前記アクチュエータ部分が蛍光タンパク質にさらに連結されている、態様39〜87のいずれか一つの方法。
89．前記アセンブルすることが、リガンド、光、または酵素の存在下でのみ生じる、態様39〜88のいずれか一つの方法。
90．前記第1の二量体化ドメインおよび前記第2の二量体化ドメインが、前記リガンドの存在下で前記リガンドにそれぞれ結合する、態様89の方法。
91．前記リガンドが化学的誘導物質またはオプトジェネティック誘導物質である、態様89または90の方法。
【０２０６】
理解を明瞭にする目的で、例示および例として前述の発明をある程度詳細に記載してきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲の範囲内である特定の変更および修正を行うことができることを認識するであろう。さらに、本明細書で提供される各参考文献は、各参考文献が個々に参照により組み入れられる場合と同じ程度に、その全体が参照により組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年5月11日(2021.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021534205000001.app
【国際調査報告】
2021534205.tif 000083
2021534205.tif 000084
2021534205.tif 000085
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