(57)【要約】  本明細書において提示される種々の態様は香料産業に関する。より詳述すれば、本明細書において提示される種々の態様は、標的の匂い物質化合物によって活性化される特定の嗅覚受容体の使用に基づいて、標的の匂い物質化合物の対象の知覚を強化する組成物及び／又は成分をスクリーニング及び同定するためのアッセイ及び方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  １つ以上の単離された細胞であって、それぞれの細胞が、ある哺乳動物の嗅覚受容体を発現し、該１つ以上の細胞が、１つ以上の匂い物質により活性化される標的の嗅覚受容体を含む、１つ以上の単離された細胞、
ｂ）  第一の化合物であって、嗅覚受容体に結合し、かつ嗅覚受容体を活性化する第一の化合物、及び
ｃ）  少なくとも１つの第二の化合物であって、第一の化合物に非競合的に関連する受容体に結合し、かつ第一の化合物に曝した受容体の活性を第二の化合物の非存在下で第一の化合物に曝した受容体の活性と比較した場合に増強する、少なくとも１つの第二の化合物
を含む、化合物の群から１つ以上の化合物を同定するためのハイスループットアッセイシステムであって、
１つ以上の化合物は、アゴニスト匂い物質化合物により誘発される嗅覚受容体の活性をポジティブに調節し、
第一の化合物は、嗅覚受容体のアゴニスト匂い物質化合物であり、
第一の化合物及び第二の化合物は、異なる化合物であり、
第二の化合物は、受容体のアゴニストではなく、かつ
受容体の活性が、第一の化合物と第二の化合物との組合せにより相乗的に増強される、
前記アッセイシステム。
【請求項２】
少なくとも１つの第二の化合物が、構造活性相関（ＳＡＲ）解析に基づいた化合物のプールから選択される、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項３】
第二の化合物が、第一の化合物が結合する部位とは異なる嗅覚受容体上の部位に結合する、請求項１又は２に記載のアッセイシステム。
【請求項４】
第二の化合物が、ポジティブなアロステリック調節化合物である、請求項１から３までのいずれか１項に記載のアッセイシステム。
【請求項５】
ステップａ）の前に、１つ以上の細胞を形質転換させて、標的の嗅覚受容体を発現させる、請求項１から４までのいずれか１項に記載のアッセイシステム。
【請求項６】
受容体が、ＯＲ５ＡＮ１、Ｏｌｆｒ１４４０、ＯＲ１０Ｊ５、又はＯｌｆｒ１６からなる群から選択される、請求項１から５までのいずれか１項に記載のアッセイシステム。
【請求項７】
少なくとも１つの嗅覚受容体が、
ａ）  配列番号２、４、６又は８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は
ｂ）  配列番号１、３、５又は７、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる
ポリペプチドを含む、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項８】
ポリペプチドが、
ａ）  配列番号２、４、６又は８に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は
ｂ）  配列番号１、３、５又は７、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる、
請求項７に記載のアッセイシステム。
【請求項９】
哺乳動物の嗅覚受容体が、マウス嗅覚受容体又はヒト嗅覚受容体である、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１０】
第一の化合物が、ムスク化合物又はフローラル化合物である、請求項１から９までのいずれか１項に記載のアッセイシステム。
【請求項１１】
第一の化合物がムスク化合物を含み、かつ嗅覚受容体が、ＯＲ５ＡＮ１又はＯｌｆｒ１４４０、それらのキメラ及び機能的断片であり、ここで嗅覚受容体が、
ａ）  配列番号２又は６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は
ｂ）  配列番号１又は５、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる
ポリペプチドを含む、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のアッセイシステム。
【請求項１２】
ムスク化合物が、大環状ケトン又はニトロムスク化合物を含む、請求項１０又は１１に記載のアッセイシステム。
【請求項１３】
第一の化合物がフローラルミュゲ化合物を含み、かつ嗅覚受容体が、ＯＲ１０Ｊ５又はＯｌｆｒ１６、それらのキメラ及び機能的断片であり、ここで嗅覚受容体が、
ａ）  配列番号４又は８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は
ｂ）  配列番号３又は７、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる
ポリペプチドを含む、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のアッセイシステム。
【請求項１４】
調節される活性が、
ａ）  オルソステリック部位への第一の化合物の結合親和性の調節、
ｂ）  オルソステリック部位への第一の化合物の結合活性のエフィカシーの調節、及び／又は
ｃ）  Ｇタンパク質結合部位の調節
を含む、請求項１から１３までのいずれか１項に記載のアッセイシステム。
【請求項１５】
受容体のアゴニストの存在下で嗅覚受容体の活性を増強する、少なくとも１つのポジティブなアロステリック調節化合物を同定するための方法であって、
ａ）  １つ以上の単離された細胞を準備すること、ここでそれぞれの細胞はある哺乳動物の嗅覚受容体を発現する、
ｂ）  １つ以上の細胞を嗅覚受容体を活性化する第一の化合物に曝すこと、
ｃ）  １つ以上の細胞を１つ以上の試験化合物に曝すこと、及び
ｄ）  第一の化合物と組合せて少なくとも１つの第二の化合物が、ポジティブなアロステリック調節化合物として受容体活性に対する相乗効果を有する場合に、１つ以上の試験化合物から少なくとも１つの第二の化合物を選択すること
を含み、
ここで、第一の化合物が、嗅覚受容体のアゴニスト匂い物質化合物であり、
第一の化合物及び第二の化合物が、異なる化合物であり、かつ
第二の化合物が、受容体のアゴニストではない、
前記方法。
【請求項１６】
第一の化合物の存在下及び非存在下で嗅覚受容体の応答を測定することにより、第一の化合物に対する嗅覚受容体の活性化を測定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの第二の化合物が、構造活性相関（ＳＡＲ）解析に基づいた１つ以上の試験化合物から選択される、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
第二の化合物が、第一の化合物が結合する部位とは異なる嗅覚受容体上の部位に結合する、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップａ）の前に、１つ以上の細胞を形質転換させて、嗅覚受容体を発現させる、請求項１５から１８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
嗅覚受容体が、１つ以上の細胞に対して異種性である、請求項１５から１９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞が、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、アフリカツメガエル（Xenopus oocytes）、ＣＯＳ、昆虫、酵母及び嗅覚プラコードに由来する細胞からなる群から選択される、請求項１５から２０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
アゴニスト匂い物質化合物により誘発される嗅覚受容体の活性を増強する化合物を同定するための方法であって、
（ｉ）アゴニスト匂い物質化合物の存在下で結合アッセイにおいて１つ以上の化合物をスクリーニングすること、
（ｉｉ）哺乳動物の嗅覚受容体へのアゴニスト匂い物質化合物の特異的結合又は結合の効果を特異的に増強するスクリーニングした１つ以上の化合物を選択すること、及び
（ｉｉｉ）嗅覚受容体へのアゴニスト匂い物質化合物の特異的結合又は結合の効果の増強に基づいて、アゴニスト匂い物質化合物の知覚を潜在的に調節する化合物を同定すること
を含む、前記方法。
【請求項２３】
哺乳動物の嗅覚受容体が、マウス嗅覚受容体又はヒト嗅覚受容体である、請求項１５から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
嗅覚受容体が、ＯＲ５ＡＮ１、ＯＲ１０Ｊ５、Ｏｌｆｒ１４４０、又はＯｌｆｒ１６である、請求項１５から２３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの嗅覚受容体が、
ａ）  配列番号２、４、６又は８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は
ｂ）  配列番号１、３、５又は７、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる
ポリペプチドを含む、請求項１５から２４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドが、
ａ）  配列番号２、４、６又は８に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は
ｂ）  配列番号１、３、５又は７、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる、
請求項１５から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
第一の化合物が、ムスク化合物又はフローラルミュゲ化合物である、請求項１５から２６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
第一の化合物がムスク化合物を含み、かつ嗅覚受容体が、ＯＲ５ＡＮ１又はＯｌｆｒ１４４０、それらのキメラ及び機能的断片であり、ここで嗅覚受容体が、
ａ）  配列番号２又は６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は
ｂ）  配列番号１又は５、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる
ポリペプチドを含む、請求項１５から２７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ムスク化合物が、大環状ケトン又はニトロムスク化合物である、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
第一の化合物がフローラルミュゲ化合物を含み、かつ嗅覚受容体が、ＯＲ１０Ｊ５又はＯｌｆｒ１６、それらのキメラ及び機能的断片であり、ここで嗅覚受容体が、
ａ）  配列番号４又は８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は
ｂ）  配列番号３又は７、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる
ポリペプチドを含む、請求項１５から２７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
調節される活性が、
ａ）  オルソステリック部位への第一の化合物の結合親和性の調節、
ｂ）  オルソステリック部位への第一の化合物の結合活性のエフィカシーの調節、及び／又は
ｃ）  Ｇタンパク質結合部位の調節
を含む、請求項１５から３０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
嗅覚受容体へのアゴニスト匂い物質化合物の結合の効果の増強が、選択された化合物の非存在下での受容体の活性と比較して、受容体の活性のポテンシー及び／又はエフィカシーを増強することを含む、請求項１５から３１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
受容体がＯＲ５ＡＮ１であり、アゴニスト匂い物質化合物が、大環状ケトン又はニトロムスク化合物を含み、かつ選択される化合物が、以下の構造：
【化１】
2021508030.tif 000020
［式中、Ｒは、任意にＣ1-4アルキルカルボキシルエステル基又はヒドロキシル基で置換されているＣ3-11直鎖アルキル基、任意にＣ1-3アルコキシ基で置換されているＣ4-11分枝鎖アルキル基、Ｃ6-12直鎖もしくは分枝鎖アルケニル又はアルカジエニル基、１つ又は２つのＣ1-3アルキル基により置換されているフェニル基、Ｃ5-8脂環式アルケニル基、又はベンジルオキシメチル基である］をその立体異性体のいずれか１つ又はそれらの混合物の形で有する少なくとも１つのポジティブなアロステリックモジュレーターを含み、ここで式（Ｉ）の化合物は、ムスク嗅覚受容体のポジティブなアロステリックモジュレーターである、請求項１５から２９まで、請求項３１又は３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
式（Ｉ）の化合物が、（Ｅ，Ｅ）−２，４−デカジエナール、（Ｅ）−２−ウンデセナール、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナール、（Ｅ）−２−トリデセナール、（２Ｅ）−２−ドデセナール、（２Ｅ，６Ｚ）−２，６−ノナジエナール、（Ｅ，Ｅ）−２，６−ノナジエナール、（２Ｅ）−２，４−ウンデカジエナール、（２Ｅ）−２，４−ドデカジエナール、（Ｅ）−２−ノネナール、（２Ｅ，４Ｅ，７Ｚ）−デカトリエナール、（Ｚ）−２−デセナール、（Ｅ）−２−オクテナール、（Ｅ）−２−デセナール、（Ｚ）−４−（ベンジルオキシ）ブテ−２−エナール、（Ｅ）−４−（ベンジルオキシ）ブテ−２−エナール、（Ｅ）−４−シクロヘキシリデンブテ−２−エナール、（２Ｅ）−３−（４−メチルフェニル）−２−プロペナール、（２Ｅ，５Ｅ）−６，１０−ジメチル−２，５，９−ウンデカトリエナール、（２Ｅ）−７，８−ジメチル−２，７−ノナジエナール、メチル（５Ｅ）−７−オキソ−５−ヘプテノエート、（２Ｅ）−７−メチル−２，６−オクタジエナール、（２Ｅ）−６，６−ジメチル−２−ヘプテナール、（＋−）−（２Ｅ）−５，９−ジメチル−２，８−デカジエナール、（Ｅ）−２−テトラデセナール、（Ｅ）−８−メトキシ−４，８−ジメチルノネ−２−エナール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
１つ以上の選択される化合物が、推定上の増強の化学的決定要因を同定するために特異的に設計された構造活性相関（ＳＡＲ）解析に基づいて選択される、請求項１５から３４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
受容体がＯＲ１０Ｊ５であり、アゴニスト匂い物質化合物が、フローラルミュゲ化合物を含み、かつ選択される化合物が、オクタナール；（Ｅ）−デセ−２−エナール、２−フェニルプロパナール；（Ｅ）−ブテ−２−エナール；３−メチルベンズアルデヒド；３−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−２−メチルプロパナール；（＋−）−３−（４−メチル−３−ペンテン−１−イル）−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、（＋−）−４−（４−メチル−３−ペンテン−１−イル）−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、及びそれらの混合物；ヘプタナール、４−プロパン−２−イルベンズアルデヒド；（３Ｒ）−３，７−ジメチルオクテ−６−エナール；（＋）−（３Ｓ）−３−［（１Ｒ）−４−メチル−３−シクロヘキセン−１−イル］ブタナール、（＋）−（３Ｒ）−３−［（１Ｒ）−４−メチル−３−シクロヘキセン−１−イル］ブタナール、及びそれらの混合物；ヘキサナール；２，６−ジメチルヘプテ−５−エナール；ベンズアルデヒド；２−メチル−３−（４−メチルフェニル）プロパナール；３，５，６−トリメチル−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、２，４，６−トリメチル−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、及びそれらの混合物；４−エチルベンズアルデヒド；６−メトキシ−２，６−ジメチルヘプタナール；（Ｅ）−ノネ−２−エナール；並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのポジティブなアロステリックモジュレーターを含む、請求項１５から２７まで又は請求項３０から３２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
スクリーニングが、活性化ウィンドウを計算してＥＣ05-50での相乗効果増強を測定することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３８】
アゴニストにより活性化されうるポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドが、アゴニストの１つ以上のポジティブなアロステリック調節化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ又は方法において使用するための、アゴニストによって活性化されるヒト嗅覚受容体から選択される、前記使用。
【請求項３９】
大環状ケトン又はニトロムスクによって活性化されうるポリペプチドの使用であって、大環状ケトン又はニトロムスクのポジティブなアロステリック調節化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ又は方法において使用するための、配列番号２又は６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記使用。
【請求項４０】
フローラルミュゲ化合物によって活性化されうるポリペプチドの使用であって、フローラルミュゲ化合物のポジティブなアロステリック調節化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ又は方法において使用するための、配列番号４又は８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月２１日に出願された米国仮特許出願番号第６２／６０９，００４号及び第６２／６０９，０１７号（U.S. Provisional Patent Application Serial No. 62/589,947 U.S. Provisional Patent Application Serial Nos. 62/609,004 and 62/609,017）、２０１８年１２月１９日に出願された米国仮特許出願番号第６２／７８１，７９６号（U.S. Provisional Patent Application Serial No. 62/781,796）、並びに２０１８年２月２０日に出願された欧州特許出願番号第１８１５７６９０．１号（European Patent Application Serial Nos. 18157690.1）及び２０１８年４月１１に出願された第１８１６６８８７．２号に対して優先権を主張し、その全記載内容は参照をもってその全体を本明細書に組み込まれたものとする。
【０００２】
技術分野
本技術分野は、匂い物質及び芳香の受容体、並びに匂い物質及び／又は芳香化合物及びより詳述すればヒト匂い物質受容体活性のポジティブなモジュレーターを同定するために使用できるアッセイに関する。
【０００３】
背景技術
嗅覚は、人間の感覚系で最も複雑であり理解が不十分なものの１つである。嗅覚受容体（ＯＲ）の活性化から知覚まで、さらなる調査が必要である多くのステップがある。個々の匂い物質及び混合物についてのＯＲコードが知覚にどのように変換されるかを理解することができる場合に、この知識を活用していくつかの分野で大きな利益をもたしうる。これらの分野は、不快な匂いの知覚を遮断する匂いモジュレーター、例えば悪臭中和剤、非生分解性又は毒性の化合物に代わる新たなフレーバー及びフレグランス成分、及び天然源からの供給が困難な化合物への依存を制限するか又はあるフレグランス成分に対する感度を改善する匂い物質エンハンサーを含む。「嗅覚受容体コード」コンビナトリアルパラダイムは、任意の単一のＯＲが複数の匂い物質により活性化されてよく、逆にほとんどの匂い物質が複数のＯＲを活性化できるという観察に集中する。マウスゲノムにおいて、約１２００個の明確に完全なＯＲがある。対照的に、ヒトは約４００個を有する。双方の場合において、ＯＲのレパートリーは、世界中で何千もの匂い物質により活性化され、この組み合わせの複雑さが、知覚できる嗅覚の幅を可能する。しかしながら、４８個のヒトＯＲ（約１２％）のみの匂い物質又はリガンドが、２０１６年の時点で従来の脱オーファン化法を使用して同定されている［Ｔｅｉｘｅｉｒａ Ｃ． Ｓ． Ｓ．ら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｅｓ， ４１（２）：１０５−２１（２０１６）］。さらに、本質的にｉｎ ｖｉｔｒｏで同定されたヒトＯＲについてのほとんどのリガンドの生理学的関連性は試験されていない。
【０００４】
１種以上の匂い物質により特異的に活性化又は阻害される生物に存在するＯＲの全レパートリー内で、比較的小さなＯＲのサブセットを迅速かつ確実に同定できる方法は、国際公開番号第２０１４／２１０５８５号（WO2014/210585）において記載されている。
【０００５】
ＯＲは、脊椎動物における最大の遺伝子ファミリー、すなわち７個の膜貫通クラスＡ Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）によってコードされているため、所与の知覚対象に不可欠である受容体の同定が困難である。
【０００６】
特定の匂い物質及び／又は芳香化合物によって活性化されるＯＲ受容体を同定する必要性が残っている。特定の匂い物質及び／又は芳香化合物又はかかる化合物の群によって活性化される１つ以上のＯＲが同定され、ＯＲ活性の揮発性モジュレーター、例えばアロステリックモジュレーターを同定及び薬理学的に特徴付けるアッセイ及び方法において使用されうる関連する匂い物質受容体を同定する必要性が残っている。匂い物質受容体活性のかかるアロステリック調節は、せいぜい推論的であり、嗅覚の分野を逃れた。
【０００７】
したがって、香料又は芳香の調香のより感受性がありより強い知覚を導きうる所望のフレグランス又は芳香を（ポジティブなアロステリックモジュレーターを使用して）調節、改善又は増強するための、又は望ましくない臭い又は化合物を（ネガティブなアロステリックモジュレーター又は競合的アンタゴニストを使用して）阻害又は中和するための、香料又は他の適用において使用できる関連する受容体及び化合物を同定するための方法が所望される。
【０００８】
要約
本明細書において提示される一態様は、化合物の群からの１つ以上の化合物を同定するためのハイスループットなアッセイシステムを提供することであり、その際、１つ以上の化合物は、
ａ．  １つ以上の単離された細胞であって、それぞれの細胞が、ある哺乳動物の嗅覚受容体を発現し、１つ以上の細胞が、１つ以上の匂い物質により活性化される標的の嗅覚受容体を含む、１つ以上の単離された細胞、
ｂ．  嗅覚受容体に結合し、嗅覚受容体を活性化する第一の化合物、及び
ｃ．  第一の化合物に非競合的に関連する受容体に結合し、第一の化合物に曝した受容体の活性を、第二の化合物の非存在下で第一の化合物に曝した受容体の活性と比較した場合に増強する、少なくとも１つの第二の化合物
を含むアゴニスト匂い物質化合物により誘発される嗅覚受容体の活性をポジティブに調節し、
第一の化合物が、嗅覚受容体のアゴニスト匂い物質化合物であり、
第一の化合物及び第二の化合物が、異なる化合物であり、
第二の化合物が、受容体のアゴニストではなく、かつ
受容体の活性が、第一の化合物と第二の化合物との組合せにより相乗的に高められる。
【０００９】
一態様において、少なくとも１つの第二の化合物は、構造活性相関（ＳＡＲ）解析に基づいた化合物のプールから選択される。
【００１０】
一態様において、第二の化合物は、第一の化合物が結合する部位とは異なる嗅覚受容体上の部位に結合する。
【００１１】
一態様において、第二の化合物は、ポジティブなアロステリックに調節する化合物である。
【００１２】
本明細書におけるアッセイ又は方法の一態様において、嗅覚受容体は、ＯＲ５ＡＮ１、Ｏｌｆｒ１４４０、ＯＲ１０Ｊ５、又はＯｌｆｒ１６からなる群から選択される。
【００１３】
本明細書におけるアッセイ又は方法の一態様において、少なくとも１つの嗅覚受容体は、
ａ．  配列番号２、４、６又は８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は
ｂ．  配列番号１、３、５又は７、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる
ポリペプチドを含む。
【００１４】
一態様において、少なくとも１つの嗅覚受容体は、
ａ．  配列番号２、４、６又は８に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は
ｂ．  配列番号１、３、５又は７、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる
ポリペプチドを含む。
【００１５】
前記アッセイ又は方法の一態様において、第一の化合物は、ムスク（musk）化合物又はフローラルミュゲ（floral muguet）化合物である。
【００１６】
一態様において、哺乳動物の嗅覚受容体は、マウス嗅覚受容体又はヒト嗅覚受容体である。
【００１７】
一態様において、第一の化合物はムスク化合物を含み、かつ嗅覚受容体は、ＯＲ５ＡＮ１又はＯｌｆｒ１４４０、それらのキメラ及び機能的断片であり、その際嗅覚受容体は、
ａ．  配列番号２又は６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は
ｂ．  配列番号１又は５、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる
ポリペプチドを含む。
【００１８】
一態様において、ムスク化合物は、大環状ケトン又はニトロムスク化合物を含む。
【００１９】
一態様において、受容体はＯＲ５ＡＮ１であり、アゴニスト匂い物質化合物は、大環状ケトン又はニトロムスク化合物を含み、かつ選択される化合物は、構造：
【化１】
2021508030.tif 000002
［式中、Ｒは、任意にＣ1-4アルキルカルボキシルエステル基又はヒドロキシル基で置換されているＣ3-11直鎖アルキル基、任意にＣ1-3アルコキシ基で置換されているＣ4-11分枝鎖アルキル基、Ｃ6-12直鎖もしくは分枝鎖アルケニル又はアルカジエニル基、１つ又は２つのＣ1-3アルキル基により置換されているフェニル基、Ｃ5-8脂環式アルケニル基、又はベンジルオキシメチル基である］をその立体異性体のいずれか１つ又はそれらの混合物の形で有する少なくとも１つのポジティブなアロステリックモジュレーターを含み、ここで式（Ｉ）の化合物は、ムスク嗅覚受容体のポジティブなアロステリックモジュレーターである。
【００２０】
他の態様において、式（Ｉ）の化合物は、（Ｅ，Ｅ）−２，４−デカジエナール、（Ｅ）−２−ウンデセナール、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナール、（Ｅ）−２−トリデセナール、（２Ｅ）−２−ドデセナール、（２Ｅ，６Ｚ）−２，６−ノナジエナール、（Ｅ，Ｅ）−２，６−ノナジエナール、（２Ｅ）−２，４−ウンデカジエナール、（２Ｅ）−２，４−ドデカジエナール、（Ｅ）−２−ノネナール、（２Ｅ，４Ｅ，７Ｚ）−デカトリエナール、（Ｚ）−２−デセナール、（Ｅ）−２−オクテナール、（Ｅ）−２−デセナール、（Ｚ）−４−（ベンジルオキシ）ブテ−２−エナール、（Ｅ）−４−（ベンジルオキシ）ブテ−２−エナール、（Ｅ）−４−シクロヘキシリデンブテ−２−エナール、（２Ｅ）−３−（４−メチルフェニル）−２−プロペナール、（２Ｅ，５Ｅ）−６，１０−ジメチル−２，５，９−ウンデカトリエナール、（２Ｅ）−７，８−ジメチル−２，７−ノナジエナール、メチル（５Ｅ）−７−オキソ−５−ヘプテノエート、（２Ｅ）−７−メチル−２，６−オクタジエナール、（２Ｅ）−６，６−ジメチル−２−ヘプテナール、（＋−）−（２Ｅ）−５，９−ジメチル−２，８−デカジエナール、（Ｅ）−２−テトラデセナール、及び（Ｅ）−８−メトキシ−４，８−ジメチルノネ−２−エナール、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２１】
他の態様において、第一の化合物はフローラルミュゲ化合物を含み、かつ嗅覚受容体は、ＯＲ１０Ｊ５又はＯｌｆｒ１６、それらのキメラ及び機能的断片であり、その際嗅覚受容体は、
ａ．  配列番号４又は８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は
ｂ．  配列番号３又は７、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる
ポリペプチドを含む。
【００２２】
一態様において、フローラルミュゲ化合物は、３−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル）シクロヘキセ−３−エン−１−カルバルデヒド、４−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル）シクロヘキセ−３−エン−１−カルバルデヒド、又はそれらの混合物である。
【００２３】
一態様において、受容体はＯＲ１０Ｊ５であり、アゴニスト匂い物質化合物は、フローラルミュゲ化合物を含み、かつ選択される化合物は、オクタナール；（Ｅ）−デセ−２−エナール、２−フェニルプロパナール；（Ｅ）−ブテ−２−エナール；３−メチルベンズアルデヒド；３−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−２−メチルプロパナール；（＋−）−３−（４−メチル−３−ペンテン−１−イル）−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、（＋−）−４−（４−メチル−３−ペンテン−１−イル）−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、及びそれらの混合物；ヘプタナール、４−プロパン−２−イルベンズアルデヒド；（３Ｒ）−３，７−ジメチルオクテ−６−エナール；（＋）−（３Ｓ）−３−［（１Ｒ）−４−メチル−３−シクロヘキセン−１−イル］ブタナール、（＋）−（３Ｒ）−３−［（１Ｒ）−４−メチル−３−シクロヘキセン−１−イル］ブタナール、及びそれらの混合物；ヘキサナール；２，６−ジメチルヘプテ−５−エナール；ベンズアルデヒド；２−メチル−３−（４−メチルフェニル）プロパナール；３，５，６−トリメチル−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、２，４，６−トリメチル−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、及びそれらの混合物；４−エチルベンズアルデヒド；６−メトキシ−２，６−ジメチルヘプタナール；（Ｅ）−ノネ−２−エナール；並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのポジティブなアロステリックモジュレーターを含む。
【００２４】
一態様において、調節される活性は、
ａ．  オルソステリック部位への第一の化合物の結合親和性の調節、
ｂ．  オルソステリック部位への第一の化合物の結合活性のエフィカシー（efficacy）の調節、及び／又は
ｃ．  Ｇタンパク質結合部位の調節
を含む。
【００２５】
本明細書において提示される一態様は、
ａ．  １つ以上の単離された細胞を準備すること、ここでそれぞれの細胞はある哺乳動物の嗅覚受容体を発現する、
ｂ．  １つ以上の細胞を嗅覚受容体を活性化する第一の化合物に曝すこと、
ｃ．  １つ以上の細胞を１つ以上の試験化合物に曝すこと、及び
ｄ．  第一の化合物と組合せて少なくとも１つの第二の化合物が、ポジティブなアロステリック調節化合物としての受容体活性に対する相乗効果を有する場合に、１つ以上の試験化合物から少なくとも１つの第二の化合物を選択すること
を含む、受容体のアゴニストの存在下で、嗅覚受容体の活性を増強する、少なくとも１つのポジティブなアロステリック調節化合物を同定するための方法を提供し、
その際、第一の化合物は、嗅覚受容体のアゴニスト匂い物質化合物であり、
第一の化合物及び第二の化合物は異なる化合物であり、かつ
第二の化合物は、受容体のアゴニストではない。
【００２６】
一態様において、第一の化合物に対する嗅覚受容体の活性化は、第一の化合物の存在下及び非存在下で該嗅覚受容体の応答を測定することにより測定される。
【００２７】
一態様において、少なくとも１つの第二の化合物は、化学的に多様な化合物ライブラリーからの１つ以上の試験化合物から選択される。
【００２８】
一態様において、少なくとも１つの第二の化合物は、最初に同定された化合物の構造活性相関（ＳＡＲ）解析に基づいた１つ以上の試験化合物から選択される。
【００２９】
前記態様のいずれか１つの方法であって、第二の化合物は、第一の化合物が結合する部位とは異なる嗅覚受容体上の部位に結合する。
【００３０】
一態様において、本明細書において提供されるアッセイシステム又は方法のステップａ）の前に、１つ以上の細胞を形質転換させて、標的の嗅覚受容体を発現させる。
【００３１】
一態様において、嗅覚受容体は、１つ以上の細胞に対して異種性である。
【００３２】
一態様において、細胞は、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、アフリカツメガエル（Xenopus oocytes）、ＣＯＳ、Ｓ２、Ｓｆ９、昆虫、酵母及び嗅覚プラコードに由来する細胞からなる群から選択される。
【００３３】
本明細書において提示される一態様は、
（ｉ）アゴニスト匂い物質化合物の存在下で結合アッセイにおいて１つ以上の化合物をスクリーニングすること、
（ｉｉ）哺乳動物の嗅覚受容体へのアゴニスト匂い物質化合物の特異的結合及び結合の効果を特異的に増強するスクリーニングした化合物の１つ以上を選択すること、及び
（ｉｉｉ）嗅覚受容体へのアゴニスト匂い物質化合物の特異的結合及び結合の効果のそれらの増強に基づいて、アゴニスト匂い物質化合物の知覚を潜在的に調節する化合物を同定すること
を含む、アゴニスト匂い物質化合物により誘発される嗅覚受容体の活性を増強する化合物を同定するための方法を提供する。
【００３４】
一態様において、嗅覚受容体へのアゴニスト匂い物質化合物の結合の効果の増強は、選択された化合物の非存在下で受容体の活性を比較して、受容体の活性のポテンシー（potency）及び／又はエフィカシー（efficacy）を増強することを含む。
【００３５】
一態様において、選択された化合物の非存在下で受容体の活性と比較して受容体の活性のポテンシー及び／又はエフィカシーを増強する選択化合物は、標的受容体と共有結合できる。
【００３６】
一態様において、受容体はＯＲ５ＡＮ１であり、アゴニスト匂い物質化合物は、ムスク化合物を含み、かつ選択される化合物は、構造：
【化２】
2021508030.tif 000003
［式中、Ｒは、任意にＣ1-4アルキルカルボキシルエステル基又はヒドロキシル基で置換されているＣ3-11直鎖アルキル基、任意にＣ1-3アルコキシ基で置換されているＣ4-11分枝鎖アルキル基、Ｃ6-12直鎖もしくは分枝鎖アルケニル又はアルカジエニル基、１つ又は２つのＣ1-3アルキル基により置換されているフェニル基、Ｃ5-8脂環式アルケニル基、又はベンジルオキシメチル基である］をその立体異性体のいずれか１つ又はそれらの混合物の形で有するポジティブなアロステリックモジュレーターを含むポジティブなアロステリックモジュレーターであり、ここで式（Ｉ）の化合物は、ムスク嗅覚受容体のポジティブなアロステリックモジュレーターである。
【００３７】
一態様において、式（Ｉ）の化合物は、（Ｅ，Ｅ）−２，４−デカジエナール、（Ｅ）−２−ウンデセナール、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナール、（Ｅ）−２−トリデセナール、（２Ｅ）−２−ドデセナール、（２Ｅ，６Ｚ）−２，６−ノナジエナール、（Ｅ，Ｅ）−２，６−ノナジエナール、（２Ｅ）−２，４−ウンデカジエナール、（２Ｅ）−２，４−ドデカジエナール、（Ｅ）−２−ノネナール、（２Ｅ，４Ｅ，７Ｚ）−デカトリエナール、（Ｚ）−２−デセナール、（Ｅ）−２−オクテナール、（Ｅ）−２−デセナール、（Ｚ）−４−（ベンジルオキシ）ブテ−２−エナール、（Ｅ）−４−（ベンジルオキシ）ブテ−２−エナール、（Ｅ）−４−シクロヘキシリデンブテ−２−エナール、（２Ｅ）−３−（４−メチルフェニル）−２−プロペナール、（２Ｅ，５Ｅ）−６，１０−ジメチル−２，５，９−ウンデカトリエナール、（２Ｅ）−７，８−ジメチル−２，７−ノナジエナール、メチル（５Ｅ）−７−オキソ−５−ヘプテノエート、（２Ｅ）−７−メチル−２，６−オクタジエナール、（２Ｅ）−６，６−ジメチル−２−ヘプテナール、（＋−）−（２Ｅ）−５，９−ジメチル−２，８−デカジエナール、（Ｅ）−２−テトラデセナール、及び（Ｅ）−８−メトキシ−４，８−ジメチルノネ−２−エナールからなる群から選択される。
【００３８】
一態様において、受容体はＯＲ１０Ｊ５であり、アゴニスト匂い物質化合物は、フローラルミュゲ化合物を含み、かつ選択される化合物は、オクタナール；（Ｅ）−デセ−２−エナール、２−フェニルプロパナール；（Ｅ）−ブテ−２−エナール；３−メチルベンズアルデヒド；３−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−２−メチルプロパナール；（＋−）−３−（４−メチル−３−ペンテン−１−イル）−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、（＋−）−４−（４−メチル−３−ペンテン−１−イル）−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、及びそれらの混合物；ヘプタナール、４−プロパン−２−イルベンズアルデヒド；（３Ｒ）−３，７−ジメチルオクテ−６−エナール；（＋）−（３Ｓ）−３−［（１Ｒ）−４−メチル−３−シクロヘキセン−１−イル］ブタナール、（＋）−（３Ｒ）−３−［（１Ｒ）−４−メチル−３−シクロヘキセン−１−イル］ブタナール、及びそれらの混合物；ヘキサナール；２，６−ジメチルヘプテ−５−エナール；ベンズアルデヒド；２−メチル−３−（４−メチルフェニル）プロパナール；３，５，６−トリメチル−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、２，４，６−トリメチル−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、及びそれらの混合物；４−エチルベンズアルデヒド；６−メトキシ−２，６−ジメチルヘプタナール；（Ｅ）−ノネ−２−エナール；並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのポジティブなアロステリックモジュレーターを含む。
【００３９】
一態様において、１つ以上の選択される化合物は、推定上の増強の化学的決定要因を同定するために特別に設計された構造活性相関（ＳＡＲ）解析に基づいて選択される。
【００４０】
一態様において、スクリーニングは、活性ウインドウを算出して、データの統計的品質を確認し、そしてＥＣ05-50での相乗効果の増強を及び他の態様においてＥＣ20で測定することを含む。
【００４１】
本明細書において提示される一態様は、アゴニストにより活性化されうるポリペプチドの使用を提供し、該ポリペプチドは、アゴニストの１つ以上のポジティブなアロステリック調節化合物を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用するためのアゴニストによって活性化されるヒト嗅覚受容体から選択される。
【００４２】
本明細書において提示される一態様は、ムスクのポジティブなアロステリック調節化合物を同定するための、配列番号２又は６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ムスクによって活性化されうるポリペプチドの使用を提供する。
【００４３】
本明細書において提示される一態様は、フローラルミュゲ受容体活性の化合物のポジティブなアロステリック調節化合物を同定するための、配列番号４又は８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、フローラルミュゲ化合物によって活性化されうるポリペプチドの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、一連の異なるムスクについてのムスクで誘発されたｉｎ ｖｉｔｒｏでのＯＲ５ＡＮ１活性記録のレベル（ａ）と、ムスコン、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（ムセノン）（登録商標）、ムスクキシロール及びムスクケトンの匂い検出閾値記録によって示される全体的に増加するヒト感受性（ｂ）との相関を示す。
【図２】図２は、ＯＲ５ＡＮ１のムスクで誘発された活性の増強についてスクリーニングするＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）及び香料原料の単点二成分混合物の結果を示す。
【図３】図３は、トリデシレンアルデヒドの存在及び非存在下でのアゴニストのムスコン、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）、ムスクキシロール及びムスクケトンの４つ全てに対するＯＲ５ＡＮ１の用量反応曲線、並びにトリデシレンアルデヒドのみに対する用量反応を示す。
【図４】図４は、図３において得られた用量反応曲線から得られたＥＣ50値を示し、かつ対応するＥＣ50倍シフトを要約する。
【図５】図５は、連続濃度のトリデシレンアルデヒドの存在下でのＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）に対するＯＲ５ＡＮ１の一連の用量反応曲線を示し、かつ協同性因子α及び平衡定数ＫBについて算出したｌｏｇ値も示す。
【図６】図６は、ポテンシーのシフト及びエフィカシーの増加に基づいたＯＲ５ＡＮ１ムスク応答の増強能力に従った６７個の揮発性化合物のランキングを示す。
【図７】図７は、ＯＲ５ＡＮ１ムスク応答の増強を引き出すために好ましいＳＡＲ解析から同定された化学的要件を示す。
【図８】図８は、ａ）デセナール、ｂ）デカジエナール、及びｃ）デカナールでのＯＲ５ＡＮ１に対する得られた異なる増強レベル、及び不飽和の要件を示す。
【図９】図９は、ａ）ドデセナール及びｂ）タンゲリナール（ｔａｎｇｅｒｉｎａｌ）でのＯＲ５ＡＮ１に対する得られた異なる増強レベル、及び不飽和位置の重要性を示す。
【図１０】図１０は、ａ）ノニレンアルデヒド、ｂ）ノネノール及びｃ）ノルデセノールでのＯＲ５ＡＮ１に対する得られた異なる増強レベル、及びアルコール官能基での増強の欠如を示す。
【図１１】図１１は、ａ）デセナール及びｂ）デセノンでのＯＲ５ＡＮ１に対する得られた異なる増強レベル、及びケトン官能基での増強の欠如を示す。
【図１２】図１２は、ａ）ウンデセナール及びｂ）ウンデセン酸でのＯＲ５ＡＮ１に対する得られた異なる増強レベル、及び酸基での増強の欠如を示す。
【図１３】図１３は、ＯＲ５ＡＮ１アレルが、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）で活性化させた場合に機能的に同等ではないが増強し、低機能アレル（ｈｙｐｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｌｌｅｌｅｓ）の活性を回復することを示す。
【図１４】図１４は、増強しない化合物と比較して、エンハンサーの存在下でＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）に対してより多い感受性のあるヒトパネリストを示す。
【図１５】図１５は、フローラルミュゲ化合物ＬＹＲＡＬ（登録商標）に対するＯＲ１０Ｊ５の用量反応曲線を示す。
【図１６】図１６は、フローラルミュゲ化合物である３−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル）シクロヘキセ−３−エン−１−カルバルデヒド、４−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル）シクロヘキセ−３−エン−１−カルバルデヒド又はそれらの混合物（商標名ＬＹＲＡＬ（登録商標）で販売されている、以下「ＬＹＲＡＬ（登録商標）」という）と香料原料との単点二成分混合物の、ＯＲ１０Ｊ５についてのＬＹＲＡＬ（登録商標）誘発活性の増強のスクリーニング結果を示す。
【図１７】図１７は、ａ）ヘリオプロパナール、ｂ）３−（４−メチルシクロヘキセ−３−エン−１−イル）ブタナール、ｃ）ヘリオトロピン及びｄ）シクロメチレンシトロネロールでのＯＲ１０Ｊ５  ＬＹＲＡＬ（登録商標）誘発活性に対して得られた別個の増強レベル、並びに後ろ２つの化合物についての増強の欠如を示す。
【図１８】図１８は、ａ）ヘリオプロパナール、ｂ）３−（４−メチルシクロヘキセ−３−エン−１−イル）ブタナール、ｃ）ヘリオトロピン及びｄ）シクロメチレンシトロネロールでのＯｌｆｒ１６  ＬＹＲＡＬ（登録商標）誘発活性に対して得られた異なる増強レベル、並びに後ろ２つの化合物についての増強の欠如を示す。
【図１９】図１９は、連続濃度のａ）ヘリオプロパナール、ｂ）３−（４−メチルシクロヘキセ−３−エン−１−イル）ブタナール、ｃ）メロナール及びｄ）ヘプタナールの存在下でのＬＹＲＡＬ（登録商標）に対するＯＲ１０Ｊ５の一連の用量反応曲線を示し、かつ協同性因子α及び平衡定数ＫBについて対応する算出したｌｏｇ値も示す。
【図２０】図２０は、増強しない化合物と比較して、エンハンサーの存在下でＬＹＲＡＬ（登録商標）に対してより多い感受性のあるヒトパネリストを示す。
【図２１】図２１は、増強しない化合物と比較して、エンハンサー濃度の関数としてＬＹＲＡＬ（登録商標）検出を増加させたヒトパネリストを示す。
【図２２】図２２は、ａ）ヘリオプロパナール及びｂ）ヘリオトロピンでのＯＲ１０Ｊ５  （＋−）−２，５−ジメチル−２−インダンメタノール誘発活性に対して得られた異なる増強レベル、並びに後者の化合物についての増強の欠如を示す。
【００４５】
発明の詳細な説明
定義
明細書及び付属の特許請求の範囲について、「又は」の使用は、特に明記されない限り「及び／又は」を意味する。
【００４６】
同様に、「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含有している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、置き換えることができ、かつ制限することを意図しない。
【００４７】
さらに、種々の実施形態の記載が「含有している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合に、当業者は、ある特定の例において、一実施形態が「実質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という言語を使用して代わりに記載されてよいことを理解していることを、理解すべきである。
【００４８】
以下の用語は、他に特定されない限りそれらに帰する意味を有する。
【００４９】
本明細書において使用されるように、「ＯＲ」又は「嗅覚受容体」又は「匂い物質受容体」は、嗅覚細胞において発現されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のファミリーの１つ以上のメンバーをいう。嗅覚受容体細胞は、形態学に基づいて又は嗅覚細胞において特異的に発現するタンパク質の発現によっても同定されうる。ＯＲファミリーメンバーは、嗅覚シグナル伝達のための受容体として作用する能力を有していてよい。
【００５０】
標的の嗅覚受容体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、又はｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで感覚知覚に対して相互に関係があってよい嗅覚受容体をいう。
【００５１】
「ムスクＯＲ」は、嗅覚細胞において発現されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のファミリーのメンバーをいい、この受容体は、ＧＰＣＲを結合及び／又は活性化するリガンドを同定するための結合又は活性化アッセイにおいてムスクにより結合及び／又は活性化される。かかるアッセイを以下に記載する。本明細書におけるムスク受容体は、断片、合成及び天然に存在するものを含むバリアント、並びにムスク化合物に応答又は結合するキメラ又は組換え核酸又はタンパク質を含む。同一の定義が、本明細書において記載される方法により同定されてよい他の関連するＯＲ又は標的ＯＲと類似して適用される。
【００５２】
匂い物質は、香料、香料成分、芳香、食品、フレーバー又はフレーバー成分を含むがこれらに限定されないあらゆるタイプの匂い物質をいう。
【００５３】
ＯＲのアゴニスト又はアゴニスト化合物は、ＯＲに結合し、ＯＲを活性化し、かつ受容体伝達カスケードを誘発する可能性を有する化合物又はリガンドをいう。
【００５４】
本明細書において考慮されるように、嗅覚受容体のアゴニストではない化合物は、アゴニスト化合物に対してＯＲに非競合的に結合し、かつアゴニストではない化合物の非存在下でアゴニスト化合物に曝された受容体の活性と比較した場合にアゴニスト化合物に曝された受容体の活性を増強又は阻害する化合物又はリガンドをいう。一態様において、アゴニストではない化合物は、アゴニスト化合物が結合する部位とは異なる受容体上の部位に結合する。
【００５５】
一態様において、嗅覚受容体のアゴニストではない化合物は、例えば、ＥＣ50値がアゴニスト化合物の値よりも実質的に高く、かつエフィカシーが典型的に飽和時の完全なアゴニスト反応のエフィカシーの２０％未満である場合に、アゴニストよりも実質的に低いポテンシー及びエフィカシーを有する。
【００５６】
ポテンシーは、所与の活性レベルを生じるために要求される量に関して、アゴニスト（匂い物質）の結合によって誘発される受容体の活性の尺度をいう。これは、種々のアゴニスト濃度に対する受容体の感度を示し、通常はＥＣ50（最大の受容体活性の半分を達成するために必要なアゴニスト濃度）を算出することにより得られる。
【００５７】
エフィカシー（efficacy）は、受容体が所与のアゴニストに応答する強度の尺度をいい、構成的（アゴニストの非存在下でのベースライン活性）とアゴニスト誘発活性との間の活性化スパンを測定することにより得られる。最大のエフィカシーは、受容体の飽和時に得られる。
【００５８】
オルソステリック結合部位は、アゴニスト又は競合的アンタゴニストについてのリガンド又は匂い物質化合物結合部位をいう。オルソステリック部位への結合事象は、一般的に、アゴニストによる活性化又は受容体の活性の競合的アンタゴニストによる阻害を導く。
【００５９】
アロステリック結合部位は、オルソステリック結合部位とは組織分布的に異なる結合部位をいう。オルソステリックアゴニストの存在下でのアロステリック結合は、立体的に妨げられておらず、したがって競合しない形で生じる。特定のアロステリックリガンドは、例えば、それぞれアゴニストによる受容体の活性化を強化又は阻害するために、ポジティブなのアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）又はネガティブなアロステリックモジュレーター（ＮＡＭ）として作用しうる。
【００６０】
２つの分子が競合して同一の結合部位で結合する場合に、結合競合が生じる。それぞれのリガンドの結合確率は、受容体に対するそれぞれの親和性及び、他のリガンドと比較したその濃度に依存する。競合は、典型的に双方のリガンドがオルソステリック部位で結合する場合に生じる。これは、競合アッセイ、例えばＳｃｈｉｌｄ回帰分析を実施することにより同定されてよく、競合が観察されない場合に、双方のリガンドは、オルソステリック結合部位及びアロステリック結合部位として定義される２つの異なる結合部位で同時に受容体に結合でき、その際、結合部位は、受容体上で組織分布的に分離されるか、又は隣接もしくは重複していてよい。この場合、オルソステリックリガンドの結合は、アロステリックリガンドの濃度に直接依存しない。アロステリック結合は、受容体のいくつかの特性、例えばアゴニスト親和性及びシグナル伝達効率を調節しうる。
【００６１】
ポジティブもしくはネガティブなアロステリックモジュレーター又はポジティブもしくはネガティブなアロステリックモジュレーター化合物は、オルソステリックアゴニスト化合物又はリガンド結合の効果を増強又は阻害する化合物又はリガンドをいうが、オルソステリックアゴニスト化合物又はリガンドの非存在下ではほとんど不活性である。アロステリック阻害又は受容体の活性の増強は、受容体の立体構造を調節することにより生じてよく、かつそれぞれ１）アゴニストに対するオルソステリック部位の親和性、２）オルソステリック結合活性化の効果（例えばエフィカシー）、又は３）ＧＰＣＲの場合にＧタンパク質への結合及びシグナル伝達効率の減少又は増加を改変しうる。
【００６２】
協同性因子は、アロステリックリガンドの存在によるオルソステリックリガンド結合効果の調節の程度の尺度をいう。
【００６３】
嗅覚受容体を阻害又は拮抗する本開示の化合物の能力は、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏで培養したニューロンアッセイを介して、又は関連する嗅覚受容体、例えばムスク嗅覚受容体を発現する細胞株を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを介して、当業者により容易に選択される任意の適した方法により決定されてよい。
【００６４】
阻害剤及び活性化剤のかかるアッセイは、例えば、細胞又は細胞膜におけるＯＲファミリーメンバーの発現、アゴニスト分子、例えばムスクの存在又は非存在下での推定モジュレーター化合物の適用、そして以下の実施例において記載したように嗅覚伝達に対する機能的効果の決定を含む。潜在的な阻害剤で処理されたＯＲファミリーメンバーを含む試料又はアッセイは、阻害の程度を試験するために、阻害剤を含まない対照試料と比較される。対照試料（阻害剤で処理されていないが、アゴニストで処理されている）は、１００％の相対最大ＯＲ活性値が割り当てられる。
【００６５】
嗅覚受容体活性アッセイは、以下のデータを示してよい：（ｉ）所与の化合物が嗅覚受容体の活性化物質であるかどうか、及び特定の嗅覚受容体についての化合物の特異性；（ｉｉ）嗅覚受容体のアゴニストのＥＣ50（すなわち、アゴニストのＥＣ50）；及び／又は（ｉｉｉ）応答の幅（すなわち、ベースラインと飽和活性レベルの間のスパン）によって決定される、嗅覚受容体についてのアゴニストのエフィカシー。
【００６６】
いくつかの態様において、ＯＲの増強された活性は、アゴニスト対照に対して標準化したＯＲ活性値（１００％）が、１００％より大きい、例えば約１１０％、任意に１２０％又は１５０％より大きい場合に得られる。一態様において、ＯＲの増強は、エンハンサー化合物の存在下でＯＲについてのアゴニストのポテンシーが増加する場合に得られる。一態様において、ポテンシーにおける増加は、アゴニストについてのＥＣ50におけるシフトによって決定される。代わりに、他の態様において、ＯＲの増強は、エンハンサー化合物の存在下でアゴニストのＥＣ50値が２倍〜３０倍減少する場合に得られる。一態様において、ＯＲの増強は、アゴニスト化合物のＥＣ50値が２倍減少する場合に得られる。他の態様において、ＯＲの増強は、エンハンサー化合物の存在下でアゴニストのＥＣ50値が３０倍減少する場合に得られる。
【００６７】
いくつかの態様において、ＯＲの増強は、エンハンサー化合物の存在下でＯＲアゴニストのエフィカシーがアゴニスト対照物に対して増加する場合に得られる。一態様において、ＯＲの増強は、エンハンサー化合物の存在下でアゴニストのエフィカシー値が１．０５倍〜２倍又はそれ以上増加する場合に得られる。一態様において、ＯＲの増強は、エンハンサー化合物の存在下でアゴニストのエフィカシー値が約１．０５倍増加する場合に得られる。他の態様において、ＯＲの増強は、エンハンサー化合物の存在下でアゴニストのエフィカシー値が約２倍増加する場合に得られる。
【００６８】
一態様において、ＯＲの阻害は、アゴニスト対照に対して標準化したＯＲ活性値（１００％）が、１００％未満、例えば約８０％、任意に５０％又は２５〜０％である場合に得られる。一態様において、ＯＲの阻害は、ＯＲについてのアゴニストのポテンシーが減少する場合に得られる。他の態様において、ポテンシーにおける減少は、アゴニストについてのＥＣ50におけるシフトによって決定される。一態様において、ＯＲの阻害は、アンタゴニスト化合物の存在下でアゴニストのＥＣ50値が約２倍〜３０倍増加する場合に得られる。一態様において、ＯＲの阻害は、アンタゴニスト化合物の存在下でアゴニストのＥＣ50値が２倍増加する場合に得られる。一態様において、ＯＲの阻害は、アンタゴニスト化合物の存在下でアゴニストのＥＣ50値が３０倍増加する場合に得られる。
【００６９】
いくつかの態様において、ＯＲの阻害は、アンタゴニスト化合物の存在下でＯＲアゴニストのエフィカシーが減少する場合に得られる。一態様において、ＯＲの阻害は、アンタゴニスト化合物の存在下でアゴニストのエフィカシー値が約１．２５倍〜４倍又はそれ以上減少する場合に得られる。一態様において、ＯＲの阻害は、アンタゴニスト化合物の存在下でアゴニストのエフィカシー値が０まで減少する場合に得られる。他の態様において、ＯＲの阻害は、アンタゴニスト化合物の存在下でアゴニストのエフィカシー値が１．２５倍減少する場合に得られる。一態様において、ＯＲの阻害は、アンタゴニスト化合物の存在下でアゴニストのエフィカシー値が４倍減少する場合に得られる。
【００７０】
ＯＲの相乗的に増強された活性は、アゴニストのみに曝された受容体の活性と比較した場合に、アゴニスト化合物とポジティブなアロステリックモジュレーター化合物との組み合わせの存在下で受容体の曝露によって増加する受容体の活性をいう。一態様において、相乗的に増強された活性は、ポテンシーにおいて約２倍〜３０倍の増加、及び／又はエフィカシーにおいて約１．０５倍〜１．５倍又はそれ以上の増加を含む。
【００７１】
「ＯＲ」又は「匂い物質受容体」又は「嗅覚受容体」ポリペプチドは、単一の〜１ｋｂの長いエキソンによってコードされる７回膜貫通ドメインＧタンパク質共役受容体スーパーファミリーに関係し、かつ特徴的な嗅覚受容体に特異的なアミノ酸モチーフを呈する場合に、そのように見なされる。７つのドメインは、３つの「内部細胞ループ」又は「ＩＣ」ドメインであるＩＣ Ｉ〜ＩＣ ＩＩＩ及び３つの「外部細胞ループ」又は「ＥＣ」ドメインであるＥＣ Ｉ〜ＥＣ ＩＩＩによって接続された「膜貫通」ドメイン又は「ＴＭ」ドメインであるＴＭ Ｉ〜ＴＭ ＶＩＩと呼ばれる。モチーフ及びそのバリアントは、これらに制限されないが、ＴＭ ＩＩＩ及びＩＣ ＩＩと重複するＭＡＹＤＲＹＶＡＩＣモチーフ（配列番号１５）、ＩＣ ＩＩＩ及びＴＭ ＶＩと重複するＦＳＴＣＳＳＨモチーフ（配列番号１６）、ＴＭ ＶＩＩにおけるＰＭＬＮＰＦＩＹモチーフ（配列番号１７）、並びにＥＣ ＩＩにおける３つの保存Ｃ残基、及びＴＭ Ｉにおける高保存ＧＮ残基の存在として定義される［Ｚｈａｎｇ， Ｘ． ＆ Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ， Ｓ． Ｎａｔ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ５， １２４−１３３ （２００２）； Ｍａｌｎｉｃ， Ｂ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０１， ２５８４−２５８９ （２００４）］。
【００７２】
「ＯＲ」核酸は、「Ｇタンパク質共役受容体活性」を有する７回膜貫通領域を有するＧＰＣＲファミリーをコードし、例えばそれらは、細胞外刺激に応答してＧタンパク質に結合し、かつ酵素、例えばホスホリパーゼＣ及びアデニル酸シクラーゼＩＩＩの刺激により細胞内セカンドメッセンジャー、例えばＩＰ３、ｃＡＭＰｃＧＭＰ、及びＣａ2+の産生を促進してよい。
【００７３】
「パラロガス」ＯＲ遺伝子又は「パラログ」は、遺伝子重複の結果物であり、同一種内で密接に関連する相同遺伝子をいう。
【００７４】
「オルソロガス」ＯＲ遺伝子又は「オルソログ」は、共通の祖先に存在する遺伝子によって系統学的に関連されるものとして定義され、他の種に密接に関連する相同遺伝子をいう。
【００７５】
「Ｎ末端ドメイン」領域は、ペプチド又はタンパク質のＮ末端（アミノ末端）で開始し、第一の膜貫通領域の始まりに近い領域まで伸長する。
【００７６】
「膜貫通領域」は、７つの「膜貫通ドメイン」を含み、これは原形質膜内にあるＯＲポリペプチドのドメインをいい、かつ対応する細胞質（細胞内）ループ及び細胞外ループも含みうる。７つの膜貫通領域並びに細胞外ループ及び細胞質ループは、標準的な方法、例えば疎水性プロファイル、又はＫｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７：１０５−３２ （１９８２）においてもしくはＳｔｒｙｅｒにおいて記載される方法を使用して同定されうる。膜貫通ドメイン、特にＧタンパク質共役受容体の、例えば嗅覚受容体の７回膜貫通ドメインの一般的な二次構造及び三次構造は、当該技術分野において公知である。したがって、一次構造配列は、以下で詳細に記載されるように、公知の膜貫通ドメイン配列に基づいて予測されうる。これらの膜貫通ドメインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏリガンド結合アッセイに有用である。
【００７７】
ＯＲファミリーメンバー媒介嗅覚伝達を調節する化合物を試験するためのアッセイの記載内容における「機能的効果」という語句は、受容体の影響下で間接的又は直接的にある任意のパラメータ、例えば機能的、物理的及び化学的効果の決定を含む。それは、リガンド結合、イオンフラックスの変化、膜電位、電流、転写、Ｇタンパク質結合、ＧＰＣＲリン酸化又は脱リン酸化、シグナル伝達受容体−リガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃度（例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ3、又は細胞内Ｃａ2+）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、及びｅｘ ｖｉｖｏを含み、かつ他の生理学的効果、例えば神経伝達物質もしくはホルモン放出の増加又は減少も含む。
【００７８】
アッセイの記載内容における「機能的効果の決定」又は「活性の確認」に関しては、ＯＲファミリーメンバーの影響下での間接的又は直接的なパラメータ、例えば機能的、物理的及び化学効果を増加又は減少する化合物についてのアッセイを意味する。かかる機能的効果は、当業者に公知の任意の手段、例えば、分光学的特性（例えば蛍光、吸光度、屈折率）における変化、流体力学（例えば形状）、クロマトグラフィー、又は溶解特性、パッチクランプ、電圧感受性色素、全細胞電流、放射性同位体流出、誘導マーカー、卵母細胞ＯＲ遺伝子発現；組織培養細胞ＯＲ発現；ＯＲ遺伝子又は活性誘導遺伝子、例えばｅｇｒ−１もしくはｃ−ｆｏｓの転写活性化；リガンド結合アッセイ；電圧、膜電位及びコンダクタンス変化；イオンフラックスアッセイ；細胞内セカンドメッセンジャー、例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）における変化；細胞内カルシウムレベルにおける変化；神経伝達物質の放出等により測定されうる。
【００７９】
本明細書において使用される「精製された」、「実質的に精製された」、及び「単離された」の用語は、本発明の化合物が通常その天然の状態で会合している他の異なる化合物を有さない状態を言い、そのため、「精製された」、「実質的に精製された」、及び「単離された」対象物は、所与の試料の質量の少なくとも０．５質量％、１質量％、５質量％、１０質量％もしくは２０質量％、又は少なくとも５０質量％もしくは７５質量％を含む。特定の一実施形態において、これらの用語は、所与の試料の少なくとも９５質量％、９６質量％、９７質量％、９８質量％、９９質量％又は１００質量％の質量を含む本発明の化合物をいう。本明細書において使用されるように、核酸又はタンパク質に関する場合に、「精製された」、「実質的に精製された」、及び「単離された」核酸又はタンパク質の用語は、天然に哺乳動物、特にヒトの身体で生じるものとは異なる精製又は濃縮された状態もいう。（１）他の関連する構造もしくは化合物からの精製又は（２）哺乳動物、特にヒトの身体において通常会合しないものに対する構造又は化合物との会合、を含む、哺乳動物、特にヒトの身体において天然に生じるものよりも大きい精製又は濃縮の任意の程度は、「単離された」の意味の範囲内である。本明細書において記載される核酸もしくはタンパク質又は核酸もしくはタンパク質の種類は、当業者に公知の種々の方法及びプロセスに従って単離されてよく又はそうでなければ通常天然に会合していないものに対する構造又は化合物と会合されてよい。
【００８０】
本明細書において使用されるように、「増幅している」及び「増幅」の用語は、以下に詳細に記載されるように、天然に発現された核酸の組換えを生じる又は検出するための任意の適した増幅方法の使用を言う。例えば、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで天然に発現されたもの（例えばゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ）又は本発明の組換え（例えばｃＤＮＡ）核酸を（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって）増幅するための方法及び試薬（例えば、特異的縮重オリゴヌクレオチドプライマー対、オリゴｄＴプライマー）を提供する。
【００８１】
「７回膜貫通受容体」という用語は、７回原形質膜を貫通する７つのドメインを有する膜貫通タンパク質のスーパーファミリーに属するポリペプチドを意味する（したがって、７つのドメインは「膜貫通」又は「ＴＭ」ドメインであるＴＭ Ｉ〜ＴＭ ＶＩＩと呼ばれる）。嗅覚及び特定の味覚受容体のファミリーは、それぞれこのスーパーファミリーに属する。７回膜貫通受容体ポリペプチドは、以下でさらに詳細に議論されるように、類似の特徴的な一次、二次及び三次構造を有する。
【００８２】
「核酸」又は「核酸配列」という用語は、一本鎖又は二本鎖の形でのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドをいう。この用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを包含する。この用語は、合成骨格を有する核酸様構造も包含する。特に明記されない限り、特定の核酸配列は、それらの保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）及び相補配列、並びに明確に示された配列も暗黙的に包含する。具体的に、縮重コドン置換は、例えば、１つ以上の選択されたコドンの３番目の位置を混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換した配列を生成することによって達成されてよい。
【００８３】
本明細書に開示された配列において示されている遺伝子配列に加えて、バリアントが所与の集団内に存在してよいＤＮＡ配列多型も含み、本明細書に開示されるポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらしうることは、当業者に明白であろう。かかる遺伝的多型は、異なる集団からの細胞中に又は天然の対立遺伝子変異による集団内に存在しうる。対立遺伝子バリアントは機能的等価物を含んでもよい。
【００８４】
さらなる実施形態は、具体的に開示された核酸からかかる配列多型によって誘導された分子にも関する。これらの自然変異は、通常、本明細書に開示された遺伝子のヌクレオチド配列又はポリペプチドのアミノ酸配列において約１〜５％の変動をもたらす。前記のように、本明細書における実施形態のポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記載された方法で使用されることが意図される非ヒト宿主生物又は宿主細胞を改質するために有用な手段である。
【００８５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、天然に生じるアミノ酸又はポリマー及び天然に生じないアミノ酸又はポリマーを含むかどうかにかかわらず、アミノ酸残基のポリマーをいう。核酸の一部に関連して使用される場合に「異種」という用語は、核酸が、天然に互いに同一の関係で見られない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換えにより産生され、それは新たな機能的核酸、例えばある供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコード領域を作成するように配置された無関係の遺伝子からの２つ以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が天然に互いに同一の関係で見られない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば融合タンパク質）。
【００８６】
「プロモーター」は、核酸の転写を指示する核酸配列のアレイとして定義される。明細書で使用されるように、プロモーターは、転写の開始部位に近い必要な核酸配列、例えばポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合にＴＡＴＡエレメントを含む。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対も離れて配置されうる遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントも任意に含む。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境及び発達条件下で活性のあるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境又は発達の制御下で活性のあるプロモーターである。「操作可能に連結された」という用語は、核酸発現制御配列（例えばプロモーター、又は転写因子結合部位のアレイ）と第二の核酸配列との間の機能的連結をいい、その際、発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００８７】
本明細書において使用される「組換え」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成又はそうでなければ操作されるポリヌクレオチド（例えば「組換えポリヌクレオチド」）、組換えポリヌクレオチドを使用して細胞又は他の生物系において遺伝子産物を製造する方法、又は組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）をいう。「組換え」は、本発明の転座ドメインを含む融合タンパク質の発現及びプライマーを使用して潜在的に増幅された核酸配列の発現、例えば誘導性発現又は構成的発現のための発現カセット又は発現ベクターへの、異なる供給源から種々のコード領域又はドメイン又はプロモーター配列を有する核酸の連結も意味する。「組換え」は、内因性遺伝子、例えば本明細書で言及する受容体遺伝子の安定な発現又は一過性発現をもたらす細胞のゲノム編集技術、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって得られる改変も意味する。
【００８８】
「発現ベクター」という用語は、原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫又は哺乳動物の細胞を含む任意の細胞において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで構成的又は誘導的に本発明の核酸配列を発現する目的の任意の組換え発現系をいう。前記用語は、制限されることなく、ウイルスベクター、バクテリオファージ及びプラスミドを含む、任意の線状又は環状の発現系を含む。当業者は、発現系に従って適したベクターを選択することができる。前記用語は、エピソームのままであるか、又は宿主細胞ゲノムに組み込まれる発現系を含む。発現系は、自己複製する能力を有するか、又は自己複製しない、すなわち細胞内で一過性の発現を操作する能力を有しうる。前記用語は、組換え核酸の転写に必要な最小限のエレメントを含みうる組換え「発現カセット」を含む。前記用語は、例えばゲノム編集方法、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した内因性遺伝子の発現のためのカセット又はベクターも対象とする。
【００８９】
「非ヒト生物又は宿主細胞」に関しては、本明細書において記載される核酸又は発現ベクターを含み、かつ発現ベクターの複製又は発現を支持する非ヒト生物又は細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌（E. coli）、又は真核細胞、例えば酵母、昆虫、両生類、又は哺乳動物の細胞、例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３等、例えば培養細胞、外植片、及びｉｎ ｖｉｖｏでの細胞であってよい。
【００９０】
「タグ」又は「タグの組み合わせ」に関しては、匂い物質受容体タンパク質に付加されうる短いポリペプチド配列を意味する。典型的に、「タグ」又は「タグの組み合わせ」をコードするＤＮＡは、最終的に「タグ」又は「タグの組み合わせ」が受容体のＮ末端又はＣ末端に融合する融合タンパク質をもたらす受容体をコードするＤＮＡに付加される。Ｌｕｃｙタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ及び／又はＲｈｏタグは、細胞膜への受容体輸送を強化することができ、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースのアッセイのための機能的匂い物質受容体の発現を支援しうる［Ｓｈｅｐａｒｄ， Ｂ．ら ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８， ｅ６８７５８−ｅ６８７５８ （２０１３）、及びＺｈｕａｎｇ， Ｈ．＆Ｍａｔｓｕｎａｍｉ， Ｈ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８２， １５２８４−１５２９３ （２００７）］。
【００９１】
特定の実施形態
本明細書において記載されるアッセイ及び方法は、関連するヒト嗅覚受容体及び／又は対応するマウスオルソログを化合物の群からの１つ以上の化合物の同定のためのアッセイ及び方法において使用し、その際１つ以上の化合物は、アゴニスト匂い物質化合物により誘発される嗅覚受容体の活性をポジティブに調節し、アゴニストは、香料に対して特に重要であり、かつ標的受容体とそのアゴニストと１つ以上の化合物との組み合わせが、スクリーニングアッセイ又は方法において使用される。
【００９２】
本開示は、それぞれ、所望のフレグランス又は標的アゴニストを調節、すなわち増強するために香料適用において使用されうる化合物、例えば、ムスク又はフローラル化合物、例えばムスコンもしくはフローラルミュゲ化合物を同定することを提供する。いくつかの態様において、標的アゴニストを増強する揮発性化合物は、標的アゴニスト嗅覚受容体のポジティブなアロステリックモジュレーターである。特定の理論に制限することはないが、香料成分間の相乗的相互作用は、香料の調香のより感受性がありより強い知覚を導きうる。したがって、かかる化合物は、香料の規則を最適化し、より優れた性能の商業香料配合物を作成する新たなルートを可能にする。
【００９３】
一実施形態において、ヒト嗅覚受容体ＯＲ５ＡＮ１及び／又はその対応するマウスオルソログＯｌｆｒ１４４０は、ムスクアゴニスト化合物の存在下で受容体の活性を調節する化合物を同定するために、種々のムスクアゴニスト化合物によって活性化される受容体として使用される。ヒト嗅覚受容体ＯＲ５ＡＮ１及びその対応するマウスオルソログＯｌｆｒ１４４０は、アミノ酸レベルで約６６％の配列同一性を有する。
【００９４】
一実施形態において、ムスク化合物に対する感覚の結果とＯＲ５ＡＮ１の応答との相関関係に関して、ＯＲ５ＡＮ１は、これらのムスク化合物のポジティブなアロステリックモジュレーターをスクリーニング及び選択するためのアッセイ及び方法において使用するための、特定のムスク、すなわち大環状ケトン及びニトロムスクによって活性化される関連標的受容体として選択される。
【００９５】
他の実施形態において、ヒト嗅覚受容体ＯＲ１０Ｊ５及び／又はその対応するマウスオルソログＯｌｆｒ１６は、フローラルミュゲアゴニスト化合物の存在下で受容体の活性を調節する化合物を同定するために、種々のフローラルミュゲアゴニスト化合物についての受容体として使用される。ヒト嗅覚受容体ＯＲ１０Ｊ５及びその対応するマウスオルソログＯｌｆｒ１６は、アミノ酸レベルで約８７％の配列同一性を有する。
【００９６】
ＯＲ１０Ｊ５及びその対応するマウスオルソログＯｌｆｒ１６のフローラルミュゲ化合物誘発活性は、フローラル、ドイツスズラン、ヒドロキシシトロネラール匂いノート、及び非常によく知られている成分である３−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル）シクロヘキセ−３−エン−１−カルバルデヒド、４−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル）シクロヘキセ−３−エン−１−カルバルデヒド又はそれらの混合物（商標名ＬＹＲＡＬ（登録商標）で販売される、以降「ＬＹＲＡＬ（登録商標）」という）の１つの強く残っている全体の嗅覚特性の知覚の感覚結果と相互に関係がある。
【００９７】
フローラルミュゲ化合物は、これに制限されないがリラール（lyral）化合物を含む、ドイツスズランのようなノート又はミュゲフローラルノートを付与するある化合物をいう。
【００９８】
フローラルミュゲ化合物の例は、これらに制限されないが、国際公開番号第２０１７／００９１７５号（WO2017/009175 A1）、又は国際公開番号第２０１０／０９１９６９号（WO2010/091969 A1）、又は国際公開番号第２０１１／０２９７４３号（WO2011/029743 A1）、又は国際公開番号第２０１８／１３４２２１号（WO2018/134221 A1）、又は国際公開番号第２００８／０６８３１０号（WO2008/068310 A1）、又は国際公開番号第２０１４／１９８７０９号（WO2014/198709 A1）、又は国際公開番号第２０１３／１１７４３３号（WO2013/117433 A1）、又は国際公開番号第２０１４／１８０９４５号（WO2014/180945 A1）、又は国際公開番号第２０１４／１８０９５２号（WO2014/180952 A1）、又は国際公開番号第２０１６／０７４１１８号（WO2016/074118 A1）、又は国際公開番号第２０１６／０７４６９７号（WO2016/074697 A1）、又は国際公開番号２０１６／０７４７１９第号（WO2016/074719 A1）、又は国際公開番号第２０１４／１８０９５２号（WO2014/180952 A1）、又は国際公開番号第２００１／０９００３８号（WO2001/090038 A1）、又は国際公開番号第２００８／０５３１４８号（WO2008/053148 A1）、又は国際公開番号第２０１７／０６６２１４号（WO2017/066214 A1）において開示された化合物を含む。
【００９９】
フローラルミュゲ化合物の他の例は、これらに制限されないが、米国特許出願番号第２０１３／００９０３９０号（US2013/0090390 A1）、又は米国特許出願番号第２０１１／０１１７０４６号（US2011/0117046 A1）、又は米国特許出願番号第２０１１／０１１８１７０号（US2011/0118170 A1）、又は米国特許出願番号第２００９／００３６３４７号（US2009/0036347 A1）、又は米国特許出願番号第２０１１／０２１７２５７号（US2011/0217257 A1）において開示される化合物を含む。
【０１００】
フローラルミュゲ化合物の他の例は、これらに制限されないが、米国特許番号第５，５２７，７６９号（5,527,769 A）、又は米国特許番号第７，８３４，２１９号（7,834,219 B1）、又は米国特許番号第２，７１０，８２５号（2,710,825 A）、又は米国特許番号第４，３５２，９３７号（4,352,937 A）において開示される化合物を含む。
【０１０１】
フローラルミュゲ化合物の他の例は、これらに制限されないが、欧州特許出願番号第２５９４６２６号（EP2594626 A1）、又は欧州特許出願番号第０３９２２５８号（EP0392258 A2）、又は欧州特許出願番号第２３２２４９５号（EP2322495 A1）、又は欧州特許出願番号１０２９８４５第号（EP1029845 A1）、又は欧州特許出願番号第１０５４０５３号（EP1054053 A2）、又は欧州特許出願番号第１５２９７７０号（EP1529770 A1）において開示される化合物を含む。
【０１０２】
フローラルミュゲ化合物の他の例は、これらに制限されないが、欧州特許番号第２５９４６２６号（EP2594626 B1）、又は欧州特許出願第６８５４４４号（EP685444 B1）、又は欧州特許番号第２５９４６２６号（EP2594626 B1）において開示される化合物を含む。
【０１０３】
フローラルミュゲ化合物の他の例は、これらに制限されないが、英国特許出願番号第２５２８４６７号（GB2528467 A）、又は英国特許出願番号第９８８５０２号（GB988502 A）、又は英国特許出願番号第１０５７３６０号（GB1057360 A）、又は英国特許出願番号第２５２９９０１号（GB2529901 A）において開示される化合物を含む。
【０１０４】
フローラルミュゲ化合物の他の例は、これらに制限されないがＬａｍｂｏｌｅｙら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ Ｆｌｏｒａｌ−Ｔｙｐｅ Ｏｄｏｒａｎｔｓ， Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， ｖｏｌ． ８４， ｐｐ１７６７−１７９３ （２００４）において開示される化合物を含む。
【０１０５】
フローラルミュゲ化合物の他の例は、これらに制限されないがＳｃｈｒｏｅｄｅｒら、 γ−Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｌｉｌｉａｌ Ｒｅｐｌａｃｅｒｓ， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ & Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｖｏｌ． １１， ｐｐ１６５１−１６７３ （２０１４）において開示される化合物を含む。
【０１０６】
フローラルミュゲ化合物の他の例は、これらに制限されないがＳｋｏｕｒｏｕｍｏｕｎｉｓら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ １，３，４，５−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２−ｂｅｎｚｏｘｅｐｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ Ｃｙｃｌａｍｅｎａｌｄｅｈｙｄｅ−Ｔｙｐｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ａｓ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ｏｄｏｕｒ−Ａｃｔｉｖｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ， Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， ｖｏｌ． ７９， ｐｐ１０９５−１１０９ （１９９６）において開示される化合物を含む。
【０１０７】
フローラルミュゲ化合物の他の例は、これらに制限されないがＷｉｎｔｅｒら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｏｄｏｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｉｎｄａｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅｓ． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａ Ｎｅｗ Ｆｌｏｒａｌ （Ｍｕｇｕｅｔ） Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ａｌｃｏｈｏｌ， Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，  ｖｏｌ．  ８８，  ｐｐ３１１８−３１２７  （２００５）において開示される化合物を含む。
【０１０８】
フローラルミュゲ化合物の他の例は、これらに制限されないが、Ｃｏｕｌｏｍｂ， Ｊ， Ｂｅｙｏｎｄ Ｍｇｕｅｔ， Ｐｅｒｆｕｍｅ ａｎｄ Ｆｌａｖｏｒｉｓｔ， ｖｏｌ． ４３ （２０１８）において開示される化合物を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、フローラルミュゲ化合物は、３（４）−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル）シクロヘキセ−３−エン−１−カルバルデヒド、４（４）−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル）シクロヘキセ−３−エン−１−カルバルデヒド又はそれらの混合物；（４Ｚ）−９−ヒドロキシ−５，９−ジメチル−４−デセナール（Ａ）＋（４Ｅ）−９−ヒドロキシ−５，９−ジメチル−４−デセナール；３−［４−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチルフェニル］プロパナール；３−［４−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）フェニル］プロパナール；（＋−）−３−［４−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）フェニル］−２−メチルプロパナール；（＋−）−４−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル）−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルバルデヒド；（２，５−ジメチル−２−インダニル）メチルホルメート；（２，５−ジメチル−１，３−ジヒドロインデン−２−イル）メタノール；（２，５，６−トリメチル−１，３−ジヒドロインデン−２−イル）メタノール；（２，４，６−トリメチル−１，３−ジヒドロインデン−２−イル）メタノール；４−メチル−２−（２−メチルプロピル）オキサン−４−オール；７−ヒドロキシ−３，７−ジメチルオクタナール；並びにそれらの混合物からなる群から選択される。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、フローラルミュゲ化合物は、ＬＹＲＡＬ（登録商標）を含んでよく、及び／又は以下の商標名ＬＹＲＡＬ（登録商標）、ＫＯＶＡＮＯＬ（登録商標）、ＭＵＧＯＮＡＬ（登録商標）及びＬＡＮＤＯＬＡＬ（登録商標）で販売されていてよい化合物、例えば３（４）−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル）シクロヘキセ−３−エン−１−カルバルデヒド、４（４）−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル）シクロヘキセ−３−エン−１−カルバルデヒド又はそれらの混合物を含んでよい。
【０１１１】
この方法は、他の関連の標的受容体及びアゴニスト（例えば香料に対して特に重要なアゴニスト）と共に、これらの標的受容体の鍵となるアゴニストの潜在的なポジティブなアロステリックモジュレーターを同定するために使用されうる。
【０１１２】
一実施形態において、配列番号１、３、５又は７、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む単離された核酸分子が本明細書において提供される。
【０１１３】
一実施形態において、配列番号２、４、６、又は８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列が本明細書において提供される。
【０１１４】
さらなる実施形態において、配列番号２、４、６、又は８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが本明細書において提供される。
【０１１５】
一実施形態において、非ヒト生物又は宿主細胞は、形質転換されて、配列番号２、４、６、又は８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する。
【０１１６】
一実施形態において、非ヒト生物又は宿主細胞は、形質転換されて、配列番号２、４、６、又は８と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する。
【０１１７】
さらに、配列番号２、４、６、又は８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターが本明細書において提供される。
【０１１８】
配列番号１、３、５又は７、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸を含む発現ベクターも本明細書において提供される。
【０１１９】
本明細書において、配列番号１、３、５又は７、又はそれらの逆相補体と同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を有する発現ベクターも提供される。
【０１２０】
ＯＲは、１つのアゴニストに特異的であってよく、又は構造的に異なるアゴニストのパネルによって、もしくは類似構造を有するアゴニストのパネルによって活性化されてよい。アゴニストは、単一のＯＲを特異的に活性化することもでき、又は複数のＯＲを活性化してよい。本明細書において記載されるアッセイ又は方法を実施するための最初のステップとして、適切な受容体アゴニスト対が同定及び選択される。一態様において、かかる受容体アゴニストは、好ましくは香料組成物を設計するために特に興味深い。
【０１２１】
例えば、図１及び実施例１を参照して、嗅覚受容体ＯＲ５ＡＮ１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのムスク誘発性活性がムスク知覚の感覚結果と相関するヒト嗅覚受容体である。ＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体は、ムスク化合物であるムスコン、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）、ムスクキシロール、及びムスクケトンによって特異的に活性化され、観察された活性レベル、すなわちポテンシー及びエフィカシーのランキングは、感覚レベルで個々で相関した（図１）。したがって、ＯＲ５ＡＮ１活性のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイは、同定された化合物の推定感覚結果に関して予測力を有しており、したがってＯＲ５ＡＮ１はムスク指向性受容体ベースの増強についての良好な標的を示す。
【０１２２】
本明細書に記載される方法及びアッセイで試験されるべき試験物質は特に制限されない。試験物質は、天然に生じる物質又は化学的もしくは生物学的に合成された人工物質であってよい。試験物質は、化合物又は化合物の混合物であってよい。
【０１２３】
図６に関して、α−β−モノ−不飽和二置換脂肪族アルデヒドが、ＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体の活性の潜在的な増強を示すことが体系的に見出された。
【０１２４】
したがって、本明細書において提示された一態様は、以下の構造：
【化３】
2021508030.tif 000004
［式中、Ｒは、任意にＣ1-4アルキルカルボキシルエステル基又はヒドロキシル基で置換されているＣ3-11直鎖アルキル基、任意にＣ1-3アルコキシ基で置換されているＣ4-11分枝鎖アルキル基、Ｃ6-12直鎖もしくは分枝鎖アルケニル又はアルカジエニル基、１つ又は２つのＣ1-3アルキル基により置換されているフェニル基、Ｃ5-8脂環式アルケニル基、又はベンジルオキシメチル基である］をその立体異性体のいずれか１つ又はそれらの混合物の形で有するポジティブなアロステリックモジュレーターを提供し、ここで式（Ｉ）の化合物は、ムスク嗅覚受容体のポジティブなアロステリックモジュレーターである。
【０１２５】
明確性の理由から、「その立体異性体のいずれか１つ」という表現又は同様の表現は、当業者によって理解される通常の意味、すなわち本発明の化合物が、純粋なエナンチオマー（キラルの場合）又はジアステレオマー（例えば、二重結合が立体配座Ｅ又はＺである）であってよいことを意味する。
【０１２６】
いくつかの態様において、式（Ｉ）の化合物は、（Ｅ，Ｅ）−２，４−デカジエナール、（Ｅ）−２−ウンデセナール、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナール、（Ｅ）−２−トリデセナール、（２Ｅ）−２−ドデセナール、（２Ｅ，６Ｚ）−２，６−ノナジエナール、（Ｅ，Ｅ）−２，６−ノナジエナール、（２Ｅ）−２，４−ウンデカジエナール、（２Ｅ）−２，４−ドデカジエナール、（Ｅ）−２−ノネナール、（２Ｅ，４Ｅ，７Ｚ）−デカトリエナール、（Ｚ）−２−デセナール、（Ｅ）−２−オクテナール、（Ｅ）−２−デセナール、（Ｚ）−４−（ベンジルオキシ）ブテ−２−エナール、（Ｅ）−４−（ベンジルオキシ）ブテ−２−エナール、（Ｅ）−４−シクロヘキシリデンブテ−２−エナール、（２Ｅ）−３−（４−メチルフェニル）−２−プロペナール、（２Ｅ，５Ｅ）−６，１０−ジメチル−２，５，９−ウンデカトリエナール、（２Ｅ）−７，８−ジメチル−２，７−ノナジエナール、メチル（５Ｅ）−７−オキソ−５−ヘプテノエート、（２Ｅ）−７−メチル−２，６−オクタジエナール、（２Ｅ）−６，６−ジメチル−２−ヘプテナール、（＋−）−（２Ｅ）−５，９−ジメチル−２，８−デカジエナール、（Ｅ）−２−テトラデセナール、及び（Ｅ）−８−メトキシ−４，８−ジメチルノネ−２−エナールからなる群から選択される。
【０１２７】
一態様において、受容体はＯＲ１０Ｊ５であり、アゴニスト匂い物質化合物は、フローラルミュゲ化合物を含み、かつ選択される化合物は、オクタナール；（Ｅ）−デセ−２−エナール、２−フェニルプロパナール；（Ｅ）−ブテ−２−エナール；３−メチルベンズアルデヒド；３−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−２−メチルプロパナール；（＋−）−３−（４−メチル−３−ペンテン−１−イル）−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、（＋−）−４−（４−メチル−３−ペンテン−１−イル）−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、及びそれらの混合物；ヘプタナール、４−プロパン−２−イルベンズアルデヒド；（３Ｒ）−３，７−ジメチルオクテ−６−エナール；（＋）−（３Ｓ）−３−［（１Ｒ）−４−メチル−３−シクロヘキセン−１−イル］ブタナール、（＋）−（３Ｒ）−３−［（１Ｒ）−４−メチル−３−シクロヘキセン−１−イル］ブタナール、及びそれらの混合物；ヘキサナール；２，６−ジメチルヘプテ−５−エナール；ベンズアルデヒド；２−メチル−３−（４−メチルフェニル）プロパナール；３，５，６−トリメチル−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、２，４，６−トリメチル−３−シクロヘキセン−１−カルバルデヒド、及びそれらの混合物；４−エチルベンズアルデヒド；６−メトキシ−２，６−ジメチルヘプタナール；（Ｅ）−ノネ−２−エナール；並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのポジティブなアロステリックモジュレーターを含む。
【０１２８】
一態様において、ポジティブなアロステリックモジュレーターは、受容体アゴニスト（活性化化合物）とは無関係に特定の受容体の活性を特異的に増強する。
【０１２９】
ＯＲ活性のモニタリング方法
ＯＲの機能が損なわれない限り、本明細書において記載される方法又はアッセイにおいて任意の形態で使用されてよい。例えば、以下のようなＯＲが使用されてよい：生体及びそれらの培養産物から単離されたＯＲ、例えば嗅覚ニューロンを本質的に発現する組織又は細胞細胞；ＯＲを有する嗅覚細胞膜；ＯＲ及びそれらの培養産物を発現するように遺伝子改変された組換え細胞；組換え細胞の膜；並びにＯＲを保有する人工脂質二重膜。
【０１３０】
さらなる実施形態において、嗅覚受容体の活性をモニタリングするための指示薬は、蛍光カルシウム指示薬色素、カルシウム指示薬タンパク質（例えば、ＧｃａＭＰ、遺伝的にコードされたカルシウム指示薬）、蛍光ｃＡＭＰ指示薬、細胞動員アッセイ、細胞動的質量再分布アッセイ、無標識細胞ベースのアッセイ、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）媒介レポータータンパク質、生化学的ｃＡＭＰ ＨＴＲＦアッセイ、ベータアレスチンアッセイ、又は電気生理学的記録から選択される。特に、嗅覚ニューロンの膜上で発現する嗅覚受容体の活性をモニタリングするために使用できるカルシウム指示薬色素（例えばＦｕｒａ−２ ＡＭ）が選択される。
【０１３１】
特定の実施形態において、化合物を連続的にスクリーニングし、カルシウム色素蛍光での匂い物質依存性の変化を、蛍光顕微鏡又は蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用して測定する。
【０１３２】
さらなる実施形態において、嗅覚受容体の分子３Ｄ受容体モデリングを使用して、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの結合能を評価し、そして嗅覚受容体の活性を活性化、模倣、遮断、阻害、調節、及び／又は増強しうる化合物を同定する。
【０１３３】
例えば、標的アゴニスト、例えばムスク又はフローラル化合物によって活性化された嗅覚ニューロンは、マイクロマニピュレーターに取り付けられたガラス微小電極又はＦＡＣＳ機器を使用して単離される。マウス嗅覚ニューロンは、前記した手順と同様のＣａ2+画像化によってスクリーニングされる［Ｍａｌｎｉｃ， Ｂ．ら。Ｃｅｌｌ ９６， ７１３−７２３（１９９９）；Ａｒａｎｅｄａ， Ｒ． Ｃ． ら、Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５５５， ７４３−７５６（２００４）；及び国際公開番号第２０１４／２１０５８５号、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする］。特に、電動可動顕微鏡ステージを使用して、スクリーニングできる細胞数を実験ごとに少なくとも１５００個まで増加する。マウスにおいて約１２００個の異なる嗅覚受容体があり、かつそれぞれの嗅覚ニューロンが１２００個の嗅覚受容体遺伝子の１個のみを発現するため、このスクリーニング能力は、実質的に全体のマウスの匂い物質受容体レパートリーをカバーする。言い換えれば、ハイスループット嗅覚ニューロンスクリーニングのためのカルシウム画像化の組み合わせは、匂い物質の特定のプロフィールに応答するほぼ全ての匂い物質受容体の同定を導く。特定の態様において、標的アゴニスト、例えばムスク又はフローラル化合物に応答する匂い物質受容体を単離してよい。例えば、少なくとも１つのニューロンが単離される。
【０１３４】
嗅覚ニューロンのカルシウム画像化のために、主な嗅覚上皮は、ニューロン解離の前にマウスから切開してよい。そして、切開された嗅上皮を、機械的及び酵素的解離のために解離緩衝液に移してよい。そして、解離したニューロンを、カバーガラスに播種して、蛍光顕微鏡による数千の細胞のスクリーニングを可能にし、そして細胞を、カルシウム感受性色素（Ｆｕｒａ−２ ＡＭ）で例えば３１℃で約３０分間ロードし、スクリーニングの準備ができた顕微鏡に移してよい。細胞は、解離した嗅覚ニューロン上で（生理食塩水中の）匂い物質の希釈溶液を灌流することにより刺激される。悪臭化合物に応答するまばらな細胞を、例えば、５０μＭの悪臭化合物で受容体を刺激し、そしてＦｕｒａ−２蛍光の変化によって示される細胞内Ｃａ2+流をモニタリングすることにより同定する。分析後に、応答している細胞を、吸引マイクロピペットを使用してガラス製カバーガラスから回収してよい。そして、単離された細胞を、１つの試料にプールするか、又は応答細胞でｍＲＮＡとして発現させた匂い物質受容体遺伝子の同定のために個別に処理する。
【０１３５】
特定の実施形態において、嗅覚ニューロンのｍＲＮＡは、Ｍａｒｋｏ， Ｎ． Ｆ．ら（（２００５）Ａ ｒｏｂｕｓｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｎｓｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ． ＢＭＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ６， ２７； ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１６４−６−２７（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ法））において一般的に記載されている方法に従って精製及び増幅される。トランスクリプトームの少なくとも一部（トランスクリプトーム全体を含む）は、次世代シーケンス（ＮＧＳ）技術を使用して配列決定されるか、又はマイクロアレイ技術を使用して公知の遺伝子にハイブリダイズされる。ＮＧＳは、一般にＭｅｔｚｋｅｒ， Ｍ． Ｌ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １１， ３１−４６（２０１０）において議論及び記載されている。特定の実施形態において、同一の応答プロフィールを提示する最低５個のニューロンがプールされる。ｍＲＮＡは、ピッキング直後に細胞溶解により放出される；ＤＮＡｓｅ及び精製ステップは実施されない。ｍＲＮＡは、２回の連続したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって増幅される。増幅を、ＭｅｓａｇｅＡｍｐＩＩ ａＲＮＡキット（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭＡ１７５１）に従って、次のパラメータ：連続１４時間のＩＶＴを２ラウンド、を使用して行ってよい。
【０１３６】
さらなる実施形態において、単一の嗅覚ニューロンのｍＲＮＡを、ＬＤ−ＰＣＲ（長距離ポリメラーゼ連鎖反応）ベースの方法、例えば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のためのＮＧＳ−ｒｅａｄｙキットにおいて記載されるもの（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ、シーケンス用ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ−ｖ３，ｃａｔ．６３４８４８）で精製及び増幅させる。単一細胞のｍＲＮＡを、最初に対応するｃＤＮＡに逆転写し、その後１８ ＰＣＲサイクルで増幅させ、そしてトランスクリプトームシーケンシングのためのＮＧＳ試料として提供する。
【０１３７】
さらに他の実施形態において、標的アゴニスト、例えばムスク又はフローラル化合物についての嗅覚受容体の群又は遺伝子ファミリーの同一性を、単離された活性化嗅覚ニューロンから得られたＮＧＳリードの結果を同一種の参照ゲノム配列と比較することにより決定する（例えば、採集したニューロンの数まで）。特に、標的アゴニスト、例えばムスク又はフローラル化合物の推定される受容体は、嗅覚ニューロン由来のＮＧＳ試料中の又は１超の独立した生物学的複製に存在する、最も豊富な嗅覚受容体ｍＲＮＡである。嗅覚コードの組み合わせの性質（１つの化合物が多くのＯＲを活性化し、かつ１つのＯＲが多くの化合物によって活性化される）のため、所与の化合物によって活性化されたいくつかのニューロンのプールは、単一のＮＧＳ実験におけるこれらの分子の知覚に関与する実質的に全ての受容体の検索を可能にする。したがって、機能的に類似したニューロンのプールは、脱オーファン化のスループット及び速度を大幅に改善する。
【０１３８】
続いて、標準的な生物情報学的ツールを使用して、相同配列受容体が同様の機能を保持しているという仮定の下で、標的アゴニスト、例えばムスク又はフローラル化合物について他の推定上の哺乳動物（非ヒト）受容体に最も密接に関連するヒト匂い物質受容体を同定する。いくつかの方法は、この仮定に基づいてヒトＯＲリガンド対を正しく同定し［Ａｒｍｅｌｉｎ−Ｃｏｒｒｅａ ａｎｄ Ｍａｌｎｉｃ（２０１７）］、マウス−ヒトオルソログの最大８０％が同様の機能的応答プロフィールを維持していると思われる［Ａｄｉｐｉｅｔｒｏ， Ｋ． Ａら、 ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ． ８， ｅ１００２８２１−ｅ１００２８２１（２０１２）］。ＢＬＡＳＴＰ及び／又はＢＬＡＳＴＮアルゴリズムのデフォルトパラメータ、又は他のオルソログ対同定アルゴリズム、例えばＩｎＰａｒａｎｏｉｄを使用してよい。
【０１３９】
標的アゴニスト、例えばムスク又はフローラル化合物についてのヒト又はは非ヒト哺乳動物の受容体は、嗅覚受容体の活性化を結合、抑制、遮断、阻害、及び／又は調節する化合物を同定するために使用されうる機能アッセイに適合されてよい。特に、アッセイは、細胞ベースのアッセイ又は結合アッセイであってよく、かつ化合物を同定する方法は、ハイスループットスクリーニングアッセイであってよい。より詳述すれば、本明細書において、目的の特定のアゴニストに対するポジティブなアロステリックモジュレーター化合物の発見のための化合物ライブラリーでの受容体のハイスループットスクリーニングに適応可能な受容体ベースのアッセイが提供される。
【０１４０】
一実施形態において、標的アゴニスト（例えばムスク又はフローラル化合物）受容体の遺伝子配列を、次のように標的アゴニストに感受性のある細胞から同定する：プールしたニューロンを７５℃まで１０分間加熱して細胞膜を破壊し、そして増幅のために利用できるそれらのｍＲＮＡを与える。この増幅ステップは、限られた量の出発材料、典型的には１〜１５個の細胞でＮＧＳ技術を適用する場合に重要である。Ｅｂｅｒｗｉｎｅ法（ＩＶＴ）に従った線形増幅は、発現させた遺伝子の相対的な転写レベルの維持を確実にする。一晩（１４時間）で連続して２回のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を使用して、十分な量のｃＲＮＡを得る；そして、増幅させたｃＲＮＡを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ｃＤＮＡライブラリーを作成する。典型的に７５〜１５０塩基対の得られた短い配列（一般に「リード」と呼ばれる）を、これらの細胞の完全なトランスクリプトームを構築するために、マウスの参照ゲノム（例えばＵＣＳＣバージョンｍｍ９又はｍｍ１０）に対して整列させる。トランスクリプトームデータの定量分析は、転写された匂い物質受容体遺伝子及びそれぞれの発現レベルのリストをもたらす。ｍＲＮＡの最も豊富なレベル（最も豊富な「リード」）を示すか又は１回超の反復実験において存在する匂い物質受容体遺伝子は、推定の標的アゴニスト受容体とみなされる。
【０１４１】
次に、予測したマウスＯＲ遺伝子を使用して、マウスとヒトの双方のゲノムデータベースの最新バージョンをマイニングしてマウス（パラロガス遺伝子）及びヒト（オルソロガス遺伝子）において最も密接に関連する受容体（すなわち、最も高い配列類似性）を同定する。このプロセスを、配列類似性検索ツールであるＢＬＡＳＴ検索アルゴリズム（ＮＣＢＩ Ｗｅｂサイトで公開）を使用して実行してよく、このツールでは、初期トランスクリプトーム解析から以前に得られた全ての推定遺伝子配列を、クエリシーケンスとして使用する。このデータマイニングプロセスから同定された新たに同定された遺伝子は、パラロガス遺伝子及びオルソロガス遺伝子が同様の活性を呈する可能性が高いという仮定の下で潜在的なムスク又はフローラルの受容体であるとみなされる。特定の実施形態において、配列相同性のペアワイズ比較を実施して、マウス及びヒトにおいて密接に関連する受容体を同定し、そして国際公開番号第２０１４／２１０５８５号に記載されているように受容体を同定する。他のアプローチ、例えばＲＴ−ＰＣＲ及びマイクロアレイ又は質量分析のアプローチも使用してよい。
【０１４２】
さらなる実施形態において、脱オーファン化プロセスを完了するために、候補ＯＲ遺伝子を、使用した化合物に対する活性の確認のためにｉｎ ｖｉｔｒｏでさらに発現させて、嗅覚ニューロン及び他の構造的に関連する目的の化合物を単離する。標的アゴニスト（例えばムスク又はフローラル化合物）に応答する単離された嗅覚ニューロンから同定されたマウス受容体は、短いポリペプチド配列（例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ（配列番号１０）、Ｒｈｏタグ（配列番号１２；ウシロドプシン受容体の２０個の最初のアミノ酸）、及び／又はＬｕｃｙタグ（配列番号１４；切断可能なロイシンリッチシグナルペプチド配列）を有するそれらのＮ末端で改質され、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で一過性に発現し、そして標的アゴニスト（例えばムスク又はフローラル化合物）で個別に刺激して、特定の標的アゴニストの本物の受容体としてのそれらの同一性を確認する。さらなる実施形態において、ＲＴＰ１遺伝子を、国際公開番号第２０１６２０１１５３号（WO 2016201153 A1）において記載されるような内因性ＲＴＰ１遺伝子の活性化によるか又は形質転換によるか又はトランスダクションによるかにかかわらず、細胞株で発現させることもできる。この細胞ベースのアッセイでのヒトＧアルファサブユニットＧαolfの同時発現は、適切なリガンドに結合すると内部ｃＡＭＰの増加を導くＧｓ伝達経路を活性化する。或いは、細胞ベースのアッセイでのヒトＧアルファサブユニットＧα15の同時発現は、適切なリガンドに結合すると内部Ｃａ2+の増加を導くＧｑ伝達経路を活性化する。前記プロセス及びこれまでに得られた結果は、標的アゴニストについての哺乳動物の匂い物質受容体の迅速で信頼性の高い同定のためのプロセスを検証するために役立つ。
【０１４３】
さらに、特定の標的アゴニスト受容体対の使用に基づいて、標的アゴニストのポジティブなアロステリックモジュレーターである化合物を同定するためのアッセイが提供される。さらなる実施形態において、アゴニストが結合し、ＯＲ５ＡＮ１、ＯＲ１０Ｊ５、Ｏｌｆｒ１４４０又はＯｌｆｒ１６からなる群より選択される少なくとも１つの嗅覚受容体の活性を増強する部位とは異なる嗅覚受容体上の部位に結合し、かつ本明細書において記載される方法によって同定されるポジティブなアロステリックモジュレーター化合物、例えば本明細書において以下に記載される化合物が、本明細書において提供される。
【０１４４】
一実施形態において、化合物の活性は、標的アゴニストと組み合わせたその結合を、標的アゴニストのみの結合及び化合物のみ結合と比較することによって測定される。
【０１４５】
さらなる実施形態において、化合物を、標的アゴニストと組合せて受容体又はキメラもしくは断片に接触させ、受容体、又はそれらのキメラもしくは断片を、受容体ポリペプチドを発現するように組換えにより改質した細胞で発現させる。
【０１４６】
化合物の活性を、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び合成スクリーニングシステムを使用して測定できる。
【０１４７】
他の実施形態において、接触を、本明細書において記載したポリペプチドを含むリポソーム又はウイルス誘発性出芽膜で実施する。
【０１４８】
他の実施形態において、標的アゴニストに対して特異的である嗅覚受容体の活性を結合、抑制、遮断、阻害、及び／又は調節する化合物を同定するための方法を、未処理の細胞で又は本明細書に記載されるポリペプチドを発現している細胞からの膜画分で実施してよい。
【０１４９】
一実施形態において、本明細書において記載されるＯＲは、特定の標的アゴニスト、例えば、ムスク又はフローラルミュゲ化合物の知覚に関与し、かつ標的アゴニストと組み合わせた場合に特定の標的アゴニストの知覚を増強するポジティブなアロステリックモジュレーター化合物の同定のための価値のある候補の受容体を構築する。
【０１５０】
本発明に従って適用可能なポリペプチド
本発明は、本明細書において具体的に記載されるポリペプチドの「機能的等価物」又は「アナログ」又は「機能的変異」に関する。
【０１５１】
例えば、「機能的等価物」は、ＯＲ活性のために使用した試験において、本明細書において定義されるように、少なくとも１〜１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも７５％又は少なくとも９０％高いか又は低いＯＲ活性を示すポリペプチドをいう。
【０１５２】
本発明による「機能的等価物」は、本明細書において挙げたアミノ酸配列の少なくとも１つの配列位置において、具体的に挙げたアミノ酸とは異なるが前述の生物学的活性の１つを呈するアミノ酸を有する特定の変異体も包含する。したがって、「機能的等価物」は、１個以上、例えば１〜２０個、１〜１５個又は５〜１０個のアミノ酸の追加、置換、特に保存的置換、欠失及び／又は逆位によって得られる変異体を含み、挙げた変化は、本発明による特性のプロフィールを有する変異体を導く限り、任意の配列位置で起こりうる。機能的等価物は、特に、活性パターンが変異体と未変化のポリペプチドとの間で定性的に一致する場合、すなわち、例えば同一のアゴニスト又はアンタゴニストとの相互作用が異なる速度である場合（すなわち、ＥＣ50又はＩＣ50値で表されるか、又は本技術分野に適した他のパラメータにより表される場合）にも提供される。適した（保存的）アミノ酸置換の例を次の表に示す：
【数１】
2021508030.tif 000005
【０１５３】
前記の意味での「機能的等価物」は、記載したポリペプチドの「前駆体」、並びにポリペプチドの「機能的誘導体」及び「塩」でもある。
【０１５４】
「前駆体」は、その場合、所望の生物学的活性を有するか又は有さないポリペプチドの天然又は合成の前駆体である。
【０１５５】
「塩」という表現は、本発明によるタンパク質分子のカルボキシル基の塩及びアミノ基の酸付加の塩を意味する。カルボキシル基の塩は、公知の方法で生成されてよく、無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄及び亜鉛塩、並びに有機塩基との塩、例えばアミン、例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン等との塩を含む。酸付加の塩、例えば無機酸、例えば塩酸又は硫酸との塩、及び有機酸、例えば酢酸及びシュウ酸との塩も本発明に含まれる。
【０１５６】
本発明によるポリペプチドの「機能的誘導体」は、公知の技術を使用して、機能的アミノ酸の側鎖基上又はそれらのＮ末端もしくはＣ末端で生成されてもよい。かかる誘導体は、例えば、カルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニアとの又は第一級もしくは第二級アミンとの反応によって得られるカルボン酸基のアミド；アシル基との反応によって生成される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体；又はアシル基との反応によって生成される遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含む。
【０１５７】
「機能的等価物」は、当然、他の生物から得られるポリペプチド、及び天然に生じるバリアントも含む。例えば、相同配列領域の範囲は、配列比較により確立されてよく、かつ等価物ポリペプチドは、本発明の具体的なパラメータに基づいて決定されてよい。
【０１５８】
「機能的等価物」は、例えば所望の生物学的機能を示す、本発明によるポリペプチドの断片、好ましくは個々のドメイン又は配列モチーフも含む。
【０１５９】
「機能的等価物」は、さらに、本明細書において挙げたポリペプチド配列又はそれに由来する機能的等価物の１つ及び機能的なＮ末端又はＣ末端会合における少なくとも１つのさらに機能的に異なる異種配列を有する融合タンパク質である（すなわち融合タンパク質部分の実質的な相互機能障害を有さない）。これらの異種配列の限定されない例は、例えばシグナルペプチド、ヒスチジンアンカー又は酵素である。
【０１６０】
同様に本発明に従って含まれる「機能的等価物」は、具体的に開示されたポリペプチドの相同体である。これらは、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８５（８）， １９８８， ２４４４−２４４８）によって計算して、具体的に開示されたアミノ酸配列の１つに対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８０％又は８５％、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性（又は同一性）を有する。本発明による相同ポリペプチドのパーセンテージとして表される相同性又は同一性は、特に、本明細書において具体的に記載されるアミノ酸配列の１つの全長に基づくアミノ酸残基のパーセンテージとして表される同一性を意味する。
【０１６１】
パーセンテージとして表される同一性のデータは、ＢＬＡＳＴアライメント、アルゴリズムｂｌａｓｔｐ（タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ）を利用して、又は本明細書において以下に規定されるＣｌｕｓｔａｌ設定を適用することによって決定してもよい。
【０１６２】
可能なタンパク質グリコシル化の場合に、本発明による「機能的等価物」は、脱グリコシル化又はグリコシル化の形態で、及びグリコシル化パターンを変更することによって得られる改変した形態で本明細書において記載されるポリペプチドを含む。
【０１６３】
本発明によるポリペプチドのかかる機能的等価物又は相同体は、変異誘発によって、例えばタンパク質の点変異、伸長もしくは短縮によって、又は以下でより詳細に記載されるように生成されうる。
【０１６４】
本発明によるポリペプチドのかかる機能的等価物又は相同体は、変異体の、例えば短縮変異体のコンビナトリアルデータベースをスクリーニングすることにより同定されうる。例えば、タンパク質バリアントの多様なデータベースは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素によるライゲーションによって生成されうる。変性オリゴヌクレオチド配列から潜在的な相同体のデータベースの生成のために使用できる非常に多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡシンセサイザーで実施してよく、そして合成遺伝子を適した発現ベクターに連結させてよい。縮重ゲノムの使用は、混合物中で全ての配列を提供することを可能にし、潜在的なタンパク質配列の所望のセットをコードする。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は、当業者に公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ， Ｓ．Ａ．（１９８３）；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）（ａ）；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）（ｂ）；Ｉｋｅら（１９８３））。コドン最適化された核酸配列での、すなわち宿主細胞のコドン使用頻度に適合させたポリペプチドの生成もこの方法でカバーされる。
【０１６５】
点変異又は短縮によって生成されたコンビナトリアルデータベースの遺伝子産物のスクリーニングのための、及び選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのいくつかの技術が公知である。これらの技術は、本発明による相同体のコンビナトリアル変異誘発によって生成された遺伝子バンクの迅速なスクリーニングに適応されうる。ハイスループット分析に基づいた大規模な遺伝子バンクのスクリーニングについて最も頻繁に使用される技術は、複製できる発現ベクターでの遺伝子バンクのクローニング、得られたベクターデータベースでの適した細胞の形質転換、及び所望の活性の検出が生成物を検出した遺伝子をコードするベクターの単離を促進する条件下での組み合わせ遺伝子の発現を含む。データベースにおける機能的変異体の頻度を増加させる技術である再帰的アンサンブル変異（ＲＥＭ）は、相同体を同定するためにスクリーニング試験と組み合わせて使用できる（Ａｒｋｉｎ及びＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３））。
【０１６６】
本発明に従って適用可能なコード核酸配列
本発明は、本明細書において定義したポリペプチドをコードする核酸配列にも関する。
【０１６７】
本発明は、本明細書において具体的に開示した配列とある程度の「同一性」を有する核酸にも関する。２つの核酸間の「同一性」は、それぞれの場合において核酸の全長にわたる、ヌクレオチドの同一性を意味する。
【０１６８】
例えば、同一性を、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ、Ｓｈａｒｐ ＰＭ．（１９８９））を使用するＩｎｆｏｒｍａｘ社（ＵＳＡ）のＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ７．１プログラムによって以下の設定で計算してよい：
【数２】
2021508030.tif 000006
【０１６９】
代わりに、同一性を、Ｃｈｅｎｎａら（２００３）のｗｅｂページ：http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#に従って、及び以下の設定で測定してよい：
【数３】
2021508030.tif 000007
【０１７０】
本明細書において挙げた全ての核酸配列（一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡ及びｍＲＮＡ）は、ヌクレオチド構成要素からの化学合成によって、例えば、二重らせんの個々の重複する相補的な核酸構成要素の断片縮重によって公知の方法で生成されうる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、亜リン酸アミダイト法（Ｖｏｅｔ， Ｖｏｅｔ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ ８９６−８９７）によって公知の方法で実施されうる。合成オリゴヌクレオチドの蓄積及びＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片及びライゲーション反応によるギャップの充填、並びに一般的なクローニング技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）において記載されている（以下を参照されたい）。
【０１７１】
本発明は、例えば人工ヌクレオチド類似体を使用して得られた前記ポリペプチド及びそれらの機能的等価物の１つをコードする核酸配列（一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡ及びｍＲＮＡ）にも関する。
【０１７２】
本発明は、本発明によるポリペプチド又はそれらの生物学的に活性のあるセグメントをコードする単離された核酸分子、及び例えば本発明によるコード核酸を同定又は増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ又はプライマーとして使用できる核酸断片の双方に関する。
【０１７３】
本発明による核酸分子は、さらに、コード遺伝子領域の３’末端及び／又は５’末端からの非翻訳配列を含みうる。
【０１７４】
本発明は、さらに、具体的に記載されたヌクレオチド配列又はそのセグメントに相補的である核酸分子に関する。
【０１７５】
本発明によるヌクレオチド配列は、他の細胞型及び生物における相同配列の同定及び／又はクローニングのために使用できるプローブ及びプライマーの生成を可能にする。かかるプローブ又はプライマーは、一般的に、本発明による核酸配列のセンス鎖又は対応するアンチセンス鎖の少なくとも約１２個、好ましくは少なくとも約２５個、例えば約４０個、５０個又は７５個の連続したヌクレオチドで「ストリンジェント」な条件下（下記参照）でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【０１７６】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離され、さらに、組換え技術により生成される場合に他の細胞材料又は培地を実質的に有さなくてよく、又は化学的に合成されている場合には、化学前駆体又は他の化学物質をゆうさなくてよい。
【０１７７】
本発明による核酸分子は、分子生物学の標準技術及び本発明に従って提供される配列情報によって単離されうる。例えば、ｃＤＮＡを、具体的に開示された全配列又はそのセグメントの１つをハイブリダイゼーションプローブ及び標準ハイブリダイゼーション技術（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）において記載される）として使用して、適したｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。さらに、開示された配列の１つ又はそのセグメントを含む核酸分子は、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により単離されうる。こうして増幅させた核酸は、適したベクター中にクローニングされ、かつＤＮＡシーケンシングによって特徴付けられる。本発明によるオリゴヌクレオチドは、標準的な合成方法によって、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーを使用しても生成されうる。
【０１７８】
本発明による核酸配列又はそれらの誘導体、それらの配列の相同体又は一部は、例えば、通常のハイブリダイゼーション技術又は他の細菌からのＰＣＲ技術によって、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを解して単離されうる。これらのＤＮＡ配列は、標準の条件下で本発明による配列とハイブリダイズする。
【０１７９】
「ハイブリダイズする」は、標準条件でほとんど相補的な配列に結合するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの能力を意味するが、非特異的結合は、これらの条件下で非相補的パートナー間では生じない。このため、配列は９０〜１００％相補的であってよい。互いに特異的に結合できる相補配列の特性は、例えばノーザンブロット又はサザンブロット法で、又はＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー結合で利用される。
【０１８０】
保存された領域の短いオリゴヌクレオチドは、有利にはハイブリダイゼーションのために使用される。しかしながら、本発明による核酸のより長い断片又はハイブリダイゼーションのための全配列を使用することも可能である。これらの標準条件は、使用される核酸に依存して（オリゴヌクレオチド、より長い断片又は全配列）、又はハイブリダイゼーションのために使用される核酸のタイプ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に依存して変化する。例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドについての融解温度は、同一の長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドよりも約１０℃低い。
【０１８１】
例えば、特定の核酸に依存して、標準条件は、０．１〜５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の濃度での緩衝水溶液中で又はさらに５０％ホルムアミドの存在下で４２〜５８℃の温度、例えば５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド中で４２℃を意味する。有利には、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣであり、温度は約２０℃〜４５℃、好ましくは約３０℃〜４５℃である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドについてのハイブリダイゼーション条件は、有利には０．１×ＳＳＣであり、かつ温度は約３０℃〜５５℃、好ましくは約４５℃〜５５℃である。ハイブリダイゼーションのこれらの前記温度は、ホルムアミドの非存在下で、約１００ヌクレオチドの長さ及び５０％のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸について計算した溶融温度値の例である。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験条件は、関連する遺伝学の教科書、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）において記載されており、かつ例えば核酸の長さ、ハイブリッドのタイプ又はＧ＋Ｃ含有量に依存して、当業者に公知である式を使用して計算されうる。当業者は、以下の教科書からハイブリダイゼーションに関するさらなる情報を得られる：Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ）（１９８５）、Ｂｒｏｗｎ（ｅｄ）（１９９１）。
【０１８２】
「ハイブリダイゼーション」は、特に、厳しい条件下で実施されうる。かかるハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）において、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９８９），６．３．１−６．３．６において記載されている。
【０１８３】
本明細書において使用されるように、特定の条件下でのハイブリダイゼーション又はハイブリダイズという用語は、互いに有意に同一又は相同であるヌクレオチド配列が互いに結合したままであるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件をいうことを意図している。前記条件は、少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、及び少なくとも約８５％、９０％、又は９５％同一である配列が互いに結合したままである条件であってよい。低いストリンジェンシー、中程度、及び高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の定義を本明細書において提供する。
【０１８４】
適切なハイブリダイゼーション条件は、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２、４、及び６）において説明されているような最小の実験で当業者により選択されうる。さらに、ストリンジェンシーな条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ｃｈａｐｔｅｒｓ ７、９及び１１）において記載されている。
【０１８５】
本明細書において使用されるように、低いストリンジェンシーの定義された条件は以下である。ＤＮＡを含むフィルターを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で６時間４０℃で前処理する。ハイブリダイゼーションを、同一の溶液中で次の変更を加えて実施する：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）デキストランスルフェート、及び５〜２０×１０６ ３２Ｐ標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で４０℃で１８〜２０時間インキュベートし、そして５５℃で１．５時間洗浄する。２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．１％ＳＤＳを含む溶液中で。洗浄溶液を新たな溶液に交換し、さらに６０℃で１．５時間インキュベートする。フィルターを吸い取って乾かし、オートラジオグラフィーのためにさらす。
【０１８６】
本明細書において使用されるように、中程度のストリンジェンシーの定義された条件は以下である。ＤＮＡを含むフィルターを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で７時間５０℃で前処理する。ハイブリダイゼーションを、同一の溶液中で次の変更を加えて実施する：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）デキストランスルフェート、及び５〜２０×１０６ ３２Ｐ標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で５０℃で３０時間インキュベートし、そして５５℃で１．５時間洗浄する。２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．１％ＳＤＳを含む溶液中で。洗浄溶液を新たな溶液に交換し、さらに６０℃で１．５時間インキュベートする。フィルターを吸い取って乾かし、オートラジオグラフィーのためにさらす。
【０１８７】
本明細書において使用されるように、高いストリンジェンシーの定義された条件は以下である。ＤＮＡを含むフィルターの事前ハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡから構成される緩衝液中で８時間〜一晩６５℃で実施する。フィルターを、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ及び５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合液中で６５℃で４８時間ハイブリダイズする。フィルターの洗浄を、２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ、及び０．０１％ＢＳＡを含む溶液中で３７℃で１時間実施する。続いて、５０℃で０．１×ＳＳＣで４５分間洗浄する。
【０１８８】
当該技術分野で周知の低い、中程度、及び高いストリンジェンシーの他の条件（例えば、種間ハイブリダイゼーションに使用される）を、前記条件が不適切な場合（例えば、種間ハイブリダイゼーションに使用される場合）に使用してよい。
【０１８９】
本発明は、具体的に開示された核酸配列又は誘導可能な核酸配列の誘導体にも関する。
【０１９０】
したがって、本発明によるさらなる核酸配列は、本明細書において具体的に開示された配列に由来してよく、かつ個々のヌクレオチド又はいくつかのヌクレオチドの付加、置換、挿入又は欠失によってそれとは異なり、さらに所望の特性のプロフィールを有するポリペプチドをコードしてよい。
【０１９１】
本発明は、特別な原生物又は宿主生物、及び天然に生じるそれらのバリアント、例えばスプライシングバリアント又はアレルバリアントのコドン使用に従って、具体的に挙げられた配列と比較して、いわゆるサイレント変異を含むか又は変更されている核酸配列も包含する。
【０１９２】
保存的ヌクレオチド置換（すなわち、問題のアミノ酸が、同一の電荷、サイズ、極性、及び／又は溶解性のアミノ酸に置き換えられること）によって得られる配列にも関する。
【０１９３】
本発明は、配列多型により具体的に開示された核酸に由来する分子にも関する。これらの遺伝子多型は、自然なバリエーションにより集団内の個々の間に存在しうる。これらの自然なバリエーションは、通常、遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変動を生じる。
【０１９４】
本発明による核酸配列の誘導体は、例えば、誘導されたアミノ酸のレベルで少なくとも６０％の相同性、好ましくは全配列範囲にわたって少なくとも８０％の相同性、非常に特に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するアレルバリアントを意味する（アミノ酸レベルでの相同性に関しては、ポリペプチドについて前記で提供した詳細を参照されたい）。有利には、相同性は、配列の部分領域よりも高くてよい。
【０１９５】
さらに、誘導体は、本発明による核酸配列の相同体、例えば、動物、植物、真菌又は細菌の相同体、短縮配列、コーディング及び非コーディングＤＮＡ配列の一本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＲＮＡであると理解されるべきでもある。例えば、相同体は、ＤＮＡレベルで、本明細書において具体的に開示された配列における所与のＤＮＡ領域全体にわたって、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、非常に特に好ましくは少なくとも８０％の相同性を有する。
【０１９６】
さらに、誘導体は、例えば、プロモーターとの融合物であると理解されるべきである。挙げられたヌクレオチド配列に付加されるプロモーターは、少なくとも１つのヌクレオチド交換、少なくとも１つの挿入、反転及び／又は欠失によって改質されてよいが、プロモーターの機能性又は効率を損なうことはない。さらに、プロモーターの効率は、それらの配列を変更することにより高められてよく、又は異なる属の生物であってもより効率的なプロモーターと完全に交換することができる。
【０１９７】
機能性ポリペプチド変異体の生成
さらに、当業者は、配列番号２、４、６、又は８のいずれかに対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であるか、及び／又は配列番号１、３、５、又は７、又はそれらの逆相補体に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる、機能的変異体を生じるための方法を熟知している。
【０１９８】
使用される技術に依存して、当業者は、遺伝子又は非コード核酸領域（例えば発現を調節するために重要である）に完全にランダム変異又はより指向性のある変異を導入し、続いて遺伝子ライブラリーを生成することができる。この目的のために必要な分子生物学の方法は、当業者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）において記載されている。
【０１９９】
遺伝子を改変するため方法、したがって遺伝子によってコードされるポリペプチドを改変する方法は、例えば以下のように、長い間当業者に公知である：
−  遺伝子の個々のヌクレオチド又はいくつかのヌクレオチドが指定された方法で置換される部位特異的変異誘発（Ｔｒｏｗｅｒ ＭＫ （Ｅｄ．） １９９６； Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、
−  任意のアミノ酸のコドンを遺伝子の任意の箇所で交換又は付加できる飽和変異誘発（Ｋｅｇｌｅｒ−Ｅｂｏ ＤＭ， Ｄｏｃｋｔｏｒ ＣＭ， ＤｉＭａｉｏ Ｄ （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：１５９３； Ｂａｒｅｔｔｉｎｏ Ｄ， Ｆｅｉｇｅｎｂｕｔｚ Ｍ， Ｖａｌｃａｒｅｌ Ｒ， Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ ＨＧ （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：５４１； Ｂａｒｉｋ Ｓ （１９９５） Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：１）
−  エラープローンＤＮＡポリメラーゼによりヌクレオチド配列を変異させるエラープローンポリメラーゼ連鎖反応（Ｅｃｋｅｒｔ ＫＡ， Ｋｕｎｋｅｌ ＴＡ （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：３７３９）；
−  好ましい変換をポリメラーゼにより妨げるＳｅＳａＭ法（配列飽和法）、Ｓｃｈｅｎｋら（Ｂｉｏｓｐｅｋｔｒｕｍ， Ｖｏｌ． ３， ２００６， ２７７−２７９）、
−  例えばＤＮＡ修復機構の欠陥によりヌクレオチド配列の変異率が増加する、変異誘発株における遺伝子の継代（Ｇｒｅｅｎｅｒ Ａ， Ｃａｌｌａｈａｎ Ｍ， Ｊｅｒｐｓｅｔｈ Ｂ （１９９６） Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｍｕｔａｔｏｒ ｓｔｒａｉｎ． Ｉｎ： Ｔｒｏｗｅｒ ＭＫ （Ｅｄ．） Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、又は
−  密接に関連する遺伝子のプールを形成して消化し、そしてその断片を、反復鎖分離及び再結合により全長モザイク遺伝子を最終的に生成するポリメラーゼ連鎖反応のための鋳型として使用する、ＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰＣ （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９； Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰＣ （１９９４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：１０７４７）。
【０２００】
いわゆる定向進化（とりわけ、Ｒｅｅｔｚ ＭＴ及びＪａｅｇｅｒ Ｋ−Ｅ （１９９９）， Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ Ｃｈｅｍ ２００：３１； Ｚｈａｏ Ｈ， Ｍｏｏｒｅ ＪＣ， Ｖｏｌｋｏｖ ＡＡ， Ａｒｎｏｌｄ ＦＨ （１９９９）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， Ｉｎ： Ｄｅｍａｉｎ ＡＬ， Ｄａｖｉｅｓ ＪＥ （Ｅｄ．） Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙにおいて記載される）を使用して、当業者は、機能的な変異体を指示された方法で大規模に生産できる。この目的のために、最初のステップで、それぞれのポリペプチドの遺伝子ライブラリーを、例えば前記方法を使用して最初に生成する。遺伝子ライブラリーを、例えば細菌によって又はファージディスプレイシステムによって、適した方法で発現させる。
【０２０１】
所望の特性に十分に対応する特性を有する機能的変異体を発現する宿主生物の関連遺伝子は、他の変異サイクルに従ってよい。変異及び選択又はスクリーニングのステップは、存在する機能的変異体が十分な程度まで所望の特性を有するまで反復して繰り返えされうる。この反復手順を使用して、制限された数の変異、例えば１、２、３、４、又は５つの変異を段階的に実施し、問題の活性に対する影響について評価及び選択してよい。選択された変異体は、同一の方法でさらなる変異ステップに送られる。これにより、調査されるべき個々の変異体の数を著しく減らすことができる。
【０２０２】
本発明に従った結果は、関連するポリペプチドの構造及び配列に関する重要な情報も提供し、これは、標的とされる方法で、所望の改変した特性を有するさらなるポリペプチドを生じるために必要である。特に、いわゆる「ホットスポット」、すなわち標的変異を導入することにより特性を改変するために潜在的に適している配列セグメントを定義することが可能である。
【０２０３】
アミノ酸配列の位置に関する情報も推定でき、その領域では、おそらく活性にほとんど影響を及ぼさないであろう変異が生じ、潜在的な「サイレント変異」として設計されうる。
【０２０４】
本発明のポリペプチドを生成するための構築物
前記ヌクレオチド配列は、発現カセットの一部であってよい。発現カセット及び発現構築物という用語は、同義的に使用される。好ましくは組換え発現構築物は、本発明によるポリペプチドをコードし、調節核酸配列の遺伝的制御下にあるヌクレオチド配列を含む。
【０２０５】
本発明に従って適用されるプロセスにおいて、発現カセットは、発現ベクター、特に組換え発現ベクターの一部であってよい。
【０２０６】
「発現ユニット」は、本発明に従って、本明細書において定義されるプロモーターを含み、発現されるべき核酸又は遺伝子と機能的に結合した後に発現を調節する発現活性、すなわち前記核酸又は前記遺伝子の転写及び翻訳を有する核酸を意味すると理解される。したがって、これに関連して、「調節核酸配列」ともいう。プロモーターに加えて、他の調節エレメント、例えばエンハンサーも存在してよい。
【０２０７】
「発現カセット」又は「発現構築物」は、本発明に従って、発現されるべき核酸又は発現されべき遺伝子に機能的に連結させた発現ユニットを意味すると理解される。したがって、発現ユニットとは対照的に、発現カセットは、転写及び翻訳を調節する核酸配列だけでなく、転写及び翻訳の結果物としてタンパク質として発現されるべき核酸配列も含む。
【０２０８】
「発現」又は「過剰発現」という用語は、本発明の記載内容において、対応するＤＮＡによってコードされる微生物中の１つ以上のポリペプチドの細胞内活性の生成又は増加を表す。この目的のために、例えば、生物に遺伝子を導入する、既存の遺伝子を他の遺伝子で置き換える、遺伝子のコピー数を増やす、強力なプロモーターを使用する、又は高い活性を有する対応するポリペプチドをコードする遺伝子を使用することが可能であり、任意に、これらの測定を組み合わせることができる。
【０２０９】
好ましくは、本発明によるかかる構築物は、それぞれのコード配列の５’−上流のプロモーター及び３’−下流のターミネーター配列、及び任意に他の通常の調節エレメントを含み、それぞれの場合にコード配列と機能的に連結する。
【０２１０】
「プロモーター」、「プロモーター活性を有する核酸」又は「プロモーター配列」は、本発明に従って、転写されるべき核酸に機能的に連結された場合に、前記核酸の転写を調節する核酸を意味すると理解される。
【０２１１】
本記載内容において、「機能的」又は「操作的」連結は、例えば、プロモーター活性を有する核酸の１つ及び転写されるべき核酸配列の１つ、及び任意にさらなる調節エレメント、例えばそれぞれの調節エレメントが核酸配列の転写時にその機能を果たすことができる方法で、核酸の転写を確実にする核酸配列、例えばターミネーターの連続配置を意味すると理解される。これは必ずしも化学的な意味での直接的な連結を必要としない。遺伝子制御配列、例えばエンハンサー配列は、より離れた位置から、又は他のＤＮＡ分子からでも標的配列に対して機能を発揮できる。好ましい配置は、転写されるべき核酸配列がプロモーター配列の後ろに（すなわち、３’末端に）配置されて、２つの配列が共有結合で一緒に結合される配置である。プロモーター配列と組換えにより発現される核酸配列との距離は、２００塩基対未満、又は１００塩基対未満、又は５０塩基対未満であってよい。
【０２１２】
プロモーター及びターミネーターに加えて、以下が他の調節エレメントの例として挙げられてよい：標的配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点等。適した調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０））において記載されている。
【０２１３】
本発明による核酸構築物は、特に、例えば配列番号１、３、５又は７、又はそれらの逆相補体に由来するポリペプチドをコードする配列、又はそれらの誘導体及びホモログ、及びそれらに由来してよく、かつ遺伝子発現を有利に制御、例えば増加させるために、１つ以上の調節シグナルと操作的又は機能的に連結させた核酸配列を含む。
【０２１４】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の自然調節が、実際の構造遺伝子の前にまだ存在していてよく、かつ任意に遺伝子改変されて、自然調節がオフになり、遺伝子の発現が強化される。しかしながら、核酸構築物は、より単純な構造、すなわち、コード配列の前に追加の調節シグナルが挿入されておらず、その調節を伴う天然のプロモーターが除去されていない構造であってもよい。代わりに、天然の調節配列が変異して、調節が起こらず、そして遺伝子発現が増加される。
【０２１５】
好ましい核酸構築物は、有利には、プロモーターと機能的に連結した既に挙げた１つ以上の「エンハンサー」配列も含み、これらの配列は、核酸配列の発現の増強を可能にする。追加の有利な配列、例えばさらなる調節エレメント又はターミネーターを、ＤＮＡ配列の３’末端に挿入してもよい。本発明による核酸の１つ以上のコピーが構築物中に存在していてよい。構築物において、他のマーカー、例えば栄養要求性又は抗生物質耐性を補う遺伝子が、構築物を選択するために任意で存在してもよい。
【０２１６】
適した調節配列の例は、プロモーター、例えばｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩq、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰBAD）ＳＰ６、ラムダＰＲ又はラムダＰＬのプロモーターに存在し、これらは有利にはグラム陰性菌で使用される。さらなる有利な調節配列は、例えば、グラム陽性プロモーターａｍｙ及びＳＰＯ２に、酵母又は真菌プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨに存在する。人工プロモーターも調節のために使用できる。
【０２１７】
宿主生物中での発現のために、核酸構築物は、ベクター、例えばプラスミド又はファージに有利に挿入され、これにより宿主での遺伝子の最適な発現を可能にする。ベクターは、プラスミド及びファージに加えて、当業者に公知である全ての他のベクター、すなわち例えばウイルス、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス及びアデノウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド及び線状又は環状ＤＮＡを意味するとも解される。これらのベクターを、宿主生物内又は染色体上で自動的に複製することができる。これらのベクターは、本発明のさらなる発展である。
【０２１８】
適したプラスミドは、例えば大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ113−Ｂ１、λｇｔ１１もしくはｐＢｄＣＩ、ストレプトミセス属（Streptomyces）のｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２もしくはｐＩＪ３６１、バチルス属（Bacillus）のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４もしくはｐＢＤ２１４、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）のｐＳＡ７７もしくはｐＡＪ６６７、真菌のｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２もしくはｐＢＢ１１６、酵母の２ａｌｐｈａＭ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３もしくはｐＥＭＢＬＹｅ２３、又は植物のｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ+、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４もしくはｐＤＨ５１である。前記プラスミドは、可能なプラスミドの小規模の選択肢である。さらなるプラスミドは、当業者に周知であり、かつ例えばクローニングベクターの本（Ｅｄｓ． Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ． Ｈ． ら、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ， １９８５， ＩＳＢＮ ０ ４４４ ９０４０１８）において見出される。
【０２１９】
ベクターのさらなる開発において、本発明による核酸構築物又は本発明による核酸を含むベクターは、有利には線状ＤＮＡの形態で微生物に導入され、異種組換え又は相同組換えを介して宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。この線状ＤＮＡは、線状化されたベクター、例えばプラスミド、又は本発明による核酸構築物もしくは核酸のみからなってよい。
【０２２０】
生物における異種遺伝子の最適な発現のために、核酸配列を改変して、生物で使用される特定の「コドン使用」に一致させることが有利である。「コドン使用」は、問題の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター評価により容易に決定されうる。
【０２２１】
本発明による発現カセットは、適したプロモーターを適したコードヌクレオチド配列及びターミネーター又はポリアデニル化シグナルに融合することによって生じる。通常の組換え及びクローニング技術がこの目的のために使用され、例えばＴ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）において、並びにＴ．Ｊ． Ｓｉｌｈａｖｙ， Ｍ．Ｌ． Ｂｅｒｍａｎ及びＬ．Ｗ． Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８４）において、並びにＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （１９８７）において記載されている。
【０２２２】
適した宿主生物での発現のために、組換え核酸構築物又は遺伝子構築物は、宿主における遺伝子の最適な発現を可能にする宿主特異的ベクターに有利に挿入される。ベクターは、当業者に周知であり、例えば「クローニングベクター」（Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ． Ｈ． ら、Ｅｄ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ， １９８５）において見出される。
【０２２３】
本明細書において同定及び／又は使用される核酸及びアミノ酸の配列を以下に挙げる：
【数４】
2021508030.tif 000008
【数５】
2021508030.tif 000009
【数６】
2021508030.tif 000010
【０２２４】
次の実施例は、例示のみであり、要約、明細書又は特許請求の範囲において挙げられる発明の範囲を制限することを意図しない。
【０２２５】
実施例
実施例１：感覚の結果に関する匂い物質受容体の同定
香料に重要な種々の標的化合物（例えば、ムスキー、フローラル、又はウッディーな成分）を選択する。国際公開番号第２０１４／２１０５８５号において記載される方法を使用して、１種以上のこれらの化合物により特異的に活性化又は阻害される生物に存在するＯＲの全レパートリー内で、比較的小さなＯＲのサブセットを同定できる。トランスクリプトーム解析、例えばＮＧＳアプローチ、又はプロテオミクス解析、例えば質量分析は、ｅｘ ｖｉｖｏでＯＲを同定することをさらに意味する。代わりに、ｉｎ ｖｉｖｏアプローチ、例えばＤＲＥＡＭ法は、揮発化合物のガス相送達に対してＯＲ脱オーファン化を可能にする［Ｖｏｎ Ｄｅｒ Ｗｅｉｄ Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， １８（１０）：１４５５−６３ （２０１５）］。
【０２２６】
嗅覚受容体を評価して、標的化合物の知覚の心理物理学的（感覚）結果がｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的化合物誘発活性と相関するかどうかを決定できる。推定感覚結果に関して予測力を有すると思われるかかる嗅覚受容体を、標的化合物指向性受容体ベースの増強のためのさらなるスクリーニングのために選択する。代わりに、香料に対して目的の特定のアゴニストによって活性化される嗅覚受容体を選択する。特定の標的受容体アゴニスト対を、標的アゴニストのポジティブなアロステリックモジュレーター化合物をスクリーニング及び同定するためのアッセイ又は方法において使用する。
【０２２７】
実施例２：ムスク嗅覚受容体の同定
ムスク化合物のムスコン、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）、ムスクキシロール及びムスクケトンは、感覚レベルでの平均の匂い検出閾値に関して非常に相関のあるグループを形成した。４つのムスク化合物間で観察された感覚相関が単一の匂い物質受容体の活性に関連しているかどうかを試験するために、ムスク化合物に対するＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体の応答を評価した。観測した受容体の特異性及び感度値を、人間の心理物理的（感覚的）な匂い検出閾値データと比較した（図１）。
【０２２８】
ＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体は、ムスコン、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）、ムスクキシロール及びムスクケトンにより特異的に活性化された。しかしながら、試験した他のムスク化合物は、ＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体を活性することができなかった。図１ａを参照されたい。
【０２２９】
ＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体活性のリガンドポテンシー（ＥＣ50値）又はエフィカシー（最大スパン）を有するムスク化合物について得られた平均又は中央値の匂い検出閾値（感覚結果）についてのピアソン相関を考慮した場合に、観測したムスク受容体（図１ａ）及び心理物理学的な（図１ｂ）活性化のランキングは同一であった。
【０２３０】
心理物理学的な測定値は、中央値の匂い検出閾値でのＥＣ50との強い直接相関及びエフィカシーとのさらに強い相関（それぞれｒ＝０．８７及びｒ＝−０．９１）を示した。同様の相関値を平均の匂い検出閾値で得た。中央値及び平均の感度の双方は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで得られたポテンシー及びエフィカシーのランキングに続いてグループレベルで得た（表１）。
【表１】
2021508030.tif 000011
【０２３１】
言い換えれば、受容体活性化プロフィールは、心理物理学的データを完全に再現しており、ムスク化合物間の観察された感覚相関を説明ために十分であった。したがって、ＯＲ５ＡＮ１は、ムスク指向性受容体ベース増強のスクリーニングのための優れた標的を示す。さらなる感覚の重要な標的受容体を同定することは、追加の香料の調香（例えば、ムスキー、フローラル、ウッディー、マリン）の増強のためのスクリーニングを可能にする。
【０２３２】
実施例３：推定ＯＲ５ＡＮ１活性エンハンサーの同定
細胞ベースのアッセイを使用して、ＯＲ５ＡＮ１を、内因性ＲＴＰ１遺伝子が活性化され、匂い物質受容体シャペロンを発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞株で試験した（国際公開番号第２０１６／２０１１５３号）。Ｆｌａｇ−Ｒｈｏをタグ付けした受容体を、嗅覚の標準的なＧタンパク質Ｇolfとコトランスフェクトし、そして単一濃度のＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）及び試験化合物の二成分混合物に曝した。
【０２３３】
揮発性化合物の大規模なライブラリーを使用して、それぞれの化合物とＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）との〜ＥＣ10（それ自体によってＯＲ５ＡＮ１の完全な活性レベルの〜１０％のみを誘発する濃度）での二成分混合物を作成した。最初のエンハンサー候補の同定のために、活性化細胞ベースのアッセイを使用した。単一の二成分混合物誘発受容体活性を、ＨＴＲＦ（Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅユニット）ベースのキット（ＣｉｓＢｉｏ、ｃＡＭＰ ｄｙｎａｍｉｃ ２キット、６２ＡＭ４ＰＥＪ）を使用してサイトゾル中のｃＡＭＰ増加を測定することによって検出した。
【０２３４】
４８１個の二成分混合物を、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）ストック溶液とそれぞれの試験化合物のストック溶液とをそれぞれ最終濃度１０及び５００μＭに混合することにより作成した。ストック溶液を、純粋なＤＭＳＯに溶解した化合物から作成した。それぞれの混合物を、ＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体を発現する細胞株に提示した。図２において、混合物をドット（黒丸）で、プレート６の空のウェルを三角形（黒塗りの三角）で表した。それぞれの二成分混合物中のＤＭＳＯの最終濃度は０．１７％であり、細胞に対して目に見える影響はなかった。
【０２３５】
次に、得られた活性化を測定し、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）のみと比較した（増強アッセイのベースラインを定義する）。ＨＴＳプロセスの品質を決定し、そしてウィンドウの変動性及びシグナルの信頼性を、それぞれのプレートのＺ’値を算出することにより評価した。２０個のヒットが得られ、そのうち５個は大環状ケトン及びニトロムスクのＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体アゴニストであった（ヒット番号１、２、３、５及び９）。図２及び表２を参照されたい。これらのＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体アゴニストは、アッセイウィンドウのダイナミックレンジが十分であり（記録された応答がベースラインを大きく上回ったため）、したがって低レベルの推定増強を検出するために十分な感度があったことをさらに確認した。
【０２３６】
表２で「増強」と印された１５個の候補を同定した。驚くべきことに、これらの推定エンハンサーの８０％（１２／１５）が同一クラスの化学物質である不飽和脂肪族アルデヒドに属していた。次に、潜在的な候補の真の増強特性を確認するための２つの並行した用量反応実験を実施した。最初に、それぞれ個々の候補の用量反応を実施して、それ自体がアゴニストであるかどうかを測定した。そして、２５０μＭ濃度の推定モジュレーターの存在及び非存在下でのＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）用量反応曲線をＥＣ50シフトについて評価した。ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）に対するＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体の応答を増加させたが、測定可能な内因性アゴニスト活性自体を示さなかった分子を、真のエンハンサーと見なし、さらなる研究のために選択した。
【表２−１】
2021508030.tif 000012
【表２−２】
2021508030.tif 000013
【０２３７】
この分析から、脂肪族α−βモノ不飽和アルデヒドである揮発性トリデシレンアルデヒド（ＴＤＡ）を同定した。この化合物は、ＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体をそれ自体活性化しなかったが、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）との組み合わせでは、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）のみと比較して明らかな増強効果を得た。図３を参照されたい。
【０２３８】
トリデシレンアルデヒドは、ＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体の効果的なエンハンサーであると思われた。ＴＤＡ２５０μＭの添加は、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）ＥＣ50における大幅な減少を導き（約２１倍のシフト）、全体的に大きい最大活性化レベル（スパンの増加）を導く（図３ａ）。単独で試験した場合に、ＴＤＡは、約１００μＭ超の非常にわずかな結合活性を除いて、有意な活性を示さなかった。この濃度では、ＴＤＡの結合は、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）活性化ウィンドウの８％未満の活性化をもたらした。したがって、トリデシレンアルデヒドはＯＲ５ＡＮ１の真のアゴニストとは見なされない。
【０２３９】
ＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体のムスク化合物誘発活性化に対するＴＤＡの効果を、ムスコン、ムスクキシロール及びムスクケトンで観察した。全てのアゴニストは、２５０μＭ濃度のＴＤＡの存在下で、同等の左方向の用量反応曲線シフトを示した（図３ｂ〜ｄ）。これは、増強が受容体結合事象によって媒介され、例えばアッセイ細胞自体に対するＯＲ５ＡＮ１非依存効果によって媒介される可能性が低いことを示した。ＥＣ50における減少は、繰り返し実験で１３〜２８倍の範囲であった（図４）。ムスクとＴＤＡとの二成分混合物で観察された見かけの増強は、主にアゴニストではないＴＤＡがアンタゴニストとしても作用しないため、競合性の結合と一致しない。むしろ、このタイプのデータは、ＴＤＡについての非競合的結合部位を示す。
【０２４０】
以下の表３ａ及び３ｂは、ＥＣ50及びＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）のスパンに対する追加の化合物の影響を報告する。
【表３ａ】
2021508030.tif 000014
【表３ｂ】
2021508030.tif 000015
【０２４１】
実施例４：トリデシレンアルデヒドがポジティブなアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）として作用してＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体活性を増強する
機能的用量反応実験を実施して、トリデシレンアルデヒド（ＴＤＡ）とＯＲ５ＡＮ１との相互作用のアロステリックな性質を明らかにした。ＯＲ５ＡＮ１の活性化の増強レベルを、異なる濃度のエンハンサーで評価した。前記と同一の細胞ベースのアッセイを使用して、０〜１ｍＭの範囲の連続濃度のトリデシレンアルデヒドの存在下でのＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）に対するＯＲ５ＡＮ１の用量反応曲線を実施した。三元複合体相互作用モデルから導いた単純化アロステリックＥＣ５０シフト効果式（simplified Allosteric EC50 shift effect equation）（Ｐｒｉｓｍ５、ｖ。５．０２で利用可能）を適用することによって曲線を得た。記録した増強レベルは、エンハンサーの濃度に対して線形従属ではなく、α（協同性係数）及びＫB（ＴＤＡの平衡解離定数）について次の重要なパラメータ値：α＝１５．７及びＫB＝２５９μＭをモデルから得た。α＞１は、ポジティブなアロステリック調節を示す。この方法に続いて、２つの強力なエンハンサーである２−デセナール及びノニレンアルデヒドは、次の重要なパラメータを有するＴＤＡと同様のアロステリック調節特性を示した：２−デセナール、α＝３７．３及びＫB＝２６４μＭ；ノニレンアルデヒド、α＝２８．８及びＫB＝９６μＭ。
【０２４２】
エンハンサーの完全な薬理学的特性は、以下の１）〜５）に基づいてエンハンサーを順位付けする手段を提供する；１）香料成分（例えば、ムスキー、フローラル又はウッディな成分）と組み合わせた場合に誘発するポテンシーシフト、２）化合物のみで観察されたエフィカシーと比較して増加するエフィカシー（標的受容体の活性レベル）、３）受容体に対する増強化合物の親和性、４）増強が生じるために必要な最小濃度、及び／又は５）最高の増強性能をもたらす香料化合物に対するエンハンサーの最も効率的な割合。
【０２４３】
さらに対照として、マウスＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）応答性匂い物質受容体であるＯｌｆｒ１４４０（ＯＲ５ＡＮ１のオルソログ）で同様の実験を実施した。トリデシレンは、Ｏｌｆｒ１４４０受容体の活性を増強しなかった。むしろ、アルデヒドはＯｌｆｒ１４４０のＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）誘発活性化をわずかに阻害した（図５）。これは、トリデシレンアルデヒドによるＯＲ５ＡＮ１の増強が受容体媒介性であり、受容体特異的であるという考察をさらに裏付ける。
【０２４４】
実施例５：ＯＲ５ＡＮ１嗅覚受容体のポジティブなアロステリックモジュレーターの構造活性相関
最初に見出した脂肪族不飽和アルデヒドに構造的に関連する６７個の揮発性化合物の化学的に多様なセット（実施例２及び図１を参照されたい）を、構造活性相関（ＳＡＲ）解析のために生成した。ＯＲ５ＡＮ１の強化特性について６７個の分子を試験し、必要な化学的要件を特徴付けた。
【０２４５】
ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）に対する用量反応曲線を、２５０μＭのそれぞれの化合物の存在下で得て、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）のみの用量反応曲線と比較した。得られた増強を、ＥＣ50倍シフト（ポテンシーの増加）及びエフィカシースパン比（エフィカシーの増加）によって定量化した。
【０２４６】
ＥＣ50倍シフトを、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）＋化合物のＥＣ50を基準ＥＣ50ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）のみで割ることによって得た。スパン比を、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）＋化合物のスパンをＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）のみの基準スパンで割ることによって得た。具体的に、多様な脂肪族α−βモノ不飽和分子又はポリ不飽和分子を比較した。
【０２４７】
α−β−モノ不飽和二置換脂肪族アルデヒドが、最も強力な増強を示すことを体系的に見出した。官能基の置換、飽和修飾及び追加の置換は、受容体を増強するその化合物の可能性を低下又は排除すると見られる（図６、８〜１２）。α−βモノ不飽和脂肪族アルデヒドの周囲の追加修飾、例えばα位での置換又は脂肪族尾部の環化は、増強効果が起こることを妨げた。
【０２４８】
特定のＯＲ５ＡＮ１増強のために要求される化学的特徴を示す、得られる一般的な化学構造を決定した（図７）。α−β−モノ不飽和アルデヒド及び誘導された飽和又は機能異性体で得られた用量反応曲線のペアワイズ比較は、ＯＲ５ＡＮ１の増強のために要求される必要な化学的特徴をさらに例示する（図８〜１２）。図８は、デセナール、デカジエナール、及びデカナールでの得られた異なる増強レベル、及び不飽和の要件を示す。図９は、ドデセナール及びタンゲリナールでの得られた異なる増強レベル、及び不飽和位置の重要性を示す。
【０２４９】
図１０は、ノニレンアルデヒド、ノネノール及びノルデセノールで得られた異なる増強レベル、及びアルコール官能基をアルデヒド基の代わりに使用した場合の増強の欠如を示す。図１１は、デセナール及びデセノンで得られた異なる増強レベル、及びケトン官能基を使用した場合の増強の欠如を示す。さらに図１２は、ウンデセナール及びウンデセン酸で得られた異なる増強レベル、及び酸基を使用した場合の増強の欠如を示す。
【０２５０】
ＳＡＲ解析を実施して、最適なエンハンサーを同定し、そして所与の受容体を増強する化合物について要求される化学的要件を決定した。ＯＲ５ＡＮ１の場合に、少なくとも１０個の強力なエンハンサーが同定され、その全てが香料の作成／設計に適用できる揮発性化合物である。特定の理論に制限されることはないが、いくつかのエンハンサーが作成に近づいている場合に、固有の匂いのその後の感覚刺激特性は、さらに、適用（すなわち香水）の全体的な調香に関して下流の適用に最適な揮発性化合物を選択可能にする。言い換えれば、それぞれの標的分子、例えばムスクに対応する増強成分ポートフォリオを生じ、調香師により多くの作成ツールが提供される。
【０２５１】
実施例６：低機能ＯＲアレルがエンハンサーの存在下で復元できる
嗅覚受容体は、単一アレルから１５個を超えるアレルまで任意の所与のＯＲ遺伝子のいくつかのアレルによって頻繁にコード化される。天然のアレル変異は、遺伝子のヌクレオチド配列又はそれをコードするポリペプチドのアミノ酸配列において約１％〜５％の範囲であってよい。
【０２５２】
５個のＯＲ５ＡＮ１アレルは、人間の集団に存在することが公知である。これらのアレルは機能的に同等ではなく、完全に機能的（アレル１及び２）、低機能（アレル３及び４）〜機能喪失（アレル５）の異なる活性レベルを示す（図１３）。
【０２５３】
同定したエンハンサーのトリデシレンアルデヒドの存在下及び非存在下での細胞ベースのアッセイにおける低機能ＯＲ５ＡＮ１アレル３及び４の試験は、活性レベルの実質的な増加を示した。ＯＲ５ＡＮ１アレル３について観察したＥＣ50値は、６．０倍のシフト（２５０μＭトリデシレンアルデヒドの存在下で９．０μＭから１．５μＭ）及び２．０２の活性スパン比（トリデシレンアルデヒドの存在下で２３１１から４６６３の相対蛍光ＨＴＲＦユニットの活性増加）を示した。ＯＲ５ＡＮ１アレル４について観察したＥＣ50値は、６．２５倍のシフト（２５０μＭトリデシレンアルデヒドの存在下で１０．１μＭから１．６μＭ）及び２．１６の活性スパン比（トリデシレンアルデヒドの存在下で２３２８から５０２６の相対蛍光ＨＴＲＦユニットの活性増加）を示した。ポテンシーとエフィカシーの双方が好転し、アレル２を保有する人々に対してＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）によって誘発されたおそらくより強い活性に匹敵する活性レベルを導いた。これらのデータは、これらのアレルを保有する個体が、増強した香料成分の存在下でＯＲ５ＡＮ１活性化ムスクを含む香料適用により感受性がありうることを示唆している。
【０２５４】
実施例７：ムスク化合物に対するヒトの感受性がエンハンサーの存在下で増加する
ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）に対するヒトの感受性を、匂い検出閾値（ＯＤＴ）試験を実施することによって評価した。ＯＤＴ試験は、パネリストの５０％、好ましくは６６％が、強制選択三点比較（forced-choice triangle test）において３つの容器のどれに標的化合物ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）が含まれているかを決定できる濃度を同定することから構成された。２つの試験を実施して、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）に加えて、化学的に類似する分子の知覚可能なバックグラウンドの匂いであるａ）エンハンサーのトリデシレンアルデヒドとｂ）非増強揮発性化合物のノナナールとを含む混合物中のＯＤＴを算出した。これらの２つの分子は化学的に類似しているが、しかしノナナールは、実施例５において同定した増強が生じるために必要なα−β−不飽和を示さない。
【０２５５】
２８人のパネリストに、濃度０．１％でのトリデシレンアルデヒドの存在下で、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）の濃度を増加させた一連の三点比較を実施した。それぞれの三点比較で、３つの試料は０．１％でのトリデシレンアルデヒドを含み、１つの試料はＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）も含んだ。２７人のパネリストに、濃度０．１％のノナナールの存在下で、ＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）の濃度を増加させた一連の三点比較を実施した。それぞれの三点比較で、３つの試料は０．１％でのノナナールを含み、１つの試料はＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）も含んだ。それぞれの三点比較において、他の２つの試料とは異なった１つの試料を同定するようにパネリストに依頼した。非線形回帰モデルをデータに当てはめ、そして正しい応答の割合が２／３（６６％、確率１／３と全ての答え１との中間点）に等しいＭＵＳＣＥＮＯＮＥ（登録商標）の濃度を計算することによってＯＤＴを計算した。これらは、ムスクを中性化合物よりもエンハンサーと混合した場合のＯＤＴ値は低く（それぞれ０．９３％と比較して０．０９％）、実験的に同様の条件下でムスク検出レベルが異なることを示した（図１４）。
【０２５６】
実施例８：推定ＯＲ１０Ｊ５活性エンハンサーの同定
実施例１〜５において記載されるのと同一のスクリーニング方法に従って、ヒトフローラルミュゲ匂い物質受容体ＯＲ１０Ｊ５をスクリーニングして、推定エンハンサーを同定する。Ｌｕｃｙ−Ｆｌａｇ−Ｒｈｏをタグ付けした受容体を、嗅覚の標準的なＧタンパク質Ｇolfとコトランスフェクトし、そして単一濃度のフローラルミュゲ化合物及び試験化合物の二成分混合物に曝す。
【０２５７】
フローラルミュゲ化合物である３−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル）シクロヘキセ−３−エン−１−カルバルデヒド、４−（４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル）シクロヘキセ−３−エン−１−カルバルデヒド又はそれらの混合物（商標名ＬＹＲＡＬ（登録商標）で販売されている、以下「ＬＹＲＡＬ（登録商標）」という）への応答におけるＯＲ１０Ｊ５の活性を示す用量反応曲線を、図１５において示す。細胞ベースのアッセイを使用して、国際公開番号第２０１６／２０１１５３号において開示された方法に従って、ＯＲ１０Ｊ５活性を、内因性シャペロンＲＴＰ１遺伝子が活性化され、匂い物質受容体シャペロンを発現してるＨＥＫ２９３Ｔ細胞株で試験した。Ｆｌａｇ−Ｒｈｏをタグ付けした受容体を、嗅覚の標準的なＧタンパク質Ｇolfとコトランスフェクトし、そして単一濃度のＬＹＲＡＬ（登録商標）及び試験化合物の二成分混合物に曝した。
【０２５８】
揮発性化合物のライブラリーを使用して、それぞれの化合物とＬＹＲＡＬ（登録商標）との約ＥＣ20（それ自体によってＯＲ１０Ｊ５の完全な活性レベルの約２０％のみを誘発する濃度）での二成分混合物を作成した。最初のエンハンサー候補の同定のために、活性化細胞ベースのアッセイを使用した。単一の二成分混合物誘発受容体活性を、ＨＴＲＦ（Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅユニット）ベースのキット（ＣｉｓＢｉｏ、ｃＡＭＰ ｄｙｎａｍｉｃ ２キット、６２ＡＭ４ＰＥＪ）を使用してサイトゾル中のｃＡＭＰ増加を測定することによって検出した。
【０２５９】
８００個の二成分混合物を、ＬＹＲＡＬ（登録商標）ストック溶液とそれぞれの試験化合物のストック溶液とをそれぞれ最終濃度４．６μＭ及び３００μＭに混合することにより作成した。ストック溶液を、純粋なＤＭＳＯに溶解した化合物から作成した。それぞれの混合物を、ＯＲ１０Ｊ５嗅覚受容体を発現する細胞株に提示した。それぞれの二成分混合物中のＤＭＳＯの最終濃度は０．１％であり、細胞に対して目に見える影響はなかった（図１６を参照されたい）。
【０２６０】
次に、得られた活性を測定し、ＬＹＲＡＬ（登録商標）のみと比較した（増強アッセイのベースラインを定義する）。ＨＴＳプロセスの品質を決定し、そしてウィンドウの変動性及びシグナルの信頼性を、それぞれのプレートのＺ’値を算出することにより評価した。４５個のヒットを得て、そのうち８個は、ＯＲ１０Ｊ５嗅覚受容体アゴニストであった（ヒット番号１、２、５、６、１０、１５、２５及び３４）、表４を参照されたい。これらのＯＲ１０Ｊ５嗅覚受容体アゴニストは、アッセイウィンドウのダイナミックレンジが十分であり（記録された応答がベースラインを大きく上回ったため）、したがって低レベルの推定増強でさえも検出するために十分な感度があったことをさらに確認した。
【０２６１】
表５において「増強」として印付けた３７個の候補を同定し、そして潜在的な候補の真の増強特性を確認するための２つの並行した用量反応実験で試験した。最初に、それぞれ個々の候補の用量反応を実施して、それ自体がアゴニストであるかどうかを測定した。次に、ＥＣ20のＬＹＲＡＬ（登録商標）濃度（ＯＲ１０Ｊ５に対して２０％の活性を生じる）の存在下での同一の候補の用量反応曲線を、活性レベルの増加について評価した。ＥＣ20を超えたＬＹＲＡＬ（登録商標）に対するＯＲ１０Ｊ５嗅覚受容体の応答を増加させたが、測定可能な内因性活性自体を示さなかった分子を、真のエンハンサーと見なし、さらなる研究のために選択した。この解析から、増強特性を示した２０個の分子を同定した。表４を参照されたい。
【表４】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【０２６２】
実施例９：特異的なＯＲ１０Ｊ５活性増強の特徴
ＬＹＲＡＬ（登録商標）増強の特異性を、同定されたエンハンサーと構造的に類似した化合物で試験した。ＬＹＲＡＬ（登録商標）に対する用量反応曲線を、一定濃度の試験化合物の存在下で得て、ＬＹＲＡＬ（登録商標）のみの用量反応曲線と比較した。得られた増強を、ＥＣ50倍シフト（ポテンシーの増加）及びエフィカシースパン比（エフィカシーの増加）によって定量化した。
【０２６３】
ＥＣ50倍シフトを、ＬＹＲＡＬ（登録商標）＋化合物のＥＣ50をＬＹＲＡＬ（登録商標）のみの基準ＥＣ50で割ることによって得た。スパン比を、ＬＹＲＡＬ（登録商標）＋化合物のスパンをＬＹＲＡＬ（登録商標）のみの基準スパンで割ることによって得た。
【０２６４】
図１７は、ＯＲ１０Ｊ５についての、ａ）ヘリオプロパナール及びｂ）３−（４−メチルシクロヘキセ−３−エン−１−イル）ブタナールで得られた異なる増強レベル、並びにｃ）ヘリオトロピン及びｄ）シクロメチレンシトロネロールでの増強の欠如を示す。ＬＹＲＡＬ（登録商標）によるＯＲ１０Ｊ５の活性化は、ヘリオプロパナール及び３−（４−メチルシクロヘキサ−３−エン−１−イル）ブタナールによって特異的に増強されたが、対応する倍シフトにより示される構造的に関連する化合物によっては増強されなかった（ヘリオプロパナール及び３−（４−メチルシクロヘキサ−３−エン−１−イル）ブタナールについてそれぞれ９．２倍及び６．７倍シフトに対して、ヘリオトロピン及びシクロメチレンシトロネロールについてそれぞれ１．８倍及び１．３倍シフト）。
【０２６５】
図１８は、ＯＲ１０Ｊ５のマウスオルソログであるＯｌｆｒ１６についての、ヘリオプロパナール及び３−（４−メチルシクロヘキセ−３−エン−１−イル）ブタナールで得られた異なる増強レベル、並びにヘリオトロピン及びシクロメチレンシトロネロールでの増強の欠如を示す。ＬＹＲＡＬ（登録商標）によるＯｌｆｒ１６の活性化は、ヘリオプロパナール及び３−（４−メチルシクロヘキサ−３−エン−１−イル）ブタナールによって特異的に増強されたが、対応する倍シフトにより示される構造的に関連する化合物によっては増強されなかった（ヘリオプロパナール及び３−（４−メチルシクロヘキサ−３−エン−１−イル）ブタナールの双方について５倍シフトに対して、ヘリオトロピン及びシクロメチレンシトロネロールについてそれぞれ１．５倍及び１．１倍シフト）。これらの結果は、他の哺乳動物の嗅覚受容体の増強を示す。
【０２６６】
実施例１０：フローラルミュゲ化合物エンハンサーがポジティブなアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）として作用してＯＲ１０Ｊ５嗅覚受容体活性を増強する
機能的用量反応実験を実施して、ヘリオプロパナール、３−（４−メチルシクロヘキセ−３−エン−１−イル）ブタナール、メロナール及びヘプタナールとＯＲ１０Ｊ５との相互作用のアロステリックな性質を明らかにした。ＯＲ１０Ｊ５の活性化の増強レベルを、異なる濃度のぞれぞれのエンハンサーで評価した。前記と同一の細胞ベースのアッセイを使用して、０〜６００μＭの範囲の連続濃度のエンハンサーの存在下でのＬＹＲＡＬ（登録商標）に対するＯＲ１０Ｊ５の用量反応曲線を実施した（図１９を参照されたい）。三元複合体相互作用モデルから導いた単純化アロステリックＥＣ５０シフト効果式（Ｐｒｉｓｍ７で利用可能）を適用することによって曲線を得た。記録した増強レベルは、エンハンサーの濃度に対して線形従属ではなく、α（協同性係数）及びＫB（エンハンサーの平衡解離定数）について次の重要なパラメータ値をそれぞれのエンハンサーについてのモデルから得た：ヘリオプロパナール、α＝６．３及びＫB＝１０μＭ；３−（４−メチルシクロヘキセ−３−エン−１−イル）ブタナール、α＝７．５及びＫB＝１５μＭ；メロナール、α＝４．１及びＫB＝１６μＭ；及びヘプタナール、α＝３．２及びＫB＝５１μＭ。α＞１は、ポジティブなアロステリック調節を示す。
【０２６７】
実施例１１：ＬＹＲＡＬ（登録商標）に対するヒトの感受性がエンハンサーの存在下で増加する
ＬＹＲＡＬ（登録商標）に対するヒトの感受性を、匂い検出閾値（ＯＤＴ）試験を実施することによって評価した。ＯＤＴ試験は、パネリストの５０％、好ましくは６６％が、一連の強制選択三点比較において３つの容器のどれに標的化合物ＬＹＲＡＬ（登録商標）が含まれているかを決定できる濃度を同定することから構成された。２つの試験を実施して、ＬＹＲＡＬ（登録商標）に加えて、化学的に類似する分子の知覚可能なバックグラウンドの匂いであるａ）エンハンサーの３−（４−メチルシクロヘキセ−３−エン−１−イル）ブタナールとｂ）非増強揮発性化合物のシクロメチレンシトロネロールとを含む混合物中のＯＤＴを算出した。これら２つの分子は化学的に類似する。
【０２６８】
２８人のパネリストに、濃度０．１％の３−（４−メチルシクロヘキセ−３−エン−１−イル）ブタナールの存在下で、ＬＹＲＡＬ（登録商標）の濃度を増加させた一連の三点比較を実施した。それぞれの三点比較で、３つの試料は０．１％での３−（４−メチルシクロヘキセ−３−エン−１−イル）ブタナールを含み、１つの試料はＬＹＲＡＬ（登録商標）も含んだ。２８人のパネリストに、濃度７％のシクロメチレンシトロネロールの存在下で、ＬＹＲＡＬ（登録商標）の濃度を増加させた一連の三点比較を実施した。それぞれの三点比較で、３つの試料は７％でのシクロメチレンシトロネロールを含み、１つの試料はＬＹＲＡＬ（登録商標）も含んだ。それぞれの三点比較において、他の２つの試料とは異なった１つの試料を同定するようにパネリストに依頼した。対応する結果を図２０において示す。
【０２６９】
現場で頻繁に使用されるアボットの式（Ｌａｗｌｅｓｓ、２０１０）を使用して推測の確率を考慮して、正しい回答の割合を調整した。説明変数として材料（エンハンサー対中立の化合物）及びログ変換された濃度レベルと、応答変数として正しい応答の割合との直線回帰から、濃度の増加に伴い、ＬＹＲＡＬ（登録商標）をエンハンサーと混合した場合に、正しい反応の割合がより高い割合で増加したこと（中立の化合物に対して、図２１を参照されたい）を示す、材料の有意な主効果（ｐ＝．０３）及びわずかに有意な相互作用（ｐ＝．０５２）を得た。
【０２７０】
実施例１２：ＯＲ１０Ｊ５活性の増強はＯＲ１０Ｊ５アゴニストに依存する
ＯＲ１０Ｊ５活性の増強を、追加のアゴニスト、及び前記実施例において記載した試験化合物の１つ及び条件を用いて試験した。（＋−）−２，５−ジメチル−２−インダンメタノールに対する用量反応曲線を、一定濃度の試験化合物の存在下で得て、アゴニストのみの用量反応曲線と比較した。得られた増強を、前記したようにＥＣ50倍シフト（ポテンシーの増加）及びエフィカシースパン比（エフィカシーの増加）によって定量化した。
【０２７１】
図２２は、ａ）ヘリオプロパナールで得られた異なる増強レベル及びｂ）ヘリオトロピンでの増強の欠如を示し、対応する倍率シフト（ヘリオプロパナール及びヘリオトロピンについてそれぞれ８．６倍及び２．０倍のシフト）によって示されるように、（＋−）−２，５−ジメチル−２−インダンメタノールによるＯＲ１０Ｊ５活性化は、ヘリオプロパナールによって特異的に増強されたが、構造的に関連する化合物によっては増強されなかった。
【０２７２】
これは、試験化合物がアゴニスト（活性化化合物）の性質とは無関係にＯＲ１０Ｊ５の活性を特異的に増強していることを示す。この特定の場合において、（＋−）−２，５−ジメチル−２−インダンメタノールは、ＯＲ１０Ｊ５の部分的アゴニストであるが、ヘリオプロパナールにより増強され、ポテンシーの増加に加えて用量反応のダイナミックレンジ内で１．７倍のエフィカシーの増加を導く（図２２ａを参照されたい）。これは、さらに、増強が受容体結合事象によって媒介され、例えばアッセイ細胞自体に対する受容体非依存効果によって媒介される可能性が低いことを示した。
【０２７３】
本明細書を通して引用された刊行物は、その全体を参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。本発明の種々の態様は、実施例及び好ましい実施形態を参照することにより前記で例示されているが、本発明の範囲は上記の説明によってではなく特許法の原則の下で適切に解釈される特許請求の範囲により評価される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021508030.tif 000044
2021508030.tif 000045
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