(57)【要約】【課題】解離定数が小さく、低分子量の有機化合物を高い特異性でスクリーニングする。【解決手段】基板上に、金属膜と、炭素原子数３〜８のアルキル鎖から形成される自己組織化膜をこの順に有し、この自己組織化膜上に、平均分子量が１万〜500万であって、且つ水中での厚さが１nm〜500nmである多糖類層を介して生理活性物質が固定された担体に対して、前記生理活性物質との解離定数が10nM〜10mMであって、且つ分子量が400以下の低分子有機化合物を接触させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に、金属膜と、炭素原子数３〜８のアルキル鎖から形成される自己組織化膜をこの順に有し、該自己組織化膜上に、平均分子量が１万〜500万であって、且つ水中での厚さが１nm〜500nmである多糖類層を介して生理活性物質が固定された担体に対して、前記生理活性物質との解離定数が10nM〜10mMであって、且つ分子量が400以下の低分子有機化合物を接触させることを特徴とする低分子有機化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記低分子有機化合物の分子量が200以上400以下であることを特徴とする請求項１記載の低分子有機化合物のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記解離定数が10nM〜300μMであることを特徴とする請求項１または２記載の低分子有機化合物のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記低分子有機化合物の前記担体への接触時間が30秒〜60秒であることを特徴とする請求項１、２または３記載の低分子有機化合物のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記多糖類層が、平均分子量10万〜20万の多糖類から形成される層であることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の低分子有機化合物のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記多糖類層が、カルボキシメチルデキストランから形成される層であることを特徴とする請求項１〜５いずれか１項記載の低分子有機化合物のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記生理活性物質を含む溶液を多糖類層に5分〜120分間接触させることによって、生理活性物質を多糖類層に固定化させることを特徴とする請求項１〜６いずれか１項記載の低分子有機化合物のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記基板が誘電体プリズムであって、前記担体に対して前記低分子有機化合物を接触させた後、該誘電体プリズムの側から、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面で全反射する条件で測定光を入射し、該界面で全反射した光を検出して、前記生理活性物質に対する前記低分子有機化合物の特異的結合を検出することを特徴とする請求項１〜７いずれか１項記載の低分子有機化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質と相互作用する低分子有機化合物のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
医薬の開発において、一つの新薬ができあがるまでには、10万から100万種類以上の化合物が検討され、その中の百種類あまりがin vitroスクリーニングを通過し、さらにそのうちの十種類程度が動物実験などで薬として見込みがあると判断され、臨床試験などを経てようやく一つの新薬として世にでるといわれている。一般にその開発期間は８〜15年と言われ、研究開発費は100億から150億円と非常に膨大である。
【０００３】
ヒット化合物を探索する技術は、薬剤のもととなるリード化合物の構築に必須であることに加え、ターゲット候補の評価や創薬のコンセプトを確認するための化合物を迅速に発見することにも大きく寄与する。しかしながらヒット・リード化合物の探索は、薬剤開発の各過程のなかで最も成功率が低く、大手の製薬会社においてもこの段階の成功率は25%に過ぎないと言われている（Drug Discovery Today 2002.7,ｐ522-527）。
【０００４】
このような状況下にあってhigh throughput screening（以下、HTSという）がヒット・リード化合物の探索段階において必須の技術となった。HTSは短時間で多くの化合物のスクリーニングを行うことを可能とするが、成功率を向上させるには、化合物ライブラリーのサイズと多様性を増大させなくてはならない。しかしながら、combinatorial chemistryにより製薬メーカーが独自に開発したライブラリー群や、試薬メーカーより購入できる化合物群を合わせても、その総数はせいぜい10の６乗から７乗個のオーダーであり、10の60乗個ともいわれる分子量500以下の有機化合物の広大なケミストリースペースを担うことはできないと考えられる（Med. Res. Rev. 1996,16,3-50）。
【０００５】
一方で、化合物の構造が複雑になり、ライブラリーが大きくなるほど、有意な結合を見つけられる確率が大きく減るという皮肉とも言える計算結果も報告されており（J.Chem. Inf. Comput. Sci. 2001, 41, 856-864）、従来のcombinatorial chemistryとHTSに頼る創薬手法だけでは、製薬メーカーは生き残っていくことができないというのが現況である。特に日本国内メーカーの化合物ライブラリーは完全にランダム化されていないために、全く新しい母核構造が提案されることがなく、HTSによる創薬の成功例は未だに報告されておらず、天然物などの薬理活性をもつ化合物を部分的に変更・修飾する方法により見出されたもののみが、実際に薬剤となっているというのが国内製薬メーカーの現状であり、多大なコストを強いるHTSに対して疑問が投げかれられている。
【０００６】
とはいえ、1980年代後半から蛋白質の結晶化および立体構造の解析技術が飛躍的発展をとげ、Protein Data Bankに登録される数は膨大なものとなりつつあり、またその中には創薬の標的となる酵素や受容体（レセプター）などに関連する蛋白質が多く含まれることから、創薬のための重要な構造情報を提供するものであることに違いはない。蛋白質の機能はほとんどの場合、構造変化に対応しており、この構造変化は酵素における反応中心での小さいが本質的なアミノ酸残基の動きから、受容体やトランスポーターなどにおける構造全体の大きな動きまで含まれる。医薬品は蛋白質の機能すなわち構造変化を制御するものであるため、新薬開発においては蛋白質の立体構造と相互作用を捉えながら、化合物を設計することができれば非常に合理的な創薬手法と言える。
【０００７】
このような背景を受けて、ターゲット蛋白や薬物複合体の立体構造および相互作用解析をもとに薬剤の設計を行うStructure Based Drug Design（以下、SBDDという） が台頭してきた。SBDDは、薬理活性が弱いリード化合物の一部をなす低分子化合物（フラグメント）を蛋白構造との活性相関を検証しながら、より活性の強い化合物（リード化合物）へとデザインしていくことが可能である。このため、SBDDは従来の創薬手法の主流であるHTSで問題となっている高コスト、低効率、擬陽性を克服できる可能性があることから高い期待を持たれている。
【０００８】
SBDDの流れのうち重要な課題のひとつが、フラグメントアッセイにおいて如何にして有効なヒットフラグメントを検出するかである。現在、フラグメントアッセイで用いられている主な手法はNMRとＸ線結晶回析であり、蛋白の結晶化というボトルネックを抱えるＸ線結晶回析に比べ、NMRは溶液中での測定が可能という利点を有しており、最も多く用いられている手法である。特にNMRによって得られる構造活性相関、SAR by NMRは、フラグメントのスクリーニングと親和性の向上を行う手法であり、実際にFKBP（免疫抑制剤ＦＫ506の標的蛋白）に対する阻害剤の開発などの成功例がある （Science, 1996, 274, 1531-4，Science, 1997, 278, 497-499）。
【０００９】
これらの手法は、１）試料濃度が濃いので弱い相互作用を検出できる、２）標的蛋白とフラグメントの直接の結合を検出できる、３）構造情報が得られる、４）結合定数を決定できる、５）フォールスポジ、フォールスネガがほとんどない、６）複数の化合物の混合物が試料中にあっても、どの化合物が標的蛋白に結合しているかをデータから同定できる、といった利点がある。一方で、１）蛋白を高純度かつ多量に用意する必要がある、２）Ｘ線結晶回析では結晶化が必要である、３）NMRではラベル化が必須であり、40Kdaまでの分子量の蛋白しか測定できない、４）スループットが低い（一番早いSAR by NMRでもスループットは1000化合物/台/日）といった問題を有している。
【００１０】
近年、金などの金属表面に蛋白などの生理活性物質を固相化し、化学物質をここに供与したときの共鳴の変化を用いて相互作用を定量する表面プラズモン共鳴法（SPR）が注目されている。この手法を利用して低分子化合物をスクリーニングする方法が非特許文献１に記載されているが、ここに示されている低分子化合物はいずれも解離定数が高いものである。一般に、低分子医薬の探索においては、通常、ひとつの生理活性物質（ターゲット蛋白）に対して、少なくとも10000個以上の低分子化合物のスクリーニングを行うため、このような高い解離定数を有する生理活性物質を固相化したSPRでは、大規模なスクリーニングを効率的に行うことはできない。
【００１１】
一方で、本出願人は、既に、特許文献１においてSPRを利用して大規模なスクリーニングを効率的に行うことが可能な方法を提案している。
【非特許文献１】Biol.Pharm.Bull.2006,29(5) 927-932
【特許文献１】特開2006-78210号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
近年の創薬レースは、世界的な認可基準の困難化が進む一方で、低分子化合物のターゲットとなりうるテーマが枯渇し、同一テーマへの企業参入が集中化しているため、創薬のスピードアップがより強く求められている。従って、このような観点からは解離定数の小さな低分子化合物をスクリーニングできることが望ましい。上記特許文献１においても、解離定数の小さなスクリーニングが可能であるものの、この疎水性ポリマーは疎水性を有する夾雑物（例えば脂質など）の非特異性吸着が多く、ノイズが増えるという問題がある。
【００１３】
本発明はこのような事情に鑑みなされたものであって、非特異性吸着を抑制し、解離定数が小さく、低分子量の有機化合物を高い特異性で、短時間に多数のサンプルをスクリーニングすることが可能なスクリーニング方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の低分子有機化合物のスクリーニング方法は、基板上に、金属膜と、炭素原子数３〜８のアルキル鎖から形成される自己組織化膜をこの順に有し、該自己組織化膜上に、平均分子量が１万〜500万であって、且つ水中での厚さが１nm〜500nmである多糖類層を介して生理活性物質が固定された担体に対して、前記生理活性物質との解離定数が10nM〜10mMであって、且つ分子量が400以下の低分子有機化合物を接触させることを特徴とするものである。
【００１５】
前記低分子有機化合物の分子量は200以上400以下であることが好ましく、また、前記解離定数は10nM〜300μMであることが好ましい。  
また、前記低分子有機化合物の前記担体への接触時間は30秒〜60秒であることが好ましい。
【００１６】
前記多糖類層は、平均分子量10万〜20万の多糖類から形成される層であることが好ましく、また、前記多糖類層は、カルボキシメチルデキストランから形成される層であることがより好ましい。  
前記生理活性物質を含む溶液を多糖類層に固定化させる際は、5分〜120分間接触させることが好ましい。
【００１７】
本発明の低分子有機化合物のスクリーニング方法は、前記基板が誘電体プリズムであって、前記担体に対して前記低分子有機化合物を接触させた後、該誘電体プリズムの側から、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面で全反射する条件で測定光を入射し、該界面で全反射した光を検出して、前記生理活性物質に対する前記低分子有機化合物の特異的結合を検出することで行うことができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の低分子有機化合物のスクリーニング方法は、基板上に、金属膜と、炭素原子数３〜８のアルキル鎖から形成される自己組織化膜をこの順に有し、該自己組織化膜上に、平均分子量が１万〜500万であって、且つ水中での厚さが１nm〜500nmである多糖類層を介して生理活性物質が固定された担体を使用することによって、前記生理活性物質との解離定数が10nM〜10mMであって、且つ分子量が400以下の低分子有機化合物を高い特異性を以て、且つハイスループットでスクリーニングすることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の低分子有機化合物のスクリーニング方法は、基板上に、金属膜と、炭素原子数３〜８のアルキル鎖から形成される自己組織化膜をこの順に有し、該自己組織化膜上に、平均分子量が１万〜500万であって、且つ水中での厚さが１nm〜500nmである多糖類層を介して生理活性物質が固定された担体に対して、前記生理活性物質との解離定数が10nM〜10mMであって、且つ分子量が400以下の低分子有機化合物を接触させることを特徴とする。まず、本発明の低分子有機化合物のスクリーニング方法に用いられる担体について説明した後、担体を使用したスクリーニング方法について説明する。
【００２０】
（１）金属膜
金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサ用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されないが、好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２１】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサ用を考えた場合、0.1nm以上500nm以下であることが好ましく、特に１nm以上200nm以下であることがより好ましい。500nmを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができなくなる。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、0.1nm以上10nm以下とすることが好ましい。
【００２２】
金属膜の形成は公知の方法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２３】
（２）生理活性物質を固定化するための層
金属膜上には、生理活性物質を固定化するための層（以下、単に固定化層ともいう）が設けられる。固定化層は、自己組織化膜と多糖類層との組み合わせから構成されてなる。それぞれについて説明する。
【００２４】
（２−１）自己組織化膜（SAMs）
自己組織化膜とは、一般に外からの細かい制御を加えていない状態で、膜材料そのものがもつ機構によって形成される一定の秩序をもつ組織をもった単分子膜やLB膜などの超薄膜を意味するが、特に、本発明においては、炭素原子数３〜８のアルキル鎖から形成される自己組織化膜形成分子により形成されるものを自己組織化膜と称する。
【００２５】
金属膜として金を用いた場合、炭素原子数３〜８のアルキル鎖から形成される自己組織化膜は、末端にチオール基（−SH）を有するアルカンチオールが、Au−S結合とアルキル鎖同士のvan der Waals力に基づき、配向性を持つ単分子膜として自己組織的に形成される。自己組織化膜は、アルカンチオール誘導体の溶液中に金基板を浸漬するという極めて簡便な手法で作製することができる。なお、アルカンチオールのチオール末端とは反対側の末端には、アミノ基、カルボキシル基等を適宜選択することができる。
【００２６】
本発明においては、ａ）末端にアミノ基を有するアルカンチオールと、ｂ）水酸基を有するアルカンチオール若しくはエチレングリコールユニットを有するアルカンチオール、の複数種のアルカンチオールを混合し、自己組織化膜を形成することが好ましい。
【００２７】
本発明で使用可能な、ａ）末端にアミノ基を有するアルカンチオールは、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物（一般式A-2）（一般式A-2において、ｎは３から８の整数を示す）でもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式A-3、A-4）（一般式A-3においてｎは３から８の整数を示し、一般式A-4においてｎはそれぞれ独立に３から８の整数を示す）と大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させた化合物でもよい。末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはジアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させてもよい。
【化１】
2008304235.tif 000002
【００２８】
本発明で使用可能な、ｂ）水酸基を有するアルカンチオール若しくはエチレングリコールユニットを有するアルカンチオールとしては、下記一般式A-6、A-7で示される化合物（一般式A-6において、ｎは３から８の整数を示し、一般式A-7において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に３から８の整数を示す）を用いることが好ましい。好ましくは、一般式A-6において、ｎは５以上であり、好ましくは６〜８である。
【化２】
2008304235.tif 000003
【００２９】
本発明において、ａ）末端にアミノ基を有するアルカンチオールと、ｂ）水酸基を有するアルカンチオール若しくはエチレングリコールユニットを有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能であるが、ａ）アミノ基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には活性エステル化されたカルボキシル基含有ポリマーの結合量が低下し、ｂ）水酸基を有するアルカンチオール若しくはエチレングリコールユニットを有するアルカンチオールの割合が少ない場合には非特異吸着抑制能が減少する。それゆえ、ａ）末端にアミノ基を有するアルカンチオールと、ｂ）水酸基を有するアルカンチオール若しくはエチレングリコールユニットを有するアルカンチオールの混合モル比は、１／１〜１／1,000,000の範囲であることが好ましく、１〜１／1,000の範囲であることがより好ましく、１〜１／10の範囲であることがさらに好ましい。活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーと反応する場合の立体障害低減の観点から、ａ）末端にアミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、ｂ）水酸基を有するアルカンチオール若しくはエチレングリコールユニットを有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。
【００３０】
（２−２）多糖類層
本発明の多糖類層に用いることができる多糖類としては、ゼラチン、アガロース、キトサン、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、澱粉、セルロース、又はこれらの誘導体、例えばカルボキシメチル誘導体、又は水膨潤性有機ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール又はこれらの誘導体などを挙げることができる。
【００３１】
本発明で用いる多糖類としてはさらに、カルボキシル基含有多糖類を用いることが可能である。カルボキシル基含有多糖類は、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等が挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるCMD、CMD-L、CMD-D40（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることができる。  
本発明で用いる多糖類の平均分子量は１万以上500万以下であり、好ましくは10万以上20万以下であることが望ましい。
【００３２】
上記の多糖類は、自己組織化膜を介して基板に固定される。  
担体表面に固定される多糖類は、水中の膜厚が１nm以上500nm以下であり、好ましくは１nm以上300nm以下であることが望ましい。膜厚が１nmよりも薄いと生理活性物質の固定量が減少し、またセンサ表面の水和層が薄くなるため生理活性物質自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。一方で、膜厚が500nmよりも厚いと低分子有機化合物（被検体物質）が膜内に拡散する障害となり、また特に基板の多糖類固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水溶液中の親水性ポリマー膜厚はAFM、エリプソメトリーなどで評価することができる。
【００３３】
多糖類の固定量は、３ng/mm2以上30ng/mm2以下であることが好ましく、好ましくは３ng/mm2以上20ng/mm2以下、さらには３ng/mm2以上15ng/mm2以下であることより好ましい。固定量は、種々の膜厚測定方法・重量測定方法などにより測定することができる。膜厚測定方法の例としては、原子間力顕微鏡（AFM）、走査型トンネル顕微鏡（STM）などの走査型プローブ顕微鏡（SPM）、透過型電子顕微鏡（TEM）、走査型電子顕微鏡（SEM）、走査型透過電子顕微鏡（STEM）などの電子顕微鏡、エリプソメトリー法などの方法が挙げられる。
【００３４】
多糖類の乾燥膜厚としては、３nm以上30nm以下であることが好ましく、３nm以上20nm以下が更に好ましく、３nm以上15nm以下が最も好ましい。膜厚測定方法の具体的な算出法としては、例えばSPMでは、基板上の多糖類が固定されているエリアと固定されていないエリアとの表面凹凸の差から膜厚を算出でき、電子顕微鏡の場合には多糖類が固定された基板の切片観察から膜厚を算出できる。重量測定方法の具体的な算出方法としては、水晶発振子マイクロバランス法（QCM）、全反射測定法（ATR）、外部反射法などの赤外分光法などが挙げられる。
【００３５】
また、表面プラズモン共鳴法（SPR）では、溶液中の基板上の多糖類の固定前・後の共鳴シグナルの変化量を、多糖類の固定量として算出することができる。
【００３６】
（２−３）多糖類の活性化
多糖類としてカルボキシル基を含有するポリマーを使用する場合は、カルボキシル基を活性化することによって、自己組織化膜で被覆された基板に固定化することができる。カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化する方法、又はEDC単独により活性化する方法を好ましく用いることができる。この手法で活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを、自己組織化膜のアミノ基と反応させることで、生理活性物質を固定化するための層を製造することが可能となる。
【００３７】
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として含窒素化合物を用いる方法があり、具体的には、下記一般式（Ia）又は（Ib）（式中、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表し、Ｒ1及びＲ2は結合により５〜６員環を形成しても良く、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す）に示される含窒素化合物を用いることもできる。
【化３】
2008304235.tif 000004
【００３８】
ここで、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表すが、好ましくはＲ1及びＲ2は結合により５〜６員環を形成する。特に好ましくは、ヒドロキシコハク酸、ヒドロキシフタル酸、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３、４−ジヒドロキシ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１、２、３−ベンゾトリアジン、及びその誘導体が提供される。
【００３９】
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として、電子吸引性基を有するフェノール誘導体を使用することも好ましく、更に電子吸引性基のσ値が0.3以上であることが好ましい。
【００４０】
更に、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法では、別にカルボジイミド誘導体物を併用することができ、好ましくは、水溶性カルボジイミド誘導体を併用することができ、例えば（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride）を併用することができる。
【００４１】
上記のカルボジイミド誘導体及び、含窒素化合物、またはフェノール誘導体は併用して使用するだけではなく、所望により、夫々、単独で用いることもできる。好ましくはカルボジイミド誘導体と含窒素化合物との併用である。
【００４２】
さらに、カルボキシル基を含有するポリマーにおけるカルボン酸を活性化する手法としては、特開2006-58071号公報「0011」〜「0022」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いて活性化することによりカルボン酸アミド基を形成する方法）、並びに特開2006-90781号公報「0011」〜「0019」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物でエステルとした後に、アミンと反応させることによりカルボン酸アミド基を形成する方法）を用いることもできる。
【００４３】
（３）生理活性物質を固定化するための層への生理活性物質の固定
生理活性物質を固定化するための層が、カルボキシル基を有する多糖類から構成されている場合は、このカルボキシル基を活性化した後に、アミノ基を有する生理活性物質を反応させることによって、生理活性物質を多糖類に固定化することができる。固定化層に固定化する際におけるカルボキシル基の活性化は、上記（２−３）多糖類の活性化において記載した方法と同様の方法により行うことができる。
【００４４】
固定化層への生理活性物質の固定は、カルボキシル基を有する多糖類のカルボキシル基を活性化した後、固定化層を有する金属膜の表面上に、固定化層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布し、乾燥させることによって金属膜表面上に均一な膜を形成する。この際、生理活性物質は、固定化層を構成する分子と共有結合することによって、金属膜の表面に固定化される。
【００４５】
生理活性物質を固定化することができる官能基としては、カルボキシル基やアミノ基などの官能基の他に、例えば、ビオチン結合性蛋白（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）、プロテインＡ、プロテインＧ、抗原、抗体（例えば、抗GST抗体等の公知のtag抗体）などを用いることが可能である。また、ポリマーにアルカンを導入した固定化層を用いれば、脂質などの膜構造を有した生理活性物質を固定することが可能になる。また、用途に応じて、ポリマー鎖の長さ、ポリマーの厚み、ポリマーの密度、あるいは、ポリマーに導入する反応基の量を調整することにより、多様な蛋白に対応することが可能となる。またポリマーに固定基として、NTA（nitrilotriacetic acid）等などを導入すれば、金属キレートを介してHis-tagリガンド等を固定することができる。
【００４６】
（４）生理活性物質
生理活性物質としては、測定対象物（低分子有機化合物）と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００４７】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちIgG、IgM、IgA、IgE、IgDを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００４８】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００４９】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。  
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、DNA（cDNAを含む）、RNAのいずれも使用できる。DNAの種類は特に限定されず、天然由来のDNA、遺伝子組換え技術により調製した組換えDNA、又は化学合成DNAの何れでもよい。
【００５０】
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。  
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（RF）等を使用することができる。
【００５１】
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。  
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ス
テアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。これらの生理活性物質のうち、蛋白質を用いることが好ましく、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン類、カルモデュリン、又は抗体を用いることがより好ましい。
【００５２】
生理活性物質を含む溶液（塗布液）の濃度は、基板表面に固定する生理活性物質の濃度が高い方が好ましい。生理活性物質により異なるが、0.1mg/mlから10mg/mlで使用することが好ましく、さらに好ましくは１mg/mlから10mg/mlである。
【００５３】
（５）生理活性物質の塗布及び乾燥
生理活性物質の固定化は、生理活性物質を含む溶液を塗布後、乾燥することによって行う。生理活性物質を含む溶液の乾燥過程において、生理活性物質は塗布した溶液の外周部または、塗布液が乾固直前まで液が残った部分に析出する傾向があり、これによって基板表面に固定される生理活性物質の量に分布が発生し好ましくない。このため、基板表面の生理活性物質固定量を均一にするため、塗布液の粘度は生理活性物質の基板表面への結合を阻害しない範囲で高くすることが好ましい。塗布液粘度を高くすることで、乾燥過程における塗布液中の生理活性物質の基板表面に対する水平方向の移動が抑えられ、結果として生理活性物質固定量のばらつきを抑えることができる。乾燥過程における塗布液の粘度は0.9cP以上に保つことが好ましい。
【００５４】
生理活性物質を含む溶液を塗布する方法としては、特に塗布液を定量吐出するディスペンサーを使用する方法が好ましく挙げられる。ディスペンサーの吐出口を基板上で一定速度、一定間隔で動作させることで基板上の任意の場所に均一塗布することが可能である。またスピンコートによって行ってもよい。この方法は、特に塗布膜厚を薄くする場合に好ましい。
【００５５】
生理活性物質を含む溶液を乾燥する工程は、生理活性物質を含む溶液の塗布後、その溶液を、静置することによる自然乾燥や、加熱や送風などによって溶液が乾燥する速度を上げ、意図的に乾燥させることにより行ってもよい。
【００５６】
生理活性物質の固定量、及び／又は生理活性物質の層の膜厚は、多糖類の固定量、及び／又は多糖類層の膜厚に対して0.3倍以上３倍以下であることが好ましい。より、具体的には、生理活性物質の具体的な固定量としては、上記の多糖類の固定量の比に加えて、1ng/mm2以上40ng/mm2以下であることが好ましく、より好ましくは、1ng/mm2以上20ng/mm2以下である。また、生理活性物質の層の具体的な膜厚としては、上記の多糖類層の膜厚の比に加えて、１nm以上40nm以下であることが好ましく、１nm以上20nm以下であることがより好ましい。
【００５７】
（６）担体を使用したスクリーニング方法
上記のようにして生理活性物質を固定化した担体は、生理活性物質と相互作用する、生理活性物質との結合定数が10nM〜300μMであって、且つ分子量が400以下の低分子有機化合物の検出及び／又は測定のためのスクリーニングに使用することができる。
【００５８】
生理活性物質と低分子有機化合物との相互作用は、非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（SPR）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（QCM）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００５９】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の担体は、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えている表面プラズモン共鳴用バイオセンサとして用いることができる。表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００６０】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平6-167443号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００６１】
そして、本発明のスクリーニング方法においては、基板を誘電体プリズムとし、上記担体に対して低分子有機化合物を接触させた後、誘電体プリズムの側から、誘電体プリズムと金属膜との界面で全反射する条件で測定光を入射し、この界面で全反射した光を検出して、生理活性物質に対する低分子有機化合物の特異的結合を検出することができる。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法に用いられるSPR装置としては、例えば、図１に示すような生理活性物質と低分子有機化合物（以下、アナライトともいう）との結合状態を反映する全反射減衰の状態を測定する測定部と、生理活性物質溶液が保管される冷却プレートと、ボトルに用意した複数の溶液（バッファ等）をプレサイスチップで吸引するためのタンクと、多種類のアナライトを含む溶液を保管するアナライトプレートと、生理活性物質溶液を固定するとともに、アナライトとの結合を行うセンサスティックと、このセンサスティックに対して生理活性物質、アナライト等の各種溶液の分注を行うプレサイスチップを備えた分注ヘッドと、測定部から出力される測定結果に基づいて生理活性物質と低分子有機化合物との結合情報を取得し、また各部位の動作を制御する制御部とを備えてなる装置を用いることができる。なお、この装置は生理活性物質を固定化後、生理活性物質の固定化条件、スクリーニング条件、試料配置といった測定条件をプロトコルとして登録し、一連の操作を装置内で行うことができるものであり、装置内でプレサイスチップを交換できるようにチップラックケースとチップ廃棄ボックスを備えてなるものである。
【００６３】
以下、この態様を例にとって本発明のスクリーニング方法を説明する。説明を簡単にするために、最初に１つのセンサスティックにおける生理活性物質の固定方法について説明を行い、次いで全反射減衰の状態の測定方法について説明する。
【００６４】
図２は、図１に示すセンサスティック10の分解斜視図である。センサスティック10は、透明な誘電体である全反射プリズム（光学ブロック）20と、この全反射プリズム20の上に取り付けられる流路部材30とで構成される。流路部材30は、図中奥側に位置する第１流路31と、図中手前側に位置する第２流路32との２種類の流路を有し、第１流路31は測定用流路、第２流路32は参照用流路となっている。そして、センサスティック10を用いて測定を行う際には、これら２つの流路31、32を１組として、１つの試料の測定が行われる。流路部材30には、各流路31、32が、それぞれ長手方向に６つずつ設けられており、１つのセンサユニット10で６つの試料を測定できるよう構成されている。
【００６５】
これらの６つの試料は、サンプルやサンプル濃度が同一であってもよく、異種であってもよい。全て異種の試料により測定した場合、最適な測定条件の抽出がより簡便になる。例えば、基板に固定化した生理活性物質と相互作用し、結合する分子を試料として流路に流し、測定を行う場合、流路１組ごとに相互作用し、結合する分子の濃度を変え、分布を持たせることで、相互作用し、結合する分子の基板への固定量を最も多く得られる試料濃度を抽出することができる。また、生理活性物質固定時、流路ごとに、(1)生理活性物質を溶解している溶媒のｐH、(2)生理活性物質の濃度、(3)生理活性物質へのタグ(ビオチン、GST、His等)の修飾比率、等を変えることによって、生理活性物質の固定量が最も多い条件を得ることができる。さらには、生理活性物質を基板に固定化後・生理活性物質と相互作用し結合する分子を接触後に洗浄する際、数種類の洗浄液を各流路ごとに変えることで、洗浄に最適な条件を簡便に得ることができる。なお、各流路31、32の数は、６つに限られるものではなく、５つ以下でもよいし７つ以上でもよい。
【００６６】
全反射プリズム20は、長尺な台形柱状に形成されたプリズム本体21と、このプリズム本体21の一端に設けられた把持部22と、プリズム本体21の他端に設けられた突出部23とからなる。この全反射プリズム20は、例えば、押し出し法などによって型成形されるものであり、プリズム本体21、把持部22、突出部23の各部は、一体に成形されている。
【００６７】
プリズム本体21は、下底よりも上底の方が長い略台形の縦断面を有しており、底面側面から照射された光を上面21aに集光する。プリズム本体21の上面21aには、SPRを励起するための金属膜25が設けられている。金属膜25は、流路部材30の各流路31、32と対面するように成形されている。
【００６８】
金属膜25の上には、生理活性物質を固定化するための層26（以下、固定化層26という）が設けられている。固定化層26は、上記で説明したように生理活性物質を固定させるための結合基を有するものであり、この固定化層26を介して金属膜25上に生理活性物質が固定される。なお、この固定化層26は、センサスティック10の製造段階において予め形成される。
【００６９】
生理活性物質は、第１流路31（測定用流路）に対面する固定化層26にのみ固定され、第２流路32（参照用流路）には固定されない。このように生理活性物質を固定した測定系、生理活性物質を固定していない参照系の２つの系を用意し、生理活性物質を固定した測定系から得られた信号と、生理活性物質を固定していない参照系から得られた信号との差分データを求め、この差分データを測定データとし、これに基づいて結合情報を取得する。こうすることで、各測定スティックや各測定セルの個体差や、装置の機械的な変動や、液体の温度変化等、外乱に起因するノイズをキャンセルすることが可能となり、Ｓ／Ｎ比の良好な信号を得ることができる。また、後述するように生理活性物質濃度が異なる場合の、溶液濃度に依存する信号変動を抑制することができる。
【００７０】
生理活性物質の固定の詳細について図３を用いて説明する。図３は一対の第１流路31に対して、プレサイスチップが挿入された状態を示す断面図である。なお、図３において図２中の構成要素と同等の構成要素には同番号を付し、それらについての説明は特に必要のない限り省略する（以下、同様）。このプレサイスチップ19は、１対のチップ19a，19bからなり、プレサイスチップ19は、各チップ19a，19bが、注入口31aと排出口31bのそれぞれに挿入される。そして、各チップ19a，19bは、それぞれが第１流路31への液体の注入と、第１流路31からの吸い出しを行う機能を備えており、一方が注入動作を行っているときには、他方が吸い出し動作を行うというように、互いに連動する。このプレサイスチップ19を用いて、注入口31aから、生理活性物質を溶媒に溶かした溶液41が注入される。
【００７１】
生理活性物質溶液41が第１流路31へ注入されると、溶液中で拡散している生理活性物質41aが徐々に固定化層26へ近づいて、結合する。こうしてセンサ面SS1に生理活性物質41aが固定される。センサ面SS1への生理活性物質41aの固定化が完了すると、流路31から生理活性物質溶液41は、チップ19bによって吸い出されて排出される。固定化が完了したセンサ面SS1は、流路31へ洗浄液が注入されて洗浄処理が行われる。この洗浄後、必要に応じて、ブロッキング液を流路31へ注入して、固定化層26のうち、生理活性物質が結合しなかった結合基を失活させるブロッキング処理が行われる。このブロッキング処理の後、再び流路31が洗浄される。流路31内の洗浄処理が完了した後、センサスティック10は測定部へ供される。
【００７２】
次に全反射減衰の状態の測定方法について、図４を参照して説明する。図４に示すように、測定部51は、照明部52と検出部53からなる。上述したとおり、生理活性物質とアナライトの反応状況は、全反射減衰角の変化として顕れるので、照明部52は、全反射条件を満足する様々な入射角の光を光入射面SS1に対して照射する。照明部52は、例えば、光源54と、集光レンズ、拡散板、偏光板を含む光学系56とからなり、配置位置及び設置角度は、照明光の入射角が、上記全反射条件を満足するように調整される。
【００７３】
全反射減衰の状態の測定は、センサスティック29によって、注入口31aから、第１流路31へまず、測定用バッファが注入される。次いで、アナライト溶液が注入され、その後、再び測定用バッファが注入される。全反射減衰の状態の測定は、基準となる信号レベルを検出するために、最初の測定用バッファを注入した直後から開始され、アナライト溶液の注入後、再び測定用バッファが注入され、所定時間が経過するまでの間、行われる。これにより、基準レベルの検出、アナライトとリガンドとの結合状態、測定用バッファ注入による結合したアナライトとリガンドとの解離状態までを反映する全反射減衰の状態を測定することができる。なお、この工程は第２流路に対しても同様に行われ、上述したように生理活性物質を固定した測定系から得られた信号（測定信号）と、生理活性物質を固定していない参照系から得られた信号（参照信号）との差分データを求め、この差分データに基づいて結合情報を取得する。
【００７４】
とりわけ、アナライトが低分子有機化合物の場合、アナライトがDMSO溶液のような高屈折率の溶液に溶けていると、DMSO溶液の濃度がアナライトごとに異なることがあり、アナライトごとに異なるDMSO溶液の濃度の違いがそのまま信号の変動として現れる場合があるが、測定信号と参照信号を利用することによって正確な測定を行うことができる。詳細には、SPR信号をS、屈折率をN、体積をV、固定化した蛋白によるSPR信号の変化量をP、SPR信号に関与している溶液の体積をVs、SPR信号に関与している蛋白の体積をVpとすると、バッファ液分注時のSPR信号は、液屈折率をNBとすると、
参照信号は、Sr_B∝NB・Vs
測定信号は、Sa_B∝{P+NB・(Vs・Vp)}
と表され、アナライト液分注時のSPR信号は、液屈折率をNAとすると、
参照信号は、Sr_A∝NA・Vs
測定信号は、Sa_A∝{P+NA・(Vs・Vp)}+Sbi
と表される（添字のaは測定用、rは参照用、Aはアナライト、Bはバッファ、pは蛋白、biは結合を意味する）。
【００７５】
実際にVpを測定することはできないため、屈折率の分かっている高濃度と低濃度の補正液を利用してアナライトの結合量Sbiを求めることができる。高濃度と低濃度の補正液による参照信号、測定信号は、高濃度補正液の液屈折率をNHとすると、
参照信号は、Sr_H∝NH・Vs
測定信号は、Sa_H∝{P+NH・(Vs・Vp)}
と表され、低濃度補正液の液屈折率をNLとすると、
参照信号は、Sr_L∝NL・Vs
測定信号は、Sa_L∝{P+NL・(Vs・Vp)}
と表される（添字のHは高屈折率、Lは低屈折率を意味する）。
【００７６】
このとき、屈折率の違いによる参照信号と測定信号の信号変化量は、次ぎのように表される。  
参照信号は、ΔSr1= Sr_H -Sr_L=(NH-NL)・Vs
測定信号は、ΔSa1= Sa_H -Sa_L=(NH-NL)(Vs-Vp)
上記２つの式を比較すると、屈折率の違いによる測定信号の信号変化は、蛋白の体積に依存していることがわかる。測定用流路に蛋白が存在していない、またはその体積が無視できる場合には、ΔSa=ΔSrとなるが、実際には蛋白の影響によりΔSa=k×ΔSrとなり、この補正液を使って測定した参照信号と測定信号から補正液kを求めることができる。
【００７７】
そして、実施にバッファ液とアナライト液を分注して結合量を測定すると、バッファ液とアナライト液の屈折率の違いによる参照信号と測定信号の信号変化量は、それぞれ次式により表される。  
ΔSr2= Sr_A -Sr_B=(NA-NB)・Vs
ΔSa2= Sa_A -Sa_B=(NA-NB)(Vs-Vp)+Sbi
【００７８】
この２つの式を先の関係式ΔSa=k×ΔSrに当てはめると、
ΔSa2-k×ΔSr2= Sbi
となりアナライトの結合量を求めることができる。このように、基準となる高濃度、低濃度の補正液、バッファ液、アナライト液の参照信号と測定信号から自動的に補正を行うことによって、アナライトごとに異なるDMSO溶液の濃度（NA）の違いがそのまま信号の変動として現れることがなく、高精度の測定を行うことができる。この自動補正は上記の図１に示す装置においては制御部において自動的に行われる。
【００７９】
ここで、より具体的に、生理活性物質としてビオチン化蛋白（ビオチン化Carbonic Anhydrase）を図２に示すセンサスティックに固定し、阻害剤をスクリーニングする方法を例にとって説明する。
【００８０】
まず、生理活性物質としてビオチン化蛋白（ビオチン化Carbonic Anhydrase）の作製について説明する。試薬として、
Carbonic Anhydrase （Sigma-Aldrich: C3934、M.W. 30000)、10×PBS (pH 7.4) （ニッポンジーン: 314-90185)
Dimethyl sulfoxide （Sigma-Aldrich: D1435）
Biotinylation Kit BK-01（FUJIFILM BK-01：ビオチン化試薬1mg in 1 tube、限外ろ過用フィルター６tube)を準備する。
【００８１】
ビオチン化試薬（MW：567.7）が入っているチューブに所定量のDMSOを添加する。別に、用意した６本のエッペンドルフチューブに所定濃度のCarbonic Anhydrase溶液を所定量、分注し、４℃で保存する。このエッペンドルフチューブに、先に準備したビオチン化試薬DMSO溶液を６本のエッペンドルフチューブの濃度がそれぞれ異なるように所定量入れてCarbonic Anhydrase溶液とを混合し、数回軽くピペッティングする。このとき、ビオチン化試薬の活性エステルが加水分解する可能性があるため、ビオチン化試薬をDMSOに溶解させたら、できるだけ迅速にタンパクと反応させることが好ましい。
【００８２】
混合後、４℃で数時間程度静置した後、限外ろ過用チューブに移し、４℃で遠心分離器にかける（10分、14000×ｇ程度）。所定量の１×PBSを添加し、ピペッティングしてフィルターに吸着した未反応ビオチン化試薬を洗い流し、再度、遠心分離器にかける。この工程をさらに２回繰り返す。フィルターに、所定量の１×PBSを添加し、ピペッティングしてフィルターに吸着したビオチン化蛋白を洗い流し、別に準備したエッペンドルフチューブに移す。再度、フィルターに、所定量の１×PBSを添加し、ピペッティングしてフィルターに吸着したビオチン化蛋白を洗い流し、先ほどのエッペンドルフチューブに移し、最後に1 ×PBSを入れて濃度を調整することにより、６つの異なるビオチン化比率を持ったビオチン化蛋白を完成する。
【００８３】
次ぎに、このビオチン化蛋白（ビオチン化Carbonic Anhydrase）をセンサスティックに固定して、阻害剤をスクリーニングする手順について、上記の図１に示すSPR装置を用いた場合を例にとって説明する。
【００８４】
まず、材料として、
センサスティック：SENSOR STICK SA-401（FUJIFILM SA-401）
384穴マイクロタイタープレート（REMP: ストレージプレート384）
96穴マイクロタイタープレート（Corning: ジェネラルアッセイプレート3363）
96穴保存用プレート（日本ジェネティックス株式会社: 96 ウェル保存用プレートysTP-96）
プレート用アルミヒートシール（WAKO: パーマネントシール298-37851）
プレサイスチップス（FUJIFILM: PT-01）
を準備する。
【００８５】
試薬として、
D-Biotin（MP Biomedicals, Inc: 194634）
10mM 水酸化ナトリウム溶液（和光純薬工業: 191-05205）
0.5% Tween20（登録商標）（ICN: 9005-64-5）
10×PBS (pH 7.4)（ニッポンジーン: 314-90185）
Dimethyl sulfoxide （Sigma-Aldrich: D1435）
化合物ライブラリー1mM in 100% DMSO（Maybridge）
を準備する。
【００８６】
さらに、バッファ類として、ランニングバッファ、蛋白固定用ランニングバッファ（例えば、1×PBS）、高濃度キャリブレーション液（検出信号の補正に利用する高DMSO濃度のバッファ） 、低濃度キャリブレーション液（検出信号の補正に利用する低DMSO濃度のバッファ) 、アナライト洗浄液（アナライトの洗浄を行う場合の再生液）、非特異洗浄液（非特異結合した蛋白の洗浄液、例えば、10mM NaOH）を別に準備する。
【００８７】
固定化及びスクリーニングには、以下のように、アナライトプレート（スクリーニングしようとするアナライトを分注するプレート）、冷却プレート（ビオチン化蛋白を分注するプレート）、処理液プレート（流路のリンス液、ブロッキングのためのビオチン溶液を分注するプレート）を準備する。
【００８８】
アナライトプレート（384穴マイクロタイタープレート）は分注前にエアーイオナイザーで除電し、分注機を用いてバッファと上記化合物ライブラリーの化合物を各wellに所定量分注する。冷却プレート（96穴マイクロタイタープレート）の所定位置にセンサスティック4本分のビオチン化タンパク質溶液（例えば、100ml /well）を分注する。分注時には各溶液が低温に保たれるようにすることが好ましい。処理液プレート（96穴マイクロタイタープレート）の所定位置にセンサスティック4本分0.5% Tween20（例えば、100ml /well)およびD-Biotin 溶液（例えば、100ml /well)、を分注する。
【００８９】
SPR装置の本体の所定位置に、上で準備した各プレート、センサスティック、バッファ類（６種類）を入れたボトルをそれぞれセットする。なお、ボトルに入れるバッファや洗浄液の濃度、種類を変えて測定を行う場合には、測定開始前に使用する液をボトルとタンクの間に接続されるチューブに循環させ、チューブを共洗いする。
【００９０】
SPR装置を駆動して固定化処理を行う。固定化処理はセンサスティックへの蛋白分注時、プレサイスチップが図３に示すような動作を行って、蛋白をセンサスティックに固定化する。センサスティック表面に蛋白を含む溶液を５分〜120分接触させることで、センサスティックに蛋白を固定化できる。この固定化時間については、蛋白を含む溶液を50分前後接触させることで充分に固定化することができる。
【００９１】
次いで、化合物ライブラリーのスクリーニング測定を実施する。スクリーニングの条件設定は適宜調整して行うが、ビオチン化蛋白をセンサスティックに固定した場合、例えば、装置内温度−25度、固定時間−15分、固定時の非特異洗浄−10mM NaOH 10 回、１チャンネルあたり測定回数−160回、使用スティック数−4本の条件で行うことができる。１回の測定は、ベースラインの測定時間と化合物の結合測定時間を合わせて100秒で測定することができる。これらの測定時間と測定回数、使用するスティック数より、24時間で、最大3840化合物（１チャンネル当り160回の測定×６チャンネル×スティック数４本）の測定をすることが可能である。  
以下に本発明のスクリーニング方法の実施例を示す。
【実施例】
【００９２】
p38キナーゼに対するフラグメント化合物の結合測定を、蛋白として、
p38a/SAPK2a(6His-tag), active (Upstate, VA, USA)
アナライト化合物として以下に示す化合物を使用して行った。なお、下記の化合物のうち、Nega-1およびNega-2は、p38キナーゼに結合しないことがわかっているNega化合物である。
【化４】
2008304235.tif 000005
【化５】
2008304235.tif 000006
【００９３】
【化６】
2008304235.tif 000007
【化７】
2008304235.tif 000008
【化８】
2008304235.tif 000009
【化９】
2008304235.tif 000010
【化１０】
2008304235.tif 000011
【００９４】
（材料）
センサスティック：SENSOR STICKSC-401（FUJIFILM SC-401）
384穴マイクロタイタープレート（REMP：ストレージプレート384）
96穴マイクロタイタープレート（Coming：ジェネラルアッセイプレート3363）
96穴保存用プレート（日本ジェネスティック株式会社：96ウェル保存用プレートrsTP-96）
プレート用アルミヒートシール（WAKO：パーマネントシール298-37851）
プレサイスチップス（FUJIFILM：PT-01）
【００９５】
（試薬）
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydroshloride)(FUJIFILM: EDC-01)
NHS (N-Hydroxysuccinimide) （FUJIFILM: NHS-01）
エタノールアミンpH 8.5 （FUJIFILM: EA-01）
Acetate buffer pH5.0 （FUJIFILM: AB-5001）
Carbonic Anhydrase （Sigma-Aldrich: C3934)
10mM 水酸化ナトリウム溶液（和光純薬工業: 191-05205）
0.5% Tween20（登録商標）（ICN: 9005-64-5）
10 × PBS (pH 7.4) （ニッポンジーン: 314-90185）
Dimethyl sulfoxide （Sigma-Aldrich: D1435）
化合物ライブラリー1mM in 100% DMSO （Maybridge）
【００９６】
（バッファ類の準備）
ボトルNo.1 ランニングバッファ               600ml
ボトルNo.2 1×PBS                           100ml
ボトルNo.3 高濃度キャリブレーション液(CH)   100ml
ボトルNo.4 低濃度キャリブレーション液(CL)   100ml
ボトルNo.5 アナライト洗浄液                 100ml
ボトルNo.6 10mM NaOH                        100ml
ランニングバッファ、高濃度キャリブレーション液（DMSO濃度10.45%）、低濃度キャリブレーション液（DMSO濃度9.50%）は、バッファ原液を調整後、以下に示す配合で調整した。なお、DMSO 量は正確に量り、蒸発に注意し、必要に応じて容器に蓋、もしくはシールをして外気との接触時間を極力短縮した。  
バッファ原液−MilliQ水 1600ml、10×PBS 200ml、DMSO 180ml
ランニングバッファ−バッファ原液 990ml、DMSO 10ml
高濃度キャリブレーション液−バッファ原液 198ml、DMSO 3.08ml、10×PBS 0.12ml
低濃度キャリブレーション液−バッファ原液 198ml、DMSO 1ml、MilliQ水 1ml
1×PBS−10×PBS 50ml、MilliQ水 450ml
【００９７】
（プレートの準備）
1×PBSで2 mg/ml のタンパク質溶液を調製した。アナライトプレートは分注前にエアーイオナイザーで除電した。外部分注機を用いて、384 穴マイクロタイタープレートにバッファ準備液を79.2μl/well ずつ分注し、次いで、上記のプレートに化合物を0.8μl/wellずつ分注した。分注後、速やかにアルミヒートシールでシールした。最終化合物濃度は10μMとした。冷却プレートとして、96穴マイクロタイタープレートの所定位置にセンサスティック4本分のタンパク質溶液（10μl /well）、EDC（100μl /well）、NHS （100μl /well）を分注した（分注時には、各溶液を低温に保った）。分注後、冷却したアルミシール台（357N100297）にプレートをおき、速やかにアルミヒートシールでシールした。処理用プレートとして、96穴マイクロタイタープレートの所定位置にセンサスティック4本分の0.5%Tween20（100μl /well）、エタノールアミン（100μl /well）、Acetate buffer pH5.0（200μl /well）を分注した。分注後、速やかにアルミヒートシールでシールした。
【００９８】
（装置へのセットおよびボトルの準備）
準備したプレート、プレサイスチップス、センサスティック、バッファを図１に示すSPR装置本体にセットした。対応するボトルにバッファ類を入れ、SPR装置を駆動してチューブの共洗いをした。共洗い終了後、測定に必要なバッファ類をいれ、ボトルをセットし、PBSバッファ pH7.4でベースラインをとった。
【００９９】
（蛋白固定）
0.4MのEDCおよび0.1MのNHSを含む溶液を注入し７分間静置した。PBSバッファ pH7.4で洗浄後、p38蛋白溶液 1.0mg/ml in Acetate Buffer pH5.5 (10 mMのp38 阻害 SB203580を含む) を注入し15分間静置した。PBSバッファpH7.4で洗浄後、エタノールアミンを注入し7分、さらにNaOH 10mMを注入し1分間静置した。PBSバッファpH7.4で洗浄後、SPR信号値を測定し、ベースラインに対する変化分を固定量とした。固定量は8100RUであった。
【０１００】
次に、２分間、ランニングバッファ（50 mM Phosphate Buffer (pH7.2) ,150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, DMSO 5%）を流しベースラインをとり、その後、同組成のランニングバッファに下記表１に示す濃度で溶解した上記化合物の溶液を２分間送液し、結合信号を記録した。次の化合物の測定前に、再生液（50 mM Phosphate Buffer (pH7.2) ,500 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, DMSO 5%）で化合物を洗い流した。各化合物の結合量を表１に示す。なお、結合量は、繰り返し２回行った実験の平均結合量として示した。
【表１】
2008304235.tif 000012
【０１０１】
表１から明らかなように、p38キナーゼに結合しないNega化合物（比較例１および２）は、固定量は無視できるほどであり、特異的結合が検出されたことがわかる。そして、実施例１〜10から明らかなように、分子量400以下、かつ結合定数10mM以下の低分子有機化合物の結合を検出することができた。また、実施例８〜13に示すように、分子量200以下のより小さな低分子行き化合物についても検出することができた。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】本発明のスクリーニング方法に用いられるSPR装置の一実施の形態を示す概略模式図
【図２】センサスティックの概略構成を示す分解斜視図
【図３】流路にプレサイスチップが挿入された状態を示す断面図
【図４】表面プラズモンの測定を示す概略断面図
【符号の説明】
【０１０３】
10     センサスティック
20     全反射プリズム
19,29  プレサイスチップ
21     プリズム本体
21a    上面
22     把持部
23     突出部
25     金属膜
26     生理活性物質を固定化するための層（固定層）
30     流路部材
31     第１流路（測定用流路）
32     第２流路（参照用流路）
41     生理活性物質溶液
41a    生理活性物質
51     測定部
52     照明部
53     検出部
SS1    センサ面
SS2    センサ面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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