(57)【要約】  本発明は、ヒトＰＤＬ１と特異的に結合する単離された抗体、並びにその医薬組成物及び使用方法に関する。本発明は更に、前記抗体をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞、及び前記抗体を産生する方法に関する。
2021501569.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する単離された抗体であって、
それぞれ、配列番号１、２及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列と、
それぞれ、配列番号１７、１８及び１９のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
を含む抗体。
【請求項２】
抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記ＶＨが、ＶＨ３又はＶＨ４、好ましくはＶＨ３である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗体が、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＬが、
ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３のＦＲ１からＦＲ３、好ましくはＶκ１のＦＲ１からＦＲ３と、
Ｖκ  ＦＲ４、特にＶκ１  ＦＲ４、Ｖκ３  ＦＲ４、及びＶλＦＲ４から選択され、特に配列番号６４から配列番号７０のいずれかから選択されるアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ  ＦＲ４、好ましくは配列番号６４から配列番号７０のいずれかに記載のＶλ  ＦＲ４、好ましくは配列番号６４又は６５に記載のＶλ  ＦＲ４、より好ましくは、配列番号６４に記載のＶλ  ＦＲ４である、フレームワークＦＲ４と、
を含む、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、
配列番号１４、１５及び１６からなる群から選択される、好ましくは配列番号１４又は１６の、より好ましくは配列番号１６のアミノ酸配列と、９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号２６及び２７からなる群から選択される、好ましくは配列番号２７のアミノ酸配列と、９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
（ａ）配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号２６のＶＬ配列、又は、
（ｂ）配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号２６のＶＬ配列、又は、
（ｃ）配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列、
を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、
（ｉ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定したとき、ヒトＰＤＬ１に対して、５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、特に５００ｐＭ未満、特に１００ｐＭ未満、好ましくは５０ｐＭ未満、より好ましくは１０ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合し、
（ｉｉ）ＳＰＲにより測定したとき、ヒトＰＤＬ１に対して、１０−３ｓ−１以下、１０−４ｓ−１以下、又は１０−５ｓ−１以下のＫｏｆｆで結合し、
（ｉｉｉ）ＳＰＲにより測定したとき、ヒトＰＤＬ１に対して、１０３Ｍ−１ｓ−１以上、１０４Ｍ−１ｓ−１以上、１０５Ｍ−１ｓ−１以上、又は１０６Ｍ−１ｓ−１以上のＫｏｎで結合し、
（ｉｖ）カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）ＰＤＬ１との交差反応性を有し、特に、ＳＰＲにより測定したとき、カニクイザルＰＤＬ１に対して、５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、特に５００ｐＭ未満、特に１００ｐＭ未満、好ましくは５０ｐＭ未満、より好ましくは１０ｐＭ未満のＫＤで結合し、
（ｖ）特に、ＳＰＲにより測定したとき、マウスＰＤＬ１との交差反応性を有さず、
（ｖｉ）特に、ＳＰＲにより測定したとき、ヒトＰＤＬ２と結合しない、
（ｖｉｉ）ＥＬＩＳＡ法で測定したとき、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）と比較し、２超、好ましくは３超、より好ましくは４超の力価（相対的な力価）で、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用を中和する能力を有し、
前記相対的な力価が、ＥＬＩＳＡ法で測定されるアベルマブのｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値の、ＥＬＩＳＡ法で測定される前記抗体のｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値との比であり、
特に、前記抗体がｓｃＦｖであり、
（ｖｉｉｉ）ＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイで測定したとき、アベルマブと比較し、２超、好ましくは３超、より好ましくは４超の力価（相対的な力価）で、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用を中和する能力を有し、
前記相対的な力価が、ＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイにおいて測定されるアベルマブのｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値の、ＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイにおいて測定される前記抗体のｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値との比であり、
特に、前記抗体がｓｃＦｖであり、及び／又は、
（ｉｘ）ＥＬＩＳＡ法で測定したとき、アベルマブと比較し、２超、好ましくは３超、より好ましくは４超の力価（相対的な力価）で、ＰＤＬ１／Ｂ７−１相互作用を中和する能力を有し、
前記相対的な力価が、ＥＬＩＳＡ法で測定されるアベルマブのｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値の、ＥＬＩＳＡ法で測定される前記抗体のｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値との比であり、
特に、前記抗体がｓｃＦｖである、
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、
（ｉ）ｓｃＦｖフォーマットであるとき、特に前記抗体がｐＨ６．４、１５０ｍＭのＮａＣｌの５０ｍＭのリン酸−クエン酸バッファにおいて調製されるとき、示差走査蛍光測定により測定したとき、６０℃以上、好ましくは６５℃以上、より好ましくは７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、
（ｉｉ）ｓｃＦｖフォーマットであるとき、本発明の抗体を１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度で、５回の連続する凍結融解サイクルに供した後、特に本発明の抗体がｐＨ６．４、１５０ｍＭのＮａＣｌの５０ｍＭのリン酸クエン酸バッファにおいて調製されるとき、５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満のモノマー含量の損失を示し、及び／又は、
（ｉｉｉ）ｓｃＦｖフォーマットであるとき、本発明の抗体を１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度で、４℃で２週間以上、特に４週間以上の貯蔵後、特に前記抗体がｐＨ６．４、１５０ｍＭのＮａＣｌの５０ｍＭのリン酸クエン酸バッファにおいて調製されるとき、１５％未満、例えば１２％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満のモノマー含量の損失を示す、
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＡｂ、ＳＴＡＢ、及びアンキリンベースのドメイン、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、フィブロネクチンに限られる足場代替物に基づいている結合ドメイン、及び抗体の定常領域に組み込まれている結合部位（例えばＦ−ｓｔａｒ’ｓ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標））からなる群から選抜され、好ましくはｓｃＦｖである、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖが、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１からなる群から選択される、好ましくは配列番号３１の、アミノ酸配列を有する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、多重特異性分子であり、特に、該多重特異性分子が１つ以上の第２機能性分子を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離された抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
【請求項１２】
薬剤として使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
癌の治療に使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体の産生方法であって、請求項１４の核酸を含む宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＰＤＬ１と特異的に結合する単離された抗体、並びにその医薬組成物及び使用方法に関する。本発明は更に、前記抗体をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞、及び前記抗体を産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＤＬ１（ＣＤ２７４、Ｂ７−Ｈ１）は、４０ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質である。ＰＤＬ１は、ＰＤ−１に対する膜表面糖タンパク質リガンドであり、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞により発現される主要な免疫チェックポイント受容体であり、免疫抑制を媒介する。ＰＤＬ１は、慢性感染症、妊娠、組織同種異系移植、自己免疫疾患及び癌の間、免疫系の反応の抑制に関係する。ＰＤＬ１は、抗原提供細胞、並びにヒトの頭頸部の扁平上皮癌、黒色腫、及び脳腫瘍、甲状腺、胸腺、食道、肺、胸部、消化管、結直腸、肝臓、膵臓、腎臓、副腎皮質、膀胱、尿路上皮、卵巣及び皮膚などにおける癌細胞、の両方で発現することが知られている（非特許文献１〜７）。ＰＤＬ１は、正常組織では発現されることは殆どなく、腫瘍部位において誘導的に発現される（非特許文献８及び９）。ＰＤＬ１は、ＰＤ−１と結合することにより、Ｔ細胞の活性化及びサイトカインの分泌を下方制御する（非特許文献１０）。ＰＤＬ１により活性化されたＰＤ−１は、腫瘍発生及び増殖に免疫寛容的な環境を潜在的に提供する。ＰＤＬ１はまた、他の受容体Ｂ７．１（Ｂ７−１、ＣＤ８０）との相互作用を通じてＴ細胞機能に対する負の制御を行う。
【０００３】
ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の抑制は、強力な抗腫瘍活性をもたらす。ＰＤＬ１に対する各種の抗体は既に公知であり（特許文献１及び２参照）、ＰＤ−１シグナリングを破壊する多くの臨床用抗体が開発されている。これらの抗体は、ＰＤ−１を標的とするもの（ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｍｅｒｃｋ社、ホワイトハウスステーション、ＮＪ）、ピジリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ、ＣｕｒｅＴｅｃｈ社、Ｙａｖｎｅ、イスラエル））、並びにＰＤＬ１を目標とするもの（ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社、サウスサンフランシスコ、ＣＡ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａａＺｅｎｅｃａ社）、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ社、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ））、の２つの主要なカテゴリーに属する（レビューについては非特許文献１１を参照）。ＰＤＬ１のターゲティングとＰＤ−１のターゲティングでは、結果としての生物学的効果が異なるようである。ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１とそのリガンドであるＰＤＬ１及びＰＤＬ２の両方との相互作用を防止する。ＰＤＬ１抗体は、ＰＤ−１のＰＤＬ２との相互作用を防止しないが、この相互作用の効果については解っていない。しかしながら、ＰＤＬ１抗体は、ＰＤＬ１の、ＰＤ−１のみならずＢ７−１との相互作用も妨害し（非特許文献１２）、それはＴ細胞に対する負のシグナリングを生じさせると考えられている。ＰＤＬ１のブロックによる有望な初期データが示されており、現在４つの抗ＰＤＬ１  ｍＡｂ、すなわちアテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）及びＭＥＤＩ４７３６（いずれもヒトＩｇＧ１のＦｃヌル変異体）、ＭＳＢ００１０７８Ｃ（ＩｇＧ１）及びＢＭＳ−９３６５５９（ＩｇＧ４）、が臨床試験に供されている（非特許文献１３）。
【０００４】
現在まで、癌患者において強力な免疫応答を誘導するための満足な方法が開示されていない。ゆえに、本技術分野では、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用を改善する治療的モジュレーターを得、癌患者において観察される免疫抑制機構を克服するための方法を得ることに対するニーズが存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０７９１７４号
【特許文献２】国際公開第２０１７／１１８３２１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｔｓｕｙａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．８８（２）：１５４−１５９（２０１５）
【非特許文献２】Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６（８）：１１７３−１１８２（２００７）
【非特許文献３】Ｎｏｍｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３（７）：２１５１−２１５７（２００７）
【非特許文献４】Ｆａｙ  ＡＰ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ．３：３（２０１５）
【非特許文献５】Ｓｔｒｏｍｅ  ＳＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３（１９）：６５０１−６５０５（２００３）
【非特許文献６】Ｊａｃｏｂｓ  ＪＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ．１１（４）：３９４−４０２（２００９）
【非特許文献７】Ｗｉｌｍｏｔｔｅ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．１６（１０）：１０８１−１０８５（２００５）
【非特許文献８】Ｄｏｎｇ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．８（８）：７９３−８００（２００２）
【非特許文献９】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｔｈｅｒ．９：５０２３−５０３９（２０１６）
【非特許文献１０】Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１
【非特許文献１１】Ｐｏｓｔｏｗ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．Ｊｕｎ  １０；３３（１７）：１９７４−８２（２０１５）
【非特許文献１２】Ｂｕｔｔｅ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７：１１１−１２２，（２００７）
【非特許文献１３】Ｃｈｅｓｔｅｒ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｏｃｔ；６５（１０）：１２４３−８（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ヒトＰＤＬ１タンパク質と特異的に結合し、例えば高い親和性や改善された有効性などの、治療用途における有益な特性、並びに、例えば溶解性、展開性及び安定性などの、改善された生物物理学的特性、を有する抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、本発明は、新規なＰＤＬ１抗体に関する。
【０００９】
一態様では、本発明は、本発明の抗体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、薬剤として使用するための、本発明の抗体又は本発明の組成物に関する。
【００１１】
一態様では、本発明は、癌の治療を必要とする被験者の該治療において使用するための、本発明の抗体又は本発明の組成物に関する。
【００１２】
一態様では、本発明は、癌の治療を必要とする被験者の該治療用の薬剤の製造における、本発明の抗体又は本発明の組成物の使用に関する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、癌の治療を必要とする被験者に対し、治療的有効量の本発明の抗体又は本発明の組成物を投与することを含む、該被験者の癌の治療方法に関する。
【００１４】
更に別の態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸に関する。更なる態様では、本発明は、前記核酸を含むベクターに関する。更なる態様では、本発明は、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、本発明の抗体を産生する方法に関し、該方法は、本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含む。
【００１６】
以下の項目にまとめる本発明の態様、有利な特徴及び好ましい実施形態は、それぞれ単独で、又は組み合わせにおいて、本発明の課題の解決に更に貢献するものである：
【００１７】
１．ヒトＰＤＬ１に対する結合特異性を有する、以下を含む単離された抗体：
（ａ）配列番号１、４、５、８、１１、３２、３５、３６、３９及び４２のいずれか１つから選択される、好ましくは配列番号１又は３２の、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、重鎖可変領域ＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号２、６、９、１２、３３、３７、４０及び４３のいずれかから選択される、好ましくは配列番号２又は３３の、より好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、重鎖可変領域ＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号３、７、１０、１３、３４、３８、４１及び４４のいずれかから選択される、好ましくは配列番号３又は３４の、より好ましくは配列番号３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、重鎖可変領域ＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号１７、２０、２３、４８、５１及び５４のいずれかから選択される、好ましくは配列番号１７又は４８の、より好ましくは配列番号１７のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、軽鎖可変領域ＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号１８、２１、２４、４９、５２及び５５のいずれかから選択される、好ましくは配列番号１８又は４９の、より好ましくは配列番号１８のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、軽鎖可変領域ＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号１９、２２、２５、５０、５３及び５６のいずれかから選択される、好ましくは配列番号１９又は５０の、より好ましくは配列番号１９のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、軽鎖可変領域ＣＤＲ３。
【００１８】
２．抗体が以下を含む、項目１の抗体：
（ａ）それぞれ、配列番号１、２及び３の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号１７、１８及び１９の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｂ）それぞれ、配列番号４、６及び７の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２０、２１及び２２の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｃ）それぞれ、配列番号５、６及び７の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２０、２１及び２２の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｄ）それぞれ、配列番号８、９及び１０の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号１７、１８及び１９の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｅ）それぞれ、配列番号１１、１２及び１３の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２３、２４及び２５の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｆ）それぞれ、配列番号３２、３３及び３４の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号４８、４９及び５０の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｇ）それぞれ、配列番号３５、３７及び３８の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５１、５２及び５３の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｈ）それぞれ、配列番号３６、３７及び３８の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５１、５２及び５３の、ＬＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｉ）それぞれ、配列番号３９、４０及び４１の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号４８、４９及び５０の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｊ）それぞれ、配列番号４２、４３及び４４の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５４、５５及び５６の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列。
【００１９】
３．以下を含む、項目１の抗体：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ３。
【００２０】
４．以下を含む、項目１の抗体：
（ａ）配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ３。
【００２１】
５．以下を含む、項目１の抗体：
（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ３。
【００２２】
６．以下を含む、項目１の抗体：
（ａ）配列番号３５又は配列番号３６のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ３。
【００２３】
７．抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記ＶＨが、ＶＨ１、ＶＨ３又はＶＨ４、好ましくはＶＨ３又はＶＨ４、より好ましくはＶＨ３である、前記のいずれか１つの項目の抗体。
【００２４】
８．抗体が、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＬが、
ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３のＦＲ１からＦＲ３、好ましくはＶκ１のＦＲ１からＦＲ３と、
Ｖκ  ＦＲ４、特にＶκ１  ＦＲ４、Ｖκ３  ＦＲ４、及びＶλＦＲ４から選択され、特に配列番号６４から配列番号７０のいずれかから選択されるアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ  ＦＲ４、好ましくは配列番号６４から配列番号７０のいずれかに記載のＶλ  ＦＲ４、好ましくは配列番号６４又は６５に記載のＶλ  ＦＲ４、より好ましくは、配列番号６４に記載のＶλ  ＦＲ４である、フレームワークＦＲ４と、
を含む、前記のいずれか１つの項目の抗体。
【００２５】
９．抗体が、
配列番号１４、１５、１６、４５、４６及び４７からなる群から選択される、好ましくは配列番号１４又は１６の、より好ましくは配列番号１６のアミノ酸配列と、９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号２６、２７、５７及び５８からなる群から選択される、好ましくは配列番号２６又は２７の、より好ましくは配列番号２７のアミノ酸配列と、９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含む、前記のいずれか１つの項目の抗体。
【００２６】
１０．抗体が、
（ａ）アミノ酸配列番号１４と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及びアミノ酸配列番号２６と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）アミノ酸配列番号１５と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及びアミノ酸配列番号２６と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）アミノ酸配列番号１６と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及びアミノ酸配列番号２７と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｄ）アミノ酸配列番号４５と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及びアミノ酸配列番号５７と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｆ）アミノ酸配列番号４６と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及びアミノ酸配列番号５８と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
（ｇ）アミノ酸配列番号４７と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及びアミノ酸配列番号５７と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、前記のいずれか１つの項目の抗体。
【００２７】
１１．抗体が、
配列番号１４、１５、１６、４５、４６及び４７からなる群から選択されるいずれかの、好ましくは配列番号１４又は１６の、より好ましくは配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号２６、２７、５７及び５８からなる群から選択されるいずれかの、好ましくは配列番号２６又は２７の、より好ましくは配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含む、前記のいずれか１つの項目の抗体。
【００２８】
１２．抗体が、
（ａ）配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号２６のＶＬ配列、
（ｂ）配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号２６のＶＬ配列、
（ｃ）配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列、
（ｄ）配列番号４５のＶＨ配列及び配列番号５７のＶＬ配列、
（ｆ）配列番号４６のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列、又は
（ｇ）配列番号４７のＶＨ配列及び配列番号５７のＶＬ配列
を含む、前記のいずれか１つの項目の抗体。
【００２９】
１３．抗体が、
（ｉ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定したとき、ヒトＰＤＬ１に対して、５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、特に５００ｐＭ未満、特に１００ｐＭ未満、好ましくは５０ｐＭ未満、より好ましくは１０ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合し、特に、前記抗体がｓｃＦｖ（一価の親和性）である、
（ｉｉ）ＳＰＲにより測定したとき、ヒトＰＤＬ１に対して、１０−３ｓ−１以下、１０−４ｓ−１以下、又は１０−５ｓ−１以下のＫｏｆｆで結合し、特に、前記抗体がｓｃＦｖである、
（ｉｉｉ）ＳＰＲにより測定したとき、ヒトＰＤＬ１に対して、１０３Ｍ−１ｓ−１以上、１０４Ｍ−１ｓ−１以上、１０５Ｍ−１ｓ−１以上、又は１０６Ｍ−１ｓ−１以上のＫｏｎで結合し、特に、前記抗体がｓｃＦｖである、
（ｉｖ）カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）ＰＤＬ１との交差反応性を有し、特に、ＳＰＲにより測定したとき、カニクイザルＰＤＬ１に対する５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、特に５００ｐＭ未満、特に１００ｐＭ未満、好ましくは１０ｐＭ未満のＫＤで結合し、特に、前記抗体がｓｃＦｖである、
（ｖ）特に、ＳＰＲにより測定したとき、マウスＰＤＬ１との交差反応性を有さず、
及び／又は
（ｖｉ）特に、ＳＰＲにより測定したとき、ヒトＰＤＬ２と結合しない、
前記のいずれかの項目の抗体。
【００３０】
１４．抗体が、以下の特性：
（ｉ）ＥＬＩＳＡ法で測定したとき、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）と比較し、１．５超、例えば２超、２．５超、好ましくは３超、より好ましくは４超の力価（相対的な力価）で、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用を中和する能力を有し、
前記相対的な力価が、ＥＬＩＳＡ法で測定されるアベルマブのｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値の、ＥＬＩＳＡ法で測定される前記抗体のｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値との比であり、
特に、前記抗体がｓｃＦｖであり、及び／又は、
（ｉｉ）任意に、ＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイで測定したとき、アベルマブと比較し、１．５超、例えば２超、２．５超、好ましくは３超、より好ましくは４超の力価（相対的な力価）で、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用を中和する能力を有し、
前記相対的な力価が、ＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイにおいて測定されるアベルマブのｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値の、ＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイにおいて測定される前記抗体のｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値との比であり、
特に、前記抗体がｓｃＦｖであり、及び／又は、
（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡ法で測定したとき、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）と比較し、１．５超、例えば２超、２．５超、好ましくは３超、より好ましくは４超の力価（相対的な力価）で、ＰＤＬ１／Ｂ７−１相互作用を中和する能力を有し、
前記相対的な力価が、ＥＬＩＳＡ法で測定されるアベルマブのｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値の、ＥＬＩＳＡ法で測定される前記抗体のｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値との比であり、
特に、前記抗体がｓｃＦｖである、
前記のいずれか１つの項目の抗体。
【００３１】
１５．前記抗体が、
（ｉ）ｓｃＦｖフォーマットであるとき、示差走査蛍光定量で測定したとき、６０℃以上、好ましくは６５℃以上、より好ましくは７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、
特に、前記抗体が、５０ｍＭのリン酸塩−クエン酸塩バッファ、ｐＨ  ６．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で製剤化される、
（ｉｉ）ｓｃＦｖフォーマットであるとき、本発明の抗体が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であるとき、５回の連続する凍結融解サイクルの後、５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満のモノマー含量の損失を示し、
特に、前記抗体が、５０ｍＭのリン酸塩−クエン酸塩バッファ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．４中で製剤化される、及び／又は、
（ｉｉｉ）ｓｃＦｖフォーマットであるとき、本発明の抗体が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であるとき、４℃で２週間以上、特に４週間以上の貯蔵後、１５％未満、例えば１２％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満のモノマー含量の損失を示し、
特に、本発明の抗体が、５０ｍＭのリン酸塩クエン酸塩バッファ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．４中で製剤化される、
前記のいずれかの項目の抗体。
【００３２】
１６．前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＡｂ、及びアンキリンベースのドメイン、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、フィブロネクチンに限られる足場代替物に基づいている結合ドメイン、及び抗体の定常領域に組み込まれている結合部位（例えばＦ−ｓｔａｒ’ｓ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標））からなる群から選抜される、前記のいずれかの項目の抗体。
【００３３】
１７．前記抗体が、単鎖可変部分断片（ｓｃＦｖ）又はＦｖである、前記のいずれか１つの項目の抗体。
【００３４】
１８．前記ｓｃＦｖが、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号６０、配列番号６１及び配列番号６２、好ましくは配列番号２９及び配列番号３１、からなる群から選択される、より好ましくは、配列番号３１のアミノ酸配列を有する、項目１７の抗体。
【００３５】
１９．前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなる群から選択されるＩｇＧであり、好ましくは、前記抗体がＩｇＧ１である、項目１６の抗体。
【００３６】
２０．前記抗体が、キメラであるか又はヒト化されている、前記のいずれかの項目の抗体。
【００３７】
２１．項目１〜２０のいずれか１つの抗体と基本的に同じエピトープに対して結合する抗体。
【００３８】
２２．多重特異性分子であり、特に、１つ以上の第２機能性分子を有する多重特異性分子である、前記のいずれか１つの項目の抗体。
【００３９】
２３．前記抗体が、単鎖ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直鎖二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状二量体のｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞結合部（ＢｉＴＥ；タンデム−ジ−ｓｃＦｖ）、タンデム−トリ−ｓｃＦｖ、ｔｒｉｂｏｄｙ（Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）２）又はｂｉｂｏｄｙ（Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）１）、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｆｖ２、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）（ＩｇＧ  ＣＨ３−ｓｃＦｖ融合体（モリソンＬ）又はＩｇＧ  ＣＬ−ｓｃＦｖ融合体（モリソンＨ））、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、ジ−ミニ抗体、ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合体、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ融合体、ジ−ｄｉａｂｏｄｙ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＣＯＶＤ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ｂｓＡｂ（軽鎖のＣ末端に連結されるｓｃＦｖ）、Ｂｓ１Ａｂ（軽鎖のＮ末端基に連結されるｓｃＦｖ）、Ｂｓ２Ａｂ（重鎖のＮ末端基に連結されるｓｃＦｖ）、Ｂｓ３Ａｂ（重鎖のＣ末端に連結されるｓｃＦｖ）、Ｔｓ１Ａｂ（重鎖及び軽鎖のＮ末端基に連結されるｓｃＦｖ）、Ｔｓ２Ａｂ（重鎖のＣ末端に連結されるｄｓｓｃＦｖ）などのＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体、Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ抗体（ＫｉＨｓ）などのヘテロ二量体Ｆｃドメインに基づく二重特異性抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＤｂ、タンデム−ジ−ｓｃＦｖ、タンデム−トリ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）１、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｆｖ２、１つのヘテロ二量体Ｆｃドメイン又は他方のヘテロ二量体ドメインのいずれかの鎖のＮ及び／又はＣ末端に融合したＣＯＶＤ、ＭＡＴＣＨ及びＤｕｏＢｏｄｉｅ、からなる群から選択されるフォーマットである、項目２２の抗体。
【００４０】
２４．項目１〜２３のいずれか１つの抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
【００４１】
２５．薬剤として使用するための、項目１〜２３のいずれか１つの抗体又は項目２４の組成物。
【００４２】
２６．癌の治療を必要とする被験者における該治療に使用するための、項目１〜２３のいずれか１つの抗体又は項目２４の組成物。
【００４３】
２７．項目１〜２３のいずれか１つの抗体又は項目２４の組成物の、癌の治療を必要とする被験者における該治療への使用。
【００４４】
２８．項目１〜２３のいずれか１つの抗体又は項目２４の組成物の、癌の治療を必要とする被験者における該治療用薬剤の製造のための使用。
【００４５】
２９．癌の治療を必要とする被験者に対し、治療的有効量の項目１〜２３のいずれか１つの抗体又は項目２４の組成物を投与することを含む、該被験者の癌の治療方法。
【００４６】
３０．項目１〜２３のいずれか１つの抗体をコードする核酸。
【００４７】
３１．項目３１の核酸を含むベクター。
【００４８】
３２．項目３１の核酸又は項目３２のベクターを含む宿主細胞。
【００４９】
３３．項目１〜２３のいずれか１つの抗体の産生方法であって、項目３１の核酸又は項目３１のベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法。
【００５０】
３４．項目１〜２３のいずれか１つの抗体又は項目２４の組成物を含むキット。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ＰＤＬ１に対し最良の親和性を有するウサギＩｇＧクローンによる、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の中和を示す。ＥＬＩＳＡにより測定される吸光度を、３３−０３−Ｇ０２（Ａ）又は３７−２０−Ｂ０３（Ｂ）の分子濃度の関数としてｎｇ／ｍｌで表わす。アベルマブを対照として用いた。
【図２】ＰＤＬ１に対し最良の親和性を有するウサギＩｇＧクローン３３−０３−Ｇ０２（Ａ）又は３７−２０−Ｂ０３（Ｂ）による、ＰＤＬ１／Ｂ７−１相互作用の中和を示す。ＥＬＩＳＡにより測定される吸光度を、分子濃度の関数としてｎｇ／ｍｌで表わす。アベルマブを対照として用いた。
【図３】細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＰＤＬ１に対し最良の親和性を有する選抜されたウサギＩｇＧクローンによる、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の中和を示す。アッセイにおいて得られた発光シグナルに対応する％阻害の比率を、分子濃度の関数としてｎｇ／ｍｌで表す。アベルマブを対照として用いた。
【図４】図４Ａは、ＣＤＲセット及びフレームワークの選択による、ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおける、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の中和に対する効果を示す。アッセイにおいて得られた発光シグナルに対応する％阻害の比率を、ｓｃＦｖ濃度の関数としてｎｇ／ｍｌで表す。アベルマブを対照として用いた。図４Ｂは、ドメイン最適化による、ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおける、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の中和力価に対する効果を示す。アッセイにおいて得られた発光シグナルに対応する％阻害の比率を、ｓｃＤｂｓ濃度の関数としてｎｇ／ｍｌで表す。アベルマブを対照として用いた。
【図５】レポーター遺伝子アッセイにおける、組換えヒト血清アルブミンの存在下における、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖｓ  ＰＲＯ９６３及びＰＲＯ１０５７（Ａ）、ＰＲＯ１１８６及びＰＲＯ１４３０（Ｂ）、ＰＲＯ１４３１及びＰＲＯ１４３２（Ｃ）、ＰＲＯ１４７３（Ｄ）、ＰＲＯ１４７６（Ｅ）、ＰＲＯ１４７９（Ｆ）及びＰＲＯ１４８２（Ｇ）による、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の中和力価を示す。アッセイにおいて得られた発光シグナルに対応する％阻害の比率を、分子濃度の関数としてｎｇ／ｍｌで表す。アベルマブを対照として用いた。
【図６】二価分子の力価、及び、モリソンフォーマットのＬＣ又はＨＣ  ｓｃＦｖ融合体の、ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおけるＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の中和力価に対する影響を示す。アッセイにおいて得られた発光シグナルに対応する％阻害の比率を、分子濃度の関数としてｎｇ／ｍｌで表す。アベルマブを対照として用いた。
【図７】ＰＤ−１／ＰＤＬ１競合ＥＬＩＳＡ。全ての分子は、対照ＩｇＧであるアベルマブと同程度又はより少ないＩＣ５０値で、ＰＤ−１とＰＤＬ１との間の相互作用を強力にブロックした。
【図８】Ｂ７−１／ＰＤＬ１競合ＥＬＩＳＡ。全ての分子は、アベルマブと同様に、Ｂ７−１とＰＤＬ１との間の相互作用を強力にブロックした。
【図９】エクスビボＴ細胞活性化アッセイ。ＰＢＭＣは、１０ｎｇ／ｍｌのＳＥＡにより刺激し、ｓｃＦｖ  ＰＲＯ９９７又はｓｃＤｂ  ＰＲＯ８８５での系列希釈で、９６時間処理した。Ｔ細胞の活性化は、回収された上清のＥＬＩＳＡによるＩＬ−２定量により評価した。ＰＲＯ８８５及びＰＲＯ９９７による処理により、顕著なＩＬ−２分泌がもたらされた。ＰＲＯ９９７は、アベルマブより高い力価を示した。アベルマブと比較し、ＰＲＯ８８５は非常に高い効果を示した。シグモイド４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ社）を使用して、データをフィットさせた。
【図１０】免疫不全ＮＯＧマウス系統及び同種異系ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を使用した、ヒトＨＣＣ８２７  ＮＳＣＬＣ異種移植における抗ＰＤＬ１  ＩｇＧ１（ＰＲＯ１１３７）治療の抗腫瘍活性を示す。マウスに対し、０、３、７及び１０日目において、抗ＰＤＬ１  ＩｇＧ１（ＰＲＯ１１３７）又はビヒクルをｉ．ｐ．投与した。腫瘍体積を週当たり２回測定し、マウスを１７及び１８日目に安楽死させた。腫瘍体積を、処理開始時の腫瘍体積に対する相対腫瘍体積として正規化した。（Ａ）２匹のドナー由来のＰＢＭＣにより再構成された、マウスにおける平均相対腫瘍体積（群当たりｎ＝８匹のマウス）。点線は処理の回数を示す。（Ｂ）ドナーＢ（群当たりｎ＝４匹のマウス）由来のＰＢＭＣにより再構成された、マウスにおける平均相対腫瘍体積。（Ｃ）２匹のドナー由来のＰＢＭＣにより再構成された、マウスにおける個々の相対腫瘍体積。各記号は、同じ処理群内の個々の動物を表す。（Ｄ）ドナーＢ由来のＰＢＭＣにより再構成された、マウスにおける個々の相対腫瘍体積。各記号は、同じ処理群内の個々の動物を表す。
【図１１】ｈＰＢＭＣで置換したＮＯＧマウスにおけるＨＣＣ８２７異種移植を示す。抗ＰＤＬ１  ＩｇＧ１（ＰＲＯ１１３７）治療による処置後の、ＨＣＣ８２７を負荷させたＮＯＧマウスの体重を示す。体重を週当たり２回測定し、マウスを１７及び１８日目に安楽死させた。体重を、処置開始時の体重に対する相対体重として正規化した。
【図１２】ヒトの臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＵＣＢ  ＨＳＣ）をグラフト化したＮＯＧマウスにおける、ヒトＨＣＣ８２７  ＮＳＣＬＣ異種移植における抗ＰＤＬ１  ＩｇＧ１（ＰＲＯ１１９６）の抗腫瘍効果の評価を示す。ＰＲＯ１１９６（０．１ｍｇ）の抗腫瘍活性を、アベルマブ（０．１ｍｇ）又はビヒクル処理（パリビズマブ（ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、０．１ｍｇ）と比較した。０、５、１０、１５及び２０日目（点線）においてマウスを処置した。腫瘍増殖及び体重を週２回記録した。腫瘍体積を、処理開始時の腫瘍体積に対する相対腫瘍体積として正規化した。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明は、ヒトＰＤＬ１タンパク質に特異的結合する抗体、及び医薬組成物、製造方法、並びにかかる抗体及び組成物の使用方法を提供する。
【００５３】
特に定義されない限り、本願明細書において用いられるすべての専門的及び科学的用語は、一般に、本発明に関連する当業者により理解されるのと同じ意味を有する。
【００５４】
用語「含む」こと及び「包含する」は、特に明記しない限り、本願明細書においては、それらのオープンエンドな、非限定的な意味において使用される。したがって、かかる後者の実施形態に関しては、「含む」という用語は、その下位概念である「〜からなる」という狭義の用語を包含するものである。
【００５５】
本発明を記載する文脈における用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の用語は、本願明細書において明記されるか、又は文脈から明らかに否定されない限り、（特に後述する請求項の文脈においては）単数形及び複数形を包含するものとする。例えば、用語「細胞」には複数の細胞が包含され、またそれらの混合物も包含するものである。化合物、塩等について複数形が用いられる場合、これはまた、単一の化合物、塩等を意味することもある。
【００５６】
第１の態様において、本発明は、ヒトＰＤＬ１と特異的に結合する抗体に関する。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「抗体」等には、以下のものが包含される：
全部抗体又はその単鎖、並びに、あらゆるその抗原結合性断片（すなわち「抗原結合性部分」）又はその単鎖、並びに、抗体ＣＤＲ、ＶＨ領域又はＶＬ領域を含む分子（限定されないが、複数特異性抗体を包含する）。天然に存在する「全部抗体」は、ジスルフィド結合により相互に結合している、２つ以上の重（Ｈ）鎖及び２つ以上の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨとして本願明細書において略記）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬとして本願明細書において略記）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）から構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域と、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される点在するより保存された領域と、に更に分割することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置される、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の各種細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）などの、イムノグロブリンの宿主組織又は因子に対する結合を媒介すると考えられる。
【００５８】
本明細書で用いられる「抗原結合性断片」、「その抗原結合性断片」、「抗原結合部分」等の用語は、所定の抗原（例えばＰＤＬ１）に特異的に結合する能力を保持する完全な全部抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」の用語に包含される結合断片の例としては、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、並びに、アンキリンベースのドメイン、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、フィブロネクチンに限られる足場代替物に基づいている結合ドメイン、及び抗体の定常領域に組み込まれている結合部位（例えばＦ−ｓｔａｒ’ｓ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標））が挙げられる。
【００５９】
「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」付番方式）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」付番方式）、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）付番方式（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９９）、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）（「ＩＭＧＴ」付番方式）、及びＨｏｎｅｇｇｅｒ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（２００１）６５７−６７０（「ＡＨｏ」付番）などに記載の、多くの周知の方式のいずれかを用いて決定される一定領域のアミノ酸配列のことである。例えば、Ｋａｂａｔの古典的なフォーマットでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基は、３１−３５（ＨＣＤＲ１）、５０−６５（ＨＣＤＲ２）及び９５−１０２（ＨＣＤＲ３）として付番され、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基は、２４−３４（ＬＣＤＲ１）、５０−５６（ＬＣＤＲ２）及び８９−９７（ＬＣＤＲ３）として付番される。Ｃｈｏｔｈｉａでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基は、２６−３２（ＨＣＤＲ１）、５２−５６（ＨＣＤＲ２）及び９５−１０２（ＨＣＤＲ３）として付番され、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基は、２４−３４（ＬＣＤＲ１）、５０−５６（ＬＣＤＲ２）及び８９−９７（ＬＣＤＲ３）として付番される。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ定義を組合わせると、ＣＤＲは、ヒトＶＨのアミノ酸残基２６−３５（ＨＣＤＲ１）、５０−６５（ＨＣＤＲ２）及び９５−１０２（ＨＣＤＲ３）と、ヒトＶＬのアミノ酸残基２４−３４（ＬＣＤＲ１）、５０−５６（ＬＣＤＲ２）及び８９−９７（ＬＣＤＲ３）と、からなる。ＩＭＧＴでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基は、およそ２６−３５（ＨＣＤＲ１）、５１−５７（ＨＣＤＲ２）及び９３−１０２（ＨＣＤＲ３）と付番され、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基は、およそ２７−３２（ＬＣＤＲ１）、５０−５２（ＬＣＤＲ２）及び８９−９７（ＬＣＤＲ３）（「カバット」による付番）と付番される。ＩＭＧＴでは、抗体のＣＤＲは、ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ  Ａｌｉｇｎのプログラムを使用して決定することができる。本発明の文脈においては、特に言及されない限り、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（「ＡＨｏ」）により提案された（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（２００１）６５７−６７０）付番方式を用いる。
【００６０】
更に、以下の残基は、ＡＨｏ付番方式によるＣＤＲとして定義される：
ＬＣＤＲ１（またＣＤＲ−Ｌ１と称する）：Ｌ２４−Ｌ４２；
ＬＣＤＲ２（またＣＤＲ−Ｌ２と称する）：Ｌ５８−Ｌ７２；
ＬＣＤＲ３（またＣＤＲ−Ｌ３と称する）：Ｌ１０７−Ｌ１３８；
ＨＣＤＲ１（またＣＤＲ−Ｈ１と称する）：Ｈ２７−Ｈ４２；
ＨＣＤＲ２（またＣＤＲ−Ｈ２と称する）：Ｈ５７−Ｈ７６；
ＨＣＤＲ３（またＣＤＲ−Ｈ３と称する）：Ｈ１０８−Ｈ１３８。
【００６１】
念のため述べると、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎによる付番方式は、天然に存在する抗体において、異なるＶＨ及びＶＬサブファミリーにおいて、特にＣＤＲにおいて見られる、長さにおける若干の増減、並びに配列中のギャップを説明するのに好都合である。したがって、所定の抗体可変ドメインでは、通常、１〜１４９の全ての位置がアミノ酸残基により占められる訳ではない。
【００６２】
抗原結合部分は、ｍａｘｉｂｏｄｙ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｉｎｔｒａｂｏｄｙ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ、ｖ−ＮＡＲ及びビス−ｓｃＦｖに組み込んでもよい（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，１１２６−３６を参照）。例えばフイブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）（米国特許第６，７０３，１９９号参照、フィブロネクチンポリペプチドのｍｏｎｏｂｏｄｙを記載）などのポリペプチドに基づく足場に、抗体の抗原結合部分を融合させてもよい。一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む単鎖分子に、補完的な軽鎖ポリペプチドと共に、抗原結合部分を組み込んで、一対の抗原結合領域を形成させてもよい（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２；及び米国特許第５，６４１，８７０号）。
【００６３】
本明細書中で使用する「結合特異性」なる用語は、１つの抗原決定基に対して反応し、異なる抗原決定基に対しては反応しない、個々の抗体の能力を意味する。本願明細書において使用する用語「特異的に結合する」又は「特異的である」とは、顕著な、及び再現性のある相互作用、例えば、標的と抗体との間の結合を指し、それは生体分子を含む不均一な分子集団の存在下における、標的の存在を決定づけるものである。例えば、それが標的（エピトープでありうる）に特異的に結合する抗体は、他の標的に結合するより強い親和性、結合活性にて、該標的とより容易に、及び／又はより強い程度で結合する抗体である。「特異的結合」とは、その最も広義の意味では（また特に定義されない場合には）、例えば、公知技術の特異性アッセイ方法に従い決定される、目的とする標的と無関係な分子とを識別する抗体の能力を指す。かかる方法としては、限定されないが、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）試験及びペプチドスキャンなどが挙げられる。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実施できる。スコアリングは、標準的な発色反応（例えば、過酸化水素を用いた、西洋ワサビペルオキシドを有する二次抗体とテトラメチルベンジジンとの反応）により実施されうる。特定のウェルにおける反応は、光学密度（例えば４５０ｎｍにおける）により記録される。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は、約０．１のＯＤであり、典型的な陽性反応は、約１のＯＤでありうる。これは、陽性と陰性のスコア間の比率が１０倍以上でありうることを意味する。更なる例としては、ＳＰＲアッセイを行うこともでき、それは、特異的な結合が、バックグラウンドとシグナルとの間で、１０倍以上、好ましくは１００倍以上の違いとなって指示されるものである。典型的には、結合特異性の決定は、単一の対照分子の使用でなく、約３〜５個の無関係な分子（例えばスキムミルク、トランスフェリン等）を併用することにより行われる。本発明の抗体は、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する。特定の実施形態では、本発明の抗体は、特にＳＰＲによる測定において、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有するが、ヒトＰＤＬ２とは結合しない。
【００６４】
適切には、本発明の抗体は単離された抗体である。本明細書で用いられる用語「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない（例えば、ＰＤＬ１と特異的に結合する単離された抗体は、ＰＤＬ１以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）抗体のことを指す。しかしながら、ＰＤＬ１と特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原（他の種由来のかかるＰＤＬ１分子）との交差反応性を有してもよい。したがって、一実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＰＤＬ１及びカニクイザル（別名Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓサル又は「Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ」）のＰＤＬ１との結合特異性を有する。さらに、単離された抗体は、他の細胞由来の材料及び／又は化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
【００６５】
適切には、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。本明細書中で使用する「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、同じ遺伝子源由来のアミノ酸配列と実質的に同一であるか、又はそれから誘導された抗体を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定の１つのエピトープとの結合特異性及び親和性、又は特定の複数のエピトープとの結合特異性及び親和性を示す。
【００６６】
本発明の抗体は、限定されないが、キメラ及びヒト化されたものを包含する。
【００６７】
用語「キメラ抗体」は、
（ａ）定常領域又はその部分が、改変され、置換され、又は交換されることにより、抗原結合部位（可変領域）が、異なる又は改変されたクラスの、エフェクター機能の、及び／若しくは種の定常領域と、又は完全に異なる分子（例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤など）と連結されて、新規な特性を付与されたキメラ抗体とされたもの、又は、
（ｂ）可変領域又はその部分が、改変され、置換され、又は異なる若しくは改変された抗原特異性を有する可変領域と交換されたもの、
のいずれかの抗体分子である。例えば、マウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンの定常領域に置換することにより修飾することができる。ヒト定常領域による置換により、キメラ抗体は、元のマウス抗体と比較し、ヒトにおける抗原性が低下すると共に、抗原を認識する際のその特異性が維持されうる。
【００６８】
本明細書で用いられる「ヒト化」抗体は、ヒトにおいて免疫原性が低い一方、ヒト以外の抗体の反応性が維持された抗体である。これは例えば、ヒト以外のＣＤＲ領域を維持し、抗体の残りの部分（すなわち定常領域及び可変領域のフレームワーク部分）をそれらのヒト相対物に置換することにより得られる。更なるフレームワーク領域の修飾は、ヒトのフレームワーク配列内で行ってもよく、また、他の哺乳動物種の生殖細胞系から誘導されるＣＤＲ配列内で行ってもよい。本発明のヒト化抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基を（例えばインビトロでのランダム又は部位特異的な変異導入により、又はインビボでの体細胞突然変異により、又は安定性若しくは高産生を促進する保存的置換により）含めてもよい。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５，１９８４、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２，１９８８、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６，１９８８、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，２８：４８９−４９８，１９９１、及びＰａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，３１：１６９−２１７，１９９４を参照。他のヒト化技術の例としては、米国特許第５，７６６，８８６号に開示されるＸｏｍａ技術が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書で使用される用語「組換えヒト化抗体」は、組換え手段により調製され、発現され、構築され又は単離される全てのヒト抗体を包含し、例えば、ヒト化抗体を発現するために形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトームから単離された抗体、並びに、ヒト免疫グロブリン遺伝子（他のＤＮＡの塩基配列に対する配列）の全部又は一部のスプライシングを含むいずれかの他の手段により調製され、発現され、構築され又は単離された抗体、を包含する。
【００７０】
「ＰＤＬ１」という用語は、特に、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ番号Ｑ９ＮＺＱ７を有するヒトＰＤＬ１のことを指し、配列番号６３として本願明細書において表す。適切には、本発明の抗体はＰＤＬ１を標的とし、特に、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ番号Ｑ９ＮＺＱ７で示すヒトＰＤＬ１であって、本願明細書において配列番号６３として表すものを標的とする。適切には、本発明の抗体は、特に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定したとき、ヒト及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＰＤＬ１を標的とし、好ましくはマウスＰＤＬ１と交差反応しない。適切には、本発明の抗体は、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する。特に、本発明の抗体は、ＳＰＲにより測定したとき、ヒトＰＤＬ２と結合しない。
【００７１】
本発明の抗体は、ＰＤＬ１阻害剤である。「ブロッカー」又は「ブロッキング抗体」又は「阻害剤」又は「阻害抗体」又は「アンタゴニスト」又は「アンタゴニスト抗体」という用語は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減させる抗体を意味する。いくつかの実施形態では、ブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。本発明の抗体は、ＰＤＬ１の、その結合パートナーとの結合能力を標的とし、低減し、阻害し、それによりＰＤＬ１の機能を妨げる。特に、本発明の抗体は、ＰＤＬ１のＰＤ−１との相互作用をブロックする。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＰＤＬ１のＰＤ−１及びＢ７−１との相互作用をブロックする。
【００７２】
本願明細書において記載される本発明の抗体は、実施例に記載されるような単離されたヒト化モノクローナル抗体を包含するが、これに限定されない。かかる抗ヒトＰＤＬ１抗体の例は、表１に列挙される配列を有する抗体である。本願明細書において記載される抗体の作製及び特徴解析に関する更なる詳細は、実施例において記載する。
【００７３】
ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の単離された抗体は、以下の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
（ａ）前記ＶＨは、順番に、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３つの相補的決定領域を含み、
（ｂ）前記ＶＬは、順番に、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３つの相補的決定領域を含む。
【００７４】
本発明は、ＰＤＬ１タンパク質と特異的に結合する抗体を提供し、前記抗体は、表１に列挙されるＶＨ  ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含む。特に、本発明は、ＰＤＬ１タンパク質と特異的に結合する抗体を提供し、前記抗体は、表１に列挙されるＶＨ  ＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つ又はそれ以上のアミノ酸配列のＶＨ  ＣＤＲを有する。
【００７５】
本発明はまた、ＰＤＬ１タンパク質と特異的に結合する抗体を提供し、前記抗体は、表１に列挙されるＶＬ  ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲを含む。特に、本発明は、ＰＤＬ１タンパク質と特異的に結合する抗体を提供し、前記抗体は、表１に列挙されるＶＬ  ＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つ又はそれ以上のアミノ酸配列のＶＬ  ＣＤＲを有する。
【００７６】
本発明の他の抗体としては、変異したアミノ酸を含むが、ＰＤＬ１タンパク質と特異的に結合し、表１に記載される配列で表されるＣＤＲ領域と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するＣＤＲ領域を有するものが包含される。一態様では、本発明の他の抗体としては、ＰＤＬ１タンパク質と特異的に結合する変異体アミノ酸配列であって、表１に記載される配列で表されるＣＤＲ領域と比較し、１、２、３、４又は５つのアミノ酸のみが変異したＣＤＲ領域を有するものが包含される。
【００７７】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における用語「同一の」又は「同一性」とは、２つ以上の配列又はサブ配列が同一であることを指す。核酸、ペプチド、ポリペプチド又は抗体配列に関する「パーセント（％）配列同一性」及び「ホモロジー」とは、特定の核酸、ペプチド又はポリペプチド配列のヌクレオチド又はアミノ酸残基との同一性を有する、候補配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、その際、配列のアラインメントを作成し、必要に応じてギャップを導入して、最大の配列同一性％を達成させており、また配列同一性の一部としていかなる保守的置換も考慮しないものである。アミノ酸配列同一性％を決定することを目的としたアラインメントは、種々の方法で行うことができ、それらは従来技術において当業者の技術の範囲内であり、例えば一般公開されているコンピュータソフトウェア（例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２又はＡＬＩＧＮソフトウェア）を用いるものである。当業者はアラインメント算出のための適切なパラメータを決定することができ、その際、比較しようとする配列の完全長にわたり最大のアラインメントを達成するために必要なあらゆるアルゴリズムが含まれる。
【００７８】
配列比較のため、典型的には、試験配列を比較しようとする対照配列として、１つの配列を用いる。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験及び対照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を割り当て、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを割り当てる。デフォルトプログラムパラメータを使用することもでき、又は、代替的なパラメータを割り当てることもできる。配列比較アルゴリズムは次に、プログラムパラメータに基づき、対照配列との比較における試験配列の配列同一性％を算出する。
【００７９】
配列同一性及び配列類似性のパーセンテージを決定するのに適するアルゴリズムの２つの例として、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムが挙げられ、それらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて一般公開されている。２つのアミノ酸配列間の同一性％は、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズムを使用して決定することもでき（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７，１９８８）、それは、ＰＡＭ１２０ウエイト残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ及び４つのギャップペナルティを用い、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性％は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３，１９７０）を使用して決定することができ、それはＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスと、１６、１４、１２、１０、８、６又は４つのギャップウエイト及び１、２、３、４、５又は６つの長さウエイトと、を用いる。
【００８０】
用語「アミノ酸」は、天然及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と類似の方法で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸擬態物を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるもの、並びに、事後的に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びＯ‐ホスホセリンを指す。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーに関連する場合には本願明細書において交換可能に用いられる。該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸を模倣した人工的化学的擬態物であるアミノ酸ポリマーにも、また天然のアミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーにも適用される。特に明記しない限り、特定のポリペプチド配列には、その保守的に修飾された変異体が暗に包含される。
【００８１】
本発明は、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する単離された抗体を提供し、該抗体は、
（ａ）配列番号１、４、５、８、１１、３２、３５、３６、３９及び４２のいずれか１つから選択される、好ましくは配列番号１又は３２の、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、重鎖可変領域ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）と、
（ｂ）配列番号２、６、９、１２、３３、３７、４０及び４３のいずれかから選択される、好ましくは配列番号２又は３３の、より好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、重鎖可変領域ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）と、
（ｃ）配列番号３、７、１０、１３、３４、３８、４１及び４４のいずれかから選択される、好ましくは配列番号３又は３４の、より好ましくは配列番号３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、重鎖可変領域ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）と、
（ｄ）配列番号１７、２０、２３、４８、５１及び５４のいずれかから選択される、好ましくは配列番号１７又は４８の、より好ましくは配列番号１７のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、軽鎖可変領域ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）と、
（ｅ）配列番号１８、２１、２４、４９、５２及び５５のいずれかから選択される、好ましくは配列番号１８又は４９の、より好ましくは配列番号１８のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、軽鎖可変領域ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）と、
（ｆ）配列番号１９、２２、２５、５０、５３及び５６のいずれかから選択される、好ましくは配列番号１９又は５０の、より好ましくは配列番号１９のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、軽鎖可変領域ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）と、
を含む。
【００８２】
適切には、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の単離された抗体は、
（ａ）配列番号１、４、５、８、１１、３２、３５、３６、３９及び４２のいずれか１つから選択される、好ましくは配列番号１又は３２の、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有する配列を含む、好ましくはそれからなる、重鎖可変領域ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）と、
（ｂ）配列番号２、６、９、１２、３３、３７、４０及び４３のいずれかから選択される、好ましくは配列番号２又は３３の、より好ましくは配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有する配列を含む、好ましくはそれからなる、重鎖可変領域ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）と、
（ｃ）配列番号３、７、１０、１３、３４、３８、４１及び４４のいずれかから選択される、好ましくは配列番号３又は３４の、より好ましくは配列番号３のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有する配列を含む、好ましくはそれからなる、重鎖可変領域ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）と、
（ｄ）配列番号１７、２０、２３、４８、５１及び５４のいずれかから選択される、好ましくは配列番号１７又は４８の、より好ましくは配列番号１７のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有する配列を含む、好ましくはそれからなる、軽鎖可変領域ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）と、
（ｅ）配列番号１８、２１、２４、４９、５２及び５５のいずれかから選択される、好ましくは配列番号１８又は４９の、より好ましくは配列番号１８のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有する配列を含む、好ましくはそれからなる、軽鎖可変領域ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）と、
（ｆ）配列番号１９、２２、２５、５０、５３及び５６のいずれかから選択される、好ましくは配列番号１９又は５０の、より好ましくは配列番号１９のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有する配列を含む、好ましくはそれからなる、軽鎖可変領域ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）と、
を含む。
【００８３】
一実施形態では、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、
（ａ）それぞれ、配列番号１、２及び３の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号１７、１８及び１９の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｂ）それぞれ、配列番号４、６及び７の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列
、並びに、それぞれ、配列番号２０、２１及び２２の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｃ）それぞれ、配列番号５、６及び７の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２０、２１及び２２の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｄ）それぞれ、配列番号８、９及び１０の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号１７、１８及び１９の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｅ）それぞれ、配列番号１１、１２及び１３の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２３、２４及び２５の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｆ）それぞれ、配列番号３２、３３及び３４の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号４８、４９及び５０の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｇ）それぞれ、配列番号３５、３７及び３８の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５１、５２及び５３の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｈ）それぞれ、配列番号３６、３７及び３８の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５１、５２及び５３の、ＬＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と、
（ｉ）それぞれ、配列番号３９、４０及び４１の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号４８、４９及び５０の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
（ｊ）それぞれ、配列番号４２、４３及び４４の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５４、５５及び５６の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、
を含む。
【００８４】
一実施形態では、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、それぞれ、配列番号１、２及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列と、それぞれ、配列番号１７、１８及び１９のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、を含む。他の実施形態では、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、それぞれ、配列番号３２、３３及び３４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列と、それぞれ、配列番号４８、４９及び５０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、を含む。
【００８５】
適切には、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、
（ａ）それぞれ、配列番号１、２及び３と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号１７、１８及び１９と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
（ｂ）それぞれ、配列番号４、６及び７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２０、２１及び２２と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
（ｃ）それぞれ、配列番号５、６及び７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２０、２１及び２２と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
（ｄ）それぞれ、配列番号８、９及び１０と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号１７、１８及び１９と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
（ｅ）それぞれ、配列番号１１、１２及び１３と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２３、２４及び２５と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
（ｆ）それぞれ、配列番号３２、３３及び３４と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号４８、４９及び５０と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
（ｇ）それぞれ、配列番号３５、３７及び３８と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５１、５２及び５３と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
（ｈ）それぞれ、配列番号３６、３７及び３８と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５１、５２及び５３と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
（ｉ）それぞれ、配列番号３９、４０及び４１と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号４８、４９及び５０と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
（ｊ）それぞれ、配列番号４２、４３及び４４と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５４、５５及び５６と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
を含む。
【００８６】
一実施形態では、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、
それぞれ、配列番号１、２及び３と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列と、
それぞれ、配列番号１７、１８及び１９と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、を含む。他の実施形態では、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、
それぞれ、配列番号３２、３３及び３４と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列と、
それぞれ、配列番号４８、４９及び５０と６０以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列と、を含む。
【００８７】
適切には、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ３と、
を含む。適切には、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、
（ａ）配列番号１に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号２に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号３に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号１７に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号１８に対する少なくとも６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号１９に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３と、
を含む。
【００８８】
更なる実施形態では、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、
（ａ）配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ３と、
を含む。適切には、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、
（ａ）配列番号４又は配列番号５に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号６に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号７に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号２０に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号２１に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号２２に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３と、
を含む。
【００８９】
適切には、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、
（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ３と、
を含む。適切には、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、
（ａ）配列番号３２に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号３３に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号３４に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号４８に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号４９に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号５０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３と、
を含む。
【００９０】
更なる実施形態では、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、
（ａ）配列番号３５又は配列番号３６のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ３と、
を含む。適切には、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、
（ａ）配列番号３５又は配列番号３６に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号３７に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号３８に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号５１に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号５２に対する６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号５３のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３と、
を含む。
【００９１】
更なる実施形態では、本発明は、ＰＤＬ１（例えばヒトＰＤＬ１タンパク質）と特異的に結合する単離された抗体を提供し、前記抗体は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。本発明の文脈において、用語「ＶＨ」（可変重鎖）、「ＶＬ」（可変軽鎖）、「Ｖκ」及び「Ｖλ」は、配列同一性及びホモロジーに従い分類される、抗体の重鎖及び軽鎖配列のファミリーを指す。例えばＢＬＯＳＵＭなどのホモロジー検索マトリックスを使用した配列相同性の決定方法（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１９９２）１０９１５−１０９１９）、及びホモロジーによる配列のグループ化方法は、当業者に周知である。ＶＨ、Ｖκ及びＶλの様々なサブファミリーは、例えばＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６（２０００）５７−８６に示すように同定することができ、それによると、ＶＨをＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ及びＶＨ２からＶＨ６に分類し、ＶκをＶκ１からＶκ４に分類し、ＶλをＶλ１からＶλ３に分類する。インビボでは、抗体のＶκ鎖、Ｖλ鎖及びＶＨ鎖は、それぞれ、生殖細胞系κ鎖のＶ及びＪ部位、生殖細胞系λ鎖のＶ及びＪ部位、並びに重鎖のＶ、Ｄ及びＪ部位、のランダムな再編成の結果である。所定の抗体可変鎖がいずれのサブファミリーに属するかは、対応するＶ部位によって、特にフレームワーク領域ＦＲ１からＦＲ３により決定される。したがって、本発明において、フレームワーク領域ＨＦＲ１からＨＦＲ３の特定のセットのみによって特徴づけられるいかなるＶＨ配列も、例えば、重鎖生殖細胞系のＪ部位の１つに由来するＨＦＲ４配列、又は再編成されたＶＨ配列に由来するＨＦＲ４配列など、いかなるＨＦＲ４配列と組み合わされてもよい。
【００９２】
適切には、本発明は、ＰＤＬ１（例えばヒトＰＤＬ１タンパク質）と特異的に結合する単離された抗体を提供し、前記抗体は、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ３又はＶＨ４を含む。
【００９３】
ＶＨ１ファミリーに属するＶＨの具体例は、配列番号１５で表される。特に、配列番号１５に由来するフレームワーク領域ＦＲ１からＦＲ４は、ＶＨ１ファミリーに属する（表１の、太字以外でマークされる領域）。適切には、本明細書で用いられるＶＨ１ファミリーに属するＶＨは、配列番号１５のＦＲ１からＦＲ４と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有する、ＦＲ１からＦＲ４を含むＶＨである。
【００９４】
ＶＨ３ファミリーに属するＶＨの具体例は、配列番号１６で表される。特に、配列番号１６に由来するフレームワーク領域ＦＲ１からＦＲ４は、ＶＨ３ファミリーに属する（表１の、太字以外でマークされる領域）。最適には、本明細書で用いられるＶＨ３ファミリーに属するＶＨは、配列番号１６のＦＲ１からＦＲ４と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有する、ＦＲ１からＦＲ４を含むＶＨである。
【００９５】
ＶＨ４ファミリーに属するＶＨの具体例は、配列番号１４で表される。特に、配列番号１４に由来するフレームワーク領域ＦＲ１からＦＲ４は、ＶＨ４ファミリーに属する（表１の、太字以外でマークされる領域）。最適には、本明細書で用いられるＶＨ４ファミリーに属するＶＨは、配列番号１４のＦＲ１からＦＲ４と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有する、ＦＲ１からＦＲ４を含むＶＨである。
【００９６】
ＶＨ配列の代替物の例は、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６（２０００）５７−８６に記載されている。
【００９７】
一実施形態では、本発明の単離された抗体は、ＶＨ４又はＶＨ３ドメインを含む。
【００９８】
適切には、本発明は、ＰＤＬ１（例えばヒトＰＤＬ１タンパク質）と特異的に結合する単離された抗体を提供し、前記抗体は、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３フレームワーク、好ましくはＶκ１フレームワークＦＲ１から３と、ＶκＦＲ４、特にＶκ１  ＦＲ４、Ｖκ３  ＦＲ４及びＶλ  ＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４と、を含む。適切なＶκ１フレームワークＦＲ１から３を、配列番号２６に記載する（表１では、ＦＲ領域を太字以外でマークする）。適切なＶκ１フレームワークＦＲ１から３は、ＦＲ１から３に対応し、配列番号２６に由来するアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む（表１では、ＦＲ領域は太字以外でマークする）。
【００９９】
代替的なＶκ１配列の例、並びにＶκ２、Ｖκ３及びＶκ４配列の例は、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６（２０００）５７−８６に記載されている。
【０１００】
適切なＶλ  ＦＲ４は、配列番号６４から配列番号７０で表される。好ましい実施形態では、Ｖλ  ＦＲ４は、配列番号６４又は６５で表され、より好ましくは、Ｖλ  ＦＲ４は、配列番号６４で表される。一実施形態では、本発明は、ＰＤＬ１（例えばヒトＰＤＬ１タンパク質）と特異的に結合する単離された抗体を提供し、前記抗体は、配列番号６４から配列番号７０のいずれかから選択される、好ましくは配列番号６４又は６５の、より好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ  ＦＲ４を含む。
【０１０１】
したがって、一実施形態では、本発明は以下を含む抗体を提供する：
（ｉ）以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列：
ａ．それぞれ、配列番号４、６及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２０、２１及び２２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
ｂ．それぞれ、配列番号３５、３７及び３８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５１、５２及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、又は
ｃ．それぞれ、配列番号３６、３７及び３８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５１、５２及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
（ｉｉ）ＶＨ３又はＶＨ４ドメインフレームワーク配列、及び
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３のＦＲ１からＦＲ３、好ましくはＶκ１のＦＲ１からＦＲ３と、
ＶκＦＲ４、特にＶκ１  ＦＲ４、Ｖκ３  ＦＲ４及びＶλ  ＦＲ４、特に配列番号６４から配列番号７０のいずれかから選択されるアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ  ＦＲ４、好ましくは配列番号６４から配列番号７０のいずれかで表されるＶλ  ＦＲ４、より好ましくは配列番号６４で表されるＶλ  ＦＲ４、から選択される、フレームワークＦＲ４と、
を含むＶＬフレームワークを含むＶＬドメイン。
【０１０２】
他の実施形態では、本発明は、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する抗体を提供し、それは以下を含む：
（ｉ）それぞれ、配列番号５、６及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２０、２１及び２２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、  
（ｉｉ）ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ３又はＶＨ４ドメインフレームワーク配列、好ましくはＶＨ１Ａ又はＶＨ１Ｂドメインフレームワーク配列、及び
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３のＦＲ１からＦＲ３、好ましくはＶκ１のＦＲ１からＦＲ３と、
ＶκＦＲ４、特にＶκ１  ＦＲ４、Ｖκ３  ＦＲ４及びＶλ  ＦＲ４、特に配列番号６４から配列番号７０のいずれかから選択されるアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ  ＦＲ４、好ましくは配列番号６４から配列番号７０のいずれかのアミノ酸配列を含むＶλ  ＦＲ４、より好ましくは配列番号６４で表されるＶλ  ＦＲ４、から選択される、フレームワークＦＲ４と、
を含むＶＬフレームワークを含むＶＬドメイン。
【０１０３】
具体的実施形態では、本発明は、以下を含む抗体を提供する：
（ｉ）それぞれ、配列番号３２、３３及び３４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号４８、４９及び５０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
（ｉｉ）ＶＨ３又はＶＨ４ドメインフレームワーク配列、好ましくはＶＨ４ドメインフレームワーク配列、及び
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３のＦＲ１からＦＲ３、好ましくはＶκ１のＦＲ１からＦＲ３と、
ＶκＦＲ４、特にＶκ１  ＦＲ４、Ｖκ３  ＦＲ４及びＶλ  ＦＲ４、特に配列番号６４から配列番号７０のいずれかから選択されるアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ  ＦＲ４、好ましくは配列番号６４から配列番号７０のいずれかで表されるＶλ  ＦＲ４、より好ましくは配列番号６４で表されるＶλ  ＦＲ４、から選択される、フレームワークＦＲ４と、
を含むＶＬフレームワークを含むＶＬドメイン。
【０１０４】
好ましい具体的実施形態では、本発明は、以下を含む抗体を提供する：
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号１７、１８及び１９のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
（ｉｉ）ＶＨ３又はＶＨ４ドメインフレームワーク配列、好ましくはＶＨ３ドメインフレームワーク配列、及び
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３のＦＲ１からＦＲ３、好ましくはＶκ１のＦＲ１からＦＲ３と、
ＶκＦＲ４、特にＶκ１  ＦＲ４、Ｖκ３  ＦＲ４及びＶλ  ＦＲ４、特に配列番号６４から配列番号７０のいずれかから選択されるアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ  ＦＲ４、好ましくは配列番号６４から配列番号７０のいずれかで表されるＶλ  ＦＲ４、より好ましくは配列番号６４で表されるＶλ  ＦＲ４、から選択される、フレームワークＦＲ４と、
を含むＶＬフレームワークを含むＶＬドメイン。
【０１０５】
一実施形態では、本発明は、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有し、
（ｉ）ＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、
（ｉｉ）ヒトＶκフレームワーク領域ＦＲ１からＦＲ３、特にヒトＶκ１フレームワーク領域ＦＲ１からＦＲ３、
（ｉｉｉ）
（ａ）ＦＲ４のためのヒトＶλ生殖細胞系の配列、特に配列番号６４から７０から選択される、好ましくは配列番号６４のＶλ生殖細胞系の配列、及び
（ｂ）配列番号６４から配列番号７０のいずれかから選択される、好ましくは配列番号６４の、アミノ酸配列を含む、ＦＲ４に最も近いヒトＶλ生殖細胞系配列と比較し、１つ又は２つの変異、特に１つの変異を有するＶλベースの配列、
から選択されるＦＲ４、
を含むＶＬを含む抗体を提供する。
【０１０６】
本発明は、ＰＤＬ１（例えばヒトＰＤＬ１タンパク質）と特異的に結合する単離された抗体を提供し、前記抗体は、表１に列挙されるＶＨドメインを含む。
【０１０７】
本発明はまた、ＰＤＬ１に特異的に結合する単離された抗体を提供し、前記抗体は、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み、フレームワーク配列（例えばＣＤＲでない配列）の変異（変異の各種の非限定的な例として、追加、置換又は削除）は、約１０アミノ酸以下である。
【０１０８】
本発明はまた、ＰＤＬ１に特異的に結合する単離された抗体を提供し、前記抗体は、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み、フレームワーク配列（例えばＣＤＲでない配列）の変異（変異の各種の非限定的な例として、追加、置換又は削除）は、約２０アミノ酸以下である。
【０１０９】
本発明の他の抗体としては、変異したアミノ酸を含むが、ＰＤＬ１と特異的に結合し、表１に記載される配列で表されるＶＨ領域と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するＶＨ領域を有するものが包含される。
【０１１０】
本発明は、ＰＤＬ１タンパク質と特異的に結合する単離された抗体を提供し、前記抗体は、表１に列挙されるＶＬドメインを含む。
【０１１１】
本発明はまた、ＰＤＬ１に特異的に結合する単離された抗体を提供し、前記抗体は、表１に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み、フレームワーク配列（例えばＣＤＲでない配列）の変異（変異の各種の非限定的な例として、追加、置換又は削除）は、約１０アミノ酸以下である。
【０１１２】
本発明はまた、ＰＤＬ１に特異的に結合する単離された抗体を提供し、前記抗体は、表１に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み、フレームワーク配列（例えばＣＤＲでない配列）の変異（変異の各種の非限定的な例として、追加、置換又は削除）は、約２０アミノ酸以下である。
【０１１３】
本発明の他の抗体としては、変異したアミノ酸を含むが、ＰＤＬ１と特異的に結合し、表１に記載される配列で表されるＶＬ領域と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するＶＬ領域を有するものが包含される。
【０１１４】
本発明はまた、ＰＤＬ１に特異的に結合する単離された抗体を提供し、前記抗体は、
配列番号１４、１５、１６、４５、４６及び４７からなる群から選択される、好ましくは配列番号１４又は１６の、より好ましくは配列番号１６のアミノ酸配列と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号２６、２７、５７及び５８からなる群から選択される、好ましくは配列番号２６又は２７の、より好ましくは配列番号２７のアミノ酸配列と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含む。
【０１１５】
一実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有し、
配列番号１４、１５、１６、４５、４６及び４７からなる群から選択されるいずれかの、好ましくは配列番号１４又は１６の、より好ましくは配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号２６、２７、５７及び５８からなる群から選択されるいずれかの、好ましくは配列番号２６又は２７の、より好ましくは配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含む。
【０１１６】
一実施形態では、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、以下を含む：
（ａ）それぞれ、配列番号４、６及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２０、２１及び２２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号１４と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列、並びに
配列番号２６と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列、
（ｂ）それぞれ、配列番号５、６及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２０、２１及び２２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号１５と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列、並びに
配列番号２６と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列、
（ｃ）それぞれ、配列番号４、６及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２０、２１及び２２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号１６と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列であって、好ましくは、Ｇ５６Ａ及びＹ１０５Ｆ変異（ＡＨｏ付番）を含む、前記ＶＨ、並びに
配列番号２７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列であって、好ましくは、Ｓ９Ａ及びＡ５１Ｐ変異（ＡＨｏ付番）を含む、前記ＶＬ、
（ｄ）それぞれ、配列番号３５、３７及び３８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５１、５２及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号４５と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列、並びに
配列番号５７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列、
（ｅ）それぞれ、配列番号３６、３７及び３８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５１、５２及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号４６と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列であって、好ましくは、Ｖ２Ｓ、Ｖ２５Ａ、Ｉ４４Ｖ、Ｇ５６Ａ、Ｖ８２Ｋ、Ｆ８９Ｖ及びＹ１０５Ｆ変異（ＡＨｏ付番）を含む、前記ＶＨ、並びに
配列番号５８と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列であって、好ましくは、Ｉ２Ｆ、Ｍ４Ｌ及びＡ５１Ｐ変異（ＡＨｏ付番）を含む、前記ＶＬ、
又は
（ｆ）それぞれ、配列番号３５、３７及び３８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５１、５２及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号４７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一のＶＨ配列であって、好ましくは、Ｖ２５Ａ及びＩ４４Ｖ変異（ＡＨｏ付番）を含む、前記ＶＨ、並びに
配列番号５７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列。
【０１１７】
一実施形態では、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、以下を含む：
（ａ）それぞれ、配列番号１、２及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号１７、１８及び１９のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号１４と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列、並びに
配列番号２６と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列、
（ｂ）それぞれ、配列番号１、２及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号１７、１８及び１９のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号１５と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列、並びに
配列番号２６と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列、
（ｃ）それぞれ、配列番号１、２及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号１７、１８及び１９のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号１６と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列であって、好ましくは、Ｇ５６Ａ及びＹ１０５Ｆ変異（ＡＨｏ付番）を含む、前記ＶＨ、並びに
配列番号２７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列であって、好ましくは、Ｓ９Ａ及びＡ５１Ｐ変異（ＡＨｏ付番）を含む、前記ＶＬ、
（ｄ）それぞれ、配列番号３２、３３及び３４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号４８、４９及び５０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号４５と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列、並びに
配列番号５７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列、
（ｅ）それぞれ、配列番号３２、３３及び３４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号４８、４９及び５０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号４６と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列であって、好ましくは、Ｖ２Ｓ、Ｖ２５Ａ、Ｉ４４Ｖ、Ｇ５６Ａ、Ｖ８２Ｋ、Ｆ８９Ｖ及びＹ１０５Ｆ変異（ＡＨｏ付番）を含む、前記ＶＨ、並びに
配列番号５８と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列であって、好ましくは、Ｉ２Ｆ、Ｍ４Ｌ及びＡ５１Ｐ変異（ＡＨｏ付番）を含む、前記ＶＬ、
又は
（ｆ）それぞれ、配列番号３２、３３及び３４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号４８、４９及び５０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号４７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一のＶＨ配列であって、好ましくは、Ｖ２５Ａ及びＩ４４Ｖ、Ｇ５６Ａ、Ｖ８２Ｋ及びＦ８９Ｖ変異（ＡＨｏ付番）を含む、前記ＶＨ、並びに
配列番号５７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列。
【０１１８】
好ましい実施形態では、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の抗体は、以下を含む：
それぞれ、配列番号１、２及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号１７、１８及び１９のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号１６と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列であって、好ましくは、Ｇ５６Ａ及びＹ１０５Ｆ変異（ＡＨｏ付番）を含む、前記ＶＨ、並びに
配列番号２７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列であって、好ましくは、Ｓ９Ａ及びＡ５１Ｐ変異（ＡＨｏ付番）を含む、前記ＶＬ。
【０１１９】
更なる実施形態では、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の単離された抗体は、以下を含む：
（ａ）配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号２６のＶＬ配列、
（ｂ）配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号２６のＶＬ配列、
（ｃ）配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列、
（ｄ）配列番号４５のＶＨ配列及び配列番号５７のＶＬ配列、
（ｅ）配列番号４６のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列、又は
（ｆ）配列番号４７のＶＨ配列及び配列番号５７のＶＬ配列。好ましい実施形態では、ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の単離された抗体は、配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号２６のＶＬ配列を含む。より好ましい実施形態では、ヒトＰＤＬ１のための結合特異性を有する本発明の単離された抗体は、配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列を含む。
【０１２０】
一実施形態では、ＰＤＬ１と特異的に結合する抗体は、表１に記載される抗体である。一実施形態では、ＰＤＬ１と特異的に結合する抗体は、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号６０、配列番号６１及び配列番号６２からなる群から選択されるアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＰＤＬ１と特異的に結合する抗体は、配列番号２９又は配列番号３０又は配列番号３１、好ましくは配列番号２９、より好ましくは配列番号３１で表される。一実施形態では、ＰＤＬ１と特異的に結合する抗体は、配列番号６０又は配列番号６１又は配列番号６２、好ましくは配列番号６０、より好ましくは配列番号６２で表される。
【０１２１】
ヒトＰＤＬ１との結合特異性を有する本発明の他の抗体は、アミノ酸又はアミノ酸をコードする核酸が変異したそれらを含むが、表１に記載される配列と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の同一性を有する。一実施形態では、それは表１に記載されている可変領域の配列と比較したとき、１、２、３、４又は５個のアミノ酸のみが可変領域において変異している変異アミノ酸配列を含むが、実質的に同じ活性が維持されている。本明細書で用いられる用語「実質的に同じ活性」とは、親抗体において測定された活性、例えば本発明の抗体、特に表１に記載される本発明の抗体と比較し、実質的に、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は１００％以上、又は１１０％以上、又は１２０％以上、又は１３０％以上、又は１４０％以上、又は１５０％以上、又は１６０％以上、又は１７０％以上、又は１８０％以上、又は１９０％以上、例えば多くとも２００％同等の活性により示される活性のことを指す。
【０１２２】
これらの抗体が各々、ＰＤＬ１と結合することができ、その抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２及び３の領域により提供される限りにおいて、ＶＨ  ＣＤＲ１、２及び３の配列、並びにＶＬ  ＣＤＲ１、２及び３の配列は、「混合及びマッチング」することができる（すなわち、異なる抗体由来のＣＤＲを混合及びマッチングすることができる）が、但し、各抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１、２及び３、並びにＶＬ  ＣＤＲ１、２及び３を含まなければならず、また本発明の他のＰＤＬ１−結合分子を形成させるものでなければならない。かかる「混合及びマッチングした」ＰＤＬ１−結合抗体は、周知の結合実験であって、実施例にも記載されているもの（例えばＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。ＶＨ  ＣＤＲ配列が混合及びマッチングされるとき、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列は、構造的に類似するＣＤＲ配列（複数含む）と置換されるべきである。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列が混合及びマッチングされるとき、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列は、構造的に類似するＣＤＲ配列（複数含む）と置換されるべきである。当業者にとり自明であるように、新規なＶＨ及びＶＬ配列は、本発明のモノクローナル抗体に関して本願明細書に示されるＣＤＲ配列から、構造的に類似する配列を有するように１つ以上のＶＨ及び／又はＶＬ  ＣＤＲ領域配列を変異させることにより作製することができる。
【０１２３】
また別の実施形態では、本発明は、表１に記載されている配列と相同性を有するアミノ酸配列を含む抗体を提供し、前記抗体は、ＰＤＬ１と結合し、また表１に記載されるそれらの抗体の所望の機能的特性が維持されている。
【０１２４】
例えば、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含んでいる単離されたモノクローナル抗体を提供し、
前記重鎖可変領域は、配列番号１４、１５、１６、４５、４６及び４７からなる群から選択される、好ましくは配列番号１４又は１６、より好ましくは配列番号１６のアミノ酸配列と８０％以上、９０％以上又は９５％以上同一のアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号２６、２７、５７及び５８からなる群から選択される、好ましくは配列番号２６又は２７、より好ましくは配列番号２７のアミノ酸配列と８０％以上、９０％以上又は９５％以上同一のアミノ酸配列を含み、
前記抗体は、ヒトＰＤＬ１にタンパク質と特異的に結合する。
【０１２５】
一実施形態では、ＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、表１に記載される配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であってもよい。一実施形態では、ＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４又は５個のアミノ酸のみのアミノ酸置換を除き同一であってもよい。
【０１２６】
一実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と、を有し、
これらのＣＤＲ配列の１つ以上は、本願明細書において記載される抗体又はその保存的修飾に基づく特定のアミノ酸配列を有し、前記抗体は、本発明のＰＤＬ１−結合抗体の所望の機能的特性が維持されている。
【０１２７】
用語「保存的に修飾された変異体」又は「保存的な変異体」は、アミノ酸及び核酸配列に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一の若しくは基本的に同一のアミノ酸配列をコードすることを指すか、又は、核酸がアミノ酸配列をコードしない核酸の場合には、基本的に同一の配列のことを指す。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が、いずれかの所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは、いずれもアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定されるいかなる位置においても、コードされるポリペプチドを変化させずに、コドンを記載される対応するいずれかのコドンに変更することができる。かかる核酸変異は「サイレント変異」であり、それは保存的に修飾される変異の１つの種類である。ポリペプチドをコードする本願明細書におけるあらゆる核酸配列は、あらゆる使用可能な核酸のサイレント変異を記載するものである。当業者であれば、核酸中の各コドン（但し、ＡＵＧ（通常メチオニンの唯一のコドン）及びＴＧＧ（通常トリプトファンの唯一のコドン）を除く）が、機能的に同一の分子の産生のために修飾できることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載されている各配列に暗示的に存在する。
【０１２８】
ポリペプチド配列に関する「保存的に修飾された変異体」又は「保存的な変異体」には、化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸置換をもたらす、ポリペプチド配列への個々の置換、削除又は追加が包含される。機能的に同等のアミノ酸をもたらす保存的置換の表が公知である。かかる保守的に修飾された変異体は、それに加えて、本発明の多形性変異体、種間ホモログ及びアレルであってもよく、それらを排除するものではない。以下の８つのグループは、相互に保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。一実施形態では、「保存的な配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に著しく影響を及ぼさないか又は変化させないアミノ酸修飾を指すために用いられる。
【０１２９】
したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか又はそれからなる、単離されたモノクローナル抗体を提供し、
重鎖可変領域ＣＤＲ１は、配列番号１、４、５、８、１１、３２、３５、３６、３９及び４２のいずれかから選択される、好ましくは配列番号１又は３２の、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列、又はそれらの保存的な変異体を含み、好ましくはそれからなり、
重鎖可変領域ＣＤＲ２は、配列番号２、６、９、１２、３３、３７、４０及び４３のいずれかから選択される、好ましくは配列番号２又は３３の、より好ましくは配列番号２のアミノ酸配列、又はそれらの保存的な変異体を含み、好ましくはそれからなり、
重鎖可変領域ＣＤＲ３は、配列番号３、７、１０、１３、３４、３８、４１及び４４のいずれかから選択される、好ましくは配列番号３又は３４の、より好ましくは配列番号３のアミノ酸配列、又はその保存的な変異体を含み、好ましくはそれからなり、
軽鎖可変領域ＣＤＲ１は、配列番号１７、２０、２３、４８、５１及び５４のいずれかから選択される、好ましくは配列番号１７又は４８の、より好ましくは配列番号１７のアミノ酸配列、又はその保存的な変異体を含み、好ましくはそれからなり、
軽鎖可変領域ＣＤＲ２は、配列番号１８、２１、２４、４９、５２及び５５のいずれかから選択される、好ましくは配列番号１８又は４９の、より好ましくは配列番号１８のアミノ酸配列、又はその保存的な変異体を含み、好ましくはそれからなり、
軽鎖可変領域ＣＤＲ３は、配列番号１９、２２、２５、５０、５３及び５６のいずれかから選択される、好ましくは配列番号１９又は５０の、より好ましくは配列番号１９のアミノ酸配列、又はその保存的な変異体を含み、好ましくはそれからなり、
該抗体は、ＰＤＬ１と特異的に結合し、ＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用をブロックすることができる。
【０１３０】
一実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物細胞における発現のために最適化された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有し、これらの配列の１つ以上は、本願明細書において記載される抗体又はその保存的な修飾に基づく特定のアミノ酸配列を有し、該抗体は、本発明のＰＤＬ１−結合抗体の所望の機能的特性が保持される。したがって、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、哺乳動物細胞における発現のために最適化された単離されたモノクローナル抗体を提供し、
該重鎖可変領域は、配列番号１４、１５、１６、４５、４６及び４７のいずれかから選択される、好ましくは配列番号１４又は１６の、好ましくは配列番号１６のアミノ酸配列、及びその保存的な修飾配列を含み、
該軽鎖可変領域は、配列番号２６、２７、５７及び５８のいずれかから選択される、好ましくは配列番号２６又は２７の、好ましくは配列番号２７のアミノ酸配列、及びその保存的な修飾配列を含み、
該抗体は、ＰＤＬ１と特異的に結合し、ＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用をブロックすることができる。
【０１３１】
一実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物細胞における発現のために最適化された完全長重鎖配列及び完全長軽鎖配列を有し、これらの配列の１つ以上は、本願明細書において記載される抗体又はその保存的な修飾に基づく特定のアミノ酸配列を有し、該抗体は、本発明のＰＤＬ１−結合抗体の所望の機能的特性が維持されている。
【０１３２】
本明細書において、用語「最適化された」とは、産生細胞又は生物（一般に、例えば真核細胞ピキア属の細胞、チャイニーズ＝ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はヒト細胞）において好ましいコドンを用いてアミノ酸配列をコードするよう、ヌクレオチド配列が改変されていることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、完全に、又は可能な限り、「親の」配列として知られる当初の開始ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を保持するよう加工される。本願明細書において、最適化された配列は、哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するよう加工されている。しかしながら、他の真核細胞又は原核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現も、本発明においては想起される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列は、最適化されたものとも呼ばれる。
【０１３３】
他のタイプの可変領域の修飾は、「親和性成熟」として知られるＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させることにより、目的の抗体の１つ以上の結合特性（例えば親和性）を改善することである。変異（複数含む）の導入は、部位特異的変異導入又はＰＣＲにより媒介される変異導入により行うことができ、それによる、抗体結合に対する効果、又は他の目的の機能的特性は、本願明細書に記載され、実施例に例示されるインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価できる。（上記のような）保存的な修飾を導入することもできる。変異は、アミノ酸置換、追加又は削除であってもよい。更に、典型的には、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つ又は、５つの残基のみを改変する。
【０１３４】
「親和性成熟された」抗体は、かかる改変を有さない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす、１つ以上の可変ドメインにおける１つ以上の改変を有するものである。一実施形態では、親和性成熟された抗体は、標的抗原に対するナノモル又はピコモル単位の親和性を有することもある。親和性成熟された抗体は、周知の手順により作製される。例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨ−及びＶＬ−ドメインのシャフリングによる親和性成熟を記載する。超可変領域（「ＨＶＲ」）及び／又はフレームワーク残基のランダムな変異導入は、例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）、Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）に記載される。
【０１３５】
一実施形態では、本発明は、Ｇ５６Ａ及びＹ１０５Ｆ変異を含み、特に配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ３と、好ましくは、Ｓ９Ａを含むＶＬ、Ａ５１Ｐ変異を含み、特に配列番号２７で表されるアミノ酸配列と、を含む単離されたモノクローナル抗体を提供する。
【０１３６】
一実施形態では、本発明の「親和性成熟された」抗体は、Ｖ２５Ａ、Ｉ４４Ｖ、Ｇ５６Ａ、Ｖ８２Ｋ、Ｆ８９Ｖ変異、特に配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ４と、好ましくは、配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む。更に別の実施形態では、本発明の「親和性成熟された」抗体は、Ｖ２Ｓ、Ｖ２５Ａ、Ｉ４４Ｖ、Ｇ５６Ａ、Ｖ８２Ｋ、Ｆ８９Ｖ、Ｙ１０５Ｆ変異、特に配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ４と、Ｉ２Ｆ、Ｍ４Ｌ、Ａ５１Ｐ変異、特に配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む。
【０１３７】
本発明の抗体は更に、開始材料として、本願明細書において示される１つ以上のＶＨ及び／又はＶＬ配列を有する抗体を、修飾された抗体への加工に用いて調製することができ、該修飾された抗体は、開始抗体よりも改変された特性を有しうる。抗体の加工は、可変領域（すなわちＶＨ及び／又はＶＬ）の一方又は両方、例えば１つ以上のＣＤＲ領域及び／又は１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することにより行うことができる。更に、又はその代わりに、定常領域内の残基を修飾することにより抗体を加工し、例えば抗体のエフェクター機能を改変することもできる。
【０１３８】
行いうる可変領域の加工の１つとして、ＣＤＲグラフトが挙げられる。抗体は、主に６つの重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基により、標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも、個々の抗体間で多様性を有する。ＣＤＲ配列がほとんどの抗体−抗原相互作用の原因となるため、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に、特定の天然に存在する抗体由来のＣＤＲ配列を融合させた発現ベクターを構築することにより、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能となる（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３、米国特許第５，２２５，５３９号（Ｗｉｎｔｅｒ）、並びに米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号及び第６，１８０，３７０号（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．））。
【０１３９】
かかるフレームワーク配列は、公的ＤＮＡデータベース、又は生殖細胞系の抗体の遺伝子配列や再編成された抗体配列を記載する公知文献から取得することが可能である。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅとしてインターネットで利用可能）、並びに、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｊ．ｆｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８、及びＣｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｅｕｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６に存在し、その開示内容を参照により本願明細書に援用する。例えばヒト重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子及び再編成された抗体配列のための生殖細胞系ＤＮＡ配列は、「ＩＭＧＴ」データベースに存在する（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇとしてインターネットで入手可能、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２０９−２１２、これらの開示内容を参照により本願明細書に援用する）。
【０１４０】
本発明の抗体に用いられるフレームワーク配列の例としては、本発明の選択された抗体により用いられるフレームワーク配列と構造的に類似するもの、例えば本発明のモノクローナル抗体により用いられるコンセンサス配列及び／又はフレームワーク配列が挙げられる。ＶＨ  ＣＤＲ１、２及び３配列、並びにＶＬ  ＣＤＲ１、２及び３の配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子に存在するのと同一の配列を有するフレームワーク領域にグラフトすることもでき、又は、生殖細胞系配列と比較し、１つ以上の変異を含むフレームワーク領域にＣＤＲ配列をグラフトすることもできる。例えば特定の例としては、抗体の抗原結合能力を維持する又は強化するために、フレームワーク領域中の残基を変異させることが有用であることが知られている（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号及び第６，１８０，３７０号明細書（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ）を参照）。
【０１４１】
得られるポリペプチドがＰＤＬ１に特異的に結合する１つ以上の結合領域を含む限り、多種多様な抗体／イムノグロブリンのフレームワーク又は足場を使用できる。かかるフレームワーク又は足場としては、ヒト免疫グロブリン、その抗原結合性断片の５つの主なイディオタイプを含むものや、他の動物種のイムノグロブリン、好ましくはヒト化された態様のそれらを含むものが挙げられる。
【０１４２】
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲをグラフト化できる非イムノグロブリン足場を用いる、非イムノグロブリンベースの抗体の産生方法に関する。標的ＰＤＬ１タンパク質に対する特異的な結合領域を含む限り、公知の又は将来開発されうる非イムノグロブリンフレームワーク及び足場を使用できる。公知の非イムノグロブリンフレームワーク又は足場としては、限定されないが、フィブロネクチン（Ｃｏｎｐｏｕｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社、ウォルサム、マサチューセッツ）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ、チューリッヒ、スイス）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ  ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、ドイツ）、小分子免疫医薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、シアトル、ワシントン）、ｍａｘｙｂｏｄｙ（Ａｖｉｄｉａ社、マウンテンビュー、カリフォルニア）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＧ、スウェーデン）及びアフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）（γ−クリスタリン又はユビキチン）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ社、ハレ、ドイツ）が挙げられる。
【０１４３】
適切には、本発明の抗体は、ＰＤＬ１と特異的に結合し、以下の１つ以上のパラメータにより特徴づけられる：
（ｉ）特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定したとき、ヒトＰＤＬ１に対して、１０ｎＭ未満、特に５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、特に５００ｐＭ未満、特に１００ｐＭ未満、好ましくは５０ｐＭ未満、より好ましくは１０ｐＭ未満、より好ましくは５ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合し、特に、前記抗体がｓｃＦｖである、
（ｉｉ）ＳＰＲにより測定したとき、ヒトＰＤＬ１に対して、１０−３ｓ−１以下、１０−４ｓ−１以下、又は１０−５ｓ−１以下のＫｏｆｆで結合し、特に、前記抗体がｓｃＦｖである、
（ｉｉｉ）ＳＰＲにより測定したとき、ヒトＰＤＬ１に対して、１０３Ｍ−１ｓ−１以上、１０４Ｍ−１ｓ−１以上、１０５Ｍ−１ｓ−１以上、又は１０６Ｍ−１ｓ−１以上のＫｏｎで結合し、特に、前記抗体がｓｃＦｖである、
（ｉｖ）カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）ＰＤＬ１との交差反応性を有し、特に、表面プラズモン共鳴により測定したとき、カニクイザルＰＤＬ１に対する５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、特に５００ｐＭ未満、特に１００ｐＭ未満、好ましくは１０ｐＭ未満のＫＤで結合し、特に、前記抗体がｓｃＦｖであり、特に、表面プラズモン共鳴により測定したとき、マウスＰＤＬ１との交差反応性を有さず、及び／又は
（ｖ）特に、ＳＰＲにより測定したとき、ヒトＰＤＬ２と結合しない。
【０１４４】
本明細書中で用いる「親和性」という用語は、単一の抗原性部位における抗体と抗原との間の相互作用の強さを意味する。各抗原性部位の範囲内で、抗体「アーム」の可変領域は、多数の部位で弱い非共有結合力により抗原と相互作用し、相互作用が多くなる程、親和性はより強くなる。
【０１４５】
「結合親和性」は、広義には、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との非共有結合的な相互作用の総計としての強さのことを指す。特に明記しない限り、本願明細書において用いられる「結合親和性」、「〜に結合する」、「〜と結合する」又は「〜との結合」とは、結合対の構成要素（例えば抗体断片及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹとの親和性は通常、解離定数（ＫＤ）により表することができる。親和性は公知技術の一般的な方法により測定することができ、本願明細書において記載される方法が含まれる。低い親和性の抗体は通常、抗原との結合が遅く、かつ解離が迅速である傾向がある一方、高い親和性の抗体は通常、抗原との結合が迅速であり、かつ長く結合を維持する傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が公知であり、そのいずれかを、本発明の課題解決のために用いることができる。結合親和性（すなわち結合の強さ）を測定するための特定の例示的な実施形態を、以下に記載する。
【０１４６】
本明細書で用いられる用語「Ｋａｓｓｏｃ」、「Ｋａ」又は「Ｋｏｎ」とは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すものとする一方、本明細書で用いられる用語「Ｋｄｉｓ」、「Ｋｄ」又は「Ｋｏｆｆ」とは、特定の抗体−抗原相互作用の分離速度を指すものとする。一実施形態では、本明細書で用いられる用語「ＫＤ」とは、解離定数を指すものとし、それはＫｄとＫａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。本発明の「ＫＤ」又は「ＫＤ値」又は「ＫＤ」又は「ＫＤ値」は、一実施形態では、ＭＡＳＳ−１  ＳＰＲ装置（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社）を用いた表面−プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。親和性を測定する際、Ｆｃ領域に特異的な抗体を、標準的なアミン−カップリング手順を用い、センサーチップ（ＳＰＲ−２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒ、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ａｍｉｎｅ、Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社）にウサギＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カタログ番号Ａ１２０−１１１Ａ）を固定化する。Ｂ細胞上清中のウサギモノクローナル抗体を、固定化した抗ウサギＩｇＧ抗体により捕捉する。Ｂ細胞上清中の最小のＩｇＧ濃度は、充分な捕捉を行わせるために必要である。モノクローナル抗体を捕捉した後、ヒトＰＤＬ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を９０ｎＭの濃度でフローセルに３分間にわたり注入し、センサーチップに捕捉されたＩｇＧからのタンパク質の分離を５分間にわたり行わせる。各注入サイクルの後、表面を１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌを２回注入して再生する。見かけの分離（ｋｄ）及び会合（ｋａ）定数、並びに見かけの分離平衡定数（ＫＤ）は、１対１のラングミュア結合モデルを用い、ＭＡＳＳ−１分析ソフトウェア（Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社）により算出し、Ｃｈｉ２の相対値（外挿された検体の最大結合レベルで正規化したＣｈｉ２）に基づき、フィットの品質をモニターし、それをカーブフィッティングの品質保持のための指標とする。Ｃｈｉ２の該値が小さいとき、１対１のラングミュア結合モデルに対するフィッティングの正確性が高いことを意味する。リガンド結合における反応単位（ＲＵ）が、抗体捕捉のＲＵの２％以上である場合、結果は有効であると判断される。抗体捕捉のＲＵに対し２％未満のリガンド結合のＲＵを示すサンプルは、捕捉された抗体へのＰＤＬ１の特異的な結合がないことを示すものと考えられる。平衡解離定数（ＫＤ）は、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出される。例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照。
【０１４７】
適切には、本発明のＰＤＬ１に対する抗体の親和性は、ＰＤＬ１のＰＤ−１に対する親和性より高い場合がある。ＰＤ−１に対するＰＤＬ１の親和性と比較しＰＤＬ１抗体の親和性が高いことは、予め形成されたＰＤ−１／ＰＤＬ１複合体を解離させる又は中和するために特に有用でありうることはいうまでもない。一実施形態では、本発明のＰＤＬ１抗体は、ＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用を中和する。他の実施形態では、本発明のＰＤＬ１抗体は、Ｂ７−１／ＰＤＬ１相互作用を中和する。適切には、ＰＤＬ１に対する本発明のＰＤＬ１抗体の親和性は、ＰＤ−１に対するアベルマブの親和性と同等又は高くてもよい。一実施形態では、本発明のＰＤＬ１抗体は、アベルマブに等しい又は高い力価でＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用を中和する。更に別の実施形態では、本発明のＰＤＬ１抗体は、アベルマブに等しい又は高い力価でＢ７−１／ＰＤＬ１相互作用を中和する。抗体の結合親和性は、例えば解離定数（ＫＤ）により決定されうる。強い親和性は低いＫＤにより表され、一方、弱い親和性は高いＫＤにより表される。
【０１４８】
したがって、適切な実施形態では、本発明の抗体は、１〜５０，０００ｐＭ、１〜４０，０００ｐＭ、１〜３０，０００ｐＭ、１〜２０，０００ｐＭ、１〜１０，０００ｐＭ、１〜５，０００ｐＭ、１〜２，５００ｐＭ、１〜１，０００ｐＭ、１〜７５０ｐＭ、１〜５００ｐＭ、１〜２５０ｐＭ、１〜１００ｐＭ、１〜５０ｐＭ、１〜１０ｐＭのＫＤを有しうる。適切な実施形態では、本発明の抗体は、特にＳＰＲで測定したとき、約５０ｎＭ未満、約４５ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３５ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２５ｎＭ未満、１００ｐＭ未満、１０ｐＭ未満又は５ｐＭ未満のＫＤを有してもよく、特に前記抗体はｓｃＦｖである。適切には、特にＳＰＲにより測定したとき、本発明の抗体は５ｎＭ未満のＫＤを有する。適切には、特にＳＰＲにより測定したとき、本発明の抗体は１ｎＭ未満のＫＤを有する。適切には、特にＳＰＲにより測定したとき、本発明の抗体は１００ｐＭ未満のＫＤを有する。適切には、特にＳＰＲにより測定したとき、本発明の抗体は５０ｐＭ未満のＫＤを有する。好ましくは、特にＳＰＲにより測定したとき、本発明のＰＤＬ１−ＢＤはヒトＰＤＬ１に１０ｐＭ未満のＫＤで結合する。好ましくは、特にＳＰＲにより測定したとき、本発明のＰＤＬ１−ＢＤはヒトＰＤＬ１に５ｐＭ未満のＫＤで結合する。
【０１４９】
適切には、本発明の抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定したとき、ヒトＰＤＬ１に対して、１０３Ｍ−１ｓ−１以上、１０４Ｍ−１ｓ−１以上、５×１０４Ｍ−１ｓ−１以上、１０５Ｍ−１ｓ−１以上、５×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、１０６Ｍ−１ｓ−１以上、５×１０６Ｍ−１ｓ−１以上、１０７Ｍ−１ｓ−１以上、５×１０７Ｍ−１ｓ−１以上のＫｏｎ速度で結合する。好ましくは、本発明の抗体は、ＳＰＲで測定したとき、１０５Ｍ−１ｓ−１以上、特に１０６Ｍ−１ｓ−１以上のＫｏｎ速度を有する。
【０１５０】
適切には、本発明の抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定したとき、ヒトＰＤＬ１に対して、１０−３ｓ−１以下、３×１０−３ｓ−１以下、５×１０−３ｓ−１以下、１０−４ｓ−１以下、５×１０−４ｓ−１以下、１０−５ｓ−１以下、５×１０−５ｓ−１以下、１０−６ｓ−１以下又は１０−７ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度で結合する。好ましくは、本発明の抗体は、ＳＰＲで測定したとき、１０−３ｓ−１以下、１０−４ｓ−１以下、特に１０−５ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度を有する。
【０１５１】
適切には、本発明の抗体は、ＰＤＬ１と特異的に結合し、以下の１つ以上のパラメータにより特徴づけられる：
（ｉ）ＥＬＩＳＡ法で測定したとき、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）と比較し、１．５超、例えば２超、２．５超、好ましくは３超、より好ましくは４超の力価（相対的な力価）で、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用を中和する能力を有し、
前記相対的な力価が、ＥＬＩＳＡ法で測定されるアベルマブのｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値の、ＥＬＩＳＡ法で測定される前記抗体のｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値との比であり、
特に、前記抗体がｓｃＦｖであり、及び、
（ｉｉ）任意に、ＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイで測定したとき、アベルマブと比較し、１．５超、例えば２超、２．５超、好ましくは３超、より好ましくは４超の力価（相対的な力価）で、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用を中和する能力を有し、
前記相対的な力価が、ＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイにおいて測定されるアベルマブのｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値の、ＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイにおいて測定される前記抗体のｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値との比であり、
特に、前記抗体がｓｃＦｖであり、及び、
（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡ法で測定したとき、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）と比較し、１．５超、例えば２超、２．５超、好ましくは３超、より好ましくは４超の力価（相対的な力価）で、ＰＤＬ１／Ｂ７．１相互作用を中和する能力を有し、
前記相対的な力価が、ＥＬＩＳＡ法で測定されるアベルマブのｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値の、ＥＬＩＳＡ法で測定される前記抗体のｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値との比であり、
特に、前記抗体がｓｃＦｖである。
【０１５２】
適切には、本発明の抗体は、有用な生物物理学的な特性を有する。
【０１５３】
適切には、本発明の抗体は、ｓｃＦｖフォーマットであるとき、特に前記抗体がｐＨ６．４、１５０ｍＭのＮａＣｌの５０ｍＭのリン酸−クエン酸バッファにおいて調製されるとき、示差走査蛍光測定により測定したとき、５５℃以上、例えば６０℃以上、好ましくは６５℃以上、より好ましくは７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。ＤＳＦは、既に報告されている（Ｅｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ，９（１）（２０１７），６８−８４、Ｎｉｅｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２（９）（２００７）２２１２−２２２１）。ｓｃＦｖ構築物の熱的変性の遷移中間点は、蛍光色素ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（Ｗｏｎｇ＆Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５（２０１６）１８３４−１８４０参照）を用いた示差走査蛍光測定により測定される。ｐＨ６．４のリン酸−クエン酸バッファのサンプルは、５０μｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度で、及び５×ＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジの最終濃度で、１００μｌの総体積において調製される。調製された２５μｌのサンプルを、白色壁のＡＢ  ｇｅｎｅ  ＰＣＲプレートに３回添加する。アッセイは、サーマルサイクラーとして用いられるｑＰＣＲ装置において行われ、蛍光放出をソフトウェアのカスタム色素校正ルーチンを用いて検出する。試験用サンプルを含むＰＣＲプレートを、２５℃から９６℃への１℃ずつ温度を上昇させ、各温度上昇の後３０秒停止させる。全アッセイ時間は約２時間である。Ｔｍは数学的２次導関数を用いたソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにより算出され、曲線の変曲点が算出される。出力されるＴｍは、３つの測定値の平均である。
【０１５４】
適切には、本発明の抗体は、ｓｃＦｖフォーマットであるとき、本発明の抗体１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度で、５回の連続する凍結融解サイクルに供した後、特に前記抗体がｐＨ６．４、１５０ｍＭのＮａＣｌの５０ｍＭのリン酸クエン酸バッファにおいて調製されるとき、５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満のモノマー含量の損失を示す。
【０１５５】
適切には、本発明の抗体は、ｓｃＦｖフォーマットであるとき、本発明の抗体１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度で、４℃で２週間以上、特に４週間以上の貯蔵後、特に本発明の抗体がｐＨ６．４、１５０ｍＭのＮａＣｌの５０ｍＭのリン酸クエン酸バッファにおいて調製されるとき、１５％未満、例えば１２％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満のモノマー含量の損失を示す。
【０１５６】
モノマー含量の損失は、ＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムの曲線下面積算出により測定する。ＳＥ−ＨＰＬＣは、ＵＳＰ第６２１章に概説される、固体安定相及び液体移動相に基づく分離技術である。この方法は、疎水性安定相及び水性移動相を利用し、それらのサイズ及び形状に基づき分子を分離する。分子の分離は、特定のカラムの空隙体積（Ｖ０）及び全浸透体積（ＶＴ）との間で生じる。ＳＥ−ＨＰＬＣによる測定は、自動サンプル注入装置及び２８０ｎｍの検出波長に設定した紫外線検出器を装備したＣｈｒｏｍａｓｔｅｒ  ＨＰＬＣシステム（株式会社日立ハイテク社）において行われる。該装置は、ソフトウェアＥＺＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．３．２  ＳＰ２）により制御され、またこれにより得られるクロマトグラムの解析がサポートされる。タンパク質サンプルは、遠心により清澄にされ、注入前にオートサンプラー内で４〜６℃の温度で維持される。ｓｃＦｖサンプルの分析の際、カラムＳｈｏｄｅｘ  ＫＷ４０３−４Ｆ（昭和電工社、＃Ｆ６９８９２０２）を用い、その際、０．３５ｍＬ／分の推奨流速で、標準化された緩衝食塩水移動相（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、３００ｍＭの塩化ナトリウム）を用いる。注入当たりの標的なサンプル添加量は５μｇであった。２８０ｎｍの波長においてサンプルを紫外線検出器により検出し、適切なソフトウェアセットによりデータを記録する。得られるクロマトグラムをＶ０からＶＴの範囲で分析し、その際１０分間より長い溶出時間のマトリックス関連するピークが除外される。
【０１５７】
本願明細書において用いられる用語「認識する」とは、抗体がその構造的エピトープを発見し、それと相互作用する（例えば結合する）ことを指す。
【０１５８】
本願明細書において用いられる用語「競合する」又は「交差競合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）する」及び関連する用語は、本願明細書では交換可能に用いられ、標準的な競合結合アッセイにおいてＰＤＬ１に対する他の抗体又は結合剤の結合を妨げる抗体の能力を意味する。
【０１５９】
本発明による抗体が他の抗体又は結合分子のＰＤＬ１への結合を妨げることができる能力又は範囲、すなわち交差競合することができるか否かは、標準的な競合結合アッセイを用いて決定することができる。特に適切な定量的交差競合アッセイでは、ＦＡＣＳ−又はＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎベースの方法を用いて、標識した（例えばＨｉｓタグ付加、ビオチン化又は放射性標識）抗体又はその断片と、そうでない抗体又はその断片との間で競合させ、標的に対するそれらの結合を測定する。一般に、交差競合抗体又はその断片は、例えば、交差競合アッセイにおいて、アッセイの間、第二抗体又はその断片単独の存在下で、本発明のイムノグロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドにより記録される置換が、試験しようとする所定量で存在する交差ブロック能力を有する抗体又はその断片による置換（例えば交差ブロックに必要とされる未処理（例えば非標識）抗体又はその断片による置換）の最大理論置換度に対して（例えばＦＡＣＳベースの競合アッセイにおいて）最大１００％となる態様で、標的と結合するものである。好ましくは、交差競合抗体又はその断片は、１０％〜１００％の記録される置換を有し、好ましくは５０％〜１００％である。
【０１６０】
用語「エピトープ」とは、抗体と特異的な結合ができるタンパク質の決定因子を意味する。エピトープは通常、アミノ酸や糖側鎖などの化学的に活性な表面グルーピング（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を有する分子からなり、通常、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。「立体構造的な」及び「直鎖状の」エピトープは、後者でなく前者に対する結合が、変性溶媒の存在下で失われるという点で区別される。本明細書で用いられる用語「立体構造エピトープ」は、ポリペプチド鎖がフォールディングされて天然のタンパク質を形成したときに表面上に位置し、Ｆａｂ結合によりＨＤ置換の速度が著しく低下する、抗原中のアミノ酸残基を指す。立体構造エピトープは、限定されないが機能的エピトープを含む。用語「直鎖状エピトープ」は、タンパク質及び相互作用する分子（例えば抗体）との間の相互作用の全ての位置が、（連続的な）タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線状に存在するエピトープを意味する。
【０１６１】
本発明はまた、表１に列挙されるＰＤＬ１−結合抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。したがって、更なる抗体は、ＰＤＬ１結合アッセイにおいて本発明の他の抗体と交差競合できる（例えば統計的に有意に競合的に結合を阻害する）それらの能力に基づいて同定される。
【０１６２】
適切には、本発明の単離された抗体は、以下からなる群から選択される：
モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＩｇＧ抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＡｂ、ＳＴＡＢ、及び代替足場に基づく結合ドメイン、例えば、限定されないがアンキリンベースのドメイン、フィノマー、アビマー、アンチカリン、フィブロネクチン及び抗体の定常領域に組み込まれた結合部位（例えばＦ−ｓｔａｒのＭｏｄｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標））が挙げられる。
【０１６３】
適切には、本発明の単離された抗体はＦｖである。適切には、本発明の単離された抗体はｓｃＦｖ抗体断片である。「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは更に、ｓＦｖが標的結合のための望ましい構造を形成することを可能にする、ＶＨとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを含む。「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは更に、ｓｃＦｖが抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能にする、ＶＨとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを含む（例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５を参照）。具体的実施形態では、前記機能性断片は、配列番号２８で表されるリンカーを含むｓｃＦｖフォーマットである。更に別の実施形態では、本発明の単離された抗体は、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号６０、配列番号６１又は配列番号６２で示す単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）である。好ましい実施態様においては、本発明の単離された抗体は、配列番号３１で示す単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）である。
【０１６４】
適切には、本発明の単離された抗体は、ＩｇＧ抗体断片である。用語「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子の違いにより生じる、例えばＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４）などの抗体クラスのことを指す。アイソタイプにはまた、Ｆｃ機能を改変するための修飾、例えばエフェクター機能又はＦｃ受容体への結合を強化するか又は低減させるために行った、これらのいずれか１つのクラスに対する修飾を含む。一実施形態では、本発明の単離された抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなる群から選択されるＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１である。
【０１６５】
適切には、本発明の単離された抗体は、
それぞれ、配列番号４、６及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２０、２１及び２２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号１４と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列、並びに
配列番号２６と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列、を含むＩｇＧ１である。より具体的な実施形態では、本発明の抗体は、
それぞれ、配列番号４、６及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号２０、２１及び２２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号９３と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含む重鎖配列、並びに
配列番号９２と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含む軽鎖配列、を含むＩｇＧ１である。適切には、本発明の単離された抗体は、
それぞれ、配列番号１、２及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号１７、１８及び１９のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号１４と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列、並びに
配列番号２６と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列、を含むＩｇＧ１である。より具体的な実施形態では、本発明の抗体は、
それぞれ、配列番号１、２及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号１７、１８及び１９のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号１６と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列、並びに
配列番号２７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列、を含むＩｇＧ１である。
【０１６６】
適切には、本発明の単離された抗体は、
それぞれ、配列番号３５、３７及び３８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５１、５２及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号４５と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列、並びに
配列番号５７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列、を含むＩｇＧ１である。より具体的な実施形態では、本発明の抗体は、
それぞれ、配列番号３５、３７及び３８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号５１、５２及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号９１と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含む重鎖配列、並びに
配列番号９０と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含む軽鎖配列、を含むＩｇＧ１である。
【０１６７】
適切には、本発明の単離された抗体は、
それぞれ、配列番号３２、３３及び３４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号４８、４９及び５０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号４５と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列、並びに
配列番号５７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列、を含むＩｇＧ１である。より具体的な実施形態では、本発明の抗体は、
それぞれ、配列番号３２、３３及び３４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ、配列番号４８、４９及び５０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、
配列番号４７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＨ配列、並びに
配列番号５７と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、好ましくは９０％以上同一のアミノ酸配列を含むＶＬ配列、を含むＩｇＧ１である。
【０１６８】
本発明の他の具体的実施形態では、本発明の単離された抗体は多重特異性分子、特に、少なくとも第２の機能性分子を有する多重特異性分子、例えば２重特異性分子、３重特異性分子、４重特異性、５重特異性、６重特異性分子である。
【０１６９】
本明細書で用いられる用語「多重特異性分子」又は「多重特異性抗体」とは、少なくとも２つの異なる標的（例えばＰＤＬ１及びＰＤＬ１と異なる他の標的）の２つ以上の異なるエピトープと結合する抗体、又は同一の標的の２つ以上の異なるエピトープと結合する抗体を指す。「多重特異性分子」の用語には、２重特異性、３重特異性、４重特異性、５重特異性及び６重特異性の抗体が包含される。本明細書中で用いられる「２重特異性抗体」なる用語は、２つの異なる標的上の、又は同じ標的上の２つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。本明細書中で用いる「３重特異性抗体」なる用語は、３つの異なる標的上の、又は同じ標的上の３つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。
【０１７０】
本発明の抗体は、誘導体化させることもでき、又は他のペプチド若しくはタンパク質などの他の機能性分子（例えば他の抗体又は受容体に対するリガンド）に連結させることもでき、それらにより、２つ以上の結合部位及び／又は異なる標的分子に結合する多重特異性分子を生じさせることもできる。本発明の抗体は、実際に、誘導体化するか、又は複数の他の機能性分子に連結させ、それにより、２つ以上の異なる結合部位及び／又は標的分子に結合する多重特異性分子となりうる。本発明の多重特異性分子を得るために、本発明の抗体は、（例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合性の会合等により）１つ以上の他の結合分子（例えば他の抗体、抗体断片、ペプチド又は結合模倣物）と機能的に連結させ、それにより多重特異性分子とすることができる。
【０１７１】
したがって、本発明には、ＰＤＬ１に対する１つ以上の第１結合特異性と、第２の標的エピトープに対する第２結合特異性と、を含む多重特異性分子が包含される。例えば、第２の標的エピトープは、ＰＤＬ１とは異なる他の標的分子に存在する。したがって、本発明には、ＰＤＬ１に対する１つ以上の第１結合特異性と、第２の標的エピトープに対する第２結合特異性と、を含む多重特異性分子が包含される。例えば第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープとは異なるＰＤＬ１の他のエピトープである。多重特異性分子は更に、第１及び第２の標的エピトープに加えて、第３結合特異性を更に含むことができる。
【０１７２】
更に別の実施形態では、本発明には、ＰＤＬ１に対して１価の、２価の又は多価の特異性、好ましくは１価の特異性を含む多重特異性分子が包含される。
【０１７３】
本発明の他の具体的実施形態では、本発明の単離された抗体は、１価の、又は例えば２価、３価、４価、５価、６価の多価ＰＤＬ１特異性分子である。
【０１７４】
本明細書で用いられる用語「１価分子」又は「１価抗体」とは、標的分子（例えばＰＤＬ１）上の単一のエピトープと結合する抗体を指す。
【０１７５】
用語「多価抗体」は、複数の価数を有する単一の結合分子を指し、該「価数」は、同一の標的分子上のエピトープに結合する抗原結合部分の数のことである。このように、単一の結合分子は、複数の標的分子と、又は複数コピーのエピトープを含む標的分子上の複数の結合部位と結合できる。多価抗体の例としては、２価抗体、３価抗体、４価抗体、５価抗体等が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いられる用語「２価抗体」とは、（各々同一のエピトープに結合する）２つの抗原結合部分を有する抗体を指す。
【０１７６】
適切には、本発明の単離された抗体は、多重特異性分子（例えば二重特異性分子）及び／又は、多価分子（例えばＰＤＬ１について一価の特異性分子、ＰＤＬ１について二価の特異性分子）であり、それは本技術分野において公知のいずれの適切な多重特異性、例えば二重特異性の抗体フォーマットから選択されてもよく、かかるフォーマットとしては、限定されないが、単鎖ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直鎖二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状二量体のｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞結合部（ＢｉＴＥ；タンデム−ジ−ｓｃＦｖ）、タンデム−トリ−ｓｃＦｖ、ｔｒｉｂｏｄｙ（Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）２）又はｂｉｂｏｄｙ（Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）１）、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｆｖ２、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）（ＩｇＧ  ＣＨ３−ｓｃＦｖ融合体（モリソンＬ）又はＩｇＧ  ＣＬ−ｓｃＦｖ融合体（モリソンＨ））、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、ジ−ミニ抗体、ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合体、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ融合体、ジ−ｄｉａｂｏｄｙ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＣＯＶＤ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ｂｓＡｂ（軽鎖のＣ末端に連結されるｓｃＦｖ）、Ｂｓ１Ａｂ（軽鎖のＮ末端基に連結されるｓｃＦｖ）、Ｂｓ２Ａｂ（重鎖のＮ末端基に連結されるｓｃＦｖ）、Ｂｓ３Ａｂ（重鎖のＣ末端に連結されるｓｃＦｖ）、Ｔｓ１Ａｂ（重鎖及び軽鎖のＮ末端基に連結されるｓｃＦｖ）、Ｔｓ２Ａｂ（重鎖のＣ末端に連結されるｄｓｓｃＦｖ）などのＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体、Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ抗体（ＫｉＨｓ）（ＫｉＨ技術により調製される二重特異性ＩｇＧ）などのヘテロ二量体Ｆｃドメインに基づく二重特異性抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＤｂ、タンデム−ジ−ｓｃＦｖ、タンデム−トリ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）１、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｆｖ２、１つのヘテロ二量体Ｆｃドメイン又は他方のヘテロ二量体ドメインのいずれかの鎖のＮ及び／又はＣ末端に融合したＣＯＶＤ、ＭＡＴＣＨ（国際公開第２０１６／０２０２４５７号、Ｅｇａｎ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ９（２０１７）６８−８４に記載）及びＤｕｏＢｏｄｉｅ（Ｄｕｏｂｏｄｙ技術によって調製される二重特異性ＩｇＧ）（ＭＡｂｓ．２０１７  Ｆｅｂ／Ｍａｒ；９（２）：１８２−２１２．ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１６．１２６８３０７）に基づくフォーマットである。単鎖ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｃＤｂ）又はｓｃＤｂ−ｓｃＦｖは、特に本発明における使用に適している。
【０１７７】
「ｄｉａｂｏｄｙ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、その断片は、同じポリペプチド鎖中に、ＶＬに連結されたＶＨを含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を行わせるにはあまりに短いリンカーを用いることにより、それらのドメインは、他の鎖の補完的ドメインと対形成し、２つの抗原結合部位を形成させるというものである。具体的実施形態では、前記ポリペプチドリンカーは、４つのグリシンアミノ酸残基と１つのセリンアミノ酸残基とからなる１つ又は２つのユニット（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ｎ＝１又は２を含み、好ましくは１つ含む。ｄｉａｂｏｄｙは、２価又は２重特異性であってもよい。ｄｉａｂｏｄｙの詳細については、例えば欧州特許第４０４０９７号明細書、国際公開第９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載されている。Ｔｒｉａｂｏｄｙ及びｔｅｔｒａｂｏｄｙもまた、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【０１７８】
２重特異性ｓｃＤｂ（特に２重特異性モノマーｓｃＤｂ）は、特に、２つの可変領域重鎖ドメイン（ＶＨ）又はその断片と、２つの可変領域軽鎖ドメイン（ＶＬ）又はその断片とを、リンカーＬ１、Ｌ２及びＬ３により連結される形で含み、それらの順序は、ＶＨＡ−Ｌ１−ＶＬＢ−Ｌ２−ＶＨＢ−Ｌ３−ＶＬＡ、ＶＨＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＬＡ、ＶＬＡ−Ｌ１−ＶＬＢ−Ｌ２−ＶＨＢ−Ｌ３−ＶＨＡ、ＶＬＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＨＡ、ＶＨＢ−Ｌ１−ＶＬＡ−Ｌ２−ＶＨＡ−Ｌ３−ＶＬＢ、ＶＨＢ−Ｌ１−ＶＨＡ−Ｌ２−ＶＬＡ−Ｌ３−ＶＬＢ、ＶＬＢ−Ｌ１−ＶＬＡ−Ｌ２−ＶＨＡ−Ｌ３−ＶＨＢ又はＶＬＢ−Ｌ１−ＶＨＡ−Ｌ２−ＶＬＡ−Ｌ３−ＶＨＢであり、ＶＬＡ及びＶＨＡドメインは、第１抗原に対する抗原結合部位を一緒に形成し、ＶＬＢ及びＶＨＢは、第２抗原に対する抗原結合部位を一緒に形成する。
【０１７９】
リンカーＬ１は、特に２〜１０アミノ酸、より具体的には３〜７アミノ酸、更に具体的には５アミノ酸のペプチドであり、リンカーＬ３は、特に１〜１０アミノ酸、より具体的には２〜７アミノ酸、更に具体的には５アミノ酸のペプチドである。具体的実施形態では、リンカーＬ１及び／又はＬ３は、４つのグリシンアミノ酸残基及び１つのセリンアミノ酸残基からなる１つ又は２つのユニット（（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ｎ＝１又は２、好ましくはｎ＝１）を含む。
【０１８０】
中間のリンカーＬ２は、特に１０〜４０アミノ酸、具体的には１５〜３０アミノ酸、更に具体的には２０〜２５アミノ酸のペプチドである。具体的実施形態では、前記リンカーＬ２は、４つのグリシンアミノ酸残基及び１つのセリンアミノ酸残基からなる１つ以上のユニット（（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７又は８、好ましくはｎ＝４）を含む。
【０１８１】
本発明の一実施実施形態では、単離された抗体は、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖフォーマットの多重特異性及び／又は多価抗体である。用語「ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ」は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片が単鎖ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｃＤｂ）と可撓性Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーにより融合した抗体フォーマットを指す。一実施形態では、前記可撓性Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーは、２〜４０アミノ酸、例えば２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０アミノ酸、特に１０アミノ酸のペプチドである。具体的実施形態では、前記リンカーは、４つのグリシンアミノ酸残基及び１つのセリンアミノ酸残基（（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７又は８、好ましくはｎ＝２）を含む。
【０１８２】
本発明の一実施形態では、単離された抗体は、国際公開第２０１６／０２０２４５７号、Ｅｇａｎ  Ｔ．ら、ｍＡｂ  ９（２０１７）６８−８４に記載されるＭＡＴＣＨフォーマットの多重特異性及び／又は多価抗体である。
【０１８３】
本発明の多重特異性及び／又は多価分子は、従来技術において周知のいずれかの有用な抗体製造法を用いて製造することができる（例えば、２重特異性構築物の作製に関しては、Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｎ．＆Ｌｅｇｅｒ，Ｏ．，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７４（２００７）３−１４を、２重特異性ｄｉａｂｏｄｙ及びタンデム型ｓｃＦｖｓに関しては、Ｈｏｒｎｉｇ，Ｎ．＆  Ｆａｒｂｅｒ−Ｓｃｈｗａｒｚ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９０７（２０１２）７１３−７２７及び国際公開第９９／５７１５０号を参照）。本発明の２重特異性構築物の調製のための好適な方法の具体例としては更に、Ｇｅｎｍａｂ（Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１０（２０１３）５１４５−５１５０を参照）及びＭｅｒｕｓ（ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０６（２０１０）７４１−７５０を参照）の技術が挙げられる。機能性抗体のＦｃ部分を含む２重特異性抗体の作製方法も公知技術である（例えばＺｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．８６（１９９４）１２７−１３４）及びＳｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１（１９８６）２１０−２２８を参照）。
【０１８４】
本発明の多重特異性及び多価分子において使用できる他の抗体は、マウス、キメラ、及びヒト化モノクローナル抗体である。
【０１８５】
本発明の多重特異性分子は、従来技術において公知の方法を用いて、幾つかの結合特異性部分をコンジュゲートすることにより調製できる。例えば２重特異性分子の各結合特異性部分は、別々に調製し、次に互いにコンジュゲートすることができる。結合特異性部分がタンパク質又はペプチドであるとき、様々なカップリング又は架橋剤を用いて共有結合的なコンジュゲート形成を行うことができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）（例えばＫａｒｐｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６、Ｌｉｕ，Ｍ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６４８を参照）が挙げられる。他の方法としては、Ｐａｕｌｕｓ，１９８５  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８，１１８−１３２、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３、及びＧｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：００：００２３６７−２３７５が挙げられる。コンジュゲート剤としては、ＳＡＴＡ及びスルホ−ＳＭＣＣが挙げられ、いずれもＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ロックフォード、イリノイ）から入手可能である。
【０１８６】
結合特異性部分が抗体であるとき、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域をスルフヒドリルにより結合するコンジュゲートを行うことができる。具体的実施形態では、コンジュゲートの前に奇数個の（例えば１つの）スルフヒドリル残基を含むようヒンジ領域を修飾する。
【０１８７】
あるいは、２以上の結合特異性部分を同じベクターにおいてコードし、発現させ、同じ宿主細胞内で組み立てることもできる。この方法は、２重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合、特に有用である。本発明の多重特異性分子は、１つの単鎖抗体及び１つの結合決定要素を含む単鎖状分子、又は２つの結合決定要素を含む単鎖状多重特異性分子でありうる。多重特異性分子は、２つ以上の単鎖状分子を含んでもよい。例えば多重特異性分子を調製する方法は、米国特許第５，２６０，２０３号明細書、米国特許第５，４５５，０３０号明細書、米国特許第４，８８１，１７５号明細書、米国特許第５，１３２，４０５号明細書、米国特許第５，０９１，５１３号明細書、米国特許第５，４７６，７８６号明細書、米国特許第５，０１３，６５３号明細書、米国特許第５，２５８，４９８号明細書及び米国特許第５，４８２，８５８号明細書に記載される。
【０１８８】
２重特異性分子のそれらの特定の標的に対する結合は、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例えば増殖阻害）又はウエスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらの各々のアッセイは通常、目的の複合体に対して特異的な標識試薬（例えば抗体）を用いることにより、タンパク質−抗体複合体の存在を特異的に検出する。
【０１８９】
更なる態様において、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸を提供する。本発明はまた、ＰＤＬ１タンパク質と特異的に結合する抗体のＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、完全長重鎖及び完全長軽鎖をコードする核酸配列を提供する。かかる核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のために最適化することができる。
【０１９０】
用語「核酸」は、本願明細書においては「ポリヌクレオチド」という用語と交換可能に用いられ、一本鎖又は二本鎖の形態の、１つ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、並びにそのポリマーを指す。該用語は、公知のヌクレオチドアナログ又は修飾された主鎖残基若しくは結合を含む核酸を包含するものであり、それらは合成物、天然物及び非天然物であってもよく、そられは参照核酸として同様の結合特性を有し、それらは参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される。かかるアナログの例としてはホスホロチオネート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。特に明記しない限り、特定の核酸配列はまた、明記される配列に加えて、その保存的に修飾された変異体（例えばコドン縮重置換）及びその相補配列を暗に包含する。具体的には、後述するように、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置を混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基により置換された配列とすることにより、縮重コドン置換を生じさせてもよい（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１，１９９１、Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８，１９８５及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８，１９９４）。
【０１９１】
本発明は、上記のＰＤＬ１−結合抗体鎖のセグメント又はドメインを含むポリペプチドをコードする実質的に精製された核酸分子を提供する。適切な発現ベクターから発現されるとき、これらの核酸分子によりコードされるポリペプチドは、ＰＤＬ１抗原との結合能力を示すことができる。
【０１９２】
また、本発明では、表１に記載されるＰＤＬ１−結合抗体の重鎖又は軽鎖に由来する１つ以上のＣＤＲ領域、通常全３つのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。幾つかの他のポリヌクレオチドは、表１に記載されるＰＤＬ１−結合抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列の全部又は実質的に全部をコードする。コードの縮重のため、様々な核酸配列が各イムノグロブリンアミノ酸配列をコードする。
【０１９３】
ポリヌクレオチド配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成により、又はＰＤＬ１−結合抗体をコードする既存の配列（例えば下記の実施例にて説明される配列）のＰＣＲ変異導入により調製できる。核酸の直接の化学合成は、公知技術の方法（例えばホスホトリエステル法（Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０）、ホスホジエステル法（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９，１９７９）、ジエチルホスホロアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９，１９８１）、及び固相法（米国特許第４，４５８，０６６号明細書））により実施できる。例えばＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異導入は、例えばＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（Ｅｄ．），Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，１９９２、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ，１９９０、Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：９６７，１９９１及びＥｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７，１９９１に記載されるように行うことができる。
【０１９４】
本発明ではまた、上記のＰＤＬ１−結合抗体を産生するための発現ベクター及び宿主細胞が提供される。
【０１９５】
用語「ベクター」とは、それが連結された他のポリヌクレオチドを輸送できるポリヌクレオチド分子を指すことを目的とする。ベクターの一種として「プラスミド」が挙げられ、それは更なるＤＮＡ断片をライゲートしうる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。他のタイプのベクターはウイルスベクターであり、更なるＤＮＡ断片をウイルスのゲノムにライゲートしうるものである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自律的増殖が可能である（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソームの哺乳動物ベクター）を、宿主細胞に導入し、宿主細胞のゲノムに組み込ませ、それにより宿主ゲノムとともに複製させることができる。
【０１９６】
更に、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書において「組換え型発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形を採る。本明細書においては、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが殆ど一般的に用いられるベクターの形態であるため、交換可能に用いられる。しかしながら、本発明では、発現ベクターには他の形態のもの（例えばウイルスベクター（例えば複製能を欠くレトロウイルス、アデノウィルス及びアデノ関連ウィルス）が含まれるものとし、またそれらは同等の機能を果たすものである。
【０１９７】
用語「可動可能に連結される」とは、２以上のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）セグメントの機能性関連性のことを指す。典型的には、それは転写制御配列の転写される配列への機能性関連性のことを指す。例えば、プロモータ又はエンハンサー配列については、それらが適切な宿主細胞又は他の発現系においてコーディング配列の転写を刺激又は調節する場合、コーディング配列に作動可能な状態で連結されている。一般に、転写される配列に作動可能な状態で連結されるプロモータ転写制御配列は、転写される配列に物理的に隣接、すなわちそれらはシスに作用している。しかしながら、幾つかの転写制御配列（例えばエンハンサー）については、それらが転写を強化しようとするコーディング配列に物理的に接近又は隣接する必要がない。
【０１９８】
ＰＤＬ１−結合抗体鎖又は結合断片をコードするポリヌクレオチドを発現させるために、各種の発現ベクターを使用できる。ウイルスベースの及び非ウイルス性の発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞において抗体を産生させるために使用できる。非ウイルス性のベクター及び系としては、プラスミド、典型的にタンパク質又はＲＮＡを発現させるための発現カセットを有するエピソームベクター、及びヒト人工染色体（例えばＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５，１９９７）を参照。例えば哺乳動物（例えばヒト）細胞におけるＰＤＬ１−結合ポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現のために有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、Ｂ及びＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、Ｂ及びＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア）、ＭＰＳ  Ｖベクター、及び本技術分野で公知の他のタンパク質発現用の様々なベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０ベースのベクター、乳頭腫ウイルス、ＨＢＰイプシュタインバーウィルス、ワクシニアウイルスベクター及びＳｅｍｌｉｋｉフォレストウイルス（ＳＦＶ）ベースのベクターが挙げられる。Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７，１９９５及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３，１９９２を参照。
【０１９９】
発現ベクターの選択は、ベクターを発現させようとする宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、ＰＤＬ１−結合抗体をコードするポリヌクレオチドに作動可能な状態で連結されるプロモータ及び他の制御配列（例えばエンハンサー）を含む。一実施形態では、誘導性プロモータを用いることで、誘導条件以外の条件では挿入した配列の発現が防止される。誘導性プロモータとしては、例えばアラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモータ又はヒートショックプロモーターが挙げられる。非誘導条件下で形質転換された生物の培養を行うことで、産生物の発現が宿主細胞にとり許容される程度となるため、コーディング配列を有する集団を偏らせることなく増殖させることができる。プロモータに加え、他の制御エレメントが、ＰＤＬ１−結合抗体の効率的な発現のために必要とされ、又は望ましくなる場合もある。これらのエレメントとしては、典型的にはＡＴＧ開始コドン及び隣接するリボソーム結合部位又は他の配列が挙げられる。加えて、使用する細胞系に適するエンハンサー（例えばＳｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５，１９９４及びＢｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６，１９８７を参照）により発現効率を増強してもよい。例えばＳＶ４０エンハンサー又はＣＭＶエンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増強させてもよい。
【０２００】
発現ベクターには、分泌シグナル配列を配置して、挿入されたＰＤＬ１−結合抗体配列によりコードされるポリペプチドを融合タンパク質として発現させてもよい。多くの場合、挿入されたＰＤＬ１−結合抗体配列は、ベクターに挿入する前に、シグナル配列に連結される。また、ＰＤＬ１−結合抗体の軽鎖及び重鎖可変領域ドメインをコードする配列を受容するために用いるベクターは、場合によっては定常領域又はその部分をもコードする。かかるベクターにより、定常領域との融合タンパク質として可変領域の発現がなされ、それにより完全な抗体及びその抗原結合性断片の生成がもたらされる。典型的には、かかる定常領域はヒト由来である。
【０２０１】
「組換え宿主細胞」又は単に「宿主細胞」という用語は、組換え発現ベクターを導入された細胞を意味する。かかる用語は、特定の細胞のみならず、かかる細胞の子孫のことも指すことを理解すべきである。かかる子孫は、変異又は周囲条件による影響のため、特定の修飾が次第になされうることから、実際上は、親細胞と同一でなくてもよいが、但し「宿主細胞」という本明細書で用いられる用語の範囲内には含まれるものとする。
【０２０２】
ＰＤＬ１−結合抗体鎖を収容し発現するための宿主細胞は、原核生物であってもよく、又は真核生物であってもよい。大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドのクローニング及び発現に有用な原核生物の宿主の１つである。使用に適する他の微生物宿主としては、バチルス属細菌（例えば枯草菌）及び他の腸内細菌（例えばサルモネラ属菌、セラチア属菌及び各種のシュードモナス属種）が挙げられる。これらの原核生物の宿主において、発現ベクターを構築することもでき、それは宿主細胞と適合性を有する発現調節配列（例えば複製開始点）を典型的に含む。更に、ラクトースプロモータ系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系、βラクタマーゼプロモータ系又はλファージ由来のプロモータ系などの、様々な公知のプロモータが挙げられる。これらのプロモータは、典型的には、必要に応じてオペレーター配列と共に発現を制御し、またリボソーム結合部位配列などを有することにより転写及び翻訳を開始し、そして終了させる。また、他の微生物（例えば酵母）を用いて、本発明のＰＤＬ１−結合ポリペプチドを発現させることもできる。バキュロウイルスベクターとの組み合わせで昆虫細胞を用いることもできる。
【０２０３】
一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−結合ポリペプチドを発現及び製造するために、哺乳動物宿主細胞が用いられる。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞系であってもよく、又は外因性発現ベクターを担持する哺乳動物細胞系であってもよい。これらは、あらゆる通常の致命的な又は通常の又は異常な不死化した動物若しくはヒト細胞をも包含する。例えばＣＨＯ細胞、各種のＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換されたＢ細胞及びハイブリドーマなど、完全なイムノグロブリンを分泌できる多くの適切な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチドを発現する哺乳動物の組織細胞培養系の使用については、その概要が、例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，ＦＲＯＭ  ＧＥＮＥＳ  ＴＯ  ＣＬＯＮＥＳ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．Ｎ．Ｙ．１９８７で述べられている。哺乳動物宿主細胞様の発現ベクターは、発現調節配列、例えば複製開始点、プロモータ及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９−６８，１９８６）、及び必要となるプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネーター配列を含むことができる。これらの発現ベクターは通常、哺乳動物の遺伝子に由来する、又は哺乳動物のウイルスに由来するプロモータを含む。適切なプロモータは、構成的、細胞特異的、段階特異的、及び／又は、調節可能若しくは制御可能なプロモータである。有用なプロモータとしては、従来技術において公知のメタロチオネインプロモータ、構成的アデノウィルス主要後期プロモータ、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモータ、構成的ＭＰＳ  Ｖプロモータ、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモータ（例えばヒト初期ＣＭＶプロモータ）、構成的ＣＭＶプロモータ及びプロモータ−エンハンサーの組み合わせ、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する方法は、細胞の宿主のタイプに応じて異なる。例えば塩化カルシウムトランスフェクションは原核細胞に一般に用いられるが、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションは他の宿主細胞に用いられうる。（概要については上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照）。他の方法としては、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソームによる形質転換、インジェクション及びマイクロインジェクション、バリスティック、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅｓ）、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合（Ｅｌｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：２２３，１９９７）、薬剤によるＤＮＡの取り込み増強、及びエクスビボトランスダクションが挙げられる。組換えタンパク質の長期的、高収率での産生のために、安定な発現が通常要求される。例えば、ウイルス複製開始点又は内因性発現エレメント、及び選抜可能なマーカー遺伝子を含む本発明発現ベクターを用いて、ＰＤＬ１−結合抗体鎖又は結合断片を安定的に発現する細胞系を調製することができる。ベクターの導入後、それらを選抜培地に切り替える前に、細胞をリッチな培地で１〜２日間増殖させてもよい。選抜可能マーカーを用いる目的は、選抜に対する耐性を付与することであり、その存在により、導入された配列を好適に発現する細胞は、選抜培地において増殖することができる。耐性を有する、安定にトランスフェクションされた細胞は、細胞のタイプに適する組織培養技術を用いて増殖させることができる。したがって、本発明は、本発明の抗体を産生する方法を提供するものであり、前記方法は、本発明の抗体をコードする核酸又はベクターを含む宿主細胞を培養する、特に発現させるステップを含み、それにより、本発明の前記抗体又はその断片が発現される。
【０２０５】
更なる態様では、本発明は、本発明の抗体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。薬学的に許容される担体は、組成物を強化し又は安定させ、又は組成物の調製を容易にする。薬学的に許容される担体には、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌及び抗かび剤、等張剤及び吸収遅延剤及び生理的適合性を有するその他の媒体が挙げられる。
【０２０６】
本発明の医薬組成物は、周知の各種の方法により投与することができる。投与の経路又は方法は、所望する効果により変化する。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下、又は標的の部位の近傍に投与することができる。薬学的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば注入又は灌注）に適していなければならない。投与の経路に応じて、活性化合物（すなわち抗体及び多重特異性分子）は、化合物を酸の作用から、及び化合物の不活性化をもたらしうる他の天然条件から保護する材料でコーティングされてもよい。
【０２０７】
本発明の医薬組成物は、公知の、従来技術においてルーチン的に実施される方法に従い調製できる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，２０ｔｈ  ｅｄ．，２０００及びＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照。医薬組成物は、好ましくはＧＭＰ条件下で製造される。典型的には、ＰＤＬ１−結合抗体の治療的有効量又は有効量を、本発明の医薬組成物において使用する。ＰＤＬ１−結合抗体は、当業者に公知の従来法により、薬学的に許容される投与形態で調製される。投与計画は、最適な所望の応答（例えば治療応答）を提供するよう調整される。例えば単回ボーラスを投与してもよく、幾つかに分割して一定時間おきに投与してもよく、又は治療的状況の緊急性に応じて用量を漸減若しくは漸増させてもよい。投与を容易にし、かつ用量を均一化する上では、該成分を単位投与形態に組成することが特に有用である。本明細書中で用いられる「単位投与形態」とは、治療しようとする被験者のための投与単位として適宜調整した、物理的に別々の単位のことを指し、各単位は、必要な医薬用担体との関連で所望の治療効果を生じさせるために算出された活性化合物を所定量で含む。
【０２０８】
本発明の医薬組成物における活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性を発揮させずに、特定の患者において所望の治療応答を達成するのに効果的である量の活性成分、組成及び投与方法となるよう、変化させることができる。選択される投与量レベルは、様々な薬物動態的要因に依存し、例えば使用される本発明の特定の組成物又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与の時期、投与経路、使用する特定の化合物の排出速度、処置期間、使用する特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬剤、化合物及び／又は材料、年齢、性別、体重、症状、一般的な健康状態、治療される患者の過去の診療履歴、及びその他の要因等に依存する。
【０２０９】
抗体は通常、複数回に投与される。単回投与の間隔は、週ごと、月ごと又は年ごとでありえる。患者のＰＤＬ１−結合抗体の血中濃度の測定結果により、投与間隔が不規則となる場合もある。あるいは、抗体を持続的放出製剤として投与することもでき、その場合には、投与を頻繁に行う必要がない。投与の量及び頻度は、患者における抗体の半減期により変化する。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体及びヒト以外の抗体のそれより長い半減期を示す。投与量及び投与頻度は、処置が予防的か又は治療的かに依存し変化しうる。予防的な投与では、比較的低い投与量を、長期間にわたり、比較的少ない間隔で投与される。患者によっては、余生の間処置を受け続けることもある。治療的な投与では、疾患の進行が減速又は終了するまで、好ましくは患者が疾患の兆候の部分的な又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い投与量を必要とする場合がある。その後、患者は予防的レジメンでの投与を受けることができる。
【０２１０】
本発明の抗体は、インビトロ及びインビボでの診断及び治療へのユーティリティを有する。例えば、これらの分子は、様々な障害の治療、予防又は診断のために、例えばインビトロ又はインビボで培養細胞中に、又は、インビボで被験者に、投与することができる。
【０２１１】
一態様では、本発明は、薬剤として使用するための、本発明の抗体又は本発明の組成物に関する。
【０２１２】
一態様では、本発明は、増殖性障害、特に癌の治療を必要とする被験者の該治療において使用するための、本発明の抗体又は本発明の組成物に関する。
【０２１３】
他の態様では、本発明は、増殖性障害、特に癌の治療を必要とする被験者の該治療のための、本発明の抗体又は本発明の組成物の使用に関する。
【０２１４】
更なる態様では、本発明は、増殖性障害、特に癌の治療を必要とする被験者の該治療用の薬剤の製造における、本発明の抗体又は本発明の組成物の使用に関する。
【０２１５】
一態様では、本発明は、増殖性障害、特に癌の治療を必要とする被験者に対し、治療的有効量の本発明の抗体又は本発明の組成物を投与することを含む、該被験者の治療方法を提供する。
【０２１６】
用語「被験者」とは、ヒト及びヒト以外の動物を包含する。ヒト以外の動物としては、例えば全ての脊椎動物である哺乳動物及び非哺乳動物（例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、犬、ウシ、ニワトリ、両生類及び爬虫類）が挙げられる。特に断りのない限り、用語「患者」又は「被験者」は本願明細書において交換可能に用いられる。
【０２１７】
本明細書で用いられる用語「治療」、「治療すること」、「治療する」、「処理された」等は、所望の薬理学的及び／又は生理的効果を得ることを指す。該効果は、疾患及び／又は疾患に起因する悪影響を部分的又は完全に治癒する意味において治療的であってもよく、又は疾患進行を遅延させる意味において治療的であってもよい。本明細書で用いられる「治療」とは、哺乳動物の（例えばヒトの）疾患のあらゆる処置をも包含するものであり、例えば：（ａ）疾患を阻害し、すなわちその進行を抑制すること、及び（ｂ）疾患を緩和させ、すなわち疾患の後退を生じさせること、が包含される。
【０２１８】
「治療的有効量」又は「有効量」という用語は、疾患の治療対象となる哺乳動物又はその他に投与されるときに、疾患のかかる処置を遂行するのに十分である薬剤の量のことを指す。「治療上有効量」は、薬剤、治療される被験体の疾患及びその重症度、並びに年齢、体重などに応じて変化する。
【０２１９】
一実施形態では、増殖疾患は癌である。用語「癌」は、迷走細胞の迅速な抑制できない増殖を特徴とする疾患を意味する。癌細胞は、局所的に、又は血流及びリンパ系を通じて身体の他の部分まで拡散することがある。各種の癌の例を以下のとおり本願明細書に記載するが、これらに限定されない：乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌等。「腫瘍」及び「癌」の用語は本願明細書においては交換可能に用いられ、例えば両用語は、固形腫瘍、及び例えば拡散若しくは循環する液性の腫瘍を包含する。本明細書において、用語「癌」又は「腫瘍」は、前癌、ならびに悪性癌及び腫瘍を包含する。用語「癌」は、本願明細書においては、腫瘍の広域性を意味するものとして用いられ、全ての固形及び血液学的な悪性病変が包含される。かかる腫瘍の例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性の又は特に悪性の腫瘍、固形腫瘍、脳癌、腎臓癌、肝癌、副腎癌、膀胱癌、乳癌、胃癌（例えば胃腫瘍）、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、大腸癌、直腸癌、前立腺癌、膵癌、肺癌（例えば非小細胞肺癌及び小細胞肺癌）、膣癌、甲状腺癌、黒色腫（例えば除去不能な又は転移性黒色腫）、腎細胞癌、肉腫、グリア芽細胞腫、多発性骨髄腫、又は胃腸癌、特に大腸癌若しくは結腸直腸アデノーマ、頭頸部腫瘍、子宮内膜癌、カウデン症候群、レルミット−デュクロ疾患、Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｚｏｎａｎａ症候群、前立腺の肥厚、腫瘍形成、特に上皮、好ましくは乳房癌又は扁平上皮癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病（例えばフィラデルフィア染色体陽性慢性骨髄性白血病）、急性リンパ性白血病（例えばフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病）、非ホジキンリンパ腫、形質細胞性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、白血病及びそれらの組み合わせ。好ましい実施態様においては、癌は、肺癌、好ましくは非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。他の実施形態では、前記癌は結腸直腸癌である。
【０２２０】
本発明の抗体又は本発明の組成物は、固形腫瘍の増殖を阻害するが、また液腫瘍をも阻害する。更に別の実施形態では、増殖疾性患は固形腫瘍である。用語「固形腫瘍」とは、特に乳癌、卵巣癌、大腸癌、直腸癌、前立腺癌、胃腸癌（特に胃癌）、子宮頸癌、肺癌（例えば非小細胞肺癌及び小細胞肺癌）、及び頭頸部の腫瘍を意味する。更に、腫瘍タイプ及び用いる特定の組み合わせに応じて、腫瘍体積を減少させることが可能となる。本発明の抗体又は本発明の組成物は、腫瘍の転移の予防、並びに癌を有する被験者の微小転移巣の増殖又は成長の予防にも適する。
【０２２１】
用語「予防する」又は「予防」とは、疾患の進行又は疾患のいかなる二次的影響の完全な抑制のことを指す。本明細書で用いられる用語「予防する」又は「予防」とは、疾患に罹患する素因を有するとは診断されたが、疾患に罹患しているとは診断されていない個人において、疾患又は症状が発症することを予防することを包含する。
【０２２２】
一態様では、本発明は、本発明の抗体又は本発明の医薬組成物を含むキットに関する。該キットは、以下のような１つ以上の他の内容物を含みうる：取扱説明書、他の試薬（例えば、ラベル、治療薬又はラベル又は治療薬に対して抗体をキレート化若しくはその他カップリングするのに有用な薬剤、又は放射線防護組成物）、投与用の抗体分子を調製するための装置又はその他の材料、薬学的に許容される担体、並びに被験者に対する投与のための装置又はその他の材料。特定の実施形態では、該キットは、薬学的に有効量の本発明の抗体を含む。更に別の実施形態では、該キットは、薬学的に有効量の凍結乾燥された本発明の抗体、及び希釈剤、及び任意の取扱説明書を含む。前記キットは更に、再調製のためのフィルタニードル及び注入用のニードルを含んでもよい。
【０２２３】
【表１】
2021501569.tif 000003
【０２２４】
【表２】
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【０２２５】
【表３】
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【０２２６】
【表４】
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【０２２７】
【表５】
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【０２２８】
【表６】
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【０２２９】
【表７】
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【０２３０】
【表８】
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【０２３１】
【表９】
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【０２３２】
【表１０】
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【０２３３】
【表１１】
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【０２３４】
【表１２】
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【０２３５】
【表１３】
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【０２３６】
【表１４】
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【０２３７】
【表１５】
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【０２３８】
【表１６】
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【０２３９】
本願の書類全体にわたり、明細書（例えば表１〜３）の記載と配列表との間の相違が存在する場合もあるが、かかる場合は明細書の記載が正文であるものとする。
【０２４０】
明確化のため、本発明の特定の特徴を別々の実施形態の文脈において記載しているが、１つの実施形態中にそれらを組み合わせてもよいことは自明である。逆に、１つの実施例の説明中に記載される本発明の様々な形態を、簡潔さのため、それらを分割し、また適切なサブコンビネーションとして適用してもよい。本発明に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本発明に具体的に包含され、またあたかもあらゆる組み合わせが個々に及び明確に開示されるかのように、本願明細書において開示されるものとする。加えて、各種の実施形態及びその構成要素の全てのサブコンビネーションも、本発明に具体的に包含され、またあたかもかかるあらゆるサブコンビネーションも、本願明細書において個々に及び明確に開示されるかのように、本願明細書において開示されるものとする。
【０２４１】
本発明は、本願明細書において記載される特定の実施形態によりその範囲を限定されるものではない。実際、本願明細書において記載される以外の本発明の各種の変更は、前述の説明から当業者にとり明らかである。かかる変更は、添付の特許請求の範囲に含まれるものである。
【０２４２】
各国の特許法が許容する限りにおいて、本願明細書において引用される全ての特許、特許出願、刊行物、試験方法、文献及びその他の材料は、参照により本願明細書に組込まれる。
【０２４３】
以下の実施例では、上記の本発明を例示するが、いかなる形であれ、本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。本関連技術分野の当業者に公知の他の試験モデルを用いて、特許請求された本発明の有用性を確認することもできる。
【実施例】
【０２４４】
ヒトＰＤＬ１に対する新規な抗体：
実施例１：ヒトＰＤＬ１に対するウサギ抗体の生成：
【０２４５】
リコンビナント的に産生させ、精製されたヒトＰＤＬ１細胞外ドメインによりウサギを免疫した。免疫処理中に、抗原に対する最大希釈（力価）を測定することにより、未だポリクローナル血清抗体の検出可能な結合を生じさせる各ウサギの血清中の、抗原に対する体液免疫応答の強度を質的に評価した。固定化抗原（組換えヒトＰＤＬ１細胞外ドメイン）に対する血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡ）を用いて評価した。免疫した全てのウサギは、血清の少なくとも１：２．６４×１０６の希釈において非常に高い力価を示した。最初の抗原注入前の同じウサギから得た血清を、バックグラウンドコントロールとして用いた。
【０２４６】
実施例２：Ｈｉｔによる同定及び選抜：
Ｈｉｔ同定手順の際、高親和性ｈＰＤＬ１結合Ｂ細胞を特異的に検出及び単離することを可能にする、フローサイトメトリーベースのソーティング手順を開発した。ｈＰＤＬ１結合Ｂ細胞を同定するため、ｈＰＤＬ１  ＥＣＤを、蛍光色素Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）により標識した。標識ＰＤＬ１上のＰＤ−１結合部位並びに抗ＰＤＬ１中和抗体の結合部位は、嵩高いＲ−ＰＥ標識により潜在的にブロックされるため、エピトープのアクセス性をフローサイトメトリーにより確認することができた。ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分又はアベルマブに融合するＰＤ−１細胞外ドメインをプロテインＧビーズに捕捉し、Ｒ−ＰＥ標識したＰＤＬ１の結合をフローサイトメトリーにより確認した。蛍光強度は、ビーズに固定された受容体と結合する標識ＰＤＬ１の量に対する比例関係を示していた。ＰＤ−１及び中和抗体に対するＰＤＬ１の結合が確認された一方、抗ＰＤＬ１抗体に対する無関係なサイトカインの結合は検出されなかった。
【０２４７】
スクリーニング：
ハイスループットな培養スケールでは、個々のウサギ抗体の精製が困難であることから、スクリーニングフェーズの間に得られた結果は、抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の培養液上清からの非精製抗体により行われるアッセイに基づくものであった。かかる上清は、大規模な数の各々の抗体どうしのランク付けは可能であるが、結合能以外の絶対的な数値は得られない。４週間以上にわたり、あらゆる個々に培養されたクローンから得た上清を回収した。培養期間の終わりに、各細胞培養上清中のウサギモノクローナル抗体を用い、組換えヒトＰＤＬ１細胞外ドメインへの結合についてのハイスループットＥＬＩＳＡにおいて特徴解析を行った。ＰＤＬ１−結合上清を用い、ヒト及びカニクイザルＰＤＬ１に対する結合動態について、更に特徴解析を行った。加えて、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の中和可能性を、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイ、並びに競合ＥＬＩＳＡにより測定した。また、ＰＤＬ１／Ｂ７−１相互作用の中和について、競合ＥＬＩＳＡにより評価した。結合動態を除いて、ハイスループットスクリーニングの報告値は「有」又は「無」の結果として解釈するものとし、それは単回測定（用量反応でない）に基づくものとした。上清のマウスＰＤＬ１結合可能性は、直接ＥＬＩＳＡにより分析し、結合動態は、陽性の上清のみについて測定した。
【０２４８】
ｈＰＤＬ１結合についての直接ＥＬＩＳＡ：
ＥＬＩＳＡプレートに、５００ｎｇ／ｍｌのＰＤＬ１を含むＰＢＳ  ５０μｌを添加し、４℃で一晩被覆した。翌日、ウェルあたり４５０μｌの洗浄バッファ（ＰＢＳ、０．００５％のＴｗｅｅｎ  ２０）によりオーバフローモードでプレートを３回洗浄し、ウェル当たり３００μｌのブロッキングバッファ（ＰＢＳ、１％のＢＳＡ、０．２％のＴｗｅｅｎ  ２０）を添加し、旋回（ｎｕｔａｔｉｎｇ）ミキサー上で室温で１時間処理した。次に、４５０μｌ洗浄バッファによりオーバフローモードでプレートを３回洗浄し、５０μｌの各上清を添加し、プレートを穏やかに振動しながら室温で１．５時間インキュベートした。４５０μｌの洗浄バッファによりオーバフローモードで３回洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲートされたヤギ及びウサギＩｇＧ抗体５０μｌを各ウェルに添加した。回転ミキサー上で室温で１時間インキュベートした後、ウェル当たり４５０μｌの洗浄バッファによりプレートを洗浄し、次に５０μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＫＰＬ、カタログ番号５３−００−００）を添加した。５〜１０分間発色させた後、ウェルあたり５０μｌの１ＭのＨＣｌの添加により酵素反応を停止させ、６９０ｎｍを基準波長として用いてプレートを４５０ｎｍで測定した。
【０２４９】
ＳＰＲによる、ｈＰＤＬ１に対する親和性：
ＭＡＳＳ−１  ＳＰＲ機器（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、ヒトＰＤＬ１に対する抗体の結合親和性を測定した。親和性スクリーニングにおいて、標準的なアミンカップリング手順を用いて、センサーチップ（ＳＰＲ−２アフィニティーセンサー、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ａｍｉｎｅ、Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社）に、ウサギＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カタログ番号Ａ１２０−１１１Ａ）のＦｃ領域に特異的な抗体を固定化した。Ｂ細胞上清中のウサギモノクローナル抗体を、固定化した抗ウサギＩｇＧ抗体により捕捉した。Ｂ細胞上清中の最小のＩｇＧ濃度は、充分な捕捉を行わせるために必要である。モノクローナル抗体を捕捉した後、ヒトＰＤＬ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を９０ｎＭの濃度でフローセルに３分間にわたり注入し、センサーチップに捕捉されたＩｇＧからのタンパク質の分離を５分間にわたり行わせた。各注入サイクルの後、表面を１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌを２回注入して再生した。見かけの分離（ｋｄ）及び会合（ｋａ）定数、並びに見かけの分離平衡定数（ＫＤ）は、１対１のラングミュア結合モデルを用い、ＭＡＳＳ−１分析ソフトウェア（Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社）により算出し、Ｃｈｉ２の相対値（外挿された検体の最大結合レベルで正規化したＣｈｉ２）に基づき、フィットの品質をモニターし、それをカーブフィッティングの品質保持のための指標とした。Ｃｈｉ２の該値が小さいとき、１対１のラングミュア結合モデルに対するフィッティングの正確性が高いことを意味する。ほとんどのＨｉｔｓでは、Ｃｈｉ２の相対値は１０％以下であった。リガンド結合における反応単位（ＲＵ）が、抗体捕捉のＲＵの２％以上である場合、結果は有効であると判断した。抗体捕捉のＲＵに対し２％未満のリガンド結合のＲＵを示すサンプルは、捕捉された抗体へのＰＤＬ１の特異的な結合がないことを示すものと考えられた。
【０２５０】
ＰＤＬ１／ＰＤ−１ブロッキングＥＬＩＳＡ：
２μｇ／ｍｌのＰＤ−１を含む５０μｌのＰＢＳを添加し、ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩被覆した。翌日、ウェルあたり４５０μｌの洗浄バッファによりオーバフローモードでプレートを３回洗浄し、ウェル当たり３００μｌのブロッキングバッファを添加し、旋回ミキサー上で室温で１時間処理した。次に、ＰＤＬ１を、２５０ｎｇ／ｍｌの所望の最終濃度より２０倍高い濃度で、ブロッキングバッファで希釈した。アッセイ感度を更に調整し、幾つかのクローンを、４０ｎｇ／ｍｌのＰＤＬ１の存在下において解析した。次に、非結合型のプレート中で１１４μｌの各上清を、６μｌのＰＤＬ１を含むブロッキングバッファで希釈し、プレートを回転ミキサー上で室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをウェルあたり４５０μｌの洗浄バッファによりオーバフローモードで３回洗浄し、５０μｌの各希釈液をＥＬＩＳＡプレートに添加した。プレートを穏やかに振とうしながら室温で１．５時間インキュベートした。ウェル当たり４５０μｌの洗浄バッファにより３回洗浄した後、５０μｌの１０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ポリＨＲＰ４０をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを４５０μｌの洗浄バッファで３回洗浄し、５０μｌのＴＭＢを添加した後、５〜１０分の間発色させた。最後に、５０μｌの１Ｍ  ＨＣｌを添加して酵素反応を停止させ、基準波長として６９０ｎｍを用いてプレートを４５０ｎｍで測定した。
【０２５１】
ＰＤＬ１／Ｂ７−１ブロッキングＥＬＩＳＡ：
４μｇ／ｍｌのＢ７−１を含む５０μｌのＰＢＳを添加し、ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩被覆した。翌日、ウェルあたり４５０μｌの洗浄バッファによりオーバフローモードでプレートを３回洗浄し、ウェル当たり３００μｌのブロッキングバッファを添加し、旋回ミキサー上で室温で１時間処理した。次に、ＰＤＬ１を、５００ｎｇ／ｍｌの所望の最終濃度より２０倍高い濃度で、ブロッキングバッファで希釈した。次に、非結合型のプレート中で１１４μｌの各上清を、６μｌのＰＤＬ１を含むブロッキングバッファで希釈し、プレートを回転ミキサー上で室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをウェルあたり４５０μｌの洗浄バッファによりオーバフローモードで３回洗浄し、５０μｌの各希釈液をＥＬＩＳＡプレートに添加した。プレートを穏やかに振とうしながら室温で１．５時間インキュベートした。ウェル当たり４５０μｌの洗浄バッファにより３回洗浄した後、５０μｌの１０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ポリＨＲＰ４０をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを４５０μｌの洗浄バッファで３回洗浄し、５０μｌのＴＭＢを添加した後、５〜１０分の間発色させた。最後に、５０μｌの１Ｍ  ＨＣｌを添加して酵素反応を停止させ、基準波長として６９０ｎｍを用いてプレートを４５０ｎｍで測定した。
【０２５２】
細胞ベースのアッセイ（レポーター遺伝子）におけるＰＤＬ１／ＰＤ−１のブロッキング：
更にＨｉｔｓを解析するため、両方の相互作用分子を細胞表面に発現されたときのＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用を中和するそれらの能力を、ＣＨＯ／ＰＤＬ１／ＴＣＲ活性化因子及びＪｕｒｋａｔ／ＰＤ−１細胞を用いて試験した。細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％のＦＣＳ）１００μｌ中の３５，０００個のＣＨＯ／ＰＤＬ１／ＴＣＲ活性化細胞を、白色の培養プレートの内側ウェルに添加し、３７℃及び５％ＣＯ２で１６〜２０時間インキュベートした。翌日、９５μｌの細胞培養培地を各ウェルから除去し、５０μｌのスクリーニングされたＢ細胞の上清、又は最大シグナルの０％、５０％及び１００％を生じさせるとして測定された濃度の陽性コントロールであるアベルマブを添加し、プレートを３０分間３７℃でインキュベートした。次に、アッセイバッファ（１０％のＦＣＳを有するＲＰＭＩ１６４０）で４００，０００細胞／ｍｌに希釈したエフェクターＪｕｒｋａｔ細胞を、各ウェルに５０μｌで添加し、プレートを３７℃及び５％のＣＯ２で６時間インキュベートした。最後に、製造業者のプロトコルに従い調製したルシフェラーゼ基質（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、ウェル当たり５０μＬで添加し、プレートを暗所で３０分間インキュベートし、発光をＴｏｐｃｏｕｎｔを用いて測定した。
【０２５３】
ＳＰＲによる種特異性：ｃｙｎｏ及びマウス
また、ヒトＰＤＬ１への結合について記載したのと同様のＳＰＲセットアップを用いて、カニクイザル及びマウスのＰＤＬ１に対する結合動態を測定したが、その際、ヒトＰＤＬ１を、それぞれカニクイザル又はマウスＰＤＬ１で置き換えた。
【０２５４】
スクリーニングＨｉｔｓの選抜：
Ｂ細胞上清における最終的なクローンのモノクローナル抗体の薬理学的特性を表４に示す。
【０２５５】
実施例３：Ｈｉｔの確認：
クローニング及び産生：
Ｈｉｔの確認のために選抜されたクローンの同定に続き、これらのウサギ抗体をクローニング、発現及び精製し、更なる特徴解析に供した。対応する軽鎖及び重鎖可変ドメインのクローニングでは、適切な哺乳動物発現ベクターにＤＮＡ断片のインビトロライゲーションを行った。ウサギＩｇＧの軽鎖及び重鎖の不変領域のコンセンサス配列を含むこれらの発現ベクターを同時発現させ、それらを会合させ、完全に機能的なウサギモノクローナルＩｇＧを分泌させた。ベクター構築後、得られた構築物の配列を再度確認し、プラスミドＤＮＡを増幅及び精製し、哺乳動物細胞へのトランスフェクションに供した。
【０２５６】
ウサギ抗体重鎖及び軽鎖のための発現ベクターを、脂質ベースのトランスフェクション試薬によりトランジェントな異種発現用の哺乳動物の浮遊細胞系にトランスフェクションした。分泌されるモノクローナルＩｇＧの発現レベルを高めるため、重鎖及び軽鎖ベクターの比などの条件を最適化した。発現用培養細胞を振とう培養装置で７日間培養した。異種発現期間の終わりに、細胞培養上清を遠心分離により回収した。次に、分泌されたウサギＩｇＧを、プロテインＡビーズによりアフィニティ精製した。ＩｇＧロードしたビーズを洗浄し、精製された抗体をｐＨのシフトにより溶出させた。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、２８０ｎｍでの紫外線吸収、及びサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を用い、溶出分画の同一性、含量及び純度を解析した。表５は、ｒＩｇＧの製造及び特徴解析をまとめたものである。
【０２５７】
【表１７】
2021501569.tif 000019
【０２５８】
【表１８】
2021501569.tif 000020
【０２５９】
ＳＰＲによる、ｈＰＤＬ１に対する親和性：
ＭＡＳＳ−１  ＳＰＲ装置（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社）を用い、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、ヒトＰＤＬ１に対する精製されたモノクローナルウサギ抗体の結合動態を測定した。抗体のほとんどが非常に遅いｏｆｆ速度を示したため、高塩濃度を含むバッファ中で３７℃で実験を実施し、抗体の違いによる結合親和性の違いを明瞭にした。標準的なアミンカップリング手順を用いて、センサーチップ（ＳＰＲ−２アフィニティーセンサー、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ａｍｉｎｅ、Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社）に、ウサギＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カタログ番号Ａ１２０−１１１Ａ）のＦｃ領域に特異的な抗体を固定化した。ウサギモノクローナル抗体を、固定化抗ウサギＩｇＧ抗体により捕捉した。モノクローナル抗体を捕捉した後、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１５０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳバッファで、９０〜０．３５ｎＭの範囲で二倍段階希釈したＰＤＬ１を試験に用い、バイオセンサーチップに捕捉されるＩｇＧへの結合、及びセンサーチップに捕捉されるＩｇＧからのタンパク質の分離の試験を、５分間にわたり行った。各注入サイクルの後、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌを２回注入して表面を再生した。見かけの分離（ｋｄ）及び会合（ｋａ）定数、並びに見かけの分離平衡定数（ＫＤ）は、１対１のラングミュア結合モデルを用い、ＭＡＳＳ−１分析ソフトウェア（Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社）により算出し、Ｃｈｉ２の相対値（外挿された検体の最大結合レベルで正規化したＣｈｉ２）に基づき、フィットの品質をモニターし、それをカーブフィッティングの品質保持のための指標とした。Ｃｈｉ２の該値が小さいとき、１対１のラングミュア結合モデルに対するフィッティングの正確性が高いことを意味する。ほとんどのＨｉｔｓは、Ｃｈｉ２の相対値は１０％以下であった。表６は、更なる開発のために選抜されたウサギＩｇＧ抗体を示す。
【０２６０】
【表１９】
2021501569.tif 000021
【０２６１】
ＰＤＬ１／ＰＤ−１ブロッキングＥＬＩＳＡにおける力価：
ＰＤ−１へのＰＤＬ１の結合を中和する力価を、競合ＥＬＩＳＡにおいて評価した。ＥＬＩＳＡプレートに、４μｇ／ｍｌのＰＤ−１を含むＰＢＳ  ５０μｌを添加し、４℃で一晩被覆した。翌日、ウェルあたり４５０μｌの洗浄バッファ（ＰＢＳ、０．００５％のＴｗｅｅｎ  ２０）によりオーバフローモードでプレートを３回洗浄し、ウェル当たり３００μｌのブロッキングバッファ（ＰＢＳ、１％のＢＳＡ、０．２％のＴｗｅｅｎ  ２０）を添加し、旋回（ｎｕｔａｔｉｎｇ）ミキサー上で室温で１時間処理した。次に、ブロッキングバッファでＰＤＬ１を、１ｎｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。次に、非結合型のプレート中で、試験するｒＩｇＧを３００〜０．００５ｎｇ／ｍｌの範囲のＰＤＬ１の系列希釈を含むバッファ１２０μｌをウェル毎に調製し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを４５０μｌの洗浄バッファによりオーバフローモードで３回洗浄し、５０μｌの各希釈液をＥＬＩＳＡプレートの隣接するウェルに添加し、反復サンプルとした。プレートを穏やかに振とうしながら室温で９０分間インキュベートした。４５０μｌの洗浄バッファにより３回洗浄した後、５０μｌの１０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ポリＨＲＰ４０をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを４５０μｌの洗浄バッファで３回洗浄し、５０μｌのＴＭＢを添加した後、５〜１０分の間発色させた。最後に、５０μｌの１Ｍ  ＨＣｌを添加して酵素反応を停止させ、基準波長として６９０ｎｍを用いてプレートを４５０ｎｍで測定した。
【０２６２】
クローン３３−０３−Ｇ０２及び３７−２０−Ｂ０３に由来するウサギＩｇＧはＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用を中和する高い力価を示した。クローン３７−２０−Ｂ０３は、アベルマブより約２倍高い力価を有した（表７）。選抜されたクローンにおいて得られた用量応答曲線を図１に示す。
【０２６３】
【表２０】
2021501569.tif 000022
【０２６４】
ＰＤＬ１／Ｂ７−１ブロッキングＥＬＩＳＡにおける力価：
ＰＤＬ１／Ｂ７−１相互作用を中和する力価を、競合ＥＬＩＳＡにおいて評価した。ＥＬＩＳＡプレートに、４μｇ／ｍｌのＢ７−１を含むＰＢＳ  ５０μｌを添加し、４℃で一晩被覆した。翌日、ウェルあたり４５０μｌの洗浄バッファ（ＰＢＳ、０．００５％のＴｗｅｅｎ  ２０）によりオーバフローモードでプレートを３回洗浄し、ウェル当たり３００μｌのブロッキングバッファ（ＰＢＳ、１％のＢＳＡ、０．２％のＴｗｅｅｎ  ２０）を添加し、旋回（ｎｕｔａｔｉｎｇ）ミキサー上で室温で１時間処理した。次に、ブロッキングバッファでＰＤＬ１を、４０ｎｇ／ｍｌに希釈した。次に、非結合型のプレート中で、試験するｒＩｇＧを９００〜０．０１５ｎｇ／ｍｌの範囲のＰＤＬ１の系列希釈を含むバッファ１２０μｌをウェル毎に調製し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを４５０μｌの洗浄バッファによりオーバフローモードで３回洗浄し、５０μｌの各希釈液を２回ＥＬＩＳＡプレートの隣接するウェルに添加し、反復サンプルとした。プレートを穏やかに振とうしながら室温で９０分間インキュベートした。４５０μｌの洗浄バッファにより３回洗浄した後、５０μｌのストレプトアビジン−ポリＨＲＰ４０をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを４５０μｌの洗浄バッファで３回洗浄し、５０μｌのＴＭＢを添加した後、５〜１０分の間発色させた。最後に、５０μｌの１Ｍ  ＨＣｌを添加して酵素反応を停止させ、基準波長として６９０ｎｍを用いてプレートを４５０ｎｍで測定した。選抜されたウサギＩｇＧは、表８で示すように、アベルマブと同等の力価でＰＤＬ１／Ｂ７−１相互作用をブロックすることができた。選抜されたクローンにおいて得られた用量応答曲線を図２に示す。
【０２６５】
【表２１】
2021501569.tif 000023
【０２６６】
細胞ベースのＰＤＬ１／ＰＤ−１ブロッキングアッセイにおける力価（レポーター遺伝子）：
ＰＤ−１にＰＤＬ１結合を中和する力価を、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイにおいて評価した。細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％のＦＣＳ）１００μｌ中の３５，０００個のＣＨＯ／ＰＤＬ１／ＴＣＲ活性化細胞を、白色の細胞培養プレートの内側のウェルに添加し、３７℃及び５％ＣＯ２で１６〜２０時間インキュベートした。翌日、９５μｌの細胞培地を各ウェルから除去し、試験しようとする分子の２倍の希釈系列（３，０００〜０．４６ｎｇ／ｍｌまで）、及び対照アベルマブ溶液を５０μｌ添加した。次に、アッセイバッファ（１０％のＦＣＳを有するＲＰＭＩ１６４０）中に４００，０００細胞／ｍｌに希釈したエフェクターＪｕｒｋａｔ細胞を５０μｌで各ウェルに添加し、プレートを３７℃及び５％のＣＯ２で６時間インキュベートした。最後に、製造業者のプロトコルに従い調製したルシフェラーゼ基質（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、ウェル当たり５０μＬで添加し、プレートを暗所で３０分間インキュベートし、発光をＴｏｐｃｏｕｎｔを用いて測定した。選抜されたクローンは、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用をブロックすることができた（表９参照）。選抜されたクローンにおいて得られた用量反応曲線を図３に示す。
【０２６７】
【表２２】
2021501569.tif 000024
【０２６８】
ＦＡＣＳによる、ＰＤＬ１発現細胞に対する結合：
ＰＤＬ１発現細胞に対する結合力価を、選抜されたＩｇＧについて測定した。５０，０００個のＣＨＯ−ＰＤＬ１発現細胞を、丸底の組織培養処理されていないた９６ウェルプレートに分配した。１００μｌのＰＢＳにより、５分間、４００×ｇの遠心分離により細胞を２回洗浄した。試験するｒＩｇＧｓ及びコントロールＩｇＧアベルマブを、染色バッファ（ＰＢＳ、加熱により不活化したＢＣＳ２％、２ｍＭのＥＤＴＡ）中で２，０００〜０．１２８ｎｇ／ｍｌに調製した系列希釈調製１００μｌ中に細胞を再懸濁した。回転ミキサー上で４℃で１時間インキュベートした後、１００μｌの染色バッファ及び４００×ｇでの５分間の遠心ステップにより、３回、細胞を洗浄した。次に、ウサギＩｇＧで処理した細胞を、２μｇ／ｍｌのヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＡＰＣ標識）を含む染色バッファ１００μｌ中に再懸濁し、またアベルマブ（ヒトＩｇＧ１）で処理した細胞を、２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＡＰＣ標識）を含む染色バッファ１００μｌ中に再懸濁した。プレートを回転ミキサー上で４℃で１時間インキュベートした。プレートを、１００μｌの染色バッファで３回洗浄し、最終５０μｌの体積で染色バッファ中に再懸濁した。最後に、ウェル当たりの２０，０００のイベントのＡＰＣシグナルを、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーターシステム（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いたフローサイトメトリーにより解析した。ＰＤＬ１発現細胞の結合が、全ての評価したウサギＩｇＧについて確認できた。選抜されたウサギＩｇＧの細胞内ＰＤＬ１に対する結合力価を表１０に示す。
【０２６９】
【表２３】
2021501569.tif 000025
【０２７０】
ＳＰＲによる種特異性：ｃｙｎｏ：
ヒトＰＤＬ１に対する結合について記載したのと同様の設定を用いて、カニクイザルＰＤＬ１に対する結合動態も測定したが、この場合、ヒトＰＤＬ１をカニクイザルＰＤＬ１と置き換えた。カニクイザルＰＤＬ１に対する結合は、全ての選抜されたＩｇＧについて確認した（表１１）。
【０２７１】
【表２４】
2021501569.tif 000026
【０２７２】
ＳＰＲによる種特異性：マウス：
ヒトＰＤＬ１に対する結合について記載したのと同様の設定を用いて、カニクイザルＰＤＬ１に対する結合動態も測定したが、この場合、ヒトＰＤＬ１をマウスＰＤＬ１と置き換えた。クローン３３−０３−Ｇ０２及び３７−２０−Ｂ０３に由来する選抜されたウサギＩｇＧについては、マウスＰＤＬ１に対する結合は検出されなかった。
【０２７３】
実施例４：ヒト化のためのクローンの選抜
Ｈｉｔ確認において得られたデータに基づき、ＣＤＲをＶＨ３、ＶＨ４又はＶＨ１Ａ若しくはＶＨ１Ｂベースのフレームワークに融合させることにより、全てのクローンをヒト化した。最良の親和性及び力価を得るため、ｒＩｇＧ、３３−０３−Ｇ０２及び３７−２０−Ｂ０３としてのヒトＰＤＬ１に最良の親和性を示した２つのクローンについて、グラフト化により異なる構造を付与し、更なる最適化を行った。以下のグラフト変異体を、クローン３３−０３−Ｇ０２及び３７−２０−Ｂ０３のために適用した：
ＣＤＲグラフト  −  ヒトフレームワーク上へのウサギＣＤＲのグラフト、
ＩＦグラフト  −  ＣＤＲグラフト＋全てのウサギＶＬ／ＶＨ界面の残基のグラフト、
完全グラフト  −  ＣＤＲグラフト＋ＡＨｏヒト化プロトコルに従っているフレームワーク残基（抗原界面（ＡＩＦ）残基（潜在的に抗原（ＡＨｏに従う）と接触するウサギ残基）は、界面形成の際の溶媒のアクセスしやすさを考慮し、２０％以上の残基変更に限定し、それにより変異数（ウサギフレームワーク残基）を減少させた）。
【０２７４】
大腸菌における誘導を伴う一晩の小スケール発現により、不溶性封入体としてタンパク質を異種発現させた（但し、ＰＲＯ９９７については、上記のｒＩｇＧ発現と同様、哺乳動物ＣＨＯ−Ｓ細胞において産生させた）。幾つかの洗浄段階を含む、細胞残渣及び他の宿主細胞由来の不純物を除去する遠心分離プロトコルにより、ホモジナイズした細胞ペレットから封入体を単離した。精製された封入体を変性バッファにおいて可溶化し、天然にフォールティングされたモノマーｓｃＦｖをミリグラム単位で生じさせるスケーラブルなリフォールディングプロトコルに従い、ｓｃＦｖｓをリフォールディングさせた。この際、標準化されたプロトコルを用いｓｃＦｖｓを精製した。リフォールディング後の生成物を親和性クロマトグラフィにより捕捉し、精製されたｓｃＦｖｓを得た。サンプルのＳＥＣポリッシングに利用できる量が確保できなかったため、所望の純度を有する主フラクションのみを用いた。加えて、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）により、ｓｃＦｖｓの融解温度を測定した（詳細は後述する）。表１２は、ＶＨ４  ＣＤＲグラフトｓｃＦｖ分子の製造を要約する。２つのクローンがそれらのＣＤＲ−ループに不対のシステイン残基を含んでいたため、Ｃ５７Ｓ変異を、表１２に示すようにクローン３７−２０−Ｂ０３に導入した。
【０２７５】
更なるグラフト変異体を、幾つかの選抜されたクローンについて設計し、それらの最初の調製及び特徴解析について、表１３（ＡＨｏ付番）及び表１４に要約する。
【０２７６】
実施例５：ヒト化ｓｃＦｖｓの薬物動態解析：
次に、Ｈｉｔ確認フェーズについて記載したのと同様のアッセイ系を用いて、ヒト化ｓｃＦｖｓの主要な薬物動態特性を解析したが、但しｓｃＦｖ分子の異なるフォーマットに応じて適宜改良を行った。
【０２７７】
５．１  ヒトＰＤＬ１に対する親和性
ヒトＰＤＬ１に対するヒト化ｓｃＦｖｓの親和性は、Ｔ２００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）によるＳＰＲ分析により測定した。この実験では、Ｆｃタグを付されたヒトＰＤＬ１を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＨｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅキットを用いて捕捉した。各検体注入サイクルの後、ＣＭ５センサーチップを再生し、新たに抗原を捕捉した。ランニングバッファにおいて希釈した０．１２〜３０ｎＭの変動する検体濃度による用量応答マルチサイクル反応速度アッセイを用い、検体としてｓｃＦｖｓを５分間にわたり注入し、タンパク質の解離を１２分間にわたり進行させた。得られたサンサーグラムを、１：１の結合モデルを使用してフィットさせた。表１５に示す通り、ヒトＰＤＬ１に対する結合が、試験したヒト化ｓｃＦｖｓにおいて確認された。
【０２７８】
５．２．競合ＥＬＩＳＡによるＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の中和：
前述したのと同様の手順に従い、競合ＥＬＩＳＡにより、ＰＤＬ１のＰＤ−１への結合を中和する力価を評価した。各プレートにおける個々のＩＣ５０値を、各プレートに添加した対照分子であるアベルマブのＩＣ５０に対してキャリブレーションした（相対ＩＣ５０：（ＩＣ５０アベルマブ／ＩＣ５０試験ｓｃＦｖ））。表１６に力価についてまとめるように、本アッセイにおいて、アベルマブに対して最大５倍のＩＣ５０が算出できることが明らかである。試験した全てのｓｃＦｖｓが、アベルマブと同等又はより高い力価を有した。
【０２７９】
５．３．競合ＥＬＩＳＡによるＰＤＬ１／Ｂ７−１相互作用の中和
前述したのと同じ手順に従い、競合ＥＬＩＳＡにより、Ｂ７−１へのＰＤＬ１の結合を中和する力価を評価した。各プレートにおける個々のＩＣ５０値を、各プレートに添加した対照分子であるアベルマブのＩＣ５０に対してキャリブレーションした（相対ＩＣ５０：（ＩＣ５０アベルマブ／ＩＣ５０試験ｓｃＦｖ））。表１７に力価についてまとめるように、本アッセイにおいて、アベルマブに対して最大１０倍のＩＣ５０が算出できることが明らかである。試験したｓｃＦｖｓは、アベルマブより高い又は同等の力価を有した。
【０２８０】
５．４．ＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイにおけるＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の中和
ＰＤ−１へのＰＤＬ１の結合を中和する能力について、上記の通りの細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイにおいて評価した。対照アベルマブと同様、試験する各分子を、系列希釈としてプレートに添加した。各プレートにおける個々のＩＣ５０値を、各プレートに添加した対照分子であるアベルマブのＩＣ５０に対してキャリブレーションした（相対ＩＣ５０：（ＩＣ５０アベルマブ／ＩＣ５０試験ｓｃＦｖ））。表１８に力価についてまとめるように、本アッセイにおいて、アベルマブに対して最大５倍のＩＣ５０が算出できることが明らかである。試験したｓｃＦｖｓは、より高い又は同等の力価を有した。
【０２８１】
【表２５】
2021501569.tif 000027
【０２８２】
【表２６】
2021501569.tif 000028
【０２８３】
【表２７】
2021501569.tif 000029
【０２８４】
【表２８】
2021501569.tif 000030
【０２８５】
【表２９】
2021501569.tif 000031
【０２８６】
【表３０】
2021501569.tif 000032
【０２８７】
【表３１】
2021501569.tif 000033
【０２８８】
５．５．フローサイトメトリーによるｈＰＤＬ１発現細胞に対する結合：
ＰＤＬ１発現細胞に対する結合力価を、幾つかの分子について測定した。Ｈｉｔ確認の間、同じ細胞系を（ＣＨＯ−ＰＤＬ１及びＣＨＯ−Ｋ１）用いたが、ｓｃＦｖは、ＡＰＣ標識されたプロテインＬにより検出された。対照アベルマブと同様、試験する各分子を、系列希釈にてプレートに添加した。各プレートにおける個々のＩＣ５０値を、各プレートに添加した対照分子であるアベルマブのＩＣ５０に対してキャリブレーションした（相対ＩＣ５０：（ＩＣ５０アベルマブ／ＩＣ５０試験ｓｃＦｖ））。力価を表１９にまとめる。
【０２８９】
【表３２】
2021501569.tif 000034
【０２９０】
５．６．種による交差反応性（ＳＰＲによる、カニクイザル及びマウスＰＤＬ１に対する結合）
カニクイザルＰＤＬ１に対する交差反応性を、ヒトＰＤＬ１において用いたのと同様のアッセイにおいて測定し、その際、Ｓｈｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製の組換えＰＤＬ１を用いた。表２０は、全ての試験したｓｃＦｖｓについて得られた親和性を要約する。ヒトＰＤＬ１に対する結合を示す試験した全てのｓｃＦｖは、カニクイザルＰＤＬ１にも結合を示した。
【０２９１】
【表３３】
2021501569.tif 000035
【０２９２】
５．７．ＳＰＲによる、ＰＤＬ１  対  ＰＤＬ２の選択性
Ｔ２００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いたＳＰＲ分析により、ヒト化ｓｃＦｖのＰＤＬ２への結合について試験した。この実験では、Ｆｃタグを付されたヒトＰＤＬ２を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＨｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅキットを用い捕捉した。各検体注入サイクルの後、ＣＭ５センサーチップを再生し、新たに抗原を捕捉した。ランニングバッファにおいて１８０ｎＭの濃度に希釈された検体としてｓｃＦｖを５分間にわたり注入し、タンパク質の分離を１２分間進行させた。表２１に列挙される試験した全てのヒト化ｓｃＦｖは、ＰＤＬ２に対する結合が観察されなかった。
【０２９３】
【表３４】
2021501569.tif 000036
【０２９４】
実施例６：ヒト化ｓｃＦｖの生物物理学的特徴解析：
アベルマブより良好な親和性を有する選抜されたドメインについて、より大規模なスケール（０．２Ｌ〜１．２Ｌの発現体積）で製造した。更に、精製後、５ｋＤの分子量カットの遠心濃縮チューブを用いて、タンパク質サンプルを１０ｍｇ／ｍＬ以上まで濃縮した。安定性評価のための材料の製造を、表２２にまとめる。
【０２９５】
６．１．保存安定性試験：
ヒト化ｓｃＦｖを安定性試験（例えば４週間の安定性試験）に供し、その際、ｓｃＦｖを１０ｍｇ／ｍｌで、緩衝水溶液（最終的なバッファ組成は、５０ｍＭのＮａＣｉＰ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．４）中に調製し、４週間、−８０℃以下、４℃及び４０℃で保存した。最低限、製剤中のモノマー及びオリゴマーのフラクションを用い、１週間後、２週間後、及び各試験終了後の、ＳＥ−ＨＰＬＣピーク面積の積分により評価した。その他の時点については、幾つかの分子において記録した。表２３は、試験の７日目と、２８日目のエンドポイントにおいて得られた測定値を比較したものである。
【０２９６】
【表３５】
2021501569.tif 000037
【０２９７】
【表３６】
2021501569.tif 000038
【０２９８】
６．２．凍結融解安定性試験：
前述の保存安定性試験に加えて、性能の優れたｓｃＦｖ分子の適合性について、凍結融解（Ｆ／Ｔ）サイクルにより評価した（コロイド安定性）。Ｆ／Ｔ安定性評価のため、保存安定性試験と同じ分析法（ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びパラメータ（％モノマー含量及び％モノマー損失）を適用し、５Ｆ／Ｔサイクルにおける分子の品質をモニターした。表２４は、５回の反復するＦ／Ｔサイクルにおける％モノマー含量損失の過程を例示する。特段の凍結融解試験を行わなかったため、２８日にわたり得られた、保存安定性試験で用いた−８０℃サンプルにより得られた凍結融解データを後記のグラフに示す。Ｆ／Ｔサイクル反復の後、モノマー含量損失が４％より大きい分子はなかった。
【０２９９】
【表３７】
2021501569.tif 000039
【０３００】
６．３．熱変性：
選抜されたｓｃＦｖ構築物の熱変性データをＤＳＦ測定から得、表２５に示す。得られたＴｍ値は、ボルツマンの式へのデータのフィッティングにより測定した。表２５に、ＤＳＦにより算出された融解温度をまとめる。
【０３０１】
【表３８】
2021501569.tif 000040
【０３０２】
本発明の抗体を含む多重特異性分子：
本発明の抗体を含む例示的な多重特異性分子を、表３に示す。
【０３０３】
実施例７：ＰＤＬ１、ＣＤ１３７、ＨＳＡ及びＭＳＡに対する親和性：
方法：
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＳＰＲ測定により、異なる種のＰＤＬ１に対する親和性を測定した。ヒトＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体を、アミンカップリングにより、センサーチップ（ＣＭ５センサーチップ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に固定した。全てのフォーマットにおいて、Ｆｃを含むモリソンフォーマットを除き、異なる種由来のＰＤＬ１−Ｆｃキメラタンパク質を、固定化抗体により捕捉した。ＰＤＬ１特異的分子の３倍系列希釈（０．１２〜９０ｎＭ）を、３分間にわたりフローセルに注入し、分離を１０分間にわたりモニターした。各注入サイクルの後、３ＭのＭｇＣｌ２溶液を１回注入して表面を再生した。見かけの分離（ｋｄ）及び会合（ｋａ）速度定数、並びに見かけの分離平衡定数（ＫＤ）は、１対１のラングミュア結合モデルを用いて算出した。異なる種由来のＣＤ１３７−Ｆｃキメラタンパク質を固定化抗体により捕捉したことを除き、ＰＤＬ１の場合と同一の設定を用いて、異なる種のＣＤ１３７に対する親和性を測定した。
【０３０４】
Ｆｃを含むフォーマットは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体により直接捕捉した。ＰＤＬ１細胞外ドメイン又はＣＤ１３７細胞外ドメインの９０〜０．３５ｎＭの範囲の２倍階段希釈を用い、バイオセンサーチップに捕捉されるＩｇＧへの結合について試験した。各注入サイクルの後、３ＭのＭｇＣｌ２溶液を１回注入して表面を再生した。
【０３０５】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＳＰＲ測定により、異なる種の血清アルブミン（ＳＡ）に対する分子の親和性を測定した。アミンカップリング化学的方法を用いて、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にＳＡを直接カップリングさせた。再生スカウンティング及び表面性能試験を行い最良のアッセイ条件を検討した後、用量応答を測定し、得られた結合曲線をダブルリファレンス（空の基準チャネル及び検体注入なし）し、１：１のラングミュアモデルを用いてフィットさせ、速度論的パラメーターを取得した。アッセイは、ｐＨ５．５の１×ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファにおいて実行した。
【０３０６】
結果：
ヒト化構築物の結合動態の測定の結果、クローン３３−０３−Ｇ０２のＣＤＲと構造グラフト（ＳＴＲ）とを比較したとき、ＰＤＬ１に対する親和親和性の違いが示され、ＳＴＲグラフトは、同じクローンのＣＤＲグラフトと比較し２０倍の親和性の向上が示される（表２６のＰＲＯ８８５  対  ＰＲＯ１１２６）。クローン３３−０３−Ｇ０２のＳＴＲグラフトと比較したとき、クローン３７−２０−Ｂ０３（ＰＲＯ９９７）由来のＣＤＲグラフトは約２倍高い親和性を示す。３３−０３−Ｇ０２のＣＤＲグラフトの結合親和性は、それらを異なる多重特異性のフォーマットに組み合わせたとき、親のｓｃＦｖの結合能と同等となる（ＰＲＯ８３０を、ＰＲＯ８８５、ＰＲＯ９５１、ＰＲＯ１１２３、ＰＲＯ１１２４、ＰＲＯ９６３、ＰＲＯ９６６、ＰＲＯ１０５７、ＰＲＯ１０５８、ＰＲＯ１０５９及びＰＲＯ１０６０と比較したとき、表２６）。両クローン由来のｓｃＦｖは、ヒト及びカニクイザルＰＤＬ１とほとんど同等の親和性を示す（表２６のＰＲＯ９７７及びＰＲＯ８３０を参照）。
【０３０７】
【表３９】
2021501569.tif 000041
【０３０８】
【表４０】
2021501569.tif 000042
【０３０９】
実施例８：ＰＤＬ１及びＴＣＲ活性化因子分子を発現するＣＨＯ細胞と、及びＰＤ−１を発現しＮＦＡＴ応答エレメント下のルシフェラーゼ遺伝子を含むＪｕｒｋａｔ細胞と、を用いる細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイにおける、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用のブロック：
方法：
生物発光レポーター遺伝子アッセイにおいて、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核内因子）−ルシフェラーゼレポーターと、ヒトＰＤ−１を安定発現する加工されたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、エフェクターＴ細胞として機能させる。ヒトＰＤＬ１及びＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子を安定発現する細胞を、抗原提示細胞として機能させる。２つの細胞系を共培養することにより、ＴＣＲ活性化因子／ＴＣＲ複合体の結合を介して、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ経路の活性化が誘導される。ＰＤＬ１発現細胞の結合に応じて、ＰＤ−１エフェクターＴ細胞におけるＰＤ−１シグナリングが、Ｔ細胞機能を阻害し、ＮＦＡＴ経路が阻害される。ＰＤ−１及びＰＤＬ１受容体の相互作用のブロックは、ＮＦＡＴ経路の再活性化につながる。
【０３１０】
細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％のＦＣＳ）１００μｌ中の３５，０００個のＣＨＯ／ＰＤＬ１／ＴＣＲ活性化因子（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）細胞を、白色の細胞培養プレートの内側ウェルに添加し、３７℃及び５％のＣＯ２で１６〜２０時間インキュベートした。翌日、９５μｌの細胞培地を各ウェルから除去し、試験する各分子を、３，０００〜０．４６ｎｇ／ｍｌの２倍希釈系列にて、対照アベルマブと共に、５０μｌ添加した。次に、ＰＤ−１を発現するエフェクターＪｕｒｋａｔ細胞（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）をアッセイバッファ（１０％のＦＣＳを有するＲＰＭＩ１６４０）中に４００，０００細胞／ｍｌで希釈し、各ウェルに５０μｌ添加し、プレートを３７℃及び５％のＣＯ２で６時間インキュベートした。最後に、製造業者のプロトコルに従い調製したルシフェラーゼ基質（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、ウェル当たり５０μＬで添加し、プレートを暗所で３０分間インキュベートし、発光をＴｏｐｃｏｕｎｔを用いて測定した。
【０３１１】
結果：
ＰＤ−１へのＰＤＬ１の結合を中和する力価に対する、ＣＤＲセット及びフレームワーク選抜の影響を評価するため、３つの抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖを、ＮＦＡＴレポーター遺伝子細胞ベースアッセイにおいて試験した。ＰＲＯ８３０は、ＶＨ４フレームワークにグラフトするクローン３３−０３−Ｇ０２のＣＤＲセットを含み、ＰＲＯ９９７及びＰＲＯ１０１３は、それぞれ、ＶＨ４又はＶＨ１フレームワークにグラフトするクローン３７−２０−Ｂ０３のＣＤＲセットを含む。ＰＲＯ８３０は、試験した３つのｓｃＦｖの中で最も低い力価を有し、４２．８８ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０値であり、３４．０９ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０値を有するアベルマブと同等の力価を有する。ＰＲＯ９９７は、最も強力な分子である。ＶＨ１フレームワークではなくＶＨ４フレームワークにグラフトしたとき、同じＣＤＲセットの力価が約２倍高かった。それぞれ、ＩＣ５０値は１１．１２ｎｇ／ｍｌ  対  ２１．２９ｎｇ／ｍｌであった。（図４Ａ及び表２７）
【０３１２】
ＰＤ−１に対するＰＤＬ１の結合を中和する力価は、３３−０３−Ｇ０２  ＰＤＬ１ドメインを有する二重特異性分子を用い、ドメイン最適化の前（ＣＤＲグラフト）及び後（構造グラフト）に測定した。ＣＤＲグラフト（ＰＲＯ８８５）を、構造グラフト（ＰＲＯ１１２６）と比較した。ドメイン最適化は、ＩＣ５０値がＰＲＯ８８５では１３７．２ｎｇ／ｍｌ、及びＰＲＯ１１２６では４８．１５ｎｇ／ｍｌと、中和力価を３倍に向上させた。（図４Ｂ及び表２７）。
【０３１３】
また、クローン３３−０３−Ｇ０２のＣＤＲグラフトを行った抗ＰＤＬ１ドメインを有する２つの３重特異性分子、及び２つの異なるヒト血清アルブミン結合ドメインを用い、ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用を中和する力価、特に半減期の延長について評価した。ＰＲＯ１０５７のＨＳＡドメインもまた、マウス血清アルブミンと結合している。実験は、２５ｍｇ／ｍｌのＨＳＡの存在下で行った。中和力価（ＩＣ５０＝６６５．１ｎｇ／ｍｌ）は、アベルマブより低かった。（図５及び表２７）。
【０３１４】
【表４１】
2021501569.tif 000043
【０３１５】
血清において、いわゆるモリソンフォーマットを、細胞ベースの力価レポーター遺伝子アッセイにおいて試験した。このフォーマットでは、１つの特異性がＩｇＧ部分（二価）により生じ、第２の標的に対する特異性を有する２つのｓｃＦｖが可撓性ペプチドリンカーを介して、ＩｇＧの重鎖（ＨＣ）又は軽鎖（ＬＣ）に連結されている。試験する全てのモリソン分子は、ＩｇＧの両アーム上にクローン３３−０３−Ｇ０２のＣＤＲグラフトによる抗ＰＤＬ１ドメインを担持するものとした。２つの構築物ＰＲＯ１０５９及びＰＲＯ１０６０は、重鎖（ＨＣ）又は軽鎖（ＬＣ）のいずれかに、２つの抗ＣＤ１３７  ｓｃＦｖが融合している点で異なる。ＰＲＯ１０６２は、ＰＲＯ１０６０とは同じ構成を有するが、異なるＣＤ１３７ドメインを有する。全ての分子の中和力価は同等であった（図６及び表２７）。
【０３１６】
実施例９：競合ＥＬＩＳＡを用いた、ＰＤ−１及びＢ７−１とのＰＤＬ１の相互作用のブロック
ＰＤＬ１阻害剤の、ＰＤＬ１とＰＤ−１との、又はＰＤＬ１とＢ．７１との間の相互作用をブロックする能力を評価するため、これらのアッセイを実施した。ｓｃＦｖ、ｓｃＤｂ、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ及びモリソンを含む異なるフォーマットについて、競合ＥＬＩＳＡにおいて解析し、対照ＩｇＧアベルマブと比較した。
【０３１７】
ＰＤＬ１／ＰＤ−１競合ＥＬＩＳＡ：
４μｇ／ｍｌのヒトＰＤ−１を用い、４℃で一晩ＥＬＩＳＡマイクロプレートをコーティングし、ウェル当たり４５０μｌの洗浄バッファで３回洗浄した。各ウェルに、１％ＢＳＡ及び０．２％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳ（希釈バッファ）を３００μｌ添加し、プレートを室温で１時間ブロッキングした。１ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＰＤＬ１を含む希釈バッファ中、３００〜０．００５ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度となるよう、阻害剤の３倍連続希釈系列を調製した。混合物を回転ミキサー（２１ｒｐｍ）で穏やかに振とうしながら、室温で１時間プレインキュベートし、ウェル当たり４５０μｌの洗浄バッファによる３回の洗浄サイクルの後、マイクロプレートに添加した。プレートを穏やかに振とうしながら室温で１．５時間インキュベートし、ウェル当たり４５０μｌの洗浄バッファで３回洗浄した後、１０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ポリＨＲＰ４０を各マイクロプレートのウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを４５０μｌの洗浄バッファで３回洗浄し、ＴＭＢを添加した。６分後、１Ｍ  ＨＣｌを添加して酵素反応を停止させ、基準波長として６９０ｎｍを用いて吸光度を４５０ｎｍで測定した。ＩＣ５０値の算出のため、対照を差し引いた値を用いＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍにおいて４−パラメータロジスティック（４ＰＬ）曲線フィットを行った。
【０３１８】
図７及び表２８に例示するように、競合ＥＬＩＳＡにおいて試験したときに、全てのＰＤＬ１阻害剤は、ＰＤＬ１とＰＤ−１との相互作用をブロックした。ｓｃＦｖ  ＰＲＯ８３０は同等の力価で相互作用をブロックし、一方、ＰＲＯ９９７及びＰＲＯ１０１３は、アベルマブより著しく低いＩＣ５０値を示し、すなわち強力な阻害剤であった。多重特異性フォーマット（すなわちｓｃＤｂｓ又はモリソン）と組み合わせたとき、全ての分子はそれらの阻害特性を維持していた。ＰＲＯ８８５はアベルマブより強力でなかったのに対し、改善された抗ＰＤＬ１ドメインを含むＰＲＯ１１２６では低いＩＣ５０値が測定された。アベルマブと比較したとき、モリソンフォーマットはわずかに力価が低かった。ヒト血清アルブミンの存在下でのＰＲＯ１０５７の中和効果も示したが、ＩＣ５０値が約２倍高かった。
【０３１９】
ＰＤＬ１／Ｂ７−１競合ＥＬＩＳＡ：
４μｇ／ｍｌのヒトＢ７−１を用い、４℃で一晩ＥＬＩＳＡマイクロプレートをコーティングし、ウェル当たり４５０μｌの洗浄バッファで３回洗浄した。各ウェルに、１％ＢＳＡ及び０．２％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳ（希釈バッファ）を３００μｌ添加し、プレートを室温で１時間ブロッキングした。４０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＰＤＬ１を含む希釈バッファ中、９００〜０．０１５ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度となるよう、阻害剤の３倍連続希釈系列を調製した。混合物を回転ミキサー（２１ｒｐｍ）で穏やかに振とうしながら、室温で１時間プレインキュベートし、ウェル当たり４５０μｌの洗浄バッファによる３回の洗浄サイクルの後、マイクロプレートに添加した。プレートを穏やかに振とうしながら室温で１．５時間インキュベートし、ウェル当たり４５０μｌの洗浄バッファで３回洗浄した後、１０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ポリＨＲＰ４０を各マイクロプレートのウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを４５０μｌの洗浄バッファで３回洗浄し、ＴＭＢを添加した。６分後、１Ｍ  ＨＣｌを添加して酵素反応を停止させ、基準波長として６９０ｎｍを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＩＣ５０値の算出のため、対照を差し引いた値を用いＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍにおいて４−パラメータロジスティック（４ＰＬ）曲線フィットを行った。
【０３２０】
ＰＲＯ１１２６を除く、全てのＰＤＬ１阻害剤について、Ｂ７−１とＰＤ−１との相互作用をブロックするそれらの能力を試験した。ＰＲＯ８３０はアベルマブと同等の力価を示したが、ＰＲＯ９９７及びＰＲＯ１０１３は低いＩＣ５０測定値であった。全てのｓｃＤｂ及びモリソンも、ＰＤＬ１とＢ．７−１との間の相互作用を阻害した。ｓｃＤｂ  ＰＲＯ８８５はアベルマブと同等の力価を示したが、モリソンのＩＣ５０値は約２〜３．４倍低かった。図８及び表２８にデータを示す。
【０３２１】
【表４２】
2021501569.tif 000044
【０３２２】
実施例１０：細胞ベースのアッセイを用いた、超抗原ＳＥＡで刺激したヒトＰＢＭＣにおけるＰＤＬ１ブロック及び同時のＣＤ１３７刺激による刺激効果の評価：
この実験では、ＰＤ−１／ＰＤＬ１の阻害及びＣＤ１３７アゴニズムの相乗効果を評価した。アッセイでは、超抗原であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）により刺激した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用い、それぞれ抗原提供細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞上でのＰＤＬ１、並びにＴ細胞上でのＣＤ１３７の発現を誘導した。抗ＰＤＬ１×ＣＤ１３７分子を適用することにより、２つのＴ細胞制御シグナル伝達経路を同時に標的とし、すなわち、二重特異性抗ＰＤＬ１×ＣＤ１３７分子（ＰＲＯ８８５）により媒介される免疫学的シナプス形成を経た、阻害的ＰＤ−１／ＰＤＬ１経路の阻害及びＣＤ１３７経路の活性化を行った。インターロイキン−２（ＩＬ−２）の分泌によるＴ細胞の活性化を評価し、ベンチマーキング対照抗体であるアベルマブにより媒介されるＰＤＬ１阻害により媒介される効果と比較した。加えて、抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖであるＰＲＯ９９７を試験し、同じ実験的セットアップにおいてアベルマブと比較した。
【０３２３】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心法により新鮮なヒト全血から単離した。次に、抗ＣＤ５６抗体及びＭＡＣＳ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用い、ＰＢＭＣからＮＫ細胞を減少させた。次に、９６ウェルプレートにウェル当たり１００，０００個のＰＢＭＣを添加し、続いて１０ｎｇ／ｍｌの濃度でＳＥＡを含むアッセイバッファ中の、ＰＲＯ８８５、ＰＲＯ９９７及びアベルマブの希釈系列を調製し、添加した。３７℃及び５％のＣＯ２で９６時間培養の後、細胞上清を回収し、培養上清中のヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）レベルを、キットの取扱説明に従い、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製のＩＬ−２ヒトＥＬＩＳＡ  ＭＡＸアッセイを用いて定量した。ＩＬ−２標準曲線からＩＬ−２濃度を補間し、逆算し、ＥＣ５０値の算出のため、アベルマブ及びＰＲＯ８８５の濃度に対してプロットした。
【０３２４】
図９に示すとおり、ＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用のブロック及び同時の二重特異性分子ＰＲＯ８８５の添加によるＣＤ１３７の刺激に続き、Ｔ細胞によりＩＬ−２が分泌された。アベルマブと比較したときに、ＰＲＯ８８５は高いＴ細胞活性化及びより良好な力価を示した（ＰＲＯ８８５：ＥＣ５０＝３９．９２ｎｇ／ｍｌ、アベルマブ：ＥＣ５０＝６９．８９ｎｇ／ｍｌ、表２９）。この発見は、二重特異性抗ＰＤＬ１×ＣＤ１３７  ｓｃＤｂ  ＰＲＯ８８５は、アベルマブによる単なるＰＤＬ１のブロックよりも強力にＴ細胞刺激を誘導できることを証明するものである。更に、高親和性抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖ  ＰＲＯ９９７は、Ｔ細胞の刺激において、アベルマブより強力であることが明らかとなった（ＰＲＯ９９７：ＥＣ５０＝４０．８６ｎｇ／ｍｌ、アベルマブ：ＥＣ５０＝９０．１８ｎｇ／ｍｌ、表２９）。
【０３２５】
【表４３】
2021501569.tif 000045
【０３２６】
実施例１１：ヒト細胞系由来の肺癌異種移植モデルＨＣＣ８２７における、抗ＰＤＬ１抗体の抗腫瘍有効性の評価：
抗ＰＤＬ１  ＩｇＧ１抗体ＰＲＯ１１３７（配列番号９０及び９１）の抗腫瘍活性を、Ｔａｃｏｎｉｃ社製の免疫不全ＮＯＧマウス系統及び同種異系ヒト末梢血単核細胞を用いた、ヒトＨＣＣ８２７  ＮＳＣＬＣ異種移植において評価した。移植されたヒトＴリンパ球は、マウス細胞由来の外来の主要組織適合（ＭＨＣ）クラスＩ及びＩＩ及び他の抗原に対する異物反応性を示す。その結果、Ｔリンパ球は様々な器官への炎症性の浸潤を示し、数週間後に動物の死をもたらし、またこのプロセスは異種移植対宿主病（ｘＧＶＨＤ）として公知である。免疫調節性抗体（例えば抗ＰＤＬ１及び抗ＣＤ１３７）による処理の結果、ｘＧＶＨＤを悪化させることが示されている（Ｓａｎｍａｍｅｄ  ＭＦ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ  ａｎｄ  ｕｒｅｌｕｍａｂ  ｅｎｈａｎｃｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｅｎｇｒａｆｔｅｄ  ｉｎ  Ｒａｇ２−／−ＩＬ２Ｒｇｎｕｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１５；７５（１７）：３４６６−３４７８）。
【０３２７】
試験セットアップ及び処理スケジュール：雌のＮＯＧマウスに、５×１０６個のＨＣＣ８２７細胞を片肢に注入した。細胞は、５０％のＰＢＳ中の細胞懸濁液と５０％のマトリゲルとの混合物中、１００μｌの全注入体積で注入した。腫瘍細胞をＮＯＧマウスへ注入し、腫瘍移植（８０〜１００ｍｍ３のメジアン群腫瘍体積）を成功させた後、マウスへの静脈内注射を、５×１０６ヒトＰＢＭＣで置換した。ランダム割り当ての日、各群の４匹のマウスはドナーＡのＰＢＭＣで再構成し、さらに４匹のマウスはドナーＢのＰＢＭＣで再構成した。処理はＰＢＭＣ注入の１〜２時間後に開始し、以下の通り適用した。
【０３２８】
【表４４】
2021501569.tif 000046
【０３２９】
ＮＦ−ＡＴレポーター遺伝子アッセイにおいてＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用をブロックする抗体のインビトロ活性に基づき、（マウス当たり）アベルマブ０．１ｍｇの用量をモデルとして同じ相対活量を得るためのＰＲＯ１１３７の用量を０．２ｍｇと設定した。したがって、０．２ｍｇのＰＲＯ１１３７の用量は、アベルマブの０．１ｍｇの用量に匹敵し、１相対単位（１ｒ．Ｕ）として示すことができる。体重測定及び腫瘍体積のカリパス副木測定を週２回行った。試験結果に応じて動物を所定の時点で屠殺した。全ての動物を、「同じ」時点（１７日目及び１８日目）に屠殺した。処理能力上の理由から、第１日目に各群の第１の半分についてサンプル回収及び処理を行い、翌日に各群の残りの第２の半分について同じサンプル回収及び処理を行った。２人の異なるドナー由来のＰＢＭＣにより再構成した動物は、２つのサンプリングコホートを適切に反映するものであった。
【０３３０】
結果：免疫不全ＮＯＧマウス系統及び同種異系ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を使用した、ヒトＨＣＣ８２７  ＮＳＣＬＣ異種移植における抗ＰＤＬ１  ＰＲＯ１１３７による抗腫瘍活性を、腫瘍体積を測定することにより評価した（図１０）。腫瘍体積を週当たり２回測定し、マウスを１７及び１８日目に安楽死させた。腫瘍体積を、処理開始時の腫瘍体積に対する相対腫瘍体積として正規化した。図１０に示すとおり、ＰＲＯ１１３７モノクローナル抗体による処理は、ビヒクルコントロール群と比較し腫瘍成長の低減を示した。特に、ＰＲＯ１１３７による処理は、体重（メジアン値）の減少をもたらさず、それはすなわち、該分子は試験投与レベルでは十分許容されるものであることを示唆する（図１１）。
【０３３１】
実施例１２：ヒトの臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＵＣＢ  ＨＳＣ）をグラフト化したＮＯＧマウスにおける、ヒトＰＲＯ１１３７の抗腫瘍効果の評価：
ヒトＰＲＯ１１９６（抗ＰＤＬ１  ＩｇＧ１、配列番号９２及び９３）の抗腫瘍活性を、ヒトの臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＵＣＢ  ＨＳＣ）をグラフト化したＮＯＧマウスを用いたヒトＨＣＣ８２７  ＮＳＣＬＣ異種移植において、ビヒクル治療又はアベルマブと比較した。
【０３３２】
試験セットアップ及び処理スケジュール：ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＵＣＢ  ＨＳＣ）をグラフト化した雌のＮＯＧマウスの皮下に、ＨＣＣ８２７  ＮＳＣＬＣ細胞を注射した。マウスの片肢に、５×１０６個のＨＣＣ８２７細胞を注入した。細胞を、５０％のＰＢＳ中細胞懸濁液と、５０％のマトリゲルと、の混合物として、１００μｌの全注入体積で注入した。腫瘍細胞をＮＯＧマウスへ注入し、腫瘍移植を成功させた後（群あたり８０〜１００ｍｍ３の腫瘍体積メジアン値）、マウス（ｎ＝１０）を処理群にランダム化した。
【０３３３】
【表４５】
2021501569.tif 000047
【０３３４】
体重測定及びカリパスによる腫瘍体積測定を週２回行った。腫瘍を、処理後２５、２９及び３０日目に回収した。
【０３３５】
結果：ヒトのさい帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＵＣＢ  ＨＳＣ）を移植した免疫不全ＮＯＧマウス系統を用いた、ヒトＨＣＣ８２７  ＮＳＣＬＣ異種移植における、ＰＲＯ１１９６（抗ＰＤＬ１  ＩｇＧ１、配列番号９２及び９３）の抗腫瘍活性を、腫瘍体積を測定することにより評価した（図１２）。腫瘍体積を週当たり２回測定し、マウスを２５、２９及び３０日目に安楽死させた。腫瘍体積を、処理開始時の腫瘍体積に対する相対腫瘍体積として正規化した。図１２に示すとおり、ＰＲＯ１１９６及びアベルマブによる処理は、対照群と比較し、腫瘍成長の鎮静化をもたらした。
【０３３６】
実施例１３：担癌のＭＣ３８大腸癌モデルにおける、ＰＤＬ１ブロックの抗腫瘍有効性及びＣＤ１３７の局所的刺激との組み合わせの評価：
加えて、本発明のＰＤＬ１ドメインを含む多重特異性抗体の抗腫瘍活性完全な免疫系を有する担癌Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＭＣ３８大腸癌モデルにおいて試験しうる。このモデルは他においても用いられており、ＣＤ１３７アゴニスト及びＰＤ−１／ＰＤＬ１アンタゴニストによる併用処理により強化された抗腫瘍活性が示されている（Ｃｈｅｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４−１ＢＢ  ａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｄ  ＰＤ−１  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ／ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｐｏｏｒｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２０１４；３（２）：１４９−１６０及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｒｕｉｚ  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ．Ａｂｓｃｏｐａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｒｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍＡｂｓ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓｐｒｉｍｉｎｇ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１６；７６（２０）：５９９４−６００５）。
【０３３７】
試験する多重特異性抗体の抗ＣＤ１３７ドメイン及び抗ＰＤＬ１ドメインのいずれも、マウスＰＤＬ１及びマウスＣＤ１３７と交差反応しないため、ＣｒｏｗｎＢｉｏ社により確立された加工されたヒトＣＤ１３７ノックインモデルを用いうる。このモデルでは、マウスＣＤ１３７の細胞外及び膜貫通ドメインを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスバックグラウンドにおいてヒトＣＤ１３７のそれぞれの配列と置き換えた。加えて、ＣＭＶプロモータの制御下でマウスＰＤＬ１の代わりにヒトＰＤＬ１を発現する修飾されたＭＣ３８腫瘍細胞系統を用いうる。腫瘍体積に対する前記多重特異性抗体の効果を、前記多重特異性抗体と同じＰＤＬ１特異的可変ドメインを含むヒト化ＩｇＧ１との、及び同じＣＤ１３７特異的可変ドメインを有するヒト化ＩｇＧ４との、併用療法と比較しうる。局所的な抗腫瘍免疫応答の更なる証拠を得るため、腫瘍浸潤リンパ球（例えばＣＤ８＋、ＣＤ４＋及び制御Ｔ細胞）の数をフローサイトメトリーにより解析しうる。抗ＣＤ１３７／抗ＰＤＬ１処理に続く免疫系の調節を全身的に試験するため、肝臓及び脾臓のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の数をフローサイトメトリー及びおそらくは免疫組織化学により解析しうる。更に、全身性のＩＦＮγレベルを、定量的ＥＬＩＳＡ法を用いて解析しうる。更に抗ＣＤ１３７／抗ＰＤＬ１併用療法の安全プロファイルを特徴づけるため、主に（診療の際の抗ＣＤ１３７療法において観察される）肝臓毒性、例えばアラニンアミノトランスフェラーゼ、グルタイン酸デヒドロゲナーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの高いレベルに関連する臨床化学病理学パラメータを評価しうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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