(57)【要約】  本発明は、温度媒介ペプチド交換を用いて、望ましいペプチドで満たしたＭＨＣ多量体を生成する速く、柔軟であり、効率的な方法に関する。該方法は、異なる望ましいペプチドについて同時に、並行して使用され得る。該方法では、低い温度で安定したペプチド−ＭＨＣ複合体を形成するが、定義した上昇した温度に曝した際に解離する条件付きのペプチドが使用される。生じた条件付きのＭＨＣ  Ｉ複合体および多量体は、最適なペプチドで満たされ得る。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．上昇した温度でＭＨＣ分子から解離するテンプレートペプチドが前記ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合しているＭＨＣ分子を低下した温度で提供するステップと；
ｂ．温度を上昇した温度に変更して、前記ＭＨＣ分子から前記テンプレートペプチドを解離させるステップと；
ｃ．前記ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合する望ましいペプチドと前記ＭＨＣ分子を、前記望ましいペプチドが前記ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合できる条件下で、上昇した温度で接触させるステップと、を含み、
前記ＭＨＣ分子は好ましくはヒト白血球抗原−（ＨＬＡ−Ａ）分子であることを特徴とするＭＨＣ分子の製造方法。
【請求項２】
低下した温度が１０℃以下の温度であるか、かつ／または上昇した温度が１５℃以上の温度であり、好ましくは、低下した温度が４℃以下であるか、かつ／または上昇した温度が２０℃〜４０℃である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）およびｃ）を同時に実施する請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
テンプレートペプチドが結合しているＭＨＣ分子過剰において望ましいペプチドが提供され、好ましくは、過剰が少なくとも約５倍、１０倍２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍モル過剰である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）において、単量体として、少なくとも２つのＭＨＣ分子を含む複合体として、または多量体として、ＭＨＣ分子が提供される請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＭＨＣ分子が、ＭＨＣ分子と、少なくとも１つの他の分子、好ましくは少なくとも１つの他のタンパク質、好ましくは少なくとも１つの他のＭＨＣ分子と、を含む複合体の一部である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＭＨＣ分子がヒトＨＬＡ−Ａ分子であり、前記ＨＬＡ−Ａ分子が、好ましくはＨＬＡ−Ａ＊０２およびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１から選択される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
テンプレートペプチドが、少なくとも１つ、２つ以上のアンカー残基、好ましくは１つまたは２つのアンカー残基の置換によって得られる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
テンプレートペプチドが、
ａ．配列番号１（ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ）、配列番号２（ＩＡＫＥＰＶＨＧＡ）または配列番号３（ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ）に示されるポリペプチド配列；または
ｂ．１、２、３、または４個のアミノ酸が置換されているか、欠失しているか、または挿入されている配列番号１または配列番号２または配列番号３に示されるポリペプチド配列
を含むポリペプチドである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合する異なる望ましいペプチドについて並行して実施される請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ステップａ）において得られるＭＨＣ分子が、低下した温度でテンプレートペプチドを用いて製造され、満たされる請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＨＣ分子のペプチド結合溝にテンプレートペプチドが結合しているＭＨＣ分子が、テンプレートペプチドの存在下、１０℃以下の温度でのＭＨＣ分子のリフォールディングによって提供される請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
無細胞で行われる請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記望ましいペプチドの前記ＭＨＣ分子への結合を検出するステップをさらに含み、好ましくは、前記結合は、前記望ましいペプチドと結合している標識を検出することによって検出され、好ましくは、前記望ましいペプチドは前記標識を含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
試験または参照化合物の存在下で前記望ましいペプチドの結合を決定するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法で得られるＭＨＣ分子。
【請求項１７】
請求項１６に記載のＭＨＣ分子と、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞と、を含む組成物。
【請求項１８】
温度が１５℃以上である場合に、好ましくは温度が１５℃〜４０℃である場合にＭＨＣ分子から解離するテンプレートペプチドがＭＨＣ分子のペプチド結合溝において結合している、１０℃以下の温度におけるＭＨＣ分子であって、さらにより好ましくは低下した温度が４℃以下であるか、かつ／または上昇した温度が２０℃〜４０℃であり、前記ＭＨＣ分子は好ましくはヒトＨＬＡ−Ａ分子であり、好ましくはヒトＨＬＡ−Ａ分子はＨＬＡ−Ａ＊０２およびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１から選択されるＭＨＣ分子。
【請求項１９】
ＭＨＣ分子のペプチド結合溝においてテンプレートペプチドが結合しているＭＨＣ分子であって、前記テンプレートペプチドが、
ａ．配列番号１（ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ）、配列番号２（ＩＡＫＥＰＶＨＧＡ）または配列番号３（ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ）に示されるポリペプチド配列；あるいは
ｂ．１、２、３、または４個のアミノ酸が置換されているか、欠失しているか、または挿入されている配列番号１または配列番号２または配列番号３に示されるポリペプチド配列を含むポリペプチドであり；
前記ＭＨＣ分子は好ましくはヒトＨＬＡ−Ａ分子であり、好ましくは前記ヒトＨＬＡ−Ａ分子はＨＬＡ−Ａ＊０２およびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１から選択されるＭＨＣ分子。
【請求項２０】
請求項１８〜１９のいずれかに記載のＭＨＣ分子を含む組成物。
【請求項２１】
更なるペプチドをさらに含み、好ましくは前記更なるペプチドが前記ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合可能な抗原ペプチドである請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ＮａＣｌ，好ましくは１００〜６００ｍＭ  ＮａＣｌ，より好ましくは２５０〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび／またはグリセロール、好ましくは１〜５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、好ましくは５〜１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロールをさらに含む請求項１７、２０〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
低下した温度でＭＨＣ分子と結合するが、上昇した温度では結合しないテンプレートペプチドであって、前記ＭＨＣ分子は好ましくはヒトＨＬＡ−Ａ分子であり、好ましくは前記ヒトＨＬＡ−Ａ分子はＨＬＡ−Ａ＊０２およびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１から選択されるテンプレートペプチド。
【請求項２４】
ａ．配列番号１（ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ）、配列番号２（ＩＡＫＥＰＶＨＧＡ）または配列番号３（ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ）に示されるポリペプチド配列；あるいは
ｂ．１、２、３、または４個のアミノ酸が置換されているか、欠失しているか、または挿入されている配列番号１または配列番号２または配列番号３に示されるポリペプチド配列
を含むポリペプチドであるテンプレートペプチド。
【請求項２５】
ＭＨＣ分子を製造するための、および／またはＭＨＣ分子のペプチド交換における請求項２３〜２４のいずれかに記載のテンプレートペプチドの使用であって、前記ＭＨＣ分子は好ましくはヒトＨＬＡ−Ａ分子であり、好ましくはヒトＨＬＡ−Ａ分子はＨＬＡ−Ａ＊０２およびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１から選択されるテンプレートペプチドの使用。
【請求項２６】
ＭＨＣ分子を製造するための、および／またはＭＨＣ分子のペプチド交換における、上昇した温度でＭＨＣ分子から解離するテンプレートペプチドが前記ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合しているＭＨＣ分子の使用であって、前記ＭＨＣ分子は好ましくはヒトＨＬＡ−Ａ分子であり、好ましくは前記ヒトＨＬＡ−Ａ分子はＨＬＡ−Ａ＊０２およびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１から選択されるＭＨＣ分子の使用。
【請求項２７】
望ましいペプチド（または望ましいペプチド−ＭＨＣ複合体）を認識するＴ細胞の検出のための、請求項１６に記載のＭＨＣ分子、または請求項１〜１５のいずれかに従って得られるＭＨＣ分子を含む組成物の使用。
【請求項２８】
１０℃未満、０℃未満、−２０℃未満の順で好ましい温度で保存される組成物であって、１５℃以上の温度でＭＨＣ分子から解離するテンプレートペプチドが前記ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合しているＭＨＣ分子を含み、好ましくは、ＮａＣｌ、好ましくは１００〜６００ｍＭ  ＮａＣｌ，より好ましくは２５０〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび／またはグリセロール、好ましくは１〜５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、好ましくは５〜１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロールをさらに含み；好ましくは前記ＭＨＣ分子が多量体であり、前記ＭＨＣ分子は好ましくはヒトＨＬＡ−Ａ分子であり、好ましくは前記ヒトＨＬＡ−Ａ分子はＨＬＡ−Ａ＊０２およびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１から選択される組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
免疫監視は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球への提示のための細胞内ペプチドを結合する主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣ  Ｉ）複合体によって媒介される。自己と外来とを区別するこの能力は、適応免疫に必須であり、それを行えないと、自己免疫疾患が生じ得る。生涯の間、ヒトは、ウイルスなどの病原体による連続攻撃の下にある。ウイルスが症状を起こすことなく潜伏状態を持続するが、時に再活性化する場合、それらの一部は、終生感染を確立する。再発感染を引き起こすそのようなウイルスの１つのクラスがヘルペスウイルスである１。
【背景技術】
【０００２】
通常、再活性化は、ウイルス抗原の認識時にＴ細胞によって感染が迅速に明らかにされることから、疾患をもたらさない。しかしながら、移植との関連で、患者が免疫不全である場合、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）などのヘルペスウイルスの再活性化は、深刻な健康上の脅威を生じ得る２、３。したがって、移植レシピエントのＴ細胞数をモニターして、患者が感染を免れている可能性が高いかどうか、または介入が必要かどうかを予測することが重要である。
【０００３】
適応免疫システムは、利益をもたらし得る。細胞免疫応答を抑制するかまたは促進することに向けられた免疫療法は、この１０年間にわたって大きく進んでいる。ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に対する抗体を含むいくつかの免疫チェックポイント阻害剤が、臨床用途に承認され、メラノーマ、非小細胞肺癌および腎臓細胞癌を含む種々の癌の治療において著しい応答を示している４−８。
【０００４】
チェックポイント阻害の結果、新抗原に対して誘発されたＴ細胞応答が顕著に増加し、癌細胞の致死を向上させる９、１０。免疫チェックポイントに向けられた治療と癌ミュータノームの情報との組み合わせは、個別化された癌治療において非常に有望である。したがって、免疫療法の成功に寄与する新抗原および他の提示した癌に特異的なエピトープを同定することは極めて重要である。
【０００５】
Ａｌｔｍａｎらによる１９９６年のそれらの最初の使用以来、蛍光色素で標識した抗原ペプチドで満たしたＭＨＣ単量体のＭＨＣ多量体−オリゴマーが、フロー・サイトメトリーによる抗原に特異的なＴ細胞の分析およびモニタリング用の最も広く使用される試薬であり続けている１１。
【０００６】
しかしながら、多量体生成は、例えば、ＭＨＣ  Ｉ重鎖およびβ２−ミクログロブリンの細菌中の発現、望ましいペプチドによるリフォールディング、精製、ビオチニル化および多量体化を含む多くの時間がかかるステップを伴う１１。最初に、すべてのこれらのステップは、空のＭＨＣ  Ｉ分子が不安定であることから、個別のペプチド−ＭＨＣ  Ｉ複合体ごとに行われる必要がある１２。
【０００７】
これは、ＭＨＣ  Ｉ分子を含むペプチド受容可能なＭＨＣ分子を自由自在に生成する方法の探索を促し、単一のインプットＭＨＣ  Ｉ−ペプチド複合体からの多数のＭＨＣ多量体の並行生産を可能にする。例えば、過ヨウ素酸塩または亜ジチオン酸を化学的なトリガーとして用いて、条件付きのリガンドをインサイチュで切断する技術、あるいはジペプチドを触媒として用い、その後、ペプチド残留物を、最適なペプチドで置換するように解離させることができる技術など、ＭＨＣ  Ｉでのペプチド交換に向けられたいくつかの技術が開発されている１３−１６。
【０００８】
代わりの方法としては、ＵＶ照射によって切断される光で開裂可能なペプチドでＭＨＣ単量体をリフォールディングし、その後、個別のペプチド残留物を解離させ、空のＭＨＣ  Ｉ分子を最適なペプチドで満たし、その後、多量体化し得る１７−１９。このアプローチは、多種多様なエピトープの発見および対応するＴ細胞のモニタリングを促進する１８、２０−２２。しかしながら、ＵＶ交換技術は、光で開裂可能なペプチドおよびＵＶ光源の使用を要する。ＵＶ暴露およびリガンド交換は、蛍光標識多量体と相性がよくなく、ビオチニル化ペプチドで満たしたＭＨＣ  Ｉ分子は、交換後にストレプトアビジンで多量体化することを要する。他の不利益としては、ＵＶ媒介の開裂による反応性ニトロソ種の生成およびＭＨＣ  Ｉおよび／または関連したペプチドの光損傷が挙げられ、一方で生じた熱が試料蒸発を引き起こす。
【発明の概要】
【０００９】
これに照らして、望ましいペプチドで満たしたＭＨＣ分子を提供するための更なる方法、生成物、組成物、および使用が望ましい。特に、望ましいペプチドで満たしたＭＨＣ多量体を生成する速く、柔軟で、効率的な方法が高度に望ましいが、未だに直ちに利用可能ではない。特に、ペプチド交換を用いてそのようなＭＨＣ多量体を提供できるようにする確実で、効率的で、再生可能な生成物、組成物、方法および使用が当分野で明らかに必要とされている。好ましくは、方法がＭＨＣ多量体で直接実施でき、ＭＨＣ分子のペプチド交換後の多量体化が必要でなくなることである。したがって、本発明の技術的課題は、上述した需要のいずれも満たすそのような生成物、組成物、方法および使用の提供にある。技術的課題は、特許請求の範囲および以下で特徴付けられる実施形態で解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明の実施形態を、添付の図面を参照して以下にさらに説明する。
【図１】温度誘導ペプチド交換が高親和性ペプチドおよび低親和性ペプチドを有するＭＨＣ  Ｉ複合体の生成を可能にすることを示す図である。（ａ）ＭＨＣ  Ｉ分子での温度誘導ペプチド交換の概略図。熱不安定性ＭＨＣ  Ｉ−ペプチド複合体は４°Ｃで安定であるが、熱攻撃下でアンフォールディングされ、分解される（上のパネル）。より高親和性のペプチドの添加によってＭＨＣ  Ｉが安定化し、その分解が妨げられる（下のパネル）。（ｂ）室温でゲル濾過クロマトグラフィーによって分析した温度誘導ペプチド交換の一次データ。ＭＨＣ  Ｉ−不安定ペプチド複合体（Ｈ−２Ｋｂ−ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ）および交換ペプチド（それぞれ０．５μＭおよび５０μＭ）を、示した温度で時点の範囲にわたってインキュベートした。以下の交換ペプチドを使用した：最適なバインダー：ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）；準最適バインダー：ＦＡＰＧＮＷＰＡＬまたはＦＡＰＧＮＹＰＡＡ．３つの代表的な実験のうちの１つを示す。（ｃ）ＨＰＬＣで測定した曲線の下の領域から交換効率を計算し、１時間の最適なペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬの結合に正規化した。３つの独立した実験からの平均値±ＳＤを示す。
【図２ａ】温度交換Ｈ−２Ｋｂ多量体効率的に染色する抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を示す図である。（ａ）単量体（最初に交換、上のパネル）または多量体（最初に多量体化、下のパネル）でのＭＨＣ  Ｉでのペプチド交換の概略図である。
【図２ｂ】温度交換Ｈ−２Ｋｂ多量体効率的に染色する抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を示す図である。（ｂ）ＯＴＩマウスから脾細胞のＭＨＣ  Ｉ多量体染色のドットプロット。インプットペプチドを、関連したペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、ＯＶＡ、上のパネル）または無関係のペプチド（ＦＡＰＧＮＹＰＡＬ、センダイウイルス、下のパネル）に３０分間、室温で交換する前、または交換した後に多量体を調製した。対照の多量体を、単量体でＵＶ媒介交換技術を用いて調製した後、多量体化した。３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。
【図２ｃ】温度交換Ｈ−２Ｋｂ多量体効率的に染色する抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を示す図である。（ｃ）Ｈ−２Ｋｂ−ＦＡＰＧＮＡＰＡＬの熱不安定性多量体が、３００ｍＭ  ＮａＣｌまたは１０％グリセロールの存在下、−８０°Ｃで保存した場合に、時間とともに安定している。Ｈ−２Ｋｂ−ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ多量体を解凍し、ＦＡＰＧＮＡＰＡＬを、染色ＯＴＩ脾細胞の染色前に、ＳＩＩＮＦＥＫＬに交換した。
【図３ａ】温度交換Ｈ−２Ｋｂ多量体は、ウイルス感染マウスからの抗原特異的なＴ細胞の染色に適していることを示す図である。（ａ）Ｈ−２Ｋｂ単量体での温度誘導ペプチド交換の一次データを、室温でゲル濾過クロマトグラフィーによって分析した。以下のペプチドを５分間、２０°Ｃで交換に使用した：ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）、ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ（センダイウイルス）、ＳＧＹＮＦＳＬＧＡＡＶ（ＬＣＭＶＮＰ２３８）、ＳＳＰＰＭＦＲＶ（ＭＣＭＶＭ３８）またはＲＡＬＥＹＫＮＬ（ＭＣＭＶＩＥ３）。２つの代表的な実験のうちの１つを示す。
【図３ｂ】温度交換Ｈ−２Ｋｂ多量体は、ウイルス感染マウスからの抗原特異的なＴ細胞の染色に適していることを示す図である。（ｂ）最適なペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）の結合に正規化したＨＰＬＣクロマトグラムからの曲線の下の領域から交換効率を計算した。２つの独立した実験からの平均値±ＳＤを示す。
【図３ｃ】温度交換Ｈ−２Ｋｂ多量体は、ウイルス感染マウスからの抗原特異的なＴ細胞の染色に適していることを示す図である。（ｃ）ペプチド交換をＨ−２Ｋｂ−ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ多量体で５分間、２０°Ｃで実施し、その後、多量体を使用して、ＬＣＭＶ感染マウスからのＰＢＭＣｓまたはＭＣＭＶ感染マウスからの脾細胞からの対応するＣＤ８＋Ｔ細胞を染色した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出されたパーセンテージは温度交換多量体と従来の多量体との間で同等であった。無関係のペプチド：ＦＡＰＧＮＹＰＡＬ（センダイウイルス）。２つの代表的な実験のうちの１つを示す。
【図４ａ】温度交換ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１多量体がウイルスに特異的なＴ細胞の染色に適していることを示す図である。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ単量体（ａ−ｂ）または多量体（ｃ）をＨＣＭＶ  ｐｐ６５−Ａ２／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、ＨＣＭＶ  ＩＥ−１−Ａ２／ＶＬＥＥＴＳＶＭＬ、ＥＢＶ  ＢＭＬＦ−１−Ａ２／ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ、ＥＢＶ  ＬＭＰ２−Ａ２／ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ、ＥＢＶ  ＢＲＬＦ−１−Ａ２／ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ  または  ＨＡｄＶ  Ｅ１Ａ−Ａ２／ＬＬＤＱＬＩＥＥＶと３時間、３２°Ｃで交換した。（ａ）単量体での交換を室温でゲル濾過クロマトグラフィーによって分析した。
【図４ｂ】温度交換ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１多量体がウイルスに特異的なＴ細胞の染色に適していることを示す図である。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ単量体（ａ−ｂ）または多量体（ｃ）をＨＣＭＶ  ｐｐ６５−Ａ２／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、ＨＣＭＶ  ＩＥ−１−Ａ２／ＶＬＥＥＴＳＶＭＬ、ＥＢＶ  ＢＭＬＦ−１−Ａ２／ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ、ＥＢＶ  ＬＭＰ２−Ａ２／ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ、ＥＢＶ  ＢＲＬＦ−１−Ａ２／ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ  または  ＨＡｄＶ  Ｅ１Ａ−Ａ２／ＬＬＤＱＬＩＥＥＶと３時間、３２°Ｃで交換した。（ｂ）インプットペプチドに関する結合に正規化したＨＰＬＣクロマトグラムからの曲線の下の領域から交換の効率を計算した。２つの独立した実験からの平均値±ＳＤを示す。
【図４ｃ】温度交換ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１多量体がウイルスに特異的なＴ細胞の染色に適していることを示す図である。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ単量体（ａ−ｂ）または多量体（ｃ）をＨＣＭＶ  ｐｐ６５−Ａ２／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、ＨＣＭＶ  ＩＥ−１−Ａ２／ＶＬＥＥＴＳＶＭＬ、ＥＢＶ  ＢＭＬＦ−１−Ａ２／ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ、ＥＢＶ  ＬＭＰ２−Ａ２／ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ、ＥＢＶ  ＢＲＬＦ−１−Ａ２／ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ  または  ＨＡｄＶ  Ｅ１Ａ−Ａ２／ＬＬＤＱＬＩＥＥＶと３時間、３２°Ｃで交換した。（ｃ）その後、交換した多量体を特異的なＴ細胞クローンまたはＴ細胞株の染色に使用した。多量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出されたパーセンテージは、温度交換多量体と従来の多量体との間で同等であった。２つの代表的な実験のうちの１つを示す。
【図５】同種幹細胞移植受容者の末梢血液中のＨＣＭＶに特異的なＴ細胞およびＥＢＶのモニタリングに使用した温度交換多量体使用した温度交換多量体を示す図である。同種幹細胞移植から採取した末梢血液試料を、ウイルスＤＮＡ負荷に関係するウイルスに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞（灰色）について分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞集団内のＨＣＭＶに特異的なＴ細胞およびＥＢＶに特異的なＴ細胞の頻度を、フロー・サイトメトリーによってを分析した、温度交換（暗色）および従来の（光の色）ＭＨＣ  Ｉ多量体染色を用いて決定した。同じ日に実施した２つの実験からの平均値±ＳＤを示す。
【図６】温度誘導ペプチド交換の温度範囲の決定を示す図である。ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体の熱変性を重心平均蛍光（ｂａｒｙ−ｃｅｎｔｒｉｃ  ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ＢＣＭ，黒色）によって測定した。ＢＣＭ（赤色）の一次導関数への適合は、最大値とし融点、Ｔｍを示す：Ｈ−２Ｋｂ−ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＬＫＥＰＶＨＧＡ、およびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＡ．４つの代表的な実験のうちの１つを示す。融点は４つの独立した実験からの平均値±ＳＤである。
【図７】ＩＡＫＥＰＶＨＧＶペプチドとの複合体でのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１が温度誘導交換に最も適していることを示す図である。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＬＫＥＰＶＨＧＡ、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶおよびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＡ複合体を、示した温度および時間で、高親和性ペプチド（ワクシニアウイルスエピトープＷＬＩＧＦＤＦＤＶ）と交換した。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を０．５μＭの濃度で使用し、交換ペプチドを、５０μＭの濃度で使用した。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＬＫＥＰＶＨＧＶおよびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＬＫＥＰＶＨＧＡは室温で安定したままであるが、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶおよびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＡ複合体は室温で不安定であり、したがって、交換に適している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
本明細書におけるセクションの見出しは、構成のためのみであり、発明の主題を制限するものではない。
【００１２】
この開示の一部は、著作権保護をうけるもの（略図、デバイス写真、または著作権保護がいずれの管轄で利用可能であるか、利用可能であり得るこの提出のいずれの他の態様などがあるがこれらに限定されない）を含む。著作権所有者は、特許庁の特許書類または記録に表れる場合には、特許文献または特許開示の誰でも、複写に異議を持たなが、それ以外の場合はすべての著作権を留保する。
【００１３】
本発明の方法、組成物、使用および他の態様に関する様々な用語が明細書および特許請求の範囲全体で使用されている。そのような用語は、特段の指示がない限り、本発明が関係する分野でのそれらの通常の意味をもつ。他の具体的に定義した用語は、本明細書に記載の定義と一致するものと解釈すべきである。本明細書に記載のものと類似または等価ないずれの方法および材料も本発明の試験のための実施に使用できるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載されている。
【００１４】
本発明において、以下の用語を下記で定義する。
【００１５】
単数形「Ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の明示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞」の参照は、２つ以上の細胞の組み合わせなどを含む。
【００１６】
本明細書で、「約」は、値または質量の量、重量、時間、容積、濃度またはパーセンテージを参照する場合、特定の量からの、一部の実施形態では±２０％、一部の実施形態では±１０％、一部の実施形態では±５％、一部の実施形態では±１％、一部の実施形態では±０．５％、および一部の実施形態では±０．１％の差を、そのような差が開示された方法を実施するのに適切である場合、含むものとする。
【００１７】
本明細書で、範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで表すことができる。本明細書に多くの値が開示され、それぞれの値が、それ自体の値に加えて「約」その特定の値としても開示されていることも理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。２つの特定の単位の間のそれぞれの単位も開示されていると理解される。例えば、１０および１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も開示されている。
【００１８】
「および／または」は、述べられているケースの１つ以上が、単独または述べられているケースの少なくとも１つとの組み合わせで、最大述べられているケースのすべてが生じ得る状況を指す。
【００１９】
本明細書で、「少なくとも」特定の値は、特定の値以上であることを意味する。例えば、「少なくとも２」は、「２以上」、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５などと同じであると理解される。本明細書で、「最大」特定の値は、特定の値以下を意味する。例えば、「最大５」は、「５以下」、すなわち、５、４、３,−１０、−１１などと同じであると理解される。
【００２０】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的およびオープンエンドであると解釈され、および排他的なものではない。具体的に、用語およびそのバリエーションは、特有の特徴、ステップまたは構成要素が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップまたは構成要素の存在を除くものと解釈されるべきではない。それは、より限定する「からなる」も包含する。
【００２１】
「従来の技術」または「当業者に既知の方法」は、本発明の方法に使用されている従来の技術の実施方法が当業者に明らかである状況を指す。分子生物学、生物化学、細胞培養、ゲノミクス、配列決定、医療、薬理学、免疫学および関連分野における従来の技術の実務は当業者に周知である。
【００２２】
「典型的な」は、「例または例示としての機能を果たす」ことを意味し、明細書に開示されている他の構成を除くものと解されるべきではない。
【００２３】
全体で使用される一般的なアミノ酸略語は以下を示す。
Ａｌａ    Ａ    アラニン
Ａｒｇ    Ｒ    アルギニン
Ａｓｎ    Ｎ    アスパラギン
Ａｓｐ    Ｄ    アスパラギン酸（アスパラギン酸塩）
Ｃｙｓ    Ｃ    システイン
Ｇｌｎ    Ｑ    グルタミン
Ｇｌｕ    Ｅ    グルタミン 酸（グルタミン酸塩）
Ｇｌｙ    Ｇ    グリシン
Ｈｉｓ    Ｈ    ヒスチジン
Ｉｌｅ    Ｉ    イソロイシン
Ｌｅｕ    Ｌ    ロイシン
Ｌｙｓ    Ｋ    リシン
Ｍｅｔ    Ｍ    メチオニン
Ｐｈｅ    Ｆ    フェニルアラニン
Ｐｒｏ    Ｐ    プロリン
Ｓｅｒ    Ｓ    セリン
Ｔｈｒ    Ｔ    トレオニン
Ｔｒｐ    Ｗ    トリプトファン
Ｔｙｒ    Ｙ    チロシン
Ｖａｌ    Ｖ    バリン
Ａｓｘ    Ｂ    アスパラギン酸またはアスパラギン
Ｇｌｘ    Ｚ    グルタミンまたはグルタミン 酸
Ｘａａ    Ｘ    いずれのアミノ酸（時に、いずれのアミノ酸も指すのに使用される）。
【００２４】
本明細書で「ＭＨＣ分子」ＭＨＣ単量体および／または多量体の両方、例えば１つ以上のＭＨＣ分子のいずれのオリゴマー形態を指す。本明細書に記載されている多量体は、非共有相互作用の領域を介して互いに結合する少なくとも２つのメンバーを含む多量体のタンパク性分子（多量体）であり、前記少なくとも２つのメンバーの少なくとも１つは、（ポリ）ペプチド鎖を含む。本明細書で単量体は、すべての非共有結合が壊れる際に、構成単位が依然として互いと共有結合している分子を指す。多量体における２つ以上の単量体は、互いに同じであっても、異なっていてもよい。したがって、ＭＨＣ多量体は、ＭＨＣ二量体、ＭＨＣ三量体、ＭＨＣ四量体、ＭＨＣ五量体、ＭＨＣ六量体、ＭＨＣ十量体に加えて、有機分子、細胞、膜、ポリマーおよび２つ以上のＭＨＣ−ペプチド複合体を含む粒子を含む。
【００２５】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の複合体は、抗原ペプチド受容体として機能し、ＭＨＣ−ペプチド複合体がＴリンパ球によって認識できる場合に、細胞内にペプチドを回収し、細胞表面へ輸送する。ヒトＭＨＣは、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）複合体（多くの場合、単にＨＬＡ）とも呼ばれる。マウスＭＨＣは、Ｈ−２複合体またはＨ−２と呼ばれる。ＭＨＣは、ヒト免疫システムにおいて極めて重要な役割を果たし、この天然の防御システムを促進し、病原体または悪性腫瘍に対する免疫を高める多数の戦略が開発されている。ＭＨＣクラスＩ分子、特にＨＬＡ−Ａ分子などのＭＨＣ分子が、特異的なＴ細胞集団を同定し、定量化し、疾患に関係する細胞免疫を評価するための有益なツールである。ＨＬＡ−Ａ分子は、ＭＨＣクラスＩ分子に属し、多くの場合、「ＨＬＡ−ＡクラスＩ」または「ＨＬＡ−ＡＩ」分子と称される。また、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ分子に加えて、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ分子も含み、これらも免疫システムにおいて重要な役割を果たす。ＭＨＣ複合体は、免疫モニタリングに用いられ、病原体または悪性腫瘍に対する細胞免疫療法に特異的なＴ細胞を単離するのに適用され得る。また、ＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞媒介疾患において望ましくない特定のＴ細胞集団を選択的に除くのにも使用され得る。
【００２６】
ＭＨＣ分子の２つのサブタイプ、ＭＨＣクラスＩおよびＩｌ分子が存在する。これらのサブタイプは、Ｔリンパ球の２つのサブセット：１）ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されたペプチド（すなわち、ＭＨＣのペプチド結合溝に結合したペプチド）を通常認識し、感染細胞または変異細胞を死滅させるＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞、および２）ＭＨＣクラスＩｌ分子によって提示されたペプチド（すなわち、ＭＨＣのペプチド結合溝に結合したペプチド）を通常認識し、免疫システムの他の細胞の応答を制御するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に対応する。
【００２７】
様々な比較的不変のＭＨＣクラスＩ分子様分子が同定されている。この群は、ＣＤ１ｄ、ＨＬＡ  Ｅ、ＨＬＡ  Ｇ、ＨＬＡ  Ｈ、ＨＬＡ  Ｆ、ＭＩＣ  Ａ、ＭＩＣ  Ｂ、ＵＬＢＰ−１、ＵＬＢＰ−２、およびＵＬＢＰ−３を含む。ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃはヒトで発見されたＭＨＣクラスＩ分子であり、マウスのＭＨＣクラスＩ分子は、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２ＤおよびＨ−２Ｌと称されている。ＨＬＡ−ＡクラスＩ分子は、免疫システムにおいて中心的な役割を果たし、ほぼすべての有核細胞の表面に発現されている。したがって、ＨＬＡ−Ａ分子は、特に、ヒト研究およびヒトに向けられた薬の開発にとって価値のあるツールである。より詳細には、ＨＬＡ−Ａは、免疫モニタリングで使用され、癌などの種々の疾患または状態に関係する病原体または悪性腫瘍に対する細胞免疫療法に特異的なＴ細胞を単離するのに適用され得ることから、ＨＬＡ−Ａ分子は、特異的なＴ細胞集団を同定し、定量化し、ヒトの疾患に関係する細胞免疫を評価するのに好都合に使用できる。また、ＨＬＡ−Ａ複合体などのＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞媒介疾患の望ましくない特異的なＴ細胞集団を選択的に除くのにも使用され得る。
【００２８】
一般に、ＨＬＡ（例えばＨＬＡ−Ａ＊０２：０１などのＨＬＡ−Ａアレル）上での温度交換に適したペプチドの設計は、ささいな作業ではないと認められている。ヒトＨＬＡ  アレル、特にＨＬＡ−Ａアレル（例えばＨＬＡ−Ａ＊０２：０１）での温度交換に適したペプチドを発見することは、Ｈ−２ＫｂなどのマウスＭＨＣ  Ｉアレルのものよりも困難であることが見出された。この１つの理由は、マウスＭＨＣクラスＩ複合体と比較してヒトＭＨＣクラスＩ複合体の安定性が本質的に高いからである。
【００２９】
別の理由は、ヒトＨＬＡ  アレル（（例えばＨＬＡ−Ａ＊０２：０１などのＨＬＡ−Ａアレル）とマウスＭＨＣ  Ｉアレル（Ｈ−２Ｋｂなど）との間の一次アンカーと二次アンカーの相対的な位置づけである。例えば、ヒトＨＬＡ−Ａにおいて、一次アンカーは、ペプチドの２位に位置するが、マウスＭＨＣ  Ｉアレルにおいては、マウスアレルに依存するが、ペプチドの中間に位置する（例えば、同じペプチドＦＡＰＧＮＹＰＡＬは、Ｈ−２ＫｂおよびＨ−２Ｄｂに結合するが、第１のものには、Ｔｙｒで結合し、第２のものにはＡｓｎで結合する）（Ｇｌｉｔｈｅｒｏら（１９９９），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ.１０，Ｐａｇｅ６３−７４）。二次アンカーの位置については、ヒトＨＬＡ−Ａにおいてペプチドの中間に位置するが、マウスＭＨＣ  Ｉにおいては、ペプチドの３位に通常位置している。さらに、二次アンカーはすべてのペプチドで見られるものではない。
【００３０】
ＭＨＣ分子に応じて、ペプチドの結合を担うドメインは、異なる命名法を有する。典型的には、ペプチドの結合に関与するＭＨＣ分子の機能部分であるＭＨＣクラスＩ分子のα１およびα２ドメインで例示されるように、２つのドメインがペプチドの特異的な結合に必要とされる。ＭＨＣ分子は、典型的には、ペプチド結合に関与しない他のドメインを含有する。ＭＨＣ分子の例は、Ｇａｒｂｏｃｚｉ  ＤＮら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９２  Ａｐｒ  １５；  ８９（８）：３４２９−３３．）によって記載されたものであり得る。好ましい実施形態では、ＭＨＣ分子は、２つ以上のＭＨＣ単量体を含む多量体の形態である。
【００３１】
例えば、最も一般的に使用されるＭＨＣ多量体は四量体である。典型的には、これらは、例えば、典型的には真核または細菌性細胞において組み換え技術によって製造される可溶性ＭＨＣ単量体のビオチニル化によって製造される。これらの単量体は、ストレプトアビジンまたはアビジンなどのバックボーンに結合し、四価構造を生じる。
【００３２】
同種の単量体および可溶な形態、並びに修飾したＭＨＣ分子、例えば、ペプチドを有する単鎖タンパク質、１つのコンストラクトに融合した重鎖および軽鎖は、細菌に加えて真核細胞で製造されている。そのような形態も「ＭＨＣ分子」に含まれ、ペプチド結合ドメイン内にないか、またはＭＨＣ分子のペプチド結合ドメインの可変ドメイン内にある改変などの改変を含むＭＨＣ分子も同様に含まれる。これらの改変は、ＭＨＣ分子の結合特異性（すなわちペプチドが結合している）を変え得る。
【００３３】
「生体内」は、対象の体内で行われる事象を指し、「生体外」は、対象の体外で行われる事象を指す。例えば、生体外アッセイは、対象の外で行ったいずれのアッセイも包含する。生体外アッセイは、生存または死滅の細胞を採用している細胞ベースのアッセイを含む。生体外アッセイは、無傷の細胞を採用しない無細胞アッセイも含む。
詳細な説明
【００３４】
本明細書に記載されているいずれの方法、使用または組成物も、本明細書に記載されているいずれの他の方法、使用または組成物について実行できることが考えられる。本発明の方法、使用および／または組成物に関連して記載された実施形態は、本明細書に記載されているいずれの他の方法、使用または組成物について採用され得る。したがって１つの方法、使用または組成物に関する実施形態は、本発明の他の方法、使用および組成物に同様に適用され得る。
【００３５】
本明細書において具体化され、広く記載されているように、本発明は、ＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子、より詳細にはＨＬＡ−Ａ分子、両方の単量体に加えて多量体に、当分野で既知の方法の様々な不利益がない、速く、確実で、再生可能な方法を用いて、望ましいペプチド（例えば抗原ペプチド）を提供し得るという驚くべき発見に向けられている。
【００３６】
該方法では、ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子などのＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合しているテンプレートペプチドが、テンプレートペプチドを提供されたＭＨＣ分子の温度を上昇させ、テンプレートペプチドをＭＨＣ分子から解離させ、ＭＨＣ分子に望ましいペプチドを結合させることによって、望ましいペプチド（すなわち、ＭＨＣ分子によって表示したいペプチド）で交換され得る。
【００３７】
該方法は、望ましいペプチドで満たしたＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子などのＭＨＣ分子を高収量かつ高純度で得る高速プロトコールを提供する。
【００３８】
本発明の重要な態様は、ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子などのＭＨＣ分子が、テンプレートペプチドを用いて多量体の形態で提供され得、望ましいペプチドでの交換が多量体を用いて直接実施され得ることである。本発明の方法を用いれば、当分野の方法と対照的に、望ましいペプチドで満たした単量体の多量体化工程をなくし得る。
【００３９】
より詳細には、ＭＨＣクラスＩ分子、特にＨＬＡ−Ａ分子などのＭＨＣ分子を提供する改善されたペプチド交換技術が、低下した温度、例えば１０℃未満、例えば４°Ｃでの低い解離を有する低親和性ペプチドの設計によって提供され得、温度依存様式で、所定の外因性ペプチド（望ましいペプチド）に交換できることを見出した。
【００４０】
すなわち、本発明は、好都合に、ＭＨＣクラスＩ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子などのＭＨＣ分子を低下した温度で安定化させるのにテンプレートペプチドを使用し、ここで、上昇した温度でテンプレートペプチドを解離させ、それを望ましいペプチドで置換することによって、テンプレートペプチドを有するそのようなＭＨＣ分子に、望ましいペプチドを効果的に提供し得る。特に、これは、確実で、安定している、再生可能な方法を可能にする。該方法では、並行して、ＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子を、例えば、９６ウェルプレートシステムまたは同種のものを用いる一方で、テンプレートペプチドで満たした同じＭＨＣ分子を並行実験のそれぞれで用いて、異なる望ましいペプチドで満たし得る。
【００４１】
実際に、定義したペプチドを提供されたＭＨＣ分子の有効な応用の障害は、当分野での製造方法の困難性である。抗原が結合していない場合、ＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子、より詳細にはＨＬＡ−Ａ分子は不安定であることは周知である。したがって、これは、処理中に、望ましいペプチドが（既に）結合しているＭＨＣ分子を製造することを必要とする。先行技術の方法を用いて、このテンプレートペプチドの望ましいペプチドへの交換は、使用したテンプレートペプチドの解離が条件下ではゆっくりであるか、またはＭＨＣ分子を不安定化させることから、非常に非効率的である（ＢａｋｋｅｒＡＨらＣｕｒｒ  ＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌ．２００５  Ａｕｇ；１７（４）：４２８−３３も参照）。多量体生成によく使用される方法は、ＵＶ媒介ペプチド交換である。この方法では、ＭＨＣ単量体がＵＶ照射によって切断される光で開裂可能なペプチドでリフォールディングされ、その後、個別のペプチド残留物が解離し、空のＭＨＣ  Ｉ分子（例えばＨＬＡ−Ａ分子）が最適なペプチドで満たされ、その後、多量体化され得る。しかしながら、ＵＶ交換技術は、光で開裂可能なペプチドおよびＵＶ源の使用を必要とする。ＵＶ暴露およびリガンド交換は、蛍光標識多量体と相性がよくなく、ビオチニル化ペプチドで満たしたＭＨＣ  Ｉ分子は、交換後にストレプトアビジンで多量体化される必要がある。
【００４２】
本明細書に開示されている方法で、そのような技術困難を克服し得る。
したがって、本発明によれば、ＭＨＣ分子の製造方法が提供される。該方法は、
ａ．上昇した温度で前記ＭＨＣ分子から解離するテンプレートペプチドがＭＨＣ分子のペプチド結合溝においてそれに結合している、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子、より好ましくはＨＬＡ−Ａ分子を低下した温度で提供するステップと；
ｂ．温度を上昇した温度に変更して、前記ＭＨＣ分子からテンプレートペプチドを解離させるステップと；
ｃ．望ましいペプチドが前記ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合できる条件下で、前記ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合する望ましいペプチドとＭＨＣ分子を前記上昇した温度で接触させるステップと、を含む。
【００４３】
該方法では、ステップａ）において、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝にテンプレートペプチドが提供されているＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子などのＭＨＣ分子が提供される。充填したテンプレートペプチドは、ペプチド結合溝によってＭＨＣ分子と結合しているか、結びついている。ステップａ）において、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝においてテンプレートペプチドがそれに結合しているＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子は、ＭＨＣ分子およびテンプレートペプチドが安定している、すなわち、テンプレートペプチドがＭＨＣ分子から解離していないか、またはＭＨＣ分子の不安定性から、適切に折り畳まれたＭＨＣ分子の実質的な喪失（例えば、全体の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％より多い喪失）がある程度でＭＨＣ分子から解離していない温度で提供される。そのような温度は、「低下した温度」と本明細書において称され得る。これに対して、本明細書において称されている「上昇した温度」は、テンプレートペプチドがＭＨＣ分子から解離する温度を示す。ＭＨＣ分子と結合可能ないずれの望ましいペプチド（すなわちＭＨＣ分子にとって望ましいリガンド）がないと、上昇した温度では、このことによってＭＨＣ分子が不安定になり、ＭＨＣ分子がもはや適切に折り畳まれなくなる。それは、ＭＨＣ分子を折りたたまず、沈殿させる。
【００４４】
好ましい実施形態では、ステップａ）のＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ａ分子（いずれの適したＨＬＡ−Ａ分子）である。さらに好ましい実施形態では、ＨＬＡ−Ａ分子はＨＬＡ−Ａ＊０２およびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１から選択され得る。
【００４５】
テンプレートペプチドは、例えば望ましいペプチドに対して、典型的には、低下した温度で解離が低い（上昇した温度で解離が高い）低親和性ペプチドであり、温度に依存して所定の外因性ペプチド（望ましいペプチド）に交換され得る。
【００４６】
本発明の中で、上昇した温度でＭＨＣ分子から解離するテンプレートペプチドがＭＨＣ分子のペプチド結合溝においてそれに結合している、ＨＬＡ−Ａ分子などのＭＨＣ分子を、例えば、実施例に記載されているそのような方法を用いて、例えば、Ｔｏｅｂｅｓら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８．１６．１−１８．１６．２０，２００９）に記載のそのような方法を用いて、単量体および多量体の両方について、どのように調製するのかを当業者であれば理解する。
【００４７】
次のステップにおいて、テンプレートペプチドが結合しているＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子の温度を、上昇した温度に上昇させる。ことが見出された好ましくは、温度を、徐々に、段階的に、例えば、ステップごとに１０秒〜６０秒、好ましくは約３０秒の温度安定化がある０．０５〜５℃ステップ勾配、好ましくは約１°Ｃステップ勾配を用いて、上昇させ得る。
【００４８】
別の実施形態では、テンプレートペプチドを有するＭＨＣクラスＩ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子などのＭＨＣ分子を、上昇した温度に直接、温度勾配を用いずに、すなわち１つのステップで、例えば、テンプレートペプチドを有するＨＬＡ−Ａ分子などのＭＨＣ分子を上昇した温度の条件下に置くことによって、曝しうることも見出された。
【００４９】
このステップが、単量体を用いても、多量体を用いても（例えば、少なくとも２つのＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子を含む複合体を用いても）良好に実施し得ることを驚くべきことに見出した。
【００５０】
どちらにしても、テンプレートペプチドを有するＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子の温度を低下した温度から上昇した温度にし、それによって、ＭＨＣ分子からのテンプレートペプチドの解離を引き起こす。
【００５１】
本発明の方法の次の部分は、ＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子を、前記ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合する望ましいペプチドと上昇した温度で、望ましいペプチドが前記ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合できる条件下で接触させるステップを含む。
【００５２】
当業者であれば、望ましいペプチドが、ＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子と上昇した温度で結合することが期待されるペプチドである一方で、同時に、テンプレートペプチドが、ＭＨＣ分子から解離し、テンプレートペプチドを望ましいペプチドで効果的に置き換えることを理解する。
【００５３】
望ましいペプチドは、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合し得るか、ＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子と結合し得る限りいずれのペプチドでもあり得る。
【００５４】
実際に、例えば、ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子である場合、テンプレートペプチドおよび／または望ましいペプチドは、約７〜約１２個のアミノ酸、好ましくは８、９または１０個のアミノ酸を含むか、あるいはＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩＩ分子である場合、テンプレートペプチドおよび／または望ましいペプチドは、約１５〜３０個のアミノ酸を含む。
【００５５】
望ましいペプチドは、例えば、新抗原の抗原／エピトープを含む、既知であるか、予想されるか、または未知である抗原ペプチドであり得る。
【００５６】
テンプレートペプチドを有するＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）が、上昇した温度がＭＨＣ分子に加えられると望ましいペプチドと接触するかどうか、または上昇した温度を加える前に、例えばテンプレートペプチドを有するＭＨＣ分子を望ましいペプチドと低下した温度で、または温度勾配中に、例えば本明細書の他の箇所に記載されているように既に接触させることによって、テンプレートペプチドで満たしたＭＨＣ分子に既に提供されることに関して、本発明は特に限定されない。
【００５７】
好ましくは望ましいペプチドは最初にＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）と接触し、テンプレートペプチドがＭＨＣ分子から解離しない条件下でテンプレートペプチドで満たされ、その後、温度を上昇した温度にする。そのような実施形態では、ステップｂ）およびｃ）は同時に実施される。
【００５８】
当業者であれば、望ましいペプチドは、特に上昇した温度で、使用したテンプレートペプチドよりもＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子に対する親和性が高いことを理解する。上昇した温度で、テンプレートペプチドは高い解離を有する一方で、望ましいペプチドは（より）低い解離を有する。
【００５９】
ＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子と望ましいペプチドとを接触させる期間は、特に限定されず、当業者によって理解されるように、使用したＭＨＣ分子（例えばＨＬＡ−Ａ分子の場合）、テンプレートペプチドおよび望ましいペプチドに依存し得る。当業者であれば、温度および接触期間の両方をどのように最適化するか理解する。しかしながら、一部の実施形態では、ステップｂ）またはステップｂ）およびｃ）を、１分〜６時間、２分〜３時間、５分〜１８０分、例えば約２分、５分、１０分、２０分、５０分、６０分、９０分、１８０分、２７０分またはそれ以上実施するのがこの順で好ましい。
【００６０】
特許請求の範囲に記載されている一般原則を考慮して、本発明は「低下した温度」および「上昇した温度」について特に限定されないが、一部の実施形態によれば、低下した温度は、１０℃以下の温度であるか、かつ／または上昇した温度は１５℃以上の温度であり、好ましくは低下した温度は４℃以下であるか、かつ／または上昇した温度は２０℃〜４０℃である。
【００６１】
例えば、本発明の実施形態では、低下した温度は、１１℃以下、９℃以下、８℃以下、６℃以下、または４℃以下の温度であることがこの順で好ましい。好ましくは低下した温度は、−１０℃超、−５℃超、−１℃超、または０℃超である。例えば、テンプレートペプチドを有するＭＨＣ分子は、ステップａ）において、氷上で提供され得る。
【００６２】
一部の好ましい実施形態では、低下した温度は、０℃〜１０℃、０℃〜８℃、０℃〜６℃、または０℃〜４℃であることがこの順で好ましい。
【００６３】
例えば、本発明の実施形態では、上昇した温度は、１７℃以上、２０℃以上、２２℃以上、２５℃以上、２８℃以上、３０℃以上、３２℃以上、３５℃以上、３７℃以上、４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、または６０℃以上である。例えば、テンプレートペプチドを有するＭＨＣ分子は室温（例えば１８℃〜２２℃）に置かれ得る。
【００６４】
好ましくは、上昇した温度は、６５℃未満、６０℃未満、５５℃未満、５０℃未満、４５℃未満または４０℃未満であることがこの順で好ましい。
【００６５】
一部の好ましい実施形態では上昇した温度は、１５℃〜６０℃、１７℃〜５０℃、２０℃〜４５℃、または２２℃〜４０℃であることがこの順で好ましい。
【００６６】
望ましいペプチドでのテンプレートペプチドの交換が、前記低下した温度と前記上昇した温度との差が少なくとも５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、または３０℃、例えば５℃〜５０℃、８℃〜４０℃または１０℃〜３０℃である場合に好都合に実施できることが見出された。
【００６７】
上昇した温度が、望ましいペプチドがＭＨＣ分子と結合し得る速度で、テンプレートペプチドがＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）から解離する温度であることを当業者であれば理解する。説明を必要とはしないが、上昇した温度が、望ましいペプチドがＭＨＣ分子（好ましくはＨＬＡ−Ａ分子）と効果的に結合できるようにするには高すぎて、ＭＨＣ分子を不安定にする温度ではない。実際に、一部の実施形態では、特に、相対的に低い親和性を有する望ましいペプチドを使用する場合には、上昇した温度、すなわち、望ましいペプチドでのテンプレートペプチドの交換が実施される温度はできる限り低い（すなわちテンプレートペプチドが依然として解離しているべきであり、望ましいペプチドが依然として結合しているべきである）ことが好ましい。
【００６８】
例えば、テンプレートペプチドが結合しているＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子は、望ましいペプチドの非存在下で増加して変性し、好ましくはテンプレートペプチドが結合しているＭＨＣ分子の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％が望ましいペプチドの非存在下で変性する。
【００６９】
本発明の方法を用いて、望ましいペプチドが、上昇した温度で、テンプレートペプチドの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％置換し得ることがこの順で好ましいことが見出された。
【００７０】
テンプレートペプチドが、上昇した温度で、ＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子から９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％解離することがこの順で好ましいことが見出された。
【００７１】
同時に、本発明の方法を用いて、交換中に、適切に折り畳まれたまたは機能するＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ分子、特にＨＬＡ−Ａ分子など）の喪失を低減し得るか、または防ぎ得ることが見出された。すなわち、望ましいペプチドで満たした、多量体を含む高収量のＭＨＣ分子（特にＨＬＡ−Ａ分子）を得ることができる。例えば、（適切に折り畳まれた）ＭＨＣ分子（例えば、テンプレートペプチドで満たしたＨＬＡ−Ａ分子）の初期の量または数の約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、７％、６％、５％、４％、３％または２％未満の喪失を達成し得る。すなわち、（適切に折り畳まれた）ＭＨＣ分子（例えば、テンプレートペプチドで満たしたＨＬＡ−Ａ分子）の初期の量または数に対して約７０％、７５％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％の収率を達成し得る。
【００７２】
本発明の実施形態では、望ましいペプチドが、テンプレートペプチドが結合しているＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子より過剰に、好ましくは、少なくとも約５倍、１０倍２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍モル過剰に、ステップｃ）で提供される。そのようなモル過剰で提供することによって、高収量の適切に交換したＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子、（多量体を含む）が得られることが見出された。
【００７３】
同時に、使用されるインプットペプチド（テンプレートペプチドに加えて導入される望ましいペプチド）が、好ましくは事前に実質的に純粋であり（例えば、別のペプチド、特に、意図されたインプットペプチドよりＭＨＣ分子（好ましくはＨＬＡ−Ａ分子）に対する親和性が高い別のペプチドを、１％（ｗ／ｗ）、０．９％（ｗ／ｗ）、０．８％（ｗ／ｗ）、０．７％（ｗ／ｗ）、０．６％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）、０．４％（ｗ／ｗ）、０．３％（ｗ／ｗ）未満含むことがこの順で好ましい）、例えば、純粋である（０．１〜０．０（ｗ／ｗ））ことが見出された。実際に、ＭＨＣ分子（例えばＭＨＣ重鎖）と比較して大過剰のペプチドが使用されることから、少量の不純物が、ＭＨＣ、例えばＭＨＣ  Ｉの大部分の不適切なリフォールディングをもたらし得る。いくつかの実験では、意図されたインプットペプチドよりＭＨＣ（好ましくはＨＬＡ−Ａ）に対する親和性が高いペプチドを有するそのような不純物は、もはや交換できないペプチド−ＭＨＣ複合体の安定したバッチをもたらし得ることが見出された。
【００７４】
ここで説明したように、本発明の方法は、ＭＨＣ単量体（ＭＨＣクラスＩ単量体、好ましくはＨＬＡ−Ａ単量体など）を用いて適用され得るが、好ましくは、ＭＨＣ多量体（ＭＨＣクラスＩ多量体、好ましくはＨＬＡ−Ａ多量体など）を用いて適用され得る。後者の場合、テンプレートペプチドで満たしたＭＨＣ多量体がステップａ）において提供され、ステップｂ）およびｃ）がそのような多量体を用いて直接実施され得、重要なことは、ＭＨＣ単量体の多量体化の追加のステップを必要としないことである。実際に、ステップａ）において、ＭＨＣ単量体（好ましくはＨＬＡ−Ａ単量体）が提供され、ステップｂ）およびｃ）がそのような単量体を用いて実施される場合に多量体が望ましい（好ましくはＨＬＡ−Ａ多量体）場合、ステップｃ）の後に、単量体を、例えば当分野で既知の方法を用いて、多量体化処理することが必要である。
【００７５】
したがって、本発明の方法の非常に好ましい実施形態では、上昇した温度でＭＨＣ分子から解離するテンプレートペプチドがＭＨＣ分子のペプチド結合溝においてそれに結合しているステップａ）のＭＨＣ分子（ＭＨＣ  Ｉ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）は、多量体の形態（好ましくはＨＬＡ−Ａ多量体）である。多量体では、好ましくは、少なくとも１つ、２つ、３つまたはすべてのＭＨＣが、上昇した温度で解離するＭＨＣテンプレートペプチドのペプチド結合溝に結合している。一部の実施形態では、ＭＨＣ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子は、少なくとも２つのＭＨＣ分子（好ましくは２つのＨＬＡ−Ａ分子）を含む複合体の形態であり得る。
【００７６】
一部の実施形態では、ＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）、は、ＭＨＣ分子と、少なくとも１つの他の分子、好ましくは少なくとも１つの他のタンパク質、好ましくは少なくとも１つの他のＭＨＣ分子と、を含む複合体の一部である。ＭＨＣ分子（好ましくはＨＬＡ−Ａ分子）、テンプレートペプチドおよび／または望ましいペプチドは、例えば、蛍光の標識または発色団などの標識を含む化学的な部分の付加基を用いて、供給結合によって提供され得る。
【００７７】
一部の実施形態では、多量体は、ＭＨＣ二量体、ＭＨＣ三量体、ＭＨＣ四量体、ＭＨＣ五量体、ＭＨＣ六量体またはＭＨＣ十量体であり、ここで、ＭＨＣ分子は好ましくはＨＬＡ−Ａ分子である。例として、Ｉｍｍｕｄｅｘ（ｗｗｗ.ｉｍｍｕｄｅｘ.ｃｏｍ／／ａｂｏｕｔ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｅｘｔｒａｍｅｒ−ｄｅｓｃｒｉｐ.ａｓｐｘ）によって提供される多量体がある。
【００７８】
本発明は、いずれのタイプのＭＨＣ分子を用いて適用され得るが、ＭＨＣ分子が、哺乳類ＭＨＣ分子、ヒトＭＨＣ分子またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、ＭＨＣクラスＩ分子、ヒトＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ａ＊０２、またはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１（ＨＬＡ−Ａ＊０２はＨＬＡ−Ａ血清型群内のヒト白血球抗原血清型）であることがこの順で好ましいと考えられる。
【００７９】
特定の実施形態では、ＭＨＣ分子がマウス由来である場合、ＭＨＣ分子は好ましくはＨ−２Ｋｂである。
【００８０】
ステップａ）の、ＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子に提供されているテンプレートペプチドは、低下した温度ではＭＨＣ分子からの解離が低く、上昇した温度ではＭＨＣ分子から効果的に解離する特性を除いて、特に限定されないが、一部の好ましい実施形態では、テンプレートペプチドが、前記ＭＨＣ分子に対する既知のリガンドまたは抗原ペプチド／エピトープのアンカー残基の少なくとも１つ、２つ以上、好ましくは、アンカー残基の１つまたは２つの置換によって得られることが見出された。抗原ペプチドは、ペプチド上のそのようなアンカーアミノ酸とＭＨＣ分子の関連したドメインとの間の相互作用によってＭＨＣ分子に結合する。アンカー残基は当業者に既知であり、例えばＭＨＣクラスＩ（例えばＨＬＡ−Ａ）およびクラスＩＩの両方の結合ペプチドにおいて見られる。実際に、ＭＨＣ  Ｉ（例えばＨＬＡ−Ａ）およびクラスＩＩ分子は、Ｔ細胞エピトープを提示するために、ペプチド結合溝を特徴付ける非常に類似した構造に折り畳める。ＭＨＣ  Ｉ分子のペプチド結合溝は、１つの重鎖によって形成される２つのαヘリックスおよび８つのβ鎖から構成される一方で、ＭＨＣ  ＩＩは、異なる鎖からの２つのドメインを使用して、ペプチド結合溝を構築する。ペプチドは、ペプチド結合溝内のポケットに突出する一次および二次アンカー残基を介してＭＨＣ分子に結合する（ＬｉｕらのＭａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ：Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｐｅｏｔｉｄｅｓ；ＤＯＩ：１０．１００２／９７８０４７００１５９０２.ａ００００９２２.ｐｕｂ２参照）。大部分のＭＨＣ分子についてのアンカー残基およびモチーフが既知である（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  Ｈ  ら  （１９９９）  ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｔｉｆｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ５０（３−４）：２１３−２１９）。
【００８１】
既知のリガンドの１つ、２つ以上のアンカー残基を置き換えることによって、本発明の方法に用いるテンプレートペプチド適したペプチドが得られ得る。好ましくは、本発明に従う方法に用いるテンプレートペプチドは、より小さいアミノ酸に対する既知の親和性を有する既知のリガンドの１つまたは複数のアンカー残基の置換によって得られる。当業者であれば、本発明に関連するより小さいアミノ酸が何であるかを理解する。一般に、アンカーアミノ酸が大きいほど、そのＭＨＣとの相互作用が大きくなる。本発明の中で、アミノ酸のサイズを小さくすると、ＭＨＣ（好ましくはＨＬＡ−Ａ分子）との相互作用の量が減少し、テンプレートペプチドとして適したペプチドを提供し得ることが見出された。一部の実施形態では、置換は、同じ機能のアミノ酸群（例えば疎水性、または帯電した）内である。
【００８２】
例えば、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶでは、本明細書の実施例で使用されているように、２位のアンカー残基Ｌおよび９位のＶは両方とも疎水性である。アミノ酸のサイズ（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ.ｍｂｉ.ｕｃｌａ.ｅｄｕ／ｓａｗａｙａ／ｍ２３０ｄ／Ｍｏｄｅｌｂｕｉｌｄｉｎｇ／ａａｄｅｎｓｉｔｙ.ｐｎｇ）を考慮すると、アラニン（Ａ）が最も小さい疎水性アミノ酸であり、それ故に、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）の両方の良い代替であり、したがって、生じる良好なテンプレートペプチドがＩＡＫＥＰＶＨＧＶまたはＩＡＫＥＰＶＨＧＡである。代わりとしては、ロイシンをバリンと置換して、ＩＡＫＥＰＶＨＧＶまたはＩＡＫＥＰＶＨＧＡより親和性が高いと予測されるが、テンプレートペプチドとして適し得るペプチドＩＶＫＥＰＶＨＧＶまたはＩＶＫＥＰＶＨＧＡを生じ得る。
【００８３】
一実施形態では、特にＨＬＡ−Ａ＊０２：０１について、２位および／または９位（例えば長さ９個の既知のリガンドペプチドの場合）、あるいは２位および／または１０位（例えば長さ１０個の既知のリガンドペプチド場合）のアミノ酸（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  のＩｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｓｏｒｃｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｉｅｄｂ.ｏｒｇ／ＭＨＣａｌｌｅｌｅＩｄ／１４３）参照）がより小さいサイズのアミノ酸で置換される。公開日を基準として、類似の様式で、他のＨＬＡ−Ａ＊０２またはＨＬＡ−Ａ分子などの他のＭＨＣ分子のアンカー残基が、本発明に従う方法での使用に適したテンプレートペプチドを提供できるように同様に置換され得ることを当業者であれば理解する。本明細書の実施例で例示されているように、テンプレートペプチドと交換されるべき望ましいペプチドは（例えばペプチドのアミノ酸配列類似性に基づいて）テンプレートペプチドと関連している必要はなく、無関係の構造のものであり得る。
【００８４】
好ましい実施形態では、テンプレートペプチド（本明細書に開示の実施例で使用される）は、
ａ．配列番号１（ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ）、配列番号２（ＩＡＫＥＰＶＨＧＡ）または配列番号３（ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ）に示されるポリペプチド配列；または
ｂ．１、２、３、または４個のアミノ酸が置換されているか、欠失しているか、または挿入されている配列番号１または配列番号２または配列番号３に示されるポリペプチド配列
を含むポリペプチドである。
【００８５】
実施例に示すように、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ複合体、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＡ複合体またはＨ−２Ｋｂ−ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ複合体は、本発明の方法で適切に使用され得るテンプレートペプチドで満たしたＭＨＣ分子である。
【００８６】
当業者であれば、本発明の精神から逸脱することなく、配列番号１（ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ）、配列番号２（ＩＡＫＥＰＶＨＧＡ）または配列番号３（ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ）に示されるポリペプチド配列において、１、２、３または４個のアミノ酸が更に置換され得ることを理解する。
【００８７】
本発明の方法の主な利点は、テンプレートペプチドを提供されたＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）、特に多量体（好ましくはＨＬＡ−Ａ多量体）が、低い温度で保存され得るか（本明細書の他の箇所に記載されているように）、または本発明の方法の実施を進めるバルクで調製され得る。さらに、本発明の方法は、本明細書で詳細に記載されているように、望ましいペプチドの存在下で、低下した温度から上昇した温度に変えることのみ必要とする。本発明に従う方法のこれらの要素は、多くの望ましいペプチドについてのアッセイを並行して行うのに、例えば、マルチウェルシステムを用いるのに特に適したものとし、ここで、例えば、望ましいペプチドでのテンプレートペプチドの交換に対するそのような化合物の調節効果を調べるために、テンプレートペプチドを有するＭＨＣ分子（好ましくはＨＬＡ−Ａ分子）は、使用したウェルのそれぞれにおいて異なるペプチドと、種々のウェル中の異なる濃度の同じペプチドと、異なるペプチドの組み合わせと、ペプチドと更なる化合物との組み合わせと接触する。これは、テンプレートペプチドを有するＭＨＣ分子多量体である場合に特に好都合である。
【００８８】
ステップａ）において提供されたＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）、好ましくは多量体が製造され、低下した温度でテンプレートペプチドで満たされる本発明に従う方法も提供される。当業者であれば、多量体を含むそのようなＭＨＣ分子（好ましくはＨＬＡ−Ａ分子）を提供する方法をよく理解する。例えば、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝においてテンプレートペプチドがそれに結合しているＭＨＣ分子（好ましくはＨＬＡ−Ａ分子）がテンプレートペプチドの存在下、１０℃以下の温度でのＭＨＣ分子のリフォールディングによって提供される。
【００８９】
一部の実施形態では、方法は、いずれの細胞もない系で実施される。一部の実施形態では方法は生体外での方法である。
【００９０】
一部の実施形態では、方法は、前記望ましいペプチドの前記ＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）への結合を検出するステップをさらに含み、好ましくは、前記結合は、  前記望ましいペプチドと結合している標識を検出することによって検出され、好ましくは、前記望ましいペプチドは前記標識を含む。
【００９１】
そのような方法は、例えば診断目的に有用である。結合は、例えば、前記ＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）に関連して提示される前記ペプチドに特異的なＴ細胞受容体または抗体によって、様々な方法で検出され得る。結合は、好ましくは、望ましいペプチドと結合している標識を検出することによって検出される。これは、特異的な結合分子、例えば、標識したストレプトアビジンによって後に可視化し得るビオチンを用いてペプチドにタグを付けることによって実施し得る。
【００９２】
好ましい実施形態では、前記ペプチドは前記標識を含む。このように、前記ＭＨＣ−分子（ＭＨＣクラスＩ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）に結合したいずれのペプチドも直接検出され得る。結合の検出は、好ましくはスクリーニング目的で、好ましくはハイスループットで行われる。好ましいスクリーニング目的は、前記ペプチドの前記ＭＨＣ分子への結合に影響を与える化合物のスクリーニングである。例えば、試験ペプチドまたは小分子が、前記ペプチドの前記ＭＨＣ分子への結合と競合し得る。競合は、前記ペプチドの結合減少を検出することによって検出され得る。
【００９３】
同様に、類似の様式で、テンプレートペプチドの結合または解離は、前記テンプレートペプチドと結合している標識を検出することによって検出され得、好ましくは、前記テンプレートペプチドは前記標識を含む。
【００９４】
ここで説明したように、試験または参照化合物の存在下で前記望ましいペプチドの結合を決定する本発明の方法も提供される。
【００９５】
本発明の別の態様によれば、本明細書に開示されている方法で得られるＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）が提供される。本発明の方法を用いて得られるそのようなＭＨＣ分子と、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞と、を含む組成物も提供される。
【００９６】
温度が１５℃である場合に、好ましくは温度が１５℃〜４０℃である場合にＭＨＣ分子から解離するテンプレートペプチドがＭＨＣ分子のペプチド結合溝において１０℃以下の温度で結合しているＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）も提供される。
好ましくは１０℃以下の温度で、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝においてテンプレートペプチドがそれに結合しているＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）も提供され、ここで、テンプレートペプチドが、
ａ．配列番号１（ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ）、配列番号２（ＩＡＫＥＰＶＨＧＡ）または配列番号３（ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ）に示されるポリペプチド配列；または
ｂ．１、２、３、または４個のアミノ酸が置換されているか、欠失されているか、または挿入されている配列番号１または配列番号２または配列番号３に示されるポリペプチド配列
を含むポリペプチドである。
【００９７】
実施例に示すように、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ複合体、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＡ複合体またはＨ−２Ｋｂ−ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ複合体は、本発明の方法で適切に使用され得るテンプレートペプチドで満たしたＭＨＣ分子である。
【００９８】
当業者であれば、本発明の精神から逸脱することなく、配列番号１（ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ）、配列番号２（ＩＡＫＥＰＶＨＧＡ）または配列番号３（ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ）に示されるポリペプチド配列において、１、２、３または４個のアミノ酸をさらに置換し得ることを理解する。
【００９９】
好ましくは１０℃以下の温度で、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝においてテンプレートペプチドがそれに結合しているそのようなＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）を含む組成物も提供される。一部の実施形態では、組成物は更なるペプチドをさらに含み得、好ましくは、更なるペプチドは、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合可能な抗原ペプチド、例えば本明細書における望ましいペプチドである。一部の実施形態では、組成物は、ＮａＣｌ，好ましくは１００〜６００ｍＭ  ＮａＣｌ，より好ましくは２５０〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび／またはグリセロール、好ましくは１〜５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、好ましくは５〜１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロールをさらに含む。特にこれは、組成物が低い温度で（例えば０℃未満）で保存される組成物である場合に好都合である。したがって、１０℃未満、０℃未満、−２０℃未満の温度の順で好ましく保存される組成物も提供され、ここで、組成物は、１５℃以上の温度で、好ましくは温度が１５℃〜４０℃である場合にＭＨＣ分子から解離するテンプレートペプチドがＭＨＣ分子のペプチド結合溝において結合しているＭＨＣ分子（好ましくはＨＬＡ−Ａ分子）を含み、好ましくは、ＮａＣｌ，好ましくは１００〜６００ｍＭ  ＮａＣｌ，より好ましくは２５０〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび／またはグリセロール、好ましくは１〜５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、好ましくは５〜１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロールをさらに含み；好ましくはＭＨＣ分子が多量体である。
低下した温度でＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）と結合するが上昇した温度では結合しないテンプレートペプチドも提供される。一部の実施形態では、テンプレートペプチドが、
ａ．配列番号１、配列番号２または配列番号３に示されるポリペプチド配列；または
ｂ．１、２、３、または４個のアミノ酸が置換されているか、欠失しているか、または挿入されている配列番号１または配列番号２または配列番号３に示されるポリペプチド配列
を含むポリペプチドである
【０１００】
ＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）を製造するための、および／またはＭＨＣ分子（好ましくはＨＬＡ−Ａ分子）のペプチド交換における、上記のテンプレートペプチドの使用も提供される。
【０１０１】
ＭＨＣ分子を製造するための、および／またはＭＨＣ分子のペプチド交換における、上昇した温度でＭＨＣ分子から解離するテンプレートペプチドがＭＨＣ分子のペプチド結合溝においてそれに結合しているＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）の使用も提供される。
【０１０２】
望ましいペプチドを認識するＴ細胞の検出のための、本発明の方法を用いて得られる、ＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ分子など）を含む組成物の使用も提供される。
【０１０３】
当然ながら、本発明の実施形態の一態様に関して議論したすべての詳細、実施形態および好ましいものは、本発明のいずれの他の態様または実施形態に同様に適用することができ、したがって、すべてのそのような詳細、実施形態および好ましいものをすべての態様について別々に説明することを必要としない。
【０１０４】
概して本発明について説明したが、同じことが、以下の実施例を参照にすることによって、より容易に理解される。実施例は例示のためのものであって、本発明を限定することを意図したものではない。更なる態様および実施形態が当業者に明らかである。
【０１０５】
本明細書において使用される配列：
ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ（配列番号１）
ＩＡＫＥＰＶＨＧＡ（配列番号２）
ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ（配列番号３）
ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４）
ＦＡＰＧＮＷＰＡＬ（配列番号５）
ＦＡＰＧＮＹＰＡＡ（配列番号６）
ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ（配列番号７）
ＦＡＰＧＮＹＰＡＬ（配列番号８）
ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（配列番号９）
ＩＬＫＥＰＶＨＧＡ（配列番号１０）
ＷＬＩＧＦＤＦＤＶ（配列番号１１）
ＳＧＹＮＦＳＬＧＡＡＶ（配列番号１２）
ＳＳＰＰＭＦＲＶ（配列番号１３）
ＲＡＬＥＹＫＮＬ（配列番号１４）
ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１５）
ＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（配列番号１６）
ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号１７）
ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号１８）
ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ（配列番号１９）
ＬＬＤＱＬＩＥＥＶ（配列番号２０）
【実施例】
【０１０６】
実施例１  −  抗原に特異的なＴ細胞検出のためのＭＨＣ多量体での温度誘導ペプチド交換。
【０１０７】
一般導入
導入
我々は、多量体におけるペプチド交換のためのより速く、より簡便な技術の開発を設計した。我々は、そのような技術が、低下した温度で、例えば４°Ｃでの解離が低い低親和性ペプチドの設計によって提供され得、温度に依存して該ペプチドを所定の外因性ペプチドに交換し得ることを驚くべきことに見出した。我々は、Ｈ−２ＫｂおよびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１多量体、優性マウスおよびヒトＭＨＣアレルの代表それぞれについて概念実証を記載する。移植受容者の種々のウイルス再活性化に対するＴ細胞動態を測定する特別の目的のために使用し得る予め折り畳まれたＭＨＣ多量体でのペプチド交換を実施した。温度交換可能なＭＨＣ  Ｉ多量体は、エピトープ発見および免疫モニタリング用の簡便なツールを提供する。
【０１０８】
我々の技術は、免疫診断用ＭＨＣ多量体の製造；免疫モニタリング、エピトープに特異的なＴ細胞の単離、抗ウイルスまたは癌治療、または一般に、免疫システムの挙動および進化を調べるエピトープの同定に使用できる。
材料および方法
【０１０９】
ペプチド合成および精製
ＳｙｒｏＩおよびＳｙｒｏＩＩシンセサイザーを用いて、Ｎ−メチル−２−ピロリドン中の標準固相ペプチド合成によって、ペプチドを我々の研究室で合成した。アミノ酸および樹脂は、Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍから購入したものを使用した。ペプチドを、分取Ｗａｔｅｒｓ  Ｘ−ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラムを備えたＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステムを用いる逆相ＨＰＬＣによって精製した。移動相は、０．１％ＴＦＡを含有する水とアセトニトリルとの混合物からなっていた。ペプチドの純度および組成は、２７９５分離モジュール（Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＴ）および２９９６光ダイオードアレイ検出器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．Ｖ．）を備えたＷａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｇ２−ＸＳ  ＱＴｏｆ質量分光計を用いるＬＣ−ＭＳによって確認した。ＬＣ−ＭＳ試料を、水／アセトニトリルのグラジエントでＫｉｎｅｔｅｘＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，米国，ＣＡ）に流した。分析は、ＭａｓｓＬｙｎｘ４.１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて実施した。必要であれば、ペプチドを２回精製した。
【０１１０】
タンパク質発現および精製
以前に公開されたプロトコール２５に従って、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ  Ｉ）複合体を発現させ、リフォールディングした。Ｈ−２Ｋｂのリフォールディングした複合体を、AＫＴＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＮＧＣシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、アニオン交換（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８中０〜１Ｍ  ＮａＣｌ；リソースＱカラム）およびサイズ排除クロマトグラフィー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５１６／６００カラム）を用いて、２回精製した。アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した場合、サイズ排除のみを用いたのと比較して回収率が大幅に低いことが見られ、これは、ペプチドとイオン交換樹脂との間の強い相互作用によって生じた可能性がある。したがって、精製収率を最大化するために、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のリフォールディングした複合体を、サイズ排除クロマトグラフィー（３００ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８）のみを用いて精製した。精製した適切に折り畳まれた複合体を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心分離機フィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮し、必要な場合にはＢｉｒＡリガーゼを用いて直接ビオチニル化し、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて再び精製し、１２.５％グリセロールを有する３００ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、−８０°Ｃで更なる使用まで保存した。
【０１１１】
タンパク質アンフォールディング
異なるＨ−２Ｋｂ−およびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ペプチド複合体の熱アンフォールディングを、Ｏｐｔｉｍ１０００（ＡｖａｃｔａＡｎａｌｙｔｉｃａｌ社）機器を用いて決定した。ＭＨＣ  Ｉ−ペプチド複合体を、０．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）緩衝液またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で測定した。１°Ｃのステップ勾配で、それぞれのステップごとに３０秒、温度を安定化させて、試料を加熱した。アンフォールディングに続いて、２６６ｎｍでの励起後、３００〜４００ｎｍの範囲で、トリプトファン蛍光放射を測定した。重心蛍光を以下の等式に従って求めた：
【数１】
2021500387.tif 000003
【０１１２】
式中、ＢＣＭλは重心平均蛍光（ｎｍ）であり、Ｉ（λ）は所与の波長での蛍光強度であり、λは波長（ｎｍ）である。
以下の等式に従って、温度の関数として、重心蛍光を用いて融点（Ｔｍ）を計算した：
【数２】
2021500387.tif 000004
式中、ｍａｘは極大であり、
【数３】
2021500387.tif 000005
は温度の関数としての重心蛍光の一次導関数
【数４】
2021500387.tif 000006
である。
【０１１３】
分析を、Ｏｐｔｉｍ分析ソフトウェアｖ２.０（Ａｖａｃｔａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）を用いて実施した。
【０１１４】
ＭＨＣ  Ｉ単量体の多量体化
アロフィコシアニン（ＡＰＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）標識ストレプトアビジンを用いてＭＨＣ  Ｉ単量体を複合体化して、Ｔ細胞分析のための多量体を形成した。典型的には、温度易変性ペプチド−ＭＨＣ複合体を、氷上で、蛍光色素標識ストレプトアビジンを１分間隔で段階的に添加することによって、多量体化した。十分なビオチニル化は、ＨＰＬＣによって検証された。多量体のアリコートを１５％グリセロールを含有する１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７.５中で即座に凍結した。Ｔ細胞染色のためにＰＢＳ中の望ましいペプチドを解凍しながら多量体溶液に添加して、０．５μＭ  ＭＨＣおよび５０μＭペプチドの最終濃度を得た。
【０１１５】
温度媒介ペプチド交換の分析
ペプチド交換を開始するために、０．５μＭ  ＭＨＣ  Ｉ−ペプチド複合体を、定義した交換条件下で、１１０μｌ  ＰＢＳ中の５０μＭ交換ペプチドとインキュベートした。インキュベーション交換後、１４,０００ｘｇで１分間、室温で溶液を遠心し、その後、移動相としてＰＢＳを用いる、３００×７.８ｍＭ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−Ｓ３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣシステムでのゲル濾過によって、上清を分析した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェア（バージョン５.８５）を用いてデータを処理し、分析した。
【０１１６】
質量分光法によって求めた相対交換効率
Ｈ−２Ｋｂでのペプチド交換を定量化するために、０．５μＭＨ−２Ｋｂ単量体（Ｈ−２Ｋｂ−ＦＡＰＧＮＡＰＡＬを、ＰＢＳ中５０μＭのペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４）、ＦＡＰＧＮＷＰＡＬ（配列番号５）、ＦＡＰＧＮＹＰＡＡ（配列番号６）、またはＦＡＰＧＮＡＰＡＬ（配列番号７）と４５分間、室温でインキュベートした。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１でのペプチド交換を定量化するために、０．５μＭ  ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１単量体をＰＢＳ中５０μＭのペプチドと３時間、３２°Ｃでインキュベートした。
【０１１７】
分析前に、交換した単量体を１４,０００×ｇで１分間、室温で回転させて、凝集体を除去し、その後、ＵｌｔｒａｃｅＬ−３０膜を備えたＭｉｃｒｏｃｏｎ−３０ｋＤａ遠心分離機フィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，トリプシンによるＢＳＡ分解物と予めインキュベートして、膜へのペプチドの粘着を防いだ）を用いて精製して、未結合の過剰ペプチドを除去した。ＰＢＳで２回、重炭酸アンモニウムで２回、室温で洗浄した後、ＭＨＣ−結合したペプチドを２００μｌ  １０％酢酸の添加によって溶出し、続いて６００ｒｐｍで１分間、室温で混合した。溶出したペプチドを、ＵｌｔｒａｃｅＬ−３０膜を備えたＭｉｃｒｏｃｏｎ−３０ｋＤａ遠心分離機フィルターユニットを用いて分離した。溶出液を凍結乾燥し、質量分光法で分析した。
【０１１８】
ＭＳ分析のために、ペプチドを９５／３／０．１ｖ／ｖ／ｖ水／アセトニトリル／ギ酸に溶解し、その後、先に記載した通り２６、１１００ＨＰＬＣシステムを用いるオンラインｎａｎｏ  ＨＰＬＣ  ＭＳ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって分析した。ペプチドを、１０μｌ／ｍｉｎで、１５−ｍＭカラム（１００−μＭ  ＩＤ；ＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ  Ｃ１８−ＡＱ，３μＭ，Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ社）上に封入し、２００ｍＭカラム（５０−μＭ  ＩＤ；ＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ  Ｃ１８−ＡＱ、３μＭ）へ１５０ｎｌ／ｍｉｎで溶出した。すべてのカラムは社内で詰めた。カラムを、０．１％ギ酸中のアセトニトリル０〜５０％の３０−ｍｉｎのグラジエントで展開した。ｎａｎｏＬＣカラムの末端をチップ（５−μＭＩＤ）に引き、溶出液を７−ｔｅｓｌａ  ＬＴＱ−ＦＴ  Ｕｌｔｒａ  質量分光計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）内へ噴霧した。
【０１１９】
質量分光計をデータ依存モードで操作し、ＭＳとＭＳ／ＭＳ取得との間で自動的に切り替えた。十分なスキャンＭＳスペクトルを、解像度２５,０００のＦＴ−ＩＣＲで、３,０００,０００の目標値で取得した。その後、２つの最も強いイオンを、目標蓄積値５０,０００、解像度５０,０００のＦＴ−ＩＣＲでの選択したイオン−モニタリングスキャンによって、正確な質量測定値に分離した。選択したイオンを、１０,０００の標的値での、衝突によって誘導された解離を用いて、直線のイオントラップにおいて断片化した。溶出したペプチドの量を定量化するために、それぞれの合成ペプチドで標準曲線を作成した。
【０１２０】
マウス
野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ    Ｌｅｉｄｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＬＵＭＣ）で、特定の病原体がない状態下で維持した。ＭＣＭＶ感染ＢＡＬＢ／ｃマウスからの唾液腺ストックに由来する５×１０４ＰＦＵマウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）−Ｓｍｉｔｈ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）ＶＲ−１９４；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞で増殖させた２×１０５ＰＦＵリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）Ａｒｍｓｔｒｏｎｇにマウスを腹腔内感染させた。ウイルス力価を、公開されているプラークアッセイ２７によって決定した。すべての動物実験は、ＬＵＭＣの動物実験委員会の承認の下、欧州評議会による”Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｉｍａｌｓ”の実施およびＬＵＭＣによる動物実験ガイドを果たすＤｕｔｃｈ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ａｃｔに従って実施した。
【０１２１】
主要ヒト材料の回収
末梢血液試料は、ＬＵＭＣによる承認およびヘルシンキ宣言に従う文書のインフォームドコンセントの後に、Ｔ細胞除去同種幹細胞移植（ａｌｌｏ−ＳＣＴ）後のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性多発性骨髄腫患者から得た。ウイルス再活性化をモニターするために、新鮮な全血でのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）およびＨＣＭＶＤＮの負荷を定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって評価した。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、フィコール・イソパーク分離（ＬＵＭＣ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて回収し、液体窒素の気相中で凍結保存した。ウイルスに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞再構成を、解凍したＰＢＭＣでフロー・サイトメトリーによって決定した。
【０１２２】
抗体および試薬
フィコール・イソパークをＬＵＭＣ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。蛍光色素結合抗体はいくつかの供給業者から購入した。Ｖ５００抗マウスＣＤ３、ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ８、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４、パシフィックブルー抗ヒトＣＤ８、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１４は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ＢＶ６０５抗マウスＣＤ８は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。蛍光色素結合ストレプトアビジンおよび７−ＡＡＤはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＤＡＰＩは、Ｓｉｇｍａから購入した。従来のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ＰＥ標識四量体を、すべての示したＴ細胞特異性について、先に記載した通り製造した１１。ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）は、Ｃｈｉｒｏｎ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。
【０１２３】
マウスＣＤ８＋Ｔ細胞のフロー・サイトメトリー分析
Ｈ−２Ｋｂ−ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ多量体を５分間、室温で選択したペプチドと交換し、その後、以前に記載した、Ｈ−２Ｋｂ制限ＯＶＡ２５７−２６４特異的ＴＣＲ形質転換系統（ＯＴ−Ｉ）の染色に使用した２８。概して、２００,０００個の細胞を、ＡＰＣ標識またはＰＥ標識の、温度交換または従来の多量体で１０分間、室温で染色し、その後、表面マーカー抗体（抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ）で、４°Ｃで２０分間染色した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．５％ＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウム）で細胞を２回洗浄し、その後同緩衝液に再懸濁した。ＤＡＰＩを０．１μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。試料を、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｆｕｓｉｏｎを用いて測定し、データをＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（バージョン８．０．２）で分析した。
【０１２４】
ウイルスに特異的なＴ細胞を、赤血球溶解後のＬＣＭＶ感染マウスの血液試料またはＭＣＭＶ感染８〜１０週齢マウス（６〜８週に感染した）から得られた脾細胞において分析した。低張塩化アンモニウム緩衝液（１５０ｍＭＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭＫＨＣＯ３；ｐＨ７.２＋／−０．２）を用いて赤血球を溶解した。適切な温度交換多量体および表面マーカー（７−ＡＡＤ、抗ＣＤ３−Ｖ５００、抗ＣＤ８−ＢＶ６０５）で３０分間、４°Ｃで細胞を同時に染色した。多量体を滴定して、最適なＴ細胞染色を確立した。一般に、５０μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液中の１０,０００〜１００,０００個のＴ細胞を染色するのには、１：２０〜１：４０の希釈が十分であった。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、再懸濁した。ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて試料データを取得し、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖソフトウェアを用いて分析した（バージョン８.０．２）。
【０１２５】
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のフロー・サイトメトリー分析
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ（配列番号１）の多量体を３２°Ｃで３時間、選択したペプチドと交換し、対応するＣＤ８＋Ｔ細胞を染色するのに使用した。ＵＶ交換した多量体を製造し、公開プロトコールに従って交換した１７、１８。
【０１２６】
示したウイルスＴ細胞特異性（１０％ヒト血清および１００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を追加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で培養）のクローンまたは細胞株をＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−陰性ドナーのＰＢＭＣｓと混合して、多量体陽性細胞と多量体陰性細胞を識別できるようにした。ＰＥ標識温度交換多量体、従来の多量体またはＵＶ交換した多量体と１０分間、４°Ｃでインキュベーション後、表面マーカー抗体（抗ＣＤ８−パシフィックブルー、抗ＣＤ１４−ＡＰＣ）で細胞を２０分間、氷上で染色した。多量体を滴定して、バックグランドなしで最適なＴ細胞染色を確立した。ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＨＳｉｎＰＢＳ中）で細胞を２回洗浄し、再懸濁した。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて試料を取得し、ＢＤＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（バージョン８.０．２）を用いて分析を実施した。多量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団および全血中のＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮物内の多量体陽性細胞のパーセンテージに基づいて計算した。
【０１２７】
結果
温度交換に適したＭＨＣ  Ｉ−ペプチド対の同定
ＭＨＣ、例えばＭＨＣ  Ｉの温度交換に適したペプチドを設計する場合、特定した最も重要な基準は、条件付きのリガンド（テンプレートペプチド）で満たしたＭＨＣ  Ｉ複合体が低い温度で安定であるべきであるが、より高い温度で不安定であるべきであり、例えば、４°Ｃで効率的にリフォールディングするべきであるが、温度上昇によってペプチドが解離し、入ってくるペプチドカーゴが結合できることである（図１ａ）。ＭＨＣ  Ｉ−ペプチド安定性にとって主要な決定基は、ＭＨＣ  Ｉからのペプチドの解離である２３。我々は、解離速度が低いそれぞれのＭＨＣ  Ｉ分子に結合することが知られているペプチドを同定し、それらのアンカー残基を置換して、解離速度を上昇させた。インプットペプチド（テンプレートペプチドに加えて導入すべき望ましいペプチド）が、それらをリフォールディング反応に添加する前に好ましくは純粋であることが見出された。ＭＨＣ重鎖と比較して大過剰のペプチドを使用していることから、ほとんど検出できない不純物が、ＭＨＣ  Ｉをリフォールディングすることによって優先的に選択でき、予想外の定性を有する複合体が得られる（データ示さず）。
【０１２８】
我々は、センダイウイルスエピトープＦＡＰＧＮＹＰＡＬ（配列番号８）（ＮＰ３２４−３３２）に由来する低親和性ペプチドとのマウスＨ−２Ｋｂの複合体を以前に製造し、それらの安定性およびペプチド結合の反応速度を分析した２３。我々は、試験した７個のペプチドから、ＦＡＰＧＮＡＰＡＬのみペプチド交換に必要とされる基準を満たしたことを見出した。熱変性の中間点として定義されるＦＡＰＧＮＡＰＡＬとＨ−２Ｋｂの複合体の融点は~３３°Ｃである（図６）。これに照らせば、試験した２つの上昇した温度（２６°Ｃおよび３２°Ｃ）のいずれかで、ＦＡＰＧＮＡＰＡＬはＨ−２Ｋｂから迅速に解離し、再結合しない２３。これは、Ｈ−２Ｋｂ−ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ複合体が４°Ｃでリフォールディングするのに十分に安定であるが、上昇した温度では不安定であり、したがって、温度誘導ペプチド交換に適した複合体であり得ることを示す。
【０１２９】
交換技術をヒトへの応用につなげるために、我々は、白色人種の集団において最も頻繁なヒトＭＨＣ  ＩアレルであるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に適したペプチドを同定することを試みた。我々は、１つのアンカー（ＩＡＫＥＰＶＨＧＶまたはＩＬＫＥＰＶＨＧＡ（配列番号１０）または両方のアンカー（ＩＡＫＥＰＶＨＧＡ）で修飾したＨＩＶ−１エピトープＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（配列番号９）（ＲＴ４７６−４８４）に基づいてペプチドを設計した。修飾したペプチドを有するＨＬＡ−Ａ＊０２：０１複合体を製造し、熱安定性実験を実施し、トリプトファン蛍光を温度範囲にわたってモニターして、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ペプチド複合体のアンフォールディングを評価した。驚くべきことに、試験した４つの複合体の中からＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶが最も低い融点（~３８°Ｃ）をｓｈｏｗｅｄ（図６）。我々は、融点が、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶが温度に基づくペプチド交換に適し得る第１の指標であることを見出した。
【０１３０】
温度易変性ＭＨＣ  Ｉ−ペプチド単量体はある範囲のペプチドを効率的に交換する。
次に、我々は、複合体におけるＨ−２ＫｂのＦＡＰＧＮＡＰＡＬとの温度範囲にわたる交換効率を、分析サイズ排除ＨＰＬＣを用いて評価した。我々は、複合体は室温で（２０℃）不安定であり、変性および沈殿を生じることを見出した。
【０１３１】
これは、ＨＰＬＣで分析した際にＭＨＣ  Ｉのピークがないことで例証される（図１ｂ）。ｏｆ高親和性ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、ＯＶＡ２５７−２６４）の存在下でインキュベートした際に、明らかなピークを観察し、これは、Ｈ−２Ｋｂがアンフォールディングから「救出」され得る（図１ｂ，上のパネル）ことを実証する。ＦＡＰＧＮＡＰＡＬ（ＫＤ＞４μＭ２３）のＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＫＤ＝１.４ｎＭ２９）への交換は、３０分以内にほぼ完了した。２４時間後に１５％のみ効率が増加した（図１ｂ，上のパネルおよび図１ｃ）。
【０１３２】
同様に、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶに基づく４つのペプチドのいずれかを有する複合体におけるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を、異なる温度および時点での高親和性結合ペプチド（ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）Ｂ１９Ｒ−Ａ２／ＷＬＩＧＦＤＦＤＶ，ＫＤ＝０．０６ｎＭ３０）（配列番号１１）との交換について試験した。ＩＬＫＥＰＶＨＧＶまたはＩＬＫＥＰＶＨＧを有する複合体におけるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１は、室温で安定のままであり、上昇した温度でも無傷のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１が依然として検出できた（３７または４２°Ｃ，図７ａ−ｂ）。それらの高い融点（それぞれ~５７および４７°Ｃ，図６）、および解離定数（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ−ＫＤ＝２.５ｎＭ３１；ＩＬＫＥＰＶＨＧＡ−ＫＤ＝１.１μＭ（ＮｅｔＭＨＣで予測）３２、３３）も考慮すると、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶおよびＩＬＫＥＰＶＨＧＡは交換反応のインプットペプチドとして失格である。
【０１３３】
我々は、効率的な温度誘導交換を可能にする、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に結合する最適なペプチドを探し続けた。ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ（ＫＤ＝７.３μＭ（ＮｅｔＭＨＣで予測）３２、３３）またはＩＡＫＥＰＶＨＧＡ（ＫＤ＝１９.１μＭ（ＮｅｔＭＨＣで予測）３２、３３）ペプチドを有するＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の複合体は、室温でもかなり安定しなかった（図７Ｃ−ｄ）。より高い安定性の結果として、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶのリフォールディング効率が、最大救出であったように、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＡのものより実質的に高かった（表１）（図７Ｃ−ｄ）。
【表１】
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表１．ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ由来ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ペプチド複合体のリフォールディング効率．リフォールディング効率は、精製し、インプットがない重鎖（封入体から）に関連した適切に折り畳まれたＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ペプチド複合体のパーセンテージとして表わした。
【０１３４】
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶを、２つの温度、すなわち３７°Ｃで１時間、または３２°Ｃで３時間、効率的に交換した（図７ｃ）。我々は、最適な交換に必要とされるより高い温度にもかかわらず、一般のペプチド交換の適用に最も良い候補複合体として、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶを選択した。
【０１３５】
結論として、我々は、効率的な温度誘導交換反応を可能にする２つのＭＨＣ  Ｉ−ペプチド対を同定した。最適な交換複合体を定める我々の選択基準は、他のＭＨＣアレルに拡張可能であるべきである。
【０１３６】
幅広い技術として、ＭＨＣ  Ｉ多量体は、それらのペプチドを、多くの癌抗原由来ペプチドなどの比較的低い親和性ものを含む多くの異なるペプチドへ交換すべきである３４。この技術の幅広い適用性を試験するために、我々は、ＦＡＰＧＮＡＰＡＬを、ＦＡＰＧＮＷＰＡＬ（２６℃でＫＤ＝３３ｎＭ、３２℃でＫＤ＝３３ｎＭ２３）またはＦＡＰＧＮＹＰＡＡ（２６℃でＫＤ＝１８ｎＭ、３２℃でＫＤ＝１４４ｎＭ２３）に交換した。準最適ペプチドの両方について、交換効率が、ＳＩＩＮＦＥＫＬについて観察された水準の８０〜９０％に達した（図１ｂ−ｃ）。質量分光法分析は、交換複合体が、ＦＡＰＧＮＷＰＡＬの９４.２％、およびＦＡＰＧＮＹＰＡＡの８４.４％をそれぞれ含んでいたことを示した。交換後、テンプレートなしのペプチドＦＡＰＧＮＡＰＡＬが検出され、これは、すべてのＭＨＣ  Ｉ−ペプチド複合体が交換したペプチドを含んでいたことを実証する（表２）。
【表２】
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表２．質量分光法による交換効率の相対的な定量化．ＭＨＣ  Ｉでのペプチド交換を、０．５μＭ単量体（Ｈ−２ＫｂまたはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１）を用いて実施し、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓにて説明した通り、単量体を５０μＭのペプチドとインキュベートした。また、単量体をペプチドなしでインキュベートして、これらの条件下での複合体の安定性を決定した。溶出したペプチドの量を定量化するために、それぞれの合成ペプチドを用いて、標準曲線を作成した。Ｈ−２Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬを陽性対照として測定した。
【０１３７】
すぐに使用できる温度交換ＭＨＣ  Ｉ多量体を用いる抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の検出
ペプチド交換の技術は、ＭＨＣ  Ｉ多量体に直接適用できればさらにより魅力的であり、現在の交換技術は厳しい制限がある。現在の交換技術では、単量体が最初に交換され、その後、多量体化されるが（図２ａ，上のパネル）、本明細書に記載の方法は、多量体にも直接適用できる（図２ａ，下のパネル）。交換した多量体の機能性を試験するために、我々は、ペプチド交換前または後に多量体を生成し、これらを使用して、ＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的なＯＴＩＴ細胞を染色した（図２ｂ）。温度交換によって調製した多量体は、従来の多量体と区別がつかないほどに機能した（図２ｂ）。多量体が交換されなかった場合、または無関係のペプチド（ＦＡＰＧＮＹＰＡＬ、図２ｂ）に交換した場合、陽性染色は見られなかった（データ示さず）。
【０１３８】
凍結での多量体の安定性を評価した際、我々は、多量体単独では凍結−解凍サイクルに悩まされたが、凍結前に約３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび／または約１０％グリセロールを添加すると、凍結−解凍サイクル中の安定性が確実になったことを見出した（図２ｃ）。したがって、温度媒介ペプチド交換を使用して、温度交換可能な多量体のストックから直接様々なペプチドを充填する状態になっているＭＨＣ多量体を製造することができると結論付けた。これは、多量体染色実験前にいずれの時間がかかる調製も取り除くことで、重要な利点を示す。
【０１３９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＬＣＭＶおよびＭＣＭＶ感染に対する免疫応答は、広く特徴付けられており、我々は、モデルとしてこれらの感染を使用して、抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の検出における我々の温度交換多量体の品質を例証した３５−３８。
【０１４０】
我々は、以下の免疫優性エピトープ：ＬＣＭＶエピトープＮＰ２３８−Ｋｂ／ＳＧＹＮＦＳＬＧＡＡＶ（配列番号１２）およびＭＣＭＶエピトープＭ３８−Ｋｂ／ＳＳＰＰＭＦＲＶ（配列番号１３）およびＩＥ３−Ｋｂ／ＲＡＬＥＹＫＮＬ（配列番号１４）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を測定した（表３）。
【表３】
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表３．本調査に使用したペプチドおよびそれらの改変の記述．使用したペプチドのいくつかは、アンカー位置（太字で示される）で修飾したＦＡＰＧＮＹＰＡＬまたはＩＬＫＥＰＶＨＧＶの誘導体である。ＨＡｄＶ−ヒトアデノウイルス、ＬＣＭＶ−リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ＣＭＶ−サイトメガロウイルス、ＨＩＶ−ヒト免疫不全ウイルス、ＥＢＶ−エプスタイン・バーウイルス、ＶＡＣＶ−ワクシニアウイルス、ｍ−マウス、ｈ−ヒト、それぞれのＭＨＣに対する親和性は、公開されている証拠からであるか、またはＮｅｔＭＨＣで予測されたもの（＊で示される）である。
【０１４１】
我々は、最初にＨ−２Ｋｂ単量体での交換をＨＰＬＣによって測定した。ＳＩＩＮＦＥＫＬについて、すべての３つのペプチドが５分以内に室温で高い効率で交換され、安定したＨ−２Ｋｂ複合体を製造し、これは、ペプチドなし、またはＦＡＰＧＮＡＰＡＬの過剰での交換反応では見られなかった（図３ａ、図３ｂにおいて定量）。その後、我々は、Ｈ−２Ｋｂ多量体で、これらの３つのウイルスエピトープへの温度媒介交換を実施し、これらの多量体を使用して、ＬＣＭＶ感染マウスからの血液試料またはＭＣＭＶ感染マウスからの脾細胞を染色した。
【０１４２】
温度感受性ペプチドを有する多量体をフリーザーから取り出した後５分以内に、多量体が用意でき、従来の多量体と同じくらい効率的に抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を染色し（図３ｃ）、温度交換技術が応用可能であることを実証する。
【０１４３】
同様に、３２°Ｃで３時間、または３７°Ｃで４５分間、インキュベートした際に、選択したウイルスエピトープ（ＨＣＭＶｐｐ６５−Ａ２／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１５）、ＨＣＭＶＩＥ−１−Ａ２／ＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（配列番号１６）、ＥＢＶＬＭＰ２−Ａ２／ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号１７）、ＥＢＶＢＭＬＦ−１−Ａ２／ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号１８）、ＥＢＶＢＲＬＦ１−Ａ２／ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ（配列番号１９）およびヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ）Ｅ１Ａ−Ａ２／ＬＬＤＱＬＩＥＥＶ（配列番号２０）（表３に詳細あり））にＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ単量体を直ちに交換できた。
【０１４４】
ＨＰＬＣ分析は、ペプチドなしで３２°Ｃでインキュベーション後、ＭＨＣピークが検出されなかったことを示し、これは、ＭＨＣ単量体の分解および沈殿を示す（図４ａ）。しかしながら、ペプチドとインキュベーション後、ＭＨＣ  Ｉ単量体のピーク領域が、すべてのペプチドについてインキュベートしていない複合体のものと少なくとも同程度に高かった（図４ａ，図４ｂで定量）。３７°Ｃで４５分間のインキュベーションは、同様に効率的な救助をもたらした。
【０１４５】
幅広いスペクトルの親和性にわたってペプチドに交換できるように、我々は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１最適な交換条件として、３時間、３２°Ｃを選択した。
【０１４６】
これらのエピトープに交換した多量体は、３時間以内に用意でき、対応する特異性でＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを染色するのに直接使用された。検出された多量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、従来のまたはＵＶ交換した多量体を用いて検出されたものに対応し、それらの適切な機能が確認された（図４ｃ）。無関係のペプチドに交換した多量体とインキュベートした際、染色が見られなかった。
【０１４７】
交換したＭＨＣ  Ｉ−ペプチド多量体は免疫モニタリングに有効な試薬である。
臨床診療における我々の試薬の価値を実証するために、我々は、我々の温度交換多量体を従来の多量体と免疫モニタリング設定において比較した。Ｔ細胞除去後同種幹細胞移植（ａｌｌｏ−ＳＣＴ）患者が重い免疫不全であることから、Ｔ細胞再構成は、ＨＣＭＶおよびＥＢＶ様の日和見ヘルペスウイルス感染によって引き起こされる病的状態および死亡を防ぐことは大きく重要である２、３。したがって、ドナー由来免疫システムが発達するまで、患者は集中的にモニターされる。
【０１４８】
我々は、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶ多量体を、ＨＣＭＶおよびＥＢＶエピトープの選択のために並行して交換し、これらを使用して、ａｌｌｏ−ＳＣＴ後に１週間間隔で得られた末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を染色し、Ｔ細胞頻度をモニターした。ＨＣＭＶ  ｐｐ６５−Ａ２／ＮＬＶに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の反応速度が、ＨＣＭＶウイルスＤＮＡの拡張によって例証されるＨＣＭＶ再活性化と一致している（図５，上のパネル）。陽性ＥＢＶ  ＤＮＡの負荷を１回のみ測定したが、ＥＢＶ  ＬＭＰ２−Ａ２／ＣＬＧに特異的なＴ細胞が時間とともに広がり、より小さい程度で、ＥＢＶＢＭＬＦ−１−Ａ２／ＧＬＣに特異的なＴ細胞が時間とともに広がった（図５，下のパネル）。ＨＣＭＶＩＥ−１−Ａ２／ＶＬＥ（図５、上のパネル）またはＥＢＶＢＲＬＦ１−Ａ２／ＹＶＬ（図５、下のパネル）に対する優位な応答は検出されなかった。実際に、これは患者に特異的である。従来の多量体を用いて検出されたこれらのエピトープに特異的なＴ細胞がないことから、このことは、本明細書に開示されている方法によって提供された多量体が特異的であることを裏付ける。特異的なＴ細胞の頻度は、従来の多量体と温度交換多量体との間で同程度であった。これは、原発性免疫モニタリング試料で典型的に見られる低い頻度でも、抗原に特異的なＴ細胞の検出のために迅速に多くの異なるＭＨＣＩ多量体を即興で製造する我々の技術の効率および柔軟性をさらに強調する。
【０１４９】
議論
我々は、多数の異なるＭＨＣ多量体の並行生成を可能にする驚くべき、信頼性のあるアプローチについて説明する。交換可能な多量体ストックの貯蔵用の−８０°Ｃフリーザー、および交換のための最適な温度でのインキュベーションのためのサーモブロック、水浴またはＰＣＲ機械を必要とするのみであることから、我々のアプローチは、すべての研究室にて適用できる。このシステムはより速く、単一のＭＨＣ  Ｉ−ペプチド組み合わせ、リフォールディングおよび精製によってそれぞれの複合体を製造することで作製されたものに加えて、化学的に引き起こされたまたはＵＶ媒介ペプチド交換によって生成されたものからの多量体の生成より困難ではない１４−１７。
【０１５０】
該アプローチは、多量体における速く、ほとんど定量的なペプチド交換を可能にする一方で、ＵＶ媒介交換を用いる多量体の並行生成は、試料プレートにわたる、試料プレートとの間における一様でない蒸発のために変化しやすく、フルオロフォア漂白により、既製のＭＨＣ  Ｉ多量体で実施できない。
【０１５１】
我々は、既製の温度−感受性のＭＨＣ  Ｉ多量体が−８０°Ｃで保存でき、解凍しながら最適なペプチドとすぐにインキュベートでき、ＭＨＣ  Ｉアレルに応じて５〜１８０分以内のペプチド交換を可能にする方法を確立した。これは、免疫モニタリングおよび新しい（新）抗原の発見を促す、今までに開発された多量体製造の最も頑丈な技術である。我々は、ＭＨＣ抗原特異的Ｔ細胞の迅速な、頑丈で、安価な検出が、感染に対する応答のみならず癌および感染症に対するワクチンに対する応答の免疫モニタリングに加えて、癌免疫療法に対しても強い衝撃を与えると予測する２２、３９−４１。
【０１５２】
我々は、１匹のマウス、１人のヒトの２つのＭＨＣ  Ｉアレルについて、温度交換多量体が、従来の多量体またはＵＶ交換した多量体と同じ程度効率的に、低い頻度で存在するものを含む特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を染色できたことを示した。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１での温度交換に適したペプチドの設計は、マウスＭＨＣ  Ｉと比較してヒトＭＨＣクラスＩ複合体の安定性が本質的により高いという一部の理由から、Ｈ−２Ｋｂより困難であると証明した。我々は、Ｈ−２Ｋｂ−ＦＡＰＧＮＡＰＡＬおよびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−ＩＡＫＥＰＶＨＧＶの両方について、温度易変性インプットペプチドを、高親和性ペプチドおよび低親和性ペプチドの両方に交換し得、Ｔ細胞特異性の幅広いアレイについての試験が可能となることを実証した。低親和性ペプチドへのＭＨＣ多量体温度交換は、従来のまたはＵＶ交換した多量体と比較してバックグランド染色の差が見られなかったことから、非常に特異的である。ａｌｌｏ−ＳＣＴ受容者におけるウイルス再活性化のモニタリングでのそれらの使用は、温度交換可能なＭＨＣ  Ｉ多量体の柔軟性および単純さを例証する。
【０１５３】
我々は、上昇した温度で放出できる、低い温度でＭＨＣ  Ｉと安定した複合体を形成するペプチドを設計した。低い温度の交換および外因性ペプチドによる十分な置換を可能にする最適なペプチドの選択は自明ではない。多くの最適な選択肢は、準最適な長さであり、より小さいアンカー残基を有し、Ｎ末端またはＣ末端を変更したペプチドを含む２４。その後、我々は最もよく使用されるマウスおよびヒトＭＨＣ  Ｉアレルについてここでは記述したように、多くのペプチド配列を試験して、最適なＭＨＣ  Ｉ−ペプチド組み合わせを同定する必要がある。さらに、拡大するこの原理を多くの他のＭＨＣ  Ｉアレルに拡大することで、ウイルスまたは腫瘍抗原を配列決定し、結合し得る断片を予測し、１日以内に合成し、すぐに使えるＭＨＣ  Ｉ多量体（−８０℃フリーザー中に保存されている）に充填する手順を提供できる。その後、ＭＨＣ  Ｉ多量体の製造がもはや時間制限要因ではないことから、２日以内に患者のＴ細胞応答をモニターできた。
【０１５４】
結論として、我々は、望みのエピトープで満たしたＭＨＣ  Ｉ多量体の速く、容易な生成方法を提示する。この方法は、ＭＨＣ多量体技術をいずれの研究または臨床化学実験に利用できるようにし、これは最適な方法となり得る。
【０１５５】
本発明について十分に説明したが、当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することない幅広い等価なパラメータ、濃度、および条件内で、過度な実験なしで、本発明を実施できることを理解する。
【０１５６】
学術論文または要約、公開または対応特許出願、特許、またはいずれの他の参考文献も含む、本明細書において引用したすべての参考文献は、引用文献にて示されたすべてのデータ、表、図、および文章を含めて、参照により本明細書にすべて組み込まれるものとする。さらに、本明細書において引用した参考文献内で引用されている参考文献の内容全体も参照によりすべて組み込まれるものとする。
【０１５７】
既知の方法ステップ、従来の方法ステップ、既知の方法または従来の方法への言及は、本発明のいずれの態様、説明または実施形態も関連分野に開示されるか、教示されるか、示唆されていると決して認めるものではない。
【０１５８】
特定の実施形態の前述の説明は、当分野の知識（本明細書において引用されている参考文献の内容を含む）を適用することによって、過度な実験なしで、本発明の一般概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を容易に改変するか、かつ／または様々な用途に適合させることができるほど十分に本発明の全体の性質を十分に明らかにする。したがって、そのような適合および改変は、本明細書において示された教示およびガイダンスに基づいて、開示された実施形態の等価物の意味および範囲内である。
【０１５９】
本明細書中の用語または専門用語は説明のためのものであり、制限するものではなく、本明細書の専門用語または用語は、当業者に照らして本明細書において示される教示およびガイダンスに照らして、当業者の知識と組み合わせて、当業者によって解釈されるものであることを理解すべきである。
【０１６０】
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【図１ａ】
2021500387.tif 000010
【図１ｂ】
2021500387.tif 000011
【図１ｃ】
2021500387.tif 000012
【図２ａ】
2021500387.tif 000013
【図２ｂ】
2021500387.tif 000014
【図２ｃ】
2021500387.tif 000015
【図３ａ】
2021500387.tif 000016
【図３ｂ】
2021500387.tif 000017
【図３ｃ】
2021500387.tif 000018
【図４ａ】
2021500387.tif 000019
【図４ｂ】
2021500387.tif 000020
【図４ｃ】
2021500387.tif 000021
【図５】
2021500387.tif 000022
【図６】
2021500387.tif 000023
【図７】
2021500387.tif 000024
【配列表】
2021500387000001.app
【国際調査報告】
2021500387.tif 000025
2021500387.tif 000026
2021500387.tif 000027
2021500387.tif 000028
2021500387.tif 000029